hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞内カルシウムイオンの制御の分子機構の解析

さらに、この領域内に部位特異的変異を導入し、リガンド結合活性とイノシトールポリリン酸の結合選択性を解析した。その結果、1アミノ酸の置換により1,4,5-IP_3に対する親和性は低下するが、2,4,5-IP_3に対する親和性は変化せず、結果として1,4,5-IP_3と2,4,5-IP_3を同等の親和性で認識する変異体が得られた。また、1,4,5-IP_3に対してより高い親和性を示す変異体も得られたイノシトール三リン酸(IP_3)は、セカンドメッセンジャーとして細胞内Ca^<2+>貯蔵部位からCa^<2+>放出を誘導する。このIP_3誘発Ca^<2+>放出において中心線役割を果たすIP_3受容体(IP_3をリガンドしたCa^<2+>放出チャネルである。IP_3/Ca^<2+>情報伝達系の解析には、IP_3Rに特異的な作用薬、拮抗薬などの開発が期待される。昨年、IP_3Rの新規作用薬として、Penicillium brevicompactumの培養培地中より、アデノフォスチンが単離された。本研究では、アデノフォスチンを用いて、リポソーム上に再構成した精製IP_3RからのCa^<2+>放出活性を測定し、IP_3とのリガンド活性の差異を検討した。IP_3Rの精製およびCa^<2+>放出活性の測定は、昨年度本大会で報告した方法に従った。アデノフォスチン誘発Ca^<2+>放出は、IP_3誘発Ca^<2+>放出に特徴的なquantal Ca^<2+> release (低濃度刺激による部分的Ca^<2+>放出)を示した。アデノフォスチン誘発Ca^<2+>放出のEC50は11nMと求まり、IP_3の場合(EC50=100nM)よりも低く、本来のリガンドであるIP_3よりも強力な作用薬であることがわかった。またアデノフォスチンは、精製IP_3Rへの結合およびCa^<2+>放出において、正の協同性(結合: nH=1.8、Ca^<2+>放出: nH=3.9)を示し、IP_3の場合(結合: nH=1.1、Ca^<2+>放出: nH=1.8)よりもそれぞれ強い正の協同性を示した。イノシトール三リン酸受容体(IP_3R)は四量体として存在し、イノシトール三リン酸が結合することにより細胞内Ca^<2+>貯蔵部位からCa^<2+>を放出する細胞内レセプターチャンネルである。IP_3Rには少なくとも3つのタイプ(タイプ1、タイプ2、タイプ3)が存在することが示されており、タイプ間にチャネル機能の差異があることを示唆されている。この3つのタイプのC末端部位を特異的に認識するモノクローナル抗体を作成した。これらの抗体でimmunoblottingを行うと、CHO-K1細胞には3つのIP_3Rが発現していることがわかった。CHO-K1細胞に存在するIP_3Rが各々のタイプからなるホモ四量体のみなのか、異なるタイプで形成されるヘテロ四量体なのかを知るために、各々の抗体で免疫沈降を行った。その結果、各IP_3Rタイプが会合していることが示され、IP_3RはCHO-K1細胞内でヘテロ四量体を形成していることが証明された。また、cDNAから同時に発現させたタイプ1とタイプ3もヘテロ四量体をつくることが確認された。ヘテロ四量体は肝臓においても検出された。当研究により、IP_3Rはホモおよびヘテロ四量体をつくることにより、チャンネル活性の多様性を増大していると考えられる。イノシトール三リン酸(IP_3)受容体(IP_3R)には、3つの異なる遺伝子にコードされたタイプ(タイプ1 : IP_3R1、タイプ2 : IP_3R2、タイプ3 : IP_3R3)が報告されている。
ヒト小型肝細胞と内皮細胞の重層化共培養による薬物代謝評価系の構築

ヒトにおける薬物の代謝予測にはヒト肝組織を用いる必要があるが、生体外から分離された肝細胞の薬物代謝酵素活性は分離数日後にほぼ消失する。このため、肝細胞機能をより長期間保持し、薬物代謝の評価が可能なヒト肝細胞培養系の構築が求められている。本研究では、肝細胞機能の高い培養系構築のために、温度応答性培養皿を用いて、ヒト小型肝細胞と血管内皮細胞を3次元的に重層し、肝小葉構造を模倣した培養系を作製した。その結果、肝細胞機能や薬物代謝酵素の発現活性が高まることがわかった。ヒトにおける薬物のin vivo代謝予測にはヒト肝組織を用いる必要があるが、生体外から分離された肝細胞の薬物代謝酵素活性は分離数日後にほぼ消失する。本研究では、培養した細胞をシートとして回収できる温度応答性培養皿を用いて、ヒト小型肝細胞と血管内皮細胞を3次元的に重層し、肝小葉構造を模倣した培養系を作製する。次いで、肝細胞機能や薬物代謝酵素の発現活性、薬物による酵素誘導や薬物代謝能について検討し、薬物代謝評価に有用な培養系となるか解析する。研究項目1)ヒト小型肝細胞と内皮細胞を用いた重層化共培養の構築凍結ヒト肝細胞を特殊条件下で培養し、増殖能をもつヒト小型肝細胞を分離培養した。小型肝細胞特異的マーカーと肝細胞特異的タンパク質の発現を免疫染色法とELISA法により調べ、小型肝細胞であることを確認した。次いで、温度応答性培養皿を用いて、ヒト血管内皮細胞をシート状に培養して回収し、この細胞を別途培養しておいたヒト小型肝細胞に重層し、重層化共培養系を構築した。研究項目2)ヒト小型肝細胞と内皮細胞の重層化共培養における、肝細胞機能解析研究項目1)で構築した、ヒト小型肝細胞と内皮細胞の重層化共培養において、肝細胞機能の指標であるアルブミンとα1-アンチトリプシンの分泌をELISA法により測定し、ヒト小型肝細胞単独培養と比較した。その結果、重層化共培養では、ヒト小型肝細胞単独培養に比べ、肝細胞機能が上昇している可能性が示唆された。現在は、重層化共培養における薬物代謝関連遺伝子の発現のPCRアレイを用いた網羅的解析や、薬物代謝において特に重要なシトクロムP450の活性測定の準備を行っており、薬物代謝評価に有用な培養系となるか検討を進めている。本研究では、肝細胞機能の高い培養系構築のために、培養した細胞をシートとして回収できる温度応答性培養皿を用いて、ヒト肝細胞と血管内皮細胞を3次元的に重層し、肝小葉構造を模倣した培養系を作製し,薬物代謝評価に有用な培養系となるか解析する。研究項目1)ヒト小型肝細胞と内皮細胞の重層化共培養における、薬物代謝遺伝子の網羅的発現解析前年度に、成熟肝細胞より未分化で増殖能をもつヒト小型肝細胞を分離培養した。温度応答性培養皿を用いて、血管内皮細胞をシート状に培養して回収し、この細胞を、別途培養しておいたヒト小型肝細胞に重層し、共培養系を構築した。この重層化共培養と小型肝細胞単独培養について、薬物代謝関連遺伝子の発現を、網羅的かつ定量的に解析できるPCRアレイを用いて解析した。測定した84遺伝子のうち14遺伝子について、積層化共培養で3倍以上の発現上昇がみられた。研究項目2)ヒト小型肝細胞と内皮細胞の重層化共培養における、薬物代謝遺伝子の発現解析と活性測定構築した重層化共培養において、薬物代謝遺伝子の発現変化をリアルタイムPCRを用いて解析した。小型肝細胞単独培養に比べて、CYP3A5は約5倍の発現上昇がみられた。また、CYP3A4の酵素活性は、小型肝細胞単独培養に比べて重層6日目に1.7倍、8日目に3倍の活性上昇がみられた。研究項目1),2)の結果より、本研究において作製したヒト小型肝細胞と内皮細胞の重層化共培養系は、薬物代謝関連遺伝子の発現や活性が小型肝細胞単独培養よりも高く保持されており、薬物代謝評価系になる可能性が示唆された。24年度が最終年度であるため、記入しない。
飼育実験手法を応用したG. ruberの2形態種の精密古環境指標の確立

堆積物を用いて低緯度の過去の水温や環境を推定する際に最もよく使われる浮遊性有孔虫種のG.ruberの中に種として別に取り扱った方がよいと考えられる2つの形態種が存在することが最近の研究より明らかになった.これまでは2形態種を区別せずに測定しているため,2種の生息深度の違いから酸素同位体比から復元される水温情報には最大約2°Cの誤差が生じていた可能性がある.より正確な古水温復元のために,この2形態種の遺伝子レベルでの違いを明らかにし,水温と殻記録とのキャリブレーションを行うことが本研究の目的である.本年度は,このG.ruberの2形態種について分子系統解析を行い,2形態種間の遺伝距離を明らかにした結果をまとめ,国際学術論文誌に投稿した.また,7・8月には南カリフォルニア大学Wrigley Marine Science Centerにて行われた長期野外実験調査国際プロジェクト(Paleo-Salt)に参加し,California大学Davis校のSpero教授やドイツAlfred Wegener研究所のBijma教授の指導のもと,有孔虫の生育環境をコントロールした飼育実験を行い,有孔虫の殻の酸素同位体比やMg/Ca比の分析から,より詳細な環境との関連について研究を行った.また,これまで報告のない,溶存酸素を減少させた環境での飼育実験にも取り組んだ.これらの昨年度および今年度の有孔虫飼育実験プロジェクトで行われた飼育実験の中のいくつかの結果は国際学会で発表された.堆積物を用いて低緯度の過去の水温や環境を推定する際に最もよく使われる浮遊性有孔虫種のG.ruberの中に種として別に取り扱った方がよいと考えられる2つの形態種が存在することが最近の研究より明らかになった.これまでは2形態種を区別せずに測定しているため,2種の生息深度の違いから酸素同位体比から復元される水温情報には最大約2°Cの誤差が生じていた可能性がある.より正確な古水温復元のために,この2形態種の遺伝子レベルでの違いを明らかにし,水温と殻記録とのキャリブレーションを行うことが本研究の目的である.本年度はこの種の分子系統解析と飼育実験手法の確立を行なった.最初にG.ruberの2形態種について分子系統解析を行い,本種についての分析方法を確立し,2形態種間の遺伝距離を明らかにした.この遺伝子解析結果から,G.ruberが2つの遺伝的別種を持つことが初めて明らかとなり、これまで他の研究から報告されていた同種間での系統樹の混乱が,本結果から説明可能となった.また,この遺伝的に異なる2形態種の中央太平洋における地理的分布と,その分布を規制する因子として水柱の成層化構造が挙げられることを提案した.3月からはプエルトリコでの長期野外実験調査プロジェクトに参加し,California大学Davis校のSpero教授やドイツAlfred Wegener研究所のBijma教授の指導のもと,浮遊性有孔虫の飼育実験の装置や手法を学んだ.低緯度の過去の水温や環境を推定する際に最もよく使われる浮遊性有孔虫種のG.ruberの中に種として別に取り扱った方がよいと考えられる2つの形態種が存在することが最近の研究より明らかになった.これまでは2形態種を区別せずに測定しているため,2種の生息深度の違いから酸素同位体比から復元される水温情報には最大約2°Cの誤差が生じていた可能性がある.より正確な古水温復元のために,この2形態種の遺伝子レベルでの違いを明らかにし,水温と殻記録とのキャリブレーションを行うことが本研究の目的である.本年度はこの種の飼育実験手法の確立と分子系統解析結果のまとめを行なった.まず,昨年度の3月から今年度の7月までの4ヶ月間,プエルトリコでの長期野外実験調査プロジェクト(PaleoSalt Project)に参加し,California大学Davis校のH.Spero教授及びドイツAlfred Wegener研究所のJ.Bijma教授の指導のもと,浮遊性有孔虫の飼育実験の基本装置や手法について学んだ.現地ではプランクトンネット採取に併せて,2日に1度,岸から7マイル沖の水深2000feetの外洋で,飼育実験用個体のマニュアル採取を行い,3-4月は水温光量等を規制した基礎実験,5-7月はアルカリ度についての応用実験を行った.また,帰国後は昨年度行った分子系統解析の結果をまとめ,学会等で発表を行った.これらのまとめられた結果は19年4月中に海外学術雑誌に投稿予定である.堆積物を用いて低緯度の過去の水温や環境を推定する際に最もよく使われる浮遊性有孔虫種のG.ruberの中に種として別に取り扱った方がよいと考えられる2つの形態種が存在することが最近の研究より明らかになった.これまでは2形態種を区別せずに測定しているため,2種の生息深度の違いから酸素同位体比から復元される水温情報には最大約2°Cの誤差が生じていた可能性がある.より正確な古水温復元のために,この2形態種の遺伝子レベルでの違いを明らかにし,水温と殻記録とのキャリブレーションを行うことが本研究の目的である.

本年度は,このG.ruberの2形態種について分子系統解析を行い,2形態種間の遺伝距離を明らかにした結果をまとめ,国際学術論文誌に投稿した.また,7・8月には南カリフォルニア大学Wrigley Marine Science Centerにて行われた長期野外実験調査国際プロジェクト(Paleo-Salt)に参加し,California大学Davis校のSpero教授やドイツAlfred Wegener研究所のBijma教授の指導のもと,有孔虫の生育環境をコントロールした飼育実験を行い,有孔虫の殻の酸素同位体比やMg/Ca比の分析から,より詳細な環境との関連について研究を行った.また,これまで報告のない,溶存酸素を減少させた環境での飼育実験にも取り組んだ.これらの昨年度および今年度の有孔虫飼育実験プロジェクトで行われた飼育実験の中のいくつかの結果は国際学会で発表された.
低温基板に真空蒸着した金属薄膜の超伝導と電子局在

昨年度に、液体ヘリウム温度に保った基板に超高真空中で蒸着した非常に均一と思われる非晶質Biやpbの超薄膜の超伝導転移を測定し、次のような結果を得た。面抵抗R_□が約6KΩより大きい膜では超伝導転移の兆候が見られず、6KΩよりそれほど大きくないR_□の膜では常伝導金属薄膜の弱局在特有のlogT温度依存性を示す。約6KΩ以下になると超伝導ゆらぎ効果による電気抵抗の減少を示しはじめ、さらにR_□を小さくするとこれまでに報告されている非晶質超伝薄膜の転移特性が得られる。今年度は、これらの結果が均一な2次元超薄膜に共通した振舞いで他の金属薄膜でも類似の結果が得られるかどうかを調べた。SnについてはSioをアンダーコーティングした上に低温蒸着すると、これまでの報告と異なり、pure Snの場合でも非晶質膜(Sn-Cu合金)のTcに近い値を示すことからかなり均一な膜になっているはずである。しかしR_□が12KΩの膜ですでに超伝導転移の兆候があらわれた。その結果はミネソタ大学や東大理学部のSn微粒子系のそれとは異なっておりTcのR_□依存性は非晶質Biほど強くなく微粒子系との中間の傾向を示す。これはSn超薄膜が十分均一になっていなかったためだと考え、Sn-Cu合金薄膜を作り測定したが著しい違いはみられなかった。Ga薄膜についてもSnと類似した結果になったがいずれも非晶質Biやpb薄膜と比べて電気導通がではじめる平均膜厚が厚くなっていることから、均一性に問題があると考えている。したがって、これからはアンダーコーティングの方法を改善したり、これまでの実験結果をもとにしてできるだけ均一な超薄膜ができそうな物質を選ぶなどの工夫をして研究をおこなうことにしている。disorderであるが均質な金属超薄膜の超伝導や電子局在を調べるため,液体ヘリウム温度に保った基板上に,高真空中で鉛やビスマスやガリウムを蒸着し, 10〓程度の薄膜試料を作成した. .そして,その電気抵抗の温度依存性を,真空を破ることなく低温に保ったまま,そのまますぐに2.6K以上で測定した.膜厚依存性(面抵抗依存性)は,追加蒸着と測定を交互に繰り返すことによって求めた.得られた主な結果は次のようなことである.1.超伝導転移温度(Tc)は,すでにこれまでにも報告があるように,常伝導状態での面抵抗(R^N_□)が大きくなるにつれて減少するが, R^N_□が大きい領域では,これまでの報告より減少の程度が小さい.また, Tc/Tco(Tcoはbulkの場合のTcの値)のR^N_□依存性は鉛,ビスマス,ガリウムともにほとんど同じになった.2.面抵抗が約6KΩ以上の超薄膜では,超伝導の兆候さえ示さず,面抵抗の温度係数は負であるが, 56KΩ以下になると温度係数は正になる.これは,超伝導ゆらぎ効果によると思われる.さらに少し面抵抗を小さくすると抵抗が零の超伝導状態を示すようになった.この特性は鉛とビスマス薄膜で類似しており,均一な超薄膜に共通した一般的な現象である可能性があるので,他の金属薄膜でも実験を試みたい.昨年度に、液体ヘリウム温度に保った基板に超高真空中で蒸着した非常に均一と思われる非晶質Biやpbの超薄膜の超伝導転移を測定し、次のような結果を得た。
空調用ヒートポンプ熱源としての地盤の有効利用法に関する研究

自然エネルギー利用の1つとして、地盤を年周期の長期蓄熱媒体として利用する方法、その特性予測法について研究を行った。研究により得られた結果は、以下の通りである。地盤蓄熱の形態は、住宅等での利用を考え、密閉型、垂直井戸形式のいわゆる熱井戸形式のものであり、地盤熱は、ヒートポンプの熱源として利用することを前提として行なった。(1)蓄熱井戸への負荷パターン(ただし年平均熱流0)と、蓄熱井戸水温の年変動を算定する方法、蓄熱井戸の熱効率、許容最大熱流振幅を定める方法を示した。(2)実物大の密閉型蓄熱井戸(直径20cm、長さ10cm)を作成し、2年間連続運転、測定を行った。熱負荷は、許容最大振幅として実験した。その間、蓄熱井戸水温、地盤内の温度、水分ポテンシャルの分布を測定した。最大負荷時の熱量振幅は大略0.5kw、井戸内水温の振幅は、予測通り外気温振幅とほぼ一致している。年周利用の蓄熱井戸の有用性を示した。又、最大負荷以下では、井戸周辺でのdryoutの危険性は全くない。(3)提案した熱水分同時移動方程式を用いて、実験時の井戸水温、地盤内温度、水分ポテンシャル分布の計算を行い、実験値と比較した。両者は極めて良い一致を示し、この解析による予測の妥当性を示した。また、降雨、常水面の位置、等について感度解析を行った。(4)関連研究として、地盤の凍結時の挙動解析法の提案を行い、数値計算を行い、さらに0°C以下での水分の平衡関係を測定し、それは0°C以上のものと一致することを明らかにした。また積雪層の熱挙動解析法を示した。(5)蓄熱槽の確率的最適制御法について検討し、熱源容量有限時の解析法の定式化と近似解析法(有限容量の確率変数化)を示した。年周蓄熱型・地盤蓄熱井戸の蓄熱特性の定量的把握、予測法の確立を本研究の主目的として、実物スケールの実験とその解析を行いこれまでに以下の成果を得た。1)単純なモデル住宅を設定し、単純、理想化した外界気象条件下での熱負荷の年周パターンを算定し、地盤蓄熱で供給すべき熱量パターンを求めた。2)径20cm、長さ10mの閉鎖型蓄熱井戸を検証実験用の蓄熱井戸と設定し、上記で求めた負荷パターンを蓄熱井戸に負荷したときの蓄熱水温、地盤温分布、地盤含水率分布等を、既に提案した熱水分移動方程式を用いて計算し、この場合のヒートポンプ成績係数を負荷パターンの振幅をパラメータとして算定し、空気熱源の場合の成績係数と比較して、蓄熱井戸に供給すべき負荷熱量の決定法を示し、実験に用いる負荷を決定した。同時に計算上の条件、重力項、移流項の影響について、検討を行った。3)上記の結果に基つき、実験用蓄熱井戸、熱供給装置、温度、含水率分布測定装置を完成し、上記計算結果に基つく熱負荷を地盤に与えた場合の熱挙動の測定を開始した。4)実験開始と共に、計算による解析を行い、これまでのところ、計算値は、実験値と良い一致を示す事、解析解の妥当性が示された。また、地盤内水分ポテンシャルの時間経過を連続的に測定した。また測定値は、計算値とほぼ一致する事を確認した。5)設計用の擬線形化方程式、Fokker-Planck型の確率微分方程式の導出と数値計算法の解討を行った。以上、研究計画通りの研究を行う事が出来た。

自然エネルギー利用の1つとして、地盤を年周期の長期蓄熱媒体として利用する方法、その特性予測法について研究を行った。本年度の研究により得られた結果は、以下の通りである。(1)蓄熱井戸への負荷パターン(ただし年平均熱流0)と、蓄熱井戸水温の年変動を算定する方法、蓄熱井戸の熱効率、許容最大熱流振幅を定める方法を示した。(2)既に前年度に作成した実物大の密閉型蓄熱井戸(直径20cm、長さ10m)を用いて前年に引き続き、さらに1年間連続運転、測定を行った。熱負荷は、許容最大振幅として実験した。その間、蓄熱井戸水温、地盤内の温度、水分ポテンシャルの分布を測定した。最大負荷時の熱量振幅は前年同様0.5kwとして測定した。井戸内水温の振幅は、前年と同様、外気温振幅とほぼ一致している。井戸周辺でのdryoutの危険性は全くない。(3)提案した熱水分同時移動方程式を用いて、実験時の井戸水温、地盤内温度、水分ポテンシャル分布の計算を前年と同様にして行い、実験値と比較した。両者は極めて良い一致を示した。2年間の実験を通じて解析値は実験測定値と良い一致を示しており、このモデルによる解析の妥当性を明確に示すと共に、十分な精度での予測が可能な事が明らかとなった。(4)関連研究として、地盤の凍結時の挙動解析法の提案を行い、数値計算を行い、さらに0°C以下での水分の平衡関係を測定し、それは0°C以上のものと一致することを明かにした。また積雪層の熱挙動解析法を示した。(5)蓄熱槽の確率的最適制御法について検討し、熱源容量有限時の解析法の定式化と近似解析法(有限容量の確率変数化)を示した。
準静的破壊における破壊発光の研究

破壊の動力学と統計法則の理解・解明は、今や多くの分野において急務の課題となっており、数多くの研究がなされている。しかしながら、破壊に関係する諸現象は身近な現象であるにもかかわらず、「なぜ破壊が進むのか?」という極めてシンプルな疑問にさえ正確に答えることはできないのが現状である。この問題に対して、破壊現象の理解・解明を困難にしていると考えられる原因のひとつに注目した。破壊現象は極めて強い非線形かつ非平衡な不可逆過程であるため、この現象によって物質が発光する可能性が考えられる。これに準静的な破壊を利用することによって破壊に伴う発光(破壊発光)の測定を可能にすることを試みた。破壊発光を前提とした準静的破壊のための実験系を作成し、発光を観測しやすい透明材料であり弾性的材料でもある板状ガラスを破壊試料として実験を行ったが発光は確認できなかった。撮像素子としてCCD、冷却CCD、光電子増倍管を用いて測定しており、感度的に十分な領域を測定していると考えられる。このため、標準的なガラスでは発光しても可視光領域ではない可能性が示唆される。バンドギャップなどを考慮すると可視光による発光を示す可能性が高いと考えられる単結晶シリコン(LSI用単結晶シリコンウェハー)を破壊試料にした実験を行ったが発光は確認できなかった。シリコンではその価格と加工の困難さからくる要因によりガラスほど十分な実験を行えなかったため、補助事業の実施期間終了後も新規に材料を入手し、開口をより大きくとれるよう実験系に改良を加えて本研究を継続する計画である。破壊発光の研究に伴う亀裂先端の測定により、準静的破壊においては破壊条件に応じて亀裂先端がその位置を変化させることが明らかになった。このことは準静的破壊に予測可能性があることを示唆している。破壊の動力学と統計法則の理解・解明は、今や多くの分野において急務の課題となっている。このため、工学分野を中心として現象論的な理解が進みつつあるが、理学的にはやはりミクロな面、原理的な面まで理解されることが必要不可欠であると考えられる。この問題に対するアプローチとして、破壊という急激な変化によって物質が発光する可能性を考え、これに一定の条件下で破壊の進展速度を制御可能である準静的な破壊を利用することによってレイリー波の速度程度で破壊が進行する高速破壊に比して長時間にわたる測定を可能にすることを試みた。まず、平成10年度は第1年目として破壊発光を前提とした準静的破壊のための実験系の作成に重点を置いた。破壊のための中心部を破壊発光に対応するように改良し、撮像素子としてCCDを用いることとした。最初にこのCCD撮像素子を用いて高速破壊によって発光すると考えられる物質(一例として氷砂糖)の破壊を観測することによって、この実験系で破壊に起因する発光をとらえることが可能であることを確認した。次に破壊試料として薄く細長いガラス板を用いてこの系によって発光の測定を試みた。しかしながら、ガラスにおいては未だ発光が観測にかかっていない。準静的破壊では破壊の進展速度が遅く単位時間あたりに破壊によって生成される新たな面が小さいため、単位面積あたりでは観測可能な発光強度であっても観測にかかりにくくなっていることも考えられる。このため、より高感度あるいは長時間露光に耐える撮像素子を用いた観測への変更を行うこと、並びに不透明ではあるが発光波長の見積もりを行いやすい単結晶シリコンを破壊試料に併用することを計画している。
軸索切断後の網膜神経節細胞が変性に至るメカニズムの解明

Wistar ratの視神経を切断し、3日後に網膜を取り出しmRNAを抽出した。視神経切断を行わなかった眼球からの網膜をコントロールとしたsubtraction libraryを作成し、視神経切断後に発現が上昇する分子を単離した。その中の一つAIG5はBH3 domain onlyproteinの一種で神経栄養因子除去後の神経細胞死に関与していることが示唆されている分子に相同性がある。ラット網膜上でAIG5は視神経切断後12時間後から7日後まで発現が認められた。AIG5のmRNAに対してラット網膜切片上でIn situ hybridization histochemistryを行ったところ、視神経切断後の網膜神経節細胞にシグナルが認められた。このことは、AIG5が軸索切断後の網膜神経節細胞のアポトーシスの決定において重要な機能を有することを示唆する。また、視神経切断ラットに種々の薬物を投与し、AIG5の発現レベルの変化をcompetitive RT-PCRにより検討したところ、FK506がその発現を抑制することが明らかになった。現在この薬物が網膜神経節細胞のアポトーシスを阻止する働きがあるかについて検討中である。同様に単離されたAIG357はopen reading frame 2694bpを含む全長約2800bpからなる遺伝子である。アミノ酸配列からはキナーゼドメインをもち、ヒトJIK(JNK inhibitory kinase)に相同性が認められる。JIKがEGF除去によるアポトーシスの誘導に関わっていることからもAIG357のアポトーシスへの関与が推定されており、実際どのような機能を持つのかについて解析をすすめている。mock operationを行った眼球からの網膜をコントロールとした。subtraction libraryを作成し、視神経切断後に発現が上昇する分子の単離した。現在、視神経切断後に発現が上昇する遺伝子の単離は進行中であるが、すでにいくつかの興味深い遺伝子が単離されている。既知の遺伝子ではHrkが視神経切断後12時間後から7日後まで発現が認められることがわかった(学会報告済み)。この分子はBH3 domain only proteinの一種でnervegrowth factor除去後の神経細胞死に関与していることが示唆されている分子である。網膜においても視神経切断後に発現が上昇することは本実験で初めて明らかになった知見であり、軸索切断後の網膜神経節細胞のアポトーシスの決定において重要な機能を有すると考えられる。また、視神経切断ラットに種々の薬物を投与し、Hrkの発現を検討したところ、その発現を抑制できる薬物が発見された。未知の分子では、ヒトJIKにホモロジーのある分子が単離された。JIKはSTE20 kinasefamilyの一種で、JNKの活性を阻害する。JIKはEGFによりnegativeなregulationを受けていると報告されており、EGF除去によるアポトーシスの誘導に関わっていることが推測されている。今回私がcloningした分子についても実際どのような機能を持ち、いかなるメカニズムでその発現がコントロールされるのかについて解析を進めている。そのほかの分子についても同様に解析中である。
近代文語文を対象とした形態素解析のための電子化辞書の作成とその活用

本研究では近代文語文の形態素解析を行うための電子化辞書「近代文語UniDic」を作成し、日本語研究者に利用しやすい形にまとめ上げてインターネット上で一般公開を行った。この辞書は「現代日本語書き言葉均衡コーパス」の開発に用いられているUniDicをベースにしており、斉一な単位・階層化された見出し語などの設計を受け継いだ、言語研究に適した辞書となっている。また、近代文語UniDicは現代語用のUniDicと見出し語の互換性があるため、近代語と現代語の比較研究に利用することが可能となった。この形態素解析辞書の応用として、この辞書で『太陽コーパス』を解析した結果を用いて語彙頻度表を作成し、コーパス言語学的手法による近代語語彙の記述的研究を行った。また、これを『現代日本語書き言葉均衡コーパス』(モニター版)を現代語版のUniDicで解析した結果と比較することにより、近代語と現代語の語彙の比較研究を行った。これらの研究成果については研究成果報告書『近代文語文を対象とした形態素解析のための電子化辞書の作成とその活用』(全233ページ)にまとめ、公開した。本研究の目的は近代語文語文の形態素解析を行うための電子化辞書を作成することである。形態素解析とは、コンピュータを使って、文章を自動で単語に区切り、品詞や読みなどの情報を付与する(コンピュータに品詞分解をさせる)技術である。現代語を対象とした形態素解析は既に実用化されているが、これまでは文語文を解析することができなかった。研究活動は、これを実現するためのデータ作成が中心になる。この解析用辞書は、解析辞書UniDicをべースとすることで、見出し・語形・書字形に階層化し、斉一な解析単位による言語研究に適したものとする。また、明治期に発行された辞書の見出し語情報などの近代語研究に役立つ情報を付与することで、幅広い研究に応用可能なものとすることを目指している。本年度は、この解析辞書を完成させるために次の活動を行った。1近代文語の語彙を、階層化されたUniDicの形式で登録するためのデータベース・システムを整備し、文語形・旧字形を中心に約3.7万語の見出し語を追加した。2辞書データベースと、別途用意した学習用のコーパスをもとにして解析システムを構築し、実際に形態素解析を行うことのできる電子化辞書を作成した。3解析用辞書の精度評価等を行い、学会で報告するとともに、解析用インターフェイスプログラムなどとあわせてパッケージにまとめ、「近代文語UniDic ver.0.7」として、Web上で一般公開を開始した。4このシステムによる解析結果を用いてコーパス言語学の手法による近代語の記述的研究を行うための予備調査を行った。本年度において,実用可能な近代文語用解析辞書を完成させるという当面の目的を達成したため,今後は,解析辞書の精度向上と,辞書の応用面での研究に注力する。本研究課題の目的は、近代語文語文の形態素解析を行うための電子化辞書を作成し、この辞書を活用した研究を行うことにより、通時的な日本語研究に形態素解析を利用した手法を導入し、その普及をはかることである。今年度は、形態素解析辞書「近代文語UniDic」の精度向上のための取り組みとして次の研究を行った。1学習用の近代語コーパスを増補し、全体で約43万語とした。また、辞書データベースの近代文語用の見出し語を増補し、現代語用の見出し語と合わせて約25.4万語まで拡充した。2近代語の形態素解析の精度向上に現代語コーパスを利用する方法を提案し(言語処理学会第15回年次大会「現代語コーパスの利用による近代語形態素解析の精度向上」)、辞書開発に利用した。また「近代文語UniDic」を利用した研究を行い、これを学会に広く紹介するために次の活動を行った。3解析用インターフェイスプログラム「茶まめ」とあわせてパッケージ化し「近代文語UniDic ver.1.0」としてWeb上で一般公開した。4日本語学会において形態素解析辞書のデモンストレーション発表を行った(2008年度春季大会「近代文語文を対象とした形態素解析辞書・近代文語UniDic」)。また、言語処理学会において研究発表を行った(第15回年次大会「語種を観点とした近代語と現代語の語彙の比較-形態素解析辞書「近代文語UniDic」
組込みマイコンとプログラマブルデバイスによるハイブリット制御学習システムの構築

研究目的:組込みマイコンやプログラマブルデバイスの一つであるFPGA(Field-Programmable Gate Array)は、近年汎用機器から教育・研究用として広く使われており、この分野での技術的な知識を獲得する機会を与えるために、それぞれの特長を活かしたハイブリッドシステムを構築できる環境を整備することを目的とした。研究実施計画:1)マイコンについては、LEDの点灯、超音波センサを用いた距離測定と液晶ディスプレイでの表示、DCモータの回転方向および回転数制御の設計を通じて、制御回路や周辺回路の設計方法、統合環境の使用方法やプログラミング手法を習得できる環境を整備する。2)プログラマブルデバイスについては、加算器を設計してLED表示、電子掲示板を作製し文字を表示、PCとFPGAボード間の有線および無線通信システムの構築を通して、論理回路の設計手法、制御方法、ハードウェア記述言語によるプログラミング、統合環境の使い方等を習得できる環境を提供する。3)マイコンやFPGAの特長を理解できるシステムを構築するため、例えば同じDCモータの制御を2, 3種類のマイコンおよびFPGAで制御することでプログラミングや周辺回路の違いなどを比較検討する。さらに、FPGAでは、演算アルゴリズムによる演算速度や使用面積の比較ために、2進数から10進数に変換する2種類のアルゴリズムを使って、その性能を比較できる実験を行う。研究結果:マイコンおよびFPGAを使って、LED制御、超音波センサによる距離測定、DCモータ制御、電子掲示板システムなどデモンストレーションのための試作品を作製、動作検証を行った。また、FPGAに関しては、並列計算が得意であることを実感するために、2進数から10進数に変換し7セグメントLEDで表示させるシステムを構築し、減算法とシフト演算法の2種類のアルゴリズムを用いた場合の演算速度の違いを比較し、その結果、入力ビット数n(今回はn=8)の場合は、それぞれ2^n回とn回の繰り返し演算で処理できることの違いを体感できるシステムを構築した。上記のシステムは、教育プログラムの一環で実習として適用している。さらに、ハイブリットシステム構築例として、人間の動きに応じて自動追尾する車を試作、動作の確認を行っており、現在赤外線センサのセンシングおよび駆動回路部分の安定化を検討している。
対流圏有機エアロゾルの起源推定のための分子炭素同位体組成リストの作成

本研究は有機エアロゾルの起源と輸送過程の解析の基本となるデータベースを作成することが目的である。具体的には陸上植物(C3植物(木本植物)とC4植物(主として草本植物))を採取し、10-100g規模の試料を調製し将来の研究に備えること、さらにn-アルカンの炭素同体比を測定することである。本研究では、同種の従来の試料調製に加えて、異なる地域の同種の植物葉試料の採取およびn-アルカンの炭素同位体比の測定を行った。シベリア域において採取したマツ試料を調製し、n-アルカンの炭素同位体比を測定した。また北海道域において試料の乾燥、粉砕、粉末化を行った。主な結果は以下の通りである。(1)長鎖n-アルカン(C29)の炭素同位体比:裸子植物は概ね-30--34‰の値を示す。これに対して、被子植物のd13C値はヤブツバキを除いて-33--37‰である。(2)このようにC3植物の中で裸子植物と被子植物との間で明瞭な同位体比に違いがあることが明かとなった。この結果は有機エアロゾルの起源推定において新しいn-アルカンの炭素同位体比が新しい指標になりうることを示唆したことになる。(3)シバやカヤ(C4植物)は同位体的に重い値を示す。これらの結果から、陸上植物葉の炭素同位体比は有機エアロゾルの輸送過程の解析に対して、重要な情報源となることは明らかである。
農業経営組織の法人化に関する問題の検討-一戸一法人の実態調査を踏まえて-

本研究は、農業経営組織、特に一戸一法人の実態調査を踏まえて、組織経営上の、またそれに伴う不動産(主に土地)管理上の問題を検討することを目的とするものであった。まず、実態調査については、大変充実した成果があがった。本研究前に蓄積された調査データに加え、島根県、新潟県の経営組織体(有限会社)、および埼玉県越谷市(組合)、草加市、千葉県市川市、松戸市の調査データを得ることができた。これらデータは、本研究で揃えられたパーソナルコンピュータおよびソフトにより、整理・分類ができ、1.法人化までの経緯、2.経営内容、3.法人化後の問題点を柱に様々な角度からの分析も行えた。特に埼玉県と千葉県に事例については日本土地法学会(関東支部)において、「水田の多面的機能とその活用のための組織」と題する報告をしている。本研究は、水田の作物生産機能以外の機能を維持するための組織(本事例では、民法上の組合)についての問題点を扱ったものである。今後は、これら分類・整理した資料を基に農業経営法人の具体的な問題点、たとえば、1.解散自由発生後の事業継続問題、2.税法上の問題、3.法人の持ち分の個人への譲渡、4.構成員の死亡による相続等について検討していくつもりである。
心筋肥大におけるN-WASP-Nebl複合体の活性化制御機構の解明

骨格筋や心筋の肥大は成長や運動,疾患により増大した機械的刺激に耐えるための重要な現象である。心筋肥大においては筋原線維形成が不可欠であるが,その分子機構は不明であった。筋原線維のアクチン線維形成を可視化したところ,心筋肥大においても筋原線維Z線からアクチン線維形成が起こった。また,N-WASP-Nebl複合体形成を抑制する分子についてAmph2を同定した。N-WASPの心筋特異的誘導性cKOにより拡張型心肥大が誘導された。したがって,心筋肥大においてN-WASP-Nebl複合体を介した筋原線維形成が心機能の維持あるいは心筋保護に関わる可能性が示唆された。当該年度ではアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)の構築と精製をおこなった。AAVベクターはEGFP-N-WASP野生型および各種変異体をコードするcDNA,心筋型alpha-actin (Actc1)-mCherryをコードするcDNA,およびN-WASP shRNAをコードするcDNAを挿入した。それぞれ十分なタイターのAAVを精製することができた。発現効率を確認したところ,注入部位に局所的に発現しており,心臓全体に発現することはなかった。このため,過剰発現系においては特にノックダウンを行うことにより心機能の影響を解析することは困難であると考えた。そこで,急遽予め得られていたN-WASP floxES細胞(129系統)を8細胞期胚とアグリゲーション法によりキメラ胚を作製し,N-WASP floxキメラマウスを作製した。このN-WASP floxキメラマウスは2系統のES細胞クローンより作製し,それぞれのキメラマウスについてCAG-Flpマウスと交配させることにより,Flp-FRT系の組換えを用いてネオマイシン耐性遺伝子を除いた。さらに,心筋特異的Myh6-CreERT2トランスジェニックマウスと交配させたN-WASPヘテロfloxマウス同士をさらに交配させることにより,N-WASP floxホモマウスを樹立した。このマウスにタモキシフェンを作用させるとCre-LoxP系の組換えにより,心室の心筋細胞において特異的にN-WASP遺伝子が欠損することを確認した。さらに,nebulette KOマウスを共同研究者から得ることができた。上記より,心筋特異的N-WASP cKOマウスとnebulette KOマウスの準備が整った。一方,N-WASP活性の測定のためのFRETバイオセンサーの構築を行い,FRET顕微鏡観察系を整えた。当該年度は心筋特異的誘導型N-WASPコンディショナルマウスのC57BL/6系統への戻し交配を行った。第5世代のC57BL/6系統における当該マウスにおいて,タモキシフェンの投与により心筋特異的にN-WASPを欠損させたところ,心肥大が認められた。したがって,N-WASPが心臓の機能維持に関わる可能性が考えられた。また,心筋におけるN-WASP結合蛋白質としてAmphiphysin 2/BIN-1 isoform-8 (Amph2-iso8)を同定した。Amph 2-iso8はBARドメインスーパーファミリーに属する蛋白質であり,筋収縮に必要な筋小胞体とT管の密着構造の形成や筋発生時における核動態を制御する膜変形蛋白質であることが知られている。そこで,N-WASPとAmph2-iso8の結合を調べたところ,Amph2-iso8のSH3ドメインを介してN-WASPのプロリンリッチ領域と結合することが明らかになった。しかし,nebuletteとN-WASPの結合とAmph2-iso8の結合は二者択一的であることから,Amph2-iso8はN-WASP-nebulette複合体形成を抑制的に制御しうると考えられる一方で,N-WASP-nebulette複合体を保持させたまま機能抑制に働く蛋白質ではないことが示唆された。心筋特異的誘導性N-WASPコンディショナルノックアウト(N-WASP cKO)マウスの作製が比較的スムーズに行うことに成功したため,当該年度以降にも本格的に使用することが出来るようになった。また,このN-WASP cKOマウスの心筋において心肥大が認められたこと,および,心筋におけるN-WASP結合タンパク質の同定においても計画に沿った実験が進んでいることから,概ね順調な進捗であると判断できる。心筋における新たなN-WASP結合タンパク質としてAmph2を得た。Amph2との結合様式を調べる目的でN-WASPのPro-rich領域を欠いた変異体を用いたところ,Amph2との結合が起こらなかった。したがって,Amph2-N-WASPの結合はN-WASPのPro-rich領域を介していることが明らかになった。N-WASP-Nebl複合体形成においてもN-WASPのPro-rich領域を介するため,N-WASPとNeblの結合とAmph2との結合は競合的であると考えられる。そこでさらにBARドメインにおいて骨格筋における中心核病に関わる変異をAmph2に導入したところ,N-WASPとの結合が減少した。また,培養細胞内ではN-WASPとAmph2は細胞膜において特に共存する様子がライブセルイメージングにより観察された。これらの結果からAmph2による膜変形と協調してN-WASPとの結合が増強する可能性が示唆された。CFPとYFPをN-WASPのN末端とC末端にそれぞれ繋いだFRETバイオセンサーは観察時に蛍光が減弱していくことが明らかになったため,現状で最高の蛍光を発するシアンおよび黄色蛍光タンパク質であるmoxCelurean

3およびmCitrineを用いて再構築している。一方,N-WASPの心筋特異的誘導性コンディショナルノックアウトマウスの作成を完了した。作成したマウス成体においてタモキシフェンを導入し,心臓発生に影響することなくN-WASPを心筋特異的にノックアウトしたところ,大動脈結紮術を行わずして3ヶ月ほどで心肥大が起こった。また,心室における心筋細胞径の短縮に対応して心筋壁も薄くなっており,さらに心筋壁には炎症や繊維化が起こっていた。したがって,N-WASPは心筋細胞の強度を維持するために働いており,筋原線維形成がそれを担う可能性が考えられた。骨格筋や心筋の肥大は成長や運動,疾患により増大した機械的刺激に耐えるための重要な現象である。心筋肥大においては筋原線維形成が不可欠であるが,その分子機構は不明であった。筋原線維のアクチン線維形成を可視化したところ,心筋肥大においても筋原線維Z線からアクチン線維形成が起こった。また,N-WASP-Nebl複合体形成を抑制する分子についてAmph2を同定した。N-WASPの心筋特異的誘導性cKOにより拡張型心肥大が誘導された。したがって,心筋肥大においてN-WASP-Nebl複合体を介した筋原線維形成が心機能の維持あるいは心筋保護に関わる可能性が示唆された。本研究計画段階では実験材料の準備が研究期間の大部分を占めると予想していたが,当該年度の実験により,すでに平成28年度までに必要な実験材料が整ったといえる。ただし,過剰発現系の実験では生理学実験を行うことが困難であるため,細胞機能実験を行うことにより代替を考えている。したがって,これを元に本年度以降は余裕をもって研究計画のとおりに実験を行い,場合によっては年度計画以上に解析を進めていくつもりである。分子細胞生物学当該年度においては本研究計画の核心となるN-WASP-Nebl複合体の活性の測定を行うため,マウス心臓より当該複合体の精製を行う。十分量の精製ができるように各種カラムワークを行う予定である。さらに,粗精製段階においても複合体に結合しているタンパク質の同定を行い,このタンパク質を発現するAAVベクターの作製とその発現系を確立する。このタンパク質とN-WASP-Nebl複合体の結合がマウス生体内における心肥大の過程でどのように変化するかを免疫沈降法により明らかにする。同様の目的で,精製したN-WASP-Nebl複合体にこのタンパク質を作用させた場合のアクチン重合活性をピレン-アクチンを用いたin vitroアクチン重合アッセイにより明らかにする。さらに,N-WASP FRETバイオセンサーおよびNeblをHeLa細胞に発現させ,N-WASPの活性に同定したタンパク質が抑制的に働くことを生体内においても明らかにする。また,AAV/Actc1-mCherryを発現させたマウスにおいて,心肥大を誘導することにより,Z線からの伸長が促進されることを示す。同様の実験を心筋特異的N-WASP cKOマウスやPI3KおよびAkt阻害剤を作用させたマウスにおいても行う。
硫化水素の生産・放出と神経細胞保護作用

ガス状生理活性物質のひとつ硫化水素(H2S)は神経細胞において3?メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素(3MST)とシステインアミノ基転移酵素(CAT)によって生産される。本研究では3MSTが内在性補因子としてチオレドキシンやジヒドロリポ酸を必要とすることを示した。また3MST-CAT経路はカルシウムにより制御され、H2Sが網膜光受容細胞のカルシウム濃度を低く保ち、光障害から保護することを明らかにした。H2Sの医療応用が期待できる。ガス性生理活性物質硫化水素(H2S)の生合成酵素の制御機構、および、生理機能解明を目的として研究を進めた。本年度は以下の成果を得た。(1)H2Sを産生するシスタチオニンγ脱離酵素(CSE)の活性がカルシウムと補酵素PLPによって制御されることを明らかにした。血管平滑筋に局在するCSEは血圧調節に重要とされ、H2S生合成系制御による心血管疾患治療に結びつく成果である。(2)脳内でH2Sが結合してポリサルファイドが生成され、アストロサイトTRPA1チャネルを活性化して細胞内へのカルシウム流入を誘導する過程を明らかにした。ポリサルファイドはアストロサイトのカルシウムシグナルを介して神経情報伝達を修飾する分子のひとつである。研究期間全体を通して、次の成果も得ている。(3)神経細胞や血管内皮細胞では、L-システインからシステインアミノ基転移酵素(CAT)と3ーメルカプトピルビン酸硫黄転移酵素(3MST)によってH2Sが生産される。この経路に必要な生体内還元性補因子としてジヒドロリポ酸とチオレドキシンを同定した。(4)3MST/CAT経路がカルシウムにより制御されることを明らかにした。さらに、網膜において、H2Sが水平細胞のプロトンポンプV-ATPaseを活性化して光受容細胞との間隙を酸性化し、光受容細胞膜上の電位依存性カルシウムチャネルを抑制することで、光受容細胞内のカルシウム濃度を低く抑えていることを示した。また、H2Sが網膜光障害を軽減することも報告した。H2Sは神経細胞保護因子として神経変性疾患の予防・治療に有効であると考えられる。これらの結果をもとに、H2Sの生合成系制御やH2S自身の薬理作用に着目した多様なアプローチから医療応用が進むことが期待できる。現在、ガス性生理活性物質と神経細胞死の関連、神経細胞死に至る分子メカニズムの解析など、さらなる研究を進めている。ガス状生理活性物質である硫化水素(H2S)は中枢神経系で神経伝達修飾物質として働くほか、細胞保護因子としても機能する。脳の神経細胞や血管内皮細胞ではL-システインからシステインアミノトランスフェラーゼ(CAT)と3-メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素(3MST)によって生合成される。しかし、その制御機構や生体内での機能については不明な点が多い。そこで、H2S生合成酵素の制御メカニズム、および、H2Sの生理機能の解明を目的として研究を進めた。実施計画に基づき研究が進展したが、以下に主要な点について述べる。1.3MSTによるH2S生産には還元性の補酵素が必要だが、対応する生体内分子はこれまで明らかになっていなかった。本研究では、これがチオレドキシン(Trx)およびジヒドロリポ酸(DHLA)であることを明らかにし、3MSTによるH2S生合成過程の分子機構を提唱した。また、3MSTがチオ硫酸も基質として取りうることを示し、H2S生合成に関連した代謝経路について知見を加えた。この成果について論文を発表した。2. 3MST/CAT経路からのH2S生産活性がカルシウムイオンによる制御を受けることを明らかにした。また、H2Sが網膜光受容細胞内のカルシウム濃度を低く抑える機能を有することを明らかにした。この現象は、H2SがプロトンポンプV-ATPaseの活性化を引き起こして光受容細胞-水平細胞間隙を酸性化し、光受容細胞の電位依存性L型カルシウムチャネルを抑制するというメカニズムによるものであった。ところが、強い光刺激を受けるとH2Sによる制御がきかなくなり網膜光障害が起きる。この状況下でH2Sを外部から投与すると、形態異常・細胞死・活性酸素種によるDNA損傷などの障害が軽減された。H2Sの細胞保護作用に基づいた医療応用が期待される。平成23年度に計画していた「脳におけるH2S生産経路の検討」については、H2S生産酵素3MSTを中心とした代謝経路を明らかにした。3MSTは3ーメルカプトピルビン酸だけでなく、チオ硫酸も基質として取りうることを明らかにし、H2Sの生産・代謝経路を整理し、新しい知見を加えた。同じく、平成23年度に計画していた「3MSTによるH2S生産活性制御因子の同定」については、3MSTのH2S生産補因子として、チオレドキシン(Trx)とジヒドロリポ酸(DHLA)を同定した。以上の成果をまとめ、論文として発表し、目標を達成した。

当初平成24年度に計画していた「神経保護因子として働くH2Sの機能の理解」については、網膜におけるH2Sの細胞保護作用を明らかにした。平成23年度の計画に関連して、3MST/CAT経路に対しカルシウムが制御因子として機能することを示した。さらに、H2Sが網膜光受容細胞のカルシウム濃度を低く保ち、網膜光障害から細胞を保護することを明らかにした。以上の成果をまとめ、論文として発表し、目標を達成した。平成23年度の計画を完成し、平成24年度の計画も推進していることから、当初の計画以上に研究が進展していると評価した。平成23年度は、H2S生産酵素3MST、および、CATの制御因子の同定を行った。平成24年度は、3MST以外のH2S生産酵素シスタチオニンβーシンテース(CBS)やシスタチオニンγーライエース(CSE)にも着目し、制御因子の同定やH2Sの代謝経路に関する理解を深めることを目的とする。タンパク質を精製し、生化学的解析を通して酵素の性質を検証する予定である。生体内におけるH2S生合成の制御機構について広く解析を進める。平成23年度は、網膜において、H2SによるプロトンポンプV-ATPaseの活性化を引き金としたカルシウム濃度の制御と網膜光障害に対する細胞保護作用について明らかにした。平成24年度は、脳神経系におけるH2Sシグナル経路への理解を深めるため、薬理学およびイメージングの手法を利用し、H2S感受性分子の探索を継続する。初代培養神経細胞、または、初代培養アストロサイトを用い、H2Sドナーを作用させたときの反応を観察するほか、薬理学的手法によってH2S感受性分子を同定する予定である。中枢神経系H2Sの生理機能に関連する分子メカニズムの解明に努める。本研究は、H2Sの神経細胞保護因子としての機能を明らかにし、神経疾患の原因究明や創薬・医療に応用に役立てることが大きな目標である。そこで、アルツハイマー病などに代表される神経変性疾患や脳梗塞による障害などで誘導される神経細胞死の分子メカニズムの解析を進め、H2Sによる細胞保護薬や治療法の確立を目指す。必要最低限の支出を行い、研究を遂行した。次年度使用研究費は、基金の制度を活用して、効率良く研究を進めていった結果、生じたものである。・設備備品:国立精神・神経医療研究センター神経研究所神経薬理研究部、および、神経研究所内の共通機器などの設備等を利用して研究を実行する予定である。したがって、新規の設備備品購入は計画していない。・物品費:生化学実験、薬理学実験で必要な試薬、プラスチック器具、タンパク質精製カラム、ガラス器具などの購入に使用する。培養細胞の維持やそれを用いた実験に必要な試薬、液体培地、プラスチック器具などの購入も計画している。さらに、マウスとラットの購入、飼育、維持管理に必要な物品に加え、動物実験とその解析に必要な試薬、抗体、器具類の費用としても使用する。さらに、本研究成果発表のための論文別刷り費用も計上している。・旅費:研究成果を発表するための学会参加・発表に使用する。