hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
口腔癌特異的分子標的治療薬の開発

近年,すでに標準治療として臨床応用され,高い治療効果が報告されている分子標的治療薬が出現してきた。しかしながら口腔扁平上皮癌に対する分子標的治療は確立されておらず,有効な標的分子も確定されていない。研究代表者は,オミックス解析技術を駆使して口腔扁平上皮癌の標的分子候補167種類をリストアップしてきた。本研究は,リストアップした発現異常分子について腫瘍マーカーとしての有用性,妥当性を検証するとともに,動物モデルを用いた臨床前試験を行い,臨床試験への発展を試みるものであった。本研究の結果,HSP90およびPDE5が口腔扁平上皮癌に対する治療標的となり得る分子である可能性が示唆された。近年の研究成果により、臨床試験を終了し標準治療として臨床応用され高い治療効果が報告された分子標的治療薬が出現してきた。一方、口腔扁平上皮癌に対する分子標的治療は確立されておらず、有効な標的分子も確定されていない。研究代表者はゲノミクス、トランスクリプトーム、プロテオミクス解析技術を駆使して167種類の標的分子候補をリストアップしてきた。本年度はリストアップした発現異常分子について腫瘍マーカーとしての有用性、妥当性を検証し動物モデルを用いた臨床前試験への発展を試みた。口腔扁平上皮癌細胞のプロテオーム解析により同定した発現異常タンパク質群についてKeyMolnet®を用いた共通上流検索を行いHSP90が口腔扁平上皮癌細胞の増殖、生存に関与する多くのクライアントタンパク質の機能維持と安定性を調節するターゲットとして抽出された。口腔扁平上皮癌細胞にHSP90阻害剤を投与しHSP90を標的とした分子標的治療の可能性について検討した。HSP90高発現株KONにHSP90阻害剤17-AAGを投与し、投与群と非投与群についてMTT assay、Wound-healing assay、Invasion assay、Apoptosis assayにより解析した。MTT assayでは17-AAG非投与群と比較して投与群の生細胞数の低下が認められた。Wound-healing assayでは投与群で細胞増殖、浸潤が抑制された。Invasion assayでは投与群で移動能、浸潤能が抑制された。Apoptosisassayでは投与群でアポトーシスを起こした細胞数が増加した。本研究の結果、HSP90は口腔扁平上皮癌の分子標的治療のターゲットとなる可能性が示唆された。次年度は口腔扁平上皮癌細胞を移植した動物モデルを用いてHSP90モノクロナール抗体を投与し、腫瘍抑制効果を検証する。近年、多階層オミクス情報を高精度かつ網羅的に取得可能となっている。本研究の目的は、口腔扁平上皮癌細胞のマイクロアレイ解析、プロテオミクス解析、メタボローム解析から、癌細胞が発現異常を示すmRNA、タンパク質、代謝産物各々の情報を階層縦断的に統合し、診断や治療標的となり得るバイオマーカーやネットワーク・パスウエイの同定を試み、リストアップした発現異常分子について腫瘍マーカーとしての有用性、妥当性を検証するとともに、動物モデルを用いた臨床前試験を行い、薬剤の安全性と有効性のデータを収集し、新規分子標的治療薬として臨床試験への発展を試みるものである。初年度の実験においては、HSP90を口腔扁平上皮癌細胞の増殖、生存に関与する多くのクライアントタンパク質の機能維持と安定性を調節するターゲットとして抽出した。本年度は口腔扁平上皮癌細胞群が大きく変動を示す分子群として、phosphodiesterase (PDE)シグナル伝達に関与する分子をリストアップした。PDE高発現細胞株HSC3にPDE5阻害剤であるシルデナフィルクエン酸塩を投与し、抗腫瘍効果を検討したところ、非投与群と比較して投与群の生細胞数の低下、細胞増殖抑制、浸潤能抑制などの抗腫瘍効果が認められた。HSP90とPDE5の阻害による口腔扁平上皮癌細胞の抗腫瘍効果をIn vivoで検証する為に、HSP90高発現株KONとPDE5高発現株HSC3をヌードマウスに移植し、担癌マウスモデルを作成した。HSP90は阻害薬が存在するが副作用が比較的強いため既存の阻害薬を用いず、HSP90モノクローナル抗体を用いた。PDE5は阻害剤が存在し、男性機能障害、肺高血圧症への適応承認済みの薬剤であり安全性の確立されたドラッグリポジショニング的な性格を有する薬剤で、同薬剤を阻害実験に用いた。それぞれ、投与方法、容量の最適条件を検討し、確定させた。本研究は、口腔扁平上皮癌細胞が発現異常を示すmRNA、タンパク質、代謝産物各々の情報を階層縦断的に統合し、診断や治療標的となり得るバイオマーカーやネットワーク・パスウェイの同定を試み、腫瘍マーカーとしての有用性、妥当性を検証するとともに、動物モデルを用いた臨床前試験を行い、新規分子分子標的治療薬として臨床試験への発展を試みるものである。初年度、次年度の研究成果として、HSP90とPDE5が口腔扁平上皮癌細胞に共通して高発現を示し、In vitroの各種解析から口腔扁平上皮癌の分子標的治療のターゲットとなり得る可能性を示唆してきた。本年度は、HSP90高発現株KONとPDE5高発現株HSC3をヌードマウスの背部皮下に移植して、担癌マウスモデルを作成し、In vivoでの検証実験を行った。KON移植マウスに、生理食塩水投与群、HSP90阻害剤17-AAG投与群、HSP90モノクローナル抗体投与群の3群を設定し解析を行った結果、HSP90阻害群に抗腫瘍効果があることが確認された。

また、HSC3移植マウスには、生理食塩水投与群、PDE5阻害剤シルデナフィルクエン酸塩投与群を設定し解析を行ったところ、PDE5阻害群に抗腫瘍効果が認められた。HSP90阻害剤は、細胞周期、細胞分裂、アポトーシス、ストレス耐性等HSP90に関わる複数のクライアントタンパク質を同時に阻害し癌細胞を抑制できる利点がある。本研究の結果、HSP90阻害剤投与による口腔扁平上皮癌細胞に対する抗腫瘍効果が認められ、HSP90は口腔扁平上皮癌の治療標的となり得る可能性が示唆された。シルデナフィルクエン酸塩は男性機能障害、肺高血圧症への適応承認済みの薬剤でありドラッグリポジショニング的な性格を有する薬剤で、早期に臨床応用が可能と考えられる。本研究の結果、PDE5も口腔扁平上皮癌の治療標的となり得る可能性が示唆された。近年,すでに標準治療として臨床応用され,高い治療効果が報告されている分子標的治療薬が出現してきた。しかしながら口腔扁平上皮癌に対する分子標的治療は確立されておらず,有効な標的分子も確定されていない。研究代表者は,オミックス解析技術を駆使して口腔扁平上皮癌の標的分子候補167種類をリストアップしてきた。本研究は,リストアップした発現異常分子について腫瘍マーカーとしての有用性,妥当性を検証するとともに,動物モデルを用いた臨床前試験を行い,臨床試験への発展を試みるものであった。本研究の結果,HSP90およびPDE5が口腔扁平上皮癌に対する治療標的となり得る分子である可能性が示唆された。本研究では、口腔扁平上皮癌細胞のいわゆるオミクス解析でリストアップした癌細胞が高発現を示すHSP90とPDE5に着目し、その阻害によりIn vitroで口腔扁平上皮癌細胞の抗腫瘍効果があることを見出した。さらに口腔扁平上皮癌細胞における抗腫瘍効果をIn vivoで検証する為に、HSP90高発現株KONとPDE5高発現株HSC3をヌードマウスに移植し、担癌マウスモデルを作成した。本移植実験に対する口腔癌細胞の生着率が安定せず、移植細胞数や移植部位などの条件設定に時間を要した。HSP90は阻害薬が存在するが副作用が比較的強いため既存の阻害薬を用いず、HSP90モノクローナル抗体を用いた。PDE5は阻害剤が存在し、男性機能障害、肺高血圧症への適応承認済みの薬剤であり安全性の確立されたドラッグリポジショニング的な性格を有する薬剤で、同薬剤を阻害実験に用いた。このPDE5阻害剤であるシルデナフィルクエン酸塩(Sildenafil Citrate)は研究用に通常の手続きで購入することが困難で入手するのに時間を要したことから、阻害実験に遅れを生じた。現在、薬剤の投与方法、投与容量の最適条件を検討し、確定させたところである。平成26年度にIn vivoでのHSP90とPDE5の阻害による口腔扁平上皮癌細胞への抗腫瘍効果の検討が終了する予定であったが、上記理由により、担癌マウスモデルの作成と薬剤投与による抗腫瘍効果の検討における最適条件の設定が終了した段階である。今後、本条件下に作成した担癌マウスモデルを用いて経時的に抗腫瘍効果を判定する予定である。口腔外科学
子宮内膜局所免疫系の内分泌調節機構とその生理・病理的意義に関する研究

子宮内膜に形成されている局所免疫系の内分泌的な制御にかかわる事が示唆されているナチュラルキラー(NK)細胞の誘導あるいは増殖の機序を、性ステロイドホルモンとの関連で検討した。cDNA expression array法を用いた子宮内膜組織や間質細胞培実験で、IL-15が間質細胞からプロゲステロン依存性に産生されること、またその分泌にはエストロゲンが重要であることなどが明らかとなった。さらに子宮内膜において初期免疫応答の鍵を握ると推測されている樹状細胞(DC)について、妊娠各週の妊婦末梢血から得られたリンパ球からCD3,7,14,16,19抗原陽性細胞を免疫ビーズ法で除去し、さらにその中のMHC class II強陽性の細胞をミエロイド系DC前駆体(CD1a+/CD11c+,CD1a-/CD11c+)およびリンパ球系DC前駆体(CD1a-,CD11c-)に分離してその比率の変化を検討したところ、リンパ球の約0.1%がDC前駆細胞であり、絶対数は少ないものの妊娠初期中期にはリンパ球系DCが多く、妊娠の進行と共にミエロイド系DCの相対的増加があることが明らかとなった。これらDCの変動に関わる因子の解析では、in vitro実験でミエロイド系DCの増加に対する絨毛性ゴナドトロピン(hCG)の有意な影響が確認された。すなわち胎児はその胎盤から分泌するhCGによって、卵巣黄体からのプロゲステロン産生を維持させるのみならず(妊娠黄体形成)、同時に局所免疫系にも働き、DCの働きによる胎児抗原の認識・提示を促し、母体免疫応答における特徴的なTリンパ球サブセットの変化(Th1/Th2比の低下)をもたらすと考えられた。子宮内膜におけるプロゲステロン代謝酵素に関する検討では、子宮内膜間質細胞には20α-HSD遺伝子があり、培養系でプロゲステロン依存性に変動することを始めて見出した。子宮内膜細胞を用いたcDNA expresson array法での遺伝子の解析では、プロゲステロン添加培養の初期から増加する遺伝子として、IL-1R(type 1)、fibrin-1&-2、microsomal glutatione S-transferase-1、fumarylacetoacetatehydrolase、G protein-coupled receptorなどが同定された。またプロゲステロンで減少する遺伝子としては、IL-13R, RNA bindingProtein 2,stannicalcin, phosphodiestrase 4B, cAMP response element-binding protein CRE-BPαなどを見出した。子宮内膜に形成されている局所免疫系が卵巣性ステロイドホルモンによる内分泌的な制御をうけている詳細について細胞・分子生物学的に検討するため、子宮内膜組織診、自然流産および人工妊娠中絶での子宮内膜掻爬手術などで得られた組織(子宮内膜組織、脱落膜組織、妊娠初期絨毛組織)を患者の同意のもとに採取した。まずこれら組織の一部を用いて免疫細胞の種類と分布を月経周期や妊娠の各時期別に詳細に免疫細胞染色で形態学的に評価して、黄体期中期以降で内膜内リンパ球が急増することを確認した。

黄体期後期及び妊娠初期子宮内膜に含まれている免疫細胞としては、多数のナチュラルキラー(NK)細胞(CD56強陽性)が分離され、T細胞及びごく一部にナチュラルサプレッサー(NS)細胞としての機能を示唆するサブグループも認められた。B細胞はほとんど認められず、さらにマクロファージが多数存在した。そのため初期免疫応答の鍵を握る樹状細胞の存在についてもpreliminaryな証明をおこなった。組織の一部から遺伝子を抽出し、また組織は機械的及び酵素的に融解して、比重遠心法、付着細胞培養法で内膜細胞と免疫細胞を分離し、さらに各種モノクローナル抗体を用いた細胞ソーティングなどで各種免疫細胞をさらに解析した。またcDNA expression array法を用いた子宮内膜組織や間質細胞の培実験で、免疫幹細胞に深く関わるIL-15が間質細胞からプロゲステロン依存性に産生されること、またその分泌にはエストロゲンが重要であることなども見いだした。そのためIL-15とNKあるいはNS細胞の関係についても解析が進行中である。子宮内膜において初期免疫応答の鍵を握ると推測されている樹状細胞(DC)の解析を試みたが、内膜局所でのDCの存在は免疫染色で確認されるものの、量的な制約からその分離や機能解析、あるいは周期的変動の検討は困難であった。そのため、妊娠各週の妊婦末梢血から得られたリンパ球からCD3,7,14,16,19抗原陽性細胞を免疫ビーズ法で除去し、さらにその中のMHC class II強陽性の細胞をミエロイド系DC前駆体(CD1a+/CD11c+,CD1a-/CD11c+)およびリンパ球系DC前駆体(CD1a-,CD11c-)に分離してその比率の変化を検討した。末梢血中リンパ球の約0.1%がDC前駆細胞であり、絶対数は少ないものの妊娠初期中期にはリンパ球系DCが多く、妊娠の進行と共にミエロイド系DCの相対的増加があることが明らかとなった。これらDCの変動には卵巣性ステロイドホルモンや胎盤由来因子が関与していると推測され、in vitro実験ではミエロイド系DCの増加に対する絨毛性ゴナドトロピン(hCG)の有意な影響が確認された。DCは着床後の胎児抗原の認識においてもその最初の段階に関わると考えられ、妊娠に伴う特徴的なTリンパ球サブセットの変化(Th1/Th2比の低下)とも関連性が注目されている。また子宮内膜NK細胞の急増との関連についての解析も必要で、そのため、昨年報告した子宮内膜間質細胞からプロゲステロン依存性に産生されるNK細胞分化増殖因子であるIL-15がこのDC細胞に与える影響も検討中である。子宮内膜細胞の増殖と分化は、性ステロイドホルモンの影響下にある多くの局所因子で制御され、その制御にヒト子宮内膜に分布する多種の免疫担当細胞が関与することが示された。
低侵襲脊椎手術実現のための新しい機能診断方法の開発

これまで診断が困難であると考えられてきた腰椎椎間孔部狭窄症の機能診断として新しく開発した電気生理学的手法を継続しておこなうことで3年間に350例におよぶデータを蓄積および解析することができ、本法が有用であることを学会報告しAsian Spine Journalにも掲載された。これによりこれまで問題とされてきた腰椎椎間孔部狭窄症合併による術後症状遺残や多数回手術のリスクを減少させることができると考えている。これが本研究で得られた一番重要な成果である。[研究の具体的内容]これまでに我々が考案し行ってきた椎間孔部狭窄の電気生理学的手法による診断を継続しDATAの蓄積をおこなった。これまでL4/5脊柱管内およびL5/Sの椎間孔部(椎間孔内、椎間孔外)の両方で圧迫される重複病変(double lesion)の頻度も不明であったが、これまでのDATA蓄積により判明してきた。第5腰神経症状を呈する240の手術症例中、画像上の重複病変が15.4%、電気診断陽性(L5/S椎間孔部病変あり)症例が10%という結果であった。つまり第5腰神経が2カ所で圧迫される病態が予想以上に多いことがわかった。またDATAの蓄積により、当科が開発した新しい腰椎椎間孔部狭窄症の電気診断法(Distal motor latency: DML法)が有用であることも証明でき、Asian Spine Journalにアクセプトされた。このDML法は2つの診断基準があり、遠位潜時を用いた診断はROC曲線下面積0.73、特異度92%、陽性反応的中度86.6%であり、遠位潜時の健患差を用いた診断では0.79、88%、88.9%であることが判明した。[本研究の意義]本検査法が確立されれば術後成績不良例の減少が確実に予想されうる。また、腰部脊柱管狭窄症の治療方針の適正化にもつながり,国民医療費の抑制にも貢献できると考えている。[本研究の重要性]椎間孔部病変の病態把握が不十分のままL4/5脊柱管内のみの手術を施行した場合には10%もの患者が満足な手術結果を得られないことが判明した。そしてこの電気生理学的診断方法が有用であることも証明できたため、この検査を行い結果に応じて手術部位の追加をおこなえば術後の症状遺残や多数回手術が激減する。これまで診断が困難であると考えられてきた腰椎椎間孔部狭窄症の機能診断として新しく開発した電気生理学的手法を継続して行いデータ蓄積を行った。この新しい腰椎椎間孔部狭窄症の電気診断法(Distal motor latency: DML法)が有用であることを多数の学会で報告し、Asian Spine Journalにも掲載された。最終年度も引き続きDML法の検査を行い、データの蓄積を行い、3年間の間に350例におよぶデータを蓄積することができた。このことにより腰椎椎間孔部狭窄症の新しい電気診断法であるDML法を確立することができ、実際の臨床の現場でこの検査法を駆使し神経の障害高位を診断し手術治療の計画に役立てている。この手法が確立できたことにより、これまで問題とされてきた腰椎椎間孔部狭窄症の見落としなどによる術後症状遺残や多数回手術を減少させることができると考えている。当初の研究実施計画の最終目標として、専用のカテーテル電極を作成しそれを用いることでより詳細な障害高位診断を行うことを最終目標としていた。しかしながら我々の施設では内視鏡下に手術を行うことも多く、現在入手可能なカテーテル電極では内視鏡のレトラクター越しに正確な位置へ電極挿入することが困難なことも判明した。そこで今後産学連携し電極付硬膜外内視鏡の開発し、最終目標の達成とさらなる脊椎疾患における障害高位診断の発展を計画している。脊椎脊髄腰部脊柱管狭窄症、特に腰椎椎間孔狭窄症の手術症例に対して電気生理学的検査を継続しておこない、DATAの蓄積を継続している。前述のごとく第5腰神経症状を呈する240の手術症例中、画像上の重複病変が15.4%、電気診断陽性(L5/S椎間孔部病変あり)症例が10%という結果であり、第5腰神経が2カ所で圧迫される病態が予想以上に多いことが判明した。腰椎椎間孔部狭窄症の新しい電気生理学的診断方法確立のためにさらなる症例の蓄積を行う。確立された診断基準をもとに障害部位診断を行い、術中所見および術後神経症状の改善から本検査法の有用性を検討する。新しい電極開発が困難な際には既存の現在使用中である電極の使用を継続し、その検査法に改良を加えることで対応したいと考えている。情報収集のため参加を予定していた第35回脊椎機能診断研究会(東京)に参加することができなくなったため、その旅費・宿泊費・学会参加費などが不要となった。

購入を予定したいたソフトウェア-(Design standard)が大学生協からの購入で定価より安く購入することが可能となった。以上により当該助成金が生じた。本研究のめざす電気生理学的手法を用いた神経機能診断法に基づく新しい手術治療戦略の確立はこれまでの腰部脊柱管狭窄症の治療を根本から見直す画期的な方法となり得るため、本研究結果を国内および国外の学会など多方面に発表することが重要であると考えている。そのため雑誌投稿および学会発表を継続していく予定であり、それらの費用の一部に使用予定である。
プロテアソーム蛋白分解系を標的とした固形がんの抗がん剤耐性克服法の開発

プロテアソーム蛋白分解系を標的とした新たな治療法について研究を行い、以下の成果を得た。1)固形がん内部のストレス環境下でプロテアソーム依存的にトポイソメラーゼ(トポ)II標的抗がん剤の耐性誘導が起こることを明らかにし、プロテアソーム阻害剤ラクタシスチンが動物レベルでもトポII標的抗がん剤のエトポシドの効果を増強することを明らかにした。2)プロテアソーム阻害剤と種々の抗がん剤との併用効果を検討し、トポIを標的とするカンプトテシン(CPT)の殺細胞効果を増強することを明らかにした。この効果増強は、CPT処理によって起こるトポI分解の抑制とよく相関することを見出した。3)グルコース飢餓ストレスによるトポIIαの分解には、トポIIαの核局在化が必要であること、また従来トポIIαの制御ドメインと考えられてきたC-末端側ではなくN-末端側に存在するATPaseドメインが重要な働きをしていることを明らかにした。4)ストレスによるトポIIαの分解やCPTによって誘導されるトポIの分解を制御していると考えられるユビキチン化の制御機構を検討するため、20種類におよぶヒトユビキチン結合酵素を発現ベクターにクローニングするとともにそのドミナントネガティブ体の作製を行った。
多臓器不全に対するリドカインの効果:基礎発展研究(メカニズムの解明)と臨床応用

基礎研究リドカインは炎症性細胞の作用を抑制することにより、エンドトキシンによる急性肺障害を軽減する。その作用機序としてのnitric oxide(NO)の発生にリドカインが関与しているかどうかを明らかにするためにマクロファージ株化細胞を用いてリドカインがNO産生に与える影響を検討した。リドカインは濃度依存性にNOの産生を抑制したが誘導型NO合成酵素のmRNAの発現は変化しなかった。次にエンドトキシン・敗血症による動物多臓器不全モデル(ウサギ、ハムスター、ラット)を用いて血液凝固系(DIC)及び横隔膜機能について検討した。リドカイン(2mg/kg/hr)はFDPの高値や血小板の減少を軽減しDICに対する有効性を示した。横隔膜機能は盲腸結紮穿孔術によって作成した敗血症動物から横隔膜条片を切りだしクレブス液槽内で電気刺激を与え等尺性収縮による発生張力を解析することにより評価した。敗血症群で見られたdp/dt maxの低下やトウィッチ刺激による発生張力の低下ならびにテタヌス刺激による筋肉疲労をリドカインは軽減させ敗血症に伴う横隔膜機能不全に対する有効性を示した。リドカインの有効性の機序を検討する目的でエンドトキシン投与後の肺におけるiNOS,nitrotyrosineのタンパク発現を経時的に免疫組織学的に評価した。肺胞・気道上皮にiNOSやnitrotyrosineの発現が見られたがリドカインはこれらの発現を軽減した。臨床研究多臓器不全の発症危険度が高いと考えられる患者(敗血症1例、急性膵炎1例、高度侵襲手術後3例)を対象にリドカインを臨床使用しその予防・軽減効果の検討を行った。急性膵炎1例ではリドカインの投与に伴いPaO2/FIO2 ratioで表わされる酸素化能が回復した。高度侵襲手術3例においては手術侵襲の大きさにもかかわらず臓器不全は起こらなかった。ウサギを用いて塩酸を経気道投与し、肺障害および多臓器不全モデルを作成した。リドカインを前投与に引き続き持続与し障害の発生に与える影響を調査した。塩酸の投与により酸素化能の低下、コンプライアンスの上昇、末梢血白血球および血小版の低下がみられた。6時間経過後に気管支肺胞洗浄液(BALF)を採取した。BALF中のアルブミン、インターロイキン8、好中球が上昇していた。また肺乾湿重量比(W/D ratio)をもとめたところ肺水分量の増加が認められた。リドカイン投与によ、酸素化能の低下の抑制がみられ、W/D ratioの減少、BALF中の遊走白血球の減少がみられ、組織学的にも、肺炎症の抑制がみられた。また、BALF中のインターロイキン8増加ががリドカイン投与群では減少していた。リドカインがインターロイキン8産生を直接抑制したか、またはリドカインにより炎症および好中球活性化が抑制されることにより産生が減少し、さらに炎症の進行を抑制した可能性も考えられる。さらに、多臓器についての影響を現在検討中である。ヒトの末梢好中球を使用して活性酸素産生に与えるリドカインの影響を調査した。リドカインは産生された活性酸素に対してはまったく影響をもたなかった。オプソニン化ザイモザンを用いて、経受容体的に好中球を刺激するとリドカインは濃度依存的に、スーパーオキシド、過酸化水素、ヒドロキシラジカルの産生をいずれも抑制することがわかった。

今後、その他の刺激(エンドトキシンなど)による刺激により好中球の分泌能に対するリドカインの効果つきさらに研究を進めている。また主にサイトカイン産生を担う単球.マクロファージについてもリドカインの作用を現在検討中である。臨床研究多臓器不全の発症危険度が高いと考えられる患者(若干例)を対象にリドカインを臨床使用しその予防・軽減効果の検討を行った。内訳は敗血症1例、急性膵炎1例、高度侵襲手術後3例であった。急性膵炎1例ではリドカインの投与に伴いPaO2/FiO2ratioで表わされる酸素化能が回復した。高度侵襲手術3例においては手術侵襲の大きさにもかかわらず臓器不全は起こらなかった。これらの症例では血中ILやIL-8の上昇も抑えられた。基礎研究エンドトキシン・敗血症による動物多臓器不全モデル(ウサギ、ハムスター、ラット)を用いて血液凝固系(DIC)及び横隔膜機能について検討した。リドカイン(2mg/kg/hr)はFDPの高値や血小板の減少を軽減しDICに対する有効性を示した。横隔膜機能は盲腸結紮穿孔術によって作成した敗血症動物から横隔膜条片を切りだしクレブス液槽内で電気刺激を与え等尺性収縮による発生張力を解析することにより評価した。敗血症群で見られたdp/dt rnaxの低下やトゥィッチ刺激による発生張力の低下ならびにテタヌス刺激による筋肉疲労をリドカインは軽減させ敗血症に伴う横隔膜機能不全に対する有効性を示した。リドカインの有効性の機序を検討する目的でエンドトキシン投与後の肺におけるiNOS,nitrotyrosineのタンパク発現を経時的に免疫組織学的に評価した。肺胞・気道上皮にiNOSやnitrotyrosineの発現が見られたがリドカインはこれらの発現を軽減した。
メディア・フレーミング効果に関する実証的研究

1.目的本研究は、マスメディアと世論との関連を、「フレーミング効果(framing effects)」仮説の観点から追究するものである。フレーミング効果仮説とは、メディアが特定の公共的争点について報道する際に用いる解釈枠組み(メディアフレーム)が、同じ問題に対する受け手の解釈枠組み(受け手のフレーム)を規定ると仮定するものである。言い換えれば、ある公共的争点をメディアがどう定義するかが、人びとがその争点をどう認識するかに影響を与えるという主張である。本研究ではコミュニケーション学者A.エーデルステインらが提起した「問題状況(problematic situations)」図式を援用し、多様な争点・テーマに適用可能な汎用刑フレームモデルを構築し、さらにフレーミング効果を自然的状況で定量的に測定するごどを目指した。2.方法研究対象として選んだテーマは「低迷する日本の経済状況」である。東京都在住の成人を対象とした意識調査によって、一般公衆がこの問題をどう認識しているかを調べ、他方、意識調査の実施期間に先立つ1年間分の全国紙(朝日、読売、日経)の1面に登場した経済記事を内容分析することで、この問題に対するディアフレームの様態を探った。3.結果新聞が日本の経済状況の問題について論じる場合こ「制度崩壊」フレームを用いることが最も多かった。すなわち、長期不況の原因として、景気循環的要因ではなく、構造的要因(日本型システムの制度疲労)が強調されていた。一方、一般公衆の側でも、新聞の経済報道への注意度が高い人ほど、この同じアレームを重要視する傾向のあることが確認された。これはフレーミング効果仮説を支持する結果である。さらに、フレーミング効果と密接な関連を有する属性型議題設定効果についてもその概念的異同について論じ、また、同じデータで属性型議題設定効果の検証も行なった。本年度は以下の研究を行なった。1.理論研究メディア・フレーミング効果仮説に関する様々な文献の収集とレビュー。2.実証研究争点の選定:実証研究で事例として取り上げるテーマを「日本の全般的な経済状況」に決めた。一般の人びとは日本の経済のどこに問題があり、どうすればよいと思っているのか-これは輪郭がきちんと定まった問題というよりも、さまざまなレベルさまざまな側面から論じることができる複合的問題である。そして、そうした経済の状況の認識にメディア報道がどう関わっているのかが追究の焦点である。グループインタビューの実施とまとめ:学生などを対象としたグループインタビューを行ない、結果として、最近の経済状況を理解するために人びとが用いる一つのフレームとして「新自由主義(ないしは市場主義)的フレーム」と呼べるものがあるのではないかという仮説を立てるに至った。意識調査の実施:人びとの意識の中に新自由主義的な考え方がどこまで浸透しているかを中心テーマとして(メディア利用など他の質問も加えて)、2001年2月に意識調査を行なった。対象は東京都に在住する20歳以上の男女800人(住民台帳より層化無作為抽出)。方法は留置法。実査の部分のみ調査会社に委託した。試行的内容分析:上記仮説に関連して、主として新聞の経済報道に関する試行的な内容分析を行なった。(1)理論的研究--フレーミング効果に関する先行研究のレビューを行ない、その中で、フレーミング効果の概念と、議題設定やプライミングといった他の効果概念との関連を整理した。さらに、1)既存のフレーミング研究が、フレームの概念化の仕方に応じて2つのタイプ(事例特殊的なフレームに依拠する研究vs.汎用的なフレームに基づく研究)に分類できること、「問題状況」モデルが有用であるという結論に達した。(2)受け手調査--平成12年度の予算で実施した、東京都民を対象とする意識調査の結果の分析を進めた。本調査でフレーミング効果の事例として取り上げた争点は経済問題である。

事前に実施したフォーカスグループインタビューの結果やメディア報道などを参考にして、一般の人びとが、最近の日本の経済状況やその停滞の原因をどうフレーミングしているかを調べる質問項目を作成した。この質問への回答結果を多変量解析にかけたところ、「問題状況」モデルにほぼ準じた形で項目がグルーピングされ、このモデルの有効性を示唆する結果が得られた。(3)内容分析--全国紙(朝日新聞、読売新聞、日本経済新聞等)を対象に、受け手調査で調べた経済問題のトピックやフレームに対応する形で内容分析を企画した。トピックによる分類とフレームによる分類の2次元によって、経済関連の社説や一般記事のコーディングを試みた。しかし、この作業については予想以上に手間取り、現在も継続中である(研究成果のとりまとめが遅れる旨の研究経過報告書を提出した)。
酸化電位水の殺菌作用による院内感染防止対策および口腔内消毒に関する研究

MRSA、B型肝炎ウイルス、あるいはエイズウイルス等の院内感染が社会問題になっている。歯科治療時には出血の頻度が高いことから、血液を介する感染疾患に対しては積極的な感染予防対策が必要である。本研究では酸化電位水、すなわち水道水に0.07%NaClを添加したのち、電気分解して得られるpH2.7以下、酸化還元電位(ORP)1100mV以上、残留塩素12ppm程度の水を用いて、消毒剤としての有用性について検討し、次の結論を得た。1.MRSA、および緑膿菌に対して酸化電位水を作用させると、作用時間1分以内で十分な殺菌作用を示した。しかし、菌液に血清を添加した場合には酸化電位水の作用は低下したことから、消毒剤に用いる場合には劣化しないだけの十分な水量が必要である。2.透過型電子顕微鏡にて酸化電位水処理後の緑膿菌を観察したところ、細胞壁は凹凸を呈し、細胞質は不規則に凝集し、空隙が認められた。3.HBsあるいはHBe抗原陽性血清を酸化電位水を用いて希釈処理して、抗原性をRadioimmunoassay法にて測定した結果、酸化電位水はHBsおよびHBe抗原を不活化した。その作用は極短時間に生じていると考えられる。4.酸化電位水中の残留塩素濃度に応じて、消毒効果に差異が生じることから、酸化電位水の殺菌効果は塩素が関係していると考えられる。
〈文芸としての覚書〉に関する資料学的基礎研究：文禄・慶長の役関連文献を中心に

本研究では、主に17世紀に入ってから、戦場を体験した武士とその子孫たちが、自らの体験や戦功などを記した〈覚書〉と呼ばれる資料群について、その文芸資料としての価値や意義を検討する。これらは諸文芸の受容史をものがたる貴重な資料群であり、かつそれら自体が当該期の文芸そのものとして評価すべきものである。まずはその伝存状況の把握し、そのなかでとくに文禄・慶長の役に関する記事に焦点をしぼって、その文芸資料としての意義の解明と定位をめざす。その際、日本と韓国の諸地域における対外意識と自己認識の多様性や偏差の把握にも取り組む。こうして中世近世移行期の文学史理解をより豊かにとらえ直すことを試みる。
中国古代地理情報システムの基礎的研究－天水放馬灘秦墓地図を事例として

本研究は古代中国における地理情報(Geographic Information)の作成と管理についての解明を試みるものである。戦国秦期の天水放馬灘秦墓出土の木製地図を分析の対象としてとりあげた。地図は西漢水流域を示していたと仮説を立て、当該地区の早期秦文化遺跡との関係、河川の分岐と距離の関係などを検討した。また、『山海経』『水経注』『穆天子伝』などの古代文献の検討から古代地理書の作成過程について研究した。平成24年度は4月に中国・西北大学の徐衛民教授を海外から招聘し、関連分野の第一人者である愛媛大学・藤田勝久教授教授を交えてのシンポジウム「早期秦文化と天水地区」を開催した(慶應義塾大学)。そのなかで「放馬灘出土地図」に関する最近の研究動向やそれに関する早期秦文化研究の状況を伺うことができた。このような研究集会と並行して、天水放馬灘秦墓出土地図の解明のため、平成23年度の調査・研究を継続し、桐本は『山海経』および村松は『水経注』に関する再検討をおこなった。桐本は『山海経』の比較研究のため、最も『山海経』との類似性が高いとされている『逸周書』『穆天子伝』の調査をおこなった。特に『穆天子伝』とは、文体こそ『山海経』とその趣を異にするものの、西王母を訪問する記載が両者に同様に散見するなど、『山海経』を研究する上で、絶対に欠かすことのできない書物である。特に『穆天子伝』の成立は戦国時代初期と考えられ、これは『山海経』五蔵山経がとりまとめられた時代とほぼ一致する。そこで両者の比較検討をすすめ、その成果として「穆天子伝訳注稿」I(『史学』80巻4号、2012年)を公とした。この作業は今後とも継続され、本年6月頃には『穆天子伝訳注稿II』を世に問う心づもりである。また、これに関連して、漢画像石および貨幣論のような分野に関する研究・論評をすすめた。村松は天水放馬灘秦墓出土地図の示す地域について、再度検討をすすめ、『水経注』資料および衛星写真との比較検討作業を継続した。平成25年度はこれまでの平成23・24年度の研究成果をまとめる作業をおこなった。本研究では天水放馬灘秦墓出土の木製地図を素材に、その地図のとらえる地域を確定し、古代中国における地理認識を理解するということを目的としてきた。研究の過程のなかで本研究班では、山脈の稜線と河川の報告から、衛星写真を含む現在の地理情報との類似点から地図に書かれた範囲を藉水・西漢水流域ととらえた。甘粛省礼県を中心とした西漢水流域は秦発祥の地と考えられ、天水地区の早期秦文化の遺跡と発掘概況は把握しておく必要があるため、平成24年度には西北大学の徐衛民氏を招聘し、状況に関するレクチャーおよび議論をおこなった。本研究の中で考えられた中国古代の地理認識と考えられるもののなかで重要な点は、河川の分岐する数についてはおおよそ実際の地理状況を反映していると考えられるが、河川の支流と本流における距離はおそらくは実際の長さとは相関関係に無いのではないかということである。このような距離に対する地理認識は水経注・山海経・穆天子伝といった地理・民俗関係の伝世文献の記載においても同じように考えられる。このことは古代では地理情報を描く際に、実際の距離や面積という測量的な数値を把握するというよりも、放馬灘秦墓地図に描かれているように、川沿いの山林の樹種や点としての地名という大枠の面的なとらえ方をしていたのではないかと考えられる。今後は堤防建設や都市の移動といった出土文献資料から知りうる地理情報についての調査・整理をすすめる必要がある。なお、平成25年度の日本秦漢史学会では武漢大学でおこなわれた放馬灘秦墓出土地図の赤外線による新たな文字の発見についての報告があった。新たに地図上に「上」の文字が発見され、本研究の結果とは異なる地図の位置関係を示す可能性が示された。新たな事実の発見により、今後もさらに研究の深化が期待される分野といえる。平成23年度の研究は計画に即し、天水放馬灘秦墓出土地図の解明のため、『山海経』(桐本)および『水経注』(村松)の再検討をおこなった。桐本は『山海経』について、これを再読し、特に西海経に神話的資料が多く含まれていることを発見し、当時の中国人の地理観念の中で、特に西方が重視されていたことを認識した。なお『山海経』は版本によって字句の移動が多いので、同書の十種類の版本を購入、または図書館で閲覧し、字句の異同を確認した。また『穆天子伝』は従来『山海経』に性格がきわめて類似しているとされる書物であり、これを研究会で講読し、訳注を作成し、その一部を出版した。

村松は天水放馬灘秦墓出土地図の示す地域について、従前の諸研究をまとめるとともに、当該地域と考えられる藉水・西漢水に関する『水経注』およびその他の地理書の再検討をすすめた。両者の研究の報告を兼ねて、2012年4月には中国・西北大学の徐衛民教授、愛媛大学の藤田勝久教授、学習院大学の鶴間和幸教授を招聘し、シンポジウム「早期秦文化と天水地区」を開催した(慶應義塾大学)。シンポジウムでは藤田氏からは地図について、放馬灘秦墓の出土資料・文物全体から地図の意味を読み取るべきであること、里耶秦簡に地方官の役割に境界における物産を把握することなどの記載があり秦代のほかの出土資料も活用すべきであるとの指摘を受けた。また、徐氏からは早期秦文化の最近の発掘状況、特に李崖遺跡の紹介があった。鶴間氏からは天水地区特に礼県の塩や鉱物(金を含む)などの物産の秦における意義を考えるべきとの指摘を受けた。今後はシンポジウムの指摘を参考にさらに研究を深める予定である。研究の目的では以下の3点を挙げた。(1)放馬灘地図はどこの地域の地理情報を蓄積したものか。ー放馬灘地図の示す領域の解明(2)天水放馬灘秦墓の墓主である地方官吏は何をする役人であったのか。ー地方官吏と地理情報システムの解明(3)地図から地理書をどのように作成したのかー古代における地理情報と管理。上記の調査については徐々にではあるが、成果を得つつある。これらの課題に対応するため、『山海経』『水経注』などの地理書および天水放馬灘秦墓地図を再検討し、その成果をシンポジウムという形で報告し、他の専門家の意見をお聞きした。その指摘をさらに進展させたい。3年目は、最終年度としてのとりまとめをすすめる。桐本の『山海経』『穆天子伝』、村松の『水経注』と衛星写真の関係についての画像分析に関して一定の成果を得たい。里耶秦簡等の出土資料についても並行して調査をすすめる。また、海外の研究者との連携もすすめる。二年目は、まず、『山海経』および『水経注』のデータ・ベース化を進める(桐本・村松)。また、放馬灘秦墓出土地図の分析をすすめ、とくにコロナ衛星を活用して、当該地域の河川の流れと出土地図を画像を合わせて変化させて画像分析をすすめる(村松)。また、シンポジウムの指摘を受けて、里耶秦簡等の出土資料の分析を並行してすすめる(村松)。これと関連して出土文字資料の専門家である中国・武漢大学の陳偉教授を訪問し、共同研究を行う(桐本)。(消耗品)図書(一式) 240,000文具100,000(旅費)海外150,000国内50,000(謝礼)資料整理100,000専門的知識の提供70,000(その他)印刷費100,000通信運搬費50,000本年度の残額は年度末に中国からの研究者招聘の際の差額によって生じた。次年度、当該研究者等から得る専門的知識の提供に関する謝礼金として使用する。(消耗品)衛星写真(データ)105,000図書(一式)200,000 (旅費)海外150,000国内50,000 (謝礼)資料整理75,000専門的知識の提供70,000 (その他)
新規のコイル状セラミックファイバ-の化学気相合成

1.コイル状カ-ボンファイバ-の合成条件を下記の様に明らかにした。(1)ファイバ-が効率良くコイル状に巻くためには,不純物として微量のH_2Sが必要である。その最適濃度は0.060.09vol%であり,0.1%以上になるとコイル化を阻害した。この他PCl_3等の不純物もコイル化に有効である。アセチレン中のアセトンは,コイル化にほとんど影響しない。(2)コイル状ファイバ-の収率は,最適不純物量で,反応温度700°Cの時,最高値3050%を示した。(3)コイルの長さは,反応開始後1時間位までは,反応時間にほぼ比例して長くなり,その後一定値を示す。コイル径は反応時間にほとんど影響されない。(4)アセチレン流量は,80sccm以内では,コイルの長さおよび径にほとんど影響しないが,その以上になるとコイルの長さは短くなる。2.コイル状カ-ボンファイバ-の成長メカニズムについて考察を行った。カ-ボンファイバ-がコイル状に巻くためにはNi触媒が不可欠である。Ni触媒はコイル先端に明らかな結晶面を持つ単結晶状で存在する。この各結晶面でのコイルの成長速度に異方性があるため,成長速度の早い面の方が外側となりコイル状に成長するものと考えられる。成長時にはNi触媒表面はNiーCー(S)の凝液体状態にあり,コイルは先端ー3.コイル状のSicおよびTicCファイバ-の合成を行った。コイル状カ-ボンファイバ-を気相シリコナイジングすることにより,コイル状SiCファイバ-を合成した。また,麦がら,スギナなどのSiO_2含有量の多い有桟プリカ-サ-を原料として,13001400°CでCCl_4+H_2雰囲気中で反応させることにより,直線状SiCウイスカ-の他,少量のコイル状SiCファイバ-が得られることを見出した。1.コイル状窒化ケイ素ファイバ-の合成(1)コイル状窒化ケイ素ファイバ-の化学気相成長は、温度分布、原料ガス組成、ガスの導入方法、不純物、等多くのCVDパラメ-タ-に極めて敏感であり、再現性が悪く、定量的な結果は得られなかった。(2)コイル状窒化ケイ素ファイバ-は、普通の金属製バネと同様の性質があり、約2.5倍まで弾性的に伸び縮みすることが確認された。2.コイル状カ-ボンファイバ-の合成(1)アセチレンを450800°Cでニッケル触媒存在下で熱分解することにより、コイル状のカ-ボンファイバ-をかなり再現性良く合成できることを見出した。(2)コイルは、ニッケル触媒(粒)から2本のコイルが互いに組合わさりながら成長して1本のコイルとなった組合わせコイルであることが初めて明らかにされた。(3)コイルの断面は、多くの場合少し楕円形をしているが、時々、四角形や偏平(きしめん状)をしたものも認められた。(4)コイルは約3倍まで弾性的に伸び縮みが可能である。また4.5倍位まで伸ばすことが可能であるが、この場合、少し歪が残ることが認められた。

(5)コイル状カ-ボンファイバ-を、12001400°Cで気相シリコナイジングあるいはチタナイジングすることにより、もとのコイル形態をほとんど保持したまま、ファイバ-表面あるいは芯まで炭化ケイ素あるいは炭化チタンとすることができることが見出された。この方法は、コイル状カ-ボンファイバ-がかなり再現性良く合成できる点を考えると、新しいコイル状炭化ケイ素、炭化チタンあるいはそれ以外の金属炭化物のコイル状ファイバ-の合成法として注目される。1.コイル状カ-ボンファイバ-の合成条件を下記の様に明らかにした。(1)ファイバ-が効率良くコイル状に巻くためには,不純物として微量のH_2Sが必要である。その最適濃度は0.060.09vol%であり,0.1%以上になるとコイル化を阻害した。この他PCl_3等の不純物もコイル化に有効である。アセチレン中のアセトンは,コイル化にほとんど影響しない。(2)コイル状ファイバ-の収率は,最適不純物量で,反応温度700°Cの時,最高値3050%を示した。(3)コイルの長さは,反応開始後1時間位までは,反応時間にほぼ比例して長くなり,その後一定値を示す。コイル径は反応時間にほとんど影響されない。(4)アセチレン流量は,80sccm以内では,コイルの長さおよび径にほとんど影響しないが,それ以上になるとコイルの長さは短くなる。2.コイル状カ-ボンファイバ-の成長メカニズムについて考察を行った。カ-ボンファイバ-がコイル状に巻くためにはNi触媒が不可欠である。Ni触媒はコイル先端に明らかな結晶面を持つ単結晶状で存在する。この各結晶面でのコイルの成長速度に異方性があるため,成長速度の早い面の方が外側となりコイル状に成長するものと考えられる。成長時にはNi触媒表面はNiーCー(S)の凝液体状態にあり,コイルは先端ー凝VLS機構により成長するものと考えられる。3.コイル状のSiCおよびTiCファイバ-の合成を行った。コイル状カ-ボンファイバ-を気相シリコナイジングすることによりコイル状SiCファイバ-を合成した。また,麦がら,スギナなどのSiO_2含有量の多い有機プリカ-サ-を原料として,13001400°CでCCl_4+H_2雰囲気中で反応させることにより,直線状SiCウイスカ-の他,少量のコイル状SiCファイバ-が得られることを見出した。
江戸時代における朝鮮通信使と日本文人との唱酬・唱和・筆語集についての研究

書籍の調査は、九州(福岡・熊本・佐賀・長崎)地区の図書館調査は、ほぼ完了。東京については、国立国会図書館・国立公文書館内閲文庫・都立中央図書館特殊文庫・国立東京博物館を閲覧、いままで未見の通信使関係文書を中心に調査を行った。関西地区は、まだ調査が終わっていない資料がいくつかある。時間的制限もあって、江戸時代中期から後期の通信使、五回(全十二回中)分を丹念に見ていった。本年度の調査で五十点以上の資料について、詳しい書誌をとった。また、地方史を調査した結果、書籍の購入が増え、その分複写の予定が削減された。今度の計画としては、購入した朝鮮通信使関係書籍、特に緒戦通信使の決定版として、現在刊行中の『大系朝鮮通信使』(明石書店、全八巻のうち四巻が既刊)に掲載されている唱和・筆談集に関する記述に誤りの大きいことが、今回の調査で判明した。例えば、年次を間違えていたり、まったく別の資料を唱和集と記していたり、大きな資料をはずしていたりと。平成七年度中には、それらの誤謬を訂正することも含めて、唱和・筆談集についての論考を公にする予定である。現段階では、今回の調査研究で、調べの進んだ明和(一七六四)度か、文化(一八一一)度から、発表していこうと考えている。また、唱和・筆談集以外でも一枚刷りの記録や実録小説などの周辺分野との関係を合わせて追いかけてみるつもりである。
低分子DNAによる遺伝子発現制御とその応用

本研究の目的は、細胞質に低分子DNAが存在し、それがmRNAとヘテロ2本鎖を形成することによって遺伝子サイレンシングで機能しているのかを明確にすることである。まず、低分子DNAが各組織で普遍的に存在することが明らかになった。また、いくつかのmRNA分子種に対するRNase H処理の感受性を調べたところ、RNase Hへの感受性はmRNA分子種によって異なり、actinやacrosinは感受性が高く、転写因子であるTRF2やTFIIAγ、ACTはやや抵抗性があることも明確になった。マウス肝臓全RNA中にはほぼ10塩基長の低分子DNAが見いだされたが、それらの配列決定までは研究が進展しなかった。この研究は、細胞質内に低分子性の1本鎖DNAが存在し、それがmRNAとヘテロ2本鎖を形成することによって遺伝子サイレンシングに関与しているか否かを解明することを目的としている。まず、マウスのさまざまな組織からRNAを調製し、oligo(dT)を添加後にRNase H処理を行い、actin、ACR、およびTRF2などをプローブとしてノーザンブロット分析を行った。予想に反して、RNase H添加量に依存してmRNAポリA鎖以外のmRNA領域もRNase H分解を受けてしまうことが判明した。この分解パターンはどの組織由来のRNA標品でも類似しており、組織特異性がないことが見いだされた。さらに驚いたことには、oligo(dT)存在の有無にかかわらず、mRNAがRNase Hによって限定分解を受けることも明らかになった。また、このRNase H消化に対する感受性はmRNA分子種によって異なり、精巣で発現する遺伝子を例にすれば、actinやacrosinは感受性が高く、転写因子であるTRF2やTFIIAγ、ACTはやや抵抗性があった。さらに、染色体DNAが切断されないような温和な条件でRNAを調製した場合でも、調製したRNA標品を熱やDNase Iで前処理した場合でも、RNase H消化に対するmRNA感受性に変化がなかった。これらの結果は、調製・精製したRNA標品に低分子DNAが含まれており、それがRNAとハイブリダイズしていることを示唆している。次に、精巣RNA標品から低分子画分を調製し、アクリルアミドゲル電気泳動を行い低分子DNAを単離した。この低分子DNAの塩基配列を明らかにする目的で、DNAを種々のベクターへ挿入後に大腸菌で形質転換したが、ベクターへの連結で好成績が得られなかった。前年度の研究成果から、マウスのさまざまな組織から調製した全RNA標品に低分子DNAが含まれており、それがRNAとハイブリダイズしていることが強く示唆された。そこで、全RNA標品中に含まれる分子がDNAかどうかを明確にするために、まず、肝臓由来の全RNA標品を水酸化ナトリウム処理し、塩酸で中和後に分解されたRNAを除去した。次いで、脱リン酸化処理後にアイソトープでリン酸基を再修飾し、尿素ポリアクリルアミド電気泳動で分離した。結果的に、ほぼ10塩基の単一スポットが得られ、これが目的のDNAと思われた。この低分子DNAは非常に微量であると考えられたので、その両末端に人為的に配列既知のアダプターを連結させて、PCR法で増幅させた後にベクターと連結させて塩基配列の決定を行った。この低分子DNAに相当するいくつかの配列、すなわちCGGCTGGAGCやACGGCGCGACなどが見いだされた。しかし、コントロール実験を行っても同様の配列を持つDNA様の分子が検出されたため、試薬などに混入した微量分子である可能性も否定できなかった。全RNA標品へ外来性RNase Hを添加すると、時間経過とともにmRNAが限定分解を受ける。そこで、アクチンをモデルとして、低分子DNAが仲介する分解様式を調べた。アクチンcDNAから人工的にビオチン化したRNAを合成し、肝臓または精巣全RNA標品と混和させてRNase H処理を行った。得られた5個前後の分解産物を精製し、PCR法で増幅後に配列決定を行った。この実験によって、低分子DNAが関与する少なくとも6か所のアクチンmRNA結合部位を同定することができた。現時点で自己点検すると、調製されたRNA標品に低分子DNAが含まれていることの再現性が得られ、ある一定の成果が得られていると考えられる。しかし、目的の低分子DNA配列決定までは到達しておらず、今後とも研究が進展するように研究方法を模索しているところである。また、今年度の実績概要には記載しなかったが、低分子DNAとRNAのハイブリッド形成部位の同定に関してもactinを中心として研究を進行させており、ある程度の成果があがっている。

生物学この研究計画のを遂行する上での変更点などは特にないが、低分子DNAの塩基配列決定で問題が生じている。ここがこの研究の大きなヤマであり、これさえ順調に進展すれば広がりが見えてくると考えられる。おそらく単離した低分子DNAの量的・質的な問題であり、DNAがメチル基やアセチル基などで修飾されている可能性もあるため、さまざまな観点から検討を加えて克服していきたいと思っている。また、業者委託などによって複数の方向から進めていく方策もあると考えられる。目的の低分子DNA配列決定が難航し、研究の遅延が生じたため、計画していた研究計画まで到達しなかった。26年度に計画通り進展しなかった低分子DNA配列決定、低分子DNAの細胞内での局在、および低分子DNAとRNAのハイブリッド形成部位の同定(一部)の消耗品購入に使用する予定である。