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マラリア原虫のプリンヌクレオチド生合成を介した新たなエネルギー代謝システムの解明

2.妊娠中のマラリアの病態の重症化は、妊娠による免疫抑制が主な原因であると考えられてきたが、本研究成果によって、「妊娠宿主においてマラリア原虫の代謝活性が亢進することで病態が重症化する」という新たな病態重症化機構の存在が示唆された。3.宿主であるヒトやマウスが妊娠すると、妊娠関連ホルモンの作用によって母体の赤血球造血が亢進し、末梢血中の幼若赤血球が増加することが報告されている。幼若赤血球は、成熟赤血球と比較して、マラリア原虫の代謝活性の亢進に関わるリンゴ酸や核酸前駆体などが多く含まれていることから、妊娠による幼若赤血球の増加が病態の重症化に関与している可能性が示された。比較ゲノム解析や比較プロテオーム解析は、遺伝子変異や病態重症化関連因子の解析に非常な有効な方法である。これらの手法を用いることで、マラリア原虫の新たな病態重症化関連因子が同定されてきた。Plasmodium berghei XATは、強毒株マウスマラリア原虫であるP. bergheiNK65にX線を照射することによって弱毒化されたマウスマラリア原虫である。しかし、これまでにP. berghei NK65とP. berghei XATの病原性の違いを決定づける因子は明らかにされていない。そこで、本研究では、P. berghei NK65とP. berghei XATとの比較ゲノム解析および比較プロテオーム解析を行い、マラリア原虫の新たな病態重症化関連因子を同定することを目的とした。比較ゲノム解析の結果、P. bergheiNK65とP. berghei XAT間で約1700個の遺伝子変異が検出された。しかし、病原性の違いを決定づける因子の同定には至らなかった。次に比較プロテオーム解析を行った。その結果、P. berghei XATにおいて感染赤血球の接着に関わると報告されているSBP1、赤血球への侵入に関わると考えられているRhoptry-associated protein (RAP) 1とRAP2/3など計8個のタンパク質が著しく発現低下していることを見出した。本研究によって、マラリア原虫の新たな病態重症化関連因子が同定された。また、比較ゲノム解析と比較プロテオーム解析を組み合わせることで、効率的にマラリア原虫の遺伝子変異や病態重症化関連因子を同定できることが示された。マラリア原虫が有する8種のTCA回路関連酵素のうち、マラリア原虫に特異的に保存されているリンゴ酸:キノン酸化還元酵素(MQO)はプリンヌクレオチド生合成系とTCA回路との代謝ネットワークの鍵分子であると考えられている。しかし、TCA回路が機能していないと考えられている赤内期のマラリア原虫において、この代謝ネットワークが機能しているかどうかは明らかにされていない。本研究により、世界に先駆けてMQOを欠損させたマウスマラリア原虫の作出に成功し、MQOがマウスマラリア原虫の病原性に関わることを見出した。これらの知見から、MQOは抗マラリア薬の新たな創薬標的になると期待される。1.フマラーゼを欠損させたマウスマラリア原虫のATP量は野生型原虫と同レベルであったことから、マウスマラリア原虫にはフマラーゼの欠損を補填する経路が存在する可能性が示された。そこで、マラリア原虫におけるフマル酸代謝を明らかにするために、野生型原虫とフマラーゼ欠損原虫の比較プロテオーム解析を行う予定である。2.マラリア原虫のフマラーゼの欠損を補填する経路として、宿主由来フマラーゼを利用した宿主ー原虫間連携フマル酸代謝が考えられる。
包接化合物カリックスアレンの分子認識センサー特性

水溶性カリックスアレンの金属認識能について主にX-線結晶回接法を用い,その包接メカニズムについて明らかにした。水溶性カリックスアレンの金属認識に関しては現在までアルカリ金属の例が報告されているが遷移金属との錯体形成について明らかにした。又,これらのカリックスアレン金属錯体は超分子としての可能性を示唆するものであり生体模倣触媒等の可能性を秘めるものであり興味深い。一方,末修飾のカリックスアレンとの金属認識能についても報告した。現在まで報告されているカリックスアレンは全て化学修飾を介した誘導体の錯体形成例であったが末修飾t-ブチルカリックス(4)アレンとアルカリ金属との錯体例について報告した。(Fumio Hamada,Kerry D.Robinson,Jerry L.Atwood,“Alkali Metal Salts of Oxganions of P-teit-Butylcalix(4) arene"Supramol.Chem掲載決定)。一方包接化合物として知られるシクロデキストリンの分子認識センサー特性についても検討した。修飾残基としてスピロピラン,アゾベンゼン及びダンシルグルシン残基を導入した。それぞれの誘導体についてステロイド,テルペン等のブスト分子に対する分子認識能力について明らかにした。スピロピラン修飾シクロデキストリンの場合開環型,閉環型では分子認識能に弱いながら差が観察され,さらに空孔径の大きいスピロピラン修飾α-シクロデキストリンの場合への拡張が期待される。アゾベンゼン修飾シクロデキストリンの場合も光異性化に伴い分子認識に顕著な差が観察された。ダンシルグルシン修飾γ-シクロデキストリンの場合は,ステロイド分子に対し高い分子認識選択性が観察されセンサーとしての有用性を示唆した。(Fumio Hamada,Tetsuo Osa,and Akihiko Ueno,“Dansgl-Modified r-cyclodextrinas a Fluorescent sensd of Molewlan Recognition."J.Incl.Phenon投稿中)。
細胞骨格及びモータータンパク質によるリポソームの変形と運動の数値シミュレーション

ジャイアントリポソームに細胞骨格タンパク質を作用させると、タンパク質が重合することにより、リポソームが膜突起形成などの変形を起こすことが知られている。この現象を工学的に応用し、アメーバ型分子ロボットの実現を目指す研究を行った。本年度は、前年度に引き続いて、有限要素法を用い、ガラス等の基板に接着したリポソーム内部で微小管やアクチン等のタンパク質が伸長した場合のリポソーム変形の数値シミュレーションを行った。その結果、マウンド状または円盤状のリポソームが、上部から見てレモン型や、より多数の突起の出た形態に変形することが確認できた。また、端緒的ではあるが、動的変形のシミュレーションにも挑戦した。これらの結果は、アメーバ型分子ロボットの実現可能性を示唆するものである。しかし、基板に張付いたリポソーム中でタンパク質を伸長させる実験に関しては、シミュレーション結果と良く似た形態が観測されているものの、安定した形態を得ることが難しく、数値シミュレーション結果と実験との比較は不十分であった。一方、負電荷を持つ脂質を含むリポソームを電解液にさらすと、細い膜チューブが伸びるなどの変形を起こすことが知られている。その要因を理論的に解明するため、膜弾性、膜電荷、溶液中の電解質の分布を考慮した数値計算を行い、実験的に妥当なパラメータで、静電気効果によりチューブが形成される場合があることを示した。タンパク質による変形と組み合わせることにより、分子ロボットへの応用の可能性がある。26年度が最終年度であるため、記入しない。ジャイアントリポソームに細胞骨格タンパク質等のタンパク質を作用させると、タンパク質が重合することにより、リポソームが膜突起形成などの変形を起こすことが知られている。この現象を工学的に応用することを目指し、本年度は、有限要素法を用いて、リポソーム内部に封入された、あるいは膜に張付いたタンパク質繊維の変形と脂質膜の変形を同時に数値的に計算する手法の開発に取り組み、部分的に成功した。この手法を用いてリポソーム内部に微小管を封入したときの膜変形の数値シミュレーションを行い、これまでに知られている回転対称変形に関する数値計算の結果と一致することを確かめた。次いで、リポソーム内部にアクチン繊維束を封入したときの繊維と膜の変形の数値シミュレーションを行った。その結果、アクチン繊維の長さが伸長した場合、アクチン繊維の弾性と膜の弾性の強さに応じて、リポソームがスプーン型に変形する場合と、赤血球状のリポソームの一部に突起の出る場合の2種類の形態が得られることが明らかになった。これら2種類のリポソームの形態は、実際に観察される形態と類似している。また、リポソームにタンパク質タリンを加えたときの変形に関しても数値シミュレーションを行い、これらの結果の一部を学会で発表した。次に、分子ロボットとしての動きを展望し、ガラス表面に付着したリポソームについて、膜とガラス表面との接着エネルギーを仮定して有限要素法を用いた形状変化の数値シミュレーションを行った。リポソーム内部で微小管が伸長した場合の数値シミュレーションで、溶液中のリポソームとは変形の起こり方が定性的に異なることが示唆された。新たな数値計算手法の開発により、ガラス表面に付着したリポソームも含め、タンパク質による様々な膜変形の計算が可能となった。溶液中及びガラス表面に付着したリポソームの内部にタンパク質を封入した場合の変形について、パラメータを変えて数値シミュレーションを進め,実験結果と比較する。ガラス表面に付着したリポソームの変形については、タンパク質に関わる化学反応系を仮定した理論計算にも取り組みたい。
荷電高分子粒子系におけるElectro "Dynamic" Interaction

我々が発見したコロイド結晶中における粒子間距離が塩濃度の関数として極大を取る現象について、超小角X線散乱法を中心に、その詳細とコロイド結晶形成の根元的メカニズムを調査した。その結果は、以下のように纏められる。(1)極大点は「固液相転移点」である。すなわち、これより低塩濃度側では固体様コロイド結晶であり、高塩濃度側では液体構造である。(2)液体構造側での挙動は、古典的なDLVO理論で定量的に説明できる。(3)極大点に置いては、粒子間距離は物理的に可能な最大距離になっている。すなわち、それより低塩濃度側では、イオン雰囲気の異常な重なりが生じている。(4)この異常な重なりによりカウンターイオンの「共有」が生じ、これが引力的相互作用を生み出し、コロイド結晶の原動力となる。(5)この原動力は、カウンターイオンがプロトンの時強く、他のイオン、すなわちナトリウムや、カリウムなどでは弱い。この事実は、カウンターイオンの動きが原動力に関与する重要な因子であることを証明している。(6)電荷数や粒径のことなるコロイド粒子を混合すると、一定の条件下で合金様構造が形成される。その構造は超小角中性子散乱により詳細に調査できる。このような合金構造は新たな機能材料開発の基礎となりうる。我々が超小角X線散乱(USAXS)測定により見い出した、コロイド結晶における粒子間距離が、イオン強度の減少と共に減少する現象は、従来の新旧コロイド間相互作用では説明できない、新たな発見であり、少なくとも低イオン強度下では、今まで考慮されていないメカニズムが存在することを示している。これを明かとするため、(1)コロイド結晶構造の温度依存性、(2)カウンターイオン種の影響、および(3)超小角中性子散乱(USANS)によるコロイド合金構造の解析、を行った。以下がその成果の概要である。(1)イオン強度依存性で観察されたコロイド結晶中の粒子間距離の変化は固液相転移に相当する事を実証するため、温度を変化させ、測定した。その結果、60C付近での融解現象が確認され、さらに、温度低下に伴いコロイド結晶が形成される際、粒子間距離が減少する傾向が確認された。これはイオン強度実験と合致する。(2)コロイド粒子のカウンターイオンをH+からNa+に徐々に変化させ、結晶構造の変化をUSAXSにより測定した。その結果、H+がNa+に入れ代わると、粒子間距離は増大し、構造が崩壊していくことが判明した。この実験に於いて、粒子およびカウンターイオンの電荷数は変化していないζとから、この実験結果は、カウンターイオンの運動性が粒子間相互作用に影響をおよぼしていることを示唆している。(3) D体とH体のラテックス粒子を混合した系についてUSANSによりその合金構造を調査した。小粒子がメジャーな成分の場合、小粒子のみ結晶構造を取り、大粒子は構造を形成しないことが判明した。また、大粒子の数を増加させると、逆に大粒子のみ結晶構造を取ることがわかった。このような混合系における合金様構造の発現は、荷電粒子間の相互作用解析に新たな知見をもたらすものと期待される。これを明かとするため、本年度は、(1)コロイド結晶構造の温度依存性、(2)カウンターイオン種の影響、(3)超小角中性子散乱(USANS)によるコロイド合金構造の解析、をさらに詳細に推し進めるとともに、上記現象の理論的考察を行った。(1)イオン強度依存性で観察されたコロイド結晶中の粒子間距離の変化は固液相転移に相当する現象が、温度変化により60C付近で同様な融解現象として種々の粒径、電荷密度を有するコロイド粒子について確認した。さらにこの現象が可逆的であることを確認した。

(2)コロイド粒子のカウンターイオンをH^+からNa^+に徐々に変化粒子間距離は増大し、構造が崩壊していく現象について、詳細なUSAXS測定を行い、その散乱曲線をLindemanの融解則および三次元派らクリスタル理論により解析し、構造変化の定量的情報を得た。その結果、H^+では固体様結晶構造を形成する条件でもNa^+では液体様構造しか形成し得ないことを確認した。これにより粒子間相互作用にはカウンターイオンの荷数のみならず動的性質が重要な寄与をしていることを確認した。(3)D体とH体のラテックス粒子を混合した系で合金構造が発現する現象について、USANSにより、さらに詳細に検討した。その結果、粒径、電荷数、濃度の相対的関係により、それぞれ一方の粒子のみ結晶構造を形成する条件が存在することが明らかとなった。以上により、低イオン強度下における粒子間相互作用はDLVO理論など従来の「静電的」理論ではなく全く説明できないものであることを確実に証明するとともに、動的揺らぎを考慮する必要性を明確に示すことができた。
次世代シークエンサーを用いた生薬のDNA鑑定法の構築

生薬の品質管理にとって、高品質な製品を市場に安定供給することは重大な課題である。生薬の基原鑑定は、五感を使った検査や形態観察、成分分析法が一般的であるが、基原生物が異なる類似品の鑑別は難しい。また、類似品が一部混ぜられていた場合には見破ることができない。そこで、生薬の遺伝子検査することで基原生物の同定や類似品の混合割合が検出できる方法、いわゆる「生薬のDNA鑑定法」の構築を試みる。この方法では、動物・植物を問わず鑑定ができるようになり、汎用性が高く、従来の試験法に続く第4の試験法として確立される方法になると考えられる。
乳歯と永久歯のう蝕発生に対する要因分析

3歳児健康診査および、追跡調査として同保健所管内での2小学校の学校歯科検診の機会を利用して、口腔内診査とアンケート調査を行った。多変量解析の手法を用いてこれらのデータの分析を行った。本研究は大きく二つの部分からなる。一方は3歳児における乳歯う蝕の発症に関する要因の分析であり、他方は3歳時点での乳歯う蝕と11歳時点での永久歯う蝕の関係に関する分析である。その結果、以下のような結論を得た。1、一人平均dmf歯数に強く関係した要因は「主たる保育者」「就寝時授乳」の項目であった。これら2つの項目の偏相関係数は、各々、0.160と0.117であった。また、6項目での重相関係数は0.247であった。とりわけ、「就寝時授乳」習慣を止めた時期が重要であった。18カ月以前にこの習癖が改善された群の平均dmftは、継続した群のそれより有意に少なかった。2、一人平均DMF歯数に強く関係したのは、「よく飲む飲物」の項目だけであった。この項目の偏相関係数は0.164で、8項目での重相関係数は0.287であった。また、乳歯におけるう蝕罹患型を9項目めとして加えると、重相関係数は0.335に増加した。この項目の偏相関係数は0.181であり、他のどの項目より高かった。これらの結果から、う蝕予防という観点より、以下のポイントが重要と考えられる。1、1歳6か月児歯科健康診査において、「就寝時授乳」の有無を調査し、この習癖の改善を目指す。2、永久歯萌出前に口腔衛生指導を徹底し、生活習慣一般に対する意識の改善を目指す。3、小学校児童に関しては、ジュース・炭酸飲料の類に注意する。乳幼児期のう蝕罹患要因を探求するため、母子保健法に基づき徳島県鳴門保健所にて実施している3歳児歯科健康診査の機会を利用し、同管内の幼児を対象に昭和62年度より行っているアンケート調査データ(郵送法)と歯科検診データを本科学研究費にて購入したコンピューターを用いて入力し、統計学的な解析を試みた。特にう蝕の多寡に関する要因分析では多変量解析のうち、「出生順位」「昼の養育者」「授乳状態」「就寝時授乳」「おやつの食べ方」「甘いおやつ」「歯磨き回数」「磨く人」の8つを説明変数、dmftを外的基準とした数量化理論第I類による解析を行った。昭和62年度より4年間のデータ分析を行った結果、重相関係数は0.29から0.31の間のよく似た値を示したが、各年度によって偏相関係数の値による説明変数の順位はやや異なる結果となった。この中で、4カ年とも「就寝時授乳」「おやつの食べ方」は高い順位を示し、歯口清掃に関する「歯磨き回数」「磨く人」は低い順位であった。ところで、臨床の場において断乳時期の遅いことがう蝕の多寡に関与するケースがしばしば認められるため、平成元年度よりアンケートの「就寝時授乳」の期間を問う項目を加えている。この2年間のアンケートを集計した結果、1年6カ月以上授乳していた者とその他の者のdmftに有意な差(p<0.01)が認められた。そこで同項目を前述した2群に再カテゴリー化して多変量解析を再度行ったところ、重相関係数は両年度とも上昇し、「就寝時授乳」の偏相関係数順位も1位あるいは2位となった。これらの結果は3歳児までの乳歯う蝕の予防においては、断乳時期を含めた乳幼児の生活習慣の適正化が重要な要因の1つであることを指摘している。

今後の研究においては3歳児以降のう蝕要因の分析を行い3歳時点での要因との関連性を追求していく予定であり、コホート調査のための歯科検診、アンケート調査を展開中である。鳴門地区の小学校2校においてアンケートおよび歯科検診を実施し、生年月日・性別・出生順位等を用いて、過去の保健所での3歳児健康診査時のデータとのマッチングを行った。小学2、4、6年生について試みたところ、その一致率は、2年生;約80/120、4年生;約100/130、6年生;約120/160であった。個人データを守る必要があったために、マッチングに際し名前を使用することができなかった。そのため、個人の同定が困難となったが、先に述べた一致率は、今後の統計処理が可能な数字と考える。以下に、2小学校のう蝕罹患状況を示す。これまでに得られた3種のデータに関して多変量解析の手法を用いて、う蝕罹患に関与する要因について、現在分析を行っている最中である。昨年に引き続き、鳴門地区の小学校2校において行われた歯科健康診査結果の集計を行った。しかし、平成7年度の学校歯科保健の改訂が行われ、従来のC_1C_4の分類がなくなり、COが導入されたことにより、う蝕の検出基準に変化が生じてしまった。そのため、当初の予定通りの実行が不可能になったためやむを得ず、追跡調査の対象を平成6年度の偶数学年のみとし、多変量解析の手法を用いて分析を行った。その結果、以下のような結論を得た。1、「主たる保育者」「就寝時授乳」「おやつの回数」「おやつの食べ方」「おやつの量」「誰が歯を磨くか」の6項目のうち、一人平均dmf歯数に強く関係した要因は「主たる保育者」「就寝時授乳」の項目であった。これら2つの項目の偏相関係数は、各々、0.160と0.117であった。また、このときの重相関係数は0.274であった。とりわけ、「就寝時授乳」習慣を止めた時期が重要であった。18カ月以前にこの習癖が改善された群の平均dmftは、継続した群のそれより有意に少なかった。2、一方、「朝食習慣」「歯磨き回数」「歯磨き時の出血」「食事の取り方」「おやつの取り方」「よく飲む飲み物」「フッ素塗布経験」「加工食品の摂取頻度」のアンケート項目のうち、一人平均DMF歯数に強く関係したのは、「よく飲む飲み物」の項目だけであった。この項目の偏相関係数は0.164で、8項目での重相関係数は0.287であった。また、乳歯におけるう蝕罹患型を9項目めとして加えた。このことにより、重相関係数が0.335に増加した。また、う蝕罹患型の偏相関係数は0.181であり、この値は他のどの項目より高かった。
分子遺伝学的手法によるIII型高脂血症の早期発見とその発症予防について

分子遺伝学的手技を用いて、【III】型家族性高脂血症の原因であるアポ蛋白Eの異常な遺伝子保有者を早期発見する方法を確立した。リポE受容体との結合に重要なアミノ酸を含むアポEの主要な対立遺伝子ε3、ε4、【ε^(2*)】、ε2に対する6種類の19量体のオリゴヌクレオチドを合成した。その5′末端にニックトランスレーションにより【^(32)P】を結合させて、標識したプローブを作成した。被験者の白血球からヒト染色体DNAを抽出し、これを制限酵素EcoRIで消化した。先に述べた【^(32)P】で標識したオリゴヌクレオチドをプローブとしてハイブリダイゼイションを行った。オートラジオグラフィーを行ない、ハイブリダイズしたDNA断片を検出した。アミノ酸のコドンに点突然変異があればプローブとはハイブリダイズしないためDNA断片が検出できなかった。今回検討したアポEの構造異常が推定される部分の合成オリゴヌクレオチドを用いたアポEのアミノ酸組成異常の早期発見は、その診断上、有力な方法であるといえる。しかし、この方法をキット化してどこの施設でも行えるように一般化するためには、オリゴヌクレオチドプローブの感度をあげる工夫が必要である。また従来知られているアミノ酸組成以外の部分に点突然変異がおき、そのために高脂血症をきたした症例が最近報告された。このような症例の発見にはSP6RNAポリメラーゼと、pSP62プラスミッドを用いてアポEcDNAを鋳型として【^(32)P】標識RNAプローブを作製し、RNaseAで処理する方法を用いる必要があり、現在検討中である。
ガウス過程の表現と積分方程式

1.確率過程の典型とされるブラウン運動に関して一般の確率過程を標準的に表現する問題に取り組んだ。2.特に対象とする確率過程はガウス過程に限定したのであるが、これはブラウン運動に関して線形的に表現でき、古典的なVolterra型積分作用素とうまく対応することによる。3.本研究により得られた結果の概要はつぎのとおりである。(1)ガウス過程の標準表現の重要性を最初に提言したLevyの研究の中にブラウン運動自身の非標準表現を構成して専門家を驚かした。本研究に於いては一般的な方法を見いだし、そのような非標準表現が"自由に"構成できることを示した。詳しく述べると、任意の二乗可積分関数のウイナ-積分に直交する非標準ブラウン運動が構成できることが判明した。この結果は古典的なHardyの不等式の一般化と関連するので興味深い結果である。(2)ブラウン運動に関して直交補空間が無限次元になる非標準表現を構成できた。これは定常過程の表現に関することからヒントを得たものであるが、Lee-Wienerの非線形回路網と関連することがわかった。表現の問題が電気的に実現されうることになったのでその一般化が次の問題となった。(3)Volterra型積分作用素と標準性の関係について詳細なリストを作成した。しかし明確な法則性を見いだすには至っていないので今後の研究課題として残る。4.各地の研究者と研究連絡を密に行いながら研究を進めた。しかし上記のような新しい問題を含めて未解決の事項も多くあるので今後も努力を続けたい。
ショウジョウバエを用いたポリ(ADP-リボース)代謝の生理的意義の解明

PARG変異体の神経細胞には大量のポリ(ADP-リボース)が蓄積しており、電子顕微鏡による観察では均一な大きさの顆粒状の蓄積物が認められた。金コロイドで標識した抗ポリ(ADP-リボース)抗体を用いた免疫電子顕微鏡では、金コロイドの局在は主に顆粒状の蓄積物と重なっていたので、顆粒状の物体はポリ(ADP-リボース)ポリマー自体か、もしくは、ポリ(ADP-リボシル)化された標的タンパク質であると考えられる。PARG変異体を大量に調整し、ポリ(ADP-リボシル)化されたタンパク質の同定を進め、いくつかの候補が得られつつある。また、PARG変異体の全身では、抗ポリ(ADP-リボース)抗体は脳および胸部神経節に顕著に反応したが、その他の部分では顕著ではなかった。中枢神経系のみにポリ(ADP-リボース)が蓄積する原因を明らかにするために、ショウジョウバエの頭部と体部でのポリ(ADP-リボース)分解活性を測定した。野生型では頭部と体部ともに分解活性があったが、PARG変異体の頭部には分解活性が無く、体部に認められた。阻害剤を用いて検討した結果、PARG変異体の体部におけるポリ(ADP-リボース)分解はホフホジエステラーゼ活性によると示唆された。植物ではPARG変異体が多くの遺伝子発現の概日振動に重要であることが示されたが、動物ではポリ(ADP-リボシル)化と体内時計の関連は未知であった。PARG変異体および、PARG、PARP過剰発現変異体を用いて概日行動リズムを測定したところ、活動リズムには野生型と有意差は見られなかった。PARG変異体の生存に影響する遺伝子変異の検索では幾つかの候補遺伝子が得られつつある。また、或る重要な癌抑制遺伝子のポリ(ADP-リボシル)化部位を特定する事に成功し、細胞分裂機構の制御におけるポリ(ADP-リボース)の重要性を明らかにした(投稿中)。申請者はポリ(ADP-リボース)分解酵素(PARG)の遺伝子破壊ショウジョウバエを作成し、PARGの欠失が晩発性、進行性の神経変性を引き起こすことを既に報告した。本研究によって、さらに、PARG遺伝子破壊ショウジョウバエの脳神経細胞内部に顆粒状の蓄積物の存在を発見し、抗ポリ(ADP-リボース)抗体を用いた免疫電子顕微鏡観察によりポリ(ADP-リボース)は主にその顆粒に存在していることを明らかにした。これはポリ(ADP-リボース)の神経細胞内部での蓄積が神経変性の直接の原因となった可能性を示唆する。また、ポリ(ADP-リボース)合成はDNA損傷後に極めて顕著な反応であり、PARGがDNA損傷後の反応に関与している可能性が示唆されてきた。申請者は、PARG遺伝子破壊ショウジョウバエの幼虫にガンマ線照射、および、DNA損傷物質投与を行った。ところが、DNAダメージ後の発生・生存率を測定したところ、PARG遺伝子破壊ショウジョウバエは野生型よりもDNAダメージへの感受性が低く、高い発生・生存率を示した。これは、PARGがDNA損傷後の細胞応答に不要であるか生存を抑制する働きがある事を示唆する。これらの成果は2004年に開催されたADP-リボシル化に関する中心的な国際シンポジウムである「第53回藤原セミナー」において発表した。現在、PARG変異体を大量に調整し、ポリ(ADP-リボシル)化されたタンパク質の同定を進めている。

野生型では頭部と体部ともに分解活性があったが、PARG変異体の頭部には分解活性が無く、体部に認められた。阻害剤を用いて検討した結果、PARG変異体の体部におけるポリ(ADP-リボース)分解はホフホジエステラーゼ活性によると示唆された。植物ではPARG変異体が多くの遺伝子発現の概日振動に重要であることが示されたが、動物ではポリ(ADP-リボシル)化と体内時計の関連は未知であった。PARG変異体および、PARG、PARP過剰発現変異体を用いて概日行動リズムを測定したところ、活動リズムには野生型と有意差は見られなかった。PARG変異体の生存に影響する遺伝子変異の検索では幾つかの候補遺伝子が得られつつある。また、或る重要な癌抑制遺伝子のポリ(ADP-リボシル)化部位を特定する事に成功し、細胞分裂機構の制御におけるポリ(ADP-リボース)の重要性を明らかにした(投稿中)。
則天武后期の仏像様式に関する研究-初唐様式から盛唐様式への展開-

本年度は、中国・則天武后期(680年代約20年間)の仏教彫刻作品についての基礎資料の収集に着手し、下記の成果を収めた。なお、当初の研究計画ではその調査活動の地域を日本国内としていたが、途中1回の中国出張、および2回の米国出張の機会を利用して、国外所在の実作例、写真・文献資料の収集にもつとめた。1写真資料の収集中国仏教彫刻に関する写真資料は日本所在作例約150カット、欧米所在作例約1,000カット、中国所在作例約500カットを実写と複写の焼付け写真として収集し、カード化した。ただしこれらのうち則天武后期に直接該当する作例は10分の1程度で、他はその前後の時代の展開を考える上で有用な参考資料と位置づけられる。2作品調査予定していた各地域のうち、大阪市立美術館、京都国立博物館、東寺(京都)での調査を実施した。また大原美術館(岡山)、東京芸術大学、書道博物館、根津美術館(以上東京)の調査を実施した。また海外出張中の時間を利用して、北京故宮博物院、河南省博物館、鄭州市博物館、洛陽市博物館、洛陽龍門石窟(以上中国)、サンフランシスコ・アジア美術館、ロサンゼルス郡立美術館、ニューヨーク・メトロポリタン美術館、クリーヴランド美術館、ペンシルヴェニア大学美術館、フィラデルフィア美術館、ボストン美術館、ハーバード大学サックラ-美術館(以上米国)での調査を実施した。3今後の課題と予定今回の調査により、海外所在の則天武后期の作例は量的にはそれほど多くなく、若干の例外を除いて質的にも重要なものが少ないことがほぼわかった。いっぽう中国本土では、洛陽を中心とする河南地域の重要な作例について資料を収集することができたのに対して、西安(長安)の陝西地域については十分な調査が行えなかった。平成6年度以降もさらに研究を継続し陝西地域についての資料を収集した上で(具体的には現地調査および東京国立博物館等国内機関での調査)、地域性の問題を考慮しながら検討を加える予定である。
加速器を用いたホウ素中性子捕捉療法のためのリチウムターゲット冷却システムの開発

線質・線量面から見た加速器BNCTの成立性を確認した条件である、エネルギー1.92.5MeV、電流1020mAの陽子ビームをLiターゲットに入射する場合を想定して、Liターゲット冷却方法の検討を継続して行った。本年度は、照射実験用の加速器が不具合により使用できなかったため、模擬計算による考察を行なった。並行して、Liターゲットの作成工法についての検討を継続して特許化するとともに、照射実験用のガラス線量計の整備を行った。模擬計算においては、1cmφの2.5MeV陽子ビームを20cmφのLiターゲットにスキャニング照射する場合を想定し、スキャニング周波数がLi温度やCuバッキング強度に及ぼす影響を汎用非線形構造解析システムFINASにより解析した。陽子のエネルギーストラグリングを無視すれば2.5MeV陽子はLi表面から深さ90μm程度にわたって中性子を発生するが、それ以降の深さの陽子発熱をCu中で起こす観点から厚さ100μmのLiと、陽子がLi中で全エネルギーを付与する230μmのLiで、上記の解析結果を比較した。その結果、予見に反して厚いLiの方が有利である事を明らかにした。この場合、スキャニング周波数9Hz以上であれば、Liの融点179°Cに対して150°C以下に保つことができ、かつBNCT照射中に熱サイクルでCuバッキングが降伏応力に達さないことがわかった。また、スキャニング機構が故障し陽子ビームがLi上の一箇所に滞留しターゲット構造を破壊するのを防ぐには、20ms程度に陽子ビームを停止する必要があることを明らかにした。これらの結果を踏まえ、引き続きLiターゲット除熱の検討を更に進めたい。これまでに、ファントム実験を通して有効性を確認した計算手法により、線量面から見た加速器BNCTの成立性を確認した。その結果、エネルギー1.92.5MeV、電流1020mAの陽子ビームをLiターゲットに入射し、発生する中性子場を減速・整形することにより、35cmのTPD(治療のための線量条件を満たす照射領域の深さ)が得られることを明らかにした。有用性を確認した陽子ビーム条件のうち、たとえば1.9MeV、19mA、直径18cmではLiターゲット発熱は約139W/cm^2となるが、これは冷却系を想定した事前計算により冷却可能性が期待できる範囲である。冷却系設計・試作のための基礎データとして、Liターゲットの製作方法について真空蒸着法と圧延圧着法が与える性能面への影響を陽子照射試験により比較検討した。具体的には、製作方法ごとにそれぞれ厚さ約100μmのLiターゲットを試作し、広島大学原爆放射線医科学研究所中性子発生用加速器(HILAC)の2.5MeV、20μA程度、直径12cm程度の陽子ビーム(1040W/cm^2)により照射を行い、Liターゲットの状態、ならびに、発生する中性子・γ線照射場の強度を比較した。これにより、次の知見を得た。(1)真空蒸着と圧延圧着によるLiターゲットは、100μm前後の厚みでは同様の照射特性を有する。(2)3時間程度にわたり中性子発生効率の変化を観測した結果、照射時間3時間経過しても中性子発生がみられることから、3時間程度の寿命は得られるものと判断した。今後は、Li温度と照射によるLi減少量の測定系を整備した上で、より高い発熱密度に対する照射試験を実施するとともに、冷却システムの検討と、その照射特性の評価を目指す。有用性を確認した陽子ビーム条件のうち、たとえば1.9MeV、19mA、直径18cmではLiターゲット発熱は約139W/cm^2となるが、これは事前計算により冷却可能性が期待できる範囲である。発熱密度が大きい条件を模擬するために陽子ビーム(50100μA)を直径12cmにしぼって、平成18年度に行ったターゲット冷却試験を継続することを想定して、陽子ビームスリットとLiターゲットの準備を行った。Liターゲットの製作方法については、真空蒸着法と圧延圧着法の性能面での違いを比較検討する意図で、4枚のターゲットの製作を行った。1枚は、Liを100μmの厚さとなるよう圧延圧着したターゲット板であり、事前のテストによりLi厚9799μmの範囲で均一性を保つことが確認している。製作した残り3枚はLiを装着していない裸の銅板である。裸の銅板の内1枚は照射試験前にLiを100μmの厚さで真空蒸着するためのものであり、1枚はバックグランドの温度計測用、1枚は予備である。これらの結果を踏まえ、最終年度となる平成20年度はターゲット冷却試験・計算を用いてLiターゲット除熱の検討を更に進めたい。

模擬計算においては、1cmφの2.5MeV陽子ビームを20cmφのLiターゲットにスキャニング照射する場合を想定し、スキャニング周波数がLi温度やCuバッキング強度に及ぼす影響を汎用非線形構造解析システムFINASにより解析した。陽子のエネルギーストラグリングを無視すれば2.5MeV陽子はLi表面から深さ90μm程度にわたって中性子を発生するが、それ以降の深さの陽子発熱をCu中で起こす観点から厚さ100μmのLiと、陽子がLi中で全エネルギーを付与する230μmのLiで、上記の解析結果を比較した。その結果、予見に反して厚いLiの方が有利である事を明らかにした。この場合、スキャニング周波数9Hz以上であれば、Liの融点179°Cに対して150°C以下に保つことができ、かつBNCT照射中に熱サイクルでCuバッキングが降伏応力に達さないことがわかった。また、スキャニング機構が故障し陽子ビームがLi上の一箇所に滞留しターゲット構造を破壊するのを防ぐには、20ms程度に陽子ビームを停止する必要があることを明らかにした。これらの結果を踏まえ、引き続きLiターゲット除熱の検討を更に進めたい。
直列弾性モデルを用いたヒト骨格筋の弾性エネルギーの定量化と運動適性

昨年度の最大弾性エネルギーの定量的解析法を用いて、本年度は競技種目の特異性を明らかにするため、種々の競技選手を対象に実験をおこなった。対象となる被験者を(1)陸上短距離選手、(2)陸上長距離選手、(3)バレーボール選手、(4)非鍛錬者の4グループとし、約10名とした。最大無酸素性瞬発エネルギーの測定ではフォースプラットフォーム上で反動なしジャンプを両脚で行い、フォースプラットフォームに加わる力、重心の上下移動速度からパワーを算出し、キックに要した時間を乗じて無酸素性エネルギーの測定を行った。最大弾性エネルギー:フォースプラットフォーム上において片脚、両脚の軽いジャンプを行い、上記の方法でジャンプ時の最大弾性エネルギーを測定した。測定項目は、片脚および両脚での減衰振動の周波数f、減衰係数b、弾性係数k、最大弾性エネルギー、最大無酸素性瞬発エネルギーである。その結果、最大無酸素性瞬時エネルギーは男子陸上短距離では238.4±53.7J、男子長距離では181.4±29.7J、非鍛錬者では177.4±43.4J、男子バレーでは222.9±23.3J、女子バレーでは136.4±26.2J、一般女子では114.6±12.0Jであった。体重補正をした値も同様な傾向になり、男子短距離は他の群よりも有意に高かった。一方、最大弾性エネルギーは、男子陸上短距離では89.7±16.5J、男子長距離では56.4±15.1J、非鍛錬者では49.0±16.2J、男子バレーでは63.7±18.7J、女子バレーでは61.9±12.0J、一般女子では40.0±9.2Jであり、男子短距離は他の群よりも有意に高かった。走運動時の全機械的エネルギーのうち、弾性エネルギーが占める割合は、男子陸上短距離では27.6±3.7%、男子長距離では23.7±5.2%、非鍛錬者では21.3±3.4%、男子バレーでは22.0±5.2%、女子バレーでは31.4±5.3%、一般女子では25.6±2.5%であり、男子短距離、女子バレー、一般女性が比較的高い割合を示し、女性の場合には弾性エネルギーの貢献が高いことが示唆された。また、弾性エネルギーは短距離選手の走スピードとの間に有意な相関がみられ、短距離走パフォーマンスには弾性エネルギー改善の重要性が示唆された。本研究では、人体エネルギーの一つである最大無酸素パワー(ATP-PC系)とそれに関連する弾性構造に由来する最大弾性エネルギーの測定理論の確立にあった。本研究では、人体下肢を直列粘弾性モデルに置き換えて、そのモデルの定数である減衰振動の周波数(f)、減衰係数(b)、弾性係数(k)を実際の測定データ(フォースプラットフォームの力曲線)から算出し、モデルの最大弾性エネルギー(Eel)、最大無酸素性瞬発パワー(あるいはエネルギー)(Pp)を定量化することであった。被験者を成人男子7名とし、連続ジャンプ(反動あり)と反動なしジャンプを繰り返し試行させた。反動連続ジャンプでは片足と両足の条件でそれぞれ10回繰り返し、最大荷重の最大値に近い数例を解析の対象にした。被験者は素足で実施した。その結果、両足ジャンプでのモデルの減衰振動の周波数fは、3.45±0.29Hz、減衰係数bは413.42±41.49N/(mls)、弾性係数kは31.42±4.26N/mmとなり、最大弾性エネルギーEelは72.21±17.47Jとなった。このときの最大無酸素パワーは3831.2±711.2Wであったので、最大弾性エネルギーの貢献は約30%となる。そこで、Eelが本当に最大無酸素性瞬発パワー時に利用させれいるかの検証として、反動ありのジャンプと反動なしジャンプでのピークパワーおよび平均パワーの差をそれぞれ独立変数として重回帰分析を行った結果、Eel=0.804+0.0202(ピークパワーの差)+0.0182(平均パワーの差),R2=0.820となり、極めて瞬発的なパワー発揮に対して弾性エネルギー(Eel)が関与していることを立証した。また、筋電図による検証では、ヒ腹筋の筋電図とフォースプラットフォームでの力波形との観察から、着地時には力波形のゆっくりした減衰現象がみられるが、筋電図にはこれと対応した筋活動はなかった。したがって、力の減衰振動の主要なメカニズムが弾性構造であることが示唆された。平成17年度は競技者を対象に、最大無酸素性瞬発パワー、最大弾性エネルギーからその特異性を明らかにする。

その結果、最大無酸素性瞬時エネルギーは男子陸上短距離では238.4±53.7J、男子長距離では181.4±29.7J、非鍛錬者では177.4±43.4J、男子バレーでは222.9±23.3J、女子バレーでは136.4±26.2J、一般女子では114.6±12.0Jであった。体重補正をした値も同様な傾向になり、男子短距離は他の群よりも有意に高かった。一方、最大弾性エネルギーは、男子陸上短距離では89.7±16.5J、男子長距離では56.4±15.1J、非鍛錬者では49.0±16.2J、男子バレーでは63.7±18.7J、女子バレーでは61.9±12.0J、一般女子では40.0±9.2Jであり、男子短距離は他の群よりも有意に高かった。走運動時の全機械的エネルギーのうち、弾性エネルギーが占める割合は、男子陸上短距離では27.6±3.7%、男子長距離では23.7±5.2%、非鍛錬者では21.3±3.4%、男子バレーでは22.0±5.2%、女子バレーでは31.4±5.3%、一般女子では25.6±2.5%であり、男子短距離、女子バレー、一般女性が比較的高い割合を示し、女性の場合には弾性エネルギーの貢献が高いことが示唆された。また、弾性エネルギーは短距離選手の走スピードとの間に有意な相関がみられ、短距離走パフォーマンスには弾性エネルギー改善の重要性が示唆された。
クラウンエーテル集合体の金属塩捕捉ならびに輸送挙動の基礎的研究

1.ビスクラウンエーテルの錯生成能ベンゾクラウンエーテル、アザクラウンエーテルを組合せたビスクラウンエーテルの錯生成挙動を比較した結果、明確な"ビスクラウン効果"を示すのはビス(ベンゾクラウンエーテル)のみであり、モノアザクラウンエーテルを含む場合は、その構造の効果が錯生成能を大きく支配し、"induced fit"ならびに"lariat"効果が重要となることが明らかになった。この結論は、チオシアナート塩錯体の^<13>CーNMRやX線構造解析からも確かめることができた。2.ベンゾクラウンエーテルを含む液晶化合物の合成と錯生成挙動ベンゾクラウンエーテルを含む7種の新しい液晶化合物の合成に成功し、液晶形成に必要な構造因子を明らかにした。また、ピクラート塩のドーピングによって、液晶状態においてもカチオンに選択的な錯生成が起ることを確かめた。これらの化合物のうち、蛍光を示すものを用い蛍光消光を利用する新たな方法によって、液晶中におけるカチオンの錯生成定数の決定に始めて成功した。3.クラウンエーテルを用いるカチオンの液膜輸送7種の対アニオンとなる化合物について比較し、抽出率および輸送能に及ぼす対アニオンの重要性とそれらの構造因子を明らかにした。瞬間マルチ測光システムを利用し、今まで全く行われていない有機相中のクラウンエーテル錯体の動的挙動を調べて以下の新しい事実を見出した。クラウンエーテルでは脂溶性基の導入による輸送速度の向上は少ないが、C_<18->鎖をもつモノアザクラウンエーテルは塩酸酸性の受液相を組合せると、有機相中におけるアニオン交換(フエノラートとCl^-)および会合体の生成を起こして、輸送速度が大きく増加することが明らかになった。この新しい効果についての詳細な検討を行った結果に基づいて、従来例のない、液膜輸送に対する新しい"double cycle"機構を提出することができた。1.液晶型クラウンエーテルおよび対アニオン化合物の合成。15および18環のベンゾクラウンエーテルに種々のP-置換ビフェニル基を結合したもの12種を合成して液晶形成能を比較し、パラ位にシアノ基をもつものが良好な性質を示すことが分った。一方、これらの比較的高い液晶形成域(170190°C)を下げるため結合鎖を変えるなど試みたが、充分な結果は得られなかったのでモノアザクラウンエーテルと結合したものの合成を行っている。対アニオン化合物として、2,6-位にアルキル基,ニトロ基,ハロゲン基,4-位に長鎖アルキル基をもつフエノール類を合成した。2.(1)イオン抽出能、輸送能の検討。上記で得た対アニオン化合物と組合せ、アルカリ金属イオンの塩化メチレン相への取込み能と輸送能との関係を比較した結果、2,6-位にあるかさ高い置換基ならびに4-位にある脂溶性のアルキル基が、カチオンの取込みおよび輸送能を著しく増加させること(t-Bu>i-Pr>Me,I>Br>Cl),これら置換フェノール類のpka値の効果は比較的小さいことが明らかになった。設備備品費で購入した分光計を用い、塩化メチレン相中の酸型とアニオン型の存在比、カチオンの取込み放出の速度を比較し、pka値はカチオンの選択性に影響するが、取込み放出の速度は主としてクラウンエーテルの種類によって支配されることを見出した。(2)液晶性クラウンエーテルの性質。液晶にピクリン酸塩を添加した系の電気的、光学的性状を検討した。

塩の添加により誘電率は著しく増加し、また15環をもつものでは液晶域の温度低下、吸収極大の変化が、【Na^+】と【K^+】および【^+N】【Me_4】との間で大きい差異を示すことが分った。結合鎖にエチニル基をもつP-シアノビフェニル-ベンゾクラウンエーテルが強い蛍光を示すこと,アルカリ金属塩の添加による蛍光波長,強度の変化がカチオンの種類により影響をうけることが明らかになった。1.クラウンエーテル錯体の構造結晶として得られたビス(モノアザ15クラウン5)K^+錯体のX線結晶構造解析に成功し,1分子内に含まれる2個のK^+が非対称な配位をしたサンドイッチ構造であることを始めて明らかにした.一方,Nーヘプチルモノアザ18クラウン6の結晶では,環面に垂直に側鎖が配置され,側鎖の3番目の原子が,環のひずみを生ぜずに環中心のカチオンに配位しうつ構造であることが明らかとなり,Nー原子を含むラリアートエーテルのもつ大きな錯生成能が,この種の分子本来の構造的特長によるものであることが分った.2.液晶クラウンエーテルの挙動昨年につづき種々のクラウンエーテルを合成して液晶生成能を調べた結果,ベンゾクラウンエーテルを含むものが液晶となり易いことが分った.アセチレン結合鎖をもつビフェンル系液晶クラウンエーテルの蛍光現象を利用し,溶液中,チオシアン酸塩との錯形成による電子移動にもとずく蛍光消光現象が,カチオンの錯生成能とよい相関を示すことを確めた.この結果を基とし,従来全く例のない液晶(固体)状態におけるクラウンエーテルーカチオン系の錯生成定数を求めた.その結果,液晶中においても,溶液中とほぼ同様な錯生成定数を与えることが分った.3.液膜輸送におけるクラウンエーテル錯体の挙動従来,クラウンエーテルを用いる液膜輸送では,カチオンを供給および補集する水相についてのみの研究に限られていた.輸送効率にもっとも影響の大きい有機液相中のクラウンエーテルカチオン錯体およびプロトン錯体について,2,6ー二置換フェノールと組合せ,カチオンの取込み,放出の速度ならびに輸送中の経時変化を調べた結果,放出側界面における拡散および錯体の分解の2つの律速過程が錯生成能のみならず,クラウンエーテルとカチオンの組合せにより種々変化することが明らかになった.1.液晶クラウンエーテルの合成と錯生成挙動、ベンゾクラウンエーテルを含む液晶性クラウンエーテルは液晶領域温度が高いので、より低い領域で液晶となるものとして、ジアザ-18ークラウンー8,および15ークラウンエーテルに、Pー長鎖置換のビフェニル基をつけたものを合成したが、柔軟なクラウン環をもつものは液晶性を示さないことが分った。一方、コレステリル基をベンゾクラウンエーテルに結合したものはコレステリック液晶性を示し、15環と18環をもつものを混合することによって室温付近まで液晶領域温度を低下させ得るという興味ある結果を得た。蛍光を利用する液晶中での錯生成能の検討について、チオシアナート塩の代りにピレンカルボン酸塩を用いて検討した。その結果、液晶中での錯生成能の評価には、クラウンエーテル環に近い距離で相互作用する蛍光剤を用いる必要があることが分った。2.液膜輸送におけるクラウンエーテル錯体の挙動、昨年につづき、新たに合成した7種の対アニオン化合物(2,6ージ置換ー4ーニトロフェノール)を、C_<18>ー鎖をもつ18ークラウンー6、C_7C_<18>
炭疽菌毒素を用いたワクチンデリバリーシステムの構築

炭疽菌の毒素は、本菌の主要な病原因子の一つであり、それぞれ独立した遺伝子に支配されている防御抗原(PA)、浮腫因子(EF)、致死因子(LF)から成る。EFもしくはLFは、PAと共存して初めて毒素として活性化されるという特徴を持つ。これらの毒素による宿主細胞への傷害作用過程は、分子量83KDのPAが先ず宿主細胞に結合し、次に宿主由来プロテアーゼにより20MD部分がPAから離れ、活性型のPA63になる。その後、EFもしくはLFは、細胞結合性のPA63を介して、即ち、EFもしくはLFとPA63との結合体が細胞内に取り込まれ、初めて毒性を発揮する。LFの場合、N-末から255アミノ酸残基(LF255)領域がPA63への結合部位で、それ以降の領域が致死活性を有している。即ち、LF255は毒性を持たず、LF255と外来の遺伝子産物との融合タンパクを作成すれば、PAの存在下で融合タンパクは真核細胞内に取り込まれる。この様な細菌毒素の細胞内侵入機構を利用して、抗原のデリバリーや癌細胞等をターゲットにしたイムノトキシンの開発が試みられている。このシステムはウィルスや細胞内寄生菌、原虫などに対する感染防御法として期待できる。本課題はこのデリバリーシステムを家畜感染症に応用しようとするものである。モデル系として人畜共通感染症の病原体であるサルモネラやトキソプラズマ等のT細胞エピトープを考えている。最終的には、牛やニワトリなどでの実用性を検討し、結果的にヒトを含めた多くの感染症の予防に結びつく成果をあげる基礎データを得るのが本研究の目的である。先ずベクター作りから初め、サルモネラの鞭毛遺伝子を用いて、サルモネラのワクチンへのアプローチを行った。その結果有意差を持って防御効果があることが明らかになった。炭疸菌の防御遺伝子及び致死因子(LF)の細胞内侵入機構を利用して、抗原のデリバリーシステムを構築し、家畜感染症に応用しようとするものである。モデル系として人畜共通感染症の病原体であるサルモネラやリステリア等のT細胞エピトープを考えている。1.蛋白精製技術の確立:LF255に直接外来遺伝子を挿入し、"6xHis-Tag"を用いて精製する系として融合蛋白を作製するためのベクターを確立した。しかし、発現量が弱く、牛などの大動物に使用するには大量の培養液が必要であった。しかし、精製蛋白を用いらたマウスでの実験を始めている。2.PAタンパクの精製:融合蛋白を混合するPAタンパクは炭疸から精製するのは極めて困難であるので、PAの組換えによる高発現系を確立し、当該蛋白を調整する方法をシステムを構築した3.マウスにおけるモデル実験:マウスー匹当り両蛋白とも10ピコモル程度の免疫で充分であるので、高発現系の確立と平行して、萌芽的研究で作出したサルモネラ表層抗原とLF255との融合蛋白のCTL活性を調べるとともに、PAおよび融合蛋白をマウスに接種し、感染防御試験を行い、本システムの有効性を確認する。

LFの場合、N-末から255アミノ酸残基(LF255)領域がPA63への結合部位で、それ以降の領域が致死活性を有している。即ち、LF255は毒性を持たず、LF255と外来の遺伝子産物との融合タンパクを作成すれば、PAの存在下で融合タンパクは真核細胞内に取り込まれる。この様な細菌毒素の細胞内侵入機構を利用して、抗原のデリバリーや癌細胞等をターゲットにしたイムノトキシンの開発が試みられている。このシステムはウィルスや細胞内寄生菌、原虫などに対する感染防御法として期待できる。本課題はこのデリバリーシステムを家畜感染症に応用しようとするものである。モデル系として人畜共通感染症の病原体であるサルモネラやトキソプラズマ等のT細胞エピトープを考えている。最終的には、牛やニワトリなどでの実用性を検討し、結果的にヒトを含めた多くの感染症の予防に結びつく成果をあげる基礎データを得るのが本研究の目的である。先ずベクター作りから初め、サルモネラの鞭毛遺伝子を用いて、サルモネラのワクチンへのアプローチを行った。その結果有意差を持って防御効果があることが明らかになった。
計算物理学ー物性研究における新展開ー・総括班

今年度発足した本重点領域研究は、39名の計画研究班員と26名の公募研究者が、各自の個別的な研究を進めるとともに、総括班企画研究会などを通して分野間の研究交流を積極的に展開し、すでに多くの成果が出ている.本研究計画(総括班)としての活動は領域全体の視点からの研究計画の点検・更新、領域全体研究会の開催(1月810日、東京)、および、領域ニュ-スレタ-の発行等の他に、以下の研究会開催等を行い、成果を得た。研究会「物性研究における計算物理(英名略称CPCMP)」を開催した(10月2123日、大阪)。領域研究の中から特に次の3つのテ-マー第一原理分子動力学法による物性計算、相関の強い量子系に対する量子モンテカルロ法や数値的対角化法を用いた研究、およびスピングラスなどのランダム系の統計力学に関する数値解析ーに焦点を当て、本領域研究で招へいしたS.White氏(米国)の他に、第6回西宮湯川記念シンポジウムで来日した9名の国外研究者の参加も得て活発な研究発表と討論が展開され、大きな成果を納めた。尚、本研究会と西宮シンポジウムの2つの会議の成果は1巻の会議録として今夏Springer社(ドイツ)より刊行される予定である。研究会「イジング・マシ-ンによる物性研究」を開催した(12月911日、東京)。イジング・マシ-ンはイジング系のシミュレ-ションを行うための個人レベルの専用機で、これを有効に活用するための計算手法や関連する物性物理、統計物理の問題が議論された。ハ-ドウェア面の今後の動向としてベクトル演算から並列演算への移行が注目されている。本領域研究でも並列処理が可能なミニス-パ-コンピュ-タを導入し(慶応大)、また、小型並列計算機の試作を領域内の重点プロジェクトとして総括班が支援した。