hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自己組織化を促進する大動脈治癒型ステントグラフトの開発

大動脈瘤など大動脈疾患に対する外科治療は開胸開腹による人工血管置換術からステントグラフト(SG)を用いた低侵襲治療に移行しつつある。これは良好な初期成績を示すためだがSGの接着不全によるEndoleakやズレも報告されており問題点も指摘されている。本研究では内因性修復因子の産生を促進することで組織再生を促すといわれるプロスタサイクリンの合成製剤である「ONO-1301」と「生体吸収性素材」を組み合わせたSGを開発し損傷した自己組織化を早期実現し大動脈解離の完全治癒を目指すことを目的とした。1ONO-1301のNHDFs・HUVECsに対する効果の検討ONO-1301によるNHDFsからのHGF,VEGF分泌促進試験ではNHDFsを培養下ONO-1301を投与後の培養上清のELISAではコントロ-ル群に比べ投与量依存性にHGF、VEGFの発現の亢進を認めた。Real-time PCR法にてNHDFsにおけるmRNAの発現を調べると投与量依存性にHGF、VEGFの発現の亢進を認めた。2ONO-1301溶出性SGの新規開発徐放性の検討では材料にステンレス製Zステントを用いクラフトとして開発研究してきたPET/PGA人工血管を用いた。ONO-1301MicroSphere製剤を凍結乾燥固定させONO-1301溶出SGを作成。溶出性試験ではコントロ-ルとして生体用ゼラチンAおよびゼラチンBにONO-1301を懸濁グラフトに塗布し薬剤放出性を比較。結果ゼラチン製剤によりONO-1301を塗布したSGに比べMicro sphere製剤を凍結乾燥固着したSGにおいてONO-1301はより緩徐に放出された。以上から本研究の基盤となるONO-1301のNHDFs・HUVECsに対する効果についての検討ONO-1301溶出性SGの新規開発およびその徐放性の検討を行い前進が得られたと考えている。大動脈瘤や大動脈解離など種々の大動脈疾患に対する外科治療は、従来の開胸・開腹による人工血管置換術から、血管内治療であるステントグラフト(SG)を用いた低侵襲治療(endovascular aortic repair; EVAR)に世界的に移行しつつある。これは後者が圧倒的に良好な初期成績を示す為である。しかしながら、遠隔期において数数10%においてSGの血管接着不全によるEndoleakや、SGのズレ(migration)が生じてしまう13)ことが報告されている。更には、SG内挿後に大動脈壁に新たな内膜の亀裂(intimal tear)が生じたり、治療により解離腔への血流を遮断し解離腔内を血栓化させた後も再解離や破裂を起こす危険性があるという、大動脈解離に対するSG治療による問題点も残っている。そこで、本研究では内因性修復因子の産生を促進することで組織再生を促すといわれるプロスタサイクリンの合成製剤である「ONO-1301」と、「生体吸収性素材」を組み合わせた新しいステントグラフトを開発し、急性大動脈解離において、損傷した大動脈壁の修復および大動脈解離腔の自己組織化を早期に実現し、従来のステントグラフトでは成し得なかった大動脈解離の完全治癒を目指すことを研究目的としている。本年度は、本研究の基盤となるONO-1301のNHDFs・HUVECsに対する効果についての検討およびONO-1301溶出性ステントクラフトの新規開発およびその徐放性の検討を行い、前進が得られたと考えている。

研究計画にて示した以下の点において、下記の成果が得られたため。1。ONO-1301のNHDFs・HUVECsに対する効果についての検討およびONO-1301によるNHDFsからのHGF,VEGF分泌促進試験NHDFsを培養下、ONO-1301(10nM/L,100nM/L,1000nM/L)を投与した。72時間後の培養上清のELISAでは、コントロ-ル群に比べ、投与量依存性にHGFおよびVEGFの発現の亢進が認められた。またReal-time PCR法にてNHDFsにおけるmRNAの発現を調べると、同様に投与量依存性にHGFおよびVEGFの発現の亢進が認められた。2。ONO-1301溶出性ステントクラフト(SG)の新規開発およひ徐放性の検討SGの材料にはステンレス製Zステント(Gianturco Z stent;径/長20/25mm; William Cook Europe A/S, Bjaeverskov, Dennmark)を用い、クラフトとして当科にて開発研究してきたPET/PGA(Polyethilene terephthalate/ Polyglycolic acid)人工血管を用いた。ONO-1301 Micro Sphere製剤をPET/PGAに凍結乾燥固定させることで、ONO-1301溶出ステントグラフトを作成した。また溶出性試験においてはコントロ-ルとして生体用ゼラチンA(ニッピ社)およびゼラチンB(新田ゼラチン社)にONO-1301を懸濁、グラフトに塗布し、その薬剤放出性を比較した。結果、ゼラチン製剤によりONO-1301を塗布したSGに比べ、Micro sphere製剤を凍結乾燥固着したSGにおいて、ONO-1301はより緩徐に放出された。平成24年度に本研究の基盤となるONO-1301のNHDFs・HUVECsに対する効果の検討およびONO-1301溶出性ステントクラフトの新規開発・徐放性の検討を行い、本研究の基礎的事項が確認された為、動物実験による検証を行う方針である。1)大動脈解離モデルの作成およびステントグラフト留置実験大動脈解離モデルの作成には体重20kg前後のHBD成犬を用い、Katoらの報告に準じて作成する。下行大動脈に実験的大動脈解離を作成した後で大動脈造影を行い解離腔が描出されることを確認し、引き続いてステントグラフト留置の手技に移る。前述の如く作成したステントグラフトを、デリバリーシステム内に格納し大動脈内に挿入、再度大動脈造影を行い解離entryの位置を確認した後に、entryを塞ぐようにステントグラフトを留置する。2)ONO-1301溶出性ステントグラフトによる治療効果検討評価項目としては、ステントグラフト移植後2週間ごとの造影検査によるによるmigrationやendoleakの有無の評価と、移植後1ヶ月目、2ヶ月目における摘出標本の病理組織学的評価(グラフト内の内膜化・自己組織再構築・解離腔の自己組織化)行う。次年度においては、動物実験に必要とされる雑種成犬の購入費および飼育費が最大出費となる計画である。研究計画書に記載した通り、雑種成犬1匹の値段を70千円とし、生存例25匹を得るための購入数を30匹として試算した。
スプライシング異常による疾病発症メカニズムの分子論的基盤研究

真核生物では、mRNA前駆体から成熟したmRNAを生成するスプライシング反応が生体制御で重要な役割を担う。本研究では、スプライシング部位の決定に関わる基本因子の分子構築(とくにスプライシング反応の活性中心を担うU2 snRNPの部分構造など)とそのmRNAへの結合をコントロールする制御因子(とくに、前頭側頭型痴呆症や筋強直性ジストロフィーの発症にかかわる制御因子)の分子間認識機構を構造生物学的に明らかにした。本年度は、筋強直性ジストロフィーの発症に関連すると思われる選択的スプライシング因子、MBNL蛋白質とCUG-BP1蛋白質のRNA結合ドメインについて高次構造解析を行った。この疾病は、CUG triplet repeat病のひとつであり、遺伝子中に増幅されたCUG repeatに上記の蛋白質が結合して、細胞質中から除外されてしまうために、本来これらの蛋白質によって制御されるべきスプライシング反応に異常が生じるために発症すると考えられている。われわれの構造解析の結果、MBNL蛋白質のCCCH亜鉛結合ドメインは、タンデムに繋がった形でひとつのドメインとして挙動し、この中に、反対方向を向くRNAを結合するふたつの独立な結合部位があることを明らかにした(研究発表(6))。また、CUG-BP1蛋白質の3番目のRNA結合ドメインは、一般にRRM foldとして知られているものであったが、従来のものとは異なり、ドメインへとつづくN末端部分が特徴的な構造をとり、RNA認識に強く関与していることが明らかとなった。CUG-BP1と同様のドメイン構成をもつ蛋白質としてHuC蛋白質があるが、この3番目のRRM foldについては、RNAの認識メカニズムが明らかにことなり、両者の制御機構を考える上で興味ぶかい結果である(学会発表(1))。また、基本因子となるU2 snRNPのブランチ部位認識に重要な役割をはたすp14蛋白質について水溶液中での立体構造を決定し、U2 snRNPへと組み込まれるメカニズムおよび、特異的なRNA認識機構について明らかにすることができた(研究発表(1))。昨年度に引き続き、筋強直性ジストロフィーの発症に関連すると思われる選択的スプライシング因子、CUG-BP1蛋白質のRNA結合ドメインについて高次構造解析の結果をまとめ、公表した(論文(3))。また、同様に、筋強直性ジストロフィーの発症に関与すると考えられるMBNL2蛋白質についてそのRNA結合ドメインの構造を解析し、公表した(論文(6))。これによると、MBNL2は4個あるRNA結合ドメインのうち、1-2と3-4がそれぞれひとつのドメインのように振る舞い、従来知られている様式とは異なる方法でRNAを結合することが明らかになった。基本因子については、質量分析計を用いた解析から、基本因子となるU1snRNPが、Hela細胞中では、U1-70KとSmBにおけるスプライシングバリアントのために、4種類存在していることが明らかになった。とくに、U1-70Kのバリアントについては、U1snRNP中で、構成要素のひとつであるU1C蛋白質との相互作用様式に変化が見られることが明らかになった(論文(1))。また、前頭側頭型痴呆症などに関連するTra2β蛋白質のRNA結合ドメインとその結合配列との複合体解析をおこなった。Tra2β蛋白質は、人だけでなくショウジョウバエなどの真核生物にも見られる普遍的なスプライシング制御因子であるが、アミノ酸の類似が高いにも関わらず、異なった結合配列が報告されている。今回、異なった二種類の配列の対するNMR解析から、結合するRNA配列の構造の違いから、認識配列が変化することを明らかにした。この結果は、ひとつの蛋白質が、状況によって異なる配列を認識する可能性を示す興味ぶかいものである。前頭側頭型痴呆症などに関連するTra2β蛋白質のRNA結合ドメインとその結合配列との複合体解析をさらに進め投稿論文として発表した。Tra2β蛋白質は、人とともにショウジョウバエなどの真核生物にも見られる普遍的なスプライシング制御因子であるが、アミノ酸の類似が高いにも関わらず、結合配列としてGAAGAA配列とUCAA配列の異なった結合配列が報告されている。今回、GAAGAA配列とTra2βのRNA結合ドメインとの複合体をNMR法により、決定することができた。これにより、AGAA配列が、特異的に認識されている様式を明らかにすることができた。さらに、UCAA配列との相互作用をNMR法によって調べたところ、この配列は、単純な一本鎖構造の中では、Tra2βのRNA結合ドメインとは強く相互作用しないが、この配列をループ部分にもつステムーループ構造のRNA分子では、AGAA配列と同程度に結合できることがわかった。また、AGAA配列をループ部分にもつステムーループ構造には、Tra2βのRNA結合ドメインは、まったく結合できなくなっていた。さらに、siRNAの生成に関与するDicerと共に働くTRBP蛋白質について、そのRNA結合に関与するふたつのRNA結合ドメインの構造決定と比較を行い、Protein Science誌に投稿した。

このRNA結合ドメインは、二本鎖のRNA分子を認識することで知られたものであり、このふたつのRNA結合ドメインによる協働的なRNA認識様式についてITCを用いた実験により明らかにすることができた。
交感神経節細胞の神経成長因子依存性と細胞内カルシウム

1脱分極による神経細胞死の阻止交感神経節細胞はその生存に神経成長因子(N6F)を必要とする。即ちN6Fを除くとin vivoでもin vitroでも神経細胞は死んでしまう。ところが高K^+培地(35mM)又はコリン、カルバミルコリン等のニコチンアゴニストは共に脱分極をひきおこすことにより細胞死を阻止することを見出し、この材構を詳しく調べた。その結果高K^+効果はCa^<2+>除去倍地では失われること、Ca^<2+>チャネルアンタゴニスト(ニモジピン、ニフェディピン)で阻害され、アゴニスト(BayK6644等)で増強されることから、Ca^<2+>チャネルを介して細胞外Ca^<2+>の流入によると考えられた。一方ニコチニックアゴニストは細胞外Ca^<2+>を除いてもその効果は失われず、細胞内Ca^<2+>をキレ-ト剤により低下させるとその効果が失われることから細胞内Ca^<2+>の放出によると考えた。この結果から細胞内Ca^<2+>細胞内Cu^<2+>とN6F依存性に関して仮説を提出した。2培養交感神経節細胞の細胞内カルシウム濃度の測定上記仮説の正否を調べるべく、細胞をfura-2によりラベルし、細胞内Ca^<2+>濃度を画像解析法により測定した。その結果通常の条件下で交感神経細胞の細胞内Ca^<2+>は100nM前後であり、高K^+(35mM)による脱分極により200230nMに上昇することが判った。又細胞を培養していくと3-4週間で交感神経細胞のN6Fに対する依存性は変わっていく即ちAgingSC6はその生存がN6Fに依存しないが、その場合細胞内Ca^<2+>濃度は高い(200250nM)ことが明らかになった。これらの細胞をε6TA処理して細胞内Ca^<2+>濃度を低下させると、交感神経細胞は再びN6F依存性をとりもどした。この結果から上記仮説は支持されたと考えている。
マイクロ電極法による電気化学的プロチウム固溶過程の解析

プロチウム固溶機能を有する各種合金材料への電気化学的なプロチウム挿・脱入反応を、マイクロ電極を用いたその場(in-situ)測定によって精密に評価し、水素2次電池用新規材料の探索と高性能化を目指した。研究の特色はマイクロ電極を用いる新規な電気化学システムにあり、合金粒子1個を測定対象とすることを可能とした。これにより、高分子結着剤や導電助剤が混在しない、合金粒子自体の電気化学挙動を精密に評価することが出来た。LaNi_5、MmNi_5、Mg_2NiおよびアモルファスMgNiについて、直径50μm以下の球状粒子を測定対象とし10μm径のカーボンファイバーをキャピラリー化したガラス管に封入て作製したカーボンマイクロ電極をX-Y-Zマイクロマニュピュレーターで標的粒子に接触させた。サイクリックボルタンメトリーにおいては、従来のコンポジット膜では分離不可能な複数の同時進行反応を明瞭に観測できた。それぞれの反応に対応した電流ピークの電位掃引速度依存性、サイクル依存性などを調べ、速度論的に解析した。一方、ポテンシャルステップを与えた際の過渡電流応答から化学拡散係数等の速度論的パラメータの導出も試みた。LaNi_5粒子およびMmNi_5粒子についてプロチウム拡散係数を決定し、電気化学的ではない精密な方法で測定された値と一致する結果を得た。また、分極曲線や充放電曲線についても複合膜で得られる結果よりも明瞭であり、精密な材料評価が出来た。以上は電気化学的な挙動が単一粒子測定によって精密に行えることを示す結果であるが、それに加えて、粒子の形状を顕微鏡で直接観察出来ることも重要な利点である。結果として、充放電試験中に粒子が分裂することを観察し、電気化学応答の変化と対応づけて議論することを可能にした。
活性酸素によって活性化されるCa^<2+>channelの生理的役割の解明

本研究では、受容体活性化Ca^<2+>チャネル(TRP)の活性化機構および生理的意義の解明を目標として研究を進めてきた。(1)受容体刺激により細胞内で生成される活性酸素種(ROS)や活性窒素種(RNS)は、数百nMから多くて数μM程度に及ぶ。このROS/RNSによって直接的に酸化修飾を受け活性化されるTRPチャネルが存在することを見出した(論文投稿中)。この結果は、我々が昨年報告したTRPM2(Hara et al.,Mol.Cell,2002)とは異なる機構で開口活性化されることを意味するものであり、TRPM2活性化による細胞死誘導とは異なる生理的役割を有するものと考えられる。(2)非興奮性細胞において、受容体刺激によって引き起こされる持続的なCa^<2+>振動(オシレーション)は、受精や細胞増殖・遺伝子発現において非常に重要な役割を果たしている。しかし、Ca^<2+>オシレーションの発生メカニズムは古くからの謎とされてきた。私達のグループが新たに開発したイノシトール1,4,5-三リン酸(IP_3)検出蛍光プローブを用いて、受容体刺激による細胞内Ca^<2+>動態と細胞内IP_3動態を経時的に解析した。その結果、受容体刺激によって惹起されるCa^<2+>流入がホスホリパーゼCγ2(PLCγ2)の膜集積を引き起こし、活性化されたPLCγ2が持続的にIP_3を産生することがわかった。さらに、Ca^<2+>流入を担う分子実体がTRPチャネル(TRPC3)であること、TRPC3とPLCγ2が恒常的に結合していることを明らかにした。これまで受容体刺激で引き起こされるCa^<2+>流入が直接的に、持続的なCa^<2+>オシレーションを発生させると考えられてきたが、本研究により、Ca^<2+>流入に依存したIP_3産生による細胞内Ca^<2+>ストアーからのCa^<2+>放出こそが、オシレーションの発生に重要であることが明らかとなった。また、この知見は、TRPチャネルを中心としたシグナルタンパク質複合体形成のもつ、生理的意義を示した初めての報告である。活性酸素種(Reactive Oxygen Species : ROS)は、病態形成における重要因子として考えられている。ROSの標的分子探索を目的として、これまでに受容体と共役するGタンパク質およびCa^<2+>channelを見出した。ROSによるG_<i/o> α活性化メカニズムの解析を行った結果、2箇所のシステイン酸化による機能修飾がG_<i/o> α活性化に関与することを示した。さらに受容体刺激や酸化ストレスによってG_<i/o> αから遊離したβγサブユニットが、心筋において保護シグナル(MAP kinaseやAkt)を活性化することも示し、外的ストレスに対する心筋の内因性保護機構の一経路を明らかにした。一方、ROS刺激により活性化されるCa^<2+>チャネル(TRPM2)の機能同定に成功した。TRPは元来受容体活性化チャネルとして発見されたチャネルであるが、TRPM2はG_<i/o> αの活性化とは異なる経路で活性化されることを示した。生理的には、TRPM2の開口活性化が積極的に細胞死を誘導することを明らかにした。生理的には、受容体刺激や酸化ストレスによって誘発されるCa^<2+>流入が、細胞内Ca^<2+>濃度上昇を引き起こし、細胞周期を制御すると考えられる。免疫B細胞株において、受容体刺激は細胞内IP_3産生と連動して持続的なCa^<2+>濃度上昇(オシレーション)を引き起こす。我々はphospholipase C(PLC)γ2の酵素活性に着目し、Ca^<2+>オシレーションの発生メカニズムを調べた。その結果、受容体刺激によるCa^<2+>流入が、酵素非依存的にPLCγ2を膜マイクロドメインへ集積させうることを明らかにした。膜近傍に集積したPLCγ2は、酵素活性依存的にIP_3を介したCa^<2+>シグナルだけでなくDAGを介したMAP kinaseシグナルをも活性化させた。Ca^<2+>流入により引き起こされるPLCγ2シグナル増幅は、細胞増殖を惹起することから、現在そのメカニズムを解析している。

私達のグループが新たに開発したイノシトール1,4,5-三リン酸(IP_3)検出蛍光プローブを用いて、受容体刺激による細胞内Ca^<2+>動態と細胞内IP_3動態を経時的に解析した。その結果、受容体刺激によって惹起されるCa^<2+>流入がホスホリパーゼCγ2(PLCγ2)の膜集積を引き起こし、活性化されたPLCγ2が持続的にIP_3を産生することがわかった。さらに、Ca^<2+>流入を担う分子実体がTRPチャネル(TRPC3)であること、TRPC3とPLCγ2が恒常的に結合していることを明らかにした。これまで受容体刺激で引き起こされるCa^<2+>流入が直接的に、持続的なCa^<2+>オシレーションを発生させると考えられてきたが、本研究により、Ca^<2+>流入に依存したIP_3産生による細胞内Ca^<2+>ストアーからのCa^<2+>放出こそが、オシレーションの発生に重要であることが明らかとなった。また、この知見は、TRPチャネルを中心としたシグナルタンパク質複合体形成のもつ、生理的意義を示した初めての報告である。
KRAS遺伝子変異肺癌におけるNampt阻害による抗腫瘍効果とその作用機序の検証

KRAS遺伝子変異を有する肺癌に対して、Nampt阻害剤の抗腫瘍効果とそのメカニズムを検証した。複数の肺癌細胞株を用いた実験の結果、Nampt阻害剤の効果に関して、治療に感受性のある群、薬剤抵抗性の群、中間の群に分けられることが明らかとなった。また、その作用メカニズムを検証した結果、Nampt阻害剤が、1Rbタンパクのリン酸化を抑制すること、2MAPKシグナル経路を抑制すること、3Bimタンパクのリン酸化を抑えること、4γH2AXの発現を亢進させ、DNA傷害を引き起こすこと、を突き止めた。さらに次世代シークエンサーを用いて、KRAS遺伝子変異を有する肺癌症例を同定するシステムを構築した。次に、Nampt阻害による抗腫瘍効果の機序を調べるため、SensitiveなKRAS肺がん細胞株を用いて、逆相タンパク質アレイ(RPPA: Reverse Phase Protein Array)によるリン酸化タンパク質のスクリーニングを行った。これにより、MAPKシグナルに関するタンパク質のリン酸化がNampt阻害により抑制すること、細胞周期に関するリン酸化タンパク質の発現量を抑制すること、を見出した。一方で、mTORシグナルも弱いながら抑制されていたため、オートファジーが抗腫瘍効果に関連している可能性も考えられた。そこで、オートファジー関連タンパクの発現量をウエスタンブロットで評価したところ、Nampt阻害によって一部のオートファジー関連タンパク質で発現量の変化が認められたが、その程度は強いものではなかった。KRAS肺癌細胞株を用いて、Nampt阻害剤による抗腫瘍効果の再現性を確認することができた。また、その作用メカニズム・抗腫瘍効果についても、逆相タンパク質アレイを用いて、候補を絞ることができた。今年度は、肺癌検体における、KRAS遺伝子変異とNamptの発現レベルの評価をする為、臨床検体組織の解析を行った。まず、適切な手順を踏んで評価の実験プロトコールを作成した。臨床検体を扱うにあたり、倫理審査委員会の承認を得た。解析を行う症例をピックアップして、KRAS遺伝子変異の解析を行った。解析にはIon PGMシステムによる次世代シークエンサーを用いた。Colon & Lung cancerpanelを用いてKRASを含む癌遺伝子の解析を行った。臨床検体は手術検体及び気管支内視鏡生検検体のホルマリン固定パラフィン包埋切片を用い、DNAを抽出した。ホルマリンによる遺伝子配列の修飾も予想された為、その修飾を除去できるようなキットを用いて検体から核酸を抽出した。手術検体からは良質な、十分量のDNAを抽出することができたが、気管支内視鏡生検検体の一部では、DNA量が少なかったり、質が次世代シークエンサーに不適切であるようなものもあった。この原因を突きとめて改善を測る為、生検検体の細胞数や、ホルマリン固定の時期、抽出処理時間の工夫などを行ったが、結果、細胞数が少ない場合は、その他の条件を適切に整えたとしても、次世代シークエンサーの解析に耐えうる良質なDNAが抽出できないことが判明した。以上から、当初予定していた解析数を増やすことを検討することとした。臨床検体の解析に関して、次世代シークエンサーを用いた。実験プロトコールが確立するまで想定より、時間を要した。この為、当初予定していたin vitro実験の進行も遅れることとなった。前年度から引き続き、次世代シークエンサーを用いてKRAS遺伝子変異および合併する遺伝子異常の解析を行うべく、プロトコールの最適化を行った。FFPE検体から抽出できるDNA量は、実験手技の変更によっても変化に乏しく改善の見込みが低かったため、次世代シークエンサーのライブラリー作成で用いるキットを変更することで対応した。Ion Ampliseq Library kit plusを用いることで測定時のIon Sphere Particel densityを適正な濃度にすることが可能となった。また、測定のパネルをIon Ampliseq Comprehensive CancerPanelに変更して解析を行った。結果、KRAS遺伝子異常および合併する遺伝子異常を持つ症例を同定することができた。次に効率よくNamptタンパク発現量を解析するため、KRAS遺伝子変異が同定された腫瘍組織からTissue microarrayを作成することとし、作成法を確立した。現在、腫瘍のNamptタンパク発現量を評価すべく、解析を行っている。KRAS肺癌細胞株を用いた実験を行って、NamptとMAPKシグナルおよび細胞周期関連タンパクとの相互作用や関連性を評価する。また、Nampt阻害剤に対する感受性に差がみられたが、Namptの発現量やNampt遺伝子変異の有無を細胞株間で評価し、関連性を検討する。さらにNampt阻害剤にResistantである細胞株で、MAPKシグナルや細胞周期関連タンパクの変化が生じにくいことも確認していく。作用機序の候補が見つかれば、その発現量をKRAS肺癌の臨床検体を用いて評価していく。

引き続き、肺癌臨床検体におけるKRAS遺伝子変異を次世代シークエンサーを用いて解析する。前述の通り、検体によっては十分なDNA量が確保されないケースがあることが判明した為、その対応策として、サンプル数を増やして解析を進めることとした。KRAS遺伝子変異の解析を行ったのちにNampt遺伝子の発現を評価していくが、研究の進行が予定よりも遅れている為、評価の効率化を測ることとした。Digital PCR (QuantStudio 3D, ThermoFisher)を用いてNampt遺伝子の発現を解析する。また、細胞培養実験で得られた成果の再現性を検証すべく、引き続きin vitro実験を行なっていく予定である。肺癌研究の進捗状況に応じて、必要物品を購入しており、次年度に繰り越すこととした。年度を越えて納入する試薬等が発生したため。試薬の一部に用いる予定である。次年度に繰り越して使用する。
蛍光性生理活性化合物の創製:(プルラマイシン類をリードとして)

抗腫瘍性天然物であるプルラマイシン類の全合成を目指した。それにあたり、効率的な新規ビス-C-グリコシド合成法とアグリコン合成法を開発した。開発した二つの手法を組み合わせることで、天然物の初の全合成を達成することができた。今後確立した合成ルートを応用することにより誘導体化が可能であり蛍光ブローブの開発も可能と考えられ、ケミカルバイオロジー研究へ展開する基盤となる技術を開発することができた。本研究は、抗腫瘍性抗生物質であるプルラマイシン類をリード化合物として、蛍光分子プローブの創製を目指すものである。プルラマイシン類は2つのアミノ糖によってDNAの塩基配列を認識し、高い生理活性を示す。一方、蛍光分子は生体分子を標識化することで、生命現象を観察するために利用される。蛍光分子にプルラマイシン類が持つ糖部位の構造を導入することができれば、特定のDNA配列を認識する蛍光プローブの創製が期待できる。しかし、その糖部位はビス-C-グリコシドという特徴的な構造を持ち、合成は容易でない。まずは、プルラマイシン類の実践的合成法の開発を目指し研究を開始した。当該年度では、プルラマイシン類のアグリコン部位の合成を目指した。すでに、申請者らのグループはビス-C-グリコシド構造の合成に成功している。しかし、2つのアミノ糖を有したままでは、使用可能な合成反応が限られるため全合成には至っていない。さらに、合成の過程において予期しない現象が頻発することも問題である。このため、いかにして糖部位の構造を保持しつつ骨格変換するかが重要であり、どんな場合にも有効に働く信頼性の高い反応の開発が必要となる。申請者はナフトキノンモノアセタールのDiels-Alder反応を鍵反応として合成に取り組んだ。ナフトキノンモノアセタールは、求ジエンとしての反応性の低さ故にDiels-Alder反応に利用された例はほとんどない。しかし、Diels-Alder反応は基質を混合するだけで反応が進行するため、適切な条件を見出すことができれば、アミノ糖を持つ基質についても適用可能と期待できる。検討の結果、Brassardジエンとモレキュラーシーブス4Aを組み合わせると反応が円滑に進行し、望む付加体を得ることに成功した。現在、糖が導入された誘導体への適用について鋭意検討中である。当該年度では、アグリコン部位のピラノアントラキノン部位の合成を目指した。前年度の検討において、反応性の低いナフトキノンモノアセタールをジエノフィルとして用いたDiels-Alder反応を良好な収率で進行させる条件を見出しており、そこから得られる付加体からアグリコンを目指した。検討の結果、付加体にヨウ素を導入できる条件を見出すことができ、そこからアリールヨージドへの変換も可能となった。さらに、導入したヨウ素を足がかりとしてアニオンを発生させることで側鎖であるイノンを導入できた。その後、環化反応によりγピロン環を構築し、アグリコン骨格を合成することができた。現在、収率の向上にむけて検討中である。本研究は、抗腫瘍性抗生物質であるプルラマイシン類をリード化合物として蛍光プローブの合成を目指すものである。プルラマイシン類は、2つのアミノ糖によってDNAの塩基配列を高度に認識することで高い生理活性を示す。しかしながら、DNA認識の鍵となる部位はビスーCーグリコシド構造という特異な構造を有しており、その合成は容易ではない。そのため、まずはプルラマイシン類の実践的合成法の開発を目指した。

当該年度では、プルラマイシン類の一つであるサプトマイシンBの全合成を目指した。我々は、これまでにビスーCーグリコシド構造の構築に成功しており、さらにアグリコンの合成にも成功している。残る課題はアミノ糖を有したままいかにしてアントラピラノン骨格を合成し、その整合性をとるかにある。これに対して我々は、できるだけ合成の終盤においてアグリコンに対して糖を導入する方法を探索した。その結果、芳香環の求核性の差をうまく利用することで三環性のアントロンに対して異なる糖を収率よく順次導入する方法を見出すことができた。さらにこのとき用いたアントロンからアントラピラノン骨格へ誘導する手法を開発し、アグリコン合成の新規経路を開拓することができた。開発したビスーCーグリコシド合成法とアグリコン合成法を組み合わせることで、サプトマイシンBの全合成を達成することができた。当初の目標である蛍光プローブ開発までの応用を試みることはできなかったが、今後確立した合成ルートを応用することで達成可能と考えられ、基盤となる技術を開発することができた。平成23年度までにプルラマイシン類の合成経路を確立する予定であったが、未だに全合成には至っていない。本化合物はアミノ糖を有したままで炭素骨格の構築や様々な官能基変換を行わなければならないため、適用可能な合成法が限られる。そのため新たな合成手法を開発する必要があり、その検討に時間を要するためである。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目標であった天然物の蛍光化を達成するためには、その全合成が不可欠であるため、とにかく全合成を目標とし鋭意検討していく予定である。現在、アグリコン部位の合成法は確立してきているため、今後はアミノ糖部位を導入し、これまで見出した方法がどこまで通用するのかを確認していく。
種特異的な発生時計が制御する器官サイズとパターン保存性のメカニズムの解析

体内に存在するすべての器官は体全体に合ったサイズで存在する。種間で比較的相似形が保たれており、ゲノムレベルでも類似性の高いニワトリとウズラで、サイズの違いが生じるメカニズムを明らかにし、サイズ決定の分子機構の一端を明らかにすることがこの研究の目的である。本研究では、特にニワトリ胚とウズラ胚の神経管の大きさの変遷に着目する。両者はゲノム構造が非常に類似しているため、遺伝子発現の違いなど、比較的小さな違いがサイズの違いや種特異的な発生時間に違いを生み出していると考えられる。そこで、この違いを移植実験や発現解析によって明らかにしたい。
嗅覚系神経上皮の神経新生を担う分子機構の解析

嗅覚系神経上皮では成体においても神経新生が恒常的に起こっており、神経細胞に障害を与えると神経新生が促進されることが知られている。神経新生の細胞分子機構を検討するため、成体マウスの片側の嗅球を外科的に除去して嗅上皮の神経新生を片側性に促し、新生細胞を核酸アナログであるBrdU投与によって標識し、時間を追って観察した。匂い分子を感知する嗅上皮と、フェロモン分子を感知する鋤鼻神経上皮のうち、神経新生の促進は鋤鼻神経上皮においてより著しいことが分かったため、これを対象とした。無処置側ではBrdU陽性細胞は鋤鼻神経上皮の基底層に少数散在するのみであったが、処置側ではBrdU陽性細胞が基底層全体にわたって多数観察されたことから、定常状態では増殖可能な細胞の多くは休止状態にあり、刺激を受けると増殖を始めると推察された。BrdU陽性細胞は、数日後には神経上皮のより表層に近い層に移動し、GAP-43,beta-III tubulinなどの神経分化マーカーを発現していた。鋤鼻神経上皮は深層と浅層の2層から成り、それぞれGo陽性、Gi陽性神経細胞が分布している。BrdU標識実験から、新生神経細胞は初めGo陽性で、その後Go陽性神経細胞と、Gi陽性神経細胞に分化することが分かり、2種類の神経細胞は共通のGo陽性未分化神経細胞から分化することが示唆された。この分化過程をより詳細に解析するため、未分化神経細胞を可視化できるネスチン-GFPトランスジェニックマウスに嗅球除去を行い、増加したGFP陽性細胞の単離回収を行った。分化マーカーの発現検討から、このマウスの鋤鼻神経上皮ではGFPは未分化な新生神経細胞に発現していた。神経上皮を剥離して細胞を分離し、蛍光顕微鏡下でGFP陽性神経細胞を選択的に回収することに成功し、より詳細な神経分化の分子機構を調べる基盤を確立することができた。嗅覚系神経上皮における神経細胞の増殖と分化の様相を明らかにするため、成体マウスの片側の嗅球を外科的に除去して片側の神経上皮の神経増殖を促し、増殖細胞を核酸アナログであるBrdUを投与して標識した。無処置側の神経上皮でも常にBrdU陽性細胞が基底層に存在しており、常時新しい神経細胞が産生されていることが示された。また、嗅球除去側の神経上皮ではBrdU陽性細胞の数が明らかに増加していた。嗅覚系の神経上皮は、匂い分子を感知するいわゆる嗅上皮と、フェロモン分子を感知する鋤鼻神経上皮があるが、嗅球除去によるBrdU陽性細胞の増加は鋤鼻神経上皮においてより著しかったため、鋤鼻神経上皮が神経再生のメカニズムを解析する上で理想的な系であることが分かった。ネスチン-GFPマウスにおけるGFP陽性細胞も、嗅球除去後の鋤鼻神経上皮で著明に増加していた。嗅球除去後の鋤鼻神経上皮においてGAP-43, beta-III tubulin, neuron specific enolase, NeuNなど神経細胞の分化マーカーの発現を検討し、新生鋤鼻神経の分化過程を解析したところ、ネスチン-GFPマウスにおけるGFPが増殖後から未分化な段階の間の新生神経細胞に発現していることが分かった。

以上、本年度では神経新生を最も効果的に解析するための対象部位、時期、GFPマウスの利用法についての知見が得られ、Notch, delta, BMPの発現を含めた神経新生分子メカニズムの解析、鋤鼻神経の培養系の確立、GFPによる未分化鋤鼻神経細胞のsortingを進めていくための基盤を作ることができた。嗅覚系神経上皮における神経細胞の増殖分化の様相を検討するため、成体マウスの片側の嗅球を外科的に除去して片側の神経上皮の神経増殖を促し、増殖細胞を核酸アナログであるBrdU投与によって標識し、時間を追って観察した。嗅覚系神経上皮には匂い分子を感知する嗅上皮と、フェロモン分子を感知する鋤鼻神経上皮があり、前年度の研究から嗅球除去によるBrdU陽性細胞の増加は鋤鼻神経上皮においてより著しいことが分かったため、本年度は鋤鼻神経上皮を対象にして解析を行った。無処置側ではBrdU陽性細胞は基底層にごく少数散在するのみであったが、処置側ではBrdU陽性細胞が基底層全体にわたって多数観察され、定常状態では増殖可能な細胞の多くは休止状態にあり、これが刺激を受けると活発な増殖を始めると推察された。このBrdU陽性細胞は、数日後には神経上皮のより表層に近い層に移動し、GAP-43,beta-III tubulinなどの神経分化マーカーを発現していた。鋤鼻神経上皮は深層と浅層の2層から成り、それぞれGo陽性、Gi陽性神経細胞が分布していることが知られている。BrdU標識実験から、細胞分裂後初期には新生神経細胞はGo陽性であり、その後Go陽性、Gi陽性細胞の2種に分化することが分かり、鋤鼻神経上皮の2種類の神経細胞は共通のGo陽性未分化神経細胞から分化することが示唆された。この分化過程をより詳細に解析するため、未分化神経細胞を可視化できるネスチン-GFPマウスに嗅球除去を行い、増加したGFP陽性細胞の単離回収を目指した。神経上皮を剥離し、トリプシン処理によって細胞を分離し、蛍光顕微鏡下でGFP陽性神経細胞を選択的に回収する方法を確立することができた。現在このGFP陽性細胞をin vitroで分化誘導する実験系を検討中であり、この培養系を用いて、より詳細な神経分化の分子機構を調べる予定である。
大規模数値計算による複数自由度の競合と協調が織りなす新奇物性の開拓

本年度は、昨年度までに得られた知見や経験を活かし、主に3つのトピックについて検討した。(1)複合自由度の存在する2次元理論模型の相転移の様相について、モンテカルロ・シミュレーションを用いて検討した。複数の競合する相互作用から構成される2次元ハイゼンベルク模型である。この理論模型の対称性はSO(3)×Z_2である。この理論模型について、Z_2対称性の破れを伴う2次相転移と、SO(3)対称性に関係する、Z_2渦の解離現象(トポロジカル相転移)が同時に発生することを見出した。更にこの2次相転移のユニヴァーサリティークラスが2次元イジング模型に属することを有限サイズスケーリングから明らかにした。この結果は、Z_2渦の解離現象が臨界現象に影響を及ぼさないことを示唆している。(2)複合自由度の存在する3次元理論模型の1次相転移の様相について、モンテカルロ・シミュレーションを用いて検討した。複数の競合する相互作用から構成される3次元ハイゼンベルク模型である。この理論模型の対称性はSO(3)×C_3である。この理論模型について、SO(3)×C_3対称性の破れを伴う1次相転移があることを見出した。積層相互作用を強くしていくと、相転移温度は上昇し、潜熱が減少することが分かった。この潜熱の振る舞いは、最も単純な平均場近似で得られる結果とは異なるものであり、複合自由度の協同効果で理解できるものと考えている。(3)最適化問題における計算手法の1つである量子アニーリングの開発に取り組んだ。量子アニーリングはシミュレーテッドアニーリングの温度(熱揺らぎ)を量子揺らぎに置き換えたものである。量子アニーリング法をクラスタ分析と呼ばれる、幅広い分野で適用可能な最適化問題に適用した。大規模量子モンテカルロ法を用いて、量子アニーリングを行ったところ、従来の方法であるシミュレーテッドアニーリンゲに比べ、効率よく解を得ることができることを確認した。本年度は、1年目及び、2年目に得た統計物理学的知見や大規模数値計算の経験を活かし、研究を推進することができた。特に複合自由度の存在する理論模型における相転移の考察を進め、2種類の新しいタイプの相転移を見出し、論文にまとめることができた。相転移点で破れる対称性と相転移の様相の関係について、これまで知られていない新しい結果を得ることができた。更に、数値計算手法に関する論文をまとめることができた。本研究課題は3年間に渡るものであり、1年目は主に磁性体の理論模型の構築に関する経験を得ることができた。2年目は主に、1年目に構築した理論模型の相転移の様相の探求、及び、平衡状態や基底状態を得るための数値計算アルゴリズムの開発に取り組んだ。3年目では、2年目に得られた結果を更に深め、論文にまとめた。残された課題として、実験的に操作可能な外場に対する応答性、特に、非平衡現象に対する研究がある。非平衡統計物理学は現在活発に研究されている分野の一つであり、磁性化学をキーワードに新しい展開をつくり上げることが期待される。また非平衡現象を正確に取り扱うための大規模数値計算手法の開発もまた、重要な課題としてあげられる。本年度は、統計物理学や計算物理学と磁性化学の分野を結びつけるための準備期間と位置づけ、以下の3点について研究を推進してきた。(1)当研究室で合成された分子磁性体の相転移の様相や酸化物の光学物性の検討を行った。分子磁性体は有機配位子と金属イオンの選択を巧みに行うことで、空間次元性を制御することができる。例えば、面内方向と面間方向の相互作用比が極端に異なる場合の物質をデザインすることも可能である。そうした系では通常の3次元系の相転移とは大きく異なる様相を示す。その解析を行うための大規模数値計算を準備している段階である。また、第一原理計算を用いた酸化チタンの光学物性の検討も行った。(2)相転移点で破れる対称性を変化させずに相転移の次数を変化させるモデルを考案し、そのモデルの相転移を解析した。スピンクロスオーバー現象を説明するためのモデル(WajnHasz-Pickモデル)と、離散的対称性を破る相転移を説明するためのモデル(Pottsモデル)を組み合わせた新しいモデル(透明状態のあるポッツモデル)を提案し、そのモデルを平均場近似や大規模数値計算(モンテカルロ法)により解析し、モデルパラメータと相転移の次数の関係、また、潜熱の関係を得ることに成功した。(3)イジングモデルにおける熱揺らぎと量子揺らぎの相違点について検討した。量子アニーリング法と呼ばれる、ハミルトニアンの基底状態を求める汎用アルゴリズムが提案されて10年以上経過し、更に有用なアルゴリズムとして用いられるためには、基礎物理学的観点からその特性を明らかにする必要がある。フラストレーションのあるイジングモデルにおける熱揺らぎと量子揺らぎの共通点と異なる点を、相転移・動的特性の観点から明らかにした。本年度は、昨年度までに得られた知見を活かし、かつ次年度に行う予定の研究の準備期間と位置づけ、以下に述べる3つのトピックについて検討した。(1)当研究室で合成された2種類の元素から成る錯体の磁気的相互作用を理論的に考察した。構成元素が異なると、磁性が大きく変わることが磁気測定結果より明らかとなっていた。1つはMnとNbから構成される系であり、もう1つはMnとMoから構成される系である。前者はフェリ磁性を示し、後者は非磁性である。

これらを統一的に理解するためにモデル計算を用いて考察を行ったところ、相互作用のオーダーが数倍程度異なる場合にこのようなことが起こることが明らかとなった。(2)2次元フラストレーション連続スピン系の相転移に関する研究を行った。2次元連続スピン系においては、Mermin-Wagnerの定理により、スピンの長距離秩序は禁止されているため、渦欠陥の解離によるトポロジカル相転移が重要である。特にフラストレーション系においてはZ_2渦転移と呼ばれる特殊な相転移の存在が示唆されている。我々は複数の競合する相互作用がある三角格子反強磁性モデルを検討し、離散対称性の破れを伴う2次相転移とZ_2渦解離が同時に起こる現象を見出した。(3)最適化問題における計算手法の1つである量子アニーリング法の実用的開発に取り組んだ。情報科学における重要な問題としてクラスタ分析があるが、ある場合には複雑ネットワーク上のイジング的相互作用で記述することを示し、量子揺らぎとして横磁場を印加することで量子アニーリング法を実装し、大規模数値計算を実行した。その結果、従来の方法に比べ、我々が検討した量子アニーリング法の方が効率よく解を得ることができることを見出した。本年度は、昨年度までに得られた知見や経験を活かし、主に3つのトピックについて検討した。(1)複合自由度の存在する2次元理論模型の相転移の様相について、モンテカルロ・シミュレーションを用いて検討した。複数の競合する相互作用から構成される2次元ハイゼンベルク模型である。この理論模型の対称性はSO(3)×Z_2である。この理論模型について、Z_2対称性の破れを伴う2次相転移と、SO(3)対称性に関係する、Z_2渦の解離現象(トポロジカル相転移)が同時に発生することを見出した。更にこの2次相転移のユニヴァーサリティークラスが2次元イジング模型に属することを有限サイズスケーリングから明らかにした。この結果は、Z_2渦の解離現象が臨界現象に影響を及ぼさないことを示唆している。(2)複合自由度の存在する3次元理論模型の1次相転移の様相について、モンテカルロ・シミュレーションを用いて検討した。複数の競合する相互作用から構成される3次元ハイゼンベルク模型である。この理論模型の対称性はSO(3)×C_3である。この理論模型について、SO(3)×C_3対称性の破れを伴う1次相転移があることを見出した。積層相互作用を強くしていくと、相転移温度は上昇し、潜熱が減少することが分かった。この潜熱の振る舞いは、最も単純な平均場近似で得られる結果とは異なるものであり、複合自由度の協同効果で理解できるものと考えている。(3)最適化問題における計算手法の1つである量子アニーリングの開発に取り組んだ。量子アニーリングはシミュレーテッドアニーリングの温度(熱揺らぎ)を量子揺らぎに置き換えたものである。量子アニーリング法をクラスタ分析と呼ばれる、幅広い分野で適用可能な最適化問題に適用した。大規模量子モンテカルロ法を用いて、量子アニーリングを行ったところ、従来の方法であるシミュレーテッドアニーリンゲに比べ、効率よく解を得ることができることを確認した。
むだ時間を含む連続時間系に対するディジタルロバストサーボ系の設計

本研究の成果を以下に示す。(1)最適ディジタルロバストサーボ系の設計理論1.混合状態空間表現に基づいて無駄時間系に対するディジタル最適制御系の設計法を提案した。評価指標としてはサンプル点間応答を考慮したH_2/H_∞ノルムを用い、等価な離散時間H_2/H_∞制御問題を導出した。さらに、最適解を求めるために必要となるリカッチ方程式を、無駄時間のないリカッチ方程式から求める計算アルゴリズムを導出した。2.上記結果を繰返し制御などサーボ系設計法へ拡張した。また、繰り返し制御のディジタルロバスト安定化条件について検討した。3.上記設計法に基づく最適設計法のパッケージを既に開発中のUNIXシステムの分散型CADシステム上に実現し、上記設計法の有効性を確認した。4.現在、上記結果に基づきサンプリング周期と無駄時間の大きさが制御性能に与える影響を定量的に検討している。(2)ステッパのディジタル繰返し制御への応用LSI製作において重要な位置を占めるステッパの制御に上記設計理論を適用し、その有効性を確認するため、ステッパのパイロット装置を用いた実験装置を準備した。また、システムと分散型CADシステムとを結合し、実験と一体化できる設計環境を整備した。今後、演算時間遅れを考慮した最適ディジタル繰返しコントローラ実験により、サンプリング周期と制御性能との関係を明らかにする予定である。
易熱性エンテロトキシンによるVZVマウス感染系の作製

病原性大腸菌由来の易熱性エンテロトキシン(LT;mutant 135)をアジュバントとし、BALB/cマウスにVZV河口株(1x10PFU^5/ml)を経鼻接種し、以下の成績を得た。1)第1実験として4週齢20例、16週齢20例を麻酔後、半数にLT+VZV、残り半数にLT+Aqを経鼻接種。うちLT+VZV接種16週齢1例は即死。2)感染2日後、LT+VZV接種4週齢5例、16週齢5例、LT+Aq接種4週齢5例、16週齢5例を眼球摘出後瀉血し屠殺、血液、肝、肺を採取。肉眼的に肝、肺に異常所見を認めず。3)感染7日後、残りのLT+VZV接種4週齢5例、16週齢4例、LT+Aq接種4週齢5例、16週齢5例を同様に屠殺、血液、肝、肺を採取。同様に肝、肺に肉眼的異常所見を認めず。LT+VZV接種4週齢1例より採取した肝、肺をMRC-5(32代)を用い培養したがVZVは分離されず。4)感染7日後、LT+VZV接種4週齢5例、LT+Aq接種4週齢5例より採取した末梢血単核球、肝、肺を用いPCR法によりVZVDNA検出を試みたが全例陰性。5)屠殺後採取した血漿中にVZV中和抗体はLT+VZV接種16週齢1例に検出。6)LT+Aq接種16週齢、4週齢は感染経過と共に体重増加を認めた。LT+VZV接種16週齢、4週齢は共に感染2日後に増加、7日後には接種前より減少、LT+Aq接種例と差を認めた。7)第2実験としてVZV単独を4週齢6例、LT単独を6例、LT+VZVを6例に接種、感染3日後に屠殺、肝、脾を採取。うちPCR法によりLT+VZV接種1例の脾よりVZVDNAが検出。8)VZV単独例、LT単独例は感染経過と共に体重増加を認めた。他方、LT+VZV例は感染3日後著明に減少、他2者より有意。以上よりLT+VZV例は感染37日後著明に体重減少し、一部の脾組織中にVZVDNAが検出された。これはVZV感染実験モデルがマウスにおいても作製可能であることを示唆する重要な知見と考えられる。
ビスマス系超伝導体の価数分析に関する研究

1ビスマス系酸化物高温超伝導体中のCu,Biの価数決定は従来滴定法によってなされて来たが1回の測定に必要な試料量は100mg以上となる。貴重な試料の消費を最少にする目的で従来のヨ-ドメトリ-及び過マンガン酸法に抽出吸光法を導入し,1mg程度の試料で価数決定する方法を開発することを目的とした。3 Bi(V)定量のための最適条件は3MHNO_3溶液中でMn^<2+>が0.001Mの時、迅速で、精度よく定量できた。全BiはBiI_4^ーをゼフィラミンとイオン対としてクロロホルムに抽出し、492nmで測定することにより、定量された。得られた結果より計算でBiの平均価数が求められた。Cuの平均価数は全Cu量をバソクプロインを用いて475nmで測定することにより求め,更にCu(II),(III)をKIにより生成するI_3^ーをゼフィラミンとイオン対としてクロロホルムに抽出し、364nmで測定し求める。その時Biも364nmに吸収を示すため,予め測定しておいたBi量から、その吸収量を予測し、補正することにより、Cu(II)、(III)の量を知る.得られた結果から、Cuの平均価数を計算で求める。本法をPbを含まないBi系超伝導体に適用した結果、従来の滴定法と良く一致した。本法による試料消費量は1回の測定で0.8mg程度あれば十分であり、従来の100mg程度に比べ十分消費量を減少させることができた。
MRI分子機能画像による子宮頸癌の治療効果の予測

本研究では、灌流画像およびBOLD画像の2種類の異なるMRI機能画像を子宮頸癌病変において作成した。放射線または放射線化学療法治療前および治療開始後の2回撮像を行った4例について解析した結果、Ktrans値は、治療開始後に3例で増加、1例で減少した。Ktransが上昇した3例ではいずれもBOLDでのT2star値が低下しており、逆にKtransが低下した1例では、T2star値が上昇していた。しかしこれら2指標間の負の相関の検討には更なる症例数が必要である。BOLD(blood oxygen-level dependent)画像、拡散強調画像、灌流画像を比較するための統一などの初期設定を行った。画像データベースより2cm以上の頸癌症例を抽出したところ、全12名のデータが得られた。年齢は56.1±19.2歳であった。うち一名は、頸癌治療抗癌剤治療前後の撮影データを得た。他11名の内訳は頸癌治療前7例、治療後1例、頸部腺癌治療前2例であった。頸癌抗癌剤治療前後データのある一例は47歳女性、子宮頸部扁平上皮癌症例で、抗癌剤治療前MRI検査において腫瘍の最大径は67mmであり、治療後には腫瘍の著明な縮小をみた。画像データとしてはBOLD画像、灌流画像が共にあり、市販の画像解析ソフトを用いて灌流画像に関して解析を行った。治療前後で同一スライスにて、腫瘍の輪郭をトレースし、全ピクセルにおける各種Perfusionパラメーター値を得たのち、それぞれのパラメーターにおいて平均値およびSDを得た。灌流画像のパラメーターとしては、Vp(毛細血管内の血漿の占める容積の割合), Ve(血管細胞外腔の占める容積の割合), Ktrans(造影剤の血漿から血管細胞外腔への移行の速度定数), Kep(造影剤の血管細胞外腔から血漿への移行の速度定数)とした。腫瘍領域のVp, Ve, Ktrans, Kepはそれぞれ抗癌剤治療前検査では632.2±23.4, 250.7±250.7, 795.9±699.7, 281.7±12310、治療後検査では27.1±51.5, 456.0±131.5, 1825.3±527.8, 3996±5.3であった。すなわち、Vpには著明な減少がみられ、Ve, Ktrans, Kepには著明な増加が確認された。1.現在子宮頸癌症例において、BOLD (blood oxygen-level dependent)画像、拡散強調画像、灌流画像についてのデータ蓄積を継続している。1.5Tおよび3Tの2種類のMRI撮像機器を併行して使用しており、そのいずれが本研究に適しているかの評価を行った。結果、BOLD画像では、1.5T機器と比べ3T機器では、ターゲットである頸癌病変近傍に直腸ガスが存在する場合、susceptibility artifact(磁化率アーチファクト)による信号低下が病変に生じることで、拡散強調像および灌流画像と比べ腫瘍ボリュームが十分に得られないことが判明した。一方、3T機器は1.5T機器と比べS/N比に優れており、特に灌流画像の画質が良好であった。2.評価方法として、MIStarという市販のソフトウエアを選定した。このソフトにおいては、3種類の画像において関心領域の保存、取り込みをする際に画像サイズが異なると位置情報を覚えていないため、Perfusionの形式に統一することとした。最終的には、ピクセル毎の比較ではなく、手書きでROIをとり、平均値で評価する。壊死がある場合には中心部の壊死領域と辺円の血流域をドーナツ型に分けて評価することとした。3.以上の1.2.項目より、子宮頸癌で放射線治療を行う患者を対象とし、3TのMRIにてPerfusion、DWI, BOLD画像による治療効果の予測を目的とした検討を最初に行うこととした。対象は、放射線治療前の子宮頸癌で、最大径2cm以上とした。MRI撮像時期は、(1)放射線治療開始前5週間以内、(2)放射線治療開始後4-5週目(day 22-35)、(3)放射線治療開始後8-9週目(day 50-63)の3回に設定した。尚、治療効果の評価は、半年、1年後にカルテチェックによりレトロスペクティブに行うこととした。BOLD(blood oxygen-level dependent)画像、拡散強調画像、灌流画像に関する検討のうち、子宮頸癌の放射線治療患者において対象を設定し、データ収集を行うこととした。また、これまで同様に、虚血の画像方法としてBOLD撮像法も同時に行うこととした。包含基準としては、放射線治療前の子宮頚癌で、最大径2cm以上とし、進行期を問わない。また、放射線治療中(CCRT)・放射線治療後の化学療法施行の有無は問わないとした。除外基準としては、放射線治療前に化学療法を行う場合や再発癌とした。