hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯の器官形成システムの分子機構

再生医療を目指したシステム細胞工学において、細胞操作により器官を形成することは重要な課題である。昨年度報告書に記載した器官原基法は、再生医療において重要な課題である器官原基を再構築する能力を持つ細胞の探索と、細胞配置による器官形成技術の開発を可能にした。そこで本研究では、多能性幹細胞としてEmbryonal Carcinoma(EC)細胞を用いて、EC細胞に由来する間葉組織を有した歯の器官発生を誘導することを目指した。EC細胞と歯胚に由来する組織を組み合わせても歯への分化は認められなかった。そこでEC細胞をDMSOで分化誘導すると、神経堤細胞マーカーと発生初期の歯胚間葉細胞マーカーを発現する細胞が得られることが判明した。さらにこの細胞は歯胚上皮組織と組み合わせることで、1/2の頻度で歯への分化が誘導され、正常な歯と同一の組織配置を有する歯の形成が認められた。また本研究では、器官原基法を用いて器官の数と形態を制御する分子機構を確立することを目指した。胎齢14.5日切歯歯胚の上皮組織と間葉細胞から作製した再構成歯胚に、歯胚より分離した歯のシグナルセンターであるエナメルノット領域や、Shhを高発現する細胞凝集体を再配置することにより、これらが歯の数や歯冠形成に及ぼす影響を解析した。腎皮膜下移植で歯を形成すると、用いたエナメルノット領域の数に応じて歯が形成され、Shhを分泌する細胞凝集体は異所的な歯尖様構造を誘導することが判明した。これらの成果により、歯の数はエナメルノット領域によって制御され、Shhは歯冠形成への関与が明確化された。以上の研究成果から、器官原基法が器官形成メカニズムの解明に貢献すること示すと共に、再生医療を目指した器官再構築に用いる細胞種の選定、および細胞配置による器官形成方法の創製に大きな役割を果たすことが期待される。次世代の再生医療に向けて、疾患や傷害を受けた器官を、生体外で細胞操作によって人工的に作製した器官と置換する臓器置換再生医療を目指した基盤技術開発が期待されている。本研究課題では、細胞操作により単一化細胞から歯や体毛の器官原基を再構成する基盤技術を開発した。胎齢14.5日のマウスの下顎切歯歯胚を摘出し、酵素処理により上皮・間葉組織をそれぞれ単一化細胞として分離した。それぞれの細胞から種々の条件で再構成歯胚を作製し、24-48時間の器官培養後に、成体マウス腎皮膜下への移植、並びに生体外器官培養により器官発生の評価を行なった。上皮・間葉細胞を用いて本法により再構成した歯胚では、腎皮膜下移植、器官培養系のいずれにおいても歯の硬組織や細胞を正しい組織配置で有する複数の切歯が、100%の頻度で発生した。さらに胎齢14.5日マウスの頬ひげ原基から、同様の方法により再構成毛胞を作製したところ、100%の頻度で毛が形成された。さらに本研究によって再構成した人工歯胚、あるいは再生歯が成体口腔内の抜歯腔で発生可能かを解析した。5週齢マウスの下顎切歯を抜歯し、切歯根尖部位の頬側面の顎骨へ移植する抜歯腔移植モデルを構築した。生体外で器官培養し発生させた再構成歯胚から単独の歯胚、あるいは腎臓皮膜下で発生させた再生歯を単独に分離して移植したところ、歯の硬組織や細胞を正常な歯と同一の組織配置で有する切歯が発生した。抜歯腔で発生した再生歯には歯根膜様の組織構造が認められると共に、再生歯の歯髄組織内部に血管と神経線維が進入していることが判明した。本研究の成果により、細胞操作によって器官発生しうる器官原基を人為的に作製可能であると共に、生体外で再構成した器官原基が成体の目的の部位で器官発生することが示され、臓器置換を目指した再生医療の実現可能性が示唆された。

以上の研究成果から、器官原基法が器官形成メカニズムの解明に貢献すること示すと共に、再生医療を目指した器官再構築に用いる細胞種の選定、および細胞配置による器官形成方法の創製に大きな役割を果たすことが期待される。
脳内神経伝達物質のNMRイメージング(MRI)の試み

神経伝達物質の磁気共鳴イメージング(MRSI)を行なうために、新しい方法であるSIDA(spectroscopic imaging by dephasing amplitude change)を高分解能NMR装置(4.7T、9cmφJEOL)に組込んだ。乳酸、アミノ酸などの標準試料液及びラット脳にて、MRSIを試みた。本装置を用いて、高濃度の乳酸、アミノ酸(N-acetyl aspartate,GABA,Glutamine)の標準液ではMRSIが可能であった。しかし、低濃度の標準液やラット脳では実用時間内にMRSIを得る事はできなかった。但し、死亡後のラット脳の乳酸は検出できた。この理由は磁石内全域の均一な磁場が得られないことと、過電流のため高速の傾斜磁場の切り交えができないなどのハードウェア上の制約のためであり解決が困難であった。次に、2.0TMRI/S装置(100cmφ、旭メディカル)を用いて、標準試料、ウサギ脳、ヒト上腕について実験を行なった。同じく、高濃度の標準液では良好なMRSIを得ることができたが、ウサギ脳及びヒト上腕では良好なMRSIを得ることができなかった。これは、水のピークの消去が困難であったためと、磁場の均一度を充分上げられなかったためであった。水ピークの抑制はpresaturation法を用いたが、測定までの時間中に、水ピークが回復し最終的には1/100位しか抑制できなかった。実際には少くなくとも1/10001/10000にする必要があり、そのために信号検出前に1ー3ー3ー1法などの方法を加えねばならないと結論付けられ、現在検討中である。また、2.0Tでは信号強度が充分ではなく、また磁場均一度の不充分さなどの問題のため、神経伝達物質、アミノ酸などの低濃度物質のMRSIを得るのには適していない。さらに4.7Tでも、今回用いた小口径の縦置き磁石では、磁石内の広い範囲に均一な磁場を得る事が困難でMRSIを行なうには適していない事が判明した。このため、少なくとも4.7T以上(できれば7T)の水平置き大口径磁石が必要である。今後、米国との共同研究で、この研究課題を発展させてゆきたい。昨年度にひき続きSIDAC(spectroscopic imaging by dephasing amplitude change)法を用いて水以外のHのspectroscopic imaging(MRSI)を試みた。まず、SIDACを4.7TのSCM200(9cmφ、JEOL)に移殖して、標準液(乳酸、アミノ酸)やラットを用いてMRSIの実験を行なった。しかし、高濃度の標準液では可能であったが、低濃度の液やラットの脳では実用的なMRSIを得る事は困難であった。その理由は、磁石内の全域に一様な高精度の均一磁場を作成できない、渦電流の問題のため高速の傾斜磁界の切り換えができない、などのハードウェア上の制約のためであり、装置上の根本的な問題であり解決がむつかしかった。次に、2.0TMRI/S装置(1mφ、旭メディカル)を用いて、標準試料、ウサギ脳、ヒト腕につき実験を行なった。比較的高濃度の標準液では、良好なMRSIを得ることができたが、ウサギ脳では死亡時の乳配以外に良いMRSIを得ることはできなかった。

これは、水のピークの消去が困難であったことと、磁場の均一度を充分上げられなかったためであった。水ピークの抑制は、pre-saturation法を用いたが、測定までの時間中に、水ピークが回復し、最終的には1/100位しか抑制できなかった。実際には少くとも1/10001/10000にする必要があり、そのためには信号検出前に1ー3^^ー3^^ー1等の水ピーク抑制法を加えねばならないと結論され、現在なお検討中である。また2.0Tでは信号強度が充分でなく、また磁場均一度の不充分さなどの問題のため神経伝達物質、アミノ酸などの低濃度物質のMRSIを得るには適していない。さらに、4.7Tでも、今回用いた小口径の高分解能スペクトル用磁石では、広い範囲に均一磁場が得られず目的は達せられない事も判明した。このため、重要なテーマの本研究課題を遂行するためには、少くとも4.7T以上(できれば7T)の水平置きの装置が必要である。現在、米国のUCSFとの共同研究を計画しており、今後この研究課題を発展させてゆきたい。
細胞分裂期におけるミオシン軽鎖キナーゼの機能解析に関する研究

平成9年度は、細胞の同調性の優れたバフンウニ、およびヒーラ細胞cDNAライブラリーより、ミオシン軽鎖をリン酸化しうるキナーゼ遺伝子の単離を行うことを第一の目的とした。すでに、予備的な実験で、キナーゼの共通ドメインの配列をもとにしたプローブを用いて2種類のクローンを単離しており、そのうちバフンウニライブラリーから得られた一種類の遺伝子の配列は、MAPキナーゼカスケード最下流のMAPKAPキナーゼ2に類似の配列を持っていることが明らかになった(MAPKAPキナーゼ4)。遺伝子の全構造を明らかにして、大腸菌に導入し、発現タンパク質を得て、そのキナーゼ活性を検討し、ミオシン軽鎖のMLCKリン酸化部立をリン酸化すること、リン酸化されたミオシンATPose活性が上昇することを明らかにした。これらの結果は、MAPキナーゼ力スケードが、ミオシンのリン酸化に重要な役割を担っている可能性を初めて指摘したものである。平成10年度は、もう一つの得られたクローン(ヒーラ細胞ライブラリーから)について、遺伝子の全構造を明らかにした。その結果、アポトーシスに関連の深いDAPキナーゼのホモログであるZIPキナーゼに配列が類似していることが明らかになった。同様に大腸菌にzipキナーゼホモログの遺伝子を導入して発現タンパクを得、そのミオシン軽鎖リン酸化活性を検討したところ、ミオシン軽鎖のMLCKリン酸化部位(2カ所)をリン酸化すること、そのリン酸化はカルシウム、カルモジュリン非依存的である事、が明らかになった。動物細胞の分裂メカニズムを解明する目的で、細胞周期の研究にすぐれたHeLa細胞またはウニ卵細胞を実験材料に様々な検討を行った。分裂時に形成される「収縮環」収縮の引き金として、ミオシンのリン酸化、およびリン酸化に伴うミオシンの活性化が重要であると考えられている。この点を明らかにすることを目的として、実際に収縮環にリン酸化ミオシンが局在するかどうかの検討を行った。HeLa細胞からはミオシンの報告がないため、まず、ミオシン調節軽鎖遺伝子の単離を行い、3種類のミオシン調節軽鎖の同定を行った。これらのN末のアミノ酸配列は、ニワトリ砂嚢ミオシン調節軽鎖の配列と相同であった。N末にはMLCKによるリン酸化部位が2カ所存在するため、それぞれの部分をリン酸化したペプチドを別々に合成してウサギに免疫し、リン酸化ミオシン調節軽鎖を特異的に認識する抗体(p1およびpp1)の作製に成功した。p1およびpp1を用いてHeLa細胞を染色したところ、収縮環がはっきりと染色され、実際に収縮環にリン酸化されたミオシンが局在することが初めて示された。次に、分裂時にミオシンをリン酸化するキナーゼの同定を行った。平滑筋MLCKの配列をもとにプローブを作製し、ミオシン軽鎖キナーゼ遺伝子の検索を行ったところ、ウニ卵細胞ライブラリーより2種類の遺伝子が単離された。シークエンスを行ったところ、その内の一種類は、MAPキナーゼカスケードの最下流であるMAPキナーゼ活性化キナーゼ2と配列の相同性が高い遺伝子であることが明らかになった(MAPキナーゼ活性化キナーゼ4と命名)。この遺伝子を大腸菌に導入して発現させた融合タンパク質は、ミオシン軽鎖のMLCKリン酸化部位をリン酸化する事、リン酸化されたミオシンのATP活性は上昇することが明らかになった。現在、このタンパク質の抗体を作製し、分裂時における細胞内局在の検討を試みているところである。

遺伝子の全構造を明らかにして、大腸菌に導入し、発現タンパク質を得て、そのキナーゼ活性を検討し、ミオシン軽鎖のMLCKリン酸化部位をリン酸化すること、リン酸化されたミオシンATPase活性が上昇することを明らかにした。これらの結果は、MAPキナーゼカスケードが、ミオシンのリン酸化に重要な役割を担っている可能性を初めて指摘したものである。平成10年度は、もう一つの得られたクローン(ヒーラ細胞ライブラリーから)について、遺伝子の全構造を明らかにした。その結果、アポトーシスに関連の深いDAPキナーゼのホモログであるZIPキナーゼに配列が類似していることが明らかになった。同様に大腸菌にzipキナーゼホモログの遺伝子を導入して発現タンパクを得、そのミオシン軽鎖リン酸化活性を検討したところ、ミオシン軽鎖のMLCKリン酸化部位(2カ所)をリン酸化すること、そのリン酸化はカルシウム、カルモジュリン非依存的である事、が明らかになった。
ナトリウム利尿ペプチドのジーンターゲティングによる機能解析

ナトリウム利尿ペプチドファミリーはANP、BNP、CNPの3種のペプチドより構成され、2種のグアニル酸シクラーゼ共役型受容体(GC-A、GC-B)に結合・作用することにより、レニン-アンジオテンシン系、バソプレシン系と拮抗し積極的に体液量や血圧を低下させるシステムを形成している。我々は種々の方法を用いてこれらのペプチドの機能解析に努めてきたが、本研究では最近開発されたジーンターゲティング法を用いることにより、これらの遺伝子欠損動物を作製し、その機能解析を行うことを企画した。マウス遺伝子ライブラリーより、ANP、BNP、CNP遺伝子、GC-A、GC-B遺伝子をクローニングした。ANP遺伝子の6kbフラグメントについてはエクソン部を中心に構造を確認した。BNP遺伝子は全エクソンを含む3.3kbの遺伝子構造を決定し、さらにこの構造を中央に含む6kbのフラグメントを調製した。CNPではエクソン1、2部を含む3.2kbフラグメント、さらに現在まで未同定のエクソン3部を含む3.2kbのフラグメントの6.5kbの構造を決定した。さらにナトリウム利尿ペプチド受容体、GC-A、GC-Bの遺伝子を34個ずつクローニングし、これらを組み合わせることによりエクソン全体が含まれることを確認した。現在、これら受容体遺伝子のレイアウトを明らかにしたので、機能を欠失させるのに適当な部分を選び、その構造を決定している。以上の結果、マウスナトリウム利尿ペプチド及びその受容体については、ジーンターゲティング用の56kbフラグメントの単離とその構造決定、確認を終わりつつあり、neoマイシン耐性遺伝子をエクソン部に含み、hsv-tkを末端に有するジーンターゲティング用変異遺伝子を5種の遺伝子について作製できる状態にできた。ナトリウム利尿ペプチドファミリーはANP、BNP、CNPの三種のペプチドより構成され、対応する二種のグアニル酸シクラーゼ共役型受容体(GC-A、GC-B)に作用することにより、レニン-アンジオテンシン系と拮抗し積極的に体液量や血圧を低下させるシステムを形成している。我々は従来よりこれらのペプチドの機能解析に努めてきたが、本研究では最近開発されたジーンタゲティング法を用いることにより、これらの遺伝子欠損動物を作成し、その機能解析を行うことを企画した。マウス遺伝子ライブラリーより、ANP、BNP、CNP遺伝子をクローニングした。この内BNP遺伝子については、全エクソンを含む3.3kbの遺伝子構造を決定し、さらにジーンタゲティング用に上記3.3kbの構造を中央に含む6kbのフラグメントを調製した。CNPについてはエクソン1、2を含む3.2kbフラグメントの配列を決定し、さらに少し離れた位置に存在し現在までヒト、ブタ、ラットでは構造決定されていないエクソン3部分を含む3kbのフラグメントについても配列を決定した。現在これら二つのフラグメントを繋ぐ中間部の構造を決定している。ANPについては6kbのジーンタゲティング用フラグメントを調製し、既知の構造と比較しているところである。さらにナトリウム利尿ペプチド系の機能を正確に評価するためにはナトリウム利尿ペプチド受容体(GC-A、GC-B)のジーンタゲティングも必須と考え、GC-A、GC-Bについてもマウス遺伝子ライブラリーよりクローニングした。現在これらの種々のフラグメントをサブクローニングし、ジーンタゲティングに適当で且つ活性発現に必須のグアニル酸シクラーゼ部分を含むフラグメントの選別を行っており、必要に応じて構造決定、cDNAの構造決定等も行うよう計画している。ナトリウム利尿ペプチドファミリーはANP、BNP、CNPの三種のペプチドより構成され、対応する2種のグアニル酸シクラーゼ共役型受容体(GC-A,GC-B)に作用することにより、レニン-アンジオテンシン系と拮抗し積極的に体液量や血圧を低下させるシステムを形成している。

我々は従来よりこれらのペプチドの機能解析に努めてきたが、本研究では最近開発されたジーンタゲティング法を用いることにより、これらの遺伝子欠損動物を作成し、その機能解析を行うことを企画した。本年度は、昨年度のマウスANP、BNP、CNP遺伝子に加え、これらの受容体であるGC-A、GC-B遺伝子を34個ずつクローニングし、これらを組み合わせることによりエクソン全体が含まれることを確認した。さらに受容体のグアニル酸シクラーゼ部、プロテインキナーゼ様部、細胞外部等のレイアウトについても明らかにし、現在機能を欠失させるのに適当な部分を選び、その構造を決定中である。ANP遺伝子については6kbのジーンタゲティング用フラグメントの構造とその中のエクソン部について構造確認を行った。CNPについてはヒト、ブタ、ラットでは構造決定されていないエクソン3部分を含む3.2kbのフラグメントについても配列を決定し、エクソン1、2を含む3.2kbフラグメントとの位置的関連を明らかにし、全体として6.5kbの構造を決定した。以上の結果、マウスナトリウム利尿ペプチド及びその受容体については、ジーンタゲティング用の56kbフラグメントの単離とその構造決定、確認を終わりつつあり、neoマイシン耐性遺伝子をエクソン部に含み、hsv-tkを末端に有するジーンタゲティング用変異遺伝子をこれら5種の遺伝子について作製できる状態となった。
膠原病に伴う肺高血圧症におけるIPAS/HIF-3αシグナルの役割の解明

結合織疾患に伴う肺動脈性肺高血圧症(PAH)は、膠原病難治性病態の一つであるが発症機序の詳細は不明である。本研究は、膠原病性肺高血圧症におけるIPAS/HIF-3αシグナル異常の意義を究明し、IPAS/HIF-3αシグナルを標的とする新規治療法の開発基盤の確立を目的としている。成果としてPAH合併強皮症患者において有意に高頻度に認められるHIF-3α遺伝子一塩基多型(SNP)を同定し、当該SNP導入HIF-3αはET1発現を増強させることを見い出した。SNP保有HIF-3αによるET1発現の増強は血管平滑筋細胞の増殖・遊走を惹起しPAHの血管リモデリング異常と密接に関連することが示唆された。結合織疾患に伴う肺動脈性肺高血圧症は、膠原病難治性病態の一つである。病理学的には肺動脈の血管収縮、リモデリング異常等を呈し、局所のエンドセリン1(ET1)の発現亢進等が関わることが示されているが発症機序の詳細は不明である。低酸素応答抑制分子IPAS/HIF-3α遺伝子破壊マウスは、肺血管構造異常、右心拡大、肺動脈ET1産生亢進等、肺高血圧症と類似した形質を示す。本研究は、膠原病性肺高血圧症におけるIPAS/HIF-3αシグナル異常の意義を究明し、IPAS/HIF-3αシグナルを標的とする新規治療法の開発基盤の確立を目的とする。具体的には、1膠原病性肺高血圧症患者におけるIPAS/HIF-3α遺伝子異常(多型)の解析、2IPAS/HIF-3α遺伝子異常がもたらすIPAS/HIF-3α分子機能の変調ならびにHIFシグナルの異常の肺高血圧症における役割の究明、3IPAS/HIF-3αシグナルを標的とする膠原病性肺高血圧症の新規分子療法開発の基盤構築、の3つの柱に沿って遂行される。本年度は特に、1)膠原病性肺高血圧症におけるIPAS/HIF-3α遺伝子多型の解析、2)膠原病性肺高血圧症患者で認めたIPAS/HIF-3α遺伝子SNPが分子機能に与える影響の解析、を中心に研究が展開され、以下の成果を得た。PAH合併強皮症患者において統計学的有意に高頻度に認めるHIF-3A遺伝子SNPを同定した。当該SNP導入HIF-3α発現細胞では、野生型HIF-3α発現細胞に比し、ET-1mRNAの発現が増強していた。そのメカニズムとして、SNP導入HIF-3αがHIF-1βと高い親和性を有し、ヒトET-1遺伝子プロモーターに強く結合することが示唆された。ET-1遺伝子プロモーターには,HIFの結合配列である低酸素応答性配列(HRE)が存在するが、SNP導入HIF-3αによるET-1遺伝子プロモーター活性化にはHRE以外の配列も重要であった。結合織疾患に伴う肺動脈性肺高血圧症(PAH)は、膠原病難治性病態の一つである。本研究は、膠原病性肺高血圧症におけるIPAS/HIF-3αシグナル異常の意義を究明し、IPAS/HIF-3αシグナルを標的とする新規治療法の開発基盤の確立を目的とする本年度は、1)膠原病性肺高血圧症におけるIPAS/HIF-3α遺伝子多型の解析、2)膠原病性肺高血圧症患者で認めたIPAS/HIF-3α遺伝子SNPが分子機能に与える影響の解析を発展的に継続し、以下の成果を得た。前年度までにPAH合併強皮症患者において統計学的優位に高頻度で認めるHIF-3A遺伝子SNPを同定したが、当該SNPはPAH合併および非合併全身性エリテマトーデス、PAH合併および非合併混合性結合織病患者のいずれにも認められなかった。すなわち、かかるHIF-3A遺伝子SNPは強皮症に合併したPAHに極めて関連が強いものと推察される。一方、SNP導入HIF-3αを発現した肺動脈内皮細胞では、正常酸素分圧下においてもET1のmRNAを強く発現することが示されていたが、HIF-3αを発現した肺動脈内皮細胞の培養上清は、血管平滑筋の増殖、遊走を誘導した。この作用はET1受容体阻害で消失する事から、培養上清には血管リモデリング活性のあるET1が含まれていると考えられた。具体的には、1膠原病性肺高血圧症患者におけるIPAS/HIF-3α遺伝子異常(多型)の解析、2IPAS/HIF-3α遺伝子異常がもたらすIPAS/HIF-3α分子機能の変調

ならびにHIFシグナルの異常の肺高血圧症における役割の究明、3IPAS/HIF-3αシグナルを標的とする膠原病性肺高血圧症の新規分子療法開発の基盤構築、の3つの柱より構成される。前年度までにPAH合併強皮症患者において統計学的優位に高頻度で認めるHIF-3A遺伝子SNPを同定し、SNP導入IPAS/HIF-3αは通常型IPAS/HIF-3αに比べ、1)ヘテロ二量体形成パートナーHIF-1βとより強く結合し、2)ET1遺伝子プロモーターに高い親和性で結合し、3)ET1遺伝子転写を強く活性化することを明らかにした。本年度は、SNP導入IPAS/HIF-3αの二量体形成能、ET1遺伝子プロモーター活性化様相の解析を発展的に継続した。まず、HIF-1βとの結合について生細胞内で解析するため分子間FRET解析システムを構築した。通常型IPAS/HIF-3αとHIF-1βの間には分子の近接を示す標識蛍光分子の励起発光が観察され、解析システムが構築できたことが示された。一方、SNP導入IPAS/HIF-3αによるET1遺伝子プロモーターの占拠様式をゲルシフト法で詳細に解析した結果、レポーターアッセイでの結果同様、HRE配列と近傍のシス配列の双方に結合することが確認された。現在、CRISPR-CAS9によるゲノム編集法を用いて同配列への結合を生細胞内で検証するシステムを構築中である。結合織疾患に伴う肺動脈性肺高血圧症(PAH)は、膠原病難治性病態の一つであるが発症機序の詳細は不明である。本研究は、膠原病性肺高血圧症におけるIPAS/HIF-3αシグナル異常の意義を究明し、IPAS/HIF-3αシグナルを標的とする新規治療法の開発基盤の確立を目的としている。成果としてPAH合併強皮症患者において有意に高頻度に認められるHIF-3α遺伝子一塩基多型(SNP)を同定し、当該SNP導入HIF-3αはET1発現を増強させることを見い出した。SNP保有HIF-3αによるET1発現の増強は血管平滑筋細胞の増殖・遊走を惹起しPAHの血管リモデリング異常と密接に関連することが示唆された。IPAS/HIF-3αノックアウトマウスにおいて、肺循環系の形質の解析、特に低酸素暴露などによる形質の変化を解析する。ノックアウトマウスでのSNP導入HIF-3αの再発現系の構築もすすめる。内科学、膠原病学IPAS/HIF-3αKOマウスにおいて、7ー10%酸素の慢性低酸素暴露による肺高血圧モデルおよびモノクロタリン誘発肺高血圧モデルを作成、その形質解析を鋭意推進する。
脂肪内分泌代謝学を基盤としたメタボリック症候群のトランスレーショナルリサーチ

脂肪萎縮症はメタボリック症候群の病態解明や新規治療法開発の足掛りとなる貴重なモデル疾患である。我々は脂肪萎縮症を対象とするレプチン補充療法の長期安全性と有用性を証明した。更に新しいマウス実験モデルを確立し、インスリン分泌不全・インスリン抵抗性・肥満を伴う2型糖尿病に対するレプチンの治療的有用性を実証した。または骨格筋AMPK活性を指標として用いることにより、レプチン抵抗性の分子メカニズムにおける視床下部メラノコルチン系の意義を明らかにした。(1)遺伝子操作モデルマウスを用いてレプチン抵抗性の分子メカニズムの解明を進めた。レプチン過剰発現トランスジェニックマウスの骨格筋においてAMPKリン酸化(活性化)が持続的に亢進していること、高脂肪食によって誘導されたレプチン抵抗性に伴い、AMPK活性化の亢進が完全に遮断されること、更に通常食への交換によりレプチン抵抗性が解除されると再びAMPK活性化の亢進が回復することが明らかとなり、骨格筋におけるAMPKの活性化が中枢神経系におけるレプチン抵抗性の評価系として有用であることが示唆された。(2)症例数を増やしてヒト全身性脂肪萎縮症に対するレプチン補償治療を展開し、糖脂質代謝異常を改善するに必要かつ安全なレプチン投与量の設定や用法の詳細な最適化を行なった。(3)マウス側脳室内レプチン投与により視床下部におけるStat 3活性化やインスリンシグナル伝達とのクロストークが検出された。長鎖脂肪酸の脳内投与によりレプチン受容体欠損や視床下部メラノコルチン系シグナルが阻害された遺伝性モデルマウスにおいても視床下部Stat 3の著明な活性化が生じ、顕著な体重の減少、摂食量の減少がもたらされることが明らかとなった。(4)脂肪細胞グルココルチコイド活性化のメタボリック症候群における病態的意義を検討した。種々の炎症性サイトカインが11β-HSD1遺伝子発現を著明に増加させること、ヒト皮下脂肪組織バイオプシーにおいて肥満者の11β-HSD1遺伝子発現が著明に亢進していることを実証した。また、メタボリック症候群の表現型と連鎖する11β-HSD1遺伝子多型を検索し、新規な多型の発見も含め我が国の遺伝的背景のスクリーニングを終了した。さらに、強力な脂肪細胞特異的遺伝子のプロモーターの支配下に11β-HSD1を過剰発現させる新しい遺伝子操作マウスの樹立を完了した。心筋梗塞や脳卒中に代表される致死的心血管病発症の高リスク群であるメタボリック症候群のメカニズムを解明し、新しい治療法の確立を目指すべく、本年度は(1)脂肪細胞由来ホルモンのプロトタイプであるレプチンによる代謝改善の分子機構、視床下部を中心とするレプチンのシグナル伝達機構とレプチン抵抗性(感受性低下)の分子メカニズムの解明、ヒト全身性脂肪萎縮症をモデル疾患とするレプチンの臨床応用(皮下注射によるリコンビナントレプチン投与によるトランスレーショナルメデイスン)を推進した。また、(2)メタボリック症候群の基盤病態としての脂肪細胞機能異常の分子機構に注目し、心血管ホルモン、アドレノメジュリンの脂肪細胞による産生機構や新規の病態的意義、脂肪細胞(組織)における細胞内グルココルチコイド活性化やマクロファージ浸潤に伴う炎症性変化などに焦点を絞った病態のメカニズム解明や病態モデルとなる遺伝子操作動物モデルの樹立と解析、更にはヒト脂肪組織バイオプシーによる遺伝子発現プロファイリングや新しい臨床検査法の開発を推進した。更に、(3)発生工学的手法を駆使して膵臓ベータ細胞の発生に関する遺伝子調節カスケードの解明を試みた。特に(1)に関しては、レプチントランスジェニックマウスを用いた視床下部のレプチン信号伝達系の解析、レプチン補償治療を施行した全身性脂肪萎縮症患者を対象とした食欲、体重および体組成変化に及ぼすレプチンの影響関する検討を行った。レプチン治療による体重減少は主に除脂肪重量の減少であり脂肪重量変化は軽度であった。除脂肪重量および脂肪重量の変化量は治療前の除脂肪重量および脂肪重量とそれぞれ相関が認められた。レプチン治療によりインスリン感受性の改善および空腹時インスリン値の低下、除脂肪重量を主とした体重減少が認められ、高インスリン血症と骨格筋肥大との関連が示唆された。(2)に関しては、培養脂肪細胞を用いた脂肪細胞分化の転写制御カスケードのメカニズムの解明やアドレノメジュリンの脂肪組織における分泌調節のメカニズム解明、遺伝子操作マウスの確立、11β-HSD1遺伝子のantisense-oligonucleotideを用いたメタボリック症候群に対する治療的意義の探索を行うとともに、グルココルチコイド活性化に関するマーカーとメタボリック症候群の病勢、血管病リスク、治療効果との相関性、種々の代謝パラメーターとの関連性を検討した。(1)リコンビナントレプチン投与の長期安全性と有用性に関してヒト全身性脂肪

萎縮症を対象疾患として長期間にわたる検討を行い、一連の基礎的検討(レプチン抵抗性の臨床指標の開発、投与モードの最適化(投与経路、投与回数、用量設定、投与期間の決定)、低用量レプチンの投与による用量-効果分析など)を実施した。レプチン補償治療を施行した全身性脂肪萎縮症患者を対象とした食欲、体重および体組成変化に及ぼすレプチンの影響関する検討を行った結果、レプチン治療による体重減少は主に除脂肪重量の減少であり脂肪重量変化は軽度であった。除脂肪重量および脂肪重量の変化量は治療前の除脂肪重量および脂肪重量とそれぞれ相関が認められた。レプチン治療によりインスリン感受性の改善および空腹時インスリン値の低下、除脂肪重量を主とした体重減少が認められ、高インスリン血症と骨格筋肥大との関連が示唆された。(2)レプチン抵抗性の分子メカニズムを探索し、骨格筋糖脂質代謝調節における中枢メラノコルチン系の意義を明らかにする目的で骨格筋AMPキナーゼ活性化が持続的に上昇しているレプチン高感受性遺伝子操作マウスに対するメラノコルチン受容体アンタゴニスト(SHU9119)あるいはメラノコルチンアゴニスト(MT-II)の脳室内投与を行い、骨格筋AMPキナーゼ活性化を解析した。更に、内因性メラノコルチン拮抗物質、agouti蛋白を視床下部で異所性に高発現する遺伝性肥満KKAyマウスを用いて同様の検討を実施した。MT-IIの脳室内投与は骨格筋AMPKおよびACCのリン酸化を顕著に亢進させた。レプチンによる骨格筋AMPKおよびACCのリン酸化の増加はSHU9119の脳室内共投与あるいはKKAyマウスにおいて明らかに減弱していた。骨格筋AMPKの活性化の減弱がレプチン抵抗性の程度とよく相関すること、メラノコルチンアゴニストが先天的、後天的に誘導されたレプチン抵抗性の状態に効果を発揮することが明らかとなった。脂肪萎縮症では脂肪細胞の分化や中性脂肪保持機構が著しく障害され、脂肪細胞で処理できなくなった糖・脂質が肝臓、骨格筋などの非脂肪組織、血液プールに過剰に蓄積することによってインスリン抵抗性、糖尿病、高脂血症、脂肪肝などの代謝異常が重積する病態であり、メタボリック症候群の病態解明や新規治療法開発の足掛かりとなる貴重なモデル疾患である。本年度もヒト全身性脂肪萎縮症を対象とする生理的濃度のリコンビナントレプチン補償療法の長期安全性と有用性を検証し、足掛け5年間にわたる長期レプチン補充療法が顕著なインスリン抵抗性の改善、除脂肪重量の減少効果を安定的に発揮することが確認できた(J.Clin.Endocrinol.Metab.92:532-541,2007)。さらに、ストレプトゾトシンによる膵島破壊・インスリン分泌低下の状態に高脂肪食を負荷した新しいマウス実験モデルを確立し、生理的濃度のレプチン補充が優れたインスリン抵抗性改善作用、糖脂質代謝改善作用を発揮することが確認され、インスリン分泌不全・インスリン抵抗性・肥満を伴う二型糖尿病に対するレプチンの治療的有用性が実証できた(論文投稿準備中)。我が国唯一の臨床研究機関として実践してきたこのトランスレーショナル研究の成果を踏まえ、最終年度の次年度はリコンビナントレプチン補償療法の医師主導型治験を開始する予定であり、種々の病態を示す糖尿病や肥満症に対するレプチンの臨床応用に向けた準備が整った。
ゼブラフィッシュにおける嗅覚受容体多重遺伝子の発現制御と嗅神経細胞の軸索投射

マウス嗅覚系において、個々の嗅細胞が千種類以上存在する嗅覚受容体(odorant receptor : OR)遺伝子の中から1種類のみをmono-allelicに発現する分子メカニズムは長い間謎であった。当グループでは、OR遺伝子の発現を正に制御するエンハンサーとしてH領域を見出した。また昨年度報告したように、ゼブラフィッシュを用いたトランスジーンの発現系を駆使して、当初2kbとされたH領域を124bpにまで絞り込み、その中に2つのホメオドメインと1つのO/E配列を同定した。本年度はまず、それ単独では発現しないMOR28遺伝子の発現カセットに、124bpのHコア領域を付加したところ、マウスにおいてもトランスジーンの高頻度発現が確認された。この結果は、ゼブラフィッシュを用いた発現系が、マウスOR遺伝子の制御領域を効率良く予測する手段として有効であることを示すと同時に、ゼブラフィッシュにもマウス嗅覚系と同様の制御領域とそれを用いた発現機構が存在することを強く示唆している。そこで我々は、ゼブラフィッシュのOR遺伝子系にもマウスで同定されたH領域様のエンハンサーが存在するかどうかについて検討した。その結果、2つのOR遺伝子クラスターの近傍に、ORの発現を正に制御するシス領域を3箇所見出した。これらのエンハンサー領域とマウスH領域との間にDNA配列上の顕著な相同性はなく、比較的短いシスエレメントが重要な機能を担っていると予想される。最近R.Axel博士のグループが、マウスH領域がトランス、即ちinterchromosomalに、OR遺伝子の発現を制御する可能性について報告した。そこでマウスH領域のノックアウトマウスを作製し解析したところ、H領域はMOR28クラスターにシスに働き、ゾーン4特異的な3つのOR遺伝子のみを制御している事が明らかとなった。我々の研究成果により、OR遺伝子の単一発現制御は単一のLCRによるものではなく、複数のLCRにより制御されていることが初めて示された。マウス嗅覚系において、個々の嗅細胞は千種類以上存在する嗅覚受容体(odorant receptor : OR)遺伝子の中から一種類のみを選択的かつ相互排他的に発現する。当グループでは既に、トランスジェニックマウスを用いた発現系により、MOR28遺伝子クラスターにOR遺伝子の発現に必要なヒトとマウスの間で配列が保存されたホモロジー(H)領域を見出した。このH領域は、そこに形成されると思われるchromatin remodeling複合体が各OR遺伝子のプロモーターと相互作用することにより、OR遺伝子の選択と活性化の制御に関与していると考えられる。本研究では、OR遺伝子の単一発現に必要なLCRやエンハンサー、プロモーターなどの制御領域を効率良く同定し、それに含まれるシスエレメントを絞り込むために、ゼブラフィッシュにおけるトランスジーンの発現系を用いることにした。通常ゼブラフィッシュのOR遺伝子プロモーターにGFP遺伝子をつないでゼブラフィッシュ胚に導入し、一過的に嗅細胞における発現を見ても、GFPの発現頻度は極めて低い。そこで、このゼブラフィッシュのトランスジェニックコンストラクトにマウスMOR28クラスターのH領域を付加し、その効果を調べたところ、GFPを発現する魚の個体数および嗅細胞数が著しく増加した。一連の解析の結果、1)付加するH領域のORプロモーターに対する相対的方向はGFPの発現頻度の上昇に影響を与えないが、2)H領域をタンデムに繋いでコピー数を増やすとGFPの発現頻度はさらに上昇すること、3)当初2kbとされたH領域は様々な欠失変異の解析の結果、最小約200bpでも機能することなどが示された。

ここで用いたゼブラフィッシュの発現系は、H領域に含まれるシス配列の特定、更にはそれら変異体の解析に極めて効果的である。今回得られた結果は、マウスのH領域がゼブラフィッシュのORプロモーターにも作用することを示すと共に、ゼブラフィッシュのOR遺伝子系にも同様のシス領域とそれを用いた制御機構のあることを示唆している。マウス嗅覚系において、個々の嗅細胞が千種類以上存在する嗅覚受容体(odorant receptor : OR)遺伝子の中から1種類のみをmono-allelicに発現する分子メカニズムは長い間謎であった。当グループでは、OR遺伝子の発現を正に制御するエンハンサーとしてH領域を見出した。また昨年度報告したように、ゼブラフィッシュを用いたトランスジーンの発現系を駆使して、当初2kbとされたH領域を124bpにまで絞り込み、その中に2つのホメオドメインと1つのO/E配列を同定した。本年度はまず、それ単独では発現しないMOR28遺伝子の発現カセットに、124bpのHコア領域を付加したところ、マウスにおいてもトランスジーンの高頻度発現が確認された。この結果は、ゼブラフィッシュを用いた発現系が、マウスOR遺伝子の制御領域を効率良く予測する手段として有効であることを示すと同時に、ゼブラフィッシュにもマウス嗅覚系と同様の制御領域とそれを用いた発現機構が存在することを強く示唆している。そこで我々は、ゼブラフィッシュのOR遺伝子系にもマウスで同定されたH領域様のエンハンサーが存在するかどうかについて検討した。その結果、2つのOR遺伝子クラスターの近傍に、ORの発現を正に制御するシス領域を3箇所見出した。これらのエンハンサー領域とマウスH領域との間にDNA配列上の顕著な相同性はなく、比較的短いシスエレメントが重要な機能を担っていると予想される。最近R.Axel博士のグループが、マウスH領域がトランス、即ちinterchromosomalに、OR遺伝子の発現を制御する可能性について報告した。そこでマウスH領域のノックアウトマウスを作製し解析したところ、H領域はMOR28クラスターにシスに働き、ゾーン4特異的な3つのOR遺伝子のみを制御している事が明らかとなった。我々の研究成果により、OR遺伝子の単一発現制御は単一のLCRによるものではなく、複数のLCRにより制御されていることが初めて示された。
輸入自由化の下での中山間地域活性化と環境資源保全に関する研究

ガット・ウルグアイ・ラウンドの最終合意において、食糧農産物の貿易自由化が推進されることになり、我が国もコメのミニマムアクセスを受け入れることにより、完全な関税化の実施は先延ばしされた。こうした自由化の効果は世界資源の最適配分という意味での経済的合理性には合致するが、資源環境問題という観点からは、必ずしも最適な方策とは言えないことが示された。近年、食糧貿易を通じた窒素、燐の土壌中へ蓄積が新たな環境問題として深刻化している。この傾向は日本やオランダ等の貿易依存度の高い国で顕著な問題となりつつあり、また輸入食品の安全性の議論も高まってきている。こうした点で、食糧貿易の自由化の効果は総合的な観点から評価されねばならないことを論じた。貿易自由化が中山間地域に及ぼす影響は、特定地域に集中する傾向があり、この影響を軽減する為の保護政策として、従来の様な価格支持を通じた所得政策は国際的にも容認され難くなっている。そこで、EU等で議論されているデカップリング政策の導入が検討されなければならないが、欧州でのデカップリング自体は日本にはなじまない。それ故、日本型にアレンジした日本型修正デカップリングをきめ細かに実施することが望まれる。具体的には、生産、消費、貿易への撹乱効果を最小限に抑え、価格支持と切り離した形での農家所得補償政策を地域毎の実状にあった形で模索すべきである。条件不利地域の活性化対策として、産業としての農業振興策のみでは不十分であり、地域資源を生かした第二次産業や第三次産業を育成し、地域内に雇用機会を創出することが重要であること、つまり農産物加工産業の振興や農業資材生産企業および教育産業の誘致が重要であり、さらに農業の持つ公益的機能への助成を通じた振興も今後ますます重要性を帯びてくることが示された。平成6年度は、これまで行ってきた「新政策研究会」に基づいて研究調査対象地域の選定と本研究に最適な方法論について基礎的検討を行い、調査対象地域のデータ収集および地域農林業の持つ公共財的価値(環境への影響)の評価手法について検討した。市場開放が地域農林業に及ぼす影響とそれを考慮した地域振興施策、さらにそれの環境資源問題へのフィードバック過程を統合したモデルの検討を行った。また北海道など既に同様な手法でなされた研究例と比較検討することにより地域の特殊性を考慮した分析を行った。加賀爪は香川県を事例として、自由化の影響に加えて瀬戸大橋、明石大橋、四国高速自動車道の開通などの交通事情の変化の影響とそれに伴う環境資源問題について調査・検討し、武部は地域農業の担い手の観点から、農業法人、農地流動化の問題に接近した。また小田と吉野は自由化に絡む流通合理化、産地間競争や高度情報化の課題について調査・検討した。これらの検討の結果、香川県においては、農協合併による京販出荷体制の強化、ブランド化が進められており、柑橘部門ではある程度の成果を上げていることがわかった。また担い手・後継者問題については集落営農の優良事例が幾つか生まれており、地域資源の保全と活性化のためには高度情報化による営農指導の普及や農地流動化、機械銀行制度の充実により自由化に対処する必要があることを実証した。また水資源対策として香川用水の建設以後、従来の溜め池が次々と公園に転用されてきたが、灌漑用水と住宅用水の競合の深刻化の観点から既存の溜め池を有効に保全する必要があることを指摘した。平成7年度は、市場開放および各種の地域開発が地域農林業に及ぼす影響とそれを考慮した地域振興施策、さらにそれの環境資源問題へのフィードバック過程の検討を行なった。なお、加賀爪は自由化および地域公共投資と環境資源問題について、香川県の事例を取り上げて調査・検討し、武部は地域農業の担い手の観点から、農業法人、農地流動化の問題に接近した。

また小田は自由化に絡む流通合理化や高度情報化の課題について調査・検討し、吉野は市場流通と産地間競争への波及効果について調査・検討した。香川県の事例では、1980年代に広域的に導入された巨大公共投資(1988年4月の瀬戸大橋の開通、1989年12月の新高松空港の開港、さらに四国横断自動車道の整備)の波及効果は、香川県の経済全体には大きな飛躍をもたらした面もあるが農業部門については必ずしも大きな便益はもたらさなかった点を指摘した。逆に、瀬戸大橋の開通により、農村部では若手労働者の流出により後継者・担い手不足が深刻化するなどのマイナス面が生じた地域もあることを明確にした。現在進行中の部分も含めて、以上の調査分析結果を統合し、自由化に対抗しうる中山間地域活性化と環境資源保全について報告書の形にまとめつつあるが、これは、かなりの作業量を伴うので、報告書の最終版は次年度に出版する予定である。
海事社会の共同体概念の醸成に関する一考察―環境保護のための地域協力を中心として

海洋環境の保護のために国際海事機関(IMO)では、海洋環境保護、海事産業で働く人の保護を目的とした条約を採択しているが、それらの条約では、特に海事先進国の意見が強く反映されている。さらに、世界の各地域では、協力して船舶による汚染を防ぐ体制(MOU)を構築しているが、ここでも海事先進国が中心になって統一基準を設け、MOU相互に協力して船舶の検査体制を整備し、海洋環境保護を積極的に行っている。それは海事社会が共同体として機能している面もあるが、先進国主導の社会でもあるといえる。本年度は、ポートステートコントロールを管轄する地域機関であるMOUとアメリカのコーストガードについて検討した。MOUとして最初に発足したParis MOUは、発足時点で14カ国だったが、東欧を巻き込み2013年には27カ国に増え、さらに、ロシア、カナダも含むなど、海事社会に大きな影響力を持つようになっている。インスペクションは、IMO、ILOなどの国際機関の検討を経た条約の基準に基づいて行われるが、参加国に対してはポートステートコントロールを行うにあたって高い水準で質的統一がはかられるように検査官のための技術的訓練プログラムが定期的に行われている。参加国が増えたことにより知識、技術等の点で高い水準に達していない国もあり、こうした訓練プログラムは質的向上を当該地域間にもたらしている。しかも、こうした訓練プログラムには他のMOUからの参加もあり、ヨーロッパの高い基準が他のMOUへも波及していく効果もあり、Paris MOUを中心とした基準の策定をみてとれる。このように環境に関し海事社会に大きな影響力を持つParis MOUに対し、アメリカは地域機関に参加することなく、コーストガードが独自にポートステートコントロールを行っている。アメリカは、同時多発テロの影響から「保安」に力をいれたポートステートコントロール制度を確立し、コーストガードがその役目を担っている。保安に主眼がおかれていることから船舶評価の項目に「旗国」、「旗国から委任された機関」もあげ、テロに関わるとアメリカが判断する国家、機関なら厳しい評価を行うことを可能としている。このように保安が中心となるため、地域的協力をあえて進めず、STCW条約の基準を満たしているカナダとだけMOUを締結し、両国船籍の定期船に限ってポートステートコントロールによるディテンションを受けないことを約束している。保安を含めたポートステートコントロールは共同体というより排他的な動向が強いといえよう。本研究では、海事社会において環境を保全することを目的とした地域協力であるMOU(Memorandum of Understanding)の検討を通し、海事社会の共同体概念を検討することを目的としている。MOUが適用する国際基準はIMO、ILOなどの国際機関で締結される条約等の規定である。そこで、今年度は、IMOで議論されている以下の三つの課題、及びILOでのSTCW条約改正に関して検討を行った。IMOでは、シップリサイクル(船舶の解轍)、バラスト水、温室効果ガスをずれも海事社会が取り組むべき重要な環境問題としている。船舶の解轍に対しては環境保護の観点から有害物質の回収を有効に行うことが不可欠であるにもかかわらず、解轍費用の削減を理由に施設の整備されていない途上国で多く行われてきた。そのため有害物質の流失による環境汚染だけでなく、労働者の健康被害も起こっているなど問題とされてきた分野である。バラスト水は、生態系の破壊、大量発生した外来種による被害、大腸菌などの増殖による健康被害など多くの問題を起こしてきた。そのため、バラスト水処理装置の搭載、バラスト水のサンプリングなどが検討されてきた。処理装置については各国の意見の一致をみているが、サンプリングなどについては船舶の運航費用の増大を理由に意見が分かれている。船舶が排出する温室効果ガスについては、京都議定書の枠外におかれ、IMOの議論の対象とされてきた。しかし、京都議定書など持続可能な開発・発展に伴う議論の中で途上国の主張する「共通だか差異のある責任」の問題はIMOでも同様に争点となっており、具体的にどのように規定されるべきか、などについてはなお検討中の課題となっている。ILOでは、STCW条約の改正が行われ、船員資格の要件が強化されており、それは来年度の課題であるMOUでのポートステートコントロールをみる上で重要である。今年度の研究計画では、国際共同体概念の検討を行うために共同体の中での規範意識の形成を、IMOの海洋環境保護をめぐる議論を検討することによって考察することを目的としていた。そのため、IMOで議論されている海洋環境保護の問題の中から特に重要な三つ、シップリサイクル条約、バラスト水管理条約、船舶からの温室効果ガス削減対策、に関する議論の検討を行った。これらの検討を通じ、海洋環境保護に関する一定の規範の策定がIMOで形成されているものの、その規範を十分でないとする国はさらに基準を強化するなどの事例が見られる。

こうした基準の強化は、先進国で行われており、それは、すなわち来年度の研究課題であるMOUでのポートステートコントロールの検討課題とするべきものである。したがって、本年度の検討を通じ、海事社会での一定のコンセンサス形成をみることができたこと、しかしながら、さらに基準を強化する動きがMOUのポートステートコントロールに影響を与えており、来年度の研究課題とすべきものであることが明らかになった点で評価できる。また今年度はILOでのSTCW条約の改正の内容について検討を行ったが、条約改正がMOUのポートステートコントロールにどのように影響するかについては来年度の課題である。24年度に検討したIMOでの議論をふまえ、MOU及びアメリカの海洋環境保護の検討を行う。特にMOU体制が各地域でどのように機能しているか、機能するにあたって各地域に共同体概念が醸成されているのか、海事社会全体をみた時にMOU体制の機能はどのようなものかを書籍、及び文献複写による資料収集によって行う。国際社会、海事社会の共同体概念を検討するため、及びMOU体制に関する書籍代、10万円、文献複写費、2万円、コピーカード1万円、MOUに関してはweb上の資料を収集することも重要であることからそのための消耗品費5万円、収集した資料の整理のための人件費5万円研究の成果の印刷に7万円以上、30万円
児童生徒の抑うつの早期対応に向けたチェックリストの開発と介入プログラムへの展開

本研究の目的は,第一に,児童生徒の抑うつの評価と行動傾向との関連について,検討を行うことであった。第二に,児童生徒の抑うつの評価と行動傾向との関連に着目した,児童生徒の抑うつ低減プログラムの開発と効果の検討を行うことであった。研究1の成果から,児童を対象とした場合の,抑うつの評価につながる尺度として,児童用BIS/BAS尺度が作成され,その信頼性と妥当性が確認された。研究2の成果として,児童用BIS/BAS尺度による評価に基づいた,行動活性化療法が児童の抑うつ低減に効果的であることが示された。これらを含む,一連の研究成果から,児童生徒の抑うつの早期対応に向けた介入プログラムが提案された。本研究では,「抑うつ関連行動」という客観的に観察可能な指標を用いることで,保護者や担任が,児童生徒の抑うつ症状の把握,共有,対応を可能にすることをねらいとする。具体的には,抑うつ症状の「把握」を目的とし,保護者が測定する「家庭用子どもの抑うつ関連行動チェックリスト」と学校の担任が測定する「学校用子どもの抑うつ関連行動チェックリスト」を開発する。この2つのチェックリストを用いることで,保護者と担任が対象児童生徒の抑うつ症状を「共有」することが可能になる。さらに,児童生徒,保護者,担任を1つのユニットとした抑うつ低減プログラムを開発し,子どもの抑うつへの「対応」を可能にする。平成27年度は,児童生徒の抑うつを中心とした心理的ストレスに影響を及ぼす変数についての検討を中心に行い,児童における認知的評価と対処方略の関連について明らかにするとともに(小関ら,2015;ストレス科学研究),児童生徒を対象としたさまざまなストレスイベントと認知行動療法の有効性について,展望を行い,本研究計画の方向性を定める研究を実施した(小関ら,2016;桜美林論考心理・教育学研究)。加えて,小1プロブレム対策としての就学支援プログラムの展望(小野・小関,2016;桜美林大学心理学研究),中学生を対象とした攻撃行動に対する一次予防的介入に関する展望(立花・小関,2016;桜美林大学臨床心理センター年報),中学生の子どもをもつ親の子育てストレスの展望(曽我部・小関,2016;桜美林大学心理学研究)を行うことによって,関連する領域の研究動向を明らかにした。研究課題全体の方向付けを行うことができ,また児童生徒の抑うつに関連する研究動向を明らかにすることができた。また,介入に関しても,パイロットスタディを実施することができ,研究全体が進行していると考えている。その一方で,データ数が不足しているため,次年度も継続して研究を実施していく。この2つのチェックリストを用いることで,保護者と担任が,対象児童生徒の抑うつ症状を「共有」することが可能になる。平成28年度は,抑うつ低減プログラム開発のための研究を実施した。まず,児童の抑うつに対する集団心理的介入に関する展望を行い(小野・小関,2017;桜美林大学心理学研究),どのような介入要素が,児童の抑うつの低減に寄与するのかという点について整理を行った。同様に,特に教育現場における実践を視野に入れ,どのような観点で心理的介入を実践していくことが重要なのか,整理を行った(小関,2017;Journal of Health Psychology Research)。加えて,抑うつ低減プログラムの確立のための試行を行い,対象となった児童や教員,保護者から,有効性についての聞き取り調査を行った。これらの成果の一部は,国内外の学会での発表,学会誌への投稿と掲載により,広く公表している。研究課題全体の方向性に沿って,研究活動を推進することができた。また,介入についても,パイロットスタディを実施することができ,研究全体が進行していると考えている。その一方で,対象となったデータ数の不足や,実施地域の限定性等の課題が残されており,来年度の継続したデータ収集が求められる。本研究では,「抑うつ関連行動」という客観的に観察可能な指標を用いることで,保護者や担任が,児童生徒の抑うつ症状の把握,共有,対応を可能にすることをねらいとした。平成29年度は,児童生徒を対象とした抑うつ低減プログラムの実施と有効性の検討を行った。これまでの成果として,児童の抑うつに影響を及ぼし,児童の抑うつ低減プログラムにおける操作変数の1つとして扱うことが可能な行動活性/抑制傾向を測定する質問紙を作成し,その信頼性と妥当性の検討を行った(小関ら,印刷中)。また,行動活性/抑制傾向に代表されるような,特性的な要因の変容を確認することが,児童生徒を対象とした集団介入の有効性を示す指標として重要であることを示した(小関,2018)。