hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
トランスジェニック鳥類を用いたインフルエンザパンデミック防御

クローニングしたMuc13遺伝子を発現させた細胞に対し、モデルウイルスとしてVSV-Gシュドタイプ型のウイルスベクターを用いて抗ウイルス活性を検討した。293FTに一過性にMuc13を発現させ、ウイルス感染性を検討したところ、大きな影響は認められなかった。このことからMuc13の過剰発現によっては強い抗ウイルス活性を持たせることは難しいことが示唆された。将来精子・卵子となる始原生殖細胞を長期培養して操作した後、ニワトリ個体まで効率よく発生させることができれば、ニワトリの遺伝子改変を自由に進めることができる。BMPやActivinなどのサイトカインの添加で長期培養が可能となったが、ニワトリ始原生殖細胞分化に関する知見はまだ限られたものである。そこで、未分化なES細胞様の細胞が存在する産卵直後の胚盤葉期胚に着目した。胚盤葉期の細胞を回収し、始原生殖細胞培養用の培地で培養し、遺伝子発現を検討した。その結果、3日間の培養後においてもCVHやDAZLなど生殖細胞特有遺伝子の発現レベル上昇は認められなかった。一方、ある程度の分化を誘導するとされるサイトカインなしのDMEM培地においてもやはり生殖細胞関連遺伝子の発現は低いものであった。また、ニワトリ始原生殖細胞の分化に重要との報告があるCVH遺伝子の過剰発現によってもDAZLなどの発現は始原生殖細胞に比べて低いものであり、他の因子の重要性が推測された。長期培養した始原生殖細胞におけるCRISPR/Cas9を用いたゲノム編集の効率について検討した。エレクトロポレーション法により導入したCRISPR/Cas9発現ベクター上に挿入された薬剤耐性遺伝子の一過的発現により選択を行った。その後限界希釈法によりクローニングし、増殖してきた細胞のゲノムを調製、配列を確認した。その結果、多くの細胞で目的遺伝子部位に欠損が入っていることが確認された。ニワトリムチンのうち遺伝子サイズが小さいMuc13に関しては検討をほぼ終えつつあり、残念ながら強い活性は期待できないことが判明した。一方、ニワトリ遺伝子操作の効率を格段に進めうる始原生殖細胞の操作および基礎的な分化・増殖メカニズムについて進展が見られた。全体としてほぼ計画通り進行していると考える。培養始原生殖細胞等を用いて基礎的解析を進めるとともに遺伝子操作ニワトリの作製を進める。抗ウイルス活性を有するとされるIFITMファミリーのうち、機能未知のIFITM10のクローニングと機能解析を行った。ニワトリIFITM10はほ乳類との相同性の低いN末端と相同性の高いC末端とを有する240アミノ酸のタンパク質であった。まず、ニワトリ個体での発現を定量RT-PCR法により調べた。成熟個体では輸卵管、脳、肺、卵巣などで発現していたが、その発現レベルは他のIFITMファミリーに比べ低かった。また、IFITM10は肝臓や精巣ではほとんど発現していなかった。一方、胚ではIFITMファミリー遺伝子は成熟個体よりも低い発現レベルを示す中で、IFITM10は成熟個体よりもやや高いレベルで発現していた。このことから、IFITM10はIFITM3とともに胚で発現する主要なIFITMであるものと考えられた。抗ウイルス活性を誘導するインターフェロンαによりニワトリ胚線維芽細胞を処理した際、他のIFITMの発現が強く誘導される一方、IFITM10はほとんど誘導されないことが示された。次に、IFITM10を培養細胞で発現させ機能解析を試みた。IFITM10はVSV-G発現細胞の酸処理により誘導される細胞融合を防ぐ活性が認められ、この活性はN末端領域を除去しても消失しなかった。次に、ニワトリ線維芽細胞株DF-1を用いてIFITM10安定発現細胞株を樹立した。この細胞を用いてVSV-Gシュドタイプ型レンチウイルスベクターの感染性を検討したところ、IFITM10がウイルス感染を若干低下させることが示された。機能未知であったニワトリIFITM10の機能解析を進め成果を公表できた。抗ウイルス活性は強くないことが示唆された。データベース上に登録のあったニワトリムチン候補遺伝子のうち、細胞外に分泌するためのシグナル配列を確認できた遺伝子の発現を定量RT-PCR法により測定した。このうち、Muc13が鳥類でのウイルス感染の場でもある腸での発現が認められたため、遺伝子をクローニングした。クローニングした配列は、NCBIに登録された予測配列に比べ、N末端近傍に存在するTRドメインの繰り返し1回分に相当する20アミノ酸短いことが確認された。次に、発現ベクターを作製し、ニワトリ細胞株DF-1、LMHで強制発現させたところ、ウエスタンブロットでMuc13の発現が確認された。分子量はタンパク質配列から計算される67kDよりはるかに大きな100kDa以上であったため、O型糖鎖が附加されていることが示唆された。また、67kDaよりも小さな分子量のバンドが検出されたことから、細胞膜型ムチンの特徴である開裂が起きているものと考えられた。さらに、Helaや293FTなどに導入したところ、細胞によってMuc13の分子量が異なったことから、糖鎖附加の状態が異なっていることが示された。次に細胞内での局在を調べた。遺伝子導入した細胞を蛍光染色したところ、N末に付加した抗FLAG抗体による染色では、細胞全体と核周囲で蛍光が観察されたことから、mucin13は細胞質もしくはタンパク質輸送経路の細胞内小器官に多く局在していることが示唆された。

一部は細胞膜上での発現が確認された。今後、ウイルス感染能に対する影響を検討する予定である。ニワトリムチンの基礎データとして発現解析とクローニングを行い、Muc13について細胞膜での発現と糖鎖附加を確認した。ウイルス抵抗性については未検討であるが、トランスジェニックニワトリ作製技術について進展があり今後ゲノム編集を含め効率よくニワトリ作製が可能となることが期待できる。クローニングしたMuc13遺伝子を発現させた細胞に対し、モデルウイルスとしてVSV-Gシュドタイプ型のウイルスベクターを用いて抗ウイルス活性を検討した。293FTに一過性にMuc13を発現させ、ウイルス感染性を検討したところ、大きな影響は認められなかった。このことからMuc13の過剰発現によっては強い抗ウイルス活性を持たせることは難しいことが示唆された。将来精子・卵子となる始原生殖細胞を長期培養して操作した後、ニワトリ個体まで効率よく発生させることができれば、ニワトリの遺伝子改変を自由に進めることができる。BMPやActivinなどのサイトカインの添加で長期培養が可能となったが、ニワトリ始原生殖細胞分化に関する知見はまだ限られたものである。そこで、未分化なES細胞様の細胞が存在する産卵直後の胚盤葉期胚に着目した。胚盤葉期の細胞を回収し、始原生殖細胞培養用の培地で培養し、遺伝子発現を検討した。その結果、3日間の培養後においてもCVHやDAZLなど生殖細胞特有遺伝子の発現レベル上昇は認められなかった。一方、ある程度の分化を誘導するとされるサイトカインなしのDMEM培地においてもやはり生殖細胞関連遺伝子の発現は低いものであった。また、ニワトリ始原生殖細胞の分化に重要との報告があるCVH遺伝子の過剰発現によってもDAZLなどの発現は始原生殖細胞に比べて低いものであり、他の因子の重要性が推測された。長期培養した始原生殖細胞におけるCRISPR/Cas9を用いたゲノム編集の効率について検討した。エレクトロポレーション法により導入したCRISPR/Cas9発現ベクター上に挿入された薬剤耐性遺伝子の一過的発現により選択を行った。その後限界希釈法によりクローニングし、増殖してきた細胞のゲノムを調製、配列を確認した。その結果、多くの細胞で目的遺伝子部位に欠損が入っていることが確認された。ニワトリムチンのうち遺伝子サイズが小さいMuc13に関しては検討をほぼ終えつつあり、残念ながら強い活性は期待できないことが判明した。一方、ニワトリ遺伝子操作の効率を格段に進めうる始原生殖細胞の操作および基礎的な分化・増殖メカニズムについて進展が見られた。全体としてほぼ計画通り進行していると考える。ムチンなど他の抗ウイルスタンパク質を検討する。ムチンの生理機能をin vitroで検証した後、始原生殖細胞を用いたゲノム編集によりムチンなどの発現を強化したニワトリの作製を試みる。また、他の遺伝子についても検討する。培養始原生殖細胞等を用いて基礎的解析を進めるとともに遺伝子操作ニワトリの作製を進める。
二成分制御系における連鎖的シグナル伝達機構の構造生物学的解明

本研究では、申請者らの開発したNMR手法である交差飽和法を用いて、原核生物の走化性を制御する細胞内シグナル伝達タンパク質であるCheAとCheYの複合体が、反応部位同士が互いに近接した状態と、離れた状態の平衡状態にあることを明らかにした。これにより、CheAが、シグナル伝達に必要な二つの反応を、一つの反応部位で、両方とも効率よく進めているメカニズムが解明された。昨年度に確立した区分標識法を用いて、変異体によるP3-5ドメインの側鎖メチルシグナルの帰属を試みた。全長CheAのP3-P5ドメイン側鎖メチル基選択的標識体と、切り出したP3-P5ドメイン(残基番号:260-654)の1H-13C HMQCスペクトルを比較したところ、両者でわずかに違いが観測されたが、特にAla領域では良く重なったため、P3-5ドメインの大部分の帰属をそのまま全長に移すことが可能であると考えた。そこで、試料調製の簡便さを考慮し、まず切り出したP3-P5ドメインに対してIle, Ala, Met残基に1つずつ変異を導入した変異体を作成し、消失したシグナルを変異導入残基として帰属した。次いで、その結果を全長に移すこととした。P3, P4, P5の3つのドメインが比較的構造上独立しているため、3つのドメイン同時に異なるアミノ酸に変異を導入することが可能であると考えて、1-3残基同時に変異を導入した各種変異体を調製した。現在までにIle, Met, Ala 71残基中63残基に変異を導入した、27変異体のスペクトルの取得を完了し、Ile 28残基中14残基、Met 13残基中3残基、Ala残基31残基中12残基の帰属に成功した。帰属済みの残基の中には、A423, A434, A462, M475などのATP結合部位近傍の残基も含まれており、これらの残基は今後ATP結合部位周辺の構造変化を調べるプローブとなることが期待される。また、交差飽和法における強度減少率と距離を正確に対応することを可能とする、定量的交差飽和法を開発した。本手法をCheA-CheYの相互作用に適用することにより、複合体中におけるP1ドメインとCheYの結合・解離の動的平衡を解明することが可能となることが期待される。CheA全長の1H-15NTROSYスペクトルを測定した結果、約150個のシグナルが高感度で観測された。各種三重共鳴実験を行った結果、観測されたシグナルは主にP1, P2ドメインに由来することが明らかとなった。また、in vitro PTS法により、P1ドメイン、P2-5ドメインの一方のみを選択的に標識する方法を確立した。そこで、全長CheA, CheYそれぞれを観測対象とするCS実験を両方行った。その結果、P2ドメイン-CheY複合体の結晶構造における結合界面上の残基の強度減少に加えて、その半分程度の大きさの強度減少が、P1ドメインのHis48とCheYのAsp57の周辺の残基にもそれぞれ観測された。したがって、P1ドメインとCheYが、反応部位同士で相互作用していることが示された。次に、全長CheAならびにP1ドメイン単独に対してCheYを滴定する実験を行った。その結果、P1ドメイン単独では解離定数が約5×10-4 Mに対応する化学シフト変化が観測された。一方、全長CheA中のP1ドメインのシグナルには、見かけの解離定数が10-6 M程度と5×10-4 M程度に対応する、2相性の化学シフト変化が観測された。以上の結果に基いて、P1ドメインとCheYは、複合体内で結合することにより、はじめて生理的条件において、反応部位同士が近接する、反応に有利な相互作用を形成すると考えた。このような結合様式は、結合と解離を迅速に繰り返して、その結果素早く次の反応を開始する上で重要であると考えた。また、P1ドメインとCheYの複合体内相互作用は、平衡定数Keqが1のオーダーの平衡にあることが示唆された。この平衡は、P1ドメインが、CheYの活性部位とも、P4ドメインのATP結合部位とも相互作用して、自己リン酸化反応とリン酸基転移反応の両方を効率よく進める上で重要であると考えた。当初の平成23年度の予定の通り、CheA, CheYのNMR解析が進行し、目標であった、CheA-CheYリン酸転移反応機構の解明を達成した。本研究において、CheAのP1, P2-5ドメインの選択標識体を調製する際、当初、最も広く行われているEPL法を適用した。しかし、収率が低いため、試料調製に多くの時間と労力が必要であった。そこで、ヘルシンキ大学の岩井秀夫博士との共同研究により、in vitro PTS法を適用したところ、十分な収量および標識率の標識体を迅速に調製することが可能となった。このような事例は報告されていなかったため、その成果をJournal of Biomolecular NMR誌に発表した。したがって、当初の計画以上に進展していると判断した。(1) CheAのP3、P5ドメインのNMR

シグナル観測法の確立:P3, P4, P5のメチル基を選択的に標識した試料を調製して、ATP結合部位を持ち自己リン酸化反応を行うP4、CheWやMCP結合部位を構成すると考えられているP5、およびP3のNMRシグナルを観測および帰属する。(2) CheA-CheW, CheA-MCP, CheW-MCP結合様式の解明:転移交差飽和法により、CheA-CheW複合体におけるCheA, CheWそれぞれの結合界面, CheA-MCP複合体におけるCheA上の結合界面、CheW-MCP複合体におけるCheW上の結合界面を同定する。(3) CheA-CheW-MCP三者複合体における結合様式の解明:(2)で用いた試料に、2H標識MCP, CheA, CheWを添加して転移交差飽和実験を行うことにより、三者複合体形成に伴う、結合界面の変化を調べる。(4)三者複合体状態におけるCheAのP1-P4相互作用の解析:2H標識MCPおよびCheWが存在する条件で、23年度のような交差飽和実験やTitration実験を行うことにより、三者複合体におけるP1ドメイン上のP4ドメイン結合部位、ならびに結合・解離の平衡を決定する。(5)三者複合体モデルの構築:(3), (4)の結果に基づいて、三者複合体のモデルを構築する。(6)リガンド結合状態の三者複合体の解析:MCPリガンドを添加した状態において、(2)(4)の解析を行い、三者複合体中のMCPへのリガンド結合によるCheAの構造変化を調べる。得られた結果に基づいて、CheAの自己リン酸化活性が制御される機構を考察する。本研究で使用するタンパク質相互作用解析装置や、タンパク質試料調製装置は、申請者の所属する研究室において既に稼動中である。そのため、設備・備品費の申請はない。今年度も、前年度に続き、安定同位体(2H, 13C, 15N)標識したCheA, CheW, MCP, CheYを大量に調製する。したがって、安定同位体試薬(2H2O、2H, 15Nセルトン、2Hグルコースなど)や、精製に用いるクロマトグラフィー担体等の消耗品に多大な経費が見込まれる。当研究では、申請者の所属する研究室の機器を用いて実験を行うが、NMRやFPLC、遠心器、凍結乾燥機などは随時修理やメンテナンスが必要となるため、そのための費用を計上する。また、旅費については、学会での成果発表を予定している。
EGFR-TKIsと抗EGFR抗体の併用療法に対するベバシズマブによる修飾効果

がん遺伝子であるEGFR変異を有する肺癌は、非喫煙者の半数を占める重要な疾患である。そのEGFRの阻害薬が有効であるが、1年前後で、2次的に耐性変異EGFRT790Mなどが出現し無効となる。本研究では、EGFRT790Mを有する肺癌を克服するためEGFR阻害薬であるアファチニブ、セツキシマブおよび血管新生阻害薬であるベバシツズマブの併用の基礎的検討を行った。EGFRT790Mを有する肺腺癌細胞株H1975およびRPC-9を移植したマウスモデルで検討した。上記3薬剤の単剤療法、2剤併用療法の効果の検証を行った。いずれも中度の効果であったが、3剤併用療法では再現性をもって腫瘍の完全寛解を得た。本研究は、EGFR遺伝子変異を有する肺癌に対し、EGFR-TKIsに抗EGFR抗体、血管新生阻害薬などを併用し、集学的にEGFRを阻害することで耐性を克服し、長期的に肺癌のコントールが可能かどうか検証することを目的としている。EGFRT790M変異を有する肺がん細胞株を用いたゼノグラフトモデルで治療効果を検証したところ、3剤併用療法のみ再現性を持って病理学的な奏功が得られることがわかった。これらの結果を、アメリカ癌学会(AACR 2015,フィラデルフィア)で報告した。EGFR遺伝子変異を伴う肺癌は,日本人の非喫煙者に発生する肺がんの半数以上を占め,非常に重要な疾患群である。EGFRチロシンリン酸化阻害薬(TKIs)は,がんの直接的な原因であるEGFRの増殖シグナルを阻害することで劇的な効果を示すものの,獲得耐性が生じることが未解決の課題である。その耐性機序の50-60%は,耐性遺伝子変異であるEGFR T790Mであることが知られている。本研究では,EGFR遺伝子変異を有する既知の肺癌細胞株のマウス皮下腫瘍モデル,遺伝子改変マウスおよび患者組織の直接移植モデルを用い,EGFR-TKIs,抗EGFR抗体および血管新生阻害薬を併用し集学的にEGFRを阻害することで耐性を克服するのみならず,長期的な肺癌の制御,治癒を目指した治療戦略の基礎的検討を行い,臨床試験のための基礎データ収集することを目的とする。計画書の予定通りに、併用療法の高い効果をin vivoで示すことができ,AACR2015にて成果を発表した。27年度が最終年度であるため、記入しない。呼吸器腫瘍計画書の予定通りに、EGFRT790Mをまだ有していない状態の肺癌における3剤併用の効果を検証する予定である。
清律の刑罰減免制度より見た清代法制度の特質に関する実証的研究

本研究課題は、儒教思想に由来する清律の刑罰減免制度を考察対象に取り上げ、主として清代の刑案(判例)史料を用いた実証的研究を通じて、当時の法実務家官僚達が、儒教的な「衿恤の意」を実現しようとする法の理念と、社会の治安維持という現実の要請との間で、如何にして折り合いをつけていたかを解明し、その対応の時代的変遷のパターンを他の王朝のそれと比較検討することによって、清朝法制度の特質の一端を明らかにすることを目的としている。本研究では、主として「誤殺」と「自首」を対象に選び、条例や判例によって制度の変遷過程について考察を行った。その結果、「誤殺」については、特に親族関係の存在を認識できずに犯行に及んだ「犯時不知」の場合において、親族関係の錯誤に関して広く刑の軽減を認めていた清朝初期の状況が、乾隆朝を境として次第に刑の軽減範囲が狭められ、嘉慶24年以降には極めて限定的な場面においてのみしか減刑が認められなくなって行ったことが明らかとなった。また「自首」に関しても、主として強盗犯の自首において、それ以前は強盗犯の自首についても広:く減免が行われていたものが、次第に自首が認められなくなる、あるいは認められたとしても刑の軽減の度合いが低下する等、やはり同様に乾隆朝辺りを境として犯人にとって不利益な方向での変更が行われていたことが明らかとなった。これはかつて「留養」制度に関して筆者が明らかにしたのと同様のパターンであり、この乾隆朝を境とした厳罰化というのが清朝の法制度上の特質として浮かび上がってきた。本課題の初年度にあたる平成17年度は、申請時の研究計画においては準備作業期間として位置づけられている。すなわち、清朝前期の刑案史料を中心とした各種の史料収集、および次年度以降の本格的な研究分析作業に向けた史料整理作業を行うことを予定していたが、本年度はこれらの作業をほぼ計画通りに終了させることができた。具体的に言えば、まず史料収集に関しては、平成17年8月に東京大学東洋文化研究所にて、清代前期の刑案史料に対する実地調査を実施し、その結果を基に「例案全集」(主に康煕年間(特に後半期)の事案を収録)、「成案彙編」(主に雍正乾隆前半期の事案を収録)、「成案続編」(主に乾隆年間の事案を収録)等の史料につき必要部分の複写を入手した。なお、当初の計画では、デジタルカメラによる撮影で史料を入手する(線装本漢籍は複写機によって直接複写することができないため)予定であったが、8月の実地調査で写真複写による紙焼きの複製本が既に存在していることが判明したため、予定を変更して通常の複写機による複写に切り替えた。また、史料の整理に関しては、上述の新規収集史料ならびに既存の史料(主として清代後半期の事案を収録した刑案史料)の中から、自首や復讐に関する事案の拾い出し作業を現在行っているところである。なお、作業途中に気づいた点として、父母の仇に対する復讐に関連した事案が、予想したよりも少なかったことを指摘しておきたい。このことは、そもそも清代においてこうした復讐事案の発生自体が少なかったためなのか、それとも単にこれら刑案史料の中に復讐事案があまり収録されなかっただけのことなのか、現時点では判然としないが、もし後者の理由であれば、復讐に関する事案を可能な限り多く収集するために、次年度以降は刑案以外の史料(例えば「清実録」や地方官の判牘等)にも目配りをして行かなければならないであろう。研究期間3年間を予定している本研究課題の第2年度に当たる平成18年度は、当初計画によれば、先行研究が必ずしも十分に検討していなかった清代初期(具体的には康煕朝雍正朝頃)の事案の検討を通じて、父母の仇に対する復讎における処罰の変遷を明らかにすることによって、清代法制度の特質を明らかにする予定であった。

ところが、実際に『例案全集』や『成案彙編』等といった清代初期の刑事先例集を検索した結果、所収されている復讎の事案は、予想外に数が少なく、それらから復讎事案処罰の時期的変遷を読み取るには必ずしも十分な量ではないことが判明した。その原因(理由)については、いずれ日を改めて検討してみたいが、今回は急遽研究対象を変更し、誤殺(錯誤による殺人)の事案、とりわけ重い罪を犯す意図で実際には軽い罪を犯した(あるいは逆に、軽い罪を犯す意図で実際には重い罪を犯した)場合の処罰規定である、「犯時不知」律の適用をめぐる時期的な変遷に着目し、清代法制度の特質を考察することにした。「犯時不知」律は、本研究課題が主たる対象として掲げているような、純然たる「刑罰減免制度」とは言えないが、その適用が犯人にとって有利に働くこと、および錯誤による犯罪を軽く扱うべきとする思考様式は、やはり儒教思想に由来すること等から、「犯時不知」律を考察対象に据えることは、本研究課題の趣旨に合致している。今回の研究によって、「犯時不知」律の適用に関して、当初はその注の例示にある如く、親族身分関係の錯誤に関する場合については、広く同律が適用されて加害者にとって有利な(寛大な)処罰が行われていたが、乾隆朝を境として次第に適用が制限され、嘉慶24年以降になると、同律はきわめて限定的な場面においてのみ適用されるように変化していったことが明らかになった。本研究は、儒教思想に由来する清律の刑罰減免制度を考察対象に取り上げ、主として清代の刑案(判例)史料を用いた実証的研究を通じて、当時の法実務家官僚達が儒教的な「衿恤の意」を実現しようとする法の理念と、社会の治安維持という現実の要請との間で、如何にして折り合いをつけていたかを解明し、その対応の時代的変遷のパターンを他の王朝のそれと比較検討することによって、清朝法制度の特質の一端を明らかにすることを目的としている。本研究課題の第3年度で最終年度に当たる平成19年度は、儒教思想に由来する刑罰減免制度の一つである「自首」を取り上げ、その中でもとりわけ、時代によって扱いに変動が見られる強盗犯の自首に着目し、強盗の自首に関する基本規定とも言える「強盗条例二六」の改正過程を跡付けることによって、自ら過ちを悔い改めた者に対して寛大な措置をとるべきとする儒教の理念を体現した自首の制度と、強盗という凶悪犯の刑を軽減することに伴うリスクを如何に回避するかという刑事政策上の要請との間で、強盗の自首に対する対応がどのように変化したかを考察した。詳細については、平成20年度中に論文の形にまとめて公表する予定であるが、結論のみを示せば、強盗の自首においても、やはり他の同様の刑罰減免制度の場合と同様に、乾隆朝頃を境目として強盗の自首に対する取り扱いが、比較的寛大なものからより厳格な方向へと変化していることが明らかになった。その変化は必ずしも直線的なものではなく、例えば嘉慶朝には一時的に寛容化されるなど、若干の紆余曲折はあるが、全体の方向としては制度運用の厳格化の方向に進んでいたと言える。
校長のコンピテンシーモデルの構築に関する理論的・実証的研究

本研究はわが国の校長のコンピテンシーモデルの構築をめざした。そのために、以下の作業をおこなった。1.コンピテンシー研究の理論的な整理・検討現在の主流である職業スタンダードアプローチと個人的資質アプローチは、要素還元(要素分解)主という問題性をもつ。それを乗り越えるためのアプローチとして、認知的パースペクティブおよびその具体化したモデルであるスコットランドの校長職スタンダード(Standard for Headship in Scotland)に注目した。このスタンダード(モデル)は次の3つの視点から構成されており、本研究のめざすモデルもこれに基づくことにした。(1)専門的価値=「なぜ=Why」その行動をとるのか(2)経営職務=「何を(=What」行うのか(3)行動の際に用いられる能力=「どのように=How」職務をうまく遂行するのか2.優れた校長へのインタビュー(若干名)学校づくりにおいて何を大切にしてきたかを中心にインタビューをおこなった。これらの校長に共通するのは、内発的動機づけを重視するY理論(D.マグレガー)に基づくリーダーシップスタイルや反省的実践家としてのスタイルである。3.広島県の公立小学校校長(約600名)へのアンケート調査教育観,校長としてのありかた・姿勢、必要性を感じる知識、「優れた校長」の考え方や行動などに関して尋ねた。上記3つの作業を統合することによって、わが国の公立小学校の校長を対象としたコンピテンシーモデル試案を構築した。我が国の公立小学校校長を対象としたコンピテンシーモデルを構築するための基礎作業として,イギリスの校長のコンピテンシーモデルを参考としながら,我が国の校長のコンピテンシーモデルの構築と活用をめぐる課題を理論的に検討した。イギリスの校長のコンピテンシーモデルの代表的な事例として,コンサルタント会社であるヘイ・マクバー社が作成したモデルを取り上げ,そのモデルの特質,作成と活用について紹介した。当然のことながら,このモデルをそのまま我が国の校長に適用するのは妥当ではない。我が国に馴染みやすく腑に落ちるようなモデルを構築するためには考慮すべき事柄として以下の点を指摘した。・要素分解的なコンピテンシーのリストだけでなく,コンピテンシー獲得に至る学習プロセスに着目し,コンピテンシーが発揮される「状況や場面」に注目すべきであり,そのためにリストだけでなく「物語」の収集をすることが重要である。・コンピテンシーモデルの構築にあたっては「何のための,誰のための成果か」を問う必要がある。我が国の学校の場合,試験の点数など数値化できる「顕在的」な部分だけでなく,児童・生徒の基本的生活習慣の形成や社会性の発達,教師の力量形成,校風づくりなどの「潜在的な」部分もあわせて学校の成果ととらえるべきである。本年度は、わが国の校長のコンピテンシーモデルの構築をめざして、次の作業をおこなった。1.コンピテンシー研究の理論的な整理・検討コンピテンシーモデルの現在の主流である職業スタンダードアプローチと個人的資質アプローチは、要素還元(要素分解)主義という問題性をもつ。このスタンダード(モデル)は次の3つの視点から構成されており、本研究の目指すモデルもこれに基づくことにした。(1)行為の背後にある専門的価値=「なぜ=Why」その行為をとったのか(2)行為のタイプ・性質=「何を(どのような機能を)=What」行ったのか(3)行為の際に用いられた能力=「どのようにして=How」機能をうまく果たしたのか2.いわゆる優れた校長へのインタビュー(若干名)学校づくりにおいて何を大切にしてきたかを中心にインタビューをおこなった。これらの校長に共通するのは、内発的動機づけを重視するY理論(D.マグレガー)に近いリーダーシップスタイルであること、等である。
長唄薄物の書誌的研究

筆者の目的は長唄の薄物形態の伝本を網羅的に調査し、それらを版種ごとに整理して目録化することである。資料の収集はすでに上田市立上田図書館・国立音楽大学附属図書館竹内道敬寄託文庫(以下竹内文庫と記載)・東京芸術大学附属図書館・東京大学教養学部黒木文庫・東京大学総合図書館霞亭文庫・東京都立中央図書館・東洋文庫・明治大学松和文庫・早稲田大学演劇博物館など長唄薄物の主要な所蔵機関における調査は済ませ、フランス国立図書館・ベルリン国立東洋美術館などからも複写を入手している。そして江戸三座の長唄薄物の版行形態について考察し、長唄の薄物をA上演時に座の専属版元が出す初版、Bこれを直ちに流用して版行した本屋儀兵衛版・無刊記版、C上演後に主に稽古本の目的で出された版に分類した。AとBついては博士論文でまとめてあり、本研究はこれを受けてCの整理が中心となる。歌舞伎の上演年表を作る際にはAが主体となるが、地本おける版権の確立過程を知る上でCは重要な資料群であり、異版が多く存在し覆刻関係も複雑である。したがって、版の識別を正確に行うには早稲田大学演劇博物館本か、国立音楽大学附属図書館竹内文庫本の複写を入手することが必要と判断し、国際日本文化研究センターの図書館を通じて昨年の9月に両所蔵機関に対し複写の申し込みを打診した。早稲田大学演劇博物館からは、大量の複写申し込みにつき難色を示されたが事情を伝えて会議にかけられ、12月に200点ごと数回に分けての複写申し込みをするかたちで許可を得られた。初回の紙焼きを2月に入手している。国立音楽大学附属図書館からは大量の複写申し込みに対応しないとの返答があり現地で突合せ作業を行うが、竹内文庫本は筆者が整理した経緯があり、約8割の資料は閲覧済みである。早稲田大学演劇博物館から紙焼きが入手できるため、諸本の校合はかなり正確に行え、目録化の作業は順調に進むであろう。長唄の薄物は、早稲田大学演劇博物館、国立音楽大学附属図書館竹内文庫、東京芸術大学附属図書館、明治大学が主な所蔵機関となるが、中でも早稲田大学演劇博物館本には資料的価値の高い薄物が多く存在する。原本の閲覧は2巡ほど済ませており、東京芸術大学附属図書館本・明治大学本の複写は入手してあるため、当初の計画では旅費を多く組み所蔵機関先で諸本の校合を確認作業として行う予定であった。しかし、「研究実績の概要」部分でCに分類した薄物はきわめて多く伝存し版面の関係も非常に複雑であるため、より正確な目録の作成を目指し複写を入手して作業を行う方針に変えた。幸い早稲田大学演劇博物館より理解を得られ、紙焼きを入手出来ることになったので、スキャナーを購入した。2月には初回の紙焼きを入手し、校合の作業は紙焼きの入手できた作品から順次進め、各版種について初刷の善本の画像をパソコンに取り込み、書誌情報を記載している。今年度も前年度に引き続き早稲田大学演劇博物館所蔵資料の紙焼きの入手に合わせて、校合の作業を進めていく。よって、早稲田大学演劇博物館の長唄薄物の紙焼きのために複写費を組んでいる。1011月頃にはすべての紙焼きを入手できる見通しである。長唄の各作品について、薄物の版種を整理し、版種ごとに初刷の善本を選び、その画像をパソコンに取り込み、書誌情報を記載していく。竹内文庫については大量の複写の申し込みは国立音楽大学附属図書館から受け付けない旨の返答があり、画像を取り込んだパソコンを持参して校合の作業を行う。そのための旅費を計上している。竹内文庫は筆者が長唄の薄物の整理に関わった経緯があり、約80%の薄物は閲覧済みであるため長期滞在の調査は必要ない。おびただしい数の薄物を扱いながら目録の信頼性を確保するには、その記載内容、特に所蔵先・架蔵番号などに正確さが求められるため校正も重要な作業となる。

国立音楽大学附属図書館からは大量の複写申し込みに対応しないとの返答があり現地で突合せ作業を行うが、竹内文庫本は筆者が整理した経緯があり、約8割の資料は閲覧済みである。早稲田大学演劇博物館から紙焼きが入手できるため、諸本の校合はかなり正確に行え、目録化の作業は順調に進むであろう。長唄の薄物は、早稲田大学演劇博物館、国立音楽大学附属図書館竹内文庫、東京芸術大学附属図書館、明治大学が主な所蔵機関となるが、中でも早稲田大学演劇博物館本には資料的価値の高い薄物が多く存在する。原本の閲覧は2巡ほど済ませており、東京芸術大学附属図書館本・明治大学本の複写は入手してあるため、当初の計画では旅費を多く組み所蔵機関先で諸本の校合を確認作業として行う予定であった。しかし、「研究実績の概要」部分でCに分類した薄物はきわめて多く伝存し版面の関係も非常に複雑であるため、より正確な目録の作成を目指し複写を入手して作業を行う方針に変えた。幸い早稲田大学演劇博物館より理解を得られ、紙焼きを入手出来ることになったので、スキャナーを購入した。2月には初回の紙焼きを入手し、校合の作業は紙焼きの入手できた作品から順次進め、各版種について初刷の善本の画像をパソコンに取り込み、書誌情報を記載している。今年度も前年度に引き続き早稲田大学演劇博物館所蔵資料の紙焼きの入手に合わせて、校合の作業を進めていく。よって、早稲田大学演劇博物館の長唄薄物の紙焼きのために複写費を組んでいる。1011月頃にはすべての紙焼きを入手できる見通しである。長唄の各作品について、薄物の版種を整理し、版種ごとに初刷の善本を選び、その画像をパソコンに取り込み、書誌情報を記載していく。竹内文庫については大量の複写の申し込みは国立音楽大学附属図書館から受け付けない旨の返答があり、画像を取り込んだパソコンを持参して校合の作業を行う。そのための旅費を計上している。竹内文庫は筆者が長唄の薄物の整理に関わった経緯があり、約80%の薄物は閲覧済みであるため長期滞在の調査は必要ない。おびただしい数の薄物を扱いながら目録の信頼性を確保するには、その記載内容、特に所蔵先・架蔵番号などに正確さが求められるため校正も重要な作業となる。
磁性半導体量子構造を用いたブロッホウォールメモリの研究

本研究では、量子ドットにおけるスピン自由度を考慮した電子輸送現象の研究と、磁性半導体量子構造の量子効果を利用したデバイスの実用化に向けた研究を行うことを目的としている。今年度は、化合物半導体量子構造において、バンド構造(sp^3軌道混成によるバンド混合効果)を厳密に考慮して、スピンを伴う電子-電子相互作用、電子-フォノン相互作用とを取り入れた量子輸送モデルを研究し、微細構造中電子の静的および動的な輸送現象の解明を行うことを達成目標とし、半導体量子構造中の電子の挙動をsp^3s^*強結合近似に基づいて結晶のバンド構造を反映させて記述する量子ダイナミクスモデルについて研究を進めた。現在まで磁性不純物を含まない系で、sp^3混成のある場合の量子輸送特性に関して定式化を行い、電子の量子輸送解析に関して成果を得た。その際、実バンド構造とエバネッセントモード(減衰波)に対応する複素バンド構造を求め、電子波の固有平面波解とヘテロ界面におけるエバネッセントモードのモードマッチング法により量子構造に垂直方向の電子の輸送解析を行った。この手法によりバンド間のミキシングとバンドの非放物線性を取り入れた量子輸送解析が可能となり、従来の単純なバンド構造では説明不可能な実験結果をも説明可能なモデルとして確立することができた。
体軸形成を制御するxE2F転写因子の活性制御機構

[目的]脊椎動物の発生過程におけるホメオボックス遺伝子の領域特異的な発現は、体軸の形成過程において重要な役割を果たしている。しかしながら、ホメオボックス遺伝子を胚の限定した領域に発現させるメカニズムは未だに解明されていない。我々は、この問題にアプローチするために、アフリカツメガエル胚の腹側と後方に特異的なホメオボックス遺伝子(Xhox3、HoxB9)の発現を誘導する因子のスクリーニングをおこない、Xenopus E2F(xE2F)を得た。本研究では、前後軸、背腹軸の形成過程におけるxE2Fの活性制御機構を明らかにすることを目的として、機能スクリーニングをおこない、xE2Fの活性を調節する遺伝子を単離することを試みた(1)。また、前後軸形成の分子機構を解明することを目的として、xE2Fと同様に後方特異的なホメオポックス遺伝子の発現を誘導し、前後軸形成を調節する新しい遺伝子を単離することを試みた(2)。[成果]1.xE2F RNAとアフリカツメガエル原腸胚ライブラリー由来のRNAをツメガエル胚に注入した後、アニマルキャップにおける遺伝子発現をRT-PCR法によって定量して、xE2FによるXhox3またはHoxB9の発現誘導活性を増強または抑制する遺伝子を探索した。その結果、xE2FによるXhox3の発現を増強する候補遺伝子を単離した。塩基配列の解析の結果、この遺伝子は新奇な遺伝子であることが分かった。2.中枢神経系の発生過程では、前方神経の一部が後方化されて神経の前後軸が作られると考えられている。我々は、前方神経の誘導因子nogginをコードするRNAとアフリカツメガエル原腸胚由来のRNAをツメガエル胚に注入した後、アニマルキャップにおける遺伝子発現をRT-PCR法によって定量して、後方神経マーカーを誘導する遺伝子を探索した。その結果、アフリカツメガエルのp53転写因子(Xp53)を単離した。RNAインジェクション法によりXp53をアフリカツメガエル初期胚で過剰発現させて、前後軸形成に対する影響を解析した結果、Xp53発現胚では多くの胚で頭部構造の欠失(胚の後方化)が起こることが明らかになった。
電力系統における電圧調整機器群の自律分散制御に関する研究

研究の目的は、同質なコントローラから成る電圧制御機器において、近隣のコントローラ間のデータ通信機能を持たせた自律分散制御方式を新たに開発することにある。本研究では、このような分散型制御アルゴリズムを構築するための基礎として、個々の機器の逆動作の回避、振動の回避、電圧崩壊の回避に主眼を置き、理論およびシミュレーションの両面からアルゴリズム中に具備すべき条件の検討を行った。以下に、本報告書の項目11に示した研究成果(上から16とする)に対応させて、研究成果をまとめる。1.変圧器タップの無駄動作の検討(研究成果1、2)変圧器タップ間の干渉動作が、本来の機能である電圧調整にあまり寄与せず、変圧器の寿命を不必要に低下させる無駄動作であることを明らかにし、無駄動作の発生条件を詳細に検討した。2.変圧器タップの逆動作の検討(研究成果3)従来より指摘されていた変圧器タップの逆動作を複数の変圧器が存在する場合に拡張し、安定条件を導出した。また、導出した条件を基に、電圧崩壊過程におけるタップの制御手法を検討した。この結果タップ制御のシーケンスに関して新たに検討すべき項目が明らかとなり、現在検討を行っている。3.電圧安定限界の検討(研究成果4、5)目的の制御方式の開発にあたり、極めて重要な要因である電圧安定限界の推定に関して、最近接最大負荷点の簡便な計算手法を開発した。4.無効電力源と高調波抑制(研究成果6)タップ制御は無効電力潮流と密接に関連している。ここでは高調波除去機能を兼ね備えた無効電力源の配置手法について検討を行った。
温暖化気候条件においてワインブドウの有機酸並びに芳香性物質を高める栽培技術の開発

白ワイン用ブドウの主要な品種群では、香り成分としてチオール系芳香性物質が重要であり、果実ではその前駆体のみ存在する。この前駆体の構造の一部をなすグルタチオンは、ブドウ特有の有機酸である酒石酸の前駆物質であるアスコルビン酸とともに、過酸化水素消去系を担う生体物質でもある。本研究では、果実中の有機酸濃度の異なる遺伝資源およびチオール系芳香性物質に富むワインを産するブドウ品種において、果実発育に伴うこれらの物質の濃度推移と相互の関係性について明らかにすることを目指した。また、窒素や、硫黄およびアミノ酸の葉面散布処理が、温暖化する気候条件においても、ブドウの果実の有機酸およびチオール系芳香性物質の前駆体濃度を効果的に高めるかを検討した。平成26年度の葉面散布試験は近年温暖化が問題となっている山梨県で実施した。窒素散布剤として尿素を散布した結果、ブドウ果実の成熟の遅延が認められ、ブドウ果実の糖度の上昇、有機酸の低下が無処理に比べ遅れる結果となった。この現象は白ワイン用ブドウでも、参考までに同時に実験を行った赤ワイン用ブドウでも認められた。赤ワイン用ブドウでは、アントシアニンの蓄積が遅れるという結果も見て取れた。窒素の葉面散布処理による病害防除抑制効果は認められず、却って病害発生を助長した。一方、窒素散布剤の処理は果実内のアミノ酸量を増加し、結果として、チオール系芳香性物質3-メルカプトヘキサノール前駆体の蓄積量も上昇した。以上の結果より、温暖化気候において窒素源の葉面散布は果実内のチオール系芳香性物質の蓄積に有効に働くと思われた。
2光子励起顕微鏡法と埋め込みインターフェイスデバイスを融合した脳計測技術の開発

マイクロ流体デバイス技術はこれまで、生体分子や細胞、組織といった生体サンプルを生体外(ex vivo)で操作、計測するためのバイオ分析ツールとして主に発展してきた。しかし、細胞の生体内での本来の機能は、細胞周囲の環境や他の細胞との相互作用に大きく影響されるものが多い。そこで、マイクロ流体デバイス技術の応用範囲を生体内(in vivo)細胞の分析にまで拡張できれば、生物学、医学の発展の基盤となる新たな研究ツールを提供できるものと期待される。以上の背景の下、本研究は、マイクロ流体デバイスの分析対象を動物個体へと拡張した「埋め込み型マイクロ流体デバイス技術」を提唱し、埋め込み型デバイスに特有の設計指針の導出、要素デバイス技術の開発、及び試作デバイスによる有用性の実証を行った。具体的には、マウスを用いる神経科学研究に利用するための埋め込み型デバイスの実現を目指して、物理的、物理化学的、ならびに生物学的観点から求められるデバイスの設計指針を明らかにし、さらに、埋め込み型デバイス特有の課題を解決するべく適正化されたデバイス製造技術とデバイス設置手術を開発し、マウス頭部に埋設可能な光学観察、試薬投与機能をもつマイクロ流体デバイスを試作した。その結果、神経科学分野でこれまで技術的に困難とされてきた試薬投与を伴った状態での生きたマウス脳組織の長期経過観察を達成し、埋め込み型マイクロ流体デバイス技術の有用性を示した。近年、超短パルス赤外レーザー励起を用いた2光子励起顕微鏡法の進歩により、脳組織中の神経細胞を直接見る手段が登場し、脳機能研究の強力な手法として期待されている。しかし、2光子顕微鏡を用いた生きたマウスの脳内の神経細胞の観察には観察部位の開頭手術が不可欠であり、細菌による汚染や脳液の流出が長期計測を妨げる問題となっている。そこで本研究課題では、2光子顕微鏡による長期的なマウス脳のin vivo高分解能観察(<1μm)を実現するべく、微細加工技術を用い顕微観察窓・試薬導入機構をデバイスに集約することで、光・物質の出し入れを可能にする埋め込み型マイクロブレインインターフェイスデバイスを開発している。平成22年度は、デバイスの試作及び動作確認を行った。デバイスには、動物個体への負荷を軽減するための微小化と生体適合性、2光子顕微鏡を用いた高分解能観察を行うための光学特性と脳の拍動の抑制、実験試薬の脳組織への投与・除去、細菌感染の回避が求められる。そこでまず、前述の要求を満たすデバイスを設計し、マウス頭蓋骨への埋め込みが可能な微小サイズ(直径2.7mm、高さ400μm)のデバイスを作製した。デバイスの材料にはガラス及びpolydimethylsiloxane(PDMS)を用いた。そして、作製したデバイスを実際にマウス頭部に埋設し、2光子顕微鏡によりマウス脳組織中の神経細胞を観察した。デバイスにより観察部位の脳の拍動が1μm以下に抑えられたことで、脳の拍動による画像のブレが生じず、サブμmレベルの高分解能観察が可能となった。さらに、デバイスを埋設したマウスの脳組織中の単一神経細胞の長期経過観察を行った。その結果、1ヶ月以上の長期にわたり神経細胞の微小構造の観察に成功し、デバイスの送液機能を利用した脳組織への試薬投与が可能な状態でのin vivo長期観察を実現した。以上の結果は、動物個体の行動と関連付けた精神疾患の治療法開発につながる可能性のある成果である。これまで、マイクロ流体デバイスは、主に細胞や血液など生体外に取り出した試料(in vitro)のバイオ分析ツールとして大きく発展してきた。本研究では、マイクロ流体デバイスを生体内(in vivo)に埋め込むことを提案し、生体組織中での細胞研究のためのマイクロ流体デバイス技術の開発を行った。まずは、in vivo観察の要請を満たした開放系のデバイスの開発を通じ、埋め込み型マイクロ流体デバイスのin vivo細胞研究への応用の可否を検討し、知見の蓄積や課題の抽出を行った。その結果、デバイスの最先端の神経細胞研究への有用性が示され、医学研究への応用を進めるなど一定の成果を得た。その一方で、観察窓部分への気泡の混入や試薬導入による脳組織の振動など既存のマイクロ流体デバイス技術の応用では解決できない課題が存在することも明確になった。そこで、物質透過性と柔軟性、生体適合性を有するハイドロゲルをマイクロ流体デバイスに応用するための要素技術を開発し、デバイスの送液系と脳組織をハイドロゲルで分離することで、上述の課題を克服した半開放系デバイスの開発を試みた。ハイドロゲルをマイクロ流体デバイスに応用するために、Tetra-PEG ge1とPDMSを接合しマイクロ流路を形成する手法であるハイドロゲルリアクティブマイクロポンディング法(HRMB法)を開発した。そして、実際にデバイス内の送液系と脳組織をハイドロゲルで分離した半開放系デバイスを作製し、デバイスを埋設したマウス脳組織の神経細胞の観察及び脳組織への試薬投与を達成した。本技術は、これまで困難であった生きたマウス脳組織中の神経細胞を長期的に観察が可能な状態での複数試薬の直接投与を可能とし、脳機能の解明や脳疾患の治療法開発に貢献することが期待される。

以上の背景の下、本研究は、マイクロ流体デバイスの分析対象を動物個体へと拡張した「埋め込み型マイクロ流体デバイス技術」を提唱し、埋め込み型デバイスに特有の設計指針の導出、要素デバイス技術の開発、及び試作デバイスによる有用性の実証を行った。具体的には、マウスを用いる神経科学研究に利用するための埋め込み型デバイスの実現を目指して、物理的、物理化学的、ならびに生物学的観点から求められるデバイスの設計指針を明らかにし、さらに、埋め込み型デバイス特有の課題を解決するべく適正化されたデバイス製造技術とデバイス設置手術を開発し、マウス頭部に埋設可能な光学観察、試薬投与機能をもつマイクロ流体デバイスを試作した。その結果、神経科学分野でこれまで技術的に困難とされてきた試薬投与を伴った状態での生きたマウス脳組織の長期経過観察を達成し、埋め込み型マイクロ流体デバイス技術の有用性を示した。現在までに、in vivo観察の要請を満たした埋め込み型インターフェイスデバイスが開発され、すでに本デバイスを用いた医学研究が進められているため。今後、本デバイスが埋設されたマウスを用いた実験を通じて、新たな医学的知見が得られると期待される。第一世代の埋め込み型インターフェイスデバイスを用いたin vivo案験から得られた課題(試薬溶液の送液速度の制御性・脳組織への庄力負荷・脳組織の振動)を克服する第二世代のデバイスの開発を進める。本研究課題でこれまでに開発したTetra-PEG ge1とPDMSを接合してハイブリッド型マイクロ流路を形成する技術を応用し、第二世代デバイスを開発する。最終年度にあたる平成24年度には、埋め込み型のマイクロ流体デバイス技術に関する知見を一般化・体系化しまとめる。
高密度コラーゲン材料と多血小板血漿を併用した新たな椎体固定法の開発

現在、脊椎領域では、長範囲矯正固定術などの侵襲の大きな手術が普及し、椎体の骨癒合不全は成績不良に直結する重大な問題となっている。本研究では確実に骨癒合を得る方法を模索すべく、高密度にコラーゲンを含む同種骨組織とコラーゲン結合型塩基性線維芽細胞増殖因子(CB-bFGF)を用いた骨形成促進法の開発を行った。ラット後側方固定モデルを用いて検討を行った結果、CB-bFGFを結合させた同種骨は、同種骨単独に比べ高い骨形成能を有していることが明らかになった。また、組織学的検討から、CB-bFGF結合同種骨は軟骨形成促進を介して骨形成を促進していることが明らかになった。本方法は骨癒合促進に有用かもしれない。株式会社ニッピとの共同研究のもと、コラーゲンを積層する技術を用いて半径34mmの円柱状のケージの作成に成功した。完成した円柱の中心部に径の異なる金属棒で、空間を作成した。径3mmの管は技術的に強度を保つことは困難であり、径1.5mmのスペースを作成し、ケージのデザインとした。300gのSDラット(n=2)の尾椎Co5/6椎間を露出し、先にデザインしたケージを挿入し、経時的にレントゲンで撮影を行った。骨癒合の判定はレントゲンでは困難であり、専用のデバイスに尾椎を固定して前後屈を行い、その可動範囲が1°未満となった時期を計測した。結果、ケージの内部に何も移植しない場合、術後約8週で骨癒合することを確認した。次に別個体から作成したラットPratelet rich Plasma(PRP)をケージに30分浸潤させ、コントロールとして同個体より作成したPratelet poorPlasma(PPP)を用いた(各n=4)。骨癒合期間はPRP群5.8±1.3週、PPP群8.0±0.8週とPRP群で有意に短かった(t検定、p<0.05)。また、レントゲン上、経時的に椎間板高位が徐々に低下していたが、両群間で投影学的な有意差を認めなかった。組織学的には術後2週、4週で2群を比較した。H-E染色では術後2週で有意な差を認めなかったが、術後4週でコラーゲン構造の周囲にPRP群で骨芽細胞が増加している傾向を認めた。昨年度までの研究から、コラーゲン材料とPRPを用いることで椎体局所での骨形成を促進できることを示した。しかし、PRPの調整法によって大きく成長因子の含有量が異なり骨形成促進作用にばらつきを生じた。他方、申請者らはコラーゲン結合ドメインの融合タンパク(bFGF-CBD)に結合させた同種骨をマウス大腿骨に移植すると、bFGFを凌駕する骨形成能を示すことを報告した。本年度はコラーゲンを高密度に含む同種骨とbFGF-CBDを用いてラット後側方固定(PLF)モデルにおける骨形成促進能を検討した。Wistarラットの両側L4/5横突起間に片側150mgの凍結乾燥同種骨を移植しPLFを施行した。骨移植前に同種骨をPBSと混合したPBS群と、FGF-CBD150mgと混合したFGF-CBD群の2群を作成した(各n=14)。隔週で単純レントゲンによる移植骨面積を、術後10日でマイクロCTを使用して、移植骨周囲の新生骨面積を計測、非脱灰組織標本を作製してH-E、von Kossa、ALP染色で評価した。移植骨の面積は、PBS群で術直後の6.1%、bFGF-CBD群で31.1%と両群で移植骨の吸収を認めたが、bFGF-CBD群がいずれの時期でも有意に面積が大きかった。マイクロCTでは、新生骨面積はbFGF-CBD群で、PBS群と比較し48.2%増加しており有意差を認めた。組織学的には、骨膜表面の膜性骨化における海綿骨構造の形成、および骨表面の軟骨形成、周囲に線維芽細胞の集簇がbFGF-CBD群で旺盛であった。骨移植とbFGF-CBDを併用することで、骨癒合が促進される可能性が示唆された。PRP内の成長因子濃度の検体は保存しており、今後計測予定である。脊椎外科組織標本は既に作成済みであり、今後、TRACP染色などの免疫組織学的評価を含めた詳細な検討を行う予定である。また、コラーゲン構造体の他、同様の検討を別個体から採取した大腿骨を採型した同種骨にて行う予定である。
生分解性材料としての多糖誘導体/脂肪族ポリエステル系ブレンドの設計と特性解析

種々のセルロースアルキルエステル誘導体とポリ(ε-カプロラクトン)(PCL)とのブレンドの相溶性に及ぼすセルロースエステルの置換基効果、ならびに相溶ブレンドの等温下での結晶化挙動について検討し、以下のような知見を得た。種々の側鎖長を有するセルロースエステル誘導体[cellulose-OCOC_nH_<2n+1>][側鎖炭素長N=(n+1)=27]のうち、側鎖にブチリル基およびバレリル基を有するセルロースブチレート(CB)、セルロースバリレート(CV)がPCLに対して最もよく相溶する。これよりエステル側鎖長が短い場合は非相溶となり、反対に側鎖長が長い場合でも部分相溶でしかない。但しこの評価は置換度(DS)が概ね2以上の場合の結果であり、DSが低くなる(DS<1.5)とCB,CVもPCLとは非相溶となる。また、セルロース混合エステルの場合、バレリル基もしくはブチリル基が高置換度で導入されている場合に限りPCLと相溶する。化学構造的にPCLと類似しているブチリル基およびバレリル基が多数導入され、両成分の構造上のアフィニティが高くなることが、相溶性発現に大きく寄与していることがわかった。CV/PCL、CB/PCLに対する融点降下現象の評価より、両成分間には引力的な熱力学的相互作用が介在していることが示された。また、相溶ブレンドの結晶加速度は、セルロースエステル成分含有率の増加に伴って遅延される。ただしCB、CV成分はPCLの結晶化に際して核形成剤として作用しない。さらに、PCLの折りたたみ結晶の界面自由エネルギーはCB、CV含有率の増加に伴って増加し、ブレンドではPCL単独の場合に比べて結晶化しにくいことがわかった。このような、複合化に伴うPCL成分の結晶加速度の遅延は、両成分の相溶性が良好であることを支持している。上記に加え、キチン誘導体の分子複合系へ本研究を展開するための準備として、新規キチン・キトサン誘導体の合成とその物性評価、および、部分脱アセチル化キチンと親水性ポリマーからなるブレンドの相溶性評価、などを行った。セルロースアルキルエステル誘導体と代表的な脂肪族ポリエステルであるポリ(ε-カプラクトン)(PCL)とのブレンドを作製し,相溶性に及ぼすセルロースエステルの置換基ならびに置換度の効果について調べた.得られた主な知見は以下のようである.ジメチルアセトアミド-塩化リチウムを溶媒とする均一系にて種々の側鎖長を有するセルロースエステル誘導体[cellulose-OCOC_nH_<2n+1>][エステル側鎖長N=(n+1)=27]を合成し,ポリマー混合溶液からのキャスト法によってPCLとのブレンドを作製した.得られたブレンドの相溶性をDSC熱分析により評価したところ,側鎖にブチリル基(N=4),バレリル基(N=5)を有するセルロースブチレート,セルロースバリレートを用いたブレンドは単一のTgを与え,また組成に応じた明確なTgシフトを示し,これらがPCLに対して最もよく相溶することがわかった.エステル側鎖長がこれらより短い場合(N=2,3)は非相溶となり,反対に側鎖長が長い場合(N=6,7)でも部分相溶でしかない.但しこの評価は置換度(DS)が概ね2以上の,高置換度セルロースエステルを用いた際の結果であり,DSが低くなる(DS<1.5)とセルロースブチレート,セルロースバリレートであってもPCLとは非相溶となることがわかった.また,上記に加え,キチン誘導体の分子複合体へ本研究を展開するための準備として,キチンおよび部分脱アルセチル化キチンと種々の親水性ポリマーとのブレンドを作製し,その相溶性や分子間相互作用について評価検討した.種々のセルロースアルキルエステル誘導体とポリ(ε-カプロラクトン)(PCL)とのブレンドの相溶性に及ぼすセルロースエステルの置換基効果、ならびに相溶ブレンドの等温下での結晶化挙動について検討し、以下のような知見を得た。