hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
スポーツマネジメント教育の課題と展望‐学系別における認識差異に注視して‐

担当者は過去にスポーツ企業現場での職務経験があり業界とのネットワークが特に緊密であることから役割を担った。また、研究分担者・協力者の研究会組織を統括し、その運営も担った。本研究の目的は、研究の目的は、1.大学における現行のスポーツマネジメントカリキュラムを定量整理するとともに、スポーツマネジメント教員のスポーツマネジメント概念に対する認識の違いから起こるカリキュラム内容の差異について検討する。2.現役学生のスポーツマネジメント教育に対するモチベーションや資質を検討するとともに、卒業学生の動向から彼らのスポーツマネジメント教育に対する意識変容について検討する。3.実践現場からみたスポーツマネジメント教育の認識を検討するとともに、実践者(現職者)の資質・行動特性と現行カリキュラムとの整合性について検討することである。本研究は、平成23年度平成24年度の3年間で行う計画である。平成23年度は、予備調査も兼ねてフィールド選定が重要となる。なお23年度は、現状把握のため定量調査が主題となり、マネジメント教育の全体状況の把握に努めることである。平成24年度以降は、それぞれのフィールドにおいて3者に対しての定性調査が主題となる。定性調査では研究者間のピア・ディスカッションを充実させることから、主担当を2名制にして実施したい(下表参照)。さらに研究の修正・補強が生じた場合は、次年度までに整理することとしている。現在までの研究実績は、特に現場側の求めるマネジメントスキルについてのインタビュー調査がメインとなった。また、現場といっても、スポーツツーリズム、スクール、スポーツクラブ経営、国際スポーツ事業従事者と限られた分野のスポーツビジネス関係者へのインタビュー調査に留まっている。また、本研究の計画では、1大学側、2学生側の現状についても調査することとなっているが、先に述べた通りの「現場側」へのインタビュー調査に留まっている。現在、経営系、スポーツマネジメント系、経営学教育系関連の書籍をベースに研究会を重ね、大学に対する質問し作成業務に入っている。また、プロスポーツチーム(パ・リーグ3球団)と限定出来ではあるが、球団スタッフに対するインタビュー調査を行うなど現場側に対するアプローチも計画通り行っている。今後、各大学から収集したカリキュラムの分析や球団からヒヤリングをおこなった内容のテキストマイニングなど、質的分析の精度を高めていく必要があるが、ほぼ計画通り進んでいる。3ヵ年の計画から達成度を考えると、4割の進捗であると考える。
系外資源流入と栄養カスケードが促進する島嶼生態系構成種の適応進化

本研究は、有人島と無人島を併せて6842にも上る島嶼が多様な海洋環境とともに存在する日本列島の特性を活かした野外研究である。伊豆諸島の長期研究で得た生態学的知見、すなわち海洋からの系外資源流入が栄養カスケードを介して捕食者と被食者の適応進化と個体群動態に及ぼす相互作用の一般性を、多様な海洋環境と島の地理的条件を考慮した統計学的研究によって検証する。
宿主特異的ACR毒素のレセプター遺伝子の単離とその解析

Alternaria alternata rough lemonpathotypeにより生産されるACR毒素の作用点はミトコンドリアであり、単離したミトコンドリアの酸化的リン酸化の脱共役と補因子の漏出によるTCA回路の停止を引き起こす。これらミトコンドリアに及ぼす毒素の作用は、ACR毒素感受性であるラフレモンのミトコンドリアにのみであり、他植物のミトコンドリアには一切毒性を示さない。先に、大腸菌をACR毒素に感受化させるカンキツミトコンドリア(mt)遺伝子(ACRS)を単離し、11年度はACRS遺伝子による毒素感受化機構について大腸菌発現系を用いて解析し、12年度はカンキツmtのACR毒素感受化決定機構における本遺伝子の役割について解析した。ACRS遺伝子を含む約2600bpのラフレモンDNA断片領域(ACRS22kpn32)の塩基配列を決定した結果、ACRS遺伝子はtRNA-Alaのイントロン部分に位置することを明らかにした。ACRS遺伝子はACR毒素感受性、抵抗性カンキツの双方のmtゲノム中に存在してたが、毒素抵抗性品種のmtでは本遺伝子転写物がプロセッシングを受け、感受性mtでのみ機能することが明らかとなった。次に、大腸菌発現産物を用いてACRS遺伝子産物に対する抗体を作成し、ウエスタンブロット法によりmtにおける本遺伝子産物の有無を検定した結果、本遺伝子産物は感受性ラフレモンmtにのみ存在することが明らかとなった。このことから、ACRS遺伝子転写物は抵抗性カンキツmtではプロセッシングを受けて翻訳されないが、感受性カンキツmtでは本遺伝子産物が翻訳され、ACR毒素感受化決定の主因子として機能していることが明らかとなった。これら植物ミトコンドリア遺伝子の転写物修飾の有無により、病原菌感受化における特異性が支配される例はこれが始めての報告である。カンキツbrown spot病菌は宿主特異的毒素であるACR毒素を生産し、本毒素が病原性の主因子である。本毒素はラフレモン等のカンキツのみに高い毒性を示し、その作用点は宿主カンキツのミトコンドリアである。先に、本来ACR毒素に耐性である大腸菌を毒素感受化させる365bpの遺伝子(ACRS)をラフレモンから単離した。本研究では、このACRS遺伝子を含む4300bpのラフレモンDNA断片(ACRS 3 2)をミトコンドリアゲノムから単離し、ACRS遺伝子を含む約2600bpの領域(ACRS22kpn32)の全塩基配列を決定した。この配列の相同検索の結果から、ACRS遺伝子はtRNA-Alaのイントロン部分に位置することを明らかにした。植物では、tRNA-Alaのイントロン部分はtRNA-Alaとともに転写された後、tRNA-Alaの切断とともにその転写物のイントロン部分が翻訳され、本来のtRNAに関係ない別の蛋白をコードすることが明らかとなっている。ACRS遺伝子このtRNA-Alaのイントロン部分に存在することから、ミトコンドリアにおいてtRNA-Alaの発現とともに転写され、tRNA-Alaの切断とともに翻訳されたその遺伝子産物が毒素感受化を担うものと推測された。また、ACRS遺伝子の推定アミノ酸配列は、ドーパミンレセプター様蛋白、グルタミン酸レセプター、黄体形成ホルモンレセプター等の幾つかのトランスメンブレン型のレセプターと部分的相同性を示した。そこで、これらのレセプターと相同性が高かったアミノ酸部位の毒素感受化機構における役割を点変異、欠失変異実験により検討した。これらの部位の1つ、もしくは2つを同時に置換した変異ACRS遺伝子を大腸菌において発現させたが、ACR毒素感受度の低下は見られなかった。しかし、4つのアミノ酸部位を同時に置換した変異ACRS遺伝子を大腸菌において発現させると34.2%の毒素感受度の低下が見られた。

次に、ACRS遺伝子配列内には植物ミトコンドリア遺伝子のプロセッシングモチーフが存在し、その下流に先にあげたレセプターとの相同性領域が含まれていた。そこで、ACRS遺伝子をモチーフ直後にある制限酵素AflII部位で切断し、大腸菌で発現させ、毒素に対する感受性を検定したところ、毒素感受性は完全に消失した。これらの結果は、ACR毒素抵抗性は本遺伝子の転写物のプロセッシングにより制御される可能性を示した。Alternariaalternata rough lemonpathotypeにより生産されるACR毒素は、本菌の病原性の主因子であり、タギング法(REMI法)による毒素生成能欠損株は病原性を完全に失う。本毒素の作用点はミトコンドリアであり、作用機構は酸化的リン酸化の脱共役と補因子の漏出によるTCA回路の停止である。ACR毒素は宿主であるラフレモンのミトコンドリアにのみ作用し、他植物のミトコンドリアには一切毒性を示さない。先に、大腸菌をACR毒素に感受化させるカンキツミトコンドリア(mt)遺伝子(ACRS)を単離し、前年度は大腸菌発現系を用いて、ACRS遺伝子による毒素感受化機構について解析してきた。今年度は、カンキツmtのACR毒素感受化決定機構における本遺伝子の役割について解析した。ACRS遺伝子を含む約2600bpのラフレモンDNA断片領域(ACRS22kpn32)の塩基配列を決定した結果、ACRS遺伝子はtRNA-Alaのイントロン部分に位置することを明らかにした。ACRS遺伝子はACR毒素感受性、抵抗性カンキツの双方のmtゲノム中に存在してたが、毒素抵抗性品種のmtでは本遺伝子転写物がプロセッシングを受けていることが明らかとなった。次に、大腸菌発現産物を用いてACRS遺伝子産物に対する抗体を作成し、ウエスタンブロット法によりmtにおける本遺伝子産物の有無を検定した結果、本遺伝子産物はACR毒素感受性ラフレモンmtにのみ存在することが明らかとなった。このことから、ACRS遺伝子転写物は抵抗性カンキツmtではプロセッシングを受けて翻訳されないが、感受性カンキツmtでは本遺伝子産物が翻訳され、ACR毒素感受化決定の主因子として機能していることが明らかとなった。これら植物ミトコンドリア遺伝子の転写物修飾の有無により、病原菌感受化における特異性が支配される例はこれが始めての報告であり、現在Scienceに投稿審査中である。
エロンガンAの標的遺伝子の同定と伸長／ユビキチンリガーゼ両機能間の変換機構の解明

Elongin A(EloA)は、RNAポリメラーゼII(Pol II)によるmRNA鎖合成を促進する転写伸長因子であると同時にユビキチンリガーゼ(E3)の基質認識サブユニットとしても働く。本研究では先ず、伸長因子EloAの標的としてHox遺伝子を同定した。次いで、EloA-E3複合体の形成が、DNA傷害並びにα-amanitin等のPol II伸長阻害剤により促進されることを明らかにした。さらに、EloA-E3が細胞内でCSBと相互作用し、同会合がDNA傷害、α-amanitin等で促進されること、CSBがEloA-E3のDNA傷害部位へのリクルートメントを促進すること等を明らかにした。2. DNA傷害(-)型転写抑制によるEloAのE3機能活性化に関わる因子の同定1.の課題の推進に全エフォートを傾けたため、着手できていない。1. DNA傷害(-)型転写抑制によるEloA-ユビキチンリガーゼ(E3)機能活性化に関わるシグナルの解析生細胞内でElongin A(EloA)-E3複合体の形成を確認するため、EloAはHalo-tagとCul5はmCherry-tagとの融合タンパクの形で発現させて、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)法を用いて各種刺激後のEloA、Cul5間の相互作用を解析した。両因子間の会合は、UV照射等のDNA傷害刺激ならびにα-amanitin、DRB等のRNAポリメラーゼII(pol II)阻害剤により促進された。また、EloA依存性の転写を活性化することが知られているERストレス誘導剤thapsigargin、栄養飢餓誘導剤histidinolやレチノイン酸(RA)の影響について調べたところ、何れの刺激も両因子の会合を有意に促進することが明らかとなった。さらに、UV照射後の両因子の会合がATMキナーゼ阻害剤のKU60019により抑制されたのに対して、その他の刺激後の会合は抑制されないことが判明し、DNA非傷害型の刺激はDNA傷害型とは異なる経路でE3複合体の形成を促進することが示唆された。2.同定したEloAの標的遺伝子の検証抗EloA抗体を用いたChIP-sequence解析の結果、レチノイン酸刺激後に有意なEloAの集積を認めたhomeobox遺伝子群、snRNA遺伝子、snoRNA遺伝子等の遺伝子上に、pol IIも同時に集積するかを確認するために、抗pol II抗体(Santa Cruz N20, rabbit polyclonal antibody)を用いたChIP-sequence解析を実施したが、noiseが非常に高く解析不能であった。また、N20抗体が発売中止となり入手できなくなった。Elongin A(EloA)-ユビキチンリガーゼ(E3)とCockayne syndrome B(CSB)タンパクとの細胞内での結合性の有無を検証するため、EloA、Cul5はそれぞれHalo-tag、mCherryと、CSBはGFPとの融合タンパクとして発現させ、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)法を用いてこれら因子間の相互作用について解析した。その結果、EloA及びCul5とCSBとの会合が、各種(camptothecin、etoposide、methyl methanesulfonate、aphidicolin、hydroxyurea等)のDNA傷害刺激並びにα-amanitin、DRB等のRNAポリメラーゼIIの伸長阻害剤により顕著に促進されることが判明した。また、UV照射刺激後のEloAとCul5間の会合がCSBの存在により顕著に促進されること、さらには、EloA-E3が細胞内のDNA傷害部位にリクルートされるのにCSBの存在が必須であること等を明らかにした。続いて、EloAの各種欠失変異体を用いてEloA-CSB間或いはEloA-Cul5間の結合性とDNA傷害部位へのリクルートメントとの関連について解析した。その結果、EloA-CSB間の結合性とリクルートメントとの間には相関が認められたが、EloA-Cul5間については、EloAのBC box欠失変異体のようにCul5との結合性は喪失するもののリクルートメントには異常をきたさないものが存在することが判明した。以上より、EloAはCul5とE3複合体を形成するより以前にDNA傷害部位にリクルートされ得ると考えられた。抗Elongin A抗体を用いて実施したChIP-sequence解析の結果、Elongin Aがhomeobox遺伝子群のみでなく一群のsmall nuclear RNA遺伝子の発現をも制御している可能性が高くなったため、当初予定していた「DNA傷害(-)型転写抑制によるElongin AのE3機能活性化の機構の解明」の課題は実施せず、代わりに「レチノイン酸刺激によるElongin Aのhox遺伝子ならびにsmall nuclear RNA遺伝子上へのリクルートメントの機構の解明」の課題を実施することとした。分子生物学
両眼を用いた水平および奥行き方向への注視トレーニングの効果に関する検討

本研究課題では、視野空間内で注視位置を維持する際において利き目が非利き目に比べて安定した特性を示すかという問題について検討した。また、スポーツ競技選手の両眼注視における左右眼の動的特性を検討した。さらに、両眼眼球運動のトレーニング効果を検証するためのシステムを構築し、両眼注視特性とスポーツパフォーマンスとの関連について検討することを目的とした。その結果、両眼注視時に利き目が非利き目に比べて安定した特性をもつことが示された。また、眼球運動に関するフィードバック情報の提示が眼球運動特性に影響を与える可能性、および奥行き方向への注視移動時の動的特性がスポーツパフォーマンスと関連することが示唆された。本研究課題では、視野空間内における注視位置の移動の際に、利き目が非利き目に比べて安定した動的特性を示すかという問題に加え、視野空間内で注視位置の維持を行う際においても利き目が非利き目に比べて安定した特性を示すかという問題に関し、各種スポーツ競技選手の両眼注視における動的特性および注視安定性を詳細に調べ、競技種目間差および技能レベルとの関連について検討し、さらにそのトレーニング効果を検証することを目的とした。初年度は2つの研究を行った。まず、両眼による注視安定性および動的特性における利き目と非利き目の差異を比較検討した。実験参加者は、暗室において頭部方向に対し左右方向に呈示されたLEDの位置を注視し、ターゲット消失後もその視線方向をできるだけ維持した。その結果、利き目は非利き目に比べて、記憶した視覚ターゲット位置への注視方向の維持および眼球運動特性が優れており、一方非利き目は反対側視野における注視位置の維持が困難であることが示された。次に、水平方向への素早い注視移動を行う際の眼球運動特性であるサッケード眼球運動の速度情報を、眼電図およびコンピュータソフトウェアを用いてリアルタイムでモニタリングし、ピーク速度に関する聴覚フィードバック情報を提示するシステムを構築した。このシステムを用いて、眼球運動ピーク速度に関する聴覚情報による即時的なフィードバック情報を実験参加者に与え、その影響を検討する実験を行った。その結果、フィードバック情報の提示が、より素早い眼球運動特性の変化に寄与する可能性が示唆された。本研究課題では、視野空間内における注視位置の移動の際に、利き目が非利き目に比べて安定した動的特性を示すかという問題に加え、視野空間内で注視位置の維持を行う際においても、利き目が非利き目に比べて安定した特性を示すかという問題に関し、各種スポーツ競技選手の両眼注視における動的特性および注視安定性を詳細に調べ、競技種目間差および技能レベルとの関連について検討し、さらにそのトレーニング効果を検証することを目的とした。研究2年度目においては、2つの研究を行った。まず、前年度に引き続き、両眼注視および両眼眼球運動を測定およびモニタリングし、左右各眼の潜時やピーク速度などの動的特性を短時間で分析するシステムを改良した。このことにより、短時間で対象者の両眼眼球運動特性を分析し、フィードバック情報を即時的に提示することが可能となった。次に、実験室で測定したデータを実際のスポーツ場面に応用することを念頭に置き、実際のプレー中に相手と対峙する状況下において素早い反応動作を行う際の注視の状態に関する検討を行った。バレーボール選手8名を実験参加者とし、実際のコート内で相手側からのスパイク攻撃に対してレシーブによる反応課題を行った。実験参加者は小型電極および携帯型データ集録装置を装着し、眼電図によりプレー中の注視の挙動を分析した。その結果、プレー中は平常時に比べ瞬目の頻度が低下したことに加え、攻撃側のボールコンタクトを基準とした直前直後のタイミングで瞬目が生起した試行において、レシーブ反応動作の遅延または失敗が起こっていることが観察された。素早く適切な反応を行う際には、反応動作を行う際の手がかり情報となる攻撃側のボールコンタクト時点付近での瞬目を防ぐように注視状態を保つことが、有効な方略の一つであることが示唆された。研究2年度目においては、次年度において実施予定である両眼注視および両眼眼球運動に関するトレーニング実験を見据え、注視および眼球運動の測定およびフィードバックに関する一連のシステムの改良を行った。これにより、スポーツ選手や実際のスポーツ場面への応用を見据えた測定環境を構築することができた。また、実験室で行う研究やデータ測定と並行して、実際の球技スポーツのフィールドにおいても、注視の挙動を測定する手法を検討した。その結果、ボールが高速で眼前に接近してくるような状況で反応動作を行う場合において、注視の状態に関するデータを取得することができた。このことにより、実験室環境で測定した注視および眼球運動特性のデータと、実際のスポーツ場面において測定した注視および眼球運動のデータとを比較検討していくことが、今後の研究において可能になると考えられる。一方、複数のスポーツ種目間での注視および眼球運動特性の比較については、十分な検討を行うまでには至っていないため、次年度以降の課題となる。本研究課題では、視野空間内における注視位置の移動の際に、利き目が非利き目に比べて安定した動的特性を示すかという問題や、視野空間内で注視位置の維持を行う際においても、利き目が非利き目に比べて安定した特性を示すかという問題に関し、各種スポーツ競技選手の両眼注視における動的特性および注視安定性を詳細に調べ、運動技能レベルとの関連について検討し、さらにそのトレーニング効果を検証することを目的とした。大学生バスケットボール選手12名を対象に、3か月間にわたり測定したスリーポイントシュートのパフォーマンステストを用い、両眼眼球運動特性および奥行き方向への注視に関するトレーニングがシュート成功率に関連するか検討した。

その結果、奥行き方向に注視を移動させるときに非利き目(左目)の潜時が利き目(右目)の潜時よりも長いという結果に加え、シュート成功率が高い選手は、非利き目の潜時が短いという関係がみられた。本研究の結果から、非利き目の注視を素早く移動させることがシュートパフォーマンスの向上に貢献する可能性が示唆された。また平成28年度は、実際にボールを扱う運動課題を行う際の両眼眼球運動の特性を検討した。バレーボール選手8名を実験参加者とし、ボールを用いた対人パス課題を行った。静止状態およびパス課題中のプレーヤーの両眼眼球運動を測定し、水平、垂直、奥行き方向の両眼注視移動および瞬目行動を分析した。その結果、プレー中は平常時に比べ瞬目頻度が低下したことに加え、パスしたボールの追従を行う際に、静止状態での奥行き方向の注視移動時に比べて、両眼がより対称的にボールを追従していることが観察された。実際のボールを用いた運動を伴う課題における注視移動において、静止状態で注視移動のみを行う場合に比べて、奥行き方向への注視移動がよりスムーズに行われることが示唆された。本研究課題では、視野空間内で注視位置を維持する際において利き目が非利き目に比べて安定した特性を示すかという問題について検討した。また、スポーツ競技選手の両眼注視における左右眼の動的特性を検討した。さらに、両眼眼球運動のトレーニング効果を検証するためのシステムを構築し、両眼注視特性とスポーツパフォーマンスとの関連について検討することを目的とした。その結果、両眼注視時に利き目が非利き目に比べて安定した特性をもつことが示された。また、眼球運動に関するフィードバック情報の提示が眼球運動特性に影響を与える可能性、および奥行き方向への注視移動時の動的特性がスポーツパフォーマンスと関連することが示唆された。初年度において、眼球運動と頭部方向を計測するシステムが構築され、実験環境のセットアップが予定通り概ね完了した。また、次年度以降に予定しているトレーニング実験を見据え、実験参加者が自身の両眼眼球運動および注視特性に関するデータを即時的に確認することができるようになり、今後更に改良を重ねていく予定である。以上のように、実験データは順調に取得できているが、実験参加者の数が予定より少なかったため、眼球運動特性の競技種目間の比較にまでは至っていない。最終年度においては、左右各眼の特性変化に着目した両眼注視のトレーニング効果に関する縦断的研究をテーマに実験研究を行う。複数種目のスポーツ選手および一般成人を対象に、3次元視野空間内に置かれた注視点への安定した注視維持や、水平方向および奥行き方向における素早く精確な注視移動を課題としたトレーニングを実施する。左右各眼の注視および眼球運動特性をトレーニング前後で比較し、その効果を検討するとともに、利き目と非利き目の差異についても継続的に検討を行う。
難治性疼痛へのガンマナイフ治療効果の機序を明らかにする

ガンマナイフは中枢痛や三叉神経痛などの難治性疼痛の治療に臨床応用され、鎮痛効果が証明されている。しかし、その鎮痛機序に関しては報告がない。本申請研究は、慢性疼痛モデルラットを用い、ガンマナイフの鎮痛効果を確認し、作用機序を検討することを目的とした。実験は以下の2つの部分からなる。(1)末梢神経損傷によるアロディニアモデルへのガンマナイフの鎮痛効果と機序の解明、(2)中枢痛治療としてのガンマナイフ下垂体照射の作用機序の解明。(1)に関しては、ガンマナイフ照射2週間後より鎮痛効果が出現した。さらに、照射部位にマクロファージが集積し、これによりmyelin debrisの除去が促進されることが判明した。この時期と鎮痛効果が出現する時期が一致する事から、集積したマクロファージにより神経損傷の修復が促進され、アロディニアからの早期の離脱が誘発されたことが示唆された(Painへ投稿中)。(2)はじめに、痛み刺激による下垂体の組織変化を免疫組織的手法にて解析した。さらに、MRI解析によりラット下垂体へのガンマナイフ照射方法を確立した。本申請研究は、ガンマナイフによる鎮痛効果の機序を基礎的な研究により解明し、三叉神経痛をはじめとする難治性疼痛へのより安全で確実なガンマナイフ治療を確立することにより患者負担を軽減させることを最終目的とする。【中枢痛へのガンマナイフ照射治療の効果機序を明らかにする】現在までに、ガンマナイフによる中枢神経細胞への影響を線条体に照射で解析をおこなってきた。マイクロアレイ解析、免疫組織染色法によれば、神経細胞への影響は小さい。一方、グリア細胞系の変化は著明であり、ミクログリアの活性化、アストロサイトでのドパミン受容体(D2)の発現、エンケファリンの増加が観察された。この結果は、マイクロアレイによる解析結果と一致していた。現在サイトカインの動向を検索中である。さらに、痛みの刺激により誘発される視床下部や下垂体におけるグリア系の動向を、フォルマリンテストを使い、免疫組織染色法、ウエスタンブロッティング法により追跡している。さらに、神経因性疼痛における視床下部、下垂体の関与を、座骨神経結紮アロディニアモデルを使用して、同様の方法により平行して実験中である。ガンマナイフによるエンケファリンの増加がどのように出現するのか、下垂体でのベーターエンドルフィンにも同様の変化が観察されるのかが今後の課題の一つである。【三叉神経痛へのガンマナイフ照射治療の効果機序を明らかにする】片側座骨神経を結紮したアロディニアモデルを作製し、ガンマナイフを照射したところ、アロディニアからの回復が促進されることが、行動実験より得られた。脊髄レベルでのミクログリア、アストロサイトの発現は変化がなく、末梢神経の回復過程を促進する作用があることを推測し、現在その解析を進めている。目的:近年、三叉神経痛や中枢痛などの難治性疼痛治療に非侵襲的方法であるガンマナイフが使用され、良好な治療効果が得られているが、ガンマナイフの治療機序は明らかにされていない。本申請研究は、ガンマナイフによる鎮痛効果の機序を基礎的な研究により解明する。1.中枢痛へのガンマナイフ照射治療の効果機序を明らかにする。癌性疹痛の除痛における下垂体へのガンマナイフ照射の効果の機序として可能性の高いのは、エンドルフィンなどのオピオイド系の分泌の変化があげあられる。そこで、末梢神経への侵害刺激により、下垂体において活性化する部位および細胞の種類を同定した。皮下へのフォルマリン注入(または、坐骨神経結さつ)による侵害刺激は、ラット下垂体の中葉にFos陽性細胞の発現が増加する結果が得られた。このFos陽性細胞がオピオイド系ペプチドを含む細胞であるか免疫組織染色による二重染色(Fos & Proenkephalin)にて同定を行っている。一方、ガンマナイフによる中枢神経細胞への影響を線条体に照射で解析をおこなって結果では、グリア細胞系の変化が著明であった。下垂体においても、侵害刺激によりラット中葉、前葉において、Iba1陽性細胞の増加があり、ミクログリア細胞の発現が増加する結果が得られた。

これらの侵害刺激による変化と痛みの関連について今後解析を行い、下垂体ガンマナイフの鎮痛作用の機序を明らかにする手がかりを得る。2.神経因性疼痛へのガンマナイフの鎮痛作用機序アロデニアモデルラットの坐骨神経にガンマナイフを照射し、ガンマナイフ照射2週間後の坐骨神経において、Iba1陽性細胞(マクロファージ)の増加を確認した。ガンマナイフの鎮痛作用が、末梢神経においては、ミエリン化が促進され修復機転が促進されている可能性が示唆された。本研究は、ガンマナイフによる鎮痛効果の機序を基礎的な研究により解明し、三叉神経痛をはじめとする難治性疼痛へのより安全で確実なガンマナイフ治療を確立することにより患者負担を軽減させることを最終目的とする。1)アロディニアモデルへのガンマナイフの鎮痛効果三叉神経痛のモデルとして、慢性疼痛モデルラットの末梢神経にガンマナイフを照射し、疼痛行動に与える影響を検討した。モデルラットへのガンマナイフ照射2週間後より鎮痛効果が出現した。さらに、照射部位にマクロファージが集積し、これによりmyelin debrisの除去が促進されることが判明した。この時期と鎮痛効果が出現する時期が一致する事から、集積したマクロファージにより神経損傷の修復が促進され、アロディニアからの早期の離脱が誘発されたことが示唆された。2)ガンマナイフ下垂体照射による鎮痛効果の機序解明(1)下垂体へのガンマナイフ照射ラット下垂体へのガンマナイフ照射方法を確立し、高線量(180Gy)の照射により、3ヵ月で下垂体重量が減少することが判明した。また、アザン染色により下垂体重量減少の要因が酸好性細胞の減少によることも判明した。下垂体前葉の細胞種によりガンマ線の放射線感受性が異なるという新たな知見が得られた。今後、実際の治療線量(120Gy)照射における行動・組織学的解析を行い、鎮痛効果発現メカニズムの解明を行なう。(2)痛み刺激による下垂体の組織学的変化急性痛及び慢性疼痛(炎症性、神経因性)における下垂体の変化を、c-Fosタンパク質の発現により検討した。急性痛及び炎症性慢性疼痛では下垂体前葉細胞(主にACTH産生細胞)にc-Fosの発現上昇が認められたが、神経因性疼痛には認められなかった。炎症性疼痛では炎症性サイトカインの血中濃度が上昇することから、サイトカインと下垂体c-Fosタンパク質発現との関連性について今後解析を行う。
ロバスト繰返し制御系の新しい枠組みの構築に関する研究

本研究者が提案した繰返し制御は,周期的な目標信号への追従に対して極めて有効であることはよく知られているが,この制御に用いるコントローラは入力の基本周期に等しいむだ時間を持つため,これを用いた繰返し制御系の安定性が常に問題となっていた.そこで,この問題を詳細に検討した結果,新たな繰返しコントローラの構築に成功し,繰返し制御系の安定問題を完全に解決することができた.従来の繰返しコントローラを含む系の安定領域は複素平面上で1を中心とする半径1の円内に限定されるため,この繰返し制御系を安定に保つためには,制御対象のベクトル軌跡を常にこの半径1の安定円内に収めなければならなかった.これに対し,新たに前向き伝達関数を従来e^<-jωL>であったのに対してe^<-jωL>/Kとし,これにゲインKでポジティブなフィードバックをかけるという新たな枠粗みを提案した.これにより,このコントローラの周波数伝達関数は1/K・e^<-jωL>/(1-e^<-jωL>)となり,基本周期およびその高調波を含む繰返し入力及び外乱に対してゲインを無限大にできることはこれまでと同様である.しかし,同時にこのコントローラを含む系の安定領域は複素平面上で(K,0)を中心とした半径Kの円内になるため,ゲインKにより安定領域を自由に変化させることができ,極端な場合,Kを0に近づけると,複素平面上で右半面全体を安定領域にできることが明らかになった.つぎに,前向きゲインを1/Kに変え,これにKe^<-jωL>でポジティブなフィードバックをかけることにより,周波数伝達関数1/K・1/(1-e^<-jωL>)をもつコントローラを構成すると,安定領域は複素平面上の全域とできることも明らかにした.そして,1次遅れ系の制御対象に対してシミュレーションにより本手法の有効性を明らかにした.さらに,2次遅れ系の制御対象に対しては,上記新しい枠組みの繰返しコントローラにフィルタを導入して安定領域を変化させることにより,安定性,追従特性ともに優れたシステムが構築できることをシミュレーションによって実証した.本研究者が提案した繰返し制御は,周期的な目標信号への追従に対して極めて有効であることはよく知られているが,この制御に用いるコントローラは入力の基本周期に等しいむだ時間を持つため,これを用いた繰返し制御系の安定性が常に問題となっていた.そこで,この問題を詳細に検討した結果,新たな繰返しコントローラの構築に成功し,繰返し制御系の安定問題を完全に解決することができた.従来の繰返しコントローラを含む系の安定領域は複素平面上で1を中心とする半径1の円内に限定されるため,この繰返し制御系を安定に保つためには,制御対象のベクトル軌跡を常にこの半径1の安定円内に収めなければならなかった.これに対し,新たに前向き伝達関数を従来e^<-jωL>であったのに対してe^<-jωL>/Kとし,これにゲインKでポジティブなフィードバックをかけるという新たな枠粗みを提案した.これにより,このコントローラの周波数伝達関数は1/K・e^<-jωL>/(1-e^<-jωL>)となり,基本周期およびその高調波を含む繰返し入力及び外乱に対してゲインを無限大にできることはこれまでと同様である.しかし,同時にこのコントローラを含む系の安定領域は複素平面上で(K,0)を中心とした半径Kの円内になるため,ゲインKにより安定領域を自由に変化させることができ,極端な場合,Kを0に近づけると,複素平面上で右半面全体を安定領域にできることが明らかになった.つぎに,前向きゲインを1/Kに変え,これにKe^<-jωL>でポジティブなフィードバックをかけることにより,周波数伝達関数1/K・1/(1-e^<-jωL>)をもつコントローラを構成すると,安定領域は複素平面上の全域とできることも明らかにした.そして,1次遅れ系の制御対象に対してシミュレーションにより本手法の有効性を明らかにした.さらに,2次遅れ系の制御対象に対しては,上記新しい枠組みの繰返しコントローラにフィルタを導入して安定領域を変化させることにより,安定性,追従特性ともに優れたシステムが構築できることをシミュレーションによって実証した.本研究者が提案した繰返し制御は周期的な目標信号の追従に対して極めて有効であることはよく知られているが、この制御に用いるコントローラは基本周期に等しい無駄時間を持つため、これを用いた繰返し制御系の安定性が常に問題となっていた。そこで今年度この問題を詳細に検討した結果、新たな繰返しコントローラの構築に成功し、この制御系の安定問題を完全に解決することができた。すなわち、従来の繰返しコントローラは基本周期に等しい無駄時間にゲイン1でポジティブなフィードバックをかけて、周波数伝達関数e^<-jωL>/(1-e^<-jωL>)を実現し、基本周期およびこの高調波を含む繰返し入力及び外乱にたいしてはゲインを無限大とすることで極めて優れた特性を与えることができた。しかしこのコントローラを含む系の安定領域は複素平面上で1を中心とする半径1の円内に限定されるため、制御対象のベクトル軌跡を常にこの安定円内に収めなければならなかった。これに対して新たな繰返しコントローラは、前向き伝達関数Ke^<-jωL>とし、ゲイン1/Kでポジティブなフィードバックをかけて、周波数伝達関数Ke^<-jωL>/(1-e^<-jωL>)を実現した。この場合も基本周期およびこの高調波を含む繰返し入力及び外乱にたいしてはゲインを無限大にできることは同様である。

しかしこのコントローラを含む系の安定領域は複素平面上で1/Kを中心とする半径1/Kの円内に拡大されるため、極端な場合Kを0近づけると右半面全体を安定領域とすることが可能となった。さらにコントローラの構造を変えることで左半面全体も安定領域とすることもできた。まず前年度、新たに提案した繰返しコントローラは、前向き伝達関数を従来e^<-jωL>であったのに対してKe^<-jωL>とし、これにゲイン1/Kでポジティブなフィードバックをかけるという新たな枠組みを提案した。今年度、このコントローラの特性について検討した。すなわちこのコントローラの周波数伝達関数Ke^<-jωL>/(1-e^<-jωL>)はとなり、基本周期およびこの高調波を含む繰返し入力及び外乱にたいしてはゲインを無限大にできることはこれまでと同様である。しかしこのコントローラを持つ系の安定領域は複素平面上で実軸(0,1/K)を中心とし半径1/Kの円内と変化するため、Kを0近づけると、安定円は中心を無限遠点にもち、半径が無限大となるため、右半面全体を安定領域にできることが明らかなった。つぎに前向きゲインを定数1/Kな変え、これにゲインKe^<-jωL>でポジティブなフィードバックをかけることにより周波数伝達関数(1/K)/(1-e^<-jωL>)をもつコントローラを実現する。これにより安定領域がさらに大幅に広げられ、複素平面のほぼ全域を安定領域にできることも明らかなった。
Thomassen予想とTutte閉トレイル問題の研究

Thoamssen予想とは、4連結ライングラフはハミルトンサイクルを持つという予想で、edge dominating cycleを持つという予想と同値である。本研究では、4連結線グラフにおけるハミルトンサイクルの条件を弱めた2因子の存在とessentially 4-edge-connected graphにおけるTutte閉トレイルの存在について研究を行い、Thomassen予想とJackson予想との関係や同値性や本研究者とJackson教授のessentially 3-edge-connected cubic graphの2因子に関する結果を強化することに成功した。Faudree教授(アメリカ・メンフィス大学)やLi教授(フランス・パリ第11大学)との共同研究である、最小次数が大きいグラフにおけるハミルトンサイクルの研究を行った。具体的には、Kierstead, Sarkozy, Selkowはp-orderedハミルトニアンであるための最小次数条件に関する十分条件を与えたが、本研究では、p-orderingという性質を、次のように弱めた時の十分条件を研究した。即ち、グラフのk点からなる交差のない2つの集合X,Yに対して、その2つの集合に含まれる点を交互に通るハミルトンサイクルが存在するための最小次数条件を与え、さらにkの上限を(n+1)/10まで改良した。この結果の元となる研究は、2013年にFaudree教授やLi教授と行われた。その時得られた条件はnがkに対して十分に大きいというものだったが、本研究者がパリ第11大学を訪問し共同研究を進め、今回kの上限を大幅に改良することに成功した。この結果について、ニュージランド・ウェリントンにあるビクトリア大学で開催された国際会議「第38回組合せ数学オーストラリア国際会議」で本研究者が講演を行った。また、国内では12月に龍谷大学で開催された応用数学合同研究集会で講演を行った。他にも国内外の研究集会に出席し、講演を行った。具体的には、9月に広島大学で開催された日本数学会で、上記の研究のもととなる研究によって得られた成果について講演を行った。また3月にはチェコ・ピルゼンで開催されたMatthews-Sumner予想に関する研究集会に出席し、3正則グラフにおける偶グラフについて講演を行った。平成27年度は、4月に中国・福州大学で開催された組合せ論国際会議に出席し、仏CNRSのLi教授と、本研究者とLi教授、Faudree教授との共同研究による成果、最小次数が大きい稠密なグラフにおける指定した非交差な頂点集合X, Yを交互に通るハミルトンサイクルの存在の拡張について議論した。10月にチェコ・西ボヘミア大学のCada准教授を招聘し、国立情報学研究所の小関助教と3人で共同研究を行い、Thomassen予想と直接関係する、3正則グラフにおける、全ての点の次数が偶数である偶グラフの最小成分数について研究し、本研究者とJackson教授の結果、essentially 3-edge-connectedグラフは、全域的な偶グラフで、どの成分も5頂点以上からなるものをもつ、を拡張した結果を完成させた。すなわち、全域性を、どの辺も接続しているという、支配性に条件をゆるめ、essentially 3-edge-connected3正則グラフが、支配的な偶グラフで、どの成分も6頂点以上からなるものをもつことを示した。12月に、オーストラリア・ブリスベン大学で開催された国際会議に出席し、Cada准教授、Kaneko博士、Ryjacek教授との共同研究によって得られた、稠密な辺着色されたグラフにおけるレインボーサイクルの存在についての講演を行った。即ち、すべての辺を着色し、どの点からも位数の2分の1+2以上の異なる色で塗られた辺があれば、全ての色が異なる(レインボーな)長さ4以上のサイクルが存在することを示した。この結果は、Li教授の長さ3のレインボーサイクルの存在についての結果を発展させた我々の予想の特別な場合になっている。Thomassen予想、すなわち4連結ライングラフはハミルトンサイクルをもつ、の解決のために重要な3正則グラフの研究が大いに進んだ。第一歩となるJackson-善本の結果の、支配的偶グラフへの拡張が完成した。証明の基本的な手法は、グラフのレダクションで、三つの、五角形を幾つか組合せて得られるグラフ-セルと呼ぶ-を特殊な方法で小さくする手法の開発が完成した。特に当初多くのセルをレダクションしなければならないと思われていたが、証明を完成させる過程で、三つに減らすことに成功したことが大きい。このことにより、さらに主張を発展させるときの戦略を見通せるようになった。本研究者は、ウエストボヘミア大学(チェコ)のRyjacek教授、Cada准教授らとの共同研究によって、辺着色されたトライアングルフリーグラフにおけるRainbow 4-サイクル(どの2辺も異なる色の長さ4のサイクル)を持つための最小色次数(各点に接続する辺で使われている色数の最小数)条件を与えた。昨年度は、この主張をより発展させるために、以下の問題をCada准教授や横浜国大の小関准教授と共同研究を行った。すなわち、辺着色されたトライアングルフリーグラフ(長さ3のサイクルを持たないグラフ)を、完全2部グラフに制限した時、最小色次数の下限を改良できないか?最初のRyjacek教授らとの結果によって得られた最小色次数の下限は(グラフの位数をnとすると)n/3である。完全2部グラフに制限することにより下限の改良が期待されたが、rainbowな部分グラフは非常に扱いが難しく、これまでのような有向グラフなどへの問題の置き換えによる手法がなかなかはたらかなかった。

そこで、Ryjacek教授らとの結果の証明で利用した主張、辺彩色(同じ色の辺が端点を共有しない着色)された完全2部グラフK_{2,4}には、必ずrainbow 4-サイクルを持つという主張を利用することに方針を変え、以下の主張を得ることに成功した。すなわち、辺着された完全2部グラフの最小色次数が3以上の場合、辺彩色された4-サイクルが存在する。4-サイクルは完全2部グラフK_{2,2}と同値であり、この主張を発展させて、完全2部グラフK_{2,4}の最小色次数の下限が得られれば、rainbow 4-サイクルに対する下限が得られることになる。共同研究者であるCada准教授を招聘し、これまでに得られた下限の改良を試み、対象を完全2部グラフに制限することにより、研究は大いに進展した。特に、Axenovich,Jiang,Tuzaによる辺着色された完全グラフにおける辺彩色された4-サイクルが存在するための最小色次数の下限3が、辺着色された完全2部グラフでも十分であることの証明に成功した。さらに、その下限が最良であることを示す例の無限列の構成に成功した。その例をもとに、辺彩色された4-サイクルを持たないグラフの構造定理を与える研究に着手することができた。4月にチェコで開催された、Thomassen予想と関係が深いMatthews-Sumner予想に関する、国際会議「9th Workshop on the Matthews-Sumner Conjecture and Related Problems」に出席し、Properly coloredな長さ4のサイクル(PC C_4 or PC K_{2,2})を持たない辺着色された完全2部グラフの構造に関する結果を「On rainbow K_{2,2} of edge-colored graphs」という題目で発表した。本研究は、チェコのCada准教授(ウエストボヘミア大学)や小関准教授(横浜国大)との共同研究による成果で、Gallaiの分割定理型の構造定理になっている。この結果をさらに発展させるために、完全グラフにおける構造定理の研究を主に行った。特に10月末からオランダのBroersma教授(Twente大学)を訪問し、PC偶サイクルを含まない完全グラフの構造定理について共同研究を行った。そこでは幾つかの重要な問題と例が発見された。さらに12月から上記Cada准教授を日本大学理工学部に招聘して共同研究を行い、辺着色された完全グラフの構造の概形を得ることに成功した。具体的には、有向グラフと深い関係のあるessentiallymultipartite tournament(EMT)になる場合とならない場合に分けられ、EMTにならない場合の構造は予想されていたものよりはシンプルできれいな構造を持っていることがわかった。EMTでない辺着色された完全グラフについての結果は他になく、本研究が最初の結果である。この結果は、2018年2月に軽井沢で開催された「2018年グラフと解析研究集会」で発表した。
MAIDS感染マウスのマクロファージ機能の解析

AIDS研究は近年、HIV感染時のマクロファージ(Mφ)上に発現するCD4のコファクターとしてのケモカインレセプターが注目を浴びている。MトロピックHIVは感染初期にMφ上のCCR5をコファクターとして標的細胞に侵入しする。MIP-1, RANTES等のケモカインはCCR5と競合してHIV感染を阻害し、CCR5遣伝子を欠損した人たちはHIV感染に耐性を示すことが明らかになった。従って、AIDS感染のMφ機能の解析が重要である。また、Mφが産生するサイトカインによってNK細胞は活性化されることから、AIDS感染時のNK細胞の機能を解析することも重要である。本研究において、マウスのAIDSモデルであるMAIDS感染マウスを用いて、MφとNK細胞の機能を解析した。IL-18はMφから産生され、NK細胞に作用してNK活性を亢進させる働きも持つ。MAIDS感染後、経時的に血清中のIL-18を測定した所、感染後8週目で検出され、12週目で著明な値を示して、16週目にマウスは死亡した。MAIDS発症は6週目以後に起こることから、病気の進行と共にIL-18値が上昇した。次に、感染後8週目の脾MφをLPSで刺激した結果、IL-18の産生が認められた。一方、非感染マウスではIL-18の産生は認められなかった。更に、Mφの活性化を細胞表面上のB7.2の発現で検討した所、MAIDSマウスではその発現が増強していた。以上の結果から、MAIDS感染の進行に伴ってMφの活性化とIL-18の産生増強が明らかになった。次に、MAIDSマウスののNK活性を検討した所、感染後4週目ではその活性は増強していないが、感染後8週目では明らかに亢進していた。最後に、予備研究段階であるが、ヒトAIDS患者の血清中IL-18を検討した。その結果、明らかにIL-18値が上昇しているAIDS患者グループが検出された。現時点では、MIDS感染にともなって増強するIL-18及びヒトAIDS患者に認められる血清IL-18の意味付けに関しては不明である。MIP-1,RANTES等のケモカインはCCR5と競合してHIV感染を阻害し、CCR5遺伝子を欠損した人たちはHIV感染に耐性を示すことが明らかになった。本研究の目的は、マウスのAIDSモデルであるMAIDS感染マウスを用いて、MφとNK細胞の機能を解析することである。

MAIDS感染後、経時的に血清中のIL-18を測定した所、感染後8週目で検出され、12週目で著明な値を示して、16週目にマウスは死亡した。MAIDS発症は6週目以後に起こることから、病気の進行と共にIL-18値が上昇した。次に、感染後8週目の脾MφをLPSで刺激した結果、IL-18の産生が認められた。一方、非感染マウスではIL-18の産生は認められなかった。更に、Mφの活性化を細胞表面上のB7.2の発現で検討した所、MAIDマウスではその発現が増強していた。以上の結果から、MAIDS感染の進行に伴ってMφの活性化とIL-18の産生増強が明らかになった。最後に、MAIDSマウスののNK活性を検討した所、感染後4週目ではその活性は増強していないが、感染後8週目では明らかに亢進していた。今後は、MIDS感染にともなって増強するIL-18が実際に感染防御に作用しているのかを明らかにしていきたい。AIDS研究は近年、HIV感染時のマクロファージ(Mφ)上に発現するCD4のコファクターとしてのケモカインレセプターが注目を浴びている。MトロピックHIVは感染初期にMφ上のCCR5をコファクターとして標的細胞に侵入しする。MIP-1,RANTES等のケモカインはCCR5と競合してHIV感染を阻害し、CCR5遺伝子を欠損した人たちはHIV感染に耐性を示すことが明らかになった。従って、AIDS感染のMφ機能の解析が重要である。また、Mφが産生するサイトカインによってNK細胞は活性化されることから、AIDS感染時のNK細胞の機能を解析することも重要である。本研究において、マウスのAIDSモデルであるMAIDS感染マウスを用いて、MφとNK細胞の機能を解析した。IL-18はMφから産生され、NK細胞に作用してNK活性を亢進させる働きも持つ。更に、Mφの活性化を細胞表面上のB7.2の発現で検討した所、MAIDSマウスではその発現が増強していた。次に、MAIDSマウスののNK活性を検討した所、感染後4週目ではその活性は増強していないが、感染後8週目では明らかに亢進していた。最後に、予備研究段階であるが、ヒトAIDS患者の血清中IL-18を検討した。その結果、明らかにIL-18値が上昇しているAIDS患者グループが検出された。現時点では、MIDS感染にともなって増強するIL-18及びヒトAIDS患者に認められる血清IL-18の意味付けに関しては不明である。
腫瘍内不均一性に基づいた抗がん剤耐性機構の打破

対象を婦人科悪性腫瘍とし、臨床検体からスフェロイド培養を実施し、合計卵巣癌5例、子宮体癌4例、子宮頸癌1例、子宮癌肉腫1例のスフェロイド樹立に成功した。次に幹細胞形質に関与するSex-determining region Y-box 2 (SOX2)遺伝子に注目し、子宮体癌細胞株を用いてSOX2の機能解析を行った。SOX2発現は子宮体癌細胞株の細胞増殖に強く関与しており、細胞周期調節に影響していた。SOX2発現は類内膜癌の悪性度及び予後と関連し、SOX2高発現+p21低発現群では、統計学的に有意に予後不良であり、SOX2とp21が子宮体癌の予後分子マーカーになりうることを明らかにした。癌組織は「腫瘍内不均一性」を有し、癌細胞に加え、癌幹細胞、癌関連間質細胞など複数の種類の細胞により構成されている。この腫瘍内不均一性が癌組織の抗がん剤耐性獲得に寄与するが、これまで臨床症例における腫瘍内不均一性の客観的評価は困難であった。本研究では、腫瘍内不均一性を考慮し、癌組織臨床検体から癌幹細胞、癌細胞、間質細胞を抽出後に全エクソンシークエンス、コピー数解析を行うことで、各細胞を特徴付けるゲノム異常を同定し、再発腫瘍のゲノム異常と比較することにより、抗がん剤耐性メカニズムを解明することを目的とした。原発卵巣癌手術検体をスフェロイド培養用、Laser Capture Microdissection (LCM)用に分割し、スフェロイド培養用の癌組織に対し、独自のスフェロイド抽出方法を用いて卵巣がんスフェロイドの作成を試みている。スフェロイド用の培養条件下で、卵巣がんスフェロイド細胞の培養を実施し、スフェロイドの癌幹細胞としての表現型の確認を進めている。現在までに3症例の卵巣癌スフェロイド細胞の作成に成功している。LCM用検体は、OCTコンパウンドで包埋後液体窒素にて凍結後に、凍結組織標本を作成し、LCMシステムを用いて、癌細胞および間質細胞を切り出し、各試料から微量DNA抽出用キットを用いて、DNA抽出が可能であることを確認している。平成27年度は、臨床検体の層別化の確立を目指し、研究を実施している。原発卵巣癌手術検体をスフェロイド培養用、Laser Capture Microdissection (LCM)用に分割し、スフェロイド培養用の癌組織をcollagenase / hyaluronidaseにて酵素処理後、遠心分離法により卵巣癌細胞を分離し、最適化された培養条件下で、卵巣がんスフェロイド細胞の培養を実施し、3症例の卵巣癌スフェロイド細胞の作成が完了している。LCM用検体は、OCTコンパウンドで包埋後液体窒素にて凍結している。凍結組織をクリオスタットで薄切し、100%メタノールで固定後、トルイジンブルー染色し、標本作製後、NIKON社のArcturus LCMシステムを用いて、癌細胞および間質細胞の切り出しを行っている。各試料から微量DNA抽出用キットを用いて、エクソームシークエンス実験に使用可能な品質のDNA抽出に成功している。また予備実験として、クローナルな細胞集団である卵巣癌細胞株(45種類)から得られたRNAシークエンスデータ解析を実施した。RNAシークエンスデータ解析のためにPipeline for RNA sequencing Data Analysis (PRADA)が動作することを確認し、卵巣癌細胞株における融合遺伝子の同定(246種類)を完了している。同定された融合遺伝子の多くは癌関連遺伝子であることが明らかになっており、これまで同定されている遺伝子変異リストに融合遺伝子プロファイルデータを統合することにより、卵巣癌細胞株の分子生物学的特徴付けを進めている。昨年度まで卵巣癌を対象とし、スフェロイド培養を行ってきたが、広く癌に共通する抗癌剤耐性メカニズムを検討するため、対象を婦人科悪性腫瘍に拡大した。今年度は、卵巣癌に加え、子宮体癌、子宮頸癌、子宮癌肉腫の臨床検体からスフェロイド培養を実施し、合計卵巣癌5例、子宮体癌4例、子宮頸癌1例、子宮癌肉腫1例のスフェロイド樹立に成功した。スフェロイド細胞を免疫不全マウスの皮下に注入し、腫瘍形成能を確認すると同時に、臨床検体と同様の組織像であることを確認した。樹立されたスフェロイドに対し、Lyoplatescreening kitを用いて250種類以上の細胞表面抗原をスクリーニングし、いくつかの癌幹細胞マーカーの同定に成功している。次に子宮体癌における癌幹細胞の特性を検討するため、幹細胞形質に関与するSex-determining region Y-box 2 (SOX2)遺伝子に注目し、子宮体癌細胞株を用いてSOX2の機能解析を行った。その結果、SOX2発現は子宮体癌細胞株の細胞増殖に強く関与しており、SOX2がp21のプロモーター領域に結合することで、p21発現を調整し、細胞周期コントロールに影響していることを明らかにした。in-vivo実験系においても、SOX2ノックダウン細胞株では、コントロール群に比し、腫瘍形成が抑制されることを確認した。さらに子宮体部類内膜癌258症例について免疫組織染色でSOX2及びp21発現レベルを調べ、臨床病理学的特徴との関連を検討したところ、SOX2発現は類内膜癌の悪性度及び予後と関連し、SOX2高発現+p21低発現群では、統計学的に有意に予後不良であり、SOX2とp21が子宮体癌の予後分子マーカーになりうることを明らかにした。