hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
実用性知能の脳内基盤に関する研究

本研究では、日常生活中で頻繁に行われる正解のない意思決定や行動の選択に関わる脳の機能(実用性知能)を、脳の一部の機能が損なわれた患者の協力を得て、明らかにすることを目的とした。まず、そのような機能を調べるための認知課題を考案し、また、日常生活における困難に関するチェックリストを作成した。結果、前頭葉の異なる部位が認知機能の異なる側面と関係しており、また、認知機能と日常生活上での困難の間にも関連が見られた。さらに、損傷後の回復過程を調べたところ、受傷後半年以降では、かなりの回復が見られるものの、半数の患者では、依然として認知機能低下や日常生活上での困難が残存することもわかった。本研究の目的は、日常的な問題の解決に関わる知能(実用性知能)の脳・認知メカニズムの解明を行うことである。実用性知能は、通常の知能検査で測られる知能とは異なる側面を反映すると考えられてきているが、その脳内機序や心理学的なメカニズムは全く明らかになっていない。そこで、脳腫瘍摘出術前後の患者の協力を得て、日常的問題の解決に関わる脳のネットワークを明らかにする。また、ワーキングメモリや実行機能など、関連する認知機能と日常的問題解決の成績の関係を明らかにすることで、日常的問題の解決にかかわる認知メカニズムのモデル化を目指す。本年度は、Open-endedで非構造的課題の作成を行った。試行錯誤を行い、最終的に2つの課題のプロトタイプを作成した。一つは、5つのキーをできるだけランダム順に押すことを求める、ランダム反応生成課題である。各キー押しの回数、1次と2次のキーの遷移から、ランダム性を評価する方法を確立した。第2の課題は、従来のdesign fluency課題を、改変し、絵が苦手な患者であっても、容易にできるように、言語的な要素を加えたものである。また、前頭葉を損傷した患者が日常生活場面で示す課題解決の困難さを患者個人、看護者や家族が評価するための質問紙を作成するために、日頃、患者と接している医師、看護師、心理士からのヒアリングを行った。その内容を、整理し、30問からなる質問紙のプロトタイプを作成した。さらに、患者の一般知能を評価するために7種類の課題からる認知機能課題を作成し、25名の患者に実施した。その結果に階層的因子分析を行い、知能の一般因子(g因子)が抽出できることを確認した。昨年度開発したopne-endedで非構造的な課題(2課題)のプロトタイプを健常者を対象に実施し、手続きや教示法の改良を行った。また、これら課題を、数名の脳損傷患者に実施した。その結果、一方の課題では、課題成績において個人差が認められ、個人の能力を測定する課題として有効である可能性が示されたものの、もう一方の課題では、課題が難しい傾向があり、明確な個人差が得られなかった。そこで、後者の課題について、改良を行った。また、昨年度作成した質問紙のプロトタイプの妥当性を検証するため、脳損傷患者本人、看護師や家族からのデータを収集中であるが、計画通りにデータを集めることができなかった。また、実験に参加した患者の脳画像をデータベース化を進めた。さらに、患者の一般的知能を評価するために昨年度、作成した認知課題を69名の患者に実施し、昨年度と同様の階層的因子分析を行った。その結果、一般知能因子が抽出できることを確認した。さらに、それら知能の程度と看護師等からの聞き取りによる日常行動についての観察記録との対応関係について、定性的なケース研究を行った。その結果、知能の術後の低下の程度と、実用性機能に関わる観察の記載との間に、特徴的な関係が多数見つかった。特に、退院後の職場復帰の低さ、育児などの家事に関わる作業の困難の訴えなどが、知能の一般因子の低い患者に顕著に見られることがわかった。本研究では、共同研究機関と連携して、脳損傷患者の協力を得て研究を行っているが、本研究に適した患者が、当初の予定よりも若干少ないため、十分な結論を導くためのデータが得られていない。また、昨年度開発した課題を患者を対象に実施しているが、想定してたよりも困難なもの(design fluency課題の改良版)があり、それらを修正するのに時間を要した。昨年度、その有効性が実証された認知課題成績の階層的因子分析に基づく一般知能(g)の結果と日常的な生活における看護師の観察記録、ならび、患者のQOLのデータをもとに、日常生活における新規な問題解決能力の指標を試作した。30名の前頭葉損傷患者について、これら指標のスコアと脳損傷部位の関係を脳画像データの統計的解析により求めたところ、右前頭葉の損傷との関連性が見出された。これは従来の研究とも一致する結果ではあるが、先行研究では、主にケース研究が主であった。それに対して、定量的なデータによって、右前頭葉が日常的な問題の解決に関与していることを裏付けることができた。これらの結果から、日常的な問題解決が、右前頭葉の抑制機能あるいはプランニング機能と関連する可能性が示唆された。

さらに、損傷後の回復過程を調べたところ、受傷後半年以降では、かなりの回復が見られるものの、半数の患者では、依然として認知機能低下や日常生活上での困難が残存することもわかった。ほぼ、当初の予定通り、Open-endedで非構造的課題の作成と、一般被験者を対象とした予備実験を行い、また、その結果を評価するための手法を確立した。また、日常の問題解決に関する困難場面について質問紙のプロトタイプを作成した。さらに、患者の認知機能や一般性知能を計測するための方法を確立した。実験の課題整備、質問紙の整備が終わり、実験参加者(患者)に関しては、7月までに必要な人数を確保できる見通しである。それらの心理実験ならびに質問紙の結果を総合して、脳画像との対応を早急に検討する。また、質問紙に関しては、統制群の健常者データをインターネット調査を介して収集するなどして、研究の加速を図る。実験心理学次年度は、本年度作成した、Open-endedで非構造的課題、日常の問題解決に関する困難場面について質問紙、認知課題を、実際の患者(50名程度)に実施し、知能検査の成績が高く日常的問題解決課題の成績が低い患者とその逆の知能検査の成績が低く日常的問題解決課題の成績が高い患者が存在することを示すことによって、両者が互いに独立であることを立証する。また、術前、および術後の脳解剖画像から損傷脳部位を特定し、日常的問題解決課題の成績の低下に寄与する脳部位を特定する。これらを通じて、日常的な問題解決に関わる脳の部位やネットワークの解明を目指す。一昨年度より、実験参加者が予想よりも集まらなかったことによって、研究の進捗に遅れが発生したために差額が生じた。予備実験が年度末になり、外部の一般被験者が予定通りに集まらなかったために、その分の実験者謝金、ならびに被験者謝金に残額が生じた。上記については、次年度前半に集中的に実験を行うことで、計画の遅れ分を取り戻す予定である。また、調査の一部をインターネット調査等に代替することを計画している。次年度、早々に、昨年度実施できなかった分の被験者実験を併せて行う。
新しい低分子量G蛋白質rhebによる細胞増殖・分化の制御機構の解明

細胞の増殖は、分化同様、遺伝子発現のプログラムにより制御されていると考えられる。特にG0期から増殖サイクルへの移行に際しては数多くの遺伝子発現が必要であり、「がん」もその遺伝子発現の異常の結果生じてくると考えられる。線維芽細胞を成長因子で刺激すると、immediate early genes(IEGs)と呼ばれる遺伝子群が誘導され、これらが増殖サイクルへの移行に重要であると考えられている。我々は既に脳から多数の新しいIEGsを見いだしており、これらの遺伝子が細胞の増殖・分子に関わっていることを示してきた。中でもrheb(ras homologue enriched in brain)は、ras familyに属する新しい低分子量GTP結合蛋白質をコードし、エフェクター領域がRasやRapのそれとよく似ており、血清で刺激された線維芽細胞でも誘導される。rhebの細胞増殖・分化における役割を明らかにするために、two hybrid systemを用いて相互作用する蛋白質のcDNAをクローニングし、raf-1を見出した。RhebはRafにGTP dependentに結合し、さらに両遺伝子をNIH3T3にco-transfectionすると,fociの形成が促進された。また、PKAでリン酸化されたRafはRhebに特異的に結合し、MEK、MAP kinaseを活性化した。以上の結果から、成長因子とcAMPの二種類の刺激が組み合わさった場合、Rhebが特異的にRafと結合し、その情報を伝えていると考えられた。また、rhebの学生学上の役割を解析するため、ゼブラフィッシュのホモログを単離した。z-rhebのGTP結合領域はよく保存されており、特にG2領域(エフェクター領域)が他の種と完全に一致していることから、種を通して共通の蛋白質間相互作用を介して、情報伝達を行っていると考えられた。
可変形状トラスを用いた可動型構造物の形状制御と追随する外装機構に関する研究

本研究課題の研究期間(平成17年度19年度)における成果として以下の知見が得られ,それらの内容をについて研究成果報告書にまとめた。(1)可動アーチ構造物の運動学,動力学,構造力学的特性の把握可変形状トラスVGTを用いた構造物に対して,運動学や動力学に基づく解析方法の定式化を行い,その各種特性を把握した。特に可動アーチの両端部を支持しながら構造体の形状変化を可能にする解析手法を確立することで,可動アーチの用途を拡大させた。また可動アーチの構造力学的特性を把握することで,アーチ端部の支持方法,VGT機構の配置方法,可動範囲の特定が可能となった。(2)可動アーチに追随する外装パネル機構の確立可動アーチと外装パネルを統合した構造物全体の設計を行い、近未来型の可動型アーチおよび外装機構のモデルを完成した。特に,アーチ構造の形状を様々に変化させ、追随する外装パネルが全体として動く様子やその効果を動画像によって明らかにした。同時に各種部材の動的挙動、構造特性を解析し、実設計に向けたデータを取得できた。(3)部分模型製作と実験検証可動アーチと外装パネル機構の部分モデルを用いて,可動・可変する屋根模型の設計,製作を実施した。ここではVGTを構成する伸縮アクチュエータや多軸ノードの開発,端部機構の具体化,制御システムの開発,さらにアーチ構造と外装パネルを結合させる中間機構の考案・製作を行い,可動アーチの動きに追随する外装パネルの模型を完成した。この部分模型を用いることで,可動屋根の複雑な動きが再現でき,問題点の抽出(可動部材の範囲や干渉域)や設計法へのフィードバックを実施することができた。一連の解析およぶ模型実験を通して,研究課題に対する有益な知見を見出すことができた。得られた結果は実設計を行うための貴重な基礎データであり,今後の研究・開発に活用してゆく。本研究計画では可動アーチ構造に対する基礎解析と模型実験を行い、その結果を踏まえながら可動構造物の試設計を展開し、総合的な技術の取得を目指す。初年度では以下に示す(1)(3)の内容を実施した。(1)VGTを用いたアーチ構造の運動学解析アーチ構造の形状変化,限界を順運動学により解析した。1端部が固定された片持ち構造を応用し、その先端が他端に一致するように逆運動学の最適解を求めてアーチ全体の形状状態を決定した。同時に応力やひずみを考慮したFEM解析法を併用することで,アーチ構造の状態を把握しながら形状変化が可能な解析プログラムの作成を行った。このプログラムを利用することで,アーチ構造の形態創生、形状デザインへと応用する。さらに、本研究の前段階にあたる片持ち構造物の解析にも開発したプログラムを適用し,その有効性を確認する。(2)運動学と動力学的解析の検討アーチ構造の曲率半径が大きい場合や形状変化率がある程度の速度を有する場合を想定し,運動学と共に動力学的解析を実施した。本年度は各種の解析手法への展開を試みオイラー法やKaneの運動方程式等を利用し、アーチ構造の定式化を検討した。解析が複雑となるため本年度購入したワークステーションを利用し,計算速度の短縮化,並列計算法の検討を実施した。さらに、逆動力学的な解析にも着手した。(3)平面アーチ構造の模型による検証上記(1)、(2)の解析研究と平行して、VGTを用いた平面アーチ構造の模型設計および可動アクチュエーターの製作を行い、さらに制御システムの改良を実施した。模型の製作には申請者がこれまで実験に使用した片持ち構造の模型を改良,追加してゆくものであり,次年度に掛けて製作を行い,完了する予定である。

本年度(18年度)は昨年度実施した研究を継続し、アーチ構造物の解析および検証模型の製作を実施した。(1)可動型トラスアーチの解析研究可変形状トラスを用いたアーチ構造物の逆動力学に対する定式化を行い、アーチの形状変化と力学的状態を求めるプログラムの製作およびその特性を調査した。特に2点支持された平面アーチ構造に対し、作用する外力を緩和するような最適形状解析、また急始動、急停止などの大きな加速度が作用した場合の形状変化や力学特性の推移などを対象とした。この結果、アーチ構造の形状変化に対して、支持された端部を状況に応じて微小変化させることで、部材の外力作用緩和を促しながら効率良い運動状態が可能であることを見出した。(2)近未来型可動構造物の試設計検討可動型の平面アーチ構造を躯体とした可動構造物の試設計を継続して実施した。アーチの形状変化に伴って外装パネル部材が3次元的に動く機構を考案し、この部分機構に対する運動解析および構造解析を行い、試設計に対する動きの範囲や部材条件(アーチ躯体、駆動装置、外装機構、外装パネル等)を整理した。これらの結果を基に次年度では構造全体の設計を行う予定である。(3)試設計に基づく部分検証模型の製作昨年度より継続製作中の可動型の平面アーチ模型を完成させ、実際に稼働させるための制御システムを構築した。制御システムは手動・自動操作が可能であり運動学、動力学を考慮したシステムを適用中である。一方、付随する外装部材は(2)の解析結果を基に製作し、可動アーチ部分と自在ジョイントで結合した3次元機構からなり、アーチの動きに追随するように外装パネル部材が動く部分模型である。今後この部分模型を基に構造全体の可動状態、付随する外装機構、制御システムの検証を実施して行く予定である。本年度(19年度)は昨年度実施した研究を継続し、可動アーチ構造物の設計手法の確立および部分模型による実験検証を行い、その成果をまとめた。(1)可動型トラスアーチの構造解析検討これまで実施した運動学や動力学的解析と有限要素法による構造解析を結合し,トラスアーチの形状変化と構造状態を同時に求めるプログラムの作成およびその検証を実施した。この結果,アーチ構造の形状変化に対する各部材の応力状態を随時把握でき,可変形状トラスを用いた各種の可動構造物(例えば,片持ち型の開閉屋根,可動モニュメント,その他)への利用展開を検討した。(2)近未来型可動構造物の試設計検討可動アーチと外装パネルを統合した構造物全体の設計を行い、近未来型の可動型アーチのモデルを完成した。特に,アーチ構造の形状を様々に変化させ、追随する外装パネルが全体として動く様子やその効果を動画像によって明らかにした。また同時に各種部材の動的挙動、構造特性を解析し、実設計に向けたデータを取得した。(3)試設計に基づく部分模型の実験検証昨年度に製作した平面トラスアーチと外装パネル機構の部分モデルを用いて可動アーチ屋根の実験検証を実施した。
新規な菌類検査方法の基礎研究

我々は細菌類検査方法前処理として電解コンデンサ、リレー、定電圧電源を組み合わせた装置を用い、細菌類を含む溶液中の電極間に低電圧パルス(low voltage application : LVP)を印加する方法を開発した。LVP印加後に遠心分離操作を行い溶液層と沈殿物とに分離した大腸菌を含む試料のそれぞれに発色する基質であるX-glucを加えその吸収スペクトル変化を観察したところ、溶液層の方が沈殿物に比べ吸光度増加は3倍程度大きかった。このことからLVP印加により大腸菌の細胞膜から酵素であるβ-D-glucuronidaseを抽出できたことが分かった。細菌類検査キットでは酵素を機能を損なわずに細胞から取り出すため、超音波照射や界面活性剤等の薬品で細胞膜を破壊する化学的方法等が用いられるが、効率が低く機能喪失の可能性がある。我々は低電圧パルス(Low Voltage Pulse:LVP)を用いて細菌類に含まれる酵素を機能を損なわずに高効率に細胞外に取り出す方法を開発した。平成23年度は基礎検討として大腸菌に含まれる酵素であるβ-D-グルクロニダーゼの活性を利用し5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-グルクロニド(X-gluc)の発色に伴う吸光度変化から本方法の有効性を検討した。培養後、比色計で濃度を約1億cfu/mLに調整した大腸菌を試料とした。カソードは5mmφのW平板、カソードはW針を用い、電極間は2 mmに固定した。試料溶液をセルに1mL分注し、5V、5Hz、1,000回のLVPを印加し37°Cで保存し20時間後に吸収スペクトル測定を行ったところ、LVP処理を行っていない試料に比べて大きな吸光度の増加が観察され、本方法の有効性が示された。一方、10V以上の電圧を印加すると呈色反応が認められずLVP処理により酵素活性が失活させられていると考えられた。LVP印加により酵素が大腸菌の細胞膜から取り出せている事を証明するため、平成24年度はLVP印加後に試料溶液を遠心操作で固形分と溶液成分に分離しそれぞれにX-glucを添加し吸収スペクトル変化を観察した。その結果、1溶液成分と固形分の吸光度増加はほぼ遠心分離を行っていない試料のそれとほぼ等しい事、2溶液成分の方が固形分より3倍程度大きい事、が分かり酵素が大腸菌から取り出せている事が分かった。また我々の実験条件では10V、5HzのLVPを印加すると10分で試料溶液が45°C程度まで温度上昇する事も分かりこれが酵素機能消失の原因と考えられることも分かった。細菌類検査では内包されている酵素の化学反応による基質の色変化を利用する検査キットが用いられている。細胞膜から酵素機能を損なわずに取り出すため、超音波照射や界面活性剤等の薬品が用いられるが、酵素機能を失う可能性がある。我々が開発した低電圧パルスを用いて細胞膜を破壊する前処理方法では菌類や細胞内に含まれる酵素の内容物をそれらの機能を損なわずに高効率に細胞外に取り出すことが可能である。平成23年度は本装置の基礎検討として大腸菌に含まれる酵素であるベーター-D-グルクロニダーゼの活性を利用し5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-ベーター-D-グルクロニド(X-gluc)の発色を観察する発色酵素基質法を利用しその吸光度変化からこの前処理方法の有効性を検討した。菌株として大腸菌を用い、LB液体培地で37°C、12時間以上振とう培養し、遠心分離(2000rpm, 15min)を行い培養時のLB液体培地を新たなLB液体培地に交換し、培養液用比色計により試料溶液とした(約108 cfu/mL)。コンデンサ容量3mF、ファンクションジェネレータ、直流電源を用いて、低電圧パルス電源を構成した。コンデンサに対する充放電が信号発生器による所定のスイッチング操作で制御され電気エネルギが供給される。放電電極はタングステン製で、針電極をカソード及び平板電極をアノードとし、電極間は2 mmに固定した。試料溶液をセルに1mL分注し、平板電極下に設置したスターラーで攪拌しつつ、5V、5Hz、1,000回のパルスを印加し、37°Cで保存し20時間後に吸収スペクトル測定を行ったところ、パルス処理を行っていない試料に比べて大きな吸光度の増加が観察され、本前処理方法の有効性が示された。一方、10V以上の電圧を印加すると呈色反応が認められず、パル印加により酵素活性が失活させられていると考えられた。(1)35Vと言った低電圧パルス印加により大腸菌内に含まれるβ-D-グルクロニダーゼが機能を保ったまま抽出できることが確認できた。

(2)SOWG分光法を用いると通常の透過法よりも基質が低濃度、つまり短時間であっても検出可能なことが観察できた。(3)10V以上の電圧パルスを印加するとβ-D-グルクロニダーセの機能が消失することが分かった。(4)他の検査方法へも応用可能なことが分かった。大腸菌からの酵素抽出に関して実験条件の最適化を進める。また、超音波照射等の他の前処理方法に比べた長所を明確にするため、これらの方法との比較検討を行う。更にその他の検査方法等への応用も積極的に進める。試薬が高価なため、消耗品購入に充てたい。また成果発表のため海外を含めて学会発表を積極的に行い、その旅費や参加費に充てる。
時相論理を用いたコンパイラ最適化器の生成・検証と別名を扱えるSSA形式高度最適化

時相論理を用いたコンパイラ最適化器の生成系を作成した.これにより,従来は実用にならないと思われていたものが手書きのものに近づいた.また,コンパイラの最適化器が正しいかどうかを,時相論理を用いて検証する方法を開発,実装した.これは,モデル検査によりバグを報告する.一方,プログラムの実行経路によって実行されない式を除去する部分冗長除去の最適化を,要求駆動の性質を用いて,ループ不変式のループ外移動を投機的に行えるように拡張した.本手法を実装し,評価した結果,従来法より効率的に高速なコードを生成できることを示した.時相論理を用いたコンパイラ最適化器の生成系を作成した.これにより,従来は実用にならないと思われていたものが手書きのものに近づいた.また,コンパイラの最適化器が正しいかどうかを,時相論理を用いて検証する方法を開発,実装した.これは,モデル検査によりバグを報告する.一方,プログラムの実行経路によって実行されない式を除去する部分冗長除去の最適化を,要求駆動の性質を用いて,ループ不変式のループ外移動を投機的に行えるように拡張した.本手法を実装し,評価した結果,従来法より効率的に高速なコードを生成できることを示した.1.コンパイラにおける時相論理を用いた最適化器の生成と最適化器の検証の研究(1)コンパイラにおける時相論理を用いた最適化器の生成の研究この研究では,時相論理の一つである双方向CTLを用いて最適化器を記述し,そこからモデル検査により最適化器を生成した.従来研究として,Laceyら(2004)のようなCTLなどの論理を用いて最適化器を生成する研究もあるが,従来研究では,理論的な側面に重点が置かれており,Pascalのサブセットなど簡単な言語だけしか扱えない,扱える最適化の種類が非常に限られている,時相論理の記述から生成した最適化器の効率が悪く,最適化時間や最適化されたコードの実行時間などの定量的なデータが得られていない,など克服すべき課題が多かった.本研究ではこれらの問題を解決したシステムを作成した.(2)コンパイラにおける手書きの最適化器の検証の研究最適化された中間コードに対し,時相論理で記述した仕様が満たされているかどうかを検証する方法を実現した.これは,まず,既存の手書きの最適化器を用い,それにアスペクト指向プログラミングの手法を用いて中間表現を変更する部分にマークをつけるように修正する.一方,個々の最適化について,中間コードが満たすべき仕様を時相論理で記述しておく.各フェーズの最適化後にその仕様が満たされているかどうかをモデル検査により検証する.これにより,最適化のバグを見つけることができた.2.配列に対するSSA形式最適化の新しい方式の実装配列をSSA形式で扱う方法は長らく研究されていたが,実用性にはほど遠かった.本研究では,RusらのFortran向けの手法をC言語向けに改良し,実装して実験を行った.結果はベンチマークにより異なるが,配列の最適化の結果,目的コードの実行時間が最大10%速くなる例もあった.1.時相論理を用いたコンパイラ最適化器の検証最適化器が正しいかどうかを,時相論理で記述した仕様が満たされているか否かによって検証する方法を開発した.これは,最適化前と最適化後の中間コードを,合同集合を作成しながら比較する.最適化前の中間コードを基にKripke構造とそのラベルを作成し,比較結果が異なっている場合には,ラベルに「追加」,「削除」,「置換」の情報を追加する.「追加」,「削除」,「置換」が満たすべき仕様を時相論理の一種であるCTL論理によってあらかじめ作成しておき,これを用いてモデル検査を行う.モデル検査の結果,バグがあると報告される.この手法は,既存の手書きの最適化二器に適用でき,しかも検証者は最適化アルゴリズムやその実装を知る必要がない点が大きな特徴である.これにより,コンパイラ・インフラストラクチャCOINSの最適化のバグをいくつか見つけることができた.2.要求駆動型部分無用コード除去プログラムの実行経路によっては使用されないことがある代入文を,適切なプログラム点に移動させて除去する部分無用コード除去を,必要に応じて行う効率的な手法を提案した。本手法を,プログラム中の実行コストの高い部分に適用することによって,必要最低限のコンパイルコストで,部分無用コード除去を適用することができる.1.時相論理を用いたコンパイラ最適化器の検証コンパイラの最適化器が正しいかどうかを,時相論理を用いて検証する方法を開発,実装した.これは,最適化前と最適化後のSSA形式中間コードを比較する.最適化前の中間コードを基にして,比較結果が異なっている場合には,ラベルに「追加」,「削除」,「置換」等8種類の情報を追加する.「追加」,「削除」,「置換」等が満たすべき仕様を時相論理の一種であるCTL論理によってあらかじめ記述しておき,これを用いてモデル検査を行う.モデル検査の結果,バグがあれば報告される.この手法の大きな特長は,既存の手書きの最適化器に適用できること,検証者が最適化アルゴリズムやその実装を知る必要がないこと,である.これにより,コンパイラ・インフラストラクチャCOINSの最適化のバグをいくつか発見することができた.

2.質問伝播に基づく投機的部分冗長除去プログラムの実行経路によって実行されない式を除去する部分冗長除去を,要求駆動の性質を用いて,ループ不変式のループ外移動を投機的に行えるように拡張した.本手法を適用することによって,他の解析やプログラム変形を行うことなく,任意のプログラム構造に対して,ループ内の実行コストをさらに低減できることを,実験の結果から明らかにした.
脳神経に付属する副交感性神経節による頭部・顔面・口腔領域の神経支配様式

1.眼窩内に新たに小神経節(副毛様体神経節)を同定した。この神経節の性質を調査するために、軸索追跡法を用いて神経結合様式を調査した。その結果、この神経節の節前線維の起始細胞は、中脳吻側部の近見運動領域から起こることが明らかになった。このことから、この神経節は眼球の血流あるいは眼圧を調節する神経節細胞ではなく、近見反射に関係する神経節であることが示された。2.眼球内に神経節細胞が存在することを証明した(眼球内神経節)。これらの神経節の神経結合様式を軸索追跡法を用いて調査したところ、その節前線維の起始は副毛様体神経節のそれの正中部に一致することが明らかになった。古くから、「近見運動に伴う毛様体筋運動は中継神経節を持たずに中枢により直接支配されている」とする根強い学説が存在するが、本研究の結果により、この説は否定され、眼球内神経節により中継されることが明らかとなった。3.脳全体の血流は翼口蓋神経節により支配されていることが知られているが、大脳新皮質の局所的血流調節を支配する神経細胞については不明であった。一酸化窒素が血管平滑筋の拡張に関係していることに注目し、それを産生する神経細胞の局在を組織化学的に調査したところ、これらの細胞は末梢系に存在するのではなく、大脳新皮質内に均等分布することが明らかとなった。4.動眼神経に含まれる血管拡張機能の有無を調査する目的で、毛様体神経節および副毛様体神経節に含まれる一酸化窒素産生細胞(血管支配細胞)の局在分布を組織化学的に調査した。一酸化窒素産生細胞は全神経節細胞の約1%を占めることが明らかとなり、動眼神経にも独自の血管支配機構が存在することが示された。
遷移金属含有双極子を経由する多環性骨格の効率的合成手法

天然有機化合物、生理活性物質には、多環性複素環骨格を有するものが数多く見られることから、各種の多環性複素環骨格を高効率的に構築可能な反応が開発できれば、それらの合成に有用な手段を提供できることになる。我々は最近、遷移金属錯体により活性化されたアルキンに対するカルボニルあるいはイミンの付加によって、遷移金属部位を含む双性イオン(遷移金属含有1,3-双極子)が生成することを見出している。この活性種は、1,3-双極子とカルベン錯体の双方の性質を持つ新規化学種であり、この特徴を活かした分子設計によって多環性複素環を一挙に構築できる触媒反応を開発することが可能となった。前年度の検討では、ベンゼン環の隣接位にアルキン部位とカルボニル(またはイミン)部位を導入した反応基質に対して、ビニルエーテルの存在下で触媒量のW(CO)5(thf),またはPtCl2を作用させると、金属含有カルボニルイリド(またはアゾメチンイリド)が室温下で効率よく生成し、これがビニルエーテルと「3+2]付加環化反応を起こすことで含酸素(または窒素)多環性化合物が一段階で収率よく合成できることを明らかとした。本年度はこの反応をより有用性の高いヘテロ環骨格の簡便な構築手法へと発展させることを主目的として検討し、ベンゼン環をもたない鎖状の反応基質を用いても同様の金属含有イリドの生成とその付加環化反応が効率よく進行することを見いだした。さらにここで開発した新反応を利用して生理活性物質の全合成研究も展開した。この遷移金属含有1,3-双極子は、1,3-双極子とカルベン錯体の双方の性質を持つ新規化学種であり、この特徴を活かした分子設計によって多環性複素環を一挙に構築できる触媒反応の開発に成功した。たとえば、o-エチニルフェニルカルボニル化合物に対して、ビニルエーテルとEt_3SiHの共存下で触媒量のW(CO)_5(thf)を作用させると、室温で速やかに反応が進行し、含酸素多環性化合物が高収率かつ単一の立体異性体として得られる。この生成物は、系中で生じたタングステン含有カルボニルイリドが、まずビニルエーテルと[3+2]付加環化反応を起こして不安定型カルベン錯体中間体となった後、そのカルベン錯体部位がEt_3SiHへ挿入を起こすことで生成したものと考えられる。同様の反応はイミン誘導体を基質として用いても進行し、マイトマイシン等の基本骨格であるpyrrolo[1,2-a]indole誘導体を一挙に合成することができる。この反応では、上記と同様の機構で生じた金属含有アゾメチンイリドと電子豊富アルケンとの[3+2]付加環化反応によって不安定型カルベン錯体中間体が生成し、ここからカルベン炭素のα位置換基の1,2-移動が進行することで生成物を与えたと考えられる。本手法は幅広い基質に適用可能であり、様々に官能基化された三環性インドールを容易に合成することができる。
有限要素法を用いた顎矯正手術後の顎骨内応力解析による術後変化予測とその臨床応用

本研究は、手術を併用した矯正治療である外科的矯正治療における術後変化について生体力学的な見地から解明しようとするものである。治療前のCT画像から3次元顎骨モデルを作成し、有限要素法という工学的手法を用いて、咀嚼力が加わった際の術後の位置変化を予測した。その結果、実際の術後変化として起こる変化を再現することが可能であり、有限要素法による術後変化の予測は治療計画立案に有効であることが明らかとなった。顎矯正手術が適用される顎変形症例に対し、術後に予想される下顎骨内応力の変化を考慮した治療体系を確立することである。すなわち、顎変形症例の術前の顎顔面形態をもとに、顎矯正手術によって変化する咀嚼筋の作用に伴う下顎骨内応力を有限要素法により解析し、術後に生じた実際の変化と比較検討することで、術後変化を規定する生体力学的要因を検索する。具体的な本年度の研究実施計画は、対象症例(主に下顎後退術が施行された骨格性下顎前突症例)の初診時CTを用いて上下顎の術前三次元予測画像モデルを作成することであった。解析を行う選択症例については顎矯正手術の前に生体等価性を検討するために咬合圧計(当科所蔵)を用いて咬合力検査を行う必要があるため、現在、咬合力テストを行って顎矯正手術を施行予定の症例のCTデータを集めている段階である。選定症例のCTデータが得られ次第、次年度初頭から三次元画像モデルの作製を開始する事ができる。また、症例の選定を進めると同時に、本年度は実際の有限要素解析を行う際に必要な物性値の予備解析を行った。本研究の対象とする顎顔面領域には硬組織と軟組織が存在しており、このうち軟組織に関する物性値は結果として得られる顎骨内応力分布以外にも、特に変位量に大きく影響するため、慎重にそのパラメータを設定する事が必要である。特に、歯根膜の物性値に関しては、術後の咬合状態のシミュレートにも大きく関与する事から、実際に歯-歯根膜-歯槽骨モデルを作製し、有限要素解析を行った。その結果、本研究で予定している静解析においては歯根膜を線形材料として扱い、Young's modules 0.13MPa、Poisson's ratio 0.45という物性値を適用することで、妥当な生体等価性が得られた。このパラメータを次年度以降の本解析にも適用する予定である。本研究の目的は、顎矯正手術の適応となる顎変形症例に対し、術後に予想される下顎骨内応力の変化を考慮した治療体系を確立することである。すなわち、顎変形症例の術前の顎顔面形態をもとに、顎矯正手術によって変化する咀嚼筋の作用に伴う下顎骨内応力を有限要素法により解析し、手術後に生じた実際の変化と比較検討することで、術後変化を規定する因子を検索する。さらに、症例を重ねて顎態の特徴別に結果を蓄積し、術後変化を考慮した術前・術後矯正治療を体系化することである。本年度は、解析モデルの作成および本解析を行う予定であった。昨年度に実施した予備解析で得られた顎骨ー歯根膜モデルを踏まえ、CTデータから実際の本解析用モデルの作成を行った。歯槽部の非博な骨は、歯根形状から作成した歯根膜モデルをさらに外側へ拡大した領域として設定し、顎骨皮質骨を一体化することで作成が可能であった。解析モデルの作成は、最も時間的負担が大きい作業であり、かつモデルの精度は解析結果に大きく影響するものであるため、本年度の作業は当初の予定よりも時間がかかったものの、より精度の高い解析を行うためには必須であったと考えられた。また、本解析に必要な咀嚼筋の作用をシミュレートした荷重条件の設定を同時に進めている。咬合力データはすでに採得しているため、咬筋、側頭筋、内側翼突筋、外側翼突筋の各筋の比率を調整して、解析モデルの生体等価性は確保できる状況である。最終年度である本年は、昨年度に作成したモデルを用いて有限要素解析を行った。さらに、顎骨内応力分布と術後変化についての関連について検討を行い、術後変化予測とその予測を組み込んだ治療システムの構築を行った。本解析での結果、顎骨内応力と遠位骨片の変位を求めた結果、術後3ヶ月で起こるとされるadaptive rotationが観察された。特に、遠位骨片後方部で上方への変位が大きく、これは過去に我々が報告した術後変化と同じ傾向を示した。その一方で、その変位量については側面セファログラム上で得られた変化を完全に再現することは困難であることが明らかとなった。本研究によって、術前の状態から顎骨内応力分布とおおよその骨片の変化様相については予測することが可能であり、生体力学的な見地から術後変化の予測に関して、有限要素解析を治療計画の立案に応用することが有益であることが明らかとなった。

その一方で、現時点では完全な予測は困難であることから、今後も継続してより再現性の高い物性値の設定や接触条件の模索が不可欠であると考えられた。本研究は、手術を併用した矯正治療である外科的矯正治療における術後変化について生体力学的な見地から解明しようとするものである。治療前のCT画像から3次元顎骨モデルを作成し、有限要素法という工学的手法を用いて、咀嚼力が加わった際の術後の位置変化を予測した。その結果、実際の術後変化として起こる変化を再現することが可能であり、有限要素法による術後変化の予測は治療計画立案に有効であることが明らかとなった。本年度には本解析が完了し、解析結果の確認を開始できる予定であったが、解析モデルの作成と咀嚼筋の機能をシミュレートする荷重条件の設定が完了せず、本解析のデータ採得に至らなかった。歯科矯正学解析モデルを早期に完成させ、可及的速やかに本解析を開始する予定である。採得済みの咬合力データから生体等価性の確認は比較的容易に行えると予想しており、荷重条件が決定すれば、本解析完了まではスムーズに進めることができると考えている。初年度に行う予定であった内容は、症例の選定と三次元画像モデルの作製であった。対象症例の選択は咬合力テストを含めて現在も進行中であるが、CTデータから三次元画像モデルの作製を開始するには至らなかった。ただ、有限要素法による解析を確実に進めていくには、設定する物性値の検討を慎重に行うことや、予備解析で結果をある程度予測することが重要であるので、本年度は本解析で用いる予定の物性値の検討を行った事から、研究全体を通してみると遅延が発生しているとは考えておらず、次年度以降はスムーズに研究の遂行が可能である。本解析を行う予定で、ラトック社の3次元有限要素解析ソフトウェアTRI/BON-FEMのレンタル料の計上を本年度に行えなかったため。今後は、選定した対象症例のCTデータから三次元画像モデルを作製し、実際の本解析を進める予定である。本年度の予備解析で有限要素解析ソフトの使用方法についてもさらに習熟することができたため、次年度の間に本解析を完了する事が可能であると考えている。また、対象症例をさらに広げて解析データを蓄積する必要があるため、本解析を進めると同時に、症例選定の基準を広げて咬合力テストならびにCTデータの収集を継続して行っていく。次年度で本解析を行う予定があるため、本年度に未計上のソフトウェアレンタル料を次年度で計上することとし、研究期間全体での変更はない。初年度には本解析を行わず、予備解析を行い、かつその予備解析についてはソフトウェアベンダーの提供するトライアル期間で解析を完了できたため、実質的な解析料の計上が不要であったため。次年度以降は、本格的な解析を開始するため、研究計画書に記載した通り、ソフトウェアのレンタ料が発生するため、その費用に充てる予定である。
子宮内炎症がヒツジ胎仔の脳血流ならびに脳室周囲白質軟化発症に与える影響の解析

子宮内炎症がヒツジ胎仔の脳血流ならびに脳室周囲白質軟化の発症に与える影響を解析するために,妊娠104日にヒツジ胎仔を用いた慢性実験系を作成した.全例に妊娠106日からG-CSF 20μg/日を5日間静注し,妊娠108日にendotoxin 20mgを羊水内に注入した.妊娠109日に対象を以下の三群に分けて負荷実験を実施した.以下に各群の基礎データ(いずれも三群間の比較に有意差なし)および基本的な実験成績(1)(5)を示した.群名負荷内容胎仔体重(kg)循環血液量(ml)胎仔脳重(g)#脱血群:.循環血液量の40%を脱血(n=5) 1.94±0.12 252±33 32±2#貧血群:同量を保存血漿と交換輸血(n=5) 1.92±0.11 202±16 33±1#対照群:負荷なし(n=5) 1.97±0.18 219±20 31±1(1)G-CSF/endotoxin投与にて胎仔血中好中球数は著しく増加し(p<0.05),負荷実験の前値で三群間に有意な差はなかった(脱血群2.60±1.00×10^3/μl,貧血群1.49±0.39×10^3/μl,対照群1.35±0.41×10^3/μl).(2)Endotoxin投与後9時間から低酸素血症と同時に脳組織中Hb濃度の持続的増加が観察され(p<0.05),その程度において三群間に有意な差はなかった(脱血群7.9±1.8%,貧血群9.0±2.5%,対照群9.3±3.7%).(3)負荷実験によって脱血群(-15.1±2.7%)と貧血群(-13.6±5.2%)ではいずれも脳組織中Hb濃度の急激な減少が負荷後46時間まで持続し(p<0.05),その後は徐々に増加して負荷後24時間には前値レベルまで回復した.(4)妊娠114日の剖検において,すべての胎仔で壊死性の卵膜炎ならびに臍帯炎が観察されたが,その程度において三群間に有意な差はなかった.(5)脳室周囲白質軟化病変は脱血群(4/5例)と貧血群(4/5例)のみに観察され,対照群には認められなかった(p<0.05).上記の成績にもとづき,壊死性卵膜炎/臍帯炎が誘導されるような子宮内炎症の下では胎仔脳血流量が代償性に増加するが,出血性低血圧や貧血性低酸素によってこの代償反応が破綻させられた場合,高率に脳室周囲白質軟化が誘導される可能性が高いと結論できた.子宮内炎症がヒツジ胎仔の脳血流ならびに脳室周囲白質軟化の発症に与える影響を解析するために,妊娠104日にヒツジ胎仔を用いた慢性実験系を作成した.全例に妊娠106日からG-CSF 20μg/日を5日間静注し,妊娠108日にendotoxin 20mgを羊水内に注入した.妊娠109日に対象を以下の三群に分けて負荷実験を実施した.以下に各群の基礎データ(いずれも三群間の比較に有意差なし)および基本的な実験成績(1)(5)を示した.群名負荷内容胎仔体重(kg)循環血液量(ml)胎仔脳重(g)#脱血群:.循環血液量の40%を脱血(n=5) 1.94±0.12 252±33 32±2#貧血群:同量を保存血漿と交換輸血(n=5) 1.92±0.11 202±16 33±1#対照群:負荷なし(n=5) 1.97±0.18 219±20 31±1(1)G-CSF/endotoxin投与にて胎仔血中好中球数は著しく増加し(p<0.05),負荷実験の前値で三群間に有意な差はなかった(脱血群2.60±1.00×10^3/μl,貧血群1.49±0.39×10^3/μl,対照群1.35±0.41×10^3/μl).(2)Endotoxin投与後9時間から低酸素血症と同時に脳組織中Hb濃度の持続的増加が観察され(p<0.05),その程度において三群間に有意な差はなかった(脱血群7.9±1.8%,貧血群9.0±2.5%,対照群9.3±3.7%).(3)負荷実験によって脱血群(-15.1±2.7%)と貧血群(-13.6±5.2%)ではいずれも脳組織中Hb濃度の急激な減少が負荷後46時間まで持続し(p<0.05),その後は徐々に増加して負荷後24時間には前値レベルまで回復した.(4)妊娠114日の剖検において,すべての胎仔で壊死性の卵膜炎ならびに臍帯炎が観察されたが,その程度において三群間に有意な差はなかった.(5)脳室周囲白質

軟化病変は脱血群(4/5例)と貧血群(4/5例)のみに観察され,対照群には認められなかった(p<0.05).上記の成績にもとづき,壊死性卵膜炎/臍帯炎が誘導されるような子宮内炎症の下では胎仔脳血流量が代償性に増加するが,出血性低血圧や貧血性低酸素によってこの代償反応が破綻させられた場合,高率に脳室周囲白質軟化が誘導される可能性が高いと結論できた.今期の実験は東北大学医学部附属動物実験施設にて平成16年11月から平成17年5月までを予定している.現在,平成17年2月までに7回の実験を実施し,そのうち4回においてデータ解析が可能であった.失敗した3回の内,2回は点滴回路の破損によるもの,残りの1回は原因不明であった.データ解析が可能であった4例における実験成績は以下のとおりであった.ID群性別負荷脱血量体重脳重壊死性卵膜炎/臍帯炎PVL予備実験の結果(平成14年11-12月)に反して,G-CSF+LPSの前処置後に循環血液量の35-40%を脱血したにもかかわらずPVLを誘導できなかった.負荷実験日齢が予備実験より1日遅く(109日),体重,脳重,循環血液量のいずれもが予備実験の胎仔より大きいことから,負荷実験日齢を早めるべき(107-8日)と考えている.また,近赤外線分光法による胎仔脳血液量解析では予備実験と同様に,LPS羊水内注入によって卵膜/臍帯炎が誘導されたと同時に代償性脳血流増加が誘導され,その後の脱血負荷によってこれが破綻する現象が観察された,しかし,予備実験の脱血群に比較してやや弱い変動であった.本実験による胎生期PVLモデルではPVLを誘導しやすいtime windowが存在する.上記の成績より,負荷実験日齢を妊娠107-8日に早めることが安定した実験成績を得るために重要と考えられた.子宮内炎症がヒツジ胎仔の脳血流ならびに脳室周囲白質軟化の発症に与える影響を解析するために,妊娠104日にヒツジ胎仔を用いた慢性実験系を作成した.全例に妊娠106日からG-CSF20μg/日を5日間静注し,妊娠108日にendotoxin 20 mgを羊水内に注入した.妊娠109日に対象を以下の三群に分けて負荷実験を実施した.以下に各群の基礎データ(いずれも三群間の比較に有意差なし)および基本的な実験成績(1)(5)を示した.群名負荷内容胎仔体重(kg)循環血液量(ml)胎仔脳重(g)#脱血群:循環血液量の40%を脱血(n=5) 1.94±0.12 252±33 32±2#貧血群:同量を保存血漿と交換輸血(n=5) 1.92±0.11 202±16 33±1#対照群:負荷なし(n=5) 1.97±0.18 219±20 31±1(1)G-CSF/endotoxin投与にて胎仔血中好中球数は著しく増加し(p<0.05),負荷実験の前値で三群間に有意な差はなかった(脱血群2.60±1.00×10^3/μl,貧血群1.49±0.39×10^3/μl,対照群1.35±0.41×10^3/μl).(2)Endotoxin投与後9時間から低酸素血症と同時に脳組織中Hb濃度の持続的増加が観察され(p<0.05),その程度において三群間に有意な差はなかった(脱血群7.9±1.8%,貧血群9.0±2.5%,対照群9.3±3.7%).(3)負荷実験によって脱血群(-15.1±2.7%)と貧血群(-13.6±5.2%)ではいずれも脳組織中Hb濃度の急激な減少が負荷後46時間まで持続し(p<0.05),その後は徐々に増加して負荷後24時間には前値レベルまで回復した.(4)妊娠114日の剖検において,すべての胎仔で壊死性の卵膜炎ならびに臍帯炎が観察されたが,その程度において三群間に有意な差はなかった.(5)脳室周囲白質軟化病変は脱血群(4/5例)と貧血群(4/5例)のみに観察され,対照群には認められなかった(p<0.05).上記の成績にもとづき,壊死性卵膜炎/臍帯炎が誘導されるような子宮内炎症の下では胎仔脳血流量が代償性に増加するが,出血性低血圧や貧血性低酸素によってこの代償反応が破綻させられた場合,高率に脳室周囲白質軟化が誘導される可能性が高いと結論できた.
魚類における組み換えサイトカインを用いた細胞性免疫の誘導

IFNγは、抗ウイルス作用や抗腫瘍作用を有し、細胞傷害性T細胞やマクロファージの活性化に関わる主要なサイトカインとして知られている。ギンブナには4種類のIFNγ(IFNγ1, IFNγ2, IFNγrel1, IFNγrel2)が存在する。そこで、本年度は4種類の組換えIFNγ投与による好中球の活性化について検討した。その結果、IFNγrel2を除き組み換えIFNγの投与により好中球の貪食率を有意に上昇させることが明らかになった。また、いずれのIFNγによる刺激においても好中球の活性酸素産生能が有意に上昇することが判明した。IL-12には多くの機能を有することが報告されているが、マクロファージや抗原提示細胞より分泌され、Th1細胞の分化(細胞性免疫の誘導)に関わることが知られている。p35及びp40の2量体から構成されており、ギンブナには4種類のp40アイソフォーム(p40A、p40B、p40C1、p40C2)が存在する。本年度はHEK293細胞を用い4種類のp40のアイソフォームについて組み換え体の作製に成功した。そこで、4種類の組み換えIL-12(1種類のp35及び4種類のp40アイソフォームの組み合わせ)をリンパ球を含む腎臓白血球に加え、発現するサイトカイン遺伝子の発現解析を行った。その結果、p35とp40Aを共発現した場合にのみ、IFNγ1及びIFNγ2の有意な発現が認められた。なお、IFNγrel1及びIFNγrel2の発現には変化は認められなかった。また、4種類の組換えIFNγをマクロファージなどを含む腎臓白血球に加え、発現するサイトカイン遺伝子の発現解析を行った。その結果、IFNγ2を加えた群において、培養6時間後にp35及びp40C2遺伝子の有意な発現増加が認められた。比重勾配遠心法により分離した好中球に、ギンブナにおける4種類のIFNγ組み換え体を添加し、IFNγのアイソフォームの違いによる好中球の貪食能及び活性酸素産生能に及ぼす影響を明らかにした。また、HEK293細胞を用いてp35とp40の2種類の分子を共発現させ、4種類のp40のアイソフォームすべてについて組み換え体の作製に成功した。これらの4種類のIL-12組み換え体を腎臓白血球に添加したところ、p35とp40Aを共発現した場合にのみIFNγ1及びIFNγ2の有意な発現を誘導することを明らかにした。このことから、作製したIL-12の組み換え体は機能的でありリンパ球を含む白血球よりIFNγの産生を誘導することが示された。また、IFNγが好中球の活性化に影響を及ぼすとともに、腎臓白血球におけるIL-12の産生を誘導することを明らかにした。以上より、組み換えIL-12の添加によるCD4陽性ヘルパーT細胞のTh1細胞への分化あるいは組み換えIFNγの添加によるCD8陽性細胞障害性T細胞の活性化について検討する準備がほぼ整い、当初の目的を達成した。IFNγ及びIL-12について、好中球あるいは腎臓白血球レベルでの活性化の影響を明らかにした。今後は、免疫磁気法によりCD4陽性ヘルパーT細胞及びCD8陽性細胞障害性T細胞を分取し、これらT細胞の活性化・分化に及ぼすIFNγ及びIL-12の影響について解析する必要がある。そこで、下記の研究を進める。1)組み換えIL-12を用いたTh1細胞の分化(細胞性免疫の誘導)の検討:免疫磁気法により分取したCD4陽性ヘルパーT細胞に、組み換えIL-12(p35, p40の2量体)を添加し、フローサイトメトリー法により、ヘルパーT細胞の細胞内にIFNγが産生されるかどうかを確認する。2) 4種類のIFNγアイソフォームのCD8陽性細胞障害性(キラー)T細胞の活性化に及ぼす影響解析:免疫磁気法により分取したCD8陽性細胞障害性T細胞に、ギンブナにおける4種類のIFNγの組み換え体を添加し、T細胞の活性化について検討する。平成27年度は、細胞性免疫において重要なサイトカインであるインターフェロンγ(IFNγ)及びインターロイキン12(IL-12)の組み換え体及び抗体の作製法、並びに免疫磁気法によるT細胞サブセットの分離法を修得することを目的とした。1.ギンブナには哺乳類と相同なIFNγに加えて、魚類特有のIFNγ(IFNγrel)が存在する。しかも、コイ科魚類にはIFNγ及びIFNγrelには2種類のアイソファームが存在し、併せて4種類のIFNγ(IFNγ1, IFNγ2, IFNγrel1, IFNγrel2)が存在する。既に滞在している研究室において、これらの4種類のIFNγについて組み換え体及び抗体が作製されており、共同研究者の指導の下に、組み換え体の作製法及び抗体の精製法を修得した。2.IL-12は、p35及びp40の2量体から構成されている。しかも、p40には4種類のアイソフォーム(p40A, p40B, p40C1, p40C2)が存在する。そこで、先ず、p40より4種類のアイソフォーム遺伝子を単離し、p35及びp40の4種類のアイソフォーム遺伝子をHela細胞に共発現させることに成功した。しかし、p40Bの発現が弱く、p35及びp40の2量体形成についてはまだ確認できていない。

3.免疫磁気法によるT細胞サブセット分離の予備実験として、モノクローナル抗体を用いた免疫染色によるCD4陽性ヘルパーT細胞及びCD8陽性細胞障害性T細胞の解析法を修得した。IFNγの組み換え体の作製法及び抗体の精製法並びにモノクローナル抗体を用いた免疫染色を修得した。また、p40の4種類のアイソフォーム遺伝子をギンブナより単離するとともに、これらのアイソフォーム及びp35遺伝子をHela細胞に発現させることに成功した。IFNγは、抗ウイルス作用や抗腫瘍作用を有し、細胞傷害性T細胞やマクロファージの活性化に関わる主要なサイトカインとして知られている。ギンブナには4種類のIFNγ(IFNγ1, IFNγ2, IFNγrel1, IFNγrel2)が存在する。そこで、本年度は4種類の組換えIFNγ投与による好中球の活性化について検討した。その結果、IFNγrel2を除き組み換えIFNγの投与により好中球の貪食率を有意に上昇させることが明らかになった。また、いずれのIFNγによる刺激においても好中球の活性酸素産生能が有意に上昇することが判明した。IL-12には多くの機能を有することが報告されているが、マクロファージや抗原提示細胞より分泌され、Th1細胞の分化(細胞性免疫の誘導)に関わることが知られている。p35及びp40の2量体から構成されており、ギンブナには4種類のp40アイソフォーム(p40A、p40B、p40C1、p40C2)が存在する。本年度はHEK293細胞を用い4種類のp40のアイソフォームについて組み換え体の作製に成功した。そこで、4種類の組み換えIL-12(1種類のp35及び4種類のp40アイソフォームの組み合わせ)をリンパ球を含む腎臓白血球に加え、発現するサイトカイン遺伝子の発現解析を行った。その結果、p35とp40Aを共発現した場合にのみ、IFNγ1及びIFNγ2の有意な発現が認められた。なお、IFNγrel1及びIFNγrel2の発現には変化は認められなかった。また、4種類の組換えIFNγをマクロファージなどを含む腎臓白血球に加え、発現するサイトカイン遺伝子の発現解析を行った。その結果、IFNγ2を加えた群において、培養6時間後にp35及びp40C2遺伝子の有意な発現増加が認められた。比重勾配遠心法により分離した好中球に、ギンブナにおける4種類のIFNγ組み換え体を添加し、IFNγのアイソフォームの違いによる好中球の貪食能及び活性酸素産生能に及ぼす影響を明らかにした。また、HEK293細胞を用いてp35とp40の2種類の分子を共発現させ、4種類のp40のアイソフォームすべてについて組み換え体の作製に成功した。これらの4種類のIL-12組み換え体を腎臓白血球に添加したところ、p35とp40Aを共発現した場合にのみIFNγ1及びIFNγ2の有意な発現を誘導することを明らかにした。このことから、作製したIL-12の組み換え体は機能的でありリンパ球を含む白血球よりIFNγの産生を誘導することが示された。また、IFNγが好中球の活性化に影響を及ぼすとともに、腎臓白血球におけるIL-12の産生を誘導することを明らかにした。以上より、組み換えIL-12の添加によるCD4陽性ヘルパーT細胞のTh1細胞への分化あるいは組み換えIFNγの添加によるCD8陽性細胞障害性T細胞の活性化について検討する準備がほぼ整い、当初の目的を達成した。