hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
独立同分布でないランダム性を持つ複素力学系に関する三つの解析的手法による研究

多項式写像や有理写像をランダムに選択しその合成列に付随する初期点の挙動を考察する,複素解析的なランダム力学系を考えます.特に,写像の選択規則が毎回同一な場合は独立同分布ランダム力学系と呼ばれますが,独立同分布でないランダム力学系が本研究の対象です.ランダム力学系の安定性に焦点を当てつつ,独立同分布ランダム力学系と独立同分布でないランダム力学系との類似・相違点を明確にし,決定論的な力学系や諸科学における数理モデルへ応用するための確固とした数学的土台を築くことが本研究の目的です.多項式写像や有理写像をランダムに選択しその合成列に付随する初期点の挙動を考察する,複素解析的なランダム力学系を考えます.特に,写像の選択規則が毎回同一な場合は独立同分布ランダム力学系と呼ばれますが,独立同分布でないランダム力学系が本研究の対象です.ランダム力学系の安定性に焦点を当てつつ,独立同分布ランダム力学系と独立同分布でないランダム力学系との類似・相違点を明確にし,決定論的な力学系や諸科学における数理モデルへ応用するための確固とした数学的土台を築くことが本研究の目的です.
医療従事者による染色体検査結果の告知に関する調査研究

本研究は、医療従事者による染色体検査結果の告知に関する調査研究である。小児の患者の染色体検査をオーダーする立場にある医師を対象に、郵送調査法を用いて、染色体検査の実施の有無を尋ね、染色体検査を行うに至った過程や、保護者に対する検査結果の説明内容、告知後のフォローの内容を明らかにすることを目的としている。平成16年度に、複数の遺伝専門医から有益なアドバイスをもらい、調査票を完成することができた。調査対象として日本周産期・新生児医学会に所属する医師を想定していたので、日本周産期・新生児医学会の理事長に、所属会員対象に本調査を実施する許可を求めた。理事会で検討してもらうことはできたが、結果として、個人情報保護法の施行を理由に、調査協力を拒否された。そこで、平成17年度には日本周産期・新生児医学会のホームページに掲載されている周産期専門医制度における新生児専門医の暫定研修施設一覧を参照して、268カ所の医療施設をピックアップした。それらの医療施設について、さらにインターネットでホームページを検索し、医療施設の郵便番号、所在地及び、小児科や小児外科等関連する診療科に所属する医師名をリストアップして、3,168人の調査対象者リストを作成した。調査対象者リストの作成においてはアルバイトを雇用して行った。調査対象者リストに基づき、平成18年4月中旬にようやく調査票を発送することができた。そのうち719人から返信があった。平成18年度には、アルバイトを雇用し、調査票を整理し、SPSSにて調査結果の分析を行った。その結果、医療従事者が染色体検査の告知に対して悩みを抱えていることがわかった。その結果を調査報告書としてまとめた。平成16年度は、まず、日本における遺伝カウンセリングの実際について報告されている文献を収集し、遺伝カウンセリングが抱えている問題について知見を深めた。日本で、遺伝カウンセリングの普及が求められるようになったのは、1980年代のことである。遺伝医療の急速な発達によって遺伝カウンセリングに対するニーズが高まっていったことと、インフォームドコンセントに代表されるように患者中心の医療のあり方が志向されるようになってきたことが背景として指摘できる。しかしながら、日本においては遺伝医療が確立しておらず、遺伝医療を支えるマンパワーの養成についても確立していない。遺伝カウンセリングを誰がどのようにおこなうべきなのかについて定まっていない。遺伝カウンセリングについての専門的な研修を受けることなく、診療の中で、主治医が患者に対して遺伝カウンセリングを行う場合が少なくないということがわかった。次に、本研究者が参画した、親を対象に行った染色体検査結果告知についての調査票をたたき台に、医師を対象とした調査票を作成した。調査票の作成にあたっては、複数の遺伝専門医から有益なアドバイスをもらうことができた。本研究は、日本周産期・新生児医学会に所属する医師を対象に調査を行うことを計画している。そこで、日本周産期・新生児医学会の理事長に、所属会員対象に本調査を実施する許可を求めた。現在、回答を待っている段階である。染色他平成16年度に、複数の遺伝専門医から有益なアドバイスをもらい、調査票を完成することができた。そこで、日本周産期・新生児医学会のホームページに掲載されている周産期専門医制度における新生児専門医の暫定研修施設一覧を参照して、268カ所の医療施設をピックアップした。それらの医療施設について、さらにインターネットでホームページを検索し、医療施設の郵便番号、所在地及び、小児科や小児外科等関連する診療科に所属する医師名をリストアップして、約3000人の調査対象者リストを作成した。現在、調査票が返送されてくるのを待っている段階である。

調査対象者リストの作成においてはアルバイトを雇用して行った。調査対象者リストに基づき、平成18年4月中旬にようやく調査票を発送することができた。そのうち719人から返信があった。平成18年度には、アルバイトを雇用し、調査票を整理し、SPSSにて調査結果の分析を行った。その結果、医療従事者が染色体検査の告知に対して悩みを抱えていることがわかった。その結果を調査報告書としてまとめた。
糖尿病網膜症における血管内皮増殖因子受容体の糖鎖変化

本研究では、糖尿病網膜症の病態責任分子である血管内皮増殖因子(VEGF)の受容体VEGFR-2上のN型糖鎖構造に関する検討をおこなった。既存データベースとの照合をおこなった結果、培養ヒト網膜血管内皮細胞におけるVEGFR-2由来のN型糖鎖16ピークについて、その糖鎖構造を推定することができた。しかしながら、糖尿病網膜症における病態変化の一つである低酸素条件に24時間曝露した培養したヒト網膜血管内皮細胞では、VEGFR-2上のN型糖鎖構造に変化を検出できなかった。近年、核酸、蛋白質に続く第三の鎖状生命分子として糖鎖分子が注目されており、糖鎖構造の変化が蛋白機能に影響を与えることが明らかとなっている。また、糖尿病網膜症の病態には血管内皮増殖因子(VEGF)が関与していることがわかっており、その受容体であるVEGFR-2上の糖鎖構造を明らかにすることは糖尿病における疾患関連糖鎖の発見に繋がり、新規治療法の開発に繋がる可能性がある。過去に我々は糖尿病網膜症患者の硝子体中でシアル酸含有N型糖鎖が増加することを報告したが、本研究ではこのシアル酸含有N型糖鎖に着目して検討を開始した。昨年度は定常条件で培養したヒト網膜毛細血管内皮細胞より細胞抽出液を調整した後、免疫沈降法でVEGFR-2を単離し、酵素によるN型糖鎖の切断、ビーズによる糖鎖の捕捉、標識試薬との交換を行い糖鎖を回収した(グライコブロッティング法)。その後、サンプルを質量分析に供して得られたスペクトルについてデータベースに照合して糖鎖構造の推定を行った。その結果、16種類のN型糖鎖構造が推定され、その中の主な糖鎖として(Hex)1(HexNAc)2(Deoxyhexose)1+(Man)3(GlcNAc)2、(Hex)2(HexNAc)2(Deoxyhexose)1+(Man)3(GlcNAc)2、(HexNAc)2(Deoxyhexose)1+(Man)3(GlcNAc)2という3種類の糖鎖構造が推定された。次年度以降は、糖尿病網膜症の病的環境下(低酸素、糖負荷、サイトカイン添加、酸化ストレスなど)で培養した網膜毛細血管内皮細胞からVEGFR-2を免疫沈降法により単離し、糖鎖構造を解析して定常条件で培養したコントロールとの比較を行う予定である。ヒト網膜毛細血管内皮細胞中のVEGFR-2上の糖鎖を解析したとする報告はこれまでなく、解析が可能かどうかが大きな鍵であったが、今回の検討で糖鎖解析までおこなうことができた。おおむね順調に進展していると考えている。また、糖尿病網膜症の病態には血管内皮増殖因子(VEGF)が関与しており、その受容体であるVEGFR-2上の糖鎖構造を明らかにすることは糖尿病の疾患関連糖鎖の発見に繋がる可能性がある。今年度は、糖尿病網膜症の主病態である低酸素条件下でヒト網膜血管内皮細胞におけるVEGFR-2の糖鎖構造に変化が生じるかについて検討した。通常酸素および低酸素条件下で培養した細胞抽出液からVEGFR-2を免疫沈降法により単離し、酵素によるN型糖鎖の切断、ビーズによる糖鎖の捕捉、標識試薬との交換を行い糖鎖の回収を行った。その後、質量分析によって得られたスペクトルについてデータベースに照合して糖鎖構造の推定を行った。現在、免疫沈降後の細胞抽出液に対してウエスタンブロッティングを行い、VEGFR2と推定している250kDのバンド切り出し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析装置による解析をおこない、免疫沈降法によるVEGFR2の単離精度を確認する検討を行っている。次年度以降の検討として、糖尿病網膜症の病的環境下(低酸素、糖負荷、サイトカイン添加、酸化ストレスなど)で培養した網膜毛細血管内皮細胞からVEGFR-2を免疫沈降法により単離し、糖鎖構造を解析して定常条件で培養したコントロールとの比較を行う予定である。もし、定常条件では存在しない糖鎖構造が糖尿病条件で検出された場合には、その病態特異的な糖鎖構造の生成に関与すると考えられる糖転移酵素や切断酵素の発現についてもReal-time PCR法、ウェスタンブロッティング法、ELISA法などを用いて検討を行う。眼科学平成28年度の研究計画は培養網膜血管内皮細胞を用いたin vitro系の検討であったが、順調に研究が行われ、予定よりも低額の研究費で計画遂行が可能であったため。平成29年度に計画している糖転移酵素や切断酵素の発現に関するReal-time PCR法、ウェスタンブロッティング法、ELISA法などに用いる予定である。
DNAループによる転写調節機構の解明

Admp/Pinheadは多くの動物で広く保存されるマイクロシンテニー遺伝子対である。このマイクロシンテニーの保存の背景には、、Pinhead遺伝子の転写が、DNAループを介して、直接にAdmpの転写を抑制するという機構が存在している。昨年度に同定した複数の動物間で保存されたマイクロシンテニーのうち、Admp/Pinheadのような相互排他的な転写調節機構が存在する可能性のある6対の遺伝子対について、ホヤ胚を用いて、解析をすすめた。このうちの1対の遺伝子については、下流側の遺伝子の転写開始点が複数存在し、内胚葉細胞で発現するときに使われる転写開始点は、上流側の遺伝子の転写開始点よりも上流に存在していた(つまり、下流遺伝子の内胚葉細胞のアイソフォームでは、第一イントロン内に上流側の遺伝子がコードされる)。この転写開始点の使い分けによって、下流遺伝子の転写時には上流遺伝子の発現が抑制されることがわかった。遺伝子の転写が、周囲の遺伝子の転写に影響をあたえるという意味で、Admp/Pinheadのローカスでの転写調節に似ているが、実際に働く機構については、同じではなかった。一つの遺伝子の転写が周囲の遺伝子の転写に与える影響は、複数の形を取りうること、また、そうした調節機構が進化的に遺伝子の並びが保存されるマイクロシンテニーの理由となっていることを示している。26年度が最終年度であるため、記入しない。公開されているゲノム情報を用いて、カタユウレイボヤとヒト、マウス、カエル、フグ、ゼブラフィッシュ、線虫、ショウジョウバエ、ミジンコ、ネマトステラの間で比較をおこない、マイクロシンテニーを探索した。探索されたマイクロシンテニーの中から41の遺伝子対について、in situハイブリダイゼーションによって発生における遺伝子発現パターンを調べた。遺伝子対の両方が胚性のゲノムから発現しているものは6対だけであった。これら6対の遺伝子はそれぞれ対となる遺伝子とは異なる組織で発現しており、Admp/Pinheadのマイクロシンテニーに見られるようなDNAループによる相互排他的な転写調節機構の存在が疑われる。残りの遺伝子については、一方のみの発現しか観察されなかった。遺伝子対の両方が胚性のゲノムから発現しているもののうち、1つを例にとって、転写調節のレベルで関連があるかどうかを調べるため、遺伝子対のいずれか一方を強制的に発現させる条件で、他方の遺伝子の発現を観察したところ、一方の遺伝子が転写されるときには他方の転写が抑制される関係が認められた。このことは、相互排他的な転写調節機構の存在を更に強く示唆している。加えて、ホヤの系統で遺伝子重複によって生じたと考えられるTwist遺伝子についても同様の解析をおこなった。Twist1およびTwist2は同じ組織で発現するものの、Twist1の発現のほうが早く、Twist2はTwist1の調節によって、Twist2の発現は、Twist1の転写が終了すると同時に開始する。この発現パターンをレポーターコンストラクトで再現することに成功した。ほぼ計画通りに研究が進行した。相互排他的な転写調節機構の存在が示唆された遺伝子について、調節機構の解析を進め、DNAループによる調節が働いているのかどうかを調べる。Admp/Pinheadの遺伝子対で発見した機構がこの遺伝子対に特異的なものではないのであれば、それを証明したい。Twist遺伝子対についても、転写調節に必要なシス領域を同定し、それをもとに相互排他的な発現を支える高次の転写調節機構があるかどうかを検討する。可能であれば、DNAループのゲノムワイドな解析によって、さらに多くのDNAループによって転写調節を受けている候補遺伝子対を探したい。
免疫細胞ネットワークを用いたヒト癌免疫療法の開発

癌患者から種々の自家腫瘍抗原特異的反応性ヒトT細胞(CD8陽性CTL細胞及びCD4ベルパーTh細胞)を効率よく短時間に大量に増殖させる培養系を用いて、invivo/invitroでの癌排除機構におけるこれらヒトT細胞群の相互作用の解析、T細胞レセプターの解析、標的細胞上のT細胞認識抗原(癌特異抗原)ペプチドの分離と解析、ヒト癌の受身免疫療法への応用を行うことにより、新たな癌免疫療法の確立を試みる目的で本研究を実施した。本年度に得られた成果は、1.悪性メラノーマ転移性リンパ節、卵巣癌転移性リンパ節より自家腫瘍抗原特異的細胞障害性T細胞(CTL)を選択的に短時間に多量に増殖させ得る培養法を確立した。2.メラノーマ細胞特異的CD4^+Th細胞を増殖させ得る培養系を確立した。3.樹立されたCTL株のHLA拘束性及びサブクローニングが容易であることを示した。4.このようにして得られたCTLクローンは、長期の培養でもその特異性、CTL活性が安定であることを示した。5.invivoにおいても、得られたCTL細胞は強い抗腫瘍活性を示した。6.ヒトCTL細胞が認識するヒトメラノーマ共通抗原の存在を示唆する結果を得た。以上の結果から以下の結論が得られた。1.種々のサイトカインを組み合わせることにより、自家癌抗原特異的なヒトCTL細胞及びヒトヘルパーTh細胞を効率よく増殖させ得る培養系を確立できることを示した。この方法は今後も、さらに改良を加えると共に、臨床への応用も可能であり、精力的に研究を続けるべき有意義なものと考える。2.GM-CSF、IL-1などを組み合わせることにより、invitroにおいて効率よく、末梢血リンパ球を自家癌抗原で感作することが可能であることがわかった。3.本法は、自家腫瘍細胞、それに反応するCTL、Th細胞を同時に確立するので、癌抗原の解析に有用である。
銀河と巨大ブラックホールの共進化の解明

今年度は主に米国プリンストン大学を拠点とし、Michael Strauss教授らとともに、Sloan Digital Sky Surveyの多波長撮像データを用いた活動銀河核母銀河の研究に取り組んだ。特にStripe 82と呼ばれる特別観測領域で得られた高精度のデータと、点源関数および銀河モデル関数の2つのプロファイルを使って、低-中赤方偏移にあるクエーサー像プロファイルを活動銀河核と母銀河の二成分に精度良く空間分離する手法を開発した。その応用により、ほぼ全てのクエーサーは星総質量が10^<10>太陽質量を越えるような巨大銀河に選択的に出現していること、一方で通常の巨大銀河とは対照的に、クエーサー母銀河では異常に活発な星形成活動が起こっていることを突き止めた。これらは銀河と巨大ブラックホールの共進化を特徴付ける非常に重要な事実である。特に母銀河の活発な星形成については、最新の理論モデルが提唱する活動銀河核フィードバック(活動銀河核、特にクエーサーにより生み出される放射・力学エネルギーが母銀河または暗黒物質ハローのガスと相互作用し、星形成を阻害する)の予測とは一見矛盾するように見える。このことは、もしも活動銀河核フィードバックが存在するとしても、その効果が星種族に発現する時期とクエーサーの最高光度時期とは大きく隔たっているという重要な可能性を示唆している。また得られた母銀河の星質量と、クエーサー輝線から推定される巨大ブラックホール質量とを比較した結果、両者の間に明らかな正の相関が確認された。この相関は近傍宇宙の静穏な(活動銀河核を伴わない)銀河で確認されており、銀河と巨大ブラックホールの共進化を裏付ける最も重要な証拠と言われる。我々の結果は、巨大ブラックホールの最高効率成長期と考えられるクエーサー期にあっても、この相関が保持されることを示している.(抄録なし)今年度は主に米国プリンストン大学を拠点とし、Michael Strauss教授らとともに、Sloan Digital Sky Surveyの多波長撮像データを用いた活動銀河核母銀河の研究に取り組んだ。我々の結果は、巨大ブラックホールの最高効率成長期と考えられるクエーサー期にあっても、この相関が保持されることを示している.(抄録なし)
BCR/ABLと細胞周期制御蛋白質との相互作用の解析

慢性骨髄性白血病(CML)の発症過程において中心的役割を演じると考えられているBCR-ABL遺伝子産物[p210^<BCR-ABL>]の機能を評価するために以下の検討を行なった。[1]薬剤選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を有するp210^<BCR-ABL>の発現ベクターpGD210をヒトおよびマウス造血因子依存性細胞株(TFI&Ba/F3)に電気的穿孔法を用いて導入し、G418によって遺伝子導入細胞を選択した。[2]これらの細胞集団を造血因子を含まない培地に移し、自律増殖能獲得の有無を調べた。この際、自律増殖クローンと依存性クローンそれぞれの樹立を試みた。その結果、Ba/F3はBCR-ABL遺伝子の導入によって効率よく形質転換し、自律増殖能を獲得した。一方、TF1由来の自律増殖クローンは2株のみ得られた。この場合G418耐性クローンのほとんどがGM-CFS依存性の形質を保持しており、GM-CSFに対して親株とほぼ同様の用量依存性増殖を示した。ただし、これらのクローンを親株と比較した場合、造血因子非存在下においてより長期間生き延びる傾向が認められた。また、TF1由来の自律増殖クローンと依存性クローン各々におけるBCR-ABLmRNAの発現量をノーザン法で調べたところ、前者のほうが後者より高い発現を示すことがわかった。BCR-ABL遺伝子がマウス個体においてCML類似の病態をひきおこすことは実験的に証明されている。しかしながら、従来BCR-ABL遺伝子の形質転換活性は、専らBa/F3のようなマウス造血因子依存性細胞に対して自律増殖能を賦与するという現象によって認められてきた。CML慢性期における腫瘍性造血前駆細胞は造血因子依存性の増殖分化を示すという事実を考慮すると、今回われわれが確立したTF1細胞のモデル系のほうがCMLの病態を反映したBCR-ABL遺伝子の機能を評価できると思われる。現在これらのTF1サブクローンを用いて、BCR-ABL遺伝子導入に伴う細胞周期制御蛋白質(サイクリン、CDK、c-Myc etc.)の量的、質的変化を解析中である。
調理・加工条件の違いによる変異原・発ガン物質の人体への曝露状態の違いについて

1981年以来,ガンは日本人を始め先進諸国の死亡原因の上位を占め続けている。この発症要因としては,生活環境特に「喫煙」と「食生活」が最も大きな率を占めている。一方,昨今の食品の第三次機能のドラスチックな研究により食生活内容に気をつけることでガンを予防できる可能性が高い事も分ってきた。しかし,これら内容が試験管レベルの実験や疫学調査の結果より明らかになればなるほど,食品因子がどの程度の割合で発ガンや抗発ガンに関与しているのかと事が疑問としてついてくる。そこで,本研究課題としてはその問題を明らかするために次の2点について検討を加え,次の事を明らかにした。1)調理条件の違いによる変異原物質の生成量の違い魚や肉などのタンパク質食品を焼いた時に,焦げ中に変異原物質/発ガン物質であるヘテロサイクリックアミン類が生成されている事はよく知られている。これら食品を摂取した際の発ガン性への危険度を確認する目的で,豚肉を実際に調理した際に変異派物質がどの程度生成するか調べた。豚肉を加熱した例では,180°Cで加熱した場合に予想通り加熱時間と共に変異原性は上昇した。また,調理法を比較した場合では,揚げるや焼く場合は変異原性を多く生成するが,煮る場合では殆ど変異原性は上昇しなかった。また,ニンジンなどの野菜を添加して料理した場合や香辛料,調味料を添加した場合にも生成量は抑えられる傾向にあった。今回使用した食材を全て使用して実際に焼肉を作成したが,その変異原性の生成量は添加したものの中で最も高い抑制串と同程度抑えられた。2)生活習慣や食事摂取内容の違いによる尿中の変異原物質量の違い実際に様々に調理した食べ物を摂取した際にその食事内容由来で排泄された尿中の変異原性を測定し,内容と変異原性の曝露状態を比較した。焼くや揚げたものなど高温で処理したものを食した際に尿中の変異原性は高くなった。また,試験管レベルで抗変異原性を示した「薬味」を食した際にも尿中の変異原性は低下した。今年度は,上記研究課題を達成する為,次の2点を中心に検討した。(1)調理条件の違いによる変異原物質の生成量の違い次に示す異なった調理条件i)煮る,ii)焼く,iii)揚げるにおける変異原物質の生成量の違いについて検討した。即ち,タンパク性食品の食品加工・調理時に生成される変異原物質は,主にヘテロサイクリックアミシ類であることが知られており,これら一連の物質は薬物代謝酵素群によって活性化を受け変異原性を誘発する事が知られている。そこで,上記目的を達成する為に,モデルケースとして豚肉を用いたメニュー,豚汁,生姜焼き,トンカツを実際に調製して変異原物質の生成量を定量した。測定法は,比色法を用いるumu-testで実施した。食品中に生成される変異原物質は多様であるので,得られた測定値をTrp-P1量に換算して多少を比較した。その結果,高温処理法である「焼く」や「揚げる」で処理した際に予想通り変異原物質の生成量が高い事が分かった。また,モデルケースとして豚肉のみをそれぞれの調理条件で処理するよりも,加熱処理条件は同じで野菜や香辛料を添加して処理した時の方が変異原物質量は低下した。(2)生活習慣や事摂取内容の違いによる尿中の変異原物質量の違い

実際の食生活において,各種食品を摂取した際に,どの程度の変異原物質に曝露しているのかを検討するために食事由来の尿中の変異原物質量を測定した(5時間以上の絶食後,食事摂取前に排尿を済ませ食後5時間の尿を全て回収した)。初年度は,食事内容由来の変異原物質は食後何時問程度で尿中に排泄されるか検討した。その結果,どの被験者も食後5時間以内に排泄が完了し,5時問後にはベースラインに戻る事が分かった。次に,生活習慣の違いによる変異原物質の曝露量(尿中の排泄量)を比較した。その結果,喫煙者(2名)と非喫煙者(3名)を比較した際に,喫煙者の方が有意に高い値を示した。今年度は,本プロジェクト最終年であり昨年度に引き続き次の3点を中心に検討した。(1)調理条件の違いによる変異原物質の生成量の違い実際に豚肉を使用し次に示す調理条件i)煮る,ii)焼く,iii)揚げるにおける変異原物質の経時的生成量の違いについて検討した。昨年度は抽出法などに問題があり食品中からの回収率が低かった為、正確な変異原物質の生成量が確認できなかった部分もあったので,今回はブルーレーヨンによってヘテロサイクリックアミンを100%試料より抽出しAmes testにより変異原物質量をTrp-P1に換算して定量した。その結果,高温処理法である「焼く」や「揚げる」で処理した際に予想通り変異原物質の生成量が圧倒的に高い事が分かった。また,モデルケースとして豚肉に野菜や香辛料を添加した際に,一緒に添加して加熱をした際に抗変異原性を示すものや豚肉の加熱後に添加した際に抗変異原性を示すものなど種類によって傾向が異なる事が分った。また、みりんや醤油、酢などの調味料でも同様に検討を行った。これら材料を使用して,実際に豚肉ショウガ焼きを調製したが,それぞれの材料の抗変異原率より算出した抗変異原性よりも高い値を示した。(2)生活習慣や食事摂取内容の違いによる尿中の変異原物質量の違い実際の食生活において,各種食品を摂取した際に,どの程度の変異原物質に曝露しているのかを検討するために食事由来の尿中の変異原物質量を昨年度に検討した方法で測定した。全く同じ条件で調理したものを摂取したわけではないので,若干差があるが動物性食品を高温で処理したものを摂取した際に生成量と同様に高い排泄量を示した。また,野菜など変異原物質の生成を抑制するものを摂取した際に尿中の変異原物質量は低下する傾向がみられた。(3)生理活性物質の体内での動向抗発ガン性と関係が高いといわれる抗酸化成分を摂取した際の体内のラジカルの状態を検討した。FRASを使用して血中のラジカル量を測定したが,正常範囲者においては影響がなかったが,ラジカルが正常値より高い被験者に関しては改善傾向が認められた。今回得られた上記データは,現在学会誌への投稿を準備している。
硝酸の三酸素同位体組成を用いた氷河生態系の窒素循環速度の推定

氷河や氷床は、巨大な淡水ストックとしての役割を有し、地球表面のアルベドを変化させるため重要である。このため、氷河や氷床の縮小は、海水準の上昇や水資源の枯渇、気候温暖化の加速など人間社会へ重大な影響を及ぼすため、その原因解明や対策立案は急務である。本研究では硝酸の三酸素同位体組成(Δ17O)という新しい環境トレーサーを導入し、氷河生態系における窒素循環速度を定量する。このため、天山山脈ウルムチNo.1氷河(中国新疆ウイグル自治区)を主たる研究地点と考えていた。しかし、2018年8月に予定していた調査は、中国国内の都合で急遽調査がキャンセルとなってしまった。このため調査は次年度に先送りしたが、同様の狙いを持って研究を進めることができるSvalbard諸島での調査やチベット高原の雪・氷・河川水の試料の分析を進めることができた。本研究は、天山山脈ウルムチNo.1氷河(中国新疆ウイグル自治区)を主たる研究地点としていたが、2018年8月に予定していた調査は、中国国内の都合で急遽調査がキャンセルとなってしまった。2019年に再度天山山脈ウルムチNo.1氷河(中国新疆ウイグル自治区)を予定している。上部涵養域から下流部消耗域、そして氷河外の流域にかけてクリオコナイト及ひ&#12441;雪試料を採取し、その窒素化合物の安定同位体解析を実施する。2018年度に予定していた調査が中止になったため、翌年度に使用するように手配した。2019年度に複数人で調査を行い、広域にわたって多数の試料採取及び分析を供試する予定である。
脳関門輸送系による痙攣誘発性物質の中枢障害回避機構

重度の腎機能低下によって引き起こされる尿毒症では、クレアチンの代謝産物であるクレアチニンが脳内に蓄積され、痙攣誘発に関与することが知られている。しかし、クレアチニンの脳内動態を決定付ける分子機構は未だ不明であり、特に脳内クリアランス機構の解明は、尿毒症においてクレアチニンの脳内蓄積を回避する方法を確立する上で重要である。すでに、研究代表者は、クレアチニンが血液脳脊髄液関門を介して脳内から排出輸送されることを明らかにしている。本研究では、クレアチニンの脳内クリアランスに関与するトランスポーターを同定することを目的とした。本課題では、血液脳脊髄液関門に発現するクレアチントランスポーター(CRT)及び有機カチオントランスポーター3(OCT3)に着目した。CRTを介したクレアチニンの取り込みは、濃度依存性(Km値52.0mM)を示し、クレアチン(Km値:約50μM)に比較して、極めて低親和性であることが示された。さらに、CRTを介したクレアチニンの取り込みは、Na^+及びCl^-依存性を示し、クレアチンによって有意に阻害された。ラットOCT3を介したクレアチニンの取り込みは、濃度依存性(Km値:47.7mM)を示し、有機カチオン輸送系の基質であるテトラエチルアンモニウム(TEA)、1-methy1-4-phenylpyridinium(MPP^+)、及び尿毒症において脳内に蓄積することが報告されているメチルグアニジンによって有意に阻害された。一方、CRTの高親和性基質であるクレアチンは、阻害効果を示さなかった。以上の結果から、脳内からのクレアチニンクリアランス機構には血液脳脊髄液関門のCRT及びOCT3が協同的に寄与していることが示唆された。中枢痙攣誘発性物質であるグアニジノ化合物は、急性てんかん発作、尿毒症、エイズ発症性痴呆、脳腫瘍などにおいて脳内又は脳脊髄液中に蓄積することが知られている。そこで、グアニジノ化合物による神経障害を回避する為には、脳内から効率的に痙攣誘発性物質を除去することが最も合理的な戦略である。本研究課題では、「脳関門は、痙攣誘発性物質グアニジノ化合物を脳内から排出輸送する分子機構を備え、中枢障害回避機構として機能している」ことを実証することを目的とする。グアニジノ化合物の一つであるグアニジノ酢酸は、エネルギー貯蔵物質であるクレアチン生合成の前駆体としてだけでなく痙攣誘発性物質として知られている。グアニジノ酢酸はラット脳室内投与後、半減期1.5分で脳脊髄液中から消失した。さらにクレアチントランスポーター(CRT)の基質であるクレアチンによって有意に阻害されたことから、血液脳脊髄液関門における能動的な排出機構の寄与が示唆された。CRT cRNAを注入したアフリカツメガエル卵母細胞を用いた[^<14>C]グアニジノ酢酸の取り込みは、濃度依存性(Km:269μM)を示し、2mMクレアチン、γ-グアニジノブチル酸、β-グアニジノプロピオン酸で有意に阻害された。免疫組織化学的解析から、CRTは脈絡叢上皮細胞に局在していることが示された。以上の結果から、グアニジノ酢酸は血液脳脊髄液関門におけるCRTを介して脳脊髄液中から除去されていることが示唆された。血液脳脊髄液関門におけるグアニジノ酢酸排出機構は、グアニジノ酢酸の脳内蓄積を回避するために脳脊髄液中から内因的な痙攣誘発性物質を積極的に除去するという中枢防御システムとしての役割を担っている可能性が高い。
網膜色素変性症原因遺伝子PAP-1を介した新たなPim-1シグナル伝達経路の解析

研究計画に基づき、PAP-1遺伝子の発現レベル変動を培養細胞を用いて各種条件下で検討した。Pim-1と違い、PAP-1には顕著な発現誘導や発現抑制を示す条件がないことから、PAP-1機能の調節には翻訳後調節やそれに伴う結合因子の変化が重要な役割を果たしていると考えた。そこで、ストレプトタグを付加したPAP-1遺伝子の恒常発現株を前立線ガン由来ヒト培養細胞を親株として作成し、PAP-1を含むタンパク複合体をタグを用いて単離することで、3種類のPAP-1結合因子を同定した。これら分子の発現ベクターを作成し、細胞内でのPAP-1との結合を確認したところ、いずれもPAP-1と結合した。これらのうちの1つは網膜色素変性症で遺伝子変異が報告されている分子の結合タンパク質であり、PAP-1も網膜色素変性症の原因遺伝子であることから、その機能的相関に興味がもたれた。一方、昨年度の研究から、我々はU2OS細胞のPAP-1発現抑制株ではPim-1によるレポーター遺伝子のスプライシングパターンへの効果に変化が生じていることを見出している。本年度はさらに誘導型のPAP-1の発現抑制細胞株をヒト胎児腎由来細胞株を用いて作成し、この細胞株が上述のレポーターと同じ遺伝子を発現していることから、そのスプライシングパターンを検討した。しかし、PAP-1単独での発現量の変動はU2OS細胞での結果と同じくスプライシングパターンには影響を与えなかった。また、この細胞株を用いてPim-1のスプライシングへ与える影響へのPAP-1発現抑制の効果も検討したが、大きな変化は見られなかった。この実験には遺伝子導入効率が大きく影響することから、今後は導入方法を工夫するか、別の細胞株を用いて、より効率的にPim-1の効果を検討できる実験系を作成する必要があると考えられた。研究計画に基づき、PAP-1遺伝子の発現抑制株をRNAiを利用したベクターにより作製した。当初の予定では網膜由来の培養細胞で発現抑制株を作製する予定であったが、遺伝子導入法を変えながら試したものの目的の細胞株は網膜由来の培養細胞からは得られなかった。そこで遺伝子導入効率が高いヒト培養細胞株で、PAP-1の発現を比較し、PAP-1発現の高かった骨肉腫由来U2OS細胞にてPAP-1発現抑制株を作製した。得られたPAP-1発現抑制株はPAP-1発現が通常の10-30%に抑制されていたがその増殖はもとの細胞株と比較しても変化は見られなかった。そこで、これまでの我々の研究からPAP-1の強制発現によってスプライシングパターンの変化が見られたレポーター遺伝子を用いて、PAP-1発現抑制細胞株でそのパターンに変化が生じるかを検討した。その結果レポーター遺伝子を単独で導入した場合にはPAP-1の発現抑制はスプライシングに影響を与えなかったが、PAP-1の上流因子と考えられるPim-1セリンスレオニンキナーゼを共導入したところ、親株ではPim-1によりレポーター遺伝子のスプライシングパターンが大きく変化したのに対し、PAP-1発現抑制株ではその変化がほぼ見られなくなっていた。このことはPim-1によるスプライシングパターンの調節はPAP-1を介して行われている可能性を示唆しており、Pim-1とPAP-1が同じシグナル経路上に存在することを示唆する初めてのデータである。一方、もう一つの初年度の研究目的である網膜由来細胞でPAP-1発現を調節する刺激の同定であるが、血清飢餓や酸化ストレス、プロテアソーム阻害剤などではPAP-1のmRNA、タンパク質量ともに大きな変化はなかった。今後さらに様々な条件を試していく必要があると考えられる。

この実験には遺伝子導入効率が大きく影響することから、今後は導入方法を工夫するか、別の細胞株を用いて、より効率的にPim-1の効果を検討できる実験系を作成する必要があると考えられた。
細胞内薬理動態からみた悪性腫瘍の化学療法の研究

従来,抗白血病剤の効果は血中薬剤濃度(C)とその持続時間(T)との積,すなわちCxTや薬剤濃度曲線下面積(AUC)によって表されてきた。しかし,抗白血病剤が作用するのは細胞内の活性型であり,その生成は血中薬剤濃度とは必ずしも平行しない。そこで本研究では白血病細胞内における活性型の生成を測定し,そのAUCによって抗白血病剤の合理的投与法や組み合わせを検討した。L1210細胞またはHL60細胞の浮遊液にcytosine arabinoside(ara-C)を加えてincubateすると,細胞内薬剤濃度は数分で培地中薬剤濃度を凌駕して上昇した。細胞内の薬剤は殆どすべてがara-CTPでありfreeのara-Cは存在しないので,培地中のara-Cはかなり低濃度でも細胞に取り込まれ,速やかにara-CTPに活性化され細胞内に貯留すると考えられる。従ってara-C投与時には血漿中のCが上昇が低くてもTの長いほうが細胞内活性型濃度は高くなると考えられる。behenoyl ara-Cやstearyl ara-CMPのごときmasked compoundはara-Cを徐放するのでCが低い割合には細胞内活性型の生成は多い。また,細胞浮遊液にあらかじめ6-mercaptopurineまたは6-thioguanineを加えると,cytidine deaminaseの生成を抑制してara-Cの不活性化が減少し,細胞内ara-CTPの生成が増加した。さらにara-C中等量療法時に相当する10μg/mlの濃度ではladder DNA fragmentationを生じ,apoptosisによる細胞死が加わることも明らかにされた。他方,ara-Cとdaunorubicin(DNR)とを作用させた上記白血病細胞のflowcytometryによると,ara-C→DNRの順序に作用させたほうがその逆の順序に作用させるよりG_1細胞の生成が少なく,次細胞周期へのprogressionが少ないこと,すなわち増殖抑制効果が強いことが解った。これらの所見は白血病の化学療法に際してara-Cの抗腫瘍効果を増強するための使用法の適正化に有力な示唆を与えるものである。
プライベートヘルスデータベースの構築と実験的運用に関する研究

プライベートヘルスデータベース(PHDB)は生まれてから死ぬまで継続的に必要な健康・医療情報を一元的に管理しようとするものである。その理念・目的・基本的構造についての考察をおこない第17・18回医療情報学連合大会で報告した。さらに、PHDBの構築のスタートとして産科領域での健康・医療情報の取扱いについて、大阪大学医学部保健学科と同附属病院産婦人科との共同プロジェクトを平成9年度よりはじめた。平成9年度と10年度にわたり、外来診療の実態調査として待ち時間調査をおこない、待ち時間短縮のための提言をおこなった。また、大阪府下の各市町村保健所がおこなっている母子保健サービスを調査し、その情報提供サービスのあり方について考察した。また、医療施設が替わっても個人の診療情報が継続されるためには医療施設間ネットワーク構築が必要である。現在使用されている診療情報提供としての紹介状に記載されている医療情報を、情報伝達という観点から言語解析をおこなった。また、これについての調査を国立循環器病センタの協力を得て実施し、センターへ報告した。患者個人の関心事に医療費の支払がある。インフォームドコンセントに医療費の項目も含めることを目的として、疾病別医療費の算出を試みた。PHDBは患者個人の健康と診療情報の集約で、その患者個人にのみ帰属する。したがって個人情報保護の観点から、個人の特定方法やプライバシー保護のための取扱い規約などを明確にしておく必要があるので、規約を制定した。これらの成果は第17・18回医療情報学連合大会および平成10年度情報処理教育研究集会で報告した。平成9年度実施内容大阪大学医学部保健学科と大阪大学医学部附属病院産科婦人科との共同プロジェクトとして産科診療情報のシステム構築をおこなっていく上で外来診療の実態調査として、患者動態調査を実施した。患者の待ち時間調査をおこない、附属病院医事課への調査報告書を提出した。また、母子保健法の改定に伴い、行政の母子保健サービスが都道府県から市町村へ移管したことをうけて、大阪府下の各市町村保健所がおこなっている母子保健サービスを調査し、その情報提供の方法について、第17回医療情報学連合大会にで「母子保健サービスの情報提供ネットワーク」として報告した。また、個人診療情報が流通することを前提に、PHDBを構築する予定であるが、現在医療機関間で流通している診療情報は、紹介状(診療情報提供)であるので、これについての調査を国立循環器病センタの協力を得て、実施した。この結果報告は国立循環器病センタ医事課へ提出した。これら診療情報がどこで、どのような形で発生しているのを調査した後、PHDBの基本構造をまとる予定である。PHDBによる診療情報の構造化については、1.診療用法の患者個人への帰属性。2.患者個人の診療情報の時系列性。3.患者個人の健康時と診療時の一元管理。4.現存する行政としての医療サービスや病院にて稼働しているシステムとの関わり方。5.臨床研究情報との関連性。について、基本的な構造を明確にしたので、第17回医療情報学連合大会にて、「プライベートヘルスデータベースPHDB個人健康・診療情報について」と題して報告した。P,HDBの構築のスタートとして産科領域での健康・医療情報の取扱いについて、大阪大学医学部保健学科と同附属病院産婦人科との共同プロジェクトを平成9年度よりはじめた。産科診療情報のシステム構築をおこなっていくうえで、平成9年度に引き続き、外来診療の実態調査として待ち時間調査をおこなった。今年度は調査期問を40日と長期間にわたって診察・内診・検査別に詳細なデータを得、分析し、長い待ち時問を解消するための提言をおこなった。

したがって個人情報保護の観点から、個人の特定方法やプライバシー保護のための取扱い規約などを明確にしておく必要があり、これらについても考察を深めた。また、患者個人の関心事に医療費の支払がある。インフォームドコンセントに医療費の項目も含めることを目的として、疾病別医療費の算出を試みた。これらの研究を総合的にまとめる意味でPHDBの基本的なデータ構造についても考察を深めた。これらの成果は第18回医療情報学連合大会および平成10年度情報処理教育研究集会で報告した。また、今年度から、退院後のフォローアップとして患者と病院(特に看護部)の連絡体制を深めるための連絡帳「ケア・ノート」の作成と運用を手がけている。
反対咬合症の咀嚼障害の評価と改善に関する臨床研究

1.反対咬合症の咀嚼障害の評価について反対咬合症の咀嚼能力の治療に伴う改善度とその後の長期的変化様相について定量的かつ縦断的に評価した。被験者は、顎矯正外科治療を受け、術後3年以上経過した女性・成人骨格型反対咬合症31例である。咀嚼能力の定量的評価方法としてATP吸光度法を用いた。結果は次の通りであった。1)治療前の反対咬合症の平均咀嚼能力は、正常咬合者のそれよりも約40%劣っていた。2)平均咀嚼能力は、術後長期経過するにつれて次第に向上していたものの、正常咬合者に比べて有意に低い値にとどまっていた。3)治療前に高い咀嚼能力を示していたものは術後に低下する傾向があり、また逆に低いものでは総じて向上しており、全体として正常咬合者の下限領域付近に向かって収束する傾向を示していた。2.反対咬合症の治療後におけるガム咀嚼訓練の効果について顎矯正外科治療後の咀嚼能力の向上を図ることを目的に、ガム咀嚼訓練を施し、その効果を定量的に評価した。研究対象者は、顎矯正外科治療を適用した女性・骨格型反対咬合症36例(訓練群:20例、対照群:16例)である。咀嚼訓練は動的治療直後から1年半までの間に3カ月間行い、咀嚼能力の変化をATP吸光度法を用いて評価した。1)訓練群、対照群ともに、術後(ガム咀嚼訓練前)の咀嚼能力は初診時と比較して有意差が認められなかった。2)訓練後の咀嚼能力は、訓練前と比べて有意に向上していた。3)訓練群の訓練後の咀嚼能力は、対照群の術後のそれよりも有意に高い値を示した。
「胃分化」の分子基盤解析に基づく胃発癌ならびに胃癌組織型決定機構の解明

新たな胃分化マーカーとして、Cathepsin Eを同定し、これが胃印環細胞癌マーカーとして病理組織学的評価に有用であることを発見・報告した(PLoS ONE 8:e56766, 2013)。また、胃分化マーカーMUC5ACに注目し、その発現が胃癌進展に伴って低下すること、同遺伝子の翻訳開始点上流125110bpにGli結合配列を含む高度保存領域が存在すること、over expression・knock down・クロマチン免疫沈降などの分子生物学的解析によってGliがこの領域に動員され、発現に必須の転写因子として機能することを報告した(PLoS ONE 9:e106106, 2014)。胃分化マーカーMUC5ACに注目し、早期胃癌周囲粘膜・内視鏡切除早期胃癌・外科切除進行胃癌における発現を免疫染色で解析したところ、胃癌の進展に伴ってMUC5AC発現が低下する傾向を認められた。次にMUC5AC遺伝子上流の様々な欠失変異を用いたLuciferase asssayを行なったところ、MUC5AC発現に必須な翻訳開始点上流125110bpの領域を発見した。多くの哺乳類で高度に保存されたこの15bpにはGli結合配列GBSが含まれ、over expression・knock downによりMUC5ACがgliの制御を受けること、クロマチン免疫沈降実験によってGli1がこの領域に動員されることが分かった。消化管由来30細胞株・各組織由来ヒト正常RNAを用いた解析を行なうとGli1・Gli2は諸細胞株・全組織に様々に発現しており、明らかな細胞・組織特異性を示すMUC5ACとの発現相関は認めず、GliがMUC5AC発現の必要因子であるものの、十分因子でないことが分かった。Luciferase asssayで更に上流を調べると、20004000bp上流により強い転写活性が認め、同領域にはCpGアイランドが存在していた。DNAメチル化阻害剤・ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬によってMUC5AC欠失細胞株のMUC5AC発現が回復することから、epigeneticな制御も関与することが明らかとなった。主に腸上皮化生を伴う慢性萎縮性胃炎を発生母地として生じる胃癌は、消化管分化の制御の異常が発癌に強く関連していると考えられており、MUC5ACの発現制御にHedgehogシグナル伝達経路(Hh/Ptch/Smo/Gli)のエフェクター分子であるGliが必須であるという結果は、胃分化の破綻から発症する胃癌の分子基盤解明に重要な結果と考えられた。すでに学術誌に報告したCathepsin E(PLoS One. 2013;8(2):e56766)・MUC5AC(PLoS One. 2014;9(8):e106106)につぐ胃分化マーカーの探索を継続し、候補遺伝子Claudin-18(variant 2)について早期胃癌周囲粘膜・内視鏡切除早期胃癌における発現を免疫染色の解析を行なって、胃分化マーカーであることを確認した。現在、同遺伝子のプロモーター領域の同定、転写制御の解析に取り掛かっている。また、胃癌の病態に大きく関与する「消化管分化の異常」の影響が、小腸大腸領域の上皮性腫瘍においても関与しているかを解析する付随研究として、非乳頭部十二指腸早期癌・腺腫における臨床病理学的検討を行なったところ、胃型マーカー・腸型マーカーの発現パターンと十二指腸上皮性腫瘍の悪性度・深達度が関連することを発見した(JDDW2014にて報告)。このうち、2014年に発現制御を決定して報告したMUC5ACの発現異常が十二指腸の上皮性腫瘍における重要な臨床マーカーになることが強く示唆される結果が得られ、現在、継続して解析を行っている。胃癌の多くが「胃分化」と「腸分化」の不安定な状態にある腸上皮化生を背景に発症することに注目した本研究では、これまで多くの解析がされてきた「腸分化」ではなく、「胃分化」の機序の解明を目指して本研究を行なった。新たな胃分化マーカーとして、アスパラギン酸プロテアーゼの一種であるCathepsin E(CTSE)を同定し、1) CTSEは、その発現は胃マーカーMUC5ACと正に相関、腸マーカーMUC2と負に相関する優れた胃型分化マーカーであること、2)同時に極めて優れた胃印環細胞癌のマーカーであり、病理組織学的評価において有用であることを発見し、報告した(PLoS ONE 8:e56766, 2013)。また、代表的な胃型マーカーであるMUC5ACのプロモーター領域を詳細に調べ、a) 13種類の哺乳類の上流塩基配列の比較で、翻訳開始点上流200bpに保存性が高い領域が認められること、b)MUC5AC遺伝子上流の諸欠失変異を用いたルシフェラーゼプロモーターアッセイの結果、翻訳開始点上流125110bpがMUC5ACの発現に必須であること、c)この15bpの領域にはGli結合配列が含まれ、クロマチン免疫沈降実験によってGliがこの領域に動員されること、d)胃癌・大腸癌細胞株にGli1・Gli2を強制発現させるとMUC5ACの発現誘導が認められ、逆にGli1・Gli2をknockdownするとMUC5ACの発現低下が認められることを解明し、報告した(PLoS ONE 9:e106106, 2014)。

一方で、胃分化を決定づける分子基盤や消化管癌化との関連については、十分に解明できず、今後の課題として残っているのが現状である。新たな胃分化マーカーとして、Cathepsin Eを同定し、これが胃印環細胞癌マーカーとして病理組織学的評価に有用であることを発見・報告した(PLoS ONE 8:e56766, 2013)。また、胃分化マーカーMUC5ACに注目し、その発現が胃癌進展に伴って低下すること、同遺伝子の翻訳開始点上流125110bpにGli結合配列を含む高度保存領域が存在すること、over expression・knock down・クロマチン免疫沈降などの分子生物学的解析によってGliがこの領域に動員され、発現に必須の転写因子として機能することを報告した(PLoS ONE 9:e106106, 2014)。Cathpesin Eの胃分化マーカー・胃癌(特に印環細胞癌)マーカーとしての臨床病理学的意義(PLoS One. 2013;8:e56766)、ならびに、MUC5ACのGliによる詳細な転写制御の解明(PLoS One. 2014;9:e106106)と、2つの代表的な胃分化マーカーについての解析を完了し、報告した。現在、第3の候補遺伝子であるClaudin-18(variant 2)の解析に着手するとともに、消化管分化マーカーを別の視点から確認するために、十二指腸上皮性腫瘍の解析を付随研究として行なっている。分子腫瘍学胃分化マーカーであるClaudin-18(variant 2)の解析を継続するとともに、他の消化管由来悪性腫瘍に対する付随研究を広げてゆく方針である。なお、これまで報告したCathpesin E遺伝子については転写制御が依然として未解明であり、また、MUC5AC遺伝子は発現を制御する転写因子Gliを同定したが、臓器特異性の低いGliと高いMUC5ACの発現の乖離の機序については十分に解析しきれていない。引き続き、こちらについての解析も継続する。胃分化マーカー遺伝子の中で最も良く知られたMUC5AC遺伝子について、その発現制御の解明に成功しており、現在はデータ解析を終えて、投稿中である。また、MUC5AC以外の胃分化マーカーとしてCathepsin Eの同定に成功しており、こちらは既にPLoS One 2013, 8:e56766.に発表している。CathepsinE遺伝子の発現制御については制御因子・制御機構の同定に難渋しているが、現在も精力的に解析を続けている。研究はほぼ予定通り、進行しているが、他の研究資金が獲得できたため、当該助成金に一部、余裕が生じたため、翌年度分への持ち越し額が生じている。ただし、もともとの予定に加えて、付随研究からの大きな発展が得られたため、この解析も並行して行なう予定である。当初の予定通りである胃分化マーカーの解析とともに、他消化管悪性腫瘍(主に十二指腸上皮性腫瘍)の解析を行なうことによって、平成27年度は当初より多くの研究費が必要となり、平成27年(最終年度)で助成金を可不足なく使用する予定である。引き続き、胃分化マーカー遺伝子の同定・発現制御の解明を継続するとともに、腸分化マーカー遺伝子の発現制御解明、臨床検体における胃分化マーカー遺伝子・腸分化マーカー遺伝子の発現解析を行なってゆく予定である。当初の計画どおり、胃分化マーカーの探索・発現制御解析と臨床検体を用いた発現解析を継続するとともに、平成27年度はデータの詳細な解析、ならびに、論文の作成・投稿に取り組む予定である。
モデル動物を用いた発癌における細胞増殖、細胞死制御の影響の分子生物学的解析

tob遺伝子を欠損したマウスと癌遺伝子Rasを肝臓に発現するマウスを交配し、癌遺伝子Rasの発現に加えてtob遺伝子の欠損が伴うと肝臓癌の発症時期は数ヶ月早くなり、また個体当たりの癌の数・大きさがそれぞれ有意に増加することを発見した。双方の遺伝子改変マウスで遺伝子発現を比較し、いくつかの発癌に関わる遺伝子の発現量に顕著な相違があることを見出した。10対以上のマウス検体の解析でほぼ同様の結果を得たので、肝臓癌発症の原因に繋がる遺伝子発現の変動であると考えられた。「遺伝子改変マウスにおける癌発症性の検索、及びその病理解析」としてtob遺伝子欠損マウスと癌遺伝子である恒常活性化型Rasを肝臓特異的に発現するトランスジェニックマウスを交配し、得られた個体で発症する癌の形態・悪性度等の相違を調べた。肉眼所見と簡易的な病理解析を行い、すでに報告にあるように恒常活性化型Rasの発現により肝臓癌が発症することを確認した。さらに、Rasの発現に加えてtob遺伝子の欠損が伴うと発症時期は数ヶ月程度早くなる傾向にあり、また癌の数・大きさがそれぞれ有意に増加することが分かった。従って肝臓癌のマウスモデルにおいてtob遺伝子が癌抑制遺伝子として関与することが示唆された。次に遺伝子改変マウスで生じた癌にどのような特徴があるかをより詳細に理解するために、マイクロアレイ解析を進めている。既に肝臓癌発症に伴ういくつかの遺伝子の顕著な発現変動を見出しており、ノザン解析においても同様に変動することを確認した。今後より多くの検体においても発現変動が再現されるかどうかを検討し、また再度マイクロアレイ解析もおこなうことで、tob遺伝子の欠損が肝臓癌発症を大きく促進する分子基盤を突き止めていく。癌を発症した多くの検体が蓄積しつつあるので、タンパク質そのものの動態を調べるため、2次元解析も行う予定である。一方、tob遺伝子の発現が上昇する分子機構の解明ではtob遺伝子のプロモーター領域をクローニングし、レポーター遺伝子の上流に挿入し、レポーターアッセイを行った。実験系としては機能したが、有力な候補分子の同定には到らなかった。しかし、並行して進めた化学物質の検索から、tob発現誘導を強く抑制する物質を発見した。さらにタンパク質の2次元電気泳動解析から、標的候補分子の同定に成功した。現在その候補分子が実際にtob発現誘導に及ぼす影響をRNAiや過剰発現の系で評価している。肉眼所見と病理解析の結果から、Rasの発現に加えてtob遺伝子の欠損が伴うと発症時期は数ヶ月程度早くなり、また個体当たりの癌の数・大きさがそれぞれ有意に増加することが分かった。次に遺伝子改変マウスで生じた癌にどのような特徴があるかを詳細に理解するために、遺伝子発現マイクロアレイ解析を行った。統計学的評価の結果、細胞増殖や細胞死の制御に関わる遺伝子群として、IGF-1やBTG2など8種類の遺伝子に顕著な発現変動があること見出した。定量的PCRとノザン解析を行うことで、実際に発現量に差があることを確認した。さらに10対以上の検体からRNAサンプルを抽出し、いずれの例においても当該遺伝子が同様の発現変動を示すことも確認できた。しかし、これらの遺伝子変動は癌の有無との相関は非常に強いが、tob遺伝子の有無とは関連がないものであった。そこで、tob遺伝子の欠損が発癌促進に及ぼした影響を理解するためのマイクロアレイ解析を再度実行した。現在、データ解析により候補遺伝子を絞り込みつつある。一方、細胞死抑制のためにtob遺伝子の発現が上昇してくる分子機構の解明に取り組み、まず、tob遺伝子の発現誘導を強く抑制する低分子化合物の発見に至った。次にタンパク質の2次元電気泳動解析を行うことで、その化合物の標的分子を同定した。RNAiでその分子の発現を抑制した時に、発現誘導されたTobがタンパク質分解をうけることが分かった。以降の生化学的な解析によって、不要な細胞死を防ぐために細胞死を抑制する効果を持つTobをタンパク質分解機構から防御するという、新しい分子機構を発見した。