hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イオン・チャネル型受容体に対する細胞骨格蛋白質の制御作用

本萌芽的研究ではイオン・チャネル型の受容体がどの様に細胞骨格により修飾されるかという問題に分子生物学的手法を応用してパッチクランプ法でせまろうとするものである。古典的には、細胞骨格を破壊するサイトカシンやコルヒチンを細胞外から与えイオンチャネルを修飾したという報告がある。従って、イオン・チャネル型受容体もアクトミオシン系やチュブリン・ダイニン系の用を受けると考えるのも理由がない訳ではない。本研究ではPC-12細胞を利用するが、最近、プリン受容体P2X_2が同定・クローニングされ、昨年度には、これをパッチクランプ法で検出できるようになり、細胞内のアクチン線維を修飾する薬物の作用を検討した。しかし、サイトカラシン(アクチン切断作用)及びファロジン(アクチン安定化作用)いずれも著しい効果を得ることができなかった。本年度はP2X_2をコードするcDNAをPCR法にてPC-12細胞より直接的に得て、受容体を発現系蛋白質化して、受容体とアクチンの直接作用を蛋白質生化学的に検出することを試みた。しかし、大腸菌内での発現蛋白質化には発現量の点で成功しかなかった。しかし、このアイデアはカプサイシン受容体で偶然に生かすことができた。即ち、最近発表されたこの受容体の配列を後根神経節ホモジェネートよりPCR法で得て、大腸菌内で大量に発現することができた。これを精製することができ、アクチンとの結合性を調べることが可能となった。先月の予備実験では確かに結合性が検出でき、本萌芽的研究の目的の一部が達成できた。本研究ではイオン・チャネル型の受容体がどの様に細胞骨格により修飾されるかという問題にパッチクランプ法でせまろうとする萌芽的研究を目指している。古典的には、細胞骨格を破壊するサイトカラシンやコルヒチンを細胞外から与えイオンチャネルを修飾したという報告がある。従って、イオン・チャネル型受容体もアクトミオシン系やチュブリン・ダイニン系の作用を受けると考えるのも理由がない訳ではない。本研究ではPC-12細胞を用い、次のような実験を行う。i)パッチクランプをかけ、ATP-gated inward currentを測定する。ii)この内向電流にアクチン線維の安定性を変化させる薬物及びアクチン修飾蛋白質を作用させる。さらにiii)CXL・レトロウイルス・ベクターを利用し遺伝子導入を図り、ii)で作用のあった蛋白質の過剰発現又は発現阻止を行い、内向電流の変化をしらべる。本年度は以下の結果を得た。1)PC-12細胞よりプリン受容体P2X_2の検出。本研究では種々の操作に耐えうる神経株細胞としてPC-12を利用する。この細胞にはプリン受容体が存在し、最近、イオンチャネル型P2X_2が同定・クローニングされた。これをパッチクランプ法で検出することができた。2)細胞内に働いてアクチン線維を短くするサイトカラシン類及びこれを安定化させるファロイジン類を与えたが顕著な作用はみられなかった。3)今度は細胞外から働く物質としてコラーゲンをRGDペプチドと共に与えると、ATPによる電流が増強された。4)今後、コラーゲンなど細胞外マトリックスに注目して研究を進める方針ができた。
菌根性きのこ発生に及ぼす共生細菌群の影響および機能評価

樹木の根には菌根菌が共生している。この菌根菌の周りには多様な土壌細菌が生息し、菌糸の成長や菌根(樹木の根に菌根菌が共生した部分)の形成量等に影響を与えることが分かってきた。しかし、これらの細菌が菌根菌との相互作用を通じて子実体(キノコ)発生にどのような影響を及ぼすかについては、研究例が無く全く明らかにされていない。本研究では、人工的な環境下においても子実体発生が可能なLaccaria parvaをモデル材料とし、菌根の周囲に生息する細菌が菌根菌の菌糸伸長量、菌根の形成量、子実体の発生量など、菌根共生の成立と発達に及ぼす役割を明らかにした。野外のL. parva菌根の周辺に生息する細菌の多様性を調査した結果、Bradyrhizobiumが優占していることを明らかにした。栄養培地上でL. parvaと細菌株の対峙培養試験を行うと、ほとんどの細菌株はL. parvaの菌糸伸長を抑制するのに対し、Bradyrhizobiumを含む一部の細菌株は抑制しない、あるいは菌糸伸長を促進させることが明らかとなった。Bradyrhizobium株のうち、L. parvaの菌糸伸長を抑制しなかった株をL. parvaーアカマツ共生系に導入すると、子実体の発生量が増加し、成熟した子実体の発生頻度が高くなった。菌糸伸長に悪影響を及ぼさないBradyrhizobium株は、何らかの相互作用を通じて、子実体の発達を補助している可能性が考えられた。以上のように、本研究は野外の菌根周辺に生息する細菌が子実体の発生量や成熟度を向上させることを世界で初めて明らかにした。微生物間の知られざる相互作用の一側面を明らかにした本研究成果は、関連する基礎学問分野のみならず、栽培が難しいとされる菌根性キノコの栽培技術の高度化など応用学問分野の発展にも貢献できる可能性がある。陸上植物の80%の根には「菌根菌」と称する共生菌が定着し、宿主植物の成長を支えている。この菌根菌の周りには細菌を初めとする多様な微生物が生息し、菌の成長や菌根の形成量に影響を与えることが分かってきた。しかし、こうした生物間相互作用を通じて、バクテリアがキノコの発生にどのような影響を与えているかは明らかでなく、菌根共生の形成・発達に及ぼすバクテリアの機能の包括的な理解は進んでいない。本研究では、菌根菌が感染した根の内部および周囲に生息する土壌細菌の多様性と、これら細菌が菌根共生系の成立と発達(菌糸成長、菌根の形成量、キノコの発生頻度)に及ぼす影響を明らかにする。2016年度は、菌根菌および細菌株の収集、分離した細菌株の分類属性の推定、キツネタケ菌根の周辺に生息する細菌群のフロラ解析を行った。長野県シミック薬用植物園のクリ園において、外生菌根菌キツネタケの菌根から計248の細菌株を得た。森林総研およびシミック植物園から計20のキツネタケ菌株を得た。16S rDNAのV3、V4領域の解析から、各細菌株の分類属性を推定した。多くがRhizobiumやBradyrhizobiumなど根粒菌として知られる分類群であった。次に、キツネタケ菌根に含まれる細菌相を16S rDNAのV3、V4領域を対象としたクローニング解析により調査した。主にProteobacteria門が優占しており、分離培養法では検出されなかった多様な系統群を確認した。しかし、分離株としても得られたBradyrhizobiumは、キツネタケやその他の菌根菌が感染した菌根から多く検出された。以上から、キツネタケ菌根の周辺にはProteobacteria門を代表とする多様な細菌が生息し、なかでもBradyrhizobium属が普遍的に存在していると考えられた。当初計画していた通りに、多様な細菌株と十分量の菌根菌株を得ることができた。野外における細菌の多様性解析については、次世代シーケンス解析を利用する予定であったが、解析に必要な十分量で高品質のDNAを抽出することができなかったため、クローニング解析に変更した。多様な分類群の検出に成功し、当初の予定であったキツネタケ菌根周辺の細菌相を明らかにすることができた。以上から、当初の目標を概ね達成できたと考えている。陸上植物の80%の根には「菌根菌」と呼ばれる共生菌が定着し、宿主植物の成長を支えている。この菌根菌の周りには多様な細菌が生息し、菌糸成長や菌根の形成量に影響を与えることが分かってきた。しかし、こうした生物間相互作用を通じて、細菌が菌根菌のキノコの発生にどのような影響を与えているかは明らかにされていない。これまでの研究により、山梨県のクリ園で確認されたキツネタケ菌根の表面および内部には多様な細菌が生息し、中でもBradyrhizobiumやRhizobiumなどのリゾビウム科細菌が多く分離培養された。本研究では、キツネタケ菌根の表面・内部から分離培養された細菌が、同菌の菌糸成長に及ぼす影響を、共培養法により明らかにした。山梨県シミック薬用植物園のクリ園において、キツネタケ菌根から分離培養した34系統を含む計80の細菌株を供試した。キツネタケは同調査地および森林総合研究所(茨城)から得られた計5菌株を供試した。グルコース含量を10分の1に調整したMMN培地のプレート(径9 cm)の中心に、径7 mmのキツネタケ菌糸片をおいた。

菌糸片の中心部から90度の間隔で2 cm離れた四方に、細菌を線状(長さ1 cm)に塗布した。室温(23から25度)で30日間培養した後に菌糸の伸長面積を計測した。細菌18系統の全ての細菌株はキツネタケ菌株の成長を阻害した。その他の系統では、菌根菌と細菌の株の組合せによって、キツネタケの菌糸成長に及ぼす影響は阻害から促進まで大きく異なった。クリ園で最も多く検出・分離されたBradyrhizobiumの1系統は、概ねキツネタケの菌糸成長に影響を与えないか成長を促進させることが分かった。細菌と菌根菌間の相互作用は、細菌の種のみならず、細菌と菌根菌それぞれの個体レベルの組合せによって異なることが示唆された。菌根菌と細菌の共培養試験について、当初計画していたとおり実験が進み成果が得られたため。樹木の根には菌根菌が共生している。この菌根菌の周りには多様な土壌細菌が生息し、菌糸の成長や菌根(樹木の根に菌根菌が共生した部分)の形成量等に影響を与えることが分かってきた。しかし、これらの細菌が菌根菌との相互作用を通じて子実体(キノコ)発生にどのような影響を及ぼすかについては、研究例が無く全く明らかにされていない。本研究では、人工的な環境下においても子実体発生が可能なLaccaria parvaをモデル材料とし、菌根の周囲に生息する細菌が菌根菌の菌糸伸長量、菌根の形成量、子実体の発生量など、菌根共生の成立と発達に及ぼす役割を明らかにした。野外のL. parva菌根の周辺に生息する細菌の多様性を調査した結果、Bradyrhizobiumが優占していることを明らかにした。栄養培地上でL. parvaと細菌株の対峙培養試験を行うと、ほとんどの細菌株はL. parvaの菌糸伸長を抑制するのに対し、Bradyrhizobiumを含む一部の細菌株は抑制しない、あるいは菌糸伸長を促進させることが明らかとなった。Bradyrhizobium株のうち、L. parvaの菌糸伸長を抑制しなかった株をL. parvaーアカマツ共生系に導入すると、子実体の発生量が増加し、成熟した子実体の発生頻度が高くなった。菌糸伸長に悪影響を及ぼさないBradyrhizobium株は、何らかの相互作用を通じて、子実体の発達を補助している可能性が考えられた。以上のように、本研究は野外の菌根周辺に生息する細菌が子実体の発生量や成熟度を向上させることを世界で初めて明らかにした。微生物間の知られざる相互作用の一側面を明らかにした本研究成果は、関連する基礎学問分野のみならず、栽培が難しいとされる菌根性キノコの栽培技術の高度化など応用学問分野の発展にも貢献できる可能性がある。H28年度に分離培養した細菌株とキツネタケを共培養し、キツネタケの菌糸成長への影響(例、成長を促進/抑制、または影響なし)を指標として、細菌株の選抜を行う。予備試験として、無菌条件下で育成したアカマツにキツネタケと細菌株を接種して、菌根の形成量やキノコの発生量を測定する。当初の計画のとおり、菌根共生系に細菌株を無菌的に導入することで、細菌が菌根菌の子実体発生に及ぼす影響を調査する。研究成果はリサーチマップで随時更新しています。クローニング解析において、植物のDNAを増幅せずに、細菌の16SrDNAだけを選択的にPCR増幅するプライマー探索に時間がかかり、予定していた細菌株の種同定解析が全て終わらなかったため。想定より物品の使用量が少なく済み、購入費を節約できたため。
イネの新規耐病性遺伝子ＢＳＲ１による広範な病害抵抗性機構の解析

イネの病害抵抗性遺伝子BSR1は、高発現することで広範囲の病原菌に対する抵抗性を付与することができるリン酸化酵素遺伝子である。マイクロアレイ解析及び遺伝学的な解析の結果、BSR1による病害抵抗性には病害抵抗性ホルモンであるサリチル酸はほとんど関与していないことが明らかになった。つぎにBSR1の機能喪失イネの解析から、BSR1がイネの本来有する病害抵抗性に寄与していることが確認された。さらに、BSR1の高発現により、イネでは白葉枯病、いもち病の2大病害に加え、他2種類の病害に対しても抵抗性を付与できることが示された。双子葉作物のトマトにおいても斑葉細菌病に抵抗性になることが示された。BSR1とWRKY45やサリチル酸経路との上下関係を調べるために、前年度BSR1過剰発現イネと、サリチル酸含量の低下したnahGイネを交配し交配種子を得ている。交配種子を用いて、SA下流の主要な転写因子遺伝子WRKY45とOsNPR1の発現を調べた結果、両遺伝子共にWTに比べBSR1-OXでは発現が上昇し、BSR1-OX/NahG植物ではNahGと同程度まで発現が低下していたので、BSR1-OXにおける両遺伝子の高発現は内在性SAに依存していることが示された。いもち病抵抗性検定を行ったところ、BSR1-OX/NahGではBSR1-OXよりやや弱いものの、WTに比べ有意に強い抵抗性を示した。よって、BSR1-OXにおける抵抗性の増大に内在SA経路はあまり寄与してなく、むしろそれ以外の経路が主に関与することが示唆された。前年度作製したBSR1ノックダウンイネについて病害抵抗性検定を行ったところ、いもち病、白葉枯病に対する抵抗性がWTより弱まっていたので、BSR1がいもち病、白葉枯病に対するイネの本来の抵抗性に寄与していることが示された。また前年度得たTOS17によるBSR1ノックアウトイネについて、ホモ系統の種子を採種した。WRKY45の発現レベルはノックダウン及びノックアウト系統において減少していた。前年度マイクロアレイにより同定したBSR1の下流候補遺伝子のいくつかについて、高発現イネを作製した。また前年度相互作用因子探索用に作製したBSR1-HPB(HA-PreScissioin site-Biotinyl domain)イネについて目的の融合タンパク質を高発現していることを確認し、稔性が低いながらも種子を採種したが、発現が最高レベルのものは不稔であった。本研究ではBSR1による抵抗性機構の解析と、抵抗性がどこまで広範囲であるかの検証を行った。まず、BSR1の下流遺伝子を探索するためにマイクロアレイ解析を行い、BSR1高発現イネではBTH(サリチル酸アナログ)誘導性遺伝子の4割以上が発現増大していることを示した。BSR1による抵抗性にサリチル酸(SA)シグナルが関与している可能性が考えられたので、SA含量の低下したnahGイネ、SA下流のキー遺伝子WRKY45をノックダウン(KD)したイネ、及びSA下流のキー遺伝子OsNPR1をKDしたイネとBSR1高発現イネをそれぞれ交配し、白葉枯病及びいもち病に対する抵抗性を評価した。その結果、BSR1による病害抵抗性には、SA, SA下流のWRKY45及びOsNPR1はほとんど関与していないことが明らかになった。つぎにBSR1の本来の役割を明らかにするために、BSR1-KDイネを作製し病害抵抗性検定を行ったところ、いもち病、白葉枯病に対する抵抗性がWTより弱まっていた。よってBSR1が、イネの本来有する病害抵抗性にも寄与していることが示された。さらに完全にBSR1の機能を喪失した系統を得るために、TOS17ミュータントパネルのPCRスクリーニングを実施し、BSR1のエキソンにTOS17が挿入しているノックアウト系統を得ることができた。さらに、BSR1高発現による病害抵抗性が、どこまで広範囲であるかについて検証した。イネでは白葉枯病、いもち病に加え、さらに2種類の病気に対しても抵抗性を付与できることが示された。また、双子葉作物のトマトにおいても、斑葉細菌病等に抵抗性になることが示された。BSR1の下流遺伝子を同定するために、BSR1過剰発現イネとWTイネで発現レベルに差のある遺伝子をマイクロアレイにより比較した。BSR1過剰発現イネではWRKY45遺伝子を含むBTH(サリチル酸アナログ)誘導性遺伝子の4割以上が発現増大していることが示された。

WRKY45の発現レベルをリアルタイムPCRで確認すると、BSR1過剰発現イネで10倍程度に増大していた。また、BSR1過剰発現イネで発現増大している遺伝子の半分以上はいもち病感染により発現が誘導される遺伝子であった。以上よりBSR1過剰発現イネにおける抵抗性の少なくとも一部は、WRKY45を含むサリチル酸経路を介していることが明らかになった。そこでBSR1とWRKY45やサリチル酸経路との上下関係を調べるために、BSR1過剰発現イネとWRKY45ノックダウンイネ、及びサリチル酸含量の低下したnahGイネを交配し交配種子を得た。またBSR1の本来の機能を明らかにするために、BSR1遺伝子をノックダウンするイネを作製した。ノックダウンレベルは50%程度であまり高くなかったので、さらにTOS17ミュータントパネルのPCR検索により、BSR1のエキソンにTOS17が挿入しているノックアウト系統を1系統得た。一方でBSR1タンパク質と相互作用タンパク質を単離・同定するために、BSR1タンパク質にHPB(HA-PreScissioin site-Biotinyl domain)タグを付けてイネ植物体で発現させた。またコントロールとしてGUS-HPBを高発現する形質転換イネを作製し次世代種子を得た。初年度にBSR1遺伝子の下流の多くの遺伝子がSA系の抵抗性関連遺伝子と重なることが示されていたが、2年目はNahGイネとの交配を通してBSR1-OXにおける抵抗性の増大に内在SA経路はあまり寄与してなく、むしろそれ以外の経路が主に関与することを示唆するデータを得ることができた。また機能欠損型変異体の解析を通して、BSR1はイネ本来の病害抵抗性機構に重要であること、またWRKY45の上流に存在することを示すことができた。BSR1-HPBイネは予想外に稔性が極めて低かったため、今後の研究に用いるための種子を1年かけて確保した。本研究の目的の1つはBSR1の下流で機能する因子の解明であったが、23年度はこの点で大きく進展した。WRKY45遺伝子を含むサリチル酸系の抵抗性に関連した多くの遺伝子がBSR1の下流に存在することが明らかになった。また2年目以降の研究に備えて、当初計画通りに相互作用タンパク質の同定用のタグ付きのイネを作製でき、ノックダウン及びノックアウト系統も取得できた。・BSR1-OXイネにおいて、病害抵抗性への関与が知られている植物ホルモンの内在レベルが変動しているかどうかについての情報を得るために、SA等のレベルを定量しWTと比較する。・BSR1ノックアウトイネの罹病性を調べるために、病害抵抗性検定を行う。前年度作製した下流候補遺伝子を高発現するイネについても病害抵抗性を検定する。ノックアウト、ノックダウンイネを用いてBSR1の下流遺伝子をさらに同定し、引続き高発現イネの作製を行う。・BSR1の高発現がいもち病、白葉枯病以外の病気に対しても抵抗性を付与できるかどうか調べる。・BSR1-HPB高発現イネが病害抵抗性を示すかどうか確認し、確認後BSR1と相互作用するタンパク質を探索し、同定を試みる。・結果のとりまとめを行う。前年度に取得したBSR1のノックダウン或いはノックアウトイネで、病害抵抗性が低下しているかどうか検定する。つぎに、前年度の解析によりBSR1過剰発現イネで発現の上昇していた代表的な遺伝子の発現レベルが、ノックダウン或いはノックアウトイネで低下しているかどうか調べる。
ポリ乳酸系高分子界面活性剤の機能重畳化による超機能性ナノカプセルの創製

本研究の目的は、ナノカプセルの分散や徐放特性に大きく影響する内部構造および表面物性の制御を可能とする新規な生分解性高分子界面活性剤の合成を行い、超機能性を呈するナノカプセル創製に向けたそれらの制御技術確立のための指針を提示することにある。そこで、Poly(ethyleneoxide monooleate)(MOPEO)を開始剤とし、ラクチドの開環重合によるMOPEO-PLAの合成およびコロイド化学的検討を実施した。その結果、開始剤であるMOPEO濃度の調節によってMOPEO-PLAの重量平均分子量を短文賛成を確保しつつ制御できた。また、MOPEO-PLAは、その分子内に2重結合を残していることが確認された。MOPEO-PLAを溶解させたトルエン溶液と水との界面張力をウィルヘルミー法により測定したところ、MOPEO-PLAは界面活性能を有していることが分かった。さらに、水面展開法によって調製したMOPEO-PLAとPLAのブレンドフィルムの接触角測定結果から、ブレンドフィルム表面がより親水性になっており、親水性PEO鎖が水面側のブレンドフィルム表面に選択的に集積することを明らかにした。MOPEO-PLAの自己組織化挙動を利用したボトムアップ方式によるナノカプセルの創製し、ナノカプセル表面形態や制癌剤徐放特性の制御に関して検討した結果、MOPEO-PLAを添加した制癌剤内包マイクロカプセルの調製では、マトリックスであるPLAとCPTとの間の相互作用に起因し表面形態を制御できることを明らかにした。さらに、MOPEO-PLAの有機溶媒中における自己組織化を巧に利用して調製したナノカプセルの特性を詳細に検討した結果、有機溶媒中で極微小な親水的空間を供与することができ、タンパク質をナノカプセル内に可溶化することができることを明らかにした。本研究の目的は,ナノサイズのマイクロカプセル(ナノカプセル)調製における分散やナノカプセルの徐放特性に大きく影響する内部構造や表面物性の制御を可能とする新規な生分解性高分子界面活性剤の合成を行い,超機能性を呈するナノカプセル創製に向けたそれらの制御技術確立のための指針を提示することにある。そこで今年度は主として,Poly(ethyleneoxide monooleate)(MOPEO)を開始剤とし,ラクチドの開環重合によるMOPEO-PLAの合成およびコロイド化学的検討を実施した。MOPEO-PLAの重量平均分子量に及ぼす開始剤(MOPEO)濃度の影響に関する結果から,開始剤濃度の調節によってMOPEO-PLAの重量平均分子量を制御できることがわかった。また^1H-NMR測定の結果から,目的物質であると同定でき,さらに,MOPEO-PLA分子内の2重結合の存在が確認された。MOPEO-PLAを溶解させたトルエン溶液と水との界面張力をウィルヘルミー法により測定したところ,トルエン中のMOPEO-PLA濃度の増加に伴い,界面張力は減少した。この結果から,MOPEO-PLAは界面活性能を有していることが分かった。さらに,水面展開法によって調製したMOPEO-PLAとPLAのブレンドフィルムの接触角測定から,ブレンドフイルムの水面側の接触角はフィルム中のMOPEO-PLA濃度の増加に伴い減少した。この結果から,ブレンドフィルム表面がより親水性になっており,親水性PEO鎖が水面側のブレンドフィルム表面に選択的に集積することを明らかにした。

その結果、MOPEO-PLAを添加した制癌剤内包マイクロカプセルの調製では、マトリックスであるPLAとCPTとの間の相互作用に起因し表面形態を制御できることを明らかにした。また、この機構に準拠し、平滑な表面を有するマイクロカプセルの調製に成功した。制癌剤の徐放特性について検討した結果、MOPEO-PLA添加量の影響は大きく、適正に添加すれば徐放初期の初期バーストを抑制できた。一方、MOPEO-PLAは油溶性高分子界面活性剤であり、有機溶媒中でナノカプセルを自発的に形成すると考えられる。このナノカプセル形成特性を、水の抽出挙動を詳細に検討した。その結果、有機溶媒中で極微小な親水的空間を供与することができ、タンパク質をナノカプセル内に可溶化することができることを明らかにした。
擬似位相整合法を用いた第二高調波発生用導波路型素子の最適化に関する研究

CD用、レーザプリンタ用の光源として重要な、コヒーレントで安定な短波長光源を得るための第二高調波発生(SHG)素子の設計・作製を行い、また、最適な材料を決定するための物性パラメータの測定を行った。このために、周期的な分極反転構造を用いた擬似位相整合によるSHG素子を設計・試作した。ニオブ酸リチウム(LN)上にTi拡散により10.7μm周期の周期的分極反転構造を作製した後、プロトン交換光導波路を作製した。この擬似位相整合素子に基本波としてYAGレーザを入射し、SHGを確認した。また、SHG素子の高効率化を阻む最大の原因である光損傷の定量的な測定を行うことにより、最適な材料について検討した。代表的なSHG材料はLN結晶であるが、Mg0ドープLN結晶、KTP結晶は、より光損傷に強いことが報告されている。ここでは、LN及びMgOドープLN結晶にプロトン交換法を用いて作製した平面導波路、KTP結晶にRbイオン交換法により作製した平面導波路について光損傷の定量的な測定を行った。測定の結果、プロトン交換層はTi拡散層に比べ10^4倍光損傷に強いが、導波層のアニール処理により光損傷耐性が減少することがわかった。SHG素子の作製の際、プロトン交換によって減少した非線形定数を回復させるためプロトン交換層を数時間アニールする必要がある。この場合、プロトン交換のみのものに比べて10^<-2>程度光損傷耐性が減少し、Mg0ドープの有無にかかわらず同様の結果が得られた。Rbイオン交換KTP導波路の光損傷耐性は作製条件により異なり、プロトン交換後数時間アニールした結晶とほぼ同じかやや大きめで、有望なSHG材料であることがわかった。また擬似位相整合素子においては、光損傷による屈折率変化が周期的分極反転構造により打ち消されて光損傷耐性が3倍程度向上し、構造自体が光損傷に強いことが実験により確認された。
ラセン神経節グリア細胞の可塑性解析と聴神経再生への応用

生後1日目のマウスラセン神経節を酵素で単細胞化して、in vitroでの培養に成功した。ラセン神経節には神経細胞、非神経細胞が含まれるが、非神経細胞はさらに、グリア細胞と非グリア細胞に分類される。Sox2-GFPマウスを用いて、ラセン神経節をSox2陽性グリア細胞と、Sox2陰性グリア細胞にFACSでソートした。グリア細胞と非グリア細胞の神経細胞へ分化転換する能力(competence)を転写因子Ascl1を強制発現させて、比較した。結果、グリア細胞から神経細胞への分化誘導効率が有意に高かった。また、神経細胞は、ラセン神経節細胞に発現する、Prox1やVglut1を発現した。さらに、野生型の成獣マウスラセン神経節細胞を単細胞化し、ラセン神経節内のグリア細胞の培養に成功した。継代により骨組織を除去し、培養皿はMatrigelでコートすることで比較的均一なグリア細胞を死滅させずに培養できた。また、酵素で単細胞化しないラセン神経節を器官培養し、神経突起の伸張や、グリア細胞の生存を確認した。成果は、Front Neurosci誌に論文発表した。昨年度、マウスラセン神経節細胞の障害モデルを、Na-K-ATPase阻害剤のウアバイン内耳局所投与により作製したが、同モデルの前庭神経節細胞を免疫組織化学的に解析した。前庭神経節内の神経細胞にはNa-K-ATPase陽性細胞とNa-K-ATPase陰性細胞が存在することが判明し、機能的な相関が示唆された。また、マウスラセン神経節細胞の障害モデルはローリングの行動異常を呈するために、前庭眼反射を測定して前庭機能を評価した。ウアバイン投与側で、コントロール群と比べてVOR gainが低下していた。本成果は、2019年2月米国ボルチモアで開催された第42回基礎耳鼻咽喉科学会で発表した。一次聴覚神経細胞であるラセン神経節細胞をシュワン細胞から誘導することが当研究の目的である。ラセン神経節細胞には内有毛細胞に接続するI型ラセン神経節細胞と外有毛細胞に接続するII型ラセン神経節細胞が存在するが、共通の神経芽細胞からどのようなメカニズムでそれぞれのラセン神経節細胞に分化するかは知られていなかった。各神経細胞分化メカニズムを解明する端緒として、I型、II型ラセン神経節細胞に特異的に発現する転写因子の探索を試みた。成獣マウス蝸牛の凍結切片を用いて免疫組織化学的手法により、I型ラセン神経節細胞はGata3が、II型ラセン神経節細胞はProx1がアップレギュレートされることを見いだした。これらの結果は学術雑誌PLOSONEにDynamic Expression of Sox2, Gata3, and Prox1 during Primary Auditory Neuron Development in the Mammalian Cochleaのタイトルで論文発表した。また、生体内でのシュワン細胞からラセン神経節細胞へのダイレクトリプログラミングを目指して、聴神経の変性動物モデルを作成した。成獣マウスに神経毒のウアバインを内耳局所投与し、聴覚機能検査(聴性脳幹誘発反応)、組織学的検査を行った。ウアバイン投与1週後で聴性脳幹誘発反応は大幅に上昇し、組織学的にラセン神経節細胞の選択的な変性を確認した。ロバストな神経誘導転写因子であるASCL1をアデノ随伴ウイルスベクターにより成獣マウス内耳に局所投与を行った。ウイルスはラセン神経節細胞を取り囲むシュワン細胞に感染したが、ASCL1によるシュワン細胞から神経細胞への形質転換は確認することが出来なかった。聴神経近傍のシュワン細胞の単離を申請者が施行したがFACSの条件検討に難渋した。同実験は共同研究先のトロント大学でも今後並行して施行する予定である。ラセン神経節非神経細胞からラセン神経節へのダイレクトリプログラミングを試みた。in vitro実験として生直後のラセン神経節非神経細胞から神経細胞の誘導に成功した。誘導された神経細胞は、蝸牛有毛細胞(末梢)や蝸牛神経核細胞(中枢)に向けて神経突起を伸張した。誘導された神経細胞からRNAを抽出しRNA seqによる解析を行った。結果、誘導された神経細胞は元のラセン神経節非神経細胞と目的とするラセン神経節細胞の中間的な性質を持つことが判明した。今後の目標は培養期間を長くする、あるいは誘導に用いる転写因子を増やして、誘導神経細胞の品質を向上させることである。成体のラセン神経節非神経細胞の培養系の樹立を試みるも難渋した。理由は成体では蝸牛が骨化するために細胞の採取が困難で、かつ骨組織の除去が初代培養においては特に困難であったことによる。ラセン神経節非神経細胞の培養法については、Method paperとして査読有りの科学雑誌に投稿中である。In vivo実験としてラセン神経節の障害モデル動物(モルモット)を作成した。その過程で、マウスを用いて見いだしたタイプIIラセン神経節の新たなマーカGata3がモルモットにおいてもタイプIIラセン神経節細胞に発現することを見いだした。In vivo実験においてラセン神経節細胞の障害と、ラセン神経節非神経細胞への遺伝子導入を同時に施行することで、遺伝子導入から3週後、機能的な聴覚回復は得られなかったものの、組織学的に非神経細胞から神経細胞へリプログラミングされた細胞を確認した。生直後および成体マウスのラセン神経節から、グリア細胞を含むラセン神経節非神経細胞のin vitro培養系を樹立した。

生直後のラセン神経節からの、初代培養の樹立とリポフェクション法による遺伝子導入およびプロトコルの改良を行った。トロント大学との共同研究において、生直後のTau-GFPマウスからラセン神経節非神経細胞、ラセン神経節細胞(神経細胞)をFACSで収集した。また、ラセン神経節非神経細胞にAscl1とNeuroD1を強制発現してリプログラミングした神経細胞(iN: induced neuron)を収集した。これら3群(バルク)からRNAを抽出してRNA-seqを行った。結果、iNはラセン神経節とラセン神経節非神経細胞の中間の遺伝子発現パターンを呈した。これらの結果は、原著論文として報告した(Noda et al., 2018)。一方で、成体ラセン神経節からの培養は困難であった。成体蝸牛は骨化しているために初代培養組織に骨が含まれ、また培地中に細菌感染コンタミネーションを頻回にきたしたからである。継代により、骨組織を除去して、グリア細胞を安定的に培養する手技を確立した。成体モルモットを用いて、in vivoでタイプIラセン神経節細胞をアブレーションさせるプロトコル(蝸牛神経障害動物モデル作成のプロトコル)を確立した。極細のヒューズドシリカチューブを正円窓膜に穿刺し、マイクロインジェクターでウアバイン5 mM, 5 ulを鼓室階に注入した。コントロールは生理食塩水を用いた。ウアバイン注入1、2、3週にABRを測定し、全周波数で生理食塩水に比較し有意に閾値上昇を認めた。免疫組織化学的に、ウアバイン注入群でタイプIラセン神経節細胞がアブレーションされていることを確認した。昨年の研究成果で、マウスタイプIIラセン神経節細胞のマーカーとしてのGata3を報告し、かつタイプIIA, IIBに分類されることを報告した(Nishimura et al., 2017)が、モルモットにおいても同様の所見が得られた。生後1日目のマウスラセン神経節を酵素で単細胞化して、in vitroでの培養に成功した。ラセン神経節には神経細胞、非神経細胞が含まれるが、非神経細胞はさらに、グリア細胞と非グリア細胞に分類される。Sox2-GFPマウスを用いて、ラセン神経節をSox2陽性グリア細胞と、Sox2陰性グリア細胞にFACSでソートした。グリア細胞と非グリア細胞の神経細胞へ分化転換する能力(competence)を転写因子Ascl1を強制発現させて、比較した。結果、グリア細胞から神経細胞への分化誘導効率が有意に高かった。また、神経細胞は、ラセン神経節細胞に発現する、Prox1やVglut1を発現した。さらに、野生型の成獣マウスラセン神経節細胞を単細胞化し、ラセン神経節内のグリア細胞の培養に成功した。継代により骨組織を除去し、培養皿はMatrigelでコートすることで比較的均一なグリア細胞を死滅させずに培養できた。また、酵素で単細胞化しないラセン神経節を器官培養し、神経突起の伸張や、グリア細胞の生存を確認した。成果は、Front Neurosci誌に論文発表した。
皮膚変形モデルを用いた巧緻な両手多指操作を実現するワイヤ駆動型力触覚提示の研究

本研究の目的であるVR世界における両手多指操作を実現するワイヤ駆動型力覚提示SPIDARと、指先の皮膚感覚提示を可能にする高精度力触覚提示デバイスの実現に向けて研究を進めた。その結果、指先と手首に高精度な力覚提示装置による力の提示、および指先への皮膚感覚の提示を可能にする高精度ワイヤ駆動型力触覚提示装置の実現に向けて完成に近づくことができた。このような高性能力触覚提示装置は実現されていない当年度はさらにVR世界における両手多指操作環境の評価を中心に行った。具体的には設計開発した力触覚提示装置をUSBインタフェースを介して、VRシミュレーション用のPCと接続し、高性能の物理シミュレータを活用しUnity3DによりVR世界を構築した。また、実現した両手多指操作機能を有するVR世界を用いて、両手多指操作環境の総合的な評価を行い、本研究の目的である両手多指操作可能な力触覚提示装置の実現の達成度の総合評価を行った。我々が日常生活で自然に行っている巧緻な両手多指操作をVR空間で実現するのに必要な要素は何か。両手操作空間と指先の皮膚感覚を提示するため皮膚のモデル化を行いリアルタイムにシミュレーションすることを実現し、力覚・触覚双方の感覚提示によって、現実世界での両手多指操作をVR世界においても実現できることを明らかにすることができた。以上のシステムを実現し、操作者の移動・操作に制限のない力覚提示と触覚提示の双方の感覚提示が巧緻な両手多指操作に重要な要素であることが明らかになれば、手術シミュレータや遠隔操作など応用範囲が広く、将来重要な役割を果たすと考える。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。・面に触れたとき、エッジに触れたとき、ピンに触れたときの3状態をシミュレーション可能な皮膚変形モデルを構築することを目的とした。リアルタイムに合計10指の両手の指先をシミュレーションするため、各指の皮膚のモデル化を行い、計算負荷と精度を考慮した設計を行なった。また、指先モデルと接触する対象物との間を物理シミュレータによってシミュレーションを行い、接触時に提示する触覚情報および、接触時の力覚情報を生成した。・手形状推定をデータベースからの推定および解析的推定をハイブリッド化しデータベースで形状の大まかな推定を行い、細かい位置・姿勢推定を解析的推定法により導出することで精度と速度の向上の両立を実現することを目指した。・5本の指の可動範囲を測定し、20本のワイヤ(一つの指先に4本のワイヤが必要)が操作中に干渉しないように、また、力覚提示領域が最大になるような最適なワイヤの張り方を検討した。片手で20本、両手で40本のワイヤの張力制御を高速に行うための小型高性能モータコントローラの設計を行い、通信には1kHz以上、力覚提示には100kHz以上の更新周波数を実現する専用のコントローラを設計した。これまでの研究成果から得られた制御手法を利用し、FPGAの制御ロジックを専用設計することで40本のワイヤ制御を実現した。指先につけても違和感がなく軽量なワイヤ駆動型の触覚提示装置の設計を行なった。小型で軽量なデバイスを目指すため、既存のアクチュエータを用いることはせずに、専用設計のアクチュエータを設計した。また、先行研究においては、既存のボイスコイル型アクチュエータを活用して極めて軽量な触覚提示装置の実現に成功しているが、本研究ではこの設計コンセプトをさらに発展させて、指先形状に適合した電磁コイルを新たに設計して、十分な触覚提示力と極限の軽量性を追求したアクチュエータを設計開発を目指した。・手のひらを反す操作を実現するためにフレームを高速に回転できるアクチュエータの選定とバックラッシュの少ないハーモニックドライブを利用した減速機を選定した。また、回転するフレームにはワイヤ駆動のためのモータと位置計測のためのロータリエンコーダが合わせて20組装着され、これらのデバイスの信号線の処理をスムースに行うためのスリップリングなどを活用した回転機構の設計も行った。・手のひらを反す操作と5本の指先操作を自然に融合させるためには、ユーザの両手多指の姿勢状態を的確に判断して、フレームの姿勢を制御する必要がある。具体的には、常にユーザの5本の指先ができるだけ自由に動かすことができ、かつ十分な力覚を指先に提示できるようにフレームの姿勢を実時間制御する必要がある。このための姿勢制御アルゴリズムの確立と制御システムの開発を行った。・両手多指操作時にユーザの指先に加わる繊細な触感を実現するためには、高速かつ的確に触覚提示部のアクチュエータを制御する必要がある。皮膚変形モデルを用いたシミュレーションおよび物理シミュレータからの指先接触情報に基づき実時間で的確に触覚を提示するためのアクチュエータの制御方法確立を目指した。フレーム可動部および制御方法の設計・開発が順調に進んでいる。また触覚提示部の制御方法についても、皮膚変形モデルを用いたシミュレーションおよび物理シミュレータからの指先接触情報に基づき実時間で的確に触覚を提示するためのアクチュエータの制御方法を確立しつつ設計を進めている。・フレーム可動部の設計・開発をさらに進めた。デバイスの信号線の処理をスムースに行うためのスリップリングなどを活用した回転機構の設計も行った。・フレーム可動部の制御方法の設計・開発を進めた。常にユーザの5本の指先ができるだけ自由に動かすことができ、かつ十分な力覚を指先に提示できるようにフレームの姿勢を実時間制御する必要がある。

・触覚提示部の制御方法の設計・開発をさらに進めた。両手多指操作時にユーザの指先に加わる繊細な触感を実現するためには、高速かつ的確に触覚提示部のアクチュエータを制御する必要がある。皮膚変形モデルを用いたシミュレーションおよび物理シミュレータからの指先接触情報に基づき実時間で的確に触覚を提示するためのアクチュエータの制御方法を確立して、設計開発を行った。・これまでに設計・開発した力覚提示フレームと触覚提示装置、及びフレーム可動部を統合し、システムの評価を行った。また、VR世界における両手多指操作環境の評価を行った。皮膚変形モデルを用いた触覚シミュレーションと物理シミュレータから得られる指先の力触覚の関する情報を用いて開発した力触覚提示装置を制御するとともに、力触覚提示装置から得られる指先位置情報を用いてVRシミュレーション内のVRの手をレンダリングすることにより、両手多指操作機能を有するVR世界の実現を目指した。フレーム可動部および制御方法の設計・開発が順調に進んでいる。両手多指操作時にユーザの指先に加わる繊細な触感を実現するために高速かつ的確に触覚提示部のアクチュエータを制御する方法を確立しつつ設計が進んでいる。VR世界における両手多指操作を実現するワイヤ駆動型力覚提示SPIDARと皮膚感覚提示を可能にする高精度力触覚提示デバイスの実現を目的とし研究を進めた。指先の皮膚モデルを計算機上でリアルタイムにシミュレーションし皮膚変形に基づく触覚提示を行うことでより巧緻な両手多指操作が可能な高精度ワイヤ駆動型力触覚提示装置の実現に向けて以下のとおり実施した。・フレーム可動部の設計・開発を進めた。フレームを高速に回転できるアクチュエータの選定とバックラッシュの少ないハーモニックドライブを利用した減速機を選定した。その他デバイスの信号線の処理をスムースに行うためのスリップリングなどを活用した回転機構の設計を行った。・フレーム可動部の制御方法の設計開発を行った。ユーザの5本の指先ができるだけ自由に動かすことができ、かつ十分な力覚を指先に提示できるようにフレームの姿勢を実時間制御する必要がある。このための姿勢制御アリコリズムの確立と制御システムの開発を行った。・触覚提示部の制御方法の設計・開発を行った。両手多指操作時にユーザの指先に加わる繊細な触感を実現するために、高速かつ的確に触覚提示部のアクチュエータを制御する方法の確立を進め設計開発を行った。・システムの統合・評価を行った。VR世界における両手多指操作環境の評価を行った。設計開発した力覚提示装置をUSBやインタフェースを介してVRシミュレーション用のPCと接続し評価を行った。フレーム可動部の姿勢制御アリゴリズムの確立と制御システムの開発が順調に進んでいる。さらに実時間でアクチュエータの制御方法を確立し設計開発が進んでいる。VR世界における両手多指操作の評価もおおむね順調である。本研究の目的であるVR
非線形非最小位相系における制御則の近似的設計法に関する研究

非線形非最小位相系,特に近似系が最小位相系となる弱最小位相系のトラッキング制御問題において,近似系に対する入出力線形化法を用いたトラッキング制御則のフィードフォワード部分に用いられる目標軌道(仮想目標軌道と呼ぶ)を動径基底関数によって表現し,仮想目標軌道をチューニングすることによって追従性能及び閉ループ系の安定性を改善する方法を開発し,垂直離着陸機の水平方向への機体の移動問題に適用し,大幅に制御性能が改善されることが確認された。また、非線形非最小位相系の一種である非ホロノミックな拘束を受ける劣駆動型移動ロボットなどのドリフトレスシステムに対して漸近的トラッキングを達成するためには,その制御則の中にはフィードバック安定化の項が含まれる。閉ループ系全体の制御性能は安定化の部分にも依存するが,従来提案されている時変フィードバックの設計法の持つ,多大な入力が必要,収束が遅い,という問題に対して,ドリフトレスシステムの持つ時間スケール変換に対する有用な性質を用いて時間と状態に依存する時間スケール変換(ゲイン変換)を適用することによって制御性能を改善し,また、事前に与えられた入力制限を満たすような安定化フィードバックを設計する方法を開発した。また、現実の移動物体のようにアクチュエータの動特性を考慮する必要がある場合に,積分器バックステッピング法を用いて改善された制御則を拡張する方法を開発した。
高速フーリェ変換で使用される窓関数に関する研究

モード解析で簡易的に伝達関数を得る方法として、インパルスハンマーによる打撃振動実験がある。この方法では、通常Force&Responseウィンドウと呼ばれる窓関数を使用している。この窓関数は、入力側と出力側で異なる窓関数を用いているため、計測により得られた伝達関数は、窓関数の影響を受け正しい伝達関数が得られないことは容易に推測される。本研究では、通常用いられるこの窓関数の影響を調べることと、新しく窓関数を提案することを行ない、以下のことが明らかになった。計測開始時間からトリガーまでの時間が長くなればなるほど、窓関数の影響は大きくなり、モードパラメーターのうちモード質量とモード剛性が大きくなることを示した。また従来このような問題が大きく取り上げられなかった理由は、実際の計測で重要視されるのはこれらの比であるところの固有振動数とモード形であるためと考えられる。しかし計測精度が飛躍的に向上している現在では、このような影響は無視できないと考えられる。そこで本研究では、このような従来の窓関数の影響を避けるために、以下のような新しい窓関数を提案した。ここで(1)式は入力側の窓関数、(2)式は出力側の窓関数を表す。この窓関数を使用することにより、計測される伝達関数は、窓関数の影響を受けない正しい伝達関数が得られることを示した。
植物細胞における細胞骨格の構造と機能

多くの成果が得られたが、その一部を研究グループごとに箇条書にまとめる。細胞周期と細胞骨格:細胞膜から精製したチューブリンを含む要素はセルロースを合成する機能を持つことが明らかとなった(水野)。細胞周期に伴うキネシン様タンパク質の動態を解析した(馳澤)。前期前徴小管束の構築の制御に関する解析を行った(峰雪)。細胞の成長と細胞骨格:表層徴小管の配向制御には細胞壁と細胞膜が重要な役割を果していることを明らかにした(水田)。核の位置制御における細胞骨格の役割を解析した(門田)。原形質流動:花粉管からミオシンを精製し、その特性を解析した(横田)。車軸藻における細胞内遊離カルシウムと原形質流動制御に関する解析を行った(新免・菊山)。セキショウモにおけるアクチンフィラメントの配列の制御には細胞壁が重要な役割を果たしていることを明らかにした(高木)。真正粘菌変形体からATPによってその活性が制御されるアクチン結合タンパク質を精製することに成功した(小浜)。変形体の周期的な運動の制御基盤となっていると考えられるカルシウム濃度の変動を可視化することに成功した(石上)。鞭毛・繊毛運動:クラミドモナス鞭毛の外腕の構造にはこれまで知られていなかった第3の因子が必要であることを明らかにした(神谷)。ミドリムシの走光性が倍地のアンモウニウムイオンによって制御を受けていることを明らかにした(渡辺)。細胞周期:タバコ培養細胞においてM/G_1期の表層微小管およびG_1/S期の細胞質微小管の伸長過程ににはアクチンフィラメントが関与していることが明かとなった(馳沢)。分裂準備体形成にタンパク質合成およびタンパク質リン酸化が関与していることが明らにした(峰雪)。細胞の成長:糸状多核緑藻においては表層微小管に安定性の高いものと低いものがあり,後者の動態が細胞壁セルロースミクロフィブリルの動態と平行関係があった(水田)。赤色光下で成長している原糸体二見られる細胞先端部と核を結ぶ微小管の存在を明らかにした。これは,核の移動に関与しているものと思われる(門田)。原形質流動:オオセキショウモにおける近赤外吸収型フィトクロームの光合成に依存した葉緑体の細胞表層への集合にはアクチンフィラメントの構築変化が関与していることが明かとなった(高木)。トチカガミの根毛において,原形質流動とtransvacuolar strandの維持にアクチンフィラメントが関与していることを明らかにした(新免)。テッポウユリ花粉管のミオシンン重鎖に対する抗体を用い,様々な植物の細胞内におけるミオシンの局在を解析した(横田)。粘菌変形体のカフェインドロップにおいて,原形質顆粒の移動とアクトミオシンの動態に関係について解析した(石上)。車軸藻において原形質の水和を起こすとカルシウムが遊離され,原形質流動を阻害することが明かとなった(菊山)。鞭毛運動:クラミドモナスの軸糸周辺微小管上に外腕の結合サイトとなる構造があることが明かとなった(神谷)。クリプト藻の走光性に関与する光受容色素はフィコビリンではなく,それ以外の色素であることが明かとなった(渡辺)。多くの成果が得られたが、その一部を研究グループごとに個条書にまとめる。前期前微小管束の構築の制御に関する解析を行った(峰雪)。細胞の成長と細胞骨格:表層微小管の配向制御には細胞壁と細胞膜が重要な役割を果たしていることを明らかにした(水田)。

セキショウモにおけるアクチンフィラメントの配列の制御には細胞壁が重要な役割を果していることを明らかにした(高木)。真正粘菌変形体からATPによってその活性が制御されるアクチン結合タンパク質を精製することに成功した(小浜)。変形体の周期的な運動の制御基盤となっていると考えられるカルシウム濃度の変動を可視化することに成功した(石上)。鞭毛・繊毛運動:クラミドモナス鞭毛の外腕の構造にはこれまで知られていなかった第3の因子が必要であることを明らかにした(神谷)。ミドリムシの走光性が倍地のアンモウニウムイオンによって制御を受けていることを明らかにした(渡辺)。
磁性体ナノワイヤによる機能性磁性体材料の創出とスピントルクデバイスへの応用

磁性体ナノワイヤの生成については主にカナダのモントリオール理工科大学にて行い、試料の提供を同大学から受ける事で主にデバイス化の研究を行った。ナノワイヤの物性を振動試料型磁力計ならびに磁気共鳴半値幅により評価し、マイクロ波・ミリ波デバイスへの応用性を確認した。ナノワイヤの成長プロセスであるメッキプロセスにおいて、表面荒さは磁気損失の増加に対応するため、これを平坦にすべく恒温環境化におけるワイヤ成長を行った。結果、従来の材料と比較して磁気損失を30%改善できることを確認した。しかしながら磁性体ナノワイヤの磁気損失低減は容易ではなく、アンテナに応用した場合放射する以前に電磁波のエネルギーが全て磁気損失にて消費されることもあり得る。この問題を回避する目的で平行平板構造をアンテナに付加することでアンテナの性能改善を試みた。この内容は12月に開催されたアジア太平洋マイクロ波会議にて発表した。磁性体ナノワイヤはフェライトと同様に非相反性を示すため、これを応用したアンテナとミキサの複合デバイスを考案し、9月にパリにて開催されたヨーロッパマイクロ波会議にて発表した。その他磁性体ナノワイヤの応用を目的としたビーム走査可能な漏洩波アンテナに関する研究を遂行し、(1)アイソレーター複合のビーム走査可能なアンテナ(2)超低姿勢モノポールアンテナ(3)ファラデー回転を用いた完全電気磁気導体の実現に関する論文を査読付き学術雑誌に6報報告した。
多発性嚢胞腎の新たな発症機序の解明～腎近位尿細管のPTENとEGF受容体の役割～

多発性嚢胞腎の発症機序は以前として不明であるが、PTENを近位尿細管特異的にノックアウトすることで嚢胞腎が形成されることを発見した。その機序として細胞増殖が主であり、アポトーシスやciliaが関わっているのではないことが示唆された。PTENとEGF受容体とのダブルノックアウトマウスは生まれているが、ラインにより、ノックアウトの比率が異なるため、現在効率のよいラインを選択して、マウスの数を増やしつつある。ヒト多発性嚢胞腎に類似した病態を示すマウスモデルである近位尿細管特異的PTENノックアウトマウスを作成、解析するとともに、EGF受容体を同時にノックアウトさせ、新たな発症機序の解明を目指した。まずはPTENノックアウトマウスの組織の評価を行った。嚢胞形成のメカニズムとしてまずは細胞増殖をKi67の染色で評価し、PTENノックアウトマウスにおいて、近位尿細管において少なくとも生後3ヶ月には有意に細胞増殖がすでにふえていることが確認された。また同じく嚢胞形成のメカニズムとして重要なアポトーシスをTunnel染色にて検討し、やはりPTENノックアウトマウスでは近位尿細管においてアポトーシスが増加しているもののその程度はきわめてわずかであり、嚢胞形成には細胞増殖が主軸となっていることが示唆された。また嚢胞形成と強い因果関係を証明されているciliaの形態の解析をすすめるため、ciliaのマーカーであるacetylated α-tubulinと、近位尿細管マーカーであるLTAとで二重染色し、近位尿細管細胞にあるciliaの数を検証したところ、その数はコントロールと比べて差がなかった。また、電子顕微鏡にてciliaの長さ、形態を検討したところ、やはりコントロールと有意差を認めなかった。以上からこのモデルではciliaの形態変化が嚢胞形成の原因となっているわけではないことが示唆された。現在同時並行してEGFR受容体floxedマウスを手に入れ、PTEN/EGFRダブルノックアウトマウスを作成中である。まずはヒト多発性嚢胞腎に類似した病態を示すマウスモデルである近位尿細管特異的PTENノックアウトマウスに関する解析だが、その嚢胞形成が細胞増殖由来であり、アポトーシスやciliaによる影響ではないことが示唆されたため、そのメカニズムについては論文を作成し、投稿準備中である。さらに念のため2年までマウスの成長をおったが、この系では期待された癌形成はみられなかった。次にこれまでの論文からEGF受容体は嚢胞腎においてその発現部位を管腔側に移動し、嚢胞液の分泌に寄与するといわれていることから、EGF受容体をPTENと同時にノックアウトしたマウスを作成し、EGF受容体が嚢胞形成に影響を及ぼすかどうか検討することを試みた。多数の交配をへてダブルノックアウトマウスは作成されたが、ラインによってCre recombinaseの働きが強いものと弱いものがあることが確認された。言い換えると、シングルノックアウトの場合100%ノックアウトされていたが、ダブルノックアウトにした場合、全くノックアウトされないライン、半分程度しかノックアウトされないライン、逆に完全にノックアウトできるラインなどが混在することがわかった。その中で完全にダブルノックアウトされるものだけを選別し、現在解析のために月齢をそろえ、マウスの数を増やしているところである。PTENノックアウトによる嚢胞形成が確実に認められるのが1年後であるため、検討まで時間を要している。
セリン:ピルビン酸アミノ転移酵素のオルガネラ局在機構に関する研究

[研究目的]ラット肝臓のセリン:ピルビン酸アミノ転移酵素(SPT)はミトコンドリア(Mt)とペルオキシゾーム(Ps)に局在し、MtとPsのSPTは異なるmRNAに由来する。MtのSPTに対するcDNAクローンの単離には既に成功したので、本研究では、構造比較のため、PsのSPTに対するcDNAのクローニングとその構造解析を目的とした。[研究実績]1.cDNAバンクの作製及びスクリーニング:正常ラット肝ポリ(A)RNAを鋳型として、岡山・バークの方法によりcDNAバンクを作成した。コロニーハイブリダイゼーションはMtのSPTに対するcDNAクローン(pRspt10)のPstI切断による約900塩基対のフラグメントを用いて行った。いくつかの実験から、このフラグメントはPs-SPTのmRNAと相同性を持っことが示唆されていた。約12万の形質変換菌をスクリーニングした結果、制限酵素による切断形式がMt-SPTに対するクローンとは異なる2個のクローンを得た。2.制限酵素地図の作製及び塩基配列の解析:この2個のクローンは長じ長さのインサートを含み、制限酵素による切断パターンも同じであったので、そのうちの1つ、pRspt216について詳細な制限酵素地図を作成した。それをMt型クローンのものと比較したところ、インサートの3′末端側半分はほとんど同じであったが、5′末端側半分はまったく異っていた。このことは塩基配列の決定(約9割完了)により更に確認された。すなわち、pRspt216の3′末端側約950塩基の配列は、間に62塩基の特異配列が存在すること以外は、Mt型クローンの3′末端側塩基配列と完全に一致していた。一方、5′末端側約850塩基については両者でまったく異なっていた。pRspt216はおそらくPs-SPTに対応するcDNAクローンと思われるが、現在その確認を行いつつある。