hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト平滑筋腫瘍におけるHMGI-C遺伝子異常の検索

ヒト平滑筋腫瘍におけるHMGI-C遺伝子変異の臓器特異性や腫瘍組織型に対する特異性について検討するため、子宮および子宮外に発生した良悪性平滑筋腫瘍36例を対象としてHMGI-C遺伝子変異ならびに発現異常を調査した。腎被膜に発生した平滑筋腫2例の染色体分析では、そのいずれの例からもこの遺伝子の局在する12q13-15における染色体転座が検出された。Reverse-transcription-polymerase chainreaction(RT-PCR)によってHMGI-C遺伝子発現を検索したところ、子宮発生例の73%および子宮外に発生した腫瘍の57%に発現が認められた。なお遺伝子発現は平滑筋腫などの良性腫瘍(71%)のみでなく、平滑筋肉腫(58%)においても認められた。また3'rapid amplification of cDNA ends(3'-RACE)によって腫瘍組織のRNAより2種類の変異型遺伝子転写産物を見い出し、良性平滑筋腫瘍の24%、平滑筋肉腫の21%にそれらの転写産物の発現を認めた。さらにそれらの発現は子宮外に発生した腫瘍においても検出された。なおHMGI-C遺伝子の発現は胎児組織(脳、肝)においては認められたが、成人組織(脳、腎、肝、心、肺)においては認められず、変異型についてはこれらの胎児および成人組織のいずれからも検出されなかった。サザンブロット法による検索では、軟部組織発生の平滑筋肉腫の1例でHMGI-C遺伝子の再構成を認めた。以上の結果から、HMGI-C遺伝子変異ならびに発現異常はこれまで報告されている子宮平滑筋腫のみでなく、子宮外に発生した平滑筋腫瘍や平滑筋肉腫においても存在することが示され、HMGI-C遺伝子変異の臓器特異性や腫瘍組織型に対する特異性は認められないことが明かとなった。平成12年度は種々の臓器に発生した良悪性平滑筋腫瘍(計36例)の凍結腫瘍組織を収集した(平滑筋肉腫19例(軟部14、子宮2、腎1、膀胱1、肝1)、平滑筋腫17例(子宮12、胃3、腎2))。組織像を顕微鏡下で確認後、平滑筋肉腫については種々の平滑筋マーカー(desmin、actin、calponin、caldesmon)に対する抗体を用いて免疫組織化学を行い、腫瘍細胞の平滑筋への分化を確認した。それらの腫瘍組織からRNAを抽出し逆転写反応によりcDNAを合成後、HMGI-C遺伝子のexon13及びexon15を増幅の対象としたPCRによって各腫瘍におけるHMGI-C遺伝子転写産物の発現を検索した。当初の予想に反し、検索したほとんどの腫瘍では内在性コントロールとしてのGAPDH遺伝子産物が検出されたにもかかわらずHMGI-C遺伝子産物は検出されなかった。なお発現が認められた腫瘍(子宮平滑筋肉腫1例)では増幅遺伝子産物が複数検出され、自動シークエンサーによる塩基配列の解析によりそのうちの一つは異常のないHMGI-C遺伝子由来の産物であることが確認された。この結果から今回検索した多くの腫瘍ではHMGI-C遺伝子産物の発現が極めて低いか、あるいはその特殊な遺伝子構造のために通常のPCRでは産物が増幅されないことなどの技術的問題も示唆された。今年度はその後者の可能性を考慮し、さらなるPCR条件の最適化やnested PCR法を実施することで検出効率の向上を図る。さらに、検出されたPCR増幅産物についてはその塩基配列を詳細に解析し、平滑筋腫瘍での遺伝子異常の検索を継続する予定である。
熱安定性フォトクロミック化合物の合成と光記録への応用

フォトクロミック分子を光記録媒体として用いようとする場合要求される性能・機能には(i)記録の保存安定性(ii)繰り返し耐久性(iii)半導体レ-ザ感受性(iv)非陂壊読み出し機能などがある。本研究ではヘテロ5員環をもつジアリ-ルエテンを化学修飾することにより,これらの要求性能・機能をあわせもつ分子の合成をめざした。アソ-ル基としてセレノフエン環,ベンゾチォフェン環,インド-ル環をもつジアリ-ルマレイン酸無水物を合成し,それらの閉環体の吸収スペクトルを測定した。ジインド-ルマレイン酸無水物の閉環体は,620nmに吸収極大があり半導体レ-ザ感受性をもつことが認められた。しかし、この閉環体は熱的に不安定という欠点をもつ。熱安定性を付与するために,1つのインド-ル環をチォフエン環あるいはベンゾチォフェン環に置き換えた非対称型マレイン酵無水物を合成した。インド-ル環とチォフェン環とを2,3位にもつマレイン酵無水物の閉環体は,595nmに吸収極大を示し,なおかつ熱安定性をもつことが見出された。更に,インド-ル環の5位にメトキシ基,チォフェン環の5位にシアノ基を導入することにより閉環体の吸収極大位置を680nmにまで長波長化することができた。この化合物は,半導体レ-ザ感受性,熱安定性をあわせもつ。これらのジアリ-ルエテンの繰り返し耐久性を測定した所,ベンゾチォフェン環を2,3位にもつマレイン酸無水物は高い耐久性を示し,酸素存在下で7人10^3回,脱気下では10^4回の繰り返しが可能であった。インド-ル環とベンゾチォフェン環とをもつ非対称ジァソ-ルエテンも高い繰り返し耐久性を示し,10^4回の繰り返し後もほとんど劣化を示さなかった。以上,長波長域に感度をもち,熱安定性,繰り返し耐久性のあるフォトクロミック分子の設計指針を明らかにした。フォトクロミック分子を光記録媒体として用いようとする時、克服すべき重要な条件は(i)記録の熱安定性、(ii)繰り返し耐久性、(iii)非破壊読み出し機能、および(iv)半導体レ-ザ感受性である。我々はすでにチォクエン環をもつジアリ-ルエテンが熱不可逆フォトクロミック反応(光生成した異性体が光反応では元へもどるが熱反応では元へもどらない)を示すことを見出している。ジアリ-ルエテン分子骨格を基本として、化学修飾により他の条件も兼ねそなえた分子の合成をすすめた。(iv)の半導体レ-ザ感受性を付与することをめざし、アリ-ル基としてセレノフェン環、ベンゾチオフェン環、インド-ル環をもつ分子の合成を行った。セレノフェン環、ベンゾチオクエン環をもつジアリ-ルエテン酸無水物の閉環体は、元のチオフェン環をもつジアリ-ルエテン酸無水物の閉環体は、元のチオフェン環をもつ分子よりそれぞれ5nmレッドシフト、16nmブル-シフトするのみで大きな長波長化は達成されなかった。一方インド-ル環をもつジアリ-ルエテン酸無水物の閉環体は620nmに吸収極大をもち、半導体レ-ザの波長(780nm)に感度をもつことが見出された。

しかし、閉環体の寿命は80°Cにおいて3hしかなく(i)の熱安定性の条件を欠き記録材料として用いることはできない。熱安定性と長波長域感受性をあわせもつ分子の設計には別のアプロ-チ(非対称構造の導入など)が必要と思われる。(iii)の非破壊読み出し機能の付与をめざして、光二量化反応するアントラセン環をチオフェン部にもつジアリ-ルエテンを合成した。開環状態においてエキシマ-発光が観測され、二量化反応と閉環反応の共存していることが認められた。しかし光閉環反応の量子収率が低く、非破壊読み出し機能を議論する以前にこのことの改善が必要である。フォトクロミック分子を光記録媒体として用いようとする時,克服すべき条件には(i)記録の保存安定性,(ii)繰り返し耐久性,(iii)半導体レ-ザ感受性,(iv)非破壊読み出し機能などがある。本研究では、ヘテレ5員環をもつフジアリ-ルエテン分子を化学修飾することにより,これらの機能をあわせてもつ分子に仕上げることをめざした。2,3ービスインド-ルマレイン酸無水物は、620nmに吸収極大をもちその吸収端は800nmにまで達することが認められた。しかし,この分子の閉環体は熱的に不安定であり、暗黒中においても元の開環体へもどる。熱安定性を付与するために、1つのインド-ル環をチオフェン環あるいはベンゾチオフェン環に置きかえた非対称置換マレイン酸無水物を合成した。インド-ル環とチオフェン環とを2,3位にもつマレイン酸無水物の閉環体は595nmに吸収極大を示し,なおかつ熱安定性をもつことが見出された。更に,インド-ル環の5位にメトキン基を,チオフェン環の5位にシアノ基を導入することにより閉環体の吸収極大を680nmにまで長波長化することができた。この閉環体の吸収端は850nmにまで達しており,半導体レ-ザ感受性をもつ。これらのジアリ-ルエテン分子の繰り返し耐久性を測定した所,ブンゾチオフェン環を2,3位にもつマレイン酸無水物は高い耐久性を示し,酸素存在下で3.7×10^3回,脱気下では10^4回の繰り返しが可能であった。インド-ル環とブンゾチオフエン環とをもつ非対称ジアリ-ルエテンも高い繰り返し耐久性を示し,10^4回の繰り返し後もほとんど劣化を示さなかった。以上,長波長域に感度をもち,熱安定性,繰り返し耐久性のあるフォトクリミック分子の設計指針を明らかにした。
国際間の所得不平等と習慣形成の理論的研究

本研究は,国際間の所得不平等の源泉を,家計の消費習慣の影響度の違いに求めるものである。特に親の消費習」償が子供の消費水準に,若年時の消費習'慣が老年時に影響を与える場合,この影響度が国際間で異なる場合に,どのような資本移動パターンおよび所得水準の違いがみられるかを明らかにするものである。分析の結果,これまでの理論研究では明らかにされなかった,現実により近い資本移動パターンを明らかにするモデルを構築することができた。本研究の目的は、国際間の所得不平等問題が生じる原因を習慣形成に求める理論的枠組みを構築することにある。このため交付申請書のとおり海外の学会((International Institute of Public Finance)や国内トップレベルの学会(日本経済学会、IEFS JAPAN)へ参加し、実証研究のサーベイや最新の研究成果の確認を行った。国際間所得不平等問題は、経済成長論の研究において中心的課題の一つであり、発展途上国にとっては切実な問題である。本研究では、当初、新古典派経済成長論の枠組みで習慣形成を通じて各国の生産構造の変化が所得不平等をもたらすというメカニズムを明らかにすることを目的としていたが、上記の学会参加や最新の研究成果の分析から、土台となる経済成長モデルを新古典派成長論に絞ることを避け、より一般的な視点でこの理論モデルを構築することがより望ましいとの知見を得た。これは近年、経済成長論が定常状態に至る移行過程を重視していること、実証研究がこの移行過程を対象範囲としていることによる。当初想定していた新古典派経済成長モデルは、資本ストックの推移を考慮したものとなっているが、近年の経済成長論が内生的経済成長理論と新古典派成長理論を歴史と整合的にさせることを目的に議論が進んでいるため,必ずしも資本ストックの推移のみが経済成長のエンジンとはなりえない。これを踏まえて、より一般的にモデル化することでいくつかの簡単化が可能であり、移行過程の分析を行うことが可能になる。本研究は,習慣形成が国家間の所得格差に与える影響を,世代重複モデルを用いて,理論的に明らかにするものであり,本年度は,昨年度において蓄積したサーベイを理論的研究に反映させ,2年間の研究を完結させることに努めてきた。その成果として,国際間の資本移動と習慣形成の関係について論じた"国際間資本移動による利益と習慣形成"および貿易公的中間財の関係から国家間の所得格差の問題を議論した"International Trade anda Public Intermediate Goods in an Overlapping Generations Model"(ともに投稿準備中)に結実した。前者は,世代重複構造を持つ家計に,(1)親から与えられる消費水準に基づく消費習慣と(2)自分の若年期の消費水準が老年期の消費水準に影響するという消費習慣が,共存する際に,資本移動のパターンおよび厚生への影響を見たものであり,分析の結果,上記二つの習慣形成の影響の大きさに基づいて,"様々な"資本移動のパターンが生じることが確認された。後者の研究は,世代重複経済に,公的中間財を入れた場合に貿易パターンにどのような影響が生じるかを明らかにしたものであり,公的中間財の影響が,資本蓄積を通じて需要側に影響を与えるという新たな効果を生むことが確認された。これらの結果は,海外の学会(The Pacific Regional Science Conference, Far Eastern and South Asian Meeting of the Econometric Society)において報告され多くの有益なコメントを得ることができた。これら構築した理論モデルをさらに近年の成長モデルの土台に移して,より現実に近い理論モデルの構築を行い研究成果をより高めたいと考えている。
タンパク質間相互作用ネットワーク解析によるがん個性の理解

様々な個性を持つがん細胞をシステムとして理解するためには、個々のがん細胞のタンパク質問相互作用(protein-protein interaction;PPI)ネットワークを大域的かつ正確に把握するためのインタラクトーム解析手法が必要になる。本研究課題では、PPIを効率的に解析できる独自の実験手法(in vitro virus法;IVV法)を有する研究者や、がん細胞のモデル実験系を有する研究者と連携し、実験によるデータとスパコンを活用した新たながんインタラクトーム解析の確立を目指して研究を行なっている。24年度は以下の三点について進展があった:(1)IVV法と次世代シーケンサの融合技術であるIVVhigh-throughput sequencing(IVV-HiTSeq)法の開発を行った。IVV法はmRNAディスプレイ技術の一つであり、核酸(mRNA)情報によってタンパク質を解析することが出来る技術であり、代表者らはこの特性を利用して従来困難であった次世代シーケンサによるPPI解析を実現させた。また、PPI検出実験の信頼性および効率が大幅に向上することを確認した。(2)IVV法は、PPIに加えてタンパク質の「相互作用ドメイン」情報を一度に解析できるインタラクトーム解析技術であるため、がん細胞に起きている異常(DNA変異など)とPPIの関連を詳細に解析するのに適した情報を提供することができる技術である。代表者らは、相互作用ドメイン情報とDNA変異などの各種データを統合し解析するための基盤として、ウェブデータベースの開発を行った。(3)薬剤耐性の異なる2種類のがん幹細胞について、抗癌剤処理後のインタラクトームおよびトランスクリプトームの経時的な変化の違いを明らかにするため、抗癌剤処理後のRNAを経時的にサンプリングした(0.5-7.5h:1h毎)。「研究実績の概要」で述べたとおり、24年度は(1)インタラクトームデータを産出するための新たな方法の開発(IVV-HiTSeq法の開発)、(2)産出されるデータを解析するための基盤確立(ウェブデータベースの開発)、(3)データ取得実験に用いるためのサンプルの準備(2種類のがん幹細胞についての抗癌剤処理後のRNAサンプルの取得)を行っており、目的を達成に向けて十分な進展があったといえる。24年度に取得したがん幹細胞のRNAサンプルを用いてマイクロアレイ実験を行い、トランスクリプトームデータを取得する。次に、それらの情報解析の結果から得られた重要な分子群について、IVV-HiTSeq実験のベイトとしてPPI検出実験を行う。得られたPPIネットワークに遺伝子発現情報を重ねあわせ、抗癌剤応答後のインタラクトームの動的変化の細胞による違いをネットワーク特性(中心性、スモールワールド性など)の観点から解析していく。また、IVV-HiTSeq法で得られる相互作用領域情報を利用し、ネットワークに変化を生じさせるがんの変異やスプライスバリアントについても探索を行う。様々な個性を持つがん細胞をシステムとして理解するためには、個々のがん細胞のタンパク質間相互作用(protein-protein interaction;PPI)ネットワークを大域的かつ正確に把握するためのインタラクトーム解析手法が必要になる。23年度は以下の三点について進展があった:(1)IVV法と次世代シーケンサの融合技術であるIVVhigh-throughput sequencing(IVV-HiTSeq)法の開発を行った。(3)薬剤耐性の異なる2種類のがん幹細胞について、抗癌剤処理後のインタラクトームおよびトランスクリプトームの経時的な変化の違いを明らかにするため、抗癌剤処理後のRNAを経時的にサンプリングした(0.5-7.5h;1h毎)。

また、PPI検出実験の信頼性および効率が大幅に向上することを確認した。(2)IVV法は、PPIに加えてタンパク質の「相互作用ドメイン」情報を一度に解析できるインタラクトーム解析技術であるため、がん細胞に起きている異常(DNA変異など)とPPIの関連を詳細に解析するのに適した情報を提供することができる技術である。代表者らは、相互作用ドメイン情報とDNA変異などの各種データを統合し解析するための基盤として、ウェブデータベースの開発を行った。(3)薬剤耐性の異なる2種類のがん幹細胞について、抗癌剤処理後のインタラクトームおよびトランスクリプトームの経時的な変化の違いを明らかにするため、抗癌剤処理後のRNAを経時的にサンプリングした(0.5-7.5h:1h毎)。「研究実績の概要」で述べたとおり、23年度は(1)インタラクトームデータを産出するための新たな方法の開発(IVV-HiTSeq法の開発)、(2)産出されるデータを解析するための基盤確立(ウェブデータベースの開発)、(3)データ取得実験に用いるためのサンプルの準備(2種類のがん幹細胞についての抗癌剤処理後のRNAサンプルの取得)を行っており、目的を達成に向けて十分な進展があったといえる。「研究実績の概要」で述べたとおり、24年度は(1)インタラクトームデータを産出するための新たな方法の開発(IVV-HiTSeq法の開発)、(2)産出されるデータを解析するための基盤確立(ウェブデータベースの開発)、(3)データ取得実験に用いるためのサンプルの準備(2種類のがん幹細胞についての抗癌剤処理後のRNAサンプルの取得)を行っており、目的を達成に向けて十分な進展があったといえる。24年度は、23年度に取得したがん幹細胞のRNAサンプルを用いてマイクロアレイ実験を行い、トランスクリプトームデータを取得する。次に、それらの情報解析の結果から得られた重要な分子群について、IVV-HiTSeq実験のベイトとしてPPI検出実験を行う。得られたPPIネットワークに遺伝子発現情報を重ねあわせ、抗癌剤応答後のインタラクトームの動的変化の細胞による違いをネットワーク特性(中心性、スモールワールド性など)の観点から解析していく。また、IVV-HiTSeq法で得られる相互作用領域情報を利用し、ネットワークに変化を生じさせるがんの変異やスプライスバリアントについても探索を行う。24年度に取得したがん幹細胞のRNAサンプルを用いてマイクロアレイ実験を行い、トランスクリプトームデータを取得する。
ＨＣＶ　ＮＳ３によるＴＧＦ－ＢＥＴＡ疑似活性発現を標的とした肝硬変治療の基礎研究

肝線維症は、C型肝炎ウイルス(HCV)が主原因であるが、HCVが肝線維化を進行させる仕組みはわかっていない。我々は、HCVのNS3プロテアーゼが、TGF-βを真似て直接TGF-β受容体に結合、肝臓内コラーゲン産生を増加させるsmadシグナルを活性化し、肝線維化が進行するという新たな分子機構を見つけた。TNF-αは、HCV感染肝細胞表面上でNS3と共局在するTGF-β受容体の発現を促進、これを亢進した。コンピュータシミュレーションにより推測されたTGF-β受容体結合部位に対するNS3抗体は、HCV感染肝細胞のsmadシグナル、HCV感染によるヒト肝細胞移植キメラマウスにおける肝線維化を抑制した。1.NS3によるTGF-β疑似活性を介する肝線維化誘導の検証:組換えNS3ならびに組換えTGF-βは、ヒト肝細胞株Hc、ヒト肝星細胞株LX-2において、線維症に関与する標的遺伝子群(TGF-β、collagen 1α1)の遺伝子発現を亢進することを、リアルタイムRT-PCRにより確認した。2.HCV肝疾患モデル系(ヒト肝キメラマウス)を用いた検証:ヒト肝置換キメラマウスにHCV(J6/JFH-1キメラウイルス)を感染させ、肝線維化、肝硬変の進展を観察した。21、56、75日目に死亡または瀕死となり、1匹のみ110日間継続して観察可能であったが、血中のHCV RNA量が10^5 copies/mlと低めの経過を示した。いずれのマウスも解剖し、肝臓の組織の病理解析を行っている。また、4週間後からNS3-TGF-β受容体結合阻害抗体を11週間、2回/週(0.5mg/kg、5mg/kg)投与した。感染2週間後、HCV RNA濃度は210×10^5 copies/mlに達し、その後もウイルス量はほぼ一定であった。現在、阻害抗体が肝線維化、肝硬変の病態形成に与える抑制効果について解析中である。3.NS3のTGF-β受容体結合・活性化機構、TGF-β様シグナル伝達機構の解析:大腸菌で発現したNS3とTGF-βI型受容体を部分精製後、in vitroで混合し、native PAGE法にて複合体形成を検討した。混合により新たなバンドの出現を認めたので、これが両者の複合体であることの確認を進めている。4.HCV肝疾患患者検体における確認:患者検体において非実質細胞、特に肝星細胞が、NS3と同じ非構造タンパク質のNS5Aを発現しているらしいことを示す染色結果を得た。5.5.スクリーニング:プローブを設計するにとどまり、実行までに至らなかった。2.HCV肝疾患モデル系(ヒト肝キメラマウス)を用いた検証:23年度にHCVを感染させたヒト肝置換キメラマウスにおいて、NS3-TGF-β受容体結合阻害抗体が肝線維化の進展を抑制する結果を得たが、24年度に行った同試験においては病態モデルの形成が確認できなかった。この原因と考えられるドナー肝細胞の違いについて検討を行ったが、NS3に対する応答性の差は見出だせず原因解明には至らなかった。3.NS3のTGF-β受容体結合・活性化機構、TGF-β様シグナル伝達機構の解析:大腸菌で発現した組換えタンパク質を用いたNS3とTGF-βI型受容体との結合について、ドッキングシミュレーションにより予測された結合サイトのペプチドフラグメントにより競合的に阻害されることを確認した。4.HCV肝疾患患者検体における確認:血中のNS3濃度を測定するための高感度ELISAの構築を試みたが、検出感度がμg/mlオーダー程度のものを構築するにとどまり、患者検体の測定までに至らなかった。5.NS3-TGF-β結合阻害物質のスクリーニング:昨年度得られたモノクローナル抗体がNS3のTGF-β疑似活性に及ぼす影響について、HCV感染Huh-7.5.1細胞におけるリン酸化Smad3のレベルを指標とし蛍光免疫染色により評価した。その結果、HCV感染により上昇したリン酸化Smad3のレベルは、同抗体処理により顕著に抑制された。1.NS3によるTGF-β疑似活性を介する肝線維化誘導の検証:炎症性サイトカインの一つであるTNF-αあるいはエタノールを前処理したヒト肝細胞株Hcにおいて、組換えNS3が線維症に関与する標的遺伝子群(TGF-β、collagen 1α1)の発現を相乗的に亢進することをリアルタイムPCRにより確認し、その分子機構の一つとしてTNF-αによるTGF-βI型受容体発現の亢進が関与することを見出した。

2.HCV肝疾患モデル系(ヒト肝キメラマウス)を用いた検証:23年度にHCVを感染させたヒト肝置換キメラマウスにおいて、NS3-TGF-β受容体結合阻害抗体が肝線維化の進展を抑制する結果を得たが、24年度に行った同試験においては病態モデルの形成が確認できなかった。この原因と考えられるドナー肝細胞の違いについて現在検証中である。また、スケールアップが簡便である限外濾過およびクロマトグラフィー法により、感染性を維持したHCV粒子の高効率な濃縮精製に成功した。3.NS3のTGF-β受容体結合・活性化機構、TGF-β様シグナル伝達機構の解析:大腸菌で発現した組換えタンパク質を用い、NS3がTGF-βのI型受容体だけでなく、II型受容体とも相互作用することを見いだした。しかし、I型およびII型受容体の共存によるNS3への結合の増強作用は見いだされず、TGF-βによるリガンド受容体複合体の形成とはメカニズムが異なる可能性が示唆された。4.HCV肝疾患患者検体における確認:患者肝切片におけるNS3の染色を試みたが、特異的な発現が認められなかったため、現在染色条件の再検討を行なっている。5.NS3-TGF-β結合阻害物質のスクリーニング:レポーターアッセイ実施をし、NS3の結合を阻害するモノクローナル抗体を得た。年度末までには1カ月残っているので、Gene Chipや、動物モデルの結果、シグナルトランスダクションの解析は、有る程度進むことが予想されるが、NS3がプロテアーゼ活性を保持しているもののTGF-β疑似活性を失うという当初想定していなかった事実に直面し、高いTGF-β疑似活性を発現する組換えNS3プロテアーゼを作り直すのに4カ月を要してしまった。また、外部委託でキメラマウスの動物実験を開始する契約に予想外に時間がかかり、スタートが3カ月遅れてしまった。これらのことから研究計画が3カ月遅れている。25年度が最終年度であるため、記入しない。HCVのNS3プロテアーゼがTGF-β疑似活性を発現し肝線維化を引き起こすという作業仮説について、ヒト検体における検証については染色条件の最適化中であるが、培養細胞及び動物レベルにおいては概ね検証が済んでいる。またシグナル活性化の分子機構について、NS3とTGF-β受容体との結合を証明できており、炎症性サイトカインによる受容体発現亢進を介したシグナルの増強について示唆する知見も得られている。高いTGF-β疑似活性を発現する組換えNS3プロテアーゼの作製・精製法が確立できたので、同タンパク質を大量精製し、計画の遅れを取り戻す。動物モデルとしてSCIDマウスを用いたヒト肝移植キメラマウスに加えてNOGマウスを用いたヒト肝移植キメラマウスでの解析も試みる。分子機構の解析を進め、臨床検体での検証を行う。また、今年度できなかったスクリーニングを行い、TGF-β疑似活性抑制候補化合物を得る。NS3によるTGF-βシグナル活性化については、TGF-βI型/II型受容体に対するsiRNAを用いたノックダウン実験、ヨードラベル化したTGF-β(或いはNS3)を用いた結合実験、さらにはNS3-TGF-β受容体複合体のX線結晶構造解析を試み、より詳細な分子機構について解明を進める。またHCV肝疾患患者検体における検証のため、NS3とTGF-β受容体の共局在を免疫染色により確認するとともに、NS3を検出するELISAを確立して血漿NS3濃度と肝線維症/肝硬変の病態進展との関連について解析を試みる。
細胞分裂に関わる大腸菌セリンtRNAの構造と機能

大腸菌では細胞周期に依存する一連のタンパク質の発現を調節する機構が働いており、serT遺伝子産物であるtRNA^<Ser>_1が関わっていることが知られている。tRNA^<Ser>_1のG_<10>がAに変異したserT42変異株では細胞分裂がts性を示すようになる。細胞周期の過程でtRNA^<Ser>_1がどの様に関わっているのか興味深い。42°CにおけるDNA合成の停止部位は特異的ではないという報告があるので、転写あるいは翻訳のどちらのレベルで働いているのか知るために、この変異株に対してセリンtRNA遺伝子のアンチコドン部位を変えたものを導入し、生育およびβ-galactosidaseの発現に対する42°Cでの回復を調べたところ、tRNA^<Ser>_1でのみ認識されるUCAコドンに対応できるtRNA^<Ser>_1(wt)、tRNA^<Ser>_1(T_<34>)の遺伝子の導入およびtRNA^<Ser>_1(G_<34>)遺伝子導入によって両回復がみられた。後者の場合はアンチコドン3'側に隣接したヌクレオチドの修飾がコドン-アンチコドン認識に影響を与えているのではないかと推察する。また、変異型のtRNA^<Ser>_1(A_<10>)遺伝子をマルチコピーベクターで導入した場合でもβ-galactosidase発現や生育は回復する。このことからtRNA^<Ser>_1は翻訳レベルでの関与が強く示唆される。42°CではtRNA^<Ser>_1(A_<10>)の発現は30°Cの約60%に落ちるが、tRNA^<Ser>_1(wt)も同様であった。in vitroのtRNA^<Ser>_1(A_<10>)のセリン受容活性はts性を示さず、in vivoではtRNA^<Ser>_1(A_<10>)は42°Cでも殆どセリンを受容した形で存在していた。また、tRNA^<Ser>_1(A_<10>)はDステムのはじめの塩基対形成ができないために42°C、in vivoでは極めて不安定であった。従って42°Cにおいて30°C時の約60%量を維持するためにはtRNA^<Ser>_1(A_<10>)自体の発現量は何らかの機構が働いて非常に活発になっているのではないかと推察される。
Wntシグナリングと生活習慣病

低密度リポ蛋白(LDL)受容体ファミリー蛋白(LRP)ファミリーの1つであるLRP5を欠損するマウスは、ヒトの中高年の多くに見られる高脂血症や型糖尿病、骨粗こつ症を発症させることを明らかになりました。また、膵臓のβ細胞からのインスリン分泌が、LRP5のリガンドであるWntにより増強されることを示し、コレステロールやグルコース、骨代謝を含む種々の細胞応答においてLRP5/Wntシグナリング系が重要な役割を担う可能性を示しました。Wnt/LRP5シグナリングにより仲介されるコレステロール代謝やインスリン分泌のメカニズムをゲノム機能学的に明らかにすることにより、糖尿病や高脂肪血症、骨代謝異常の治療への応用することが可能です。コレステロールや糖代謝におけるLRP5/Wntシグナリング系を明らかにするために、Wntの精製を行いました。Wntを大量に発現する細胞を樹立して、培地よりWntタンパクを部分精製し、膵臓のβ細胞からのインスリン分泌増強がベータカテニンの安定化を伴う古典的カノニカル経路ではなく、非カノニカルな経路により担われる可能性を示しました。また、絶食時におけるケトン体代謝に重要なアセチルCoA合成酵素が転写因子KLF15により制御されることを示しました。さらに、耐糖能異常の代償機構に転写因子SOX6が関与していることを示しました。高脂肪食や遺伝的肥満マウスではSOX6がダウンレギュレーションを受けることにより、インスリン分泌が増加し、結果的に高インスリン血しょうを引き起こす可能性を示しました。私たちは低密度リポ蛋白(LDL)受容体ファミリー蛋白(LRP)ファミリーの1つであるLRP5の異常が、中高年の多くに見られる高脂血症や型糖尿病、骨粗こつ症を発症させることをマウスを用いて明らかにしてきた。さらに膵β細胞からのインスリン分泌がLRP5のリガンドであるWntにより誘導されることを示し、耐糖能を含む種々の細胞応答においてLRP5/Wntシグナリング系が重要な役割を担う可能性を示した。本研究ではWnt/LRP5シグナリングにより仲介されるコレステロール代謝やインスリン分泌のメカニズムをゲノム機能と環境因子の観点から明らかにすることにより、糖尿病や高脂肪血症、耐糖能異常の治療への応用を目的としている。コレステロールや糖代謝におけるLRP5/Wntシグナリング系を明らかにするために、Wntの精製を行った。Wntを大量に発現する細胞を樹立し、培地よりWntタンパクを精製した。現在精製Wntタンパクを用いて種々の遺伝子系を持つマウスでの個体レベルのWntの機能解析を行っている。また、LRP5のシグナル系を明らかにするために、クレーメン1/2遺伝子に異常を持つミュータントマウスを作製し、現在その表現型を解析中である。また、東京大学先端研の酒井教授のグループと共同で、絶食時におけるケトン体代謝に重要なアセチルCoA合成酵素が転写因子KLF15により制御されることを示しました。

さらに、耐糖能異常の代償機溝に転写因子SOX6が関与していることを示しました。高脂肪食や遺伝的肥満マウスではSOX6がダウンレギュレーションを受けることにより、インスリン分泌が増加し、結果的に高インスリン血しょうを引き起こす可能性を示しました。
金石範研究を主軸とするリアリズムの日朝比較文学的研究

本研究「金石範研究を主軸とするリアリズムの日朝比較文学的研究」には以下の2つの具体的遂行課題があった。(1)日朝鮮人文学者が形成していた朝鮮語による文学言説について、1950・60年代という期間で調査し、そこにおける金石範の朝鮮語テクストの位置づけを考察すること、(2)50・60年代の在日朝鮮人文学者らによる朝鮮語文学言説に影響を与えていた同時代の朝鮮民主主義人民共和国(以下、共和国と略記)の文学言説を調査することである。以上2つの調査から、金石範への言及が主に彼の日本語テクストをめぐってなされているのに対し、金石範を日朝比較文学の視点から評価することが本研究の目的であった。調査を進めるなかで年配の在日朝鮮人の文学研究者と交流が深まり、所蔵資料を買い受けたが、これによって50・60年代の共和国文学の1次資料を入手できたと同時に、共和国に近い在日朝鮮人知識人の教養(特に芸術分野や政治分野において)の一端を、当該個人の例を通じて知ることができた。一連の交流は50・60年代在日朝鮮人文学の、文献にはあらわれにくい外堀を知るという点で貴重なものとなった。また、平成22年度からの継続作業として50・60年代の共和国の文学関連資料の調査にあたった。韓国で所蔵されている共和国の文学関連資料の調査ならびに韓国における共和国文学の研究動向の調査のために韓国に長期滞在し、資料調査や研究者との交流をおこなった。韓国での調査を通じて判明した一番大きな事柄としては、韓国において、共和国の文学を扱った先行研究はあるが、朝鮮文学史における社会主義文学の受容という文脈で共和国文学を扱うという視点での先行研究は乏しいということであった。本研究「金石範研究を主軸とするリアリズムの日朝比較文学的研究」の研究目的は、リアリズムの受容・解釈の観点から、在日朝鮮人作家・金石範(1925-)の創作活動全般を調査することと、朝鮮語と日本語の領域にまたがる文学史を調査することの二つである。その具体的な作業としては、金石範の日本語・朝鮮語テクストの調査に加え、50年代・60年代を中心に在日朝鮮人の朝鮮語文学の調査と朝鮮民主主義人民共和国(以下、共和国)文学の調査が主となる。2010年度に集中的におこなう作業として、在日朝鮮人の朝鮮語文学に関する調査と、韓国に渡航し、韓国における在日朝鮮人文学に関する研究成果・動向と共和国文学に関する研究成果・動向・資料所蔵状況の調査を予定していた。後者の予定については2010年4月6月にかけてこれを実施した。前者については予定を変更した。共和国文学に関する調査の過程で、在日朝鮮人の文学関係者を介して、50年代・60年代のものを中心に共和国の文学関係資料を期せずして相当数購入することができたためで、これをきっかけに予定を変更し、それらの資料にもとづいて50年代・60年代共和国文学についての調査をおこなった。2011年度に予定していた作業を繰り上げたかたちである。それらの資料のうち、朝鮮語文献については、これまで日本語に訳出して紹介されたことはほとんどなく、他の言語圏でも調査対象となってこなかったと考えられるものも含まれている。そうした研究状況を踏まえ、朝鮮語文献のいくつかについては日本語訳を作成した(未発表)。2010年11月13日には、同時代史学会(於:立教大学)にて、50年代・60年代の在日朝鮮人運動という統一テーマのものとで、「1960年代の在日朝鮮人朝鮮語文学圏と金石範-比較リアリズム文学にむけて」と題した研究報告をおこなった。
分子標的治療による小細胞肺癌に対する新規治療法の開発と臨床応用

HER2とEphA2の2つの分子が小細胞肺癌の治療標的分子となるかを検討した。HER2を標的とした先進医療としてtrastuzumabとirinotecanの併用療法を行い、再々発HER2陽性小細胞肺癌2症例の病勢を制御する事ができた。Trastuzumab emtansineはirinotecan耐性HER2陽性小細胞肺癌細胞のマウス皮下移植片の増殖を有意に抑制した。また、EphA2ノックダウンやdasatinibによる機能阻害は、EphA2陽性小細胞肺癌細胞にsenescenceを誘導し、その増殖を抑制した。以上から、HER2とEphA2は小細胞肺癌の新たな治療標的となり得ると示唆された。小細胞肺癌(SCLC)はの予後を改善するには抗癌剤耐性の克服が不可欠であるが、現在に至るまで、再発後の有効な治療法は確立されていない。本研究において、我々はHER2とEphA2の2つの受容体型チロシンキナーゼに注目して研究を行っている。HER2について、我々はこれまでにHER2陽性抗癌剤耐性SCLC細胞に対し、抗HER2抗体であるtrastuzumabが抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性を惹起し、抗腫瘍効果を発揮する事をpreclinicalに示してきた。この知見を実臨床に応用するため、患者本人の同意と大阪大学医学部附属病院倫理委員会および先進医療委員会の承認を得た上で、生検検体の免疫染色でHER2の発現が確認できた再々発SCLC2症例において、trastuzumabとirinotecanの併用療法を行った。重篤な副作用は認めず、治療効果は過去に報告された再発SCLCに対するirinotecan単剤治療の成績を上回っていた。上記2症例については、学会および論文発表を行った。今後もpilot studyとして症例を蓄積していく予定である。EphA2については、阻害剤としてdasatinibを使用し、in vitroの実験を行った。dasatinibは実臨床で応用可能な濃度でEphA2陽性のSCLC細胞(SBC-3, SBC-5, Smk)の増殖を排他的に阻害した。また、SBC-5細胞のEphA2をsiRNAでノックダウンするとその効果はキャンセルされた。この事から、dasatinibは確かにEphA2を標的として抗腫瘍効果を発揮していると考えられた。その機序としては、当初想定していたErkやAktといった増殖や生存に関わるさらに下流のsignalの阻害ではなく、senescenceによってもたらされている事が、SA-β-gal染色や、FACSを用いたcell cycle analysisによって明らかとなった。今後、in vivoでdasatinibが抗腫瘍効果をもたらすかなどを検討していく予定である。小細胞肺癌(Small Cell Lung Cancer; SCLC)の予後を改善するには抗癌剤耐性化の克服が不可欠であるが、現在に至るまで、再発後の有効な治療法は確立されていない。本研究において、我々はHER2とEphA2の2つの受容体型チロシンキナーゼに注目して研究を行った。HER2について、我々はこれまでにHER2陽性抗癌剤耐性SCLC細胞に対し、抗HER2抗体であるtrastuzumabが、抗腫瘍効果を発揮する事をpreclinicalに証明してきた(Mol Cancer Ther. 2012, Sci Rep. 2013)。この知見を実臨床に応用するため、生検検体の免疫染色でHER2の発現が確認できた再々発SCLCの2症例に対し、trastuzumabとirinotecanの併用療法を行った。重篤な副作用は認めず、2症例のみの治療経験であるが、いずれの症例でも良好な病勢コントロールを得る事ができ、その結果を論文化し発表した(Lung Cancer. 2015)。現在はpilot studyの準備を進めている。また、近年再発乳癌に対し保険適応となったtrastuzumab emtansine(T-DM1)のHER2陽性SCLCに対する効果を検証した。T-DM1はirinotecanの誘導体SN-38に耐性となったHER2陽性SCLCマウス皮下移植片の増殖を有意に抑制する事を見出した。本結果については、現在論文投稿準備中である。EphA2については、siRNAでノックダウン(KD)することにより、EphA2陽性SCLC細胞の増殖が著明に抑制され、EphA2阻害剤として用いたdasatinibは、実臨床で応用可能な濃度でEphA2陽性のSCLC細胞の増殖を排他的に阻害する事を見出した。一方で、EphA2 KD細胞では、dasatinibの効果は上乗せできなかった。この事からdasatinibはmultikinase阻害剤であるものの、確かにEphA2を標的として抗腫瘍効果を発揮していると考えられた。その機序としては、senescenceによってもたらされている事を明らかとし、以上の結果を学会発表した。現在EphA2強制発現SCLC細胞を作成し、EphA2 signalのさらなる解析を行っている。

また、EphA2ノックダウンやdasatinibによる機能阻害は、EphA2陽性小細胞肺癌細胞にsenescenceを誘導し、その増殖を抑制した。以上から、HER2とEphA2は小細胞肺癌の新たな治療標的となり得ると示唆された。1. HER2陽性再発小細胞肺癌に対するtrastuzumabの臨床応用ヒトSCLC検体のHER2の発現を免疫染色法で検証し、約25%の症例でHER2の発現を確認した。さらに、evidenceのある化学療法に抵抗性となったHER2陽性SCLC2症例に、trastuzumabとirinotecanの併用療法を行い、従来報告されているirinotecan単剤療法を上回る効果が期待できる事が示唆された。実臨床でtrastuzumabをSCLC症例に使用した経験は、新たな治療戦略を樹立するための重要な一歩と考え、結果を学会および英文雑誌にて発表した。2. EphA2を標的とした小細胞肺癌に対する新たな分子標的治療法の開発HER2以外の新たな治療標的EphA2陽性SCLC細胞はdasatinibにより腫瘍の増殖が抑えられる事、dasatinibはmultikinase inhibitorであるが、その抗腫瘍効果は確かにEphA2の阻害を介している事を明らかにした。また、dasatinibの抗腫瘍メカニズムはsenescenceである事を見出し、これらの成果は学会で発表することができた。以上から、研究はおおむね順調に進展していると判断した。医歯薬学1. HER2陽性再発小細胞肺癌に対するtrastuzumabの臨床応用SCLC臨床検体の免疫染色を引き続き行い、HER2陽性のSCLC症例を蓄積する。HER2の発現がSCLC症例において化学療法の効果や予後に影響を及ぼしているかを統計的に解析する。HER2陽性SCLC症例においては、trastuzumabとirinotecanの併用療法をpilot studyとして行っていく。さらに、trastuzumabの主たるメカニズムであるADCCの効果に関わるbiomarkerとなり得る分子を、臨床検体から探索する。2. EphA2を標的とした小細胞肺癌に対する新たな分子標的治療法の開発EphA2陽性SCLC細胞の増殖がdasatinibによって抑制できる事をin vitroで示す事ができたため、次年度はin vivoでのdasatinibの効果を検証する。また、EphA2を強制発現した細胞株を樹立し、dasatinibによってsenescenceに至る詳細なシグナルを解析する。ヒトSCLC検体の免疫染色を行い、EphA2の発現頻度を検証する。差額は生じているものの、比較的少額であった。概ね計画通りの予算で、研究を進展させる事ができていると考えている。次年度使用として、試薬の購入を行う予定である。
水素水による肝線維化治療戦略

近年抗酸化活性剤として知られる水素水の肝線維化抑制効果を調べるために、C57BL/6マウスに水素水を飲用させながら、四塩化炭素、チオアセトアミド、胆管結紮により肝臓の線維化を誘導し、コントロール飲水群との比較を行った。その結果、四塩化炭素モデルとチオアセトアミドモデルでは水素水の飲用により肝線維化抑制効果が示されたが、胆管結紮モデルにおいてはその効果は見られなかった。次にそのメカニズムを調べるために、肝細胞および星細胞をマウスから分離し水素含有培地で培養することにより、活性酸素による肝細胞傷害、星細胞の活性化への影響について検討を行った。1μg/mLのアンチマイシンAを分離した肝細胞に投与することにより、肝細胞にヒドロキシルラジカルの発生を確認した。それらのヒドロキシルラジカルは水素含有培地において有意に発生が抑制され、肝細胞死の軽減も観察された。星細胞については水素含有培地においても明らかな活性抑制効果は観察されなかった。水素水は肝細胞でのヒドロキシルラジカルを抑制することで肝細胞死を軽減し、肝線維化抑制効果を呈することが示された。本研究は、近年活性酸素の選択的阻害効果が注目されている水素水を用いて肝線維化抑制効果を検証することを目的とし研究を行った。動物モデル実験として、通常の水で飼育したマウスと水素水を用いて飼育したマウスに肝線維化誘導を行った。肝線維化誘導の方法として肝細胞障害型の四塩化炭素腹腔内投与モデル、チオアセトアミド腹腔内投与モデル、胆管細胞障害型の胆管結紮モデルを用いた。結果、四塩化炭素、チオアセトアミド投与モデルでは、水素水群において有意な肝線維化抑制効果が示されたものの、胆管結紮モデルにおいては明らかな差を認めなかった。線維化誘導モデルの違いによる水素水に対する効果の差を調べるために、線維化誘導肝内部に生成される活性酸素について調べた。水素の抗酸化活性のターゲットであることが示唆されているヒドロキシルラジカルは、四塩化炭素投与モデル、チオアセトアミド投与モデルにおいて、水素水の投与により肝臓内の有意な抑制効果が示された。一方胆管結紮モデルにおいては、その線維化誘導過程において、肝臓内にヒドロキシルラジカルが生成されないことが示された。他の活性酸素であるO2アニオンや活性窒素(ペルオキシナイトライト)については水素水投与における有意な差は見られなかった。次にこのヒドロキシルラジカルの標的細胞を同定すべく、肝臓から分離した細胞を用いた実験を行った。マウス肝から分離した肝細胞に活性酸素を誘導したところ、ヒドロキシルラジカルの発現上昇、肝細胞死が観察され、これらは水素含有培地で培養することにより抑制された。ヒドロキシルラジカルは、線維芽細胞の主たる起源といわれている星細胞には観察されなかった。本研究は水素による肝線維化抑制効果を証明したのみならず、肝線維化誘導過程において活性酸素の中でもヒドロキシルラジカルの果たす役割を示せた点において意義深い結果が得られたものと考える。本研究は、近年活性酸素(フリーラジカル)の選択的阻害効果が注目されている水素水を用いて肝線維化抑制効果を検証する事を目的とし研究を開始した。In vivo実験として、通常の水で飼育したマウス(コントロール群)と水素水を用いて飼育したマウス(水素水群)に肝線維化誘導を行った。肝線維化誘導の方法として肝細胞傷害型の四塩化炭素腹腔内投与、および胆管細胞傷害型の胆管結紮により肝線維化を誘導した。結果、四塩化炭素投与による線維化誘導に対しては有意な肝線維化抑制効果を示したものの、胆管結紮モデルにおいては明らかな差を認めなかった。両モデルの水素水に対する効果の差を肝傷害メカニズムによる効果の差であると考え、他の肝細胞傷害薬剤であるチオアセトアミド腹腔内投与モデルを用い、コントロール群と水素水群で比較を行ったところ、水素水による有意な線維化改善効果を認めた。

これまでの結果をもとに考察するに、肝硬変を来す病態は数多くあるが、大きく分類すると上に示したように肝細胞傷害型、胆管細胞傷害型の2種類に分類される。両者とも肝硬変に帰結することが知られており、前者の代表例がC型肝炎、B型肝炎、アルコール性肝炎、生活習慣病に関連する肝炎であり、後者の代表例が小児の胆道閉鎖症、原発性胆汁性肝硬変などである。肝硬変は、その肝傷害機転によらず類似した組織像、臨床像を呈するが、傷害のメカニズムにより肝硬変の形成機序は異なるはずである。本研究の結果は肝硬変の形成過程において活性酸素の果たす役割が、両者の間で異なる可能性が考えられる。さらに肝硬変の治療を行うにあたり、その傷害機転により異なった治療法が必要である可能性を示唆する。今後、活性酸素が肝臓内のどの細胞に影響して肝傷害を引き起こしているのか、また水素水がそれをどのように抑制するかを調べることは肝硬変に対する根本治療を模索する上で意義深いと考える。本研究開始時の研究計画の箇所に記載したとおり、平成23年度中に水素水を用いたin vivoの実験を完了し得た。予定した四塩化炭素投与モデルにおいては当初予想された結果が得られたが、胆管結紮モデルにおいては水素水による線維化抑制効果を認めなかった。そのため、他の線維化モデルであるチオアセトアミドモデルの実験を追加したものの、平成23年度中にin vivoの実験を完遂することができた。平成24年度には当初の研究計画の通り、細胞レベルにおいて水素水の線維化抑制効果のメカニズムの解明するため、in vitroの実験を開始する。当初の研究計画の通りin vivoにおける水素水の線維化抑制効果が確認されたため、その機序を解明するべく、肝臓より細胞を分離して細胞培養系において水素水の効果を検討する。まず肝線維化の際の主要な線維産生細胞であると言われている星細胞に対する効果を検討する。星細胞を、密度勾配遠心法を用いてマウス肝臓より分離培養する。培地中に水素水を添加し、星細胞の活性化を観察する。さらに肝を構成する星細胞以外の細胞(肝細胞、クッパー細胞など)への影響も検討する。以上の当初の研究計画概要に変更はない。当初の研究計画のとおり実験を遂行し得ているが、試薬の値引き等により本年度研究予算に若干の余剰(\73)が生じた。次年度の研究費と合算し、必要な物品を購入する。
Alternaria属菌によるtetrahydroanthraquinone類の光誘導生産機構の解析

Altersolanal類は植物病原菌が生産するtetrahydroanthraquinone類である。トマト感染葉より分離したAlternaria solani FY-03株より新規のaltersolanol関連化合物を単離し,それらの抗菌作用・植物細胞毒性のメカニズムを解明した。活性型altersolanol類はミトコンドリア及びミクロソームにおける電子伝達の過程で電子放流系を形成し,そのプロセスでスーパーオキサイドアニオンを生成することが明らかとなった.A・solani FY-03株によるaltersolanol類の光誘導生産について検討したところ,培養初期の光照射に生産促進効果が認められた。また,この光照射は培養開始の一時期で充分であり、連続的な光照射はむしろ生育を抑制した。A・solaniFY-03株は光照射後56日目にalter-solanol類の生産を開始し,光遮断による生産量の減少は認められなかった。短時間の光の認識により生合成過程が活性化されることが推察される。光誘導型のaltersolanol類の生産は同化合物生産菌であるA.solaniIFO 7516やA・porri IFO 9762には認められなかった。現在,この光誘導生産に関与する蛋白の消長に関して追跡中である。
Folliculin遺伝子異常と諸臓器腫瘍発生に関する分子病理学的研究

BHD症候群と遺伝学的検査で確定した発端者185名、BHD症候群関連疾患の既往がある血縁者含めて計477名の解析を行った。FLCN変異は45の異なるパターンを認めた。exon単位で欠失する希少な変異パターンが3件同定された。腎癌発症率は40歳以上では35%と高率で、その他に肺癌、大腸癌、甲状腺癌が3%前後に認められた。肺は腺癌、異型腺腫様過形成や微小結節性肺胞上皮過形成様病変で、しばしばはFLCN LOHパターンを認めた。浸潤癌はEGFR, KRAS変異も認めた。甲状腺癌と耳下腺腺腫は嫌色素性腎癌と形態学的に類似し、FLCN LOHを伴っており、腫瘍発生にFLCN遺伝子異常の関与が示唆された。H27年度は、肺に腫瘍性病変をきたしたBHD症候群確定例について検討した。7名の確定患者から採取された14箇所の腫瘍性肺病変を病理学的に検討したところ、5個の腺癌が見つかった。それらの組織型は上皮内腺癌(n=2)、微少浸潤腺癌(n=1)、乳頭状腺癌(n=1)、微小乳頭状腺癌(n=1)であった。また8個の異型腺腫様過形成(AAH)が見つかり、うち7つは一人の患者の肺に多発性に発症していた。残る1個は単発であるが微小結節性肺上皮過形成(MPH)様病変であった。これは気胸で採取された標本内に偶発性に含まれていた病変で、臨床歴から結節性硬化症の可能性は否定された。これらの病変がBHD症候群と関係があるか、腫瘍細胞をレーザーマイクロダイセクションしてDNAを抽出した。AAH以外の6病変でDNA抽出に成功し、FLCNと、散発性肺癌に高頻度に見られるEGFR, KRASについて検討した。6検体中5検体でFLCNにLOHが認められた。浸潤腺癌3検体にはいずれもEGFR或いはKRAS変異も認められた。これまでBHD症候群における肺病変は嚢胞以外認識されていなかったが、今回、肺腫瘍発生とBHD症候群との関連を示唆する結果が得られた。一方で、浸潤癌部においては散発性肺癌に共通するドライバー遺伝子の変異を伴っていたことから、FLCNのLOHが高悪性度の癌に直結するかは不明である。今後は腎臓のみならず肺に関しても悪性を念頭に置いたフォローアップが必要かもしれず、症例をさらに集積して長期的に検討する必要がある。また、1例のみだがMPH様病変が得られたことは興味深い。BHD症候群と結節性硬化症は、ともにmTOR経路の制御因子に変異を来すことで肺や腎臓に病変を来す。今回、BHD症候群においてもMPH様病変を認めたことは、両疾患の相同性やmTOR阻害剤を用いた治療の可能性を検討する上で重要である。これまで研究されていなかったBHD症候群の肺腫瘍発生について解析を進め、一定の成果を得た。現在、オンコサイト様変化を呈する病変の対象臓器や病変の種類の選定に時間を要している。今後、検索対象が決定されたら、腫瘍を中心にフォリキュリン異常の解析を進める必要がある。H28年度は、本邦におけるBHD症候群の診療状況をとりまとめた。まず遺伝学的検査で確定した発端者120名と、BHD症候群関連疾患の既往がある血縁者計312名についての疫学集計を行った。FLCN変異は31の異なるパターンからなり、最も多い変異はexon 11のpolyC領域におけるcytosine挿入であった。その他にも欧米では殆ど見つかっていないexon 12の7塩基挿入やexon 13の4塩基欠失が日本人BHD家系のホットスポットであることが明らかになった。Exon 11のcytosine挿入は欧米人や中国人家系にも多いことから普遍的なホットスポットで、一方exon 12, 13の変異は日本における創始者効果を反映していると考えられた。日本人における312名のうち、気胸発症は230名(73.7%)と最も多く、肺CT検査を受けた患者家族156名において153名に同定可能な多発嚢胞がみつかり、他の3名は画像でとらえられない小嚢胞であった。腎腫瘍罹患率は全体では19.2%であったが、40歳以上の中高年層のみでは34.8%であった。これらの数字は欧米人データとほぼ同様であった。一方で皮膚症状は欧米人では9割以上に認められるが、日本人では半分程度にとどまり、殆どの場合は治療を要さない軽微な皮疹であった。病理学的には線維性毛包腫以外にも毛包周囲の脂肪腫やアクロコルドンなど複数の病変が認められた。特記すべきは気胸と腎癌の初発年齢はそれぞれ37.9歳、56歳と、10年の開きがあり、気胸時の肺病理診断を含めた診療時に本症例を疑い検査で確定することが、腎癌の早期発見早期治療に大きく貢献できることが示された点である。この結果を国際誌に発表した。全国の医療機関からは年間40件ほどの相談や解析依頼を受けており、うち検査同意を得て確定するBHD症候群患者は年間30名ほどである。2009年から本格的に開始した本研究は10年目を経過し、診断確定後の患者家族の病歴情報も集計が進んでいる。