hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物におけるオーキシン二重制御機構の解明

本研究では、インドール-3-酢酸(IAA)とフェニル酢酸(PAA)が植物で似た機能を示すが、異なる移動特性をもつオーキシンであることを示した。PAAは植物界に広く分布し、生理活性は低いが、IAAよりも多量に植物に存在していた。受容機構と制御遺伝子の解析から植物におけるPAAとIAAの機能は類似していると考えられ、またPAAとIAAの生合成経路も似ていると予想された。一方、IAAは極性輸送されるが、PAAはこの調節を受けないことから、植物における両者の移動特性は異なることが明らかになった。以上の結果、植物の成長制御には輸送機構の異なる2つのオーキシンが関与している可能性がある。オーキシンは植物の生長や環境応答の制御において中心的な役割を果たす植物ホルモンであり、これまで主要なオーキシンであるインドール酢酸(IAA)を中心に研究が行われてきた。最近、申請者らはフェニル酢酸(PAA)がIAAと共に合成されるもう一つのオーキシンであることを発見した。また、IAAは植物体内で極性輸送されるが、PAAはこの特徴をもたないことを明らかにした。本研究ではPAAの生理的役割の解明を目的として、遺伝学的および生化学的なアプローチによりPAAの作用機構を中心に解析する。まず、今年度の研究計画に従って、IAA生合成の律速酵素であるYUCCAフラビンモノオキシゲナーゼかPAAの生合成に関与することを酵素学的に検証した。大腸菌で調製したYUCCA6タンパク質を用いて酵素活性を詳細に解析した結果、FADを補因子として、NADPH存在下でフェニルピルビン酸からPAAを生成することを示した。また、ストップトフロー法によりYUCCA酵素の反応機構も明らかにした。この研究結果は」.Biol.Chem,(2013)にて報告した。次に、PAAの輸送機構についてシロイヌナズナのオーキシン取り込み輸送体の欠損変異体aurlを用いて解析した。この結果、AUXIを介さずに拡散輸送により細胞内へ取り込まれる合成オーキシンのナフタレン酢酸はaurl変異体の表現型を回復するが、IAAやPAAはaurl変異体の表現型を回復しなかった。これにより、PAAはIAAと同様にAUX1依存的に細胞内へ移動することが明らかになった。また、PAAの生理的役割を解析するために重要なPAA欠損変異体を作成するため、高度好熱菌ThemnusthermoρhitusのpaaK(PAA-CoAリガーゼ:PAA代謝酵素)遺伝子をクローニングし、これを高発現したシロイヌナズナ形質転換体の作成を進めた。オーキシンは植物の生長や環境応答の制御において重要な役割を果たす植物ホルモンであり、これまで最初に発見されたオーキシンであるインドール酢酸(IAA)を中心に研究が行われてきた。最近、申請者らはフェニル酢酸(PAA)がIAAと共に合成されるもう一つの天然オーキシンであることを発見した。本研究ではPAAの生理的役割の解明を目的として、遺伝学的および生化学的な手法によりPAAの作用機構の解析を進めている。まず、今年度の研究計画に従って、PAAの生理的役割を解析するために重要なPAA欠損変異体を作成するため、高度好熱菌T. thermophilusのpaaK(PAA-CoAリガーゼ:PAA代謝酵素)遺伝子をエストラジオール誘導型発現ベクター(pMDC7)に組み込み、シロイヌナズナを形質転換、そのT2種子の回収まで終了した。今後、ホモ接合体の選抜、paaKの遺伝子発現の確認、PAAとIAAの内生量の分析、表現型の解析を進める。また、PAAの生理的役割を解明するため、PAAを選択的に不活化する、あるいはIAAの不活化を選択的に促進する代謝酵素の探索を進めた。酵母を使った活性スクリーニングの結果、シロイヌナズナのUDP-グルコシル転移酵素ファミリーから複数のPAAグルコシル化酵素を同定した。また、この活性スクリーニングによりIAAの主要な代謝物である2-Oxindole-3-acetic acid(OxIAA)のグルコシル転移酵素(UGT74D1)を同定した。シロイヌナズナのugt74d1欠損変異体の機能解析の結果、この遺伝子がシロイヌナズナの主要なOxIAAグルコシル化酵素であることを示した。この結果はPlant Cell & Physiologyに掲載された。本研究では、インドール-3-酢酸(IAA)と異なる輸送機構で調節されるオーキシンであるフェニル酢酸(PAA)の生理的役割を明らかにするため、遺伝学的および生化学的なアプローチによりその作用機構について解析した。植物界におけるPAAの分布を調べた結果、IAAと同様に蘚苔類を含む様々な植物に存在することが分かった。

PAAのオーキシン活性を側根の形成促進作用やDR5:GUSを指標に解析するとIAAに比べて10-20倍程度低かったが、シロイヌナズナでは分析した全ての組織に存在し、また殆どの組織でIAAよりも内生量が高いことが判明した。PAAの情報伝達機構について酵母ツーハイブリッド法を用いて調べた結果、PAAが様々な様々な組み合わせのオーキシン受容体複合体(TIR1/AFB-Aux/IAA)の形成を促進したことから、IAAと同様にTIR1/AFB経路を介してオーキシン応答遺伝子を制御することが示唆された。シロイヌナズナのIAA/PAA早期応答遺伝子をマイクロアレイにて解析したところ、両者により発現が誘導される遺伝子に高い相関が見られたことから、植物における2つのオーキシンの役割は類似していると考えられた。PAAの生合成経路については、酵素活性試験やPAA代謝物の定量分析の結果からIAA生合成遺伝子として知られるTAAとYUCCAの関与が示唆されたが、これらの遺伝子の欠損変異体におけるPAA量の減少が僅かであったことから、他の生合成遺伝子が関与している可能性も考えられた。一方、輸送機構については、トウモロコシの幼葉鞘への重力刺激やオーキシン極性輸送阻害剤処理により、内生のIAAとPAAの分布パターンに顕著な差が見られた。以上の結果、IAAとPAAは植物において似た生理機能を示すが、移動特性が異なることを明らかにした。26年度が最終年度であるため、記入しない。植物生化学26年度が最終年度であるため、記入しない。シロイヌナズナ由来の複数のYUCCAタンパク質を、大腸菌を用いて安定的に大量調製する方法が確立できたことから、それらの酵素反応機構の解析が著しく進展した。初年度にYUCCAフラビン含有モノオキシゲナーゼがインドール-3-酢酸(IAA)とフェニル酢酸(PAA)を合成する仕組みを解析し、その詳細な酵素反応機構を論文で発表した(J Biol Chem, 2013)。今年度はPAAを選択的に代謝するグルコシル基転移酵素(UGT)を探索し、新規酵素をシロイヌナズナから複数同定した。これにより、当初予定していたpaaK遺伝子以外にも、PAAの生理的役割を解明するために重要な代謝酵素遺伝子を新たに獲得した。また、その過程でIAAの主要代謝経路の鍵酵素UGT74D1も新たに同定し論文で発表した(Plant Cell Physiol, 2014)。当初の計画に従い、PAAの生理的役割を明らかにするためにシロイヌナズナのPAA欠損変異体の作成を進める。また、PAA生合成経路の全容解明のため、PAA生合成中間体の分析法の確立を進める。PAA代謝酵素であるpaaKおよびPAAグルコシル基転移酵素の過剰発現体をシロイヌナズナで作成し、これにより得られるPAA欠損変異体を使ってPAAの生理的役割を明らかにする。また、新たに得られた複数のグルコシル基転移酵素の基質特異性などについても解析を進める。さらに、PAA生合成経路の全容解明のため、PAA生合成中間体の高感度質量分析法の確立を進める。研究支援員を1名採用する予定であったが、研究費が予定額に達しなかったため研究支援員を採用できなかった。そのため研究支援員なしの研究計画に変更して進めているため。次年度にPAAグルコシル化
正常血液量性血液希釈下における消化管粘膜pHの変動及び消化管創傷治療に関する研究

1.正常血液量性血液希釈下における家兎胃粘膜pHの変動(段階的血液希釈)家兎をペントバルビタール静注にて麻酔導入し、気管内挿管を行い、F_1O_20.21、イソフルラン1%にて麻酔を維持し調節呼吸とした。トノミータ(ヒト直腸用)を経口的に胃に挿入し、各段階で胃粘膜pH(pHga)を測定した。血液希釈は、循環血液量の10%に相当する血液を脱血し、等量のヒドロキシエチルスターチ製剤の輸注を繰り返し行った。その結果、血液希釈に伴い、pHgaは緩やかな減少を示した後、Hb46g/dlより急激に減少した。Hb5.5g/dl前後で、2本の回帰直線が得られた(r=0.426,0.463)。動脈血pH、Base Excess(BE)も同様の変動を示し、pHgaと動脈血pH、pHgaとBEは有意な相関関係にあった(r=0.754,0.841)。以上より、家兎、正常血液量性血液希釈モデルにおける胃粘膜の酸素化はHb5.5g/dlまで維持され、全身組織の酸素化の指標と平行していることが示唆された。2.正常血液量性血液希釈下における家兎胃粘膜pHの変動(Hb値を固定した血液希釈)家兎をペントバルビタール静注にて麻酔導入し、気管内挿管を行い、F_1O_20.21、イソフルラン1%にて麻酔を維持し調節呼吸とした。トノミータ(ヒト直腸用)を経口的に胃に挿入し、脱血し、等量のヒドロキシエチルスターチ製剤の輸注を繰り返してHb値10、7、5、3.5g/dlとした各段階で胃粘膜pH(pHga)を測定した。その結果、pHgaはHb5g/dlまで保たれた。1.の結果もふまえて、家兎、正常血液量性血液希釈モデルにおける胃粘膜の酸素化はHb5g/dlまでは十分維持されることが判明した。しかしこれはあくまでも直接侵襲の加わっていない場合であり、今後侵襲を加えた場合の変化を検討する予定である。
生態資源の選択的利用と象徴化の過程

5年計画の最終年度にあたる本年は、まず、環境と資源との関連を実際に見て歩く海外研修シリーズの第3回目として、メラネシアにおける現地研修を行った。過去に乾燥草原地帯、温帯高山地帯で行った研修では、それぞれの気候および自然環境の特性に合わせたサブシステンスや食糧資源の利用を実際に見学し、歩くことで、各参加者のフィールドにおける資源利用を考え直す刺激的な成果があがった。最終回の今回は、島嶼環境をもつニューカレドニアにおいて研修を行った。ニューカレドニアは、広大なオセアニアの島嶼域へと人類が拡散した初期に拡散居住された島で、東南アジアから持ち込んだ土器文化が最も栄え、ラピタ土器というユニークな文様土器の名前が由来する遺跡のある島でもある。現地では、ラピタ遺跡の踏査を行い、土器をはじめとする遺物の包含層と居住立地を実見することで、海洋環境における居住特性を観察した。ニューカレドニア博物館ではC.Sand博士から、先史時期から現代にかけてのニューカレドニアにおける資源利用の特性や変容過程についてスライドを用いた講義を受け、理解を深めることができた。最後に、本島の東に位置するウヴェア島へ移動し、火山島である本島とは異なるサンゴ島特有の自然環境や資源分布・利用などを踏査した。12月には総括班主催の国際シンポジウムが行われ、全員が出席の元、竹沢尚一郎が班を代表して発表を行った。最後に、各自が5年間の成果をまとめて論文を執筆し、2007年10月に『生態資源と象徴化』(資源人類学シリーズ第7巻)として弘文堂から出版される予定である。当研究班は生態環境と時間軸という2つの変数を研究の中心に据え、人間集団による資源利用の様態を史的側面から解き明かすことを目的としている。異なる自然環境を研究対象とする研究分担者の今年度の活動実績は以下の通りである。・印東は、島嶼居住民における資源利用の再構築のためパラオの離島で発掘予備調査を行った。・竹沢は、物質文化の歴史的再構成のためマリ共和国北部で考古学発掘調査をおこなった。・小長谷は、モンゴルで乾燥地域における生態資源利用について調査を行った。・佐々木は、極東ロシアの先住諸民族の狩猟活動を、持続的な森林利用の一種と見なしながらこれまでに得てきた調査データの整理を行った。・関は、古代アンデス文明の形成期(前2500紀元前後)におけるトウモロコシの酒としての利用を、人骨のコラーゲンによる食性解析などを逼じて研究した・野林は台湾と南中国におけるイノシシ(Sus)属の利用の差に関連した文献調査を行った。・小川は、フィリピン、ルソン島のラロ貝塚群の発掘調査と出土遺物の分析を行い、狩猟採集社会と農耕社会の交流の歴史的プロセスを探る時間尺度となる土器編年体系を確立した。・高宮は、「資源利用」という視点から、鹿児島から沖縄にかけて分布する遺跡出土の植物遺体の鑑定を行い、鹿児島や奄美大島最古のイネやアワを同定したなお、研究会を2回開催し、以下の研究発表が行われた。・竹沢尚一郎「西アフリカの気候変動と農業起源」・小川英文「北部ルソン島の考古学-石器研究、民族考古学、貝塚調査」2回の公開研究会(アンデスおよび島嶼環境における資源利用)を実施した他、個々の研究者は以下のような研究成果を着々とあげつつある。印東はミクロネシア、パラオのトビ島で行った発掘予備調査結果の分析をおこない、海洋資源の獲得がリーフ内およびリーフ周辺でもっぱら行われたことやトビ島の孤立性を明らかにした。竹沢は西アフリカマリ共和国東部のガオ地区で発掘を行い、814世紀の石造りの建造物を初めて発見し、西アフリカの歴史の再構成に大きく寄与する結果が期待される。小長谷は中国内蒙古自治区西方の砂漠化地域で自然環境の劣化とそれに対する行動変化に関する調査を行い、「時間軸による変動」を社会環境としての「空間による占有」に完全に置換すると、「生態資源」の「象徴資源」化がすすむことを明らかにした。佐々木はヨーロッパ諸国の民族学博物館に所蔵されている狩猟関係の資料調査を研究分担者とともに行い、ロシアの先住民族ウデへの狩猟実態調査も行った。生態資源の一つであるオコジョの毛皮に着目することによって、シベリア産の狩猟産品がヨーロッパで象徴資源化された例を指摘した。関は中央アンデス地帯北高地形成期におけるトウモロコシの導入時期を出土人骨のコラーゲン分析から明らかにした。さらに形成期末期には、酒として利用されていた可能性を指摘し、社会集団を結ぶ役割を果たした、酒を用いた儀礼に存在を推測した。野林は福建省において定住農耕民の家畜、家禽の飼育方法や利用方法について調査を行った。資源の象徴化と脱象徴化は、利用可能な資源、利用できない資源、または利用する資源、利用しない資源という関係を作り出す軸になりうることが予想される。小川はフィリピンルソン島、ラロ貝塚群出土土器群の型式学的編年研究を行なった。また、狩猟採集民アグタが棲む丘陵帯地帯の洞穴の分布調査を行ない、同時期に異なった生業をベースとした集団が近い距離に生活していた可能性を示唆した。高宮は、沖縄諸島出土の動物遺体/植物遺体の分析から、縄文晩期から弥生相当期にかけてフード・ストレスが存在したことを指摘した。グスク時代には沖縄本島中南部と北部・奄美では雑殻とイネという異なる農耕システムが存在した可能性を指摘した。本年度は3年目に当たるため、各個研究もフィールドでの調査研究を中心としてますます充実したものとなっている。

班全体の企画としては、2つの国際ワークショップを行った。一つ目は、モンゴルにおいて行い、乾燥地域における資源利用の歴史的検討を、モンゴル科学技術大学人類学研究室との共催で行った。土地所有や人口流動の問題など、歴史的かつすぐれて現代的な問題が活発に討論された。その成果は総括班から『モンゴル国における土地資源と遊牧民-過去・現在・未来-』(小長谷有紀・辛嶋博善・印東道子編)文部科学省科学研究費補助金特定領域研究『資源の分配と共有に関する人類学的統合領域の構築』総括班(代表者:内堀基光)発行として3月に出版された。その後に行ったフィールドエクスカーションには、他班からの参加も含め10名の研究者が参加し、それぞれがみな異なる自然環境において研究していることから、異なった資源研究への観点、問題点の指摘などが活発に行われ、モンゴル研究者だけではなく、参加者それぞれの資源研究に新たな視点を提供するという意味で、非常に有意義なものとなった。二つ目は、3月に国立民族学博物館において行った、森林資源の利用に関するワークショップ『北東アジアにおける森林資源の商業的利用と先住民族』で、ロシアから研究者2名を招聘し、国内からは約10名の研究者が参加して行われた。森林資源の利用や管理、野生動物資源の開発に関して、異なった観点からの発表や議論が展開された。この成果は、上記と同じく総括班からのシンポジウムシリーズの一冊として2005年度中に発行予定である。研究助成4年度目に当たる2005年度は、各研究分担者がフィールドワークのまとめを行うことを優先し、研究会を5回(春日班との合同研究会「交易と社会成層化」および本特定科研における当班の研究成果をどのように理論化するかに関する4回のディスカッション)を開催した。各研究分担者の研究成果は以下の通りである。印東は、島嶼環境への人間の移動によってひきおこされる技術変化と、土器自体の形状変化の関連をモデル化した。竹沢はマリ共和国での発掘成果を分析し、ほぼ同一の隣接した生態学的環境の中で、国家を生んだ社会と生まなかった社会の違いの背景に、長距離交易の関与があったことを指摘した。関は権力資源の概念を精緻化するとともに、アンデスの考古学的データによる検証作業を行った。佐々木はロシア連邦の先住少数民族ナーナイの狩猟・漁撈・採集による生態資源の利用方法についての調査を行い、1年間の狩猟、漁撈サイクルや儀礼に関する情報を得た。小長谷はモンゴルにおける土地私有化制度の導入を、生態資源の象徴化としてとらえ、コモンズ研究に関する理論的展開にも重要な事例を提供することを指摘した。野林は人間によるSus属の飼育形態について、雲南省西北部において短期的な観察を行った。生業基盤や自然環境の相違に加え、飼育する人間側のSus属へのイメージや考え方が複合的に関係し、比較的自由度の高い飼育形態を生じていることがわかった。平井は北タイにおいて、ラーンと呼ばれる椰子の分布と、生態資源としての利用様態について現地調査を行った。利用は仏典の記録媒体にほぼ限定され、その知識を有する者が消失しかかっている一方で、最近の伝統文化復興運動に関わる仏教関係者が、ラーンの栽培と、利用法の伝承に積極的に関わりはじめていることがわかった。小川はラロ貝塚群から出土した、過去7000年にわたる遺物の型式
光蓄積リング型自由電子レーザーの発振実証研究

リングは、97年9月までにほとんどの要素の製作と単体テストを完了し、岡崎分子研の入射器室にて組立を開始して11月までに完成した。1ターンコイルであるパ-タベータの4500A励磁と加速空洞への平均500Wパワー投入に成功し、入射実験を開始した。クリスマスイブには少なくとも100μsの間電子が周回するのを確認した。蓄積電流値はあきらかではないが、遠赤外線モニターはピーク値で300mW以上を示した。パ-タベータによる電子のキャプチャーを確認したわけである。高周波加速は、ランプアップ時の反射の調整はまだ成功していない。パ-タベータは2台設置しおり、1台は外側の電子を外側へ、1台は内側の電子を外側へキックしている。パルス電源は、sin半波を生成し、ピーク電流4500Aのとき30kVの電圧が発生する。幅は4μsである。我々は、これをさらに磁気圧縮してパルス幅を0.4μsにすることに成功した。加速空洞は、特異な形をしているが、基本的にはリエントラント型であり、TM01モードの発生に成功した。加速周波数は、ハ-モニクス8に対して2.45GHzで、ソースとしてCWマグネトロンを使用している。2台の加速空洞へのパワーをT型同軸管で分岐して投入している。2台の加速空洞はカップリングしている状態であるために、2台の固有周波数は、正確に一致していなければならない点と、同軸管のカップリングも正確に等しくしなければならないが、我々はこの調整方法を見いだし、パワーの長時間投入に成功した。ミラーは、SiC焼結体で製作し、その真円度を1ミクロン以下に押さえることができた。ミラーを設置したレーザー発振実験は今後のスケジュールを待っている状態であり、残念ながら期間内に実験を終えることができなかった。一方、ハードX線の発生実験を東大物性研SORで行った結果、電子軌道に細線を挿入しても数秒のビーム寿命があることを確認した。これにより、高輝度小型X線源の道が開けた。本プロジェクトは、1997年度に光蓄積リングのレーザー発振を行う計画である。今年度は、小型電子蓄積リングの基本設計を行い、常電導磁石の制作を完了し、来年度に高周波加速システム、電子入射システム及び完全円形光共振器を完成する予定で進めている。結果は、予定どうり基本設計を完了し、磁石の制作を完了した。また、高周波加速空洞の設計を行うとともに、2/3共鳴入射のためのパ-タベータの設計と入射のシミュレーションを実施し、入射効率を確認した。加速空洞は2台設置し、パ-タベータも2台設置する設計とした。据え付け誤差を除くために、加速空洞、パ-タベータ、ビームダクトを一体で制作する設計とした。加速空洞の周波数に2.45GHzを採用したのは、ソースとしてマグネトロンを使用し、制作費を押さえるためと、マグネトロンが、空洞に追随させる方式で周波数を可変にできる可能性を含んでいるためである。ミラーに関しては、当初発振波長を30μmに設定し、その曲率半を207mmとし、ひずみをさける目的と熱伝導の点で、SiCセラミクスを母材に用いることした。制作精度は、0.1μmの真円度と0.01μmの表面荒さを達成することを目標としている。ミラーは電子軌道と同心で有ることが発振に必要であるが、このためミラーのx,y,θ微調機構を導入する。以上の構成要素は、いずれも高度な制作技術を要求するが、これにチャレンジするメーカーを見いだすことができた。一方、光蓄積リングの理論的な研究をさらに前進させることができたが、50MeVという低エネルギー小型リングを用いて高輝度ハードX線を生成する手段を明らかにした。電子軌道上に金属細線を挿入することにより、計算では10^<12>個/s, mrad^2, 0.1%bandを達成することができる。金属細線を挿入しても電子ビームは平均0.1msのあいだ周回し続けることを発見したのが鍵である。光蓄積リング開発の現状は以下のとうりである。1)蓄積リング用磁石は、磁場測定を実施し、設計どうりの磁場分布を確認した。2)加速空洞は、モード測定を実施し、電場分布及び固有周波数を最適化する手法を確立し、パワーの投入に成功した。3)パ-タベータ用パル電源を完成し磁場測定を実施し、設計どうりであることを確認した。また、4)真空槽を完成した。5)SiC光共振器の製作は、遅れているが、真円度0.1ミクロンを達成する見込みである。入射器の購入は、予算的に不可能となったため、岡崎分子科学研究所との共同研究を推進して、UVSORの入射器を利用することにした。装置は、現在岡崎に設置している。この6月を目処にBT系の製作(分子研負担)を進め、夏には入射実験を行う予定である。光蓄積リングによる超高輝度遠赤外線発生を控えて、今年度は、光利用計画の検討を進めた。医学利用では、動脈硬化の治療が考えられる。動脈硬化は、コレステロールと脂肪酸が結合したものであり、その結合エネルギーが波長にして5ミクロンであるところから、遠赤外線でこれを切断することに期待が持たれる。熱化学反応を、特定の遠赤外線を用いて非可逆に行うことは、化学合成に重大な革新をもたらすが、その可能性につき検討をおこなった。

高輝度遠赤外線光源の出現は、分光の分野にも変革をもたらす。分光のSN比が10^6になることにより、不可能であった水の測定が可能になること、光蓄積リングのパルス幅がサブピコ秒になることを利用して、時間領域での測定に変革がもたらされること等を検討した。ホトンエコーによる寿命測定は、インコヒーレントなSR光を用いても実施できることが明らかになっているが、遠赤外領域でのホトンエコーを実施することの意義について検討した。遠赤外線にたいする関心は、最近徐々に高まっている。97年春の物理学会では、量エレで特別シンポジュームを企画している。研究代表者が特別講演を行う予定である。リングは、97年9月までにほとんどの要素の製作と単体テストを完了し、岡崎分子研の入射器室にて組立を開始して11月までに完成した。1ターンコイルであるパ-タベータの4500A励磁と加速空洞への平均500Wパワー投入に成功し、入射実験を開始した。クリスマスイブには少なくとも100μsの間電子が周回するのを確認した。蓄積電流値はあきらかではないが、遠赤外線モニターはピーク値で300mW以上を示した。パ-タベータによる電子のキャプチャーを確認したわけである。高周波加速は、ランプアップ時の反射の調整はまだ成功していない。パ-タベータは2台設置しおり、1台は外側の電子を外側へ、1台は内側の電子を外側へキックしている。パルス電源は、sin半波を生成し、ピーク電流4500Aのとき30kVの電圧が発生する。幅は4μsである。我々は、これをさらに磁気圧縮してパルス幅を0.4μsにすることに成功した。加速空洞は、特異な形をしているが、基本的にはリエントラント型であり、TM01モードの発生に成功した。加速周波数は、ハ-モニクス8に対して2.45GHzで、ソースとしてCWマグネトロンを使用している。2台の加速空洞へのパワーをT型同軸管で分岐して投入している。2台の加速空洞はカップリングしている状態であるために、2台の固有周波数は、正確に一致していなければならない点と、同軸管のカップリングも正確に等しくしなければならないが、我々はこの調整方法を見いだし、パワーの長時間投入に成功した。ミラーは、SiC焼結体で製作し、その真円度を1ミクロン以下に押さえることができた。ミラーを設置したレーザー発振実験は今後のスケジュールを待っている状態であり、残念ながら期間内に実験を終えることができなかった。一方、ハードX線の発生実験を東大物性研SORで行った結果、電子軌道に細線を挿入しても数秒のビーム寿命があることを確認した。これにより、高輝度小型X線源の道が開けた。
ルテニウム錯体触媒を駆使した不斉シアノ化反応と水素化反応の開拓

研究者独自の光学活性ルテニウム・リチウム複合金属錯体触媒を用い、1)アルデヒド類およびアルジミン類のヒドロシアノ化、2)単純ケトン類およびα-アルコキシケトン類のシアノシリル化、3)α,β-不飽和ケトン類やアシルピロール類の共役シアノ化において、高い触媒活性(基質/触媒比:最高1万)とエナンチオ選択性(最高99%)を達成した。二官能性ルテニウム錯体触媒を用い、1)ケトン類のフラッシュ(超高速)不斉水素化、2)N-アリールイミン類およびキノキサリン類やベンゾキサジン類の不斉水素化に成功した。1)においては、世界最高速の触媒回転効率、毎分3万5千回転と99%以上のエナンチオ選択性を達成した。本研究はカルボニル化合物やイミン類の不斉シアノ化反応と水素化反応に対し、世界最高水準の効率と立体選択性を示す触媒の開拓を目的とする。研究者独自のルテニウム・リチウム複合金属錯体触媒と二官能性ルテニウム錯体触媒の概念を発展させ、従来の触媒では為し得なかった高効率と高エナンチオ選択性の実現を目指す。以下に本年度の研究成果を示す。1.不斉シアノ化:(1)単純ケトン類の不斉シアノシリル化における触媒の構造と反応条件の最適化を行った。光学活性ジホスフィンBINAPとフェニルグリシンを配位子とするRu錯体とC_6H_5OLiからなる複合金属触媒が優れた性能を示すことがわかった。(2)アルデヒド類の不斉ヒドロシアノ化の検討を行った。Ru錯体とLiClから調製、単離した新規Ru・Li複合金属触媒を用い、基質/触媒比2000、不斉収率99%を達成した。(3)α,β-不飽和ケトン類の不斉共役シアノ化における触媒と反応条件の最適化を行った。Ru錯体/C_6H_5OLi複合金属触媒により、基質/触媒比1000、不斉収率98%を達成した。上記のように、世界最高水準の反応性、選択性、基質一般性を示す不斉シアノ化触媒を開拓した。2.不斉水素化:(1)と(2)ケトン類のフラッシュ(超高速)不斉水素化の達成に向けた触媒検討を行った。光学活性ジボスフィンとジアミンを配位子とし、配位子のアリール基がルテニウムに結合した新規Ru-C型触媒を開拓した。この触媒により、世界最高速の触媒回転効率、毎分3万5千回転と>99%の不斉収率を達成した。この触媒は低い塩基性条件でも反応性を示し、高い基質一般性を示すことがわかった。(3)N-アリールイミンの不斉水素化における触媒と反応条件の最適化を行った。ジボスフィンとジアミンがシス型に配置する新規シス型触媒を開拓し、世界最高の触媒回転数1万8千回と99%の不斉収率を達成した。1.不斉シアノ化:24年度に見いだした複合金属触媒を用い、(1) α位ヘテロ置換ケトン類の不斉シアノシリル化の検討を行った。不斉誘起の源となる光学活性ルテニウム錯体部の構造最適化により、α,α-ジアルコキシケトンやα-モノアルコキシケトンの反応を検討し、基質/触媒比10000、不斉収率99%を達成した。また、β,β-ジアルコキシケトンのシアノ化も高選択的に進行した。(2) α,β-不飽和カルボン酸誘導体の不斉共役シアノ化では、アシルピロール基質に対し、基質/触媒比2000、99%以上の不斉収率で目的のβ-シアノ化物を得た。また、本触媒がシリカゲルカラムで分解しない安定な配位飽和ルテニウム錯体構造をもつことに着目し、(3)錯体の回収・再利用の検討を行ったところ、基質/触媒比500の条件で、性能を落とすこと無く5回以上の再利用が可能であることがわかった。2.不斉水素化:24年度の検討結果を踏まえ、(4)有効な触媒がなかった芳香族γ-ケトエステル類の不斉水素化を、研究者らが開拓したシス型二官能性ルテニウム錯体触媒を用いて行ったところ、94%の不斉収率で生成物が得られた。(5)と(6)高い

エナンチオ選択性と基質一般性の得られていないキノキサリン類とベンゾキサジン類の不斉水素化を、研究者らが開拓したRu-C型二官能性ルテニウム錯体触媒を用いて検討し、99%以上の不斉収率で目的の環状アミン類を得ることに成功した。9400回の優れた触媒回転数も達成した。また、ベンゾチアジンの不斉水素化に初めて成功した。上記のように、世界最高水準の反応性、選択性、基質一般性を示す不斉シアノ化反応および不斉水素化反応の開拓に成功した。本研究はカルボニル化合物やイミン類の不斉シアノ化反応と水素化反応に対し、世界最高水準の効率と立体選択性を示す触媒の開拓を目的とする。1.不斉シアノ化:昨年度迄に見いだした複合金属触媒を用い、(1)イミン類の不斉ヒドロシアノ化(不斉ストレッカー型反応)の検討を行った。アルデヒド由来のイミンにシアン化水素を反応させたところ、イミン窒素上にアルコキシカルボニル基をもつ基質に対して世界最高水準の反応性とエナンチオ選択性が得られた。基質/触媒比5005000で反応はすみやかに進行し、不斉収率99%を達成した。本反応は基質適用範囲も広く、従来困難とされてきた脂肪族アルデヒド由来のイミンも高選択的にシアノ化することができた。(2)反応系の各種スペクトル分析、基質構造と反応性・エナンチオ選択性の相関等を検討し、触媒が基質のアルコキシカルボニル酸素に配位して反応を促進する機構を提案した。(3)得られた不斉ストレッカー生成物は光学活性α-アミノ酸等価体である。酸性条件下でシアノ基を加水分解するとともにアルコキシカルボニル基を脱保護し、光学純度を損うこと無くα-アミノ酸へ誘導することができた。2.不斉水素化:昨年度迄の検討結果を踏まえ、(4) α位の置換基に立体的・電子的差異が少なく、従来高ジアステレオ選択的に還元できなかったケトン類の水素化を検討した。ジホスフィンとジアミンを配位子とする二官能性ルテニウム触媒のジアミン配位子窒素上にメチル基を導入することで、ほぼ完璧なジアステレオ選択性を達成した。また、触媒を光学活性とし、動的速度論分割を利用した水素化を行うことで、99%以上のエナンチオ選択性も達成した。(5)と(6)触媒構造と立体選択性の相関を検討することで、他方ではなし得ない優れた立体制御能の仕組みをほぼ解明した。また、この反応を鍵とする抗鬱剤レボキセチンの高純度合成に成功した。26年度が最終年度であるため、記入しない。有機合成化学26年度が最終年度であるため、記入しない。不斉シアノ化および不斉水素化において、世界最高水準の触媒活性とエナンチオ選択性を達成した。とくに、不斉水素化についての検討では、独自に開拓した触媒を用いて前人未到の毎分3万5千回転の触媒回転効率とほぼ完璧なエナンチオ選択性を実現した。不斉シアノ化においても、独自の触媒により、単純ケトンおよびα,β-不飽和ケトン基質について最も高い反応性が得られた。以上の成果は、将来の有機合成化学における触媒設計指針に大きく貢献するものと期待される。独自に開拓した触媒を用い、不斉シアノ化および不斉水素化において、世界最高水準の反応性、エナンチオ選択性、基質一般性の獲得に成功した。いずれの反応においても当初の計画以上の成果が得られている。不斉水素化:Ru-C型二官能性ルテニウム錯体触媒によるケトン類の不斉水素化では、前人未到の毎分35,000回の触媒回転効率を達成した。一般乗用車のエンジン回転速度の10倍以上の速さである。計画では、毎分10,000回が目標であった。N-アリールイミン類の反応においては、シス型二官能性ルテニウム錯体触媒を用い、計画を上回る世界最高の触媒回転数18,000回と完璧に近い不斉収率99%を達成した。Ru-C型触媒を用いるキノキサリン等の環状イミン類の水素化において、世界最高水準の触媒回転数9400回とほぼ完璧な(>99%)不斉収率を達成した。また、この触媒によりベンゾチアジンの不斉水素化に世界で初めて成功し、期待以上に高い基質一般性を確認した。
酸化物界面における誘電応答変調の第一原理解析

本研究では、金属/酸化物界面における誘電応答の変調をシミュレーションするための第一原理(量子力学)計算手法の開発と応用を進めた。最初に、金属/酸化物/金属キャパシターに電圧を印加した状況をシミュレーションするための「軌道分離法」プログラムの高速化を進め、開回路および閉回路条件に対応するための機能追加を行った。さらに、電圧印加時の蓄積電荷量の計算手法を開発し、実装した。これを使って、理想的な結晶構造を有する強誘電体・常誘電体2層キャパシタに電圧を印加したシミュレーションを行い、「負のキャパシタンス」が発現すること、その起源は強誘電体分極ドメインのダイナミクスにあることを突き止めた。「負のキャパシタンス」は従来の半導体のスケーリング則を打ち破り、ナノエレクトロニクスのさらなる発展を実現するための有望な現象とされているが、その起源を明らかにしたことで、実用化により一層近づいたと言える。最終年度では、理想的な界面構造のみならず、より現実的な計算モデルでシミュレーションを行うために、界面の欠陥分布を熱力学的に予測するための計算フレームワークを開発した。熱力学的配置サンプリング計算を行うための並列アルゴリズムであるレプリカ交換モンテカルロ法と第一原理計算を直接組み合わせることで、並列スーパーコンピュータを効率的に利用し、界面の欠陥分布の予測精度を飛躍的に向上した。この計算手法については、界面のみならず、様々な多成分系の物質の不規則性を予測するためのソフトウェアとして、整備および公開準備を進めている。本研究で利用するバイアス印加シミュレーション手法である軌道分離法の拡張を行い、従来から可能であったバイアス電圧の制御に加えて、自由電荷量の計算・制御を可能にし、開回路状態の計算を行うことができるようになった。強誘電体BaTiO3・常誘電体SrTiO3の2層薄膜をSrRuO3金属で挟んだキャパシタ構造に対して、軌道分離法を使ってバイアス電圧を印加した第一原理計算を行い、分極ドメイン構造の変化やキャパシタンスの評価を行った。電圧がかかっていないときは界面垂直方向に並んだ縞状の180°ドメイン構造が安定であるが、電圧を加えることで分極ドメイン壁が消失し、単一ドメイン構造が実現することが分かった。また、ドメイン壁の消失に伴って、キャパシタンスの増幅が発現することが分かった。その結果、常誘電体だけのキャパシタとくらべて強誘電体・常誘電体2層キャパシタの方がキャパシタンスが大きくなることが計算によって予測され、強誘電体薄膜によってキャパシタンスの増幅が見られること、言い換えれば強誘電体薄膜が「負のキャパシタンス」を有することを明らかにした。また、当初の計画には無かったが、強誘電性およびイオン伝導性の両方を有するとされる興味深い物質であるヒドロキシアパタイトについても研究を開始した。この物質は永久分極を有するエレクトレット材料の候補として研究されているが、分極の固定に寄与するメカニズムについては十分明らかになっていない。今年度はバルク中の分極メカニズムについて検討を行い、OH-イオンの回転による分極反転、OH-イオンの空孔を介したホッピング、H+イオンの空孔を介したホッピングについて、活性化エネルギーの計算を行った。いずれも1.5 eV未満であり、分極処理条件下で十分起こりうる素過程であることが分かった。軌道分離法の拡張や負のキャパシタンスの発現機構についてのシミュレーションを進めることができ、また、当初想定していなかった新たな材料系(ヒドロキシアパタイト基エレクトレット材料)への取り組みを開始した。一方、大規模計算に向けた軌道分離法のOpenMXへの実装などは進んでおらず、その必要性も含めて改めて次年度に検討を行う。二層グラフェンの電場応答ー誘電応答と電子状態の変調ー近年の酸化物エレクトロニクスにおいて、グラフェンに代表される二次元系や、酸化物界面の二次元電子ガスを電極やチャネル材料として用いることが検討されている。応用上は高いキャリア移動度や負のキャパシタンスの発現などが期待される。このような低次元系では、従来の一般的な3次元バルク金属と異なり、電場やドーピングによって電子構造が変調されやすく、誘電応答に対する量子効果、すなわち量子キャパシタンスの成分が無視できなくなる。本研究課題で調べる酸化物界面の誘電応答は、電極に由来する量子キャパシタンスの成分も含まれる。そこで本論文では、界面の誘電応答変調の統一的理解に向けてのステップとして、チャネル材料として期待される二層グラフェンの電場応答を調べた。まず、面直方向の電場によってバンドギャップが生じるという先行研究の結果を再現し、この状況で二層グラフェンの誘電率を評価した。内部電場と外部電場の比から求めた誘電率の値は6程度であり、また、非常に弱いが有限の電場強度依存性を見いだした。ドーピングによるバンドギャップの変化は、実験的に現実的な範囲では電場に比べてやく1/10とかなり小さいことが分かった。欠陥を含む酸化物界面の誘電応答解析ー材料のプロセス条件などによって誘電応答が異なることはよく知られているが、その微視的起源については十分明らかにはされていない。そこで今年度は、金属/酸化物/金属構造の酸化物中の欠陥が誘電応答に及ぼす影響を調べる計算を開始した。予備的な結果で計算精度の吟味は不十分であるが、欠陥が界面近傍にある場合は誘電率が若干向上し、バルク中にある場合は低下する傾向が見られた。計画どおり、界面に欠陥がある場合の誘電応答の計算を開始した。

また、当初は想定していなかった量子キャパシタンスについても取り組みを行い、本課題における重要性を再認識した。一方、界面の欠陥分布を明らかにするためのモンテカルロ法などを援用したシミュレーションについては、検討中であり、実施には至っていない。ヒドロキシアパタイトエレクトレットの分極メカニズム解析ー当初の計画になかったものの、平成27年度から開始したヒドロキシアパタイトの分極・イオン拡散メカニズムの研究について原著論文を執筆し、論文誌に掲載された。ヒドロキシアパタイトは人間の骨の主成分であるセラミック材料であり、高温下で分極処理を行うことで、半永久的に分極を固定できる(エレクトレット化する)ことが知られている。医療への応用や、IoT向けの振動発電への応用を念頭に研究がなされているが、分極やイオン伝導のミクロスコピックなメカニズムについては、中性子散乱などを介した限定的な知見しかなかった。本研究で初めて、ミクロスコピックなメカニズムの詳細について、シミュレーションで可視化することができた。今後は、分極固定に関する界面の役割の解析に進む。格子モンテカルロ法と第一原理計算を直接組み合わせたシミュレーションコードの開発ー酸化物中のイオン欠陥などに由来する不規則性をシミュレーションするためのコード開発を進めて、動作を確認した。MgAl2O4スピネルのカチオン副格子の不規則性や、ヒドロキシアパタイトのOHイオンの整列、Pt/ZrO2界面における酸素空孔空間電荷層の生成などについて、テスト計算を行った。スーパーコンピュータを活用することで、クラスター展開などの軽量モデルを介さずに、第一原理計算による熱力学的サンプリングを直接、十分に行うことができることを確認した。当初計画していなかった材料系について、原著論文が論文誌に掲載された。また、モンテカルロ法と第一原理計算を組み合わせて熱力学的サンプリングを行うプログラムコードの開発も順調で、次年度の界面の欠陥モデルに関するシミュレーションを行う準備が整った。本研究では、金属/酸化物界面における誘電応答の変調をシミュレーションするための第一原理(量子力学)計算手法の開発と応用を進めた。最初に、金属/酸化物/金属キャパシターに電圧を印加した状況をシミュレーションするための「軌道分離法」プログラムの高速化を進め、開回路および閉回路条件に対応するための機能追加を行った。さらに、電圧印加時の蓄積電荷量の計算手法を開発し、実装した。これを使って、理想的な結晶構造を有する強誘電体・常誘電体2層キャパシタに電圧を印加したシミュレーションを行い、「負のキャパシタンス」が発現すること、その起源は強誘電体分極ドメインのダイナミクスにあることを突き止めた。「負のキャパシタンス」は従来の半導体のスケーリング則を打ち破り、ナノエレクトロニクスのさらなる発展を実現するための有望な現象とされているが、その起源を明らかにしたことで、実用化により一層近づいたと言える。最終年度では、理想的な界面構造のみならず、より現実的な計算モデルでシミュレーションを行うために、界面の欠陥分布を熱力学的に予測するための計算フレームワークを開発した。熱力学的配置サンプリング計算を行うための並列アルゴリズムであるレプリカ交換
アタカマ1m望遠鏡によるGRB可視赤外撮像分光観測

2010年度は当初の予定どおり、透過型グリズムの制作を行い、フィルターホイール内へのインストールを9月に完了した。10月から行った観測ランでこのフィルターホイールを近赤外線カメラANIRの可視チャンネルに取り付け、試験観測を行うことに成功した。この観測では近傍の2型セイファート銀河NGC1068の銀河核のスリットレス分光を行い、Hα+[NII]λ6563Åと[OIII]λ4959/5007Åの輝線を同定することができた。波長校正を行った結果、波長分解能は当初の予定通りλ/δλ30を達成していることが確認された。これにより波長校正の手法もほぼ確立できたため、今後ガンマ線バーストが発生した場合に即座にスリットレス分光を行い、高赤方偏移バースト(z>4)であれば赤方偏移の同定が可能となる。これと並行してガンマ線バーストのフォローアップ観測を行い、GRB101023A,101011A,101017Aの観測に成功し、その結果をGCN(GRB Circular Service)への報告を行った。また、当初予定より半年の遅れが生じたものの、2011年3月に山頂と山麓サンペドロ・デ・アタカマ間の無線LANによるネットワーク接続に成功した。これにより山頂がインターネット常時接続され、リアルタイムでGRBのアラートを取得できるようになる。ガンマ線バーストの即時フォローアップ観測が可能となるとともに、GCNへの報告がリアルタイムで行えるようになる。更に2011年度中には山麓からのリモート観測への移行を目指しており、これによる観測効率の向上も期待できる。本年度2009年6月に、標高5640mのチャナントール山頂に設置された東京大学1m赤外線望遠鏡(通称miniTA0望遠鏡)に近赤外可視カメラANIRを取り付けてのファーストライト観測に成功した。この観測ランは安定運用に向けた主にエンジニアリング試験を目的としたものであり、ガンマ線バーストフォローアップを行うことはできなった。しかしながら、各種試験データを取得し、近赤外チャンネルの性能がほぼ当初の目標に達していることを確認した。また、その際に搭載されていたCCDカメラはインターレース型の量子効率の低いものであり、観測の結果からもシステム効率で3-10%しかないことを確認した。その後予定通り裏面照射型CCDカメラFLI・PL4710-1-MBを購入し、10月に行われた2度目の観測時に取り付けた。これにより、システム効率が15-30%に向上し、特に長波長側のIバンド(800nm)で5倍以上の感度向上が確認できた。さらに、この観測ランでGRB091015、GRB091018の2イベントのフォローアップ観測を行った。その結果、GRB091018の可視・近赤外残光観測に成功し,GCN (GRB Circular Service)への報告を行った。この観測から、アタカマの安定した気象条件と1秒角を切る良好なシーイングなど、このサイトがガンマ線バーストのフォローアップ観測に非常に適した場所であることが確認できた。しかしながら、山頂はネットワークに接続されていないために、観測前に山麓でアラートをチェックし、そこで出ていた天体の観測を行うしかなく、観測の即時性の問題が残った。これについては、2010年度に整備される予定の山頂-山麓間の無線ネットワークで解決される予定である。
抗酸菌前処理法の効率化に関する研究

現在最も高感度な液体培養法でも100 CFU/mL程度の菌濃度を必要とし、例えば肺結核患者全体の80%強までしか細菌学的に証明できない。さらに検体中の結核菌濃度が低いほど培養陽性までに時間がかかる。核酸増幅法は迅速だが感度の点で液体培地に劣る。原因は検体中から迅速性と感度を確保するのに十分な結核菌を回収・濃縮できないことにあり、この問題を解決し、結核菌検査を高感度化・迅速化するため、臨床検体からの抗酸菌検出感度を現時点の100倍程度(1 CFU/mL程度)に高めることを目的とする。臨床検体からの結核菌検出感度が高くなることにより、より正確な細菌学的診断が可能となる。平成30年度は臨床分離株を含む複数の結核菌株を培養し、懸濁液を作成した。この際、分散媒を均質化処理後の喀痰として、結核菌を捕獲するのに最適な電流・電圧および周波数が特定可能か検討した。喀痰を均質化するための試薬をセミアルカリプロテアーゼ、NアセチルLシステイン、その他で検討した。電極に結核菌を捕獲した状態でバッファー洗浄することが可能か(洗浄液での捕獲特性の変化)を評価し、最適な検体処理・誘電泳動条件を決定した。本年度の研究予定はほぼ順調に進展し、バッファー中の結核菌を最も効率的に誘電泳動にて捕捉する条件を決定することができた。問題点として、喀痰自体の導電率が誘電泳動に適切でないことが判明したこと、さらに従来の喀痰均質化技術のほとんどが導電率を上げる方向に作用し、誘電泳動の実施に必要なレベルまで分散媒の導電率を下げる必要性があることが明確となった。現在、既に複数の方法で導電率を下げることに成功しているが、実験手順における結核菌のロスを最小化するため、さらに改良が必要である。まず結核菌における最適な誘電泳動の設定をBCG培養液で検討した。液体培地(Mycobroth)でBCG予測菌量1.0×10^5-6の培養液を準備し、培養液の導電率を下げるために懸濁液であるMycobrothをエレスタバッファーで置換した。検体をエレスタ試作機(AFIテクノロジー)で誘電泳動を行った。誘電泳動では一定の電圧で流速と周波数を適宜変更した。チップに捕捉されたBCGを回収し、BCG菌量をReal-time PCRで定量的に測定した。捕捉されたBCGの定量結果から誘電泳動の最適設定は周波数2,500 kHz、電圧10 V、流速1mL/hと決定した。続いて誘電泳動による濃縮効果をBCG培養液で検討した。上記の通りに検体を作製し、誘電泳動を行った。BCG懸濁液total 5mLを上記設定で5時間誘電泳動施行し、チップに捕捉された菌を回収しReal-time PCRで定量的に捕捉菌量を誘電泳動前後で確認した。当初、濃縮効果は約5-10倍という結果であったがチップの改良(捕捉面積の拡大)により、現時点では約20倍の濃縮効果が得られている。現在は臨床検体、主に喀痰検体において誘電泳動を適切に行うための前処理の検討を行っている。誘電泳動を利用し、効率的な抗酸菌検査を行うためには喀痰検体の均一化・汚染除去を行いつつ、検体の導電率を低下させる必要がある。喀痰の均一化・汚染除去にOMNIgeneを使用している。この理由としては誘電泳動法は喀痰均一化後の検体処理に時間を要するため、時間経過とともに菌が死滅する可能性が高い従来のNALC-NaOHでの処理は適さないためである。またイオン交換樹脂を検体に混合することで導電率を1/1000程度に低下させることができることが確認された。しかしイオン交換樹脂に菌が付着することが問題となっており、喀痰の前処理法確立に至っていない。喀痰の前処理でイオン交換樹脂を使用する場合はイオン交換樹脂と菌の付着を防ぐことが必要であり、検体とイオン交換樹脂をフィルターで仕切り、フィルター間でイオン交換のみを行うことで対応可能か検討中である。また、イオン交換樹脂を使用せず検体の導電率を下げる方法として懸濁液のバッファー置換を検討する。現在検体中の菌をロスせずバッファー置換を行う方法を作成し、実験中である。この方法が成功すれば、元の喀痰量を4mlとした場合、全ての結核菌を50uLまで濃縮できるので、80倍濃縮が可能となると推定される(目標値100倍濃縮)。前処理の手法を確立した後に、実際の結核患者の臨床検体を処理し、従来法であるNALC-NaOH処理・遠心集菌法と比較し、誘電泳動を利用した前処理が核酸増幅効率、培養陽性度、培養陽性までの時間の点において従来法よりも優位であるかどうかの検討を行う。また誘電泳動を利用して集菌した検体からメタゲノム解析を実施し、その結果を指標としつつ結核菌単体で分離可能な条件が設定可能かも検討する。その場合、喀痰前処理は抗酸菌検査に特化した手法が必要とならない可能性もある。

具体的には、喀痰を粉末状の中性プロテアーゼなどで均一化し、誘電泳動で喀痰中の細菌叢を網羅的に捕捉する。誘電泳動の条件設定によっては結核菌を選択的(相対的場合も含む)に分離する可能性も考慮される。結核菌が十分量分離可能であれば、直接ゲノム解析して耐性変異の検出が可能か検討する。現在最も高感度な液体培養法でも100 CFU/mL程度の菌濃度を必要とし、例えば肺結核患者全体の80%強までしか細菌学的に証明できない。さらに検体中の結核菌濃度が低いほど培養陽性までに時間がかかる。核酸増幅法は迅速だが感度の点で液体培地に劣る。原因は検体中から迅速性と感度を確保するのに十分な結核菌を回収・濃縮できないことにあり、この問題を解決し、結核菌検査を高感度化・迅速化するため、臨床検体からの抗酸菌検出感度を現時点の100倍程度(1 CFU/mL程度)に高めることを目的とする。臨床検体からの結核菌検出感度が高くなることにより、より正確な細菌学的診断が可能となる。平成30年度は臨床分離株を含む複数の結核菌株を培養し、懸濁液を作成した。この際、分散媒を均質化処理後の喀痰として、結核菌を捕獲するのに最適な電流・電圧および周波数が特定可能か検討した。喀痰を均質化するための試薬をセミアルカリプロテアーゼ、NアセチルLシステイン、その他で検討した。電極に結核菌を捕獲した状態でバッファー洗浄することが可能か(洗浄液での捕獲特性の変化)を評価し、最適な検体処理・誘電泳動条件を決定した。本年度の研究予定はほぼ順調に進展し、バッファー中の結核菌を最も効率的に誘電泳動にて捕捉する条件を決定することができた。問題点として、喀痰自体の導電率が誘電泳動に適切でないことが判明したこと、さらに従来の喀痰均質化技術のほとんどが導電率を上げる方向に作用し、誘電泳動の実施に必要なレベルまで分散媒の導電率を下げる必要性があることが明確となった。現在、既に複数の方法で導電率を下げることに成功しているが、実験手順における結核菌のロスを最小化するため、さらに改良が必要である。まず結核菌における最適な誘電泳動の設定をBCG培養液で検討した。液体培地(Mycobroth)でBCG予測菌量1.0×10^5-6の培養液を準備し、培養液の導電率を下げるために懸濁液であるMycobrothをエレスタバッファーで置換した。検体をエレスタ試作機(AFIテクノロジー)で誘電泳動を行った。誘電泳動では一定の電圧で流速と周波数を適宜変更した。チップに捕捉されたBCGを回収し、BCG菌量をReal-time PCRで定量的に測定した。捕捉されたBCGの定量結果から誘電泳動の最適設定は周波数2,500 kHz、電圧10 V、流速1mL/hと決定した。続いて誘電泳動による濃縮効果をBCG培養液で検討した。上記の通りに検体を作製し、誘電泳動を行った。BCG懸濁液total 5mLを上記設定で5時間誘電泳動施行し、チップに捕捉された菌を回収しReal-time PCRで定量的に捕捉菌量を誘電泳動前後で確認した。当初、濃縮効果は約5-10倍という結果であったがチップの改良(捕捉面積の拡大)により、現時点では約20倍の濃縮効果が得られている。現在は臨床検体、主に喀痰検体において誘電泳動を適切に行うための前処理の検討を行っている。誘電泳動を利用し、効率的な抗酸菌検査を行うためには喀痰検体の均一化・汚染除去を行いつつ、検体の導電率を低下させる必要がある。喀痰の均一化・汚染除去にOMNIgeneを使用している。この理由としては誘電泳動法は喀痰均一化後の検体処理に時間を要するため、時間経過とともに菌が死滅する可能性が高い従来のNALC-NaOHでの処理は適さないためである。またイオン交換樹脂を検体に混合することで導電率を1/1000程度に低下させることができることが確認された。