hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
カドミウムの血管毒性防御の分子機構を担う転写因子Nrf2

カドミウムの血管毒性に対する生体の防御システムの解明を目的として、培養血管内皮細胞を用いて、カドミウムの毒性に対するNrf2/Keap1系の防御的役割とその分子機構を解析した。その結果、内皮細胞はNrf2/Keap1系にてカドミウムを感知し、活性化されたNrf2が抗酸化応答配列を介してメタロチオネイン-I/IIを含む抗酸化酵素群の発現誘導を正に制御することにより、カドミウムの毒性に対して防御に働く細胞応答システムであることが明らかとなった。環境汚染重金属であるカドミウムは、現在でも低レベルで環境中・食品中に存在し、長期にわたって曝露することにより、ヒトの健康を障害する可能性が指摘されている。しかし、カドミウム曝露に対する細胞応答・適応の分子機構には未だに不明な点が多い。本研究の目的は、Nrf2-Keap1システムがカドミウムの毒性防御機構において重要な役割を担っているという仮説に基づき、カドミウム曝露による血管内皮傷害に対する防御応答の分子機構を明らかにすることである。ウシ大動脈血管内皮細胞において、無毒性レベルのカドミウムの曝露により、濃度依存的に転写因子Nrf2の活性化が生じ核への蓄積が観察された。またそれに伴い、濃度依存的な抗酸化剤応答配列の転写活性化が見られた。またカドミウムの曝露により、Nrf2の下流のタンパク質としてヘムオキシゲナーゼ-1やNAD(P)H :キノン酸化還元酵素1、γ-グルタミルシステイン合成酵素などの抗酸化酵素群の発現誘導が観察された。そこで、RNA干渉によりNrf2をノックダウンしたところ、カドミウムの細胞毒性は有意に増強された。このとき、カドミウムによるNrf2の下流のタンパク質の発現誘導が減弱していたが、興味深いことにメタロチオネイン-I/II(MT-I/II)の発現誘導レベルも減少していた。また、Nrf2欠損細胞のモデルとしてNrf2遺伝子欠損マウスの初代肝細胞を用いて検討した結果、野生型に比べNrf2欠損細胞でカドミウムの細胞毒性は顕著に増強された。また同条件下において、細胞内カドミウム蓄積量に変化は見られず、カドミウムによるMT-I/IIの発現誘導がNrf2の欠損細胞において減弱していた。以上の結果より、転写因子Nrf2はカドミウムに対して、抗酸化酵素群だけでなくMT-I/IIの発現誘導を正に制御することにより毒性防御に働く細胞応答システムであることが示唆された。昨年度の研究成果より、血管内皮細胞におけるカドミウムの毒性発現に対する転写因子Nrf2の防御的な役割が明らかとなった。そこで本年度は、Nrf2を負に制御している感知・応答センサーであるKeap1の役割と、メタロチオネイン(MT)の発現誘導機構におけるNrf2の作用機序を検討した。その結果、無細胞系においてKeap1のチオール基とカドミウムは強い親和性を示した。また、ウシ大動脈血管内皮細胞(BAEC)においてKeap1をノックダウンしたところ、恒常的なNrf2の活性化およびAREの転写活性化が観察され、カドミウムの細胞毒性を軽減できた。同条件下において、カドミウム曝露によるMT-I/IIの発現誘導レベルは増強していた。また、MT-Iのプロモーターアッセイを行ったところ、Nrf2のノックダウンによりMT-Iのレポーター活性は有意に低下し、この効果はMT-Iのプロモーター領域に存在するARE配列に変異を加えることでほぼ消失した。したがって、Nrf2はMTのプロモーター領域のARE配列に依存した機構でMTの発現誘導を正に制御していることが示唆された。加えて、Keap1欠損細胞のモデルとしてマウス初代肝細胞を用いて検討した結果、Keap1欠損細胞は野生型に比べてカドミウムの毒性に耐性を示し、MT-I/IIの発現誘導レベルもやはり増強していた。以上の結果より、内皮細胞はNrf2-Keap1系にてカドミウムを感知し、活性化されたNrf2がAREを介してMT-I/IIの発現誘導を正に制御することにより、カドミウムの毒性に対して防御に働く細胞応答システムであることが明らかとなった。以上の成果は現在投稿準備中である。
ヒト腎髄質集合管上皮細胞培養法の確立と同細胞alpha2受容体存在と役 割に関する研究

研究によって得られた新たな知見等の成果ヒト腎髄質、乳頭部の集合管上皮細胞の選択的分離培養で以下のことが判明した。1、分離培養は可能であるがラット腎集合管上皮細胞と比べ、増殖力は弱く、受容体解析、サイクリックAMP測定等に十分な細胞を確保することは困難であった。2、継代培養による増殖では母細胞と異なるファイブロブラストの出現が多く、継代培養細胞に母細胞と同一性を見い出せなかった。3、新鮮ヒト腎皮質、髄質はサイクリックAMP測定には不適当であったが、受容体解析は可能であった。この結果、ヒト腎皮質、髄質粗膜分画で交感神経alpha2受容体に特異的拮抗作用を持つ^3H-ロウオルシンの結合をみた。この結合は皮髄質共に迅速で飽和性を示し、非特異的alpha受容体拮抗薬フェントラミンで分離された。Scatchard解析で結合は直線性を示し、Kdは5.6nM(皮質)、5.1nM(髄質)、Bmaxは33.4fmol/mg protein(皮質)、63fmol/mg protein(髄質)であった。拮抗阻害作用を検討し、アンタゴニスト群では、皮髄質共に、ロウオルシン、ヨヒンビン、WB4101、BAM1303、オキシメタゾリン、SKF104078、プラゾシン、コリナンチンの順に親和性を示すことが判明した。以上の結果から、ヒト腎皮質髄質共に、交感神経alpha2受容体のサブタイプalpha2A受容体の存在を示す結果が得られた。この結果は他研究所で報告のある遺伝子ハイブリダイゼーションによるヒト腎alpha2C受容体の存在とは異なるものであった。まったく違った方法による結果であり、今後の検討が必要である。展開交感神経alpha受容体はサブタイプ1と2に分けられ、さらにそのサブタイプA、B、Cが証明されつつある。これら究極の特異的分類はそれぞれの受容体に極めて特異的な拮抗薬の開発を可能とさせ、その薬物の主作用を限定し、副作用を少なくさせる可能性を示すものとみられる。この結果、ヒト腎皮質、髄質粗膜分画で交感神経α2受容体に特異的拮抗作用を持つ^3H-ロウオルシンの結合をみた。この結合は皮髄質共に迅速で飽和性を示し、非特異的α受容体拮抗薬フェントラミンで分離された。

拮抗阻害作用を検討し、アンタゴニスト群では、皮髄質共に、ロウオルシン、ヨヒンビン、WB4101、BAM1303、オキシメタゾリン、SKF104078、プラゾシン、コリナンチンの順に親和性を示すことが判明した。以上の結果から、ヒト腎皮質髄質共に、交感神経α2受容体のサブタイプα2A受容体の存在を示す結果が得られた。この結果は他研究所で報告のある遺伝子ハイブリダイゼーションによるヒト腎α2C受容体の存在とは異なるものであった。まったく違った方法による結果であり、今後の検討が必要である。展開交感神経α受容体はサブタイプ1と2に分けられ、さらにそのサブタイプA、B、Cが証明されつつある。これら究極の特異的分類はそれぞれの受容体に極めて特異的な拮抗薬の開発を可能とさせ、その薬物の主作用を限定し、副作用を少なくさせる可能性を示すものとみられる。1.ヒト腎皮質、髄質の新鮮細胞上皮に交感神経α受容体のうちサブタイプα1受容体とα2受容体の存在がradioligand binding assay法により証明された。2.ヒト腎髄質、乳頭部の集合管上皮細胞の選択的分離培養で以下のことが判明した。a.分離培養は可能であるが実験試料として十分ではない。b.継代培養はできない。従って、継代による増殖は不可能である。展開1.現在、交感神経α受容体のサブタイプα1A、α1B、α2A、α2B受容体に各々特異的親和性をもつWB4101、CDC、ロオウオルシンが入手可能となった。これによりα1、α2受容体のサブタイプの同定が行われる予定である。2.同時にcAMP測定による細胞内刺激伝達系の情報も得られる可能性がある。3.また、これら選択的α受容体遮断薬は、ヒト腎髄質のみならず、α受容体濃度のより高いヒト腎皮質の交感神経α受容体への研究にも応用が期待出来る。ヒト腎皮質α受容体は、これを介して、水・電解質再吸収を抑制する作用、あるいは近位尿細管におけるPTH(副甲状腺ホルモン)の受容体を介するcAMP産生を抑制することが動物実験で知られてきた。しかし、ヒトでは、in vivo,in vitroともに未だ証明されていない。従って、今回の実験方法と選択的α受容体遮断薬がヒト腎皮質へのα受容体研究にも応用可能となる。
局所適合セミパラメトリック平滑化の理論

パラメトリックモデルを用いた平滑化推定量を初期推定量とし、その残差をノンパラメトリックに平滑化したセミパラメトリックな平滑化推定量を提案し、その推定量の良さ・挙動を理論的、数値的に調べてきた。回帰においては、このセミパラメトリック推定方式による回帰平滑化推定量のクラスを提案した。理論的考察により、提案されたセミパラメトリック推定量は、我々が想定したパラメトリックモデルがデータの背後にある構造の少なくともその近傍に構成されている時にはノンパラメトリック推定量、特に従来の核型推定量を優越する事がわかり、その優越の度合いはパラメトリックモデルの持つバイアスにより規定される。また、パラメトリックモデルがバイアスを持つ場合でも、このセミパラメトリック推定量は一致性を持つ事が証明され、ノンパラメトリックな調整項の重要性が確認できた。提案された推定量の良さの尺度としての平均積分2乗誤差をシミュレーションで数値的に評価し、理論的結果を検証した。このように、回帰においても昨年度進行した密度推定の研究で得た結果とほぼ同様の結果を得る事ができ、局所適合セミパラメトリック平滑化の有効性が確認できた。また、密度推定の研究の延長として、提案した推定量のクラスの中で漸近的に最良な推定量を規定する特性量の推定問題についても、推定量の構成アルゴリズムを提案するのと同時に、特性量の一致推定量も構成し、その挙動について調べた。核型推定量を初期推定量として、その残差をノンパラメトリックに調整して得られるフルにノンパラメトリックな密度推定量は縮小バイアスをもつことがわかり、そのような推定量の一般的なクラスを構成し、最良の推定量を導出した。理論的挙動についての結果を導き、有限標本での挙動はシミュレーションで考察した。結果は部分的に、北海道大学での日本統計学会において発表した。パラメトリックモデルを用いた平滑化推定量を初期推定量とし、それをノンパラメトリックに調整したセミパラメトリックな平滑化推定量を提案し、その推定量の良さ・挙動を理論的、数値的に調べた。密度推定においては、このセミパラメトリック推定方式による密度推定量のクラスを提案した。統計的漸近理論を駆使した理論的考察により、提案されたセミパラメトリック推定量は我々が想定したパラメトリックモデルがデータの背後にある構造を含むように、あるいは少なくともその近傍に構成されている時にはノンパラメトリック推定量、特に核型推定量を優越する事がわかった。その優越の度合いはパラメトリックモデルの持つバイアスにより規定される。また、そのクラスの中で漸近的に最良の推定量も導出し、推定量の構成アルゴリズムを提案した。回帰平滑化でこのセミパラメトリック手法を用いた場合、得られる推定量の良さを従来の多項式回帰(パラメトリック)や局所多項式回帰(ノンパラメトリック)と比較し、密度推定の場合とほぼ同様の結果を得た。ここでは、従来のパラメトリック回帰推定量とその残差のノンパラメトリックな平滑化推定量と加法的に結合する方法が有効であることがわかった。回帰におけるこのセミパラメトリック手法は、多変量回帰、成長曲線分析にも拡張された。回帰における結果は部分的に、広島大学での日本数学会秋季総合分科会やアメリカ合衆国アラバマ大学で開催された国際会議において発表した。
染色体高精度解析の技法改良と、その遺伝子マッピングへの応用

1.既存の高精度染色体文染法(細胞同調法、染色体凝縮抑制法など)の各種培養細胞系への汎用性を検討し、とくに蛍光in sibuハイブリダイゼーション(FISH)への適用を目的として既存法の改良を行った。1)エチジウムブロマイド(EB)による染色体凝縮抑制法は、抹消血培養に好適であるが、増殖能の高い腫瘍細胞株にも、処理条件を改変(コルセミド、EBの処理濃度を通常より低く)することで好結果を得た。2)イヌ(Canis familiaris)の血液培養にメソトレキセート(MTX)による同調法とBrdu添加法を適用して高精度R分染像の標準化に寄与した。3)リンパ芽球細胞株にMTX同調培養法を適用した場合に好結果が得られないのは、MTX解除後に分裂期に入るまでの時間(6.57)時間が遅いためであることが判った。そこで過剰チミジン添加による細胞同調を行い、かつEB法を併用した至適条件(処理時間、濃度)を検討し550バンド期以上の高精度分染標本を作製する技法を確立した。2.EB法を抹消血培養に適用して染色体構造異常の切断点を解析し、次のような疾患遺伝子座の領域マッピングを行った:ダウン症候群関連領域(22q22.2→qter)、HMC症候群(1q31.2又は7p15.1-p15.3)、神経線維腫症第2型(22912.2)。さらに、染色体異常症候群の各種構造異常(相互転座、部分欠矢、部分重複、リング染色体など)を解析し、それぞれの表現型異常に関連する染色体領域を詳細に検討した。3.上記方法で作製した染色体の高精度分染標本を用いて、反復配列のDNA(メサテライトDNA、テロメアDNA、rDNA,Alu配列を含むDNA断片など)および21番染色体に由来たユニーク配列DNA(NOtI-SfiI-リンキングクローンなど計20種)をプローブとしたFISHを行った。前者では各種の構造・数的染色体異常の性状解析に適用し、後者では550バンド期での高精度領域マッピングを行った。[1]既存の高精度染色体分染法(細胞同調培養法,染色体凝縮抑制法など)の各種培養細胞系への汎用性を検討した.1)臭化エチジウム(EB)による染色体凝縮抑制効果を利用した方法は、増殖能の高い腫瘍細胞株に対しては処理条件を改変する(コルセミド処理を短かく、EB濃度を通常より低くする)ことにより適用可能であることを認め、腎癌細胞株の染色体構造異常の解析に資した.2)リンパ芽球細胞株にメソトレキセ-ト(MTX)による細胞同調法を適用した場合に好結果が得られないのは,MTX解除後に分裂期に入る迄の時間(6.5ー7.5時間)が遅いためであることを認めた.3)イヌ(Canis familiaris)の血液培養にMTX同調ーBrdU処理法を適用して高精度Rーバンドを検出させることによって76個の全染色体の同定を可能とし、高精度Rバンドパタ-ンの模式図作製に貢献した.[2]EB法を用いて各種の染色体構造異常の高精度バンド解析を行い、次のような疾患遺伝子(領域)座の領域マッピングに貢献した.ダウン症関連領域(4/21転座由来の部分トリソミ-の解析):22q22.2

→gter.HMC症候群(1/7転座の解析):1q31.2又は7p15.1ーp15.3.神経線維腫症第2型(4/22転座例及び22qの部分欠損例の解析):22q11.23ーq12.2.[3]遺伝子領域マッピングに貢献できた上記染色体異常の他に、21番環状染色体を始めとする数種の染色体異常保有者に由来したリンパ芽球細胞株を昨年度に引きつづき樹立し、凍結保存した.[4]ビオチン標識したDNAプロ-ブによるin situハイブリダイゼ-ション法と高精度分染法との併用を試みる第一段階として、18番の偽二動原体染色体を解析し、不活化動原体部にもアルファサテライトDNAをプロ-ブとして検出できるセントロメアDNAが残存していることを確認した.1.エチジウム・ブロマイド(EB)法の応用と、その適用範囲の検討(1)染色体高精度分染法の簡便法として本研究代表者が開発したEB法を、未梢血培養による各種染色体構造異常の解析に適用し、本法の実用性を再評価した。主要例の内訳は:(1)第18染色体の逆位[inv(18)(p11.2g21.3)]の保因者に由来した組換え染色体の逆位[rec(18),dup g,inv(18)]を有する患児(第18短腕の部分的モノソミ-、長腕の部分的トリソミ-);(2)多重癌(肺癌,乳癌,皮膚癌)の男性例に見られたY染色体と第6染色体短腕間の相互転座[t(Y;6)(g12;p21)](正常核型の細胞とのモザイク);(3)後天性多嚢胞腎患者(腎細胞癌を併発)に見られた先天性相互転座[t(7;19)(g22;g13.1)]など。上記の後2者は、転座切断点に腫瘍発生に関わる遺伝子か座位する可能性を示唆する点で特に興味深い。他に、Duchenne型及び常染色体性の筋ジストロフィ-症4例について高精度バンド解析したが、微細構造異常は認定されなかった。(2)腫瘍の初代培養細胞(腎癌,大腸腺腫ポリ-プ,デスモイド腫瘍)にEB法の適用を試みたが、高精度バンド解析には至らなかった。しかし、増殖能の旺盛な培養樹立株にはかなり有効であった。2.同調培養法の再検討:リンパ芽球細胞の染色体は短縮しやすいので、EB法や同調法を用いても高精度解析が難しい。同調法の改良を目的として、同調剤MTXの処理濃度を検討したところ、従来の10^<-7>Mより高濃度(3×10^<-7>,3×10^<-6>M)で有効性がより高いことを認めた。(1)超高級蛍光顕微鏡及び各種機材を新設・整備し、来年度以降の単一配列DNAプロ-ブの高精度領域マッピングの準備を完了した。(2)セントロメアとテロメアのDNAプロ-ブによるFISHを行い、各種染色体異常(トリソミ-,環状染色体など)の性状解析を行った。1.リンパ芽球細胞株(LCL)における高精度染色体分染の技法検討:遺伝子地図の作成に際し、染色体構造異常を有するLCLを試料とした高精度バンド解析が必要な局面が非常に多い。LCLに、末梢血リンパ球培養で汎用されるエチジウムブロマイド(EB)法を適用しても良好な結果が得られないので、メソトレキセート(MTX)による細胞同調とBrdu取組みとの併用法(高精度Rバンドを検出)の至適条件を検討した。その結果、MTX(3×10^<-7>M)17時間処理およびBrdu(30mg1ml)の77.5時間が至適であることを確認した。2.各種の染色体構造異常の高精度バンド解析: EB法による高精度G分染法、MTX-Brdu法による高精度R分染法を用いて、次のような構造異常の正確な切断点を同定し得た。転座t(7;16)(q11.12;q24)、欠失del(4)(q32q35)、欠失del(xq)、重複dup(16q)など。
脳内神経伝達機能の画像診断を可能にする新規放射性診断薬の開発に関する研究

本研究の成果は、以下のように要約される。1.既に開発した脂溶性プロドラッグの妥当性を評価するために、1-FTMのα-炭素を水素化したモデル化合物にてエステル化の効果を検討した。メチルエステル体の脂溶性は向上し、高い脳移行性が確認された。よって、脳機能診断薬開発におけるエステル化の有用性が示された。2.アミノ酸膜能動輸送機構の利用を考え、DOPA構造類似体のヨウ素標識体の脳内ドーパミン生合成機能測定の可能性を検討した。I-L-mTyrはアミノ酸膜能動輸送機構により脳や膵臓に高く集積した。同時に、高い代謝安定性と体外排泄性を具備していることから、アミノ酸膜輸送機能診断薬として有用であることが示された。3.2種のI-L-mTyr位置異性体を分取し体内挙動を比較した。6位標識体(6-I-L-mTyr)ではマウス脳に滞留した。この脳集積は、立体選択的なエネルギー依存性能動輸送機構によるものであり、AADCの中枢性阻害剤で前処置した場合、中脳領域の集積が無処置群と比較して低下した。よって、6-I-L-mTyrは脳内ドーパミン作働性神経終末機能診断薬として有用であると考えられた。4.代謝安定性を具備する数種のヨウ素標識アミノ酸を選択し、腎排泄機序を詳しく検討した。その結果、多くは有機酸輸送系に関与しており、アミノ酸輸送蛋白の特定アイソフォーム発現系における輸送特性から、I-AMTが、特定トランスポーターに高親和性を示すことを見い出した。5.脳機能診断薬の血清蛋白結合部位において置換効果を有する安全性の高い薬物を用い、血中遊離濃度を増大させ、脳移行性の向上と体外排泄の促進を試みた。脳血流診断薬I-IMPの血清蛋白結合部位を同定すると共に、競合阻害効果を示す安全性の高い置換薬を併用し、組織移行性の決定因子である血中遊離濃度を顕著に増加させ得ることを確認した。一連の検討結果より、脳内神経伝達物質の生合成前駆体であるチロシン、ドーパの誘導体I-AMT、I-DOPAが、脳のアミノ酸膜輸送機能を選択的に測定し得る放射性診断薬として有用であることを明らかにした(06770731,07770764)。また、脳内神経終末でチロシンを神経伝達物質に変換する芳香族アミノ酸脱炭酸酵素(AADC)活性測定を目的として、AADCの阻害剤であるDFMTを標識原料として、そのヨウ素標識体の評価を行った。I-DFMTの代謝安定性は高く、その脳集積はAADC活性に依存していたが、脳への集積量は低かった(08770750)。詳細な検討より、I-DFMTは生理的pHではアミノ基が十分に解離しておらず、カルボキシル基の荷電が膜透過性を低下させたと考えられた。そこで、脂溶性による脳移行性の向上と脳内での酵素的解裂によりI-DFMT生成が期待されるメチルエステル体(I-FTM)をプロドラッグとして応用した。I-FTMは予想通り高い脳移行性を示し、脳内で速やかに脱メチル化され、I-DFMTに変換されることが確認された。I-FTMの脳スライスへの集積はAADC阻害剤の前処理により有意に低下し、I-FTMの脳への集積がAADC活性の指標になると考えられた(09557071)。

meta-Tyrosine(mTyr)は芳香環4位の水酸基を欠くDOPAの構造類似体であることから、I-mTyrが脳内ドーパミン生合成機能を測定し得る可能性を有する。一方、mTyrを直接酸化法で標識すると2種の位置異性体が生成することから、逆相系HPLCを用いて分取し、これらの体内挙動を比較した。6位標識体(6ーI-mTyr)ではマウス脳に滞留する傾向が見い出された。組織集積阻害実験の結果、両者の脳への集積は、立体選択的なエネルギー依存性能動輸送機構によるものであった。酵素阻害実験では、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素の阻害剤NSD-1015により6ーI-mTyrの脳集積が有意に低下したが、チロシン水酸化酵素の阻害剤であるH22/54では影響が認められなかった。よって、6ーI-mTyrは脳内ドーパミン作働性神経終末機能診断薬として有用であると考えられた。脳内神経伝達機能の核医学診断法の開発は、脳機能と精神疾患等の関連性を明らかにする上で極めて重要である。これまでに、脳内神経伝達物質の生合成前駆体であるチロシン、ドーパの誘導体I-AMT、I-DOPAが、脳のアミノ酸膜輸送機能を選択的に測定し得る放射性診断薬として有用であることを明らかにした(06770731,07770764)。また、脳内神経終末でチロシンを神経伝達物質に変換する芳香族アミノ酸脱炭酸酵素(AADC)活性測定を目的として、AADCの阻害剤であるDFMTを標識原料として、そのヨウ素標識体の評価を行った。I-DFMTの代謝安定性は高く、その脳集積はAADC活性に依存していたが、脳への集積量は低かった(08770750)。詳細な検討より、I-DFMTは生理的pHではアミノ基が十分に解離しておらず、カルボキシル基の荷電が膜透過性を低下させたと考えられた。そこで、脂溶性による脳移行性の向上と脳内での酵素的解裂によりI-DFMT生成が期待されるメチルエステル体(I-FTM)をプロドラッグとして応用した。I-FTMは予想通り高い脳移行性を示し、脳内で速やかに脱メチル化され、I-DFMTに変換されることが確認された。I-FTMの脳スライスへの集積はAADC阻害剤の前処理により有意に低下し、I-FTMの脳への集積がAADC活性の指標になると考えられた(09557071)。既に、ヨウ素標識L-meta-tyrosine(I-L-mTyr)が、アミノ酸膜能動輸送機構によりアミノ酸代謝の盛んな脳や膵臓に高く集積することを見い出した。この化合物は、同時に高い代謝安定性と体外排泄性を具備していることから、アミノ酸膜輸送機能診断薬として有用であることが示された(Nucl.Med.Commun.20:153-157,1999)。一方、mTyrを直接酸化法でヨウ素標識すると2種の位置異性体が生成することから、逆相系HPLCを用いて分取し、これらの体内挙動を比較した。6位標識体(6-I-mTyr)ではマウス脳に滞留する傾向が見い出された。
骨髄内酸素環境が及ぼす破骨細胞動態のin vivo解析

研究代表者らは、破骨細胞分化にかかわる研究に長年取り組んでおり、2015年、破骨細胞分化の制御において好気的代謝が重要な役割をもつことを報告した。当該成果から、破骨細胞を取り巻く酸素は破骨細胞制御にかかわる重要な環境因子であることが考えられる。しかしながら、生体内で種々の細胞がどの程度の酸素分圧に日々晒されているのか、そして恒常的な酸素環境が乱された際に細胞にどのような影響がもたらされるかは不明である。本研究では、近年、研究代表者らが取り組んでいる時間相関単一光子計数による寿命測定法を用いた定量イメージンングを活用することで、生体内破骨細胞における酸素と代謝の関係性を明らかにすることを目的とする。本年度は、二光子蛍光寿命イメージングを用いて破骨細胞の代謝動態を解析するための2つの実験系を確立した。1つは、ATPに対するFRET型バイオセンサーGOATeamを発現するマウスの系統を用いたエネルギー代謝の解析である。GO-ATeamは、ドナータンパク質EGFPとアクセプタータンパク質OFPをATP結合ドメインで連結した構造をもち、ATPの量に応じてGFPからOFPへのFRETを生じるバイオセンサーである。通常、FRETを計測するためには、EGFPとOFPの蛍光強度を用いたレシオ法が用いられるが、二光子蛍光寿命イメージングを用いることでドナータンパク質EGFPの寿命測定からFRETを算出し、in vivoでのATP動態を解析する方法を確立した。2つめは、NAD(P)Hの自家蛍光を用いた解糖系活性の解析である。以上の2つの実験手法を用いることで、酸素分圧の変動(酸素の定量解析法は昨年度確立した)に伴う破骨細胞内の代謝活性への影響を明らかにした。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の代表者は、破骨細胞の研究に長年取り組んでおり、近年、破骨細胞分化の制御において好気的代謝が重要な役割をもつことを見出している。しかし、骨組織は低酸素の臓器であると考えられており、好気的代謝を利用する細胞の存在は一見パラドックスである。しかしながら、生体内で種々の細胞が晒されている酸素分圧は全く明らかにされておらず、さらに生体内酸素環境に応じて細胞の状態がどのように影響を受けるかをin vivoで明らかにした研究はない。近年の生体イメージング技術の進歩は、生体内現象を高い時空間解像度で捉えることを可能にしている。そこで、本研究の目的は、二光子励起顕微鏡を用いた酸素イメージング法を確立し、本法を用いることで破骨細胞内の酸素分圧の絶対定量解析に取り組む。さらに、破骨細胞内の酸素分圧とエネルギー代謝や破骨細胞動態との関係をin vivoで明らかにすることである。これによって、酸素による骨代謝制御の分子基盤を解明することを目標に掲げる。本年度は、時間相関単一光子計数法を備えた二光子励起顕微鏡を用いて、生きたマウスの骨組織において破骨細胞並びに破骨前駆細胞からの蛍光・リン光を同時に寿命イメージングする実験系を立ち上げた。そして、本法を用いることで、破骨細胞内の酸素イメージング法を確立した。また、破骨細胞内のエネルギー代謝を生体イメージングする手段として、破骨細胞の細胞系列特異的にATPのバイオセンサーGO-ATeamを発現するマウスの系統を作出した。即ち、GO-ATeamをROSA26遺伝子座にノックインしたマウスの系統と破骨前駆細胞特異的にCreを発現するCX3CR1Creを交配することで作出した。本年度では、酸素イメージング法の立ち上げに加えて、エネルギー代謝のイメージングツールの作出にも成功を収めており、おおむね順調に進展していると考えられる。

今後は、本年度立ち上げを行った実験系を活用することで、破骨細胞内の酸素分圧の絶対定量解析に取り組む。さらに、破骨細胞内の酸素分圧とエネルギー代謝や破骨細胞動態との関係をin vivoで明らかにすることを計画している。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
原発事故後の福島におけるマスメディア報道による健康不安への影響の検証とその対策

原発事故以後、福島県民が抱く放射線健康不安には、報道や情報が関連していると考え、県民2000人に対し、健康不安の程度、信用する情報源、利用するメディアについて質問紙調査を行った。健康不安の程度を目的変数、信用する情報源と利用するメディアを説明変数とした重回帰分析の結果、NGO等を信用する群、ネット・サイトを利用する群の不安が有意に高く、政府省庁、自治体を信用する群、地元民放テレビを利用する群は、不安が有意に低かった。情報源やメディアの違いによる、不安の程度の差が明らかになった。また、ヘルスリテラシー得点上位群の不安が有意に低く、放射線不安を減らす上での、ヘルスリテラシーの有効性が示唆された。次年度(平成28年度)の質問紙調査の理論的フレームワーク構築、質問内容の検討のため、マスメディアと住民への面接調査を行った。マスメディアニ対しては、福島県内に支局を持つ全国メディアとして、NHK、読売新聞、朝日新聞、毎日新聞、また地元メディアは福島テレビ、福島中央テレビ、福島放送、テレビユー福島、福島民報、福島民友新聞の支局長、報道統括担当者に面接し、東京電力福島第一原子力発電所事故後の放射線に関する報道の意図、立場等について尋ねた。その結果放射線の影響の報道について、全国メディアと地元メディアの違い、事故後の時期による変化、また放射線被ばくによる健康影響の見方を大きい、小さいという、いわゆる両論併記を行ったこと、数社はその両論併記によって弊害があったのではないかと考えている事などが明らかになった。住民に対しては、福島県民合計20人に、放射線に対する不安と報道・情報についての面接を行った。対象者の内訳は、男性11人、女性9人、年齢は3060代、居住地は県北15人、県中2人、いわき、南相馬、東京(避難中)各1人である。避難経験の有無は、避難区域から6人、自主避難3人、避難無し11人である。原発事故後3か月までは男性2人を除き、共通して大きな不安を持っていた。また事故後4年以上経過した面接時にも、6人を除き不安を持ち続けており、その内容は、将来のがん発症、子どもへの健康影響、子孫への遺伝影響、将来の差別、偏見への不安等であった。情報、報道に関しては、伝達経路としてはテレビ、新聞に加えインターネット、SNSが利用され、二転三転する情報に振り回された経験や、それ以降情報、報道を批判的に受け止めるようになっていったこと、全国メディアと地元メディアの伝え方の違いに気づいたこと等が語られた。27年度末には、これらの結果を踏まえて、次年度(平成28年度)実施する調査の質問紙を作成した。27年度中に予定していた面接調査を終えて、質問紙案を作成している。平成27年度の文献検索、新聞・テレビ等のメディア関係者・福島住民への面接調査を通じて、福島県民への質問紙を用いた郵送調査により、放射線による健康への影響不安についての調査広告を選定した。郵送調査の対象は、福島県の浜通り、中通り、会津、及び、避難区域の住民から約2,000人を無作為抽出した。質問項目は、性・年齢・家族構成・子どもの有無、学歴・就業状況、、居住地・居住形態、避難による転居の有無、生活習慣、保健行動、マスメディアによる情報別の信用・利用、放射線に関する知識、ヘルスリテラシー、PTG(心的が外傷後成長)、社会的紐帯、地域組織・団体への加入、アウトカムとしての震災直後・現在の健康不安などである。回答率は、44.5%(861/1,934、男性382人、女性479人、青壮年(20歳以下)264人、中年(21-64歳)336人、高年(65歳以上)323人)であった。アウトカムである「現在の健康不安」の関連要因を明らかにする目的で、単変量解析を行った。有意に関連したのは、女性であること、年齢が若いこと、避難区域であること、自宅以外居住、就労していない、健康状態が悪いこと、ヘルスリテラシー得点が引くこと、政府省庁情報・自治体情報を信用しないこと、地元民放情報を利用しないこと、NGO情報を信用すること、Netsite情報・口コミ情報を利用することなどが有意であった。今後、単変量解析で有意になった要因を用いて、多変量解析により、現在の健康不安を規定している要因を明らかにする予定である。3年間の研究期間の2年目の研究内容として、当初計画した研究計画書とほぼ同じ内容の調査研究が実施できている。なお、当初、懸念のあった低い調査回答率については、過半数以上の回答はなかったものの、被災地における調査にしては、先行研究等と比較しても決して低くない回答率であったことは、本研究結果を解釈する際に大変重要な点である。なお、分析については、単変量解析で解釈が困難な結果も見られ、多変量解析を行う際には十分気をつけなければならないことが分かった。そのため、解析については、平成28年度のみで完結しなかったが、平成29年度も引き続き、慎重に解析を進めていく予定である。今年度は、平成28年に実施した調査の分析、学会発表、論文執筆、及びワークショップ準備会等を行った。平成28年8月に実施した、福島県内の2079歳2000人を対象とした質問紙調査「健康と情報についての調査」で得た916通の回答の内、有効回答の861人を分析対象として、「現在の放射線健康不安」に対する、「信用する情報源」、「利用するメディア」との関連を探った。

その結果、NGO等を信用する群、インターネット・サイトを利用する群が、不安が有意に高く、政府省庁を信用する群、自治体を信用する群、地元民放テレビを利用する群は、不安が有意に低かった。この結果に関して、9月の第46回福島県保健衛生学会、11月の第76回日本公衆衛生学会総会で発表した。また、発表内容について、論文の執筆を行い、平成30年度前半に海外学術雑誌に投稿予定である。また、関連研究として「東京電力の福島第一原子力発電所過酷事故後のメディア報道:「県民健康調査」の価値劣化報道に対する批判」が「健康開発」(第22巻第3号2018)に掲載された。30年2月には、専門家、マスコミ(福島民報、福島民友新聞、NHK福島支局、福島テレビ、福島中央テレビ、福島放送、テレビユー福島の報道担当者)、及び住民(県内の保健師と保育士)参加の「ワークショップ準備会」を開催した。原発事故後、福島住民が放射線被ばくの健康影響に関する情報、報道によって、健康不安を増大させられた現象について、また、福島で放射線・健康に関するリテラシーを向上させるには、マスメディアには何が求められるか、について話し合った。原発事故以後、福島県民が抱く放射線健康不安には、報道や情報が関連していると考え、県民2000人に対し、健康不安の程度、信用する情報源、利用するメディアについて質問紙調査を行った。健康不安の程度を目的変数、信用する情報源と利用するメディアを説明変数とした重回帰分析の結果、NGO等を信用する群、ネット・サイトを利用する群の不安が有意に高く、政府省庁、自治体を信用する群、地元民放テレビを利用する群は、不安が有意に低かった。情報源やメディアの違いによる、不安の程度の差が明らかになった。また、ヘルスリテラシー得点上位群の不安が有意に低く、放射線不安を減らす上での、ヘルスリテラシーの有効性が示唆された。次年度においては、これまでの調査で明らかになった事を踏まえて、福島住民の不安、報道、情報に関する量的調査を実施する。まず予備調査として、福島市および飯舘村の住民12人に質問紙案による調査(プリテスト)を行い、この結果による質問紙の修正等を行う。本調査は福島県の3地域(浜通り、中通り、会津)およびいわゆる避難地域から、各500人ずつ、合計2000人を無作為抽出し、郵送調査を行う予定である。次年度初めに倫理委員会の承認を得られるように、年度内に手続きを済ませてある。研究計画書に記載のあるように、平成27年度、28年度の研究結果に基づき、マスメディア、住民(福島県民)、行政(国の代表として復興庁、福島県庁、市町村担当者)によるワークショップを開催する予定である。これは、今回の東日本大震災における福島の避難住民の健康不安へのマスメディア報道の影響の検証を行い、今後の福島におけるマスメディア報道のあり方について議論を深めることが目的である。上述のワークショップの結果を踏まえ、今後の災害等が発生した場合などの住民にとって必要、かつ、求めるべき情報の内容、質、意義等について検討し、今後の方向性を示すような報告書してまとめ、提言を行えればと考えている。データ分析を行ない、その結果を学会等で発表した。また、論文を執筆中である。ワークショップ(準備会)を行った。公衆衛生学インタビュー対象者、研究補助アルバイトへの謝金・人件費が、予定額より支出しなかったため。郵送調査による回収率が若干予想よりも低かったこともあり、伴うデータ処理、通信運搬費、消耗品費等が、若干安く済んだことが主因であると考える。
人工市場を用いたエネルギーサービス事業における意思決定支援システムの構築

テキストマイニングによる動向分析手法の開発、人工市場シミュレーションソフトウェアの開発、実データによるシステム評価の3つの研究要素について、当該研究期間において下記の研究実績が得られた。以下の内容について海外および国内の学術誌での研究成果の発表を行った。本分野の発展および人事養成のため、新規国際および国内研究集会の設立に貢献した。1.テキストマイニングによる動向分析手法の開発:経済新聞記事データを用いて、テキストマイニング(関連用語のカテゴリ分類、各単語やカテゴリの頻度及び共起関係の分類)を実行して人工市場シミュレーションの入力データを作成するプログラムを構築した。分析手法の性能評価のために、国際金融情報センターの発行した解説記事による経済動向分析を行った。同じテキストデータで金融関係者が判別した結果と比較したところ、訓練データに対する正答率のテストでは平均92.2%、外部データに対する交差検定テストでは平均71.9%の高い精度を示すことができた。2.人工市場シミュレーションソフトウェアの開発経済動向分析結果を入力として受け取る人工市場シミュレーションを行うプログラムの作成を行った。テキストマイニングプログラムと連携し統合的なシミュレーションを行うためのデータ連携手法を開発した。実際のテキストデータと市場データを用いて実証実験を行った結果、100試行の平均で約67%の価格変動をシミュレーションにより再現することに成功した。3.実データによるシステム評価前述のテキストマイニングプログラミングと人工市場シミュレーションを統合した意思決定支援システムを構築した。システム評価のために実際のテキストデータと市場データを用いて、市場安定化のための行動方略を提示させたところ、実際の市場価格の分散を70%以上低減することができる方略を示すことができた。本研究課題は、テキストマイニングによる動向分析手法の開発、人工市場シミュレーションソフトウェアの開発、実データによるシステム評価の3つの研究要素により構成されている。今年度は各研究要素について下記の研究実績が得られた。(1)テキストマイニングによる動向分析手法の開発14年間分(1990年2003年)の経済新聞記事テキストデータを用いて、エネルギーサービス事業の市場動向を分析するための統計手法のテストを行った。具体的には関連用語のカテゴリ分類、各単語やカテゴリの頻度分析及び共起関係の分類を行った。この予備的分析で明らかになった、入力データの種類と分析手法を用いて、市場動向分析のためのテキストマイニングに関して分析アルゴリズムの基本設計を行った。(2)人工市場シミュレーションソフトウェアの開発エネルギーサービス市場分析の実績のある日立製作所の研究者と共同で人工市場に参加する各エージェントのタイプ分けとそれらの行動ルールの基本設計を行った。この設計と前述の経済新聞記事の統計分析結果を基に、オンライン上の経済ニュースサイトから関連テキストデータを取り込み、関連カテゴリの頻度や共起関係を分析して、人工市場シミュレーションソフトウェアの入力データを自動的に作成するソフトウェアモジュールをJava言語で作成した。また、人工市場シミュレーションによる市場分析の基礎理論や基本設計についていくつかの論文を学術雑誌上や書籍上で発表した。(3)実データによるシステム評価エネルギーサービス事業への取り組みの実績がある日立製作所の研究者とシステムの実用化イメージに向けて話し合いを行い、システム評価のために必要なデータの種類の選別と評価手法の決定に向けて検討を行った。(1)テキストマイニングによる動向分析手法の開発平成16年度に設計したテキストマイニング手法の基本アルゴリズムを基にして、15年間分(1990年2004年)の経済新聞記事テキストデータを用いて、テキストマイニング(関連用語のカテゴリ分類、各単語やカテゴリの頻度分析及び共起関係の分類)を実行して人工市場シミュレーションの入力データを作成するプログラムの作成を行った。(2)人工市場シミュレーションソフトウェアの開発平成16年度に設計した人工市場シミュレーションの基本

アルゴリズムの設計を基にして、人工市場シミュレーションによる市場分析を用いた市場での意思決定支援システムのプログラムを試作し、予備的な実験として市場の安定化の意思決定支援に用いた結果を発表した。さらに前述のテキストマイニングプログラムと連携し統合的なシミュレーションを行うためのデータ連携やプログラムの相互制御に関する方式について基本的な設計を完了した。(3)実データによるシステム評価システム評価のために必要なデータの種類の選別と評価手法の決定に向けた予備実験として、前述の試作プログラムを用いて市場の安定化のための意思決定支援のテストを行った。これにより人工市場シミュレーションの基本アルゴリズムの有効性を実証した。本研究課題は、テキストマイニングによる動向分析手法の開発、人工市場シミュレーションソフトウェアの開発、実データによるシステム評価の3つの研究要素により構成されている。今年度は各研究要素について下記の研究実績が得られた。以下の内容について海外および国内の学術誌での研究成果の発表を行った。(1)テキストマイニングによる動向分析手法の開発平成17年度に作成した経済記事テキストデータの分析プログラムの性能評価のために、国際金融情報センターの発行した解説記事の分析および経済動向分析を行った。同じテキストデータを金融関係者に判別してもらったデータと比較したところ、訓練データに対する正答率のテストでは平均92.2%、外部データに対する交差検定テストでは平均71.9%の高い精度を示すことができた。(2)人工市場シミュレーションソフトウェアの開発前述の経済動向分析結果を入力として受け取る人工市場シミュレーションを行うプログラムの作成を行った。過去4年間の実際のテキストデータと市場データを用いて実証実験を行った結果、100試行の平均で約67%の価格変動をシミュレーションにより再現することに成功した。(3)実データによるシステム評価前述のテキストマイニングプログラミングと人工市場シミュレーションを統合した意思決定支援システムを構築した。システム評価のために実際のテキストデータと市場データを用いて、市場安定化のための行動方略を提示させたところ、実際の市場価格の分散を70%以上低減することができる方略を示すことができた。
行動ログと調査回答の乖離の理解及び介入法による改善

実施予定であった「購買行動の行動ログと調査回答の乖離の理解」「介入を伴う調査法の実施と実購買行動との比較」として、具体的にネット上で提供されるサービスの中でも比較的利用頻度や消費額の大きいアプリゲームに着目し、ゲームアプリの利用時間を質問調査で聞いた回答値とログで得た値を比較する調査を実施した。結果としてログに対して調査での利用時間の回答は平均としては過小回答になるものの、個人差が大きいこと、およびその個人差が属性情報やいくつかの行動経済学的な指標によって説明できることが明らかになった。また購買履歴について実際の行動ログが得られる対象者パネルに対して回顧式の調査を実施し、乖離の程度を把握するのみならずメンタルシミュレーションなどの介入法を伴う調査を実施し、乖離がどの程度減少するかを調べた。さらに昨年実施した「介入を伴う調査法によるアドホックな調査手法の予測や回答者傾向の比較」については、予測のための追跡調査を実施した。これらの研究結果について、現在3本の査読付き論文にまとめて投稿準備中である。本年度実施する予定であった「購買行動の行動ログと調査回答の乖離の理解」「介入を伴う調査法の実施と実購買行動との比較」としては、大手市場調査会社が実施している2万人規模の継続パネル調査(少なくとも1年間継続して調査に協力している人を対象とする)では店頭での商品購買や外食、サービスの購入をバーコードスキャン、レシート読み取りによって実施しているが、このパネルに対してアルコール飲料の購入についての調査を実施し、すでに得られている行動ログから把握される実行動と調査回答を比較することで現状の調査手法にはどの程度乖離が生じているかを理解するための解析を実施した。さらにメンタルシミュレーション、解釈レベル操作、コグニティブインタビューに基づく想起といった介入を伴う調査法が乖離をどの程度軽減できるか、各介入法と非介入に被験者を割り付けた被験者間要因実験を、行動ログを取得している同パネルに実施する。そのうえで、行動ログと各介入条件での回顧式質問への回答を比較することで、どの操作介入が効率的に回答と実行動の乖離を低減できるか検証した。これについては調査回答前に実施した特定の介入法で無操作に比べて有意に乖離が低減したことが分かっており、現在論文を作成し投稿予定である。また「介入を伴う調査法によるアドホックな調査手法の予測や回答者傾向の比較」については、予測のために追跡調査が必要であり、現在追跡調査を企画中である。計画書に記載した「購買行動の行動ログと調査回答の乖離の理解」「介入を伴う調査法の実施と実購買行動との比較」を実施し、現在論文を作成し投稿予定と順調に実施をしているため。昨年度は計画通り実施されており、今年度も計画通りに研究を実施する予定である。但し、選挙時の調査研究については、衆院選があるかどうか不明であることから、大都市の市長選挙や都道府県知事選挙に変更する可能性がある。平成29年度に実施する予定だった調査について、企業側の都合で我々の研究費からの支払いではなく共同研究として企業側の費用で実施されることになったこと、および追跡調査が平成30年度に実施となったことによる。
ドラッグリポジショニングを応用したインプラント周囲炎予防薬の開発

本研究は、インプラント周囲軟組織に特異的に発現減少をした遺伝子を増加させる薬剤を明らかにするために、複数の既知薬剤を含むドラッグライブラリーから目的とする薬物を同定することが出来るハイスループットドラッグスクリーニング(HTS)法を用いる。まずは、ラット口腔粘膜由来の線維芽細胞に対して効果がある薬剤をHTS法を同定する。その次に、インプラント周囲炎モデル動物に対して、同定した薬剤を予防と投与し、その効果を組織形態学的、分子生物学的、細菌学的に評価を行っていく。
サイログロブリン遺伝子異常による小胞体貯蔵病の病因解析と細胞内蛋白輸送機構の解明

我々は、日本人に多く認められるサイログロブリン(Tg)遺伝子異常症としてC1264R変異とC1996S変異を報告してきたが、その他に新たに4ヵ所の変異を確認した。2ヵ所(C1077RとG2375R)は日本人に認められたものであり、他の2変異(G233EとV1460I)はヒスパニック系米国人に認められたものである。また、先天性甲状腺機能低下症動物モデルとしてrdwラットにG2320Rミスセンス変異を解析した。これらの変異Tgは細胞内を正常に輸送されることなく小胞体に蓄積する。そこで、変異Tg蛋白を培養細胞に発現させることにより細胞内輸送障害を再構築し、その病態解析をすることとした。まず、正常および変異を有するヒトTg cDNA発現ベクターを腎細胞株に導入し、Tg発現細胞株を樹立した。正常Tgを導入した細胞株よりは培養液中にTgが分泌されたが、変異Tgを導入した細胞株はTgを分泌しなかった。これ等の細胞内輸送障害型変異Tgを導入した安定発現細胞内でおこる遺伝子発現の変化をcDNAアレイを用いて検討した。発現レベルの差は定量的RT-PCRにて確認した。既知遺伝子のcDNAアレイを用いた検討では、C1264R、C1996S変異Tg発現細胞株ともに2倍以上発現増加している遺伝子は、リボゾーム蛋白、分子シャペロン、プロテアゾーム、細胞増殖、アポトーシス、転写因子、DNA複製に関連する遺伝子が多かった。サブトラクション-PCR法にて作成したcDNAライブラリーでは1500クローンをスクリーニングし、654クローンにインサートを認め、うち発現レベル差の大きかった244遺伝子をシークエンスした。うち、81遺伝子はリボゾーム蛋白遺伝子であったが、他は分子シャペロン、プロテアゾーム、転写因子、DNA複製に関連する遺伝子であったが、約30遺伝子は現在機能不明の遺伝子であった。我々は、細胞内輸送障害の原因となるサイログロブリン(Tg)遺伝子異常症として、C1263Rミスセンス変異を4例4家系、C1995Sミスセンス変異を4例2家系に同定し、先天性甲状腺機能低下症動物モデルとしてrdwラットにG2320Rのミスセンス変異を見い出した。以上の結果をもとに、(1)変異Tg蛋白を培養細胞に発現させることにより、細胞内輸送障害を再構築し、その病態解析をすることとした。まず、正常および変異を有するヒトTgcDNA発現ベクターをG401腎細胞株に導入し、G418選択培地中、限外希釈法にてクローニングしTg発現腎細胞株を樹立した。正常Tgを導入した細胞株よりは培養液中にTgが分泌されたが、C1995S変異Tgを導入した細胞株はTgを分泌しなかった。しかし、細胞内Tg蛋白量は正常、C1995S変異Tg発現細胞株ともに全細胞蛋白量の2-3%と同等であり、変異Tgのみが細胞内に蓄積しているわけではなかった。これは、変異Tgが細胞内で効率的にプロテアゾーム等にて分解されている可能性があり、その機構の解明と、次の課題として小胞体貯蔵病を解析するために、変異Tgを細胞内に蓄積させることが必要である。(2)次に、変異Tg蛋白蓄積による遺伝子発現状況をプロファイリングするため、変異Tg発現ヒト甲状腺組織に発現増加する遺伝子群をマクロアレイ法で解析することとした。

正常および変異Tgを有するヒト甲状腺組織よりmRNAを抽出し、両者に発現するmRNAをハイブリダイゼーションにて除いた後、変異Tg組織に多く発現しているmRNAをRT-PCR法にて増幅し、クローニングした。スクリーニングした1480クローンのうち57%、846クローンにインサートを認めた。現在、この846クローンをメンブランに固定し、2種類の異なる蛍光色素で、それぞれ正常、変異Tg組織mRNAを標識し、発現量の差を検討予定である。最終的には、発現量の差を認めたクローンをシークエンスし、その遺伝子群を同定する予定である。我々は、細胞内輸送障害の原因となるサイログロブリン(Tg)遺伝子異常症として、C1263Rミスセンス変異を4例4家系、C1995Sミスセンス変異を4例2家系に同定し、先天性甲状腺機能低下症動物モデルとしてrdwラットにG2320Rのミスセンス変異を見い出した。これらの変異を有するTgは、細胞内を正常に輸送されることなく、小胞体内に蓄積する。本年度、これ等の細胞内輸送障害型変異Tgを導入した安定発現細胞株を樹立し、細胞内でおこる遺伝子発現の変化を既知遺伝子のcDNAアレイおよびサブトラクション-PCRを用いて作成したcDNAライブラリーのアレイを用いて検討した。発現レベルの差は定量的RT-PCRにて確認した。正常および変異TgはpcDNA3.1発現ベクターにクローニングし、G401腎細胞株に導入した後、株化した。既知遺伝子のcDNAアレイ(Atlas 3.6 array;3528遺伝子、Atlasstress array;234遺伝子)を用いた検討では、C1263R、C1995S変異Tg発現細胞株ともに2倍以上発現増加している遺伝子を陽性とした。変異Tg発現細胞株で発現増加の認められた遺伝子は、リボゾーム蛋白、分子シャペロン、プロテアゾーム、細胞増殖、アポトーシス、転写因子、DNA複製に関連する遺伝子が多かった。サブトラクション-PCR法にて作成したcDNAライブラリーでは、1500クローンをスクリーニングし、654クローンにインサートを認め、うち発現レベル差の大きかった244遺伝子をシークエンスした。うち、81遺伝子はリボゾーム蛋白遺伝子であったが、他は分子シャペロン、プロテアゾーム、転写因子、DNA複製に関連する遺伝子であったが、約30遺伝子は現在機能不明の遺伝子であった。来年度は、さらに多くの遺伝子をアレイを用いて検討するとともに、各遺伝子の機能を検討する予定である。昨年まで、日本人に多く認められるサイログロブリン異常としてCys1264ArgとCys1996Serを報告してきたが、本年新たに4ヵ所の変異を確認した。2ヵ所は日本人に認められたものであり、Cys1077ArgとGly2375Argである。Cysl077Argはホモ接合体として、Gly2375ArgはCys1264Argと複合ヘテロ接合体として発見された。他の2変異はヒスパニック系米国人に認められたもので、Gly233GluとVall460Ileで、同一患者に複合ヘテロ接合体として発見された。変異サイログロブリンは細胞内を正常に輸送されることなく小胞体に蓄積するが、それは細胞自身に有害であるので、異常蛋白を優先的に分解する等細胞の自己防衛機構が働く。昨年までに、変異サイログロブリン発現細胞株を樹立し、変異サイログロブリン発現に伴い発現増加する遺伝子を解析してきた。