hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
小中学生の内在化・外在化問題発現における家庭および学校要因の解明

2017年度に引き続き,2016年度調査した公立8小学校児童541名,父回答233児童分,母回答275児童分のStrengths and Difficulties Questionnaire (SDQ)日本語版評定データを項目反応理論により解析し,特異項目機能(DIF: Differential Item Functioning)の検討を行った。その結果,1)親子間でのDIFは内在化問題(情緒不安定)で顕著に認められること,2)外在化問題(問題行動ならびに多動・不注意)でもDIFは見られたが,内在化問題に比べると軽度であること,3)父・母の評定におけるDIFはほとんど検出されず,各問題領域の状況に対する父・母の認識はほぼ一致していることなどを明らかにした(日本健康心理学会で報告)。一方,児童の性別によるDIFの可能性を検討した結果,1)一部の項目にしか性別DIFは見られず,評定者別に見ると25項目中4項目程度で検出されたこと,2)父親も母親も女子(娘)に対して過大に問題視する傾向が見られること,3)評定者に共通に認められた特徴的DIFとして,特に男子(息子)の「いじめ」に関する項目が過大評価されていること,4)これは逆に女子では過小評価されている(見逃されている)可能性を示唆しているなどを明らかにした(日本心理学会で報告)。さらに,2017年度追跡調査した縦断データを用いて,SDQ・自己効力感・レジリエンスの変化と学校・家庭要因との関連について統計解析を行い,学校要因より家庭における親の養育態度や家族の雰囲気の関連の方が大きいことを明らかにしてきている。2015年度計画した調査実施が2016年度に遅延したことにより,各年次計画は1年づつ順延していたところ,2018年度7月の西日本豪雨により,介入研究を予定していた地域を含めて,大きな被害があり,2018年度の計画実施は全面的に見直しせざるを得ない状況になった。すでに得ている調査データに対して,1)内在化・外在化問題の測定評価に関する項目反応理論による解析を進める,2)内在化・外在化問題に関連する家庭要因・学校要因を明らかにする,3)家庭要因のうち,親の関わり方や家族の雰囲気に関する知見を基に,義務教育現場に役立つ資料として小冊子(パンフレット)を作成する予定である。2014年度の当初研究計画は、公立7小学校5・6年生の内在化・外在化問題行動に関する質問紙調査を実施する予定であった。調査は児童自身、児童の保護者、および児童が所属するクラスの担任教師を対象とするもので、これまで児童を対象にした調査に協力が得られていた公立7小学校での調査を予定していた。その目的達成のために、学校関係者と協議を行ってきたが、今回の研究では各養育者(保護者)にも調査参加協力を求めるという点が大きく異なっており、この点で学校側の了解を得るのに多大な時間を要し、すべての小学校から調査の承諾を得ることが非常に困難であった。特に本申請者が研究目的で保護者へ協力依頼することを学校側が承諾しているという点で同意を得るに至っていない。一方、今回のベースになる小学校から中学校に移行した際のストレス調査の方は順調に進んだ。調査対象小学校から進学する2公立中学校で調査を実施し、その成果を日本健康心理学会および学校保健学会にて報告した。すでに前年度に調査したA公立中学校区4小学校(166名),小小連携・小中連携に積極的に取組んでいるB公立中学校区2小学校(73名)の6年生のA・B中学校入学後に調査を実施し、小学6年時の結果と個人内の変化を検討した。調査票はストレッサー・ストレス反応・ソーシャルサポートなどの尺度で構成された。A・B中学校生徒ともに「学業」ストレッサーが有意に上昇していた。ストレス反応では,A中学校で「身体反応」「不機嫌・怒り」「無力感」が有意に上昇した。一方,B中学校ではストレス反応の上昇は認められなかった。両地域とも性差は見られなかった。小小連携・小中連携によって,「中1ギャップ」の発現を抑制できる可能性が示唆された。さらにこの変化には、特に父親のサポートが関連していることが示された。2015年度の当初研究計画は,公立7小学校5・6年生の内在化・外在化問題行動に関する質問紙調査を実施する予定であった。調査は児童自身,児童の保護者,および児童のクラス担任教師を対象とするもので,これまで児童を対象にした調査に協力が得られていた公立7小学校での調査を予定していた。この調査実施に向けて,前年度より学校関係者と協議を行ってきた。しかしながら,今回の研究では養育者にも調査協力を求めるというプロジェクトであり,その点が大きな障害となり,学校側の調査承諾を得るに至っていない。一方,本研究のベースラインとなる小学校から中学校に移行した際のストレス調査は昨年度で終了し,データ整理および解析を行った。すなわち,A公立中学校区4小学校(166名),小小連携・小中連携に積極的に取組んでいるB公立中学校区2小学校(73名)の6年生次のデータとA・B中学校入学後のデータをリンクさせ,個人内の変化およびグループ間の相違を検討した。A・B中学校生徒ともに「学業」ストレッサーが有意に上昇した。ストレス反応では,A中学校で「身体反応」「不機嫌・怒り」「無力感」が有意に上昇したが,B中学校ではストレス反応の上昇は認められなかった。

小小連携・小中連携によって,「中1ギャップ」の発現を抑制できる可能性が示唆され,この変化には,特に父親のサポートが関連している可能性が示唆された。それらの一部は,市民向け公開講座および中国四国心理学会にて報告した。さらに,縦断データの最新の解析技法を用いて,変動パターンが異なる集団の特定およびそれに影響する要因の解明を進めているところである。本申請者がこれまで連携してきている広島県内7公立小学校で調査を行う予定で,各小学校の校長等学校関係者ないしPTA役員等に研究概要を説明してきた。しかしながら,今回の研究では各養育者(保護者)にも調査参加同意を得る必要があり,しかも一部の保護者だけではなく,少なくとも学級単位での同意が必要である。学級担任の同意も同様である。個人情報に関する意識の高まりとカリキュラムがタイトな編成になっている現在の小学校では,これらのすべての協力を得ることが困難で,現在までのところ,研究計画にすべて沿った形での調査実施に至っていない。まず,本申請者が研究目的で保護者へ協力依頼することを学校側が承諾した上で,各家庭への依頼書が送付されるという手順を構想したのだが,保護者への懸念もあってか,この段階で難色が示されている。一方,児童生徒のみの調査は実施されてきており,少なくとも児童生徒の小学校中学校移行に伴う心身のストレス状態の変化に関する知見は蓄積されてきている。また,先行研究レビューおよび調査項目選定もほぼ順調に進んでおり,本研究課題に則した質問紙測定尺度の検討は完了している。2015年度に計画しながら学校側との調整困難により実施に至らなかった,保護者まで含めた総合調査を公立8小学校5・6年生およびその保護者・担任教師を対象に実施した。ただし,2校では学校側の意向により保護者への調査ができず(全体の20%),また全体の約3割の児童では父母の回答が得られなかったため,保護者未調査小学校を除き,父母の両方あるいはいずれかの回答を得られたのは64%であった。一方,1校では5年生の教師評定が得られず,524名(96.9%)の児童に関する教師評定を得た。児童の内在化・外在化問題の測定には国際標準測定ツールであるStrengths and Difficulties Questionnaireの日本語版(SDQ)を用いた。Goodmanらの子ども・保護者・教師の評定によるSDQの尺度得点および保護者・教師の影響評定による情緒障害・行為障害・多動性障害の暫定診断のためのアルゴリズムに基づくと,情緒障害(内在化問題)は23名(5%),外在化問題の行為障害は148名(27%),多動性障害は34名(6%)に認められた。さらにこの暫定診断に基づいて,関連する個人・学校・家庭要因を検討した結果,内在化・外在化問題を促進・助長する危険因子として抽出されたのは学校ストレッサーや学校不満足,統制(厳しいしつけ)であった。その逆の防御因子としては,朝食摂食・レジリエンス・父母のサポート・親密な親子関係や家庭の状況の良さなどであった。学校不満足や統制は,危険因子というより,むしろ問題行動や多動・不注意の結果,起きている状況とも考えられる。また,危険因子よりも多くの防御因子が家庭・親子関係の領域で認められたことは本研究結果の特徴である。
心房細動の治療効果を規定する分子機構の解明とリスク診断

心房細動は、不整脈の約1/3を占める最も頻度の高い疾患である。加齢とともに発症リスクが急激に上昇し、70歳代で5 %、80歳代で10 %、90歳代で25 %が発症すると言われている。合併症である心原性脳塞栓が寝たきり老人の主要原因の1つとなることから、高齢化率が21%を超える超高齢社会のわが国では深刻な社会問題を引き起こす疾患の一つである。心房細動を始めとする生活習慣病は、多数の遺伝的因子と環境要因が複雑に絡みあって発症すると考えられている。生活習慣病の遺伝的要因に関しては、近年の急速なゲノム解析技術の発達により、数百万ヶ所に及ぶSNP座位について比較的容易に情報を得ることができるようになってきた。この技術を用いてゲノムを網羅的に相関解析するゲノムワイドアソシエーション研究(GWAS)により、多数の疾患について、数多くの疾患関連遺伝子座位が同定され、報告されてきた。心房細動についても多数の関連遺伝子が発見されている。しかしながら、臨床的に有用な指標についての遺伝子研究を含むバイオマーカー探索研究や分子メカニズム解明研究はなされていない。「体質」としての遺伝的要因を把握し、同時に治療の前後で患者の体内で起きている変化を捉え、遺伝的因子と環境要因との複合的な分子ネットワークの解明をすることで、心房細動の治療効果に個人差が生じる原因をつきとめる。平成30年度は倫理審査委員会での研究計画の承認後、サンプルの収集を開始した。また、それらのサンプルについてゲノム解析と発現情報解析を施行した。また、多階層情報解析のためのアルゴリズム開発に着手した。当初の予想より、学内倫理審査委員会の承認が遅れたため、サンプル収集開始が1ヶ月ほど後ろにずれたが、収集開始後は順調に収集が行われている。また、ゲノム解析、発現情報解析に関しては、すでにパイプラインが構築されており、特段の問題なく進行した。当初の研究計画の通りに研究を推進する予定である。ただし、承認された研究経費は応募の際に申請した研究費用の6割程度であったため、当初予定のサンプル数を解析できない可能性が高い。民間も含む他の研究資金へ応募し、経費の確保を目指す。
球面上のデザイン、距離集合とアソシエーションスキームの研究

本年の研究は主に次の三つである。(1)複素球面デザインの研究、(2)多重交差族の研究、(3)距離集合のサイズに関する不等式の改善。(1)主な研究対象であった、実球面上のデザインにならって複素球面上でのデザインの研究を行った。この空間ではこれまでデザインが定義されてきたランク1のコンパクト対称空間ではないものの、これまでに使われてきた線形計画法が働き、またアソシエーションスキームとも非常に関連性が強いことが分かった。対称なアソシエーションスキームに対しては実球面への埋め込みが非常に重要な役割を果たしたのと同様、今回の研究で非対称なアソシエーションスキームに対しては複素球面への埋め込みがやはり重要な研究手段になりうるといえる。これはAidan Royとの共同研究に基づくものである。(2)極値集合論において、古くから研究されている交差集合の問題の多くは自然にQ-多項式距離正則グラフという特別なアソシエーションスキームのクラスにおいて考えることが出来、実際数多くの研究がその枠組みでなされている。今回はその問題の一般化である多重交差族に対して、同じ枠組みであるQ-多項式距離正則グラフにおいて考察した。その結果、重要な様々なクラスにおいて多重交差族のサイズの不等式を得ることに成功し、特にtwisted Grassmann graphに対しては真に新しい結果を得ることが出来た。これは田中太初氏との共同研究に基づくものである(3)距離集合の最も重要な問題は現れる距離の個数を固定したとき、距離集合のサイズの上からの不等式を得ることである。s-距離集合のabosolute boundを達成する例については2s-デザインになることが示されている。ここではデザインの強さが2s-2以下であるs-距離集合のサイズの上からの不等式を改善した。次数sが低いところでは幾つかの例も知られている。これは野崎寛氏との共同研究に基づくものである本年の研究は球面上のデザインにおいて最も基本的かつ重要な結果である、球面上の有限集合がアソシエーションスキームとなるためのパラメーターが満たす十分条件に関する定理を拡張したことが挙げられる。この定理によってさまざまな系が得られたがそのうちの二つが、本年度の研究実施計画に挙げた「Maximal MUBがスーパースキームになることのデザインを用いた証明」と「tightなSpherical designがスーパースキームになるか否かの決定」に対して前者に対しては肯定的結論が得られ、後者に関してはtight 11-designを除いては肯定的な結論が得られた。また、この拡張によりアソシエーションスキームの一般化であるcoherent configurationに対して、Q-polynomialという概念を定義することが出来た。この概念はアソシーションスキームに対して既に定義されていた概念で、球面上の代数的組合せ論を考察するにあたって非常に重要な概念である。(Q-polynomial coherent configurationはcoherent configurationの中でも滅多に存在するものではないが、重要なcoherent configurationはQ-polynomialという性質を有しているので、この性質も重要な概念と思われる。(1)Real MUBsの四重正則性の特徴づけ、(2)Q-多項式スキームの第一原始冪等元により得られた球面上のデザインの強さの特徴づけ、(3)多項式スキームの部分集合に対する新しいパラメーターの定義。1.昨年の研究ではReal MUBsから得られるアソシエーションスキームは三重正則であることを示した。MUBsの研究において最大でどれだけの正規直交基底がとれるかが重要であるが、Real MUBsにおいて個数が最大となるような"Maiximal" MUBsを研究した結果、そのような条件は四重正則性と必要十分であることが分かった。これは研究の出発点であったMaximal real MUBsの直交する二点から内積が正となる元がアソシエーションスキームになる、という結果の一般化である。2.Delsarte-Goethals-Seidelの定理は高い球面上のデザインはQ-多項式スキームの構造を持ち、さらに元の球面上の集合は第一原始冪等元により得られることを示している。では、Q-多項式スキームの第一原始冪等元による埋め込みで得られる球面上のデザインの強さはどのように記述されるか?ここでは任意の強さに対してクラインパラメータによる特徴づけを与えた。3.多項式スキームの部分集合に対して定義されるinner distribution, dual inner distributionにどれだけ零が並ぶか(Delsarte)、終わりの項に零がどれだけ並ぶか(Brouwer-Godsil-Koolen-Martin)が考察されている。並ぶ零の個数はdegree, dual degreeで上から押えられること、またその個数が大きいとき、元の部分集合は完全正則符号やQ-多項式と呼ばれる構造を持つことが示されていた。ここでは初め、終わりの項に関係なく零がどれだけ並ぶか、また並ぶ零の個数が大きいとき、元の部分集合は先の先行結果と同様に完全正則符号、Q-多項式スキームの構造を持つこと示した。

対称なアソシエーションスキームに対しては実球面への埋め込みが非常に重要な役割を果たしたのと同様、今回の研究で非対称なアソシエーションスキームに対しては複素球面への埋め込みがやはり重要な研究手段になりうるといえる。これはAidan Royとの共同研究に基づくものである。(2)極値集合論において、古くから研究されている交差集合の問題の多くは自然にQ-多項式距離正則グラフという特別なアソシエーションスキームのクラスにおいて考えることが出来、実際数多くの研究がその枠組みでなされている。今回はその問題の一般化である多重交差族に対して、同じ枠組みであるQ-多項式距離正則グラフにおいて考察した。その結果、重要な様々なクラスにおいて多重交差族のサイズの不等式を得ることに成功し、特にtwisted Grassmann graphに対しては真に新しい結果を得ることが出来た。これは田中太初氏との共同研究に基づくものである(3)距離集合の最も重要な問題は現れる距離の個数を固定したとき、距離集合のサイズの上からの不等式を得ることである。s-距離集合のabosolute boundを達成する例については2s-デザインになることが示されている。ここではデザインの強さが2s-2以下であるs-距離集合のサイズの上からの不等式を改善した。次数sが低いところでは幾つかの例も知られている。これは野崎寛氏との共同研究に基づくものである
ヒストンアセチル化を標的にした新しい子宮内膜症治療法の基礎的検討

まず正常内膜機能発現におけるヒストンアセチル化の役割について検討を行ったところ、HDACiが性ステロイドホルモン依存性分化を促進すると同時に、性ステロイド依存性のコアヒストンアセチル化を増強し、その作用点が分化マーカーであるIGFBP-1プロモーターのプロゲステロン応答エレメント近傍であることを明らかした(参考文献1)。
EnamelErosionの早期検出・定量法構築のための基礎的研究

近年,食習慣の変化から酸蝕症が注目されている.酸蝕症はう蝕とは異なり微生物の関与がない状態でエナメル質の喪失が生じる.しかし,酸蝕症による初期の変化を視診によって診断することができず,臨床の現場では実質欠損を伴った重症化した状態で酸蝕症が診査されるのが現状である.酸蝕症の早期検出が可能になれば,酸蝕症の予防が可能となるだけでなく,エナメル質の健康増進が可能となる.本研究では,光学的手法を用いることで,酸蝕症の初期変化を診査できる可能性が示唆された.本研究はエナメル質酸蝕症の早期検出および検出されたエナメル質酸蝕症の定量を確定するための基礎的な研究である.また,酸蝕症の予防に効果的な手段を構築することも重要であると考えている.よって酸蝕症の試料を作成するにあたって,単にエナメル質試料の酸暴露時間をアレンジした試料のみを作成するのではなく,予防手段として効果的であると推測されるフッ化物を酸蝕症試料の作成に取り入れる必要があると考えている.本研究では牛歯エナメル質を試料として,エナメル質ブロックを切り出し,通法に従って表面研磨を行った後,フッ化物による表面処理を行った試料と行わなかった試料を作成し,それぞれの試料に対して30秒間隔で120秒間の酸処理を行うことによって1試料あたり5つの異なった酸蝕試料を作成した.顕微鏡像を観察した後,より早期の酸蝕状態を観察するための照明環境およびCCDカメラのレンズに取り付けるフィルター,および観察環境の検討を行った.つまり,現在臨床でエナメル質の表面観察のために使用されている機器ではエナメル質酸蝕症の検出や定量が困難であるため,より早期にエナメル質の変化を検出するための条件を検討した.その結果,観察環境は暗室が望ましい事,照射光は波長405nmのLEDを用いること,CCDカメラに取り付けるフィルターは410nmのバンドパスフィルターを用いることによってエナメル質表面の微細な変化を検出,観察できる可能性が分かった.近年,食習慣の変化から酸蝕症が注目されている.酸蝕症はう蝕とは異なり微生物の関与がない状態でエナメル質の喪失が生じる.しかし,酸蝕症による初期の変化を視診によって診断することができず,臨床の現場では実質欠損を伴った重症化した状態で酸蝕症が診査されるのが現状である.酸蝕症の早期検出が可能になれば,酸蝕症の予防が可能となるだけでなく,エナメル質の健康増進が可能となる.本研究では,光学的手法を用いることで,酸蝕症の初期変化を診査できる可能性が示唆された.本研究はエナメル質酸蝕症の早期検出および検出されたエナメル質酸蝕症の程度の定量法を確定するための基礎的な研究である.また同時に酸蝕症の予防に効果的な手段を構築することも重要であると考えている.よって,酸蝕症サンプルを作成するにあたって,単にエナメル質試料の酸暴露時間を変えた試料のみを作成するのではなく,予防手段として効果的であると推測できるフッ化物を酸蝕症サンプルの作成に取り入れる必要があると考えている.本研究ではサンプル作成にあたって,牛歯エナメル質試料を用いエナメル質ブロックを切り出し,通法に従って表面研磨を行った後,酸処理の前処理として臨床で用いられているフッ化物歯面塗布剤によるフッ化物応用を行った後,設定した酸処理時間を試料に施し,酸処理エナメル質試料の作成を行った.作成にあたって,一つのサンプルで数パターンの酸処理エナメル質の観察を可能にするために,サンプル中の部分部分で酸処理時間を変化させている.作成された試料表面の観察方法は,1)デジタル画像撮影,2)Quantitative light-induced fluorescence (QLF法),3)DIAGNOdent,4)FluoreCamといった現在初期う蝕検出および定量に使用されている機器を用いて実施している.さらに購入した顕微鏡に接続するデジタルカメラを用いた実態顕微鏡による観察も行った.しかし,観察に用いている機器の性能や限界等を考慮して,より早期に酸蝕を検出(酸処理時間の短い試料の検出)するための測定条件などを検討している.昨年の9月に試料表面の観察に用いていた機器であるQLFが故障した.QLFはオランダの会社のみが取り扱う機器であること,技術者が一人しかいないこと,修理が完了したはずの機器が輸送中のトラブルから再故障,などの理由により修理に時間を要したため,十分なデータ採取が行われなかったためである.試料表面の観察および解析を続行する.すなわち,電子顕微鏡による試料表面の観察や,さらに観察条件を変化させて,早期検出のために最適な観察環境,条件を検討する.さらに臨床応用するための方法を検討する.試料表面の観察条件を検討するためには,試料観察時に試料に照射する光の波長,観察時にデジタルカメラに設定するフィルターに依存するために,よって,光照射装置およびフィルター等の購入に使用するとともに,研究成果の発表および情報収集のための学会参加費用として用いる予定である.
頭頸部癌におけるTet-assist Bisulfite 法による脱メチル化解析

頭頸部癌での脱メチル化酵素、メチル化酵素の働きと、これらの酵素の発現変化がDNAメチル化にどのように影響を与えているか、また脱メチル化酵素、メチル化酵素の発現をコントロールしていると考えられる転写因子Xの影響を細胞株に対するsiRNAを使ってノックダウンし解析した。頭頸部癌において脱メチル化酵素(TET1,TET2,TET3)、メチル化酵素(DNMT3A、DNMT3B)が、Gene Xの働きなどを通して、メチル化、脱メチル化のコントロールを行い、DNAメチル化の蓄積に関与していることが予想された。エピジェネティック修飾のひとつであるDNAメチル化は,遺伝子発現の抑制やゲノム安定性の維持に必須である.これまでDNAメチル化の解析は詳細に行われていたが,DNAのメチル基を消去する分子基盤(DNA脱メチル化)は不明であった。最近、DNA脱メチル化酵素として機能する可能性をもつTetタンパク質が着目され、そのDNA脱メチル化活性に依存して生成される5-ヒドロキメチルシトシンが検出された。今回我々は、2012年に開発されたTet-assistバイサルファイト処理を使った脱メチル化解析を行い、今まで困難であったDNA脱メチル化(5-ヒドロキメチルシトシン)状態を検出する方法の導入を行い頭頸部癌のエピゲノム異常の知見を蓄積していきたい。1μgのDNAを、前処理としてT4-β-glucosyltransferase(βGT)にて、hmCの-CH2OH基にグルコシル化処理を行い,Tet1 oxidation reagentによるカルボキシル化から保護処理をし、Tet1 oxidation reagentによりmCのみにカルボキシルシトシン(caC)への変換を行ったのち、Traditional Bisulfite法と同じ亜硫酸水素塩処理を行い、非メチル化CとcaCをウラシルに変換する。hmCは、hmCとして変化を受けない。Tet-assist Bisulfite法によるシークエンスにより3番4番のCpGがTに変化していたら、そのCpGはmCと判別され、CのままであればhmCとなる。Traditional Bisulfite法とTet-assist Bisulfite法の2手法をおこなってどちらもシークエンスし比較することでmCかhmCの判定を行う。1Tet-assist Bisulfite法を使った脱メチル化解析の導入2臨床検体をつかったTet-assist Bisulfite法を使ったDNA脱メチル化解析3DNA脱メチル化酵素のTet遺伝子の頭頸部癌での役割の解明の3つの研究を行う。申請者と所属する研究グループは、頭頸部癌における癌抑制遺伝子のメチル化解析を行ってきた。今回は、Tet-assist Bisulfite法を使ったDNA脱メチル化解析法の確立と、頭頸部癌におけるDNA脱メチル化の意義の解明を目標とする。5-ヒドロキメチルシトシンの解析を始めている。さらにサンプル数を増やす予定である。近年、DNA脱メチル化酵素として機能する可能性をもつTetタンパク質が着目され、そのDNA脱メチル化活性に依存して生成される5-ヒドロキメチルシトシンが検出された。今回の研究で、脱メチル化酵素であるten eleven translocation (TET1,TET2,TET3)の頭頸部癌での発現とメチル化酵素DNA methyltransferases (DNMT3A、DNMT3B)の発現の解析を行い頭頸部癌での脱メチル化酵素、メチル化酵素の働きと、これらの酵素の発現変化がDNAメチル化にどのように影響を与えているか、また脱メチル化酵素、メチル化酵素の発現をコントロールしていると考えられる転写因子SALL4の影響を細胞株に対するsiRNAを使ってノックダウンし解析した。また臨床検体を使って、高SALL4発現症例と低SALL4症例での脱メチル化酵素、メチル化酵素の発現の変化を解析した。SALL4siRNAを使ってノックダウンするとDNMT3A、DNMT3Bが低発現になりTET1、TET2、TET3は高発現になった。臨床検体でのSALL4、DNMT3A、DNMT3B、TET1、TET2、TET3の発現解析でもSALL4高発現群は高メチル化になることが分かった。その結果、SALL4遺伝子は、メチル化酵素、脱メチル化酵素の働きを介して、DNAメチル化の蓄積に関与していることが予想された。頭頸部癌において脱

メチル化酵素(TET1,TET2,TET3)、メチル化酵素(DNMT3A、DNMT3B)が、Gene Xの働きなどを通して、メチル化、脱メチル化のコントロールを行い、DNAメチル化の蓄積に関与していることが予想された。Traditional Bisulfite法とTet-assist Bisulfite法の2種類の方法で処理したサンプルで、PCRの立ち上がり(Ct値)に差がある場合、このサンプルは脱メチル化がおこっていると判断されが、今までの結果では安定した脱メチル化は起こっていない。ゲノム全体のメチル化度との比較、予後との関連など解析を進める。頭頸部癌今後は脱メチル化検出キットを変更し実験を行っていく予定である。おおむね研究は順調に進んでいるが、実験消耗品の消費を抑えることができた結果である。研究は少し遅れているが、実験を進行している。来年度は本年度の分の研究費を使用できる予定である。最終年において研究の完了にむけ研究をすすめていく。新しい脱メチル化キットを使用して実験を行う予定である。
DNAナノ構造体の創成と物性の研究

生体が、DNAの塩基配列情報を読み取り、タンパク質や他の分子からなるナノ構造体をつくり、それを見事に配置していくプロセスと同様に、DNAをベースにして配線の鋳型をつくり、ナノスケール分子デバイスのプロトタイプを形成するナノサイエンスの確立を本研究の目的とした。本グループが世界をリードしている高分解能走査プローブ顕微鏡を発展させたナノポア型SPMにより微細なナノ構造を観察・制御し、ダイナミックにフィールドバックしながら研究を進めると同時に、ナノメートル精度の分子の位置決めにトップダウンの超微細加工技術をとりいれ、分子デバイス形成に向けたDNAナノデバイスサイエンスを進めた。(1)ナノポア型SPMの開発とDNAナノ構造の観測:DNAをベースとした電気・磁気回路形成の研究には、塩基配列の情報によって形成されたDNAナノ構造の精緻な観察とナノスケール物性測定法の確立が重要である。この課題の解決に向けて、ナノポア型SPM(走査プローブ顕微鏡)の開発を行った。その結果、本年度、以下の成果を得た。(1)DNAのナノポア構造によるセンシングを行うためシリコン基板上に直径40nmのナノポアの作製が電子線リソグラフィーにより可能となった。(2)DNA電気伝導測定に用いる実験系として,MCBJ(Mechanically controllable break junction)装置の設計・開発及び立ち上げを行った。(3)DNA分子に関する空間的な情報(二重鎖形成、塩基配列)をナノポア構造により読み取るため、微細なナノポア構造をナノワイヤをテンプレートとした自己集合的な手法によるアプローチを試みた。そのテンプレートとなる酸化物ナノワイヤ(MgO)の構造制御を本年度は行い、10nm以下の非常に小さなワイヤを得ることに初めて成功し、そのメカニズムを解明した。(4)既存のSPMのシステムとパッチクランプ(一分子電気生理測定)を融合したナノポア型SPMを開発し、マイクロメーター程度の孔の開けたサファイヤ基板およびプラーによりマイクロメーター程度に細くしたガラス管のキャピラリーを切断して得られた孔に人工脂質二重膜を固定した系の作成に成功した。(2)DNAの2次元規則構造の形成:上記測定手法の開発と同時に、2次元ナノ構造の形成・制御について新たな展開を図った。DNA分子回路を形成するそれぞれの部品となる分子材料について、以下の成果を得た。(1)中距離で周期的にデザインされたDNAを用いてさまざまな多次元周期構造を作成した。さらに、DNAと他分子との水素結合、π-π相互作用の利用に展開した。(2)金属錯体内包DNAワイア:Ni, Pt系の錯体を水素結合を介してDNA塩基対の間に内包し、新しい1次元ナノワイアを作成した。(2)チオールなどを介して金属超微粒子をDNAオリゴマーに結合し、このオリゴマーの塩基シークエンスとワイアDNAの相補性を利用して、その情報に従いナノ粒子を並べた。ケルビンフォースSPMおよび磁気力SPMによりナノ粒子の電気磁気特性を明らかにした。電子線リングラフィーとシリコン加工技術を用いて、Si3N4基板に垂直な直径100nmのナノポアを持ち、Si3N4基、板平面上にナノポアを挟み込むナノ電極を持つナノ構造の作製プロセスを開発した。しかし、開発したプロセスでは、最小直径50nm程度のナノポアまでしか作ることができないことができなかったため、50nm以下のナノポア構造を作る新プロセスの開発を行った。トップダウン的手法では困難な微小ナノポア構造(30nm以下)を創製する為に、自己集合的に作製されるナノワイヤ構造体及び自発的に中空構造を発現するKirkendall効果を利用した手法を提案・開発した。第一に、テンプレートとなる酸化物ナノワイヤの創製制御及びコアシェル構造化を行い、次いでKirkendall効果及び反応性イオンエッチレグ法を併用した手法により20nm以下のナノポア構造体の創製に成功した。ナノポア型SPMの開発:既存のSPMのシステムに、パッチクランプ(一分子電気生理測定)を融合したナノポア型SPM開発を試みた。パッチクランプの手法としては、確立した手法である「削り取り法」で使われるテフロンのポアを基礎とした。光学顕微鏡を用いて黙視でモニターしながら、加熱した探針を低融点テフロン薄膜に接触させることにより、テフロン薄膜に数数十ミクロンの真円に近い孔を開けることに成功した。このテフロンの孔は人工脂質膜を長時間安定に保持できることより、SPMに適した平面型パッチクランプ基板の作成に成功した。ナノ加工技術を応用し,in-plane方向にマイクロ流路を設けたMCBJ試料を作製した。金単原子接合の安定性評価実験を通し、MCBJが十分な機械的安定性(サブピコメートルスケール)を有している事を確認した。電気泳動により流路を流れる直径2ナノメートルの金ナノ粒子についてトンネル電流計測を行った.Si3N4及びパッチクランプナノポアを作成する過程で、「生体分子解析ナノポア形成の新しい電子線リングラフィープロセス」という、当初の予想をはるかに上回る興味深い手法がみつかった。

この端緒的な発見は、より微細なナノポアの効率的形成を可能とするものであり、本研究の目的であるナノポアセンシングデバイスの作成に重要な影響を与えるものであり、このプロセスをさらに詳しく調べることを行った。その結果、従来の加工サイズの限界を越える微小ポアを作成できた。又、微少電極間での電流測定に成功した。・ナノポア型SPMの開発:既存のSPMのシステムに、パッチクランプ(一分子電気生理測定)を融合したナノポア型SPMを開発を試みた。前年度に我々が確立した加熱した探針で数十ミクロン以下の孔を開ける手法を改良し、確実に数マイクロメーター以下の孔を開けることに成功した。具体的には、導電性ガラス上にテフロンフィルムを固定し、探針とガラス間に流れる電流をモニターする手法を開発して、制御性を高めた。また、このように作成した10マイクロメーター程度の微少なテフロン孔が、実際に平面型パッチクランプ基板として安定に動作することを評価した。チャネル蛋白(ライセニン)のポア電流をパッチクランプによる一分子計測で実際に検出することに成功した。さらに、ポア径が数マイクロメーターでは、有機溶媒フリーなリポソームより脂質膜を作成することが望ましいためリポソームのAFMによる評価も行った。・構造が高度に規定された酸化物ナノワイヤ構造をテンプレートとした手法を用いてサイズが20nm以下のナノポア構造を作製した。・マイクロ流路組込み型MCBJを用い、DNAの直径と同等の大きさを有する金ナノ粒子について、電気計測による検出実験を行った。その結果、流路を流れる単一金ナノ粒子の検出に成功した。更に、電極間を通過する際に、ナノギャップ電極間に印加する直流電場の大きさに比例して、ナノ粒子の流速が減少することを明らかにした。・電子リソグラフィー、リフトオフプロセス、およびエッチングを組み合わせた12プロセスにより、Si3N4/Si/Si3N4基板上に最小直径20nmのナノポアとナノ電極が融合したナノ構造の作製プロセスを確立した。このナノ構造とPDMSによるマイクロ流路を組み合わせることで、流路を流れる直径15nmの金ナノ粒子の電気検出に成功した。
簡易式低周波治療器（EMS)の下肢深部静脈血栓症に対する予防効果の検討

本研究の目的は簡易EMSを深部静脈血栓予防目的で使用した場合に、1下肢血流改善から予防効果があるかおよび2それを実際の患者に使用して有害事象が発生しないかを調べることであった。下肢血流改善効果を実証するため、市販されている簡易EMSのうち2000円5000円台の低価格帯から5機種を試験購入し、研究者自身で実際に脹脛に装着し収縮するかを確認した。そのうち2機種は出力不足で使用に適さないと判断。残る3機種のうちより低価格でタイプの異なる2機種(2パッドタイプ、1パッドタイプ)を選定し、本研究に使用した。本学倫理審査委員会とともに十分にプロトコルを検証したのち、研究協力者2名とともに健康ボランティア20名(男女各10名、ネット公募)に装着し、2分後および10分後の大腿静脈及び膝窩静脈の最高血流速度と平均血流速度などを安静時と比較し変化を調べた。その結果、2機種ともEMS開始2分後で膝窩静脈の最高流速度が安静時より有意に上昇し、また10分後には最高血流速度と平均血流速度とも膝窩および大腿静脈で安静時に比べ有意に上昇していることが分かった。膝窩静脈に関しては10分後に2機種とも血流量が増加していた。健康ボランティア20名で痛みや苦痛など諸事情によるプロトコル逸脱は発生しなかったが、事後インタビューで2名で翌日に軽度の筋肉痛を訴えた。過去の研究では最高流速の有意な上昇が下肢血栓予防の重要な因子とされていることから、本研究の下肢血流改善効果はあるといえることが聡明できた。次は臨床応用として2について調べることであり、今後、同2機種(あるいは1機種)を患者に装着することでバイタルサインなど身体的なデメリット、有害事象が発生しないかを検証する。健康ボランティアに対する研究につて倫理審査会での審議の遅延。以下のステップを予定1臨床応用に向けた研究に対する書類倫理審査会提出、認可取得2健康ボランティアを対象とした現状までの結果の一般公表(論文、学会発表)3適応を十分検討し、臨床研究の実施42と合わせて学会発表一方で電気的筋肉刺激(Electrical Muscle Stimulation: EMS)は、わが国では予防に推奨されていないが、サイズや体形に影響されずに用いることができ、欧米ではエビデンスに基づき予防に用いられ、専用の医療機器も販売されている。一方、わが国でEMSは、深部静脈血栓症(Deep Vein Thrombosis: DVT)予防には用いられていないが、同様の機能を持つ家庭用の簡易式EMSが多数市販されており、値段もIPCより安価である。これら医療用EMSと簡易EMSは、原理や使用法は同じで、使用目的が医療(DVT予防、リハビリテーションなど)か、家庭用(マッサージ、筋肉トレーニング)かの違いだけである。そこで今回我々は健康成人を対象に、わが国で販売されている幾つかの家庭用の簡易式EMSを用いて、下肢深部静脈のうっ血改善効果の有無を、超音波パルスドプラを用いた評価法で研究する。一方で下記に述べる理由により、研究実施計画書の通りには遂行できなかったため、研究実績としては特にない。本研究は健康ボランティアを募集し、市販されている高価ではないEMSをもちいる、という点で当施設の倫理委員会の承認を申請していたが、あらたな医療機器を導入するのであれば第2相臨床試験に相当するなどの指摘をいただき、年度末まで許諾を得られずに経過した。また、再申請において倫理委員会の許可を得たが、申請書に登録していたEMSの一部の機種が販売終了となった関係で、本年度は、研究計画立案通りには遂行できずに終わった。現在、次年度は研究を遂行できる状況が整った事で、研究実施計画書の遅れを取り戻すべく、プロジェクトを遂行していきたい。

健康ボランティアに対する研究につて倫理審査会での審議の遅延。1)選定した2機種を購入し、電気刺激の設定を確定する。2)インターネットの麻酔科HP、麻酔科フェイスブックページおよび病院および医学部内に研究協力者募集ポスターを掲示し、通常の診療業務時間外である平日夕方18:00以降から約60分の拘束時間でかつ2回の来院が可能で、除外基準に当該しないものを募集する。3)健常ボランティアに、市販されているEMS(2種類、1500円6000円前後のものを選択)を装着し、文献で推奨されている刺激法(0.05ms、10Hzあるいはそれに近いもの)を用いて、下肢血流うっ滞改善効果があるかを調べる。超音波パルスドプラをもちいて、安静臥床時における深部静脈(膝窩静脈、総大腿静脈)の血流について、下記の項目を評価し、EMSの血流うっ滞改善効果の有無を明らかにする。次年度中にすべてのデータを取りそろえ解析する。4)次々年度には一般公開(学会、論文等)できるよう準備する。以下のステップを予定1臨床応用に向けた研究に対する書類倫理審査会提出、認可取得2健康ボランティアを対象とした現状までの結果の一般公表(論文、学会発表)3適応を十分検討し、臨床研究の実施42と合わせて学会発表先に述べた理由のごとく、研究が遅延して、予定した消耗品の購入や人件費が使用されなかったため、その分を次年度に繰り越して使用する予定。次年度使用額が生じた理由として以下の点があげられる。129年度交付金のうち直接経費全額が30年度に繰り越されたこと230年度直接経費のうちその他の費用として計上した論文校正費や学会渡航費が研究の遅れで使用されていなかったことまた、共同研究者が費用を使用していないことは2の理由による。これらを踏まえ今後、共同研究研究者とともに以下のように使用計画を立てている。1学会発表にける旅費(国際学会2名分約50万円)2英文投稿の際の和訳、校正費用(2本分約30万円)以上。
Prunus属果樹における配偶体型自家不和合性の機構解明とその園芸育種学的利用

Prunus属にはオウトウやアーモンド,ウメやスモモなど,商業的に重要な果樹類が多く属する.これらPrunus属果樹の多くは一遺伝子座の複対立遺伝子によって支配される配偶体型の自家不和合性を示す,単為結果性を全く持たないPrunus属果樹において,自家不和合性は栽培上の大きな制限要因になっている.すなわち,Prunus属果樹を栽培する上で結実の安定に必要な受粉用の品種と優良栽培品種の組み合わせを選定する際に,S遺伝子型が明確にされていないために判断を誤ったり,あるいは受粉樹と優良栽培品種の開花期が年によって一致せず結実が不安定になったりするなどの問題が生じる.本研究は,Prunus属果樹の自家不和合性の分子機構を明らかにし,園芸育種学的に利用することを目的に始められた.本研究の研究期間内に,自家不和合性を示すPrunus属果樹であるアーモンド,カンカオウトウ,ニホンスモモ,ウメにおける自家不和合性反応の花柱側因子であるS-RNaseを同定することに成功した.また,これらS-RNaseをコードするcDNAを単離することにも成功した.得られたcDNAの塩基配列情報を利用することで,DNA分析によってS遺伝子型を判別することが可能になった.さらにウメでは,自家和合性形質と強く連鎖したS-RNaseの対立遺伝子を同定することができ,このS-RNase遺伝子指標とすることで,自家和合性個体を判別することが可能になった.Prunus属にはオウトウやアーモンド,ウメやスモモなど,商業的に重要な果樹類が多く属する.これらPrunus属果樹の多くは一遺伝子座の複対立遺伝子によって支配される配偶体型の自家不和合性を示す,単為結果性を全く持たないPrunus属果樹において,自家不和合性は栽培上の大きな制限要因になっている.すなわち,Prunus属果樹を栽培する上で結実の安定に必要な受粉用の品種と優良栽培品種の組み合わせを選定する際に,S遺伝子型が明確にされていないために判断を誤ったり,あるいは受粉樹と優良栽培品種の開花期が年によって一致せず結実が不安定になったりするなどの問題が生じる.本研究は,Prunus属果樹の自家不和合性の分子機構を明らかにし,園芸育種学的に利用することを目的に始められた.本研究の研究期間内に,自家不和合性を示すPrunus属果樹であるアーモンド,カンカオウトウ,ニホンスモモ,ウメにおける自家不和合性反応の花柱側因子であるS-RNaseを同定することに成功した.また,これらS-RNaseをコードするcDNAを単離することにも成功した.得られたcDNAの塩基配列情報を利用することで,DNA分析によってS遺伝子型を判別することが可能になった.さらにウメでは,自家和合性形質と強く連鎖したS-RNaseの対立遺伝子を同定することができ,このS-RNase遺伝子指標とすることで,自家和合性個体を判別することが可能になった.当初の研究計画通り,本年度は,まずオウトウ(P.avium)やウメ(P.mume)あるいはニホンスモモ(P.salicina)やア-モンド(P.dulcis)などの配偶体型自家不和合性を示すPrunus属果樹の自家不和合性に関与するS-RNaseの同定と,S-RNaseをコードするcDNAの単離を試みた.その結果,上記4種のPrunus属果樹の全てにおいて,花柱に存在するS-RNaseを2次元電気泳動ゲル上の塩基性領域に同定することが出来た.2次元電気泳動で同定されたS-RNaseのN末のアミノ酸配列をペプチドシーケンサーで決定した.N末のアミノ酸配列をもとに作成したオリゴヌクレオチドを用いた3'RACEによりS-RNaseのcDNA断片の単離に成功した.これらのcDNA断片をプローブとして用いて,花柱から作成したcDNAライブラリーをスクリーニングすることで,S-RNaseの完全長cDNAを単離することに成功した.これらのPrunus属果樹のS-RNaseのcDNAの塩基配列より推定されるアミノ酸配列は,Prunus属と同じバラ科(Rosaceae)に属して,Prunus属果樹と同じタイプの自家不和合性を示すリンゴ(Malus x do mestica)やニホンナシ(Pyrus serotina)のS-RNaseのアミノ酸配列とはかなり異なることが明らかになった.このことはこれまでリンゴとニホンナシのS-RNaseのアミノ酸配列のみに基づいて推測されていたバラ科植物のS-RNaseの分子進化を考える上で重要な知見となるものと考えられた.続いて,次年度以降の形質転換実験のために,オウトウのシュート培養系の確立を試みた.萌芽約1ヵ月後の新梢先端部をゼアチン3μMを添加したMS培地で培養することで,オウトウ7品種のシュート培養を行うことが出来た.当初の研究計画の通り,本年度はこれまでの交配試験でS遺伝子型が明確にされているカンカオウトウ16品種を供試し,様々な制限酵素を用いたゲノムサザン分析を行い,S遺伝子型の判別法の確立を試みた.その結果,CTAB法で抽出しEcoRlとHindlllで消化した全DNAをS2,S3,あるいはS6-RNaseのC2-C5フラグメントとサザンハイブリダイズすることで,これまで同定されているS1-S6対立遺伝子を相互に見分けることが可能になった.

引き続いて,昨年度の実験で単離したS2,S3,S6-S-RNase cDNAの塩基配列を比較検討して見い出された保存領域の配列から2種類のフォワードプライマー(T2とC2)および1種類のリバースプライマー(C4R)を考案し,上記同様の方法で単離した16品種の全DNAをPCR増幅したところ,S1-S6の6種類の対立遺伝子を相互に見分けることが可能になった.以上の結果より,本研究の主要目的の一つであるDNA分析によるカンカオウトウのS遺伝子型の判別法が確立できた.すなわち,より詳細なそして正確な判別が必要な際はゲノムDNAのサザン分析を行い,またより簡便にそして短時間でS遺伝子型の判別をする際にはPCR分析を行うことで,カンカオウトウのS遺伝子型を交配試験によらずに,そしてまた開花の見られない幼若実生段階で行うことが可能になった.本研究のもう一つの主要な目的である形質転換によるオウトウの自家和合性組み換え個体を作出するために,昨年度に作出したシュート培養系の葉切片からの再分化系の確立に関する予備試験を行ったところ,葉切片からの不定芽形成が認められた.しかしながら,不定芽の形成率は非常に低く,また形成された不定芽からの植物体の再生も困難であったので,来年度引き続いて,葉片からの再分化に関する検討を行う予定である.本年度は、Prunus属果樹類のアグロバクテリウム法による形質転換系を確立し,昨年度と一昨年度の両年の研究で得られたS-RNaseのcDNAをアンチセンス方向で組み込むことで自家和合の形質転換個体を作出するために,まずはカンカオウトウを材料に種々の検討を行った.種々のサイトカイニンとオーキシンを添加した培地に,未受精の胚珠組織や未熟胚組織,あるいは成熟胚の子葉切片を置床し,培養を行ったが,カルスの形成は認められるものの不定胚や不定芽などの器官形成は全く認められなかった.そこで,培養シュートから葉片を作製し,種々のサイトカイニンとオーキシンを添加した培地上で培養を行ったが,前記の胚組織の培養と同じく,カルスの形成は認められるものの,不定胚や不定芽などの器官形成は全く認められなかった.このように,本年度は再生系の確立はできなかったが,本年度に得られたデータを吟味し,来年度も引き続いて,培地条件等をさらに検討して,再生系の確立を目指す予定にしている.なお,本年度も、培養の実験に加えて,昨年度と同様にクローニング実験も行い,オウトウのS-RNase遺伝子の部分配列やサンカオウトウやニホンスモモのS-RNaseのcDNAを単離することに成功した.オウトウのS-RNase遺伝子の部分配列をクローニングし,その塩基配列を明らかにしたことで,昨年度までの実験で確立していたPCRによるS遺伝子型の判別よりも,さらに精度の高いPCR/RFLPによるS遺伝子型の判別法を確立できた.この手法を適用することで,オウトウ新品種のS遺伝子型の判別を行うことに成功した.オウトウやウメ,あるいはニホンスモモやアーモンドなどのPrunus属果樹の多くは,配偶体型の自家不和合性を示す.本研究は,これら配偶体型自家不和合性を示すPrunus属果樹を材料に,自家不和合性機構を解明し,得られた情報の園芸育種学的な利用をはかるものである.これまでの研究で,カンカオウトウ,ウメ,ニホンスモモ,およびアーモンドの配偶体型自家不和合性に関与するS-RNaseを同定し,それらS-
植物のバイオマス増大をもたらすｍＲＮＡ転写後調節の分子機構

mRNAの3'末端に存在するポリA鎖は分解からの保護に重要であり,また近年ではポリA鎖長と翻訳効率の間に正の相関がみられることが報告されている。このことから,ポリA鎖長制御はmRNA分解と翻訳制御という二つの転写後制御における重要なステップであると考えられる。真核生物に広く保存されたポリA鎖分解酵素CCR4は複数のタンパク質とCCR4-NOT複合体を形成し機能する。シロイヌナズナにおける2つのCCR4オルソログ,AtCCR4aとAtCCR4bの二重変異株(atccr4変異株)ではエンドサイクルの亢進によってバイオマスの増大を示すが,その原因となる標的mRNAは未だ明らかでない。本研究ではatccr4変異株が示すバイオマス増大の原因となる標的mRNAと,その認識に関わるRNA結合タンパク質を明らかにすることを目的としている。本年度は,AtCCR4と相互作用するRNA結合タンパク質APUM2とAtCCR4a/bが,細胞質と細胞質中の顆粒状構造において相互作用することを明らかにした。mRNA分解や翻訳抑制に関わる因子の多くは細胞質中の顆粒状構造に局在することが知られており,この結果はAPUM2がAtCCR4を介した転写後制御に関与することを示唆する。この結果はAtCCR4-NOT複合体の相互作用解析結果と併せてPlant and Cell Physiology誌に投稿した。また,野生型株に比べてatccr4変異株のバイオマスが増大し,かつエンドサイクルが亢進している条件で,Ribo-seqおよびRNA-seqによる網羅的なmRNA翻訳量とmRNA蓄積量の測定を行なった。今後このデータを元に,エンドサイクルの制御に関わる遺伝子で,atccr4変異株で野生型株に比べ翻訳効率が上昇しているmRNAに着目することで,バイオマス増大の原因となる標的mRNAを絞り込めることが期待される。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。ポリA鎖の除去(脱アデニル化)はmRNA分解の最初の段階である。真核生物に広く保存された脱アデニル化酵素複合体としてCCR4-NOT複合体があり,脱アデニル化酵素サブユニットとしてCCR4とCAF1を持っている。他の真核生物ではCCR4-NOT複合体と相互作用するRNA結合タンパク質が,CCR4とCAF1の標的mRNAの認識に働くことが知られている。シロイヌナズナの脱アデニル化酵素であるAtCCR4aおよびAtCCR4bの二重変異株ではエンドサイクルの亢進によってバイオマスの増大を示すが,その原因となる標的mRNAは明らかとなっていない。本研究ではAtCCR4a/b二重変異株が示すバイオマス増大の原因となる標的mRNAと,それを認識するRNA結合タンパク質を解明することを目的としている。本年度は,AtCCR4a/bの相互作用因子のより包括的な探索を目指して,従来のIP/MS解析の実験系の改良を行った。その結果,AtCCR4-NOT複合体に含まれるもう一つの脱アデニル化酵素であるAtCAF1や複数のRNA結合タンパク質をAtCCR4a/bの相互作用因子候補として見出した。さらにシロイヌナズナに保存された複数のAtCAF1ファミリーについて,別のサブユニットとの相互作用を個別解析で調べた結果,一部のAtCAF1サブファミリーはAtCCR4a/bとは相互作用を示さないものの,複合体の足場タンパク質であるAtNOT1とは相互作用を示し,植物は異なる構成のCCR4-NOT複合体を持つことを示唆する結果を得た。また,AtCCR4a/bのバイオマス増大に関わる標的mRNAを同定するために,各mRNAのポリA鎖長を網羅的に同定するTAIL-seqの予備実験を実施し,実験条件の検討を行った。申請者はこれまでにIP/MS解析によるAtCCR4a/bの相互作用因子の探索を行い,AtCCR4-NOT複合体の構成サブユニットの同定を進めてきた。従来のIP/MS解析ではいくつかの相互作用因子が同定されたが,一方で個別解析によって明らかとなった相互作用因子の一部は検出されなかった。本年度はより包括的な相互作用因子の探索を目指してIP/MS解析の実験条件の検討を行い,AtCCR4を過剰発現させる植物材料を従来のタバコからシロイヌナズナに変更してIP/MS解析を行った。その結果,新規の相互作用因子を含む多くの候補因子を見出すことに成功した。IP/MS解析から別の脱アデニル化酵素であるAtCAF1ファミリーの一部が同定されたことから,AtCAF1ファミリーと複合体サブユニットとの相互作用を個別に検証した結果,AtCAF1の3つのサブファミリーのうち2つが複合体の足場であるAtNOT1と,またそのうちの1つがAtCCR4a/bとも相互作用し,AtCCR4-NOT複合体にAtCAF1が含まれることが明らかとなった。さらに,複数のRNA結合タンパク質を新たに相互作用因子候補として見出した。現在これらのRNA結合タンパク質の欠損変異株および過剰発現株の作成を進めている。TAIL-seqに関してはフランスの共同研究者との協議から,実験手法にさらなる工夫が必要であることが明らかとなり,本年度はより精度良く実験を行うための追加の予備実験を行った。一方で,現在までに解析に用いるRNAサンプルの調製を終えており,実験に用いる野生型株と二重変異株で核相に差が見られること,また既知の標的mRNAのポリA鎖長がAtCCR4a/b二重変異株では野生型株に比べて実際に長くなっていることを明らかにした。ポリA鎖はmRNAの保護構造であり,また近年ではポリA鎖長と翻訳効率に相関があることが報告されている。