hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨格筋から発見された新規マイオカイン分子の機能解析

運動がもたらす多様な健康効果は、骨格筋から分泌されるマイオカインによってもたらされるという研究が進展している。しかし、これまでにマイオカインと報告されているものは、実際には「新規」ではない。それらは過去に骨格筋以外の臓器で分泌タンパク質として知られていたものが、骨格筋でも分泌されることが明らかになったものである。本研究では、次世代シーケンス法によるトランスクリプトーム解析から発見された新規マイオカイン(仮称#30020)が、骨格筋でペプチド・タンパク質に翻訳され、分泌され、生理的な役割を生じさせるかどうかを明らかにすることを目的としている。これまでの結果、ヒト骨格筋における発現をPCRにより確認したところ、予測される位置にバンドが見られた。また、ヒト骨格筋から#30020の全長cDNAをクローニングして、HAのタグをつけ、今後のツールに使用するための発現ベクターを構築した。2018年度はHAタグ付きの発現ベクターをマウス骨格筋または骨格筋細胞に過剰発現させ、そのタンパク質として発現するかについてHA抗体と特異的抗体の作製により検証した。抗体の作製は、#30020のC末側のペプチドをターゲットとした。その結果、HA抗体ではタンパク質の発現が確認できたが、#30020の特異的抗体では明確な検出ができなかった。現在はさらに手法を変え、継続して研究を行っている。また、HAタグ付きの発現ベクターを過剰発現させたマウス骨格筋組織内での局在も同時並行で検証中である。#30020の発現と分泌を証明したのちに、その生理的役割の解明につなげることで、#30020のマイオカインとしての性質を明らかにしていく。昨年度までに#30020を骨格筋からクローニングし、実験ツールとして使うため、タグが付加されていないベクター、または、HA-tagを付加した発現ベクターを作製した。これらのベクターをin vivoエレクトロポレーション法にてマウス下肢に強制発現させ、HA抗体を用いたウェスタンブロッティングすることで#30020が骨格筋で発現すること確認している。H30年度は、骨格筋に#30020が内因性に発現していることを確かめるため、、#30020分子のペプチド断片に対する抗体を作製して、ヒト骨格筋での発現を検証した。まず、作製した抗体が#30020を認識できるかの検証を行った。マウス片脚に#30020-HAtagベクターを、もう一方には空ベクターを強制発現させた骨格筋サンプルを用いて、作製した抗体と、HA抗体を用いて検証した。しかし作製した#30020抗体ではHA抗体で確認される位置にバンドを確認することができなかった。HA抗体にくらべて作製した細胞の力価が低い可能性が考えられたので、より効率的に#30020を発現させたサンプルを用いて再度検証することにした。そこで、これまでに作製していたベクターを細胞で薬剤選択が可能なベクターにサブクローニングし、C2C12細胞に強制発現させ薬剤選択し、発現した細胞のみを検証に用いることにした。しかし、C2C12への導入効率が悪く薬剤選択により死滅してしまい、検証に必要なサンプルを得ることができなかった。2019年度は、別の手法で引き続き検証予定である。これと並行して#30020の骨格筋における発現様式を免疫染色法を用いて検証した。さらに、分泌タンパク質であるかを#30020を強制発現させた細胞とヒト由来骨格筋細胞であるHu5KD3細胞を用いて行った。現在、明確なシグナルが得られておらず、引き続き検証していく予定である。H30年度に作製した抗体が#30020を検出できるかの検証を、サンプルを変えて検証する。HAタグ付きの#30020を過剰発現させたサンプルをHA抗体により免疫沈降し、そのサンプルを用いて作製した抗体でウェスタンブロッティング法にて検出を試みる。これらの方法を用いても検証が不可能であった場合は、作製した抗体が目的のものを十分に認識できないと判断し、手法を質量分析法に変えて、再度確認する。#30020を強制発現させたサンプルとヒト骨格筋サンプルを電気泳動により分離し、銀染色によりこれまでHA抗体で得られているバンドの位置にあるバンドを切り出して、質量分析法により#30020の存在を明らかにする。さらに、#30020の骨格筋での局在を明らかにするため、強制発現させた骨格筋から凍結横断切片を作製し、免疫染色法により#30020の細胞内での局在を明らかにする。#30020の抗体で認識が不可能であった場合は、HA抗体で検証する。また、#30020が分泌されるタンパク質であるか否かは、ヒト骨格筋細胞であるHu5KD3細胞を用いて、電気刺激による収縮の有無の状況下で培養上清を回収し、濃縮してウェスタンブロッティングにて分泌の検証を行う。もし、抗体が目的のものを認識できない抗体であった場合はHAタグ付きの#30020を骨格筋細胞に強制発現させた細胞の培養上清を上記と同様の方法で回収・濃縮し、HA抗体でwesternブロッティング法により検証する。Hu5KD3細胞は株化された細胞であるため、上記方法で明確な結果が得られないときは、Lonzaからヒト初代培養細胞を購入して、検証を行う。

それらは過去に骨格筋以外の臓器で分泌タンパク質として知られていたものが、骨格筋でも分泌されることが明らかになったものである。本研究では、次世代シーケンス法によるトランスクリプトーム解析から発見された新規マイオカイン(仮称#30020)が、骨格筋でペプチド・タンパク質に翻訳され、分泌され、生理的な役割を生じさせるかどうかを明らかにすることを目的としている。H29年度はヒト骨格筋から#30020のクローニングを行った。次世代シークエンス解析から得られた#30020の遺伝子配列を元にクローニングを実施し、予想通り5.7kの遺伝子がクローニングできた。これを今後の実験ツールとして使うため、タグが付加されていない発現ベクター、または、N末、C末にHA-tagを付加した発現ベクターを作製した。HA-tagを付加した発現ベクターをマウスの下肢にエレクトロポレーション法により一過性に発現させ、タンパク質として発現しているかをHA抗体をもちいて検証したところ、#30020はタンパク質として発現することが明らかとなった。今後は、#30020そのものの抗体で発現を確かめる必要があるために、30020分子のペプチド断片(C末をターゲットとする)に対する抗体を作製してさらに検証をすすめる予定である。これを今後の実験ツールとして使うため、タグが付加されていないベクター、または、N末、C末にHA-tagを付加した発現ベクターを作製した。マウス下肢の一方にTagつきのベクターを、もう片脚にはemptyベクターをエレクトポレーション法で導入し、強制発現させた。2週間後に骨格筋を摘出し、#30020がタンパク質として発現しているかを、HA抗体を用いて検証した。その結果、N末、C末のtagの位置に関わらず、タグ付き#30020を過剰発現させたマウスの骨格筋ではタンパク質として発現していることが明らかとなった。以上の本年度の結果から、当初の予定通り目的遺伝子のクローニングを終えたことから、おおむね順調に進展していると考える。運動がもたらす多様な健康効果は、骨格筋から分泌されるマイオカインによってもたらされるという研究が進展している。しかし、これまでにマイオカインと報告されているものは、実際には「新規」ではない。これまでの結果、ヒト骨格筋における発現をPCRにより確認したところ、予測される位置にバンドが見られた。また、ヒト骨格筋から#30020の全長cDNAをクローニングして、HAのタグをつけ、今後のツールに使用するための発現ベクターを構築した。2018年度はHAタグ付きの発現ベクターをマウス骨格筋または骨格筋細胞に過剰発現させ、そのタンパク質として発現するかについてHA抗体と特異的抗体の作製により検証した。
血管新生と血管内皮細胞分化に対するRIGFの作用

ニワトリ胚から単離された、VEGFファミリーの一つであるRIGF(Retinoicacid-Induced Growth Factor)の胚発生過程における機能を解析した。RIGFは、申請者らがニワトリ胚から単離した、VEGFファミリーに属する細胞増殖因子である。名前が表すとおり、レチノイン酸によってニワトリ胚に過剰に誘導される遺伝子として単離した。マウスのVEGF-dと最も高い相同性を持つことから、両者がそれぞれの種の相同分子である可能性もある。まずin situ hybridization法によりRIGFの発現部位の詳細を検討した。さらに、マウスのFIGFの発現パターンを解析比較し、両者の発現状態の違いを明確にし、上述のRIGFとFIGFが相同分子である可能性を否定する結果を得た。またRIGFとレチノイン酸およびshhとの関係について、in vivoにおける局所投与実験系を用いてRIGFがレチノイン酸あるいはshhのいずれによっても誘導されることを見出し、RIGFがこれらの因子の下流に存在する機能分子である可能性を示した。さらにRCASレトロウイルスによるRIGFの強制発現系を確立し、RIGFの過剰発現による胚発生への影響を調べた。その結果、RIGFの過剰発現は著しい水腫及び皮下出血を引き起こすことがわかった。このことはRIGFがニワトリ胚発生において血管形成および浸透圧調整に機能している可能性を示唆している。また、四肢を栄養する血管網のパターン形成を理解する基盤作りとして、手足の形成における様々な分泌因子の寄与とくにFGFファミリーの機能を解析(Akiba et al.,2001)し、また手と足の原基を移植する実験系を構築(Saito et al.,2002)し、どのようにして血管が四肢に進入し手足の中に血管網が形成されていくかを調べる基礎を作った。
積層型芳香族アミンの電荷輸送特性の解明とデバイスへの応用

前年度に引き続き、特異な立体構造を有する新規含窒素共役系分子の開発をおこなった。1)前年度に開発したN-ヘテロアセンのタンデム酸化カップリングによるダブルヘリセン合成法を、代表的なドナー性有機分子であるフェノチアジンおよびそのセレン類縁体であるフェノセレナジンへと適用した。その結果、いずれの場合も十字型二量体を経てダブルヘリセン骨格の構築に成功した。単結晶構造解析の結果、フェノセレナジンからなるダブルヘリセンはフェノチアジンからなるものよりもらせんのねじれ角が大きいことが明らかになった。また、いずれのダブルヘリセンも高い電子ドナー性を示し、電子スピン共鳴および吸収スペクトル測定から一電子酸化によって発生させたラジカルカチオンにおいて正電荷が分子内を高速で移動していることが明らかになった。2)アザアセンの位置選択的酸化的カップリング反応によって、#型構造を有する6,13-ジアザペンタセン四量体の合成に成功した。ジベンゾフェノキサジンからなる#型四量体が非発光性であったのに対し、ジアザペンタセン四量体は高い蛍光発光を示した。そのため、本分子は円偏光発光材料への応用が期待できる。本合成手法は一般的なN-ヘテロアセンへ適用可能であることから、新規円偏光発光材料の汎用的構築法としての可能性を有しており、今後さらなる展開をおこなっていく。3) 2つのジアザペンタセンが積層した構造をもつクリップ状分子について、中性およびラジカルカチオン状態における電荷輸送特性を時間分解マイクロ波伝導度(TRMC)法によって測定した。その結果、ラジカルカチオン体において中性状態の20倍以上の過渡伝導度信号が観測された。この結果は、クリップ状分子のモノカチオン状態が、有機導体として理想的なであるハーフフィリング電子状態をとっていることを示唆しており、今後の有機導体開発の指針となる結果である。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、新規積層型共役系分子の開発を目指し、ペンタセンの6,13位が窒素原子で置換されたジアザペンタセンを鍵骨格とした分子群の合成を行なった。芳香族求核置換反応によって、2つのジアザペンタセンがオルトフェニレンを介して層状にスタックした構造を有する分子1の合成を試みた。その結果、目的化合物1が得られるとともに、ジアザペンタセンが二量化した分子2が生成した。X線単結晶解析によりこれらの構造決定に成功し、二量体2はジアザペンタセンの5位の炭素と6位の窒素が連結した十字型構造を有することが明らかになった。また、分子2はアセン骨格が直接十字型に連結した特異な構造を有しており、この分子を平面状誤役分子を介して連結することで、3つの平面状洪役系が積層した構造が構築できると考え、2つの分子2をビフェ1ニルをリンカーとして連結した分子3の合成を試みた。分子2と4,4'-ジブロモビフェニルに対してPd触媒を用いたクロスカップリング反応を行うことで、目的の分子3の合成に成功した。また分子3の単結晶構造解析にも成功し、予想どおり3つのzπ役系が積層した構造を有していることが明らかになった。ジアザペンタセン平面とビフェニル間の面間距離はおよそ3.3-3.4Åと近接しており、空間を介した電子的な相互作用が期待できる。実際に、分子3の蛍光測定から、励起状態1においてジアザペンタセンとビフェニルの間でエキサイプレックスを形成していることが強く示唆された。今年度の研究から、十字型分子2は坪面が多層化した三次元π役系を極めて簡便に構築できるビルディングブロックであることが明らかになった。前年度に引き続き、三次元的な伝導経路を有する含窒素新規半導体分子の開発を目指した研究をおこなった。今年度は、ヘテロペンタセンが直交する形で二量化した十字型ヘテロアセン二量体が、これまでに例のない三次元構造を有するπ電子系構築に極めて有望であることを実証した。具体的には、十字型二量体について、異なる三種類の手法によって分子拡張をおこない、3つの異なる立体構造を有する三次元π電子系分子の構築に成功した。すでに前年度において、パラジウム触媒を用いたクロスカップリング反応による三層積層分子の合成に成功している。今年度は分子間および分子内による酸化的カップリングによる拡張を試みた。十字型二量体をDDQで酸化したところ、二量体がさらに二量化した分子の生成が確認された。X線単結晶解析によりこの分子は、二量体同士が炭素-炭素結合によって連結された"#"字型構造をもったヘテロアセン四量体であることが明らかになった。この分子は分子内に直交する2つのπスタックペアをもっていることから、バルク中で等方的な電荷輸送経路を有する可能性があり、有機半導体材料として興味深い分子系である。また、十字型二量体をDDQとSc(OTf)3を用いて酸化することで、2つのらせんを有するダブルヘリセンを簡便に合成することができた。このダブルヘリセンは、分子内に同じ向きのらせん(右右および左左)をもっており、光学活性であることがわかった。この分子は圧力によって移動度が変調する半導体材料となる可能性があり、非常に興味深い。このダブルヘリセンは酸化体が極めて安定であり、ラジカルカチオンを結晶として単離することにも成功した。カチオン状態の吸収

スペクトルおよび電子スピン共鳴測定から、ダブルヘリセン内において正電荷が分子全体に非局在化していることが明らかになり、この分子のホール輸送材料としての高いポテンシャルが示唆された。前年度に引き続き、特異な立体構造を有する新規含窒素共役系分子の開発をおこなった。1)前年度に開発したN-ヘテロアセンのタンデム酸化カップリングによるダブルヘリセン合成法を、代表的なドナー性有機分子であるフェノチアジンおよびそのセレン類縁体であるフェノセレナジンへと適用した。その結果、いずれの場合も十字型二量体を経てダブルヘリセン骨格の構築に成功した。単結晶構造解析の結果、フェノセレナジンからなるダブルヘリセンはフェノチアジンからなるものよりもらせんのねじれ角が大きいことが明らかになった。また、いずれのダブルヘリセンも高い電子ドナー性を示し、電子スピン共鳴および吸収スペクトル測定から一電子酸化によって発生させたラジカルカチオンにおいて正電荷が分子内を高速で移動していることが明らかになった。2)アザアセンの位置選択的酸化的カップリング反応によって、#型構造を有する6,13-ジアザペンタセン四量体の合成に成功した。ジベンゾフェノキサジンからなる#型四量体が非発光性であったのに対し、ジアザペンタセン四量体は高い蛍光発光を示した。そのため、本分子は円偏光発光材料への応用が期待できる。本合成手法は一般的なN-ヘテロアセンへ適用可能であることから、新規円偏光発光材料の汎用的構築法としての可能性を有しており、今後さらなる展開をおこなっていく。3) 2つのジアザペンタセンが積層した構造をもつクリップ状分子について、中性およびラジカルカチオン状態における電荷輸送特性を時間分解マイクロ波伝導度(TRMC)法によって測定した。その結果、ラジカルカチオン体において中性状態の20倍以上の過渡伝導度信号が観測された。この結果は、クリップ状分子のモノカチオン状態が、有機導体として理想的なであるハーフフィリング電子状態をとっていることを示唆しており、今後の有機導体開発の指針となる結果である。前年度に開発した十字型アザアセン二量体が、積層π電子系分子の構築に有効であるのみならず、これまで開発が難しかった2つのらせん状構造を有したダブルヘリセン合成の簡便な前駆体であることを明らかにすることができた。本結果は化学系最高峰誌であるAngewandte Chemie International Editionに掲載され、査読者から高評価を得たことからバックカバーを飾るに至っている。このダブルヘリセンは積層π電子系分子同様、圧力印加によって電荷移動度が変調可能な有機半導体分子となる可能性があり、非常に興味深い。以上より、今年度の研究は当初の予定を上回る成果を上げたと考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに合成に成功してき特異な三次元構造を有する含窒素π共役系分子について、時間分解マイクロ波伝導度(TRMC)法などの測定によって伝導性のスクリーニングをおこない、材料としての応用を目指す。これまでに合成してきた積層型芳香族アミン群に対して、TRMC法による電荷移動度特性評価をひと通り行なうことができた。現在は得られたデータを元に構造-物性相関について考察をおこなっている。また、新規積層型分子として、レイヤーにアザアセンを用いた分子群の合成に成功した。
植物プランクトン葉緑体関連遺伝子による溺死の証明

溺死体を証明する為の壊機法にかわる簡便な検査法の確立を目的として、ヒトには存在しない植物プランクトン葉緑体関連遺伝子に着目し、PCR法による植物プランクトンの検出を試みた。ヒト組織へのプランクトン含有サンプル添加検討により良好な結果を得た4組のプライマーを選択した。1.死後の動物水没実験を行い、水圧によりプランクトンが侵入・到達する部位を検討した。その結果、全ての心臓血で増幅産物は観察されなかった。肺では増幅が見られたが、水深やプライマーによる差異は認めらなかった。従って、死後の水没によって、肺までプランクトンが侵入することが確認された。2.溺死体の多くは死後経過時間の長いことから、麻酔下にウサギを溺死させた直後、及び冷蔵庫内に1月、2月、3月放置後に心血、臓器を摘出し、PCR法と壊機試験でプランクトンの検出の比較を行った。その結果、死後変化により心血、臓器からの植物プランクトン検出に差異が見られた。植物プランクトン葉緑体DNAは保持される環境、時間により何らかの変化がおきると考えられた。3.溺死事例組織及び現場採取対照水について、壊機試験とPCR法によるプランクトンの検出の比較を行った。壊機試験で肺からプランクトン検出された事例1では、PCR法では、EG1で肺、EG2で肺,肝及び腎、SK2で腎からプランクトンDNAが検出された。事例2では、G1で肺,肝及び腎、EG2で腎から検出された。事例3では壊機試験で肺及び肝からプランクトンが検出され、PCR法でもEG1で肺、肝及び腎が陽性であった。壊機試験で肺、肝及び腎からプランクトンが検出された事例4及び事例5では、PCR法でもEG1で肺、肝及び腎からプランクトンDNAが検出された。壊機試験でプランクトンが検出された組織では肝1例を除きすべての組織でPCR陽性であった。さらに壊機試験で陰性であった組織からもPCRによりプランクトンDNAが検出され、PCR法は有用と思われた。1.溺死を証明するための壊機法にかわる簡便な検査法の確立を目的として、ヒトには存在しない植物プランクトン葉緑体関連遺伝子に着目し、6組のプライマーを作成してPCR法による植物プランクトンの検出を試みた。その結果、ヒト組織だけではプランクトンDNAは増幅されず、植物プランクトン含有サンプル添加試料で増幅を確認した。2.次に、死後の動物水没実験を行い、水圧によりプランクトンが侵入・到達する部位を検討した。1)宮城県女川湾の水深0m、10m、30mの地点から海水を採取し、植物プランクトンの同定・計数をした。その結果、植物プランクトンの種類及び数が、水深30m、10m、0mの順に多く、珪藻綱以外の植物プランクトンも検出された。この採取海水1ml、3ml、5ml、10mlからDNA抽出し、4組のプライマーによる増幅を行った。その結果、4組のプライマーにより水深・量に関係なく全ての海水で増幅され、しかもプランクトン含有数に比例するように増幅が確認されるなど、プライマーによる増幅の違いが確認された。

2)安楽死させたウサギを開口して硬直させ、仰向けの状態で水深0m、15m、30mに各2羽を6.5時間沈めた後引き上げて、肺・心臓血・胃内容を採取した。肺及び心血はホモジネートし、Percollにより分離された沈殿物からDNAを抽出してPCRを行った。その結果、全ての心臓血で増幅産物は観察されなかった。肺では増幅が見られたが、水深やプライマーによる差異は認めらなかった。従って、死後の水没によって、肺までプランクトンが侵入することが確認された。尚、ウサギ肺のホモジネートで目的とする増幅産物以外のバンドが観察されたので、今後DNA抽出法、PCR条件等の検討が必要である。溺死体を証明する為の壊機法にかわる簡便な検査法の確立を目的として、ヒトには存在しない植物プランクトン葉緑体関連遺伝子に着目し、PCR法による植物プランクトンの検出を試みた。ヒト組織へプランクトン含有サンプル水を添加した検討により良好な結果を得た4組のプライマーを選択した。また、死後の動物水没実験を行い、プランクトンが侵入到達する部位を確認した。これらの検討結果を踏まえ、1.溺死体の多くは死後経過時間の長いことがことから、麻酔下にウサギを溺死させた直後、及び冷蔵庫内に1月、2月、3月放置後に心血、臓器を摘出し、PCR法と壊機試験でプランクトンの検出の比較を行った。壊機試験では1月放置の肺、肝、腎でプランクトンが検出できたが、2月及び3月放置後では検出されなかった。PCR法では溺死直後の心血、肺、肝、腎から増幅が確認でき、1月及び2月放置の肺、肝、腎から増幅が見られたが、心血からの増幅は見られなかった。3月放置では心血、肺、肝で増幅が見られた。以上、死後変化により心血、臓器からの植物プランクトン検出に差異が見られた。植物プランクトン葉緑体DNAは保持される環境、時間により何らかの変化がおきると考えられた。2.溺死事例組織及び現場採取対照水について、壊機試験とPCR法によるプランクトン検出の比較を行った。壊機試験で肺からプランクトン検出された事例1ではPCR法では、EG1で肺、EG2で肺,肝及び腎、SK2で腎からプランクトンDNAが検出された。事例2では、EG1で肺,肝及び腎、EG2で腎から検出された。事例3では壊機試験で肺及び肝からプランクトンが検出され、PCR法でもEG1で肺、肝及び腎が陽性であった。壊機試験で肺、肝及び腎からプランクトンが検出された事例4及び事例5では、PCR法でもEG1で肺、肝及び腎からプランクトンDNAが検出された。壊機試験でプランクトンが検出された組織では肝1例を除きすべての組織でPCR法は陽性であった。さらに壊機試験が陰性であった組織からもPCR法によりプランクトンDNAが検出され、PCR法は有用と思われた。今後、水域特異性の高いプライマーの検討が必要である。
髄鞘の形成と維持におけるCNP遺伝子の役割

2'、3'-環状ヌクレオチド3'-フォスフォジエステラ-ゼ(CNP)は中枢神経系のオリゴデンドログリア特異酵素として知られる。本年はマウスCNPのcDNA及び遺伝子DNAをクロ-ニングし、CNP遺伝子の構造を明らかにした。マウス脳cDNAライブラリ-から2374bpのマウスCNPcDNAを得た。cDNAから推定されるマウスCNPタンパクのアミノ酸残基数は400で、アミノ酸配列はウシとは83%ヒトとは85%のホモロジ-を示した。cDNAはHindIIIで3つに切断し、マウスCNP遺伝子を解析するためのプロ-ブとして用いた。マウス遺伝子ライブラリ-から9個の独立クロ-ンが得られ、そのうち少なくとも7個が同一遺伝子に由来すると考えられた。7個のうち3つのcDNAプロ-ブのいずれとも反応する2個のクロ-ン(クロ-ン071及び201)を選びさらに解析を進めた。その結果、マウスCNP遺伝子の全長は約6kbpで、2つのイントロンにより3つのエクソンに分断されていることが判明した。翻訳開始点から約430bp上流にTATAボックスのコンセンサス配列(TATATAA)が見出され、プライマ-伸長法及びSIヌクレア-ゼ法で転写開始点はTATATAAから27bp下流のヌクレオチド-398であると結論された。サザンハイブリダイゼイションのバンドはすべてクロ-ンの071と201の断片に対応していて、マウスCNP遺伝子はハプロイドあたり1個と結論された。以上のようにCNP遺伝子の構造が明らかになった。本研究はCNP遺伝子の発現調節機構の解明に道を開くとともに、CNP遺伝子を用いて神経系における細胞特異的な遺伝子発現の研究に役立つものと期待される2'、3'-環状ヌクレオチド3'-フォスフォジエステラ-ゼ(CNP)は中枢神経系のオリゴデンドログリア特異酵素として知られる。本研究はCNP遺伝子の発現調節機構の解明に道を開くとともに、CNP遺伝子を用いて神経系における細胞特異的な遺伝子発現の研究に役立つものと期待される
民族的マイノリティの社会統合を目的とする政策の運営に関する研究

本年度は2年計画の第二年度として、本研究のポイントである以下の3点について、とくに第一点と第三点を中心に調査した。1.「政策の基本方針と政策運営の制度的枠組み」について中央レベルの政策に関する前年度の調査を受け、地方レベルの政策に関するインタビューを行った。(1)地方レベルの施策では、特定の分野(職業訓練や教育など)を対象に全国で実施されるテーマ型の施策より、特定地区のあらゆる問題を対象とするエリア型の施策への期待が高いことが明らかになった。(2)政策運営の枠組みとしては、民間ではなく地方自治体が主導するプログラムの重要性が見直されており、そこへの中央政府や民間非営利団体の関与(オランダでは、労働組合も)が重視されるようになっていることが明らかになった。(3)イギリスでは、対象を民族的マイノリティに限定していた施策が国民全体を対象とする社会統合策に吸収されていく傾向が顕著であり、この背景に、オランダと比較し、民族グループ毎の組織化が少なく、プロジェクトへの関与が制度化されにくい点があると予想されるに至った。2.「歴史的規定要因」についてイギリス公文書館で1960年代後半の政策形成に関する資料調査を行い、民族的マイノリティの社会統合は、イギリス政府内で当時すでに、住民への社会サービスの問題ではなく、都市の物理的再開発に関する問題と位置づけられる傾向が強かったことが明らかになった。3.「超国家レベルの制度的影響」について民族的マイノリティの統合に関するEUの政策は主に差別禁止法令の制定という形をとっており、この点で統合の3側面(良好な民族関係の構築、文化的独自性の尊重、社会経済環境の改善)のなかで第一の側面にほぼ限定されている。この背景には、各国に共通する社会統合理念を形成することの困難さや財政的な制約という問題のあることが明らかになった。本年度は2年計画の初年度として、基礎資料の分析ならびにイギリス・オランダ両国の公的機関、EU・欧州審議会さらに各種の非営利団体から情報収集(文献・インタビュー)を行い、とくに(1)両国における政策の基本方針と政策運営の制度的枠組み、(2)歴史的規定要因、(3)超国家レベルの制度的影響について分析を進めた。第一の点については、当分野における政策をその目標から概ね3つに区分することが可能であること、またイギリス・オランダは従来、それぞれ異なる目標に従い政策を展開させてきたが、90年代に入り新たに第三の目標が共通して注目されるようになり、両国の政策に類似性が多くなっていることが明らかになった。また国内における政策運営の制度的枠組みや政策主体間関係にも、政策目標に関する以上の重点の推移に伴い変化が生じていることが明らかとなった。第二点については、とくにイギリスにおいて政策の導入期となった60年代半ばから後半にかけての政府内部文書の検討を進めており、人種・民族・国籍差別への対応、中央政府の補助金による関係自治体への援助、都市街区再開発といった側面が、議論としては独立しながらも、移民に対する入国管理という入り口での規制を含め、互いに密接に関係し影響を及ぼしあいながら政策としての形態を整えていったことが明らかになりつつある。第三点については、当分野における各国の政策にみられる収斂と、欧州審議会・EUを通じた国際的政策協調の間には相互関係が推定され、またこれらはともに西欧地域における全体的な政治経済的制約のもと生じていることが明らかになりつつある。
セラピスト・カウンセラーのバーンアウトを予防するセルフケアプログラムの開発

平成17年度は、「カウンセラーのバーンアウト兆候チェックリスト」質問紙の開発を行い、信頼性と妥当性を確認した。信頼性は再テスト法を行い、x2乗検定の結果、一致率の低い項目を削除した。妥当性については、「カウンセラーのバーンアウト兆候チェックリスト」総得点とGHQ30の総得点との関連を調べ、ピアソンの相関係数を算出したところ、r=-.571(p<.01)であり、精神的症状をあらわすGHQ総得点とは有意傾向のある負の相関が得られた。平成18年度は、平成17年度の研究を元に作成された「カウンセラーのバーンアウト兆候チェックリスト」を全国の大学に勤務する学生相談担当者に調査協力を仰ぎ、郵送法にて実施した。回収数は165部で回収率は67.3%であった。チェックリストの構造を確かめるために、項目の因子分析(主成分分析、バリマックス回転)を行った結果、6因子解を得た。それぞれの因子について、第1因子「疲労感」第2因子「感覚鈍麻」第3因子「援助能力への疑い」第4因子「孤立感」第5因子「充実感・満足感の喪失」第6因子「逃避感」と命名した。これらの調査結果は、現在論文にまとめている段階であり、平成18年度中には学会誌への投稿を予定している。また、平成17年度に行った調査と合わせて、カウンセラーのバーンアウト予防に関する情報を提供するために、「カウンセラーの健康支援-セラピスト・カウンセラーのバーンアウト(燃え尽き症候群)の予防のページ」というタイトルのWebサイトを開設した。本HPでは、カウンセラー・セラピストのバーンアウト予防に関するコンテンツとして「バーンアウトとは」「バーンアウトに関する主な研究」「バーンアウト予防戦略」「バーンアウトセルフチェック」「調査研究の成果より」「研究者プロフィール」などを柱とした、啓発情報、予防情報を提供した。平成18年度は、文献を収集し、カウンセラー・セラピストバーンアウトの徴候をチェックするチェックリストスケールを作成し、信頼性と妥当性を検討する計画である。まず、セラピスト・カウンセラーのバーンアウトに関するアメリカの文献と日本の文献を検索し、網羅的に記述できるように、幅広い資料や書籍を入手し、ファイリングを行った。この資料はのちにweb上に紹介し、カウンセラーが広く利用できるデータベースとして機能させる予定である。「カウンセラーのバーンアウトチェックリスト」による調査については、これまでのバーンアウトに関する文献や他の領域のバーンアウト尺度などを参考に、70項目前後を収集し、プロトタイプの尺度を作成した。対象は、安定して質問紙調査に協力してもらえるため大学でカウンセラートレーニングを受けている大学院生・研究生に依頼した。第1回目の調査から1週間おいて、第2回目の調査を実施する再テスト法をおこない、信頼性を確認している。また、カウンセラーに当てはまるように記述を若干改変したソーシャルワーカーのバーンアウト尺度と精神的健康度を測定するGHQ30をもって、妥当性を確認している。現在、研究協力者に研究の趣旨を説明し、研究同意書にサインをもらい、質問紙を実施して、現在回収している最中である。回収後すぐに、(1)κ値を算出し、各項目ごと一致度を検討し、一致度の低い項目を削除する(2)因子分析を試みる(3)バーンアウト徴候スケールの得点とGHQ30の得点とのピアスンの相関を算出し、妥当性を検討する。これらの結果を元に、カウンセラーのバーンアウト徴候をチェックする「カウンセラーのバーンアウトチェックリスト」をリバイスして、web上で機能するようにプログラムを作成する手順を踏む予定である。
前立腺全摘術後の性機能・尿失禁リハビリテーション

前立腺全摘術後の性機能障害と尿失禁に対してPDE5阻害剤が有効であるかを検討した。術後に悪化した性機能と尿禁制は経時的に回復するが、PDE5阻害剤内服群は非内服群に比べて性機能と尿禁制の回復が良好であり、術後早期から内服するほうが良いことが示唆された。しかしながら、術直後からの内服では一過性の尿失禁悪化を認めた。基礎実験で、PDE5阻害剤は従来報告されている組織保護作用とは別に尿道括約筋を弛緩する作用を持ち、尿失禁を防ぐ反射機構が減弱することが解った。PDE5阻害剤は性機能・尿禁制の回復に貢献し、早期内服が勧められるが、術直後からの内服で一過性に尿失禁悪化が起こることが判明した。2002年から昨年までにわれわれが行った365例の前立腺全摘時症例から両側神経温存が術中に電気刺激で確認された141症例を対象として、自己記入式アンケート調査(Expanded Prostate Cancer Index Compositeを使用)を術前、術後1,3,6,12,18,24,36,48ヶ月に行い、性機能スコアおよび排尿機能スコアの集計をしたところ、PDE5阻害剤は術後の性機能障害回復に効果があるだけでなく、尿禁制回復においても効果があることがわかり、さらに、中央値である術後3ヶ月を境にそれ以前にPDE5阻害剤内開始した早期群と3ヶ月以降に内服を開始した晩期群を比較したところ、早期群は晩期群よりも性機能・排尿機能の回復が良い傾向にあることが判明した。これらのデータをもとに、さらなる効果を期待して術直後から内服を開始するプロトコールを開始しして、術直後からPDE5阻害剤を内服した群における性機能および排尿機能を解析したところ、排尿機能に関しては、術後一過性ではあるが、有意に尿失禁が悪くなることがわかった。一方で、ラットを用いてPDE5阻害剤の尿道機能に対する効果の実験を行った。くしゃみ誘発ラット尿失禁モデルを用いて、通常の尿道内圧を示す尿道基線圧とくしゃみなどの急激な腹圧上昇時に反射的に失禁を予防する尿禁制反射の振幅を評価した。尿道基線圧にはPDE5阻害剤投与による変化は観察されなかったが、くしゃみ時に誘発された尿禁制反射に対してPDE5阻害剤は抑制効果をもつ(尿失禁が起こりやすくなる作用を持つ)ことが判明した。前立腺全摘時症例から両側神経温存手技141症例を対象として、自己記入式アンケート調査を術前、術後1,3,6,12,18,24,36ヶ月に行い、性機能スコアおよび排尿機能スコアの集計をした。PDE5阻害剤内服群と非内服群の比較ではPDE5阻害剤は術後の性機能障害回復に効果があるだけでなく、尿禁制回復においても効果があることがわかった。中央値である術後3ヶ月より以前にPDE5阻害剤内開始した早期群と3ヶ月以降に内服の晩期群を比較したところ、早期群は晩期群よりも性機能・排尿機能の回復が良い傾向にあることが判明した。これらのデータをもとに、さらなる効果を期待して術直後から内服を開始するプロトコールを開始し、術直後からPDE5阻害剤を内服した群における性機能および排尿機能を解析したところ、性機能スコアのさらなる改善は認められず、また、排尿機能に関しては、逆に一過性の尿失禁悪化を認めた。ラットを用いてPDE5阻害剤の尿道機能に対する効果を調べた。くしゃみ誘発ラット尿失禁モデルを用いて、主に平滑筋性尿道括約筋の作用による通常の尿道内圧を示す尿道基線圧と、主に横紋筋性括約筋によるくしゃみ時の急激な腹圧上昇時におきる尿禁制反射の振幅を評価した。尿道基線圧にはPDE5阻害剤投与による変化は観察されなかったが、くしゃみ時に誘発された尿禁制反射に対してPDE5阻害剤は濃度依存性に反射振幅の抑制効果をもつ(PDE5阻害剤によって尿道括約筋の反射が減弱し尿失禁が起こりやすい状態になる)ことが判明した。以上の基礎実験の結果は、PDE5阻害剤は組織保護作用および線維化防止などにより長期的に術後の性機能・尿禁制機能を保持する作用を持つが、尿禁制反射を弱める作用も併せ持ち、これにより、臨床データでみられた術直後の尿道機能が不安定な時期には一過性の尿失禁悪化を認めると考えられた。2002年から昨年までにわれわれが行った365例の前立腺全摘時症例から両側神経温存が術中に電気刺激で確認された141症例を対象とした自己記入式

アンケート調査EPIC(術前、術後1,3,6,12,18,24,36,48ヶ月)から、性機能および排尿機能スコアの集計を行った。PDE5阻害剤は術後の性機能障害回復および尿禁制回復の両方に効果があり、加えて、術後3カ月以内にPDE5阻害剤内服を開始した早期群が、3か月以降にPDE5阻害剤を開始した群に比べて性機能・排尿機能の回復が良い傾向にあることが判明した。以上の結果から、PDE5阻害剤を用いたリハビリテーションは性機能回復や尿禁制回復に有効であり、3か月以降よりはそれ以前の内服スタートが望ましいと考えている。これまでの基礎実験の報告でPDE5阻害剤は血管平滑筋の弛緩による血流増加で組織保護作用を持ち、陰茎海綿体においては線維化を予防することがわかっている。これら陰茎海綿体に対するPDE5阻害剤の長期作用はわかっているが、尿道に対する直接作用の報告はない。最終的には組織保護にはたらくとは予想されるが、一方で、PDE5阻害剤の持つ平滑筋弛緩作用は尿道ではどの程度なのか?との疑問があり、ラットを用いてPDE5阻害剤の尿道機能に対する効果の予備実験を行った。予備実験の結果では、尿道平滑筋にPDE5阻害剤投与による変化は観察されなかった。しかし、非常に興味深い所見として、PDE5阻害剤はくしゃみなどの急激な腹圧上昇時に働く尿禁制反射を抑制している(尿失禁が起こりやすくなる作用も併せ持つ)ことが判明した。【学会発表】2011.9.18.第19回日本排尿機能学会前立腺全摘術後の尿失禁に対するPDE 5阻害薬の効果2012.2.18.第22回日本性機能学会東部総会前立腺全摘術後の性機能障害に対する神経温存手術と陰茎リハビリテーション本年度行ったこれまでのデータ解析から、性機能のみならず、尿禁制にもPDE5阻害剤内服が作用していることが判明した。しかしながら、PDE5阻害剤を術直後に内服すると将来的な尿失禁の回復には貢献するものの一過性に尿失禁がひどくなることが判明した。平行して施行していたラットを用いた基礎実験では、PDE5阻害剤の尿道機能に対する作用として、くしゃみなどの時に尿漏れを防ぐ反射をPDE5阻害剤が抑制することがわかった。本年度行ったこれまでのデータ解析から、性機能のみならず、尿禁制にもPDE5阻害剤内服が作用していることが判明した。また、平行して施行していたラットを用いた予備実験では、PDE5阻害剤の尿道機能に対する作用として、くしゃみなどの時に尿漏れを防ぐ反射にPDE5阻害剤が関与することが示唆されており(これまでこのような報告はない)、臨床的にはPDE5阻害剤は将来的な尿失禁の回復には貢献するものの一過性に尿失禁がひどくなる可能性が示唆され、最終目的のひとつである`最適な内服時期の設定'に直接関係する可能性がある所見と考えている。次年度は定量実験に入る予定である。これまでの臨床データの解析で、PDE5阻害剤を用いたリハビリテーションは性機能回復や尿禁制回復に有効であることが判明したが、PDE5阻害剤を術直後に内服すると将来的な尿失禁の回復には貢献するものの一過性に尿失禁がひどくなることが判明した。平行で行っているラットを用いた実験では、PDE5阻害剤は平滑筋の緊張による通常の尿道圧には変化を与えないが、くしゃみなどの急な腹圧上昇に対応する尿禁制反射を抑制することがわかった。動物実験の結果は、前立腺全摘術の直後からPDE5阻害剤を内服すると一過性に尿失禁が悪化する現象を説明し得ると考えている。次年度はPDE5阻害剤の最適な投与doseを求めていくとともに、尿失禁が悪化するのであれば術後PDE5阻害剤の最適な内服開始時期を検討する。
高温ストレスによる光化学系障害機構とその光依存獲得性高温耐性機構の解明

高等植物の光化学系は高温ストレスに対して感受性を示す。しかし高温ストレス時に光が共存すると光化学系は高温耐性を示す。本研究では暗所高温条件下で光化学系が障害を受けるメカニズムと、光依存獲得性高温耐性機構の解明を目的とした。暗所高温条件下では、光化学系が存在するチラコイド膜内の過還元状態に起因して活性酸素が生成し、光化学系II中に存在するD1タンパク質が分解されることにより、光合成機能が障害を受けることを明らかにした。また光依存性高温耐性機構は光化学系のステート遷移が関わっていることを明らかにした。遺伝子解析については従来法では難しかったため、今後次世代ジーケンス解析を用いた解析が必要である。植物は暗所で40°C以上の高温ストレスを受けると光化学系II活性が重篤な障害を受ける。しかしあらかじめ、光存在下で40°Cの高温処理を施しておくと、引き続き暗所で高温ストレスを与えても光化学系IIの障害が見られなくなる。この現象は、気温が40°Cを超える自然環境が夏場の昼間、つまり光が存在する高温状況でも生存可能であることを説明できる重要な機構であると考えられる。申請者はこの機構を光依存獲得性高温耐性機構と名付け、この分子機構を明らかにすることを目的として、本研究計画を立案した。光依存獲得性高温耐性を担う分子機構については全く未知のため、当該機構を欠損した突然変異体を獲得し、その原因遺伝子を特定することで、分子機構の解明する戦略を本研究では採用した。まず突然変異誘発薬剤であるエチルメタンスルホン酸(EMS)処理により突然変異を誘導したアラビドプシス個体を生育させ、光依存獲得性高温耐性を示さない突然変異体の獲得を試みた。その結果、約4000個体のEMS処理個体群から、一系統の突然変異体系統(lat, light-dependent acquired themotolerance)を獲得することに成功した。次に変異体の原因遺伝子を特定するため、遺伝学的解析の常套手段である「戻し交配」から「遺伝子座の特定」をおこなった。変異株系統のバックグラウンド(Colombia)と異なる遺伝子バックグラウンドを持つ系統(Lernsberg)を掛け合わせて、キメラ系統の作成を行ったが、キメラ系統の高温処理後の回復が遅く、回復処理中に枯死する個体が多かった。そのため解析に必要な個体数を得ることができず、異なる戦略をたてる必要があり、平成25年度は次世代シーケンサーを用いて原因遺伝子の特定を行う計画を予定している。変異株系統のバックグラウンド(Columbia)と異なる遺伝子バックグラウンドを持つ系統(Lernsberg)を掛け合わせて、キメラ系統の作成を行ったが、キメラ系統の高温処理後の回復が遅く、回復処理中に枯死する個体が多かった。そこで、ここ数年で急速に発展してきた遺伝子配列決定技術を応用した、遺伝子変異部位の特定を試み、光依存高温耐性機構を担う遺伝子を決定することとした。その結果多数の変異部位が確認され、現在は網羅的にそれらの劣性変異体の解析を行っている。本研究課題では、他の生物種では見られない、植物に独自の光依存獲得性高温耐性機構の解明を目指し、遺伝学的手法により機構を欠損したアラビドプシス突然変異体を獲得することを目的とした。また光獲得性高温耐性が阻止する高温障害メカニズムを明らかにすることも目的としている。突然変異体の作製は、突然変異誘発化学物質エチルメタンスルホン酸処理によりおこなった。

ホモ化された変異株を播種し、25°Cで4週間生育させたものを用い、光照射下40°Cで1時間高温処理(以下、光40°C処理と略す)した後、引き続き暗下40°Cで1時間高温処理(以下、暗下40°C処理と略す)した。野生株は光40°C処理により光依存獲得性高温耐性が誘導され、暗下40°C処理でも光合成活性の低下を示さないので、野生株と比較し顕著に活性の低下を示す個体の選抜を行った。変異体を選抜後、高温障害のダメージを回復させるため二週間25°Cで生育させ、もう一度前述の高温処理を行い、再度顕著な光合成活性の低下を示す個体を選抜した。その後は25°Cで栽培し種子を採取した。この一連の一次選抜により、約5,000のアラビドプシス植物体から13の候補系統を得た。選抜された系統の種子を播種し、一次選抜と同様の方法により、二次選抜を行った。得た突然変異体(lat, Light-dependent Acquired Thermotolerance)は、野生株と戻し交配、ホモ系統の選抜を行い、lat系統を固定した。遺伝子の同定を進めるため、固定したlat系統(Columbiaバックグラウンド)とLernsbergとの交雑を行い、キメラ系統(lat x Lernsberg)を作製した。現在は引き続き、ポジショナルクローニングにより原因遺伝子の特定を進めている。突然変異体を獲得し、その変異株の固定ができたことは、本研究計画を進める上での重要な前提を乗り越えることができたという意味で、大きな進展である。しかしその後の突然変異体の原因遺伝子の特定に苦戦しており、当初予定した遺伝学的手法を、次世代ゲノムシーケンス技術を用いた遺伝子解析法に変更した。このことから、当初予定していた計画より少し遅れていると判断している。本研究計画では、課題1)光に依存しない光化学系高温障害メカニズムの生理生化学的解明、課題2)遺伝学的解析による光依存獲得性高温耐性機構を司る遺伝子の解明、という二つの課題を研究期間内に明らかにし、最終的に光化学系タンパク質を高温障害から保護する光依存獲得性高温耐性機構の全貌を明らかにすることを具体的な目標にしている。課題1)「光に依存しない光化学系高温障害メカニズムの生理生化学的解明」に関しては、計画通り研究が進行し、ストロマ還元力のチラコイド膜への流入によりD1タンパク質の損傷をもたらすことを明らかにすることができた。この研究成果は、2012年にPlanta誌に発表した。このことから、課題1)に関しては予定通り計画が進行していると評価できる。課題2)「遺伝学的解析による光依存獲得性高温耐性機構を司る遺伝子の解明」については、キメラ系統の確立に手間取り、予定通り進んでいない。このため、今後はこの課題にてこ入れを施し、研究の円滑な進行を促す必要がある。従来法である遺伝学的常套手段、「戻し交配」→「遺伝子座の特定」という実験法では、本研究計画期間内での遺伝子特定が困難であると考えた。そこで、ここ数年で急速に発展してきた遺伝子配列決定技術を応用した、遺伝子変異部位の特定を試み、光依存高温耐性機構を担う遺伝子を決定することを予定している。
生体内ポリアミンの機能制御分子の設計・合成とその機能探索

生体内には,スペルミジン・スペルミンに代表される20種を超えるポリアミン類が存在し,これらは前立腺,膵臓,がんなど分泌活性やたんぱく質・核酸合成の盛んな組織中に多く含まれている.これらポリアミン類の機能は,核酸の安定化,核酸合成系の促進作用,細胞膜の安定化や化学物質の膜透過性の強化など多岐にわたっており,種々の生物現象の鍵物質となっている.本特定領域研究では,ポリアミン類の作用機序・生物現象の解明および探索を目指し,ポリアミン類の生体内機能制御分子を創製することを目的とする.この検討では包接化合物による錯形成を鍵とした超分子化学的手法を用い,ポリアミン包接錯体の構造活性相関研究を行う.包接化合物として,ポリアミンと選択的にロタキサンを形成するクカビト[6]ウリルに着目し,(1)その機能探索および(2)類縁体合成手法の開拓を行った.平成13年度までに無置換クカビト[6]ウリルがポリアミンの核酸関連機能を変化させることを見いだしている.今年度は一連の置換クカビト[6]ウリルの合成を可能とする合成手法の開発を行った.クカビト[6]ウリルはその最初の合成からほぼ100年を経た今でも置換体の合成手法がなく,最初の多置換クカビト[6]ウリルがわずか2%生成することが昨年報告されたのみである.本研究ではクカビト[6]ウリルの出発物質であるグリコールウリルの混合物を合成反応に用いることで置換体が比較的よい収率で得られることを見いだし,さらにポリアミンを包接したロタキサンへと変換できることを見いだした.生体内には,スペルミジン・スペルミンに代表される20種を超えるポリアミン類が存在し,これらは前立腺,膵臓,がんなど分泌活性やたんぱく質・核酸合成の盛んな組織中に多く含まれている.これらポリアミン類の機能は,核酸の安定化,核酸合成系の促進作用,細胞膜の安定化や化学物質の膜透過性の強化など多岐にわたっており,種々の生物現象の鍵物質となっている.本特定領域研究では,ポリアミン類の作用機序・生物現象の解明および探索を目指し,ポリアミン類の生体内機能制御分子を創製することを目的とする.この検討では包接化合物による錯形成を鍵とした超分子化学的手法を用い,ポリアミン包接錯体の構造活性相関研究を行う.包接化合物として,ポリアミンと選択的にロタキサンを形成するクカビト[6]ウリル(CB[6])に着目し,(1)その機能探索および(2)類縁体合成手法の開拓を行う.本年度は,このうちCB[6]の天然ポリアミン分子の機能調整因子としての機能探索を行った.その結果,CB[6]が(1)ポリアミンのTopoisomerase Iの反応促進効果を増強させること,および(2)制限酵素の反応抑制効果を軽減させることを持つことを見いだした.ポリアミン・DNA錯体の原子間力顕微鏡による直接観察により,このCB[6]によるポリアミンの機能制御効果がポリアミン・DNA錯体の凝集状態の変化によるものであることが示唆され,現在その作用機序を解明すべくさらに詳細な検討を行っている.生体内には,スペルミジン・スペルミンに代表される20種を超えるポリアミン類が存在し,これらは前立腺,膵臓,がんなど分泌活性やたんぱく質・核酸合成の盛んな組織中に多く含まれている.これらポリアミン類の機能は,核酸の安定化,核酸合成系の促進作用,細胞膜の安定化や化学物質の膜透過性の強化など多岐にわたっており,種々の生物現象の鍵物質となっている.本特定領域研究では,ポリアミン類の作用機序・生物現象の解明および探索を目指し,ポリアミン類の生体内機能制御分子を創製することを目的とする.この検討では包接化合物による錯形成を鍵とした超分子化学的手法を用い,ポリアミン包接錯体の構造活性相関研究を行う.包接化合物として,ポリアミンと選択的にロタキサンを形成するクカビト[6]ウリルに着目し,(1)その機能探索および(2)類縁体合成手法の開拓を行った.平成13年度までに無置換クカビト[6]ウリルがポリアミンの核酸関連機能を変化させることを見いだしている.今年度は一連の置換クカビト[6]ウリルの合成を可能とする合成手法の開発を行った.クカビト[6]ウリルはその最初の合成からほぼ100年を経た今でも置換体の合成手法がなく,最初の多置換クカビト[6]ウリルがわずか2%生成することが昨年報告されたのみである.本研究ではクカビト[6]ウリルの出発物質であるグリコールウリルの混合物を合成反応に用いることで置換体が比較的よい収率で得られることを見いだし,さらにポリアミンを包接したロタキサンへと変換できることを見いだした.