hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
GnRHニューロン活動の周期形成と同期化機構 : 多電極皿記録法を用いた研究

本研究は、光学技術及び多電極皿法を用いた電気活動記録により、神経回路を形成するGnRHニューロン活動の周期形成とその同期化のメカニズムを探求することを目的とし、研究期間中、以下の結果を得た。第一に、培養GnRHニューロンに電位感受性蛍光色素を適用し、光信号に変換された神経細胞の電気活動を計測することにより、神経回路を形成しているGnRHニューロン群全体の神経活動を観察した。個々のGnRHニューロンは互いに結合した細胞集団内で同期して自発性活動を呈していろことが明らかとなった。また、一個の細胞に刺激を与えると細胞間連絡を介して興奮が伝わった。この興奮の伝わりは、Na^+チャネル阻害剤:Ca^<2+>チャネル阻害剤で阻止され、ある種のK^+チャネル阻害剤で増弦された。第二に、視床下部ニューロンの多電極皿法による記録を試みた。GnRHニューロンを含む視床下部ニューロンを培養したところ、細胞は軸索を伸ばして他の隣接ニューロンと結合し、形態的に神経回路を形成した。多電極皿記録により、この視床下部ニューロンから長時間の記録(2-3時間)が得られた。隣接したニューロン同士で同期して発火する細胞を見いだした。同期発火するニューロン同士はシナプス様に結合していた。その発火周期は10-60分間隔で明らかな周期性は現在のところ検出されていない。さらに、これらの培養視床下部ニューロンを免疫組織化学的に同定したところ、一部はGnRHニューロンであると確定できたが、多くは非GnRHニューロンであった。これらの結果から、第一に、視床下部には少なからず同期して活動するニューロン群が存在すること、第二に、GnRHニューロンもその一部に含まれること、第三に、GnRHニューロンは非GnRNニューロンと同期発火する、即ち、GnRHニューロンの機能的ネットワークは異種細胞も含まれて形成されている可能性があることが示唆された。本研究は、光学技術及び多電極皿法を用いた電気活動記録により、神経回路を形成するGnRHニューロン活動の周期形成とその同期化のメカニズムを探究することを目的とする。平成9年度は以下の結果を得た。まず第一に、培養GnRHニューロンに電位感受性蛍光色素を適用し、光信号に変換された神経細胞の電気活動を計測することにより、神経回路を形成しているGnRHニューロン群全体の神経活動を観察した。光学的計測法は、次に行なう多電極皿法による記録に比べ、より広い視野で、視野内の細胞活動をもれなく記録することができるので、多電極皿記録の指南的研究としても有用である。実験には不死化GnRHニューロンを用いた。不死化ニューロンを用いることにより、単一種ニューロンで形成されたネットワークという単純な系での初期的解析ができる。個々のGnRHニューロンは互いに結合した細胞集団内で同期して自発性活動を呈していた。一個の細胞に刺激を与えると細胞間連絡を介して興奮が伝わった。この興奮の伝わりは、Na^+チャネル阻害剤、Ca^<2+>チャネル阻害剤で阻止され、ある種のK^+チャネル阻害剤(4-アミノピリジン)で増強された。また、cAMPを合成するアデニルシクラーゼ阻害剤や蛋白キナーゼA阻害剤によっても興奮の拡がりは縮小された。次に、視床下部ニューロンの多電極皿法による記録を試みた。

多電極皿記録により、この視床下部ニューロンから長時間の記録(1-2時間)が得られた。隣接したニューロン同士で同期して発火する細胞を見いだした。同期発火するニューロン同士はシナプス様に結合していた。現在、周期的に発火するニューロン群を検索中であり、今後、免疫組織化学的に周期性同期生に発火するニューロンを同定する予定である。本研究は、多電極皿法を用いた電気活動記録により、神経回路を形成するGnRHニューロン活動の周期形成とその同期化のメカニズムを探求することを目的とした。培養ラット視床下部ニューロンを単離し培養した。これらのニューロンにはGnRHニューロンが含まれる。形態的にネットワークを形成した培養ニューロンを8チャネルの多電極皿法を用いて電気活動の記録を試みた。多電極皿記録により長時間の記録(2-3時間)が得られ、隣接したニューロン間で同期して発火する細胞が検出された。これらのニューロン間はシナプス様に結合していた。その発火周期は10-60分間隔で明らかな周期性は現在のところ検出されていない。さらに、これらの培養視床下部ニューロンを免疫組織化学的に同定したところ、一部はGnRHニューロンであると確定できたが、多くは非GnRHニューロンであった。これらの結果から、第一に、視床下部には少なからず同期して活動するニューロン群が存在すること、第二に、GnRHニューロンもその一部に含まれること、第三に、GnRHニューロンは非GnRHニューロンと同期発火する、即ち、GnRHニューロンの機能的ネットワークは異種細胞も含まれて形成されている可能性がある、ことが示唆された。
インクルーシブ保育における保護者支援・家族支援の実証的研究

1保育者に「保育を通しての保護者支援・家族支援」の実態と意識調査については、文献研究を行い本研究の位置づけを明らかにした。。また保育巡回相談を活用した保育園を対象に継続的に予備調査を行い調査内容を精選した。予備調査内容としては、要支援への気づき、保護者支援に向けての関係作り、具体的な支援についての自由記述を中心とした簡便な質問紙およびヒアリングを併用した。2保護者を対象に1子育て情報の収集、2子育ての相談相手、3地域子育て支援の活用、などから生態学的子育て親が持つ子育てネットワークシステムを明らかにする調査を実施した。三世代同居環境と核家族環境など居住形態の違いも考慮した家庭教育の考え方、育児文化の継承性、育児文化の世代間伝達、子育てサポート源とサポート内容(情報的サポート、道具的サポート、情動的サポート)についての調査結果の分析を進めた。3保育コンサルテーションでの園内カンファレンスにおける協同の意思形成プロセスを分析については、パイロット的にデータを収集し、分析の枠組みを検討している。データ収集および、プロトコルを作成後の質的分析を検討した。4特定自治体において、公立保育所保育士を対象とした年間6回、各3時間の「保育支援コーディネータ連続研修」を企画、実施した。各園からの事例の分析を通して、保護者支援・家族支援実践の実態、問題点、課題を抽出し、共通理解を深め、具体的対応を模索した。具体的には1保育支援コーディネータの意義と役割(各園での保育支援コーディネータの実際)、2保育における家族・保護者への支援(各園での保護者のニーズに応じた対応の実際)、3保育における個とクラス集団への支援の実際、4多機関の専門家との協働的な連携の実際、5園内の支援体制づくりのあり方、6保育支援コーディネーターによる保育士支援を実施した。内容、研究成果と課題についての分析を進めた。3年間の研究を通じて次の4点の研究を進めている。それぞれについての状況は次の通りである。1保育者に対して「保育を通しての保護者支援・家族支援」の実態と意識調査の準備は予定通り進展している。2保護者の子育て環境の違いによる子育て支援の実態については順調に分析を進めている。3保育コンサルテーションでの園内カンファレンスにおける協同の意思形成プロセスを分析については、十分に検討が行われたとは言い難く、数名の予備的分析にとどまっている。研究12年目に予定していたので遅れているわけではないが、十分な時間が作れなかった。4保育における保護者支援・家族支援の専門家育成の研修プログラムについては当初の計画以上に進展している。全般的にはほぼ順調に進んでいるので、申請時当初の研究企画の変更や修正はなく、引き続き2年目の研究を進めていく。最終的には、それぞれの研究を総合して幼児期の子育てに対する「インクルーシブ保育を通しての保護者支援・家族支援システムの構築」を行う。1保育者に「保育を通しての保護者支援・家族支援」の実態と意識調査を行う。2保育施設利用保護者に支援ニーズ調査を行うための予備調査を2年目に実施し、調査の企画立案を行う。また三世代同居環境と核家族環境など居住形態の違いも考慮した家庭教育の考え方、育児文化の継承性、育児文化の世代間伝達、子育てサポート源とサポート内容については引き続き分析を進める。3保育コンサルテーションでの園内カンファレンスの分析については、時間を必要とするので、本年度に集中的に進めていけるようなロードマップを作成し、実施していく。会話分析の方法についての分析ツールの検討も進めていく。4これまでの研究成果を踏まえ、1年目の成果を翌年の研修企画に反映させるアクションリサーチを通し、保育における保護者支援・家族支援の専門家育成の研修プログラムを作成する。。

3年間の研究を通じて次の4点の研究を進めている。それぞれについての状況は次の通りである。1保育者に対して「保育を通しての保護者支援・家族支援」の実態と意識調査の準備は予定通り進展している。2保護者の子育て環境の違いによる子育て支援の実態については順調に分析を進めている。3保育コンサルテーションでの園内カンファレンスにおける協同の意思形成プロセスを分析については、十分に検討が行われたとは言い難く、数名の予備的分析にとどまっている。研究12年目に予定していたので遅れているわけではないが、十分な時間が作れなかった。4保育における保護者支援・家族支援の専門家育成の研修プログラムについては当初の計画以上に進展している。全般的にはほぼ順調に進んでいるので、申請時当初の研究企画の変更や修正はなく、引き続き2年目の研究を進めていく。最終的には、それぞれの研究を総合して幼児期の子育てに対する「インクルーシブ保育を通しての保護者支援・家族支援システムの構築」を行う。1保育者に「保育を通しての保護者支援・家族支援」の実態と意識調査を行う。2保育施設利用保護者に支援ニーズ調査を行うための予備調査を2年目に実施し、調査の企画立案を行う。また三世代同居環境と核家族環境など居住形態の違いも考慮した家庭教育の考え方、育児文化の継承性、育児文化の世代間伝達、子育てサポート源とサポート内容については引き続き分析を進める。3保育コンサルテーションでの園内カンファレンスの分析については、時間を必要とするので、本年度に集中的に進めていけるようなロードマップを作成し、実施していく。会話分析の方法についての分析ツールの検討も進めていく。4これまでの研究成果を踏まえ、1年目の成果を翌年の研修企画に反映させるアクションリサーチを通し、保育における保護者支援・家族支援の専門家育成の研修プログラムを作成する。4つの研究を同時に進めており、いづれも予備調査、準備調査であった。研究のロードマップを探索的に検討していることもあり、分析、資料収集、プロトコル作成などの研究補助者への依頼までに至らなかった。今年度の後半に予定していたビデオ分析を翌年度に集中的に実施することとした。使用計画としては、1保護者意識調査、2保育支援者支援調査、3カンファレンスプロトコル資料作成、4文献、5研究発表などについての予定している。
インドにおける医薬品及び薬剤耐性菌環境汚染調査

2014年にチェンナイより採集した河川水・底質試料について医薬品及び有害化学物質の分析を行った。先進国では過去50年以上にわたって汚染が進行している有機過フッ素化合物や有機シロキサンについては、インドの汚染は始まったばかりであることが柱状底質試料を用いた歴史的復元により明らかとなった。医薬品ではイブプロフェンの濃度が最も高く、薬剤耐性菌への関与が疑われるキノロン剤のオフロキサシン濃度が次いで高濃度であった。また、同じ底質試料の変異原性強度の空間的と鉛直分布を、コメットアッセイを用いて、多環芳香族炭化水素(PAHs)、およびそのハロゲン化物を指標として判定した。チェンナイ市・クーム川の底質は石油起源のPAHsによる高度な汚染が検証された。底質の変異原性の強さは、PAHsの汚染度に関連していた。また、4種類の下水汚泥の抽出物を雄性マウスに摂取させ、肝臓の遺伝子発現の変化をマイクロアレイ解析した。200以上の遺伝子について、それぞれの下水処理施設に特有な異なる誘導が見いだされ、排水の性質は排出元に大きく影響されることが示唆された。さらに、これまでに分離した446株の大腸菌のうち、セフォタキシムやイミペネムといった人の治療に汎用されるβ-ラクタム剤に耐性を示す169株(38%)の薬剤耐性因子等を詳細に解析した。12の抗菌剤に対する薬剤感受性を調べたところ2剤を除いて50%以上の耐性菌分布率を示した。また、全ての菌は3剤以上に耐性を示し、最も分布率が高かったのは10剤耐性菌(25%)であった。β-ラクタマーゼ遺伝子型別のうち、CTX-M型の分布率が66%と最も高く、次いでTEM、OXA、CIT型の分布率がそれぞれ約40%であった。無作為に選んだ36の環境水サンプルに由来する49プラスミドの全塩基配列を解読し、β-ラクタマーゼ遺伝子を含む各プラスミドの系統と薬剤耐性遺伝子の分布を明らかにした。インドから採集したサンプル中の広範な環境汚染物質の汚染実態を調べ、インド特有の化学汚染の存在を確認した。特に表層泥については多数の報告がある医薬品汚染について、初めて柱状底質試料中の鉛直分布を明らかにすることに成功し、本プロジェクトのオリジナリティを明確にした。また、動物投与実験を実施し、下水処理施設に特有な生物学的影響について明らかにした。さらに、400株以上の大腸菌を環境水サンプルから分離し、その38%が広域セファロスポリンやカルバペネムに耐性を示すことを示した。これら菌株の薬剤耐性因子を塩基配列レベルで解析し、インド環境が多彩な薬剤遺伝子に汚染されていることを示した。一方、今まで得られた結果は国際学会誌に投稿、また国内外学会で発表した。また、インドのカウンターパートから派遣された研究員の研修を受け入れ、今後に現地における研究遂行に必要な技術指導を行った。以上のことから、本研究は概ね順調に進展していると判断できる。現在までの調査により医薬品汚染の著しい事が判明しているチェンナイを中心に、試料採集を継続する。医薬品・抗生物質・ペルフルオロ化合物・パーソナルケア製品由来化学物質等の化学分析データをとりまとめ知的基盤データベースとして完成させる。また、雌性マウスのトキシコゲノミクスデータを収集し、下水汚泥による毒性に関する性差について検討する。下水処理過程による環境汚染の生物学的・生理学的影響を理解するために、国際的データベースを用いた検索データによって、さらに遺伝子ー化学物質ー疾病の関連性に関するデータ収集を行う。さらに、広域セファロスポリンやカルバペネムに耐性を示す大腸菌プラスミドの全塩基配列を決定し、ネットワーク解析を実施することで、どの系統のプラスミドがその遺伝子の運搬に貢献しているかを明らかにするとともに、それら情報を国立感染症研究所が開発したソフトウェアを用いてデータベース化する。2013年5月と2014年1月に、マニパル、コーチン、ハイデラバード、チェンナイを中心に現地調査を行い、特に高濃度汚染が懸念されるチェンナイにおいて、河川水・底質試料を採集した。これらの一部について分析した結果、内分泌かく乱物質のビスフェノールの濃度が日本と比較して10倍から500倍も高い値を示した。成分ごとに解析すると先進国では使用されなくなったビスフェノールAの濃度が依然として高く、インド特有の化学汚染の存在が確認された。上記に加えて,収集した水質試料について、26種の金属元素の定量を行った。また、今年度は多量の医薬品を含むと予想される病院排水が下水処理水に及ぼす影響を明らかにすることを目的として調査を行い、サンプル中の抗菌剤濃度を測定すると共に、大腸菌の分離収集と薬剤感受性試験を含む性状解析を行った。その結果、下水処理水中の抗菌剤濃度は病院排水を受け入れているSTPで高値を示した。各種抗菌剤に対する耐性菌分布率は生活排水のみ受け入れているSTPと比較して、病院排水を受け入れているSTPで有意に高いことが示された。病院排水中に含まれる高濃度の抗菌剤が下水処理水中の大腸菌に影響を及ぼすことを示唆する成績と考えられた。さらに、STP環境における処理段階に応じた生物学的活性を解明するために、排水抽出物をラットの初代培養肝細胞に感作させ、主要な2種の薬物代謝酵素の発現状態を解析した。

病院の排水のみを受け入れているSTPではそれ以外のSTPに比較して排出口ではAhR活性(CYP1A1発現)、PXR活性(CYP3A11発現)の双方が高かった。このデータは病院排水を受け入れているSTPにおいては薬剤による影響が大きく、その影響は排水処理によって減弱しないことを示唆している。今年度は現地連携研究者との研究打ち合わせ、サンプルの採集と予備的分析を行った。具体的には、インド北部Patna大学と連携し、ガンジス川流域のサンプル約30検体を採集した。インド南西部Manipal大学と連携しGoa、Manipal、MangaloreとHyderabadからサンプル約60検体を採集した。採集した試料の一部は現地で抽出、残りは日本へ輸送した。医薬品汚染調査では、HLBカートリッジを用いて水サンプルからの固相抽出を行った。抽出物を日本に持ち込み、HPLC/MS/MSにより、スルファメトキサゾール(SMX)、トリメトプリム(TMP)、クロラムフェニコール(CHL)、エリスロマイシン(ERY)、エリスロマイシン-H2O(ERY-H2O)の定量を行った。Manipalで収集したサンプル中の医薬品濃度が、CHLを除き、最も高い値を示した。薬剤耐性菌汚染調査では、水サンプルからキット(NucleoSpin Soil)を用いてDNAを抽出し、それらをテンプレートとしてNDM-1を含むβラクタマーゼ遺伝子のPCR検出を行った。一部の水サンプルからNDM-1、CMY-2、FOX、TEM、SHV、CTX-M-1のいずれか1つ、または複数のβラクタマーゼ遺伝子がPCR検出できた。残留化学物質の毒性評価では、乾固した水サンプルの沈渣をジクロロメタン(DCM)を用いて抽出した。抽出物は濃縮後、C18カートリッジを用い分画した。画分を乾固し、DMSOに再溶解して豚初代培養肝細胞に添加し、24時間後にRNAを抽出した。薬物代謝酵素シトクロムP450ファミリーのCYP1A1遺伝子の発現をRT-PCRで検出した。抽出物を豚初代培養肝細胞に添加したところ、CYP1A1遺伝子が誘導されることから、サンプル中にアリル炭化水素受容体アゴニスト活性が存在することを示唆する成績と考えられた。2014年にチェンナイより採集した河川水・底質試料について医薬品及び有害化学物質の分析を行った。先進国では過去50年以上にわたって汚染が進行している有機過フッ素化合物や有機シロキサンについては、インドの汚染は始まったばかりであることが柱状底質試料を用いた歴史的復元により明らかとなった。医薬品ではイブプロフェンの濃度が最も高く、薬剤耐性菌への関与が疑われるキノロン剤のオフロキサシン濃度が次いで高濃度であった。また、同じ底質試料の変異原性強度の空間的と鉛直分布を、コメットアッセイを用いて、多環芳香族炭化水素(PAHs)、およびそのハロゲン化物を指標として判定した。チェンナイ市・クーム川の底質は石油起源のPAHsによる高度な汚染が検証された。底質の変異原性の強さは、PAHsの汚染度に関連していた。また、4種類の下水汚泥の抽出物を雄性マウスに摂取させ、肝臓の遺伝子発現の変化をマイクロアレイ解析した。200以上の遺伝子について、それぞれの下水処理施設に特有な異なる誘導が見いだされ、排水の性質は排出元に大きく影響されることが示唆された。
製造業と異なるサービス業の原価企画の研究

代表的な調査としては日本航空株式会社の調査を行った。具体的にはインタビュー・会議の観察などの調査を行った。その結果,2015年に博士論文が受理された。さらに2015年には学術書籍に論文が掲載された。2016年には日本航空株式会社の子会社に関する学会報告を行った。その内容をもとにした論文が2017年に学会誌に掲載された。その他にも2017年に学術書籍に論文が掲載され,シンポジウムでも報告を行った。当初の研究計画に沿って下記の2社の事例調査を実施した。さらに、追加でCに示す調査を年度末に実施した。a.日本航空(株)・航空運輸サービス:約3年半のインタビュー・会議の観察などのデータに基づき神戸大学の三矢裕教授との共著で2016年夏出版に向けてJAL再生に関するビジネス書を執筆した。2016年4月現在、リサーチサイトに原稿をチェックしてもらっている段階である。また、この調査のデータを用いて『日本の管理会計研究』廣本敏郎・挽文子編著の中に「精度向上を目指す予算管理ー日本航空株式会社の経営改革からの考察ー」として執筆し、2015年8月に刊行された。この調査で得られたデータを使っておよびサービス業のアメーバ経営の論文を現在執筆中である。アメーバ経営学術研究会編著の書籍に所収される予定である。b.ぶどうの木(株)・レストランサービス:2013年6月20日より,石川県に本店を有するぶどうの木(株)のレストランサービスの調査を行っている。2016年2月に追加調査を行い、サービス業の原価企画としての論文をメルコ管理会計に投稿した。c.ブロンコビリー(株)・レストランサービス:ブロンコビリーは2014年度に飲食業界利益率1位になった東証一部上場企業である。2016年3月に名古屋の本社に行き、店舗サービスの観察および会長および社長へのインタビューを実施した。その際、今後の継続調査の許可をもらった。当初の計画通りに調査を進めることが出来、さらに当初の計画には無かったブロンコビリーの調査を年度中に実施することができたからである。当初の計画に沿って下記の2社の事例調査を実施した。a.日本航空(株)・航空運輸サービス:約4年半のインタビュー・会議の観察などのデータに基づき神戸大学の三矢教授との共著で2017年度中出版に向けてJAL再生に関するビジネス書を執筆している。現在,リサーチサイトと修正箇所について最終調整中である。また,この調査データを用いて,2017年3月に刊行された『アメーバ経営の進化ー理論と実践』中央経済社の中では第一論文として「サービスの品質を高めるアメーバ経営ー日本航空株式会社の客室サービスを変えたJALフィロソフィー」(近藤・三矢)が掲載された。2016年夏の原価計算研究学会での統一論題において,元日本エアコミューター社長・安嶋新氏と三矢教授とともに共同報告を行った。この報告内容に基づく論文「管理会計が人材育成に与える影響:日本エアコミューター株式会社における部門別採算制度の事例研究」(三矢・安嶋・近藤)が2017年刊行の学会誌『原価計算研究』に掲載される。b.ぶどうの木(株)・レストランサービス:2013年6月20日より,石川県に本店を有するぶどうの木(株)のレストランサービスの調査を行っており,2016年夏に追加調査を行った。これを反映した論文「レストランサービスの原価企画ー株式会社ぶどうの木のレストラン事業部の考察ー」をメルコ管理会計に投稿し受理された。メルコ管理会計9巻第2号に掲載される予定である。2017年3月『アメーバ経営の進化ー理論と実践』(中央経済社)第一論文「サービスの品質を高めるアメーバ経営ー日本航空株式会社の客室サービスを変えたJALフィロソフィー」(近藤・三矢)が掲載された。2016年夏の原価計算研究学会での統一論題において,元日本エアコミューター社長・安嶋新氏と三矢教授とともに共同報告を行い,この報告内容に基づく論文「管理会計が人材育成に与える影響:日本エアコミューター株式会社における部門別採算制度の事例研究」(三矢・安嶋・近藤)が2017年刊行の学会誌『原価計算研究』に掲載される。石川県に本店を有するぶどうの木(株)のレストランサービスの調査を行っており,2016年夏に追加調査を行った。このように,当初の計画通りに調査を進め,着実に論文としての成果を残している。2013年6月からはじめたぶどうの木の調査は,サービス業の原価企画という視点から調査を進めて論文「レストランサービスの原価企画ー株式会社ぶどうの木のレストラン事業部の考察ー」(2017年7月)を執筆し,メルコ管理会計にて公刊された。現在も調査を継続している。航空サービスを提供する日本航空株式会社の調査を行った。子会社にまで変革が波及したのかという疑問を解消すべくJ-AIR,JACといった子会社の調査も行った。そして,2016年8月にはJALの子会社に焦点を当て,JACの経営改革と管理会計というテーマで学会発表を行い,論文を共同執筆し,2017年に学会誌『原価計算研究』に掲載された。2016年末からは,日本航空株式会社のサービス業としての側面に焦点を当てて調査を進めた。

そして,最も顧客と接する機会の多い客室部門に着目して,データを入手し,考察して論文「サービスの品質を高めるアメーバ経営ー日本航空株式会社の客室サービスを変えたJALフィロソフィー」を執筆し,『アメーバ経営の進化ー理論と実績ー』(中央経済社)の第一論文として掲載され2017年に発刊された。2011年3月からアメーバ経営の導入に関する研究を行うようになった。アメーバ経営の導入経験のあるインフラテックを調査する機会に巡り会い,導入前・導入後・廃止後の状況についてインタビュー調査を実施した。その後,幾度となく追加調査を重ね論文「アメーバ経営導入の阻害要因ーインフラテックからの教訓ー」を執筆し,2017年にメルコ管理会計に掲載された。代表的な調査としては日本航空株式会社の調査を行った。具体的にはインタビュー・会議の観察などの調査を行った。その結果,2015年に博士論文が受理された。さらに2015年には学術書籍に論文が掲載された。2016年には日本航空株式会社の子会社に関する学会報告を行った。その内容をもとにした論文が2017年に学会誌に掲載された。その他にも2017年に学術書籍に論文が掲載され,シンポジウムでも報告を行った。当初の計画どおり研究を進める予定である。また、2016年夏の原価計算研究学会での統一論題における報告(日本エアコミューター安嶋新社長と神戸大学三矢裕教授との共同報告)など、当初の計画にはない研究アウトプットの機会に恵まれているので、計画外の追加的な研究についても積極的に進めていく予定である。著書『JAL再生の研究ー経営者を育てるー』について,日本航空株式会社の総務本部長と打ち合わせの結果,一部内容を削除・修正することになって,現在,原稿を修正中である。まずはこの書籍を無事に発刊させたい。そして,ステーキハウスブロンコビリーの調査を継続しているため,レストランサービスの研究もさらに進める予定である。最後に,レストラン以外のサービス業の原価企画に関する調査も進める予定である。管理会計計画通り執行したが2,231円ほどの差異が生じた。論文執筆作業が多く,調査旅費の支出などが予定よりも少なかった。差異は少額であるため、研究計画通りに使用する予定である。今年度は新たなリサーチサイトへの調査も想定されるので,それらの調査に資源を投資しようと考えている。
腎癌におけるインターフェロンαの感受性予測とペプチド導入増感療法の開発

腎癌におけるインターフェロンα(IFNα)の感受性に関わる分子の同定、増感法の開発は腎癌の治療戦略において有意義と考えられる。まずIFNα感受性・抵抗性腎癌細胞株の網羅的遺伝子解析で感受性に関わる7候補遺伝子を同定し、腎癌細胞株においてADFP、MITF、MTUS1、TNNT1の4遺伝子の発現量による感受性(増殖抑制率)予測式を作成、他の樹立腎癌株、初代培養株で妥当性を確認した。さらに4遺伝子の中で、単独発現量が感受性に相関するMITF遺伝子を抵抗性株に導入したところMITF発現量が増加し、野生株、mockに比較して、感受性の増加が認められた。MITFはp16やHIF-1αのプロモーター領域に結合しうる転写因子のひとつで、腎癌の発生進展および細胞周期制御を通した増殖に関わる可能性が示唆される。そこでp16の発現異常の検討とp16機能性ペプチド(p16-MIS)の導入によるIFNα感受性、細胞増殖の変化を検討した。感受性株、抗性株ともp16発現は欠損しており、MITF導入抵抗性株においてもp16の発現上昇はなかった。そこで、p16-MIS導入とIFNα感受性の変化を検討した。導入用トランスポーターペプチド(Wr-T)により、p16-MISを導入したところ、P16 MISは濃度依存性に細胞質、核内に取り込まれ、抵抗性株においては、IFNα感受性が増強し、MTTアッセイでは2.5倍100倍以上の増強であった。以上、腎癌におけるIFNα感受性に関わる遺伝子候補による感受性予測とその関連分子による増感療法の可能性が示唆された。特にp16-MIS導入はIFNα感受性の増強に有用な可能性があり、実用を目標に移植腫瘍動物治療モデルの作成を行う予定である。インターフェロンα(IFNα)に感受性あるいは抵抗性の腎癌細胞株における網羅的遺伝子解析でIFNα感受性に関わる候補7遺伝子を同定し、これらを腎癌細胞株において遺伝子発現量とIFNαの感受性との相関性を重回帰分析を用いて検討した。その結果、ADFP、MITF、MTUS1、TNNT1の4遺伝子による感受性(増殖抑制率)予測式が有用と考えられた。さらに他の樹立腎癌細胞株あるいは初代培養腎癌細胞においてIFNα感受性とこれらの遺伝子のRNA発現量を定量し、予測式が妥当であることを確認した。4遺伝子の中で、単独の発現量がIFNα感受性と良く相関するのはMITFF遺伝子であったので、まずMITFをpcDNA3.1(+)を発現ベクターとして腎癌細胞株に遺伝子導入し、MITFの発現量の変化、IFNα感受性の変化を検討した。MITF遺伝子導入により、IFNα抵抗性株ではMITF発現量が増加し、野生株、mockに比較して、IFNα感受性が濃度依存的に増加が認められた。一方、野生株においてMITF発現の高い1FNα感受性株は遺伝子導入後もMITF発現、IFNα感受性ともに高く、有意な差は認められなかった。MITFはp16^<INK4a>やHIF-1αのプロモーター領域に結合しうる転写因子のひとつで、腎癌の発生進展に関わる可能性と細胞周期制御を通して増殖に関わる可能性が示唆される。以上よりp16の発現異常とMITF発現、IFNα感受性の低下に関する検討が必要と考え、p16発現、Rbリン酸化の有無の検討、さらにp16ペプチドの導入によるIFNα感受性の変化、細胞増殖の変化を検討する予定である。すでにペプチド導入用トランスポーターペプチド(Mol Cancer Ther 2004;3:1623)、FITC標識p16ペプチドの準備と腎癌細胞への導入のin vitro基礎検討を行い、良好な細胞内導入を確認した。インターフェロンα(IFNα)

感受性の異なる腎癌細胞株の網羅的遺伝子解析による比較から抽出した感受性に関連する遺伝子群から単独発現量がIFNα感受性と相関の良好なMITF遺伝子について、その発現とMITFによりプロモーターを制御されるとするp16INK4a(p16)に注目しその発現、そのペプチド導入によるIFNα感受性の変化について検討した。IFNα抵抗性の腎細胞癌においてp16機能性ペプチドの導入はIFNαの感受性を増強させる可能性が考えられ、マウスの腎癌細胞株同所移植による治療モデルの作成を行う予定である。
カーボンブラック・金属酸化物アロイ薄膜のセンシング機能の高性能化

平成9、および10年度において、カーボンブラック・アルミナゲルアロイ薄膜の電気抵抗値は、グラフト鎖の良溶媒蒸気中で著しく低下し、新規のガスセンサーとして機能することを明らかにした。そこで、本年度は、(1)カーボンブラック表面への分子量の制御されたポリマーのグラフト、(2)カーボンブラック・アルミナゲルアロイのガス応答速度に及ぼすグラフト鎖の分子量の影響、(3)カーボンブラック・アルミナゲルアロイのガス応答性に及ぼすグラフトポリマー鎖の種類の効果、および(4)酵素固定化カーボンブラックを組み込んだアルミナアロイの合成について検討を行った。その結果、以下の成果が得られた。1.カーボンブラック表面へ導入したアミノ基でリビングポリマーカチオンを停止することにより、粒子表面へ分子量分布が狭く、しかも分子量が制御されたポリマーがグラフトできることを見出した。2.カーボンブラック・アルミナゲルアロイ合成の際、分子量の小さいポリマーをグラフトしたカーボンブラックを用いるほど、その抵抗値のアルコールや水蒸気に対する応答性が速くなることが分かった。3.カーボンブラック・アルミナゲルアロイのガスセンシングにグラフト鎖のカルボニル基とアルミナゲルの水酸基との間で形成される水素結合が重要な役割を演じていることを明らかにした。4.各種のカルボニル基含有ポリマーをグラフトしたカーボンブラックとアルミナゲルとのアロイの電気抵抗値は、グラフト鎖の良溶媒蒸気中で著しく低下し、しかも乾燥空気中へ戻すと、初期抵抗値へ戻り、新規の多機能センサーとして機能することが分かった。5.グラフト鎖へ酵素を固定化したカーボンブラックを用いると、酵素を組み込んだアルミナアロイが得られることが分かった。しかしながら、この様な抵抗体にはグルコースヘの応答性は認められなかった。
内リンパ液Ca^<2+>活量と蝸牛電位変化に対するPHの影響

プライエル反射正常の有色モルモットを用い、全身麻酔下で露出した蝸牛第二回転より、蝸牛内直流電位(endocochlear DC potential ; EP)と内リンパ液と外リンパ液中のCa^<2+>活量とpHをイオン選択性微小電極を用いて調べた。EPが82.3±0.9mV(n=5)の状態で、内リンパ液イオン組成はK^+144.5±1.6mM/l,Na^+1.95±0.39mM/l,Ca^<2+>170±0.6nM/l,pH7.61±0.09,Cl^-140.5±3.2mM/l(n=5)であった。一方、外リンパ液イオン組成はNa^+163.0±9.4mM/l,K^+5.6±0.3mM/l,Ca^<2+>1.3±0.8mM/l,pH7.39±0.15,Cl^-141.4±0.8mM/l(n=5)であった。外リンパ液イオン組成は従来からの研究報告とほぼ同様の結果が得られたが、内リンパ液イオン組成では、K^+,Na^+,Cl^-のイオン組成は従来からの研究報告と合致するが、内リンパ液Ca^<2+>活量及び内リンパpHは違いが見られた。以前の報告で、内リンパ液Ca^<2+>濃度は2×10^<-5>M/lと非常に高い濃度が報告されていたが、今回の研究では、内リンパ液Ca^<2+>濃度は1.7×10^<-7>M/lと非常に低い濃度が得られた.また内リンパpHも7.6と弱アルカリ性を示し、従来のpH7.4と異なった結果であった。この内リンパ液Ca^<2+>濃度は、細胞内のCa^<2+>濃度として報告されている10^<-7>M/lとほぼ同程度の濃度で、内リンパ液イオン組成が細胞内液のイオン組成と同一傾向を持つ事と一致した結果である。従来のCa^<2+>イオン選択電極によりも感度の高いCa-PVCイオン選択性電極を用いて測定しているので、信頼性が高い内リンパ液Ca^<2+>濃度が測定できたと考えられる。
微生物を用いたα-置換カルボン酸のデラセミ化反応

生体触媒を用いたα-置換カルボン酸に対するデラセミ化反応についての研究を行った。デラセミ化反応とは基質化合物の構造を全く変化させることなく、単にラセミ体を光学活性体に変化させる反応のことである。つまり、ラセミ体を合成することが光学活性体を調製することとと同等の意味を持つ。昨年度までは放線菌の一種Nocardia diaphanozonaria JCM3208株を用い、本反応が脂肪酸の代謝経路であるβ-酸化経路との競合反応であること、本過程が複数の酵素が関与する複合反応機構であることを確認した。しかし、酵素の不安定性から酵素精製を行なうことは断念した。今年度は、α-メチルカルボン酸に対してデラセミ化活性を有する微生物を新たに探索した。その結果、菌体を破砕しても高いデラセミ化活性を保持している菌株Brevibacterium ketoglutamicum KU1073株を新たに見出した。本菌株を用いて酵素糖製を行なったところ、立体選択的にチオエステル化を触媒する酵素(ACS)を得ることができた。N-末端解析より、本酵素はバクテリア由来のMACSと高い相同性を有することを確認した。さらに遺伝子のクローニングを行い大腸菌による大量発現系を確立した。次にα-アミノ酸に対するデラセミ化反応についても検討を行った。D-フェニルアラニンを資化することを指標にスクリーニングを行い、複数の微生物を得ることに成功した。全菌体および破砕菌体を用いた検討から、本反応はケト酸を経由する反応であることを確認し、補因子要求性の検討から反応に関与する酵素を予想するに至った。検討に用いたSinorhizobiummeliloti ATCC51124株は既に全塩基配列が明らかにされていたことから、アミノ基転位反応を触媒すると予想されるORFを大腸菌を用いて大量発現し、同時に大腸菌の有するD-アミノ酸デヒドロゲナーゼ(DadA)を培養条件を工夫することによって活性化することで、効率よくデラセミ反応を行なう組換え大腸菌を構築することに成功した。デラセミ化反応とは基質化合物の構造を全く変化させることなく、単にラセミ体を光学活性体に変化させる反応のことである、本手法を用いれば、ラセミ体を調製することと光学活性体を調製することとが同等の意味を持つことになり、これまでに報告されている光学活性体調製法(例えば速度論的光学分割)とは全く違った概念を提供することとなる。検討の結果、放線菌の一種Nocardia diaphanozonaria JCM3208株が2-アリールおよび2-アリールオキシプロパン酸をデラセミ化する酵素活性を有し、増殖菌体反応条件下、高い選択性にて効率よく(R)-体が得られることを見出した。注目すべきは、2-アリールプロパン酸についてこれまでに報告されている酵素的デラセミ化反応とは逆の鏡像体を与える例であること、さらに2-アリールプロパン酸および2-アリールオキシプロパン酸という類似した構造を有する二つのタイプの化合物間において、得られた光学活性体の絶対立体配置が逆転しているということである。また光学活性体、重水素置換体、あるいは酵素阻害剤を用いた検討から本反応が複数の酵素が関与する複合反応機構で進行していることを示すことができた。2-フェニルチオプロパン酸および2-メチル-3-フェニルプロパン酸誘導体からは同様の条件下ではデラセミ化生成物は得られなかった。特に2-メチル-3-フェニルプロパン酸からはα-メチル桂皮酸が得られた。このことから本反応は脂肪酸の代謝経路であるβ-酸化経路との競合反応であることが判明した。そこでこの事実をもとに反応条件を工夫することによって、上記2種の化合物に対してもデラセミ化反応を優先させることに成功した。本手法を用いれば、ラセミ体を調製することと光学活性体を調製することとが同等の意味を持つことになり、これまでに報告されている光学活性体調製法(例えば速度論的光学分割)とは全く違った概念を提供することとなる。昨年度までの検討より私は、放線菌の一種Nocardia diaphanozonaria JCM3208株が様々な構造を有するα-置換プロパン酸をデラセミ化し、全菌体を用いた場合に、高い選択性にて(R)-体生成物が得られることを見出している。また本反応は脂肪酸の代謝経路であるβ-酸化経路との競合反応であること、複数の酵素が関与する複合反応機構であることを確認している。今年度は、本反応に関与する酵素群の単離精製を目的として破砕菌体を用いた際の最適反応条件検討を行った。検討基質としては静止菌体反応条件下、高い選択性をもってデラセミ化反応が進行する2-(p-クロロフェノキシ)プロパン酸を選択した。当初、菌体を破砕すると酵素活性は著しく低下し、反応液中にデラセミ化活性を見出すことはできなかった。これは過去に報告されているデラセミ化微生物の例と同様であった。そこで破砕上清中にデラセミ化

活性を見出すことを目的とし、精密な条件、具体的にはinducer、添加有機溶媒、反応温度、緩衝液の強度、pHおよび界面活性剤について検討を行い、短時間ではあるがデラセミ化酵素を安定化し、反応を進行させる条件を構築することに成功した。また補因子要求性の検討から、本反応にはATP、Mg^<2+>およびCoASHが必要であることが判明した。このことは反応中にカルボン酸が活性化される段階が存在することを示している。現在、反応中間体アナログを合成し、これを利用して多段階反応を個別の反応として追跡しており、酵素失活の原因について次第に明らかになりつつある。生体触媒を用いたα-置換カルボン酸に対するデラセミ化反応についての研究を行った。デラセミ化反応とは基質化合物の構造を全く変化させることなく、単にラセミ体を光学活性体に変化させる反応のことである。つまり、ラセミ体を合成することが光学活性体を調製することとと同等の意味を持つ。昨年度までは放線菌の一種Nocardia diaphanozonaria JCM3208株を用い、本反応が脂肪酸の代謝経路であるβ-酸化経路との競合反応であること、本過程が複数の酵素が関与する複合反応機構であることを確認した。しかし、酵素の不安定性から酵素精製を行なうことは断念した。今年度は、α-メチルカルボン酸に対してデラセミ化活性を有する微生物を新たに探索した。その結果、菌体を破砕しても高いデラセミ化活性を保持している菌株Brevibacterium ketoglutamicum KU1073株を新たに見出した。本菌株を用いて酵素糖製を行なったところ、立体選択的にチオエステル化を触媒する酵素(ACS)を得ることができた。N-末端解析より、本酵素はバクテリア由来のMACSと高い相同性を有することを確認した。さらに遺伝子のクローニングを行い大腸菌による大量発現系を確立した。次にα-アミノ酸に対するデラセミ化反応についても検討を行った。D-フェニルアラニンを資化することを指標にスクリーニングを行い、複数の微生物を得ることに成功した。全菌体および破砕菌体を用いた検討から、本反応はケト酸を経由する反応であることを確認し、補因子要求性の検討から反応に関与する酵素を予想するに至った。検討に用いたSinorhizobiummeliloti ATCC51124株は既に全塩基配列が明らかにされていたことから、アミノ基転位反応を触媒すると予想されるORFを大腸菌を用いて大量発現し、同時に大腸菌の有するD-アミノ酸デヒドロゲナーゼ(DadA)を培養条件を工夫することによって活性化することで、効率よくデラセミ反応を行なう組換え大腸菌を構築することに成功した。
Fe(III)塩触媒反応による多元素環状化合物合成法の開発

鉄は地球上で4番目に存在度の多い元素であり,低毒性で環境に対する負荷が小さく,環境に優しい「グリーンケミストリー」の実現のために好ましい元素と考えられるが,触媒反応への応用例はさほど多くない。我々は,鉄イオンの性質に注目した触媒反応を開発したいと考え,触媒量の過塩素酸鉄(III)塩によって,シクロプロパノンチオアセタール類の分子内ラジカル環化反応およびtrans-アネトールの環化二量化反応2)が進行することを見いだしている。今回,さらに反応媒体に着目して研究を進め,電子豊富なスチレン類とベンゾキノンの3+2型環化反応による多元素環状化合物の合成を検討した。鉄イオンの酸化電位は反応媒体によって変化し,アセトニトリル中では1電子酸化剤として働くことが知られている。そこで,アセトニトリル中,3mol%のアルミナ担持過塩素酸鉄触媒でシクロブタン誘導体が90%以上の収率で得られることを明らかにしていた。trans-アネトールの環化2量化反応は,電子豊富な基質を1電子酸化して発生するラジカルカチオン種を他の電子豊富な分子が補足することによって進行していると考えられる。そこで,もし,電子不足な基質と電子豊富な基質の間の1電子移動を,鉄イオンが橋渡しするような触媒反応が構築できれば,ドナー分子の電子をアクセプター分子へ鉄イオンが橋渡しすることで生じるラジカルイオンペアにより環化体が得られることが期待される。そこで,アネトールと電子不足オレフィンとの反応を種々検討したところ,メチルビニルケトンをアクセプターとした時に,[2+2]型の環化体が不満足な収率ながら得られることがわかり,さらに1,4-ベンゾキノンをアクセプターとすると,[2+2]型の反応ではなく,[3+2]型の反応が進行し2,3-ジヒドロベンゾフランが生成した。反応を最適化したところ,3mol%のアルミナ担持過塩素酸鉄触媒でほぼ定量的に2,3-ジヒドロベンゾフランを得ることができた。ついで,常温溶融塩であるブチルメチルイミダゾリウムヘキサフルオロフォスフェート([bmim]PF_6)溶媒中で3mol%の鉄(II)フルオロボレート(Fe(BF_4)_2)を触媒にスチレン誘導体とキノンを反応させると,2,3-ジヒドロベンゾフラン誘導体が得られ,しかもアセトニトリル中では数時間要する反応が数分間で完了するという顕著な反応加速が実現した。また,この反応システムによる触媒のリサイクル使用を行うこともできた。
生理活性脂質受容体と免疫・炎症反応

LTB4受容体BLT1, BLT2を対象に、受容体の分子解剖、生体内リガンドの同定、遺伝子欠損マウスの表現型解析を行った。BLT1のGタンパク質認識部位の同定、BLT2の形質膜発現におけるヘリックス8の役割の解明、BLT2の生体内リガンドの同定に成功した。遺伝子欠損マウスの解析から、樹状細胞に発現するBLT1がTh1型免疫反応を促進すること、BLT2が腸管炎症に保護的に作用することを見いだした。1)樹状細胞におけるロイコトリエンB4受容体BLT1の役割マウス樹状細胞にBLT1の発現が認められた。骨髄由来の樹状細胞(BMDC)はLTB4に対して、ベル型の走化曲線を有する走化性を示したが、この走化性はBLT1欠損マウスの樹状細胞で消失していたため、BLT1を介しているものと考えられた。ヒト単球由来樹状細胞にもBLT1が発現していた。BMDCの培養上清中のサイトカイン産生を定量したところ、BLT1欠損BMDCではIL-12の産生が低下しており、混合リンパ球培養試験におけるT細胞の活性化が、BLT1欠損樹状細胞を用いた場合に減弱していた。また、外来抗原感作・惹起による遅延型過敏反応がBLT1で大きく減弱していた。以上から、樹状細胞に発現するBLT1はTh1型の免疫反応を亢進させる役割を有していることが示唆された。2)BLT1のGタンパク質共役部位の同定BLT1受容体はGiとG16という薬理学的に異なる三量体Gタンパク質を活性化することが知られているが、BLT1のどのドメインが両者を区別しているのかは明らかではなかった。BLT1のGタンパク質共役部位を同定する目的で、BLT1の細胞内ループの4アミノ酸を一単位として、全てアラニンに置換した変異受容体を合計14個作成し、おのおのの変異型受容体の細胞内シグナル伝達を観察した。第三細胞内ループのアミノ末端に存在するi3-1に変異を加えたBLT1は、G16を正常に活性化するが、Giは全く活性化出来ず、この部位でGiタンパク質を認識していることが明らかとなった。i3-1変異型BLT1は細胞内カルシウム上昇は正常であるが、アデニル酸シクラーゼの抑制とLTB4に対する細胞走化性を消失しており、Giタンパク質の活性化ができないことを裏付けている。興味深いことにGiを活陛化出来ない変異BLT1は、高親和性のLTB4結合能を失っており、Giタンパク質との共役によって高親和性の構造をとることが明らかとなった。1)ロイコトリエンB4受容体の機能解析:ロイコトリエンB4(LTB4)第一受容体BLT1,第二受容体BLT2を欠損するマウスを用いて炎症反応における役割の解明を試みた。デキストラン硫酸投与による大腸炎モデルにおいてBLT2欠損マウスは亢進した炎症反応を示し、IFN-γ,IL-6の発現の亢進を認めた。一方で、BLT1欠損マウスは野性型マウスと同様の表現型を示した。以上からBLT2は炎症反応に抑制的に働いていることが示唆された。2)ロイコトリエンB4第二受容体の生体内リガンドの同定:ラットの様々な臓器より脂質抽出を行い、BLT2過剰発現細胞に添加してBLT2の活性化能を検討した。小腸から抽出したアセトン可溶性の脂質画分をHPLCにて展開したところ、LTB4とは異なるフラクションにBLT2活性化能を検出し、これを精製・質量分析系にて構造を決定したところ、12-HHT(12(S)-Hydroxyheptadeca-5Z,8E,10E-trienoic acid)であることがわかった。合成12-HHTを用いて詳細な解析を行ったところ、12-HHTはLTB4よりも低濃度でBLT2に結合し、細胞内カルシウム上昇を引き起こすことが明らかとなった。これまで12-HHTはトロンボキセンA2産生に伴うバイプロダクトであり、生物活性は無いと考えられてきたが、強力なBLT2活性化能を有する新規生理活性脂質であると考えられた。本年度は主として以下の3つの実験系を用いてBLT1,BLT2の生体内での役割の解明を目指した。DSS誘導性腸炎モデルにおけるBLT2の保護的役割:BLT2はマウス腸管に高く発現していることから硫酸デキストラン(DSS)投与による腸炎モデルを作成したところ、BLT2欠損マウスでは野生型マウスよりも大きな体重減少と致死率を示した。腸管上皮細胞におけるCCL9,19などのケモカイン、TGF-βやIFN-γといったサイトカインの産生が上昇していることが原因として考えられた。腸管上皮細胞で転写因子Stat3のリン酸かが亢進しており、これが炎症性サイトカインの発現上昇の原因であった。以上からBLT2とそのリガンドである12-HHTは腸管上皮細胞の維持を通じて腸管に保護的な作用を有することが明らかとなった。

マクロファージ刺激におけるBLT1、BLT2の役割:マウス腹腔マクロファージと胎児線維芽細胞(MEF)をLPS、IFNγで刺激した際の炎症性サイトカイン産生におけるBLT1,BLT2欠損の影響を観察したが、遺伝子欠損マウスと野生型マウスの間に差を認めなかった。以上から、マクロファージとMEFからのサイトカイン産生には、BLT1,BLT2は影響を与えていないことがわかった。マスト細胞におけるBLT1.BLT2の役割:マウス骨髄由来マスト細胞(BMMC)がBLT1,BLT2を発現しそれぞれLTB4、12-HHTを介した細胞遊走を引き起こすことから、マスト細胞のFcε受容体を架橋刺激した際の細胞内カルシウム上昇と炎症性サイトカイン産生を測定した。BLT1,BLT2をそれぞれ欠損するマスト細胞は正常なカルシウム上昇と炎症性サイトカイン産生を示したことから、マスト細胞に発現するBLT1,BLT2は、主としてマスト細胞の移動のみに関与していると考えられた。
脳内D-セリン動態の解明と興奮神経毒性新規治療薬の開発

本研究では、神経機能と病態におけるD-セリンの役割を明らかにするために、D-セリン動態に関わる合成酵素のセリンラセマーゼ(SR)の役割を中心に個体レベルでの機能解析を行った。また、D-セリンの神経細胞型輸送体(Asc-1)の機能解析を個体レベルで行うためのコンディショナルノックアウトマウス系統の作製と、脳内D-セリンのアストロサイトにおける機能を明らかにするために、酵母由来D-セリン分解酵素(Dsd-1)を発現するマウス系統の作製を進めた。一方、SRを標的とした新規阻害剤の開発を進め、興奮神経毒性に対する新規治療薬候補の開発を行った。哺乳類脳内にはD-セリンが存在し、NMDA受容体の機能制御に関わっているが、脳内D-セリン動態には不明な点が多い。また、D-セリン合成酵素セリンラセマーゼ(SR)遺伝子ノックアウト(KO)マウスは、神経変性疾患とてんかん発作モデルにおいて症状が軽減した。従って、SRは神経過剰興奮に伴う病態に対する新たな薬物標的と考えられる。これらの背景のもと、本研究では、神経細胞由来D-セリンの動態解析を行うとともに、SRを標的とした神経変性疾患や過剰興奮等の脳病態に対する新たな治療薬候補を開発することを目的とした。本年度は、次の2つの研究を進めた。1)脳内D-セリン動態の解明:神経細胞およびグリア細胞由来D-セリンの放出とその役割を明らかにするために、神経細胞特異的なD-セリントランスポーターAsc-1遺伝子のコンディショナルノックアウトベクターの構築を行い、完成した標的遺伝子組み換えベクターをマウス胚性幹(ES)細胞に導入して、相同組換えES細胞クローンを取得した。一方、アストロサイト特異的にD-セリンの分解酵素(D-serine dehydratase1;Dsd1)を発現させるトランスジェニック(Tg)ベクターの構築を進めた。得られたES細胞ならびにTgベクターを用いて、マウス系統の作製を進める。2)SR新規阻害薬の開発:In silicoスクリーニングを元に、SR活性阻害作用を示す新規阻害薬候補を有機合成し、従来知られているSR阻害薬のマロン酸より100倍以上活性の高い新規化合物等を見出した。この化合物の神経活動に与える影響を、神経活動モニターマウス(Arc-Luc Tg)を用いて評価し、経口投与によりNMDA受容体の活性を抑制する可能性を示唆する結果を得た。本年度は、以下の研究成果を得て論文発表を行った。1)セリンラセマーゼの新規阻害薬候補をin silicoスクリーニング、in vitroでのSR活性評価により開発した(Mori et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 24:3732-, 2014)。2)脊髄に存在するセリンラセマーゼが、炎症性疼痛の制御に関わることを明らかにし、疼痛の創薬標的であることを見いだした(Tabata-Imai et al., PLoSONE, 9:e105282, 2014).また、本年度当初計画した、1)D-セリントランスポータのAsc-1の発現抑制に関しては、条件的遺伝子ノックアウトを行うための標的遺伝子組換えES細胞を取得した。2)アストロサイト特異的D-セリン分解遺伝子操作マウスに関しては、D-セリン分解酵素を発現させるためのBAC-トランスジェニックベクターを導入したES細胞候補を取得した。3)神経変性疾患、過剰興奮マウスモデルを持ちいたセリンラセマーゼ阻害薬の評価に関しては、上記した新たに開発したセリンラセマーゼ阻害薬を神経活動を発光により評価できるArc-Luc Tgマウスに投与し、検討を行い、てんかん発作を引き起こすカイニン酸による発光上昇を抑制する作用を見いだした。本年度は、以下の研究成果を得た。1)D-セリン合成酵素のセリンラセマーゼ(SR)が、細胞質と核の間を移動し、神経細胞死が誘導される際には核に局在しGAPDHやSiahと複合体を形成して不活性化され、過剰興奮に伴う神経細胞死の拡大を抑制する新たな機構を明らかにした。2)D-アスパラギン酸合成酵素と報告されたGot1l1の遺伝子の機能解析を進めた。その結果、in vitroではGot1l1は、D-アスパラギン酸合成能を示さず、また、Got1l1の遺伝子ノックアウト(KO)マウス系統を作製し解析した結果、Got1l1の分布は精巣に選択的であり、また、各種臓器でのD-アスパラギン酸濃度を測定した結果、Got1l1は、マウスのD-アスパラギン酸合成には関わらないとの結論を得た。3)SRを培養細胞に過剰発現させるとアミノ酸代謝制御を介してATP合成を高め、細胞死抑制に関わることを明らかにした。さらに、SRにはD-アスパラギン酸合成能があることを、in vitro及び培養細胞で明らかにした。4)新たに野生型SRの結晶構造解析を明らかにし、新規SR阻害剤のリード化合物を同定した。リード化合物をもとにして新規化合物を合成し、in vitroでのSR酵素活性に与える効果の評価と、カイニン酸誘導Arc発現モニターマウスを用いた個体レベルでの機能評価を実施した。5)アストロサイト特異的にD-セリンを分解するDsd1を発現するBACトランスジェニックマウス系統のファウンダーを作製した。