hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物病原糸状菌感染植物の生体防御と病原体受容における情報伝達機構

HWC処理による過敏感反応の誘導過程において、0_2^-生成反応の活性化に先だって原形質膜結合Ca^<2+>の遊離がおこり、GTP結合タンパク質の増加、プロテインキナ-ゼ依存性のフォスフォリパ-ゼA2の活性化されることが判明した。一方、イネとトウモロコシに選択的に病原性を発現する<Bipolaris>___ー<zeicola>___ーに関しても病原体受容機構を解析し、本菌は胞子発芽過程に、非病原菌の侵入に対するイネおよびトウモロコシ細胞の拒絶応答を抑制するBZR毒素を生産することが判明し、しかもこのBZR毒素は単独では活性を示さない4つの類似複合成分からなることを明らかにした。また、<Alternaria>___ー<solani>___ーの感染因子として<Alternaric>___ー<acid>___ーが胞子発芽過程に生産され、それが宿主のジャガイモおよびトマトの原形質膜のH^+ーATPaseに直接影響を与えないが、膜における能動的H^+ー輸送を阻害することにより、宿主の原形質膜機能にが低下し、能動的拒絶反応の誘導抑制が菌の感染受容の一原因になっていることを示した。植物細胞の誘導抵抗性の機構と関連し、ナス科植物(ジャガイモ、トマト、ピ-マンおよびタバコ)の懸濁培養細胞では、Phytophthora属菌の菌体壁成分がエリシタ-となって過敏感細胞死を起こし、その細胞死は、供試したP.infestans,P.capsiciおよびP.nicotianae var.nicotianaeの水溶性グルカンによって宿主選択的に阻害されることを示してきた。この懸濁細胞の過敏感細胞反応の始動時には活性酸素が生成することをルミノ-ルを介した化学発光で検出し、細胞死抑制活性を示す水溶性グルカンはその活性化を阻害した。P.infestansのレ-ス0およびレ-ス1.2.3.4の遊走子発芽および侵入過程には比活性の高いグルカンが放出され、前者では中性と陰イオン性グルカンが、後者には陰イオン性グルカンのみが含まれていた。陰イオン性グルカンのTSKーGEL3000のカラムを用いたHPLC分析で、異なった宿主に対して選択的活性を示す数種のサプレッサ-グルカンが分画された。活性酸素生成系の活性化に関連し、エリシタ-と反応した懸濁細胞では膜結合型のCa^<++>が急速に遊離し、細胞内Ca^<++>が急速に増加する現象が、それぞれクロロテトラサイクリンおよびFluoー3というCa^<++>の蛍光検出薬により判明した。一方、Ca^<++>のキレ-ト剤のEGTAはそれらのCa^<++>の変動を阻害し、同時に活性酸素生成系の活性化も阻害した。また、活性酸素生成系の活性化に、GTP結合蛋白、CA^<++>ーカルモジュリン依存キナ-ゼの関与を示唆する結果が得られた。Alternaria alternata tomato pathotypeの生産する宿主特異的毒素のALーtoxinは感受性トマト品種のホスファチジルエタノ-ルアミン生合成系を阻害することが判明した。また、A.alternate strawberry pathotypeの生産するAFーtoxinは感受性イチゴ品種の懸濁培養細胞ならびにそのプロトプラストにも特異的に作用し、それらの系で毒素作用の定量的解明が可能となった。ナス科植物の誘導抵抗性の引金的反応であるNADPH
C13-ノルイソプレノイド系香気成分生合成経路の分子レベルでの解明

1.バラRosa damascena花弁に含まれるdamascenone香気前駆体の解明2.茶飲料製造過程で生成するdamascenone香気前駆体の解明茶飲料製造時、滅菌過程で異臭となる化合物が生成する。これらの一部がdamascenoneであることからこの前駆体3種を単離し、それぞれの立体中心も決定した。また、それらの生成経路についても考察した(論文投稿準備中)3.C13-ノルイソプレノイド生成酵素(カロテノイド分解酵素)の解明バラ花弁、果実(スターフルーツ、クインスフルーツ)、茶葉、キンモクセイなどはdamascenoneだけでなくiononeなどのC13-ノルイソプレノイドを特徴的香気成分として生成し、発散する。これらの生合成起源と考えられるカロテノイドを基質としてカロテノイド分解酵素を探索した。その結果、上記の植物中に当該酵素の存在を明らかとし、かつ、酵素の生化学的性状、基質特異性の解明、生成物の同定に成功した。これらの研究成果のうちスターフルーツ、クインスフルーツについては論文に既発表である。臭いの閾値が0.1ppb以下と低くバラの精油、茶、ワイン、リンゴやスターフルーツなどの果実の香気にとっては極めて重要であるダマセノン、β-イオノンなどのC-13ノルイソプレノイド化合物はC-40カロテノイド:ネオキサンチン、β-カロテンが酸化的に分解することによって生成するといわれている。しかし、この反応を触媒する鍵酵素、C-13ノルイソプレノイド香気成分に至る各反応の分子機構もほとんど明らかになっていないのが現状である。本研究においては主として以下の3点を中心にして研究を展開した。1.C-13ノルイソプレノイド系化合物の前駆体の同定2.仮想前駆体および酵素基質の化学合成3.カロテノイドからC-13ノルイソプレノイドへの変換過程を触媒する未解明の酵素系の解明バラの花弁からダマセノンの真の香気前駆体の単離、同定に成功し、その一部をアメリカ化学会発表し、論文として発表された。またスターフルーツ、キンモクセイ、茶葉にカロテノイドを分解する酵素の存在を確認し、その反応生成物がC13ノルイソプレノイドであることを明らかにした。これらの成果の一部も論文として発表した。これらの研究に必須な前駆体化合物の3,9-位の立体特異的合成にも成功した。以上のように、研究は当初の予定通り進捗している。しかし、この反応を触媒する鍵酵素,C-13ノルイソプレノイド香気成分に至る各反応の分子機構もほとんど明らかになっていないのが現状である。1.C-13ノルイソプレノイド系化合物の前駆体の同定2.仮想前駆体および酵素基質の化学合成3.カロテノイドからC-13ノルイソプレノイドヘの変換過程を触媒する未解明の酵素系の解明バラの花弁からダマセノンの真の香気前駆体の単離、同定に成功し、その一部をアメリカ化学会発表し、論文として発表された。また、茶飲料の滅菌過程で生成するダマセノン前駆体の化学構造も明らかにできた。また、それらの生成経路についても考察した(論文投稿準備中)

3.C13-ノルイソプレノイド生成酵素(カロテノイド分解酵素)の解明バラ花弁、果実(スターフルーツ、クインスフルーツ)、茶葉、キンモクセイなどはdamascenoneだけでなくiononeなどのC13-ノルイソプレノイドを特徴的香気成分として生成し、発散する。これらの生合成起源と考えられるカロテノイドを基質としてカロテノイド分解酵素を探索した。その結果、上記の植物中に当該酵素の存在を明らかとし、かつ、酵素の生化学的性状、基質特異性の解明、生成物の同定に成功した。これらの研究成果のうちスターフルーツ、クインスフルーツについては論文に既発表である。
ストレンジネスを含む原子核

本研究の目的はストレンジネスを含む核物理の新しい展開をはかることであり、以下にその研究成果の概要をしめす。1)ハイパー核γ線分光のために、ビームをもちいたテスト実験、開発研究の後、14台の高純度G,検出器とBGO Compton shieldからなるわが国最大規模のGe検出器システム(Hyperball)を完成させた。2)Hyperballを用いた^7Li_Λの実験で史上はじめて高分解能(keV)のハイパー核γ線の観測に成功し、spin doublet間のM1遷移からΛNのspin-spin相互作用が明らかとなり、E2遷移の寿命測定からΛがLi核の半径を小さくすることが初めて実験的に明らかとなった。3)^9Be_Λと^<13>C_Λのハイパー核γ分光の実験でΛのspin-orbit相互作用に起因するレベルの分岐の値が初めて測定され、従来のOBE-modelの予想よりはるかに小さいことが明らかとなった。4)ΛNの弱い相互作用について、ハイパー核の寿命と非中間子崩壊の陽子・中性子比の精密な新しいデータや、スピン偏極したハイパー核からのパリティの破れによる崩壊粒子の非対称についてはじめて信頼できるデータをだした。5)Ξハイパー核の束縛状態の証拠を示し、HダイバリオンについてはΛΛの共鳴状態の可能性を示唆する結果をえるなど、今後の実験の一つの方向を示した。6)ダブルハイパー核探索の実験のための新しい検出器システム(ハイブリッドエマルジョンシステム、パイオン用円筒型検出器(CDS))がともに完成し、KEKとBNLでKビームを用いて実験を行いデータをとることができ、現在解析が順調に進んでいる。7)ワークショップなどを通じて、ハイパー核の生成、構造、ハイペロン-核子の相互作用などのテーマについての多くの理論研究、計算がすすみ、これまですでに100編近くの論文がでている。日中共同シンポジウムをはじめとする国際シンポジウムや、国内の研究会を開催し、国内外のこの分野の研究のactivityをあげた。総括班の役割は、この重点領域研究(ストレンジネスを含む原子核)の設定目的である。柱となる計画研究の進行を有機的にはかること、及びこの研究分野の現状を把握し、今後の重要課題を明らかにして、国内外の研究者を組織することにある。今年度は初年度であり、まず7月に70名規模の研究会『ストレンジネスと原子核』を3日間にわたって開催し、ストレンジネス核物理の現状をレビューし今後の研究計画を検討した。研究会での報告、討論を報告集として印刷配布した。さらに、12月にはINS国際シンポジウムに合わせて、ハイパー核に関する国際ワークショップを開催し、国外の研究者との研究討論を行い、又、同月末には、特にこの重点領域研究の柱であるγ線核分光についての研究会を開催した。これらの研究会を通じて、他分野、国外の研究者と、又、理論・実験研究者の相互討論を行い、研究の進展に大きな力となった。又、10月には、Brookhaven国立研究所に実験のプロポーザルを提出し、その多くが認められたのも大きな成果である。又、平成9年4月から始まるBrookhaven国立研究所でのS=-2核の探索実験(計画研究A3)の準備を多くの研究者を派遣して行った。又、この重点領域研究の為の事務局を京都大学理学部に置き、ニュースの発行など、各研究の連携及び研究者の組織化を行った。各計画研究は順調にスタートしており、初年度としては順調なすべり出しと云えるだろう。

総括班は、領域全体の目標を実現すべく、各計画研究の代表者を含むメンバーが、学会や研究会その他の機会に総括班会議を開催し、各研究の進展状況と今後の計画研究の検討や研究会を組織するなどの研究活動を行ってきた。とくに国内外のこの分野の研究の発展をはかるという立場で研究会活動をおこなってきており、一定の成果をあげてきたと考えている。今年度開催した研究会は、以下のとうりである。1)1997.7.12-14『ストレンジネスと原子核』(蓼科高原)1)については報告集をすでに出版しており、この領域全体の研究の進展状況と成果はこの報告書に詳しい。領域全体の中で特筆すべきこととしては、1)ハイパー核γ線分光のための高純度Ge検出器の建設がほぼ終わり、ビームをもちいたテスト実験が順調に進んでいる。2)ダブルハイパー核探索の実験のための検出器システム(ハイブリッドエマルジョンシステム、パイオン用円筒型検出器(CDS))がともに完成し、それぞれKEKとBNLで実際のKビームを用いて実験をはじめた。3)Hダイバリオン探索についてはAAの共鳴状態の可能性を示唆する結果を得た。4)ハイパー核の生成と構造に関する理論計算の進展。などがあげられる。今年度はこの特定領域研究の最後の年でもあり、いくつかの計画研究で成果をあげるべく総括班としても努力した。とりわけブルックヘブン国立研(BNL)では5月から12月までに計画研究の3つの実験がおこなわれた。総括班では実験をスムースに遂行できるよう研究者の派遣など研究組織の調整を行い、結果としてΛハイパー核のγ分光実験とダブルハイパー核探索実験のデータを取得することができた。また総括班としては大きな研究会として次の二つの研究会を組織した。11月に箱根で"ストレンジネスと原子核"と題するこの分野の全体的な研究会を行い、約70名が参加して最新の研究結果について討論を行った。特にハイパー核の寿命やγ線分光の新しいデータが報告され活発な議論があった。さらにこの2月には、APCTP(Asia Pacific Center for TheoreticalPhysics)と協賛してIntemational Workshop for Strangeness Nuclear Physicsと題する国際会議をソウルで開催した。この特定領域研究で得られた成果が数多く報告され国際的にも大きな注目をあびることとなった。5月には"超原子核の世界"と題する公開講演会を東京で開催した。さらに総括班会議などで領域全体の研究の進展状況を検討して、特にハイペロン-核子散乱実験のデータ解析などのman powerの必要と思われる分野を強化するなどのことを行った。全体としては当初の研究計画をほぼ遂行しえたと考えている。今年度は特定領域研究(ハイパー核)の成果のまとめの年であり、計画研究を中心に研究結果をだして、それについて検討し論文にまとめることに努力した。KEKおよびBNLでのΛハイパー核のγ分光実験は、ハイパー核の微細構造を始めてあきらかにし、ΛN相互作用のスピン依存性を明らかにするなどの大きな成功を収め、国際会議などで発表され注目をあびた。ハイパー核の精密γ分光学の分野を切り開いたことはこの特定領域研究のなかでも特筆すべき成果といえよう。
子どもが生活文化を体得する過程に関する実証的研究

本研究の目的は2つあり、1つは、母子のままごと遊びを分析し、子どもが生活文化を体得する過程を明らかにすることである。他の1つは、保育園児のままごと遊びを分析し、子ども間で生活文化の共有化がどのように図られるかを明らかにすることである。目的1の対象者は、1歳児とその母親44組であり、子どもが3歳になるまで継続研究を行った。目的2の対象児は、2-6歳の保育園児16名である。母子のままごと遊びは、対象児の誕生日の前後2週間以内に観察室で行われ、保育園児のままごと遊びは、保育園のままごとコーナーで任意に行われ、いずれもビデオに収録された。これらのビデオ映像をスロット及びスクリプトの観点から分析し、次の結果を得た。1.生活文化の体得過程:飲食に関するスクリプトの総表出数及びスクリプトを構成するスロット数は、子どもの年齢の上昇に伴い顕著に増加した。1歳時のスロットの獲得は、食べる行為に直接関連するものが中心となっていた。2歳時は食べる行為に付随する感謝・賞賛など、文化的色彩の強いスロットに拡大した。3歳時にはスクリプトの構造化が進むことが明らかになった。また、母親が子どもと同じスロットを表出することが、ままごと遊びの展開要件となることが明らかになり、子どもの生活文化体得に重要な機能を持つことが示唆された。2.保育園児の生活文化の共有化:保育園児のままごと遊びでは、スロットの行為的側面の共有だけでなく、意味の共有を図り、進行スロットを表出することがままごと遊びを継続する要件となることが明らかになった。本研究の目的は、子どもの生活を象徴するままご遊びに関するスクリプトの形成を指標とし、1歳児を対象に3年間継続研究を行い、子どもが遊びを介して生活文化を体得する過程を明らかにすることにある。本年度の研究対象は、1歳0か月児とその母親54組(男児20名、女児34名)である。対象児の誕生日の前後2週間以内に大学の観察室に来所を依頼する。観察室には、木製のままごとセット、バスセット、Bブロックセットの3種類の玩具を配置する。観察室の四隅にカメラを1台づつ設置し、母子の行動を録画後、パソコンに取り込み、5秒単位のファイルを作成する。ファイルを反復視聴し、スクリプトの構成要素であるスロットについて分析するため、38項目のカテゴリーに分類する。スロットの種類が最も多いスクリプトを抽出し、スロットの出現率と自発・受動・模倣における母子間比較および多くの子どもに出現した「食べる」「飲む」スロットと母親のスロットとの関係について分析し、以下の結果を得る。(1)子どものスロットは、日常生活の主要行為である「食べる」「飲む」に集中し、母親のスロットはその行為を促すスロットが多く出現する。(2)1歳0か月児のスクリプトの構造化に対して、母親の寄与が大きいことが明らかとなる。(3)母親のスロットは、子どもの行為を強化する効果をもつことが示唆される。本研究の自的は、子どもの生活を象徴するままご遊びに関するスクリプトの形成を指標とし、1歳児を対象に3年間継続研究を行い、子どもが遊びを介して生活文化を体得する過程を明らかにすることにある。本年度の研究対象は、2歳0か月児とその母親47組(男児15名、女児32名)である。観察方法及び分析方法等は、1歳児の場合と同様である。以下の結果を得た。(1)子どもの表出するスロットは、その種類数、出現ともに、母親の表出するスロットと類似の経口が認められた。(2)日常生活の主要行為である「喰べる」「飲む」

スロットは母子ともに多く表出し、子どもには調理や供応に関するスロットの表出が多く、母親には飲食時のマナーや「おいしいという」スロットの表出が多く認められた。(3)母親は、子どものスロットに対して、新たなスロットを付与し、統合させる機能を果たしており、2歳0か月時においても、母親はスクリプトの構造化に重要な役割を持つことが示唆された。(4)多くの子どもから表出された自発のスロットは、時系列的関係の中核をなしていることが明らかになった。本研究の目的は、子どもの生活を象徴するままごと遊びに関するスクリプトの形成を指標とし、1歳児を対象に3年間継続研究を行い、子どもが遊びを介して生活文化を体得する過程を明らかにすることにある。本年度の研究対象は、3歳0ヶ月児とその母親44組(男児14名、女児30名)である。対象の母子は、平成12年度から研究に協力を得ている人々である。対象児の誕生日の前後2週間以内に大学の観察室に来所を依頼する。観察室に木製のままごとセット、バスセット、Bブロックセットの3種類の玩具を配置する。観察室の四隅にカメラを各1台設置し、母子の行動を録画後、パソコンに取り込み、5秒単位のファイルを作成する。ファイルを反復視聴し、スクリプトの構成要素であるスロットを分析するため、38項目のカテゴリーに分類する。スクリプトの構造と特徴およびスクリプトの構造化に関する母親の関わりについて検討し、以下の結果を得る。(1)母子ともに食べるに関するメインスロット、飲むに関するメインスロットの全てが出現する。しかし、その出現は一様ではないことが明らかになる。(2)子どもは調理や供応、片付けに関するスロットの表出が多く、母親は飲食時のマナーや「おいしいという」などの賞賛のスロットの表出が多い。(3)食べるに関するスロットでは、母親は子どものスロットに対して発話や応答的な関わりをすることによりスクリプトの構造化を図るなど、スクリプトの構造化に母親が重要な役割を果たす。(4)飲むに関するスロットでは、子ども自身でスロットの時系列的関連づけが可能となり、子どもの内部で飲むに関するスクリプトの構造化が進展していることが示唆される。本年度の目的は、スクリプト及びスロットの獲得過程を子どもの年齢的発達との関連から明らかにすると共に、家庭保育児と保育園児のスクリプトの獲得過程について検討することである。対象児は、家庭保育児各年齢時(1歳時、2歳時、3歳時)44名とその母親及び保育園児16名(2歳から6歳児)である。家庭児のままごと遊びは、対象児の誕生日の前後2週間以内に行った観察室での母子のままごと遊びをビデオに収録した。保育園児のままごと遊びは、自由保育時間帯にままごとコーナーで任意に行われたままごと遊びをビデオに収録した。ビデオ映像についてスロット及びスクリプトについて分析を行い、次の結果を得た。スクリプト及びスロット獲得過程と子どもの年齢的発達:食べると飲むに関するスクリプトの総表出数は、子どもの年齢的上昇に伴い顕著に増加することが明らかになる。スクリプトを構成するスロット数も、子どもの年齢的上昇に伴い顕著に増加し、スクリプトの構造が複雑化することも明らかになる。1歳時のスロットの獲得は、食べる行為に直接関連するものが中心となるのに対して、2歳時は食べる行為に付随する感謝・賞賛など、より文化的色彩の強いスロットに拡大し、3歳時は殆どのメインスロットが、多くの子どもに表出されるなど、スクリプトの構造化が進むことが明らかになった。子どものスクリプトの獲得は、異種スロット→同一スロット→進行スロットという方向性を持つことが示唆された。
動作法訓練における障害を持つ子どもの社会相互作用と心身面の発達援助

長期4年間の動作法訓練における障害を持つ子どもの社会相互作用と心身面の発達援助の成果4年間で、ニューデリーのマザー・テレサ・ジーワン・ジョティ障害孤児施設、太宰府地域、Kota Kinabalu MalaysiaのSerimengasih施設の重度の脳性麻痺、自閉症、情緒障害、ダウン症、知的障害を持つ子ども45名に動作訓練による心身面の発達援助及び社会相互作用の援助。長期4年間の動作法訓練における障害を持つ子どもの社会相互作用と心身面の発達援助の成果現在、トレーナー、トレーニーと保護者の社会相互作用の集めたデータを分析して論文を書き、2008年7月20日25日までのXXIXth International Congress of Psychology, Berlin, Germanyで発表し、動作法のプレー・コングレス・ワークショップを行う予定である。平成20年4月11日12日まで太宰府市の社会総合福祉センターで自閉症を持つ子ども6名と脳性まひの子ども3名にKwak先生の協力を得て、一泊二日の動作法訓練会を行った。Seri Mengasih Institute, Kota Kinabalu,マレーシアで平成20年8月5日12日まで障がい児に臨床心理学の心理リハビリテーションのワークショップを行い、トレーナー、トレーニーと保護者の社会相互作用のデータを収集した。トレーナーのためにも臨床動作法の一日の研修を行った。平成20年12月15日28日までManasa Institute, Shimoga; Balvantray Mehta Special School, New Delhi; Mother Teresa障がい孤児施設New Delhiインド(3箇所)で障がいを持つ子どもに臨床心理学の心理リハビリテーションのキャンプを行い、トレーナー、トレーニーと保護者の社会相互作用のデータを収集した。知的障がい、脳性麻痺、自閉症、運動障がいを持つ子どもがインドのキャンプで計41名とマレーシアでは13名の参加だった。20年度に知的障がい、自閉症、脳性麻痺を持つ子ども9名に毎週土曜日大宰府の総合福祉センターで研究用の1日動作法訓練を継続的に行った。平成21年12月12日13日まで太宰府市の社会総合福祉センターで自閉症を持つ子ども3名と脳性まひの子ども3名に井村修先生の協力と、平成22年2月20日21日までマレーシアからのNgo York Kong先生& Jenny Tham先生のアドバイスを得て、一泊二日の動作法訓練会を行った。Seri Mengasih Institute, Kota Kinabalu,マレーシアで平成22年3月4日6日まで障がい児に臨床心理学の心理リハビリテーションのワークショップを行った。トレーナーのためにも臨床動作法の3時間の研修を行った。平成22年2月10日12日までMother Teresa障がい孤児施設New Delhiインドで障がいを持つ子どもに臨床心理学の心理リハビリテーションのキャンプを行った。それぞれのところでトレーナー、トレーニーと保護者の社会相互作用と心身面の変化についてのデータを収集した。知的障がい、脳性麻痺、自閉症、運動障がいを持つ子どもがインドのキャンプで計18名とマレーシアでは21名の参加だった。21年度に知的障がい、自閉症、脳性麻痺を持つ子ども7名に毎週土曜日大宰府の総合福祉センターで研究用の1日動作法訓練を継続的に行い、研究データを収集した。
核酸医薬デリバリーにおける自然免疫活性化機構の解明とその制御に関する研究（国際共同研究強化）

本国際共同研究では、基課題の研究成果を基に、核酸・ナノキャリア複合体の自然免疫活性化機構を利用した静脈内投与型ワクチン開発に係る基礎的検討を進める。申請者らは、微粒子表面に提示されたPEGがT細胞非依存性抗原として脾臓辺縁帯のB細胞受容体に認識され、濾胞へと送達される極めてユニークな現象を明らかにしている。さらに、抗PEG抗体分泌がPEGと核酸(TLRリガンド)の共局在・共刺激によって増強された事から、核酸含有PEG修飾リポソームが脾臓濾胞への抗原送達体として優れているだけでなく、細胞選択的なアジュバントとしても機能するのではないかという仮説を得るに至った。そこで本共同研究ではこれらの研究成果を基に、T細胞非依存性抗原(PEGおよびポリリポサッカライド)とTLRリガンドを共役したナノ粒子を創製し、これにT細胞依存的抗原を封入することで、T細胞非依存的免疫をうまく利用した静脈内投与型ワクチンの開発を目的として研究を進めている。当該年度では、OVAをT細胞依存的抗原とし、これをPEG修飾リポソームに封入し、TLR刺激剤としてa-galactosylceramideを共封入した製剤を開発し、これをEG7-OVA(OVA発現がん細胞)移植モデルマウスに投与して腫瘍増殖抑制効果を評価したところ、良好な降下を得ることができた。また、治療期間を通じて、被験動物に顕著な体重減少が見られなかったことから、懸念していた強い毒性は生じない可能性が示唆された。現在、本製剤の安全性について、検討を進めているところである。事前の十分な打ち合わせにより、製剤を効率よく調製し、in vivoでの抗腫瘍効果の評まで到達できているため。また、成果の一部を論文として発表できたため。渡航前に十分な打ち合わせを行い、また予備検討等を入念に行うことで、効率よく安全性の試験を行い、本課題の目的を達成する。既に次回の渡航日程を確定させており、具体的な結果が得られる見込みである。内定年度:2015本国際共同研究では、基課題の研究成果を基に、核酸・ナノキャリア複合体の自然免疫活性化機構を利用した静脈内投与型ワクチン開発に係る基礎的検討を進める。申請者らは、微粒子表面のPEGがTI抗原としてMZ-B細胞受容体に認識され、濾胞へと送達される現象を明らかにした。この現象を利用すれば、抗原と核酸を含むPEG修飾リポソームが脾臓濾胞へ抗原を送達するだけでなく、TLR刺激を介したアジュバントとしても機能する可能性が高い。一方で、核酸・ナノキャリア複合体は血中の補体系や単核球を活性化し有害事象を引き起こす可能性も考えられる。そこで本共同研究では、T細胞非依存的免疫をうまく利用した静脈内投与型ワクチンの開発を目的として、T細胞非依存性抗原(PEG)とTLRリガンドを共役したナノ粒子の創製、これにT細胞依存的抗原を封入したワクチン効果の検討、静脈内投与時の免疫反応の検討を行う。当該研究期間においては、共同研究者らと十分な事前打ち合わせを行った後、実際に渡航して検討を行った。意図したナノ粒子の作製を共同研究先が保有する超高速ナノ医薬作製装置(NanoAssemblrTM)を用いて行った。検討の結果、アジュバントであるレシキモドとT細胞依存的抗原であるモデルタンパクを良好に含有するモデル微粒子の作成に成功した。さらに、調製の条件を変えることで上記成分の含有量が異なると同時にその粒子径も異なる複数のモデル微粒子を得ることもできた。現在、これらを静脈内投与した際の生体反応について検討を開始したところである。渡航期間は短いものであったが、事前の十分な打ち合わせにより、微粒子製剤のプロトタイプを短期間で調製する事ができ、次のステップに進む事ができたため。本研究では、基課題の研究成果を基に、核酸・ナノキャリア複合体の自然免疫活性化機構を利用した静脈内投与型ワクチン開発に係る基礎的検討を進めている。申請者らは、微粒子表面に提示されたPEGがT細胞非依存性抗原として脾臓辺縁帯のB細胞受容体に認識され、濾胞へと送達される極めてユニークな現象を明らかにした。さらに、抗PEG抗体分泌がPEGと核酸(TLRリガンド)の共局在・共刺激によって増強された事から、核酸含有PEG修飾リポソームが脾臓濾胞への抗原送達体として優れているだけでなく、細胞選択的なアジュバントとしても機能するのではないかという仮説を得た。昨年度に引き続き、超高速ナノ医薬作製装置(NanoAssemblr)を使用し、効率よくナノ微粒子が作製できるよう工夫した。がんワクチンへの応用として、担がんモデルマウスの系で検討を行ったところ、良好な抗腫瘍効果を示すことがわかり、微粒子の更なるチューンアップを進めている。一方で、静脈内投与により急性のアレルギー様反応を示すことも確認しており、効果と副作用のバランスをどのようにとるかが今後の課題となっている。この点に関しても、改善を目指し、共同研究先と議論を進めている。当初の計画通りに研究が進展するとともに、新規な知見も得られ始めている。また、共著での論文発表も間近となっているため。

本国際共同研究では、基課題の研究成果を基に、核酸・ナノキャリア複合体の自然免疫活性化機構を利用した静脈内投与型ワクチン開発に係る基礎的検討を進める。申請者らは、微粒子表面に提示されたPEGがT細胞非依存性抗原として脾臓辺縁帯のB細胞受容体に認識され、濾胞へと送達される極めてユニークな現象を明らかにしている。さらに、抗PEG抗体分泌がPEGと核酸(TLRリガンド)の共局在・共刺激によって増強された事から、核酸含有PEG修飾リポソームが脾臓濾胞への抗原送達体として優れているだけでなく、細胞選択的なアジュバントとしても機能するのではないかという仮説を得るに至った。そこで本共同研究ではこれらの研究成果を基に、T細胞非依存性抗原(PEGおよびポリリポサッカライド)とTLRリガンドを共役したナノ粒子を創製し、これにT細胞依存的抗原を封入することで、T細胞非依存的免疫をうまく利用した静脈内投与型ワクチンの開発を目的として研究を進めている。当該年度では、OVAをT細胞依存的抗原とし、これをPEG修飾リポソームに封入し、TLR刺激剤としてa-galactosylceramideを共封入した製剤を開発し、これをEG7-OVA(OVA発現がん細胞)移植モデルマウスに投与して腫瘍増殖抑制効果を評価したところ、良好な降下を得ることができた。また、治療期間を通じて、被験動物に顕著な体重減少が見られなかったことから、懸念していた強い毒性は生じない可能性が示唆された。現在、本製剤の安全性について、検討を進めているところである。事前の十分な打ち合わせにより、製剤を効率よく調製し、in vivoでの抗腫瘍効果の評まで到達できているため。また、成果の一部を論文として発表できたため。渡航前の事前の打ち合わせ、また予備検討等を行うことで、滞在が短期間であっても十分な成果を得られるように努める。具体的には、共同研究先に一部のプロトタイプ製剤の調製を依頼するなどする。渡航前の事前の打ち合わせ、また予備検討を十分に行うことで、滞在が短期間であっても十分な成果を挙げられるように努める。さらには共同研究先に渡航前に製剤の調製を依頼し、到着後直ぐに試験をすることができるように調整を十分に行う。渡航前に十分な打ち合わせを行い、また予備検討等を入念に行うことで、効率よく安全性の試験を行い、本課題の目的を達成する。既に次回の渡航日程を確定させており、具体的な結果が得られる見込みである。
ツシマヤマネコ保全に向けた食物連鎖の解明及び腸内細菌叢と個体特性との関連解析

ツシマヤマネコは長崎県対馬にのみ生息している。生息地の破壊等により、生息数が減少している。非侵襲的な手法である糞を用いた解析は、野生個体の解析に非常に有用である。食性の正確な情報は、域内保全や飼育個体の飼育管理に極めて有用である。また、免疫等に関連する腸内細菌叢の解析は種の保全に有用な情報となりうる。本研究では、次世代シークエンサーを用い、食性解析及び腸内細菌叢のメタゲノム解析を実施した。飼育下個体及び野生下の糞便からDNAを抽出し、次世代シークエンス用ライブラリー作成を目的にPCR、タグ標識を実施したが、最終ライブラリー濃度が低く、条件の再検討が必要であった。ツシマヤマネコは絶滅危惧種であり、国や多くの機関が保護増殖事業に取り組んでいるが、保全のためには生態学や栄養学など様々な知見が必要である。近年、希少種の保全に分子遺伝技術(次世代シークエンス)が応用されるようになってきており、申請者らもグレビーシマウマなどの保全に有用なマイクロサテライトマーカーの開発を行ってきた。本課題ではツシマヤマネコの保全に資する目的で、次世代シークエンスを用いて,食性と腸内細菌叢の解明を目的として実施した。本年度は,ツシマヤマネコ保全事業を実施する環境省と公益社団法人日本動物園水族館協会平成28年度はツシマヤマネコの保全に取り組む各関係機関から,研究内容について協議を行い,研究の有用性・必要性について了解を得た。ツシマヤマネコ飼育機関・保護施設から40検体,近縁種のベンガルヤマネコ4検体の提供を受け,DNA抽出を行った。また,京都市動物園提供3検体については検体保存状況及びDNA抽出条件の検討を行った。また,中部地方の動物園を対象にDNA細胞データベース構築を目的に研修会を開催し,動物園における分子遺伝学的技術の応用を検討した。環境省,公益社団法人日本動物園水族館協会が共同で種の保存に取り組んでいる種であり,検体採取・提供までに想定より時間を要したが,許可後は各機関より速やかな協力が得られたため。ツシマヤマネコ(Prionailurus bengalensis euptilurus)はベンガルヤマネコ(P. bengalensis)の一亜種で、長崎県対馬にのみ生息している。生息地の破壊等により、生息数が80-110頭に減少し、絶滅危惧種IA類に指定されている。糞解析においても次世代シークエンサーにより詳細な食性の解析が可能となる。また、動物の腸内には非常に多くの腸内細菌が存在しており、それらは動物の健康にとって重要な役割を果たしており、抗生剤投与等による腸内細菌叢の変化は致死的な疾患につながることもある。これらの背景から本研究では、次世代シークエンサーを用い、食性解析及び腸内細菌叢のメタゲノム解析を実施した。飼育下個体の糞便72検体(一部の個体では、採取・保存条件を変えて採取)、野生下の糞便64検体からDNAを抽出した。飼育下個体については、飼育状況(出自、移動歴、出産歴、給餌内容、抗生剤・整腸剤使用の有無)についてアンケートを実施した。野生採取糞便のうち、63検体はベンガルヤマネコ配列を増幅するPCRにおいて増幅が確認された。腸内細菌叢、食性解析とも次世代シークエンス用ライブラリー作成を目的にPCR、タグ標識を実施したが、最終ライブラリー濃度が低く、条件の再検討が必要であった。また、野生下において、季節や成長による腸内細菌叢の変化を把握するために、ベンガルヤマネコにおいて開発されたマイクロサテライトマーカーを用いて、個体識別及び遺伝的多様性の評価を行った。結果、ツシマヤマネコは大陸に生息するベンガルヤマネコと比較し、極めて低い遺伝的多様性しか有しておらず、12マーカーのみでは個体識別は不可能であった。飼育個体についてはほぼ全個体検体を収集できたが,野生個体については2検体のみである。過去に採取された検体について,提供を依頼し検体数を増加させる。収集した検体については当初の計画通り,細菌叢及び食性解析を実施する。また,過去の野生由来の検体について,収集が可能であれば,季節・採取地域の食性の比較を実施したい。29年度が最終年度であるため、記入しない。保全遺伝学29年度が最終年度であるため、記入しない。
消化管平滑筋層の自動運動を調節する細胞群

消化管平滑筋層の自動運動を調節する細胞群として筋層のペースメーカー細胞(c-Kit発現細胞)と組織常在型マクロファージの研究を行い、以下の成果を上げた。1.ぺースメーカー細胞(c-Kit発現細胞)についてペースメーカー細胞はレセプターチロシンキナーゼc-Kitを発現し、これに依存して分化増殖する。このc-Kitの発現を抑制するとペースメーカー細胞の正常な発生、分化が障害され、律動的自動運動は消失する。このときペースメーカー細胞として分化すべき細胞は外縦走筋細胞へと分化の方向を転換した事を示し、論文発表した。またc-Kit陽性細胞の培養系での解析を試みた。培養細胞塊(直径30-100μm)の中にc-Kit免疫活性陽性細胞を同定し、共同研究者の中山がこの陽性細胞からペースメーカー電流を生理学的に(Patch clamp法)検出し投稿した。また鳥橋はカルシウム蛍光指示薬を用いて、培養細胞塊に含まれるペースメーカー細胞のカルシウム動態を記録し投稿する予定である。2.組織常在型マクロファージについてラット回腸の筋層をlipopolysaccharide(LPS)で処理する筋層の組織常在型マクロファージはprostaglandinおよび一酸化窒素(NO)を産生し、これらは平滑筋を弛緩させた。またこれと同時に主用組織適合抗原クラスIIを発現し、リンパ球を介して免疫応答を惹起した。この結果を論文発表するとともに国際学会で口頭発表した。またマクロファージにFITCをラベルしたdextranを取りこませたところ、取りこみ刺激は誘導型合成酵素であCOX2を発現してprostaglandinを産生するがNOの産生は見られず、平滑筋の収縮も起こさなかった。これについて口頭発表および論文発表を予定している。今後の課題として、カルシウムを指標としてぺースメーカー機構の解析を試みる。またマクロファージの活性化に関わるサイトカインそして活性化マクロファージのペースメーカー細胞に対する作用を検討する。消化管平滑窃層の自動運動を調節する細胞群として筋層内のペースメーカー細胞(c-kit発現細胞)と組織マクロファージについて研究し以下のごとく成果を上げた。1.ペースメーカー細胞(c-kit発現細胞)についてモルモットの結腸には生理学的に強く規則正しく自動運動が計測される部位がある。この部位を形態学的に検索をした結果、ここにc-kit発現細胞であるペースメーカー細胞が特に多く分布していることがわかった。さらにこのべースメーカー細胞が特殊な平滑筋細胞であることを示した。またこれまで不明であったヒト消化管のペースメーカー細胞についてc-kitを指標とした免疫組織化学で分布を明らかにした。ヒト結腸のペースメーカー細胞が神経節細胞を欠くヒルシュスプルング病患者で変化するかどうかについて検討したところヒルシュスプルング病患者でもペースメーカー細胞は正常と変わり無く分布していることがわかった。以上の結果についてはすべて口頭および論文で発表した。2.組織マクロファージについて平滑筋層にはほぼ均等に密に分布するマクロファージが存在する。食胞は通常目立たないが主要組織適合抗原クラスIIを発現している。これらのマクロファージの機能について検討した。細菌毒素のひとつリポポリサッカライド(LPS)を含む培養液で筋層を処理するとこれらマクロファージは誘導型のNO合成酵素を発現し、NOを産生ずるようになる。その結果筋層は弛緩した。これらの反応は経時的に増強した。

さらにヒルシュスプルング病のモデルラットでは消化管運動異常から腸内細菌が増加し、腸内環境は悪化しているがこれを反映するようにこのモデル動物ではマクロファージの数がコントロールと比べて有意に増加していた。以上の結果については投稿準備中である。また今後、増殖したマクロファージがNOを産生し実際に平滑筋を弛緩させているかどうかについて検討していく。消化管平滑筋層の自動運動を調節する細胞群として筋層のペースメーカー細胞(c-Kit発現細胞)と組織常在型マクロファージの研究を行い、以下の成果を上げた。1.ペースメーカー細胞(c-Kit発現細胞)についてc-Kitの発現を抑制するペースメーカー細胞の正常な発生、分化が障害され、律動的自動運動は消失する。このときペースメーカー細胞として分化すべき細胞は外縦走筋細胞へと分化の方向を転換した事を示し、論文発表した。さらにc-Kitの免疫活性を指標としてペースメーカー細胞の単離培養を試みた。培養3日から7日の培養細胞および細胞塊(直径30-100μm)の中にc-Kit免疫活性陽性細胞を同定し、共同研究者の中山がこの陽性細胞からペースメーカー電流を生理学的に(Patch clamp法)検出した。今後この系を用いた研究を継続する。2.組織常在型マクロファージについてラット回腸の筋層をlipopolysaccharide(LPS)で処理すると筋層の組織常在型マクロファージはprostaglandinおよび一酸化窒素を産生し、これらは平滑筋を弛緩させる。またこれと同時に主用組織適合抗原クラスIIを発現し、リンパ球を介して免疫応答を惹起した。またマクロファージにFITCをラベルしたdextranを取りこませたところ、取りこみ刺激は誘導型合成酵素であCOX2を発現してprostaglandinを産生するがこれを抑制する系も存在する事がわかった。これらの結果について口頭発表および論文発表を予定している。消化管平滑筋層の自動運動を調節する細胞群としてペースメーカー細胞(c-kit発現細胞)と組織常在型マクロファージの研究を行い以下の成果を得た。1.ペースメーカー細胞について生後約10日齢のマウス小腸より筋層を剥離し、細切の上コラーゲネース処理をした。これを48時間培養して平滑筋およびペースメーカー細胞を含む直径約100μmの筋層の組織小塊をえた。これは律動的な自動収縮運動を示した。研究分担者中山はパッチクランプ法により生理学的に周期的な電流を記録した。その周期はvivoでの微小電極法によって計測され、ペースメーカー細胞から発生すると考えられている膜電位変動(緩徐波)の記録とほぼ一致した。組織学的に検索したところこの組織小塊には微細構造上正常な平滑筋、ペースメーカー細胞と考えられているカハールの介在細胞そして少数の壁内神経が認められた。研究代表者鳥橋はこの組織小塊に蛍光カルシウム指示薬を添加して組織小塊のカルシウム変動を記録した。その結果、収縮と同調する組織小塊全体のカルシウム変動が認められた。
多様な英語への対応力を育成するウェブ教材を活用した教育手法の研究

平成30年度は、本研究の目的と年度計画に基づき、以下の実績を上げた。1.インドのデリー大学のSatynath准教授の指導のもとで完成したインド英語の40会話のスクリプトを使い、平成30年7月に神田外語大学と東京外国語大学においてスタジオ収録影を行った。その際に、Satynath准教授と助手のSharma氏を招聘し、スタジオ収録の現場で出演者たちを指導してもらった。さらに、両氏に神田外語大学と東京外国語大学においてインド英語についての講演を行ってもらい、インド英語についての研究会を開催した。その後、研究協力者たちが、最終版のスクリプトと収録した動画音声をもとに、字幕、和訳、語彙記述、発音記述を行った後、ウェブページを構築し、平成31年2月「インド英語会話モジュール」を両大学の専用ウェブサイト上で公開した。2.平成31年1月にフィリピン英語会話モジュールの40会話のスクリプトをフィリピンのデラサール大学の研究者たちに依頼した。2月末、研究代表者の矢頭と研究協力者の小中原がフィリピンを訪問し、デラサール大学のDita准教授が監修したフィリピン英語の40会話のスクリプトの内容について説明を受け、フィリピン英語の特徴について研究した。3.東京、静岡、福岡、札幌など全国10都市で開催された全国7外大連合主催の公開講座において、高校生を対象に、すでに公開している英語会話モジュールを使って「世界の英語」と題する講座を行い、本ウェブ教材の有効性を検証した。また、9月に神田外語大学で開催された「通訳ボランティア育成セミナー」と11月に開催された「スポーツ・リベラル・アーツ講座」において大学生を対象に同様の講座を行った。4.本科研の代表者と分担者たちが、本報告書10.に示すように、それぞれ学術誌等に論文を発表し、学会や研究会で報告した。平成30年度は、研究代表者矢頭典枝の責任のもと、モジュール開発と研究が当初の計画通り、円滑に遂行された。インド英語会話モジュールのスタジオ収録を年度の前期に行ったために、その後の編集作業に十分な時間を費やすことが出来た。他言語・多民族国家インドの英語は、欧米の英語と異なり、話者の母語、出身地、社会階層、教育レベル、欧米の英語との接触の度合いにより、きわめて多様な英語として表れるため、出演者たち一人ひとりの背景を調べることが重要となり、分析が困難を極めた。モジュールの編集に携わった多くの研究協力者たちが、膨大かつ難解な作業を遂行するのに尽力し、本科研代表者と分担者たちも時間をかけて監修し、さらなる分析と修正を行い、その結果、満足のいくモジュールを公開することが出来た。また、2月末にフィリピン英語会話モジュールの40会話のスクリプトが完成したため、次年度における完成を円滑に行う布石を敷くことができた。さらに、今年度は高校生と大学生を対象とする数多くの公開講座に参加する機会に恵まれたため、本ウェブ教材の有効性を検証する基盤を構築することができた。令和元年は、すでに完成しているフィリピン英語の40会話を使ってスタジオ収録し、その後、一連の編集作業を行い、10月頃に公開する予定である。また、7月に、デラサール大学のDita准教授を招聘し、神田外語大学と東京外国語大学においてフィリピン英語とアジア英語についての講演を行う予定である。他方で、マレーシア英語会話モジュールの開発を開始する。まず、年度初めにマラヤ大学のPillai教授にマレーシア英語の40会話のスクリプトの作成を依頼し、夏に矢頭と小中原が同大学を訪問し、Pillai教授の監修のもとで完成したマレーシア英語のスクリプトの内容について説明を受け、マレーシア英語の特徴について研究する予定である。9月にPillai教授を招聘し、スタジオ収録に参加してもらうとともに、神田外語大学と東京外国語大学においてマレーシア英語をめぐる最新の研究についての講演を予定している。マレーシア英語会話モジュールの公開は年度内に行う。また、来年度に開発を着手するスコットランド英語モジュールの40会話のスクリプト作成をスコットランドのエジンバラ大学の英語学を専門とする研究者たちに依頼し、作成に取り掛かる。令和元年では、学習者である高校生・大学生だけではなく、英語を教える立場にある高校・大学の教員を対象としたセミナーを開催し、本ウェブ教材を活用して英語の多様性について教え、教員にとっての本ウェブ教材の教育効果を検証する。そのうえで、「共通語としての英語(English as a lingua franca)」の視点から、多様な言語文化・背景の英語使用者同士が英語変種を超えてコミュニケーションをとる能力を育成する英語教育の手法を確立することを目指す。

2月末、研究代表者の矢頭と研究協力者の小中原がフィリピンを訪問し、デラサール大学のDita准教授が監修したフィリピン英語の40会話のスクリプトの内容について説明を受け、フィリピン英語の特徴について研究した。3.東京、静岡、福岡、札幌など全国10都市で開催された全国7外大連合主催の公開講座において、高校生を対象に、すでに公開している英語会話モジュールを使って「世界の英語」と題する講座を行い、本ウェブ教材の有効性を検証した。また、9月に神田外語大学で開催された「通訳ボランティア育成セミナー」と11月に開催された「スポーツ・リベラル・アーツ講座」において大学生を対象に同様の講座を行った。4.本科研の代表者と分担者たちが、本報告書10.に示すように、それぞれ学術誌等に論文を発表し、学会や研究会で報告した。平成30年度は、研究代表者矢頭典枝の責任のもと、モジュール開発と研究が当初の計画通り、円滑に遂行された。インド英語会話モジュールのスタジオ収録を年度の前期に行ったために、その後の編集作業に十分な時間を費やすことが出来た。他言語・多民族国家インドの英語は、欧米の英語と異なり、話者の母語、出身地、社会階層、教育レベル、欧米の英語との接触の度合いにより、きわめて多様な英語として表れるため、出演者たち一人ひとりの背景を調べることが重要となり、分析が困難を極めた。モジュールの編集に携わった多くの研究協力者たちが、膨大かつ難解な作業を遂行するのに尽力し、本科研代表者と分担者たちも時間をかけて監修し、さらなる分析と修正を行い、その結果、満足のいくモジュールを公開することが出来た。また、2月末にフィリピン英語会話モジュールの40会話のスクリプトが完成したため、次年度における完成を円滑に行う布石を敷くことができた。さらに、今年度は高校生と大学生を対象とする数多くの公開講座に参加する機会に恵まれたため、本ウェブ教材の有効性を検証する基盤を構築することができた。令和元年は、すでに完成しているフィリピン英語の40会話を使ってスタジオ収録し、その後、一連の編集作業を行い、10月頃に公開する予定である。また、7月に、デラサール大学のDita准教授を招聘し、神田外語大学と東京外国語大学においてフィリピン英語とアジア英語についての講演を行う予定である。他方で、マレーシア英語会話モジュールの開発を開始する。まず、年度初めにマラヤ大学のPillai教授にマレーシア英語の40会話のスクリプトの作成を依頼し、夏に矢頭と小中原が同大学を訪問し、Pillai教授の監修のもとで完成したマレーシア英語のスクリプトの内容について説明を受け、マレーシア英語の特徴について研究する予定である。9月にPillai教授を招聘し、スタジオ収録に参加してもらうとともに、神田外語大学と東京外国語大学においてマレーシア英語をめぐる最新の研究についての講演を予定している。マレーシア英語会話モジュールの公開は年度内に行う。また、来年度に開発を着手するスコットランド英語モジュールの40会話のスクリプト作成をスコットランドのエジンバラ大学の英語学を専門とする研究者たちに依頼し、作成に取り掛かる。
複合糖質の合成を目指した蛋白工学による加水分解酵素の反応特異性の改変

本研究では,ニワトリ卵白リゾチーム(溶菌酵素,糖加水分解酵素)を蛋白工学的に改変した変異体Asn46Glu/Asp52Ser(N46E/D52S)を用いて,その転移活性による複合糖質合成法の確立を目指してきた。N46E/D52Sの反応機構は,野生型リゾチームとは異なり,共有結合中間体を経由した反応機構を有する。この変異体中間体はある条件下では非常に安定であるため,固定化担体上で転移反応を利用した複合糖質の合成反応に応用できると考えられた。そこで,研究方法として,担体に固定化した変異体を基質と反応させ共有結合中間体を形成させた後,基質の除去を行い,次に受容体(糖,アミノ酸など)と反応させ,転移反応により目的の複合糖質を得ることを計画した。酵素の固定化条件を検討した後,固定化酵素と基質(GlcNAc)_6との反応により共有結合中間体の形成を調べた。樹脂に固定化されたリゾチームは90%以上の活性を保持しており,100%に近い収率で共有結合中間体が形成された。この中間体は,酸性(<pH3)条件下,並びに酸性の水・エタノールあるいはアセトニトリル混合溶媒中では安定でった。転移反応は,種々の条件の検討の結果,pH4.5,50%アセトニトリルにて行うこととし,固定化した酵素反応中間体と受容体(10mMPNP-(GlcNAc)_2,10mMPNP,0.5Mグリシン,0.5Mギ酸)との反応生成物は,逆相HPLCにて分析した。その結果,p-nitrophenol-(GlcNAc)_2,0.5Mグリシン,0.5Mギ酸については,転移反応物の生成が認められたが,収率は,0.5Mギ酸が最も高いものの10%程度であった。本研究によって,N46E/D52S変異体酵素による複合糖質の合成は可能であることが示されたが,加水分解との競合による収率低下や,受容体の選択性の問題解決が今後の課題である。本研究は,ニワトリ卵白リゾチーム(溶菌酵素,糖加水分解酵素)を蛋白工学的に改変し触媒機構を変換したリゾチーム変異体Asn46Glu/Asp52Serを用いて,その転移活性による複合糖質の合成法の確立を目指している。Asn46Glu/Asp52Serの反応機構は,野生型リゾチームのオキソカルボニウムイオン遷移中間体型とは異なり,共有結合中間体を経由した反応機構を有する。そこでこの変異体を基質と反応させ共有結合中間体を形成させた後,基質の除去を行い,次に受容体(糖,アミノ酸など)と反応させ,転移反応により目的の複合糖質を得ることを計画した。この変異型の中間体がある条件下では非常に安定に存在するため,これらの反応を固定化担体上で段階的に行えることが本研究の特徴である。まず,担体の検討を行い,Tresyl toyopearl上に10mg/mlでリゾチームを固定化できることを確認した後,基質(GlcNAc)_6との反応により共有結合中間体の形成を調べた。固定化されたリゾチームは90%以上の活性を保持し,ほぼ100%の収率で共有結合中間体が形成された。この固定化酵素担体を用いて,p-nitrophenol-(GlcNAc)_2ならびにp-nitrophenolとの転移反応を検討した結果,前者では,転移反応物が確認されたが後者では確認されなかった。現在,有機溶媒の添加による反応効率の変化並びに受容体側の構造特性について検討している。また,X線結晶解析によるAsn46Glu/Asp52Ser構造解析を進めており,その類似変異体(D52E)の中間体については本年度報告した。

その結果,p-nitrophenol-(GlcNAc)_2,0.5Mグリシン,0.5Mギ酸については,転移反応物の生成が認められたが,収率は,0.5Mギ酸が最も高いものの10%程度であった。本研究によって,N46E/D52S変異体酵素による複合糖質の合成は可能であることが示されたが,加水分解との競合による収率低下や,受容体の選択性の問題解決が今後の課題である。
新生代における堆積盆と褶曲構造の形成機構に関する実験的研究

本研究が堆積盆と褶曲構造の形成機構に関して、とくに実験的としたが、この試みは、次の研究段階を経るものとした。(1)野外データーのモデル化。(2)数値および模型実験。(3)実験結果の野外における検証。の3つの段階である。(1)については、本邦における主要な堆積盆について、地表地質および地震探査・ボーリング試料などにより、できるだけ深部までの地質断面図の作成を基本とし、この段階をモデル化とよんだ。対象地域を東日本以西とした。(2)の数値実験については、このメンバーのなかの一人が開発した、仮想基盤変位法(VDB法)を一例とし、その他自由とした。(3)はその結果の野外の事実の検証はそれぞれの地域とし、とくに、層厚変化と断裂系の分布,火山岩の併入との関係が主体となる。綜合研究として、実験を取り入れたのは初めての試みで、慣れていない分野であるが、予定した関東・新潟地域と、山陰・フォッサマグナ地域の一部については、仮想基盤変位法による数値実験・模型実験を行い(2)および(3)の研究段階まで進んだ。以上は沈降域を対象にしたもので、マグマ性の隆起域の有限要素法による解析も行った。VDB法については、2次元のものを3次元に進展させ、またスピード化が行われ、関東南部海域と山陰の一部では3次元解析を行い得、また野外での検討も行った。本研究の成果は、これまでイメージ的に描かれていた地層の形成と変形の問題について、段階的に復元できたことにより構造地質学的に大きく貢献をした。またこの手法は、深部を探査する石油開発企業,断裂系の規則性を求める金属鉱床企業,地質地盤調査の企業との共同研究などに発展したことも特記すべきことであった。なお、本研究成果の公式発表については、地質学会の地質学論集を予定している。の3つの段階である。