hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
網膜変性における炎症をターゲットとした新規治療戦略の解明

加齢黄斑変性や網膜色素変性症等の網膜変性疾患は患者視機能を著しく傷害し失明へと至る難治性疾患群である。網膜変性での失明へのプロセスは光を感知する細胞である視細胞の細胞死による。近年の研究により網膜変性時に生じる局所炎症が視細胞へと傷害を与えることが明らかとなってきた。今研究において我々は網膜変性時に炎症を発生させる起源であると考えられる網膜内在住マクロファージであるマイクログリアと骨髄由来のマクロファージに特異的に発現しているケモカインレセプターに蛍光蛋白質を遺伝的に導入しそれぞれの細胞を可視化できる網膜変性動物モデルを作成した。この動物モデルは網膜変性疾患の新規治療戦略の開発に有用となる。加齢黄斑変性や網膜色素変性などの網膜変性疾患は視細胞死を生じ失明に直結する難治性疾患である。視細胞は光シグナルを受容し後頭葉視覚野へ伝達する視覚に取って不可欠である細胞である。中枢神経系である視細胞は一度ダメージを受けるとその後の再生は不可能であることから、網膜変性疾患の治療においてはどのようにして視細胞を保護していくのかを検討していくことが重要である。しかしながら、現在までに人において視細胞を直接に保護する治療戦略はいまだ開発されておらず、新たな方法を発見しなくてはならない。我々はこれまでに視細胞死を促進させる因子として網膜内の炎症に着目し研究を進めてきた。その中で網膜内にて炎症を生じる原因となりうる細胞として1)網膜内在住マクロファージであるマイクログリア、2)網膜色素上皮細胞、3)網膜外から侵入したモノサイト由来マクロファージ、に着目している。我々の検討により、視細胞由来蛋白質をこれらの細胞が貪食すると炎症性サイトカインおよびケモカインを産生し活性化を呈することが判明した。この結果は細胞死を生じた視細胞をこれらの炎症細胞が貪食し活性化することが網膜内炎症を生じさせる機序の一つであることを示唆している。今研究は網膜変性を生じた生体内でいつ、どのようなタイミングで、どうしてこれらの細胞が活性化し炎症へと至るのかを明らかにすることにより、将来的な網膜変性疾患に対する新規治療戦略を考案していく。近年、加齢黄斑変性や網膜色素変性症を含む網膜変性疾患において網膜内炎症が視細胞へと傷害を与えることが明らかとなってきた。しかし、その詳細なメカニズムは不明な部分が多い。今研究は網膜変性時における炎症惹起細胞と考えられる網膜在住マクロファージであるマイクログリアと骨髄由来マクロファージを生体内にて識別することにより網膜炎症の新知見を解明することを目的に行われた。網膜色素上皮細胞の貪食能が損なわれることにより網膜変性を生じるMertk-/-マウスにケモカインレセプターであるCx3cr1およびCcr2に蛍光物質を遺伝的に導入したCx3cr1GFP/GFPマウスとCcr2RFP/RFPマウスを配合しMertk-/-Cx3cr1GFP/+Ccr2RFP/+マウスを作製し、その網膜表現型を観察した。その結果、網膜内マイクログリアは網膜変性発症前にはCx3cr1単陽性であったが、その発症とともにCcr2を発現し網膜内層より網膜下腔へと遊走した。また、網膜変性の進行とともに血液網膜間柵が破たんしCcr2単陽性の骨髄由来マクロファージが網膜内へと侵入した。今回作成されたMertk-/-Cx3cr1GFP/+Ccr2RFP/+マウスは網膜変性時におけるマイクログリアおよびマクロファージを分離して観察することを可能にし、炎症をターゲットとした網膜変性の新規治療戦略の開発に有用な動物モデルであるといえる。当該研究は現在論文投稿中であり、今後論文報告や学会発表を用いて次の研究へと発展させていく。26年度が最終年度であるため、記入しない。眼科学26年度が最終年度であるため、記入しない。東京慈恵会医科大学にて今研究を開始するにあたり、本学動物実験委員会および遺伝子組み換え安全対策委員会にて審査を受け許可を得た後に開始したため当初予定より若干の遅れが出ている。しかしながらすでに目的のMertk-/-Cx3cr1GFP/+Ccr2RFP/+マウスの完成に近づいており研究期間内に十分に挽回できることが期待できる。Mertk-/-Cx3cr1GFP/+Ccr2RFP/+マウスを完成させ当初の予定通りに網膜変性時に網膜下腔に侵入するマイクログリアおよびマクロファージの動態を検討していく。また、ケモカインレセプターであるCx3cr1やCcr2が網膜変性における治療ターゲットとなりうるのかを検討するためにMertk-/-Cx3cr1GFP/GFPマウスおよびMertk-/-Cx3cr1RFP/RFPマウスを作成しMertk-/-と比較することによって網膜変性におけるこれらの役割を検討していく。
傷害性ストレスに対する歯髄細胞の恒常性維持と回復反応に関する分子機構の解明

GFPマウス由来骨髄細胞の調製と骨髄細胞移植を行い、GFP骨髄移植マウスを作製した。このマウスの臼歯にメカニカルストレスを負荷し,歯髄組織における骨髄幹細胞の関与について,病理組織学的・細胞生物学的検索を行った。メカニカルストレスを負荷した歯髄組織を経時的に観察した結果、HSPやALPを中心とするストレスおよび細胞傷害関連因子の発現増強がみられ、それに加えて歯髄では神経内分泌関連因子の著明な発現増強が確認された。また歯髄内にGFP陽性細胞が出現し、これらは種々の割合で既存の歯髄組織の構成細胞に変化していた。さらにGFP陽性細胞は細胞傷害因子、ストレス因子の発現増強が生じている領域を中心に出現していることが明らかになった。また、骨髄幹細胞は神経内分泌関連因子を産生している末梢神経の近傍に分布しており、傷害性刺激をうけた末梢神経へ誘導されている可能性が示唆された。今回得られた結果は歯髄組織の再生修復に道を開くものであると考えている。さらに、この歯髄でみられる現象が広く体組織全般に適用される現象であるならば、様々な臓器の再生と修復に応用可能であると思われる。これらの新知見の一部は学術誌上および学会で公表した。平成24年に予定していたGFP骨髄移植動物の作製と、これを用いた歯髄へのストレス付与実験を行い、歯髄組織を病理組織学的に検索した。その結果、従来知られていなかった組織の再生と修復および組織幹細胞に関する重要な新知見を得ることができた。当該年度に得られた新知見をさらに詳細に検討していく。研究手法は従来行ってきた方法を踏襲する。新知見は骨髄幹細胞の誘導と歯髄の神経細胞との関連性であるので、この点を中心に主に組織学的手法を用いて関連因子を網羅的に検索していく。これにより、組織幹細胞と骨髄幹細胞の関連、これらの局所誘導、分化、増殖、および幹細胞特性の維持に関わる知見が得られる事を期待している。また、組織再生修復への具体的な応用方法についても検討していく。次年度使用額の当該年度直接経費に占める割合は0.8%であり、おおむね問題なく使用できていると考えている。支出の大部分を価格の安定しない消耗品費が占めていることが次年度使用額が生じうる原因である。現在のところ研究費の使用計画に大きな変更はない。
里親委託支援システム構築に関する研究-日英比較研究から-

2018年度は、主にイギリス(イングランド)の里親支援の実践状況の確認に取り組んだ。イギリスは民間(営利/非営利)と自治体の里親支援機関が永く並立しているが、イギリスの主要民間非営利児童福祉団体は、里親委託・養子縁組・被虐待児童治療支援・虐待者治療支援・人権擁護・非行防止・物質関連障害の治療・十代の未婚の母親に対する支援・コミュニティワーク・EU内からの移住児童の定着支援・HIV感染の子どもおよび家族支援など特別なニーズへの支援活動や、調査研究、ロビーイング、ソーシャルアクションなど子どもの最善の利益を保障の実現に努めている。里親支援について先進事例のあるイギリスの実践状況を明らかにすることは、わが国の里親支援体制を検証するうえで重要な意味を持つと考え、今年度はBarnardo's(民間非営利の里親支援機関)のソーシャルワーカーと、自治体(Hillington)において里親や養子縁組に関わっているソーシャルワーカーに対してインタビュー調査を実施し、それぞれの実践状況や課題について理解を深めることができた。Barnardo'sでは専門性の高い里親を養成しており、いわゆる「委託困難児」(高年齢の子ども、問題行動のある子ども、など)の委託においては自治体がBarnardo'sのサービスを利用する場合がある。そして、独立型民間機関の場合は、benefact(出資者を得ること)が重要となるが、それをどのようにして、どのような理念で求めていくかも考える必要があることが分かった。また、自治体の里親支援機関については5-6年前から活用促進が始まり、なかには民間機関よりもよい実践を行う自治体機関もあることが分かった。このほか、日本の実践状況についての継続的な検証として、2018年度も「養子と里親を考える会」主催の研修において里親支援専門相談員に対するアンケート調査を実施した。当初の研究計画において予定していたイギリスの里親支援に携わる専門職へのインタビュー調査を実施できた。この実地調査において、自治体の里親支援機関のソーシャルワーカーと民間非営利団体による里親支援機関のソーシャルワーカーの双方の見解を知ることができ、現在のイギリスの里親支援の状況について理解を深めることができた。また、里親支援専門相談員へのアンケート調査を今年度も実施することで、国内の里親支援の実施状況や課題について考察することができた。当初の研究計画においては、今年度は本研究の総括として、論考の投稿や報告書の作成を計画していたが、2018年度のイギリス調査時の際に、インタビュイー(民間非営利団体のソーシャルワーカー)より、さらに実践的な学びのために、当該民間支援機関の地方自治体支部(バーミンガム)おける実践状況を観察することを提案された。バーミンガムにおいてモニタリングを実施することで、民間の里親支援機関のより具体的な実践内容について学ぶことができると予想されるので、2019年度の研究期間においては、イギリスでの実地調査(モニタリング調査)を追加調査として実施する予定である。既出版の資料やインターネット上の資料より、文献調査を行った。そのなかで、「福祉行政報告例」において、里親委託児童の委託につながった経路について「家庭からの委託」「児童福祉施設からの委託」「その他」の3つに分けて調査されていた。そこで、里親支援専門相談員の配置と里親委託児童数の関連についてみるため、「児童福祉施設からの委託」となった児童数について、里親支援専門相談員が配置された2012年度から2016年度までの5年間の状況をみたところ、全国的には大きな変化は見られなかった。また、里親支援専門相談員自身が感じている困難さを明らかにするために、全国の里親支援専門相談員を対象とした研修(「養子と里親を考える会」主催、2017年11月18日実施)においてアンケート調査を実施した。この調査の自由記述において、里親支援専門相談員は、所管の児童相談所との連携と情報共有や所属施設の里親委託に関する理解、里親支援のソーシャルワークに関する専門性等に課題を感じていることが明らかになった。また、所管の児童相談所の方針によって、里親支援専門相談員の業務内容に違いが生じていることが明らとなった(例:里親と接する機会のある相談員もいれば、児童相談所から断られる相談員もいる)。さらに、里親委託につながらない要因として、施設の定員充足率との関連が見られる回答もあった(例:1施設入所定員が少ない状況であるため、なかなか施設から子どもが短期里親・週末里親等の里親委託に出されない状況がある、2施設の入所率も75%くらいという状況。その中で施設から措置変更し、里親委託へ結びつけることの困難さを感じている。)。この自由記述から、里親支援専門相談員は、自身の専門性や、児童相談所との関係性のほか、施設の定員充足率が低い状況では里親委託につなげることが難しいという、施設職員としての課題を抱えていることが分かった。当初は、民間の里親支援機関を対象とした質問紙調査を実施する予定であったが、民間の里親支援機関については機関数がまだ多くないため、全国的な比較が困難であり、調査方法の変更を検討した。その結果、全国的な質問紙調査ではなく、近畿圏の民間里親支援機関への訪問調査を実施する予定である(実施は2018年度を予定)。また、国内の文献調査において、乳児院の里親支援専門相談員の報告書等は刊行されていたため、業務内容や実施状況について確認することができたが、児童養護施設の里親支援専門相談員の報告書等は入手できなかった。この点についても、今後訪問調査が必要となる可能性がある。

イギリスは民間(営利/非営利)と自治体の里親支援機関が永く並立しているが、イギリスの主要民間非営利児童福祉団体は、里親委託・養子縁組・被虐待児童治療支援・虐待者治療支援・人権擁護・非行防止・物質関連障害の治療・十代の未婚の母親に対する支援・コミュニティワーク・EU内からの移住児童の定着支援・HIV感染の子どもおよび家族支援など特別なニーズへの支援活動や、調査研究、ロビーイング、ソーシャルアクションなど子どもの最善の利益を保障の実現に努めている。里親支援について先進事例のあるイギリスの実践状況を明らかにすることは、わが国の里親支援体制を検証するうえで重要な意味を持つと考え、今年度はBarnardo's(民間非営利の里親支援機関)のソーシャルワーカーと、自治体(Hillington)において里親や養子縁組に関わっているソーシャルワーカーに対してインタビュー調査を実施し、それぞれの実践状況や課題について理解を深めることができた。Barnardo'sでは専門性の高い里親を養成しており、いわゆる「委託困難児」(高年齢の子ども、問題行動のある子ども、など)の委託においては自治体がBarnardo'sのサービスを利用する場合がある。そして、独立型民間機関の場合は、benefact(出資者を得ること)が重要となるが、それをどのようにして、どのような理念で求めていくかも考える必要があることが分かった。また、自治体の里親支援機関については5-6年前から活用促進が始まり、なかには民間機関よりもよい実践を行う自治体機関もあることが分かった。このほか、日本の実践状況についての継続的な検証として、2018年度も「養子と里親を考える会」主催の研修において里親支援専門相談員に対するアンケート調査を実施した。当初の研究計画において予定していたイギリスの里親支援に携わる専門職へのインタビュー調査を実施できた。この実地調査において、自治体の里親支援機関のソーシャルワーカーと民間非営利団体による里親支援機関のソーシャルワーカーの双方の見解を知ることができ、現在のイギリスの里親支援の状況について理解を深めることができた。また、里親支援専門相談員へのアンケート調査を今年度も実施することで、国内の里親支援の実施状況や課題について考察することができた。今年度は、2018年度9月ごろに社会的養護に関する海外調査を実施する予定である。欧州の社会的養護に詳しい徳永祥子氏にコーディネートを依頼し、調査予定地は英仏を予定している。イギリスでは主に里親支援機関において調査を行い、フランスでは養子縁組後の支援に関する機関での調査を予定している。イギリスでは自治体のみならず民間の里親委託機も存在し、公私民間機関が長く並立して支援を行っている。日本では、里親の認定は児童相談所のみが行うものであるが、イギリスでは、民間の里親委託機関(独立里親委託機関)においても里親認定が可能であり、独自資源を活用し、里親委託という法律的業務を実施できる。現在、UK全体で約250の独立里親委託機関が存在するが、先駆的な実践を行っている民間機関において行う。調査予定機関は、BAAF、リーズセンター、バナードズの3機関を予定している。
長期飢餓ストレスが及ぼすエピジェネティック変化メカニズムの解明と臨床応用への展開

マウスを用い、40%食餌制限であれば死亡率は低く、十分な体重減少が得られた。通常慢性ストレスを10日間施行したマウスも作成した。マイクロアレイ法を用い、長期飢餓ストレスにより海馬において複数のmiRNAの発現が変化する事を見いだした。リアルタイムPCR法においては通常ストレス群と比較し、飢餓ストレス特異的miRNAが同定された。特定のmiRNAの標的は脳神経の発育に重要な蛋白である可能性が示唆された。飢餓ストレスで発現変化するmiRNAの機能が推定され、神経性食欲不振症等の飢餓ストレス状態におけるエピジェネティックメカニズムの解明やバイオマーカーの開発という観点からも重要な知見が得られた。<飢餓モデルマウス(Food restriction法)>1日食餌量を50%以上制限するとマウスの死亡率が高まり、実験への使用が困難である事が判明した。40%食餌制限であれば、死亡率は低く、十分な体重減少が得られた。<TaqMan microRNA assaysを用いたmiRNAの定量>マイクロアレイ法を用い、長期飢餓ストレスによりmiRNAの発現が増加または低下する事を見いだした。それらは単独ではなく、多数存在し、かつ統計学的に有意であった。今回の大きな発見は、飢餓以外の慢性ストレスマウスにおける当該miRNAとの発現比較により飢餓特異的miRNAを同定されたことである。<ターゲットの特定と機能解析>同定したすべてのmiRNAのターゲットmRNAをTarget scanを用いて予測した。すでに判明しているmiR NAのターゲットは脳神経の発育に重要な蛋白である可能性が示唆された。飢餓特異的miRNAの発見は極めて新しい知見であり、神経性食欲不振症患者における後天的な異常のメカニズム解明や治療への応用が期待され、成果についてリスボンにおける第22回世界心身医学会で発表した。今後はDNAメチル化異常の検討やヒト血液サンプルを用いた検討を実施していく。また、ポジティブコントロールとしてウォーターアボイダンステストを1時間/日×10日間施行したマウスも作成し、海馬よりRNAを抽出した。統計学的に有意に発現変化したmiRNAすべて(約20個のmiRNA)についてTaqMan microRNA assaysを用い、リアルタイムRT-PCR法を施行し発現確認を行った。リアルタイムPCR法においても有意に発現が変化するmiRNAが同定されている。すでに判明しているmiRNAのターゲットは脳神経の発育に重要な蛋白である可能性が示唆された。以上、長期飢餓ストレスにより発現変化した複数のmiRNAの機能を明らかにする事を目的として研究を行った。飢餓ストレスにより後天的に発現変化するmiRNAの機能が推定され、神経性食欲不振症等の飢餓ストレス状態における新たな病態メカニズムの解明やバイオマーカーの開発という観点からも重要な知見が得られた。第15回アジア心身医学会ではベストポスター賞を受賞した。長期飢餓ストレスにより変化するマイクロRNAを見出し、それらの機能を明らかとし、神経性食欲不振症のバイオマーカを確立することを目的とし研究を行った。Balb-cマウスを用い、長期飢餓モデルマウスを作成した。1日食餌量を50%以上制限するとマウスの死亡率が高まり、実験への使用が困難である事が判明した。また、通常慢性ストレスを1時間/日×10日間施行したマウスも作成し、海馬よりRNAを抽出した。動物実験により、飢餓ストレスで優位に変化するmiRNAは約20個存在し、リアルタイムPCRでも幾つかのmiRNAに発現亢進や発現低下が見られることが明らかとなった。また、通常ストレスマウス群の海馬RNAと比較することにより飢餓ストレス特異的なmiRNAを特定した。miRNAをコードするDNA領域のメチル化異常についても引き続き検討中である。患者群の検討も引き続き検討中である。一部のmiRNAは神経の発育に関連するタンパクを制御している可能性が予測された。神経性食欲不振症における、内科的あるいは心理・行動面の異常を説明する手がかりとなり得ることが考えられた。飢餓ストレスにより後天的に発現変化するmiRNAの機能が推定され、神経性食欲不振症等の飢餓ストレス状態における新たなエピジェネティックメカニズムの解明やバイオマーカーの開発という観点からも重要な知見が得られた。心身医学飢餓

特異的miRNAのを同定する為に、付加的に通常慢性ストレスマウス群の実験を行った。メチル化異常やヒトにおける検討が残されているのみであり、研究は概ね順調に進んでいると思われる。重要な知見が得られているが、依然、評価が必要なmiRNAが残っている。その機能については無数に存在するためターゲットを絞り込む作業に時間を要していることが、やや遅れている要因として挙げられる。研究計画に従い、次年度はDNAのメチル化研究およびヒトサンプルでの検討を行う。また、成果については積極的に学会発表および論文発表を行っていく。物品の購入についても、事前の計画を十分に行い、さまざまな側面から無駄のない様に努力していく。研究計画に従い、次年度はDNAのメチル化研究を中心に行っていく。動物実験は既にほぼ終了しているが、飢餓特異的miRNAの検索に重きをおいた研究を行った。また、研究関連の知識の習得および学会における研究発表をおこなったため、メチル化異常についての実験試薬などの購入が本年度はできなかった。DNA抽出キットおよびメチル化異常検索キットの購入を5月中に行う。ヒトサンプルにおける検証を行うための、miRNA検索キットを早急に購入する。実験動物および実験試薬の購入に主に充当する。
新規リン酸カルシウム系歯内療法材料の開発と生体反応の分子基盤構築

ラット露髄モデルへの直接覆髄による材料周囲組織の応答解析とマウス皮下組織埋入実験および各種セメントに対する培養細胞の応答解析行い以下の結果を得た。1ラット露髄モデルへの直接覆髄実験として、8週齢の雄性Wistarラットの右側上顎第一臼歯を露髄させ、2Mリン酸二水素ナトリウム水溶液を練和液としたα-TCP/Te-CP混合セメントあるいは比較対照としてMTAセメントや水酸化カルシウム製剤を填入する群を作製し覆髄部での組織の応答を経時的に検討したところ、覆髄後714日で、α-TCP/Te-CP混合セメント覆髄群に被蓋硬組織形成がみとめられ、直接覆髄後の覆髄部での歯髄組織の反応として、炎症反応の有無を解析するために覆髄後714日でCD68等、マクロファージマーカーと炎症の有無を検討したところ水酸化カルシウム製剤覆髄群では覆髄7日後で炎症反応が顕著にみられたのに対し、α-TCP/Te-CPセメント覆髄群では炎症反応はみとめられなかった。22Mリン酸二水素ナトリウム水溶液を練和液としたα-TCP/Te-CP混合セメントの歯髄由来幹細胞、線維芽細胞を用いた培養系での評価を行ったところ、水酸化カルシウム製剤からの溶出物を含む培地で培養した細胞では細胞増殖が阻害され、骨芽細胞分化マーカー、象牙芽細胞マーカーの発現量に顕著な変化は見られなかったが、α-TCP/Te-CPセメントからの溶出物を含む培地は細胞増殖を阻害せず、コントロール培地と同等の細胞増殖性を示し、また、MTAセメントと比較して、α-TCP/Te-CPセメントからの溶出物を含む培地は骨芽細胞マーカーであるアルカリホスファターゼやオステオカルシン、象牙芽細胞マーカーでもあるDMP-1のmRNA発現量が顕著に増加し、α-TCP/Te-CPセメントが硬組織形成細胞への分化誘導能を有することが示された。本年度は、ラット露髄モデルへの直接覆髄による材料周囲組織の応答解析とマウス皮下組織埋入実験および各種セメントに対する培養細胞の応答解析行い以下の結果を得た。1ラット露髄モデルへの直接覆髄実験として、8週齢の雄性Wistarラットの右側上顎第一臼歯を露髄させ、2Mリン酸二水素ナトリウム水溶液を練和液としたα-TCP/Te-CP混合セメントあるいは比較対照としてMTAセメントや水酸化カルシウム製剤を填入する群を作製し覆髄部での歯髄組織の反応、および被蓋硬組織形成過程でどのような細胞が機能しているかを経時的に切片に作製し、組織化学的・免疫組織化学的解析を行ったところ、覆髄後714日で、α-TCP/Te-CP混合セメント覆髄群に被蓋硬組織形成がみとめられ、列をなす象牙芽細胞様細胞が観察された。さらに、マウス皮下組織への埋入群も作製し、組織応答を検討する予定である。2マウス皮下組織埋入モデルに先立って、歯髄由来幹細胞を用いた培養系での評価を行った。ところ、水酸化カルシウム製剤からの溶出物を含む培地はpH8.89.0となり細胞属性、細胞増殖阻害を示したが、α-TCP/Te-CP混合セメントからの溶出物を含む培地はMTAセメントと比較しても細胞増殖を阻害せず、両者ともに細胞毒性を示さなかった。また、セメントからの溶出物を含む培地で培養した細胞を経時的に固定、あるいは総RNAを回収しており、骨芽細胞や象牙芽細胞等への分化の指標としてマーカー遺伝子の発現解析を行う予定である。そのうちの、固定した細胞を用いてアルカリホスファターゼ(ALP)活性染色を行ったが、α-TCP/Te-CP混合セメントで経時的に染色性が増加し、硬組織形成細胞への分化誘導能を有することが示された。α-TCP/Te-CP混合セメントの細胞親和性が、近年評価の高いMTAセメントと同等であり、骨芽細胞への分化の指標となるALPの活性上昇も促進したことから直接覆髄材として有望である見通しを得たため。また、マウス皮下への埋植実験は、in vitroでの評価を前倒しで行ったため次年度に持ち越したが、in vitroでの結果を解析の指標とできるため全体としては順調に進んでいる。本年度は、昨年度に引き続きラット露髄モデルへの直接覆髄による材料周囲組織の応答解析と各種セメントに対する培養細胞(線維芽細胞および歯髄由来幹細胞)の応答解析行い以下の結果を得た。まず、1ラット露髄モデルへの直接覆髄後の覆髄部での歯髄組織の反応として、炎症反応の有無を解析するために覆髄後714日でCD68等、マクロファージマーカーの免疫組織学的解析と、形態学的な炎症の有無を検討したところ水酸化カルシウム製剤覆髄群では覆髄7日後で炎症反応が顕著にみられたのに対し、α-TCP/Te-CPセメント覆髄群では炎症反応はみとめられなかった。次いで、2歯髄由来幹細胞、線維芽細胞を用いた培養系での評価を行った。

ところ、水酸化カルシウム製剤からの溶出物を含む培地で培養した細胞では細胞増殖が阻害され、骨芽細胞分化マーカー、象牙芽細胞マーカーの発現量に顕著な変化は見られなかったが、α-TCP/Te-CPセメントからの溶出物を含む培地はMTAセメントと比較しても細胞増殖を阻害せず、コントロール培地と同等の細胞増殖性を示し、また、MTAセメントと比較して、α-TCP/Te-CPセメントからの溶出物を含む培地は骨芽細胞マーカーであるアルカリホスファターゼやオステオカルシン、象牙芽細胞マーカーでもあるDMP-1のmRNA発現量が顕著に増加した。以上より、α-TCP/Te-CPセメントが硬組織形成細胞への分化誘導能を有することが示された。α-TCP/Te-CPセメントが、近年臨床生成器の評価されているMTAセメントと比較しても骨芽細胞への分化誘導能や象牙が細胞マーカーのmRNA発現を促進したことから、直接覆髄材として有望であるとの見通しを得たため。また、in vitroでの結果を解析の指標として次年度のエピジェネティック因子の解析を進めることができるため全体として順調に進んでいるといえる。ラット露髄モデルへの直接覆髄による材料周囲組織の応答解析とマウス皮下組織埋入実験および各種セメントに対する培養細胞の応答解析行い以下の結果を得た。1ラット露髄モデルへの直接覆髄実験として、8週齢の雄性Wistarラットの右側上顎第一臼歯を露髄させ、2Mリン酸二水素ナトリウム水溶液を練和液としたα-TCP/Te-CP混合セメントあるいは比較対照としてMTAセメントや水酸化カルシウム製剤を填入する群を作製し覆髄部での組織の応答を経時的に検討したところ、覆髄後714日で、α-TCP/Te-CP混合セメント覆髄群に被蓋硬組織形成がみとめられ、直接覆髄後の覆髄部での歯髄組織の反応として、炎症反応の有無を解析するために覆髄後714日でCD68等、マクロファージマーカーと炎症の有無を検討したところ水酸化カルシウム製剤覆髄群では覆髄7日後で炎症反応が顕著にみられたのに対し、α-TCP/Te-CPセメント覆髄群では炎症反応はみとめられなかった。22Mリン酸二水素ナトリウム水溶液を練和液としたα-TCP/Te-CP混合セメントの歯髄由来幹細胞、線維芽細胞を用いた培養系での評価を行ったところ、水酸化カルシウム製剤からの溶出物を含む培地で培養した細胞では細胞増殖が阻害され、骨芽細胞分化マーカー、象牙芽細胞マーカーの発現量に顕著な変化は見られなかったが、α-TCP/Te-CPセメントからの溶出物を含む培地は細胞増殖を阻害せず、コントロール培地と同等の細胞増殖性を示し、また、MTAセメントと比較して、α-TCP/Te-CPセメントからの溶出物を含む培地は骨芽細胞マーカーであるアルカリホスファターゼやオステオカルシン、象牙芽細胞マーカーでもあるDMP-1のmRNA発現量が顕著に増加し、α-TCP/Te-CPセメントが硬組織形成細胞への分化誘導能を有することが示された。本年度の結果をふまえ、引き続き、各種セメント存在下での周囲組織由来細胞の動態解析を行うため、歯髄由来幹細胞と線維芽細胞を用いて骨芽細胞や象牙芽細胞への分化の指標となる石灰化の度合いを検討し、mRNA発現変化との相関性を確認する。また、石灰化誘導の有無による種々の細胞の分化特性の解析も行い、由来組織の異なる細胞の歯内療法材料に対する応答性について明らかにするととも、セメントからの溶出成分の同定を蛍光X線解析にて行う予定である。さらに、セメント存在下での細胞応答に関与するエピジェネティック因子のスクリーニングとして、DNAの脱アセチル化解析、microRNA等のエピジェネティックな因子の探索を行うほか、遺伝子の転写制御、細胞の分化調節に重要なヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)の関与を阻害剤の1つであるトリコスタチンA (TSA)を用いて評価し、由来組織および適用するセメント材料によって、同酵素の阻害効果の違いを検討する。そして、TSA阻害による骨芽細胞分化や象牙芽細胞分化に関わる因子の発現レベルの変化を解析する。本年度の結果をふまえ、各種セメント溶出物存在下での歯髄由来幹細胞と線維芽細胞の動態を細胞応答に関与するエピジェネティック因子の解析を中心にスクリーニングを行う。
帝政ロシアの統治構造－情報収集・管理の観点から－

19世紀初頭以降、西欧諸国では社会統計を国内の統治に応用する。帝政ロシアは近隣諸国を参考に、1858年に内務省に中央統計委員会を設置し、国内の様々な統計データをこの統計委員会に集約する。内務省は統計データに基づき、国内統治を円滑化すると同時に、公衆衛生の改善に努める。1917年のロシア革命を称賛する余り、帝政ロシアの行政を過少評価してきた。しかし、内務省の新聞の分析から明らかになったのは、帝政ロシアは社会政策により国民の厚生を高めたこと、国内の情報をくまなく収集する統計制度を整備したことである。帝政ロシアの統計制度が十分に整備されていたため、ソ連の計画経済が可能となったと考えられる。本年は、科学研究費の課題研究の初年度であり、かつ、今後の比較研究の基礎となる研究に取り組むため、統計制度の形成史に焦点を当て、日欧露の統治構造の違いに関する仮説を準備した。19世紀以降、ヨーロッパ諸国は国の統治手段として統計制度を発展させる。1851年のロンドン万博で国際統計会議の定期開催が提案されて以降、ヨーロッパ各地で国際統計会議が開催されるが、ロシアもその会議の常連メンバーであった。実際に、1872年にロシアのサンクトペテルブルクで国際統計会議が開催されている。したがって、ロシアの官僚(統計専門家)は、ヨーロッパの統計制度に通じ、統計の標準化や国際比較に関わった。他方、19世紀後半に日本は開国し、ヨーロッパで完成した国民国家モデルを導入した。日本とヨーロッパは旧来の身分制を廃止し、国民の一体化を進め、公的空間である「社会」を創り上げた。「社会」が成立するためには、身分や宗教を抑え国民意識を高める必要がある。19世紀にロシアは国民意識を育めなかったため、20世紀初頭にも、日本で成立した「社会」はロシアに誕生しなかった。ロシアは最新の統計制度に通じていたが、「社会」が存在しない以上、近代の統計制度を包括的に導入できなかった。また、ロシアは統計の国際標準化にも関与できなかった。19世紀にロシアは貿易統計や定期市統計等の分野でヨーロッパの水準に達するが、「社会」統計の発展は望めず、統計の国際標準に対応できなかった。ロシアの統計制度は優れていたが、「社会」=「国民」を創造できなかったことがロシアの限界であり、それは統治構造の限界でもあったと考えられる。上記の内容は、2014年に山口大学で行われた「比較経済体制学会」の自由論題報告で、「帝政ロシアにおける統治構造の卓越性と限界についてー統治手段としての統計の観点からー」という論題で報告を行った。平成28年2月3月にかけてサンクト・ペテルブルクに滞在し、ロシア国立図書館とロシア国立公文書館で内務省関連の資料を閲覧した。ロシア国立図書館では、内務省が刊行した新聞『北の郵便』(1862年1868年)、雑誌『内務省』(1829年1861年)を閲覧し、重要な箇所をデジタル・ファイルに変換し、日本に持ち帰った。ロシア国立図書館では、さらに内務省の新聞『一時的な政府通報』(1869年1917年)を閲覧しようとしたが、時間が足らなかった。ロシア国立公文書館では、内務省の中央統計委員会の文書(フォンド1290)が存在することを知った。これは1812年1918年までの膨大な文書が保存されており、9種類に分けられている。ロシアの統計制度の発展史を理解するには、非常に貴重な文書が存在することがわかった。これまでロシアの文書館では、文書を予約してから3日後に閲覧できるシステムであったが、現在では、日本からインターネットで予約することが可能となっているため、十分に下調べをして、2週間程度の時間を取れば効果的に公文書館での文書の閲覧が可能だと思われる。今回、ロシアの統計制度の資料を閲覧する中で、ロシアの内務省の組織が、戦前の日本の内務省の機構と極めて類似していることに気付いた。戦前の日本でも、国家の体系的な統計整備は内務省が担っていた。このことを踏まえれば、日露の内務省を比較することにより、統計制度の発展の違いに着目した比較研究が十分成立する。近い将来、統計制度を巡る日露比較の研究に取り組みたい。家庭の諸事情で、平成26年度にロシア(サンクト・ペテルブルク)に滞在して資料収集ができなかったため、計画より進捗が一年程遅れることになった。しかし、その遅れについては、研究期間を当初の2年間から、1年延長していただき、遅れている部分は、平成28年度にロシア(サンクト・ペテルブルク)に滞在し、資料を閲覧することで、遅れを取り戻す予定である。とりわけ、平成28年2月に閲覧できなかった、内務省の新聞『一時的な政府通報』(1869年1917年)の閲覧に尽力したい。27年度にロシアで『雑誌・内務省』(18291861年)を閲覧し、帝政ロシアがどのように統計制度を整備したかに関する記事を閲覧し、重要な記事・レポートをスキャンデータに加工し、日本に持ち帰った。28年度にはそのデータを基に、なぜロシアが内務省・中央統計委員会を設置したかについて、論文をまとめた。研究の結果から、帝政ロシアは統計制度を整備する際、欧州諸国の統計制度を参考にしたことが明らかになった。内務省と統計制度の緊密な関係を、ロシアはベルギーの制度から学んだ。近代国家は国民を統治するため、様々な社会統計を整備し、政策決定の参考とした。

19世紀にロシアも国家の統治を円滑に行うために、内務省・中央統計委員会を設置するが、この制度はロシア独自に設計したというよりも、欧州諸国の制度から学んだ結果だと言える。29年2月にロシアのペテルブルクに滞在し、ロシア国立図書館で内務省の新聞『政府通報』(18691889年)を閲覧し、内務省の政策と統計制度の整備の関連を調査した。新聞を閲覧すると、コレラで病気になった人々の数が県別に毎月掲載されていた。これは統計の問題だけではなく、内務省が医療機関と連携を取りながら、伝染病の予防と羅漢した人々の治療等も真剣に議論していた。19世紀後半に内務省は、公衆衛生の改善に積極的に取り組んだ。具体的には、都市における下水道の敷設である。また、クリミア戦争後の孤児に対する政策や、学校教育の充実や刑務所の改善等にも、内務省は取り組む。それに連動する形で、孤児院や学校、刑務所の受刑者の犯罪に関する社会統計の整備が進む。したがって、ロシア内務省の統計制度は、その時々のロシア政府の政策と密接に関わる形で発展し、改善されていく。これらの調査結果は、現在、論文にまとめているところであり、29年度内に学術雑誌に投稿する予定である。19世紀初頭以降、西欧諸国では社会統計を国内の統治に応用する。帝政ロシアは近隣諸国を参考に、1858年に内務省に中央統計委員会を設置し、国内の様々な統計データをこの統計委員会に集約する。内務省は統計データに基づき、国内統治を円滑化すると同時に、公衆衛生の改善に努める。1917年のロシア革命を称賛する余り、帝政ロシアの行政を過少評価してきた。しかし、内務省の新聞の分析から明らかになったのは、帝政ロシアは社会政策により国民の厚生を高めたこと、国内の情報をくまなく収集する統計制度を整備したことである。帝政ロシアの統計制度が十分に整備されていたため、ソ連の計画経済が可能となったと考えられる。平成26年度は、研究課題について基本文献を閲覧収集することと、ロシアの図書館で帝政ロシア時代の内務省と大蔵省の新聞・雑誌を閲覧することを目指していたが、基本文献の閲覧集と仮説を構築することには成功したものの、ロシアに滞在し内務省と大蔵省の新聞・雑誌を閲覧することができなかった。それは、東北大学とモスクワ大学との協力を基に、「伝統と現代の対話」というテーマで、人文社会系の日露の研究者を仙台に集め、27年3月に「第3回日露人文社会フォーラム」を組織したためである。これは、日露の様々な人文社会領域の研究者を招聘し、深い議論を目指したものであり、非常に充実した内容になったものと自負している。このフォーラムの実施により、日露の学術交流には貢献したが、準備に忙殺され、ロシアの図書館での新聞・雑誌の閲覧時間が取れなくなった。この遅れは27年度に取戻し、最終的には研究課題の目的を遂行したいと考えている。平成28年度については、2月3月にかけてロシア(サンクト・ペテルブルク)に滞在し、ロシア国立図書館で『一時的な政府通報』(1869年1917年)の全機関の閲覧に努める。19世紀前半におけるロシア内務省の統計整備状況については、ほぼ調査を終えたので、今年度は19世紀後半からロシア革命直前までの統計整備状況について調査する。平成28年2月に資料閲覧を行った成果については、今年度に論文にまとめ、学術雑誌に投稿する予定である。日露の内務省(中央統計委員会)の比較史の可能性についても、年度内に検討を続けたい。
個々の分類群のアバンダンス分布に基づくアンモニア酸化細菌群集の動態解析手法の開発

本研究の目的は、環境微生物群集の群集構造を忠実に反映する、簡便・迅速な特徴付け手法、及び群集の構成微生物群の分類学的位置づけ(分類群)推定のための新規手法を開発し、フレームワークを示すことである。窒素循環での意義付けが明確な化学合成無機栄養アンモニア酸化細菌(AOB)群集を対象とした。AOBは増殖速度が遅くかつ収率も低いことから培養が困難である。そのため群集構造解析ではPCRをはじめとする分子生物学的方法が用いられることが多く、近年、PCRを用いたAOBの定量的評価の可能性が検討されている。本研究ではアンモニア酸化細菌の定量に核酸定量法の一つであるリアルタイムPCR法を適用することを試み、その妥当性について検討した。アンモニア酸化細菌の動態解析に汎用されている標的部位のまったく異なる2種類のプライマーセットを用い、分類学的に多様なアンモニア酸化細菌5株から抽出したDNA標品に対してリアルタイムPCR法を適用した。その結果、供試した5株由来のDNAについて検量線を作成することができた。しかし、検量線は菌株間での違いが顕著であり、検量線を作成する菌株の選択によって標的遺伝子の定量値を過大または過小評価する可能性があることが示めされた。標的遺伝子の定量値が過大または過小評価されるケースについて、それが起こる機構の解明を行った。その結果、過小評価の原因となる主な機構を解明することができ、正確な定量が可能なプライマーと標的(分類群)の組み合わせを求める条件を特定した。それらの結果から、環境微生物群集の群集構造を構成する微生物分類群のアバンダンス分布として表現する新規方法のフレームワークを考察した。生物学的硝化反応の初期段階を担う化学合成無機栄養アンモニア酸化細菌(AOB)は培養が困難であるため、群集構造に関する研究では分子生物学的方法が用いられることが多い。近年、PCRを用いた微生物群集構造解析においても定量的評価の可能性が検討されている。リアルタイムPCR法は、インターカレーターや蛍光プローブを用いてPCR増幅産物の蛍光強度をサーマルサイクラーと一体化した分光蛍光光度計でサイクルごとに検出する核酸定量法である。本研究では、環境中のアンモニア酸化細菌群集の動態解析を目的として、リアルタイムPCR法による定量分析の可能性を検討している。本年度は、アンモニア酸化細菌の動態解析に汎用されている標的部位のまったく異なる2種類のプライマーセットを用い、リアルタイムPCR法の適用を試み、その妥当性について検討した。AOB菌株5株を純粋培養し、各菌株から抽出したDNAを供試した。Proteobacteria β-subdivision AOBの16SrDNAおよびamoA遺伝子を増幅する2種類のプライマーセットを用い、BIO-RAD社製iCycler iQ^<TM>リアルタイムPCR装置でPCRを行った。インターカレーターとしてSYBR Green Iを用いた。供試したAOB5株由来のDNAはすべて相対蛍光強度が指数関数的に増加する範囲を持ち、検量線を作成することができた。検量線は菌株間での違いが顕著であり、検量線を作成する菌株の選択によって16SrDNAおよびamoA遺伝子の定量値を過大又は過小評価する可能性があることが示唆された。本研究の目的は、環境微生物群集の群集構造を忠実に反映する、簡便・迅速な特徴付け手法、及び群集の構成微生物群の分類学的位置づけ(分類群)推定のための新規手法を開発し、プロトタイプを示すことである。窒素循環での意義付けが明確な化学合成無機栄養アンモニア酸化細菌(AOB)群集を対象とする。本研究ではアンモニア酸化細菌の定量に核酸定量法の一つであるリアルタイムPCR法を適用することを試み、その妥当性について検討している。

これまで、アンモニア酸化細菌の動態解析に汎用されている標的部位のまったく異なる2種類のプライマーセットを用い、分類学的に多様なアンモニア酸化細菌5株から抽出したDNA標品に対してリアルタイムPCR法を適用した。その結果、供試した5株由来のDNAについて検量線を作成することができた。しかし、検量線は菌株間での違いが顕著であり、検量線を作成する菌株の選択によって標的遺伝子の定量値を過大または過小評価する可能性があることが示唆された。この結果を踏まえ、本年度は、標的遺伝子の定量値が過大または過小評価されるケースについて、それが起こる機構の解明を行った。その結果、過小評価の原因となる主な機構を解明することができ、正確な定量が可能なプライマーと標的(分類群)の組み合わせを求める条件を特定した。つづいて、各分類群のアバンダンスが得られる検出限界、定量限界、測定範囲等を検討した。それらの結果から、環境微生物群集の群集構造を構成する微生物分類群のアバンダンス分布として表現する新規方法開発の方向性を考察した。
海塩粒子とオゾンの不均一化学反応の研究

クヌッセンセル法を用い、海塩粒子のモデル化合物に対するオゾン(O_3)の取り込み過程を調べた。特に、海塩粒子中に含まれる微量金属イオンが不均一反応に及ぼす影響を調べるため、塩化第二鉄(FeCl_3)をごく微量に含んだ塩化ナトリウム(NaCl)及び合成海塩粒子をモデル化合物として、これら固体粒子表面へのオゾンの取り込み係数の測定、及び取り込みにより生成する化合物の同定を行った。FeCl_3を微量に含んだNaClの系では、Fe/Na比が0.1%、0.5%、1%の3種類の試料を調製し、これらへのオゾンの取り込み係数を測定した結果、Fe/Na比によらず(1.6-1.9)×10^<-2>という値が得られた。また、オゾンの取り込みに伴い塩素分子(Cl_2)の生成が観測されたが、その生成収率はFe/Na比に依存し、Fe/Na比=0.1%では検出限界以下であったのに対し、Fe/Na比=0.5%、1%でそれぞれ27%、47%であった。一方、合成海塩粒子にFeCl_3を微量に混合させた系では、同程度の取り込み係数1.9×10^2が得られたが、塩素分子の生成はみられず、かわりに臭素分子(Br_2)の生成が観測された。これは、合成海塩粒子に含まれる臭化物イオンが塩化物イオンに比べ反応性が高いため、まず臭素分子が生成したものと考えられる。これらの結果は、陸起源の土壌粒子などとの内部混合によりFe^<3+>イオン濃度が高くなった海塩粒子において、オゾンとの不均一反応が促進されることを示唆している。特に、大気寿命の長い(数日以上)、粒径の小さい粒子では、臭化物イオンがまず欠乏する結果、オゾンの取り込みにより塩素分子が生成することが予想され、これまで特定されなかった、海洋境界層における塩素分子発生源としてこの反応のはたらく可能性が高い。クヌッセンセル法を用い、海塩粒子のモデル化合物に対するオゾンの取り込み過程を調べた。海塩粒子のモデル化合物として、臭化ナトリウム、臭化マグネシウム、合成海塩粒子の三種類の固体粒子を用いた。臭化ナトリウムに対するオゾンの取り込みは本研究で用いた装置では観測されず、取り込み係数は<1×10^<-5>と小さい値であることがわかった。また、取り込みにともなう生成物もみとめられなかった。一方、臭化マグネシウム及び合成海塩粒子に対しては、オゾンの取り込み及びそれにともなう臭素分子の生成が見られた。取り込み係数に関しては、臭化マグネシウムの場合で(1.4±1.0)×10^<-3>、合成海塩の場合で(1.2±1.0)×10^<-3>という、ともに大きい値が得られた。生成する臭素分子の収率を見積もったところ、臭化マグネシウムで50%、合成海塩粒子で1050%という値が得られた。臭素分子は太陽光により解離し、反応性の高い臭素分子を生成することから、ここで得られた実験結果は、実際の海洋境界層において、オゾンと海塩粒子との不均一化学反応を通して臭素分子が生成し、その光解離により生成する臭素原子がオゾンの触媒的な破壊反応をはじめ大気化学過程に関することを示唆している。また、臭化ナトリウムでは取り込みが見えなかったにもかかわらず、合成海塩粒子及び臭化マグネシウムでは、約10^<-3>の係数で取り込みが起こることから、実際に海塩粒子に対するオゾンの取り込み過程には、マグネシウムをはじめとする微量成分が重要な役割を果たしていることが分かった。
ヘビの第六感、赤外線受容はどのようにして獲得されたのか？

本研究では赤外線感知能力を獲得し、暗黒の中で温血動物を捕らえるといったユニークな適応行動を進化させたヘビの一種であるマムシの胚を材料に用いて、その頭部にみられる赤外線受容器官(ピット器官)と赤外線受容能を持つ特殊な神経細胞から構成される赤外線受容神経回路の形成機序を調べる。これにより、動物の適応的な行動が生み出される際に起こる大規模な神経回路の再編成の背景にある分子・細胞基盤の理解をめざす。本研究には、神経回路再編成と生物進化との関連性を探究する進化生物学の新たな研究領域の開拓や医療・工業分野で利用される高精度温度センサーデバイス開発の期待が寄せられる。
滑膜肉腫幹細胞の同定と創薬基盤の確立

滑膜肉腫は若年成人の関節周辺に発生する悪性度の高い腫瘍であり有効な治療法は未だ確立されていない。本研究では根源的な治療法を開発するため、滑膜肉腫幹細胞を同定し腫瘍発生機構・病態を解明し、発癌メカニズムに基づく治療薬開発の基盤技術を確立する。発癌機構の解析は、1肉腫幹細胞の分離とマーカー分子の同定、2滑膜肉腫キメラ遺伝子SYT-SSXによるクロマチンリモデリング測定システムの開発、3滑膜肉腫の腫瘍化に必須のシグナル伝達分子Crkによる転移・浸潤メカニズムの解明、の3つを柱とする。治療薬剤のリード化合物の探索は独自に開発した1分子特異的シグナル抑制薬剤スクリーニング法、2分子結合FRETイメージング法、分子構造に基づくin silico分子設計法を用いて、スクリーニング法の基盤を確立する。候補となる化合物は申請者らが確立した滑膜肉腫モデルマウスを改良し、臨床応用の可能性を含めて有効性を評価する。本研究では肉腫幹細胞、クロマチンリモデリング機構、HGF-Crkシグナルの3点に焦点をあて、SYT-SSXの癌化のメカニズムについて分子生物学的に包括的・総合的な理解を目指す。特に肉腫幹細胞はこれまで報告がほとんどなく、治療上極めて重要な発見となる。クロマチンリモデリングと発癌との関連については、近年急速に解析が発展している分野であるが、滑膜肉腫については癌化に必須であるSYT-SSXとhBRMとの結合は当研究室で発見されたものであり独創性が高い。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
小児急性白血病の発症前診断法の開発

小児急性リンパ性白血病におけるMLL-AF4およびTEL-AML1融合遺伝子のDNAを用いた迅速な検出・同定の方法を確立した。それぞれの遺伝子の転座切断点が集中するイントロン領域に一定の間隔でPCRプライマーを設定した。その際融合遺伝子の検出時におけるPCR産物の予想サイズが6kb以下になるようにPCRプライマーを設定した。これら複数のPCRプライマーを混合してPCRを行うことにより、必要なDNA量を少なくすることができる。今後白血病のスクリーニングのためにガスリー血などの濾紙血を用いてDNA抽出を必要としない検出法の確立を目指す。MLL-AF4融合遺伝子のゲノム上の転座切断点は、MLL遺伝子上のイントロン5からエクソン11までの約8.3kbと、AF4遺伝子のイントロン3から6(約48kb)に集中している。これらの領域に0.72kbの間隔で複数のプライマー(MLL側に12個、AF4側に32個)を設計し、PCRにて転座切断点の検出を試みた。MLL-AF4融合遺伝子陽性白血病細胞株を検体として用いた。AF4遺伝子上の32個のリバースプライマーを8個ずつ4セットに分けてMLL遺伝子上の12個のフォワードプライマー全てを混合して行ったPCRでは各細胞株で少なくとも一つのセットで増幅産物が得られ、MLL-AF4融合遺伝子を検出可能であった。12個のフォワードプライマーと32個のリバースプライマーを混合して1本のチューブで行ったPCRでも各細胞株で同様にMLL-AF4融合遺伝子を検出可能であった。TEL-AML1融合遺伝子に関しては、ゲノム上の転座切断点はほとんどの症例で、TELのイントロン5(約15kb)とAML1遺伝子のイントロン1(約150kb)に集中している。TEL遺伝子のイントロン5に15個のフォワードプライマーを設定し、AML1遺伝子のイントロン1に52個のリバースプライマーを設定した。MLL-AF4融合遺伝子と同様に、AML1遺伝子上のリバースプライマーを13個ずつ4セットに分けてTEL遺伝子上の15個のフォワードプライマーと混合して行ったPCRでは十分にゲノム上のTEL-AML1融合遺伝子を検出可能であった。これらの方法は白血病細胞株のみでなく、患者検体を用いた解析にも問題なく応用でき、迅速にゲノム上の転座切断点を同定できる実験系を作製できた。これらのPCRの検出感度は白血病細胞のDNA 100 pgまでであり、この方法での融合遺伝子の検出には白血病細胞が20個程度必要であると思われた小児急性リンパ性白血病医におけるMLL-AF4およびTEL-AML1融合遺伝子のDNAを用いた迅速な検出・同定の方法は前年度に確立できており、白血病症例の初診時検体の場合にはDNAを用いた1回のPCRでこれらの融合遺伝子のゲノム上の融合配列を同定することが可能である。微小病変の検出を目的とした実験では、これらの融合遺伝子を有する白血病症例の治療後の検体や白血病細胞株を非白血病細胞と混合した培養液などを用いた。白血病細胞が概ね1万分の1以下のレベルでは、融合遺伝子のPCR産物のサイズによって検出の可否が影響され、PCR産物のサイズがある程度大きな場合には検出率は低下した。現在MLL-AF4融合遺伝子で44個のプライマー、TEL-AML1融合遺伝子で67個のプライマーを用いてそれぞれの転座集中領域のほぼ全域をカバーしているが、PCR産物のサイズを小さくするために、プライマーの数をさらに増やして、プライマー同士の間隔をより短くすることで結果を改善できると思われ、今後検討を続けていく。検出方法をより簡便にするために、ガスリー血などの濾紙血を用いて、DNA抽出を行わずにゲノム上の融合遺伝子検出を試みたが、同様にPCR産物のサイズが大きな場合には増幅産物を得ることは困難であった。この点に関しても前述のごとく改善試み検討を続けていく。またこれらの融合遺伝子以外にも急性骨髄性白血病で認められるAML1-ETOやPML-RARA、小児軟部腫瘍で認められるEWS-FLI1などの融合遺伝子についても同様の方法で迅速に検出・同定する方法をほぼ確立できた。MLL-AF4およびTEL-AML1融合遺伝子のゲノム上の転座切断点の迅速な同定方法は確立できた。ごく少数の白血病細胞を含む血液検体での融合遺伝子の検出は試行中であるが、まだ方法は確立していない。小児科学基本的は迅速検出方は確立したが、白血病細胞の混入が少ない場合にはPCRでの特異的な産物の増幅が不安定であり、方法を改善する必要がある。当初の目的である早期診断のためのスクリーニングへの応用には実験方法のさらなる改良が必要であり、今後も検討を続けていく。また方法が確立した後に実際に臍帯血などを用いて、TEL-AML1、MLL-AF4融合遺伝子のスクリーニングを行い、白血病の早期診断への応用の可能性について検討する予定である。

初年度に本研究計画のために購入予定であったPCR装置(Applied Biosystems Veriti 96-Well Fastサーマルサイクラー、一式98万円)の購入を見合わせ、本研究室で保有するPCR装置および学内共同実験施設のPCR装置を使用したため、当初予算より使用経費が少なくなり、次年度使用額が生じた。研究計画の遂行に高性能なPCR装置が必要となる可能性は高く、次年度に繰り越した予算を用いて必要な装置の購入を行う予定である。