hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
総合周産期母子医療センター内助産システムを中核とする新規地域産科医療モデルの構築

地域医療の中核として運用可能でかつ臨床的有用性の高い、新しい総合周産期母子医療センターにおける院内助産システムを確立し、これを中核とした今までにない地域産科医療ネットワークモデルを構築することを目的に、最終年度である本年度の研究を遂行した。2016、2017年度の計2年間の研究成果をもとに構築した、総合周産期母子医療センター内助産システムを中核とする新規地域産科医療ネットワークモデルの、茨城県つくば・県西ブロック内で前方視的運用を2018年4月より遂行した。その結果、計101名が本地域産科医療モデルを通じて本総合周産期母子医療センターにおいて院内助産システム下で分娩した。これらの女性の管理経験、および母児に対する安全性や患者満足度を含む分娩に関連する臨床的事項の後方視的検討を通じて、以下の2点が明らかとなった。1)この総合周産期母子医療センターにおける院内助産システムのその母児に対する安全性は、通常の医師主導の産科管理のそれに劣らない。2)本研究で構築した総合周産期母子医療センター内助産システムを中核とする新規地域産科医療ネットワークモデルは、わが国の地域の産科医療提供体制の一部として非常に有用であり、地域産科医療学の発展に寄与する。なお、研究実績の一部は日本周産期・新生児医学会雑誌(第54巻3号,809ー813頁,2018年)に原著論文として発表した。これ以外の研究成果については、現在論文投稿準備中である。研究計画の変更は不要と考えられるため、現在の研究計画に沿って研究を継続・遂行していきたい。なお、本研究は総合周産期母子医療センターにおける院内助産システムを中核とした地域産科医療ネットワークモデルを構築することが目的であるため、そのための茨城県つくば・県西ブロック内の産婦人科医療機関との協議を、よりスピード感を持って行い、研究全体の推進を図りたいと考えている。研究計画の変更は全く不要と考えられるため、現在の研究計画に沿って研究を継続・遂行していきたい。なお、本研究は地域産科医療ネットワークモデルを構築することが目的であるため、茨城県つくば・県西ブロック内の産婦人科医療機関との連携については、より綿密に行い、研究全体の推進と研究の質の向上を図りたいと考えている。
都市における便益とリスクの一体的評価とそれを用いた都市環境計画の展開

都市における便益とリスクを都市環境計画に適用するために、便益、リスクの各事項を、それぞれの効用にしたがって、安全性、利便性、快適性、審美性、文化性、の5つに分類した。また便益には、純然たる便益とリスクの減少を便益とみなすものがあることから、前者を純便益、後者をみなし便益として評価した。例えば、防災施設の建設、交通事故防止施設の整備などはみなし便益に相当する。このみなし便益をリスクとするか便益とするかは、リスクを評価する際の基準値の取り方により、評価の本質には影響を与えない。リスクについても同様である。以上のことを踏まえて、各事項の便益、リスク、コストを評価するために、それぞれを貨幣価値ないしは統一指標で換算した。項目によっては貨幣価値に換算しにくいものがある。その代表が人命であるが、便益やリスクを個人単位ではなく社会全体として評価するため、新ホフマン方式を用いて、損失余命から人命の価値を算定した。その結果、年齢分布を考慮した一人当たりの平均額は2604万円となった。この値はあくまでも社会として容認する最低額と考えるべきである。評価を行った事項は、浸水防除施設、高齢者介護施設、交通事故防止施設、下水道施設、ごみ処理施設等である。投資金額一定の場合のこれらの事項の便益の和の最大値を計算するために、キューン-タッカー条件を用いた非線形計画法を援用し、コンピュータを用いて解析を行い、便益-リスク-コストを最大にするコスト配分を算定した。そして、この結果と実際に行われている投資配分とを比較し検討を行った。その結果、実際の投資配分とほぼ類似の結果が得られた。したがって、現在の行政による投資判断における便益は最大値に近いものと考えられる。
リスクを取るべきか避けるべきか－意思決定をめぐる神経基盤を解明する－

競争を勝ち抜くにはリスクを避けては通れないが、過度なチャレンジは身を亡ぼす。脳はどのようにして行動選択しているのだろうか。本研究ではラットのギャンブル行動モデルを用い島皮質前部と前頭眼窩野の神経活動を計測することで、これら2領域が意思決定にどのように寄与しているのか調べた。その結果、島皮質前部および前頭眼窩野のニューロンは意思決定をする際に、過去にギャンブルに勝っていた場合と負けていた場合とでは全く異なる神経活動を示すことが明らかとなった。これは2つの領域が意思決定の際に過去の経験をリコールしている可能性を示している。競争を勝ち抜くには時としてリスクを冒す必要があるが、過度なチャレンジは身を亡ぼす。我々の脳はどのようにしてこの2つの戦略を使い分けているのだろうか。これまでの研究によって個々の脳領域の機能については理解が進んできたが、それらがどのようにシステムとして機能し最終的な意思決定がなされているのかについてはほとんど分かっていない。我々はその端緒として、本リスク選択を促進する島皮質前部とリスク選択を抑制する前頭眼窩野がどのように連関して機能するか、すなわちこの2領域が拮抗しリスク選択・回避が決定されていくような神経活動のダイナミクスを捉えることを目指している。研究では初年度に電気生理学的手法を用い複数脳領域の活動の同時計測し、機能連関の推定を目指すし、次年度において推定されたネットワークに対し特定の神経回路の操作を可能にする光遺伝学的手法を用いることで、実際の因果関係を導き出す計画である。本年度は当初の計画通り電気生理実験を中心に行い、ギャンブル課題遂行中のラット島皮質前部および前頭眼窩野から単一神経活動を同時記録した。その結果2領域のおよそ15%の神経細胞から、意思決定がまさに行われるであろう選択の直前のタイミングにおいてリスク選択あるいは回避と関連する活動を記録することができた。当成果は2015年10月にシカゴで開催された北米神経科学会において発表した。現在はそれら2領域の神経活動がどのように連関しているのか解析を進めているところである。初年度は計画通りギャンブル課題遂行中のラットの島皮質前部と前頭眼窩野から神経活動の同時計測を行うことができ、その成果について国際学会で発表することができた。ラットのギャンブル行動モデルを用いた研究代表者の過去の研究により、島皮質前部を薬理学的に不活性化した際にはラットはリスクを忌避するようになり、前頭眼窩野を不活性化した際にはリスクを選好するようになることが見出された。そこで本研究では、島皮質前部と前頭眼窩野の神経活動を計測することで、これら2領域が意思決定にどのように寄与しているのか調べた。神経活動の計測にあたっては、本当にその活動がリスクに相関しているのか、それとも運動情報などリスクとは直接関係ないものに相関しているのかを分離するため複数のコントロール条件を試験する必要があった。例えばリスクを伴う選択肢と確実な選択肢を提示する位置を途中で左右入れ替えたり、リスクを伴わない報酬量の弁別課題についても試験することで、情報表現がリスクを伴う際特有のものであることを確かめた。そのためラットを用いた行動実験としては難度が非常に高くなった。しかし選択肢の提示方法の改良の結果軌道に乗り、昨年度と合わせ2年間で5匹のラットから1000以上の単一神経活動を計測することに成功し、解析に十分なデータ数が得られた。その結果については昨年度、そして本年度の北米神経科学会で発表を行っている。特筆すべき発見は、島皮質前部および前頭眼窩野のニューロンの多くが、選択を行う際、過去の選択においてギャンブルに勝っていた場合と負けていた場合で異なる神経活動を示した点である。本年度の後半では光遺伝学的手法および薬理学的手法を用いてこの仮説の検証を試みた。これらの成果については現在論文を執筆中である。今後の計画は当初の予定通り、初年度に得られた電気生理実験の結果の解析を行いネットワークを推定し、その後光遺伝学的手法と電気生理実験を組み合わせながらそのネットワークが実際に意思決定に寄与しているのかを検証していく。神経科学物品費について...神経活計測用ケーブルの耐久性が低く当初複数回の買い替えを見積もっていたが、予想外に長持ちしているため支出が抑えられている。但し今後故障した場合には新規に購入する必要がある。旅費について...北米神経科学会の旅費を東北大学脳科学センターに支援して頂いたため支出の必要がなくなった。引き続き電気生理実験を行っていくため、神経活動計測に必要な消耗品の購入に充てていく。
食嗜好形成メカニズムの解明：食物の希少性による学習の成立

ヒトは時に不必要に食べてしまうが、これは食物に「おいしさ」という快楽的側面があるためである。この食物のおいしさ(食嗜好)に種差や個体差を超える普遍的な脳のメカニズムが存在すると予想し、その解明のための実験パラダイム確立と脳機構の解明を目指した。実験動物にとって一般的な食物(ヒマワリ)を用いた。幼若ラットにヒマワリを与えると、経日的に摂食量や摂食速度が増加し、食嗜好が経日的に上昇することが分かった。また、摂食中に開眼率(眼をどの程度開けているか)が小さくなることが分かった。以上のことからヒマワリを用いて開眼率を調べるという実験パラダイムが食嗜好研究に有用であることが分かった。日常的な食物に対する嗜好性形成のメカニズムを明らかにするために、ラットを対象とした行動学的実験を行った。「希少性」という付加価値が食物の嗜好性を増進するのではないかと予想し、食物の種類や呈示方法といった条件が摂食行動に及ぼす影響を調べた。日常的な食物に近く、性質が比較的均一に保たれているものとして、市販されているげっ歯類用の飼料を用いることにした。ペット用であるため栄養素を考慮して、ヒマワリの種、乾燥コーン、粟、人工飼料など様々な素材が含まれていた。これらの素材への嗜好性の違いを調べたところ、ラットはヒマワリの種と乾燥コーンを好んで食べるものの、他の素材は積極的には食べないことが分かった。次に、希少性が食嗜好に及ぼす影響について調べるために、「食べやすさ」をコントロールすることにした。ヒマワリの種については、中身である胚を食べるために皮を剥くという作業をラットは行う。一方、乾燥コーンについては直接食べることができるため、人為的に食べやすさをコントロールしやすいと考えた。具体的には落花生の殻を2つに割り、実を取り出して替りに乾燥コーンを入れ、でんぷん糊を用いて閉じた。完全に密閉せず、少し穴をあけることで中の匂いを嗅ぐことができるようにした。この食材(落花生+乾燥コーン)をラットに与え、食べ方の変化を観察した。ラットは徐々に殻の割り方を学習し、摂食個数が増加し、完食に要する時間は短くなる傾向がみられた。しかし、これらの行動指標については個体差が大きく食嗜好が形成されたとは結論づけられなかった。問題点としては、人為的に作製したものであること、落花生の殻から乾燥コーンを取り出すところを観察するのは非常に困難であることが明らかとなった。そこで現在は、ラットが積極的に摂食するもう一つの素材であるヒマワリの種を用いて実験を行っている。食嗜好形成の実験パラダイムを行動学的実験によって確立することが平成27年度の当初の予定であった。実験パラダイムを完全に確立したとはいえない状況であるため、計画よりやや遅れていると判断している。申請時の計画では、プラスチック製の小さなエサ箱を用いる予定であった。エサの取り出しやすさが異なる2種類の箱を用いることで、食物の希少性をコントロールする予定であった。市販のプラスチック板を加工して様々なエサ箱を試作したが、ラットはそれらの箱からエサを摂取しなかった。結果として明らかとなったのは、ラットは人工物に対して神経質であり、興味を示さないことであった。このようなラットの性質については予想外のことであり、ラットがエサ箱から食べるようになるにはかなりの時間を要すると考えられた。実験パラダイムの確立という目的からすると、長期間を要するのは望ましくなかったため、エサ箱を使うことを諦めた。次の段階として、より自然物に近いものを使おうと考えたが、その考案と作製に時間を要した。このような経緯は十分にありうることであったため、研究全体にとって大きな問題ではないと考えているが、当初の計画が少し遅れた原因になったことは間違いない。しかし一方で、ラットがどういった素材を好み、どのように摂食するかといった食性については、毎回の実験においてビデオを撮影し、スロー再生による画像分析をすることで様々な情報を得ることができた。この報告書を作成している時点でヒマワリの種が食材として適当であり。食嗜好形成の実験パラダイムを確立することができる方向性が見えてきている。したがって、平成28年度において計画の遅れを取り戻すことができると考えている。本研究は「ヒトはなぜ食べるのだろうか」という疑問から開始されたものである。ヒト時に不必要に食べてしまうが、これは食物に「おいしさ」という快楽的側面があるためと考えられる。この食物のおいしさ(食嗜好)には種差や個体差があるが、食嗜好を生み出す普遍的な脳のメカニズムが存在すると予想し、その解明のための実験パラダイム確立と脳機構の解明を目指した。本研究では、実験動物にとって一般的な食物(ひまわりのタネ)を用いた。この食物に「希少性」という価値を付加することで食嗜好が形成される過程とその脳内メカニズムを明らかにすることを目指した。希少性を付加する方法として給餌箱をの構造を工夫することを計画した。給餌箱からひまわりのタネを取り出しにくくすることで希少性を高める予定であった。様々な形の給餌箱を作製したが、実験動物(ラット)にひまわりのタネを取り出すことを学習させることが非常に困難であることが明らかとなった。しかし、その一方で、幼若ラットにひまわりのタネを与えると、経日的に摂食量や摂食速度が増加することがわかった。このことは食嗜好が経日的に上昇することを示唆している。

また、観察の過程において、ひまわりのタネを食べている間に眼を閉じる傾向があることが観察された。そこで、摂食中に眼をどの程度開けているか(開眼率)と摂食量や摂食速度に関連性があるかを調べ、開眼率が食嗜好の指標として用いることができるかを検討した。その結果、開眼率は経日的に低下し、摂食量や摂食速度の増加と反比例の関係にあることが明らかとなった。本研究課題では脳内メカニズムについて明らかにするところまで到達することはできなかったが、将来的な研究において、開眼率を指標として食嗜好の脳内メカニズムを調べることができると期待される。ヒトは時に不必要に食べてしまうが、これは食物に「おいしさ」という快楽的側面があるためである。この食物のおいしさ(食嗜好)に種差や個体差を超える普遍的な脳のメカニズムが存在すると予想し、その解明のための実験パラダイム確立と脳機構の解明を目指した。実験動物にとって一般的な食物(ヒマワリ)を用いた。幼若ラットにヒマワリを与えると、経日的に摂食量や摂食速度が増加し、食嗜好が経日的に上昇することが分かった。また、摂食中に開眼率(眼をどの程度開けているか)が小さくなることが分かった。以上のことからヒマワリを用いて開眼率を調べるという実験パラダイムが食嗜好研究に有用であることが分かった。食嗜好形成のための実験パラダイムを可能な限り早い段階で確立する。特に解決すべきなのは、ラットの行動をどのように解析するかという問題と、どのような客観的指標によって食嗜好を評価できるかという問題である。ラットがヒマワリの種に対する食嗜好を形成し、徐々に増進させていると推察される現象を観察しているものの、上述の課題に関してはまだ解決できていない。また、実験に用いた個体数も十分ではない。したがって、個体数を増やすとともに、解析と評価に関する課題を並行して解決していく。また、行動実験を終えた動物を用いて、脳内報酬系(側坐核、腹側淡蒼球、腹側被蓋野などによって構成される神経回路)を操作することで、ヒマワリの種に対する食嗜好への影響を調べる。脳内報酬系に発現するオピオイド受容体を刺激すると高嗜好性味溶液である甘味溶液の摂取量が増加することが知られている。また反対に、オピオイド受容体を阻害すると、甘味溶液の摂取量が減少する。これらのことから、脳内報酬系のオピオイド受容体は嗜好性に関与すると考えられている。そこで、ヒマワリの種に対する食嗜好が形成されたラットにおいて、脳内報酬系のいずれかの脳部位におけるオピオイド受容体を刺激あるいは阻害することで、ヒマワリの種を与えた時の行動にどのような影響が生じるかを調べる。食嗜好の指標となる行動がオピオイド受容体を刺激することで増加し、反対に阻害することで減少すれば、ラットがヒマワリの種に対する食嗜好を形成したことを生理学的な証拠によって証明することができる。これらの実験を終えることができたら、ラットが食嗜好を形成する段階(ヒマワリの種を与える初期の段階)でも同様に脳内報酬系の操作を行い、食嗜好の形成が早まったり遅れたりするかどうかを調べる。行動神経科学次年度に行う予定の薬物注入実験は消耗品の購入量が増えることが予想される。研究の進行度合いもやや遅れているために、前倒しして実験を行うには至らなかった。
スラグーメタル界面における固体酸化物の局部溶損におよぼす印加電圧の影響

スラグーメタル界面に生じる固体酸化物の局部溶損におよぼす印加電圧の影響を,透明石英ガラスるつぼ-(PbO-SiO_2)スラグーPb系を用いて800°C,アルゴン雰囲気のもとで調べ,以下の結果を得た.1.スラグーメタル間に電圧を印加した状態で,るつぼ内壁に生じる局部溶損の進行状況と,その付近のスラグフィルム(SF)の運動を,るつぼの外側から光学的に直接動的に観察し,映画フィルム等に記録することに成功した.2.メタルを陰極にした状態での局部溶損は,回路を開いた状態に比較して,水平方向の溶損が小さく,上下方向に広い幅をもつなだらかな溶損形態を示す.これに対して,メタルを陽極にした状態では,水平方向に深く,上下方向に幅の狭い,鋭いくびれをもつ局部溶損形態を示す.3.水平方向の局部溶損量は,メタル陰極の場合が最も小さく,次いで開回路,メタル陽極の順に大きくなる.4.局部溶損部のメタルーるつぼ内壁間に存在するSF(凝固後)には, SFの厚さ方向および, SF-メタル界面の上下方向にSiO_2濃度の変化が検出される.局部溶損部のSFのSiO_2濃度は,メタル陽極の時が最も低く,次いで開回路,メタル陰極の順に高くなる.いずれの場合にも, SF-メタル間の界面張力は,下方ほど大きくなり,マランゴニ効果によりSFが,下方に引張られていることを示す.5.上記マランゴニ効果に基づくスラグフィルムの運動のもと,溶解成分SiO_2の物質移動律速として導いた溶損速度式を用いて, 3の結果等を定性的に説明できた.しかし,溶損速度の絶対値の一致は十分なものではなかった.試料の急冷等により,局部溶損進行時にできるだけ近い状態でのスラグフィルムの性状を明らかにすることが今後の課題と考えられる.スラグーメタル界面に生じる固体酸化物の局部溶損におよぼす印加電圧の影響を,透明石英ガラスるつぼ-(PbO-SiO_2)スラグーPb系を用いて800°C,アルゴン雰囲気のもとで調べ,以下の結果を得た.1.スラグーメタル間に電圧を印加した状態で,るつぼ内壁に生じる局部溶損の進行状況と,その付近のスラグフィルム(SF)の運動を,るつぼの外側から光学的に直接動的に観察し,映画フィルム等に記録することに成功した.2.メタルを陰極にした状態での局部溶損は,回路を開いた状態に比較して,水平方向の溶損が小さく,上下方向に広い幅をもつなだらかな溶損形態を示す.これに対して,メタルを陽極にした状態では,水平方向に深く,上下方向に幅の狭い,鋭いくびれをもつ局部溶損形態を示す.3.水平方向の局部溶損量は,メタル陰極の場合が最も小さく,次いで開回路,メタル陽極の順に大きくなる.4.局部溶損部のメタルーるつぼ内壁間に存在するSF(凝固後)には, SFの厚さ方向および, SF-メタル界面の上下方向にSiO_2濃度の変化が検出される.局部溶損部のSFのSiO_2濃度は,メタル陽極の時が最も低く,次いで開回路,メタル陰極の順に高くなる.いずれの場合にも, SF-メタル間の界面張力は,下方ほど大きくなり,マランゴニ効果によりSFが,下方に引張られていることを示す.5.上記マランゴニ効果に基づくスラグフィルムの運動のもと,溶解成分SiO_2の物質移動律速として導いた溶損速度式を用いて, 3の結果等を定性的に説明できた.しかし,溶損速度の絶対値の一致は十分なものではなかった.試料の急冷等により,局部溶損進行時にできるだけ近い状態でのスラグフィルムの性状を明らかにすることが今後の課題と考えられる.
漢籍利用者の研究行動の解明と利用者タスクに基づく目録作成・評価枠組みの開発

本研究の目的は,1)特定の資料群,具体的には漢籍の研究者を対象としたインタビュー調査と質的分析により,漢籍利用者の研究行動を明らかにすること,2)漢籍利用者の研究行動から漢籍利用者の利用者タスクを明らかにすることを通じて,特定の資料群の利用者タスク解明手法を開発すること,3)図書館のコンピュータ目録や,デジタルアーカイブにおける漢籍の書誌データに必要なデータ要素を,利用者タスクと対応づけて明らかにし,同時に利用者タスクを用いて,既存の書誌データを評価する枠組みを開発することである。初年度にあたる2018年度は,1)国内外6名の漢籍利用者(研究者)に対するインタビュー調査およびインタビューデータの質的分析を行い,漢籍利用者の研究行動を部分的に明らかにした。2)上記1)の分析を通じて,インタビュー結果から漢籍利用者の研究行動を理解するための手法の検討を行った。3)国内で構築されている漢籍デジタルアーカイブにおいて記録されている書誌データ,日本の冊子体漢籍目録やカード目録に記録されている漢籍書誌記述のなかの各項目,中華人民共和国にて実施されている古籍センサスで採用されている書誌データ要素を抽出し,比較検討を行った。1)については,次年度以降も引き続き調査を継続する。その分析を通じて,2)インタビュー手法や分析手法の改善を図るとともに,利用行動全体から,特に漢籍の書誌データを利用する際の利用者タスクを特定する予定である。さらに,3)2018年度に抽出した書誌データ要素を活用しつつ,中国,台湾,米国等の漢籍を扱うための目録規則や標準類から書誌データ要素を抽出する作業を続け,最終的には書誌データ要素と利用者タスクを関連づけて示す予定である。研究開始時期に所属機関の変更があったことを主な要因として,1年目に国内研究者へのインタビュー調査を終えるという当初の予定を達成することができなかった。しかしながら,国内研究者5名,海外研究者1名へのインタビュー調査および分析を実施し,調査・分析方法や結果の提示方法に一定の目途をつけることができた。1)引き続きインタビュー調査と分析を進める。2018年度のインタビュー調査の結果,国内の漢籍利用者にさまざまなパターンの研究行動が見られ,研究者の専門分野や年代によりさらなる研究行動の違いが観察されると予想されることから,2019年度も充分な調査対象者数を確保できるまでは国内研究者へのインタビュー調査を継続する。2)同時に,海外の漢籍利用者へのインタビューを,遅くとも来年度中には実施できるよう調整を図る。3)中国,台湾,北米の漢籍整理に関する標準類を整理し,漢籍書誌データに記録されうるデータ要素の抽出を2019年度中に完了する予定である。2018年度より所属機関が変更となったため研究環境が変わり,当初初年度に支出予定の金額より多くの物品費を支出し,必要な図書やソフトウェアをそろえた。

一方で,2018年度にインタビュー調査を実施できた件数が予定よりも少なかったため,謝金や交通費の支出が予定よりも少なくなり若干の次年度使用額が生じた。未使用分は2019年度中にインタビュー謝金として支出する予定である。
RNAの新しい機能に関する研究

動物界に存在する転写される反復配列は、ほとんどがtRNAを起源としていることが明らかになったが、そのレトロポゾンとしての性質を利用し、進化の特定の時期に増幅した反復配列をカタログ化することにより、100%間違いのない系統樹を作成出来ることが明らかになった(岡田)。レトロポゾンの転移の機構に関して、「コピア」の逆転写の際に、イニシエ-タメチオニンtRNAの5'半分子が、M1ーRNAにより切断されプライマ-として用いられることを示し、さらにこのtRNAのコンフォメ-ション変化に影響を与えると思われる変異体を作成し、このtRNAがクロ-バ葉構造以外の構造を取りうることを明らかにした(菊池)。イントロンとスプライシングに関しては、いくつかの重要な研究の進展が見られた。ショウジョウバエの性決定の過程において、Sx1遺伝子からオルタナチブスプライシングにより生じた雌型の産物が、Tra遺伝子のmRNA前駆体に結合し、雌型のmRNAを生じさせること、更にこの雌型のTra遺伝子産物が、Dsx遺伝子のmRNA前駆体に結合し、雌型のmRNAを特異的に産生することが示された(坂本、志村)。前者の結合が、雄型に対して阻害的に働くのにたいし、後者の結合が雌型にたいして増強的に働くことがしめされ、これはオルタナチブスプライシングの制御機構が分子レベルで明らかになった最初の例である(坂本、志村)。スプライシグに関与するU6RNAのなかでも、分裂酵母のU6RNA中にはmRNA型のイントロンが存在することが明らかにされていたが、今回U6RNAのイントロンの存在する場所が、ある種の植物ウイルスの自己切断部位の構造と極めて良く類似していることを明らかにした(谷)。HTLVー1のmRNA前駆体のスプライシングを制御するRex蛋白質が、U1snRNPとの相互作用によってmRNA合成を制御することが、Rex変異体を用いた分析から明らかになった(志田)。ショウジョウバエの極細胞の生殖細胞への分化の過程において、生殖細胞特異的なスプライシングを起こすことの出来る極細胞のみが、生殖巣に進入し始原生殖細胞に分化しうることが明らかになった(小林)。グル-プIイントロンのRNAが、M1ーRNAの基質になることが示されたが、その切断部位がグアノシン結合部位であることを考えると、グル-プIイントロンtRNAとの共通の起源を示唆しているようで興味深い(岡田)。
難治性気道疾患への新たな挑戦-病態、診断、治療へのアプローチ-

難治性の気道疾患という観点から慢性閉塞性肺疾患(Chronic obstructive pulmonary disease : COPD)と気管支喘息をとらえ、その克服をめざしたものである。近年、酸化ストレスが、COPD、気管支喘息の病態に様々な形で関与すると考えられており、具体的には1)治療標的の特定を目指す病態の解明、2)低侵襲的気道病態の評価法の開発(新規酸化ストレスバイオマーカー・3次元的気道画像解析)、3)抗酸化剤治療介入へ向けての基礎的研究、4)北海道COPDコホート研究という4つのプロジェクトからなる。難治性の気道疾患という観点からCOPDと気管支喘息の克服をめざした以下の4項目の研究を行う。・COPD、気管支喘息患者の気道上皮における酸化還元関連物質、関連遺伝子の発現:COPD患者の細気管支上皮、マクロファージを検体として、転写因子Nrf2の発現を定量し、その標的抗酸化遺伝子発現低下との関連を検討した。非喫煙者、COPDのない喫煙者に比較し、COPD患者において、Nrf2遺伝子発現、HO-1等の抗酸化遺伝子の発現低下が認められた。・COPD、気管支喘息患者の喀痰中酸化ストレスマーカーの測定:当院通院中の喘息患者(約30名)、健常ボランティア(約30名)から、喀痰を採取し、カルボニル化蛋白については、dinitrophenylhydrazine(DNP)処理した後、Western blot法により分子量別にカルボニル化蛋白を半定量化した。臨床的データ、喀痰中の炎症細胞、他の酸化ストレスマーカーとの比較検討を行った。喘息患者の痰中では53kDaと68kDaの蛋白に強いカルボニル化が認められた。・OVA誘発気管支喘息モデルにおける炎症と経時的酸化ストレス変化の評価C57/BL6マウスにOVA誘発気管支喘息モデルを確立し、気管支肺胞洗浄液中カルポニル化蛋白を定量し、気道炎症細胞出現との関連を評価した。53kDaカルボニル化蛋自は、OVA吸入6時間後に出現し12時間後には消失し、一方68kDaカルボニル化蛋白は2448時間後に出現し、好酸球の出現に関連する。道被覆液中に存在する蛋白は、発作時に選択的にカルボニル化を受けることを初めて明らかにした。・気管支喘息の3次元的気道画像解析の方法55歳以上の気管支喘息患者対象に、3D-CTを施行した。気管支拡張薬投与前後で同検査を施行し、画像上の変化と臨床症状、呼吸機能検査、喀痰中のバイオマーカー、との関連を分析した。COPDと気管支喘息の克服をめざした以下の4項目の研究を行った。COPD患者におけるNrf2遺伝子発現、HO-1等の抗酸化遺伝子の発現低下を論文として報告した。・COPD、気管支喘息患者の喀痰中酸化ストレスマーカーの測定:当院通院中の喘息患者(約30名)、健常ボランティア(約30名)から、喀痰を採取し、カルボニル化蛋白については、dimitrophenylhydrazine(DNP)処理した後、Western blot法により分子量別にカルボニル化蛋白を半定量化した。喘息患者の痰中で強いカルボニル化が認められる53kDaと68kDaの蛋白をそれぞれalphal-antitrypsinとアルブミンと同定した。・OVA誘発気管支喘息モデルにおける炎症と経時的酸化ストレス変化の評価C57/BL6マウスにOVA誘発気管支喘息モデルを確立し、気管支肺胞洗浄液中カルボニル化蛋白を定量し、気道炎症細胞出現との関連を評価した。53kDaカルボニル化蛋白は、OVA吸入6時間後に出現し12時間後には消失し、一方68kDaカルボニル化蛋白は2448時間後に出現し、好酸球の出現に関連する。喘息患者痰のデータとマウス喘息モデルのデータをまとめ論文として報告した。
マウス ES 細胞の樹立過程のライブセルイメージング解析

本研究課題ではマウス初期胚からのES(胚性幹)細胞の樹立過程をライブセルイメージングすることで、ES細胞の起源、ES細胞の形成過程について明らかにすることを目的としている。研究代表者はDNAのメチル化状態をMBDプローブによって可視化したマウスを作製することに成功し、このレポーターを用いてイメージング解析を行った。これによりES細胞とマウスの初期胚(ICMの細胞など)とでは、DNAのメチル化状態が大きく異なることが明らかとなった。ES(胚性幹)細胞やips(人工多能性幹)細胞は再生医療の切り札として大きく期待されている。しかしながらES細胞が生体内のどの時期の細胞に由来するのか、またどのような過程を経てICM(内部細胞塊)の細胞がES細胞になるのかなど、まだ解決されていない疑問は多い。本研究ではマウス初期胚からのES細胞の樹立過程を、各種レポーターマウスを用いてライブセルイメージングすることで、ES細胞の起源、ES細胞の形成過程について明らかにすることを目的としている。昨年度はES細胞樹立過程のライブセルメージングを行うのに必要不可欠な各種ノックインマウスの作製を行なった。当初の計画ではES細胞が樹立される過程での細胞系譜の変遷を単純に追跡することを考えていたが、米国ベイラー医科大学のThomas Zwaka博士らのグループから手法は異なるものの、類似の研究が報告されたため(Chu et a. CurrBiol. 2011)研究の方向性を少し軌道修正した。具体的には、エピジェネティクスの変化を可視化出来るレポーターマウスも作製し、これと細胞系譜を追跡出来るレポーターマウスを組み合わせることでES細胞の樹立過程をイメージングしようと計画している。これらの各種レポーターマウスを用いて平成24年度の後半くらいより本格的な解析に移行したいと考えている。なお、本研究課題で樹立したレポーターマウスはES細胞研究、生殖細胞研究にも有用となる可能性があるため、バイオリソースとして迅速に論文等で公開し、広く生命科学研究者に提供する。ES(胚性幹)細胞やiPS(人工多能性幹)細胞は再生医療の切り札として大きく期待されている。本研究課題ではマウス初期胚からのES細胞の樹立過程を、各種レポーターマウスを用いてライブセルイメージングすることで、ES細胞の起源、ES細胞の形成過程について明らかにすることを目的としている。本年度は前年度に引き続き、各種レポーターマウスの作製と、その検証を行った。昨年度は丹羽仁史博士より分与いただいたOct4-EGFPのノックインマウスの作製に成功したが、本年度は新たにDNAのメチル化状態をMBDプローブによって可視化したマウスを作製することに成功した。このレポーターを用いてイメージングしたところ、ES細胞とマウスの初期胚(ICMの細胞など)とでは、DNAのメチル化状態(主にヘテロクロマチンが可視化される)が大きく異なることが明らかとなった。より具体的には、ES細胞のヘテロクロマチンは細胞周期を通じて常に凝集していた(明瞭なfocusが確認された)のに対して、初期胚のそれは非常に動的に変化しており、時折ヘテロクロマチンのfocusが消えることが明らかとなった。今後は本研究課題で作製したレポーターマウス由来の胚を用いてES細胞の樹立過程のライブセルイメージング解析を行なっていく。ES細胞樹立過程のライブセルメージングを行うのに必要不可欠な各種ノックインマウスの作製を行ない、既にキメラマウスを得ている。現在これらのキメラマウスと野生型のマウスを交配することでF1世代を樹立しようとしている。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画ではES細胞が樹立される過程での細胞系譜の変遷を単純に追跡することを考えていたが、米国ベイラー医科大学のThomas Zwaka博士らのグループから類似の研究が報告されたため(Chu et a.CurrBiol. 2011)、研究の方向性を少し軌道修正した。
エイコサペンタエン酸を用いた二次性リンパ浮腫に対する薬物治療法の開発

リンパ浮腫では皮膚障害を発症するが皮膚評価方法開発は遅れている。目的:ヒトリンパ浮腫の皮膚粘弾性評価方法を確立すること。方法:蛍光リンパ管造影とシンチグラフィーで下肢リンパ浮腫と確定診断された症例を対象とし、皮膚粘弾測定器(Cutometer)プローベを皮膚に当て2秒間吸引した後に吸引を解除し、吸引時皮膚位置(a)、吸引解除2秒後皮膚位置(b)からR = b/aを算出した。前腕、大腿R値を計測し、年齢と前腕R値、前腕R値と健常大腿R値の相関式を求めた。相関式、前腕R値、リンパ浮腫大腿R値から、実測粘弾性年齢、予測粘弾性年齢、粘弾性年齢差(実測粘弾性年齢ー予測粘弾性年齢)を算出した。国際リンパ学会病期分類により、下肢を、健常、Stage I/IIa, IIb+IIIの3群に分け、粘弾性年齢差を比較した。結果:25例(原発/続発:7/18,片側/両側:15/10)、50下肢(健常:15、Stage I/IIa:27、IIb/III:8)。粘弾性年齢差はI/IIa群で5歳、IIb/III群で10歳増加した。考察:加齢や上肢リンパ浮腫におけるCutometerの有用性は既に報告されている。皮膚粘弾性は加齢にて低下するため、リンパ浮腫患者の皮膚粘弾性低下が、加齢による影響かリンパ浮腫による影響かを判断するのは困難である。上肢リンパ浮腫では、患肢を健常な非患肢と比較すれば加齢の影響を補正できるが、下肢リンパ浮腫では両側発症も多く左右の比較は有用ではない。年齢の影響を補正するため、前腕皮膚粘弾性から大腿皮膚予測粘弾性年齢を算出し、実際の皮膚粘弾性年齢との差を算出することで、リンパ浮腫の皮膚粘弾性への影響を定量的に評価できることを示した。この評価方法は、リンパ浮腫治療による皮膚弾性改善効果の評価にも有用な可能性がある。リンパ浮腫のラット動物モデルの開発に成功し、国際学会(Gordonカンファレンス、世界分子イメージング学会、国際リンパ学会)等に発表し、これまでで最もヒトリンパ浮腫の病態に近い動物モデルとして高い評価を得た。同モデルを用いてリンパ浮腫の病態解明についての研究も進め、線維化を呈する他疾患(肺線維症、肝硬変等)においては、筋線維芽細胞とTGF-β1が重要な役割を担っている。リンパ浮腫においても、急性期に浸潤したマクロファージと、慢性期の筋線維芽細胞からのTGF-β1産生が重要である。ラットモデルを作成し、術後2週間から6カ月まで、薬物(エイコサペントエン酸)の混餌投与を行った。コントロール群、リンパ浮腫群、リンパ浮腫+薬物投与群を作成し、比較した。薬物投与群では、皮膚中の線維化促進サイトカイン(TGF-β1)の発現は抑制され、皮膚中のコラーゲン増成も抑制された。さらに、薬物投与群では、リンパ浮腫群に比べ、皮下リンパ管が温残され、皮下組織中のリンパ液漏出も消失した。エイコサペントエン酸の、リンパ浮腫による皮膚線維化への有効性を証明した。以上の内容を、日本リンパ学会、日本静脈学会にて報告した。また、現在、FASEB journalへ投稿中である。さらに、ヒトリンパ浮腫症例に対し、四肢の皮膚を、皮膚硬度計、皮膚弾力計を用いて評価し、健側、患側を比較した。皮膚硬度計では、両群間に有意差を認めなかった。皮膚弾力計では、患側での有意な弾力低下を認めた。皮膚弾力計は、ヒトリンパ浮腫の非侵襲的な進行度・皮膚硬度の評価方法として有効である。以上の内容を、国際リンパ学会、日本リンパ学会にて報告した。また、現在、Journal of vascular surgeryへ投稿準備中である。ラットモデルにおいては、仮説通りの結果が得られた。ヒトリンパ浮腫症例においては、CT、MRI等の評価も予定していたが、研究への参加症例が集まらなかった。また、皮膚硬度計では期待した結果が得られなかった。皮膚弾力計では、期待以上の結果が得られた。

考察:加齢や上肢リンパ浮腫におけるCutometerの有用性は既に報告されている。皮膚粘弾性は加齢にて低下するため、リンパ浮腫患者の皮膚粘弾性低下が、加齢による影響かリンパ浮腫による影響かを判断するのは困難である。上肢リンパ浮腫では、患肢を健常な非患肢と比較すれば加齢の影響を補正できるが、下肢リンパ浮腫では両側発症も多く左右の比較は有用ではない。年齢の影響を補正するため、前腕皮膚粘弾性から大腿皮膚予測粘弾性年齢を算出し、実際の皮膚粘弾性年齢との差を算出することで、リンパ浮腫の皮膚粘弾性への影響を定量的に評価できることを示した。この評価方法は、リンパ浮腫治療による皮膚弾性改善効果の評価にも有用な可能性がある。ラットリンパ浮腫モデルへの薬物経口投与による皮膚線維化の抑制効果の検証については、順調であり、今後はデータ解析、学会発表、論文投稿を中心に進める。ヒトリンパ浮腫の非侵襲的な進行度・皮膚硬度の評価方法を確立については、皮膚弾力計を中心に、さらなる参加症例数が必要である。今後は、データ解析、学会発表、論文投稿、症例の登録を中心に進める。ヒトリンパ浮腫症例における治療効果の検討については、現在、研究体制の準備中である。今後、参加者を募集予定である。
治療遺伝子を強発現させた歯髄幹細胞による脳梗塞治療法の確立-臨床応用へ向けて-

前回の実験により我々は、歯髄幹細胞移植により脳梗塞治療効果が得られることを確認した。しかし、動物モデルによる均一化された脳虚血と比べヒトの脳虚血は不均一で多様性があるため、老齢の動物や糖尿病、高血圧などの併存疾患をもつ動物を用いて臨床試験により近づけるように調整する必要がある。これらの疾患動物における脳梗塞モデルを用いて歯髄幹細胞移植の有効性を確認し、細胞治療の臨床へのトランスレーションの成功率を上昇させることを目指している。まず我々は、脳卒中易発症系高血圧自然発症ラットを用いて脳虚血モデルを作成し、虚血導入直後にラットの尾静脈から歯髄幹細胞を投与して、虚血再灌流24時間後における梗塞体積および神経兆候等の評価を行なっている。脳卒中易発症系高血圧自然発症ラットを用いた脳梗塞モデルの作成に苦慮しており、細胞移植の効果の検討が進んでいない状況であるため。使用する動物や虚血モデルの変更を検討し、基礎疾患を合併した脳梗塞モデルの作成の確率を急ぐ予定である。動物モデルの確立に予想外の時間を要したために実験の進行が遅れた。モデルを変更し、進捗のスピードを上げる予定である。
神経発生におけるシグナル伝達経路の動物種間保存の解析

Tlxはニワトリ初期胚前脳部で特異的に発現する核内レセプター型の転写因子であり、ショウジョウバエtaillessに相同である。taillessも脳神経前駆体での発現が認められ、脳神経の発生分化を制御する遺伝プログラムにTlx/taillessの関与する進化的に保存された側面のあることが予想される。この可能性について、Tlxの動物種間における比較解析を行い、発現制御メカニズム、遺伝子破壊マウスの作出を行った。ヒト(部分配列)、ゼブラフィッシュ(完全長)Tlx cDNAを取得し、Tlxのアミノ酸一次配列が、魚類から霊長類まできわめて高い(>90%)類似性を示すことを見いだした。ゼブラフィッシュ胚でもTlxは神経管の前端部で発現を開始し、引き続き、終脳、間脳、眼胞、および中脳で発現するようになる。ヒトTlxも新生児脳で発現しており、中枢神経の発生と同調していることが予測された。Tlxの発現制御機構についてマウスで解析を進め、基本プロモーターを開始コドンの1.4kb上流に同定した。また、神経発生における機能を個体レベルで解析するために、Tlxを欠損したマウスを作成した。Tlx遺伝子中央部の約10kbをβガラクトシダーゼ遺伝子で置換したES細胞を単離し、キメラマウスを経てTlx遺伝子を欠失したヘテロ接合体を得た。βガラクトシダーゼ活性を有する細胞集団の分布はTlx遺伝子のin situ hybridizationパターンと一致し、これらの細胞がnestin陽性の神経前駆体細胞であることを神経上皮細胞の初代培養によって確認した。ヘテロ接合体では頭部形態の異常は見られなかったため、ホモ接合体を得ることを試みたところ、きわめて早期に致死となることが判明した。この原因についてはさらに解析を進めているが、神経の発生以前に致死となるため、今後他のアプローチの導入についても検討する。
ＳＲＹ標的遺伝子および初期卵巣化因子の同定と発現解析

マウス胎子XX卵巣を父性環境下(雄ヌードマウス腎臓被膜下への移植)で発生させると、生殖腺が発生初期の未分化な状態に戻り、精巣化する(XX精巣化モデル)。本研究は、このXX精巣化モデルを用いて、「1精巣決定遺伝子SRYの標的遺伝子」および「2初期卵巣化因子」の同定を行うことを目的に行われている。1申請者は、SRYの新たな標的遺伝子を同定するために、XX精巣化の過程で未分化な状態に戻ったXX生殖腺に異所的なSRYを誘導し、遺伝子発現を解析した。マイクロアレイ解析の結果、発現が上昇した遺伝子の中には、セルトリ細胞特異的に発現している転写因子が含まれており、それらの発現は、Sox9発現と高い正の相関を示していた。また、これら3つの転写因子は、胎生期の野生型XYまたはSRY恒常発現型XX生殖腺においても高発現しており、胎生期の精巣決定においてSRY標的遺伝子として機能している可能性が示された。2申請者は、XX精巣化の過程での遺伝子発現変動を、マイクロアレイにより継時的に解析した。その結果、XX精巣化の進行に伴い、顆粒膜細胞特異的遺伝子群のうち、約25%の遺伝子が発現の減少を示すことが分かった。これらの発現が減少した遺伝子の中に、初期卵巣化に関わる遺伝子が含まれている可能性がある。対照的に、XX精巣化の進行に伴い、セルトリ細胞に特異的な遺伝群の約25%の遺伝子が発現の増加を示すことが分かった。XX精巣化の過程で発現が上昇した遺伝子に関して、CRISPR-Cas9システムを用いてノックアウトしたマウスを作製した。ノックアウトマウスの移植卵巣では、野生型の移植卵巣と比較して、退行中の卵胞数が有意に増加していた。これらの結果から、ノックアウトした遺伝子は、移植卵巣の雄性化過程における卵胞の維持に関与していることを明らかにした。28年度が最終年度であるため、記入しない。マウス胎子XX卵巣を雄マウス腎臓被膜下へ移植し発生させると、移植10日目までに一度起こった卵巣化がリセットされ、移植20日目までに精巣様構造が出現する(XX精巣化)。本研究はこのXX精巣化モデルを用いて、「精巣決定遺伝子SRYの標的遺伝子」および「初期卵巣化因子」の同定と、それらの遺伝子の時間的・空間的な発現解析を行い、哺乳類の支持細胞の初期性分化の分子機構の解明に寄与することを目的に行われている。申請者は、XX精巣化の過程で未分化な状態に戻ったXX生殖腺にSRYを誘導し、発現の上昇が見られた約4000の遺伝子の中から、胎生期のセルトリ細胞で特異的に発現する遺伝子約80個を、SRY標的遺伝子候補として抽出した。これらの候補の中には、雄の性分化に関連する因子や、胎生期の精巣形成に関与する因子等が含まれていた。またこの中には、精巣分化に関する機能が明らかになっていない複数の転写因子が含まれていた。申請者はそれらの転写因子に関して、胎生期XX生殖腺と比較しXY生殖腺において高発現する傾向をqRT-PCRで得ており、新たなSRY標的遺伝子の有力な候補と考えている。また申請者は、マイクロアレイによりXX精巣化過程における遺伝子発現変動を継時的かつ網羅的に解析した。その結果、XX精巣化の進行に伴い、約25%の顆粒膜細胞特異的遺伝子群の発現が減少することが明らかとなった。また、それらの遺伝子の発現減少は、XX生殖腺の未分化性が再獲得される移植10日目までに起こる結果が得られた。申請者は、移植10日目までに減少傾向を示した因子のうち、胎生期の顆粒膜細胞に特異的に発現する遺伝子を初期卵巣化因子の候補として抽出した。それらの候補因子のいくつかに関しては、qRT-PCRにおいても移植10目までに遺伝子発現が減少することを確認しており、初期卵巣化因子の有力な候補と考えられる。本研究はこのXX精巣化モデルを用いて、「精巣決定遺伝子SRYの標的遺伝子」および「初期卵巣化因子」の同定と、それらの因子およびXX精巣化に関連した遺伝子の解析を行い、哺乳類の支持細胞の初期性分化の分子機構の解明に寄与することを目的に行われている。申請者は、SRYの新たな標的遺伝子を同定するために、XX精巣化の過程で未分化な状態に戻ったXX生殖腺にSRYを誘導し、発現の上昇が見られた遺伝子の中から、精巣分化に関する機能が明らかになっていない複数の転写因子を抽出した。申請者はそれらSRY標的転写因子の候補に関して、XX生殖腺においてもSRYが恒常発現するマウスを用いて、胎生期生殖腺での発現を調べた結果、マウス胎生期の野生型XX生殖腺と比較して、野生型XY生殖腺およびSRY恒常発現型XX生殖腺で高発現する因子を特定した。また申請者は、XX精巣化の進行に伴い、約25%の顆粒膜細胞特異的遺伝子の発現が減少することが明らかにした。減少傾向を示した因子に関して、胎生期XX生殖腺における組織学的な解析を行ったところ、性的に未分化な細胞において、陽性シグナルが観察されない因子を特定した。

一方、XX精巣化の進行に伴い、セルトリ細胞特異的遺伝の約25%が、移植15ー20目までにかけて発現の増加を示すことが分かった。発現が増加したいくつかの因子に関しては、RT-qPCRにおいてもXX精巣化の過程で遺伝子発現が増加することを確認している。申請者は、未分化性を再獲得したXX精巣にSRYを誘導した場合に発現が上昇してくる遺伝子の中から、精巣分化に関する機能が知られていない複数の転写因子をSRY標的転写因子として抽出した。申請者は、これらの因子の中から、マウス胎生期の野生型XX生殖腺と比較して、野生型XY生殖腺およびSRY恒常発現型XX生殖腺で高発現する因子を既に特定している。この因子は、XX精巣化という人為的に作り出したモデルにおいてのみならず、正常な生殖腺発生過程においてもSRYによって発現が誘導されうる因子であり、SRY標的遺伝子に関する研究のさらなる進展が見込まれる。また申請者は、XX精巣化の進行に伴って発現が減少した因子の中から、胎生期XX生殖腺の性的に未分化な細胞において、陽性シグナルが観察されない因子を特定した。この因子は、XX精巣化において未分化性の再獲得に伴って発現が減少し、胎生期XX生殖腺の未分化性消失にともなって発現することから、初期卵巣化因子の有力な候補と考えられる。更に申請者は、XX精巣化の進行に伴い、セルトリ細胞特異的遺伝の約25%が移植15ー20目までにかけて発現の増加を示すことを明らかにした。これらの精巣化因子について解析を進めることで、雄環境下で起こるSRY非依存的な精巣化を引き起こす原因遺伝子の解明につながることが期待できる。マウス胎子XX卵巣を父性環境下(雄ヌードマウス腎臓被膜下への移植)で発生させると、生殖腺が発生初期の未分化な状態に戻り、精巣化する(XX精巣化モデル)。本研究は、このXX精巣化モデルを用いて、「1精巣決定遺伝子SRYの標的遺伝子」および「2初期卵巣化因子」の同定を行うことを目的に行われている。1申請者は、SRYの新たな標的遺伝子を同定するために、XX精巣化の過程で未分化な状態に戻ったXX生殖腺に異所的なSRYを誘導し、遺伝子発現を解析した。マイクロアレイ解析の結果、発現が上昇した遺伝子の中には、セルトリ細胞特異的に発現している転写因子が含まれており、それらの発現は、Sox9発現と高い正の相関を示していた。また、これら3つの転写因子は、胎生期の野生型XYまたはSRY恒常発現型XX生殖腺においても高発現しており、胎生期の精巣決定においてSRY標的遺伝子として機能している可能性が示された。2申請者は、XX精巣化の過程での遺伝子発現変動を、マイクロアレイにより継時的に解析した。その結果、XX精巣化の進行に伴い、顆粒膜細胞特異的遺伝子群のうち、約25%の遺伝子が発現の減少を示すことが分かった。これらの発現が減少した遺伝子の中に、初期卵巣化に関わる遺伝子が含まれている可能性がある。対照的に、XX精巣化の進行に伴い、セルトリ細胞に特異的な遺伝群の約25%の遺伝子が発現の増加を示すことが分かった。XX精巣化の過程で発現が上昇した遺伝子に関して、CRISPR-Cas9システムを用いてノックアウトしたマウスを作製した。ノックアウトマウスの移植卵巣では、野生型の移植卵巣と比較して、退行中の卵胞数が有意に増加していた。これらの結果から、ノックアウトした遺伝子は、移植卵巣の雄性化過程における卵胞の維持に関与していることを明らかにした。
イネのアレロパシー物質モミラクトンの作用機構に関する研究

モミラクトンはイネのアレロパシー物質として働き,強い成長抑制活性をもつ.モミラクトンの成長抑制の仕組みを明らかにするために,モミラクトン高感受性シロイヌナズナ変異株2種(tt3, ban)と低感受性株1種(tt6)を見つけ出した.これらは,フラボノイド代謝に関する変異体であった.また,モミラクトンの投与でフラボノイド中間代謝産物の濃度が増減することが明らかになり,フラボノイドがモミラクトンの成長抑制に関与している可能性があると考えられた.特にシアニジンの蓄積が大きく,モミラクトンはシアニジンの濃度の増加させることで,成長をコントロールしている可能性がある.申請者らは,SALK T-DNA-Insertion-lineの14,585種のシロイヌナズナ変異株にモミラクトンを投与したところ,モミラクトンBに対して低感受性を示す変異体を同定した.この変異体はフラボノイド生合成経路のtt6である.同じ生合成経路の他の変異体を観察したところ,高感受性(tt3, ban)を示す変異体が見つかった.また,tt6を除く他の変異体及び野生型は,モミラクトンB存在下で,植物体に赤色の色素を蓄積したことから,モミラクトンBはフラボノイド生合成経路を活性化させることが示唆された.これらフラボノイド生合成経路の変異体でモミラクトンBの感受性が変化したのは,モミラクトンBがフラボノイド生合成経路を活性化させ,成長抑制作用を持つ物質の合成を誘導させているためであると考えられる.そして植物体に色素が蓄積するのは,これらの物質が高濃度に蓄積したためだと考えられる.一方,tt3やbanで高感受性を示したのは,これらの酵素の基質となる物質が,この経路の最終産物よりも強い生長抑制活性を持っているためだと考えられる.このような中間産物が最終産物より強い生長抑制活性を持つことは,イネのモミラクトン生合成経路の変異体ksl4で発芽や生長が著しく阻害されるが,その一つ上流のcps4では阻害されないことが報告されている.現在,変異体スクリーニング及びフラボノイド生合成経路に関する変異体の観察結果から,フラボノイド生合成経路とその発現を制御している転写因子の遺伝子発現をqRT-PCRを用いて測定している.モミラクトンはイネのアレロパシー物質として働き,強い生長抑制活性をもつ.申請者らは,モミラクトンの生長抑制の仕組みを明らかにするために,SALK T-DNA-Insertion-lineの14,585種のシロイヌナズナから,モミラクトン感受性が高いシロイヌナズナ変異株2種(tt3, ban)と感受性が低い株1種(tt6)を見つけ出した.これらは,いずれもフラボノイドの生合成経路に関する変異体であった.今年度は,モミラクトンがフラボノイド生合成経路に与える影響を,代謝産物の濃度を測定することで検討した.その結果,いくつかの代謝産物の濃度がモミラクトンの投与で増減することが明らかになり,これらのフラボノイドがモミラクトンの生長抑制に関与している可能性があると考えられた.特にケルセチンの蓄積が大きく,モミラクトンはケルセチンの濃度の増加させることで,生長をコントロールしている可能性がある.更に,シロイヌナズナ野生型の種子,高感受性(tt3, ban)と低感受性(tt6)の種子にモミラクトンを投与し,蓄積量が増加または減少したタンパク質を同定した.その結果,野生型の種子では活性酸素除去に関わる酵素グルタミントランスフェレーゼの蓄積量が増加していたが,高感受性変異体の種子では減少していた.活性酸素は生長抑制に関与することが報告されている.野生型の種子と高感受性変異体の種子ではタンパク質のフォールディングに関わるタンパク質ヒートショックプロテインの蓄積量が減少していたが,低感受性変異体の種子では増加していた.フォールディングはストレスに対する植物の保護に重要な役割を担っている.野生型の種子では解糖系の酵素トリオースイソメラーゼの蓄積量が減少していたが,低感受性変異体の種子では増加していた.この結果から,モミラクトンに対する高感受性には活性酸素が関係し,低感受性にはフォールディングと解糖系が関係している可能性がある.モミラクトンはイネのアレロパシー物質として働き,強い生長抑制活性をもつ.申請者らは,モミラクトンの生長抑制の仕組みを明らかにするために,SALK T-DNA-Insertion-lineの14,585種のシロイヌナズナから,モミラクトン感受性が高いシロイヌナズナ変異株2種(tt3, ban)と感受性が低い株1種(tt6)を見つけ出した.モミラクトンがフラボノイド生合成経路に与える影響を,代謝産物の濃度を測定することで検討した.その結果,いくつかの代謝産物の濃度がモミラクトンの投与で増減することが明らかになり,これらのフラボノイドがモミラクトンの生長抑制に関与している可能性があると考えられた.特にシアニジンの蓄積が大きく,モミラクトンはシアニジンの濃度の増加させることで,生長をコントロールしている可能性がある.シアニジンは,イロイヌナズナに対して生長抑制活性を持つことも明らかになった.シロイヌナズナ野生型の種子,高感受性(tt3, ban)と低感受性(tt6)の種子にモミラクトンを投与し,蓄積量が増加または減少したタンパク質を同定した.その結果,野生型の種子では活性酸素除去に関わる酵素グルタミントランスフェレーゼの蓄積量が増加していたが,高感受性変異体の種子では減少していた.活性酸素は生長抑制に関与することが報告されている.