hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血流制限下の簡易筋力トレーニングによるサルコペニア予防・治療法の開発

本研究の結果、血流制限下の簡易筋力トレーニングは「1)弾性バンドを負荷抵抗とした場合、生体への安全性を維持しつつ、高齢者の下肢骨格筋を十分に肥大させることができる2)骨格筋nNOSの発現とともに、ミトコンドリア機能に関連する各種タンパク質発現が亢進する3)多くの高齢者が全国で実施し、安全で有用な効果を得ている(全国アンケート調査調査)4)3年間以上継続すると、リハビリが必要な体力レベルの中高齢者においても安全性を保ちつつ十分な下肢骨格筋量の改善に繋がる」ことが判明した。本研究では、日常生活レベルの負荷強度で十分な筋肥大を示し、動脈の硬さや安全性も維持できる血流制限下の筋力トレーニングに注目し、高齢者に有用な在宅での筋力トレーニングを検討している。<実験1:弾性バンド・トレーニング>【目的】12週間の筋力トレーニング(スクワットと膝伸展運動)を実施し、血流制限下の弾性バンド・トレーニングが高齢者の筋サイズ、最大筋力および安全性へ及ぼす影響を検討した。【結果】血流制限群では動脈のしなやかさ等、生体への安全性が確保されたままで顕著な骨格筋の肥大と最大筋力の増加が生じることが明らかとなった。【考察・結論】12週間のトレーニング後、中高強度群は骨格筋の大きさに変化がなかったが、血流制限群では大腿四頭筋の筋横断面積が7.2%の増加を示した。これは同じトレーニング条件(12週間、週2回)で高齢者を対象とし、低重量負荷のマシンを利用した血流制限トレーニングによる増加(8%)とほぼ同等である。したがって、血流制限トレーニングは、弾性バンドを用いた場合でも高齢者の下肢骨格筋を十分に肥大させることができると判明した。このトレーニング方法はマシンや重りを必要としないため、ベッドサイドでも実施することができ、急性期病床の患者に対する廃用性筋萎縮の予防・治療としても大きな効果が期待できると考えられる。弾性バンド・トレーニングが終了し、論文としても掲載が決定したため。本研究では、寝たきりの高齢者・患者さんでも改善が期待できるトレーニングモデルを検討した。詳細なメカニズムを調べるため、ラットモデルを用いてその効果を検討している。<実験2:電気刺激トレーニング>【背景】血流制限下トレーニング(加圧トレーニング)は,低強度であっても筋力増強、筋肥大を引き起こすとともに多面的効果を有することが報告されている。【目的】ラットに対してトレーニング実験を実施しトレーニング前後での骨格筋各種蛋白発現を検討した。【方法】ラットを、コントロール、電気刺激のみ、加圧下電気刺激、加圧のみの4群(各n=6)に分けて検討した。トレーニングは、週3回3週間で、血流制限はラットの大腿部のカフ装着によって血流制限を加え,電気刺激は前脛骨筋にアイソメトリック収縮を1分間隔で4セット負荷した。【結果】電気刺激のみ群、加圧下電気刺激群では、COX4, FNDC5, GLUT4, MCT1及びNOS, nNOSβ蛋白発現の有意な亢進を認めた。また、加圧下電気刺激群では、PGC1α, MCT1, GLUT4の発現が有意に亢進していた。これらの各種蛋白発現量とnNOSの発現量との間には、有意な正の相関を認めた。【結論】血流制限下のトレーニングでは、骨格筋nNOSの発現とともに、ミトコンドリア機能に関連する各種蛋白発現が亢進した。加圧トレーニングは、骨格筋肥大のみならず、さまざまな多面的効果を有する可能性があると思われた。ヒトでの実験が困難である詳細なメカニズムについて、ラットを用いた実験を行うことができている。サルコペニア対策としての現状を「調査」し、全国の実態を調べた。また、長期的な効果や安全性を確認するため、「トレーニング効果」について検討した。<研究1:アンケート調査>【方法】日本加圧トレーニング学会に所属する施設のリーダー・指導者を対象とし、アンケート調査を実施した。【結果】有効回答は232施設から得られた。60歳代以上の高齢者が利用している施設は全体の65%であった。質問項目のうち、加圧トレーニングの効果・改善がみられた割合は、「8割以上」の施設が最も多く、「全員」、「8割以上」と「57割以上」の回答を併せると全体の92%を占めた。また、「加圧トレーニング実施中に気になる症状があった場合、その症状をお答えください」に対して、重篤な副作用症状の回答はみられなかった。【結論】ほとんどの施設では、加圧トレーニングによる十分な効果を感じ、重篤な副作用症状の回答はなかった。また、血流制限下トレーニングは有用な効果が期待でき、多くの高齢者も実施している実態が明らかになった。<研究2:トレーニング効果>【方法】半月板損傷患者(50代後半)を対象とし、3年以上に及ぶ血流制限下トレーニングを実施した(下肢6種目)。【結果】患側の大腿部では、CT画像による骨格筋横断面積の顕著な増加が見られ、3年後には健側とほぼ同程度の骨格筋量に改善ことが確認された。【結論】週1回程度の血流制限下トレーニングを長期に継続すると、リハビリを必要とする中高齢者においても十分な下肢骨格筋量の改善に繋がると判明した。<まとめ>全国では、血流制限下トレーニングを実施する際に、高齢者や患者のサルコペニア対策を想定して実施するケースも増加していると推測された。

また、適切な指導者の元でトレーニングを行うと、長期間の安全性を確保しつつ、十分な骨格筋量の改善が観察され、サルコペニア予防・治療として十分であると判明した。本研究の結果、血流制限下の簡易筋力トレーニングは「1)弾性バンドを負荷抵抗とした場合、生体への安全性を維持しつつ、高齢者の下肢骨格筋を十分に肥大させることができる2)骨格筋nNOSの発現とともに、ミトコンドリア機能に関連する各種タンパク質発現が亢進する3)多くの高齢者が全国で実施し、安全で有用な効果を得ている(全国アンケート調査調査)4)3年間以上継続すると、リハビリが必要な体力レベルの中高齢者においても安全性を保ちつつ十分な下肢骨格筋量の改善に繋がる」ことが判明した。次の実験(ステップ・トレーニング)に必要となる実施環境(被験者、実験場所や機材の確保など)を整えたいと考えている。今後は筋肥大メカニズムの詳細に焦点を当てるとともに、電気刺激の手法をヒトでの臨床実験として実施していきたいと考えている。運動生理学、応用健康科学職場の変更に伴い、平成27年度に骨格筋の評価装置「体成分分析装置(InBody 430)」の購入を検討していた。しかし、その測定装置の重要性から、学内全体での共有が決定し、研究者個人の予算(科研費)で購入する必要がなくなったため。科研費を申請する時には必要と思われた機器を所属研究機関の予算で購入することができたため。また、共同研究者の機器・消耗品などを使用することができたため。被験者の確保、実験機器の購入・移送費、骨格筋測定(MRIにかかる費用)など2017年度に予定している実験において、より高性能の機器(エコー、骨密度、電気刺激装置など)を購入し、実験データの充実・測定評価の充実を図る予定である。
アスベスト曝露による悪性中皮腫発症の分子機構の解明とそれを標的とした予防法の開発

悪性中皮腫においては、癌抑制性microRNAのmiR-34b/cのメチル化が生じており、DNAメチル化の解除には、DNAメチル化阻害剤とヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤の併用が有効なことから、悪性中皮腫細胞に併用処理を実施した。その結果、増殖抑制とアポトーシスの増加およびmiR-34b/cの発現増加が認められた。これらの結果は、悪性中皮腫では、メチル化の解除が治療・予防に有効な可能性を示唆する悪性中皮腫においては、癌抑制性microRNAのmiR-34b/cのメチル化が生じており、DNAメチル化の解除には、DNAメチル化阻害剤とヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤の併用が有効なことから、悪性中皮腫細胞に併用処理を実施した。これらの結果は、悪性中皮腫では、メチル化の解除が治療・予防に有効な可能性を示唆する悪性中皮腫発症におけるHDAC阻害剤による抗腫瘍効果を解明様々の悪性中皮腫細胞株を入手し、それらに対するHDAC阻害剤の抗腫瘍効果を検討した結果、試験した悪性中皮腫細胞5種すべてにおいて、HDAC阻害剤による増殖抑制が認められた。次に、そのHDAC阻害剤による増殖抑制効果の詳細を検討するために、細胞周期解析を実施したところ、細胞周期の停止よりも、アポトーシスの誘導が起きていることが明らかとなった。更にこの悪性中皮腫細胞におけるHDAC阻害剤のアポトーシス誘導に対して、reactive oxygen species (ROS)のスカベンジャーであるN-acertyl cysteine処理を行ったところ、HDAC阻害剤により誘導されるアポトーシスが減弱したこと、また、HDAC阻害剤により実際にROSの産生が確認されたことから、このアポトーシス誘導にはHDAC阻害剤によるROSの産生誘導が強く関与していることが明らかとなった。従来、HDAC阻害剤による抗腫瘍効果は、p21誘導に代表される細胞周期の停止が主たる作用と考えられているが、悪性中皮腫細胞ではROSの産生によるアポトーシス誘導が顕著であることから、悪性中皮腫でのROSの産生されやすさに着目した解析を実施中である。また、正常細胞に対するHDAC阻害剤の効果や、nude mouseでのxenograftモデルにおけるin vivoでの悪性中皮腫細胞に対するHDAC阻害剤による抗腫瘍効果も現在解析中である。悪性中皮腫発症におけるHDAC阻害剤による抗腫瘍効果を解明悪性中皮腫に対し、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤の投与が有効であろうことが、現在、臨床試験において期待されている。そこで、HDAC阻害剤による悪性中皮腫に対する抗腫瘍効果の分子機構を明らかにすることで、悪性中皮腫の発症における分子機構やその予防法・治療法の解明が期待される。当該年度の研究成果により悪性中皮腫におけるHDAC阻害剤の抗腫瘍効果の発現には、HDAC阻害剤によるreactive oxygen species(ROS)の産生が関与していることが示唆された。そこで、HDAC阻害剤によるROSの産生を規定する因子が、悪性中皮腫細胞におけるHDAC阻害剤による抗腫瘍効果の感受性規定因子であると考え、細胞内の酸化還元機構における代表的な分子であるグルタチオン量の測定や、酸化還元酵素の遺伝子発現を検討した。また、大腸癌細胞における感受性細胞と耐性細胞での比較も実施した。また、nude mouseでのxenograftモデルにおけるin vivoでの悪性中皮腫細胞に対するHDAC阻害剤による抗腫瘍効果を確認した。22年度の研究成果により悪性中皮腫におけるHDAC阻害剤の抗腫瘍効果の発現には、HDAC阻害剤によるreactive oxygen species(ROS)の産生が関与していることが示唆された。そこで、23年度はHDAC阻害剤によるROSの産生を規定する因子として細胞内小器官であるミトコンドリアに着目し、大阪市立大学・井上教授より悪性中皮腫細胞からミトコンドリアを欠失させた細胞を入手し、その親株細胞とHDAC阻害剤の感受性を比較した。その結果、親株細胞ではHDAC阻害剤により顕著なアポトーシスが誘導されるが、ミトコンドリア欠失細胞ではアポトーシスの誘導が低下することが明らかとなった。この結果は、悪性中皮腫細胞にHDAC阻害剤を処理した際に生じるアポトーシスは、ミトコンドリア由来のROSによるものと考えられた。したがって、ミトコンドリア量を検討することで、HDAC阻害剤の感受性を予測できるのではないかと考えている。発癌のエピジェネティックな要因として遺伝子のメチル化による発現の抑制が知られており、悪性中皮腫においてはがん抑制機能を持つとされるマイクロRNAのmiR-34b/cのメチル化が生じていることが報告されている。DNAメチル化の解除には、DNAメチル化阻害剤とヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤の併用の有効性が示されていることから、悪性中皮腫細胞に対して、DNAメチル化阻害剤5-Aza-2'-deoxycytidineとHDAC阻害剤YM753の併用処理を実施した。その結果、DNAメチル化阻害剤とHDAC阻害剤の併用により、悪性中皮腫細胞の増殖抑制とアポトーシスの増加、及びmiR-34b/cの発現増加が認められた。

これらの結果は、悪性中皮腫においては、miR-34b/cを含むアポトーシス誘導遺伝子がメチル化により抑制されており、そのメチル化を解除させることで細胞死を誘導する可能性を示唆する。感受性規定因子の検討において、既報論文を参考にした候補分子群の検討で時間を消費した。24年度が最終年度であるため、記入しない。23年度の成果において、細胞内のミトコンドリア量が悪性中皮腫細胞におけるHDAC阻害剤の感受性規定因子であることが明らかになったことから、ミトコンドリア量の定量を検討する。
大学生の主体的な学習態度の形成と促進に関する教育心理学的研究

本研究の目的は,大学生の「主体的な学習」を量的側面としての学習時間,質的側面としての主体的な学習態度に分離した上で後者に着目し,その測定尺度の開発及び心理的要因との実証的な検討を通して,(1)量・質の両側面から大学生の「主体的な学習」を測定及び評価するための枠組みを構築すること,(2)心理的要因に沿った主体的な学習態度をサポートする方策を検討することであった。作年度の研究では,主体的な学習態度を測定及び評価するための尺度が開発され,主体的な学習態度の形成要因として,アイデンティティ,内発的動機づけ,自己調整学習方略が見いだされ,それぞれの関連性が共分散構造分析によって実証的に検討された。これらの成果により,(1),(2)の目的は概ね達成されたと言える。ただし,主体的な学習態度と諸変数との関連が相関関係の検討にとどまっていること,アイデンティティの測定が多様であるにも関わらず,測定した内容が限定的であるという課題があった。そこで本年度では主体的な学習態度と自己調整学習方略の共変関係を検討し,アイデンティティの多面性を測定可能な尺度を開発した。前者に関して,大学1年生に対して4月と7月の2時点で縦断調査を実施し,自己調整学習方略と主体的な学習態度に対して潜在変化モデルに基づく共分散構造分析を行った結果,自己調整学習方略の下位次元である認知調整方略,動機づけ調整方略の変化と主体的な学習態度の変化の間に正の関連性が見られた。後者に関して,アイデンティティの感覚を測定するEPSI(第5段階),アイデンティティの探求,コミットメントを測定する多次元アイデンティティ尺度がそれぞれ開発された。これらの成果により,4月から7月にかけて,アイデンティティを高めるような方策をとることが主体的な学習態度の獲得に効果的である可能性が示され,アイデンティティの発達を多面的に測定するための素地が整った。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は,大学生の「主体的な学習」を量的側面としての学習時間,質的側面としての主体的な学習態度に分離した上で後者に着目し,その測定尺度の開発及び心理的要因との実証的な検討を通して, (1)量・質の両側面から大学生の「主体的な学習」を測定及び評価するための枠組みを構築すること, (2)心理的要因に沿った主体的な学習態度をサポートする方策を検討することであった。研究1では主体的な学習態度を測定及び評価するための尺度を開発し,信頼性及び妥当性の検討を行った。研究2,3では,主体的な学習態度とアイデンティティと内発的動機づけの関係,研究4,5,6では主体的な学習態度と内発的動機づけ,自己調整学習方略との関係を実証的に検討した。これらの研究結果から得られた知見は,主体的な学習態度の形成を促す心理的要因として,アイデンティティ,内発的動機づけ,自己調整学習方略の4つの変数が見出された。アイデンティティ,内発的動機づけは大学1年生から3年生まで,自己調整学習方略は1年生において主体的な学習態度の形成を促すことが明らかになった。実証的研究を通して得られた知見から考えられる本論文の示唆は,大学生の主体的な学習を捉える上で,量・質の両側面から捉えることの重要性を示したこと,心理的変数に則したサポートの方策を提示したことである。特に後者に関しては,アイデンティティはキャリア教育で,内発的動機づけは専門科目め授業によって,さらにSRLSは初年次教育においてサポートすることが特に有効である可能性が示唆された。今後の課題としては, (1)因果関係に踏み込んだ検討を行うため,長期にわたる縦断調査が必要であること,(2)主体的な学習態度の予測的妥当性を検討する必要があること,(3)行動観察や学業成績など,主体的な学習態度尺度と直接評価の指標との関係を検討する必要があることの3点が見出された。

後者に関して,アイデンティティの感覚を測定するEPSI(第5段階),アイデンティティの探求,コミットメントを測定する多次元アイデンティティ尺度がそれぞれ開発された。これらの成果により,4月から7月にかけて,アイデンティティを高めるような方策をとることが主体的な学習態度の獲得に効果的である可能性が示され,アイデンティティの発達を多面的に測定するための素地が整った。26年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度は大学生の主体的な学習態度の形成を促す心理的要因としての内発的動機づけおよび自己調整学習方略との関係を検討し、その成果を論文に投稿する予定であったが、それらはすでに論文として採択され、また主体的な学習態度の形成を促す心理的要因としてのアイデンティティとの関連まで検討することができたから。これまでの調査では変数間の関係が概ね横断調査に基づいており、その関係が相関関係から推測されているという限界があった。そこで、今年度では縦断調査を実施し、アイデンティティ、内発的動機づけ、自己調整学習方略と主体的な学習態度との共変関係を明らかにし、因果関係に踏み込んだ検討を行うこととする。そのための縦断調査はすでに実施中であり、当初の計画通り進んでいる。なお、縦断調査には個人情報の問題が関連するが、調査の実施は外部に委託しており、プライバシーの保護については万全を期していることが確認されている。
胃癌腹膜播種のドライバー遺伝子機構の解明と治療標的分子の同定

胃癌腹膜播種マウスモデルとヒト胃癌200症例におけるWES/SNP/遺伝子/メチル化アレイの4データベースについて包括的統合的数理解析により、ドライバー遺伝子候補YAP1、CXCR7およびLoxl1を同定した。YAP1発現と予後不良との相関を確認した。既知のYAPの核内移行の制御ではなく、YAP1mRNA転写を抑制し蛋白機能を阻害することも明らかにした。Loxl1、CXCR7高発現群は低分化癌、リンパ節転移が多く、また進行した癌が多かった。Loxl1過剰発現胃癌細胞株は有意に高い増殖能・遊走能・浸潤能を認めた。増殖、遊走、浸潤、EMTを介し、腹膜播種を制御する可能性が示唆された。胃癌腹膜播種性転移は胃癌の転移形式で最も多く予後不良であるが、そのメカニズムについては不明な点が多い。われわれは、胃癌腹膜播種モデルマウスと200例の胃癌臨床検体から得られたオミックスデータ(エキソームシークエンス、遺伝子発現アレイ、SNPアレイ、メチル化アレイ)を統合的に解析した。その結果、「腹膜播種陽性胃癌細胞特異的」に高頻度に生じる変異や、有意に高発現な遺伝子シグネイチャーが存在する事を明らかにした。まずわれわれは、その変異遺伝子の内ECMシグネイチャーに含まれるDDR2に着目して研究を進めた。DDR2のノックダウンにより、胃癌腹膜播種モデルマウスにおいて播種の形成は有意に抑制された。さらに、DDR2がc-Srcの上流に存在する遺伝子であることに注目して、胃癌腹膜播種モデルマウスにSrcインヒビターであるダサチニブを投与したところ、同様に播種の形成は有意に抑制された。すなわち、上記の統合解析で得られた遺伝子群は信頼出来うるものであることが確認できた。われわれの以上の研究内容は、Scientific Reportsにアクセプトされている(Kurashige J, etal: Sci Rep, 2016)。胃癌腹膜播種に対する標準的な治療が確立されていない中、真の治療法の確立が待たれている。胃癌患者が将来的に腹膜播種になる事を予測する事や、腹膜播種を生じても早期に発見する事はもちろん重要な事である。しかし、われわれは腹膜播種を生じた後の真の治療法の確立をメインの目標とし、上記の統合解析で得られた遺伝子にターゲットを絞り現在研究を進めている状況である。統合解析で得られた遺伝子リストの内、治療標的分子として現在われわれが注目している遺伝子はFGFR1である。FGFR1のゲノム異常は乳癌や肺癌、前立腺癌、神経膠芽腫など多くの悪性腫瘍で報告されており、FGFR1は腹膜播種において重要なEMTに関連している事が知られている。さらに、FGFR1の阻害剤(PD173074)は既に存在し、いくつかの研究で使用例が報告されている。FGFR1ゲノム異常の胃癌腹膜播種における役割は明らかにされておらず、またFGFR1阻害剤が既に存在する事から、DDR2の次の治療標的分子としてFGFR1に注目した。臨床検体において、FGFR1高発現群は低発現群に比べて予後不良、FGFR1高発現群は低発現群に比べて有意に腹膜播種の頻度が多かった。公共データベースベースを用いたGSEA解析で、FGFR1発現とEMT関連遺伝子は正の相関を認め、FGFR1ノックダウン腹膜播種性高転移細胞株を作成した(shFGFR1)(CRISPR/Cas9システムによるノックアウトは現在進めている。FGFR1ノックダウンにより、腹膜播種性高転移細胞株増殖能・浸潤能の有意な低下を認め、PD173074投与により、腹膜播種性高転移細胞株増殖能の有意な低下を認めた。近年次世代シーケンサー等の開発により胃癌の膨大な癌ゲノム情報が蓄積されつつあるが、胃癌の生命予後を決定する腹膜播腫の早期診断または治療標的分子は同定されていない。我々は『胃癌腹膜播種のマウスモデル』と『ヒト胃癌200症例』におけるWES/SNP/遺伝子/メチル化アレイの4データベースについてスパコンを用いた包括的統合的数理解析により、ドライバー遺伝子候補CXCR7およびLoxl1を同定した。同定した標的候補遺伝子について、当科の196例の胃癌臨床検体においてRTPCR法で予後因子としての意義を確認し発現量と臨床病理学的因子及び予後との関連を検討した。さらに腹膜播種性転移細胞株を用いて、候補遺伝子をノックダウンし種々の機能解析を実施すると同時に、モデルマウスを用いて播種抑制効果について確認した。1)CXCR7:腹膜播種性転移細胞株でCXCR7をノックダウンし種々の機能解析を実施すると同時に、腹膜播種モデルマウスを用いてCXCR7阻害剤の播種抑制効果について確認した。当科の胃癌臨床検体では、CXCR7高発現群は、低発現群に比べ有意に予後不良であり、遠隔転移症例が有意に多かった。CXCR7過剰発現は胃癌腹膜播腫の危険因子となるbiomarkerとして、あるいはCXCR7阻害剤は、胃癌腹膜播腫阻害剤として期待される。2)一方、当科胃癌症例において、Loxl1高発現群は低発現群に比較して有意に低分化癌、リンパ節転移が多く、また進行癌が多かった。多変量解析ではLoxl1発現量は独立予後不良因子であった。

Loxl1過剰発現胃癌細胞株は有意に高い増殖能・遊走能・浸潤能を認め、またE-cadherinとVimentinの発現量が低下していた。Loxl1はリシル酸化酵素(LOX family)をコードする遺伝子の1つで、細胞外基質の生合成に必要である。LOX familyはFAK/Srcなどのシグナル回路を制御することで細胞マトリックス接着や細胞遊走を制御する。胃癌腹膜播種マウスモデルとヒト胃癌200症例におけるWES/SNP/遺伝子/メチル化アレイの4データベースについて包括的統合的数理解析により、ドライバー遺伝子候補YAP1、CXCR7およびLoxl1を同定した。YAP1発現と予後不良との相関を確認した。既知のYAPの核内移行の制御ではなく、YAP1mRNA転写を抑制し蛋白機能を阻害することも明らかにした。Loxl1、CXCR7高発現群は低分化癌、リンパ節転移が多く、また進行した癌が多かった。Loxl1過剰発現胃癌細胞株は有意に高い増殖能・遊走能・浸潤能を認めた。増殖、遊走、浸潤、EMTを介し、腹膜播種を制御する可能性が示唆された。以上の公共データベース・in vitroの実験結果から、FGFR1は胃癌腹膜播種のドライバー遺伝子である事が示唆され、治療標的分子として有望であることが判明した。今後はin vivo実験を進め、さらなる検証をすすめたい。詳細は以下の通りである。(1)胃癌腹膜播種モデルマウスにおける、FGFR1ノックダウンによる播種抑制効果の確認。(2)胃癌腹膜播種モデルマウスにおける、PD173074投与による播種抑制効果の確認。並行して、統合解析で得られた他の遺伝子についても同様の研究を進め、胃癌腹膜播種における真の治療標的分子の同定を行っていく。さらに、われわれが得意とする数理統計学的解析を駆使し、オミックスデータを用いた「胃癌の進化機構」についても明らかにしていく。胃癌次年度消耗品購入のため。28年度の実験消耗品を購入予定。
直置き型鋼構造建築物の構造性能と耐震設計

より高度な耐震構造を構築すべく、本研究では、上部構造と基礎部を緊結させず、大地震に対してはこの界面で滑らせることによって、上部構造に作用する最大せん断力を制御する「直置き型構造物」を提案した。黒鉛潤滑剤を界面に撒くという簡便かつ安価な方法によって、滑り係数として約0.2を確保することができ、また多数回の滑りに対しても安定した滑り係数が保持されることを、一連の振動台実験から明らかにした。また滑りを伴う2自由度系への理論展開と網羅的な時刻歴応答解析から、パルス性の高い地震動に対して上部構造に作用する最大せん断力係数として、滑り係数の2倍が目安になることを導いた。低層建築物を対象に,1基礎と上部鋼構造を緊結せず,鋼構造柱脚を基礎上にモルタルを介して直置きする,2鋼ベースプレートとモルタルの間に材料を塗布し摩擦係数を低減・調節することによって,上部構造への損傷を抑える,3ストッパー機能を付加することによって,大地震下における過大水平変形や鉛直方向への浮き上がりを防ぐ.というコンセプトに基づく構造システムの構築を本研究の射程とし,それを実現するために,(1)鋼とモルタル間の繰返し摩擦特性の定量化,(2)摩擦係数の低減と制御,(3)ストッパーを用いた変位制御,(4)提案構造システムの設計法からなる4フェーズに,準静的実験,振動台実験,トライポロジー理論,弾塑性時刻歴応答解析を駆使することによって取り組む.本研究の初年度においては、(1)に注力することとし、地震時における現実的な荷重条件である水平2軸載荷実験から摩擦係数とすべり変位の関係に対する基礎的知見を得たうえで、その現象を再現しうるモデル化に取り組んだ。また上部構造が剛ではない場合起こりうるスティックスリップ現象を,鋼とモルタルの摩擦面の上に骨組を模した試験体に対する実験によって把握するとともに、摩擦特性を分子間の凝着と掘り起こしという2つの機構によって説明するトライポロジー理論を用いて、この現象を解釈した。低層建築物を対象に、基礎と上部鋼構造を緊結せず鋼構造柱脚を基礎上にモルタルを介して直置きする、というコンセプトに基づく構造システムの構築をめざす。本年度は、鋼とモルタル間の繰返し摩擦特性の定量化、ストッパーを用いた変位制御に取り組んだ。黒鉛潤滑によって摩擦係数にして約0.2を安定して得ることを一連の振動台実験から検証した。実際の構造物において柱脚部で滑りを許容するとすれば、振動台実験に用いる試験体の各柱脚には負担面積に対応する比較的均等な軸圧縮力が作用しなければならない。また実際の適用を考えれば、各柱脚の変形を同一にするための回し梁等の存在は現実的ではない。このような制約を満たすべく、各柱頂部に錘を設置し剛な柱と柔な梁からなる1層1スパン標準骨組を設計し、それに振動台実験を適用することから、滑り挙動に対するねじれの影響、滑りを許容する各柱脚変形の同一性、転倒モーメントの影響を詳細に検討した。その結果、設計骨組では柱の負担軸力が均等になること、その場合にはねじれの影響はほとんど消滅すること、また浮き上がりがない限り転倒モーメントの影響(変動軸力の影響)も僅かであることを確認することから、提案する構造システムの妥当性を明らかにすることができた。低層建築物を対象に,1基礎と上部鋼構造を緊結せず,鋼構造柱脚を基礎上にモルタルを介して直置きする,2鋼ベースプレートとモルタルの間に材料を塗布し摩擦係数を低減・調節することによって,上部構造への損傷を抑える,3ストッパー機能を付加することによって,大地震下における過大水平変形や鉛直方向への浮き上がりを防ぐ.というコンセプトに基づく構造システムの構築を、本研究の射程とし,それを実現するために,(1)鋼とモルタル間の繰返し摩擦特性の定量化,(2)摩擦係数の低減と制御,(3)ストッパーを用いた変位制御,(4)提案構造システムの設計法からなる4課題に,準静的実験,振動台実験,トライポロジー理論,弾塑性時刻歴応答解析を駆使することによって取り組んでいる。今年度は主として(2)を一連の振動台実験を通じて検討した。本年度の研究は予定通りに実施できた。低層建築物を対象に,1基礎と上部鋼構造を緊結せず,鋼構造柱脚を基礎上にモルタルを介して直置きする,2鋼ベースプレートとモルタルの間に材料を塗布し摩擦係数を低減・調節することによって,上部構造への損傷を抑える,3ストッパー機能を付加することによって,大地震下における過大水平変形や鉛直方向への浮き上がりを防ぐ.というコンセプトに基づく構造システムの構築を本研究お射程とし,それを実現するために,(1)鋼とモルタル間の繰返し摩擦特性の定量化,(2)摩擦係数の低減と制御,(3)ストッパーを用いた変位制御,(4)提案構造システムの設計法からなる4フェーズに,準静的実験,振動台実験,トライポロジー理論,弾塑性時刻歴応答解析を駆使することによって取り組む.本研究の3年度である本年度では、2の「摩擦係数低減と制御」に継続的に取り組むとともに、3の「ストッパーを用いた変位制御」の開発と検証に従事した。2に関しては、直置き型鋼構造建物を想定し、転倒モーメントによる変動軸力下における摩擦と摩擦低減特性と、多方向入力下のねじれ応答について、振動台実験を通じて必要な情報を獲得できた。さらに黒鉛塗布等による摩擦係数低減を反映させた骨組解析モデルを構築し、直置き型鋼構造建物の地震応答特性評価を可能にする解析技術を確実にした。

また3に関しては、現行の耐震設計で想定する地震力を超す地震動に対して、滑り量が過大にならないように、ストッパー機能を付与することとし、具体的にはゴムを用いた緩衝材の配置、緩衝材の復元力特性、緩衝材との衝突による上部構造物応答の変化を、上記の解析と一部動的載荷実験によって検証した。今年度は主として(2)と(3)の内容について、一連の数値解析と振動台実験を通じて検討した。鉛直方向の浮き上がりについては、それを阻止するためのストッパー機構の設計と検証を提案することができた。その一方で、実用的な観点からは、浮き上がりに伴う不具合を克服するために要する細かな技術を考えれば、浮き上がりがほぼ起こらないと考えられる低層・中低層建物に提案システムの適用を限ることが、当面は適切であるとの所見も得た。このように、本研究は概ね予定通りに推移している。低層建築物を対象に,1基礎と上部鋼構造を緊結せず,鋼構造柱脚を基礎上にモルタルを介して直置きする,2鋼ベースプレートとモルタルの間に材料を塗布し摩擦係数を低減・調節することによって,上部構造への損傷を抑える,3ストッパー機能を付加することによって,大地震下における過大水平変形や鉛直方向への浮き上がりを防ぐ.というコンセプトに基づく構造システムの構築を、本研究の射程とし,それを実現するために,(1)鋼とモルタル間の繰返し摩擦特性の定量化,(2)摩擦係数の低減と制御,(3)ストッパーを用いた変位制御,(4)提案構造システムの設計法からなる4課題に,準静的実験,振動台実験,トライポロジー理論,弾塑性時刻歴応答解析を駆使することによって取り組んでいる。最終年度である本年度では、研究の目的に記した(3)のストッパーを用いた変位制御を継続するとともに、本研究で提案するシステムの実用設計を念頭においた(4)設計法の構築に取り組んだ。(3)においては、大きな転倒モーメントや上下動によって生じうる直置き柱脚の浮き上がりを防ぐためのストッパーの開発で、鋼板を十字型に組み上げた装置を用いて、水平移動(滑り)を許容しつつ浮き上がりを最上限に止める機構を設計し、その妥当性を一連の解析と実験から検証した。(4)においては、地震動の大きさ、摩擦係数、質量比、最大ベースシェア係数、最大滑り(変位)を結びつける関係式を、滑りを許容する1自由度、2自由度系に対する支配方程式に基づいて導出した。とりわけ、提案構造システムの最大の特徴である最大ベースシェア係数の上限値については、一連の時刻歴応答解析も援用して、摩擦係数の2.5倍とする実用的な設計式を導いた。さらに上部構造に僅かな塑性化を許容した場合にはこの値を2倍にできることも併せて実証した。より高度な耐震構造を構築すべく、本研究では、上部構造と基礎部を緊結させず、大地震に対してはこの界面で滑らせることによって、上部構造に作用する最大せん断力を制御する「直置き型構造物」を提案した。黒鉛潤滑剤を界面に撒くという簡便かつ安価な方法によって、滑り係数として約0.2を確保することができ、また多数回の滑りに対しても安定した滑り係数が保持されることを、一連の振動台実験から明らかにした。また滑りを伴う2自由度系への理論展開と網羅的な時刻歴応答解析から、パルス性の高い地震動に対して上部構造に作用する最大せん断力係数として、滑り係数の2倍が目安になることを導いた。4フェーズからなる本研究の第1フェーズである本年度研究は概ね達成することができた。
ほ乳類の進化過程における顎の基部―先端部軸位置遺伝情報の改変

ほ乳類が単弓類から進化する過程では、顎の基部-先端部軸にそった領域特異的な特殊化がおきた。本研究では、顎原基におけるホメオボックス遺伝子群の発現を有袋類のオポッサム等複数の動物で比較し、その歯式との関連を調べた。その結果、Msx1、BarX1共発現領域から前臼歯が形成されることが示され、マウスの下顎原基ではこの領域が無いことがわかった。また、ほ乳類の進化過程では顎関節を形成する骨が中耳骨に転用され、新たな顎関節が形成された。有袋類の発生過程で顎の進化過程が再現される可能性が示唆されていたので、オポッサムの顎関節や中耳骨の発生過程を観察したが、進化過程の再現はみられなかった。ほ乳類の進化過程における切歯、犬歯、小臼歯、大臼歯といった機能や形態の異なる歯の分化が顎の基部から先端軸にそっておこり、また、顎の基部側にある顎関節(関節骨と方形骨)が耳小骨(ツチ骨とキヌタ骨)として聴感覚のために転用された。これらの変化は、顎原基の基部から先端部軸にそったプレパターンの変化として理解できる。顎原基の基部から先端部軸にそってMsx1やDlx1などの異なるホメオボックス型転写制御因子をコードする遺伝子が発現しており、それらの遺伝子が異なる形態の歯を生じるための情報を担っているとされ、ホメオボックスコードと呼ばれる。これらについては研究のほとんどがマウスを用いておこなわれたものであり、マウスの歯列は小臼歯や犬歯が無い特殊な歯列である。本研究では、ほ乳類の祖先型に近い歯列を持つオポッサムを主な材料とし、顎原基におけるホメオボックス転写因子の発現をマウスや、ほ乳類が進化する前の顎関節を持つニワトリと比較することで、基盤となる遺伝子制御について明らかにすることをめざしている。それに先駆けてオポッサムを材料とした共同研究「有袋類における頭部神経堤/顎原基のヘテロクロニー的発生メカニズムの解明」により顎原基のもととなる頭部神経堤細胞の発生と遺伝子発現について解析を進め、顎発生と歯の形態研究の先鞭をつけた。その基礎に立って,オポッサムの11.5日胚,13.5日胚,新生児についてMsx1とBarX1,Dlx1,Alx3の検索を行ないホメオボックスコードのモデルと比較検討し新しい所見を得た。また,顎形成に用いる新たな試料の採取も進めている。哺乳類の進化過程において、切歯、犬歯、小臼歯、大臼歯といった機能/形態の異なる歯の分化が顎の基部-先端部軸に沿っておこり、また顎の基部側にある顎間接が耳小骨として超感覚のために転用された。これらの特徴は顎原基間充織の基部-先端部軸に沿って発現するMsx1やBarX1などのホメオボックス型転写因子の種類と組み合わせによって規定されていると考えられており、ホメオボックスコード仮説と呼ばれている。しかし、この仮説は小臼歯や犬歯の無い特殊化した歯式を持つマウスを用いた研究から得られたデータをもとに提唱されたもので、哺乳類としての原型がどうなっているのかを知るためには、ヒトなどの霊長類を含む基本的な歯式を持つ哺乳類でホメオボックスコードがどうなっているのかを明らかにする必要がある。昨年度は基本的な歯式を持つオポッサムについて、発生期の顎原基におけるホメオボックス遺伝子群の発現を調べた。その結果、顎原基先端部のMsx1の発現領域とより基部側のBarX1の発現領域にマウスには見られない重複する部分が見つかり、これが予定犬歯-小臼歯領域に対応する可能性が示された。本年度は、Msx1やBarX1の発現領域と歯式の対応を明らかにするために、生後のオポッサム個体について頭部の連続切片を作成し、3D再構築によって歯胚の位置と形態の変化を追跡した。その結果、Msx1とBarX1が重複して発現する領域が予定犬歯-小臼歯領域に対応する可能性が高いことがわかった。また、マウスでは顎原基の上皮で発現するBMP4によって間充織にMsx1の発現が誘導されることが示されていることから、オポッサム胚の顎原基におけるBMP4とMsx1の発現を比較した。すると、Msx1の発現のうち基部側のBarX1発現領域と重複する部分についてはBMP4の発現領域から離れていたことから、BMP4とは別のMsx1発現誘導メカニズムの存在が示唆された。昨年度終わりに計画した、生後のオポッサムでshhの発現によって歯胚を同定する試みは、ホールマウントin situハイブリダイゼーションがうまくいかなかったために失敗に終わった。しかし、パラフィン連続切片の作成と3D再構築によって、歯胚の形態を複数の発生段階で明らかにすることができたため、マウスとオポッサムの間でのホメオボックスコードの違いと歯式の違いを遺伝子発現と歯胚の形態の関連によって説明することができるようになったことは、本研究を推進するにあたって非常に大きな前進であったといえる。また、ホメオボックスコードの違いが、オポッサムにおけるこれまで知られていたBMP4による発現誘導とは異なるMsx1遺伝子の発現誘導機構の存在による可能性が示唆されたことは、本研究のさらなる進展にとって重要な発見であった。

一方で、昨年度に計画していたオポッサム胚の全胚培養実験系の確立やオポッサム線維芽細胞のリプログラミングによる頭部神経堤細胞作成の進展は限定的であり、来年度も継続する必要がある。哺乳類では、顎の基部ー先端部軸に沿って形態や機能の異なる歯が分化する。発生初期の顎原基間充織組織に領域特異的に発現するホメオボックス型転写因子が歯の形態を決定すると考えられているが、小臼歯や犬歯の無い特殊な歯列を持つマウスのデータをもとに提唱されたモデルで、霊長類など原始的な歯列を持つ哺乳類でどうかは明らかでなかった。昨年度までに、原始的な歯式を持つオポッサムの顎原基では、マウスと異なり、ホメオボックス遺伝子のBarX1とMsx1の発現領域が大きく重複することがわかった。歯胚の形態学的観察から、BarX1-Msx1共発現領域が小臼歯に対応すると考えられた。また、マウス顎原基においてBarX1はFGF8、Msx1はBMP4により発現誘導されるが、オポッサムのBarX1-Msx1共発現領域では異なる制御機構があると考えられた。本年度は原始的歯列をもつフェレットの顎原基でもBarX1-Msx1共発現領域があること、鳥類胚では共発現領域がマウスと同様に狭いことを明らかにした。また、多様な動物の上顎と下顎でのBarX1やMsx1の発現を比較することで、犬歯はMsx1陽性、BarX1陰性の領域に対応することがわかった。哺乳類の進化過程では、初期単弓類において顎関節を構成していた関節骨と方形骨は耳小骨となり、歯骨と鱗状骨による新たな関節が形成されたことが知られている。今年度は、有袋類の顎関節の形成について、形態学的解析をおこなった。より具体的には、生後のオポッサムの発達段階をおって小動物用マイクロCTや骨染色により頭部骨格を可視化し、顎関節部の形成過程を調べた。その結果、哺乳類の進化過程をなぞるような古い顎関節から新しい顎関節への移行は観察されず、授乳が終了して固形餌を食べるようになる生後40日ごろまでに徐々に歯骨と側頭骨・頬骨による顎関節が形成されていく様子が見られた。ほ乳類が単弓類から進化する過程では、顎の基部-先端部軸にそった領域特異的な特殊化がおきた。本研究では、顎原基におけるホメオボックス遺伝子群の発現を有袋類のオポッサム等複数の動物で比較し、その歯式との関連を調べた。その結果、Msx1、BarX1共発現領域から前臼歯が形成されることが示され、マウスの下顎原基ではこの領域が無いことがわかった。また、ほ乳類の進化過程では顎関節を形成する骨が中耳骨に転用され、新たな顎関節が形成された。有袋類の発生過程で顎の進化過程が再現される可能性が示唆されていたので、オポッサムの顎関節や中耳骨の発生過程を観察したが、進化過程の再現はみられなかった。オポッサムの11.5日胚の頭部について4つのプローブでin situをおこなった。ホメオボックスコードのモデル図ではほとんど無いことになっている部分において,Msx1とBarX1の発現がオーバーラップしている領域がかなり広い。ホメオボックスコードのモデル図ではAlx3+Msx1が切歯、Msx1が犬歯と小臼歯、BarX1が大臼歯に対応することになっているが、Alx3/4の変異体で下顎の切歯に表現型が無いことも考慮に入れると、Alx3領域、Msx1のみの領域、Msx1+BarX1、BarX1の領域に対応する仮説を検討している。後方のDlx1のみ発現の部分の歯骨基部側に対応する仮説も必要となろう。13.5日についての実験ではMsx1が下顎前端から発現しており、BarX1は先端に発現が無くMsx1より基部側まで発現しているという結果で、基本的にもっと早い時期の結果と同様になる。しかし,予想よりMsx1,BarX1は基部側近くまで発現している可能性が考えられる。
基準認証制度と競争政策・独禁法

本研究の目的は,政府,事業者団体らが定める基準ないし標準が,競争と貿易を阻害せず,むしろこれを促進しながら,製品の安全性や互換性,相互運用性確保という目的を果たし機能するための規制・制度のあり方を追究することにあった。このためには,まず第一に,標準があまねく使われるようにしなければならない。ところが,近年では,標準採用にあたり必須の知的財産権を保有する者が当該知的財産権の許諾を公平に行わいことにより,標準の普及・採用活動を阻害する例が増え,問題となっている。本研究では,本問題ならびに標準化に関わる者らが対策のためにとっているスキーム・措置の実態を調査するとともに,これら対応・措置を独禁法に照らして評価し,さらには独禁法を適用することで本問題を解決することができないかどうかを考察した。標準に関する第二の課題は,標準が適正に策定・運用されることである。本研究では,WTO・TBT(技術的障害に関する協定)の運用実態ならびにこれを補完する諸制度,独禁法による規制について考察した。これらの研究成果については,論文等の形で公刊し,大学研究者や関係政府機関、企業らが参画する研究会において発表してきている。本問題は,学術上も実務上も重要であるわりには,専門的かつ分野横断的であるために取り組みがたい課題であるところ,本研究は本問題にかかる研究・政策形成ならびに実務に寄与したものと考えられる。なお,WTO・SPS(衛生と植物防疫のための措置)協定ならびに関連する規制・基準に関しては,2007年度中に知的財産権に関する大きな動きがあいついで起こり追加的調査研究を行わなければならなかったこともあって,公表にはいたらなかった。もっとも本課題について調査研究は済ませつつあるところでおり,2008年度以降,速やかに結果をまとめ,公表したいと考えている。本年度には、国家的標準化機関・政府規制における濫用行為における独禁法の適用可能性、WTO・TBT協定、技術標準にかかる必須特許へのアクセスにかかる国際的・国家的技術標準化機関における取り組みの状況を研究・調査し、独禁法のほか、国際経済法・国際貿易にかかる諸政策、消費者保護法等の観点から法的・政策的検討を行った。ジュネーブに所在する国際標準化機関における動向をウォッチするとともに、国際標準化プロセスや国際標準整合化に関して国際的に消費者の利益を代表する国際消費者機構(本部:ロンドン)および同アジア・太平洋地域オフィス(マレーシア、クアラルンプール)、日本国内の消費者団体等を訪問し、英国の消費者保護団体について調査を行う等して、現状および問題の所在について知見を得て、専門家らとの意見交換等を行った。基準認証に関しては、近時、食品の安全性確保と貿易の促進との両立が喫緊の課題となっているところ、WHOおよび英国内関係諸機関の調査を実施し、SPS協定・CODEXにかかる研究を開始した。これらのうち、前半に挙げた諸事項については本研究報告書II「研究発表」に挙げた論文等(「技術標準化活動と独禁法」「Trade Barrier, Forever?」「基準認証制度と貿易、競争、消費者一欧州における電気通信機器基準認証制度の検討-」等を通じて、日本内外で研究発表を行った(あるいは、行いつつある-刊行は決定されている)。後者(消費者保護との関わり、食品分野における諸問題)については調査を通じて端緒をつかみ、概要を把握しつつあるところであり、2007年度前半中ごろにかけて独禁法・競争政策の観点から問題の精査・検討を行った上で、論文等の形で研究の成果をまとめたいと考えている。
ミトコンドリア病治療を目的としたミトコンドリア内での外来遺伝子発現の基礎的研究

動物ミトコンドリア内に遺伝子を導入・発現させる技術は確立されていないが、この技術はミトコンドリアDNAに変異を持つミトコンドリア病の治療法に応用出来る可能性がある。ミトコンドリア内に導入する外来DNAはミトコンドリア内での分解に抵抗性を示しかつDNAの遺伝子発現を阻害しない必要がある。本研究ではミトコンドリア内に導入する外来DNAの保護因子の評価を行い、ミトコンドリアDNA結合タンパク質TFAMが適切な候補である可能性を示した。ミトコンドリアDNAに変異を持つミトコンドリア病患者の細胞内では正常なmtDNAと変異mtDNAが混在し、変異ミトコンドリアDNAの割合が閾値を超えると機能障害を生じ発病に至ると考えられている。もし患者のミトコンドリア内で変異部位に対応する野生型遺伝子を発現させ野生型遺伝子産物を相対的に優位に立たせることができれば、ミトコンドリア病に対する遺伝子治療法となりうる可能性がある。そこで本研究はミトコンドリア病に対する遺伝子治療法開発に向けた第一歩として、外来遺伝子をミトコンドリア内に導入・発現させる技術の基礎的研究を行うことである。まず、ミトコンドリア内での遺伝子発現を検出するために蛍光タンパク質を用いることにした。最初にミトコンドリア移行シグナルを付加した蛍光タンパク質を核遺伝子として発現させることで、蛍光タンパク質は細胞質で翻訳された後にミトコンドリア内に移行すること、さらにミトコンドリアマトリクス内で蛍光タンパク質が安定して存在することを確認した。この蛍光タンパク質は通常の遺伝子がそうであるように核コドンに対応したものであるため、ミトコンドリア内で発現させるために遺伝子を細胞質での翻訳に用いる核コドンからミトコンドリア翻訳系に対応したミトコンドリアコドンへと改変した。現在はこのミトコンドリア型蛍光タンパク質遺伝子を組み込んだDNAベクターの構築とミトコンドリアへの遺伝子導入のための条件検討を行っている。ミトコンドリアDNA(mtDNA)に変異を持つミトコンドリア病患者の細胞内では正常なmtDNAと変異mtDNAが混在し、変異ミトコンドリアの割合が閾値を超えると機能障害を生じ発病に至ると考えられている。もし患者のミトコンドリア内において変異部位に対応する野生型遺伝子を発現させ野生型遺伝子産物を相対的に優位に立たせることができれば、ミトコンドリア病に対する遺伝子治療法となりうる可能性がある。そこで本研究はミトコンドリア病に対する遺伝子治療法開発に向けた第一歩として、外来遺伝子をミトコンドリア内に導入・発現させる基礎情報の獲得を目的とする。またmtDNAの発現に関しては未だ不明な点も多いことから、mtDNAの発現に関する基礎的研究も行いその成果を外来遺伝子の発現に応用する。当該年度では、パッケージング因子の選択を行った。ミトコンドリアへの遺伝子導入のためには導入するDNAを安定的にミトコンドリアへ送達するとともに、ミトコンドリア内でのDNA分解に耐えさらにこのDNAが転写されることで外来遺伝子を発現させる必要がある。そこでDNAのパッケージング因子としてミトコンドリアDNA結合タンパク質TFAMを選択し解析を行った。組み換え大腸菌から調製したヒトTFAMタンパク質を実験に用い以下のことを明らかにした。(1)TFAM/DNA複合体は電荷の置換や限外ろ過のような物理的な力で容易に乖離しないこと(2)TFAM/DNA複合体は通常DNAの転写に悪影響を与えないが、TFAMがDNAに対し大過剰となる条件では転写阻害を引き起こすこと。以上の結果はTFAMがミトコンドリアへの遺伝子導入時の適切なDNAパッケージング因子であることが期待されることを示している。またパッケージング因子として用いる際にはTFAMとDNAの比率を考慮して用いなければならないことも明らかとなった。もし患者のmtDNA変異部位に対応する野生型遺伝子を発現させ変異型遺伝子産物より相対的に優位に立たせることができれば、ミトコンドリア病に対する遺伝子治療法となりうる可能性がある。そこで本研究はその第一歩として外来遺伝子をミトコンドリア内に導入・発現させる基礎情報の獲得を目的とする。当該年度ではミトコンドリアDNA結合タンパク質であり我々がミトコンドリアへの遺伝子導入時のDNAパッケージング因子として着目しているTFAMとDNA凝集化にかかわり外来遺伝子導入時にDNAパッケージングによく用いられるプロタミンとを詳細に比較を行った結果以下のことが判明した。(1) TFAM/DNA複合体の粒子径はプロタミン/DNA複合体とほぼ同じであるが、より緩やかな構造を維持していると考えられること。(2) TFAM/DNA複合体では環状DNAと直鎖DNAともに約17bp当たりTFAM一分子の割合で結合している条件が最も高い転写活性を示したが、プロタミン/DNA複合体ではいかなる割合においても転写活性化作用は示さなかった。

導入されるDNAはミトコンドリア内でのDNA分解に耐え、さらにこのDNAが転写されることで外来遺伝子を発現させる必要がある。以上の結果はTFAMがミトコンドリアへのDNA導入時の適切なパッケージング因子であることを示している。外来遺伝子をミトコンドリア内に導入・発現させるためのベクター構築や、導入DNA複合体に対するパッケージング因子の選定や評価についてはほぼ当初の目的通り進んでいるが、最終目標である細胞内ミトコンドリアへの遺伝子導入・発現を行うための実験方法の確立が遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。現在までに導入すべき遺伝子やパッケージング因子などの材料の選定を行った。今後はこのパッケージング因子の詳細な評価を行う必要がある。また最終目標である細胞内への効率的な遺伝子導入・発現の成功には至っておらずミトコンドリアへの効率的な遺伝子導入方法の構築などの越えるべきいくつかのハードルが存在することも明らかとなった。今後は、これらの課題の克服に向けた研究行う必要がある。
新規α,α-二置換グリシンを利用した分子認識能をもつペプチドの構築

本研究では、側鎖が大変込み合っているα,α-二置換グリシンがそれを含むペプチド骨格の自由度を減少させ二次構造を安定化させることを利用して、機能性オリゴペプチドを開発しようとした。そのために、新規α,α-二置換グリシンを含むペプチドの合成、構造および機能に関して検討した。1.テトラペプチド(Trp-Aib-Gly-Leu-NHAr)を合成し、両端の芳香環による第四級アンモニウムの捕捉を検討した結果、これはAibの立体効果と分子内水素結合によりβ-ターン構造をとり、そのため両端の芳香環が近接し、両者間にアンモニウムを捕捉した錯形成をしていることが分った。これは小さなテトラペプチドをホストとしたカチオン-π相互作用によるゲスト分子の捕捉の初めての例である。2.α,α-ジフェニルグリシン(Dph)を含むペンタペプチド(Z-AA_1-AA_1-Dph-AA_3-AA_3-OMe)およびヘキサペプチド(Z-AA_1-Dph-AA_3-AA_1-Dph-AA_3-OMe)を合成した。ペンタペプチドのX線結晶構造解析からAA_1がAibの場合にはAA_3がGly、Aibのいずれでも3_<10>ヘリックスをとっており、NMF解析から溶液状態でも同様のコンホメーションをとっていると分かった。また、ヘキサペプチドとドデシルピリジニウム塩との錯形成を検討し、両者が1:1の錯体を形成することが分かった。3.新規な9-アミノフルオレン-9-カルボン酸(Afc)を含むペプチドをUgi反応を用いて、トリペプチド(Z-AA_1-Afc-AA_3-OMe)およびヘキサペプチド(Z-AA_1-Afc-AA_3-AA_1-Afc-AA_3-OMe)を合成した。ヘキサペプチドとドデシルピリジニウム塩との錯形成はやや安定性は低いものの、両者が1:1の錯体を形成することが分かった。ペプチドの構造と蛍光スペクトルとの関係も検討した。4.側鎖に2個のピリジン環をもつ新規なα,α-ジ(2-ピリジル)グリシン(2Dpy)を含むトリペプチド(Z-AA_1-2Dpy-AA_3-OMe)を初めて合成した。NMRにより、2個のピリジン環の窒素原子がそれぞれアミドNHと分子内水素結合をした新規なコンホメーションをとっていることが分かった。このペプチドは過塩素酸銅と容易に2:1錯体の結晶を与え、X線解析により結晶構造が明らかになった。本研究の自的は、側鎖が大変込み合っているα,α-二置換グリシンがそれを含むペプチド骨格の自由度を減少させ、二次構造を安定化させることを利用して、機能性オリゴペプチドを開発しようとするものである。本年度は、側鎖が蛍光を発するフルオレン骨格である新規アミノ酸、9-アミノフルオレン-9-カルボン酸(Afc)を含むヘキサペプチドについて検討し、次のような興味ある結果を得た。