hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
免疫抑制剤による血管内皮障害の分子機序の解明

免疫抑制剤FK506は造血幹細胞移植時に発症する移植片対宿主病を予防するのに使用される。一方で、造血幹細胞移植では重篤な合併症である血管内皮障害がしばしば発症する。本研究では、血管内皮障害の病原因と考えられるFK506に焦点を当てて、3次元血管モデルを用いた血管内皮障害の分子機序の解明を目的に実験を行った。その結果、1)FK506は免疫抑制作用およびカスパーゼ経路とは独立して血管内皮細胞の生存因子ERK1/2およびAktの活性を減弱させることにより管腔構造の崩壊と細胞死を誘導する、2)組換型トロンボモジュリンはFK506によるAkt不活性化を抑制することで細胞死を抑制することを明らかにした。組換え型トロンボモジュリン(recombinant human soluble thrombomodulin, rTM:製剤名リコモジュリン)は、藩種性血管内凝固症候群(disseminated intravascular coagulation, DIC)に対する製剤として使用されている。近年、rTMにおける造血幹細胞移植後の血管内皮障害の抑制効果が報告されているが、その機序は明らかになっていない。3次元血管モデルを用いた昨年度までの本研究において、1)FK506は細胞死だけでなく構築された血管構造の崩壊(管腔崩壊)も誘導し、2)その細胞死はカスパーゼを介した古典的なアポトーシスとは独立して誘導され、3)FK506による血管内皮障害は生存因子であるAkt及びERK1/2の活性化を減弱させることにより誘導される、ことを明らかにしてきた。平成25年度ではFK506による血管内皮障害に対するrTMの抑制効果の解析を行った。その結果、1)rTMはFK506による管腔崩壊を抑制できないものの細胞死には抑制効果を示し、2)FK506による細胞死に対するrTMの抑制効果はFK506によるAkt活性化の減弱をキャンセルさせることによりもたらされることが明らかとなった。これらの結果は、臨床におけるFK506による血管内皮障害に対するrTMの抑制効果の基礎的なエビデンスであり、効果的な製剤がない血管内皮障害に対する予防薬として期待されることが示唆された。平成24年度の研究内容として、FK506による細胞死・管腔崩壊に対するカルシニューリン及びFKBPの関与を解析した。その結果、カルシニューリンはFK506によって確かに活性抑制が確認されたが、カルシニューリンをRNA干渉によって発現抑制させてもFK506による血管内皮細胞の細胞死及び管腔崩壊は抑制されなかったことから、FK506によるカルシニューリンの阻害が血管内皮障害の主原因でないことが判明した。FKBPに関しては、FKBPのうちFKBP12をRNA干渉によって発現抑制した結果、FK506による血管内皮細胞死は抑制されなかったものの、管腔崩壊に関しては一部抑制することが観察された。これらの結果から、FK506による血管内皮障害にはカルシニューリンは関与せず、FKBPとFK506の複合体の関与が示唆された。また、この血管内皮障害はカスパーゼを介した古典的なアポトーシスを介さないことも示された。加えて、細胞内のシグナル伝達を解析したところ、FK506によって血管内皮細胞の生存に重要なリン酸化酵素であるAktとERK1/2の弱い活性抑制が解析された。さらに、それらリン酸化酵素の特異的阻害剤を使用してそれぞれを非常に弱く活性抑制を促したところ血管内皮障害が確認されたことから、FK506による血管内皮障害はAktとERK1/2の弱い活性抑制が原因で誘導されることが判明した。免疫抑制剤はドナー由来の造血幹細胞を移植する患者が発症する移植片対宿主病(GVHD)を予防するのに使用される。一方で、造血幹細胞移植では重篤な合併症である血栓性微小血管症などの血管内皮障害がしばしば発症する。その血管内皮障害の病原因に、GVHD、放射線、免疫抑制剤が関与することが疑われるが、詳細な発症機序はわかっていない。本研究では、国内で使用される免疫抑制剤FK506に焦点を当てて、3次元培養による血管モデルを用いた血管内皮障害の分子機序の解明を目的に実験を行った。昨年度までの本研究結果から、1)臨床血中濃度のFK506は管腔構造の崩壊(管腔崩壊)と細胞死を誘導する、2)FK506による免疫抑制作用やアポトーシス実行因子であるカスパーゼの活性化は血管内皮障害の原因ではない、3)FK506は血管内皮細胞の生存因子であるERK1/2およびAktの活性を減弱させることにより血管内皮障害を誘導することを明らかにした。

また、播種性血管内凝固症候群に使用される組換型トロンボモジュリン(rTM)が造血幹細胞移植時に発症する血管内皮障害を軽減することが臨床的に知られているが、その機序は明らかになっていないため、FK506による血管内皮障害をrTMが実験的に軽減するかをさらに解析した結果、4)rTMはFK506による管腔崩壊は抑制しないが細胞死を抑制する、5)rTMによるFK506誘導性の細胞死の抑制はFK506によるAkt不活性化の抑制が原因である、ことも昨年度までに明らかにした。本年度ではFK506の血管内皮障害に関与するタンパク質を解析した結果、FK506結合タンパク質(FKBP)のうちFKBP12.6ではなくFKBP12が管腔崩壊に関与する可能性が示唆された。血管生物学本研究に関して平成25年度の学会で報告した全ての内容を論文投稿し、一部はすでに出版され、一部は最近受理された。これらの受理された論文内容は若手研究Bに申請した際の平成25年度以降の研究計画の大半が遂行された結果である。本研究に関して平成24年度の学会で報告した内容の一部を論文投稿し、最近受理された。この受理された論文内容は若手研究Bに申請した際の初年度の研究計画を完全に遂行した結果である。平成26年度ではFK506による血管内皮障害の総括を行う。平成25年度では、FK506による細胞死・管腔崩壊に対する製剤Aの治療効果の解析を行う。平成25年度では、主に実験に必要な試薬・消耗品・機器及び平成24年度末に受理された投稿論文の英文校正代及び別刷り代に研究費を使用した。当初予定していた実験量よりも少ない研究費でさらなる研究結果が論文として受理されたが、この論文における別刷り代は平成25年度内で支払うことが出来なかったため、論文別刷り代を次年度使用額の経費として計上する必要がある。また、平成25年度以降の研究計画の内、遂行が完了していない実験を次年度に行う必要がある。平成26年度の研究費はまだ明らかとなっていない本研究の課題実験に使用する予定である。加えて、平成25年度末に受理された論文の別刷り代が一部経費として計上される予定である。また、申請者が所属する兵庫医科大学には共同利用研究施設が存在し、本研究において最も必要な機器であるコールターカウンター(自動細胞計数装置)が設置されているが、近年の当該施設の利用者増のため、それを次年度には購入し、申請者が所属する研究施設に設置する予定である。平成24年度では試薬・消耗品に研究費を使用する予定であったが論文投稿及びその受理までに大幅に時間をとられたため、平成25年度の研究費は試薬・消耗品がほとんどを占める。また、今回の論文受理によってその英文校正代及び別刷り代が一部経費として計上される。
家族性拡張型心筋症モデルにおける運動療法の確立

遺伝性拡張型心筋症(DCM)は、慢性心不全(CHF)の原因疾患の一つであり、左心室の拡大と収縮能低下を特徴とする心筋症で、約50%が遺伝子変異を伴う家族性である。さらに家族性DCMでは3040%に心室性の致死性不整脈による突然死が報告されている。CHFでは病態が進行する過程において、交感神経系、レニン-アンギオテンシン系、サイトカイン等が活性化し、収縮力低下を代償しようとする(代償期)が、やがて心拍出量が低下し、肺うっ血等の心不全症状が現れる(非代償期)。既に、CHFのガイドラインでも運動療法が取り上げられており、うっ血の改善、心血管系の改善、副交感神経系の活性化などを介した効果であると言われている。しかし、DCMではCHFの重症化や致死性不整脈による突然死が多く、患者を対象にした運動療法の検討は危険を伴うため効果が明らかでない。研究者は、森本らにより作出されたヒト家族性DCMに似た特徴をもつモデルマウス(以下DCMマウス)を用いて、DCMにおける運動療法の効果を検討してきた。DCMマウスを用い若年より頻回(毎日2日毎)の自発的運動を行ったところ、明らかな寿命延長効果が認められた。また、自発運動と強制運動とでは心機能に与える影響の質が異なることを2017年度に報告した。今年度は、若年から毎日自発運動を行ったDCMマウス群と2日毎に自発運動を行った群において、組織および細胞での比較や、分子レベルでの比較を試みた。これらより、DCMにおいても適切な運動が症状改善に有効であり、より頻繁な自発運動の方が細胞レベルでの心機能保護に効果があること、また、イオンチャネルのリモデリングの進行も抑制される傾向があることが明らかになった。拡張型心筋症(DCM)は慢性心不全(CHF)の主要な原因の一つであり、左心室の拡大と収縮能低下を特徴とした心筋症で、約50%は遺伝子変異を伴う家族性である。病態が進行する過程において、交感神経系、レニン-アンギオテンシン系、サイトカイン等が活性化し収縮力の低下を代償しようとする(代償期)が、やがて心拍出量が低下した非代償期に移行し、肺うっ血等の心不全症状が現れる。家族性拡張型心筋症では3040%が心室性の致死性不整脈により突然死するとの報告がある。近年、運動療法はうっ血の改善、心血管系の改善、副交感神経系の活性化などを介してCHFに効果があると報告されているが、家族性DCMでは心不全の重症化や致死性不整脈が悪化する恐れがあるため、運動療法の効果が明らかでない。これまで、森本らによって作出されたヒト家族性拡張型心筋症に基づく拡張型心筋症モデルマウス(以下DCMマウス)を用いて研究を続けており、ヒトのDCMの病態を良く再現すると考えられた。その過程で心筋のイオンチャネルリモデリングが心筋細胞膜の易興奮性を惹起して心室性不整脈を引き起こすこと、アンギオテンシン受容体阻害薬(ARB)の投与が個々の心筋細胞の肥大化および心筋組織の線維化、イオンチャネルリモデリングを抑制してDCMマウスの寿命を延長すること等を明らかにしてきた。同時に、幼若時より頻繁に(毎日2日毎)自発運動をさせたDCMマウスは致死性不整脈をほとんど起こさず寿命が延長することを見出した。一方、低頻度(10日毎)の運動では有効性は見られなかった。これらの結果から、DCMにおいても適切な運動が症状改善に有効であるという仮説を得た。本研究では、細胞、分子レベルの検討により運動療法の分子メカニズムに迫ることを目的とした。幼若期からの自発運動を行ったDCMマウスでは、心拡大および収縮能低下が遅延している傾向がみられ、イオンチャネルリモデリングも抑制されていた。この研究では、トロポニンT遺伝子変異をノックインしたマウスのホモ接合体をDCMマウスとして用いている。平成27年度は、特に雄性のDCMマウスの繁殖能力が著しく低下し、実験計画遂行が遅れた。期間中に動物飼育室および動物実験室が移動し、飼育環境の変化が要因のひとつと考えられる。これまでの結果は以下の通りである。1ヵ月齢から自発運動を開始したDCMマウスを自発運動群、運動をしていないDCMマウスを非運動群とした。1ヶ月齢において、自発運動群は非運動群に比べ心重量/体重比が小さかった。肺重量/体重比は野生型、自発運動群、非運動群で有意な差は認められなかった。3ヶ月齢では、非運動群の中には心重量/体重比、肺重量/体重比ともに著明に増加している個体がみられたが、自発運動群ではみられず、有意に心拡大および肺うっ血が改善されていることが判った。また、2ヶ月齢で行った心エコーにおいて、自発運動群は非運動群に比べて左室拡張末期径が短く、駆出率および左室内径短縮率が高い傾向にあり、生体データでも心拡大の進行と左室収縮能の低下が遅延している傾向が認められた。さらに、DCMマウスの左心室からの遺伝子発現解析において、自発運動群は非運動群に比べイオンチャネルのリモデリングが抑制されていた。拡張型心筋症(DCM)は慢性心不全(CHF)の主要な原因疾患であり、左心室の拡大と収縮能低下を特徴とする心筋症で、約50%が遺伝子変異を伴う家族性である。

病態が進行する過程において、交感神経系、レニン-アンギオテンシン系、サイトカイン等が活性化し、収縮力低下を代償しようとする(代償期)が、やがて心拍出量が低下し、肺うっ血等の心不全症状が現れる(非代償期)。さらに家族性DCMでは3040%に心室性の致死性不整脈による突然死が報告されている。近年、CHFに対し運動療法はうっ血の改善、心血管系の改善、副交感神経系の活性化などを介して効果があると言われている。しかし、DCMでは心不全の重症化や致死性不整脈が悪化する恐れがあるため運動療法の効果が明らかでない。本研究計画では、我々は森本らによって作出されたヒト家族性拡張型心筋症に基づく拡張型心筋症モデルマウス(以下DCMマウス)を用いてDCMに対する運動効果の是非とそのメカニズムを検討する。特に、細胞、分子レベルの検討による運動療法の分子メカニズムの解明を目的とした。幼少より頻繁に(毎日2日毎)自発運動を行ったDCMマウスは、致死性不整脈を起こす個体が少なく寿命が延長していた。一方、低頻度(10日毎)の自発運動では有効性は見られなかった。幼少から頻回の自発運動を始めたDCMマウスでは心拡大および収縮能低下が遅延しており、イオンチャネルリモデリングも抑制されていた。これらより、DCMにおいても適切な運動が症状改善に有効であり、それにはイオンチャネルの遺伝子発現変化も関与しているという結果が得られた。今年度は、ヒトでの運動処方を念頭に置き、DCMマウスにおいて自発運動と強制運動を比較した。この研究では、トロポニンT遺伝子変異をノックインしたマウスのホモ接合体をDCMモデルマウスとして用いている。平成27年度内に動物飼育室および動物実験室が移動して以降、特に雄性DCMマウスの繁殖不良が続き、実験計画遂行が遅延した状況が続いている。平成28年度では自発運動における効果のメカニズムを模索する方法のひとつとして、自発運動と強制運動の比較を行った。DCMマウスを3群に分け、ホイールによる自発運動群とトレッドミル運動負荷による強制運動群は共に1ヵ月齢から運動を開始し、いずれの運動も行わないDCMマウスをコントロール群とした。強制運動群では5度の傾斜をつけて走行負荷を漸増し、最大20m/分、30分の負荷を行った。2か月齢で心臓超音波検査、心電図検査、血中ホルモン解析、心筋からのRNA解析を検討した。心電図検査において、自発運動群ではコントロール群に比べQT延長が有意に抑制されたのに対して、強制運動群では有意な変化は認められなかった。遺伝子発現解析でも自発運動群ではカリウムチャネルの発現低下が緩和する傾向がみられ、心電図での変化を裏付ける結果であり、不整脈突然死が減少する理由と考えられた。遺伝性拡張型心筋症(DCM)は、慢性心不全(CHF)の原因疾患の一つであり、左心室の拡大と収縮能低下を特徴とする心筋症で、約50%が遺伝子変異を伴う家族性である。CHFでは病態が進行する過程において、交感神経系、レニン-アンギオテンシン系、サイトカイン等が活性化し、収縮力低下を代償しようとする(代償期)が、やがて心拍出量が低下し、肺うっ血等の心不全症状が現れる(非代償期)。一般に、CHFでは運動療法により臨床症状の改善や再入院率が低下する等の報告があり、うっ血の改善、心血管系の改善、副交感神経系の活性化などを介した効果であると言われている。しかし、DCMではCHFの重症化や致死性不整脈による突然死が多く、患者を対象にした運動療法の検討は危険を伴うため効果が明らかでない。
結核菌を含むマイコバクテリアの細胞壁合成に関わるタンパク質の構造と機能の解析

結核菌を含むマイコバクテリアが有している特徴的な厚い細胞壁構造の形成に関与しているタンパク質について、その機能と構造の解析を目的として種々の研究を行った。細胞壁構造の主要な脂質成分であるミコール酸の生合成に関与している2種類の結核菌由来酵素、Propionyl-CoA carboxylaseとAcyl-CoA synthetaseについて、大腸菌を宿主とした大量発現株を構築してSDS-PAGE上で単一バンドになるまで精製した。精製酵素を用い結晶化条件のスクリーニングを行い、得られた結晶を用いて放射光施設での回折データの収集を試みた。また、細菌の細胞壁構造には無機リン酸の重合体であるポリリン酸が関与しているとの報告例があることから、結核菌においてもポリリン酸と細胞壁構造との関連が予想された。そこでポリリン酸合成酵素である結核菌由来ポリリン酸キナーゼについて、大腸菌を宿主とした大量発現株を構築してSDS-PAGE上で単一バンドになるまで精製を行い、その詳細な酵素学的諸性質を明らかにした。その結果、結核菌由来ポリリン酸キナーゼは、溶液中では活性を保持している状態として6量体を形成していた。また、本酵素はATPを基質としてポリリン酸を合成する反応とその逆反応であるポリリン酸とADPを基質としてATPを合成する反応を触媒するが、速度論的解析からATPよりもADPに対する親和性の方が高いことが示された。両反応ともに、2価の金属イオンが活性の発現には必須であり、その濃度には至適濃度が存在していた。これらの研究結果より、結核菌の細胞壁構造に関与しているタンパク質の機能と構造の一端について明らかにすることができた。結核菌を含むマイコバクテリアが有している特徴的な厚い細胞壁構造と病原性との関連性が指摘されているにもかかわらず、その合成経路には未知の部分が数多く存在し、細胞壁構成に関与する遺伝子・タンパク質の機能や構造について十分な解析が行なわれていないのが現状である。そこで本研究では、細胞壁構成に関与している新規遺伝子・タンパク質を同定してその詳細な機能を明らかにするとともに、細胞壁構成に関連するタンパク質の立体構造解析を行なうことを目的としている。これまでに細胞壁構成に関与していると予想した遺伝子を破壊した抹をMycobacteium bovis BCG株を用いて作成した。その結果、破壊株のコロニー形態は野生株で見られるRough型からSmooth型に変化していることを示した。そのため、本遺伝子は細胞壁構成に深く関与していることが示唆された。現在は、相補株の作成、並びに野生株と破壊株における細胞壁構造の詳細な違いについての解析を行なっている。また、維胞壁合成に関わる結核菌由来タンパク質であるRv1110の立体構造解析に着手した。Rv1110は非メバロン酸経路の重要な酵素であり、高等動物には非メバロン酸経路は存在しないことから、本酵素は新規抗結核薬の標的としても予想されている。Rv1110を大腸菌内で大量発現させ、SDS-PAGE上で単一バンドになるまで精製を行なった。ゲルろ過カラムの結果より、Rv1110は溶液中で2量体を形成していることが示唆された。精製したタンパク質を用いて結晶化条件のスクリーニングを行なったが、これまでにX線を用いた測定が可能な結晶は得られなかった。現在は、さらなる結晶化条件のスクリーニングを行なっている。
非再生系成体組織における異常細胞の検出・排除システム

非再生系組織のような増殖力がきわめて低い組織では、異常細胞の積極的な排除は、組織の縮小に直接つながる。そのため、異常レベルを検出し、深刻な異常をきたした細胞のみを限定的に排除する仕組みが必要である。本研究では、ショウジョウバエ非再生系組織である附属腺をモデルとして用い、異常細胞の検出・排除メカニズムの解明を目的としている。1)隣接細胞における細胞非自立的な応答機構:paired遺伝子をノックダウン時(老化を遺伝的に再現)により誘導される異常細胞が組織から排除される際に、排除細胞の周辺細胞でJNKシグナルの活性化と、それに伴うアクチン細胞骨格の発達が観察される。pairedノックダウン細胞のおいてJNKシグナルを抑制により、細胞排除の遅れが観察された。また、limkDNを強制発現し、アクチン細胞骨格重合を抑制した場合も同様の効果が現れた。2)異常細胞の検出・排除システムの再現:老化時に活性化するシグナル経路として、Notch・JAK-STAT・Pvrシグナルを同定している。このうち、Pvrシグナルのみが細胞死誘導能を有していたが、その効果は低かった。そこで、Pvr・Notchシグナルの共活性化を試みたところ、高い細胞死誘導能を示した。Pvr・Notchシグナルの共活性化も同様の効果を示した。3) Pvf2/Pvrシグナルによる異常レベルに応じた細胞排除機構: Pvrシグナルは、Notch・JAK-STATシグナルを介して、pairedレベルの低い細胞(異常レベルが高い細胞)のみを限定的に排除していると予想できる。そこで、PvrシグナルがPairedレベル依存的に細胞死誘導を行うのか検証した。その結果、paired強制発現時においては、Pvrシグナルは細胞死を誘導しないのに対し、pairedノックダウン時には高頻度に細胞死を誘導した。25年度が最終年度であるため、記入しない。【附属腺での異常細胞排除におけるNotch・JAK-STATシグナルの機能】異常細胞では、細胞自律的にNotch・JAK-STATシグナルが上昇することを明らかにしている。これらのシグナルについて、異常細胞の排除との関係について調べた。解析の結果、Notch・JAK-STATシグナルを人為的に活性化させても、細胞死は誘導されないことが明らかになった。一方で、Notch・JAK-STATシグナルを抑えることで、異常細胞の排除が顕著に遅れることが明らかになった。以上の結果から、Notch・JAK-STATシグナルは、異常細胞の排除を促進していることが分かった。【異常細胞において細胞死を誘導するPvrシグナルの機能】上記のようにNotch・JAK-STATシグナルは細胞死誘導能を持たないことを明らかにされた。そこで申請者は、老化/異常細胞において細胞死を誘導する因子の同定を試みた。paired遺伝子のノックダウンを行い異常状態を再現し、応答シグナルを探索した。その結果、Pvrシグナルが同定された。人為的にPvrシグナルを活性化させることで、一定頻度で細胞死を誘導できた。この結果から、老化/異常細胞における細胞死誘導シグナルはPvrシグナルであることが示唆された。【隣接細胞における細胞非自律的なJNKシグナルの活性化機構】排除細胞に隣接する細胞では、JNKシグナルが上昇する。しかしながら、JNKシグナル活性化因子TNFαは、附属腺ではJNKシグナルを活性化しない。そこで、JNKシグナルの活性化する要因について、さらなる解析をおこなった。解析の結果、附属腺においてモザイク状に細胞死を誘導すると、隣接細胞でJNKシグナルが活性化することが明らかになった。この結果から、細胞死・細胞喪失自体が隣接細胞におけるJNKシグナルの活性化を誘導することが示唆された。

当初計画においては、老化/異常細胞の排除におけるNotchシグナルとJAK-STATシグナルの解析を軸として、これらの機能解析を計画していた。しかしながら、予想とは異なり、これらのシグナルは細胞排除において細胞死自体を誘導する因子ではなかった。そこで、当初の計画には無かった、細胞死誘導シグナルの探索をおこない、細胞死誘導シグナルとしてPvrシグナルを同定することができた。これらの解析により、Notch・JAK-STATシグナルは細胞排除促進因子、Pvrシグナルは細胞死誘導因子と予測された。この結果は、当初予測していた仮説(異常細胞で細胞死誘導シグナルが活性化し細胞死がおこる)より興味深いものであり、細胞死と細胞排除は独立かつ連携して起こることを示唆するものである。また、排除細胞に隣接する細胞での細胞非自律的なJNKシグナルの活性化は、細胞死そのものが引き起こしていることが示唆された。従来、細胞死に関連するJNKシグナルの活性化の主な要因は、分泌型因子TNFαによると考えられてきた。しかしながら、本システムにおいてはTNFαは関与しておらず、細胞死自体による物理的要因が関与する可能性が示唆された。細胞死自体によるJNKシグナルの活性化という液性因子を介さないシステムについては、より検証を行っていく必要があるが、広く保存されているシステムである可能性がある。その他の計画については、当初の予定を完遂しており、研究目的である“非再生系成体組織における異常細胞の検出・排除システム"の解明に向けて滞りはない。以上の結果を踏まえ、当初研究目的の達成度は“当初の計画以上に進展している"と評価をおこなう。【異常への応答時における異常細胞でのシグナル制御機構の解明】これまでの研究成果により、1)老化時における細胞排除はPairedレベルの低下に起因する、2)Pairedレベルの低下はNotch・JAK-STAT・Pvrシグナルを誘導する、といったことが明らかになった。さらに、3)Notch・JAK-STATシグナルは細胞排除を促進する、4)Pvrシグナルは細胞死を誘導する、ということが明らかになった。一方で、Pvrシグナルを活性化させた場合でも細胞死を誘導する頻度は低く、Pvrシグナルによる細胞死誘導は単純ではない。以上の結果を踏まえ、Pvrシグナルによる細胞死誘導は、Pairedレベルが低下(Notch・JAK-STATシグナルが上昇)している場合のみに誘導され、これにより異常細胞の限定的な排除がおこなわれるという仮説が考えられた。今後の研究方策では、この仮説について以下の方法で検証をおこなう。<Pairedレベルに応じたPvrシグナルによる細胞死誘導機構の検証>
ナノポーラス材料の界面熱輸送の研究

本研究の主旨は,液体He/ナノポーラス金属界面におけるフォノン反射測定による界面熱抵抗評価にある.研究では実験装置にトラブルが多発し,さらに研究室移動,He回収系の問題等のため,研究未了の点が多く残されている.関連研究の成果は,以下のとおりである(i)破断シミュレーションによりMg・Fe単原子接点形成の結晶方位依存性を解明した.(ii) Niの伝導度ヒストグラムを測定し,単原子ピークが約50Kで消失することを見出した.平成24年度は測定の準備を進めたが,液体ヘリウムの実験系を他の研究に使用する必要が生じたため,超流動実験は未了の点が多く残されている.関連した原子サイズ系の研究では,以下の成果を得ている.(i) MgおよびFeを対象として接点破断の分子動力学シミュレーションを実施し,単原子接点の形成について,その結晶方位依存性および温度依存性を明らかにした.特にFCC金属で見出されたpentagonalnanowireの形成がHCPのMgの破断でも観測されることが明らかになった.(ii) Niの単原子接点形成の温度依存性を調べるために,室温から液体ヘリウム温度に亘ってコンダクタンスヒストグラムの変化を測定し,極低温で観測されるNiの単原子ピークが,約50Kで消失することを見出した.(iii) Znの接触過程におけるコンダクタンス変化を室温で測定したところ.1G0程度のコンダクタンスを示す異常に長いプラトーが観測された.この結果はナノワイヤー形成では理解できず,長大プラトーの成因を検討中である.(iv) Yはd価電子が一つしかないので,単原子コンダクタンスからdチャネルの透過率を決定できる可能性がある.今回Y接点のコンダクタンス測定を室温超高真空中で実施したが,結果が収束せず,結論は持ち越しになっている.本研究の主旨は,液体He/ナノポーラス金属界面におけるフォノン反射測定による界面熱抵抗評価にある.研究では実験装置にトラブルが多発し,さらに研究室移動,He回収系の問題等のため,研究未了の点が多く残されている.関連研究の成果は,以下のとおりである(i)破断シミュレーションによりMg・Fe単原子接点形成の結晶方位依存性を解明した.(ii) Niの伝導度ヒストグラムを測定し,単原子ピークが約50Kで消失することを見出した.ナノスケールにおける熱輸送は学問的にも実用的にも重要な問題であり,これからの研究発展が期待される領域である.実用的なナノ構造材料であるナノポーラス材料については,その熱輸送特性はほとんど手付かずのまま残されている.細孔が非常に小さく表面積の大きなナノポーラス材料の熱輸送では界面における熱抵抗が重要であるが,粘性が無く内部に温度勾配が発生しない超流動ヘリウムはナノ細孔内に浸透して材料の全面積と接触するため,ナノポーラス材料の界面熱抵抗を測定するためには最適の媒体である.本研究では,超伝導トンネル接合から熱フォノンを発生させ,これが液体ヘリウムとナノポーラス材料との界面で反射される強度を測定して,ナノポーラス材料の界面熱抵抗を評価する実験を実施する.平成23年度は界面熱抵抗測定用クライオスタットと周辺設備の導入を行った.トンネル接合にAlを使用する都合上,試料室はAlの超伝導転移温度である1.2K以下に冷却する必要がある.ここでは液体He3を使用せずに,液体ヘリウム溜めの排気口にオリフィスを設けて超流動フィルムによる熱損失を防止し,大きな排気容量のポンプを用いて液体He4を減圧する方式で1Kの実現を目指すこととした.しかしながらクライオスタットの設計に時間を要し,またクライオスタットの電流導入端子が溶接時にリークを起こすなどのトラブルが多発して,クライオスタットの完成が大幅に遅れることとなった.このため,まだ本格的な測定を行うには至っておらず,現在遅れを取り戻すべく,準備を進めている.界面熱抵抗測定用クライオスタットの完成に時間を要したことが全体の遅延要因となっている.一つには液体He3を使用せずに,液体He4の減圧で1K達成を目指すこととしたため,クライオスタットの減圧系がやや通常のHe4クライオスタットとは異なる構造になっていることも原因している.また周辺設備などはクライオスタットに整合するように配備・設置しなければならにため,合わせて遅れが生じている.装置に関しては,測定準備を整えることが急務であり,界面熱抵抗測定用クライオスタットにより1.2K以下の所用の温度が実現できることを早急に確認する.ナノポーラス金属試料の作製に関しては,Si基板上へのAuAg合金の蒸着とdealloyingは作製プロセスの完習までに時間を要すると思われるため,比較的容易に作製できるナノポーラス金フィルムをSi基板に接着する方式を採用する.直接蒸着の場合と比較すると,接着層により反射強度がいくらか低下すると思われるが,先ずは結果を得ることを優先する.また,ナノポーラスSi, SiC,Znの作製と界面熱抵抗測定については,時間に余裕のある場合の実験項目にすることとし,先にナノポーラス金フィルムの実験に注力してゆく.主要な備品類については平成23年度に購入を済ませているため,平成24年度の研究経費は主として消耗品類の購入に使用する.具体的には,第一に液体窒素・液体ヘリウムの使用であり,1回の実験で30リットル程度の液体ヘリウムの消費を見込んでいる.材料関係ではSi基板およびナノポーラス金フィルムの作製,等が主なものである.計測装置は既存の装置を使用できるが,消耗品類として配線・同軸ケーブルやコネクタ類,小型の増幅器ユニットおよびフィルタ等の電子部品,を購入する.また真空・低温関連の部品も若干購入を予定している.
非侵襲血糖値センサーの実現を目指した超音波アシスト中赤外分光イメージング

(I)超音波定在波による試料内部の反射面創成(i)高効率パラメトリック定在波生成試料内部に発生させた超音波定在波により任意の深さに屈折率差(=反射面)を発生させて光を反射させる可変光路長の反射面創生方法の検証を行った。ラットを用いた動物実験により、耳内部に非線形現象によるパラメトリック効果により4倍音の高次高調波の周波数により反射面が形成されていることを確認した。また、中赤外分光イメージングにより、グルコース固有の吸収ピーク(@9.25マイクロメーター、9.65マイクロメーター)を確認した。(II)豆粒大中赤外分光イメージングユニットの試作(i)高開口数高感度光学系の構築前記動物実験から、高開口数レンズによる計測が有効であることが判明した。そこで、光軸長を短くして開口数を大きくした、豆粒大の高感度中赤外分光イメージングユニットの設計製作を行った。これは、対物レンズの背面を2自由度に傾けたプリズムを形成したポイントワンショット中赤外分光装置である。N.A.(数値開口数:Numerical Aperture)を0.9まで上げることが可能であり、高感度化と同時に焦点深度を極めて浅くすることが可能である。これにより、皮膚表層近傍からの反射光を検出する際でも、皮膚表面からの強い反射光の悪影響を除去することが可能となる。試作した豆粒大ポイントワンショット中赤外分光装置から、対物レンズの非球面化と反射防止コーティングの重要性が判明した。そこで、光学シミュレーター(CodeV)により非球面係数を求めて新たな試作に着手している。皮膚内部の超音波パラメトリック効果により、ラット耳内部からの反射光を分光することによりグルコース固有の吸収ピークを実験的に確認するに至っている。更に、この動物実験結果に基づいて、当初想定していたワンショット分光法を更に高感度化できる豆粒大ポイントワンショット中赤外分光法へ改善して特許出願した。また、装置の試作を行った結果を踏まえて光学シミュレータにより、非球面係数などの具体的な指針を得ることができた。高開口数(N.A.=0.9)の豆粒大ポイントワンショット中赤外分光装置の試作を進める。試作装置の干渉鮮明度や感度などの実機検証を行い、更なる装置改善を進める。また、試作した装置によりラット耳内部からの反射光の分光特性から血糖値の検量線を作成する。また、超音波定在波により創成した反射面の時間的な安定性の評価も進める。
種特異的性行動を規定するｆｒｕ遺伝子とｆｒｕ神経回路の解明

動物は種によって独特の行動を示す。本研究では、求愛行動様式に歴然たる相違のあるショウジョウバエ2種、Drosophila melanosgaterとD. subobscuraに着目して、なぜ行動の違いが生まれるのかを解明した。あらゆる行動は、特定のニューロンが決まった順序で活動することによって生み出される。研究の結果、fruitlessという遺伝子のスイッチがどのニューロンでオンになるかが変わることによって、種ごとの行動の違いが生まれる可能性が示された。本研究の主たる目的は、行動様式に見られる種差を、特定の遺伝子の変異によってもたらされる神経回路の変容によって、単一細胞レベルで理解することにある。対象とするのは雄の求愛行動である。遺伝的モデル生物であるDrosophila melanogasterをホストに、求愛行動のマスターコントロール遺伝子とされるfruitless(fru)の推定調節配列を同属別種のsubobscuraから移入し、その配列の制御下に神経回路を構築させることで、求愛行動そのものの「種間移植」を試みる。その上で、求愛行動の種差を規定するニューロンを同定し、行動の進化の基盤となる遺伝子と神経回路の変化を特定することが目標である。今年度はその第一歩として、ゲノム配列情報のないsubobscuraから、fru遺伝子最遠位側プロモータ上流31kbをクローニングし、その塩基配列を確定した。続いてこの推定調節配列の異なる領域に由来する諸断片とGAL4コード配列とを融合させたminigenes(sub fru 5'-GAL4s)を各種作成し、それを持つキイロショウジョウバエ形質転換系統を多数確立した。形質転換にあたっては、ゲノムの任意の位置に挿入の起こるpPTGALベクターの他、ゲノムにあらかじめ組み込まれたAttP siteに挿入の起こるP[acman]ベクターを用いて、導入したsubobscuraの配列の転写活性化能をin vivoでの機能アッセイによって評価した。すなわち、UAS-fruを介して運動ニューロンにFruタンパク質を発現させると、そのニューロンが雄特異的筋肉であるローレンス筋(MOL)を誘導する能力を獲得することを利用して、subfru5'-GAL4の機能評価を行った。野生型melanogaster雄ではA5節にMOLが一対形成されるのに対し、subobscura雄はDrosophila属で唯一、A4とA5にMOLを有することが知られている種である。このアッセイの結果、少なくともpPTGALベクターを用いた形質転換系統の一部でMOLが二対形成され、この手法で神経細胞の種特異的形質を異種に移植可能であることが明らかとなった。今後、さらに行動形質の解析とニューロンでのGAL4発現パターンの検討をすすめてゆく。本研究の到達目標は、種ごとに異なる行動様式がどのような神経回路レベルの変化に根差しているのかを特定し、その神経系の種差を生み出す遺伝的基盤の解明を通じて行動の多様化を導く進化機構を探究することである。平成25年度には、以下の3つのアプローチをとり、それぞれ記載の通りの実績を挙げた。1. Drosophila subobscuraのfru神経回路をD. melanogasterに移築するアプローチsubobscuraのfru遺伝子の推定制御領域にGal4を接続した人工遺伝子、sub fru5'-Gal4をmelanogasterに導入し、それを用いてdTrpA1を強制発現することで、Gal4発現ニューロンの人為的活性化の効果を検討した。Gal4発現細胞の一括的活性化の結果、subobscuraに特徴的と思われる求愛行動要素が惹起され、さらにMARCMを用いた一部の細胞に限定的な活性化によっても、同様の行動が誘導できた。2. Drosophila simulansとD. melanogasterの雑種個体の配偶者選択特性の分析遺伝学を縦横に駆使できるD. melanogasterには種間雑種個体の得られる同胞種が存在している。その一つ、simulansの雄は、melanogasterの雌には求愛しない。一方、melanogasterの雄は両種の雌に求愛する。種間雑種雄の配偶者選択を調べたところ、melanogaster雌には求愛しない“simulans型"であることが分かった。さらなる検討の結果、配偶者選択の種差は性フェロモンとして働く体表の炭化水素への反応の違いによって説明できる可能性が示唆された。そこでフェロモン受容ニューロンを標識した結果、種間雑種個体とmelanogasterとの間に相違を見出すに至った。3. Drosophila subobscuraのゲノム改変による求愛行動の解析D. melanogasterに移築するのではなく、D. subobscuraそのものでの神経回路の解析を可能にすべく、subobscuraでの遺伝子操作を、CRISPR/Cas9によって行うことに着手した。本研究は、動物の行動に見られる顕著な種特異性(多様性)が、どのような遺伝子のメカニズムにより、また神経メカニズムにより生み出されるのかを、ショウジョウバエの性行動に着目して解明することを目的としている。Drosophila melanogaster(キイロショウジョウバエ)を用いた研究から、fruitless(fru)遺伝子が性行動を作り出す上で中心的な役割をしていることがわかっているので、性行動様式が種ごとに異なっている要因にfru遺伝子の発現、機能の種差があると推察される。そこで、melanogasterとは明確に異なる性行動様式を示すD. subobscuraからfru遺伝子をクローニングし、その推定発現領域にGAL4を接続したtransgene、sub-GAL4を持つmelanogaster形質転換体を作成して、sub-GAL4発現ニューロンを標識、同定するとともに、それらを強制的に活性化して生ずる行動を解析する。

本年度は、subobscuraのfru遺伝子の最遠位側プロモーターから上流約31kbまでのゲノム配列をdriverに用いて温度感受性dTrpA1チャンネルをコードする導入遺伝子をmelanogasterに発現させ、温度シフトを与えて全てのsub-GAL4発現ニューロンを強制的に活性化する実験を行った。その結果、単独で観察容器に入れられたmelanogaster形質転換体の雄個体に一連の性行動が誘導され、melanogasterではほとんど見られずsubobscuraで普通に観察される両側の中脚を前後に振り動かす行動、swingingも繰り返し生じた。すなわち、sub-GAL4により、行動様式の種間移植が部分的に可能であることが明らかになった。本研究は、雄の求愛行動神経回路の構築にあたってマスターレギュレーターとして働くfruitless遺伝子に着目し、行動の種差を生み出す遺伝子機構の解明を目的としている。具体的には、モデル動物であるDrosophila melanogasterを対象として、固有の行動レパートリーを有する非モデル種、D. subobscuraの求愛制御にどのような変化が生じているかを明らかにすることを目指す。これまでに、subobscuraからmelanogasterに移入したfruitless制御配列が、melanogasterの内在性Fruitlessを持たないニューロンにも遺伝子発現を誘導しうること、及びsubobscura由来の制御配列支配下にニューロンの強制活性化を行うと、subobscura固有の求愛パターンに類似した行動が惹起されることを示した。しかしこれらの結果は、subobscura由来のfruitless制御配列を、nativeなfruitless座とは無関係なゲノム部位(Attp2部位)に挿入して得られたものであり、melanogasterの内在性fruitless発現の効果と比較することは十分に合理的とは言えない。そこで今年度は、subobscura由来の制御配列の相同部分をmelanogasterゲノムから得て、これをAttp2部位に挿入することとした。すでに、melanogaster由来の制御領域にGal4を接続したmini-geneの作成に成功している。これとは別に、subobscura個体を用いて、その内在性fruitless遺伝子を操作し、ニューロン回路と行動の特性に対するその効果を解析することが望まれる。その実現に向け、CRISPR/Cas9システムを用いてsubobscuraのゲノム編集を開始し、fruitless遺伝子中に欠失変異を導入することに成功した。動物の行動様式は、種ごとに異なっている。
夜間低酸素血症によるNASH線維化進展機構の解明とその新規対処法の確立

本研究の目的は、メタボリックシンドロームと密接な関係を有する睡眠時無呼吸症候群(SAS)患者を対象とし、それに比較的高頻度に合併する、未だ有効な治療法が存在しない非アルコール性脂肪肝炎(NASH)の病態解明を試み、その線維化進展を予防する薬物療法によらない新たな治療戦略を確立することである。非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)は、単純性脂肪肝(NAFL)と、炎症・線維化を伴い肝硬変に進展しうるNASHに分けられる。本研究ではNAFLDを合併したSASにおいて、SASの第一選択治療法である持続陽圧呼吸療法(CPAP)を行って夜間低酸素血症を改善させることにより、肝障害や肝線維化、肝脂肪化の程度が有意に改善するかどうかを検討した。平成28年度から平成30年度において当院を受診してSASと診断された患者のうち、本研究に登録できた患者数は計139人であった。患者の背景肝は、正常肝39人、NAFLD 77人、アルコール性肝障害21人、B型慢性肝炎1人、C型肝硬変1人であった。NAFLDを背景肝とするSAS 77名のうち、半年間のCPAPの治療を行い、CPAP治療前と半年後の臨床生化学的検査結果が得られた50人をまず抽出した。さらにこのうち、CPAP治療前のALT値が30U/L以上、および半年間のCPAPの使用率が良好で、CPAP治療前・半年後において体重変化が見られなかった17人を抽出し、CPAP治療前・半年後のデータを比較検討した。また、肝線維化と肝脂肪化の程度については肝フィブロスキャンを用い、肝線維化の程度の指標としてLSM値を、肝脂肪化の程度の指標としてCAP値を測定した。治療半年後において、LSM値やCAP値、血清学的肝線維化マーカーに変化は認められなかったが、AST値、ALT値の有意な改善を認め、CPAPのSAS合併NAFLDに対する有効性が示唆された。この研究のまず第一の目的は、SAS(睡眠時無呼吸症候群)の患者に対し、CPAP(持続陽圧呼吸)を行って夜間低酸素血症を改善させることにより、それがSASに高率に合併するNAFLD(nonalcoholic fatty liver disease)やNASH(nonalcoholic steatohepatitis)による肝障害(肝の脂肪化、硬化度)へどのような影響をおよぼすかどうかを検討することである。夜間低酸素血症が改善することにより、肝の脂肪化や硬化度が改善する可能性がある。平成28年10月1日から平成29年1月31日までに、当院にてSASと診断され、CPAPが新規で開始された27症例を集めることができた。それぞれインフォームドコンセントを行い、研究への参加の同意書を得ている。それらすべての症例より採血にて血清を得て、身長、体重、飲酒歴、喫煙歴、採血データ(肝機能、脂質、血糖、肝硬化度の指標となるM2BPGiなど)、およびフィブロスキャンによる肝の脂肪化、硬化度のデータを得ることができた。それらの27症例はすべて平成29年4月1日から、順次にそれぞれCPAPを開始してから約半年後にあたる日に二回目の採血を行って一回目と同様のデータを得、体重測定、およびフィブロスキャンによる肝の脂肪化、硬化度のデータを得ている途中である。まだ二回目のデータの採取は始まったばかりで、これから解析に入るところである。さらにこれら27症例は、CPAPを開始して約1年後の平成29年10月1日から平成30年1月31日までに三回目のデータを得る予定である。27症例とは別に、平成29年4月1日から新たに新規の症例の収集も開始しており、すでに8症例が追加されている。今後総計で60症例を目標としている。平成28年10月1日から平成29年1月31日までに睡眠時無呼吸症候群で新規にCPAPを開始し、研究に参加していただいた症例は27例であった。目標は30例であったためやや症例数は少ない。しかしすべての症例で採血データ、フィブロスキャンによる肝の脂肪化、硬化度のデータを得ることができ、さらに平成29年4月1日から新たに8症例を得ることができおおむね順調と考えている。本研究の目的は、夜間間欠的低酸素状態にある睡眠時無呼吸症候群(SAS)の患者において、それに高頻度に付随する非アルコール性脂肪肝炎(NASH)の病態解明と、その線維化進展を予防する薬物療法によらない新たな治療戦略を確立することである。SASの患者において、持続的陽圧呼吸療法(CPAP)による低酸素血症の改善が肝の線維化や脂肪化の進展の予防・改善に寄与することが認められれば、治療効果が期待できる患者の囲い込みを行い、現在有効な治療法が見当たらないNASHの治療の新たな治療戦略を確立することができる。本研究では当初よりSAS患者の登録収集に努め、平成29年度末においては登録人数は100人を超えている。それぞれ肝フィブロスキャンにおける肝線維化・脂肪化を数値化したデータ、および採血による肝胆道系酵素、脂質、血糖、空腹時インスリンのデータの他に種々の血清肝線維化マーカーのデータの収集を継続している。また、それぞれCPAP開始前、開始半年後、開始一年後のデータを収集し、現在、詳細なデータ解析を行っているところである。

今のところ、CPAPによって明らかな肝線維化の改善は見られてはいないが、体重減少がないにもかからわずCPAPによって夜間間欠的低酸素血症が改善され、肝障害(肝脂肪化も含む)の改善を認めるケースも見受けられる。今後、CPAPのアドヒアランス(CPAPの使用率)ごとに解析を行い、NASHの改善効果が認められる患者の囲い込みができれば、潜在的に低酸素血症が関与しているNASHに対する新たな治療法の開発に寄与できると考える。現在ではSASの患者登録数は119人であり、それぞれCPAP開始前、開始半年後、開始一年後にフィブロスキャンによる肝線維化・脂肪化のデータ採取、および血清肝線維化マーカーのデータを採取している。さらに患者登録数を増やす予定ではあるが、現在はデータの詳細な解析を行っているところである。また、実験マウスを用い、低酸素血症がNASHの発生にどのように関与しているかどうかを検討した分子生物学的な実験も進行中である。本研究の目的は、メタボリックシンドロームと密接な関係を有する睡眠時無呼吸症候群(SAS)患者を対象とし、それに比較的高頻度に合併する、未だ有効な治療法が存在しない非アルコール性脂肪肝炎(NASH)の病態解明を試み、その線維化進展を予防する薬物療法によらない新たな治療戦略を確立することである。非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)は、単純性脂肪肝(NAFL)と、炎症・線維化を伴い肝硬変に進展しうるNASHに分けられる。本研究ではNAFLDを合併したSASにおいて、SASの第一選択治療法である持続陽圧呼吸療法(CPAP)を行って夜間低酸素血症を改善させることにより、肝障害や肝線維化、肝脂肪化の程度が有意に改善するかどうかを検討した。平成28年度から平成30年度において当院を受診してSASと診断された患者のうち、本研究に登録できた患者数は計139人であった。患者の背景肝は、正常肝39人、NAFLD 77人、アルコール性肝障害21人、B型慢性肝炎1人、C型肝硬変1人であった。NAFLDを背景肝とするSAS 77名のうち、半年間のCPAPの治療を行い、CPAP治療前と半年後の臨床生化学的検査結果が得られた50人をまず抽出した。さらにこのうち、CPAP治療前のALT値が30U/L以上、および半年間のCPAPの使用率が良好で、CPAP治療前・半年後において体重変化が見られなかった17人を抽出し、CPAP治療前・半年後のデータを比較検討した。また、肝線維化と肝脂肪化の程度については肝フィブロスキャンを用い、肝線維化の程度の指標としてLSM値を、肝脂肪化の程度の指標としてCAP値を測定した。治療半年後において、LSM値やCAP値、血清学的肝線維化マーカーに変化は認められなかったが、AST値、ALT値の有意な改善を認め、CPAPのSAS合併NAFLDに対する有効性が示唆された。平成29年4月1日からさらに症例数を増やし、まずは総計で60症例を目標としている。CPAPによる夜間低酸素血症の改善が、SASに高率に合併するNAFLDやNASHによる肝障害(肝の脂肪化、硬化度)の改善に結びつくことが明らかになれば、その患者の臨床的背景を明らかにし、それに基づいてCPAPによるNASHの治療の臨床試験へと発展させることができると考えている。さらに今後は、特殊なチャンバーを用いてマウスに周期的な低酸素状態を暴露させ、実際に低酸素血症が肝の脂肪化をもたらし、特に脂肪肝マウスの肝においてNASHと同様に炎症や線維化の進展をもたらすか否かについて解析する。その後、低酸素血症がNASHの発症、進展に関与する理論的根拠を確立させる。今後さらに患者登録数を増やし、平成30年の夏までには150人を目指している。
大名家を介した地域文化と都市演劇文化交流史の研究

近世の地域文化形成において、大名家を介した都市演劇文化享受がどのような影響を与えていたかを解明するため、対馬藩、大和郡山藩の事例を中心に研究を進めた。第一に、対馬藩において、江戸藩邸および国元での演劇上演記事について整理した。宗家の大名一族が機会をとらえては江戸や大坂・京で人形浄瑠璃や歌舞伎を観覧していた状況が把握できている。これらの関心の高さが、従来から注目している、国元における小姓による操り上演へとつながったことが確認された。なお、継続してきた江戸藩邸における演劇上演記事の翻刻紹介について、当初からの目標としてきた享保期までの翻刻紹介と調査研究論文をまとめることができた。第二に、大和郡山藩の藩主を中心とする演劇享受の実態について、引き続き、『松平美濃守日誌』の研究を進めた。大坂の浄瑠璃太夫を招き、最新の演目の浄瑠璃を藩主自ら稽古していた実態が、具体的な演目の情報を分析することによって、明らかになってきている。大坂と大和郡山の地理的な近さから、当初想定していた江戸藩邸における都市演劇文化の享受だけにとどまらない影響が認められ、さらに視野を広げた研究の必要性を認識した。第三に、鳥取藩の元禄期の江戸藩邸における演劇享受や、武士が芝居町に出かけて観覧していた実態が藩士の日記および藩政史料から知る事ができるという事例について、特に国元での演劇文化への関心の高さとそのニーズにいかに鳥取藩側が対応したかといった問題にも視野を広げて研究を進めた。対馬藩宗家文書について、東京大学史料編纂所および対馬歴史民俗資料館の所蔵資料を調査し、情報を収集してきた。それらの記事から得られる演劇文化や地域文化に関する情報の重要性を認識し、年次的な継続公開を実施してきた。今年度、公開の下限として目標としていた享保期までの記事について翻刻紹介を完了することができた。大和郡山藩の『松平美濃守日誌』の読解に伴い、第一に都市演劇史への位置づけ、第二に大和郡山藩の地域文化との関連を視野に入れて研究を進められた。藩政史料と照らし合わせる作業もおおむね順調に進めることができた。第一に、対馬藩宗家については、江戸藩邸における享保期までの上演記録の翻刻紹介を完了したことを受けて、国元における演劇関連記事の研究を進める予定である。国元における演劇上演記事に加え、藩主の母親が湯治として旅に出て、大坂・京の歌舞伎を観覧していた事例や、藩主が参勤交代の途上、大坂屋敷においても演劇を呼んでいた事例などにも注目して分析していく。第二に、大和郡山藩の『松平美濃守日誌』について、演劇関連記事の調査研究を完了するとともに、その上で全文の翻刻紹介を目指したいと考えている。近世の地域と都市の文化がどのような関係性をもって交流していたのかを、大名家を媒介とする演劇文化享受の調査を通して解明するため、対馬藩、大和郡山藩の文書調査などを中心に研究を進めた。第一に、江戸藩邸における演劇文化享受の実態について研究を進めた。さらに共同研究を行い、研究成果の一部をEAJS(2017年9月2日・リスボン新大学)で「大名屋敷における歌舞伎ー見物客たちー」のテーマで報告した。大名屋敷において座敷内や庭に仮舞台を設置して演劇を上演していた実態や、足軽小者や女中などを含め家中を挙げて見物していた事例が認められることを明らかにした。さらに、江戸の大名屋敷において芝居町の舞台と同様の演劇文化を享受したいという要望が存在し、それに対応した事例も少数ながら見られることに注目した。袖岡政之助や市川団十郎の上演記録を通して、その実態について考証した。大名屋敷が歌舞伎界を支える一定の基盤であり続けたことを示し、藩邸で享受した演劇文化が各藩の国元に運ばれ、地域文化形成に寄与していたことを明らかにした。第二に、対馬藩において、江戸藩邸で人形操りの演者から指導を受けた小姓たちが国元で上演している事例に注目し、対馬藩邸での上演記事について翻刻紹介を行った。特に『江戸藩邸毎日記』から抽出した歌舞伎・浄瑠璃等上演記事(元禄十五年から宝永六年まで)を翻刻し、演劇を享受していた対馬藩の状況について考証した結果をまとめた。第三に、大和郡山藩における藩主が中心となった演劇享受の実態を明らかにするため、柳沢文庫所蔵の『松平美濃守日誌』について読解、研究を進めた。全貌の解明を目指して、調査研究を継続している。さらに、演劇享受に留まらない、文化的歴史的価値が見出されることから、翻刻紹介の必要性を認識し、検討している。歌舞伎と観客というテーマでの共同研究を進められ、予定通り、EAJSにおいてパネル発表を実施することができた。パネル発表を通じて研究成果を共有したことにより、本研究の対象である近世初期の演劇文化にとどまらず、近世中期、後期における歌舞伎文化の享受についての知見を得られ、大名家の演劇享受が文化形成に果たした役割に関して、江戸時代を通したおおよその見通しを立てることができた。対馬藩宗家文書の上演記事の考証と調査研究の成果については、継続的に公開を行っていて、今年度も予定していた範囲の翻刻紹介を完了した。これまで個別に調査を進めてきた対馬藩宗家文書、加賀藩前田家文書、岡山藩池田家文書、大和郡山藩柳沢家文書における上演記事について、大名家の演劇文化享受と国元への影響という観点で、総合的な研究を行った。複数の大名家に共通した要素を見出すことができて、今後の研究の見通しを立てることにつながった。大和郡山藩柳沢家文書についての考証もおおむね予定通り、進めることができた。