hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
修復・転写・細胞周期に関わるＭａｄ２Ｌ２シグナリング複合体の構造生物学

Mad2L2は,細胞周期のG2/M期からM期にかけてユビキチンリガーゼAPCCdh1に結合しAPCCdh1の活性を阻害している.赤痢菌の産生するIpaBはMad2L2と結合することで,Mad2L2のAPCCdh1を阻害する機能を阻害し,APCCdh1は活性化する.APCCdh1の活性化によって細胞周期が遅延し,赤痢菌は効率的に腸管上皮細胞に感染する.IpaBはMad2L2との相互作用に重要であると考えられているプロリンがアラニンに変異している.そこで,IpaBとの相互作用機構を明らかにするために,Mad2L2-IpaB複合体のX線結晶構造解析を行った.複合体を安定に得る調製法を確立し,X線結晶構造解析に適した結晶を得た.つくばフォトンファクトリーBL-1Aにおいて低エネルギーX線を用いたデータ測定を行い,SAD法によって電子密度を得た.しかし,IpaBのコイルドコイル構造に相当する電子密度は確認出来たものの,Mad2L2の明瞭な電子密度は確認出来なかった.一方,すでに構造解析に成功しているMad2L2-REV3複合体において,Mad2L2との相互作用に重要なREV3のプロリンをアラニンに変異させ, IpaBを模倣した複合体のX線結晶構造解析を行った.その結果,プロリンの変異によって生じた空間を水分子が占有し,水素結合ネットワークを形成することで複合体形成に寄与していた.この結果から,Mad2L2-IpaB複合体においても同様な水分子を介した相互作用が形成されていることが予想された.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。Mad2L2は,「DNA修復」,「転写」,「細胞周期」に関わるタンパク質である.「DNA修復」において, Mad2L2は誤りがちなDNAポリメラーゼであるREV1およびREV3と複合体を作りDNA損傷による複製停止を回避する.「転写」では,転写因子TCF4と複合体を作り, E-カドヘリンの発現を促進する.「細胞周期」のM期からM/G1期にかけて, Mad2L2は様々なタンパク質と相互作用し,細胞周期を制御する.また,赤痢菌のIpaBはMad2L2と結合し, Mad2L2の阻害複合体を形成し,宿主の細胞周期を変調させる. Mad2L2シグナリング複合体の構造機能相関は不明な点が多く,構造解析が求められている.本研究では, Mad2L2複合体の構造解析によって, Mad2L2が機能する現場を捕らえ,タンパク質間相互作用と細胞内シグナルの制御機構を明らかにする. H25年度はMad2L2と赤痢菌由来のIpaBとの複合体の調製,結晶化, X線回折実験を行い, 3.1オングストローム分解能の回折データを集積した.今後はセレノメチオニンを利用した構造解析を進め, Mad2L2による複合体形成とシグナリング機構を解明する.Mad2L2は,細胞周期のG2/M期からM期にかけてユビキチンリガーゼAPCCdh1に結合しAPCCdh1の活性を阻害している.赤痢菌の産生するIpaBはMad2L2と結合することで,Mad2L2のAPCCdh1を阻害する機能を阻害し,APCCdh1は活性化する.APCCdh1の活性化によって細胞周期が遅延し,赤痢菌は効率的に腸管上皮細胞に感染する.IpaBはMad2L2との相互作用に重要であると考えられているプロリンがアラニンに変異している.そこで,IpaBとの相互作用機構を明らかにするために,Mad2L2-IpaB複合体のX線結晶構造解析を行った.複合体を安定に得る調製法を確立し,X線結晶構造解析に適した結晶を得た.つくばフォトンファクトリーBL-1Aにおいて低エネルギーX線を用いたデータ測定を行い,SAD法によって電子密度を得た.しかし,IpaBのコイルドコイル構造に相当する電子密度は確認出来たものの,Mad2L2の明瞭な電子密度は確認出来なかった.一方,すでに構造解析に成功しているMad2L2-REV3複合体において,Mad2L2との相互作用に重要なREV3のプロリンをアラニンに変異させ, IpaBを模倣した複合体のX線結晶構造解析を行った.その結果,プロリンの変異によって生じた空間を水分子が占有し,水素結合ネットワークを形成することで複合体形成に寄与していた.この結果から,Mad2L2-IpaB複合体においても同様な水分子を介した相互作用が形成されていることが予想された.26年度が最終年度であるため、記入しない。Mad2L2-IpaB複合体の精製条件の検討を含めた結晶化条件の改良とX線回折実験を行い, 3.1オングストローム分解能の回折データを収集できた.また,実験的な位相決定のため,重原子同型置換結晶の調製やセレノメチオニン標識タンパク質の調製を進めた.その結果,メチオニン要求大腸菌を用いてセレノメチオニン標識タンパク質の調製に成功している.また, Mad2L2-CAMP複合体の調製も進めている.H25年度は結晶化条件の検討と放射光を利用したX線回折実験によって,結晶化条件の最適化を行うことが出来た.その結果, 3.1オングストローム分解能の回折強度データを収集することに成功した.しかし既知構造をモデル分子とした分子置換法では構造解析に至らなかった.そこで,重原子同型置換法による構造解析を試みたが有効な重原子誘導体結晶を作製することが出来なかった.

したがって,現在ではセレノメチオニンを利用した構造解析を進めている. H26年度はセレノメチオニンで標識したMad2L2-IpaBを調製し,異常分散効果を利用した構造解析によってMad2L2-IpaBの立体構造を解明する.さらに変異体実験から相互作用メカニズムを解明する.これまでに,大腸菌の発現系を用いた組換えタンパク質の調製を試みたが, CAMPの発現量が低く,目的タンパク質を得ることが出来なかった.そこでH26年度は大腸菌のコドンに最適化したCAMP遺伝子を用いて, Mad2L2-CAMP複合体の調製を行い, X線結晶構造解析を進める.具体的には, Mad2L2-IpaB複合体の系を参考に, Novagen社のpET-DuetベクターにMad2L2遺伝子と最適化したCAMP遺伝子を導入し,共発現によってMad2L2-CAMP複合体を得る.精製および結晶化はMad2L2-IpaBと同様な戦略で進め, X線結晶構造解析を目指す.
がん発症と進行におけるアファディンの役割

アクチン結合蛋白質アファディンは、イムノグロブリン様細胞接着分子nectinの細胞質ドメインに作用し、細胞骨格リモデリングを調節すると考えられている。本研究ではアファディンの発がんおよび転移機構への関与を生体内で検証した。アファディンを欠損した腸上皮では傍細胞透過性が充進し、化学発がん実験モデルでは有意に発がん率が上昇していた。アファディンは腸上皮細胞のホメオスタシスを調節し、炎症による大腸発がん促進作用に抑制的に機能することが示唆された。本研究課題は、細胞接着および細胞運動を調節する分子のがん形質に及ぼす影響を個体レベルで解明しようとするものである。特に、がん組織と異種細胞間の接着に関与するイムノグロブリン様膜貫通型蛋白質nectinファミリー蛋白質の細胞内共通アダプター蛋白質であり、細胞骨格リモデリングおよび極性形成に関わるアクチン結合蛋白質afadinに着目し、afadin腸上皮細胞特異的欠損マウスを用いて大腸がん形成およびがん形質の検討を行った。腸上皮細胞特異的afadin欠損マウスは腸上皮細胞の傍細胞透過性の上昇、腸上皮細胞に傷害を与えるdextran sulfatesodium(DSS)処理に対する感受性の亢進を示し、さらに低分子量G蛋白質Rap1の活性低下が観察された。また、このマウスに大腸化学発がん実験を適用し、initiatorとしてazoxymethane(AOM)、promoterとしてDSSを処理すると、野生型に比べafadin欠損下では大腸がん形成が有意に増加していた。これらの結果からafadinは腸上皮細胞のバリア機能とホメオスタシスを調節し、炎症性の大腸がん形成に抑制的に作用することが示唆された。ヒト大腸がん培養細胞を用いたafadinノックダウン実験では、細胞骨格再構成を伴うシグナルに対して細胞形態変化および細胞間接着面へのアクチン集積低下が観察された。同時に低分子量G蛋白質RapおよびRacの活性低下と不活性型integrinβ1の蓄積がみられ、wound healing assayによる細胞運動能の低下も示した。以上より、腸上皮細胞では細胞骨格リモデリングの調節が発がんおよびがん細胞運動に影響し、afadinがその役割を担っていることが示唆された。特に、がん組織と異種細胞間の接着に関与するイムノグロブリン様膜貫通型蛋白質nectinファミリー蛋白質の細胞内共通アダプター蛋白質であり、細胞運動および極性形成に関わるアクチン結合蛋白質afadinに着目し、afadin腸上皮細胞特異的欠損マウスを用いて大腸がん形成およびがん形質の検討を進めている。このマウスに大腸化学発がん実験を適用し、initiatorとしてazoxymethane(AOM)、promoterとしてDSSを処理すると、野生型に比べafadin欠損下では大腸がん形成が有意に増加していた。またヒト大腸がん培養細胞を用いてafadinノックダウン実験も行った。DLD-1細胞でafadinをノックダウンすると、細胞骨格再構成を伴うシグナルに対して細胞形態変化および細胞間接着面へのアクチン集積低下が観察され、afadinは腸上皮細胞で細胞骨格リモデリング過程においてアクチンを細胞間接着部位に集積させる働きを持つことが明らかとなった。Afadinのがん形成および悪性化における役割を明らかとするため、平成23年度は、マウス個体を用いた化学発がん実験、APC遺伝子変異モデルマウスでのポリープ形成能検討、乳がん転移モデルマウスの導入、および培養細胞レベルでのafadin欠損解析を計画した。腸上皮細胞特異的afadin欠損マウスを用いた化学発がん実験結果によりafadin欠損は炎症性の大腸がん形成に対し促進的に働くことが明らかとなった。さらにAPC遺伝子変異マウスとの交配により、発がん率およびがん形質の検討も行っている。また大腸発がんモデルとは別に、肺転移効率の変化を確認するための転移モデルとして乳腺上皮細胞にpolyomamiddleT antigenを発現するトランスジェニックマウス(MMTV-PyVTマウス)との交配も進め、MMTV-PyVT/afadin欠損マウスも作製中である。同時に培養細胞レベルではnectinに依存しないafadin機能解析を行うため、遺伝子導入あるいはノックダウン実験を行い、平成24年度の計画で使用予定の培養細胞株の樹立も終了している。平成23年度の実験計画はほぼ予定通り進行しており、現在までにafadinの大腸がん形成における抑制的作用を個体レベルで明らかとした。

大腸化学発がんにおけるafadinの抑制的役割に関しての研究成果の発表と、さらにafadinのがん形成および悪性化に対する役割を明らかとする目的で、APC遺伝子変異モデルマウスを用いたがん形質の検討、乳がん転移モデルマウスの作製と解析を引き続き進めていく。また当初の計画通り、平成23年度に遺伝子導入したヒト大腸がん細胞を用い、平成24年度は低分子量G蛋白質の活性測定を含む分子レベルでの実験を進め、nectin依存性および非依存性シグナルを明らかにする予定である。平成24年度はおもに研究成果発表の諸経費と、転移モデルマウス実験におけるマウス作製および維持、またマウス組織病理解析時の免疫染色に必要となる試薬類の購入、さらに培養細胞を用いたafadin機能解析実験での培養試薬、免疫染色試薬、蛋白活性測定キットの購入に研究費を使用する予定である。
活性化するフィリピン・タール火山の噴火予知と火山災害の研究

フィリピン・ルソン島の地殻活動は現在極めて活発である。1990年7月にフィリピン地震が発生,翌年6月には今世紀最大といわれるピナツボ火山大噴火が起きた。しかも時期も前後して,マニラの南60kmにあるタール火山の地震活動が活発になった。タール火山は1965年に水蒸気爆発を起こし,タール湖周辺の住民数百名が死亡した。その後、数回の火山・地震活動が活発になったが,大噴火を起こすに至っていない。ところが,活動は断続的に継続し,1991年3月,1994年3月にはタール火山島の住民に避難命令が出ている。このような中で,タール火山の噴火予知のためには,火山構造の調査が欠かせないことが明らかになった。マグマ溜りの位置,大きさ,ベントの位置,さらに深部のマグマ供給源の位置,その形態を知ることは,タール火山の噴火予知,災害防止,調査研究立案にとって極めて重要なものと思われる。昨年度より,タール火山の構造調査のために,人工震源を用いた構造調査が開始された。昨年度は,タール火山湖の周囲に臨時地震観測点を配置し,人工震源として50mの深さの孔内にダイナマイト300kgを入れて爆発させ,伝播する波を観測することにより,地下構造の推定を行った。解析の結果,現在のカルデル湖内火山島の中心部の下に,地震波の減衰域が存在することが明らかになった。さらにP波の後続波として,深さ10km付近で反射してきたと思われる反射波も検出された。マグマ溜りは,この反射面つまり部分溶融面から供給されたものと考えられる。本年度は,上記で得られた構造をさらに確かめるためにタール火山カルデル湖周辺での重力測定,火山岩石学的調査,自然地震と人工震源を用いた火山構造調査を実施した。以下に簡単に記述する。(1)重力測定タール湖および周辺の地殻構造測定のため,湖周辺の200点で重力測定を実施した。位置はGPSの単独測位と地図を基に確認し,高度な湖面からの高さを水準測量によって測定した。高さの精度は数cmと推定される。重力測定は,ラコステ重力計を用いて行われた。測定精度は数マイクロガルである。現在はこれらのデータの解析中であるが,昨年度に得られた結果と調和的であることが確認された。また、すでに横山他が重力調査を行っているが,それらの結果とも一致しており,さらに詳しい結果が得られていると言うべきであろう。(2)火山岩石学的調査タール火山はピナツボを含む火山列に属し,マニラ海溝からの沈み込みに伴う弧状列島型の火山と考えられる。しかしながら,タール火山から南へ向かうと火山列は東西に並び種々の点で弧状列島の火山群と異なる配列をなす。これらの配列は引張力の下で形成されたとの考えもある。このような点から,岩石学的に分析・調査を行うことが必要とされる。タール火山および周辺域の多数点でサンプリングを行い,現在分析中である。(3)自然地震のアレイ地震観測タール湖内の地震活動は現在低下しているものの,地震波源としては極めて重要なものである。今年度は特に火山島下の反射面の精度良い検出を目的として小スパンのアレイ観測を実施した。1月中旬より3月上旬までの50数日にわたり,トリガー方式で収録を進めた。収録されたイベントは2000個にのぼったが,地震と思われるものは小数である。現在解析が進められている。(4)人工地震観測タール火山島南西の湖岸に深さ7mのボーリング孔を6本堀り,それぞれにダイナマイト30kgを入れ,同時に爆発させ,地震波を収録した。地震記録は,北岸のピラピラソ-,および北東岸の臨時小スパンアレイ,フィリピン・フランス共同の常設テレメータ観測点のすべてで明瞭な波形が収録された。現在これらのデータの解析が進められている。予備的な解析結果では,明瞭な反射波が得られていないようであり,今後の検討が急がれている。上記のように,昨年度と今年度の観測と調査に基づく成果は当初の目的を達成し,今後の発展へつなぐものとなったと結論できる。

昨年度は,タール火山湖の周囲に臨時地震観測点を配置し,人工震源として50mの深さの孔内にダイナマイト300kgを入れて爆発させ,伝播する波を観測することにより,地下構造の推定を行った。解析の結果,現在のカルデル湖内火山島の中心部の下に,地震波の減衰域が存在することが明らかになった。さらにP波の後続波として,深さ10km付近で反射してきたと思われる反射波も検出された。マグマ溜りは,この反射面つまり部分溶融面から供給されたものと考えられる。本年度は,上記で得られた構造をさらに確かめるためにタール火山カルデル湖周辺での重力測定,火山岩石学的調査,自然地震と人工震源を用いた火山構造調査を実施した。以下に簡単に記述する。(1)重力測定タール湖および周辺の地殻構造測定のため,湖周辺の200点で重力測定を実施した。位置はGPSの単独測位と地図を基に確認し,高度な湖面からの高さを水準測量によって測定した。高さの精度は数cmと推定される。重力測定は,ラコステ重力計を用いて行われた。測定精度は数マイクロガルである。現在はこれらのデータの解析中であるが,昨年度に得られた結果と調和的であることが確認された。また、すでに横山他が重力調査を行っているが,それらの結果とも一致しており,さらに詳しい結果が得られていると言うべきであろう。(2)火山岩石学的調査タール火山はピナツボを含む火山列に属し,マニラ海溝からの沈み込みに伴う弧状列島型の火山と考えられる。しかしながら,タール火山から南へ向かうと火山列は東西に並び種々の点で弧状列島の火山群と異なる配列をなす。これらの配列は引張力の下で形成されたとの考えもある。このような点から,岩石学的に分析・調査を行うことが必要とされる。タール火山および周辺域の多数点でサンプリングを行い,現在分析中である。(3)自然地震のアレイ地震観測タール湖内の地震活動は現在低下しているものの,地震波源としては極めて重要なものである。今年度は特に火山島下の反射面の精度良い検出を目的として小スパンのアレイ観測を実施した。1月中旬より3月上旬までの50数日にわたり,トリガー方式で収録を進めた。収録されたイベントは2000個にのぼったが,地震と思われるものは小数である。現在解析が進められている。(4)人工地震観測タール火山島南西の湖岸に深さ7mのボーリング孔を6本堀り,それぞれにダイナマイト30kgを入れ,同時に爆発させ,地震波を収録した。地震記録は,北岸のピラピラソ-,および北東岸の臨時小スパンアレイ,フィリピン・フランス共同の常設テレメータ観測点のすべてで明瞭な波形が収録された。現在これらのデータの解析が進められている。予備的な解析結果では,明瞭な反射波が得られていないようであり,今後の検討が急がれている。上記のように,昨年度と今年度の観測と調査に基づく成果は当初の目的を達成し,今後の発展へつなぐものとなったと結論できる。フィリピン・ルソン島のタール火山は,爆発的な噴火をする火山として世界的に知られている。1991年ピナツボ火山大噴火直前に,タール火山の地震活動が活発となり,フィリピン火山地震研究所からの要請で京大防災研究所より地震観測チームが派遣された。これを契機に本研究が企画された。本年度の課題は,〔1〕タール火山外輪山のタガイタイ観測所に設置されたSTS地震観測システムの保守・管理と時刻精度の改善,および収録データの解析,〔2〕タール火山下の地下構造の人工震源を用いた研究。課題
CRISPRゲノム編集法によるCaspase-11依存的パイロトーシスの解析

Caspase-11依存的なパイロトーシスの誘導には、GBP2依存的なグラム陰性菌の膜破壊が重要である。膜破壊のモデルとして寄生虫であるトキソプラズマを使用した研究は重要な知見をもたらす。ヒトには主にトキソプラズマが感染している肉を加熱不十分で食することによって感染し、エイズや抗癌剤治療下にある免疫不全患者に致死性の脳症や心筋炎を引き起こす他、妊婦が初感染すると流産または新生児の先天性疾患の原因になり、わが国でも症例数が増加している。トキソプラズマに対してわれわれ宿主はインターフェロンガンマに依存した免疫反応を起こし対抗するが、その免疫反応がどのように抑制されているのかについては全く不明であった。本研究で、インターフェロンガンマによって誘導されるトキソプラズマを破壊する免疫反応が、宿主からRabGDIαを取り除くことによって著しく増強され、その結果、トキソプラズマ原虫数が少なくなること、高力価トキソプラズマ感染でも、RabGDIα欠損マウスは生存率が高く、致死的な脳症の程度が軽いこと、RabGDIαに存在する脂質結合ポケットが、そのブレーキ機能に必須であることを示した。本研究成果は、RabGDIαの機能を阻害することによってトキソプラズマに対する免疫機能が大幅に増強し、トキソプラズマ脳症の重症度が改善されたことから、近年我が国においても症例報告が急増しているトキソプラズマ症に対して、RabGDIαという新たな分子を標的とした新規治療戦略を提供できる。さらにRabGDIαがCaspase-11依存的なパイロトーシスの誘導の負の制御因子である可能性も示唆された。28年度が最終年度であるため、記入しない。空胞形成病原体を介したCaspase-11依存的なパイロトーシスの活性化には、空胞の膜が破壊される必要があるが、空胞膜の破壊機構及びそれに伴ってどのような宿主応答が起きるかについては不明な点が多い。そこで本研究においては、モデルとしてトキソプラズマを使って、空胞膜破壊機構について解析した。トキソプラズマはエイズや抗癌剤投与下にある免疫不全の大人で致死的な脳炎や肺炎を引き起こす病原体である。また、健康な妊婦が初感染すると胎児に垂直感染し流産や死産、さらには新生児がトキソプラズマに感染した状態で生まれ先天性疾患の原因ともなる。しかし、トキソプラズマの空胞(寄生胞)がどのようにして壊され、その結果免疫的効果を発揮するのかよく分かっていなかった。本研究で1インターフェロンガンマ刺激依存的に宿主タンパク質であるp62がトキソプラズマに蓄積すること、2トキソプラズマ感染細胞では、p62とインターフェロンガンマ依存的にキラーT細胞活性化能が高まること、3p62欠損マウス個体で、トキソプラズマ不活化ワクチン投与に対するキラーT細胞活性が著しく低下することを示した。本研究成果は、近年我が国においても症例報告が急増しているトキソプラズマ症に対して、p62という新たな分子を標的とした新規のトキソプラズマ不活化ワクチン開発戦略を提供できるものとして大いに期待できるとともに、空胞破壊に伴う細胞死を伴う宿主応答機構に示唆を与えた。本研究成果は、米国の科学雑誌『Cell Reports』に掲載された。本研究成果を、米国の科学雑誌『Cell Reports』に掲載することができたため。トキソプラズマのみならず、Caspase-11を活性化するサルモネラやシトロバクターなどのグラム陰性バクテリアに対する免疫系の活性化に、パイロトーシスがどのように関与するのかを包括的に明らかにしていく。
微小梗塞・血液バイオマーカーによる頚動脈狭窄症の認知症発症機序解明に関する研究

内頚動脈狭窄症は高齢者に多く,認知機能低下と関与することが知られている.内頸動脈狭窄症患者では,ラクナ梗塞,皮質脳梗塞,大脳白質病変などの虚血性脳障害が認知機能低下と関連することが報告されているが,このような粗大な病変がない症例でも認知機能低下を認めることがあり,微小な虚血性病変である皮質微小梗塞(CMI)が認知機能低下に関与している可能性がある.内頚動脈狭窄患者において,DIR画像を用いた3T MRI検査により検出される皮質微小梗塞と臨床的・画像的特徴,血液バイオマーカー及び認知機能との関連を検討した.当科外来を受診した頚動脈エコーで内頚動脈狭窄症(>30%)を有する89例を前向きに登録し,頚部・脳MRI検査を撮影して,血液検査と神経心理検査を行った.CMIは脳MRIの3D-DIR画像と3D-FLAIR画像で高信号を示し、T1強調画像で低信号を示す、径5mm未満で皮質に限局する病変と定義した.内頚動脈の狭窄率はMRAでNASCET法を用いて評価した.3DT1強調black blood画像で,胸鎖乳突筋に対するプラーク内の信号比が150%以上の場合にプラーク内出血と定義した.内頸動脈狭窄症患者においてCMIは患側で有意に多く,プラークの不安定性を反映するプラーク内出血と関連したことから,CMIの機序としてプラークからの微小塞栓の関与が考えられた.また皮質微小梗塞は,認知機能全般の低下及び,処理速度と視覚認知機能の低下と関連した.血液バイオマーカーとの関連は認めなかった.以上の成果から,内頚動脈狭窄患者において,不安定プラークは皮質微小梗塞のリスクを増し,それに伴う認知機能障害を起こしうることが明らかとなった.頚動脈硬化症は認知症の潜在的治療ターゲットとなり得る可能性を見出した.本研究では、頚動脈狭窄症で認知症を発症するメカニズムを解明を目指したものである。そのため、3Tesla MRIのDIR画像を用いて微小梗塞を検出し、主に以下の3点に関して調査を行っている。1)頚動脈狭窄症患者における微小梗塞の特徴を明らかとする。2)微小梗塞の予測因子に関する検討として、臨床的特徴である年齢、性別、高血圧、脂質異常症、糖尿病、喫煙といった血管危険因子の他に頚動脈狭窄の性状、血液バイオマーカーを含めた解析を行う。3)微小梗塞が認知機能に及ぼす影響に関する検討を行う。平成29年度には、当初想定した頚動脈狭窄症例100例の登録を行った。それぞれの症例に対して記憶、言語機能、注意・実行機能、視空間機能といった項目を含めた詳細な神経心理検査、DIR画像を含めた頭部MRI検査を完遂した。現在、微小梗塞による頚動脈狭窄症の認知機能低下を呈する機序に関して統計・画像解析を進めており、研究成果に関して、2018年5月に行われる第59回日本神経学会学術大会で報告予定であり、学術誌への投稿も計画している。また頚動脈狭窄症患者における微小梗塞や認知機能低下に関わる血液バイオマーカーを探索するために、100例余りに及ぶ血清保存も完了している。今後、これらの保存血清を用いて、血液バイオマーカーの測定を行い、これらの血液バイオマーカーが微小梗塞や認知機能低下の予測因子となるか解析をすすめていく予定である。平成29年度は当初の予定通り、症例の登録、各種検査の実施、画像撮影・解析を行ったため、血液バイオマーカーの測定に関する進捗がやや遅れた。内頚動脈狭窄症は高齢者に多く,認知機能低下と関与することが知られている.内頸動脈狭窄症患者では,ラクナ梗塞,皮質脳梗塞,大脳白質病変などの虚血性脳障害が認知機能低下と関連することが報告されているが,このような粗大な病変がない症例でも認知機能低下を認めることがあり,微小な虚血性病変である皮質微小梗塞(CMI)が認知機能低下に関与している可能性がある.内頚動脈狭窄患者において,DIR画像を用いた3T MRI検査により検出される皮質微小梗塞と臨床的・画像的特徴,血液バイオマーカー及び認知機能との関連を検討した.当科外来を受診した頚動脈エコーで内頚動脈狭窄症(>30%)を有する89例を前向きに登録し,頚部・脳MRI検査を撮影して,血液検査と神経心理検査を行った.CMIは脳MRIの3D-DIR画像と3D-FLAIR画像で高信号を示し、T1強調画像で低信号を示す、径5mm未満で皮質に限局する病変と定義した.内頚動脈の狭窄率はMRAでNASCET法を用いて評価した.3DT1強調black blood画像で,胸鎖乳突筋に対するプラーク内の信号比が150%以上の場合にプラーク内出血と定義した.内頸動脈狭窄症患者においてCMIは患側で有意に多く,プラークの不安定性を反映するプラーク内出血と関連したことから,CMIの機序としてプラークからの微小塞栓の関与が考えられた.また皮質微小梗塞は,認知機能全般の低下及び,処理速度と視覚認知機能の低下と関連した.血液バイオマーカーとの関連は認めなかった.以上の成果から,内頚動脈狭窄患者において,不安定プラークは皮質微小梗塞のリスクを増し,それに伴う認知機能障害を起こしうることが明らかとなった.頚動脈硬化症は認知症の潜在的治療ターゲットとなり得る可能性を見出した.頚動脈狭窄症患者における認知機能低下のメカニズム解明に向けて、血液バイオマーカーの測定・解析を行い、研究を推進していく。次年度使用額が生じた理由として、詳細な画像解析及び、血液バイオマーカーの測定が遅れたことが挙げられる。
真核生物の電子伝達機構の多様性と分子進化

糸状菌は、新規かつ多様な細胞外電子シャトルを用いて、細胞内のレッドクス恒常性を調節し、その調節には、細胞内NAD+ /NADH量の調節が関わる。本研究では、Aspergillus nidulansをモデルとして、この解明を目指した。具体的には、Nudix hydrolaseであるAnNUDT1 (NdxA)が細胞内のNAD+/NADHを加水分解することでチアミン生合成や解糖系代謝が調節されることを見出した。また、サーチュインを介したヒストンアセチル化による二次代謝産物の生合成も調節することも明らかにできた。得られた成果は真核生物の電子伝達反応の多様性の理解と糸状菌の産業利用の効率化に貢献する。本研究では、古くから遺伝学の研究対象とされゲノム解析も終了したカビ(真菌・糸状菌)Aspergillus nidulansを真核生物の新たなモデルとして用いて、その低酸素環境への応答・適応機構を解明する。申請者のこれまでの研究から、A. nidulansの低酸素応答・適応は複雑な現象の組み合わせであることが明らかとなりつつある。本年度は、特に、細胞外電子シャトルと細胞内レッドクス恒常性の維持機構についての以下の研究を行った。これまでに、申請者は、酸素欠乏下で酸素の代わりとして利用可能な様々な細胞外電子受容体を検索し、それまでに報告してきた硝酸塩・亜硝酸塩に加えて、元素状硫黄、鉄イオン、フミン酸などの環境中に広く分布する不・難溶性化合物がA. nidulansの電子受容体となりうることを発見した。また、元素状硫黄の還元がポリスルフィドを解した細胞外電子シャトルによる元素状硫黄の解毒の生理的意義を持つことを示したが、このときの細胞内での代謝変化については未解明であるのでこれを解明することは重要である。そこで、新たに見出した鉄イオンとフミン酸への細胞外電子シャトル機構の構成成分を同定すべく、当該菌から、それを担う酵素の精製を試み、これを継続している。また、プロテオームの手法を用いて、このときの細胞内代謝変化を追跡した。また、これらの電子伝達反応に関する電子供与体、最適培養条件、菌体の生育に対する影響を初めとする生理学的知見を明らかとすることができた。これまでに、申請者は、酸素欠乏下で酸素の代わりとして利用可能な様々な細胞外電子受容体を検索し、それまでに報告してきた硝酸塩・亜硝酸塩に加えて、一酸化窒素、鉄イオン(Fe3+)、フミン酸などの環境中に広く分布する不・難溶性化合物が糸状菌Aspergillus nidulansの電子受容体となりうることを発見した。また、元素状硫黄の還元がポリスルフィドを解した細胞外電子シャトルによる元素状硫黄の解毒の生理的意義を持つことを示した。しかし、このときの細胞内での代謝変化については未解明であった。そこで、本年度までに、細胞外電子シャトルと細胞内レッドクス恒常性の維持機構の解明に焦点を絞った研究を展開した。また、新たに見出したFe3+とフミン酸への細胞外電子シャトル機構の構成成分を同定するとともに、フミン酸の代謝能が強かったAspergillus nidulansを用いて,糸状菌によるフミン酸代謝の分子機構を解明することを試みた。最少液体培地にA. nidulansの分生子を添加して12時間振とう培養した後、これに0.1%フミン酸を添加し,さらに324時間培養した菌体から全RNAを抽出し,DNAマイクロアレイ解析を行った。遺伝子発現パターンによるクラスター解析の結果,フミン酸の添加後に伴い発現が上昇するクラスターには,カルボン酸,有機質,脂肪酸(GO No. 46395,1901575,6631)の代謝遺伝子が多く見られた。また、芳香族の分解に関わるFlavin-containingmonooxygenaseおよびCytochrome P450遺伝子群のうち、それぞれAN10582、AN7522の発現が上昇しており、これらがフミン酸の代謝になんらかの機能を有すると考えられた。本年度は、一酸化窒素(NO)耐性遺伝子に関する研究を精力的に進め、まとめた。具体的には、25,000株の形質転換体から取得した31のNO耐性化クローンについて、プラスミドのインサート領域に導入された遺伝子を同定した。各遺伝子の高発現株の作製とNO耐性の検定を通して、NO耐性に寄与する遺伝子としてnapA、proC、rbgB、riboBを特定した。proC、rbgB、riboBのNO耐性機能は初めての発見であった。引き続き、proC/rbgBが関わるNO耐性機構についての解析を進めた。まず、Saccharomyces cerevisiaeのプロリンの生合成に関わるPRO3のオルソログであるproCに注目した。NO供与体の存在下での生育は、proC高発現株で野生株より強く、プロリンを生合成できないproA変異株では野生株より弱かった。また、培地中にプロリンを添加することで、野生株、proC高発現株、proA変異株のすべてでNO条件下での生育が強くなった。さらに、NaNO2を培地に添加した時の細胞内プロリン量は、NaNO2濃度依存的に減少することが明らかになった。他のアミノ酸の多くについてもNO濃度依存的な細胞内濃度の低下が見られた。これらの結果から、細胞内アミノ酸量を低下させアミノ酸飢餓を誘導するというNOの新たな毒性メカニズムが明らかとなった。

糸状菌は、新規かつ多様な細胞外電子シャトルを用いて、細胞内のレッドクス恒常性を調節し、その調節には、細胞内NAD+ /NADH量の調節が関わる。本研究では、Aspergillus nidulansをモデルとして、この解明を目指した。具体的には、Nudix hydrolaseであるAnNUDT1 (NdxA)が細胞内のNAD+/NADHを加水分解することでチアミン生合成や解糖系代謝が調節されることを見出した。また、サーチュインを介したヒストンアセチル化による二次代謝産物の生合成も調節することも明らかにできた。得られた成果は真核生物の電子伝達反応の多様性の理解と糸状菌の産業利用の効率化に貢献する。26年度が最終年度であるため、記入しない。応用微生物学26年度が最終年度であるため、記入しない。研究開始年度で成果発表には至っていないが、計画通り、それにむけた基礎データを蓄積できているため。上述の研究の成果によって、現存の真核生物であるカビが有する細胞外電子伝達系が多様であることが明らかとできた。またこの機構をもつことおよびそのエネルギー維持(呼吸、異化)系としての意義の考察が可能となった点は、基礎科学として意義が大きい。また、研究の過程で、細胞内酸化還元反応に伴って生じるラジカル分子の解毒と耐性化が、糸状菌の細胞外電子伝達に重要であること判明し、特に一酸化窒素解毒という新たな研究へと展開した。これらを総合的に評価し、(2)とした。電子伝達に関わるタンパク質や遺伝子を分子生物学的手法を用いて単離・同定する。研究計画の変更や大きな問題はない。以下を主な課題として推進する。・フミン酸の還元については、A. nidulansが細胞外のフミン酸に応答して変化させる細胞内代謝についての網羅的な解析を引き続き行う。本代謝に関わる遺伝子を予想し、その組み換え酵素の調製と遺伝子破壊株の作製と解析をとおして、それら遺伝子のフミン酸代謝への寄与を特定する。・新たに見出された一酸化窒素耐性化代謝については、耐性化遺伝子の特定と機能の解析をすすめる。具体的には、それら遺伝子の発現パターンの追跡、遺伝子破壊株の作製と解析をとおして、それら遺伝子の機能を分子レベルで明らかにする。電子伝達タンパク質の単離・同定の過程で、上記の生理学的解析が重要であることが判明したので、これに重点を置いた研究を進めた。これに伴い、比較的高価な分子生物学用消耗品の使用が少なくなり、次年度に使用することが研究の遂行上、必要である。
大質量星の進化における重力崩壊型超新星の総合的研究

本研究課題では、太陽の約10倍以上の質量を持ついわゆる大質量星において、その準静的進化段階からコアの重力崩壊と超新星爆発を経て中性子星またはブラックホールの形成に至る過程を理論的に研究した。まず、近似的シミュレーションを数100のモデルに対して行い、爆発前のコアのコンパクトさが爆発のしやすさを決める重要なパラメターであることを明らかにした。一方、人為的近似を用いないより厳密な数値計算を京スーパーコンピューターで行い、現在の知見を総動員したモデルでも実は爆発を再現できないことを明らかにした。また、コードの相対論化も進めた。他方、回転星の歪んだ形状を数値的に求める独自の新たな手法を完成させた。本研究課題では大質量星の進化において、(1)IDSAを用いた重力崩壊後のランドスケープ探査と(2)ボルツマンソルバーによる重力崩壊の精密計算、(3)重力崩壊に至るまでの大質量星の準静的進化の計算、及び(4)ブラックホール形成チャンネルの研究の4つを主たる柱に据えた理論的研究を行っている。以下の本年度の成果を各項目ごとに述べる。まず(1)については、3次元(3D)の超新星シミュレーションを行った。その結果,従来の軸対称(2D)計算に比べて乱流モードがより小さなスケールまでカスケードしてしまうので、3Dでは2Dに比べ爆発を再現するのはより難しいことを明らかにした。またニュートリノ輸送を簡単化した3Dモデルで自転の効果を調べ、自転が爆発を助ける示唆を得た。(2)に関しては、6次元ボルツマン方程式計算コードにより、3次元超新星コアのバウンス後のプロファイルにおけるニュートリノ輻射を系統的に調べて、多次元におけるニュートリノ輻射輸送の特徴を明らかにした。ニュートリノ分布や加熱率について、Ray-by-ray法による近似計算手法との比較を行い、近似法が方向変動を強調しすぎることを、世界で初めて3次元空間のもとで示した。また、流体力学との統合計算コードにより、重力崩壊からコアバウンス、その後の定常降着衝撃波に対する不安定性(SASI)を記述することに成功した。一方(3)については、ラグランジュ的変分法に基づく定式化を行い、モンテカルロ法で数値的に回転平衡解を解くコードを完成させ、いくつかのテスト計算を行った。その結果、従来困難であったbaroclinic状態方程式に対する平衡解も求められることを示し、現在論文を投稿中である。最後に(4)に関しては、(2)で開発したコードの相対論化を進め、ブラックホール形成の計算に向けた準備を進めた。特殊相対論化は完成し、論文投稿中である。今年度は本研究の4本の柱に関して以下のような成果を得た。まず、IDSAを用いたランドスケープ探査に関しては、超新星爆発の3次元輻射流体シミュレーションを世界に先駆けて実行した。輻射計算に関しては、光線分割法によって超並列計算を可能にした独自のスキームを実装しているのが特徴となっている。11太陽質量の親星に関して、重力崩壊からその動的進化を追う、いわゆるこの分野で言うところ第一原理計算において初めて、ニュートリノ加熱メカニズムで爆発が起こる、3次元計算における第一例を報告することができた。次に、ボルツマンソルバーを用いた精密計算については、3次元ニュートリノ輻射輸送を扱うボルツマン方程式を解く計算コードを完成させて、3次元分布におけるニュートリノ輻射輸送の特徴を明らかにすることが可能となった。固武・滝脇らのシミュレーションで得られた超新星コアの3次元分布への適用を行い、光線分割法などの近似計算手法との比較を行い、近似手法によるニュートリノ加熱への影響を探ることができた。3次元計算コードにおける疎行列の反復解法では最適化手法を提案した。大質量星の準静的進化については、ラグランジュ的記述に基づく回転星の平衡形状計算の定式化に進展を見た。具体的には、これまで有限要素法を形式的に応用した定式化を行っていたものを、変分原理に基づくものに変更した。これにより、近似の物理的意味が明確となるとともに、より多くの解法が試せるようになった。実際、ニュートン法に基づく解法では小さい固有値の問題がまだ解決を見ないのに対して、別途モンテカルロ法に基づく解法では球対称解が問題なく求まることがわかった。また、境界条件に関する知見も得られた。最後に、ブラックホール形成チャンネルの研究では、ボルツマンソルバーの特殊相対論化を進め、一般相対論化の足がかりとした。また、他のスキームの検討も行った。本研究課題では大質量星の進化において、(1)IDSAを用いた重力崩壊後のランドスケープ探査と(2)ボルツマンソルバーによる重力崩壊の精密計算、(3)重力崩壊に至るまでの大質量星の準静的進化の算、及び(4)ブラックホール形成チャンネルの研究の4つを主たる柱に据えた理論的研究を行っている。以下に本年度の成果を各項目ごとに述べる。まず(1)については、重力崩壊からコアバウンスを経て衝撃波の停滞およびその後の復活までの3次元のシミュレーションを世界に先駆け行い、その結果を論文や様々な研究会、国際会議で発表した。軸対称2次元とは乱流の性質が異なり、それが爆発のしやすさに影響を与えること、また結果の解像度依存性も明らかにした。一方、軸対称2次元の計算も質量や金属量の異なる300を超える親星モデルに対して行い、結果を系統的に解析した。その結果、コンパクトネスと呼ばれるパラメターが結果を解釈する上で有効であることを明らかにした。

(2)については主としてニュートリノ輸送を記述するボルツマン方程式を差分化して数値的に解くコードの開発チューニングを行った。ここで提案した手法では特殊相対論的効果が全て近似なしに取り込まれているのが大きな特徴である。また、特殊相対論効果を無視して3次元シミュレーションができるように開発したバージョンのボルツマンソルバーを用いてray-by-ray近似と比較し、後者は角度ごとのコントラストを強調しすぎる傾向があることを示した。(3)では、星の回転平衡形状を得るためのラグランジュ変分法を用いた新しい定式化をレター論文として発表した。より詳細な解析を本論文として発表する準備中である。(4)については、(2)のコードを改良するための定式化を終えたところである。この他、大質量星連星における超新星爆発が伴星に与える影響も数値シミュレーションにより調べた。本研究は、(1)IDSAを用いたランドスケープ探査、(2)ボルツマンソルバーによる精密計算、(3)大質量星の準静的進化の計算、(4)ブラックホール形成チャンネルの研究、の4つの柱からなる。以下、各項目に関する今年度の成果を挙げる。(1)初期質量と金属量が異なる総計400モデルにも及ぶ親星に対して、IDSA法を用いた大質量星の重力崩壊の数値シミュレーションを系統的に行った。この結果、親星コアの密度集中度が爆発の可否の可能性を支配的に決める物理量であることを明らかにした。また、爆発エネルギーの成長率が大きいモデルにフォーカスし、数値コードの改良の上、バウンス後7秒にも及ぶ長時間計算を実行し、爆発エネルギーの飽和値が観測値に近くなることを確かめた。(2)京コンピュータにおいて、開発したボルツマンソルバーを用いた超新星の軸対称長時間シミューレションに成功した。また、軸対称を仮定しない6次元ボルツマン方程式による厳密計算と近似計算法を比較することにより、モーメント法による角度分布評価を定量的に行なった。さらに、電子捕獲反応による重力崩壊を記述する計算コードを開発し、核反応によるエネルギー生成の評価方法が超新星に与える影響についても明らかにした。(3)高速回転星の準静的進化を追うため、遠心力を含む軸対称2次元の力学平衡をラグランジュ変分法を用いた独自の手法で数値的に解くコードを開発し、オイラー法を用いた他の定式化による結果との比較を詳細かつ定量的に行った。結果は現在論文としてMNRASに投稿中である。(4)ブラックホール形成を定量的に計算するための一般相対論的ボルツマンソルバーの定式化と開発を行った。特に、原始中性子星の重心が球座標の中心からずれないようにメッシュを動かす手法を一般相対論の3+1分解で定式化する手法を確立した。結果は年度を越えたもののApJSに掲載決定となっている。本研究課題では、太陽の約10倍以上の質量を持ついわゆる大質量星において、その準静的進化段階からコアの重力崩壊と超新星爆発を経て中性子星またはブラックホールの形成に至る過程を理論的に研究した。まず、近似的シミュレーションを数100のモデルに対して行い、爆発前のコアのコンパクトさが爆発のしやすさを決める重要なパラメターであることを明らかにした。
バイオコンバーションを利用した光学活性蛾類性フェロモン大量合成技術の構築

地球環境に配慮した永続的な生産活動が求められ、殺虫剤に依存しない害虫管理法としてフェロモンの利用が注目されている。鱗翅目昆虫ではすでに500種をこえる蛾類昆虫の性フェロモンが同定され、チャハマキやコナガなどでは、合成性フェロモンを圃場に拡散させることによって雌雄間のコミュニケーションを妨害し、交尾を阻害する交信撹乱法が実用化されている。それらフェロモンの殆どは直鎖状不飽和一級アルコールやその誘導体であるが、近年シャクガ類を中心にエポキシアルケン系の化合物も多数同定され、交信撹乱剤としての利用が考えられつつある。ただし、エポキシ化合物は不斉中心を有しており、大量な光学活性体を有機合成的手法で調製することは容易でなく、現在のところ低コストな農業資材とはなり難い。そこで今回、微生物変換を利用して光学活性なエポキシ系性フェロモン、およびそれらの関連化合物を大量に調製する方法の構築を計画した。リノレン酸などにおけるポリエン構造近傍の酸化あるいは不飽和化反応をも視野に入れ、それらの変換を行なう微生物を、国内外の分譲機関から提供される多数の保存株からスクリーニングし、目的とする化合物を大量合成する技術を確立すべく、薬剤耐性を獲得しエポキシ化酵素の特異的な発現が予想される植物病原菌を中心にスクリーニングを行った。その結果、ポリエン炭化水素に加えてリノレン酸などの不飽和脂肪酸に対して構造変換を行う可能性の菌株を数種特定することができた。また、他の構造変換物に関しては現時点では合成標品が無いため、アセチレンカップリング反応などを利用しいくつかの有効な化合物の合成を行うことができた。今後それらの合成標品を指標にして、培養ろ液のGC/MSおよびLC/MS分析を再検討する予定である。鱗翅目昆虫ではすでに500種をこえる蛾類昆虫の性フェロモンが同定され、チャハマキやフナガなどでは、合成性フェロモンを圃場に拡散させることによって雌雄間のコミュニケーションを妨害し、交尾を阻害する交信撹乱法が実用化されている。リノレン酸などにおけるポリエン構造近傍の酸化あるいは不飽和化反応をも視野に入れ、それらの変換を行なう微生物を、国内外の分譲機関から提供される多数の保存株からスクリーニングし、目的とする化合物を大量合成する技術を確立すべく、現在、薬剤耐性を獲得しエポキシ化酵素の特異的な発現が予想される植物病原菌を中心にスクリーニングを行っている。今後さらに国内の微生物分譲機関の支援を受け、ポリエン炭化水素に加えてリノレン酸などの不飽和脂肪酸に対して構造変換を行う菌株を、多数の微生物群からスクリーニングし発見する予定である。また、他の構造変換物に関しては現時点では合成標品が無いため、アセチレンカップリング反応などを利用し有機合成を開始した。得られる合成標品を指標にして、培養ろ液のGC/MSおよびLC/MS分析を今後行う予定である。

鱗翅目昆虫ではすでに500種をこえる蛾類昆虫の性フェロモンが同定され、チャハマキやコナガなどでは、合成性フェロモンを圃場に拡散させることによって雌雄間のコミュニケーションを妨害し、交尾を阻害する交信撹乱法が実用化されている。それらフェロモンの殆どは直鎖状不飽和一級アルコールやその誘導体であるが、近年シャクガ類を中心にエポキシアルケン系の化合物も多数同定され、交信撹乱剤としての利用が考えられつつある。ただし、エポキシ化合物は不斉中心を有しており、大量な光学活性体を有機合成的手法で調製することは容易でなく、現在のところ低コストな農業資材とはなり難い。そこで今回、微生物変換を利用して光学活性なエポキシ系性フェロモン、およびそれらの関連化合物を大量に調製する方法の構築を計画した。リノレン酸などにおけるポリエン構造近傍の酸化あるいは不飽和化反応をも視野に入れ、それらの変換を行なう微生物を、国内外の分譲機関から提供される多数の保存株からスクリーニングし、目的とする化合物を大量合成する技術を確立すべく、現在、薬剤耐性を獲得しエポキシ化酵素の特異的な発現が予想される植物病原菌を中心にスクリーニングを行った。その結果、ポリエン炭化水素に加えてリノレン酸などの不飽和脂肪酸に対して構造変換を行う可能性の菌株を数種特定することができた。また、他の構造変換物に関しては現時点では合成標品が無いため、アセチレンカップリング反応などを利用しいくつかの有効な化合物の合成を行うことができた。今後それらの合成標品を指標にして、培養ろ液のGC/MSおよびLC/MS分析を再検討する予定である。
イネの種子根および冠根メリステムの形成・維持機構

(1)T3-7-1変異体の解析新たに選抜したT3-7-1変異体は根長が増加する特徴を示す。本変異体の原因遺伝子の発現性をGFPレポーター遺伝子により解析した結果、再分化個体の不定根や側根の分裂組織内の静止中心(QC)を中心とした領域での発現が確認された。根端分裂組織には"open"タイプと"closed"タイプが存在し、イネは後者に属する。この"closed"タイプは根冠と根端分裂組織の境界がはっきりしていることが特徴であるが、本変異体ではその境界面が曖昧になり、"open"タイプに似た構造を示した。本原因遺伝子の発現はオーキシンにより誘導されたため、今後は本遺伝子の発現制御機構を精査するとともに、根端における分裂細胞の分布の経時的変化等を詳細に解析し、長根化へとつながる分子機構の解明を目指したい。(2)T11-22-2変異体の解析T11-22-2変異体は根端メリステムサイズが肥大化する特徴を示す。本変異体の原因遺伝子は、miRNAの生成を担うことが示唆された。今後は標的遺伝子を同定するとともに、本変異体で見られる根端メリステムサイズの肥大化との関連性を解析する必要がある。最終年度研究結果を総合的にとらえると、まず根端メリステムへ輸送されたオーキシンがその細胞群に受容され、microRNAが生成されることにより根端メリステムの制御が行われるものと推定される。今後はこれらの制御因子に注目し、根端メリステムの形成・維持機構の解明を目指したい。(1)CRL5転写因子の標的因子の決定これまでに、野生型とcr15変異体を用いたマイクロアレイ解析により、CRL5下流候補因子群を選抜してきた。本年度は、その標的因子をwater in oil(w/o)エマルジョン内1分子固相PCR法とFluorescence-activatedcell sorting(EACS、蛍光活性化細胞分離)を用い選抜を試みた結果、CRL5転写因子の標的候補遺伝子としてサイトカイニンの不活化に関わることが想定されるOグルコシル転移酵素等が選抜された。これまでに、CRL5遺伝子はサイトカイニン信号伝達の抑制に関与することが判明しているため、CRL5遺伝子下流では根の発生を負に制御するサイトカイニン作用の打ち消しが徹底的に行われていることが示唆された。(2)根端メリステムの維持機構に関わる制御因子の単離根端メリステムの維持に異常を示すrrl2変異体の原因遺伝子の単離を試みた結果、DNA型トランスポゾンであるMuDR因子内のmudrA転移酵素と高い相同性を示す候補遺伝子内にナンセンス変異が認められた。近年、シロイヌナズナのFHY3やFAR1がコードずるタンパク質も同転移酵素由来ドメインを有することが報告されている(Linetal.2007,Science21:1866)。いずれのタンパク質もN末にWRKY-GCM1 familyに属するC2H2タイプのzincfingerとC末にSWIM zincfingerを有しており、このうち転移酵素とSWIM zincfingerを含むC末側領域に転写活性能があることが判明している。一方、RRL2候補遺伝子のC末にもSWIMzincfingerが存在しており、本候補遺伝子も転写因子として機能し、根端分裂組織の維持を制御することが示唆された。当初の目的であった、CRL5転写因子の標的候補遺伝子の選抜に成功した。また、根端分裂組織の維持に関わるRRL2遺伝子の単離にも成功しており、計画通りに順調に進展していると判断できる。最終年度冠根形成に特異的に関与する制御因子、および冠根や種子根のメリステムの維持に共通して機能する遺伝子の実体が明らかとなった。今後はこれらの機能を解析することに加え、種子根のみが欠損するrall変異体の解析を通して種子根形成に特化した制御因子の同定を試みる。研究結果を総合的にとらえると、まず根端メリステムへ輸送されたオーキシンがその細胞群に受容され、microRNAが生成されることにより根端メリステムの制御が行われるものと推定される。
口腔癌とその周囲に拡がる異型上皮の段階的なエピジェネティック変化を検索する

近年、様々な疾患における遺伝子発現制御の機構として、塩基配列の変化を伴わないエピジェネティックな変化が注目されている。特に各種癌組織では、ゲノムワイドな低メチル化、特定ゲノム領域の高メチル化を認め、ゲノム不安定性の誘発や癌抑制遺伝子の不活性化により発癌への関与が報告されている。ところで、DNAの異常メチル化には、加齢やウイルス感染、炎症など様々な環境要因に影響を受けている。口腔粘膜でもこのような要因により異常メチル化を生じ、その後に多段階のエピジェネティックな変化によって前癌病変から発癌へと進行しているものと予想されるが、未だ詳細な検索はなされていない。そこで本研究は、前癌病変(異型上皮)および口腔扁平上皮癌におけるエピジェネティックな変化を検索し、口腔粘膜における発癌メカニズムの解明を試みる。本年度は、本研究の開始にあたり、新潟大学歯学部倫理委員会に本研究計画について倫理審査を受け、承認を受けた(承認番号21-R29-10-03)。また、本研究を遂行するために必要な核酸・蛋白質精製機QIAcube(キアゲン社)およびStarter Packを購入し、次いで、ゲノムDNA精製用キット、Bisulfite処理用試薬、MSP法やMethyLight法に必要な試薬を購入し、研究環境の整備を行った。現在、研究モデルに適する口腔扁平上皮癌患者からの組織検体採取を進めており、今後、DNAメチル化解析を予定している。本年度は、口腔癌患者に研究内容を説明し、同意をいただいた2症例の手術の際に、摘出標本から健常部、異型上皮部、癌部の組織をそれぞれ検体として採取した。現在、組織検体からゲノムDNAを抽出した後、DNAメチル化解析を行い、統計解析(差分解析、抽出・比較解析)を進めている。【緒言】近年、様々な疾患における遺伝子発現制御の機構として、塩基配列の変化を伴わないエピジェネティックな変化が注目されている。そこで本研究は、健常組織、異型上皮および口腔扁平上皮癌におけるエピジェネティックな変化を検索し、口腔粘膜における発癌メカニズムの解明を試みた。【対象および方法】新潟大学歯学部倫理委員会の審査と承認(承認番号21-R29-10-03)を受け、当科を受診した口腔癌患者に研究内容を説明し、同意をいただいた2症例について、摘出標本から健常部(N)、異型上皮部(D)、癌部(C)の組織検体を採取した。症例の内訳は、症例1は70歳男性、症例2は48歳男性で、いずれも下顎歯肉癌であった。組織検体は、MBL社のDNAマイクロアレイ受託解析にてゲノムDNAを抽出、illumina HumanMethylation27にてDNAメチル化解析をした後、統計解析(差分解析、抽出・比較解析)を行った。【結果および考察】