hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超小型・高機能バイオセンシングを実現するハイドロキシアパタイト薄膜の配向制御技術

また、配向制御のメカニズムに関する理論的考察も併せて検討した。これらの結果は、当初計画に照らし合わせ、予定通り遂行できているといえる。しかし、昨年度発生した想定外の問題として、アパタイト結晶膜にクラックが生じる現象が観察された。すでに、この原因についての特定まではできており、配向を制御するためのバッファ材料の熱的性質に起因するものであることが明らかとなっている。したがって、現状のままでは、配向制御と、クラックフリーで薄膜を得ることは両立できない状況にあり、容易には解決できない困難な問題となっている。最終目標であるセンサ応用を実現するに向けては、上記を解決する方法を見出す必要があり、最終年度の当初計画を実施する前に解決しなければならない最優先課題となっている。また、現在まで行った研究成果から、学術的な観点、技術的な観点で、大きく2つの新しい知見が得られている。一つは、配向制御が可能となる結晶成長のメカニズムに関する理論的なモデル、もう一つは、配向制御膜製造方法に関する新たな技術である。これらの論文発表については、本来のスケジュール上、昨年までに完了するべきであったが、時間的な遅れが生じているため至急進めることが必要である。本課題開始後1年目は、アパタイト薄膜の結晶方位を完全なa面とc面の配向面に制御し作り分ける技術を確立することができた。2年目には、初年度得られた配向制御膜を用いて、酸性/塩基性タンパクの選択的吸着を確認する実験を行い、さらには配向制御のメカニズムに関する理論的考察を行った。最終年度となる本年度は、この配向制御膜作製法と結晶成長のモデル化についてまとめ、論文として投稿した。(現在査読中)これと並行して、当初計画に従い配向制御アパタイト膜のセンサ応用を試みた。具体的には、比較的構造が簡単な水晶振動子マイクロバランスセンサ表面に配向制御アパタイト吸着層を形成し、これに選択的吸着するタンパク質を電気的に検出することができるかの実験を行った。本課題の計画段階では予備実験としてアモルファスアパタイトを用いて一定の効果とともに、良好な動作が得られていたが、今回結晶性の配向制御膜を用いた場合には、センサとしての動作が安定せず、タンパク質の分離吸着の確認までに至ることができなかった。その理由について検討した結果、「配向制御アパタイト膜のセラミクスとしての機械的性質が水晶振動子の電極として金のそれと大きく異なるため、アパタイトにクラックが生じ、それが共振の安定動作に影響していること」または「センサを構成する水晶振動子の厚さが数10μmと薄く、アパタイト膜のストレスにより水晶に反りが生じ正常な共振を妨げている」という2つの可能性が浮かび上がった。これらを解決することは、本課題内では困難と判断し、今後の課題として残った。クロマトグラフィーチップやバイオセンサの高感度化、高分解能化などを目指し、ハイドロキシアパタイト(HA)結晶膜の配向制御技術を確立し、そのデバイス応用の可能性について調べた。完全なa面配向とc面配向のHA膜を作り分ける手法を新たに開発し、その結晶成長メカニズムも明らかにした。ここで得られた配向制御膜を用いて、酸性タンパク・塩基性タンパクの選択的吸着が可能であることを示唆する結果が得られた。
嗅球における情報処理の構造的基盤解明：新たな視点からのニューロン構成の再考

顆粒細胞GC、傍糸球体細胞PGは嗅球内の主要な2種のGABA性介在ニューロンである。従来、GCは無軸索、PGは軸索突起を糸球体層に伸ばし、側方抑制に重要とされてきた。しかし、軸索初節部分子マーカーの検討で、PGサブグループは無軸索であることが示唆された。更に、カルシウム結合タンパクsecretagoginの解析で、新たなニューロンtransglomerular cellを発見し、糸球体近傍ニューロングループを再考する必要性を示した。また、僧帽・房飾細胞の糸球体内tuftの解析で両者の差異を示し、特にこれまでPGに特徴的とされてきたスパインが房飾細胞のtuftにも存在することが明らかとなった。本年度は以下の3点について主に解析を進めた。まず、軸索初節部AISの分子マーカー及び各傍糸球体細胞periglomerular cells(PG)グループの化学的マーカーを用いたレーザー顕微鏡による検討においては、数種類の化学的に同定できる介在ニューロン群で明らかに軸索が同定できたのはいわゆる大型のshort-axon cellsと従来から呼ばれてきたニューロン群とtyrosine hydroxylase陽性のドーパミンニューロンのうち大型のグループで我々が糸球体間の結合に関係していると指摘したニューロン群であった。一方、糸球体近傍の小型のいわゆるPGおよび、顆粒細胞層のgranule cellsではその一部でパッチ状の軸索初節部AISの分子マーカー部位が見られた。このようなパッチを示すニューロン群はかなり限られているようでその詳細の解析の必要性が明らかとなった。第2に、化学的性質の解析としてtranscription factors,Sp8とTbx21の解析を進め、ニューロン群の多様性を更に明確にした。第3にbiotinylated dextran amine(BDA)標識をin vivoで行い電子顕微鏡標本作成が可能な固定をした後、蛍光標識標本として、共焦点レーザー顕微鏡観察を進めた。外房飾細胞ET・表在性房飾細胞SMTと僧帽細胞Mを同定し、その糸球体内樹状突起の構造の詳細(スパインの有無等)を画像解析システムNeurolucidaを用いて3次元解析した。その後で、蛍光標識をABC法で処理し、電子顕微鏡観察できるDAB標識に変換した。一部の標本は既に超薄連続切片を作成し電子顕微鏡写真を撮影するところまで進んでいる。これらの写真からモンタージュを作成し、コンピューターを用いた3次元再構築を行うことが可能となった。本年度は主にsecretagogin含有ニューロン(SCGNニューロン)について更に解析を進めた。その解析の過程で糸球体近傍に存在する新たなニューロンタイプとしてその突起が一つの糸球体から隣の別の糸球体へと延びているニューロンを発見し、transglomerular cellと命名した。糸球体近傍のニューロン群をさらに詳細に形態解析する目的で、ごく少量のbiotinylated dextran amine (BDA)を糸球体近傍に電気泳動的に投与し、標識されたニューロンを解析する実験を進めた。tufted cells等の既知の糸球体近傍ニューロンに加えて、transglomerular cellと考えられるニューロンもいくつか標識できた。興味深いことにtransglomerular cellと考えられるニューロンで、あるものは確かにsecretagogin陽性であるが、同様の形態的特徴を示していてもsecretagogin陰性のニューロンも存在していた。このようにtransglomerular cellの化学的性質の面での多様性を示唆する所見が得られたが、これはtransglomerular cellのより詳細を解析する必要性を示している。このような所見を踏まえて、SCGNニューロン及びBDA標識されたsecretagogin陰性transglomerular cellの電子顕微鏡による解析を開始した。一方external tufted cells(ET cells)の光顕・レーザー顕微鏡・電顕での解析を進めたが、主に使用した固定(4%パラフォルムアルデヒド+1%グルタールアルデヒド)ではやや組織の保存が満足できない面があり、より強力な固定(2%パラフォルムアルデヒド+2.5%グルタールアルデヒド)を行ったBDA標識標本の作成を進めた。本年度はBDA標識されたexternal tufted cells(ET cells)の光顕・レーザー顕微鏡・電顕での解析と、近年新たなカルシウム結合タンパクとして報告されたsecretagogin含有ニューロン(SCGNニューロン)についていくつかの手法で解析を進めた。ET cellsの糸球体内突起はスパインを有し、嗅神経終末から多数のシナプスを受けていた。一方、SCGNニューロンはいわゆる顆粒細胞granule cells,傍糸球体細胞periglomerular cells(PG細胞)がほとんどであると考えられている。しかし、PGグループの免疫細胞学的検討により形態的にSCGNニューロンは従来のPG細胞とはかなり異なることが示唆された。

それをより明確にするためin vivoでごく少量のbiotinylated dextran amine (BDA)を糸球体層に電気泳動的に注入し近傍の細胞を標識した。興味深いことにBDA標識されたかなりのニューロンがSCGNニューロンであり、糸球体内にタフト様の突起を伸ばしているいわゆる典型的なPG細胞ではなく、糸球体に比較的枝分かれの少ないスパインを有した突起を伸ばし、しかもしばしば、その突起が一つの糸球体から隣の別の糸球体へと延びていた。これは一見superficial short-axon cellsに類似していたが、糸球体の周りに突起を伸ばし糸球体内には突起を出さないsuperficial short-axon cellsとは明らかに異なっていた。このことは、糸球体層の近傍のSCGNニューロンは従来のsuperficial short-axon cellsにもPG細胞にも適合せず、糸球体層の近傍のいわゆるjuxtaglomerular neuronsの分類はこれから再考していく必要があることを示唆している。本年度はbiotinylated dextran amine (BDA)標識された外房飾細胞external tufted cells(ET cells),僧帽細胞mitral cellの光学顕微鏡・共焦点レーザー走査顕微鏡・電子顕微鏡での解析と、イタリアのDr. Belluzziより提供されたTH-GFP遺伝子改変マウス嗅球スライスで細胞内染色したドーパミンニューロンについ解析を進めた。外房飾細胞及び僧帽細胞は電子顕微鏡解析用の強力な固定液(2%パラフォルムアルデヒド+2.5%グルタールアルデヒド混合固定液)でかなり良好な標本が得られた。固定した嗅球から50ミクロン厚の連続スライスを作製、蛍光標識ストレプトアビジンで染色、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した後、DABを基質としてABC法で標識された細胞・突起を光学顕微鏡・電子顕微鏡で観察できるようにした。記録しておいた外房飾細胞・僧帽細胞それぞれから糸球体内の突起の連続切片を作製した。各切片410枚の写真撮影によりモンタージュを作製し、連続した100以上の切片において、標識された突起、それらとシナプス結合している突起等を追跡した。これらの結果に基づきコンピューターソフトで三次元再構築を進め、僧帽細胞と外房飾細胞の差異を検討している。一方、スライスパッチクランプ法で標識されたドーパミンニューロンは形態的に多様で従来のPG細胞とはかなり異なることが示唆された。一つの糸球体にタフト様の突起を出している小型のニューロンも見られたが、中には、我々がSCGNニューロンの解析で見出した、突起が一つの糸球体から隣の別の糸球体へと延びていくtransglomerular cellと名付けたニューロンに類似したものも見られた。このような多様性を考慮して今後の解析を進める必要があることが示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。神経解剖学
遺伝子レベルにおける甲状腺癌発生機構の解明

甲状腺癌に新しい受容体型チロシンキナーゼ群癌遺伝PTCか発見された。この新しいPTC癌遺伝子が甲状腺乳頭癌の成因に関与しているかどうか検索した。甲状腺癌cell line4種と22人の甲状腺癌の癌組織を用いてPTC癌遺伝子が存在しているかどうかreverse transcuptase polymerase chain reactionとSouthern blot分析を行なった。その結果、4種のうち一つの甲状腺癌cell line TPC-1のみでPTC癌遺伝子の存在を確認したが、他の三つの甲状腺癌cell line、22人の甲状腺癌組織においてPTC癌遺子は見出せず、この癌遺伝子は少くなくとも日本では甲状腺乳頭癌の成因に関与していないことが判明した。甲状腺癌cell line NPAとWROの細胞増殖の機構の解明を行った。両細胞ともTg遺伝子の発現がみられ、甲状腺細胞由来であることが判明したが、TSH刺激に対してcAMPの産生はみられなかった。しかし、torskolin choise toxin isoprotenol刺激ではcAMPの産生が明らかにみられた。またTSHの特異的結合もみられた。さらにTSMレセプターmRNA Tg mRNAはTSH刺激に対して反応はみられなかった。このことからこの甲状腺癌細胞はTSHレセプターG蛋白に異常があることが示唆された。このNPA細胞はcAMPやtorskolinでDNA合成が抑制され、TSHでは無反応で、TSHレセプター情報伝達に障害が認められた。サイトカイン特にIL_1は甲状腺細胞の増殖に関与しているが、これを加えると、正常甲状腺細胞の場合とは異なりDNA合成は強く抑制された。これは同時にcmyc mRNAを抑制しておりこれを介してのDNA合成抑制が示唆された。以上によりIL_1は甲状腺癌のあるものでは抗腫瘍性の作用を有することが判明した。レチノール酸は細胞分化に重要な作用を有すると考られているが、甲腺細胞の分化の指標であるTg,TPOのmRNAを濃度依存性に抑制し、甲状腺に対しては抑制的に作用していることが判明した。甲状腺癌発生機構の解明を行なうため、甲状腺特異蛋白である甲状腺ペルオキシダ-ゼ(TPO)とサイログロブリン(Tg)の遺伝子発現に関する基礎検討を各種サイトカイン(インタ-ロイキン1及び6、インタ-フェロンγ)とレチノ-ル酸を用いて行なった。上記三つのサイトカインではいずれもTPOの遺伝子発現を抑制し、インタ-ロイキン1はTgの遺伝子発現を抑制した。これらに関してはすでに論文報告を行なった。レチノ-ル酸に関しては、正常甲状腺細胞と甲状腺癌細胞の単層培養系を用いて、現在検討中である。1μモルのレチノ-ル酸は3日間の培養によって、正常甲状腺細胞及びラット甲状腺細胞(FRTL-5)におけるTPO遺伝子発現を抑制した。またレチノ-ル酸は正常甲状腺細胞の増殖には影響しなかった。この結果は、第10回世界甲状腺学会を含め、平成2年度の国内学会に報告予定である。またクロ-ン化された甲状腺癌細胞株におけるTPO遺伝子のメチル化及びその遺伝子発現や、TPO蛋白の酵素活性を測定中であり、一部有用な結果を得つつある。一方、レチノ-ル酸と甲状腺ホルモンの相互作用について下垂体細胞を用いて検討を行なった。成長ホルモン合成・分泌に対して、レチノ-ル酸と甲状腺ホルモンは相加作用を示した。この結果は現在論文印刷中であり、現在甲状腺細胞を用いて同様の検討を行なっている所である。

今後も手術時に得た甲状腺癌細胞等を用いて細胞増殖やTPO・Tg遺伝子発現に対するレチノ-ル酸の作用を検討していく予定である。癌細胞において癌遺伝子に種々の異常がみられることが報告されている。種々の癌遺伝子の欠失,再配列,点突然変異等がそれである。甲状腺癌細胞においても,myc,ras,erfA,erfBなどの癌遺伝子の異常が報告され,我々の研究でも同様の結果を得ている。レチノ-ル酸(ビタミンA)は細胞の増殖,分化の調節に重要な役割を果している。前癌状能細胞の増殖を抑制し、正常機能の分化へ誘導することが,種々の細胞で報告されている。そこで,甲状腺癌細胞における癌遺伝子の検索,ならびにレチノ-酸の影響について研究を行ってきた。甲状腺乳頭癌の細胞株PCTについて調べた。本細胞にはサイログロブリン,およべ甲状腺のベルオキシダ-ゼのmRNAは検出できず,これら遺伝子の発現はみられなかった。この細胞について,受容体チロシンカイネ-ス型の癌遺伝子retの再配列を認めた。ヒト甲状腺癌組織を用いてこのret癌遺伝子を検索したところ,異常を発見できなかった。他の甲状腺癌細胞株,WROを用いた実験を行った。この細胞にTSHは結合したが,cAMPの増加は認められず,TSH受容体とcAMP産生系の間に異常が発見された。サイログロブリンのmRNAは検出できたが甲状腺ベルオキシデ-スのmRNAは検出できなかった。この細胞のcmyc癌遺伝子の増幅が見出され,異常増殖にこのcmyc癌遺伝子の増幅が関与していることがうかがえた。そこで,レチノ-ル酸を加えたところ,このcmycの増殖は抑制され,細胞増殖も抑制された。すなはち,レチノ-ル酸が,甲状腺癌細胞のcmyc癌遺伝子の異常発現を抑制することにより,癌細胞の増殖抑制作用のあることが示唆された。
発がん性ヘテロサイクリックアミンによる遺伝子損傷とその修飾

代表的な発がん性ヘテロサイクリックアミンであるTrp-P-2とその代謝活性化体Trp-P-2(NHOH)を用いて、DNA鎖切断作用の機構、遺伝子損傷作用の多様性、及びそれら活性の修飾因子の検討を行った。Trp-P-2(NHOH)水溶液は酸素存在下分解し、・O_2^-を生じDNA一本鎖切断を起こす。細胞外からTrp-P-2(NHOH)を働かせた場合にも細胞内DNA鎖切断が起こる。今回DNA鎖切断反応において・O_2^-からsuperoxide dismutaseによって生じるH_2O_2が重要な役割を果たしているらしいことが、catalase-enriched FM3A細胞を用いて認められた。H_2O_2を分解するcatalase活性が10倍に上昇しているこの細胞ではH_2O_2及びTrp-P-2(NHOH)によるDNA鎖切断が減少していた。反対にH_2O_2を増加させる作用のあるフタル酸モノブチル銅を培地に添加すると細胞内DNA鎖切断が増加することからもH_2O_2の関与が示唆された。Trp-P-2(NHOH)はλファージの2種の変異株間の組換え頻度を上昇させたり、溶原化したファージを誘発することが分かった。これらの反応はTrp-P-2では起こらず、Trp-P-2(NHOH)のDNA鎖切断作用と重要な相関性があると考えられる。さらにFM3A細胞に対してTrp-P-2(NHOH)はouabain耐性変異を誘導することが明らかにされた。一方代謝活性化酵素を持つショウジョウバエに対して、Trp-P-2が体細胞突然変異を誘発することが分かっていた。今回、DNA傷害修復能欠損株を用いた実験からTrp-P-2はハエDNA上に修復可能なDNA傷害を起こすことが分った。これらの活性はクロロフィルやクロロフィリンを培地中に同時に添加することによって抑制された。クロロフィリンがTrp-P-2のgenotoxicityを抑制する機構についてラットを用いて検討したところ、クロロフィリンを混合した飼料を与えた方が、Trp-P-2のみの飼料の場合よりTrp-P-2の排泄率が高かった。in vitroの実験でTrp-P-2とクロロフィリンの複合体形成が示唆されており、消化管内でも両者の間の複合体形成により吸収が妨げられると推測される。
ヘリウム混合ガス圧暴露の減圧症リスクに関する実験的研究(ヘリウム混合比の違いが生体的気泡形成に及ぼす影響)

近年、大深度の高圧作業では空気の代用としてヘリウム混合ガスが使用される傾向にある。本実験では、短時間の高圧作業におけるヘリウム混合ガスの減圧症リスクについて実験的に検討した。ラットを7絶対気圧にて30分間の圧曝露を行う際にヘリウムを80%含むヘリウム酸素混合ガスを用いると、空気を用いた場合にはみられることのない減圧症による死亡例や生存例中の脊髄型減圧症罹患例がみられる。しかしながら、麻痺を起こしても生存例では血管内気泡は減圧後60分以内に消失する。一方、Heを半減させたヘリウム窒素酸素混合ガス(3種混合ガス)においても死亡例が確認された。また、生存例中にも脊髄型減圧症罹患例がみられた。しかしながら、生存例の中には減圧後60分以上経過しても血管内気泡(右股静脈)の出現が認められる例もあった。以上の結果から、比較的短時間の高圧曝露について次のことが知られた。(1)ヘリウムが含まれると減圧症リスクが高くなる。この際、ヘリウム混合比が高いほど減圧症リスクが高い。(2)脊髄型減圧症はヘリウム酸素混合ガス曝露に限ったものではなく、ヘリウム混合比を半減しても生じる危険性がある。(3)減圧症リスクとは反対にヘリウム混合比が低くなると気泡消失には時間を要する。以上の結果は日本衛生学会(発表予定)および日本高気圧環境医学会(発表、投稿予定)等で報告する。
中山間地域における基礎コミュニティ・自治機能の実態と今後の在り方

本研究は、中山間地域における小規模自治体を主な素材として、国内各地域の比較分析を行うことによって、中山間地域における維持可能な自治体づくりに対する集落・地区組織などの地縁組織や住民団体などのコミュニティ機能が果たしている役割を分析し、新たな狭域行財政システムの可能性を明らかにすることを目的とした。本研究は、上記の課題を達成するために現地調査と住民アンケートを実施したが、その研究成果は以下のとおりである。第一に、中山間地域自治体における地域づくりにおいて、地区・集落の役割が大きいことである。多くの住民が地区の必要性を認識しており、役場との関係や地域づくりの話し合いにおいても地区の役割が大きい。第二に、地区、老人クラブなどの旧来型地域組織とともに、ボランティアグループ、NPOなどの新しい住民組織が地域づくりに活力を与えていることである。第三に、中山間地域においては、機能別の自主的住民団体と地区との関わりが深いことである。第四に、地区の課題として収入不足、役員のなり手、および民主主義のあり方の問題が大きいことである。第五に、多くの地域活動において、その主要な取り組み主体を役場以外の地区、住民組織がふさわしいと考え、参加意欲をもつ住民が多く、地区住民と行政との協働によって地域的公共性が確保される条件がかなりあることである。また、中山間地域における新たな狭域行財政システムに関しては、それを展望するうえで、地区計画、権限と財源、担い手と民主主義、導入プロセス、および行政内分権と自治体職員の役割について提起した。中山間地域自治体における基礎コミュニティ・自治機能に関するヒアリング調査を6町村で実施した。このヒアリング調査によって明らかになったことは、第一に、中山間地域自治体における地域づくりにおいて地区・集落の役割が大きいことである。第三に、公民館活動、健康推進員、生活改善グループ、加工グループなど、行政や農協などのコーディネート、支援による住民組織とコミュニティが育っていることである。第四に、合併をする自治体においても合併をしない自治体においても、住民参加のあり方や狭域的な自治のしくみについての模索が始まっていることである。次に、基礎コミュニティ・自治機能の実態把握、および新しい住民自治機能と狭城的行財政システムの可能性を探るための住民アンケート調査を高知県本山町および長野県泰阜村において実施した。本年度のアンケート調査によって明らかになったポイントは以下の点である。第一に、多くの住民が地区の必要性を認識しており、役場との関係や地域づくりの話し合いにおいても地区の役割が大きいことである。第二に、地区の課題として収入不足および役員のなり手の問題が大きいことである。第三に、安全・防災、福祉、健康づくり、子育て支援、ゴミの減量、道路・河川の美化、自然・景観を守るとりくみなど、多くの地域活動において、その主要な取り組み主体を役場以外の地区、住民組織がふさわしいと考える住民が多いことである。これらのアンケートから得られる分析は中山間地域における新たな狭域的行政システムを検討する重要な手がかりとなると考えられる。本年度は、昨年度に引き続き、主に基礎コミュニティ・自治機能の調査として新たに2市村の調査を行った。広島県安芸高田市の場合、合併後の地域自治機能のあり方を追求する事例として注目しうるものであり、旧高宮町の地域振興会を合併後の全市に広げ、市の自治振興部を中心としながら、新たに地域自治組織を育成していく点に特徴がみられる。宮崎県諸塚村の場合、非合併自治体として、戦後から、自治公民館を中心とした地域自治組織が継続しており、役場との両輪ともいうべき重要な役割を持っていることが明らかとなった。また、昨年度に引き続き、長野県阿智村において住民アンケートを実施した。今年度は、昨年度に実施した泰阜村と本由町の住民アンケート調査の分析を行い、以下のような分析結果となった。第一に、中山問地域における地区組織は、行政の下請けといったイメージにも関わらず、それにとどまらず、集落コミュニティを基盤とした地域づくりに関して中心的な役割を担っているということである。

第二に、泰阜村や本山町ではまだ少数ではあるが、ボランティア団体、NPOなど機能別の自主的住民団体の発展可能性が高いことである。第三に、中山間地域では、機能別の自主的住民団体と地区との関わりが深いことである。第四に、中山間地域自治体において、これまで役場が担うべきと考えられていた活動に住民の参加意欲が強く、かつ、地区が中心となって担うほうがよい領域が多くあるという意見があり、地区住民と行政の協働による地域的公共性の確保の可能性が大いにあると考えられる。第五に、現在の地区のあり方には財源、担い手、および民主主義のあり方について大きな課題があることである。本年度は、昨年度に引き続き、主に基礎コミュニティ・自治機能の調査として新たに3市町の調査を行った。高知県梼原町においては、2地区のヒアリング調査を実施し、地区組織の実態把握を行った。三重県名張市においては、地域予算制度、地域保健福祉に関する調査とともに国津地区のヒアリングを行った。長野県松本市においては、地区公民館・町内公民館と「福祉ひろば」の調査を行った。また、蟻ヶ崎西区の取り組みについてヒアリング調査を実施した。また、昨年度の長野県阿智村に引き続いて高知県梼原町において、住民アンケート調査を実施した。今年度は、昨年度に実施した長野県阿智村と今年度に実施した高知県梼原町の住民アンケート調査の分析を行い、以下のような分析結果となった。阿智村のアンケートにおいては、地区によって課題の重点や内容に独自性があり、個々の自治会が自主的に地域課題に取り組む必要性が明確になること、地区によって各分野の地域活動への住民参加度や主要な取り組み主体についての認識に違いがみられること、地域づくりに関する学習会、講演会への参加が高い地区においては、地域づくりに関する話し合いが比較的多くなされていること、などが明らかになった。梼原町アンケートにおいては、区・部落への満足度が他の3町村と比して高く、居住満足度も比較的高いこと、梼原町の自治システムが役場と区・部落を中心としていることなどが明らかとなった。
形態形成シグナル伝達経路の異常による発がん機構の解析

Rasファミリー低分子量G蛋白質Rap2が3つのキナーゼ(MAP4K4、TNIK、MINK)と特異的に結合することを見出したので解析している。これらのキナーゼはMAPKKKキナーゼとしてJNK、p38MAPKなどを活性化することから、Rap2はいわゆるストレス応答性MAPキナーゼ経路を介して細胞機能の制御に関与する可能性が高い。しかし、私共はRap2とTNIKが上皮系細胞のbasolateral細胞膜に局在してMAPキナーゼ経路と無関係に基質細胞接着や細胞間接着を制御することを見出し解析しており、MAP4K4ノックアウトマウスやショウジョウバエオルソログ変異体の形態形成異常表現型(細胞移動異常、神経軸索誘導異常、細胞分化異常、平面内細胞極性異常)の報告もMAPキナーゼ経路と無関係の下流シグナル伝達経路の存在が示唆している。従って、Rap2とエフェクターキナーゼ群は、MAPキナーゼ経路に加え未知のシグナル伝達経路を介して、分化異常など、がん細胞の異常形質に関与すると予想される。この未知の経路の解明が重要と考えて、ディファレンシャル二次元電気泳動と質量分析によりエフェクターキナーゼのリン酸化標的分子の同定を進めている。TNIKについてはリン酸化スポットだけでなく脱リン酸化スポットも複数見られ、経路は単純でないことが判明した。また、Rap2がRhoGAPの一つであるPARG1と特異的に結合することも見出し解析している。PARG1を線維芽細胞に発現させると、細胞内のRhoが不活化された時に特有の表現型が見られたが、Rap2はPARG1と結合してその機能を負に制御することを示唆する結果が得られた。がん抑制遺伝子patchedは細胞膜受容体PTCをコードし、形態形成リガンドHedgehogの細胞内シグナル伝達に関与する。Trc8遺伝子は家族性腎細胞がんに関与するとして報告されたpatched類縁遺伝子である。TRC8の細胞内領域と相互作用する分子をYeast Two-Hybrid法を用いて検索し、COP9 signalosomeのサブユニット4、MSP58、及びforkhead-associated(FHA)ドメインを持つ新規分子を見出した。COP9 signalosomeは転写制御因子Junの活性を修飾するとされるシグナル分子複合体である。MSP58は悪性腫瘍細胞で強く発現する蛋白質p120と相互作用する分子で、Junの転写標的であり形質転換能を持つ分子(TOJ3)としても報告されている。FHAドメインを持つ新規分子は5'RACEにより全長ORFを得たが、機能は全く不明である。一方、グルココルチコイドはある種のがん細胞の細胞形態を正常化させるが、Dexras1はグルココルチコイドにより発現が誘導されるRasファミリー分子であり、3量体GTP結合蛋白質を介するシグナル伝達経路への関与が報告されている。また、RhesはDexras1の類縁分子であり、腫瘍新生血管内皮細胞に特異的に発現するとの報告もある。Dexras1と相互作用する分子としてPIBF1、EDD、及びアネキシンVIを、Rhesと相互作用する分子としてARMS、PP2AのB56ε制御サブユニット、及びBAI3を見出した。PIBF1はコイルドコイル分子、EDDは乳がん細胞において黄体ホルモンにより発現誘導されるHECTドメイン分子である。ARMSはNGF受容体の下流分子であり、B56εはWntシグナル伝達経路に関与するとされる。BAI3は機能不明の脳特異的膜蛋白質である。Rasファミリー低分子量GTP結合蛋白質の中でも特異なサブファミリーを構成するRhes及びDexras1の機能について解析している。また、Rhes及びDexras1のエフェクター結合領域がRap2のそれに類似していることから、Rap2と結合する分子についても解析した。Dexras1は3量体GTP結合蛋白質を介するシグナル伝達を制御することが示唆されているが、G_i共役型ケモカイン受容体(IL-8受容体CXCR1)とDexras1をCOS7細胞で共発現させIL-8で刺激したところ、Dexras1はIL-8受容体を介するシグナル伝達を抑制した。しかし、Dexras1のdominant negative変異体を共発現させても抑制は見られなかった。一方、Rap2の新規結合分子候補としてYeast Two-Hybrid法によりRhoGEFドメインを持つ分子を得ている。また、アフィニティークロマトグラフィーによりRap2に結合する4つの分子(66、75、80、160kDa)を得ており、これらの同定に向けて解析を進めている。また、Rap2はRGS12、RGS14との結合を介して3量体GTP結合蛋白質を介するシグナル伝達を制御する可能性があるが、Two-Hybrid法によりRGS14がPDZドメインを持つprotein tyrosine phosphataseと結合することを見出しており、さらに解析を進めている。がんの発症に関わるシグナル伝達分子には、形態形成シグナル伝達経路に関与するものが少なくない。一方、Rasファミリーに属する低分子量GTP結合蛋白質は、Ras以外のメンバーも、細胞の増殖、分化、アポトーシス、あるいは、細胞骨格や接着、運動などの制御を介して発がん機構やがん細胞の形質に関与している可能性がある。Rap2はRasファミリーに属するが、そのエフェクター結合領域はRas、Rap1とは1アミノ酸異なるため、Rap2に特異的に結合するエフェクター分子が存在する可能性がある。私共は、このようなRap2特異的エフェクター候補分子をTwo-Hybrid法とアフィニティークロマトグラフィー法を用いて検索し、3つのプロテインキナーゼを同定した。

これらのキナーゼは、形態形成とがん細胞の形質に関与するHGK/NIK/MAP4K4(以下MAP4K4)と、MAP4K4に類似の構造を持つTNIK、MINKであった。これらのキナーゼはTwo-Hybrid法においてRap2と結合したがRas、Rap1とは結合しなかった。また、MAP4K4とTNIKは試験管内でRap2とGTP依存性に結合することが確認された。さらに、細胞内局在もRap2と一致した。これらのキナーゼはストレス応答性MAPキナーゼであるJNKの上流に位置するとされるが、Rap2はMAP4K4によるJNKの活性化を相乗的に促進した。以上の結果からRap2がMAP4K4、TNIK、MINKを介してRasやRap1とは異なる独自の機構で発がん過程やがん細胞の形質に関与している可能性が示唆された。Rasファミリー低分子量G蛋白質Rap2が3つのキナーゼ(MAP4K4、TNIK、MINK)と特異的に結合することを見出したので解析している。これらのキナーゼはMAPKKKキナーゼとしてJNK、p38MAPKなどを活性化することから、Rap2はいわゆるストレス応答性MAPキナーゼ経路を介して細胞機能の制御に関与する可能性が高い。しかし、私共はRap2とTNIKが上皮系細胞のbasolateral細胞膜に局在してMAPキナーゼ経路と無関係に基質細胞接着や細胞間接着を制御することを見出し解析しており、MAP4K4ノックアウトマウスやショウジョウバエオルソログ変異体の形態形成異常表現型(細胞移動異常、神経軸索誘導異常、細胞分化異常、平面内細胞極性異常)の報告もMAPキナーゼ経路と無関係の下流シグナル伝達経路の存在が示唆している。従って、Rap2とエフェクターキナーゼ群は、MAPキナーゼ経路に加え未知のシグナル伝達経路を介して、分化異常など、がん細胞の異常形質に関与すると予想される。この未知の経路の解明が重要と考えて、ディファレンシャル二次元電気泳動と質量分析によりエフェクターキナーゼのリン酸化標的分子の同定を進めている。TNIKについてはリン酸化スポットだけでなく脱リン酸化スポットも複数見られ、経路は単純でないことが判明した。また、Rap2がRhoGAPの一つであるPARG1と特異的に結合することも見出し解析している。PARG1を線維芽細胞に発現させると、細胞内のRhoが不活化された時に特有の表現型が見られたが、Rap2はPARG1と結合してその機能を負に制御することを示唆する結果が得られた。
運動開始時の一過性の脳活動から潜在的な動作不安定性を評価する

周期的な両手運動では、左右の同じ筋肉を交互に動かす非鏡像モードは不安定である。ただしこの不安定さには個人差が大きく、しかも運動開始時の動作からはその後の動作安定性が予測しにくい。fMRIを用いて、両手非鏡像モードと鏡像モードの脳活動を解析した結果、両モードの運動開始時の一過性の大脳基底核被核の活動の差とその後の運動不安定性に高い相関が見られた。本研究の結果は、運動開始時の行動からは予測しにくい個々人の両手非鏡像運動の巧拙が運動開始時の脳活動からは予測できることを示している。潜在的な動作不安定性を運動開始時の一過性の脳活動から予測するのが本研究の目的である。今年度は実験モデルとして、周期的な両手非鏡像運動中に生じる両手鏡像運動への突然のパターン遷移現象を取り扱い、いつ起こるか分からない、突然生じるパフォーマンスのエラーを運動開始時の一過性の脳活動から予測しうる脳部位の同定を行った。被験者18名について、両手非鏡像条件(BP)、両手鏡像条件(BM)で30秒間のタッピング運動を行う際の脳活動を磁気共鳴画像法(fMRI)で記録した。取得した脳活動データを一般線形モデルにより、運動開始に関わる一過性の脳活動成分と30秒間の運動継続に関わる持続性の脳活動成分に分離した。特に、運動開始時の一過性の脳活動の強さについて両手非鏡像条件と両手鏡像条件の差をとり、行動データとの相関を計算した。その結果、大脳基底核吻側の運動開始時の一過性の活動量の非鏡像条件と鏡像条件の差が、運動開始後20秒経過以降の鏡像運動の動作のばらつきと高い相関(r=0.81)を示した。これは大脳基底核の運動開始時の一過性の活動により、両手非鏡像周期運動での動作の数10秒後のパフォーマンスが予測可能であることを示唆している。また、動作開始直後の行動データのいくつかの指標では、運動開始後20秒経過以降の鏡像運動の動作のばらつきと有意な相関がなかった。すなわち、行動そのものを観察するよりも脳活動を観察したほうが、高い精度で未来の行動パフォーマンスが予測できる可能性を示している。本研究は、行動そのものからは予測しにくい、将来おこる運動のエラーを運動開始時の一過性の脳活動パターンから予測することを目的とした。本研究が突然の運動エラーの実験モデルとして取り扱うのは、周期的な両手協調運動時の相転移現象である。相転移現象は非同名筋の同時収縮(両手非鏡像モード)を繰り返していると、突然意思とは無関係に同名筋の同時収縮(両手鏡像モード)に切り替わってしまう現象である(Kelso,1984,Am J Physiol)。この両手協調タッピング課題を突然の運動エラーの実験モデルとして採用し、潜在的な動作不安定性を脳活動から予測する手法を開発することを本研究の目標とした。被験者は3Hzの速さのメトロノーム音にあわせて両手鏡像条件と両手非鏡像条件でタッピングを行った。両手非鏡像条件は両手鏡像条件に比べて不安定で、たとえ運動開始後数秒間はミスなくこなすことができても、30秒間の試行中にミスをする被験者がでてくる。それぞれの条件での脳活動を磁気共鳴画像法により計測し、まず計測データを運動開始時の一過性の成分と運動の継続に関わる持続的な成分に分離した。次に、この運動開始時の一過性の脳活動を利用して、課題終盤の期間における運動の乱れを予測した。その結果、大脳基底核被殻前部の活動と将来(運動開始後約20秒経過時からの10秒間程度)の運動の乱れ具合との間に、相関係数0.81という非常に強い相関関係が見つかった。これは大脳基底核の一過性の活動を見れば、高い精度で両手非鏡像運動の将来のパフォーマンスが予測できることを示している。
ヒト乳がん幹細胞の機能制御に関わる細胞表面タンパク質の解析

本研究は、ヒト乳がん幹細胞の機能制御に関わる細胞表面タンパク質を中心とした分子機構を解明することを目的としている。本年度は下記の実験を通じて、ヒト乳がん幹細胞で特異的に発現するマイクロRNAであるmiR-142が、WNTシグナル伝達系の活性化とmiR-150の発現を介してがん幹細胞の幹細胞性制御に関わること、および細胞表面タンパク質であるケモカインレセプターCXCR4がヒト乳がん幹細胞による原発巣および転移巣の形成能に重要な働きをもつことを解明した。さらに転移ヒト乳がん幹細胞に特異的な一連のマイクロRNAを解明して、その標的細胞表面タンパク質候補の解析をすすめた。1. CXCR4の機能解析:ヒト乳がん異種移植マウスの原発巣および肺転移巣より単離したがん細胞の細胞表面タンパク質の発現を単細胞レベルで解析した。CD44発現ヒト乳がん細胞ではCXCR4の発現を強く認め、CXCR4の阻害によりヒト乳がん異種移植マウスの原発巣の増殖および転移巣の形成が抑えられた。2.ヒト乳がん幹細胞特異的マイクロRNAであるmiR-142とmiR-150の機能解析:細胞表面タンパク質FZDを介して乳がん幹細胞の機能を制御するWNTシグナル伝達系の構成タンパク質APCがmiR-142の標的であること、miR-142を介したWNTシグナル伝達系の活性化がmiR-150の転写を誘導すること、miR-142とmiR-150が共に正常乳腺組織の過形成を誘導すること、およびmiR-142の発現抑制がヒト乳がん幹細胞の腫瘍形成能を抑制することを解明した。3.転移ヒト乳がん幹細胞特異的マイクロRNAの解析:ヒト乳がん異種移植マウスの原発巣および転移巣のがん幹細胞のマイクロRNA発現を網羅的に解析して、転移がん幹細胞を特徴づける一連のマイクロRNAを同定するとともに、標的細胞表面タンパク質候補の解析をすすめた。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、ヒト乳がん異種移植マウスの作成、樹立されたマウスの肺転移巣の検索、さらにヒト乳がん幹細胞に特徴的な細胞表面タンパク質の検索とそれらの発現制御へのマイクロRNAの関与の検討を行うため以下の研究を計画し実施した。(1)ヒト乳がん異種移植マウスの作成:ヒト乳がん異種移植マウスを作成するため、同意の得られた乳がん患者の手術検体を収集し、それらをマウスの乳腺領域に移植した。現在までに90症例以上の手術検体を移植し、そのうち計8例がマウスの乳腺領域へ生着した。ヒト乳がんにみられる代表的な組織型を含むこれらの腫瘍の中で継代可能な6例については腫瘍組織の保存、継代、セルソーターによる解析を行った。(2)ヒト乳がん異種移植マウスの肺転移巣のがん細胞の分離と細胞周期制御機構の解析:ヒト乳がん異種移植マウスの肺より転移がん細胞をセルソーターにて分離し、その細胞表面タンパク質の発現を単細胞PCR法にて解析することにより、転移がん細胞を特徴づける細胞表面タンパク質を同定した。また、細胞表面タンパク質の阻害物質を用いて、マウスモデルにより腫瘍増殖抑制効果を確認した。(3)がん幹細胞を培養する培養系の開発:がん幹細胞を効果的に培養する三次元培養系について検討し、ヒト手術検体由来のニッチ細胞との協調によりその増殖を効率化できることを見出した。(4)がん幹細胞に特徴的に発現するマイクロRNAによる細胞表面タンパク質の発現制御機構の解析:がん幹細胞に特徴的に発現がみられるマイクロRNAが、糖鎖修飾酵素を標的としてその発現を低下させることで細胞表面タンパク質の発現を抑制することを解明した。また、miR-214がAPCを標的としてWntシグナル活性を上昇させるとともに、乳腺細胞の増殖を誘導するmiR-150の発現を誘導し、がん幹細胞の幹細胞性の維持に関わることを解明した。3.転移ヒト乳がん幹細胞特異的マイクロRNAの解析:ヒト乳がん異種

移植マウスの原発巣および転移巣のがん幹細胞のマイクロRNA発現を網羅的に解析して、転移がん幹細胞を特徴づける一連のマイクロRNAを同定するとともに、標的細胞表面タンパク質候補の解析をすすめた。26年度が最終年度であるため、記入しない。同意の得られた乳がん患者の手術検体を積極的に集めることにより、ヒトの乳がんを代表するさまざまな組織型からなる一連のヒト乳がん異種移植マウスを樹立した。また、がん幹細胞の細胞周期制御に関わる細胞表面タンパク質や、肺転移がん幹細胞で発現が上昇する細胞表面タンパク質を同定した。また、ヒト乳がん異種移植マウスの原発巣および転移巣にあるがん細胞の多くが、ヒト乳がん手術検体と同様に、細胞周期の停止した状態にあることを示した。さらに、乳がん組織由来のがん細胞の三次元培養を可能にするニッチ細胞に関する研究が進展した。特にmiR-142とそれにより発現が誘導されるmiR-150が、Wntシグナル系の活性化を通じてヒト乳がん幹細胞および正常乳腺幹細胞の増殖を刺激することが明らかになった。一方、乳がん手術検体のマウスへの生着率の低さや、生着した腫瘍の増殖の遅さは研究を迅速に進める上では障害になっている。ヒト乳がん幹細胞を特徴づける細胞表面タンパク質の機能解析をさらに推進するため、今後は以下の三点について研究を進める。(1)ヒト乳がん異種移植マウスの肺転移巣より分離したがん細胞の細胞表面タンパク質およびマイクロRNAの発現解析をさらに進める。(2)ヒト手術検体由来のニッチ細胞を用いた乳がん細胞の三次元培養系を確立し、細胞表面タンパク質の刺激および阻害による効果をより効率的に判定できる系を樹立する。(3)細胞表面タンパク質に対する阻害分子およびその発現を制御するマイクロRNAがヒト乳がん腫瘍細胞の増殖および転移におよぼす影響を、ヒト乳がん異種移植マウスモデルを用いて検討する。
X線分析によるエジプト出土イスラームガラスのステイン装飾技法の研究

中世イスラーム時代のラスター彩ガラス表面には銅や銀の顔料を用いて製作された赤、黄、褐色の美しい装飾が施されている。これらの発色は金属コロイド粒子によるものとされているが、その存在状態や製作技法の詳細は明らかでない。本研究では、ラスター彩ガラスの製作技法を解明するため、発掘調査を行なっているエジプト・シナイ半島へポータブル蛍光X線分析装置を持ち込み、現地で分析を行なうことで、ガラスの組成を明らかにすることを目的とした。エジプトでは出土した遺物を国外へ持ち出すことは禁じられている。このため、本研究では、企業と共同でポータブル蛍光X線分析装置を開発し、(財)中近東文化センターイスラーム・エジプト調査室(川床睦夫発掘調査隊長)により発掘調査が行なわれているエジプト・シナイ半島へ装置を持ち込んで設置し、現地で分析を行なった。イスラーム・ガラスは、原料であるアルカリ源の相違からナトロン・ガラスと植物灰ガラスとに分類されている。ラーヤ遺跡城塞区から出土したガラスを分析したところ、K_2O vs.SrOのプロットにより、大きく二種類のガラスグループに分類され、ナトロン・ガラスと植物灰ガラスの二種類が混在していることが明らかとなった。一方、ラーヤ遺跡居住区から出土したガラスの分析結果では、植物灰ガラスはほとんどみられず、ほとんどがナトロン・ガラスであった。さらにナトロン・ガラスの中でもSrO濃度が高いガラスと低いガラスの存在が示唆され、非常に興味深い結果となった。今後は出土層位との照らし合わせを行なうなど、より詳細に年代との関係を考察し、一方、組成の面から原料や製造地について知見を深めることが課題である。本研究では、銅や銀の存在状態とナノ粒子の存在を明らかにし、ラスター彩ガラスの復元および当時の製作技法の解明を目的とした。まずステイン顔料を用いて、ラスター彩ガラスの復元実験を行い、製作した復元ラスター彩ガラスについて、TEM測定を行った。一方、X線吸収分光法によりラスター彩ガラス顔料中金属元素の化学状態分析を行った。Cuについては高エネルギー加速器研究機構PF BL-12Cで、Agについては高輝度光科学研究センターSPring-8 BL01B1で、それぞれK吸収端の蛍光XAFS測定を行った。さらに中近東文化センターの所蔵品数点について、同様の測定を行った。復元実験の結果、水素ガスを電気炉に流した還元状態下の加熱により赤の発色が得られた。それ以外では黄や褐色が得られた。このラスター彩復元ガラスの薄片について、TEM観察を行った結果、試料表面の赤色部分からは直径5-50nm程度に成長したナノ結晶が見出された。またその電子線回折から銅と銀の多結晶体であることが示された。一方、黄色部分については、83Kでの電子線回折から、Agの微結晶の存在を示すブロードな回折リングが得られた。また高分解TEM観察を行ったところ、格子像が得られ、5nm程度かそれ以下のAgのナノ粒子の存在が示された。一方、蛍光XAFS測定の結果、黄および褐色部分ではCuは酸化物として存在しているのに対して、赤色部分ではCuは金属として存在していることが明らかになった。Agについては、いずれの試料についても金属銀に類似したスペクトルが得られ、TEMの測定結果と一致した。
GJB2遺伝子優性阻害変異マウスの生後発育段階における外有毛細胞の細胞機能評価

マウスの聴覚の生後の成熟段階でのgap結合に障害に基づくコルチ器支持細胞の変性とそれに付随する二次的な外有毛細胞の変性の詳細な検討は未だなされていない。本研究では、この遺伝性難聴マウスモデルの発育過程での外有毛細胞の細胞機能を評価することを目的とした。ヒトで証明された優性的阻害効果を持つミスセンス変異R75WをCAGプロモーターに組み込み、各組織で変異connexin26を発現させるようにした。同マウスはPCR法による変異遺伝子同定に加え、導入遺伝子で同時発現する緑色蛍光遺伝子GFPの発現を口腔や鼻腔内へGFP傾向観察用LEDライト照射により検出、又は採取した尾部を蛍光顕微鏡で観察することによりトランスジェニックマウスを同定する新たな選抜法が作られた(研究協力:神谷和作)。聴覚機能解析については、ABRおよび別途我々のグループで開発したマウスの歪成分耳音響放射(DPOAE)専用測定機器を用いて確認した。これまでの実験施設では建築物由来の電気的ノイズの影響が大きく、正確なABRおよびDPOAEが測定できなかったため、新たに他の研究棟の実験動物施設内に電気シールドを搭載した防音室を建設した。現在機材の再構築を行いトランスジェニックマウスによる解析を進めておりABRでのノイズは大きく減少した。現在DPOAE設備を再構築し幼若マウスでの正確な解析を可能にする測定環境の調整を行っている。ノックアウトマウスが胎生致死であることが知られているので、プロモーターと変異遺伝子の間にloxP配列を挿入し、変異体の発現がCre recombinaseで調節されるように設計した。直鎖化したベクターを受精卵に注入し、偽妊娠状態の雌子宮に戻し、その結果得られたマウスをCre recombinaseを有するトランスジェニックマウスと交配し、PCR,RT-PCR法により内耳で変異遺伝子が発現している個体を選別した(研究協力:飯塚崇、井下綾子)。生後10日目から14日目までのコルチ器の成熟段階の時期のマウスを用いて、側頭骨の連続薄切切片を作成し、顕微鏡にてすべての切片の画像を取り込み、パーソナルコンピュータを用いてコルチ器を三次元的に再構築して、コルチ器の薄切連続切片の組織学的観察とパーソナルコンピュータによる三次元再構築作業を行った。正常とGjb2変異マウスにおいてi)内・外有毛細胞の体積、ii)支持細胞の体積、iii)コルチトンネルの体積を計測・比較して、Gjb2遺伝子変異のよるコルチ器のイオン動態と容積の変化に関して現在解析評価を行っているところである。

これまでの実験施設では建築物由来の電気的ノイズの影響が大きく、正確なABRおよびDPOAEが測定できなかったため、新たに他の研究棟の実験動物施設内に電気シールドを搭載した防音室を建設した。現在機材の再構築を行いトランスジェニックマウスによる解析を進めておりABRでのノイズは大きく減少した。現在DPOAE設備を再構築し幼若マウスでの正確な解析を可能にする測定環境の調整を行っている。
センサータンパク質における多様な機能獲得機構の解析

本研究では、センサータンパク質のPASドメイン部位における多様な機能獲得機構をその補欠分子に着目して、解析した。同一の補欠分子を持ちながら異なる反応を示すPASドメインタンパク賢として同一のp-クマル酸を有する2種類のPhotoactive Yellow Protein(PYP)について、その分光学的な特性の解析を行った。その結果、この2種類のPASドメインタンパク質はアミノ酸の類似性が約60%にもかかわらず、その可視吸収スペクトル、光反応性に大きな違いが現れていることが、明らかになった。しかし、さらに詳細に、光反応を解析して、その分光学的な分子種を同定していくと、両者の分光学的な相違は、局所環境で違い付けられた性質であることが示され、基本的には同一のメカニズムで達成されていることが明らかになった。具体的には、両者の極端に異なる反応速度の違い一部は、2つの保存性の低い残基によって調整さてており、非保存性のアミノ酸残基による多様な性質の獲得を示していた。また。相互作用タンパク質との反応性についても、このような反応速度の違いは寄与していると考えられ、保存性残基の土台の上に、異なる機能を表現していく非保存性の残基の役割が記述されていることが考えられた。また、補欠分子を持たない光合成色素合成遺伝子発現抑制因子(PPSR)におけるPASドメインの役割を、その相互作用タンパク質であるAPPAとの相互作用において検証した。その結果、PPSRに2個存在するPASドメインのうち1つが、相互作用における接触部位であることを明らかにした。このさい、今まで機能未知であったAPPAタンパク質のC末端部位に結合することも同時に明らかにした。以上のことから、PASドメイン部位が、タンパク質-タンパク質相互作用部位であると同時に、その相互作用が補欠分子の状態に影響を与えていることが示唆された。本研究では、センサータンパク質のPASドメイン部位における多様な機能獲得機構をその補欠分子に着目して、解析している。本年度の研究実績については、申請書に掲げた、(1)同一の補欠分子を持ちながら異なる反応を示すPASドメインタンパク質、(2)補欠分子を持つものと、補欠分子を持たないPASドメインタンパク質の解析について、執り行った。(1)の課題に関しては、補欠分子として同一のp-クマル酸を有する2種類のPhotoactive Yellow Protein(PYP)について、その分光学的な特性の解析を行った。その結果、この2種類のPASドメインタンパク質はアミノ酸の相同性が約60%にもかかわらず、その可視吸収スペクトル、光反応性に大きな違いが現れていることが、明らかになった。この原因は、特定の重要なアミノ酸残基の相違に基づくものではなく、タンパク質全体の安定性によることが示唆された。また、このような、安定性の違いが起きる要因として、相互作用タンパク質の寄与も考えられた。相互作用タンパク質の共存下では、両者の吸収スペクトル上に、非共存下におけるほどの差異は見られなかった。また、(2)の解析においては、補欠分子を持たない光合成色素合成遺伝子発現抑制因子(PPSR)におけるPASドメインの役割を、その相互作用タンパク質であるAPPAとの相互作用において検証した。その結果、PPSRに2個存在するPASドメインのうち1つのPASドメイン部位が、相互作用における接触部位であることを明らかにした。また。