hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
哺乳類の皮質下情動回路における運動発現機構の解明

情動は、個体そして種の生存のためには欠かせないものであり、ヒトをはじめとする哺乳類の脳機能のなかでも最も重要なものの一つである。本研究では、上丘から前頭前野にいたる情動関連領域において、感覚刺激によって生じた情動を運動出力に変換する神経メカニズムを解明することを目的とする。視覚刺激をもとに決められた運動を行なって報酬を獲得する行動課題を学習させたマウスにおいて複数の脳領域のニューロン群の活動を同時に測定し、また特定のニューロン集団の活動を人為的に操作することで、どのように情動から運動信号へと変換しているのかを明らかにすることを目指す。
イノベーション人材育成を通じた知識社会の持続的成長

公共部門において営まれる科学技術「知識」生産は現代知識社会の基盤を形成している。先進諸国のイノベーション政策は知識生産の促進を目的として数々の施策を試みてきたが、多くの政策は近視眼的であり、特に知識生産を支える「知識人材」の長期的育成の視点に欠ける。学術的にも類似の問題が存在し、知識生産と人材育成を整合的に説明する理論の構築が必要とされている。本研究では、「知識生産」と「知識人材育成」の時間発展のメカニズムを理論化し、これを実証データに基づき検証し、イノベーション政策への示唆を提供することを目的とする。
血液悪性腫瘍におけるテロメレースの活性化

白血病細胞におけるテロメア機能構造の変化とその病態との関連を明らかにするために、白血病細胞のテロメア長とテロメレース活性とを検討した。正常人の抹消血有核細胞のテロメア長を測定したところ、おおむね検体の由来する個体の年齢と相関して減少することを見いだした。しかし、調べられた最も高齢の98歳の正常人でも、平均テロメア長は約6kbを示し、正常個体の示すテロメア長には下限があることが示唆された。一方、慢性骨髄性白血病(CML)と急性骨髄性白血病(AML)では、患者の年齢に関わらずいずれも、正常人が示す下限値よりも短いテロメア長を示した。テロメレース活性を定量的かつ高感度で測定するために、我々はstretch PCR assayと呼ぶ方法を独自に開発した。テロメレース活性は正常細胞ではほとんど検出されなかったが、CMLの芽球転化後やAMLの再発例など、予後の悪い悪性化傾向の強い症例で特徴的に著しい活性が認められた。以上の検討から、短いテロメア長と強いテロメレース活性の二条件がそろうことは、悪性腫瘍の予後が悪いことを占う診断上の価値があることが示唆された。一方、逆に、この二条件が悪性腫瘍の進化の原動力となることを提唱した「テロメア・クライシス」モデルを発表した。テロメア・クライシスモデルでは、テロメアの短小化による染色体の癒合と切断、活性化テロメレースによる異常染色体末端のテロメア機能の修復が、異常染色体の出現を可能にすると考える。本モデルに従えば、テロメレース阻害剤の開発により、悪性腫瘍進行例における特徴的な高いテロメレース活性を阻害することができれば、これまでの抗腫瘍療法では治療が困難であった進行性の難治癌に有効である可能性がある。
環境音の可視化による聴覚障害者支援ーマンガ表現を用いた臨場感フォントによる支援ー

聴覚障害者は大きく分けて2つの困難を抱えている。一つ目は必要としている情報が十分に得られないこと、もう一つは誤解や認識不足などのコミュニケーションに関するストレスである。平成18年度の調査で分かっている日本の聴覚障害者数は34万3000人であり、およそ1000人に3人が聴覚障害者である。にもかかわらず周囲の細やかな気づきが十分とは言えず、いまだ十分な支援があるとは言えない状況である。我々はこれまで、音声認識エンジン「Julius」を活用し、話し手の熱意や教室のざわめきなどを視覚化するシステムに取り組んできた。本研究では、聴覚障害学生が必要とする音情報に感覚的な要素を付加し、環境音の可視化に取り組む。中でも、聴覚障害者には気付くことが難しいとされる視野外の危険音に意識が向く危険音可視化システムを開発する。本研究の目的は、聴覚障害者が視覚野の危険や注意を環境を表現するフォントを通して感じることにより、社会生活の安全を確保し、聴覚障害者の心理的負担を改善することである。平成30年度は数多くある環境音の中から、聴覚障害者が危険にさらされる危険音の絞り込みを行い、危険音・環境音に関する収集・分析を行った。また危険音を知らせるインターフェースに使用するための臨場感フォントを作成し、その使用ルールの検討を行った。音量は、フォントサイズ、ディスプレイ上の動きの速さ、フォントスタイルのトーン、およびディスプレイ上の位置の方向に反映される。これらの投影するためのHMD(ヘッドマウントディスプレイ)やARディスプレイの機種検討も行った。研究者チームである我々の専門外である音の解析が、当初の目論見をはずれ思いのほか前進していない。シンプルな機器を使っての測定ということもあり、風きり音を始めとする複雑な自然音の分析が難航している。30年度からそれまで使用していたロボット聴覚ソフトウェアHARKをクラウドサービスとして実装したHARKSaaS(SoftwareasaService)を新しく解析に用いることにした。これは従来のHARKで必須であったローカル計算機へのインストール作業や、高負荷の信号処理が実行できる高い性能要求が不要となるとの理由からである。今後の音解析を扱う研究が円滑にすすむことを期待するが、新しい環境へ移行したことでの難しさもあり、関連論文や書籍、インターネットから情報収集を行い、試行錯誤を繰り返しながらすすめている。平成29年度まですすめていた危険音を認識するための3要素でありおおまかに目処がついている音源方向の推定については、危険音の種類や距離など、録音条件を変え収集した音で数回にわたり検証を行い一定の精度がでていることが確認できている。また音データの解析に関して、実際の使用を想定する中で不要と思われる詳細なデータを排除し、危険音の定義を限定的なものに見直した。これらの再定義により、音源の特定や音量による音源からの距離をはかるの精度について遅れている問題が前進するであろうと考えている。これらの結果については2件の学会発表(海外、国内を各一回)と2件の論文投稿を行った。令和元年度は、環境音取得と解析で納得できる結果が出ていないプレシステムの調整と、臨場感フォントの表示方法を最終決定し、引き続き臨場感プレシステムの構築をすすめる。当初想定してた幅広い危険音の解析が難航しているため、新しく解析に用いることにしたHARK Saanの活用についてより理解を深め、データ解析に活かす。最終年である、今年度はこれまでの研究成果をまとめ、最終的なインターフェースとなる臨場感フォトの出力に反映しHMDで確認できるようまとめあげる。残念ながら、根本的な音解析で時間を大幅に使ってしまったが、解析するデータを再定義し簡略化したことで遅れを取り戻す予定である。まず詳細な調整は最終段階にするとして、まずシステムとしての構築を最優先に進める。また、これまでプレシステムの精度や進み具合が遅れていることから、協力してもらえる聴覚障害者のアドバイスをとれずにいる。現段階では健常者に耳栓を装着した聴覚障害状況をつくり検証をしている。最終年は実験に協力してもらえる聴覚障害者の声をフィードバックを行う予定である。これらの成果について海外発表1回、国内発表1回を予定している。聴覚障害は、一見してその不便さがわかりにくい障害である。そのため周囲の理解が十分に得られず、本人も周囲に不便さを隠して生活をしている場合が多い。また、周囲の状況を音で判断できないことは、日常生活の中で不自由を感じるだけでなく、危険な目にあうことも多い。我々は、危険や注意に関連する環境音(危険発生音と注意喚起音)を可視化する「臨場感フォント」を開発し、これらを用いて、聴覚障害学生が気づきにくい視野外の危険を検知し注意を喚起するシステムの構築に取り組んでいる。また、臨場感フォントを表示するインターフェースには、マンガ記号(漫符)やオノマトペ表現といったマンガ技法を用い、リアルタイムにそれらを表示するシステムの構築を目指している。平成29年度は、改めて環境音認知や音源測定に関する論文収集を行い、危険発生音と注意喚起音の選定方針について検討した。当初、想定していた8つの環境音を「危険発生音」と「注意喚起音」に分類し、その代表例として金属の落下音と自動車のクラクションを用いて基礎実験を行った。音は発生源の方向情報を含めて収集するため、水平方向8カ所にマイクが配置されたマイクアレイを使用した。音解析にはWindows10で動作するHAWKというソフトウェアを利用した。HARKは、音源定位や音源分離、音声認識を可能にするソフトウェアでWindowsとLinuxで動作する。

当該年度の実験では、8方向から音データを取得できることを確認し、取得した音情報から音源方向を推定することができた。「音源方向の推定」は、本研究の3要素の一つであり、今後は残りの2つの要素である「音種の推定」と「情報表示」に重きを置く予定である。研究計画では、1年目に(1)数多くある環境音の中から、聴覚障害者が危険にさらされる危険音の絞り込みを行い、危険音・環境音に関する調査・収集・分類する(2)臨場感フォントを作成し、危険・注意音と紐付け臨場感プレシステムの構築を進める予定であった。(1)の調査等では、聴覚障害学生の協力を予定していたが、当該学生の居住地移動など想定外の状況となった。このため、健常者に耳栓やヘッドフォンを装着して仮想的に聴覚障害状況をつくっての調査も検討したが、予備実験として筆者が調査をしたところ、長期にわたって調査をしなければ、日常的におこりうる危険な状況は感じにくいことがわかった。また、同手法では聴覚障害の状況把握としての精度に疑問が残るため、仮想実験は断念した。実験に代わる聴覚障害の状況把握方法として、現在は関連書物やインターネットでの情報収集を中心に、できる限りの環境を想定して実験を進めている。調査対象とする音についても再考した。当初は想定していなかった音でも、危険発生音として認識しなければいけないものがあると考え、本システムで検知すべき音の種類を再検討している。次年度以降も実験に協力してもらえる聴覚障害者を探り、アドバイスをいただけるよう努める。(2)の臨場感プレシステムの構築については、音情報の収集に関するノウハウがなかったため、試行錯誤をしながら進めている。その結果、8方向からの音情報の取得と、取得した音情報による音源方向の推定が可能となった。なお、同実験は、当初想定していた8つの環境音を「危険発生音」と「注意喚起音」に分類したうえで、認識しやすいであろう2つの音を用いて行った。これらの結果については1件の学会発表、2件の論文投稿を行った。聴覚障害者は大きく分けて2つの困難を抱えている。一つ目は必要としている情報が十分に得られないこと、もう一つは誤解や認識不足などのコミュニケーションに関するストレスである。平成18年度の調査で分かっている日本の聴覚障害者数は34万3000人であり、およそ1000人に3人が聴覚障害者である。にもかかわらず周囲の細やかな気づきが十分とは言えず、いまだ十分な支援があるとは言えない状況である。我々はこれまで、音声認識エンジン「Julius」を活用し、話し手の熱意や教室のざわめきなどを視覚化するシステムに取り組んできた。本研究では、聴覚障害学生が必要とする音情報に感覚的な要素を付加し、環境音の可視化に取り組む。中でも、聴覚障害者には気付くことが難しいとされる視野外の危険音に意識が向く危険音可視化システムを開発する。本研究の目的は、聴覚障害者が視覚野の危険や注意を環境を表現するフォントを通して感じることにより、社会生活の安全を確保し、聴覚障害者の心理的負担を改善することである。
光合成の起源に関する研究-原始地球における光エネルギー変換機構

本研究者は従来,生命の起源,特に光合成の起源に関する知見を得ることを目的とした調査研究を行って来たが,幸いにも当該研究課題に対し平成5年度文部省科学研究費補助金の援助を受け,実験的研究を開始することが出来た。御助成に対し深謝申し上げる次第である。本研究は,原始海洋に多量に存在したと思われるFe^<2+>イオン,あるいはFe^<2+>を含む無機化合物の光触媒機能に着目し,モデル原始大気を出発物質とした前生物的な有機化合物の生成過程をシミュレートしようとするものである。その第一段階として,原始大気の主成分であったと予想されるCO_2の光還元によるホルムアルデヒドの生成反応を取り上げた。これまでに種々の実験設備を整えるとともに実験手法を確立し,現在種々の試料を用いて光照射実験を行っている。補助金により,試料溶液にCO_2を常時通気させつつ,効果的に光照射を行える実験装置(タングステンランプ,冷却装置,ガス循環装置,ガラス製反応セルおよび攪拌機より構成)一式を作成した。また,ポテンシャルスイ-パ-を購入し,既存の設備と併せてサイクリックボルタンメトリー装置を組立て,光反応に伴うFeイオンの酸化数変化を検出する為の基礎的な知見を蓄積した。さらに,本試料におけるホルムアルデヒドの定量法として,フェニルヒドラジン法が適用できることを確認した。また,試料の一つとして,粘土あるいは火山灰にFe^<2+>が吸着した状況をシミュレートするために,シリカコロイド表面の吸着能に関する予備的な実験も行っている。以上の成果に基づき,現在種々の試料を用いて光照射実験を行っている段階である。
強誘電体薄膜分極スイッチング過程の時間分解その場X線構造解析

ナノ秒オーダーのパルス電場によって薄膜内で誘起される格子歪を検出する時分割X線測定と誘電率の高速測定を組み合わせた新しいシンクロトロン回折法を開発した。その方法を強誘電体エピタキシャル薄膜や多結晶薄膜の構造評価に適用し、ナノ秒オーダーのパルス電場によって誘起される格子の電気歪を放射光パルスX線回折測定によって検出できた。回折ピークシフト量から圧電定数を見積もった。SPring-8蓄積リングの"時計"であるRF信号を508MHzカウンターを介してパルス信号を高速パルス強誘電体分極評価装置は受けて試料へのナノ秒オーダーのパルス電場を印加した。これによって試料へのX線の入射のタイミングと同期した。SrRu03薄膜(下部電極)上に有機金属気相成長法により作製した膜厚750nmの強誘電体単結晶薄膜Pb(Zr_<0.25>,Ti_<0.75>)O_3(PZT)を調べた。白金(直径100μm)の上部電極同士をプローバーと呼ばれる先端R 10μmの電極針で押さえ、幅200ns、周期約800nsのパルス電圧を試料に印加した。最初に波高30Vのパルスを印加し、PZT薄膜内にPr+の残留分極状態にした後、0,10,20,30,40,50,60,70Vのそれぞれの波高について、PZT004回折付近でθ-2θスキャンし、時分割X線検出器を用いて回折X線強度を時間、角度の関数として記録した。電場印加時にPZT004主ピークは低角側にシフトした。また、低角側に別ピークを観察できた。これは、パルス電場に応じて、薄膜の格子に電気歪(電場誘起歪)が生じ、格子が伸張したことを意味する。印加電圧25Vでは、主ピークから見積もられる歪量Δd/dは0.0004であった。得られた圧電定数d_<33>は13pm/Vであった。また、別ピークから得られた圧電定数d_<33>は約50pm/Vであった。2個のピークが現れた理由も含め、データを検討している。強誘電体薄膜の分極反転過程のX線回折と誘電率を同時に測定することを目指し、本研究費により購入した強誘電体評価システムと既設の多軸回折計とを組み合わせた装置を大型放射光施設SPring-8、ビームラインBL13XUで立ち上げた。強誘電体評価システムは、プローバシステム、広帯域QV変換器と100Vパルスジェネレータ、および、コントローラから構成されている。試料はタンタル酸カリウム基板(KTaO_3)(100)(500μm)上にルテニウム酸ストロンチウム(SrRuO_3)(100)の下部電極(60nm)、強誘電体のチタン酸ジルコン酸鉛(Pb(Zr,Ti)03、ここではPZTと略す)(001)(100)

薄膜(2.4μm)を成長させ、白金(Pt)(無配向)上部電極(直径100μm)を取り付けたものである。入射X線エネルギーは12.4keVを用いた。試料の直前に置かれた屈折レンズ(Si基板上にポリマーSU-8をX線リソグラフィーで加工した開口約100mの微小レンズ列から構成されている)により、横方向は2.2μmに集光されたXI線ビームを用いた。印加する電場の大きさを徐々に大きくしながら、PZTのc-ドメイン002とa-ドメイン200回折強度付近のX-θmapを測定した。印加電圧により、ドメイン構造が変化することが観察できた。より詳細な解析によると、新たなドメイン構造の存在が確認できた。さらに、X線照射中と未照射中の試料中の電荷の時間変化を記録した。また、準備した集光ビームを用い、チタン酸ストロンチウム(SrTiO_3)基板上に育成したPZT薄膜(3μm厚)の断面からの、基板と薄膜からの020回折の逆格子マップを記録した。薄膜の深さの関数で格子定数が基板の格子に引きずられて変化していることを定量的に観察できた。平成18年度に導入した100V高速パルス強誘電体分極評価装置とX線計測システムを平成19年度では立ち上げ、強誘電体薄膜がナノ秒オーダーのパルス電場によって誘起される格子の電気歪を放射光パルスX線回折測定によって検出できた。SPring-8蓄積リングの"時計"であるRF信号を508MHzカウンターを介してパルス信号を高速パルス強誘電体分極評価装置は受けて試料へのナノ秒オーダーのパルス電場を印加した。これによって試料へのX線の入射のタイミングと同期した。SrRu03薄膜(下部電極)上に有機金属気相成長法により作製した膜厚750nmの強誘電体単結晶薄膜Pb(Zr_<0.25>,Ti_<0.75>)O_3(PZT)を調べた。白金(直径100μm)の上部電極同士をプローバーと呼ばれる先端R 10μmの電極針で押さえ、幅200ns、周期約800nsのパルス電圧を試料に印加した。最初に波高30Vのパルスを印加し、PZT薄膜内にPr+の残留分極状態にした後、0,10,20,30,40,50,60,70Vのそれぞれの波高について、PZT 004回折付近でθ-2θスキャンし、時分割X線検出器を用いて回折X線強度を時間、角度の関数として記録した。この研究のために、X線マイクロビームを形成するとともに時間分解測定系も準備した。電場印加時にPZT 004主ピークは低角側にシフトした。また、低角側に別ピークを観察できた。これは、パルス電場に応じて、薄膜の格子に電気歪みが生じ、格子が伸張したことを意味する。上部電極一下部電極間の電圧25Vでは、主ピークから見積もられる歪量Δd/dは0.0004であった。得られた圧電定数d_<33>は13pm/Vであった。また、別ピークから得られた圧電定数d_<33>は約50pm/Vであった。2個のピークが現れた理由も含め、データを検討している。
性腺発生・分化過程におけるStAMP遺伝子の発現および制御機構の解析

目的:StAMP(Steroidogenic acidic mitochondrial protein)は、成体においてステロイドホルモン産生組織(副腎・精巣・卵巣)に発現しており、StAMPがステロイド産生過程に関与している可能性がある。今年度の研究ではステロイド産生機構におけるStAMPの役割の解明を目的とした。方法:マウス副腎皮質腫瘍由来のY1細胞株を用いて、StAMPを標的としたsiRNA(100nM)を導入してOSAPの発現抑制を試み、0.5mM 8Br-cAMPにより刺激されたステロイド産生量について、RNAi活性を示さないnegative control導入群と比較検討した。ステロイド産生量は、培養液中のプロゲステロン濃度とし、RIAにより測定した。成績:siRNAによるStAMPの発現抑制の効果は,リアルタイムRT-PCR法や抗OSAPポリクロナル抗体を用いた免疫細胞化学染色法、ウエスタンブロットにより確認し、mRNA蛋白レベル双方とも約90%の抑制効果を示した。また、StAMPを発現抑制することにより,cAMP刺激後のプロゲステロン産生量はcontrolと比較し約40%減少した。そしてそのステロイド産生量減少は、膜浸透性の高いコレステロールアナログである5μMの22Rヒドロキシコレステロールを投与することにより回復した。尚、siRNA導入後の細胞のviabilityは特に有意に低下しなかった。結論:StAMPは、その発現抑制によりミトコンドリアの機能自体は低下することなくプロゲステロン産生を減少させることが判明し、ステロイド産生機構の主にコレステロールの外膜から内膜への輸送に関与する可能性が示唆された。目的:StAMP (Steroidogenic acidic mitochondrial protein)は、成体においてステロイドホルモン産生組織(副腎・精巣・卵巣)に発現しており、その組織内分布が核内レセプター型の転写因子であるSF-1に一致している。またSF-1は、ノックアウトマウスの成績から副腎・性腺の発生分化に不可欠の因子であることが明らかになっている。以上より、StAMPが性腺の発生分化に関与している可能性が考えられる。今年度の研究では、胎仔・新生仔期性腺におけるStAMPの発現変化をSF-1の発現と比較検討することを目的とした。方法:胎生12.518.5日および出生後021日の雌雄のマウスより各性腺を採取し、リアルタイムRT-PCR法によりStAMP、SF-1 mRNAの発現について定量的に検討した。また、抗StAMP、抗SF-1抗体を用いた免疫組織化学染色により、各時期の性腺における組織内局在を検討した。成績:胎仔・新生仔期におけるStAMP mRNAの発現量は、卵巣に比して精巣において高く発育に伴い漸増し、マウスの性成熟が開始される出生後21日目には、胎生12.5日目の約10倍の発現量を認めた。この発現変化は、SF-1 mRNAの発現と概ね同様の傾向を示した。組織内局在については、精巣では初期の間質細胞に、さらに分化の過程でleydig細胞に発現を認め、卵巣では主に出生後の莢膜細胞層にそれぞれ発現を認め、SF-1蛋白発現と類似した傾向を示した。結論:胎仔・新生仔期の性腺において、StAMPは卵巣に比べ精巣においてより強い発現を示した。その発現傾向は、性依存性の発現変化を認めるSF-1と類似していた。このことから、性腺分化におけるSF-1の機能発現に、StAMPの共在が必須である可能性が示唆された。
ウェルシュ菌の糖鎖分解酵素の機能および病原性解析

ウェルシュ菌感染時の侵襲性に大きく影響を与えると考えられるヒアルロニダーゼの性質を明らかにすることを試みた。ヒアルロニダーゼ遺伝子としてCanardらによりnagHが報告されており、その後のゲノムプロジェクトによりnagI, nagJ, nagK及びnagLの計5種類が報告された。組換えウェルシュ菌によりそれらのNagを過剰発現し、精製したところ、それらの酵素はすべてN-acetyl-β-glucosaminidaseで、ヒアルロン酸分解酵素活性は全く検出されなかった。そこで、本菌染色体より真のヒアルロニダーゼを検索した結果、新規遺伝子を見出し、発現・精製に成功した。ウェルシュ菌の感染時に重要な働きをすることが示唆されている糖鎖分解酵素の性質はほとんど明らかにされていない。そこで、本菌の侵襲性に大きく影響を与えると考えられるヒアルロニダーゼや各種糖鎖分解酵素の性質を明らかにすることを試みた。ヒアルロニダーゼ遺伝子としてCanardらによりnagHが報告されており、その後のゲノムプロジェクトによりウェルシュ菌13株の染色体上にはnagI, nagJ, nagK及びnagLの計5種類が存在することが明らかとなった。昨年度、組換えウェルシュ菌によりNagH及びNagJを過剰発現させ、これらの酵素を精製し基質特異性及び、同様に発現・精製したウェルシュ菌のβ-ガラクトシダーゼ(BgaA)及びシアリダーゼ(NanI、NanJ)との協同作用を調べた。また、NagH及びNagJには、ヒアルロン酸分解酵素活性が全く検出されなかったので、真のヒアルロニダーゼを検索した結果、新規リアーゼ(Hyl)を見出し、発現・精製に成功した。今年度は、残りのNagI, NagK, NagLの発現系を構築し、組換えウェルシュ菌により過剰発現させ、精製を試みた。NagLはNagH, Jと同様な方法で発現することに成功したが、NagI及びNagKは培地中にほとんど遊離しなかった。これらの酵素はC-末端領域にLPxTG motifを有し、細胞壁にアンカーリングされると考えられたので、C-末端領域をそれぞれ37残基及び36残基欠失させたrNagI及びrNagKの発現系を構築したところ、大量に培地中に遊離し、精製に成功した。精製した酵素はすべてpNP-GlcNAcを加水分解したので現在カイネティクス解析を行っている。また、Hylの部位特異的変異体の発現系を構築した。Y282Fのヒアルロニダーゼ活性が消失していたことから、Y282が活性残基であることが示唆された。ウェルシュ菌の感染時に重要な働きをすることが示唆されている糖鎖分解酵素のなかで、本菌の侵襲性に大きく影響を与えると考えられるヒアルロニダーゼや各種糖鎖分解酵素の性質を明らかにすることを試みた。ヒアルロニダーゼ遺伝子としてCanardらによりnagHが報告されており、その後のゲノムプロジェクトによりnagI, nagJ, nagK及びnagLの計5種類が知られている。そのなかで、まず、組換えウェルシュ菌によりNagH及びNagJを過剰発現させ、これらの酵素を精製した。精製したNagH及びNagJには、pNP-GlcNAcは加水分解したが、ヒアルロン酸分解酵素活性は全く検出されなかった。pNP-(GlcNAc)2やpNP-(GlcNAc)3、キチンを基質とした場合、NagJはこれら基質を徐々に分解するが、NagHは全く分解しなかった。次に、同様に発現・精製したウェルシュ菌のβ-ガラクトシダーゼ(BgaA)及びシアリダーゼ(NanI、NanJ)で処理したfetuinを基質とした場合、NagJでは効率よくGlcNAcを遊離したが、NagHではGlcNAcの遊離は認められなかった。HT-29細胞抽出物を基質としたところ、両酵素ともO-GlcNAc化タンパク質からGlcNAcを遊離させた。一方、NagH、NagJともに、L-AsnにGlcNAcが結合したN-Asnやendo-H処理したRNaseBからN-結合型GlcNAcの遊離は認められなかった。これらの結果から、NagJは糖鎖の末端GlcNAcを分解するN-acetyl-β-glucosaminidaseで、NagHはO-GlcNAc化タンパク質からGlcNAcを遊離させる厳密な基質特異性を有するO-GlcNAcaseであることが示唆された。ウェルシュ菌の感染時に重要な働きをすることが示唆されている糖鎖分解酵素の性質についてはほとんど明らかにされていない。一方、Clostridium属の遺伝子は極端にAT-richであり、糖鎖分解酵素の多くは高分子量であるため、通常の大腸菌発現系を使った場合、その完全長を発現させることは困難である。

そのため、ウェルシュ菌をホストとした大量発現系を構築し、今までに、5種類のexo-β-N-acetylglucosaminidase、2種類のsialidase、β-galactosidaseや本菌の侵襲性に大きく影響を与えると考えられるhyaluronidase等の分泌型糖鎖分解酵素を精製し、それらの性質の一部を明らかにしてきた。今回、endo-β-N-acetylglucosaminidaseの発現系を構築し、糖タンパク質であるfetuinやRNaseBに作用させたところ、fetuinの糖鎖は全く分解せずに、RNaseBの糖鎖を加水分解した。sialidase及びβ-galactosidase処理したfetuinも加水分解しないことから、この酵素は高マンノース型糖鎖に特異的に作用すると考えられる。また、Clostridium属の遺伝子を効率的に発現させるために新規発現システムを構築した。T7 RNA polymerase遺伝子とClostridium difficileのキシロース利用オペロンのレプレッサー遺伝子xylRを、ウェルシュ菌染色体上のα毒素遺伝子とその上流のyplC遺伝子と置換し、キシロース添加によりT7 RNA polymeraseが発現するホストを構築した。T7プロモーターを有する発現ベクターで形質転換することにより、T7プロモーター下にクローニングしたClostridium属の遺伝子が高効率に発現することを示した。分子微生物学本研究では、ウェルシュ菌感染時における糖鎖分解酵素の役割を解明することを目的として、糖鎖分解酵素を発現・精製し、基質特異性、糖鎖結合特性を解析すると共にそれらの協同作用を明らかにすることを目指している。当初から計画どおり研究が進まないことを考慮して、各課題を並行して進めることができるように研究を計画している。前年度は、平成25年度、平成26年度に実施を計画していた課題を前倒しし、NagHの基質特異性解析や構造解析のための触媒ドメイン発現系の構築に成功するとともに、真のヒアルロニダーゼである新規リアーゼ(Hyl)の発現と一部機能解析に成功した。今年度は、平成24年度の実施計画で示したNagI、NagK、NagLの発現・精製に成功し、さらにHylの部位特異的変異株を作製しヒアルロニダーゼ活性が消失することを示した。それらのことから、全体的にはおおむね順調に進展していると考えられる。本研究では、ウェルシュ菌感染時における糖鎖分解酵素の役割を解明することを目的として、糖鎖分解酵素を発現・精製し、基質特異性、糖鎖結合特性を解析すると共にそれらの協同作用を明らかにすることを目指している。平成24年度の実施計画で示したNagI、NagK、NagLの発現・精製は未だ成功していないが、平成25年度、平成26年度に実施を計画していた課題を前倒しし、NagHの基質特異性解析や構造解析のための触媒ドメイン発現系の構築に成功するとともに、真のヒアルロニダーゼである新規リアーゼの発現と一部機能解析に成功した。当初の研究計画どおりNagI, NagK, NagLのカイネティクス解析を行う。なお、NagHとNagJについてはすでに解析済みである。
脳内覚醒伝達物質、オレキシンは吸入麻酔薬の麻酔深度に影響する

平成16年度は脳内オレキシン細胞の特異的破壊が麻酔深度に与える影響を検討した。研究目的オレキシンは近年発見された神経ペプチドで人間の摂食行動を制御するだけでなく、脳内覚醒伝達物質として注目を集めている。このオレキシン細胞が減少する病態はナルコレプシーとして知られ、覚醒維持が困難となり睡眠に移行しやすくなる。このことから、オレキシン細胞は覚醒維持に重要な役割を果たしていると考えられる。視床下部外側はオレキシンを放出するオレキシン細胞が局在している場所である。しかし、視床下部外側には他の神経細胞も存在するため、従来用いられてきた電気的焼灼や薬物注入によるオレキシン細胞の破壊では特異性に欠ける。オレキシンとサポリンを結合させた物質、オレキシン-サポリン複合体は、オレキシン細胞表面に存在するオレキシン受容体と特異的に結合してオレキシン細胞内へ侵入し、細胞内リボゾームを破壊する。この複合体を視床下部外側にmicroinjectionした。オレキシン細胞を特異的破壊し、オレキシンの作用が不活化されたラットの麻酔深度の変化をTail clump testで測定することで吸入麻酔薬との関連性を評価した。結果脳内覚醒伝達物質であるオレキシンの作用が不活化されたラット群はコントロール群と比較して、吸入麻酔薬の必要量が有意に低下した。このことから、オレキシンは吸入麻酔薬の作用機序に関係がある可能性が高くなった。
軌道自由度を有する分子性超伝導体における電子対形成の研究

超伝導には、永久電流を担うための弱い電子対を形成する結合力が必要である。一方で、電子を引き離す反発力による磁気的効果も無視できない。本研究では、分子性超伝導体を用いて、結合力と反発力が両立できる「からくり」を解明する。分子性結晶の超伝導体は、HOMOとLUMOの準位が近いので、軌道自由度が存在する。例えば「HOMOは結合力を担い、LUMOは反発力を担う」というように、互いの役割が独立している。分光学的手法による結合力と反発力の定量化を行うことで、弱い電子対の形成に適した条件を見出す。また、結合力や反発力を選択的に促進させることで、分子性結晶に複合的機能を付与できるのか試みる。
高度認知障害を有する高齢患者に対するケアの効果を測定するための方法開発

本研究の目的は、高度認知障害を有する高齢患者に対して行ったケアの効果を測定するための適切な次元と方法を見出し、この検討過程から高齢患者のケアの現場で実用可能な測定用具開発のための理論的基盤を明らかにすることである。本年度は、昨年度得られた効果測定の主次元として対象患者の「快適さ=心地よさ」をとりあげ、ケア提供者がチェックするツールに構成して(1)研究者自身が認知症治療病棟で3例の患者に使用、(2)認知症療養病棟看護師により計15例の患者に使用した。これらの結果をもとに専門家会議で妥当性、運用可能性を検討した。ツールを使用した認知症療養病棟看護師へのインタビューでは、簡単にチェックできること、チェックすることで観察視点が明確になったこと、ケア方法を工夫したことなどが語られ、運用可能性は高いことが示された。また、患者の経過からチェック項目の妥当性が考えられた。検討結果をふまえ修正したツールは、対象患者の心地よさを示す表情等6項目と心地よくない状態を示す項目6項目、および日常生活の次元として食事、排泄、睡眠の状態を示す3項目のチェックと、その他気がついた点の自由記述から成る。評価方法は、心地がよい/よくない状態を示す12項目は、そのレベルを「全くみられない」「1度みられた」「複数回みられた」という頻度で示すこととした。また、その性質を把握することでケアの効果の変化をより詳細に示すことができるため、特に印象に残った状態について記述する欄を設けた。このツールが効果測定としての信頼性を得るには測定方法に基準を設けるなどの課題がある。しかし、ケア提供者たちがケアの効果として患者の心地よさをとらえようと努力し、その経過を見ることで、より心地よい状態を目指す取組みを成し得ることが示され、これを理論的基盤として構造化した。本年度は、老年看護領域の研究者と実践者との検討会議および実践者へのヒヤリング調査により研究者が文献検討をもとに提示した測定次元・方法を検討した。検討会議では、ケアの効果を測定するための次元として文献検討をもとに、「回復、快適さ」「予防」「ケアを提供する者のケア姿勢、倫理観」の3点を提示したが、これらの関係性を明確にする必要があることが問題提起された。そこで、ケア提供のプロセスとして、(1)予防的観点、(2)ケアを提供する者のケアに対する倫理観を含むケア姿勢があり、これが実施されているか、その結果として、(3)快適さ(comfortable)のアウトカムが得られているかの両側面(プロセスと結果)を測定次元にする必要があると考えられた。測定方法については、前提として、高度認知障害を有する高齢患者の特性により患者本人に問う質問紙では把握できないため、患者に関しては観察による測定となる。ヒヤリング調査においては、患者の「快適さ」に関する観察項目はわずかなものしか出されなかった。また、ケアを行っている最中では、苦痛も伴うが、その後にケア前よりもより「快適さ」の高い状態がもたらされることがあげられた。すなわち、ケアの効果としての「快適さ」を、ケアのどの時点で測定するかも検討事項となることが明らかになった。また、高度認知障害を有する高齢患者の看護において、ケアを提供する者の倫理観を含むケア姿勢に関しては、重要な課題であることについて語られた。来年度は、これらの結果をもとに、主として「快適さ」に関するアウトカム測定について、現実的な方法を試用することから理論的基盤を明らかにする。
膜電位センサーとしてのカルシウム・チャネルの構造機能相関

1.心筋・骨格筋型のK_<ATP>チャネルが、先にクローニングしたスルフォニル尿素受容体SUR1に類似のSUR2Aと内向き整流性Kチャネルの仲間のKir6.2から構成される事を生理・薬理学的実験、およびmRNA発現の組織分布の研究等により明らかにした。2.SUR1の構造・機能相関を調べる目的で、SUR1の2つのヌクレオチド結合領域(NBF-1と-2)にアミノ酸点突然変異を導入した。変異を持った8種のK_<ATP>チャネルをそれぞれ発現させ、パッチクランプ法、スルフォニル尿素結合実験、^<86>Rb^+流測定実験、共焦点顕微鏡観察により性質を調べた。NBF-1の変異では、蛋白の発現量、スルフォニル尿素結合量、機能的なチャネルの活性が、大きく減少した。NBF-2の変異では、UDPによるチャネル活性の増強作用が消失した。これらの結果は、2つのNBFが異なる役割を果たす事を示唆する。3.K_<ATP>チャネルを構成するSUR1とKir6.2分子の構成比を明らかにする目的で、SUR1の後ろにKir6.2を1つ、あるいは2つ繋いだ蛋白を発現させた。^<86>Rb^+流測定、パッチクランプ法により調べた結果4つのKir6.2と4つのSUR1がチャネルを構成すると考えた。4.SUR1とSUR2Aで構成されるK_<ATP>チャネルは、活性を阻害するATPやスルフォニル尿素の濃度、有効なチャネル開口薬の種類などが違う。これらの性質の差を決めているSURの分子内構造を探るために、SUR1とSUR2Aの分子の一部を入れ替え、^<86>Rb^+流測定実験、パッチクランプ法などによりキメラ・チャネルの性質を調べた。5.SUR1とKir6.2およびSUR2AとKir6.2によって構成されるK_<ATP>チャネルが、G蛋白によってどのような制御を受けるか調べた。両チャネルの活性はともにGi-α1で上昇し、βγサブユニットは活性に影響を与えないことがわかった。
分子レベルその場観察によるタンパク質結晶へのマイクロ欠陥取り込み機構の解明

結晶表面上に吸着した不純物や空孔を起源とするマイクロ欠陥が,タンパク質結晶の成長に及ぼす影響の解明に取り組んだ.個々の空孔の可視化にはいたらなかったが,結晶表面上の個々のタンパク質分子や単位成長ステップを様々な条件下で可視化・その場計測することに成功した.そして,不純物が不均一2次元核形成やステップカイネティック係数に顕著な影響を及ぼすこと,アガロースゲルが不純物の輸送を抑制すること,結晶表面上での分子の拡散運動は溶液中にくらべて4-5桁遅いこと,分子の吸着は逐次的に徐々に進行すること,などを見出した.結晶表面上に吸着した不純物や空孔を起源とするマイクロ欠陥が,タンパク質結晶の成長に及ぼす影響の解明に取り組んだ.個々の空孔の可視化にはいたらなかったが,結晶表面上の個々のタンパク質分子や単位成長ステップを様々な条件下で可視化・その場計測することに成功した.そして,不純物が不均一2次元核形成やステップカイネティック係数に顕著な影響を及ぼすこと,アガロースゲルが不純物の輸送を抑制すること,結晶表面上での分子の拡散運動は溶液中にくらべて4-5桁遅いこと,分子の吸着は逐次的に徐々に進行すること,などを見出した.1.マイクロ欠陥観察装置の設計・作製・立ち上げ現有のレーザー(532nm)とシリンドリカルレンズ等を組み合わせて,タンパク質結晶中のマイクロ欠陥からの散乱光をその場観察する装置を設計・作製し,立ち上げた.装置は,現有のレーザー共焦点微分干渉顕微-結晶表面近傍タンパク質1分子観察-複合顕微鏡に組み込んだ.そして,ニワトリ卵白リゾチーム正方晶系結晶を用いて,結晶表面および内部に取り込まれた微小な固相インクルージョンからの散乱高を十分な感度で観察できることを確認した.2.不純物濃度分布観察装置の設計・作製・立ち上げ新規に購入した蛍光顕微光学系(株式会社和泉テック製)を現有のレーザー共焦点微分干渉顕微-結晶表面近傍タンパク質1分子観察-複合顕微鏡に組み込み,タンパク質結晶周囲の微量な不純物の濃度分布をその場観察する装置を設計・作製し,立ち上げた.そして,ニワトリ卵白リゾチーム正方晶系結晶を用いて,装置の動作を確認した.しかし,装置の設計・作製に予想外の時間を要したため,タンパク質結晶周囲の蛍光ラベル化不純物タンパク質濃度分布をどこまで低濃度で測定できるかの確認は行うことが出来なかった.3.タンパク質結晶の成長に及ぼす不純物効果のその場観察さらに,1.で立ち上げたマイクロ欠陥観察装置と2.での蛍光顕微光学系を合体させ,結晶表面での単位成長ステップ,結晶表面での不純物の吸着・脱離・拡散挙動,転位・インクルージョン,結晶周囲の不純物濃度分布を全て同時にその場観察できる装置を立ち上げた.そして,本装置を用いて,不純物の種類と結晶表面での吸着サイトの相関を明らかにするとともに,不純物がリゾチーム結晶のステップ前進速度および2次元核形成速度に及ぼす効果を明らかにした.1.タンパク質結晶中のマイクロ欠陥観察について昨年度に立ち上げたマイクロ欠陥観察装置を用いて,リゾチーム結晶中のマイクロ欠陥のその場観察を行った.そして結晶の成長中に結晶中に取り込まれたマイクロ欠陥からの散乱光を検出する事に成功した.ただ,結晶表面をエッチングして得られる平底型エッチピット(マイクロ欠陥起源)の密度と結晶中で検出されるマイクロ欠陥の密度との定量的な相関関係はまだ得られていない.この問題点を解決するには,1)マイクロ欠陥からの散乱光を光源とする迷光の完全な除去,および2)散乱光強度の基準となる標準試料の作成(ナノ粒子を既知密度で内包するガラス等)が必要であることがわかった.2.不純物が2次元核形成に及ぼす効果について種々の濃度が異なる不純物を純度99.99%のリゾチーム過飽和溶液に意図的に加え,レーザー共焦点微分干渉顕微鏡を用いて,リゾチーム結晶表面での2次元核形成速度を系統的に測定した.その結果,高過飽和度下では不純物の種類や濃度によらず均一2次元核形成が進行するが,低過飽和度下では顕著な不均一2次元核形成が進行する事を見出した.また,結晶表面に吸着した不純物が起点となり,結晶表面上の同一の点から3-5回程度2次元核形成が繰り返し起こる事や,微結晶が付着した表面からは多層厚みの2次元アイランドが形成される事も見出した.3.流れが成長に及ぼす効果について観察セル内に強制流れを発生させ,純度99.99%および98.5%のリゾチーム過飽和溶液中でのリゾチーム結晶の成長過程をその場観察した.そして,従来,光干渉法を用いた研究で報告されているステップ成長速度の振動は起きない事,流れの効果の本質は不純物の輸送促進にある事,高純度試料溶液中の流れにより引き起こされる成長促進の原因は表面過飽和度の増加ではなく表面の状態変化に伴うステップ密度の増加にあることを明らかにした.1.不純物がタンパク質結晶のステップ前進速度に及ぼす効果について純度が99.99%のリゾチーム試料,および本試料に意図的に不純物タンパク質を加えた試料を用いて,リゾチーム正方晶系結晶{110}面上の単位成長ステップの前進速度を,レーザー共焦点微分干渉顕微鏡で測定した(LCM-DIM).また,蛍光ラベル化したリゾチームモノマーおよびダイマーの1分子観察を行った.その結果,テラスにランダムに吸着するダイマーの場合には,過飽和度の増加とともに結晶表面の溶液に対する露出時間が減少する為,不純物効果は単調に減少した.

一方,ステップに選択的に吸着する蛍光ラベル化リゾチームモノマーの場合には,過飽和度の増加に伴い不純物効果は単調には減少せず,低過飽和度領域下で不純物効果が一定の領域が存在することを見出した.また,この違いを,不純物の吸着サイトに違いによって説明することに成功した.2.タンパク質の結晶化におけるゲルの利用と不純物効果について通常の溶液とアガロースゲル溶液中で,純度が99.99%および98.5%の試料を用いて,リゾチーム正方晶系結晶の2次元核形成速度およびステップ前進速度をLCM-DIMで測定した.その結果,ゲルがリゾチーム結晶と良い親和性をもつため,不均一核形成サイトとして働くこと,およびステップの前進を妨げないことを見出した.また,ゲルは不純物の結晶表面への輸送を抑制し,不純物フィルターとして働くことを明らかにした.本研究では,これまで別々に議論されていたゲルの効果を,はじめて定量的に実証することに成功した.
哺乳類上皮細胞における初期接着構造でのaPKCの機能解析

Atypical PKC (aPKC)は線虫やショウジョウバエからヒトまで種を越えて保存されたセリンスレオニンキナーゼであり、様々な細胞極性の制御に関与している。哺乳類上皮においてaPKCは上皮特有の接着構造の構築に関わっていることが報告されているが、その分子メカニズムは未だ不明な点が多い。加えて、接着装置の形成過程は細胞骨格のダイナミックな再編成を伴うため、その解析は非常に困難なものである。我々は、上皮接着構造形成におけるaPKCの機能を探るとともに、細胞骨格に対するaPKCの機能的な関与について詳細に検討を行うことを目的として、Disc Confocal Live Cell Imagingのシステムを立ち上げた。これにより、GFP-actin導入細胞での極性化依存的なアクチン細胞骨格の時空間的な動的変化について、これまでにない高解像度での観察が可能となった。この解析を通じて、上皮細胞のコーティカルアクチンバンドルの後期発達過程に、特にコーティカルバンドルの前駆構造が拡張する過程において、aPKCのキナーゼ活性が必須な役割を担っていることが明らかとなった。また、非筋ミオシンはコーティカルアクチンバンドル形成に関与する事が知られているが、この後期課程において非筋ミオシンはaPKCの機能とは独立に、かつ相互反発的に機能していることも明らかとなった。これらの結果は、解析の困難であった接着構造形成の後期課程におけるaPKCの機能的な重要性についての新たな視点を与えると共に、アクチン細胞骨格の後期発達過程における新たな作用機序の存在を示唆している。現在、本内容をもとに論文投稿準備中である。
EGF受容体・シグナル伝達を分子標的とする口腔がん治療の基礎的検討

近年、がん細胞内分子を標的とする薬剤の開発が進められ、臨床応用が図かられて来ている。この中で、EGF受容体ならびにそのシグナル伝達物質(PKC,PI3K等)を標的分子とするものが開発され、注目と議論がなされて来ているが、作用機序については検証すべき部分も多いままとなっている。そこで、本研究では、より詳細なEGF刺激のシグナル伝達様式を解明し、これらシグナル伝達物質を標的とする薬剤の効果を検証すると伴に、口腔がんの浸潤転移能獲得機序および分子標的治療のKey Pointを明らかとすることを目標として展開している。これまでの成果と今年度の成果を包括すると・・・、1:EGF刺激後のPKC活性化に関与するPKC分子種間のクロストーク機序の解明これまでの結果、浸潤シグナル(運動能亢進シグナル)がEGF高感受性クローンでは、[EGF受容体リン酸化(erbBホモ二量体)⇒PLCγ活性化⇒PKC活性化]又はの2つの経路により伝達され、nPKCδ,aPKCξの2つの分子種が関与していることが示された。このことは、単にpanPKCを抑制するのではなく、分子種を特定し、これを特異的に抑制することによって、同等の効果が得られ、副次的作用を回避できる可能性を示唆した。2:EGF刺激高感受性クローン、低感受性クローン間におけ遺伝子発現の差異高感受性クローン、低感受性クローンを用い、EGF刺激後の遺伝子発現の相違をDNAマイクロアレーにて検討した所、発現増強するもの減弱するもの各々50種ほどの既知の遺伝子が有意に変化していた。即ち、EGF刺激が単純にPKCシグナルのみに作用するのではなく、かなり多くの分子を動員したカスケードが構築されている可能性を示唆した。3:ラットがん細胞およびヒト口腔がん細胞にEGF刺激を加えると、細胞質内にreactive oxygen radicalsが誘導され、これに呼応してDNA damage productsの増加と形質変換(運動能・浸潤能の増強等)が観察された。このことは、単にEGF刺激が受容体を介するシグナル伝達のみならず、受容体を介さない系も示唆された。上記の研究により、現在、以下の点までが明らかとなった。1:EGF刺激後の運動シグナルは、受容体リン酸化⇒PLCγ活性化⇒DG依存性PKC活性化により伝達されること、別の経路として受容体リン酸化⇒PI3K活性化⇒PKC活性化により伝達されることが明らかとなった。また、EGF刺激後の運動シグナルはerbBホモ二量体形成又はerbB,erbB3ヘテロ二量体形成により伝達が開始され、その両者のシグナルが合同する必要のあることが示された。即ち、一方のシグナルが遮断されることにより運動抑制を図ることが可能と考えられ、erB3のシグナル伝達に関与するPI3Kのみを制御することにより、他方の刺激を無効とする機序が考えられた。2:上記の各シグナルはnPKCδ,aPKCξを活性化し、この二つのシグナルにより始めて運動が生じ、両者のクロストークにより以降のシグナルが伝達されることが示唆された。また、EGF刺激によりがん細胞内にROS(reactive oxygen spices)が発生し、これ自体もシグナル伝達に関与しており、受容体そのものを根源的にブロックすることは、この観点において意義があることと考えられた。

3:ヒト口腔扁平上皮がんにおける浸潤シグナルの末端では、FAK、Rhoが重要な働きをしていることが明らかとなった。また、Rhoは浸潤刺激において発現量には変化は認められないものの細胞内の分布(局在)に変化が生じ浸潤にかかわる細胞運動を制御していることが明らかとなった。近年の分子生物学の発展に伴い、がん細胞内分子を標的とする薬剤の開発が進められ、臨床応用が図かられて来ている。この中で、EGF受容体ならびにそのシグナル伝達物質(PKC, PI3K等)を標的分子とするものも開発されて来ているが、その作用については検証すべき部分も多いままとなっている。そこで、本研究では、以下の点を比較検討し、より詳細なEGF刺激のシグナル伝達様式を解明し、これらシグナル伝達物質を標的とする薬剤の効果を検証し、口腔がんの浸潤転移能獲得機序および分子標的治療のKey Pointを明らかとすることを目標としている。1:EGF刺激後のPKC活性化に関与するPKC分子種間のクロストーク機序の解明これまでの結果、浸潤シグナル(運動能亢進シグナル)がEGF高感受性クローンでは、[EGF受容体リン酸化(erbBホモ二量体)⇒PLCγ活性化⇒PKC活性化]又はの2つの経路により伝達され、nPKCδ,aPKCξの2つの分子種が関与していることが示された。2:EGF刺激高感受性クローン、低感受性クローン間におけ遺伝子発現の差異高感受性クローン、低感受性クローンを用い、EGF刺激後の遺伝子発現の相違をDNAマイクロアレーにて検討した所、発現増強するもの減弱するもの各々50種ほどの既知の遺伝子が有意に変化していた。しかしながら、あまりに候補となる遺伝子が多いため、各論には達しておらず、次年度以降の課題となっている。3:EGFオートクリン・ループ獲得クローンに於けるPKC分子種の解析ならびに分子標的の効果の解明本年度は上記検討を行うためのオートクリン・ループ獲得クローンの管理を行い、候補確定には達していないが、最も研究に使用しやすいクローンの選定を行った。近年、がん細胞内分子を標的とする薬剤の開発が進められ、臨床応用が図かられて来ている。この中で、EGF受容体ならびにそのシグナル伝達物質(PKC,PI3K等)を標的分子とするものが開発され、注目と議論がなされて来ているが、作用機序については検証すべき部分も多いままとなっている。そこで、本研究では、より詳細なEGF刺激のシグナル伝達様式を解明し、これらシグナル伝達物質を標的とする薬剤の効果を検証すると伴に、口腔がんの浸潤転移能獲得機序および分子標的治療のKey Pointを明らかとすることを目標として展開している。これまでの成果と今年度の成果を包括すると...、1:EGF刺激後のPKC活性化に関与するPKC分子種間のクロストーク機序の解明これまでの結果、浸潤シグナル(運動能亢進シグナル)がEGF高感受性クローンでは、[EGF受容体リン酸化(erbBホモ二量体)⇒PLCγ活性化⇒PKC活性化]又はの2つの経路により伝達され、nPKCδ,aPKCξの2つの分子種が関与していることが示された。