hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非線形現象の発現・操作による柔軟劣駆動マニピュレータの運動制御

柔軟劣駆動マニピュレータの運動制御法の確立を目標にして,研究を行った.マニピュレータの柔軟性は梁モデルを用いて表し,自重で座屈する程度の柔軟性を持つ場合(ベッセル関数で固有モードが表される場合)と自重で座屈しない程度の柔軟性を持つ場合(三角関数や双曲線関数で固有モードが表される場合)とに分けて,運動制御法を構築した.高周波で変位加振を境界に加えると,加振振幅および加振周波数に依存して,ピッチフォーク分岐が発生し,安定な平衡点が自明な位置とは異なる位置に発生することを理論的に示した.さらに重力方向と加振方向との相対角度を変えることにより,様々な位置へ安定な平衡点を移動できることを明らかにした.理論的アプローチには,多重尺度法を利用したが,その際高周波加振の影響を適切に取り込むことができる,オーダ評価法を確立し,平均化方程式を導くことに成功した.そして,平衡点の位置と安定性が上記のパラメータ値に依存してどのように変化するかを大域的かつ解析的に示した.このようにして明らかになった安定な平衡点の変化を利用することにより,柔軟劣駆動マニピュレータの運動制御法を理論的に提案した.さらに模型実験装置を製作して,提案した運動制御法の有効性を確認した.また,重力がほとんど存在しない宇宙空間での利用を念頭においた制御法を理論的ならびに実験的に提案した.すなわち,宇宙機のスピンによる遠心力を利用し,分岐現象の摂動を作り出し,重力が存在する場合と同様な運動制御が可能であることを明らかにした.柔軟劣駆動マニピュレータの運動制御法の確立を目標にして,研究を行った.マニピュレータの柔軟性は梁モデルを用いて表し,自重で座屈する程度の柔軟性を持つ場合(ベッセル関数で固有モードが表される場合)と自重で座屈しない程度の柔軟性を持つ場合(三角関数や双曲線関数で固有モードが表される場合)とに分けて,運動制御法を構築した.高周波で変位加振を境界に加えると,加振振幅および加振周波数に依存して,ピッチフォーク分岐が発生し,安定な平衡点が自明な位置とは異なる位置に発生することを理論的に示した.さらに重力方向と加振方向との相対角度を変えることにより,様々な位置へ安定な平衡点を移動できることを明らかにした.理論的アプローチには,多重尺度法を利用したが,その際高周波加振の影響を適切に取り込むことができる,オーダ評価法を確立し,平均化方程式を導くことに成功した.そして,平衡点の位置と安定性が上記のパラメータ値に依存してどのように変化するかを大域的かつ解析的に示した.このようにして明らかになった安定な平衡点の変化を利用することにより,柔軟劣駆動マニピュレータの運動制御法を理論的に提案した.さらに模型実験装置を製作して,提案した運動制御法の有効性を確認した.また,重力がほとんど存在しない宇宙空間での利用を念頭においた制御法を理論的ならびに実験的に提案した.すなわち,宇宙機のスピンによる遠心力を利用し,分岐現象の摂動を作り出し,重力が存在する場合と同様な運動制御が可能であることを明らかにした.本年度は、フリーリンクが柔軟な2自由度劣駆動マニピュレータの運動方程式を導出し、高周波加振によるフリーリンクの運動制御法を提案した。まず、多重時間尺度を導入し、摂動法を用いて、解析をおこなって弾性モードと剛体モードに関する平均化方程式を求めた。つぎに平均化方程式に対して分岐解析を行い、フリーリンクを重力とは逆の方向への振り上げそしてその状態での安定化が状態でフィードバック制御を用いずに達成された。すなわち、フリーリンクに発生するピッチフォーク分岐を完全超臨界から摂動を受けた超臨界さらに摂動を受けた亜臨界、そして完全亜臨界と変化させることにより、安定な平衡点を変化させた。フリーリンクはその安定状態の変化に追従して振り上がり、最終的に安定な倒立状態へと位置決めされる。つぎに、より柔軟な弾性体(自重で座屈する梁)について、高周波加振による座屈状態から安定で自明な平衡状態への安定化制御法の可能性を理論的に解析し、それが可能であることを分岐理論を用いて指摘した。この場合固有関数はベッセル関数になるが、前述の方法と同様に多重時間尺度を導入し、固有関数の直交条件から可解条件すなわち平均化方程式を導いた。平均化方程式の解析によって、高周波加振は座屈状態を安定化する役割を持つことが明らかにされた。模型を用いた実験を行い、分岐点が高周波加振によりシフトし、自明な平衡点が不安定化する様子を確認した。本年は、リンクの剛体モードの非線形特性を把握するため,鉛直加振される振り子の係数励振現象を理論的ならびに実験的に明らかにした.その支点を固有周波数の2倍に近い周波数で重力と平行に加振すると,係数励振が発生するがその周波数応答特性は,システムに存在する非線形性の大きさによって決定される.本研究では高次近似解析により理論的に周波数応答曲線を導き,実験結果との比較を行った.このテーマは古くから多くの研究者に取り上げられているが,解析法に不備があり,また定量的な実験データの比較が行われていなかったものである.さらにこの結果を利用して,柔軟構造物の非線形ノーマルモードの非直交性を利用した,振動制御法を理論的ならびに実験的に提案した.この手法は柔軟劣駆動マニピュレータの運動制御の基礎となるべき手法である.まず梁の曲率および中立面の伸びにより発生する幾何学的非線形復元力成分を無視せずに運動方程式を導いた.

さらに特異摂動法によって特性を明らかにした.得られた振幅方程式の考察から,非コロケートな位置に制御用アクチュエータが存在しても,モードの非直交性により振動制御が可能なことを見出し,解析によりそれを確かめた.また軸方向に周期的な加振を受ける両端単純支持梁に発生する2次モードの係数励振振動について,上記の制御手法を適用することにより,対称位置に装着されたアクチュエータを利用しても非対称なモードの励振現象を安定化できることを実験的に確認した.宇宙空間での劣駆動マニピュレータの運動制御法を提案した.衛星本体のスピン回転によって発生する遠心力を積極的に利用した.衛星に接続された第1リンクを高周波で加振することにより,リンクが持つ運動の非線形性を発現させ,劣駆動リンクに分岐現象を発生させた.さらに加振周波数を変化させることにより,スピン速度の大きさ(遠心力の大きさ)との相対的な関係から,劣駆動リンクを様々な位置へ移動し,そこで安定化できることを理論的に示した。理論解析には多重時間尺度法を利用し,著者らが提案するオーダー評価の元で平均化方程式を導き,発生する分岐の形態および平衡点の安定性,さらに制御法を明らかにした.また,模型実験を行い,理論的に提案された制御法の有効性を確認した.柔軟性に関する研究は上記の研究とは別に行った.構造物の基本要素として梁を取り上げ,超柔軟状態(座屈点近傍)の状態に関する,制御法として,高周波加振による方法を提案し,高周波加振が分岐の非線形特性を亜臨界から超臨界へ変化させることを実験的に明らかにした.さらに,加振振幅の変化や加振振動数の変化によって分岐形態が変化し,平衡点の位置および安定性が変化することを実験によって明らかにした.理論的には特殊コッセラ理論により柔軟物体の支配方程式を非線形復元力をも考慮して導出し,その定性的な解析は今後の課題として残されている.本年度は最終年度に当たるため,国際会議の招待講演でこれまでの成果を発表し,機械システムの非線形性の積極的な利用について,討論を行った.
個別要素法による積雪変形解析手法の開発に関する研究

積雪の長時間に亘る粘性変形の解析を目的に、個別要素解析手法の開発研究を行い、以下の成果を得た。1.個別要素で構成される粘性粒子の運動方程式をランダムな格子上の陽的差分式と見做し、その極限で与えられる連続体の運動方程式を誘導した。その結果、粒子集合体の巨視的粘性係数は、粒子間距離、巨視的密度、粒子どうしの統計的接触角分布である接触点密度関数に支配され、これらの値が変形に伴い変化するため一定とならず、一般に異方性を示すことが明らかとなった。2.各要素間のダッシュポットの粘性係数を粒子間距離、巨視的密度および接触点密度関数の逆数に比例する形で設定して変形に対するこれらの影響を相殺し、さらにダッシュポットの粘性係数を引張と圧縮とで異なる値に設定することで、積雪に近い力学特性を有し、かつ巨視的性質が変形に依存しない集合体が構成可能であることがわかった。3.ダッシュポットの粘性係数の設定に必要となる、接触点密度関数の各要素単位での評価方法について検討した。パーソナルコンピュータ上に装着したトランスピュータCPUにより、粘性体の一軸変形場の個別要素解析を行ない検討した結果、各要素における接触点の分布を接触要素間で平均化する操作を繰り返す方法が、接触点密度関数の一軸載荷試験を行い、雪の粘性係数の密度依存性等を調べ、その結果を反映した個別要素モデルを構成した。非一様な変形場の理論解などに対する比較解析を通し、ここに開発した個別要素解析手法が積雪の変形解析に十分適用可能であることがわかった。
骨吸収窩と破骨細胞刷子縁の超微細形態

急速凍結技法を試料作製に用いて、骨吸収窩と破骨細胞刷子縁の超微細構造を観察した。急速凍結固定・ディープエッチング法によるレプリカ像は、試料の切削、割断面から氷の層が昇華除去され、破骨細胞内外の構造が深いレリーフとして浮かび上がって観察された。凍結置換の電子顕微鏡像観察で刷子縁の形態は指状突起finger-shapedと葉状突起foliate-shapedに区分(Akisaka T. et al.,1997)されているが、本研究のディープエッチング・レプリカ像で刷子縁の連続的な形態がはじめて示された。指状突起は葉状突起の深い陥入から連続的に形作られている。刷子縁が横断された面では突起の中心に芯を形成するように格子状をあらわす細胞骨格の構成要素が観察された。格子状構造は膜内面と接続する細胞裏打ち構造が認められる。刷子縁突起の機能的支持と膜タンパク、細胞骨格の構成要素の付着を示唆しているが、今回明らかにすることはできなかった。このことは刷子縁の極性(膜貫通タンパクの違いやエンドサイトーシス、エクソサイトーシスの機能的違い)を反映している可能性がある。側基底膜側の細胞膜は平坦で、刷子縁の様な膜の陥入が観察されない。細胞質には多量のミトコンドリア、r-ER、細管小胞構造が観察される。破骨細胞の刷子縁は骨のミネラルと基質の除去が行われる機能面である。骨切片、人工アパタイトペレット上に分離培養した破骨細胞を用い、骨吸収を行っている破骨細胞刷子縁の超微細構造の観察を行った。観察試料は細胞の超微細構造の固定、とくに膜構造の保存とその解析に有用とされる急速凍結技法を用い作製した。試料は急速凍結・凍結置換法で超薄切片を作製したものと急速凍結固定後に試料の水分を昇華させるディープエッチング、凍結乾燥を行い白金とカーボンを蒸着し金属レプリカ膜を作製して何れの試料も透過型電子顕微鏡にて観察を行った。この試料作製法では凍結固定時の氷晶形成による構造破壊が大きな問題となるが、骨切片、人工アパタイトペレットの何れを用いた試料ともに良好な凍結固定が得られた。細胞膜をはじめとする細胞小器官の各膜はその微細構造がよく保たれ、各細胞膜の裏打ち構造が観察された。破骨細胞による骨基質の分解は刷子縁側から側底部表面に向かうトランスサイトーシス、GTP結合調整タンパクに依存する輸送が報告されている。本研究で観察された刷子縁の細胞膜裏打ち構造は吸収窩の局所的酸性領域を生み出し維持するための構造で、刷子縁側から側底部側まで細胞中央部に広がる小胞細管状構造の膜裏打ち構造は吸収した骨基質の輸送、トランスゴルジ網との膜融合に関わる構造であることが示唆される。今後、膜裏打ち構造と細胞骨格との関係および裏打ち構造を免疫細胞化学的に解明する計画である。ディープエッチング法では、観察面が細胞体で被われていること、化学的・物理的方法による細胞質内外の可溶性タンパク質や細胞小器官の除去はその程度が難しく、試料作製に困難をきたしているが、現在、解析中である。刷子縁はその形態からruffled-fingerとruffled-plateに区分されるが、ruffled-fingerは一様ではなく、骨基質の吸収面側でfinger間が開いている領域(遊離finger)と、plate側でfinger間が互いに接着している領域(接着finger)とが細分される。遊離fingerでは突起間に骨基質であるコラーゲン線維、針状の結晶が観察される。密着fingerでは突起間が密着性結合状態で、スタッド様の細胞裏打ち構造が認められ、突起の機能的支持と膜タンパク、細胞骨格の構成要素の付着を示唆している。

さらに、密着fingerは、トランスサイトーシスとしての小胞細管状構造へ移行する機能的形態、吸収基質分解のための酸性環境維持としてのシールが考えられる。刷子縁は吸収窩の酸性環境と基質吸収に関わるだけでなく、トランスサイトーシスの始まりとしての機能が超微細構造から示唆された。現在、共焦点レーザー顕微鏡による密着finger領域でのスタッド様の細胞裏打ち構造の検索を進めている。
大気からの蒸散要求に対するアクアポリンの応答機構とそれが通水性に及ぼす影響の解明

蒸散は、根が土壌水分を吸収する際の主要な駆動力である。アクアポリン(水チャネル)は根の細胞間での水移動において重要な役割を担う膜タンパク質である。本研究では、日々の天気によって変動する蒸散要求量が根のアクアポリン発現量に及ぼす影響を調査した。イネの根においてOsPIP2;4、OsPIP2;5、OsTIP2;1等の根局在型のアクアポリン遺伝子の発現量は、晴天日に多く雨天日に少ない傾向を示し、直前の蒸散要求量(ポテンシャル蒸発量)と有意な正の相関を示すことが分かった。これらのアクアポリンは、高蒸散時において根での水吸収を促進する役割を果たしている可能性が示唆された。作物にとって、大気からの蒸散要求の変動に対する適応性は、土壌水分不足や塩ストレスに対する耐性機構と並んで重要な形質であるにもかかわらず、その理解は進んでいない。根から地上部への水分補給系では、細胞間水輸送系の水透過性が律速となる。本研究では、それを担うアクアポリン(水チャネル)に着目し、蒸散要求に対する根のアクアポリンの発現量の変化とそれが通水性に及ぼす影響を野外で観察し、その自然環境変動適応性を明らかにすることを目的としている。2年目にあたる平成25年度は、前年度までに整備した解析手法に基づき、水耕栽培したイネ幼植物体を用いた屋外条件での調査に着手した。イネのゲノムにコードされている33種類のアクアポリン遺伝子の分子種の内、根で発現している約17種類のアクアポリン分子種を対象にして、それぞれの遺伝子発現量をリアルタイムPCR法を用いて定量した。その結果、上記17種の中でも細胞膜型(PIP)及び液胞膜型(TIP)に属するアクアポリン分子種の多くは、発現量が夜間に少なく、晴天日では夜明け前から日中にかけて上昇し、午後から夕方にかけて減少する日周変動パターンを示すが、その振幅の大きさは分子種によって異なり、根特異性の高いアクアポリンでは振幅が大きい特徴が認められた。一方、蒸散要求量の少ない曇天及び雨天日では、日中におけるこれらアクアポリンの発現量の上昇は小さかった。また、上記17種のうち、約8種のアクアポリンについてはその発現量が前数時間のポテンシャル蒸発量(蒸散要求量)と有意な正の相関を示す事が明らかになった。本研究は、大気からの蒸散要求に対するイネ根のアクアポリンの発現量の変化とそれが通水性に及ぼす影響を観察し、その自然環境変動適応性を明らかにすることを目的としている。初年度である平成24年度は、実験手法の確立に重点を置いた。蒸散要求量の具体的指標として使用するポテンシャル蒸発量については、連携研究者である桑形恒男氏の協力を得て、東北農業研究センターの気象観測所で観測された時別の気象データを元に、時刻別のポテンシャル蒸発量を計算する方法を整備した。また、人工気象室の栽培実験等で得た植物材料を用いて、アクアポリン等の遺伝子発現量を正確に定量する手法の確立に取り組むとともに、根の通水性(水透過性)を精度よく測定するために、プレッシャーチャンバを用いて根の水透過性の測定を試みた。イネは単子葉植物でありその形態的な特性のために、根の基部(葉鞘)の付け根の部位をパッキングしてプレッシャーチャンバに装着し、根部位を加圧する場合に、加圧に伴う地上部切除部位からの出液が根を通過したものなのか、それとも葉鞘部位をバイパスしたものなのかの判定が難しいことが分かった。そこで種子根のみを生育させたイネ幼苗を用いて、種子根基部をプレッシャーチャンバに装着することでこの問題が回避できることがわかった。作物にとって、大気からの蒸散要求に対する適応性は、土壌水分不足や塩ストレスに対する耐性機構とならんで重要な形質であるにもかかわらず、その理解は進んでいない。本研究では、それを担うアクアポリン(水チャネル)に着目し、蒸散要求に対する根のアクアポリン発現量の変化とそれが通水性に及ぼす影響を観察し、その環境変動適応性を明らかにすることを目的としている。3年目にあたる平成26年度は、実際に水田で生育しているイネの体内で、アクアポリン遺伝子の発現量が気象条件に対してどのような応答性を示すのかを明らかにするために、圃場(水田)での栽培実験を行なった。主として分げつ期の複数品種のイネから根と葉身を定時(午前10時)、あるいは時刻別にサンプリングを行なうとともに、気孔コンダクタンスと蒸散量の測定を行なった。これらのサンプルにおけるアクアポリンの発現量については、現在解析中であるが、各種のアクアポリンの発現量が蒸散要求や気温、地温、日射、長波放射量などの気象要因の変動に対してどのような応答を示すか、また品種間で差異があるかどうか等を明らかにするため材料を取得することができた。また今年度は、水耕栽培したイネのアクアポリン遺伝子発現量の野外気象応答性、ならびに蒸散要求量が根の水透過性に及ぼす影響に関してこれまでに得られた実験データを分析、整理し原著論文にまとめる作業にも力を入れた。平成27年度は本研究課題の最終年度にあたる。これまでに実施した屋外実験により、イネ根で比較的多量に発現しているアクアポリン約17種類のうち、根局在型のアクアポリン(OsPIP2;5, OsTIP2;1等)の遺伝子発現量は前数時間の蒸散要求量と有意な正の相関を示すことが明らかになった。

また人工気象室内の湿度と風速を調節し蒸散要求を高めた環境に置かれたイネでは根の水透過性(Lpr(os))が有意に増加することが示された。このことからイネ地上部の蒸散要求量が増加すると根で特定の遺伝子の発現量が増加し、根からの水分供給が促進される可能性が示唆された。一方、蒸散要求量とは正の相関を示さないアクアポリン遺伝子の中には、別の気象要素と有意な相関を示すものがあることがわかった。これらのアクアポリンの根の内部での局在性は、蒸散要求量と正の相関を示すアクアポリンとは異なり細胞分裂・伸長が活発な組織での発現が認められた。このことから、根では地上部への水分補給を促進する役割を担うアクアポリンの他に、根の伸長生長に関わるアクアポリンが存在する可能性が考えられ、今後の有望な研究テーマが見出された。蒸散は、根が土壌水分を吸収する際の主要な駆動力である。アクアポリン(水チャネル)は根の細胞間での水移動において重要な役割を担う膜タンパク質である。本研究では、日々の天気によって変動する蒸散要求量が根のアクアポリン発現量に及ぼす影響を調査した。イネの根においてOsPIP2;4、OsPIP2;5、OsTIP2;1等の根局在型のアクアポリン遺伝子の発現量は、晴天日に多く雨天日に少ない傾向を示し、直前の蒸散要求量(ポテンシャル蒸発量)と有意な正の相関を示すことが分かった。これらのアクアポリンは、高蒸散時において根での水吸収を促進する役割を果たしている可能性が示唆された。今年度(平成26年度)は、水耕イネを材料とした実験結果、すなわち根の特定のアクアポリン遺伝子の発現量が前数時間の気象条件(ポテンシャル蒸発量)と高い相関を示すことや、蒸散要求量が根の水透過性(Lpr(os))を変化させることなどについて、これまでに得られたデータを解析、集約して原著論文にまとめることができた。また、研究対象を水耕栽培というモデル系から一歩進んで、実際の水田で生育するイネにも拡大した。さらに、根でアクアポリンの遺伝子発現を誘導するメカニズム(地上部から地下部への信号伝達のメカニズム)を解明するための手がかりを得ることを目的に、イネの根部を人為的に加圧する実験を試みるなど、当初の予定通りおおむね順調に進捗したと考えている。農業気象平成27年度は、本研究課題の最終年度にあたることから、これまでに、様々な気象条件の下で採取したイネの根(および可能であれば葉身のサンプルについても)、各種アクアポリン遺伝子の発現量の定量を進め、それぞれの遺伝子の発現量と気象条件(特に蒸散要求量)との関係をより詳しく明らかにすることを目指す。また、特定の気象条件がアクアポリンの遺伝子発現を誘導する信号伝達のメカニズムを明らかにするための実験にも引き続き取り組む予定である。平成25年度は、前年度までに整備した解析手法に基づき、イネ幼植物体を用いて、大気からの蒸散要求量の変動がアクアポリンの発現誘導に及ぼす影響について屋外条件での調査、解析に着手し、概ね当初の予定通りに進捗した。根で発現している約17種類のアクアポリン分子種の中でも、根に特異性の高いアクアポリンでは発現量の日周変動の振幅が大きく、その変動パターンは当日の気象条件の影響を強く受けることなどの知見が得られ学会発表につながった。平成24年度は、本研究課題の初年度にあたり実験手法の確立に重点を置き、当初の予定どおりに進捗した。蒸散要求量の具体的指標として使用するポテンシャル
顔の識別能力の発達と柔軟性：人工知能を用いた人間性の探求

人は、それぞれに固有の顔を持つ。他者の顔を識別する能力が、どの程度生得的で、どの程度後天的なのかを知ることで、発達科学において重要な「氏と育ち」の問題への示唆となるばかりでなく、動物の中でも際立つ人の社会性の基盤を解明することにつながる。本研究課題では、まず、様々な月齢の乳児を対象として、乳児期における顔の識別能力の発達過程を明らかにする。また、サルの個体識別をした経験を持つサル研究者と一般成人を比べて、成人期における顔の識別能力の柔軟性を探る。最後に、人工知能と人の識別能力を比較し、人が持つ識別能力は、人工知能で代替できるのか、できないならば、人工知能にはない人の特徴が何かを検討する。
神経因性疼痛発生の分子機構の解明と痛覚評価系の開発に関する研究

神経や組織の炎症等による傷害後に発生するモルヒネ抵抗性の難治性慢性疼痛として知られる神経因性疼痛は、その発生メカニズムが未だ十分に解明されていない。炎症時には様々な炎症性内因性物質が放出され、これが痛覚過敏を引き起こすと考えられている。そこで本年度は、炎症メディエーターであるセロトニンによる疼痛過敏機序について調べ、以下の成績を得た。セロトニンは5HT2Aおよび5HT7受容体を活性化させ、Aキナーゼ、Cキナーゼを介して、TRPV1受容体を活性化(感作)することが分かった。また、アジュバンドにより惹起した炎症ラットの後根神経節細胞では5HT2A及び5HT7受容体遺伝子の発現量が増加することを見出した。これらの結果より、炎症性痛覚過敏の発生は、炎症時に血小板や肥満細胞から放出されるセロトニンがTRPV1分子の活性化、あるいはセロトニン受容体サブセットの発現量増大が関与していることを明らかにした。神経因性疼痛は神経や組織の炎症などによる傷害後に発生するモルヒネ抵抗性の難治性慢性疼痛で、ヒト・獣医臨床において疼痛管理上、重要な問題になっている。本年度は神経因性疼痛の関連蛋白質として近年着目されている痛覚受容体の一つであるバニロイド受容体(TRPV1)遺伝子をクローニングしてその機能解析を行った。1)ブタ背根神経細胞のcDNAから、既に報告されているラットTRPV1遺伝子配列を用いて、TOPOイソメラーゼを用いたGATEWAYシステムによりPCRクローニングを行った。2)ブタTRPV1はラット、ヒト、モルモット遺伝子と高い相同性があったが、他種とは異なりC末端の5アミノ酸が欠失していた。3)ブタTRPV1遺伝子のオープンリーディングフレームをGFP-fusionプラスミドに組み替え、HEK293細胞にリポフェクション法を用いて強制発現させ、TRPV1受容体蛋白質の機能解析を行った。GFP蛍光の有無により発現細胞を同定した。4)TRPV1発現細胞はカプサイシン等のバニロイド受容体アゴニストにより細胞内Ca増加と非選択的陽イオン電流を引き起こした。また、細胞外pHの低下、高温(>42C)によりチャネル活性が生じることが見出され、ブタTRPV1が機能的なポリモーダル受容体として働いていることが明らかになった。次年度以降、この受容体のリン酸化による活性化調節機構や他の痛覚アゴニストとの相互作用を調べることにより、受容体レベルで神経因性疼痛メカニズムを明らかにする予定である。セロトニン(5HT)は炎症や組織傷害により放出される内因性痛覚伝達物質であり、個体レベルの研究ではヒトや動物に著明な痛覚過敏(hyperalgesia)を引き起こすことが知られている。本年度は、昨年遺伝子クローニングによりその機能を明らかにした痛覚受容チャンネルであるtransient receptor potential V1(TRPV1)機能に対する5HT作用を詳細に調べることにより、単一細胞レベルでのセロトニンによる痛覚過敏発現の機構について検討し、以下の成績を得た。1)初代培養ラット背根神経節(DRG細昭)にfura-2を負荷して、細胞内Caイメージングを行い、TRPV1活性により生じる細胞内Ca増加反応を解析した。DRG細胞はTRPV1アゴニストのカプサイシンにより濃度依存性にCa増加を引き起こし、この反応はカプサゼギンで抑制された。2)同様なCa増加反応は外液pH低下(酸)、熱によっても生じた。3)5HTの前処置によりカプサイシン、酸、熱によるCa増加反応は有意に増大した。4)パッチクランプ法により測定したカプサイシンによる細胞膜の脱分極と内向き電流は5HTにより増加した。5)5HTによるTRPV1機能増加反応はprotein kinase C(PKC)およびprotein kinase A(PKA)阻害薬により抑制された。6)RT-PCRおよび免疫細胞化学的解析によりDRG細胞には5HT2Aと5HT7受容体が発現してることが示された。7)カプサイシンによるTRPV1増強作用は5HT2A、5HT7アゴニストにより模倣され、各アンタゴニストにより抑制された。以上の成績から5HTによる痛覚過敏のメカニズムには5HT2Aおよび5HT7受容体を介したTRPV1痛覚受容体チャネルリン酸化による機能亢進が関与していることが明らかになった。
部位特異的リジン残基修飾を目指したアミン反応性DNAの合成とその機能評価

C4'酸化型脱塩基部位(C4'-OAS)を含む酸化DNAの効率的生成法の開発と、C4'-OASを有する酸化DNAによる蛋白質リジン残基の部位特異的修飾による機能研究への応用を目的とし、以下の研究項目を中心に実験を行った(研究項目は交付申請書の研究実施計画に掲げた項目1-4に相当する)。項目1,2:光照射によってC4'-OASに変換可能な前駆体として、光分解性保護基(ケージ)の導入位置が異なる2種のケージドュニット(ケージドヌクレオシドおよびケージドフラノシド)合成に成功した。さらにそれらを含む2種類のケージドDNAを合成した。ケージドDNAの光反応性(速度論解析、定量解析)を詳細に検討した結果、ケージドヌクレオシドを含む二重鎖DNAが最もC4'-OASへの変換効率に優れており、酸化DNAの良好な前駆体となり得ることを見出した。また、これらの光反応研究から、ケージが導入された位置及びDNA全体として見たときのケージが置かれているDNA環境が光反応性に影響を与えることも分かった。この知見は、ケージド化合物の生体利用の展開において重要な光化学的基盤を提供するものである。項目3:DnaA蛋白質のDNA結合部位(ドメインIV)を用いてのリジン修飾実験を行った。ドメインIV中の部位特異的リジン残基修飾反応の進行の有無をMALDI-TOF MSによって行った。その結果、ドメインIV中にある7つのリジン残基の内、一つリジン残基が修飾(ラクタム化)された推定分子量の誤差範囲内に相当するピークが観測されたことから、C4'-OAS近傍のリジン残基が修飾されている可能性が示唆された。このことは、DNA酸化がもたらす生体機能への影響の理解とケージドDNAによる酵素機能制御に関する基盤技術の創出に資するものと期待される。項目1,2:光照射によってC4'-OASに変換可能な前駆体として、光分解性保護基(ケージ)の導入位置が異なる2種のケージドユニット(ケージドヌクレオシドおよびケージド糖)合成に成功した。ケージドDNAの光反応性(速度論解析、定量解析)を詳細に検討した結果、ケージドヌクレオチドを含む二重鎖DNAが最もC4'-OASへの変換効率に優れており、酸化DNAの良好な前駆体となり得ることを見出した。また、これらの光反応研究から,ケージが導入された位置及びDNA全体として見たときのケージが置かれているDNA環境が光反応性に影響を与えることも分かった。その結果、ドメインIV中にある7つのリジン残基の内一つが修飾(ラクタム化)されている可能性が示唆された。
潰瘍性大腸炎関連癌におけるRNAメチル化マーカーの臨床的意義

潰瘍性大腸炎(ulcerative colitis: UC)患者は本邦約10万人で、年間約4千人が発病し、患者数は増加の一途を辿っているが、ステロイド、5-ASAに加え、近年の免疫抑制剤、生物学的製剤を中心とした内科的治療の進歩により、劇症例、内科的治療抵抗例は減少傾向を示してきた。その一方で、慢性長期経過例では、炎症を母地とした大腸癌を合併することがあり、7-8年以上経過した全大腸炎型の累積癌化率は30年で30-40%とされ、全大腸炎型の長期経過例に対しては癌合併のサーベイランスが重要となる。本邦における潰瘍性大腸炎診療ガイドラインにおいても、潰瘍性大腸炎発症から8-10年経過後に、年1回以上の全大腸内視鏡検査下のrandom-step biopsyあるいは拡大内視鏡を併用した有所見部位のtarget biopsyによるサーベイランスが推奨されている。しかしながら潰瘍性大腸炎関連大腸癌の特徴として、組織型が多発癌・低分化型であり、びまん性病変を呈するため、背景粘膜に炎症を伴うため色調での判別も困難となるため、サーベイランスの内視鏡で肉眼的発見が困難なケースも多く、癌発見時にはすでに進行癌であることも少なくないことから、低侵襲で精度の高い早期診断マーカーを確立することが重要となる。今回、潰瘍性大腸炎における様々な部位の大腸粘膜におけるRNAメチル化の程度を明らかにし、さらに内視鏡検査にて簡便に評価可能かつ肛門鏡で生検可能な直腸粘膜を用い、そのRNAメチル化のField effect/cancerizationを用いた大腸全体の癌化の状況を判別する概念を確立することを目的として研究をすすめている。現在、臨床検体からのDNA, RNA抽出作業も終了し、有望な候補メチル化を同定し、すでに臨床検体での検討を開始している。臨床検体からのDNAやRNAの抽出とそのバイサルファイト処理にやや時間を要したため、進捗はやや遅れているが、現在は有望な候補メチル化マーカーの測定を鋭意進行中である。さまざまな組織・臨床検体を用いたメチル化マーカーの測定を継続し、その臨床的意義や機能解析を進める予定である。臨床検体からのDNA, RNA抽出作業が遅れたことにより、使用予定額が減少し、次年度に測定系の実験をおこなうこととなったため次年度使用額に変更が生じた。
小脳小節および虫部垂小帯域の視運動眼反射制御における役割

破壊実験から小脳小節は、視運動性後眼振の制御に関与している。小脳小節の視運動眼反射における役割および虫部垂の眼運動制御への関与の様式をニューロンレベルで解明することが本研究の目的である。我々は、視覚パターンの移動刺激に対するネコ小脳小節のプルキンエ細胞複雑スパイクの反応性を調べた。ネコ小脳小節内で水平あるいは垂直の視覚刺激に対して反応するプルキンエ細胞を同定した。反応細胞の至適反応速度は、小脳片葉と同様に低速度(1-20°/s)であったが、片葉に比べると反応性は強くなかった。視覚刺激に対して反応しない細胞も多くみられた。本研究は、非動化の有無の点でネコ小脳片葉において前回我々が調べた研究方法とは異なるが、片葉は大多数の細胞が視覚刺激に対して反応したのに対して、小節では反応性が片葉と比べ強くなかったことおよび反応しない細胞が多く認められたことは興味深い結果である。ネコ小脳片葉が下オリーブ核の吻側背側帽、腹側外側突出部および尾側背側帽のニューロンより登上線維入力を受けるのに対して、小節は、それらに加えて下オリーブ核のβ核および背内側細胞柱のニューロンからも登上線維入力を受ける。ウサギのβ核および背内側細胞株のニューロンは、前庭刺激および視覚刺激に対して反応する。ネコ小脳小節では、視覚入力を受ける領域は限られており、今回視覚刺激に対して反応しなかった細胞は、前庭入力に関与した領域であった可能性がある。さらに視覚刺激に対する反応細胞を同定し、その細胞局在を調べる必要がある。今後は、前庭刺激も行い、小節の微小域構造を明らかにする予定である。
「フランス語圏アジア系女性文学におけるジェンダーとエスニシティに関する比較研究」

本研究では、フランス語圏におけるアジア系女性文学に見られるジェンダーとエスニシティに関する比較研究を行った。特に、日系、ベトナム系、中国系女性の文学に関して、欧州におけるフランス語文学の中心であるフランスの女性文学と北米のフランス語圏文学の中心であるケベックの女性文学に関しての比較研究を行った。研究成果については、国内学会(フランス語フランス文学会)や国際学会(フランコフォニー研究学会、オーストラリアアジア研究学会など)において研究発表を行い、また、欧州と北米のフランス語圏において、在外研究を行った。また、最終年度には、国際シンポジウムを開催した。平成26年度は、該当テーマに関する研究調査、資料蒐集、ならびにその解読、分析を中心に行った。特に、理論的枠組みとして、フランス語圏のポストコロニアリズム、アジア系文学、ケベック文学における移動文学の歴史とその変遷を軸に資料収集とその解読、分析を丁寧に行った。文学作品としては、フランスとケベックのアジア系(ベトナム、中国、日本)の女性作家の文学作品を中心に解読、分析を行った。研究成果としては、日本ケベック学会の学会誌やその研究会で、研究発表を行った。平成27年度は、北米のフランス語圏におけるアジア系女性文化の研究を中心に行った。7月には、フランコフォニー研究学会(カナダ・マニトバ州ウィニペグ市、ウィニペグ大学にて開催)にてケベックのアジア系作家イン・チェン(中国系)やキム・チュイ(ベトナム系)、アキ・シマザキ(日系)の作品についての研究発表を行った。8月には、ケベック州モントリオール市にて、在外研究を行い、最近のケベックを中心としたフランス語圏のアジア系女性文学についての資料蒐集を行い、現地のケベック文学専門家と近年の同研究テーマについて、意見交換を行った。当該年度には、前年度にひきつづき文献蒐集とその分析、ならびに、北米のフランス語圏ケベック州での在外研究、国際学会での研究成果の中間報告を行うことができた。本研究では、在外研究を行い、新たな研究資料を蒐集することと、国内外の学会で研究発表を行い、研究成果を発信することを研究の中心としてしていたが、それらを実行することができた。初年度の26年度は、国際学会(フランコフォニー学会)における研究発表と、北米カナダのモントリオールでの在外研究を行い、北米における最新資料の蒐集を行った。27年度には、国内の学会(フランス語フランス文学研究学会)での発表などを行った。研究最終年度に当たる28年度には、まず7月に国際学会(オーストラリアアジア研究学会)にて、それまでの研究成果の発表を行った。また、2月には欧州での研究調査を実施するため、フランスのパリ国立図書館や日本文化会館の図書室で資料蒐集を行い、アジア人街の視察を行った。また、最終年度の11月には、ベトナム系ケベック人作家キム・チュイ氏と日系フランス語作家関口涼子氏を招聘し、カナダ大使館においてシンポジウムを開催した。シンポジウムには、ケベック関係研究者やフランス系文学研究者らが多数訪れた。また、シンポジウム開催後NHKワールド(ラジオ)からのインタビューが行われるなど、本研究テーマに関する最新の情報を国内外に発表することができた。26年度は、予定通り、該当テーマに関する、研究資料の蒐集とその解読、分析を中心に研究を行った。その結果、理論的枠組みとなる、フランス語圏のポストコロニアリズムについて、アジア系女性文学について、ケベックとフランスの移民文学について、フランス語圏の多文化社会について、理解を深めることが出来た。また、研究対象地域の対象作家の作品を丁寧に精読し、その作品に描かれる内容をよりよく理解することが出来た。本研究は「比較的視野」にたって同テーマについて考察することがその大きな目的であるため、28年度は、欧州最大のフランス語圏であるフランスにおけるアジア系女性とその文化や文学について研究を進めていく予定である。移動女性文学27年度は、北米のフランス語圏におけるアジア系女性文学についての研究を中心に行う。北米フランス語圏の文化的中心地であるケベック、モントリオールに手現地調査を行い、資料収集や研究対象となる作家や研究分野の専門家らと面会し、該当研究テーマについての現地での研究の様子の聞き取り調査を行い、意見交換を行う予定である。また、最終年度に予定されている、研究成果発表の場となる国際シンポジウム開催の準備として、同シンポジュウムに招聘予定の作家や研究者らと、シンポジウムの内容について、意見交換を行う予定である。後半には、これまでの研究成果について研究発表を行い、次年度に取り組む予定の欧州のフランス語圏における該当テーマについての研究調査準備を行う予定である。欧州におけるテロリズムなどによる不安定な状況から、27年度後期の在外研究ならびに国際学会発表を見送った。初年度の研究として、理論的枠組みを確立するため、資料収集とその解読分析を中心に行ったため、在外研究を2,3年目に行うこととなったため。28年度は、欧州における状況の改善が見られていることから、予定していたフランスでの在外研究を遂行する予定である。また、研究成果の発表の場として、状況の不安定な欧州ではなく、比較的安定している北米だけでなくオセアニア地域での研究発表も予定している。本年度の在外研究を行ぅ際、また、初年度に行った資料解読と分析によって得られた成果発表の際に使用する予定である。
微生物燃料電池を用いた省エネ型窒素除去システムの開発

「微生物燃料電池」と「アンモニア電解処理」を組み合わせた、ハイブリッド型の新規窒素除去システムの開発を行った。廃水を上流の微生物燃料電池から下流のアンモニア電解槽に流して二段階で処理し、微生物燃料電池と電解槽を直列の電気回路でつなぐことにより、微生物燃料電池の電力のみでアンモニア電解除去を行い、微生物燃料電池単独での処理に比べて窒素除去性能を大きく高めることができた。本システムは電解法によりアンモニアをN2に酸化するため、硝化のための曝気エネルギーが不要である。また、電解のためのエネルギーには微生物燃料電池の電力を利用するため、外部からエネルギーを投入する必要もない。廃水を処理する独立した複数の微生物燃料電池と電解槽が直列の電気回路でつながったシステム(独立処理型)で、人工廃水を処理する運転を試みた。実験に用いた微生物燃料電池用の廃水には有機物源として酢酸を含むもの、電解処理対象の廃水にはアンモニウムイオンおよび高濃度の塩化物イオンを含むものを用いた。電解槽では、処理によるアンモニウムイオン濃度の減少と共に、pHの低下が観察された。そして、pH3程度以下になるとアンモニア除去効率が大きく減少することを確認した。これは、廃水中の塩素ガス(Cl2)の割合が増加して相対的に次亜塩素(HClO)が減少したためであると考えられる。そこでリン酸バッファを用いて人工廃水を弱酸性に保ち、処理を試みたところ、pHが3以上であるにも関わらず、アンモニウムイオン濃度がほとんど減少しなくなった。このことは、高濃度のリン酸の存在がアンモニアの除去を阻害することを示唆している。そこでpHコントローラーを用いてアルカリを添加し、電解液のpHを5以上に保つようにした。その結果、アンモニア除去効率を保った状態で電解処理を進めることができた。そして、微生物燃料電池の電力のみで、廃水中のアンモニアの完全な除去が可能であることが確認できた。また、この時の微生物燃料電池の直列台数は3台以上であればよいことがわかった。一方、電解処理のクーロン効率は1520%程度であったが、今後、高めていく予定である。さらに、本システムにおける廃水中のアンモニア除去時の窒素収支の把握に着手した。微生物燃料電池の電力を用いて電解処理を行い、廃水中からアンモニア態窒素(NH4+-N)を除去するシステムにおいて、廃水の性状が電解処理に与える影響について検討を行った。平成26年度の結果より、廃水のpHを56以上に制御して全ての実験を行った。NH4+濃度についての検討を、10mM100mMの間の条件で行った結果、NH4+濃度が低くなると除去速度が低くなった。また、電気伝導度(EC)については、500mS/m以下ではほとんど差がみられなかったが、1000mS/m以上ではECが高いと除去速度が高くなる傾向がみられた。さらに、Cl-濃度についての検討を3100mMの間の条件で行った結果、Cl-濃度が低くなると除去速度が低くなった。また、上記のシステムで、廃水中のNH4+除去時の窒素収支の把握を試みた。その結果、電解処理により除去されたNH4+のほとんどが、窒素(N2)ガスとして大気中に放出されることがわかった。本研究の開始当初には、有害なアンモニアガスが大気中に揮散する可能性が考えられたが、実際には揮散はほとんど起きていなかった。ただし、わずかながらNO3-およびN2Oの生成が確認された。この生成量は、電解処理の条件によって変化した。今後は窒素ガスの定量分析の精度向上を試みる。さらに、平成26年度の電解処理のクーロン効率は1520%程度であったが、本年度は2倍以上に高めることができた。平成26年度に、研究代表者の体調不良により研究の進行に遅れが生じ、平成27年度もその遅れを取り戻すことができなかった。26年度の研究において、廃水中にリン酸が共存するとアンモニアの電解除去が進まなくなるという現象が見つかった。そこで本年度はこの問題に取り組み、アンモニア電解槽のアノードの種類を変更することによって解決することができた。また、電解電源として必要な微生物燃料電池の直列台数をさらに減らすべく検討を行った。26年度に3台以上という成果を得ていたが、本年度の検討の結果、電解時の電流密度を低くすることにより、直列台数を2台にまで減少させることが可能であることがわかった。また、この検討において80%近い極めて高いクーロン効率を達成することができた。次に、電解槽内の残留有機物がアンモニア除去に与える影響の評価を行った。生分解性が高い有機物として酢酸ナトリウム、低い有機物としてインジゴカルミンを用いて試験を行った結果、NH4+濃度が比較的高いときは、除去効率の低下はほとんどみられなかった。一方、NH4+濃度が低い条件ではわずかながら除去効率の低下が確認された。さらに、微生物燃料電池による一次処理水(残存有機物を含む)の電解処理を行い、NH4+の除去が進行することを確認した。実廃水からのアンモニアの電解除去も試みた。消化汚泥の遠心分離上澄み液(高濃度の有機物とNH4+を含む)の処理をおこなったところ、NH4+がほとんど除去されなかった。そこで塩化物イオン源としてKClを添加して再度処理を行ったところ、クーロン効率50%程度と比較的高い効率でNH4+を除去することができた。この結果から、本法においては塩化物イオンを追加しなければならない場合があるという課題が明らかになった。

一方、このとき有機物の除去も行われており、微生物燃料電池処理後の残存有機物を除去し、有機物濃度をさらに低減させる効果があることも明らかになった。平成26年度に、研究代表者の体調不良により研究の進行に遅れが生じた。平成27年度、28年度は比較的順調に検討を進めることができたが、平成26年度の遅れを取り戻すには至らなかった。微生物燃料電池と電解窒素除去槽を組み合わせた二段階処理システムを作成し、実廃水を連続的に流入させ、有機物および窒素の除去を試みた。微生物燃料電池を上流、電解窒素除去槽を下流とし、流入廃水にはろ過および希釈を行った養豚廃水(COD濃度:約4000mg/L、アンモニア濃度:約25mM、塩化物イオン濃度:約10mM)を用いた。電解窒素除去のエネルギー源には、上流の微生物燃料電池から得られた電力のみを用いた。微生物燃料電池を2台とし、HRT:2日で運転を行った結果、処理水中のCOD濃度は500900mg/L(除去率:約8090%)、アンモニア濃度は約15mMに減少した。この時、微生物燃料電池(HRT:1.3日)のアンモニア除去の寄与は2060%、および電解槽(HRT:0.7日)の寄与は4080%であった。また、運転中の電解槽の電極間電圧は約1.2Vであった。すなわち、わずか2台の微生物燃料電池を直列にするだけで必要な電解電圧をまかなうことができ、微生物燃料電池の電力のみで電解窒素除去を行い、微生物燃料電池単独での処理に比べて、窒素除去性能を大きく高めることができた。また、上記と同様のシステムで、微生物燃料電池の台数を増加させることによって電解槽でのアンモニア除去性能の向上を試みたところ、微生物燃料電池の台数を2台→3台にすることによって、電解槽に流れる電流が増加し、電解槽でのアンモニア除去率を向上させることができた。「微生物燃料電池」と「アンモニア電解処理」を組み合わせた、ハイブリッド型の新規窒素除去システムの開発を行った。廃水を上流の微生物燃料電池から下流のアンモニア電解槽に流して二段階で処理し、微生物燃料電池と電解槽を直列の電気回路でつなぐことにより、微生物燃料電池の電力のみでアンモニア電解除去を行い、微生物燃料電池単独での処理に比べて窒素除去性能を大きく高めることができた。本システムは電解法によりアンモニアをN2に酸化するため、硝化のための曝気エネルギーが不要である。また、電解のためのエネルギーには微生物燃料電池の電力を利用するため、外部からエネルギーを投入する必要もない。平成26年度の中頃から、研究代表者の体調不良により、当初の計画通りのスケジュールで進めることが困難になったため。進行状況はやや遅れているが、当初の計画に沿って順次研究を遂行する予定である。新規窒素除去システムで人工廃水を処理した際の窒素収支の把握の、精度向上を試みる。さらに、電解処理のための電力を供給する微生物燃料電池の直列台数や、有機物とアンモニアの両方を含む廃水の処理に関する検討を行う。そして、実廃水を用いた実証試験を行う。29年度が最終年度であるため、記入しない。下水道工学進行状況はやや遅れているが、当初の計画に沿って順次研究を遂行する予定である。
鍼通電で発見したＡｉｇ１ｌタンパク質の機能と鍼治療メカニズムの解明

鍼治療効果のメカニズム研究に際して発見したAcupuncture-induced 1-L (Aig1l)タンパク質の機能と鍼治療メカニズムの解明の研究に取り組んだ。合成ペプチドを抗原として5種類のAig1lタンパク質の抗体を作製し、特異性の高い抗体を得た。次に、ホモロジーモデリング法とフラグメントアセンブリ法を組み合わせた方法で、Aig1lタンパク質の217番目から895番目までの679アミノ酸の立体構造を解析し、3個のCUBドメインと5個のSushiドメインの位置関係を明らかにした。この構造に類似の膜タンパク質は細胞接着や神経細胞の軸索誘導に関係しており、同様の可能性がある。本研究の目的は、鍼治療効果のメカニズム研究に際して発見したAcupuncture-induced 1-L (Aig1l)タンパク質機能の解明と鍼治療効果機序の解明である。今年度は、(1)特異性の高いAig1l抗体の選択とシグナル伝達経路の解析系の確立、(2)フラグメントアセンブリ法によるAig1lタンパク質の立体構造の解析、を行った。(1)では、前年度に作製した5種類のAig1l抗体の中から特異性の高い抗体を選択する目的でウェスタンブロッティング解析した。その結果、3種類の抗体は特異性が低いAig1l抗体であった。現在、残りの2種類の抗体について継続して解析している。鍼治療効果に関与するPI3K/AKTシグナル伝達経路の解析系については、まずウェスタンブロッティング解析時に内部標準として用いられる2種類のハウスキーピングタンパク質の実験条件を決定した。次に、PI3K/AKTシグナル伝達経路にかかわる2種類のタンパク質について、その解析条件を決定した。(2)では、分子シミュレーションによる立体構造の解析方法の確立を最終目標に、鋳型が不要な立体構造解析法であるフラグメントアセンブリ法(Simons KT et al. J Mol Biol 268:209-225, 1997)を基にした解析プログラムを作成した。このプログラムにより、Aig1lタンパク質に存在するホモロジーモデリング法の適用が不可能な領域(Aig1lタンパク質の1番目から216番目の216アミノ酸と、896番目から962番目の67アミノ酸)の構造解析が可能になると期待される。今回、Aig1lタンパク質でホモロジーモデリング法の解析が不可能なN末端領域を対象に、今年度作成したプログラムを用いて部分立体構造を解析した。本研究の目的は、鍼治療効果のメカニズム研究で発見したAcupuncture-induced 1-L (Aig1l)タンパク質機能の解明と鍼治療効果機序の解明である。研究期間内に、(1) Aig1lタンパク質の抗体作製した後に、Aig1lタンパク質の組織化学解析、(2)分子シミュレーションによるタンパク質の立体構造の解析方法を確立し、Aig1lタンパク質の立体構造を解析する。本年度は、合成ペプチドを抗原として5種類のAig1lタンパク質の抗体を作製した。具体的には、EMBOSSソフトウエアで抗原認識部位を選択し、5種類のペプチドを合成した。そして、合成ペプチドを抗原として、ウサギを用いたポリクローナル抗体を作製した。次に、分子シミュレーションによるタンパク質の立体構造の解析方法を確立するため、Aig1lタンパク質の構造解析を行った。具体的には、Protein Data Bank JapanのSequence Navigator機能を用いて、Aig1lタンパク質に対してホモロジーが高く、立体構造が解かれている他のタンパク質の領域を検索した。その結果、利用可能な3個のCUBドメインと5個のSushiドメインの領域が得られた。MOEプログラムで各々のドメインの立体構造を計算し、構造最適化を行った。その後、CUBドメインとSushiドメインの立体構造をドキングシュミレーションで連結し、Aig1lタンパク質の217番目から895番目の679アミノ酸の立体構造を解析した。今年度は、(1)特異性の高いAig1l抗体の選択と、鍼治療効果に関与するシグナル伝達経路の解析系を確立した。(2)ホモロジーモデリング法とフラグメントアセンブリ法を組み合わせて、Aig1lタンパク質の立体構造の解析を行った。(1)では、昨年度に候補とした2種類のAig1l抗体のうち、1種類が特異性の高い抗体であった。この抗体は組織解析には不適応であることが判明した。作成したポリクローナル抗体よりも特異性が高いモノクローナル抗体の作製の可否を検討したが、最近抗体の販売が開始されたため、市販の抗体を入手した。この抗体を用いてAig1lタンパク質の脳内局在や細胞局在を解明するため、現在も実験を継続している。次に、PI3K/AKTシグナル伝達経路が鍼治療効果に関与する結果を得た。PI3K/AKTシグナル伝達経路に関連するAkt, mTOR、p70S6Kのタンパク質のウェスタンブロティング

法の解析条件を決定した。(2)では、Aig1lタンパク質の立体構造の解析により、3個のCUBドメインと5個のSushiドメインの位置関係を明らかにした。そして、MOEプログラム(Chemical Computing Group社)とNAMD (イリノイ大学)を利用した新たな解析系を確立し、解析時間の短縮が実現した。また、1つの構造最適化計算を複数の計算機で分散処理できる解析系を確立した。本研究で作成した解析プログラムにより鋳型のない部分の立体構造を解析した結果、解析プログラムの改良点も明らかになった。引き続き、解析プログラムの研究開発に取り組む。東洋医学特異性が低い抗体を除いた2種類の抗体の可否について解析中である。次に、PI3K/AKTシグナル伝達経路の解析系の確立のため、内部標準として用いられるハウスキーピングタンパク質であるβ-アクチンとα-チュブリンの実験条件を決定した。また、PI3K/AKTシグナル伝達経路のmTORとP70S6Kのウェスタンブロッティングの解析条件も決定した。Aig1lタンパク質の立体構造の解析に向け、フラグメントアセンブリ法を基にした解析プログラムを作成した。実際、このプログラムを用いて部分立体構造の解析が可能であった。このように、順調に研究が進展している。加えて、本研究内容について学会から依頼があり、1回講演した。本年度の達成目標は、(1) Aig1lタンパク質の抗体作製と、(2)分子シミュレーションによるAig1lタンパク質の立体構造の解析方法の確立である。まず、Aig1lタンパク質の抗体作製については、膜タンパク質であるAig1lタンパク質の分離精製は困難が予想されたので、合成ペプチドを抗原として5種類のペプチド抗体を作製した。その際、Aig1lタンパク質の抗原認識部位を決定するため、EMBOSSソフトウエア(http://emboss.sourceforge.net/)を利用した。その結果、数種類の候補の中から5種類の抗原ペプチド領域を選択し、ペプチドを合成した。これらの5種類の合成ペプチドを抗体作製に供した。本研究では、ウサギポリクローナル抗体を作製した。その理由は、速やかに作製可能で、ある程度抗体量を得ることができるからである。次に、分子シミュレーションによるAig1lタンパク質の立体構造解析に取り組んだ。まず、Protein Data Bank JapanのSequence Navigator機能を用いて、Aig1lタンパク質に対して相同なタンパク質を検索した。その結果、部分的にホモロジーが高く、構造が解かれている領域が数種類存在していた。それは、主にAig1lタンパク質の3個のCUBドメインと5個のSushiドメインの領域であった。