hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
機能化サプリメントを目指した脂質ータンパク質ハイブリッド型キャリアの創成

栄養補助食品(NC)の高機能化を目的に、各種NCのキャリアとなり且つそれ自体がNC成分であるカゼインミセルならびにレシチンリポソームのハイブリッド化と、NCキャリアとしての有用性を明らかにする事を目的に研究を行った。NC成分として抗酸化作用を有するポリフェノールの一種であるゲニステインをモデルとして選び、各キャリアへの可溶化量を明らかにし、可溶化されたゲニステインの抗酸化能力の評価を行った。カゼイン系ではゲニステインの抗酸化作用を向上させる相乗効果が認められる一方、リポソーム系は多量のゲニステインを可溶化できることが分かった。両者を同時に用いることで、量質の両面からの機能化の達成が期待される。栄養補助食品(NC)の高機能化を目標に、NCのキャリアとなり且つそれ自身がNC成分である、カゼインミセル、ならびにレシチンリポソームのハイブリッド化と、NCキャリアとしての有用性を明らかにすることを目的に研究を行った。カゼインは牛乳由来のカゼインナトリウム塩を、レシチンにはジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)ならびにジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)を、抗酸化作用物質としてポリフェノールの一種であるゲニステインをそれぞれ利用した。初年度は、カゼインミセルの臨界会合濃度や会合体サイズ、ならびにカゼインミセルへのゲニステインの可溶化量を明らかにした。二年目にあたる最終年度は、主にリポソームへのゲニステインの可溶化量ならびに、可溶化されたゲニステインの抗酸化能力の検討を行った。ゲニステインは疎水性の高い物質であり、殆ど水に溶解しないため可溶化操作が必要である。カゼインミセルを利用した場合、その可溶化量はカゼイン1分子あたり12個程度であり、質量比に換算するとカゼインの0.5%程度のゲニステインしか可溶化できない事がわかった。一方リポソーム系では、リポソームを構成するリン脂質分子の10倍程度のゲニステインを可溶化できることが分かった。他方、可溶化されたゲニステインの抗酸化作用をABTSラジカル消去能から見積もったところ、リポソーム系は可溶化されたゲニステインの量に単純に比例する一方、カゼイン系ではカゼイン自身にも抗酸化作用が認められ、キャリアとしてのカゼインとゲニステインの抗酸化作用に関する相乗効果が確認できた。以上の結果より、カゼイン系ではゲニステインの抗酸化作用を向上させる働きがあり、リポソーム系ではゲニステインの可溶化量を向上させることが可能であり、両者を同時に用いる事で抗酸化物質の質・量両面からの機能化が達成されることが明らかとなった。栄養補助食品(NC)の高機能化を最終目的に掲げ、NC成分であり、かつそれ自身が自己組織化してNCのキャリアとなりうる、カゼインミセル、ならびにレシチンリポソームに着目し、それらのハイブリッド化とNCキャリアとしての有用性を明らかにすることを目的に研究を行った。リポソームはDPPCにより作製し、従来の方法に従い100nmのサイズに調整を行った。カゼインについては当初はκ-カゼインを用いる予定であったが、今回入手した牛乳由来のカゼインナトリウム塩の単分散性が比較的優れていたため、こちらを利用した。カゼインミセルのサイズは、DLS測定とAFM観察を用いてカゼイン濃度とカルシウム濃度の観点から検討したところ、カルシウム濃度が10mM以下では、20nmのサブミセルとして存在できることが分かった。次にNC可溶化物として、抗酸化作用を有するポリフェノールの一種であるゲニステインを選び、カゼインミセルへの可溶化量を検討した。今回利用したカゼインミセルの臨界会合濃度は0.5μMと見積もられたが、ゲニステインの可溶化量はこの臨界濃度を境にその増加率が減少した。このことからゲニステインはカゼインミセルの表面に結合する形で可溶化されているものと考えられる。また現在、カゼインミセルに可溶化されたゲニステインの抗酸化能力について、DPPHのラジカル消去能から測定を行っているところである。更にリポソームとカゼインミセルとのハイブリッド化については、リポソームにリン酸塩アニオン型脂質を混合させることで、カルシウムイオンを介したカゼインとの相互作用を利用することを検討した。表面電位測定や限外ろ過を用いた吸着量の測定から一部のカゼインがリポソームに結合することが分かった。またcryo-TEMによる直接観察からも、同じくリポソーム表面に結合したカゼインミセルの存在を確認できた。

当初の計画では、初年度に、(1)リポソームとカゼインミセルのサイズ制御、(2)リポソームとカゼインミセルへの各種ニュートラシューティカルズの可溶化量の決定、(3)リポソームとカゼインミセルとのハイブリッド体の調製、の3項目の達成を目指していた。(1)については概ね計画通り達成されている。(2)については、現在カゼインミセルへの脂溶性NCであるゲニステインの可溶化量の決定のみ達成された。しかしながら、リポソームを用いた水溶性NCの検討にはまだ至っていない。一方で可溶化されたNCの抗酸化作用については、次年度に計画されていたが、この部分については既に初年度から取り組みを開始できている。(3)については当初の計画とは異なり、リン脂質とカゼインがそれぞれに有するリン酸基をカルシウムイオンを介して結合させる方法を検討した。吸着量の測定やTEM観察から確かに一部のカゼインミセルがリポソームに結合したことを確認できたが、多くのカゼインミセルが遊離の状態で存在しており、リポソームとカゼインとの相互作用を更に強める方策が必要である。このように一部には計画通りの成果を挙げることができていない部分も存在するものの、当初の計画に従い、概ね実行できている。よって現在までの達成度としては、概ね順調に進展していると判断した。当初の計画では、次年度はカゼインーリポソームのハイブリッドキャリアに可溶化された、ニュートラシューティカルズの機能性に対して解明を進める予定となっている。よって計画通りに研究を遂行する予定である。ただし、初年度のうちに、カゼインに可溶化されたゲニステインのラジカル消去能の評価方法を検討を行ったところ、カゼイン自体の影響の評価方法に少し問題があることが分かった。まずはこの点を中心に取り組む予定である。また、初年度の期間において、十分な成果が挙げられていない項目については、再度検討を繰返し、速やかに達成させることが必要である。具体的には、リポソームとカゼインとのハイブリット化の方法を、アシル化ペプチドを介する方法や、カゼイン表面に脂肪鎖を化学的に就職させる方法などを検討したい。更には次年度が研究の最終年度にあたることから、研究内容をまとめ、成果の公開を積極的に行っていきたい。研究計画において、大きく変更が必要になった事柄は存在しない。よって当初の計画通り研究費を利用する予定である。具体的には研究遂行のための消耗品、謝金に対して主に執行し、また研究成果の公表のための学会活動参加のための旅費などに使用する予定である。
癌転移における好中球細胞外トラップ(NETs)の機能解析

食道癌術後や大腸癌肝転移術後において、感染性合併症が予後不良因子の一つであるとする報告がある。過大な手術侵襲や術後感染症などにより免疫能が低下することで、転移巣が急性増悪することが原因とされる。腹膜炎・手術侵襲下では、体内で好中球細胞外トラップ(Neutrophil extracelluar traps: NETs)と呼ばれる生体防御機構が惹起される。申請者らは敗血症性臓器障害の過程で初期にNETs形成と血小板凝集との相互作用により過度なNETosisが惹起され、NETosisに起因したDAMPsが血管内皮細胞の剥離・脱落を来し、生体に種々の障害を生じさせることを報告してきたが、この機構ががん細胞の転移にも重要な役割を果たしていると考えられる。また癌転移形成における血小板の重要な役割として、circulating tumor cellを血小板が取り囲み、血小板の細胞表面に存在するMHC class Iが癌細胞に移り、NK細胞などの免疫担当細胞から自己と認識されることで、免疫回避につながるという報告があるが、我々はこれまでに、血管内に入る前の原発巣において既に癌細胞が血小板に取り囲まれていることを報告してきた。本研究は、敗血症マウスモデルを作成し、転移促進に関与するNETs形成・血小板の細胞間相互作用という視点から癌転移に着目してその機構を解明する。さらに抗血小板作用を有するPDE3阻害剤(cilostazol)によるNET形成の制御により癌転移が抑制できるかどうかを検証することを目的とした。実験1)LPS腹腔内投与し敗血症マウスモデルを作成し、経時的に採血及び屠殺したマウスの肝臓を観察した。血液検査ではLPS投与6時間後の白血球一時的低下・再上昇、血小板の漸減を認めた。また摘出した肝臓の免疫染色にて12時間・24時間後にNETs形成・血小板凝集を証明した。実験2)血小板と各種膵癌細胞(高分化:BxPC-3、中分化:MIA-PaCa、低分化:PANC-1)の共培養を行い、BxPC-3と比較しMIA-PaCaやPANC-1は血小板との接着性が亢進していることを証明した。当初の予定通り、敗血症マウスモデルに各種膵癌細胞株を脾注し、転移における過程として、癌細胞周囲のNETs形成及び血小板凝集を同定し、癌細胞のトラップを証明する。膵癌細胞同定をヒト由来細胞核を染色するMab4383のみではなく、細胞形態評価目的に細胞膜・細胞質を染色するcytokeratinを用いて、膵癌細胞の同定を行う予定とした。また、膵癌細胞周囲の癌細胞周囲の活性化した好中球(NETs形成: MPO、neutrophil elastase)の有無や血小板凝集(P-selectin、vWF)を評価する予定である。これまでの実験過程において、敗血症マウスモデルの作成に難渋したが、薬剤調整・投与方法が確立し安定的にモデルマウス作成が可能となった。膵癌細胞同定をヒト

由来細胞核を染色するMab4383のみではなく、細胞形態評価目的に細胞膜・細胞質を染色するcytokeratinを用いて、膵癌細胞の同定を行う予定とした。また、膵癌細胞周囲の癌細胞周囲の活性化した好中球(NETs形成: MPO、neutrophil elastase)の有無や血小板凝集(P-selectin、vWF)を評価する予定である。これまでの実験過程において、敗血症マウスモデルの作成に難渋したが、薬剤調整・投与方法が確立し安定的にモデルマウス作成が可能となった。本年度の進捗状況としてやや遅れていることと、研究計画の変更が生じ、必要物品の購入の不足が生じた。次年度は後れを取り戻し、次年度分と合わせて適正に予算を使用する。
胃粘膜増殖因子の抽出および精製に関する研究

1.急性胃粘膜病変(AGML)患者および、塩酸エタノ-ル誘発AGMLラット血漿からの抽出物を、ヒト胃癌養細胞に投与し、各細胞への^3Hーチミジンの取り込みの促進が確認された。2.上記血漿を、硫安分画、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ-、さらにゲルクロマトグラフィ-にかけた結果、分子量約10万と1万の二つの「胃粘膜増殖因子活性」を精製した。3.小分子「増殖因子活性」をBio gelクロマトグラフィ-にかけ、ラジオイムアッセイをおこなった結果、本活性はTGFーαであることが確認された。4.大分子「増殖因子活性」をSDSーPAGE、HPLCにかけ、さらに精製した後、アミノ酸分析をおこない、一部PheーLeuーProーGluーArgーTyrというアミノ酸配列を得た。5.今回得られた「胃粘膜増殖因子活性」の正常胃粘膜や胃癌の増殖に及ぼす効果を、ガストリン、TGFα、プロスタグランディンE_2(PGE_2)、カルシトニン等と比較検討した。その結果、モルモット胃粘膜に対する増殖促進効果は胃粘膜増殖因子>TGFα=ガストリン>PGE_2>カルシトニンの順に強かった。一方ヒト胃癌KATOIII細胞に対してはTGFα=ガストリン>胃粘膜増殖因子の順で、PGE_2やカルシトニンは逆に抑制作用を示した。6.一方、細胞内の変化については、PGE_2やカルシトニンが、正常胃粘膜細胞やKATOIII細胞のcAMP合成を促進させたのに対して、ガストリンは、PI代謝回転を促進させ、かつ細胞内Ca^<++>濃度を上昇させた。さらに、「胃粘膜増殖因子」は正常胃粘膜細胞のCa^<++>濃度を上昇させ、かつチロジン・リン酸を促進させたが、KATOIIIに対してはその効果は弱かった。1.急性胃粘膜病変(AGML)患者および、塩酸・エタノ-ル誘発AGMLラット血漿からの抽出物を、ヒト胃癌培養細胞株KATO IIIおよびモルモット胃粘膜培養細胞に投与し、各細胞への^3Hーチミジンの取り込みの促進が確認された。2.本活性は56°C、30°Cの熱処理には安定であるが、80°C、10分の処理で失活する。またトリプシン、キモトリプシン処理で失活し、ヘパリンの存在下で発現されるので、まず蛋白質であると考えられる。さらにヘパリン依存性であることから、FGFのように細胞間支持組織のglycosaminoglycane(ヘパリン)等によって修飾を受け、活性化される可能性が考えられる。3.上記血漿を硫安分画ののち、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ-にかけることによって、「胃粘膜増殖因子」活性を約700倍に濃縮することができた。4.その後さらに本活性をゲルクロマトグラフィ-にかけた結果、「増殖因子活性」は分子量的10万の大分子部分と1万以下の小分子部分の2ヵ所に認められた。5.小分子の「増殖因子活性」を、さらにBio gelクロマトグラフィ-にかけた結果、分子量約6000の部分に溶出された。また本活性はラジオノムノアッセイの結果、TGFーαであると同定されたが、その他EGF、ガストリン、ヒスタミン、インスリン、IGFーI等のアッセイ系では同定されなかった。6.一方分子量約10万の「胃粘膜増殖因子」活性はSDSーPAGEの結果では分子量約8万の位置に認められた。

1.初年度(平成2年)の研究において、急性胃粘膜病変(AGML)患者および塩酸エタノ-ル誘発AGMLラット血漿中より得られた抽出物を、硫安分画、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ-、ゲルクロマトグラフィ-、SDSーPAGEにかけて「胃粘膜増殖因子」活性を精製した。2.上記の精製物をHPLCにかけてさらに精製した。3.これをさらに分析器にかけてアミノ酸分析をおこない一部PheーLeuーProーGluーArgーTyrというアミノ酸配列を得た。4.今回得られた「胃粘膜増殖因子活性」の正常胃粘膜や胃癌の増殖に及ぼす効果を、従来のガストリン、TGFα、プロスタグランディン、カルシトニン等と比較検討した。5.その結果、モルモット胃粘膜培養細胞への^3H^-チミジンの取りこみの促進効果は胃粘膜増殖因子〉TGFα=ガストリン〉カルシトニン〉プロスタグランディンE_2(PGE_2)の順に強かった。しかしヒト胃癌培養細胞KATOIIIに対してはTGFαとガストリンが同程度に促進効果を示したのに対して、「胃粘膜増殖因子」は作用が弱く、またPGE_2やカルシトニンはむしろこれを抑制した。6.一方、細胞内の変化については、PGE_2やカルシトニンが、正常胃粘膜細胞やKATOIII細胞のcAMP合成を促進させたのに対して、ガストリンは、PI代謝回転を促進させ、かつ細胞内Ca^<++>濃度を上昇させた。さらに「胃粘膜増殖因子」は正常胃粘膜細胞のCa^<++>濃度を上昇させ、かつチロジン・リン酸化を促進させたが、KATOIIIに対してはその効果は弱かった。
系統的破壊を通じた巨大有糸分裂装置・スピンドルの分子モデル構築

本研究では、遺伝情報を姉妹細胞へ継承するのに必須の細胞分裂装置・スピンドル総体の分子モデルを構築することを目標に定めた。近年、多くのスピンドル形成因子が報告され、またスピンドル形成の各過程には複数の機構が存在することも示されたが、遺伝子解析法の不完全さにより相矛盾する報告も多く、分子モデルの構築には至っていない。本研究では、ロバストな遺伝子破壊法を用い、スピンドル形成因子候補の役割を逐一詳細に突き止めることを目的とした。これまでに、ヒト培養細胞、ショウジョウバエ培養細胞、ヒメツリガネゴケ幹細胞を用いた研究で成果が上がった。ヒト培養細胞を用いた研究では、スピンドル極に局在する2因子が冗長的に働くことで、スピンドル微小管を極付近で収束させていることを見出した(Tungadi, Ito et al. J Cell Sci. 2017)。ショウジョウバエ培養細胞およびヒト培養細胞を用いた研究では、動原体微小管の末端に局在するモータータンパク質が微小管動態を制御することで動原体と微小管の安定な結合に必要であることを示した(Edzuka and Goshima. J Cell Biol. 2019)。ヒメツリガネゴケ幹細胞を用いた研究では、まず、植物の動原体構成因子の動態の包括的に描写することに成功した。さらに、遺伝子破壊・ノックダウン実験を駆使し、動原体の欠損により染色体の分配異常だけでなく、細胞質分裂の阻害が引き起こされることを発見した(Kozgunova et al. eLife. 2019)。ショウジョウバエの動原体因子のプロジェクトで予想に反する結果が出て予定外の追加実験を行ったため遅れは生じたが、最終的にこのプロジェクトを含めた3本の原著論文を公表できたため。動物培養細胞、植物細胞(ヒメツリガネゴケ原糸体幹細胞)に加え、酵母細胞でも遺伝子機能阻害プロジェクトを遂行する。これまでに、スピンドル極の収束、微小管生成、染色体のスピンドル内整列、細胞質分裂に関する興味深い予備的知見が得られたので、これらの点に特に着目する。CRISPR/Cas9法や相同組み換えを用いた特定の遺伝子の完全破壊と、RNA干渉、植物ホルモン・オーキシン依存的なタンパク質分解系を用いた別の遺伝子産物の迅速な分解を組み合わせることで、系統的な遺伝子機能阻害を行う。
二十世紀フランス文化圏における「アール・ネーグル」受容の総合的研究

本年度の研究は二つに大分される。一つは前年度に資料の渉猟を行ったマリの画家カリファラ・シディベ(Kalifala Sidibѐ)に関する研究であり、もう一つは前年度までに蓄積した「アール・ネーグル(ニグロ芸術)」研究の総括である。前者は、前年度に主にパリの国立図書館、ケ・ブランリー美術館メディアテーク、及びダカールの黒人アフリカ基礎研究所図書館で調査・渉猟した両大戦間の新聞・雑誌等を中心に、シディベの活動及びそれに対する当時の評価をプリミティブな視線及び同時代的関心事(黒人文化運動、植民地行政、民族誌)との関係性の中で考察を行い、学会発表及び論文投稿(印刷中)を行った。この研究では、世界的に見ても先行研究が皆無でありながら、両大戦間の西欧におけるアフリカ芸術受容を考えるうえで特異かつ重要なカリファラ・シディベという人物を再考するきっかけとなるものと評価されよう。発表及び論文では、シディベの絵画が、「ニグロ彫刻」の延長線上にあるようなプリミティヴィズムが反映された「真正」のアフリカ芸術として受容された側面と、西洋との接触を通じて生成した新たな「ニグロ芸術」として受容された側面という、重なりつつも異なる多様な評価が与えられていたことを明らかにした。本年度の研究のもう一点である「アール・ネーグル」研究の総括は、多分野にまたがる提議として、黒人(文化)表象とそれにまつわる美的質に焦点をあてた文化史研究を行った。そこでは研究代表者のこれまでの研究を「リズム」という主題に沿って新たな視点のもとに考察した。黒人表象と「リズム」とのクリシェともいえる結びつきを、アフリカとカリブの音楽・ダンスの側面、及びアフリカ彫刻の側面から言説史を再考し、両大戦間期の黒人知識人ら(L. T.アシル、L. S.サンゴール)によって、どのように主体形成へと接合されたのかを論じ、美的質としての「リズム」概念が必ずしもイデオロギー的に中立的なものではなく、文化政治的言説と美術批評との座標のなかで不安定に揺れ動く概念であることを指摘した。(抄録なし)フランスを中心としたアフリカ彫刻の言説史を研究するにあたり、本年度は特にフランス国立図書館や国立アーカイブ等を利用し、主に1910年代から40年代の雑誌、新聞、広報誌等を渉猟した。分析の中心となった刊行物は、まず、アフリカ彫刻及びモダニズム絵画の美術商P.ギヨームによって刊行された『パリの芸術』(Les Arts a Paris)があり、特に20年代以降のアメリカにおける黒人教育とアフリカ芸術に関するアメリカの医師であり美術収集家A.バーンズによる記事を中心に同誌の分析を進めた。続いて、マルティニーク系知識人らによる、ネグリチュード運動揺藍期を特徴づける『アフリカ通信』(Les depeches africaines)、『黒人世界誌』(La.revue du monde nolre)の研究に着手し、L.S.サンゴールの芸術論に強い影響を与えた人物であるバイ=サルツマンによる活動及び論考の分析を行った。加えて、先行研究ではあまり触れられてこなかったが、『アフリカ通信』へのP.ギョームの関与が明らかとなり、アフリカ美術の収集・批評家と黒人文化運動との結節点の一つとして次年度以降更なる分析を行う予定である。他方で、フランス植民地領西アフリカにおける教育の指針を提示する『フランス領西アフリカ教育公報』(Bulletin del'enseignement del'A.O.F.)を通じて、「原住民芸術」というより広範囲な範疇によるアフリカ芸術の分類、歴史化、教育、刷新等が扱われている点に注目し植民地主義の歴史研究に着手した。これらの資料媒体は、アフリカ彫刻が単なる美術的観点からの批評を超え、多用な形で援用されながら、「芸術」として概念形成されてきたことを浮き彫りにし、次年度以降の研究をより豊かなものとするだろう。科研費採択課題に沿って、本年度は海外(フランス、パリ)での資料調査(主に両大戦間期の新聞、雑誌)と論文執筆を中心に研究を行った。当初の課題通り、本年度の研究は三つのテーマに大分することができる。一つはフランス植民地行政とアフリカ芸術との相互的な影響関係であり、とりわけ植民地行政官G.アルディに焦点を当てた。パリの国立図書館及びケブランリー美術館の図書館にてアルディの論文及び著書を渉猟し、アフリカ芸術受容の文脈の中でアルディのアフリカ芸術観そして「原住民芸術」観を分析し、論文として発表した。二つ目のテーマは、セネガル出身の知識人・政治家らがどのような形で西欧におけるアフリカ芸術受容に関与していくかという問題だが、このテーマは、三つ目のテーマである、マリ出身の画家K.シディベ(1900?・1930)の資料調査(主にパリでの展覧会が開催された時期【1929年10月1の日刊新聞や雑誌)の過程で、興味深い形として結実してくることがわかった。つまり、新興の芸術分野である「アフリカ美術」、その中でも、とりわけ非アフリカ的とみなされていた「絵画」というジャンルにて人気を博したシディベの絵画及び彼の活躍に対し、植民地支配地域の知識人らは、一方で植民地地域の人々を鼓舞し新たな領域でのアフリカ黒人の活躍を予期させる存在として熱狂的に語りつつも、他方で過剰な評価の産物であるという冷静な判断をもとに着実な政治的参与の必要性へと帰着していく。シディベに関する研究発表及び論文執筆は平成25年度行う予定である。

本年度の研究は、狭義の美術界に限定されない形でのアフリカ芸術受容の言説をたどることの重要性を改めて認識させてくれるものであったといえよう。本年度の研究は二つに大分される。一つは前年度に資料の渉猟を行ったマリの画家カリファラ・シディベ(Kalifala Sidibѐ)に関する研究であり、もう一つは前年度までに蓄積した「アール・ネーグル(ニグロ芸術)」研究の総括である。前者は、前年度に主にパリの国立図書館、ケ・ブランリー美術館メディアテーク、及びダカールの黒人アフリカ基礎研究所図書館で調査・渉猟した両大戦間の新聞・雑誌等を中心に、シディベの活動及びそれに対する当時の評価をプリミティブな視線及び同時代的関心事(黒人文化運動、植民地行政、民族誌)との関係性の中で考察を行い、学会発表及び論文投稿(印刷中)を行った。この研究では、世界的に見ても先行研究が皆無でありながら、両大戦間の西欧におけるアフリカ芸術受容を考えるうえで特異かつ重要なカリファラ・シディベという人物を再考するきっかけとなるものと評価されよう。発表及び論文では、シディベの絵画が、「ニグロ彫刻」の延長線上にあるようなプリミティヴィズムが反映された「真正」のアフリカ芸術として受容された側面と、西洋との接触を通じて生成した新たな「ニグロ芸術」として受容された側面という、重なりつつも異なる多様な評価が与えられていたことを明らかにした。本年度の研究のもう一点である「アール・ネーグル」研究の総括は、多分野にまたがる提議として、黒人(文化)表象とそれにまつわる美的質に焦点をあてた文化史研究を行った。そこでは研究代表者のこれまでの研究を「リズム」という主題に沿って新たな視点のもとに考察した。黒人表象と「リズム」とのクリシェともいえる結びつきを、アフリカとカリブの音楽・ダンスの側面、及びアフリカ彫刻の側面から言説史を再考し、両大戦間期の黒人知識人ら(L. T.アシル、L. S.サンゴール)によって、どのように主体形成へと接合されたのかを論じ、美的質としての「リズム」概念が必ずしもイデオロギー的に中立的なものではなく、文化政治的言説と美術批評との座標のなかで不安定に揺れ動く概念であることを指摘した。当初の計画に沿い、本年度は両大戦間期を中心とした雑誌記事や新聞等を渉猟できたと同時に、先行研究では指摘されてこなかった論者や記事の分析を通じて、細かい歴史的事実や言説の変化を分析することができた。他方で、フランス国内においても、30年代のアフリカやマルティニック出身の知識人らによる刊行物は必ずしも全て揃っているわけではなく、アルシープにも存在しない巻号に関しては別の方策を講じる必要があるようだ。海外調査を通じ日本では参照不可能な資料を数多く渉猟できたこと、そして海外での研究者との情報交換は、本研究を大きく進展させるものであった。他方で、現地においても参照不可能な資料や散逸してしまっている資料が幾つかあったことは、本研究の目標を十全に達成させることができなかった要因であったといえよう。引き続き資料の渉猟と論文執筆・学会での発表に向けた資料整理が中心となる。特にフランスでの資料収集を通じて明らかとなった、20年代の保守系美術批評家によるアフリカ彫刻批判や、キリスト教使節団による多くのアフリカ彫刻論等は、執筆された政治的・文化的背景や意図(20年代後半の外国人排斥の流れや、ライシテ確立以降のキリスト教使節団らによるアイデンティティの模索)を含め研究を進める価値があるだろう。
生殖タイマーの神経機構

生物時計については,これまでのところ概日リズムをつくる時計がよく知られているが,タイマー時計についてはほとんど研究がない。報告者は,雄コオロギが約1時間の砂時計式タイマーをもつことをみいだし,それが最終腹部神経節に局在することを証明した。このタイマーの本体であるニューロンの同定をめざし,そこから影響を受けていると思われる運動ニューロンの活動をしらべた。具体的には精包準備行動(タイマーのスタート)後のスパイク頻度の変化を解析した。その結果,挿入器ニューロンは,精包準備後約8分で活動を停止した。交接器支配ニューロンには,8分で停止するもの,約10分まで減少して安定するもの,逆に増大して10分以後に安定するものなどがあった。腹葉支配ニューロンには,30分から減少し40分で安定するものと,逆に30分から発火して40分で安定化するものがあった。正中嚢支配ニューロンには,2つのスパイク群があり,その1つは,最初持続発火し,その後,バースト発火に変わり40分で安定化した。これらの時間依存的活動は,常にスパイク活動の変化が一定しており,最終腹部神経節を分離しても変わらなかった。このように異なるニューロンに異なる発火司令を送るものとしては,おそらくタイマーニューロンではないか思われる。一方,これらニューロンの標的器官の切除や支配神経切断によっていびつな精包ができた。このことは,これらの器官が精包材料の受け取り,分割,鋳型への搬入,保持などを分担して行っており,正常な精包形成には欠かせないものであることを示している。また,タイマーの修飾に関しては,雄を30分のストレス下におくと,タイマー時間が約20-30%短縮することが判明した。さらに付属腺から神経除去を行うと,これによっても30%の短縮がおこった。これらはいずれも生体アミンであるオクトパミンの影響によるものであることを示唆している。生物が体内に測時機構をもっていることはよく知られているが,その多くは概日時計に関するものである。これとは異なって,目覚まし時計のようなタイマー式の測時機構については,ほとんど知られていない。われわれは,雄コオロギが性周期のうち,精包準備(SP)から求愛開始(CS)までの時間が一定(約60分)であることの仕組みについて研究し,それがタイマーによって制御されていることを示した。このタイマーは最終腹部神経節にあること,また,タイマーには温度依存性があるが,タンパク質合成は関与していないことも明らかにした。次なるステップは,タイマーニューロンの候補の探索であるが,それにふさわしい活動とはいかなるものであるかを検討するため,最終腹部神経節の生殖器支配運動ニューロンの発火パターンを長時間記録し,結果を詳細に分析した。実験では,雄コオロギの体を開き,固定し,最終腹部神経節の神経束のうち,生殖神経を経て各種生殖器官を支配する神経分枝から遠心性神経のスパイク活動を吸引電極で長時間記録した。雄の性周期を更新するためには,交接器の感覚毛を人為的に刺激して精包を放出させ,交尾期から交尾不応期へと変化させた。一方,雄のアンテナを雌の体に接触させて精包準備を誘発し,タイマーをスタートさせた。その結果,スパイク頻度が常時一定で,時間依存性をもたないもの,2)常時自発活動がなく,タイマーストップ時の頃に突然,活動が開始するもの,3)SPから一定の時間経過後にゆっくりと活動が増大あるいは減少するものがあった。これらのうち,精包の形成になんらかの形で関わっている器官の運動ニューロンはタイプ3であった。

この結果は,精巧な精包のパーツを仕上げるためには,時間的制御が重要であることを示唆している。それら運動ニューロンの背後にある大元のタイマーニューロンの同定が必要である。生物時計については,これまでのところ概日リズムをつくる時計がよく知られているが,タイマー時計についてはほとんど研究がない。報告者は,雄コオロギが約1時間の砂時計式タイマーをもつことをみいだし,それが最終腹部神経節に局在することを証明した。このタイマーの本体であるニューロンの同定をめざし,そこから影響を受けていると思われる運動ニューロンの活動をしらべた。具体的には精包準備行動(タイマーのスタート)後のスパイク頻度の変化を解析した。その結果,挿入器ニューロンは,精包準備後約8分で活動を停止した。交接器支配ニューロンには,8分で停止するもの,約10分まで減少して安定するもの,逆に増大して10分以後に安定するものなどがあった。腹葉支配ニューロンには,30分から減少し40分で安定するものと,逆に30分から発火して40分で安定化するものがあった。正中嚢支配ニューロンには,2つのスパイク群があり,その1つは,最初持続発火し,その後,バースト発火に変わり40分で安定化した。これらの時間依存的活動は,常にスパイク活動の変化が一定しており,最終腹部神経節を分離しても変わらなかった。このように異なるニューロンに異なる発火司令を送るものとしては,おそらくタイマーニューロンではないか思われる。一方,これらニューロンの標的器官の切除や支配神経切断によっていびつな精包ができた。このことは,これらの器官が精包材料の受け取り,分割,鋳型への搬入,保持などを分担して行っており,正常な精包形成には欠かせないものであることを示している。また,タイマーの修飾に関しては,雄を30分のストレス下におくと,タイマー時間が約20-30%短縮することが判明した。さらに付属腺から神経除去を行うと,これによっても30%の短縮がおこった。これらはいずれも生体アミンであるオクトパミンの影響によるものであることを示唆している。
RNA結合タンパク質結合サイト周辺のRNA構造モチーフ発見とデータベース開発

本研究の主目的は、RNA結合タンパク質(RBP)結合サイト周辺に頻出する配列・構造モチーフを、CLIP-Seqデータから発見するための、RNAインフォマティクス技術の開発を行い、RBPのターゲット認識機構の解明を目指すことであった。この目的のために、二次構造のエネルギーモデルによる二次構造確率の計算と、RBP結合部位の配列特異性を表す重み行列(Position Specific Weight Matrix、PSSM)の推定とを条件付きランダム確率場(Conditional Random Fields、CRF)の枠組みで同時に行うアルゴリズム(RNAelem)の開発と実装を行っている。今年はRNAelemの最初の実装に成功し、シミュレーションデータを使った精度評価を行った。すると最適化されたパラメータは局所最適解に陥っており、精度が既存プログラムのものより劣ることがわかった。このため実装を変更し、バックグラウンド配列を、ポジティブデータのランダムシャッフルで置き換え、最急降下法の繰り返し計算のたびに、バックグラウンド配列をシャッフルし直す確率最適化法を用いることにした。すると、局所最適解に陥ることが少なくなり、精度が大幅に向上した。現在は、CLIP-seqの実データにRNAelemを適用する実験を行っている。課題は沢山のモチーフ候補パターンから尤もらしい候補を選ぶ手法であり、これについて検討を行っているところである。この他、更なる精度向上のために、ポジティブデータをランダムにバッチに区切り、確率最大可法を適用する手法の開発を進めているところである。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の主目的は、RNA結合タンパク質(RBP)結合サイト周辺に頻出する配列・構造モチーフを、CLIPーseqデータから発見するための、RNAインフォマティクス技術の開発を行い、RBPのターゲット分子認識機構の解明を目指すことであった。この課題については、二次構造のエネルギーモデルによる二次構造確率の計算と、RBP結合部位の配列特異性を表す重み行列(Position Specific Weight Matrix、PSSM)の推定とを条件付きランダム確率場(Conditional Random Fields, CRF)の枠組みで同時に行うアルゴリズム(RNAelem)の開発・及び実装に成功した。二次構造モチーフの生成ソフトウェアを用いたシミュレーション実験の結果、RNAelemは、従来のソフトウェアに比べて、高い精度で正しい二次構造モチーフを推定できることが分かった。また、RBP結合部位の配列特異性の強弱を変化させると、それに応じて、二次構造的な特異性への依存性もあるべき方向に変化することが分かり、アルゴリズムが妥当な動作をすることが判明した。今後は、背後にあるモチーフの二次構造パターンを様々に変化させた場合のRNAelemの精度変化を調べることにより、実用的なソフトウェアであることを検証することが必要である。本年度はそのほかに、本学術領域の実験研究者との共同研究を行い、CLIPーseq, RNAーseq, PARIS等のRNAとRBPに関する実データ解析を行った。配列・二次構造モチーフアルゴリズムについては、初年度に開発及び実装を終える予定にしていた。しかしながら、想定していたアルゴリズムを実装したところ、計算速度の面で十分な性能が出ず、十分な計算機実験も難しいことが分かった、このため、計算速度を改善するための新たな方策を考案・実装することが必要になった。計算速度を改善するため、予め計算済みの塩基対確率行列の値を用いて、塩基対を組むことを考慮する領域を制限することを試しているところである。また、確率モデル自体に柔軟性を持たせることにより、モチーフ候補として検索する二次構造パターンを減らすことができると考えており、これを試そうとしているところである。
宇宙マイクロ波背景放射偏光観測のためのメタマテリアル方式半波長板の開発

インフレーション仮説の検証に向けた観測装置開発として、メタマテリアル方式の半波長板の開発を進めている。メタマテリアル方式の半波長板は、誘電体に対して微細構造を作成することで実現する。これまで、設計および作成の両面から研究を進めてきた。設計においては、自作のソフトウエアは2次のEffective Medium Theory(EMT)に基づくものと、Rigirous Coupled Wave Analysis(RCWA)法と呼ばれるアルゴリズムを元に厳密解を計算する商用ソフトウエアに基づくものを取り入れて進めた。特に、前者の方が計算速度が速い。一方で、その計算精度はRCWA法と比較し精度が下がる。この精度について検証を行った。結果として、EMTを用いた計算では周波数依存はあるが1ー10%程度の計算精度にて高速計算ができることを示すことができた。これにより、設計速度の向上を実現した。また、製造についてはレーザー加工および3次元プリンターを用いた手法を利用した。CMB観測では、大きく分けて2種類の誘電体が用いられる。一つはプラクチック系材料(UHMWPE、HDPE)。もう一つは、アルミナ、サファイア、シリコンなどのセラミック系材料も用いられている。前者は加工が容易であるが、屈折率が小さい、また熱伝導性が悪いため、大型光学素子としては不向きである。一方で、後者はよりCMB実験への応用に適しているが、一方で加工性に難がある。それぞれの長所を生かして、プラスチック系材料については3次元プリンターを用いて簡易的かつ迅速に設計実証モデルを作成する。セラミック系は実際のCMB観測に用いることを想定した小型試作品の設計・製作・評価を進めている。メタマテリアル式波長板の開発を進めている。開発項目はメタマテリアルとしての機能を実現するための微細構造設計、作成、ミリ波光学評価である。今年度、設計およびレーザー加工機を用い微細構造の作成条件出しを進めた。現在保有するレーザー加工機の故障および修理に想定以上の時間を有した。自前の修理とコンプレッサーの交換を行い、現在は加工が行えるようになった。現在、プラスチック系誘電体に対して3次元プリンターを用いた微細加工方法と、セラミック系材料に対してレーザー加工を用いてメタマテリアル式波長板の設計・製造・評価を平行して開発を行っている。今年度は、それぞれの方式において、光学評価が可能なサンプルを作成し、評価を行う予定である。具体的には、プラスチック系材料をPLAから、よりミリ波光学素子として適しているポリプロピレンを用いる。すでに、3次元プリンターのためのポリプロピレンを調達しており、試作可能な段階に入っている。今年度の推進方針のベースになる点として、以下の成果があることを示す。すでに、3次元プリンターでは材料(PLA)を用いてサブミリメートルの反射防止機能および波長板として機能させるための異方性構造を有した微細構造アレイを同時に作成することに成功した。また、レーザーを用いた加工では、その加工条件出しを行うことで、現在ピッチ約500ミクロン、高さ2ミリメートル程度のサブミリメートル微細構造アレイを作成することに成功した。この2点の成果に基づき、プラスチック系材料はよりミリ波透過性の良いポリプロピレンを用いたメタマテリアル式波長板、またセラミック系材料はレーザー加工条件に基づき光学評価可能なサンプルを作成し、偏光特性評価を行う。インフレーション仮説はビッグバンの残り火である宇宙マイクロ波背景放射(Cosmic Mic rowave Background=CMB)のBモード偏光を観測することにより検証が可能であり、世界的にその発見に向けた熾烈な競争がある。本研究計画では、高感度化を目指し大型化する実験に対応すべく、自然界に存在する材料ではなく、人工的に光物性を設計、作成することができるメタマテリアル方式の偏光変調器のための光学素子、半波長板、の開発を目指す。波長よりも小さい構造を誘電体に作成した場合、その部分の屈折率は真空と誘電体の屈折率の間の値を持つことになる。ゆえに真空と誘電体の占める割合を調整することで、自由に屈折率を設定することができ、結果として人工的に光物性を設計し作成することができる。本研究提案では、ダイシングまたはレーザーの微細加工を用いることで、反射防止膜機能を持つ半波長板を単一誘電体から作成する。今年度は広帯域にて反射防止機構付き波長板として機能するための微細形状の最適化のためにシミュレーションを行なった。また、シミュレーションの手法には2通りあり、一つはEffective Medium Theoryを用いた近似的な手法、そして厳密解を用いた方法がある。両者は精度と計算時間のトレードオフする関係であり、前者では波長と形状のピッチの大きさが近い場合、有効誘電率と波長の依存性が大きくなり、広帯域にて反射防止機構付き波長板を機能を要求する場合手法として不適切であることを示した。したがって時間がかかるが厳密解を用いた手法を採用して行なう方針である。また、東京大学カブリ数物連携宇宙研究機構が保有するナノ秒UVレーザーを用いた微細加工の最適化を行なった。すでに、ピッチ0.4mm、高さ2mm程度の構造物を20mmx20mm程度の領域に加工することを示した。

本研究提案では、ダイシングまたはレーザーの微細加工を用いることで、反射防止膜機能を持つ半波長板を単一誘電体から作成する。今年度は広帯域にて反射防止機構付き波長板として機能するための微細形状の最適化のためにシミュレーションを行なった。また、シミュレーションの手法には2通りあり、一つはEffective Medium Theoryを用いた近似的な手法、そして厳密解を用いた方法がある。両者は精度と計算時間のトレードオフする関係であり、前者では波長と形状のピッチの大きさが近い場合、有効誘電率と波長の依存性が大きくなり、広帯域にて反射防止機構付き波長板を機能を要求する場合手法として不適切であることを示した。したがって時間がかかるが厳密解を用いた手法を採用必要があり結果として、想定していた最適化に要する以上に時間を要するため。インフレーション仮説の検証に向けた観測装置開発として、メタマテリアル方式の半波長板の開発を進めている。メタマテリアル方式の半波長板は、誘電体に対して微細構造を作成することで実現する。これまで、設計および作成の両面から研究を進めてきた。設計においては、自作のソフトウエアは2次のEffective Medium Theory(EMT)に基づくものと、Rigirous Coupled Wave Analysis(RCWA)法と呼ばれるアルゴリズムを元に厳密解を計算する商用ソフトウエアに基づくものを取り入れて進めた。特に、前者の方が計算速度が速い。一方で、その計算精度はRCWA法と比較し精度が下がる。この精度について検証を行った。結果として、EMTを用いた計算では周波数依存はあるが1ー10%程度の計算精度にて高速計算ができることを示すことができた。これにより、設計速度の向上を実現した。また、製造についてはレーザー加工および3次元プリンターを用いた手法を利用した。CMB観測では、大きく分けて2種類の誘電体が用いられる。一つはプラクチック系材料(UHMWPE、HDPE)。もう一つは、アルミナ、サファイア、シリコンなどのセラミック系材料も用いられている。前者は加工が容易であるが、屈折率が小さい、また熱伝導性が悪いため、大型光学素子としては不向きである。一方で、後者はよりCMB実験への応用に適しているが、一方で加工性に難がある。それぞれの長所を生かして、プラスチック系材料については3次元プリンターを用いて簡易的かつ迅速に設計実証モデルを作成する。セラミック系は実際のCMB観測に用いることを想定した小型試作品の設計・製作・評価を進めている。メタマテリアル式波長板の開発を進めている。開発項目はメタマテリアルとしての機能を実現するための微細構造設計、作成、ミリ波光学評価である。今年度、設計およびレーザー加工機を用い微細構造の作成条件出しを進めた。
蛋白質のミスフォールデングに起因するアミロイド症の異種動物への伝播性とそのリスク

アミロイドA(AA)アミロイド症は、血清アミロイドAが構造変換して形成されるAAアミロイドの臓器沈着により発症する疾患であり、同種動物および異種動物に伝播する、本研究では、ウシおよびニワトリ由来のAAアミロイドをマウスに接種することにより、その病態や熱に対する抵抗性について解析した。ニワトリおよびウシのAAアミロイドのマウスへの伝播は、マウスに比べて低率であった。マウスでのAAアミロイドの沈着は、時間の経過と共に消失し、再接種により増加した。AAアミロイド症の初期ではIL-6の発現が増加し,その後IL-10が増加した。また、動物由来AAアミロイドは、熱に極めて抵抗性を示すことが明らかとなった。蛋白質のミス・フォールデングに起因する疾病の中で、多種の動物で多発し種を超えて伝播が確認されているAAアミロイド(血清アミロイドAタンパク質SAAの構想変換体)の形成機構と起病性について解析を続けている。平成25年度は以下の4項目について検討し研究成果を得た。課題1ニワトリ、ウシおよびマウスに対する抗体の作成:ニワトリSAAのアミノ酸配列の一部を合成しマウスに免疫して抗体を得たが、ハイブリドーマの純化の段階で抗体価の高いハイブリドーマが得られなかった。ウシのSAA抗体に対して抗体を精製し免疫組織化学およびウエスタンブロット解析への活用が可能となった。課題2同種および異種動物へのAAアミロイドの伝達性と免疫組織化学的解析:同種の伝達実験では、マウスのAAアミロイドをマウスに投与することによりマウスのアミロイド症を発症させて経時的にマウス体内でのアミロイドの蓄積と減少を追跡調査した。ウシ由来アミロイドを用いたマウスへの伝達実験も開始した。課題3キメラSAA分子の発現と培養細胞を用いたアミロイド形成能の解析:マウスのSAA分子とウシのSAA分子のキメラを作成し、大腸菌内にて発現することを目的とした。本年度は、マウスSAA分子に色素を結合し、大腸菌内にて発現できるマウスSAA分子を得た。課題4免疫系細胞でのアミロイドの蓄積性と分解性の解析:マウス由来のマクロファージRaw株を用いてマウス由来AAアミロイドの蓄積性と分解性を解析した。マウスSAAとマウス由来AAアミロイドを細胞に添加した場合でのみアミロイドの蓄積性が細胞の周りに観察された。マウスSAAやAAアミロイド単独では細胞により急速に分解されることが明らかとなった。今後は、異種動物のAAアミロイドとの反応性について解析する予定である。蛋白質のミスフォールデングに起因するAAアミロイド症は鳥類やウシに発症し、臓器にAAアミロイドが蓄積して発症する致死性疾患である。AAアミロイドの前駆体は、血清アミロイドA蛋白質(SAA)であり、SAA濃度が高い動物にAAアミロイドを投与すると容易にアミロイド症を発症・伝播することができる。本研究はAAアミロイド症の発症機序と起病性を明らかにするものであり、平成26年度は以下の4項目を解析し結果をえた。課題1:ニワトリおよびウシSAAに特異的なモノクローナル抗体の作成:ウシSAAを用いてモノクローナル抗体の作製に成功しているが、ニワトリSAAに対するモノクローナル抗体の作製には至っていない。ニワトリSAAのN端側のアミノ酸配列に対して抗体を作製する予定である。課題2:同種および異種動物への伝達性と免疫組織化学的解析:マウス、ウシおよびニワトリのアミロイド症からAAアミロイドを精製し、マウスに炎症刺激を与えた後、アミロイドの伝達実験を行った。マウスAAアミロイドでは、ほぼ100%伝達したが、ウシおよびニワトリ由来のAAアミロイドの伝達性は低かった。課題3:キメラSAAの発現と培養細胞を用いたAAアミロイド形成の解析:マウスSAA1とマウスSAA3のキメラを作製して、キメラSAA分子を大腸菌で合成するのに成功した。課題4:免疫系細胞でのアミロイドの蓄積性と分解性の解析:マクロファージRaw株上でのSAA1からAAアミロイドへの構造変換を知る目的でマウスSAA1とAAアミロイドを細胞上で混合培養して解析しているが未だ充分に納得するデータを得ていない。AAアミロイドの前駆体は、血清アミロイドA蛋白質(SAA)であり、SAA濃度が高い動物にAAアミロイドを投与すると容易にアミロイド症を発症・伝達することができる。本研究はAAアミロイド症の発症機序と起病性を明らかにするものであり、平成27年度は以下の項目を解析し結果を得た。課題1.ニワトリSAAに対するモノクローナル抗体の作製:昨年度につづき、ニワトリSAAのアミノ酸を合成し、マウスに免疫してモノクローナル抗体の作製を試みた。結果的には、免疫組織化学検査に使用できる抗体は作製できなかった。しかし、免疫組織化学検査には、マウスの血清を用いて検査した。課題2.異種動物へのAAアミロイドの伝播性と免疫組織化学解析:自己免疫疾患マウスBL57 lpr/lrpと2型糖尿病疾患マウスBL57Ham ob/obにマウス、ウシ、ニワトリ由来のAAアミロイドを投与し、アミロイド症の伝播について解析した。

その結果、自己免疫疾患モデルマウスおよび2型糖尿病疾患モデルマウスともコントロールのマウスに比べて、AAアミロイド症の伝播性は低かった。課題3.キメラSAA分子の発現と培養細胞を用いたアミロイド形成能の解析:SAA1とSAA3とのキメラを作製してキメラSAA1/3とキメラ3/1を作製した。アミロイド形成能の解析については、平成28年度の課題とした。課題4.動物由来AAアミロイドの熱抵抗性試験:マウスとウシ由来のアミロイドの熱抵抗性について解析した。その結果、アミロイドは、熱に極めて抵抗性であり、100度の過熱でもマウスへの伝播性を有していた。マウスへの伝播性を完全に消失させるには、135度30分の加熱が必要であることが明らかとなった。課題1.ニワトリSAAに対するモノクローナル抗体の作製:ウシに対するモノクローナル抗体の作製は成功したが、ニワトリに関しては苦戦している。課題2.異種動物へのAAアミロイドの伝播性と免疫組織化学解析:平成27年度は、自己免疫疾患マウスと2型糖尿病疾患モデルマウスを用いてAAアミロイドの伝播性を解析した。両疾患モデルマウスにおいては、概ね、実験は順調に進み、結果を得ることができた。課題3.キメラSAA分子の発現と培養細胞を用いたアミロイド形成能の解析:キメラ作製まで進行している。培養細胞を用いたアミロイド形成については、平成28年度に実施する予定である。課題4.動物由来AAアミロイドの熱抵抗性試験:マウスおよびウシ由来のAAアミロイドの熱抵抗性について解析した。その結果、プリオン同様に、熱に抵抗性であることが明らかとなった。実験を平成27年度に終了し、学術論文として公表した。蛋白質のミスフォールデング(構造変換)に起因する疾病としては、プリオン病とアミロイド症が知られている。血清アミロイドA蛋白質(SAA)から構造変換して形成されるAAアミロイドは、致死性のアミロイド症を誘発し、異種動物(ウサギ、マウス)に経口的に伝播する。本研究では、ウシおよびニワトリのアミロイド症に由来するAAアミロイドの伝播性を中心に、AAアミロイドの形成や分解性および熱抵抗性について検討し、動物由来のAAアミロイドのリスクについて明らかにした。検討項目1.特異的なモノクローナル抗体の作製(mAb):ウシSAAに対しては、ウエスタンブロットおよび免疫組織化学検査で有効なmAb 25BF12を得ることができた。検討項目2.同種および異種動物へのAAアミロイドの伝播性と免疫組織化学的解析:ウシおよびニワトリ由来のAAアミロイドは、マウスに伝播した。しかし、自己免疫疾患モデルマウスおよび糖尿病疾患モデルマウスを用いた動物由来AAアミロイドの伝播性の解析では、コントロールに比べて伝播性は低率であった。検討項目3.動物由来AAアミロイドの熱抵抗性試験:全般的に、AAアミロイドは、100度の熱に抵抗性を示し、マウスに伝播することが示された。一方、135度の加熱では、AAアミロイドの伝播性は消失し、動物由来AAアミロイドは、熱に抵抗性を有することが明らかとなった。検討項目4.培養細胞を用いたAAアミロイドの蓄積性と分解性、および細胞内活性因子の解析:
甲状腺ホルモン核受容体の転写発現調節因子のクローニングと機能解析

甲状腺ホルモン核受容体のプロモーター配列1300塩基対を、4つに分けてPCRで増幅後、300400塩基対のフラグメントを得た。片側の末端をDNAポリメラーゼと^<32>P-dCTPで標識し、成熟ラット肝核抽出液を用いフットプリントを行った結果、10カ所の部位で蛋白質の結合が確認された。先に報告された転写開始起点に、最近位のGCボックスは、その他4カ所のGCボックスと異なり、プロモーター全体の転写活性に、重要な役割を担っている。最近位のGCボックスを含む約20塩基対の配列に結合する蛋白質を成熟ラット脳のcDNAライブラリーを用い現在クローニングを進めている。結合部位のうち、-913-904の部位は、POU転写因子の結合配列と相同の部位であった。成熟ラット脳、肝、腎、心、脾、精巣の核抽出液を用い、ゲルシフトを行ったところ、単一のバンドが得られた。ラット脳核抽出液を、胎生19日、生直後2時間、24時間、2日、6日から得、同様のゲルシフトを行ったところ、胎生期と生直後のバンドはいずれも1本であったが、バンドの移動度に変化を認めた。この配列に結合する蛋白のDNA配列に対する親和性をスキャッチャード解析したところ、成熟ラットのそれぞれの臓器の核抽出液は、ほぼ同様の親和性を示したが、胎生期の蛋白は、成熟ラットの親和性よりも高く、異種のものである可能性が考えられた。現在、ラット脳の胎生期、及び成熟ラット脳のcDNAライブラリーを用い、サウスウエスタン法によりこれらの蛋白のクローニングを行っている。