hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
食品廃棄物を利用した植物修復促進剤の開発

そのため、TEOS/APTES混合シリカゲルの場合は、触媒を添加しない条件でゲル化したものの徐放特性を調べた。徐放性は、乾燥させたキセロゲルに超純水を5 ml加えて浸漬液中に放出されたDM量を420 nmにおける吸光度で追跡することで評価した。植物修復実験への応用を想定して毎日0.2 mlずつ浸漬液を交換して吸光度測定を行なったが、実際の栽培培地ではゲルからのDMの徐放特性がどうなるのか今後、検証実験が必要となると思われる。TEOS/APTES混合ゲルではDMの一次放出量(1日目)そして二次放出量(6-20日目)が大きく抑えられることがわかり、実際に植物修復への使用があまり意味をなさない事が明らかとなった。これまで廃糖蜜から精製した暗色物質(DM)による植物修復の促進効果の検証実験は、アブラナ科ダイコン属のダイコンとアブラナ科アブラナ属の農林20号アブラナ(Brassica rapa var.nippo-oleifera)、セイヨウアブラナ(Brassica napus)、キカラシナ(Brassica juncea var. cernua)で行なわれてきた。培地へのDM添加によって、ダイコン属は銅イオンの吸収が、アブラナ属は鉛やカドミウムイオンの吸収が促進される事がわかっている。後者に関しては、同じアブラナ属でも園芸種の農林20号アブラナより野生種のセイヨウアブラナの方が、また同じ園芸種でも農林20号アブラナよりもキカラシナの方が個体当りの鉛蓄積量がDM添加によって一層促進された。この事から論理的に考えると、DM添加と組み合わせた野生種のセイヨウカラシナ(Brassica juncea L. Czern.)の植物修復の能力に期待できる。しかし、アブラナ属は交雑性が高いため、これまで調査した群馬県内を流れる粕川流域ではセイヨウカラシナの純正種を見つける事ができなかった。最終年度、群馬県内を流れる広瀬川流域でセイヨウカラシナの純正種の群生地を発見して、種子を採集する事に成功した。本報告書では、前年度に詳しく徐放特性を調査したDM含有シリカキセロゲル錠剤を埋め込んだ硝酸鉛培地でセイヨウカラシナを栽培して、ゲル錠剤添加による鉛蓄積量の促進効果を検証した。この他にも上記の硫酸カドミウム培地での植物修復実験や、フミン酸に対する鉄と銅イオンの結合容量の分析も行なったので、研究成果報告書に別途報告する。植物抽出は重金属汚染を浄化する方法の一つであり、キレータは重金属の毒性を緩和して植物の生物利用能力を向上させると考えられている。サトウキビ廃糖蜜由来の暗色物質(DM)は、銅汚染培地の植物修復の促進効果がある事がこれまで明らかにされた。本報告書では、鉛やカドミウムを含む培地でDMによる植物抽出効率の向上効果を評価した。これら重金属の毒性に耐久性が強いアブラナ属の植物種を用いた結果、1 mM硝酸鉛培地における乾燥重量と鉛摂取量は、DMを加える事によって有意に増加した。取り込まれた鉛はほとんど根に蓄積されていた。1 mM硫酸カドミウム培地においては育ちが悪く、DMを添加しないと全滅した。植物修復実験に関しては、従来のダイコンから鉛やカドミウム吸収に特化したアブラナやカラシナに植物種を変更した。そのため日照条件、培地そして培養液を一新させて栽培したが、重金属やキレート剤を添加しないブランク条件でも十分に生長させることができた。また本年度は計画になかったが、DMのキレート特性を議論する上で重要な金属結合容量を測定した。
保険負債の公正価値評価がもたらす企業行動の変化とその経済的影響

本研究では,IASBの方向性と既存のGAAPとの相違点を明らかにした上で,IASBが提案する保険契約の会計基準が適用された場合の経済的な影響を予測し,考察した。既存の保険会社のGAAPは保険会社の資金提供者である保険契約者を保護する機能を持っている。つまり,情報提供機能よりも利害調整目的が重視されてきた。わが国の保険会社は北本(1974)が「超保守性」といったように,諸外国(特にアングロサクソン諸国)よりも一層保守的な会計慣行が容認されてきた。IASBは保険会社(保険契約)のGAAPについての基準設定を進めており,その中で保険負債を公正価値測定により行うモデルを提示している。保険契約の会計基準は保険会社を一般の企業と同じ競争のフィールドに置くことを意味する。保険会社のあり方そのものを変えることが求められるといっても過言ではないであろう。平成20年度では、保険会計の先行研究をまとめ理論的な背景を明らかにした。また海外のセミナーに参加し情報収集を行った。(1)保険会計の研究サーベイわが国の保険会計は証券取引法・会社法・監督法会計が一体で、責任準備金に関しては監督法会計で定められ、他の2制度はそれを受け入れている。英米では監督法会計と投資家への情報提供を目的とするGAAP会計とが並立しているなど、保険に関する会計のあり方は各国で様々である。監督法会計、GAAP会計の下で開示された会計情報を用い、企業行動や格付け・株価との関係を検証した論文として古くはHarmelink(1973)や、最近ではGaver and Pottier (2005)などがある。こうした論文をサーベイし、分析手法を検討した。(2)会計基準に関する検討2007年5月にIASBは保険契約のディスカッション・ペーパーを公表した。この資料を用い、本基準の理論的、技術的な点を考察し、その特徴を明示した。保険負債の評価方法、財務諸表への計上方法を重点的に検討している。会計基準の検討状況についてはIASBのホームページ(http://www.iasb.co.uk/)等でも情報を入手できるが、その理論的・技術的な背景をより詳細に調査するためにイギリスで開催されたIFRS(国際財務報告基準)のワークショップに参加した。また途中経過の報告として、日本会計研究学会で学会報告を行った(立教大学で開催)。また今回の成果は、「保険学雑誌」第609号に掲載される予定である。平成20年度では、環境制約に関する調査、EU諸国の開示状況調査を行なった。(1)環境制約の調査-日米欧の立場を明らかに-(平成21年度に実施)日本、アメリカ、EU諸国、カナダ、オーストラリア等の環境制約の相違点を明らかにする。会計基準は経済活動の基礎に位置するインフラであり、その背景となる資本市場の制度や会社法制、税制は各国で異なる。またIFRSへの関与の程度も各国で異なる。各国の保険経営の形態(株式会社、相互会社の数など)や保険市場、保険に関する法規制の実態を調査した。(2) EU諸国の開示状況調査(平成21年度に実施)EU加盟国では2005年よりIFRSに基づいた財務諸表が開示され、IFRS第4号「保険契約の会計基準」が適用されている。IFRS第4号の適用は、保険契約の会計基準が完成するまでの経過的なものである。暫定基準であるIFRS第4号は、保険契約の認識及び測定については基本的には現行の各国の国内基準を認めていながらも、(1)保険契約に関する情報の開示、(2)平衡準備金・異常危険準備金の禁止、(3)組込オプションおよび保証の公正価値による表示など、一定の統一した開示を求めている。IFRS第4号の下で公開された主要保険会社の開示状況、そして適用前後の会計数値の変化を調査した。本年度では,保険会計における特殊性を明らかにするために,保険会社の特性に焦点を当てて考察を行った。本研究実績を通じて,保険負債の公正価値評価がもたらす経済的影響が改めて明らかにされたと考えている。「箸の上げ下ろしまで指示する」と揶揄されるように,かつて日本の金融業は,国の監督下で運営される性格が強く,厳しく規制されていた。保険業においては,業務の範囲,保険料率,商品設計などが規制されていた。こうした規制は,金融機関は原則として倒産させないという方針で行なわれ,金融システムの安定を目的としていた。脱落者を出さないことを前提にするこの方針は,「護送船団方式(行政)」などと言われた。

金融ビッグバン以後,こうした方針が転換され,金融検査は財務諸表の数値とその裏づけとなる会計監査を補強するものと位置づけられた。つまり,一般の企業と同じ企業会計基準に従い会計処理を行うことが求められた。しかし,保険業においては,他業種との比較は極力避けられ、同業種間での比較に焦点が当てられていた。保険業には時価会計に関する緩和措置が設けられる一方で,ソルベンシー・マージン比率およびその内訳が一般に公表され,同業種間で健全性の程度を競うことが求められている。しかし,保険業の特性を配慮した取り扱いは,将来的には認められなくなる可能性が高い。保険会社に対する諸規制は,監督規制と企業会計の両面から国際的な枠組みが形成されつつある。その変化の大きさは,1995年の保険業法改正から始まった規制緩和を上回るものかもしれない。
生体組織メゾスケール3次元解析のためのFIB連続切削SEM表面組成観察法の最適化

新規概念に基づく顕微装置(focusedionbeam/scanningelectronmicroscope;FIB/SEM)の医学生物学研究応用における最適化により、肝細胞ミトコンドリアのcristaejunctionの発見、精嚢壁間質にみられる間葉細胞の扁平な形態の証明とそれらによる機能的区画化"comparmental-ization"という概念の提唱、皮膚真皮の生理および病態における線維芽細胞と膠原線維束構築の解析、骨膜および腱骨付着部の力学的妥当性を示す細胞構築の視覚化など、細胞小器官から細胞・組織構築レベルに至る多くの形態的新事実を明らかにした本研究は、ナノテクノロジーの技術革新により実現した新規概念の顕微装置(focused ion beam/scanning electron microscope; FIB/SEM)の生命科学研究への応用の最適化を目的として遂行した。材料系研究分野で発展してきた本装置は、1)走査型電顕の低加速電圧・高感度化、2)超微細精密切削を可能とするFIB技術開発、という最先端技術の融合により実現し、組織・細胞の三次元超微細構造解析に驚異的威力を発揮する。本装置がいち早く導入された当該研究者の所属施設では、今回交付された科学研究費助成(挑戦的萌芽研究)により、長年蓄積してきた形態研究のノウハウを活用し、本装置の能力が最大限に発揮できる観察法や試料作製法の最適化に取り組んできた。第1に、本研究の成果を公開することにより、これまでの電顕手技と得られた所見のギャップ故に理解され難かったFIB/SEMの医学生物学研究における能力と意義が認知されるようになった。また、肝細胞ミトコンドリアのcristae junctionの発見に続き、本年度は精嚢壁間質にみられる間葉細胞の詳細な解析により、それら細胞が分布する精嚢壁の領域・部位による形態の違いを見いだした。個々の細胞はこれまで考えられていたような、突起をもった形状ではなく、扁平であることを明確に示し、これらの細胞が全体としてゆるい隔壁を構築することにより機能的ユニットを形成していると解釈し、"comparmentalization"という概念を提唱した。これらの成果は、これまで主流であった共焦点レーザー顕微鏡をはじめとする光学顕微鏡、単独切片の透過型電子顕微鏡、また、酵素や塩酸を用いて消化処理した組織試料の走査型電子顕微鏡による観察では、固定法や観察分解能の限界により、決して明らかにすることはできなかったものであり、医学生物学的意義は大きい。新規概念に基づく顕微装置(focusedionbeam/scanningelectronmicroscope;FIB/SEM)の医学生物学研究応用における最適化により、肝細胞ミトコンドリアのcristaejunctionの発見、精嚢壁間質にみられる間葉細胞の扁平な形態の証明とそれらによる機能的区画化"comparmental-ization"という概念の提唱、皮膚真皮の生理および病態における線維芽細胞と膠原線維束構築の解析、骨膜および腱骨付着部の力学的妥当性を示す細胞構築の視覚化など、細胞小器官から細胞・組織構築レベルに至る多くの形態的新事実を明らかにした本研究は、ナノテクノロジーの技術革新により実現した新しい概念の顕微観察装置であるFIB/SEMの生命科学分野の研究応用への最適化を目的として遂行している。材料系・半導体研究分野で注目されているFIB/SEMの医学生物学研究への応用のために、1)走査型電子顕微鏡観察法の改良(照射ビームへのBDの導入)、および、2)樹脂包埋生物試料の切削断面における断面観察のための試料作製法(固定、ブロック染色等)開発を柱として、これらを適切に連携・総合することにより、組織・細胞の的確な3次元的微細構造解析を可能とする技法を開発しつつある。時間と熟練した技術・労力が必要であった超薄連続切片観察と同等の画像の半自動取得を可能とし、切片作製時の変形等のない連続画像からは定量性にすぐれた3次元形態情報が得られるようになった。これまでに消化器系(消化管、肝臓、膵臓)、泌尿器系(腎臓、尿管、膀胱)、循環器系(心筋、血管、リンパ管)、生殖器系(精嚢)、神経系(海馬)、運動器系(骨・軟骨、腱)および、皮膚においてデータを得ており、医学生物学研究においてポストゲノム次元での生命現象理解の大きなbreakthroughとなる萌芽と考えられるこれらの成果は、研究成果欄に挙げるように、順次、日本解剖学会、日本顕微鏡学会をはじめとする学会/研究会において公表し、また、学術論文としてMicron等発表し、さらに引き続き実験データのまとめおよび発表準備を進めている。最新の顕微技術を駆使した次世代電子顕微鏡であるFIB/SEMの医学生物学研究への応用の最適化を目指す本研究は、当初予想しなかった成果を挙げており、これまでの研究成果は、すでに国内外の学会において公表し、学術論文として発表している。中でも、直径30nm程度のミトコンドリアのcristae junctionの証明、および、間葉組織中に分布する厚さ50nm以下の極めて扁平なシート状突起をもつ細胞の形態をはじめて明らかにしたことは特記するに値する。いずれも生体組織に普遍的に存在し、機能研究に重要な形態情報であるにもかかわらず、これまで明確でなかった構造であり、期待以上の成果が得られた理由は、対象の構造とサイズが、これまでTEM、SEM、共焦点レーザー顕微鏡いずれの方法においても同定が難しかったことにあると考えられる。その他、新たに開発した、骨・軟骨・靭帯の超微形態をそのまま観察できる手法により、これまでは極めて困難であった硬組織およびその周辺で機能する細胞の形、分布様式、周囲の細胞および細胞外基質との関連、動態等の観察が実現できることが明らかとなってきた。

本装置は、試料作成法の難易度が低く、透過型電子顕微鏡(TEM)レベルの高解像度をもって、走査型電子顕微鏡(SEM)ひいては光学顕微鏡レベルの広範囲の観察を可能とし、医学生物学研究においてポストゲノム次元での生命現象理解の大きなbreakthroughとなると期待される。1)皮膚真皮、間葉組織中に分布する線維芽細胞の細胞間相互関係と組織構築の解析におけるFIB/SEM法の最適条件の検討により、末梢組織中の生体防御・免疫系細胞、組織幹細胞のニッチ等の細胞逐次型解析が可能となり、昨今、Romaniaの研究グループにより注目されている細胞群とは異なる新たな間葉組織像を明らかにする可能性を追求する。2)ミトコンドリアのクリステ構造に注目した、肝細胞、心筋細胞、骨格筋線維、脂肪細胞、ステロイドホルモン分泌細胞等の各種組織細胞の解析を行い、最近注目されているミトコンドリア機能との関連について解析する。3)コネクトーム解析として、海馬ニューロンの時系列変化について、詳細な検討を行う。また、4)FIB/SEM法により得られた連続画像データの精密計測のための技術的問題点の把握とその解決の基盤となる情報を収集し、さらに、観察対象組織の特性を勘案したFIB/SEM観察のための試料作製・加工方法の検討・最適化を進める。本研究では、すべての対象について、FIB/SEM所見が基本であり、本装置を適切に稼働させるための消耗品の購入、および、学術情報交換、研究打合せのための出張旅費として、23年度と同様の研究費を計上する。私学助成により申請者が所属する研究施設に設置された本装置のうち、SEM機能部分は当該施設がの維持・管理している。次年度研究費は、本装置の特徴であり、本研究に特化した、FIB切削装置の稼働および関連実験に必要なGaガス、および、高感度検出器などの消耗部品の維持・管理に充当する。
ゲルロボットの研究(電場応答性高分子ゲルの形状設計と運動制御)

本研究で得られた研究成果は次の通りである。1.大変形するゲルロボットの形状設計手法変形の特異性を実現するために、表面に微細な凹凸を持つ平板状の型を作り、型にゲル材料を流し込んで表面にひだをもつゲル成型する手法を確立した。表面にひだをつけたゲルは、伸張する面のひだの方向に沿って曲がりやすくなり、変形の方向性を形状により設計可能となることを明らかにした。2.電界制御による変形予測モデルの構築ゲルの持つ能動的および受動的な変形特性をモデリングする手法を提案し、この手法に基づいてシミュレータを実装し、アレイ状電極裟置により生成する2次元空間分布電場内におけるゲルの変形シミュレーションを行った。電場を適切なタイミングで平行移動することにより、ダイナミックな運動を生成することができることを明らかにした。3.ゲル連続体の形状を制御する電場制御システムの開発大変形を生じる駆動電場の条件を明らかにするために、電場の空間分布を制御可能な多電極駆動装置を開発し、空間分布を少しずつ変化させた場合の変形応答性を詳細に計測し、シミュレーション結果と比較し、モデルの正当性を検証した。4.軟体動物状ゲルロボットの変形と運動制御の実現総合実験として、触手状ゲルの巻きつき運動生成実験、およびヒトデ型ゲルロボットの表裏反転運動制御実験を行い成功した。長さ24[mm]の触手状ゲルが直径4[mm]のスペーサを一周巻きつけるのに180[s]、直径15[mm]のヒトデ型ゲルロボットが反転するのに50-60[s]を要した。平成13年度の研究の内容は次の通りである。1)表面に微細なひだを持つゲルロボットの製作法の確立変形の特異性を実現するために、表面に微細な凹凸を持つ平板状の型を作り、型にゲル材料を流し込んで表面にひだをもつゲルを成型する手法を確立した。その手順は以下の通りである。目的とするゲルの3次元形状データを元に、型の3次元形状データを作り、NC工作機械に読み込ませて型を加工する。この型を用いてゲルを重合する。ここで設計するゲルの3次元形状データは、シミュレーションにも用いることができる。2)ゲルロボットの変形応答性測定表面に微細なひだを持つゲルと、平らな表面を持つゲルの全体的な変形応答を測定し、ひだの効果を比較した。また、大変形を生じる駆動電場の条件を明らかにするために、電場の空間分布を制御可能な多電極駆動装置を開発し、空間分布を少しずつ変化させた場合の変形応答性を詳細に計測した。表面にひだをつけたゲルは、伸長する面のひだの方向に沿って曲がりやすくなり、変形の方向性を形状により設計可能となることが明らかになった。3)ゲルロボットの変形予測シミュレータゲルの持つ能動的な変形特性に関するモデリング手法は確立されていたが、受動変形を考慮したモデリング手法は明らかでなかった。そこで、能動-受動変形を考慮したモデリング手法を提案し、この手法に基づいてシミュレータを実装し、ゲルのいろいろな電場中での変形についてシミュレーションを行った。平成14年度の研究の内容は次の通りである。1)入力周波数変調法によるゲルの曲線形状生成電場応答性高分子ゲルを一様電場中において,基本周期の倍数長で極性を反転することにより,曲率が大きく複数の極を有する曲線形状に到達させる手法を提案した.本手法は,一様電場中において,片持ち梁状ゲルが入力を全く切り替えなくても自発的に波状パタンを形成する自己組織化現象を活用するものである.極めて少ない入力切り替え回数(1回-3回)で,曲率が大きく変化する曲線形状を生成することができることを実験的に示した.2)空間分布電場平行移動法と変形運動生成シミュレーション本研究で用いるゲルは,界面活性剤溶液中で平行平板電極の間に一端を固定した状態で配置し,電極に電圧を印加すると陽極側に屈曲する.アレイ状電極装置により生成する

2次元空間分布電場でゲルを一括駆動し,これを適切なタイミングで平行移動することにより,ダイナミックな運動を生成する手法を提案した.平行移動速度を変化することで,反転や巻きつきなど多様な変形運動が生成可能であることをシミュレーションにより明らかにした.3)ゲルロボットの巻きつき運動・反転運動制御実験上述(2)の手法に基づいて目的動作を生成する条件を同定し,触手状ゲルの巻きつき運動および,ヒトデ型ゲルロボットの表裏反転運動制御実験に成功した.長さ24[mm]の触手状ゲルが直径4[mm]のスペーサを一周巻きつけるのに180[s],直径15[mmのヒトデ型ゲルロボットが反転するのに50-60[s]を要した.以上を通じ,本手法の有効性を実証した.
PIポリアミドによる核DNAをターゲットにした新たな放射線増感剤の開発

放射線治療において治療効果を高めるために用いられる放射線増感剤には、腫瘍細胞への取り込みの選択性・特異性の低さ、細胞毒性による副作用といった問題点がある。本研究では、配列特異的なDNA結合能を持つPIポリアミド分子にヨード元素等を結合させた。このヨード化PIポリアミドはDNAに選択的に結合しヨード元素のX線吸収により強力なDNA損傷を引き起こす可能性がある。選択性が高く副作用の少ないかつ抗腫瘍効果の高い放射線増感剤の開発を試みた。既に作成済みであったヨード化PIポリアミド(I-PI)および臭素化PIポリアミド(Br-PI)を1,5,10,50μMまで濃度を調整しヒト膀胱癌(T24)とヒト乳癌細胞(MCF7)などの腫瘍細胞株に投与し24時間後に0,2,6GyのX線照射を行った。照射後48時間後に非投与群とのWST法による比色定量により生細胞数の評価を行ったがこれらのPIポリアミドに明らかな放射線増感効果は確認出来なかった。また1分子中にヨード元素を2個以上持つPIポリアミドの作成を検討している。また放射線増感効果が確認されている既存の抗がん剤であるシスプラチンをPIポリアミドに結合させる合成を行っている。これによりシスプラチンより腫瘍特異性が高く副作用が少ない新規の放射線治療を実現したい。合成スキームが長いが現在中間化合物まで合成に成功しtrans-白金(II)ジアンミンジクロリドとPIポリアミドの結合中である。既存のシスプラチンによる放射線増感効果は過去の文献にならいヒト子宮頸癌細胞で確認した。シスプラチンは過去の文献にならい0.01,0.1,0.5,1μMまで濃度を調整し投与し24時間後に0,2,4,6GyのX線照射を行った。非投与群とのWST法による比色定量およびColonyformation assayによる生存曲線から我々も0.5μM以上で放射線増感効果を確認した。既に合成済みであったヨード化PIポリアミド(I-PI)がWST法による比色定量による生細胞数の評価およびColonyformation assayによる細胞生存率のin vitroにおいて期待した放射線増感効果が得られなかった。そこで放射線増感効果が確認されている既存の抗がん剤であるシスプラチンと類似の化合物としてプラチナにPIポリアミドを結合させることを考え新たな白金PIポリアミドを二種類作成した。まずは化合物の安定性を考えPIポリアミドは短くし白金が核DNAに移行することを目標にした。この白金PIポリアミドはPIポリアミドの優れた核DNA移行性のために既存のシスプラチンより腫瘍選択性が優れている可能性がある。これは臨床において問題となるシスプラチンによる正常細胞に対する腎毒性などの副作用を減らしてくれる可能性がある。この白金PIポリアミドのin vitroにおける放射線増感効果をシスプラチンと比較中である。シスプラチン投与と放射線治療が標準治療となっている癌として子宮頸癌が挙げられる。そこで子宮頸癌細胞株HeLaを使用してWST法による比色定量による生細胞数の評価およびColony formation assayによる細胞生存率のin vitroにおいてシスプラチン投与群と白金PIポリアミド投与群で濃度や照射線量など条件を比較検討中である。X線照射は日本大学医学部医学研究支援部門に設置してある日立X線照射装置(MBR-1520R-3, Hitachi Medico社)の基板が故障したため同型の代替機を日本大学医学部医学研究支援部門に設置して行っている。2015年4月に同型の代替機が日本大学医学部医学研究支援部門に設置されたがこの間X線照射を行えなかったため。ヨード元素や臭素元素の結合したPIポリアミドを複数作成し培養腫瘍細胞株に投与して核DNAに摂取されることを確認しin vitroでの放射線増感効果を検証した。1使用するヨード化および臭素化PIポリアミドについてまずはヨード元素および臭素元素を確実に核DNAへ移行させるために短い配列の分子量の少ないPIポリアミドにヨード元素および臭素元素を結合させたヨード化PIポリアミドを複数合成した。2in vitroにおけるヨード化PIポリアミドの放射線増感効果の確認についてヨード化PIポリアミドを培養腫瘍細胞に投与した後にX線を照射した。X線照射は日本大学医学部医学研究支援部門に設置してある日立X線照射装置(MBR-1520R-3, Hitachi Medico社)で行った。期間中にこの照射装置が故障してしまい照射実験に遅れが生じた。放射線増感効果は非投与群とのWST法による比色定量による生細胞数の評価とColony formation assayによる細胞生存率の評価で確認した。細胞株は現在医療の現場で一般的に放射線治療が行われている子宮頸癌細胞株HeLaを使用した。細胞株の培養濃度やヨード化PIポリアミドの投与濃度およびX線照射線量の検討をWST法およびColony formation assayで検討した。ヨード化PIポリアミドの細胞毒性を少ないしかつ放射線増感効果のある条件を検討したが期待した放射線増感効果は得られなかった。

X線照射は日本大学医学部医学研究支援部門に設置してある日立X線照射装置(MBR-1520R-3, Hitachi Medico社)で行っていたが2014年11月に基板が故障し現在まで修理中である。このためX線照射が不可能となっており、既存の抗がん剤であるシスプラチンの照射なしでの抗腫瘍効果の条件検討のみを行っている。条件検討が終了次第、放射線増感効果の機序をX線照射後の活性酸素ROSを測定し明らかにしたい。放射線増感剤日立X線照射装置の基盤修理に時間がかかるため代換機を注文中である。放射線増感効果が確認されている既存の抗がん剤であるシスプラチンをPIポリアミドに結合させる合成を行っている。これにより既存のシスプラチンより腫瘍特異性が高く副作用が少ない新規の放射線治療を実現したい。現在合成スキーム内の中間化合物まで合成に成功している。研究計画立案時に想定していた以上に白金PIポリアミド合成のための化合物や試薬を安価な価格で購入することができたため経費に余裕が生じた。日本大学医学部医学研究支援部門に設置してある日立X線照射装置(MBR-1520R-3, Hitachi Medico社)の基板が故障中、放射線照射実験が出来なかったため予定していた試薬を購入せず経費に余裕が生じた。予想より試薬が安かったため。次年度の細胞培養の培地購入や放射線増感効果確認のための活性酸素測定などの試薬購入の足しおよび可能であればvivoの実験用のマウスの購入や管理や学会発表の足しにし比較検討のため既存の放射線増感効果のある抗がん剤であるシスプラチンの購入の足しにする。放射線増感効果が確認され次第白金PIポリアミドの大量合成のための白金や試薬購入の足しにする。次年度の試薬購入の足しにする。
大血管ナビゲーションを駆使した術者のイメージング能力向上に寄与する革新的治療戦略

大血管対象のナビゲーションシステム"TAAA Navigator"を開発してきた.従来のレジストレーション方法に改良を加え,機能を統合した新システムを構築した.レジストレーションは開胸前に体表上から骨の特徴点を探索し,点レジストレーションする方法とした.画像上のレジストレーション点は骨の特徴点から方向別に皮下組織厚の厚みに応じた値を移動させた点として設定する.レジストレーション後は手術中のベッド移動量を計測する参照用マーカを利用し,結果を追従させる.開胸後,体表点と体内点の組み合わせによる点レジストレーションで標的を探索する.臨床利用中には評価できないレジストレーション誤差についてファントムで調査した.皮下組織厚のオフセット補正は誤差の低減に効果的であった.部位ごとに与えた信頼度に応じた誤差補正の効果についてはさらなる検討を要する.大血管対象のナビゲーションシステム"TAAA Navigator"を開発してきた.従来のレジストレーション方法に改良を加え,機能を統合した新システムを構築した.レジストレーションは開胸前に体表上から骨の特徴点を探索し,点レジストレーションする方法とした.画像上のレジストレーション点は骨の特徴点から方向別に皮下組織厚の厚みに応じた値を移動させた点として設定する.レジストレーション後は手術中のベッド移動量を計測する参照用マーカを利用し,結果を追従させる.開胸後,体表点と体内点の組み合わせによる点レジストレーションで標的を探索する.臨床利用中には評価できないレジストレーション誤差についてファントムで調査した.皮下組織厚のオフセット補正は誤差の低減に効果的であった.部位ごとに与えた信頼度に応じた誤差補正の効果についてはさらなる検討を要する.大血管ナビゲーションは温存する肋間動脈の位置,走行を確認し,安心な手術を行うための支援システムである.これまでの研究成果により,体内の解剖学的特徴点を用いたレジストレーションを利用することで,目標血管同定のための十分な精度を実現し,体内の目視で確認できない部位の立体的構造を理解するのに役立つシステムとなった.しかし,現在のレジストレーション法では症例によって設定が異なり,精度も一定とはいえない.本研究は大血管ナビゲーションを難しいスキルを要さず,誰でも一定以内のレジストレーション誤差を維持できるシステムへの改良を行うことを目的とする.特に,本年度は問題点の洗い出し,ナビが実現するべき目的およびナビゲーションの仕様の再検証を行い,改善策を提案した.本ナビゲーションはオリエンテーションをつけるのが苦手な医師への普及を目指している.現在のレジストレーションの問題点は,体内の狭い範囲で組織の裏側などの特徴点を指し示しているため,レジストレーション点計測の正確性は術者にしかわからない.そこで,開胸前のナビゲーションで肋骨や椎骨の位置関係を把握し,目標とする肋間動脈の大まかな位置を予測する方法を導入した.このナビゲーションでは体表上から骨の凹凸部など特徴のある部位を用いるレジストレーションを行う.体表面から手探りで特徴点(左右頚切痕,胸骨角,左右前腸骨棘,恥骨稜など)を探索し,ポインタで指し示して光学式位置計測器で計測した点を画像上の同一点と対応付けた.解剖学的特徴点には,頚切痕,胸骨角が探索しやすく,剣状突起は先端を指し示すのが難しかった.レジストレーションの精度は10mm以上あったが,胸部の切開ラインを判断するには十分であった.従来法に比べて結果が直感的にわかりやすく,レジストレーション作業が簡便で,時間的余裕があるため,現場の医師には好評な方法であった.手術ナビゲーションは患者の画像情報を地図のように利用しながら,患者体内の肉眼で見ることができない情報を可視化させ,標的までのアプローチを支援するものである.われわれは,胸腹部領域では難しいといわれていた手術ナビゲーションを,臨床応用できるまでに向上させた.他施設で利用できるようにするためには,患者の画像情報と実際の身体構造との位置合わせ(レジストレーション)の簡易化が重要な点である.体表面からでも認識しやすい点を触れながら探索して背骨をレジストレーションし,その結果をもとに肋間動脈の位置を特定できる精度にすることを目標とする.しかし,レジストレーション後にベッドを動かすと位置誤差が生じ,再レジストレーションを要する.そこで,ベッドの動きを計測し,位置補正するシステムの開発を行う.今回,固定法の異なる2種類のマーカ(A,B)を設計・開発し,機能を比較した.いずれも,ベッドの固定治具を利用し,棒を取り付けるが,マーカの棒への取り付け方法が異なる.マーカAは2方向から板で挟んで固定する方式,マーカBは4方向から締め付けて固定する方式とした.水平方向ではマーカをX-Y-Zステージに固定し,等間隔で動かしたときの誤差を算出し,また回転方向ではマーカをゴニオステージに固定し,動かしたときの追従性の確認を行った.その結果,水平方向の誤差はマーカAでX軸0.037mm, Y軸0.018mm, Z軸0.005mm,マーカBでX軸0.015mm Y軸0.005mm Z軸0.025mmとなり,ともに光学式位置計測器の計測誤差範囲内であった.回転方向ではステージの設定値と光学式位置計測値との相関図を作成し,回帰直線の傾きを求めたところ,マーカAで0.978マーカBで0.987となり追従した.作成したマーカは実験室系では十分な精度を有した.

今後は実際にベッドに固定し,臨床での応用を目指す.われわれがこれまでに開発した大血管手術用ナビゲーションシステムには,身体全体のうち大まかな血管位置を特定するナビゲーションと再建する標的血管位置特定のためのナビゲーションの2段階がある.これらの一本化には,患者の画像情報と実際の身体構造との位置合わせ(レジストレーション)の簡易化が求められた.レジストレーションへの影響は特に,手術中のベッド移動,患者個人ごとの体格の違いが大きい.そこで,次の2つのサブシステム,1)ベッドを動かしたときの位置ずれを補正するベッドマーカシステム,2)体表から骨格点を用いる際に患者の皮下組織厚を考慮した大局レジストレーションアルゴリズムを開発し,統合した.1)についてはベッド移動に対する追従実験を行ったところ,ドレープの上から固定しても位置計測誤差は0.1mm以下であり,十分な性能を満たした.2)については患者によって異なる皮下組織厚を補正し,骨格上の特徴点でレジストレーションを行った上で標的血管の位置推定するアルゴリズムを開発した.人体模型を対象に,骨格上のレジストレーション点として体表から3点(胸骨角,左前腸骨棘,恥骨稜)を選び,標的血管として体内の3点(左の肋間動脈起始部Th10,Th11,Th12)を特定する評価実験を行った.皮下組織厚に基づいた補正を行ったところ,全体誤差は補正前の8.3mmから5.3mm,方向別では左右方向が6.3mmから3.8mm,背腹方向で3.8mmから1.6mm,頭足方向で2.3mmから1.8mmとなった.これにより,皮下組織厚の補正で標的血管との位置関係が修正され,誤差の低減につながると考えられた.上記システムの統合で,体表から骨格上の点を計測し,体内の標的血管を特定するナビゲーションが構築された.肋間動脈のレベル同定は,頭足方向に5mm以下の誤差範囲である必要条件を満たす可能性が示唆された.
特発性門脈圧亢進症における遺伝子異常の検索

我々は、Altas cDNA micro alley法により数種類のIPH肝に特異的に発現する遺伝子群をピックアップし、その中で特にconnective tissuegrowthfactor (CTGF)に注目し検討を行ってきたIPH症例ではELISA法にて測定したCTGF値は健常コントロールやC型慢性肝疾患患者に比べ異常高値示す症例が存在し、CTGFが病態と関連している可能性があることを見出した。次に我々はプロテインチップを用い、IPHに特異的に発現するタンパク質の解析を行った。検体としてIPH患者5例、原発性胆汁性肝硬変(PBC)患者3例の血清を使用した。タンパク質の解析はサイファージェン・バイオシステムズ社製のプロテインチップシステムを用い行った。タンパク重量の解析にはserface-enhanced laser desorption Ionization (SELDI)-time of flying (TOF)型のチップリーダーを使用した。タンパク質の発現解析を行ったものの内IPHに特異的に発現していたのは陽イオン交換、pH6.0、変性条件での7770Daのタンパク質であった。その量は、IPH5例中4例で上昇していた。また、PBCに特異的に発現していたのは陽イオン交換、pH6.0、非変性条件で8935Daのタンパク質であった。その発現量はPBC3例全例で上昇していた。今回の症例ではIPHで全例一致したパターンを示したタンパク質はなく、そのことは本疾患が単一の病態を示すものでない可能性がある。単一のタンパクではなくクラスター解析などによりタンパクのパターンでみた方がよいのかもしれない。最終的にはカラムや電気泳動を用いて精製を行なう必要がある。また、精製されたタンパク質は分解産物の分子量を測定し、データベース上のタンパク質配列を用いて解析することにより同定する必要がある。Atlas cDNA Expression Arrays法を用いて健常人肝臓とIPH症例肝臓との比較にてIPH症例より特異的にCTGF遺伝子が得られた。その特異性を確認するために、患者血清を用い、血清中のCTGF量をELISA法を用いて測定した。コントロールとして、健常人血清と肝炎患者における線維化のステージ分類(F1-F4)で分けられた血清を用いた。CTGFは結合組織成長因子であり、CCNファミリーに属する遺伝子である。その主な働きは、線維芽細胞に対して走化作用や増殖促進作用を示すこと、また、線維化の過程でTGF-βの作用を仲介することが挙げられるIPH症例におけるCTGFと肝線維化との関連性であるが、CH症例と同様に線維化の一過程における病態との関わりだけなく、特筆すべきはIPH症例に異常高値例が存在することである。IPHを症候群としてみたとき、IPH病態を引き起こす首座としてCTGF関与の可能性が示唆される。また、IPHによく合併する強皮症でもCTGF高値が報告され、病因として注目されている。このことからもIPHの病態とCTGFの関与が強く示唆される。CTGFの線維化における機能解析を進めるにはトランスジェニックマウスの作成が必要となる。しかし、肺移植によるトランスジェニックマウスやノックアウトマウスの作成は発育・継代が困難であるため、アデノウイルスを用いた遺伝子導入法を検討した。発現ベクターとしてアデノウイルスを用いる利点として、1)高ウイルスを得る(10^810^9PFC/ml)ことができる、2)ヒトだけでなくマウスやラットを含む広い動物種に用いることができる、3)増殖細胞だけでなく静止期細胞にも感染・発現できる、4)動物個体に直接注入・投与可能であるなどの点があげられる。アデノウイルスは主として肝臓や神経に集まるため組み換えアデノウイルスを用いれば目的のタンパクを肝臓に発現させることが可能である。human CTGFのmRNAのアミノ酸配列は2075塩基から成っている。このCTGFのmRNAからcDNAを作製した。

アデノウイルスへの遺伝導入はAdenovirus Expression Vector Kit(Takara Biochemical)を用いて行った。作製したcDNAををコスミドベクターのE1領域に導入する。E1領域を制限酵素で切断し欠失させたアデノウイルスのゲノムDNA(DNA-TPC)とこのコスミドベクターをE1を恒常的に発現している293細胞にco-transfectionにより導入する。293細胞内で相同組み換えが起こり、組換えアデノウイルスが出現する。現在、組換えアデノウイルスの作製および精製ウイルスの調整まで終了している。今後、このウイルスを肝臓に感染させることにより、CTGFを発現させる予定である。我々はその検体を用いて、Atlas cDNA micro alley法により数種類のIPH肝に特異的に発現する遺伝子群をピックアップし、その中で特にconnective tissuegrowthfactor (CTGF)に注目し検討を行ってきた。^<2)>その結果、IPH症例ではELISA法にて測定したCTGF値は健常コントロールやC型慢性肝疾患患者に比べ異常高値示す症例が存在し、それら症例ではCTGFが病態と関連している可能性がある。近年、プロテインチップを用いた方法により検体中のタンパク質を直接検出することができるようになってきた。^<3)>今回、我々はプロテインチップを用い、IPHに特異的に発現するタンパク質の解析を行った。検体としてIPH患者5例、原発性胆汁性肝硬変(PBC)患者3例の血清を使用した。タンパク質の解析はサイファージェン・バイオシステムズ社製のプロテインチップシステムを用い行った。タンパク重量の解析にはserface-enhanced laser desorption Ionization (SELDI)-time of flying (TOF)型のチップリーダーを使用した。タンパク質の発現解析を行ったものの内IPHに特異的に発現していたのは陽イオン交換、pH6.0、変性条件での7770Daのタンパク質であった。その量は、IPH5例中4例で上昇していた。また、PBCに特異的に発現していたのは陽イオン交換、pH6.0、非変性条件で8935Daのタンパク質であった。その発現量はPBC3例全例で上昇していた。今回、対照として感染性の検体を用いることができないためPBC症例を用いたが、健常者の方が疾患の特徴が明確に現れるかもしれない。今回の症例ではIPHで全例一致したパターンを示したタンパク質はなく、そのことは本疾患が単一の病態を示すものでない可能性がある。そのためIPHの症例数を増やしてさらなる検討を加える必要がある。
ヒト肺腺癌の発癌初期に係わる発現遺伝子の網羅的解析

肺腺癌の前癌病変に相当するAtypical adenomatous hyperplasia(AAH)の不死化細胞株である+PL16Tと同じ症例の正常気管支上皮細胞から不死化した細胞株PL16Bからそれぞれttotal RNAを採取し、cDNA microarray法によりPL16TにPL16B細胞株にり高発現している2610個の遺伝子群を同定した。このいち上位20遺伝子についてPL16TとPL16Bでの実際の発現を定量的real time PCR法を用いて確認した。Sushi domain containing 2 (SUSD2)とNeuromedin U (NMU)がPL16TにおいてPL16Bよりも10倍以上高発現しているのが確認された。この結果からSUSD2とNMUの2つの遺伝子が腺癌の初期病変現している遺伝子である可能性が高いと考え、肺胞上皮癌(BAC) 7例、BAC成分を含む浸潤癌14例(野口分類Type C)、BAC成分を含まない浸潤癌3例(同Type D)の切除例についてその発現を確認した。SUSD2は正常肺組織よりもBACで有意に発現が上昇していた(p=0.043)。またBACでの発現が浸潤癌より有意に亢進していた(p<0.01)。NMUは正常組織からBAC-浸潤癌にかけて次第に変現が上昇し、正常肺組織よりもType Cで有意に発現が亢進していた(p=0.043)。しかし正常肺組織とType Dとの間では有意な発現亢進はみられなかった。この結果からSUSD2とNMUはBAC成分を持腺癌の上皮内癌または浸潤癌のマーカーである可能性が考えらられた。そこで2つの遺伝子発現が肺腺癌の予後因子となるかを検討するため、他病死を除く2cm以下の小型肺腺癌133例を用いて免疫染色と予後との関係を解析した。SUSD2では染色陽性率50%以上の症例は有意に予後良好であり(p=0.002)、NMUは陽性率50%以上の症例が有意に予後不良であった(p=0.017)。この結果より、SUSD2とNMUは小型肺腺癌の新たな予測因子であることが示された。今回の研究で予後良好を予測する因子と、予後不良を予測する因子の両方が同時に取られたことは極めて興味深く有意義なことであった。この他に高発現していた2608個の遺伝子群の中にも発癌や進展にかかわる遺伝子が多く含まれると考えられるので、AAH不死化細胞株での発現遺伝子の解析は肺癌の予防を含めた治療に大きく寄与するものと考えられた。今後はこの2遺伝子の解析能解析行っていくと同時に他の遺伝子群の中から新たな予後因子や発癌に関わる因子を解析すべく次年度の科学研究費に応募した肺腺癌の前癌病変に相当するAtypical adenomatous hyperplasia(AAH)の不死化細胞株である+PL16Tと同じ症例の正常気管支上皮細胞から不死化した細胞株PL16Bからそれぞれttotal RNAを採取し、cDNA microarray法によりPL16TにPL16B細胞株にり高発現している2610個の遺伝子群を同定した。

今後はこの2遺伝子の解析能解析行っていくと同時に他の遺伝子群の中から新たな予後因子や発癌に関わる因子を解析すべく次年度の科学研究費に応募した肺腺癌の前癌病変に相当するAtypical adenomatous hyperplasia(AAH)の不死化細胞株である+PL16Tと同じ症例の正常気管支上皮細胞から不死化した細胞株PL16Bからそれぞれtotal RNAを採取し、cDNA microarray法によりPL16TにPL16B細胞株より高発現している2610個の遺伝子群を同定した。このうち上位20遺伝子についてPL16TとPL16Bでの実際の発現を定量的real time PCR法を用いて確認した。Sushi domain containing 2(SUSD2)とNeuromedin U(NMU)がPL16TにおいてPL16Bよりも10倍以上高発現しているのが確認された。この結果からSUSD2とNMUの2つの遺伝子が腺癌の初期病変に関連している遺伝子である可能性が高いと考え、肺胞上皮癌(BAC)7例、BAC成分を含む浸潤癌14例(野口分類Type C)、BAC成分を含まない浸潤癌3例(同Type D)の切除例についてその発現を確認した。SUSD2は正常肺組織よりもBACで有意に発現が上昇していた(p=0.043)。またBACでの発現が浸潤癌より有意に亢進していた(p<0.01)。NMUは正常組織からBAC-浸潤癌にかけて次第に発現が上昇し、正常肺組織よりもType Cで有意に発現が亢進していた(p=0.043)。しかし正常肺組織とType Dとの間では有意な発現亢進はみられなかった。この結果からSUSD2とNMUはBAC成分を持つ腺癌の上皮内癌または浸潤癌のマーカーである可能性が考えられた。そこで2つの遺伝子発現が肺腺癌の予後因子となるかを検討するため、他病死を除く2cm以下の小型肺腺癌133例を用いて免疫染色と予後との関係を解析した。SUSD2では染色陽性率50%以上の症例は有意に予後良好であり(p=0.002)、NMUは陽性率50%以上の症例が有意に予後不良であった(p=0.017)。この結果より、SUSD2とNMUは小型肺腺癌の新たな予測因子であることが示された。今回の研究で予後良好を予測する因子と、予後不良を予測する因子の両方が同時に取られたことは極めて興味深く有意義なことであった。この他に高発現していた2608個の遺伝子群の中にも発癌や進展にかかわる遺伝子が多く含まれると考えられるので、AAH不死化細胞株での発現遺伝子の解析は肺癌の予防を含めた治療に大きく寄与するものと考えられた。今後はこの2遺伝子の機能解析を行っていくと同時に他の遺伝子群の中から新たな予後因子や発癌に関わる因子を解析すべく次年度の科学研究費に応募した。
液―液界面を識別するペプチド分子から発想する抗体ナノ操作

本研究では、液体界面を識別できるペプチドを用いて、あたかもリン脂質のような両親媒性分子を扱うかのように蛋白質分子をナノ操作できる技法を開発し、単なる蛋白質間相互作用だけに頼っていた蛋白質アセンブリ手法を拡張させ、蛋白質が均一配向したプロテインラングミュア単分子膜や超多価抗体クラスターの作製を行った。本研究では、液体界面を識別できるペプチドを用いて、あたかもリン脂質のような両親媒性分子を扱うかのように蛋白質分子をナノ操作できる技法を開発し、単なる蛋白質間相互作用だけに頼っていた蛋白質アセンブリ手法を拡張させ、抗体分子を例に、蛋白質が均一配向した超多価抗体クラスターを作製し、効果的ながん治療への応用を検討する。そのため、本年度は、昨年度作成した、無機ナノ粒子を内包した超多価抗体クラスターを用いて、がん細胞に対する細胞特異性の評価を行った。まず、フローサイトメトリーを用いてがん細胞に対する結合特異性を評価した。その結果、クラスターに用いている抗体単独と比較して細胞への結合力は向上していることが分かった。また、蛍光顕微鏡を用いて抗体クラスターの結合性も評価したところ、抗体単独と比較して洗浄操作でも抗体クラスターは細胞から解離しにくいことも分かった。次に、昨年度成功した抗体クラスター作製技術を用いて蛍光性有機性分子を内包することを行った。その結果、有機分子から貧溶媒化で有機結晶粒子を作製するプロセスと抗体クラスター作製プロセスを合わせることにより、疎水性の有機分子を抗体クラスター内へ内包させることができた。そこで、この抗体クラスターに関してもフローサイトメトリーと蛍光顕微鏡を用いてがん細胞への結合特異性評価を行ったところ、抗体単独よりもすぐれた結合性を持っていた。これより、抗体単独よりも抗がん剤などの疎水性有機分子をがん細胞へ特異的に運搬できるシステムを提案できた。(1)自在な価数を設計できる多価抗体クラスター化技術まず、水相がリッチな水ーイオン液体不均一溶液をエマルジョン化し、疎水性イオン液体親和性ペプチド融合抗体分子をクラスター化させるため、抗EGFR特異的ラクダ抗体の抗原認識断片であるVHH断片のC末端にリンカーを介してイオン液体親和性ペプチドを融合させて、大腸菌で発現を行った。その結果、不溶性画分として発現したので、グアニジン塩酸塩などで可溶化した後、段階透析法を用いて巻き戻した結果、多量体として調製された。しかし、CDスペクトルで二次構造を評価したところ、免疫グロブリン構造を形成しており、さらにフローサイトメトリーで結合活性評価を行ったところ、結合機能を有していた。このことから、イオン液体親和性ペプチドをラクダ抗体のC末端に融合し、巻き戻し操作をすることによって、多価抗体クラスターを調製することに成功した。(2)無機ナノ粒子を内包した超多価抗体クラスターの作製(1)で行った抗体分子のクラスター化手法の際に、疎水性イオン液体に可溶な疎水性の表面を持つセラミックスナノ粒子を疎水性イオン液体に加えて、(1)で行った巻き戻し操作を行った。その結果、抗体クラスター内にナノ粒子が導入されることが分かった。さらにこのナノ粒子内包抗体クラスターは、水と疎水性イオン液体の二相溶液に加えると界面付近でクラスター体が解離し、抗体が界面に単層膜を作製することが分かった。研究計画通りに、本年度において、抗体のクラスター化に成功し、さらにナノ粒子を内包することに成功したため。予定よりも障害無く目的抗体クラスターを作製することに成功したため、次年度使用研究費が発生した。次年度は、開発した抗体クラスターをがん治療に応用すべく、がん細胞に対する細胞特異性と細胞傷害性の評価を推進する。そのために、まず、疎水性イオン液体に溶解する蛍光分子,抗がん薬剤,がん殺傷ナノ粒子をスクリーニングする。そして、当該年度で開発したナノ粒子内包抗体クラスター技術を用いて、各々を別途、もしくは混合した状態で抗体クラスターに内包することを試みる。そして、各々内包した抗体クラスターをがん細胞と正常細胞の混合懸濁液に添加し、フローサイトメトリーや蛍光顕微鏡を用いて、抗体クラスターのがん細胞に対する細胞特異性を評価する。薬剤内包クラスターに関しては、細胞残存率をフローサイトメトリーにより評価する。次年度使用額は、今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額であり、平成25年度請求額とあわせ、平成25年度の研究遂行に使用する予定である。
心筋ミトコンドリア薬理学

心臓のポンプ機能にとって、その容積の30%を占めるミトコンドリアの関わりは極めて基本的である。ミトコンドリアは真核細胞と共生して、その内膜でATPなどのエネルギー通貨をH^+勾配を作って産生する一方、Ca^<2+>、Na^+イオンを介して、ミトコンドリア自体の機能を保持し、心筋収縮系に対する細胞質の環境を整える。この意味から、虚血心筋/再灌流障害の機能障害のメカニズムを知るには、ミトコンドリアのエネルギー通貨ATP,Pcrの生産と輸送をNMRで測定し、ミトコンドリア内pH,Ca^<2+>などの蛍光測定は、心筋の機能の情報と理解に重要である。また、近年、ミトコンドリアに働く薬物とそのレセプターが解明され、細胞内小器官の薬理学の研究が始まった。平成6年度には、MNR所見より急性虚血心筋の収縮脳は、細胞質内Ca^<2+>よりも、ミトコンドリアのエネルギー通貨ATP,CP,Pi,ADP産生比率により規定される自由エネルギー変化(-ΔG)が大きく影響することを明らかにした(H.6.10イタリー)。その後、更に、エネルギー転送機構のクレアチン憐酸CPシャトルとイオン動態と収縮能との密接な関係を示した(H.7.3名古屋薬理学会総会)平成7年度には、エネルギー産生/利用とH^+,電解質動態との連関が重要であるとの認識から、電解質のうち、ミトコンドリアのATP産生の元となるプロトンと他の電解質Na^+,K^+,Ca^<2+>との交換系に注目して研究を行った。これら電解質とH^+との交換系は心筋細胞膜とミトコンドリア内膜にあるので、この部位を区別するべく、単離ミトコンドリアをポリリジンに固着させてその表面を灌流し、顕微鏡下に主要イオンH^+,Ca^<2+>を蛍光測定し、イオン輸送の交換阻害があると思われる物質(ELPA,omeprasol)や、Na^+,K^+などの添加条件について検討した。この結果、ミトコンドリア内膜には、H^+-Na^+交換系のみならず、H^+-K^+交換系が存在することが明らかとなり、ミトコンドリア内pHは、Na^+,K^+,Ca^<2+>との関係に於いて変化した。また、ミトコンドリアは高濃度処理後の生理濃度Ca^<2+>やpHの酸性化で急上昇し、虚血/再灌流障害をミトコンドリアレベルで説明する知見を得た。また、心筋の前負荷変化にミトコンドリアのエネルギー産生との電解質輸送が大きく変化するとの結果を得て、機械的な伸展が電解質およびエネルギー代謝にカップルするとの結論に達した(H.8.3.,長崎,69回薬理学会総会)。