hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ａ軸/非ｃ軸配向のBi-2223単結晶薄膜によるプラナー型新構造ＴＨｚ素子の作製

得られた単結晶薄膜について、表面モフォロジーを原子間力顕微鏡(AFM)を用いて観察し、直流4端子法により超伝導転移温度Tcを調べ、素子設計・作製の素材とした。実用レベルの高出力なTHz波の発振が可能な、新しい素子構造を設計した。前年度に引き続き、素子の基本形状は固有ジョセフソン接合(IJJ)の接合方向を長辺方向とする長方形で、その両端に電極を持つだけの、極めて簡単なプラナー型構造とした。膜厚の異なる単結晶薄膜を作製し、その上に、つくばの半導体素子加工ファンドリーで、素子長(電極間距離)、素子幅を変えた様々な寸法のパターンを描画して素子を作製し、IJJの電流・電圧(I-V)特性を調べた。それらの結果を逐次、薄膜作製と素子の寸法・形状にフィードバックして、最適化を進めている。新構造の高出力THzデバイスの実現に向けて不可欠とされる、膜厚が異なり、双晶のない、かつ結晶性の高い高品質な(117)配向のBi-2212や(100)配向のBi-2223の単結晶薄膜の作製に成功するなど、クリアーすべき課題が順次解決されている。また、寸法の異なるパターンを持つ素子の作製も軌道に乗っている。一方。研究の途上において、MOCVD法で配向性を制御したBi-2212薄膜が、抵抗の小さな温度依存性を持つことがわかり、パワーエレクトロニクスで喫緊の課題となっている酸化インジウムを代替する新しいモジュール抵抗になる可能性を見出した。実用レベルの発振強度を持つテラヘルツ(THz)素子を目指し、ビスマス系酸化物超伝導体BSCCO薄膜の高品質化を進めてきた。その過程で、非c軸配向の単結晶膜を用いると、表面に電極を設けるだけの極めて簡単な構造で、実用化に向けブレークスルーするべき最大の課題である、高強度のTHz波を発振する新しい素子ができることを着想した。これは、バルク結晶やc軸配向膜では不可能である。薄膜の作製には、我々が独自に開発した固体を原料とする有機金属化学気相成長法(MOCVD)を用い、超伝導薄膜として、c軸が基板に対して傾いた(117)配向の非c軸配向Bi-2212薄膜を作製した。非c軸配向膜の作製のポイントは、薄膜と格子整合性の良い単結晶基板を用いることにある。そこで、我々はベルヌーイ法を用いて、新たに32mmmφ径のSrTiO3単結晶の有効長を大きくする技術を開発し、高品質な基板結晶を歩留まり良く得ることができた。これらの(110)SrTiO3や(110)LaAlO3単結晶基板を用い、(117)Bi-2212の非c軸配向の単結晶薄膜を作製した。成膜した薄膜は双晶膜であったが、傾斜基板を用いることに拠り、双晶のない(117)Bi-2212の非c軸配向の単結晶薄膜を作製することに成功した。双晶や配向性に係る結晶性の評価はψ-φスキャンのX線回折法を用い、特許として公開した。薄膜の抵抗の温度依存性を測定し、抵抗の温度係数が小さいことを見出した。得られた単結晶薄膜について、プラナー型新構造THz素子の設計を行い、つくばの半導体素子加工ファンドリーで素子を試作し、寸法やパタンの異なる素子について、IV特性を調べた。29年度では、ISEC2017の国際会議に参加し、研究成果の発表(アブストラクト提出済み、採択済み)予定であったが、渡航の安全性に配慮して中止した。その後、原料供給システムが不調になり、薄膜作製を中断した。そこで30年度は、原料供給システムを調整して追加実験を行い、これまでに作製に成功した双晶の無い(117)Bi-2212の非c軸単結晶薄膜を作製し、これを用いて、寸法やパタンの異なるプラナー型新構造THz素子を試作し、その結果も併せて、国際会議で発表する。我々は、薄膜を使って、実用レベルの発振強度を持つテラヘルツ(THz)素子を目指し、Bi系超伝導薄膜の高品質化を進めてきた。
共産圏崩壊後の米国の輸出規制-東アジアを中心に-

本研究は、共産圏崩壊後の米国による輸出規制政策を切り口にして、東アジア(とくに中国)に焦点をあてて、「国家」と(情報技術革命がもたらす)「国家の変容」がどのように交錯しているのかについて分析するものである。輸出規制のなかでも、米国における「みなし輸出規制」に焦点をあてて研究した。ちなみに、「みなし輸出規制」とは、技術移転に関わるものであり、規制技術が規制対象国に移転され「輸出とみなされる」場合に適用される規制をさす。みなし輸出規制をめぐっては、2005年から米国政府や産業界、学界を巻き込んだ論争が起きた。この論争では、(1)貿易に属する「ものの移動」、(2)移民研究に属する「人の移動」、(3)学生や研究者などの教育・研究の国際交流、(4)技術移転などの異分野が交錯している。これらの異分野を、「国家による規制」と情報技術革命という視点から分析し、そのことにより21世紀に入って急速に進みつつある「国家の変容」の解明をめざした。本年度は、米国における「みなし輸出規制」について分析した。「みなし輸出」(deemed export)とは、技術移転に関わるものであり、規制技術が輸出規制対象国に移転され、「輸出とみなされる」場合をさす。具体例をあげれば、規制技術やソフトウェアを口頭で規制対象国の外国人に伝えたり(学会発表も含む)、当該外国人が規制対象の装置や施設を視察する場合などがあげられる。みなし輸出規制に関しては、日本でも導入の動きがあり、みなし輸出規制は、米国のみならず日本の問題にもなっている。第二次世界大戦後、米国は物品だけでなく技術も規制してきたが、米国の輸出管理においては特に1979年の輸出管理法以降、技術移転規制に以前より注目が集まるようになった。米国では一昨年に産業界、学界と政府の間で「みなし輸出」論争が起きたが、この論争を垣間見ると、「みなし輸出」規制対象国には、「冷戦の終焉」以前との連続性があるものの、今日ではロシアよりは中国がとくにその規制対象の前面に出ていることがわかる。また、みなし輸出規制は、米国による人の移動の規制、とくに9.11テロ以降の米国政府による移民規制強化と連動している。みなし輸出論争の中では、国家と国家を超える動きとの相克が顕著に見られ、科学技術の発展はいかにあるべきか、国力とは何か、といった問題も論じられており、21世紀における国家や国際関係の変化を分析するのに有効な切り口の一つになっている。筆者は、「共産圏崩壊後の米国の輸出規制-東アジアを中心に-」というテーマで、平成18年度以来、研究を続けているが、平成19年度は、米国で論争を呼んでいる「みなし輸出規制」の問題に焦点をあてて、分析を試みた。みなし輸出規制とは、技術移転に関わる輸出規制で、物品の輸出規制とは異なる。その規制は、科学技術の研究開発・教育、人の移動(移民や留学等)など多方面に関わるものである。筆者は、様々な領域で進行している情報技術革命やグローバル化と、みなし輸出規制論争との関係を分析した。そのなかで既存の研究に対する新しい視点として、以下の2点を見出した。(1)輸出と国家を越えた人の移動(移民だけでなく国際的な研究開発、留学なども含む)は、別分野の研究対象とみなされているが、米国のみなし輸出規制ではこれらは連動し、ともに国家安全保障政策に結びついている。それゆえ、輸出と移民や留学等を別個の領域とみなす、これまでの研究のあり方は再考されるべきであること。(2)情報技術革命により「輸出」が大きく変化していること(一例をあげれば、ソフトウェアを用いる際に、[従来からすれば輸出業者ではない]日本の一般の人々が、米国の輸出規制に抵触する可能性も出ている)-以上の2点である。研究成果は、平成19年10月に日本国際政治学会で、また、平成20年3月には日本安全保障貿易学会で報告した。10月の報告をもとに、『国際問題』567号(日本国際問題研究所、2007年12月)で『科学技術の教育・研究、人の移動とみなし輸出規制-米中関係の文脈で-』(24-33頁)という論文を執筆した。今日、急速に進展しつつあるグローバル化と世界の一体化は、20世紀型の国家の変容を促し新しい国際関係が生み出されようとしている。人の移動も頻繁になり、人種や国籍等に対しても、従来とは異なる視点からの対応が必要になってきている。

本研究が対象とする輸出規制は、国家を基盤として行われ、物の移動のみならず、人の移動にも関わる分野である。しかし、複合人種が増え、○○人という概念が変化していくときまた、移民の増加により出生国と市民権を保持する国とが異なる場合などでは、20世紀型の国家を基盤とした輸出規制の実施は難しくなっていく。こうした問題関心のもと、本年度には、米国の2000年の国勢調査を分析し、○○人という概念がどのように変化してきているのかを分析し、論文として発表した。また、9.11テロ後の米国の入国管理政策がどのように変わってきているのか、9.11テロ以前と以後、あるいはソ連崩壊以前と以後の連続性と非連続性は何なのかを分析し、口頭で報告した。
致死性不整脈の遺伝子基盤に関するゲノム薬理学的研究

(1)正常人・患者のゲノムの登録現在までに正常ボランティア120人、先天性QT延長症候群(LQTS)30例、後天性LQTS4例、無症候性Brugada症候群(BS)30例、有症候性BS37例、進行性心臓ブロック(PCCD)2例、心房停止2例の末梢血よりゲノムを抽出し、遺伝子解析をおこなった。(2)遺伝子変異の同定・機能解析先天性LQTS1例にKCNH2遺伝子変異を同定した。先天性LQTS2例、後天性LQTS1例、無症候性BS1例、有症候性5例、PCCD1例、心房停止1例にSCN5Aの遺伝子変異を同定した。ヒトNaチャネルcDNA(hNav1,5)に上記8種類の変異を導入し、tsA201細胞に一過性トランスフェクションし、パッチクランプで全細胞Na電流を測定し、変異Naチャネルの機能を解析した。有症候性BS変異5例のうち中2例と心房停止1例の変異は無機能チャネルであった。先天性・後天性LQTS症例は典型的な3型LQTS様の遅延電流を示した。無症候性BS症例に見られた変異は同一exon上のdouble mutationであり、Na電流を低下させる特徴的なチャネル機能異常を示した。後天性BSの一例の機能異常は軽微であったが、その他の変異は典型的な機能低下を示した。以前から報告されているSCN5AのSNPのほかに、新たな2種のSNP V1951L,・L1988Rを同定した。これらのSNPについて正常人、有症候性・無症候性BS患者のallele頻度をTaqman PCR法によって明らかにしたが、Brugada症候群症例にこれらのSNPが多い傾向は見られなかった。これらのSNP Naチャネルの機能とI群抗不整脈薬であるフレカイナイドの薬効を(2)と同様の手法で解析したが、現時点ではI群抗不整脈薬に感受性が強いNaチャネルSNPはなかった。(4)総括無症候性BSに遺伝子変異が同定されたのは本研究が世界的にも初めてであり、非常に重要な知見である(Yokoi et al, Heart Rhythm, 2005)。心房停止に認められたSCN5A変異は、我々の関連で2例目、世界的にも4例目である。本例は心房特異的なギャップジャンクションConnexin 40のSNPの合併例であり、さらに詳細な検討をおこなっている。(1)正常人・患者のゲノムの登録現在までに正常ボランティア120人、先天性QT延長症候群(LQTS)30例、後天性LQTS4例、無症候性Brugada症候群(BS)30例、有症候性BS37例、心房停止2例の末梢血よりゲノムを抽出し登録した。(2)遺伝子変異の同定先天性LQTS1例、後天性LQTS1例、無症侯性BS1例、有症侯性5例、心房停止1例にSCN5Aの遺伝子変異を同定した。

(3)遺伝子変異の機能解析SCN5AのcDNA hNav1.5に上記8種類の変異を導入し、tsA201細胞に一過性トランスフェクションし、パッチクランプで全細胞Na電流を測定し、変異Naチャネルの機能を解析した。有症候性BS変異5例のうち中2例と心房停止1例の変異は無機能チャネルであった。先天性・後天性LQTS症例は典型的な3型LQTS様の遅延電流を示した。無症候性BS症例に見られた変異は同一exon上のdouble mutationであり、Na電流を低下させる特徴的なチャネル機能異常を示した。後天性BSの一例の機能異常は軽微であったが、その他の変異は典型的な機能低下を示した。以前から報告されているSCN5AのSNPのほかに、新たな2種のSNP V1951L,・L1988Rを同定した。これらのSNPについて正常人、有症候性・無症候性BS患者のallele頻度をTaqman PCR法によって明らかにしたが、Brugada症候群症例にこれらのSNPが多い傾向は見られなかった。これらのSNP Naチャネルの機能と1群抗不整脈薬であるフレカイナイドの薬効を(3)と同様の手法で解析したが、現時点では1群抗不整脈薬に感受性が強いNaチャネルSNPはなかった。(5)総括無症候性BSに遺伝子変異が同定されたのは本研究が世界的にも初めてであり、非常に重要な知見である。心房停止に認められたSCN5A変異は、我々の関連で2例目、世界的にも4例目である。これらの2症例に関して日本循環器学会などで報告し、英文論文の作成中である。SNPおよび薬理学的解析に関しては引き続き検討を続ける。(1)正常人・患者のゲノムの登録現在までに正常ボランティア120人、先天性QT延長症候群(LQTS)30例、後天性LQTS 4例、無症候性Brugada症候群(BS)30例、有症候性BS 37例、進行性心臓ブロック(PCCD)2例、心房停止2例の末梢血よりゲノムを抽出し、遺伝子解析をおこなった。(2)遺伝子変異の同定・機能解析先天性LQTS1例にKCNH2遺伝子変異を同定した。先天性LQTS 2例、後天性LQTS1例、無症候性BS 1例、有症候性5例、PCCD 1例、心房停止1例にSCN5Aの遺伝子変異を同定した。ヒトNaチャネルcDNA(hNav1,5)に上記8種類の変異を導入し、tsA201細胞に一過性トランスフェクションし、パッチクランプで全細胞Na電流を測定し、変異Naチャネルの機能を解析した。これらのSNP Naチャネルの機能とI群抗不整脈薬であるフレカイナイドの薬効を(2)と同様の手法で解析したが、現時点ではI群抗不整脈薬に感受性が強いNaチャネルSNPはなかった。(4)総括
集学的アプローチによる注意・意識の神経メカニズム

注意と意識の相同性を、確からしさ(確信度)という観点から問うために、初年度には、確信度の成立過程において、霊長類の共通性を支持する知見を得ている。本年度は、もう一端の標的である注意のコンポーネントへ踏み込んで、検証した。同一の視覚刺激に対し、異なる二つの刺激特徴に着目させ、それぞれの条件から得られる確信度を比較した。その結果、着目させた刺激特徴によって、表出される確信度が、信号検出理論による予測値から逸脱することが判明した。このような現象は、呈示する刺激の種類や、条件間での判別成績の違いにはよらず、観察された。このことは、外界のどのような側面に注意を払うかという能動的プロセスによって、主観評定に反映される情報が左右されることを意味している。以上から,我々の視知覚系は,物理的に同一のボトムアップ情報を受け取ったとしても,トップダウン信号に応じて,質的に異なる情報処理を行い,また,その情報が主観的経験として変換する過程においても,量的に異なる確からしさが付与されていることが推察された。27年度が最終年度であるため、記入しない。我々の眼前に広がる物理情報が、意識経験に変換するまでには、受動的・能動的注意のプロセスを媒介していることが多い。長年、注意と意識は、類似のものと捉えられてきたが、近年、その相違点も指摘されはじめている。本研究では、主観的な確からしさ(確信度)が、両者の関係性を明らかにする鍵になると考え、ヒトの行動心理実験とサルの神経生理実験、双方から検証する。初年度は、まず、確信度を形成する上で、霊長類に共通する計算原理を探った。ヒトの心理実験で一般的に用いられる2種の知覚判別課題において、視覚刺激の曖昧さを操作し、自己判断に対する確信度を測定した。その結果、確信度スコアと刺激の明瞭度に明らかな相関を認め、正解した試行と誤った試行では、特徴的なパターンを示した。一方、サルの神経生理実験においても、判別回避のオプションを組みこんだ知覚判別課題を用いて、視床枕の神経応答が、同様の相関とパターンを示すことが分かっている。両者の結果を信号検出理論の観点から検証すると、試行毎に揺らぐ確信度の値を反映する単一の計算フレームで再現できる。以上、ヒト・サルを用いた実験結果は、知覚の確からしさの成立過程において、霊長類で同じ計算機構を共有している事を示唆している。ヒトの主観報告とサルの神経活動という二つの結果を、単一の計算モデルで説明できたことで、双方からアプローチする実験的基盤が明確になった。今後、注意水準が確信度へどのような影響をもたらすのか、両者の相違・相関を検証していく。
高等植物の多様なＲＮＡサイレンシング経路の制御機構

植物におけるRNAサイレンシングと遺伝子発現の制御機構の解明を目的として、低分子RNAによる花色遺伝子の発現制御が関与するアサガオの模様形成機構を解析した。低分子RNAとmRNAの網羅的な解析などから、特定のRNAサイレンシング経路が特有な模様形成に関与することが示唆された。また、アサガオのゲノム配列を解読に成功した。ゲノム配列を利用した解析から、模様形成に関わる可能性がある複数の遺伝子を同定した。高等植物におけるRNAサイレンシングと遺伝子発現の制御機構の解明を目的として、低分子RNAによる花色遺伝子の発現抑制が関与するアサガオの模様形成機構を解析した。模様形成に必要な遺伝子をマップドベースクローニングするために、その遺伝解析を行った。吹雪模様の系統と模様を持たない標準系統を交配し、その第2世代(F2)を栽培して表現型を観察した。その結果、メンデル遺伝する1遺伝子領域により、吹雪、車絞(覆輪)、無地の3種の表現型が支配されていることを強く示唆する結果を得た。また、吹雪模様の系統とは遠縁にあたり、マップベースドクローニングに必要な遺伝的多型が多い標準系統との交配系統も作成した。一方、マップドベースクローニングに必要なアサガオのゲノム情報の整備と、アサガオの精密な遺伝地図の作成を、新学術領域「ゲノム支援」の支援により進めた。ゲノム情報の整備は、次世代シークエンサー(NGS)によるショットガンシークエンス法により行った。各種サイズのゲノム断片をNGSで解析し、得られたゲノムの断片配列をつなぎあわせる計算機処理を進めた。ゲノムDNAの抽出法を見直すことなどにより、計算結果が飛躍的に改善した。遺伝地図の作成は、標準系統とアフリカ系統を交配して得たF2集団を材料とした。F2集団の各個体について、RAD-seq(Restriction Site Associated DNA Sequence)を行い、遺伝地図の作製に必要な多型マーカー(RADマーカー)を大量に検出することができた。これらのRADマーカーをもとに、400のマーカーがアサガオの染色体数である15の連関群に収束した遺伝地図を作ることができた。さらに、標準系統のゲノムDNAを用いたBACライブラリーを作成することができた。まず、模様形成の分子機構について、非着色細胞で特定のRNAi経路が活性化しているとする「RNAi活性化モデル」と、RNAiを誘導するノンコーディングRNAの転写量が多いためにRNAiが活性化するという「閾値モデル」を立てた。これらのモデルを検証するために、吹雪模様を構成する着色細胞と非着色細胞に蓄積するsmall RNAの配列を次世代シークエンサーで解析した結果、22塩基のsiRNAが非着色細胞で特異的に増加していることを見いだした。ほかの長さのsmall RNAは、着色細胞と非着色細胞の間で有意な差が見られなかったことから、この22塩基のsiRNAを構成因子としたRNAi経路が活性化していることが示唆された。一方、模様形成に必要な優性遺伝子座の存在が遺伝学的な解析から示されている。これらをマップドベースクローニングするために、アサガオのゲノム情報の整備、特にアサガオの精密な遺伝地図の作成を試みた。必要な分子マーカーを大量に取得するために、新学術領域「ゲノム支援」の支援も受けてRAD-seq(Restriction Site Associated DNA Sequence)を行った。標準系統とアフリカ系統を交配して得たF2集団の各個体からゲノムDNAを抽出し、制限酵素などを用いてRAD-seq用のライブラリーを作成した。これを次世代型シークエンサーで処理し、得られた配列の計算機による解析を進めている。また、模様を持つ系統を標準系統と交配したF1植物を育成して、クローニングの材料とするF2種子を得ることもできた。アサガオの吹雪変異体は、野生型の濃色地に淡色の縞模様の花を咲かせる。この吹雪変異体と無地の花を咲かせる標準系統を交配して得た第2世代(F2)植物では、吹雪と無地のほか、花の周縁が淡色になる車絞(覆輪)模様が出現する。その分子遺伝学的な解析から、これらの模様が花の着色に関連する1つの遺伝子座に支配されている可能性が示唆された。一方、吹雪系統の中から、吹雪と車絞の花を咲き分ける1個体を得ることができた。このような咲き分けの出現は、これまでの古典遺伝学解析の報告にはない予想外の現象である。その表現型からはトランスポゾンの転移のような突然変異か、エピジェネティックな変化の関与が推測され、これらの現象が吹雪と車絞の違いを支配していることが示唆された。また、吹雪変異体の花から濃色細胞と淡色細胞を分けてサンプリングしたRNAについて、次世代シークエンサー(NGS)による塩基配列の解析(RNA-seq)を行った。また、新学術領域「ゲノム支援」の協力により、吹雪変異の解析に必要なアサガオのゲノム解読を進めた。昨年度までに得られていたNGSのデータに加えて、新たに高性能なプラットフォームのNGSが利用可能となり、そのデータを追加することができた。これらのデータを計算機で解析することで、想定していた水準(コンティグ10kb、スキャフォールド100kb)をはるかに上回る高精度なゲノム配列が得られつつある。

また、これまでに得られていた標準系統のRNA-seqのデータについて、計算機による解析を行い、花弁で発現する転写産物の配列や、そのうち花弁に特異的な配列などを取得することができた。高等植物におけるRNAサイレンシングと遺伝子発現の制御機構の解明を目的として、低分子RNAによる花色遺伝子の発現抑制が関与するアサガオの模様形成機構を解析した。アサガオの吹雪変異体は、野生型の濃色地に淡色の縞模様の花を咲かせる。H27年度は、吹雪変異の解析に必要なアサガオのゲノム解読が大きく進み、吹雪変異体のRNA-seqのデータをゲノム配列にもとづいて解析した。ゲノムについては推定ゲノムサイズの98%の配列を解読することができた。解読されたゲノム配列は、従来の次世代型シークエンサーを用いて解読された生物のゲノム配列よりも非常に長く、シークエンスのエラーも少ない高精度なものであった。また、RAD-seqのデータをもとに高密度な連鎖地図を作成し、これが1956年に公表された古典的な表現型マーカーを用いた連鎖地図と、よく一致することを確認した。作成した連鎖地図上には、全ゲノム配列のうち80%以上の配列がマップされ、アサガオの染色体数である15組の染色体レベルの配列を得ることもできた。さらに、RNA-seqの配列をもとにした遺伝子予測も行った。完成したゲノム配列からは、吹雪変異遺伝子座に挿入している非自律性トランスポゾンに転移酵素を供給する、自律性トランスポゾンを同定することができた。吹雪変異体については、ゲノム配列を参照にして花の濃色細胞と淡色細胞で発現する遺伝子を比較解析し、RNAの代謝やエピジェネティクスに関連し、吹雪模様の形成や、吹雪と車絞の模様の違いの決定に関わる遺伝子の候補を複数同定することができた。植物におけるRNAサイレンシングと遺伝子発現の制御機構の解明を目的として、低分子RNAによる花色遺伝子の発現制御が関与するアサガオの模様形成機構を解析した。低分子RNAとmRNAの網羅的な解析などから、特定のRNAサイレンシング経路が特有な模様形成に関与することが示唆された。また、アサガオのゲノム配列を解読に成功した。ゲノム配列を利用した解析から、模様形成に関わる可能性がある複数の遺伝子を同定した。吹雪変異体で予想外の現象が観察され、その検証などが必要になったため。また、アサガオのゲノムや転写産物の配列の情報を利用した吹雪変異体の解析に時間を要しているため。植物分子遺伝学花の模様(吹雪、車絞、無地)を支配していることが示唆された遺伝子について、模様の違いとの関連を分子生物学的な手法で検討する。また、吹雪と車絞の花を咲き分けが出現した原因を明らかにするために、咲き分ける個体とその次世代についても解析する。さらに、ゲノム解読を完了させて、その情報や吹雪変異体のRNA-seqのデータからRNAi経路について解析する。これまでの結果を統合して、RNAサイレンシングによる模様形成機構を明らかにする。
抗アポトーシス作用を持つ新規心筋転写因子の機能解析

抗アポトーシス作用を持つ新規心筋転写因子として、Zac-1遺伝子を同定した。Zac-1をCOS細胞に遺伝子導入し、抗体で染色した結果、および核分画と細胞質分画を分離し、Western blotを行った結果、この遺伝子は主として核分画に存在することが明らかになった。胎生7.5日以後のマウス胎児をwhole mount in situ hybridizationを行い、心臓領域のZac-1遺伝子の発現を観察したところ、Zac-1は胎生7.75日より発現し、胎生8日より強く発現することが明らかとなった。Zac-1遺伝子はANPプロモーターに対する転写促進活性を有していた。この転写因子がANPプロモーターのいずれの部位に結合するかを明らかにするため、ANP-Lucプラスミドのdeletion mutantを作成し、Zac-1遺伝子の結合部位を同定したところ、Zac-1は2カ所あるNkx2.5遺伝子結合部位の2個目の直前に存在することが推測された。種々の長さのZac-1の変位位体を作成し、変位体プラスミドとANP-LucプラスミドをともにCOS細胞に共遺伝子導入し、ルシフェラーゼアッセイを行ったところ、Zac-1遺伝子のいずれの部分がANPプロモーターと結合することが明らかとなった。COS細胞のNkx2.5、GATA4、MEF2Cのいずれかの遺伝子とZac-1変位体を共発現させ、共免疫沈降により、会合を確認した。既知の心臓特異的転写因子とZac-1遺伝子のANPプロモーターに対する作用を観察し、Zac-1遺伝子の心臓における転写因子としての性質を解析したところ、Zac-1とNkx2.5遺伝子は共調的に働き、ANPの転写活性を増強させた。
生物活性を有する海洋産環状ペプチドの合成と制癌への応用

1.ダイデムニンBの構造活性相関ダイデムニンB合成中間体、類縁体につき、マウスL1210培養細胞に対する毒性を調べたところ、Ist部とHip部が重要な活性フラグメントであることがわかった。さらに環状デプシペプチド構造は必ずしも必須ではないこと、しかし環状構造になると毒性は極めて強くなることも明らかになった。これらの知見は今後ダイデムニン型制癌薬の分子設計に大いに役立つものと期待している。2.ユリチアサイクラマイドの毒性発現機構強力な細胞毒性を有するユリチアサイクラマイドについて、大量合成法を確立した。ついでそれによって得られたサンプルを用い、毒性発現機構を検討した。その結果ユリチアサイクラマイドは1)細胞成分と自壊的に反応して毒性を発現すること、2)細胞膜成分はその標的でないこと、3)蛋白合成を最も阻害し、DNA合成はほとんど阻害しないこと、4)ブレオマイシン、ペプレオマイシンと相乗効果を示すこと、を明らかにした。これらの知見をふまえて、現在in vivo試験を実施中である。3.ユリチアサイクラマイドの安定立体配座ユリチアサイクラマイドの安定立体配座につき、核磁気共鳴および分子動力学計算を用いて検討したところ、馬の鞍型の配座であることを確認した。この立体配座確認は、毒性発現機構考察のよりどころとなろう。4.ユリサイクラマイドの毒性発現機構ユリサイクラマイドはこれまでに検討してきた活性環状ペプチドとは異なり、オキサゾリン環の毒性発現への寄与は少なく、また蛋白合成はほとんど阻害せず、DNA、RNAの生命を阻害することが明らかとなった。
動脈硬化不安定プラークを特異的に検出する分子標的イメージング剤の開発

動脈硬化病変に生じる不安定プラークは、破綻し血管を閉塞させ脳梗塞・心筋梗塞などを引き起こすため、早期に検出し治療を行うことが重要である。そこで本研究では、不安定プラークへの特異性が高い分子イメージング剤の開発を機能性リポソームを用いて行った。この結果、ホスファチジルセリンにより修飾したリポソームを用いることで、不安定プラークに多く存在するマクロファージを標的としたイメージングに成功し、動脈硬化モデル動物を用いて病変を画像化することができた。メタボリックシンドロームは動脈硬化の原因となり、さらに動脈硬化病変に生じる不安定プラークは、心筋梗塞や脳梗塞を引き起こす。一方、動脈硬化病変が進行しても安定プラークであればこのような病態を生じない。したがって、動脈硬化性疾患の予防のためには、不安定プラークを早期に検出し治療を行うことが重要である。本研究では、分子標的化機能性リボソームを基盤とした、不安定プラークの分子イメージング剤を開発する。まず初年度である平成21年度は、リボソームを用いた不安定プラーク光イメージング剤の開発に着手した。本来の予定では、先に、定量評価が可能である、放射性標識したリボソームを作成する予定であったが、原子炉により製造された99Moからジェネレータにより得られる放射性核種99mTcが、カナダ原子炉の停止により入手困難な状態となったため、まず、蛍光標識したリボソームを作成し検討を進めてきた。リボソーム内にTAMRAやindocyanine green(ICG)などの蛍光色素を封入し、マウス腹腔マクロファージに取り込ませ、蛍光顕微鏡により観察した。この結果、100-200nmのリボソームはマクロファージに効率よく取り込まれることが判明した。また、ICGを蛍光分子として用いた場合、リボソームに内包されている場合は光がOFFに、リボソームが壊れるとONになることを見いだした。すなわち、ICGを用いれば、不安定プラークでのみ特異的に光信号がONになる、アクチベータブルプローブを作成できる可能性が示された。来年度以降、リポソームの不安定プラークへのターゲティング研究、定量的測定を目指した放射性標識リボソームの作成を行う予定である。本研究では、分子標的化機能性リポソームを基盤とした、不安定プラークの分子イメージング剤を開発する。平成21年度までに、蛍光標識リポソームを作成し培養マクロファージにて蛍光顕微鏡にて観察を行い、100-200nmのリポソームはマクロファージに取り込まれることを見いだした。この結果を基に平成22年度は、リポソームに表面修飾を施しマクロファージへの標的性を高める検討を行った。すなわち、不安定プラークに存在するマクロファージは、フォスファチジルセリン(PS)を認識しPSを発現した細胞を取り込むことが知られていることから、構成脂質としてPSを組み込んだリポソームを作成した。作成したリポソームは、^<111>Inを内包することにより放射性標識をした。放射化学的収率は98%であり、極めて効率よく標識することに成功した。次に、作成したリポソームを用い、培養マクロファージへの取り込みについて、定量的に検討を行った。この結果、100nmのPS修飾リポソームでは、100nmの非修飾リポソームおよび200nmのPS修飾リポソームに比較し、有意に高く取り込まれることがわかった。そこで、作成したリポソームをマウスに投与し体内動態を検討したところ、PS標識リポソームは非標識リポソームに比較し脾臓への蓄積が少なく、細網内皮系への取り込みが少ないと考えられた。これらの体内挙動が、in vivoでの不安定プラークへの集積に及ぼす影響を調べるため、来年度は動脈硬化モデル動物であるapoEノックアウトマウスやWHHLウサギを用い、解剖法さらにSPECTにて検討を行っていく予定である。幇メタボリックシンドロームは動脈硬化の原因となり、さらに動脈硬化病変に生じる不安定プラークは、心筋梗塞や脳梗塞を引き起こす。

この結果を基に平成22年度は、リポソームに表面修飾を施しマクロファージへの標的性を高める検討を行い、さらに、^<111>Inにより放射性標識することで、フォスファチジルセリン(PS)修飾リポソームがマクロファージ特異的に取り込まれることを見いだした。そこで、平成23年度は、まず、マクロファージの泡沫化が本リポソームの集積に影響を及ぼすか確認するため、in vitroにてacLDLによって泡沫化させたマクロファージを用いて取り込みに関する検討を行った。この結果、100nmのPSリポソームにおいては、泡沫化させることで取り込みの減少が認められた。一方、200nmのPSリポソームに関しては有意な差は認められなかった。次に、動脈硬化モデル動物であるapoEノックアウトマウスに^<111>In標識PSリポソームを静脈投与し、2時間後に血管を摘出しオートラジオグラフィを行った。この結果、Oil-Red O染色と一致した放射能の集積を認め、インビボでの不安定プラークへの集積が確認された。さらに、動脈硬化動物であるWHHLウサギを用いてSPECTによるin vivoイメージングを行ったところ、血管を描出することに成功した。
感染動物モデルを用いたMERS-CoVが引き起こす重症肺炎の病態解明と治療法開発

MERS-CoVの本来の病原性は軽度の風邪を起こす程度のものであり重症化するには宿主側かウイルス側、あるいはその両方に原因がある。そこで、感染動物モデルを用いて、宿主側(マウス側)あるいはウイルス側を変化させて、MERS-CoVの重症肺炎の機序を探る。最終的には重症かの原因を特定し、病原性の解明、治療薬の開発、治療法の解明につなげる。
全固体マグネシウム硫黄電池への展開を目指した分子結晶電解質の開発

本研究では、全固体マグネシウム硫黄電池の実現を目的として、以前から我々が着目してきたイオン伝導パスを有する超分子結晶をマグネシウムイオン伝導体として展開することを検討してきた。昨年度までは、マグネシウム電池の動作が確認されている電解液の構成要素を参考に、マグネシウムビス(トリフルオロメタンスルホニル)アミドを出発原料とした分子結晶の合成に主に取り組んできたが、今年度はより伝導性の高い試料の合成を目的としてアニオンを変化させた分子結晶の合成に取り組んだ。具体的には、ボロヒドリドイオンを対アニオンとして有するマグネシウム塩と種々の有機基質との反応を検討し、いくつかの分子結晶を得ることに成功するとともに、その構造解析、相転移挙動、イオン伝導性の評価に取り組んだ。また、マグネシウム電池とともに多価金属電池として期待されているアルミニウム電池にも新たに着目し、アルミニウムビス(トリフルオロメタンスルホニル)アミドと種々の有機基質を構成要素とした新規分子結晶の合成も試みた。こちらについても、得られた試料の単離と単結晶X線結晶構造解析、相転移挙動の評価、結晶状態におけるイオン伝導性の測定を行った。無機系材料からなるマグネシウムイオン伝導体やアルミニウムイオン伝導体では、イオン伝導性の発現に数百度の加熱を要することが一般的であるが、本研究で得られた試料は、いずれも室温付近の温度域で結晶状態を保ちながらイオン伝導性を示している。これらの結果は、イオン伝導が困難とされている多価イオン伝導体の開発において、分子結晶の活用が有効であることを示唆するものと考えている。本研究では、ユビキタス元素を構成要素とするマグネシウム硫黄電池の全固体化を目的として、我々が以前から着目していたイオン伝導パスを有する超分子結晶を固体電解質材料として展開することを試みた。本年度はマグネシウム電池の動作が確認されている電解液の構成要素を参考に、マグネシウムビス(トリフルオロメタンスルホニル)アミドとトリグライムからなる分子結晶を合成し、その構造解析、相転移挙動を評価した。我々はマグネシウムとトリグライムがモル比1:2で反応した分子結晶をすでに合成していたが、今回、このモル比を1:1とすることにより新規超分子結晶を得ることに成功した。単結晶X線構造回折測定より、得られた分子結晶ではマグネシウムイオンが7配位構造をとっていることを確認した。ビス(トリフルオロメタンスルホニル)アミドアニオンはマグネシウムイオンのアキシャル位に配位し、トリグライムは4座配位子となっていることを明らかにした。また、新たに有機基質の代わりにイオン液体を構成要素としてマグネシウムビス(トリフルオロメタンスルホニル)アミド塩を組み合わせた分子結晶の合成にも取り組んだ。その結果、[N(CH3)2(CH2CH3)2][N(SO2CF3)2]を出発原料に用いることにより、新規分子結晶[N(CH3)2(CH2CH3)2][Mg{N(SO2CF3)2}3]を得るとともに、その結晶構造解析を行った。また、イオン伝導体の評価を行うことにより、得られた試料は室温付近で10-6 S cm-1程度の伝導性を示すことも確認した。無機系マグネシウムイオン伝導体では、多くの場合イオン伝導性の発現に数百度の加熱を要するのに対し、本研究で得られた試料は室温でイオン伝導性を示していることから、イオン伝導が困難とされている多価イオン伝導体の開発において、有機物の活用が有効であることを示唆する結果が得られたと考えている。「リチウムイオン伝導性分子結晶の開発」に関する検討で得られた知見を基礎に、分子結晶のイオン伝導性向上には、構成要素の立体的サイズが小さいことが望ましいことを見出している。これを参考に、{N(SO2CF3)2}ーを持つマグネシウム塩と有機分子との自己集積化を利用した新規分子結晶の合成を検討した。すでにマグネシウム電池の動作が確認されている電解液の構成要素を参考に、トリグライムとMg{N(SO2CF3)2}2をモル比1:1で反応させることにより、トリグライムと{N(SO2CF3)2}ーの両者がマグネシウム中心に配位した新規分子結晶[Mg(triglyme){N(SO2CF3)2}2]を得た。さらにその結晶構造を明らかにすることに成功した。この結果は電解液中でのMg{N(SO2CF3)2}2の振る舞いについて新たな知見を与える結果でもある。また、イオン液体を構成要素とした超分子結晶の合成にも着手し、Mg{N(SO2CF3)2}2と同種のアニオンを持つイオン液体[N(CH3)2(CH2CH3)2][N(SO2CF3)2]とMg{N(SO2CF3)2}2との反応から、{N(SO2CF3)2}2アニオンがマグネシウムイオンを架橋したアニオン性一次元鎖構造を有する新規結晶[N(CH3)2(CH2CH3)2][Mg{N(SO2CF3)2}3]を得た。この結晶は室温下で1x10-6 S cm-1程度のイオン伝導性を示すことも明らかにした。これはイオン伝導性の発現に加熱を要する既報の無機系マグネシウムイオン伝導体に比べて著しく高いものとなっている。

具体的には、ボロヒドリドイオンを対アニオンとして有するマグネシウム塩と種々の有機基質との反応を検討し、いくつかの分子結晶を得ることに成功するとともに、その構造解析、相転移挙動、イオン伝導性の評価に取り組んだ。また、マグネシウム電池とともに多価金属電池として期待されているアルミニウム電池にも新たに着目し、アルミニウムビス(トリフルオロメタンスルホニル)アミドと種々の有機基質を構成要素とした新規分子結晶の合成も試みた。こちらについても、得られた試料の単離と単結晶X線結晶構造解析、相転移挙動の評価、結晶状態におけるイオン伝導性の測定を行った。無機系材料からなるマグネシウムイオン伝導体やアルミニウムイオン伝導体では、イオン伝導性の発現に数百度の加熱を要することが一般的であるが、本研究で得られた試料は、いずれも室温付近の温度域で結晶状態を保ちながらイオン伝導性を示している。これらの結果は、イオン伝導が困難とされている多価イオン伝導体の開発において、分子結晶の活用が有効であることを示唆するものと考えている。これまでは、リチウムイオン伝導性分子結晶の合成において、高い解離度と多点配位能を併せ持つ{N(SO2CF3)2}アニオンの活用が有効であることを参考に、このアニオンを有するマグネシウム塩を出発原料とした分子結晶の合成を検討してきた。ただし、得られた含マグネシウム分子結晶のイオン伝導性は、同様の有機基質とアニオンを持つリチウムイオン伝導性分子結晶に比べて低い。この要因として、1価のリチウムイオンに比べて2価のマグネシウムイオンでは対アニオンとの相互作用が大きいことが予想される。特に、{N(SO2CF3)2}アニオンは多点配位能を持つため、キレート効果によってマグネシウムイオンとの相互作用が大きくなり、イオン伝導が不利になっている可能性が考えられる。分子結晶を電解質として展開するには、伝導性の向上が必須である。そのため、今後は分子結晶の構成要素の中でも、特に対アニオンの選択肢を拡げることによりこの課題に取り組んでいく。すでにこのような観点から、固体電解質としての報告例もあるボロハイドライドに着目し、新規分子結晶の合成に着手している。ボロハイドライドはケトンやニトリルに対し還元剤として働く。そのため、このような還元を受けない官能基で構成される有機基質を適切に選択し、ボロハイドライドを対アニオンとするマグネシウムイオン伝導性分子結晶の合成を重点的に検討する。また、ボロハイドライド以外の対アニオンを持つマグネシウム塩を出発原料とした分子結晶電解質の開発も並行して検討する。イオン伝導性の高い試料が得られ次第、電位窓や輸率の測定、電池の作成を検討する。
遺伝性疾患患者家族の心理的ストレスとその関連要因に関する研究

【研究課題1:遺伝性疾患患者家族が抱く遺伝医療で用いられる言葉に対する印象と知識量が言葉の印象に与える影響に関する研究】遺伝医療の場で使用される言葉(遺伝子の変異、遺伝子の変化、遺伝子の傷)に対して、小児科遺伝外来に通う患者の家族が抱く印象について調べ、言葉の印象と"遺伝子突然変異"という言葉の知識量との関連について検討した。研究結果は昨年度までの報告の通りである。本年度は、Journal of Genetic Counselingに原著論文を投稿し、受理・出版された。また、第33回日本遺伝カウンセリング学会学術集会シンポジウム2「認定遺伝カウンセラーの現状と今後」にて、本研究に関する講演を行った。【研究課題2:遺伝性疾患患者の心理的ストレスとその関連要因に関する研究】北里大学病院外科乳腺外来を初診にて受診し、研究参加に書面にて同意した患者に対し、特性不安、否定的感情抑制の程度、ライフストレス経験、心理的ストレス、乳がん家族歴及び乳腺自覚症状の有無について調査し、同時に面接調査を実施した。面接において「遺伝に係ること(家系内がん患者の有無、自らのがん体質についてなど)」を自発的に表出する個人に関連する要因について、153名を対象として解析を行った。その結果、乳がん家族歴がある場合、面接において遺伝に関して語る人の頻度が有意に高く、自覚症状がある場合、遺伝に関して語る人の頻度が有意に低かった。また、遺伝に係る語りの表出に対して、乳がん家族歴、自覚症状、年齢、および心理特性を考慮した多変量的検討をするために多重ロジスティック回帰分析を行った結果、乳がん家族歴があり、抑うつ感情の表出を抑制し、怒り感情を表出する人ほど、遺伝に係る語りを表出することがわかった。本研究成果は、学術雑誌に投稿中である。以上の研究による知見は、よりよい臨床活動(遺伝医療)実践に貢献するものであった。1.(研究課題1遺伝性疾患患者家族が抱く遺伝医療で用いられる言葉に対する印象と知識量が言葉の印象に与える影響に関する研究)遺伝医療の場で遺伝性疾患の説明を実施する際に使用される言葉(遺伝子の変異、遺伝子の変化、遺伝子の傷)について、小児科遺伝外来に通う患者の家族がどのような印象を抱いているかについて調べ、"遺伝子突然変異"という言葉の知識量と言葉の印象との関連性について検討した。その結果、(1)小児科遺伝外来に通う患者の家族(おもに親)は、言葉の印象には知識量の影響は受けないものの、「遺伝子の傷」は他の2語に比べると発達性を感じられず、「遺伝子の変化」に比べで好ましさが低いことから、「遺伝子の傷」という言葉は他の言葉に比べて否定的な印象を持つ言葉であることが示唆された。(2)患者の年齢が低いと「遺伝子の変異」「遺伝子の傷」という言葉に対して「遺伝子の変化」よりも好ましさを感じていない一方で、患者の年齢が高いと3つの言葉の印象に対する好ましさには差がなかった。(3)患者家族と学生が「遺伝子の変異」という言葉に対して抱く印象に関する比較からは、患者家族が学生と比較して「遺伝子の変異」という言葉に対して好ましさ、発達性、意図性を感じていなかったことがわかった。以上のことから、遺伝性疾患を説明する際には、使用する言葉の選択のより注意深い配慮が必要であることが示唆された。これらの知見は、実際の遺伝医療現場における臨床実践に有用なものであった。研究内容は、日本人類遺伝学会第52回大会、日本心理学会第71回大会および第20回日本総合病院精神医学会にて発表を行った。2.(研究課題2遺伝性疾患患者の心理的ストレスとその関連要因に関する研究)乳腺外来受診患者における、乳がんの家族歴、心理的ストレス、個人特性の関連を調べるため、情報収集(カルテ情報の収集)およびデータ解析に着手したところである。(課題1遺伝性疾患患者家族が抱く遺伝医療で用いられる言葉に対する印象と知識量が言葉の印象に与える影響)遺伝医療の場で遺伝性疾患説明の際に使用される言葉について、小児科遺伝外来患者の家族がどのような印象を抱いているかについて調べ、"遺伝子突然変異"に関する知識量との関連性について検討した。結果は昨年度の報告の通りである。本年度は、研究成果を27th NSGC-AEC(米国)にて発表し、J Genet Counselに論文投稿中である。(課題2遺伝性疾患患者の心理的ストレスとその関連要因に関する研究)北里大学病院外科乳腺外来を初診にて受診した患者を対象に、特性不安、否定的感情抑制の程度、ライフストレス経験、乳癌家族歴の有無、乳腺自覚症状の有無が、初診時の患者の気分状態に与える影響について検討した。最終的に154名を対象として検討した結果、特性不安が高く、感情を抑制し、ライフストレス経験が多く、自覚症状がある人ほど初診時の気分状態は良好ではないことがわかった。特に特性不安が気分状態に与える影響は大きく、心理的援助の重要性が示唆された。研究結果は、第21回日本サイコオンコロジー学会学術集会、31st SABCS(米国)にて発表を行った。また、Support Care Cancerに受理されている。さらに、乳腺外来初診患者における遺伝に関する意識に関する検討を行ったところ、面接調査において、遺伝に関する意識は233名中39名(16.7%)によって自発的に語られた。そのうち、乳癌家族歴のある患者は16名、ない患者は23名であり、遺伝に関する意識は乳癌の家族歴に関係なく表出された。また、遺伝に関する意識を自発的に語った患者は、家族歴が癌罹患のリスク因子であることを認識していることがわかった。

本研究の成果は、日本人類遺伝学会第53回大会、日本心理学会第72回大会にて発表を行った。【研究課題1:遺伝性疾患患者家族が抱く遺伝医療で用いられる言葉に対する印象と知識量が言葉の印象に与える影響に関する研究】遺伝医療の場で使用される言葉(遺伝子の変異、遺伝子の変化、遺伝子の傷)に対して、小児科遺伝外来に通う患者の家族が抱く印象について調べ、言葉の印象と"遺伝子突然変異"という言葉の知識量との関連について検討した。研究結果は昨年度までの報告の通りである。本年度は、Journal of Genetic Counselingに原著論文を投稿し、受理・出版された。また、第33回日本遺伝カウンセリング学会学術集会シンポジウム2「認定遺伝カウンセラーの現状と今後」にて、本研究に関する講演を行った。【研究課題2:遺伝性疾患患者の心理的ストレスとその関連要因に関する研究】北里大学病院外科乳腺外来を初診にて受診し、研究参加に書面にて同意した患者に対し、特性不安、否定的感情抑制の程度、ライフストレス経験、心理的ストレス、乳がん家族歴及び乳腺自覚症状の有無について調査し、同時に面接調査を実施した。面接において「遺伝に係ること(家系内がん患者の有無、自らのがん体質についてなど)」を自発的に表出する個人に関連する要因について、153名を対象として解析を行った。その結果、乳がん家族歴がある場合、面接において遺伝に関して語る人の頻度が有意に高く、自覚症状がある場合、遺伝に関して語る人の頻度が有意に低かった。また、遺伝に係る語りの表出に対して、乳がん家族歴、自覚症状、年齢、および心理特性を考慮した多変量的検討をするために多重ロジスティック回帰分析を行った結果、乳がん家族歴があり、抑うつ感情の表出を抑制し、怒り感情を表出する人ほど、遺伝に係る語りを表出することがわかった。本研究成果は、学術雑誌に投稿中である。以上の研究による知見は、よりよい臨床活動(遺伝医療)実践に貢献するものであった。
造血系幹細胞株の樹立と再生医療を目指したアロ免疫寛容誘導に関する研究

昨年に引き続き、ミネソタ大Verfaillie等のグループと直接連絡を取り、彼女らがNature誌に報告したMarrow-derived Adult progenitor cells(MAPC)培養に準じ、あるいはIGF1など他の増殖因子の添加などの培養条件の改良を試みたが、造血幹細胞の株化は報告通りには再現できないことが明らかになった。一年以上の培養努力で骨髄由来間葉系幹細胞株は、GFPマウスであるか否かを問わず、安定して樹立されることから、研究の方向を心臓組織内の心筋前駆細胞の同定に変更し、当初の目的に近い研究を行う事とした。これまでの研究から、骨格筋筋芽細胞シートによる細胞移植をラット梗塞心に行うと、移植細胞自身は急速に消失するものの、低下した心機能が著明に改善することが明らかになっていたので、同部位で宿主の心筋前駆細胞が活性化され、心機能改善効果を生んでいるのではないかとの仮説を立て、未熟細胞の同定と定量化を試みた。その結果、1.筋芽細胞移植後の心筋梗塞部にc-kit陽性あるいはSca-1陽性の増殖細胞(BrdU取り込み細胞)の集積が認められた。2.この未熟増殖細胞は形態的には小実質細胞であることが示唆された。3.未熟増殖細胞の密度は、シート移植群が、未処置あるいは遊離筋芽細胞の注入群より有意に高く、心機能の改善度と相関することが示唆された。これらの結果を、平行する自己筋芽細胞シートによる心不全治療研究の一部として論文報告を行った。当初の実験計画に従い、CM Verfaillie等(Nature 418:41,2002)の方法を参考として、B6背景のGFPトランスジェニックマウス(GFPTg)の骨髄細胞をFibronectin coated plasticdish上で培養した。まず培養液交換頻度を検討したが、マウス骨髄細胞培養の場合、細胞播種後1-3日およびその後2-3日に1度の頻度の培養液交換によって浮遊細胞を除去しなければ、表面イムノグロブリン陽性のB細胞系列の集団が増加し、長期生存細胞がえられない事が明らかになった。1/3日の培養液交換により、骨髄細胞から付着性細胞を3週間に渡って、肉眼観察上の増殖を維持しつつ培養可能となったので、培養液に10ng/mlのEGF, PDGF-BB, LIFを加えて培養を行ったところ、EGFあるいはPDGF-BBの添加により、観察上の増殖率は若干増加したが明らかな形態変化は認められなかった。LIF添加による明らかな形態・増殖性の変化は認められなかった。以後培養はEGF, PDGF, LIFを加えた条件で行った。培養開始3週間後の細胞集団から長期培養可能なクローン樹立するため、MACS beadsを用いてCD45-/Ter119-の細胞集団を分離し、1-200cells/wellの条件で96well plateによる培養を行った。CD45,Ter119両陰性の細胞は約30-60%であったが、いずれの細胞密度の培養からも長期継代可能な小型細胞クローンは得られなかった。しかし、当初目標とした細胞とは形態的に異なるものの、長期継代可能な中型付着細胞が得られた。現在、得られた細胞の表面抗原解析、骨髄採取元のマウス系統や週令の違いによる影響を検討している。