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糖尿病でのインスリン分泌不全の成因に関する生理学的および分子生物学的研究

糖尿病の大多数を占めるインスリン非依存型糖尿病(NIDDM)では、病態生理上の重要な知見の一つとして、ブドウ糖尿刺激に対する選択的なインスリン分泌能の低下の存在が知られている。一方、ブドウ糖以外の分泌刺激に対しては、分泌はむしろ亢進している。そこで細胞内Ca^<2+>濃度の動態に重要な役割を果している電位依存性Ca^<2+>チャネル(VDCC)活性についてpatch clamp法により直接的な検討を加えた。遺伝性NIDDMモデルのGKラットより膵ラ氏島を単離し分散して得た単一β細胞を用い、whole cell recordingによりL型ならびにT型VDCC電流を記録した。さらにATP感受性K^+チャネルの閉鎖による細胞膜の脱分極を介さずに、膵β細胞内糖代謝機構により直接VDCC活性が修飾される機構を検討する目的で、ナイスタチンを用いたperforated patchによる検討を行った。GKラットでは脱分極刺激に対して、whole cell recordingで明かなL型VDCC電流の増大を認めた。また同様の現象は、T型VDCCにおいても認められた。細胞内糖代謝機構が保持されたperforated patchでは、対照で高濃度ブドウ糖によりVDCC活性はさらに増大を示した。しかしながらGKラットではこの様な活性の増大は認められなかった。一方T型VDCCはL型とは異なり細胞内糖代謝機構による直接的な活性の調整は受けていなかった。したがってNIDDM状態下では、K_<ATP>チャネルの閉鎖を介さない細胞内糖代謝機構によるL型VDCCの活性化の増大にも障害が存在し、ブドウ糖刺激によるVDCC活性化の低下に拍車をかけている事実が明かとなった。しかしながら一方では、ブドウ糖以外の脱分極刺激に対してはむしろVDCC活性は増大を示すことより、NIDDMでのインスリン分泌不全でのブドウ糖に対する選択性の発症機序に、これらの事実が密接に関与しているものと考えられた。糖尿病患者の大多数を占めるインスリン非依存型糖尿病(NIDDM)では、その病態の特徴として、ブドウ糖に対するインスリン分泌不全の存在が認められる。一方、ブドウ糖以外の分泌刺激に対してはむしろ分泌は亢進している事実が知られているが、その分子メカニズムについては未だ明らかではない。そこで膵β細胞におけるインスリン分泌機構において重要な役割を演じている細胞内Ca^<2+>濃度、ならびに細胞外からのCa^<2+>の流入口である電位依存性Ca^<2+>チャネル(VDCC)について、蛍光指示薬Fura 2を用いたvideo image analysisおよび電気生理学的手法のpatch clamp法により直接的な検討を加えた。遺伝性NIDDMモデルのGKラットではブドウ糖刺激による細胞内Ca^<2+>濃度上昇の障害を認めたものの、一方、ブドウ糖以外の脱分極刺激である高濃度K^+に対しては上昇反応の亢進を認めた。次いで脱分極刺激に対するVDCC活性をpatch clamp法のwholecell recordingにより検討を加えたところ、GKラットの膵β細胞では対照に比して内向きCa^<2+>電流の増大を認めた。また脱分極刺激の強度と内向き電流から成るI-V曲線の比較検討により、この電流の増大は広い範囲の脱分極刺激(-20mV+40mV)で認められた。一方、細胞内ブドウ糖代謝機構を保持し得るナイスタチン法によるperforated patchの検討により、ブドウ糖代謝を介した直接的なVDCC活性化機構に障害が認められた。したがって、これらの事実がNIDDMでのブドウ糖以外の脱分極刺激に対するインスリン分泌反応の亢進、すなわちインスリン分泌不全のブドウ糖刺激に対する選択性の成因に密接に関与しているものと推測された。

糖尿病の大多数を占めるインスリン非依存型糖尿病(NIDDM)では、病態生理上の重要な知見の一つとして、ブドウ糖刺激に対する選択的なインスリン分泌能の低下の存在が知られている。一方、ブドウ糖以外の分泌刺激に対しては、分泌はむしろ亢進している。そこで細胞内Ca^<2+>濃度の動態に重要な役割を果たしている電位依存性Ca^<2+>チャネル(VDCC)活性についてpatch clamp法により直接的な検討を加えた。遺伝性NIDDMモデルのGKラットより膵ラ氏島を単離し分散して得た単一β細胞を用い、whole cell recordingによりL型ならびにT型VDCC電流を記録した。さらにATP感受性K^+チャネルの閉鎖による細胞膜の脱分極を介さずに、膵β細胞内糖代謝機構により直接VDCC活性が修飾される機構を検討する目的で、ナイスタチンを用いたperforated patchによる検討を行った。GKラットでは脱分極刺激に対して、whole cell recordingで明かなL型VDCC電流の増大を認めた。また同様の現象は、T型VDCCにおいても認められた。細胞内糖代謝機構が保持されたperforated patchでは、対照で高濃度ブドウ糖によりVDCC活性はさらに増大を示した。しかしながらGKラットではこの様な活性の増大は認められなかった。一方T型VDCCはL型とは異なり細胞内糖代謝機構による直接的な活性の調整は受けていなかった。したがってNIDDM状態下では、K_<ATP>チャネルの閉鎖を介さない細胞内糖代謝機構によるL型VDCCの活性化の増大にも障害が存在し、ブドウ糖刺激によるVDCC活性化の低下に拍車をかけている事実が明かとなった。しかしながら一方では、ブドウ糖以外の脱分極刺激に対してはむしろVDCC活性は増大を示すことより、NIDDMでのインスリン分泌不全でのブドウ糖に対する選択性の発症機序に、これらの事実が密接に関与しているものと考えられた。
熱帯熱マラリア原虫の細胞内寄生成立における抗酸化酵素系の役割の解明

熱帯熱マラリア原虫ペルオキシレドキシン(Prx)の生理機能を明らかにする目的で、原虫1-Cys型および2-Cys型Prxの組換え体タンパク質について性状解析をおこなった。その結果、両組換え体Prxに過酸化水素に対する還元活性が認められた。また、2-Cys型Prxにはチオレドキシンペルオキシダーゼ活性が確認された。非還元SDS-PAGEで分離した原虫ライセートを抗Prx抗体とウエスタンブロット法で反応させたところ、2-Cys型Prxはホモダイマーとして検出された。一方、1-Cys型Prxはモノマーとして検出された。このことから、熱帯熱マラリア原虫の2-Cys型Prxは、他生物でのそれと同様に、チオレドキシン系のターミナルペルオキシダーゼとして機能していると推測された。一方、1-Cys型Prxは、チオレドキシン系に拘束されずに独立して機能する酵素と推測された。Prxの赤内型原虫各発育期における発現パターンをウエスタンブロット法で調べたところ、両Prxタンパク質の発現は、原虫での代謝の活性化に一致して栄養体/分裂体期に亢進した。このことから、熱帯熱マラリア原虫は、ヘモグロビン消化等の代謝過程から派生する内因性活性酸素種の消去にPrxを利用していることが推測された。最後に、1-Cys型Prxをマラリア原虫で過剰発現させたところ、クロロキンに対するIC_<50>値が親株のそれより有意に上昇し、1-Cys型Prxがクロロキンの殺原虫作用に何らかの関連を有することが示唆された。クロロキンの殺原虫作用の一つとして、原虫のヘモグロビン代謝系でのヘムの解毒を阻害して細胞内過酸化物を増加させる作用が知られているが、1-Cys型Prx過剰発現原虫ではこの作用が緩和された結果、クロロキンに対する感受性が低下したものと考察された。
環境適応ホメオスタシス系における新しい生理活性物質の意義

本研究は、体温、水電解質、摂食、代謝、循環などの研究者間の有機的協力研究を行ない、ホメオスタシス系における新しい生理活性物質の意義を2年間に亘って解析した。研究実績は以下の通りである。(1)ラットが摂食した時のaFGFの脳内増加及びaFGF脳室内投与による摂食量の低下から、aFGFが内在性摂食制御物質である事が判明した(大村)。(2)大村らが発見した食欲制御物質2B4Oが迷走神経肝枝求心活動を抑制する。(新島)他、外側視床下部ニューロンの活動を低下させ、摂食及び脳内自己刺激行動を抑制する(小野)。(3)褐色脂肪組織の熱産生にグルカゴンが関与している(黒島)。(4)脳内ニューロテンシン、ボンベシン、VIP、グルカゴン、CCK8の体温、代謝、循環各調節への中枢作用様式が判明した(永坂)。(5)AII及びANPのAV3V、SFO、視交叉上核、室傍核への作用及び腎交感神経活動への作用(山下)とANPによる血液量減少機序及び飲水行動への作用(森本)が判明した。(6)脊髄後角細胞へのNA及び5HTの作用、涙腺分泌におけるアセチルコリンの作用と細胞内Caイオン動態が明らかにされた。(入来)。(7)in situハイブリダイゼーション法を用いてオキシトシン産生細胞の視床下部分布、免疫組織化学法による内因性ジギタリス様物質の視床下部特にバゾプレッシンニューロンにおける分布、ANPの心室内分布の様式が明らかにされた(佐野)。(8)アルゴンレーザーによる脳加温による体温調節反応解析法が開発された(小坂)。(9)プロゲステロン、CO_2張力の視床下部温度ニューロンの作用と運動時の体温上昇の中枢機構を解明した(中山)。(10)制限給餌によるコルチコステロンピークに室傍核NA細胞の活性が関与している(広重)。(11)IL-1、IFN、TNFの視床下部温度ニューロン(堀)、ブドウ糖反応性ニューロン(大村、堀)、脾臓及び副腎交感神経(新島)への作用及び脳オピオイド系の脾NK細胞活性への作用(堀)を明らかにした。(入来)。本研究の目的は,体温,水電解質,摂食,代謝,循環など従来個々別々に追求していた研究者間で有機的な協力研究を行い,ホメオスタシス系における新しい生理活性物質の意義を解明する事である.研究結果:(1)ラットの摂食後,脳脊髄液中に酸性型FGFが著しく増加する事及び酸性型FGFのIII脳室内投与は摂食量を低下させる事などから,この物貭が内在性摂食制御物質である可能性が明らかになった(木村).

(2)2DTAの類似物貭2B40が迷走神経肝臓枝の求心活動を抑制する事(新島)及びブドウ糖摂取及び脳内自己刺激のためのリック行動を抑制するが,リック行動そのものには影響しないので外側視床下部ニューロンが2B40の作用点であるらしい(小野),外側野ニューロンのオペラント摂食及び脳内白己刺激行動時の活動様式が明らかにされた(小野).(3)in situハイブリダイゼゼーション法によりオキシトシン産生細胞の視床下部内分布と性ホルモン投与による変化が明らかになった(佐野).(4)非ふるえ熱産生亢進にグルカゴンが関与している(黒島).(5)ニューロテンシン,ボンベシン, VIP,グルカゴン, CCKー8の脳室内投与による体温調節反応様式とその機序が明らかになった(永坂).(6)AII及びANPのAV3V, SFO,視交又土核,室傍核への作用(山下)とANPによる血液量減少機序及び飲水行動への作用が明らかになった(森本)(7)制限給餌によるコルチコステロソピークに室傍核のNA細胞の活性が関与している(広重)(8)各種体温制御物貭の視床下部温度ニューロンへの作用機序と体温反応との関係(中山)及びインターフォロン, ILー1の温度ニューロン作用機構(堀)が明らかにされた(9)脊髄後角細胞へのNA及び5HTの作用が明らかにされた(入來). (10)アルゴンレーザーによる脳加温による体温調節反応解析法が開発された(小坂).これらの結果は62年12月の班会議(唐津市)で報告,討議された本研究では体温、水電解質、摂食、代謝、循環などの研究者間の有機的協力研究を行ない、ホメオスタシス系における新しい生理活性物質の意義を解析した。研究実績は次の通りである。(1)ラットが摂食した時のaFGFの脳内増加及びaFGF脳室内投与による摂食量の低下から、aFGFが内在性摂食制御物質である事が判明した(大村)。(2)大村らが発現した食欲制御物質2B40が、迷走神経肝枝求心活動を制御する(新島)他、外側視床下部ニューロンの活動を低下させ、摂食及び脳内自己刺激行動を制御する(小野)。(3)褐色脂肪組織の熱産生にグルカゴンが関与している(黒島)。(4)脳内ニューロテンシン、ボンベシン、VIP、グルカゴン、CCK8の体温、代謝、循環各調節への中枢作用様式が判明した(永坂)。(5)AII及びANPのAV3V、SFO、視交又上核、室傍核への作用及び腎交感神経活動への作用(山下)とANPによる血液量減少機序及び飲水行動への作用(森本)が判明した。(6)脊髄後角細胞へのNA及び5HTの作用、涙腺分泌におけるアセチルコリンの作用と細胞内Caイオン動態が明らかにされた(入来)。(7)in situハイブリダイゼーション法を用いてオキシトシン産生細胞の視床下部分布(免疫組織化学法)による内因性ジギタリス様物質の視床下部特にバゾプレッシンニューロンにおける分布、ANPの心室内分布の様式が明らかにされた(佐野)。(8)アルゴンレーザーによる脳加湿による体温調節反応解析法が開発された(小坂)。(9)プロゲステロン、CO_2張力の視床下部温度ニューロンへの作用と運動時の体温上昇の中枢機構を解明した(中山)。(10)制限給餌によるコルチコステロンピークに室傍核NA細胞の活性が関与している(広重)。(11)IL-1、IFN、TNFの視床下部温度ニューロン(堀)、ブドウ糖反応性ニューロン(大村、堀)、脾臓及び副腎交感神経(新島)への作用及び脳オピオイド系の脾NK細胞活性への作用(堀)を明らかにした。
スーパーオキシドディスムターゼ機能を持つ新規金属錯体の合成

本研究は酸素毒性の本体であるスーパーオキシドを効率よく消去する活性(SOD活性)を持つ新規金属錯体の開発・合成を行い,それらを医薬品へ応用することを目的としている.スーパーオキシドをはじめとする活性酸素種が,炎症・老化・虚血再環流障害・発癌等様々な疾病と関連していることが明らかにされてきており,SOD酵素そのものを医薬品として応用する試みもなされているが,(1)タンパクであるため細胞膜を通過できない,(2)血中半減期が短い,(3)抗体産生能を有する,などの欠点があり実用化には至っていない.そしてこれらの欠点を克服したSOD様の活性を持った低分子化合物の開発が望まれていた.本研究では世界で初めてSOD活性を有する化合物(Fe-TPENおよびその誘導体)の開発に成功し,その有用性をパラコート毒性の防御効果で評価し,ビタミンCとの併用によりパラコート毒性を完全に抑制出来ることは明らかにした.成果を以下に示す.・SOD活性発現には置換活性錯体であることが重要.・錯体の酸化還元電位とSOD活性との間には負の相関がある.すなわち,酸化還元電位が低くなると活性が上昇し,酸化還元電位が高くなると活性が低下する.・鉄に配位しているメチル基は立体的影響よりむしろ電子的影響によりSOD活性を変化させるが,酸素に対する安定化については立体的効果が大きく作用している.これらの知見はこれらSOD類を医薬品に応用する際に重要であり,得られたデータに基づいて動物実験にはいることが可能となった.本研究は酸素毒性の本体であるスーパーオキシドを効率よく消去する活性(SOD活性)を持つ新規金属錯体の開発・合成を行い,それらを医薬品へ応用することを目的としている.スーパーオキシドをはじめとする活性酸素種が,炎症・老化・虚血再環流障害・発癌等様々な疾病と関連していることが明らかにされてきており,SOD酵素そのものを医薬品として応用する試みもなされているが,(1)タンパクであるため細胞膜を通過できない,(2)血中半減期が短い,(3)抗体産生能を有する,などの欠点があり実用化には至っていない.そしてこれらの欠点を克服したSOD様の活性を持った低分子化合物の開発が望まれていた.本研究では世界で初めてSOD活性を有する化合物(Fe-TPENおよびその誘導体)の開発に成功し,その有用性をパラコート毒性の防御効果で評価し,ビタミンCとの併用によりパラコート毒性を完全に抑制出来ることは明らかにした.成果を以下に示す.・SOD活性発現には置換活性錯体であることが重要.・錯体の酸化還元電位とSOD活性との間には負の相関がある.すなわち,酸化還元電位が低くなると活性が上昇し,酸化還元電位が高くなると活性が低下する.・鉄に配位しているメチル基は立体的影響よりむしろ電子的影響によりSOD活性を変化させるが,酸素に対する安定化については立体的効果が大きく作用している.これらの知見はこれらSOD類を医薬品に応用する際に重要であり,得られたデータに基づいて動物実験にはいることが可能となった.生体内では各部位、各細胞内オルガネラで活性酸素種が普遍的に生成し、それにより酸素毒性が発現することが知られている。本研究はこの酸素毒性の本体であるスーパーオキシドを効率よく消去する活性(SOD活性)を持つ新規金属錯体の開発・合成を行ない、それらの医薬品への応用の基礎を固めることを目的としている。そして本研究の特徴としてat randamなスクリーニングによる活性物質の探索ではなく、反応機構の解析に基づいてドラッグデザインを行う点,また、開発したSOD機能を持つ錯体を実用的医薬品,具体的には抗炎症薬などに応用する点が挙げられる。このような観点の下、平成6年度に新規化合物を含む20数種の配位子およびそれに対応する金属錯体を合成した。その活性を測定した結果(1)Fe-TPENが高いSOD活性を持つこと.(2)Fe-TPENのSOD活性は大腸菌細胞内でも発現すること.(3)その結果パラコート毒を軽減すること.(4)活性発現にはエクアトリアル位のピリジン環配位子の置換活性が本質的に重要なこと.(5)その置換活性を有するようにするためには錯体に歪みを与えることが必要であること.(6)II価鉄錯体が空気中で安定であるためには六配位構造をとらねばならないこと.などの知見を得た。そしてこれらの知見に基づいて全く新しいSOD活性を有するFe-6Me TPTN錯体を創製した。この錯体はFe-TPEN類と同様、スピンクロスオーバー錯体であり、スピンクロスオーバー錯体とSOD活性錯体の相関が示唆された。更に実用的使用を目的に細胞内でのSOD活性を測定するAssay法として96穴のプレートを用いて行う方法も新たに開発した。この方法を用いることにより,多量のサンプル数あるいは各種抗酸化剤との組み合わせなどの一斉分析が可能となり、簡便な薬理活性物質探索システムとして期待できる。酸素は人間にとって必要欠くべからざる分子であるが、その一方で、生体内の各部位細胞内の各小器官で酸素から活性酸素種が生成し、それにより酸素毒性が発現することが知られている。本研究はこの酸素毒性の本体であるスーパーオキシドを効率よく消去する活性(SOD活性)を持つ新規金属錯体の開発・合成を行い、それらの医薬品への応用の基礎を固めることを目的としている。本研究の特徴として金属錯体化学の素反応の解析に基づいたドラッグデザインを行う点、また開発したSOD機能を持つ錯体を実用的医薬品へ応用する点が挙げられる。

平成6年度までに20数種の新規配位子を合成し、それらに対応する金属錯体を調製し、SOD活性を測定した。その結果、構造と活性の相関が得られた。平成7年度は実用的応用を考え、より簡便なSOD活性測定法として96穴のマイクロプレートリーダーを用いる方法を開発した。本方法は細胞内にスーパーオキシドを発生させ、その毒性を軽減する活性としてSOD活性を測るもので96穴プレートを使うことにより23種の化合物のCombinationとして検索することも可能となった。その結果、Fe-TPEN+VitaminEの組合せによりスーパーオキシド毒を完全に消去することができた。本研究は酸素毒性の本体であるスーパーオキシドを効率よく消去する活性(SOD活性)を持つ新規金属錯体の開発・合成を行い,それらを医薬品へ応用することを目的としている.スーパーオキシドをはじめとする活性酸素種が,炎症・老化・虚血再還流障害・発癌等様々な疾病と関連していることが明らかにされてきており,SOD酵素そのものを医薬品として応用する試みもなされているが,(1)タンパクであるため細胞膜を通過できない,(2)血中半減期が短い,(3)抗体産生能を有する,などの欠点があり実用化には至っていない.そしてこれらの欠点を克服したSOD様の活性を持った低分子化合物の開発が望まれていた.本研究では世界で初めてSOD活性を有する化合物(Fe-TPENおよびその誘導体)の開発に成功し,その有用性をパラコート毒性の防御効果で評価し,ビタミンCとの併用によりパラコート毒性を完全に抑制出来ることは明らかにした.今年度が最終年度であるが,今年度の成果を以下に示す.・SOD活性発現には置換活性錯体であることが重要.・錯体の酸化還元電位とSOD活性との間には負の相関がある.すなわち,酸化還元電位が低くなると活性が上昇し,酸化還元電位が高くなると活性が低下する.・鉄に配位しているメチル基は立体的影響よりむしろ電子的影響によりSOD活性を変化させるが,酸素に対する安定化については立体的効果が大きく作用している.これらの知見はこれらのSOD類を医薬品に応用する際に重要であり,得られたデータに基づいて動物実験にはいることが可能となった.
中国における企業立地環境の変化と立地調整に関する研究

近年の中国における賃金水準の上昇により、同国に進出した外資系企業や地場企業を取り巻く立地条件がどのように変化したのかという点や、それにともなう企業の立地動向の変容について、いくつかの代表的な企業や地域を事例として実証的な分析を行った。結論として、対象企業の中には撤退や移転、業務内容を変更したもの等も見られたが、日系企業では、管理職人材を現地化すること等でコスト削減と売上拡大を図っている企業もあった。また中国資本の民営自動車メーカーでは、高付加価値な高級車の開発・生産に乗り出し、産業高度化に取り組む企業もあったものの、現状では十分な成果を上げてはいないため今後の動向を検討する必要がある。本研究では、中国都市における立地環境の変化や立地調整の実態を把握するために、製造業におけるいくつかの代表的な企業を取り上げ、その製造部門とオフィス部門を対象とした調査を行ってきた。研究計画の時点で行う予定であった、遼寧省大連市における日本語コールセンターに関する調査結果については、同市にはHP(ヒューレット・パッカード)社を始め、相当数の企業が日本語コールセンターを設立していたものの、人件費や地価の高騰にともなうコスト上昇により、現地の優秀な日本語人材を確保できなくなったことで、日本国内に回帰している状況がみられた。この研究成果は、査読付学会誌に投稿・掲載することができた。次に、製造業企業の生産部門を対象とした立地環境変化への対応と研究開発能力や生産技術の高度化に関する調査としては、調査対象の代表性を考慮しながら以下の4つの業種に属する企業を対象に調査・考察を行った。1つ目の事例として、中国北部で有数の国有製鉄業企業である東北特殊鋼を事例として、同社の人員調整や工場・販売部門の立地再編に関する調査を行った。その結果は研究代表者が共編者となった著書の中で発表した。2つ目として、スウェーデンのボルボ社を買収したことでも有名な中国最大の民営自動車企業である吉利汽車を取り上げ、立地環境変化への対応として、同社の高級車開発・生産戦略とそれにともなう部品の調達先や調達方法の変化について調査を行った。その結果も査読付学会誌にて公表することができた。さらに本年度は、電器産業で最も早期に中国に進出した日系企業であるパナソニック社を対象として研究開発部門の現地化に関する調査を行ったほか、ソフトウェアの受託開発で中国最大手の企業であるニューソフト社(東軟集団)を対象として、ソフトウェア開発技術の水準と生産管理のあり方を調査した。これらの内容は今後、発表していく予定である。中国における企業の立地条件の変化にともなう立地調整のあり方を検討するための一連の調査の一つとして、近年、電機・電子部品産業における生産・部品調達における「垂直分割」化に注目した検討が必要になってくる。このような「垂直分割」化の進展にともない、海外に進出した電機・電子部品メーカーでは、海外企業との部品の取引が増加していくとともに、それに対応して、現地法人の責任者や管理職に現地人材が増加していく可能性がある。そこで本年度は、日系電機・電子部品メーカーA社の中間材を扱う上海における3つの販売部門を取り上げ、製品特性の違いにより取引先企業の本社所在地別構成や人材現地化の程度にどのような差異があるのか等について調査を行い、その結果を学術雑誌に投稿した。結論として3つの総括部のうち、中国企業向けの販売比率が最も高い第1総括部では、管理職等への中国人人材の登用が進んでおり、現地法人からの提案を受ける形で中国市場の需要に合わせた製品の開発・販売も行われていたが、それが低い第2総括部と第3総括部ではこのような傾向はみられなかった。特に第3総括部では、垂直統合型の製品を販売しているため、グループ企業等の日系企業への販売が多く、中国人人材の管理職への登用はあまり進んでいなかった。同社では今後いっそう人材の現地化を進めていく必要性が認識されていた。その一方で同社は、日本本社が取引に関する決定権を持ち続けながら、本社の現地法人への支援機能を強化する方針も採っていたことが明らかになった。以上の研究結果は、助成対象が所属する分野の中では、国内屈指の会員数を有する日本地理学会の学会誌『地理学評論』に掲載が認められる等の成果がみられた。本年度は,研究計画の提出の際に挙げた5つの調査の中でも,中国自動車産業の発展にともなう発注方式とサプライヤー分布の変容についての調査・研究を行い,その内容を,当該分野における全国的な査読付き学術雑誌に投稿・掲載させることに重点をおいて研究を行った.具体的には,中国の自動車メーカーにおける部品の発注方式の変化について明らかにした上で,このような変化がサプライヤーの選択や分布にどのような影響を与えたのかという点について検討した.調査対象として大手民営メーカーである吉利汽車の低価格車と中高級車を事例として分析を行った.研究結果は以下のようになった.中国メーカーの発注方式は,サプライヤー間の競争を促し,調達コストを下げるために複数のサプライヤーから調達する複社発注が一般的であった.

これに対して吉利では,近年,開発・生産を始めた中高級車の場合,外資系(特に日系)完成車メーカーと同様に,各部品に対して1つのサプライヤーから部品を調達する一社発注を行う例が増加している.加えて,高い技術力を持つ大手サプライヤーから一次部品に近いものを一括発注する例が増えており,品質が向上した反面,調達コストは上昇している.サプライヤー分布を見ると,特に高付加価値部品については,省内の中小サプライヤーからの調達は減少し,長江デルタ内外にある外資系等の大手サプライヤーから調達するようになっており,サプライヤーの分布は広域化していることが明らかになった.また,この研究以外にも,中国大連市に進出した日本語コールセンターの存続状況に関する研究と大手国有企業である東北特殊鋼有限公司の事業再編に関する調査と論文の執筆を行った.4年間の研究プロジェクトの仕上げとして、当初の研究計画書にて、中国における企業立地環境の変化についての5つ目の調査として挙げていた、中国の産学連携企業の発展状況に関する事例調査の内容を査読付学術雑誌に投稿し、掲載にこぎ着けることができた。具体的には、中国東北地方の瀋陽市に本社を持つ東軟集団を事例として、同社が、大学発ベンチャー企業が抱えがちな諸課題を克服し、ソフトウェア受託開発・ITソリューションの分野では中国有数の企業にまで成長した背景について検討した。その論文の内容は以下の通りである。同社の特徴として、大学発企業でありながら、技術力以外の側面,すなわち顧客サービスや営業・販売戦略を重視する経営理念を採っているという点や,起業当初から取引先である外資系企業等からも多くの出資を受け、資金を確保することができた点が挙げられる。加えて大学が持つ教育機関としての側面を活かし、従業員への教育・トレーニング制度が充実している点をアピールすることで、中国東北地方の大学を卒業した新卒IT人材を比較的安い賃金で採用することにも成功している。同社の事例からは、経済発展の速度が比較的遅れているとされてきた東北地方の都市において、大学発ベンチャー企業を創出・育成していくためには、技術開発に特化した企業を目指すだけでなく、大学発企業が有する教育機関としての強みをより活かす方向での発展戦略を採ることも有効である点が示唆された。この他にも、近年の企業立地環境の変化と新卒大学生の就職活動との関連について、山東省済南市にて行った調査結果や、日系企業で現地採用者として働く日本人若者に関する調査結果を論文にまとめ、学会誌等に掲載される見込みとなっており、多くの研究成果が得られた。人文地理学4年間の研究期間のうち、2年間を修了した時点で、当初の研究計画に挙げた5つの調査のうち3つが完了し、既に学術雑誌などに公表している。これらの論文・著作のうち2編は、当該分野の中では知名度がある査読付の学術雑誌であり、他の1編は、研究代表者が共編者を務めた著書の1章として公表された。これらの研究成果は、数的にも、また掲載雑誌の知名度から判断しても、研究代表者が過去に獲得した研究助成金の研究成果を上回るものである。学界等でも比較的高い評価を受けているのを聞くことが多い。
核融合炉ブランケット工学の総合的研究

本年度は核融合特別研究最終年度であり、ブランケット工学における過去10年間の研究成果をとりまとめ、次段階の起点を設定するため、本班以外の2つの計画研究と協力して集中的なレビュウーを進めた。実施にあたり本総括班では構造・熱サブ班、トリチウム・中性子工学サブ班を置き、各々宮と椙山が世話役を勤めた。さらに具体的作業では、炉・ブランケット構造(宮)、高負荷除熱(井上)、トリチウム(高橋)、核融合中性子(椙山)の4小グループとしての作業も多かった。これらの成果は、平成2年1月30日2月1日に開催された総合総括班主催第3回核融合特別研究成果報告会(昭和61平成元年度)において、口頭発表で上記4名による総合的報告が、またポスター・セッションにおいては、30件近い各分担者による発表がなされた。また同種の性格を持つ総合総括班事業の“核融合実験と放射線計測ワーク・ショップ"主管班として、その実施にあたった。
米国国立公園局の核兵器ツーリズムにみる原子力政策の変質と公教育のための博物館展示

(1)本研究の調査の対象となる非営利団体、ATOMIC HERITAGE FOUNDATION(原子遺産財団)への聞き取り調査を実際した。米国、ワシントンDCに拠点を置く原子遺産財団の代表者とスタッフに会い、今後、本格的に米国内の3カ所でフィールドリサーチを実施する際に大変重要となる人的ネットワーク構築に協力を得ることができた。(2)原子遺産財団が発刊しているガイドブックを参考にしながら、ニューヨークを拠点とするマンハッタン計画に関連した施設を訪れ、現在の状況を検証した。何らかの「説明文」がこれらの場所に残されているか否かを確認し、歴史的現場の保存とツーリズムの関係を探った。(3)ワシントンDCの国立建造物博物館で開催されていた「建築とマンハッタン計画」特別展示を視察し、資料収集を行った。展示で使用されているビデオは上記の原子遺産財団が作成していることから、特別展示開催時に至るまでの経緯を原子遺産財団関係者に聞き取り調査をした。(4)広島原爆投下の描写をリアルに表現するために広島平和記念資料館東館ではデジタル技術を駆使したホワイトパノラマが展示に使用されている。このホワイトパノラマの他にも館内ではデジタル技術が活用されていることに焦点をあて、今後の展示がどのように歴史観の形成に影響するのかを検証した。成果の一部は英論文を(レフリーつき)国際的学術専門雑誌Museum International「デジタル時代の博物館」特集号、2018年12月に発刊した。広島平和記念資料館の本館は2019年4月末に開館する予定のため、2019年度に調査することとした。おおむね順調に進展しているが、当初予定していたオークリッジ(テネシー州)での視察は次年度にすることとした。理由以下の通りである。1)オークリッジのマンハッタン計画に関する展示を行っている「アメリカ科学エネルギー博物館」の移転が2018年度に入ってから発表され、半年は閉館となることが決まった。そのため、「アメリカ科学エネルギー博物館」はマンハッタン計画に関する常設展示がどのようにリニューアルプロジェクトの進捗状況を報道する地元メディアより情報を収集することとした。2)オークリッジは他の2カ所のマンハッタン計画国立公園(ロスアラモス、ハンフォード)と違い、米国市民でなければ米国国立公園局実施のフィールドツアーに参加できない状況が続いている。2019年度の海外調査は夏と春の二回にわけて実施する。夏はロスアラモス(ニューメキシコ州)とオークリッジ(テネシー州)の二か所を、3月初旬はハンフォード(ワシントン州)を重点的に調査し、原子爆弾製造に関連した公教育とツーリズムの接点を体系的に捉えていく。それぞれのフィールドで調査対象となる公共施設などは以下の通りである。ロスアラモス:(1)ブラッドベリー科学博物館と近隣のロスアラモス歴史博物館を示視察・資料収集し、コンタクトパーソンへの聞き取り調査を実施する。(2)ウォーキングツアー「核の時代へ」に参加し、町の歴史がどのように語られているかを調査する。(3)米国立公園局が運営しているロスアラモス市内の施設ヴィジターコンタクトセンターの視察・資料収集を実施する。オークリッジ:(1)米国立公園局ヴィジターセンターの展示視察(マンハッタン計画と冷戦時代関連)(2)オークリッジこども博物館(マンハッタン計画の伴う家屋が保存されている)、(3)アメリカ科学エネルギー博物館(AMESE)内のリニューアル後のマンハッタン計画常設展示、(4)マンハッタン計画に携わったオークリッジの関係者を称える「秘密の都市記念散策公園」内にある記念碑の視察。ワシントン州ハンフォード:(1)マンハッタン計画と地元の歴史を語るREACH博物館を視察・資料収集を実施する。(2)REACH博物館が教育関係者に推奨している小・中・高校生向けに提供しているフィールドトリップについての調査を実施する。また本研究の調査対象となっているワシントンDCに拠点をおく原子遺産財団への聞き取り調査を引き続き実施していく。(1)本研究の初年度となる平成29年度は、調査の対象となる非営利団体Atomic Heritage Foundation(米国ワシントンDC本部), Los Alamos Historical Society(米国ニューメキシコ州)、米国国立公園局(米国ワシントンDC本部)の関係者と連絡をとり、定期的に最新情報を入手するように努めた。また、これらの団体とは今後の現地調査が円滑に実施できるように本研究の理解と協力を求めて信頼関係作りを積極的に行った。(2)広島・長崎の原爆投下に繋がった「マンハッタン計画」は、原爆製造に関連する三つの施設を国立公園として保存することが2015年オバマ政権時代の議会で決定した。本研究開始年度に政権交代があったものの、米国国立公園局がまとめた「マンハッタン計画基本文書」(2017年発刊)を読む限り、記載事項の目立った変更はみられなかった。(3)本研究は、最終的に日米両国民が共有可能な原爆展示の条件を導き出すことにあるため、本年4月にリニューアルオープンした広島平和記念資料館(東館)の展示の分析も行う必要があった。リニューアル前と比べて、どう何が変わったのかを調査するとともに、広島平和記念資料館の今日まで開催されている展示検討会議の資料分析を行った。(4)本研究の成果の一部は夏に国際学会(ラドバウト大学、オランダ)で発表を行い、また歴史的事件の保存事業に関しての論考を『歴史を社会に活かす』(東京大学出版会2017年発刊)の中にまとめて発表した。本年度は本研究を開始する初年度にあたるが、夏に実施する予定であった米国ロスアラモスでの海外調査を次年度まで延期することとした。主な理由は次のとおりである。

(1)ロスアラモス歴史協会の関係者が当該年度に来日する可能性があることを受けて、研究代表者は広島とロスアラモスの関係者の今後の人的交流の経緯を見守る必要があると判断したためである。(2)分析対象となっていた「マンハッタン計画、基本文書」は2017年度中に米国国立公園局より発刊されることになっていたが、完全版が入手可能になったのは年末になったためでる。また追加調査として本研究と関係が深い、広島平和記念資料館の東館がリニューアルプロジェクトを終えて開館したため、展示デザインを担った主要な関係者にも聞き取り調査をする必要がでてきた。(1)本研究の調査の対象となる非営利団体、ATOMIC HERITAGE FOUNDATION(原子遺産財団)への聞き取り調査を実際した。米国、ワシントンDCに拠点を置く原子遺産財団の代表者とスタッフに会い、今後、本格的に米国内の3カ所でフィールドリサーチを実施する際に大変重要となる人的ネットワーク構築に協力を得ることができた。(2)原子遺産財団が発刊しているガイドブックを参考にしながら、ニューヨークを拠点とするマンハッタン計画に関連した施設を訪れ、現在の状況を検証した。何らかの「説明文」がこれらの場所に残されているか否かを確認し、歴史的現場の保存とツーリズムの関係を探った。(3)ワシントンDCの国立建造物博物館で開催されていた「建築とマンハッタン計画」特別展示を視察し、資料収集を行った。展示で使用されているビデオは上記の原子遺産財団が作成していることから、特別展示開催時に至るまでの経緯を原子遺産財団関係者に聞き取り調査をした。(4)広島原爆投下の描写をリアルに表現するために広島平和記念資料館東館ではデジタル技術を駆使したホワイトパノラマが展示に使用されている。このホワイトパノラマの他にも館内ではデジタル技術が活用されていることに焦点をあて、今後の展示がどのように歴史観の形成に影響するのかを検証した。成果の一部は英論文を(レフリーつき)国際的学術専門雑誌Museum International「デジタル時代の博物館」特集号、2018年12月に発刊した。広島平和記念資料館の本館は2019年4月末に開館する予定のため、2019年度に調査することとした。おおむね順調に進展しているが、当初予定していたオークリッジ(テネシー州)での視察は次年度にすることとした。理由以下の通りである。1)オークリッジのマンハッタン計画に関する展示を行っている「アメリカ科学エネルギー博物館」の移転が2018年度に入ってから発表され、半年は閉館となることが決まった。そのため、「アメリカ科学エネルギー博物館」はマンハッタン計画に関する常設展示がどのようにリニューアルプロジェクトの進捗状況を報道する地元メディアより情報を収集することとした。2)オークリッジは他の2カ所のマンハッタン計画国立公園(ロスアラモス、ハンフォード)と違い、米国市民でなければ米国国立公園局実施のフィールドツアーに参加できない状況が続いている。
対話モデルとしての質問返答システムの研究

本研究の目的は、具体的に会話において疑問文・質問がどのように機能しているかを明らかにすることである。発話行為理論の最近の研究では、質問と返答を対をなすものとして発話の最小単位とする考え方が見られる。本来、別々の話者の発話である質問と返答を一対のものとして扱うことができるのは、「対話」という概念を導入したためである。質問は、情報の提供を求める依頼の一種とみなすことができ、質問者は必要な情報に応じて質問の形式を決定する。決定疑問文の選択肢は肯定と否定の二つであり、補足疑問文の選択肢は可能な答えの集合である。実際のコミュニケーションにおける質問にはしかし、このような疑問文の特徴が必ずしも現れてはこない。その発話が質問であることを示すには、音声信号やパラ言語学的信号である場合が少なくない。また、疑問分が質問以外の用途に用いられることや、質問にたいする扁桃が疑問文の形をとっていることさえある。分析資料は、1994年に収録した会話資料である。札幌在住のドイツ語の話者5名による座談会であって、約90分にわたって、日本での生活や将来のことなどを話題にしている。フライブルク・コーパスは、この座談会資料に比べて、情報の詳細さにおいて劣るので、今回は参考資料としたが、後日、量的分析の際にさらに活用する予定である。irgent so, oder so, glaub ich等の表現を、G.レイコフ「ヘッジ」と名付け、その、ものごとを曖昧にする性質に注目したが、質問にヘッドが用いられると、情報提供の要請という質問本来の目的が曖昧化され、一見質問としての目的を達成できないかのように思われるが、この曖昧化によって返答を要求されている聞き手は、心理的により大きな自由が与えられることとなり、このようにして行われる返答は、質問者の意図に添う結果となる。座談会資料全般にわたる分析を今後も続ける予定である。1.質問と返答からなる対話が、どのような条件下でどのような機能を果たしているかを、フライブルク・コーパスを中心とするテクスト・データベースから得た資料に基づいて明らかにすることが本研究の目的であるが、平成6年度は研究の初年度にあたり、データベース検索のための機器の納入が年度半ばになることが予想されたために、データベース検索に先立ち、ドイツ語話者5人による座談会の録音とそれに基づく談話資料の作成をおこなった。その一部を分析した結果は「談話を構成する要素-話者交替とあいづち-」(『好村冨士彦教授退官記念論集』)にまとめてある。2.9月上旬に大阪で開かれた研究会において、ウユルツブルグ大学のシュウイタラ教授およびマンハイムのドイツ語研究所のカイム研究員と談話分析研究の様々な側面についての意見交換をおこなう機会があった。データ採取の方法、分析目的に応じて記述において留意すべき点、文脈の策定と形式化に伴う問題点、今後の研究において参考となる資料提供者などについて様々な有益な助言を得た。3.本来の目的であるデータベースの検索、およびそこから得た談話資料の分析を現在おこなっているが、その際に、1.であげた生の談話資料の分析経験が大いに役立っている。また、フライブルク・コーパスの一部については音声資料も入手できたので、文字資料に併せて活用している。複数の異なった種類のデータに基づく分析によって、より精密な結果を得ることができることとなったが、このことは同時に分析に要する時間の増大をももたらし、今後の課題となっている。質問と返答から成る対話が、どのような文脈においてどのように機能しているのかを、実際の会話資料について明らかにすることが本研究の目的であった。

質問者の知識の空白を埋めるために用いられる典型的な言語形式としての疑問文が、現実の会話においてどのように用いられているのか、また、疑問文が質問のために使用されないときには、どのようなコミュニケーション機能をになっているのか等を、具体的な会話資料の分析を通じて調査した。使用したのは、昨年度収録したドイツ語話者5名による座談会記録およびフライブルク・コーパスである。実際に分析作業を行った結果、録音テープを自分で起こして作成した座談会記録が提供する情報のほうが、コーパスより検索によって得た資料よりも、はるかに豊かであることが判明したので、当面の重点を座談会資料に置くこととし,フライブルク・コーパスのデータは参考資料として適宜参照することとした。座談会資料の問題点は、発話を質問として特定することであったが、この分析の過程でG.レイコフがヘッジと名付けた一連の表現の出現頻度が高いことに気づいた。また、ヘッジが質問と共起する場合には質問の知識の補填という性格が一方では曖昧となり、しかし、他方ではそのことによって質問を受けた聞き手の側の心理的負担が減少するために、かえって自由に情報を提供できる場合がある、というふたつの相反する現象が生ずることに気づいた。この現象については平成7年9月の日本独文学会秋季研究発表会におけるシンポジウム「言語における連続性と離散性」において「疑問表現における連続性と離散性」という発表をおこなった。
個別要素法を用いた鉱石圧の評価技術の構築に関する研究

個別要素法(DEM)と有限要素法(FEM)を用いて鉱石粒子の運動と船体構造の変形を連成させた解析プログラムを開発した。実際の鉱石粒子の挙動はDEMに限界回転モーメントを導入することによって再現することがで,静的鉱石圧はDEMを用いて正確に算出することができることを確認した。動揺下での鉱石圧を正確に評価するためには鉱石の荷崩れ,締め固まりの影響を考慮する必要があり,船体構造の変形が鉱石圧に影響を与えることを確認した。ばら積み貨物船の構造強度を正確に評価するためには,船倉内に作用する鉱石圧の推定精度を向上させ,作用荷重を正確に評価する必要がある。本研究では,個別要素法を用いて鉱石圧を数値計算で精度よく求めようとしている。個別要素法では鉱石を円形にモデル化して,鉱石間の接触,離反等の挙動を追跡する。一般に鉱石は扁平あるが,これを円形でモデル化することは,回転運動が実際の鉱石に比べて生じやすくなり鉱石の重要な物性値である安息角が実際と合わず,鉱石圧の評価精度が低下する。そこで,隣接する粒子との相対位置関係に応じた復元力,限界回転モーメントを導入し,粒子の回転運動を制御し回転運動の精度を向上させた。その結果,個別要素法に限界回転モーメントを導入することにより安息角の操作が可能となり,粒状体の安息角に応じた圧力の計算が可能となった。安息角の計算を実船モデルについて実施し,平均粒子半径(75mm,100mm,150mm)においても実際の安息角が形成されることを確認した。さらに,実船モデルでの静的鉱石圧について検討した。鉱石圧検討のための最適な粒子半径について検討した結果,平均粒子半径を100mmとすることにより底圧,側圧ともに良い分布形状が得られることがわかった。また,船級ルールであるCSRの鉱石圧算定式と比較して妥当な結果であることを示すとともに,現状の鉱石圧算定では考慮していない粒状体特有の挙動をとらえることができることを確認した。そのために、船倉模型を作製し,水圧試験,鉱石載荷試験,繰返し傾斜試験を行い,静的鉱石圧および動的鉱石圧を求め,個別要素法の検証データの取得,鉱石の挙動などについて調べた。1、鉱石載荷試験に用いる船倉模型を作製した。その際,鉱石圧作用下における船体の弾性変形の影響を考慮するために,船倉モデルの寸法と変形の比率を実船の寸法と変形の比率を一致させた。2、実際の鉱石の寸法,摩擦係数,かさ比重および安息角を実験により求めた。これにより個別要素法の解析パラメータを同定することができた。3、船体の変形には有限要素法を用いて,鉱石の挙動は個別要素法を用いて両者を連成させて計算するプログラムの作成を行った。4、水圧試験;鉱石載荷時の鉱石圧との比較を目的として,船倉モデルに水を張りひずみの計測を行った。水圧試験に対応する有限要素法解析を実施し,計算結果と計測結果が一致することを確認した。5、鉱石載荷試験;静的鉱石圧作用時のひずみ計測を目的とし船倉模型に鉱石を充填し,模型の各部に生じるひずみの計測を実施した。実験によって計測されたひずみ計測値から有限要素法解析を介して船倉模型に作用している鉱石圧を推定し,船級ルールを用いて計算される鉱石圧と比較した。実験により推定された静的鉱石圧と船級ルールである鉱石圧算定式と比較して妥当な結果であることを確認した。6、鉱石載荷後の船倉模型を繰返し傾斜させ,船倉模型に生じるひずみの計測,荷崩れや締め固まりによる鉱石圧の変化を調べた。その結果,鉱石特有の荷崩れや締め固まりといった挙動が鉱石圧に大きく影響を与えることを実験によって確認した。前年度に引き続きアクリル製船倉模型に鉱石を積載して模型の各部に生じるひずみ計測を実施した。実験は鉱石載荷時の鉱石圧との比較を目的とした船倉模型に水を注入する水圧試験,鉱石載荷試験,鉱石載荷後の動揺試験を実施した。次に,試験で同定した実際の鉱石の物性値(鉱石の寸法,摩擦係数,かさ密度,安息角)等を用いて,鉱石の挙動,鉱石圧の変化を個別要素法を用いてシミュレーションを行なった。その結果,アクリル製模型では,周辺の温度変化により計測されるひずみ値が変化することが分かり,この影響を考慮してひずみ値を評価する必要があることが分かった。個別要素法では円形粒子モデルを使用しているため粒子が回転しやすく実際の鉱石の挙動を再現することができない。粒子の回転を制御するために個別要素法に限界回転モーメントを導入して計算を行なう。

計算において実験で得られた安息角を再現するための限界回転モーメントの大きさの同定を行なった。個別要素法を適用して鉱石載荷試験のシミュレーションを行ない,これを実験結果と比較し計算手法の妥当性を検証した。実験による鉱石圧推定値は個別要素法の鉱石圧分布とほぼ一致することを確認した。鉱石載荷後の動揺試験のシミュレーションでは,実験による鉱石の挙動を再現することができ,鉱石特有の荷崩れや締め固まり挙動が鉱石圧に大きく影響することがシミュレーションで確認することができた。以上より本研究で構築した個別要素法を適用した鉱石圧の推定手法は実際の鉱石圧を推定する有用なツールとなりうることが確認できた。個別要素法の解析パラメータである鉱石寸法,摩擦係数,かさ比重および安息角を計測することができた。さらに,鉱石特有の荷崩れや締め固まりといった挙動が鉱石圧に大きく影響することを実験的に確認することができ,個別要素法による数値計算検証用データを取得することができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。実験により船倉モデルに生じるひずみを計測したが,このひずみを船倉モデルに作用する鉱石圧に換算する手法の確立が必要である。その方法として,水圧試験で計測されたひずみと鉱石載荷試験で計測されたひずみの比から鉱石圧を求める。または,有限要素法解析を介して鉱石圧を推定する。計測した個別要素法のパラメータを用いて,構築した鉱石の挙動と船倉モデルの弾性変形との連成解析シミュレーションを実施し,計測結果との比較を行い連成解析手法の精度検証を行う。次に,構築した手法を用いて,船体横揺れ時の実船の船倉に働く動的鉱石圧を推定し,船体構造に作用する荷重を評価する。
ミトコンドリア外膜局在因子ＧａｓＺの機能解析によるｐｉＲＮＡの特徴決定機構の解明

本研究は、生殖組織に発現する小分子RNAであるpiRNAの生合成機構の解析である。piRNAは、Piwiタンパク質と複合体を形成し、トランスポゾンを認識して抑制することで生殖組織のゲノムを保護する。piRNAは24-31塩基長であり、5 ́末端塩基が主にウリジンであるという特徴を持つ。この特徴は、piRNAがPiwiと複合体を形成し機能するために重要であるが、その決定機構は不明である。先行研究により、piRNAはミトコンドリア外膜上に局在するエンドヌクレアーゼであるZucchini(Zuc)により切断を受けて産生されるが、Zucによる切断自体には配列特異性がない。申請者のこれまでの研究により、ミトコンドリア外膜タンパク質であるGasZの機能がpiRNAの特徴決定に寄与することが示唆された。そこで本研究では、GasZの分子機能を詳細に解析し、piRNAの特徴を決定する機構を解明することを目的としている。本研究の目的を達成するために、本年度は、1GasZの免疫沈降法による相互作用因子の探索と、2同定した相互作用因子とGasZの相互作用の階層性の解明,3これらの複合体に含まれるRNAの解析を行った。1では、GasZ抗体を用いた免疫沈降を行って相互作用因子を調べた結果、Piwiタンパク質とともにヘリカーゼタンパク質であるArmitage(Armi)も相互作用することが明らかとなった。2では、ArmiはPiwi依存的にミトコンドリア上のGaszと相互作用することが確かめられた。3ではGasZ-Armi-Piwi複合体にpiRNAの前駆体が含まれることがわかった。以上のことから、GasZはミトコンドリア外膜上にてArmi-Piwi-piRNA前駆体をアンカリングすることで、ZucによるpiRNA前駆体の切断を促進していることが明らかとなった。本年度の研究計画では、GasZの相互作用タンパク質の同定と、その詳細な相互作用関係の解明に主眼を置いていた。まず、GasZの免疫沈降法による相互作用因子の探索については、申請までの期間に確立したミトコンドリア分画法を用いて、OSC抽出液のミトコンドリアフラクションからGasZ抗体を用いた免疫沈降を行って相互作用因子を調べ、Piwiタンパク質とともにヘリカーゼタンパク質であるArmitage(Armi)も相互作用することが明らかとなった。Armiの細胞内局在を調べると、コントロールのOSCではあまりミトコンドリア上には観察されないが、Zucをノックダウン(KD)するとミトコンドリア上に蓄積することが明らかとなった。このミトコンドリアへの蓄積はGasz KDにより減少することが明らかとなり、ArmiはGasZ依存的にミトコンドリア上に蓄積することが示唆された。このように、当初想定していなかったYb bodyからミトコンドリアへのpiRNAプロセシング因子が移行する現象を初めて捉えることができた。次にGasZ, Piwi, Armiの相互作用の階層性を解析した。まずGasZ KD下ではPiwiとArmiの相互作用は維持された。この結果より、PiwiとArmiはGasZ非依存的に、相互作用していることが明らかとなった。また、Armi KD条件下においてもGasZはPiwiと相互作用するが、一方、PiwiのKD下ではGasZとArmiの相互作用は見られなくなった。このことより、GasZとArmiの相互作用はPiwi依存的であることが明らかとなった。同様の条件下でArmiの免疫染色を行うと、Armiはミトコンドリアに蓄積しなくなったことから、ArmiはPiwi依存的にミトコンドリア上のGaszと相互作用することがわかった。このように相互作用の詳細まで突き止めることができた。本年度はGasZ, Armi, PiwiがどのようにしてZucによるpiRNA前駆体の切断を制御しているかを解明することに主眼を置く。具体的には以下の実験を行う。【1, GasZのRNA結合能の評価】抗GasZモノクローナル抗体を用いたCLIP法により、GasZに相互作用するRNAを単離し、放射性同位体(RI)標識して検出することで、RNA結合能を評価する。昨年度に大腸菌を用いたGasZ組み換えタンパク質の精製方法を確立しており、上記と平行してGel shift assay法においてもGasZのRNA結合能を評価する。GasZはRNA結合能を有する可能性があるSAMドメインを持つ。GasZのRNA結合能が認められれば、SAMドメイン内の種間で保存性が高い塩基性アミノ酸を置換した変異体を作製し、RNA結合に重要な残基を同定する。この変異体を用いてpiRNA生合成におけるGasZのRNA結合能の重要性を評価する。【2, GasZとその相互作用因子を用いたin vitro反応系の構築】GasZやその相互作用因子がpiRNAの特徴決定においてどのような役割を果たすかを明らかにするため、in vitro反応系の構築を行う。昨年度までに既にGasZだけでなくArmi, Piwi, Zucの組み換えタンパク質の精製方法は確立しているため、今後はこれらを反応させるbufferなどの条件検討を行う。GasZ, Armi, Piwiを様々な組み合わせでpiRNA前駆体と反応させ、そこにZucを加えることで、どのようにpiRNAの前駆体が切断を受けるかを観察する。内在piRNAと同様の切断が見られた場合は、各因子の変異体を作製し、より詳細な分子機構を解明する。