hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
癒し技法としての「手あて」を用いたリラクセーションに関する研究

癒し技法としての「手あて」の効果を生理的・心理的指標を用いて評価した。本報告では、タッチ中のタッチ施行者の生理的反応に焦点を当て、分析結果を述べた。研究成果として、タッチ施行者は、集中してタッチを行っている時にリラックスした状態になっていること、また音楽を聴きながらタッチを行うとリラックスした状態になりやすく、バックグラウンドミュージックとして活用すれば有用であることが示唆された。【目的】本研究は,癒し技法としてのタッチの効果を科学的に評価することを目的としている。【研究方法】研究の趣旨に同意した2030歳代の健康な女性14名に,タッチの施行者と受け手を交互にペアで行ってもらった。実験手順は(1)安静5分,(2)呼吸法5分,(3)タッチの施行5分,(4)タッチの受け手5分とし,持続的に皮膚電気抵抗,手指先温度,心電図を測定した。また(2)(4)の後でPOMSを行った。【結果】今回は皮膚電気抵抗のデータを中心に,欠損値のない12名分を分析した。皮膚電気抵抗値(AC成分)は,安静時より呼吸法時がやや高く,また安静時とタッチ施行時の比較では,先にタッチを受けた群はタッチ施行時がやや高く,先にタッチを施行した群はタッチ施行時がやや低かった。POMSは,先にタッチを受けた群でタッチ施行後の活気得点がやや高かった。【考察】皮膚電気抵抗値(AC成分)の上昇は交感神経系の興奮を示すといわれる。よって今回の結果は,先にタッチを受けた群において交感神経系の興奮がやや大きい傾向にあったと考えられる。またタッチにより手指先温度が上昇するという前回の結果と併せて考えると,皮膚電気抵抗値の上昇は,交感神経系の過度の興奮ではなく,適度な興奮を示すといえる。このことは皮膚電気抵抗値の上昇が,リラクセーション反応の生じやすい呼吸法中にみられていることからも裏付けられると考える。他方,タッチを受けた群の被験者が,その直後に施行したタッチにおいて皮膚電気抵抗値の上昇がみられたことは,やはり交感神経系の適度な興奮の状態にあったのではないかと推測できる。この群の被験者においてタッチ施行後の活気得点がやや高いことを考慮すると,効果的なタッチを行っている状態とは,単に副交感神経系優位の状態ではなく,交感神経系の適度な興奮をともなう状態である可能性があり,この点を追求することが今後の課題である。【目的】本研究は,癒し技法としてのタッチの効果を科学的に評価し,その結果から効果的なタッチの技法を開発することを目的としている。今回はタッチ実施時の条件として,「集中タッチ」と「タッチ+撹乱刺激」の2条件を設定し,タッチ施行者の集中の有無がタッチの効果に影響を与えるかどうかを検討した。【研究方法】研究の趣旨に同意した20歳代の健康な男女16名に,タッチ施行者と受け手を交互にペアで行ってもらった。タッチは研究者の誘導によって行った。タッチ施行者はタッチ受け者の上背部に柔らかく手をあて,相手の呼吸を感じ取りながら手に意識を集中するようにした。実験手順は(1)安静5分,(2)集中タッチ5分,(3)タッチ+撹乱刺激5分,(4)安静5分とした。なお被験者のうち半数は(2)と(3)の順序を入れ替えて行った。タッチの評価は,生理的データとして指先皮膚温と心拍を持続的に測定し,また心理的データとしてPOMSを(2)(4)の後で測定して行った。【結果】各条件における指先皮膚温を比較すると,タッチ施行者では「集中タッチ」の場合の指先皮膚温の平均値が「タッチ+撹乱刺激」の場合と比べて有意(p<.01)な高値を示した。また「集中タッチ」の場合においては指先皮膚温の上昇がみられていた。他方タッチ受け者では,両者の差はわずかだった。同様に心拍変動を比較すると,タッチ施行者では「集中タッチ」の場合のHFが「タッチ+撹乱刺激」の場合と比べて有意(p<.05)に高値であった。タッチ受け者では「集中タッチ」のHFが高かったが,「タッチ+撹乱刺激」の場合と比べて,その差は有意でなかった。以上の結果については,本年度の看護系学会で詳細に報告する予定である。【目的】本研究の目的は,リラクセーション効果をもたらすタッチ技法を開発することであった。今回は集中力を高める音楽を聞きながらタッチを行うことによって、タッチ施行者に生じる反応を検討した。【研究方法】被験者は20歳代の健康な女子学生10名で、無作為に2人組になりタッチ施行者とタッチ受け者を交互に行った。倫理的配慮:研究目的と内容を説明し自由意志で研究に参加してもらった。タッチの方法:タッチ施行者は、研究者の誘導に従って、タッチ受け者の呼吸を感じ取ってから上背部に柔らかく手をあて、手の感覚に意識を集中させた。

実験手順:5分間の安静の後,(1)「音楽を聴きながら行うタッチ」を5分,(2)「音楽のないタッチ」を5分行った。音楽はモーツアルトを使用し、タッチ施行者にヘッドホーンで聴いてもらった。効果測定:タッチ施行者の心拍と指先温度を持続的に測定し、また終了時にタッチ施行中の感じを自由記載してもらった。データ解析:心拍は高周波成分(HF)と低周波成分(LF/HF)を求めた。HF, LF/HF,指先温度は個別に平均値を求めた。これらを「音楽を聴きながら行うタッチ」と「音楽のないタッチ」で比較し,ウィルコクソン符号付き順位和検定で検討した。【結果】HF値は10人中6人が「音楽を聴きながら行うタッチ」の方が「音楽のないタッチ」より高かったが、有意差はなかった。LF/HFと指先温度には差がなかった。自由記載では5人の被験者が、音楽を聴いた方がリラックスしたが、手に意識を集中する感覚は弱かったと報告していた。【考察】HF値が高いこと、指先温度が高いことはリラックスした状態にあることを示す。今回の研究では、音楽がリラックスを促進した可能性はあるが、それがタッチへの集中を高めるには至らなかった。その理由として、ヘッドホーンを使用したため、手の感覚よりも音楽への集中が高まったのではないかと考えられた。
ALOS衛星搭載合成開口レーダのポーラリメトリック較正

従来から様々なポーラリメトリック較正アルゴリズムが研究され、提案されてきた。これらには、それぞれ長所、短所があり、必要に応じて使い分けられてきた。本研究では、2基の基準反射器(偏波保存型反射器、偏波選択型反射器)を使用するアルゴリズムを開発し、シャトル搭載レーダのデータを用いてその妥当性を示した。ALOS衛星搭載合成開口レーダは、Lバンドという比較的低い周波数の電波を使用する。観測時に、その偏波面が電離層内でファラデー回転を起こすが、電離層の状態によっては無視し得ない場合がある。そこで、ファラデー回転の影響を除去する方式についても、新しく提案を行なった。レーダのポーラリメトリック較正には、偏波回転型や偏波選択型の反射器を使用する。新しく考案し、別途開発したretro-directive PARCの詳しい特性測定を実施し、広い角度特性と高い交差偏波識別度を確認した。また、受動型の偏波回転型反射器において、直接散乱波を抑圧する手法を考案し、実験によってその有効性を確かめた。さらに、フィールド実験用の受動型偏波回転型反射器を試作し、レーダ断面積15dBm^2を持つことを実験的に確認した。この他、偏波グリッドを用いた偏波選択型反射器についても研究を進め、2層構造の新しい反射器を考案して、その有効性を実験により示した。H-2ロケットの不具合により、残念ながら研究期間内にALOS衛星が打ち上げられることは無かった。しかし、JAXA/NICTによって実施された航空機搭載合成開口レーダ実験をALOS衛星実験として位置付け、ポーラリメトリック較正実験を行なった。その結果、水平偏波と垂直偏波の差が1dB以内、位相差が10度以内、交差偏波ノイズが-25dB以下と満足すべき結果を得、本アルゴリズムの妥当性、本反射器の妥当性が示された。送受信の偏波が水平、および垂直の4つの組み合わせで観測を行なうポーラリメトリック合成開口レーダ(SAR)を用いることにより、各分解能セルにおけるマイクロ波の散乱特性を完全な形で観測することが出来る。しかし、SARアンテナの偏波伝送特性には歪があるので、その補正が必要であり、これをポーラリメトリック較正という。ポーラリメトリック較正を行なうため、偏波特性が既知である基準ターゲットを使用する。従来、基準ターゲットとしてコーナリフレクタが主に使用されてきたが、ポーラリメトリック較正に適用するためにはSARの特性に仮定を設ける必要があった。しかし、コーナリフレクタで様々な偏波散乱特性を実現することは容易ではなく、また、そのビーム幅は一般に狭い。従って、ターゲットのポインティングには正確性が要求される。これらの問題点を解決するため、本研究においては、レトロディレクティブ特性を有するヴァンアッタアレーに着目し、小型のモデルを試作して基礎的な実験を行なった。実験モデルは2基の4素子のサブアレーからなる8素子ヴァンアッタアレーであり、各素子は反射器付きの2素子八木アンテナである。これらのアンテナの設置方向を変化させることにより、送受信の偏波特性を任意に選ぶことが出来る。ここで、従来から問題であったアンテナ素子自体で散乱される電界成分を抑圧する手法として、2つのサブアレーを互いにλ/4ずらす配置を考案した。様々な偏波の組み合わせについて、基礎的な測定を実施した結果、広い角度範囲において良好な反射特性が得られること、アンテナ素子自体で散乱される電界成分を効果的に抑圧できることが確認された。この結果は、ポーラリメトリック合成開口レーダの較正を行なう際、本方式の反射器が有効であることを示すものである。送受信の偏波が水平、および垂直の4つの組み合わせで観測を行なう

ポーラリメトリック合成開口レーダ(SAR)を用いることにより、各分解能セルにおけるマイクロ波の散乱特性を完全な形で観測することが出来る。しかし、SARアンテナの偏波伝送特性には歪があるので、その補正が必要であり、これをポーラリメトリック較正という。ポーラリメトリック較正を行なうため、偏波特性が既知である基準ターゲットを使用する。従来、基準ターゲットとしてコーナリフレクタが主に使用されてきたが、ポーラリメトリック較正に適用するためにはSARの特性に仮定を設ける必要があった。しかし、コーナリフレクタで様々な偏波散乱特性を実現することは容易ではなく、また、そのビーム幅は一般に狭い。従って、ターゲットのポインティングには正確性が要求される。これらの問題点を解決するため、本研究においては、レトロディレクティブ特性を有するヴァンアッタアレーに着目し、基礎的な実験研究を推進するとともに、別途開発したALOS衛星搭載PALSARの較正に用いるためのシステムについて、その特性測定を実施した。また、衛星実験に備え、同様の機能をもつ航空機搭載型合成開口レーダを用いた予備的な実験を実施した。この実験における基準反射器として、48素子からなるヴァンアッタアレーを試作した。この反射器は偏波変換を行なうとともに、波源を追尾する機能を有しており、また直接散乱波を抑圧する工夫がなされている。この他、衛星実験に備えて、平板型の反射器についての実験的な検討、ポーラリメトリック較正アルゴリズムについての理論的な検討を行なった。合成開口レーダのポーラリメトリック較正は、観測データに含まれるレーダハードウェアに基因するエラーを補正する作業であり、データを正しく使用する上で不可欠のものである。我々は、(自然)ターゲットの反射散乱特性に仮定をおくことが無く、かつ、なるべく少ない数の(人工)ターゲットを使用する方法について検討し、これに必要なターゲットの研究開発を行なってきた。ポーラリメトリック較正アルゴリズムとして、偏波保存型反射器と偏波選択型反射器の二基を用いる方法を提案し、先に実施されたスペースシャトル搭載合成開口レーダ実験で取得されたデータを用いて、その妥当性を示した。さらに、ALOS衛星搭載合成開口レーダはLバンドという比較的低い周波数を使用しているので、電離層による偏波面のファラデー回転が予想される。そこでこの効果をも勘案したアルゴリズムを提案し、数値計算によってその妥当性を確認した。これと並行して、ヴァンアッタアレーの原理を使用した偏波回転型反射器、およびグリッドを使用した偏波選択型反射器の研究を実施した。理論的、実験的な検討の結果、不要な反射成分を除去するための手法として、1/4波長だけ位置をずらせた構造を考案し、偏波回転型、および偏波選択型反射器の何れにおいても、不要反射成分が劇的に抑圧されることが明らかとなった。H-2ロケット打ち上げの延期の影響により、残念ながら研究期間内にALOS衛星は上がらなかった。しかし、JAXA/NICTが共同で開発した航空機搭載合成開口レーダを用いた公募実験において、先に開発したアルゴリズムおよび反射器を実際に使用する機会を得た。
海洋越境汚染物質の海鳥類を用いた生態系への影響評価

海洋生態系の高次消費動物である海鳥類を指標生物として,生態系への蓄積量を定量的に分析し,生物濃縮過程を明らかにすることを目的とした.重金属の蓄積について分析した結果,太平洋側で繁殖する海鳥類は日本海側に比べ水銀蓄積濃度が2ー3倍程高いことがわかった.水銀の生体内の濃縮においては,種内においては,種ごとあるいは個体ごとで保有する腸内細菌の違いが影響することが示唆された.有機塩素化合物の一種である塩素化多環芳香族炭化水素類について分析した.その結果,PAHsの蓄積は生殖器で最も高く,成鳥においてPAHsが蓄積する傾向があった.PAHsの蓄積は外的要因によるものであると考えられた.本研究の目的は,東アジア諸国から排出された様々な汚染物質の影響を海洋生態系における高次消費動物である海鳥類を指標生物として,汚染物質の流入が著しい日本海と流入が少ない太平洋沿岸で繁殖する海鳥を比較し,広域的な汚染物質のモニタリング体制を確立することである。汚染物質の流入が著しいと予想される日本海側で繁殖するオオミズナギドリを「汚染」,汚染物質の流入が少ないと予想される太平洋沿岸で繁殖するウミネコを「非汚染」として,それぞれ死体および糞を採集した。オオミズナギドリの糞から腸内細菌のDNAを抽出し,PCR法により16SrRNA遺伝子のV3ーV4領域(大腸菌の16SrRNA遺伝子で341bpから534bpに相当)を増幅させた。各個体由来のサンプル(増幅遺伝子産物)を変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法(DGGE)により,腸内細菌毎の塩基配列の違いにより遺伝子を分離させた。検出されたバンドの塩基配列を決定するため,各バンドのPCR増幅・精製を行った後,DNAシーケンサーにより塩基配列を決定した。その結果をもとにNCBI BLASTから近縁細菌種の同定を行った。DGGEの泳動結果より,相同性が98.7%以上で種同定に必要な数値を満たしていたバンドは,カモメ類,シギ類の糞中に存在する細菌であったが,汚染物質分解への関与は不明であった。また,既知の塩素系化合物分解する細菌種やそれに類似した細菌も検出されなかった。越境汚染マーカーとして重金属ならびに有機塩素化合物の蓄積量を解析するため,採集した海鳥類より,羽,筋肉,心臓,肝臓,腎臓,脳を採材した。凍結乾燥後,粉末し,有機溶剤で脱脂した。環境残留性が比較的高い芳香族系塩素化合物の分析に先立ち,本年度は前処理条件の検討を行った。その結果GPCカラムを用いることで効率的に夾雑成分を除去できることが明らかとなった。本研究の目的は,東アジア諸国から排出される様々な汚染物質の海洋生態系への影響を高次消費動物である海鳥類を指標生物として,近年,汚染物質の流入が著しいであろう日本海と流入が少ないであろう太平洋沿岸で繁殖する海鳥類の汚染状況を比較し,広域的な汚染物質のモニタリング体制を確立することである。汚染物質の流入が著しいと予想される日本海側に位置する利尻島と天売島および,汚染物質の流入が少ないと予想される太平洋側に位置する蕪島で繁殖する海鳥計21個体について,重金属濃度を蛍光X線分析により分析した。その結果26種類の重金属元素が検出され,有毒性を示す水銀,鉛,亜鉛において,日本海側より太平洋側で有意に高い濃度を示した。しかし,バナジウムは太平洋側より日本海側で濃度が高い傾向にあり,アジア地域の化石燃料燃焼による影響の可能性を示した。オオミズナギドリとウトウの糞から腸内細菌のDNAを抽出し,各個体由来のサンプルを変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法(DGGE)により,遺伝子を細菌種ごとに分離し,検出された各バンドの塩基配列をDNAシーケンサーにより決定した。その結果,オオミズナギドリの腸内細菌にはカモメ類などの糞中からも検出されるLactobacillus属やCatellicoccus属と高い相同性(99100%)を示す細菌が優占化し,ウトウの腸内細菌ではオオミズナギドリとは異なりCampylobacter属と100%の相同性を示す細菌種の存在が示唆され,この他にPCBなどの芳香族系化合物を分解代謝すると報告されているRhodococcus属と高い相同性(98%)を示す細菌が検出された。海鳥における汚染物質の曝露は,各臓器の多環芳香族化合物濃度から評価した。前年度開発した抽出法にて分析した結果,生殖器から最も高濃度で検出され,次いで肺,腎臓の順であった。本研究の目的は,東アジア諸国から排出される様々な汚染物質の流入が著しいであろう日本海と流入が少ないであろう太平洋沿岸で繁殖する海鳥類を越境汚染物質のモニタリング種とし,広域的な汚染物質のモニタリング体制を確立することである。そのため,日本沿岸海域を主な採食場として利用する沿岸性の海鳥類をモニタリング種とした。その結果,重金属については当初の予想に反して,日本海側よりも太平洋側の海鳥について高濃度という結果を得た。特に水銀については,北太平洋の中では日本沿岸で高濃度であることが知られており,黒潮によってアジアから運ばれてくる汚染物質の影響を考慮しなければならないことが明らかとなった。その一方で,バナジウムは太平洋側より日本海側で濃度が高い傾向にあり,アジア諸国の化石燃料燃焼による影響を受けていることも示唆された。バナジウムがアジア地域からの越境汚染マーカーとなる可能性が示された。

汚染物質を特異的に分解する腸内細菌の特定と種同定を同時に行うためにPCR-DGGE法による網羅的な解析により,一般的な海鳥に存在する細菌種(Lactobacillus属やCatellicoccus属)だけでなく,PCBなどの芳香族系化合物を分解代謝することができる細菌(Rhodococcus属)が検出された。これらの菌株が有する遺伝子が特定されたことから,これらの細菌を標的とした定量PCRなどによりオオミズナギドリやウトウの腸内細菌量の変化を経時的に解析することも可能である。また,芳香族系塩素化合物の分析では生体組織によって脂肪などの夾雑物の含量が大きく異なるため,前処理工程の手法を検討した。その結果,効果的に夾雑物を除去する手法の開発ができ,ウミネコを用いた生体試料の分析に着手できた。以上より,各項目の分析はおおむね順調に進んでいるといえる。本研究の目的は,東アジア諸国から排出される様々な汚染物質の海洋生態系への影響を高次消費動物である海鳥類を指標生物として,広域的な汚染物質のモニタリング体制を確立することである。東南アジア海域で越冬するオオミズナギドリについて,伊豆諸島沖で混獲された個体の肝臓および腸内の糞を採集した。取り出した肝臓の水銀濃度を分析した結果,3.249ppm±0.239であった。昨年分析したウミネコ肝臓の水銀濃度(10.7ppm ±6.5)より,低い値を示した。オオミズナギドリの糞(3個体)からDNAを抽出し,PCR法により腸内細菌の16SrRNA遺伝子のV3ーV4領域(大腸菌の16SrRNA遺伝子で341bpから534bpに相当)を増幅させた。このDNAに対して次世代シークエンサー(HiSeq2000)を用いた腸内細菌叢の群集構造解析を行った。その結果,2個体のオオミズナギドリではLactobacillus属やWeissella属といった乳酸菌に相当する塩基配列が半数を占めた。水銀耐性菌の割合はそれぞれ3.48%,12.42%,15.82%であった。肝臓中の水銀濃度は,4.9ppm,2.1ppm,1.4ppmと水銀耐性菌の割合が増えると減少する傾向があった。青森県八戸市蕪島で繁殖するウミネコ(3個体)より,糞とDNAを採集し,同様に腸内細菌叢を分析した。ウミネコからはKlebsiella属というヒトの常在菌やPeptostreptococcus属といった抗生物質耐性菌の配列が存在した。また,水銀耐性菌として報告がされているClostridium属やEnterococcus属の配列が存在し,その割合は42.39%,35.86%,57.18%であった。汚染物質の流入量の違いだけでなく,種ごとあるいは個体ごとで保有する腸内細菌の違いにより,水銀汚染の影響が異なる可能性が示唆された。海洋生態系の高次消費動物である海鳥類を指標生物として,生態系への蓄積量を定量的に分析し,生物濃縮過程を明らかにすることを目的とした.重金属の蓄積について分析した結果,太平洋側で繁殖する海鳥類は日本海側に比べ水銀蓄積濃度が2ー3倍程高いことがわかった.水銀の生体内の濃縮においては,種内においては,種ごとあるいは個体ごとで保有する腸内細菌の違いが影響することが示唆された.有機塩素化合物の一種である塩素化多環芳香族炭化水素類について分析した.その結果,PAHsの蓄積は生殖器で最も高く,成鳥においてPAHsが蓄積する傾向があった.PAHsの蓄積は外的要因によるものであると考えられた.
短波レーダによる沿岸海洋観測の現状と可能性について

海上・海岸設置型レーダとして、HF・VHFおよびXバンドレーダを取り上げ、これらによる沿岸海洋観測の現状と可能性について企画調査を行い、以下のような成果を得た.1.国内外のおける海洋短波レーダを用いた海洋観測の現状調査:土木学会海岸工学委員会研究現況レビュー小委員会での活動実績を踏まえて数回の個別・全体会議を持ち、その成果を土木学会から刊行予定の出版物『海上・海岸設置型レーダによる海洋観測』の第10章「海上・海岸設置型レーダによる海象・気象計測に関する海外の動向」として取りまとめた.2.海洋物理とレーダ技術双方を基礎とした新しい観測・解析技術の確立:HFレーダによる海面からのドップラースペクトルを基に波高分布を導く手法を開発し、その成果を論文として公表するとともに、上述の出版物の第4章「HF・VHFレーダを用いた海洋観測・解析手法」および「船舶用Xバンドレーダを用いた海洋観測・解析手法」として取りまとめた.3.短波レーダによる海洋観測の可能性とこれからの海象観測のあり方:船舶用Xバンドレーダによる広域海浜流速度場の計測やVHF海洋レーダを用いた表層流観測によって潮目挙動の解析が可能となることを実証し、その成果を論文として発表するとともに、上述出版物の第6章「HF・VHFレーダによる観測」、第7章「船舶用Xバンドレーダによる観測」、第11章「海洋レーダの課題、将来展望」として取りまとめた.4.合同観測による各種海洋短波レーダによる特性の把握:三重県紀勢町七里御没海岸のHFレーダサイト(三重県管理)にXバンドレーダを持ち込み、合同観測を行うための準備を進め、各種短波レーダによる観測システムを構築した.これによって、2000年の早い段階での観測とその結果に基づくレーダ特性の把握が可能となった.海上・海岸設置型レーダとして、HF・VHFおよびXバンドレーダを取り上げ、これらによる沿岸海洋観測の現状と可能性について企画調査を行い、以下のような成果を得た.1.国内外のおける海洋短波レーダを用いた海洋観測の現状調査:土木学会海岸工学委員会研究現況レビュー小委員会での活動実績を踏まえて数回の個別・全体会議を持ち、その成果を土木学会から刊行予定の出版物『海上・海岸設置型レーダによる海洋観測』の第10章「海上・海岸設置型レーダによる海象・気象計測に関する海外の動向」として取りまとめた.2.海洋物理とレーダ技術双方を基礎とした新しい観測・解析技術の確立:HFレーダによる海面からのドップラースペクトルを基に波高分布を導く手法を開発し、その成果を論文として公表するとともに、上述の出版物の第4章「HF・VHFレーダを用いた海洋観測・解析手法」および「船舶用Xバンドレーダを用いた海洋観測・解析手法」として取りまとめた.3.短波レーダによる海洋観測の可能性とこれからの海象観測のあり方:船舶用Xバンドレーダによる広域海浜流速度場の計測やVHF海洋レーダを用いた表層流観測によって潮目挙動の解析が可能となることを実証し、その成果を論文として発表するとともに、上述出版物の第6章「HF・VHFレーダによる観測」、第7章「船舶用Xバンドレーダによる観測」、第11章「海洋レーダの課題、将来展望」として取りまとめた.4.合同観測による各種海洋短波レーダによる特性の把握:三重県紀勢町七里御没海岸のHFレーダサイト(三重県管理)にXバンドレーダを持ち込み、合同観測を行うための準備を進め、各種短波レーダによる観測システムを構築した.これによって、2000年の早い段階での観測とその結果に基づくレーダ特性の把握が可能となった.
カーボンナノケージ空間のバイオリアクターへの応用

本研究では、鋳型としてケージ型のメソポーラスシリカKIT-5を用いることにより、入り組んだケージ構造のメソポーラスカーボンが得られる。具体的には、炭素源であるショ糖を鋳型であるシリカ構造に封入し、熱処理による重合化と炭化のプロセスを経て、最終的にフッ化水素酸でシリカ部分を選択的に溶出することによってカーボンナノケージを合成した。カーボンナノケージの詳細構造を高解像度の透過型電子顕微鏡(HRTEM)観察によって検討したところ、高い規則性の孔構造が確かめられた)。窒素吸着・脱着挙動より、平均孔径は5.2nmであり、広い部分のケージ径は15.0nmとなることがわかった。作製条件を変化させ検討し最適化されたカーボンナノケージの比表面積および比孔容積の値は、それぞれ1600m^2g^<-1>および2.10cm^3g^<-1>であり、代表的なメソポーラスカーボンCMK-3の値(比表面積1260m^2g^<-1>および比孔容積1.1cm^3g^<-1>)や合成温度を変えて改質した鋳型を用いて作製したCMK-3の値(比表面積1350m^2g^<-1>および比孔容積1.6cm^3g^<-1>)をはるかに凌ぐことがわかった。カーボンナノケージの機能を探るため、生理活性物質としてカフェイン、カテキン、タンニン酸、および内分泌かく乱物質であるビスフェノールAの吸着挙動を検討した。カーボンナノケージの優れた吸着特性はタンニン酸の吸着において明白であり、より低い濃度で多段階吸着が起こり、最終的にCMK-3の約5倍、活性炭の約10倍の吸着容量が得られた。ケージ型の余裕のあるナノ空間内ではタンニン酸などのπ共役系分子のスタッキングなどによる多層吸着が促進されているものと予想される。カテキンやビスフェノールAに対しても、カーボンナノケージは優れた吸着能を示した。
領野間情報伝達を担う投射先選択的な神経細胞間の同期発火

本研究計画は、視覚関連脳領域間の情報伝達における同期発火の機能的な役割と神経基盤および発達機構を明らかにすることを目的とする。これまでに、一次視覚野(V1)神経細胞の同期活動が、生後の視覚経験に依存して発達することを見出した(Ishikawa et al., 2018)。多チャンネル記録法によりV1の複数の神経細胞活動を同時記録したところ, 2-4層の細胞は、生後の形態視環境下でのみ類似した視覚反応性をもつ細胞間で同期発火を発達し、5-6層の細胞は、視覚遮断下においても同期的な神経活動が発達した。本年度は、V1の2/3層とそのターゲット領域であるV2神経細胞の活動を同時記録した。生後発達期の環境を操作することによりV1の2/3層の同期発火を低下させたラットでは、V2神経細胞の発火頻度そのものが低下することを見出した。この結果は、同期発火がV1-V2間の情報伝達において機能的な役割を果たしていることを示唆する。V1-V2領域間の発達時期を同定するために異なる発達段階のラットを用い、視覚生理実験を行った。V2神経活動は、開眼直後より観察された。また視覚入力遮断後一週間以降にV2神経活動が低下することを見出した。この結果は、V1における同期的な神経活動が、V1-V2間における情報伝達の維持にかかわっていることを示唆する。今後は、V1神経細胞の同期発火がV1-V2間の発達における役割をより直接検証するために生後の発達時期特異的にV1の2/3層神経細胞を光遺伝学的手法により活動操作し、V1-V2間の生後発達期においてV1神経活動パタンの機能をより直接的に検証する。従来の計画では、個々の領域における受容野位置と活動同期性の強度を対応付けて評価するため、あらかじめ内因性信号の光学的マクロイメージングにより各視覚領野の視野地図を再現し、その後電気生理学的手法によりその領野における神経活動の記録を行うことを計画していた。しかし、幼若ラットにおいて内因性信号による安定した視野地図の再現が行えなかったため、神経トレーザーを記録する領域の対側脳に予め注入し、対側に投射する脳領域を可視化したうえで電気生理学的手法を用いて記憶を行った。この方法により、V1-V2境界領域を可視化することは可能となったが、記録前に正確な受容野位置を同定することは困難であり、実験の成功率が低下した。この点を解決するために、より多くの神経細胞から同時に記録できるシステムの構築を検討する予定である。本研究計画は、当初の研究計画では1投射先を共有するV1神経細胞群が微小神経回路網を形成するか2V1における同期発火と投射先の神経活動の関係の同定3V1と高次視覚野の機能的結合の生後発達を検証する予定であったが、1については他の研究グループより同様の研究成果が先に報告された。今後は、主に23を明らかにするために、V1同期発火が領野間結合の発達における機能的役割を検証する。すでに、1) V2領域の神経細胞の視覚反応性が開眼直後から存在すること2)視覚遮断により減弱することを見出しており、これらの結果は、V1同期発火がV2神経活動の形成ではなく維持に必要であることを示唆する。今後は、この点をより直接的に検証するために、光遺伝学を用いV1神経活動を人為的に操作しV1-V2の機能的結合の生後発達様式を同定する。視覚情報は脳の複数の視覚関連領域が協調的に機能することで処理される。本研究では、領域内及び領域間における同期的な神経活動の機能的役割、その神経基盤そして発達過程を明らかにすることを目的とする。特に一次視覚野(V1)-二次視覚野(V2)間に着目し、複数神経細胞の同期活動が領野間情報伝達において担う機能とその発達機構を解析した。通常飼育したラットを用い、多チャンネル電極によりV1/V2を含む複数の視覚関連領域から多細胞の神経活動を同時記録した。空間的に限局した視覚刺激を提示し、個々の神経細胞の受容野位置を同定した。複数の神経細胞の受容野位置から視野地図を再構築することでV1/V2領域の切り分けに成功した。個々の受容野構造を定量的に解析したところ、V1領域とV2領域の受容野構造に違いを見出した。V2細胞の受容野はV1神経細胞より有意に大きかった。次に、様々な視覚環境で飼育したラットを用い、V1、V2領域の受容野構造について解析した。V1、V2どちらの領域においても開眼直後から視野地図が存在することを見出した。しかし、それぞれの領域における受容野構造の発達過程は異なり、V1よりもV2においてより大きな変化が発達に伴い生じることを見出した。最後に、V1神経細胞の同期発火がV1-V2間の神経活動の伝播に及ぼす影響を明らかにする目的で、V1複数細胞間での同期発火とV2神経細胞の活動強度の関係を解析しする予定だった。しかし、活動電位レベルでのV1-V2相互作用の同定が困難であったため、局所場電位における相互作用を解析し、局所場電位において視野地図上の位置に依存して同期活動が上昇することを見出した。現在、局所場電位における同期性の発達過程を定量的に解析している。計画が予定より遅れている。大きな原因として、動物の搬入に支障がでたことがあげられる。

本研究計画は、視覚関連脳領域間の情報伝達における同期発火の機能的な役割と神経基盤および発達機構を明らかにすることを目的とする。これまでに、一次視覚野(V1)神経細胞の同期活動が、生後の視覚経験に依存して発達することを見出した(Ishikawa et al., 2018)。多チャンネル記録法によりV1の複数の神経細胞活動を同時記録したところ, 2-4層の細胞は、生後の形態視環境下でのみ類似した視覚反応性をもつ細胞間で同期発火を発達し、5-6層の細胞は、視覚遮断下においても同期的な神経活動が発達した。本年度は、V1の2/3層とそのターゲット領域であるV2神経細胞の活動を同時記録した。生後発達期の環境を操作することによりV1の2/3層の同期発火を低下させたラットでは、V2神経細胞の発火頻度そのものが低下することを見出した。この結果は、同期発火がV1-V2間の情報伝達において機能的な役割を果たしていることを示唆する。V1-V2領域間の発達時期を同定するために異なる発達段階のラットを用い、視覚生理実験を行った。V2神経活動は、開眼直後より観察された。また視覚入力遮断後一週間以降にV2神経活動が低下することを見出した。この結果は、V1における同期的な神経活動が、V1-V2間における情報伝達の維持にかかわっていることを示唆する。今後は、V1神経細胞の同期発火がV1-V2間の発達における役割をより直接検証するために生後の発達時期特異的にV1の2/3層神経細胞を光遺伝学的手法により活動操作し、V1-V2間の生後発達期においてV1神経活動パタンの機能をより直接的に検証する。従来の計画では、個々の領域における受容野位置と活動同期性の強度を対応付けて評価するため、あらかじめ内因性信号の光学的マクロイメージングにより各視覚領野の視野地図を再現し、その後電気生理学的手法によりその領野における神経活動の記録を行うことを計画していた。しかし、幼若ラットにおいて内因性信号による安定した視野地図の再現が行えなかったため、神経トレーザーを記録する領域の対側脳に予め注入し、対側に投射する脳領域を可視化したうえで電気生理学的手法を用いて記憶を行った。この方法により、V1-V2境界領域を可視化することは可能となったが、記録前に正確な受容野位置を同定することは困難であり、実験の成功率が低下した。この点を解決するために、より多くの神経細胞から同時に記録できるシステムの構築を検討する予定である。他領域の神経活動の相互関係を明らかにすることを目的とする。また、その関係が発達にともなう変化を同定する。そのために、より解析手法について検討する必要がある。本研究計画は、当初の研究計画では1投射先を共有するV1神経細胞群が微小神経回路網を形成するか2V1における同期発火と投射先の神経活動の関係の同定3V1と高次視覚野の機能的結合の生後発達を検証する予定であったが、1については他の研究グループより同様の研究成果が先に報告された。今後は、主に23を明らかにするために、V1同期発火が領野間結合の発達における機能的役割を検証する。すでに、1) V2領域の神経細胞の視覚反応性が開眼直後から存在すること2)視覚遮断により減弱することを見出しており、これらの結果は、V1同期発火がV2神経活動の形成ではなく維持に必要であることを示唆する。今後は、この点をより直接的に検証するために、光遺伝学を用いV1神経活動を人為的に操作しV1-V2の機能的結合の生後発達様式を同定する。実験飼育室で感染事故がおこり、実験計画が遅れている。
二枚貝類コラーゲンのサブユニット特異的低プロテアーゼ耐性の発現メカニズム

二枚貝類組織より抽出したコラーゲンをペプシン処理に供すると、多くの種について特定のα鎖の相対的減少が起こるなど、顕著な電気泳動パターンの変化を生じる。本研究では、ペプシン処理による構造変化の機序を解明するための基礎的情報を集積することを目的として、プロテアーゼによる分解を受けていないインタクトな構造を保持したコラーゲンの抽出法を確立するとともに、得られたインタクトコラーゲンおよびその構成サブユニットの性状解析を試みた。数種二枚貝類組織より得たアルカリ抽出残渣(RS-AL)について、塩酸グアニジン処理を行うことによってインタクトな構造を保持したコラーゲン(塩酸グアニジン可溶性コラーゲン、3SC)が得られることが分かった。RS-ALについて解繊処理を予め行うことによってその後の塩酸グアニジン処理における可溶化率が若干上昇することも判明した。コラーゲンに対するペプシン処理による影響が比較的小さいマガキを材料として、その外套膜よりペプシン可溶化コラーゲンを調製し、それに含まれるマガキ主要コラーゲンのサブユニット組成を調べた。主要コラーゲンを構成する2種のα鎖のアミノ酸分析結果から、本主要コラーゲンが(α1)_2α2のサブユニット組成を有するヘテロトリマーであることが示唆された。数種二枚貝類外套膜より調製したGSCについて、各構成α鎖のN末端アミノ酸配列分析を行ったところ、いずれの種についてもN末端は閉鎖されておらず、Asp-Glu-という特異なN末端を持つ場合が多いという興味深い事実が判明した。また、GSCを構成する特定のα鎖(暫定的にα2鎖とする)の内部アミノ酸配列を解析したところ、[-Gly-X-Y-]とは異なる配列(非トリプレット)を検出した。この結果は、当該α鎖三重らせんドメインにプロテアーゼ感受性領域が存在することを示唆するものである。さらに、GSCについて変性条件下にて陽イオン交換クロマトグラフィーを行ったところ、GSCは遺伝的に異なる3種類のα鎖を含むことが明らかとなった。現在、これらを完全精製してさらなる構造解析を進めている。コラーゲンの3重らせん領域はGly-X-Yというアミノ酸配列の繰り返しにより構造が保持され、通常のプロテアーゼに対し耐性を持つ。しかし、二枚貝類コラーゲンについてはペプシン処理によりα1成分の特異的減少が起こる。その機構を解明するために、本研究は一次構造を保持したコラーゲンの調製法の確立、およびそのN末端アミノ酸配列の解読を目的とした。ホタテガイ外套膜を0.1M NaOHで抽出することによりアルカリ抽出残渣(RS-AL)を得た。RS-ALを解繊溶液(0.05M EDTA、0.5M NaClおよび0.2M 2-メルカプトエタノールを含む0.05M Tris-HCl緩衝液、pH8.0)で1週間処理した後、残渣を4M塩酸グアニジンで抽出して塩酸グアニジン可溶化コラーゲン(GSC)を調製した。その残渣について0.5M酢酸中でペプシンによる限定消化を行いペプシン可溶化コラーゲン(PSC)を調製した。対照として解繊処理を行わず、RS-ALから直接GSCおよびPSCを調製した。イワガキ、マガキ、インコガイおよびムラサキイガイ外套膜からもGSCを調製した。

得られた数種の二枚貝類外套膜GSCをSDS-PAGEに供し、PVDF膜に転写後α1およびα2鎖のバンドを切り出し、プロテインシークエンサーによるN末端アミノ酸配列分析に供した。解繊処理により塩酸グアニジン抽出におけるコラーゲンの可溶化率は7.5%から25.6%へと増加した。解繊処理により移動度はやや減少したが、GSCおよびPSCのSDS-PAGEパターンに大きな変化は生じなかった。このことより、解繊処理は一次構造を保持したコラーゲンの調製に有効であることが分かった。ホタテガイ外套膜GSCα1鎖およびα2鎖のN末端アミノ酸はそれぞれA-Y-R-Y-G-およびD-E-A-F-M-と解読され、他の二枚貝類外套膜GSCいずれについてもN末端アミノ酸配列を解読することができた。これらの結果は、二枚貝類外套膜コラーゲンのN末端アミノ酸がピログルタミル基などにより修飾されていないことを示唆するものである。コラーゲンの3重らせん領域はGly-X-Yというアミノ酸配列の繰り返しにより構造が保持され、通常のプロテアーゼに対し耐性を持つ。しかし、二枚貝類コラーゲンについてはペプシン処理によりα1成分の特異的減少が起こる。つまり、α1成分においてプロテアーゼ感受性の領域が存在する可能性があるが、これに関する知見はほとんどない。その機構を解明するための基礎として、本研究では一次構造を保持したコラーゲンの調製法の確立を目的とした。マガキおよびムラサキイガイ外套膜を0.1M NaOHで抽出することによりアルカリ抽出残渣(RS-AL)を得た。RS-ALを解繊溶液(0.05M EDTA、0,5M NaClおよび0.2M2-メルカプトエタノールを含む0.05MTris-HCl緩衝液、pH8.0)で1週間処理した後、残渣を4M塩酸グアニジンで抽出して塩酸グアニジン可溶化コラーゲン(GSC)画分を調製した。その残渣について0.5M酢酸中でペプシンによる限定消化を行い可溶化された画分をペプシン可溶化コラーゲン(PSC)画分とした。対照として解繊処理を行わずに、RS-ALから直接これらの画分を調製した。これらの画分に含まれるコラーゲンをWoessnerの方法により定量して、塩酸グアニジンおよびペプシンを用いたコラーゲンの抽出・可溶化に及ぼす解繊処理の影響を調べた。塩酸グアニジン処理におけるコラーゲンの可溶化率は解繊処理によりマガキでは1.2%から6.3%へと増加したが、ムラサキイガイでは解繊処理の有無に関わらず3.7%であった。また、ペプシン処理におけるコラーゲンの可溶化率に関しては、解繊処理によりマガキでは42.9%から53.5%へと増加したが、ムラサキイガイでは33.7%から23.9%へと減少傾向を示した。いずれの種においても解繊処理により各構成サブユニットの移動度にやや変化が認められたものの、GSCおよびPSCのSDS-PAGEパターンに大きな変化は生じなかった、昨年のホタテガイに関する結果およびこれらの結果を総合すると、動物種によっては効果が低い場合があるものの、おおむね解繊処理は塩酸グアニジン可溶性コラーゲン(インタクトな一次構造を保持したコラーゲン)の収率を高める手段として有効であり、さらにペプシン可溶化コラーゲンの収率の増加にも寄与することが分かった。多くの二枚貝類についてコラーゲンをペプシン処理に供すると、特定のコラーゲンα鎖の相対的減少が起こるなど、顕著な電気泳動パターンの変化を生じる。
小胞体ストレス応答がインスリン抵抗性および動脈硬化形成に果たす役割の解明

本研究の目的は、インスリン抵抗性の形成や動脈硬化に代表される血管合併症の発症に果たす小胞体ストレス応答の役割を、その調節メカニズムも含めて詳細に検討することである。小胞体ストレスを軽減する役割を持WFS1を欠損したマウスや培養細胞を詳細に検討し、WFS1が高脂肪食に及ぼす影響について分子メカニズムを解析した。また動脈硬化モデルマウスを用いてWFS1欠損マウスとかけ合わせWFS1が動脈硬化の発生進展について解析を行った。このようにメタボリックシンドロームの基盤となる病態から動脈硬化に至るまでの経路における小胞体ストレス応答の重要性を明らかにした。本研究はインスリン抵抗性の形成や動脈硬化に代表される血管合併症の発症に果たす小胞体ストレス応答の役割を検討するのを目的にする。WFS1欠損マウスを中心にした解析から、高脂肪食負荷後のインスリン抵抗性や動脈硬化モデルでも解析から小胞体ストレスタンパクWFS1がインスリン抵抗性や動脈硬化の発症・進展に及ぼす役割を検討し、新規予防・治療法の可能性を探ることである。具体的に行った研究I)野生型とWFS1欠損マウスに高脂肪食を負荷し、代謝パラメータを測定し、糖負荷試験やインスリン負荷試験をおこない、耐糖能やインスリン感受性を解析する。肝臓と脂肪組織でのインスリン抵抗性の程度を評価し、代謝にかかわる種々の分子の発現変化や小胞体ストレスに関する分子遺伝子の変化について解析を行う。2)WFS1欠損マウスにおける炎症による反応性血管内膜肥厚の検討を行い、肥厚部位での遺伝子発現について検討を行う。粥状動脈硬化モデルであるapoE欠損マウスと交配し、高コレステロール血症を背景にした粥状動脈硬化の進展におけるWFS1の役割を検討する。3)骨髄移植を行い、血球細胞と血管細胞でのWFS1が動脈硬化に果たす役割をそれぞれ検討をする。具体的に、骨髄移植血管炎症性内膜肥厚と高コレステロール血症を背景にした粥状動脈硬化の進展いについて動脈硬化の定量を行い、評価をした。本研究はインスリン抵抗性や動脈硬化の血管合併症の発症に影響を果たす小胞体ストレス応答の役割を検討をや可能な新規治療方法の開発と目的にする。WFS1欠損マウスを用いた解析から高コレステロール食を負荷した後、動脈硬化モデルや高脂肪食を負荷したインスリン抵抗性モデルの解析からWFS1タンパクが動脈硬化とインスリン抵抗性の発症・進展に及ぼす役割を検討する。具体的に1;野性型とWFS1欠損マウスに高脂肪食を負荷し、代謝パラメータを測定し、糖負荷及びインスリン負荷試験など代謝関連実験を行う。肝臓でのインスリン抵抗性の程度を評価し、代謝にかかわる種々の分子の発現や小胞体ストレスに関する分子遺伝子の変化を解析する。2;WFS1欠損マウスがカフ傷害による炎症反応性血管内膜肥厚の検討を行い、また血管肥厚部位での遺伝子発現の検討を行う。粥状動脈硬化モデルであるアポE欠損マウスを掛け合わせ、また高コレステロール血症を背景にした粥状動脈硬化の進展においてWFS1の役割について検討を行う。3;骨髄移植実験を行い、血球細胞と血管細胞でのWFS1が動脈硬化についての影響についてけんとうする。骨髄移植血管炎症性内膜肥厚と高コレステロール食による粥状動脈硬化の進展について定量及び評価を行う。その中で小胞体ストレスを軽減する役割を持つと想定されるWFS1を欠損したマウスや培養細胞を詳細に検討し、メタボリックシンドロームの基盤となる病態から動脈硬化に至るまでの経路における小胞体ストレス応答の重要性について研究を進めた。1)WFS1欠損マウスから採取した腹腔Mφを、ECと共に培養することで、MφのWFS1がECに及ぼしている作用に関して、接触共培養とトランスウェルを用いた非接触共培養の条件で検討する。培養内皮細胞系にてWFS1のsiRNAのノックダウン実験とWFS1欠損Mφを共同培養し、炎症性因子や増殖因子の発現について検討を行った。2)アデノウィルスを用いたWFS1過剰発現の検討WFS1発現アデノウィルスを用いてに示す各種培養細胞に添加し、あるいは肥満・糖尿病マウスに静脈投与することでWFS1過剰発現の系を作成し、インスリン抵抗性や動脈硬化形成におけるWFS1の役割を解析した。研究資金の支持の下で、研究に必要な試薬準備やマウスなどの飼育が順調に進み、事前計画をしっかり行い、研究計画通り進んでいる。医歯薬学小胞体ストレス関連タンパクWFS1が小胞体ストレスシグナールに及ぼす経路について検討を行う。1)骨髄移植を用いた反応性内膜肥厚と粥状動脈硬化の検討;6週齢前後の野生型マウスとWFS1欠損マウスを用いて骨髄移植を行う。

具体的にはドナーとレシピエントの組み合わせによって、全身にWFS1を有する、骨髄のみWFS1を有する、骨髄のみWFS1を欠損する、全身にWFS1を欠損する4群のマウスを作成する。またアポE欠損マウスを掛け合わせたモデルに同様に骨髄移植を行う。これらのマウス大腿動脈のカフ傷害による内膜肥厚と、高コレステロール食を負荷しながら一定期間飼育し、大動脈の粥状動脈硬化進展における血球細胞(マクロファージ)と血管細胞(内皮や平滑筋細胞でのWFS1の役割を解析する。4)培養細胞におけるsiRNAを用いたWFS1ノックダウウン及びアデノウィルスベクタによる過剰発現の検討;血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、マクロファージの各培養細胞に対して、WFS1のsiRNAを用いてWFS1蛋白のノックダウンやアデノウィルスベクタによるWFS1過剰発現を試みる。in vivoでの動脈硬化病変の解析は現象・結果を主に解析しているのに対して、本検討から、動脈硬化巣に存在する各種細胞におけるWFS1による小胞体ストレス・酸化ストレス応答などへの効果を個別に直接解析し、in vivoの実験で認められた動脈硬化促進効果のメカニズムを解明できると思われる。事前計画をしっかりし、研究資金の支持の下で、実験に使う試薬やマウスなど準備が完成してるおかげで、ほぼ研究計画通り順調に進んでいる。小胞体ストレス応答経路の中で、WFS1が主に果たすシグナールについて検討を行う。1)WFS1欠損マウスについて薬物た食事、酸化ストレスや炎症高血糖、肥満を誘導し、それぞれの状況でインスリン抵抗性や反応性内膜肥厚の検討を行い、肝臓、脂肪、大動脈における生体内ストレス応答に関連する分子の発現の解析を行う。2)各種培養細胞においてのストレス応答に関連する検討。インスリン抵抗性に関与する肝細胞、脂肪細胞、また動脈硬化形成に関与するマクロファジ、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞を用いて詳細な分子メカニズムを検討する。各種細胞に小胞体ストレスや酸化ストレス、炎症、高血糖を誘導し、WFS1を中心とした細胞蛋白やmRNAレベルで生体内ストレス応答についてsiRNAでWFS1をのノックダウンした状況で、マクロファジ、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞を共同培養することで、動脈硬化に影響する各種細胞の相互作用について検討を行う。3)アデノウィルスを用いてWFS1の過剰発現の検討。各種細胞においてWFS1の過剰発現によって肥満、糖尿病、動脈硬化形成におけるWFS1の解析を行う。
歯周炎に伴う免疫反応の特異性の解明とその制御

マウスを未変性のPorphyromonas gingivalis線毛で免疫して多数のモノクローナル抗体(mAb)を樹立し、各mAbの反応特異性を解析したところ,全てのmAbは線毛ポリマーには反応するがモノマーには反応を示さなかった。モノマーの線毛サブユニットを免疫した場合には線毛モノマーに反応性を示すmAbが樹立されたが,これらのmAbは未変性線毛に全く反応を示さなかった。以上より,P.gingivalisの線毛では、未変性のポリマーとそのサブユニットモノマーとでは抗原性が大きく異なること、そして立体構造依存性B細胞エピトープが圧倒的にimmunodominantである事が定量的に示された。同様の手法を他のタンパク質抗原に適用して、immunodominant B細胞エピトープが立体構造依存性であることは、安定な高次構造を保有するタンパク質における一般的な現象であることが示唆された(以上,平成9年度)。P.gingivalis線毛2量体を認識するmAbの中から,同一もしくは近接するエピトープを認識すると考えられた2クローンを選択し,これらのmAbが認識するエピトープ構造の解明を目的として,phage-displayed random peplide libraryを用いてmAbが認識する立体構造を模倣するペプチドの探索を試みた。Panningの繰り返しによってmAbに反応性を示す複数のファージクローンが得られたが,対照のmAbとの反応性や種々の競合阻害試験の結果に基づいて,最終的に1 mAbに対する1ファージクローンの特異性が確認された。挿入ペプチドのアミノ酸配列を調べたところ,線毛サブユニットの260番目からのアミノ酸配列とごく部分的な相同性を認めた。平行して,線毛サブユニットの遺伝子DNA配列から1分子中に3カ所の存在が予想されるシステイン残基の存在様式をタンパク化学的に解析した。1分子中3残基のシステインが存在が確認され,うち2つがジスルヒド結合を形成することが明らかになった。マウスを未変性のPorphyromonas gingivalis線毛で免疫して40クローンのモノクローナル抗体(mAb)を樹立し、各mAbの線毛モノマーおよびオリゴマーに対する反応パターンをイムノブロット法にて解析した。全てのmAbはポリマーには反応するがモノマーには反応することが出来なかった。さらにこれらのmAbは、2量体以上のポリマーに反応するものが20クローン、3量体以上には反応するが2量体には反応しないものが11クローン、全く変性操作を加えない線毛にしか反応を示さないもの9クローンに分類され、抗原結合性の高いmAbは前2群に集中していた。次に、モノマーの線毛サブユニットを調製し、これをマウスに免疫して線毛モノマーに反応性を示すmAbを4クローン樹立することに成功した。しかし、これらのmAbはいずれも、未変性の線毛に全く反応を示さなかった。すなわちP.gingivalisの線毛では、未変性のポリマーとそのサブユニットとでは抗原性が大きく異なること、そしてimmumnoominant B細胞エピトープは立体構造依存性であり、線毛の2量体あるいは3量体に表現されるものが特に重要である事を定量的に示すことが出来た。2量体あるいは3量体の線毛に反応を示すmAbから、結合性の高い3種を選択し精製後、標識抗体を作製し、他の非標識のmAbとの間での未変性線毛抗原をめぐる競合阻害の有無をELISA法で検討したところ、これら31のmAbは少なくとも3種以上の異なる立体構造依存性エピトープを認識することが示唆された。

同様の手法を適用して、Serratia marcescensの線毛と卵白リゾチームにおいても、immunodominant B細胞エピトープが立体構造依存性であることが示され、このことは、安定な高次構造を保有するタンパク質における一般的な現象であることが示唆された。前年度の研究において,歯周病原性細菌porphyromonas gingivalisの組織定着因子である線毛に対する40クローンのモノクローナル抗体(mAb)を作製した。これらの反応特異性の内訳は,線毛2量体を認識するもの20,3量体を認識するもの11であり,単量体を認識するものは無かった。本年度はまず,2量体を認識するものについて競合阻害実験を行い,その結果から同一あるいは近接するエピトープを認識すると考えられた2クローン,Pfyx205(α,κ)およびPfyx206(γ1,κ)を選択した。次いでこれらのmAbが認識するエピトープ構造の解明を目的として,phage-displayed random peptide libraryを用いてmAbが認識するアミノ酸配列の決定を試みた。Panningを繰り返すことで,mAbに反応性を示す複数のファージクローンが得られたが,対照のmAbとの反応性や種々の競合阻害試験の結果に基づいて,最終的にPfyx206に対する1クローンの特異性を確認することができた。この挿入ペプチドのアミノ酸配列を調べたところQAAQDVWGVHTAGであり,線毛サブユニットの260番目からのアミノ酸配列LAAAQAANWNDAEGと部分的な相同性を認めた。これら2種のペプチドの反応特性をさらに詳細に解析するために,両ペプチドを化学合成した。しかし合成されたペプチドは水溶性が低く,そのままでは抗原抗体反応実験に供し得なかった。現在,水溶性を高めつつ抗原性に影響を与えない化学修飾法等を検討している。また平行して,線毛サブユニットの推定アミノ酸配列から1分子中に3カ所の存在が予想されるシステイン残基の存在様式をタンパク化学的に解析した結果,確かに1分子中3残基のシステインが存在し,うち2つはジスルヒド結合を形成し,残りの1つは還元状態で存在することが明らかになった。