hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ラセミ触媒の「不斉活性化法」の合理設計:ラセミ触媒による不斉合成法の開拓

本申請研究は、ラセミ触媒による触媒的不斉合成を極微量の不斉活性化剤を用いて達成しようとするものである。既に申請者らは、全く新しいラセミ触媒の活用法として、一方のエナンチオマーTi触媒を選択的に活性化する「不斉活性化法」を報告した。それに対して不斉活性化剤がラセミ触媒のいずれのエナンチオマーをも活性化するケースも考えうる。そうしたケースを検討するには他の金属へと研究対象を移さなければならない。そこで本申請研究では野依教授らのBINAP-Ru触媒のジアミンによる活性化を取り上げた。1)ラセミ触媒の不斉活性化における基質依存性ラセミのBINAP′-Ru触媒に対してジアミンの量を0.5当量以下に抑えてもBINAP′-Ru/ジアミン錯体はほぼ1:1のジアステレオマ-比で生成した。さらに、いずれのジアステレオマ-錯体がより高い触媒活性を示すかはケトン基質の構造に依存して決定された。2)不斉活性化錯体のスペクトル解析アキラルなビフェニルホスフィン配位子(BIPHEP)を有するルテニウム触媒のキラルなジアミンとの活性化錯体形成についてIHおよび31PNMR分析を行った。ケトン基質存在下でも1:1のジアステレオマ-比でBIPHEP-Ru/ジアミン錯体が確認されるものの、不斉水素化が進行した。3)エナンチオマー触媒選択的活性化からエナンチオマー非選択的活性化への数値解析ラセミ触媒のホモキラル⇔ヘテロキラル二量体間の平衡定数(K)、不斉活性化剤との活性化錯体形成時のそれぞれのエナンチオマー触媒との反応速度kR,kSと逆反応速度k-R,k-S、さらにはそれぞれのジアステレオマ-活性化錯体による基質の反応速度kR,R,kS,R(活性化剤のキラリティーをRとする)に基づいて、エナンチオマー触媒選択的活性化からエナンチオマー非選択的活性化(基質に依存してジアステレオマ-錯体の触媒活性が決定される)までの連続的変化を数値解析した。
T細胞特異的アダプター分子SAPの発現制御による新たな炎症性腸疾患治療法の開発

1)炎症性腸疾患患者の腸粘膜内CD4陽性細胞内SAP異常発現の検討昨年の生検腸組織での検討を踏まえ、健常人5名、クローン病患者5名、潰瘍性大腸炎患者5名の腸切除標本より分離したCD4陽性細胞におけるSAPmRNAの発現につきrea1-timePCR法を用い検討した。サンプル数を増やす必要があると思われるが、これまでの検討では、3群間において有意差を認めていない。前年度と同様の方法でマウスの大腸炎モデルを作製し、SAPノックアウトマウスCD4陽性細胞の機能異常につき検討した。すなわちこの実験では、SCIDマウスにwild type C57BL/6由来のCD45RBhi CD4陽性細胞2x10^5を移入する通常のtransferモデルを対照群とし、C57BL/6 background SAPノックアウトまたはトランスジェニックマウス由来のCD45RBhi CD4陽性細胞2x10^5を移入した群を作製した。しかし、3群間で体重減少・血清下痢、sacrifice後の肉眼所見・組織所見にて炎症の程度に有意差は認められなかった。SAPノックアウトマウスCD4陽性細胞はin vitro刺激においては明らかなTh2への分化異常を示し炎症惹起細胞として働くこと(Nature Immunol)、またSAPトランスジェニックマウスCD4陽性細胞はTh2への分化が亢進していること(unpublished data)から期待された結果は得られなかった。in vivoでのprimingにはvitroとの違い、特に腸管腔の抗原や腸管局所のサイトカイン環境などの因子が複雑に関与していることが原因として考えられている。1)炎症性腸疾患患者の末梢血、大腸粘膜内単核球におけるSAPの発現異常の検討末梢血中単核球よりCD4陽性細胞を分離し、SAP mRNAの発現を検討した。健常人10名、クローン病患者10名、潰瘍性大腸炎患者10名で検討したが、SAP mRNAの発現に有意差は得られなかった。大腸内視鏡施行時に生検にて得られた正常粘膜、Crohn病および潰瘍性大腸炎由来の病変粘膜においてもSAP mRNAの発現に有意差は見られなかった。(各5例検討)しかしながら大腸粘膜全体の生検検体では、その構成成分が一定でないため、Tリンパ球にのみ発現されるSAPの差につき検討することは困難であると判断し、現在手術検体よりCD4陽性細胞を分離し検討を進めている。2)マウス大腸炎モデルの炎症部粘膜内単核球におけるSAPの発現異常の検討TNBS免疫大腸炎モデルおよびCD45RBhi CD4陽性細胞transferモデルにおいて炎症部大腸粘膜より粘膜固有層リンパ球を採取し、MACSカラムを用いてCD4陽性細胞を分離し、SAP mRNAの発現をreal-time PCR法にて検討した。脾臓由来CD4陽性細胞に比較し、TNBS免疫大腸炎モデルならびにCD4陽性細胞transferモデル由来の粘膜固有層CD4リンパ球においてはSAP mRNAの発現が低下している傾向を認めた。現在、再現性につき再実験を進めており、SAP蛋白レベルの発現についても並行して検討する予定である。1)炎症性腸疾患患者の腸粘膜内CD4陽性細胞内SAP異常発現の検討昨年の生検腸組織での検討を踏まえ、健常人5名、クローン病患者5名、潰瘍性大腸炎患者5名の腸切除標本より分離したCD4陽性細胞におけるSAP mRNAの発現につきreal-time PCR法を用い検討した。すなわちこの実験では、SCIDマウスにwild type C57BL/6由来のCD45RBhi CD4陽性細胞2x10^5を移入する通常のtransferモデルを対照群とし、C57BL/6 background SAPノックアウトまたはトランスジェニックマウス由来のcD45RBhi CD4陽性細胞2x10^5を移入した群を作製した。

しかし、3群間で体重減少・血清下痢、sacrifice後の肉眼所見・組織所見にて炎症の程度に有意差は認められなかった。SAPノックアウトマウスCD4陽性細胞はin vitro刺激においては明らかなTh2への分化異常を示し炎症惹起細胞として働くこと(Nature Immunol)、またSAPトランスジェニックマウスCD4陽性細胞はTh2への分化が亢進していること(unpublished data)から期待された結果は得られなかった。in vivoでのprimingにはvitroとの違い、特に腸管腔の抗原や腸管局所のサイトカイン環境などの因子が複雑に関与していることが原因として考えられている。
接触温を考慮した床暖房設計規準の提案と竣工検査用模擬足の開発

床暖房において、低温やけど問題の懸念が発露する原因は、ふたつある。ひとつは、床暖房の設計規準に、人体皮膚との接触面温度、あるいは流入熱量の上限規定がないこと。もうひとつは、床暖房という設備は、断熱性や気密性といった建物の熱性能との整合性の上に成り立っているのに、床暖房という設備側だけを規制していることである。本研究は、この矛盾を解決すべく三つの目標をたてている。一つは、床暖房における低温やけどの発生の閾値を明らかにすること。二つ目は、床暖房の設計規準に安全性の確認項目を追加すること。そして最後に、床暖房を施工したとき安全が確保された価値ある暖房と判断できるための装置、床暖房性能評価用模擬足を開発することである。本報告書では、具体的な基準案作成に取り組み、床暖房工業会において、施設型電気床暖房設備を対象に、竣工後の試験基準としての熱的安全性能を評価する案を策定し、該当する委員会に提出した。また、竣工検査用模擬足の開発についても、各種改良の結果、ほぼ試験機器としての開発をなし終え、上記基準の履行に用いる重要な機器の役割を今後演じることになろう。加えて、本研究の審査領域が家政学であることを考えれば、実生活としての床暖房をみたとき、本来の運転方法と、それにょって得られる快適空間の実現性を、いかに生活者に知ってもらうかも、床暖房を実践していくうえでは重要な課題のひとつである。国内での床暖房の運転実態は明らかに間欠運転そのものであり、韓国の連続運転と大きく異なる。こうした実態は、低温やけどそのものの危惧を取り除く上での大きな障害ともなりうる。運転方式による接触温度の実態についても、さまざまな設定をおこなったうえで、実験的にどの程度の値となるかを明示し、先に示した安全のための基準との整合性を考察した。医学方面で低温治療の際の皮膚温度刺激の注意事項としてよく引合に出されるGerweckの生物細胞の温度依存性試験結果から、本研究の低温やけどに閾値に関する有益な情報を入手することができ、これによれば、40°Cを越え出すと細胞の死亡率が上昇し始め、42°Cを越えると細胞不活性化作用が顕著となり危険であることが判った。また、温浴療法などの文献調査より、体温が40°Cを越える時点で動脈瘤が生じやすくなり、高齢者にとっては危険側の温度となることも判った。このとき、たとえ浴槽温度が38°Cであっても、20分間以上も浴槽に浸かっていると体温調節機能が維持できなくなり、先の危険域である40°Cを越え出すこともわかった。床暖房は、浴槽と異なって人体接触面は小さく、この意味で熱容量も浴槽ほど効かないが、睡眠など長時間の高温接触は、やはり浴槽と同じ影響を及ぼすと考えられるので、生活行動の規範を作成する上での資料とすることとした。また、接触温度を推定する模擬足は、本研究の発足理由ともなっていた水循環の漏水問題に解決の糸口を見出した。循環部と蓄熱部、および模擬足支持部の構造体への取り付けにOリングを採用し、圧着面加工を施すことで、解決しつつある。一方、現実との整合性試験については、冬季に実験計画をたて、2月から年度末まで実施中である。実際の利用家庭での床暖房の使用実態、生活様式や家族構成などを模擬した環境で、シミュレーションや模擬足の温度推定の精度判定に反映させる予定である。

床暖房と極めて似た構造をもち、十数世紀に渡って生活に密着して利用されて来た韓国における温突(オンドル)の表面温度ややけど発生事例などのを海外調査したところ、韓国では建物躯体への蓄熱を利用した正しい設計方法が行き渡っている関係で、室内空気温度の上昇不足による表面温度の高温化はみられず、やけど発生の懸念が日本よりもかなり薄いことが確認された。つぎに、模擬足での懸念事項であった水漏れ対策は、Oリング追加による構造仕様変更で対応可能なことがわかった。また、恒温を保持する型ではなく、ペルチェ素子型発熱体を有する新型模擬足の試作が行われたが、放熱部分が十分確保されないため、人体深部を模した箇所の恒温化が不十分となり課題を残している。申告尺度の非線形依存問題は、実験から得られたカテゴリデータをもとに、個人間と個人内変動の関係を検討中である。現実との整合性を図るため、模擬足と床暖房を一組にした全体での熱負荷シミュレーションを実施中である。床構造体までも含む大規模熱循環システムとして解こうとしているため、メモリや時間など計算上の難点を克服しきれていない。また、実施の際の要素分割についても、最適分割の提案やある程度のマクロ化を目指したいが、現在シミュレーションの実行中であるため、明確な解答は次年度に持ち越しとなった。規準案の骨子については、既に床暖房工業会などで試作的に、本研究の一部が導入されつつあり、成果としての規準は、確実に浸透する方向で動いているようである。低温やけど防止のための安全規準を考える上で、床暖房システムの熱源方式の違いが重要になってきた。というのも、温水式では循環する温水の温度そのものを規定する方向を目指すため、接触面からの人体への熱流入量が制限され、結果として接触面温度に制限がかかることになる。一方、電気式では電気容量が明示されるものの、人体への流入熱量は人体内部温度と接触温度との差異のみで決まってしまうため、接触温度を規制するには表面温度をセンシングし、これを規制する以外に手がない。以上の現象は、本年度のシミュレーションで明らかにしたが、規準の設定を考えたとき、方式の違いによって異なる規準を導入するのは、整合性の面で劣るので、電気式の場合に限っては、表面温度を低減する意味で、熱拡散を十分行うための均熱板をどの位置にどの素材をどのくらいの厚さで配するかという最適配置問題を慎重に扱う必要が生じた。本年度は位置についてのみを考慮したシミュレーションを行ったが、実際は厚さと挿入位置が製作過程には重要なので、次年度はそうした復号要因について解明する予定である。模擬足については、可搬性を重視し恒温槽を排したペルチェ素子型冷却システムを実装した、新模擬足の試作を行ったが、人体を模した温度制御系が不完全で、十分な実装に至っていない。主に、強制冷却の際の制御システムの変動防止に問題があることがわかった。床暖房工業会などが加盟する業界基準、あるいは公の基準のひとつであるBL基準の次期改訂時の採用意見聴取など、本研究成果は、業界関係にも確実に周知され出している。北欧のスウェーデンで床暖房本来の低温放射を活かした24時間床蓄熱方式も運転実績が出始めているので、実際の長期運転期間での床接触温度や床表面温度が本研究の安全規準に抵触するか否かの確認・調査を行いたい。最終年度であることから、主に具体的な基準案作成に取り組み、研究発表に示したように、床暖房工業会において、施設型電気床暖房設備を対象に、竣工後の試験基準としての熱的安全性能を評価する案を策定し、該当する委員会に提出した。今後この基準は、いろいろな評定を経た上で、正式な基準として発足することになろう。
褐藻類の原形質連絡調節機構の解明

多細胞体制をとる褐藻類には隣接細胞間の物質のやりとりを可能にする細胞間連絡構造である原形質連絡が存在している。褐藻類の原形質連絡は直径10-20 nmの管状の構造で、発生段階により出現・分布の異なっていること、細胞質分裂時に形成される一次原形質連絡と成熟した隔壁に新たに形成される二次原形質連絡が存在していることが電子顕微鏡の観察から明らかになった。蛍光標識デキストランを使用した観察から、多列形成的な体制をとる褐藻類では20 - 40 kDa、原形質連絡が隔壁の一箇所に集中して存在するピットフィールドを形成している場合は3 - 10 kDaのところに排除分子量が存在していることが示されている。褐藻類と一部の緑色植物には、原形質連絡(隣接する細胞の細胞膜が隔壁に対して垂直に貫通・連結する管状構造)が存在している。褐藻類では、原形質連絡の構造と機能に関する知見がほとんどないことから、排除分子量、発生段階による出現・分布の違いなどを明らかにするために以下の解析を行った。Halopteris(クラガシラ目・多列形成的)の細胞に蛍光標識デキストラン(3kDa, 10kDa, 40kDa)、組換えGFP (27kDa)を細胞内に注入し、原形質連絡を通過する分子サイズを調べた。その結果、排除分子量の限界は27-40kDaの間にあることがわかった。また、3kDaと10kDaで隣接細胞への移動時間、距離を比較したところ、分子サイズが小さいほど、早く移動し、サイズが大きくなると移動量にも制限があることがわかった。そして、物質の移動には、極性が存在していることも示唆された。原形質連絡の細胞骨格による調節機構を調べる目的で、1アクチン阻害剤(latrunculin B, rhodamine phalloidin)、2微小管阻害剤(nocodazole, taxol)と10kDa蛍光標識デキストランを同時に細胞内にインジェクションしたところ、アクチン重合阻害剤であるlatrunculin Bにより隣接細胞への移動が阻害される傾向が見られた。ヒバマタ接合子の発生における原形質連絡の出現・分布の変化について、電子顕微鏡で観察を行ったところ、葉状部が分裂を繰り返し、表層細胞と髄層細胞へ分化を始める頃に、原形質連絡はpit field (集中して存在する領域)を形成し、単列形成的な仮根部では、分散して存在していることがわかった。そして、仮根部では排除分子量は10kDa以上であるのに対して、葉状部では3 kDa以下であることが蛍光標識デキストランの移動観察により示された。褐藻類の原形質連絡は直径10 - 20 nm程度の管状の構造で、隣接細胞の原形質を細胞膜を介して連結している。内部には陸上植物の原形質連絡にみられるデスモ小管(小胞体から派生)は存在せず、シンプルな構造をとっている。平成27年度は、大きな頂端成長細胞を有し、多列形成的な体制を示すHalopteris congesta(クロガシラ目)と複雑な多細胞体制を有するFucus distichus(ヒバマタ目)の一次原形質連絡(細胞質分裂中に形成される)と二次原形質連絡(細胞質分裂後に形成される)の形成過程について電子顕微鏡により詳細な観察を行った。H. congestaの原形質連絡は、隔壁中に散在して存在している。細胞分裂が盛んに行われている頂端部分から、多列部分の隔壁中の原形質連絡について形態観察を行ったところ、頂端細胞の分裂直後の隔壁に見られる原形質連絡の直径は平均で22 nmであったが、細胞壁成分が蓄積されていくと直径が5 nm程度減少していくことがわかった。一方、褐藻類の中でも複雑な多細胞体制(表層、皮層、髄層に分化している)を持つF. distichusの原形質連絡は一箇所に集中し壁孔域(pit field)を形成する。壁孔域の周辺では、既存の原形質連絡から分枝し、新たな原形質連絡が形成される様子が見られている。この結果を受け、現在は電子線トモグラフィー法を用いて、三次元構造を再構築し、二次原形質連絡の形成過程について解析を行っている。平成27年度の研究計画では、原形質連絡プロテオミクスの結果から、構造や機能に関連するタンパク質について抗体を作製する予定であったが、現時点でその段階に来ていない。一方、褐藻類では明らかにされていなかった二次原形質連絡の存在を確かめ、電子線トモグラフィー解析を進めていることから、当初の研究計画の一つは順調にすすんでいる。以上の理由から、やや遅れている状況とした。

昨年度までの蛍光標識デキストランを使用した移動観察から、多列形成的な体制をとるHalopteris congesta (クロガシラ目)では20 - 40 kDa、原形質連絡が隔壁の一箇所に集中して存在するpit fieldを形成しているFucus distichus (ヒバマタ目)では3 - 10 kDaのところに排除分子量が存在していることが示されている。今年度は、排除分子量の調整に関与すると考えられる原形質連絡周辺の多糖類の性質について調べるために、原形質連絡が分散、もしくはpit fieldを形成している場合についてアルギン酸、フコイダン、カロースに対する抗体を用いて免役電子顕微鏡法で解析を行った。その結果、いずれの抗体も原形質連絡周辺に陽性を示さなかった。今後は他の硫酸化多糖類の局在についてレクチンなどを使用して調べて行く必要がある。また、原形質連絡内部のアクチンをはじめとする細胞骨格の有無、および細胞骨格による物質移動への調節機構について昨年度までの結果に対して、新たな細胞骨格阻害剤と異なるサイズの蛍光標識デキストランを用いて再検討を行った。これらの結果から、排除分子量や移動距離、時間においていずれも明確な阻害作用はみられなかったことから、原形質内部に細胞骨格が存在していない可能性も強く示唆された。多細胞体制をとる褐藻類には隣接細胞間の物質のやりとりを可能にする細胞間連絡構造である原形質連絡が存在している。褐藻類の原形質連絡は直径10-20 nmの管状の構造で、発生段階により出現・分布の異なっていること、細胞質分裂時に形成される一次原形質連絡と成熟した隔壁に新たに形成される二次原形質連絡が存在していることが電子顕微鏡の観察から明らかになった。蛍光標識デキストランを使用した観察から、多列形成的な体制をとる褐藻類では20 - 40 kDa、原形質連絡が隔壁の一箇所に集中して存在するピットフィールドを形成している場合は3 - 10 kDaのところに排除分子量が存在していることが示されている。実験計画では、1原形質連絡のプロテオーム解析、2排除分子量の限界、3細胞骨格阻害剤による原形質連絡への影響、4原形質連絡周辺の細胞壁多糖類の特定が主なものであった。計画2に関しては、単列、多列、複雑な多細胞体制をとる場合について、比較を行うことができ、計画3に関しても一定の成果をあげることができた。計画1と4に関しては、現在、条件検討を含め、取り組んでいるところである。当該年度の計画すべてが達成できたわけではないが、一部、次年度の計画を前倒しに行ったことから、概ね、順調に研究計画は進められていると考える。原形質連絡内を移動する分子サイズとカルシウムの関係について調べる。それにより前年度までに明らかにしてきた各種細胞骨格阻害剤を用いた際の結果と合わせて、原形質連絡の排除分子量に影響を及ぼす因子について明らかにする。褐藻類の原形質が持つ構造と生理的特性について陸上植物と比較を行うため、引き続き原形質連絡を構成するタンパク質、周辺の多糖類構成、微細構造観察についても取り組んでいく。藻類形態学原形質連絡プロテオミクスを行い、1緑色植物の原形質連絡に存在するタンパク質と相同性の高いタンパク質、2褐藻類の原形質連絡周辺に存在する多糖類の合成・分解に関わるタンパク質に着目し、ポリクローナル抗体を作製・局在解析を行う。成果をまとめた論文が受理されているが、掲載料の請求が次年度になるため。予定していたプロテオミクスの解析と抗体作製が次年度になるため。受理されている論文の掲載料(カラー印刷のチャージ代)に使用予定。質量分析をするためのタンパク質解析関連試薬、抗体作製関連試薬を購入する。
半導体結晶中における金属相析出粒子の粗大化段階の研究

この特定研究では、超高速光スイッチヘのMBE低温成長層の応用を目指して、低温成長でフラックスを極力制御して化学量論的組成に近いLT-GaAs層を成長して、その電気的特性および光学的特性を調べた。SiあるいはBe不純物を注入したLT-GaAs層の電気的特性の測定から以下のような結果と、その意味するところが得られた。(1)同一のフラックス条件下で、donor不純物であるSiあるいはacceptor不純物であるBeを注入すると、注入不純物の増加につれてtrapサイトとなる過剰As点欠陥の濃度が増加する。この結果は、成長層が化学量論的組成に近く、その結果伝導電子や正孔が存在しえるために、それらを過剰As点欠陥で捕獲し、Fermi準位をmidgapに近付けることにより系の自由エネルギーを低下させようとする基本的な傾向によって説明できる。(2)一定の不純物注入濃度のもとで、trapされたcarrier濃度、言い替えればcarrierをトラップする過剰As点欠陥の濃度は、As/Gaフラックス比の1からのズレに比例して増加している。この比例関係は、先に我々によって提案された過剰As導入機構のLangmuir吸着モデルから期待される結果である。上述の電気的特性についての実験結果を踏まえ、化学量論的組成に極めて近いLT-GaAs層およびそのAlAs/GaAsMQw構造を成長し、量子閉じ込め効果による励起子が観測されるかどうかphotoluminescence(PL)分光実験で調べた。その結果、通常の条件、すなわち高温で成長したものにくらべ強度は幾分弱いが、量子閉じ込め効果による励起子ピークが、液体ヘリウム温度、さらには室温で初めて観察された。
運動発生におけるキネシン頚部の役割

キネシンスーパーファミリーに属するncdは、キネシンとは逆に微小管の一端に向かって運動する。両者の頭部の構造は、結晶構造解析により解かれているが、あまり大きく違わないので、運動方向を決定する要因として、頚部が関与するものと考えられる。そこで、キネシン頭部にncdの頚部をつないだキメラタンパク質を作製し、その運動性を調べたところ、ATP非存在下では微小管を結合するが、ATP存在したで微小管から解離してしまい、一方向への運動を観察することはできなかった。ATPase活性を測定すると、KcatおよびK50%MTsの値は、それぞれ7.8S^<-1>および0.22μMであった。同じ長さの頚部を持つキネシンフラグメント(キネシン頭部+キネシン頚部)のそれらの値と比較すると、キネシンのような連続的な運動ができないと考えられる。以上より、ncd頚部は一端への方向性を決定することはできないが、キネシン頭部の持つ+端方向への運動性をキャンセルできることがわかり、頚部が運動方向決定に重要な役割を持つことが明らかになった。キネシンは微小管上を滑走するモータータンパク質で、モータードメインを有する頭部と、細胞内小胞などに結合する棒状の尾部なる。頭部と尾部をつなぐ領域(頚部)は柔軟性に富み、微小管と結合したまま360度以上回転することが観察されている。この頚部の柔軟性が、運動の力発生にどのような役割を果たしているかを明らかにするために、本研究では、頚部の長さの異なるキネシン頭部のフラグメントを作製し、それらの分子の回転自由度を測定した。キネシン分子をガラスに固定するために、以前に開発したビオチン・アビジン系を用いたが、この系の内部に回転自由度がないことをコントロール実験で確かめた。次に、nativeのキネシン分子(全長)の回転自由度を調べたところ、3回転以上した。棒状部分の長さがnativeの分子の1/8程度に短くなったアミノ酸数410フラグメントでも、2回転以上した。さらに、アミノ酸数を減らしたフラグメントについて測定したところ、386では2.4回転、368では2.1回転、351では1.2回転、340では1.7回転することが観察された。棒状部分の長さが短くなるにつれ、最大回転数は少なくなる傾向があるが、340アミノ酸のフラグメントはほとんど球状のモータードメインと考えられているおり、1回転以上できるのは、微小管との結合の方向性から考えると充分回転できる結果といえる。以前に340のフラグメントが410アミノ酸のフラグメントの約1/10の速さで運動するということを報告したが、以上の結果より、それはキネシン分子のの回転自由度が失われたためではないと考えられる。両者の頭部の構造は、結晶構造解析により解かれているが、あまり大きく違わないので、運動方向を決定する要因として、頸部が関与するものと考えられる。そこで、キネシン頭部にncdの頸部をつないだキメラタンパク質を作製し、その運動性を調べたところ、ATP非存在下では微小管を結合するが、ATP存在下では微小管から解離してしまい、一方向への運動を観察することはできなかった。ATPase活性を測定すると、K_<cat>およびK_<50%MTs>の値は、それぞれ7.8S^<-1>および0.22μMであった。同じ長さの頸部を持つキネシンフラグメント(キネシン頭部+キネシン頸部)のそれらの値と比較すると、キネシンのような連続的な運動ができないと考えられる。以上より、ncd頸部は一端への方向性を決定することはできないが、キネシン頭部の持つ+端方向への運動性をキャンセルできることがわかり、頸部が運動方向決定に重要な役割を持つことが明らかになった。
閉路探索問題に基づいた曲面上のグラフの本型埋め込みに関する研究

与えられたグラフの本型埋め込みに要するページの数を求めることは,理論的にも応用的にも重要な問題である.本研究では,グラフの種数とページ数の関係を記述することを目標として研究に取り組んだ.そして,曲面上のグラフにある種の性質を満たす閉路を探索し,それを用いてある曲面に埋め込み可能なグラフの効率的な本型埋め込みアルゴリズムを構築することに成功した.特に,任意の向き付け可能閉曲面上の局所平面グラフのページ数と,射影平面的グラフのページ数の上界を,その連結度に応じて与えることができた.グラフが与えられたとき,そのある種の複雑度を測る尺度として,グラフの種数とページ数がある.本研究の目的は,その2つの尺度が互いにどのように関係を持つかについて明らかにすることである.特にグラフの種数を固定し,そのページ数を評価したいと考える.これまでに,平面グラフのページ数は4以下であることが示されているが,4ページを必要とする平面グラフが存在するかどうかは知られておらず,今後の研究が待たれる.一方,トーラスグラフが7ページ埋め込み可能であることが知られている.これらに関連する問題に対して,私たちのこれまでの研究により,向きつけ可能曲面の局所平面グラフが7ページ埋め込み可能であること,トーラス上の2部グラフが5ページ埋め込み可能であること,さらに,射影平面グラフが9ページ埋め込み可能であることを証明した.1番目の成果については,一般に種数をあげるとグラフのページ数の上界も上がることが知られているのに対して,局所平面性を仮定すると,種数に依らない上界が存在することを指摘するものであり,たいへんに興味深い.また,2番目については,2部グラフ性の扱い方にアイデアがあり,今後も同様の手法により,他の問題も攻略できる可能性がある.3番目にについては,向きつけ不可能な曲面上のグラフのページ数を評価した最初の研究であり,今後の研究を一気に加速するものとなるだろう.今後は,これまでの研究成果に関連する様々な問題を解決してゆきたいと考えている.研究実績の欄にも記入したが,本補助金を申請するための計画書に記載した目標について,その半分程度はすでに解決した.今後は残り半分の難解な部分への取り組みとなる.そのための研究の方向性を以下の「今後の研究の推進方策等」で述べる.グラフの本型埋め込みに関する研究は,巨大集積回路設計(VLSI-design)など,工学への応用を動機としたものであり,1970年代から多くの研究者たちにより盛んに研究されてきた.グラフの本型埋め込みにおいて,各ページでは辺の交差が許されないため,グラフの本型埋め込み問題は自然に「グラフの平面への埋め込み可能性」に関係を持つ.本研究では,私たちが専門とする「グラフの平面や曲面への埋め込み可能性」に関する知見から,グラフの本型埋め込みに関する問題を解決しようというものである.グラフの本型埋め込みについて,「どんな平面グラフも4ページ以下の本型埋め込みを持つ」という予想が知られているが,そのページ数の最良性に関しては結論が出ていない.ここまでの研究成果は1970年代までさかのぼるが,その後,この問題の解決に関する発展は見られない.私たちも平面グラフのページ数の問題の解決を目指して研究しているが,なかなか進展はない.しかしながら,曲面上のグラフを研究してゆく過程において,曲面上のグラフにはいろいろな分解定理があることがわかり,それらをうまく応用することにより,以下のように,曲面上のグラフの本型埋め込みの問題に対して結論を与えている.「1.向き付け可能な曲面上のグラフは7ページ埋め込み可能である」,「2.トーラス上の2部グラフは5ページ埋め込み可能である」,「3.射影平面上のグラフは9ページ埋め込み可能である」本研究では,上の1,2,3の結果を拡張できないかについて研究を行っている.本研究を申請する段階で計画書に示した目標は半分程度は解決し,あとは難解な部分を残すのみである.その解決のための方向性を「今後の研究の推進方策」に示す.グラフの本型埋め込みやページ数に関する研究は,理論的にも実用的には重要なテーマであり,今日まで様々な研究がなされてきている.そして,理論的な興味から,グラフの種数とページ数の関係性を記述する研究は大変興味深いと思われる.本研究では,曲面上のグラフの中のある性質を満たす閉路の存在を巧妙に用いて,グラフのページ数の評価を行う試みを行った.最も基本的な問題「どんな平面的グラフも4ページ埋め込み可能であるか.また,4ページ必要な平面的グラフが存在するか」については,結論は出せなかったが,これにともなって提唱したいくつかの予想に対して,結果を得ることができた.まず,トーラス上のグラフが7ページ埋め込み可能であることが,Endo(1997)によって証明されている.その手法を模倣し,私たちは,任意の向き付け可能曲面上において,どんな局所平面的グラフ(どんな非可縮サイクルも十分な長さを持つ)も7ページ埋め込み可能であることを証明することに成功した.この結果は,どんなにグラフの種数が高くてもある種の性質を満たせば,そのページ数が定数で抑えられることを指摘しており,一般に,グラフのページ数は種数に応じて単調増加するという事実と対照的な現象を指摘しており,理論的に大変興味深いと言える.さらに,既存の研究成果から,射影平面上のグラフについて,そのページ数は9以下であることが既知であったのに対して,私たちは,射影平面上のグラフに良い性質を満たすハミルトン閉路が存在することを示すことにより,「9ページ」という上界を「7ページ」に改良することに成功した.

さらに,射影平面上のグラフの連結度を4と5に制限することにより,その上階をそれぞれ「5ページ」と「3ページ」とすることに成功した.与えられたグラフの本型埋め込みに要するページの数を求めることは,理論的にも応用的にも重要な問題である.本研究では,グラフの種数とページ数の関係を記述することを目標として研究に取り組んだ.そして,曲面上のグラフにある種の性質を満たす閉路を探索し,それを用いてある曲面に埋め込み可能なグラフの効率的な本型埋め込みアルゴリズムを構築することに成功した.特に,任意の向き付け可能閉曲面上の局所平面グラフのページ数と,射影平面的グラフのページ数の上界を,その連結度に応じて与えることができた.これまでの私たちの研究により,トーラス上の2部グラフのページ数,射影平面グラフのページ数,向きつけ可能曲面のグラフのページ数に関する結果を得た.今後はこれまでに得た知見をもとに,研究成果を拡張することになるが,特に,グラフの連結度とページ数の関係を考察したいと考えている.例えば,平面グラフのページ数については最良の上界の決定は未解決のままとなっているが,グラフの4ー連結性を仮定すれば,そのグラフはハミルトン閉路を持ち,その構造がグラフの辺集合の効率的な分割を可能とし,結果的に2ページ埋め込みを構成することができる.平面以外の曲面でも,トーラス上の2部グラフはハミルトン閉路に類似するある種のグラフ構造を持ち,それにより効率的な本型埋め込みを構成することが可能となる.今後の研究では,一般には非効率となるグラフの構造を取り上げ,それを解消するための条件をうまく設定する.そして,その条件下でグラフのページ数を下げる工夫を行いたいと考えている.特に,そのためにグラフの連結度を扱い,そのハミルトン閉路の存在やそれに近い構造を抽出し,グラフの辺集合の効率的な分解を考えたいと思っている.特に,射影平面上のグラフについて,一般には9ページ埋め込み可能であることはすでに証明をしたが,5ー連結のものについては3ページ埋め込み可能,4ー連結のものは5ページ埋め込み可能であると予想している.そして,現在はその結果を得るための情報収集を行っている.トーラス上のグラフについての一般のページ数の上界「7」についても,連結度を上げることにより,いくらか改良できるのではないかと予想している.平面的グラフのページ数の上界についての未解決問題は難しく,直ちにその解決には向かいにくい.今後の研究としては,これまでに得た「トーラス上の2部グラフの5ページ埋め込み」に関する結果と,「向き付け可能曲面の局所平面グラフの7ページ埋め込み」の結果を向き付け不可能曲面に拡張したいと考えている.しかしながら,本型埋め込みと「曲面の向き付け不可能性」はかなり相性が悪いため,それを克服するアイデアが必要となる.一方,種数1の向き付け不可能曲面(射影平面)については,射影平面三角形分割のうまい分解があり,その分解を用いることで,そのようなグラフの本型埋め込みを巧妙に構成することができる.これからの研究では,この2つをどのように組み合わせられるかを考察していくつもりである.一方,前述の「射影平面グラフの分解」は.グラフの連結度を仮定することで,さらに巧妙な分解が得られそうなことがわかってきた.今後の研究としては,グラフに4ー連結性を仮定してページ数がどれくらい下がるか,さらに,5ー連結性を仮定してどのようになるかについて,具体的に考察を行う予定である.
肺癌化学療法におけるメチオニン欠乏による効果増強の可能性についての基礎研究

【研究目的】癌細胞の中にはメチオニン存在下でないと増殖しないものがあり・メチオニン依存性という現象として知られている。メチオニンは必須アミノ酸であり、食物からの供給が必要である。しかしながら、細胞内にはメチオニン・サルベージ経路が存在し、非小細胞肺癌の約40%で欠損している酵素methylthioadenosinephosphorylase (MTAP)が重要な役割を果たしてい。MTAP欠損肺癌は『メチオニン依存性』であると予想されるので、本萌芽研究では、メチオニン欠乏状態が抗癌剤の抗腫瘍効果を増強させるかどうかの検討を行った。【研究方法】(1)細胞培養:肺癌細胞株は、10%FCSを含むRPMI-1640を用いてCO2インキュベーターで培養した。(2)ヒトMTAP cDNAを組込んだMTAP発現ベクターを作製した。(3)MTAP遺伝子強制発現細胞株の作製:肺癌細胞株A549にMTAP発現ベクターを移入し、MTAP発現A549細胞株を樹立した。ベクターのみを移入した細胞株をコントロールとして用いた。(4)肺癌細胞株の増殖に対する発現MTAPの効果:MTAP発現A549細胞(A549/MTAP+)およびコントロールA549細胞(A547/MTAP-)をPBSで洗浄後、種々の濃度の抗癌剤を含む培養液に浮遊させ、2.5x10^3細胞を96穴マイクロプレートの分注し、2日間培養後、MTT-assayにより増殖細胞数を測定した。【研究結果】選択的化学療法剤として開発が進められているL-alanosineを種々の濃度で含む培養液でA549細胞を培養したところ、A549/MTAP-細胞では、L-alanosine濃度に依存して増殖抑制が認められ、そのIC50は約5μMであった。一方A549/MTAP+細胞は、L-alanosineに対して耐性を獲得し抗腫瘍効果は著しく減弱したことから、MTAP欠損癌細胞に対するL-alanosineの抗腫瘍効果への『メチオニン欠乏』による増強効果が期待された。しかし、同様の条件下で、メチオニンを含まない培養液でA549/MTAP-細胞を培養し、その効果を検討したところ、メチオニンの有無による細胞増殖に差を認めず、A549細胞はMTAP欠損細胞であるが、『メチオニン欠乏』非感受性細胞であると考えられた。したがって、肺癌化学療法における『メチオニン欠乏』による増強効果は、MTAP欠損腫瘍であるとともに、『メチオニン欠乏』感受性腫瘍に期待できることが示唆された。
軟性裏装材-アクリルレジン界面の有限要素法と接着試験法による解析

(目的)総義歯に軟性裏装材を応用した場合、軟性裏装材の厚みやレジンとの移行形態、義歯辺縁での形態などの適切な形状を、有限要素法と接着試験を用いて考察することである。(本年度のまとめ)有限要素解析を行うために、ハードにNEC社製パソコン:PC-9801BX/U2、有限要素解析プログラムとしてMSC社製構造解析プログラム:MSC/PAL2(V4.0)とモデル作成用プリプロセッサー:MSC/MOD(V2.0)、計算後の処理プログラムなどを購入した。そして、これらの設備を用いて、軟性裏装材を用いた総義歯を想定した有限要素モデルを作成し、解析を行った。従来の有限要素モデルでは、要素と要素の連結を通法のとおり行うと、顎堤粘膜と義歯床下面が少しも離れずまったく同じように変位することになる。実際には、顎堤粘膜と義歯床下面とは垂直方向には同様に変位するが水平方向には異なる変位が許される挙動を行うと考えられるので、今回の解析ではこのような挙動を考慮して、顎堤粘膜と義歯床下面との連結は1軸性の剛性要素を用い、顎堤粘膜と義歯床下面は接触している状態としモデル化を行い、解析を行った。解析の結果、軟性裏装材を用いることにより、ミ-ゼスの相当応力は軟性裏装材-アクリルレジン界面より上部が大きく、顎堤粘膜部での相当応力の低下、顎堤粘膜部での増加がみられた。また、主応力は軟性裏装材-アクリルレジン界面で荷重下を中心とした緩やかなサインカーブ状の値が得られた。これらのことから、軟性装裏材は顎堤粘膜に接する義歯床下だけでなく、義歯床辺縁を越えて義歯床頬側面まで延長することが望ましいと考えられた。
ハイブリット含浸反応法による作製した複合材料の特性評価及び応用への展開

研究成果としては、比表面積を5800m2/m3の金属多孔体を用いて複合材料を製造し、金属多孔体の比表面積が金属間化合物の微細化に影響を与えることを明らかにした。金属多孔体である部分にアルミを含浸させた後、ハイブリッド含浸反応法によりアルミの内部には元の金属多孔体の構造は残らず、約50100ミクロン程度の金属間化合物が分散している。複合材料の比重(2.768g/cm3)、熱伝導率(112.53W/mK)の結果を得られた。比重はアルミと同比重であり、熱伝導率はアルミよりわずかであるが高い熱伝導率を有する複合材料の開発に成功した。更に、超微細なナノサイズの金属間化合物を生成させるために、表面上ミクロンサイズの凹凸がある多孔体を用い、複合材料を組織観察した結果、1ミクロン以下の超微細なナノサイズの金属間化合物の生成に成功し、面積率30%を有する部分複合材料の製造に成功した。材料内部に存在する欠陥(未含浸部による欠陥、凝固欠陥等)は強度低下、摩耗量の増加などの悪影響を及ぼすため、未含浸部による欠陥は多段階加圧力(0.1MPa+0.2MPa)を変化させ、欠陥率を0.2%以下まで抑えることに成功した。なお、SiC論文の投稿及び国際会議に参加し、新技術の発表及び情報共有を行った。金属間化合物粒子分散複合材料を新たな製造する申請者の特許(特許第5988667号,金属間化合物強化複合材料及びその製造方法)を用い、金属の溶湯温度、保持時間等の制御による金属間化合物のサイズ制御、材料内部の欠陥制御を目指とする製造プロセスが構築されていたので、複合材料の製造が進み早く、部分複合材料の製造及び評価までできる状況である。部分複合化の組織観察及び熱特性の評価を行う予定です。複合材料を構造材料として幅広い分野に広げるためにも、低コストも考慮しないといけない。この研究で部分複合化を目指す。作製された部分複合材料の分散性などの組織観察を行う。また、構造材料でありながら、高温環境下での構造材料は熱伝導率及び熱膨張係数のデータも考える必要があるため、今後熱特性のデータを取得する予定である。5652円は予定していた消耗品の発注が変更になり、残ってしまいました。次年度に消耗品として使用する予定です。なお、分担金(10万円)はH30年度分と合わせて次年度の国際会議の参加費用として使うために残しています。令和1年の国際会議の参加のために使う予定です。
ドイツ啓蒙主義とロマン主義の関係

本研究は、従来啓蒙主義へのアンチテーゼとみなされていたドイツ・ロマン主義を啓蒙主義的諸学問との関係で捉え直し、ドイツ・ロマン主義が啓蒙主義的学問を踏まえ、それを乗り越えて行く運動であることを明らかにする試みである。当該研究では主に、ノヴァーリス『ハインリヒ・フォン・オフターディンゲン』、フリードリヒ・シュレーゲル『ルツィンデ』、クレメンス・ブレンターノ『ゴドヴィ』、およびハインリヒ・フォン・クライストの短編を分析し、ロマン主義的「新しい神話」運動の変遷の過程を啓蒙主義的感覚論、歴史哲学、自然科学の文脈から捉え直した。平成24年度は、任期切れに伴い非常勤講師という厳しい立場のもと、精力的に研究活動を行った。4月にはノヴァーリス『信仰と愛』に見られるロマン派の危機意識について学会発表を行い、10月にはロマン主義と「多文化共生」思想に関しての講演を行った。また、12月にはフリードリヒ・シュレーゲル『ルツィンデ』において展開される感覚論について学会発表を行った。また、宇都宮大学紀要『外国文学』に、一昨年度から続く翻訳、ペネロピ・フィッツジェラルド『青い花』その3を掲載した。さらに、10月の講演原稿に加筆・訂正する形で、宇都宮大学国際学部附属多文化公共圏センター年報に1本の論文を執筆し、12月の学会発表原稿を基に慶應義塾大学独文学研究室『研究年報』に1本の論文を執筆した。多文化公共圏センター年報には、ロマン主義文学に見られる多文化共生的思想に関して、ノヴァーリス、クライスト、アルニムの作品を例に取り、啓蒙主義の著作と比較することで、ロマン主義者たちが啓蒙主義における楽天的な多文化共生的思想を批判しつつ、独自の批判的思想を展開していったことを明らかにした。また、『研究年報』においては、フリードリヒ・シュレーゲルが小説『ルツィンデ』において、啓蒙主義の感覚論の影響を受けつつも、そこにロマン主義特有の官能性を付与することで独自の思想を作り上げていることを示した。ノヴァーリス、クライスト、アルニム、フリードリヒ・シュレーゲルに関し、啓蒙主義との関わりを明らかに出来たことで、ロマン主義思想の全体像を把握するという研究プロジェクトは大きく前進した。今年度は主にドイツ・ロマン主義の詩人クレメンス・ブレンターノ(1778-1842)が「マリア」という偽名で発表した小説『ゴドヴィ』(1801)の研究に従事した。予算は主に、国内での一次文献、二次文献の購入費用、及び研究成果発表のための国内旅費に充てられた。研究の目的は、クレメンス・ブレンターノ最初の長編小説『ゴドヴィ』を初期ロマン主義から後期ロマン主義への移行期の作品と位置づけ、当該作品の分析により初期と後期のロマン主義の相違点を明らかにする包括的ロマン主義研究の礎を築くことである。本研究の成果の一つは、平成25年11月、東北大学において開催された「東北ドイツ文学会」研究発表会において行われた発表「クレメンス・ブレンターノ『ゴドヴィ』における“Sinn“と“Wahnsinn“について」である。初期ロマン主義者たちが提唱した超感覚的世界を感覚的に体験可能なかたちで描出する試みとしての「感性的宗教」が、ブレンターノにおいては「官能の狂気」として継承されている点、及び初期ロマン派の「絶対的なるもの」への無限の憧れがブレンターノにおいては「無」への回帰への憧れに変わっている点において、『ゴドヴィ』が初期ロマン主義から後期ロマン主義への文学史的転換を告げる作品であるということが本発表で明確に示された。本発表の原稿を加筆、修正したものが近々「東北ドイツ文学」に論文として掲載される予定である。23年度から続く本研究において、ノヴァーリス、フリードリヒ・シュレーゲルに続きブレンターノに関して一定の成果を挙げることができ、ロマン主義の全体像の把握に大きく前進した。当該年度は、複数論文を執筆したが、編集の都合により、22年度の実績になってしまったもの、また、24年度以降に回されてしまったものもあり、23年度発表論文は1本となってしまった。これは大きな反省点であるが、本数以上の大きな成果を挙げたことができたと確信している。22年度の実績となってしまった論文:「触覚という活動的感覚ーポエジー」ー「触覚」に関するノヴァーリスのヘルダー受容(ヘルダー研究16号、pp. 25-44)では、ノヴァーリスとヘルダーの感覚論の相違を明らかにし、感覚による世界把握がロマン主義文芸における最重要テーマの一つであると結論づけた。また、当該年度発表論文:ノヴァーリス『信仰と愛』における「詩的国家」(宇都宮大学外国文学研究61号、pp. 39-56)においては、ノヴァーリスが執筆活動を行っていた1800年前後の時代に対する危機意識を浮き彫りにし、危機的状況においてこそロマン主義者たちが見いだそうとした希望の原理を、当時の国家情勢を交えて明確にした。

この論文をもとに、平成24年4月1日、ゲーテ自然科学の集い(於慶應義塾大学)にて、学会発表を行い、今後の研究に対し有意義な意見、指摘を得た。また、平成23年8月にはドイツ・マールバハ文学資料館及びオーバーヴィーダーシュテット初期ロマン派研究所にて資料収集を行い、最新の研究書や新しく発見された一次文献等を入手することができた。これを基に、ノヴァーリスの自然科学研究に関してドイツ語論文を執筆した。これは24年度以降ドイツの学会誌に掲載を見込んでいる。また、ペネロピ・フィッツジェラルドによるノヴァーリスの伝記小説『青い花』の翻訳を宇都宮大学外国文学研究61号、pp. 83-97に掲載し、最新の資料に基づく注釈を付与し、学術的意義のある翻訳を行うことができた。本年度の研究成果の最初のものは、昨年度東北ドイツ文学会にて学会発表を行ったブレンターノに関して、発表原稿に加筆、修正を加え、論文「「狂気の中で感覚の妄想は癒されねばならない」ークレメンス・ブレンターノ『ゴドヴィ』における"Sinn"と"Wahnsinn"についてー」を執筆したことである。この論文は、近日刊行予定の「東北ドイツ文学56号」に掲載決定となった。初期ロマン派の「新しい神話」計画と、後期ロマン派におけるその挫折の過程を明らかにする上で、初期から後期への文学史的転換点となる『ゴドヴィ』の分析ができたことは大きな収穫であった。さらに5月には日本アイヒェンドルフ協会研究発表会において、「ノヴァーリスの「感性的宗教」ー「新しい神話」としての『ハインリヒ・フォン・オフターディンゲン』」と題した研究発表を行った。また、発表原稿に加筆・修正を加えた同題の論文が、日本アイヒェンドルフ協会「あうろら」33号に掲載決定となっている。これはいわば当該課題の集大成ともいえる研究であり、これによってノヴァーリスからブレンターノを経て、クライストに至る「新しい神話」の変遷を、啓蒙主義的感覚論及び啓蒙主義的歴史観の文脈から明らかにすることができたと確信している。4年間にわたり、研究計画に挙げたノヴァーリス『ハインリヒ・フォン・オフターディンゲン』、フリードリヒ・シュレーゲル『ルツィンデ』、ブレンターノ『ゴドヴィ』及びクライスト『マリオネット劇場』の研究を遂行し、ロマン主義運動が啓蒙主義へのアンチテーゼではなく、啓蒙主義諸学問を取り込んで発展してゆく運動であることが確証された。近代ドイツ文学研究の目的は、ノヴァーリス、フリードリヒ・シュレーゲル、ブレンターノ、クライストの4人のロマン主義者の文学作品を例に取り、啓蒙主義との関係を明らかにすることでロマン主義の全体像を把握することであった。4年計画の2年目にあたる平成24年度は、このうち、ノヴァーリスとフリードリヒ・シュレーゲルに関して考察を行っただけでなく、当初計画になかったクライスト『聖ドミンゴ島の婚約』、アルニム『エジプトのイザベラ』に関してもそれぞれ論文の一部としてまとめることができ、研究は大いに前進した。宇都宮大学多文化公共圏センターにおいて「多文化共生」をキーワードに講演をさせて頂いたことで、自身の研究の幅が大いに広がることになった。前期及び後期のロマン主義に関して、「多文化共生」というキーワードで啓蒙主義との関係を明らかに出来たことで、25年度以降の研究にも大きな指針が出来た。従って、自己評価は「当初の計画以上に進展している」とさせて頂く。
三倍体ドジョウの配偶子形成過程における特殊な染色体挙動と妊性に関する研究

日本に生息するドジョウにはA,Bの二系統が存在し、一部地域では二系統の交雑起源であるクローン系統が発見され、2n卵を作り雌性発生を行う。またクローン系統の二倍体が偶発的に精子を取り込むとクローン由来三倍体が生じる。この三倍体オスは様々な倍数性の受精能力を持たない精子を作り不妊になるが、メスは卵形成過程で異質なゲノムを1セット排除することで1nの卵を形成する。つまりメスには不妊を回避する機構が備わっており、また減数分裂のプロセスはゲノム構成・倍数性・雌雄によって異なることを示唆している。本研究では特にクローン由来三倍体メスが行う減数分裂プロセスの解明を目指している。そのためには二系統の染色体を識別するツールの開発が必要であり、これまでにB系統の染色体を識別するプローブ(ManDra-B)が開発された。それに対してA系統を識別するプローブ(ManDra-A)も開発されたが、シグナルが弱く安定した検出が困難であるといった問題があった。そこで安定してA系統の染色体を識別できるプローブを開発するため、既知のManDra-A配列(136bp)を参考にManDra-A領域を増幅するプライマーを設計し、ManDra-A領域が5回繰返し存在すると推測された増幅産物からプローブ(ManDra-A 5 repeats)を作製しFISHを行った。その結果、A系統では2本の中部動原体着糸型(M型)と24本の端部動原体着糸型(T型)染色体のセントロメア領域にManDra-A 5 repeatsシグナルが非常に安定して検出された。それに対してB系統ではシグナルが検出されなかったため、ManDra-A 5 repeatsプローブはA系統の染色体を識別する強力なツールになると判明した。特殊な配偶子形成を染色体の挙動から解明するには、各系統の染色体を識別するプローブが必要である。本年度の成果としてA系統の染色体を安定して検出するプローブの開発に成功した。これによって二系統の染色体挙動を追跡することが可能になった。また、サンプル魚も順調に成長しており、組織学的観察の材料として利用可能になっている。また本研究の対象となる三倍体のオスはゲノム構成や倍数性によって形成する精子の倍数性やゲノム構成も変化することが報告されている。これまで精子のゲノム構成・倍数性は受精卵から生じた子孫のDNA解析とフローサイトメトリーの結果を組み合わせることで判定してきた。しかし、フローサイトメトリーでは個々の精子の倍数性を判別することはできず、受精能力を持たない異常精子のゲノム構成は子孫から推定できない。そのため個体のゲノム構成・倍数性が精子形成に与える影響を理解することが困難であった。そこで個々の精子のゲノム構成と倍数性を判別するためにA系統を識別するManDra-Aプローブ、B系統を識別するManDra-Bプローブ、そして倍数性を判定する5.8S+28S rDNAプローブを用いてSperm-FISHによるゲノム構成と倍数性判別法の確立を目指してきた。これまでに系統判別プローブと倍数性判別プローブを組み合わせることで精子のゲノム構成と倍数性の判定が可能であることがわかってきた。今後さらに詳細に分析を行う。クローン由来三倍体メスの卵巣を裁断後、最終成熟に関わるホルモンを用いて培養を行い、(動物極側へ移動開始崩壊)までの卵核胞を摘出し固定する。卵核胞に対してA、B系統識別プローブを用いて2-Color FISHを行い、1n卵ゲノムと排除ゲノムを調査する。またパーコールを用いて卵巣から各成長段階の卵母細胞を単離し、各卵母細胞でA、B系統識別プローブを用いて2-Color FISHを行い、異質ゲノムの排除機構を解明する。同質三倍体オスの精巣から染色体標本を作製し5.8S+28S rDNAプローブを用いてFISHを行い、精母細胞の減数分裂時における対合像を観察することで不妊原因を調査する。異質三倍体オスではパーコールを用いた不連続密度勾配遠心により、精巣細胞からA型精原細胞、B型精原細胞、精細胞、6n精子様細胞を単離し、各細胞で5.8S+28S rDNAプローブを用いてFISHを行い、6n細胞化のタイミングを解明し、さらにA型精原細胞を培養し経時的に観察することで6n細胞の形成メカニズムを解明する。ドジョウMisgurnus anguillicaudatusには遺伝的に分岐したA、Bの二系統が存在する。また、一部地域には遺伝的に同一で雌性発生を行うクローン二倍体が生息し、このクローンはA系統とB系統の交雑起源であることが推測されている。また稀に精子核を取り込む場合がありクローン由来の三倍体が作られる。本年度は1様々なゲノム組成を持つ供試魚の作出、2A系統の染色体識別プローブの開発を行った。それぞれの研究実施状況を以下に記す。1第二極体放出阻止による同質・異質三倍体とクローン由来三倍体の作出を行った。2A系統個体からゲノムDNAを抽出後、29種類の制限酵素を用いてDNA断片化、そして電気泳動によりサテライトDNAの有無を確認した。その結果、制限酵素DraIを用いて切断することによりサテライトDNA(136bp)が得られ、このサテライトDNAが挿入されたプラスミドを新規プローブとしてFISHを行った結果、B系統の染色体ではシグナルが検出されなかったのに対して、A系統では多数の端部動原体着糸型(T型)