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超効率的遺伝子発現制御に向けた人工核酸類の創製

ポストゲノム時代において、遺伝子を標的とした医薬品の開発研究並びにその基礎研究が極めて重大な意義を持つことは言うまでもない。申請者らはこれまでにいくつかの人工ヌクレオシド類の合成を行い、それらを導入したオリゴヌクレオチド(ODN)類の機能評価を行ってきた。その中で、糖部立体配座をRNAと同じN型に固定化した人工ヌクレオシド類(BNA)をODNへと組み込むことにより、相補鎖RNAに対してこれまでに類を見ないほど優れた結合親和性を示すという興味深い知見を得ている。本研究ではBNA類を導入したアンチセンス分子の遺伝子発現制御能について詳細に検討を加え以下のような知見を得た。1.各種非天然核酸塩基を有するBNA類の効率的合成昨年度までの研究により、安価でかつ大量合成にも適したBNA類の合成系路を開拓してきた。本年度は、これらの知見を基に、優れた機能性発現が期待できる非天然型核酸塩基を各種設計・合成し、BNA類への導入を検討した。その結果、D-グルコースやD-リボースを出発原料として用いることにより、種々の非天然型核酸塩基(オキサゾール、ピリドン等)を有するBNA類の効率的合成経路を確立することができた。2.BNA修飾型アンチセンス分子の機能評価合成に成功したBNA類をDNA合成機によりODNへと導入し、各種BNA修飾型アンチセンス分子を作成した。培養細胞系におけるレポーター遺伝子の発現量を指標に、これらBNA型アンチセンス分子の機能評価を行ない、その優れた遺伝子発現制御効果を明らかにした。また、これらBNA型アンチセンス分子は、従来アンチセンス法で問題となっていた標的mRNAの二次構造の影響をほぼ受けず、極めて強力な遺伝子発現制御を可能にすることがわかった。この結果、アンチセンス法の適応範囲を大きく拡大し、その実用化を一気に推進し得るもので、国内外を問わず極めて重要且つ意義深いものである。1.人工ヌクレオシド(BNAモノマー)の効率的な合成系路の開拓既に申請者らは糖部の立体配座をN型に固定化した人工ヌクレオシド(BNAモノマー)を始めとする各種ヌクレオシド類縁体の合成に成功している。しかし実用化を念頭に置いた人工核酸類の創製研究には比較的大量のヌクレオシド類縁体の合成が必要となるため、本年度は、安価でかつ大量合成にも適した合成系路の開拓を行なった。これまでの経路では出発原料として比較的高価な天然のリボヌクレオシドを用いていたが、ここでは安価で大量に入手可能なD-グルコースを出発原料として用いる経路について検討を加えた。その結果、D-グルコースから導いたジアセタート体を共通中間体とし、これに対し天然型、非天然型核酸塩基を導入する効率的経路の確立に成功した。本経路の確立により、各種核酸塩基を導入したBNAモノマー類の大量調製が可能となった。2.BNAを素子として用いた人工アンチセンス・リボザイム分子の合成上記合成経路によって得られたBNAモノマー類を、常法に従いアミダイト体へと導いた後、DNA合成機によりオリゴヌクレオチドへと導入した。ここで標的とした配列は、ガン関連遺伝子のmRNAに対して相補的なアンチセンス配列、SHELX法によりその活性が見い出されてきたDNAzyme配列、及び、ホモプリンーホモピリミジン配列を有する二重鎖DNAに対し三重鎖を形成させるためのTFO配列である。これらの配列中の任意の位置にBNAモノマーを導入した各種人工オリゴヌクレオチド類を効率的に調製することに成功した。次年度はこれら人工オリゴヌクレオチドを用いた遺伝子発現制御について詳細な検討を進める予定である。
リパーゼのランダム変異による光学活性α-アシルグリセロール合成の最適化

リパーゼを触媒としたモノアシルグリセロールの合成を行った。研究の目的は、天然に豊富に存在する光学活性アシルグリセロールをリパーゼを用いて合成し、その反応条件を最適化することにあった。そこで、Candida antarctica由来のChirazyme L-2を用いてエナンチオ選択性を調べ、反応をモニターするための方法論を確立した。興味深いことに、環状の脂肪族酸無水物からはS体が得られ、芳香族酸無水物はR体を与えた。この理由を調べるために、現在、共役二重結合を有する脂肪族がR体を与えるか否かを検討中である。さらに、上記の研究と併行して、有用生理活性物質の創製研究を展開しつつある。具体的にはミコフェノール酸をリード化合物として、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)の阻害剤の設計と合成を行っている。現在までに、HDACの活性部位の存在するZnイオンとキレート形成が期待できるミコフェノール酸から、そのヒドロキサム酸の合成に成功している。反応条件の最適化およびミコフェノール酸を増炭した酸を出発原料としてたヒドロキサム酸の合成を検討中である。また、ビアコアを用いてミコフェノール酸ならびにその誘導体と核内受容体との相互作用の直接証明を行うべく検討を始めている。リパーゼ触媒による酸無水物からの光学活性α-モノアシルグリセロールの合成(日本農芸化学会2003年度大会で発表)一方、α-モノアシルグリセロールの光学純度を向上させるために、Candida antarctica由来のリパーゼBのランダム変異を計画した。その第一歩として、まずはその遺伝子を得ることが必要であるが、遺伝子源としてのCandida antarcticaの菌株はデンマークのノボ社のものであり、入手することはできない。そこで、公開されている遺伝子情報を基に90塩基のオリゴヌクレオチドを30塩基ずつ重なるように16個設計し、そのオリゴヌクレオチド断片からアセンブリーPCR法を用いて全長1014塩基対のリパーゼB遺伝子を合成することに成功した。遺伝子構造は、シーケンシングにより確認した。
多バンド系の励起子相におけるFFLO状態と新奇超伝導の理論

遷移金属カルコゲナイドTa2NiSe5は、328Kで構造相転移を示すとともに、低温相で価電子バンドの平坦化が観測され、励起子相の有力な候補物質として近年活発に研究されている。特に、圧力印加に伴い、常圧の半導体から次第に半金属的となり、励起子秩序が消失する8GPa付近で超伝導が発現することから、励起子揺らぎと超伝導の係わりに注目が集まっている。これまで、第一原理バンド計算を再現する、2つの伝導バンドと1つの価電子バンドからなる3バンドハバード模型に基づき、伝導電子と価電子間のサイト間クーロン相互作用Vの効果を平均場近似および乱雑位相近似(RPA)の範囲で調べ、半金属状態において伝導バンドと価電子バンドのネスティングベクトルQに対応する重心運動量をもつFFLO励起子相が実現すること、また、その揺らぎを媒介として、クーパー対が有限の重心運動量をもつFFLO超伝導が実現することを示した。一方、常圧や低圧の半導体的状況においては、励起子対のpreformed-pairやBCS-BECクロスオーバーが示唆され、強結合状態の重要性が認識されている。そこで、本年度は強相関・強結合効果の記述に有効な動的平均場理論(DMFT)を上記の3バンドハバード模型に適用し、これまでの平均場近似やRPAで得られた結果と比較・検討した。その結果、平均場近似やRPAでは、オンサイトクーロン相互作用Uを考慮すると、Vの効果による励起子状態よりも電荷密度波状態(CDW)が安定化されたのに対して、DMFTでは現実的なUとVの値に対して、励起子状態がCDWよりも安定化されることが分かった。また、励起子相への転移領域では、擬ギャップ的な1粒子スペクトル関数が得られることも分かった。従来の研究に用いてきた平均場近似および乱雑位相近似では考慮されなかった強相関・強結合効果を十分に考慮できる動的平均場理論を用いることにより、現実的なオンサイトとサイト間のクーロン相互作用の値に対して、励起子状態が電荷密度波状態よりも安定化される結果を得たこと、また、励起子相への転移領域では、擬ギャップ的な1粒子スペクトル関数が得られことは、強相関・強結合の基礎理論としてだけでなく、現実のTa2NiSe5における励起子相の実現可能性を理論的にサポートする意味でも重要な結果と考えられる。FFLO励起子状態の発現機構は、フェルミ準位近傍のバンド構造やフェルミ面の詳細に大きく依存するため、圧力下の正確なバンド構造を決めることが重要となる。そこで、鉄系超伝導体などの研究で行ってきたように、第一原理計算と最局在ワニエ関数を用いて、各圧力に対する現実的な低エネルギーの多バンド有効模型を導出する。この有効模型に基づいて、Ta2NiSe5の励起子相の温度ー圧力相図を求める。その際、伝導バンドと価電子バンドのバンド間クーロン斥力(即ち電子ー正孔間の引力)相互作用と、斜方晶から単斜晶への構造相転移に関与する局所フォノンと電子との相互作用の効果を、平均場近似やRPAに加えて、動的平均場理論も用いて考慮する。これにより、半金属の弱結合BCS領域から半導体の強結合BEC領域にわたる全パラメータ領域で定量的に信頼性のある相図を完成させる。また、DMFTで得られた自己エネルギー補正に基づいて、特にBEC領域で重要となる励起子相の転移温度以上の正常相における電子ー正孔対形成の前駆現象の効果(擬ギャップなど)についても調べる。励起子秩序を示す候補物質として最近注目を集めているTa2NiSe5は、328Kで構造相転移を示すとともに、低温相で価電子バンドの平坦化が観測され、理論実験の両面から近年精力的に研究されている。これまでの研究では、Ta2NiSeを記述する1次元3鎖ハバード模型に対してTa-Ni間のクーロン相互作用Vを平均場近似の範囲で考慮し、圧力下の半金属状態において伝導バンド(2重)と価電子バンド(1重)の縮重度の違いにより必然的に生じる電子と正孔のインバランスにより、励起子が電子ー正孔フェルミ面間のネスティングベクトルに対応する有限の重心運動量Qを持つFFLO励起子状態が安定化されることが示されていた。本研究では、現実的な鎖間トランスファーを考慮することにより模型を2次元に拡張した擬1次元3鎖ハバード模型を導入し、半金属状態において実現するFFLO励起子状態が、従来の1次元模型でも得られていた比較的低圧領域でのq=(qx,0)のFFLO1状態に加えて、高圧下でのq=(qx,π)のFFLO2状態、さらに、低圧、低温領域におけるq=(0,π)のFFLO3状態の3状態となることを示した。さらに、この擬1次元3鎖ハバード模型に対して励起子揺らぎの効果をRPAの範囲で調べ、励起子揺らぎを媒介とする超伝導が、FFLO1励起子相の近傍ではクーパー対がQ=(Qx,π)の重心運動量をもつFFLO超伝導、FFLO2励起子相の近傍ではQ=(Qx,0)の重心運動量をもつFFLO超伝導が実現することがわかった。

従来の研究に用いてきた1次元3鎖模型を拡張し、鎖間トランスファーの効果を考慮した現実的な擬1次元3鎖模型を導入した。その結果、従来の1次元3鎖模型では得られなかった新しいFFLO励起子相が見つかった。また、FFLO励起子相の近傍で増大するFFLO励起子揺らぎを媒介として、FFLO超伝導が実現することが示された。これらの研究の実施において、従来の研究に用いてきた数値計算手法の改善も行った。また、得られたFFLO状態は、励起子や超伝導機構として興味深いだけでなく、今後の実験の指針としても重要であると考えられる。これらの成果は、日本物理学会で4件の発表を行い、擬1次元3鎖模型のFFLO励起子相については既に論文が出版され、FFLO超伝導に関しても近日中に論文を投稿する予定である。以上から、本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。遷移金属カルコゲナイドTa2NiSe5は、328Kで構造相転移を示すとともに、低温相で価電子バンドの平坦化が観測され、励起子相の有力な候補物質として近年活発に研究されている。特に、圧力印加に伴い、常圧の半導体から次第に半金属的となり、励起子秩序が消失する8GPa付近で超伝導が発現することから、励起子揺らぎと超伝導の係わりに注目が集まっている。これまで、第一原理バンド計算を再現する、2つの伝導バンドと1つの価電子バンドからなる3バンドハバード模型に基づき、伝導電子と価電子間のサイト間クーロン相互作用Vの効果を平均場近似および乱雑位相近似(RPA)の範囲で調べ、半金属状態において伝導バンドと価電子バンドのネスティングベクトルQに対応する重心運動量をもつFFLO励起子相が実現すること、また、その揺らぎを媒介として、クーパー対が有限の重心運動量をもつFFLO超伝導が実現することを示した。一方、常圧や低圧の半導体的状況においては、励起子対のpreformed-pairやBCS-BECクロスオーバーが示唆され、強結合状態の重要性が認識されている。そこで、本年度は強相関・強結合効果の記述に有効な動的平均場理論(DMFT)を上記の3バンドハバード模型に適用し、これまでの平均場近似やRPAで得られた結果と比較・検討した。その結果、平均場近似やRPAでは、オンサイトクーロン相互作用Uを考慮すると、Vの効果による励起子状態よりも電荷密度波状態(CDW)が安定化されたのに対して、DMFTでは現実的なUとVの値に対して、励起子状態がCDWよりも安定化されることが分かった。また、励起子相への転移領域では、擬ギャップ的な1粒子スペクトル関数が得られることも分かった。従来の研究に用いてきた平均場近似および乱雑位相近似では考慮されなかった強相関・強結合効果を十分に考慮できる動的平均場理論を用いることにより、現実的なオンサイトとサイト間のクーロン相互作用の値に対して、励起子状態が電荷密度波状態よりも安定化される結果を得たこと、また、励起子相への転移領域では、擬ギャップ的な1粒子スペクトル関数が得られことは、強相関・強結合の基礎理論としてだけでなく、現実のTa2NiSe5における励起子相の実現可能性を理論的にサポートする意味でも重要な結果と考えられる。Ta2NiSe5の常圧及び低圧の半導体領域においては、低密度キャリアに起因する励起子対のpreformed-pairやBCS-BECクロスオーバーの可能性が議論されている。こうした励起子対の強結合状態と、半金属側の計算で示された非等価な伝導-価電子バンド数に起因するFFLO揺らぎとの関係を明らかにするために、平均場近似を超えて強結合効果を正確に扱える動的平均場理論(DMFT)を擬1次元3鎖模型に適用し、励起子揺らぎの発達による強結合状態について調べる。
解析関数の有限分割問題

実特異点の研究において、初期の頃のホイットニ-・トムによる層化理論やマザ-によるイデアルを用いた代数的道具の導入以降、発展的な結果は別として、道具となるべき手法は全く導入されなかった。本研究では、その新しい道具となるべきものとして、「解析関数の有限分割問題」に取り組んだ。この問題を解くということは、自然な定式化を与えることである。言いかえると、分割された関数の持つ弱い情報から、もとの関数の持つ強い性質を導くような分割に関するアルゴリズムの構成を行うことである。この問題に対しては、本研究に入る以前から2つの方向より試みをなし、いずれの方向に対しても第一段階と言える結果を得ていた。それらの方向とは、1つはブロ-アップした後の関数のロジャズィヴィック不等式を用いる方向であり、他は重みを考えたジェットのC^0ー十分性に対して層化写像の正則性条件を用いた特徴付けを与える方向である。本研究においては、前者に対して第二段階迄進む結果を得、それを通して以後進むべきアルゴリズムの持つ意味を明らかにすることが出来た。又、後者に対しては、重み付きのロジャズィヴィック不等式を用いたジェットのC^0ー十分性の対する十分条件を得た。それは、分割した関数が持つべき層化写像の正則性条件の定式化を明らかにした。「解析関数の有限分割問題」に関する設定理由や目的、上記の述べた結果の総括については、本年度ハワイ大学で開かれた特異点の国際研究会議で発表した。本研究に関連して、代数的側面より松山廣が、微分方程式的側面より渡辺金治が論文発表を行った。
膵β細胞と視床下部を標的としたビオチンのエピゲノム制御による２型糖尿病の発症予防

昨年度は、肥満抑制におけるビオチンの新たな作用機序として甲状腺機能亢進とそれに伴うエネルギー代謝亢進を推察する結果を得た。しかし、これらビオチンの効果について高脂肪食負荷による肥満への進展抑制は検討したものの、肥満症状からの肥満改善については検討していない。本年度は、高脂肪食誘導性肥満マウスを用いて肥満改善におけるビオチンの効果を検討した。さらに、代謝亢進系ホルモンの血中濃度と脂質代謝関連物質の測定に加え、マウスの行動量を測定することでビオチンによる自発性活動量の変化を評価し、体重増加抑制効果におけるビオチンの作用機序について多面的に検討した。その結果、体重、副睾丸周囲脂肪重量、肝臓脂質含量は、ビオチンにより有意な低値を示し、肥満マウスにおいても脂質代謝亢進を介した体重増加抑制効果が明らかにされた。また、肝臓及び血中のビオチン含量はビオチン投与により有意に増加し、特に血中濃度は非投与の45倍まで増加した。以上のことから、ビオチンの体重増加抑制効果は、高濃度の血中ビオチン濃度によって誘導されることが強く示唆された。一方、マウスの行動解析では、撮影用のケージに入れた直後15分と、その後の30分間の総移動距離にビオチンの効果は認められず、sniffing回数においても有意差は認められなかった。以上の結果から、ビオチンによる肥満改善は、自発的活動量の増加には因らず代謝系亢進に起因することが示唆された。平成27年度は、健常マウス(C57BL/6jマウス)を使用してビオチンによる視床下部を介した摂食抑制と膵島細胞増殖について検討した。ビオチンの有力な標的遺伝子であるglucokinase遺伝子及び関連遺伝子の発現量をそれぞれの組織で測定し、膵島細胞増殖効果を蛍光免疫組織染色法で評価した。その結果、視床下部ではビオチン群(ビオチン内服)のglucokinase遺伝子発現量は対照群の1.3倍を示し、hexokinase遺伝子の発現量には変化を認めなかった。以上のことから、ビオチンは視床下部において高血糖に応答する神経核(腹内側核)で摂食抑制作用を示すことが示唆された。膵島では、ビオチン群のglucokinase遺伝子及びGLUT2遺伝子の発現量は対照群の1.4倍に増加した。膵島細胞における細胞増殖マーカーMiniChromsome Maintenance 7の陽性細胞数は対照群の2.4倍を示し、膵β細胞におけるKi-67陽性細胞数は対照群の1.3倍であった。さらに、膵α細胞ではKi-67陽性細胞数は対照群の3倍を示しており、ビオチンによる膵島細胞増殖の促進が示唆された。本年度は、ビオチンによる視床下部への効果を再検討し、腹内側核の摂食抑制遺伝子であるglucokinaseの発現上昇を示唆する結果を得た。さらに、新たな視点から膵島におけるビオチンの効果を検討し、ビオチンによる膵島細胞の増殖促進を明らかにした。摂食行動や膵β細胞増殖が亢進する2型糖尿病マウスでは、ビオチンはより効果に作用することが期待される。ビオチンによる2型糖尿病予防の基盤となるデータが得られた点から、本年度の研究はおおむね順調に進展していると言える。平成27年度は、健常マウス(C57BL/6jマウス)による検討で、ビオチンが視床下部及び膵島細胞でのglucokinase遺伝子発現量の増加を介した摂食抑制と膵島細胞増殖を示すことを明らかにした。そこで、平成28年度は、活発な摂食行動と代償性膵β細胞増殖の亢進を特徴とする高脂肪食負荷C57BL/6jマウス(食事誘導性2型糖尿病マウス)を使用して、2型糖尿病進展過程におけるビオチンの視床下部及び膵島細胞でのglucokinase遺伝子の発現調節と摂食抑制及び膵島細胞増殖作用を検討した。その結果、高脂肪食負荷条件下では、ビオチンは摂食抑制作用と顕著な体重増加抑制作用を有することを明らかにした。視床下部におけるglucokinase遺伝子発現量はビオチンによって有意に増加しており、ビオチンによるグルコース応答性ニューロンを介した摂食抑制が示唆された。加えて、ビオチンは、高脂肪食負荷による耐糖能の悪化を改善し、高血糖状態への進展を抑制することを明らかにした。視床下部同様、膵島細胞においてもビオチンによるglucokinase遺伝子発現量の増加が観察され、IRS-2遺伝子についても増加傾向が認められたことから、ビオチンによる膵島細胞増殖の亢進が示唆された。以上の結果から、ビオチンは視床下部及び膵島細胞における共通分子であるglucokinase遺伝子の発現を上昇して摂食行動の抑制と膵島機能を維持することで2型糖尿病への進展を抑制することが示唆された。本年度は、これまで健常マウスで明らかにしてきたビオチンによる摂食抑制作用と膵島機能維持作用を2型糖尿病モデル動物である高脂肪食負荷マウスで検討した。その結果、ビオチンが視床下部及び膵島細胞に作用して2型糖尿病への進展を抑制することを明らかにした。加えて、これらビオチンによる効果が視床下部及び膵島細胞における共通分子(glucokinase)を介して惹起されており、ビオチンによる新たな視点からの抗糖尿病作用を示した。本年度は、2型糖尿病モデルマウスを用いて視床下部及び膵島細胞を標的としたビオチンによる抗糖尿病作用の検証とglucokinaseを介した作用機序を確認できたことから、おおむね順調に進展していると考える。

本年度は、昨年度に明らかにしたビオチンによる摂食抑制と膵島機能維持を介した2型糖尿病の発症抑制効果を再確認した後、ビオチンによる膵島細胞増殖能を膵α/β細胞の発生・分化調節転写因子(共通分子:PDX-1、α細胞:Arx, MafB、β細胞:Pax4, Nkx6.1)の遺伝子発現量を検討することで評価した。その結果、ビオチンは高脂肪食負荷による2型糖尿病の発症を早期の段階から抑制することが明らかとなった。また、膵島細胞増殖においては、ビオチンは膵α/β細胞の発生・分化調節転写因子の遺伝子発現量には変化を及ぼさず、発生・分化には影響しないことを明らかにした。一方、ビオチンは、高脂肪食摂食下、顕著な体重増加抑制効果を示し、摂食抑制以外での新たな作用として、甲状腺ホルモンの血中濃度の上昇から、ビオチンによる甲状腺機能亢進が示唆された。関連遺伝子発現量の検討から、ビオチンは、視床下部・下垂体前葉には作用点を持たず、甲状腺に直接的に作用することが推察される。本年度は、これまでのビオチンによる摂食抑制と膵島機能維持を介した2型糖尿病の発症抑制効果に加え、新たな作用機序として甲状腺機能亢進による肥満抑制作用を明らかにし、ビオチンによる新たな視点からの糖尿病発症予防の可能性を示した。これらの点から、本研究はおおむね順調に進展していると考える。昨年度は、肥満抑制におけるビオチンの新たな作用機序として甲状腺機能亢進とそれに伴うエネルギー代謝亢進を推察する結果を得た。しかし、これらビオチンの効果について高脂肪食負荷による肥満への進展抑制は検討したものの、肥満症状からの肥満改善については検討していない。本年度は、高脂肪食誘導性肥満マウスを用いて肥満改善におけるビオチンの効果を検討した。さらに、代謝亢進系ホルモンの血中濃度と脂質代謝関連物質の測定に加え、マウスの行動量を測定することでビオチンによる自発性活動量の変化を評価し、体重増加抑制効果におけるビオチンの作用機序について多面的に検討した。その結果、体重、副睾丸周囲脂肪重量、肝臓脂質含量は、ビオチンにより有意な低値を示し、肥満マウスにおいても脂質代謝亢進を介した体重増加抑制効果が明らかにされた。また、肝臓及び血中のビオチン含量はビオチン投与により有意に増加し、特に血中濃度は非投与の45倍まで増加した。以上のことから、ビオチンの体重増加抑制効果は、高濃度の血中ビオチン濃度によって誘導されることが強く示唆された。一方、マウスの行動解析では、撮影用のケージに入れた直後15分と、その後の30分間の総移動距離にビオチンの効果は認められず、sniffing回数においても有意差は認められなかった。以上の結果から、ビオチンによる肥満改善は、自発的活動量の増加には因らず代謝系亢進に起因することが示唆された。平成27年度では、健常マウスによる検討によって、ビオチンによる視床下部及び膵島におけるglucokinase遺伝子の発現上昇を介した摂食抑制及び膵島細胞の増殖効果を示唆する結果を得た。そこで平成28年度は、摂食亢進及び膵β細胞の代償的増殖を示す高脂肪食負荷マウスを用いて、これらビオチンの効果について検討する。2型糖尿病の発症・進展をグルコース負荷試験とインスリン負荷試験で確認し、視床下部では、腹内側核にターゲットを絞り、glucokinase遺伝子及び摂食抑制関連遺伝子の発現量とこれら遺伝子がクロマチンを形成するヒストンのビオチニル化頻度について検討する。
バイオセンサを用いた糖尿病合併症バイオマーカーの探索

糖尿病合併症は、ポリオール代謝経路の活性化によるソルビトールの蓄積が成因の1つであることが知られている。そこで本研究では、糖尿病合併症の予防を目的として、ソルビトールを高感度に計測可能な光ファイバ型バイオセンサを開発し、評価した。その結果、開発したバイオセンサは、糖尿病合併症の診断基準値を含む範囲で、ソルビトール濃度の定量が可能であることが分かった。糖尿病合併症のバイオマーカーとしてソルビトールの有効性が示唆されている。本研究は、ソルビトールを選択的かつ高感度に計測できる小型なバイオセンサシステムを開発し、バイオマーカーとしてのソルビトールの有効性を検証することを目的としている。そこで今年度は、基盤技術となる「酵素サイクリング法を用いたNADH検出システムの構築」を検討した。本研究では、高水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウム塩(WST)に着目し、まず、生成したホルマザンを比色定量するための光学システムの構築を行った。ハロゲン光源を光ファイバにてキュベットホルダ内の石英キュベットに導入し、光ファイバを介して小型分光器と接続し、生成したホルマザンのピーク波長460nmの透過率を計測することで、NADHの計測が可能なシステムを構築した。次に、酵素サイクリング反応を効率的に行い、目的物質を高感度に計測するため、各試薬の濃度(WST-8、ジアホラーゼ)や緩衝液のpHにおける酵素サイクリング法の最適化を行った。その結果、WST-8、ジアホラーゼともに、1.0U/mlの濃度であれば十分量であり、また、緩衝液については、pH 8.0のリン酸緩衝液(100mM)を用いることにより、高感度かつ迅速な計測が可能であることが分かった。また、今後、ソルビトール計測に展開する上で、先行研究で構築したNADH蛍光検出システムとの比較を行う必要があるが、計測手法が蛍光と透過率で異なるため、現状では比較が困難な状況である。引き続き、酵素サイクリング法及びNADH蛍光検出システムの光学系の改良を継続しながら、ソルビトールバイオセンサの開発に展開していく予定である。今年度は、昨年度に構築した酵素サイクリング法を用いたNADH検出システムを応用し、「ソルビトールバイオセンサの開発」を検討した。本研究では、ソルビトール脱水素酵素の触媒反応により生成したNADHを、ホルマザン色素を用いて比色定量することで、ソルビトールの測定を行う。まずは、使用するソルビトール脱水素酵素の選定を行い、微生物由来の酵素を用いることで、高選択性を有するセンサの構築が可能であることを確認した。さらに、使用する緩衝液の種類やEDTAの濃度、測定時間等の諸条件についての検討を行い、ソルビトール計測条件の最適化を行った。その結果、酵素サイクリング法を用いたNADH検出システムを応用したソルビトールバイオセンサは、0.250 μmol/Lの範囲でソルビトールの定量が可能であることが分かった。一方で、先行研究にて構築してきたNADH蛍光検出システムに関しても、ソルビトール計測における諸条件(補酵素の濃度、酵素固定化方法等)について検討し、ソルビトールバイオセンサを構築した。その結果、1.01000 μmol/Lの範囲でソルビトールの定量が可能であることが分かった。今年度構築した両センサとも、臨床検査会社で用いられている糖尿病合併症の診断値を含んでおり、糖尿病合併症の評価に有効である可能性が示唆された。今後は、実際の生体試料を用いたソルビトール計測に展開していく予定である。今年度は、バイオマーカーとしてのソルビトールの有効性検証に向けて、これまで開発してきたバイオセンサを、糖尿病モデル動物の生体液中ソルビトール計測に展開した。まず、動物実験を行う前段階として、生体試料の前処理方法の検討を行った。その結果、遠心分離で得られた血漿に、過塩素酸を加えてタンパク質を除去した後、水酸化カリウムを入れてpH調整を行うことで、全血中ソルビトールの計測が可能であることが分かった。また、尿については、イオン交換樹脂を用いて酵素阻害の一因となる塩類を除去した後、全血と同様の前処理操作を行うこととした。生体試料の前処理方法を検討した上で、事業倫理審査委員会の承認を受けて、糖尿病モデルラットを用いた動物実験を実施した。その結果、正常ラットと比較して、糖尿病モデルラットでは、生体液中のソルビトール濃度が高い傾向にあることが確認できた。また、血液および尿中ソルビトール値の間に相関関係があることが分かった。さらに、市販されているソルビトール測定用試薬であるF-kitでも計測を行った結果、開発したセンサと同様の傾向が得られた。以上より、今回開発したセンサが生体液中のソルビトール計測に応用可能であることが示唆された。

その結果、開発したバイオセンサは、糖尿病合併症の診断基準値を含む範囲で、ソルビトール濃度の定量が可能であることが分かった。今年度は、ソルビトールバイオセンサの開発を行い、糖尿病合併症の診断値を含む範囲でソルビトールの定量が可能であることを確認した。今年度の研究実施計画通り、ソルビトールバイオセンサの開発を行い、開発したセンサの特性評価を実施したことから、本研究は順調に進展している。人間医工学今後は、これまでに構築したNADH検出システムの改良を進めながら、ソルビトールバイオセンサの評価を進めていく。その後、開発したソルビトールバイオセンサを用いて、糖尿病モデル動物の生体液中ソルビトール計測に展開させる予定である。今年度は、1分光器や光源を用いたホルマザン測定システムの構築、2構築した測定システムによる試薬濃度や緩衝液の最適化、を実施した。今年度の研究実施計画通り、酵素サイクリング法を用いたNADH検出システムを確立したことから、本研究は順調に進展している。今年度は、先行研究で使用していた光学機器や試薬等を代用して実験を遂行したため、予定していた物品費が抑えられた。また、今後の動物実験に向けて、糖尿病合併症モデルラット作製等の準備を行う予定であったが、委託業者との打合せが難航したため、外注費の執行が遅延している。今後は、これまでに構築したNADH検出システムの改良を進めながら、ソルビトールバイオセンサの開発について検討する。来年度は、今年度構築したソルビトールバイオセンサの有効性評価として、動物実験の委託費を中心に計画している。また、これまでの研究成果発表及び情報収集のため、国内外の学会参加や論文校閲を予定している。今年度構築した「酵素サイクリング法を用いたNADH検出システム」及び、先行研究で構築した「NADH蛍光検出システム」の改良を行うため、光学機器の購入を中心に計画している。また、ソルビトールバイオセンサの作製に展開するにあたり、酵素等の試薬を購入する予定である。また、今後の動物実験に向けて、委託業者との打合せを引き続き行い、モデル動物作製等の準備を行う。また、研究成果発表及び情報収集のため、国内学会への参加や論文校閲を予定している。
海水ウラン採取を目的にした新しい吸着剤の開発と分析法の研究

1高分子系吸着剤:イミノプロピレンアミドキシム型樹脂を合成した。この樹脂は機械的強度も充分で、選択性もあるが、PH5で吸着極大を示し、海水のPH8ではウランをほとんど吸着しなかった。またアクリル酸型樹脂にアミド結合でプロピレンアミドキシム基を結合させウラン吸着性を調べた。その結果側鎖に官能基をもつものは非常に良好なウラン吸着性を示すことが判明した。2含水酸化チタン系吸着剤:含水酸化チタンスラリーとアクリルアミドモノマーを混剤した後、70100Cの有機溶媒中に滴下し、脱水しながら造粒を行なった。しかし、この方法では含水酸化チタンの量を1gの吸着剤あたり0.2g以上には上げることが出来なかった。そこで含水酸化チタンの含有量を増した混和物中に活性炭を添加し、同様に有機溶媒中に滴下した。その結果、アクリルアミドの量が少なくても固形化した。このような方法によるとチタンの少量アクリルアミドの少量で吸着剤の製造が可能となり、極めて有望と思える。3ウラン(【VI】)の螢光光度定量法:感度のよいウランの螢光法の開発を行なった。螢色はリン酸で行なうこととした。前処理の濃縮法としてアミドキシム型樹脂カラムによる吸着濃縮、トリオクケルホスヒンオキサイドによる溶媒抽出濃縮を検討した。その結果、樹脂2gをつめたカラムに海水500mlを流し、水洗後、2Mリン酸、1M硫酸混涎で脱着し、そのまま螢光光度を測定すれば簡単に定量可能なことが判明した。またトリオクケルホスヒンオキサイド抽出、炭酸アンモニウム逆抽出リン酸発光でも定量可能と思える。
中高年齢者用の健康・体力度評価方法の作成とその応用

ヒトの身体は生活環境により強く影響される.本研究では農村部と都市部に在住する中高年齢者を対象に皮下脂肪厚及び筋厚分布パターンを測定し,血液中の成分との関係を見ることから,健康度・体力度を客観的に評価する方法を開発する.更に,身体組成に及ぼす生活環境の影響を明らかにする事である.農村部と都会に在住する中高年齢者層の皮下脂肪分布及び筋厚分布パターンを見た結果,農村部在住で農作業従事者の皮下脂肪厚は都会在住者に比較して各部位ともに少ない傾向を示した.一方,筋厚については,上肢(上腕,前腕)については農村在住者が高い値を示したが,下肢(大腿及び下腿)については都市在住者の方が高い値を示す傾向が見られた.以上のことから,農村在住者の下肢の筋が充分に発達していないことの重要性が示唆された.この事は,農村部の機械化農業の影響が反映されているものと考えられた.今後,農家の高齢者の下肢筋の運動不足解消が課題として上げられよう.ヒトの身体は生活環境により強く影響される.本研究では農村部と都市部に在住する中高年齢者を対象に皮下脂肪厚及び筋厚分布パターンを測定し,血液中の成分との関係を見ることから,健康度・体力度を客観的に評価する方法を開発する.更に,身体組成に及ぼす生活環境の影響を明らかにする事である.農村部と都会に在住する中高年齢者層の皮下脂肪分布及び筋厚分布パターンを見た結果,農村部在住で農作業従事者の皮下脂肪厚は都会在住者に比較して各部位ともに少ない傾向を示した.一方,筋厚については,上肢(上腕,前腕)については農村在住者が高い値を示したが,下肢(大腿及び下腿)については都市在住者の方が高い値を示す傾向が見られた.以上のことから,農村在住者の下肢の筋が充分に発達していないことの重要性が示唆された.この事は,農村部の機械化農業の影響が反映されているものと考えられた.今後,農家の高齢者の下肢筋の運動不足解消が課題として上げられよう.本研究の目的は,中高年齢者を対象にした安全で簡易な健康・体力水準を評価する為の計測方法を開発し,高齢者の為の健康・運動プログラム実施の為の基礎的資料を提供しようとするものである.本年度は,内蔵脂肪量を簡易に推定する方法を開発するとともに,身体活動量との関係を明らかにする研究を実施した.内蔵脂肪量推定方法;まず,水中体重秤量法により全身の脂肪量(ToFAT)を測定し,一報,超音波断層法を用いて全身12カ所の皮下脂肪厚を測定し,身体各部位の表面積との積から皮下脂肪量(SuFAT)を求める.内蔵脂肪量は,ToFAT-SuFATとして算出する.このようにして測定した内蔵脂肪量と血中の脂質レベル(中性脂肪)との間には高い有意な相関関係が見られた;男性r=0.61(n-49),女性r=0.38(n=38),何れも1%水準で有意.この事は,内蔵脂肪が血中脂肪動態に影響することを示唆するものである.更に,身体活動量が脂肪に与える影響を見るために,一日の平均歩数と腹部の皮下脂肪厚との関係を見た結果,r=0.45(p<0.01)で有意な関係が見られ,活動量が多い人ほど腹部皮下脂肪厚が少ない傾向が観察された.ヒトの身体は生活環境により強く影響される.本研究では農村部と都市部に在住する中高年齢者を対象に皮下脂肪厚及び筋厚分布パターンを測定し,血液中の成分との関係を見ることから,健康度・体力度を客観的に評価する方法を開発する.更に,身体組成に及ぼす生活環境の影響を明らかにする事である.農村部と都会に在住する中高年齢者層の皮下脂肪分布及び筋厚分布パターンを見た結果、農村部在住で農作業従事者の皮下脂肪厚は都会在住者に比較して各部位ともに少ない傾向を示した.一方,筋厚については,上肢(上腕,前腕)については農村在住者が高い値を示したが,下肢(大腿及び下腿)については都市在住者の方が高い値を示す傾向が見られた.以上のことから,農村在住者の下肢の筋が充分に発達していないことの重要性が示唆された.この事は,農村部の機械化農業の影響が反映されているものと考えられた.今後、農家の高齢者の下肢筋の運動不足解消が課題として上げられよう.
中央政府における生産性測定に向けた指標の構築に関する研究

民間部門における生産性測定は半世紀以上の歴史を有し、その向上を目指した取組は数多くなされてきたが、公的部門に関しては長年にわたって生産性の経年変化はないものと措定されてきた。しかし、近年、英国政府統計局(ONS)がアウトプット指標を開発し始め、学術的にもロンドン大学(LSE)のチームがいくつかのアウトプット指標に基づく研究を開始した。日本ではまだ全く取組がなされていないが本研究は日本の中央政府に関して生産性測定の基礎を構築することを目指す。
多孔性カーボンモノリスへのヘテロ原子の導入と新規電極材料への応用

ミセル鋳型法と相分離法を組み合わせることで、規則的配列を有するメソ孔と共連続構造を有するマクロ孔を併せもつフェノール樹脂の1段階合成に成功した。また、窒素・リン・硫黄原子それぞれのカーボン骨格中への導入にも成功し、3種のヘテロ原子のトリプルドープにも成功した。さらに、ヘテロ原子ドープ活性炭モノリスをバインダーフリー電極として用いることで、それぞれのヘテロ原子ドープの電気二重層キャパシタ容量に与える影響について、基礎的知見を得ることができた。リチウムー硫黄二次電池の正極材料の開発については、顕著な結果が得られなかったものの、ナトリウムイオン二次電池の正極材料として優れた特性を示すことが分かった。相分離を伴うゾルーゲル法により作製した、マクロ多孔性レゾルシノールーホルムアルデヒド(RF)ゲルに炭素化・炭酸ガス賦活処理を施すことで、高比表面積を有するマクロ多孔性カーボンモノリスを作製した。得られた試料を封管中で、尿素・赤リン・ピロ亜硫酸ナトリウムとともに加熱処理し、それぞれ窒素・リン・硫黄ドープされたカーボンモノリスを作製した。加熱によりそれぞれの化合物が分解もしくは昇華することで発生したガスと炭素表面との反応により、高い割合でヘテロ原子が導入された活性炭モノリスを得ることができた。さらに、炭素材料への窒素および硫黄原子の導入において、上記以外の化合物との反応により、様々なカーボンモノリス試料を得た。これらのヘテロ原子が導入されたカーボンモノリスの表面化学構造をX線光電子分光測定により詳細に調べた結果、反応させる化合物の種類や反応温度を変化させることで、異なる表面化学構造を有するカーボンモノリスを得ることができることが分かった。前駆体カーボンモノリスおよび窒素・リン・硫黄をそれぞれドープしたカーボンモノリスをバインダーフリーのモノリス型電極として用い、ヘテロ原子ドープのキャパシタ容量に対する影響について調べた。その結果、ヘテロ原子の導入により、電流ー電圧曲線に疑似容量に起因できるような酸化還元ピークは確認できなかったものの、単位比表面積あたりの容量は増加することが分かった。容量の増加の程度は、導入したヘテロ原子の種類に依存し、また、電解液の種類にも影響されることが分かった。レゾルシノールーホルムアルデヒドのゾルーゲル系において、両親媒性のブロック共重合体型界面活性剤を用い、自己組織化を利用したミセル鋳型による2d-hexagonal型の規則的配列を有するナノメートル領域の細孔(メソ孔)と、相分離により形成されたマイクロメートル領域の細孔(マクロ孔)を有する、多孔性フェノール樹脂の1段階合成に成功した。その後、得られた多孔体フェノール樹脂を不活性ガス雰囲気下で焼成することによりカーボンモノリスを作製し、さらに炭酸ガス賦活処理を施すことで活性炭モノリスを得た。炭素化および賦活処理の後も、メソ孔およびマクロ孔構造は維持されており、階層的多孔構造を有するカーボンモノリスおよび活性炭モノリスを得ることができた。得られたカーボンモノリスに溶融した硫黄を含浸させることにより、カーボン/硫黄複合体を作製し、バインダーフリーのリチウムー硫黄二次電池正極としての性能評価を行った。しかし、この方法で得られたカーボン/硫黄複合電極は、容量・サイクル特性ともに、顕著な特性を示さなかった。これは、カーボンモノリスが90%程度の高い気孔率を有するため、硫黄の割合が大きくなりすぎたためであると考えられる。そこで、カーボンモノリスのナトリウムイオン二次電池の負極としての評価を行った。その結果、20 mA g-1で340 mAh g-1という大きな容量が得られ、メソ孔を持たないカーボンモノリスに比べ、良好なレート特性を示すことが分かった。研究期間全体を通じ、階層的多孔構造を有するカーボンの新たな作製手法の確立・カーボン中へのヘテロ原子の導入手法の開発に成功し、作製したカーボン多孔体を電気二重層キャパシタ電極に用いることで、さまざまな基礎的知見を得ることができた。窒素に加え、リン・硫黄原子をカーボンモノリスに導入することに成功した。さらに、それらの試料をモノリス電極として用い、ヘテロ原子ドープのキャパシタ容量に与える影響について知見を得ることに成功し、研究は期待通りに進展したと思われる。材料化学引き続き種々の化合物を用い、カーボンモノリスへのヘテロ原子の導入実験を行い、随時、キャパシタ電極としての性能評価を行う。また、RFゲルの重合系において、ミセル鋳型法によるゲル骨格中へのメソ孔の導入を試みる。その後、メソ孔の有無による電極容量への影響について調べる。さらに、メソ孔を作製したカーボンモノリスについてもヘテロ原子の導入を行い、リチウムー硫黄電池正極としての性能評価を行う。平成27年4月から所属変更にかかる引っ越しが見込まれたため、平成26年度に購入予定であった物品の内、比較的運搬が困難なもの(管状炉など)の購入を平成27年度に遅らせた。
スペクトル領域干渉法に基づく高速分光偏光計測

分光エリプソメトリは、薄膜の膜厚などを非接触かつ非破壊で測定する方法として、様々な分野で用いられている。この計測法では、多色光を測定対象の表面に斜入射し、反射光の各波長毎の偏光状態を求め、それから薄膜の膜厚や複素屈折率などを得る。この反射光の偏光状態を調べる際に現用のエリプソメトリでは、回転検光子などの機械的可動部を有する偏光計が利用されてきた。このため現用の偏光計では、測定に要する時間がこれらの機械的な素子の制御時間により制約されていた。薄膜成長中に膜厚のその場測定を行う際には、より高速な分光エリプソメータを実現することが望まれる。このような背景の下で本研究では、機械的可動部を有しない新しい分光偏光計測法を考案した。この分光偏光計測法では、波長に依存した偏光状態を持つ被測定光を、2枚の水晶移相子と検光子を順に透過させた後、分光器に入射する。分光器から得られるスペクトルには、異なる周期で振動する3つの成分が含まれる。フーリエ変換を用いた信号処理によって各々を分離検出すると、被測定光の偏光状態をあらわすストークスパラメータの波長分布S_0(λ),S_1(λ),S_2(λ)およびS_3(λ)が得られる。この偏光計では、移相子や検光子などの制御が不要で、分光器から得られる一つのスペクトルより、被測定光の偏光状態の波長分布を表す全てのパラメータを同時に、かつ独立に求められるという特徴を持つ。本年度は、前年の偏光計動作確認実験を受け、実際にエリプソメータを試作しその特性を調べた。Si基板上のSiO_2薄膜の膜厚を、一回のスペクトル測定のみで2nm以下の精度で測定できることが示された。さらに、その誤差要因の解析も行い、分光エリプソメータの設計指針を明らかにした。本年度は、この分光偏光計測法の動作原理を確認するため、実証実験を行った。キセノンランプとバビネソレイユ補償子を用いて、波長に依存した偏光状態を持つ楕円偏光を作り、それを被測定光とした。様々な被測定光に対して、理論値と良く一致する測定結果が得られた。

本年度は、前年の偏光計動作確認実験を受け、実際にエリプソメータを試作しその特性を調べた。Si基板上のSiO_2薄膜の膜厚を、一回のスペクトル測定のみで2nm以下の精度で測定できることが示された。さらに、その誤差要因の解析も行い、分光エリプソメータの設計指針を明らかにした。
疾患特異的iPS細胞を用いた鎖骨頭蓋異形成症の病態解明

口腔領域を中心とする先天性疾患である鎖骨頭蓋異形成症(CCD)は非常に稀な疾患で未解明な点が多く更なる病態解明が治療法開発に必須である。一方、疾患特異的iPS細胞の樹立は病態解明、治療法の開発、薬剤の選択など大きな貢献が期待できる。本研究では、我々の開発した骨分化誘導技術を基にCCD由来iPS細胞の機能的評価を行い、病態との関連を解明すること、さらには遺伝子編集技術を応用し変異塩基を正常塩基に入れ替えた変異正常化iPS細胞を作製し臨床応用への道を開くことを目的とする。これまでにCCD4症例すべてに対しiPS細胞を作製し、さらに、ゲノム編集技術を用いてReversed-iPS細胞およびRUNX2 KO-iPS細胞を作製し、未分化性および多能性を確認した。これらのiPS細胞に対し骨分化誘導を行い、qPCRにて骨芽細胞分化マーカの発現を検討し、CCD-およびKO-iPS細胞での発現低下を認めた。また、ヌードラット頭蓋骨欠損部へ骨分化誘導後の細胞を移植し、組織学的解析によりCCD移植群で骨形成が著しく低下することを確認した。4症例のCCDからiPS細胞作製に成功した。さらにゲノム編集技術により、RUNX2遺伝子変異を正常化したReversed-iPS細胞と、RUNX2 KO-iPS細胞を作製した。以前に開発した骨分化誘導方法を用いて機能解析を行い、CCD-iPS細胞がCCDの表現型を示す細胞であることを確認し、またKO-iPS細胞の骨芽細胞分化は著しく抑制されることをqPCRにより確認した。これによりヒトRUNX2+/+、+/-、-/-のiPS細胞を用いて、今後さらに詳細な機能解析を行うことが可能である。これまでのところ、透過型顕微鏡を用いた解析により、Reversed-iPS細胞由来の骨芽細胞が正常な核形態を示したのに対し、CCD-およびKO-iPS細胞の骨分化誘導後の細胞では核膜の異常陥入による分葉状の核を示すことを認めている。ヒトCCD患者由来iPS細胞(CCD-iPS細胞)のほか、遺伝子編集操作によりRUNX2変異を正常化したiPS細胞(Revertant-iPS細胞)の樹立に成功し、これを報告した(Stem Cell Research & Therapy (2018) 9:12)。さらに同様の方法でノックアウトiPS細胞(KO-iPS細胞)を樹立し、これらの細胞を骨芽細胞へと分化誘導する過程において、RUNX2欠損細胞が核溝や分葉核といった異常な核形態を示すことを発見した。また、核構造維持に関連する遺伝子群の発現を調べたところ、RUNX2欠損細胞では核形態維持に必須のLamin A/C遺伝子発現が著しく低下していた。以上のことから、CCD病態におけるRUNX2発現・機能減弱と核形態維持に関わる遺伝子発現に関連がある可能性が考えられた。核膜関連タンパク質の発現異常は様々な骨形成不全を引き起すことが報告されており、CCD-およびKO-iPS細胞の骨分化誘導後の細胞においても核膜関連タンパク質の発現に異常をきたしている可能性がある。今後はこれらの遺伝子発現をqPCRで検討し、RUNX2との関連についても詳細に検討していく予定である。生化学
ウロキナーゼとプラスミノゲンアクチベータインヒビター2の遺伝子発現機構

Cキナーゼ活性化作用を有するphorbol myristate acetate(PMA)やcAMP、サイトカインなどのウロキナーゼ(uPA)とその阻止因子であるプラスミノゲンアクチベータインヒビター2(PAI-2)の白血病/悪性リンパ腫細胞株(PL-21とRC-K8)での遺伝子発現に対する影響の検討が行われた。cAMPがRC-K8細胞でのuPA遺伝子の転写の抑制をしてuPAの産生を減少させ、その作用は、de novoの蛋白合成を必要とし、またcAMP依存性蛋白リン酸化キナーゼ(PKA)活性依存性であることが判明した(BBA 1268、1995)。Prostaglandin I2(PGI2)は、アデニル酸シクラーゼを活性化して細胞内cAMPレベルを上昇させる。その安定化誘導体であるBeraprostが、RC-K8細胞のPKAの活性を上昇させるとともに、uPA産生を抑制することも明らかとなった(Thromb Haemost 1996,in press)。また、RC-K8細胞には、IL-1リセプターが存在し、IL-1α、βが、uPAの転写効率を高めることでPAの産生を誘導することが判明した(Thromb Haemost 74、1995)。さらに、double stranded AP1 oligoを用いたgel-shift assay法にて、RC-K8細胞中にTPA-response elementに結合する蛋白(TREB)が存在し、それがPMA刺激で増加することが観察され、PMA刺激にTREBが関与することが示唆された。一方、IL-1の場合は、TREBの増加は観察されなかった。PAI-2に関し、cAMPとPMAが異なる機序によりPAI-2遺伝子の発現を誘導し、両者間にクロストーク機構の存在していることが明かとなった(Thromb Haemost72,1994)。そして、TREBの一種であるAP1蛋白をコードするc-fosのantisense S oligoが、PMA及びcAMP誘導PAI-2遺伝子発現に、抑制的に働くことがRT-PCR法で確認された。また、複数のTREBがPL-21細胞には存在し、その結合量がPMAの刺激で増加することが判明した。細菌内毒素であるlipopolysaccharide(LPS)がいずれの細胞でもそれぞれuPAおよびPAI-2の産生を誘導することが判明した。IL-1の中和抗体は、LPSによるuPA誘導作用を抑制せず、LPSがIL-1系を介さないでuPAを誘導していることが明かとなった(Thromb Haemost 74,1995)。しかし、RC-K8は、LPSレセプターCD14を細胞表面に発現していないので、LPSは、まだ良く知られていない機序でuPA産生を誘導するものと推定され、現在、そのメカニズムを検討中である。

しかし、RC-K8は、LPSレセプターCD14を細胞表面に発現していないので、LPSは、まだ良く知られていない機序でuPA産生を誘導するものと推定され、現在、そのメカニズムを検討中である。今年は、昨年から引き続き炎症反応時のウロキナーゼ(u-PA)およびその阻害因子であるプラスミノゲンアクチベータインヒビター2の産生制御機構の解明を進めており、インターロイキン-1(IL-1)α、β以外に細菌内毒素であるlipopolysaccharide(LPS)がヒト悪性リンパ腫細胞株RC-K8によるu-PAおよびヒト骨髄性白血病細胞株PL-21よるPAI-2の産生を誘導することが判明した。特に、RC-K8細胞では、IL-1が2時間をピークとする早期のu-PAmRNA誘導作用を示すのに反し、LPSは9時間をピークとするu-PA mRNA上昇作用を示した。IL-1α、βのいずれの中和抗体もそれぞれL-1α、βによるu-PA誘導に対して阻害的に作用したが、LPSによるu-PA誘導作用には影響せず、LPSがIL-1系を介さないでu-PAを誘導していることが明かとなった(Thromb Haemost 74: 1511-5,1995)。しかし、RC-K8細胞は、pre-Bリンパ腫細胞で、LPSレセプターCD14を細胞表面に発現していない。従って、RC-K8細胞では、LPSは、まだ良く知られていない別の経路でu-PA産生を誘導していることが示唆され、現在そのメカニズムやu-PAのIL-1誘導転写因子、cAMP誘導転写抑制因子を同定するために蛋白リン酸化阻害剤や各種転写因子のシスエレメント、その抗体などを用いてelectrophoretic mobility shift assay法などで検討中である。また、血管内皮細胞の産生するprostaglandin I2(PGI2)は、アデニル酸シクラーゼを活性化して細胞内cAMPレベルを上昇せしめることが知られているが、そのPGI2の安定化誘導体であるBeraprostが、RC-K8細胞のcAMP依存性プロテインキナーゼ(PKA)の活性を上昇させるとともに、u-PA産生を遺伝子レベルで抑制することが明らかとなった(Thromb Haemost 1996,June, in press)。u-PA,PAI-2遺伝子のプロモータ領域をクローニングし、u-PA、PAI-2遺伝子発現機構を解明のための共同研究がスイスのフリードリッヒミシェ-ル研究(Nagamine博士)との間で行われることになり、現在その研究の進め方を検討している。
イネ種間雑種強勢の実用化に向けた雑種不稔遺伝子S1の単離と変異体作出

本研究ではイネの種間雑種で見いだされた顕著な雑種強勢を利用するため、障壁となる現象「雑種不稔」の克服を目指している。アジア栽培イネO.sativaとアフリカ栽培イネO.glaberrimaの種間交雑では得られた雑種は種子不稔を示す。これまでにイネの種間雑種において種子不稔を引き起こす遺伝的要因の一つとして、S1遺伝子が報告されている。S1はヘテロ接合の状態で特異的に作用し、花粉および種子の退化を引き起こす。S1はイネ第6染色体上にマッピングされているが、原因となる遺伝子の同定はできていない。そこで本研究では、S1に着目し、遺伝子機能欠損変異体を単離する。得られた変異体を利用してS1の原因遺伝子の特定を行う。変異体の作出には重イオンビームを用いる。通常、突然変異処理を行うと多くの遺伝子が影響を受けるため、種子稔性が低下した個体が頻繁に生じる。一方、重イオンビームはその軌跡に沿って半径数nm程度の範囲に広がるDNA二本鎖を電離作用により切断するため、切断箇所以外の遺伝子が影響を受けるリスクが低いと考えられている。そのため、本研究においてS1遺伝子のみを欠損させ、種子稔性が上昇する個体をスクリーニングするために適した変異処理であると考えられる。本年度はS1遺伝子をヘテロ接合で持つ種子を交配により作出し、得られた交配後の種子に重イオンビーム(炭素イオン照射150Gy LET30)を照射した。重イオンビーム処理後、圃場に植物体を移植し、種子稔性が高い個体を選抜した。選抜した個体はS1遺伝子が欠損した個体である可能性が高い。そこですでに報告されているS1遺伝子候補領域をシークエンスし、変異が生じている箇所を特定した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。