hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
in vitro において卵を産生する新規技術の開発

3)卵胞形成異常を克服する新規培養系の構築:エストロジェン受容体は遺伝子発現の転写調節を行っている。そこで、エストロジェン受容体のアンタゴニストを培地に添加することで、過度に活性化されたエストロジェンシグナルを抑制すれば、卵胞形成が改善されると考えた。アンタゴニストを添加した結果、卵胞形成は大幅に改善された。4)卵胞の体外培養:培養卵巣より得られた卵胞の培養条件を検討した結果、高分子化合物であるPVPの添加により卵胞の生存率および卵母細胞の成熟率が大幅に改善されることが明らかとなった。5)PGCから体外で産生された卵の発生能:1)5)の研究の結果、得られた卵を体外成熟、体外受精、胚移植に供試したところ、1卵巣当たり最大で7匹のマウスを得られることができ、マウスの表現型の正常性や妊孕性についても確認された。以上の結果から体外で機能的な卵を産生する新規in vitro系が構築できたものと判断した。当初、マウス始原生殖細胞から機能的な成熟卵を産生する培養系は5年間で遂行する研究計画を立案していたが、研究分担者や領域内研究者との連携を密にすることで、3年目に達成することができた。また、RNA-seq等で得られたメガデータの適切な解釈により、培養系確立を大きく前進させることができた。平成27年度までに開発した「卵子形成を再現する体外培養系」を軸に、卵形成機構を解明するため、本年度は以下の研究を行った。1)成体マウス卵巣内の原始/一次卵胞から卵を産生する新規in vitro系の構築ピンセットとタングステン針で成体マウス卵巣から原始/一次卵胞を単離した。1卵巣当たりおよそ10卵胞が単離できた。得られた卵胞は、5%代替血清物(SPS)、100 ng/ml SCF、100 ng/ml GDF9、および0.1IU/ml FSH添加alphaMEM培地内で培養した。培養には96ウェルディッシュを用い、1卵胞を1ウェルで培養し培養後の発育を個々に追跡した。原始卵胞の培養7日後の生存率は57%、このうち成長した卵胞は25%存在したが、ほぼ多くの原始卵胞が体内と同様、体外でも成長せずに静止状態にあることが示された。一方、一次卵胞は、培養7日後の生存率が42%、このうち成長が認められたものは85%だった。これらの卵胞をさらに培養すると胞状卵胞に発育し、第二減数分裂中期卵を得ることができた。2)卵形成および卵胞形成を制御する因子の探索これまでの研究で、in vitroで卵胞形成を遂行するためにはエストロジェン受容体の阻害剤(ICI)を添加し、体内と比較して過度に活性化されているエストロジェンシグナルを抑制する必要があることが示された。本年度は、既知の3種のエストロジェン受容体(ESR1、ESR2、Gper1)のうちどの受容体をを介して、卵胞形成異常が生じているのか、RNA-seq解析と培地への特異的阻害剤添加実験で検証した。その結果、ESR1特異的阻害剤を添加すると有意に卵胞形成が改善されることが明らかとなり、またこれを介してin vitroの卵巣で異所的に発現する遺伝子群が存在し、これらが卵胞形成を阻害していることが示唆された。1)成体マウス卵巣内の原始/一次卵胞から卵を産生する新規in vitro系の構築
ヒト制御性T細胞の生物学的機能と特性:新たな分子経路の発見とその作用機序の解明

免疫は生体に侵入する病原体やがん細胞を認識して除去することにより生体を防護する機構である。一方、免疫が過剰に反応して別種の病気になることを防ぐため、免疫反応を抑える働きを担うリンパ球、CD4^+CD25^+制御性T細胞(Treg)が存在する。がん組織中では、Tregががんに対する免疫反応を抑えて、がん進展を促進している。本研究では、Tregがどのような仕組みで働くのかを検討するために、その仕組みに関わる新たな分子を見出し、その分子について解析した。CD4^+CD25^+制御性T細胞(Treg)は免疫反応を負に調整し、免疫系のホメオスターシスの維持に重要である。Treg活性の増減により腫瘍の増悪や自己免疫疾患の発生が促進されることがわかり、これら疾患病理の理解や効果的な治療法の開発にとって、Tregの生物学的機能の理解を深めることは大変意義深い。われわれは、ヒトTregの生物学の解明に取り組み、特に、他のリンパ球に対する抑制活性の分子機序を明らかにすることを目的として、その抑制活性の発現に必要なFoxP3以外の新たな転写因子の同定を試みた。そこでナイーブCD4^+T細胞にTGF-β存在下でT細胞レセプター(TCR)刺激を加えて、natural Tregと同様にリンパ球抑制活性を有する細胞を誘導し(induced Treg)、コントロール細胞に比して有意に発現亢進する遺伝子を、マイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現解析により選別した。それらの中から、多様なサブセットの免疫担当細胞の中でTregに特徴的に発現亢進を示す遺伝子を定量的RT-PCR法にて選別した。さらにレトロウィルスベクターを用いてナイーブCD4^+T細胞にこれらの遺伝子を導入し、その細胞にリンパ球抑制活性を誘導する遺伝子を検索した。最終的にこれら全ての条件を満たし、Zinc fingerドメインを持つ遺伝子を同定し、TF-HTR(transcription factor-human Treg)と名付けた。TF-HTR遺伝子の発現は、健常人15人のnatural Tregでも見られるが、特にinduced Tregで高発現する傾向にあり、他のCD4^+T細胞サブセットでの発現は殆ど認められなかった。ナイーブCD4^+T細胞に遺伝子導入した細胞のリンパ球増殖抑制活性を見ると、FOXP3遺伝子を導入した際よりもTF-HTR遺伝子導入時の方が強い抑制活性を認めた。現在、Treg形質・機能発現におけるTF-HTRの役割ならびに、Tregのリンパ球抑制活性発現に関わるTF-HTRの下流遺伝子について、さらに検討を続けている。ナイーブCD4^+T細胞にTGF-β存在下でT細胞レセプター刺激を加えて誘導したTregにおいて、コントロールに比して有意に発現亢進する遺伝子を、マイクロアレイ・定量的RT-PCR法により選別した。最終的にこれら全ての条件を満たし、Zinc fingerドメインを持つ遺伝子を同定し、TF-HTR (transcription factor-human Treg)と名付けた。Treg形質・機能発現におけるTF-HTRの役割ならびに、Tregのリンパ球抑制活性発現に関わるTF-HTRの下流遺伝子について、さらに検討を続けている。TF-HTRに対するモノクローナル抗体を作成し、これを用いて免疫組織化学によりがん組織に浸潤するTF-HTR^+Trcgを同定し、そのヒトがんにおける臨床病理学的意義についても検討している。われわれは、ヒトTregの生物学の解明に取り組み、特に、他のリンパ球に対する抑制活性の分子機序を明らかにすることを目的として、その抑制活性の発現に必要なFox P3以外の新たな転写因子の同定を試みた。ナイーブCD4^+可細胞にTGF-β存在下でT細胞レセプター刺激を加えて誘導したTregにおいて、コントロールに比して有意に発現亢進する遺伝子を、マイクロアレイ・定量的RT-PCR法により選別した。