hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
う蝕病原性細菌のバイオフィルム関連遺伝子と母子感染の研究

ミュータンス菌は、う蝕(虫歯)の主な原因菌であり、歯の表面にバイオフィルム(細菌の集合体、歯垢)を形成する。ミュータンス菌のバイオフィルム形成には様々な遺伝子が関与していると言われている。本研究では、SMU832, 833の遺伝子発現は、凝集やバイオフィルム形成の早い時期に影響を及ぼしていることが示唆された。また、デキストロースを含まないTSBにグルコースを添加した培地において、SMU832やSMU833欠損変異株のバイオフィルム形成には菌体外DNAが関与していることも示唆された。本研究は、Streptococcus mutansの病原性の指標として、従来から調べられていたグルコシリトランスフェラーゼ(gtf)ではなく、バイオフィルムの質を評価するために、バイオフィルム形成能やバイオフィルムの構造に着目し、S. mutansの母子感染との関連について研究を行うことを目的としている。具体的には、DNAマイクロアレイを用いて我々が現在までに解析してきたS. mutansのバイオフィルム調節やクオラムセンシングに関わる遺伝子が母子間の伝播・定着にどのように影響を及ぼしているのかについて研究を行っている。本年度は、既に我々がDNAマイクロアレイを用いて解析したS. mutansのバイオフィルム調節に関わる遺伝子の74のうち、SMU832(hypothetical protein),833(putative glycosyltransferase)について引き続き研究を行った。昨年度、Wild Type UA159に対し、SMU832 mutantとSMU833 mutantのBHIやTSB w/odextrose培地における増殖曲線においては差が認められなかったが、TSB w/odextrose +sucrose培地における増殖曲線においては、差が認められたため、本年度は、sucroseを構成しているglucoseとfructose下における増殖の違いを検討した。その結果、fructose下において、増殖曲線に明らかな違いが認められ、来年度学会発表を行う予定である。また、今年度はもう一つの目的である、本大学歯学部附属病院小児歯科外来を受診している母子よりプラークと唾液を採取し、S. mutansを分離することができた。同母子ペアの口腔内環境の指標として、dmftや唾液pH値、および唾液緩衝能も測定し、これに関しては解析を進めている。本年度の目的は、既に我々がDNAマイクロアレイを用いて解析したS. mutansのバイオフィルム調節に関わる遺伝子の74( Appl. Environ. Microbiol., 2006)のうち、SMU832(hypothetical protein),833(putative glycosyltransferase)についてはバイオフィルム形成に変化が認められ、糖代謝において関与している可能性が示唆されたため検討を行った。その結果、Wild Type UA159に対し、SMU832 mutantとSMU833 mutantのBHIやTSB w/odextrose培地における増殖曲線においては差が認められなかったが、TSB w/odextrose +sucrose培地における増殖曲線においては、差が認められた。本年度の目的は、既に我々がDNAマイクロアレイを用いて解析したS. mutansのバイオフィルム調節に関わる遺伝子の74のうち、SMU832(hypothetical protein),833(putative glycosyltransferase)については欠損株を作製し、様々な栄養状態の異なる培地におけるPhenotypeを検討した。Glucoseが添加されたTSB without dextrose培地において、SMU832やSMU833の欠損株のバイオフィルム形成には、Extracellular DNAが関与していることがわかったが、Lysozymeも関与している可能性が示唆された。また、本学歯学部附属病院小児歯科外来を受診している母子よりプラークと唾液を採取してきたが、その中に含まれるMutans streptococciの細菌数のカウントおよび分離を行った。本研究は、Streptococcus mutansの病原性の指標として、従来から調べられていたグルコシルトランスフェラーゼ(gtf)ではなく、バイオフィルムの質を評価するために、バイオフィルム形成能やバイオフィルムの構造に着目し、S. mutansの母子感染との関連について研究を行うことを目的としている。具体的には、DNAマイクロアレイを用いて我々が現在までに解析してきたS. mutansのバイオフィルム調節やQuorum Sensing System(微生物間情報伝達細胞密度依存的遺伝子発現制御系)に関わる遺伝子が母子間の伝播にどのように影響を及ばしているのかについて研究を行っている。

本年度の目的は、既に我々がDNAマイクロアレイを用いて解析したS. mutansのバイオフィルム調節に関わる遺伝子の74のうち、SMU832 (hypothetical protein), SMU833 (putative glycosyltransferase)については欠損株を作製し、栄養状態の異なる培地におけるPhenotypeを検討した。Glucoseが添加されたTSB without dextrose培地において、SMU832やSMU833の欠損株のバイオフィルム形成には、Extracellular DNAが関与していることがわかったが、初期のバイオフィルム形成において、Lysozymeも関与している傾向が認められた。ミュータンス菌は、う蝕(虫歯)の主な原因菌であり、歯の表面にバイオフィルム(細菌の集合体、歯垢)を形成する。ミュータンス菌のバイオフィルム形成には様々な遺伝子が関与していると言われている。本研究では、SMU832, 833の遺伝子発現は、凝集やバイオフィルム形成の早い時期に影響を及ぼしていることが示唆された。また、デキストロースを含まないTSBにグルコースを添加した培地において、SMU832やSMU833欠損変異株のバイオフィルム形成には菌体外DNAが関与していることも示唆された。数年前より大学全体の改築工事が行われているが、平成26年度は当医局の実験室と医局が大規模改修の対象となったため、実験を行えなえなかった期間が生じてしまった。小児歯科学改修工事にあたって新しい実験室にガス管がないなどの不備が多数あるため、事務に掛け合い一日も早く工事を行ってもらい実験を早急に再開したい。SMU832, 833欠損株は、培地が静止している系(96-wells plate)におけるバイオフィルム形成において、Extracellular DNAが関与していることが示唆されたので、今後は培地が流動している系(フローセルシステム)においてバイオフィルムの形態や形成量の定量を行いたい。本年度は、日本小児歯科学会50周年記念大会の主幹を務めた上、2012年3月に教授が定年退職したため、様々な行事があり、医局の体制も変わり、予想していた研究に対するエフォートを割くことが物理的に不可能であった。本学の女性研究者支援事業において研究支援員配備事業の採択を受け、テクニシャンを1名配備していただいた結果、研究を進めることができたことが大きいと思われる。バイオフィルム調節に関わる遺伝子のうち、SMU832 mutantとSMU833 mutantの様々な培地での増殖曲線での違いが認められた。
酵母液胞形成における小胞輸送:Vam3p依存とPep12p依存の二つの経路

液胞は高等植物の細胞体積の90%以上を占める大きな細胞内コンパートメントを形成し,各種代謝産物の貯蔵と区画化に機能する.さらに,液胞は生体高分子の分解コンパートメントであり,動物細胞のリソソームと相同な細胞内小器官である.先に同定した出芽酵母のVam3pは,液胞膜のシンタクシン分子であり,一方,Pep12pはプレ液胞コンパートメントのシンタクシンであることが示された.酵母での分子細胞生物学的解析の結果,これらの二つの分子は,それぞれ,液胞形成に必須ではあるが,両者の機能は直列的では.なく,並列的な経路を構成していることを明らかにした.出芽酵母で得られている知見が,ひろく高等真核細胞に適用できるが否かを検討し,さらに高等生物のオルガネラ構築を分子レベルで理解する目的で,酵母で発現できるマウスcDNAライブラリーを新規に構築し,マウスsyntaxin-7,syntaxin-12を見いだした.CDNAの構造決定より,両者は酵母Vam3pと相同性を有するtypeII膜タンパク質をコードすることが示唆された.大腸菌発現系を用いて融合タンパク質を作成し,抗原とすることにより特異的抗体を得た.出芽酵母の液胞コンパートメント構築に関与するt-SNARE分子として,Pep12pとVam3pが知られている.これら二つのt-SNAREがゴルジ装置以降の小胞輸送過程においてどのような機能を行っているのかを遺伝学的に解析した.その結果,液胞タンパク質分解酵素の機能発現に関与する遺伝子として同定されたPEP12遺伝子に欠損をもつ変異株pep12は可溶性液胞タンパク質,CPYを細胞外に輸送してしまうが,一方,vam3変異株はCPYを細胞外には誤輸送しない・vam3変異株は液胞膜タンパク質,ALPの生合成に欠損を示し,細胞内には断片化した液胞コンパートメントが存在するといいた表現型を示すのに対して,pep12変異株はALPの生合成には顕著な異常を示さず,また,形態的に野生型と同様の液胞を持つといった,対照的な表現型を示した.このことは二つの異なったシンタクシン様分子,Vam3pとPep12pが異なる機能を果たしながら液胞形成に関与していること,また,液胞可溶性タンパク質と液胞膜タンパク質の局在化には異なる機構が関与していることを意味した.そこで,vam3 pep12二重突然変異株を作成し、その表現型を解析したところ,この二重突然変異株はCPY,ALP両方の成熟化に欠損を示したのみならず,形態的に液胞と認められる構造を欠いていた.以上の結果より,液胞形成には2つの異なるpathwayが存在しておりPep12pとVam3pがこのpathwayに機能していると考えている.液胞は高等植物の細胞体積の90%以上を占める大きな細胞内コンパートメントを形成し,各種代謝産物の貯蔵と区画化に機能する.さらに,液胞は生体高分子の分解コンパートメントであり,動物細胞のリソソームと相同な細胞内小器官である.先に同定した出芽酵母のVam3pは,液胞膜のシンタクシン分子であり,一方,Pep12pはプレ液胞コンパートメントのシンタクシンであることが示された.酵母での分子細胞生物学的解析の結果,これらの二つの分子は,それぞれ,液胞形成に必須ではあるが,両者の機能は直列的では.なく,並列的な経路を構成していることを明らかにした.出芽酵母で得られている知見が,ひろく高等真核細胞に適用できるが否かを検討し,さらに高等生物のオルガネラ構築を分子レベルで理解する目的で,酵母で発現できるマウスcDNAライブラリーを新規に構築し,マウスsyntaxin-7,syntaxin-12を見いだした.CDNAの構造決定より,両者は酵母Vam3pと相同性を有するtypeII膜タンパク質をコードすることが示唆された.大腸菌発現系を用いて融合タンパク質を作成し,抗原とすることにより特異的抗体を得た.
人工染色体技術とゲノム編集技術によるヒト化薬物代謝モデルラットの作製

薬物代謝関連遺伝子をヒトと実験動物で置き換えたヒト化動物は、ヒト特異的な薬物代謝や安全性を予測する上で大きな役割を果たすと考えられる。本研究では医薬品開発のスピードアップと成功確率の向上を目指して、実験動物の中でも経時採血が可能、毒性試験等の背景データが豊富なラットを用いてヒト化動物を作製し、評価を行った。本年度はこれまでに作製したヒト化UGT2ラット(ヒトUGT2導入/ラットUgt2破壊)を繁殖させて以下の実験を行った。1)ヒト化UGT2ラットおよび正常ラットおよびUgt2破壊ラットから肝臓ミクロソームを調整し、さらに購入したヒトミクロソームを用いて、Gemfibrozilのグルクロン酸転移酵素活性を計測した。Ugt2破壊ラットでは低い活性を示し、正常ラットでは高い活性を示し、ヒト化UGT2ラットとヒトでは中程度の活性を示した。2)1)と同様にZidovudineグルクロン酸転移酵素活性を計測したところ、Ugt2破壊ラットでは活性を示さず、正常ラットでは中程度の活性を示し、ヒト化UGT2ラットとヒトでは高い活性を示した。従って、ヒト化UGT2ラットがヒトに近い種差を反映したヒト化モデルであることを明かにした。3)また、ゲノム編集技術を用いて、ラット受精卵にPxr遺伝子破壊用あるいはMdr1遺伝子破壊用のmRNAを導入することで、Pxr破壊ラット、およびMdr1破壊ラットを作製することに成功した。計画したストラテジーについて、予定どおりに成果を上げることができたため。作製できたPxr破壊ラットとMdr1破壊ラットを繁殖させ、各遺伝子の機能が破壊されているかを検討する予定である。本年度は人工染色体技術でこれまで作製したCYP3A導入ラットを正常ラットと交配することで繁殖させた。一方、ゲノム編集技術を用いて、ラット受精卵にゲノム編集用のmRNAを導入することでラットCYP3A遺伝子を破壊し、数種類の変異タイプのCYP3A遺伝子破壊ラットを系統化した。次に各系統のCYP3A破壊ラットより肝臓由来ミクロソームを抽出し、それを用いてCYP3Aの基質であるトリアゾラムの水酸化活性を測定し、ラットCYP3A遺伝子の機能破壊ができた系統を選別した。さらに、ヒトCYP3A-MAC導入ラットと上記CYP3A破壊ラットを交配することで、完全なヒト化CYP3Aラットの作製に成功した。計画したストラテジーについて、予定どうりに成果を上げることができたため。H27年度にCyp3a破壊ラットとCYP3A-MAC導入ラットの交配により、完全ヒト化CYP3Aラットの作製に成功した。本年度はこれらのラットを繁殖させ、以下の実験に用いた。1)肝臓および小腸のミクロソームを調整し、トリアゾラムの代謝活性を計測したところ、肝臓においてはヒトCYP3Aの活性が弱いながらも検出され、小腸においては十分にヒトCYP3Aの活性が検出された。2)CYP3A誘導剤を投与することで、1)と同様の検討を行ったところ、肝臓および小腸ミクロソームいずれにおいても活性が誘導された。3)ヒトCYP3A4特異的阻害抗体を用いて、1)2)と同様の検討を行ったところ、活性が阻害されたことから、導入されたヒトCYP3Aが機能的であることが確認された。4)トリアゾラムのKineticsを完全ヒト化CYP3Aラット、正常ラットおよびヒトとで比較したところ、完全ヒト化CYP3Aラットはヒトに類似していることが確認された。5)完全ヒト化CYP3Aラット、正常ラットおよびヒトとでトリアゾラム代謝物のクリアランス比を比較したところ、完全ヒト化CYP3Aラットはヒトに類似していることが確認された。本年度は人工染色体技術でこれまで作製したUGT2導入ラットを正常ラットと交配することで繁殖させた。一方、ゲノム編集技術を用いて、ラット受精卵にゲノム編集用の2種類のmRNAを導入することでラットUgt2遺伝子クラスター(約760kb)が全て欠損されたラットを系統化した。次にUgt2破壊ラットより肝臓由来ミクロソームを抽出し、それを用いてUgt2の基質であるGemfibrozilのグルクロン酸転移酵素活性を測定し、ラットUgt2遺伝子の機能破壊ができたことを確認した。

さらに、ヒトUGT2-MAC導入ラットと上記Ugt2破壊ラットを交配することで、完全なヒト化UGT2ラットの作製に成功した。計画したストラテジーについて、予定どうりに成果を上げることができたため。薬物代謝関連遺伝子をヒトと実験動物で置き換えたヒト化動物は、ヒト特異的な薬物代謝や安全性を予測する上で大きな役割を果たすと考えられる。本研究では医薬品開発のスピードアップと成功確率の向上を目指して、実験動物の中でも経時採血が可能、毒性試験等の背景データが豊富なラットを用いてヒト化動物を作製し、評価を行った。本年度はこれまでに作製したヒト化UGT2ラット(ヒトUGT2導入/ラットUgt2破壊)を繁殖させて以下の実験を行った。1)ヒト化UGT2ラットおよび正常ラットおよびUgt2破壊ラットから肝臓ミクロソームを調整し、さらに購入したヒトミクロソームを用いて、Gemfibrozilのグルクロン酸転移酵素活性を計測した。Ugt2破壊ラットでは低い活性を示し、正常ラットでは高い活性を示し、ヒト化UGT2ラットとヒトでは中程度の活性を示した。2)1)と同様にZidovudineグルクロン酸転移酵素活性を計測したところ、Ugt2破壊ラットでは活性を示さず、正常ラットでは中程度の活性を示し、ヒト化UGT2ラットとヒトでは高い活性を示した。従って、ヒト化UGT2ラットがヒトに近い種差を反映したヒト化モデルであることを明かにした。3)また、ゲノム編集技術を用いて、ラット受精卵にPxr遺伝子破壊用あるいはMdr1遺伝子破壊用のmRNAを導入することで、Pxr破壊ラット、およびMdr1破壊ラットを作製することに成功した。計画したストラテジーについて、予定どおりに成果を上げることができたため。作製できた完全ヒト化CYP3Aラットを繁殖させ、代謝機能がヒト型化されているかを検討する予定である。完全ヒト化CYP3Aラットを系統維持するとともに、UGT2等の新たなヒト化モデルラット系統作製を行う予定である。作製できた完全ヒト化UGT2ラットを繁殖させ、代謝機能がヒト型化されているかを検討する予定である。作製できたPxr破壊ラットとMdr1破壊ラットを繁殖させ、各遺伝子の機能が破壊されているかを検討する予定である。
ダイレスフォ-ミングによる異形鋼管のテ-パ引抜き加工

断面形状が円形でないわゆる異形管を、工具を用いて長手方向にテ-パ状に引抜き加工することは不可能ある。そこで本研究では、円管素材からロ-ルフォ-ミングにより成形した異形鋼管に対してダイレスフォ-ミング法を適用し、テ-パ状異形鋼管の製造を試みるとともに、実用化についても検討を加えた。一連の基礎研究から得られた成果は以下の通りである。1.高周波加熱装置(3kw,2MHz)ならびに空気冷却器を組入れた定速材料試験機を用いて、角鋼管(辺長21×21mm,肉厚1.22.1mm)の引抜きを行いテ-パ加工の加工精度を調べた。その結果、±1.0%以内の誤差で引抜きができることがわかった。2.加熱幅が加工後の管材の断面形状の変化におよぼす影響について検討を行い、加熱幅の大きい方が形状精度が良く、テ-パ精度も高いことがわかった。3.テ-パ加工における変形挙動を調べるために種々の条件下で実験を行った。その結果、冷却速度が小さい場合は、変形の応状性が低下して誤差の生じることがわかった。4.テ-パダイレス引抜きの工業化を促進するため、実用機の基本設計を行った。加工温度をSTK材の場合700900°C、SUS材では9001000°Cと設定し、生産速度を2.5m/minとして加熱装置の容量を求めると、60kw(加熱効率80%、周波数25kHz)が必要であることがわかった。また引抜き装置は、高温変形抵抗の基礎デ-タから最大50tonfの容量が必要であるが明らかになった。以上の基礎研究から、ダイレスフォ-ミング法によるテ-パ異形鋼管製造の工業化の見通が得られた。断面が円形でないいわゆる異形鋼管をテーパ状に引抜き加工する新しい加工技術を開発するために、以下のような研究を行った。すなわち、高周波加熱装置(3MHz、3Kw)ならびに冷却装置を組み入れた定速(500mm/min)材料試験機を用いて、角鋼管(材質STK41,一辺の長さ21mm、肉厚1.22.1mm)のダイレス引抜きを行い、所定のテーパ状加工が可能であることを確かめた。現在のところ加熱温度770800°Cにおいて最大断面減少率62.5%のテーパ加工に成功している。ただし、これは引張り速度を段階的に制御した非定常変形を利用した方法であり、変形プロファイルは加熱幅によって異なることが判った。そこで、種々の加熱幅を有する四角形状の高周波加熱コイルを試作し、ダイレス引き抜き中の軸方向温度分布についての計測を行うとともに、テーパ引抜き加工後のパイプの形状・加工精度について種々の検討を行った。加熱幅の大きい場合の方が形状精度は良くテーパ度の精度も高いことが判った。温度計測に関しては、赤外線温度計による測定と、アルメルクロメル熱電対を試料表面に溶接して測定する2つの方法をとった。また、測定した温度分布と計算による温度分布を比較した結果、両者はよく一致していることが確かめられたので、最適温度分布の設定に今後これらの解析手法を適用し得ることができる。昭和63年度の研究経過は、おおむね当初計画どおりの進展をみせており、次年度以降の研究計画にも大きな変更点はない。本年度はテ-パ引抜き加工における形状制御ならびに変形挙動の解析に関する研究を行うとともにダイレス引抜き材の機械的性質(主として硬さ)および金属学的研究を行った。研究成果は以下の通りである。(1)形状制御ならびに変形挙動の実験的解析前年度においては引張り速度を段階的に変化させる方法について検討を加えたが、本年度では形状精度を向上させるために引張り速度を連続的に制御する方法を検討した。

引張り速度を段階的に変化させる場合は非定常変形を利用しているため速度の切替えのタイミングが形状精度(テ-パ角など)に直接影響を及ぼし制御が難しかった。しかし連続的な速度制御によれば、テ-パ角に対応する刻々の変形量を与えるため形状精度が向上するほかテ-パ加工がきわめて容易になった。引張り速度を変化させたときの変形挙動(変形の応答性)を調べるために種々の条件下で実験を行った。その結果、ダイレス引抜きにおける冷却速度が小さすぎる場合は変形の応答性が低下しテ-パ角に誤差が生じることがわかった。(2)機械的性質および金属組織円管素材からロ-ルフォ-ミングにより成形した各種の異形管ではコ-ナ部のひずみがきわめて大きく著しく加工硬化(構造部材として試用する場合の割れの原因)しているが、ダイレス引抜きにおける加熱と冷却により異形管の機械的性質が均一化することがわかった。また、加熱温度、冷却速度の制御により材質調整が可能でありかなり広範囲にわたって機械的性質の制御ができることが明らかとなった。(金属組織の改善)本年度は,これまでの研究成果を吟味し総括するとともに,工業的利用の展望を明らかにするためテ-パダイレス引抜きの実用機の基本設計を行った。また,角鋼管以外の異形鋼管についてのテ-パダイレス引抜きを行い,本加工法の適用範囲の拡大についても検討を加えた。テ-パタイレス引抜き機の設計にあたっては,加工対象材質をSTK41炭素鋼およびSVS304ステンレス鋼とし,素材寸法を50×50×2.3mm175×175×8.2mm(正方式断面で最大単位重量を42.1kg/mと設定)とした。また目標とする製品精度は,辺長誤差を±0.5mm/100mm(精度±1.0%),テ-パ-角誤差を±1.0°,平枝部の凸凹を0.5mm以下(精度0.4%以下)とした。また高周波加熱による加工温度はSTK材の場合700900°とし,SVS材では9001000°Cと設定した,加熱コイルの最大移動速度を1500mm/min,最大引張速度を1000mm/min(最大生産速度:2.5m/min)として加熱装置の容量を温度解析結果より求めると,60kw(加熱効率80%,周波数25KHz)が必要であることがわかった。また,引張り装置については高温変形抵抗の基礎デ-タから最大50tonfの容量が必要であることが明らかになった。以上のような設計計算結果より,引抜きストロ-ク3000mm,加熱コイル移動範囲06000mmの油圧駆動方式のテ-パ-ダイレス引抜き機の基本設計を行うことができた。なお装置の部分設計にあたっては,高温加熱による製品自重での曲りを防止するためのロ-ラ支持法および高精度の速度制御を行うためのディジタル制御法について検討を加えた。角鋼管以上の異形管のテ-パダイレス加工については六角管に関しての実験を行い、十分な加工精度が得られることを明らかにした。
倫理的ジレンマを伴う看護管理者の意思決定プロセスの分析

本研究は、看護職トップマネジヤーが、倫理的ジレンマが生じた際にも善しと思える意思決定を行い、倫理的風土が確立された組織作りを担えるためのモデルを提案することを念頭においている。その初段階として、1)実際に生じている倫理的ジレンマにどのようなものがあるのかについて現状を調査し、記述すること、2)倫理的ジレンマを生じさせている要因を明らかにすることを目的とした。第一次調査(平成12年11月から12月)では延べ11人、第二次調査(平成13年12月から平成14年2月)では8人の看護部長に面接調査を実施した。面接協力者の選定は研究者のネットワークを通じて行った。また、兵庫県立看護大学の研究倫理委員会に諮り研究倫理には十分配慮して実施した。面接では事前に「これまでに行った倫理的意思決定のうちで最も困難であった事例」について自由に語っていただいた。その結果、(1)日本的文化規範に従う、(2)住民の要望に応える、(3)政策的な要求を受け入れる、(4)個人の誇りを守る、(5)市民としての義務を果たす、(6)女性性を受け入れる、(7)社会的に人を助ける、(8)看護。の質を保証する、(9)患者の権利を守る、(10)患者の生命を守る、(11)組織の利益を上げる、(12)労働者の権利を守る、(13)看護部門を代表する、(14)医師と協調する、(15)組織のルールに従う、(16)法を守るの合計16の道徳的要求が衝突して倫理的ジレンマを引き起こしていることが明らかになった。また、ジレンマが生じても意思決定の際の価値基準や判断基準が明確である場合には、状況に左右されずに「善し」と思える意思決定が行えていることが示唆された。今後は、1)面接を重ねて道徳的要求のカテゴリーの理論的飽和をめざす、2)看護管理者の倫理的ジレンマを道徳的要求の葛藤パターン毎にまとめ、それらが日常的に起きる頻度を確認する、3)16の道徳的要求の影響の強さを探索する、4)道徳的推論を探索する、5)意思決定をサポートする仕組みを考案することなどを課題としたい。本研究では、医療施設の看護部長が抱える倫理的ジレンマの記述を行った。平成12年11月から12月の間に、10名の看護部長を対象に、半構成的質問項目を使用して面接を行った結果、倫理的ジレンマにまつわる16の事例を聞き取ることができた。次に、一つずつの事例について、倫理的ジレンマを生じさせている道徳的要求が何であるかという視点から内容分析を行った結果、13の道徳的要求が明らかになった。それらは、(1)個人の誇りを守る、(2)女性性を受け入れる、(3)日本的文化規範に従う、(4)看護の質を保証する、(5)患者の権利を守る、(6)組織の利益を上げる、(7)労働者の権利を守る、(8)看護部門を代表する、(9)政治的圧力を受ける、(10)住民の要望をきく、(11)医師パワーと共存する、(12)組織のルールに従う、(13)法を守る、である。さらに、看護部長がどのような立場(アイデンティティ)に立つかという視点でこれらの道徳的要求を整理した。その結果、一個人としての看護部長は、(1)、(2)、(3)を、看護職としては、(4)と(5)を、経営者としては、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)を、組織人としては、(10)、(11)、(12)をもっており、(13)はどの立場にあっても必要な道徳的要求と考えられた。これらの結果から、様々なアイデンティティを持つ看護部長は、それぞれのアイデンティティに伴って必要とされる道徳的要求のぶつかり合いの中で倫理的ジレンマを感じていることが明らかになった。今後は、役割葛藤と倫理的ジレンマの関係性、13の道徳的要求のジレンマへの影響度、一人一人の看護部長の道徳推論過程などを明らかにしていくことを課題と考えている。の質を保証する、

(9)患者の権利を守る、(10)患者の生命を守る、(11)組織の利益を上げる、(12)労働者の権利を守る、(13)看護部門を代表する、(14)医師と協調する、(15)組織のルールに従う、(16)法を守るの合計16の道徳的要求が衝突して倫理的ジレンマを引き起こしていることが明らかになった。また、ジレンマが生じても意思決定の際の価値基準や判断基準が明確である場合には、状況に左右されずに「善し」と思える意思決定が行えていることが示唆された。今後は、1)面接を重ねて道徳的要求のカテゴリーの理論的飽和をめざす、2)看護管理者の倫理的ジレンマを道徳的要求の葛藤パターン毎にまとめ、それらが日常的に起きる頻度を確認する、3)16の道徳的要求の影響の強さを探索する、4)道徳的推論を探索する、5)意思決定をサポートする仕組みを考案することなどを課題としたい。
二分決定グラフに基づく大規模ベイジアンネットワーク解析処理法の研究

1.「二分決定グラフを用いた大規模ベイジアンネットワーク解析処理法」の基本アルゴリズムの開発と改良を進めた.問題の規模が大きいとBDDがメモリあふれを起こす場合がある.そこで問題を複数の部分に分割して解く方法についても検討を行った.2.実用規模の例題を用いた性能評価に向けた準備を進めた.ベイジアンネットワークを表現する二分決定グラフから確率推論計算を高速に行うプログラムを自動合成する方法の改良を進めた。3.前年度に引き続き,統計確率モデルを表現し効率よく解析するための,より一般的なデータ構造の研究を進めた.二分決定グラフは,元来は組合せ論理データを操作するために開発されたデータ構造であるが,確率モデルを表現するために特化することで,さらに改善の余地があるかどうかを随時検討した。さらにベイジアンネットワーク以外の様々な問題に応用範囲を広げて考察を行った。以上の挑戦的萌芽研究の成果は、科学技術振興機構(JST)のERATO湊離散構造処理系プロジェクトの採択につながり、今後も発展的に研究が継続される見込みである。1.「二分決定グラフを用いた大規模ベイジアンネットワーク解析処理法」の基本アルゴリズムの開発と改良を行つた.二分決定グラフは,変数の順序付けによりサイズが著しく変化する性質があるので,与えられたベイジアンネットワークの構造情報を用いて比較的よい変数順序を求めるアルゴリズムの開発を進めた.また,多値論理を2値論理に符号化する方法についても検討する.問題の規模が大きいとBDDがメモリあふれを起こす場合がある.そこで問題を複数の部分に分割して解く方法についても検討した.2.実用規模の例題を用いた性能評価に向けた準備を進めた.ハードウェア/ソフトウェアの故障解析や医学疫学データの解析等,それぞれの分野の専門家と協力して,本手法の有効性の評価を行うための予備検討を行った.3.統計確率モデルを表現し効率よく解析するための,より一般的なデータ構造の研究を進めた.二分決定グラフは,元来は組合せ論理データを操作するために開発されたデータ構造であるが,確率モデルを表現するために特化することで,さらに改善の余地があるかどうかを随時検討した.1.「二分決定グラフを用いた大規模ベイジアンネットワーク解析処理法」の基本アルゴリズムの開発と改良を行った.二分決定グラフは,変数の順序付けによりサイズが著しく変化する性質があるので,与えられたベイジアンネットワークの構造情報を用いて比較的よい変数順序を求めるアルゴリズムの開発とその評価を行った.2.実用規模の例題を用いた性能評価に向けた準備を進めた.ベイジアンネットワークを表現する二分決定グラフから確率推論計算を高速に行うプログラムを自動合成するシステムの実装を行い,その性能を評価した.3.前年度に引き続き,統計確率モデルを表現し効率よく解析するための,より一般的なデータ構造の研究を進めた.二分決定グラフは,元来は組合せ論理データを操作するために開発されたデータ構造であるが,確率モデルを表現するために特化することで,さらに改善の余地があるかどうかを随時検討した。
骨導補聴器の適合方式の改良とその臨床応用

1.骨導補聴器の装用効果推定の精度擬似難聴例と外耳道閉鎖伝音難聴例を対象に、骨導補聴器の物理的特性(聴力レベル表示の音響機械感度レベル,AMSL_<HL>)と装用耳の骨導域値から音場における補聴域値を推定し実測値と比較した。その結果、推定誤差(実測値-推定値)のばらつき(標準偏差)は、気導補聴器よりやや大きかった(擬似難聴で約4dB、難聴例では約7dB)が、臨床で使用可能な精度と考えられた。ただし、フィッティング調整を行うに当たり、測定器であるメカニカルカプラが普及していないので、補聴器のメーカーは、高出力補聴器に補聴器用の骨導受話器を接続した場合のAMSL_<HL>の周波数特性を説明書に表示することが望ましいとの結論に達した。2.伝音難聴患者に対する骨導補聴器の処方方式について骨導補聴器は最大出力が約70dBHLに限られるので線形増幅では会話レベルの音に十分なラウドネスを付加しようとするとそれより大きい音が歪んでしまう。この点を考慮すると、最適な処方は、AMSL_<HL>が-20dBの線形増幅処方と、50dBHL以下の入力音圧ではAMSL_<HL>が0dBの線形増幅、これ以上90dBHLまでの入力音圧では圧縮比を2:1とする非線形増幅処方の範囲にあるとの結論に達した。この点については今後臨床例について検討する予定である。3.骨導語音了解閾値の基準レベル三種類の骨導受話器について、聴力正常者20名の67-S数字語表に対する語音了解域値(SRT)を求め、JIS T1201-2の勧告値の妥当性について検討した。その結果、3種の受話器によるSRTのフォースレベル平均値は勧告値に近いが有意な受話器間差が認められた。原因として、高音域の気導放射音の有無、周波数特性の差が考えられた。骨導語音聴力検査の基準レベルについては、受話器ごとの周波数特性の違いが無視できないので、周波数特性を規格化するか、受話器ごとの基準値の設定が必要と結論した。本年度は、主に骨導補聴器の音響特性から装用利得を予測する理論式の妥当性について検討した。1.測定の精度の向上、能率化:骨導補聴器の振動出力特性を測定する際に、小型加振器とインピーダンスヘッド(申請設備)を用いて人工マストイドの感度較正を行い精度の向上を図った。骨導補聴器の特性測定を簡単に行うために、補聴器測定装置を改良して、気導受話器のカプラ出力の代りに人工マストイドの出力の周波数特性を表示できるようにした。2.擬似難聴を用いた検討:聴力正常被験者10名を対象に、両側の外耳道にイヤモールド用印象剤を注入して擬似難聴を作り、気導骨導差と骨導補聴器の特性の測定結果から装用利得の予測値を計算した。次に、この補聴器を擬似難聴耳に装用させ装用利得を実測し予測値と比較したところ、周波数によっては10dBを超える系統誤差が認められた。3.誤差の原因の検討:聴力正常被験者

10名を対象に、骨導閾値測定用受話器と骨導補聴器の受話器を用いて聴覚閾値を測定し、閾値相当の振動の力のレベルを比較したところ、500Hzと3000Hzで両受話器間に平均5dB以上域値の力のレベルに差が認められた。この差を修正すると、予測値の誤差は10dB以内に改善した。そのほかの誤差の原因として、骨導補聴器のマイクの位置と外耳道入口部の音圧差、臨床的測定法による正常域値と0dB基準値とのずれ等について現在検討を行っている。4.骨導語音聴覚閾値の受話器間差に関する検討:正常各20耳を対象に3種の骨導受話器により語音聴取域値を測定し、これに相当する力のレベルを測定したところ、有意な受話器間差が認められた。周波数特性の受話器間差が原因と結論した。したがって、現行JIS T1201-2のように単一の基準レベルを規定するには、受話器の周波数特性を規定することが必要との結論を得た(Audiol Jpn誌に投稿中)。1.骨導補聴器の装用利得予測における誤差要因昨年度に引続き、補聴器の振動出力特性と装用耳の気導骨導差から装用利得を予測する上での系統誤差要因について検討を行い、以下の誤差要因の存在とその大きさが明らかになった。(1)補聴器の音響機械感度レベルが大きい場合、骨導聴力が正常な装用者では補聴器の内部雑音にマスキングされるため装用閾値の改善度が制限される。(2)音場基準点の音圧と装用時の骨導補聴器のマイクへの入力音圧の差が誤差要因となる。(3)聴力検査用骨導受話器と、骨導補聴器用骨導受話器の聴覚閾値相当のフォースレベルに差が見られる。これらの誤差要因をその平均値で補正するように利得予測式を修正したところ、予測誤差は耳掛け形補聴器の500Hzを除いて平均5dB以内に改善した。2.骨導語音了解閾値の基準レベル三種類の骨導受話器について、聴力正常者の67-S数字語表に対する語音了解(聴取)域値(SRT)を求め、IEC60645-2の基準レベルおよびJIS T 1201-2の勧告値の妥当性について検討した。その結果、3種の受話器によるSRTのフォースレベル平均値は、47.1dB51.2dBと新JIS規格案の勧告値(49dB)の前後の値が得られたが、いずれもIEC基準値より明らかに低い値となった。SRTの受話器間差の主な原因として、高音域の気導放射音の有無、ならびに周波数特性の差が考えられた。骨導語音聴力検査の基準レベルについては、受話器ごとの周波数特性の違いが無視できないので、周波数特性を規格化するか、受話器ごとの基準値の設定が必要である。1.骨導補聴器の装用効果推定の精度擬似難聴例と外耳道閉鎖伝音難聴例を対象に、骨導補聴器の物理的特性と装用耳の骨導域値T_bから音場における補聴域値T_<aided>を、により推定し実測値と比較した。ただし、マイク位置効果は、音場基準点の音圧と装用時の骨導補聴器のマイクへの入力音圧の差で、箱形骨導補聴器の値は知られているが、耳掛け形骨導補聴器の頭部のマイク位置での値の報告はないので、この値を周波数別に測定して得た値を使用した。その結果、推定誤差(実測値-推定値)のばらつき(標準偏差)は、擬似難聴で約4dB、難聴例では約7dBであった。これは臨床で使用可能な精度と考えられた。2.臨床応用に向けて骨導補聴器の音響振動特性にもとづいて難聴者の聴力に合わせた補聴器の調整を行うに当たり、測定器であるメカニカルカプラが普及していないことが問題である。これに対する対策を検討し、以下の方法が適当との結論に達した。骨導補聴器に使用する骨導受話器は、現在世界で1機種しか市販されていないので、補聴器のメーカーは、高出力補聴器にこの骨導受話器を接続した場合のAMSL_<HL>の周波数特性を説明書に表示することにより、これを用いて骨導補聴器のフィッティングが可能となる。3.伝音難聴患者に対する骨導補聴器の処方方式について、以下の処方が適当との結論に達した。
腹腔動脈虚血再灌流後の肺血管内皮細胞機能不全に対するPARS阻害薬の効果

昨年度の研究で虚血再灌流群で肺動脈血管内皮細胞由来の拡張反応が減弱していることが分かった。本年度はこの拡張反応をPARS(Poly ADP-ribose Synthetase)阻害薬投与により改善できるかについて研究した。(方法)雄SDラット(体重350-450g)を用いた。麻酔後開腹し腸管膜動脈を1時間クランプし、解除5分前にPARS阻害薬(3-aminobenzamide)の投与を開始した。3群(1mg群、5mg群、10mg群)に分け、1mg群は1mg/kg投与後1mg/kg/hで持続投与し、5mg群、10mg群も同様に初回投与と持続投与を施行した。再灌流は1時間行った。再灌流終了後、ヘパリンを静注し3mm長の肺血管リングを摘出した。肺血管リングを緩衝液内に吊るし1000mgの張力を懸けフェニレフリン10^<-6>Mを投与して前収縮させた後、アセチルコリン(レセプター依存性)、A23187(レセプター非依存性)を10^<-9>10^<-6>M投与した時の拡張反応を測定した。(結果)PARS阻害薬5mg群、10mg群で有意に虚血再灌流群より拡張反応が改善し、腸間膜動脈非クランプ群の拡張反応と同等であった。また、5mg群と10mg群では拡張反応の改善に有意差はみられなかった。1mg群では拡張反応を改善しなかった。統計学的検定にはANOVAを用い、5%未満を有意差ありとした。(まとめ)PARS阻害薬は虚血再灌流よる血管内皮細胞障害を改善した。ラットの虚血再灌流モデルではヒトのARDSやエンドトキシンショック時と同様の肺組織像がみられることから、このような病態に対してPARS阻害薬が有効な治療手段となる可能性が示唆された。虚血再灌流による組識障害が好中球集積、elastase放出を起因としていることから、今後更にPARS阻害薬が肺への好中球浸潤を抑制するかについて検討する予定である。本年度は主に機器の設定と血管リング(肺動脈,大動脈)の虚血再灌流に対する拡張反応の変化について調べた。(方法)雄SDラット(9週,体重350-450g)を用いた。虚血再灌流群,コントロール群,sham群の3群に分け,虚血再灌流群は開腹後腸管膜動脈を1時間クランプし解除,解除後2時間おいて肺動脈,大動脈を3mmの血管リングとして摘出した。sham群は開腹はするがクランプはせず,3時間後に血管リングを摘出,コントロール群は麻酔後直ちに血管リングを摘出した。血管リングをEBSS内に吊るし1000mgの張力を懸け,フェニレフリン10-6Mを投与して前収縮させた後アセチルコリン(レセプター依存性),A23187(レセプター非依存性),ニトロプルシド(血管平滑筋への直接作用)を10-910-6M投与した時の拡張反応を測定した。(結果)1.フェニレフリンに対する収縮反応肺動脈ではコントロール群で有意に大きかったが虚血再灌流群,sham群に差はなかった。大動脈では3群に差はみられなかった。2.アセチルコリンに対する拡張反応肺動脈では虚血再灌流群で10^<-7>,10^<-6>M投与にて有意に減弱した。大動脈では3群に差はなかった。3.A23187に対する拡張反応肺動脈では虚血再灌流群で10^<-7>,10^<-6>M投与にて有意に減弱した。4.ニトロプルシドに対する拡張反応肺動脈,大動脈共に3群で差はみられなかった。(まとめ)以上のように虚血再灌流群で肺動脈血管内皮細胞由来の拡張反応が減弱していることが分かったが,大動脈では同様の結果にならなかった。今後PARS阻害薬(Benzamide)を用いてこの肺動脈の拡張反応が改善されるかどうか,また血管リング内のNAD濃度,肺組織内のMPO活性を各群で測定する予定である。

(結果)PARS阻害薬5mg群、10mg群で有意に虚血再灌流群より拡張反応が改善し、腸間膜動脈非クランプ群の拡張反応と同等であった。また、5mg群と10mg群では拡張反応の改善に有意差はみられなかった。1mg群では拡張反応を改善しなかった。統計学的検定にはANOVAを用い、5%未満を有意差ありとした。(まとめ)PARS阻害薬は虚血再灌流よる血管内皮細胞障害を改善した。ラットの虚血再灌流モデルではヒトのARDSやエンドトキシンショック時と同様の肺組織像がみられることから、このような病態に対してPARS阻害薬が有効な治療手段となる可能性が示唆された。虚血再灌流による組識障害が好中球集積、elastase放出を起因としていることから、今後更にPARS阻害薬が肺への好中球浸潤を抑制するかについて検討する予定である。
幼児・児童の課題解決過程の個人差及びカリキュラム開発に関する発達心理学的実践研究

本研究の目的は,幼児・児童の課題解決過程における個人差の問題を情報処理の側面から明らかにすることであった.幼児の認知スタイルと自由遊び場面での行動に関する2年度にわたる縦断的な研究の結果,次のようなことが明らかになった.1.衝動型ー熟慮型次元の認知スタイルの安定性は,この年齢段階では低いという従来の研究結果と異なり,年中児から年長児にかけて幼児の反応潜時と誤反応数は安定していること.2.同様に,場依存型ー場独立型次元の認知スタイルも安定しており,熟慮型は場独立型と,衝動型は場依存型と関連することが明らかとなった.3.場依存型ー場独立型を測定するための課題において,成人では外部からの刺激による干渉や促進を比較的受けにくいのに対し,幼児では干渉や促進がみられるという反応の特徴がみられた.これは,幼児と成人では情報処理の速さが異なることや選択的注意などの能力の違いを示唆する結果であった.4.幼児の自由遊び場面での行動を観察し,その遊びと幼児の行動の分析を通じて、実際の遊び場面での行動と場依存型ー場独立型次元の認知スタイルと関連がみられた.5.自己主調に関して.典型的なスタイルを示す二人の幼児(自己主張の強い子,自己主張の弱い子)に対する日常の保育者の働きかけをカテゴリ-化して分類し,それぞれのスタイルにどのような指導が行われているかを縦断的に検討した.その結果,自己主張の強い幼児の依存や甘えに対する保育者の対応は,説明,言語的,行動的受容や言語的・行動的拒否が多く,自己主張の少ない幼児による同様の行動に対しては言語による受容が多いことがわかった.また保育者の子どもの行動に対する対応は,スタイルによって異なり,時期によって変化することを示した.以上のような結果をもとに,現在,個人差を活かす年間カリキュラムやデイリィプログラムを検討中である.本研究の目的は,幼児・児童の課題解決過程における個人差の問題を情報処理の側面から明らかにすることであった.幼児の認知スタイルと自由遊び場面での行動に関する2年度にわたる縦断的な研究の結果,次のようなことが明らかになった.1.衝動型ー熟慮型次元の認知スタイルの安定性は,この年齢段階では低いという従来の研究結果と異なり,年中児から年長児にかけて幼児の反応潜時と誤反応数は安定していること.2.同様に,場依存型ー場独立型次元の認知スタイルも安定しており,熟慮型は場独立型と,衝動型は場依存型と関連することが明らかとなった.3.場依存型ー場独立型を測定するための課題において,成人では外部からの刺激による干渉や促進を比較的受けにくいのに対し,幼児では干渉や促進がみられるという反応の特徴がみられた.これは,幼児と成人では情報処理の速さが異なることや選択的注意などの能力の違いを示唆する結果であった.4.幼児の自由遊び場面での行動を観察し,その遊びと幼児の行動の分析を通じて、実際の遊び場面での行動と場依存型ー場独立型次元の認知スタイルと関連がみられた.5.自己主調に関して.典型的なスタイルを示す二人の幼児(自己主張の強い子,自己主張の弱い子)に対する日常の保育者の働きかけをカテゴリ-化して分類し,それぞれのスタイルにどのような指導が行われているかを縦断的に検討した.その結果,自己主張の強い幼児の依存や甘えに対する保育者の対応は,説明,言語的,行動的受容や言語的・行動的拒否が多く,自己主張の少ない幼児による同様の行動に対しては言語による受容が多いことがわかった.また保育者の子どもの行動に対する対応は,スタイルによって異なり,時期によって変化することを示した.以上のような結果をもとに,現在,個人差を活かす年間カリキュラムやデイリィプログラムを検討中である.1.衝動型ー熟慮型認知スタイルと呼ばれる個人差が幼児においても存在するかどうかを検討するために、MFFT課題を実施した。その結果、4歳児(年中児)においても衝動型ー熟慮型次元の認知スタイルが存在し、同時にケ-ガンのMFF課題が認知スタイル測定課題として使用できることを示した。さらに、場依存型ー場独立型認知スタイルを測定するために音声ストル-プ課題を実施した。その結果、5歳児(年長児)においても、場依存的行動傾向の強い幼児と場独立的傾向の強い幼児が存在し、音声言語が線画の命名を干渉したり、促進することが明らかになった。がみられた。このように音声ストル-プ課題を使うことによって、体系的文字教育を受ける前の幼児についても、場依存型ー場独立型認知スタイルを測定できることを示した。また、幼児のこの課題に対する反応の特徴は、成人が音声言語による影響(干渉や促進)を比較的受けにくいのに対して、影響を大きく受けることであった。2.保育場面での幼児の行動評定のための基礎的観察を5月に行なった。それを基にあ遊びの形態、相互作用の相手およびその幼児のスタイル、行動内容(提案、要求、主張、非難、命令など)について、6月からほぼ1ヵ月毎の観察を行なっている。その中でも、特に、友達との友達とのかかわりの少ない幼児について、前述の変数と認知スタイルや社会的地位との関連が見られるかどうかについて検討し、カリキュラムを考えるための資料を得ている。本研究の目的は・幼児・児童の課題解決過程における個人差の問題を情報処理の側面から明らかにすることであった。幼児の認知スタイルと自由遊び場面での行動に関する2年度にわたる縦断的な研究の結果,次のようなことが明らかになった。1.衝動型ー熟慮型次元の認知スタイルの安定性は,この年齢段階では低いという従来の研究結果と異なり,年中児から年長児にかけて幼児の反応潜時と誤反応数は安定していること

.2.同相に,場依存型ー場独立型を測定するための課題において,成人では林部からの刺激による干渉や促進を比較的受けにくいのに対し,幼児では干渉や促進がみられるという反応の特徴がみられた.これは,幼児と成人では情報処理の速さが異なることや選択的注意などの能力の違いを示唆する結果であった.4.幼児の自由起び場面での行動を観察し,その遊びと幼児の行動の分析を通じて,実際の遊び場面での行動と場依存型ー場独立型次元の認知スタイルと関連がみられた.5.自己主張に関して.典型的なスタイルを示す二人の幼児(自己主張の強い子,自己主張の弱い子)に対する日常の保育者の働きかけをカテゴリ-化して分類し,それぞれのスタイルにどのような指導が行われているかを縦断的に検討した.その結果,自己主張の強い幼児の依存や甘えに対する保育者の対応は,説明,言語的・行動的受容や言語的・行動的拒否が多く,自己主張の少ない幼児による同様の行動に対しては言語による受容が多いことがわかった.また保育者の子どもの行動の対する対応は,スタイルによって異なり,純期によって変化することを示した.以上のような結果をもとに,現在,個人差を活かす年間カリキュラムやデイリィプログラムを検討中である。
Study on microfluidic devices for isolation of circulating tumor cells expressing a variety of surface makers

癌の治療・診断・研究において高い有用性が認められつつある血中循環腫瘍細胞(CTC)を効率よく捕捉する“ポリマーCTCチップ"を開発した。従来このようなデバイスでは癌細胞のEpCAMをターゲットとして捕捉するが、本研究ではEpCAM発現が低いCTCの捕捉を目指し、比較的多くの癌で高発現が見られるEGFRを中心とした他のターゲットによる捕捉を検討した。その結果、抗EGFR抗体としてCetuximabを選択することにより、これまでEpCAMでは捕捉困難だった癌細胞の捕捉を可能とした。癌の原発巣から血管に侵入し体内を循環する血中循環腫瘍細胞(CTC)は、癌の治療・診断・研究において高い有用性が認められている。CTCは極希薄に存在するため単離は困難だが、表面の上皮細胞接着分子(EpCAM)をターゲットとしその抗体とマイクロ流体デバイスとを組み合わせたCTCチップが、有望な単離デバイスとして提案されている。筆者らはこれまでに新規のポリマーCTCチップを開発し、実用化を進めてきた。しかし最近の研究からは、癌細胞の上皮性を利用したEpCAMによる単離では、細胞の捕捉効率が極端に低下する場合があることが知られており、さらそれが癌細胞のEpCAM発現レベルの低下に起因することも明らかとなっている。そこで本研究では、EpCAM発現が極めて低い癌細胞を単離できるよう、ポリマーCTCチップの改良検討を行っている。始めに従来のポリマーCTCチップを用い、低EpCAM発現の乳癌細胞株であるMDAーMBー231の捕捉をテストした結果、捕捉率(チップに捕捉された細胞数/チップに流れた細胞数)は11%であった。このような細胞において捕捉率を向上させるには、EpCAM以外の表面マーカーをターゲットとしそれに対する抗体をチップ表面に導入することが考えられる。そこでEpCAM発現の低い種々の癌細胞株について調査したところ、MDAーMBー231を含めそれらにおいては上皮成長因子受容体(EGFR)の高発現が多く見られることが分かった。そこでポリマーCTCチップに抗EGFR抗体(細胞外ドメインのエピトープに対する)を固定し、MDAーMBー231の捕捉を行ったところ、捕捉率は3%であった。EGFR発現が高いにも関わらずEpCAMよりも低い捕捉率を示しため、その原因を探ったところ、抗原/抗体の相互作用の影響を示唆する結果を得た。現在、これらの知見をもとにEGFRによる癌細胞捕捉の改良を進めている。血中循環腫瘍細胞(CTC)を効率よく単離し臨床応用へ繋げることを目指し、筆者らが開発した“ポリマーCTCチップ"について検討している。ポリマーCTCチップは、マイクロ流体デバイスと抗体との組み合わせからなり、血中濃度が極めて低いためにこれまでは単離が困難だったCTCを効率よく捕捉できる。しかしこのチップでは、癌細胞表面マーカーとチップに固定した抗体の結合を利用して捕捉するため、性能は捕捉ターゲットのマーカーおよび抗体の選択に大きく左右される。ターゲットは、これまで癌の上皮性からEpCAMを選択してきたが、本研究では前報で述べた理由からEGFRについて検討している。昨年度に引き続き市販の2種類の抗EGFR抗体を使用して、高EGFR発現の癌細胞(KYSE220)でチップの捕捉率(チップに捕捉された細胞数/チップに流れた細胞数)を測定したところ、9%、24%となった。さらに抗体としてEGFRの分子標的治療薬であるCetuximabを用いると、89%の捕捉率が得られ、チップ捕捉における抗体選択の重要性が示唆された。一方、低EpCAM発現の癌細胞株(MDA-MB-231)をCetuximabで捕捉したところ、捕捉率は44%となり、EpCAMで捕捉した場合(抗EpAM抗体による捕捉率は11%)と比較して捕捉率は大きく向上することが分かった。さらに市販の抗EGFR抗体を使用して、EGFR発現レベルが異なる癌細胞(EGFR:6万1200万receptors/cellの4種類の食道癌細胞株)でチップ捕捉率を求めたところ1833%の値が得られた。EGFR数の変化に比べ捕捉率変化が小さく、捕捉がチップ上の抗体密度により規制されていることが考えられ、この抗体密度向上による捕捉率改良の可能性が示唆された。本研究では、筆者らが開発したポリマーCTCチップを用い、一般的なCTCの捕捉ターゲットであるEpCAMの欠点を補うべく、癌に高発現する他のマーカーによるCTC捕捉を検討している。これまでにEGFRについて検討を続けており、新たに次の結果を得た。(1)EGFR発現が系統的に変化する癌細胞株(食道癌由来のKYSEシリーズ、1細胞あたりのEGFRが6万1200万個)について、3種類の異なる抗EGFR抗体で捕捉試験を実施し、再現性などを確認して捕捉率を決定した、(2)捕捉率は抗体により大きく変化し、使用抗体の1つ(Cetuximab)が何れのKYSEも効率よく捕捉することを確認した、(3)EGFR量の変化に対し捕捉率変化が極めて小さい結果が得られ、捕捉がチップ表面上の抗体密度により規制されていることが示唆された、(4)EpCAMによる捕捉が困難なことが知られている乳癌細胞株MDA-MB-231(EpCAM-、EGFR+)を用い、Cetuximabで捕捉試験を行い、70%以上の捕捉率を確認した、(5)食道癌の臨床検体を用いてEGFRで捕捉試験を実施し、CTCを検出した。さらに他のマーカーについても検討し、CD318、CD47による細胞株捕捉を実施した。