hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
カルシウム拮抗を指標とするクマリン類の分子設計と合成

1.サリチルアルデヒド誘導体とヴィッティッヒ試薬によるクマリン環の簡易合成法の開発.既に我々が開発したアリ-ルプロバルギルエ-テルのCsF存在下でのクライゼン転位にて選択的に合成されるベンゾフラン体をオゾン酸ついで加水分解すれず容易にサリチルアルデヒドが合成出来る事を見出した.更にヴィッティッヒ試薬を反応させれば非常に簡便に無置換クマリンを合成出来る事も見出した.2.キク科植物から得られているクマリンの構造の訂正.デプケらはベトナム産のモク科植物よりクマリンを単離し,その構造は5.8ージメトキシクマリン(I)であると報告した。そこで上記の方法を用いてScheme 2に示すル-トで(I)を合成したが一致しなかった.スペクトルデ-タから天然から得られたクマリンは7.8ージメトキシクマリン(II)であろうと推定し,Scheme 3のル-トにより(II)を合成し,天然品と一致する事を明らかにした.
ミヤコグサ根粒菌におけるアミノ酸代謝と宿主との物質交換の分子遺伝学的・生化学的解析

1)実験系の評価:材料とする菌株自体の特性を明確にするため、ミヤコグサまたは近縁のマメ科植物(西洋ミヤコグサやネビキミヤコグサ)の根粒から単離された国内外15株の根粒菌の16S rRNAならびにnodJ-nodS領域の部分塩基配列を新たに決定した。15菌株の宿主特異性を調べた結果は、16S rRNAを用いた結果より、nodJ-nodS領域を用いた結果より強くリンクしていた。これは宿主特異性に共生アイランドが主要な役割を果たしていることを示唆した。2)変異株作製:MAFF303099株のアミノ酸輸送系遺伝子や菌体表層構造の変異性を蓄積するために、大腸菌アルカリ性フォスファターゼphoA遺伝子の成熟タンパク質コード領域を含むmini-TnphoAを用いたトランスポゾン挿入実験を行った。約4000の挿入株から、357株のフォスファターゼ発現株を得た。これらは膜貫通タンパク質のペリプラズム露出部位またはペリプラズムタンパク質にin-frame融合しているものと期待できる。しかし、挿入株総数と期待される膜タンパク質遺伝子の数を勘案すると、フォスファターゼ発現株の数は多すぎると考えられた。これらの栄養要求性や菌体表層構造ならびに根粒形成能・共生能の評価を行うとともに、TnphoAによって破壊されていないと想定されるアルギニン合成系遺伝子などの有無をPCRで調べた。その結果は、集積した変異株候補のうち少なくとも65%、最大で85%程度が、非根粒菌の混入に由来するものと判断された。但し、残る15から30%程度の変異株の中には、共生不全のものが含まれ、新規の遺伝子の発見に繋がることが期待される。しかしながら、フェローの在日中には、inverse PCRやクローニングによる挿入断片の回収が十分に達成できず、遺伝子の同定は今後の課題である。ゲノム塩基配列が決定済みのミヤコグサ根粒菌Mesorhizobium loti MAFF303099株ならびに類縁のミヤコグサ根粒菌株を材料にして,アミノ酸代謝と輸送に関わる遺伝子の破壊株を蓄積し,形質の評価を行いつつある。類縁株としては、MAFF303099株が共生不能なミヤコグサ近縁宿主Lotus pedunculatusとも共生可能なNZP2037株等を用いた。1)実験系の評価:材料とする菌株自体の特性を明確にするため、NZP2037株を含む国内外15株の16S rRNAならびにnodJ-nodS領域の塩基配列を決定し、系統学的な位置づけを行った。16SrRNA解析の結果は、MAFF303099を含む14株は、Mesorhizobium lotiの標準株よりはレンゲソウ根粒菌Mesorhizobium huakuiiに近縁で、さらに4程度のサブグループに分岐すること、一方、nodJ-nodS領域の分岐が宿主特異性により強くリンクしていることを示した。2)変異株作製:MAFF303099株のアミノ酸輸送系遺伝子や菌体表層構造の変異株を蓄積するために、大腸菌アルカリ性フォスファターゼphoA遺伝子の成熟タンパク質コード領域を含む、ミニトランスポゾンを用いたトランスポゾン挿入実験を行った。約1万の挿入株から、157株のフォスファターゼ発現株を得た。現在、これらの栄養要求性や菌体表層構造ならびに根粒形成能・共生能の評価を行っている。3)ミニトランスポゾン改良:ミニトランスポゾンにより作出する変異株をより有用なものとするために、Tn5のIS配列を両端に持ち、その内部にρ因子非依存生の転写終結配列と3フレームのどの読み枠でも翻訳を終結させる配列、さらに内側に配列特異的リコンビナーゼflpの認識配列に挟まれた薬剤体積遺伝子を配置したミニトランスポゾン・カセットを作製した。現在、根粒菌への導入を可能とするsuicideベクターへのサブクローニングを行っている1)実験系の評価:材料とする菌株自体の特性を明確にするため、ミヤコグサまたは近縁のマメ科植物(西洋ミヤコグサやネビキミヤコグサ)の根粒から単離された国内外15株の根粒菌の16S rRNAならびにnodJ-nodS領域の部分塩基配列を新たに決定した。これらの栄養要求性や菌体表層構造ならびに根粒形成能・共生能の評価を行うとともに、TnphoAによって破壊されていないと想定される

アルギニン合成系遺伝子などの有無をPCRで調べた。その結果は、集積した変異株候補のうち少なくとも65%、最大で85%程度が、非根粒菌の混入に由来するものと判断された。但し、残る15から30%程度の変異株の中には、共生不全のものが含まれ、新規の遺伝子の発見に繋がることが期待される。しかしながら、フェローの在日中には、inverse PCRやクローニングによる挿入断片の回収が十分に達成できず、遺伝子の同定は今後の課題である。
筋電図による斜視の原因と治療の研究

斜視の原因には、眼筋自己受容器が密接に関係している。一方斜視の形成には、光刺激が関与している。そこで斜視の形成過程は眼筋自己受容器と光刺激の相互作用によることを研究した。対象は1才2ヵ月から7才の内斜視の小児、15才から62才までの外斜視の患者である。方法はフラッシュVECP検査と筋電図検査によった。フラッシュVECPの誘導は、O_1,O_2から行なった。フラッシュ刺激は右眼、左眼、両眼に行なった。網膜全視野刺激となるように光照射を行なった。筋電図は水平4直筋同時記録を小児(内斜視)では全麻下で、外斜視では覚醒下で記録した。内斜視の症例では、両眼刺激のVECPはO_1とO_2の電位に差はみられなかったが、1眼を刺激したときには、同側の電位が大きく、反対側の電位が小さい例があった。全例に全麻下にも関わらず内直筋の異常放電がみられた。しかし、VECPの電位に左右差がみられた例と、見られなかった例との間には、筋電図では差がなかった。外斜視ではVECPでO_1,O_2との間で差がある症例はなかった。外斜視の症例では全例に斜視眼の異常放電がみられた。眼筋自己受容器は外斜視では交差性に、内斜視では非交差性に作用している。また0.61x以上の光刺激がなければ内斜視、外斜視も斜視は消失する。眼筋自己受容器の作用は、光刺激によるインパルスが無くては無効になる。以上のことから、内斜視のVECPに交差性の電位よりも非交差性の電位が大きい例があったことは、先天的に視路の交差繊維に異常のある例に内斜視が発生しやすいことが推察された。当補助金により購入したニューロパックを用いて, 4直筋の筋電図を記録し,今までは外斜視にのみ認められていたMagician's Forceps現象が,内斜視にも存在することを発見した.これにより,内斜視,外斜視法共に外眼筋の伸張反射が関与していることがわかった.しかし,伸張反射は外斜視では対側性であるのに反して,内斜視では同側性である.したがって,外斜視では他動的に動かした眼球の,反対側の眼球が動くので,この現象は明確であるが,内斜視では,他動的に動かした眼球に反応が現われるために,筋電図によって始めて確認できた.また眼球の光運動反射も,外斜視では対側性であるのに対して,内斜視では同側性に反応することが確認できた.以上のことは,内斜視,外斜視共に眼筋の伸張反射が関与していることをはじめて確認した.また,内斜視および外斜視では反射の反応結果に,対側性と同側性の差があると言うことを発見した.したがって斜視の原因の解明に一歩近づけたものと思う.更に, 1例ではあるが,伸張反射の伝達径路である半月神経筋ブロックにより,外斜視を治すことができた.この治療法について今後研究を進めて行く.昭和62年度の本研究によって、視路の左右の感度差によって斜視が発生すること、および、三叉神経半月神経節をキシロカインで一時的なブロックを行うことによって永久的に斜視が矯正されることが発見された。昭和63年度はこれらの結果に基づいて次にような研究成果をあげることができた。1)Master眼とslave眼の交代現象の発見。斜視では、眼筋自己受容器がその発生に関与している。

眼筋自己受容器に異常なインパルスを送る方の眼がmaster眼であり、その結果、眼筋に痙攣を起こして眼位に異常をきたす方の眼がslave眼である。一般にはこの関係には恒常性がある。しかし、実際にこの治療を行っていると、何例かは斜視が矯正されない例に遭遇し、これらを4直筋同時記録筋電図などで詳細に検討すると、master-slaveの関係が逆転していることが判明した。2)三叉神経半月神経節ブロックによる斜視の治療法の確立。以上の事から、三叉神経半月神経節ブロックによる斜視の治療は次にように分類されることが判明した。a)1回のブロックで斜視が矯正される例。これはmaster-slaveの関係が強固なもので、変化しない例である。b)1回のブロックでmaster-slaveの関係が逆転し、反対側の三叉神経半月神経節のブロックを必要とする例。これらの例には左右のブロックを必要した。c)1回のブロックで斜視は矯正されなかったが、master-slaveの逆転はなかった例。これはブロックの技術に問題があるものと思われる。以上は斜視の成因の解明に重要なdataである。眼筋自己受容器の影響で斜視がおこること、その際に網膜の光刺激によるインパルスの介在が必要であることは既に知られている。そこで今回はVECPと筋電図をもちいて斜視の解析を行なった。すなわち、斜視を内斜視群と外斜視群にわけて、VECPと水平4直筋同時記録による筋電図を記録した。その結果次のような事実が明らかになった。1.内斜視では、VECPの電位が同側性に大きい例があった。すなわち、視路の交叉性線維の異常と思われる例が発見された。2.外斜視では、このような例は見つからなかった。3.筋電図では、内斜視では両内直筋の異常放電が見られ、外斜視ではslave eyeの外直筋に異常放電が見られた。眼筋を引っ張った時に見られる牽引反射は、内斜では同側性であり、外斜では交差性である。また暗い所では斜視が消失し、網膜に光刺激が加わってはじめて斜視があらわれる。以上の結果から、先天的に視路の交叉線維に異常がある例では、同側性の光刺激によって同側の眼筋自己受容器の信号が増強されて内斜視が発生したと考えられる。更に、外斜視のVECPの左右差、光刺激を加えた時と加えなかった時の筋電図の差を検討したが、明らかな結論を得られなかった。
頭部外傷後のうつ病発症に関わるストレス感受性分子の同定とその機序の解明

今回の検討より、複合多糖並びにリポ多糖類はマウスにおける脳振とう誘発性うつ病様行動に影響を及ぼさないとこを見出した。膜透過性亜鉛キレート剤投与は脳振とう誘発性うつ病様行動と海馬におけるミクログリアの活性化を抑制することを見出した。活性酸素除去剤であるエダラボンは脳振とう直後のマウスへ投与するとうつ病様行動ならびに海馬における酸化ストレスとアストロサイト内5-lipoxygenaseの活性化を抑制することを明らかにした。これらの結果は、亜鉛キレート剤並びにエダラボンが脳振とう誘発性うつ病を抑制すること、そしてこの保護効果にグリア関連性脳内炎症反応の抑制作用が関与していることを示唆している。[具体的内容]昨年度の検討により報告者らは、1頭部外傷直後のマウスに脳梗塞治療薬であるエダラボンを投与することで頭部外傷3日後に惹起されるうつ病様行動が阻止されることを見出した。さらに2頭部外傷1日後の海馬領域においてNADPH oxidsaeを介した酸化ストレスと同領域におけるアストロサイト内の5-lipoxygenaseの活性化を見出し、エダラボンがこれらを抑制することを明らかにした。また35-lipoxygenase阻害剤を頭部外傷直後と1日後にマウスへ投与することでうつ病様行動が阻止されることを明らかにした。[意義、重要性]頭部外傷患者はしばしばうつ病を発症するが、このような頭部外傷後うつ病はリハビリテーションや社会復帰への悪影響や自殺などの要因となることが危惧されている。また頭部外傷患者ではうつ病症状が顕著であっても適切な診断や治療が行われにくいことから重症化しやすく、さらに抗うつ病薬も効き難いことから重大な問題とされている。昨年度の検討より報告者らは脳梗塞治療に用いられているエダラボンが頭部外傷後うつ病に有効であることを示唆する結果を見出しており、同時に頭部外傷後うつ病の発症機序についても明らかにしている。これらの結果は、頭部外傷後うつ病の新規治療法の開発ならびに環境ストレス感受性分子の同定につながる重要な手掛かりになることが期待できるという点で臨床的のみならず学術的にも意義があり重要な成果である。[具体的な内容]昨年度の検討により報告者らは、1受傷後からうつ様行動が出現するまでの日数と衝撃の強さについて検討することで頭部外傷後うつ病発症モデルマウスの作成に成功し、2受傷直後に既存の脳保護薬または藻類由来の複合多糖を投与することでうつ様行動の出現が抑制できることを見出した。さらに報告者らは3慢性緩和ストレスのうつ様行動誘導条件を解析することで軽度ならびに重度うつ様行動を誘導できる条件を確立した。[意義、重要性]頭部外傷患者はしばしば「うつ病」を発症するが、損傷が直接の原因となる他に頭部外傷が1次的なトリガーとして分子や細胞を変化させ、その後の環境ストレスに対する感受性を高める可能性に関してほとんど解明されていない。昨年度の検討により報告者らは、マウスが軽度または重度のうつ様行動を現す頭部外傷条件ならびに慢性緩和ストレス条件を確立しており、これは本研究課題を遂行するために重要な成果である。また報告者らは脳保護薬または藻類由来の複合多糖が頭部外傷後のうつ様行動の出現を抑制することも見出しており、これは頭部外傷後のうつ病発症に対する新しい予防法の開発、さらには頭部外傷後うつ病発症の機序または環境ストレス感受性分子の同定につながる重要な手掛かりになることが期待できるという点で臨床的のみならず学術的にも意義があり重要な成果である。[具体的内容]昨年度の検討により報告者らは、以下の2点について明らかにした。1脳振とう誘発性うつ病様行動モデルマウスにLPSを腹腔内投与することで炎症ストレスを負荷したが、うつ病様行動を増悪化しなかった。2亜鉛キレート剤を投与することで一過性に脳内キレータブル亜鉛を減少させたマウスに脳振とうを負わせたところ、その後に惹起されるうつ病様行動が抑制された。[意義、重要性]頭部外傷はしばしば「うつ病」を発症するが、損傷が直接の原因となる他に、脳への衝撃が1次的なトリガーとなり分子や細胞を変化させ、その後のストレスへの感受性の変化が原因となる可能性が考えられている。しかし未だこれについて十分な解析が行われていない。昨年度の検討により、1脳振とう誘発性うつ病はその後の炎症ストレスにより増悪しないことが明らかになった。Fluid percussion法による中程度頭部外傷モデルマウスでは同様の炎症ストレスによりうつ病様行動の増悪化が報告されている。これら相反する結果は、脳振とうのような軽度頭部外傷と中程度頭部外傷では外傷後のストレスに対する感受性変化が異なることを示しており、頭部外傷の重症度に合わせたうつ病予防法の開発が必要であることを提案する臨床的さらには学術的にも意義のある重要な成果である。

また、報告者らは2一過性に脳内キレータブル亜鉛を減少させたマウスに脳振とうを負わせたところ、脳振とうによって惹起されるうつ病様行動の出現が抑制されることを見出した。キレータブル亜鉛は海馬領域などのグルタミン酸神経細胞内に貯蔵されているが、頭部外傷時に細胞外に過剰放出されることが知られている。このことから今回の結果は脳振とう誘発性うつ病の発症機序の詳細を解明するための重要な成果であり、さらにこの成果は治療法ならびに予防法の開発につながることが期待される医歯薬学本研究計画では、頭部外傷後に変化する分子のうち環境ストレスに対する感受性を高める分子を同定し、うつ病発症への関与を詳細に解析することで、全く新しい頭部外傷後のうつ病発症に対する検査法や予防法ならびに治療法の開発を研究の全体構想としている。現在までに報告者らは、頭部外傷後うつ病モデルマウスの作成に成功しており、さらに頭部外傷後うつ病の発症機序を詳細に解析することで海馬領域におけるNADPH oxidsaeとアストロサイト内の5-lipoxygenaseの活性化が大きく関与していることと、エダラボンがこれら酵素の活性化を抑制しうつ病発症を阻止することを明らかにしている。これらの結果は頭部外傷後うつ病発症に対する検査法や予防法ならびに治療法の開発につながる手掛かりになることが期待される。また海馬におけるNADPH oxidaseの活性化は拘束ストレスなどによって惹起されるうつ病様行動に関与しており、5-lipoxygenase遺伝子欠損マウスは水泳ストレスに対して抗うつ様行動を示すことが報告されていることから、これらが環境ストレス感受性分子である可能性が考えられる。以上のことから本年度までの達成度はおおむね順調に進展している。本研究計画を成功させるためには、マウスに軽度または重度のうつ病様行動を惹起させる頭部外傷ならびに慢性緩和ストレスの十分な条件設定が必須であるため、昨年度は多くの時間を費やしてこの検討を行った。その成果として頭部外傷後うつ病発症モデルマウスの作成に成功し、軽度または重度うつ病様行動を期待通りに惹起させることが可能になった。このようなことから、頭部外傷後に慢性緩和ストレスを与えて脳内亜鉛関連分子の発現変化を検討することとミクログリアを用いた検討を行う時間的余裕がなくなり当初の計画よりやや遅れる事態に至った。しかしながら報告者らはモデルマウス作成に関して十分な条件設定を終えているため、今後は迅速な研究を行うことが期待できる。このことは、すでに代表者らが既存の脳保護薬ならびに藻類由来複合多糖が頭部外傷後うつ病様行動の出現を抑制できることを見出していることからも実証されている。今後は頭部外傷モデルマウスに慢性緩和ストレスを暴露することで、その後のうつ病様行動の変化を検討し、すでに報告者らが同定した頭部外傷後うつ病発症関連遺伝子(NADPH oxidaseならびに5-lipoxygenae)が慢性緩和ストレス後のうつ病様行動の変化に関与しているか否かを検討し、アストロサイトに由来する慢性緩和ストレス感受性分子の同定につなげる。
細胞保護的ミクログリアの選別・機能解析と神経疾患治療への発展

ラット初代培養ミクログリアはトル様受容体4活性化により速やかに細胞死を起こすが、その中に長期にわたり生存する細胞が現れる。本研究ではこの生存ミクログリアに注目し、長期生存の機序としてGM-CSFの自己分泌を介したメカニズムを明らかにした。さらに、P2Y2受容体、アデノシンA2a受容体の発現誘導を介して死細胞貪食・抗炎症性機能を獲得すること、さらにアクチビンなどの神経保護因子の産生を介して神経保護作用を発揮することを明らかにした。ミクログリアは活性化を受け、神経毒性と神経保護の相反する作用を発揮する。研究代表者は、ラット初代培養ミクログリアにはTLR4活性化を受け細胞死を起こす細胞と、細胞死を起こさず長期にわたり生存し続ける細胞が存在することを報告してきた。これらの長期生存細胞が自身の生存を維持する機序として、通常ではアストロサイトが産生するGM-CSFをTLR4活性化を受けて自己産生する可能性を見出した。TLR4活性化によりGM-CSF受容体の発現亢進も認められ、この受容体の下流のシグナルであるJAK2チロシンキナーゼと転写因子STAT5の活性化も引き起こされた。従って、これらのGM-CSFオートクライン経路が働くことにより、STAT5が制御する生存関連遺伝子の転写が引き起こされ、生存が長期間維持されると考えられた。また、TLR4活性化長期生存ミクログリアには、死細胞を活発に貪食する細胞が存在する。これらの細胞は通常のin vitro実験に用いる培養1-2週間後のミクログリアには少なく、培養3週間以降急激に増加することが分かった。また、TLR4活性化生存細胞はATP受容体であるP2Y2受容体の著しい発現を引き起こし、死細胞貪食に重要な役割を果たすことを見出し、さらに新たに、TLR4活性化により引き起こされるアデノシンA2a受容体の発現亢進が貪食機能にも重要な役割を果たすことを明らかにした。このように、保護的ミクログリアの機能制御には、ATPやアデノシンなどの一連のヌクレオチドが重要な役割を果たす可能性が示唆された。高齢化社会を迎え、神経変性疾患、脳虚血疾患の対応が急務であるが、画期的方策は見つかっていない。ミクログリアは細胞外の環境に応答して傷害的にも保護的にも働き、神経疾患の増悪・改善に深く関わっている。しかし、それらの作用の発現機構はいまだ不明である。研究代表者は、Toll-like受容体4を刺激したミクログリアは傷害性因子を大量に産生し自ら細胞死を起すが、その中に一定の割合(約20%)で細胞死を免れ生存し続ける集団が存在することを見出した。この細胞集団は、ダイナミックに死細胞を貪食し傷害性因子の産生も低いことから、細胞保護的性質をもつミクログリア群である可能性が高い。平成24年度は、LPS刺激により生存維持するミクログリアに発現亢進する遺伝子を調べ、著しい亢進を示す遺伝子群を見出した。特に顕著であったのは、P2Y受容体のP2Y2サブタイプ、TNF受容体タイプ2(TNFR2)、ミクログリア・マクロファージ生存因子であるGM-CSFであった。これらの変化は同じファミリーであるP2Y6,P2Y12,TNFR1,M-CSFには認められなかったことから、特異的なタンパク質発現誘導であり、生存ミクログリアの生存能獲得と保護的機能発現に重要な役割を果たすと考えられた。また、タイムラプス観察により、LPS刺激により生存維持するミクログリアは、高い運動性を獲得し、死細胞に向かい遊走し活発に貪食すること、P2Y2受容体を遮断するスラミン存在下では、LPS刺激による死細胞への遊走は抑制されることなく、貪食が特異的に阻害される様子が確認された。この結果より、ミクログリアの死細胞貪食にP2Y2受容体が関与する可能性を初めて明らかにした。ラット初代培養ミクログリアは、LPSによりTLR4活性化を受けると強い炎症反応により自ら細胞死を起こすが、そのなかに高い死細胞貪食能をもち長期生存するミクログリアが現れる。これらの細胞はP2Y2受容体・アデノシンA2a受容体の著しい発現亢進を引き起こすことから、細胞外ヌクレオチドによる制御能を新たに獲得する可能性がある。このLPS刺激後の受容体発現誘導はP2Yサブタイプ(1,2,4,6,12,13,14)のうちP2Y2に特異的であった。ATPは速やかに加水分解しアデノシンとなるが、非水解性のATPアナログであるATPγSは持続的なATP受容体活性化を引き起こす。LPS活性化ミクログリアをATPγSで刺激すると、神経保護作用のあるVEGF、アクチビンA、アルギナーゼ1の遺伝子発現が著しく上昇した。これらのうち、アルギナーゼ1とアクチビンAのmRNA発現亢進はP2受容体アンタゴニストであるスラミンで有意に抑制された。

これらの結果から、TLR4活性化を受け長期生存するミクログリアは細胞外ATPの刺激により神経保護因子を産生する可能性が示された。一方、ラット初代培養大脳ニューロンは血清不含DMEM低栄養培地中では細胞死を起こすが、ミクログリアと共培養すると長期にわたり生存し続けた。このミクログリアの神経保護作用はLPS刺激を受けたミクログリアにより強く認められた。すなわち、ニューロンはTLR4活性化ミクログリアが分泌する神経保護因子を持続的に受けとることにより生存を維持する可能性が示唆された。以上の結果から、TLR4活性化ミクログリアの長期生存サブポピュレーションは受容体発現を介したATPシグナル亢進を介してアクチビンAなどの神経保護因子を産生し神経を保護する新しい機序が示された。神経薬理学、神経科学TLR4活性化を受け長期生存する保護的ミクログリアが、アストロサイトとの混合初代培養系において発現してくる培養条件や時期を明らかにすることができた。これらの成果から、保護的ミクログリアを効率よく選別・増殖させることが可能となった。また、GM-CSF自己分泌系を介した生存維持の機序も明らかし、さらに死細胞貪食機能を制御するヌクレオチド受容体(P2Y2・A2a)も同定できた。これらの新しい知見をもとにさらなる研究発展の基盤が整い、研究はおおむね順調に進展していると考えている。LPS刺激したミクログリアのうち、細胞死を起さず長期にわたり生存維持する細胞において発現亢進する遺伝子群を発見した。これらの中には、ミクログリアの生存維持や保護機能発現に関わることが推測される重要な因子が含まれていた。さらに、これまでミクログリアでは発現や機能が不明であったP2Y2受容体の新しい役割(死細胞貪食による恒常性維持)も解明できた。従って、現在での計画の遂行はおおむね順調であると考えている。アストロサイト・ミクログリア混合初代培養において、なぜ、異なる機能を持つミクログリアが異なるタイムコースで発現してくるのか、その機序を明らかにすることは、脳内炎症疾患におけるミクログリアの機能制御を理解する上で大変重要である。平成26年度は、異なる性質のミクログリアが誘導される機序を明らかにする目的で、ミクログリアの性質を決定するアストロサイト由来因子の同定を試みる。また、GM-CSF産生ミクログリアを回収・増殖させ、神経細胞との共培養から神経細胞に対する神経保護効果を検討する。さらに、これらの機能発現におけるヌクレオチド(ATP・UTP・アデノシン)とその受容体(P2Y2・A2a)受容体の役割についても分子レベルで解明を進める予定である。平成25年度以降は、LPS刺激により生存維持するミクログリアに特異的に発現する遺伝子群をさらに網羅的に調べる。ミクログリアの増殖に関与するVEGF,IL-3,神経細胞生存を維持するIGF-1,ミクログリアの保護的機能発現に関与するIL-4などに焦点を当て解析する。免疫染色、FACSにより、発現パターンを検討し、異なる機能を持つサブポピュレーションの存在を検討する。発現変化するこれらの自己分泌因子の作用がリコンビナント蛋白により再現できるか検討する。特に劇的な変化を示すGM-CSFなどのタンパクを中心に、神経傷害的あるいは神経保護に重要な因子の発現誘導パターンを調べ、GM-CSF産生ミクログリアの生存維持、保護機能発現における機序を調べる。
作物の葉の光合成活性に影響する個体全体の窒素分配および窒素代謝ネットワークの解析

本研究では,作物の葉の光合成活性の増加とその維持に関係する生理的機構を明らかにするため,窒素の吸収・同化,分配および再分配に関与する植物体各器官の窒素代謝ネットワークに着目して,根の窒素吸収・同化,窒素分配および再分配が葉の光合成活性に及ぼす影響とその要因を明らかにすることを目的に検討を行った.得られた研究成果は,以下の通りである.1.稔実期の葉の光合成速度の低下の大きいダイズ品種は遅いダイズ品種に比べて,葉のRubisco含量および窒素含量の低下が大きく,このことには稔実期に根からの窒素吸収が低下し,葉から莢への窒素分配の割合が大きいことが関係した.稔実後期になると葉の老化促進作用のあるアブシジン酸の著しい蓄積が認められ,このこともRubisco含量の減少の一因であった.2.登熟期の水稲葉の光合成速度の減少ともに,Rubisco含量および窒素含量は低下し,硝酸還元酵素活性の低下がみられ,また根の窒素吸収の減少が認められた.葉の光合成速度を高く維持する水稲品種は低下の大きい品種に比べてRubisco含量および葉の窒素含量を高く維持し,このことには根からの窒素吸収が多く,葉への窒素分配が大きいことと,根から葉に遅ばれるサイトカイニン量が多いことが関係した.また,根から地上部に送られるサイトカイニンは,根の窒素吸収には影響を及ぼさないが,葉の窒素分配割合を高め,葉への窒素の流入を高め流出を抑制した.3.サイトカイニンにより水稲葉のRubiscoのmRNA蓄積量が高く維持された.4.水ストレスによる水稲葉の窒素含量,Rubisco含量の低下には,サイトカイニンの減少が関係し,葉からの窒素流出,Rubisco分解が促進されることが主要因であった.本研究では,作物の葉の光合成活性の増加とその維持に関係する生理的機構を明らかにするため,窒素の吸収・同化,分配および再分配に関与する植物体各器官の窒素代謝ネットワークに着目して,根の窒素吸収・同化,窒素分配および再分配が葉の光合成活性に及ぼす影響とその要因を明らかにすることを目的に検討を行った.得られた研究成果は,以下の通りである.1.稔実期の葉の光合成速度の低下の大きいダイズ品種は遅いダイズ品種に比べて,葉のRubisco含量および窒素含量の低下が大きく,このことには稔実期に根からの窒素吸収が低下し,葉から莢への窒素分配の割合が大きいことが関係した.稔実後期になると葉の老化促進作用のあるアブシジン酸の著しい蓄積が認められ,このこともRubisco含量の減少の一因であった.2.登熟期の水稲葉の光合成速度の減少ともに,Rubisco含量および窒素含量は低下し,硝酸還元酵素活性の低下がみられ,また根の窒素吸収の減少が認められた.葉の光合成速度を高く維持する水稲品種は低下の大きい品種に比べてRubisco含量および葉の窒素含量を高く維持し,このことには根からの窒素吸収が多く,葉への窒素分配が大きいことと,根から葉に遅ばれるサイトカイニン量が多いことが関係した.また,根から地上部に送られるサイトカイニンは,根の窒素吸収には影響を及ぼさないが,葉の窒素分配割合を高め,葉への窒素の流入を高め流出を抑制した.3.サイトカイニンにより水稲葉のRubiscoのmRNA蓄積量が高く維持された.4.水ストレスによる水稲葉の窒素含量,Rubisco含量の低下には,サイトカイニンの減少が関係し,葉からの窒素流出,Rubisco分解が促進されることが主要因であった.作物の葉の光合成活性に及ぼす葉の窒素同化、葉の窒素分配に関わる植物体の窒素代謝の影響とその要因を検討するため、本年度は、すでにモデル植物であるアラビドプシスを用いて解析方法を確立している海外研究協力者の協力を得て、各種窒素代謝産物、窒素代謝系に関連する各種酵素活性を多試料同時に測定可能な実験系を確立し、これまで葉の老化過程の光合成速度、Rubisco含量および遺伝子発現の解析を行ってきた水稲、ダイズを用いて、葉の光合成活性と葉の窒素同化、根による窒素吸収、植物体内の窒素吸収、分配および再分配との関係について、検討を行った。結果の概要は以下の通りである。(1)温度制御可能なマルチプレート対応スペクトロフォトメーターを用いた硝酸、アンモニア、各種アミノ酸などの窒素代謝産物の酵素化学的な測定方法、硝酸還元酵素、グルタミン合成酵素などの窒素同化系の酵素活性の多試料測定法を確立した。これにより、これまで1点の酵素活性を測定する時間で、96点の測定を行うことが可能となった。また、液体窒素中で粉砕可能な凍結粉砕機TissueLyserにより、多くの試料を迅速に粉砕することが可能となった。(2)この実験系を用いて、登熟期の水稲の葉の老化過程の硝酸還元酵素活性を測定した結果、登熟期における葉の硝酸還元酵素活性は老化とともに低下した。この酵素活性の低下はRubisco含量の低下と関係が認められた。(3)葉の老化のはやいダイズ品種は老化の遅いダイズ品種に比べて、稔実期のRubisco含量および葉の窒素含量の減少が大きいことには、稔実期の窒素吸収が低下し、葉より莢への窒素分配割合が大きいことが関係した。稔実後期には葉に老化促進作用のあるアブシジン酸の著しい蓄積が認められ、このこともRubisco含量の減少と関係があることが推察された。

本年度は、老化に作用するサイトカイニンなどの植物ホルモンが窒素の吸収・同化、分配と再分配に及ぼす影響を検討し、植物ホルモンの窒素代謝における生理的機構を明らかにし、植物ホルモンによる窒素代謝ネットワークへの作用を通じた葉の光合成活性維持の生理的機構を解析した。また水ストレスなどの環境ストレス条件下で促進される葉の光合成活性の低下に植物体全体の窒素代謝系の変化がどのように関係し、またストレスによる植物体全体の窒素代謝系の変化に植物ホルモンが関係するか検討した.結果の概要は以下の通りである。(1)サイトカイニンは植物体全体の窒素蓄積には影響せず、窒素吸収には影響を及ぼさなかった。しかしながら、葉への窒素分配割合が増加し、穂への窒素分配割合が減少し、サイトカイニンにより葉の窒素蓄積が高まることがわかった。(2)窒素の安定同位体^<15>Nを用いて、トレーサー実験を行った結果、サイトカイニンにより水稲の葉の窒素含量および光合成炭酸固定酵素Rubisco含量は高く維持されるが、その要因にはサイトカイニンにより窒素の流入、Rubiscoの合成促進と、窒素の流出、Rubiscoの分解抑制が関与することがわかった。(3)根系のよく発達したコムギの葉の光合成速度が高く維持されることには、植物体の窒素吸収が多く、葉の窒素蓄積が多いことによることがわかった。(4)水ストレスによる水稲葉の窒素含量、Rubisco含量の低下には、サイトカイニンの減少が関係し、葉からの窒素流出、Rubisco分解が促進されることが主な要因であることがわかった。昨年度までに水稲,コムギの葉の光合成活性に影響する葉Rubisco含量および窒素含量に対する植物ホルモンの影響とその要因を検討するため,サイトカイニンが葉の窒素の流入と流出,Rubiscoの合成と分解に及ぼす影響を検討した,本年度は,葉の光合成活性に関係する植物体の窒素分配および窒素代謝に対する植物ホルモン・サイトカイニンの影響とその要因を解析し,植物ホルモンによる窒素代謝ネットワークを通じた葉の光合成活性維持の生理機構について検討を行った.また,水ストレスで促進される葉の光合成活性の低下に植物体全体の窒素分配および窒素代謝とサイトカイニンがどのように関係するか解析した.その結果,(1)水稲植物体にサイトカイニンを処理すると光合成活性が高く維持され,炭酸固定効率が高く維持されることが関係し,炭酸固定酵素Rubiscoが高く維持されることによること,Rubiscoが高く維持されたことには,植物体の窒素吸収が促進されたことによるものではなく,サイトカイニンにより葉への窒素分配が高くなったことが関係すること,(2)根系のよく発達した水稲では,根でつくられるサイトカイニン量が多く,窒素吸収量が多く,葉への窒素分配が多いことによって,葉の窒素含量,Rubisco含量が高く維持され,発熱期の光合成活性が高く維持されること.(3)水ストレスにより光合成活性の低下した水稲にサイトカイニンを処理すると,光合成活性の低下およびRubisco含量の低下が抑制され,Rubiscoの分解,葉からの窒素の流出が抑制されることによることが明らかとなった.
排卵誘発剤を使用する女性が安楽に安心して過ごすためのセルフケア支援モデルの効果

排卵誘発剤を用いた不妊治療を受ける女性のセルフケア支援モデルを開発し,その効果を無作為比較試験により,明らかにすることを目的とした。リコンビナントFSH製剤の在宅自己注射の支援を考慮した。セルフケア教材として,Digital Versatile Diskおよび手帳を開発した。アウトカム指標に用いる自己管理評価質問紙(28項目),注射部位.からだ・こころの症状質問紙(34項目)を開発した。今回は,研究代表者の健康上の理由により,効果測定には至らなかった。本研究は、排卵誘発剤を用いた不妊治療を受ける女性のセルフケア支援モデルを開発し、自己管理、健康関連QOL、不安・抑うつを指標として、その効果を無作為比較試験により、明らかにするものである。本年度は下記のように研究計画を遂行した。1.既存の調査資料・関連書籍・雑誌記事等の文献検索、本年度研究協力者の看護師による専門的知識の提供、自助グループメンバーの意見やコメントをもとに、患者用・医師および看護師用の2種類のインタビューガイドを作成した。2.インタビューガイドを用いて、体外受精-胚移植を実施する際に用いられる排卵誘発剤他・ホルモン剤等の処方や患者への説明・ケアにっいて、医師3名・看護師2名にインタビュー調査を行った。また、-医療機関の協力を得て、前述の薬を用いた体外受精-胚移植を受けた経験のある女性6名(うち3名は多嚢胞卵巣症候群)に症状と対処にっいてインタビュー調査を行った。医療者のインタビューからは、医師・看護師を問わず、共通の認識があり、それは、治療に対する納得が得られているかどうかが服薬に関する理解や自覚する副作用の程度に影響したり、服薬上のトラブルと関係するという見方であった。医療機関それぞれに、リーフレットなどを用い、患者への説明と理解を促す努力をしていた。患者のインタビューからは、個人差はあるものの、細かな副作用の自覚や不安があることが伝えられた。3.インタビューデータを分析し、症状・対処に関して、医療者側からの問題認識と、患者側からの問題認識を抽出・照合し、構造化して、調査用紙を作成した。今後の予定としては、薬剤に関する専門的知識の提供を仰ぐこと、文献検索の結果をレビューとして論文(報告)にまとめ公表すること、作成した調査用紙による、全国の医療機関に調査依頼をすることである。本年度の目標の一つは、排卵誘発剤を使用する女性の症状およびこれに対する対処、医療者から受けているケアに関し、調査することにあった。2007年からリコンビナントFSH製剤の普及が進み始め、2008年7月に在宅自己注射が認可され、10月にペン型注射器が販売されるなどの臨床状況における大きな変化があった。今後、排卵誘発剤の投与方法の変化のみならず、ケアニーズについても劇的に変化していくことが予測された。そのため、調査内容を見直し、在宅自己注射の自己管理とその指導ケアに焦点を絞った質問紙への内容の変更をはかった。質問紙調査は、複数の専門医療機関の協力を得ながら、現在進行中である。目標二つ目は、不妊治療を受ける女性へのインタビューにより明確化した症状および対処、ケアニーズのなかから、排卵誘発剤との関連で絞り込み、医療者へのインタビューによるケアの実際や課題をもとにケアモデルを検討し作成することにあった。これについても臨床状況の変化に対応し、在宅自己注射を行うためのケアモデルに焦点化した。ケア介入に用いる教材として、タイトル「安心・安楽に行える排卵誘発剤の在宅自己注射」のDVD教材を制作した。なお、現在、治療周期のおける心身のモニタリングを女性自身が行うためのセルフケア教材としてそ「セルフチェックノート」を製作中である。本研究は、排卵障害に対するゴナドトロピン療法、体外受精に対する調節卵巣過剰刺激のため排卵誘発剤を使用する研女性が時間や経費面でも通院による負担を過度に負うことなく日常生活を送り、かつ、心身の健康を保証しQOLを保ちながら治療できるよう、在宅自己注射を安全にサポートすることにつながる。生殖医療分野では今、まさに求められている優先性の高い研究課題である。今回の調査結果を踏まえて質問紙を洗練し、教材の完成を待って、次の介入研究を予定している。本研究の目的は、排卵誘発剤等を用いた不妊治療を受ける女性のセルフケア支援モデルを開発し、症状・対処、健康関連QOL、不安・抑うつを指標として、その効果を無作為比較試験により、明らかにすることにある。そのため、本年度の研究目標と実施計画に照らし、成果を記述する。1.在宅自己注射薬として認可された排卵誘発剤フォリスチムに焦点を絞り、その在宅自己注射を行うために受けた指導・ケアやサポートの評価とデモグラフィックデータ(22項目)、薬の作用・副作用症状(4項目)や自己管理達成状況(41項目)を測定する質問紙を開発した。これと合わせて健康関連QOL (sf36項目)、不安・抑うつ(14項目)に関し、初めて在宅自己注射を行う女性患者約100名を対象に不妊専門クリニック8ヶ所の協力を得て平成21年2月より調査中である。

フォリスチムの普及は徐々に進んでいるが排卵誘発剤の中ではまだ主流とはいえず、使用者数が少ないことから、現在、解析可能なデータ数に達していない。データ数が得られたら質問紙の妥当性・信頼性を検討し、ただちに介入研究へと進む計画である。2.在宅自己注射におけるセルフケア支援モデルの案を検討した。支援に活用するための視聴覚教材DVD「安心して行える排卵誘発剤の在宅自己注射」を制作した。また、その一方で女性が治療周期中の薬の作用・副作用をセルフモニタリングし、セルフケアを記録するためのセルフチェックノート「i-メモリー」を企画・開発した。本年度の研究目的は1)排卵誘発剤の在宅自己注射を実施する女性の自己管理達成度(対処含む)、薬剤副作用症状、健康関連QOL、不安・抑うつに関し、実施した調査結果を分析すること2)排卵誘発剤の在宅自己注射を実施する女性に対し、作成したケア支援モデルを用いて介入し、その効果を自己管理達成度(対処含む)、薬剤副作用症状、健康関連QOL、不安・抑うつを指標として分析することの2つあった。目的1)に対しては、7医療施設にて初めて在宅自己注射を行う女性118名を対象とし、排卵誘発剤の在宅自己注射を実施する女性の自己管理達成度(対処含む)、薬剤副作用症状、健康関連QOL、不安・抑うつに関し、調査を実施した。その結果、70名から回答を得た(回収率59.3%)。自己管理達成度調査票を因子分析し、因子名を第1因子「不安・緊張と負担感」、第2因子「体調や効果のモニタリング」、第3因子「主体的な参加」、第4因子「家族・医療者の協力と活用」と命名した。28項目の信頼性係数クロンバックαは.86であり、因子毎では.625.897であった。また、女性の心の健康状態(不安・抑うつ)は、排卵誘発剤の在宅自己注射実施時の局所的な症状を除き、自覚される心身の症状数(頻度)に影響していた。これらの結果を日本生殖医学会で2題発表した。目的2)に対しては、ケア支援モデルで用いる2つの教材(DVD教材)「安心して行える排卵誘発剤の在宅自己注射」とセルフチェックノート「i-メモリー」の開発過程を日本生殖看護学会で1題発表した。研究代表者の健康障害と治療のため、セルフケア支援モデルによる介入効果についての調査は実施できなかった。
国際カルテルに対する民事的救済-国際私法・独禁法上の諸問題の包括的研究-

本研究は、諸外国での国際カルテル違反行為にかかる民事的救済制度の法原理・法制度・法運用状況を比較検討し、それを基に、日本における妥当な解釈を提言することを目標としていた。しかし、(1) EUでの立法作業が頓挫したこと、(2)米国判例の分析に予想したより多くの時間がかかったことから、具体的な解釈提言まで至ることができなかった。日本や韓国でも競争法の本格的な域外適用が始まり、また、消費者の権利の集団的救済の必要性が叫ばれる中で本研究は急務の課題であり、引き続き検討を続けていき、数年うちにまとまった形での成果公表をする予定である。本年度は、当初予定では米国法における問題を検討対象とすることにしていたが、EUにおいて、本申請とほぼ内容を同じくするプロジェクトが、マックスプランク外国私法国際私法研究所・ルーヴァンカトリック大学(ベルギー)・パリ第2大学の共同研究として、EC委員会の資金援助を受けて進行中であることが判明し、急遽、研究代表者(長田)は同プロジェクトと連携してEUでの議論状況の調査を主として行うこととした。この連携により、同プロジェクトが開催したリサーチセミナー、シンポジウムに参加することができた。結果、研究課題に関して、EUでいかなる点が議論されているのかという点についての知見を広める一方、それまでの研究で生じていた疑問点を同プロジェクトのメンバーに直接確認するなどすることができた。さらに同プロジェクトのメンバーからの協力を次年度以降得ることについて、確認できた。初期の段階でこのような機会を得たことは今後研究を進めていく上で、非常に大きな財産になるものと思われる。研究分担者(武田)は、計画通りに、米国における国際カルテル事件にかかる調査を進めており、かなりのデータをすでに収集済みである。今後この資料の分析を進めていきたい。研究分担者と研究代表者との共同作業もこれまでに引き続き行ってきた。できるかぎり週1回のペースで研究の進捗状況に関する意見交換を行った。それと同時に、最低月1回、多いときには週1回のペースで収集した資料についてお互いに報告し合い、米国における重要な判例やEUにおける重要判例および議論状況、立法の状況について知識を共有することにより、長田にとっては経済法の視点から、武田にとっては国際私法の視点からの示唆を得ることができた。研究成果の公表については、いまだ本研究についての詳細な成果を公表できる段階ではないため、いわばバックグラウンドとしての経済法一般、国際私法一般にかかる公表物が中心となっている。本年は、研究年度の2年目にあたることから、昨年に引き続き、競争法違反行為に基づく損害賠償請求にかかる諸問題に関して、ヨーロッパでの議論の動向を、主として論文等に基づき調査研究する一方で、アメリカにおける状況についても調査研究を深めた。具体的には、EUにおいて始められていた競争法違反行為に基づく損害賠償請求にかかる立法の進捗状況について、ルーヴァン・カトリック大学(ベルギー)ステファニー・フランク教授およびトゥールーズ第一大学(フランス)シルヴェーヌ・ペルツェット教授と密に連絡を取り合いつつ、情報のアップトゥーデイトをはかった。その一方で、ローマII規則に定められた準拠法規定にかかる研究や、ブリュッセルI規則下での本課題の問題点についての研究も進めており、この点に関して、長田が平成22年6月の関西国際私法研究会で、本研究課題にかかる報告(競争法違反行為に基づく損害賠償請求の国際裁判管轄権-Provimi判決を下に)を行った。このような現状でのEU法の動向を研究することは、立法措置を検討していない我が国の議論について、非常に大きな意義を有すると考えられる。他方、アメリカの判例研究は、外国取引反トラスト改善法(FTAIA)の判例を中心に猟渉しているところであるが、数が大変に多く、データベース化に当初想定していたより時間がかかっている。FTAIAは、競争法違反行為に基づく損害賠償請求の国際的な側面について非常に重要な規定であるにも関わらず、これまで日本で、まとまった研究がされてこなかったこともあり、この判例データの集約、解析は、きわめて重要な価値を持つものと思量する。これら現在までの研究の進捗状況および成果は、研究代表者研究分担者間で、定期的に打ち合わせを行うことにより、できる限り共有するようつとめている。従来、国際カルテルの問題は、もっぱら競争法執行官庁による外国事業者に対する規制という、「公法的な」域外適用の問題として論じられてきた。これに対して、本研究は、国際カルテルに対する民事救済のあり方という、いわば「私法的な」域外適用の問題を、国際私法を専門とする研究者と経済法を専門とする研究者が共同で研究するものであった。本研究の目的として、主に以下の2点をあげていた。すなわち、(1)国際カルテルにかかる、米国及びEUにおける民事的救済の包括的研究(外国法研究)、(2)(1)の研究を基礎として、我が国独占禁止法による国際カルテルの被害者救済のあり方について、法制度及び法解釈にかかる具体的な提言をなすことである。

本年度は最終年度にあたるため、これまでのEC法・EU加盟国法および米国法にかかる研究成果を基礎として、国際カルテル違反行為にかかる民事的救済制度の法原理・法制度・法運用状況を比較検討し、それを基に、【日本企業加害者型】に対する妥当な解釈を提言することを具体的な目標としていた。しかるに、いくつかの理由から、妥当な解釈を提言するまでに至ることができなかった。第1に、EUで進められていた国際カルテルにかかる民事的救済制度構築のための立法プロセスが、様々な政策的な理由により頓挫してしまったこと、第2に、アメリカにおける判例の数が予想よりも遙かに多く、その分析に当初の予想よりも多くの時間がかかってしまっていることの2点が主な理由である。しかし、本研究は日本や韓国でも本格的な公法的域外適用が始まり、また、消費者の権利の集団的救済の必要性が叫ばれる中で、急務の課題であり、補助金の交付終了後も引き続き検討を続けていき、数年うちにまとまった形での成果公表をしたいと考えている。
体内時計制御における一酸化炭素の生理機能の解析

ヘム結合モチーフ(HRM)に変異を導入したmCRY1蛋白(mCRY1-AP)の全身性過剰発現マウス(CRY1-AP Tgマウス)の異常なフリーラン挙動をもたらす分子的機構を解明するため、HRM変異がCRY1の機能に及ぼす影響をin vitroで共同研究により調べた。その結果、mCRY1は実際にヘムと結合する事、mCRYI-APは細胞内でmCRY1より不安定であり、BMAL1に対する結合能が増加し、CLOCK:BMAL1に対するリプレッサー能も増加する事が判明した。これらの結果から、ヘムのmCRY1へのHRMを介した結合によりmCRY1-BMAL1相互作用及びmCRY1のリプレッサー機能が制御を受ける事が考えられる。COがこの制御に如何に関与しているかの解明は今後の課題である。また、CRY1-APTgマウスの明暗への同調能をさらに評価するべく、LD12:12サイクルの位相前進(12h前進)のjet lag実験を行った。正常型mCRY1の全身性過剰発現マウスでは野生型と同様の再同調挙動を示すのに対し、CRY1-AP Tgの行動パターンはシフト後のLDに瞬時に追随した。CRY1-AP TgマウスはLD12:12への同調能は保持している一方、jet lag実験においては活動は光に強く影響されることから、CRY1-AP Tgマウスの概日時計の発振は著しく微弱であり、マスキング効果が優位に現れる事が考えられる。また、ヘム合成律速酵素ALAS-NのmRNAの給餌による転写制御や概日変動が失われたマウス(ALAS-N GFPノックインホモマウスにALAS-Nの全身性恒常発現のトランスジーンを導入したマウス)では、明暗同調に関して特段の異常は見られなかった。このマウスのフリーラン及び周期的制限給餌下でのリズムは測定中であり、ヘム及びCOの体内時計制御に於ける機能をさらに追求している。CO並びにヘムの体内時計制御における生理機能を明らかにする目的で、ALAS-N、mCRY1等の種々の遺伝子改変マウスの、明暗及び恒暗条件下での輪回し活動を指標とした活動リズムの測定を行った。その結果、mCRY1の遺伝子改変マウスが特徴的な表現型を示す事が判明した。すなわち、mCRY1を全身的に過剰発現させたトランスジェニック(Tg)マウスは比較的マイルドな表現型を示す(明暗条件下では野生型マウスと比べて活動開始時刻が数時間程早まる;恒暗条件下でやや短周期のフリーランリズムで活動する場合がある)のに対し、ヘム結合モチーフに変異を導入したmCRY1の全身性過剰発現Tgマウスは特異な表現型を示す(明暗条件下では明期においでも顕著な活動が観察される;恒暗条件下ではリズム分割を伴った極めて長周期の(約28h)フリーランリズムで活動する)事が明らかになった。明暗条件下の両Tgマウス肝臓でのmPER2、mDBPのmRNAの発現リズムをリアルタイムPCRで測定したところ、mCRY1 Tgマウスでは、振幅がやや小さくなるが野生型マウスとピーク位置は変らなかったのに対し、モチーフ変異型mCRY1 Tgの場合は振幅の極めて小さく、また形状の異なったピークの発現リズムが見られた。これらの結果は、ヘムによるCRYの制御が、体内時計の明暗周期への同調及び周期の制御、さらに内的同調において重要な役割を果たしている事を強く示唆している。現在、このCRYのモチーフ配列を介してのCOの体内時計制御機構の検討を、in vitroで行っている。ALAS-N全身性過剰発現マウスは、やや長周期のフリーラン周期を示す傾向が観察され、さらに確かな結論を得るべくマウスの個体数を増やして、上述のCRY Tgマウスと共に活動リズムの測定を継続している。また、NPAS2、HO-1の種々の遺伝子改変マウスの作製も進行中である。また、ヘム合成

律速酵素ALAS-NのmRNAの給餌による転写制御や概日変動が失われたマウス(ALAS-N GFPノックインホモマウスにALAS-Nの全身性恒常発現のトランスジーンを導入したマウス)では、明暗同調に関して特段の異常は見られなかった。このマウスのフリーラン及び周期的制限給餌下でのリズムは測定中であり、ヘム及びCOの体内時計制御に於ける機能をさらに追求している。
核内レセプターを介した胆汁酸の大腸発癌修飾の分子機序

【目的】胆汁酸レセプター(FXR)を介した胆汁酸の大腸発癌及び胆汁酸代謝に関連する遺伝子発現に対する作用を調べる。【結果】COX-1、COX-2の遺伝子発現はFXRをK/Oすることにより増加した。CDCA投与ではFXRのK/Oに関わらずCOX-1の発現が著明に増加したが、COX-2の発現は変化を受けなかった。また、UDCAはwildではCOX-1、COX-2とも発現を上昇させ、FxR-K/Oでは変化しなかった。雄においては、FXRをK/Oすると対照群やCDCA投与群における腫瘍発生個数が抑制された。UDCA投与群ではFXRのK/O群で腫瘍発生が抑制される傾向が見られた。胆汁酸代謝遺伝子中、大腸で発現がみられたMrp3,Mrp4,MDR-1aではwild、FXR-K/O両マウスにおいてその発現に胆汁酸の影響は見られなかった。一方、FXRをK/OするのみでMrp3、Mrp4、MDR-1aの発現は低下する傾向が見られた。【考察】FXRがCOX-1、COX-2発現に影響を与えること、UDCAはFXRを介してCOX-1、COX-2発現を変化させることが示唆された。また、CDCAがFXRを介して大腸発癌を促進している可能性が示唆された。さらに、マウス本来の大腸内に存在する胆汁酸がFXRを介してMrp3、Mrp4、MDR-1aの発現を常時刺激している可能性が考えられた。【目的】胆汁酸レセプターFXRが胆汁酸による大腸発癌過程の修飾に関与しているかどうかを解明する。【方法】)FXRをK/0したC57BL/6Nマウスとそのwild typeマウス(7週齢)に対し、大腸癌発癌物質Dimethylhydrazine(DMH,20mg/kg)を週1回×12週間皮下投与しDMH投与開始と共に基礎食(MF)のみ、0.4%CDCA含有MF、0.4%UDCA含有MFの3種類の餌をwild typeのマウス、FXR-K/0マウスの雌雄別に投与した(計12群)。43週齢で犠牲死させ、大腸を摘出し正常大腸粘膜および腫瘍組織からRNAを抽出し、大腸発癌に関連する遺伝子COX-1、COX-2のmRNA発現量をReal Time PCRを行い検討した。【結果】(1)COX-1、COX-2の遺伝子発現はFXRをK/0することにより増加していた。CDCAの投与群ではFXRのK/0に関わらずCOX-1の発現が著明に増加していた。対照的にCOX-2の発現はFXRのK/0に関わらずCDCA投与により変化を受けなかった。また、UDCAはwildではCOX-1、COX-2とも発現を上昇させたが、FXR-K/0では変化しなかった。WildではCOX-1、COX-2の発現は正常粘膜よりも腫瘍が高かった。(2)雄においては、FXRをK/0すると対照群やCDCA投与群における腫瘍発生個数が抑制された。UDCA投与群ではFXRのK/0群で腫瘍発生が抑制される傾向が見られた。