hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マスト細胞サブセットの提唱とサブセット特異的な免疫疾患治療方策

マスト細胞にこれまで存在することが提唱されてきたサブセットとは異なるマスト細胞サブセットが存在することを明らかにするため、マスト細胞において重要な役割を果たしている分子を探索し、アレルギー等でマスト細胞の機能への関与が報告されているスフィンゴシン-1-リン酸受容体に着目し研究を行ってきた。また、マスト細胞が重要な役割を果たしている疾患である炎症性腸疾患においてもこれらの分子は重要な役割を果たしていることが知られている。しかし、スフィンゴシン-1-リン酸受容体のうちSIP2受容体は炎症性腸疾患における機能が知られていない。これを明らかにするため、野生型マウスとSIP2欠損マウスにデキストラン硫酸ナトリウムによる炎症性腸疾患モデルを誘導したところ、SIP2欠損マウスにおいて、野生型マウスと比較して激しい体重の減少が観察された。このとき、野生型の腸管では見られない組織の炎症像、マスト細胞の活性化、好中球の浸潤がSIP2欠損マウスでは観察された。さらに、ILCやマクロファージなどといった炎症性細胞の増加も観察され、SIP2が欠損することで炎症の増悪化が引き起こされることがわかった。炎症の増悪化の原因として、COX-2分子に着目した。この分子は腸管の粘膜バリアーを強化し、炎症性腸疾患の防御に働くことが報告されている。一方で、このCOX-2はSIP2によって産生が制御されるという報告もこれまでにあることから、各マウスから得た細胞におけるCOX-2の産生を比較したところ、SIP2欠損マウスの血管内皮細胞やILCから産生されるCOX-2の産生量が野生型マウスより減少していることが示唆された。これにより、COX-2による粘膜バリアー形成が低下していることが考えられた。よって、粘膜バリアー機能を評価するためにFITC-dextranを用いた実験を行ったところ、SIP2欠損マウスではバリアー機能の低下が起きている可能性が示唆された。本年度においては、当該内容で論文投稿までは最低限行う予定であったが、論文の投稿に十分な量のデータの収集が行えなかったため。(抄録なし)免疫担当細胞の一つであるマスト細胞は全身組織に広く分布する細胞で、炎症やアレルギーといった生体に悪影響を及ぼす疾患のみならず、寄生虫感染や敗血症においては生体防御に働くといった二面性を持った細胞である。マスト細胞には古くから粘膜型マスト細胞と結合組織型マスト細胞の二種類が存在すると考えられており、この分類はマスト細胞の産生するマスト細胞プロテアーゼの違いにより規定されてきたが、現在では同じプロテアーゼの産生を行なっているにも関わらず他に発現する分子が異なるなど、既存の分類には当てはまらない細胞が存在することが知られており、マスト細胞は組織ごとに異なるサブセットを有しているのではないか、ということも示唆されている。私は以上のことから、組織ごとに異なるマスト細胞サブセットが疾患の発症において異なった作用を示しているのではないかと考え、マスト細胞サブセットの提唱とサブセット特異的な免疫疾患治療方策という課題を遂行してきた。私は、本年度に研究課題を遂行するにあたり、マスト細胞において重要な役割を果たす分子と、そのマスト細胞関連疾患に関する探索を行なってきた。その一つが本年度に当研究室で報告した、マスト細胞上の核酸受容体の炎症性腸疾患への関与である。また、当研究室では以前に食物アレルギーモデルマウスにおいて、スフィンゴシン-1リン酸受容体SIP1,3,4の阻害剤であるFTY720を投与することでマスト細胞の遊走が抑制され、食物アレルギーが改善することを見出している。このFTY720は炎症性腸疾患マウスに投与することで炎症性腸疾患の病態が改善することが報告されている。しかし、マスト細胞上に発現するスフィンゴシン-1-リン酸受容体の一つである、SIP2の炎症性腸管疾患での機能は報告されていない。以上のことから、マスト細胞が重要な役割を果たす炎症性腸疾患でのSIP2の役割を調べるため、SIP2欠損マウスにおいて炎症性腸疾患を誘導した。野生型マウスとSIP2欠損マウスにデキストラン硫酸ナトリウムによる炎症性腸疾患モデルを誘導したところ、SIP2欠損マウスにおいて、野生型マウスと比較して激しい体重の減少が観察された。

炎症の増悪化の原因として、COX-2分子に着目した。この分子は腸管の粘膜バリアーを強化し、炎症性腸疾患の防御に働くことが報告されている。一方で、このCOX-2はSIP2によって産生が制御されるという報告もこれまでにあることから、各マウスから得た細胞におけるCOX-2の産生を比較したところ、SIP2欠損マウスの血管内皮細胞やILCから産生されるCOX-2の産生量が野生型マウスより減少していることが示唆された。これにより、COX-2による粘膜バリアー形成が低下していることが考えられた。よって、粘膜バリアー機能を評価するためにFITC-dextranを用いた実験を行ったところ、SIP2欠損マウスではバリアー機能の低下が起きている可能性が示唆された。SIP2欠損による炎症性腸疾患への悪影響を見出しており、その根拠となる細胞やサイトカインの変動傾向をこれまでに明らかにしている。現在その検証と検体数の増加を行なっている段階である。これまでに、SIP受容体を阻害するFTY720が炎症性腸疾患治療に有用であるという報告がされてきたが、今回の結果から、より選択性の高いSIP受容体阻害薬が炎症性腸疾患治療に重要であることを示し、新たなマスト細胞関連腸管免疫疾患治療法につなげる事が可能になると言える。本年度においては、当該内容で論文投稿までは最低限行う予定であったが、論文の投稿に十分な量のデータの収集が行えなかったため。前項でも述べたように、現在、SIP2欠損による悪影響の中心となる細胞とサイトカインを明らかにしつつあり、この結果を補強する実験を行なっている。今後は、その細胞、及びサイトカインの存在や機能が炎症性腸疾患の増悪化に繋がっていることを逆に示していくことで、論文として発表できる形に繋げていこうと考えている。また、我々はこれまでに炎症性腸疾患の責任細胞がマスト細胞であることを示しているが、マスト細胞が他の細胞にどういった影響を与え、炎症性腸疾患を引き起こしているかは明らかにしていない。今回の研究から、マスト細胞と現在影響を見出しつつある細胞との関連を明らかにすることも試みていきたいと考えている。(抄録なし)
植物の発芽種子へのアグロバクテリウム注入による遺伝子導入法の開発

本研究の目的は組織培養で再分化の困難な植物の遺伝子導入法の開発である。これまで、マメ類の種子を遺伝子導入の対象として、種々の条件について検討してきた。これまでの検討結果から、形質転換率に影響する主要な要因として(1)アグロバクテリウムを注入する種子の状態、(2)アグロバクテリウムを注入する部位と注入方法、(3)注入後の植物の育成法、であることが判明した。この中で、(2)においては、注射器を用いるため、実験者の技術に形質転換の成否が影響されるので、技術の影響があまり受けないソニケーションと減圧処理による方法について、昨年度から検討してきた。その結果、インゲンマメ、ダイズにおいて、ソニケーションは、装置(Honda W103T model)を用い、frequency:45KHz,5分間処理し、その後、減圧処理(80mmHg)を行うことによって、形質転換が得られることがわかった。さらに、今年度は、この方法が他植物(ダイコン、コムギ)に適用できるのかどうか、発現マーカー遺伝子GUSを用い検討して、以下の結果が得られた。1)ソニケーション、減圧処理時間について:45KHz,3-5分間、減圧処理(80mmHg)5分間行った場合、ダイコン、コムギともに、生存率も高く、GUS染色率も高かった。2)アグロバクテリウムの濃度と共存時間について:アグロバクテリウムの濃度はOD0.5、共存時間:48時間が生存率も高く、GUS染色率も高かった。3)PCR,ゲノミックサザン分析:上記のうち、GUS染色された個体の後代(T1)について一部の材料を調査したところ、形質転換体が含まれていることが判明した。以上の結果から、インゲンマメ、ダイズで用いた遺伝子導入方法は、ダイコン、コムギにも適用可能であると結論できる。本研究は組織培養による再分化が困難なマメ類を中心に種子に直接遺伝子を導入することにより、再分化過程における培養変異などに影響されることなく、安定して形質転換体を得ることのできる形質転換系の開発を目的とする。本年度はこれまで最も困難とされるダイズ発芽種子を用いた形質転換系について再度、検討すると共に、既に確立しているインゲンの場合と比較した。本研究では、SAAT法、vacuum infiltration法を用いてアグロバクテリウムを発芽種子に感染させ形質転換体作出を試みた。また、これらの方法での処理条件を決定するためにそれぞれの処理方法について条件検討を行った。これと同時に選抜条件の検討も行った。本研究における条件:アグロバクテリウムの濃度、共存培養期間を検討した結果、アグロバクテリウムの濃度はOD660=0.3、共存培養期間は3日間が適当であることがわかった。EHA101(plg121)、EHA101(pSPB1129)系統のアグロバクテリウムを用いて遺伝子導入を行い、得られたT_1固体についてPCR、ゲノミックサザンハイブリダイゼーションによる解析を行った。Δ5、Δ6不飽和化酵素遺伝子の導入上記条件検討で決定した条件で不飽和化酵素遺伝子Δ6desaturaseの導入を試みた。sonication処理、vacuum処理あわせて125個の種子に処理を行い、6個体から種子を得た。それらの種子から得られたT_1固体については遺伝子解析を行った。その結果、EHA101(pSPB1129)のアグロバクテリウムとsonication処理の組み合わせで遺伝子導入を試みたもののうち1系統1個体のT_1個体でポジティブな結果が得られ、形質転換体と思われる個体を得ることに成功した。本研究においては、組織培養による再分化が非常に困難なマメ類の種子を遺伝子導入の対象として,遺伝子導入法について検討してきた。これまでの検討結果から、形質転換率に影響する主要な要因として(1)アグロバクテリウムを注入する種子の状態,(2)アグロバクテリウムを注入する部位と注入方法,(3)注入後の植物の育成法,であることが判明した。2)においては、注射器で注入する際の実験者の技術が形質転換率に影響することから,注射器を用いず,ソニケーションと減圧処理によって,インゲンマメにおいて形質転換体を作出することができた。そこで、本研究では、この方法がダイズに適用できるのかどうかを検討するために,発芽種子にアグロバクテリウムを感染させ,脂肪酸Δ6不飽和化脂肪酸酵素遺伝子の導入を試み、以下の結果が得られた。1)ソニケーション、減圧処理時間について2)アグロバクテリウムの濃度及び共存培養時間についてアグロバクテリウムの懸濁液の濃度はOD0.5、共存培養時間は48時間、の場合が生存率は高かった。3)PCR、ゲノミックサザンブロット及びノーザンブロット分析T0世代341個体を用いて分析したところ、9個体が形質転換体であることがわかった。以上の結果から、ダイズ発芽種子へのソニケーション及び減圧処理によるアグロバクテリウム法で遺伝子導入が可能であることが示された。

この中で、(2)においては、注射器を用いるため、実験者の技術に形質転換の成否が影響されるので、技術の影響があまり受けないソニケーションと減圧処理による方法について、昨年度から検討してきた。その結果、インゲンマメ、ダイズにおいて、ソニケーションは、装置(Honda W103T model)を用い、frequency:45KHz,5分間処理し、その後、減圧処理(80mmHg)を行うことによって、形質転換が得られることがわかった。さらに、今年度は、この方法が他植物(ダイコン、コムギ)に適用できるのかどうか、発現マーカー遺伝子GUSを用い検討して、以下の結果が得られた。1)ソニケーション、減圧処理時間について:45KHz,3-5分間、減圧処理(80mmHg)5分間行った場合、ダイコン、コムギともに、生存率も高く、GUS染色率も高かった。2)アグロバクテリウムの濃度と共存時間について:アグロバクテリウムの濃度はOD0.5、共存時間:48時間が生存率も高く、GUS染色率も高かった。3)PCR,ゲノミックサザン分析:上記のうち、GUS染色された個体の後代(T1)について一部の材料を調査したところ、形質転換体が含まれていることが判明した。以上の結果から、インゲンマメ、ダイズで用いた遺伝子導入方法は、ダイコン、コムギにも適用可能であると結論できる。
変化する社会における学校組織と教職員の職務実態の在り方に関する総合的研究

1.本研究全体を通して、今日の学校組織の特徴として、制度的画一性とその中における学校規模や教育指導の困難性による多様化の並存状況を示すことができた。また教職員の職務については、全般的に業務の多様化による「ゆとり」のなさと、その職責による多忙さの偏差の拡大を指摘できる。今後の学校の自律性確立に向けた課題として、個々の学校のもつ諸条件を活かした柔軟な組織編成と教職員の職務分担を図ることといえる。2.学校組織の実態と問題点としては、次の4点を提示したい。(1)校内組織編成、教職員勤務実態の在り方に関して、事例都道府県は多様な実態をもっているが、それは法制度的な面よりも、政治的背景や教員組合の組織状況に規定されている。(2)学校内部組織の運営は全般的に形式化、形骸化しており、その見直しが必要である。そして職員会議の法制化により、安定した校内運営が期待されるが、各校においてその役割や機能についてこれまでの問題を析出し、その運営体制を再構築していくことが必要である。(3)主任の果たしている役割は連絡調整を中心として認識されており、その指導助言機能の強化が課題である。(4)教育組織については、学級編成基準の弾力化により学校の教育課題に対応していくことが必要である。3.教職員職務の見直しとしては、次の2点の検討が必要である。(1)学校経営の自律性確立に向けて、経営管理機能の充実が必要であり、複数教頭制の拡充等が課題である。(2)勤務負担の個人差が広がっており、教職員組織における機能、職責、職位、権限、待遇の抜本的見直しを図る段階にきているものと思われる。1.本年度は本研究の第1年度として、研究実施計画・組織の策定、先行研究の整理・検討から着手し、主要には以下の事例調査研究を実施した。(1)11都道府県を対象として都道府県教育委員会における学校(公立小中学校)の組織編成、教職員の勤務条件に関する基準、規定についての資料収集及び面談調査。(2)各都道府県において、人口20万程度の市及び同1万人程度の町を各々1つ設定し、その教育委員会における同上の調査。(3)11都道府県の2市町において、各々小学校1校、中学校1校を選定し、校内組織編成、教職員勤務実態に関する資料収集及び面談調査(一部、教員に対する質問紙調査)。2.上記の調査から得られた知見として、以下の諸点を提示できる。(2)教職員勤務・管理は、所管する市町村教育委員会の規模によって学校の裁量幅に差異が認められる。(3)都道府県教育委員会-市町層教育委員会-小中学校の順で、より「上位の機関」の指導助言を拘束的に捉える傾向が強い。(4)校長の権限については実態において一律ではなく、そのキャリアや力量によって可変的である。(5)職員会議等の学校内部組織の運営はおしなべて形式化、形骸化しており、その見直しが必要である。3.本研究の成果については、本年6月の日本教育経営学会において、課題研究として発表する予定となっている。1.本年度は昨年度の11都道府県を対象とした事例調査研究の成果を踏まえ、全国の公立小中学校35000校の1/7に当たる5000校を無作為抽出し、学校長宛てに質問紙調査を実施した。郵送法により10月下旬に実施し、有効回答数は配布数の52.2%に当たる2598(小学校-1769、中学校-829)であった。2.全体として、小学校-中学校の別、学校規模、地域(都道府県)の違いによって学校の内部組織編制・運営や教職員勤務の特徴が現れている。3.調査結果に表れた具体的な特徴を示せば、以下の通りである。

(1)教職員の構成については、スクール・カウンセラー、専修免許所持者は小学校より中学校に顕著である。(2)主任の種類では、研究主任は2/3、同和主任は1/3が小中校に共通して置かれ「その他の主任」の設置は同じく2割程度である。主任の果たしている役割としては、指導助言以上に連絡調整と認識されている。(4)運営委員会の設置は中学校が9割程度であるのに対して、小学校は7割程度に止まっている。(5)「クラス替」は小学校でも毎年するものが1/4あり、また小中合わせて「原則なし」が最も多い。(6)「地域教育協議会」やそれに類するものは、小学校で2割、中学校で3割程度設置されている。1.本年度は1997年度の11都道府県を対象とした事例調査研究及び1998年度の全国の公立小中学校の学校長に対する質問紙調査の結果分析を踏まえた理論的検討と本研究の全体の取り纏めを行った。2.全体を通して、今日の学校組織は一方における行政基準・規範によって大きな共通基盤を有しているが、他方においては、子どもの学校に対する不適応や少子化による学校規模の変化、また親や地域住民の学校に対する意識の変化によって、個別に変容してきている。また教職員の勤務については、隔週の学校5日制、生徒指導の困難性増大、学社連携・融合の要請等により多様性を増し、教職員の多忙感を大きくしてきている。そして展開しつつある分権化、自律化による職員会議等、学校内部組織の見直し、運営システムの再構築、また新教育課程編成や教授組織の革新に対して戸惑っている状況が認められる。3.調査結果の分析、また研究班での議論を通して次の諸点を学校組織改革、教職員勤務改善として提起した。(1)学校管理規則の改訂による教委との関係が見直されるが、個々の学校において校内規則の整備が急がれる。(2)職員会議の法制化により、安定した校内運営が期待されるが、各校においてこれまでの問題を析出し、その運営体制を再構築していくことが必要である。(3)教職員勤務については、絶対的には定数改善が望まれるが、それ以上に学校裁量による弾力的な学級編成により、勤務時間の不均衡の是正が必要である。(4)「学校評議員」制度の創設が認められたが、そのための論議が不十分であり、まず先進的取組の紹介や実験的取組が求められている。
遺伝子の発現制御機構に基づく自己免疫疾患の発症・予後診断法の開発

遺伝子の発現制御に重要な役割を担うmicroRNA(miR)等のnoncoding RNAやDNAメチル化等のエピジェネティクスを調べた結果、miRは個体内変動が大きいが、miR-146aやmiR-125a、let-7aの発現レベルやmiR-125aの遺伝子多型、miRの生成に必要なDicerやDroshaの発現レベルや遺伝子多型、さらにヒストン修飾に関係するSIRT1や自然免疫のTLR、そしてIL-15、TSHR、VDR、アポトーシス制御因子、ケモカイン等の遺伝子多型が自己免疫性甲状腺疾患の発症・予後と関連しており、これらが自己免疫疾患の発症・予後診断法の開発に利用できることを明らかにした。(1)RANTES、IL-6、TGF-βのネガティブレギュレーターであるmicroRNA(miR)-125aの遺伝子のrs12976445 C/T、rs10404453 A/G、rs12975333 G/Tの3つのSNPをPCR-RFLP法で解析し、またmiR125aの末梢血単核球における発現を定量リアルタイムPCRで測定した。そして、rs12976445 C/T多型のCCゲノタイプとCアリルが健常人に比べて橋本病で多く、寛解バセドウ病に比べて難治性バセドウ病で多いことを解明した。またmiR-125aの発現が年齢と逆相関していること、そして健常人に比べてバセドウ病で減弱していることを発見した。したがって、miR-125a遺伝子のrs12976445 C/T多型およびその末梢血単核球における発現が自己免疫疾患の発症や予後と関連することを明らかにした。(3)炎症性サイトカインTNF-αの-1031C/T多型が自己免疫性甲状腺疾患との関連を以前明らかにしたが、そのTNF-α遺伝子の-245-239 CpG領域のメチル化解析をパイロシークエンス法で解析する方法を確立した。今後自己免疫性甲状腺疾患の各種病態で解析し発症や予後との関連を明らかにする予定である。(4)他にビタミンD関連遺伝子であるVDR、GC及びCYP2R1のSNPを解析した結果、VDR遺伝子の機能的SNPは自己免疫性甲状腺疾患の発症やバセドウ病の活動性と関連し、GC及びCYP2R1遺伝子の機能的なSNPはバセドウ病の難治性と関連することを見出した。またTRL4遺伝子のSNPを解析した結果、TRL4遺伝子の機能的なSNPが橋本病の重症度と関連することを明らかにした。(1)マイクロRNAの一つであるlet-7eの末梢血単核球(PBMC)のおける発現レベルがIL-10のmRNAの発現レベル及び活性化させたPBMC中のIL-10陽性細胞比率と逆相関すること、そしてlet-7eの発現レベルがバセドウ病(GD)及び健常人(NC)に比し橋本病(HD)で増加していることを見出し、let-7eがIL-10の発現を制御することによりHDの病態を関係している可能性を示した。(2)炎症細胞の浸潤を促すケモカインの機能的な一塩基多型(SNP)を解析し、IL-8、RANTES、MIGが自己免疫性甲状腺疾患(AID)の発症に、MIGがバセドウ病の難治性に、そしてRANTESがGDの若年発症と関連することを明らかにした。(3)免疫応答に対して抑制的な相互作用を有するT細胞のICOSと樹状細胞のICOSLの両分子の遺伝子多型の頻度と機能を調べたが、AITDの発症や病態との明かな関係はなかった。(4)寿命と関係するSIRT1の遺伝子多型とAITDの関連を調べたところ、AITDの発症や病態との明かな関連はなかったが、甲状腺自己抗体の血中レベルとの関連が見出された。(5)疾患の発症が遺伝因子(遺伝子多型)と環境因子(エピジェネティクス)によって規定されていることより、TNFαとIFNγの遺伝子多型とそれらの遺伝子のプロモーター領域のメチル化が、AITDの発症や病態とどのように関係するかについての解析を行っている。マイクロRNA、一塩基多型、DNAメチル化の解析を候補を絞って解析を進めており、おおむね順調に成果がえられているので。自己免疫性甲状腺疾患をモデルに自己免疫疾患の発症・予後を規定する因子として、以下のマイクロRNA(miRNA)を含むnoncoding RNAや種々の遺伝子多型を明らかにした。1生体機能制御に重要な役割を担うmiRNAの生成に必要なRNaseIII酵素であるDicerとDroshaと自己免疫性甲状腺疾患との関連を調べた結果、DicerとDroshaの遺伝子多型がバセドウ病及びバセドウ病と橋本病の違いに関連していること、そしてDicerとDroshaの遺伝子発現が自己免疫性甲状腺疾患で低下し、Dicerの発現がバセドウ病の重症度(難治度)に関連し、Droshaの発現が橋本病の重症度と関連していた。2mRNAの発現を負に制御するmiRNAの発現レベルを末梢血単核球で調べた結果、調べた5つのmiRNAの固体内変動が70-100%とかなり大きかったが、miR-146aの発現レベルは自己免疫性甲状腺疾患で約3倍に増加しており、病因と関連していた。3免疫学的自己寛容の維持に必要なアポトーシス制御因子と自己免疫性甲状腺疾患との関連を精げた結果、FASLとBCL2の遺伝子多型と血中sFasL濃度が免疫異常と関係していた。

4Toll-like receptor(TLR)は炎症性サイトカインを産生するシグナルを活性化するパターン認識受容体で、自己免疫性甲状腺疾患との関連を調べた結果、B細胞内TLR7/TLR9比がバセドウ病の発症及び重症度(難治度)と関係していた。5TSH受容体(TSHR)の遺伝子多型はTSHRの発現量を規定することによりTSH受容体抗体(TRAb)の産生(=バセドウ病の発症)に影響を及ぼす可能性がある。そこでTSHR遺伝子多型と自己免疫性甲状腺疾患との関連を調べた結果、バセドウ病と橋本病の発症に強く関連するTSHR遺伝子多型を見出した。遺伝子の発現制御に重要な役割を担うmicroRNA(miR)等のnoncoding RNAやDNAメチル化等のエピジェネティクスを調べた結果、miRは個体内変動が大きいが、miR-146aやmiR-125a、let-7aの発現レベルやmiR-125aの遺伝子多型、miRの生成に必要なDicerやDroshaの発現レベルや遺伝子多型、さらにヒストン修飾に関係するSIRT1や自然免疫のTLR、そしてIL-15、TSHR、VDR、アポトーシス制御因子、ケモカイン等の遺伝子多型が自己免疫性甲状腺疾患の発症・予後と関連しており、これらが自己免疫疾患の発症・予後診断法の開発に利用できることを明らかにした。マイクロRNAの多型解析及び機能解析は順調に進み成果を論文として発表し、TNF-α遺伝子のプロモーター領域のCpG配列部位におけるメチル化のパイロシークエンサーによる解析法を確立できたので。TNFαとINFγの遺伝子多型とDNAメチル化との関連を明らかにし、さらに遺伝因子としてHLAと甲状腺特異抗原の遺伝子多型の解析を進める予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。医歯薬学今後は新たなマイクロRNAにおいて同様の解析を進め、疾患の発症や予後に関連する機能的な多型を有する遺伝子のエピジェネティックな解析を進める。パイロシークエンス法によりDNAメチル化解析の測定法の確立が遅れたため臨床検体の測定も遅れ、試薬等の物品費が余ったため。次年度の既に測定するために保存している臨床検体のDNAメチル化解析に使用する。
発酵食品由来アレルギー抑制成分の分離と機能解析

近年、アレルギー患者が増加しており、社会的に問題となっている。この原因として、細菌成分への暴露機会の現象が影響するという「衛生仮説」が提唱されている。そこで、人為的に細菌成分に暴露させ免疫応答を制御することが考えられ、プロバイオティクス食品等に利用されている。しかし、その有効成分についての情報は少ない。そこで本研究ではアレルギー抑制効果が示されている発酵食品として乳発酵食品及び黒酢に注目して、その有効成分について検討した。本研究では、主にこれらの食品の発酵に関与する細菌である乳酸菌と酢酸菌をターゲットにして研究をすすめ、免疫系を調整する成分の分離、化学構造解析、アレルギー抑制機構を実施した。近年アレルギー患者が増加しており、社会的に問題となっている。この原因として、細菌成分への暴露機会の減少が影響するという「衛生仮説」が提唱されている。そこで、人為的に細菌成分に暴露させ免疫応答を制御することが考えられ、プロバイオティクス食品などに利用されている。そこで本研究では、アレルギー抑制効果が示されている発酵食品に注目して、その有効成分について検討する。本研究では、代表的な発酵食品として、乳酸発酵食品および黒酢をターゲットにし、これら製品および主要な発酵細菌である乳酸菌と酢酸菌を用いて、以下の3点、1)自然免疫および獲得免疫を調整する成分の分離、2)アレルギー抑制機構、3)成分の化学構造について明らかにする。本年度は乳酸菌を主要なターゲットとして以下の点について検討した。A)アレルギーを抑制しうる成分の分離精製。まず、乳酸菌から菌体成分の抽出分離を検討した。乳酸菌は細胞壁が固いため、細胞壁の破砕のため、超音波破砕、ガラスビーズ破砕、酵素消化を試みたが満足いく結果は得られなかった。この破砕物から抽出したところ、活性画分の収量は極わずかであった。これは加熱死菌を用いたため、表層タンパク質が不溶化し、菌体成分の分散が悪かったことが原因と考えられた。そこで生菌からの成分分離を試みたところ、容易に活性画分が分離しうることが明らかとなった。B)アレルギーを抑制しうる成分の同定。上記で少量分離した成分はタンパク質と予想されたので、質量分析による同定を試みた。ゲル内トリプシン消化で得たペプチドを分析したところ、二種類のタンパク質を同定できた。現在、活性最小構造の分析を実施している。C)マウスを用いたアレルギーの抑制の検討。今年度は免疫方法について検討し、使用するアジュバントに問題があったことが分かった。本年度は以下の3点を検討した。A)乳酸菌由来TLR2活性化成分の効率的な分離方法の検討。活性画分の回収法を再検討し、前年度に同定した以外の3種類のタンパク質を質量分析法により同定した。同定した成分の分取SDS-PAGEを用いた分離方法を検討し、溶媒沈殿法によりタンパク質として回収できることが分かった。またタンパク質のトリプシン分解後のHPLC分離によって小分子量活性成分を分離できることが分かった。B)乳酸菌由来活性画分による免疫調整機構の検討。活性画分を用いexo vivoでマウス臓器由来細胞を刺激しサイトカイン産生能を検討した。C)酢酸菌リポ多糖の化学構造の検討。本年度は糖鎖部分の構造を明らかにした。本年度は以下の2点について検討した。A)免疫能を調整する成分の分離精製。

まず、菌から菌体成分を抽出分離した。黒酢および乳酸菌を対象とし、トリトンX-114ー水二相分配法を用いて疎水性の免疫調整成分を分離した。本方法は簡便な操作で数リットルの大量分離にも適用できた。また、従来の疎水性クロマトグラフィーを用いる分離法より活性回収率が10倍程度も高く、分離法として優れていた。B)アレルギー抑制活性の検討。上記で分離した成分の自然免疫活性化能を検討した。黒酢抽出物は、主にTLR2, TLR4を活性化し、マウス脾臓細胞に対してTNFやIFNを誘導した。また、乳酸菌抽出物は、主にTLR2を活性化し、マウス脾臓細胞に対してTNFを誘導した。本年度は、発酵食品の活性化成分の分離法の改善と、その構造について検討することを目的としていた。乳酸菌については、菌の破砕方法を検討したが、最終的に死菌では満足いく結果が得られず、生菌から分離すべきであることが分かった。これは、普通のグラム陽性菌に比べ、乳酸菌が大幅に固い構造を持つことから事前に予想すべき点であったが、検討に時間を要した。しかし、生菌を使用する方法を見いだせたため、今後の研究の進展には問題はない。また、成分もタンパク質と同定できたことから、今後は大量分取によって活性構造を決定できると考えられる。一方で、前年度も課題であったマウスを用いたアレルギーの抑制の検討については、免疫時の安定性に問題があることが分かった。今後、アジュバントの変更を含め検討して行く予定である。以上のことから、一部遅延が見られるものの、本年度はおおむね順調に研究が進展していると考えられる。本年度は、発酵食品の活性化物質の大量分離法の検討と、活性化方法について検討することを目的としていた。従来の分離方法は、水溶性の抽出物を疎水性クロマトグラフィーを用いたグラジエント溶出で分離していたため、クロマトグラフ担体のコスト、カラム容量、流速の限界、減圧濃縮や透析等による有機溶媒の除去にかかる時間の問題があり、大量分離には適していなかった。しかし、今回用いたトリトンX-114を用いた二層分配法は、簡便なバッチワイズ法であり、成分の濃縮も有機溶媒沈殿法を用いることから、迅速に大量分離することが可能になった。これは、今後の研究に大きく貢献するものである。また、活性化能の検討では、マウスの脾臓細胞が感度が良いことが分かり、系を確立できた。しかし、今回は試みなかった、パイエル板細胞を用いた方法がより優れている可能性があるため、今後の検討が必要である。一方で、マウスを用いたアレルギーの抑制の検討については、系の立ち上げがうまく行かず、予定よりも遅延が見られる。こんご、投与法を改良する等して、検討を進める予定である。
医療用重粒子線入射軽イオン生成反応測定とハイブリッド型測定システムの開発

医療用重粒子線入射軽イオン生成反応の測定に用いる検出器体系の最適化と新たな検出器の開発とその基礎特性調査を行った。医療用重粒子線入射の核反応では広い角度・広いエネルギー範囲で粒子が生成され飛び出すため、その測定にはその粒子の位置とエネルギーを正確に求めることができる測定体系が必要となる。まず、医療用重粒子線入射軽イオン生成反応から得られる粒子のエネルギーと角度を見積もるため、検出器シミュレーションコードGEANT4と汎用粒子輸送計算コードPHITSを用いてシミュレーションを行い、必要な検出器の配置と大きさ等の最適化を行った。本測定では高エネルギー粒子の測定であるため、従来の核反応測定法である無機シンチレータ積層型スペクトロメータを用いた方法では検出器中で測定粒子が核反応を起こしてしまい、効率良く測定できないことが分かった。そこで、飛行時間測定法と無機シンチレータ発光量測定法を組み合わせた測定法を開発し、この方法を用いると高エネルギーの粒子ほど高効率で測定できることが分かった。この測定法の基礎実験を放射線医学総合研究所の医療用重粒子加速器施設HIMCで行い、従来の方法では数%の測定効率であった400MeV以上の高エネルギー粒子を1040%程度で測定できるという結果を得た。この測定法により高効率に医療用重粒子線入射軽イオン生成反応の測定が行うことができると期待できる。さらに、粒子の位置測定を安価なプラスチックシンチレータを用いて容易に行うことができる三角型シンチレータ位置検出器の開発を行った。この測定法の基礎実験をHIMACで行い高エネルギー陽子に対して3mm以下、炭素に対して1mm以下の位置分解能を得た。この三角型シンチレータ位置検出器を重粒子線入射軽イオン生成反応の測定体系の最前方に配置することにより、容易に粒子の位置を測定できると期待できる。
日本人のゆとり意識と余暇・観光行動

本年度は昨年行った予備調査の検討をふまえて、本調査に向けた尺度項目の選定作業を行った。因子分析の結果を参考に項目の取捨選択を行い、内外の旅行会社における専門家の意見などを参考に調査票を作成した。本年度の調査1では大学生・大学院生およびその父母を対象に調査を行った。その結果、「知識探求」「リラックス」「非日常性」「威信」「トレンド意識」「楽しみ」「自然」「人とのふれあい」など18次元の旅行動機次元が改めて確認された。信頼性などの検討を経て、これらの項目を本調査項目として用いた。本調査は大手旅行誌の協力を得て、海外旅行および国内旅行の計画においてその雑誌を利用している一般読者1000名を対象に郵送法で行った。結果として50%をこえる回収率を達成し、旅行動機の各次元とゆとり感との関係や旅行形態や行き先などとの関連の検討を行った。その結果、ゆとり因子のうちでも「富裕性」や「時間自由性」と観光行動との正の関係が確認された。これら物理的なゆとり因子以外でも「遊楽性」などの心理的なゆとり因子と特定の観光動機次元との密接な関係が示された。余暇・観光行動の充実度や欲求とゆとり感との関係の分析からは、余暇・観光行動が生活満足度に及ぼす役割の大きさが示唆された。なお、昨年度行った予備調査の結果の一部は、本年度(平成12年)にスウェーデンのストックホルムで行われた第27回国際心理学会議において「Japanese workers in the 90's(3):Life」の題名で発表を行った。その際に、北欧でオフィスをもつ旅行会社の現地事務所の協力を得て、海外での日本人観光客の観光行動の特徴などについて、ヒアリング調査を行った。「ゆとり」はあこれまで国民的課題として政策的に極めて重要な位置づけがなされてきたが、その主張は長びく不況で影の薄いものとなり、日本経済の凋落と共に日本人全体が「ゆとり」という言葉を忘れてしまった感がある。しかしながら、労働時間短縮や人口の高齢化などに伴った自由時間の増大は、自己実現的な価値への志向を増大させ「物質的な面での生活の豊かさ」よりも「心の豊かさやゆとりのある生活」への志向が強まっている。そのような状況の中で、「旅行(国内・国外)」は、自由時間において「これからやってみたいこと」の上位を占めており、旅行や観光に対するニーズは依然として強く、より多様な形態が求められているといえる。このような背景から、日本人の持つゆとり意識と旅行・観光行動の関連を検討すべく本年度は予備調査を行った。ゆとり意識については研究代表者らが作成した測定尺度を用いることとし、予備調査では主に旅行動機に焦点を当てた。本来、旅行動機の研究には心理学的な観点が不可欠であると考えられるが、これまで我が国においては心理学的な見地から旅行動機を本格的に整理・検討する試みはなされてこなかった。そこで、旅行動機に関する要因を網羅的に収集し、整理する目的で文献や各種観光資料の収集を行った。また、大学生を用いて、旅行に行く目的や旅行に求めるものに関するブレイン・ストーミングを行い、意見を収集した。集められた意見はKJ法にて整理・分類を行った。以上のような手順で収集・分類された各要因、意見をもとに予備調査項目を作成し、そこに欧米での先行研究で挙げられた要因や項目を加えて、旅行動機に関する予備調査調査票を作成した。
高感度酸素絶対測定による組織や細菌の薬剤感受性検査法の開発

本研究は、2原子酸素添加酵素のカテコール2,3-ジオキシゲナーゼ(Mpc)とその基質の4-クロロカテコール(4-CC)とからなる高感度酸素絶対測定系を組織や細菌の酸素消費速度の定量的測定に応用し、薬物の有効性や毒性・抗生物質感受性の迅速な定量方法を開発することを目的に実施した。その結果、以下の成果が得られた。1.酸素濃度ゼロ緩衝液供給システムシリンジ中の緩衝液の溶存酸素をMpc-4-CC系で除去し、未反応4-CCと酸素を取り込んだ生成物(5-クロロ-2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒド、CHMSA)とのトラップカラム(逆相系と強アニオン交換用ゲルをタンデムに充填)を通して送液することで、即時に酸素濃度ゼロ緩衝液を作成・供給できる。2.酸素濃度検出用Mpc固定化ゲルの作成Mpcの強結合拮抗阻害剤である2-ヒドロキシピリジンN-オキシド(2-HPNO)を安定化剤として用い、耐圧性活性化ゲル(TSKgel AF-Tresyl Toyopearl)にMpcを高密度固定し、高活性で長期間安定な酵素固定化ゲルを作成した。本ゲルを充填したミクロカラム(1.0mm×30mm)は、流速0.1mL/minで酸素と4-CCを加えてもほぼ反応を完了させる。3.0-250μMの任意酸素濃度の緩衝液供給システム酸素ゼロ緩衝液と空気飽和緩衝液を2系統のシリンジポンプで混合・供給して反応系の酸素濃度を自由に制御できることを実証した。酸素のinとoutを同時に制御・モニターする還流型反応装置のプロトタイプも作成した。4.ミクロスケール(100μL)フロンタルゲルろ過法(FGC)の実現タンパク質-リガンド系の結合曲線を実験的に求められる比類のない方法であるFGCが、100μLの微量サンプルで可能になった。5.Mpc-2-HPNO複合体の結晶化に成功し、その予備的結晶構造解析を行なった。本研究は、extradiol型酸素添加酵素のメタピロカテカーゼ(Mpc)と4-クロロカテコール(4CC)とからなる超高感度酸素分子絶対定量系をセミミクロスケールでの組織や細菌の酸素消費速度測定に応用し、組織や細菌の薬剤感受性を酸素濃度の関数として解析することを目指している。平成15年度は、以下の成果を得た。1.(固定化Mpcの作成)各種の活性化ゲルや活性化磁気ビーズへのMpcの固定化を試み、HPLC用酵素カラムを作成した。本カラムに4CC吸着カラムと5-クロロ-2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒド(P_<4Cl>)吸着カラムを直結すれば酸素濃度ゼロの緩衝液を供給でき、酸素飽和緩衝液と混合すれば任意の酸素濃度の反応液が調製できる。強アニオン交換樹脂がP_<4Cl>吸着カラムとして利用できるが、4CC吸着カラムは現在検索中である。2.(連続測定装置の開発)LCMass用高耐圧製シリンジポンプ(最大容量250μl)を購入し、ミクロ還流法やフロー法による酸素濃度連続測定を実現するために、パソコンで流路・流速(nl/minまで制御可)・容量をコントロールできるようにした。本装置でフロンタルゲルろ過法によるMpcとフェノール類との結合実験を行い、250μlの反応液量でも正確な結合データが得られることを示した(これまでの最小必要量は1ml)。これにより、目標とする100μ

lスケール試料の酸素濃度連続測定に本装置が利用可能なことを実証した。3.(酸素電極用反応容器の改良)低酸素レベルでの酸素の流入が少なく必要な反応液量が小さい改良型専用ガラス反応容器を設計・作成した。反応液量が少なくなるほど、より厳しい密閉性が要求されることが明らかになり、現在テフロンとガラスを併用した反応容器を設計中である。4.(好熱菌由来Mpcの機能解析とMpc安定化)Mpcは経時的に失活する。Mpcの活性を劣化させずに安定性を高めるように改変できるか検討するため、Mpcと好熱菌MpcのX線構造比較と好熱菌由来Mpcの機能解析を行った。好熱菌Mpcは、活性がMpcより約千倍小さいが、極めて安定で、過酸化水素にも耐性を示すことが分かった。本研究は、酸素添加酵素のメタピロカテカーゼ(Mpc)とその基質の4-クロロカテコール(4CC)とからなる超高感度酸素分子絶対測定系を組織や細菌の酸素消費速度の定量的測定に応用し、薬物の有効性や毒性・抗生物質感受性の迅速な定量方法を開発することを目指している。平成16年度は、以下の成果を得た。1.(酵素カラムの作成)強い活性を持ち、長期間安定に保存可能で、再活性化が可能なMpc固定化法を確立した。pH8.0で、非常に強い拮抗阻害剤である2-ヒドロキシピリジンN-オキシド(2HPNO)存在下で活性化担体(トヨパールやセファロース)と反応させることで、90%以上の効率で1mlのゲル当たり1020mgのMpcを固定化できた。これらの固定化酵素はバルクでも反復使用・回収が可能である。2.(酸素濃度ゼロ緩衝液供給系の作成)4CCはC18やPhenyl基を固定化した逆相系樹脂で、酵素反応生成物の5-クロロ-2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒド(CHMSA)は強アニオン交換樹脂で効率よくトラップできることが分かった。緩衝液に1mMの4CCと触媒量のMpcとを加えてシリンジに封入し、2者をタンデムに充填したトラップカラムを通してシリンジポンプで送液することにより、酸素濃度ゼロの緩衝液を簡単に供給できるようになった。これにより、任意の酸素濃度の緩衝液を反応槽に送液する技術が実現した。3.(酸素濃度の連続測定系)1.で作成したMpc固定化樹脂を充填したカラムは強い安定した酵素活性を示した。反応槽からの溶出液にCHMSAだけのトラップカラムを通した酸素ゼロの4CC溶液(2.参照)を混合した後、本カラムを通して検出器に導くことで、酸素濃度の連続測定が可能なことを実証できた。本研究で、酸素濃度を制御した還流測定の要素技術をほぼ確立できた。反応容器の作成が今後の課題である。
1930年代におけるロシア教育の歴史的総合的研究

本研究は、第1班「教育計画と教育統制」においては、「5カ年計画」を成す工業化・農業集団化との関連で初等義務教育の施行経緯を検討し、1929年秋の時点で、学齢児童の親に就学義務を課し義務違反に対する罰金・強制労働の措置を導入する、政治姿勢転換が行われたことを明らかにした。また、中国と接するソ連周辺部=満州における外交実務活動の分析を通してソビエト教育政策の地方貫徹の状況を解明した。第2班「普通教育と児童学」においては、1930年代前半ソビエト学校の近代化・効率化のためボリシェヴィキ政府は児童学ネットワーク(専門家、学校付き研究室、IQテスト等)を全国的に拡大・普及させようとしたことを初めて明らかにし、次いで、地域史を児童に学ばせる地域社会学習「郷土研究」について、その1932年の転換が地域の生産力資源の教育に向かったことを明らかにした。第3班「労働・生活と児童学」の研究では、30年代前半伝統的な教授方法に復帰しつつあったロシアの学校において労働教育が不振だったこと、1937年の「労働科」の公式の廃止の過程と現場におけるその不徹底を現地公文書館資料に基づいて明らかにした。また、ソビエト児童学(ヴィゴ-ツキ-、ル-リヤ等)が「文化的に遅れた」民族の子どもの心理学的遠征調査を行い、環境の改善による子どもの成長・発達保障という「文化歴史学派」の発達論を形成して行ったことを解明した。以上、本総合研究は、1930年代ロシアの教育が「実験の時代」の教育から、近代化と国民統合を行うための中央集権的動員タイプの制度に転換させられたこと、そこにおいて児童学がボリシェヴィキ路線に沿い、従来勉学機会に恵まれなかった諸階層・少数民族の児童の発達可能性を証明する役割を担ったことを明らかにした。1.平成5年度は、1930年代におけるロシア教育を特徴づける「画一的統制的教育」の一つの典型とみなされている、1936年の児童学批判(児童学の研究と教授の権力的禁止)にいたる過程の歴史的分析を行った。2.そのために、平成5年10月(山形市にて)と平成6年12月(札幌市にて)の2回にわたり、夫々、十数人の研究分担者と研究協力者の参加により、研究成果の交流、研究資料の収集、今後の研究打合せを行った。3.また、1930年代のロシア教育史研究についての既往研究の分析を行い、日本とロシアをはじめとする旧ソ連の研究はいうに及ばず、広く、イギリス、ドイツ、フランス、アメリカ、オーストラリアなどの既往研究の分析を行い、国際的な研究水準の把握と、それによる研究課題の一層の精緻化を行った。これらの成果を学会及び公刊の形で発表した。4.とくに、児童学批判については、1930年代初め(20年代末から)は、もてはやされていた児童学が、1936年になって、なぜスターリンらによって弾圧されたかの実証的研究を行い新たな知見を得、これも、学会発表及び公刊を行った。5.また、(1)教育計画と教育統制、(2)普通教育と児童学、(3)労働・生活と児童学、(4)高等教育と社会、の4つのチームにおいて分担・共同研究を行い、とくに、(2)、(3)、(4)のチームの研究が進み、児童学にかんしての学会発表と公刊、さらに高等教育にかんして顕著な研究成果を上げ公刊した。計画の班ごとに実績を述べる。

第1班「教育計画と教育統制」では、1928年以降の「5カ年計画」による工業化・農業集団化との関連で初等義務教育の施行経緯が検討され、1929年秋の時点で、学齢児童の親に就学義務を課し義務違反に対する罰金・強制労働の措置を導入する、政治姿勢転換が見られたことを初めて明らかにした。また、中国と接するソ連周辺部=満州における外交実務活動記録の分析を通してソビエト教育政策の地方貫徹の状況が検討された。第2班「普通教育と児童学」の作業では、地域の実態を児童に学ばせるカリキュラム開発方法としての「郷土研究」につき、その1932年の転換が地域の生産力可能性の教育に傾斜したことを明らかにし、また就学前施設をめぐる論争史の分析から、地方資金と初歩的な施設(夏期子ども広場等)を動員して児童の施設包摂を進めた実態を明るみにした。第3班「労働・生活と児童学」の研究では、30年代前半ロシアの学校における進学準備も容認した教科教育への転換とそのもとでの労働教育の不振、1937年の「労働科」の公的廃止の過程と現場におけるその不徹底などを初めて明らかにし、学会誌に発表した。また、ソビエト児童学が「文化的に遅れた」民族の子どもの心理調査を行い、教育環境の改善による子どもの成長・発達保障という「文化歴史学派」の主張を形成して行ったことを解明した。以上から本共同研究は、1930年代ロシアの教育について、限られた資金の下で近代化と国民統合を行うため動員される中央集権的なものに転換させられたこと、そこにおいて児童学が従来勉学機会に恵まれなかった諸階層・少数民族の児童の発達可能性を証明する役割を担いボリシェヴィキ路線に沿っていたことを総合的に明らかにすることができた。
GFP導入口腔癌細胞を用いた分子標的薬による浸潤転移抑制治療の開発

目的:平成14,15年度において,舌扁平上皮癌細胞から分離した高浸潤性SAS-H1細胞に対してGFP導入癌細胞を作製し,GFP高発現癌細胞の安定株を得た.GFP高発現癌細胞をヌードマウスへ同所移植し,in vivo浸潤転移モデルの作製を行った.この浸潤転移モデルを用いて,分子標的薬ならびに抗菌ペプチドによるin vivoにおける浸潤転移抑制治療効果を判定することを目的とする.有効な治療薬については,投与方法,至適濃度,投与間隔等について検討する.口腔扁平上皮癌のin vivo転移実験系を確立し、分子標的薬による治療効果を判定する。方法:高浸潤性ヒト舌扁平上皮癌細胞SAS-H1にpEGFP-N1プラスミド(CLONTECH)を電気穿孔法(Nucleofector device)で遺伝子導入を行った.GFP高発現癌細胞2X106個をKNS系雄性ヌードマウス(4-6週齢)の舌側縁に注入した.細胞を注入して1日目にLY294002(0,25,50,100mg/kg)を4週にわたり毎日腹腔内へ投与した.4週後に担癌マウスは屠殺し蛍光実体顕微鏡下(KEYENCE)で観察を行った.さらに,同様にヒト抗菌ペプチドであるhCAP18(0,50,100μg/ml)を原発部の腫瘍に毎週2回,局所投与を行い効果を検討した.結果:GFP高発現癌細胞を舌側縁に注入し1日経過したものを観察すると,腫瘍細胞が粘膜を通して蛍光を発現していることを認めた.注入後4週屠殺して,舌原発部を中心に周囲にGFP発現癌細胞の播種が認められ,すべてのマウスで頸部リンパ節転移を認めた.GFP高発現細胞が頸部リンパ節で観察することができた.LY294002投与群では,投与濃度依存的に原発部腫瘍の局所浸潤と頸部リンパ節転移が減少した.100mg/kgのLY294002を投与したものでは,頸部リンパ節転移の完全な阻害効果が観察された.一方,hCAP18投与群では,原発部の腫瘍容積が濃度依存的に減少したが,頸部転移リンパ節の阻害効果は得られなかった.結論:LY294002は局所浸潤,微小転移巣と頸部リンパ節転移を阻害することがin vivoで示されたことから,口腔扁平上皮癌における有効な治療薬としてPI3K阻害剤が重要であることが示唆された.また,われわれの結果から,PI3K阻害剤と抗菌ペプチドであるhCAP18の併用により,口腔扁平上皮癌の癌転移と癌細胞の増殖を阻止する有効な手段であることが示唆された.目的:平成14,15年度において,舌扁平上皮癌細胞から分離した高浸潤性SAS-H1細胞に対してGFP導入癌細胞を作製し,GFP高発現癌細胞の安定株を得た.GFP高発現癌細胞をヌードマウスへ同所移植し,in vivo浸潤転移モデルの作製を行った.この浸潤転移モデルを用いて,分子標的薬ならびに抗菌ペプチドによるin vivoにおける浸潤転移抑制治療効果を判定することを目的とする.有効な治療薬については,投与方法,至適濃度,投与間隔等について検討する.口腔扁平上皮癌のin vivo転移実験系を確立し、分子標的薬による治療効果を判定する。方法:高浸潤性ヒト舌扁平上皮癌細胞SAS-H1にpEGFP-N1プラスミド(CLONTECH)を電気穿孔法(Nucleofector device)で遺伝子導入を行った.GFP高発現癌細胞2X106個をKNS系雄性ヌードマウス(4-6週齢)の舌側縁に注入した.細胞を注入して1日目にLY294002(0,25,50,100mg/kg)を4週にわたり毎日腹腔内へ投与した.4週後に担癌マウスは屠殺し蛍光実体顕微鏡下(KEYENCE)で観察を行った.さらに,同様にヒト抗菌ペプチドであるhCAP18(0,50,100μg/ml)を原発部の腫瘍に毎週2回,局所投与を行い効果を検討した.結果:GFP高発現癌細胞を舌側縁に注入し1日経過したものを観察すると,腫瘍細胞が粘膜を通して蛍光を発現していることを認めた.注入後4週屠殺して,舌原発部を中心に周囲にGFP発現癌細胞の播種が認められ,すべてのマウスで頸部リンパ節転移を認めた.GFP高発現細胞が頸部リンパ節で観察することができた.LY294002投与群では,投与濃度依存的に原発部腫瘍の局所浸潤と頸部リンパ節転移が減少した.100mg/kgのLY294002を投与したものでは,頸部リンパ節転移の完全な阻害効果が観察された.一方,hCAP18投与群では,原発部の腫瘍容積が濃度依存的に減少したが,頸部転移リンパ節の阻害効果は得られなかった.結論:LY294002は局所浸潤,微小転移巣と頸部リンパ節転移を阻害することがin vivoで示されたことから,口腔扁平上皮癌における有効な治療薬としてPI3K阻害剤が重要であることが示唆された.また,われわれの結果から,PI3K阻害剤と抗菌ペプチドであるhCAP18の併用により,口腔扁平上皮癌の癌転移と癌細胞の増殖を阻止する有効な手段であることが示唆された.