hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
格子量子色力学に基づくクォーク・グルーオンの非摂動的性質の解明と有効理論の構築

カラーの閉じ込めとカイラル対称性の自発的破れは,量子色力学を理解する上で重要な2つの非摂動現象である.そして,有限温度においてほぼ同時に相転移を示す点などから,これらの現象は互いに深く関連したものと考えられているが,直接の対応については不明な点が多い.本研究では,両者の関係を論じるため,カイラル対称性の自発的破れに重要となるDirac演算子の固有状態に注目し,格子量子色力学を用いて閉じ込め現象に対するDirac固有状態の寄与を解析した.その結果,カイラル対称性の破れに重要となるDirac演算子の低固有値状態がない場合であっても,閉じ込めを特徴付けるクォーク間の線形ポテンシャルは依然として存在すること判明した.また,有限温度での非閉じ込め相転移に関しても研究を進め,閉じ込めに対して特別に重要であるDirac固有状態はないという結果が得られた.これらの成果は,両者の非摂動現象間の対応が単純な1対1対応でない可能性を示唆する興味深い成果である.また,量子色力学の相互作用を媒介するグルーオンの自由度に注目し,ハドロンの弦的励起状態やCoulombゲージでの閉じ込め描像へのグルーオンの寄与の解析を行った.ハドロンの弦的描像からは,そのハドロン弦の振動に由来する状態も予想されており,実験的にも振動状態の候補が発見されている.この研究では,これらの弦的励起状態への紫外のグルーオンの寄与を解析し,Coulombゲージでは1.5GeV以下のグルーオン成分が重要となることを明らかにした.また,Coulombゲージ閉じ込め描像では,Faddeev-Popov演算子の非自明なゼロ固有値近傍の状態がクォークの閉じ込めに重要な役割を果たすと考えられている.この研究では,これらの非自明な固有状態が生じる原因は赤外のグルーオン成分であることを明らかにした.格子量子色力学を用いて,カイラル対称性の自発的破れに重要となるDirac演算子固有状態から閉じ込め力や有限温度における非閉じ込め相転移を解析し,カイラル対称性の自発的破れと閉じ込め現象とは,単純な1対1対応でないことを明らかにできた.また,ハドロン弦の振動による励起状態ならびにCoulombゲージ閉じ込め描像に関して,量子色力学の基本的要素であるグルーオンに注目して解析を行い,それらの状態に寄与するグルーオンの運動量成分を明らかにできた.本研究で進めたカイラル対称性の自発的破れと閉じ込めとの対応について,更に明らかにするためには,高精度のより詳細な数値解析を行う必要がある.しかし,現状での我々の開発したDirac演算子固有状態での分解手法では,膨大な計算コストが必要であり,このままでは精密な解析は困難である.したがって,更に効率のよい計算手法の開発や高性能の計算機の利用が不可欠である.また,これら非摂動的量子色力学真空の性質の理解を進める為には,カイラル対称性の破れだけに注目するのではなく,閉じ込めのみに重要な要素・状態とは何かを明らかにするための研究も必要となる.クォークの重要な非摂動的性質としてカイラル対称性の自発的破れと閉じ込め現象があげられるが、この両者の関係を解析することは困難である.そこで、この2つの非摂動的性質を同時に解析するための新しい手法の開発を格子量子色力学の菅沼・権業らと行った.この研究ではカイラル対称性の破れにDirac演算子のゼロ固有値状態が重要であることに着目し、クォーク間のポテンシャルをDirac演算子固有状態で展開することを定式化し、加えて数値計算も行った.研究の結果、たとえゼロ固有値近傍の状態を取り除き、カイラル対称性が有効的に回復した状態であっても、閉じ込めポテンシャルが依然として存在していることが明らかになった.これは、量子色力学において、カイラル対称性と閉じ込めが直接には相関しないことを示唆しており、例えば量子色力学の相構造において閉じ込め相であるがカイラル対称性は回復しているような相が出現する可能性も示唆している.また、閉じ込めに重要な自由度としてCoulombゲージでのFaddeev-Popov演算子の固有状態に注目し、その非摂動的性質について研究した.Faddeev-Popov演算子のゼロ固有値近傍の状態数密度が自由場の場合よりも増加することが、閉じ込めに強く関係すると考えられている.その非摂動的性質と量子色力学真空との関係、特にエネルギースケールとの関連について格子量子色力学を用いて解析した.具体的には、グルーオンの低運動量・高運動量成分をそれぞれ取り除き、固有状態の応答を数値的に調べることにより、エネルギースケールとの関係を研究した.その結果、低エネルギー領域の物理と閉じ込めに重要なFaddeev-Popov演算子の固有状態の性質は強く相関していることが明らかになった.カラーの閉じ込めとカイラル対称性の自発的破れは,量子色力学を理解する上で重要な2つの非摂動現象である.そして,有限温度においてほぼ同時に相転移を示す点などから,これらの現象は互いに深く関連したものと考えられているが,直接の対応については不明な点が多い.本研究では,両者の関係を論じるため,カイラル対称性の自発的破れに重要となるDirac演算子の固有状態に注目し,格子量子色力学を用いて閉じ込め現象に対するDirac固有状態の寄与を解析した.その結果,カイラル対称性の破れに重要となるDirac演算子の低固有値状態がない場合であっても,閉じ込めを特徴付けるクォーク間の線形ポテンシャルは依然として存在すること判明した.また,有限温度での非閉じ込め相転移に関しても研究を進め,閉じ込めに対して特別に重要であるDirac固有状態はないという結果が得られた.これらの成果は,両者の非摂動現象間の対応が単純な1対1対応でない可能性を示唆する興味深い成果である.

また,量子色力学の相互作用を媒介するグルーオンの自由度に注目し,ハドロンの弦的励起状態やCoulombゲージでの閉じ込め描像へのグルーオンの寄与の解析を行った.ハドロンの弦的描像からは,そのハドロン弦の振動に由来する状態も予想されており,実験的にも振動状態の候補が発見されている.この研究では,これらの弦的励起状態への紫外のグルーオンの寄与を解析し,Coulombゲージでは1.5GeV以下のグルーオン成分が重要となることを明らかにした.また,Coulombゲージ閉じ込め描像では,Faddeev-Popov演算子の非自明なゼロ固有値近傍の状態がクォークの閉じ込めに重要な役割を果たすと考えられている.この研究では,これらの非自明な固有状態が生じる原因は赤外のグルーオン成分であることを明らかにした.クォークの重要な非摂動的性質であるカイラル対称性の自発的破れと閉じ込めを同時に扱い、その関係を議論することのできる新しい格子量子色力学の解析手法の開発ができた.また、その手法を用いて実際に格子量子色力学の数値計算を行い、両者の直接の関係を調べた.そして、カイラル対称性が回復した状態であっても、閉じ込めの性質は残るという非常に興味深い結果を得ることができた.格子量子色力学を用いて,カイラル対称性の自発的破れに重要となるDirac演算子固有状態から閉じ込め力や有限温度における非閉じ込め相転移を解析し,カイラル対称性の自発的破れと閉じ込め現象とは,単純な1対1対応でないことを明らかにできた.また,ハドロン弦の振動による励起状態ならびにCoulombゲージ閉じ込め描像に関して,量子色力学の基本的要素であるグルーオンに注目して解析を行い,それらの状態に寄与するグルーオンの運動量成分を明らかにできた.新たに開発した格子量子色力学の諸量をDirac演算子固有状態で展開する解析手法を、既に行ったクォーク間ポテンシャルだけでなく他の非摂動的な物理量の計算に応用する.まずは、閉じ込めの秩序変数であるPolyakov loopの解析があげられる.特に、有限温度での振る舞いについて研究を行う.また、Coulombゲージでの閉じ込めに重要な自由度と考えられるFaddeev-Popov演算子固有状態に関しても、Dirac演算子固有状態での分解と同様の解析手法の定式化とその数値解析を行う.本研究で進めたカイラル対称性の自発的破れと閉じ込めとの対応について,更に明らかにするためには,高精度のより詳細な数値解析を行う必要がある.しかし,現状での我々の開発したDirac演算子固有状態での分解手法では,膨大な計算コストが必要であり,このままでは精密な解析は困難である.したがって,更に効率のよい計算手法の開発や高性能の計算機の利用が不可欠である.また,これら非摂動的量子色力学真空の性質の理解を進める為には,カイラル対称性の破れだけに注目するのではなく,閉じ込めのみに重要な要素・状態とは何かを明らかにするための研究も必要となる.
精製栄養素注入飼育子牛における十二指腸への内因性蛋白質流入量

若齡子牛では、反芻胃の発達にともない、十二指腸へ移行する内因性窒素量が変化することが予想される。本研究では、第一胃内と第四胃内に注入する精製栄養素だけで飼育した若齡子牛を用い、第一胃から第三胃以降へ流出する窒素量を測定し、十二指腸へ移行する内因性窒素量に及ぼす要因について検討した。試験には第一胃と第四胃にカニューレを装着したホルスタイン雄子牛3頭を用いた。子牛には、第一胃内へ窒素を含まない揮発性脂肪酸混合液、緩衝液および主要ミネラルを、第四胃内へカゼイン、微量ミネラル、ビタミンをそれぞれ4週齡から注入し、これらの精製栄養素のみで14週齡まで飼育した。注入栄養水準は維持の1.3倍とした・また、1頭の子牛については12週齡から第四胃内へグルコースを追加注入することにより、栄養水準を維持の1.6倍に高めた。6・8週齡(2頭)および12・14週齡(グルコース注入した1頭)において指標物質を用いて第一胃内溶液量と第一胃からの流出液量を測定し、同時に測定した第一胃内溶液中窒素濃度をもとに、第一胃からの内因性窒素流出量を算出した。また、頸静脈血を採取し、血漿中尿素態窒素と遊離アミノ酸濃度を測定した。得られた結果は以下の通りである。6・8週齢での第一胃からの窒素流出量は平均133mg/BW^<0.75>であり、8週齢(159mg/BW^<0.75>)の方が6週齢(105mg/BW^<0.75>)よりも多かった。グルコースを第四胃内注入した子牛(12・14週齢)では、第一胃からの窒素流出量は平均24mg/BW^<0.75>と少なかった。血漿中の尿素態窒素および遊離アミノ酸濃度はグルコース注入により低下した。そのため、第一胃からの窒素流出量と血漿中尿素態窒素および遊離アミノ酸濃度の間には有意な正の相関関係が得られた。以上のことから、第一胃から流出し十二指腸へ移行する内因性窒素量は、子牛の成長にともない変化するだけでなく、体内での窒素代謝の影響も受けるものと考えられた。
マウスモデルを用いたエイズ合併クリプトコックス症の内因性再燃発症に関する研究

クリプトコックスはエイズの重要な日和見病原真菌であり、重篤な髄膜脳炎を引き起こす。近年、クリプトコックス症は免疫低下による内因性再燃として発症すると考えられており、その病態解明のために、マウスの潜伏感染モデルを用いてメモリーT(Tm)細胞の動態を解析した。さらに、本真菌の主要なT細胞抗原に特異的なT細胞受容体を発現したトランスジェニック(Tg)マウスの作製を試み世界に先駆けて成功した。このマウスでは、クリプトコックス感染後顕著なIFN-γ産生がみられ、真菌排除が促進した。このマウスを用いることで、感染後のTm細胞の動態及び内因性再燃時のTm細胞への影響をより正確に解析することが可能となった。クリプトコックスはエイズの重要な日和見病原真菌であり、エイズの進行とともに重篤な髄膜脳炎を引き起こす。近年、クリプトコックス症は免疫低下による内因性再燃として発症すると考えられており、その病態を解明するために、マウスのクリプトコックス持続感染モデルを用いて感染後のメモリーT(Tm)細胞の動態について解析を行った。クリプトコックス感染後の肺では、3から5日にかけてCD44^<bright>CD127^-エフェクターT細胞が増加し、その後2から3週にかけて減少した。一方、5日から3週にかけてCD44^<bright>CD127^+ Tm細胞の増加が観察され、CD4^+細胞はほとんどがCD62L^+(エフェクターTm)であったのに対してCD8^+細胞ではCD62L^+(セントラルTm)が優位な集団であった。興味深いことに、感染3日後の早期に、肺内のCD4^+ Tm細胞、CD8^+ Tm細胞が大量のIFN-γを産生することを見出し、自然免疫相で積極的に感染防御に関与する可能性が示唆された。また、感染7日後にはTh1型のみならずTh17型のTem細胞の存在も確認された。これらの解析はC57BL/6マウスを用い、表面抗原解析のみでTm細胞の同定を行ったことから、必ずしもクリプトコックス特異的なTm細胞を検出しているわけではない。そこで、特異的なTm細胞解析を行うためのプローブとして、本真菌の主要なT細胞抗原であるマンノプロテイン(MP98)から決定した抗原エピトープを結合したMHCIIテトラマーの作製を試みており、今年度はMP98の細分化と大腸菌発現システムの構築を行った。また、Tm細胞のより正確な解析を目的として、同エピトープに特異的なT細胞受容体を発現したトランスジェニック(Tg)マウスの作製を試みており、'今年度はMP98応答性T細胞ハイブリドーマP1D6からT細胞受容体α鎖、β鎖遺伝子の未知塩基配列を決定し発現プラスミドに組み込んだ。次年度はTgマウスの作製を完了し、MHCIIテトラマーをプローブとして用いることで、クリプトコックス特異的なT細胞免疫記憶応答機構の解析を実施する。近年、クリプトコックス症は免疫低下による内因性再燃として発症すると考えられており、その病態解明のためにマウスの持続感染モデルを用いてメモリーT(Tm)細胞の動態を解析した。本モデルでは、肺内生菌数が感染後徐々に減少するものの、7ヶ月後でも500CFU/マウス程度で感染が持続した。このマウスにデキサメサゾンを投与すると、有意に菌数が増加し感染の再燃が観察された。この時の肺内におけるTm細胞を解析すると、内因性再燃群においてIFN-γを発現するTm細胞の減少が観察され、このことが免疫不全にともなう内因性再燃の発症と深く関連していることが示唆された。しかしながら、これらの解析は細胞表面マーカーのみでTm細胞の同定を行ったことから、必ずしも抗原特異的なTm細胞を検出しているとはいえない。そこで、本真菌の主要なT細胞抗原であるMP98に特異的な受容体(TCR)を発現したトランスジェニック(Tg)マウスの作製を試み世界に先駈けて成功した。このTgマウスの脾細胞はMP98刺激により、著明な増殖反応、IL-2、IFN-γ産生を示したのに対し、コントロールマウスではまったく反応しなかった。クリプトコックス感染により、コントロールマウスに比べ肺内で顕著なIFN-γ産生がみられ、真菌排除が促進した。

感染後3日目という急性期に肺内で著明なTm細胞の増加が観察されたが、Tgマウスを用いた解析から、初期のTm細胞の増加は近年注目されているtissue-resident Tm(Trm)細胞によるものであることが明らかとなり、感染7日目以降は抗原特異的なTm細胞の動態を明確に追跡することが可能になった。Trm細胞は細胞内にIFN-γを発現しており、抗原特異的なTm細胞のみならず、自然免疫の時相においてもTrm細胞から産生されるIFN-γが感染防御に重要な役割を果たすことが示唆された。クリプトコックスはエイズの重要な日和見病原真菌であり、重篤な髄膜脳炎を引き起こす。近年、クリプトコックス症は免疫低下による内因性再燃として発症すると考えられており、その病態解明のためにマウスの持続感染モデルを用いてメモリーT(Tm)細胞の動態を解析した。本モデルでは、肺内生菌数が感染後徐々に減少するものの、7ヶ月後でも500CFU/マウス程度で感染が持続した。このマウスにデキサメサゾンを投与すると、有意に菌数が増加し感染の再燃が観察された。肺内のTm細胞は感染3日後でCD4+、CD8+ともに増加し、7日後には一旦減少したが、その後1ヶ月にかけて再び増加を示した。傍気管リンパ節では7日後でピークとなり、その後減少するものの一定数が維持された。肺内のIFN-γ+Tm細胞は37日後でピークを示し、その後徐々に減少した。感染7ヶ月後のデキサメサゾン投与では、CD4+、CD8+Tm細胞ともにIFN-γの発現が減少したことから、内因性再燃への関与が示唆された。一方で、感染3日後にIFN-γ+Tm細胞が増加することを見出したが、これは末梢血から肺への集積によること、Cタイプレクチン受容体のシグナル伝達に重要なCARD9やI型インターフェロンがその制御に関わること、CCL4、CCL5のようなケモカインがその集積に関与する可能性があることを明らかにした。これらの解析は細胞表面マーカーのみでTm細胞の同定を行ったことから、必ずしも抗原特異的なTm細胞を検出しているとはいえない。そこで、本真菌の主要なT細胞抗原であるMP98に特異的な受容体(TCR)を発現したトランスジェニックマウスの作製を試み、TCRα鎖、β鎖遺伝子を有するマウスが得られた。次年度は、このマウスを用いることで、クリプトコックス感染後のMP98特異的な免疫記憶応答と、内因性再燃における意義について解析を実施する。当初の研究計画に従って通常のC57BL/6マウスを用いてクリプトコックス感染後のメモリーT細胞の解析を行ったが、予想以上に非特異的なメモリーT細胞の存在の影響が大きいことが分かったため、その影響を極力排除するために、当初の計画にはなかったがクリプトコックス応答性T細胞の抗原受容体遺伝子を発現するトランスジェニックマウスの作製を実施することにしたため。25年度が最終年度であるため、記入しない。クリプトコックス感染後の抗原非特異的なメモリーT細胞応答については、感染7ヶ月と長期的な解析を実施することができ、デキサメサゾン投与による免疫不全時の内因性再燃におけるメモリーT細胞への影響についても明らかにすることができた。しかしながら、本研究の最終的な目的のためにはクリプトコックス抗原特異的な免疫記憶応答の解析が必要であり、そのために抗原特異的なT細胞受容体遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを作製することが重要となる。予定では、完成したマウスを用いた解析を開始することになっていたが、作製段階で遅れが生じたため当該年度中に開始できなかった。当初の計画に従って研究を実施するが、「11.現在までの達成度」に述べた問題点への対応策として以下の点で変更を加える。
美味しさと安全をより確実に！殺菌効果と食品品質の確率論的な新たな評価方法の開発

本研究では食品の品質と殺菌効果とを両立させる安全性理論の構築を目的とする。少数の細菌で食中毒を引き起こす腸管出血性大腸菌とサルモネラを用いる。対象とする細菌集団が完全に死滅する時間を確率分布で表記し,細菌集団の死滅条件を確率に裏付けられた方法で設定する。例えば,「〇〇°C△△分以上加熱殺菌した場合,サルモネラ10万個は99.99%の確率で完全に死滅する。」といった殺菌条件を提示する。確率論に裏付けされた殺菌条件に加え,食品の品質と安全性のバランスを考える。確率論の知見に基づき品質劣化を最小限に抑えつつ,安全面も許容レベルにできるといった殺菌効果と品質保持の両面における最適化を可能とする殺菌条件を提示する。新たな安全性評価理論の構築により,実際の殺菌工程における殺菌条件の設定において,“どの程度の確率で対象とする細菌集団が完全に死滅したか?"といった製造業者やリスク評価者の関心事への回答を可能とする。今年度は,サルモネラの死滅・及び増殖をベイズ統計モデルによって解析した。滞在先のギリシャでのディスカッションの結果,不確実性を考慮したモデルづくりに着手することになった。国際共同論文の作成にいたり現在論文を2報投稿中である。今後も共同研究を引き続き行っていき,食品の品質と殺菌効果を両立させる安全性理論について研究を進めていく。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。これまでの研究としては,液体培地などを用い,サルモネラと腸管出血性大腸菌の加熱殺菌による細菌死滅時間の確率予測モデルを構築した。殺菌条件は50°Cから70°Cの範囲で5条件,複数の汚染レベルを設定し,細菌の死滅時間を確率分布で評価し比較検討した。更に,従来の化学工学的な根拠に基づく決定論的な細菌死滅の評価手法を見直し,確率論的に安全を保証した殺菌時間の設定を行った。具体的には,「〇〇°C△△分以上加熱殺菌した場合,サルモネラ10万個は99.99%の確率で完全に死滅する。」といった殺菌条件を提示した。また,10月からはギリシャに渡航し,Aristotle University of Thessalonikiで共同研究を始めた。本研究の基本となる加熱殺菌における細菌集団死滅確率評価の実験系を構築した。加熱殺菌で複数の温度帯で細菌集団の死滅確率を求められた。従来の殺菌指標との比較を行っている。簡易的に従来の殺菌評価との比較を行えた。本年度は細菌挙動の確率過程モデルの作成,コンピュータシミュレーションの基になる部分を構築した。そのため,来年につながる結果となった。現在投稿論文を作成中であり,今年度の研究をまとめることできた。また,予定通りに,Aristotle University of Thessalonikiとの共同研究も進んだ。本研究での実験系を基に今後,理論,コンピュータ・シミュレーションを作成していく。平成29年度に作成するモデル系を用いて,実施の食品系での微生物学的安全評価手法の適応可能性を検討する。

具体的には,低温殺菌を前提とする業務用加工液卵や牛乳などの液状食品の殺菌を行う。モデル系と同様に複数の汚染レベルと殺菌温度を設定し,細菌集団の死滅時間を確率分布として評価する。食品においては種々の成分(タンパク質,脂質など)の影響を細菌が受けることから,開発した予測モデルにさらに食品の影響要因を組み込む必要がある。モデル系と同様に食品での実験において確率的に保証された殺菌条件を算出し,従来の殺菌条件と比較検討する。平成29年度に引き続きギリシャでの共同研究を行う。食品系においても,顕微鏡及びコンピュータ・シミュレーションからのアプローチを行い,多角的に細菌集団の死滅時間の予測を行う。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
長鎖ノンコーディングRNA、SRAによる転写制御の構造的基礎

長鎖ノンコーディング(lnc)RNAのひとつであるSRA(steroid hormone receptor RNA activator)は、転写されたRNA分子自身が多くの因子と相互作用し、転写を調節する足場分子として機能する。SHARPタンパク質はSRAと直接相互作用し、HDACをリクルートすることで核内受容体による転写を抑制的に制御する。本研究では、SHARPによる転写調節の分子機構の解明を目指し、SHARP・SRA複合体の構造解析、またCLIP等の生化学的手法により解析を行った。SHARPのホモログRBM15や、カウンターパートとしてlncXISTの解析も行った。長鎖ノンコーディングRNAのひとつであるSRA(steroid hormone receptor RNA activator)は、転写されたRNA分子自身が多くの因子と相互作用して、転写を調節する足場分子として機能することが知られている。SHARPタンパク質は、このSRAと直接相互作用し、HDACをリクルートすることで核内受容体による転写を抑制的に制御する。本研究では、SHARP-SRA複合体の構造解析により、SRAによる転写調節の分子機構の解明を目指し、解析を行った。まず、SHARPのRRM1-4ドメインの大腸菌の発現系を構築し、これを用いて同位体ラベルした試料を調製して、多次元NMR解析を行った。現在までにRRM1、RRM234、RRM34のコンストラクトに関して、信号の分離の良いNMRスペクトルを取得に成功した。化学合成したRNAを用いてRRM1、RRM2、RRM34、RRM234との相互作用を調べたころ、RRM1は相互作用がみられず、RRM2で弱い相互作用、RRM234とRRM34では顕著な相互作用が確認された。RRM34の試料ではNMR測定中に試料の凝集が見られたため、その改善のため溶液条件の検討を行った。また現在までに立体構造の報告されていないRRM1については、多次元NMR法により、その立体構造を決定した。SHARPのRRM34とXistの直接的な相互作用をNMRで確認できた。このような非常に重要な基盤的知見が得られたこと、また立体構造未知であったRRM1に関して、多次元NMR法により立体構造を決定したことから、研究はおおむね順調に進展していると判断できる。長鎖ノンコーディングRNAの一つであるSRA(steroid hormone receptor RNA activator)は、転写されたRNA分子自身が多くの因子と相互作用して、HDACをリクルートすることで核内受容体による転写を抑制的に制御する。本研究では、SHARP-SRA複合体の構造解析により、SRAによる転写調節の分子機構の解明を目指している。まず、SHARPのRNA結合ドメインであるRRM234の安定同位体標識とNMRによる解析を行った。RRM234は極めて信号の良いスペクトルを与えた。また、現在までにその機能が未知であるRRM1については、多次元NMR法により立体構造を決定し、その構造の精密化を進めている。RRMドメインは単にRNAに結合するだけのドメインではなく、異種のタンパク質・タンパク質相互作用やRRMドメイン同士の相互作用を担うことも知られていることから、RRM間の相互作用による自己阻害等の可能性を考慮して、RRM同士の相互作用もニ次元NMR法を用いて検証した。さらに、タンパク質-RNAをクロスリンクさせるCLIP法を用いて、SHARPの標的の再探索を試みた。全長を発現する哺乳類細胞の安定株を用いて、SHARPと標的RNAを免疫沈降により得た。この際、効率のよいHalo-Tagを用いたトラップを行った。免疫沈降した複合体に結合している長いRNAを短い断片にマイルドに分解し、現在、シーケンスを解析中である。SHARPタンパク質側の立体構造解析は、RRM1の立体構造解析やRRM234のNMR解析が行われている。また標的RNAに関しては、ノンコーディングRNAであるXistもSHARPの標的の一つであると考えられることから、CLIP法の専門家である河原行郎教授を分担者に迎え、標的の探索を行いシーケンス段階まで来ている。以上より、おおむね順調に進展していると判断した。長鎖ノンコーディングRNAの一つであるSRA(steroid hormone receptor RNA activator)は、転写されたRNA分子自身が多くの因子と相互作用して、HDACをリクルートすることで核内受容体等による転写を抑制的に制御すると考えられている。本研究では、SHARP-SRA複合体の立体構造解析により、SRA等、長鎖ノンコーディングRNAによる転写調節の分子機構の解明を目指している。まず、SHARPのRNA結合ドメインであるRRM234の安定同位体標識とNMRによる帰属を行った。その機能が未知であるRRM1については、多次元NMR法により立体構造を決定した。また、CLIP法の専門家である河原行郎教授を分担者に迎え、タンパク質-RNAをクロスリンクさせるCLIP法を用いて、SHARPの標的の再探索を試み、認識配列に関する有力な情報を取得した。また本研究期間において、SHARPの標的RNAに関して、哺乳類の遺伝子量補正を担う長鎖ノンコーディングRNAであるXistもその一つであるという報告が他のグループによってなされたことから、SHARP-Xist複合体の解析についても、研究協力者のSattler教授との共同で行った。Xistを標的とした場合においても、SHARPのRRM2-3の部分との結合が観測された。

さらに、SHARPのホモログであるRBM15タンパク質もXistとの直接の結合に関与すると考えられたことから、RBM15のRRM1,RRM2,RRM3の発現系を構築して、安定同位体標識を施した試料調製に成功し、NMRによる解析を行った。RBM15については、RRM2-3の信号の帰属を完了した。長鎖ノンコーディング(lnc)RNAのひとつであるSRA(steroid hormone receptor RNA activator)は、転写されたRNA分子自身が多くの因子と相互作用し、転写を調節する足場分子として機能する。SHARPタンパク質はSRAと直接相互作用し、HDACをリクルートすることで核内受容体による転写を抑制的に制御する。本研究では、SHARPによる転写調節の分子機構の解明を目指し、SHARP・SRA複合体の構造解析、またCLIP等の生化学的手法により解析を行った。SHARPのホモログRBM15や、カウンターパートとしてlncXISTの解析も行った。2015年になり、SRAに加えて、ノンコーディングRNAであるXistもSHARPの標的RNAであることが示された。構造解析のためには詳細なXistの結合領域の知見が必要である。そのためCLIP法による標的の探索をより強力に推進するため、CLIP法の専門家である大阪大学の河原行郎教授を分担者に迎え、強力に推進する。並行して、NMRでの構造解析のための条件検討を進めていく。SHARP以外にも、ホモログであるRBM15の関与も考えられることから、RBM15の構造解析にも取り組む。またSHARP-Xist複合体の解析については、研究協力者のSattler教授との共同での解析に取り掛かる。29年度が最終年度であるため、記入しない。構造生物化学29年度が最終年度であるため、記入しない。
DNA合成酵素遺伝子の構造と機能

本研究はDNA合成を担う酵素、タンパク質因子の遺伝子の構想と機能の解析し、その生理的意義と、発現調節と細胞がん化(増殖誘導)の関係を解明することを目的とする。本年度の主な実績を以下に記す。(1)DNAポリメラーゼβ遺伝子の発現抑制領域が複数のドメインから成り、ここに結合する因子を発見した。またこの領域が複製も抑制することを見いだした。(松影)。(2)ヒトDNAポリメラーゼαの5千塩基対に及びcDNAのクローン化に成功した(花岡)ヒトターミナルトランスフェラーゼ遺伝子のエクソン、イントロン構造を決定し、B細胞とT細胞に特異的な発現調整領域を見いだした。(小祝)。(4)増殖細胞核抗原(PCNA)遺伝子の染色体座位をきめ、また先天的多発性奇形疾患でその異常をみいだした(守内)。またショウジョウバエのPCNA遺伝子上流にホメオドメインタンパク質の結合領域を発見した(松影)。(5)B型肝炎ウイルスの逆転写酵素遺伝子のプロモーターに結合する肝細胞特異的な因子を見いだした。(柳沼)。(6)ヒトチミジル酸合成酵素遺伝子の第一イントロンにエンハンサーが存在し、細胞周期存在性発現に関与している可能性を示唆した(竹石)。(7)トポイソメラーゼIの機能を抑制するとc-fos遺伝子の発現が誘導されること発見し、さらにこれがタンパク質リン酸化反応を必要とすることを示した(安藤)。(8)ひとc-myc遺伝子上流にあるc-mycタンパク質結合領域が複製開始点およびエンハンサーとして機能することを見いだした。またc-mycタンパク質がN-myc遺伝子発現を抑制することも示した(有賀)。(9)ヒトc-myc遺伝子上流の複製開始領域配列をもつプラスミドを試験管内で複製させることに成功し、必要な酵素の同定を行った(吉田)。(10)ひと21染色体の60%をカバーする遺伝子ライブラリーの作成に成功した(大木)。(松影)。(小祝)。(柳沼)。
妊娠の成立・維持に於ける免疫調節機構の解析

胎児・胎盤系は父方組織適合抗原を表現しているので、母体にとっては異系移植片となる。妊娠の成立と維持には、これらの抗原によって惹起される免疫応答を調節する機構が、母樹間の接点に作動していると考えられる。この機構を解析するために、我々は胎盤の絨毛細胞に注目し、その産生する免疫抑制物質の生物活性をヒト免疫応答系を用いて検討した。絨毛癌細胞株は正常絨毛細胞と同一の物質を産生しているので、我々はその培養上清を用いた。免疫応答の中心的役割はT細胞が担うことから、その物質がヒトT細胞の活性相・増殖相・分化相へ及ぼす影響を調べた。T細胞をホルボルエステルとカルシウムイオノフォアで刺激すると、IL-2依存性増殖反応を示す。この系へ上清を添加すると、活性化相でみられるTac抗原発現とIL-2産生は抑制されなかったが、増殖反応が抑制された。この物質の作用部位は、ILー2とIL-2レセプタ-結合後の細胞内情報伝達経路であった。高濃度のホルボルエステルでT細胞を刺激すると、IL-2非依存性増殖をするが、抑制物質は活性化相を抑制せずに増殖相を抑制した。このT細胞増殖反応特異的抑制により、父方抗原反応性T細胞は生成できなかった。一方、T細胞がIL-2によりLAK細胞が誘導されるが、その系への影響も検討した。LAK細胞にはこの物質で生成が阻害される細胞群と生成が阻害されぬ群とが存在することが明らかとなり、LAK細胞の分化相は抑制しなかったT細胞とLAK細胞は、活性化されると胎児・胎盤系を拒絶し、流産に関与する重要な細胞となるが、絨毛細胞由来免疫抑制物質はそのいずれの活性も調節している。以上から、絨毛細胞は抑制性液性因子を産生し、母体の細胞性免疫の増殖相のみを局所的に調節することにより、妊娠の成立と維持に重要な役割を果していることを明らかにした。胎盤は胎児と母体の接点に存在する臓器であり、母体の胎児拒絶を調節していると考えられる。我々は胎盤よりこの調節を司どる免疫調節因子が産生されている事を報告し、絨毛癌細胞よりも同様の物質が産生されている事を報告してきた。今回我々はこの物質の免疫反応調節機序を検討した。この物質はヒトT細胞のマイトジェンによる増殖反応を抑制し、その抑制は反応細胞の傷害によるものでなく、生理的作用による結果であった。この機序を詳細に検討する為、T細胞をフォルボルエステルとカルシウムイオノフォアで刺激する糸を用い、T細胞のILー2依存性経路にこの因子の及ぼす影響について検討した。この経路は活性化相と増殖相の2相に分けられる事から、先ずILー2リセプター発現とILー2産生へ及ぼす影響する検討した。ILー2リセプターの検定は抗Tac抗体を用いてFACSでその表現パターンを解析し、ILー2産生量はILー2依存性増殖細胞のCTLLー2を用いて検討した。正常人末梢血T細胞を用いた我々の研究では、この両反応ともに影響を受けず、即ちT細胞活性化時のプロテインキナーゼCかCa^<2+>チャネルの作用を阻害しない事が明らかとなった。次にフォルボルエステルとカルシウムチャネルで活性化して作製したT細胞芽球をリコンビナントILー2刺激による増殖反応をそのDNA合成で検討すると、我々の因子はこの反応を完全抑制した。この事はILー2とILー

2レセプターを介した細胞内刺激伝達糸に作用し、その情報伝達を阻害している事を示唆している。ラベルした^<125>IーILー2を用いたリセプター結合試験に及ぼす研究では全く阻害しない事から、ILー2とILー2リセプター結合後の細胞内刺激伝達系を抑制している事が示唆された。この事実は高親和性ILー2リセプターを表現するConA T細胞芽球を用いた実験よりも確認された。以上の現象の妊娠現象や担癌宿主に於ける意義について現在種々の角度より検討を加えている。胎児・胎盤系は父方組織適合抗原を表現しているので、母体にとっては異系移植片となる。妊娠の成立と維持には、これらの抗原によって惹起される免疫応答を調節する機構が、母児間の接点に作動していると考えられる。この機構を解析するために、我々は胎盤ぼ絨毛細胞に注目し、その産生する免疫抑制物質の生物活性をヒト免疫応答系を用いて検討した。絨毛癌細胞株は正常毯毛細胞と同一の物質を産生しているので、我々はその培養上清を用いた。免疫応答の中心的役割はT細胞が担うことから、その物質がヒトT細胞の活性相・増殖相・分化相へ及ぼす影響を調べた。T細胞をホルボルエステルとカルシウムイオノフォアで刺激すると、ILー2依存性増殖反応を示す。この系へ上清を添加すると、活性化相でみられるTac抗原発現とILー2産生は抑制されなかったが、増殖反応が抑制された。この物質の作用部位は、ILー2とILー2レセプタ-結合後の細胞内情報伝達経路であった。高濃度のホルボエステルでT細胞を刺激すると、IL2非依存性増殖をするが、抑制物質は活性化相を抑制せずに増殖相を抑制した。このT細胞増殖反応特異的抑制により、父方抗原反応性T細胞は生成できなかった。一方、T細胞がIL2によりLAK細胞が誘導されるが、その系への影響も検討した。LAK細胞にはこの物質で生成が阻害される細胞群と生成が阻害されぬ群とが存在することが明らかになり、LAK細胞の分化相は抑制しなかった。T細胞とLAK細胞は、活性化されると胎児・胎盤系を拒絶し、流産に関与する重要な細胞となるが、絨毛細胞由来免疫抑制物質はそのいずれの活性も調節している。以上から、絨毛細胞は抑制性液性因子を産生し、母体の細胞性免疫の増殖相のみを局所的に調節することにより、妊娠の成立と維持に重要な役割を果たしていることを明らかにした。
杭基礎に作用する地震荷重分布に関する研究

杭支持建物の耐震設計では、従来、杭頭に集中水平力を与えて解析を行っている。これは上部構造の慣性力を想定したものである。この場合、計算される応力は深さとともに急激に減少するため、杭下方部では断面性能を落とす設計がなされることが多い。しかし、最近の地震応答解析や地震観測結果によれば、杭下方部でも杭頭付近と変わらない応力が生じ、地盤の応答性状が支配的な役割を果たすことが明らかになってきた。この点を考慮し、本研究では、地盤の応答効果を導入した静的荷重分布に対する杭の水平抵抗解析法を提案しようとするものである。まず、無限長杭の場合を基本にして弾性支承上の梁の曲げ理論を適用し、集中荷重、等分布荷重、三角形分布荷重の解をM.Hetenyiと同様の方法で誘導した。次に、数値解析法によって杭頭、杭先端の境界条件および各層境界での連続条件を導入することにより、実際の杭の場合に対応させた。すなわち、無限長杭の解に加算すれば、丁度境界条件を満足するような補正解を数値解析法で求める方法である。4種類の地盤と5階、10階、15階建の建物モデルの組合せについて地震応答解析を行った結果、杭頭付近では上部構造慣性力の影響が大きいこと、下方部では地盤の応答が支配的であることが分った。次に、杭の曲げモーメント時刻歴について、地盤振動成分と上部構造慣性力成分に分離したところ、後者については現行設計法による分布でよく表現できることが判明した。また、前者については、剛性が極端に異なる中間層がある場合には、少なくとも地盤の2次固有モードまでは評価する必要があることが分った。最後に、杭の設計用曲げモーメントを求める際の地震振動成分と上部構造慣性力成分の合成法を検討した結果、地盤と建物の組合せに応じてT_5>T_bのケースでは絶対値和が、T_5=T_bとT_5〈T_bのケースでは、2乗和平方が比較的よく対応することが分った。現行の耐震設計における杭の検討は,地震力を静的な集中水平力として杭頭に与えた場合に対して杭体断面を設計している。この場合,計算される応力は杭頭付近では大きな値を示すが深くなると急激に減少する。しかし,実際には中間層がある場合などが多いので,このような結果には疑問も多い。この点を検討するために数値実験とも言うべき解析的な研究として,杭で支持された14階建て建物の地震応答計算を行い,杭の深さ方向の応力分布について検討した。典型的な軟弱地盤を選定し,種々の条件の中間層が存在する場合も数種類想定した。その結果,定性的な範囲ではあるが,極端に剛性が異なる中間層,例えば超軟弱粘性土層や液状化層が存在する場合には,その境界付近で杭の応力が杭頭の値よりも大きくなることもあり,曲げ剛性の大きい杭ほどその傾向が顕著になることが分った。また,過去の地震観測例についての文献調査を行ったところ,杭先端支持層境界付近や比較的密な中間砂層の付近で,杭頭部と変わらないほどの大きな曲げ歪が発生していることが認められた。これら動的な効果を静的に表現する一方式として,外力を杭頭における集中水平力のみでなく,分布荷重(あるいは何箇所かに分配された集中荷重)とする方法を考えてみた。

その第一近似として,比較的均質地盤の場合を想定し,杭への設計荷重を上部構造の慣性力による成分と地盤の応答による成分とに分け,前者に対しては杭頭への集中水平力,後者に対しては,最も単純な場合として深さ方向への逆三角形分布荷重と考え,それぞれに対する抗の応力を合成するという方法を考えた。今後は,これを中間層などがあって複雑な地盤条件を示す場合に拡張し,解析例を積み重ねることを考えている。杭基礎支持建物の場合,現行の耐震設計では杭頭に集中水平力を与える検討法が定着しており,荷重分布の多様性の導入は殆ど考えられていない。しかし,地盤ー杭ー建物系の既往の地震観測や応答解析によると下方部での杭応力が大きくなることから,建物の慣性力のみでなく地盤の応答効果も加味する必要があることが指摘される。このような効果を導入したものに応答変位法と呼ばれる検討法があるが,地震時に生じる地盤の変位を実際に計算するか,いくつかのパタ-ンを想定するかのいずれかが必要となる。これに対して,本究研では深さ方向に荷重を分布させることで地盤の応答効果を導入しようと試みるものである。任意形の分布荷重を受ける弾性支承上の梁の曲げに対する理論解は,M.Hetenyiによって示されている。本研究では,この解を杭に応用し,荷重分布を適切に組合せることにより地中における任意荷重分布の場合の解を得ようとするものである。杭の水平抵抗問題では,一般に杭の断面設計に対しては曲げモ-メントが重要となる。杭の曲げモ-メントは,集中荷重に対しては1/βの関数となることから,まず第一近似として杭頭の集中水平荷重と地盤各層の1/βに対応させた荷重分布の組合せが想定される。ここで,β= ^4√<KnB/4EI>(Kn:地盤反力係数,B:杭径,EI:杭の曲げ剛性)である。このような想定荷重分布に対する計算例題を行ったところ,定性的な範囲ではあるが剛性が異なる中間層が存在する場合には,その境界付近で杭の曲げモ-メントが大きくなるという地震時の性状を傾向的には表現し得る結果が得られた。今後は,与える集中荷重と分布荷重の比率の影響が重要な検討課題の一つとなると思われる。前年度までに得られた無限長杭の理論解に対し,杭頭,杭先端および各層境界における連続条件を数値解析法によって導入することにより,多層地盤中の有限長杭の応力を求める方法まで拡張した。解析例として4種類の地盤モデルと5階,10階,15階建の建物モデルの組合せについて地震応答解析を行い,上部構造の慣性力と地盤応答の杭応力への影響について分離を試みた。杭は直径1.2mの場所打ちコンクリート杭を,また,建物はある平面形を想定し,階数の増加に応じて5階建20本,10階建40本,15階建60本で支持するものと想定した。固有値解析から,地盤の1次固有周期T_S,は地盤A(0.8秒),B(0.83秒),C(0.76秒),D(1.11秒)であり,建物の1次固有周期T_bは5階建(0.4秒),10階建(0.8秒),15階建(1.2秒)が得られた。さらに上部構造の慣性力がない場合,すなわち地盤の影響のみを抽出できることを想定して0階建(杭のみ1本存在すると仮定)の場合も追加した。地震応答解析結果からは,杭頭付近では各ケースで著しい差がみられ,上部構造慣性力の影響がかなり大きく含まれるのに対し,下方部ではほとんど差異がなく,地盤の応答が支配的であることが分った。次に,杭の曲げモーメント時刻歴について,地盤振動成分と上部構造慣性力成分への分離を試みた。その結果,上部構造慣性力による曲げモーメントは現行設計法で計算される分布でよく表現できることが判明した。
遺伝子移入骨髄幹細胞とコンドロイチナーゼABCを利用した哺乳動物脊髄再生

哺乳動物における脊髄損傷後の運動、知覚機能不全の改善作用につき明らかにすることを目的として研究を行った。齧歯類と同様、脊髄損傷後のビーグル犬においてもGDNF発現骨髄幹細胞とコンドロイチナーゼABCの効果が確認された。脊髄損傷後における、脊髄再生において、コンドロイチナーゼABC0.05U/200μLが運動機能回復において至適投与量であった。我々は、コンドロイチン硫酸以外にもケラタン硫酸の脊髄再生阻害作用についても証明した(J Neurosci. 2010 28;30(17):5937-47)。コンドロイチン硫酸分解酵素であるコンドロイチナーゼABCの有効性に加え、ケラタン硫酸分解酵素であるケラタナーゼIIの有効性についても証明した(至適濃度: 0.05U/200μl)(J Neurosci. 2011Nov 23;31(47):17091-102.)哺乳動物における脊髄損傷後の運動、知覚機能不全の改善作用につき明らかにすることを目的として研究を行った。コンドロイチン硫酸分解酵素であるコンドロイチナーゼABCの有効性に加え、ケラタン硫酸分解酵素であるケラタナーゼIIの有効性についても証明した(至適濃度: 0.05U/200μl)(J Neurosci. 2011Nov 23;31(47):17091-102.)【目的】ラットにおいて、脊髄損傷後のコンドロイチナーゼABC投与が運動・知覚機能不全の改善作用を及ぼすことはこれまでに示された。同様のことが、哺乳脊椎動物ビーグル犬において確認できるか検討する。【方法】ビーグル犬の脊髄損傷モデルを作製し、クモ膜下にコンドロイチナーゼABC(0.2U/200μ1)を充填した。浸透圧ポンプ(Alzet osmotic pump)を使用し損傷直後から、14日間髄腔内に持続投与した。対照群には生理食塩水を投与した。また、同時にビーグル犬骨髄間質細胞にヌクレオフェクション法を用いてGDNF(グリア由来神経栄養因子)を強制発現させたものを脊髄損傷空洞部に移植した。【結果】<後肢運動神経機能評価>3分間歩行させ、グリッドを下肢でグリップできた割合を%グリップ値とした。コンドロイチナーゼABC投与群(以下ABC群)において、生理食塩水投与群と比較して%グリップ値が高値を示し、ABC群における後肢運動神経機能回復が確認された。(後肢知覚神経機能評価)ビーグル犬後肢を55°Cに温めたホットプレートの上に載せ、後肢を放すまでの時間を計測した。生理食塩水投与群では、損傷前に比して、損傷後、経時的に反応時間が短縮していき、熱刺激に対して過敏反応を示した。一方、ABC群では、損傷早期には生理食塩水投与群と同様の傾向を示したが、損傷3週間後から5週間後には徐々に過敏反応は軽減し、損傷8週後には、損傷前とほぼ同程度の反応時間となり、知覚神経機能回復の回復が認められた。【考察】検討個体数が少ないため今後のさらなる検討が必要であるが、齧歯類と同様、脊髄損傷後のビーグル犬においてもGDNF発現骨髄幹細胞とコンドロイチナーゼABCの効果が期待できる。【目的】ラットにおいて、脊髄損傷後のコンドロイチナーゼABC投与が運動・知覚機能不全の改善作用を及ぼすことはこれまでに示された。同様のことが、哺乳脊椎動物ビーグル犬において確認された(n=1)。今年度は、検討個体数をn=3としてさらなる検討を加えた。【方法】ビーグル犬の脊髄損傷モデルを作製し、クモ膜下にコンドロイチナーゼABC(0.2U/200μl)を充填した。コンドロイチナーゼABC投与群(似下ABC群)において、生理食塩水投与群と比較して%グリップ値が高値を示し、ABC群における後肢運動神経機能回復が確認された。【考察】

醤歯類と同様、脊髄損傷後のビーグル犬においてもGDNF発現骨髄幹細胞とコンドロイチナーゼABCの効果が期待できる。我々は、コンドロイチン硫酸以外にもケラタン硫酸の脊髄再生阻害作用についても証明した(J Neurosci. 2010 28;30(17):5937-47)。コンドロイチン硫酸分解酵素であるコンドロイチナーゼABCの有効性に加え、ケラタン硫酸分解酵素であるケラタナーゼの有効性についても、今後検討を加える予定である。哺乳動物における脊髄損傷後の運動、知覚機能不全の改善作用につき明らかにすることを目的として研究を行った。齧歯類と同様、脊髄損傷後のビーグル犬においてもGDNF発現骨髄幹細胞とコンドロイチナーゼABC(以下、ABC)の効果が確認された。ABC群の損傷脊髄において、コントロール群と比較して神経栄養因子の有意な発現上昇を認めた。ABC群において、損傷部周囲でastrocyte・microgliaの増殖が抑制されており、oligodendrocyteに関してはコントロール群と比較して有意な差を認めなかった。損傷部周囲の軸索再生に関してはABC群において有意に再生線維の増殖を認めた。ABC群において、コントロール群と比較して有意な後肢運動神経機能回復が確認された。ABC群では、コントロール群と比較してアロディニアの発現が抑制され、知覚神経機能の有意な回復が認められた。脊髄損傷後における、脊髄再生において、コンドロイチナーゼABC0.05U/200μLが運動機能回復において至適投与量であった。コンドロイチン硫酸分解酵素であるコンドロイチナーゼABCの有効性に加え、ケラタン硫酸分解酵素であるケラタナーゼIIの有効性についても証明した(至適濃度:0.05U/200μl)(J Neurosci. 2011Nov 23;31(47):17091-102.)。当初計画通りに進行していると判断している24年度が最終年度であるため、記入しない。24年度が最終年度であるため、記入しない。
立体構造と発現スクリーニングに立脚した非天然型酵素反応の創出

インドールテルペノイドは構造多様性に富み、有用な生理活性を持つ。その一つであるテレオシジンとそのホモログ生合成酵素を用いて、構成アミノ酸が変異したテレオシジンアナログを新たに取得する。テレオシジン生合成系P-450酸化酵素であるTleBと、希少放線菌Streptoalloteichusに存在するアナログHinDをHis-tag融合タンパク質として大腸菌に発現し、Ni Affinity精製することで、酵素標品を取得した。これに対して、化学合成によって調製したジペプチド基質を作用させることで、TleBはN-methyl-L-valyl-L-tryptophanolを、HinDはそれに加えて、N-methyl-L-phenyl-L-tryptophanolを受け入れることを明らかにした。また、それぞれN-methyl基を求核性の異なる官能基へと変換した基質を用いることで、C-N結合でなく、新規6-5-6員環構造を持つ化合物、あるいは脱メチル化が起きた生成物を合成することに成功した。TleB、HinDの結晶構造解析を行い、そのアポ体の回折データを共に2.2Aの解像度で、基質の複合体構造をそれぞれ1.9, 2.6Aの解像度で取得した。複合体の構造解析により、indole環のN1位がヘム鉄に近づくことが明らかとなり、C-N結合形成および、6員環形成反応はまずN1位からの水素原子の引き抜きによって反応が開始することが示唆された。続く反応によって、N1位の水素原子の引き抜き後コンフォメーション変化が生じ、N13位がヘムに近づくことでN13位の水素原子が引き抜かれ、ラジカルが生じると考えられた。さらに詳細に活性部位の解析を行うことで、TleBのLeu85、Ser170、Val388、HindDのMet85、Phe170、Ala388が基質の保持に重要であることを示した。テレオシジンとそのホモログ生合成酵素を用いて、構成アミノ酸が変異したテレオシジンアナログを新たに取得するために、それぞれの酵素の立体構造解析を行っている。その中の鍵反応であるC-N結合形成に関わるP-450酸化酵素TleBとそのホモログ酵素のHindDの機能の同定、X線結晶構造を行い、基質特異性や反応性の改変に必要な情報の取得を行っている。TleB、HinDの結晶構造解析に成功し、これらの構造と特異な反応基盤を明らかにしつつある。また、非天然型基質を反応に用いることで、C-N結合形成以外の予想外の生成物の取得に成功し、新規インドール化合物を取得した。今後、酵素の立体構造解析から得た知見を遺伝子発現系へと応用することで、新規化合物物質生産へとつなげていく予定である。現在、野生型の修飾酵素反応と非天然型の生合成反応とを組み合わせることで、新たな有用活性を持つテレオシジン化合物を合成するための基盤を構築している状態であり、おおむね順調に進展していると判断できる。C-N結合形成に関わるP-450酸化酵素TleBにさらにアミノ酸変異を加え、TleB、HinDの機能の相互変換を試み、基質特異性に重要なアミノ酸残基を同定する。また、N13位の水素原子の引き抜きの証拠を得るために、基質アナログの複合体結晶構造解析やストップフロー解析を行う。TleB、HinDのホモログであるHinC、HinIもHinDクラスターに含まれており、これらの触媒機能を同定し、さらに基質特異性、反応性に関する知見を得る。また、HinDの基質であるN-methyl-L-phenyl-L-tryptophanolをin vivoで合成すべく、TleAの基質認識ドメイン(Aドメイン)にランダム変異を加え、得られた変異酵素を放線菌内でin vivoスクリーニングすることで、物質生産に適した変異体の取得を試みる。最終的にはプレニル基転移酵素TleC、環化酵素TleDを利用し、非天然型のインドールテルペノイド生産ライブラリーを構築する。PKCサブタイプ特異的な活性化因子、抑制因子を求めて、その中より活性スクリーニングを行う。天然からの新規化合物単離数が減少の一途にある現在、酵素反応を用いた新規化合物創成の手法は興味深い。本研究では酵素の立体構造を元に変異を導入し、スクリーニングによって非天然型基質を受け入れる変異酵素を創出する。対象として、テルペンインドールアルカロイドの一群であるテレオシジン類に注目し、その生合成酵素の基質特異性、反応性の改変を目的として研究を行う。テレオシジンBは細胞内のシグナル伝達に関わるprotein kinase Cを活性化する生理活性を持つため、酵素反応をエンジニアリングし、その基本骨格を作り替えることによって、有用な医薬品シード化合物の創出が期待される。本年度は特にテレオシジン生合成に関わる酸化酵素TleBとそのホモログに注目して、その構造機能解析を行い、変異実験を行う基盤を構築した。まず、希少放線菌Streptoalloteichus hindustanusよりTleBホモログであるHinC(identity57%)、HinD(identity58%)、TleAとは異なりフェニルアラニンを選択する基質特異性を持つAドメインを持つNRPSを含む遺伝子クラスターを見出した。そこで、HinC, HinDはTleBと異なる基質特異性や反応性を持つことが予想された。そこで、HinC、HinDをin vitro反応に供して、その基質特異性を解析した結果、HinDはTleBの受け入れないフェニルアラニルトリプトファノールを受け入れC-N結合を形成、HinCは水酸基の導入を行うことが明らかとなった。