hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
シグナル伝達に関与するGTP結合タンパク質の構造と機能

1.哺乳動物Gタンパク質の構造と機能については、昨年度に引続き、ヒトGoα及びGxα遺伝子の構造決定を行なった。Goα遺伝子のエキソン・イントロンの構造は、Giα遺伝子群のそれと同様で8個のエキソンを含んでいたが、Gxα遺伝子は2個のエキソンから構成されていた。現在、各Gαタンパク質の機能を解析するために、大腸菌でのリコンビナントGαタンパク質発現系の確立、各Gαタンパク質に対する抗体の調製等を行っている。2.哺乳動物Gタンパク質遺伝子の発現調節機構については、主にGi1α遺伝子について解析を行っている。今回、新たにラットGi1α遺伝子のプロモーター領域を単離しその構造を決定した。Gi1α遺伝子のプロモーター領域の中には、ヒトとラットの間でよく保存された領域が数個存在している事が明らかになった。ヒト及びラットGi1α遺伝子の発現に重要な領域をCATアッセイを用いて決定した。3.ras遺伝子の機能については、rasタンパク質を過剰生産しているマウスSwiss3T3細胞株を用い、PDGF刺激により、GTP結合型のrasタンパク質が増加することを明らかにした。このことは、この細胞では、rasタンパク質がPDGFを介するシグナル伝達系に関与していることを示している。今後、上記のような系を用いてrasタンパク質の機能を更に詳しく検討することを計画している。4.サッカロミセス酵母のRAS/cAMP系路による細胞増殖制御の解析を行ない、IRA1,IRA2と呼ばれる遺伝子の産物の機能が、哺乳動物においてrasタンパク質のGTPase活性を促進する因子として同定されたGAPと相同であり、哺乳動物GAPの発現によりその機能が代償しうることを明らかにした。この結果は、rasが関与するシグナル伝達系におけるGAPの機能を考える上で極めて重要な知見である。ホルモン,神経伝達の物質のシグナル伝達の際に,トランスデューサーとして機能しているGタンパク質,および細胞の増殖,分化の情報伝達に関与すると考えられるrasタンパク質は,いずれも膜局在性のGTP結合タンパク質である.本研究は主にこの両者の構造と機能の解析を目的としている.本年度に得られた主な知見をあげると, 1)ラットC6グリア腫cDNAライブラリーより,新たなGiα分子種(Gi3α)をコードするcDNAを単離し,その構造を決定した.2)ラット脳よりGilαcDNAを単離した.3)ヒト染色体遺伝子ライブラリーよりGsα, Gi2α, Gi3α, Goα,およびGilαに対する染色体遺伝子を単離した.前3者については全エキソン構造を明らかにした,現在後2者の解析を行っている.これらの遺伝子解析よりGiが少なくとも3種のsubtypesよりなることが明らかとなった.4)各Gα遺伝子の組織特異的発見をノザン分析より解析した.5)精製タンパク質の部分アミノ酸配列の決定より,哺乳動物の脳に存在する41KDa, 40KDaタンパク質が各々Gilα, Gi2αに相当することを示した.5)酵母S.CerevisiaeにGPA1, GPA2という少なくとも2種のGタンパク質αサブユニット相同遺伝子が存在することを明らかにし,前者は酵母接合因子のシグナル伝達に関与することを遺伝学的に示した.6)大腸菌を用い,野性型(Gly^2)および変異型(Vai^<12>)Ha-rasタンパク質を生産させ,両者のタンパク質化学的性質およびグアニンヌクレオチドの接合および水解活性を比較検討した.7)さらに,これらの組換え体rasタンパク質をPC12細胞に微量注入することにより,神経細胞への分化誘導の効果を調べGTP・rasタンパク質複合体が分化を誘起することを明らかにした.8)PDGFによるfibroblastの増殖刺激シグナル伝達系にrasが関与することを示し,イノシトールモノリン酸レベルの上昇を観察した.ホルモン、神経伝達物質などのシグナル伝達の際に、トランスデューサーとして機能しているGタンパク質、および細胞の増殖と文化の情報伝達に関与すると考えられているrasタンパク質は、いずれも膜局在性のGTP結合タンパク質である。本研究は主にこの両者の構造と機能の解析を目的としている。本年度に得られた主な知見をあげると、1.ラット脳よりGi1αの全長をコードするcDNAを単離しその構造を解析した。この結果、Gsα、Gi1α、Gi2α、Gi3α、GoαのcDNAを単離しその一次構造を決定した。2.ヒト染色体遺伝子ライブラリーより上記5種のGα遺伝子を単離し、その構造を明らかにした。3.百日咳毒素非感受性と思われる新たなGタンパク質αサブユニット(Gx.α)をコードするヒト染色体遺伝子の単離と解析を行い、さらにそれに対応するcDNAをラット脳より単離し、その構造を決定した。4.上記各Gα遺伝子のプロモーター領域の解析を行なうとともに、細胞レベルおよび無細胞系における遺伝子の発現とその調節機構に関する研究を開始した。5.先に酵母より単離し、酵母接合因子の情報伝達に関与することを示したGPA1について遺伝学的解析から、接合因子の情報伝達に関与するいくつかの新たな遺伝子を単離し解析を進めている。6.同じく酵母GPA2遺伝子の機能について解析を行っている。7.変異性ras遺伝子を誘導可能なプロモーターに連結してPC12細胞に導入した。この細胞株を用いて、変異型rasタンパク質の誘導的発現により神経突起形成が誘起されること、またこの場合に誘導されたrasタンパク質にはGTPが結合していることを明らかにした。8.rasタンパク質の発現を調節し得るfibroblast系培養細胞を作成した。

その細胞の解析から、rasタンパク質の発現にともなってβアドレナリン等の刺激に対する応答が減弱し、それが受容体数の減少に起因することが判明した。1.哺乳動物Gタンパク質の構造と機能については、昨年度に引続き、ヒトGoα及びGxα遺伝子の構造決定を行なった。Goα遺伝子のエキソン・イントロンの構造は、Giα遺伝子群のそれと同様で8個のエキソンを含んでいたが、Gxα遺伝子は2個のエキソンから構成されていた。現在、各Gαタンパク質の機能を解析するために、大腸菌でのリコンビナントGαタンパク質発現系の確立、各Gαタンパク質に対する抗体の調製等を行っている。2.哺乳動物Gタンパク質遺伝子の発現調節機構については、主にGi1α遺伝子について解析を行っている。今回、新たにラットGi1α遺伝子のプロモーター領域を単離しその構造を決定した。Gi1α遺伝子のプロモーター領域の中には、ヒトとラットの間でよく保存された領域が数個存在している事が明らかになった。ヒト及びラットGi1α遺伝子の発現に重要な領域をCATアッセイを用いて決定した。3.ras遺伝子の機能については、rasタンパク質を過剰生産しているマウスSwiss3T3細胞株を用い、PDGF刺激により、GTP結合型のrasタンパク質が増加することを明らかにした。このことは、この細胞では、rasタンパク質がPDGFを介するシグナル伝達系に関与していることを示している。今後、上記のような系を用いてrasタンパク質の機能を更に詳しく検討することを計画している。4.サッカロミセス酵母のRAS/cAMP系路による細胞増殖制御の解析を行ない、IRA1,IRA2と呼ばれる遺伝子の産物の機能が、哺乳動物においてrasタンパク質のGTPase活性を促進する因子として同定されたGAPと相同であり、哺乳動物GAPの発現によりその機能が代償しうることを明らかにした。この結果は、rasが関与するシグナル伝達系におけるGAPの機能を考える上で極めて重要な知見である。
非NMDAグルタミン酸受容体拮抗薬の脊髄鎮痛効果と副作用の研究

研究初年度は、予備実験を施行した。Sprague-Dawly系雄ラットを用いてペントバルビタール麻酔下に下部腰椎間からくも膜下腔にカテーテルを留置した。くも膜下腔に局所麻酔薬を投与し、投与前、投与後の鎮痛効果と循環動態の変動を測定した。ラットに生理食塩水を投与しても、Tail Flick test値の%MPEの変化はなかった。局所麻酔薬リドカインをくも膜下投与すると、Tail Flick test値の%MPEは用量依存性に上昇した。循環動態の変動を調べるために吸入麻酔薬ハロタンを用いて全身麻酔下に局所麻酔薬リドカインをくも膜下投与した。全身麻酔導入後から徐々に血圧の低下し、血圧が安定したところでリドカインをくも膜下投与した。低濃度から高濃度の鎮痛効果が得られた投与量では循環に変動はなかった。次に、ペントバルビタール麻酔下にリドカインをくも膜下投与した。この場合も、ペントバルビタール麻酔後から徐々に血圧が低下し、血圧が安定したところでリドカインをくも膜下投与したが、全身麻酔下と同様にリドカインで鎮痛効果が確認された投与量では循環に変動はなかった。覚醒下のラットのくも膜下にリドカインを投与したところ、この状態においても鎮痛効果の得られる投与量では循環の変動はなかったが、鎮痛効果が得られる何倍もの投与量では血圧の低下がみられた。次年度は、引き続き非NMDAグルタミン酸受容体拮抗薬の単独投与と局所麻酔薬との混合薬をくも膜下投与したときの鎮痛効果、並びにその際の循環変動を調べる予定である。
触地図とオンライン地図との情報共有化手法の提案

本研究は,触地図をオンライン地図のような情報を引き出す利用形態にすることを目標としている。すなわち,オンライン地図から道路情報のみを抽出したベクトルデータ型の触地図を作成して,元のオンライン地図と触地図との間で情報の共有化を図る。触地図上の触指位置の検出は電子ペンの技術を用いることで,触地図とオンライン地図の位置が同期されて,全盲者でもオンライン地図の便利な機能や情報提供を受けることが可能となる。近年,地理情報システムの発達により,誰もがパソコンや携帯端末などでオンライン地図(例えば,グーグルマップやヤフーマップなど)を利用している。最近,タブレット型パソコンに,画面の拡大操作や読み上げ操作などのアクセシビリティ機能が充実された結果,弱視者はオンライン地図を使えるようになったが,全盲者は未だ,旧来からの触地図に頼るのみである。本研究は,触地図とオンライン地図との情報共有化を図り,全盲者でもオンライン地図の便利な機能や情報支援を受けられることを目標としている。初年度である平成25年度は,オンライン地図から道路情報を抽出し,ベクトルデータ型の簡易触地図を作成することを試みた。その手順は,オンライン地図画像から,文字領域と地図記号,アイコン記号の抽出を行い,道路領域を判定して道路情報をベクター画像(例えば,SVGファイルなど)に変換する。また,文字認識された文字列と地図記号,アイコン記号などは説明をテキスト化し,音声化用のファイルとして蓄える。この際,文字領域の抽出や文字認識は既存の手法を利用している。作成したベクター画像,すなわち,ベクトルデータ型簡易触地図は,編集作業が可能な自己メンテナンス型で,様々な用途への触地図作成が可能となる。この簡易触地図と元のオンライン地図との間で情報の共有化を図るには,簡易触地図上の触指位置の検出が必要になるが,これは平成26年度の課題である。最近,パソコンに手書き文字を入力する電子ペンが流行っているが,その手法を用いた指サック型の触指位置検出機器があれば,簡易触地図とオンライン地図の位置同期がとれて,全盲者でもオンライン地図の機能や情報を受け取ることが可能となる。現在,誰もがパソコンや携帯端末などでオンライン地図(例えば,グーグルマップやヤフーマップなど)を利用している。また,最近のタブレット端末は画面の拡大操作や読み上げ操作などのアクセシビリティ機能が充実した結果,弱視者はオンライン地図を使えるようになった。しかし,全盲者は未だに旧来からの触地図に頼るのみである。本研究課題は,触地図とオンライン地図との情報共有化を図り,全盲者でもオンライン地図の便利な機能や情報支援が受けられることを目標としている。平成25年度の成果である“オンライン地図からの道路情報抽出"と“ベクトルデータ型の簡易触地図作成"をもとに,平成26年度は簡易触地図と元のオンライン地図との間で情報の共有化を図った。そのためには簡易触地図上での触指位置検出が必要となる。近年,パソコンに手書き文字を入力する電子ペンが普及しているが,その原理である赤外線・超音波法(赤外線と超音波の時間差で位置を同定する)を用いて,触指位置の検出プログラムを作成した。研究計画では,赤外線・超音波法を用いた指サック型の触指位置検出装置の開発を目指していたが,センサの精度やノイズによる誤差の関係上,触地図のような狭い2次元平面では触指位置の同定が難しい場面が生じた。そのため,指先に貼り付けたマーカーを高性能カメラが認識して位置を同定する光学的手法を併用して,被験者の触指位置の検出を行った。構築したシステムで実験した結果,簡易触地図とオンライン地図との位置同期がとれて,全盲者でもオンライン地図の情報や機能を受け取れることが確認できた。また,触指位置の検出は図形のエッジ軌跡を追跡できるので,被験者がどのように図形イメージを把握するのかを計測可能になった。これは,視覚障害者が行う図形イメージの獲得分析や認知理解へのアクセシビリティ支援に展開できる。情報学交付申請書に記載した平成25年度の計画項目は「1.オンライン地図から道路情報のみを抽出してベクトルデータ型簡易触地図を作成すること,2.その触地図を自己メンテナンス型にすること」であり,これらは概ね達成できた。項目1に関して,オンライン地図から道路情報を抽出する際,グーグルマップを例にとると,そのAPIを使えば簡単に記述できる。また,我々は過去に地図画像に音声テキストを埋め込んだベクトルデータ型ファイルの作成経験があるので,簡易触地図の作成も順調に遂行できた。項目2に関して,抽出データを自己メンテナンス型にする理由は,オンライン地図には載っていない点字ブロックや音声付きの交差点信号などの情報を書き加えるためである。視覚障害者に必要と思われる情報編集の自由さは確保したつもりであるが,もう少し工夫する必要がある。これらのことから上記のとおり達成度を評価した。交付申請書に記載した平成26年度の計画項目は「3.簡易触地図上の触指位置の検出,4.ベクトルデータ型簡易触地図とオンライン地図の位置同期を図ること」である。これらはハードウェアを伴う研究であるので困難さが予想される。項目3に関して,現状では触指位置の検出を,赤外線・超音波法による電子ペンの原理で検討している。

その基本技術はイスラエルの会社が所有しており,ソフトウェア開発ツールも公開されている。しかし我々は,視覚障害者向きの指サック型触指位置検出機器を開発するつもりであり,これに電子ペンの基本技術が使えるか否かは研究計画に影響を及ぼすので慎重に対処したい。項目4に関して,両地図の位置同期は触地図の指定した位置を触指することで行う。そのため,項目3が達成されれば簡単である。共有化インタフェースプログラムを開発して,触指位置をマウス位置として機能させることを考えている。次年度使用額の61円が生じた理由は,交付申請段階で予定していた測定機器が使用できずに,新たな測定機器部品を購入したことによる物品費の見込み違いであった。このため,当初予定していた旅費の半額(30万円ほど)と人件費・謝金(5万円)を物品費(当初の予定は75万円)に充てて対処した結果の残金である。次年度使用額の61円は,平成26年度請求額と合わせて物品費に充てる予定である。
都市の地震災害脆弱性の定量評価とその国際比較に関する研究

本研究の志向には国際防災の10年の活動があり、防災先進国の我国の研究者として発展途上国を主として対象と取り上げ地震災害の軽減に寄与できればとの考えから計画した。研究の進め方として1つは都市のマクロ情報から防災に関連する情報を収集し、それから都市の地震災害脆弱性を定量的に評価すること、並びに先進国のそれと比較検討する。次は特定の幾つかの都市について出来るだけその内部の地域を細分化し、各々の地域の自然条件や地域の都市構造、社会・経済システム等から科学的によりミクロな視点で地震災害危険度を評価しようとした。前者についてはほぼ方法論は確立したが、発展途上国の都市は、この事を評価しようとするとき問題になるのは必要となる資料が乏しい事にある。それで評価指標を16項目程度に絞り込む手法を開発した。その過程で明らかになったのは死傷者の多発は経済被害も大きいことを意味し、兵庫県南部地震でその事が実証されてしまった。即ち先進国では人的被害は少なく経済被害に対する脆弱性が問題になると考えられてきたのだが、この震災では共通の課題である事を認識させられた。なお、この地震に際し我国大都市の地震災害脆弱性を評価・比較し、神戸市はその点で平均的な都市であった事、手法の一般性を確認した。後者については我国の幾つかの都市、さらにはマニラ大都市圏、メキシコ市をモデル都市として研究を進め、その幾つかは本研究の期間内に発表した。この研究でも問題になるのは資料の整備の度合いである。我国では相当に小さな都市でもそれらは良く整っているが、米国など先進国でも国際比較に耐えうるほど整備されていないか、入手困難であった。考え方は我国の都市のように木造住宅が相当数を占める都市とそうでない都市、および都市規模により評価法を変えることが基本となるが、地盤条件と構造物の被害(震度)の関係など兵庫県南部地震を中心に現在も解析中である。研究の初年度にあたり、都市の地震脆弱性に関する一般化評価スキームの立案に向けて、マクロ・レベル(国べつ)、メソ・レベル(都市にべつ)での調査・研究をすすめた。1.マクロ・レベルの調査・研究:既存の地震カタログを用いて被害データを収集し、被災国の所得水準(一人あたり国民総生産額)に対する被害額の変化を記載する評価式をみちびいた。また、これを利用した試算により、経済開発の初期段階にある国々において、地震脆弱性が高まることを明らかにした。次年度以降、この成果を発展させ、被災域の人為環境(都市特性)を説明要因として取り入れつつ、災害脆弱性を評価する手法を具体化する予定である。2.メソ・レベルの調査研究:世界各地の都市(途上国では、マニラ、メキシコシティ、アンカラ、先進国では、サンフランシスコ、ウェリントン)で行った、専門家および一般市民に対するアンケート調査の結果を分析した。専門家に対する調査の結果からは、都市ごとの震災イメージと地震対策上の問題点を、また、市民に対する調査の結果からは、防災意識や災害時に予想される行動について整理した。この作業によって、次年度に計画している、都市間比較のための素材の準備を完了した。さらに、アンケート調査をおこなった都市を対象として、都市の環境に関する地域データの収集を試み、これを利用した脆弱性評価の方法と、その実現の可能性について検討をすすめた。

11.研究発表に示すように、1994年12月の日本地震工学シンポジウムにおいて、塩野計司以下、分担者、代表者は共著として(米国、メキシコ、フィリピンなどの被災国で実施したアンケート調査やマクロデータ(既往の地震災害の諸データ、経済的諸データ)から、先進国、発展途上国の災害構造を把握、検討し、それぞれの発展レベルの国々間の地震災害脆弱性を定量比較した。総合都市研究第55号で中林以下3名が発表したように、各国の防災エキスパートアンケート調査、市民アンケート調査を実施し、対する首都圏の1都市市川市で実施した市民アンケート調査を整理分析し、大都における防災まちづくりと居住環境整備の方向性を探った。主として近年、北海道各地で地震が多発した。代表者望月を中心にそれらの被災地の自然条件、社会・経済構造、インフラの実態を調査し、GISをツールとして、災害の地域性を総合的に解明した。この調査研究実施中、兵庫県南部地震が発生した。現在組織的調査を実施中であり、カリフォルニアの幾つかの最近の地震災害を再調査し、地震と震害の総合比較を開始した。代表者を中心に首都圏とりわけ東京の被災危険度を再調査し、その一部は上記日本地震工学シンポジウムで発表した。同様の研究をメトロマニラで実施中であり、同様の機会にその一部を発表した。平成7年度は兵庫県南部地震(阪神・淡路大震災)の調査等に相当のエネルギーを代表者,分担者とも注がざるを得なかった。11.に示す総合都市研究は上記震災の特集号であり、本研究の担当者による論文(報告)が7編を占める。ところで、この震災の被災地は主として神戸市を中心とする関西大都市圏であり、我国大都市が、これほど地震災害に対し脆弱であった事は我国のみならず世界の地震工学(防災)研究者たちに大きな衝撃を与えた。それ故,ここに計画・実施してきた本研究の主旨から考えても重視しえない重要なイベントであるとの立脚点から主として東京都区部を含む我国の全政令都市の自然条件、都市・社会構造などでも地震災害に関わる可能性がある40の都市情報を収集し、神戸市のそれらと被災状況の関係を分析しつつ都市の地震災害脆弱性を規定する要因を定量的に解明することを本研究における重要な課題と位置付けた。手法は上記をはじめ被害量の諸々の資料の収集,地震防災研究者へのいわゆるエキスパートアンケート,多変量解析法を含む様々な数学的モデルの適用等である。成果はまだ十分とは言えないが,主成分分析の結果が現状では上記の目的に最も適合することから11thWCEEに論文として発表する予定である。当然、そこで提案する手法は資料が外国の諸都市についても同レベルで得られるとすれば、定量的な国際比較に十分耐えられると考えている。なお本年度の外国の都市における事例研究としては、分担者の一人松田磐余がカラカス(ベネズエラ)を訪問し、資料収集を行い国際比較のための解析を実施中であり,また申請時,研究分担者の一人であった現長岡工専助教授塩野計司が中国,トルコに出張し同様のプロセスにある。本研究は本年(平成7年度)をもって終了することから平成8年度中にはそれらを全て終了させ,従来の研究成果と併わせ申請した到達目標に適合するよう研究のとりまとめを急いでいる。
心筋細胞分化の段階的DNAメチル化プロファイリングと幹細胞分化能評価ツールの開発

エピゲノム情報はその分化可能性を評価する指標となることが考えられるが、どのような領域のエピジェネティック状態が細胞の性質に影響しうるかは明らかでない。本研究では、細胞種に特徴的な未知のエピゲノム変化を探索し、幹細胞の分化可能性評価のためのエピゲノム情報基盤を整備することが目的である。本研究計画内において、申請者らは心筋細胞特異的なgene body領域の低メチル化状態を見出した。広範囲に渡る低メチル化状態は、転写およびエピジェネティック因子の蓄積を伴っており、細胞の特性に密接に関わるエピゲノムを形成する一因となる。本研究計画では、エピゲノム情報による幹細胞評価系の整備に重要な細胞特異的エピジェネティック状態を見出した。本研究計画では、iPS細胞など人工的に作出された幹細胞の分化能を評価する基準を整備するために心筋細胞分化におけるエピジェネティックな変化の筋道となる重要な領域(心筋細胞DNAメチル化ランドマーク領域:CM-DMLR領域)を選出することを目的としている。そのため、22年度は心筋細胞の分化過程における経時的DNAメチル化プロファイルを作るために、培養下での心筋細胞分化誘導系を用いて均一な細胞集団を作製したが、得られた心筋細胞の品質の均一化の評価が必要であると考えられた。そこで、均一性の評価のために生体由来心筋細胞集団DNAメチル化プロファイルを作成した。胎仔期、新生仔期、成体から心筋細胞を精製し、経時的DNAメチル化プロファイルを作成し、非心筋細胞のコントロールとして心臓線維芽細胞のDNAメチル化プロファイルも作成し、比較を行なった。心筋および非心筋細胞の遺伝子発現プロファイルから、遺伝子発現パターンに基づき遺伝子群を分類して比較すると、心筋細胞特異的発現を示す遺伝子群の一部に、心筋細胞特異的に低メチル化状態になる集団が観察された。これらの低メチル化状態は遺伝子発現変化とは独立に新生仔期以降に形成されるため、心筋細胞が成熟する過程におけるエピジェネティック動態を反映していると考えられる。分化後細胞におけるエピジェネティック動態のメカニズムは大変興味深い。これらは本計画の目的とするCM-DMLR領域の候補領域と考えられ、心筋細胞分化および成熟度の評価に利用可能であると期待される。H22年度に引き続き、本課題ではCM-DMLR領域の同定のために、HELP法によるDNAメチル化プロファイルの解析を行った。生体由来心筋細胞集団のDNAメチル化データより、心筋細胞に特異的なDNAメチル化パターンを持つ領域を抽出した。更に包括的に、細胞特異的遺伝子を抽出、比較するために肝臓組織を用いた遺伝子発現およびDNAメチル化パターンの解析を追加した。心筋細胞特異的遺伝子のプロモーター領域に注目した結果、心筋細胞特異的に高発現する遺伝子のプロモーターはES細胞及び肝臓の細胞でメチル化され、心臓の組織でのみ脱メチル化されており、その多くは既に報告されている低CpG頻度を持つ細胞特異的プロモーター領域の特徴を備えていた。一方、心筋特異的ミオシン重鎖タンパクのMyh6・Myh7を始めとする心筋細胞特異的遺伝子群は、プロモーターのみならず、gene body領域(プロモーター以外のエクソン-イントロンを含む遺伝子コード領域)全体が低メチル化状態にあった。これはゲノム全体から見て稀な現象であるが、エピジェネティック状態を集約したENCODE projectデータから、これらの遺伝子のgene body領域には、特にRNAポリメラーゼII(pol II)、脱アセチル化酵素p300およびCTCFが高度に蓄積されていることがわかった。これらDNA結合因子の蓄積は、わずかではあるが他の低メチル化領域にも存在することがゲノムワイドな比較から明らかになったことから、gene body領域の顕著な低メチル化状態が、pol IIなどの蓄積を助け、相乗的に細胞特異的遺伝子の転写活性の効率化に貢献している可能性が考えられる。幹細胞及び発生時間軸に沿った心筋細胞のDNAメチル化profileの完成により、心筋細胞の細胞種特異的遺伝子発現とエピゲノム動態の連係についての新たな知見が加えられた。23年度が最終年度であるため、記入しない。
神経損傷によって誘導される上位中枢神経回路の改編におけるミクログリアの制御機構

末梢神経の損傷は、直接は損傷を受けない上位中枢神経回路の改編を引き起こす。本研究では、ヒゲ感覚神経経路を用いて、神経損傷モデルマウスを使い損傷に伴う体性感覚伝導路の改編を誘導するメカニズムを明らかにすることを目標とした。メカニズムを明らかにする前に、視床神経回路の改編過程を明らかにした。ヒゲ神経損傷をした後、視床の上行性線維に異所性線維が侵入し、それと同領域の受容野が広がり、異所性のアロデニアが起きることを明らかにし論文に報告した。この現象を基軸に、シナプス改編の制御に関与するという特性からミクログリアの役割に着目した。組織学的解析から、神経損傷は損傷経路特異的にミクログリアの活性化を引き起こすことがわかった。脳幹では、体性感覚伝導路である三叉神経核のヒゲ受容野において顕著なミクログリアの凝集と、活性型に特徴的な細胞形態変化や分子発現の上昇が見られた。これらミクログリアの活性変化は、三叉神経核のヒゲ以外の受容野や、偽手術マウスの三叉神経核では見られなかった。一方、改編が生じる視床では、ミクログリアの細胞密度、また活性化に大きな変化は見られなかった。次に、神経損傷に伴うミクログリアの活性化を制御するため、薬理学的(マウスの餌を介して経口投与)、または遺伝学的(ミクログリアのCreマウスと、Cre依存にジフテリア毒素受容体を発現するマウスを用いる)なミクログリアの除去を行った。ミクログリア除去マウスを用いた電気生理学的解析から、ヒゲ感覚神経の損傷による視床回路の改編が抑制されることがわかった。マウスにおいて、ヒゲ感覚神経の損傷は下顎への感覚刺激に対する異所的アロディニアを引き起こす。ミクログリア除去マウスでは、この異所的アロディニア応答も抑制された。29年度が最終年度であるため、記入しない。ヒゲ感覚神経である眼窩下神経を切断することで末梢神経が損傷したマウスを作製し、損傷から視床回路改編が起きるまでの期間におけるミクログリア活性を免疫組織化学的手法によって調べた。損傷したヒゲ感覚の伝導路は、これまでに我々が確立してきた遺伝学的ツールを用いて可視化した。この結果、神経損傷後に視床回路改編が生じる術後5-6日より前の時期で、損傷経路特異的にミクログリアが集積することを見出した。損傷経路のPr5核では、手術の翌日からバレレット領域特異的にミクログリアの集積が見られた。このミクログリアの集積は損傷後3日の時点でほぼ最大に近くなり、その後、視床回路改編が引き起こされる損傷から1週間後においても持続していた。また、損傷経路のPr5核バレレット領域におけるミクログリアは活性化型に特有の細胞形態を有しており、免疫組織化学的手法を用いることで、高い貪食活性マーカー発現を示すこともわかった。これらのミクログリア集積や活性化は対照である非損傷経路のPr5核領域や、偽手術を施したマウス群においては有意に認められなかった。一方、回路改編の舞台である視床VPm核バレロイド領域では、Pr5核バレレット領域に見られたようなミクログリアの顕著な集積や活性化の指標となる細胞形態・貪食活性マーカーの高発現は認められなかった。以上の結果から、神経損傷に伴う視床回路改編には、VPm核よりも内側毛帯線維の起始核であるPr5核におけるミクログリア活性が強く関与していることが示唆された。このため、時期特異的なミクログリアの選択的除去を行うための新たな遺伝子改変マウス系統の導入を進め、ミクログリア活性の操作が直接的に視床回路改編へ作用するかを調べる実験を開始しつつある。神経損傷に伴う視床回路改編を誘導する因子として、ミクログリア活性に着目した。その結果、損傷後の回路改編に先んじて、損傷経路特異的にミクログリア活性が上昇することを見出した。また、神経損傷に伴う疼痛様行動を評価する行動実験系の立ち上げも試行している。当初の計画にあわせて研究が進捗しており、結果も得られつつある。従って、今後の研究のさらなる発展が期待できる。

次に、神経損傷に伴うミクログリアの活性化を制御するため、薬理学的(マウスの餌を介して経口投与)、または遺伝学的(ミクログリアのCreマウスと、Cre依存にジフテリア毒素受容体を発現するマウスを用いる)なミクログリアの除去を行った。ミクログリア除去マウスを用いた電気生理学的解析から、ヒゲ感覚神経の損傷による視床回路の改編が抑制されることがわかった。マウスにおいて、ヒゲ感覚神経の損傷は下顎への感覚刺激に対する異所的アロディニアを引き起こす。ミクログリア除去マウスでは、この異所的アロディニア応答も抑制された。平成29年度は、昨年度に得られた知見を元に、遺伝子改変マウスを用いて神経損傷前後の時期特異的にミクログリアを選択的に除去する手法を用いることで、ミクログリア活性の視床回路改編への直接的な影響を電気生理学的かつ組織学的に評価する。さらに、このミクログリア活性の遺伝的制御を用いて、ミクログリア活性の疼痛様行動への影響も行動学的に調べる。29年度が最終年度であるため、記入しない。
車粉公害に伴う粉塵吸入量の実測

仙台市内では冬季にスパイクタイヤが多用され、このタイヤは非積雪面を車両が走る場合には路面を著しく摩耗させ、この道路粉塵が市内中心部の環境汚染を著しいものとし健康影響が問題となり、1984年冬季より健康影響調査を行ってきた。本年度は健康影響に関連し最も懸念される吸入性粉塵の量およびその中の遊離珪酸濃度について検討を行った。(1)大気粉塵中の吸入性粉塵濃度の季節的変動の解明とその中の遊離珪酸濃度を明らかにするため、分析上の制約から大量の粉塵を集める必要もありハイボリュームエアサンプラー(紀本電子、モデル-1201)およびアンダーセンサンプラー(ダイレック、AN-200)を用いて1986年2月よりスパイクタイヤ多用期の4月まで毎週および非使用期の7,8,9,11月は月に1度各1週間の連続した採集を行い、1987年1月の採集後に全試料を対象にX線分析法およびICP法、原子吸光法によりSi【O_2】を始め有害重金属を中心に元素分析を行っている。(2)1986年12月より近年急速に開発されたポータブルダストサンプラー(柴田科学、L-4W)および粉塵用個人サンプラー(柴田科学、PS-46)を用いて、とくに道路に面した条件等の高濃度曝露下で各個人が、吸入性粉塵とくにその中でSi【O_2】に一日どの程度に曝露されているかを推定するための調査を検討した。微量のSi【O_2】を直接ICP装置に導入し測定することを考え、粉塵を小溶液に捕集し、捕集液を密閉式テフロンルツボ(ユニシール社)を用いて湿式酸分解処理を行った。ポータブルダストサンプラー捕集ではインピンジャーに蒸留水50ml、個人サンプラー捕集にはミゼットインピンジャーに蒸留水を10ml用い、68時間のサンプリングを高値で行った時、ICP法でSi,Al,Fe,Ca等へ定量が可能となった。
酸化ストレスをターゲットにした頭頸部重複癌に対する治療戦略

本研究は治療に難渋する頭頸部領域の重複癌について、酸化ストレスの関与を病理組織学的レベルから分子生物学的レベルで解析し、酸化ストレスをターゲットにした頭頸部重複癌治療/予防への臨床応用を展開するための研究基盤を確立することが目的である。過去2年の研究実績として、1.頭頚部領域の酸化ストレスの発現の解析のため、動注化学療法を行った症例についてHIF-1,p53,p16を解析した。2.以前解析した上咽頭癌症例において8-ニトログアニンの発現解析を行い、他の酸化ストレスマーカーとの関連を解析した。3.重複癌の代表切片を用いたHIF-1、8-OHdG発現の解析を行った。4.パラフィン包埋標本およびフローズン標本を用いたcDNAの作成を行った。最終年度の研究実績として、作成したcDNAを用いて酸化ストレス関連因子の遺伝子解析を行い、過去に行ったHIF-1、8-OHdG発現との相関について解析した。平成24年度の研究実績として、頭頚部領域の酸化ストレスの発現の解析としてまず、動注化学療法を行った症例についてHIF-1,p53,p16を解析。以前解析した上咽頭癌症例において8-ニトログアニンの発現解析を行い、他の酸化ストレスマーカーとの関連を解析をおこなった。現在の研究実績として1.重複癌の代表切片を用いて、酸化ストレスマーカーであるHIF-1α、8-OHdG発現の解析。2.マイクロダイセクションによる、重複癌それぞれのcDNAを抽出し、酸化ストレスマーカーの遺伝子解析。以上の2項目について検討中である。現在の研究実績として1.頭頚部領域の酸化ストレスの発現の解析としてまず、動注化学療法を行った症例についてHIF-1,p53,p16を解析。2.以前解析した上咽頭癌症例において8-ニトログアニンの発現解析を行い、他の酸化ストレスマーカーとの関連を解析。以上の2項目について発表準備中である。今年度の目標であった、酸化ストレスマーカーの分子生物学的解析が順調に進んでいるから。酸化ストレスマーカーおよびその防御因子についての分子生物学的解析を行うとともに、喫煙や環境因子など酸化ストレスマーカーに影響を与えうる項目についても検討する。酸化ストレスマーカーとしての他の因子の解析を継続するとともに、酸化ストレスマーカーが蓄積するメカニズムを解析するため、酸化ストレスに対する防御因子の解析を行う計画である。購入予定物品を当該年度に購入しなかったため。プライマーや免疫染色の抗体を購入予定である。酸化ストレスマーカー解析システムとして解析用顕微鏡、記録用カメラ、解析用パソコンを購入予定である。また、複数の研究室で研究をしているため、データ保存用システムとしてNASを用いたデータ保存を行うため、RAID HDD、バックアップ用HDDを購入予定である。
視神経炎治療の基礎的研究

視神経炎の動物モデルを作製するために、リン脂質であるカルジヲリピン、ミエリン塩基性蛋白を完全フロイントアジュバントとともにWistaer系ラットおよび家兎皮下に注入し、その前後で生じる視機能変化を観察した。カルジヲリピン注入は家兎を用いて行ったが、追感作を施行しても有為な視覚誘発電位(VEP)の延長は認められず、組織学的にも網膜、視神経に変化は観察できなかった。ミエリン塩基性蛋白10mgをアジュバントとともに家兎に注入したところ、注入後約2週間より約10%の体重減少が出現し、約20msecに認められるVEP頂点潜時は25msec延長した。検眼鏡的には家兎の有髄神経線維が一部脱落している変化が認められたが、組織学的な検索はまだできていない。現在研究を続行している。なお生化学的な検査を行うためにラットを用いて同様の感作をおこなっている。これら視神経炎モデルの作製と並行して、視神経賦活療法に応用する目的で、近年発見された血管由来弛緩因子である一酸化窒素(NO)の眼循環改善作用、視機能に対する影響を研究した。NO自発発生化合物であるSNAPを家兎硝子体内に注入すると、視神経乳頭血流量は注入後90-120分をピークに増加し、NOに眼循環改善作用があることが確認された。しかし一方で網膜電位図(ERG)a波振幅の減少、潜時延長などの網膜毒性の存在も明らかになり、組織学的にも視細胞層の障害が明らかに確認された。NOは現在眼科だけでなくあらゆる分野で注目されているが、本来ラジカル反応を惹起する物質であり、臨床応用には毒性の問題を解決する必要があると思われる。
MAGE-3抗原提示樹枝状細胞を用いたHCCに対するCTL誘導の試み

ヒト肝細胞癌患者末梢血より樹状細胞を分離し、ヒトIL-4及びGM-CSFにて7日間培養して成熟樹状細胞を誘導した。成熟樹状細胞の表面マーカーをFACSにて解析した結果、CDla,11b,14,16,80,83,86,HLA-A,B,C,HLA,-DR,ICAM-1の表出を認めた。特にCD1a,14,16,83はその表出に個人差が認められた。成熟樹状細胞をHLA-A2結合性の合成MAGE-3ペプチド(アミノ酸配列:FLWGPRALV)にてハルスし、患者自己リンパ球と混合培養してMAGE-3特異的CTLを誘導した。In vitroでのCytotoxicity assayにてこのCTLはMAGE-3陽性自己肝細胞癌及びMAGE-3陽性HLA-A2陽性非自己肝細胞癌株に対して高い細胞障害活性を示したが、HLA-A2陰性MGAE-3陰性肝細胞癌株に対しては細胞障害活性を示さず、MAGE-3抗原特異的細胞障害活性を示した。12例の肝細胞癌症例におけるMAGE-3mRNAの発現をRT-PCRにて検索した結果、12例中6例にMAGE-3mRNAの発現を認め、肝細胞活におけるMAGE-3mRNAの発現率は50%であった。MAGE-3特異的CTLの誘導にIL-12を併用することにより細胞障害活性の著明な増強が確認された。この細胞障害活性の増強は非特異的な傾向が認められた。以上本研究により合成MAGE-3ペプチド捉示白己樹状細胞を用いてMAGE-3抗原特異的CTLの誘導が可能であり、MAGE-3陽性ヒト肝細胞癌に対する新しい免疫療法と臨床応用への期待が示された。本年度は最初にヒト肝細胞癌患者からの自己樹状細胞の分離培養系の確立を研究した。肝細胞癌患者自己末梢血よりFicoll-Perque比重遠心分離法にて単核細胞層を採取し、37度にて2時間静置培養し非付着細胞を取り除き、ヒトGM-CSF及びIL-4添加培養液にて710日培養して成熟樹状細胞を誘導した。この樹状細胞は樹枝状の突起を有し、CD11b,CD14,CD83,HLA-A,B,C,HLA-DR,CD80(B7.1),CD86(B7.2)の表出をFACSにて認めた。この樹状細胞を自己肝細胞癌でパルスして自己リンパ球と混合培養することにより自己腫瘍特異的な細胞障害活性を有するCTLが誘導可能であった。次に肝細胞癌におけるMAGE-3抗原の発現を調べるために、新鮮肝細胞癌のtotalRNAを抽出し、RT-PCRにてMAGE-3mRNAの発現を検索した。またそれぞれの症例でHLAをタイピングした。実験対象としている培養肝細胞癌株のMAGE-3mRNAの発現を同様にRT-PCRで検討した。MAGE-3抗原ペプチドの合成はすでに海外で臨床に使用されているアミノ酸配列を利用して合成した(FLWGPRALV)。このペプチドは現在臨床試験が開始されており、今後我が国での臨床治療に向けて安全性の評価が可能なペプチドであると考えられる。平成10年度にはMAGE-3抗原ペプチドにてパルスした自己樹状細胞を用いてCTLを誘導し、その自己肝細胞癌、MAGE-3抗原陽性肝細胞癌株に対する細胞障害活性と抗原特異的Type1/Type2サイトカイン産生能を評価する予定である。
位置非依存的な新しい分子コーディング法の開発とコンピュータ支援創薬への応用

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
ミラ型変光星の精密位置天文観測による天の川銀河の動力学的研究

VERA電波望遠鏡を用いて高精度位置天文VLBI観測を行ってきた。本申請課題の期間に2件の論文が日本天文学会の査読付き雑誌に掲載された。AGB星の星周現象や銀河系内での運動などが明らかになった。年周視差が計測された天体数は6天体に増え、周期光度関係確立のためのデータが揃いつつある。HIPPARCOS衛星のデータをもとにして、視線速度、距離などのデータベースを整理し、およそ300天体の銀河系内ミラ型変光星について6次元動力学情報が整理された。銀河系内のミラ型変光星の距離を精密に測定するために、21年度はVERAによる位置天文観測を中心にして進めてきた。ミラ型変光星であるT UMa,Y Lib,Z Pup,GX Mon,U Lyn、RX Booなどの天体をモニター観測してきたが、21年度の研究期間中にこの中の2つの天体の年周視差計測に成功し、距離を決定することができた。それまでに計測が成功していた天体と合わせて7つの天体についての距離が計測できたことになり、本研究の大きな目標であるミラ型変光星の周期光度関係の確立に向けて大きく前進したといえる。また年度中に新たに5つの天体(S Crb,SW Lib,Fs Lib,IRC-20540,IRC+10374)の観測も開始し、順調にモニター観測が進んでいる。現在これらの新規観測のデータが届き始め、天体からの電波が受信できていることを確認済みである。年周視差を計測するために、更におよそ1年の継続観測が必要である。また1m光赤外線望遠鏡を用いた観測についても赤外線モニター観測のデータ解析が進み、およそ260天体の変光星について変光周期が求められ、同時に見かけの明るさ(実視等級)の計測も行うことができた。これらの情報とVERAにより求められた周期光度関係の予備的結果を利用することにより、上記260天体までの距離を推定することができた。天体数はまだまだ少ないが、これは本研究の目標である銀河系内ミラ型変光星の3次元動的地図作成の初期結果となるものである。現在は視線速度等の情報を論文を中心とした文献資料から整理しているところであり、現段階で得られている情報に運動情報を加えるためのステップとなる。HIPPARCOS衛星による固有運動の計測結果データベースを活用した星の運動情報の収集も進んでいる。天文学において星までの距離は天体の大きさなどの物理量に直結する非常に重要な量である。星の進化段階末期にあるミラ型変光星では、その変光周期と明るさの間に比例関係が知られており、この関係は星の距離を知る指標として利用できる。この指標の精密な較正を行うためにVERA電波望遠鏡を用いて高精度位置天文VLBI観測を行ってきた。ミラ型変光星周辺の水メーザー電波源を1カ月間隔で2年間観測し、年周視差を測ることにより距離を決定する。本申請の研究期間に、年周視差が計測された天体数はそれまでの2天体から6天体ほどに増えた。また現在でも多くの星を引き続き観測中である。これらの成果により、周期光度関係確立のためのデータが揃いつつあり、既に予備的な結果が得られている。天文学会などで報告している。微視的な視点からの成果として、観測した星周辺のガスの運動の様子なども同時に明らかになり、精密な距離を利用する事によって観測したミラ型変光星の半径や明るさ、温度などの信頼性の高い物理量が得られている。一方、銀河系全体のスケールを考えた巨視的視点からは、観測した星の銀河系内での回転運動などを得ることができ、その星が銀河円盤の厚い成分に属することなどを明らかにしている。得られた周期光度関係の予備的結果と、既存のデータに基づいて整理した多くの星の視線速度、固有運動、赤外線での実視等級などの情報から、およそ300天体の銀河系内ミラ型変光星について6次元動力学情報が整理された。これは現在進展している銀河系の動力学シミュレーションと突き合わせる良いサンプルとなる。本申請研究の成果として2件の論文(Nakagawa et al 2008, Nyu et al 2011)が日本天文学会の査読付き雑誌に掲載されている。
宇宙初期の銀河の系統探査とその性質に関する研究

赤方偏移5(宇宙年齢約10億年)における銀河の大規模系統探査を二天域において実施し、約600個以上の候補天体を発見した。これは世界最大規模のサンプルである。これを用いて以下のような結果を得た。まず、銀河の紫外光度関数の最高精度での導出を行った。この結果、赤方偏移3、4付近のそれと比べて、明るい側での進化はほとんど見られないが、暗い側で少し進化が見られることがわかった(i)。また、赤方偏移5付近での宇宙における平均的星形成率密度は赤方偏移3、4のそれより少し小さいものの、まだ活発な星形成を行っている時代であることを明らかにした。さらに、一部のサンプル銀河について紫外域でのスペクトルを得る事ができた。赤方偏移の確認と共に、これらの銀河におけるライマンα輝線強度がかなり弱いということがわかってきた。また、銀河中の金属による星間吸収線が強いこともわかった。これらの結果から、宇宙年齢10億年の時代でも一定の化学進化があった事が示唆される(ii)。又、輝線の等価幅は、紫外線の明るさに依存する可能性がでてきた(iii)。これは、ライマンα輝線天体がライマンブレイク銀河の暗いものの一部であることを示唆している。銀河の静止系における、紫外から可視域でのスペクトル分布を銀河進化スペクトルモデルと比較することによって、見つかった銀河の一部について、その年齢とダスト吸収量の評価を行った。また、明るいものには青いものが少ないという結果も得た(iv)。ライマンブレイク銀河の空間分布を調べた結果、その相関長は、より低赤方偏移でみられるそれより大きく、密度超過の大きな場所では早くから銀河形成が始まるというシナリオを支持する結果を得た。また、同じ赤方偏移5においても、明るい銀河ほど大きな相関長を示すことがわかった(v)。その他、X線源のカタログと相関をとり、新たに2ないし4の対応天体候補がみつかった。スタッキング解析も行ったが、有意な信号は得られなかった。以上の結果(i)-(v)等から、密度の高い場所において大きな銀河から形成が始まるという描像が示唆されることを示した。赤方偏移5(宇宙年齢約10億年の時代)における銀河の大規模系統探査を行った結果、約300個の候補天体を発見した。本年度は、さらに撮像データを加える事によって、より精度の高いカタログを作成した。これを用いて、以下のような結果を得た。・光度関数の再計算を行い、これまでの我々の結果を確認するとともに、その精度を上げることに成功した。特に重要な点は、この結果が、一部で指摘されているような色選択基準の違いにはほとんど依存しないことを明らかにしたことである。この結果、赤方偏移5付近での宇宙における平均的星形成率は赤方偏移3、4のそれより少し小さいものの、まだ活発な星形成を行っている時代であることを明らかにした。・クラスタリングの大きさを評価した。その相関長さは、非常に大きく、時間が経つと近傍宇宙の銀河団規模の相関長になることが予想される。このことは、我々が発見した銀河団は、やがて大きな銀河団に成長していくような領域に存在していて大きな楕円銀河になる可能性を示唆する。

・明るいものについての可視分光観測をすばる望遠鏡を用いて進めた。その結果、8つの銀河については、その赤方偏移が確認できた。(但し、一つはクエーサー。)非常に興味深いことに、これらの銀河におけるライマンα輝線は弱く、銀河内での吸収が大きいことが示唆される。また、その銀河の中での金属による星間吸収線も強いことがわかり、宇宙年齢10億年の時代でもそこそこの化学進化があることがわかった。このような結果は、赤方偏移が3付近(宇宙年齢20億年)でも見られるがその割合は小さいため、なんらかの進化を見ている可能性が高い。ただし、サンプル数が小さいので、来年度も観測を実施する。・X線源のカタログとも相関をとったところ、新たに2ないし4の対応天体候補がみつかった。今後分光観測で確認したいと考えている。赤方偏移5(宇宙年齢約10億年の時代)における銀河の大規模系統探査を行った結果、約600個の候補天体を発見した。これは世界最大規模のサンプルである。これを用いて、以下のような結果を得た。・紫外光度関数と星形成率密度の評価最高精度の紫外光度関数の導出をする事ができた。この結果、赤方偏移5付近での宇宙における平均的星形成率密度は赤方偏移3、4のそれより少し小さいものの、まだ活発な星形成を行っている時代であることを明らかにした。・紫外スペクトルの特徴すばる望遠鏡による可視分光観測により、約10の銀河についてスペクトルを得る事ができた。赤方偏移の確認と共に、これらの銀河におけるライマンα輝線強度がかなり弱いということがわかってきた。また、その銀河中の金属による星間吸収線も強いこともわかった。これらの結果から、宇宙年齢10億年の時代でも一定の化学進化があった事が示唆される。又、輝線の等価幅は、紫外線強度即ち星形成率の大きさに依存する可能性がでてきた。このことは、ライマンα輝線天体と呼ばれる種族とライマンブレイク銀河と呼ばれる種族の関係について、後者は前者の暗いものの一部であるという重要な知見を示唆していると考えられる。・クラスタリングの大きさライマンブレイク銀河の空間分布の様子を調べた。その相関長さは、非常に大きく、時間が経つと近傍宇宙の銀河団規模の相関長になることが予想される。このことは、我々が発見した銀河は、やがて大きな銀河団に成長していくような領域に存在していて大きな楕円銀河になる可能性を示唆する。・X線源との相関X線源のカタログとも相関をとったところ、新たに2ないし4の対応天体候補がみつかった。
ミトフュージンを中核とした細胞内酸素およびカルシウム制御機構の解明

血管平滑筋において、カルシウムイオンは筋収縮や細胞増殖など多様な生体応答を引き起こす。また、エネルギー産生の場であるミトコンドリアの機能においても、カルシウムイオンは重要な役割を担う。近年、小胞体とミトコンドリアが非常に近接している構造が平滑筋細胞において報告されている。本研究では、小胞体とミトコンドリアを連結する分子として知られているミトフュージンに着目し、その生理的意義を解明することを目指した。ラット大動脈から単離した平滑筋細胞を培養し、ミトフュージン2をノックダウンした結果、小胞体-ミトコンドリアの共局在率が減少した。また、ミトフュージン2ノックダウンにより小胞体-細胞質-ミトコンドリア間のカルシウムシグナルが抑制されたことから、ミトフュージン2が小胞体-細胞質-ミトコンドリア間のカルシウムシグナルを効率化する役割を担うことが示唆された。ミトフュージン2ノックダウンによりミトコンドリア膜電位の消失も認められた。さらに、ミトコンドリア内ATP量の減少も見られたことから、ミトフュージン2は血管平滑筋細胞において、ミトコンドリアATP産生に寄与していることが示唆された。次に、多くの循環器疾患で病態形成に関与する細胞増殖に着目した。ミトフュージン2ノックダウンにより血管平滑筋細胞の細胞増殖が抑制されたことから、ミトフュージン2は細胞増殖を亢進することが示唆された。以上より、ミトフュージン2が小胞体-ミトコンドリア間の距離を制御し、ミトコンドリアのカルシウム取り込みを効率化することや、ミトコンドリア機能であるATP産生を促進し、結果として細胞増殖を亢進することが示唆された。血管平滑筋において、ミトフュージン2が支える小胞体-ミトコンドリアカルシウムマイクロドメインは、ミトコンドリア機能および細胞機能の制御に重要であると考えられる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。あらゆる細胞種において、細胞内情報伝達の要となる細胞内カルシウム濃度変化は、細胞膜上のイオンチャネルやカルシウム貯蔵部位である筋小胞体とミトコンドリアによって緻密な制御を受けている。ミトコンドリアは生体において、主要なエネルギー産生の場として重要である。また、ミトコンドリアによるエネルギー産生は、カルシウム濃度依存的に行われるが、これを効率的に行うためにミトコンドリアと筋小胞体は互いに近接していると想定されている。このオルガネラ間の近接を担う分子として、ミトコンドリア外膜および筋小胞体上にミトフュージン2が存在する。ミトフュージン2はアミノ末端領域にGTPaseドメインを持ち、ミトコンドリア外膜の融合を担うことが知られているが、ミトコンドリア機能に対するミトフュージン2の役割に関しては不明な点が多い。本研究課題では、血管平滑筋細胞のミトコンドリアに着目し、血管平滑筋細胞におけるミトフュージン2によるミトコンドリア機能への影響を明らかにすることを目指した。その結果、血管平滑筋細胞のミトコンドリアにおいて、ミトフュージン2ノックダウンによりミトコンドリアへのカルシウム取り込み活性が減少することが分かった。また、ミトコンドリア膜電位はミトフュージン2ノックダウンによって減少した。次に、定常状態におけるミトコンドリア内ATPは、ミトフュージン2をノックダウンした群で減少が認められた。以上の結果、ミトフュージン2は血管平滑筋においてミトコンドリアカルシウム動態やミトコンドリア膜電位の制御を介してATP産生に寄与していると考えられる。本研究課題の主な目的である、血管平滑筋細胞のミトフュージン2によるミトコンドリア機能への影響を一部明らかにすることが出来たため。

本研究課題の1年目にミトフュージンの血管平滑筋における生理機能を明らかにすることができた。2年目は、ミトフュージンの機能破綻を発端とする各種循環器疾患に着目し、研究を展開する予定である。特に、肺高血圧症、門脈圧亢進症、高血圧症などにおいて、ミトフュージンの発現変化をリアルタイムPCR法、ウェスタンブロット法、免疫抗体染色法で解析する。発現変化が認められた場合には、画像・電流測定などの機能解析を行い、ミトフュージンの病態における機能変化を明らかにすることを目指す。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。