hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
全層角膜移植のCD28/B7経路の役割とサイトカインネットワーク

前年度は全層角膜移植手術後の拒絶反応発生時に、角膜および前房内細胞においてIL-2、IFN-gammaなどのTh1サイトカインが優位であることを示した。本年度は、T細胞レセプター抗体、LFA-1とVLA-4に対する併用療法の拒絶反応抑制効果を角膜移植モデルで明らかにするととももに、Th1優位のサイトカイン発現パターンが治療によりどのように変化するかについて、蛋白、遺伝子レベルで検討した。T細胞レセプター抗体の術後早期の短期投与により、マイナー抗原不適合モデルで86%、完全不適合モデルで23%の完全生着が得られた。サイトカインパターンは治療群で前房内細胞、角膜ともIL-2、IFN-gamma、IL-10の減少、IL-4の増加が見られた。LFA-1とVLA-4に対する術後短期の併用療法では、全例術後5週間完全生着が得られた。術後5週目に反対眼に第一眼のドナーと同系の角膜を移植(チャレンジテスト)したところ、2週後に50%が生着、50%が拒絶反応をおこした。この2群についてサイトカインパターンを検討したところ、生着群でTh1サイトカインの減少がみられ、拒絶群でTh1サイトカインの増加のみならずIL-4も全身、局所で増加したいた。これらのことから、抗原提示にかかわる抗原のブロックにより得られるTh2サイトカインの増加は、必ずしも臓器生着に不可欠でなく、Th1サイトカイン抑制のみが重要な因子であることが示唆された。本年度は、Isograft,allograftモデルを用いて、移植角膜局所におけるサイトカイン、サイトカインメッセージの発現(IFN-γ,IL-2,IL-4,IL-10)および、前房水、角膜組織におけるサイトカインおよびサイトカインメッセージの発現を検討で、全層角膜移植における眼局所のTH1、TH2バランスを明らかにすることを目的として研究を行った。結果として、免疫組織学的および遺伝子転写レベルの検討え、マウス全層角膜移植モデルの拒絶反応発生時は、移植角膜においてTh1サイトカイン優位であり、その状態は更に2-3週間経過しても変わりは無かった。また、同時期の前房内細胞についても検討したところ、前房内細胞のサイトカイン発現レベルも角膜のものとほぼ同様であった。但し発現細胞数は、局所の免疫反応に対して前房内細胞の方がより敏感に反応し、その局面をよりよく反映していた。免疫抑制実験としては、抗LFA-1抗体と抗VLA-4抗体の併用投与でアログラフトモデルにおいて免疫学的寛容が約50%で得られることが判明した。また抗LFA-1抗体とFK506の併用投与でラット、マウス異種移植において相乗効果の得られることを明らかにした。しかしながらこれまでのところアログラフトモデルにおいて抗B7-1抗体と抗B7-2抗体併用による拒絶反応抑制効果は、他の臓器で示されているのと同等の有効性は角膜移植では明らかとなっていない。
図領域統合と注意選択の皮質表現――同期と脳型階層構造が導く情報統合の理解

研究代表者は、高次視覚領野からのフィードバックを仲介するNMDA受容体シナプスが図領域検出(BO)細胞同期の起源であると考えた。脳の階層構造の中で、情報統合の皮質表現である同期発火により、図領域が統合され、これが注意選択の起源になると考えられる。この仮説を大脳視覚系の計算モデル構築とそのシミュレーションを通じて検証した。研究代表者が構築した神経回路ネットワークモデル(Wagatsuma et al., J. Neurophysiol., 2016)を拡張し、より厳密なBO細胞同期発火の皮質メカニズムを計算論的に検証した。物体識別を行う視覚経路と空間情報知覚を担う視覚経路から、フィードバックがBO細胞へと独立して投射される神経回路モデルを構築した。拡張したモデルは、電気生理実験で観測されたBO細胞の同期発火特性をより正確に再現した。この研究成果は、2019年に行われる国際会議Computational Neuroscience Meeting (CNS 2019)に採択された。また、欧米学術論文誌に投稿する論文を現在執筆している。研究代表者は、ヒトの視線位置を予測するSaliency MapモデルにBO細胞を導入し、図領域統合が注意選択の起源となる仮説を検証した。図領域を統合する細胞集団が協働するSaliency Mapモデルは、先行モデルよりも、ヒトの視線位置を定量的に良く予測した。これは、図領域統合がヒトの注意選択に重要な役割を果たす可能性を示唆する点で重要である。この研究結果は、国際会議CNS 2017だけでなく学術論文誌Neural Networksに採択された。研究代表者は、以前に構築した神経回路ネットワークモデル(Wagatsuma et al., J. Neurophysiol., 2016)を拡張し、より厳密な図領域検出(BO)細胞同期発火の皮質メカニズムを計算論的に予測した。また、図領域統合が注意選択の起源となるという仮説を検証するため、ヒトの視線位置を予測するSaliency MapモデルにBO細胞を導入した。図領域統合が注意選択に果たす役割を計算論的に検証した。これらのモデルのシミュレーションから、研究代表者の仮説を支持する結果が得られている。研究代表者は、脳の階層構造の中で、情報統合の皮質表現である同期発火により、図領域(BO)が統合され、これが注意選択の起源になるという仮説を神経回路ネットワークモデルの構築とシミュレーションから検証してきた。これまでの研究から、この仮説を支持する結果が得られている(Wagatsuma et al.,投稿準備中; Wagatsuma, Neural Networks, 2019)。しかし、図領域を検出するための基本単位となる視覚皮質の局所神経回路は、未解明である。この局所回路内の相互作用がBO細胞同期発火誘発に重要な役割を果たす可能性がある。今後は、図領域検出の局所神経回路を探求する。そして、局所神経回路内・外の相互作用がBO細胞同期発火と図領域統合に及ぼす影響を計算論的に検証する。近年、3種類の抑制性細胞(PV, SOM, VIP)の相互作用が視覚情報処理とその応答ダイナミクスに重要な役割を果たすことが神経生理学的に示された。これは、抑制性細胞がBO細胞の同期発火に寄与する可能性を示唆していると考えられる。神経生理学的知見に忠実な3種類の抑制性細胞を、これまで構築した神経回路ネットワークモデルに導入する。これらの抑制性細胞がBO細胞同期と図領域統合における役割をシミュレーションから同定することを計画している。これにより、より厳密なヒト注意選択の皮質メカニズムを明らかにできると期待している。高次視覚系からのフィードバック信号を生理学的に忠実なNMDA受容体シナプスモデルが伝達する神経回路ネットワークを構築し、大脳視覚野V2におけるBO細胞の物体皮質表現特性である同期発火を算出した。このフィードバック信号は、生体の視知覚最大の特性である視覚的注意や呈示された物体の形状表現を仲介する。特に、モデルから仮想的なBO細胞反応のビッグデータを生成し、モンテ・カルロ的なデータ解析法であるJitter法を適用し、モデルが示す密な時間特性の同期発火特性を検証した。構築した神経回路モデルは、Martin & von der Heydtにより示されたBO細胞の同期発火特性と良く一致する応答特性を示した。特に、注意によるBO細胞の応答促進と同期発火抑制を定量的に良く再現した。また、Jitter法によるデータ解析から、モデルのシミュレーションデータから密な時間特性の同期発火が確認された。これらの結果は、NMDAシナプスが高次視覚系からのフィードバックを仲介し、BO細胞の同期発火の起源となるという神経回路メカニズムを示唆する。また、視覚的注意の伝達に、NMDAシナプスが重要な役割を果たす可能性を示す点でも重要な結果である。申請者は、情報統合の皮質表現である神経信号の同期発火メカニズムを検証するため、神経生理学的知見に忠実な神経回路ネットワークモデルを構築し、シミュレーションを行った。NMDA受容体シナプスが同期発火と注意選択に重要な役割を果たすという仮説に立脚したモデルは、電気生理実験で報告された神経細胞の多様な同期発火特性を良く再現できることが示された。これらより、神経細胞が同期する視覚皮質メカニズムの解明という研究目標を良く達成していると考える。

研究代表者が構築した神経回路ネットワークモデル(Wagatsuma et al., J. Neurophysiol., 2016)を拡張し、より厳密なBO細胞同期発火の皮質メカニズムを計算論的に検証した。物体識別を行う視覚経路と空間情報知覚を担う視覚経路から、フィードバックがBO細胞へと独立して投射される神経回路モデルを構築した。拡張したモデルは、電気生理実験で観測されたBO細胞の同期発火特性をより正確に再現した。この研究成果は、2019年に行われる国際会議Computational Neuroscience Meeting (CNS 2019)に採択された。また、欧米学術論文誌に投稿する論文を現在執筆している。研究代表者は、ヒトの視線位置を予測するSaliency MapモデルにBO細胞を導入し、図領域統合が注意選択の起源となる仮説を検証した。図領域を統合する細胞集団が協働するSaliency Mapモデルは、先行モデルよりも、ヒトの視線位置を定量的に良く予測した。これは、図領域統合がヒトの注意選択に重要な役割を果たす可能性を示唆する点で重要である。この研究結果は、国際会議CNS 2017だけでなく学術論文誌Neural Networksに採択された。研究代表者は、以前に構築した神経回路ネットワークモデル(Wagatsuma et al., J. Neurophysiol., 2016)を拡張し、より厳密な図領域検出(BO)細胞同期発火の皮質メカニズムを計算論的に予測した。また、図領域統合が注意選択の起源となるという仮説を検証するため、ヒトの視線位置を予測するSaliency MapモデルにBO細胞を導入した。図領域統合が注意選択に果たす役割を計算論的に検証した。これらのモデルのシミュレーションから、研究代表者の仮説を支持する結果が得られている。当該年度の成果から、神経細胞が同期するための主要な回路メカニズムが示唆された。今後は、この主要メカニズムを生体の厳密な神経回路ネットワークへと適用し、同期発火を通して神経回路が図領域を統合する過程を研究する。さらに、同期発火により促進される図領域統合が、注意選択に果たす役割を検証する。具体的には、電気生理学的知見と神経解剖学的知見をまとめた大規模かつ厳密な層構造の神経回路ネットワーク(Wagatsuma et al., PLOS ONE, 2013)へとNMDAシナプスが仲介するフィーバック信号を適用する。モデル細胞活動の同期と各層の連携により、時間とともに図領域が統合され、その皮質表現の疎性が変調・変異する特性を分析し、注意選択メカニズムをモデル化する。構築する層構造神経回路モデルのシミュレーション開始直後は、各層において反応が広く分布すると予測される。時間経過とともに、細胞が同期し図領域が統合される活動応答表現が疎になる事により、注意選択が定量的に決定されると期待している。
ゲノム的アプローチによるがん関連遺伝子としてのインプリント遺伝子の探索

どちらか一方の親から受け取ったコピーしか発現しないインプリント遺伝子の多くは細胞の増殖分化に密接な関連を持ち、発がんとの関連にも注目がされているが,その系統的単離が難しく、がんとインブリンティングとの関連を探る研究はまだ大きく立ち遅れている。そこで、ゲノム的アプローチによってインプリント遺伝子の組織的単離を行い、この方面の研究発展の基盤を整備することを目的として、ヒトゲノムドラフトシークエンス(21番染色体)より情報科学的手法で抽出したCpGアイランド(CPI)のメチル化状態を新たに考案したHpall/McrBC-PCR法で検討した.対象とした全140配列中、21個が完全メチル化、10個が部分メチル化(PM)であり、残りはメチル化されていないことが分かった。また10個のPMのうち2個については、多型を利用してアレル特異的にメチル化されていることを証明し、うち一つは母親由来のアレルのみが選択的にメチル化されていることを明らかにした.現在、近傍遺伝子のアレル別発現状況を検討している。また、我々が以前同定した新規インプリント遺伝子Impactの解析から、特徴的反復構造を持つCpGアイランドのインプリンティングにおける重要性が明らかになった。この配列を材料として、トランスの因子を酵母1ハイブリッド法で探索する日的で、酵母細胞内において標的配列をメチル化された状態に維持する方法を確立した。現在、この酵母株に対して、様々なライブラリーをトランスフオームし、スクリーニングを重ねている段階である。
両親の職業性暴露と小児主要疾患との関連についてのレコード・リンケージ研究

最近研究が進めらている父親の職業性暴露による発生毒性(developmental toxicity)のうち、子の先天性心疾患およびいくつかの先天異常について、北欧で整備されている健康管理登録データを用いたレコード・リンケージ研究により検討する。【方法】資料にはスウェーデンの国勢調査および母子医療記録登録(The Medical Birth Registry:MBR)を用いた。1985年の国勢調査の父親職業データと1985-86年のMBRデータを国民番号によりリンケージした。先天異常のうち比較的症例数の多い、先天性心疾患、循環系のその他の先天異常(動脈管開存など)、顔面裂(口蓋・唇裂)、合・多指(趾)および副耳について分析した。【結果】有意な相対危険度を示しかつ症例期待値が5以上であった職業を記す。先天性心疾患では塗装工および製紙業、顔面裂では農林園芸業、郵便業および塗装工、多指(趾)では自動車運転手であり、循環系のその他の先天異常(症例数n=348)、合指(趾)(n=201)および副耳(n=370)では該当がなかった。【考察】今回用いたMBRによる先天性心疾患のデータについては先天異常登録などに比し信頼性が低いとされているので、今後、先天異常登録、先天性心疾患登録等の診断精度の高い登録を用いた同様の分析が行われることが望まれる。その他の顔面列などは体表奇形であるので、MBRデータも比較的信頼できると思われる。先天性心疾患と塗装工、顔面裂と林業および塗装工の関連はこれまでの他の症例対照研究などと一致する結果である。
化学物質胎児期曝露の酸化ストレスとDNA損傷による生後発育，免疫機能への影響解明

DNA損傷度指標となる母体血清中8-OHdG濃度と母児のPON1遺伝子多型,OGG1遺伝子多型,ERCC1遺伝子多型,XRCC1遺伝子多型との交互作用が生後のアレルギー性疾患・感染症に及ぼす影響を検討したところ,3歳半では,母体血清中8-OHdG濃度が2.7倍上昇すると,児の遺伝子多型がERCC1遺伝子CC型の場合は喘鳴リスクが2.26倍になり,XRCC1遺伝子AG/AA型でも喘鳴リスクが1.94倍と増加する傾向が認められた。一方,1歳半および7歳時のアレルギー性疾患・感染症や胎児発育,生後の身体発育への有意な関連はなく,母の遺伝子多型との関連も認められなかった。近年,子どもの肥満,アレルギーや行動障害などが増加していることが報告されており,胎児期の環境化学物質曝露がその一因として示唆されている。本研究では,既に立ち上げている前向きコーホート研究「環境と子どもの健康に関する北海道スタディ」の児を対象として,胎児期の環境化学物質曝露によるDNA損傷と母児の遺伝的感受性素因による交互作用が胎児発育や生後の身体発育および免疫機能に及ぼす影響を解明することを目的とした。DNA損傷度指標として,妊娠中の母親から採取,保存している母体血(血清)で酸化ストレスマーカーである8-OHdG濃度を高感度ELISA法(検出限界値0.125ng/mL)で測定した。遺伝子多型の違いによるDNA損傷度の個体差について評価するために,母体血から抽出したDNAでDNA修復遺伝子であるXRCC1遺伝子とERCC1遺伝子の多型を解析した。本研究は,「環境と子ども健康に関する北海道スタディ」の小規模コーホートにおける出生児を調査対象として,胎児期の環境化学物質曝露によるDNA損傷と母児の遺伝的感受性素因による交互作用が胎児発育や生後の身体発育および免疫機能に及ぼす影響を解明し,遺伝的ハイリスク群を検出して,早期発見や早期予防的介入へ繋がる効果的な予防対策構築に役立てることを目的としている。近年,世界的に子どもの肥満や喘息,アトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患,精神行動発達障害などが増加していることが報告されており,胎児期の環境化学物質曝露がその一因として示唆されている。本研究では,妊娠中の母親から採取,保存している母体血(血清)で酸化ストレスマーカーである8-OHdG濃度を高感度ELISA法(検出限界値0.125ng/mL)で測定し,DNA損傷度指標とした。妊娠中に採取した母体血および出生時に採取した臍帯血から抽出したDNA検体で抗酸化作用に関与するPON1遺伝子の遺伝子多型とDNA修復に関与するXRCC1遺伝子,ERCC1遺伝子,OGG1遺伝子の遺伝子多型の解析を実施した。環境化学物質曝露に対して遺伝子多型の違いによるDNA損傷度やDNA修復能の個体差について評価した。本研究のベースライン調査票では,妊娠中の社会経済的状況や栄養状態,飲酒,喫煙などの生活習慣を把握しており,診療録から分娩,出生時の母児の状態を収集している。また,生後6ヵ月,1歳6ヵ月,3歳6ヵ月,7歳時の追跡調査票でも,児の食生活や受動喫煙曝露状況などの生活環境および身体発育や感染症,アレルギー疾患の状況を把握している。本研究では,前向きコーホート研究「環境と子どもの健康に関する北海道スタディ」に登録している母児を対象として,胎児期の環境化学物質曝露によるDNA損傷と母児の遺伝的感受性素因の交互作用が胎児発育や生後の身体発育および免疫機能に及ぼす影響を解明することを目的とした。母460名の平均年齢は,30.8±4.9歳,妊娠前のBMIは,21.2±3.3kg/m2であった。初産婦は46.7%(215名),短大・大卒以上が55.2%(254名),妊娠中に喫煙した者(途中禁煙者も含む)は24.1%(111名),飲酒した者は30.4%(140名)であった。DNA損傷度指標となる母体血清中8-OHdG濃度は0.130ng/mL(中央値)であった。母体血清中8-OHdG濃度と母児のPON1遺伝子多型,OGG1遺伝子多型,ERCC1遺伝子多型,XRCC1遺伝子多型との交互作用が胎児発育や生後の身体発育に及ぼす影響については有意な関連は認められなかったが,3歳半時のアレルギー性疾患・感染症との関連では,母体血清中8-OHdG濃度が2.7倍上昇すると,児の遺伝子多型がERCC1遺伝子CC型の場合は喘鳴リスクが2.26倍になり(95%CI: 1.03-4.95, p=0.04),XRCC1遺伝子AG/AA型でも喘鳴リスクが1.94倍と増加する傾向が認められた(95%CI: 0.98-3.86, p=0.06)。一方,1歳半および7歳時のアレルギー性疾患・感染症への有意な関連はなく,母の遺伝子多型との関連も認められなかった。近年,子どもの肥満やアレルギー疾患が世界的に増加していることが報告されているが,本研究から環境化学物質の胎児期曝露によるDNA損傷の個体差が児の健康に影響を及ぼすことが示唆された。DNA損傷度指標となる母体血清中8-OHdG濃度と母児のPON1遺伝子多型,OGG1遺伝子多型,ERCC1遺伝子多型,XRCC1

遺伝子多型との交互作用が生後のアレルギー性疾患・感染症に及ぼす影響を検討したところ,3歳半では,母体血清中8-OHdG濃度が2.7倍上昇すると,児の遺伝子多型がERCC1遺伝子CC型の場合は喘鳴リスクが2.26倍になり,XRCC1遺伝子AG/AA型でも喘鳴リスクが1.94倍と増加する傾向が認められた。一方,1歳半および7歳時のアレルギー性疾患・感染症や胎児発育,生後の身体発育への有意な関連はなく,母の遺伝子多型との関連も認められなかった。今年度は,母体血清について酸化ストレスマーカー8-OHdG濃度の測定が全て終了した。妊婦476名の平均値は0.14±0.11ng/mL,中央値は0.13 ng/mLであった。DNA修復または抗酸化作用に関与するDNA遺伝子多型解析は,母体血496検体で2多型(OGG1,PON1),臍帯血292検体で6多型(XRCC1,ERCC1,OGG1,PON1)の解析が終了した。環境疫学胎児期の環境化学物質曝露(ダイオキシン・PCBs類,PFOS/PFOA,MEHP,BPA濃度が測定済)によるアウトカム評価を行う。診療録から得た出生時体重・身長と生後6ヵ月,1歳6ヵ月,3歳6ヵ月,7歳時の追跡調査票から得た身体発育状況(体重・身長,体格指数)を,また,1歳6ヵ月,3歳6ヵ月,7歳時のISAAC調査票から得た感染症,アレルギー疾患の発症・維持,寛解を解析して総合的に評価する。さらに,DNA損傷(遺伝要因)によるアウトカム評価を行い,曝露要因と遺伝子多型解析から得られた母児の個体要因を総合的に解析して遺伝環境交互作用の解明を行う。胎児発育や生後の身体発育,感染症・アレルギー疾患発症に関連する要因の評価を行ない,胎児期の環境化学物質曝露に対する発育遅延,免疫機能低下の危険因子を同定し,研究成果について,学会ならびに学術専門雑誌に発表する。今年度は,酸化ストレスマーカーである母体血清中8-OHdG濃度測定が377検体終了した。DNA遺伝子多型解析は母体血496検体で4多型の解析が終了し,平成26年度は臍帯血についても解析を行う。アウトカムとなる身体発育状況や感染症,アレルギー疾患発症についての質問紙調査は7歳時調査票までクリーニングが終了した。母体血清中8-OHdG濃度測定と母児DNAの遺伝子多型解析を継続する。母体血残り99検体の血清中8-OHdG濃度を測定する。母体血DNA検体でDNA修復遺伝子OGG1遺伝子と抗酸化作用遺伝子PON1遺伝子の多型および臍帯血DNA296検体の遺伝子多型を解析する。胎児期の環境化学物質曝露(ダイオキシン・PCBs類,PFOS/PFOA,MEHP,BPA濃度が測定済)によるアウトカム評価を行う。さらに,DNA損傷(遺伝要因)によるアウトカム評価を行い,遺伝環境交互作用の解明を行う。研究成果について,学会ならびに学術専門雑誌に発表する。平成25年度では,81,900円の未使用額が発生した。これは平成25年度末に購入した物品の支払が平成26年4月に支払われることになったため生じたものである。平成26年5月現在では未使用額はない。
同位体イメージングによる炭素の樹木内移動の可視化と木部形成過程の解明

本研究課題では、樹木木部における炭素の移動と固定の過程を明らかにすることを目的とした。炭素の安定同位体で標識した二酸化炭素を用いてラベリングを行い、安定同位体比測定および二次イオン質量分析法による同位体イメージングを組み合わせて標識炭素の追跡を行った。樹体内における炭素の挙動と木部細胞壁への堆積過程を解析した結果から、木部への炭素堆積の過程や放射方向への移動の様子が可視化により示されたほか、木部細胞壁への炭素の取り込み量、すなわち細胞壁堆積活動に1日の中で変動があることが示唆された。本研究では、木部形成を光合成で吸収した炭素の堆積活動としてとらえ、炭素の樹木内での移動や木部細胞への取り込み過程を調べることにより、細胞分裂や細胞壁の形成タイミングなどの木部形成活動と光合成の関係や日周性を明らかにすることを目的とする。そのために、炭素の安定同位体である13Cで標識した二酸化炭素(13CO2)を樹木に一時的に与えて光合成により取り込ませた試料を作出し、組織・細胞内での標識13Cの分布や細胞壁成分への13Cの分配を調べる。初年度である平成27年度は、植物を13C標識する実験系および、二次イオン質量分析法(SIMS)により13C分布を可視化するためのサンプル調製法の検討を行った。これまでの申請者の研究から、高濃度の13CO2を与えた場合に木部細胞内での標識13Cの分布を観察できることがわかっていたが、今回は大気組成に近い400ppm程度にコントロールして13CO2を投与を行い、さらに明暗周期の中でタイミングを変えて13CO2を吸収させた。その結果、以降の測定に十分な量の13Cの取り込みがあることがわかった。しかし取り込み量のばらつきや、一部では予備実験とは異なる結果が得られており、現在さらに検討を行っている。平行して、これまでにSIMSで標識13Cの分布が観察されている細胞壁やデンプン粒に加えて細胞質における分布を可視化することを目指して固定・包埋法の検討を行っている。現在のところ、可溶性成分の保持と良好な形態保存の両方を十分に満たす試料調製方法の確立には至っていないものの、当研究課題を進める上で必要な試料調製についての情報が得られてきており、今後は目的に合わせた試料の作製を行う予定である。13CO2濃度コントロール下での投与を行い、予定していた13C標識ポプラの試料を得た。またSIMS用の試料調製法について検討を進めた。その一方、13C標識試料の一部がまだ作出できておらず、細胞壁成分への13C取り込みの分析が遅れている。そのため、達成度を(3)とした。本研究では、樹木が吸収した二酸化炭素由来の炭素を追跡し、樹体内での移動や木部細胞への取り込み過程を調べることにより、木部形成過程について明らかにすることを目的とする。そのために、炭素の安定同位体である13Cで標識した二酸化炭素(13CO2)を樹木に一時的に与えて光合成により取り込ませて13Cで標識した試料を作出し、安定同位体質量分析計(IR-MS)測定によるバルク分析と、二次イオン質量分析法(SIMS)を用いた標識13Cの細胞レベルでのマッピングを行って、標識13Cの移動や分配様式を評価する。平成28年度は、13CO2濃度を大気組成に近い400ppmに制御したグロースチャンバー内で、ポプラ(Populus alba x P. grandidentata)のシュートに13CO2を投与してパルスラベリングを行い、標識13Cの取り込みについて分析を行った。明期の前半あるいは後半に13CO2を2時間投与し、投与後の生育時間を変えて試料を採取した。試料の一部はグルタルアルデヒドで固定後、樹脂包埋して薄切片を作製し、SIMSでの同位体イメージングにより13C分布を観察した。また葉、師部、木部についてIR-MS測定による13C量の分析を行い、樹体内における標識13Cの移動を調べた。木部試料からは細胞壁成分の前駆物質を含む画分と細胞壁、さらに細胞壁はホロセルロース、セルロース、リグニンに分画して、それぞれの成分への13C取り込み量の経時変化を調べた。光合成により取り込まれた標識13Cは速やかに木部に移行して細胞壁に堆積し、細胞壁の各成分に取り込まれていた。また13CO2投与のタイミングにより13Cの取り込みの挙動には差違が検出された。前年度に13CO2によるパルスラベリングの方法とその後の試料調製法について検討を行い、平成28年度はこの方法を用いて異なる条件下での13C標識ポプラの作出とその分析を行った。まず明暗周期の中での13CO2投与のタイミングと投与からの経過時間を変えた13Cラベル試料の作出を行った。これらの試料について細胞壁構成成分の調製と各成分への13C取り込み量の測定が完了した。SIMS測定のためのサンプル調製と13Cの分布解析についても予備的な測定を終えた。これらより標識13Cの取り込み過程について結果を得ることができた。一部の条件では13C取り込み量の個体差が大きく、再実験を要すると判断したものもあるが、すでに準備が進んでおり大きな遅れにはならないと考えて、おおむね予定通りに進行中とした。本研究では、光合成で吸収した二酸化炭素由来の炭素が木部細胞に取り込まれる過程を明らかにすることを目的とした。

炭素の安定同位体である13Cで標識した二酸化炭素(13CO2)を光合成により樹木に短時間取り込ませて標識した試料を作出した。安定同位体比質量分析計(IR-MS)測定による13C量の分析と、二次イオン質量分析法(SIMS)を用いた標識13Cの細胞レベルでのマッピングを行って、樹木内の標識13Cの移動や分配を評価した。ポプラ(Populus alba x P. grandidentata)のシュートに13CO2を2時間投与してパルスラベリングを行った。13CO2を投与する時間帯は明期の前半あるいは後半の2条件とし、投与後4-30時間生育させた後に試料を採取して、それぞれの試料について標識13Cの取り込みを調べた。IR-MSによる分析結果から、明期前半に投与された13CO2は速やかに幹木部の細胞壁に取り込まれることがわかった。さらに各試料中の13C取り込み量の比較から、細胞壁に固定される炭素の量は、明期に多く、暗期には減少することが示唆された。SIMSによる13Cマッピングでは、分化中木部内の13C取り込み位置を特定することができた。二次壁肥厚中木部細胞の細胞壁最内層に13C濃度が顕著に高い層が検出された。またすでに肥厚した細胞壁層での細胞壁全体での13C濃度の上昇が見られた。細胞壁成分の堆積には細胞壁内表面に積み重なるような付加的堆積とすでに形成された細胞壁に染みこんでいくような挿入的堆積が考えられており、標識13Cの分布はこれらの堆積様式を反映していると見られる。また、投与からの経過時間に伴い、標識13Cが形成層から離れた、より形成の進んだ木部にも取り込まれることが観察された。本研究課題では、樹木木部における炭素の移動と固定の過程を明らかにすることを目的とした。炭素の安定同位体で標識した二酸化炭素を用いてラベリングを行い、安定同位体比測定および二次イオン質量分析法による同位体イメージングを組み合わせて標識炭素の追跡を行った。樹体内における炭素の挙動と木部細胞壁への堆積過程を解析した結果から、木部への炭素堆積の過程や放射方向への移動の様子が可視化により示されたほか、木部細胞壁への炭素の取り込み量、すなわち細胞壁堆積活動に1日の中で変動があることが示唆された。異なる条件下での13C標識ポプラ作出を行い、主に木部細胞壁成分に注目して標識13Cの取り込みについて評価を行う。まずは安定同位体質量分析法(IR-MS)によるバルク分析、さらにSIMSによる13Cイメージングを行い、光合成産物が木部細胞壁に堆積する過程について調査を進める予定である。平成28年度には、木部細胞壁への標識13C取り込みについておおよその傾向が把握できた。今後はさらに細胞壁内分布、細胞内分布など詳細な解析を行う予定である。加えて、形成層帯や師部への特徴的な標識13C分布がこれまでに観察されている。これらについてもSIMSによる解析を行い、光合成による炭素の供給と木部形成の関係について考察する。樹木細胞学同位体分析費用をその他として計上していたが、その分析の一部を次年度に行うことになったため次年度使用額が発生した。通常3月中に開催されるアメリカ化学学会大会が2017年4月に開催されたため、当学会に参加するための参加登録費、ならびに海外旅費の予算として次年度使用額とした。同位体分析費用として使用予定である。2017年4月の国際学会参加にかかる経費に使用する。残額は消耗品購入や同位体測定に要する経費に使用予定である。
核機能の解明を目指した分裂酵母のケミカルローカリゾーム解析

抗癌活性をもつ化合物Spliceostatin A(SSA)はスプライシングに必要なSF3b複合体に結合し、スプライシング機能を阻害する。本研究では、SSAによる分裂酵母全タンパク質の細胞内局在(ローカリゾーム)に対する影響を網羅的に解析する「ケミカルローカリゾーム」解析を実施した。SSA処理後に核小体へ移行するタンパク質にはリボソーム生合成に関与するものが多く存在していた。この結果より、Spliceostatin Aがリボソームプロセシング過程に影響することが示唆された。本研究では、スプライシング因子を標的とする低分子化合物SpliceostatinA(以下SSAと表記)による分裂酵母全タンパク質の細胞内局在(ローカリゾーム)に対する影響を網羅的に解析する「ケミカルローカリゾーム」解析を実施する。これは、「局在制御」という観点から新たな機能を導きだす極めて有効なスクリーニング法といえる。本年度は、まず、SSAをはじめとする様々な薬剤に感受性となるよう薬剤排出ポンプをコードする遺伝子を破壊した分裂酵母株に約5,000個のYFP融合型分裂酵母遺伝子を導入したライブラリーを構築した。次に、このライブラリーの各細胞株を発現誘導培地で一晩培養し、5μg/mLのSSAで6時間処理後、YFP融合型タンパク質の局在を蛍光顕微鏡下でコントロール(溶媒=メタノールのみで処理した細胞)と比較した。これまでに、約4,000個のタンパク質について局在観察を終えたが、局在変化が見られたタンパク質の中には、リボソームタンパク質が多ぐ含まれており、また、タンパク質の核一細胞質間輸送を担う輸送担体も存在していた。近年、スプライシング因子がスプライシング以外にもテロメア長の維持やRNAi機構によるサイレンシングにも関与していることが報告されている。本研究結果からも、スプライシング因子がリボソーム生合成や核ー細胞質間輸送に関与するという、これまで報告されていない新たな機能を呈示できる可能性がある。抗癌活性をもつ化合物Spliceostatin Aはスプライシングに必要なSF3b複合体に結合し、スプライシング機能を阻害する。本研究では、Spliceostatin Aによる分裂酵母全タンパク質の細胞内局在(ローカリゾーム)に対する影響を網羅的に解析する「ケミカルローカリゾーム」解析を実施する。タンパク質局在変化を指標としたSpliceostatin Aの作用機序およびスプライシング因子の新たな機能を導き出すことを目的とする。分裂酵母のYFP融合型の全タンパク質可視化ライブラリー(Matsuyama et al., 2006, Nat. Biotechnol.)を用いて、Spliceostatin Aにより局在変化の起こるタンパク質を網羅的に探索したところ、4,489クローン中、約140クローンが局在変化を示した。局在変化のパターンとして、細胞質のドットや核小体に移行するタンパク質が多く見られた。特に核小体へ移行するタンパク質にはリボソーム生合成に関与するものが多く存在していた。さらに、局在変化を示したタンパク質をコードする遺伝子群について、Gene Ontology(GO)Termの統計学的抽出を行ったところ、「Biological process」において「RNA代謝」、「核酸代謝」、「転写」関連遺伝子が有意に濃縮されていることがわかった。抗癌活性をもつ化合物Splioeostatin Aはスプライシングに必要なSF3b複合体に結合し、スプライシング機能を阻害する。本研究では、タンパク質局在変化を指標としたSpliceostatin Aの作用機序およびスプライシング因子の新たな機能を導き出すことを目的として、Spliceostatin Aによる分裂酵母全タンパク質の細胞内局在(ローカリゾーム)に対する影響を網羅的に解析する「ケミカルローカリゾーム」解析を実施した。分裂酵母のYFP融合型の全タンパク質可視化ライブラリー(Matsuyama et al., 2006, Nat.Biotechnol.)を用いて、Spliceostatin Aにより局在変化の起こるタンパク質を網羅的に探索したところ、全体の約3%のタンパク質が局在変化を示した。そこで、SF3b複合体の因子をコードする遺伝子変異株を用いて、リボソーム生合成に変化が見られるかどうかポリソーム解析を行ったところ、一部の変異株においてポリソーム形成が減少していることが見出された。よって、SF3b複合体はポリソーム形成に関与することが示唆された。
北太平洋亜表層亜熱帯前線の時間変動の解明

北太平洋亜熱帯前線の時間変動の実態とその物理メカニズムを,観測資料および数値モデルの計算結果の解析から明らかにした.季節および年々の時間スケールでは,亜熱帯前線上に形成される低気圧性の風系の変動が,そして地球温暖化に伴う長期傾向においては,亜熱帯前線北側の水温躍層中に見られる水塊の変動が,亜熱帯前線の変動を引き起こすことが明らかになり,前線の変動メカニズムが時間スケールにより異なることが示された.北太平洋亜熱帯前線の時間変動の実態とその物理メカニズムを,観測資料および数値モデルの計算結果の解析から明らかにした.季節および年々の時間スケールでは,亜熱帯前線上に形成される低気圧性の風系の変動が,そして地球温暖化に伴う長期傾向においては,亜熱帯前線北側の水温躍層中に見られる水塊の変動が,亜熱帯前線の変動を引き起こすことが明らかになり,前線の変動メカニズムが時間スケールにより異なることが示された.北太平洋亜熱帯前線は,亜熱帯反流と呼ばれる東向きの表層海流を伴っており,亜熱帯循環系上層の特徴的な構造の一つであるが,亜熱帯前線の時間変動については,ほとんど研究されていない.最近,我々の研究により,亜熱帯反流域に,局所的に低気圧性の回転を示す海上風が春季に現れることがわかった.この低気圧性の風は,亜熱帯海面水温前線が大気へ及ぼす影響によって形成される.本研究では,低気圧性の風に着目して,亜熱帯反流(亜熱帯前線)の時間変動のメカニズムを調査した.過去14年間の長期の人工衛星資料と大気の再解析資料を用いて,海面水温前線,海上風,亜熱帯反流の季節変動及び年々変動を調べた.亜熱帯反流は,明瞭な季節変動を示し, 5-6月に最も強化することがわかった.一方,低気圧性の風応力カールは,海面水温前線が強化する5月に最も顕著に見られ,亜熱帯反流の強化に1ヶ月ほど先行する.年々の時間スケールでも大きな変動が見られ,相関解析を行った結果,低気圧性の風応力カールは,海面水温前線が強い年に形成され,この風応力カールしにより海面高度の低下が起こり,これに伴い亜熱帯反流が強化することが示された。アルゴフロートの資料を用いて海洋内部の構造を調べたところ,低気圧性カールが強い年には,主水温躍層が全体的に上昇しており,低気圧性カールに伴うエクマンパンピングによって海面高度の低下が起こることがわかった.さらに,コンポジット解析を行った結果,亜熱帯反流の5-6月の強化は,低気圧性カールが顕著に見られる年のみに起こり,低気圧性の風応力カールが春季の亜熱帯反流の強化の主要因であることがわかった.今後は,亜熱帯反流とモード水との関係についても調査を進める予定である.前年度は季節および年々の時間スケールについて解析を行ない亜熱帯前線および亜熱帯反流の時間変動と局所的な風系との関係を指摘した.今年度は,時間スケールのより長い長期の変化傾向に注目して,亜熱帯前線の変化とその要因について調査した.解析には,大気海洋結合数値モデルによる20世紀気候再現シミュレーションと温室効果ガス排出シナリオA1Bに基づく21世紀予測シミュレーションの計算結果を用いて,地球温暖化時の亜熱帯前線の変化を調べた.数値モデルに再現された亜熱帯前線は,海水密度の鉛直一様性で特徴付けられるモード水の南側に沿って分布し,上部水温躍層の北向きの浅化に関係し,観測資料に見られる前線と良く一致する特徴を持つ.この亜熱帯前線は,温暖化時に弱化し,亜熱帯前線に伴う亜熱帯反流も弱くなることがわかった.前線の弱化は,特に亜熱帯循環系中央部の東亜熱帯前線で顕著に見られ,前線北側に分布する中央モード水の高渦位化によって起こることが明らかになった.モード水の高渦位化により上部水温躍層の南北勾配が弱くなり,亜熱帯前線の弱化が起こる.さらに,モード水の高渦位化は,モード水の循環自体を変化させ,その結果,低渦位水が前線北側に集まりにくくなるという副次的な効果も,前線弱化の一つの要因であることが示唆された.中央モード水は,日本東方沖の冬季の深い表層混合層で形成される.温暖化時には冬季混合層が浅化し,これにより中央モード水の高渦位化が起こることが明らかになった.さらに,混合層の浅化は,冬季の海面冷却の弱化に起因していて,これは亜熱帯循環系北西部の偏西風が弱くなることにより起こることが示唆された.本研究の結果は,モード水が渦位の輸送を通して,海洋の密度構造と表層海流の変化を生じさせうることを示しており,従来の海洋学の認識を大きく変えるものと考えられる.
車いすユーザーに着目した歩道の段差・路面の計測と面的バリアフリー評価に関する研究

近年、「利用者の疲労軽減や快適性への配慮」や「バリアフリーの面的評価方法」などの研究も必要である。本研究は車いすユーザーを中心に、路面のすべりを点的に評価し、路面と疲労との関係を線的に評価した上で、これらのデータを用いた面的なバリアフリー評価の実現を目的とした。その結果、車いす利用者による評価、計測器を用いた路面のすべり評価と振動の評価を実施し、面的評価に至るまでのマップづくりができた。本研究は車いすユーザーを中心に面的なバリアフリーを評価する手法とより負担感を減らすことのできる車いす仕様の考察を提案するため、今年度は(1)点的に段差の衝撃、路面のすべり、および走行時の振動を計測し、(2)車いす使用者の負担と路面状況の違いによる関係を線的に評価した。今年度の結果は以下の三点に集約される。1.車いす利用者の路面走行時の問題点に関するアンケート調査車いすユーザーを対象としたアンケート調査により把握した。その結果、多くの回答者が車いすで歩道を走行する時に路面の凹凸に対して不快感を表していた。場合によっては、走行後気分が悪くなる人も存在し、長時間走行に対する配慮も必要である事が分かった。とくにタイル舗装についてはすべりやすく危険度も高いとの評価結果を得た。2.車いすユーザーを対象とした歩道の点的評価歩道を対象に段差乗り越え時の衝撃、路面の滑り、および路面走行時の振動を計測した。歩車道境界縁石を通過する時の衝撃については、各種の歩車道境界縁石の衝撃度の違いについて測定した。路面のすべり評価では区間的なすべり抵抗は見た目が同じ路面であっても振れ幅のあることが分かった。湿潤時のタイル舗装に関して滑りやすい路面素材であることが確認された。振動評価では、走行時の通常的な振動と段差通過時などの衝撃的な振動に暴露されることが分かった。振動を抑えるための工夫を路面と車いすの機構両面から検討してゆくことが今後の課題であることも確認された。3.車いすユーザーの負担感評価道路区間を実際に走行したときの負担感を計測した。本研究では0.8m/s2以上の振動に、130秒の走行で65秒間暴露された計算結果となり、今後車いす利用者の外出がより活発になると、現状では二次障害を誘発する原因となり、身体負担評価を取り入れたバリアフリー評価と負担感を減らす車いす機構の必要性を確認できた。今年度は「路面走行時の問題把握」、「車いすユーザーを対象とした歩道の線的評価」、および「バリアフリーの面的評価」を目標に研究を進めた。結果は以下である。(1)昨年度来から路面の凹凸に対して、多くの車いすユーザーは不快感を持っており、路面走行時の振動と段差通過時などの衝撃的な振動に暴露されることが分かった。よって、今年度はテストコースを対象に、横断歩道の縁石を通過するときの振動計測値を用いた点的な路面評価から、車いすがアスファルト、インターロッキングブロック等の路面を走行する時に得られる身体振動・駆動トルク値を用いた線的な評価に至るまでを実施した。その結果、横断歩道の縁石を通過するときは、身体振動と乗り越えに必要な駆動トルクが大きく、身体負担が大きいことが明らかになった。また、テストコースは130秒の走行で65秒間0.8m/s^2以上の振動に暴露された結果となり、これらの測定値を用いた評価ができた。(2)この研究の知見として、車いす走行時の加速度を蓄積することが重要であることが分かったため、ドライブレコーダーを用い、位置データ、加速度データ、および画像データを集積することができた。これらを地図に落とすことで、対象エリア内の面的なバリアフリー評価を実施した。一方、坂道などの身体特性負担が大きいことも分かったため、車いすが登坂する時の負担を人間工学的なアプローチから改めて計測した。その結果、身体負担的なアプローチの評価をすることも可能となった。以上、これまで主観的評価に留まっていた部分について、車いすユーザーの身体的負担・機構などからも明らかにできた。
フェムト秒レーザーによるガラスフォトニック結晶の作製と光集積回路への応用

フォムト秒レーザーを利用すると、ホウケイ酸ガラスの内部にボイドを形成でき、さらにレーザーの照射条件を変化させることでボイドの体積を自由に制御できることを確認した。本年度においては、ホウケイ酸ガラスやその他の高屈折率ガラス内部に周期的なボイド形成し、フォトニック結晶を作製すると仮定した時、フォトニックバンドギャップが形成される条件について調査を行った。予測されるフォトニックバンドギャップの周波数位置に関しては、平面波展開法用いて計算を行った。まず最初に、ガラスの内部に柱状の孔がx-y方向に配列した2次元フォトニック結晶に関して計算を行った。フォトニック結晶が有するバンドギャップを計算する場合、単位格子を占める誘導体の体積率が重要なファクターとなる。体積率のフォクターをR(R=r/a : a=周期、r=半径)と定義し、Rを変化させた時のバンドギャップの変化について調査した。又、ガラスの屈折率を変化させた時のフォトニックバンドギャップ形成の有無に関しても同様に調査した。ガラスの屈折率を1.7、ボイドの屈折率を1として計算を行った場合、R=0,3-0.45の範囲でフォトニックバンドギャップが形成されることが分かった。ただし、バンドギャップの幅はR=0.350.40の間で最も大きく開く。そして、Rが0.45以上になると再びバンドギャップが閉じる傾向にあることが分かった。屈折率を大きくするに従い、フォトニックバンドギャップのバンド幅は拡がる傾向にある。又、n=2.2以上になると高周波側のバンド(第二バンド)も同時に形成することを分かった。バンド計算の結果から、ガラスの内部に空孔を周期的に形成することで、フォトニック結晶の作製が可能であることが予測された。ガラス内部にフォトニック結晶を作製するための基礎技術として、ガラス基板内部に亀裂を発生させることなくドット状の空孔(ボイド)を作製可能なレーザー条件の調査を行った。ガラスは、市販されているホウケイ酸ガラスを使用した。繰り返し周波数1kHzのフェムト秒レーザー(スペクトラフィジックス社製)、200kHz(コヒーレント社製)を使用し、対物レンズ、パルスエネルギー、集光部の深さ、照射パルス数の調整を行い、ガラスの加工を試みた。繰り返し周波数が200kHzのレーザーを用いてガラス内部に集光照射(パルスエネルギー:0.5μJ1.3μJ)すると、レーザー集光部に直径1μm程度の黒いドットが確認できた。ドット周辺部に関してAFMを用いて解析した結果、黒いドットはボイドであることを確認した。レーザーのパルスエネルギーを上げると、ドット周辺部においてリング状の屈折率変化が誘起された。ドット周辺部に関してEPMAによる組成分析を行った結果、ガラスを構成する特定のイオンが移動している現象(イオン交換)が確認された。繰り返し周波数が1kHzのレーザーを用いて、上記と同様にガラス内部に集光照射(パルスエネルギー:1040μJ)すると、数100nmサイズのボイドがレーザー照射方向に複数並ぶ現象を確認した。ボイドは等間隔に周期を有して並んでおり、レーザーの照射条件を変化させることで、ボイドのサイズ、数、周期を制御できることを確認した。ボイドの周辺部にはクラック等も確認されず、良好なボイドが形成できていることを確認した。以上のように、レーザーの照射条件を調整することで、ガラス基板内部に亀裂を発生させることなくボイドを作製、また形状の制御を行えることを実証した。
軟骨肉腫鑑別分子マーカーとしての尿素輸送体UT-Bの発現・機能解析

軟骨肉腫細胞株SW1353においてSLC14A1(UT-B)をsiRNAノックダウンすると、WST assayで評価する細胞増殖が著明に抑制された。SLC14A1の発現は、内軟骨腫に比べて軟骨肉腫で減少する事を確認しているが、したがってcell growthから観る悪性度については、SLC14A1は負に働いていると考えられた。一方で、TGF-β1刺激によってSLC14A1が発現減少することと、この時cell growthも抑制される事も確認しているので、このよく知られたTGF-βの細胞増殖抑制効果は、実はSLC14A1発現を抑制することによる経路もあり得る、という新たな知見につながる可能性が出てきた。尿素自体の細胞増殖への影響をWST assayで調べると、0.05, 0.5, 5mMではほぼ差がなく軽微な抑制が観られ、5mMでさらに軽度の抑制効果を観たが、500mMにすると停止し、toxicと考えられた。細胞遊走能については、scratch assayを行なったが、SLC14A1 siRNAによって抑制がかかった。しかし、尿素添加によっては0.05, 0.5mMでは不変で、5mMで促進、50mMで逆転して不変、500mMで明らかな抑制となった。従って、5mMでは尿素は細胞運動に促進的に働くことが示唆され、SLC14A1ノックダウンで抑制がかかるということから、UT-Bを介する尿素輸送が、軟骨肉腫細胞の運動を促進している可能性がある。しかし、これも仮説と逆の結果となった。一方で、TGF-β1刺激下でSLC14A1と発現が連動するPEG10の、軟骨肉腫悪性度への影響についても同時に解析を進め、細胞増殖については、TGF-βと逆の促進効果、細胞運動と浸潤については、TGF-βと逆の抑制効果を認め、TGF-β/BMPのAKT経路を抑えることによることを見出し、論文報告した。細胞培養系におけるSLC14A1/UT-Bの機能解析について、順調に結果を得ることができている。細胞浸潤への尿素やSLC14A1ノックダウンの影響、さらに増殖、運動を含めた軟骨肉腫細胞の表現型に対する抗がん剤の影響に対する尿素とSLC14A1ノックダウンの影響を調べ、治療標的としてのSLC14A1/UT-Bの機能を評価する。臨床検体における発現解析も進める。軟骨肉腫臨床組織サンプルに対して、尿素輸送体UT-B(コード遺伝子:SLC14A1)の免疫組織化学染色の条件検討を行なった。これまでに、軟骨肉腫細胞株SW1353において、TGF-β1を添加してhigh-gradeをmimicした場合にSLC14A1の発現が著明に減少すること、また実際に臨床組織サンプルにおいてSLC14A1の発現が良性の内軟骨種に比較してgrade1, grade2軟骨肉腫では強く抑制されていることを確認している。一般に悪性腫瘍の悪性度と分化度は反比例するので、SLC14A1の軟骨細胞分化マーカーへの影響をSW1353細胞とsiRNAで観察した。その結果、siRNAによるSLC14A1のノックダウンは十分に得られたが、4日目までは明らかな分化度の変化はなかった。ところが、8日目においては軟骨細胞分化マスター転写因子SOX9の弱い、しかし有意な増加を認め、軟骨特異的遺伝子COL2A1は著明に2.5倍ほどの増加を呈し、分化後期マーカーCOL10A1は有意差はなかったが、増加する傾向を示した。この結果はSLC14A1が分化度の低い軟骨肉腫で発現抑制されている事から考えると、逆の結果であり、したがってSLC14A1が軟骨肉腫で発現抑制される意義は、分化度とは別のメカニズムにあると考えられた。すなわち、本来のトランスポーターとして悪性化を阻止している可能性、また浸潤に重要なMMP-13の発現にかかわる報告が一つある(Sato T., et al,Ann Rheum Dis, 2011)事から浸潤能に関わる可能性、などに研究の重心を移す必要が考えられた。がん研究会とのサンプル解析共同研究については手続きを進めている。SLC14A1の機能解析に着手できている。

しかし、尿素添加によっては0.05, 0.5mMでは不変で、5mMで促進、50mMで逆転して不変、500mMで明らかな抑制となった。従って、5mMでは尿素は細胞運動に促進的に働くことが示唆され、SLC14A1ノックダウンで抑制がかかるということから、UT-Bを介する尿素輸送が、軟骨肉腫細胞の運動を促進している可能性がある。しかし、これも仮説と逆の結果となった。一方で、TGF-β1刺激下でSLC14A1と発現が連動するPEG10の、軟骨肉腫悪性度への影響についても同時に解析を進め、細胞増殖については、TGF-βと逆の促進効果、細胞運動と浸潤については、TGF-βと逆の抑制効果を認め、TGF-β/BMPのAKT経路を抑えることによることを見出し、論文報告した。細胞培養系におけるSLC14A1/UT-Bの機能解析について、順調に結果を得ることができている。SLC14A1のMMP-13をはじめ、浸潤にかかわる遺伝子発現の解析と、浸潤能への影響をmatrigel assayなどを用いて解析する。尿素の軟骨肉腫細胞の表現型への影響を詳細に検討する。その影響に対するSLC14A1 siRNAの効果を解析する。がん研究会との共同研究を進める。細胞浸潤への尿素やSLC14A1ノックダウンの影響、さらに増殖、運動を含めた軟骨肉腫細胞の表現型に対する抗がん剤の影響に対する尿素とSLC14A1ノックダウンの影響を調べ、治療標的としてのSLC14A1/UT-Bの機能を評価する。臨床検体における発現解析も進める。免疫組織化学染色が本格的に始まっていない為であるが、次年度以降に推進し使用する予定である。細胞培養系の実験において、使うリガンドの量が少なくて済んだこと、しかし、今後刺激リガンドの種類を増やす予定である。siRNAについては、前年度の余りを用いた事も原因だが、今後も使用量は増えると予想される。表現型解析実験は今後も増えるため、次年度使用額はこれらに充填できる。