hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
SH3 (Src類似)ドメインに結合する蛋白質の機能解析

出芽酵母のSH3ドメインを持つ蛋白質であるBEM1は、細胞の極性化に重要な因子として同定され、今までにCDC24, STE20,アクチンなど芽形成のために重要な因子らと相互作用することが報告されており、酵母の芽の形成の際の細胞極性確立維持に中心的な働きをしている因子と考えられている.芽の形成の際には,CDC42とRHO3などの低分子量GTP結合タンパク質が関与していが,BEM1には,過剰発現によりrho3欠損を抑圧する作用がある。BEM1のSH3ドメインの解析を行い,それと結合するBOI蛋白質を同定し,解析した。BEM1のSH3ドメインは、高温での酵母の出芽開始に必要なだけでなく、BEM1によるrho3欠損の抑圧にも必須であることがわかった。そのSH3ドメインに結合するBOI2を同定し、塩基配列より、構造的ホモログと考えられるBOI1を見い出した.遺伝学的解析より、BOI1とBOI2は、機能的に重複し,BOIは、酵母の芽の成長に重要な働きをしていた.BOI機能を欠失した細胞の示す表現型は、rho3機能を欠失した細胞のものと酷似しているばかりでなく、BOI機能の欠失は、RHO3の過剰発現により抑圧されることがわかり、BOIとRHO3は、芽の形成に密接に関連して機能していると考えられる。酵母の芽の形成には、出芽部位において,蛋白質複合体が形成、発展、再構成されていくことで、出芽部位の決定、出芽開始、芽の成長、細胞質分裂という一連の過程が進行すると考えている。BEM1は、この複合体の因子と考えられ,機能的に出芽開始に関与する因子であるにもかかわらず,芽の成長に関与するBOIにより制御をうけていることを示唆する結果が得られた。また、BOI機能とRHO3機能は密接に関連していた。これらのことは、出芽部位複合体の発展、再構成の機構を解析する上で重要な知見であると考えている。
高齢者の転倒要因としての立位バランス能力認知に関する研究

平成9年度は、健常若年者を対象に立位保持のための姿勢応答形式(postural movement strategy)について、随意的立位重心移動範囲と立位保持限界期の下肢筋活動パターンの分析から検討し、危険認知による姿勢応答形式(ankle strategyからhip strategyへ)の切り換えが起こることを報告をした。平成10年度は、健常高齢者10名(平均年齢75.5歳±4.7)を対象に同様の実験を行った。重心移動限界域における足底接床面に対する相対的重心移動量は前方が開眼で59.4%、閉眼で58.6%、後方が開眼で74.9%、閉眼で72.2%であった。これは健常若年者と比べて有意に低下し、特に前方への移動量の低下が著しかった。課題動作中に筋活動については、足関節周囲の遠位筋と股関節周囲の近位筋が共に持続的な収縮を示し、重心移動限界域における相動的な筋活動は認められなかった。また、限界域における遠位筋の活動から近位筋への活動の変換も認められず、むしろ遠位の足関節低背屈筋の同時収縮を示し、健常若年者に認められた近位筋のサイレントピリオッドの出現も認められなかった。動作パターンとしては、足底を床につけたまま、股関節を屈曲・伸展しないように重心を前後へ移動させるよう十分説明し、被験者も了解していたのにも関わらず股関節を屈曲させたり脊柱を反り返ったり動作開始から大きく骨盤を前後へ移動させる方法を取っていた。これらの結果から、高齢者においては、足関節周囲の筋力低下や可動域の低下などの筋骨格系の老化が考えられるが、立位保持のために、若年者が使用するankle strategyを十分活用できず、当初より股関節を中心とした制御、いわゆるhip strategyを用いた姿勢制御により立位保持に適応しようとしていることが示唆された。またこれは姿勢制御方略の多様性の低下を示すものと考えられ、高齢者の立位姿勢制御の低下を示唆するものと思われる。立位保持のための姿勢応答形式(postural movement strategy)について、随意的立位重心移動範囲と立位保持限界期の下肢筋活動パターンの分析から検討した。健康成人男性5名、女性5名、平均年齢22.6±2.6歳を対象に、随意的立位重心移動(前後方向)を可動限界範囲まで行い、その時の立位保持のための姿勢応答を足圧中心軌跡と表面筋電図から分析した。足圧中心軌跡は重心動揺計(アニマ社)で計測し、筋活動は右側の大腿直筋、ハムストリング、前脛骨筋、ヒラメ筋、母指球筋の5筋を表面筋電図で導出した。足圧中心軌跡と筋活動は重心動揺計を改良し、計測開始パルスを筋電計へ出力し同期させた。足圧中心軌跡の可動範囲は、開眼で足長前後径の約76.8%で、閉眼では可動範囲が拡大する傾向にあった。筋活動パターンは、前方移動では重心移動限界域に達する前にヒラメ筋が活動し、限界域に達した後大腿二頭筋が活動した。後方移動では前脛骨筋が限界域前に活動し、大腿直筋が限界域後に活動した。母指球筋は常時活動傾向にあった。開眼に比べ閉眼で重心可動範囲が大きいのは、視覚情報欠如による危険認知情報が減少することによると思われる。重心移動限界域での筋活動パターンは遠位から近位への応答形式変化が認められた。これはNashnerやShumway-Cookらの言うankle strategyからhip strategyへの切り換えと解釈でき、危険認知による別の姿勢応答形式への移行を示唆するものと思われる。一方、高齢者10名(平均年齢76.4歳)を対象に同様の分析を行ったが、股関節運動をせず足関節を使って前後へ重心を移動させることが難しく、股関節を屈曲伸展し前後へ重心を移動させようとする傾向が強かった。重心移動範囲も狭い傾向が認められた。しかし、課題の理解が十分とは言えない場合もあり、今後被験者数を増やし検討する必要がある。

動作パターンとしては、足底を床につけたまま、股関節を屈曲・伸展しないように重心を前後へ移動させるよう十分説明し、被験者も了解していたのにも関わらず股関節を屈曲させたり脊柱を反り返ったり動作開始から大きく骨盤を前後へ移動させる方法を取っていた。これらの結果から、高齢者においては、足関節周囲の筋力低下や可動域の低下などの筋骨格系の老化が考えられるが、立位保持のために、若年者が使用するankle strategyを十分活用できず、当初より股関節を中心とした制御、いわゆるhip strategyを用いた姿勢制御により立位保持に適応しようとしていることが示唆された。またこれは姿勢制御方略の多様性の低下を示すものと考えられ、高齢者の立位姿勢制御の低下を示唆するものと思われる。
アデシノン受容体を介したヒト精子先体反応引き金機構に関する研究

1.精漿と血漿中のアデニルプリン量を測定した結果、両者ともアデニルプリンが存在し、精漿総アデニルプリン量は血漿の約10倍であった。プリン構成比は、血漿ではATP、ADPが93.8%を占め、アデノシンは1.6%であったのに対し、精漿ではアデノシンが約60%占め、精漿のアデノシン濃度は血漿の約360倍であった。透析精漿に合成ATPを添加して脱リン酸化を経時的に観察すると、ATPは30分以内に99%が消失し、ADPが出現し、最終的にアデノシンに分解された。一方、血漿に添加したATPは脱リン酸ではなく、直接脱アミノされることによりアデニルプリンが消失し、精漿と血漿では分解mannerが異なることが示された。2.先体反応の観察法の改良を行い、FITC-Con A(緑色蛍光)ならびにDNA染色試薬であるプロピウムアイオダイド(赤色蛍光)を用いて2重染色し、さらにαメチルマンノシド(7.0mM)で非特異染色をカットオフすることにより、より定量的な測定が可能となった。3.in vitroでは精漿を除去すると先体反応が自発的に誘起するが、アデノシン存在下では精漿を除去しても先体反応誘起が抑制された。4.アデノシンA1受容体作動薬(PIA)は先体反応誘起を抑制した。2.アデノシンA1受容体選択的拮抗薬(FK-352、FK838)は濃度依存的に先体反応誘起を促進した。5.アデノシンA1受容体拮抗薬による先体反応誘起促進はL型Caチャンネルブロッカーにより消失した。6.アデノシンA2受容体作動薬、拮抗薬は先体反応に影響しなかった。7.ATPにより先体反応誘起に要する時間の短縮が見られた。以上の結果から、精液中ではアデノシンA1受容体を介して先体反応の誘起を抑制している可能性が示された。アデノシンA1受容体はG蛋白質を介してL型カルシウムチャネルを制御していることが報告されており、洗浄によるアデノシンの除去が先体反応の引き金である可能性が示唆された。精漿と血漿中のアデニルプリン量を測定した結果、両者ともアデニルプリンが存在し、精漿総アデニルプリン量は血漿の約10倍であった。プリン構成比は、血漿ではATP、ADPが93.8%を占め、アデノシンは1.6%であったのに対し、精漿ではアデノシンが約60%を占め、精漿のアデノシン濃度は血漿の約360倍であった。アデノシンが精漿中における先体反応誘起抑制因子の一つではないかとの作業仮説のもとに、アデノシン受容体作動薬、拮抗薬の先体反応に対する影響を観察した。1. in vitroでは精漿を除去すると先体反応が自発的に誘起するが、精漿と同程度のアデノシン存在下では精漿を除去しても先体反応誘起が抑制された。2.アデノシンA1受容体作動薬(PIA)は先体反応誘起を抑制した。

2.アデノシンA1受容体選択的拮抗薬(FK-352、FK838)は濃度依存的に先体反応誘起を促進した。3.アデノシンA1受容体拮抗薬による先体反応誘起促進はL型Caへチャネルプロッカーにより消失した。4.アデノシンA2受容体作動薬、拮抗薬は先体反応に影響しなかった。以上の結果は、精液中ではアデノシンが精子アデノシンAl受容体を介してして先体反応誘起を抑制している可能性を示唆している。すでにアデノシンA1受容体はG蛋白質(Gl)を介してL型Ca2+チャネルを制御することが報告されている。洗浄によるアデノシン除去がアデノシンA1受容体によるL型Ca2+チャネル抑制を解除し、Ca2+が精子先体に流入することが先体反応誘起の引き金となっている可能性が考えられた。1.精漿と血漿中のアデニルプリン量を測定した結果、両者ともアデニルプリンが存在し、精漿総アデニルプリン量は血漿の約10倍であった。プリン構成比は、血漿ではATP、ADPが93.8%を占め、アデノシンは1.6%であったのに対し、精漿ではアデノシンが約60%を占め、精漿のアデノシン濃度は血漿の約360倍であった。透析精漿に合成ATPを添加して脱リン酸化を経時的に観察すると、ATPは30分以内に99%が消失し、ADPが出現し、最終的にアデノシンに分解された。一方、血漿に添加したATPは脱リン酸ではなく、直接脱アミノされることによりアデニルプリンが消失し、精漿と血漿では分解mannerが異なることが示された。2.先体反応の観察法の改良を行い、FITC-Con A(緑色蛍光)ならびにDNA染色試薬であるプロピウムアイオダイド(赤色蛍光)を用いて2重染色し、さらにαメチルマンノシド(7.0mM)で非特異染色をカットオフすることにより、より定量的な測定が可能となった。3. in vitroでは精漿を除去すると先体反応が自発的に誘起するが、アデノシン存在下では精漿を除去しても先体反応誘起が抑制された。4.アデノシンA1受容体作動薬(PIA)は先体反応誘起を抑制した。5.アデノシンA1受容体拮抗薬による先体反応誘起促進はL型Caチャネルブロッカーにより消失した。6. ATPにより先体反応誘起に要する時間の短縮が見られた。
匿名性を利用したネットいじめの数理モデル化と分析

近年、ネットいじめが深刻な社会問題として取り上げられている。ネットいじめとは、パソコンや携帯電話、あるいは、インターネット上のサービスを利用して、加害者が被害者に対して、継続的に精神的苦痛を与えることと定義される。本研究では、ネットいじめの特徴を理解することを目的として、ソーシャルメディアサイトにおけるユーザ間のコミュニケーションデータを分析した。また、ネットいじめの被害者を推定する方法について考察した。本研究は,ソーシャルメディアにおけるユーザ間のコミュニケーションを「匿名性」の観点から分析し,現在深刻な社会問題となっている「ネットいじめ」の発生原理を理解することを目的としている.この目的を達成するために,初年度は,米国のソーシャルメディアサイト(SNS) spring.meよりユーザ間のコミュニケーションデータを取得・分析し,ネットいじめの特長を理解する.また,次年度には,初年度に得られた知見をもとに匿名ユーザの合理的行動モデルの構築と集団行動の理論分析を行い,ネットいじめを検出した匿名ユーザが被害者を擁護する条件を導く.また,収集したデータセットや開発ツールを一般公開すると共に,著名国際会議や国際学術論文誌へ研究論文を投稿する.初年度には,spring.meよりテキストデータを収集し,自動的にデータベース化するプログラム(Web Crawler)の開発を進めた.中傷的メッセージが多数投稿されているページのユーザを被害者として抽出し,被害者の社会ネットワーク(周辺ユーザの集合と繋がり)を重み付き有向グラフで表現する.有向グラフのノードはユーザを表し,識別子(ユーザ名や「匿名」)でラベルした.また,ノード間のエッジでメッセージの投稿を示す.投稿回数や悪質度合いをエッジの重みで表現した.今後,このグラフ構造を分析し被害者,加害者,匿名ユーザの社会関係を理解する.例えば,匿名ユーザと被害者を結ぶエッジの重みが大きい場合,匿名性を利用した攻撃が行われている可能性がある.また,加害者が被害者に対して社会的に優位なネットワーク(例えば,多数の友人をもつ)可能性があり,その真偽を検証する.本研究では,現在深刻な社会問題となっている「ネットいじめ」の発生原理を理解することを目的として,ソーシャルメディアサイト(Spring.me)におけるユーザ間のコミュニケーションを分析した.まず,ソーシャルメディアサイトからテキストデータを自動的に収集し,データベース化するウェブクローラを開発した.次に,開発したウェブクローラを使ってユーザ間のコミュニケーションデータを自動収集し,分析対象とするデータセットを構築した.続いて,構築したデータセットを単純なテキスト処理により分析・分類した.その結果,比較的高い頻度で中傷的表現が利用されていることや(11.9%),そのような表現を利用するユーザが多く存在することが分かった(13.5%).今後の課題として,中傷的表現を頻繁に用いるユーザを含む社会ネットワークを,重み付き有向グラフで表現し,ネットワークの特徴を分析することが挙げられる.研究期間内に実施したネットワーク分析では,統計的に有意な特徴は抽出できなかった.今後様々な指標や観点から分析を進めていく予定である.情報ネットワークウェブデータの自動収集プログラムの開発に想定以上の時間を要した.対象としているソーシャルメディアサイトのデザイン変更に伴い,自動収集プログラムにも変更が生じたり,自動収集プログラムからソーシャルメディアサイトに接続できなくなる,などテクニカルな問題が発生した.現在まだ問題を解決できていない.通信ログの分析をして,自動収集プログラム内で生じている問題を同定する.問題解決できない場合,利用しているライブラリを変更する.これでも問題解決できない場合には,対象とするソーシャルメディアサイトを変更すること考える.解析データの自動収集プログラムの開発に大幅な遅れが生じたため,研究成果発表まで進められず,旅費などに残額が生じた.次年度には,プログラム開発のための研究員を雇用して,プログラムのデバッグを進める.
コミュニケーション障害児の鑑別診断と教育に関する研究

昭和63年度重点領域研究「コミュニケーション障害児の診断と教育に関する研究」の採択に伴い,同研究の実施のための準備研究を主として行った.1.使用用語の定義付けの検討:コミュニケーションおよびコミュニケーション障害について,辞典類13種(国内9種,国外4種),事典類8種からその項目を抽出し,また外国文献についてはDIALOGを通して,医学・心理学・教育学・社会学等の領域で,19661987年間の検索を行った.その分析の結果,言語にかかわってはノンバーバルの領域が広く含まれ,またコミュニケーションにかかわっては相互交渉の分析が重要な要素であった.2.早期発見と鑑別診断の研究:実践教育研究対象児に対する医学的診断の項目について検討を進め,問診内容,大脳生理学的方法を定めた.また行動観察的立場から,コミュニケーション発達チェックリストの改訂を行った.3.指導法の研究:各障害児に対する從来の研究の検討を行い,コミュニケーション障害全般について,相互の間の共感性の成立過程のあり方等が共通的に検討される必要があることが認められた.また学校システムのあり方,言語発達の記号論的分析も検討された.4.発達予測の研究:予測のための検査として,簡易発達検査,親子言語関係診断テスト,知覚ー運動スキル検査等の再検討を行った.5.教育工学的方法の研究:アメリカで使用されている言語障害児指導用CAI教材の調査を行い,そのモデル的なものの分析を行った.また精神薄弱児の数量概念構成のためのプログラムの試作を行った.6.社会適応の研究:社会適応に関係する要因について分析を行った.7.鑑別診断と教育に関する総合的研究:各領域における研究内容の相互関係について検討し,診断領域,工学領域,社会適応領域の実践研究領域へのかかわり方を明かにした.昭和63年度重点領域研究「コミュニケーション障害児の診断と教育に関する研究」の採択に伴い,同研究の実施のための準備研究を主として行った.1.使用用語の定義付けの検討:コミュニケーションおよびコミュニケーション障害について,辞典類13種(国内9種,国外4種),事典類8種からその項目を抽出し,また外国文献についてはDIALOGを通して,医学・心理学・教育学・社会学等の領域で,19661987年間の検索を行った.その分析の結果,言語にかかわってはノンバーバルの領域が広く含まれ,またコミュニケーションにかかわっては相互交渉の分析が重要な要素であった.2.早期発見と鑑別診断の研究:実践教育研究対象児に対する医学的診断の項目について検討を進め,問診内容,大脳生理学的方法を定めた.また行動観察的立場から,コミュニケーション発達チェックリストの改訂を行った.3.指導法の研究:各障害児に対する從来の研究の検討を行い,コミュニケーション障害全般について,相互の間の共感性の成立過程のあり方等が共通的に検討される必要があることが認められた.また学校システムのあり方,言語発達の記号論的分析も検討された.4.発達予測の研究:予測のための検査として,簡易発達検査,親子言語関係診断テスト,知覚ー運動スキル検査等の再検討を行った.5.教育工学的方法の研究:アメリカで使用されている言語障害児指導用CAI教材の調査を行い,そのモデル的なものの分析を行った.また精神薄弱児の数量概念構成のためのプログラムの試作を行った.6.社会適応の研究:社会適応に関係する要因について分析を行った.7.鑑別診断と教育に関する総合的研究:各領域における研究内容の相互関係について検討し,診断領域,工学領域,社会適応領域の実践研究領域へのかかわり方を明かにした.
H.pylori CagA蛋白による細胞内シグナルネットワークの撹乱

Helicobacter pyloriCagAタンパク質は菌体内で合成後、感染後宿主細胞内に注入され分子内に存在する複数のチロシン残基がリン酸化を受ける。CagAの細胞内標的分子であるSHP-2は、Rasの活性化に関わる分子として考えられている。そこで、CagAにより修飾されるSHP-2介在性シグナル伝達系をより詳細に検討するため、Tet-On systemを用い野生型CagAおよびリン酸化を受けるチロシン残基をアラニン残基に置換したリン酸化耐性CagAの発現制御が可能なAGSヒト胃上皮細胞株を樹立した。野生型CagAを誘導発現させた細胞株では、CagA陽性H.pylori感染時に観察される特徴的な細胞形態変化hummingbird表現型を示した。hummingbird細胞をタイムラプスビデオで経時的な観察を行ったところ、hummingbird表現型を示した細胞は細胞運動性が亢進していることが明らかとなった。次に、CagAがチロシンリン酸化依存的にRas/MAPK系に与える影響を検討した。その結果、CagAの細胞形態変化誘導能は、優性陰性型Ras分子の異所性発現では全く影響を受けず、またRasの活性調節因子であるGrb2の優性陰性型分子を発現させた細胞においても同様の結果であった。一方、MAPKK阻害剤により細胞内Erk活性化を阻害したところ、CagAによる細胞形態変化誘導が抑制された。また、SHP-2特異的siRNAを用いてSHP-2の発現を抑制した細胞においてもCagA依存的な細胞形態変化誘導が阻害された。これらのことより、CagAはSHP-2の活性化とRas非依存的なMAPKカスケードの活性化を介して、細胞形態変化の誘導のみならず細胞運動能を亢進していることが明らかとなった。
細胞膜伸展により分泌された伝達物質を介する細胞容積感受性アニオンチャネル制御機構

本研究は細胞膜伸展刺激により細胞から分泌された化学伝達物質の作用が誘起する細胞容積感受性外向整流性アニオンチャネル(VSOR)活性化機構と、それによる細胞の容積及び形態変化や移動の制御機構の解明を目的とした。研究の結果、分泌されたATPやグルタミン酸の作用により、個々のカルシウムイオン透過型チャネル蛋白質開口部近傍に形成される高カルシウムイオン濃度領域「カルシウムナノドメイン」を介してVSORが活性化されることが明らかになり、細胞の形態変化の際の1細胞上の局所的な容積制御基盤が解明された。また、胎生脳発達過程においてVSORを通じて放出されたタウリンによる神経細胞移動制御機構も明らかになった。我々の主な研究対象である細胞容積感受性外向整流性アニオンチャネル(VSOR)は、あらゆる種類の細胞において環境変化に応じた細胞容積及び形態の適切な調節を促す重要な役割を担っている。前年度はマウス大脳皮質のアストログリア細胞において、細胞外低浸透圧溶液暴露により細胞膜伸展刺激を加えた際に細胞から放出されるATPの、その細胞自身への作用により誘起されるVSOR活性化成分と、その細胞容積調節における重要性を明らかにした。そこで、本年度は先ずATP以外に同刺激により放出されることが知られるグルタミン酸が、ATPと同様な効果を持つか否かについて検討を行った。その結果、グルタミン酸はATPと全く同様に、Ca2+透過型イオンチャネル開口部の極めて近傍に形成される高Ca2+濃度領域「Ca2+ナノドメイン」を介してアストログリアのVSORを活性化しうることが判明した。しかし、低浸透圧暴露による膜伸展刺激で放出されたグルタミン酸のアストログリアへの作用は弱く、同刺激により誘起される細胞内Ca2+シグナリングにはあまり寄与しないことも明らかになった。同刺激によるグルタミン酸の放出量自体はATPよりもむしろ多いことが知られているが、アストログリアに発現するグルタミン酸受容体の感受性が低いため、我々が用いた培養標本では細胞表面上に十分なグルタミン酸濃度が蓄積されなかったことが考えられる。従って、今後は組織標本で再検討する必要があるだろう。さらに、Ca2+ナノドメインを介するVSOR活性化の中間シグナルである活性酸素種(ROS)が、低浸透圧暴露による細胞膜伸展刺激でどの程度活性化されるかを、ROS産生酵素阻害剤を用いて調べたところ、Ca2+ナノドメインを介して産生されるROSとは別に、Ca2+非依存的に産生されるROSも、VSOR活性全体の2割程度を担っていることが明らかになった。本研究は細胞膜伸展刺激が加わった際に細胞から分泌される化学伝達物質の作用により誘起される細胞容積感受性外向整流性アニオンチャネル(VSOR)活性化機構と、その機構による細胞容積及び形態の制御、そして細胞群全体への容積制御の波及効果について検討し、種々の物理的ストレスが細胞(群)に加わった際の適応機構を理解するのみならず、細胞の形態変化や移動の基本制御原理の解明を目指すことを目的とした。初年度と次年度では、マウス大脳皮質由来アストログリア細胞において細胞膜伸展刺激により分泌されるATPやグルタミン酸の作用が、Ca2+透過型イオンチャネル開口部近傍に形成される高Ca2+濃度領域「Ca2+ナノドメイン」を介してVSORを活性化する機構が明らかとなり、細胞の形態変化や移動時の1細胞上の局所的な容積変化を駆動する基盤機序の一端が解明された。最終年度はマウス胎生期脳内での神経細胞の増殖や形態変化及び移動の過程におけるVSOR活性化機構とその意義についての検討を行った。胎生脳神経細胞でのVSOR活性化の報告は皆無であったことから、まず胎生脳大脳基底核原基内の神経細胞を急性単離した標本を用いて、低浸透圧環境への暴露により胎生脳神経細胞においても確かにVSORが活性化されることを確認した。続いて大脳皮質発達過程の脳室帯からの神経細胞の放射状移動におけるVSOR活性化の有無とその意義について検討したところ、移動中に活性化されるVSORを通じて常時タウリンが放出されており、そのタウリンが移動細胞上のGABAA受容体に作用することが、移動の過度の進展を制御して大脳皮質の適切な発達を促すために必須であることが明らかになった。この成果は学会及び論文にて報告した。今後、その移動中のVSOR活性化がどのような細胞間相互作用や膜伸展刺激により誘起されているかについて、継続して検討を進める必要がある。我々の主な研究対象である細胞容積感受性外向

整流性アニオンチャネル(VSOR)は、あらゆる種類の細胞において環境変化に応じた細胞の容積及び形態の適切な調節を促す重要な役割を担っているが、本年度我々はマウス大脳皮質由来アストログリア細胞において、細胞外低浸透圧溶液暴露により細胞膜伸展刺激を加えた際に細胞から放出される化学伝達物質の細胞自身への作用により誘起されるVSOR活性化成分の有無、及びその活性化機序について検討を行った。その結果、低浸透圧刺激により誘起される細胞内Ca2+シグナリングが、放出されたATPの細胞自身への作用にほぼ完全に依存していること、またそのシグナリングを担う各種Ca2+透過型イオンチャネル開口部の極めて近傍に形成される高Ca2+濃度領域「Ca2+ナノドメイン」を介してVSORが活性化されることが明らかになった。但し、この機序によるVSOR活性化は全体の4割程度であり、残りの6割は何らかの別の機序によることが示唆された。しかし、そのATPの作用そのものは、VSORのみならず或る種のK+チャネルを同時に活性化することを通じて、細胞外環境変化時の細胞容積調節には必要不可欠なものになっていることが判明した。このATPの作用によるCa2+ナノドメインを介するVSOR活性化、即ち細胞容積調節機構は、1細胞上の局所的な容積調節をもたらす基盤機序と考えられ、このことは細胞の形態変化・分裂・移動時に1細胞の部分毎に独立した容積変化を誘導する上で必要不可欠である。従って、本年度の我々の研究により、細胞の普遍的基本性質である形態変化・移動の基本制御原理の一端が解明されたということができる。なお、本研究の一部は、松前国際友好財団の招聘によりベラルーシから来日したSergei V Fedorovich博士との国際研究者交流を通じて行われた。前年度の研究を通じて顕わになった課題である、ATPとともに細胞膜伸展により分泌されるグルタミン酸のVSOR活性化機序が、本年度の研究で解明されたこと、また、細胞膜伸展によるROS生成にCa2+依存性と非依存性の2つの異なる機序があることが新たに判明したことで、研究には一定の成果が認められた。しかし、当初本年度内に計画していた、細胞(または細胞群)の一部分にのみ膜伸展刺激が作用した場合の細胞(群)全体への波及効果の検討については、本年度途中に研究代表者の他研究機関への異動があったこと等から、進展がやや遅れている。初年度の第一目標であった、細胞膜伸展により細胞から分泌される主な化学伝達物質の同定と、その細胞自身への作用により誘起されるVSOR活性化機構及びその細胞容積制御への寄与を明らかにするということについては、一通りの結論を得ることができ、且つ初年度内に論文発表を行うことができたという点では、計画はおおむね順調に達成されたと言ってよい。当初の計画では、初年度・次年度にアストログリア細胞にて判明したことが、他の上皮細胞系cell lineや血管内皮細胞等についても当てはまるか否かを調べ、機序の普遍性や細胞種特異性の有無について検討する予定であった。しかし、研究代表者の新たな異動先の所属講座では脳スライス標本、特に胎生期脳を用いた研究が盛んになされていることを活かして、今後細胞群全体への波及効果を検討するに当たっては、脳スライス標本を用いて研究を進めていきたい。これにより、これまでアストログリアで得られた知見が直接適用されるとともに、胎生期脳神経の発達・移動・回路形成過程にも着目することで、当初の研究目的である「脳浮腫や高血圧等で病的な物理的ストレスが細胞(群)に加わった際のその適応機構を理解するのみならず、細胞の普遍的基本性質である形態変化・移動の基本制御原理の解明を目指す」ことが、一層合理的に達成されうることとなる。
硫黄圧制御分子線エピタキシー法による硫化亜鉛系多層構造と紫外半導体レーザの作製

本研究では、紫外半導体レーザへの応用を最終的な目的として、高品質な硫化亜鉛(ZnS)系多層構造を作製するための基礎技術、とくにこれまで検討が十分でなかったZnS系エピタキシャル成長層/燐化ガリウム(GaP)界面構造の最適化のための基礎研究をおこなった。結晶成長に用いる分子線エピタキシー装置において、これまでは成長前の基板の酸化膜除去等の処理を結晶成長チャンバーでおこなってきたが、本年度は基板の表面処理専用の真空チャンバーを導入し、原料、特に硫黄の残留雰囲気のない高真空中での処理を可能にした。その結果、まず反射高エネルギー電子線回折(RHEED)による観察から、630°C前後で酸化膜が除去されることがわかった。従来の成長チャンバーにおける熱処理では硫黄と基板表面のGaの反応により安定な硫化物層(Ga_2S_3)が形成され、RHEEDパターンの明確な変化を観測することが難しかった。また、このGa_2S_3層は欠陥生成の核となっていると考えられるのでこれが生成しないような処理手順を確立する必要があった。そのため、硫黄がない条件下で酸化膜除去をおこない、Ga液滴が生成しないようにP分子線照射をおこない、さらにZn分子線を供給してP-Zn結合の形成を促進することを試みた。このような熱処理を施したGaP基板を真空中で成長チャンバーに移動し、まず基本材料であるZnSの成長のおこなった。その結果、従来の成長室における熱処理の場合と比較して、結晶性の向上を得た。現在のところ、初期的結果が得られた段階ではあるが、P分子線、Zn分子線それぞれの照射により、その後に成長したZnSの結晶性が向上する効果が得られた。現在のところZnSの膜厚約1μmでX線ロッキングカーブの半値幅が約500秒である。これは、格子不整合の影響があるため、決して十分な値ではないが、今後、格子整合系混晶の作製、p型伝導制御のための基礎となる成果であると考えられる。本研究では、硫化亜鉛(ZnS)系多層構造を用いた紫外半導体レーザの作製を目指し、量子井戸構造の作製と評価、およびp型電気伝導制御のための基礎研究をおこなった。これまで、硫黄分子線を十分に制御した条件下で多量に供給することにより、ZnSおよびZnS系混晶が基板温度400°Cから500°Cという高温において成長可能なことを明らかにしてきたが、これを受けて、ZnS/ZnMgSおよびZnCdS/ZnMgS量子井戸構造を作製した。ZnS/ZnMgS歪量子井戸構造においては、井戸幅を小さくすることにより軽い正孔、重い正孔の励起子発光のエネルギーが大きくなり、量子閉じ込め効果が確認された。またこれらの発光エネルギーから歪によるバンドギャップの変化を表す変形ポテンシャルを決定することができた。ZnCdS/ZnMgS単一/多重量子井戸構造についてはフォトルミネッセンススペクトルにおいて活性層/井戸層からの非常に強い紫外発光を示した。また、発光は室温まで観測することができた。これはZnCdS/ZnMgS構造においてはキャリア閉じ込めが実現されていることを示すと考えられる。一方、紫外半導体レーザへの応用に向けてのキーポイントとなると考えられるp型伝導層の作製のために、ベースとなるZnS半導体へのp型不純物(Na)の添加を行った。2次イオン質量分析等により、ZnSへNaが添加されていることは確認できたが、明確なp型伝導が得られるには至っていない。なお、次年度の課題として、量子井戸構造の各構成層の高品質化と、それによる光励起レーザ発振の実現、ZnS、ZnMgSのp型化、電流注入による紫外レーザ発振などが挙げられる。

現在のところZnSの膜厚約1μmでX線ロッキングカーブの半値幅が約500秒である。これは、格子不整合の影響があるため、決して十分な値ではないが、今後、格子整合系混晶の作製、p型伝導制御のための基礎となる成果であると考えられる。
食品高分子電解質から調製される複合ゲルのpH応答型膨潤特性の解析

塩基性多糖類であるキトサンと種々の酸性多糖類から調整される高分子電解質複合ゲルはpH応答型の膨潤挙動を示す。本研究では、その膨潤機構の解明を試みるため、複合ゲルの膨潤平衡に及ぼすpHやイオン強度およびゲル組成の影響について検討を行った。硫酸基を有する酸性多糖類であるk-カラギ-ナンまたはデキストラン硫酸をキトサンと高塩濃度下で均一に混合した後、脱塩して種々の組成の円柱状複合ゲルを調製した。調製した複合ゲルは窒素雰囲気下で希NaOHまたはHCl溶液中に浸漬し、膨潤平衡状態と初期状態の体積比を測定し、平衡膨潤度として比較した。いずれの酸性多糖類を用いた場合にも、複合ゲルは1012のpH範囲においてのみ膨潤し、pH10.5で平衡膨潤度は最大となったが、その最大平衡膨潤度は、デキストラン硫酸を用いた場合の方がk-カラギ-ナンを用いた場合に比べてはるかに大きかった。すなわち、これら複合ゲルの膨潤挙動はキトサン分子中のアミノ基の電離特性に由来するものであるが、その相手となる酸性多糖類の分子構造あるいはゲル化能など物性の違いも膨潤特性に大きな影響を及ぼすことが示された。また、デキストラン硫酸濃度の異なる複合ゲルで比較した場合、pH10.5における平衡膨潤度は、硫酸基とアミノ基のモル比が1となる複合ゲルで最大となった。浸漬液にNaClを添加してイオン強度を増加させると、平衡膨潤度が減少すると同時に膨潤の起こるpH範囲が中性側へと移動した。さらに、浸漬液のNaCl濃度を0.17Mまで上げると、複合ゲルはpH78において著しく収縮した。複合ゲル内部のイオン濃度測定結果に基づいてゲル内の有効電荷密度を推定した結果を考え合わせると、以上に述べた複合ゲルのpH応答型膨潤挙動はゲル内の有効電荷に起因する浸透圧と外液の浸透圧とのバランスによって定性的にほぼ説明可能であった。
エンハンサー選択とエンハンサー変換による副腎皮質の形成機構

核内受容体型転写因子であるAd4BP/SF-1は副腎皮質における各種遺伝子の転写を通じ、細胞の分化と機能維持に重要な機能を担っている。この因子の機能を通じ細胞が分化するにあたっては、クロマチン構造の制御を通じ、機能するエンハンサーが選択ならびに変換されるはずである。本研究では副腎皮質を対象として、Ad4BP/SF-1ならびにヒストン修飾を認識する抗体を用いたクロマチン免疫沈降法と大容量シークエンスをおこなった。その結果、Ad4BP/SF-1が遺伝子近傍または内部に存在するエンハンサーに結合することで解糖系遺伝子を制御していることが明らかになったAd4BP/SF-1遺伝子は副腎皮質や生殖腺などのステロイドホルモン産生細胞に発現し、これらの細胞の分化には必須の因子であることが知られている。我々は既に胎仔副腎皮質エンハンサーを同定していたが、昨年度に更に胎仔ライディッヒ細胞エンハンサーを同定した。これらのエンハンサーを用い、GFPを駆動するトランスジェニックマウス系統を作出したところ、胎仔精巣のライディッヒ細胞がGFP陽性のマウスが得られた。そこで、胎仔ライディッヒ細胞をFACSで調製し、マイクロアレイ解析を行った。その結果、これまで胎仔精巣においてはライディッヒ細胞が男性ホルモンを産生するとされてきたが、男性ホルモン産生に不可欠な遺伝子の発現が認められず、従来の常識を覆る結果をえている。また、胎仔ならびに成獣ライディッヒ細胞、そして副腎皮質細胞を用い、次世代シークエンサーにてChIP-sequenceを行うために、クロマチン調製に関する予備実験を行った。その結果、成獣の細胞を使用する限りにおいては、全ゲノムレベルでの解析に十分なシークエンスが得られる条件を見いだした。今後、少ない胎仔細胞を用いた条件を検討することで、胎仔ならびに成獣にてChIP-sequence解析を行うことで、副腎皮質とライディッヒ細胞におけるクロマチン構造を明らかにする。特に、遺伝子の機能領域が明らかになっているAd4BP/SF-1遺伝子座の解析を通じ、エンハンサー選択や変換が起きていることを示すことができると考えている。その結果、Ad4BP/SF-1が遺伝子近傍または内部に存在するエンハンサーに結合することで解糖系遺伝子を制御していることが明らかになった組織特異的遺伝子発現制御の中心的役割を果たすのは組織特異的エンハンサーである。Ad4BP/SF-1遺伝子は副腎皮質や生殖腺のステロイド産生細胞において発現するが、その発現は異なるエンハンサーによって制御されている。本研究では、副腎皮質において選択的に使用されるにおけるエンハンサー領域のクロマチン構造を明らかにし、その変換がエンハンサー選択を可能することを示すことで、副腎皮質の細胞分化メカニズムの一端を明らかにすることを目的とする。本年度は、副腎皮質由来のY1細胞を用い、全ゲノムを対象とするChIP-sequence法の確立、ならびにChIP-sequence法による解析を行った。本方法では次世代シークエンサーを用い、大量のデータが得られるため、データ解析においては情報生物学の研究者との共同研究も開始している。既に、Ad4BP/SF-1、ピストンH3K4のメチル化、H3K27のアセチル化に対する抗体を用いたChIP-sequence解析を行い、現在、得られたデータの処理を行っているところである。Ad4BP/SF-1の集積領域はゲノム中に数千箇所が存在し、これらの領域のヒストンの修飾状況と照らし合わせながら、潜在的なエンハンサー領域の同定を進めている。今後は、得られたデータをもとに、エンハンサー領域の普遍性と多様性の抽出、ならびにそれらのエンハンサー活性の生体における検討を、遺伝子改変動物の作製を通じ、行う予定である。副腎皮質細胞ではステロイドホルモン産生に関わる種々の遺伝子が発現することで、糖質コルチコイドや電解質コルチコイドを産生、分泌する。このような遺伝子の発現は副腎皮質に特異的であり、副腎皮質に特異的な発現を示す転写因子Ad4BP/SF-1の制御を受けている。一方、Ad4BP/SF-1は精巣や卵巣においても発現し、同様にステロイドホルモンの産生に関与する遺伝子の発現を制御している。このように、Ad4BP/SF-1は数種の特徴的な細胞で発現することで、それらの細胞の特異性を担保するが、我々はこれらの発現が異なるエンハンサーによって制御されていることを明らかにしてきた。このように、一つの遺伝子内に複数のエンハンサーが存在し、これらのエンハンサー異なる細胞における発現を制御しているとの結果は、細胞分化の過程でそれぞれの細胞がエンハンサーを選択していることを意味する。そこで、本研究では副腎皮質細胞におけるエンハンサーの構造、ならびにエンハンサーの機能を発揮する上でキーとなる転写因子Ad4BP/SF-1がどのような領域に結合しているかについて、次世代シークエンサーを用いた実験を行うことで、全ゲノムレベルでの解析を行った。その結果、副腎皮質細胞ではヒストン3の27番目のリジン残基がアセチル化されるようなエンハンサーマークをもつ、2万を越える領域が確認された。

これらの領域のうちAd4BP/SF-1が結合している領域は約7千カ所であった。同時に、トランスクリプトーム解析によって、活性化されている遺伝子を調べたところ、活性化されている多くの遺伝子内に上記のエンハンサーが存在することが明らかになった。以上の結果から、次世代シークエンサーを用いたエンハンサー解析が可能であるとの結果を得ることができた。また、これらの解析を通じ、Ad4BP/SF-1が解糖系遺伝子などの細胞内代謝に関与する遺伝子の転写制御に関わっていることが示された。このことは、組織特異的転写因子がハウスキーピングな細胞機能を制御するとの新たな発見につながった。
コネクショニストモデルを用いた非線形データ解折手法の研究

本研究では多層パーセプトロンなどに代表される非線形写像モデルの性質をそれに含まれるパラメータ数との関連で明らかにし,非線形な枠組みにおけるデータ解折の基本的方法論を構築することを目標とした。そのために写像自体の微分幾何学的特微量を一般のニューラルネットに定義し,この特微量を用いて多変量解折での重回帰分析の基礎となる関数近似問題ならひに判別分析問題への応用を試みた。またこの調査の過程で,写像に関する微分幾何の観点のみでなく他の種々の幾何学的観点を取り入れて拡張した結果,写像特微密度なる概念を導出するに至った。以下ではこの過程を整理した成果を大系的に述べる。1.写像特微密度の概念の導入とその性質非線形写像において,その出力空間に張られる多様体の幾何学的性質を表す示性数を考え,これを写像に含まれる母数空間全体で算出したものを密度分布化すれば写像モデルに関する"容量"を定義できる。また2個以上の写像モデルどうしで,その容量の比較,類似性の考察などが可能となる。2.関数近似における写像特微密度の性質上記の示性数として大域的曲率を用いる。すなわち,一入力一出力のニューラルネットでの出力多様体全体にわたる絶対曲率の積分値を採用した場合,中間層素子数の増加に伴い「写像の容量」がどのように増大するかが評価できる。またべき多項式関数における次数の増加に伴う同様の評価も可能であることから,べき多項式とニューラルネットの"写像容量"を比較することも可能であろう。3.非線形判別における写像特微密度特微空間において各々が正規分布に従う複数のクラスタが存在し,各々にW_1またはW_2のいずれかのラベルが付された条件で、ラベルW_1のデータとW_2のデータのみによりそれらの真の境界を解折する問題の複雑さを,クラスタの総数との関連において評価するために上記の大域的曲率による写像特微密度を用いた。これによりクラスタ数の増加に伴う境界の複雑さの変化を中間層nの増加に伴うニューラルネットの同様な変化との関連で評価することが可能となった。これはクラスタ数が予測できる場合の分類問題等で,モデル推定に応用し得る。本研究では、多層パーセプトロンの非線形写像の性質を素子数、層数などとの関連で明らかにし、非線形な枠組みにおける多変量解析(外的基準をもつ回帰分析、重回帰分析、判別分析ならびに外的基準をもたない主成分分析、因子分析など)の方法論を構築することを最終目標としている。そのための準備段階として、当該年度では、多層パーセプトロンの汎化能力を統計論的に評価しようとする立場ではなく、それの実現する写像における幾何学的性質を直接的に解析しようとする立場をとった。すなわち・筆者らは文献(1)および(2)において、多層パーセプトロンの写像を関数とみたときの関数全体の群が、層数や素子数によってどのように変化するかについて微分幾何学的に考察した。その一環として、まず最初に写像としての多層パーセプトロンの能力を解析する一手法を提案した。・具体的には、入力層、中間層、出力層の各素子数を1、m、nとした場合の多層パーセプトロンについて結線の重みとしきい値を全て固定すれば、入力素子の値を負の無限大から正の無限大に変化させたときに出力空間R^nには1次元多様体の軌跡が張られる。

ここで重みとしきい値をそれらの値域で変化させ、生成される個々の1次元多様体の全曲率のそれらについての平均を、3層パーセプトロン(1-m-n)の写像能力に対する一つの評価関数とする。この評価関数は理論的に中間層素子数m、出力層素子数nについて単調増加となり得ることは文献(3)などの結果から容易に類推できるが、文献(2)においてこれを始めて定式化し、3層(1-m-n)および4層(1-m-k-n)の場合について、それらの具体的な値を測定する数値シミュレーション実験を行った。・その結果、全曲率の統計量は層数や素子数に対して単調に増加しており、同評価関数が多層パーセプトロンの写像能力(すなわち近似可能な関数空間の大きさ)の評価に有効であることが確認できた。また、全曲率に与える影響は入力層に近い層の素子数の方が、遠い層の素子数に比較して相対的に大であることが確認できた。以上の議論を、より一般のトポロジーをもつ多層パーセプトロンに敷延し、微分幾何学的な観点からの関数近似能力ならびにデータ解析能力を考察する予定である。本研究では、多層パーセプトロンなどに代表される非線形写像モデルの性質をそれに含まれるパラメータ(層数や素子数)との関連で明らかにし、非線形な枠組みにおける多変量解析(外的基準をもつ回帰分析、重回帰分析、判別分析ならびに外的基準をもたない主成分分析、因子分析など)の方法論を構築することを最終目標としている。その準備として前年度では、素子数が1-m-nとなるような3層パーセプトロンを例にとり、入出力写像の諸性質のうちm,nの変化に固有なものとして微分幾何学的な特徴に着目し、その特徴を解析した。当該年度ではこの概念すなわち写像の微分幾何学的特徴量をより一般のトポロジをもつニューラルネットに敷延し、多変量解析での重回帰分析の基礎となる関数近似問題ならびに判別分析問題への応用を試みた。更にこれを調査する過程で、写像の幾何学的特徴を微分幾何の観点のみでなく他の種々の幾何学的観点を取り入れて拡張した結果、写像特徴密度という、より上位の概念を導出するに至った。以下、これらを具体的に述べる。1.写像特徴密度の概念の導入とその性質の調査非線形写像において、その出力空間に張られる多様体の幾何学的性質を表す適当な示性数を考え、これを写像に含まれる母数全体の空間で算出したものを密度分布化すれば、写像モデルに関する容量を定義できる。また、2個以上の写像モデルどうしで、その容量の比較、類似性の考察などが可能となる。2.関数近似問題における大域的曲率の統計量に関する写像特徴密度の性質の調査上記の示性数として大域的曲率を用いる。すなわち、一入力一出力のニューラルネットでの出力多様体全体にわたる絶対曲率の積分値を採用した場合、中間層素子数の増加に伴い「写像の容量」がどのように増大するかが評価できる。また、べき多項式関数における次数の増加に伴う同様の評価も可能であることから、べき多項式と3層ニューラルネットの「写像の容量」を比較することも可能であろう。これらは当該年度に実験的に明らかにされた。3.非線形判別問題における大域的曲率の統計量に関する同様の調査特徴空間において各々が正規分布に従う複数のクラスタが存在し、各々にはw1またはw2のいづれかのラベルが付されている。このような仮定のもと、w1のデータとw
自己免疫疾患モデルB/WF1マウスの自己抗原T細胞エピトープの解析

(NZBxNZW)F1(B/WF1)マウスは全身性ヒト自己免疫疾患であるSLEに極めてよく似た病態を呈するモデル動物で,MHC(H-2)のヘテロ接合性およびT細胞がこの自己免疫症状の進行に関与していることが知られている。このことから、B/WF1マウスのハプロタイプ混合クラスII分子に結合した自己抗原ペプチドを認識する自己反応性T細胞が疾患発症・進行に重要な役割を有していると考え,その解析を行なった.まず,B/WF1由来のT細胞クローンを作成し,その特異性を解析したところ,ハプロタイプ混合クランプII分子(Aβz/Aαd)に反応する自己反応性T細胞クローンがB/WF1マウスに存在することを明らかにした.特異モノクローナル抗体を用いた免疫沈降・SDS/PAGEにより解析したところ,このAβz/Aαd分子の発現は他のクラスアイ,アイ分子に比べて非常に微量であることがわかった.この自己反応性T細胞クローンが自己免疫症状に関与しているかいなかを解析したところ,それらのいくつかは,疾患未発症の若令B/WF1マウスに細胞移入するとIgGクラスの抗DNA後退産生を誘導することが確かめられた.このAβz/Aαd分子を発現するトランスフェクタント抗原提供細胞株と,自己反応性T細胞クローンを刺激しない変異株を用いて解析するとAαd鎖69位のアミノ酸がこの自己反応性T細胞クローンの抗原認識に重要であることがわかった.この自己反応性T細胞が認識する自己抗原ペプチドを解析するために,Aβz/Aαd分子発現トランスフェクタントからアフィニティーカラムを用いてクラスII分子を作製し,結合ペプチドを溶出しHPLCにて分離しそのアミノ酸配列を解析した.その結果,Aβz/AαdクラスII分子結合ペプチド主要モチーフ(I,F)XXXX(M,F,Y)を同定した.(NZBxNZW)F1(B/WF1)マウスは全身性ヒト自己免疫疾患であるSLEに極めてよく似た病態を呈するモデル動物で,MHC(H-2)のヘテロ接合性およびT細胞がこの自己免疫症状の進行に関与していることが知られている。このことから、B/WF1マウスのハプロタイプ混合クラスII分子に結合した自己抗原ペプチドを認識する自己反応性T細胞が疾患発症・進行に重要な役割を有していると考え,その解析を行なった.まず,B/WF1由来のT細胞クローンを作成し,その特異性を解析したところ,ハプロタイプ混合クランプII分子(Aβz/Aαd)に反応する自己反応性T細胞クローンがB/WF1マウスに存在することを明らかにした.特異モノクローナル抗体を用いた免疫沈降・SDS/PAGEにより解析したところ,このAβz/Aαd分子の発現は他のクラスアイ,アイ分子に比べて非常に微量であることがわかった.この自己反応性T細胞クローンが自己免疫症状に関与しているかいなかを解析したところ,それらのいくつかは,疾患未発症の若令B/WF1マウスに細胞移入するとIgGクラスの抗DNA後退産生を誘導することが確かめられた.このAβz/Aαd分子を発現するトランスフェクタント抗原提供細胞株と,自己反応性T細胞クローンを刺激しない変異株を用いて解析するとAαd鎖69位のアミノ酸がこの自己反応性T細胞クローンの抗原認識に重要であることがわかった.この自己反応性T細胞が認識する自己抗原ペプチドを解析するために,Aβz/Aαd分子発現トランスフェクタントからアフィニティーカラムを用いてクラスII分子を作製し,結合ペプチドを溶出しHPLCにて分離しそのアミノ酸配列を解析した.その結果,Aβz/AαdクラスII分子結合ペプチド主要モチーフ(I,F)XXXX(M,F,Y)を同定した.B/WF1マウス由来のKLH反応性T細胞クローンを確立した.種々の抗原提供細胞を用いて特異性を解析し,自己反応性T細胞クローンを樹立した.このT細胞クローンがSLE様の病態を起こすか否かを,T細胞クローンを病気が発症していない週令の若いB/WF1マウスに細胞移入して,抗DNA抗体産生を指標として解析した.その結果,いくつかの自己反応性T細胞が,抗DNA抗体の産生を誘導することが明らかになった.また,T細胞クローンが,invitroにおいて抗DNA抗体の産生を誘導する能力を有しているか否かを,B/WF1マウス由来のB細胞と共に培養し,培養上清中の抗DNA抗体産生を解析したところ,IgMクラスの抗DNA抗体の産生が誘導された.以上の結果は,B/WF1マウス由来の自己反応性T細胞クローンがinvivo,in vitroにおいて抗DNA抗体産生を誘導する能力を有していることを示している.この自己反応性T細胞クローンの拘束特異性を抗体阻止実験により解析すると,すべてのクローンはA_β^z/A_α^dに拘束されていることがわかった.現在この自己反応性T細胞クローンおよびその認識対象となる抗原の解析を行なっている.一方,B/WF1マウスに於けるハプロタイプ混合クラスII分子の存在を,モノクローナル抗体を使用した2次元電気泳動法により解析したところ,ハプロタイプ混合クラス2分子の存在は認められなかった.T細胞クローンを使用した解析から,A_β^z/A_α^d分子がB/WF1マウスに存在することは明らかであるので,この結果は,この分子の量が通常のクラスII分子に比較して非常に少ないことを示している.B/WF1マウス

由来の自己反応性T細胞クローンを作成し,その疾患発症誘導能およびTCR遺伝子とそのTCRが認識する自己抗原ペプチドの解析を行なった.(1)これらのT細胞クローンのうちいくつかは,疾患未発症の若令B/WF1マウスに細胞移入すると,IgGクラスの抗DNA抗体産生誘導能が認められた.(2)これらのT細胞クローンをB/WF1 B細胞と共にSCIDマウスに移入するとIgGクラスの抗DNA抗体産生と,軽度の糸球体病変が認められ,これらのT細胞クローンは疾患発症に関与している可能性が示唆された.(3)これらのT細胞クローンはCD4陽性で,サイトカイン分泌のパターンによりTh2タイプの細胞であることがわかった.(4)疾患発症に関与するT細胞と関与しないT細胞クローンのTCRはPCRおよび蛍光抗体法によりいずれもVbeta4を使用していることがわかった.(5)疾患発症に関与するT細胞と関与しないT細胞が異なったT細胞であることは,種々の異なったMHCクラスII分子を発現したAPCトランスフェクタントのパネルを使用した実験により確かめられた.また,疾患発症に関与するT細胞も単一ではなく,異なったTCRを発現するT細胞であることが明らかにされた.(6)疾患発症に関与するT細胞の認識抗原を明らかにするために,このT細胞クローンが認識するクラスII分子を発現するAPCトランスフェクタント細胞から薬剤誘導異株を作成し,そのうちクラスII分子の発現は正常であるがこのT細胞クローンが認識しない変異株を選択した.この変異株に発現しているクラスII分子のalpha/beta鎖のDNAシークエンスを解析した結果,ペプチド結合部位のアミノ酸変異が認められた.従って,この変異APCのクラスII分子には疾患発症に関与する自己抗原ペプチドが結合していないと推測され,野生型のAPCトランスフェクタント細胞由来のペプチドと比較することにより,疾患発症に関与する自己抗原ペプチドを解析する有効な研究材料となる.現在この結合ペプチドのアミノ酸解析を行なっている.昨年度に引き続きB/WF1マウス由来の自己反応性T細胞クローンの機能的解析ならびにTCR遺伝子とそのTCRの標的抗原ペプチドの解析を行なった.本年度は特にSCIDマウスに若令B/WF1マウス脾臓細胞とともにT細胞クローンを移入して,そのIgG抗DNA抗体産生誘導能を解析した.その結果,若令B/WF1マウスにおいて活性を示したT細胞クローンは,このSCIDマウスを用いた細胞移入の実験系においてもIgG抗DNA抗体産生誘導能を示すことが明らかになった.この実験で細胞移入を受けたSCIDマウスのtotal Ig量は抗DNA抗体の上昇の有無にかかわらず同程度の価を示していたので,病原性T細胞クローンによる抗DNA抗体産生誘導能は特異的なものであることが確認された.次にこの病原性T細胞クローンのTCRβ鎖のDNA塩基配列を解析した.このT細胞クローンはVβ4を使用しており,標的ペプチドが結合するCDR3領域のアミノ酸が100番目にアスパラギン酸,105番目にグルタミン酸といった陰性荷電を有するアミノ酸が存在した.