hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
動物実験によるβ3インテグリン組み換え型培養表皮の有効性の検証

われわれはβ3インテグリン組み換え型培養表皮の有効性を動物実験により検証した.β3インテグリン遺伝子導入ヒトケラチノサイトをレトロウイルスベクター法により作製した.Cell sortingによりβ3陽性細胞を増加させ(89%),フィブリンゲル上で5日間培養して培養表皮を作製した.ヌードマウスの創傷治癒遅延モデル(マイトマイシンC外用により作製)での全層皮膚欠損創に同培養表皮を移植し(コントロール培養表皮:β-galactosidase cDNA導入ヒトケラチノサイトを使用),経時的(1,2,3週)に組織学的検査を行った.その結果,β3インテグリン組み換え型培養表皮は,13週のすべての時期においてコントロール培養表皮に比べて軽度から中等度に生着率が増加した.同培養表皮のin vivoでの有効性を結論づけるために今後さらに実験条件を改善して検討する予定である.われわれはβ3インテグリン組み換え型培養表皮の有効性を動物実験により検証した.β3インテグリン遺伝子導入ヒトケラチノサイトをレトロウイルスベクター法により作製した.Cell sortingによりβ3陽性細胞を増加させ(89%),フィブリンゲル上で5日間培養して培養表皮を作製した.ヌードマウスの創傷治癒遅延モデル(マイトマイシンC外用により作製)での全層皮膚欠損創に同培養表皮を移植し(コントロール培養表皮:β-galactosidase cDNA導入ヒトケラチノサイトを使用),経時的(1,2,3週)に組織学的検査を行った.その結果,β3インテグリン組み換え型培養表皮は,13週のすべての時期においてコントロール培養表皮に比べて軽度から中等度に生着率が増加した.同培養表皮のin vivoでの有効性を結論づけるために今後さらに実験条件を改善して検討する予定である.1. β3インテグリン・サブユニットcDNA導入ヒトケラチノサイトを作製した.レトロウイルスベクター法によりβ3インテグリン・サブユニットcDNAを正常ヒトケラチノサイトに導入した.具体的には,高力価β3-組み換えレトロウイルスのproducer cells(米国ですでにクローニングをし,凍結保存してある)を培養し,その上清中のβ3-組み換えレトロウイルスを正常ヒトケラチノサイト(Cascade社)に感染させた.培地はEpiLife+growthfactor(Cascade社)を用いた.Subconfluentの状態で同ケラチノサイトを凍結保存した.凍結保存したケラチノサイトを培養して,αvβ3の蛋白発現を蛍光抗体法ならびにFACSにより確認した後,cell sortingによりαvβ3発現陽性細胞のenrichmentを行った.そしてそれらをさらに増殖させた後,再び凍結保存した.平均84%のαvβ3発現陽性率を得た.コントロール細胞として,同様方法によりβ-galactosidase cDNA導入ヒトケラチノサイトを作製した.2. I型コラーゲン膜を使用してβ3インテグリン組み換え型培養表皮を作製した.市販のI型コラーゲン膜上でβ3インテグリン・サブユニットcDNA導入ヒトケラチノサイト(コントロール細胞として,β-galactosidase cDNA導入ヒトケラチノサイトを用いた)を培養して培養表皮を作製した.I型コラーゲン膜として,豚由来コラーゲン膜(ペルナック^<[○!R]>)と細胞培養用透過性コラーゲン膜(AteloCell^<[○!R]>)とを比較した.その結果,AteloCell^<[○!R]>のほうが正確な細胞数を使用でき,均一な培養表皮を作製することができた.本研究の目的は,種々の難治性の創傷部にも生着率の高い培養表皮を分子生物学的手法を用いて開発することである.平成21年度には,(1)ヌードマウスを用いて創傷治癒遅延モデルを作製した.急性創傷モデルでは,創傷治癒経過が早いため,β3インテグリン組み換え型培養表皮とコントロール培養表皮との間に効果の差を生じにくいことが予想されたからである.免疫不全マウス(ヌードマウス)を実験動物として用い,ストレプトゾトシン投与により糖尿病モデルマウスを作製する方法ならびにマイトマイシンC外用による方法とを検討した.その結果,マイトマイシンC外用による方法のほうが,確実に創傷治癒遅延モデルを作製することができ,また簡便であった.(2)ヌードマウスでの創傷治癒遅延モデル(マイトマイシンC外用により作製)においてβ3インテグリン組み換え型培養表皮の有効性を検証した.その予備実験として,ヌードマウスの背部に1.5cm四方の全層皮膚欠損創を作製し,培養表皮を移植する方法,またシリコンチャンバー内に培養表皮を移植する方法について検討した.培養表皮作製は,昨年度の結果から,I型コラーゲン膜(AteloCell^<[○!R]>)を使用する方法を採用した.その結果,シリコンチャンバー内に培養表皮を移植し,4日目前後にシリコンチャンバーを除去する方法が最も適していると判定できた.ヌードマウスでの創傷治癒遅延モデルにおいてβ3インテグリン組み換え型培養表皮の生着率向上効果について検証した.ヌードマウスでの創傷治癒遅延モデルとして,平成21年度の検索結果からマイトマイシンC外用による方法を採用した.すなわち,ヌードマウスの背部皮膚にfull-thickness woundsを2箇所ずつ作製し,皮下にシリコンチャンバー(lower chamber,直径11mm)を装着後,マイトマイシンC溶液(0.5mg/

ml濃度,0.2-0.3ml)をガーゼに含浸させたものを5分間,潰瘍部に適用した.PBSで洗浄後,培養表皮を移植した.培養表皮は,β3インテグリン遺伝子導入ヒトケラチノサイト(cell sortingによりβ3陽性率89%)を使用し(コントロール細胞としてβ-galactosidase cDNA導入ヒトケラチノサイトを使用),フィブリンゲル上で5日間培養して作製した.培養表皮移植片は,生検トレパン(直径8mm)で切除し,潰瘍部に30分間静置した後,ソフラチュール,培地を含浸させた創傷被覆材を重層し,シリコンチャンバー(upper chamber)をかぶせ,2針皮膚を含めて縫合,テープ貼付により固定した.培養表皮の生着率向上効果は経時的(1,2,3,4週後)な組織学的検査により調べた.また,マイトマイシンC無処置(MMC処置-)のマウスでも同様の実験を行った.その結果,β3インテグリン組み換え型培養表皮は,14週後のすべての時期においてコントロール培養表皮に比べて軽度から中等度に生着率が増加した(MMC処置+<MMC処置-).しかし,現時点では同組み換え型培養表皮の動物実験での有効性を結論づけるにはデータが不十分である.今後さらに実験条件を改善すると同時に実験数を増加して検討する予定である.
唐代を中心とする中国裁判制度の基礎的研究

本研究課題は,滋賀秀三氏による唐律疏議現代語訳の試みを継承し,唐断獄律の現代語訳を作成するとともに,そこから得られた唐代裁判制度に関する知見を各研究分担者が専門とする時代の裁判制度と比較検討することを通じて,唐代裁判制度の再検討を試みるものである。4年間に及ぶ研究活動の結果、断獄律全34条の翻訳を完了し公表するとともに、断獄律16条の立法趣旨や断獄律20条に見える「比附」の性格など、唐代裁判制度をめぐるいくつかの重要な問題を明らかにすることができた。本年度は、唐代を中心とする前近代中国裁判制度の特徴を再考するための基礎的な作業として、唐断獄律の1条から12条までの条文およびその註釈を翻訳し、年4回の研究会を通じて検討を重ねることを予定していたが、ほぼ計画通りに研究を進めることができた。各研究会の開催日時・場所および概要は以下のとおりである。【第1回研究会】平成22年7月11日(大阪):唐断獄律1条(囚人の拘束方法に関する規定)・2条(脱獄幇助の罪)・3条(死刑囚からの嘱託殺人罪)の翻訳検討および意見交換を行った。【第2回研究会】平成22年9月19日(大阪):4条(自供翻意の教唆に関する罪)・5条(支給品不提供による囚人の虐待に関する罪)・6条(拷問免除者に対する立証方法に関する規定〉の翻訳検討および意見交換を行った。【第3回研究会】平成22年10月30日(金沢):7条(共犯者捏造に関する罪)・8条(拷問手続きに関する規定)・9条(拷問回数の限度に関する規定)の翻訳検討および意見交換を行った。【第4回研究会】平成23年2月13日(大阪):10条(拷問に服さなかった場合の手続)・11条(他所にいる共犯者の喚問手続)・12条(告状に基づかない取調べの禁止規定)の翻訳検討および意見交換を行った。なお、今年度予定されていた唐代研究者からの聞き取り調査は、日程の調整がつかず、実施することができなかった。本年度も前年度に引き続き、唐代を中心とする前近代中国裁判制度の特徴を再考するための基礎的な作業として、唐断獄律の13条から22条までの条文およびその註釈を翻訳し、年4回の研究会を通じて検討を重ねることを予定していたが、ほぼ計画通りに研究を進めることができた。【第1回研究会】平成23年7月9日(大阪):唐断獄律13条(囚人の拘束方法に関する規定)・14条(脱獄討助の罪)・15条(死刑囚からの嘱託殺人罪)の翻訳検討および意見交換を行った。【第2回研究会】平成23年10月29日(金沢):16条(自供翻意の教唆に関する罪)・17条(支給品不提供による囚人の虐待に関する罪)・18条(拷問免除者に対する立証方法に関する規定)の翻訳検討および意見交換を行った。【第3回研究会】平成24年1月18日(大阪):19条(共犯者捏造に関する罪)の翻訳検討および意見交換を行った。【第4回研究会】平成24年3月15日(大阪):20条(拷問に服さなかった場合の手続)・21条(他所にいる共犯者の喚問手続)・22条(告状に基づかない取調べの禁止規定)の翻訳検討および意見交換を行った。なお、これまでの研究活動の中間まとめとして、断獄律の前半部分(『唐律疏議』巻29断獄上、1条14条まで)の訳註を『金沢法学』55巻1号に掲載する予定である。本年度は本研究課題の最終年度として、前年度に終了することができなかった唐断獄律32条34条の翻訳作業を継続して遂行すると同時に、これまでの研究活動の総まとめとして各分担者の個別研究成果を発表し、研究会メンバー全員での検討を行うため、年3回程度の研究会を実施することを予定していたが、ほぼ計画通りに研究を進めることができた。【第1回研究会】平成25年6月23日(大阪):唐断獄律32条(徒役の執行違反に関する規定)・33条(逃亡中の死罪囚の捕縛の際の報告義務に関する規定)の翻訳原案を中村が作成し、全員で検討および意見交換を行った。【第2回研究会】平成25年10月26日(金沢):唐断獄律34条(疑罪に関する規定)の翻訳原案を中村が作成し、全員で検討および意見交換を行った。

また、川村・七野両氏が個別研究(川村康「律疏比附箚記ー断獄律20条の比附は特殊かー」・七野敏光「唐断獄律『断罪引律令』条とその周辺」)を報告し、メンバー全員で検討を行った。【第3回研究会】平成26年1月12日(大阪):研究成果報告書『唐代を中心とする中国裁判制度の基礎的研究』(自費出版)の内容検討および研究活動全体の総括、ならびに次年度以降の研究活動の継続計画について議論した。また、これまで4年間の研究活動の締めくくりとして、平成26年3月15日に科学研究費補助金研究成果報告書を作成し、関係方面に配布した。本年度も前年度に引き続き、唐代を中心とする前近代中国裁判制度の特徴を再考するための基礎的な作業として、唐断獄律の23条から34条までの条文およびその註釈を翻訳し、年4回の研究会を通じて検討を重ねることを予定していたが、事情により研究会の開催は3回に止まり、そのため断獄律31条までしか検討を終えることができなかった。本年度中に作業を終えることができなかった残りの3条の翻訳・検討については、次年度に引き続き行う予定である。その他にこれまでの研究活動の中間まとめとして、断獄律の前半部分(『唐律疏議』巻29断獄上、1条14条まで)の訳註を『金沢法学』55巻1号に掲載した。なお、各研究会の開催日時・場所および概要は以下のとおりである。【第1回研究会】平成24年7月7日(大阪):唐断獄律23条(誤った没官の適用に関する規定)・24条(徒流罪の執行の遅延に関する罪)・25条(贖罪金・没収品等の納入の遅延に関する罪)・26条(妊娠中の女性に対する死刑執行に関する規定)の翻訳検討および意見交換を行った。【第2回研究会】平成25年1月13日(大阪):27条(妊娠中の女性に対する笞杖刑の執行および拷問の実施に関する規定)・28条(死刑執行時期の制限に関する罪)・29条(死刑覆奏制度の違反に関する規定)の翻訳検討および意見交換を行った。【第3回研究会】平成25年3月3日(大阪):30条(誤った贖罪金の徴収に関する規定)・31条(死刑執行方法の違反に関する規定)の翻訳検討および意見交換を行った。年4回の研究会を開催し、断獄律22条までの翻訳検討を終了し、さらには断獄律1条から14条までの翻訳の公表を準備する等、申請時の研究計画をほぼ予定通りに遂行しているため。25年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画では、本年度に年4回の研究会を開催し、断獄律の翻訳作業をすべて終了することとなっていたが、研究会の開催回数が3回に止まり、断獄律32条から34条までの3条文の翻訳作業が終了しなかったため。ただし、当初計画の段階から、翻訳作業が遅れる可能性を見越して、最終年度に当たる平成25年度は若干余裕を持たせたスケジュールとなっているため、最終的に研究計画の遅れを取り戻すことは十分に可能であると見込まれる。基本的には当初の計画通り、年4回の研究会を通じて、唐・断獄律の翻訳作業を継続していくが、唐代の裁判制度を研究する上では、やはり唐・獄官令の検討も必要になってくることが予想される。予定では断獄律の翻訳作業は平成24年度中に完了するため、その後に研究期間の延長も視野に入れて獄官令の翻訳作業を新たに開始するか否かを検討したいと考えている。基本的には当初の計画通り、今年度は本研究課題の最終年度として研究のまとめ作業を行い、年34回の研究会において各自の個別研究課題の報告を行い、年度末に予定される報告書作成のための準備を進める。ただし、断獄律の翻訳作業が当初見込みよりも若干遅れたため、こちらの作業も並行して進める予定である。
ホルモン依存性細胞増殖、分化及び細胞死に関与する新しい因子の検索

ラット卵巣から、コラゲナーゼ処理によって2-3層の顆粒膜細胞を有する卵胞を単離し、2%血清存在下に浮遊状態で培養を行った。培養後、卵胞の組織切片を作成し顕微鏡下で卵胞の形態および大きさの変化、さらに顆粒膜細胞のAppoptosisの有無を定量的に測定し、細胞増殖、分化、細胞死それぞれの活性の指標とする。DESを投与したラット1000匹から卵巣を集め、DES刺激した卵巣の抽出物を得た。この抽出物中には、顆粒膜細胞に対する増殖因子および細胞死因子が高濃度に含まれていた。またPMSGを投与したラット1000匹からも卵巣を集め、PMSG刺激した卵巣の抽出物を得た。これらの抽出物中より顆粒膜細胞に対する増殖因子、分化因子、細胞死因子をそれぞれ上記のアッセイシステムを用いて精製を試みた。まず抽出液をDEAEおよびCM-Sepharoseによるイオン交換クロマトグラフィーにより分画し、さらにゲル濾過、Hysrophobicクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーにより精製した。高速液体クロマトグラフィーによって、最終的に精製された標品を得た。精製された標品をアミノ酸シークエンサーで分析し、部分アミノ酸配列を決定した。決定されたアミノ酸配列の情報をもとにオリゴヌクレオチドプローブを合成し、卵巣のcDNAライブラリーから、これら増殖、分化、細胞死の各因子のcDNAをクローニングすることを現在試みている。得られたcDNAの塩基配列をDNAシークエンサーを利用して決定し、各因子の構造を明らかにしたい。さらにこれらのcDNAを発現ベクターに組み込み、動物細胞で発現させ、これらの因子の作用機構の解明に利用して行きたい。
腫瘍マーカーによる治療と診断

1.腫瘍マーカーに対するモノクローナル抗体と制癌剤との複合体による標的療法-腫瘍マーカーとしてα-フェトプロテイン(AFP),癌胎児性抗原(CEA),トランスフェリン(T)が用いられ制癌剤としてはアドリアマイシン(Adr)ダウノマイシン(Dau)マイトマイシンC(MMC)ネオカルシノスタチン(NCS)をデキストラン(Dex)ポリLグルタミン酸(PLGA)血清アルブミン(Alb)を中間支持体として複合体をつくり標的腫瘍に対する制癌効果をラットおよびヒトの腫瘍で検討された。種々の対照群に比べ複合体が顕著な抗癌効果を示した。その作用機序を調べたところ複合体は腫瘍細胞へエンドサイトーシスによりそのまま取り込まれた後リソゾームで酵素または低PHにより結合が切られた後活性型遊離制癌剤が核に作用することが確認された。2.腫瘍マーカーによる癌の診断-CEAおよびγ-グルタミルトランスペプチダーゼ(γGTP)に対するモノクローナル抗体により腫瘍の示す表現型の多様性が浮彫にされた。肺癌関連抗原に対するモノクローナル抗体が検討され96Kdの糖蛋白質を認識していることが示された。AFPのレンズ豆レクチン(LCH)結合性亜種の割合を肝細胞癌と肝硬変症例で比較したところ肝硬変合併症肝細胞癌36例ではLCH結合性亜種31.1±23.6%,肝硬変23例では7.0±7.8%で前者が有意の高値を示した。肝硬変より肝癌を併発した11例で肝細胞癌と診断される3年前の追跡例で7例中全例共に1年前では11例中10例にAFPのLCH結合性亜種が認められ経時的に増加する傾向が認められた。このようにAFPのLCH結合性亜種の測定は肝細胞癌併発の早期発見に有用と思われた。ras遺伝子産物P21に対するモノクローナル抗体によるヒト大腸癌におけるP21の発現が検討された。反応陽性細胞率は大腸癌組織では30%をcut off値とすると72%前癌病変とされる腺腫性ポリープでは58.3%でいずれも正常大腸よりも有意に高率であった。腺癌に関連するモノクローナル抗体と共に更に検討を続行中である。
赤外3色カメラによる銀河アトラスの作成

2001年5月にIRSF/SIRIUSで観測した巨大電波楕円銀河PKS1343-601周囲30'×30'領域のデータ解析を行った。その結果、少なくとも20個の銀河候補を発見した。このうち、中心に位置するPKS1343-601以外はこれまでに知られておらず、本研究による新しい発見である。また、このうちの4つ(PKS1343-601を含む)はKsバンド(2.2μm)20mag/arcsec^2の表面輝度までの長軸直径が30"を超える大きな銀河であった。さらに、そのうちの1つは比較的強い未同定X線源2E1344-6022と位置が一致している。さらにPKS1343-601領域と銀河密度を比較するために、参照領域の観測を行った。参照領域はグレートアトラクター領域内で、PKS1343-601と同銀緯で銀河面による吸収がほぼ同じと考えられる2領域を設定した。観測面積は2領域合わせて、PKS1343-601領域の3分の1である。参照領域からは長軸直径が30"を超える大きな銀河は見つからなかった。これらのデータをもとに、PKS1343-601領域の銀河集中度およびグレートアトラクターへの寄与についての論文(仮題:Deep infraed survey around giant radio galaxy PKS1343-601)を執筆するための準備をすすめている。
希土類元素の生体影響

液晶テレビや携帯電話, CD等に広く用いられている希土類元素の生体への影響に関する研究を行った。微生物では希土類元素存在下で特異な増殖を示す希土類元素応答菌として,セリウム応答菌1株,ユウロピウム応答菌3株およびスカンジウム応答菌1株の計5株を分離し,それらの培養特性等を明らかにした。また,マウスに様々な形態の希土類化合物を静脈内注射,経口および吸入曝露により投与した結果,希土類化合物の種類,形態および投与量により各臓器への取り込み量と蓄積性が異なることを認めた。先端産業分野で広く用いられ、また医療分野でもMRIおよびその造影剤として使用されている希土類元素の生体影響を明らかにするために,環境変化に敏感に応答する微生物と実験動物を用いた希土類元素の投与実験を行った。I.微生物については, 1)Sc存在下でFusarium solani SC-2株により生産される赤紫色色素を単離し機器分析を行ったところ,キノンを母核とする構造を有しているものことが推定された。2)Ce存在下で特異的にラムナンを生産するBradyrhizobiumsp. CE-3株についてプロテオーム解析を行ったところ, Ce存在下で顕著に増加したタンパク質が見出され,このたんぱく質がメタノール脱水素酵素の大サブユニット様タンパク質に高い相同性を有することを認めた。さらに本菌株がメタノール脱水素酵素を有していることを示すことができた。(3)Methylobacterium sp. EU-1株のメタノール脱水素酵素がLaやCeの添加により著しく上昇することおよび本酵素の基本的な特性を明らかにした。これらの研究は希土類元素の生物学的意義を解明するうえで極めて貴重な知見を与えるものである。II.マウスに対する影響については, Sm_3O_2微粒子の投与実験が行われた。吸入暴露実験では1週間暴露で肺におよそ50μg/g, 4週間暴露で120μg/gが取り込まれたが, 1年後には前者で1/100程度に,また後者では1/4程度に低減することが分かり,暴露量(期間)によって低減経過に違いが見られた。他の臓器のSm濃度は肝>腎>脾>精巣の順で, 1年後における低減量は臓器により異なることが明らかになった。これらの結果は,高Sm濃度短時間暴露時におけるSmの肺への取込みと排出に関し,貴重な情報を提供している。農学
カーボンクロス担持触媒を用いた高エネルギー密度のガスハイドレート蓄電装置の研究

ガスハイドレートの生成速度に活性を示す酸化鉄ーグラファイト系の触媒を高分散化して、微細構造の大きな表面積を持つカーボンクロスに担持させることで、3相界面(ガス、液体、触媒)の接触確率を制御した。カーボンクロス担持触媒を、ガスハイドレートの熱サイクル試験に適用して、大幅なガスハイドレートの生成速度の23倍の増加に成功した。この結果、今後は自然エネルギー及び小温度差などで駆動する新しいがスライドレート蓄電システムへつながることが予想される。研究課題は、a.ガスハイドレート(GHR)のメモリ効果の評価、b.GHRの効率的な生成に要する核の利用、c.ガス・液体・触媒の接触確率の改善、d.GHRによる熱サイクルの評価、e.蓄電システムの設計からなる。平成23年度は上に述べたa.からc.を重点的に実施し、特にガス・液体・触媒の接触確率を改善するために、酸化鉄-グラファイト系触媒によるカーボンクロス担時触媒を作成して、接触面積の拡大に取り組み、以下を実施した。(1)ガスハイドレート(GHR)の効率的な生成に要する核の利用:GHRの生成速度に活性を示すと考えられる、数十から数百μmの粒系の触媒をGHRの材料である液体に混入して、ガスハイドレート(GHR)の効率的な生成に要する核の利用を試みた。また、触媒の効果については活性の劣化についても評価した。(2)ガス、液体、触媒の接触確率の改善:触媒のサンプルをカーボンクロスに担時することで、接触面積の大幅な拡大を試みた。そこで、カーボンクロスへの触媒の担持はホットプレスで行い、ガス、液、触媒の接触確率が最も高いカーボンクロス及び触媒の仕様と、ホットプレスの温度、プレス圧、バインダなどの条件を繰り返し調査した。カーボンクロスは、繊維の太さ、密度、気孔率、厚さなどで性質が大きく異なるため、本研究では実験計画法を導入してGHRの熱サイクルの評価を行い、最適なカーボンクロスの仕様を調査した。(3)ガスハイドレートによる熱サイクルの評価:低温熱源によるGHRの生成過程と高温熱源によるGHRの解離膨張過程を繰り返し実施して、熱サイクルの面積の変化を評価する装置の準備を行った。熱サイクルの評価では、GHRの状態図に基づいて、できるだけ広い温度と圧力の領域を扱うように試験装置の仕様を調製した。ガスハイドレート(以下にGHRと述べる)は,直接燃焼のほかに、ガス燃料の輸送やCO2の海底貯蔵などの分野で利用が検討されている(例えばXuemei Lang, et al, Journal of Natural Gas Chemistry, 19(3), 2010)。さらに,冷熱貯蔵の検討(例えばYingming X, et al., AppliedEnergy, 87(11), 2010),CO2の固定に用いる検討(例えばAudun A., AppliedEnergy, 86(6), 2008)が調査されている。しかしながらGHRの特異な状態変化を利用して、小温度差で駆動する蓄電システムを構築した例はこれまでにない。一方、限られた時間にエネルギー密度を増加させるには、ガスハイドレート生成速度の向上を要する。そこで、ガス、液、触媒の3相界面の接触確率を大幅に増加させて、効率的にGHRを生成する工夫を加えることにより、高エネルギー密度の蓄電装置に発展させる着想に至った。3相界面の接触面積の増加については、応募者が過去に行った、固体高分子膜形燃料電池のガス拡散層と触媒分散の技術から着想に至った。本プロジェクトではGHRの生成に活性を示す酸化鉄-グラファイト系触媒を、高分散化してカーボンクロスに担持させ、水、ガス、触媒の接触面積を増加させる。CO2及びCH4などの炭化水素によるGHRについて、カーボンクロス担持触媒を用いたGHRの生成試験を実施して、GHR発電システムの蓄電量を明らかにすることを目的として、以下について明らかにした。GHR生成反応の律速条件と考えられる、ガス、液体、触媒の接触確率を操作することで、飛躍的な生成速度の増加を試みるのに、過去にない「カーボンクロス担持触媒をGHRの生成に適用」したことで、攪拌機による電力消費なしに効率10%の発電の目途をつけた。平成26年度実施予定の「ガスハイドレートによる熱サイクルの評価」については、装置の仕様設計と備品が揃うのに時間がかかり、実験設備の準備を行うにとどまった。実験は平成27年度への持越しとなった。エネルギーシステム繰り返し実験を行って仮説を立証する。実験の実施担当者が、個人的な都合で継続した実験を行うことができなかった。実験担当者を増員するなどして、数ヶ月の遅れを取り戻す。
複合荷電膜を用いたイオン素子とイオン回路の作成

高分子の負荷電層(N層)と正荷電層(P層)が膜厚方向に積層したメンブレンダイオードイオン素子は電位差駆動系において半導体ダイオードと類似な整流作用を示すだけでなく、濃度差駆動系ではイオン素子に特有なイオン流特性を示すことが予想されている。本研究では電解質濃度差が存在する実験系においてこのイオン素子に発生する電位差、イオンコンダクタンスとイオン濃度との関係を検討した。N層、P層中のキャリヤ-濃度が異なる3種類のメンブレンダイオードイオン素子はポリビニルアルコールに種々の分率でポリスチレンスルホン酸ナトリウムまたはポリアリルアミンをブレンドして作製した。これらのイオン素子の両端のKCl、CaCl_2電解質濃度を変化させてイオン素子に発生する電位差、及びイオン流を自作した作動ポテンシャル測定装置を用いて測定した。その結果、KCl等の1-1型電解質濃度差駆動系におけるイオン素子に発生する電位はイオン濃度勾配に対するPN結合の方向により異なり、N層が高濃度側となる回路では濃度勾配と電位勾配が同方向となったが、P層を高濃度側に配置すると逆向きとなった。2-1型電解質電解質濃度差駆動系では発生電位のPN結合方向性だけでなく、荷電層の固定キャリヤ-濃度が電解質溶液濃度の約1/10の値となる場合に発生電位のピークが観測された。これは両荷電層/溶液界面における界面電位が移動キャリヤ-の価数に比例することに起因する現象であることが両荷電層の界面電位測定から判明した。また2-1型電解質系における濃度差-イオン流特性においてP層が高濃度側となる回路のイオン流がP層が低濃度側である回路より大きな値を示し、電解質濃度差駆動系において整流作用が観測された。この整流作用は膜キャリヤ-濃度が電解質溶液濃度の約1/10のところで最大値をとり、またP層に対するN層のキャリヤ-濃度比が大きいほど高い価を示した。
グルタミン酸レセプターイオンチャンネル蛋白の化学選択性の新しい評価法の創案

(i)ラット脳より単離したGluR蛋白分子を平面脂質二分子膜に包埋した膜系において、GluR分子がアゴニストを認識して透過させるイオンの総量(クーロン数:電流値×時間)を指標にNMDAサブタイプのGluRに対するアゴニスト間の選択性を評価する新しい方法を提案した.ラット全脳より単離したGluRを脂質二分子膜中に複数個包埋したマルチチャンネルセンサーを用い,典型的アゴニストN-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA),L-グルタミン酸,L-2-(カルボキシシクロプロピル)グリシン(L-CCG-IV)間の選択性を総イオン透過量の大きさに基づいて評価した.得られた選択性はアゴニストとGluRとの結合能の比と比較して,著しく縮まっていることを見出した.(Biosensors&Bioelectronics).(ii)NMDAレセプター分子種のうちε1/ζ1分子種のみを発現したCHO(chinese hamster ovary)細胞から単離したε1/ζ1NMDAレセプター分子一個を平面脂質二分子膜中に包埋し,総イオン透過量に基づいてアゴニスト選択性を評価した.ε1/ζ1分子種1分子が示した1秒間当たりの総イオン透過量は,異なる膜間においてもよい一致を示し,ε1/ζ1分子種に固有の値としてのアゴニスト選択性を定められることを見出した.(投稿中).(iii)GluR(ラット脳より抽出)を包埋したリポソームから放出されるCa^<2+>イオンを薄層ポテンシオメトリーで検出し,Ca^<2+>透過量に基づいてアゴニスト選択性を透過イオン特異的に評価した.その結果,上記3種のアゴニスト間の選択性は(i)の場合と同様に,結合能に比べて著しく縮まっていた.(投稿中).(iv)Ca^<2+>蛍光指示薬(fura-2)を用いてリポソーム内へのCa^<2+>流入量に基づいてアゴニスト選択性を評価することを検討した.これまでに,fura-2導入条件の最適化を行い,fura-2を再現性良くリポソーム内へ導入できることを確認した.今後は,アゴニスト刺激に伴うCa^<2+>流入量に基づくアゴニスト選択性の定量的評価法の確立を行うことが必要である.(i)ラット脳より単離したGluR蛋白分子を平面脂質二分子膜に包埋した膜系において、GluR分子がアゴニストを認識して透過させるイオンの総量(クーロン数:電流値×時間)を指標にNMDAサブタイプのGluRに対するアゴニスト間の選択性を評価する新しい方法を提案した.ラット全脳より単離したGluRを脂質二分子膜中に複数個包埋したマルチチャンネルセンサーを用い,典型的アゴニストN-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA),L-グルタミン酸,L-2-(カルボキシシクロプロピル)グリシン(L-CCG-IV)間の選択性を総イオン透過量の大きさに基づいて評価した.得られた選択性はアゴニストとGluRとの結合能の比と比較して,著しく縮まっていることを見出した.(Biosensors&Bioelectronics).(ii)NMDAレセプター分子種のうちε1/ζ1分子種のみを発現したCHO(chinese hamster ovary)細胞から単離したε1/ζ1NMDAレセプター分子一個を平面脂質二分子膜中に包埋し,総イオン透過量に基づいてアゴニスト選択性を評価した.ε1/ζ1分子種1分子が示した1秒間当たりの総イオン透過量は,異なる膜間においてもよい一致を示し,ε1/ζ1分子種に固有の値としてのアゴニスト選択性を定められることを見出した.(投稿中).(iii)GluR(ラット脳より抽出)を包埋したリポソームから放出されるCa^<2+>イオンを薄層ポテンシオメトリーで検出し,Ca^<2+>透過量に基づいてアゴニスト選択性を透過イオン特異的に評価した.その結果,上記3種のアゴニスト間の選択性は(i)の場合と同様に,結合能に比べて著しく縮まっていた.(投稿中).(iv)Ca^<2+>蛍光指示薬(fura-2)を用いてリポソーム内へのCa^<2+>流入量に基づいてアゴニスト選択性を評価することを検討した.これまでに,fura-2導入条件の最適化を行い,fura-2を再現性良くリポソーム内へ導入できることを確認した.今後は,アゴニスト刺激に伴うCa^<2+>流入量に基づくアゴニスト選択性の定量的評価法の確立を行うことが必要である.
細胞生物学的手法による内リンパ水腫発症の病因解析

メニエール氏病、変動する低音部感音性難聴の病態として古くより、内リンパ水腫が考えられてきたが、その成因については、明確な回答は得られていない。今回我々は,内リンパ嚢上皮に存在する37kdaの抗原に対する計3種のモノクローナル抗体を作製した。これらは、内リンパ嚢の中間部遠位部の上皮細胞表面に認められ、電子顕微鏡レベルでは、いわゆる暗細胞、明細胞両者に反応がみられた。このうち2種の抗体は腎近位尿細管と交叉抗原性がみられた。水分、イオンの吸収という代謝の活発な近位尿細管に交差性がみられたことは、内リンパ嚢の機能を考える上で興味深く、現在近位尿細管のin vitroの実験系で、モノクローナル抗体のepitopeが機能を有するか検討中である。一方、カテコールアミンの静脈内投与により、内リンパ嚢内電位の変化が生じることが知られていたが、今回の検討により、モルモット内リンパ嚢内の交感神経分布が、電子顕微鏡レベルで明らかにされた。S状静脈洞に沿って、内リンパ嚢遠位部に達した交感神経は中間部に密かに分布し、近位部までのびるか、内リンパ管には分布せず内耳の交感神経との交通はみられなかった。この交感神経は血管周囲に分布する他、上皮近くにも分布し内リンパ嚢の機能に関係していることが予想された。これら内リンパ嚢上皮の近位尿細管と交差する抗原の機能と神経制御が如何に内リンパ水腫発症に結びつくかについては、次年度の課題としたい。
エンドポリガラクツロナーゼの超原子分解能結晶を用いた酵素反応の直接観察

1)EndoPGI塩基触媒残基はAsp153とAsp174の二つの候補が上げられている。そこで、超高分解能解析により水素原子を含めた構造解析により両残基の解離状態の違いを観察することで塩基触媒の特定を試みた。以前の野生型酵素と生成物ガラクツロン酸(GalA)の複合体の超高分解能解析では、活性中心付近にGalAのフラノーズ型の異性体が低い占有率で結合し、結果、構造が乱れ水素原子の観察が出来なかった。そこで、フラノースの結合に関与するSer201をAlaに置換したS201A変異体を発現、精製、結晶化し、そのGalA複合体結晶を解析に使用した。測定は、SPring-8のBL41XUで行い、反応の至適であるpH5.0と不活性なpH2.7の二つの条件で、それぞれ0.8Åを越える分解能のデータを得た。解析の結果、活性中心にフラノースの結合は確認されなかった。また、pH2.7の条件において、Asp153とAsp174の内、前者のみがプロトン化を受けたと思われるピークが差フーリエマップ上で観察され、現在その確認のため更なる構造精密化を行っている。2)活性に重要なAsp残基をAsnに置換した変異体酵素D153NおよびD173Nと基質GalA6量体の超高分解能解析による水素を含めた構造解析を試みた。昨年の解析では、基質の占有率が不十分なため活性に関わる水素原子を観察出来なかった。そこで、占有率を改善するため、NaCl濃度下げ、沈殿剤PEGをより高分子量し濃度を下げることで、基質の溶解度を高めた溶液を作成し、それに結晶を浸漬後、BL44B2にて0.8Å以上データ収集を行った。しかし、解析の結果、両変異体とも十分な占有率の基質結合を得ることが出来なかった。したがって、酵素基質複合体中での水素原子の観察には、加水分解耐性な基質アナログの利用が必要と考えらる。一般酸塩基触媒により行われる酵素エンドポリガラクツロナーゼ(endoPGI)の反応機構を水素原子の挙動を含め解明するため、1)超原子分解能データ収集のための結晶化および測定条件の検討、2)変異体酵素と基質の超原子分解能X線結晶構造解析を試みた。1)大腸菌発現endoPGIのの構造解析の結果、Cys300-Cys303がジスルフィド結合している分子(SS型)としていない分子(SH型)の混合物と考えられた。この分子の欠陥は、更なる分解能向上の障害と考えその除去を試みた。SH体の変性温度が低いことを利用し、熱処理後に残った酵素のみを結晶化した。また、従来の結晶化では、容器から結晶を剥がすため一旦沈澱剤濃度を下げる必要があり結晶性への影響がと考えられた。そこで、高比重液体フロリナートの上に浮かせて結晶化を行った。得られた結晶、SPring-8のBL41XUにて、窒素クライオ条件で測定を行った。その結果、最高で0.56Åの超高分解能の回折点を確認した。しかし、放射緑損傷が激しくデータ処理後の分解能は0.74Åにすぎず、超原子分解能測定にはヘリウムクライオ装置が必須であることを確認した。一方、その電子密度から、上記の結晶化によりSS型のみが結晶化したことを確認した。2)事前の予備実験で、変異体D153NおよびD173Nの結晶を基質ガラクツロン酸6量体を含む溶液に浸漬することで複合体が得られることを確認した。そこで、分解能向上のため両結晶を大型化し、BL41XUに測定を行った。その結果、両複合体とも0.8Åを超える高分解能の回折点が得られた。しかし、1.4Å分解能での予備解析の結果、両複合体とも基質の電子密度が薄く、占有率が低いことが確認された。従って、水素を含めた構造解析には、大型結晶で基質の占有率の高い複合体作成条件の再検討が必要であることが分かった。

昨年の解析では、基質の占有率が不十分なため活性に関わる水素原子を観察出来なかった。そこで、占有率を改善するため、NaCl濃度下げ、沈殿剤PEGをより高分子量し濃度を下げることで、基質の溶解度を高めた溶液を作成し、それに結晶を浸漬後、BL44B2にて0.8Å以上データ収集を行った。しかし、解析の結果、両変異体とも十分な占有率の基質結合を得ることが出来なかった。したがって、酵素基質複合体中での水素原子の観察には、加水分解耐性な基質アナログの利用が必要と考えらる。
酸素活性化金属酵素の鍵中間体のモデル化学と分光学

効率的な酸素の活性化および還元は金属酵素が成しえる重要なエネルギー変換化学である。本課題では金属酵素の酸素活性化機構の解明を目的とし、機能性ヘムモデル錯体を用いた酸素活性化反応において捕捉した重要な反応中間体について分光学的解析を行い、構造-電子状態-反応性の相関の理解に寄与した。酸素活性化金属酵素による選択的四電子酸素還元反応は、高効率な酸化触媒、燃料電池の酸素極触媒において重要な化学である。選択的酸素活性化反応機構の解明には、反応過程に生じる中間体の分子構造、電子状態、反応性の相関についての理解が必要である。一般に、反応中間体は熱、分光解析のための光照射に対して非常に不安定であり、研究が困難なことが多い。ヘムー(ヒドロ)ペルオキサイド種は、酸素活性化機能を有するヘム蛋白質において普遍的に生成し、酵素活性化において鍵と成る反応中間体と考えられているが、その分光学的研究例は希有であった。本年度の研究においては、この酸素活性化において鍵となる反応中間体の分光解析のために、不安定試料を液体窒素凍結下にてラマン分光測定可能な装置系を開発した。このラマン分光装置を用いて、合理的に設計したヘムモデル化合物において調製したヘムー(ヒドロ)ペルオキサイド種の分子振動構造の解明に成功した。ヘムー(ヒドロ)ペルオキサイド種は、鉄三価-スーパーオキサイド種を液体窒素凍結下、γ線照射によって生じる電子による還元により分光学的に観測された例は報告されていたが、その種を溶液中で選択的に発生させ研究された例は本研究が世界初である。また、エンドオン型ヘムーペルオキサイド種も酸素活性化において重要な反応中間体であるが、この不安定化学種の安定化のために、新たに立体的に込み入った側鎖を接合したポルフィリンを合成して、反応中間体を捕捉してラマン分光により解析した。酸素活性化ステップで鍵となる化学種、低スピン6配位のエンドオン型ペルオキシ種を初めて分光学的に同定することに成功した。昨年度の成果をもとに、酸素活性化において鍵となる化学種(鉄-(ヒドロ)ペルオキシ種)の分光学的解析をしたほか、酸素活性化において鍵となるプロトン共役電子移動を可能にするヘム錯体の合成および分光学的解析をした。酸素活性化ヘム酵素においては、ヘム鉄と酸素が結合を生成した後、電子移動反応がおこる。この電子移動反応に対する環境の効果について検討するために、溶媒の極性および対カチオン存在の有無によるヘム鉄-酸素錯体の一電子還元機構について検討した。極低温下77Kにおいてヘム鉄-酸素付加体をγ線照射して得られる還元化学種について各種分光法(電子スピン共鳴および共鳴ラマン分光)により検討した。その結果、低極性溶媒中では、鉄二価スーパーオキシ体が生成するのに対し、高い極性溶媒中においては、鉄三価ペルオキシ体が生成することを明らかにした。スーパーオキシ種およびペルオキシ種は原子価互変異性体であり、ヘム周辺環境により電子状態に違いが生じることは理論化学的な解析と一致している。核共鳴非弾性散乱分光法をもちいて酸素活性化ヘム錯体中の鉄の低振動モードの解析を行った。従来、共鳴ラマン分光法では明らかにできなかった、振動モードの解明に寄与し、ヘム微細構造と酸素活性化反応性の相関について新たな知見を得た。生体反応を規範とした効率的な酸素活性化反応を人工ヘム錯体において実現すべく、プロトン共役電子移動を可能にするプロトンメディエーターを導入したヘムモデル錯体を合成し、その反応機構について分光学的な解析を行った。プロトン共役機構が酸素活性化において機能していることを実証するために、プロトンメディエーターのカルボン酸をエステル基で置換したモデルについても、その酸素活性化の分子機構および反応性について解析した。反応機構の解析においては、低温下において反応中間体の選択的な生成と捕捉、および、その分光学的解析を行い、分子構造と反応性の相関について洞察を得た。特筆すべきことに、鉄-ヒドロペルオキシ中間体の単離および分光学的同定に成功し、酸素活性化において鍵となる化学種の解明に寄与した。また、触媒反応性について電気化学的に解析し、プロトンメディエーターの存在により酸素還元反応が著しく促進されることを明らかにした。これらの成果により、酸素還元を低い過電圧で実現する分子触媒の設計指針について、重要な知見が得られた。さらに酸素活性化ヘム錯体の分子構造と反応性の相関について理解を深めるために、核共鳴非弾性散乱分光法と密度汎関数法計算を用いてヘム鉄の振動ダイナミックス構造について解析し、酸素活性化機構に本質的なヘム軸配位子の効果について考察した。軸配位子の配位により、Dead-end種と考えられていたSide-on型ヘム-ペルオキソ種が活性化される分子機構について、ヘムの電子状態およびヘム鉄の振動ダイナミックスの観点から明らかにし、酸素活性化金属酵素の重要な分子構造メカニズムの解明に貢献した。
特発性間質性肺炎の病態における血管内皮細胞の役割

特発性間質性肺炎(Iip)の病態における血管内皮細胞の変化とその病態における役割を知るため培養血管内皮細胞における接着分子発現やサイトカイン産生を検討した.ヒト肺動脈血管内皮細胞は,ブレオマイシンの刺激により培養上清中へIL-8やMCP-1を産生し,また,ICAM-1を発現したが,これらはアンチオキシダントであるN-アセチルシステイン(NAC)によって抑制されることが示された.マウスブレオマイシン(BLM)誘発肺線維症モデルを用いて接着分子intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)の発現や動態jを検討した.また,抗ICAM-1抗体によって肺の線維化が抑制し得るか否か検討した.BLMモデルにおいては主として比較的早期の炎症形成期の病態にICAM-1抗体が関与していることが示唆さてた。また、炎症形成期に抗ICAM-1抗体を用いることで炎症細胞浸潤及びそれに引き続く線維化形成を抑制しえた.以上の結果より,血管内皮細胞は,炎症の早期に刺激に対してサイトカインの産生や接着分子の発現を起こし,炎症細胞集積など炎症を惹起し,それに引き続く線維化の形成に重要な役割を演じている.また,アンチオキシダントであるN-acetylcysteine(NAC)がサイトカイン産生や接着分子発現を抑制することから,線維化病態の改善において有効な治療法で可能性が示唆された.特発性間質性肺炎(Iip)の病態における血管内皮細胞の変化とその病態における役割を知るため培養血管内皮細胞における接着分子発現やサイトカイン産生を検討した.ヒト肺動脈血管内皮細胞は,ブレオマイシンの刺激により培養上清中へIL-8やMCP-1を産生し,また,ICAM-1を発現したが,これらはアンチオキシダントであるN-アセチルシステイン(NAC)によって抑制されることが示された.マウスブレオマイシン(BLM)誘発肺線維症モデルを用いて接着分子intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)の発現や動態jを検討した.また,抗ICAM-1抗体によって肺の線維化が抑制し得るか否か検討した.BLMモデルにおいては主として比較的早期の炎症形成期の病態にICAM-1抗体が関与していることが示唆さてた。また、炎症形成期に抗ICAM-1抗体を用いることで炎症細胞浸潤及びそれに引き続く線維化形成を抑制しえた.以上の結果より,血管内皮細胞は,炎症の早期に刺激に対してサイトカインの産生や接着分子の発現を起こし,炎症細胞集積など炎症を惹起し,それに引き続く線維化の形成に重要な役割を演じている.また,アンチオキシダントであるN-acetylcysteine(NAC)がサイトカイン産生や接着分子発現を抑制することから,線維化病態の改善において有効な治療法で可能性が示唆された.【目的】特発性間質性肺炎(IIP)の病態における血管内皮細胞の変化とその病態における役割を知るため培養血管内皮細胞における接着分子発現やサイトカイン産生を検討した.【方法】ヒト肺動脈血管内皮細胞をブレオマイシンで刺激し培養上清中へのIL-8やMCP-1の産生をELISA法で測定した.また,ICAM-1の発現をcell-ELISA法で解析した.アンチオキシダントであるN-アセチルシステイン(NAC)の効果も検討した.【方法】ブレオマイシン刺激によって培養上清中に濃度依存性にIL-8やMCP-1の産生が増加した.ICAM-1の発現もブレオマイシンによって誘導された.NACは,これらのブレオマイシンの作用を抑制した.【総括】IIPの動物モデルとしてブレオマイシン誘発肺臓炎が用いられるが,ブレオマイシンは血管内皮細胞を刺激してIL-8やMCP-1などのケモカインおよびICAM-1などの接着分子の発現を促し,循環血液中の好中球やリンパ球,単球の肺への集積を惹起している可能性が示唆された.アンチオキシダントであるNACが抑制したことよりブレオマイシンの作用はオキシダントやNF-κBの活性化を介していることが示唆された.NACがブレオマイシン肺臓炎さらには,同様にオキシダントが発症に関与しているIIPの治療として有用であると考えられた.【目的】特発性間質性肺炎(IIP)の病態における血管内皮細胞の変化とその病態における役割を知るためマウスブレオマイシン(BLM)誘発肺線維症モデルを用いて接着分子intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)の発現や動態を検討した.また,抗ICAM-1抗体によって肺の線維化が抑制し得るか否か検討した.【方法】ICRマウスにBLMl50mg/kg ivして1)BALF中総細胞数,細胞分画の変化,2)血中およびBALF中の可溶型ICAM-1値の変化,3)BALF中肺胞マクロファージにおけるICAM-1発現のFACSによる解析,4)肺組織におけるICAM-1発現の免疫組織学的解析を行った.BLM投与後Day 19までAnti-ICAM-1mAb(KAT-1)を隔日投与(100mg/body i.p.)し効果を検討した.【結果】BLM静注直後より血管内皮におけるICAM-1発現が増強し,炎症細胞浸潤に関与している.肺胞上皮細胞や肺胞マクロファージなど肺胞内におけるICAM-1の発現増強も早期より認められたが,線維化の形成期時期ではむしろ低下した.BAL中の可溶型ICAM-

1濃度は炎症期には上昇するが、28日後の線維化形成期には低下していた。炎症形成期に抗ICAM-1抗体を用いることで炎症細胞浸潤及びそれに引き続く線維化形成を抑制しえた.【総括】BLMモデルにおいては主として比較的早期の炎症形成期の病態にICAM-1が関与していることが示唆された.早期のICAM-1発現は,炎症細胞浸潤を介して線維化形成に関与しているものと考えられた.後期の線維化形成期では,肺胞腔におけるICAM-1の発現が,特に肺胞マクロファージでは低下していたが,その意義は明らかでなかった.
神経系における活性イオウ分子種によるレドックスシグナル制御機構

システインのチオール基にイオウ原子が過付加したパースルフィドは、活性酸素、レドックスシグナルを制御する「活性イオウ分子種」として注目されている。神経系において活性酸素、レドックスシグナルが病理・生理学的に重要であることが明らかになりつつあるが、その内在性制御因子である活性イオウ分子種に関する知見は、これまでにほとんどなかった。本研究では、神経系における活性イオウ分子の代謝、レドクスシグナル制御機構を解明し、さらに神経変性疾患モデルを用いて発症メカニズムとの関連を明らかにすることを目的としている。平成30年度は、活性イオウ分子種の動態解析を行うために、質量分析による活性イオウ-メタボロミクス法について各種親電子性アルキル化剤について検討した。その結果ヒドロキシフェニル基を持つβ-(4-hydroxyphenyl)ethyliodoacetamide (HPE-IAM)が活性イオウを安定化することを見出した。さらに様々なヒドロキシ基を持つ化合物の安定化能を解析したところ、チロシンが非常に高い活性イオウ安定化能を有することを見出した(Redox Biol. 2019)。この知見を利用した活性イオウ-メタボロミクス法を開発し、アルツハイマー病モデルマウスにおいて病態進行と活性イオウレベルのとの間に相関があることを見出した(論文投稿準備中)。また、新規の活性イオウドナーを開発し、炎症疾患モデル細胞または動物を用いて生体内における活性イオウレベルの上昇が、炎症抑制に有効であることを明らかにした(Cell Chem. Biol. 2019)。この新規活性イオウドナーを用いてアミロイドベータ誘発性細胞毒性試験を行ったところ、細胞内活性イオウレベルの上昇がアミロイドベータ誘発性細胞毒性を軽減することを明らかにした(論文投稿準備中)。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。システインチオール基に過剰なイオウ原子が付加したシステインパースルフィドは、活性酸素、レドックスシグナルを制御する活性イオウ分子種として注目されている。神経系において活性酸素、レドックスシグナルの内在性制御因子である活性イオウ分子種に関する知見はほとんどない。平成28年度は、活性イオウ分子種の動態解析を行うために、質量分析による活性イオウ-メタボロミクス法を改良し、より正確な定量が可能となった。また、タンパク質中に含まれているシステインパーサルファイドの解析法の確立、タンパク質合成途中のペプチド鎖に取り込まれているシステインパーサルファイドの解析なども行い、生体内におけるシステインパーサルファイドの生合成経路の解明、ミトコンドリア機能との関連について検討した(Nature Comm.投稿中)、細菌のシステイン代謝関連酵素を用いた新規安定同位体化合物の合成法の確立(Free Radic Biol Med. 2017)、様々な生体試料中の活性イオウ分子種の総量を測定する方法の確立(Anal Chim Acta. 2017)、抗体を用いた全活性イオウ量の簡易測定法の開発(特願特願2017-31238)、さらに、神経細胞を用いたメチル水銀中毒、アルツハイマー病モデル実験を行い、両モデルにおいて、細胞内の活性イオウ分子種が減少すること、活性イオウ分子種を前処理することにより、神経毒性が軽減されることから、活性イオウ分子種が神経毒性の制御に関わっていることを明らかにした(J. Biol. Chem.投稿中)。子種が神経毒性の制御に関わっていることを明らかにした(J. Biol. Chem.投稿中)。研究計画として、平成28年度は、1蛍光プローブを用いた活性イオウ分子種の解析、2質量分析による活性イオウ-メタボロミクス、3質量分析による活性イオウ-メタボロミクス、4神経細胞特異的遺伝子ノックダウン-AAV2レスキュー法を計画していた。1に関しては、2014年に報告した蛍光色素SSP2の改良版で、さらに高感度検出が可能なSSP4を用いて細胞内活性イオウ分子種のイメージング解析を行った。神経細胞を神経毒素であるメチル水銀で処理すると、細胞内の蛍光シグナルが減弱した。この結果は、後述するメタボロミクス解析の結果と一致する。2に関しては、活性「イオウ分子種の抽出時の標識試薬としてモノブロモビマンの代わりに親電子性の低いヨードアセトアミドを用いることで、より定量的な解析が可能となった。また、トリプル四重極型タンデム質量分析装置を購入したため、迅速に解析することが可能となった。研究改良法を用いて神経毒性と細胞内活性イオウ分子レベルを比較したところ、メチル水銀毒性、アミロイドβ毒性と活性イオウ分子種レベルの低下に相関が認められた。3に関しては、新たなタンパク質中の活性イオウ分子標識方法を開発した。すなわち、親電子性の低いヨードアセトアミドと親電子性の高いビオチン標識マレイミドを用い、活性イオウ分子を特異的にビオチン化することで、検出、精製が可能となった。4に関しては、試薬を購入したのみで実際の実験は行っていない。当初の「計画以外にも関連する成果として、細菌のシステイン代謝関連酵素を用いた新規安定同位体化合物の合成法の確立(Free Radic Biol Med. 2017)、様々な生体試料中の活性イオウ分子種の総量を測定する方法の確立(Anal Chim Acta. 2017)、抗体を用いた全活性イオウ量の簡易測定法の開発(特願特願2017-31238)などの成果が上がっている。