hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
亜熱帯性ホンダワラ類の分布拡大メカニズムの解明

近年,九州西岸域の藻場では,ホンダワラ類の優占種が温帯性から亜熱帯性の種へと交代している。本研究では,亜熱帯性ホンダワラ類の分布が拡大したメカニズムの解明を目的とした。亜熱帯性ホンダワラ類は温帯性ホンダワラ類に比べ,食害にあっても再生する能力が高いこと,光を巡る競争関係において不利なことが示唆された。亜熱帯性ホンダワラ類の分布が拡大したのは,温帯性種との競争に勝ったためではなく,食害などで温帯性種が生育できなくなったためであると考えられた。近年、九州西岸で分布が拡大している亜熱帯性ホンダワラ類について、その分布の広がりを把握するとともに、分布拡大を可能にした要因を探った。具体的には、在来種と亜熱帯性ホンダワラ類について食害からの回復力を比較するとともに、在来種群落の有無が亜熱帯性ホンダワラ類の分布拡大の必要条件かどうかについて検討した。1.これまで亜熱帯性ホンダワラ類の分布について聞き取り情報しかなかった小値賀島周辺で、5月下旬に13箇所を潜水調査したところ、4箇所でキレバモクを、2箇所でツクシモクを確認した。これらの地点では在来種のホンダワラ群落は衰退していた。2.在来種のノコギリモクおよび亜熱帯性種のそれぞれが優占する藻場において光量子量を測定した。また、ノコギリモク群落内に人為的に空き地を作り、空き地の内外で亜熱帯性ホンダワラ類が生長・生残するかを調べるための野外実験を開始した。今後は、室内実験により、ノコギリモク群落内外の光環境下における亜熱帯性ホンダワラ類と在来種の光合成や生長特性を比較することにより、野外実験の結果を検証する予定である。3.亜熱帯性ホンダワラ類と在来のホンダワラ類の主要種について、食害を受けた状況を再現し、個体の主枝をすべて切断し水槽内に収容したところ、水温22°Cで全ての種が主枝や葉が再生した。また、野外の潜水観察により、在来のノコギリモクは茎先端部を切断すると組織が再生しないこと、亜熱帯性のマジリモクやキレバモクでは、茎を失った個体でも組織が再生することが観察された。今後は、これらのホンダワラ類の付着器から再生能力を定量的に比較するために、サンプル数を多く確保できる室内実験を行う予定である。近年、九州西岸で分布が拡大している亜熱帯性ホンダワラ類について、分布拡大を可能にした要因を探った。1.在来種のノコギリモク群落内に移植したキレバモク(亜熱帯性ホンダワラ)は,ほとんど生長せず葉が脱落したが,ノコギリモク群落外へ移植したキレバモクは全長約18cmまで生長するなど,両地点での生育状態に大きな違いのあることが把握された。また,両地点の光強度を連続的に測定し,それらの差異を把握した。これらの結果から,在来のホンダワラ類群落が衰退しなければ,亜熱帯性ホンダワラが侵入し生育することはできないのではないか,という可能性が示された。2.温帯性および亜熱帯性ホンダワラ類の13種にについて,培養実験によって付着器から葉や主枝が再生するかどうかを調べ,亜熱帯性ホンダワラ類が高い再生能力を持つ一方で,在来種であるヤナギモクとノコギリモクは全く再生しないことを明らかにした。また,主枝や葉の生育限界温度を超える32.5°Cで5,11日間にわたり培養したマメタワラ(本種のみ17日間でも実験)とキレバモクの付着器も,その後水温を20°Cに下げて培養すると再生能力を示すことも把握された。温帯性あるいは亜熱帯性のホンダワラ類が示した付着器からの再生能力の違いは,食圧や水温などの厳しい環境下で,生存できるかどうかを左右する重要な要因であることが分かった。
Cys-tRNAの二段階合成反応を触媒する酵素複合体の分子機構解明

DNAの塩基配列をもとに蛋白質を合成するには,アミノ酸を転移RNAに正しく結合させる必要があり(アミノアシル化反応),通常,酵素aaRSがその役割を担う.しかし,メタン生成古細菌では,transsulfursomeと呼ばれる3者複合体(SepRS :SepCysE:SepCysS)が行う.本研究では,X線結晶構造解析法,X線小角散乱法,電子顕微鏡観察,その他の生化学的手法を使い,この系の反応機構を明らかにした.Transsulfursomeは,原始のアミノアシル化システムと考えられている.その機構が解明されたことにより,今後,遺伝暗号誕生に関わる謎の解明が一層進むことが期待される.古細菌におけるCys-tRNA(Cys)生合成経路は,tRNAにアミノ酸を直接付加する通常の一段階の反応ではなく,2つの酵素(SepRS, SepCysS)が触媒する二段階の反応から成り立っている.近年,研究代表者らは,この反応経路に必須の第3のタンパク質SepCysEを同定し,SepCysEを含めた3者複合体(Transsulfursomeと命名)が反応の機能単位であることを明らかにした.本研究では,そのTranssulfursomeとtRNA複合体のX線結晶構造解析を行い,構造をもとに二段階の反応から成るアミノアシル化反応の分子機構を解明し,それを通して生命進化の謎に迫ることを研究の目的としている.計画に基づき,平成27度には以下の3点について研究を実施した.○SepRS, SepCysS及びSepCysEとtRNACysの結合親和性・化学量論比の解析.それぞれの成分を精製した後,ネイティブPAGEおよびSECにより,SepCysE-SepCysSとtRNACysとは2:1で結合することを明らかにした.またITCの測定により,SepCysE-SepCysS複合体では, tRNACysの結合に対してSepCysEのCTDが重要な役割を果たしていることを明らかにした.○TranssulfursomeおよびTranssulfursome-tRNACys複合体の構造解析.結合親和性・化学量論比解析の結果に基づいて,さまざまな複合体をデザインして結晶化を試みた.その結果,2種の複合体の結晶化に成功し,X線結晶構造解析を行った.○小角X線散乱(SAXS)によるTranssulfursomeとtRNACys会合体の溶液状態の解析.放射光施設SPring-8とPFにてSAXS実験を行った.X線結晶構造解析の結果を利用して,そのデータを解析した.初年度の計画を順調に実行し,2種の複合体の結晶化と構造解析に成功した.古細菌におけるCys-tRNA(Cys)生合成経路は,tRNAにアミノ酸を直接付加する通常の一段階の反応ではなく,2つの酵素(SepRS, SepCysS)が触媒する二段階の反応から成り立っている.近年,研究代表者らは,この反応経路に必須の第3のタンパク質SepCysEを同定し,SepCysEを含めた3者複合体(Transsulfursomeと命名)が反応の機能単位であることを明らかにした.本研究では,そのTranssulfursomeとtRNA複合体のX線結晶構造解析を行い,構造をもとに二段階の反応から成るアミノアシル化反応の分子機構を解明し,それを通して生命進化の謎に迫ることを本研究の目的としている.これまでの結晶構造解析により,SepCysEは2つのリンカーでつながった3つの構造単位から成り立っており,全体として,N-helix : linker1 : NTD : linker2 : CTDという構造をしていることが明らかになった.この構造をもとにSepCysEは,N-helixとNTDを利用して,SepRSとSepCysSを結合させ,また,CTDがtRNAを捕まえた後,2つのリンカー部の構造変化によって,tRNAをSepRSの活性部位からSepCysSの活性部位へ移動させるという新しい作業仮説を立てた.28年度には,この仮説を検証するために様々な変異体を作製し, tRNA結合実験および活性測定実験を行い,さらに,電子顕微鏡観察をも行い,実際に,TranssulfursomeがSepCysEの2本のリンカーを利用して構造変化をしながら,1つ目の反応部位から2つ目の反応部位へtRNAを運んでいることを証明した.またその結果をもとに論文を作製して投稿した.初年度,二年度の計画を順調に実行し,2種の複合体の構造解析に成功して,現在,論文投稿中である.古細菌におけるCys-tRNA(Cys)生合成経路は,tRNAにアミノ酸を直接付加する通常の一段階の反応ではなく,2つの酵素(SepRS, SepCysS)が触媒する二段階の反応から成り立っている.近年,研究代表者らは,この反応経路に必須の第3のタンパク質SepCysEを同定し,SepCysEを含めた3者複合体(Transsulfursomeと命名)が反応の機能単位であることを明らかにした.本研究では,そのTranssulfursomeとtRNA複合体のX線結晶構造解析を行い,構造をもとに二段階の反応から成るアミノアシル化反応の分子機構を解明し,それを通して生命進化の謎に迫ることを本研究の目的としている.これまでのX線結晶構造解析により,SepCysEは2つのリンカーでつながった3つの構造単位から成り立っており,全体として,N-helix : linker1 : NTD : linker2 : CTDという構造をしていることが明らかになった.

この構造をもとにSepCysEは,N-helixとNTDを利用して,SepRSとSepCysSを結合させ,また,CTDがtRNAを捕まえた後,2つのリンカー部の構造変化によって,tRNAをSepRSの活性部位からSepCysSの活性部位へ移動させるという仮説を立てた.この仮説を検証するために様々な変異体を作製し,tRNA結合実験および活性測定実験,電子顕微鏡観察を行い,実際に,TranssulfursomeがSepCysEの2本のリンカーを利用して構造変化をしながら1つ目の反応部位から2つ目の反応部位へtRNAを運んでいることを証明した.最終年度には,これらの結果を論文にまとめ国際誌に発表した.また,学会,ホームページ等でも広く公表した.DNAの塩基配列をもとに蛋白質を合成するには,アミノ酸を転移RNAに正しく結合させる必要があり(アミノアシル化反応),通常,酵素aaRSがその役割を担う.しかし,メタン生成古細菌では,transsulfursomeと呼ばれる3者複合体(SepRS :SepCysE:SepCysS)が行う.本研究では,X線結晶構造解析法,X線小角散乱法,電子顕微鏡観察,その他の生化学的手法を使い,この系の反応機構を明らかにした.Transsulfursomeは,原始のアミノアシル化システムと考えられている.その機構が解明されたことにより,今後,遺伝暗号誕生に関わる謎の解明が一層進むことが期待される.平成27年度に実施した複合体の結晶構造解析より,SepCysEは2つのリンカーで分断された3つの構造単位から成り立っており,全体として,N-helix : linker1 : NTD : linker2 : CTDという構造をしていることが明らかになった.N-helixとNTDは,どちらも2量体として,それぞれ,SepRS,SepCysSに結合し,またCTDはtRNAに結合する.したがって,SepCysEは,N-helixとNTDを利用して,SepRS,SepCysSを結合させ,CTDが2つのリンカーを利用して,tRNAをSepRSからSepCysSへ移動させるという作業仮説を立てることができた.今後は,その仮説を検証するために様々な変異体を作製し,活性測定とtRNA結合実験を行い,その結果をもとに論文を作製して発表する.これまでのX線結晶構造解析により, transsulfursomeは中心にSepRS4量体を持ち,また両端にはSepCysS2量体が結合しており,その中間の位置にSepCysE2量体が存在して,N-helixとNTDで,SepRSとSepCysSとを結び付けていること, SepCysEのCTDはtRNA結合ドメインであること,これらの3つのドメインは2つのリンカーでつながっていることを明らかにした.さらに,この構造をもとに,電子顕微鏡や活性測定実験の結果と併せて,transsulfursomeは,SepCysEのCTDによってtRNAを捕まえ,2つのリンカーを使ってSepRSからSepCysSへtRNAを移動させることを証明した.29年度には,この反応機構を国際誌,および学会で発表し,さらにはホームページなどを利用して広く一般に公表する.29年度が最終年度であるため、記入しない。X線構造解析29年度が最終年度であるため、記入しない。
スパースモデリングを用いた大脳中次視覚野における自然視覚情報処理機構の解明

(1)大脳皮質視覚野における情報表現をスパースコーディングで解明するため、事象のスパース表現の一つである自然言語を媒介とした情報表象モデルを考案した。このモデルによって、自然動画刺激下において大脳中次視覚野を含む広範囲の脳活動が説明できることを示した。また同モデルの表象内容を解析することで、形容詞等で指示される主観的な知覚意味内容に関する意味空間の定量や、脳活動からの知覚内容解読等が行えることを示した(Nishida et al., 2015 SfN)。また同モデルの中間情報表現を更にスパース化することでモデルの説明能力が向上すること(Kawase et al., 2016 J-SAI)、深層学習由来のモデルを援用することで脳活動から知覚内容を一定精度で文章として取り出すことを示した(Matsuo et al., 2016 J-SAI)。更に本件に関連した特許を3件出願した(Nishimoto et al., 2015, 2016a, b)。(2)大脳皮質中次視覚野における細胞情報表現の局所的機能構造を解明するため、V1野およびV4野においてカルシウムイメージング法によって記録した神経活動をスパース表象(運動エネルギー表象)でモデル化した。その結果、V4野においては刺激方位については選択性が似た細胞が局在化しているのに対し、空間周波数についてはその傾向が見られないなど、V1野と異なる局所的機能構造を持つことを示した(Amano et al., 2016IEICE Technical Report)。27年度が最終年度であるため、記入しない。スパースモデリング手法を用いて大脳視覚領野における神経表象の定量と可視化を推進した。特に下記(1)と(2)について顕著な進展が見られた。(1)私たちが日常的に受けとる視覚入力は非常に複雑・多様かつダイナミックなものであるが、そこから最終的に得られる知覚は言語等によって記述できるよりスパースなものである。このため、視覚体験のスパース情報表象理解の試みとして、自然言語処理技術を応用した定量的モデルを新たに構築し、同モデルによって自然視覚体験下におけるヒト脳神経活動の説明と予測を試みた。この結果、同モデルはヒト大脳皮質後頭部から下側頭部にかかる広い領域(主に中次から高次視覚領野)の脳活動をよく説明することが分かった。また同モデルの逆関数を求めることで、脳活動から知覚内容を推定することにも成功した。これらの結果は、ヒト脳活動を説明するスパース表象としての自然言語モデルの有効性及び重要性を示すものである。(2)中次視覚野において自然動画刺激下における神経細胞単位の活動を運動エネルギーモデル等を用いてモデル化した。同モデルの表象内容を解析することにより、各種視覚表象の皮質局所領域におけるクラスタリングや空間勾配を定量可視化することが出来た。表象の皮質内分布の様相を理解することは、機能的神経回路形成機序の解明、及びfMRI(機能的磁気共鳴画像法)等のより大局的な脳活動計測データに関するモデル構築等に重要な示唆を与える。脳神経活動モデル化に関して、スパースモデリング手法の適用によって高精度かつ解釈可能性に優れたモデル化が実現している。また中次視覚野における局所機能構造に関しての新知見が得られつつある。これらにより、申請時に想定していた研究内容がおおむね順調に進展している。前年度に引き続き、多様なモデリングアプローチの適用を介したより精度の高い脳神経活動モデルの構築、及びその定量可視化を介した神経表象の定量理解を推進していく。更に同モデルの逆問題を解くことで脳情報デコーディングの高度化も平行して行っていく。
生体内における血管内皮細胞の接着メカニズムについて

血管内皮に於ける細胞と細胞及び細胞と基質の間の接着は、血管の正常な機能を維持する上で極めて重要である。本研究ではニワトリ胚およびヒヨコの血管の全載標本(内径が0.1mm以上の血管)を材料に、内皮細胞と細胞基質(なすわち基底膜)の間に働く接着メカニズムの解明、特にストレスファイバー(SF)を介した接着機構の解明に向け、細胞生物学的研究を進めてきた。以下に本研究で明らかになった新しい知見について報告する。まず血管内膜を形成している内皮細胞のSFの超微構造や末端部の形態が、培養細胞SFと同一で、血管内膜でもビンキュリンやフィブロネクチン(FN)の局在を伴う接着斑の形成があり、細胞と基低膜間の接着に関与することが分かった。さらに培養細胞にみられるSFとFNの位置関係が血管壁にもあるかどうかについて、SFとFNのパターン変化を血管の発達にそって調べた。同じ個体では、大きい血管ほどSFの発達がよく、小さいものではSFがほとんどみられなかった。FNの走行は大きな血管では血流方向へ並んでいるが、小さくなるに従って並び方が乱れていき、内径が0.1mm前後の血管ではランダムになっていた。大きな血管でも分岐部の下流側ではSFの発達が悪く、FNの走行も乱れていた。これらの結果は血管基低膜のFN構造が内皮細胞SFの影響を受けることを示唆する。また同じ血管の発生に伴う変化をみると、血流方向への細胞の伸長、続いてSFの配向、そしてFNの配向、という順序がみられ、ここでもSFとFNの並び方の深い関係がみられた。このような生体内での観察に加え流れ負荷装置を使い、流れ存在下の内皮細胞のSFとFNの構造の関係をin vitroで解析し始めている。FN構造ができるには長い時間がかかることから、単層形成内皮細胞の長期間培養システムをマロチレートを使用して開発した。これからこのシステムを用いin vitroでSFとFN構造の関係を解析する計画である。血管内皮細胞の細胞間及び細胞基質間の接着は、正常な血管機能の維持にとって極めて重要である。細胞と基質間の接着についての研究は培養細胞を用いた研究がその主流をしめる中で、実際の組織を扱ったものとしてこの研究はユニ-クであると考える。本年度の目的は血管壁にある内皮細胞のストレスファイバ-(SF)の超微構造および末端部の形態を明らかにし、培養細胞SFと比較・検討することであり、この目的はほぼ達成できた。まず生体内の細胞のSFは、超微形態的にも培養細胞のものと、際だった違いのないことが明らかになった。このことは我々が以前発表した蛍光抗体染色の結果と矛盾しない。培養細胞の基底側にあるSFの末端部は接着斑と呼ばれる、細胞と基質の接着部になっているが、血管内膜でもSF末端部はビンキュリン、ファイブロネクチン(FN)などの局在、電子密度の極めて高いことなど、接着斑の基本的特徴を備えていた。この結果は血管内膜を形成している内皮細胞にも接着斑があり、細胞一基底膜間の接着に携わっていることが強く示唆される。また蛍光抗体染色法でみた各種細胞骨格蛋白の生体内細胞SFでの局在は、一般的に見て、培養細胞に比べて規則性(または周期性)が顕著であった。このことについては、培養細胞が培養という極めて非生体的環境で生息するために、SFの発現が誇張され、規則性が見え難くなったためと考えている。培養細胞は接着斑に局在するインテグリンを介して、繊維上になったFNに結合している。

この場合しばしばFNの繊維とSFが同じ方向に並んで見えることが知られている。ニワトリ胚の腸間動脈内皮のSFと基底膜にあるFNの繊維の方向を調べてみると、両者とも血流方向に並んでいた。この相互関係の成立過程を発生胚で見てみると、SFの発達・方向性の確立がFNのものに先行して起こることが分かった。血管内皮組織に於ける細胞ー細胞間及び細胞ー基質間の接着は、血管の正常な機能を維持する上で極めて重要である。これまで内皮細胞と細胞基質の間に働く接着メカニズムの解明、特にストレスファイバー(SF)を介した接着機構の解明に向け、細胞生物学的研究を進めてきた。前年度の研究でin situ内皮細胞のSFの超微構造や末端部の形態が、培養細胞SFと際だった違いは無く、血管内膜でもビンキュリンやフィブロネクチン(FN)の局在を伴う接着斑の形成があり、細胞ー基底膜間の接着に関与することが分かった。本年度は培養細胞にみられるSFとFNの位置関係が、血管壁にもあるかどうかを調べた。ニワトリ胚およびヒヨコの動脈を用い、SFとFNのパターン変化を血管の発達にそって調べた。全載標本作成可能な血管の大きさは、内径が0.1mm以上でなくてはならないという制約があるが、その範囲内で以下のことが分かった。まず同じ個体では、大きい血管ほどSFの発達がよく、小さいところではSFが殆んどみられなかった。FNの走行は大きな血管では血流方向へ並んでいるが、小さくなるに従って並び方が乱れていき、小さいものではランダムになっていた。大きな血管でも分岐部の下流側ではSFの発達が悪く、FNの走行も乱れていた。これらのことから血管基底膜のFN構造は内皮細胞のSFの影響を強く受けていることが分かった。また同じ血管の発生に伴う変化を追ってみると、細胞の血流方向への伸長、SFの血流方向への配向、FNの血流方向への配向、という順序がみられた。ここでもSFの発達とFNの並び方の深い関係が示唆された。このようなin vivoでの観察に加え流れ負荷装置を使いin vitroで、流れ存在下の内皮細胞のSFとFN構造の関係を解析しはじめている。単層を形成している内皮細胞と単独の細胞ではSFの走行が異なるので、長期間単層を維持できる内皮培養システムをマロチレートを使用して開発した。
ホワイトカラー労働の生産性管理に関する研究

この研究はホワイトカラー労働の生産性問題を、ブルーカラー労働の分析にあたって有効であった部門業績管理の研究を適用して、その特性と課題を発見しようとしたものである。研究によって得られた主な知見は概要次の通りである。1.ホワイトカラー労働の変動は、ブルーカラー労働と同様に、外部環境の変化→経営戦略の再構築→部門業績管理の再編→人事考課の再編→資金管理の改正という管理体系の変動という経路をたどる。バブル経済崩壊後のホワイトカラー労働の再編論議の主潮流は、この経路のうちもっぱら人事考課の再編と賃金管理の改定という次元のみに着目しているために、生産性との関係を積極的に取り扱えない。2.製造業であれ、サービス業であれ、営業部門がそうした管理体系の変動を最も敏感に反映しうる。売上高管理から収益管理への部門業績管理指標の移行、人事考課における数値指標の比重増大がそれである。重要な点はそれに応じて、管理間接部門の管理が、営業部門での管理との比較において、組織内合意を促す内部調整を必要としていることである。特定業務の外部化、要員管理の厳格化、もしくは報酬における従来の規範を超えた格差設定(年俸制)は代表的な調整内容である。3.この研究は、日本の経営の現況の社会科学的記述の新たな方法を示している。ケーススタディをさらに積み重ねた場合、人事管理論と経営学とがより有機的に組み立てられる可能性が強い。この研究過程で新たに考慮すべき課題として浮かび上がってきた論点は、ノルマ設定をめぐる労使関係の詳細を論理化することである。国策である「ゆとりある勤労者生活」を科学する端緒にようやくたどりついたということができる。
帰国子女の世界像に関する地理教育論的研究

本研究は,主として,帰国子女および海外日本人学校における地理教育カリキュラム開発のための基礎理論の確立をめざし,発生的地理教育論の視点に立って,帰国子女が主に滞在国において形成してきた世界像の構造と,その帰国後の変容過程を明らかにしようとしたものである.世界像(Weltbild)は年令と共に発達するが,人生観や世界観の形成とも相互に密接なかかわりをもつ.同時に,生育時における自然環境および文化の諸形態と著しく関連し,これらがその形成に大きく影響することが知られてきた.従って,日本国内で生れ,成長した場合には,その世界像は互いに比較的似たものとなるが,生育時を海外で過ごした帰国子女の場合は著しく複雑になる.一般には,滞在国または地域と日本の,少くとも二つの「極」をもって世界像が構成されると考えられているが,その実証的研究は乏しい.自由表出法を中心とした本研究によって明らかとなったのは下記の通りである.1.小学校中・高学年の帰国児童の世界像は,むしろ予想以上に貧困であり,滞在国に関する地理的空間認識も概して乏しい. 2.小・中・高を通じて,世界像の構造上には性差が認められ,概して,男子のそれが明確であり,内容的にも豊かな場合が多い.3.帰国直後の彼等の世界像における日本は,主として「知覚圏内における認識の島」として構造化されている.しかし,時間と共に滞在国との間に, "動線"が形成され,認知圏内に取り込まれている.4.中・高校の帰国子女の世界像は,一般に滞在国(地域)に「極」をおきつつも,明確なものとなる.しかし,帰国後,日本語の修得が進み,自我が確立していく過程で,日本への「極」の転換が急速に行われる場合がある.何等かのモメントによってidentityに関する葛藤が解決した結果とみられるが,その過程の究明は,今後の課題である.本研究は,主として,帰国子女および海外日本人学校における地理教育カリキュラム開発のための基礎理論の確立をめざし,発生的地理教育論の視点に立って,帰国子女が主に滞在国において形成してきた世界像の構造と,その帰国後の変容過程を明らかにしようとしたものである.世界像(Weltbild)は年令と共に発達するが,人生観や世界観の形成とも相互に密接なかかわりをもつ.同時に,生育時における自然環境および文化の諸形態と著しく関連し,これらがその形成に大きく影響することが知られてきた.従って,日本国内で生れ,成長した場合には,その世界像は互いに比較的似たものとなるが,生育時を海外で過ごした帰国子女の場合は著しく複雑になる.一般には,滞在国または地域と日本の,少くとも二つの「極」をもって世界像が構成されると考えられているが,その実証的研究は乏しい.自由表出法を中心とした本研究によって明らかとなったのは下記の通りである.1.小学校中・高学年の帰国児童の世界像は,むしろ予想以上に貧困であり,滞在国に関する地理的空間認識も概して乏しい. 2.小・中・高を通じて,世界像の構造上には性差が認められ,概して,男子のそれが明確であり,内容的にも豊かな場合が多い.3.帰国直後の彼等の世界像における日本は,主として「知覚圏内における認識の島」として構造化されている.しかし,時間と共に滞在国との間に, "動線"が形成され,認知圏内に取り込まれている.4.中・高校の帰国子女の世界像は,一般に滞在国(地域)に「極」をおきつつも,明確なものとなる.しかし,帰国後,日本語の修得が進み,自我が確立していく過程で,日本への「極」の転換が急速に行われる場合がある.何等かのモメントによってidentityに関する葛藤が解決した結果とみられるが,その過程の究明は,今後の課題である.二年計画の初年度にあたる本年度は、小・中・高の各学年にわたる帰国子女約40例について、自由表出法に基く世界像の検出調査を実施した。現在、結果の分析を急いでいるが、ほぼ次の結果が明らかになりつつある。|)滞在期間と共に、在留国の治安状態とも関連するが、概して、小学校中・高学年に渡航したものは、当該地域についての地域認識が適確であり、単なる基礎世界像の充実にどどまらず、当該国の副極化がみられる場合が多い。これは、探検行動期における渡航が効果的に作用したためとも言えるが、帰国後にも及ぶ、当該国の友人達との交流を含む積極的友情報行動による刺激が地域認識の強化をもたらしたとみることができる。この「地域認識に関する結晶作用」とも言うべき副極化の過程,動機,メカニズムについての分析は、次年度の課題の一つである。なお、この様な現象は、米国,西欧諸国など、ヨーロッパ文化の卓越する地域について顕著なことは活目に価する。2)特に前期の渡航時における場合、世界像形成の背後をなす歴史的時間軸が不明確な場合が多いが、これは第三世界の場合に、顕著である。すなわち、国内で生活する通常の小・中・高生が、ごく日常的に備えている日本史に関する流れが、世界像における歴史的時間軸の物指として利用することが容易でない。滞在国の歴史については、確かに一定の認識があるが、それを歴史的時間軸として、世界像に組み込めるほど確かなものとはなり難い。この様なことは、とくに世界史像の形成に際しても著しくマイナス面をもたらしていることがうかがえ、今後、日本人学校の地理教育カリキュラムにおける歴史教材とのかかわりで、さらに研究すべきテーマといえる。
糸状菌の遺伝子組換えを革新的に変えるマルチコピー遺伝子導入法の開発

麹菌Aspergillusoryzaeでは、分子ツールが潤沢でないため遺伝子工学的な改変に多くの制限と多大な時間と労力を要する。一方で、A. oryzaeでは、染色体上に非相同的に組み込むコトランスフォーメーションによりマルチコピーで遺伝子導入が可能であることが経験的に知られている。本研究では、コトランスフォーメーションにおける染色体上遺伝子導入部位偏重を解析し、新しいマルチ遺伝子破壊法や多種類遺伝子の同時導入法開発を目指した。平成29年度までに、導入遺伝子数の異なる多数の遺伝子組み換え麹菌を作出しており、当初予定していた次世代シーケンサ(超並列型ショートリードシーケンス)からロングリード解析が可能なナノポアシーケンサを用いた解析手法の確立に成功していた。平成30年度は、このナノポアシーケンサを用いた解析技術を種々の形質転換体のゲノム解析に適応することで、コトランスフォーメーションによってマルチコピー導入された外来遺伝子のゲノム中での構造を詳細に解析することとした。また、導入遺伝子の末端配列を変更することでコピー数の多型性を生じさせた株間のゲノム構造を比較した。複数株のゲノム構造解析の結果、コトランスフォーメーションでのマルチコピー導入では、ゲノム上の様々な位置に散在して導入されると予想されていたが、その予想とは全く異なり、ゲノム上のある場所に集約的に導入されるロングタンデムリピート構造になることを世界で初めて発見した。ゲノム上に導入される場所は、固定されておらず、ゲノム上でも外来遺伝子が入りやすいホットスポットのような場所が存在する可能性を考えていたが、形質転換体ごとに導入遺伝子部位は染色体レベルで異なり、かつ集約的に導入されることを明らかにした。一方で、A. oryzaeでは、染色体上に非相同的に組み込むコトランスフォーメーションによりマルチコピーで遺伝子導入が可能であることが知られている。本研究では、コトランスフォーメーションにおける染色体上遺伝子導入部位偏重を解析し、新しいマルチ遺伝子破壊法や多種類遺伝子の同時導入法開発を目指す。(1)次世代シーケンス解析による導入部位の特定:コピー数の多形性と遺伝子導入部位の関係性を探るために、同一導入遺伝子に対して三つの異なるプロモーター/ターミネーターのセットを用意して形質転換を行い、合計9株の形質転換体を作成した。これらの形質転換体の染色体上のコピー数を確定するために、プローブ法による定量PCRを行った。従来の傾向の再現性を取り、9株中4株についてMiSeqを用いたリシーケンスを行った。今後、残りの5株のリシーケンスを行う。(2)マルチコピー遺伝子導入株を足場とした相同組み換えを利用した部位特異的遺伝子導入:ligD遺伝子破壊株は相同組換え効率が上昇することが知られている。そこで、既に構築してあるマルチコピー遺伝子導入株について、従来法に従ってligD遺伝子を破壊し、ligD遺伝子破壊セルラーゼマルチコピー遺伝子導入株(MultiCelΔligD株)を得た。今後、この株を宿主として部位特異的外来遺伝子の再導入を行う。(3)非相同的組換えにおける導入部位偏重の解析:(1)および(2)の実験に想定外に時間を要したため、形質転換体構築の時間を利用して、H29年度予定分を前倒しして導入遺伝子の末端配列を任意配列にした形質転換体を行い、複数の形質転換体を得た。平成28年度の目標として、(1)および(2)の実験項目について以下を掲げていた。(1)次世代シーケンス解析による導入部位の特定:コピー数多形性の異なる9株についてコピー数を決定し、ゲノムリシーケンスを行う。(2)マルチコピー遺伝子導入株を足場とした相同組み換えを利用した部位特異的遺伝子導入:既に構築してあるマルチコピー遺伝子導入株について、従来法に従ってligD遺伝子を破壊する。実際の進捗状況として、下記の通りとなっており、順調な部分と、遅れている部分、逆に前倒しで進めている部分があるため、トータルでみておおむね順調に進展していると自己評価を行った。(1)次世代シーケンス解析による導入部位の特定:コピー数多形性の異なる三つのプロモーター/ターミネーターセットを用いて9株の形質転換体を取得し、それぞれの株についてプローブ法による定量PCRにより、染色体上の導入遺伝子コピー数を決定した。この内、約半分の4株についてリシーケンスを行ったが、残りの5株について未実施となっている。(2)マルチコピー遺伝子導入株を足場とした相同組み換えを利用した部位特異的遺伝子導入:予定通りligD遺伝子破壊セルラーゼマルチコピー遺伝子導入株(MultiCelΔligD株)を構築した。一方で、(1)および(2)の形質転換体の取得に想定外の時間を費やしたため、遅い生育速度の合間を利用して、平成29年度実施予定の(3)非相同的組換えにおける導入部位偏重の解析を前倒しで実施した。導入遺伝子断片の末端に任意の配列を持ち鎖長の異なる配列を付加して形質転換を実施した。長すぎる鎖長や短すぎる鎖長では、これまでの形質転換体の取得し易さの傾向と異なってきており、末端配列の重要性が示唆されつつある。

一方で、A. oryzaeでは、染色体上に非相同的に組み込むコトランスフォーメーションによりマルチコピーで遺伝子導入が可能であることが経験的に知られている。本研究では、コトランスフォーメーションにおける染色体上遺伝子導入部位偏重を解析し、新しいマルチ遺伝子破壊法や多種類遺伝子の同時導入法開発を目指している。(1)次世代シーケンス解析による導入部位の特定:染色体上にマルチコピーで導入された遺伝子断片が、どの位置にどのような形で導入されているのか検討するために平成28年度まではMiSeqを用いて検討していた。しかしながら、この方法ではタンデムに並んで導入されている場合、それを正しく評価することは難しい。そこで、一分子シーケンサ(MinION)を用いて長鎖DNA断片を対象としたゲノムリシーケンスを実施確認し、数10 kb長のDNA断片の解析から、タンデムリピート化して導入されている現象を発見をした。(2)部位特異的遺伝子導入:多数の遺伝子を染色体上に導入し、高発現させる場合プロモーターの競合が発現効率を低下させる問題が生じたため、H29年度は競合しない高発現用プロモーターセットの探索を実施した。(3)導入部位偏重の解析:H28年度までに、導入遺伝子の末端配列を任意配列に改変してコトランスフォーメーションを実施し、複数の形質転換体を得ている。高コピー低効率型のDNA断片に、低コピー高効率型DNA断片の末端配列を導入した場合、形質転換効率が向上する傾向を掴んでおり、形質転換体に対する網羅的な定量PCRにより、低コピー高効率型DNA断片の末端配列を導入することで染色体上のコピー数をコントロールすることに成功した。概要にも記載した通り、一分子シーケンサを用いて長鎖DNA断片の解析を行うことで、タンデムリピート化して染色体上に導入されている現象を発見した。これまで、染色体上の複数の位置にランダムに導入されているのか、部位特異的に導入されているのかも分からない状態であったが、一分子シーケンサを用いることでどの部位に入っているのかを明確にできただけでなく、その導入形状としてタンデムリピート化を発見できたのは完全に新しい発見である。従来型の超並列型ショートリード解析の次世代シーケンサやサザンハイブリダイゼーションでは数10kbにも及ぶタンデムリピート構造を明確にすることは出来なかった。大きな進捗である。また、高発現用プロモーターを新規に複数発見することができたので、プロモーターの競合問題を回避して複数の遺伝子を高発現できるようになった。セルラーゼ遺伝子を用いたレポーターアッセイにより、これまで使用していたプロモーターと同等もしくはそれ以上のプロモーター活性を有しており、プロモーターの数と強度のバリエーションから、発現レベルにグラデーションを与えることが可能になった。これは、マルチコンポーネントの酵素の生産や代謝フラックスを制御する遺伝子発現への応用が期待できる。導入部位偏重の解析においても、高コピー低効率型のDNA断片に、低コピー高効率型DNA断片の末端配列を導入することで、形質転換効率や染色体上コピー数を変えることに成功しており、その末端配列の特徴も見出している。
２次元状有機ナノシートのサイズ制御を要素技術としたナノカーボン材料の機能化

本研究では、規則的な格子構造をもつ2次元シート材料を形成可能な「共有結合性有機フレームワーク(COF: Covalent Organic Framework)」を基幹素材とした機能性カーボン材料の開発を行った。その成果として、室温合成法というCOFの新規合成手法を開発し、ソルボサーマル法(従来法)で作製したものと比べ高い比表面積と熱安定をもつ高結晶性COFを調製することに成功した。さらに、得られた高結晶性COFを炭化することによって窒素ドープカーボンを合成できることを見出した。特に、COFの結晶化度が炭化後に得られる窒素ドープカーボンの構造や状態に大きな影響を及ぼすことを明らかにした。本研究では、規則的な格子構造をもつ2次元シート材料を形成可能な「共有結合性有機フレームワーク(COF: Covalent Organic Framework)」を新しい材料創製の基幹素材とするため新手法の開拓と機能材料の開発を進めている。特に、独自のアプローチとして、これまでに未開拓であったナノサブミクロンサイズにおけるCOF粒子自体のサイズ制御技術を開発している。上記の目的を達成するために今回考案した新規のCOF合成法を検討したところ、高い構造規則性を有した高結晶性COF粒子を作製可能な室温合成法を開発することに成功した。特に本手法で得られるCOFは既報のものと比べて、1)より明瞭なX線回折パターンを示す、2)3倍を越えるBET表面積をもつ、3)高い熱安定性を示す、などの特徴があることがわかった。さらに、COF合成時に第3成分を添加するアプローチによって、生成物が均一なナノサイズの粒子として得られることを見出した。以上の知見は、従来検討が行われていなかった手法に基づく本研究の取り組みから、新規のCOF構造制御が可能となることを示唆している。次年度はこれらの成果をもとに、COFの構造制御のための条件最適化を検討し、2次元シートを基本構造にもつCOFのサイズ制御合成を達成する。さらに、得られたサイズ制御COFの特徴を活かして、カーボンナノチューブなどに代表されるナノカーボンの機能化への展開を進める。本研究では、規則的な格子構造をもつ2次元シート材料を形成可能な「共有結合性有機フレームワーク(COF: Covalent Organic Framework)」を新しい材料創製の基幹素材とするための新合成法の開拓とそれをもとにした機能性カーボン材料の開発を目的としている。昨年度、室温合成法というCOFの新規合成手法を開発し、ソルボサーマル法(従来法)で作製したものと比べ、高い比表面積と熱安定をもつ高結晶性COFが得られることを明らかにした。本年度は、得られた高結晶性COFが窒素原子を含んだ分子骨格を有することに着目し、本材料を炭化することによって窒素ドープカーボンを合成できることを見出した。特に、参照試料として低結晶性のCOFを炭化して作製したサンプルとの比較を行った結果、高結晶性COFを用いた場合はラマンスペクトル測定においてグラファイト構造に由来するシグナルが明瞭に観測され、X線光電子分光測定からはグラフィティック窒素構造の形成割合が高くなっていることわかった。以上のように、COFの結晶化度が炭化後に得られる窒素ドープカーボンの構造や状態に大きな影響を及ぼすことを明らかにした。また、分子骨格の異なるCOFを炭化することで、ドープ状態などの構造や物性が異なる異種元素ドープカーボンを調製することにも成功している。以上のことから、本研究ではCOFが異種元素ドープカーボンを創製するための原料として有効なことを明らかにしており、異種元素ドープカーボンの利用が期待されている燃料電池触媒などの応用分野へ貢献しうる重要な知見と成果を得た。今回提案しているCOF作製方法によって、高結晶性COFの室温合成法を開発することに成功した。また、COF粒子のサイズ制御を目的として添加した第3成分の分子の存在によって、生成物が均一なナノサイズの粒子となることがわかった。以上により、当初計画していた通り、COFのサイズ制御合成を達成するための基礎となる重要な知見を得ることに成功した。27年度が最終年度であるため、記入しない。ナノカーボン科学、超分子化学、高分子化学本年度得た知見をもとに、本アプローチによって種々のサイズのCOF粒子を作り分けられることを実証し、サイズ制御COF粒子の合成法としての一般性を示す。さらに、第3成分分子の添加を利用して、サイズ制御COF粒子の機能化を達成する。最終的に、得られた材料が2次元シートを基本構造として有している特徴を活かして、新規なナノカーボン材料の開発ならびにカーボンナノチューブの高機能化に向けた検討を実施する。
乳児突然死に関連したミトコンドリア呼吸鎖異常症の原因遺伝子PNPAL4の機能解明

本研究の目的は、PNPLA4の分子生物学的機能を明らかとし、小児の希少難病であるミトコンドリア呼吸鎖異常症および乳児突然死症候群/乳児突発性危急事態の新たな発症機序を解明することである。本遺伝子は、乳児突発性危急事態として発症したミトコンドリア呼吸鎖異常症患者において、我々が同定した原因遺伝子であり、マウスを除く多様な生物種に発現してリン脂質代謝に関与するが、その詳細は未だ不明である。PNPLA4の生体内での役割を解明するためにはモデル生物を用いた研究が必要不可欠だが、本遺伝子はマウスでは発現していない。そのため、我々はモデル生物としてゼブラフィッシュを選択した。ゼブラフィッシュは世代時間が短く、遺伝学やイメージング解析で非常に優れている。また、CRISPR/Cas9システムなどによって容易に疾患モデルを作製することが可能な脊椎動物である。全ゲノム配列はヒトと高い相同性を有し、遺伝子数や主要臓器・組織の発生および構造もヒトとの類似性が高い。本研究を通してPNPLA4の詳細な分子メカニズムが明らかとなれば、ミトコンドリア呼吸鎖異常症の新たな治療戦略の創出ならびに乳児突然死の予防法提唱に大きく寄与する可能性がある。本研究では、現在までに、CRISPR/Cas9システムを用いて疾患モデルとなるpnpla4ノックアウトゼブラフィッシュの樹立に成功した。今後、その表現型を詳細に観察するとともに、ミトコンドリア呼吸鎖複合体活性と脂質代謝への影響を調べることで、変異pnpla4が及ぼす生体への影響と脂質代謝への関与を明らかとする予定である。我々は既に、CRISPR/Cas9システムを用いて疾患モデルとなるpnpla4ノックアウトゼブラフィッシュの樹立に成功した。現在、pnpla4ノックアウトゼブラフィッシュの表現型や、ミトコンドリア呼吸鎖複合体活性と脂質代謝への影響について、詳細な検討を実施しているところである。現在、pnpla4ノックアウトゼブラフィッシュの表現型や、ミトコンドリア呼吸鎖複合体活性と脂質代謝への影響に関する実験を実施しているところである。今後、RNAシーケンスやリピドミクス解析を実施し、研究内容をさらに発展させる予定である。当該年度の支出額は当初の予定を下回ったが、差額分を次年度に繰り越し、RNAシーケンス解析やリピドミクス解析に充当する予定である。
円弧状Al-Al_3Ni FGM圧延に及ぼすロール径とロール周速の影響

本研究で行った実験・実験結果の概要を以下に箇条書きに記す。2.前記の厚肉円筒から厚さ6mm,内径54mm,幅20mmの円弧状FGM試験片を作成した。3.表面にセラミックスをプラズマ溶射したロールを用いて圧延を行ったが,圧延回数が多くなるとロール表面に試験片の凝着が見られ圧延できなかったので,セラミックス(パイロコート)を塗布したロールにより圧延を行い正常な圧延が可能であった。4.同径同周速圧延,異径同周速圧延,同径異周速圧延,異径異周速圧延を円弧状均質材料と円弧状FGMについて実験を行った結果,均質材料については同径同周速圧延において平板化圧延が困難であったが,他の圧延形式では平板化圧延が可能であり,FGMについては全圧延形式において可能であった。5.圧下率1,2,3%,異径同周速圧延した。圧下率1,2,3%のいずれの場合においても円弧状FGM試験片の断面形状の変化は圧延回数が増えるに従い曲率半径は大きくなった。6.本研究の実験範囲において曲率半径と接触投影長さ比の関係を求めると,曲率半径は接触投影長さ比が約1.01.3のときに無限大となり,平板に加工できる。7.圧延後のFGM試験片の様相を観察した結果,試験片に割れは生じず,良好な圧延ができた。8.圧延加工後の試験片の最終形状における試験片の圧延入口からの長さと曲率半径の関係を求めた。この形状変化の傾向を解析することにより平板化のシミュレーションができる。9.したがって,平成10年度平成12年度に行った一連の研究において,圧延加工後のFGM試験片の最終形状の傾向は同じであり,上下ロールの最適制御により平板化できる。制御の手法・条件については今後のさらなる研究が必要である。本年度に行った実験概要を以下に箇条書きに記す1.金属間化合物Al_3Niの傾斜した直径90mm、長さ90mm、厚さ20mmの厚肉円筒傾斜機能材料を作成した。この試験片のAl_3Niの体積分率を測定したところ、円筒外周のAl_3Niリッチ部で平均体積分率62%、円筒内周のAlリッチ部で25%となる傾斜組成であった。2.前記の円筒状FGMから厚さ方向に4層に分割した試験片を作成し、曲げ共振法にてヤング率を測定したところ、ヤング率は円筒外周から3.5、4.8、6.3、7.8mmの位置でばらつきはあるもののそれぞれ96、91、88、83GPaであった。3.室温から高温域での各層の試験片の変形抵抗を測定するため、熱間平面ひずみ圧縮試験ジグと圧縮ジグを600°Cまで加熱できる電気炉を作成した。これらの装置を用いて、前記の4層分割試験片の各層の変形抵抗を室温、200、400、620°Cにて測定した。全ての実験条件で、各層における変形抵抗の大きさに傾向は見られなかった。これは、圧縮試験片のAl_3Niの分散にかなりばらつきがあったことが原因と考えられる。室温、ひずみ0.10.2における各層平均の変形抵抗は180MPaで、純Al試験片では70MPaであり、Al_3Ni分散による効果が確認できた。

室温、200、400、620°Cの各温度、ひずみ0.10.2における各層平均の変形抵抗は試験温度が高くなるにつれて、180、120、55、15MPaのように減少した。4.平板化圧延におけるロール径、ロール周速の影響を調べるための4組の圧延ロールを作成し、圧延実験を行った。純Alの圧下力は3%の圧下率で約140kgf、5%の圧下率で約200kgfであった。Al-Al_3NiFGMの圧下力は3%の圧下率で約370kgfであった。FGM平板化に及ぼすロール径、ロール周速の影響については今後検討する予定である。本年度に行った実験概要を以下に箇条書きに記す。1.金属間化合物Al_3Niの傾斜した直径90mm、長さ90mm、厚さ20mmの厚肉円筒傾斜機能材料(Al-Al_3Ni FGM)を作成した。この試験片のAl_3Niの体積分率を測定したところ、円筒外周のAl_3Niリッチ部で平均体積分率52%、円筒内周のAlリッチ部で17%となる傾斜組成であった。2.前記の厚肉円筒から厚さ6mm、内径54mm、幅20mmの円弧状FGM試験片を作成した。また、FGM平板化圧延における圧延モデルを検討するため、6mm厚さの純アルミニウム(A1050)板より内径82.5mm、幅20mm、長さ200mmの円弧状試験片を作成した。3.円弧状純アルミニウム試験片の平板化圧延モデルについて、同径同周速・同径異周速・異径同周速・異径異周速の4つの条件で圧延実験を行った結果、同径同周速圧延では平板化圧延が不可能で、内接ロール周速の速い同径異周速圧延、内接ロール径の小さい異径同周速、内接ロールの周速が速く、直径の小さい異径異周速におけるいずれの場合も平板化圧延が可能であった。4.前記3.の結果を踏まえ、Al-Al_3Ni FGMの平板化圧延実験を行った。このFGMは脆いため620°Cに加熱して圧延したが、試験片がロールに凝着した。この凝着を防止するため、ロール表面にセラミックスをプラズマ溶射した。5.Al-Al_3NiFGM試験片の平板化圧延について、純アルミニウムと同様な条件で圧延実験を行った。同径同周速・同径異周速・異径同周速・異径異周速圧延におけるいずれの場合も平板化圧延が可能であり、平板化圧延における強度傾斜モデルと異周速モデルの有効性が明らかになった。FGM平板化に及ぼすロール径、ロール周速の定量的な影響については今後検討する予定である。本年度に行った実験・実験結果の概要を以下に箇条書きに記す。2.前記の厚肉円筒から厚さ6mm,内径54mm,幅20mmの円弧状FGM試験片を作成した。3.前年度までの結果を踏まえ,表面にセラミックスをプラズマ溶射したロールを用いて圧延を行ったが,圧延回数が多くなるとロール表面に試験片の凝着が見られ圧延できなかった。そこで,セラミック(パイロコート)を塗布したロールにより圧延を行った。4.圧下率1,2,3%,異径同周速圧延した。圧下率1,2,3%のいずれの場合においても円弧状FGM試験片の断面形状の変化は圧延回数が増えるに従い曲率半径は大きくなった。5.本研究の実験範囲において曲率半径と接触投影長さ比の関係を求めると,曲率半径は接触投影長さ比が約1.01.3のときに無限大となり,平板に加工できる。6.圧延後のFGM試験片の様相を観察した結果,試験片に割れは生じず,良好な圧延ができた。7.圧延加工後の試験片の最終形状における試験片の圧延入口からの長さと曲率半径の関係を求めた。この形状変化の傾向を解析することにより平板化のシミュレーションができる。8.したがって,平成10年度平成12年度に行った一連の研究において,圧延加工後のFGM試験片の最終形状の傾向は同じであり,上下ロールの最適制御により平板化できる。制御の手法・条件については今後のさらなる研究が必要である。
ＧＰＩアンカー型蛋白質の輸送機構の解明

グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー型蛋白質の輸送機構解明を目的として研究を行った。前年度で報告者は、GPIアンカー型蛋白質の輸送に関与する遺伝子の同定を試みた。その結果、エンドソームからトランスゴルジ網(TGN)への逆行輸送に関わるGARP複合体のサブユニット、VPS51,VPS52,VPS54を同定した。今年度は、GARP複合体のKO細胞におけるGPIアンカー型蛋白質の輸送遅延を過剰発現によりレスキューできる分子の探索を行った。VPS54-KO細胞にcDNAライブラリーを導入し、GPIアンカー型蛋白質の輸送遅延がレスキューされた細胞をセルソータで濃縮し、次世代シークエンサーによりcDNAの配列を決定した。その結果、機能未知の6回膜貫通型蛋白質と予想されるTMEM87Aを同定した。TMEM87Aの過剰発現によりVPS54-KO細胞におけるGPIアンカー型蛋白質及び膜貫通型蛋白質の輸送遅延はレスキューされた。TMEM87Aによる輸送異常のレスキューが直接的であるか間接的であるかを調べるために、VPS54-KO細胞にTMEM87Aを過剰発現させ、コレラ毒素Bサブユニット(CTxB)のTGNへの逆行輸送を解析した。その結果、TMEM87Aの過剰発現によりCTxBの逆行輸送異常がレスキューされた。以上の結果から、TMEM87AによるVPS54KO細胞の順行輸送のレスキューは間接的なものであり、TMEM87Aはエンドソーム-TGN間の逆行輸送経路で機能する分子である可能性が示唆された。GPIアンカーのイノシトール脱アシル化はGPIアンカー型蛋白質の効率的な輸送に必須である。そこで、本年度はGPIイノシトール脱アシル化に関与する分子の同定も行った。ヒト半数体細胞株と次世代シークエンス解析を利用して、GPIイノシトール脱アシル化に関与する遺伝子を同定した。27年度が最終年度であるため、記入しない。グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー型蛋白質の輸送に関与する遺伝子の網羅的なスクリーニングを行い、その機能を解析する事によりGPIアンカー型蛋白質の輸送機構を明らかにすることを目的として研究を行った。本年度はGPIアンカー型蛋白質の輸送に関与する遺伝子の網羅的なスクリーニング及び得られた遺伝子の機能解析を行った。まず、ヒト半数体細胞株であるHAP1細胞にGPIアンカー型蛋白質の輸送を追跡するためのレポーター蛋白質を安定的に発現させた細胞株(HAP1-FF9細胞)を樹立した。このレポーター蛋白質はVesicular stomatitisvirusのG蛋白質の温度感受性変異体(VSVGts045)にFLAGタグ、GFP、GPI付加シグナル配列を持ったキメラ蛋白質である。次に、HAP1-FF9細胞に遺伝子トラップベクターを用いて変異を導入し、GPIアンカー型レポーター蛋白質の輸送が遅延した細胞をセルソーターで濃縮し、次世代シークエンサーを用いて遺伝子トラップベクターの挿入箇所を同定した。その結果、エンドソーム-トランスゴルジ網(TGN)間の逆行輸送に関与する蛋白質複合体であるGARP複合体のサブユニットをコードする遺伝子を同定する事が出来た。CRISPR-Cas9システムを用いてGARP複合体をノックアウトした細胞を作出し、解析したところ、GPIアンカー型蛋白質のゴルジ体以降の輸送が遅延することが明らかとなった。このことから、エンドソーム-TGN間の逆行輸送の異常によりゴルジ体-細胞膜間の順行輸送が遅延することが明らかとなった。この結果は、GPIアンカー型蛋白質の輸送に必須な分子がエンドソームを経由してTGNへとリサイクルされることを示していると考えられる。今後、そのような分子の実態を解明する上で重要な情報となり得ると考えられる。

そこで、本年度はGPIイノシトール脱アシル化に関与する分子の同定も行った。ヒト半数体細胞株と次世代シークエンス解析を利用して、GPIイノシトール脱アシル化に関与する遺伝子を同定した。本年度の当初の目的はGPIアンカー型蛋白質の輸送に関与する遺伝子の網羅的同定及びその機能解析であり、その目標は上述の通り達成できた。その理由は、GPIアンカー型蛋白質の輸送に関与する遺伝子の網羅的なスクリーニングを行った際、想定外の事が起こらず、計画通りに実験を進める事が出来たからだと思われる。27年度が最終年度であるため、記入しない。上述の通り、GPIアンカー型蛋白質の輸送に必須な分子はエンドソームを経由してTGNへとリサイクルされていると考えられるので、そのような分子の実態の解明を試みる。GARP複合体のノックアウト細胞ではGPIアンカー型蛋白質の輸送に必須な分子が不足している事が考えられるため、GARP複合体のノックアウト細胞にcDNAライブラリーを導入し、GPIアンカー型蛋白質の輸送遅延が回復した細胞を、セルソーターを用いて濃縮する。濃縮した細胞に導入されていたcDNAはGPIアンカー型蛋白質の輸送に必須な分子をコードする可能性が高いと思われるため、得られた遺伝子の機能を解析する。また、GPIアンカーの構造変化、特にGPIイノシトールの脱アシル化はGPIアンカー型蛋白質の効率的な輸送に必須であることから、GPIイノシトールの脱アシル化に関与する遺伝子を網羅的にスクリーニングすることも試みる。スクリーニングは輸送で行ったように、ヒト半数体細胞株と遺伝子トラップ法による変異導入を組み合わせた手法で行う。