hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
正常妊娠・流早産・子宮内胎児発育遅延例における胸腺外分化T細胞の子宮内分布の解析

妊娠32例,即ち初期自然流産例8例(A群),母体保護法に基く初期人工流産例8例(B群),早産例4例(C群),満期分娩例12例(D群)を対象とした。対象の子宮脱落膜を細切し,メッシュ濾過および比重遠心法にて分離されたリンパ球をCD3,CD45,CD56またはCD57に対する蛍光抗体で標識,その後フローサイトメトリーを用いて全T細胞中に占めるCD56^+CD3^+T細胞およびCD57^+CD3^+T細胞(胸腺外分化T細胞のsubset)の割合を解析し,4群間で比較した。また対象のうち妊娠後期に分娩に至った16例において,過数相当の体重の児を得た14例(AGA群)と子宮内胎児発育遅延の2例(IUGR群)の間で同様の比較を行った。その結果,脱落膜中のCD57^+CD3^+T細胞はA群で23.0±5.2%,B群で18.7±2.2%,C群で20.9±4.6%,D群で21.9±8.1%であり,A群はB群に比べ有意に高い割合を示した。CD56^+CD3^+T細胞はA群で21.4±18.0%,B群で15.6±10.9%,C群で11.0±2.4%,D群で11.5±3.2%であり4群間で有意差は認められなかった。またAGA群とIUGR群との比較では,CD57^+CD3^+T細胞においてはAGA群23.0±7.7%,IUGR群18.3±6.1%で両群間で有意差は認められず,CD56^+CD3^+T細胞においてはAGA群11.0±2.9%,IUGR群13.2±1.1%で同じく有意差が認められなかった。以上の結果より,CD57^+CD3^+胸腺外分化T細胞が自然流産に関与する可能性が示唆された。これまでの解析の対象は13例である。対象の内訳は,正常妊婦4例,妊娠中毒症・胎児発育遅延例2例,SLE合併妊娠2例,流産例5例であった。平成11年2月23日現在でそのうち7例について,フローサイトメトリーを用いた脱落膜および末梢血の胸腺外分化T細胞(CD57^+CD3^+T細胞,CD56^+CD3^+T細胞)の分布率の解析を終了した。結果としては,CD57^+CD3^+T細胞に関しては,脱落膜での分布率は正常妊婦3例でそれぞれ12.9%,16.6%,17.0%,妊娠中毒症・胎児発育遅延の2例でそれぞれ19.3%,19.4%,SLE合併妊娠の2例で10.5%,10.3%となった。末梢血での分布率は,正常妊婦3例では5.2%,5.8%,8.5%,妊娠中毒症・胎児発育遅延の2例で11.3%,4.3%,SLE合併妊娠の2例で21.5%,25.5%であった。CD56^+CD3^+T細胞に関しては,脱落膜での分布率は正常妊婦3例ではそれぞれ4.9%,11.3%,9.7%,妊娠中毒症・胎児発育遅延の2例ではそれぞれ10.4%,11.1%,SLE合併妊娠の2例では8.3%,4.7%となった。末梢血での分布率は,正常妊婦では3.3%,6.3%,10.4%,妊娠中毒症・胎児発育遅延の例では4.4%,6.4%,SLE合併妊娠の例では7.0%,1.4%であった。以上の結果から下記の事項が示された。1.脱落膜ではすべての例においてCD57^+CD3^+T細胞がCD56^+CD3^+T細胞よりも高い分布率を示したが,末梢血では一定の傾向を認めなかった。2,妊娠中毒症・胎児発育遅延の症例では,正常妊婦に比べて脱落膜のCD57^+CD3^+T細胞分布率が高い傾向にあった。3.正常妊婦では脱落膜のCD57^+CD3^+T細胞分布率が末梢血のそれより高い値を示したが,SLE合併妊娠では末梢血の方が高かった。

その結果,脱落膜中のCD57^+CD3^+T細胞はA群で23.0±5.2%,B群で18.7±2.2%,C群で20.9±4.6%,D群で21.9±8.1%であり,A群はB群に比べ有意に高い割合を示した。CD56^+CD3^+T細胞はA群で21.4±18.0%,B群で15.6±10.9%,C群で11.0±2.4%,D群で11.5±3.2%であり4群間で有意差は認められなかった。またAGA群とIUGR群との比較では,CD57^+CD3^+T細胞においてはAGA群23.0±7.7%,IUGR群18.3±6.1%で両群間で有意差は認められず,CD56^+CD3^+T細胞においてはAGA群11.0±2.9%,IUGR群13.2±1.1%で同じく有意差が認められなかった。以上の結果より,CD57^+CD3^+胸腺外分化T細胞が自然流産に関与する可能性が示唆された。
全層角膜再生を目指した培養３次元角膜実質モデルの確立

全層角膜再生のためにin vitroで角膜実質の再現に取り組んだ。角膜実質は体内で最もコラーゲンが配向した組織であり、その構造により角膜の透明性を維持している。我々は透明な角膜実質を再現するために配向コラーゲンシートを開発することに成功した。持続的伸縮運動により作製された配向コラーゲンシート上で角膜実質がコラーゲン繊維に沿って配向した。さらに、角膜が湾曲を持つ構造であることから3次元構造物上でもコラーゲン繊維が配向できるかを調べた。その結果、半円筒形上でもコラーゲン繊維を円周方向に沿って配向させることに成功した。この結果により、角膜再生のための透明性を持つ足場の作成が可能であることを示唆した。ラットと豚の角膜から角膜実質細胞を分離することに成功している。動物実験で安楽死される動物の数を減らすためにと畜過程で発生する豚の角膜を使用した。豚の角膜の性質は人と類似しているためより角膜移植に役立てる研究ができると考えている。コラーゲンビーズの内部に角膜実質細胞を入れ、外部には角膜上皮細胞を付着し培養した結果、コラーゲンビーズの収縮により培養した組織が混濁する問題が生じた。この問題を解決すべく、コラーゲンビーズを代替できる新しい足場を開発した。コラーゲンは体内及び角膜組織で主な細胞外マトリックスの成分であり、再生医療において移植材料の安定性、強度及び機能を維持する重要な足場の材料として注目されている。角膜実質は体内組織の中でもコラーゲンの配向が優れている組織であり、この配向性が角膜の透明性を維持していると知られている。しかし、in vitroでは体内と似た配向したコラーゲンの足場を作成することが非常に困難である。この研究では、コラーゲンシートに持続的物理刺激を与えることにより配向したコラーゲンシートを開発コトに成功している。配向したコラーゲンシートは約42%の配向率を示しており、透明性を持っている。この結果は2015年ポルトガルで開かれたMEMS Conferenceにより発表している。配向したコラーゲンシート上で豚の角膜実質を培養した結果、角膜実質細胞が約40%の配向を示した。そして、細胞による収縮がなく、角膜組織の移植で最も必要とされる透明性を維持していることから3次元角膜組織の構築が可能であることを示唆した。平成26年度の研究計画として1.ケラトサイトを付着させたマイクロコラーゲンビーズによる立体培養角膜実質の構築、2.角膜上皮細胞の培養による3次元角膜実質モデルのニッチ形成の評価を計画した。従来の計画であったコラーゲンビーズ上の培養では、コラーゲン分解による強度の低下と組織の収縮により混濁度の増加が見られた。この問題を解決すべく新しい足場である配向コラーゲンシートを開発することに成功している。この結果は2015年度MEMS Conferenceに発表している。このシート上で培養した豚の角膜実質シートは透明性を維持している。強度の定量的評価は27年度に行う予定である。26年度は新しい足場の開発を主に行っているため、3次元角膜実質モデルのニッチ形成の評価は27年度に行う。しかし、開発した配向コラーゲンシートに角膜実質細胞を培養した時に、配向していないコラーゲンシートより増殖速度が速く形状的に角膜実質細胞を維持していた。この結果により配向したコラーゲンシートに細胞の再生を促すニッチ環境を備わっていることが期待されている。27年度が最終年度であるため、記入しない。再生医療配向コラーゲンシート上培養した角膜実質シートの強度の定量的評価及びシートの重層による3次元培養を行う。これにより角膜移植ソースとしての3次元組織構築が可能であると考えられる。配向コラーゲンシートの上に培養した3次元角膜実質モデルが移植ソースとして適用可能であることを確認した後、実験IIIを行う。デスメ膜の直前までの角膜上皮と実質組織を除去した深層角膜損傷モデルのラット25匹へ角膜上皮細胞を有する3次元角膜実質モデルの移植を行う。観察期間内では、臨床学的評価として角膜混濁スコアと血管新生スコア(Ang, L. et al., Invest. Ophthalmol. Vis Sci., 2010; Kim, J et al. Exp. Eye. Res., 2000)を実施するとともに、角膜知覚計を用いて神経再生の程度を評価する。

移植後7、14、28、56、84日後に、各々5匹を安楽殺して角膜組織を採取し、3次元角膜実質モデルを移植したことによる角膜の治癒過程を病理組織学的に評価するとともに、電子顕微鏡により角膜実質のコラーゲン配列などのECM構造を確認する。そして、ケラトサイトの密度をH&E染色で確認し、ケラトサイトの固有性質の維持とコラーゲンの性質を蛍光免疫染色で検証することにより、3次元角膜実質モデルに含まれていたケラトサイトが移植後に角膜の透明性の回復と実質の修復にどのような影響を与えたかを評価する。27年度が最終年度であるため、記入しない。
経皮吸収促進機能を有する油状ナノキャリアの創成とがんワクチンへの応用

本研究は皮膚に塗るだけで体の免疫力を活性化し、がんの予防や治療を行う経皮がんワクチンの開発を目的とする。免疫を惹起するには、抗原と呼ばれるタンパク質を皮膚内部の免疫細胞へ送達する必要があるが、異物の侵入を防ぐ角層のバリア機能により、皮膚内部への抗原浸透は強く阻害される。イオン液体は常温で液体の塩であり、その特異な静電的・構造的な特性から、強力な皮膚浸透促進作用を示すことが近年明らかとされた。そこで本研究では生体適合性イオン液体で抗原を被覆する「イオン液体逆ミセル」を設計した。これによって抗原の大幅な皮膚浸透性向上を目指し、さらには経皮がんワクチンとしての機能を総合的に評価することを目的とする。
難治性うつ病のECT標的分子としてのアストロサイト由来TSP-1に関する研究

難治性うつ病の新規標的分子としてシナプス新生関連因子であるTSP-1に着目し、うつ病の病態や電気けいれん療法(ECT)の作用にどのように寄与するのかを明らかにする目的で研究を行った。重症うつ病患者の血清中TSP-1は、女性患者特異的に有意な低下がみられたがECT前後で変化しなかったことから、性別依存的なtrait markerとなる可能性が示唆された。基礎的研究として雄のコルチコステロン慢性投与うつ病モデルにおける海馬シナプス新生関連因子の遺伝子発現を測定したが、有意な変化は見られなかった。今後は性差に着目した検討が必要だと考えられた。難治性うつ病の新規標的分子としてシナプス新生を誘導するアストロサイト由来分泌因子トロンボスポンジン-1(thrombospondin-1: TSP-1)に着目し、TSP-1がどのようにうつ病の病態や電気けいれん療法による抗うつ作用に寄与するかを明らかにする目的で以下の検討を進めた。1)うつ病患者の電気けいれん療法前後の末梢血・脳脊髄液の収集を、研究協力者の協力を得て進め、目標数に概ね達成してきた。また、うつ病患者死後脳の提供を受ける準備も整った。これら臨床サンプル中のTSP-1測定に関わる基礎検討として、末梢血に関しては完了している。一方で最近、末梢血液中から中枢由来のエキソソームを抽出し、中枢由来エキソソーム中のタンパクを測定することで、中枢での変化を末梢でとらえることが可能であることを示唆する報告がなされた。TSP-1はアストロサイト由来の因子であることから、末梢血中の変化だけでなく、そこから抽出した中枢エキソソーム分画中の変化を検討することが今後重要になると考えられた。そこで、末梢血中の総エキソソームを抽出したところ、アストロサイトマーカーであるglutamateaspartatetransporter(GLAST)が検出されることを確認した。つまり、末梢血中にアストロサイト由来エキソソームが存在することが示唆された。現在、このアストロサイト由来エキソソームを抽出する手技の確立に関する検討も並行して行っている。2)TSP-1の関与を動物の行動学的指標を用いて評価するための予備検討を進めた。ストレス負荷によるうつ病様の行動変化、抗うつ薬を投与した際の効果発現を評価できる条件を決めることができた。1)サンプルの収集自体は順調であった。末梢血中のTSP-1測定に関しては条件を決めることができた。しかし、末梢血中からアストロサイト由来エキソソームを抽出するための条件検討に時間を要してしまった。2)動物の行動評価系の条件を決めるのに時間を要したため、当該年度計画していた行動学的指標を用いたTSP-1の関与の検討に進めなかった。1)研究協力者の協力を得て、電気けいれん療法が必要な重症のうつ病患者の血清を収集し、TSP-1についてELISA法で測定した。健常者との比較、電気けいれん療法前後の比較などを行った。女性のうつ病患者でのみ有意に血清中TSP-1の値が低下していることが明らかになった。一方、電気けいれん療法の前後では血清中TSP-1の値に変化は見られなかった。現在、査読付き学術論文に投稿する準備を行っている。脳脊髄液中のTSP-1を測定する検討を行ったが、現在の実験技術では測定感度以下であり、健常者と患者での差を比較することは困難であると考えられた。2)TSP-1を含むアストロサイト由来シナプス新生関連因子がうつ病の病態に関与するか否か検討するため、コルチコステロン慢性投与によるうつ病モデルマウスを作成し、脳の組織からmRNAを抽出後、real time PCRを用いて、TSP-1、Glypican-4, Secreted protein acidic and rich in cysteine (SPARC)のmRNAを測定した。作成したコルチコステロン投与モデルは有意なうつ病様行動変化を示す事を確認したが、脳組織由来のTSP-1, Glypican-4, SPARC mRNAはいずれもコントロール群と変わらなかった。臨床サンプルの収集が順調に進められたので、重点を置いて研究を進める。脳脊髄液、死後脳組織について、TSP-1を測定するための条件検討を完了させ、実際にサンプル中のTSP-1を測定して比較検討を行う。また、血液に関しては、末梢血そのものだけでなく、中枢由来エキソソームでの測定も行えるよう、検討を進める。in vivo実験に関しては、行動学的指標を用いたTSP-1の関与の検討を進める。

行動学的評価実験に伴って得られる脳組織などからmRNAやタンパクを抽出し、TSP-1の変化を追う。神経精神薬理学当該年度は計画していたよりも少ない予算で進行したため。次年度に必要な物品の購入費にあてる。
膵β細胞SUR・Kir6.2蛋白間構造機能連関制御因子についての研究

膵β細胞のATP感受性K^+チャネル(KATPチャネル)はインスリン分泌機構において極めて重要な働きをしている。このチャネルはβ細胞の静止膜電位を決定しているイオンチャネルであり、このチャネルの抑制はグルコース刺激時にみられる最初のβ細胞膜応答である。一方、スルフォニル尿素(SU)剤はその固有のレセプターに結合することによりK-ATPチャネルの抑制をもたらし、インスリン分泌を刺激することが知られている。ATP感受性K^+チャネルのサブユニットであるスルフォニル尿素レセプター(SUR)、内向き整流性K^+チャネル(Kir6.2)蛋白間の情報伝達機序を明らかにすることを目的として本研究を遂行し以下の実績を得た。1)トルブタミド(スルフォニル尿素薬)はKATPチャネルを抑制するが、細胞膜を高濃度のCa^<2+>(2mM)で処理すると本薬剤に対する感受性を減少した。2)この時、チャネルのADPによって活性化される作用も同時に消失していた。3)しかし、ATPによるチャネル抑制作用は保たれていた。4)膜リン脂質であるPIP2はこのCa^<2+>によるチャネル蛋白性質の変容作用を防止した。5)これらの結果から、Ca^<2+>は膜内のPIP2の濃度を減少させることによりチャネルのトルブタミドとADPに対する感受性に変化を及ぼすことが考えられた。このことはSURからKir6.2への信号の伝達過程にPIP2が必要であることを示唆する。また、細胞内ATPはPIP2と共同してこれらSUR/Kir6.2蛋白間の機能的関連を保持する作用があることも明らかになった。6)また、心臓においても同様なチャネルが発現しているが、PIP2を減少させる作用を細胞外受容体(ATP受容体)を介して適用すると、KATPチャネルの活動の著明な低下がみられた。これらの研究成果は第41回日本糖尿病学会総会、第58回米国糖尿病学会、第64回日本循環器学会にて発表した。膵β細胞のATP感受性K^+チャネル(K-ATPチャネル)はインスリン分泌機構において極めて重要な働きをしている。本研究では、ATP感受性K^+チャネルのサブユニットであるスルフォニル尿素レセプター(SUR)、内向き整流性K^+チャネル(Kir6.2)蛋白間の情報伝達機序を明らかにすることを目的とし以下の実績を得た。1)トルブタミド(スルフォニル尿素薬)はK-ATPチャネルを抑制するが、細胞膜を高濃度のCa^<2+>(2μM)で処理すると本薬剤に対する感受性を減少した。5)これらの結果から、Ca^<2+>+は膜内のPIP_2の濃度を減少させることによりチャネルのトルブタミドとADPに対する感受性に変化を及ぼすことが考えられた。このことはSURからKir6.2への信号の伝達過程(スルフォニル尿素薬やADPの刺激の伝搬)にPIP_2が必要であることを示唆する。

また、ATPはPIP_2と共同してこれらの蛋白感の機能的連絡を有効に保つ作用があることも明らかになった。これらの研究成果は第41回日本糖尿病学会総会、米国糖尿病学会にて発表した。膵β細胞のATP感受性K^+チャネル(KATPチャネル)はインスリン分泌機構において極めて重要な働きをしている。このチャネルはβ細胞の静止膜電位を決定しているイオンチャネルであり、このチャネルの抑制はグルコース刺激時にみられる最初のβ細胞膜応答である。一方、スルフォニル尿素(SU)剤はその固有のレセプターに結合することによりKーATPチャネルの抑制をもたらし、インスリン分泌を刺激することが知られている。ATP感受性K^+チャネルのサブユニットであるスルフォニル尿素レセプター(SUR)、内向き整流性K^+チャネル(Kir6.2)蛋白間の情報伝達機序を明らかにすることを目的として本研究を遂行し以下の実績を得た。1)トルブタミド(スルフォニル尿素薬)はKATPチャネルを抑制するが、細胞膜を高濃度のCa^<2+>(2mM)で処理すると本薬剤に対する感受性を減少した。2)この時、チャネルのADPによって活性化される作用も同時に消失していた。3)しかし、ATPによるチャネル抑制作用は保たれていた。4)膜リン脂質であるPIP2はこのCa^<2+>によるチャネル蛋白性質の変容作用を防止した。5)これらの結果から、Ca^<2+>は膜内のPIP2の濃度を減少させることによりチャネルのトルブタミドとADPに対する感受性に変化を及ぼすことが考えられた。このことはSURからKir6.2への信号の伝達過程にPIP2が必要であることを示唆する。また、細胞内ATPはPIP2と共同してこれらSUR/Kir6.2蛋白間の機能的連関を保持する作用があることも明らかになった。6)また、心臓においても同様なチャネルが発現しているが、PIP2を減少させる作用を細胞外受容体(ATP受容体)を介して適用すると、KATPチャネルの活動の著明な低下がみられた。これらの研究成果は第41回日本糖尿病学会総会、第58回米国糖尿病学会、第64回日本循環器学会にて発表した。
脆弱X症候群の遺伝子解析

脆弱X症候群は遺伝性の精神遅滞の中では最も頻度の高い疾患であり臨床的に重要である。この疾患における遺伝子の異常は、正常者にみられる三塩基反復配列の数の多型がある範囲を逸脱して多くなるというものであり遺伝病の発症機序について新しい知見を加えた。白人集団におけるDNA解析では一部の患者においてはこのようなDNA増幅は観察されず、脆弱X症候群患者には分子的な異質性が存在する可能性が示唆された。本研究の目的は日本人脆弱X症候群患者においてDNA増幅のある患者の頻度を検討し遺伝子診断法を確立すること、および胎児診断などへの適応の可能性を探ることである。日本人で脆弱X症候群と診断されている患者とその家族149人について、主としてサザンハイブリダイゼーション法を用いて三塩基反復配列の増幅を検討した。ほとんどの家系で、正常者は正常パターンとなり、保因者、患者にはそれぞれ期待された増幅がみられた。正常者で異常な増幅がみられた例はなかったが、患者で増幅がみられない家系が3家系あった。一つの家系内の患者どうしで増幅の有無が相反することはなく、増幅がない家系では家系内のどの患者にも増幅はなかった。すなわち増幅がある家系では増幅と発症が完全に一致している一方、増幅のない家系は三塩基反復配列とは関係のない機序で疾患が起きていると考えられた。したがって、1つの疾患の分子的な異質性と考えるよりも、三塩基反復配列の増幅で起きている精神遅滞とそうでない精神遅滞を別の疾患と考えるのが適当と思われた。そのような観点からDNA解析を確定診断に使用することが可能であると考えられた。また、脆弱X症候群遺伝子(FMR-1)上流のCpG islandのメチル化について検討した結果、三塩基反復配列の増幅とメチル化は常に相関していることが分かった。
prologによるフランス語の自動構文分析とこれに関する動詞価の統辞・意味論研究

1.本研究は、プログラミング言語prologを用いて現代フランス語の重要な構文を自動解析するプログラムを作成するという「実践面」と、これを通して、構文の中心的担い手である動詞の統辞・意味論的諸特性を研究するという「理論面」という、ふたつの研究目的を持つ。2.第一章では、TENIEREに始まる「動詞結合価」の理論的基盤、とりわけ、「基本的補語」と「状況補語」(=「非基本的補語」)の区別の妥当性を、これまでに提案された幾つかの基準に照らして考察した。この2種類の補語の区別は、実際、いかなる結合価理論においても前提とされていると言えるが、区別を一挙に明確にするに足る基準は見いだしがたい。我々は、ある基本文全体の意味解釈ならぴにその文の動詞の用法に貢献するものを基本補語とするという、MELISの大原則を認め、個々の動詞をその用法ごとに記述しタイプ分けする方法が実際的と考える。一方、様々な状況補語については、それが基本文とその諸要素からいかなる生起の制限を受けるかを明確にしなければならない。3.第二章では、理論的枠組みは異なるものの上述の原則をフランス語の動詞記述に実践的に適用したと言えるM.GROSSらの「語彙文法」の研究成果を参照し、基本文を補足節を含む文に限定して、構文タイプごとに補語の統辞・意味的特性を具体的例文にあたって検討した。語彙文法の理論では補足節を含む文は「二文変形」から成るものであり、基本文の埋め込み(再帰)を含むだけに、計算機上での自動分析の試みに面白みを加えるからでもある。4.第三章では、我々の試作したprologによる補足節構文の分析結果を提示した。トップ・ダウン型分析法によるこのプログラムは構成素を基本的形式単位とし、より抽象的な機能単位は含んでいないが、分析結果を読みやすくするために、便宜的に直接・間接補語などの機能的ラベルを出力するモジュールを含んでいる。また、不定詞節の「意味上の主語」や代名詞の「先行詞」なども分析出力し、文の意味解釈への試みも示した。今後、補足節を持たない動詞についても語彙部を充実させ、状況補語を取り込むところまで至ることができれば、より現実的で興味ある文の分析に近づくことができるであろう。なお、第四章にはプログラムの主要部分と語彙部のサンプルを提示した。1.本研究は、プログラミング言語prologを用いて、現代フランス語の中心的構文を持つ文を自動解析するプログラムを作成することを目指しつつ、これ通して、構文の重要な担い手である動詞の統辞・意味論的研究を進めることを目的としている。この2つの目的を、便宜上、「実践面」および「理論面」の研究と呼ぶ。2.理論面では、「動詞結合価」の理論を中心に、本年度は、とりわけ、A.MARTINETの機能文法における扱いとM.GROSSらのlexiqueーgrammaireにおける扱いの相違を明らかにすることに力を注いだ。両者の間には、「結合価」理論の中に「機能」という概念を如何に取り込むかについて大きな相違があることが明らかになった。3.文の構成素の表面的形態、それが相々な異なる文脈でとる統辞上の行動(代名詞化、疑問詞化など)、それの表す意味などの観点から、現代フランス語の記述にとって必要な機能単位を幾種認めるべきかについて、全般的な考察をおこなった。理論面における未解決の問題も少なくはなく、更なる考察は来年度も続けるが、現段階では、一般に認められている主語、直接機能、間接機能、与格機能、時・場所の状況機能などを措定し、実践面での自動構文分析の結果もこのような単位として出力する方向で研究を進めている。4.実践面のプラグラム作成では、「確定節文法」に基づくトップ・ダウン型分析法により、直接・間接目的機能の補足節、間接疑問節の自動分析については、前編集のない文を入力し、これに形態素修正を加え、更に、文中の活用した動詞形を不定詞に戻して辞書を検索するという手順を踏んで、文を機能的構成単位として出力するプログラムを作成した。理論面での進展に伴って、扱える動詞、形容詞の数と構文の種類を増やしてゆくことが来年度の研究の中心課題となるが、本年度の成果はこの目的に対して明るい見通しを与えるものと信じている。

3.第二章では、理論的枠組みは異なるものの上述の原則をフランス語の動詞記述に実践的に適用したと言えるM.GROSSらの「語彙文法」の研究成果を参照し、基本文を補足節を含む文に限定して、構文タイプごとに補語の統辞・意味的特性を具体的例文にあたって検討した。語彙文法の理論では補足節を含む文は「二文変形」から成るものであり、基本文の埋め込み(再帰)を含むだけに、計算機上での自動分析の試みに面白みを加えるからでもある。4.第三章では、我々の試作したprologによる補足節構文の分析結果を提示した。トップ・ダウン型分析法によるこのプログラムは構成素を基本的形式単位とし、より抽象的な機能単位は含んでいないが、分析結果を読みやすくするために、便宜的に直接・間接補語などの機能的ラベルを出力するモジュールを含んでいる。また、不定詞節の「意味上の主語」や代名詞の「先行詞」なども分析出力し、文の意味解釈への試みも示した。今後、補足節を持たない動詞についても語彙部を充実させ、状況補語を取り込むところまで至ることができれば、より現実的で興味ある文の分析に近づくことができるであろう。なお、第四章にはプログラムの主要部分と語彙部のサンプルを提示した。1.本研究は、プログラミング言語prologを用いて、現代フランス語の中心的な構文を持つ文を自動解析するプログラムを作成するという「実践面」と、同時にこれを通して、構文の重要な担い手である動詞の統辞・意味論的研究を進めるという「理論面」の2つを、有機的に結び付けようと試みるものである。2.理論面では、A.MARTINETの「機能文法」とM.GROSSらの「語彙文法」(lexique-grammaire)を中心に、それぞれの文法体系中で「動詞結合価」が如何に扱われているかを明らかにすることに力を注いだ。TESNIERE同様、依存文法の流れをくむ前者では、文は述辞を中心としこれに依存する様々な「機能(的単位)」から成り立つものとされるが、動詞に関して言えば、どのような動詞とも結びつきうる「非特有機能」と、ある特定の下位クラスとのみ結びつく「特有機能」が区別される。機能は、更に、その統辞上の行動を中心に、主辞・目的・間接・与格・随伴・具格・様態・時間・空間、等々に細分される。動詞の結合価は、結局、どの動詞がどのような種類の機能を幾つ取り得るかという問題となるが、個々の動詞に関する記述よりも機能の分類にもっぱら関心が注がれている。後者は、構成素文法とZ.HARRISの変形文法の流れをくむ。文構造の記述は、名詞句(N)と動詞(V)の形式上の結合に基づいて、10余りの「基本文」を認めるところから始まる。個々の動詞はいずれかの基本文をつくるものとして記述されるが、同時に、各動詞ごとに、基本文中の構成素の意味・統辞的諸特性、基本文の取り得る諸々の派生構文の有無が記述される。こうして8000余りの動詞について形式的・統辞的な詳細な記述を進めることにより、意味の側面に切り込むことを目指す。3.「語彙文法」の記述結果は、各動詞を見出しとする諸特性のマトリックスとして表されるが、これは我々の「実践面」のプログラム作成に極めて有用な資料となる。昨年までに作成した「確定節文法」に基づくトップダウン型の構文分析では、動詞辞書部において、各動詞の取り得る補語の種類、その省略の有無を明示しなければならない。辞書部を簡潔にする意味では、更に、派生構文の可能性も記述した方がよい。本年度は、GROSSらのデータを検証しつつプログラムで扱える文型と動詞を増やすことに力を注いだが、特性の数が多くなるとこれを如何に有効にプログラム用データとするかが難しい問題となりつつある。
カルシウムクロック機構の再構築と平滑筋組織ペースメーカーシミュレーション

(1)Ca2+クロックとイオンチャネルの機能連関によるペースメーカーモデル構築3型リアノジン受容体(RyR3)を介したCa2+遊離がペースメーカー電位発生・調律・伝播に果たす役割を明らかにするため、Ca2+活性化Cl-チャネル(TMEM16A)を定常発現させたHEK293細胞に、RyR3受容体を発現させて検討を行った。巨大タンパクであるRyR3を安定的に発現させるためにバキュロウイルス系による遺伝子導入法を用いた。その結果、細胞内Ca2+濃度上昇に同期した細胞膜電位の脱分極が観測され、ペースメーカー細胞のCa2+クロックによるペースメーキングをHEK293細胞で再現することができた。(2)Ca2+クロックによるペースメーキング電位発生機構の普遍性検討比較Ca2+活性化Cl-チャネル(TMEM16類)の分子機能として、Ca2+振動の電位変化へのシグナル変換素子としての機能を想定し、概日リズムの形成に関与する松果体でのTMEM16の発現及び機能の解明を目指した。これまで、松果体細胞における短周期のCa2+クロック機構が存在すること、またTMEM16A,TMEM16Bが高発現し、ヘテロ二量体を形成することを見出した。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、ペースメーカー電位発生細胞でのペースメーカー電位発生機構を解明することである。Ca2+活性化Cl-チャネル(CaCC)は自発収縮能を有する門脈平滑筋において、そのペースメーカー活性を制御すると報告されたが、その分子実体は不明であった。ところが近年、TMEM16AがCaCC活性を持つことが報告されたことから、このTMEM16Aが門脈平滑筋のペースメーカー電位発生機構に関与するか調べた。TMEM16A特異的阻害薬によってCaCC電流のうち約60%が阻害され、門脈組織の自発的収縮も消失した。TMEM16Aにはadの4つのバリアントセグメントが含まれており、これらの部位の発現変化で複数のスプライスバリアント体が生じる。RT-PCRの結果、門脈平滑筋においてはabc体とacd体が90%を占めた。更に1分子イメージング解析より、abc体とacd体はそれぞれホモあるいはヘテロ2量体を形成することを明らかにした。また、アクチン重合阻害薬であるCytochalasin Dを用いて細胞骨格のCaCC活性に対する影響を調べたところ、CaCC電流の脱活性化時定数が延長し、ペースメーカー活性に対して細胞骨格が関与することが示唆された。我々は日内リズムの調節に重要な器官である松果体において、自発的かつ周期的な細胞内Ca2+濃度上昇(Ca2+オシレーション)が生じることを発見した。このCa2+オシレーションはアセチルコリン(ACh)あるいはニコチンによっても誘発され、細胞膜の脱分極と同期し、ニフェジピンによって阻害された。メラトニンの分泌量を測定したところ、ノルエピネフリンの投与により分泌量は増強し、AChの投与によって抑制された。このように、L型電位依存性Ca2+チャネルの開口によるCa2+オシレーションは細胞内Ca2+濃度上昇を引き起こし、メラトニン分泌を負に制御していることが示唆された。門脈平滑筋組織において、組織標本や単離細胞を用いた機能解析とmRNA発現解析により、TMEM16Aが門脈平滑筋ペースメーカー活性に対して重要な役割を担うことを明らかにした(2報発表)。また、中枢系のホルモン分泌組織である松果体においても、カルシウムオシレーションが生じ、メラトニン分泌量の制御に関与することを明らかにした(1報発表、2報投稿準備中)。この成果は概日リズム形成の分子基盤の解明に大きく寄与するものである。(1)Ca2+クロックとイオンチャネルの機能連関によるペースメーカーモデル構築:細胞内Ca2+遊離チャネルの3型リアノジン受容体(RyR3)をHEK細胞に強制発現させ、同受容体を介したCa2+遊離がペースメーカー電位発生・調律・伝播に果たす役割を、TMEM16Aとの共発現系で検討する。

従来通り発現ベクターを用いて進めると共に、Tet-Onシステムあるいはウイルスベクターを用いて、より発現効率のよい系を確立することも目指す。(2)生体内Ca2+クロック機構の解明:ミトコンドリア呼吸リズムと小胞体間の機能的一体性が生じ、Ca2+オシレーションを安定的に発生させると推測している。消化管・門脈等のペースメーカー部位の微小標本を用い、細胞内局所におけるミトコンドリア呼吸リズムと小胞体間でのミトコンドリア膜電位と細胞内Ca2+動態の関係を共焦点蛍光顕微鏡及び全反射顕微鏡で高速で同時記録し、Ca2+クロックの発生機序の解明に挑む。(3)Ca2+クロックによるペースメーキング電位発生機構の普遍性検討比較:TMEM16類の分子機能として、Ca2+振動の電位変化へのシグナル変換素子としての機能を想定している。中枢神経系を中心にTMEM16類の発現部位を探索し、自律性Ca2+振動(Ca2+クロック)を起源とするペースメーカー的な電気活動へのTMEM16類の寄与の普遍性を検討する。申請者らは既に松果体においてTMEM16Bが高発現していること見出し、Ca2+クロックから活動電位の発生へのシグナル変換にTME16Bが寄与している可能性を見出した。松果体でのCa2+クロックの発生機序とペースメーカー的な電気活動へのTMEM16Bの寄与をさらに解明する。(4) Ca2+透過チャネルのペースメーカー電位への寄与の検討:平滑筋臓器でのICCペースメーカー細胞でのCa2+クロックに対する、Ca2+透過チャネル(電位依存性Ca2+チャネルや容量依存性Ca2+チャネル)の寄与を明らかにする。
口腔自然免疫応答と口腔発がんのクロストーク

ヒト遺伝子発現において,3'UTR中にAUUUA配列を有するいわゆるARE-mRNAはRNAの半減期が厳密に制御されていることが知られている。我々は種々のARE-mRNAの中でHIF-1αの3'UTRが、他のc-myc,c-fosなどのARE-mRNAとは異なった制御を受けている可能性を見出した。同じ乳がん細胞株でもMCF7に比較して悪性度が高いとされるMDA-MB-453では特にHIF-1αの3'UTRを介したRNA安定化が亢進しており、これには悪性度と相関していると考えられた。また、一部の口腔がん細胞においても同様の現象が確認された。HIF-1αのmRNAが安定化し、タンパク質発現が亢進することにより血管誘導・浸潤能亢進・上皮間葉移行などの悪性化につながるシグナル伝達が正に制御されていることが示唆された。平成22年度においては、ラット歯髄細胞由来のRPC-C2Aと肺がん細胞H1299において、アデノウイルスE1AによるNF-kB抑制能発現に差異があることを発見した。両細胞の差はがん抑制遺伝子p53がH1299において欠損していることであり、E1AによるNF-kB抑制には内在性のp53発現が必要であることが疑われた。そこで我々はNF-kBとp53の結合を疑い、免疫共沈法によりこの反応を確認した。さらにGSTプルダウン法をあわせて行うことにより、p53のC末端領域に結合ドメインが存在することを突き止めた。しかしながらその生理活性を解析してみるとC末端領域だけでなくN末端領域にも抑制活性に必要な領域があることがわかった。次年度はこのドメインに結合するタンパク質のクローニングを行っていく予定である。次に我々は、両転写因子が直接結合することから自然免疫刺激によって活性化される(核移行)NF-kBがp53の転写活性化能を阻害するのではないかと考え、p21のプロモーター領域を組み込んだルシフェラーゼ・プロモーターを用いて検討した。予想どおり過剰に発現させたNF-kBによりp53の転写活性化能は著しく抑制された。この事実は口腔細菌による自然免疫刺激が、がん抑制遺伝子の働きを負に制御している可能性を示すものであり、本研究の目的の一つである、口腔細菌感染による口腔発がんあるいはがんの悪性化のメカニズムの一端を示すものと考えられた。次年度においては軟寒天コロニー法などの併用により、上記メカニズムとがんの悪性化についてより詳細な検討を行なっていく。in vitroの感染実験系においてアデノウイルスEIAによるNF-kB抑制には内在性のp53発現が必要であることが証明された。またp53強発現によりNF-kBのサブユニットRe1Aユビキチン化依存的に分解されることを突き止めた。この事実は自然免疫刺激が、がん抑制遺伝子の働きを負に制御している可能性を示すものであり、本研究の目的の一つである、口腔細菌感染による口腔発がんあるいはがんの悪性化のメカニズムの一端を示すものと考えられた。また、自然免疫刺激によるNF-kB活性化が、一部のAREメッセージの安定化を誘導することも見出されており、自然免疫系のアゴニストが腫瘍プログレッションにおいて重要な役割を有することが証明されつつあると考えられる。これまで、in vitroの感染実験系においてアデノウイルスE1AによるNF-kB抑制には内在性のp53発現が必要であることが証明された。

またp53強発現によりNF-kBのサブユニットRelAがユビキチン化依存的に分解されることを突き止めた。最終年度は、p53のN末端領域がユビキチンリガーゼ結合領域、C末端領域がNF-kBとの結合領域でありこれら3分子の複合体形成がNF-kBのプロテアソームを介した分解に必須であるという仮説に基づき、p53に結合することが報告されているユビキチンリガーゼがNF-kB抑制有するか否かを検討した。Mdm2、MdmX、Socs1、VHL、Pirh2などの中でMdm2はp53と協調的にNF-kB分解を促進した。さらにMdm2との結合能のみを欠失したp53はNF-kBを抑制できなかった。さらに、ヒトアデノウイルスは感染初期に宿主細胞の内因性p53を安定化させることも確認した。以上より、我々の実験系において、アデノウイルスはTLR2により認識されNF-kBが活性化されるが、同時にp53の安定化を誘導することによりNF-kBをユビキチン化経路にて分解し、自然免疫系から逃避することが確認された。研究計画通りの結果が得られている。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画に大きな変更予定はない。自然免疫系のアゴニストが腫瘍プログレッションにおいて重要な役割を果たすことを証明していく。
甲状腺ホルモン濃度操作によるブタの筋線維タイプ改変に関する研究

胎齢18日目から21日齢にラットの甲状腺ホルモン分泌を抑制したときに、MHCの各タイプのmRNA発現量にどのような影響をおよぼすかを明らかにした。妊娠18日目から雌ラットにPTU(15ppm)を溶解した水道水を給与し、対照区には水道水のみを給与した。21日齢の産仔から腓腹筋を採取し、MHCのmRNA発現量を測定した。embryo型およびneonatal型の発現量は、甲状腺ホルモン分泌を抑制した産仔のほうが高かった。一方、adultタイプのMHCの各タイプの発現量は、いずれも甲状腺ホルモン分泌を抑制した産仔のほうが低かった。産仔の甲状腺ホルモン分泌が抑制されたことで筋形成も遅延したと考えられる。本研究では、ブタのパイロット動物としてラットを用い、出生前後の筋肉におけるミオシン重鎖タンパク質の各アイソフォームのmRNA発現量の変化を明らかにするとともに、この発現量の変化に甲状腺ホルモンが関与しているか明らかにすることを目的として実施している。以上の目的のために、以下の2つの動物実験を実施した。1妊娠ラットを飼育し、出生時、離乳時(3週齢)、6週齢に子ラットから胸最長筋と腓腹筋を採取した。採取したサンプルから総RNAを抽出し、ミオシン重鎖タンパク質の胎児型、新生児型、1型、2A型、2X型、2B型のmRNA発現量をPCR法で解析する予定である。2妊娠14日目の雌ラットを導入し、妊娠18日目から飲水中に抗甲状腺剤プロピルチオウラシル(PTU)を15ppmのレベルで混ぜて給与した。出生時、離乳時(3週齢)、6週齢時に子ラットから胸最長筋と腓腹筋を採取した。血清分離時のトラブルで離乳時の母ラットと3週齢の子ラットの血清を得ることができなかったので、甲状腺ホルモン濃度を確認できなかった。しかし、離乳時の対照区の子ラットの平均体重が48gだったのに対し、PTU投与区は27gだったことから、授乳中の母ラットへのPTU投与によって、子ラットの甲状腺ホルモン濃度は低下していたと考えられる。1と同様に、採取したサンプルから総RNAを抽出し、ミオシン重鎖タンパク質の胎児型、新生児型、1型、2A型、2X型、2B型のmRNA発現量をPCR法で解析する予定である。本研究は、ブタのパイロット動物としてラットを用い、出生前後の筋肉におけるミオシン重鎖タンパク質の各アイソフォームのmRNA発現量の変化に、甲状腺ホルモンが関与しているかどうか明らかにすることを目的として実施している。さらに、タウリンの経口投与で筋形成を促進できる可能性があることから、妊娠から授乳中の雌ラットへのタウリン投与が、子ラットの筋肉の発達に及ぼす影響についても検討している。1妊娠14日目の雌ラットを導入し、抗甲状腺剤プロピルチオウラシル(PTU)を15ppmの濃度で飲水中に混ぜて、妊娠18日目から給与した。出生時と離乳時に子ラットから胸最長筋と腓腹筋を採取した。離乳時の対照区の子ラットの体重は50.7gであったのに対し、PTU投与区は30.4gだった。2出生時のラットの脚の筋肉では、胎児型、新生児型、1型のMHC mRNAの発現量が高く、2A、2X、2B型の発現量は低いことを確認した。315週齢の雌ラットを妊娠させ、妊娠期間中は0.5、1.0、2.0%の濃度でタウリンを飲水中に混ぜ、授乳期間中は0.25、0.5、1.0%の濃度でタウリンを飲水中に混ぜて給与した。離乳時の子ラットの腓腹筋重量の体重に対する比率(%)は、対照区、0.5%区、1.0%区、2.0%区の順に、0.84、0.79、0.80、0.79となり、タウリンを投与した3区の値が対照区よりも低くなった。タウリンは筋形成を促進させると予想したが、予想とは逆の結果になった。PTUを投与する動物実験は終了したが、ミオシン重鎖タンパク質のmRNA発現量の分析が遅れているため。子ラットが3週齢に達した時点で腓腹筋と胸最長筋を採取し、MHCのmRNA発現量を測定した。腓腹筋ではMHC1、2A、2X、2BのmRNA発現量がPTU区で低くなったのに対し(P<0.01)、embryoとneonatalタイプのMHCのmRNA発現量はPTU区のほうが高かった(P<0.01)。胸最長筋では、MHC2A、2X、embryoならびにneonatalタイプの結果は腓腹筋と同様だったが、MHC1と2BのmRNA発現量はPTU投与の影響をうけなかった。妊娠終盤から授乳期にかけて雌ラットにPTUを投与すると、子ラットの筋線維のadultタイプへの発達が阻害された。14週齢のラットの雄と雌を導入し、1週間の馴致後に交配した。妊娠を確認した雌ラットに、タウリン無添加(対照区)、同0.5%添加、同1.0%添加、同2.0%添加の水道水を給与した。授乳中はラットの飲水量が増加するので、各々のタウリン添加水準を半量にした。

腓腹筋の重量が体重当たりに占める割合は、タウリンを給与した雌ラットの子が対照区の子ラットと比較して低かった(P<0.05)。タウリンを給与した雌ラットの子の腓腹筋のMHC2BのmRNA発現量の平均値は対照区と比較して低かった。AdultタイプのMHCタンパク質の中でも、MHC2Bの発現が最後に高くなることを考えると、タウリンを給与した母ラットの子は、筋肉の発達が遅くなった可能性がある。母ラットの血漿と腓腹筋中の遊離タウリン含量は、飲水へのタウリンの添加水準に用量依存的には増加せず、筋肉中の遊離タウリンの含量の平均値は0.5%区のほうが2.0%区よりも高かった。飲水へのタウリン投与水準が高くなると、筋肉へのタウリンの取り込みが影響を受けるのかもしれない。胎齢18日目から21日齢にラットの甲状腺ホルモン分泌を抑制したときに、MHCの各タイプのmRNA発現量にどのような影響をおよぼすかを明らかにした。妊娠18日目から雌ラットにPTU(15ppm)を溶解した水道水を給与し、対照区には水道水のみを給与した。21日齢の産仔から腓腹筋を採取し、MHCのmRNA発現量を測定した。embryo型およびneonatal型の発現量は、甲状腺ホルモン分泌を抑制した産仔のほうが高かった。一方、adultタイプのMHCの各タイプの発現量は、いずれも甲状腺ホルモン分泌を抑制した産仔のほうが低かった。産仔の甲状腺ホルモン分泌が抑制されたことで筋形成も遅延したと考えられる。飲水中に抗甲状腺剤プロピルチオウラシル(PTU)を15ppmのレベルで混ぜて妊娠から授乳期の母ラットに給与すると、離乳までの子ラットの増体を阻害できることを確認するなど、動物実験は順調に進捗している。これから、ミオシン重鎖タンパク質の発現量の解析に着手する。PTUを投与する動物実験は終了したので、最終年度はミオシン重鎖タンパク質のmRNA発現量の分析を終了させる。タウリン給与試験は各区3反復が終了したところなので、あと1反復の動物実験を実施するとともに、筋形成について解析する。家畜栄養動物実験については、研究実績の概要に記入した2の実験をもう一回実施する予定にしている。離乳時の子ラットは体重が小さく採血に工夫が必要である。タウリンの経口投与で筋形成を促進できる可能性があるので、妊娠から授乳中のラットへのタウリン投与が、出生前後の子ラットの筋肉におけるミオシン重鎖タンパク質の各アイソフォームのmRNA発現量の変化についても併せて検討し、甲状腺ホルモン濃度との関連を検討する。動物実験は順調に進んだが、採取したサンプルの解析が計画よりも少し遅れており、試薬など消耗品の購入額が予定よりも低くなったため。平成26年度は初年度にあたり、おもに動物実験を行ったが、物品費として支出した額で、必要な実験動物、飼料、試薬などの消耗品などを購入することができたため。サンプルの解析を終了させるために、試薬などの消耗品を計画通りに購入する。平成27年度はこれまでの動物実験で取得したサンプルの分析も並行して実施するので、おもに試薬などの消耗品の購入に充てる予定にしている。また、必要に応じて、組織をホモジナイズする機器の購入を検討する。
温熱治療応用を目的とした金銀コアシェルナノロッドの作製

ナノテクノロジーは様々な分野で用いられている有効な技術である。特に、ナノマテリアルは診断、イメージングツール、治療のアプリケーションとしての利点を有している。金ナノ材料(金コロイドと金ナノロッド)は現在バイオテクノロジーとしてのイメージングツールや癌治療として注目されている。我々は、金ナノ粒子の癌治療への応用を検討している。そのため、はじめに界面化学技術を用い金ナノ粒子の安定化のため、生物、化学機能材料のポリマー合成の研究を行うことで、新しい分散剤を開発した。この分散剤(PEG-g-Py)はタンパク質非特異的吸着を抑制するポリエチレングリコール(PEG)とピリジン(Py)からなるコポリマーで金ナノロッドの安定性を維持するために利用されている。その上、金ナノロッドは熱変換効特性を持っている特徴を利用し、新しい分散剤の技術を組み合わせることで、我々は癌の温熱療法のための金銀コアシェルナノロッドを開発した。このナノロッドは、熱変換効率を高めるため金ナノロッドの周りに銀の薄膜をコートしたナノ粒子である。我々はPEG-g-Pyでコートされた金銀コアシェルナノロッドの新規特性の研究を行った。さらにPEG-g-Pyをコートした金銀コアシェルナノロッドの癌温熱療法へ適用できることを確認した。抗癌剤を使用しない癌治療として金ナノロッドを用いた治療法が注目されている。温熱治療の際に、熱変換効率の高い金銀コアシェルナノロッドを使用することで、今までの金ナノロッド以上に効率のよい治療法を開発することが期待される。本年度の目的は、温熱療法に応用可能な金銀コアシェルナノロッドを作製することである。金銀コアシェルナノロッドを作製する手順として、(1)金ナノロッドを作製する。(2)次に当研究室で開発された分散安定剤を金ナノロッドにコートする。(3)最後に銀を金ナノロッドにコートすることで金銀コアシェルナノロッドを作製する。以上の手順が必要になる。(1)金ナノロッドはすでに報告されている手法を参考にし、界面活性剤であるCTABを使用することで作製できることを確認した。作製した金ナノロッドの吸収波長を確認しつつ、作製時に最適な条件を検討した。(2)作製した金ナノロッドに当研究室で開発された分散安定剤であるPy-g-PEGをコートすることで、分散安定性のよい金ナノロッドが作製することを確認した。(3)Py-g-PEGをコートした金ナノロッドに銀をデポジットさせる量を条件検討することで、金銀コアシェルナノロッドを作製することに成功した。電子顕微鏡による形状観察、粒子の安定性を解析することにより物性評価を行った。本年度は、物性評価を行った金銀コアシェルナノロッドの近赤外光照射による温度応答変化を解析。さらに培養細胞への投与による安全性を確認と温熱効果による癌細胞の治療の可能性を検討していく予定である。本年度は、Au-Ag nanorodの安全性の確認を行ったAu-Ag nanorodを作製、温度上昇効果を確認後に培養細胞で安全性を確認する。実験段階として以下のようにいくつかにわけて確認した。(i)レーザーを用いて近赤外光を細胞へ照射することにより細胞の影響を検討した。実際に用いるレーザーの強度を検討する必要があり、近赤外光を照射することでの細胞に対して影響がないことを確認した。ナノロッドにレーザーを当てない状態では、細胞に毒性が現れないことが確認された。あわせて、レーザー自体には影響がないことを確認した。(ii)Au-Ag nanorodの細胞内への取り込みを確認する。Au-Ag nanorodはナノ粒子なので細胞内へエンドサトーシスにより、とりこまれる可能性が高い。そのため細胞内へ取り込まれた後の金銀ナノ粒子の細胞内の影響を時間依存的とAu-Ag nanorodの投与量依存的に観察することにより、細胞毒性が見られるのか検討した。Au-Ag nanorodに蛍光物質を付加した分散剤をコートした。しかし、ナノロッドにコートした蛍光物質を検出することができなかった。

そこで、現在用いている分散剤の形状を他の蛍光物質を付加できるようにするため、構造を変更する検討を行った。細胞培養内の可視化はできなかったが、金銀コアシェルナノロッドの作製と安全性についての確認までは行うことができた。