hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
低分子RNA解析を基軸とした渦鞭毛藻の遺伝子発現調節機構に関する研究

したがって,進捗状況はやや遅れていると考える.平成28年度は,有毒渦鞭毛藻Alexandrium tamarenseから我々が単離した低分子RNA(sRNA)への結合成分の有無を詳細に検討するために,34および35塩基で構成されるsRNAにつき,DIG標識した合成sRNAおよび細胞抽出物を用いてゲルシフトアッセイを行った.その結果,35塩基のsRNAではsRNAの移動が認められなかったものの,34塩基のsRNAではsRNAのみの場合と比較して,一部の合成RNAが低分子側に移動するとともに,一部のsRNAが高分子側に移動する結果と,シグナルが消失する結果が得られた.本結果は,34塩基のsRNAが細胞抽出物中に存在した成分と結合して構造が変化し,低分子側に移動した可能性,および他の成分と結合して高分子側に移動した可能性を示した.さらに,A. tamarenseがsRNAを利用した遺伝子発現機構を有するか否かを確認するために,既報の生物種でRNAサイレンシングに関与するタンパク質として報告されている,ArgonauteをコードするcDNA断片の増幅をPCR法で試みた.増幅されたDNA断片の塩基配列を決定した結果,piwiドメインをコードすることが確認出来たことから,本mRNAにつき,RNAドットブロット解析を試みたものの,シグナルを得ることができなかった.したがって,A. tamarenseもsRNAを利用した遺伝子の発現調節機構を有するものと推測されるが,mRNA量は少ない可能性が示唆された.さらに,A. tamarenseの転写因子結合配列を明らかにすることを目的として,本種から既に単離している遺伝子の推定5'上流非転写領域および転写領域を含む標識二本鎖DNAと核抽出物とを用いたゲルシフトアッセイを行った.その結果,標識DNAの高分子側への移動が確認できたことから,使用した領域に転写因子が結合する可能性が示唆された.渦鞭毛藻Alexandriumtamarenseの遺伝子発現調節機構を明らかにするため,低分子RNA(sRNA)の機能解析を中心に行った.その結果,単離した34塩基のsRNAが細胞内の成分と結合する可能性を示すことが出来た.また,本sRNAのゲノムDNAおよび推定前駆体cDNAの部分塩基配列を決定し,同様のsRNAをA. catenellaから単離することができた.さらに,Argonauteの一部をコードするDNA断片を得ることができたことから,本種もmiRNAを利用した調節機構を有する可能性が示唆された.最後に,渦鞭毛藻遺伝子の推定5'上流域に核内の成分が結合する可能性を示すことが出来た.これまでに,我々が既に単離しているsRNAにつき,前駆体の単離および結合成分の同定を試みた.複数のプライマーや鋳型を用い,様々の条件でPCRを行なったものの,前駆体を単離するには至らなかった.また,生体内に存在する際のsRNAへの結合成分の存在の有無を,ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて調べた結果,sRNAに何らかの成分が結合している可能性が推測された.さらに複数種の合成RNAを用いてsRNAに対する結合タンパク質のアフィニティー精製を試みたものの,当該sRNAへの結合タンパク質を単離・同定するには至らなかった.
新しいバイオマーカーのアテローム血栓症発症予測能評価に関する研究

追跡開始後6年以上経過したコホート研究の保存血清468例のS100A12蛋白と補体成分C3a分解産物の濃度を測定し、ベースライン調査との比較を行った。S100A12とC3a分解産物の血清濃度のSpearmanの相関係数は0.504で、P値は0.0001未満であった。S100A12濃度と中性脂肪、白血球数と有意な相関が認められた。C3a分解産物はHDLコレステロール、白血球数、血糖値、HbA1c、収縮期血圧、拡張期血圧、Body Mass Indexと有意な相関を認めた。既往疾患および脳卒中罹患とは何れも有意な関連は認められなかった。本研究では、アテローム性動脈硬化症の有力なバイオマーカー候補であるS100A12蛋白、フィブリノーゲンα断片、補体成分3断片について、追跡開始後6年以上経過したコホート研究の保存血清を用いて測定し、脳卒中、心筋梗塞の発症例、危険因子との関連を明らかにする。22年度、保存用冷凍庫を確保し、和歌山県立医科大学公衆衛生学講座に保管してあった保存血清を岩手医科大学内に移管した。また、S100A12蛋白との相関が高く、S100A12と同時測定することにより、患者群の抽出と、頸動脈プラークの危険度をより精度高く評価できる可能性がある'補体成分3断片'について、既知の測定系の検証と新たな測定系の開発を試みた。すなわち、現在、'補体成分3断片'の特異的な測定系はないので、スクリーニング段階で選定した12クローンのモノクローナル抗体を使って測定系を構築したが、いずれも補体成分3(C3a)とその断片のいずれも測定できなかった。そこで、市販のポリクローナル抗体Goat anti-C3a(GeneTel#OA0016)とAnti-C3a Mab(BioPorto#GAUO13-16)とを用いて、サンドイッチの系を作り、血清中の補体成分3を測定した。正常人8名の平均値は8.7μg/ml、頚動脈硬化症の患者33名の平均値は92μg/mlであった。C3aは血中で断片に分解されるが、本測定系はC3aと断片いずれにも反応することから、両者を測定していると思われる。このことから、C3a断片の特異的な測定系の構築には、ポリクローナル抗体でも十分に可能であると予想され、23年度では、補体断片のペプチドをウサギに免疫し、抗体価が上がったウサギのIgG分画を、C3aペプチドカラムで抗C3a抗体を吸収させることで、抗C3a断片特異的なポリクロ抗体を精製し、特異的な系の構築を目指す。本研究では、アテローム性動脈硬化症の有力なバイオマーカー候補であるS100A12蛋白、フィブリノーゲンα断片、補体成分3断片について、追跡開始後7年以上経過したコホート研究の保存血清を用いて測定し、脳卒中、心筋梗塞の発症例、危険因子との関連を明らかにする。23年度は、S100A12蛋白との相関が高く、同時測定することにより、患者群の抽出と、頸動脈プラークの危険度をより精度高く評価できる可能性がある'補体成分3断片'について、測定系を確立した。市販のポリクローナル抗体Goat anti-C3a(GeneTel#OA0016)とAnti-C3a Mab(BioPorto #GAU013-16)とを用いて、サンドイッチの系を作り、血清中の補体成分3を測定した。正常人の平均値は8.7μg/ml、頚動脈硬化症の患者33名の平均値は9.2μg/mlであった。このことから、C3a断片の特異的な測定系の構築には、ポリクローナル抗体でも十分に可能であると予想され、補体断片のペプチドをウサギに免疫し、抗体価が上がったウサギのIgG分画を、C3aペプチドカラムで抗C3a抗体を吸収させることで、抗C3a断片特異的なポリクロ抗体を精製し、特異的な系を構築した。24年度は、岩手医大に凍結保存している約1095検体について測定の上縦断的な解析を実施し、代表的な動脈硬化性疾患である脳血管疾患、心疾患の発症等との関連について明らかにする予定である。我々は、頸動脈内膜剥離術(CEA)施行例を対象に、外科的に切除されたプラークの病理所見と対応しながら、イベント発生の危険度を的確に評価できるバイオマーカーの探索を行ってきた。

これまでに、S100A12蛋白の血中濃度の測定が、内頸動脈硬化症の患者と健常者との区別に有用であること、また、血清ペプチドのプロファイリングにより、補体成分C3aの分解産物が患者群の中で高危険度群と低危険度群を区別できることを明らかにしてきた。今年度、これらのマーカー候補因子の特異的なELISA系を開発したので、追跡開始後6年以上経過したコホート研究の保存血清480例の濃度を測定し、ベースライン調査との比較を行った。S100A12の平均値と中央値はそれぞれ、195(±141) ng/ml、166 ng/mlで、最高値は1468 ng/mlであった。また、とC3a分解産物の平均値と中央値はそれぞれ、2735±1719 ng/ml、2218 ng/mlで、最高値は9448 ng/mlであった。S100A12とC3a分解産物の血清濃度のピアソンの相関係数は0.4805で、p値は0.0001以下であった。コホート研究のベースライン調査で実施された生化学検査結果(ALP、LDH、総コレステロール値、HDLコレステロール値、白血球数、血糖値)との相関を解析したところ、S100A12濃度と白血球数と相関(相関係数;0.4045、p値<0.0001)を認めた。今回の測定では、S100A12の値は安定していたが、C3a分解産物の値のばらつきが目立った。検体の凍結融解などの影響も見過ごせない。今後、1000症例まで測定し、脳卒中、心筋梗塞の発症例、危険因子との関連を解析する予定である。'補体成分3断片'について、測定系を確立するのに時間が当初の見込み以上に要したことが、主な理由である。しかしながら、平成24年度中に、当初の目的を達成することは充分可能と考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。コホートの追跡は順調に推移していることから、S100A12蛋白、フィブリノーゲンα断片、補体成分3断片の検査成績と縦断的な研究成績との解析は、当初の計画通り実施する予定である。
地域間格差がもたらす家計の医療需要分析～コンジョイント分析によるアプローチ～

医療需要についての地域間格差が大きいのが、現在の日本の現状である。インターネット調査会社に登録するモニターに対して、医療の地域間格差や金融借り入れに焦点を当てて、アンケート調査を行った。一連の研究の中の1つでは子供育成策の面に焦点を当て、子ども医療費を助成することを始めとするいくつかの子ども支援策(給付の拡大)と同時に、それに伴う負担として消費税の負担を様々な形で組み合わせて提示することで給付と負担についてコンジョイント分析を用いて定量的に計測した。得られた結論としては、住んでいる地域で子供医療費に対する意識が大きく異なることがわかった。特に、子供の外来医療給付が脆弱である大阪府や東北のいくつかの県では、医療需要が他の都道府県よりも高いことがわかった。現在の日本では、生命に直結する医療へのアクセスの格差は医療崩壊とも言われるほど深刻である。また、医療機関のアクセスが悪い地域ほど、保険料未納問題が際立っているとも言われている。こうした地域間格差の問題を医療に焦点を当てて、21年度にはアンケート調査を行った。同一個人を追跡調査することができるように、ネット調査会社に登録する1万人に対して、アンケート参加を募り、2049歳の若年者およびひとり親で構成される2000人の標本を得た。これにより、調査最終年までの間の制度変更による影響や仮想的状況に対する選好の違いを分析することができる。まず、初年度である21年度は、地方の医療需要に焦点を当てて、地域ごとに異なる「子供の外来医療費」助成制度に焦点をあて、助成制度が充実されて、中学卒業まで医療費が無償化された場合という仮想的状況を設定し、個人間での選好の違いを計測した。その結果、「子供の外来医療費」助成制度が貧弱な東北地方の県に在住する個人では、助成制度の充実に対する選好度が高いことがわかった。また、アンケートで回答した若年世帯には、働いても生活さえもままならない家計および、貧困世帯の代表ともいわれる母子家庭が多く存在する。昨年での調査では、母子家庭の親は「医療抑制」を行っている割合が一般家庭よりも高く、5人に1人は医療抑制を行った経験があるとことがわかった。こうした調査を延長し、地域間で医療抑制の差があるのか、さらにはどのようなときに医療抑制を行うかも調査し、金銭面や地域間で差など、幅広い内容の調査項目を設定する。昨年の調査結果をまとめたものを、22年度日本経済学会春季大会で報告する予定である。同個人を追跡調査することができるように、ネット調査会社に登録する1万人に対して、アンケート参加を募り、2049歳の若年者およびひとり親で構成される2000人の標本を得た。22年度は、地方の医療需要に焦点を当てて、地域ごとに異なる「子供の外来医療費」助成制度に焦点をあて、助成制度が充実されて、中学卒業まで医療費が無償化された場合という仮想的状況を設定し、個人間での選好の違いを計測した。また調査では、母子家庭の親は「医療抑制」を行っている割合が一般家庭よりも高く、5人に1入は医療抑制を行った経験があるとことがわかった。この調査結果をまとめたものは、22年度日本経済学会春季大会および日本財政学会で報告した。医療へのアクセスについて地域間格差が大きいのが、現在の日本の現状である。また、母子世帯や若年世帯を中心として、保険料未納率などの問題に格差が生じているとも言われている。こうした地域間格差や世帯属性の問題を医療・金融借り入れに焦点を当てて、23年度にはアンケート調査を行った。同一個人を追跡調査することができるように、ネット調査会社に登録し、前年に調査を行った若年者世帯、およびひとり親世帯で構成される世帯を中心に調査を実施した。23年度は、医療需要ともに金融借り入れに焦点を当てて、いくつかの仮想的状況を設定し、個人間での選好の違いを計測した。

これまでの調査の結果では、「子供の外来医療費」助成制度が貧弱な東北地方の県に在住する個人では、助成制度の充実に対する選好度が高いことがわかっていた。また、アンケートで回答した若年世帯には、働いても生活さえもままならない家計および、貧困世帯の代表ともいわれる母子家庭が多く存在した。また、母子家庭の親は「医療抑制」を行っている割合が一般家庭よりも高く、5人に1人は医療抑制を行った経験があるとこともわかっていたが、今回の調査で金融借り入れについて焦点を当てた結果、過去1年間で生活費の支払いを怠ったことがある割合(デフォルト比率)は、母子世帯で有意に高いことなどがわかった。この調査結果をまとめたものは、23年度日本経済学会春季大会で報告した。少子高齢化の進展で、医療費の高騰が今後も予測される中、新技術の医療費高騰への影響が最も大きい要素であるという認識は広まりつつ。新技術がどのような人々に厚く(あるいは薄く)配分されるべきであるか、を海外のいくつかの国では分析され、実際に(イギリス・オーストラリアでは)政策決定に指標として用いられつつある。しかしながら、このような医療需要の分析、とくにだれにどれだけ医療資源を配分すべきか、を分析した先行研究はわが国ではほとんどない。こうした医療資源配分の問題と地域間の医療需要の歪みについて分析するのが本年度の目標であった。こうした地域間格差や世帯属性の問題を医療需要に焦点を当てて、24年度にはアンケート調査を行った。同一個人を追跡調査することができるように、ネット調査会社に登録し、前年に調査を行った若年者世帯、およびひとり親世帯で構成される世帯を中心に調査を実施した。24年度は、医療需要に焦点を当てて、いくつかの仮想的状況を設定し、個人間での選好の違いを計測した。また、母子家庭の親は「医療抑制」を行っている割合が一般家庭よりも高く、5人に1人は医療抑制を行った経験があるとこともわかっていたが、今回の調査でだれに配分するのを優先するか、という点に関しては、男性・若年者・非喫煙者などを優先することなどがわかった。調査結果を詳細にまとめたものは今後学会で報告する予定である。毎年のように成果を学会報告している。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度が本研究の最終年度であるので、報告書等の形でまとめることとしたい。
犬のリンパ球クローナリティ検査におけるピットフォールの探索

犬のクローナリティ検査は、リンパ球の免疫グロブリン重鎖遺伝子およびT細胞受容体遺伝子を利用して、リンパ球のクローン性を検出する方法である。この検査はリンパ腫のようなリンパ球増殖性疾患の診断に有効で、臨床例に広く利用されるようになっている。本研究ではリンパ球浸潤が認められるリンパ球増殖性疾患以外の疾患(胸腺腫、皮膚組織球腫、多形紅斑、正常な十二指腸、脾臓結節性過形成)においてリンパ球クローナリティ検査を行い、ピットフォールを探索した。またB細胞由来である形質細胞腫でのクローナリティ検査の感度が調査されていないことから、本研究では犬の皮膚形質細胞腫での感度も調査した。それぞれ30例ずつの症例を用いた。ホルマリン固定パラフィン包埋切片からゲノムを抽出し、リンパ球クローナリティ検査を行った。クローナリティ検査はガイドラインに基いて実施した。胸腺腫においては、30例中5例にT細胞クローナリティを認めた(16.7%)。皮膚組織球腫では30例中13例にT細胞クローナリティを認めた(43.3%)。多形紅斑および正常十二指腸では、それぞれ30例全てがクローナリティは認められなかった。脾臓の結節性過形成では、30例全てにおいてクローナリティは認められなかった。皮膚形質細胞腫におけるクローナリティ検査では、B細胞クローナリティは30例中11例に検出された(36.7%)。胸腺腫および皮膚組織球腫はリンパ球増殖性疾患では無いにも関わらず、T細胞クローナリティを示す症例が認められた。この原因は明らかにされていないが、腫瘍に応答するT細胞によると推測される。多形紅斑と正常な十二指腸ではボリクローナル反応が認められるため、多様なリンパ球が浸潤していることが示唆された。形質細胞腫はB細胞に由来するため、B細胞リンパ腫と同等の感度が得られると予想されたが、感度は36.7%であり、B細胞リンパ腫の感度に比べて著しく低いことが明らかになった。配列分析によりプライマーのアニーリング領域の変異が確認されたことから、検出感度の低下は体細胞超変異によることが示唆された。
高精細ｉｎ　ｖｉｖｏグルタミン酸イメージングによる大脳皮質シナプス機能の精密解析

神経回路での神経伝達物質の放出機構を理解には個々のシナプスでのグルタミン酸の放出ダイナミクスの精密な計測が必要である。本研究では脳標本における神経細胞のシナプスから放出された神経伝達物質グルタミン酸の高精細な蛍光イメージング技術の確立を目的とする。本研究では高性能グルタミン酸蛍光プローブの開発と神経細胞に選択的にグルタミン酸プローブを標識する技術の開発を行った。開発したグルタミン酸プローブをボツリヌス毒素の非毒性領域やHaloTag技術を採用することで神経細胞に選択的に標識することで、大脳皮質標本において放出されたグルタミン酸をシナプスレベルの解像度で可視化解析することに成功した。平成24年度までに開発した高性能蛍光グルタミン酸プローブの神経細胞上での性能の評価を行った。神経細胞上のシナプスから放出されたグルタミン酸を高いシグナル/ノイズ比で検出できるようにグルタミン酸プローブを神経細胞上にのみ選択的に標識するための技術開発を行った。Haloタグ、SNAPタグ、ロイシンジッパータグ、BLINK法などの分子タグと、神経細胞へ選択的に目的タンパク質を発現させることができるレンチウイルスベクターを組み合わせることで、神経細胞に選択的的な標識を試みた。その結果、Haloタグを採用した系でグルタミン酸プローブを神経細胞選択的に標識することができた。また、神経細胞上に存在しているガングリオシドへの選択的な結合が報告されているボツリヌス毒素C型の非毒性ドメインとグルタミン酸プローブの複合体形成を利用して神経細胞選択的にグルタミン酸プローブを標識することができた。いずれの標識方法でグルタミン酸プローブを標識した神経細胞でも、電気刺激によって惹起されたグルタミン酸放出を蛍光顕微鏡システムで可視化することに成功した。本年度は、脳スライス標本や動物個体のin vivoでの蛍光イメージングにおいて大きな問題となりうる脳組織に由来する自家蛍光や光散乱を回避するために長波長蛍光を有する蛍光性のグルタミン酸プローブの開発に取り組んだ。このために、申請者らが既に開発に成功し、グルコースやATPなどの高性能蛍光プローブの開発に応用しているハイスループットスクリーニング系を採用した。620nm以上の長波長の蛍光を発するローダミン系やシアニン系の赤色の蛍光を発する蛍光色素に交換し、長波長蛍光を発する構成のグルタミン酸プローブの開発を行った結果、赤色の蛍光プローブとしてCy3を標識した蛍光プローブを得ることができた。得られた長波長蛍光プローブについて、グルタミン酸との反応特性(グルタミン酸への親和性、最大蛍光変化率)を評価し、実際のイメージングに適用するための基礎的なデータの取得を完了した。また、この赤色プローブを海馬神経細胞の分散培養標本に適用し、実際にグルタミン酸イメージングを試みたところ、一回の活動電位でプレシナプスから放出されたグルタミン酸を単一シナプスレベルの解像度で得ることに成功したことより、脳スライス標本や動物個体標本での使用に耐えうることが示唆された。開発した長波長蛍光グルタミン酸プローブを脳スライス標本内の神経細胞上にのみに局在化させるために神経細胞上で分子タグと分子タグの選択的リガンドとの選択的な結合を用いた方法論の構築を開始した。そのために、分子タグとしてHaloタグ、ロイシンジッパータグなどを、膜タンパク質としてPDGF受容体の膜貫通領域やGPIアンカードメインを用いた分子タグ付き膜タンパク質を神経細胞に特異的に発現させるためのレンチウイルス、シンドビスウイルス、アデノ随伴ウイルスの作製を完了した。本年度は前年度までに開発した高性能グルタミン酸蛍光プローブと神経細胞への特異的な蛍光プローブの標識法を用いて、大脳皮質の標本においてグルタミン酸イメージングを行った。これまでに開発した複数のプローブ特異的標識法をテストした結果、神経細胞に発現させたHaloTagを介した蛍光プローブを標識する方法によって、大脳皮質の2/3層の神経細胞に蛍光プローブを選択的に標識することができた。この標本を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した結果、樹状突起上のスパインまで明瞭に確認できた。さらに、グルタミン酸蛍光プローブを標識した神経細胞上の樹状突起スパインの近傍への電気刺激によって近傍のプレシナプスを活性化させてグルタミン酸放出を惹起させた。この際に、共焦点レーザー顕微鏡によるタイムラプスイメージングによって単一スパインレベルの空間分解能でのグルタミン酸プローブの蛍光変化を捉えることに成功した。本研究で確立したグルタミン酸の蛍光イメージング技術によって、脳内の神経回路での興奮性シナプスの活性化をシナプスレベルの解像度で定量的に解析することが可能になり、シナプスにおける情報のコーディング機構の理解への貢献が期待できる。薬理学本年度で確立する予定であった神経細胞への選択的なグルタミン酸プローブの標識法の開発が計画通りに進捗したため。

当初計画通り、赤色蛍光のグルタミン酸プローブの開発が完了した。また、開発したプローブが培養神経細胞で機能することを確認することができた。グルタミン酸プローブを神経細胞に特異的に標識するための分子タグ含むキメラタンパク質を神経細胞特異的に発現させるウイルスベクターの作製が計画通りに完了した。これまでに確立した技術を基に脳スライス標本でのグルタミン酸イメージングに進む。当初計画どおり、開発したグルタミン酸プローブを脳スライス標本や動物個体の脳で用いるための技術の最適化を進める。さらに完成したイメージング技術を用いることで、大脳皮質内の神経回路での情報処理過程についてシナプスでのグルタミン酸放出様式に着目して理解を進める。今後は脳スライス標本や動物個体を用いたイメージング実験が中心になるため、実験動物購入及び光学部品に研究費が当てられる予定である。また、成果発表を行うための旅費や論文投稿、掲載のための費用にも充当する。
電力システムの過渡挙動と安定性喪失判断基準に関する基礎研究

電力系統の設備余裕率が低落傾向にあり、系統事故時には運転点が安定限界ぎりぎりに追い込まれることがある。本研究では、電力系統の安定性を判断するため、電力系統のシミュレーションおよび同期機のモデルの観点から、次の点を明らかにした。・制御系を含む一機無限大系統の計算機シミュレーションを行い、定態安定限界近傍における系統の動作に及ぼす制御系の効果を調べた。発電機の出力、線路長、PSSゲインを変化させて分岐集合を求めた結果、安定な運転点(平衡点)から持続動揺(周期解)への分岐、フリップ分岐、カスケードを経た後のカオス、サブクリティカルホップ分岐等を観察することができた。また、対象とした系統では、発電機のガバナを動作させない方が、より安定になることを示した。これは、供試系統のガバナおよび水理系の特性と、系統動揺の共振現象によることが判明した。・界磁極片端部に飽和のある同期機を対象として、その非線形性を表現するモデルを構築した。すなわち、同期機内部の磁束の挙動を磁気回路により表し、同期機の空隙に生じる磁束分布を計算するモデルを作る。可飽和部によって消費される起磁力を仮想的な飽和電流として表現し、空隙部のパ-ミアンスに着目することにより、界磁極片の局所的な飽和を考慮して、同期機の空隙磁束分布を計算するモデルが得られた。いくつかの負荷状態で同期機を運転する実験を行い、構築したモデルで計算される磁束分布と実測した磁束分布の一致を確認した。
睡眠が小学生の認知情動能力に与える影響の客観的計測

近年、夜11時以降に就寝する学童が、全体の半数以上を占めるようになるなど、子どもの夜更かしと、それにともなう睡眠障害の増加が問題視されている。また、これらの睡眠障害が、学童の注意力・忍耐力の低下を初めとした、学童に多く認められる各種の心理的・行動的問題の要因となっている可能性が指摘されている。しかし、学童の睡眠の実態把握は進んでおらず、客観的根拠に基づいた生活指導を行うのに必要とされるデータが、十分に整備されていないのが現状である。そこで、アクチグラムを用いた体動量計測による学童の睡眠の客観的評価と、行動学的手法による学童の認知情動能力の客観的計測を行なうことで、(1)学童の睡眠の実態把握を推進すると共に、(2)睡眠の質が学童の認知情動能力に与える影響を実証的に検討することを目的とし本研究を実施した。本年度は、小学3・4年生20名、小学5・6年生20名を対象に以下の測定を実施した。測定1:アクチグラフを一週間にわたり装着してもらい、客観的生活リズム測定を行った。測定2:客観的生活リズム測定終了後、標準化された行動課題(フランカー課題)を実施し、注意能力測定を実施した。測定1のデータをもとに、小学生の夜間睡眠を特徴づける睡眠パラメータ(実質睡眠時間・睡眠効率・中途覚醒回数など)を抽出した。これら睡眠パラメータと測定2で計測した注意能力との相関を分析した結果、両群で注意能力の指標となるConflicting Scoreと実質睡眠時間との間に有意な負の相関がみられた。この結果は、実質睡眠時間が短い小学生ほど、日中の注意能力が減退している可能性を示唆している。
ダリエ病の原因遺伝子同定とその機能解析の試み

1993年より我々は、ダリエ病(DD)遺伝子の同定を試みてきたが、1999年3月イギリスのグループによりDD遺伝子がsarco/endoplasmic reticulum Ca ATPasetype 2 isoform(SERCA2、遺伝子シンボルATP2A2)であることが報告された。その後直ちに我々は、DDと臨床的・組織学的に幾つかの重複を示すヘイリーヘイリー病(HHD)の遺伝子局在部位におけるCa pumpをコードする遺伝子を同定し、その遺伝子(ATP2C1)の変異によりHHDが生じることを証明した。次に正常皮膚におけるATP2A2の発現と、紫外線照射による培養角化細胞のATP2A2の発現の変化について、新しく開発されたRT-PCR器(ライトサイクラー)を用いて検討した。その結果、DDの皮膚症状が頻繁に見られる脂漏部位皮膚のATP2A2の発現量は、DDの皮膚症状が見られにくい非脂漏部位皮膚のその量の約40%と低下していた。また培養角化細胞に30mJ/cm_2のUVBを照射したところ、ATP2A2の発現は照射後1および3時間には約60%低下し、その後徐々に増加、12時間後にはもとのレベルまで復帰した。これらは、1)ATP2A2の発現の多寡によりDDの皮疹の分布が規定されている可能性と、2)夏季にDDが憎悪する原因として紫外線によるATP2A2の発現量の低下が関係している可能性を示唆するものと思われた。直ちに我々は、DDと臨床的・組織学的に部分重複を示すヘイリーヘイリー病(HHD)の遺伝子局在部位におけるCa pumpをコードする遺伝子を同定し、その遺伝子(ATP2C1)の変異によりHHDが生じることを証明した。また培養角化細胞に30mJ/cm^2のUVBを照射したところ、ATP2A2の発現は照射後1および3時間には約60%低下し、その後徐々に増加、12時間後にはもとのレベルまで復帰した。これらは、ATP2A2の発現の多寡によりDDの皮疹の分布が規定されている可能性と、夏季にDDが増悪する原因として紫外線によるATP2A2の発現量の低下が関係している可能性を示唆するものと思われた。
ポルフィリン自己集合体における構造と光物性の相関に関する研究

1.ポルフィリン自己組織化集合体の形成メゾ位のフェニル基のpara-位にスルホ基を導入したポルフィリン誘導体、TSPPは塩酸溶液中においては、静電相互作用によって棒状のJ一会合体を形成することが知られている。しかしながら、塩酸溶液中においてはこのポルフィリンモノマーと会合体の間で平衡状態が存在し、選択的な会合体の形成は比較的困難であるということが報告されている。本研究において、スルホ基の代わりに疎水性の大きなアルコキシ基を導入した両親媒性のポルフィリンを合成し、塩酸水溶液中において選択的な会合体形成を行うことを目指した。ポルフィリン誘導体の塩酸溶液における各種構造・スペクトル測定から、疎水性のアルコキシ基を導入することによってTPPSよりも強固な会合体の形成が実現できることが分かった。また、適切な鎖長のアルコキシ基を導入したポルフィリンの会合体は他の系と比較して均一な構造を有していることが明らかとなった。2.ポルフィリンのLB膜の形成これまでポルフィリン誘導体のLangmuir-Blodgett(LB)膜に関する研究がなされているが、いずれの場合にも界面活性剤のような支持体が必要であり、ポルフィリンのみでの自己組織化膜は報告されていない。そこで、両親溶性のポルフィリン誘導体を合成し、液-気界面においてポルフィリンのLangmuir-Schaefer(LS)膜を形成させることにした。塩基性水溶液を液相に用いてLS膜を形成させて・-A依存性を取ったところ、強固な単分子膜構造を取っていることが示唆された。また、この単分子膜の表面反射吸収スペクトルの表面圧力依存性を調べたところ、表面圧力の増加に応じてポルフィリンが高密度でパッキングされることが示唆された。また興味深いことに、圧力の増減を繰り返したところポルフィリンの傾斜角度は可逆的に変化することが明らかとなった。フラーレンを結合させたシリカ・マイクロ粒子表面上にポルフィリンを結合させ、これをフラーレンとともにコロイド化させた。電気泳動法を用いて、このコロイドを酸化スズ被覆ITO電極上に集積化させ、その光電気化学的特性などを詳細に検討した。その結果を速報としてChemical Communications誌にて発表した。シリカ粒子に担持させたポルフィリンの光電気化学的特性はこれ以前には報告されていなかった。昨年度から引き続き研究を行っていたフラーレン結合デンドリマー系についての研究成果をまとめ、米国のJournal of Physical Chemistry C誌にて発表することができた。フラーレンデンドリマーの分子構造が各種の巨視的な諸物性に影響を与えることが分かり、明確なデンドリマー世代効果を示すことができた。現在はポルフィリン誘導体の会合体形成特性について研究を行っている。これまで水溶液中で選択的にJ-会合体を形成させたという報告はなされていない。より選択的にJ-会合体形成を水溶液中で行うために、疎水性基であるアルコキシ基を導入することで水溶性ポルフィリンTPPS(=Tetraphenylporphine Tetrasulfonic Acid)に両親媒性を持たせた。導入した疎水性鎖の長さに従って、会合体の溶液中での構造を制御できるということがAFM像やcryo-TEM像から分かった。また紫外-可視吸収スペクトルから、両親水媒性ポルフィリンは従来のTPPSとは異なり、より選択的に塩酸水溶液中でJ-会合体を形成していることが分かった。このことから各ポルフィリンの遷移双極子モーメントの方向は揃っていると考えられ、フィンランドのTampere大学Tkachenko教授と高速フォトダイナミクス測定を行う予定である。既に構造特性については3月の日本化学会にて口頭発表を行った。また、各種電気化学的特性が変化すると考えられるので会合体の電子移動度を測定する。より詳細な各種物性をまとめて、速報として論文を投稿する予定である。

また、この単分子膜の表面反射吸収スペクトルの表面圧力依存性を調べたところ、表面圧力の増加に応じてポルフィリンが高密度でパッキングされることが示唆された。また興味深いことに、圧力の増減を繰り返したところポルフィリンの傾斜角度は可逆的に変化することが明らかとなった。
脊椎動物初期発生における体軸形成機構の解明

(1)魚類・両生類においては、体軸形成(前後・背腹軸)を決定する仕組みは、受精直後より始まると考えられている。ゼブラフィッシュホメオボックス遺伝子bozozok/dharmaは、背側化決定因子の下流の母性Wnt/β-cateninシグナルで制御され、背側オーガナイザーの誘導に必要な遺伝子である。本研究においては、bozozok過剰発現した背側化胚と、axin,bmp4を過剰発現した腹側化胚を用いて、ディファレンシャルディスプレイを行い、転写抑制因子であるBozozokによって発現が抑制されるホメオボックス遺伝子vega3を単離した。Vega3は、vox(vega1),vent(vega2)と相同性を示し、bozozokやgoosecoidの発現していない腹側に発現した。モルフォリーノオリゴヌクレオチドを用いた蛋白翻訳阻害実験から、腹側に発現するvega3はvox,ventとともに、bozozokの下流で、背腹軸形成に関与していることを見出した。(2)体軸形成に異常を示す、新たなゼブラフィッシュ変異個体のスクリーニングを行い、腹側化変異体2系統・背側化変異体2系統を含む、多数の変異体を単離した。腹側化変異体の一つのpositional cloningを行っている。(3)ゼブラフィッシュ前脳特異的遺伝子fez-likeのマウス相同遺伝子fez及びfez-likeを単離した。両遺伝子とも、胎生8.5日より重複した前脳領域に発現していた。さらに、fez-likeノックアウトマウスを作成した。(4)ゼブラフィッシュを用いた発現cDNAライブラリーのスクリーニングを行い、後方神経特異的に発現し、後方神経の発生に必要な新規ホメオボックス遺伝子pnx(posterior nervous system-specific homeobox)を単離した。
歯の発生におけるエナメル蛋白の分子多様性と相互作用の意義に関する分子生物学的研究

エナメル蛋白の一次構造は種特異性に乏しい反面、mRNAの択一的スプライシングによる多様性を持つ。しかし、歯の発生の初期段階におけるこの分子多様性の意義はよく分かっておらず、また、これら多様な分子間の相互作用の役割についても、全く明らかにされていない。そこでシースプロテインについて、部位特異抗体を用いて歯の発生の初期段階におけるエナメル蛋白の発現様相をより詳細に調べた。ラット切歯の分化期におけるエナメル芽細胞と間葉系細胞におけるシースプロテインの発現様式について詳細に検討した。内エナメル上皮細胞の細胞分裂が終了し、エナメル芽細胞へ分化を開始すると、分化期エナメル芽細胞に先立って、分化しつつある象牙芽細胞にシースプロテインが発現した。この発現は一過性で、分化期エナメル芽細胞がシースプロテインを発現する時期になると、象牙芽細胞の発現は消失した。分化期エナメル芽細胞では、ゴルジ装置が細胞遠心部に移動し、基底膜が連続した段階で、電顕免疫組織化学によりゴルジ装置にシースプロテインの免疫活性が検出できた。象牙芽細胞が分化し、象牙質基質を形成し始めると、象牙芽細胞に近接する歯髄細胞の一部がシースプロテインを発現するようになるが、この発現も一過性であった。ウエスタンブロットで切歯成長端のシースプロテインの発現について検討すると、ブレフェルディンA投与により、33kDaおよび36kDa蛋白の発現が増加したが、分泌型である65kDa蛋白はほとんど変わらなかった。これらの結果から、分化期の象牙芽細胞とエナメル芽細胞は、従来知られている以外の低分子型シースプロテインを発現し、これが上皮-間葉相互作用に関係している可能性が示唆された。そこでまずアメロゲニンとシースプロテインについて、部位特異抗体を用いて歯の発生の初期段階におけるエナメル蛋白の発現様相を調べた。アメロゲニンのうち、ブタ歯胚のエナメル芽細胞の分化期で最も早く発現したのは、25kDaアメロゲニンで、次いで6.5kDaアメロゲニンが発現し、18kDaアメロゲニンの発現は最も遅かった。また、6.5kDaアメロゲニンは、基質形成期に比べて分化期で強く発現していた。27kDaアメロゲニンは、タンパクの発現が免疫組織化学で確認できなかった。マウス臼歯歯胚のエナメル芽細胞でシースプロテイン(アメロブラスチン)の発現を調べると、基質形成期では65kDaアメロブラスチンが発現しているが、分化期初期では65kDaアメロブラスチンは発現せず、35kDaアメロブラスチンが発現していた。ラット切歯の基質形成期エナメル芽細胞では、65kDaアメロブラスチンが発現しているが、分化期エナメル芽細胞においては、その他にコア蛋白として33kDa及び36kDaアメロブラスチンが発現していた。これらの33kDaおよび36kDaのアメロブラスチンは、65kDaアメロブラスチンのC端部を認識する抗体と反応したが、N端部を認識する抗体と反応しなかった。また、アメロブラスチンとアメロゲニンの発現時期を比較すると、アメロブラスチンはアメロゲニンの発現に比べやや遅れて発現していた。以上の結果から、分化期エナメル芽細胞と基質形成期エナメル芽細胞では、アメロゲニン及びシースプロテインのmRNAの択一的スプライシングが異なると考えられ、また従来知られていなかったシースプロテインの分子型が存在することが明らかとなった。

しかし、歯の発生の初期段階におけるこの分子多様性の意義はよく分かっておらず、また、これら多様な分子間の相互作用の役割についても、全く明らかにされていない。本年度はシースプロテインについて、部位特異抗体を用いて歯の発生の初期段階におけるエナメル蛋白の発現様相をより詳細に調べた。ラット切歯の分化期におけるエナメル芽細胞と間葉系細胞におけるシースプロテインの発現様式について詳細に検討した。内エナメル上皮細胞の細胞分裂が終了し、エナメル芽細胞へ分化を開始すると、分化期エナメル芽細胞に先立って、分化しつつある象牙芽細胞にシースプロテインが発現した。この発現は一過性で、分化期エナメル芽細胞がシースプロテインを発現する時期になると、象牙芽細胞の発現は消失した。分化期エナメル芽細胞では、ゴルジ装置が細胞遠心部に移動し、基底膜が連続した段階で、電顕免疫組織化学によりゴルジ装置にシースプロテインの免疫活性が検出できた。象牙芽細胞が分化し、象牙質基質を形成し始めると、象牙芽細胞に近接する歯髄細胞の一部がシースプロテインを発現するようになるが、この発現も一過性であった。ウエスタンブロットで切歯成長端のシースプロテインの発現について検討すると、ブレフェルディンA投与により、33kDaおよび36kDa蛋白の発現が増加したが、分泌型である65kDa蛋白はほとんど変わらなかった。これらの結果から、分化期の象牙芽細胞とエナメル芽細胞は、従来知られている以外の低分子型シースプロテインを発現し、これが上皮-間葉相互作用に関係している可能性が示唆された。
血管新生因子に基づいた硬膜動静脈瘻新規治療の確立

頚静脈と内頚動脈を吻合して静脈洞を閉塞することで動物モデル作成を行った。AVF動物モデルは高い確率では作成できず、治療効果を検証しうる動物モデルの作成は困難であった。動物実験では内科治療の可能性を検索することは困難であったため、硬膜動静脈瘻症例の病変部の血液を採取して血管新生因子の発現を検証した。病変部まで誘導したマイクロカテーテルからの血液と大腿静脈の血液を採取して、病変部における血管新生因子の発現を抗体アレイキットを用いて42種類の血管新生因子を網羅的に測定して、対照との比較を行って病変部の血管新生の半定量値を算出した。算出されたデータは病変部位、病期によって分類した。症例は20例、海綿静脈洞部10例、横静脈洞/S状静脈洞部7例、そのほか3例であった。海綿静脈洞部においてはAggressive typeではBenign typeと比べてVEGF-R3、IL1β、MMP9、uPARの発現が抑制されていた。Aggressive type、Benign typeのいずれでも発現が亢進している因子は認めなかった。現在はそのほか採取した検体の計測を行っており、今後は病変ごとや病期ごとに血管新生因子の発現の評価を行う。硬膜動静脈瘻の発生や進行に関与する血管新生因子を同定する。硬膜動静脈瘻の原因や病期進行に血管新生因子が関与していると考えられている。本研究の目的は、硬膜動静脈瘻の病態を血管新生関連因子に基づいて解明することと硬膜動静脈瘻の内科治療の可能性を模索することである。本研究と平行して、硬膜動静脈瘻の臨床例において脳血管内治療で経静脈アプローチを行った際に病変部位(罹患静脈洞)と大腿静脈の血液を採取して、得られた血清から血管新生因子の発現についてRayBiotech社のHuman Angiogenesis Array C1000をもちいてサンドイッチELISA法で網羅的に解析を行った。その結果、罹患静脈洞では大腿静脈と比べていくつかの血管新生因子および抑制因子の増加もしくは抑制を認めていた。さらには、病期の進行や罹患静脈洞によって血管新生因子の相違がある可能性が指摘された。これまでの結果ではAngiogenin、Rantes、VEGF-R2、TIMP-2が関与していることが指摘された。本疾患の病態解明において、いくつかの血管新生因子が標的となり得る可能性が高いと考えられる。H28年度は硬膜動静脈瘻モデル作製を行った。従来から報告されている方法(一側の頚動脈と頚静脈の吻合、対側の頚静脈結紮、静脈洞の閉塞)で作製した。モデル作製の手技は高い確率で行うことができたが、硬膜動静脈瘻形成の発現性が低かった。現在は硬膜動静脈瘻の発現時期の検証をおこなっている。さらには今後モデルの血管新生因子の測定を行う計画である。モデル作製においては従来から報告されているように、頚動静脈の吻合と静脈洞の閉塞を行うモデルを作製している。しかしながら、硬膜動静脈瘻の発現性が低いために、モデルの血管新生因子の計測には至っていない。本研究の目的は,硬膜動静脈瘻の病態を血管新生関連因子に基づいて解明することと硬膜動静脈瘻の内科治療の可能性を模索することである。本研究と平行して硬膜動静脈瘻の臨床例において脳血管内治療で経静脈アプローチを行った際に病変部位(罹患静脈洞)と大腿静脈の血液を採取して、えられた血清から血管新生因子の発現についてRayBiotech社のHuman Agniogenesis Array C1000を用いてサンドイッチELISA法で網羅的に解析を行った。その結果、罹患静脈洞では大腿静脈と比べていくつかの血管新生因子及び抑制因子の増加もしくは抑制を認めた。さらには病期の進行や罹患静脈洞によって血管新生因子の相違がある可能性が指摘された。これまでの結果ではIL-1β、VEGFR3、MMP-9、uPARは流入血管の多い病初期に発現亢進する可能性が示唆された。本疾患の病態解明において、いくつかの血管新生因子が標的となりえる可能性が高いと考えられる。H29年度は硬膜動静脈瘻モデル作製をおこなった。硬膜動静脈瘻形成の発現率が低いためにさらに異なる手技にておこなったが、従来法よりも高い再発減率はえられなかった。動物モデルの発現率が低いため、他の手法を試みたが従来法以上の発現率はえられなかった。また施設の異動のために動物実験用機材の調達等に時間を要した。施設移動後は研究費の事務的異動手続きが遅延したために研究費の使用ができなかった。

病変部まで誘導したマイクロカテーテルからの血液と大腿静脈の血液を採取して、病変部における血管新生因子の発現を抗体アレイキットを用いて42種類の血管新生因子を網羅的に測定して、対照との比較を行って病変部の血管新生の半定量値を算出した。算出されたデータは病変部位、病期によって分類した。症例は20例、海綿静脈洞部10例、横静脈洞/S状静脈洞部7例、そのほか3例であった。海綿静脈洞部においてはAggressive typeではBenign typeと比べてVEGF-R3、IL1β、MMP9、uPARの発現が抑制されていた。Aggressive type、Benign typeのいずれでも発現が亢進している因子は認めなかった。現在はそのほか採取した検体の計測を行っており、今後は病変ごとや病期ごとに血管新生因子の発現の評価を行う。硬膜動静脈瘻の発生や進行に関与する血管新生因子を同定する。硬膜動静脈瘻は病態の進行度によって分類されているが、人工的に作製した硬膜動静脈瘻モデルでは放射線学的評価と病理学的評価のみで病態の進行度を判定することは困難である。そのため、硬膜動静脈瘻モデルにおける血管新生因子の発現を計測して,臨床例から得られているデータを用いることで病態の進行度の判定が可能になる。とくにこれまでの臨床データでは、血管新生因子、抑制因子の関与が推測され放射線学的評価と病理学的評価によって硬膜動静脈瘻の有無を判定して生物学的評価(血管新生因子)によって病態の進行度を判定することで、各病態に応じた治療効果判定が可能になる。モデル作製が困難な可能性があるため、硬膜動静脈瘻の臨床例から得られたサンドイッチELISA法で得られたデータを元に、検証する血管新生因子に焦点を絞って、in vitroでの内皮細胞実験を平行して行っていく。具体的には内皮細胞に各種ストレス(低酸素、シェアストレスなど)を加え、血管新生因子の変化を検証することで、硬膜動静脈瘻に関わる因子や治療の手がかりを模索する。人工的に作製した硬膜動静脈瘻モデルでは放射線学的評価と病理学的評価のみで病態の進行度を判定することは困難である。すでに臨床症例からのデータは蓄積されているので、硬膜動静脈瘻モデルの血管新生因子を評価して、病態の進行度の判定が可能となる。また検証する血管新生因子に焦点を絞って、in vitroでの内皮細胞実験を平行して行っていく。具体的には内皮細胞に各種ストレスを加え、血管新生因子の変化を検証する。動物モデルとin vitroでの実験を用いて、抗血管新生療法による治療効果を判定する。H28年度は硬膜動静脈瘻モデル作製を行った。従来から報告されている方法(一側の頚動脈と頚静脈の吻合、対側の頚静脈結紮、静脈洞の閉塞)で作製した。モデル作製の手技は高い確率で行うことができたが、硬膜動静脈瘻形成の発現性が低く、モデルにおける血管新生因子の計測が行えていない。現在は硬膜動静脈瘻の発現時期の検証をおこなっている。(理由)H29年度は硬膜動静脈瘻モデル作製を行った。従来から報告されている方法(一側の頚動脈と頚静脈の吻合、対側の頚静脈結紮、静脈洞の閉塞)と他の手法で作製したが、硬膜動静脈瘻形成の発現性が低く、モデルにおける血管新生因子の計測が行えていない。(使用計画)従来の方法で硬膜動静脈瘻モデルを作製して、血管新生因子の発現を計測して、臨床例から得られているデータを用いることで病期の進行度を判定する。in vivoでの検証と平行して、内皮細胞に各種ストレスを加えて血管新生因子の発現を検証して、硬膜動静脈瘻に関わる要因の手がかりを模索する。
ABCタンパク質の基質輸送活性の測定

<分泌小胞上に発現させたABCタンパク質の機能解析>出芽酵母はSec6遺伝子の変異Sec6-4によって、25°Cでは正常に生育するが、37°Cでは分泌小胞を細胞内に大量に蓄積することが知られている。出芽酵母の主なABCタンパク質遺伝子を破壊した株(AD1-8u)にこのSec6-4遺伝子変異を導入し、37°Cにおいて分泌小胞を蓄積するような株(Ap1-8u-sec6-4)を構築した。また、Sec6-4遺伝子変異の本体がL633Pのアミノ酸置換によるものであることを明らかにした。<Candida glabrataのABCタンパク質Cdr1pおよびPdh1pのリン酸化による活性制御>病原真菌Candida glabrataのABCタンパク質、Cdr1PとPdh1Pのリン酸化状態と薬剤排出機能の相関を調べた。抗リン酸化セリン・スレオニン抗体を用いたウエスタンブロット解析により、両者はそれぞれ異なるPKAの触媒サブユニットによってリン酸化されること、またそのリン酸化量がストレスや栄養条件によって変動することを明らかにした。さらに、Cdr1Pの予測されるリン酸化部位を変異させたタンパク質を用いて解析を行った。その結果、307番目のセリンと、484番目のセリンをアラニンに置換させると、リン酸化量とATP加水分解活性が低下し、薬剤耐性能も低下することを明らかにした。<Cdr1pとCdr2pの基質特異性>相同性の高いアミノ酸配列をもつCdr1pとCdr2pが異なる薬剤排出活性をもつことを利用し、それぞれのドメインを交換したキメラタンパク質を作製し解析を行うことで、基質特異性を決定する領域を調べた。その結果、分子内の二つのTMDを交換したものは薬剤感受性試験において基質特異性が大きく変化しており、特に、TMD1の交換が基質特異性の決定に大きく貢献することが示唆された。出芽酵母の主なABCタンパク質遺伝子を破壊した株(AD1-8u-)にこのSec6-4遺伝子変異を導入し、37°Cにおいて分泌小胞を蓄積するような株(AD1-8u-sec6-4)を構築した。まず、この酵母株がどのような温度において報告されているような分泌小胞を蓄積するのかを透過型電子顕微鏡観察により検討した。その結果、AD1-8u-sec6-4は25度でも少量の分泌小胞の蓄積が見られ、温度依存的に小胞の蓄積が増えていくが、37°Cでは正常な細胞形態をとっていなかった。<Candida glabrataのABCタンパク質Cdr1pおよびPdh1pのリン酸化による活性制御>病原真菌Candida glabrataのABCタンパク質、Cdr1pとPdh1pはアゾール系抗真菌薬を排出し、真菌に薬剤耐性能を付与する。Cdr1pとPdh1pを出芽酵母において大量発現させて、タンパク質のリン酸化状態と薬剤排出機能の相関を調べた。さらに、Cdr1pの予測されるリン酸化部位を変異させたタンパク質を用いて解析を行った。これらのリン酸化部位は近傍にあるNBD(nucleotide binding domain)の活性を調節し、タンパク質全体の薬剤輸送活性を調節するものと考えられる。
アポリポ蛋白Eのトランスジェニックマウスの開発と応用

アポEはLDLレセプターとの強い親和性により、コレステロール代謝において中心的役割を果している。私共は従来より、アポEの静注により血漿コレステロール値の低下することを報告してきた。これは、外因性にアポEの血中レベルを増加させたが、今回は内因性にアポE遺伝子を過剰発現させることにより、血漿脂質代謝がどのように変化するかを観察した。マウスメタロチオネインプロモーターにラットアポEのgenomicDNAを結合させた融合遺伝子を導入遺伝子としてトランスジェニックマスを作成した。そしてアポEを過剰発現するマウスライン4-20を得ることが出来たが、その血漿脂質値、リポタンパク代謝について解析を行なった。血漿アポE値はホモ型では5倍に増加し、血漿コレステロール値は70%、血漿中性脂肪値は80%の低下を示した。また、コレステロール食を投与したが、血漿コレステロール値は正常範囲内であった。従ってアポEは血漿脂質値を決定する重大な因子であることが明らかになると同時に、高コレステロール血症を抑制する作用のあることが明かとなった。これは、肝でアポEが過剰に合成され、分泌されて、リポ蛋白粒子上のアポE分子が増加することにより、血中よりそのリポ蛋白のLDLレセプターを介する異化が促進することによると考えられた。現在、アポEを血管壁で発現させることにより動脈硬化症の成因におけるアポEの役割について検討を行っている。