hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
真核生物における組換え依存的複製再開機構の解明

DNA損傷部位との衝突などによって停止した複製フォークにおいてDNA切断が起きた場合(「フォークの崩壊」と呼ぶ)、組換えにより複製フォークが再生されて再開可能となることが知られている。しかし、このときフォークにおいてDNA複製を担っているレプリソームがどのように制御されているのかほとんど分かっていない。本研究では、レプリソーム因子GINSのサブユニットであるPsf2がフォーク停止時にATR/ATMによるリン酸化を受けること、さらにこのリン酸化が複製再開に関与していることを明らかにした。本研究課題の目的は、崩壊した複製フォークおよびレプリソームが組換え依存的に再生される仕組みを明らかにすることである。GINS複合体はレプリソームにおいてCMGヘリカーゼ複合体の一員として働く因子であるが、哺乳類ではGINSサブユニットの一つであるPsf2がDNA損傷や複製ストレスに応答してATM/ATRによるリン酸化を受けることが知られている。このリン酸化がレプリソームの制御に関与しているのではないかと考え、Psf2のリン酸化の役割についてアフリカツメガエル卵無細胞系とニワトリDT40細胞を用いて調べた。まず始めに、卵無細胞系においてもツメガエルPsf2はDNA損傷シグナルの存在下でATM/ATRに依存してリン酸化されることを明らかにした。また、部位特異的変異体を作製することにより、リン酸化部位が哺乳類と保存されたセリン182番目であることを明らかにした。リン酸化変異型組換えGINSを用いた再構成実験では、ゲノム全体レベルでの複製進行にはこのリン酸化の影響は見られなかった。このリン酸化がどの程度ゲノムの安定性維持に重要であるのかを評価するために、ニワトリDT40細胞を用いたコロニー形成アッセイを行った。ニワトリPsf2の182番目のセリンをアスパラギン酸に置換して恒常的なリン酸化を擬態した変異体を過剰発現した場合には、野生型や非リン酸化型を過剰発現したときに比べて、UVやMMSなどの変異原に対する抵抗性が向上することが分かった。これらの結果は、DNA損傷による複製進行の阻害が起きた場合の応答にPsf2のリン酸化が重要な役割を果たしていることを示唆している。本研究の目的は、崩壊した複製フォークおよびレプリソームが組換えによって再生される仕組みについて明らかにすることである。GINS複合体はレプリソームにおいてCMGヘリカーゼ複合体の一員として働く因子であるが、DNA損傷の存在下ではGINSサブユニットの一つであるPsf2のC末端がATR/ATMによるリン酸化を受けることが知られている。このリン酸化がレプリソームの動態制御に関与しているのではないかと考え、Psf2のリン酸化部位に変異を導入した組換えGINS複合体を作製して、アフリカツメガエル卵無細胞系による解析を行った。内在性GINSを免疫除去した卵抽出液に組換えGINSを添加して複製活性を調べた結果、DNA損傷の有無に関わらず、野生型とリン酸化変異型との間で大きな差は見られなかったことから、ゲノム全体的なレベルでの複製進行にはPsf2のリン酸化は必要ではないと考えられる。しかし、卵抽出液からの共沈降解析では、野生型および擬似リン酸化型(グルタミン酸置換)とCMGヘリカーゼの一員であるCdc45が共沈降したのに対し、非リン酸化型(アラニン置換型)とは共沈降しなかったことから、個々のレプリソームにおいては、Psf2のリン酸化がCMG複合体の安定性を制御している可能性が示唆される。また、DNA鎖間架橋(ICL)誘導剤であるマイトマイシンにより複製進行を阻害した条件でクロマチン結合タンパク質の解析を行った結果、変異型GINSの存在下ではMCM9の結合が低下していることを見出した。MCM9はMCM8と複合体を形成してICLの組換え修復に関与すると考えられている因子であり、レプリソームがICL部位と衝突した際のMCM8-9複合体のリクルートにPsf2のリン酸化が関与する可能性を示唆している。停止したフォークを一本鎖特異的エンドヌクレアーゼ処理すると、レプリソームからGINSが脱落するが、組換え因子Rad51依存的に再結合して複製再開可能となることが過去の研究で分かっている。そこで、GINSの制御に着目して研究を行った。GINSのサブユニットPsf2は、DNA損傷や複製ストレスに応答してATR/ATMによるリン酸化を受けることが知られている。昨年度の研究で、アフリカツメガエル卵抽出液中でPsf2の182番目のセリン(Ser182)がリン酸化されることを明らかにしたので、今年度はPsf22リン酸化変異体を含むGINSを用いて複製活性に与える影響について調べた。低濃度のアフィディコリンとS1ヌクレアーゼの存在下ではGINSのクロマチン結合の維持と効率的な複製進行にRad51が必要となるが、このときPsf2リン酸化部位をアラニン置換すると野生型やグルタミン酸置換型に比べて複製活性が低下することが分かった。

また、オーキシンデグロン法を用いて停止したフォークにおいてGINSを分解誘導すると、複製再開の際には新たにGINSのクロマチン結合が必要となるが、このときPsf2リン酸化変異体では複製再開の活性が低下することが分かった。これらの結果は、レプリソームからGINSが失われてもATR/ATM活性依存的に再結合してレプリソームを再形成できることを示唆している。分子生物学、生化学ツメガエル卵無細胞系を用いた研究については若干遅れているが、当初の計画に無かったニワトリDT40を用いた実験を導入してある程度の進展があったため、全体としてはおおむね順調であると言える。卵無細胞系でPsf2のリン酸化を確認できた点と全体レベルでの複製進行への影響を調べた点は進展があったが、個々の複製フォークへの影響を調べるためにはDNA combing法の技術習得が必須であり、この点の進展が少し遅れている。また、ツメガエル卵無細胞系の改良型である核質抽出液(NPE)を用いたプラスミドの複製系、さらにこれを応用した部位特異的な複製フォークの崩壊を誘導する系の開発も遅れている。一方、リン酸化の重要性が卵無細胞系では明らかにできない可能性があるため、培養細胞(ニワトリDT40)で生存率への影響を調べたが、これは計画にはなかった進展である。H24年度の計画は本来、複製フォークの崩壊と再生を再現できる系の構築が第一目標であったが、この点について進展が遅れている。アフリカツメガエル卵の粗抽出液を用いた系で個々のフォークの停止と再開を検出するためには、DNA combing法で展開したDNAファイバーを顕微鏡観察する必要があるが、技術的な難易度が高く、習熟するために時間を要している。また、通常の粗抽出液から膜画分を除いたサイトゾル(HSS)と核画分の抽出液(NPE)を用いてプラスミド上でフォークの崩壊と再生を再現する系の構築についても、NPEの調整が律速となってるのが現状である。そのため、「研究実績の概要」で記したように本来、H25年度以降に実施する計画であったレプリソーム因子の動態や修復系因子との関連などの解析を前倒しして行いつつ、DNA combing法やNPE調整などの習得に努めているところである。ニワトリDT40細胞でPsf2のリン酸化変異により生存率に影響があることが分かったので、DT40細胞とツメガエル卵無細胞系を併用してこのリン酸化の意義を明らかにしていく予定である。特に以下の項目について解析を進め、最終年度には論文としてまとめたい。(1)DNA combing法を用いて、Psf2リン酸化変異による個々のフォークの進行速度への影響、停止したフォークからの再開への影響などを調べる。(2)Psf2リン酸化による他の修復因子との相互作用の変化、あるいはCMG複合体の安定性への影響について免疫沈降、質量分析などにより明らかにする。(3)リン酸化特異的抗体を作製し、フォークの停止・崩壊・再生のどの過程でリン酸化が起きていて、どのように必要となるのか、特に組換え経路との関係に注意して明らかにする。H24年度の研究結果から、Psf
マイナス金利及び仮想通貨普及の下での金融・為替政策ー国際比較に基づく実証研究

平成30年度には、研究目的および研究実施計画を踏まえ、以下のような研究を実施し、所要の成果を得た。本研究においては、国際比較を重視しつつ、計量経済学の様々な手法を用い、関連する種々のデータを分析することで、研究目的を達成していくこととしている。このため、まず、「共和分多変量自己回帰モデル」(Cointegrated Vector Autoregressive Model,以下CVARモデルと略記)の枠組みを活用し、経済現象に内在する非線形性をモデル化するための手法を様々な観点から検討した。具体的には、CVARモデルの中の共和分関係の中に確定的な非線形トレンドを導入し、この非線形モデルの枠組みで共和分パラメーター行列のランクを検定する手法を考案した。検定統計量の漸近分布を導出するとともに、検定を実際に行うために必要な分位点をコンピューター・シミュレーションにより計算し、分位点表を作成した。また、考案した検定手法を実際の経済・金融分野の時系列データに適用し、その有用性を確認した。こうした研究に加え、時系列データ内に観測される構造変化を階段関数で捉える形でCVARモデルを定式化し、このモデルの利用によって、経済学的な解釈を比較的容易に行える共和分関係をデータ分析から見いだせることを明らかにした。こうした諸研究は、金融政策に関して、データ内の非線形性に配慮した計量経済分析を行う上で、極めて有用な分析手法を提供するものである。また、ノルウェーなどのマクロ計量経済分析の研究者と共同し、北欧諸国に焦点をあてた計量経済分析のための準備を進めているところである。現在、これまでに得られた研究成果を、複数の論文に取りまとめている。完成した論文の一部は、査読付き英文ジャーナルに受理され出版された。他の論文も、完成次第、査読付き英文ジャーナルに順次投稿する予定である。当初の計画通り、非線形計量経済モデルに関する研究が進んでおり、また実際の経済・金融の時系列データの分析に関しても研究が進展しているため。今後も引き続き、非線形計量経済モデルに関する研究を進展させるとともに、金融・為替政策に関連する時系列データの実証分析をさらに多面的に行っていく。本年度は、既存の研究設備等を用い研究を遂行できたため、次年度使用額が生ずることとなった。今後は、既存の研究設備費が老朽化することを踏まえ、研究設備の更新などを行っていく予定である。
GISTの発生、顕性化、悪性化に関与する遺伝子異常の解明

・GISTの多発転移により死亡した剖検31症例(imatinib未治療30例、imatinib治療後1例)および、GIST転移巣切除術2症例(imatinib, sunitinib治療後1例、imatinibm未治療1例)の併せて33症例152病変について組織形態学的な多様性およびKIT, CD34の発現について免疫組織化学的な検索を行った。KIT陰性転移巣については、分子標的治療薬のターゲットになりうる他のチロシンキナーゼ型レセプター(EGFR, PDGFRB, Met, Her2)発現の有無について追加検索を行った。さらにPDGFRB, EGFR陽性症例についてはFISHにより遺伝子増幅の有無、遺伝子変異解析を行った。【結果】33症例154病変中、7症例15病変でKITの陰性化が見られ、組織像もGISTとしては非典型的な所見への変化を認めた。これらKIT陰性15病変のうち4症例7病変でPDGFRBの発現を、1例3病変でMETの発現を、1病変でPDGFRBとEGFRの同時発現を認めた。またKIT陰性PDGFRB陽性を示す症例の一部転移巣においてPDGFRB遺伝子exon 12のmissense point mutationを認めた。EGFRの変異はなく、FISH解析にてPDGFRB, EGFR遺伝子の増幅はみられなかった。【考察】GISTの晩期転移・再発巣においては、imatinib未治療症例であっても一部の病変は形態学的な変化を伴ってKIT陰性化を示し、他のチロシンキナーゼ型レセプターの活性化が腫瘍の増殖に関与している可能性がある。この結果は、薬剤耐性の獲得を考慮してimatinib投与を遅らせることに意義はない事を示している。さらに、KIT陰性化したimatinib不応症例については、他のRTKs inhibitorの併用、変更が治療として有効な可能性がる。・平成20年度までの研究で、我々はGISTの転移巣において悪性化に関与する遺伝子異常を調べるため、GISTの多発転移により死亡した病理解剖30症例145病変について解析を行っている。これらの症例はメシル酸イマチニブによる治療は行われていない。それにも関わらず一部の症例(4症例10病変)において、KITの陰性化がみられた。さらにこのKIT陰性病変について、他のチロシンキナーゼ型レセプター(TKR)発現(Her2, EGFR, MET, PDGFRA, PDGFIB)について免疫染色を行ったところ、6病変においてPDGFRBの発現が見られ、他のTKRの発現は観察されなかった。以上の結果から、GISTの転移再発巣においてはKITの発現低下に伴い、PDGFRBが腫瘍の増殖に関与している可能性が示唆された。現在、活性化のメカニズムを明らかにするため、以下の検索を行っている1)PDGFRB遺伝子変異の検索(傍細包膜領域exon12、チロシンキナーゼドメインexon18)2)PDGFRB遺伝子増幅の検索(FISH法により腫瘍細胞におけるPDGFB遺伝子増幅について検索を行う)・GIST発生初期に関与する遺伝子の探索については、現在1p, 14q, 22qにターゲットを絞った超高密度マイクロアレイによりCGHのデータ解析を行っている。現在までに腫瘍径5-35mm大までの小GIST14症例、NF1合併GIST, GISTcell lineについての検索を終了しておりデータの解析中である。さらにプロモータ領域の異常メチル化についてマイクロアレイによる解析を引き続き症例を増やして行っており、GIST発生初期に関与する癌抑制遺伝子の候補を特定し、この遺伝子についてGIST細胞株(GIST882)への導入実験を行う予定である。
口腔癌増殖・浸潤を促進するRAGEの分子標的阻害薬の開発

口腔がん患者のがん組織において、その82%に終末糖化産物受容体RAGEが発現している。RAGEは、HMGB1などをリガンドとし、種々の細胞内シグナルを介し、細胞増殖、細胞運動・浸潤、血管新生を促進する。一方、I型ムチンのMUC1は、多くのがん細胞に発現し、がん抗原として着目されている。本研究ではRAGE及びMUC1に対する2重抗体を作成する目的で、RAGEに対するモノクローナル抗体を作成し、2重単鎖抗体の作成及び結合性の改良を試みた。口腔がんのみならず、さまざまながんにRAGE及びMUC1が発現していることから、これらの改良した抗体を用いることで、腫瘍の増殖抑制をもたらす可能性を示した。口腔癌の治療において、形態及び機能の温存治療が社会的にも求められている。口腔癌患者の腫瘍組織には、RAGE(終末糖化産物受容体)が発現しており、RAGEが癌の進展・転移に大きく影響していることが報告されている。そこで本研究では、遺伝子工学技術を用いて口腔癌上のRAGEを特異的に阻害する新規薬剤を作成し、その効果とメカニズムを検証することを目的とした。26年度は、RAGEを認識する抗体を作成するため、はじめに、リコンビナントRAGEを作成することにした。口腔癌細胞株HSC4よりmRNAを抽出し、可溶性RAGE(sRAGE)と膜型RAGE(fRAGE)のcDNAを発現ベクターに組み込んだ。CHO細胞に遺伝子導入し、sRAGE又は、fRAGEの高発現細胞株を作成した後、sRAGE産生細胞よりsRAGEを精製し、BALB/cマウスに投与した。sRAGEに対する抗体価の上昇が確認できたので、ハイブリドーマを作成した。ELISA法及びフローサイトメトリー法により、スクリーニング及びクローニングを行い、2種類の抗体産生細胞を樹立した。これらのモノクローナル抗体は、口腔癌細胞以外の乳癌細胞、胃がん細胞の一部にも反応性があることが確認された。そこで本研究では、遺伝子工学技術を用いて口腔癌上のRAGEを標的とした新規薬剤を作成し、その効果とメカニズムを検証することを目的とした。27年度は、CHO細胞に膜型RAGE (fRAGE)を遺伝子導入したCHO-RAGE及び、口腔癌細胞株を用いて、作成した抗RAGE抗体の機能解析を行った。CHO-RAGE細胞に高親和性のモノクローナル抗体を用いて、腫瘍細胞上のRAGEの発現を検討したところ、市販の抗RAGE抗体では反応できない腫瘍細胞にも反応性が確認できる抗体であることがわかった。また、抗癌剤処理により、腫瘍細胞上のRAGEの発現が上昇する傾向が認められたため、RAGEをターゲットにした治療の可能性が期待された。また、口腔癌特異的な抗原MUC1分子に対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマよりmRNAを単離後、cDNAを合成した。5'RACE法により、抗MUC1抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域の遺伝子配列を決定した。抗MUC1抗体の重鎖と軽鎖を人工的にリンカーでつなぎ合わせ、抗MUC1単鎖抗体(anti-MUC1 scFv)を発現するベクターを構築した。さらに抗RAGE抗体と抗MUC1抗体を、Knob-in Holeシステムにて二重機能抗体を作成するため、LCL細胞(EBV感染Bリンパ芽球様細胞)よりヒトIgG1のFc領域の遺伝子をクローニングし、anti-MUC1 scFv抗体と組み合わせた抗体を作成した。現在、可溶性HMGB1を作成し、CHO-RAGE細胞を用いて、RAGE-HMGB1シグナルを検出するシステムの構築を行っている。2015年1月に名古屋市立大学医学研究科免疫学教室より、愛知県がんセンター研究所腫瘍免疫学部に異動した。作成したハイブリドーマや、各種腫瘍細胞を移動させるのに、細胞の調子が良くなかったことなどで時間がかかったため。そこで本研究では、口腔癌上のRAGEを標的とした新規薬剤を作成し、その効果とメカニズムを検証することを目的とした。28年度は、可溶性HMGB1とCHO-RAGE細胞を用いて、RAGE-HMGB1シグナルを検出するシステムの構築を行った。樹立した2種類の抗RAGE抗体について、解析したところ、RAGEに高親和性を示すが、どちらも機能阻害活性を有さないことが判明した。さらに、口腔癌特異的な抗原MUC1分子に対する単鎖抗体を発現するベクターを、CHO細胞又はCOS7細胞に導入して抗MUC1単鎖抗体(anti-MUC1 scFv)を作成した。CHO-MUC1細胞を用いて、MUC1に対する結合性をフローサイトメーター及びELISA法で確認したところ、scFv(一価)では腫瘍細胞に対して親和性が弱く、腫瘍を標的化するには結合力を改善する必要があることが明らかになった。そこで、抗MUC1抗体を二価型にする条件検討を行った。Diabody型、及びtandem scFv型の2種類作成し、フローサイトメーター及びELISA法により、結合性を確認したところ、ワイルドタイプの抗体と同等の結合力を持っていることが確認できた。

今後は、RAGEに対する抗体と、二価型の抗MUC1抗体と組み合わせた抗体を作成する予定である。作成したハイブリドーマの調子が悪く、改善に時間がかったため、計画より遅延している。また、抗腫瘍抗体が一価では結合力が極端に落ちることが判明し、そのため、二価にするための条件検討が必要になったため時間がかかっている。口腔がんの治療において、形態及び機能の温存治療が社会的にも求められている。口腔がん患者の腫瘍組織には、その82%にRAGE(終末糖化産物受容体)が発現しており、RAGEががんの進展・転移に大きく影響していることが報告されている。一方、口腔がんに特異的に過剰発現している粘液の主成分で高分子糖蛋白質ムチンMUC1は、大腸がん、前立腺がん、乳がんなど多くのがんにおいてもその過剰発現が高頻度にみられる分子であり、がんの分子標的として注目を浴びている。そこで本研究では、遺伝子工学技術を用いて口腔がん細胞上のRAGEを標的とした新規薬剤を作成し、その効果とメカニズムを検証することを目的とした。多くのがん細胞では、HMGB1やその他の増殖因子を自ら産生し、オートクリン的にRAGEなどの自らの細胞表面に発現している受容体に作用させ、増殖する。今年度は、今回作成した抗RAGE抗体が、RAGEを介した細胞増殖に阻害効果を持つかどうかを検討した。はじめに、がん細胞を抗RAGE抗体で処理を行い、その後HMGBを加え、Erk1/2のリン酸化を抑えることができるかどう検討したところ、今回作成した抗体で、RAGEを阻害する傾向が確認できた。これらの抗体は、RAGE及びMUC1を発現しているがん細胞において、腫瘍の増殖抑制をもらたす可能性を示した。特に、RAGEについては、さまざまながん種で発現しているため、今後のがん治療に貢献できる可能性を示した。口腔がん患者のがん組織において、その82%に終末糖化産物受容体RAGEが発現している。RAGEは、HMGB1などをリガンドとし、種々の細胞内シグナルを介し、細胞増殖、細胞運動・浸潤、血管新生を促進する。一方、I型ムチンのMUC1は、多くのがん細胞に発現し、がん抗原として着目されている。本研究ではRAGE及びMUC1に対する2重抗体を作成する目的で、RAGEに対するモノクローナル抗体を作成し、2重単鎖抗体の作成及び結合性の改良を試みた。口腔がんのみならず、さまざまながんにRAGE及びMUC1が発現していることから、これらの改良した抗体を用いることで、腫瘍の増殖抑制をもたらす可能性を示した。2015年1月名古屋市立大学医学研究科免疫学教室より愛知県がんセンター研究所腫瘍免疫学部に異動したため。また、ハイブリドーマの作成に使用したミエローマ細胞の調子がよくなかったため、作成できたハイブリドーマが少なかったため。移動させた腫瘍細胞の調子が改善されれば、樹立したモノクローナル抗体に、RAGE-HMGB1システムの機能阻害活性を持つかどうか検討する。その後、ハイブリドーマより抗体遺伝子を単離し、MUC1への結合能を持った2重機能抗体を作成する。
カテゴリの知覚と形成における言語的符号化および言語ラベルの寄与について

本年度は、異なるカテゴリに属する刺激同士の方が、同じカテゴリに属する刺激同士よりも弁別しやすいという、カテゴリカル知覚と呼ばれる現象(Hamad,1987)のメカニズム、さらには、カテゴリの形成が知覚に及ぼす影響を包括的に検討するため、いくつかの異なる種類のカテゴリ(例えばAshby,Alfonso-Reese,Turken,&Waldron,1998)の学習が、それぞれ視覚的認知にどのような影響を及ぼすかについて検討を始めた。これまでカテゴリカル知覚には言語的なものと非言語的なものの2つのタイプが報告されている。また、新奇カテゴリの学習に関する研究から、カテゴリには複数のタイプがあり、学習メカニズムが脳レベルから異なるという報告がある。これらの報告から、異なる機序により学習されたカテゴリに基づいて、異なるタイプのカテゴリカル知覚が生じる可能性がある。Ashby and Maddox(2005)によれば、カテゴリには、言語によって顕在化可能な規則に基づいたカテゴリ(Rule-Based Category:以下、RBカテゴリとする)、複数の特徴次元が統合された言語化不可能な規則に基づいたカテゴリ(Information-Integrated Category:以下、IIカテゴリ)、複数の特徴次元のランダムな組み合わせによって定義されるカテゴリ(以下、RDカテゴリ)、刺激を反復呈示することでプロトタイプが形成されるカテゴリ(以下、PTカテゴリ)の4つのタイプがあり、それぞれ脳レベルで異なる学習メカニズムが存在する。本研究ではこれらの4つのタイプのカテゴリを学習することで、視覚認知がどのような影響を受けるかについて、複数の実験を行い検討した。その結果、RBカテゴリの学習は知覚に影響を及ぼしカテゴリカル知覚を生じさせるのに対し、IIカテゴリやRDカテゴリの学習は知覚に影響を及ぼさないことが示唆された。それらのカテゴリの学習メカニズムを明らかにすることでカテゴリカル知覚のメカニズムが解明される可能性もある。今後は未だ検討されていない残る1つのタイプのカテゴリであるPTカテゴリについて、PTカテゴリの学習が視覚認知に及ぼす影響について新たな実験を計画中である。等しい差をもつ刺激対の弁別では、異なるカテゴリに属する刺激対の方が同じカテゴリに属する刺激対よりも弁別しやすいというカテゴリカル知覚が生じるメカニズムについて、言語的符号化および言語ラベルという観点から研究を行った。初年度である本年度は、まず、色のカテゴリカル知覚における言語的符号化の寄与を検討した。実験の結果、色刺激に対する言語的符号化に干渉を生じさせると、色のカテゴリカル知覚が消失することが示された。また、言語的符号化に対する干渉の強度を強くするほど、色のカテゴリカル知覚もより減衰・消失することも示された。さらに、刺激色に対して誤った言語的符号化を誘導すると、誤った言語ラベルに基づいて擬似的に色のカテゴリカル知覚が生じることも示された。これらの研究成果は色のカテゴリカル知覚において言語的符号化によって形成された言語ラベルが重要な役割を担うことを強く示唆するものである。さらに、上記の色のカテゴリカル知覚に関する実験パラダイムを応用し、色以外のモダリティである形態のカテゴリカル知覚のメカニズムについても検討を開始した。実験では、アルファベットの「H」の側線分の角度を操作し、「H」から「A」に至る物理的に連続した刺激セットを用いた。しかし、実験の結果、物理的に連続した刺激セットではカテゴリカル知覚が生じなかった。このことは、カテゴリカル知覚が生じるには物理的ではなく心理的に等間隔な刺激セットを用いる必要があることを示唆しており、今後、形態のカテゴリカル知覚における言語的符号化の寄与を検討するにあたって重要な知見となる。等しい色差をもつ刺激対の弁別では、異なるカテゴリに属する刺激対の方が同じカテゴリに属する刺激対よりも弁別しやすいという色のカテゴリカル知覚について、言語的符号化および言語ラベルという観点から研究を行った。第2年度である本年度は、昨年度までに得られた研究結果、特に誤った言語ラベルが誘発されることがカテゴリカル知覚にどのような影響を及ぼすのかについての研究結果をまとめ、国内外の研究会や国際会議で報告した。さらに、これまでに得られた一連の研究成果を国際誌に投稿するため、英語論文を執筆中である。また、これまでのカテゴリカル知覚研究においては「言語的なカテゴリカル知覚」対「非言語的なカテゴリカル知覚」という構図がみられるが,このように言語という概念を用いた二分法では説明不可能な現象も報告されている。例えば、言語獲得前の乳児でも色のカテゴリカル知覚が生じたという報告と、異なる言語圏では異なる色のカテゴリカル知覚が生じたという報告がある。このような問題に対応するため、言語・非言語という二分法ではなく、カテゴリカル知覚を包括的に説明可能な理論を提案することも本研究の目的である。このことに関して、カテゴリを潜在的に学習する場合と顕在的に学習する場合では関連する脳部位が異なり、言語の影響も異なるという知見が近年報告されている。このような知見に基づき、次年度ではカテゴリの学習方法とカテゴリカル知覚の関係について精力的に検討する。本年度ではそのための予備実験として、潜在的に学習したカテゴリと顕在的に学習したカテゴリの双方について、新たに獲得したカテゴリに基づいてカテゴリカル知覚が生じるかどうかを検討した。その結果、顕在的に学習したカテゴリによってはもちろん、潜在的に学習したカテゴリによってもカテゴリカル知覚が生じることが示された。潜在的に学習したカテゴリによってもカテゴリカル知覚が生じることを示した例は他になく、次年度から本格的に取り組むカテゴリの学習方法とカテゴリカル知覚の関係についての研究に対して、意義のある予備実験結果である。

本年度は、異なるカテゴリに属する刺激同士の方が、同じカテゴリに属する刺激同士よりも弁別しやすいという、カテゴリカル知覚と呼ばれる現象(Hamad,1987)のメカニズム、さらには、カテゴリの形成が知覚に及ぼす影響を包括的に検討するため、いくつかの異なる種類のカテゴリ(例えばAshby,Alfonso-Reese,Turken,&Waldron,1998)の学習が、それぞれ視覚的認知にどのような影響を及ぼすかについて検討を始めた。これまでカテゴリカル知覚には言語的なものと非言語的なものの2つのタイプが報告されている。また、新奇カテゴリの学習に関する研究から、カテゴリには複数のタイプがあり、学習メカニズムが脳レベルから異なるという報告がある。これらの報告から、異なる機序により学習されたカテゴリに基づいて、異なるタイプのカテゴリカル知覚が生じる可能性がある。Ashby and Maddox(2005)によれば、カテゴリには、言語によって顕在化可能な規則に基づいたカテゴリ(Rule-Based Category:以下、RBカテゴリとする)、複数の特徴次元が統合された言語化不可能な規則に基づいたカテゴリ(Information-Integrated Category:以下、IIカテゴリ)、複数の特徴次元のランダムな組み合わせによって定義されるカテゴリ(以下、RDカテゴリ)、刺激を反復呈示することでプロトタイプが形成されるカテゴリ(以下、PTカテゴリ)の4つのタイプがあり、それぞれ脳レベルで異なる学習メカニズムが存在する。本研究ではこれらの4つのタイプのカテゴリを学習することで、視覚認知がどのような影響を受けるかについて、複数の実験を行い検討した。その結果、RBカテゴリの学習は知覚に影響を及ぼしカテゴリカル知覚を生じさせるのに対し、IIカテゴリやRDカテゴリの学習は知覚に影響を及ぼさないことが示唆された。それらのカテゴリの学習メカニズムを明らかにすることでカテゴリカル知覚のメカニズムが解明される可能性もある。今後は未だ検討されていない残る1つのタイプのカテゴリであるPTカテゴリについて、PTカテゴリの学習が視覚認知に及ぼす影響について新たな実験を計画中である。
サンゴ礁環境のデ-タベ-ス化と時空間分析

昨年の実績にたち、本年度の研究成果は次のとおりである。(1)ランドサットTMデ-タの画像処理による現況デ-タを数値化してデ-タベ-ス(グリット法など)を作成する方法論を確立する。さらに過去のTMデ-タ・空中写真を利用して時空間分析を行った。(2)現地調査では、海外でのサンゴ礁環境の反祥スペクトル計測を実施しTMデ-タとの現況での整合性や問題点を検証することができた。(3)昨年の石垣島でのデ-タベ-ス化の改良を試み、日本全体のデ-タベ-ス化への可能性をさぐる検討を行った。とくに(2)の分光反射率測定は、23項目について、計3,910の測定値を得た。これらの結果は、縦軸に分光反射率、横軸に波長をとった分光反射率曲線図にあらわした。分光反射率の測定結果を要約すると次のようになる。1:陸上に上げて測定すると、生サンゴと死サンゴは分光反射率から区別できる。しかし、水中にある場合、分光反射率曲線図をもとに両者を区別することは難しい。2:陸上に上げて測定すると、緑藻、紅藻、褐藻は分光反射率から区別できる。3:生サンゴ・死サンゴと藻類は、水中では前者が反射率が高いことから区別できる。4:堆積物は、水中にあっても相互の区別は容易である。
ベトナム・ラムドン省及びミャンマー・シャン州における天然薬物資源の調査研究

ベトナムにおける調査1)ホーチミン、ダラット、ニャチャン、トウィフォア、フォンテットなどにおいて、伝統医師、科学技術研究所、林業研究所、栽培技術研究所、病院などを訪問し、伝統医学、沈香やTaxusの栽培状況、キナ、アーティチョークなどの調査を行った。また、伝統医師が使用する260種の生薬を入手した。2)Khan Hoa省で、沈香を生成する原木の一つである自生のAquilaria crassnaを発見した。沈香で生計をたてている少数民族に聞き取り調査を行い、資源の利用、加工工程、栽培状況、等級の選択方法、品質について調査すると共に、各等級の沈香を収集した。さらに、資源保護のためにAquilaria crassnaの栽培がベトナムの数ヶ所で始められていることを確認した。ミャンマーにおける調査1)シャン州のタウンジィーおよびラシオを中心に伝統医療の診療所、病院、薬店を訪問し調査した。また、タウンジィーおよびチャウメイでは、伝統医師との聞き取り調査ならびにシャン州の伝統薬の製造、加工工場を調査し、75点のミャンマー産生薬を入手した。また、タウンジィーで初めて野生種の薬用人参を採集した。日本での研究1)ベトナムで入手した生薬のエキスを作成し、スクリーニングならびに癌転移抑制、肝臓保護などの活性成分の研究を行い、その結果を30報の欧文誌に公表した。2)ミャンマーで採集した野生種の人参が、中国の絶滅の危機がある保護植物の一つであるPanax zinziberensisであることを証明し論文とした。3)沈香の調査について論文としてまとめた。(印刷中)4)ベトナムの薬用植物ならびにAlpinia blepharocalyxの研究をまとめ、総説として欧文誌に公表した。5)ベトナム、ミャンマーおよび東南アジア諸国のOrthosiphon stamineusの薬用成分比較を行い論文にまとめた。ベトナムにおける調査1)ホーチミン、ダラットを中心として、国立ホーチミン市大学、科学技術研究所、農業省栽培技術研究所、林業試験所、ダラット大学、病院などを訪問し、伝統医学、薬草栽培、沈香、Taxusの栽培状況、伝統薬物を利用した製剤等について聞き取り調査した。また、生薬市場の調査及び生薬製造工場で用いられる生薬や伝統医師が使用する薬物の調査を行い、約110種の生薬を入手した。2)ダラットで少数民族K'HO族の薬物について調査した。また、フランス人によって栽培されたキナ、アーティチョークなどの薬用植物のフィールド調査を行った。3)ニャチャンで沈香について、栽培状況、栽培実験、加工方法、等級の選択方法、品質などについて調査するとともに、各等級の沈香を収集した。ミャンマーにおける調査1)シャン州のタウンジィーを中心に、伝統医薬の診療所、病院、薬店を訪問し、国内の薬草栽培状況、伝統薬物について聞き取り調査をした。少数民族パオ族の案内で薬用植物のフィールド調査を行い、ミャンマー国では初めて薬用人参の野生種を採集することが出来た。また、数十種の薬用植物を蒐集した。2)シャン州ピンダヤの伝統医師の聞き取り調査ならびに伝統薬の製造、加工工場を調査し、55点のミャンマー産生薬を入手した。日本での研究1)ベトナムとミャンマーで収集した生薬の整理及び採集した植物の同定を行っている。2)収集した生薬の水及びメタノールエキスを作製し癌転移阻止作用、肝臓保護作用、抗麻薬中毒作用などを指標とした活性成分の検索を行っている。3)ベトナム産薬用植物の90種について、メタノール、メタノールと水、水抽出エキスを作製し、各エキスについてマトリックスメタロプロテアーゼ阻害活性を指標としてスクリーニングを行い、7種のエキスに活性を認め現在、活性成分の検索を行っている。ベトナムにおける調査

1)ホーチミンでは、人参センターを訪問しベトナム人参の栽培の現況、問題点などについて懇談した。2)Khanh Hoa省で沈香を生成する原木の一つである自生のAquilaria crassnaを発見した。また、沈香で生計を立てている少数民族に聞き取り調査を行い、沈香の資源利用や加工工程について調査した。さらに、資源保護のためにAquilaria crassnaの栽培がベトナムの数ヶ所で始められていることを確認した。3)ニャチャン、トウィフォア、フォンテットでは、薬店、嚇売医師に聞き取り調査を行い、使用している南薬(ベトナムの伝統薬)を約150種を収集した。また、フォンテットでは、薬用植物の現地調査を行い、細胞毒性活性を示したStreptocaulon juventasを始め数十種の薬用植物を採集し、薬効、応用例について調査した。ミャンマーにおける調査1)シャン州ラシオを中心に伝統医療の診療所、病院、薬店を訪問し、調査を行い、資料および生薬数十種を収集した。また、チャウメイでは、伝統医師との聞き取り調査ならびにシャン州の伝統薬の製造、加工工場を見学、懇談し、資料を収集、調査した。日本での研究1)今回の調査で収集したベトナムおよびミャンマーの生薬の整理を行っている。2)ミャンマー産Orthosiphone stamineousの活性物質を決定した。3)ベトナム産生薬の細胞毒性スクリーニング結果ならびに活性物質を論文にまとめている。4)ミャンマーで採集した野生種の人参が、現在、中国で絶滅の危機がある保護植物の一つであるPanax zinziberensisであることを成分研究ならびに遺伝子解析の結果判明した。5)抗麻薬作用が認められたミャンマーの現地名ヤッケより活性成分を見出した。
鴻池幸武の人形浄瑠璃文楽研究に関する考察

1、研究目的鴻池幸武は昭和十年代に活躍した演劇評論家である。幼少より父善右衛門の趣味でもあった浄瑠璃義太夫節に親しみ、長じては人形浄瑠璃文楽および歌舞伎の研究に着手し、私家版として二つの芸談『吉田栄三自伝』『道八芸談』を著した。とはいえ、卅一歳の若さで戦没したこともあり、研究の具体的内容や方向性等については整理されないまま現在に至っている。したがって、論理的思考と音楽的感性を兼ね備えた鴻池の論考を検討することにより、戦後の豊竹山城少掾(二世豊竹古靭太夫)に代表されるいわゆる義太夫節の近代化というものの本質と、その延長線上にある現在の人形浄瑠璃文楽を、新たな視点からとらえ直すことが可能となる。2、研究方法今回はその第一段階として、鴻池幸武が残した評論を分析しその中核となる観点を体系的に把握することを主眼とした。鴻池の評論は、「浄瑠璃雑誌」を中心として、武智鉄二主宰の同人誌「劇評」に寄稿されたものがほとんどで、その他浄瑠璃を中心とした演劇批評誌に散見された。収集した資料は、検索が容易に進められるよう、まずパソコンを利用してデジタル化した。その上で、各評論を検討してその主題を分類し整理した。評論により取り上げられた音源については、SPレコードからデジタル化されたものを入手し、音声処理ソフトを導入してその雑音等を除去した上で、丸本および五行本と照らし合わせながら精密な聞き分けを行った。3、研究成果鴻池幸武の主張を端的に表現すれば、「風」を体現できない浄瑠璃はもはや義太夫節ではないのであり、体現できたもののみが芸術的価値を有する、というものであった。そして、現状においてそれが可能なのは、二世豊竹古靱太夫であると結論付けられている。また、「風」の伝承にあって最も重要な役割を果たしたのは、三味線の名人二世豊沢団平と彼が中心となった彦六座であり、それは現行文楽座における技巧の優劣や番付上の位置とはまったく無関係とする。文楽座の櫓下であった古靭は、彼を育てた相三味線三世鶴沢清六が、団平によって鍛えられた二世竹本大隅太夫の相三味線を務めていたことから、「風」の正統的後継者として芸術家たる評価を受けるに至った。このように、戦後の近代化の象徴は、明治期にその原形が見出されたのである。
超音波キャビティを用いた有害物質分解の機構解明と可制御高効率化

超音波キャビティを利用した有害物質の分解について、本年度は次の研究項目について実施し、以下の知見を得た。1.超音波による有害物質分解の最終生成物の同定前年度に超音波分解の有効性を確認した環境ホルモンに対して、ガスクロマトグラフによる容器内の液面上方ガスの分析を行なった。その結果、ビスフェノールA(BPA)、ジクロロフェノール、フタル酸ジブチル等の実験したすべての物質で、基質の分解とともにCO_2の発生が確認された。CO_2は基質が分解して検出されなくなった後も発生を続け、すぐに完全無機化するトリハロメタン類とは異なることが明らかとなった。2.分解反応機構と反応サイトとの対応関係の検討超音波分解の溶存ガス依存性について、BPA、クロロフェノール類はアルゴンより酸素の方が速く分解するのに対し、ニトロベンゼンではその逆であった。前者は、分子構造内にOH基を含み、より親水性であるためと解釈できる。BPAの分解において、酸素下では特有の中間生成物(メチル-ベンゾフラン)が検出され、Fenton反応によるOHラジカル分解と同様であった。一方、アルゴン下でのみメタンガスが検出された。これらの結果より、アルゴン下ではキャビティ内の熱分解が、酸素下では液体内のOHラジカル分解が、それぞれ支配的であると示唆された。3.超音波分解と電気分解、光分解および光触媒分解との重畳効果の検討前年度の電気分解に続き、光触媒と超音波の重畳による環境ホルモンの分解を試みた。実験したすべての物質で、重畳により分解速度は増加し、基質の分解速度定数はそれぞれを加算した値となった。さらに、重畳によるCO_2の生成速度は、それぞれの速度定数の加算値を超え、無機ガス化速度に相乗効果が発現することが明らかとなった。また、光分解との比較により、光触媒分解における光分解の寄与が確認され、その有効性が基質に依存することが明らかになった。超音波キャビティを利用した有害物質の分解について、本年度は以下に示す3つの観点から研究を行った。1.具体的な有害物質の超音波分解についてのデータ収集有害物質は、環境省が発表した内分泌撹乱化学物質(いわゆる環境ホルモン)と疑われる65物質の中から、ビスフェノールA、2,4-ジクロロフェノール、p-tert-ブチルフェノール、ベンゾフェノンの4種類の物質を対象とした。周波数500kHzの収束振動子を用い、電力約120Wで液中に超音波を照射し、前者3物質については初期濃度50mg/L、ベンゾフェノンについては飽和濃度38mg/Lを、すべて5時間以内に分解できた。分解速度は物質によって異なり、超音波分解の有効性が物質の種類に依存することが示唆された。2.ビスフェノールAの超音波分解に及ぼす溶存気体の効果ビスフェノールAについて種々の溶存気体を用いて実験し、その分解速度が、窒素<空気<アルゴン<酸素の順に速くなることがわかった。窒素は他の気体に比べて著しく分解が遅く、酸素と空気では特有の中間生成物が発現した。中間生成物の構造をガククロマトグラム質量分析計によって同定し、酸素の存在によって反応経路が変わることを示した。よって、超音波分解に及ぼす溶存気体の効果が、キャビテーション気泡内の到達温度という物理的効果と、気泡内生成化学種が反応経路に影響する化学的効果の両方が存在することを明らかにした。3.超音波分解と電気分解、光照射下電気分解との比較超音波分解と電気分解、光照射下電気分解との分解速度の比較を行った。また、超音波照射と他手法を同時に行うことを検討した。すべての場合で、超音波と電気分解を同時に行う超音波電気分解法が最速であった。しかし、各分解法の速度や、超音波を重畳したときの速度増加率は、物質の種類に大きく依存し、反応機構を解明する上での貴重なデータを得た。

さらに、重畳によるCO_2の生成速度は、それぞれの速度定数の加算値を超え、無機ガス化速度に相乗効果が発現することが明らかとなった。また、光分解との比較により、光触媒分解における光分解の寄与が確認され、その有効性が基質に依存することが明らかになった。
仏教を基調とした日本的「いのち」教育についての研究

本研究の目的としては、まず日本的「いのち」教育の必要性と意義、さらにはその教育の在り方について、仏教を基調として論拠をもって明確にすることであった。そのために、日本における「いのち」教育の歴史的な系譜の整理と確認、あるいは欧米のみならずアジア各国の義務教育レベルでの実情を把握し、その上で、幼児、義務、専門、生涯等の各教育段階に即したカリキュラム、テキスト、教材等を、指導時期・場所(媒体)・方法論と併せて作成することを当初の目的とした。研究分担者の田宮や得丸らが粗織した「新潟大・上越教育大いのちの教育を考える会」で、13年度に「いのち教育実践のための研修講座」を上越教育大で開催し、学校教育現場における「いのち教育」の実態や問題点、教員の抱えているニーズを把握することができた。また、医学や看護学教育に携わる教員、仏教者、ビハーラ僧、患者や一般の方から「いのち教育」に対する期待やニーズ等を知り得たことは、今後の研究に向けての課題や示唆となった。3年間の研究を振り返ってみると、当初の目的をすべて果たすまでには至らなかった。しかし、当初の目的であった、本研究の成果を形にするということでは、上記の公開講座の企画・実施、さらには学校教育における小学生高学年向けの「いのち教育」の教材作成等について、それなりの成果を得たのではないかと考えている。今後は、本研究を通して知り得た「いのち教育」に関する知識・情報・技術・教育方法等を、研究分担者それぞれが、看護教育、学校教育の場において活用していくとともに、今後は、家庭や社会における「いのち教育」のあり方や必要性の検討についても取り組んでいきたいと考えている。そのための日本における「いのち」教育の歴史的な系譜の整理と確認、あるいは欧米のみならずアジア各国の義務教育レベルでの実情の把握。さらには、幼児、義務、専門、生涯、等の各教育段階に即したカリキュラム、テキスト、教材等を、指導時期・場所(媒体)・方法論と併せて作成することにあった。平成11年度においては、当初の計画通り、研究分担者全員参加による研究例会を数次に渡って開催するとともに、各分担者は各自の役割に添って個別の資料収集や調査に当たった。例会時の討議内容は録音等を含めて共有化している。現時点では、各分担の調査研究の途中報告に終始しているが、第2次対戦後の日本の教育の在り方、とりわけ教育と宗教に関する戦後処理の不徹底が、本研究の必要性に繋がっているということでは、意見の一致を見るに至っている。なお、本年度の成果としては、研究分担者得丸が上越教育大において卒論指導を通して小学生高学年向けの「いのち」教育の教材作成をCDロムを利用して進めていることや、「新潟大・上越教育大いのちの教育を考える会」を組織し、生涯教育の一環としての「いのち」教育の可能性を公開講座の企画実施等という形で具体化していることをあげておきたい。平成12年度においては、当初の計画通り、研究分担者全員参加による研究例会を数次に渡って開催するとともに、各分担者は各自の役割に添って個別の資料収集や調査に当たった。

現時点では、各分担の調査研究の途中報告に終始しているが、第2次対戦後の日本の教育の在り方、とりわけ教育と宗教に関する戦後処理の不徹底が、本研究の必要性に繋がっているということでは、意見の一致を見るに至っている。なお、本年度の成果としては、研究分担者得丸が上越教育大において卒論指導を通して小学生高学年向けの「いのち」教育の教材作成をCDロムを利用して進めたことや、平成12年3月に研究分担者田宮が関わって「新潟大・上越教育大いのちの教育を考える会」を組織し、生涯教育の一環としての「いのち」教育の可能性を、新潟県長岡市において10回の公開講座の企画・実施等という形で具体化したことをあげておきたい。本研究の目的としては、まず日本的「いのち」教育の必要性と意義、さらにはその教育の在り方について、仏教を基調として論拠をもって明確にすることであった。そのために、日本における「いのち」教育の歴史的な系譜の整理と確認、あるいは欧米のみならずアジア各国の義務教育レベルでの実情を把握し、その上で、幼児、義務、専門、生涯等の各教育段階に即したカリキュラム、テキスト、教材等を、指導時期・場所(媒体)・方法論と併せて作成することを当初の目的とした。研究分担者の田宮や得丸らが組織した「新潟大・上越教育大いのちの教育を考える会」で、13年度に「いのち教育実践のための研修講座」を上越教育大で開催し、学校教育現場における「いのち教育」の実態や問題点、教員の抱えているニーズを把握することができた。また、医学や看護学教育に携わる教員、仏教者、ビハーラ僧、患者や一般の方から「いのち教育」に対する期待やニーズ等を知り得たことは今後の研究に向けての課題や示唆となった。3年間の研究を振り返ってみると、当初の目的をすべて果たすまでには至らなかった。しかし、当初の目的であった、本研究の成果を形にするということでは、上記の公開講座の企画・実施、さらには学校教育における小学生高学年向けの「いのち教育」の教材作成等について、それなりの成果を得たのではないかと考えている。今後は、本研究を通して知り得た「いのち教育」に関する知識・情報・技術・教育方法等を、研究分担者それぞれが、看護教育、学校教育の場において活用していくとともに、今後は、家庭や社会における「いのち教育」のあり方や必要性の検討についても取り組んでいきたいと考えている。
先天性血液凝固系因子欠乏症の分子病態学的研究

目的先天性血栓性素因であるアンチトロンビン(AT)欠乏症の分子病態を解明する目的で、type I AT欠乏症の一種AT Morioka(C95R)の変異導入・発現実験を行い、変異型AT分子の細胞内動態を解析した。結果野性型および変異型(C95R)ATコンストラクトを作製し、CHO細胞に導入して安定過剰発現株を分離した。パルス-チェイス法・免疫沈降法を用いた解析では野性型AT分子は液体培地中に分泌されたが、変異型分子は細胞外にはほとんど分泌されず、チェイス後9時間を経過しても細胞内に蓄積したままであった。細胞内の変異型AT分子のサイズは液体培地中に分泌された野生型AT分子より約5kDa小さいことから変異分子の蓄積はGolgi装置より上流で起こるものと推定された。免疫電顕による観察で、変異AT分子は細胞質内に多数存在する特異な小胞構造内に局在することが確認された。この様な小胞構造は野生型AT発現細胞では認められなかった。AT Morioka(C95R)ではAT分子内に存在する3個のdisulfide結合(C8-C128、C21-C95、C247-C430)のうちの1個(C21-C95)が失われるが、disulfide結合の喪失が変異蛋白の細胞内動態に与える影響を検討する目的でC95以外のcysteine残基をarginineに置換した5種類の変異型コンストラクトを作製し、CHO細胞に一過性に発現させた。いずれの変異蛋白も細胞外分泌の障害が認められたが、C95Rの様な細胞内への長時間残留は認められなかった。結語AT Morioka(C95R)は極めて特異な細胞内動態を示し、従来考えられていたproteasome-ubiqutin系とは異なる変異蛋白処理機構により処理される可能性が示唆された。現在、変異AT分子を包む膜の由来や、関与する分子シャペロンについて解析中である。本モデルは分泌型蛋白の品質管理機構の解明にあらたな手がかりを与えるものと考えられる。代表的な先天性血栓性素因であるアンチトロンビン(AT)欠乏症の発症機序を解明するため,研究者が発見したtype IAT欠乏症であるAT Morioka(C95R)の変異導入・発現実験を行った。(1)全長ヒトATcDNAにsite-directed mutagenesis法によりC95R変異を導入しCOS-7細胞に発現させた。RT-PCR法による解析では野性型および変異型cDNAともにmRNAに転写されることが確認された。Western blot法による解析では正常型ATは培養液中に分泌されるが,変異ATは分泌されないことが確認された。(2)一方,患者(heterozygote)の末梢血リンパ球に異所性に発現するmRNAをRT-PCR法で解析したところ野性型mRNAのみ検出され,変異mRNAは検出されなかった。(3)以上より,培養細胞内ではcDNAから翻訳された変異AT分子は細胞内輸送から分泌にいたる過程に障害が起こると推定されるが,実際の生体内ではmRNAの不安定性などの他の原因によりAT欠乏を生ずる可能性が考えられた。(4)現在,CHO細胞を用いて安定発現株を作製中であり,樹立され次第パルスチェイス法や共沈する分子シャペロンなどのより詳細な解析を行う予定である。また,mini-geneを用いて変異遺伝子の転写過程に異常が認められないかを検討する予定である。

(5)AT Morioka以外の変異についても同様の検討を計画している。目的先天性血栓性素因であるアンチトロンビン(AT)欠乏症の分子病態を解明する目的で、type I AT欠乏症の一種AT Morioka(C95R)の変異導入・発現実験を行い、変異型AT分子の細胞内動態を解析した。結果野生型および変異型(C95R)ATコンストラクトを作製し、CHO細胞に導入して安定過剰発現株を分離した。パルス-チェイス法・免疫沈降法を用いた解析では野生型AT分子は液体培地中に分泌されたが、変異型分子は細胞外にはほとんど分泌されず、チェイス後9時間を経過しても細胞内に蓄積したままであった。細胞内の変異型AT分子のサイズは液体培地中に分泌された野生型AT分子より約5kDa小さいことから変異分子の蓄積はGolgi装置より上流で起こるものと推定された。免疫電顕による観察で、変異AT分子は細胞質内に多数存在する特異な小胞構造内に局在することが確認された。この様な小胞構造は野生型AT発現細胞では認められなかった。AT Morioka(C95R)ではAT分子内に存在する3個のdisulfide結合(C8-C128、C21-C95、C247-C430)のうちの1個(C21-C95)が失われるが、disulfide結合の喪失が変異蛋白の細胞内動態に与える影響を検討する目的でC95以外のcysteine残基をarginineに置換した5種類の変異型コンストラクトを作製し、CHO細胞に一過性に発現させた。いずれの変異蛋白も細胞外分泌の障害が認められたが、C95Rの様な細胞内への長時間残留は認められなかった。結語AT Morioka(C95R)は極めて特異な細胞内動態を示し、従来考えられていたproteasome-ubiqutin系とは異なる変異蛋白処理機構により処理される可能性が示唆された。現在、変異AT分子を包む膜の由来や、関与する分子シャペロンについて解析中である。本モデルは分泌型蛋白の品質管理機構の解明にあらたな手がかりを与えるものと考えられる。