hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
実用植物が作る志賀毒素特異的分泌型ＩｇＡ植物抗体の毒素中和作用と安全性の研究

腸管出血性大腸菌や赤痢菌が産生する志賀毒素(Stx1)を中和する組換え型の分泌型IgA抗体(SIgA)を産生するトランスジェニック植物を、モデル植物シロイヌナズナおよび実用植物リーフレタスで作製した。Stx1の侵入機構として大腸上皮の傷害が考えられる。ヒト大腸細胞株を用いた評価系を確立し、植物由来IgA抗体の毒素中和活性を証明した。また小胞体保留シグナルの付加によってSIgAの一構成成分である分泌片(SC)の発現が増加した。植物に生産させたSCをマウスに投与すると、静脈内投与ではSCに対する抗体ができたが、経口投与では抗体ができず、植物由来生物製剤の経口投与での安全性の根拠が示された。今後有用性が期待できる植物に生産させた抗体(植物抗体)の有効性および安全性の研究を目的とした。腸管出血性大腸菌や赤痢菌の志賀毒素(Stx1)に対する組換え型IgA抗体を作り、動物細胞、モデル植物(シロイヌナズナ)、実用植物(レタス)で分泌型IgAとしての発現を行なった。シロイヌナズナ由来のプロモーターを利用した発現カセットを使った発現システムにより、組換え型IgAのH鎖、L鎖、J鎖および分泌片を同時に遺伝子導入して、シロイヌナズナおよびレタスでの分泌型IgAの発現に成功した。Stx1特異的な分泌型IgAの発現をELISAで確認した。また、分泌型IgAタンパク質の組み立ては、SDS/PAGE/western blotで確認した。組換え型シロイヌナズナの葉の抽出物は、ベロ細胞に対するStx1による傷害を中和した。シロイヌナズナにおいて、二重標識金コロイド免疫電子顕微鏡法によってIgAのH鎖および分泌片が葉の内部で共局在することを示した。シロイヌナズナに生産させた2量体IgAの精製については、チオール親和性クロマトグラフィーおよび調製用液体クロマトグラフィーが有効であった。さらに、小胞体保留シグナルを付加した分泌片をシロイヌナズナに単独発現させたところ、発現量の大幅な改善を認めた。この分泌片タンパク質を精製することに成功した。ヒト大腸がん細胞の一つであるCaco-2を試験管内で分化させることで、Stx1に対する感受性の上昇を認めた。ヒト大腸上皮細胞を用いたStx1の傷害の中和に基づく植物抗体の評価系が確立できた。Stx1特異的分泌型IgAのシロイヌナズナでの発現は、順調に進んでいる。また、実用植物であるレタスにおいても、Stx1に結合する分泌型IgAの発現に成功している。なお、小胞体保持シグナルを付加した分泌片の単独発現により、シロイヌナズナでの発現量の大幅な改善を認め、タンパク質としての精製も見通しがついた。この点については、当初の計画を前倒しにして進めることができた。分泌片単独発現植物は、2量体IgA発現シロイヌナズナとの交配相手として有用である。そのうえ、分泌片をマウスに投与することで、植物が生産するタンパク質製剤に対する抗体産生応答(アレルギー誘発)の評価にも利用できる。大腸上皮細胞に対するStx1の傷害活性の測定系としては、ヒト大腸がん細胞を用いて試験管内での抗体による中和を測定する実験系を確立した。今後有用性が期待できる植物を用いた抗体医薬の製造(植物抗体)の技術基盤の確立、および有用性と安全性の研究を目的として研究を行なった。具体的には、腸管出血性大腸菌や赤痢菌が産生する志賀毒素(Stx1)に対して、組換え型IgA抗体を作製し、分泌型IgAとして植物に発現させた。植物に発現させた分泌型IgAがStx1の毒性を中和できることを証明した。分泌型IgAを構成するH鎖、L鎖、J鎖、分泌片(SC)という4種類の異なるポリペプチド鎖を同時に発現するシロイヌナズナを作製した。平成27年度に確立したヒト大腸上皮細胞(Caco-2)を標的としたin vitro評価系を用い、Stx1による細胞傷害およびアポトーシス誘導を植物抗体が中和することを明らかにし、原著論文として発表した。in vivo評価系として、Stx1をマウス直腸経由で暴露し、大腸上皮細胞の一過性傷害を検出する実験系を開発した。一方、実用植物であるレタスの葉においても分泌型IgAの産生を確認しているが、in vivoでの評価のためには、さらに発現量の向上が必要である。そこで、植物におけるコドン最適化および小胞体での保留性を考慮した新たなコンストラクトの作製を実施し、完成に近づいている。一方、安全性研究のモデル実験に用いるため、小胞体保留シグナルであるKDEL配列を付加した分泌片単独発現シロイヌナズナを確立した。これにより、KDEL付加が植物での発現量の向上に有用であることが確認できた。植物由来の分泌片を、塩析およびイオン交換で精製する方法を確立し、植物由来biologicsモデルとして、マウスを用いた安全性研究に活用できるようになった。Stx1がヒト大腸上皮細胞Caco-2に細胞死を誘導し、アポトーシスを引き起こすことをDNAの断片化を用いて示した。モデル植物であるシロイヌナズナに発現させたStx1特異的分泌型IgA抗体が、Caco-2細胞の細胞死、アポトーシス誘導を阻害することを証明し、原著論文として発表した。

小胞体保留シグナルおよび植物でのコドン最適化を行なった人工遺伝子を取得し、クロロフィル結合タンパク質a/bのプロモーターを用いて4種類の遺伝子を一括して発現させるコンストラクトの作製がほぼ完成段階に近づいている。シロイヌナズナに小胞体保留シグナルを付加した分泌片遺伝子を単独発現させ、分泌片を精製する方法を確立した。この分泌片をマウスに投与し、植物由来biologicsに対する抗体産生の有無を評価する実験を開始している。マウス大腸内にStx1を投与する実験を開始し、組織学的な評価をすすめつつある。トマトについては、人工遺伝子発現コンストラクトの完成をふまえて、実験を開始する予定である。今後有用性が期待できる植物を用いた抗体医薬の製造(植物抗体)の技術基盤の確立、および有用性と安全性の研究を目的とした。本研究では、志賀毒素(Stx1)特異的な分泌型免疫グロブリンA (SIgA)を植物で生産し、経口投与可能な抗体医薬への発展をめざしている。SIgAは、抗体のH鎖、L鎖およびJ鎖で構成される2量体IgAと、粘膜表面への分泌に必要な分泌片(SC)からなる、4種類のポリペプチド鎖で構成される。特に、SCをいかに効率よく植物で生産させるのかが重要な点の一つである。小胞体保留シグナルであるKDEL配列をC末端側に配置した分泌片SC-KDELを発現したシロイヌナズナを確立した。その結果、植物内での分泌片発現量の増加および、植物特有な糖鎖付加量の減少に成功した。志賀毒素(Stx1)特異的なマウス2量体IgAモノクローナル抗体、動物細胞で発現させた組換え型2量体ハイブリッドIgA (hyIgA)とSC-KDELを試験管内で反応させ分泌型IgA (SIgA)を構築した。試験管内で構築したSIgAは、抗原であるStx1Bに結合した。さらに2量体hyIgAを発現するシロイヌナズナとの交配で、SIgAを発現する植物が得られた。SIgAを一括で発現させた場合よりSIgA産生量の増加が達成され、志賀毒素中和活性も保持されていた。安全性研究としては、精製が可能となった分泌片を植物由来biologicsのモデルとし、マウスへの経口投与および静脈内投与を比較して抗体産生を評価した。SC-KDELの静脈内投与では、マウスにSC-KDELに結合するIgG抗体が誘導されたが、経口投与では抗体産生が誘導されず安全性が明らかにされた。以上より、植物で生産した志賀毒素特異的分泌型IgAの毒素中和活性を実現し、IgA植物抗体の経口投与における安全性の基礎となる事実を示すことができた。腸管出血性大腸菌や赤痢菌が産生する志賀毒素(Stx1)を中和する組換え型の分泌型IgA抗体(SIgA)を産生するトランスジェニック植物を、モデル植物シロイヌナズナおよび実用植物リーフレタスで作製した。Stx1の侵入機構として大腸上皮の傷害が考えられる。ヒト大腸細胞株を用いた評価系を確立し、植物由来IgA抗体の毒素中和活性を証明した。また小胞体保留シグナルの付加によってSIgAの一構成成分である分泌片(SC)の発現が増加した。植物に生産させたSCをマウスに投与すると、静脈内投与ではSCに対する抗体ができたが、経口投与では抗体ができず、植物由来生物製剤の経口投与での安全性の根拠が示された。植物に生産させた抗体の生物活性の評価を実現させるため、植物内での抗体産生量の向上および安定性の確保のための研究をすすめる。
家族性パーキンソン病の原因遺伝子parkinの機能解析

parkin蛋白異常によって、封入体を形成しない神経細胞死がおこる。このような細胞死はSMNおよびNAIPの蛋白異常によっても起こり、これらの蛋白が非神経系培養細胞においてspoptosisを抑制することが報告されている。この事実に基ずき、parkinがこのような細胞非特異的で普遍的なapoptosis抑制蛋白である可能性を、293細胞を使って検討した。1)parkinの過剰発現は293細胞においてFas,Baxによるapoptosisを抑制しなかった。2)parkinの過剰発現は、proteasome inhibitionによるapoptosisを抑制しなかった。293細胞においてはproteasome inhibitionは、jnkの活性化を介してbaxを活性化するので、1)の結果をあわせると、jnk活性化によるbaxの活性化をparkinは抑制しないことがわかった。以上より、parkinは、bcl-2,XIAPやNAIPのような、組織非特異的で、普遍的なapoptosis抑制蛋白ではないことが示された。今後は、神経系由来の培養細胞を使ったapoptosisi抑制試験による検討と、apoptosis以外の細胞死径路を反映するassay systemを開発することが重要である。Parkinが、apoptosisに関与するかを以下の方法で検討した。1)wild-type Parkinをmyc-pcDNA3に組み込んだvectorを作った。293細胞にtransfectし、westernblotによりその発現を確認した。2)293細胞において、Fasとbaxの発現は、caspase活性化経路のほとんどを活性化するが、Parkinの同時発現により、それを抑制できなかった。positive controlは、caspase阻害蛋白XIAPを使用した。Etoposide,Menadione,血清除去によるapoptosisに対しても、COS-1細胞でも同様の結果を得た。3)cell-freeのapoptosis実験として、293細胞のlysateに、cytCとATPをいれて、invitroでcaspaseを活性化した。大腸菌から精製したGST-parkin下でも、caspaseの活性化は抑制されなかった。positivecontrolとしては、caspase阻害蛋白XIAPを用いた。caspase活性のfluorometricassayでも同様の結果を得た。以上より、293細胞においては、parkinのcaspase下流経路に対する抑制は、in vivo,in vitroにおいて、認めなかった。293細胞でapoptosis抑制がないということは、parkinがneuron内のcaspase経路にdirectに作用する蛋白ではないことが予想される。Parkin蛋白異常によって、封入体を形成しない神経細胞死がおこる。このような細胞死はSMNおよびNAIPの蛋白異常によっても起こり、これらの蛋白が非神経系培養細胞においてapoptosisを抑制することが報告されている。
糖尿病合併症におけるジヒドロピラジン誘発性遺伝子障害の関与とその機構の解析

我々は、ジヒドロピラジン類(DHPs)の生体影響を明らかにするため、HepG2細胞を用いて検討を行った。メチル化DHPを曝露した結果、HepG2細胞に細胞障害が惹起された。また、影響が強かった3-hydro-2,2,5,6-tetramethylpyrazine (DHP-3)曝露により酸化ストレス応答性タンパク質のmRNA量が顕著に増加することが明らかとなった。一方、糖尿病患者の血中では、健常者の血中に比べDHPの濃度が上昇していた。以上の結果から、DHP類は、生体内に普遍的に分布しており、酸化的ストレスを介して影響を及ぼしている可能性が示された。近年、糖尿病による合併症発症の要因の一つとして、血糖による生体分子の糖化が注目されている。グルコースなどの還元糖とアミノ基を有するタンパク質によって引き起こされる非酵素的反応(メイラード反応)は生体内における代表的な糖化反応の一つであり、これによって生成する糖化産物(glycation products)は、生体内に数十種類存在すると言われている。これらglycation productsと糖尿病合併症との関連性については不明な点が多いが、その解明は、合併症発症機構の解明に向け有益な情報を与えると考えられる。我々は、糖化反応の中間体であるdihydropyrazine類(DHPs)をモデル化合物として、哺乳動物細胞に対する影響を観察した。これまでの検討から、メチル化DHPである2,3-Dihydro-5,6-dimethylpyrazine (DHP-1)、2,3-Dihydro-2,5,6-trimethylpyrazine (DHP-2)、および3-Hydro-2,2,5,6-tetramethylpyrazine (DHP-3)が、ヒト肝癌細胞であるHepG2細胞に対して細胞障害性を発揮することが明らかとなった。そこで、DHPによる細胞障害の発症機構を明らかにするため、細胞内の還元型/酸化型glutathione濃度を測定し、その比(GSH/GSSG)を比較した。細胞障害が観察された曝露条件(各DHP 1 mM, 24時間曝露)において、細胞内の還元型glutathione濃度に変化は認められなかった。これに対し、酸化型グルタチオン濃度は、DHP-3処理においてのみ顕著に増加した。以上の結果から、DHP-3による細胞障害の発症機構には、細胞内グルタチオンバランスの崩壊が関与している可能性が考えられた。ジヒドロピラジン類(DHP類)は、糖化反応中間体の一つであり、生体内や食品中に非酵素的に産生することが知られている。さらに、近年、糖尿病合併症の発症に糖化反応産物の関与が示唆されたことから、その生体影響の解明は重要な研究課題の一つとなっている。申請者らは、遺伝子への影響を起点としたDHP類の生体への影響を明らかにするため検討を行った。その結果、DHP類によるヒト肝ガン細胞への細胞障害作用が、細胞内グルタチオンバランスの崩壊を伴って引き起こされることを明らかにした。この細胞障害に、遺伝子の障害が関与することを明らかにすることはできなかった。しかしながら、グルタチオンバランスの崩壊は細胞内におけるredox balanceの崩壊を意味している。そこで、本年度は、DHPによる細胞内redox factorの変動を観察した。その結果、3-hydro-2,2,5,6-tetramethylpyrazineを曝露した細胞において、酸化的ストレス応答性遺伝子であるhemeoxygenase-1とglutamate cysteine ligase catalytic subunitのmRNAが顕著に増加した。また、抗DHPポリクローナル抗体を用いた競合的ELISAを行った結果、健常者血清に比べ糖尿病患者血清においてDHP量が増加していることが明らかとなった。本研究成果から、DHP類は、酸化的ストレスの発生に伴うNrf2-ARE signal pathwayの活性化を介して生体に影響を及ぼし、その濃度は、健常者に比べ糖尿病患者において増加していることが明らかとなった。従って、DHP類と糖尿病合併症とは大きく関連性があると推測された。近年のライフスタイルの変化に伴い、糖尿病患者やその予備軍と呼ばれる患者の増加は、世界的な社会問題となっている。糖尿病は、血糖値が異常高値を示す状態であり、それ自身ほとんど無症状である。しかしながら、症状の長期化に伴い様々な合併症を引き起こすリスクが増加する。合併症発症の要因として、近年、終末糖化産物、並びにその糖化反応中間体が注目されてきた。そこで、本研究では、糖化反応中間体であるdihydropyrazine類(DHPs)のモデル化合物として、2,3-Dihydro-5,6-dimethylpyrazine (DHP-1)、2,3-Dihydro-2,5,6-trimethylpyrazine (DHP-2)、および3-Hydro-2,2',5,6-tetramethylpyrazine (DHP-3)を用いてヒト肝ガン細胞であるHepG2細胞に対する影響を検討した。

DHP-1、DHP-2およびDHP-3をそれぞれ1 mM調製して細胞に曝露した結果、いずれのDHPも細胞障害性を示した。さらに、genome DNAを市販のキットを用いて抽出し、ヌクレアーゼを反応させdigestionを行い、紫外部分光光度検出器と電気化学検出器を接続したHPLCを用いて各ヌクレオシド濃度を定量した。その結果、曝露されたDHPの種類に関わらず酸化的ストレスの指標である8-OHdGは検出されず、さらに各ヌクレオシド濃度比に顕著な差は見られなかった。この時、断片化されたgenome DNAを検出するためアガロースゲル電気泳動を行ったが、いずれのDHP曝露genome DNAにおいても断片化DNAは検出されなかった。以上の結果から、今回検討した条件化では、DHP類は哺乳動物細胞に対して遺伝子障害性を有していない可能性が考えられた。昨年度、DHPによる細胞障害の発症機構として遺伝子損傷を予想しその検証を行ったが、明らかにすることができなかった。そこで、本年度は、昨年度行った検討を再検証すると共に、交付申請書に記載したタンパク質の発現変動についても解析を行ったが、いずれの検討においてもDHPによる明らかな変化を見いだすことができなかった。そこで、DHPによる細胞障害がストレスに起因しているとの予想のもと、細胞内ストレス応答性の因子に注目し検討を行った。その結果としてDHP-3曝露時における酸化型グルタチオン濃度の変動を見いだすことができたが、これに至るまでに時間を費やしてしまったため、達成度に遅れが生じてしまった。さらに、グルタチオン濃度の変動を観察した条件もDHP 1 mM、24時間曝露のみであったことから、その他の条件でどのような変動を示すかを明らかにする必要があったと思われた。本年度は、交付申請書に記載した内容に則し、DHP類が哺乳動物細胞に与える影響について遺伝子障害性を中心に解析した。その結果、DHP類がヒト肝ガン細胞HepG2細胞に対して細胞障害性を有することが明らかとなった。この機構を明らかにするため、遺伝子を抽出して解析を行った。しかしながら、アポトーシス時に見られる遺伝子の断片化、もしくは酸化的ストレスの発生により生じる8-OHdGを検出することはできなかった。今回の検討ではDHPによる遺伝子への影響の全貌を明らかにすることはできなかった。しかしながら、本検討は、DHP 1 mMの24時間曝露時において遂行されたものであり、その他の条件により遺伝し影響を観察することができる可能性は否定できないと考えられた。本年度の研究から、DHPによる細胞障害の発症に酸化的ストレスが関与する可能性が見いだされた。しかしながら、今回検討した条件が、DHP 1 mM、24時間曝露のみであったことから、その他の曝露条件におけるグルタチオンバランスの変動を検証する必要があると考えられる。また、グルタチオンバランスの変動は酸化的ストレスの生物学的指標のひとつであるが、それのみで酸化的ストレスの発生を論ずることはできない。
ヒト常染色体優性遺伝性口唇裂口蓋裂における高多型DNAマーカーによる連鎖分析

当科における常染色体優性遺伝性口唇裂口蓋裂家系と疑い家系の患者とその健常家族より血液を採取し白血球を分離した。加えてサンパウロ大学より供与された単因子性遺伝性口唇裂口蓋裂家系の患者と家族の白血球を分離した。これら白血球からゲノムDNAを抽出しサザンブロッテイング法に用いるために保存した。プローブDNAは、国立予防衛生研究所遺伝子バンクより5種類のプローブの供与を受け、他にAmerican Type Culture Collectionより20種類を購入した。これらのプローブを含む大腸菌をプレート法で増殖させアルカリ法でプラミドDNAを抽出した。このうち優性遺伝性口唇裂口蓋裂との関連が報告されているD1S58とD1S76、裂奇形との関連が疑われる9番染色体に局在するD9S15、形態発生に関与するホメオボックス遺伝子群D12S32、D1S76に対して制限酵素を用いてプローブDNA断片を抽出した。数家系のDNA試料を多型性が得られる制限酵素を用いて切断し、ゲル電気泳動により分離しナイロンフィルターにトランスファーして上記5種類のプローブDNAと対合させ、非RI法(ECL遺伝子検出システム)を用いて検出を試みたが安定した結果が得られなかったため、現在RI法を用いて検出を試みている。今のところ口唇裂口蓋裂と特定のプローブとの明らかな関連はみられていない。連鎖検定のためのコンピュータープログラムLIPEDを、その開発者であるJurg Ottより供与された。十分な検索例数が得られ次第プローブと口唇裂口蓋裂との連鎖検定を行う予定である。当科における常染色体優性遺伝性口唇裂口蓋裂(Van der Woude症候群)の患者の家系から血液を採取し、白血球を分離して高多型DNAマ-カ-による連鎖分析のためのDNAを抽出し保存している。本年度に行った資料採取のほとんどは本症の患者からのものであるため、連鎖分析に十分な資料を得るためにはさらに家系内の健常者においても行われなければならない。本年度の調査の対象となった家系の中で、核家族全員から資料の採取ができた本症が疑われる口唇(口蓋)裂3名を有する6人家族において、本年度に購入した核酸分離用電気泳動システムなどを用いて高多型DNAマ-カ-による分析を行ったが、今のところ本症と明らかに連鎖するマ-カ-はみつかっていない。今後は対象者の数やDNAマ-カ-の種類を増やして検討する必要がある。Burdickら(1985年)は、白人の優性遺伝性口唇裂口蓋裂の家系を用いてその家系図より遺伝疫学的に検討し、本症の病因遺伝子の突然変異率、浸透率、gene controlなどについて推定している。我々もこれまでの本邦での本症の報告例70例以上(当科の19例を含む)を集計し、Burdickらと同様の手法を用いて日本人における本症の病因遺伝子の様態について検討しており、次年度の日本口蓋裂学会総会において報告する予定である。今後は、本年度に継続して家系からの資料を採取し高多型DNAマ-カ-による連鎖分析と、将来その結果の裏付けとなるであろう遺伝疫学的分析を合わせて検討していきたい。昨年度に引き続き常染色体優性遺伝性口唇裂口蓋裂(Van der Woude症候群:VWS)及びその疑い家系の患者とその家族より血液を採取し、白血球を分離して連鎖分析に使用するために-80°Cで保存した。その資料の一部は、本年度に購入したマイクロ冷却遠心機と遠心エバポレ-タ-を用いてDNAを抽出し、高多型DNAマ-カ-と対合させ得るまで処理しサザンブロッド法の準備をした。今後、他施設から患者とその家族の血液や、当科で所有していないDNAプロ-ブの供与を予定しており、さらにサンプル数を増やし連鎖分析を行う予定である。遺伝統計学的な面から本邦における本症の報告例を集計し検討した。日本人のVWSは優性遺伝と劣性遺伝によるものが混在する可能性があること、遺伝子支配はSeparate Control説が支持されること、VWS遺伝子の自然突然変異率は1.86×10^<-6>が推定値であることを平成3年日本口蓋裂学会総会において報告した。次年度はこれまでの結果をふまえて、高多型DNAマ-カ-による連鎖分析をすすめ、本症と口唇裂口蓋裂に関与する原因遺伝子が複数である可能性や、そのSeparate Control(多元性発現)による支配の可能性を考慮しながら、コンピュ-タ-プログラム・LINKAGEC Lathrop)を用いて常染色体優性遺伝性口唇裂口蓋裂の遺伝子の染色体上の局在部位を明らかにしたい。尚、最近NonーSyndrmic口唇裂口蓋裂の12家系の血液の供与を受けており、これらのサンプルも同時に分析して従来別の疾患群であると考えられていたNonーSyndromic口唇裂口蓋裂に、どの程度本症候群が含まれるのかも検討したい。

これらのプローブを含む大腸菌をプレート法で増殖させアルカリ法でプラミドDNAを抽出した。このうち優性遺伝性口唇裂口蓋裂との関連が報告されているD1S58とD1S76、裂奇形との関連が疑われる9番染色体に局在するD9S15、形態発生に関与するホメオボックス遺伝子群D12S32、D1S76に対して制限酵素を用いてプローブDNA断片を抽出した。数家系のDNA試料を多型性が得られる制限酵素を用いて切断し、ゲル電気泳動により分離しナイロンフィルターにトランスファーして上記5種類のプローブDNAと対合させ、非RI法(ECL遺伝子検出システム)を用いて検出を試みたが安定した結果が得られなかったため、現在RI法を用いて検出を試みている。今のところ口唇裂口蓋裂と特定のプローブとの明らかな関連はみられていない。連鎖検定のためのコンピュータープログラムLIPEDを、その開発者であるJurg Ottより供与された。十分な検索例数が得られ次第プローブと口唇裂口蓋裂との連鎖検定を行う予定である。
新規植物ホルモン、ジャスモン酸、の生理活性発現機序に関する研究

新規植物ホルモンであるジャスモン酸類を含水ラノリンペーストとしてチューリップ茎葉部に処理するとガム物質が誘導、生成する。糖類の分析およびゲル濾過カラムを用いた分析から、このガム物質は酸性糖(グルクロン酸)を含み、アラビノースとキシロースからなる多糖であることが示された。チューリップ茎葉部の細胞壁多糖を構成する糖組成とガム物質のそれを比較した結果、両者には明確な相違が認められた。ガスクロマトグラフ質量分析計を用いた解析から、チューリップ茎葉部にはジャスモン酸およびジャスモン酸メチルの存在が確認され、さらに重水素標識した内部標準品を用いてそれらの定量分析を行った結果、ガム物質の誘導、生成時にそれらの内生レベルの上昇が認められた。この様なジャスモン酸類によるガム物質誘導効果はエチレンによって促進された。しかしながら、ジャスモン酸メチル処理は内生エチレンレベルを上昇させるものの、外生的にエチレンを単独に処理しても、ガム物質は誘導されなかった。さらに、エチレン処理によって内生ジャスモン酸レベルは変化しなかった。一方、ジャスモン酸メチルおよびエチレンをチューリップ茎葉部に処理するとグロロフィルの分解を促進し、老化が促進された。以上の結果から、チューリップ茎葉部におけるガム物質の誘導、生成の主たる要因はジャスモン酸類であること、エチレンは植物組織のジャスモン酸類に対する感受性を高めることによって、ジャスモン酸類のガム物質の誘導、生成効果を高めることが示唆された。なお、以上の研究結果は国際シンポジウムにおいて発表するとともに、国際的に認められている学術雑誌に3編の論文として掲載されることになった。
授乳後の骨密度回復に及ぼす食生活、生活習慣の影響-介入研究

(1)骨密度は授乳期間が0-1カ月(G1群)では変化なし、2-6カ月(G2群)では出産後0.5-1.5年、8-12カ月(G3群)では出産後1-4年で妊娠初期値まで完全に回復する。平均的にはG1-G3群順に出産後0.5年,1年,1.5年でそれぞれ妊娠初期値と有意差は見られなくなる。(2)離乳後1年以上後に再出産した場合、再出産時の骨密度は前回出産時とほぼ同じあるいはそれ以上となり、再授乳後には妊娠初期値よりさらに高くなる場合も見られる。(3)離乳後1年以内に再出産した場合、再出産時の骨密度は前回出産時まで回復せず、再授乳後にも授乳開始時までの回復には5年以上の長期間を要する。(4)長期授乳後の骨密度回復率には、授乳による骨密度低下率が最も大きく関係し、食を含む生活要因との関連は認められなかった。(5)授乳による低下率が高いほど、授乳前までの完全な回復には長期間を要する。結論妊娠、授乳により低下した骨密度は授乳期間に応じて出産後0.5-4年で妊娠初期値まで回復する。再妊娠、再授乳による骨密度回復への影響は授乳期間ではなく、離乳後次回出産までの間隔である。授乳後の骨密度の回復には、授乳による低下率が最も関係し、食生活を含む生活要因との関連は認められなかった。授乳による低下率が高いほど、授乳前までの完全な回復には長期間を要するので、授乳期間中の食生活が重要である。4年計画の初年度であり、今年度は研究目的の1つである、「授乳による骨密度低下を食生活により阻止できるか」について、今年度新たに授乳初期の対象者を20人増して、前回と同じく骨密度測定、尿分析、食事指導を行った。この結果も含めた結論は来年度以降にしか判明しないので、今年度はこれまでの対象者の追跡調査結果より検討した結果を報告する。対象者は平成12年に開始した出産後12週以内の授乳婦24人および平成13年に開始した授乳婦19人計43人である。カルシウムを始め授乳婦に必要な栄養素を充足させる食事指導、開始時、6ヵ月後、1年後の3回の骨密度測定と骨密度関連要因の調査、尿中カルシウム(Ca)、Hydroxyproline、Creatinineの測定を行い相互関係を分析した。結果は、1.Ca摂取量が充足されていても第1子では授乳により骨密度が下がる。2.授乳中には骨吸収、骨形成ともに亢進しており、また、Ca摂取量の少ない者では尿中Ca排泄量が有意に少なく腎臓でのCa保持が行われている。3.蛋白質摂取量と骨密度低下率間には有意の負相関が見られ、蛋白質摂取量が多すぎると骨密度低下が大きい。特に動物性蛋白質の場合に明らかである。蛋白質摂取量が多い者では骨吸収が亢進しており、骨密度の低下となったことが伺えた。4.乳・乳製品摂取量が極端に少ない場合、骨密度の低下が有意に大きい。今年度は、13年度に授乳を開始し骨密度測定および諸調査を追跡している第1子または第2子への授乳婦約20人および14年度に新たに調査を開始した20人併せて40人を対象者とした。1.新たな対象者には食事指導として蛋白質、ミネラル、ビタミンなどバランスのとれた食事をすることを料理の実例を示して指導した。1,2カ月後に3日間の食事調査、また、2週間ごとに食事目標の自己評価記録を記入させた。半年間隔で2回の調査を行った。2.食事調査、超音波法による骨密度測定以外に、以下の諸測定を行った。・尿中のカルシウム、Hydroxyproline,クレアチニン、尿素窒素今年度は特に蛋白代謝との関係から尿素窒素を測定した。・授乳状況および授乳中、断乳後の生活調査3.授乳と食生活に関する論文作成し、投稿中である。

栄養素摂取状況、生活状況と骨密度回復率との関係を、出産回数、授乳期間、授乳開始時の骨密度値・身体活動度を考慮して分析したが、最終結論は来年度のデータを得て後にまとめたい。今年度はこれまでの数年間のデータを基に論文を作成し公表した。概要を示す。目的食事からのカルシウム(Ca)摂取量の増大は長期授乳婦の骨密度低下を阻止し得るか、また、長期授乳により低下した骨密度の回復について、骨代謝を考慮して検討する。方法1年間以上の授乳婦について、授乳中のCa摂取量を食事指導により増大させた群(M群)と授乳中に乳・乳製品を殆ど摂取しなかった群(N群)、および非授乳群(C群)について、超音波法による骨密度測定および尿、血液中の骨代謝指標の測定を行い、それらの変化を比較検討した。結果1.M群のCa摂取量は平均1032mg/日で、日本人の授乳婦の栄養所要量に較べ幾分少なかった。2.骨密度変化のパターンは3群間で有意に異なり、1年後にN群では有意に低下(-8.0%)、C群では有意に上昇したが、M群では有意な変化は認められなかった。開始時の骨密度値および出産回数を考慮して、1年後の骨密度変化率は3群間およびM, N群間で有意であった。3.1年半後の骨密度変化率は3群間で有意差は認められなかった。結論授乳に対してCa摂取量が充足されれば、1年以上の長期授乳でも骨密度低下は見られない。長期授乳により骨密度が低下した場合も平均的には離乳後半年で開始時まで回復するが、授乳期間中の骨密度の極端な低下は母児双方にとって好ましくない。今年度はこれまでの数年間のデータを基に論文を3編作成し、1編を投稿した。概要を示す。1.妊娠中の骨密度変化に及ぼすカルシウム/たんぱく質摂取比の効果(日本公衆衛生学会誌投稿中)<方法>妊娠中異常および出産時異常の見られなかった妊婦37人を対象に、妊娠前半期および後半期の栄養摂取状況を食品(群)の摂取目標に対する達成頻度法と秤量法により把握し、それらと超音波骨密度測定法による妊娠中の骨密度変化、および血液、尿中骨代謝関連指標との相互関係を分析した。<結論>妊娠中の骨密度変化率に対してたんぱく質摂取量は負に、Ca摂取量は正に関連し、Ca/たんぱく質摂取比が高いほど妊娠中の骨密度低下を抑制することが示唆された。2.授乳婦の骨密度変化に及ぼすカルシウム/たんぱく質摂取比の効果1年間以上の長期授乳婦38人について半年後、1年後の骨密度低下率と食事内容との関連を出産回数を考慮して分析した結果、妊婦の場合と同様に、エネルギー摂取量で補正された蛋白質摂取量は負に、Ca摂取量は正にいずれも有意に関連した。一尿中Hydroxyprolineと蛋白質摂取量間には正相関が見られ蛋白質摂取量の増大によって骨吸収が示唆された。カルシウム/たんぱく質摂取比が授乳婦の骨密度にも影響することが明らかとなった。3.長期授乳後の骨密度回復に関係する要因1年間の長期授乳による骨密度低下後、回復に関連する要因として、授乳による低下率が最も大きく、次いで体重増加量や食事要因が含まれた。
最初期遺伝子による神経内分泌ニューロンの調節―その生理・病態生理的意義

FosBはFosファミリーに属する最初期遺伝子産物で、c-Fosと比較して発現が長時間持続することが知られる。我々は、ラット視床下部においてFosB発現がストレスにより惹起され、それが糖質コルコイドによって挿制されることを明らかにした。本研究では、手術侵襲ストレスおよび拘束ストレスによりFosB発現の時間経過を視床下部室傍核で検討し、c-Fosの時間経過を比較した。FosBはc-Fosと比較してより遅く立ち上がり、長期間発現が持続することが明らかにされた。次に、Fos-B発現がいずれの神経内分泌ニューロンに発現するかを検討した。ストレスによりFosBは視床下部室傍核のCRHニューロンに選択的に発現が認められた。さらに、ストレスにより視床下部室傍核において発現増加するFosBタンパク質は主としてFosBであり、deltaFosBタンパク質には明らかな増加が認められなかった。一方、FosBmRNA発現はc-Fos mRNA発現と同様、ストレス負荷後約30分程度で頂値を示した。したがって、FosB発現がc-Fosと比較して長期間持続するのは、転写レベルの差異ではなく、翻訳レベルあるいはタンパク質の安定性の差異による可能性が示唆された。今後、FosBがストレス応答において果たす生理的役割を明らかにして行く予定である。平成22年3月11日の東日本大震災により研究室が壊滅的な被害を受け、外国人特別研究員のGopal Das君もバングラデシュに一時帰国を余儀なくされた。その後研究室の復旧が進み、Gopal君も研究を再開したが、完全にキャッチアップできていない。Gopal君は7月一杯研究期間の延長が認められたので、研究の完遂に向けて実験を行っているところである。日程調整を行いながら、完成のための実験プロトコールを作成し、指導教員ともども最大限努力するつもりである。我々は、ラット視床下部においてFosB発現がストレスにより惹起され、それが糖質コルコイドによって抑制されることを明らかにした。一方、FosB mRNA発現はc-Fos mRNA発現と同様、ストレス負荷後約30分程度で頂値を示した。
対応づけ得点の信頼性に着目した新しい対応づけ可能性分析法の開発

統計的な手法により,二つの異なるテストX, Yのスコアを比較可能にすることを「対応づけ」という.対応づけすると,テストXの80点がテストYの85点に相当するなど,テストX, Yのスコアの対応関係を知ることができる.その際,意味ある対応づけを実現するためには,さまざまな観点から「対応づけ可能性」を吟味する必要がある.本研究の目的は,「対応づけ得点の信頼性」という新たな視点を対応づけ可能性分析に導入することである.平成28年度までに,対応づけ得点の測定モデルを構築し,対応づけ得点の信頼性を評価するための基本的な指標(測定のRMSE,信頼性係数など)を定式化した.さらに,それらの指標が対応づけ得点の信頼性不足の検出に利用できることを例示した.平成29年度には,対応づけ得点の信頼性がしきい値以上であることを簡便に検出できる指標を定式化した.さらに,対応づけ得点の信頼性という観点から,これまでに定式化した指標を組み合わせ,対応づけ可能性分析に応用できることを例示した.これらの研究成果により,対応づけ得点の信頼性評価が可能となり,対応づけの濫用を防ぐなどの効果が期待できる.研究成果については,順次,日本テスト学会第13回大会,第14回大会,第15回大会,第16回大会において発表した.最終年度には,NCME(National Council on Measurement in Education)の年次大会(米国ニューヨーク,2018年)においても成果を発表した.今後は,本研究の国際的な独自性を確保するため,海外ジャーナル等への論文掲載を一つの目標として研究を継続する.等化や予測の技術を利用すれば,形式的には任意の二つの異なるテストの対応づけ(linking)が可能である.しかしながら,意味ある対応づけを保証するためには,さまざまな観点から対応づけ可能性(linkability, feasibility of linking)を吟味する必要がある.その検討内容は,構成概念の類似性,テストの仕様,テストの相関関係,テストの信頼性,対応づけ関数の集団不変性など多岐にわたる.本研究の目的は,対応づけ得点の信頼性という新たな視点を対応づけ可能性分析に導入することである.佐藤・柴山(2014)では,線形等化法の場合に焦点を絞り,対応づけ得点の信頼性に関する指標を定式化した.本研究では,佐藤・柴山(2014)の提案指標を非線形な等化法の場合および下位テストから構成されるテストの場合へと発展させるとともに,それらの指標を対応づけ可能性分析に応用することを目指す.平成27年度には,非線形な等化法(例:等パーセンタイル法)を含め,対応づけ得点の信頼性に関する指標を定式化した.さらに,それらの指標を対応づけ可能性のネガティブチェックに応用する方法を示した.このネガティブチェックにより,対応づけ得点の信頼性不足を検出可能であり,対応づけの濫用を防ぐ効果が期待できる.これらの研究成果の一部を日本テスト学会第13回大会において発表した.佐藤喜一・柴山直(2014).対応づけ得点のための信頼性指標の提案ー対応づけ可能性分析への応用ー.日本テスト学会誌,10(1),69 -- 80.本研究の目的は,対応づけ得点の信頼性という新たな視点を対応づけ可能性分析に導入することである.平成27年度の計画は,指標の定式化,対応づけ可能性分析への応用,研究発表(国内),研究発表(国外)への応募であった.研究発表(国外)は採択にはならなかったものの,「研究の概要」に示した成果により,本研究は着実に進展している.統計的な手法により,テストX, Yの得点に何らかの対応関係をもたせることを対応づけ(linking)という.対応づけすると,テストX, Yの得点を結びつける情報ーたとえば,テストXの80点がテストYの85点に相当するなどーが得られる.その際,意味ある対応づけを保証するには,さまざまな観点から対応づけ可能性(linkability, feasibility of linking)を吟味する必要がある.その中でも,テストの信頼性が十分に高いことは対応づけ結果の正しい解釈のために重要な要素の一つである.これまで,対応づけ可能性分析においては,テストの信頼性として個々のテストの信頼性が評価されるのが常であった.しかしながら,対応づけを伴うテストの場合,私たちの関心の多くは共通尺度における受験者の得点,すなわち対応づけ得点にある.それにもかかわらず,対応づけ得点の信頼性については現在まで十分な議論がなく,テスト得点を線形変換すると信頼性係数はどう変化するかに議論が留まっている.本研究の目的は,対応づけ得点の信頼性という新たな視点を対応づけ可能性分析に導入することである.平成28年度には,対応づけ得点の信頼性評価において最も利用価値が高いと考えられる「対応づけ得点の信頼性係数」を定式化した.さらに,その指標が対応づけ得点の信頼性不足の検出に利用できるため,対応づけ可能性のネガティブチェックに応用できることを例示した.このネガティブチェックにより,対応づけの濫用を防ぐ効果が期待できる.これらの研究成果の一部を日本テスト学会第14回大会において発表した.本研究の目的は,対応づけ得点の信頼性という新たな視点を対応づけ可能性分析に導入することである.平成28年度の主たる成果は,対応づけ得点の信頼性評価において中心的な指標となる「対応づけ得点の信頼性係数」を定式化したことである.

その作業に時間を要したため,成果の発表は国内の学会発表に留まっているものの,本研究は着実に進展していると判断される.統計的な手法により,テストX, Yの得点に何らかの対応関係をもたせることを対応づけ(linking)という.対応づけすると,テストX, Yの得点を結びつける情報ーたとえば,テストXの80点がテストYの85点に相当するなどーが得られる.その際,意味ある対応づけを保証するには,さまざまな観点から対応づけ可能性(linkability)を吟味する必要がある.その中でも,テストの信頼性が十分に高いことは対応づけ結果の正しい解釈のために重要な要素の一つである.これまで,対応づけ可能性分析においては,テストの信頼性として個々のテストの信頼性が評価されるのが常であった.しかしながら,対応づけを伴うテストの場合,私たちの関心の多くは共通尺度における受験者の得点,すなわち対応づけ得点にある.それにもかかわらず,対応づけ得点の信頼性については現在まで十分な議論がなされてこなかった.本研究の目的は,対応づけ得点の信頼性という新たな視点を対応づけ可能性分析に導入することである.平成28年度までに,対応づけ得点の測定モデルを構築し,対応づけ得点の信頼性を評価するための基本的な指標(測定のRMSE,信頼性係数など)を定式化した.さらに,それらの指標が対応づけ得点の信頼性不足を検出できるため,対応づけ可能性のネガティブチェックに応用できることを例示した.一方,対応づけ得点の信頼性評価のためには,対応づけ得点の信頼性が十分に高いことを検出できる指標があると便利である.そこで平成29年度には,対応づけ得点の信頼性が閾値以上であることを簡便に検出できる指標を定式化した.さらに,これまでの指標と新たな指標を組み合わせて用い,対応づけ得点の信頼性という観点から対応づけ可能性分析に応用できることを例示した.これらの成果を日本テスト学会第15回大会において研究発表した.本研究の目的は,対応づけ得点の信頼性という新たな視点を対応づけ可能性分析に導入することである.平成29年度には,対応づけ得点の信頼性が閾値以上であることを簡便に検出できる指標を定式化した.さらに,これまでの指標と新たな指標を組み合わせて用い,対応づけ得点の信頼性という観点から対応づけ可能性分析に応用できることを例示した.これらの成果を日本テスト学会第15回大会において研究発表した.目的達成に向け,本研究は着実に進展していると判断される.統計的な手法により,二つの異なるテストX, Yのスコアを比較可能にすることを「対応づけ」という.対応づけすると,テストXの80点がテストYの85点に相当するなど,テストX, Yのスコアの対応関係を知ることができる.その際,意味ある対応づけを実現するためには,さまざまな観点から「対応づけ可能性」を吟味する必要がある.本研究の目的は,「対応づけ得点の信頼性」という新たな視点を対応づけ可能性分析に導入することである.平成28年度までに,対応づけ得点の測定モデルを構築し,対応づけ得点の信頼性を評価するための基本的な指標(測定のRMSE,信頼性係数など)を定式化した.さらに,それらの指標が対応づけ得点の信頼性不足の検出に利用できることを例示した.平成29年度には,対応づけ得点の信頼性がしきい値以上であることを簡便に検出できる指標を定式化した.さらに,対応づけ得点の信頼性という観点から,これまでに定式化した指標を組み合わせ,対応づけ可能性分析に応用できることを例示した.
微細鉱物による土壌有機物の蓄積と分解の制御-土壌炭素の温暖化応答

陸域最大の炭素プールである土壌有機物の蓄積メカニズムおよび土壌炭素分解の温暖化応答を規定する因子の解明を目指し、有機物と土壌鉱物の反応という新しい着眼点から、以下の研究を行った。先ず、選択溶解法を改良し、土壌鉱物の中でも有機物との反応性が高いとされる鉄・アルミニウム酸化物による土壌有機物の安定化を定量的に評価した。次に、比重の違いを基にする分画手法から起源や反応性の異なる土壌有機物を別個に評価し、土壌有機物分解の温度依存性は、微生物がアクセスしやすい軽比重画分の炭素構造が複雑であるほど増加するというアレニウスの反応速度論と一致する傾向を発見した。まず、本テーマに関する文献レビューを行い論文化した。具体的には、土壌微細鉱物および無機成分による土壌有機物動態の制御を整理するため、膨大な文献の中から比重分画法を用いたものに焦点を当てて、レビューを行った。これにより、土壌有機物プールのうち、微細鉱物によって分解抑制が起こりやすいプールの分離・定量化の目途がたった。同時にH20年度は、化学的な分解抑制メカニズムによって安定化されている土壌有機物の定量化を行った(現在継続中)。具体的には、土壌無機成分の化学性評価に使われてきた選択溶解法を改良した手法開発をおこない、鉱物表面への吸着および鉄・アルミニウムイオンとの錯体形成・沈殿している有機物の定量化を試しみている。この新たな手法によって、これまで不明であった「化学的な安定化作用が土壌有機物の蓄積にどの程度貢献しているか」という問いに、定量的な解答が得られる可能性がある。よって、この研究は、土壌炭素プールの長期動態や温暖化応答プロセスの理解やモデル改良に重要な情報を提供すると考えている。尚、この実験結果は、H21年度の国際会議で発表予定である。H21年度は、高い炭素蓄積能を有する火山灰土壌(アロフェン質黒ぼく土)に対象を絞り、表層土壌環境において存在しうるほぼ最大と最小の炭素含有量、その中間である土壌試料を採取し、分解と蓄積プロセスを比較検討した。異なる温度条件における培養実験から微生物による有機物分解速度とその温度依存性および微生物バイオマスを求めた。同時に、それぞれの土壌試料を物理分画し、異なるメカニズムによって蓄積している土壌有機物量を調べた。これにより、少なくとも調査した火山灰土壌においては、全炭素含量がある程度以上であれば、土壌炭素分解の温度依存性はほぼ一定であることが分かった。一方、有機物供給量が少なく、全炭素量が低い土壌では、残存する土壌有機物には難分解性の芳香族炭素の割合が高まるため、分解の温度依存性は高まることが示され、土壌炭素量と分解の温度応答には非線形的な関係があることを突き止めた。これは、土壌炭素プールの温暖化応答に関する新しい知見であり、国際学会で発表した。現在、国際学術雑誌に投稿準備中である。土壌有機物の長期的な動態および安定化メカニズムについては、まだ未解明であるため、更に比重画分の理化学分析を行う予定である。また、本研究課題の一環として、米国の研究者らと上記の分画法を用いた土壌有機物蓄積プロセス解明についての共同研究を行っており、トップクラスの国際学術誌での発表に繋がった。最終年度は、初年度から継続して行ってきた以下の2つの研究のまとめを行った。(1)微細鉱物粒子との結合により安定化した土壌有機物の定量的評価:溶解度の異なる土壌鉱物を選択する手法は以前から存在するが、溶解試薬は炭素を含むため、それらの鉱物と結合する有機物の量的情報はほとんど存在しない。そこで私は、土壌有機物中の炭素と窒素の存在比は狭い範囲に収束することに注目し、鉱物の選択溶解に伴い可溶化する窒素を定量化する手法を開発した。この手法を用いて主要な土壌タイプを調べたところ、ポドゾルと火山灰土壌では全窒素量の最大7割、そのほかの熱帯強風化土壌や沖積土では3割程度が、微細鉱物粒子(鉄/アルミニウム酸化物や非晶質鉱物)と結合して安定化していることを初めて明らかにした。(2)鉱物との結合度の異なる土壌有機物の温度応答性を支配する因子の解明:微細鉱物との結合により安定化している有機物量が段階的に異なる一連の土壌試料(火山灰土壌)を用いて、鉱物による安定化が土壌有機物の分解速度とその温度応答性に及ぼす影響を実験的に評価した。難分解な有機物であるほど分解に要する活性化エネルギーが大きいため、分解速度の温度依存性は高い(アレニウスの法則に従う)という理論的研究があるものの、大半の有機物が鉱物によって安定化されている実際の土壌において、この仮説の詳細の検証はなされていなかった。本研究では、土壌炭素のうちの鉱物と結合していない低比重画分の炭素構造を核磁気共鳴法から直接的に評価することで、微生物がアクセスし易い土壌画分中の炭素の難分解性が、土壌有機物分解の温度依存性を支配することを突き止めた。

試料数は少ないものの、ここで得られた知見は、陸域最大の炭素プールである土壌炭素の温暖化応答を予測するために必須の基礎情報になるだろう。尚、(1)はトップクラスの国際学術誌で査読中であり、(2)については投稿準備中である。
胆汁酸の腹腔内投与による肝脂質過酸化の亢進と肝再生障害に対する抗酸化剤投与の意義

肝切除後の胆汁性腹膜炎による肝再生障害について,ラットを用い実験的に検討した。今回70%肝切除後に総胆管を結紮し、肝側に切開を加え作成した胆汁性腹膜炎モデルは、残肝に胆汁鬱滞を認めず、腹水培養も陰性で、腹腔内に持続的に漏出した胆汁が腹膜から吸収された結果、経時的に黄疸の上昇がみられ、DNA合成に代表される早期の肝再生における胆汁性腹膜炎の影響を検討する上で極めて有用なモデルであった。術後24および48時間のBrdU標識細胞によるlabeling index(LI)は、肝切除後のみで22.4、7.5%、胆汁性腹膜炎付加にて4.4、8.8%、scavenger(SODとcatalase)の反復投与にて6.4、24.5%であった。胆汁性腹膜炎の誘導は切除残存肝のDNA合成の発現を有意に遅延させ低下させたが、scavengerは肝再生発現の遅延は改善しないものの、肝再生の低下を有意に改善した。残存肝の脂質過酸化をTBA法により測定したMDAにて評価すると、肝切除のみでは亢進せず,胆汁性腹膜炎でみられた有意に亢進(約7倍)は,scavengerの投与にて約1/2に抑制され、生存率も有意に改善され、生存率も有意に改善された.胆汁性腹膜炎で残存肝energy chargeの低下がより大きく,回復も遅れる傾向にあり、血中endotoxin(Et)の軽度上昇も認められた。Etが活性酸素の生成を促し、残存肝における脂質過酸化反応亢進の原因の一部を担っているが,胆汁成分の直接的なミトコンドリア膜障害によるエネルギー代謝障害が肝再生障害を引き起こすものと考えられた.肝切除後の胆汁性腹膜炎による肝再生障害について,ラットを用い実験的に検討した。Etが活性酸素の生成を促し、残存肝における脂質過酸化反応亢進の原因の一部を担っているが,胆汁成分の直接的なミトコンドリア膜障害によるエネルギー代謝障害が肝再生障害を引き起こすものと考えられた.
前立腺肥大症に対する新規分子標的治療法開発のためのＫＩＴ陽性間質細胞の機能解明

我々は前立腺肥大症(BPH)におけるKIT陽性細胞の役割についてヒト前立腺組織ならびにヒト前立腺間質細胞系(PrSC)を用いて検討した。RT-PCR、ウエスタンブロットで前立腺間質にKITが発現していることを確認した。さらにKITリガンドであるSCFが前立腺の増殖に関与し、KIT阻害剤であるイマチニブがそれを抑制することを確認した。この抑制はJAK2とSTAT1を介する経路を抑制していた。以上の結果から、SCF/KITシグナルを調整することによる、是韻律線肥大症に対する新しい分子標的治療薬の可能性が示唆された。前立腺肥大症に対する薬物療法は前立腺平滑筋の過緊張を緩和させるα1受容体阻害剤および前立腺容量を縮小させる5α還元酵素阻害剤が主に用いられている。しかし、前立腺の収縮機構および増殖機構に関しては未だ詳細に解明されておらず、これらの解明が新規治療薬の開発につながると考えている。消化管にはカハールの介在細胞が存在しており、消化管の自動運動の源であることがわかっている。この細胞は細胞膜にc-kit遺伝子によりコードされるKit(受容体型チロシンキナーゼ)を発現しており、細胞増殖にも関与していると言われている。近年、ヒト前立腺においても平滑筋の自発収縮が報告され、Kit陽性間質細胞が存在することから、前立腺肥大症の病態生理において、Kit陽性細胞が主要な役割を担っているのではないかと推察した。そこで本研究では前立腺におけるKit陽性細胞の役割を明らかにし、前立腺肥大症に対する新規分子標的治療の開発につなげたい。昨年度は、、ヒトおよびモルモット前立腺においてKit陽性細胞を同定した。Kitに対する抑制因子であるメシル酸イマチニブの投与により、前立腺自動運動は濃度依存的に抑制されることを確認した。前立腺におけるKit陽性細胞の役割を明らかにするため、以下の実験を行った。等尺性収縮法を用いてモルモット前立腺の自動運動を確認し、Kitに対する抑制因子であるメシル酸イマチニブを投与することで前立腺の自動運動が抑制されたこ。また、KitのリガンドであるSCFを投与することで自動運動はより活発化した。このことからKIT陽性細胞は前立腺自発収縮に関与していると考えられた。次にヒト前立腺細胞(Prostate Stromal Cells、Prostate Smooth Muscle CellsおよびProstate Epithelial Cells)を培養し、Kitに対する抑制因子であるイマチニブを作用させ、MTT assayにより細胞増殖能を検討し、Kit陽性細胞の前立腺における細胞増殖への関与を検討したところ、イマチニブの濃度依存的に増殖が抑制された。またこの細胞増殖において、SCF/KITシグナルの下流にはJAK2/STAT1を介する経が明らかにされた。さらに前立腺肥大症モデルラットを用いてコントロール群、イマチニブ投与群を設定し、各群間で排尿記録のパターン、Kit陽性細胞の分布、平滑筋機能などを比較検討をしたところ、イマニチブ投与群において前立腺重量の縮小はみたものの、排尿パターンには有意な差は見られなかった。これらの結果から、Kit陽性細胞は前立腺平滑筋の収縮ならびに増殖に関与することが、その活性を抑制することが前立腺肥大症に対する新しい薬理学的治療薬の開発につながると期待される。当該年度に実施した研究の成果について記載する。実験動物(モルモット)およびヒト前立腺におけるKit陽性細胞の確認するため、免疫組織化学染色および分子生物学的解析(PCR、Western blotting)を用いることにより、ヒトおよびモルモット前立腺においてKit陽性細胞を同定した。前立腺自動運動に対するKit陽性細胞の役割を検討するため、まず等尺性収縮法を用いてモルモット前立腺の自動運動を確認した。Kitに対する抑制因子であるメシル酸イマチニブの投与により、前立腺自動運動は濃度依存的に抑制された。平成24年度は以下の2項目を計画していた。1前立腺肥大症モデルラットの作成2前立腺における細胞増殖機構の解明。1については、モデルラットを作成する技術を十分に習得することができ目的を達成できた。2についても、KITリガンドによりヒト前立腺培養細胞の細胞増殖能およびKITシグナル伝達系の下流蛋白であるJAK2・STAT1の発現を亢進することが確認できた。