hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膵管内乳頭粘液性腫瘍の発生メカニズムを反映した新規マーカーの確立

膵管内乳頭粘液性腫瘍(IPMN: Intraductal Papillary Mucinous Neoplasm)を発生する新しい遺伝子改変マウスを起点とした解析から同定された、原因遺伝子変異によって発現が制御される分子群に関して、マウス実験系でさらなる解析を行った。その結果、インターロイキン1ファミリーとSOX転写因子が有望な分子として同定された。患者由来IPMN組織、正常ヒト膵管上皮細胞培養系、ヒト膵癌細胞株を含むヒト実験系における解析を施行した。実績1.研究計画に従い、上記12分子に関してマウス実験系における追加のvalidationを行った。IPMN発生遺伝子改変マウス由来膵癌細胞株において、有効な抗体の存在する一部の分子に関しては、Western blotによって蛋白レベルでの発現増加を確認した。原因遺伝子変異の発現をoffにした場合に、上記12分子全ての発現が有意に低下することをqPCRで確認した。また、IPMN発生原因遺伝子変異のeffectorと考えられるシグナル伝達経路を薬理学的に刺激し、これら12分子の変化を解析し、関連するシグナル伝達経路を確認した。IPMN発生遺伝子改変マウスの膵組織を免疫染色し、IPMN発生過程の上皮病変において高発現がみられる分子を同定した。IPMN発生遺伝子改変マウスを起点とした詳細なvalidationを行うことにより、IPMN発生メカニズムに基づいたマーカー分子を同定する上で基礎となる重要な知見が得られた。ヒト実験系におけるトランスレーショナルな解析を、効率的かつ効果的に進めていく上でも必須の実績であると考えられる。実績2.ヒト実験系におけるvalidationに必須の作業として、所属機関におけるIPMN切除症例に関するデータベースの作成を開始した。臨床病理学的所見や予後に関して明らかにしている。マウス実験系におけるvalidationは概ね順調に進展している。Microarray解析から同定された12分子に関して、qPCR、Western blotによるvalidationを進め、IPMN発生原因遺伝子変異のOn/Offに連動して、発現が有意に変化することを確認した。IPMN発生原因遺伝子変異のeffectorと考えられる、シグナル伝達経路のactivatorとinhibitorを用いて、12分子の発現変化を解析し、これらの分子の発現に関連するシグナル伝達経路を確認できた。さらに、IPMN発生遺伝子改変マウスモデルの膵組織の免疫染色を行い、明瞭な染色性が得られ、IPMN発生過程で発現が増加する分子を絞り込むことができた。これらの解析から、ヒト実験系におけるvalidationを、効率的かつ効果的に進める上で重要な知見が得られた。現在の研究は、ヒト実験系におけるvalidationに移行しているが、やや遅れがみられる。ヒト実験系でのin vitroのvalidationでは、応募者が以前に確立した正常ヒト膵管上皮細胞モデル(Yamaguchi H, et al. Am J Pathol 177, 2010)を用いた解析を予定していた。この正常ヒト膵管上皮細胞モデルは膵切除標本を利用して確立するものであるが、細胞分離・培養システムの再構築とIRBの審査に時間を要している。そのため、ヒト実験系でのin vivoのvalidationも開始する方針とし、所属機関におけるIPMN切除症例に関するデータベースの作成を開始した。本研究の目的:本研究は膵管内乳頭粘液性腫瘍(Intraductal papillary mucinous neoplasm: IPMN)の発生メカニズムに基づき、質の高いトランスレーショナルなvalidationのなされた新規マーカーを確立することを目的としている。研究代表者は、IPMNを発生する新しい遺伝子改変マウスモデルを作成し、原因変異遺伝子によって制御される分子群を同定した。これらの分子群に関してヒトIPMNの診断、病勢把握、治療におけるマーカーとしての有効性を研究する。1.マウス実験系における解析研究代表者が作成した遺伝子改変マウスは、任意のタイミングで原因変異遺伝子の発現を誘導できるため、原因変異遺伝子発現後の膵組織の変化、IPMN発生過程を組織学的に追跡し、分子群の免疫染色を行った。マウスにおける免疫染色の結果から、インターロイキン(IL-)1ファミリーとSRY-box (SOX)転写因子をヒト実験系における重点的な解析対象として同定することができた。2.ヒト実験系における解析当学IRBの承認を得て、当科におけるIPMN切除例のデータベースを作成した。2005年から2016年までの連続切除例85例に関して臨床病理学的所見の確認、予後の調査を行った。作成したデータベースを基に、腺腫症例と浸潤癌症例のH-E染色による組織所見を再検し、典型的な症例を抽出し免疫染色による解析を施行した。また、研究代表者が以前に膵切除標本から確立した正常ヒト膵管上皮細胞モデル(Yamaguchi H, et al. Am J Pathol 177, 2010)に関して、当学IRBの承認が得られ、培養系の確立を再開し、分子群の発現に関するin vitroの解析を開始した。1.ヒト実験系におけるin vitroのvalidation:IRBの承認が得られ次第、膵切除標本から正常ヒト膵管上皮細胞モデルを確立し、in vitroのvalidationを開始する。具体的にはまず有望と考えられる分子の発現状態を解析する。IPMN発生原因

遺伝子変異のeffectorとして重要なシグナル伝達経路のactivatorとinhibitorを投与して、分子の発現変化を解析する。ヒト膵癌細胞株を用いて、同様の解析を行い、正常ヒト膵管上皮細胞モデルでの結果と違いがみられるのかを解析する。正常ヒト膵管上皮細胞モデルの確立にさらに時間を要する場合には、膵癌細胞株を用いた解析を先行させることも考慮する。有望な分子が同定された場合には、安定細胞株を確立し、機能解析を行うが、進捗状況がやや遅れているため、in vivoでのvalidationを優先させる。2.ヒト実験系におけるin vivoのvalidation:in vitroの解析にやや遅れを生じているため、所属機関におけるIPMN切除例に関するデータベースの作成を既に開始している。データベースに登録されたIPMN切除例に関して、腫瘍組織の免疫染色を行い、分子の発現と臨床病理学的因子との関連性を解析する。Pilot解析として、IPMNの進行度に応じて、adenoma、non-invasive carcinoma、invasive carcinomaの代表的な症例を5例ずつ程度抽出して、免疫染色を行い、抗体の有効性や染色条件を評価する。分子発現に違いがみられるか解析し、注目すべき病変や臨床病理学的因子に関して検討する。validationを行う対象症例や症例数に関して決定し、免疫染色を進めていく。ヒト実験系におけるin vitroとin vivoのvalidationの結果から、IPMNの診断、病勢把握、治療において有効なマーカーとなり得る新規分子を同定する。29年度が最終年度であるため、記入しない。消化器外科学、膵臓外科学、分子腫瘍学、細胞生物学29年度が最終年度であるため、記入しない。
免疫グロブリンMの成熟化に関与するシャペロン複合体の分子機構の解明

免疫グロブリンM (IgM)は、二組の軽鎖と重鎖で形成されたIgM単量体が、ジスルフィド結合で架橋された五または六量体として細胞外に分泌される。これまでの研究から、細胞の分泌経路において、小胞体で合成されたIgM単量体が小胞体シャペロンであるERp44によって捕獲され、糖タンパク質の運搬を担うERGIC-53上でIgMの正確な会合体が形成されると考えられている。ERGIC-53は、小胞体とゴルジ体の中間区画であるERGICに局在する一回膜貫通タンパク質であり、糖鎖修飾された様々な分泌タンパク質を小胞体からゴルジ体へと輸送させる役割を果たしている。全体構造は、糖鎖結合ドメイン(CRD)、ストークドメイン、膜貫通ヘリックス(TM)およびERGIC局在モチーフで構成されており、ストークドメイン間で六量体を形成して機能すると考えられている。しかし、全長ERGIC-53の立体構造は未決定であり、六量体としての分子機構は不明な点が残されている。またERp44との相互作用様式についても、十分には分かっていない。本研究は、全長ERGIC-53の立体構造ならびにERp44やIgMとの複合体の構造解析によって、IgMの正確な会合体形成の分子基盤の解明を目指すものである。今年度は、構造解析を目的として全長ERGIC-53の大量発現、精製条件の検討を中心に取り組んだ。ヒト培養細胞HEK293Tの発現誘導型安定発現株を樹立し、発現条件の最適化によって10倍以上のタンパク質発現の亢進に成功した。またERGIC-53の可溶化および精製に用いる界面活性剤のスクリーニングにより、単分散性の精製サンプルを得るに至った。現在、ネガティブステインおよびクライオ電子顕微鏡によるサンプルのスクリーニングを進めている。ERp44については、亜鉛によってERp44の構造機能が制御されていることを、構造解析および生物物理学的手法によって明らかにし、亜鉛を介したタンパク質品質管理の新しい機構として論文発表に至った。本研究課題の中心であるERGIC-53の構造解析について、発現および精製条件の最適化によって、単分散性の精製サンプルの調製に成功した。現在、クライオ電子顕微鏡による画像撮影に取り組める段階に到達できており、おおむね順調と考えられる。ERGIC-53については、スクリーニング用の200kVクライオ電子顕微鏡を利用して、界面活性剤やタンパク質濃度の最適化に取り組み、構造解析に最適な凍結グリッドの作成を目指す。適したグリッドが得られたら、300kVクライオ電子顕微鏡を利用して高分解能構造解析に取り組む。ERp44とERGIC-53との複合体については、pHや金属イオンなど種々の条件下において両者の相互作用解析を行い、安定した複合体形成の条件を決定する。さらに安定した複合体を用いてクライオ電子顕微鏡での構造解析に取り組む。

適したグリッドが得られたら、300kVクライオ電子顕微鏡を利用して高分解能構造解析に取り組む。ERp44とERGIC-53との複合体については、pHや金属イオンなど種々の条件下において両者の相互作用解析を行い、安定した複合体形成の条件を決定する。さらに安定した複合体を用いてクライオ電子顕微鏡での構造解析に取り組む。外部施設でのクライオ電子顕微鏡実験が、施設の都合により予定よりも実施できなかったため、旅費相当分が繰越となった。翌年度の旅費として使用予定である。
ヒトの脳温の左右差についての生理学的及び病態生理学的検討

健常者で鼓膜温の左右差の発現とその程度を観察し、また実験的な左右差の発現時における脳血流と鼓膜温の相関及びその体温調節反応との関連を調べ、さらに偏側脳血管障害の範囲、程度、罹患期間と鼓膜温の左右差との関連及びその体温調節機能に対する影響を調べ、脳温の左右差の発現とその機序について総合的な検討を試み、概略次の成果をえた。1.携帯用体温記録装置を用いて数名の健常者の両側鼓膜温を848時間連続測定し、通常鼓膜温に僅かな左右差があり、その変動は必ずしも左右並行せず、ときには左右が逆向きに変動することを観察した。2.上記の変動が姿勢の変化と関係が深いと推察されたので、体位・頭位と左右鼓膜温の変動との関係を追究した結果、側臥位、座位における頭の側屈、背臥位における頭の回転により下になった側の鼓膜温が上昇し、対側で下降することを認め、迷路刺激の関与した反射機構により頚動脈血流の左右差が起こりうると推定した。^<99m>Tc-HMPAUを用いた脳血流シンチグラフィーSPECT-を2例について実施し、背臥位頭部の右回転により右の脳内血流が左のそれより低下することを認めた。3.一側星状神経節ブロックを施行し、同側の鼓膜温の僅かな低下を認めたので、これと^<123>I-IMP及び^<99m>Tc-HMPAOを用いたSPECT像との関連を調べ、後者により、8例中6例で同側脳血流の明らかな増加を認めた、4.一側の頸動脈を圧迫したり、高温環境で顔面を冷風で冷やしつつ、一側の眼角静脈を圧迫することにより、同側の鼓膜温の上昇を認めた。5.数十例の偏側性の脳血管障害患者について、左右鼓膜温を測定し、障害側の鼓膜温が対側より有意に低下し、その程度とX線CT像から算出した障害範囲、その程度、罹患期間などとの間に緊密な関連を認めた。以上の所見より、脳の局所的な代謝変動、血流及びその温度の変化が脳温の左右差を引き起こすことがあり、これが鼓膜温に反映されると考えられる。健常者における鼓膜温の左右差の発現とその程度を観察し、また実験的な左右差の発現時における脳血流と鼓膜温の相関及びその体温調節反応との関連を調べ、さらに偏側脳障害の部位、範囲、罹患期間と鼓膜温の左右差との関連及びその体温調節機能に対する影響を調べ、脳温の左右差の発現とその意義について総合的な検討を試みている。現在までに得られた所見は次の通りである。1.携帯用体温記録装置を用いて数名の健常者の両側鼓膜温を848時間連続測定し、通常鼓膜温に僅かな左右差があり、個人によりいずれかがほぼ常に高く、1日のうちに数回差が狭まるか逆転することを観察した。その要因に分析し、姿勢の変化、特に頭部の傾きが主要なことを認め、迷路刺激の関与を推測した(口腔粘膜血流量、前額血流量にも影響をみた)。2.一側星状神経節ブロックを施行し、同側の鼓膜温の僅かな低下を認めたので、これと^<123>

IーIMP及び[ ^<99m>Tc]HMーPAOを用いたSPECT像との関連を調べた。前者では、薬品の特性及び手技上の問題もあり明らかな脳血流の左右差を認めなかったが、後者では、8例中6例で同側脳血流の僅かながら明らかな増加を認めた。6例ではさらに、人工気候室で左右上下肢の発汗量を調べ、同側上肢の発汗は停止することが多いが、同側下肢の発汗量もやや減少することが多いことをみた。3.数十例の偏側性の脳血管障害患者について、左右鼓膜温を測定し、脳梗塞では梗塞側の鼓膜温が対側より有意に低下することを認めた。さらに、その程度とX線CT像にみられる障害部位、及びそれから算出した障害範囲との間に緊密な関連を認めた。数例の患者では、人工気候室で左右対称部位の発汗量を連続記録し、脳梗塞側より反対側の方が発汗量が多く、梗塞側とは非同期性の、過剰の発汗波が、亜急性期にも慢性期にもしばしば出現することをみた。梗塞部位の刺激症状に加え、梗塞側の脳温低下による同側の発汗低下も考えられる。健常者で鼓膜温の左右差の発現とその程度を観察し、また実験的な左右差の発現時における脳血流と鼓膜温の相関及びその体温調節反応との関連を調べ、さらに偏側脳血管障害の範囲、程度、罹患期間と鼓膜温の左右差との関連及びその体温調節機能に対する影響を調べ、脳温の左右差の発現とその機序について総合的な検討を試みているが、昨年度までに概略次の成果をえた。1.携帯用体温記録装置を用いて健常者の両側鼓膜温を長期間連続測定し、鼓膜温に僅かな左右差があり、その変動は必ずしも左右並行しないことを観察した。2.この変動は姿勢の変化と関係が深く、側臥位、座位では頭の側屈、背臥位では頭の回転により下になった側の鼓膜温が上昇し、対側で下降することを認め、迷路刺激の関与した反射機構により頚動脈血流の左右差が起こりうると推定した。3.一側星状神経節ブロックにより同側の鼓膜温の僅かな低下を認め、これと^<123>I-IMP及び^<99m>Tc-HMPAOを用いたSPECT像との関連を調べ、多くの例で同側脳血流の明らかな増加を認めた。4.数十例の偏側性の脳血管障害患者について、左右鼓膜温を測定し、障害側の鼓膜温が対側より有意に低下し、その程度とX線CT像から算出した障害範囲、その程度、罹患期間などとの間に緊密な関連を認めた。本年度は先ず、2.について、^<99m>Tc-HMPAUを用いた脳血流シンチグラフィーSPECTーを2例について実施し、背臥位頭部の右回転により右の脳内血流が左のそれより低下することを認めた。また4.の例数を増し(66例)、統計的処理により昨年度の所見を確認した。さらに、5.として、一側の頸動脈を圧迫したり、高温環境で顔面を冷風で冷やしつつ、一側の眼角静脈を圧迫することにより、同側の鼓膜温の上昇を認めた。以上の所見より、脳の局所的な代謝変動、血流及びその温度の変化が脳温の左右差を引き起こすことがあり、これが鼓膜温に反映されると推定した。
逆ミセル中の新規ボーズ・アインシュタイン凝縮の検証

フレーリッヒが提案した細胞の誘電体モデルは、細胞中で代謝エネルギーを使ってボーズ・アインシュタイン凝縮が起こるという革新的理論である。代謝エネルギー発生速度が閾値を超えた時に、コヒーレントな巨視的格子振動が発生(フレーリッヒ凝縮)することを理論的に示した。しかし、非常に多数の構成要素からなる細胞を対象にこの凝縮現象を検証することは困難であった。我々は、このモデルの物理的条件をもとに、逆ミセルという微小水滴を用いて構成要素が格段に少ないモデル細胞を構築し、また、代謝エネルギーの代わりに逆ミセル内にレーザー光エネルギー注入を行うことを着想した。本研究の目的は、逆ミセルを用いてこの振動の凝縮に起因した振動スペクトル転移の観測をテラヘルツ領域の振動分光により行い、このモデルの物理的核心部分を検証することである。本年度は、検証実験の準備として(1)モデル細胞の構築及びその光学特性評価と(2)振動スペクトル検出に使用するラマン分光装置の構築を実施した。(1)モデル細胞としてはAOTという界面活性剤分子たちの自己組織化により細胞膜類似構造を構築し、その中にミオグロビンという蛋白質分子が一つ存在する系を構築した。ミオグロビンが逆ミセル中に存在する条件で、光エネルギー注入に利用するミオグロビンの吸収バンドが存在し、十分な吸収強度を持つことを確認した。(2)ラマン分光装置はテラヘルツ領域の低周波分光を可能にするために高分解能フィルターを組み合わせた装置を構築し性能評価を実施した。(1)モデル細胞の構築及びその光学特性評価:界面活性剤AOT(ジ-2-エチルヘキシルスルホコハク酸ナトリウム)、蛋白質ミオグロビン、油溶媒イソオクタン及び超純水を試料調製のために用いた。真空オーブン中でAOT/イソオクタンの残存水を除去した後、ミオグロビン水溶液を微量注入することにより逆ミセル中にミオグロビン微小水滴を構築した。所定のミオグロビン濃度にするために、真空オーブン中で脱水とミオグロビン水溶液の微量注入を繰り返した。サイズ制御は水とAOTの濃度比により行い、水滴径約4 nmから10 nmの範囲の逆ミセルの調製を実現した。ミオグロビン中の発色団であるヘム色素分子の400nm付近に存在するSoretバンドを光エネルギー変換に利用する。逆ミセル中でSoretバンドを確認し、実験に必用な吸収強度が得られることが分かった。(2)ラマン分光装置の構築既設の分光器とレーザー光を用いて装置の構築を行った。レーザー光の中心周波数付近からのラマン散乱測定が必用であり、10 cm-1程度の分解能を目標とした。信号光に比べて強い強度のレーザー光の裾に起因した背景信号を除去する必用がある。そのために、高分解能ノッチフィルターを複数導入した光学系を構築し、フィルターの個数依存性など幾つかの配置で最適化及び性能評価を行った。水、エタノールや逆ミセルなどの試料を対象にラマン散乱測定を行い、およそ40 cm-1にピークをもつラマンスペクトルの測定が可能になった。分光器とノッチフィルターの性能を考慮すると分解能をさらに高めることが可能であり光学系の再検討を行っている。1.実験条件の探索:試料条件及びレーザー照射条件を決める。試料としてはミオグロビン水溶液、4 nmから10 nmのサイズ範囲のミオグロビン導入逆ミセルを対象とする。400 nmのレーザー光の強度を変えて照射する。タンパク質濃度依存性測定を行う。これらの実験により、試料の変性や溶液の突沸が起こらない照射条件及び試料条件範囲の探索を行う。ここで、試料全体にレーザー光を照射する必要があるために、試料セルとしてガラスキャピラリーを用いる。セルの適正サイズを検討する。2.ラマン散乱測定(1)本年度までに構築したラマン散乱分光装置を用いて上記によって得た条件の範囲でラマン散乱測定を行う。照射強度を変化させフレーリッヒ凝縮に伴う振動スペクトルの転移の探索を行う。ここで、エネルギー注入用レーザー光源の波長は400 nm,ラマン散乱用レーザー光源の波長は532 nmで実験を行う。(2)光学系の検討を行い10 cm-1程度の高分解能化のための分光装置の再構築を実施する。(1)の実験で振動スペクトルの転移を観測した場合、その実験条件でより分解能が高いラマン散乱測定を行いスペクトル転移を詳細に調べる。(1)で振動スペクトル転移を観測できなかった場合は、(1)と同様の実験を高分解能で行う。(3) (1)或いは(2)で振動スペクトルの凝縮転移が見られた場合、ダブル分光器(周波数分解能:約2cm-1)やサンダーコック型分光器(周波数分解能:約0.1cm-1)を用いてそのスペクトル転移をより高分解能で測定し調べる。(1)及び(2)でスペクトル転移を観測できなかった場合は(1)と同様の実験をより高分解能で行い振動スペクトルの転移の探索を行う。

我々は、このモデルの物理的条件をもとに、逆ミセルという微小水滴を用いて構成要素が格段に少ないモデル細胞を構築し、また、代謝エネルギーの代わりに逆ミセル内にレーザー光エネルギー注入を行うことを着想した。本研究の目的は、逆ミセルを用いてこの振動の凝縮に起因した振動スペクトル転移の観測をテラヘルツ領域の振動分光により行い、このモデルの物理的核心部分を検証することである。本年度は、検証実験の準備として(1)モデル細胞の構築及びその光学特性評価と(2)振動スペクトル検出に使用するラマン分光装置の構築を実施した。(1)モデル細胞としてはAOTという界面活性剤分子たちの自己組織化により細胞膜類似構造を構築し、その中にミオグロビンという蛋白質分子が一つ存在する系を構築した。ミオグロビンが逆ミセル中に存在する条件で、光エネルギー注入に利用するミオグロビンの吸収バンドが存在し、十分な吸収強度を持つことを確認した。(2)ラマン分光装置はテラヘルツ領域の低周波分光を可能にするために高分解能フィルターを組み合わせた装置を構築し性能評価を実施した。(1)モデル細胞の構築及びその光学特性評価:界面活性剤AOT(ジ-2-エチルヘキシルスルホコハク酸ナトリウム)、蛋白質ミオグロビン、油溶媒イソオクタン及び超純水を試料調製のために用いた。真空オーブン中でAOT/イソオクタンの残存水を除去した後、ミオグロビン水溶液を微量注入することにより逆ミセル中にミオグロビン微小水滴を構築した。所定のミオグロビン濃度にするために、真空オーブン中で脱水とミオグロビン水溶液の微量注入を繰り返した。サイズ制御は水とAOTの濃度比により行い、水滴径約4 nmから10 nmの範囲の逆ミセルの調製を実現した。ミオグロビン中の発色団であるヘム色素分子の400nm付近に存在するSoretバンドを光エネルギー変換に利用する。逆ミセル中でSoretバンドを確認し、実験に必用な吸収強度が得られることが分かった。(2)ラマン分光装置の構築既設の分光器とレーザー光を用いて装置の構築を行った。レーザー光の中心周波数付近からのラマン散乱測定が必用であり、10 cm-1程度の分解能を目標とした。信号光に比べて強い強度のレーザー光の裾に起因した背景信号を除去する必用がある。そのために、高分解能ノッチフィルターを複数導入した光学系を構築し、フィルターの個数依存性など幾つかの配置で最適化及び性能評価を行った。水、エタノールや逆ミセルなどの試料を対象にラマン散乱測定を行い、およそ40 cm-1にピークをもつラマンスペクトルの測定が可能になった。分光器とノッチフィルターの性能を考慮すると分解能をさらに高めることが可能であり光学系の再検討を行っている。1.実験条件の探索:試料条件及びレーザー照射条件を決める。試料としてはミオグロビン水溶液、4 nmから10 nmのサイズ範囲のミオグロビン導入逆ミセルを対象とする。400 nmのレーザー光の強度を変えて照射する。タンパク質濃度依存性測定を行う。これらの実験により、試料の変性や溶液の突沸が起こらない照射条件及び試料条件範囲の探索を行う。ここで、試料全体にレーザー光を照射する必要があるために、試料セルとしてガラスキャピラリーを用いる。セルの適正サイズを検討する。
フタロシアニンを含むフレキシブルな単結晶の開発

平面大型配位子錯体であるフタロシアニン金属錯体(MPc)は、対アニオンを用いた部分酸化塩を作成すると高い電気伝導性を示し、かつ力学的に「柔軟な単結晶」が得られる場合があることが知られている。本研究では、中心金属としてパラジウムを用いたフタロシアニン(PdPc)とアニオンAsF_6^-、ClO_4^-を組み合わせ、電気化学的酸化法により新規部分酸化塩の作成を試みた。PdPcとClO_4^-との組み合わせからは針状結晶、AsF_6^-では針状結晶と板状結晶が得られた。AsF_6塩の板状晶は、粉末X線回折により判明した格子定数が既知の(H_2Pc)_3(AsF_6)_2C_<10>H_7Clの格子定数と類似しており、同型構造であると推定される。また元素分析結果もこのことを支持する。一方、これらの針状結晶はこの種の塩によく見られるTetragonalタイプの単結晶であるが、奇妙なことに「捻れた単結晶」が生成しやすい。このことは、他の中心金属のフタロシアニンではあまりみられない現象で、中心金属のパラジウムの特殊性に起因する他、H_2PcのPF_6塩が柔軟性を示すことと関係があるかもしれない。なお、今回のパラジウムを用いた実験は、Pdフタロシアニンにおいて部分酸化(電子引抜)が起こきる場所を特定することもその目的の一つであり、赤外吸収スペクトルによれば、今回合成されたPdPcの各塩では、部分酸化は有機配子部分に起きており、中心金属(Pd)の荷電状態には変化が生じていないことが判明した。PdPcのAsF_6塩の針状結晶の場合、室温での電気伝導度は8S・cm^<-1>であった。本研究ではフレキシブルな単結晶を開発し研究している。通常、「フレキシブル」である(小さな曲率半径で曲げても折れない)ということと、「単結晶」であるということは、分子性結晶やイオン性結晶では両立し難いことであるが、筆者は有機色素分子であるフタロシアニンの陽イオンと、PF_6-陰イオンの組み合わせで、通常では考えられないほどの柔軟性を持つ単結晶を作成した。(例えば長さ3mm、太さ20μm程度の単結晶でループを作っても折れず、外力を外せば元の形状に戻る。)イオン性を持つと考えられる単結晶でありながらこれほどまでの柔軟性を示す例は殆どなく、結晶構造との関係が注目される。本研究で得られた単結晶についてX線結晶構造解析を行ったところ、この結晶は従来知られているフタロシアニン含んだ物質の結晶構造とは大きく異なり、3回対称牲のある特異な分子配列を持つことが明らかとなった(空間群R3-、a=b=36.86Å、c=4.872Å、γ=120°)。この分子配列が、結晶の柔軟性と大きく関係していると考えられる。またアニオン部にはディスオーダーが見られ、その組成を元素分析や質量分析などの手法を用いて現在検討しており、アニオン部にはPF_6-アニオン以外に、HPO_2Cl-アニオンなどが含まれており、全体の平均組成としてはH_2Pc (PCl_<0.5>F_<1.4>O_<4.1>)_<0.3>であることが明らかとなっている。物性として注目される電気伝導度は、室温で約10S/cmとかなり高い値を示した。本研究ではフタロシアニンを用いたフレキシブルな単結晶を開発・研究している。通常「フレキシブル」である(小さな局率半径で曲げても折れない)ということと、「単結晶」であるということは分子性結晶やイオン性結晶では両立が難しいが、筆者はメタルフリーフタロシアンの陽イオンとPF_<6^->を用いて、通常では考えられないほどの柔軟性を持つ単結晶を作成した。)本年度は、メタルフリーフタロシアニンを用いてフレキシブル単結晶を作成する方法を確立し、再現性よく試料をある程度まとめて(5mg程度)作成することを可能にした。また、これによって得られたサンプルについて熱分析を行うことにより、本単結晶はポリマーにはなっていないらしいこと、及び本結晶が熱的にかなり安定であることを確認した。また中心金属を変えたフタロシアニンについて、晶系が類似した結晶を作成することを目指し、原料や結晶成長条件を変えながら多数回の実験を行ったが、これについては結晶が得られず、現在実験を継続している。以上の他、分子軌道計算を援用しての物性の解明や、結晶成長機構の検討を行っており、本結晶の性質の理解にかなりの進展があった。研究成果は、分子構造総合討論会2003(平成15年9月25日、2Aa06)、及び新素材・分析化学研究部会(和歌山技術交流推進協議会主催、平成16年1月29日)で公表した。

PdPcとClO_4^-との組み合わせからは針状結晶、AsF_6^-では針状結晶と板状結晶が得られた。AsF_6塩の板状晶は、粉末X線回折により判明した格子定数が既知の(H_2Pc)_3(AsF_6)_2C_<10>H_7Clの格子定数と類似しており、同型構造であると推定される。また元素分析結果もこのことを支持する。一方、これらの針状結晶はこの種の塩によく見られるTetragonalタイプの単結晶であるが、奇妙なことに「捻れた単結晶」が生成しやすい。このことは、他の中心金属のフタロシアニンではあまりみられない現象で、中心金属のパラジウムの特殊性に起因する他、H_2PcのPF_6塩が柔軟性を示すことと関係があるかもしれない。なお、今回のパラジウムを用いた実験は、Pdフタロシアニンにおいて部分酸化(電子引抜)が起こきる場所を特定することもその目的の一つであり、赤外吸収スペクトルによれば、今回合成されたPdPcの各塩では、部分酸化は有機配子部分に起きており、中心金属(Pd)の荷電状態には変化が生じていないことが判明した。PdPcのAsF_6塩の針状結晶の場合、室温での電気伝導度は8S・cm^<-1>であった。
問題発見型グループ学習の意見形成過程を用いた評価支援システム

本研究では、問題発見型グループ学習において、対話と議論による意見形成の結果を成果物とする学習活動を記録し自己や他者による学習評価することを支援するシステムの構築にある。そこで本年度はまず、記録データ分析法を探るため、発言の様相をマクロな視点でテキスト分析した。実際に社会の中で問題発見型の議論をする複数の場での発言録を対象に分析し、発言の場の設計によって意見の現れ方が異なる可能性がわかった。テーマを具体的に絞ることにより深い議論が可能であること、発散的な場と実務的な場とで意見に関わる語彙が大きく異なることがわかった。これにより、議論を測るための一指標が得られたと考える。また、今後の分析法の確立に向けて、このような場を注意深く設計することと分析法が両輪であることが明確になっている。次に、問題発見型グループ学習の場面で多く用いられている模造紙と付箋紙の利用状況を含めた意見形成過程を記録するシステムの設計・開発に着手している。このシステムでは、グループ学習活動の中で行われる、意見を書き示した付箋紙の提示や移動、それらの遠近で表現される関係性とその変化をさせる作業を記録し、発言の音声とともに半自動認識できるように進めている。これにより、音声情報のみでは困難な意見間の関係を抽出できると期待される。このシステム構築を進め、記録データ分析法を組み込み、評価観点を定めることにより発話関連付けシステムの構築につながる。分析手法の確立に向けて、問題発見型の議論を比較することで注目すべき一指標が得られた。また、システムの構築に向けて、標準的な問題発見型グループ学習の場を記録するシステムの開発を始めている。分析手法の確立のほかに、活動評価を確実にするための手法の開発が求められる。同時に、システムの構築を進める。出席を予定していた国際会議に対し日程等が合わなかったため次年度に繰り越した。繰り越した助成金は、関係する国際会議への参加・発表のために使用する計画である。
脊髄損傷モデル系を用いた嗅神経鞘細胞を含む移植用生体材料の調製法最適化

脊髄損傷に関わる医療環境は、この1年間に大きく変化した。先ずは、ステミラック注の条件および期限つき承認、そして、iPS細胞由来神経前駆細胞を用いた再生医療の臨床研究開始の承認があった。本研究が目指す、完全型の皮質脊髄路損傷の治療にこれらが結びつくかどうかは不明だが、ステミラック注において、自家の骨髄間葉系幹細胞を用いた治療に関し、製剤の製造販売が承認されたということは注目すべき変化であった。本研究も、自家の嗅神経鞘細胞を移植する技術によって、脊髄損傷での神経結合の回復、機能の回復を目指すものであるが、臨床および動物実験で用いられている細胞懸濁液は、嗅神経鞘細胞を含む種々の細胞の混合物と考えられる。このことに関連して、海外の研究者との情報交流から、嗅粘膜には間葉系幹細胞が含まれ、これがオリゴデンドロサイトによるミエリン鞘形成を良く促進するという論文(Glia. 61 p368, 2013)を知った。様々な部位から採った間葉系幹細胞など、種々の細胞を意識しながら、より優れた細胞の探索を行うこと、あるいは、嗅神経鞘細胞の他の細胞に対する優位性を検出することなども、実験的研究としては視野に入れる必要性が生じている。そのような中、幸運なことに、学内発の細胞治療のプロジェクトに参画する機会が与えられた(ADC Letter for Infectious Disease Control. 6 p8, 2019)。この1年間の大半は、このプロジェクトの準備に費やされることとなったが、基礎研究を担当する予定となり、本研究にとって大きなプラスとなった。そのような中、ラットに加え、C57BL/Jマウス、ICRマウスでの前額断スライス培養に成功したこと、エレクトロポレーションによる遺伝子導入用装置を整備し、マウスでも遺伝子導入ができるようになったこと、などが具体的成果として挙げられる。学内発の細胞治療のプロジェクトに参画する機会が与えられ、基礎研究を担当する予定となり、本研究にとって大きなプラスとなった。しかし、そのプロジェクトの準備に多くの時間を費やしたため、本研究の当初の実験計画が予定どおり進まなかったことがあり、評価は「やや遅れている」とした。以下、進捗のあった項目につき述べる。スライス培養系の整備ができたこと:過去にラットでの前額断スライス培養の実績はあった。今回、C57BL/6マウス、あるいはICRマウスでの培養にも成功した。エレクトロポレーション用の装置の整備を進めたこと:現有のDsRed2発現プラスミドを用いた場合、マウスの皮質錐体細胞へのエレクトロポレーションによる遺伝子導入は、ラットに比べ、成功率が低いことが判った。そこで、エレクトロポレーション中の動画および音声をモニターできる装置を導入し、系統的に条件検討ができるようにした。このことで、エレクトロポレーションを行うときに添加するプラスミド溶液の量を半定量的に測れるようになり、また、添加した後電流刺激を与えるまでの間隔を定量的に測れるようになった。今後の条件検討により、マウスの皮質錐体細胞へのエレクトロポレーションによる遺伝子導入の成功率を向上させてゆく準備ができたと考えている。新しく参画することとなった学内発の細胞治療のプロジェクトとの協力関係を、本研究のための推進力とすることが、目下の最大の課題といえる。新しいプロジェクトの対象疾患は脳性麻痺だが、脊髄損傷と同様、進行性ではないが重篤な神経の傷害が原因である点は共通している。軸索の再生が、治療につながり得るという点も共通しているので、脳性麻痺のモデル動物に有効であった細胞を、脊髄損傷でも試し、またスライス培養系でも試すという流れが理想的である。場合によっては、嗅神経鞘細胞に固執せずに、最も有効な細胞とその調製法を探すという方向に動いて行くのが良い場合もありうると考える。新しいプロジェクトは、準備段階なので、協力関係を活かした具体的方策はまだ立てることができないが、実験的研究が始まった段階で、協議の上、方策を立てたい。しかしながら、嗅神経鞘細胞が脊髄損傷治療の切り札となる可能性は依然として高いので、当面、GFP発現動物から採取した嗅神経鞘細胞をスライス培養系に適用する実験を最優先に進める。

この1年間の大半は、このプロジェクトの準備に費やされることとなったが、基礎研究を担当する予定となり、本研究にとって大きなプラスとなった。そのような中、ラットに加え、C57BL/Jマウス、ICRマウスでの前額断スライス培養に成功したこと、エレクトロポレーションによる遺伝子導入用装置を整備し、マウスでも遺伝子導入ができるようになったこと、などが具体的成果として挙げられる。学内発の細胞治療のプロジェクトに参画する機会が与えられ、基礎研究を担当する予定となり、本研究にとって大きなプラスとなった。しかし、そのプロジェクトの準備に多くの時間を費やしたため、本研究の当初の実験計画が予定どおり進まなかったことがあり、評価は「やや遅れている」とした。以下、進捗のあった項目につき述べる。スライス培養系の整備ができたこと:過去にラットでの前額断スライス培養の実績はあった。今回、C57BL/6マウス、あるいはICRマウスでの培養にも成功した。エレクトロポレーション用の装置の整備を進めたこと:現有のDsRed2発現プラスミドを用いた場合、マウスの皮質錐体細胞へのエレクトロポレーションによる遺伝子導入は、ラットに比べ、成功率が低いことが判った。そこで、エレクトロポレーション中の動画および音声をモニターできる装置を導入し、系統的に条件検討ができるようにした。このことで、エレクトロポレーションを行うときに添加するプラスミド溶液の量を半定量的に測れるようになり、また、添加した後電流刺激を与えるまでの間隔を定量的に測れるようになった。今後の条件検討により、マウスの皮質錐体細胞へのエレクトロポレーションによる遺伝子導入の成功率を向上させてゆく準備ができたと考えている。新しく参画することとなった学内発の細胞治療のプロジェクトとの協力関係を、本研究のための推進力とすることが、目下の最大の課題といえる。新しいプロジェクトの対象疾患は脳性麻痺だが、脊髄損傷と同様、進行性ではないが重篤な神経の傷害が原因である点は共通している。軸索の再生が、治療につながり得るという点も共通しているので、脳性麻痺のモデル動物に有効であった細胞を、脊髄損傷でも試し、またスライス培養系でも試すという流れが理想的である。場合によっては、嗅神経鞘細胞に固執せずに、最も有効な細胞とその調製法を探すという方向に動いて行くのが良い場合もありうると考える。新しいプロジェクトは、準備段階なので、協力関係を活かした具体的方策はまだ立てることができないが、実験的研究が始まった段階で、協議の上、方策を立てたい。しかしながら、嗅神経鞘細胞が脊髄損傷治療の切り札となる可能性は依然として高いので、当面、GFP発現動物から採取した嗅神経鞘細胞をスライス培養系に適用する実験を最優先に進める。備品については、高価なステージトップインキュベータの購入を延期または中止した。その代わりに急務となった安全キャビネットヘパフィルターの交換を行い、また、エレクトロポレーション中の動画と音声の保存ができるシステムを三眼の実体顕微鏡を中心とした構成で購入した。この差額がB - Aに大きく反映されている。
細胞増殖におけるポリADP-リボース合成酵素の役割

ポリADPリボース合成酵素は,細胞核内に局在し,その酵素活性の変動や阻害剤を用いた解析などから, DNA鎖の損傷修復や細胞の増殖などに重要な役割を果しているものと推測されている.しかしながら,本酵素の生理的役割については未だ不明な点が多い.そこで報告者らは,本酵素の役割を解明する手がかりとして,ヒト由来の本酵素蛋白の構造の特質を明らかにし,かつ本酵素に対するモノクローナル抗体を用いて以下の結果を得た.1)ヒト胎盤由来の本酵素は, DNA結合領域,自己修飾領域,及びNAD結合領域の3つのドメインからなり, N末端側からこの順に配列している.2)NAD結合領域のポリペプチド断片から部分アミノ酸配列を決定し,これをもとにオリゴヌクレオチドプローブを作製して,本酵素に対するCDNAを単離した.このcDNAから本酵素蛋白の一次構造を決定したところ,本酵素蛋白はアミノ酸1,014残基から成る単鎖ポリペプチドで, DNA結合領域と自己修飾領域は塩基性アミノ酸に富み全体として塩基性であるが, NAD結合領域は全体として中性であった.3)本酵素のDNA結合領域には,癌遺伝子c-fosの遺伝子産物と部分的相同性を示す部位が存在し,かつ種々のDNA結合蛋白に共通して見出されるいわゆるZinc Finger構造を有することが明らかとなった.4)本酵素に対するモノクローナル抗体のうちの1つは, NAD結合領域内の抗原決定基を認識し,かつ中和抗体活性を有することから,本酵素の活性中心はNAD結合領域に存在することが強く示唆された.現在,培養ヒト細胞内に注入された抗体が核内の局在部位に蓄積する方法を確立しており,今後,細胞増殖制御における本酵素の役割を解明する上でこれらの結果が役立つものと思われる.ポリADPリボース合成酵素は,細胞核内に局在し,その酵素活性の変動や阻害剤を用いた解析などから, DNA鎖の損傷修復や細胞の増殖などに重要な役割を果しているものと推測されている.しかしながら,本酵素の生理的役割については未だ不明な点が多い.そこで報告者らは,本酵素の役割を解明する手がかりとして,ヒト由来の本酵素蛋白の構造の特質を明らかにし,かつ本酵素に対するモノクローナル抗体を用いて以下の結果を得た.1)ヒト胎盤由来の本酵素は, DNA結合領域,自己修飾領域,及びNAD結合領域の3つのドメインからなり, N末端側からこの順に配列している.2)NAD結合領域のポリペプチド断片から部分アミノ酸配列を決定し,これをもとにオリゴヌクレオチドプローブを作製して,本酵素に対するCDNAを単離した.このcDNAから本酵素蛋白の一次構造を決定したところ,本酵素蛋白はアミノ酸1,014残基から成る単鎖ポリペプチドで, DNA結合領域と自己修飾領域は塩基性アミノ酸に富み全体として塩基性であるが, NAD結合領域は全体として中性であった.3)本酵素のDNA結合領域には,癌遺伝子c-fosの遺伝子産物と部分的相同性を示す部位が存在し,かつ種々のDNA結合蛋白に共通して見出されるいわゆるZinc Finger構造を有することが明らかとなった.4)本酵素に対するモノクローナル抗体のうちの1つは, NAD結合領域内の抗原決定基を認識し,かつ中和抗体活性を有することから,本酵素の活性中心はNAD結合領域に存在することが強く示唆された.現在,培養ヒト細胞内に注入された抗体が核内の局在部位に蓄積する方法を確立しており,今後,細胞増殖制御における本酵素の役割を解明する上でこれらの結果が役立つものと思われる.
アミロイドβ依存性に異常タウリン酸化を誘導する分子群の網羅的解析

アルツハイマー病脳では,不溶性タンパクの凝集により老人斑と神経原線維変化が形成される。老人斑は,アミロイドβ(Aβ)から成り,神経原線維変化はリン酸化タウを主成分とする。Aβ蓄積からリン酸化タウが誘導される機序は未解明である。本研究は,Aβ依存性にタウリン酸化を誘導する分子群を同定することを目的とした。Aβを産生するドナー細胞と,内在性タウを発現する初代神経培養細胞(レシピエント細胞)の共培養を行い,レシピエント細胞の全RNAを回収した。RNA発現解析チップを用いた網羅的解析を行い,発現が変動する分子群を同定し,パスウェイ解析によりをインスリンシグナルに関与する経路の障害を見出した。アルツハイマー病の脳内にはアミロイドβで構成される老人斑とリン酸化タウにより形成される神経原線維変化が特徴的に認められる.時間的な病態としては,アミロイドβ蓄積がアルツハイマー病の最も初期のイベントであり,それに引き続きリン酸化タウの凝集蓄積が生じる.アミロイドβ蓄積に関する分子病態の理解が進む一方で,アミロイドβ蓄積によりタウリン酸化が生じる分子メカニズムのについては未だ不明な点が多い.本研究では,アミロイドβ依存性にタウリン酸化を誘導する分子群を同定することを目的としている.本研究では,研究代表者らが開発したアミロイドβ依存性に異常タウリン酸化をin vitroで再現する共培養システムを用いて解析を行っている.各種アミロイドβを産生するドナー細胞と,内在性タウを発現する初代神経培養細胞(レシピエント細胞)の共培養を行い,アミロイドβ依存性に異常リン酸化タウが生じることをウエスタンブロットにより確認した.この培養細胞から全RNAを回収し,RNA品質をRIN(RNA integrity number)スコアで評価したところ,良好な値を得た.回収したRNAを用いてRNA発現解析チップを用いて網羅的な解析を行い,過剰アミロイドβ依存性に発現が変動する分子を,それぞれ増加群,減少群とに区分しリストを作成した.特に変動が強かった分子については,TaqManプローブを用いたリアルタイムPCRによる発現解析を行い,発現チップ解析との相関を解析した.アルツハイマー病患者脳では,不溶性タンパクの凝集により老人斑と神経原線維変化が形成され,大脳に広範な神経細胞脱落が生じる.老人斑はアミロイドβ(Aβ)から成り,神経原線維変化はリン酸化タウを主要成分とする.アルツハイマー病を臨床的に発症する以前から,病理学的には老人斑および神経原線維変化はほぼ完成している点は注目に値する.Aβ蓄積に関する分子病態の知見が進む一方で,Aβ蓄積からリン酸化タウが誘導されるメカニズムについては未だ未解明である。本研究は,Aβ依存性にタウリン酸化を誘導する分子群を同定することを目的として実施した。本研究は,研究代表者らが開発したAβ依存性に異常タウリン酸化をin vitroで再現する共培養システムを用いた解析を行った。各種Aβを産生するドナー細胞と,内在性タウを発現する初代神経培養細胞(レシピエント細胞)の共培養を行い,Aβ依存性に異常リン酸化タウが誘導されることを免疫ブロットで確認した。このレシピエント細胞から全RNAを回収し,RNA品質をRINスコアで評価した。回収したRNAを用いてRNA発現解析チップを用い網羅的な解析を行い,Aβ依存性に発現が変動する分子を明らかにした。アルツハイマー病の病態機序として,アミロイドβ(Aβ)蓄積→異常リン酸化タウ→神経細胞障害にいたる「アミロイドカスケード」仮説がある.アミロイドカスケードの最上流に位置するAβ蓄積に関する機序が進む一方で,過剰Aβから異常リン酸化タウに至る機序はほとんど未解決である.本研究は,過剰Aβ→異常リン酸化タウを再現する共培養システムを構築し,この過程において変化する分子群を網羅的に解析する.この解析により,Aβ依存性に異常リン酸化タウを誘導する新たな標的分子を同定することを目的としている.本年度は,過剰Aβ→異常リン酸化タウを再現する共培養システムの構築を行った.ドナー細胞として過剰もしくは異常Aβを産生する細胞(HEK293)を,レシピエント細胞として初代神経培養細胞を共培養し,細胞外Aβがレシピエント細胞のタウ異常リン酸化を誘発できるか否かを検討した.過剰Aβ(APP Swedish変異),過剰Aβ42産生(PSEN1ΔT440変異),オリゴマーAβ(APPPΔE693変異)を産生するドナー細胞(HEK293)をレシピエント初代神経培養細胞と共培養を行い,レシピエント細胞の内在性タウを評価した.総タウ(Tau-5),脱リン酸化タウ(Tau-1)ではmock発現ドナー細胞と変化を認めなかった.

しかしながら,リン酸化特異抗体(AT8: p198/202,PHF6: ,AT180:)で解析を行うと,過剰および異常Aβを産生するドナー細胞との共培養で,リン酸化タウの蓄積が認められた.このAβ依存性異常タウリン酸化が生じる共培養システムを用い,レシピエント初代神経培養細胞からRNAを回収し,網羅的解析を行う準備が整った.研究はおおむね研究計画にそって順調に進展している.大きな支障は生じていない.研究計画に記載した予定にほぼ沿った形で研究が進行しているので.網羅的な解析により得られた結果について,個々の分子レベルの発現解析を行うとともに,変化がみられた遺伝子群の意味づけを行っていく必要がある.Aβ依存性異常タウリン酸化が生じる共培養システムを用い,レシピエント初代神経培養細胞からRNAを回収してRNAの品質をBioanalyzerを用いてチェックする.RNAチェックをクリアーしたサンプルについては,マイクロアレイを用いた網羅的な発現変動の解析を行う.発現解析に用いる試薬の納期が遅れたため,本年度未使用額は次年度の消耗品の経費として使用します.研究を遂行をする上での支障は生じない.消耗品700千円,旅費100千円を予定している
植物の分布を左右する微地形及び水分環境変動と発芽特性に関する研究

米国メリ-ランド州のChesapeake BayにあるEastern Shoreの農地に造成された130年の人工湿地(写真E)の遷移過程における埋土種子の役割及び定着過程を1994年3月10月に調べた。水位は春先に高く、徐々に減少しまた夏期に増加した。湿地植物のいくつかは水際付近に多く帯状に分布していた。アオイ科の多年生草本のHibiscus moscheutos L.の分布は特に際だっていた。造成後5年生の湿地(Wetland No.1)の地形測量・土壌水分測定を行い、H.moscheutos個体のサイズ・種子の量・埋土種子の数などを調べた。H.moscheutos実生の生態分布は春の最大水位の水際ラインから高低差にして±0.1mの付近に限られて生育しており、親個体よりも生態分布の狭い事が明らかになった。土壌水分のデータから実生はやや乾いた所に多い事が解った。Shootの高さと数ははあまり顕著な関係はなく、5-6本以下のShootを持つ個体が多かった。実生のあるのはShootの高さの比較的小さい個体の近くが多かった。さく果を付けない個体も半数近くあった。大部分の種子はさく果にあるうちコクゾウムシの類に食べられ地面に供給される種子はごくわずかであった。3つの人工湿地の土壌水分の異なる地点にH.moscheutosの種子を蒔いて、発芽率と土壌水分の関係を実験的に調べた。土壌水分15kPaの所で最も発芽率が高く、水中や乾燥した所では低かった。屋外でポットに種子を蒔き、異なる水位のもとで実生を育てた。過度に水分がある所では実生の生育が悪かった。また、ポットに種子を蒔き、乾燥する温室内で異なる水位のもとで実生を育てた。土壌水分の多い方が生育は良く、土壌水分と降水や湿度の環境条件で最適な水分環境が変化した。H.moscheutos実生の定着には土壌水分の関わりが大きい事が明らかになった。
アンチセンス導入による一酸化炭素の中枢性循環調節における役割

共にガス状シグナル伝達物質であり内皮由来血管拡張物質である一酸化窒素NOと一酸化炭素COの合成酵素は中枢神経系にも局在し交感神経活動や血圧調節に関与する。これらの合成阻害剤を中枢内に急性投与すると交感神経活動が亢進し血圧上昇がみられるが、長期の循環調節に対する中枢性NO及びCOの役割については未だ明らかでない。そこで今回末梢血管内皮に影響を与えない量のNO及びCOの合成阻害剤を浸透圧ポンプを用い脳内に長期間微量注入し血行動態の変化を検討した。7週齢の雄性Wistar ratの大槽に浸透圧ポンプに接続したシリコンチューブを挿入し、NG-monomethyl-L-arginine(L-NMMA)及び対照としてNO阻害作用を有しない光学異性体であるD-NMMAを、更にCO合成阻害剤としてzinc deutroporphyrin及び対照としてCO阻害作用を有しないdeutroporphyrinを一週間かけて持続投与し、この間の無拘束・覚醒状態の24時間血圧・心拍数の変化をテレメトリーにより持続測定した。観察終了後脳採取しNO産生の指標として脳内硝酸・亜硝酸(NOx)含量を測定した。L-NMMAによる慢性NO合成阻害はD-NMMA対照群に比し脳内NOx含量を明らかに低下させた(p<.05)。無拘束・自由行動下の血圧・心拍数及びそれらの変動性は24時間・日中・夜間何れにおいてもNO合成阻害・CO合成阻害共に変化しなかった。このことは、急性麻酔下実験の結果と相反するが、既に神経型NO合成酵素ノックアウトマウスの血圧が正常であるという報告と一致しており、慢性的には神経性NO及びCOが必ずしも降圧に作用しないことを示唆する。
ダイナミック パラトグラフィーによる舌運動の解析

歯科矯正臨床において、舌の機能異常が一因と考えられる不正咬合を治療することがある。その治療の補助的手段として、舌の機能訓練が行われている。しかし、正常咬合者や不正咬合者における発音や嚥下にともなう舌運動については、いまだ明確ではない。そこで平成5から7年度に渡り、舌運動を口蓋に装着した電極への舌の接触・非接触で見るダイナミックパラトグラフィーを用いて、舌運動と顎顔面形態との関連性について臨床的指針を得るため、以下の研究を行った。本学学生より種々の咬合を有する71名(男35、女36)を選出し、側方頭部X線規格写真の撮影、歯列模型の作製、および、嚥下時と発音時のダイナミックパラトグラムの記録を行った。それをもとに、嚥下に伴う舌運動時間の個体差と経日変動を分散分析(男女それぞれ7名に対して3日間)で、顎顔面形態とどのような関連性があるかを単相関分析、および重回帰分析で調べた。その結果、嚥下時の舌の口蓋接触時間に有意な個体差が認められ、嚥下時の舌の口蓋接触時間と下顎の回転に関する計測項目(下顎角、下顎下縁平面傾斜角、下顎下縁平面と大臼歯のなす角など)間、および、上顎前歯の唇舌側傾斜間に有意な単相関が認められた。また、舌の口蓋接触時間を従属変数、角度・距離計測数項目を独立変数とする重回帰式を得た。このことは、嚥下時の舌運動に伴う舌の口蓋への接触時間の相違が骨格形態と深い関わり合いがあることを示唆するものである。また、発音に伴う舌運動に関してはパラトグラフ上で視覚的に個体差は認められるが、有意か否かの判定は行えなかった。その客観的な判定方法の選択も今後の課題である。歯科矯正臨床において、舌癖による開咬を防ぐことは重要なことである。その方法の一つに、舌訓練があげられる。しかし、その効果を高めるための基礎資料となる、一般集団における発音や嚥下にともなう舌運動については、いまだ明確にわかってはいない。そこで、一般集団に対して、舌運動と顎顔面形態との関連性について検討を行い、舌運動の個体差について臨床的指針を得るため、以下の研究を行った。始めに、ダイナミックパラトグラフィーの記録方法を決定するために、予備実験(23例)を行い、記録方法を以下のように決定した。嚥下に伴う舌運動については、嚥下を行った際に舌が口蓋に触れ始めてから離れるまでの時間を5回記録し、最大、最小値を除く3回の平均を代表値とした。2.発音については、母音(いあえおう)と子音を含む(さしゃたら)を発音させ舌が口蓋に触れる状態を記録した。上記の記録方法に従って記録し、嚥下に伴う舌運動時間の個体差と経日変動を調べるための分散分析(10例)と、顎顔面形態とどのような関連性があるかを調べるための相関分析(32例)を行った。その結果、嚥下時の舌運動時間に有意な個体差や、舌運動時間と顎顔面形態(数項目)間に有意な相関が認められたがまだ例数が少なくはっきりとしたことが言えないので、今後も例数を増やし検討していく予定である。また、発音に伴う舌運動に関してはパラトグラフ上で視覚的に個体差は認められるが、有意か否かの判定は行っていないので、その客観的な判定方法の選択も今後の課題である。歯科矯正臨床において、不正咬合の改善の補助的手段として、舌の機能訓練が行われている。