hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
断層破砕帯の酸緩衝効果

その結果、断層破砕岩は母材であるトーナル岩に比べ、Siは平均約-30%,Feは平均約-50%,Mgは平均約-40%,Naは平均-70%低い値を示し,反対にCaは平均約350%,Alは平均約150%高い値を示す岩石であることが明らかとなった。したがって断層破砕岩はSi, Fe, Mg, Naに乏しくCaとAlに著しく富む、トーナル岩とは全く異なる化学組成を持つ岩石に変化していることが明らかとなった。さらに、昨年採取した同集水域内の断層破砕帯流出水の観測を8地点、渓流河川本流6地点、林内雨観測2地点それぞれの断層破砕帯流出水、渓流河川水及び林内雨について、フレーム原子吸光法でNa^+,K^+、ICP発光分光分析法でMg^<2+>,Ca^<2+>,Al^<3+>,SiO_2,PO_4^<3->、イオンクロマトグラフィーでCl^-,NO_2^-,NO_3^-,SO_4^<2->の溶存成分の分析を行った。各々の溶存成分を比較するため、各採水地点でほぼ一定の値を示した溶存Siを使って規格化し検討した。断層破砕帯流出水は、渓流河川水に比べMg^<2+>,Ca^<2+>,Al^<3+>,HCO_3^-がそれぞれ1.52倍高い値を示すことが明らかとなった。以上のことから、CaとAlに著しく富み、物理的にも化学的にも風化の進行が速い断層破砕岩(帯)内部に降水及び表層水が直接または間接的に流入し、各種粘土鉱物との間に酸中和反応を起こしCa^<2+>などの塩基性陽イオンを渓流河川水へ供給しているものと考えられる。尚、以上の研究成果を一部まとめ、論文として現在投稿中である。
ポドサイトにターゲットを絞った腎障害メカニズムの解明と新規治療薬の開発

糸球体足細胞(ポドサイト)は、血液濾過の最終障壁として働き、その障害により蛋白尿が起こり、慢性的に障害が続くと糸球体から脱落し、糸球体は硬化へと導かれて行く。我々は、ポドサイト障害により細胞死(アポトーシス)が起き、糸球体硬化へと導かれることを見つけた。また、ポドサイトアポトーシスを活性型ビタミンDとNotch2活性化抗体が抑制すること見つけ、慢性腎臓病の新規治療法となりえることを報告した。さらに、ポドサイトに特異的に発現する蛋白であるpodocalyxinがIgA腎症患者の尿中に脱落しており、その尿中濃度を測定することで、IgA腎症の活動生を予測できることを報告した。ポドサイトアポトーシスを促進するスリット膜関連蛋白Dendrinを遺伝子配列を使用し、yeast two-hybridscreeningを行い、Dendrinに結合すると考えられる蛋白を同定した。その蛋白とdendrinが蛋白間相互作用があることを免疫沈降法を使用し確認し、さらに、その蛋白がDendrinに結合する事でポドサイトのアポトーシスを減少させることを見いだした。現在以上の結果について論文投稿中である。ADR腎症マウスを使用し、ARBと活性型ビタミンDのconbination therapyが単剤投与に比べ有効である事を見つけ現在投稿準備中である。Small Rho GTPases Rac1のポドサイト特異的ノックアウトマウスを作成し、ADR腎症を誘発した所、蛋白尿・糸球体硬化の悪化を認めた。さらに、培養ポドサイトにconstitutive active Rac1、dominant negative Rac1を遺伝子導入し、Rac1ノックアウトマウスにおいて糸球体硬化増加のメカニズムを解明し、投稿準備中である。ヒト腎生検組織におけるDendrinの発現とその意義の検討について、IgA腎症患者の腎生検組織においてDendrinがポドサイトの核に移行している事、尿中に脱落したポドサイトの核にDendrinが移行している事と、IgA腎症の病勢との関連についてNDTに報告した。また、IgA腎症患者のステロイド治療の判定を予測できるマーカーとして尿中podocalyxin濃度測定が有用であることを見いだし、CJASNへ報告した。ポドサイトアポトーシスを促進するスリット膜関連蛋白/dendrinの遺伝子配列を使用してYeast two-hybridscreeningを行い、dendrinがYes associated protein 2(YAP2)と分子間相互作用があることを発見し、YAP2が核においてdendrinと結合することで、dendrinのアポトーシス促進作用を抑制することを見いだし報告した(J Biol Chem.299:2013)。また、細胞内シグナル分子である、Notch2が、その活性化によりポドサイトのアポトーシスを抑制することを見つけた。さらに、Notch2を活性化するNotch2アゴニスト抗体が、ポドサイトアポトーシスを抑制することで、慢性腎臓病からの慢性腎不全への進展を抑制する新規薬剤と使用できる可能性を見いだした(Nature Commun. 2014)。・ポドサイトのアクチン骨格:Rhofamily GTPasesの一つであるRac1のポドサイト特異的ノックアウトマウスを作製し、アドレアマイシンを静脈注射し、ネフローゼ症候群・糸球体硬化モデルを作製した。現在、蛋白尿・腎組織変化を検討中である。また、同時に培養野生型ポドサイトにconstitutive active Rac1, constitutive negative Rac1の遺伝子を導入しstable cell lineを作製した。今後、これらの細胞のphenotypeを検討する予定である。Synaptopodinに関係ある蛋白については現在、クローニングを行い、Synaptopodinと同時に遺伝子導入したときと、しない時でアクチン骨格の変化・細胞移動について検討中である。・ポドサイトのアポトーシス:ネフローゼ症候群・糸球体硬化モデルであるアドレアマイシン(ADR)腎症マウスに、活性型ビタミンD(OCT)を投与したところ、蛋白尿・糸球体硬化が著明に改善した。さらに、ADR腎症におきるポドサイトアポトーシスがOCTの投与により著明に抑制され、ポドサイト障害による糸球体からの脱落ポドサイト数が著明に減少していることが判明した。以上の結果は、(Am J Nephrol.35.58-68.2011)へ報告した。さらに、ポドサイトアポトーシスを抑制することが知られているアンギオテンシン受容体拮抗薬(ARB)とOCTを同時にADR腎症マウスに投与し、蛋白尿・糸球体硬化に対し相乗効果があるか検討したところ、ARBとOCTを同時に投与した群で蛋白尿・糸球体硬化の改善が認められ相乗効果が確認された。この結果については現在投稿準備中である。提案していた研究計画(1)マウスにおけるネフローゼ症候群・糸球体硬化モデルを使用した糸球体硬化進展機序の解明とポドサイト

障害にターゲットを絞った新規治療薬の探索と開発、(2)small Rho GTPases Rac1のポドサイト特異的KOマウスの作成とその解析、に関してはすでに投稿準備中である。(4)ヒト腎組織におけるdendrinの発現とその意義の検討、に関してはすでに論文化されており、さらに臨床応用できるかどうか検討中である。ADR腎症マウスを使用し、活性型ビタミンDがポドサイトアポトーシス・糸球体硬化の新規治療薬となりえることを見つけ論文投稿することができた。また、Rac1についてもconstitutive activeとneogativeの安定遺伝子導入ポドサイトの作製に成功し、現在そのphenotypeを検討できる状況にある。さらに、尿中podocalyxin濃度測定によりIgA腎症との病態との関係を検討し投稿中である。ポドサイト特異的Rac1 KOマウスをから糸球体をマイクロビーズ法を使用して単離し、ポドサイトのprimary cultureを行ったあと、レンチウイルスを使用してSV40を遺伝子導入し不死化する。Rac1 KOポドサイト、constututive active Rac1ポドサイト、Dominant negative Rac1ポドサイトを使用し、ポドサイトにおけるRac1の役割をさらに解明するためプロテオミクスやマイクロアレイを行う予定である。また、Rac1とポドサイトのアクチン関連蛋白であるSynaptopodinとの関連を、Synaptopodin KOマウスを使用し検討予定である。ヒト腎生検組織におけるdendrinの発現とその意義の検討については、dendrinだけでなくpodocalyxinに関しても尿、腎生検組織で検討し、疾患活動性や治療硬化判定に使用できるか検討中である。当初の計画通り、ポドサイト障害・糸球体硬化に対して活性型ビタミンDだけでなくARBを使用し、ADR腎症マウスを使用し効果を検討する。また、ポドサイト特異的Rac1ノックアウトマウスの検討、Synaptopodinノックアウトマウスのphenotypeを検討する。さらに、ヒト腎生検組織を使用し、尿中dendrin陽性細胞数と腎疾患との関連について検討予定である。ノックアウトマウスの維持、プロテオミクス、マイクロアレイ、細胞培養関連物品、遺伝子導入試薬関連に使用する。マウスの維持費用、分子生物学的手法に用いる試薬の購入費用として使用する。
持続可能な水資源利用のための環境流量設定手法の構築

本研究では,環境流量必要量を月別に算出する全球モデルを構築した.既往の環境流量全球モデルは,流量の大小でしか地域区分できなかったが,本研究では,生物学的生産性の高い場所,あるいは生態系が脆弱な場所を抽出し,こうした場所により多くの環境流量を配分するアルゴリズムを用いている.さらに,本研究で得られた環境流量必要量の妥当性を検証するため,16カ国28地域の現地調査に基づく環境流量必要量,及び3つの既往全球モデルの計算値と比較した.その結果,本研究で提案する環境流量必要量は,現地調査に基づく環境流量基準と最も整合性の高いことを確認した.特に,既往の全球モデルでは過小評価となっていたアジア=モンスーン地域やサバナ地域など,生物多様性が高く年間の流量変動の大きな地域において,現地調査に基づく評価と遜色のない精度を持つことがわかった.加えて,最も多くの環境流量が必要になる月とその季節傾向から全球を5つの型に類型化した.対象地域がどの型に含まれるかを確認することで,水資源開発に際し,河川環境への配慮が特に必要な季節を確認したり,年間の放流規則を検討したりすることが出来るようになった.水資源開発の広域計画や基本検討の際には,対象地域がどの程度の流量減少に耐えられるのか,周辺地域と比べてどの程度保全の優先度が高いのかを比較・判断する情報が必要である.そのため本研究では,モデル計算結果を用いてこれらの判断のための二つの指標を導入した.河川生態系の豊かさを示す指標(生産性指標)と脆弱性を示す指標(脆弱性指標)である.これらを全球で提示した.研究の段階ごとに,国内外の学会,研究会,勉強会に積極的に参加して研究成果を発表するとともに,生態学,土木,水資源,河川管理等関連分野の専門家と議論を行い,モデルの改善や精度向上に努めた.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。A)環境流量研究の網羅的文献分析:2009年以降の環境流量に関する77か国789本の論文を対象に最新の研究成果,研究課題,環境流量設定手法,対象種などを包括的に整理した.B)全球モデルの改良と妥当性の検証:既往の全球モデルでは,年間を通して一定の環境流量基準しか設定できなかった.しかし,魚類の産卵・遡上など河川生物にとって必要となる流量には季節変化があり,灌漑等の人間の水需要も季節により異なるため,環境流量を水資源管理規則に盛り込むためには最低でも月別に推定する必要があると考えた.従って,全球の流量情報から月別に環境流量を設定できるように全球モデルを改良した.さらにモデルで計算された環境流量基準の妥当性に関して十分な検証がなかったことから,世界の様々な気候帯におけるケーススタディの値と計算値を比較しモデルの妥当性を検証した.検証の結果,今回構築したモデルは現地観測に基づき目標設定する手法と比較しても遜色なく十分な精度があることを確認した.C)ローカルモデルの構築と環境流量放流効果の検証:環境流量評価モデルを流域に適用できるようダウンスケールし,日本の小貝川,多摩川を対象に流域の実測値を参照しながらモデル計算結果の挙動の確認やパラメータ設定の検討,感度分析を行いモデル精度向上に取り組んだ.さらに,ローカルモデルを用いて環境流量放流が水質改善にどれほど効果があるのかを評価した.評価に当たっては,将来の人口減少による取水量の減少等の社会的側面も考慮することで現実性の高いシナリオを設定した.D)対外発表:研究の段階ごとに,国内外の学会,研究会,勉強会に積極的に参加して研究成果を発表するとともに,生態学,土木,水資源,河川管理等関連分野の専門家と議論を行い,モデルの改善や精度向上に努めた.また,土木研究所にて講演会を行い,環境流量の現状や重要性を情報発信した.本研究では、河川縦断方向の一貫した流れを考慮し、河川の純一次生産力からその場の河川生態系の質と脆弱性を指標化し,環境流量設定を行うモデル(河川バイオマスモデル流下プロセスモデル)を用いて,全球の環境流量必要量を推定するのが目的である.今年度は,既往のモデルを用いて,人間の水需要などの社会的要因や河川生態系サービスとしての価値を取り込んだ評価を実施する予定であった.しかし,河川バイオマス流下プロセスモデルの妥当性について,生態学や河川の物質循環等の専門家と議論をしたところ,幾つかの課題があることが明らかになった.例えば,一次生産力と流量増減の関係が不明確である点,水生植物から捕食者へのエネルギーの流れが曖昧である点,通年で計算するため季節変動が考慮されない点等である.従って,モデルの改善が急務であると判断し,今年度はモデルの改善と,妥当性の検証に計画よりも多くの時間を割いた.改善後のモデルを検証した結果,環境流量評価に有効となる地域の差異を十分に反映できており,現地観測に基づき目標設定する手法と比較しても遜色なく十分な精度があることを確認した.当初計画であった,社会的要素を取り入れた環境流量評価については,部分的であるが進捗した.多摩川を対象に,水質改善のための環境流量の効果を検証した.評価に当たっては,将来の人口減少による取水量の減少等の社会的側面も考慮した.本研究では,環境流量必要量を月別に算出する全球モデルを構築した.既往の環境流量全球モデルは,流量の大小でしか地域区分できなかったが,本研究では,生物学的生産性の高い場所,あるいは生態系が脆弱な場所を抽出し,こうした場所により多くの環境流量を配分するアルゴリズムを用いている.

さらに,本研究で得られた環境流量必要量の妥当性を検証するため,16カ国28地域の現地調査に基づく環境流量必要量,及び3つの既往全球モデルの計算値と比較した.その結果,本研究で提案する環境流量必要量は,現地調査に基づく環境流量基準と最も整合性の高いことを確認した.特に,既往の全球モデルでは過小評価となっていたアジア=モンスーン地域やサバナ地域など,生物多様性が高く年間の流量変動の大きな地域において,現地調査に基づく評価と遜色のない精度を持つことがわかった.加えて,最も多くの環境流量が必要になる月とその季節傾向から全球を5つの型に類型化した.対象地域がどの型に含まれるかを確認することで,水資源開発に際し,河川環境への配慮が特に必要な季節を確認したり,年間の放流規則を検討したりすることが出来るようになった.水資源開発の広域計画や基本検討の際には,対象地域がどの程度の流量減少に耐えられるのか,周辺地域と比べてどの程度保全の優先度が高いのかを比較・判断する情報が必要である.そのため本研究では,モデル計算結果を用いてこれらの判断のための二つの指標を導入した.河川生態系の豊かさを示す指標(生産性指標)と脆弱性を示す指標(脆弱性指標)である.これらを全球で提示した.研究の段階ごとに,国内外の学会,研究会,勉強会に積極的に参加して研究成果を発表するとともに,生態学,土木,水資源,河川管理等関連分野の専門家と議論を行い,モデルの改善や精度向上に努めた.今年度に実施したモデルの改良及び妥当性の検証により,提案したモデルは環境流量を全球規模で推定するのに十分な精度があることが確認された.モデル構築の目処がついたので,今年度はモデルを用いた評価に移行する.今後はモデルを用いて社会的側面(気候変動や水需要)を考慮した様々なシナリオにおける環境流量必要量を推定する.推定結果を基に,全球の水資源の現状や課題と絡めながら環境流量のあり方を評価する.さらに引き続き積極的な対外発表を行っていく予定である.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
n-butyric acid のラット大腸炎モデルに対する抑制効果の検討

Trinitrobenzen sulufonic acid(TNBS)の注腸投与にて作製したラット大腸炎モデルを用い、食物繊維が腸内細菌叢の発行により生じる短鎖脂肪酸のn-butyric acidを注腸前投与したところ、生理的食塩水を注腸前投与した対照群に比較して潰瘍の面積及び炎症性細胞の浸潤、粘膜下層の肥厚そして出血といった組織病理学的所見に於いて有意な抑制効果を有することが明らかにされた。次にn-butyric acidのTNBS誘発性大腸炎に対する抑制効果の機序を明らかにする目的で、両群の大腸炎組織中に於けるmyeloperoxidase(MPO)activity濃度の比較検討、interleukin-1β(IL-1β)濃度の比較検討をしたところ、n-butyric acid投与群では両者とも対照群に比して有意に低下していた。更にn-butyric acidに傷害物質に対する直接的なバリアーとして重要な粘膜からのmucineの産生を増加させる作用があるかを検討したところ、有意に増加させる効果があることも明らかにされた。以上の研究成果より、食物繊維の発行によって生じるn-butyric acidには大腸炎を予防する効果を有する可能性があることを示した。このことより、日常の食生活において近年急激に増加傾向を示している潰瘍性大腸炎といった特発性大腸炎の増悪再燃予防として食物繊維の積極的な摂取が効果的であることが示唆された。(1)大腸炎の肉眼的検討:粘膜面を写真撮影してNIHイメイジ-グアナライザーを用い潰瘍面積を解析、対照群に比べ有意にn-Butyric acid注腸投与群では潰瘍面積の縮小を認めた(2)大腸炎の病理学的検討:大腸炎の中心的部位より病理標本を作成、HE染色にて炎症性細胞の浸潤の程度、出血の程度、粘膜下層の浮腫の程度をスコアー化総合してdamaging scoreとして算定し両群で比較検討したところ対照群に比べ有意にn-Butyric acid注腸投与群では低下していた3.今後の研究の展開:大腸炎の炎症性パラメイタ-を両群間で比較検討するTrinitrobenzen sulufonic acid(TNBS)の注腸投与にて作製したラット大腸炎モデルを用い、食物繊維が腸内細菌叢の発酵により生じる短鎖脂肪酸のn-butyric acidを注腸前投与したところ、生理的食塩水を注腸前投与した対照群に比較して潰瘍の面積及び炎症性細胞の浸潤、粘膜下層の肥厚そして出血といった組織病理学的所見に於て有意な抑制効果を有することが明らかにされた。以上の研究成果より、食物繊維の発酵によって生じるn-butyric acidには大腸炎を予防する効果を有する可能性があることを示した。このことにより、日常の食生活において近年急激に増加傾向を示している潰瘍性大腸炎といった特発性大腸炎の増悪再燃予防として食物繊維の積極的な摂取が効果的であることが示唆された。
シリコン系光学薄膜からの高効率発光を目指した基礎研究

紫外発光するSi/SiO2多層膜において,Si層とSiO2層との推定膜厚比に対する発光ピーク強度の変化について調べた。結果として,一周期あたりのSi推定膜厚比が0.29の時,紫外発光ピークが最大になることがわかった。更に,微細周期構造の付与による光取り出し効率改善のための基礎検討として,発光材料としてのZnO薄膜をSi基板上に成膜し,その試料の表面に,二光束干渉露光法を駆使してZnOからなる微細周期構造を形成後,その発光特性の変化を調べた。その結果,微細周期構造が有る場合は,無い場合に比べ,観測される発光ピーク強度が約5倍にまで向上することを確認できた。本研究は、高周波スパッタリングで形成したSi/SiO2多層膜から観測される紫外発光強度の増大を目的としている。Si/SiO2多層膜からの紫外発光は、ナノ結晶化していると推測されるSi層(Si-nc)と、Si-ncとSiO2層との界面に存在する境界層が関与し、その発光強度は、Si-ncのサイズによって変化するものと考えられている。Si-ncのサイズは、SiおよびSiO2の堆積量の比で、ある程度制御が可能と思われる。そこで平成26年度は、Si層とSiO2層との推定膜厚の比に対する、紫外発光ピーク強度の変化について初めて詳しく調べた。Si/SiO2多層膜の一周期あたりの推定厚さに対するSi層一層の推定厚さの比をパラメータとし、この比を0.15から0.30の範囲で変えた複数の試料を、高周波マグネトロンスパッタリング装置を用いて作製した。それらをアニール処理後、フォトルミネッセンス(PL)スペクトルを測定し、波長370nm付近の紫外発光ピーク強度を評価した。PLスペクトルの測定には、励起光源としてHe-Cdレーザ(波長325nm)を使用し、モノクロメータ、光電子増倍管、およびロックインアンプを用いた。結果として、Si/SiO2多層膜の一周期に対するSi層の推定膜厚の比が0.29の時、紫外発光ピーク強度が最大になることがわかった。その最大発光強度は、最もピーク強度が低い試料と比較すると、約8倍であった。すなわち、Si/SiO2多層膜から観測される紫外発光ピーク強度が、SiおよびSiO2層の膜厚比により変化することが初めて示された。シリコン(Si)系光学材料を発光デバイスに応用しようとする場合,その光取り出し効率の改善が大きな課題となる。これを解決するための手段として,本研究では,フォトニック結晶(Photonic Crystal,以下PhC)構造の適用を試みた。最近,発光ダイオード(LED)にPhC構造を導入して光取り出し効率を向上させる試みがなされている。LEDからの発光は,空気との境界で全反射される成分が存在するため,これが観測される発光強度の低下につながるが,境界にPhC構造を付与することによって,全反射される成分の一部が回折波として透過するようになり,光取り出し効率を改善させることができる。平成27年度は,基礎検討として,発光材料としてのn型ZnO薄膜(膜厚約1μm)をp型Si基板上にスパッタリング法で成膜し,更にその試料の表面に,二光束干渉露光法を駆使してZnOスパッタ膜からなる一次元周期構造(周期:約1.4μm,深さ:約0.25μm)を形成して発光スペクトルを測定した。一次元周期構造は,広義のPhC構造とみなすことができ,周期構造の有無による発光特性の違いを比較することで,PhC構造の効果を確認することができる。今回は,励起光源としてHe-Cdレーザー(波長325nm)を用いて発光スペクトルを測定したところ,周期構造の有無にかかわらず波長390400nm付近に発光ピークが観測された一方,周期構造が有る場合は,無い場合に比べ,観測される発光ピーク強度が約5倍にまで向上することを確認できた。平成27年度は,発光体の表面にPhC構造を形成し,光取り出し効率が改善される効果を確認することが目標であった。前述の通り,広義のPhC構造である一次元周期構造(周期:約1.4μm,深さ:約0.25μm)の試料への付与により,観測される発光ピーク強度を5倍程度にまで高めることに成功し,PhC構造の効果を確認できたため,本年度の目標はほぼ達成できたものと考えている。これを解決するための手段として,本研究では,フォトニック結晶(Photonic Crystal,以下PhC)構造の適用を試みる。平成28年度は,その基礎検討として,発光材料としてのn型酸化亜鉛(ZnO)薄膜(膜厚約1μm)をp型Si基板上にスパッタリング法で成膜し,更にその試料の表面に,簡便な二光束干渉露光法およびリフトオフ法を組み合わせた独自のプロセス(プラズマエッチング無し)により,ZnOスパッタ膜からなる一次元微細周期構造(周期:約1.4μm)を,深さ約350nmとして初めて形成した。

二光束干渉露光法を用いた微細周期構造作製プロセスにおいて,従来,リフトオフ法の適用は難しいとされていたが,我々は,フォトレジストの厚さや露光条件(露光強度および露光時間),ZnOスパッタ膜の膜厚などを最適化することでこれを実現した。この微細周期構造の効果を確認するため,作製した試料のフォトルミネッセンススペクトルを,励起光源としてHe-Cdレーザー(波長325nm)を用いて測定したところ,微細周期構造の有無にかかわらず波長390400nm付近に発光ピークが観測された一方で,微細周期構造が有る場合は,無い場合に比べ,観測される発光ピーク強度が約6倍にまで向上することを確認できた。紫外発光するSi/SiO2多層膜において,Si層とSiO2層との推定膜厚比に対する発光ピーク強度の変化について調べた。結果として,一周期あたりのSi推定膜厚比が0.29の時,紫外発光ピークが最大になることがわかった。更に,微細周期構造の付与による光取り出し効率改善のための基礎検討として,発光材料としてのZnO薄膜をSi基板上に成膜し,その試料の表面に,二光束干渉露光法を駆使してZnOからなる微細周期構造を形成後,その発光特性の変化を調べた。その結果,微細周期構造が有る場合は,無い場合に比べ,観測される発光ピーク強度が約5倍にまで向上することを確認できた。平成26年度の計画では、Si/SiO2多層膜のスパッタ成膜条件(主にSi層とSiO2層の膜厚の比率)やアニール条件と発光特性との関連性を詳しく調べ、それらの条件の最適化を行うことを予定していた。それに対し、平成26年度の研究実績は、Si層とSiO2層の膜厚の比率に対する紫外発光ピーク強度の変化を詳しく調べ、そのピーク強度が最大となる比率を絞り込むことに成功した。本研究の目的である、Si/SiO2多層膜の発光強度向上へのステップは、着実に進展しているものと考えている。PhC構造の格子定数(周期)及び凹凸深さと光取り出し効率との関連性を結合波解析法(Coupled Wave Analysis: CWA)を用いて解析する。簡単のためPhCは一次元周期構造として計算を行い,前述の波長390400nmにおいて光取り出し効率が最大になるよう凹凸の周期及び深さを設計する。本研究では,二光束干渉露光法を使用しているため,正弦波に近い形状の一次元周期構造を想定して解析を行う。前述の解析及び設計から周期や凹凸深さを決められた一次元周期構造を試料上に形成し,光の取り出し効率の更なる改善を試みる。周期構造の形成には,平成27年度と同様,二光束干渉露光及び高周波スパッタリングを用いる。所望の周期構造が得られるよう,干渉露光時のフォトレジストの厚さや露光時間を様々に変化させ,作製条件の最適化を行う計画である。光エレクトロニクスSi/SiO2多層膜から観測される発光の更なる向上を目指すためには、その光取り出し効率の改善(主にSi/SiO2多層膜と空気等との界面での反射損失の低減)が重要な課題となる。そのための手段として、今後、Si/SiO2多層膜に対し、フォトニック結晶構造の適用を試みる計画である。まず、フォトニック結晶構造がSi/SiO2多層膜上に形成されているモデルを考え、フォトニック結晶の格子定数および凹凸深さと、光取り出し効率との関連性を、結合波解析法等を用いて解析する。本研究では、簡単のため、フォトニック結晶を一次元周期構造として計算を行い、目的の発光波長において光取り出し効率が最大になるよう、フォトニック結晶の構造を設計する。
リボザイムを活用した微生物代謝制御

本年度はin vitroでのリボザイムの触媒活性を調べ、大腸菌in vivoでリボザイムが効率的に働かない要因を調べた。まず、昨年度構築したリボザイム発現ベクターを用いてin vitro転写によりリボザイムを調整した。その結果、本来の転写産物である260ntの前駆体RNAの他に、ベクター内シス作用リボザイムによって切断された場合に生じる100ntのRNAと、目的のリボザイム本体を含む約160ntのRNAが検出された。従って、反応溶液中のMgCl_2を用いたシス作用によるRNA切断が起きていることを確認した。得られたリボザイムとpurA mRNAとをMg^<2+>存在下で混合し、切断活性を調べた。その結果、purA mRNAの150-164nt領域を認識するリボザイム(R2)が最も高い切断活性を示し、8-22nt領域(R1)と210-224nt領域(R3)を認識するリボザイムでは活性が極めて弱かった。しかし、最も活性の高いR2でも2.5時間の反応で多くの基質purA mRNAが残存しており、切断活性が弱いことが示唆された。リボザイムR1はpurAの二次構造上のステム領域R2とR3はループ領域を認識して切断するが、基質認識部位の二次構造と触媒活性とにおいて相関は認められなかった。リボザイムのin vitro転写では反応溶液中の10mM MgCl_2により30分間の反応で約半分のシス切断が起こったが、原核細胞では転写と同時に翻訳が始まるため、シス作用切断によるリボザイムの生起に引き続く、本来の目的であるトランス作用による切断では時間がかかりすぎると考えられる。従って、シス切断部位が無くトランス作用リボザイムのみを直接発現するリボザイム発現プラスミドを作製することが適切だと考えられた。本研究では微生物用に新規なリボザイムをデザイン・構築し、これを代謝工学へ活用することにより、新たな微生物育種法を開発することを目的とする。本年度は、大腸菌のイノシンの大量生産に関与するpurA遺伝子とビフェニル代謝遺伝子(bphC)をターゲットに機能性リボザイムの設計・開発を試みた。1)purA mRNAを標的としたリボザイムの構築。まずリボザイム発現宿主として、染色体上に正常なpurA遺伝子を保有する大腸菌FDRadd::KQ株にIPTG誘導可能なT7polymerase遺伝子を含むDE3を形質導入したFDRadd::KQ(DE3)株を構築した。ついで、標的purA mRNAの立体構造を予測し、purA mRNAのループ構造近傍を選択した。さらに転写時のリボソームとの競合的結合を避けるためリボソーム結合部位を認識するリボザイムを含め3種のリボザイムをデザインした。pUC系高コピーベクター上のIPTGによる誘導発現可能なT7プロモーター下流に3種のデザインしたリボザイムを挿入し、purA遺伝子機能の抑制を試みた。形質転換体をイノシン生産培地で生育させ各種核酸生産量をHPLCにより測定した。その結果、リボザイム導入発現によるイノシン生産量の増加は認められず、3種のリボザイムによるpurA遺伝子の抑制は観察できなかった。2)bphCを標的としたリボザイムの構築。リボザイムは上記の方法にてbphC mRNAの2次構造を考慮して3種デザインし、リボザイム発現ベクターに挿入した。標的bphC遺伝子は、リボザイムとの接触効率を上げるため、リボザイム発現ベクターと同一のベクターに挿入した。宿主はDE3を染色体に保有するBL21株を用いた。bphCを標的とするリボザイム発現菌株では、コントロールに比べ25%程度のbphC活性の低下が認められた。
MEN1遺伝子産物メニンを介する内分泌細胞の増殖調節機構の解明

1.多内分泌腺腫瘍症1型の原因遺伝子MEN1の遺伝子産物メニンが内分泌細胞の増殖調節に関わる機構を解明することを目的として、内分泌細胞におけるメニン結合因子を探索した。インスリン産生膵ランゲルハンス島腫瘍の培養細胞にFlagタグ付加メニンを発現させ、Flag-メニンを安定して発現する細胞株を単離した。この細胞のFlag-メニンを抗Flag抗体で免疫沈降させ、メニンと共沈するタンパクを電気泳動法により同定した。Flag-メニンを発現させた細胞で特異的に共沈するタンパクを質量分析により解析した結果、各種の熱ショックタンパクとともに、数種類のリボソームタンパク群やその他の転写関連因子など、タンパクの転写に関与する因子群が同定された。そのうち、転写開始因子類似タンパクの一つは哺乳動物細胞内two-hybrid法により、弱いながらもメニンとの結合が確認できた。また、免疫組織化学的に解析した結果、細胞内では核の近傍に存在することが明かになった。2.メニン分子がもつGTPase活性に必須なタンパク領域を決定するために、in vitroの転写-翻訳により合成したメニンの酵素活性を測定した。しかし、酵素活性は検出できなかったため、メニンが活性をもつためには翻訳後修飾を必要とする可能性が示唆された。3.多内分泌腺腫瘍症1型の患者に発生した副甲状腺腫瘍の細胞を用いた実験により、メニンがTGF-βによる副甲状腺細胞の増殖抑制作用を仲介している可能性があることを明らかにした。4.種々のアミノ酸置換をもつ変異型メニンの細胞内安定性を免疫ブロット法により解析した結果、疾患の原因となるミスセンス変異は、メニンタンパクの安定性を損なう場合が多いことが明らかになった。1)多内分泌腺腫瘍症1型の原因遺伝子MEN1の遺伝子産物メニンが内分泌細胞の増殖調節に関わる機構を解明することを目的として、内分泌細胞におけるメニン結合因子を探索した。インスリノーマ細胞Rin-m、副腎皮質細胞Y-1、下垂体細胞GH3及び下垂体細胞AtT-20などの内分泌系培養細胞、グリオーマ細胞C6などの非内分泌系培養細胞にFlag Tag付加メニンを発現するpIREShyg3をベースとしたプラスミドを導入した。Flag-メニンを恒常的に発現する細胞株を免疫組織化学的に検出して単離した。このようにして強制発現させたFlag-メニンを、抗Flag抗体で免疫沈降させ、メニンと共沈するタンパクをSDS-PAGEにより解析し、抽出した。Flag-メニンを発現させたRin-m細胞で特異的に共沈するタンパクを質量分析(TOF-MS)の手法を用いて探索した結果、各種のheat shock proteinとともに、数種類の転写開始因子やリボソームタンパク群など、タンパクの転写に関与する因子群が同定された。現在、これらのメニン結合候補タンパクとメニンとの特異的結合を検討中である。2)メニン分子のGTPase活性に必須な領域の決定のために、Puresystem【○!R】によるin vitroの転写-翻訳によるタンパク合成を試み、SDS-PAGE上で合成タンパクを検出した。現在、この合成タンパクのGTPase活性の測定を試みている。1)多内分泌腺腫瘍症1型の原因遺伝子MEN1の遺伝子産物メニンが内分泌細胞の増殖調節に関わる機構を解明することを目的として、ラット膵ランゲルハンス島腫瘍細胞Rin-mにFlagタグ付加メニンを発現するpIREShyg3べ一スのプラスミドを導入し、タグ付きメニン発現細胞を単離した。タグ付きメニンを抗Flag抗体で免疫沈降させ、メニンと共沈するタンパクをSDS-PAGEにより分離・抽出した。これを質量分析により解析することにより、共沈タンパクを同定した。そのうちのひとつは、RIKENcDNAとして登録されているものであることが判明した。このタンパクとメニンの結合を哺乳動物細胞内two-hybrid法により検討した結果、弱いながらも有意な結合が認められた。

抗Flag抗体による免疫組織化学染色により、その細胞内局在を解析すると、核近傍で点状に存在することが判明した。2)メニン分子のGTPase活性に必須の領域を決定するために、Puresystem (R)により合成したメニンのGTP活性の検出を試みたが、活性は認められなかった。本システムで合成したタンパクは生物学的活性をもつために翻訳後修飾を必要とする可能性がある。3)多内分泌腺腫瘍症1型の症例から手術で切除した副甲状腺腫瘍細胞を用いて、腫瘍細胞増殖に対するTGF一βの作用を検討した。この腫瘍細胞では正常メニンが欠損していることがMEN1遺伝子のヘテロ接合性の消失および抗メニン抗体を用いた免疫組織化学染色により示唆された。この腫瘍細胞では、正常副甲状腺細胞に見られるTGF-βによる増殖抑制および副甲状腺ホルモン分泌抑制が認められなかった。以上の結果より、メニンがTGF-βによる増殖抑制作用を仲介していることが示唆された。メニンの機能解析を目的として、平成18年度までの研究で同定したメニン結合候補因子(RIKENcDNA登録タンパク)にFlagタグを付加し、Mycタグ付加メニンを用いて、in vitroで両者の結合を検討したが、結合が確認できなかった。また、Flagタグ付加メニンの欠失変異体を作成し、すでに報告のあるGTPase活性に必須な領域の決定を試みたが、欠失変異型メニンが非常に不安定なため成功しなかった。そこで、メニンの機能喪失型ミスセンス変異体の機能解析を試みた。多内分泌腺腫瘍症1型及びその軽症型である家族性副甲状腺機能亢進症の原因として報告されているgermlineのMEN1変異のうちミスセンス型変異を選び、培養細胞に強制発現させてその安定性を比較した。多内分泌腺腫瘍症1型を来す変異型メニンはすべて不安定で発現量が少なかったが、家族性副甲状腺機能亢進症を来す変異は、比較的安定なものが見られた。このような安定型ミスセンス変異を有するメニンについて、メニンの機能として従来知られているJunDを介する転写抑制作用を検討したところ、軽症型の原因となる安定型メニンはJunDによる転写を抑制したが、野生型よりも若干抑制が弱かった。また、典型的な多内分泌腺腫瘍症1型を来す不安定型ミスセンス変異は、JunDによる転写を全く抑制しなかった。以上の結果より、メニンの機能はタンパクの安定性と密接に関連していることが明らかになった。さらに、メニンの機能が低下するミスセンス変異であっても、必ずしも機能に直接関連したアミノ酸の変化ではなく、タンパクの安定性を損なう変化をもたらすものである可能性が示された。
イオン液体を利用する金属ナノ構造体の精密構造制御

金属ナノ粒子は、粒子サイズや形状・結晶構造に依存して物理化学特性が大きく変化する。そのため、これらを制御することは、高活性触媒、電極触媒など様々な応用を目指す上で極めて重要である。当研究グループではこれまでに、イオン液に対して金属をスパッタ蒸着することにより、安定化剤などを添加することなく、イオン液体中に均一に分散した金属ナノ粒子や合金ナノ粒子を作製することに成功してきた。今年度、本手法を用いて、インジウム、金-銅合金、金-パラジウム合金を作製し、コア-シェル構造・中空構造などの形状制御、加熱処理による結晶構造制御、および組成制御による高活性電極触媒への応用について、それぞれ検討を行った。120°Cで減圧乾燥したイオン液体(BMIm-BF_4)に対して、2.0Paのアルゴン雰囲気下でインジウムをスパッタ蒸着したところ、金属インジウムをコアに、アモルファス酸化インジウムをシェルに持つ、In/In-2O_3コア-シェル構造ナノ粒子を作製することに成功した。この粒子はコアサイズ4.0nm、シェル厚2.0nmのナノ粒子であった。さらに空気中200°C以上で加熱処理することにより、インジウムと酸素の拡散速度の違いにより、粒子内部が中空化した中空In_2O_3ナノ粒子を作製することにも成功した。このように我々が開発したイオン液体へ金属をスパッタ蒸着するナノ粒子合成法は、金属ナノ粒子のみならず、半導体ナノ粒子や構造特異性を有するナノ粒子を作製可能であることを見出した。一方、例えばAuCu合金ナノ粒子を液相で合成した場合、原子が規則的に配列した規則合金化するためには450°C付近まで加熱する必要があったが、減圧アルゴン下で加熱したイオン液体ヘスパッタ蒸着することにより、AuCu規則合金ナノ粒子を150°Cという低温で形成できることを見出した。金属ナノ結晶は、粒子サイズに依存した物理化学特性を示し、光エレクトロニクス材料や(電極)触媒などへの応用が期待されている。当研究グループでは、蒸気圧の極めて低いイオン液体に対して金属をスパッタ蒸着することにより、表面修飾剤の添加なしでイオン液体中に均一に分散した金属ナノ粒子の作製に成功している。本年度、この手法で作製される金属ナノ粒子のより詳細な構造制御、合金ナノ粒子の作製、および電極触媒に向けた基板への固定化法について検討した。105°Cで3時間減圧乾燥したイオン液体(BMI-PF6)に対して、5Paのアルゴン雰囲気下で5分間、銀をスパッタ蒸着した。この時、蒸着電流を10mAから40mAへと増加したところ、得られる銀ナノ粒子の平均粒径5.7nmから11nmへと増加し、イオン液体中のAg原子濃度も、0.26mmol dm^<-3>から1.4mmol dm^<-3>へと増加した。一方、スパッタリング時間のみを長くしたところ、銀粒子の直径は時間によらず一定となり濃度のみが増加した。このように蒸着電流と時間を制御することにより、生成する銀ナノ粒子の粒径と濃度を制御できることがわかった。また、スパッタ蒸着して作製した、銀ナノ粒子によって誘起されるイオン液体中でのガルバニ置換反応を利用して、AuAgナノ粒子を作製することに成功した。この時の合金組成は、イオン液体中の塩化金酸の濃度で自在に制御できることがわかった。さらに、金をスパッタ蒸着したイオン液体(TMPA-TFSA)をグラファイト電極上に滴下したのち150°Cで加熱することにより、グラファイト電極上に金ナノ粒子が緻密に集積化することを見出した。この電極を用いて、酸素飽和KOH水溶液中でサイクリックボルタモグラムを測定したところ、酸素の2電子還元に由来する還元ピークが確認された。また、数サイクル測定した後も電極上の金ナノ粒子の形状や固定状態にほとんど変化はなく、安定な電極触媒として作用することがわかった。

一方、例えばAuCu合金ナノ粒子を液相で合成した場合、原子が規則的に配列した規則合金化するためには450°C付近まで加熱する必要があったが、減圧アルゴン下で加熱したイオン液体ヘスパッタ蒸着することにより、AuCu規則合金ナノ粒子を150°Cという低温で形成できることを見出した。
酸素同位体比測定による南極底層水低塩化過程と淡水循環変動の実態把握

南極海沿岸の四割に及ぶ領域で南極底層水・沿岸陸棚水の特性変化の実態を把握し、あわせて酸素同位体比解析のための資料の収集とそれによる変動原因の考察を行った。南極底層水は全般的に低塩化しつつある。ロス海では特に顕著で、陸棚水の低塩化と関連している可能性があるが、酸素同位体比解析により氷床融解の影響が示唆された。酸素同位体比は底層水の生成源の推定にも有効であった。インド洋区における起源淡水として降雪と陸氷の分析を実施したところ、平均的には両者は十分区別可能で、本手法の有効性が示された。南極大陸沿岸域は、冷たく重い南極底層水の生成域であり、世界中の大洋に底・深層水を供給している。沿岸海洋表層の密度低下は、密度成層の強化を通じて海洋子午面循環の弱化を引き起こし、大気との熱交換に影響を与えて気候変動のトリガーとなりうる。このような気候変動において重要な過程を明らかにするため、極域海洋変動の実態を把握することが急務となっている。南極底層水の生成海域としてはウェッデル海やロス海が知られているが、近年アデリー海岸沖の重要性が注目されてきている。アデリー海岸沖では、これまでの幾つかの観測と2000年代に入って行われた日豪共同観測により、観測資料が蓄積されてきた。注意深く観測点を選択することによりサンプリング地点の相違による誤差を取り除いて解析を行った結果、アデリーランド底層水の長期的な低塩化傾向が明らかになった。低塩化の原因には幾つかの可能性があるが、母海水となる陸棚水の淡水化が考えられる。陸棚水の淡水化は、氷床融解の増加や積雪量の増加、海氷生成の減少などによって引き起こされうるが、その実態は明らかではない。この淡水化要因を特定するために、沿岸水の酸素同位体比のマッピングを開始した。本年度は、2004-05年に南極沿岸の四海域において得た海水サンプルについて酸素同位体比の測定を開始した。このうち、WOCE I9ライン(東経115度)およびロス海東経175度線ラインにおけるサンプルの分析を実施した。全体的に、陸棚水・南極表層水および南極底層水で小さい同位体比が認められた。特に、陸棚水の同位体比は最も小さく、氷床融解の影響を顕著に示している。また、ウェデル海東部において、より広範囲かつ空間分解能の高い同位体比分布を得るために、豪プロジェクトMARGINEX-WESTに参加し、海水サンプルを取得した。このサンプルは日本に持ち帰り次第分析を開始する。南極大陸沿岸は世界で最も重い南極底層水の生成域であり、世界中の大洋に底・深層水を供給している。南極沿岸海洋表層の密度低下は、密度成層の強化を通じて地球規模の海洋子午面循環の弱化を引き起こし、大気との熱交換に影響を与えて気候変動のトリガーとなりうる。このような気候変動においても重要な過程を明らかにするため、南極沿岸海洋変動の実態を把握することが急務となっている。またそうした密度変動を引き起こす上で重要となる淡水循環の変動要因を特定するためには、酸素同位体比を用いた解析が極めて有効である。前年度はデータ解析に基づいてアデリーランド沖における南極底層水の淡水化を明らかにしたが、ロス海において同位体比測定用のサンプルと同時に取得した開洋丸のデータを解析することにより、近年、同海域においても底層水が顕著に低塩化および高温化していることが分かった。この変化に伴う密度変化は、アデリーランド沖における変化をしのぐものであり、地球規模の深層循環に対する影響が考えられる。同位体比測定については、前年度末にウェデル海で取得した約2,500の海水サンプルの日本への輸送が完了し、これについても分析を開始した。また、積雪による淡水化のエンドメンバーを決定するために、南極昭和基地での通年積雪サンプル取得を依頼・実施した。また研究分担者は2006年9月に行われたウェデル海における冬季海氷・海洋観測に参加し、表層海水ならびに積雪・海氷について酸素同位体比の測定を行った。海氷の同位体比は、同位体分別により、母海水+0.1パーミル程度となることが分かった。また積雪の同位体比は-17パーミル程度になることが分かった。これにより、積雪による淡水フラックスのエンドメンバーの見積もりを与えるとともに、低緯度への淡水輸送過程における海氷の同位体比変化についての知見が得られた。南極沿岸海洋表層の密度低下は、成層の強化を通じて地球規模の海洋子午面循環の弱化を引き起こし、大気との熱交換に影響を与えて気候変動のトリガーとなりうる。

このような気候変動への影響から、南極沿岸海洋変動の実態とその原因を把握することが急務となっている。海洋密度変動を引き起こす上で重要となる淡水循環の変動要因を特定するためには、酸素同位体比を用いた解析が極めて有効である。今年度は前年度までに取得した東南極の陸棚上の海水サンプル、海洋上での積雪サンプルなどの分析を行った。また、5つの国内・国際観測計画(東経110度、東経4070度x2、東経140度x2)に参加・観測依頼し、同位体分析用サンプルを取得した。本年度分析を行ったサンプルから、以下のような結果が得られた。季節混合層内の低塩化に寄与する成分には、海氷融解に起因する分と積雪融解に起因する分があるが、酸素同位体比組成から、海氷の融解に起因する成分のみを特定した。この結果、東経30度の観測点数点で、海氷厚は水換算で40cm程度とみつもられた。これは従来この海域で指摘されている値と整合的であり、酸素同位体比を表層内部の塩分分布と併せることでより正確な海氷厚の評価に道を開くものと期待される。また、夏季船上観測中に取得した積雪の同位体比には、-3‰・-13‰・-23‰の3つのクラスターが確認できた。最も軽い同位体比は豪モーソン基地で取得した根雪にみられ、高緯度ほど軽い酸素同位体がみられる従来の描像と整合的であるが、海上での降雪にも10‰を超える変動幅が確認され、海水中の降雪に起因するエンドメンバーの幅の重要な情報が得られると同時に、降雪の起源推定の重要性を示唆する。南極大陸沿岸は南極底層水の生成域であり、世界中の大洋に底・深層水を供給している。南極沿岸海洋の密度低下は地球規模の海洋子午面循環の弱化を引き起こす。密度低下を引き起こす上で鍵となる淡水循環の変動要因を特定するためには、酸素同位体比を用いた解析が有効である。本最終年度は、まとめとして、i)南極底層水の塩分変化の解析と海水資料の酸素同位体比分析による解釈、ii)昭和基地での通年降雪・氷山サンプルの取得と分析を実施し、検討した。i)ウェデル海西部を除く南極海主要部で南極底層水の水塊変化傾向が得られた。ロス海、オーストラリア-南極海盆では低塩化が顕著であった。ロス海高塩陸棚水の水質は塩分0に対して酸素同位体比-36‰方向への変化を示すことから、観測された底層水塩分変化は氷床融解による影響を反映している可能性を示唆する。また酸素同位体比解析から、プリンセスエリザベストラフにおける南極底層水はオーストラリア-南極海盆の底層水と同様の性質をもち、過去に指摘された局在的な底層水形成には否定的な結果が示唆された。ii)2008年3月から12月までの降雪資料は平均して-24‰の値を示すと同時に、顕著な季節変動がみられた。氷山では-46‰程度の値が得られた。前年度までの外洋域での資料と併せ、インド洋区では、降水は-3-33‰、氷山は-32-46‰という値が得られた。こうした値は他海域で過去に報告されている値と整合的であり、本海域でも平均的には両者の効果を区別しうることを明らかにした。本研究で得られたデータが、今後の南極域における気候変動の原因を特定する上でのベースラインとして有効に活用されていくものと期待される。
花粉散布様式から見た虫媒花植物の繁殖戦略と交配システムの再評価

本研究は、植物の多様な繁殖システムをポリネーションの見地から解明することを目的とした。植物の花蜜分布がポリネーターの行動に及ぼす影響を、人工花序を用いた屋内実験により調べた.様々な花蜜分布に対するマルハナバチの花序内移動パタンと滞在時間を詳細に記録して解析した結果、花蜜分配様式は昆虫の行動に強く作用し、その影響は花序形態により変化することが示された。すなわち花蜜分泌様式は、花粉散布戦略であることが示された。野外実験では以下の事柄について調べた。1.花色変化するウコンウツギへのマルハナバチの訪花様式を解析し、花色変化は植物の花粉散布であることを解明した。2.盗蜜型と正当訪花型のマルハナバチがエゾエンゴサクの繁殖成功に及ぼす影響について解析し、花序内性配分様式が個体群間で異なることを見いだした。3.開花時期が自殖率や花粉親多様度に及ぼす影響を高山植物キバナシャクナゲ個体群で調べた。季節的な訪花昆虫の行動の違いは、送粉効率や生産種子の遺伝的多様度に大きく影響することが示された。4.森林性植物で種子生産の制限要因を調べた。春植物は一般に高い結実率を達成しているが、マルハナバチ媒花はハエ媒花植物に比べて結実率の年変動が大きかった。初夏に開花する植物は一般に結実が低く、光資源により結実が制限されていた。林床が暗くなってから開花結実する夏秋咲き植物は一般に結実率が高いが、ハチ媒花植物は花粉制限を受け易かった。光環境に応じた開花フェノロジーグループ毎に共通の結実特性が認められた。5.クローナル植物スズランを対象として繁殖戦略に関わる調査を行った。人工交配実験の結果、同一クローン内の花序間の受粉ではほとんど種子は結実しなかった。また、結実率は近隣にある和合花粉を持つ異なるクローンの花数により大きく左右されていた。クローン成長の程度は、花粉媒介者を誘引する花密度に影響を及ぼし、和合花粉の供給効率や種子繁殖を通じた個体の繁殖成功に影響を及ぼすことが示された。人工的にコントロールされた環境で、植物の花序形態がポリネーターの行動に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした「屋内実験」と、自然状態で植物の開花状況や花蜜分布とポリネーターの行動を観察し、実際の花粉散布量を評価することを目的とした「野外実験」を中心に研究を行った。屋内実験では,エゾオオマルマルハナバチの人工コロニーと閉鎖空間(ビニールハウス)を連結した実験系を作り,蜜量をコントロールした人工花序への訪花行動を定量化した.花序形態としては,総花数を一定にして総状花序・円錐花序・散形花序の3形態を用意し、様々な花蜜分布(一定、ランダム、方向性を持った変化)に対するマルハナバチの花間の移動パタンと滞在時間を詳細に記録した.その結果、花蜜の分配様式が訪花昆虫の行動に及ぼす影響は、花序形態により変化することが示された。野外実験では、花色変化するスイカズラ科ウコンウツギへのマルハナバチの訪花様式とウコンウツギの繁殖成功の関係について解析を行い、花色変化は植物の花粉散布成功と深く関係していることが明らかになった。この成果は、論文として発表した。

また、盗蜜型のマルハナバチと正当訪花型のマルハナバチが、ケマンソウ科エゾエンゴサクの繁殖成功に及ぼす影響について野外調査を行い、成果の一部を論文として公表した。エゾエンゴサクは花序内の性配分様式を個体群間で変異させており、これは個体群に特有のマルハナバチタイプに適応した変異である可能性が示された。さらに、常緑性の多年草イチヤクソウ科8種の混生集団において、各種の開花期間ならびに有効な花粉媒介者と考えられるマルハナバチの訪花行動の観察を行った。8種の開花期のオーバーラップは少なく、連続な開花が認められたことから、種間において訪花昆虫をめぐり時間的ニッチ分化が生じていることが示唆された。人工花序を用いた室内実験(1)では、同一規格の人工花を3種の花序形態(散形花序、円錐花序、総状花序)の花序内蜜分布を変えたセットでマルハナバチに訪花させて、花序の性質が訪花昆虫の訪花行動や送粉成功に及ぼす効果について評価した。花序サイズはマルハナバチの訪問頻度に影響を及ぼさなかったが、大きな花序では訪問あたりの連続訪花数が大きくなった。花序形態は訪花行動に何ら影響を及ぼさなかったが、蜜のない空花を混在させた花序では滞在時間と連続訪花数がともに減少し、送粉効率は向上すると予測された。すなわち、花序内花蜜分布は訪花昆虫の行動に影響を及ぼすことが検証された。また、人工花序を用いた室内実験(2)では、display size(開花数)が訪花昆虫の植物選択に及ぼす影響を調べた。マルハナバチは、大きいdisplay sizeの花序を訪れたときほど、次にも同じ色の花序を選ぶ傾向が観察された。本研究は、display sizeの新たな意義<訪花昆虫の植物選択への影響>を提唱したものと言える。野外調査では、高山環境に生育するキバナシャクナゲを用いて、花粉の散布様式と果実内の花粉親多様性を異なる生育地で比較した。開花時期の早い風衝地では主に越冬直後のマルハナバチ女王に訪花され、訪問頻度は低いが花粉散布距離は大きく、花粉親多様性は低かった。一方で、開花時期の遅い雪田ではマルハナバチのワーカーに訪花され、訪問頻度は高いが花粉散布距離は小さく、花粉親多様性は高かった。開花時期の違いが訪花昆虫の組成に影響し、送粉効率にも影響が及ぶことが実証された。また、イチヤクソウ亜科の植物について訪花昆虫への報酬の違いについて野外調査を行った.イチヤクソウ亜科では訪花昆虫への報酬として、蜜を提供する種と花粉を提供する種が分化している。蜜を分泌する種において開花時期とマルハナバチの訪花頻度ならびに結実率との関係を調査した。エゾコマルハナバチの訪花頻度が最も高く、開花時期はこのマルハナバチの巣の解散時期と一致していた。巣の解散直前に出現する雄と新女王は花粉を必要としないため、蜜を分泌する花だけに訪花するためであることが示唆された。平成15-16年度に行った人工花序を用いた室内実験の結果について、花蜜分布、花序サイズ、花序密度、花色などの諸形質が送粉成功に及ぼす効果について解析を行い、一般化を行った。高山生態系において、開花時期が自殖率や花粉親多様度に及ぼす影響をキバナシャクナゲ個体群で調べた。季節的な訪花昆虫の行動の違いは、送粉効率や生産種子の遺伝的多様度に大きく影響することが明らかとなった。また、開花の時間的変異が花粉散布パタンに大きく作用し、個体群内に空間遺伝構造を作り出すことをエゾコザクラ個体群で見いだした。光有効性が季節的に変動する落葉広葉樹林の林床植物群落で、繁殖成功の制限要因を調べた。