hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨塩量測定による骨フッ素症および骨粗鬆症の集団検診への応用

(1)入院中の本症患者で検討した結果、全身の骨塩量測定は計測時間がかかり過ぎるので、当面は診断に有用な部位の骨塩量を測定することとし、計測時間、精度、測定の容易さ等の点から腰椎部(L_2L_4)、次いで大腿骨頚部が適当と認めた。(2)この腰椎部骨塩量は健常者では1.0g/cm^2前後が最頻値であるのに比し、骨粗鬆症では軽症例でも0.7g/cm^2以下、一般には0.50.6g/cm^2が最も多く、スクリ-ニングの基準設定が可能なことを認めた。ただ(3)腰椎部骨塩量は圧迫骨折、すべり症等による著明な偏位・変形例の場合に常法では計測不能なことがあり、計測技法になお検討を要する点のあることを認めた。最後に、骨塩量の正常値の設定について、その減少が50才代の女性から加齢と共に急増する傾向を認めるので、今後、この年齢層を中心に詳細に検討することとした。本年(二年)度は、まず導入したノ-ランド社製デュアルX線骨密度測定装置の性能を検討した。再現性についてはin vitroで変動係数は1%未満であり、長期間の観察でも同様であった。in vivoでの変動係数は2%未満であった。精度については、QCT用標準ファントムを用いて検討したが、各ロッドの実測BMC(Bone Mineral Content)値と公称値がほぼ直線関係を示した。単位面積当りの測定時間を長くとると、単位時間当りの光子束強度が増加し再現係数がより小さくなる傾向を認めた。また、腰椎前後方向での骨塩量測定時に他部位にTLD素子を付け散乱線量を測定したが、非被曝素子と有意差はなく、侵襲性は充分に低いと考えられた。次に、集団調査の基礎的検討として、健常高齢者について対面聞き取り調査を実施した結果、過去の食生活と現在の推定骨量との間に関連を認めた。さらに各年代の男女について主に腰椎前後方向L_2L_4領域の骨塩測定を行なった。この研究においては、対象椎体に圧迫骨折等を認めず、日常生活に制限の無い者を正常者として各年代群の平均値を算出した。若年者群では男女ともBMD(Bone Mineral Density)値が1.0g/cm^2前後であり、加齢に伴う変化は男性では少ないのに対し、女性ではほぼ年1%の割合で減少が認められた。腰椎側面では体厚の関係上、再現性が低く、測定時間が長くなることや高齢者では側臥位を取り難い者が多いこと等、集団検診技法としては未だ検討を要する点が少なくない。大腿骨頸部も検査技法がやや煩雑となり、頸部骨折者の健側頸部は腰椎BMD値と比べ明らかに低値であり、測定の必要性が示唆された。全身スキャンでは全身の骨塩量が求められ、体脂肪量も同時に測定し得るが、現行機器では測定に20分程要することから一次検診には不適と考えられた。平成3年度は導入した米国ノ-ランド社製デュアルX線骨密度測定装置XRー26を用いた骨密度測定の集団検診を実施し、その問題点や集検術式を検討した。当初、同測定装置を集団検診車に装備して各地を移動して集検する方式を検討する予定だったが、集検車を入手できなかったため、本年度は、本装置をトラックで輸送し現地に設置して地域住民の骨粗鬆症集団検診を実施する場合について検討した。骨密度の測定は部位として腰椎前後方向で1名につき10分余りの測定時間を要し、一日に約40名の検診はスム-ズに行ない得た。本法では、同時に富士メディカルシステム社製の比色/酵素アナライザ-富士ドライケム5500を用いて血清カルシウム値、血清無機リン値、アルカリ性フォスファタ-ゼ活性値等の血液検査を行ない、簡便な体力測定(立位体前屈・屈膝上体起し)とケット科学研究所製近赤外線皮脂厚測定装置フィットネスアナライザ-BFTー2000を用いた皮脂厚測定等を加え、保健婦による問診、医師による診察と結果の説明、これに基づいた保健婦・栄養士・体育指導員による指導まで一日の検診時間内に実施しえた。この方式による妥当性と実用性を検討するとともに、輸送等に伴う問題点の検討を行なったが、十分に実用可能と結論した。
マウナケア天文台における銀河と銀河系の構造の観測的研究

昭和61年度ハワイ大学のマウナケア天文台において海外学術研究を実施した.それぞれの研究班はマウナケア天文台のハワイ大学2.2m望遠鏡, 0.6m望遠鏡, NASAのIRTF望遠鏡,英国のUKIRT望遠鏡などの観測時間を,諸外国の研究班に伍して個々に申請して供与された.研究班の自前で開発した装置を運搬して,望遠鏡に装着,調整して,観測データを取得した班もある.昭和62年度には各班は取得した観測データを処理,整約,解析した.以下に各研究班の成果を要約する.1.密小銀河群の研究においては5個の密小銀河群の構成銀河の赤方偏移の予備的結果が得られた.密小銀河群CGCG202(z=0.027)の中で暗い銀河No.13は,背後(z=0.1)にあり,凋密な銀河と見られる銀河は総て直径ー面輝度図(DSBD)上で飽和枝上に並ぶことが伴った. (小平ほか)2.星生成活動の盛んな銀河の研究においては木曽観測所で検出した紫外超過銀河KUGの分光観測をして,凋密なKUGにも大規模な星生成活動があることを見出した. (前原ほか)3.白色矮星の連星における活動の研究においては,相互作用している近接連星BLEriの測光観測をして,光度曲線を得た.光度曲線の解析から,二星は非常に接近しているが接触していないことがわかった.両星の質量,半径を求めて,連星の進化の重要な過渡期にあることが伴った. (山崎ほか)4.重力収縮して恒星が誕生する前段階と言われるボックグロビュールB6の方向の8星について狭帯域測光が行われた.そして半径1pc,質量は太陽の20倍を求めた.1km/sec以上の乱流または15μG以上の磁場がなければ,重力収縮して恒星になる可能性が認められた. (関ほか)5.横向き渦巻き銀河NGC7814の周囲の球状星団の分布を観測して力学的状態を調べようという研究は,天候に恵まれず十分な観測資料を得ることができなかった. (山県ほか)6.星周塵の赤外未同ばかりの高分解能分光器によって,水素の輝線が3.297μmを中心に5本,未同定輝線帯は極大が3.295μm, 3.39ー3.40μmに小さなこぶのあるものもある.これらの未同定輝線帯は実験室で得られた炭素質の物質であると推定して構造の決定を進めている. (坂田ほか)7.赤外線分光観測のための分光器と検出器について検討を進めた. (野口ほか)8.京大で開発した近赤外線分光器は8素子のInSbアレイ検出器を用いて,グレーチングを交換してKバンド分光とLバンド分光を行う. (舞原ほか)9.オリオン座の散光星雲NGC2024を2.17μm(Brγ)で強度分布図を作って励起星を捜した. IRAS2の南30′′にBrγの強い領域を発見した.星間吸収A.ナ_<v.ニ>=25等の下に励起星が隠れている可能性がある. (舞原ほか)10.おうし座暗黒星雲領域で検出された近赤外天体の中から小質量の主系列に達する前の星を探索した. KHー1, KHー4, KHー11には2.3μmから長波長側にCOの吸収帯(らしい)スペクトルが見付かった. KHー9には逆にCOの輝線帯(らしい)スペクトルが観測された. (舞原ほか)11.相互作用している銀河NGC3690ーIC694に2.43μmの水素分子(Qーブランチ)輝線と2.17μmの水素Brγ輝線を7.2′′の分解能で観測した.水素分子輝線は銀河の中心から放射されている.星生成領域に見られるような小規模の衝撃波による励起か,大規模な銀河衝撃波による励起か検討中である. (舞原ほか)昭和61年度ハワイ大学のマウナケア天文台において海外学術研究を実施した.それぞれの研究班はマウナケア天文台のハワイ大学2.2m望遠鏡, 0.6m望遠鏡, NASAのIRTF望遠鏡,英国のUKIRT望遠鏡などの観測時間を,諸外国の研究班に伍して個々に申請して供与された.研究班の自前で開発した装置を運搬して,望遠鏡に装着,調整して,観測データを取得した班もある.昭和62年度には各班は取得した観測データを処理,整約,解析した.以下に各研究班の成果を要約する.1.密小銀河群の研究においては5個の密小銀河群の構成銀河の赤方偏移の予備的結果が得られた.密小銀河群CGCG202(z=0.027)の中で暗い銀河No.13は,背後(z=0.1)にあり,凋密な銀河と見られる銀河は総て直径ー面輝度図(DSBD)上で飽和枝上に並ぶことが伴った. (小平ほか)2.星生成活動の盛んな銀河の研究においては木曽観測所で検出した紫外超過銀河KUGの分光観測をして,凋密なKUGにも大規模な星生成活動があることを見出した. (前原ほか)3.白色矮星の連星における活動の研究においては,相互作用している近接連星BLEriの測光観測をして,光度曲線を得た.光度曲線の解析から,二星は非常に接近しているが接触していないことがわかった.

両星の質量,半径を求めて,連星の進化の重要な過渡期にあることが伴った. (山崎ほか)4.重力収縮して恒星が誕生する前段階と言われるボックグロビュールB6の方向の8星について狭帯域測光が行われた.そして半径1pc,質量は太陽の20倍を求めた.1km/sec以上の乱流または15μG以上の磁場がなければ,重力収縮して恒星になる可能性が認められた. (関ほか)5.横向き渦巻き銀河NGC7814の周囲の球状星団の分布を観測して力学的状態を調べようという研究は,天候に恵まれず十分な観測資料を得ることができなかった. (山県ほか)6.星周塵の赤外未同ばかりの高分解能分光器によって,水素の輝線が3.297μmを中心に5本,未同定輝線帯は極大が3.295μm, 3.39ー3.40μmに小さなこぶのあるものもある.これらの未同定輝線帯は実験室で得られた炭素質の物質であると推定して構造の決定を進めている. (坂田ほか)7.赤外線分光観測のための分光器と検出器について検討を進めた. (野口ほか)8.京大で開発した近赤外線分光器は8素子のInSbアレイ検出器を用いて,グレーチングを交換してKバンド分光とLバンド分光を行う. (舞原ほか)9.オリオン座の散光星雲NGC2024を2.17μm(Brγ)で強度分布図を作って励起星を捜した. IRAS2の南30′′にBrγの強い領域を発見した.星間吸収A.ナ_<v.ニ>=25等の下に励起星が隠れている可能性がある. (舞原ほか)10.おうし座暗黒星雲領域で検出された近赤外天体の中から小質量の主系列に達する前の星を探索した. KHー1, KHー4, KHー11には2.3μmから長波長側にCOの吸収帯(らしい)スペクトルが見付かった. KHー9には逆にCOの輝線帯(らしい)スペクトルが観測された. (舞原ほか)11.相互作用している銀河NGC3690ーIC694に2.43μmの水素分子(Qーブランチ)輝線と2.17μmの水素Brγ輝線を7.2′′の分解能で観測した.水素分子輝線は銀河の中心から放射されている.星生成領域に見られるような小規模の衝撃波による励起か,大規模な銀河衝撃波による励起か検討中である. (舞原ほか)
AI社会におけるコンピュテーショナルシンキング育成教育課程基準策定国際共同研究

2019年は高等学校、2020年は小・中学校に焦点を当て、APEC教育課程調査官研修への提案準備を行う。先端のAI研究者・AI教育利用研究者(海外研究協力者)と協働し資料並びに関連機材を探索収集し、それを基盤に、教育課程開発・実施の責任者である国立教育政策研究所研究者と協働して教育内容の構成要素を探り、その範例教材を教材開発専門家である教科教育研究者と生み出す。
三次元金属錯体をテンプレートとする不斉な多重環状レセプターの一段階合成

4本の金属配位性側鎖をもつ12員環テトラアミン『アームドサイクレン』は、ナトリウムイオンや希土類イオンと安定な八配位型金属錯体を形成し、結晶中のみならず溶液中においても4本の側鎖を同一方向を向けた『4重らせん構造』をとることを見い出した。本特定領域研究では、生体系に匹敵する優れた認識機能を発揮する多重環状レセプターの新合成法の開発をめざして、1)基本骨格となる4重らせん構造をもつ『アームドサイクレン・金属錯体』の側鎖上置換基として光学活性団の導入を図り、高度に不斉制御された4重らせん構造を誘起・保持させることに成功を収めるとともに、2)側鎖上置換基としてピリジン環をはじめとする多彩な金属配位性団を付加し、金属配位結合を活用した4本の側鎖間での効率的な架橋反応を実現し、新しいタイプの多重環状化合物のための一段階合成法を確立した。本特定領域研究によって合成された新規多重環状化合物は、ヘテロ複核金属錯体の配位特性を活用した空間制御型多点分子認識機能の発現や、発光特性をもつレニウム金属中心の導入による光応答性金属錯体系の構築など、新しい分子機能材料への展開に大きな可能性をもつものとして重要である。また、従来よりクラウンエーテルやポリアミンなどを基盤とする「かご型環状化合物」を中心に、国内外を問わず活発な研究が展開されてきた環状レセプター分子系とは異なり、これらの研究成果は、『アームドサイクレン・金属錯体』上に誘起した不斉な4重らせん構造の特性を活かして、高度な不斉構造をもつ『多重環状レセプター』の開発に有効な新しい合成戦略を確立したものとして注目される。
ミトコンドリアのタンパク質輸入装置複合体の構造解析

ミトコンドリアには外膜・内膜それぞれにタンパク質膜透過装置すなわち「tom(translocase of outer membrane)-複合体」および「Tim(Translocase ofinnermembrane)-複合体」が存在する。本研究はミトコンドリアへのタンパク質輸入に関わる各複合体因子の構造を明らかにし、さらに内膜・外膜のタンパク質輸入装置の構造を解明し、ミトコンドリアへのタンパク質輸入というダイナミックな生命現象を原始レベルで解明することを目的とする。本年度は、Tom-複合体のなかで透過チャネルを構成する中心成分であるTom40の解析を中心に進め以下の成果を得た。(1)大腸菌で発現し、封入体として高度に精製し、変性剤によって可溶化後、Ni-カラムに結合させその後カラム樹脂上で変性剤から界両活性剤に置き換えることによって立体構造を再生できた。(2)リポソームに再構成したTom40はカチオン選択性のチャネル活性を示し、この活性はミトコンドリア標的化プレ配列ペプチドで阻害されることがわかった。(3)電子顕微鏡では、内直径3nmのリング状構造が観察された。(4)マトリクスへ標的化される前駆体タンパク質を特異的に認識・結合することが、抗体を用いた共沈殿の実験や表面プラズモン共鳴の実験で明らかになった。また、この結合は静電的なものであることが判明した。(5)Tom40に結合した前駆体タンパク質はプロテアーゼに耐性となり、リング状構造の内側にまで進入して結合していることが示唆された。(6)Tom40単独および前駆体タンパク質(Su9-DHFR)との複合体の結晶化条件を検討中である。ミトコンドリアには外膜・内膜それぞれにタンパク質膜透過装置、すなわち"Tom(Translocase of Outer Membrane)-複合体"および"Tim(Translocase of Inner Membrane)-複合体"が存在する。本研究は、ミトコンドリアのタンパク質輸入に関る各因子の構造を明らかにし、さらに内膜・外膜のタンパク質輸入装置複合体の構造を解明することによって、ミトコンドリアへのタンパク質輸入過程を原子レベルで理解することを目標としている。本年度は、特にTom-複合体の中でポリペプチド鎖の透過チャネルを形成するTom40の大腸菌体内での発現・可溶化・精製・生化学解析を進展させた。先ず封入体をグアニジン塩によって変性可溶化し、ニッケル-樹脂カラムに結合させた後、カラム内で変性剤を除きながら界面活性剤に置換することによって高度に精製すると同時にリフォールドさせるという一連の精製・再生に極めて効率的な方法を開発した。これにより精製・再生されたTom40タンパク質はミトコンドリアの前駆体タンパク質に(他のTom因子の助けに依存せず)直接結合できること、この結合がプレ配列によっていること、再生リフオールドさせたTom40がイオン透過特性を有し、CDスペクトルにより予想通りβ構造に富むこと、Tom40に結合したプレ配列はプロセシング酵素に対して耐性を示すことなどを明らかにした。以上のように、タンパク質輸送担体として期待されるユニークな特性が明らかにされた。以上の生化学解析と並行して、大量調製と結晶化条件の検索に本格的に取り組んでおり、有望と思われる結晶様沈殿の生成にまで至っている。
両生類の中枢神経系における体液変動感知とアンギオテンシンⅡによる体液調節

両生類の体液恒常性に関わる脳部位と脳内アンギオテンシンIIの役割を調べた。中枢神経系において、第3脳室周囲部は血液脳関門を欠いており、細胞外液の状態を感知する役割をもつ。クローニングしたアマガエルTRPV1とTRPV4はリアルタイムPCRによる各体組織における発現解析では体液変動による影響は無かった。c-Fos免疫陽性ニューロンは終脳視索前野の小細胞性視索前核、室傍核、視交叉上核、間脳視床下部の前結節において観察された。脱水処理によりこれら全ての神経核でc-Fos活性が高まった。アンギオテンシン1型受容体は、脳室前壁背側の中隔核に局在し、中隔核と室傍核の機能的な連絡の可能性が示唆された。陸生動物にとって「渇き」を感じることは,飲水を誘発して体液恒常性を維持するために最も本質的な生理現象の一つである.両生類がどのような生理機構によって渇きを感じ,水場を探して(索水行動),皮膚から吸水している(経皮性吸水行動)のかを個体・器官ならびに細胞・分子レベルにおいて解析を行った.(1)索水行動と吸水行動の観察.多様な環境に適応している無尾両生類の環境選択性について行動観察を行った.乾燥処理後に索水と吸水は促進されるが,長期絶水により索水行動は陸生種と樹上生種で不活発になり,夜間行動も低下した.一方,半水生種では絶水処理により行動が活発化した.吸水については,低張液環境への滞在時間が半水生種では最も長く,陸生種,汽水生種と樹上生種は陸での滞在が長かった.オオヒキガエルにおいて,環境水中へのAmiloride処理による影響は見られなかった.無尾両生類では索水・吸水行動の違いが,生息環境への適応に役立っていることが示唆された.末梢受容体は環境水中のNa+濃度で無く,溶液浸透圧を受容していると考えられる.(2)乾燥処理により活性化する中枢神経系領域の探索.アマガエルとオオヒキガエルの脳連続切片を作成した.また,中枢神経系の血液脳関門領域を同定した.アマガエルc-fosタンパクをクローニングし,特異抗体を作成した.ウシガエルのアンギオテンシン1型受容体(ATR1)とアンギオテンシン2型受容体(ATR2)をクローニングし,各抗体を作成した.c-fosタンパク発現部位については,解析が進んでいる.今後はアンギオテンシン各受容体の発現部位の同定とc-fosタンパクとの共局在部位を明らかにしていく.(3)脳室内投与と脳領域破壊実験.アマガエルとウシガエルの脳室内ホルモン投与実験を行った.アマガエルの脳弓下器官の同定と破壊実験を試みている.両生類は生活史を通して水環境から離れることはできないが,様々な生息環境に適応放散している.外部環境へ順応するためには,体液の恒常性(体液量と体液成分の維持)が,最も重要な因子の一つである.脱水時の索水行動と吸水行動の観察から,索水・吸水行動の違いが,生息環境への適応に役立っていることが示唆された.樹上生種の日周期リズムでは,薄明時に活発化,夜間は不活発になった.実験室内環境の温度,湿度,気圧を変化させた実験から,行動の変化や雨鳴き行動は皮膚からの体水分の不感蒸泄に関わる温度と湿度の影響が重要で,気圧の影響は無いようである.乾燥処理により活性化する中枢神経系領域の探索を行った.アマガエルとオオヒキガエルの脳連続切片を作成して,中枢神経系の血液脳関門領域を同定した.アマガエルc-fosタンパクをクローニングし,特異抗体を作成した.c-fosタンパク発現部位について,解析を進めた.昨年度作成したアンギオテンシン受容体抗体を用いて,発現部位の同定とc-fosタンパクとの共局在部位を検討したが,十分な結果に至っていない.アマガエルとウシガエルの脳室内ホルモン投与実験を行った.アマガエルの脳弓下器官の同定と破壊実験を試みている.アマガエルについては,アンギオテンシンIIによる経皮吸水行動の活性化が観察された.一方,ウシガエルの吸水行動にはアンギオテンシンIIの有意な影響は,現在まで得られていない.ウシガエルのアンギオテンシン受容体(AT1R,AT2R)をクローニングし,脳ならびに体組織における発現をRT-PCR法により解析した.AT1Rは脳,肺,肝臓,大腸,腎臓,脾臓,膀胱膜で発現していた.AT2Rは心臓,動脈,肺,胃,膀胱膜で発現していた.乾燥環境や脱水環境下におけるAT1RとAT2Rの発現動態は,腹側皮膚と腎臓で有意に増加した.一方,脳領域での変化は見られなかった.以上の成果を投稿準備中である.(1)索水行動と吸水行動の観察:アマガエルの索水・吸水行動を記録した.特に赤外線カメラを用いて夜間の行動記録し,日中,薄明時と暗黒時の比較を行った.温度,湿度,気圧についての変化と行動記録を行い,アマガエルの雨鳴きを誘発する因子の探索に関しての基礎データを得た.(2)各種抗体による免疫組織化学的研究:市販c-fos抗体ならびにアマガエル

用c-fos抗体を使用して,ウシガエルとヒキガエルの脳領域における発現の観察に用いた.抗体の特異性あるいは実験技術上の問題があるため,安定した結果が得らなかった.このため,新たに実験方法を工夫している.(3)アンギオテンシン受容体(ATR)ならびにTRPVの分子生物学的研究:アズマヒキガエルのATR遺伝子とTRPV遺伝子の部分配列をクローニングしている.アマガエルをもちいて,外部環境変化時(温度変化と湿度変化)におけるTRPV1とTRPV4遺伝子発現の変化を定量的PCRで調べている.ウシガエルについては,AT1RとAT2Rのクローニングを確認後,脳など各器官での発現ならびに環境変化に対する発現変動を調べた.本研究は両生類の細胞外液浸透圧と細胞外液量を保つための仕組み,特に「吸水行動」に焦点をあてた.索水・吸水行動を連続して記録したところ,活動は昼夜を問わず見られ,体液よりも低張な吸水源に留まって経皮吸水を行った.水質の判断は末梢組織で行われていることが示唆された.瀉血や脱水処理を施して吸水させると,体液量の調節は浸透圧調節よりも速やか行われ,α受容体を介する交感神経系の関与が示唆された.また,前脳の脳室内に高張溶液やアンギオテンシンIIを投与すると吸水行動が促進された.一方,脳室周囲部を破壊された動物では,これらの反応や行動が抑制された.体液調節に関わる脳領域を特定するため,アマガエル脳切片を作成してc-Fosタンパク免疫陽性細胞の分布と発現頻度を観察した.前脳の脳室腹側を取り囲む小細胞性視索前核,室傍核,視交叉上核および前結節核においてc-Fos免疫陽性ニューロンが認められ,脱水処理動物ではc-Fos免疫陽性ニューロン発現が増加した.アンギオテンシンII1型受容体(AT1R)mRNAは間脳領域で高発現し,AT1R免疫陽性反応は脳室前壁背側の中隔核(MSN)に局在していた.MSNのAT1R免疫陽性ニューロンにおいて,c-Fos免疫陽性反応が認められたが,c-Fos発現率は脱水による影響は認められなかった.c-Fos発現率はMSNと室傍核との間で強い正相関が有り,機能相関が示唆された.一過性受容器チャネル(TRPV)ファミリーは,げっ歯類において浸透圧を受容すると言う報告がある.アマガエルTRPV1とTRPV4はHEK293細胞を用いた強制発現系において,げっ歯類と同様に温度と浸透圧変化に反応した.一方,リアルタイムPCRによるアマガエル各体組織におけるTRPV1とTRPV4の発現解析では,体液変動による影響はなかった.両生類の浸透圧センサーについて,さらなる研究が必要である.両生類の体液恒常性に関わる脳部位と脳内アンギオテンシンIIの役割を調べた。中枢神経系において、第3脳室周囲部は血液脳関門を欠いており、細胞外液の状態を感知する役割をもつ。クローニングしたアマガエルTRPV1とTRPV4はリアルタイムPCRによる各体組織における発現解析では体液変動による影響は無かった。c-Fos免疫陽性ニューロンは終脳視索前野の小細胞性視索前核、室傍核、視交叉上核、間脳視床下部の前結節において観察された。脱水処理によりこれら全ての神経核でc-Fos活性が高まった。アンギオテンシン1型受容体は、脳室前壁背側の中隔核に局在し、中隔核と室傍核の機能的な連絡の可能性が示唆された。(1)索水行動と吸水行動の観察.多様な生態系に生息する無尾両生類各種について,索水・吸水行動を昼夜にわたりビデオ記録した.これらの解析結果は,両生類各種の生活パターンから予想されうる行動を示したことから,両生類が各生息環境へ適応するためには索水と吸水行動様式が重要であることが明らかになった.
免疫異常に伴う急性感音難聴と蝸牛血管内皮細胞障害の関係について

MRL/lprマウスは加齢とともに免疫異常を発現し、生後20週令から感音難聴が生じることが報告されている。我々の施設においても、クリック音刺激によるABRを用いて、この聴力閾値の経時的変化について検討したが、現時点まで明らかな聴力閾値の上昇は認められていない。一方、組織学的検討では、これら閾値上昇を認めなかったマウスにおいても、抗マウス免疫グロブリンによる免疫染色で、蝸牛血管条に1gGの沈着が認められたことから、免疫複合体が血管壁周囲に存在することは明らかであると考えられるが、細胞浸潤などを呈する典型的な血管炎の像を示したものは認められなかった。従って、単に免疫複合体が血管壁に沈着するだけでは血管炎による蝸牛機能障害が生じることはなく、別の新たな刺激が加わることで障害が生じる可能性があると考えられた。そこで昨年度は、インターロイキン1(IL-1)、腫痛壊死因子(TNF-α)、γ-インターフェロン(γ-INF)等の炎症性与イト力インをMRL/1prマウスおよびBALA/cマウスの蝸牛において外リンパ潅流することにより、難聴を生じさせることを試みたが、マウスの蝸牛は我々が外リンパ潅流の実験に通常用いているモルモットにくらべて小さく、脆いため、外リンパ潅流の成功率がきわめて低かった。今年度の実験では、これら炎症性サイトカインを蝸牛外リンパ腔に連続する髄液中に投与することによって生じる変化を検討したが、難聴の発現は明らかではなく、蝸牛血管内皮におけるICAM-1の変化にも一定の傾向は認められなかった。このことから、単なるサイトカインの変化だけでは難聴を生じさせることは困難であると判断し、現在、一側の内耳を破壊して、内耳組織による抗原暴露を行うことで、MRL/1prマウスに難聴を生じさせる実験を継続中である。一方、組織学的検討では、これら閾値上昇を認めなかったマウスにおいても、抗マウス免疫グロブリンによる免疫染色で、蝸牛血管条にlgGの沈着が認められたことから、免疫複合体が血管壁周囲に存在することは明らかであると考えられるが、細胞浸潤などを呈する典型的な血管炎の像を示したものは認められなかった。そこで平成9年度の研究では、前年度に引き続き、インターロイキン1(1L-1)、腫瘍壊死因子(TNF-α)、γ-インターフェロン(γ-INF)等の炎症性サイトカインをMRL/lprマウスおよびBALA/cマウスの蝸牛において外リンパ潅流することにより、ICAM-1、VCAM-1等の接着分子の発現に変化が生じるか否かについて、免疫染色、western blotting法を用いて検討をおこなった。しかしながら、マウスの蝸牛は我々が外リンパ潅流の実験に通常用いているモルモットにくらべて小さく、脆いため、外リンパ潅流の成功率がきわめて低く、組織学的検討においてもアーチファクトが大きいのが現状である。そこで今後は、炎症性サイトカインを髄液内もしくは腹腔内に投与することによって、蝸牛における変化を検討する予定であるが、さらに内耳の抗原性を高めるため、炎症性サイトカイン投与前に一側内耳を破壊したマウスについての検討をおこなう予定である。

このことから、単なるサイトカインの変化だけでは難聴を生じさせることは困難であると判断し、現在、一側の内耳を破壊して、内耳組織による抗原暴露を行うことで、MRL/1prマウスに難聴を生じさせる実験を継続中である。
高脂肪食負荷時における膵β細胞オートファジー機構の解析

(目的)骨髄移植により、膵β細胞容積が増加する現象が認められている。このメカニズムを解明する。(方法)C57BL6マウスにいろいろな条件下で骨髄液注入や放射線照射を行い、どのような手技が膵β細胞容積増加に必須であるかを検討した。また、我々の観察では、膵β細胞容積増加が認められる際には必ず、膵ラ氏島内の血管内皮細胞数の増加も認められていた。従って、膵ラ氏島の血管内皮細胞数の規定因子である膵β細胞におけるVEGF-Aの発現がこの現象に関わっている可能性がある。そのため、膵β細胞特異的VEGF-Aノックアウトマウスに骨髄移植を行ない膵β細胞容積が増加するか否かに関して検討した。(結果)骨髄移植のさまざまな条件を検討した結果、全身へ放射線照射すれば、骨髄液注入を行わなくとも膵β細胞容積増加が認められることが明らかになった。一方で、骨髄のみ、あるいは、膵のみに放射線照射を行った群では、膵β細胞容積増加が認められなかったことから、全身の放射線照射が膵β細胞容積増加に必須でかつ十分であることが明らかになった。また、VEGF-Aノックアウトマウスでは、骨髄移植を行っても、膵β細胞容積の増加は認められないことが明らかになった。(結論)骨髄移植による膵β細胞容積増加のためには、全身の放射線照射が必須でかつ十分であることが明らかとなった。さらに、この現象には膵β細胞に発現するVEGF-Aが必須と考えられた。近年、オートファジー機構の破綻と様々な臓器おける疾患関連性が最近報告されている。今回、我々は膵β細胞における恒常的オートファジーの役割について検討を行う目的で、autophagosomeの形成に必須の遺伝子であるAtg7をCre-lox Pシステムを用いて作製した、膵β細胞特異的Atg7KO(Atg7β-/-)マウスおよびコントロールとしてAtg7flox/flox(Atg7βf/f)マウスを用いて膵β細胞におけるオートファジーの生理的役割について検討した。Atg7β-/-マウスに、腹腔内ブドウ糖負荷試験を施行したところ、Atg7βf/fと比較し,耐糖能障害を認め、同時に測定した血中insulin値の低下を認め、耐糖能障害は加齢に伴い顕著になった。インスリン感受性に有意差は認めなかったことから、Atg7β-/-マウスで認められた耐糖能障害はインスリン分泌不全によるものと考えられた。組織学的検討において、光顕レベルで膵β細胞容積は同等であったが、Atg7β-/-膵島においてballooning cell様の構造変化が認められた。また、Atg7β-/-膵β細胞内にオートファジーにより特異的に分解されるp62およびubiquitinの蓄積を認めた。単離膵島を用いた蛋白レベルの検討においても同所見が確認された。単離膵島を用いたインスリン分泌実験の結果、Atg7β-/-膵島はグルコースへの反応は低下していたが、KCIへの反応は保たれており、KATPチャネル以前の障害が考えられた。また、電顕レベルではAtg7β-/-膵β細胞内にミトコンドリアの形態異常が認められた為、ブドウ応答性ATP産生レベルを検討したところ、Atg7β-/-膵島では有意に低下していた。以上より、オートファジー機構は膵β細胞の恒常性維持に必須と考えられた。
脊髄視床路細胞へのATP P2X受容体感受性入力とカプサイシンVR1受容体入力の統合

TRPV1 (VR1)受容体は痛み刺激を伝達するC線維に広く発現しており、TRPV1受容体は末梢からの痛み情報を調節すると考えられている。実際の診療において、TRPV1受容体に作用するカプサイシンクリームは神経因性疼痛などの鎮痛薬として臨床応用されている。その鎮痛機序は、TRPV1受容体の脱感作に起因すると考えられているが、その作用機序は未だ不明である。今回、脊髄後角深層細胞からパッチクランプ記録を行い、抑制性シナプス伝達におけるTRPV1受容体の作用を検討した。脊髄後角深層の第V層細胞において、TRPV1受容体の活性化による長時間の抑制性シナプス伝達賦活化作用が観察された。カプサイシンに反応するTRPV1受容体が脊髄後角表層に入力するC線維に発現していることと、TTX存在下においてカプサイシンによるmIPSC発生頻度の増強効果は観察されなくなったことから、カプサイシン感受性C線維は多シナプス性に脊髄第V層細胞に抑制をかけることが示唆された。一次求心性線維終末と脊髄神経細胞間の興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸の作用を完全に除去して状態においても、TRPV1受容体の活性化によってGABAおよびグリシンを介する抑制性シナプス伝達を賦活化させた。さらに、各種SP受容体拮抗薬の存在下でTRPV1受容体を介する抑制性シナプス伝達の賦活化作用は減弱した。以上の結果から、カプサイシン感受性抑制系伝達回路が脊髄内に存在し、神経ペプチドであるサブスタンスPを介していることが明らかとなった。過去にTRPV1受容体による抑制性シナプス伝達への関与を示した報告は無く、本研究によってはじめて明らかとなった抑制性神経回路におけるTRPV1受容体の役割は、今後の脊髄内鎮痛機序解明に重要な役割を果たすものと期待される。本年度、我々は当教室において、記録システムを立ち上げました。赤外線顕微鏡下に、脊髄スライス標本を用いて、脊髄後角単一細胞からのパッチクランプ記録に成功しました。当教室において、安定した記録手技の確立が達成できた後に、研究課題に沿って研究を進めてきました。まず、我々は脊髄第V層の単一細胞記録において、ATP P2X受容体作動薬あるいはカプサイシン単独投与において、活動電位が発生することを確認しました。同時に両受容体の作動薬を投与した際には、各単独投与と比較し、活動電位の発生頻度が高くなることを観察しました。本現象は、反復性の末梢刺激によって脊髄後角深層において観察されるWind-up現象に類似していました。当初研究計画では、後根を付した脊髄標本をもちいて、後根をC線維閾値以上の強度で反復性電気刺激を行い、反復刺激後の後根誘起電流の振幅が、反復刺激以前の振幅より大きくなるのではないかと仮定していました。しかしながら、今回の研究においては、反復刺激後の後根誘起電流の振幅は、有意には反復刺激以前の振幅より大きくはありませんでした。従って、ATP P2X受容体拮抗剤およびカプサイシン受容体拮抗剤存在下において、同研究は行っていません。更に、我々は本システムを用いて、関連する研究の課題を考案し、研究成果を上げました。サブスタンスPとその受容体作動薬は、脊髄第V層細胞において、興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸だけでなく、抑制性神経伝達物質であるグリシン、GABAの遊離を増強させ、脊髄痛覚伝達回路の抑制系を賦活化させることを明らかにし、学会発表しました。カプサイシンに感受性のTRPV1受容体(VR1受容体)は脊髄後角内の痛み刺激を伝達するC線維終末にも強く発現し、末梢からの痛み情報を調節することを明らかにしてきた。

本年度において、我々は脊髄後角深層細胞からパッチクランプ記録を行い、抑制性シナプス伝達におけるTRPV1受容体の作用について検討した。細胞外にカプサイシンを還流投与すると、自発性抑制性シナプス後電流は長時間に渡って増強された。本現象はC線維反復刺激によっても観察された。これらのカプサイシン還流投与やC線維反復刺激による抑制系賦活化作用はサプスタンスP受容体阻害剤によって抑制された。以上の結果より、カプサイシン感受性C線維はサプスタンスPを介して、脊髄内抑制系介在細胞を興奮させることが明らかとなった。また、ニコチンに鎮痛作用があることは既に約70年前に報告されていたが、その作用機序は長らく明らかではなかった。今回、様々な選択的ニコチン受容体作動薬を用い、脊髄後角におけるニコチン受容体の作用機序を詳細に検討した。各種ニコチン受容体作動薬を潅流投与して抑制性シナプス後電流の変化を観察すると、脊髄後角深層と浅層において抑制性シナプス伝達を賦活化させるニコチン性アセチルコリン受容体は異なることが明らかとなった。脊髄深層細胞において上位の中枢神経系に多く発現していると考えられているα4β2サブタイプのニコチン受容体作動薬によって抑制性シナプス後電流は増強された。一方、浅層細胞においては末梢神経側に多く分布するとされるβ4を含むサブタイプのニコチン受容体作動薬によって抑制性シナプス後電流は増強された。TRPV1(VR1)受容体は痛み刺激を伝達するC線維に広く発現しており、TRPV1受容体は末梢からの痛み情報を調節すると考えられている。実際の診療において、TRPV1受容体に作用するカプサイシンクリームは神経因性疼痛などの鎮痛薬として臨床応用されている。その鎮痛機序は、TRPV1受容体の脱感作に起因すると考えられているが、その作用機序は未だ不明である。今回、脊髄後角深層細胞からパッチクランプ記録を行い、抑制性シナプス伝達におけるTRPV1受容体の作用を検討した。脊髄後角深層の第V層細胞において、TRPV1受容体の活性化による長時間の抑制性シナプス伝達賦活化作用が観察された。カプサイシンに反応するTRPV1受容体が脊髄後角表層に入力するC線維に発現していることと、TTX存在下においてカプサイシンによるmIPSC発生頻度の増強効果は観察されなくなったことから、カプサイシン感受性C線維は多シナプス性に脊髄第V層細胞に抑制をかけることが示唆された。一次求心性線維終末と脊髄神経細胞間の興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸の作用を完全に除去して状態においても、TRPV1受容体の活性化によってGABAおよびグリシンを介する抑制性シナプス伝達を賦活化させた。さらに、各種SP受容体拮抗薬の存在下でTRPV1受容体を介する抑制性シナプス伝達の賦活化作用は減弱した。以上の結果から、カプサイシン感受性抑制系伝達回路が脊髄内に存在し、神経ペプチドであるサブスタンスPを介していることが明らかとなった。過去にTRPV1受容体による抑制性シナプス伝達への関与を示した報告は無く、本研究によってはじめて明らかとなった抑制性神経回路におけるTRPV1受容体の役割は、今後の脊髄内鎮痛機序解明に重要な役割を果たすものと期待される。
原子層界面からのテラヘルツ放射の計測と機能開拓

前年度には、グラフェンおよび2硫化タングステンなどの2次元原子層材料に吸着する酸素分子が、電気双極子を形成し、基板として用いているInP等の半導体の表面バンド構造を変調するため、フェムト秒パルスレーザー励起により放射されるテラヘルツ波の波形が変化することを見いだした。さらにこの現象を利用して、レーザーテラヘルツ顕微鏡(LTEM)により吸着ガス分子濃度分布のイメージングが可能であることを示した。平成27年度は、2次元原子層物質表面の酸素分子の吸着エネルギーをより定量的に計測するために、昇温脱理法とLTEMを組み合わせた新規な計測手法を開発した。具体的には、2次元材料を真空中で、室温から約450Kの温度範囲で昇温しながら、放射されるテラヘルツ波の波形およびその振幅イメージングを行った。すでに述べたように、放射される波形は酸素分子の吸着濃度にしたがって変化するため、各温度におけるレーザー照射位置における吸着ガス濃度の分布がLTEMで計測可能である。この現象を利用して、グラフェンおよび単原子層2硫化タングステンにおける、テラヘルツ波のピーク振幅の温度依存性をPolanyi-Wignerの式を用いて解析した。その結果、本実験により求めた吸着エネルギーは第1原理計算によって見積もられた酸素の物理吸着エネルギーとほぼ一致した。通常の質量分析器などを利用した昇温脱理法では表面全体の平均的な計測しかできないが、本手法では局所的な情報が得られ、さらに脱離過程だけでなく吸着過程においても計測可能であると言った特徴がある。このように、LEMが、2次元原子層物資の局所的な吸着ガス分子の分析手法として、非常に有効であることを明らかにした。27年度が最終年度であるため、記入しない。グラフェンをコートした半絶縁性InP(100) (Graphene/InP)からの放射テラヘルツ波をレーザーテラヘルツ放射顕微鏡(LTEM)を用いて測定し、グラフェンの堆積がInPからの放射テラヘルツ波に与える影響を計測した。その結果、大気中、及び真空中でGraphene/InPからの放射テラヘルツ波の波形が時間変化し、その変化が酸素の吸着・離脱によるものであることを明らかにした。また、UV光を照射することにより、Graphene/InPからの放射テラヘルツ波の波形が劇的に変化することを見いだした。さらに、基板がInAsやp型もしくはn型のInP基板を用いた場合は、大きなテラヘルツ波の波形変化は観測されなかった。これらの実験結果を基に、酸素分子の吸着によりGraphene/InP基板界面で双極子が形成され、InP表面のポテンシャルが増加することによりテラヘルツ波の波形が変化すると言うモデルを提案した。さらに、グラフェンと同様に二硫化タングステン(WS2)を用いて同様の実験を行った結果、グラフェンの場合と同じく、大気中では酸素吸着によるテラヘルツ波形の変化が観測されたが、グラフェンとは酸素の吸着・離脱の条件が異なることを見いだした。これらの結果は、このような2次元ナノ材料と半絶縁性InP基板の接合により、ナノ材料表面の酸素の吸着・離脱(酸化・還元)反応の計測が可能であることを示しており、2次元ナノ材料の新規な評価法としての展開が期待できる。本研究で取り組む課題は以下の4項目である。1)InP、GaAs、InAs基板(様々な方位・ドーピング)上にグラフェン薄膜を積層し、発生したテラヘルツ波の分光およびイメージングを行う。2)ガス吸着・反応による放射テラヘルツ波の変化を観測し、ガスセンサー応用の可能性を探究する。3)表面グラフェンに電界を印加することで、フェルミ準位などポテンシャル制御によるテラヘルツ放射特性の観測により、原子層薄膜と半導体接合界面の電荷ダイナミクスを調べる。4)グラフェン以外の2次元原子層とのヘテロ界面の光キャリアダイナミクスについても同様の手法で計測を行う。

項目1)に関しては、26年度においてほぼ完了し、InPで我々が提案したモデルですべての現象が説明可能であることが明らかとなった。項目2)に関しては、同じグラフェンでもCVD法で作成したものと、液層剥離法で作成したもので、特性が異なるという結果が得られた。これは、グラフェンの形状や欠陥密度によりガス分子の吸着エネルギーが異なるためと考えている。項目3)に関しては、26年度は項目1と2に集中したためあまり進んでいないが、新学術領域の他のメンバーとの交流や講習会で、電極作製法に関する知見を得ている。27年度は実際にデバイス構造を作製し、テラヘルツ放射特性の観測を試みる。項目4)は27年度から行う予定であったが、26年度に先行的な研究を開始している。27年度はWS2に関して本格的な研究を行い、グラフェンを用いた結果と比較することにより、2次元電子層特有の現象を抽出する。以上、項目3)以外は計画通りもしくは計画以上に進展しており、Scientific Reports誌に成果が掲載されるなど、おおむね順調に進展していると考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、項目1)4)のそれぞれの項目に関して以下の方針で研究を行う。項目1)については、n型およびp型InP、GaAs、InAsなどからのテラヘルツ波放射について検証するなど、基礎的なデータの取得はほぼ終了した。今年度は項目2)4)に注力する。項目2)前年度に、グラフェンの作成法により、吸着・離脱ダイナミクスが変化することが分かった。グラフェンなど2次元材料とガス分子の吸着エネルギーを詳細に検証するために、ガス圧や温度を変化させてより定量的なデータを取得する。これにより、ガスセンサーとしてのスペックを検証できると考えている。項目3)では、グラフェン表面に電界を印加し、フェムト秒レーザー照射により発生するテラヘルツ波の変化を観測する。この際、グラフェンのフェルミ準位シフトにバンド内遷移確率の変化および半導体基板表面のポテンシャル変化に起因するバンド構造の変化という両面から放射特性の変化を検証し、テラヘルツ波変調素子としての機能開拓を行う。項目4)MoS2やMoS2, h-BNなどをグラフェンと同様に半導体基板上に積層し、テラヘルツ波の放射特性から界面における光励起キャリアのダイナミクスおよびテラヘルツ波変調のメカニズムを探求する。
イネ発芽種子のエンドペプチダーゼ:発現制御及び翻訳後プロセシング

イネ発芽種子中のエンドペプチダーゼ活性は疎水性クロマトグラフィにより主要な2画分に分離でき、これらはREP-1及びREP-2と名付けられた。REP-1については、さらに精製を進め、単一の酵素タンパク質として単離した。REP-1の部分精製標品を用いて、イネ種子中の貯蔵タンパク質の約80%を占めるグルテリンの消化実験を行った。疎水性クロマトグラフィによって部分精製したREP-1標品を酵素として使用した場合、グルテリンの酸性及び塩基性両サブユニットは経時的に減少することが認められた。またREP-1のN末端アミノ酸20残基を決定し、そのcDNA(pRP60と命名)を単離して塩基配列を決定した。さらに、これと類似のcDNAを得てpRP-80と名づけ、全塩基配列を決定した。pRP60cDNAの塩基配列から導き出されるアミノ酸配列には、シグナル配列につづく推定プロ領域が存在し、オオムギ発芽種子の分泌性エンドペプチダーゼEP-Bと同様にREP-1も多段階の翻訳後プロセシングを受けることが推定された。次に、pRP60及びpRP80mRNAの植物ホルモンによる発現応答の解析を行った結果、ジベレリン及びアブシジン酸による両mRNAの発現制御が示された。また、ゲノムライブラリーからそれぞれの遺伝子を得てRep1及びRepAと名づけ、塩基配列を決定した。cDNAとの比較からRep1にはイントロンが存在せず、RepAは5つのエキソンから成ることが示された。また両遺伝子の上流域には、イネ科種子のα-アミラーゼ遺伝子などで報告されているジベレリン応答の保存配列は見いだされなかった。
遺伝子改変マウスを用いたLRRTM4の変異による優性黄斑変性の疾患機序解明

本研究は、優性遺伝性黄斑変性の日本人家系から同定した新規原因遺伝子LRRTM4の変異について、変異マウスの病態と変異タンパク質の機能的変化を検討するものである。LRRTM4は1回膜貫通型のシナプス分子として知られており、シナプス形成を促進する機能が知られている。他の網膜変性疾患及び機能不全の原因遺伝子として同定されているシナプス分子の欠損マウスでは視細胞と双極細胞の間のリボンシナプスの形態に異常が見られることが多いため、LRRTM4の変異も視細胞と双極細胞の間のシナプス形成に影響すると予想される。平成30年度は、Lrrtm4にヒトと同一のアミノ酸変異を持つマウスの網膜層構造を網膜断層像撮影によって経時的に観察し野生型マウスと比較した。また、LRRTM4タンパク質を発現するコンストラクトを作製し、細胞内局在と複合体形成について検討した。LRRTM4タンパク質にはC末端側の配列が異なるshort isoform(S型)とlong isoform(L型)があり、上記変異はL型のみに含まれる配列に位置する。しかし現在市販されている抗体ではS型とL型を区別できないため、L型特異的に認識する抗体を外部受託により作成した。変異モデルマウスを用いた実験では、通常飼育下では変異マウスと野生型マウスの間に顕著な差は見られなかったが、強い光を当てた条件下では変異マウスは野生型マウスに比べて視細胞層の減少が見られた。またLRRTM4の機能解析では、LRRTM4タンパク質がホモ複合体を形成することが示された。L型特異的抗体はin vitroにおいてLRRTM4のL型アイソフォームのみを認識することを確認した。Lrrtm4変異マウスはCRISPR/Cas9法を用いて患者と同じ1アミノ酸置換を持つマウスを作出した。本変異が黄斑変性の患者から同定されたことから、変異マウスでは視細胞変性が見られることが期待された。変異ヘテロマウス、変異ホモマウスは、通常飼育下で1年齢までの観察では野生型マウスと比較して視細胞層の顕著な減少は見られなかった。しかし、8週齢10週齢のマウスに対してLEDライトを用いて3000lxの白色光を1時間照射した条件では、光照射1週間後に野生型マウスに対して優位に視細胞層の厚さが減少する結果が得られた。免疫組織染色によりマウス網膜組織で視細胞の核の数が減少していること、桿体視細胞と錐体視細胞の外節が消失していることを確認した。また視細胞が変性した領域では双極細胞の末端の形に変化が見られた。上記結果は変異マウスでは視細胞が光に対して脆弱なことを示唆している。In vitroの検討では、免疫沈降実験によりLRRTM4タンパク質がホモ複合体を形成すること。L型とS型のアイソフォーム間でも複合体を形成することを確認した。野生型タンパク質と変異タンパク質の間で複合体形成効率に差がある傾向が見られた。LRRTM4の細胞内局在を調べるためにプラスミドベクターを用いてLRRTM4を過剰発現させたHEK293T細胞、COS7細胞に対して免疫細胞染色を行った結果、L型に対してS型のタンパク質の方が細胞膜に局在する傾向があった。L型タンパク質はゴルジ体に強く局在したが、野生型と変異型タンパク質の間に局在の顕著な差は見られなかった。L型タンパク質を特異的に認識する抗体を作製するため、L型特異的なペプチド配列を用いてウサギに対して免疫しポリクローナル抗体を得た。同抗体はin vitroで発現させたタンパク質についてはL型のみを認識した。変異マウスを用いたin vivo実験では、変異マウスは野生型に対して光刺激に対して脆弱なことが示唆された。通常飼育条件では変性は見られなかったが、遺伝子変異により視細胞と双極細胞の間のシナプス結合に何らかの影響があると予想されるため、双極細胞のマーカーとシナプス分子の局在を免疫組織染色により詳細に検討する。また、LRRTM4は1回膜貫通型シナプス分子であるため、細胞膜に局在して機能すると考えられる。免疫細胞染色に加えて細胞分画を用いて細胞膜への局在に関して野生型と変異体の間に差があるかどうかを検討する。また各ドメインの欠失コンストラクトを用いて複合体形成に必要な領域を調べる。Lrrtm4の網膜内での局在をmRNAレベルおよびタンパク質レベルで確認するために、L型とS型特異的なRNAプローブを用いたin situ hybridizationおよびL型特異的認識抗体を用いた免疫組織染色を行う。

しかし現在市販されている抗体ではS型とL型を区別できないため、L型特異的に認識する抗体を外部受託により作成した。変異モデルマウスを用いた実験では、通常飼育下では変異マウスと野生型マウスの間に顕著な差は見られなかったが、強い光を当てた条件下では変異マウスは野生型マウスに比べて視細胞層の減少が見られた。またLRRTM4の機能解析では、LRRTM4タンパク質がホモ複合体を形成することが示された。L型特異的抗体はin vitroにおいてLRRTM4のL型アイソフォームのみを認識することを確認した。Lrrtm4変異マウスはCRISPR/Cas9法を用いて患者と同じ1アミノ酸置換を持つマウスを作出した。本変異が黄斑変性の患者から同定されたことから、変異マウスでは視細胞変性が見られることが期待された。変異ヘテロマウス、変異ホモマウスは、通常飼育下で1年齢までの観察では野生型マウスと比較して視細胞層の顕著な減少は見られなかった。しかし、8週齢10週齢のマウスに対してLEDライトを用いて3000lxの白色光を1時間照射した条件では、光照射1週間後に野生型マウスに対して優位に視細胞層の厚さが減少する結果が得られた。免疫組織染色によりマウス網膜組織で視細胞の核の数が減少していること、桿体視細胞と錐体視細胞の外節が消失していることを確認した。また視細胞が変性した領域では双極細胞の末端の形に変化が見られた。上記結果は変異マウスでは視細胞が光に対して脆弱なことを示唆している。In vitroの検討では、免疫沈降実験によりLRRTM4タンパク質がホモ複合体を形成すること。L型とS型のアイソフォーム間でも複合体を形成することを確認した。野生型タンパク質と変異タンパク質の間で複合体形成効率に差がある傾向が見られた。LRRTM4の細胞内局在を調べるためにプラスミドベクターを用いてLRRTM4を過剰発現させたHEK293T細胞、COS7細胞に対して免疫細胞染色を行った結果、L型に対してS型のタンパク質の方が細胞膜に局在する傾向があった。L型タンパク質はゴルジ体に強く局在したが、野生型と変異型タンパク質の間に局在の顕著な差は見られなかった。L型タンパク質を特異的に認識する抗体を作製するため、L型特異的なペプチド配列を用いてウサギに対して免疫しポリクローナル抗体を得た。同抗体はin vitroで発現させたタンパク質についてはL型のみを認識した。変異マウスを用いたin vivo実験では、変異マウスは野生型に対して光刺激に対して脆弱なことが示唆された。通常飼育条件では変性は見られなかったが、遺伝子変異により視細胞と双極細胞の間のシナプス結合に何らかの影響があると予想されるため、双極細胞のマーカーとシナプス分子の局在を免疫組織染色により詳細に検討する。また、LRRTM4は1回膜貫通型シナプス分子であるため、細胞膜に局在して機能すると考えられる。免疫細胞染色に加えて細胞分画を用いて細胞膜への局在に関して野生型と変異体の間に差があるかどうかを検討する。また各ドメインの欠失コンストラクトを用いて複合体形成に必要な領域を調べる。
含水メタノールを用いた小形Zサイクル火花点火エンジンの圧縮比と最適点火時期の関係

メタノールは親水性、吸湿性が大きく、水とは任意の割合で混合する。そのためにメタノールを燃料として用いるときには、含水の影響をも考慮しなければならない。逆に適当に含水化することにより、水の蒸発による体積膨張などを積極的に利用して熱効率を上げることも可能と考えられる。また、メタノールはオクタン価が高いので耐ノック性が大きく、圧縮比を上げて熱効率の向上をねらえる。しかし、含水率を変化させると、全体としての燃料の発熱量や、蒸発潜熱が変わるために着火遅れや、燃焼速度に変化が生じ圧縮比を変化させると燃焼距離や圧縮圧力・温度も変化し安定燃焼範囲に影響を与える。そこで本研究では圧縮比が通常(7.1)のエンジン(ガソリン用)にメタノールを燃料として用い、含水率を変化させたときのエンジンの燃焼安定性に及ぼす影響を筒内圧力変化の測定により調べた。本研究の供試機関は、空冷単気筒2サイクル火花点火機関で排気量175×10^<-6>m^3、圧縮比7.1である。動力吸収および回転数の制御には交流式電気動力計を用いた。供給燃料としてニートメタノールの他に含水率を5,10,20%に変化させた含水メタノールを用いた。燃焼安定性の評価は、主として図示平均有効圧力(IMEP)と最高圧力(Pmax)の変動率について検討して行った。圧力変動は空燃比が希薄側になるほど増加し、また含水率が増えることによっても増加する。しかし、理論空燃比付近では含水率のIMPEとPmaxの変動率に与える影響は一定ではない。従って、含水メタノール燃料を用いたときの燃焼安定性を検討する場合、IMEPの変動率だけではなくPmaxの変動率をも検討する必要がある。