hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アデノウイルス発現ベクターを用いたp16遺伝子導入による食道癌、膵癌治療の試み

p16^<INK4a>発現アデノウイルスベクターの作製先ず、東京大学医科研、斎藤泉先生より御供与いただいたアデノウイルス発現ベクターによりp16^<INK4a>発現ベクターを作製した。詳細は以下の如くである。すなわち、開始コドン前約10塩基、終止コドン後約30塩基をつける形で組み込むべきp16^<INK4a> cDNA(0.8kb)をPCR cloningにより、cloningした。これをコスミッドカセットDNAのSwa-1 siteにIn vitro pachage法により組み込み、さらに、これをEco T22Iにて切断された親アデノウイルスと293細胞にco-transfectし、組換えウイルスを分離しp16^<INK4a>発現アデノウイルスベクターを作製した。p16^<INK4a>発現による膵癌細胞増殖抑制効果遺伝子導入によりp16^<INK4a>発現が確認された膵癌培養細胞株; MIAPaca-2とコントロールとしてのアデノウイルス添加されたMIAPaca-2の細胞増殖曲線を比較したがp16^<INK4a>発現によりMIAPaca-2の細胞増殖は有意に抑制された。すなわち、開始コドン前約10塩基、終止コドン後約30塩基をつける形で組み込むべきp16^<INK4a>cDNA(0.8kb)をPCR cloningにより、cloningした。これをコスミッドカセットDNAのSwa-1 siteにIn vitro pachage法により組み込み、されに、これをEco T221にて切断された親アデノウイルスとと293細胞にco-transfectし、組換えウイルスを分離しp16^<INK4a>発現アデノウイルスベクターを作製した。p16^<INK4a>発現による膵癌細胞増殖抑制効果遺伝子導入によりp16^<INK4a>発現が確認された膵癌培養細胞株;MIAPaca-2とコントロールとしてのアデノウイルス添加されたMIAPaca-2の細胞増殖曲線を比較したがp16^<INK4a>発現によりMIAPaca-2の細胞増殖は有意に抑制された。p16^<INK4a>発現アデノウイルスベクターの作製と発現の確認(In vitro)昨年は開始コドン前約10塩基、終止コドン後約30塩基をつける形で組み込むべきp16^<INK4>cDNA(0.8kb)をPCRによりcloningし、これをコスミッドカセットDNAのSwa-1siteにIn vitro pachagc法により組み込み、さらに、これをEco T22Iにて切断された親アデノウィルスと293細胞にco-transfectし、組換えウィルスを分離しp16^<INK4a>発現アデノウイルスベクターを作製した。またp16^<INK4a>遺伝子のhomozygous deletionが確認された膵癌培養細胞(MIAPaca-2)において、上記の発現ベクターによる遺伝子導入によりp16^<INK4a> mRNAの高度の発現がNorthern Blot Hybridizationにより確認できたことを報告した。本年度はさらにWestern Blot Hybridizationを行ったが、実際に上記の遺伝子導入によりMIAPaca-2においてp16^<INK4a>遺伝子のタンパクレベルの発現が見られることを確認し、さらにその細胞においてアポトーシスが誘導されることも確認した。p16^<INK4a>発現による膵癌、食道癌細胞増殖抑制効果昨年は遺伝子導入によりp16^<INK4a>発現が確認された膵癌培養細胞(MIAPaca-2)はコントロール(MIAPaca-2)細胞に比較し、その細胞増殖は有意に抑制されることを確認したが、本年度さらに食道癌細胞(TT,TTn)において細胞増殖抑制効果を検討した。しかし膵癌細胞と異なり、有意な細胞増殖抑制効果は見られなかった。現在その要因につき検討中である。p16^<INK4a

>発現アデノウイルスベクターの膵癌細胞における発現と細胞増殖抑制効果p16^<INK4a>cDNA(0.8kb)をPCR cloning法によりcloningし、これをコスミッドカセットDNAのSwa-1 siteにIn vitro package法により組み込み、さらに、これをEco T221にて切断された親アデノウイルスと293細胞にco-transfectし、組換えウイルスを分離しp16^<INK4a>発現アデノウイルスベクターを作製した。P16^<INK4a>のhomozygous deletionが確認された膵癌培養細胞株;MIAPaca-2に対し、このP16^<INK4a>発現アデノウイルスベクターによりp16^<INK4a>遺伝子導入を行った。実際にp16^<INK4a>遺伝子導入されたMIAPaca-2にp16^<INK4a>遺伝子のRNAレベル、タンパクレベルの高度の発現が見られることを確認した。P16^<INK4a>発現が確認された膵癌培養細胞株;MIAPaca-2とコントロールとしてのアデノウイルス添加されたMIAPaca-2の細胞増殖曲線を比較したがp16^<INK4a>発現によりMIAPaca-2の細胞増殖は有意に抑制された。p16^<INK4a>発現アデノウイルスベクターによる食道癌細胞増殖抑制効果食道癌細胞(TT,TTn)において、同様の検討を行ったが食道癌細胞においてはp16^<INK4a>発現アデノウイルスベクターによる増殖抑制効果は確認できなかった。
マイクロプラズマのマイクロマシン、バイオマイクシステムへの応用

20世紀のCMOS技術ベースの集積化システムに続き,21世紀に入ってもMEMSが自動車,デジタル家電などの産業分野で本格的な実用化を迎え,さらに,医療やバイオテクノロジーの分野においてもマイクロTASやLab-on-a-chipが有力な新産業技術として急速に成長しており,ナノ・マイクロテクノロジーはハイテク産業の軸となる不可欠な技術である.本研究では,微小化によるプラズマ技術の新たな展開を目指す「マイクロプラズマ技術」を,これらの高付加価値・高機能マイクロシステム技術分野に展開し,その応用技術としての有用性を確立することを目的とし,(1)大気圧マイクロプラズマを用いた携帯型極微量元素検出システムや(2)マイクロマシン加工技術を開発・研究した.(1)に関しては,携帯可能なチップ型プラズマ源を開発し,その高性能化ならびに当該プラズマ源の水溶液分析への適用の可能性を研究した.(2)に関しては大気圧マイクロプラズマジェットを用いたシリコン高速エッチングにより革新的な局所高速プロセスの可能性を明示し,チップ方式の大気圧マイクロプラズマジェット源を搭載した走査型マイクロプラズマジェットプロセス装置を開発した.さらに,走査型プラズマジェットエッチャーを用いてSiウエファ上に最小線幅0.3mmの局所加工を達成し,続いて生体適合性ポリマー(ポリジメチルシロキサン),酸化ケイ素膜の高速パターン加工を研究した.また,走査型ラジカルジェット装置を開発してポリマー表面の親水化処理を研究し,細胞のパターン化培養技術に応用した.さらに,時間領域差分法(Finite Difference Time Domain法)により,マイクロプラズマの内部パラメータのシミュレーションを行い,マイクロプラズマジェット技術をより深く理解するための知見を得た.20世紀のCMOS技術ベースの集積化システムに続き,21世紀に入ってもMEMSが自動車,デジタル家電などの産業分野で本格的な実用化を迎え,さらに,医療やバイオテクノロジーの分野においてもマイクロTASやLab-on-a-chipが有力な新産業技術として急速に成長しており,ナノ・マイクロテクノロジーはハイテク産業の軸となる不可欠な技術である.本研究では,微小化によるプラズマ技術の新たな展開を目指す「マイクロプラズマ技術」を,これらの高付加価値・高機能マイクロシステム技術分野に展開し,その応用技術としての有用性を確立することを目的とし,(1)大気圧マイクロプラズマを用いた携帯型極微量元素検出システムや(2)マイクロマシン加工技術を開発・研究した.(1)に関しては,携帯可能なチップ型プラズマ源を開発し,その高性能化ならびに当該プラズマ源の水溶液分析への適用の可能性を研究した.(2)に関しては大気圧マイクロプラズマジェットを用いたシリコン高速エッチングにより革新的な局所高速プロセスの可能性を明示し,チップ方式の大気圧マイクロプラズマジェット源を搭載した走査型マイクロプラズマジェットプロセス装置を開発した.さらに,走査型プラズマジェットエッチャーを用いてSiウエファ上に最小線幅0.3mmの局所加工を達成し,続いて生体適合性ポリマー(ポリジメチルシロキサン),酸化ケイ素膜の高速パターン加工を研究した.また,走査型ラジカルジェット装置を開発してポリマー表面の親水化処理を研究し,細胞のパターン化培養技術に応用した.さらに,時間領域差分法(Finite Difference Time Domain法)により,マイクロプラズマの内部パラメータのシミュレーションを行い,マイクロプラズマジェット技術をより深く理解するための知見を得た.微細加工技術を利用して化学・生化学分析装置の構成要素を小型化するμTAS(マイクロ化学分析システム:Micro Total Analysis System)あるいはLab-on-a-chid、バイオマイクロシステムと呼ばれる新技術の研究・開発が、欧米を中心に急速に進展している。この技術はゲノミクス、プロテオミクス、創薬、医療、環境などの広い分野を支える基盤技術である分析に要するコストや時間を数桁に及ぶ革新的レベルで改善できると期待されている。μTASは基板上に微細流路を形成しただけの電気泳動チップから進歩してきたが、より高い機能性を実現するためには半導体製造技術として高度に発展してきたマイクロ・ナノテクノロジーを積極的に導入し、サンプル処理系や検出系など様々な要素技術のシステム化することや、更には単なる従来技術の応用・統合に留まらず、μTASのための新原理デバイスやデバイス作製プロセスに独自の新技術を開拓していくことが必須である。我々は新しいプラズマ科学として注目されているマイクロプラズマをμTAS分野に応用することを着想し、独創性の高いマイクロプラズマ分析システム、マイクロマシン加工技術の開発準備を進めてきた。本研究ではこのような背景のもと、(1)マイクロプラズマ源を搭載した携帯型極微量元素検出システムの開発、(2)大気圧マイクロプラズマジェットを利用した数値制御3次元マイクロマシン加工システムの開発を目指す。本年度は、(1)に関してチップ型プラズマ源の高密度化ならびに当該プラズマ源の水溶液分析への適用の可能性を研究し、(2)に関してはマイクロプラズマジェットを用いたシリコン高速エッチングの基礎特性の評価ならびに2次元走査型マイクロプラズマジェットエッチング装置の試作を行った。次年度以降は、携帯分析システム実現を目指した周辺要素技術の検討ならびに3次元微細加工プロセスの検討を中心に研究を進める予定である。20世紀を変革したマイクロエレクトロニクスに引き続き、ナノ・マイクロテクノロジーは21世紀のハイテク産業の成長においても、欠かすことのできない存在となっている。MEMS(Microelectromechanical System)が自動車、デジタル家電などの産業分野で本格的な実用化を迎え、さらに、医療やバイオテクノロジーの分野においてもμTASやLab-on-a-chipなどのバイオマイクロシステムが新産業技術の有力候補として急速に成長している。

微小化によるプラズマ技術の新たな展開を目指す「マイクロプラズマ技術」が、これらの高付加価値・高機能マイクロシステム技術においてアプリケーションを生み出し、産業技術としての有用性を認知されることは、マイクロプラズマ研究の今後の発展に繋がる有望なシナリオである。昨年度、我々はチップ方式の大気圧マイクロプラズマジェット源を開発し、当該プラズマ源を搭載した走査型マイクロプラズマジェットプロセス装置を開発した。また、開発した走査型大気圧プラズマジェットエッチャーを用いてSi上ウエファ上に最小線幅0.3mmの局所加工を達成したが、更なる微細化の検討が今後の課題として残った。より局所的な加工、表面処理プロセスを実現するためにはプラズマの微小化だけではなく、プラズマとその周囲の雰囲気ならびに基材への中性粒子や熱の移動現象を理解した上で反応空間を微小化する工夫をする必要がある。そこで、本年度は、以上を踏まえて、マイクロプラズマ源を用いた走査型ラジカルジェット装置を用いたポリマー表面の親水化パターン処理と、走査型マイクロプラズマジェットエッチングへのシースガスの付与によるプラズマ境界での熱・物質移動の制御とその微細パターンエッチングへの効果を研究した。本年度は、(1)3次元走査型マイクロプラズマジェットエッチャーを用いたSiマイクロマシニングプロセスと(2)マイクロプラズマ源を用いた走査型ラジカルジェット装置を用いた生体適合性ポリマーの表面処理と細胞パターニングへの応用を研究した。(1)では、まず、3次元走査型マイクロプラズマジェットを用いたSiウエファ上のホールならびにラインパターンエッチングについて研究した。3次元走査型マイクロプラズマジェットを用いたプロセス装置の基本的な特性を初めて調べ、実際に3次元マイクロ加工が行われた。本研究で用いた装置では小型のプラズマ源がx、y、z軸方向に独立に移動し、同一ウエファ上に異なる深さのエッチングを行ったり、平面でない物体の表面上に加工したりできる利点がある。ラインパターンエッチングについて主に検討し、「L(プラズマ源-基板間距離)制御」と「L&t(エッチング時間)制御」の2つのアプローチによって所望のエッチング深さが達成できることが示された。いずれのアプローチにも有利、不利があるため必要な加工寸法に応じて適当な制御方式を選ぶ必要があることが示唆された。(2)では、走査型ラジカルマイクロジェット源を用いたPDMS上の親水化パターニングについて研究し、細胞接着性の向上を達成した。親水化パターン処理において走査速度や酸素流量などの実験パラメータの効果について総合的に調べられた。これらの動作パラメータの制御により、PDMSの表面特性を本来の疎水性から水滴接触角で約70度の親水性まで連続的に改質することが可能であった。
遅発性ジスキネジアの発症要因としての脳内鉄イオンの挙動に関する研究

本研究において、我々は遅発性ジスキネジアの「活性酸素仮説」の検証を進めた。同時に、この分野の研究に必要な幾つかの研究技術を新たに開発した。得られた結果は次のようである。1.活性酸素は強い神経毒性をもつが、わけてもヒドロキシ・ラジカルにおいてその作用が強い。ヒドロキシ・ラジカルは過酸化水素より生ずるが、この反応は鉄イオンの触媒下に進行する。そこで、我々はまず、抗精神病薬慢性投与後の脳内の2価と3価の鉄イオンの挙動について検討した。脳内の2価と3価の鉄イオンには、当初の予想に反して、明らかな変化がなかった。しかし、本研究遂行のために開発した電子スピン共鳴法を用いた鉄イオンの計測法はこの方面の研究に有用な手段となるものである。2.抗精神病薬投与後の脳内の過酸化水素濃度と脂質過酸化反応の程度について検討した。過酸化水素は電極法を用いて計測し、脂質過酸化反応は脂質酸ラジカルを指標に検討した。過酸化水素生成の亢進と、細胞膜の脂質過酸化反応の進行が観察された。3.ビタミンE、ビタミンC、イデベノン(アバン)の抗酸化作用を生体計測用電子スピン共鳴法を用いて検討し、いずれにも強い抗酸化作用を認めた。この結果は、遅発性ジスキネジアに対する治療薬としての可能性をさぐるための基礎データとして重要である。4.ス-パオキサイド・アニオンの計測法を確立した。今後、この方法を応用して、遅発性ジスキネジアの「活性酸素仮説」の詳細を追求できるはずである。本研究でえられた成果と、新たに開発された研究技術は遅発性ジスキネジアの「活性酸素仮説」の理解とそれに基づく治療法の開発に新しい指針を与えるものと考える。過酸化水素と鉄イオンが接触すると、ヒドロキシ・ラジカルが発生する。(Fenton反応)。このヒドロキシ・ラジカルはもっとも強い神経毒性をもつ活性酸素で、神経細胞の機能と形態に重大な傷害をもたらす。このようなメカニズムが遅発性ジスキネジアの発症に関与している可能性がある(遅発性ジスキネジアの活性酸素仮説)。本研究はこの仮説を検証するため、ハロペリドールをラットに慢性投与し、線条体と前頭皮質の過酸化水素と鉄イオンの挙動を検討し、脂質過酸化反応産物の変化を調べた。その結果は次のようであった。(1)ハロペリドールを2週間与えた後に2価と3価の鉄イオンと過酸化反応産物の変化について検討した。鉄イオンは電子スピン共鳴法で、過酸化反応産物はチオバルビタール酸法で測定した。2価と3価の鉄イオン濃度は、線条体と前頭皮質のいずれでも明かな変化はなかった。過酸化反応産物にも、いずれの部位でも明かな変化はなかった。(2)一方、ハロペリドールを2か月間与えた後に過酸化反応産物の変化を測定したところ、前頭皮質で有意な上昇が観察された。しかし、線条体では明らかな変化は認められなかった。(3)過酸化水素に選択的に応答する電極を作製し、線条体に挿入し、ハロペリドールを投与した時の過酸化水素濃度の推移を調べた。過酸化水素濃度はハロペリドールの投与用量に依存して有意に上昇した。以上のことから、ハロペリドールは脳の膜脂質の過酸化反応を惹起すること、そして、それには過酸化水素の過剰生成が関与していることが示唆された。遅発性ジスキネジアの「活性酸素仮説」の検証を進めた。平成7年度に得られた成績は次のようである。1.活性酸素は強い神経毒素をもつが、わけてもヒドロキシ・ラジガルにおいてその作用が強い。

しかし、ヒドロキシ・ラジカルを直接計測する方法は確立されていない。そこで、その基質である過酸化水素の脳内挙動を電極法を用いて調べた。また、電子スピン共鳴法を用いた、高感度な脂肪酸ラジカルの検出法を開発し、抗精神病薬投与後の脂質過酸化反応の有無を調べた。その結果、抗精神病薬により過酸化水素の生成が亢進するが、この現象は抗精神病薬の急性投与時に強く、慢性投与後には、むしろ弱くなることが明らかとなった。しかし、細胞膜の脂質過酸化反応は慢性投与によって亢進していた。2.さらに我々はビタミンE、ビタミンC、イデベノン(アバン)を長期投与した時の抗酸化作用を生体計測用電子スピン共鳴法を用いて検討し、いずれにも強い抗酸化作用が認めた。ここで得られた成果は、遅発性ジスキネジアに対する治療薬としての可能性をさぐるための基礎データとして重要である。3.本研究において、遅発性ジスキネジア発症にはヒドロキシ・ラジカルの関与が重要であることが示された。このヒドロキシ・ラジカルの前駆物質としてス-パオキサイド・アニオンがあるが、この物質の計測法は確立されていない。しかし、我々は本研究において、ス-パオキサイド・アニオンを計測する電極の開発に成功した。今後、この方法を応用して、遅発性ジスキネジアの「活性酸素仮説」の詳細を追求できるはずである。本研究でえられた成果と、新たに開発された研究技術は遅発性ジスキネジアの「活性酸素仮説」の理解とそれに基づく治療法の開発に新しい指針を与えるものと考える。
地下圏に生きるCandidate Phyla Radiationの生存戦略に迫る

環境ゲノミクスの発展により、培養例のない系統群Candidate Phyla Radiation(CPR)がバクテリアの多様性の15%以上を占めることが明らかとなった。ゲノムから見えるCPR細菌の特徴は、アミノ酸、核酸、脂質の生合成経路の多くを欠き、リボソームRNA遺伝子内にイントロンをコードし、呼吸代謝系を持たないというもので、その生き様は全くの謎である。我々はCPR細菌の1つであるOD1細菌が強アルカリ・超還元的な蛇紋岩湧水中で優占することを突き止めた。OD1細菌が優占する環境は他に例がないため、蛇紋岩湧水はCPR細菌の生存戦略の解明には最適であると考えられた。よって、本研究では、CPRに属する微生物に関する知見を蓄積することで、その理解の拡大を目指す。今年度は、陸性、海性の蛇紋岩化反応サイトを対象とした7つの異なるメタゲノムデータを解析し、それぞれのサイトから、ゲノムビニング(ゲノムの再構築)を行った。その結果、すべての蛇紋岩化反応サイトには、OD1門の中でもNealsonbacteriaというグループに属する微生物群が多く存在することが明らかとなった。このことは、OD1門は、多くの遺伝子を欠損しており、実際、アルカリ環境適応が可能な遺伝子群等も見いだされなかったが、特定の環境への適応が可能であることが示された。一方、今回取得したメタトランスクリプトミクスデータによると、OD1門の微生物は、環境条件が変化しても遺伝子発現にほとんど変化は見られないことが分かった。今年度は、上述の通り、陸性、海性の蛇紋岩化反応サイトを対象とした7つの異なるメタゲノムデータを解析し、それぞれのサイトから、ゲノムビニング(ゲノムの再構築)を行っい、OD1門の中でもNealsonbacteriaというグループに属する微生物群が、どのサイトにおいても多く存在することを突き止めた。一方で、これらの微生物の遺伝子発現の制御システムはゲノムがコードする遺伝子群の中にも見当たらず、さらには、環境変動による転写発現の変化は見られないことが明らかとなった。このことは、ゲノムがコードする遺伝子の転写を制御することで、環境適応をしているのではなく、コードする遺伝子の組み合わせを持ってして、環境適応する可能性を示すものである。このことは、全く新しい進化戦略を利用していることを示唆するものである。よって、今後、これらの仮説を証明する方向へ研究を進めていくこととする。本研究開始以前は、OD1門の微生物に関する情報が非常に限られており、適切な仮説を立てることが困難であった。しかし、上述の通り、オミックスの手法を用いることで、いくつかの新しい知見が得られた。これらは、CPRの生きざまの一端を示すものであり、その生存戦略と大きくかかわるものと推定される。よって、オミックスの解析をさらに進めるととともに、多様なOD1門に属する微生物ゲノム情報の収集を進める。
ヘムオキシゲナーゼ1による生体保護作用:バイオマーカーとしての呼気一酸化炭素

集中治療室に敗血症にて入室患者の、血中一酸化炭素(CO)濃度(ガスクロマトグラフィー)、単球中ヘヘムオキシゲナーゼI蛋白量(フローサイトメトリー)、血液中酸化ストレス度(分光高度計)、炎症性サイトカイン(ELISA)等を測定することにより、侵襲による酸化ストレス、ヘムオキシゲナーゼI発現、CO濃度の相関を検討した。その結果、ヘムオキシゲナーゼI蛋白発現と血中CO濃度間に正の相関が認められた。COはNOとともにグアニールサイクラーゼ活性化による血管拡張作用を有するが、それ以外に抗炎症作用も有する。内因性COの起源は、その代謝経路からヘムオキシゲナーゼ系由来と推察されていたが確証はなかった。今回の結果は、内因性のCOとヘムオキシゲナーゼ経路との関連性を強く推察するものである。次にヘムオキシゲナーゼ1を調節する要因として酸化ストレスをはじめとした生体侵襲が重要視されている。今回、APACHE IIによる重症度スコアー、酸化ストレス度、およびヘムオキシゲナーゼI発現間に正の相関が認められた。この結果は、強い侵襲が生体に加わり酸化ストレス度が増加した状態下で、抗炎症作用を有するヘムオキシゲナーゼ1蛋白質が増加している可能性を強く示唆する。ヘムオキシゲナーゼIの上昇しない敗血症患者は予後が悪いことも今回の検討から明らかになっており、ヘムオキシゲナーゼI-CO系は生体防御系として重要な役割を果たしている可能性が示唆された。本年度は末梢血単球中のヘムオキシゲナーゼI(HO-1)活性測定法の検討から実験を進めた。測定にはwestern blottingが通常選択されるがその測定の煩雑さを考え、私はFACSによる方法を選択した。Vayssier-Taussat Mらの方法に従い、細胞膜透過処置後抗HO-1抗体にて染色しFACSにて測定した。すなわちヘパリン加採血にて採取した全血より、遠心濃度勾配法にて単核球分画を分離する。分離した単核球分画は抗CD3抗体および抗CD14抗体にて表面抗原を染色したのち1%ホルマリンにて固定する。ついで0.2%サポニン加PBSにて細胞膜透過処置を行う。PBSにて2回洗浄後、FITC標識抗HO-1抗体を添加し20分間incubateする。1回洗浄後にフローサイトメーターにて単球領域およびリンパ球領域のFITC蛍光度を測定する。リンパ球はHO-1を含まないためリンパ球から得られた蛍光度を対照として単球から得られた蛍光度をHO-1タンパク量とした。現在20例ほどのICU入院患者で測定を終えている。また同一患者全血中に含有する一酸化炭素濃度はガスクロマトグラフィーで測定を行っている段階である。さらに酸化ストレスの指標として血液中ヒドロペルオキシドによるジエチルパラフェニレンジアミンの呈色反応を、また血液中の抗酸化能は次亜塩素酸の酸化に対する血液サンプルの消去能を分光光度計で測定予定にしている。現在のところ重症度、敗血症の有無、と血液中一酸化炭素濃度、HO-1活性との間に有意な相関は認められていない。今後症例を重ねてより詳細な検討を行う予定にしている。集中治療室入室患者の、血中一酸化炭素(CO)濃度(ガスクロマトグラフィー)、単球中ヘムオキシゲナーゼI活性(フローサイトメトリー)、血液中酸化ストレス度(分光光度計)、炎症性サイトカイン(ELISA)等を測定することにより、侵襲による酸化ストレス、ヘムオキシゲナーゼI活性、CO濃度の相関を検討している。現在のところ、ヘムオキシゲナーゼI活性と血中CO濃度間に正の相関が認められている。次にヘムオキシゲナーゼ1活性を調節する要因として酸化ストレスをはじめとした生体侵襲が重要視されている。今回、APACHE IIによる重症度スコアー、酸化ストレス度、およびヘムオキシゲナーゼI活性間に正の相関が認められた。ヘムオキシゲナーゼI活性の上昇しない敗血症患者は予後が悪いことも今回の検討から明らかになっており、ヘムオキシゲナーゼI-CO系は生体防御系として働いている可能性が示唆された。

今回、APACHE IIによる重症度スコアー、酸化ストレス度、およびヘムオキシゲナーゼI発現間に正の相関が認められた。この結果は、強い侵襲が生体に加わり酸化ストレス度が増加した状態下で、抗炎症作用を有するヘムオキシゲナーゼ1蛋白質が増加している可能性を強く示唆する。ヘムオキシゲナーゼIの上昇しない敗血症患者は予後が悪いことも今回の検討から明らかになっており、ヘムオキシゲナーゼI-CO系は生体防御系として重要な役割を果たしている可能性が示唆された。
都市部における母親の社会的孤立予防・孤独感軽減プログラムの開発

少子高齢化、核家族化、都市化、地域の希薄化などの社会背景により、都市部在住の乳幼児を育てる母親は特に社会的孤立する傾向にあり孤独感を抱きやすいことが指摘されている。孤独感は、乳幼児を育てる母親の誰しもが経験する可能性のある心の状態である一方、その程度が高じると、産後うつや育児不安などの母親の精神的健康の悪化、ひいては児童虐待につながる可能性もある。そのため、母親自身および子どもの健康や地域社会全体に影響を及ぼす重要な課題である。しかし、母親の社会的孤立や孤独感を予防し軽減する方策の開発と評価に関する実証研究は見当たらず、社会的孤立予防ならびに孤独感の軽減に向けた方策が必要である。本研究の目的は、乳幼児の母親に対する孤独感軽減プログラムを開発することである。平成30年度は、前年度に続き、1)乳幼児の母親に対する孤独感軽減プログラム案の作成、2)母親における孤独感の実態と育児経験および母親の特性の解明、3)評価指標の検討を実施した。1)2)については、国内外の文献レビューを行い、最新の知見を吟味の上、Precede-Proceed modelを用いてプログラムのフレームワークおよびコンセプトを検討した。2都市において、インタビュー調査(母親8名、支援に携わる保健師・助産師・子育て支援施設職員・子育て支援者・民生児童委員17名)を行い、乳幼児の母親における孤独感、育児の実態を明らかにし、孤独感軽減プログラム案の洗練に活用した。3)については、評価指標として、UCLA孤独感尺度第3版および短縮版2種の乳幼児の母親における妥当性・信頼性を明らかにした。今年度の成果の意義は、乳幼児の母親に対する孤独感軽減プログラム案のフレームワークとコンセプトが明らかとなった点である。今後の課題は、疫学調査による実態および実践的有用性を加味したプログラム案の洗練と評価計画である。当初の計画で挙げていた、1)都市部の地域特性に応じた乳幼児の母親に対する孤独感軽減プログラム案の作成(国内外の文献レビュー)、2)母親における孤独感の実態と育児経験および母親の特性の解明(インタビュー調査)、3)文献レビューおよび調査結果の統合によるプログラムフレームワーク案の開発、4)評価指標の信頼性・妥当性の検討をおおむね予定通り進められた。平成31年度は、乳幼児の母親における孤独感軽減プログラム案の洗練、および、プログラム案の試行と評価を行い、プログラム案の開発を目指す。その方策として、国内外の文献レビューの追加・内容整理、母親の特性および地域特性に関するアンケート調査を実施し、プログラム案および評価指標案に反映する。プログラム案および評価指標案については、研究協力地域ならびに先駆的活動地域における保健師等専門家グループおよび主任児童委員・ボランティア等の地域住民のグループ、本領域に精通した研究者・実践者を選定し、専門的知識の提供を受ける。しかし、母親の社会的孤立や孤独感を予防し軽減する方策の開発と評価に関する実証研究は見当たらず、社会的孤立予防ならびに孤独感の軽減に向けた方策の明確化が必要である。本研究の目的は、都市部における母親に対する地域特性に応じた社会的孤立予防・孤独感軽減プログラムを開発することである。平成29年度は、第1段階として、1)都市部の地域特性に応じた社会的孤立予防支援プログラム案の作成、2)社会的孤立・孤独感に影響を及ぼす都市部の地域特性および母親の特性の解明を実施した。1)については、国内外の文献レビューを行い、主要キーワードを含む国内外の文献を収集し、最新の知見を吟味の上、プログラムのフレームワーク案を検討した。2)については、都市部2都市において、地域看護診断(既存資料分析)による地域特性の把握、インタビュー調査(母親31名、支援に携わる保健師・子育て支援者4名)を行い、乳幼児の母親における社会的孤立・孤独感、育児の実態、それらを取り巻く地域環境(人的・物理的、社会資源などを含む)などを明らかにした。今年度の成果の意義は、社会的孤立・孤独感に影響を及ぼす都市部の地域特性および母親・子ども・家族の特性が明らかとなった点である。今後の課題は、文献レビューによる根拠の明確化、特性に加えて実践的有用性を加味したプログラム案の洗練である。当初の計画で挙げていた、1)都市部の地域特性に応じた社会的孤立予防支援プログラム案の作成に向けた国内外の文献レビュー、2)社会的孤立・孤独感に影響を及ぼす都市部の地域特性および母親の特性の解明をおおむね予定通り進められた。ただし、プログラム案作成に向けた文献レビューならびにエキスパートインタビューは、研究遂行する中で、国内外文献の系統的レビューを追加した後に実施するほうが望ましいと考え、30年度に評価指標案とともに実施することとした。

そのため、母親自身および子どもの健康や地域社会全体に影響を及ぼす重要な課題である。しかし、母親の社会的孤立や孤独感を予防し軽減する方策の開発と評価に関する実証研究は見当たらず、社会的孤立予防ならびに孤独感の軽減に向けた方策が必要である。本研究の目的は、乳幼児の母親に対する孤独感軽減プログラムを開発することである。平成30年度は、前年度に続き、1)乳幼児の母親に対する孤独感軽減プログラム案の作成、2)母親における孤独感の実態と育児経験および母親の特性の解明、3)評価指標の検討を実施した。1)2)については、国内外の文献レビューを行い、最新の知見を吟味の上、Precede-Proceed modelを用いてプログラムのフレームワークおよびコンセプトを検討した。2都市において、インタビュー調査(母親8名、支援に携わる保健師・助産師・子育て支援施設職員・子育て支援者・民生児童委員17名)を行い、乳幼児の母親における孤独感、育児の実態を明らかにし、孤独感軽減プログラム案の洗練に活用した。3)については、評価指標として、UCLA孤独感尺度第3版および短縮版2種の乳幼児の母親における妥当性・信頼性を明らかにした。今年度の成果の意義は、乳幼児の母親に対する孤独感軽減プログラム案のフレームワークとコンセプトが明らかとなった点である。今後の課題は、疫学調査による実態および実践的有用性を加味したプログラム案の洗練と評価計画である。当初の計画で挙げていた、1)都市部の地域特性に応じた乳幼児の母親に対する孤独感軽減プログラム案の作成(国内外の文献レビュー)、2)母親における孤独感の実態と育児経験および母親の特性の解明(インタビュー調査)、3)文献レビューおよび調査結果の統合によるプログラムフレームワーク案の開発、4)評価指標の信頼性・妥当性の検討をおおむね予定通り進められた。平成30年度は、都市部の地域特性に応じた社会的孤立予防・孤独感軽減プログラム案の洗練、および、評価指標案の検討を行い、プログラム案の開発を目指す。その方策として、国内外の文献レビュー、文献レビューからの内容整理、地域特性および母親の特性に関する調査結果をふまえ、エキスパートによるインタビューを実施し、プログラム案および評価指標案に反映する。選定するエキスパートは、プログラム案については、研究協力地域ならびに先駆的活動地域における保健師等専門家および主任児童委員・ボランティア等の地域住民、評価指標案については、本領域に精通した研究者・実践者などを想定し、専門的知識の提供を受ける。平成31年度は、乳幼児の母親における孤独感軽減プログラム案の洗練、および、プログラム案の試行と評価を行い、プログラム案の開発を目指す。その方策として、国内外の文献レビューの追加・内容整理、母親の特性および地域特性に関するアンケート調査を実施し、プログラム案および評価指標案に反映する。プログラム案および評価指標案については、研究協力地域ならびに先駆的活動地域における保健師等専門家グループおよび主任児童委員・ボランティア等の地域住民のグループ、本領域に精通した研究者・実践者を選定し、専門的知識の提供を受ける。
亜熱帯・温帯未利用荒地における高バイオマス生産植物の探索

(1)テオシント:一年生テオシントはトウモロコシ畑の雜草で、飼料作物として広く世界で栽培されているが、本種は短日植物のため、我が国では稔実種子が得られない。本種は荒地でよく繁茂し、茎葉生産量が大であるので、飼料として、またエネルギー源として有用性をもつ。本年度は京都と横浜で栽培した。10月末までの結実種子の稔性は横浜でも80.3%を示した。すなわち京都から横浜と、漸進的な高緯度地域における栽培および採種時期による選抜のくり返しで、我国で採種可能な高稔性系統の育成に成功した。また本系統は京都において栽培畑の跡地に翌年自生し、結実をみ、自生化の可能性を示した。多年生テオシントは2Xと4Xの野生種がある。2Xと4Xの越冬性に関する試験結果は、4Xがやや強く、僅かに越冬する。横浜で株を覆土することで、十分に越冬可能である。なお1984年5月に株当り5本の分けつ数をもつ株を栽植し、覆土による越冬条件で、1985年11月に調査した分けつ数は、2X:47本、4X:155本を示した。以上の結果から4Xは今後多年生として暖地において、荒地利用によるエネルギー源植物として利用可能と結論された。(田中正武)。(2)メキシコにおいて耐暑、耐湿、耐寒性を示し、旺盛な発育を示すメキシコヤナギの挿木苗により、東京では畑地、沖縄では新開地で発育調査を実施し、挿木2年および3年後の苗の発育は、本邦産の同条件のリュウゾウジヤナギに比し、樹高、幹径ともに約2倍の発育を認めた。1985年12月メキシコヤナギの沖縄における潅水条件下で砂の挿木床における活着率は85%であった。収集したキクイモの諸条件下における生産性は、北海道残存の赤色系、エジプトより導入の白色系が、適応性が広く優れていた。さらに挿木による系統維持、パルプ資源として有用なマダガスカル産ウンカリーナの挿木増殖の檢討および亜熱帶・温帶の主要イネ科水辺植物の収集を行つた。(山本三夫)。(田中正武)。(山本三夫)。
超高率分子変換

重点領域研究「超高率分子変換」は,総括班と5つの研究実施班よりなり,本研究はその総括班に関するものである.各研究班の研究課題は「酸素酸化による分子変換」「炭素-水素結合の活性化による分子変換」「増炭素手法による分子変換」「不斉分子識別に基づく分子変換」「反応性電極による分子変換」であり,総括班はこれらの研究班を統括するとともに,機器分析手段の提供,オンライン検索による各種化学情報の提供,ならびにシンポジウムを通しての各班および各班員間の情報交換の促進等により,各班員の研究の支援を目的とするものである.また総括班には研究評価グループを置き,本重点領域研究全体の進捗情況を把握し,適宜適切な助言を与える.上記目的を達成するため,本年度に行なった活動の概要は次の通りである.1.本年度は各班員の研究支援のための設備備品として, 200MHz多核NMR, FT-IR,ガスクロマトグラフィー質量分析計を導入し,順調に稼働している.また,各種化学情報の提供および研究成果の取りまとめのためデータ処理装置を導入した.特にオンライン検索による各班員への化学情報の帝京は,研究の効率的推進に極めて有用であった.2.本年度は計3回の公開シンポジウムを開催した.第1回シンポジウムでは,班員全員野研究計画を発表し,活発な討論を通して研究計画の検討を行った.第2回,第3回シンポジウムでは,それぞれ9人, 10人の班員による研究成果の発表を行ない,今後の進展に向けての全班員による討議を行なった.また各シンポジウムでは,上記全体会議の他に班別会議を開き,各研究課題別に綿密な検討を行なった.以上,本年度は,本重点領域研究の初年度に当り,研究支援態勢の整備と各班員間の情報交換の促進を通じ全体計画の推進をはかった.各研究実施班からは既に多くの重要な研究成果が生まれている.重点領域研究「超高率分子変換」は,総括班と5つの研究実施班よりなり,本研究はその総括班に関するものである.各研究班の研究課題は「酸素酸化による分子変換」「炭素-水素結合の活性化による分子変換」「増炭素手法による分子変換」「不斉分子識別に基づく分子変換」「反応性電極による分子変換」であり,総括班はこれらの研究班を統括するとともに,機器分析手段の提供,オンライン検索による各種化学情報の提供,ならびにシンポジウムを通しての各班および各班員間の情報交換の促進等により,各班員の研究の支援を目的とするものである.また総括班には研究評価グループを置き,本重点領域研究全体の進捗情況を把握し,適宜適切な助言を与える.上記目的を達成するため,本年度に行なった活動の概要は次の通りである.1.本年度は各班員の研究支援のための設備備品として, 200MHz多核NMR, FT-IR,ガスクロマトグラフィー質量分析計を導入し,順調に稼働している.また,各種化学情報の提供および研究成果の取りまとめのためデータ処理装置を導入した.特にオンライン検索による各班員への化学情報の帝京は,研究の効率的推進に極めて有用であった.2.本年度は計3回の公開シンポジウムを開催した.第1回シンポジウムでは,班員全員野研究計画を発表し,活発な討論を通して研究計画の検討を行った.第2回,第3回シンポジウムでは,それぞれ9人, 10人の班員による研究成果の発表を行ない,今後の進展に向けての全班員による討議を行なった.また各シンポジウムでは,上記全体会議の他に班別会議を開き,各研究課題別に綿密な検討を行なった.以上,本年度は,本重点領域研究の初年度に当り,研究支援態勢の整備と各班員間の情報交換の促進を通じ全体計画の推進をはかった.各研究実施班からは既に多くの重要な研究成果が生まれている.
光ストレス下での光化学系II反応中心結合タンパク質の凝集と細胞死

本研究では、ホウレンソウチラコイド膜とシアノバクテリアSynechocystis PCC6803を用いて、光ストレスおよび熱ストレスによる光化学系II反応中心結合タンパク質D1の分解と凝集について、詳細な検討を行った。その結果、以下のような結果を得た。1.光ストレスに伴う光化学系IIの光阻害においてはD1タンパク質が分解されるが、Synechocystis PCC6803とシロイヌナズナArabidopsis thalianaでは、このタンパク質分解に金属プロテアーゼFtsHが関与することが示されている。我々は、ホウレンソウのチラコイド膜に熱ストレス(40°C、30分)を与えるとD1タンパク質がFtsHにより分解され、23kDaと9kDaの分解産物が生じることをFtsHの可溶化と再構成実験により示した。2.熱ストレスをホウレンソウのチラコイド膜に与えると、光化学系II周辺で一重項酸素とヒドロキシルラジカルが生じ、それがD1タンパク質に酸化的損傷を与えることと発見した。また、熱処理で光化学系IIのPsbO、P、Qの3種類の膜表在性タンパク質が光化学系IIから遊離するが、この際にもこれらのタンパク質の酸化的損傷がタンパク質遊離の直接の原因となっていることを示した。また、光化学系IIの周辺では熱ストレスで脂質の過酸化が顕著に起こることを見いだした。3.Synechocystis PCC6803のFtsH欠損株では、光ストレス下で野生株に比べてD1タンパク質の凝集が著しいことを見いだした。この結果は、FtsHプロテアーゼがD1タンパク質の凝集物を分解しているか、D1タンパク質の凝集を妨げる分子シャペロンとしての役割を果たしている可能性を示している。過剰な可視光照射にともなう光化学系II反応中心結合タンパク質D1の凝集について、以下の研究を行った。(1)シアノバクテリアSynechocystisPCC6803の野生株細胞に1,000μE m^<-2> s^<-1>程度の強光を照射すると、D1タンパク質の凝集が生じた。このD1タンパク質の凝集物はD1とD2およびD1とcytb559 α-subunitとの凝集物と思われるが、未だ最終的な特定には至っていない。このD1タンパク質凝集物を分解するプロテアーゼを同定する目的で、FtsH(slr0228)、DegP、DegQ、DegSをそれぞれ欠損する突然変異株(ΔFtsH、ΔDegP、ΔDegQ、ΔDegS)に対して同様の強光照射を行い、D1タンパク質凝集の程度を比較した。その結果、ΔFtsHを強光照射したときに著しいD1凝集物の増加が見られた。このことは、FtsHプロテアーゼ(slr0228)が光損傷をうけたD1タンパク質の凝集物を分解する活性を持つことを示唆している。(2)シアノバクテリアSynechocystisPCC6803のチラコイドおよびホウレンソウのチラコイドでは、強光だけでなく熱(40°C、30分)でもD1タンパク質が凝集することを見いだした。この熱によるD1タンパク質の凝集は嫌気条件では起きないことから、活性酸素がタンパク質凝集に関与する可能性が明らかとなった。チェコの研究グループとのEPR測定の共同研究から、暗条件で熱処理したホウレンソウチラコイド膜からスーパーオキシドが発生していることが確かめられた。(3)ホウレンソウチラコイド膜をdigitoninで処理し、グラナとストロマチラコイドに分けて強光照射や熱処理を行ったところ、グラナで非常に著しいD1タンパク質の凝集が生じることが分かった。このD1タンパク質の凝集は、D1タンパク質が脱リン酸化されていないときに著しくなることも明らかとなった。

今後、光化学系IIの機能不全と細胞死を考える際に、極めて重要な情報となる可能性がある。本研究では、ホウレンソウチラコイド膜とシアノバクテリアSynechocystic PCC6803を用いて、光ストレスおよび熱ストレスによる光化学系II反応中心結合タンパク質D1の分解と凝集について、詳細な検討を行った。その結果、以下のような結果を得た。1.光ストレスに伴う光化学系IIの光阻害においてはD1タンパク質が分解されるが、Synechocystis PCC6803とシロイヌナズナArabidopsis thalianaでは、このタンパク質分解に金属プロテアーゼFtsHが関与することが示されている。我々は、ホウレンソウのチラコイド膜に熱ストレス(40°C、30分)を与えるとD1タンパク質がFtsHにより分解され、23kDaと9kDaの分解産物が生じることをFtsHの可溶化と再構成実験により示した。2.熱ストレスをホウレンソウのチラコイド膜に与えると、光化学系II周辺で一重項酸素とヒドロキシルラジカルが生じ、それがD1タンパク質に酸化的損傷を与えることと発見した。また、熱処理で光化学系IIのPsbO、P、Qの3種類の膜表在性タンパク質が光化学系IIから遊離するが、この際にもこれらのタンパク質の酸化的損傷がタンパク質遊離の直接の原因となっていることを示した。また、光化学系IIの周辺では熱ストレスで脂質の過酸化が顕著に起こることを見いだした。3.Synechocystis PCC6803のFtsH欠損株では、光ストレス下で野生株に比べてD1タンパク質の凝集が著しいことを見いだした。この結果は、FtsHプロテアーゼがD1タンパク質の凝集物を分解しているか、D1タンパク質の凝集を妨げる分子シャペロンとしての役割を果たしている可能性を示している。
胚発生工学のための染色体移植法の開発

前年度に続きVSVウイルス外皮タンパク(VSV-G)を用い微小核融合の改良をめざすため、まずVSV-Gの細胞融合に必要な領域を同定した所、細胞外皮ドメインに存在する2カ所の糖鎖結合領域が必須であった。一方、ヒト化TNFα抗体遺伝子をクローン化した。抗体遺伝子はH鎖及びL鎖からなり、それらが一定比率で発現する必要がある。そこで人工染色体に組込まれ核移植する前に発現比率について検討することとした。まず常法とおり、ウイルス性IRES配列によりモデル抗体のH鎖、L鎖を連結したところ、IRES上流の遺伝子が下流の遺伝子の約5倍強発現していた。そこで現在H鎖、L鎖遺伝子を別々のプロモーターで駆主力し、発現量を揃えることを試みている。さらにニワトリ導入した際人工染色体がサイレイシングを受けるのを防ぐためβ-グロビン遺伝子のインシュレータ配列をクローン化した。今後これらを組合わせ人工染色体を構築する予定である。さらに三重ら線DNAを用い手相同組換えを効率化することをめざしてマウスグリア細胞に特異的に存在するGAP43タンパク質遺伝子をクローン化し、その5'比翻訳領域にTGの繰り返しで三重ら線構造をとり得る配列を同定した。染色体移植とは、ヒトの場合46本、またニワトリの場合約80本と複数ある染色体をある細胞から取り出し、他の細胞へ移す技術である。この技術は、実験的にはマウスのみで可能であるがきわめて効率が悪く、現段階では汎用技術となっていない。しかし抗体などきわめて大きい遺伝子座を扱う必要がある時は必須の技術である。微小核細胞は1または2個の染色体を持つ細胞断片であり、他の細胞と微小核の融合により染色体移植が可能であるが、すべての細胞での微小核ができるわけではない。そこでHeLa細胞で作製が可能であるかどうかを調べた。使用するコルセミド濃度について検討したところ実験した濃度範囲ではほぼ等しく染色体の凝集がみられた。次に、微小核細胞の融合の効率をあげるためVSVウイルスの外被タンパク(VSV-G)を用いることとした。このため、まずHeLa細胞にVSV-G遺伝子をリポフェクション試薬を用いて導入し24時間経過後、0.05μg/ml、24時間のコルセミド処理、つづいて20μg/mlのサイトカラシンB処理をし、34°Cで42000rpm、70分のパコール密度勾配遠心にかけ、微小核細胞を精製した。これを3μmのフィルターを通し、1.8×10^5/mlの微小核を含むサンプルを得ることができた。現在、HeLa細胞と微小核の融合を試みている。また我々は、動物個体をバイオリアクーとして用い卵の中にタンパク性医薬品を生産させることを目的として研究を行っており、このために卵白に局在するオボアルブミン遺伝子を利用している。そこで、まずDT40で相同組換えを起こす遺伝子として卵白の主要タンパクであるオボアルブミンを選び、この遺伝子座にマーカーである発光タンパクGFP(Green fluorescence protein)遺伝子を導入を試みている。
運動・スポーツ指導者の体罰問題における心理的メカニズムの解明

本研究は、3ヶ年計画の下、運動・スポーツ指導者の体罰問題における心理的メカニズムを解明することを目的としてきた。この目的を達成するために、1)運動・スポーツ指導者の体罰問題に関する先行研究を概観し、解決すべき問題点を整理し、2)質的研究方法の熟達に向けて関連文献を概観し、本研究を遂行するための研究方法や研究範囲を同定し、3)体罰経験を有する運動・スポーツ指導者を対象としたフィールドワークを敢行し、直接的で集中的なインタビュー調査を実施し、4)本研究から得られた成果を積極的に公開し、運動・スポーツ指導場面における体罰の根絶に向けての議論を活性化させる、といった4つの研究課題に取り組んだ。特に、今年度は最終年度ということもあり、研究のまとめにも取り組んだ。その結果、上記1)に関連して、スポーツ心理学領域の先行研究のみならず、スポーツ倫理学領域の文献についても概観した。特に、現状においては体罰否定論が強く謳われているにも関わらず、根強く体罰肯定論が通底している側面も確認でき、本研究課題の根深さに直面することとなった。そのような中で、上記3)に関連して、研究1では、暴力的な指導を経験した運動・スポーツ指導者に対して、直接的で集中的なインタビューを敢行し、「体罰・暴力的な指導を生み出していくメカニズム」を成果として導き出した。一方、研究2では、このようなフィールドワークを進めていく中で、体罰・暴力を受けた者が、そのことを、図らずとも容認してしまっている現状を確認することができ、そのことが当該現象を複雑にし、深刻化しているのではないかという疑問を抱くに至った。そして、体罰・暴力的な指導を受け容れてしまっているインフォーマントに直接的なインタビューを敢行し、「体罰・暴力を受け容れていくプロセス」を導き出すに至った。これらの研究成果については、日本体育学会でのポスター発表にて公表している。本研究の目的は、3か年計画の下、運動・スポーツ指導者の体罰問題における心理的メカニズムを解明することにある。この目標を達成するために、4つの研究課題を設けた。それは、1)運動・スポーツ指導者の体罰問題に関する先行研究を概観することで解決すべき問題を整理する、2)質的研究法の熟達にむけて関連文献を概観し、本研究を遂行するための研究方法や研究範囲を同定する、3)体罰経験を有する運動・スポーツ指導者を対象としたフィールドワークを敢行し、直接的かつ集中的なインタビュー調査を実施することにより、当事者の体罰に関連する心理的メカニズムを可視化する、4)本研究から得られた成果を積極的に公開し、今後、運動・スポーツ指導場面における体罰根絶へ向けて議論を拡大する、などであった。特に、本年度においては、1)、2)および3)について課題解決に向けた取り組みを行った。特に、日本スポーツ心理学会第43回大会において、「体罰・暴力を生み出していく心理的メカニズムの検討ースポーツ指導者への集中的なインタビューからー」というタイトルでポスター発表を行い、本研究を遂行するにあたって有益な情報交換の機会を得ることができた。具体的には「スポーツ指導者は、どのようにして体罰・暴力を生み出したのか」といったリサーチクエスチョンを設定し、質的なアプローチを行った。分析の結果、3つの概念(体罰・暴力に対する認識の混乱、体罰・暴力を助長する態度の奔放化、体罰・暴力を黙認する雰囲気の定着)と8つの下位概念(1手を出すことへの迷い・罪悪感、2かつて体罰・暴力を受けた経験、3体罰・暴力の効果の容認、4隠蔽しようとする動き、5自らの行為の正当化、6開き直った態度、7体罰・暴力を肯定する指導環境、8権威力を強めたいという願望)から構成される「体罰・暴力を生み出していくメカニズム」を導き出した。本研究の進捗状況としては、概ね順調といえる。特に、研究課題としてあげた4点のうち、3点については仮説的知見を導き出すに至っている。その研究課題とは、1)運動・スポーツ指導者の体罰問題に関する先行研究を概観することで解決すべき問題を整理する、2)質的研究法の熟達にむけて関連文献を概観し、本研究を遂行するための研究方法や研究範囲を同定する、3)体罰経験を有する運動・スポーツ指導者を対象としたフィールドワークを敢行し、直接的かつ集中的なインタビュー調査を実施することにより、当事者の体罰に関連する心理的メカニズムを可視化する、であった。上記1)については、スポーツ心理学領域において希少な先行研究を収集し、概観することはもちろんのこと、スポーツ哲学、スポーツ社会学、教育社会学など、有益な基礎的情報が獲得できることが期待できる領域においても先行研究を概観することができた。上記2)については、質的心理学研究法に関連する先行文献を概観し、特に、修正版グラウンデッド・セオリー・アプローチや複線径路等至性モデルなど、本研究の分析をより一層充実させることのできる分析方法について検討を重ねた。加えて、日本質的心理学会における情報収集やセミナーなどに積極的に参加し、質的研究法の熟達に努めた。上記3)については、特に、日本スポーツ心理学会第43回大会において、「体罰・暴力を生み出していく心理的メカニズムの検討ースポーツ指導者への集中的なインタビューからー」というタイトルでポスター発表を行い、次の様な仮説的知見を導き出した。それは、その1)体罰・暴力に対する認識が混乱している、その2)体罰・暴力を助長する態度が奔放化している、その3)体罰・暴力を黙認する雰囲気が定着している、その4)認識