hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アミノ酸摂取量および血漿アミノ酸プロファイルと糖尿病リスクマーカーに関する研究

アミノ酸と糖尿病の関わりが近年注目されている。そこで本研究は、アミノ酸摂取量および血漿アミノ酸濃度と糖尿病リスクマーカーとの関連を評価することを目的とした。研究対象者は人間ドックを受診した女性およそ500名である。アミノ酸摂取量は食物摂取頻度調査票の回答および食品成分表から推定した。血漿アミノ酸濃度は閉経前女性350名、閉経後女性150名について測定した。分岐鎖アミノ酸摂取量は体格指数や血清インスリン濃度と負の関連を示す一方で、血漿分岐鎖アミノ酸濃度は正の関連を示した。これらの関連は先行するいくつかの研究報告と一致しており、閉経前後では差は見られなかった。糖尿病は生活環境要因・遺伝的要因などさまざまな要因が複雑に関与しあい発症すると考えられているが、その規定要因やメカニズムは依然明らかでない。近年、アミノ酸と糖尿病との関連がいくつか報告されている。そこで、アミノ酸摂取量と血漿アミノ酸濃度を同一集団で把握し、アミノ酸と糖尿病との関わりを評価するため、人間ドック受診女性を対象として研究を開始した。生活習慣に関するアンケート調査、食物摂取頻度調査票(FFQ: Food Frequency Questionnaire)による食習慣の評価、採血および早朝尿の採取が実施された。これらの調査により飲酒・喫煙・運動などの生活習慣や既往歴、各種栄養素摂取量・食品群摂取量などの情報を得た。また閉経前女性およそ350名について血漿アミノ酸濃度が測定された。血漿中の分岐鎖アミノ酸濃度(バリン・ロイシン・イソロイシン)と体格指数、インスリン抵抗性値との間に有意な正の相関(スピアマン偏順位相関係数r = 0.17, 0.10)が見られた。一方、食事由来の分岐鎖アミノ酸摂取量と体格指数、インスリン濃度との間には有意な相関は見られなかった(r = -0.04, 0.07)。今後はFFQに基づきグリセミック・インデックス値(GI値)およびグリセミック・ロード値(GL値)を推定する。又、閉経後女性における血漿アミノ酸濃度についても測定し、関連を検討する。研究実施施設においてドック長および医師らの支援を得られたが、FFQに基づくGI値およびGL値の推定に時間を要している。糖尿病は生活習慣や遺伝的要因などさまざまな要因が複雑に関与し発症する。近年、アミノ酸と糖尿病との関わりがいくつか報告されており、本研究は人間ドックを受診した女性を対象者として、アミノ酸摂取量と血漿アミノ酸濃度の両方を把握した上で、アミノ酸と糖尿病と関連を明らかにすることを目的とした。アンケート調査および食物摂取頻度調査票によって生活習慣や既往歴、栄養素摂取量、食品群摂取量などのデータを構築した。また採尿および採血も実施された。平成28年度は、閉経後女性およそ150名の血漿アミノ酸濃度が測定された。血漿分岐鎖アミノ酸濃度(バリン・ロイシン・イソロイシン)と体格指数およびインスリン濃度との間に正の相関が見られた(スピアマン偏順位相関係数r = 0.31, 0.12)。一方で、食事由来の分岐鎖アミノ酸摂取量と体格指数、インスリン濃度との間には負の関連は見られた(r = -0.12, -0.19)。平成27年度は、閉経前女性において血漿アミノ酸濃度を測定し関連を評価しており、閉経前後においてこれらを比較した場合、関連の差は観察されなかった。しかし、閉経状態に関わらず、血中濃度と摂取量の糖尿病リスクマーカーに対する関連には乖離が観察され、既報の結果と一致した。糖尿病リスクマーカーとしては、食事由来のグリセミック指数やグリセミック・ロード値も重要であり、今後これらも考慮した上で、関連を評価する必要があろう。FFQに基づくGI値およびGL値を推定し、横断解析用データセットの速やかな作成に努める。又、閉経後女性における血漿アミノ酸濃度を測定する。物品購入費が抑えられたため。次年度の測定費用等に充当する。
離散的多重度解析法における可解モデルの実現

音声・画像に代表される高次元空間上に表現された情報の解析・処理・認識・予測を行う問題においてしばしば利用されている離散的多重度解析法について、(1)関数近似誤差および(2)統計的推定誤差を具体的に計算可能にすることが本研究の目的である。それぞれの問題について得られた成果を述べる。(1)離散的多重度解析法による関数近似誤差については、近似される関数の属する関数空間に依存して、著しく効率的な近似ができる場合と、そうでない場合があることが知られていた。本研究ではこの問題に関して、近似される関数が従う汎関数確率速度を導入し、その速度による平均的な近似誤差を考察するべきことを提唱した。また、この枠組みで関数近似を考察すると、離散的多重度解析法が有効であるかどうかは、近似を行う関数の係数が作る確率空間における相関関数によって定まり、その近似のオーダーが相関係数のオーダーによって決定されていることを明らかにした。この結果は、離散的多重度解析法がどのような情報を対象とする場合に有効であるのかを明らかにしたことを意味している。(2)離散的多重度解析法による統計的推測誤差は、確率モデル族に導入されるフィッシャー計量が縮退することが原因で従来の統計的推測理論では解明することができなかった。本研究では、代数幾何・代数解析で構成された概念を応用して、この問題を原理的に解決し、また統計的推測制度を解明するための計算アルゴリズムを実現した。具体的には、真の確率密度関数と離散的多重度解析モデルとのカルバック情報量のサンプルに関する平均(学習曲線)が、離散的多重度解析モデルの特異点の不変量であり、それは佐藤幹夫・ベルンシュタインのb関数の零点で与えられることを示し、その零点を具体的に計算する手段として、カルバック情報量を局所化によって代数化した後に広中平祐の特異点解消アルゴリズムを適用する方式を提案した。これによって与えられた任意の離散的多重度解析システムの統計的推測誤差を計算することができる。具体的なモデルについての計算も行った。離散的多重度解析モデルによる統計的推測誤差は統計的正則モデルによる推定誤差よりも一般的に小さくなることも証明した。以上を要するに、本研究は、神経回路網、混合正規分布、離散ウェーブレット等の名称で広く情報科学に用いられている階層的な学習モデルの数学的基礎を初めて厳密に確立したものであり、また学習理論と現代数学の中心である代数幾何・代数解析との緊密な関係を解明した世界でも類似物のないものである。今後の研究展開として、実世界にある情報を発生している確率速度の推測と、最尤推定法による学習精度の解明の問題がある。画像や音声などの多様な形を取りうる信号の情報圧縮や知能的なデータ解析を行うための手段として、高次元上の関数を適応的に表現できる基底系を見いだす方法(可解モデル)を与え、その有効性を数理的に明らかにし、計算機科学への応用を確立することが本研究の目的である。

平成9年度は、次の2点に関する研究と開発を行った。(1)雑音を含む信号を表現する基底系のうち、予測誤差を最小とする組を見いだすことは非正則な統計モデルの設計と等価であって未だに解決されていない問題である。本研究では、局所自由エネルギーが予測誤差と対応することから、この量を規準とすることで信号の真の情報を獲得するための最良な設計法を与え、この設計法によって正則な統計モデルよりも予測に優れる信号推定が実現できることを明らかにした。(2)適応的な基底系を可解モデルによって最適化した場合、どの程度、固定された基底系よりも有用であるかについては、これまで明らかにされて来なかった。本研究では、信号全体の作る空間上に確率測度を導入し、信号の情報構造と適応的な基底系の近似精度との関係について数理的な解析を行うことにより、以下の事柄を明らかにした。もし信号がウイナ-型の自由場に従うなら、適応的な基底系選択は固定系とほぼ同程度の性能であるが、もし信号が強い相互作用を持つ場に従うなら(すなわち実世界の情報環境では)、適応的な基底系選択は固定系に対して遥かに有用であって信号が表現されている空間の次元に依存しない情報圧縮が可能である。以上の(1)(2)を要するに、本研究で提案している離散的多重解析における可解モデルは、統計的推定と関数近似とにおいて、従来の正則モデルよりも情報処理および知能系設計の基礎として有用であることが明らかになった。次に取り組むべき課題は、画像音声などの実世界の情報が従う確率測度を解明し、その測度に対して最適なモデル設計を行うことである。音声・画像に代表される様々な情報メディアの解析・処理・認識において、高次元関数を近似推定するモデルの持つ性質を明らかにし、最適設計法と近似推定精度が具体的に計算できるモデルを実現することが本研究の目的である。昨年度の研究において、離散基底系を最適に設計した場合、どの程度まで効率的な情報圧縮が可能になるかを明らかにした。平成10年度は、主に雑音を含む情報の推定に適応基底系を用いた場合に、推定精度がどのようになるかについて、代数解析学の方法を適用することにより、従来の統計的手法では不明であった推定誤差を厳密に算出する方法の確立を行った。また、この方法を情報処理で最も多用される階層型の神経回路網に応用し、その推定精度が通常の統計的方法において利用される正則モデルよりも遥かに小さな誤差となることを明らかにした。実績は次の二つである。(1)階層型の非線形推論モデルは、真の推論を近似可能な場合には解の集合が一般に次元を持つ特異点を持つ解析的集合となり正則なモデルにならないため、その性質を解明することができなかった。平成10年度の研究では、このようなモデルを含む一般の非線形非正則な推論モデルをギブス分布を用いて学習させた場合の推定誤差を、平均対数尤度関数の佐藤b関数を算出することにより計算可能であることを示し、佐藤b関数の零点とその多重度より定まる有理数と自然数とによって推定誤差が直接得られることを明らかにした。これによって、従来は近似計算しかできなかった乱雑な系の自由エネルギー、言い換えれば非正則モデルの確率的複雑さを厳密に計算するアルゴリズムが確立された。
安定同位体をトレーサーとしたヒラメ変態期の生体物質・エネルギー代謝

はじめに、仔稚魚の生体物質・エネルギー代謝の測定に安定同位体をトレーサーとして使う実験方法の確立を試みた。タンパク質と脂肪の代謝を測定するため、^<13>Cと^<15>Nによる二重標識をおこなった。無機態の^<13>Cと^<15>Nを植物プランクトンに取り込ませ、それを餌に3日以上飼育した動物プランクトンを仔稚魚に与えることにより、トレーサーの同位体がタンパク質および脂質の形で仔稚魚へ均一に取り込まれることがわかった。以上の結果から、取り込まれた同位体の体成分(遊離アミノ酸・タンパク質・脂質)ごとの分布を経時的に追うことにより、従来の実験方法では困難であった仔稚魚の生体物質・エネルギー代謝の測定が可能であることが明らかとなった。取り込み実験は仔魚期・変態期・稚魚期の3ステージのヒラメについて、異なる3水温(16、18、20°C)下でおこなった。仔魚期のヒラメは蛋白質・脂質の両方を餌に含まれている形のまま取り込み、その取り込んだエネルギーのほとんどを成長にまわした。一方、変態期以降では、同位体が遊離アミノ酸分画へ急激に取り込まれた後、タンパク質画分へ緩やかに取り込まれたため、餌のタンパク質は消化管で消化されアミノ酸の形で吸収され、体内を輸送された後、体成分のタンパク質に合成されることがわかった。また、この時期以降、タンパク質の代謝回転が始まり、体内へ取り込むエネルギーのうち脂質の割合が低くなった。これらの事実から、ヒラメの仔魚期における高い成長速度は、タンパク質の合成・分解といった代謝回転の節約と代謝基質としての脂質の有効な使用に依っていることが明らかとなった。1ヒラメの生体物質の代謝^<15>Nと^<13>Cをトレーサーとしてヒラメの生体物質(蛋白質および脂肪)の代謝を明らかにする実験を行った。トレーサーのヒラメへの取り込みは、無機態の^<15>Nと^<13>Cを植物プランクトン、Nannochlor opsis oculateに取り込ませた後、この植物プランクトンを餌として飼育したワムシ、Brachionus plicatilisおよびアルテミア、Artemia salinaの幼生をヒラメに給餌することにより可能であることが明らかとなった。また、メタノール・クロロホルム混液による抽出・分離によりヒラメを蛋白質、脂質および低分子各分に分けることが可能であり、それぞれの各分のトレーサー比を測定することにより、生体物質の代謝が明らかにできることがわかった。実験は仔魚、変態および稚魚期についてそれぞれ16、18および20度で行っており、同時に測定した成長量の違いを生体物質の代謝の違いにより説明し、ステージ特有の代謝を明らかにすることを最終目的としている。現在、安定同位体比の測定が終了し、データの解析を行っているところである。2ヒラメのエネルギー代謝ヒラメ仔稚魚の酸素消費量とアンモニア排泄量を給餌および無給餌条件で日令を追って測定した。アンモニア排泄量と酸素消費量の比であるN/O比から、飢餓条件下で代謝基質に脂肪を使うことのできる飢餓耐性能は変態後約一週間で獲得されることが明らかとなった。また、給餌条件を変えた稚魚のN/O比の変化から、飢餓耐性が獲得される時期は魚の大きさではなくそれまでの栄養状態に大きく影響され、稚魚期であっても同化エネルギーを飢餓耐性より成長のために優先的に使うことが明らかとなった。
新しい血小板放出機構異常症 (トロンボキサンA_2不応症)の研究

研究者が見出したA23187凝集異常を主徴とするトロンボキサン不応症(本症)の病態解析のためトロンビン, A23187,トロンボキサンアナログSTA_2に対する細胞内Caイオン([Ca^<++>]i)動員を, Aequorin法を用いて検討した.また他型血小板機能異常症も検討した.1.本症ではトロンビンによる[Ca^<++>]i動員反応は正常, A23187, STA_2による反応は一部障害されていたが,凝集が障害されている高濃度では正常で,したがって本症の放出機構の本態は今回の方法で調べられる[Ca^<++>]i動員の全体の障害とは直接関係しないと考えられた.しかし細胞外Ca^<++>添加, Adrenalin potentiationで[Ca^<++>]i動員は凝集とともに増強される場合があることなどより,本症では,凝集,放出に関する一部の[Ca^<++>]i動員が障害されていると推定された.しかし細胞内Ca動員を抑制するといわれるTMB-8処理とは異なることが知られた.2.Bernard-Soulier症候群ではThrombinによる[Ca^<++>]i動員の遅延, Cyclo-oxygenase欠乏症でA23187による[Ca^<++>]i動員の障害と,これまで知られていない低濃度アラキドン酸によるPGH_2, Txへの転換を欠く[Ca^<++>]i動員をみとめ, Hermansky-Pudlak症候群,他の血小板放出機構異常症でA23187, STA_2による軽度の[Ca^<++>]i動員障害をみとめた.〔結論〕Tx不応性を中心とした放出機構異常症において[Ca^+]i動員の部分障害がみとめられた。それと放出障害の本態とは直結しないと考えられた。今後各種アゴニスト別の[Ca<#>]i源および放出に至るル-トの解明によって本態解析の可能性が展けると期待される。他型血小板機能異常症で各種の軽度障害をみとめた。1.Aequorin法に基づいた【Ca^++】動員の正常値の決定。A23187(A)2,1,0.5,0.25uMで【Ca^(++)】peakおよびそれまで要する時間は夫々、13.5±3.0(SD)μM,(0.4±0.22分),10.8±3.0(0.70±0.33),8.3±2.0(1.34±0.71),8.7±1.0(1.67±0.45)であった。トロンビン(T)1,0.5,0.25,0.125

U/mlでは同様に9.9±6.6μM(0.24±0.07分),7.5±3.1(0.31±0.10),6.4±2.8(0.4±0.17),5.8±2.7(0.58±0.23)であり、またST【A_2】(S)0.4,0.2,0.1,0.05μMでは同様に6.9±2.9μM(0.16±0.06分),6.6±2.1(0.17±0.05),6.0±2.0(0.18±0.06),5.8±2.2(0.18±0.05)であった。2.A23187凝集異常を主徴とするTx不応症例の検討。Peak値は5,8,3.7μM,Tでは順に11.7,11.0,10.7,8.3μM,Sでは順に6.7,6.6,5.2,3.7μMとAとSの低濃度で低下をみとめたにすぎなかったが、pe-akに達するまでの時間がAでとくに延長していた。即ち本症ではA,Sによる【Ca^(++)】動員初期の軽度の障害がみられた。3.Adrenalin potentiationおよび細胞外【Ca^++】の影響。患者は両者によって、【Ca^(++)】の立ち上がりあるいはpeak値が改善された。これはPRPにおける凝集および放出の補正と一致する。なお患者のTx産生量は正常であった。4.以上の結果から本症においてはA23187,ST【A_2】刺激時の初期のCa動員とくにCa influxが障害されることが放出機構異常の原因と推定される。1.Ca^<++>動員と微細構造との関連を, Aequorin処理血小板のトロンビン, A23187によるCa^<++>動員前,動員初期,ピーク時点において検討した.基礎として, Aequorin処理過程における形態も検討した.円板形で偽足形成の少ない血小板は, PGE_1およびEGTA処理により球状化し偽足形成を行う.Aequorin負荷後細胞小器官は十分保存されていた.トロンビンなどの刺激によりCa^<++>動員初期から小器官の中心化が進行するが, Ca^<++>貯蔵部位と推定されている暗調小管系に著明な変化はみられなかった.凝集塊内部の構造は対照と差なく, Aequorin法による凝集の検討の妥当性が示された.2.新しい一家系2症例についてCa^<++>動員を検討したが,著明なCa^<++>動員の異常はみられなかった.3.前年度からの症例についての基礎検討で, TMBー8処理血小板のCa^<++>動員を検討した.400ー800μMのTMBー8処理正常血小板は,形態, PRPでの凝集, ATP放出障害の面から,本症例の血小板と酷似する. TMBー8はSTA_2によるCa^<++>動員を完全に抑制することが見出され,前年度の症例の成績と異なった.しかしTMBー8はA23187によるCa^<++>動員は抑制しない.これはSTA_2によるCa^<++>動員がA23187のそれと異なること,症例の異常はSTA_2によるCa^<++>動員障害ではないことを示唆すると考えられる.またTMBー8は症例にみられたAdrenalin potentiation (Ap)によるSTA_2凝集の補正を惹起しないことから症例のApはSTA_2によるCa^<++>動員を基礎として起こすと考えられた.まとめ:Aequorin処理血小板の凝集像は障害されない.症例の障害はTMBー8でシミュレート出来ず, STA_2によるCa^<++>動員後の過程にある.
プロテアソーム構造変換を介した糖シグナル伝達制御機構の解明

ユビキチン・26Sプロテアソームを介したタンパク質の能動的分解システムは,不要となったタンパク質の分解による除去を行うことで,′′品質管理システム′′としての細胞内のホメオスタシスの維持に重要である。またこのシステムは,特定のタンパク質の分解することで,様々な生命現象プロセスを誘起するための′′分子スイッチ′′としても機能することが明らかになってきた。タンパク質分解の実行機械である26Sプロテアソームは,19S調節複合体(19S)と20S活性複合体(20S)から構成される。20Sはペプチダーゼ活性を有するが,20Sの活性調節や標的タンパク質の選択の制御は19Sの調節機能にあると考えられる。本研究では,高等植物の糖シグナル伝達機構において。ビキチン・26Sプロテアソームシステムが関与することが示唆されたため,その解析を行った。rDt2a変異体は,先に示した糖応答異常とともに,様々な形態異常を示す。その代表例が葉器官の肥大である。詳細な解析によv),rp2a変異体では表皮細胞が巨大化しかつ核相の増加が観察された。これらの結果は,エンドリデュプリケーション(以下ERDと略;細胞分裂を伴わないDNA複製)が促進していることを意味する。プロテアソームサブュニットの異常がERDを促進するとの知見は,これが初めての報告となる。この現象の詳細を解明するため,トライコームと下胚軸でのERD促進現象について分子遺伝学的解析を試み,その遺伝学的ネットワークを明らかにした。また,「細胞周期調節とプロテアソームとの関係」の解明に最終的な研究目標を設定し,細胞周期制御遺伝子との関係,核分裂装置との関係について詳細な研究を進めた。ユビキチン・26Sプロテアソームを介したタンパク質の能動的分解システムは,不要となったタンパク質の分解による除去を行うことで,"品質管理システム"としての細胞内のホメオスタシスの維持に重要である。またこのシステムは,特定のタンパク質の分解することで,様々な生命現象プロセスを誘起するための"分子スイッチ"としても機能することが明らかになってきた。本研究では,高等植物の糖シグナル伝達機構においてユビキチン・26Sプロテアソームシステムが関与することが示唆されたため,その解析を行った。本研究では、シロイヌナズナの19SサブユニットであるRPT2に着目し、その機能解析を試みた。シロイヌナズナのゲノムにはRPT2をコードする遺伝子として、AtRPT2aおよびAtRPT2bが存在する。AtRPT2aは培地中に糖を添加することで、顕著な発現の増大が観察され、ノックアウト変異体(rpt2a)では糖に対して過剰応答を示したことから、AtRPT2aは糖のシグナル伝達経路に何らかの関与があることが考えられた。また、rpt2a変異体では細胞や器官レベルでの様々な形態・発育の異常が認められた。これに対し、AtRPT2bは構成的に発現しており、そのノックアウト変異体(rpt2b)では、rpt2a変異体で見られた表現型は観察されなかった。以上のことから、AtRPT2aをサブユニットとして構成するプロテアソームと、AtRPT2bをサブユニットとして構成するプロテアソームでは機能性が異なることが強く示唆された。
リン酸化修飾による魚肉水溶性タンパク質の機能改変

すり身工場をはじめとした水産加工現場からの廃水には多量の水溶性タンパク質が含まれ、このタンパク質を回収して有効することは廃水処理の負荷を軽減するばかりでなく、資源の有効利用に結びつく。しかし、回収された水溶性タンパク質には各種機能が欠如しているため、何らかのタンパク質修飾が必要である。本研究では、クロカジキ水溶性タンパク質をグルコースあるいはグルコース-6-リン酸(G6P)とメイラード反応させてタンパク質の修飾を行い、どのように機能が改変できるかについて検討し、次のような結果を得た。1.水溶性タンパク質のメイラード反応は、水分活性0.65、加熱温度60°Cで、24時間まで行った。水溶性タンパク質の褐色化度、遊離アミノ基の消失、フルクトサミン(ケタミン)の生成、リン含有量の増加、SDS-PAGEパターンの変化などから、メイラード反応はグルコース存在下よりG6P存在下の方が速やかに進行することが判明した。また、リン酸化は特にメイラード反応初期に起こった。2.G6Pとのメイラード反応初期段階で、水溶性タンパク質の各種機能特性すなわちpH溶解性、熱安定性、乳化性、保水性、消化性、リン酸カルシウム可溶化性、抗酸化性が顕著に改変されたが、グルコースとの反応では改善されなかった。3.水溶性タンパク質に対するG6Pの最適添加比率は、タンパク質に対して45%前後であった。以上の結果より、クロカジキ水溶性タンパク質をG6Pとのメイラード反応によりリン酸化修飾すると、水溶性タンパク質が本来保有していないような各種機能が負荷されるか、あるいは改善されることが明らかとなった。すり身工場をはじめとした水産加工現場からの廃水には食用としての利用が可能なタンパク質が多く含まれているが、ほとんど利用されることなく廃棄され、廃水処理の負荷を大きくする原因となっている。そこで、廃水から水溶性タンパク質を回収し、食品素材として利用する研究が進行しているものの、回収された水溶性タンパク質に優れた機能特性が欠如しているため、その利用が極端に制限されているのが現状である。本研究では、魚肉水溶性タンパク質の機能改変を、主としてグルコース-6ーリン酸(G6P)とのメイラード反応を利用するリン酸化修飾により行うことを目的としている。試料としてはクロカジキ(Makaira mazara)の冷凍肉を解凍して使用した。水溶性タンパク質は5倍量の0.1Mトリス緩衝液(pH7.6)により抽出した。透析した抽出液にタンパク質乾重量の50%に相当するグルコース(G)、あるいは94%に相当するG6Pを混合溶解してから凍結乾燥により粉末試料を調製した。本試料の水分活性を0.65に調整後、60°Cの恒温槽中で12時間まで加熱してメイラード反応を起こさせた。このように調製した水溶性タンパク質(WSP)、WSP+G、WSP+G6Pの3種類粉末について、褐色度、残留G及びG6P量、遠離アミノ基量、フルクトサミン量、結合リン量の測定と、SDS-PAGEを行って、メイラード反応の進行を追跡した。また、これら試料の各種pH溶液に対するタンパク質溶解度と100°Cまでの加熱によるタンパク質溶解度の変化を測定した。その結果、G及びG6Pの添加によりWSPのメイラード反応の進行が促進され、またWSP+G6Pの方が顕著であった。C6P修飾によりWSPのpH安定性がある程度向上した。また、G6Pによるリン酸修飾の結果、WSPの熱安定性はメイラード反応初期段階で顕著に改善され、いずれの温度でもほぼ100%の溶解性を示すことを明らかにした。

そこで、廃水から水溶性タンパク質を回収し、食品素材として利用する研究が進行しているものの、回収された水溶性タンパク質に優れた機能特性が欠如しているため、その利用が極端に制限されているのが現状である。本研究では、魚肉水溶性タンパク質の機能改変を、主としてグルコース-6-リン酸(G6P)とのメイラード反応を利用するリン酸化修飾により行うことを目的としている。試料としてはクロカジキ(Makaira mazara)の冷凍肉を解凍して使用した。水溶性タンパク質は5倍量の0.1Mトリス緩衝液(pH7.6)により抽出した。透析した抽出液にタンパク質乾重量の50%に相当するグルコース(G)、あるいは94%に相当するG6Pを混合溶解してから凍結乾燥により粉末試料を調製した。本試料の水分活性を0.65に調製後、60°Cの恒温槽中で12時間まで加熱してメイラード反応を起こさせた。このように調製した水溶性タンパク質(WSP)、WSP+G、WSP+G6Pの3種類粉末について、タンパク質の機能として乳化性、保水性、消化性、カルシウム溶解性の変化を測定した。WSPの乳化性、保水性、消化性は、G6Pとのメイラード反応初期におけるリン酸化によって顕著に改善された。一方、Gとのメイラード反応はこれら機能をわずかに改善するに留まった。WSPのグリコシル化及びリン酸化はWSPにリン酸カルシウムを溶解させる機能を付与させ、特にリン酸化でその傾向が顕著であった。以上の結果、G6Pとのメイラード反応によるWSPのリン酸化は、WSP機能の改善に極めて有効であることが明らかになった。すり身工場をはじめとする水産加工現場からの廃水には多量の水溶性タンパク質が含まれ、このタンパク質を回収して有効することは廃水処理の負荷を軽減するばかりでなく、資源の有効利用に結びつく。しかし、回収された水溶性タンパク質には各種機能が欠如しているため、何らかのタンパク質修飾が必要である。本研究では、クロカジキ水溶性タンパク質をグルコースあるいはグルコース-6-リン酸(G6P)とメイラード反応させてタンパク質の修飾を行い、どのように機能が改変できるかについて検討し、次のような結果を得た。1.水溶性タンパク質のメイラード反応は,水分活性0.65,加熱温度60°Cで,24時間まで行った。水溶性タンパク質の褐色化度,遊離アミノ基の消失,フルクトサンミン(ケタミン)の生成,リン含有量の増加,SDS-PAGEパタ-ンの変化などから,メイラ-ド反応はグルコース存在下よりG6P存在下の方が速やかに進行することが判明した。また、リン酸化は特にメイラ-ド反応初期に起こった。2.G6Pとのメイラ-ド反応初期段階で,水溶性タンパク質の各種機能特性すなわちpH溶解性,熱安定性,乳化性,保水性,消化性,リン酸カルシウム可溶化性,抗酸化性が顕著に改変されたが,グルコ-スとの反応では改善されなかった。3.水溶性タンパク質に対するG6Pの最適添加比率は,タンパク質に対して45%であった。以上の結果より,クロカジキ水溶性タンパク質をG6Pとのメイラ-ド反応によりリン酸化修飾すると,水溶性タンパク質が本来保有していないような各種機能が負荷されるか,あるいは改善されることが明らかとなった。
インドシアニングリーンによる捻転卵巣の壊死予測

卵巣茎捻転は、卵巣腫瘍などを背景に、突如卵巣への栄養血管がねじれ、強い腹痛を訴える疾患であり、その発生頻度は高い。その際、卵巣への酸素供給が途絶え壊死が起こるため、卵巣を温存するか摘出するかを手術中に判断しなければならない。ところが、虚血の程度を判断する方法はいまだに確立されておらず、主観的な「見た目」によって判断されている。卵巣茎捻転の手術中に、卵巣を残せるのかどうかを判断する基準を作成することが、本研究の目的である。そのためにIndocyanine Greenと近赤外線カメラを用いて組織への血流評価をおこなう。
大気海洋間におけるCO2交換量の直接測定法の確立を目的とした大気圧乱流変動の観測

本研究は、大気乱流による気圧変動を精確に捉えるための計測手法を開発し、海洋と大気間の二酸化炭素交換量の唯一の直接測定法である渦相関法において必須である空気密度変動補正について、これまで考慮されてこなかった気圧変動項の大きさを実測によって明らかにすることを目的としている。初年度は野外で気圧変動を計測するために選定した3種類の円盤型プローブに関して、気圧の計測値に影響を及ぼす動圧についての風速や風向の依存性に対する各プローブ固有の影響を明らかにするための風洞実験を実施し、水平と鉛直の各風向に対して風速を変数とする補正式を作成した。これら円盤型プローブを用いて、大気乱流によって気圧が変動する要因を明らかにするための予備観測を熱対流が活発に生じることが予測されるアスファルト面において実施し、対流プリューム理論にて予測されている熱的要因による乱流渦よりも力学的要因による乱流渦によって気圧変動が卓越する可能性を示唆する結果を得た。次に、室内風洞実験で用いられている注射針型プローブを野外観測に応用するため、先端の注射針部の長さ(尖り度)や静圧孔の大きさと数、全長などを変えることで最適な計測プローブを構築するために数種類の型を設計し、工作に着手する段階にまで進めた。さらに気圧変動を検出する圧力計について、大気乱流により生じる低周波の気圧変動を捉えられない差圧計に代わって、0.01s1時間程度の応答性のある水晶振動式圧力計を導入し、全周波数域の気圧変動の検出を試みるための予備試験を実施した。初年度は注射針プローブの構築を終え、十分に取り除くことのできない動圧を補正するための風速や風向の依存性を円盤型プローブと共に明らかするところまで実施する予定であったが、先に取り組んだ円盤型プローブの性能評価の再現性を得るために実験方法を見直す必要性が生じたため、本年度中に完了することができなかった。工作中の数種類の注射針型プローブを完成させた後、風洞実験にて動圧に関する風速や風向の依存性に対する各型固有の性能を評価して最適な形状を明らかにする。WPL補正を適用した渦相関法により二酸化炭素交換量が零を示さないアスファルト面において、選定した円盤型と注射針型のプローブによる気圧変動の野外観測を実施し、導出理論に誤りのない空気密度変動補正を実証する。気圧変動項を含めた空気密度変動補正を適用した渦相関法による海洋大気間における二酸化炭素交換量の集中観測を実施し、通年観測も開始する。注射針型プローブの加工が完成にまで至っておらず、工作費の支出が次年度になったためである。また想定より工作費が安価となるため、観測旅費に充当することで、より多くの観測データを蓄積する予定である。
マントル最下部構成鉱物の圧力-体積-温度状態方程式の確立

高輝度放射光施設SPring-8(兵庫県)のビームラインBL10XUへ設置した抵抗加熱(外熱)式ダイアモンドアンビルセル(DAC)を用いて、マントル最下部構成鉱物の相関係、および物性を測定した。1.昨年度実験が終了していたCaSiO_3組成のペロブスカイトの相転移温度圧力境界について、国際学会誌Earth and PlanetaryScienceLettersに投稿した。現在改定稿を提出し、編集委員からの返答待ちである。2.MgSiO_3組成のポストペロブスカイト、ペロブスカイトの熱膨張率を測定し、圧力-体積-温度状態方程式を両相について構築した。出発物質にMgSiO_3組成のゲルを用い、DACに封入した。ペロブスカイト、ポストペロブスカイトそれぞれの安定領域内でレーザー加熱を行い、一つのセルの中で2相を合成した。これにより、低圧相と高圧相の体積の同時測定、直接比較が可能である。抵抗加熱式DAC、およびレーザー加熱DACにより、高温高圧X線その場観察実験を行い、それぞれの装置で、832K、2330Kまでの両相の熱膨張率を測定した。実験データをバーチマーナガンの状態方程式にフィットし、熱弾性パラメータを決定した。その結果、マントル最下部条件において、(1)両相の体積差(密度差)は温度に依存せずほぼ一定(1.5%)である。(2)両相は同程度の熱膨張率を持つ。(3)両相の熱膨張率は1.1^*10^<-5>K^<-1>と小さく、密度差1.5%は、相転移を考えない場合の1000Kの温度異常に対応することがわかった。これらの結果をマントルダイナミクスと関連させて議論し、現在国際学会誌Earth and Planetary ScienceLettersに投稿準備中である。1.CaSiO_3組成のペロブスカイトの相転移温度圧力境界を決定した。出発物質にCaSiO_3組成のガラスを用い、DACに封入した。高圧下(30-70GPa)でレーザー加熱によりCaSiO_3ペロブスカイトをいったん合成し、抵抗加熱式DACにより高温高圧X線その場観察実験を行った。結果は、ペロブスカイトは30-80GPaにおいて、550-580Kでtetragonalからcubicに構造相転移した。この温度は従来の理論計算の予測(2000K)と大きく異なっており、マントルの構造を考える上で重要なデータである。現在、国際学会誌Earth and Planetary ScienceLettersに投稿準備中。2.MgSiO_3組成のポストペロブスカイト、ペロブスカイトの熱膨張率を測定した。室温で110GPaまで加圧し、レーザー加熱によりMgSiO_3ポストペロブスカイトとペロブスカイトの両相を一つのセルの中で合成した。抵抗加熱式DACにより、高温高圧X線その場観察実験を行い、800Kまでの両相の熱膨張率を測定した。その結果、ポストペロブスカイトはペロブスカイトに比べて、小さな熱膨張率を持つことがわかった。これは、MgSiO_3ポストペロブスカイトの高温物性としては、実験的に求められた最初のデータである。また、抵抗加熱式DACを用いたポストペロブスカイトに関する初めての実験でもある。非常に高圧が要求されるため技術的に困難であるが、今後もデータを追加していきたい。
菜の花多段階活用型ビジネスモデルの存立要件に関する研究

農村活性化のためには、地域内で農業が二次・三次産業と連携し、付加価値を生み出すビジネスモデルを構築する必要がある。秋田県内で取り組まれている菜の花の多段階活用では、ナタネ栽培、搾油、ラー油加工による産業連携が、大きな経済効果を地域内にもたらしていた。しかし、ナタネ生産量に依存するナタネ栽培段階及び搾油段階における付加価値創出額は伸び悩んでおり、地域特性に応じた栽培技術の確立、助成措置の安定化を通じて、生産基盤を強化することが、菜の花多段階活用の定着のために不可欠である。本年度は、菜の花多段階活用過程の前段部分である菜の花栽培に着目し、それが地域に普及するための条件を探るため、菜の花栽培の先進事例である秋田県小坂町を対象として菜の花栽培に取り組む約30戸の農家にヒアリング調査を実施した。そこでは菜の花栽培に取り組んだ経緯と栽培の現状、今後の意向等を調査した。そこで明らかとなったのは以下の諸点である。第1に、農家が菜の花栽培に取り組んだのは、労力や費用負担が比較的小さく、しかも栽培に対する経済的サポートがあったからであった。中山間地域という厳しい条件において、菜の花が普及するためには、まず農家が取り組みやすい環境を整備することが必要であることが明らかとなった。第2に、取組みの背景にあったのは、ビジネスという考え方よりは、農地保全あるいは地域活性化という視点であった。放っておけば荒れてしまう農地をなんとか維持し、地域を元気にしたいという農家の意志が働いていることが明らかとなった。第3に、菜の花連作後の圃場の多くが以前の低利用状態に戻ってしまった一方で、輪作体系確立に向けた萌芽的な動きが見られ、今後菜の花栽培を定着させていくためには、後者の動向を広めていくことが重要である。すなわち第4に、菜の花栽培を普及・定着させるためには、菜の花と輪作させる作物への栽培技術指導、助成措置といった、菜の花栽培にとどまらない広いサポートが必要である。本年度は、秋田県内の多段階活用の取組みをサーベイし、多段階活用の進捗状況及び今後の取組みの水準を向上させるための課題について明らかにした。菜の花栽培からバイオ燃料製造・利用に至る各段階において価値を生み出しうるこの取組みが普及することは、秋田県農業・農村が危機的状況を脱するために有効な手段である。取組みが始まり5年足らずであるが、秋田県の菜の花栽培面積は全国トップレベルであり、搾油施設も3つ整備されるまでになっている。とはいえ、油の原料となる菜種の生産基盤はいまだ脆弱であり、今後、菜種生産を拡大し、菜種油の原料となる菜種のロットを確保していくためには、農家が菜の花栽培に本気で取り組み、菜種単収の向上を追求できる環境が整わなければならない。行政や農協といった地域の指導機関は栽培推進の意志を明確に提示するとともに、菜の花栽培に対する技術的、経済的支援を継続的に行うことが必要である。技術面については、NPOや大学等研究機関と連携をとりながら、もう一手間かければ単収が伸びることを実証的に示し、農家の単収増大への意欲を喚起させることが重要になる。加えて、単収増大に対する経済的インセンティブを農家に与えるためにも、菜種買取額の引き上げとそれを可能とする秋田県産菜種油の販売体制確立に向けて、産学官が連携して取り組んでいくことが求められよう。本年度は、5年間にわたる秋田県内における菜の花多段階活用の取組みの成果と蓄積をふまえ、多段階活用過程の付加価値創出構造を明らかにするとともに、菜の花多段階活用が新たなビジネスモデルとして、わが国の農業・農村に広く普及する条件を提起した。付加価値創出の内実を見れば,川下部分に位置する連携主体である加工販売業者が付加価値の大部分を取得し,川中に位置する搾油業者,川上に位置するナタネ栽培農家には,加工販売による付加価値は全くといってよいほど配分されていない。栽培農家が手にするのは国や町から支払われる交付金とナタネ販売額のみである。財源問題より前者は増える見込みはなく,後者については単収の減少傾向が続く中,これまた増える要素は乏しい。すなわち,いくら加工販売が伸びたとしても,現状の路線が続く限りナタネ栽培に対する経済的メリットを栽培農家はそれほど感じることができず,ナタネ生産基盤の脆弱化につながる恐れがある。事実,産地づくり交付金から水田利活用自給力向上事業へと変わったことで農家の所得は減少している。搾油業者についても,町内のナタネ収穫量が伸び悩めば,油取扱量も減ってしまうので,とちらも町内産ナタネに由来する付加価値増が困難な状況にある。菜の花多段階活用が普及していくためには、まず生産基盤を整備する必要があり、そのための条件は(1)低単収・低収益問題、(2)連作問題、(3)品種問題、(4)菜種油の差別化問題、の4つの課題の解決である。
黒ボク土と赤色土におけるソバのリン栄養と収量および品質との関係

ソバは世界各地で栽培され、我が国でも北海道から九州の黒ボク土が分布する地域を中心に栽培されてきた。また近年、沖縄でも栽培されている。沖縄でのソバ栽培は赤色土や暗赤色土であり、施肥リンも難溶性リンに固定されるためリン肥沃度の低い土壌である。しかも、主にAl型でリンを固定する黒ボク土と異なり沖縄の土壌はFe型でリンを固定する。また、有機物の多い黒ボク土に比べて沖縄の土壌は有機物が少なく有機態リンも少ない。本研究は、難溶性としてリン固定量の大きい土壌を用い、ソバの難溶性無機リンや有機態リンの吸収特性を明らかにし、適切なリン施肥での収量増大と品質向上の可能性を調査、検討する。
黄色植物における青色光受容体オーレオクロムの機能解析

本年度の研究は、ドイツ連邦共和国、マックスプランク生物無機化学研究所、Wolfgang Gaertner教授の研究室で行った。ヒバマタオーレオクロム2およびオクロモナスオーレオクロム1の全長遺伝子をそれぞれpET28aベクターに導入し、タンパク質発現用の大腸菌Rosetta (DE3)pLysS内で発現を試みた。既に公表されているフシナシミドロオーレオクロム1の条件では発現しなかったため、発現条件の検討を行い、IPTG濃度200μM、温度22°C、overnight(12-16時間)、暗条件下での振とう培養でヒバマタオーレオクロム2およびオクロモナスオーレオクロム1の発現に成功した。その後の比較で、オクロモナスオーレオクロム1がより安定して発現したため以後のタンパク質精製にはオクロモナスオーレオクロム1を用いた。オーレオクロムタンパク質の精製はニッケルレジンを用いたイミダゾール溶出で行い、精製したタンパク質のイミダゾールを除去後、その分光学的特徴を解析した。オクロモナスオーレオクロム1の吸収スペクトルは、422, 448, 480nmのピークを示し、青色光照射によって、この範囲の吸収が減少し、代わって390nmの吸収が上昇した。これらの性質は、他のフラビンを結合するLOV光受容体と同様の特徴であり、オクロモナスオーレオクロム1が光受容能力を持つ事を示唆する。この結果と各オーレオクロムのアミノ酸配列比較から、ヒバマタオーレオクロム2も光受容能をもつ可能性が強く示唆される。すなわち、LOVドメイン中のフラビン結合に必要なアミノ酸の同義置換はフラビンとの結合に影響を与えない事が示唆された。フシナシミドロから単離したオーレオクロム(AUREO)は、in vitroでの特性および、形態形成反応に関与していること、他の黄色植物であるヒバマタ(Fucus)と2種のケイ藻にもオルソログがあること等をすでに明らかにしてきた。ヒバマタにおいて、オーレオクロムは一つだけ全長が決定しており、後にFdAUREO2と命名した(Takahashi et al.2007)。今年度、すでに単離されているLOV断片をもとに3'RACE,5'RACE法で全長配列の決定を試みた。ヒバマタのAUREOのうち、新たにFdAUREO1と名付けたオルソログは、5'RACEを行いbZIPドメインの存在を確認したが、3'側の配列は未決定である。それ以外の数種のLOV断片に関しても、3'RACE,5'RACEを用いての全長配列は未決定である。ヒバマタは陸上植物と異なり、多量のフェノール物質を含んでいるため、抽出したRNA試料からこれらの夾雑物質を除去しなければ、分子生物学実験に使えるRNA試料とならない。このことは、他の黄色植物での分子生物学的解析を行う上での重要な知見となる。また、褐藻ヤハズグサ(Dictyopteris)を用いて、その青色光反応とAUREO機能の解析を開始した。ヤハズグサは、サイズが小さく短期間で培養が行える。また粘液質が他の褐藻類に比べ少ないため、分子生物学的解析と細胞学的・生理学的解析を容易に行える。培養実験から、ヤハズグサは異なる2つの種類の形態形成を起こすことが明らかとなった。一つは、新たな葉状体の形成であり、もう一つは、葉状体部分からの仮根の形成である。ヒバマタとヤハズグサでのオーレオクロムの機能解析は、今後、他の黄色植物の形態形成反応を解明するための大きな手がかりとなる。当初計画した褐藻ヒバマタ(Fucus distichus ssp.evanescens)のオーレオクロム1(FdAUREO1)の全長配列決定は、未知の原因のため何度繰り返しても成功しなかった。そこで、すでに単離しているヒバマタオーレオクロム2(FdAUREO2)、黄金色藻オクロモナス(Ochromonas danica)のオーレオクロム1と2、ラフィド藻シャットネラ(Chattonella antiqua)等のデータの解析を行った。これら黄色植物のオーレオクロムおよび,緑色植物のフォトトロピンや菌類のLOV光受容体等のLOVドメインを基に作成した系統樹はオーレオクロム、陸上植物のフォトトロピン、菌類の光受容体のLOVドメインが独自に進化してきたことを明らかにした。また、オーレオクロムのLOVドメインの配列比較から、ほぼすべてのオーレオクロムが光受容体として機能する可能性を示唆した。これらの結果はPLANTAに掲載され,光生物学者に高く評価された。また、褐藻ヤハズグザ(Dictyopteris latiuscula)の光応答反応の解析をさらに詳しく行い、ヤハズグザの示す2種類の形態形成反応、葉状体の成長とhairの形成、への光波長の関与を解析した。その結果、ヤハズグザの葉状体成長には主に青色光、hairの形成には赤色光が関与していることが明らかになった。緑色光でも葉状体の成長は観察できたが、これは褐藻が持つ光合成の補助色素であるフコキサンチンの影響が考えられる。また、阻害剤処理実験から、少なくともhairの形成にはアクチンとミオシンが関与していることが明らかとなった。

既に公表されているフシナシミドロオーレオクロム1の条件では発現しなかったため、発現条件の検討を行い、IPTG濃度200μM、温度22°C、overnight(12-16時間)、暗条件下での振とう培養でヒバマタオーレオクロム2およびオクロモナスオーレオクロム1の発現に成功した。その後の比較で、オクロモナスオーレオクロム1がより安定して発現したため以後のタンパク質精製にはオクロモナスオーレオクロム1を用いた。オーレオクロムタンパク質の精製はニッケルレジンを用いたイミダゾール溶出で行い、精製したタンパク質のイミダゾールを除去後、その分光学的特徴を解析した。オクロモナスオーレオクロム1の吸収スペクトルは、422, 448, 480nmのピークを示し、青色光照射によって、この範囲の吸収が減少し、代わって390nmの吸収が上昇した。これらの性質は、他のフラビンを結合するLOV光受容体と同様の特徴であり、オクロモナスオーレオクロム1が光受容能力を持つ事を示唆する。この結果と各オーレオクロムのアミノ酸配列比較から、ヒバマタオーレオクロム2も光受容能をもつ可能性が強く示唆される。すなわち、LOVドメイン中のフラビン結合に必要なアミノ酸の同義置換はフラビンとの結合に影響を与えない事が示唆された。
二光子吸収を利用した放射光の二次空間コヒーレンス測定法の開発研究

本研究の目的は、放射光の何X線領域での二次コヒーレンス(光子統計)を二光子吸収から評価することである。実験方法の確立のために、(a)He-Neレーザーから生成された擬似カオス光の二光子吸収測定、(b)軟X線発光測定、(c)遅延時間変調法による放射光の二次空間コヒーレンス測定、の3つ研究を並行して進めた。(a)では、光子統計を人為的に制御できる可視光のレーザーと回転すりガラスを用いて、光電子増倍管の二光子吸収確率の測定を行った。カオス光の方がコヒーレント光に比べて揺らぎが大きいため、二光子吸収確率が増大すると予想されたが、実験ではカオス光の方が二光子吸収確率が減少するという非常に興味深い結果が得られた。現時点では、その結果の解釈は完全にできていないが、非局所的な二光子吸収等が原因である可能性があり、研究を継続する予定である。軟X線での二光子吸収は、二光子吸収によって生じた内殻正孔に電子が遷移することで放出される軟X線を検出するものであるが、そのために軟X線発光分光技術を確立する必要があった。(b)の研究では、希土類金属、遷移金属の発光分光測定を高エネルギー加速器研究機構放射光実験施設で行った。この研究から、軟X線発光分光測定が物質の電子状態の研究に極めて有効であることが分かり、希土類金属、遷移金属の軟X線発光過程の特徴を理解することができた。この実験の成果は論文として発表済みである。何X線二光子吸収によって放射光の二次コヒーレンスを評価する前に、参考として別の測定方法によって二次コヒーレンスを測定しておくのが望ましい。(c)では、「遅延時間変調法」という新しい二次コヒーレンス測定法を開発し、高エネルギー加速器研究機構放射光実験施設で実験を行った。実験では、放射光がカオス光であることを明確に示すデータが得られた。この研究成果の論文は、投稿済みおよび投稿中である。今年度は、(1)He-Neレーザーを用いた可視光領域での二光子相関実験、(2)希土類金属の内殻励起軟X線発光分光測定を行った。本研究の最終的な目標は、非線型発光分光から放射光の二次空間コヒーレンスを評価する実験手法を確立することにあるが、(1),(2)はその予備的実験である。(1)He-Neレーザーを回転する擦りガラスに通すことで擬似カオス光を生成し、一次および二次空間コヒーレンスの測定を行った。一次空間コヒーレンスの測定は、100μm1000μm間隔の二重スリットを備えたヤング型干渉計を構築することで行った。また、二次空間コヒーレンスの測定は、二台の光電子増倍管からの信号の相間をTAC(Time to Amplitude Converter)で測定することによって行った。光が完全な擬似カオス光であるには、一次と二次の空間コヒーレンスに簡単な関係が成り立つが、実験結果はそれを満足していないことがわかった。これは、一次と二次のコヒーレンス測定では、光を観測する時定数が異なる(一次では秒、二次ではマイクロ秒程度)ためであると考えられる。この実験結果は、将来加速器内の電子ビーム状態の観測にを2次コヒーレンス測定を使う場合、きわめて短い時定数で観測できることを示唆している。また、この研究の付加的な成果として、TACによって得られる光子の相関関数の計算にクラスター展開を適用することで、定量的に二次コヒーレンスを評価できることを発見した。(2)軟X線の二光子吸収過程を観測するためには、二光子吸収後にできた内殻正孔に電子が遷移して放たれる蛍光を観測すればよい。その予備実験として、希土類金属(Gd, Tb, Dy, Ho)の4d内殻電子による一光子吸収後の蛍光測定を行った。これらの金属では、現在の放射光強度で十分に強い蛍光が得られることがわかった。

この研究から、軟X線発光分光測定が物質の電子状態の研究に極めて有効であることが分かり、希土類金属、遷移金属の軟X線発光過程の特徴を理解することができた。この実験の成果は論文として発表済みである。何X線二光子吸収によって放射光の二次コヒーレンスを評価する前に、参考として別の測定方法によって二次コヒーレンスを測定しておくのが望ましい。(c)では、「遅延時間変調法」という新しい二次コヒーレンス測定法を開発し、高エネルギー加速器研究機構放射光実験施設で実験を行った。実験では、放射光がカオス光であることを明確に示すデータが得られた。この研究成果の論文は、投稿済みおよび投稿中である。
非侵襲生体内１分子イメージング顕微鏡の開発

我が国で開発された1分子イメージング技術は、これまでin vitroでの分子モーター研究などタンパク質分子機械の動作原理の解明や細胞膜表面でのシグナル伝達の研究など様々に応用される基盤技術である。しかし、全反射顕微鏡をベースとした方法であるため、カバーグラス近傍100nm程度の範囲しか観察できず、細胞内部や個体内での生命現象には適用できなかった。本研究では、ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡と高感度低ノイズ検出器を組み合わせることで、細胞深部における1分子イメージングを実現した。さらに、新規に開発された色素と組み合わせることで、細胞深部における超解像イメージングに成功した。本年度は、前年度の成果を発展させて、以下の研究開発を行った。1)ゼブラフィッシュは透明でin vivo光学観察が容易であるが、皮膚の色素胞が蛍光観察の障害となる。3種類の色素胞のうち、黒色素胞は、青色光励起で強い緑黄色の蛍光を発し、黄色素胞は青緑色励起光により黄橙色の蛍光を発する。従って、薬剤処理などで色素合成を阻害しても、残存する色素由来の強い蛍光により、蛍光1分子由来の微弱な蛍光は隠されてしまう。また、虹色素胞は強い偏光特性を持つ光の散乱体であり、皮下の観察に多大な悪影響を及ぼす。これら3種類の色素胞をすべて欠く透明ゼブラフィッシュCasper系統は、病弱で飼育が困難であるとされていたが、飼育条件の最適化を行い、安定して採卵・繁殖できる条件を確立した。2) Casper系統受精卵に発現プラスミドを微量注入することで一過性発現の実験系を構築した。この系では、全身の細胞のごく一部で確率的に外来遺伝子を発現する。この系を用いて体表から100200μm程度までは蛍光標識された小胞の輸送が観察できることが確認された。しかし、体組織による光波面の乱れの影響で分解能および結像性(=信号強度)は低下し、より深部の観察は困難であった。この系では、発現量と発現位置の調節は困難で、現時点では蛍光1分子の観察には成功していない。そのため、細胞特異的な発現プロモーターを用いた発現系をもつ系統を樹立中である。3) 2)で明らかとなった光波面の乱れの影響については、補償光学系の利用が有望であり、補償光学系の導入の検討を開始した。本年度は、計画通り以下の研究開発を行った。1)ゼブラフィッシュ初期胚の非侵襲蛍光ライブイメージングシステムの構築。これまで1分子観察によく用いられている全反射顕微鏡では細胞のカバーグラス付着面極近傍しか観察することが出来ず、厚みのあるゼブラフィッシュ初期胚のイメージングには適さない。厚みのある初期胚内部の蛍光像を焦点面外からのぼけ光を排除して取得するためには、共焦点顕微鏡システムが通常用いられるが、広く用いられている点走査型共焦点顕微鏡では1分子イメージングに必要な時間分解能を達成出来ない。そこで、ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡をベースに開発することで、厚みのあるゼブラフィッシュ初期胚で光学断層像を作成しつつ1分子イメージングが可能となるような顕微鏡システムを作成した。2)ゼブラフィッシュ自家蛍光の低減。ゼブラフィッシュ初期胚皮膚からの自家蛍光の多くは色素細胞に由来していた。従って、これを克服するため、色素細胞を持たない変異体casperの系統を導入した。本系統は野生型に比べて病弱で飼育困難であるとされていたが、安定して飼育繁殖させることに成功している。3)ニポウディスク方式共焦点顕微鏡を用いた1分子ライブイメージング。ニポウディスク方式共焦点顕微鏡は、光利用効率が低く1分子イメージングの用途で用いられることは稀である。今回、光学系の見直しと再調整を行うことで、ニポウディスク方式共焦点顕微鏡で1分子ライブイメージングが十分に可能であることが示された。当初想定していた通りに研究開発は進行しており、特に予定からの著しい解離はない。顕微鏡システムの構築はほぼ予定通り進行しているので、25年度には、これを利用して、いよいよゼブラフィッシュ個体での1分子イメージングに挑戦する。Casper系統を利用して、transient expressionの系を上手く構築することで、短い開発期間で初期胚表層での1分子イメージングの実現を最初の目標とする。1分子イメージング用の蛍光タンパクとしては、ppluGFP2ベースのものに加え、ごく最近発表されたlamprey由来のmNeonGreenなども検討する予定である。H24年度、消費税などで生じた端数により753円の未使用額が発生し、H25年度へ繰り越した。少額なので、とくに計画の変更はない。