hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
企業との連携による創造性育成のための実践的工学教育システムに関する研究

さらに,アンケートから得られる分析を,的確に実施カリキュラムにフィードバックするために,テキストマイニング技術を活用した分析手法を開発して実践した.以上のように,企業との連携を生かして創造性育成の科目群の内容の充実が進んだといえる.さらに,創造性育成科目をサポートするシステムが,「システム開発応用」という創造性育成科目の成果として開発された点は非常に意義があると考える.
光誘起による核スピン偏極を利用した１９ＦーＭＲ核酸類イメージング法の開発

近年、細胞内イメージング技術の進歩によって、様々な疾病の病理に関わる金属イオンや酵素活性の可視化が現実のものとなっている。しかしながら、現在最も普及している蛍光イメージング法では光の組織透過性の低さから、生体深部の可視化は困難であるという問題が指摘されている。一方で19フッ素を各種とするMRイメージングは、シグナルの生体透過性が高く、低バックグラウンドであるという特長を持つことから注目を集めているが感度が低いという問題があった。そこで本研究では核酸類のイメージングにおいて、19フッ素を各種とするMRイメージングの感度を光化学的に向上させるためのプローブ設計と反応開発に取り組んだ。フッ素を検出核種とするMRIは、生体バックグラウンドの低さから生体分子イメージングの新たなモダリティーとして期待されている。しかし、その検出感度の低さが実応用のボトルネックとなっている。そこで本研究では核酸類の生体内可視化を目指し、狙った位置およびタイミングで超偏極状態のプローブを誘導することで高感度検出する新しいイメージング法の創出を目的とする。光ライゲーションとして実績のあるビニルウリジン骨格を参考に光ライゲーション可能なフッ素含有ヌクレオシド誘導体を設計し、ジフルオロベンゼンを主骨格とする新規光応答性フッ素含有ヌクレオシドの合成を行った。ジフルオロベンゼンとグリカールのC-C結合形成反応において各種条件検討(触媒、配位子、保護基、温度等)を行ったところ、Palladium acetate (II)、Triphenyl arsineの触媒系が最も有効であることを見出した。その際、思いがけず立体選択的にβ体ヌクレオシド合成が可能であることも見出した。超偏極状態の寿命測定を行うまでには至っていないものの、実際にフッ素含有ヌクレオシドの合成に成功した。また19FーNMRと蛍光イメージングによりDNAを選択的に検出可能な新たな分子プローブの開発も行った。具体的には、高い検出感度を持つDNA検出用蛍光性プローブとして知られる、2重鎖DNAの塩基対間にインターカレートするアクリジンオレンジ、および2重鎖DNAの副溝のアデニン及びチミンが連続する領域に結合するDAPIを基本骨格に、19F源としてトリフルオロメチル基を持つ新たなDNA検出プローブの開発を試みた。合成したアクリジンオレンジ骨格プローブにおいてマルチモードイメージング(蛍光ならびにNMR)が可能であることを見出した。フッ素を検出核種とするMRIは、生体バックグラウンドの低さから新たな生体分子イメージングのモダリティーとして注目されている。これまでに種々のイメージングプローブが提案されており、タンパク質、酵素、核酸の検出が報告されている。しかし、その検出感度が十分ではなく、生体内での応用例は少ない。実際、応募者も最近、核酸を認識部位に用いた19F MRIプローブの開発を行い、配列選択的に核酸類をOFF/ON型で認識することに成功しているが(Bioorg. Med. Chem. Lett. 2011, 41, 303.)検出感度は数μMと不十分である。一方で、光ラジカル反応により検出核の超偏極状態を作り出すことで、NMR検出感度を数100倍にまで増強できる超偏極核磁気共鳴法(Photo-CIDNP:Photochemically Induced Dynamic Nuclear Polarization)(J.Am.Chem.Soc.,1972, 94, 6262.)が提案されている。しかしながら、この手法においても、超偏極状態の寿命は短く、現状では数100秒が限界である。これでは標的分子に到達する前に検出感度が低下してしまい、イメージング検出の高感度化は望めない。こで本研究では核酸類の生体内可視化を目指し、狙った位置およびタイミングで超偏極状態のプローブを誘導することで高感度検出する新しいイメージング法の創出を目的としている。また、最終的には標的RNA配列選択的DNA光ライゲーション反応の系で19F NMR感度の増強効果を評価し、19F NMRシグナル増強法の新原理ならびに核酸類の高感度検出法を開発する。平成24年度では光ライゲーションとしての実績のあるビニルウリジン骨格(J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 5646.)を参考に、光ライゲーション可能な高感度フッ素含有ヌクレオシド誘導体を設計し合成を行うこととしていた。その合成経路の中でもジフルオロベンゼンとグリカールのC-C結合形成反応過程が最も困難と考えており、実際に触媒、配位子、保護基、温度等をいろいろ条件検討を行ったところ、Palladium acetate (II)、Triphenyl arsineの触媒系を用いる事で可能となる事が判り、この触媒系を用いた時、Glycalの3'を保護してなくてもβ体を生成する事が判った。この条件検討に苦労をしたものの本合成の最大の山場は超えたものと考えられる。

一方で、思いがけず立体選択的合成が可能であることも見出すことが出来たことも合わせて、おおむね順調に進展していると考えた。24年度より合成を始めたジフルオロベンゼンヌクレオシドのホスホロアミダイト誘導体を用いて、DNA自動合成機により短鎖のオリゴDNA(10量体程度のモデル配列)を合成、HPLC精製を行い、MALDI-TOF-MSにより同定する。相補的オリゴDNAと混合した溶液に対し光照射(312, 366 nmなど)を行った後、HPLC解析を行う。HPLCで検出されたピークのMALDI-TOF-MS解析から、光ライゲーション体の生成を確認する。種々の分光学的手法を用いて光照射後に生じる三重項ジラジカル活性種の寿命を調べ、これと検出感度増強効果との比較から、超偏極状態への遷移反応機序を明らかにする。具体的には、時間分解ESR測定、過渡吸収スペクトル測定により活性中間体としての三重項ジラジカルの存在の有無を明らかにし、その寿命と検出感度増強効果の相関から反応機構を検証する。最終的には相補的microRNA存在下、最適波長の光照射前後で19F NMR測定を行い、光反応による検出感度増強効果について定量的に評価する。既に設計し合成途中である高感度フッ素プローブ含有ヌクレオシドの全合成をさらに押し進めようと考えている。その為の有機合成試薬ならびに有機合成溶媒等、各種ガラス器具を購入しようと考えている。また、合成したヌクレオシドをDNA自動合成機に適用するためのホスホロアミダイト化剤、DNA合成機関係試薬類も購入予定である。さらに次年度はこれらプローブを用いて、光ラジカル環化反応に伴うフッ素NMR増強効果を検証しようと考えている。検証に用いるターゲット核酸として23merのmicroRNAを想定している(MiR-27b; 5'-UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC-3')。相補的microRNA存在下、最適波長の光照射前後で19F NMR測定を行い、光反応による検出感度増強効果について定量的に評価する予定である。これらmicroRNAに関連する生化学試薬類の購入も必要と考えている。その他分析機器などは大学ならびに研究室保有の機器類で行う予定であり特に購入は考えていない。
フランス現代哲学における主体・人格概念の分析（愛・性・家族の解体と再構築を軸に）

共著2冊(12)、単独論文2本(34)、翻訳1冊(5)を刊行し、仏語での発表(6)や今後の研究の方向性を模索する発表(7)を行なった。研究は順調以上に進行したと言える。当初の予定より多く、共著2冊(12)、単独論文2本(34)、翻訳1冊(5)を刊行し、仏語での発表(6)や今後の研究の方向性を模索する発表(7)を行なってはいるが、最後の総括的なシンポジウムが発表者の体調の問題で延期となったため。2020年2月に18世紀の文学者・思想家レチフ・ド・ラ・ブルトンヌに関する国際シンポジウムを行なう。本シンポジウムは4年間の科研プロジェクトの総仕上げであり、また新たな科研プロジェクトのキックオフとなるはずである。本年度は交付内定が大幅に遅れたため、残念ながら本年度前半に刊行した共編著3冊・共著2冊・論文1本、研究発表1本は成果に数えることができないようである。本研究課題に関係するそれ以外の成果としては、論文は2本刊行予定(掲載確定済み)である。1藤本夕衣・古川雄嗣・渡邉浩一編『反「大学改革」論』:「パフォーマティヴの脱構築ーデリダの『哲学への権利』における哲学的大学論」:57-80頁、2岩野卓司編『共にあることの哲学ーフランス現代思想が問う〈共同体の危険と希望〉2実践編』:「現代社会における愛・性・家族のゆくえードゥルーズの「分人」概念から出発して」:書肆心水:2017年夏刊行予定。ちなみに前者は、パフォーマティヴ概念(とその脱構築)が愛・性・家族を考えるにあたっても重要であると考えているゆえにここに記載している。これは例外的な事態ではなく、ベルクソン研究や大学論において用いられた概念が、愛・性・家族について考えるにあたっても機能しうるのではないかという考えはむしろ本研究の中核にある。分人概念などはその典型例である。研究発表は交付日内定以後、5回行った。主な三つを挙げる。1日本フランス文学会2016年度秋季大会ワークショップ:「18世紀フランス文学における結婚の形而上学とその脱構築ーレチフの場合」:2016年10月23日(日):東北大学、2第23回新潟哲学思想セミナー《家族の「きずな」を哲学する》:「家族の脱構築ーヘーゲル、デリダによるアンティゴネー読解」:2016年11月18日(金):新潟大学、3近代化中的『神話』:臺灣與日本(IV)」2017臺日聯合研討會:「是枝裕和における家族の時間」:2017年2月17日(金):国立台湾大学芸術史研究所。その他、関連のトークイベントを6回(交付内定日以後1回)行なった。交付内定日が大幅に遅れたため、予定されていた成果が成果として挙げられていないが、限られた時間内であるということを考えると、おおむね順調に進展していると言える。2年目となる昨年度は、当該課題を出発点として幅広く研究を行ない、共編著2冊・共著2冊・論文1本を刊行し、発表を四つ行なった。中心になった論文は、岩野卓司編『共にあることの哲学と現実ー家族・社会・文学・政治(フランス現代思想が問う〈共同体の危険と希望〉2実践・状況編)』(書肆心水、2017年)所収の論文「現代社会における愛・性・家族のゆくえードゥルーズの「分人」概念から出発して」(37-81頁)である。ここから主体性・個体性・人格性概念の基礎となる記憶の問題などにも展開を試みた。また、「家族の時間ー是枝裕和の近年の作品における「分人」的モチーフ」:シンポジウム「ネット文化のなかの台湾と日本ーオリジナリティー再考」(2017年7月23日(日)@京都工芸繊維大学60周年記念館1階大ホール)では映画の領域、「レチフ的ユートピアにおける結婚ー『南半球の発見』を中心に」:九州仏文学会ワークショップ「変愛のフランス文学」(2017年12月9日(土)@西南学院大学)では文学の領域、そして「フーリエ的ユートピアにおける愛・性・家族ー『愛の新世界』と結婚の未来」:国際シンポジウム「フーリエ研究集会」(2018年3月27日(火)@一橋大学)では社会思想史の領域へと、それぞれ積極的にアプローチした。英語中心主義が鮮明になるなか(あるいは業績量産のためか依然として人文科学においては日本語での研究が中心であり続けるなか)、フランス語による共著の刊行や口頭発表を行なったことも特記しておきたい。2年目となる昨年度は、当該課題を出発点として幅広く研究を行ない、共編著2冊(うちフランス語1冊)・共著2冊・論文1本を刊行し、発表を四つ(うちフランス語1つ)行なったので。

研究計画に基づいて、研究を遂行していく予定である。公務多忙につき、実現は不透明であるが、本年は最終年度となるので、可能なかぎり国際シンポジウムを開催し、総括を行ないたいと考えている。また、昨年度行なった学問分野上の(映画研究や文学研究との)クロスオーバーをさらに大きく展開できないかどうかも検討してみたい。2020年2月に18世紀の文学者・思想家レチフ・ド・ラ・ブルトンヌに関する国際シンポジウムを行なう。本シンポジウムは4年間の科研プロジェクトの総仕上げであり、また新たな科研プロジェクトのキックオフとなるはずである。本年度シンポジウム開催を計画していたが、学部再編・大幅縮小に伴う諸業務負担の増大により、計画の適正な執行が困難になったため。最終年度となる本年度に何とか国際シンポジウムを開催したいと考えている。昨年度(2018年度)に予定されていた国際シンポジウムが出席者の体調により延期せざるを得なくなったため。今年度(2019年度)実施する予定である(2020年2月開催予定)。
う蝕細菌のバシトラシン耐性機構の解明

う蝕細菌として最も注目されているStreptococcus mutansはバシトラシン耐性を示すが、その耐性機構については全く不明である。そこで本研究では、本細菌のバシトラシン耐性に関与する遺伝子を特定するため以下の操作を行った。まず、野生株であるXc株の染色体遺伝子をSau3AIで完全消化し、S.mutans内で複製できないプラスミドpResEmBBNに組み込んだクローンバンクを作製した。このクローンバンクでXc株の形質転換を行い、得られた形質転換株をバシトラシンを含む寒天培地と含まない寒天培地のそれぞれに接種し、バシトラシン感受性の変異株を選択した。この結果得られた変異株の染色体遺伝子中のプラスミド挿入部位をマーカーレスキュー法で単離した。単離した遺伝子の塩基配列を決定した結果、この部位には6つのopen reading frame(ORF)が認められた。最上流のORFは既知のgtfC遺伝子であり、下流の遺伝子をそれぞれ順にORF1,ORF2,ORF3,ORF4,ORF5と名付けた。各遺伝子を失活した変異株を作製したところ、ORF1,ORF2,ORF3,ORF4のいずれの遺伝子を失活してもバシトラシン耐性が低下したことから、これらはいずれもバシトラシン耐性に関与する可能性が示唆された。一方、ORF5を失活してもバシトラシン耐性の低下は認められなかった。
沿面放電による負イオン生成機構の研究と大強度パルス水素負イオン源の開発

従来の方式で発生できる負イオンビ-ムの電流密度はイオン源プラズマの密度,組成比,加速電圧等で制限され,核融合用に開発された大規模な装置でも高々1A程度であった。これに対して,パルスパワ-技術を用いると短パルス沿面放電プラズマから従来の10^310^4倍の大電流を引き出せる可能性がある。本研究は,パルスパワ-電源(5Ωー60ns)で駆動される同軸構造の磁気絶縁型二極管(ダイオ-ド)から発生される負イオンビ-ムを,プラズマ源の種類,絶縁磁場強度,陰極表面電流等のパラメ-タの広い範囲に渡って実験的に調ベ,負イオン形成に影響する因子を明らかにするとともに,この形式の装置の大出力負イオン源としての可能性を検討する事を目的とした。負イオン形成にはダイオ-ド動作初期に大量の中性粒子を供給する事が重要であると予測されたため,中心電極を冷却可能な構造とし,電極表面に埋め込んだパラフィンや氷をプラズマ源として動作させ,特にプラズマ源の影響に注目した研究を行った。ダイオ-ドの加速電圧300500kV,電極間隔410mm,プレパルス電圧レベル100kV,絶縁磁場強度07kGのパラメ-タ領域で実験を行い,ダイオ-ド動作や発生イオン電流値に対するこれらのパラメ-タ依存性を調べた。その結果,プラズマ源に氷を用いてダイオ-ドの動作初期に粒子放出を盛んにしてやるとイオン電流は増加し,短パルス沿面放電による負イオン形成にはプラズマ源の影響が大きい事が明らかになった。また、再現性はあまり良くなかったが,プラズマ源をパラフィンとし,印加磁場5.2kGの時,ピ-ク値で約2kA(15A/cm^2)の負電流を観測した。以上の結果,イオン源プラズマを供給する物質やダイオ-ドの動作パラメ-タを最適化する事により,この形式の装置がGW(500keVー2kA)級の大出力負イオンビ-ムを発生できる事を示した。負イオンビ-ムは、一般に目的イオン種を成分として含む陰極プラズマから電界によって引き出されるが、ソ-ス(陰極)プラズマ中には、電子や不純物イオンが存在し加速ギャップ内に負の空間電荷を形成するため、達成可能な電流密度はプラズマ中の目的イオン種の組成比で制限されている。パルスイオンダイオ-ドを用いると、イオン源プラズマの密度、水素負イオンの組成比を大きくできるうえ、加速ギャップに高電圧を印加てきるので、従来の直流イオン源の10^210^3倍の電流密度、10倍程度の加速電圧が達成できると見込まれている。従来この形式のイオン源には、ポリエチレン等、炭化水素系のプラスチックの沿面放電プラズマが用いられているが、負イオン生成機構が明らかでないうえ、炭素等の競合するイオンの存在により、水素負イオンの組成比は高々数%以下であると予測される。本研究は、H_2OやCH_4等の凝縮物質の沿面放電プラズマいを調べ負イオン生成機構を明らかにするとともに、最終的には固体水素を用いて大強度水素負イオンビ-ムを発生する事を目的としている。凝縮物質の沿面放電プラズマをイオン源とすることにより、次の2点で電流密度の向上が図れると考えられる。(1)沿面放電初期に大量の分子状水素が放出されるため、解離電子付着による水素負イオン生成が促進される。(2)炭素、酸素等競合する負イオンが存在しないため、水素負イオンの組成比が向上する。今年度は、陰極を極低温にまで冷却可能なダイオ-ドを設計・製作し、既存電源の極性変換、冷却テスト、基本的な動作テストを行った。現在、パラフィン、水(H_2O)等をイオン源としてビ-ム生成実験が進行中である。

以上の結果,イオン源プラズマを供給する物質やダイオ-ドの動作パラメ-タを最適化する事により,この形式の装置がGW(500keVー2kA)級の大出力負イオンビ-ムを発生できる事を示した。
ＤＮＡ合成反応の可視化技術を基としたタンパク質複合体の精密挙動解析

1分子解析技術は、DNAやタンパク質の1分子を対象とした分子挙動やその分布に基づきDNA代謝反応の素過程等を解析することが可能である。この技術を用いて、DNA代謝反応であるDNA合成反応とDNA分解反応の1分子観察技術を開発した。クレノウフラグメントによるDNA合成の1分子観察により、鋳型DNAの形態変化はDNA合成速度へ影響を与え、伸長させた鋳型DNAの方が縮んだランダムコイル形態の時よりも75%速くなることを見出した。一方、T7エキソヌクレアーゼによるDNA分解反応の解析では、酵素の供給を制御する事により分解反応の一時停止がおきることを見出し、その挙動を明らかにすることに成功した。【研究の目的】DNA代謝酵素をはじめとするタンパク質の機能解析の成果の多くは電気泳動を主とする解析結果によるものである。しかし、この多分子解析法では対象とする反応の前後でしか測定できないため反応過程の酵素活性やDNA代謝反応のメカニズム等が覆い隠されてしまう。また、1反応中に数百万分子以上の集合分子の挙動による平均値のみの解析結果であり、個々の分子挙動やその分布の詳細について不明な部分が多い。一方、1分子解析技術は、DNAやタンパク質の1分子を対象とした分子挙動やその分布に基づきDNA代謝反応の素過程である酵素活性やDNA代謝反応のメカニズムを解析することが可能であるため、DNA代謝反応を含む多くのDNA-酵素相互作用の分子挙動を明らかにすることを目的とした。【昨年度までの結果】熱硬化性高分子であるPolydimethylsioxane (PDMS)を用いた微細流路装置を作製し、送液ポンプにより流路中に調製溶液を連続的に注入する1分子観測システムを開発した。この開発した技術を基に修飾ガラス基板上に修飾DNA分子を片端固定し、流路中の流速を制御することで目的の1分子DNAの形態を制御すると共に、酵素を含む調製溶液を連続的に供給することでリアルタイムにDNAと酵素の相互作用解析を可能にした。ssDNA結合能を持つReplication protein A (RPA) 70kDaサブユニットと黄色蛍光タンパク質の融合タンパク質及び大腸菌RecAのssDNA結合ドメインペプチドを蛍光化合物Atto-488で化学修飾した蛍光ペプチドによるssDNAの可視化技術を開発した。【今年度の結果】開発した技術を用いて、DNA合成反応の進行に伴い鋳型ssDNAに結合したRPA-YFP分子が自由端からの解離し、RPA-YFP分子による可視化領域が短くなることを観察した。【各種DNA代謝関連因子の蛍光標識法】DNA代謝酵素と蛍光タンパク質との融合タンパク質発現系を構築した。緑色蛍光タンパク質(GFP)とRecAおよび黄色蛍光タンパク質(YFP)とReplication Protein A(RPA)70kDaの1本鎖DNA(ssDNA)結合ドメインを融合させるタンパク質発現ベクターを構築し、RecA-GFPとRPA-YFPの調製に成功した。また、RecAのssDNA結合部位である24アミノ酸残基ペプチドと蛍光化合物(Atto488)を化学修飾した蛍光ペプチド(ssDNA Binding Peptide-Atto488: ssBP-488)を調製した。【微細流路中でのssDNA可視化技術の確立】RecA-GFP、RPA-YFP、ssBP-488はssDNA結合活性をもつことを確認した。その後、微細流路中に片端固定したssDNAの可視化法を検討した。その結果、RecA-GFPおよびssBP-488はssDNAとの相互作用が非常に強く、2M NaClを含む緩衝液でも解離することなく可視化できた。また、RPA-YFPはssDNAを可視化後、短時間はssDNA全長を可視化できたが、緩衝液の流れにより自由端から解離した。そのため、片端固定したssDNAの自由端側にオリゴDNAをアニールした短い2本鎖DNA部位をもつssDNAを可視化すると、RPA-YFPを安定的に可視化でき、0.1 M NaClを含む緩衝液で解離した。【まとめ】流れのON/OFF制御により、RPA-YFP標識ssDNA形態を伸張形態及びランダムコイル形態に制御し、DNA合成反応を直接観察した。ランダムコイル形態のDNA合成反応の場合、一時的に緩衝液を流しDNAの伸張させることで観察した。DNA合成速度は、伸長形態では91 bases/sec、ランダムコイル形態では52 bases/secであった。DNA合成速度の伸長形態はランダムコイル形態に比較し75%速かった。この結果よりDNAの形態がDNA合成酵素反応のDNA合成速度に影響を与えている事が示されたと考える。T7Exoは5'-3'の方向へdsDNAを分解する酵素である。T7Exoを含む緩衝液を一時的に供給したとき、dsDNAの自由端から単調に短くなる様子を確認した。この自由端からのdsDNAの分解反応はT7

Exoを含まない緩衝液を供給してから数分後に停止した。その後、このdsDNAの伸張の長さに変化はなかった。一方、T7 Exoを連続的に供給した場合、DNA分解反応途中で複数以上の反応停止がおこることを確認した。それらの停止以外はdsDNAの自由端から単調に短くなる様子を確認した。DNA分解反応の間に起こった停止はT7 ExoがdsDNAから解離した事を示したと考える。T7ExoのDNA分解速度とprocessivityにおいて、T7 Exoを一時的に供給したときでは5.7 bases/secと6692 basesまた、T7 Exoを連続的に供給したときにおいて5.2 bases/secと5072 basesであった。この結果、T7 Exoを一時的に供給したときと連続的に供給したときのDNA分解速度とprocessivityはほとんど同じであった。T7 Exoの供給方法を変化させることによりT7 Exo活性の性質を明らかにする事ができた。分子生物学DNA合成酵素の1分子計測に成功し、論文および学会での発表を行った。具体的な内容は、RPA-YFPにより標識した鋳型ssDNA分子を流れのON/OFF制御により伸張形態及びランダムコイル形態に制御し、これらのDNA形態がDNA合成酵素Klenow Fragment (3'-5' exo-)へどの様な影響を与えるのかをDNA合成反応の直接観察により解析を行った。DNA合成反応中の流れをOFFに制御したランダムコイル形態では観測中のみ一時的に緩衝液を流し鋳型ssDNA分子を伸張させた。得られた結果は、DNA合成反応が進むにつれて各形態の鋳型ssDNAに結合していた蛍光RPA分子の自由端からの解離を観察した。また、DNA合成速度は、伸長形態では91 bases/s、ランダムコイル形態では52 bases/sであった。これらの結果より、おおむね順調に進展していると判断した。微細流路中でのssDNAの可視化条件を決定することができた。RecA-GFPおよびssBP-488とRPA-YFPは異なる性質を持ち、RecA-GFPおよびssBP-488は不可逆的なssDNAの可視化に使用出来るがDNA合成反応の可視化には不向きであった。しかし、RPA-YFPは可逆的な可視化に使用可能であり、DNA合成反応の可視化に使用可能であることを確認した。現在は、既に1分子解析技術によるDNA合成反応の解析に着手しており興味深い結果を得始めた。1分子に着目した直接観察によるDNA合成反応の解析技術を確立した。この技術を用いて各種DNA合成酵素の解析を行い、各種酵素の性質の相違を明らかにしていく。また、DNA合成酵素そのものも蛍光標識することにより、より詳細な性質を明らかにしていく。DNA合成酵素の蛍光標識法については、蛍光タンパク質との融合タンパク質の調製及びssDNAに結合させたDNA合成酵素と蛍光化合物を架橋する方法を試みている。
山地流域の水循環および水質形成過程に果たす谷底地下水域の役割に関する研究

本研究では,急峻な斜面と明瞭な谷底地下水域とを有する丘陵地源流域を対象として,詳細な水文観測および水サンプリング・化学分析を実施することにより,源流域における水循環および水質形成過程における谷底地下水域の役割を明らかにし,さらに源流域の水循環過程に関する一般則を得ることを最終目的とした.本年度は昨年度に続き対象流域において,河川水位および流量の連続観測,斜面尾根部から谷底に至る地中水の流動に関する観測,および林内雨,地中水,河川水のサンプリングを実施した.得られた水サンプルはすべて実験室に持ち帰り,水素・酸素安定同位体比,およびCl-,SiO2濃度の分析を行った.この結果,約2年間にわたる基礎的な水文・水質・安定同位体データが得られた.対象流域においては,降雨に対する河川の応答がきわめて速やかである傾向が認められた.また豪雨時において,河川水の安定同位体比は降水の影響をきわめて強く受けるという結果が得られた.地中水の挙動に関するデータ,また地中水の安定同位体比データなどを考慮すると,降雨流出時に河川水のかなりの部分は,谷底近傍の飽和域において発生した飽和地表流によって形成されているものと判断された.すなわち飽和域に降った降水が,地中水と混合することなく,降水成分を保存したまま飽和地表流として河川に流出したものと結論づけられる.従来,飽和地表流については,降雨流出に対して量的にかなり寄与することが報告されているが,本研究によってその成分が初めて特定され,小流域における降雨流出過程に果たす飽和地表流の重要性が,量的にも質的にも実証された.近年,源流域の水循環および水質形成過程において,とくに谷底地下水域における地中水の流動過程とそれに伴う水質変化過程がきわめて重要であることが示唆されている.しかしながら,谷底地下水域における地中水の流動過程と水質変化過程を,詳細に明らかにした研究例は少ない.そこで本研究では,急峻な斜面と明瞭な谷底地下水域とを有する丘陵地源流域を対象として,詳細な水文観測および水サンプリング・化学分析を実施することにより,源流域における水循環および水質形成過程における谷底地下水域の役割を明らかにし,さらに源流域の水循環過程に関する一般則を得ることを最終目標とした.本年度は対象流域において,河川水位および流量の連続観測を行い,基本的な河川の流出特性を明らかにした.併せて流域内の複数箇所において,土層貫入試験および土壌サンプリングを実施し,土層厚の空間分布および土壌の物理特性を詳細に明らかにした.さらに,斜面尾根部から谷底に至る測線を,流域の横断方向および縦断方向の2本設定し,この測線に沿って地中水の流動に関する観測および地中水のサンプリングを実施した.得られた水サンプルはすべて実験室に持ち帰り,各種無機溶存イオンおよび水素・酸素安定同位体比の分析を行った.この結果,準備段階を含めて約1年間にわたる基礎的な水文・水質データが得られた.対象流域においては,降雨に対する渓流の応答がきわめて速やかである傾向が認められた.また豪雨時において,渓流水の塩素イオン濃度がきわめて顕著に降雨によって希釈されるという結果が得られた.また豪雨時においては,斜面脚部の表層地中水中の塩素イオン濃度が,きわめて低い値をとる傾向がみられ,さらに斜面脚部の表層地中水が完全に飽和し直接渓流に流出するというデータが得られた.以上のデータは,豪雨時において谷底地下水域に降った降水成分は,いわゆる地下水成分とはほとんど混合しない状態で渓流に流出していることを示唆している.来年度さらに観測を継続することによって,より一般的な結論を得ることが可能になろう.本研究では,急峻な斜面と明瞭な谷底地下水域とを有する丘陵地源流域を対象として,詳細な水文観測および水サンプリング・化学分析を実施することにより,源流域における水循環および水質形成過程における谷底地下水域の役割を明らかにし,さらに源流域の水循環過程に関する一般則を得ることを最終目的とした.本年度は昨年度に続き対象流域において,河川水位および流量の連続観測,斜面尾根部から谷底に至る地中水の流動に関する観測,および林内雨,地中水,河川水のサンプリングを実施した.得られた水サンプルはすべて実験室に持ち帰り,水素・酸素安定同位体比,およびCl-,SiO2濃度の分析を行った.この結果,約2年間にわたる基礎的な水文・水質・安定同位体データが得られた.対象流域においては,降雨に対する河川の応答がきわめて速やかである傾向が認められた.また豪雨時において,河川水の安定同位体比は降水の影響をきわめて強く受けるという結果が得られた.地中水の挙動に関するデータ,また地中水の安定同位体比データなどを考慮すると,降雨流出時に河川水のかなりの部分は,谷底近傍の飽和域において発生した飽和地表流によって形成されているものと判断された.すなわち飽和域に降った降水が,地中水と混合することなく,降水成分を保存したまま飽和地表流として河川に流出したものと結論づけられる.従来,飽和地表流については,降雨流出に対して量的にかなり寄与することが報告されているが,本研究によってその成分が初めて特定され,小流域における降雨流出過程に果たす飽和地表流の重要性が,量的にも質的にも実証された.
フードファクターの分子ターゲットとしてのIMP脱水素酵素に関する研究

1)各種食品素材からのポリフェノール抽出物についてIMP脱水素酵素への影響について調べたところ、ボイセンベリーからの抽出物について阻害作用が見出された。DHAとEPAについてもIMP脱水素酵素への影響を調べたがいずれも軽微な阻害作用であった。ビタミンK以外の脂溶性ビタミンについてもIMP脱水素酵素への影響を調べたが、ほとんど影響しないか、軽度の阻害作用のみ見られた。あわせて、カロチノイド類についても検討を行った結果、興味あることに、β-Cryptoxanthinに非常に強い阻害作用が見出され(IC_<50>値:9.1μM)、これまで調べた天然化合物の中では最強であった。コエンザイムQ群についても調べたがいずれも影響は見られなかった。ビタミンK類の化合物にIMP脱水素酵素の阻害作用が見出されたので、キノン系化合物についても調べたところ、1,4-Benzoquinone(IC_<50>値:8.4μM)と1,4-Naphthoquinone(IC_<50>値:6.1μM)に強い阻害作用が見出された。ナフトキノン系化合物の中では、1-Naphthol (IC_<50>値;58μM)、1-Naphthaldehydem(IC_<50>値:13μM)、2-Naphthol(IC_<50>値:77μM)そこ阻害作用が見出された。2)GTPを肥満モデルマウスKKAyに摂取させ、肥満や血中脂肪、血糖などへの影響を調べたが、特に影響は見られなかった。3)クルクミンによる結腸がん細胞の増殖抑制がIMP脱水素酵素の阻害によるものか否か検討を調べるために、クルクミン添加条件にGTPやGMPを加えたところ、細胞増殖の抑制が僅かしか回復しなかった。このことは、クルクミンの細胞増殖抑制作用へのIMP脱水素酵素の関与は少ないことを示唆している。1.IMP脱水素酵素の研究を遂行するために、マウスIMP脱水素酵素type II型のクローニングを行い、大腸菌を用いてこの酵素の大量調製を行った。2.調製したIMP脱水素酵素を阻害するフードファクターの探索を行った。その結果、クルクミン、およびカテキンに強い阻害作用が見出された。その他、エラグ酸やクロロゲン酸など数種のポリフェノールについても阻害作用が示された。3.種々の長鎖脂肪酸の影響についても検討を加えた。その結果、炭素数20の複数の脂肪酸について調べた結果、いずれも不飽和結合を含む脂肪酸に阻害作用が見られた。炭素数20の多価不飽和脂肪酸の中では、eicosadienoic acidに最も強力な阻害作用が見られた。4.クルクミンのIMP脱水素酵素阻害作用について詳細な酵素化学的な解析を行った。その結果、その阻害様式は、拮抗、および非拮抗阻害の混合型であることが判明した。5.クルクミンの結腸癌細胞HT-29への影響について解析を行った。その結果、クルクミンにより細胞増殖の抑制とGTP濃度の減少が確認され、細胞レベルの実験でもクルクミンがIMP脱水素酵素を阻害していることが示唆された。6.IMP脱水素酵素の新たな生理的意義を明らかにするため脂肪細胞の分化との関連について解析を行った。その結果、この酵素は脂肪細胞の分化に伴って一過性に発現が上昇し、その生合成産物のGTPがその分化促進に関わる可能性が示された。1.昨年、検討を加えた以外のポリフェノール化合物12種類やその他のフードファクター(アスタキサンチン等のカロチノイド類、その他)10種類についても、IMP脱水素酵素(IMPDH)阻害作用についてスクリーニングを行った。その結果、数種類のフードファクターについて、若干の阻害作用が見られたが、前年度に見出したクルクミンやエラグ酸などの作用と比べて弱いものであった。2.ビタミン類については、ビタミンK化合物(Kl、K2、及びK3)についてIMPDH阻害作用を調べた。その結果、ビタミンK3に強い阻害作用が見出された。そこで、さちにビタミンK3と同じキノン化合物10種以上をスクリーニングした結果、1,4-Naphthoquinoneが最も強い阻害を示した。3.IMPDHの新たな生理的意義として脂肪細胞の分化との関連について検討を行い、IMPDHは脂肪細胞の分化に関連する因子である可能性が示された。そこで、IMPDHを阻害することが明らかとなったクルクミンやエラグ酸が脂肪細胞の分化を抑制するか否か検討を行った。その結果、クルクミンが脂肪細胞の分化を抑制することが判明した。4.エラグ酸がIMPDHを阻害し、脂肪細胞の分化を抑制していたので、実際に高脂肪食誘発肥満に対してエラグ酸が肥満を抑制するか否か検討を加えた。その結果、エラグ酸の摂取は肥満には影響を与えなかったが、血中のトリグリセリドやコレステロールの低下が見出された。

コエンザイムQ群についても調べたがいずれも影響は見られなかった。ビタミンK類の化合物にIMP脱水素酵素の阻害作用が見出されたので、キノン系化合物についても調べたところ、1,4-Benzoquinone(IC_<50>値:8.4μM)と1,4-Naphthoquinone(IC_<50>値:6.1μM)に強い阻害作用が見出された。ナフトキノン系化合物の中では、1-Naphthol (IC_<50>値;58μM)、1-Naphthaldehydem(IC_<50>値:13μM)、2-Naphthol(IC_<50>値:77μM)そこ阻害作用が見出された。2)GTPを肥満モデルマウスKKAyに摂取させ、肥満や血中脂肪、血糖などへの影響を調べたが、特に影響は見られなかった。3)クルクミンによる結腸がん細胞の増殖抑制がIMP脱水素酵素の阻害によるものか否か検討を調べるために、クルクミン添加条件にGTPやGMPを加えたところ、細胞増殖の抑制が僅かしか回復しなかった。このことは、クルクミンの細胞増殖抑制作用へのIMP脱水素酵素の関与は少ないことを示唆している。
筋特異的ユビキチンリガーゼMURFとコネクチンによる筋恒常性維持メカニズムの解析

本研究により、昨年度までに、筋特異的に発現するユビキチンリガーゼMuRF1がエネルギー代謝酵素やアミノ酸代謝酵素、あるいは転写調節因子といった多様なタンパク質を分解に導くこと、また、MuRF1が筋タンパク質合成を負に制御し、アミノ酸飢餓時にはMuRF1が血中アミノ酸濃度の維持に寄与していることなどを見出し、MuRF1が筋細胞の代謝恒常性維持に重要な機能を担っているというモデルを提唱していた。このように、MuRF1の機能については興味深い知見を得ることが出来ていたが、本研究のもう一つの主要な課題である、MuRF1とカルパイン系との関わりについてはほとんど知見を得られていなかった。そこで、本年度は、MuRF1とカルパインの関わりを明らかにする第一段階として、未だ不明な点の多いカルパインの基質特異性に関する解析を行った。MuRF1は骨格筋内において骨格筋特異的カルパインp94と近接していると考えられている。そこで、カルパインの基質特異性、つまり、p94と組織普遍的な分子種であるm-、m-カルパインとの基質特異性の差異などを明らかにすることは、MuRF1とカルパイン系の関わりを論じる上で非常に重要であると考えられる。本年度は、まず、そのアプローチとして、μ-、m-カルパイン間の基質特異性の有無について、ペプチド基質の混合物を両者で切断させ、その切断速度を網羅的に解析するという新規方法論により調べた。その結果、両者の基質特異性には差異があるということが明かとなった。今後、この手法を発展させ、カルパインの基質特異性に関してより詳細を明らかにし、MuRF1とカルパイン系の関わりについても迫っていきたい。MURF1は、筋萎縮誘導に際し主要な役割を担う、骨格筋および心筋特異的なユビキチンリガーゼである。本年度は、MURF1による筋萎縮誘導のメカニズムおよびその生理的意義を明らかにすることを目的とし、二つの観点から研究を行った。即ち、生化学的手法を用いた分子レベルでの解析と、遺伝子改変マウスを用いた個体レベルでの解析を行った。まず、生化学的手法による解析により、MURF1の相互作用分子の一つとして、筋型クレアチンキナーゼ(M-CK)を同定した。M-CKは筋細胞内におけるエネルギー代謝制御の中心的酵素である。また、培養細胞を用いた共発現系により詳細な解析を行い、この結合はMURF1のB-boxドメインを介していること、MURF1がM-CKをユビキチン化し、プロテアソームによる分解へと導くことを明らかにした。続いて、MURF1遺伝子の欠損(KO)マウスと野生型マウスをアミノ酸飢餓による筋萎縮誘導条件下で飼育し、比較解析を行った。これらのマウスについて血中アミノ酸濃度を測定したところ、MURF1KOマウスでは筋萎縮誘導時に必須アミノ酸濃度が低下していることが明らかとなった。これは、必須アミノ酸の中でも、筋細胞内でエネルギー源として利用される分岐鎖アミノ酸濃度について特に顕著であった。また、MURF1の相互作用分子として同定されたM-CKの量が、野生型マウスに比べKOマウスで増加していることも明らかにされた。このことは、実際に生体内においてもMURF1がM-CKを分解に導いていることを示していると考えられた。以上のように、本年度の研究により、MURF1が飢餓に代表される異化的な条件下において、必須アミノ酸の供給およびエネルギー代謝酵素(M-CK)の分解制御を介し生体のエネルギー代謝の恒常性維持に寄与していることが示唆された。なお、これらの結果は、近く論文として投稿する予定である。MuRF1は、筋細胞特異的に発現するユビキチン(Ub)リガーゼであり、筋タンパク質をUb化し分解に導くことにより筋萎縮誘導の中心的な役割を担っていると考えられている。筋萎縮は寝たきりの生活や怪我をした際のギブス固定など、様々な場面で生じる。そのため、MuRF1の機能を明らかにすることは、その予防法や治療法の確立に必須であり、また、これからの高齢化社会において極めて重要な意味を持つと考えられる。そこで、本研究では、このMuRF1の機能とその生理的意義を明らかにすることを目的として、分子レベルおよび個体レベルでの解析を行っている。まず、分子レベルでの郷析として、MuRF1の相互作用分子を同定し、培養細胞を用いた共発現系により、その作用機序を解析した。これにより、昨年度までに、MuRF1が筋細胞内の重要なエネルギー産生酵素である筋型クレアチンキナーゼ(M-CK)をUb化し分解へ導くということを見出していた。この系によるMuRF1の基質の同定は、本研究において最もカを入れている部分であるが、本年度は、新たにMuRF1が筋細胞内の重要な転写調節因子GMEB1および必須アミノ酸バリン(Val)の代謝酵素HIBADHをUb化し分解に導くことを見出した。一方、個体レベルでの解析として、野生型マウスとMuRF1遺伝子欠損(KO)マウスをMuRF1依存的な筋萎縮誘導条件下で飼育し、これらのマウスを比較解析することで、MuRF1の持つ生理的機能を明らかにすることを試みている。昨年度までに、MuRF1依存的な筋萎縮誘導条件として10%グルコース水および飲料水のみでマウスを飼育する条件(アミノ酸飢餓条件)を確立し、この条件下ではKOマウスで血中必須アミノ酸量が減少していること、すなわちMuRF1が血中アミノ酸量の維持に重要であるということを見出していた。本年度は、この系を用いて更に解析を行った。

その結果、アミノ酸飢餓条件において、KOマウスでは野生型マウスよりも筋タンパク質合成量が多いこと、すなわちMuRF1が筋タンパク質合成を負に制御している可能性を見出した。従来、MuRF1の機能としてはUb化を介した筋タンパク質分解の昂進という視点でのみ考えられており、この、「MuRF1による筋タンパク質合成抑制」という考えは、MuRF1の機能解析に新たな流れをもたらすものと期待される。本年度得られたこれらの知見および昨年度までの知見から、MuRF1が次のような二つの生理機能を有すると予想された。まず一つ目がATP産生酵素M-CKおよびVal代謝酵素HIBADHの分解制御による筋細胞内のエネルギー代謝制御である。一方、二つ目は、Ub化を介した筋タンパク質分解量の増加および筋タンパク質合成の抑制による、血中アミノ酸量の維持である。また、この筋タンパク質合成の抑制は、一部は転写調節因子GMEB1の分解制御を介した転写レベルでの制御によりなされていると考えられる。これらのことから、MuRF1がエネルギー代謝制御および血中アミノ酸量の維持という機能を介し生体の代謝恒常性維持に寄与している、とのモデルを提唱し、投稿論文としてまとめた。これは、J.MoL.Biol.に受理された。本研究により、昨年度までに、筋特異的に発現するユビキチンリガーゼMuRF1がエネルギー代謝酵素やアミノ酸代謝酵素、あるいは転写調節因子といった多様なタンパク質を分解に導くこと、また、MuRF1が筋タンパク質合成を負に制御し、アミノ酸飢餓時にはMuRF1が血中アミノ酸濃度の維持に寄与していることなどを見出し、MuRF1が筋細胞の代謝恒常性維持に重要な機能を担っているというモデルを提唱していた。このように、MuRF1の機能については興味深い知見を得ることが出来ていたが、本研究のもう一つの主要な課題である、MuRF1とカルパイン系との関わりについてはほとんど知見を得られていなかった。そこで、本年度は、MuRF1とカルパインの関わりを明らかにする第一段階として、未だ不明な点の多いカルパインの基質特異性に関する解析を行った。MuRF1は骨格筋内において骨格筋特異的カルパインp94と近接していると考えられている。そこで、カルパインの基質特異性、つまり、p94と組織普遍的な分子種であるm-、m-カルパインとの基質特異性の差異などを明らかにすることは、MuRF1とカルパイン系の関わりを論じる上で非常に重要であると考えられる。本年度は、まず、そのアプローチとして、μ-、m-カルパイン間の基質特異性の有無について、ペプチド基質の混合物を両者で切断させ、その切断速度を網羅的に解析するという新規方法論により調べた。その結果、両者の基質特異性には差異があるということが明かとなった。今後、この手法を発展させ、カルパインの基質特異性に関してより詳細を明らかにし、MuRF1とカルパイン系の関わりについても迫っていきたい。
複雑時系列からの決定論的支配方程式の抽出手法に関する研究

観測データから系の支配方程式を抽出することは,多くの科学・工学領域において中心的な課題であり続けている.膨大な実験データと研究者の洞察力によって様々な分野において基礎方程式と呼ばれる微分方程式が見出されており,支配方程式として簡潔な微分方程式を導出することは当該分野の発展の基盤となる.しかし,例えば生物学,神経科学のように,明確な物理現象・化学プロセスに基づくモデルが明らかにされていない分野も多い.本研究では,潜在構造が明らかでない複雑時系列データから,系の時間遷移を記述する決定論的力学系を同定する方法論の開発を目指す.観測データから系の支配方程式を抽出することは,多くの科学・工学領域において中心的な課題であり続けている.膨大な実験データと研究者の洞察力によって様々な分野において基礎方程式と呼ばれる微分方程式が見出されており,支配方程式として簡潔な微分方程式を導出することは当該分野の発展の基盤となる.しかし,例えば生物学,神経科学のように,明確な物理現象・化学プロセスに基づくモデルが明らかにされていない分野も多い.本研究では,潜在構造が明らかでない複雑時系列データから,系の時間遷移を記述する決定論的力学系を同定する方法論の開発を目指す.
免疫自己寛容維持および自己免疫病発症における制御性T細胞のシグナル伝達機構に関する研究

平成14年9月に来日以来、自己免疫病の発症に関与する自己反応性T細胞に対する制御機構を、細胞レベル、分子レベルで研究している。ふたつのプロジェクトを担当しており、現在成果が出始めたところである。ひとつのプロジェクトは、本研究室で発見した内在性CD25+CD4+制御性T細胞の活性化機構について樹状細胞の役割を解析するものである。具体的成果として、(1)マウスの骨髄細胞から試験管内で樹状細胞を分化させる実験系を確立した。(2)試験管内で樹状細胞を細菌内毒素(LPS)で刺激することにより分化・成熟させると、そのような樹状細胞は制御性T細胞の増殖を惹起することを発見した。(3)同時に、制御性T細胞の増殖はToll-like receptorの刺激によっても惹起出来ることを確認した。現在、この樹状細胞と制御性T細胞の間の相互作用の意味について生体内で解析している。またこの反応が自己免疫病の発症にどのような効果をおよぼすかを検討しようとしている。第二のプロジェクトとして、樹状細胞を含む抗原提示細胞の活性化が自己免疫病の発症に及ぼす効果を解析している。用いている実験系は、当研究室で確立した自己免疫性関節炎自然発症マウスモデルである。現在、抗CD40抗体の生体内投与により関節炎発症が促進されるか検討している。研究以外に、Fehervari博士は、研究室の大学院学生の英語の語学力向上のため、彼等の英語での論文執筆、発表に積極的助言を与え、感謝されている。
植物における側根から不定シュートへの置換の分子機構に関する研究

植物の根は普通側根を形成するが、分類群によっては根から不定シュートを形成し、クローン繁殖や環境に適応した形態を作り出す。従って、根からの不定シュート形成は植物の重要な形態形成の一つである。本研究の目的は、「根からの不定シュート形成」に関し、自然条件下で根からシュート形成を行う種を用い、その機構を解明することである。セイヨウオトギリ(オトギリソウ科)は、実生の上胚軸を切除することで根からの不定シュート形成が誘導される。地上部を切除した後、切口にオーキシンを含ませた寒天を与えたところ、オーキシンを含まない寒天を与えた時に比べ、不定シュート形成個体の割合が減少した。このことから、地上部を除去したことにより地下部へのオーキシンの供給が妨げられたことが不定シュート形成を誘導している可能性が示唆された。渓流沿い植物カワゴケソウ科のほとんどの種は、幼根を欠き、胚軸から生じる不定根が不定シュートを形成する。カワゴケソウ科のボディプランの起源を探るために、姉妹群のオトギリソウ科の実生形態を観察した。セイヨウオトギリの成熟胚は幼芽と幼根を持ち、胚軸の内鞘組織から不定根を形成した。根は地中を葡匐し不定シュート形成を行った。これらの形態形成がカワゴケソウ科の基部系統群のテルニオプシス属と類似していることから、カワゴケソウ科は陸生祖先種の段階で「胚軸からの不定根形成」と「根からの不定シュート形成」という形質を備えていたことが示唆された。一方、カワゴケソウ科の不定シュートは、根端分裂組織内で発生する点でオトギリソウ科と異なり、今後両者の発生機構を詳細に比較する必要がある。根は、普通側根を形成するが、分類群によってはシュート(不定シュート)を形成する。しかし、モデル植物のシロイヌナズナが自然条件下で根から不定シュート形成を行わないことから、その分子機構は解析されていない。本研究の目的は、自然条件下で根から不定シュート形成を行う種を用い、不定シュート形成と側根形成を分子レベルで比較することにより、「根からの不定シュート形成」の分子機構を明らかにすることである。まず、セイヨウオトギリ(オトギリソウ科)を材料に用い、根から選択的に側根と不定シュートを形成させる系を確立するために、培養条件の検討を行った。その結果、種子から発芽した幼植物体を無処理で培養した場合は側根のみを形成するが、上胚軸を除去した場合は根の基部付近から不定シュートを形成した。不定シュートの発生過程を切片観察した結果、根の中心柱の内鞘組織から発生しており、他の分類群と同様、側根と同じ組織に由来することが明らかとなった。不定シュートのアイデンティティがどのように確立するのかを分子マーカーを用いて解析するため、茎頂分裂組織と根端分裂組織の形成・維持に関わる遺伝子の単離を行った。現在までに、SHOOT MERISTEMLESSWUSCHEL、WUSCHEL-LIKEHOMEOBOX 5の相同遺伝子を単離した。今後は、不定シュート形成過程を詳細に観察するとともに、遺伝子の発現パターンを側根形成と不定シュート形成の間で比較し、不定シュートがどのような機構で生じるのかを探る。また、遺伝学的解析を行うために、オトギリソウ科で形質転換系を確立する。セイヨウオトギリ(オトギリソウ科)では、地中の根の一部が水平方向に伸長し,不定的にシュートを形成する。上胚軸を切除することで根からの不定シュート形成を誘導する系を用いて観察を行ったところ、不定シュートは根の木部に近接した内鞘組織から発生した。一方、側根は木部に接した内鞘組織および内皮組織から発生した。従って、不定シュートと側根の発生開始機構は一部共通している可能性が示唆された。不定シュートのアイデンティティがどのように確立するのかを分子マーカーを用いて解析するため、茎頂分裂組織と根端分裂組織の形成・維持に関わる遺伝子の単離を行い、SHOOT MERISTEMLESS (STM)、WUSCHEL (WUS)、WUSCHEL-LIKE HOMEOBOX 5 (WOX5)の相同遺伝子を単離し全長を決定した。現在、これらの遺伝子のRNAプローブを作成し,in situ hybridization法により発現解析を行っている。また、不定シュートの発生開始にどのような植物ホルモンが関わるのかを明らかにし、生理学的な側面からも側根形成との比較解析を行っている。

セイヨウオトギリ(オトギリソウ科)は、実生の上胚軸を切除することで根からの不定シュート形成が誘導される。地上部を切除した後、切口にオーキシンを含ませた寒天を与えたところ、オーキシンを含まない寒天を与えた時に比べ、不定シュート形成個体の割合が減少した。このことから、地上部を除去したことにより地下部へのオーキシンの供給が妨げられたことが不定シュート形成を誘導している可能性が示唆された。渓流沿い植物カワゴケソウ科のほとんどの種は、幼根を欠き、胚軸から生じる不定根が不定シュートを形成する。カワゴケソウ科のボディプランの起源を探るために、姉妹群のオトギリソウ科の実生形態を観察した。セイヨウオトギリの成熟胚は幼芽と幼根を持ち、胚軸の内鞘組織から不定根を形成した。根は地中を葡匐し不定シュート形成を行った。これらの形態形成がカワゴケソウ科の基部系統群のテルニオプシス属と類似していることから、カワゴケソウ科は陸生祖先種の段階で「胚軸からの不定根形成」と「根からの不定シュート形成」という形質を備えていたことが示唆された。一方、カワゴケソウ科の不定シュートは、根端分裂組織内で発生する点でオトギリソウ科と異なり、今後両者の発生機構を詳細に比較する必要がある。
クローンおよび人為三倍体ギンブナの魚体成分の比較

遺伝的に異なる2系統のクローンギンブナ(以下クローンIおよびII)および通常の2倍体の交配によるギンブナ(以下コントロール)子孫を以下の実験に用いた。あらかじめ体長をそろえたクローンI,クローンIIおよびコントロールの幼魚各20尾を50mlの容器で個別飼育した。給餌はすべての個体について同じになるように1日3回配合飼料を投与した。試験機関は50日間で,飼育終了時にすべての個体をとりあげ生物学的性状および生化学的分析に供した。その結果,成長の良否はクローンI>コントロール>クローンIIの順となったが,クローンIおよびクローンIIの体長や体重の変動係数は対照としたコントロールのそれより明らかに縮小した。このような傾向は肥満度や比肝重量にも認められた。さらに各群の体成分を比較したところ,クローンIおよびクローンIIの水分含量,脂質含量,脂質クラス組成ならびに脂肪酸組成のバラツキはコントロールのそれらより明らかに縮小した。また,成長の良かったクローンIのタンパク質合成能(RNA/DNA)は高く,分解能(酸性プロテアーゼ活性)が低かったが,成長の停滞したクローンIIのタンパク質合成能は低く,分解能は高かった。以上の結果より,クローンは成長変異のみならず魚体成分の個体間変動も低下することから,栄養生理学への実験魚としての有用性が立証された。また,ギンブナ幼魚期の成長は,タンパク質の合成能と分解能とのバランスによってコントロールされていることが明らかになった。したがって,これらの生化学的性状を分析することにより,成長の優れた系統を検索できる可能性が示唆された。