hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
地球の初期分化と進化に関する実験的研究

深さ1000km以上におよぶマグマオーシャン(MO)中でのコア分離過程をシミュレートするために、超高圧での下溶融鉄(MI)とけい酸塩の間の元素分配を実験的に決定することを目指した。分割球型装置のアンビルとして焼結ダイアモンドを使用することによって30GPa以上での溶融実験が行えるようになった。また、二次イオン質量分析計により5μmの領域について濃度1ppm以下の元素分析が可能になった。これらの新しい実験法のもとでけい酸塩、鉄一けい酸塩系の溶融関係を調べ、MIと溶融けい酸塩(SL)および共存する固相との間の主要、微量元素の分配関係を圧力の関数として決定した。本研究で得られた主な結果は以下のようにまとめられる。(1)深さ600-1000kmのMOの底での地球始源物質のリキダス相はマグネシオビュスタイト(Mw)である。しかし、SL+Mwの領域の温度幅が狭いことからペロフスカイト(Pv)もコア形成前のMIと共存していた可能性がある。(2)20GPa以上の圧力では、SiとOのSLからMIへの溶解が圧力とともに顕著になる。従って、深いMOの中でコア分離が生じた場合にはマントルのMg/Si比が増大する。(3)Mn,Ni,CoのMIとSL,MwおよびPvとの間の分配係数が26GPaまで決定された。その結果、マントルのNiとCoの存在度はコア物質(MI)が900kmより深いMOの底でSLでMwと平衡にあれば説明できることがわかった。しかし、Pvが共存した場合にはさらにふかいMOが必要になる。(4)20GPa以上では、相当量の稀土類元素(REE)がSLからMIに溶解することが判明した。この溶解には軽REEと重PEEとの間に著しい分別がともない、コア形成後の原始マントルは軽REEに欠乏しているはずであることが示された。原始マントルのREEの相対存在度は先験的にコンドライトのものと同じであると仮定されていたので、この結果はマントルの化学に極めて重要な意義をもつ。1.地球形成初期に生じたマグマオーシャンの中でのコア(中心核)の分離過程を地球化学的に明かにするため、超高圧下におけるFe-けい酸塩系の溶融実験が行なわれた。15GPa以上の圧力ではSi、Oの溶融けい酸塩から溶融鉄への溶解が生じ、圧力とともに溶解量が増大することが明かになった。しかし、Mgの溶解は認められず、1000km以上の深さのマグマオーシャンの中でコアの分離が生じたならば、Si、Oがコアに軽元素として取り込まれるとともに、マントルのSi/Mg比、Mg/(Mg+Fe)比が大きく影響を受けたことが示された。さらに、溶融鉄の冷却に伴うこれらの軽元素の析出の観察から、コアの化学的進化と対流の駆動力の検討がおこなわれた。地球の熱源として注目されているKが26GPaで0.2wt%程度溶融鉄に溶けることが確認された。また、希土類元素の若干の溶融も認められた。現在、隕石を出発物質にして同種の実験が進行中である。2.微量・極微量元素分析用の二次イオン質量分析計の導入がなされ、標準試料の準備とともに定量化をめざした分析実験が進められている。

また、圧力部材として焼結ダイヤモンドを用いた圧力発生を行なうための油圧直接駆動方式の装置の据付けが最近完了した。今後、実験圧力の拡大と、広い範囲の親石元素の溶融鉄とけい酸塩の間の分配係数の決定を行う予定である。1、実験、分析法の確立をめざして(1)超高圧の発生:焼結ダイアモンド(SD)を用いて実験圧力の拡大を計り、30GPa以上の圧力と1500°Cまでの温度発生が実現した。しかし、目的とする50GPaの発生にはSDのサイズ拡大が必要であることが明らかになり、これを年限内に是非実現させたい。(2)主要、半微量元素分析:×線マイクロアナライザーが導入された。けい酸塩、鉄合金分析用の標準試料も整備され良好な状態で稼働をはじめた。(3)徴量、極微量元素分析:二次イオン質量分析計の整備とともに、30以上の元素について数ppm以下の濃度をもつ50個以上の標準試料の選定を行なった。その結果、火山ガラスの稀土類元素(REE)の分析が極めて安定に行なえることが確認された。2、高圧高温下での溶融鉄と溶融けい酸塩の反応(1)マントルの主要元素であるSiとOが圧力の増大にしたがって溶融鉄に溶解することまた冷却にともないしSiO_2、FeOからなる不混和液が生ずることが認められ、これらの元素が外核の軽元素である可能性が示されるとともに、中心核分離に伴うマントル組成の変化、中心核の化学的進化が検討された。(2)Fe,Fe-S系藤体へのMn,Ni,Coの分配を26GPaまで調べた。現在までの結果はマントルと中心核が化学的に平衡ではないことを示唆している。(3)REEの分配が調べられ、高圧下では溶融けい酸塩に対して軽REEが溶融鉄に濃集する傾向が認められた。今後、定量化を進めて行く。焼結ダイヤモンド(SD)を圧力発生部材として用いることによって,8mm^3の試料体積に、40GPa程度の圧力を発生させ2500°C以上の高温を得ることが可能になった。その結果、少なくとも37GPaまでは広い組成の超塩基性岩において第1リキダス相はマグネシオビュスタイト(MW,(Mg.Fe)O)であることが明らかになった。30GPa以上における鉄一けい酸塩系の溶融実験は限られた加熱容積のもとで、試料容器材質の選択が問題となっている。しかし、SDの立方体を一辺10mmから15mmに大形化できる見通しがついたので、試料体積を拡大することによって,十分解決できると考えられる。26GPaまでの圧力で、溶融鉄(MI),けい酸塩融体(MS),MW,けい酸塩ペロフスカイト(Pv)の間のMn,Fe,Co,Ni,の分配関係を決定した。一方、宇宙存在度と現在のマントル中での存在度からこれらの元素のマントル/中心核の分配係数を見積り、中心核形成の条件を検討した。中心核の分離はマグマオーシャン中でMIがSとMWと平衡を保って進行したことが示唆される。これに対して、MIとPvとの共存はマントルのNi,Co存在度を著しく減少させることになる。二次イオン質量分析計は標準試料の整備が終了し、5マイクロン程度の領域についてppmオーダーの微量元素の定量分析が十分な精度で行こなえるようになった。早急に鉄一けい酸塩系元素分配決のための出発物質の調整を行って本実験にかかる。焼結ダイアモンド(SD)を圧力発生部材に用いて、2mm^3の試料を50GPa程度まで加圧することが可能になった。しかし、2000°C以上の高温を発生させると圧力が30-40%も低下することが判明し、大型化したSD(1辺14mmの立方体)を用いてこの問題の解決に取り組んだ。
膜結合酵素の実用的固定化担体としての大型ハイブリッド型ベシクルの機能

膜結合酵素は生体膜中に存在する酵素であり、その活性発現のためには、"脂質場"が必要であることはよく知られている。従って、このような酵素を固定化酵素として使用するための担体は通常の担体では適当ではなく、脂質場を有する担体であることが必要である。本研究では、Span80を主成分とする大型のハイブリッド型ベシクル(550μmの粒径)を膜結合酵素(フルクトースデヒドロゲナー、,FDH)の固定化担体として利用することを試みた。その結果以下のような結論を得た。まず、(1)脂質ベシクルに種々の生理活性物質を固定化する方法を検討した。その結果、FDH、膜タンパク質シトクロームC、およびコンカナバリンA(ConA)などのタンパク質が二次乳化法により、多量に、また脂質膜の奥深く固定化することが出来、この方法の有効性を指摘した。また(2)これらのタンパク質は固定化により、コンフォーメーション変化が生じていることも判明した。さらにFDH以外の数種の膜結合酵素について同様の結果を得た。(3)メンブランフィルターによるベシクルの回収再利用操作により、固定化FDHの繰り返し利用が可能であることを指摘した。また、コレステロールの脂質膜への添加は、ベシクルの安定化を促した。更に、(4)この固定化酵素の活性は、脂質膜中にBSAあるいは、γグロブリンを適当な濃度で共存させることにより、活性を最大に発現させることが出来た。また、BSA共存系では水素結合支配であり、γグロブリン共存系では疎水結合支配でFDH酵素反応が進行することが判明した。(5)固定化FDHのヘリックス含量あるいは、脂質膜の流動性とFDHの活性間には良好な直線関係が得られた。(6)ConA固定化ベシクルは、DDSへの利用にも期待でき、膜結合酵素の固定化ベシクルは、機能性を有するタンパク質固定化ベシクルへと広がる基点でもあることが確認された。膜結合酵素が活性発現するためには、脂質反応場が必要であり、この酵素は、脂質必要酵素とも呼ばれる。本研究では、このような酵素の一つとして、フルクトースデヒドロゲナーゼ(FDH)を選択した。固定化酵素担体として、大型で、単分散型の球状脂質ベシクルを用い、固定化FDHとしての、繰り返し利用を試みた。また、その固定化酵素反応特性について、動力学的あるいは熱力学的検討も行った。固定化担体に用いた単分散型のベシクルは、粒径が550μmと大きく限外濾過により、繰り返し回収することに成功した。また、ベシクル一個あたりの活性劣化は、5回の繰り返し利用において、前回の約8パーセント程度内に収まり、このような固定化酵素が十分実用化できることが判明した。つぎに、固定化担体として、凝集型のベシクルを用いて検討した。このベシクルは粒径が約2050μmで、ベシクル表面に空隙が存在し、基質の拡散抵抗が存在するが、粒径が非常に大きく、工業的に実用的な固定化担体として期待できる。このようなベシクルを用いた固定化FDH系の酵素反応についての反応速度式を、化学工学的立場から理論的に検討した。その結果、ベシクルと基質の間の静電効果、および、ベシクル表面の空隙内への基質の拡散を考慮した速度式を用いて、固定化FDHの反応をよくシミュレートすることができた。

さらに、上記のFDH固定化ベシクル系および、FDHの均相水溶液系において、それぞれの熱力学的諸量、ΔG、ΔH、ΔSを求め、FDHと、基質フルクトースの結合および、その反応速度について、熱力学的検討を行った。その結果、FDHが基質と結合する際、FDHはfoidingな状態にコンフォメーション変化し、活性発現することが明らかになった。このことは、CDスペクトルの測定からも実証することができた。また、その反応速度は、酵素と基質の疎水的結合に支配されていることも指摘した。膜結合酵素は生体膜中に存在する酵素であり、その活性発現するためには、"脂質場"が必要であることはよく知られている。従って、このような酵素を固定化酵素として使用するための担体は通常の担体では適当ではなく、脂質場を有する担体であることが必要である。本研究では、Span80を主成分とする大型のハイブリッド型ベシクル(550μmの粒径)を膜結合酵素(フルクトースデヒドロゲナー、,FDH)の固定化担体として利用することを試みた。その結果以下のような結論を得た。まず、(1)脂質ベクシルに種々の生理活性物質を固定化する方法を検討した。その結果、FDH、膜タンパク質シトクロームC、およびコンカナバリンA(ConA)などのタンパク質が二次乳化法により、多量に、また脂質膜の奥深く固定化することが出来、この方法の有効性を指摘した。また(2)これらのタンパク質は固定化により、コンフォーメーション変化が生じていることも判明した。さらにFDH以外の数種の膜結合酵素について同様の結果を得た。(3)メンブランフィルターによるベシクルの回収再利用操作により、固定化FDHの繰り返し利用が可能であることを指摘した。また、コレステロールの脂質膜への添加は、ベシクルの安定化を促した。更に、(4)この固定化酵素の活性は、脂質膜中にBSAあるいは、γグロブリンを適当な濃度で共存させることにより、活性を最大に発現させることが出来た。また、BSA共存系では水素結合支配であり、γグロブリン共存系では疎水結合支配でFDH酵素反応が進行することが判明した。(5)固定化FDHのヘリックス含量あるいは、脂質膜の流動性とFDHの活性間には良好な直線関係が得られた。(6)ConA固定化ベシクルは、DDSへの利用にも期待でき、膜結合酵素の固定化ベシクルは、機能性を有するタンパク質固定化ベシクルへと広がる基点であることが確認された。
概日リズム可塑性を生み出す神経機構の解明

リズム可塑性現象の基盤となるメカニズムに脳内の神経ペプチドが関わるのかを明らかにするために、まず、ミツバチの育児バチの脳内の神経ペプチドを免疫組織化学的な方法を用いて、その時空間的な局在パターンを明らかにする。その後、神経ペプチドを直接与える方法、あるいは分子生物学的な手法により機能阻害する方法を用いて、その機能を解析する。さらに、神経科学的な方法も用いて、ミツバチのリズム可塑性の基盤となる生理機構の一端を明らかにする。
ポリオ-マウイルス群癌遺伝子産物の作用機作

1.細胞膜分画のT抗原:細胞質及び細胞膜に存在したままで一部の継代細胞をトランスホームすることのできる変異T抗原は、細胞内にプールされているTGFを細胞外に効率よく放出していた。2.細胞質のT抗原:細胞質の内膜系に変異T抗原が多量に存在している細胞では細胞の糖鎖が対照と比べ著く分岐していることが明らかになった。このことは特に酸性糖鎖について認められた。又、この細胞のEGFりセプターの糖鎖も対照に比較し変化していることが明らかになった。3.細胞核のT抗原:(1)in A941,in A942の片方が発現している細胞にもう一方をトランスフェクトすると細胞はトランスホームしたことより両株の欠損機能は互いに相補的であることが分かった。(2)先に精製した分子量68,000のたん白と、DNAポリメラーゼのなどを含む分画を混合し、SV40のin vitroDNA合成系を再構成した。(3)マウス乳癌ウイルス(MMTV)LTRにSV40ラージT抗原遺伝子を連結したプラズミッドを3Y1細胞に導入し、デキサメサゾン(DX)によってT抗原の転写が増大する細胞(MM3Y細胞)を樹立した。この細胞では、DX添加によって、対照の未添加に比べ、約3040倍のT抗原転写促進が認められた。又、MM3Y細胞は、DX添加によって軟寒天中で、未添加のものより、大きなコロニーを形成した。この際、細胞の外に対照に比べ、10倍以上のTGFが放出されていた。MM3Y細胞ではDX添加によって20種類のC-oncの中で、C-H-ras遺伝子の転写が促進されること、c-fos遺伝子の転写が抑制されることが明らかになった。
神経系はなぜ東なのか-並列構造の起源に関する実験的検証

神経系はなぜ多数の繊維からなる束なのか?多細胞生物としての当然の帰結なのか?これらの疑問は、つまるところ、神経系は進化の上での如何なる淘汰圧への適応の産物なのか、またその適応にはいかなる拘束条件が付きまとったのか、を問うことである。情報の生成(観測)にはエネルギー散逸が避けられず、感覚細胞における情報のエネルギーコストは統計熱力学上の理論限界である0.7K_BT[Joule/bit]に近い。本研究は、細胞の熱雑音感受性は進化を通して達成した適応ではなく、生命の起源に遡る拘束であることを明らかにし、資源や危害が時間的空間的に偏在する生存環境は情報伝送(観測)速度増大の淘汰圧として働くこと、それに対する唯一の適応方策は神経細胞の並列化であること、を次のように明らかにした。1)気流感覚毛で、揺動散逸定理に従ったブラウン運動を観察できることを光学計測によって示した。コオロギ尾葉上の近傍にある二つの気流感覚毛のブラウン運動の無相関性の計測は達成できなかった。2)気流感覚毛のブラウン運動と感覚細胞の電気的応答の相関(コヒーレンス)の実証には至らなかった。3)神経細胞は熱雑音領域で動作しており、情報伝送素子としての信号対雑音比が極めて低いことを、実証した。4)計測と平行して、信号対雑音比の極めて低い神経細胞のパルス列からでも、介在神経へのシナプス加重によって信号を再構成できることを理論的に示した。確率統計学や情報理論で、標本の平均値が母集団の真の平均値から外れる確率が標本数の平方根に反比例して少なくなる「加算平均原理」に着目し、熱雑音に拘束された細胞でも多数による加算平均によって、熱雑音以下の信号の検出精度が向上することを示した。もちろん「束」の前提として多細胞化は必要であるが、多細胞化の直接的生存価自体も、「加算平均原理」で説明できることを示した神経系はなぜ多数の繊維からなる束なのか?多細胞生物としての当然の帰結なのか?これらの疑問は、つまるところ、神経系は進化の上での如何なる淘汰圧への適応の産物なのか、またその適応にはいかなる拘束条件が付きまとったのか、を問うことである。もちろん「束」の前提として多細胞化は必要であるが、多細胞化の直接的生存価自体も、「加算平均原理」で説明できることを示した神経系の特徴は並列信号処理にあると言われている。しかし、なぜ「並列」なのか、「高性能な単一」ではなく多数の繊維からなる「束」なのか、単細胞から多細胞への進化の当然の帰結なのか、単細胞でも細胞表面に並んだ複数の受容体による「並列処理」が行われているのか?これらの疑問は、つまるところ、神経系は進化の上での如何なる淘汰圧への適応の産物なのか、またその適応にはいかなる拘束条件が付きまとったのか、を問うことになる。本研究では、神経細胞は熱雑音感受性を持っており、そのことが全動物に共通する神経系の並列構造の起源であることを、実証する目的で行っている。コオロギ尾葉上で近傍にある気流感覚毛でも、そのブラウン運動は互いに無相関であることを確認するため、既設の気流感覚毛ブラウン運動計測装置の2チャンネル化を完了し、隣り合う感覚毛のブラウン運動を同時計測して、互いに無相関であることの実証データを集積することを試みている。また、気流感覚毛のブラウン運動と、感覚細胞および介在神経細胞の電気的応答の同時計測を行い、これらに相関(コヒーレンス)があることを示すため、感覚神経および介在神経の応答を電流として安定に計測できる、ボルテージ・カレントクランプ増幅器を設備備品費として購入した。

計測は現在進行中であるが、これらの成果により、コオロギ気流感覚系では、1.感覚細胞は情報受容にあたってエネルギーを散逸し、揺動散逸定理に従ったブラウン運動を観察できること、2.感覚細胞の膜電位揺らぎはブラウン運動と相関を持つこと、3.神経細胞は熱雑音領域で動作しており、情報伝送素子としての信号対雑音比が極めて低いこと、4.それでも神経細胞からの信号は、介在神経へのシナプス加重によって再構成されること、を実証していく。神経系は並列信号処理を行っていると言われている。なぜ神経系は「並列」の信号処理を採用したのか、「高性能な単一」ではなく多数の繊維からなる「束」で信号処理をするのか、単細胞から多細胞への進化の当然の帰結なのか、単細胞でも細胞表面に並んだ複数の受容体による「並列処理」が行われているのか?これらの疑問は、つまるところ、神経系は進化の上での如何なる淘汰圧への適応の産物なのか、またその適応にはいかなる拘束条件が付きまとったのか、を問うことになる。神経細胞は熱雑音感受性を持っており、そのことが全動物に共通する神経系の並列構造の起源であることを、本研究では実証する目的で行っている。コオロギ尾葉上で近傍にある気流感覚毛でも、そのブラウン運動は互いに無相関であることを確認するため、既設の気流感覚毛ブラウン運動計測装置を2チャンネル化し、隣り合う感覚毛のブラウン運動を同時計測して互いに無相関であることの実証データを集積すること、気流感覚毛のブラウン運動と感覚細胞の膜電位・電流応答との相互相関関数の計測を試みている。また、気流感覚毛のブラウン運動スペクトル解析および気流感覚細胞への薬物の効果の計測のため、薬物を局所的に微量投与するためにピコポンプとその制御に必要な電気刺激装置を設備備品費として購入した。計測は現在進行中であるが、これまでの成果から、コオロギ気流感覚系では、1.感覚細胞は情報受容にあたってエネルギーを散逸し、揺動散逸定理に従ったブラウン運動を観察できること、2.感覚細胞の膜電位揺らぎはブラウン運動と相関を持つこと、3.神経細胞は熱雑音領域で動作しており、情報伝送素子としての信号対雑音比が極めて低いこと、4.それでも神経細胞からの信号は、介在神経へのシナプス加重によって再構成されること、を実証していく。神経系の特徴は並列信号処理にあると言われている。しかし、なぜ「並列」なのか?神経が「高性能な単一」ではなく多数の繊維(神経細胞)からなる「束」なのか?多細胞生物としての当然の帰結なのか?単細胞でも細胞表面に複数の受容体分子が並んでいるのは「並列処理」を意味しているのか?これらの疑問は、つまるところ、神経系は進化の上での如何なる淘汰圧への適応の産物なのか、またその適応にはいかなる拘束条件が付きまとったのか、を問うことになる。本研究の目的は、全ての細胞は熱雑音感受性を持っており、そのことが全動物に共通する神経系の並列構造の起源であることを実証することである。コオロギ尾葉上で近傍にある気流感覚毛でも、そのブラウン運動は互いに無相関であることを確認するため、既設の気流感覚毛ブラウン運動計測装置を2チャンネル化し、隣り合う感覚毛のブラウン運動の同時計測を試みたが、検討に値する計測は達成できなかった。また、ボルテージ・カレントクランプ両方をプローブの付替えで計測できる高性能アンプをもちいて、気流感覚毛のブラウン運動と感覚細胞の電気的応答の相関(コヒーレンス)計測を試みたが、十分な計測法を確立できなかった。計測と平行して理論的検討を進め、確率統計学や情報理論で「加算平均原理」と呼ばれる現象(標本の平均値が母集団の真の平均値から外れる確率が、標本数の平方根に反比例して少なくなる)に着目した。生きているがゆえに熱雑音に拘束された細胞でも、多数による加算平均化によって、生存価すなわち雑音以下の外界の信号(資源の時間的空間的偏在という淘汰圧)の検出精度が向上することを明らかにした。
術後関節拘縮および癒着に対する合成吸収性癒着防止剤による新規予防法の開発

ラット膝関節内でポリエチレンとチタン片を骨内に留置して動物モデルを作製する。処置膝の関節可動域を測定し健常膝と比較jし、サンプルを摘出して、組織学的に膠原線維と血管が最も増加している部位を特定する。癒着の最も強い部位に合成吸収性癒着防止フィルムを使用し、経時的に関節可動域の測定とフィルムの残存を確認する。合成吸収性癒着防止フィルムの至適枚数、設置位置を検証し、組織学的評価による癒着防止効果を立証する。またヒト組織由来間葉系幹細胞を細胞シートとして培養し、合成吸収性癒着防止フィルムとともに重ねてヌードラットへ移植し、ヒト間葉系細胞組織とフィルム間でも癒着防止効果があると立証する。
アマゾン河中下流域における河川水位の変動と人間活動に関する時空間分析

平成8年度の研究成果の概要については,リオ・ネグロ川の水位の年変化特性を中心に述べる。第1に,マナウス地点におけるリオ・ネグロ川の水位は,67月頃に最高となり,1011月頃に最低となる。水位は11月頃から上昇に転じ,約8か月間を要してゆっくりと最高値に近づき,7月頃から約4か月間という短い期間の内で再び最低値にもどる。このように各年の水位は,主要因としては流域の雨季と乾季の降水量に反映されて,滑らかなサインカーブのように見える規則的な年変化をくり返す。この規則性は,20年平均のカーブで示すことによってより明瞭に見てとれる。第2に,年間を通しての最高水位の出現日は,1975年から1995年までの21年間の平均を算定した結果,6月22日となった。この間,最高水位の出現日の頻度は,10日間の間隔ごとに見ると次のようにほぼ正規分布を示す形で現れる。5月中:1回,6/01-6/10:3回,6/11-6/20:4回,6/21-6/30:8回,7/01-7/10:4回,7/11-7/20:1回。最高水位の出現日の最も早かったのは,5月20(1992年)であり,最も遅かったのは,7月16日(1986年)である。この間の開きは,約2か月である。なお,最高水位に達する日数は,多くの年の場合,24日間程度は続くので,その間の第1日目を最高水位の出現日として採用した。第3に,年間を通しての最低水位の出現は,1975年から1995年までの21年間の平均を算定した結果,11月7日となった。この間,最低水位の出現日の頻度は,10日間の間隔ごとに見ると次のように現れる。10/01-10/10:1回,10/11-10/20:3回,10/21-10/31:5回,11/01-11/10:4回,11/11-11/20:2回,11/21-11/30:4回,12/01-12/10:1回,それ以降1回。最低水位の出現日の最も早かったのは,10月08日(1980年)であり,最も遅かったのは,暦年を越えた01月16日(1989年)であった。この間には,3か月余りの幅がある。最低水位の出現する期間の幅は,最高水位の出現する期間の幅よりも約1か月延びく。しかも,最低水位の出現日の頻度は,最高水位の出現日の頻度に比べてバラツイており正規分布を示す形ではない。上に示したとおり,最低水位が比較的多く現れる時期は,10月末期と11月末期の2つの時期に分かれていることが認められる。なお,最低水位に達する日数も,多くの年の場合,24日間程度は続くので,その間の第1日目を最低水位の出現日として採用した。第4に,上記の21年間の年最高水位の平均値は,27.91m,年最低水位の平均値は,18.30m,これら両者の差は,9.61mである。第5に,この21年間の水位の年変化の中で,1992年の変動は他の年のものに比べてかなり異なっている。その第1は,年間を通しての最高水位の値が他の年に比べて小さく(25.42m),しかもその値が他の年よりも早く現れている(5月20日)ことであり,第2は,年最高水位と年最低水位(17.56m,11月11日)との間の変動幅が7.86mと小さいことである。なお,マナウス港管理局の水位観測記録によると,1903年以降の観測史上,年最高水位がもっとも小さかったのは1926年の21.77m(7月5日)であった。同年の最低水位は14.54m(10月12日)であり,従って年最高,年最低の水位差は7.27mであった。第6に,1989年の最低水位の出現経緯は他の年に比べて特異な現象を呈した。すなわち,水位は11月末に一旦は低下するが,その後上昇に転じ,11月の末から再び低下を続けて翌1990年1月16日に最低水位に達した。加えて,ソリモンエス川の流量がリオ・ネグロ川の流量をはるかに上まわっているために,ソリモンエス川の水がリオ・ネグロ川の流れを堰止める一種のダム的機能を派生させているのではないかと暗示させる。この下線部の疑問を解くための考察を試みた。その結果,第1に,ソリモンエス川の流出量は,リオ・ネグロ川の流出量に比べれ圧倒的に大きい。平均値で見ると,前者の値は後者の値の約2.4倍(6月中旬7月初旬のピーク時)から6倍強(流出量の少ない1月)の状態にある。つまり,流出量の大小に見られるとおり,ソリモンエス川の方が,リオ・ネグロ川に比べて明らかに主力・支配河川である。第2に,10月以降,ソリモンエス川の流出量は1976年,1980年,平均値ともに増加の方向に転ずる。

他方,10月以降のリオ・ネグロ川の流出量は,各年次および平均値とも増加の方向に転ずることはなく,引き続き降下の方向をたどる。第3に,10月以降,リオ・ネグロ川の流出量が降下を続けるなかで,同河川の水位変動はどのように現れるか。流出量の減少にもかかわらず,水位の方は上昇に転じている。しかも上昇に転じる時点は,1976年,1980年ともソリモンエス川の流出量が上昇に転ずる時点と期をいつにしている。第4に,マナウス地点のリオ・ネグロ川において,特に10月以降,流出量が減っているにもかかわらず,水位が上昇しているということは,リオ・ネグロ,ソリモンエス量河川の合流地点において,支配河川となるソリモンエスの流勢が勝り,劣性のリオ・ネグロ川の流れを押しとどめ,その結果,リオ・ネグロ川の流出量は減少をたどるにもかかわらず,水位の方はソリモンエス川の流出量の増加に対応して上昇に転ずる。このことにより,合流地点より上流のマナウス付近のリオ・ネグロ川は一種のダム湖的な現象を呈す。なお,上の第4の点に関しては,実際に10月末11月初の最低水位期において,マナウス地点のリオ・ネグロ川の流速はきわめて緩慢となり,対して合流地点におけるソリモンエス川の流勢・流速は際だって大きい。両河川の実流速の相違は,今後の実測を待って示してゆきたい。平成8年度の研究成果の概要については,リオ・ネグロ川の水位の年変化特性を中心に述べる。第1に,マナウス地点におけるリオ・ネグロ川の水位は,67月頃に最高となり,1011月頃に最低となる。水位は11月頃から上昇に転じ,約8か月間を要してゆっくりと最高値に近づき,7月頃から約4か月間という短い期間の内で再び最低値にもどる。このように各年の水位は,主要因としては流域の雨季と乾季の降水量に反映されて,滑らかなサインカーブのように見える規則的な年変化をくり返す。この規則性は,20年平均のカーブで示すことによってより明瞭に見てとれる。第2に,年間を通しての最高水位の出現日は,1975年から1995年までの21年間の平均を算定した結果,6月22日となった。この間,最高水位の出現日の頻度は,10日間の間隔ごとに見ると次のようにほぼ正規分布を示す形で現れる。5月中:1回,6/01-6/10:3回,6/11-6/20:4回,6/21-6/30:8回,7/01-7/10:4回,7/11-7/20:1回。最高水位の出現日の最も早かったのは,5月20(1992年)であり,最も遅かったのは,7月16日(1986年)である。この間の開きは,約2か月である。なお,最高水位に達する日数は,多くの年の場合,24日間程度は続くので,その間の第1日目を最高水位の出現日として採用した。第3に,年間を通しての最低水位の出現は,1975年から1995年までの21年間の平均を算定した結果,11月7日となった。この間,最低水位の出現日の頻度は,10日間の間隔ごとに見ると次のように現れる。10/01-10/10:1回,10/11-10/20:3回,10/21-10/31:5回,11/01-11/10:4回,11/11-11/20:2回,11/21-11/30:4回,12/01-12/10:1回,それ以降1回。最低水位の出現日の最も早かったのは,10月08日(1980年)であり,最も遅かったのは,暦年を越えた01月16日(1989年)であった。この間には,3か月余りの幅がある。最低水位の出現する期間の幅は,最高水位の出現する期間の幅よりも約1か月延びく。しかも,最低水位の出現日の頻度は,最高水位の出現日の頻度に比べてバラツイており正規分布を示す形ではない。上に示したとおり,最低水位が比較的多く現れる時期は,10月末期と11月末期の2つの時期に分かれていることが認められる。なお,最低水位に達する日数も,多くの年の場合,24日間程度は続くので,その間の第1日目を最低水位の出現日として採用した。第4に,上記の21年間の年最高水位の平均値は,27.91m,年最低水位の平均値は,18.30m,これら両者の差は,9.61mである。第5に,この21年間の水位の年変化の中で,1992年の変動は他の年のものに比べてかなり異なっている。
病原細菌のタイプIII分泌装置の機能とその超微形態学的解析

グラム陰性病原細菌の多くはタイプIII分泌装置を介してエフェクターと呼ばれる機能性タンパク質を宿主細胞内に移行させる。宿主に移行したエフェクターは、様々な宿主側因子に作用することで感染成立に重要な役割を果たす。本研究の目的は、腸管病原性大腸菌(enteropathogenic E.coli, EPEC)が保持するタイプIII分泌装置の超微形態学的解析、および構成タンパク質の局在と機能を調べ、タイプIII分泌装置を介したエフェクターの宿主移行システムの全体像を明らかにすることである。タイプIII分泌装置に関与すると考えられるEscC、EscD、EscJの欠損株をそれぞれ作製し、各欠損株におけるタイプIII分泌タンパク質の培地中への分泌をCBB染色及び抗Tir抗体等を用いたウエスタンブロット法で解析した。その結果、欠損株ではタイプIII分泌タンパク質の菌体外へ分泌は認められなかった。また、上記欠損株よりタイプIII分泌装置の精製を試み、透過型電子顕微鏡で解析したが、欠損株ではタイプIII分泌装置を確認することができなかった。このことから、EscC、EscD、EscJはタイプIII分泌装置を直接構成するタンパク質であることが示唆された。さらに抗EscC抗体を用いた免疫電顕により、EscCはタイプIII分泌装置の外膜リングを構成することが示唆された。申請者らは前年度の特定領域研究にて、EspA鞘状構造が付随したタイプIII分泌装置の高次構造を明らかにしたが、今年度の研究で分泌装置基部の外膜リングを構成するタンパク質を同定した。今後は内膜リングのタンパク質を同定するとともに、GSTプルダウン法によって個々の構成タンパク質の相互作用を明らかにする。
プロスタノイド受容体欠損マウスを用いたアレルギー性皮膚疾患発症機構の解明

トロンボキサン受容体(TP)欠損マウスをC57BL/6に10代、Balb/cマウスへ10代戻し交配を行った。これらのマウスにTh1型反応の代表である接触皮膚炎モデルと、Th2型反応の代表であるアトピー性皮膚炎モデルを適用し、トロンボキサンの免疫、炎症への関与を検証した。接触皮膚炎モデルでは、WTに比べTP欠損マウスにおいてハプテン塗布による著しい耳介腫脹、頸部リンパ節腫大が見られ、さらに頸部リシパ節ではTh1型サイトカインであるIFN-γの産生の亢進も認めた。このリンパ球を同一のハプテンでin vitroにて再刺激するとTP欠損マウスで強いチミジン取り込みも見られ、TP欠損マウスで抗原特異的な免疫反応が亢進している事が確認された。ランゲルハンス細胞に置いては遊走能、Co-stimulatory moleculeの発現レベルに差は見られなかったことより、トロンボキサンが直接Tリンパ球に作用している事が示唆された。一方、アトピー性皮膚炎モデルでは、TP欠損マウスにおいてLate phase reactionの亢進や組織学的に好酸球の強い浸潤などが見られた。IgEの産生もTP欠損マウスにおいて亢進していた。さらに、免疫、炎症反応における遺伝子発現プロファイルをGene Chipを用いて解析したところ、TP欠損マウスではSPF環境化においてもリンパ節において免疫活性化に関する遺伝子群の発現プロファイルが上昇していることが明らかになった。したがってTP欠損マウスは外来抗原に対して野生型マウスより強い外来抗原に対する応答を有していることが示唆された。以上より、トロンボキサンがアトピー性皮膚炎を始めとするアレルギー性皮膚疾患において炎症を抑制する機能を有している事が示唆された。一方でプロスタグランジン(PG)E2受容体のサブタイプの一つであるEP4欠損マウスにおいて接触皮膚炎反応の減弱を認めた。そのメカニズムにランゲルハンス細胞の遊走能とT細胞活性化能の減弱によることを明らかにした。以上より、トロンボキサン、PGE2が炎症性皮膚疾患において重要な役割を果たしていることが示唆され、今後、治療への応用を図りたいと考えている。
高圧下レーザーフォトリシス法によるヘム蛋白質の構造と機能の動的解析

本研究では、以下の4点について研究を行なった。1アミノ酸置換ミオグロビンにおける配位子結合反応の動的解析ヘム近傍の疎水性アミノ酸残基は、ヘム蛋白質の配位子結合反応に大きな役割を果たしているものと考えられている。疎水性クラスターを形成する29位のロイシンを立体障害の異なる他のアミノ酸に置換すると、一酸化炭素結合の活性化体積の符号が異なり、これは29位のアミノ酸残基の立体障害の変化により、反応機構が変化することを意味している。2チトクロームP450における配位子結合反応の動的解析基質と配位子との相互作用を明らかにするため、基質の有無や種類による配位子結合反応の圧力依存性の変化を検討した。その結果、基質の有無や種類によって活性化体積の符号は大きく変化し、基質と配位子との相互作用が配位子結合機構に大きな影響を与えることが明らかとなった。3高圧および常圧における分光法を用いた構造的解析ヘモグロビン単離鎖の高圧NMR、高圧吸収スペクトルを測定し、その構造変化を配位子結合反応の結果と相関させた。高圧NMRおよび高圧吸収スペクトルの結果からβサブユニットの方がαサブユニットに比べ、圧力に対して敏感でより大きな構造変化が誘起されることが明らかになった。4高圧下レーザーフォトリシス法を用いた蛋白質内電子移動過程の圧力効果電子伝達系のモデルとしてルテニウム錯体でアミノ酸を修飾した亜鉛置換ミオグロビンを用いた。ヘム鉄から約10A離れているヒスチジン48を修飾したミオグロビンの電子伝達速度の活性化体積は約+1m1/mol、また、約20A離れているヒスチジン81を修飾した場合には活性化体積、約+11m1/molであることが明らかとなった。このように活性化体積の値が大きく異なることから、両者の電子伝達の機構は大きく異なっていることが考えられた。本年度は以下の点について研究を行なった。1アミノ酸置換ミオグロビンにおける配位子結合反応の動的解析ミオグロビンにおける酸素や一酸化炭素の結合反応においては、へム近傍の疎水性アミノ酸残基により形成されるクラスタ-が重要な働きをしているものと考えられる。そこで我々は、Leu29、Leu72、Leu104、Va166を立体障害の異なる他の疎水性アミノ酸残基に置換し、その配位子結合反応の解析から、29位の置換により配位子結合反応が著しく遅くなることを示してきた。今回、これらのアミノ酸置換体の高圧下での配位子結合反応を行ない、29位の置換体では一酸化炭素結合時の活性化体積(ー15から10cm^3/mol)の符号が異なり、また酸素の結合では大きく増加(3から13cm^3/mol)することが明かとなった。これは29位の疎水性アミノ酸残基の立体障害が変化することにより、配位子結合過程の反応速度が単に遅くなるだけではなく、反応機構までもが変化することを意味している。2チトクロ-ムP450における配位子結合反応の動的解析チトクロ-ムP450はその反応過程においてまず基質がヘム近傍に結合し、次に、酸素分子がヘム鉄に結合して、酸素添加反応が始まると考えられている。そこで基質結合時にヘム近傍構造の変化を明かにするため、基質の有無や種類によって配位子結合反応がどのように変化するかを検討した。その結果、基質が結合していない状態では一酸化炭素の結合反応速度が約10倍加速されるばかりではなく、その活性化体積の符号も変化し、ヘム近傍の構造が大きく変化したことを示している。

また、基質としてdーカンファ-ではなくノルカンファ-を用いた場合でも反応速度、活性化体積共、基質の結合していない状態によく似ており、dーカンファ-結合した場合のみ大きな構造変化を起こることが明かになった。本研究では本年度、以下の2点について研究を行なった。1高圧および常圧における分光法を用いた構造的解析本年度はヘモグロビン単離鎖の高圧NMR、高圧吸収スペクトルを測定し、その構造変化を配位子結合反応の結果と相関させた。高圧NMRおよび高圧吸収スペクトルの結果から、βサブユニットの方がαサブユニットに比べ、圧力に対して敏感でより大きな構造変化が誘起されることが明らかになった。このことは従来、我々が得てきた配位子結合の結果、つまり、βサブユニットの方がαサブユニットに比べ低い圧力で結合過程律速から拡散過程律速へ変化することと対応している。また、高圧下での多次元NMR測定を実現するために、まず、高圧下での2次元NMRの測定条件を検討し、従来の耐圧NMRセルよりも試料部分がセルの底部に近いところに位置したほうが効果的であることを明らかにした。2高圧下レーザーフォトリシス法を用いた蛋白質内電子移動過程の圧力効果本年度は電子伝達系のモデルとしてルテニウム錯体でアミノ酸を修飾した亜鉛置換ミオグロビンを用いた。ヘム鉄から約10A離れているヒスチジン48を修飾したミオグロビンの電子伝達速度は50000/s、その活性化体積は約+1ml/mol、また、約20A離れているヒスチジン81を修飾した場合には電子伝達速度、100/s、活性化体積、約+11ml/molであることが明らかとなった。以上の結果、特に活性化体積の値が大きく異なることから、両者の電子伝達過程の機構は大きく異なっていることが考えられ、電子伝達過程の速度は単なる電子伝達の距離の関数ではなく、その経路にあたるアミノ酸残基に依存するものと考えられた。
高選択的機能を有するイオン会合性試薬の設計

高機能性イオン会合性試薬を合成し、分析化学的側面から種々検討し、実際分析への応用についても検討した。(1)陰イオン性試薬として、アゾ系染料イオンのP-(N,N-アルキルアミノフェニルアゾ)ベンゼンスルホン酸誘導体21種類を新たに合成し、水溶液での酸解離挙動、吸収波長等の基礎的物性値を求めた。さらに第四級アンモニウムイオンとのイオン会合体の水-クロロホルム間の分配挙動について検討し、各染料イオンの抽出性に寄与する諸因子を考察し、試薬設計の指針とした。さらにフェノール、安息香酸、ベンゼンスルホン酸に電子吸引性、電子供与性の置換基を導入してその抽出性に及ぼす寄与を、電荷の分散効果、かさ高さの効果、立体障害の点から考察し、イオン会合性及び抽出性の予測を可能とした。(2)陽イオン性試薬として、P-(N,N-アルキルアミノフェニルアゾ)ピリジン及びそのアルキルピリジニウム塩を合成し、水溶液での酸解離挙動、溶解度等の基礎的物性値を求めた。対陰イオンとして長鎖アルキルスルホン酸、アルキル硫酸イオン、無機陰イオン等を用いて、イオン会合抽出平衡を検討し、抽出性に寄与する諸因子を考察した。これらの諸因子を試薬設計に生かし、新たにキノリルアゾ系染料を合成し、高機能性試薬とすることができた。(3)トリフェニルメタン系染料の陽、陰イオンのイオン会合反応への機能的利用法として、金属ハロゲノ錯陰イオン、モリブデン-カテコール錯陰イオンのイオン会合抽出-吸光光度法を開発した。(4)イオン会合体のミセル抽出法という新しい概念を発表し、抽出溶媒のかわりにミセルを用いる方法について検討した。アゾ系染料陰イオンをモデル化合物として用い、第四級アンモニウムイオン、アルカロイド等の医薬品の簡便な定量法も開発することができた。本研究により、機能的イオン会合性試薬開発の指針をかなり多量かつ正確に得ることができ、これに基づいて新しい分析法も開発することができた。
統一理論を視野に入れた素粒子の現象論及びその宇宙論への応用

・研究課題「統一理論を視野に入れた素粒子の現象論及びその宇宙論への応用」の一環として、今年度は超対称性理論の現象論、宇宙論について研究を進めた。超対称性理論は素粒子の標準模型を超える枠組みとして広く考えられており、(i)ヒッグス粒子の質量に対する輻射補正をコントロール(ii)ゲージ結合定数の見事な一致(iii)宇宙の暗黒物質の有力な候補を含む、といった理由から非常に魅力的である。(特に(ii)は大統一理論の存在を強く示唆している。)・特に今年度前半は超対称性理論の枠組みの中での「宇宙のバリオン生成」について調べた。現在我々が住む宇宙の物質-反物質の非対称性を説明する機構(=宇宙のバリオン生成)は素粒子論及び宇宙論が解明すべききわめて重要な課題の1つである。さて、超対称性理論では一般にスカラー場のポテンシャルに平坦な方向があり、これを用いて非常に効率よくバリオン数を生成する機構(Affleck-Dine機構)が知られている。ところが最近になって、このAffleck-Dine機構で生成されたバリオン数はいったん「Q-ball」と呼ばれるソリトンに閉じこめられてしまうことが分かった。したがって、現在観測されているバリオンはQ-ballの崩壊によって生成されたはずである。このシナリオの下での宇宙の熱史を詳細に追ったところ、Q-ballの崩壊が比較的低い温度で起こるため、暗黒物質の候補である超対称性粒子が熱平衡に至る事が出来ないことが分かった。さらに、暗黒物質の候補としての超対称性粒子に要求されている性質(質量が対消滅断面積)が通常に考えられているものとは大きく異なる事が分かった。【Physical Review D66(2002)083501】これは超対称性理論の現象論的研究に大きな影響を与える重要な結果だと思われる。・今年度後半においては超対称性模型のレプトンフレーバー混合について考察した。(hep-ph/0212172)・研究課題「統一理論を視野に入れた素粒子の現象論及びその宇宙論への応用」の一環として、今年度は超対称性理論の現象論、宇宙論について研究を進めた。(hep-ph/0212172)
正常及び攣縮脳血管のmyagenic propertyの相異について

従来のin vitroの方法では、1]血管内壁への一様な力の負荷、2]内皮損傷、3]血管内外の環境操作、4]血管内圧の保持、5]血管内流速調節ができない等の欠点があった。近年発表されたHalpernらのシステムは、これらの点を解消し、理想的実験条件を提供するものである。したがって、当システムは、我々がかねてから提唱しているところのactive tonusの増大が脳血管攣縮の発生機序の重要因子であることを解明するために最適であると考えられた。本研究期間で正常及び攣縮脳血管について研究実施する予定であったが、本システムの技術的困難さに慣れる事に時間を費やしてしまい、7-9週齢Sprague-Dawley rat脳血管の血管内圧変動に対する収縮弛緩現象を当システムを用いて検討することに終始した。血管をセット後、血管内圧を10mmHgより100mmHgまで上下させ装着作業によるmechanicl hysteresis effectを減少させた。その後、血管の安定化を計るために、30分以上30mmHgにて保持した。クレブス溶液を恒温槽内にて加温し、organ bath内を灌流した。流量はorgan bath内温度が37°C前後に安定する量とした。モニターテレビで、クモ膜などの付着のない部分を選びdimension analyzingsystemのscanlineを設定した。その後、30mmHgより20-30秒かけて10mmHgステップで180mmHgまで血管内圧を上昇させ、約10分間ずつ血管内径、壁厚の変化を測定し、organ bath内温度、血管内圧と共にMacintosh用ソフトAcqknowledgeにて記録した。内圧40mmHgまでは圧上昇に伴って血管径は拡大した。一方、50mmHgから80mmHgまでは収縮がすすみ、その後150mmHgまで定常状態を維持した。それ以上の高圧になると血管は拡張した(hysteresis)。各々の設定圧での血管径の安定には数分を要した。また、organ bath内温度およびpH変化に血管径は極めて敏感に反応した。Osol等の結果と比較して、血管収縮はより低圧で始まって、血管径の維持範囲はより高圧まで広がっていた。これは、血流による内皮細胞の平滑筋収縮、弛緩機能への影響が、血管径維持調節機能に、深く関わっていることを意味している。今回の結果は、内圧が50から90mmHgの間で、(生理的条件下の値と推測され)、血管内圧変動に対しもっとも鋭敏に反応できる範囲と思われた。今回は、Halpern,Bevan(Bevan J,Laher l:FASEB J.5:H2267-H2273,1991、Osol G,Halpern W:Am J Physiol 249:H914-H921,1985)らにより開発されたビデオシステムを利用した。

今年度は、犬の脳低動脈、前大脳動脈、中大脳動脈、後大脳動脈、内頚動脈を正常クレブス溶液中でwater bathにセットし、血管内圧/血管径標準曲線を得、頭蓋内外の血管の特殊性を比較した。具体的には、血管内圧を0-120mmHgの範囲で20mmHg毎に30分の安定時の血管内径、外径、血管壁の厚さを測定した。この測定条件を安定化させ、次にPKC阻害剤であるH-7及びカルシウ--阻害剤のニカルジピン、エンドリン、フォルボールの血管内外投与による血管内圧/血管径曲線の変化を観察した。血管内皮細胞由来の弛緩因子である一酸化窒素の作用にも注目して一酸化窒素合成酵素であるL-arginine誘導体(N-ω-nitro-L-arginine:LNNA,10-4,-5,-6M)による血管トーヌスへの影響についても検討した。正常脳血管における血管内圧/血管径の関係は、予想したとうり100-120mmHgを契機にstableとなる。即ちこの段階でmyogenic toneが最大となることがわかった。従って、血管に対する各収縮、弛緩剤の効果はこのレベルで検討した。今回は、正常血管を対象にしたためにカルシウム依存性のmyogenic toneが主体であり、相加的に加えたH-7の弛緩効果は、ニカルジピン単独によるものより微弱であった。次年度は、実際の攣縮血管における反応と比較する。従来のin vitroの方法では、1〕血管内壁への一様な力の負荷、2〕内皮損傷、3〕血管内外の環境操作、4〕血管内圧の保持、5〕血管内流速調節ができない等の欠点があった。近年発表されたHalpernらのシステムは、これらの点を解消し、理想的実験条件を提供するものである。したがって、当システムは、我々がかねてから提唱しているところのactive tonusの増大が脳血管攣縮の発生機序の重要因子であることを解明するために最適であると考えられた。本研究期間で正常及び攣縮脳血管について研究実施する予定であったが、本システムの技術的困難さに慣れる事に時間を費やしてしまい、7-9週齢Sprague-Dawley rat脳血管の血管内圧変動に対する収縮弛緩現象を当システムを用いて検討することに終始した。血管をセット後、血管内圧を10mmHgより100mmHgまで上下させ装着作業によるmechanical hysteresis effectを減少させた。その後、血管の安定化を計るために、30分以上30mmHgにて保持した。クレブス溶液を恒温槽内にて加温し、organ bath内を灌流した。流量はorgan bath内温度が37°C前後に安定する量とした。モニターテレビで、クモ膜などの付着のない部分を選びdimension analyzing systemのscan lineを設定した。その後、30mmHgより20-30秒かけて10mmHgステップで180mmHgまで血管内圧を上昇させ、約10分間ずつ血管内径、壁厚の変化を測定し、organ bath内温度、血管内圧と共にMacintosh用ソフトAcqknowledgにて記録した。内圧40mmHgまでは圧上昇に伴って血管径は拡大した。一方、50mmHgから80mmHgまでは収縮がすすみ、その後150mmHgまで定常状態を維持した。それ以上の高圧になると血管は拡張した(hysteresis)。
細胞膜受容体の分子挙動と細胞応答の統合的測定技術の開発

1.細胞表面受容体のオリゴマー化モニタリング系の開発細胞膜受容体であるRAGE (receptor for advanced glycation endproducts)をモデルとし、2分子FRET法により受容体オリゴマー化をモニタリングする技術を確立した。これにより、受容体の蛍光タンパク融合組換え体を作製することなくFRETでオリゴマー化をモニタリングすることが可能となった。(1)RAGE細胞外ドメインに結合し、かつRAGEとリガンドとの結合を阻害しないモノクローナル抗体を作製し、FRETのドナーとアクセプターの対をなす2種の蛍光色素で標識した。(2)RAGE過剰発現細胞株の培養液中に上記の2種の蛍光標識抗体を加え、生細胞表面のRAGEを蛍光標識し、RAGEのオリゴマー化をFRETシグナルの変化を測定することによりモニタリングした。(3)その結果、リガンド刺激後20分をピークとするFRETシグナルの上昇が検出され、本技術の有効性が示された。2.1分子FRET法による細胞内シグナルモニタリングと受容体発現量の相関関係の解析細胞内シグナル強度のモニタリングと、受容体の発現量解析を同時に行うことにより、受容体発現量とシグナル強度の相関解析が可能な系を開発した。(1)NFκBの活性化によりβ-ラクタマーゼを発現するレポーター遺伝子を組み込んだ細胞株に、RAGE発現ベクターを導入した。(2)上記細胞にβ-ラクタマーゼによる分解で分子内FRETが消失する蛍光色素分子を取り込ませ、FRETシグナルによりNFκB活性化を検出すると同時に、蛍光抗体でRAGEを標識し発現量を測定した。(3)その結果、RAGE発現量が中程度の細胞において最も強くNFκBが活性化されており、発現量が過剰な細胞ではむしろ活性化の程度が低いことが明らかとなった。