hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
QX-314の脊髄後角ニューロンに対する作用と毒性に関する解析

その理由は、反応に乏しいと思われた正常ラットでも、ある程度の反応が得られたためである。すなわち、正常ラットで一通りの結果をまとめてからモデルラットでの実験を行う方針としたたためであるから、遅延ではない。今後の方針として、3つの点を挙げる。1脊髄横断スライスから得られたデータの解釈:データ収集は行ってきたものの、一部のデータに関しては、詳細な解析に至っていない。例えば、誘発性興奮性シナプス後電流に関しては、薬理作用なのか、記録上の問題なのかを客観的には判断できていない状況である。これらを統合して、QX-314の脊髄スライスに対する作用を明らかにする。2in vivo標本からの記録:25年度に細胞外記録によって得られたデータを、in vivoパッチクランプ記録によって検証する。25年度中に行った実験よりも、技術的な困難が予想されるが、研究室内で同様の実験を行う研究者に助言と協力を仰ぐ予定である。3神経障害性疼痛モデルラットからの記録:正常ラットで得られたデータとモデルラットで得られたデータを比較する。モデルラットのほうがQX-314に対してより強い反応を示すことが想定される。もし2が遅延した場合、3の実験に到達できない可能性もある。その場合、正常ラットでのデータをまとめるため、2を優先する方針である。残金は実験に必要な手術器械や電極ホルダーなどを購入するには少なかった。それゆえ電極用の微細ガラス管などの消耗品を購入し残金をなくす予定であったが、年度末時点でストックが多く、保管場所もなかった。よって、次年度に繰り越して使用するほうが有益に活用できると判断し、その方針とした。研究テーマであるQX-314という薬剤は、本研究においては高濃度で灌流投与するため、消耗が早い。当該年度末には残薬があったものの、数回の実験で使い切ると予想される。QX-314は比較的高額であるため、繰り越した52,980円は、主に翌年度のQX-314購入費用に充当する予定である。翌年度分として請求した助成金に比して、繰越金額は小さいため、合算して特別な器材などを買う予定はない。翌年度分の予算に関しては、応募した際の目的の通りに使用する。
中咽頭癌におけるマイクロＲＮＡ解析による新規バイオマーカーの探索

中咽頭癌71例中23例(32%)がHPV陽性であった。本研究により一部の中咽頭癌の発症にHPV感染が関与していることが明らかとなった。HPV陽性中咽頭癌の治療成績に関する検討ではHPV陽性例の方が陰性例に比べ生存率は良好であった。HPV感染とp16発現の関与に関する検討では、p16陽性例の方が有意に生存率は良好であったが、HPV陰性p16陽性例の予後はHPV陰性p16陰性例と同様に不良であり、p16の発現がHPV感染の完全なsurrogate markerとはなり難いことを明らかにした。中咽頭癌治療前標本を用いてマイクロRNAプロファイルの解析を行い、手術治癒群ー再発群、放射線治療治癒群ー再発群、化学療法治癒群ー再発群でのマイクロRNA発現パターンと臨床病理学的因子との関連を検討し、実際の中咽頭癌症例においてその発現パターンが予後予測に有用であるか解析中である。特定のマイクロRNA発現プロファイルにより発現調節を受ける可能性のある遺伝子発現をmRNAレベルまたはタンパク質レベルで検討をおこない、予後、放射線感受性、化学療法感受性を決定する新規因子の同定を試みた。結果としては、中咽頭癌症例におけるHPV感染と予後の関係を示した論文が英文誌International Journal of Oncology電子版に掲載された。本論文は日本人症例において初めての報告である。また女性喉頭癌とHPV感染の関与について検討を行い第8回世界頭頸部癌学会において報告した。さらに中咽頭癌症例において転移リンパ節を予後との関連を第25回日本口腔咽頭科学会において報告し、同学会誌に受理された。本研究はFFPE組織からのマイクロRNA解析が可能となったため、過去の症例からのレトロスペクティブに大規模な解析が可能となっている。マイクロRNA解析には商業ベースで行われているマイクロRNA解析用マイクロアレイを用いたので再現性の高いデータを得ることができた。基礎的・臨床的検討をさらにおこない、治療効果、予後予測に関わる新規因子の同定を引き続きおこなう予定である。本研究では、1中咽頭癌症例におけるHPV感染の関与について、2HPV陽性中咽頭癌の治療成績、特に化学放射線療法の治療成績について、3中咽頭癌症例におけるHPV感染とp16発現の関与に関する検討を行った。中咽頭癌症例におけるHPV感染の関与を明らかにするために、当科で加療を行った中咽頭癌症例71例を対象にmultiplex-PCR法を用いてHPV感染の検出を行った。中咽頭癌71例中23例(32%)がHPV陽性であったが、対照群として正常扁桃78例および下咽頭癌41例は全例HPV陰性であった。本研究により日本人中咽頭癌症例におけるHPV陽性率は欧米に比べると高くはないものの、一部の中咽頭癌の発症にHPV感染が関与していることが明らかとなった。化学放射線療法施行症例においても同様の結果となり、これらの結果は欧米での報告と一致していた。上記について国内外の学会で報告し、英文誌International Journal Clinical Oncologyおよび国内誌である頭頸部癌において報告した。中咽頭癌症例91例を対象に行ったHPV感染とp16発現の関与に関する検討では、HPV陽性であった29例中24例(83%)がp16陽性で、HPV陰性であった62例中7例(11%)がp16陽性であった。p16陽性例の方が有意に生存率は良好であったが、HPV陰性p16陽性例の予後はHPV陰性p16陰性例と同様に不良であったことからp16の発現がHPV感染の完全なsurrogate markerとはなり難いことを明らかにした。上記について国内外の学会で報告し、国内誌である頭頸部癌において報告した。これらの研究内容は日本人症例においての報告はこれまで存在せず、本研究によって日本人症例における頭頸部癌とHPVとの関連について臨床的および分子生物学的アプローチにより明らかとなった。平成23年度はHPV陽性中咽頭癌の臨床像をまとめ、研究成果を報告した。HPV陽性中咽頭癌は陰性例に比べて放射線治療や化学療法の感受性が良好であるとされているが、HPV陽性であっても放射線治療や化学療法に対して再発する症例もあることを報告した。欧米ではHPV陽性中咽頭癌は予後が良好なので治療強度を下げる、"less intensive therapy"を行う方向にあるが、欧米の症例と日本人の症例では臨床像が異なる場合もあり、現時点で日本人のHPV陽性中咽頭癌に対して"less intensive therapy"を行うのは時期早尚であることを第35回日本頭頸部癌学会および第24回日本口腔・咽頭科学会にて報告し、その内容について学会誌「頭頸部癌」に投稿した。

予後が良好であるとされているHPV陽性中咽頭癌のなかにも予後不良例が存在することから、治療開始前の評価にてこれらをスクリーニングできれば、予後良好例には治療強度を下げ副作用の軽減をはかることができ、予後不良例には治療強度を高めるという個別化治療を行うことが可能となる。そのためには予後を左右する分子生物学的マーカーの探索が求められる。そこで、HPV陽性/陰性細胞株間での遺伝子発現の差異を検討しHPV陽性癌に特異的に感受性を持つ薬剤を検索を行った。cDNAマイクロアレイにてHPV陽性株/陰性株間における遺伝子発現の比較を比較しConnecting MapにてHPV陽性癌に特異的に作用する薬剤を検索したところHSP90阻害薬であるgeldanamycinが挙げられた。HPV陽性、陰性細胞株をgeldanamycinで処理したところ、HPV陽性細胞株の方がgeldanamycinの感受性が良好であった。したがってHSP90阻害薬がHPV陽性細胞株に対する新たな戦略的薬剤となり得る可能性が示唆された。中咽頭癌症例におけるHPV感染との関与を英文誌に掲載され、さらにHPV感染以外の予後因子についての報告も行うことができたため。臨床の面ではHPV陽性中咽頭癌の臨床像をまとめ、基礎的にはHPV陽性/陰性細胞株間での遺伝子発現の差異を検討しHSP90阻害薬がHPV陽性細胞株に対する新たな戦略的薬剤となり得る可能性を見い出すことができ、おおむね順調に進展していると考えられる。中咽頭癌症例における治療効果と予後因子との関連について検討を行う。今後は中咽頭癌の個別化治療を行うことができるように分子生物学的手法を用いて解析を進めてゆく。上記の研究成果について学会発表を行い論文投稿を行う。引き続き中咽頭癌組織を用いたマイクロRNA発現プロファイルの解析、シスプラチン感受性ー耐性細胞間のマイクロRNA発現差異の解析およびドセタキセル感受性ー耐性細胞間のマイクロRNA発現差異の解析を行う。得られた結果を基に、中咽頭癌症例の治療効果、再発予測に関わるマイクロRNA発現パターンの検討および新規バイオマーカーの同定を行う。具体的には(1)中咽頭癌治療前標本を用いてマイクロRNAプロファイルの解析(2)前記にて行った手術治癒群ー再発群、放射線治療治癒群ー再発群、化学療法治癒群ー再発群でのマイクロRNA発現パターンと臨床病理学的因子との関連を検討することにより、実際の中咽頭癌症例においてその発現パターンが予後予測に有用であるか明らかにする。(3)特定のマイクロRNA発現プロファイルにより発現調節を受ける可能性のある遺伝子発現をmRNAレベルまたはタンパク質レベルで検討し、予後、放射線感受性、化学療法感受性を決定する新規因子の同定を試みる。マイクロRNA用逆転写プライマーセット、PCR試薬の購入や国内海外において当該研究についての情報収集、成果発表をおこなう。23年度は当初の予定より消耗品の使用が少なく済んだため未使用額が生じたが、引き続きおこなう解析処理に必要な専用ソフトや、試薬を購入予定である。
新規コラーゲン架橋剤の角膜への架橋効果および円錐角膜治療への応用

我々の開発した新規コラーゲン架橋剤のプロトタイプについては、コラーゲン溶液との撹拌にょってコラーゲン溶液がゲル化され架橋されていることをすでに確認していたが、本年度は、さらにこまかな条件を検討し、繊維性のコラーゲンのみを選択的に架橋し、他のタンパク質などはゲル化しないという、繊維性コラーゲシに対する特異性が高いことを明らかにした。さらに数日間は安定して架橋されていることも分かった。また走査型電子顕微鏡(SEM)にて、コラーゲン線維と架橋剤を混合したあとのゲルを解析すると、コラーゲン線維と架橋剤のネットワーク構造が明らかにすることができた。これらのことは、この架橋剤が繊維性コラーゲンのみを選択的に架橋できることを意味しており、点眼剤としての臨床応用を考えたときに、毒性が少なく角膜の強度を増加させることが可能であり、円錐角膜の治療に対して非常に臨床応用できる可能性が高いことを意味し、大いに期待される。また、実際の角膜に対する効果として、本年度は家兎角膜の引っ張りおよび圧縮による強度測定を行って、家兎の週齢による角膜強度のデータを収集する予定としていたが、大量の家兎を使用することが困難であったため、市販の家兎眼球より作製した角膜ボタンを使用して、新規架橋剤に浸漬することによって架橋を行い、突き刺し試験による強度測定を行った。その結果、架橋することによって正常角膜に比して、有意に強度が増加することが分かった。実際の角膜組織に対しても効果があることが分かり、成体角膜実質組織などのプロテオグリカンや角膜実質細胞など、コラーゲン以外の成分が混在する組織においても、本架橋剤の効果が認められた。実際の成体角膜にも効果があることがわかり、今後もさらなる検討を続けていく。
Dependence receptor UNC5H4経路による神経芽腫細胞死解析

ヒト神経芽腫cDNAライブラリーから予後良好群と予後不良群の間で発現に差の認められる遺伝子を大量に同定したところ、予後良好群において発現の高い遺伝子として依存性受容体UNC5H4が同定された。そこでUNC5H4の機能解析を行ったところ、UNC5H4はp53の標的遺伝子でありアポトーシス誘導能を持つことが判った。また、そのアポトーシス誘導能は、UNC5ファミリーのリガンドであるnetrin-1によって抑制されることが明らかとなった。従って、UNC5H4は神経芽腫の細胞死において重要な役割を果たすことが示唆された。これまでヒト神経芽腫cDNAライブラリーから予後良好群と予後不良群の間で発現に差の認められる遺伝子を大量に同定してきた。その中で予後良好群において発現の高い遺伝子としてUNC5Hファミリーの新規遺伝子UNC5H4(UNC5D)(Dependence receptor)が同定された。この遺伝子は、神経芽腫の細胞死に関係した遺伝子である可能性は非常に高いが、その機能は未だに明らかではない。そこで、神経芽腫の細胞死におけるUNC5H4の機能解析を行うことを目的とした。神経芽腫の予後良好群および予後不良群においてUNC5H4の発現を検討したところ、予後良好群でUNC5H4の発現は高いことが判った。108症例の神経芽腫を対象にUNC5H4の発現を解析した結果、UNC5H4の高発現と良好な予後との相関が認められた。U20S(p53野生型)ならびにH1299(p53変異型)にアドリアマイシンを処理し、UNC5H4の発現解析を行った。UNC5H4の発現は、U20Sでは、アドリアマイシン処理によって増加したが、H1299では変化は認められなかった。U20SにUNC5H4 siRNAをトランスフェクトし、アドリアマイシン処理によってアポトーシスが抑制されるか検討を行った。その結果、Control siRNA群のsub GO/G1に比べ、UNC5H4 siRNA群のSub GO/G1の比率は、減少していることが判った。すなわち、UNC5H4 siRNAによりアポトーシス誘導が抑制されることが示唆された。SY5Y (p53野生型)およびSK-N-AS(p53変異型)にUNC5H4を過剰発現させ、colony formationassayを行った。その結果、SH-SY5Yでは細胞増殖は抑制されたが、SK-N-ASでは、細胞の増殖抑制は認められなかった。UNC5H4の細胞死誘導はp53と関与している可能性が示唆された。昨年度の結果から依存性受容体UNC5H4は神経芽腫の予後良好群で発現が有意に高く、その高発現と良好な予後との相関が認められた。さらに、UNC5H4はがん抑制遺伝子p53と関連し、アポトーシス誘導能を持つことが判った。つまり、UNC5H4は神経芽腫の細胞死において重要な役割を果たすことが示唆された。今年度はこれまでの研究結果を踏まえ、神経芽腫の細胞死における依存性受容体UNC5H4の機能をさらに検討することを目的とした。神経芽腫細胞株SH-SY5YおよびSK-N-BEにUNC5H4を過剰発現させ、アポトーシス誘導能を検討するためTUNNELアッセイ法を行った。その結果、ベクターをトランスフェクトしたコントロール群に比べ、UNC5H4を過剰発現させた群ではTUNNEL染色陽性細胞が著しく上昇していることが判った。すなわち、UNC5H4の過剰発現が神経芽腫細胞にアポトーシス誘導を引き起こしたことが示唆された。さらに、UNC5H4を過剰発現させたSK-N-BEを用いて、細胞増殖能を検討したところ、UNC5H4過剰発現群では細胞の増殖が抑制されていることが明らかになった。また、SH-SY5Y細胞にUNC5H4を過剰発現させるとカスペース3が活性化されUNC5H4の切断断片が検出された。UNC5H4はリガンド依存性受容体であることから、手術によって摘出された神経芽腫から調整した細胞を用いて以下のアッセイを行った。調整した細胞にUNC5ファミリーのリガンドであるnetrin-1を添加した条件のもと、神経成長因子NGFを加えた後、NGFを除去することによってアポトーシス誘導能を検討した。その結果、でnetrin-1未添加に比べ、netrin-1添加条件下では、アポトーシスの誘導が減少していることが判った。従って、UNC5H4の細胞死誘導はnetrin-1により制御される可能性が示唆された。
EGF発現亢進に着目したPG-F2α製剤の新しい角膜上皮障害機序解明と予防戦略

抗緑内障点眼薬であるプロスタグランジンF2α(PG-F2α)製剤による副作用として薬剤性角膜上皮障害が知られているが、防腐剤である塩化ベンザルコニウムの作用が挙げられるが主薬の影響について検討する必要があると考える。予備実験でおしなべてPG-F2α製剤主薬は培養角膜上皮細胞のEGF発現と増殖、遊走を促進した。特にトラボプロストで顕著であった。これらの作用は角膜上皮細胞の恒常性を破綻させている可能性があり、薬剤性角膜上皮障害発症の新しいメカニズムの可能性と治療戦略が提唱できると考える。今回の実験にはトラボプロストを用いたところ、トラボプロストにはin vitro(角膜上皮培養細胞)で増殖亢進作用、マウス角膜におけるex vivoで増殖(ki 67, β-catenin, ERK)の亢進作用と細胞間接着因子(zo-1, E-cadherin)の脆弱化を免疫染色化学法、rea1-time RT-PCR、ウェスタンブロット法で確認した。実験結果より、増殖亢進作用と細胞間接着因子の脆弱化にPG-F2α受容体を介した経路とPG-F2αによって活性化されたEGF受容体を介した経路の2つの経路が関与している可能性が示唆された。次に、トラボプロストによって発現亢進していたEGFの受容体阻害薬(PD168393)を併用することでトラボプロストによるin vitroおよびex vivoでの増殖亢進作用と細胞間接着因子の脆弱化は抑制された。このことからPG-F2α主薬による角膜上皮の増殖亢進作用と細胞間接着の脆弱化は主にEGF受容体を介した経路の関与しており、EGF受容体を制御することでPG-F2α製剤による薬剤性角膜上皮障害を予防できる可能性が示唆された。
焼却施設の労働者におけるダイオキシン類曝露状況調査の効率的戦略を確立する

この研究の目的は、焼却施設の梁などに堆積している粉塵中のダイオキシン類濃度と労働者の血中ダイオキシン類濃度の関係を明らかにすることにより、堆積粉塵中ダイオキシン類濃度を用いて健康調査(血中ダイオキシン類濃度測定)実施の必要性を判断する手法を確立することである。このため、焼却施設13ヵ所において、職員の血清中ダイオキシン類濃度と堆積粉塵中ダイオキシン類濃度を測定し、曝露指標と血清中濃度の関係を検討した。その結果、以下のことがわかった。(1)堆積粉塵中ダイオキシン類濃度は0.5433ngTEQ/gと一般土壌の1000倍のレベルであり、職員の勤務中のダイオキシン類曝露が懸念された。(2)焼却施設13ヵ所中10ヵ所で、職員の血清中七塩化ジベンゾフランが一般人よりも有意に高くなっており、堆積粉塵中の同族体パターンから考えて、勤務中の取り込みに起因すると考えられた。また、一部の施設では血清中六塩化ジベンゾフランが一般人よりも有意に高くなっており、やはり勤務中の取り込みに起因すると考えられた。(3)曝露指標と血清中ダイオキシン類濃度の関係の検討では、1施設(調査の前年に大規模な改造工事を実施)除けば、七塩化ジベンゾフランおよびジベンゾフラン毒性等量で正の相関が見られた。したがって、焼却施設の堆積粉塵中ダイオキシン類濃度を測定し、曝露指標を算出すれば、職員の血中ダイオキシン類濃度測定を含む健康調査を実施することが必要か、否かの判断がある程度可能と言える。ただし、大規模な改造工事などにより、堆積粉塵の質が変化した場合には、このような方法は誤った方針を示すことになる。この研究の目的は、焼却施設の梁などに堆積している粉塵中のダイオキシン類濃度と労働者の血中ダイオキシン類濃度の関係を明らかにすることにより、堆積粉塵中ダイオキシン類濃度を用いてダイオキシン類曝露状況調査(血中ダイオキシン類濃度測定)を実施する必要性を判断する手法を確立することである。今年度は、既に血中ダイオキシン類濃度の測定を実施していた焼却施設5ヶ所において、堆積粉塵を採取しダイオキシン類濃度を測定した。また、新たに焼却施設2ヶ所において、堆積粉塵中ダイオキシン類濃度および血中ダイオキシン類を測定した。血中ダイオキシン類濃度は16-196PgTEQ/g脂肪であり、ほとんどの労働者は一般人の範囲に入っていたが、一部の労働者では一般人の範囲を超えていた。各物質ごとに見ると、六塩化および七塩化ジベンゾフランが一般人より高くなっていた。堆積粉塵中ダイオキシン類濃度は0.91-43ngTEQ/gであり、一般土壌の100-1000倍のレベルであった。2,3,7,8-体パターンを見ると、七塩化および八塩化ダイオキシン、そして七塩化および八塩化ジベンゾフランが高かった。堆積粉塵中ダイオキシン類濃度と血中ダイオキシン類濃度の関係を見ると、毒性等量では相関は見られなかったが、六塩化および七塩化ジベンゾフランでは正の相関が見られた。来年度、新たに焼却施設3ヶ所において同様の調査を実施し、さらにデータを増やせば、堆積粉塵中ダイオキシン類濃度を用いてダイオキシン類曝露状況調査の必要性を判断する手法を確立できる可能性が高い。

昨年度は、既に血中ダイオキシン類濃度の測定を実施していた焼却施設5ヶ所において、堆積粉塵を採取しダイオキシン類濃度を測定するとともに、新たに焼却施設2ヶ所において、堆積粉塵中ダイオキシン類濃度および血中ダイオキシン類を測定した。今年度は、さらに焼却施設5ヶ所において、堆積粉塵中ダイオキシン類濃度および血中ダイオキシン類を測定した。血中ダイオキシン類濃度は16-196pgTEQ/g脂肪であり、ほとんどの労働者は一般人の範囲に入っていたが、一部の労働者では一般人の範囲を超えていた。各物質ごとに見ると、六塩化および七塩化ジベンゾフランが一般人より高くなっていた。堆積粉塵中ダイオキシン類濃度は0.91-43ngTEQ/gであり、一般土壌の100-1000倍のレベルであった。2,3,7,8-体パターンを見ると、七塩化および八塩化ダイオキシン、そして七塩化および八塩化ジベンゾフランが高かった。堆積粉塵中ダイオキシン類濃度と血中ダイオキシン類濃度の関係を見ると、毒性等量では相関は見られなかったが、六塩化および七塩化ジベンゾフランでは正の相関が見られた。
ネオ・サイエンスとしての天文人類学：人類学者が作るプラネタリウム・コンテンツ

本研究においては、日本国内の琉球列島の太陽信仰、西日本の降星伝説を中心に調査を行った。海外ではオセアニアおよび中米の資料を遺跡の踏査によって行うことによって、人類集団が従来もっていた天体に関する知識を改めて「ネオ・サイエンス」として捉え直す試みを行った。また本科研の成果は移動式プラネタリウムを使ったイベント「星空人類学」にて、ポリネシアや中南米先住民の星座にまつわる生活の知恵や神話などをプラネタリムの中で投影し市民に紹介した。このようにして本科研は学術的な資料の収集、国内外での学術成果の発表、さらに一般市民への還元という形で、新しい民俗科学のあり方を実践した。本研究では研究代表者は天文民俗の人類学的な再検討を目標に、沖縄本島、山口県下松市および岡山県美星町、台湾のアミ族、ハワイなどに調査旅行を敢行し、島嶼部・海岸部において方位確認、天候予測や季節告知のために太陽や星辰がどのように利用されてきたかを探った。また上記の地域におけるグスクや古墳のような遺跡、また御嶽(沖縄)や神社仏閣のような宗教施設において天体に関する信仰がどのように伝承、記録あるいは物証化されているかを調査してきた。それらの成果を含めて26年11月には南山大学にて「星空人類学2014」を挙行、人類学的プラネタリウム番組の試作品を一般社会に向け実施し、好評を得た。なおプラネタリウムは研究協力者の協力をえて五藤光学研究所から借用した。26年7月、南アフリカケープタウンの南アフリカ天文台において行われた国際考古天文学・考古民族学(通称Oxford 10)に参加して琉球列島の王権と太陽信仰の関係について発表した。さらに12月台湾の台東で行われた太平洋誌会議において、研究代表者らが関わった沖縄海洋博公園内海洋文化館のリニューアル展示における、スターナビゲーションについて発表し、また同館付設のプラネタリウムにおいて研究代表者らが監修した「星に導かれて」という天文人類学的プログラムを国際発信した。天文の人類学的研究に関しては文化人類学の学会誌『文化人類学』、『東南アジア考古学』、『南方文化』、『南山考人』などに関連論文を投稿してきた。またケープタウン学会での発表は現在英文論文として投稿済み、現在査読中である。プラネタリウムのコンテンツを開拓するための国内調査は夏至および冬至期に沖縄で行った。夏至には沖縄本島の玉城城の城門に夏至の太陽が昇り、冬至には浦添城から久高島の背後から太陽が登る事実を確認し写真撮影を行った。また海外調査では2月にグアムでミクロネシアのカヌー復興グループから天体を使った航海術に関する情報を得たほか、3月には考古天文学の本場、メキシコにおいてテオティワカン、アステカおよびマヤの遺跡を巡って天体と古代遺跡との関係を探った。これらの情報は最終年度のプラネタリウムイベントにおいて、画像の投影や関係する考古資料(レプリカ)の展示などとして活用する予定である。天文人類学関係の論文は日本語で3本、また英語で1本(査読中)を書くことが出来た。さらに11月には勤務校にて移動型プラネタリウムを借用し「星空人類学2015」を開催、研究成果を市民に還元する活動を実施した。2015年度は計画通り、市民対象の人類学的プラネタリウム・プログラムを実施した。使用したデジタル式プラネタリウムに自らが撮影した遺跡の画像も使用し、考古学・民族学展示と融合させるなどを実現した。この種の研究を行っているということで6月には沖縄南城市の夏至祭り、2016年1月には総合地球環境研究所の東京セミナー、2月には国立民族学博物館の共同研究会「宇宙人類学への文化人類学的接近」にて天文人類学の講演を依頼された。また国立天文台から天文学者(研究協力者の吉田二美氏を含む)と考古学者を招き、勤務校の人類学研究所では「天文学と人類学の融合」という公開講演会も実施した。さらに8月にはハワイ州ハワイ島ヒロ市にある、イミロア天文センターにて日本の星民俗に関する1時間の講演を依頼されて実施するなど、海外でも天文人類学のプラネタリウムにおける実践活動ができたことは予想以上の成果であった。その内容については現在、英文論文を投稿中である(本助成金への謝辞記載あり)。本年度の調査としては2016年6月に沖縄の久米島の太陽石にて夏至の日の出の調査を行った。水平線に雲があり直接は実見できなかったが、従来言われているように、粟国島の背後から夏至の太陽が登ることはほぼ確認できた。しかし冬至の太陽が登ると言われてきた久場島であるが、現在、植物が繁茂して、実際は確認できないであろうことがわかった。2016年11月には北海道の日高地方と胆振地方の調査を行った。アイヌ民族文化の中心地である二風谷遺跡、および埋葬遺跡が特定の方位を向いていることで有名な静内町の御殿山遺跡などを踏査し、周辺の地形と方位を確認し、写真撮影を行った。さらに二風谷のアイヌ資料館や静内町の博物館を訪問し情報を集めた。また白老のアイヌ民族博物館を訪問し、アイヌ文化の情報を集め、伝統家屋チセの構造や方位などを確認した。さらに2016年12月には東京三鷹の国立天文台にて成果の報告会および意見交換を行った。後藤はこの科研で調査を行ってきた西日本の降星伝説について報告した。また角南は仏教民俗と星の文化について報告を行った。さらに石村と大西はキリバス諸島の景観分析について、またゲストの日本航海訓練所の奥智樹は専門の立場から星の航海術の経験について報告、天文台の吉田およびゲストの高田裕行らと意見交換を行った。

海外調査では2016年12月にハワイのカエナ岬(死者の魂が旅立つ場所と言われる岬)にて冬至の太陽の没入について観察した。なお成果の社会還元として11月には南山大学にて「星空人類学2016」を挙行し、従来のアラスカ、ポリネシアおよびインカの星空に加えて、科研の成果である琉球列島および北海道アイヌ民族の星座についてコンテンツを加えることができた。本研究においては、日本国内の琉球列島の太陽信仰、西日本の降星伝説を中心に調査を行った。海外ではオセアニアおよび中米の資料を遺跡の踏査によって行うことによって、人類集団が従来もっていた天体に関する知識を改めて「ネオ・サイエンス」として捉え直す試みを行った。また本科研の成果は移動式プラネタリウムを使ったイベント「星空人類学」にて、ポリネシアや中南米先住民の星座にまつわる生活の知恵や神話などをプラネタリムの中で投影し市民に紹介した。このようにして本科研は学術的な資料の収集、国内外での学術成果の発表、さらに一般市民への還元という形で、新しい民俗科学のあり方を実践した。26年度は研究代表者は国内の天文民俗の調査を沖縄本島南東部、および瀬戸内地方(山口県下松市、岡山県美星町)にて行った。さらに海外では台湾の先住民およびハワイのポリネシア系の天文民俗について実地調査や文献調査を行うことができた。また研究協力者の角南は沖縄八重山諸島における星見石など天文関係文化財の調査を行った。さらに研究協力者全員(角南、大西、石村)および研究代表者は国内の学会で景観論に関して学術発表を行い、従来の景観論に天文現象を加えることの可能性についてさまざまな事例から検討を行った。とくに研究代表者は26年度の調査や文献研究の成果を4本の日本語論文にして発表した。さらに研究で得た知見の社会的アウトリーチを目指して、五藤光学研究所から借用した移動式プラネタリウムを用いて一般社会へ公表を行った。プラネタリウム上映は27年度と28年度に行う予定であったが、研究進展の度合いが良好だったため一年前倒しして26年度に行うことができた。27年度も引き続きその改良版のプログラムを社会に公表する予定である。以上の実績によって人類学的な知に基づいてプラネタリウム番組を制作し実施するという当初の目的はプラネタリウム上映を前倒しでするなど計画以上に進展していると判断した。2016年度は最終年度になるが、さらに国内およびオセアニアを中心とした考古天文学あるいは民族天文学の調査を行い、コンテンツの充実に努めたい。まず5月にはグアムの太平洋芸術祭時に行われる「太平洋カヌーサミット」に議長役で参加し、各地の航海術と天文民俗の情報を収集し、また星空人類学で展示するための関連する民具やカヌー模型などの収集も行いたい。そして11月に予定されている「星空人類学2016」においては3年間の集大成として日本、オセアニア、そして比較事例としてメソアメリカの古代遺跡の画像をプラネタリウムの天体提示と融合させる形で、斬新な天文人類学的プラネタリウム・プログラムを発表し、市民や学生、研究者に評価を仰ぐ予定である。文化人類学人類は天文学的知識、あるいは空に関する知識一般(スカイロア)を漁業や農業といった実践的な中で利用してきたが、その情報は現代においてはきわめて断片的になっている。
新しい血管新生のメカニズム:細胞間マトリックス内血流に誘発される血管新生

血管新生は、既存の血管の透過性亢進、基底膜融解、内皮細胞の遊走および分裂、基底膜形成、管腔形成など一連の過程を経て行われるとされている。しかし、私達がウサギ耳窓内に新生される血管を経時的に観察したところ、一日当り数百ミクロンに及ぶ急速な伸長や急激な出現と消滅など、従来の出芽法による血管新生法のみでは説明できない現象に気付いた。そこで、血管新生の他のメカニズムの可能性を検討するため本研究を行った。ウサギ耳介に装着した耳窓内では、新生血管は耳窓内に充満している血液の中を伸長していく。このため、固定した組織切片上では赤血球の存在のみで新生血管を同定することは困難である。そこで、人工的に変形させた赤血球を潅流したのち、超薄切片を作成し、電顕で観察した。新生血管先端部は、次のような形態的特徴を示した。1)血管内皮は一部分不連続になっているものがある。極端な場合には、横断面で血管の1/41/3周が内皮を欠くこともある。2)このように血管の内皮細胞は、rERがよく発達していて内皮細胞よりむしろ線維芽細胞に類似している。3)内皮の欠損したところからは、赤血球が血管外へ流出している。4)流出した赤血球は、細胞間マトリックスの主成分であるフィブリンや線維芽細胞に囲まれている。以上の結果から、漏出性の血管から流出した血流が細胞間マトリックス内を流れる間に、血流にさらされた線維芽細胞が血流を取り囲み、最終的に内皮細胞に分化発展することにより血管が形成されるという新しいメカニズムの可能性が示唆された。線維芽細胞の内皮細胞への分化についての直接的な証明は、培養線維芽細胞を標識するなどの方法を用いて今後行う予定である。
非同期式プロセッサのアーキテクチャと設計方法に関する研究

1)レジスタ間の転送や演算といった基本的な操作の間に成り立つべき依存関係からなるグラフを仕様として、それを信号遷移の因果関係に直接写像し、その結果をあらかじめ定義された回路素片の接続関係に置換することで等時分岐を持つDelay-insensitive回路モデルのもとで動作する非同期式制御回路を合成する手法を提案した。この制御回路はハンドシェ-クによって2相方式でデータパス部の制御を行う。2)等時分岐を持つDelay-insensitive回路モデルに基づいて非同期式汎用プロセッサTITACを設計、製作、評価した。その結果、クロックを用いない非同期式システムが容易に設計・製作可能であること、設計に際してタイミングに関する特別の考慮が不要であるが実証された。3)等時分岐を持つDelay-insensitive回路モデルの下で信号遷移グラフで表現された非同期式論理回路の縮退故障テスト故障が回路の状態遷移にもたらす影響を考察し、その結果に基づいてテスト可能な回路の条件を明らかにするとともに回路の信号遷移規則を用いてテスト入力系列を生成する手法を示した。4)等時分岐をDelay-insensitive回路モデルの下で2線2相式組み合わせ回路が正しく動作するために満たすべき信号遷移の因果律を明らかにし、この因果律を満たす最大並列を達成する回路構成方式を提案した。また、論理設計においてどの回路モデルを選択するのが適切であるかの指針を得るためのタイミング信頼性の評価尺度として、非同期式回路のタイミング余裕の概念を提案した。5)ジョセフソン素子のような超伝導素子で実現されるパルス論理での非同期式回路をモデル化することを目的として、非同期式回路に適した基本素子を提案し、シミュレーションによってその動作をモデル化し、パルス駆動型素子が将来の超高速非同期回路の基本素子として利用可能であることを示した。1)素子と配線の遅延上限値を未知とするDelay Insensitive回路に「同時分岐」仮定を導入した「素子出力純粋遅延」モデルのもとで、2線2相式レジスタ間データ転送モデルにおける組合せ回路が非同期的環境の中で正しく動作するために各信号が満たすべき必要十分条件を「遷移因果律」と呼ぶ概念で定式化し、遷移因果律を満たす範囲で可能な最大並列動作を達成する組合せ回路モジュールの構成方法が得られた。また、上記モデルのもとで設計されたデータ転送路の組合せ回路が必要な遷移因果律を満たすかどうか検証する組織的方法の検討を開始した。2)レジスタ間転送や演算などの基本操作の間で成立なべき依存関係を記述した「依存性グラフ」を仕様とし、それを回路の信号遷移因果関係に直接写像することによって非同期制御回路を合成する方法を開発した。依存性グラフの記述要素に対応してデータパス実現のビルディングブロックとなるべき回路要素の集合を定義した。これらの回路要素は要求・応答モデルに基づく2相方式で正しく動作することが保証される。3)Huffmanモデルのもとで「MullerのC素子」を用いて非同期式順序回路を合成するためにC素子駆動関数の「単調性条件」を満たすことが必要十分であることを見いだし、それを満たす駆動関数生成アルゴリズムを開発した。4)「素子出力純粋遅延」モデルのもとで、2分木決定グラフから完了信号生成を伴う2線2相式組合せ回路を合成する方法を考案した。また、非同期式順序回路における信号線の単一縮退故障が与える影響を解析し、テスト可能条件の検討を開始した。5)要求・応答モデルに基づく2線2相方式を基本として、レジスタ付きモジュールを基本ビルディングブロックとするノイマン型アーキテクチャの非同期式8ビッリ汎用プロセッサを設計し、そのチップ・レイアウトを作成した。1)素子と配線の遅延上限値を未知とするDelay-Insensitiveモデルに「同時分岐」仮定を導入したQuasi-Delay-Insensitiveモデルのもとで、2線2相式データ転送方式による非同期式マイクロプロセッサのビルディングブロックとなる基本論理回路モジュール群の回路構成案を得た。

2)非同期式システムの動作仕様をC言語で記述し、基本操作間の依存性を抽出し、与えられた資源制約のもとで最適並列化処理を行ない、得られた依存性グラフ記述からの直接写像に基づいて制御回路網を合成するアルゴリズムを開発した。この制御回路合成アルゴリズムと2線2相方式データパス合成アルゴリズムを統合した論理合成システムのプロトタイプを前年度に購入したワークステーション上で実現し、いくつかの設計例を用いてその合成性能を評価した。3)前年度に設計した2線2相方式のノイマン型非同期式マイクロプロセッサに上記の制御回路合成手法を適用して再設計し、非同期式論理シミュレーションを行なった上で、CMOSゲートアレイによってプロセッサ・チップを製作し、動作実験を行なった結果、遅延の変動にかかわらず正常に動作することを確認した。4)非同期式システムのタイミング信頼度とタイミング性能を統合した新しいシステム評価モデルの第一近似尺度として非同期式タイミング余裕なる尺度の計算法を開発し、これを用いて、これまで知られている各種非同期回路を評価し、最適な非同期式システム設計の一つの指針を与えた。5)次世代非同期式プロセッサに用いる論理素子として、超伝導素子を用いた単一磁束量子パルス論理のシミュレーション実験を実施して、非同期式パルス論理の基本ゲートモデルを開発し、それに基づいて、アレイ型乗算回路を設計し、その性能を評価した結果、単一磁束量子バルス論理にもとづく非同期式回路の高速性を確認した。
陽電子ビーム法による金属疲労破壊予知に関する研究

本実験を行うにあたり、陽電子線源として陽電子ビーム装置の開発を行った。今回、本装置による疲労試験片の測定には至らなかったが、50x30x30cm^3程度の小型の陽電子銃を設計・作成し、数10kVの高電圧により陽電子ビームを取り出し、2次元光子計数装置を用いて陽電子イメージングを行った。また、計算機シミュレーションにより本装置を用いて0.23mm程度までビーム系を収束できることがわかった。また、陽電子ビーム装置を用いた疲労試験片のシミュレーション実験として従来の薄膜で密封した陽電子線源による疲労試験片の陽電子消滅実験を行い、以下の結果を得た。純鉄およびオーステナイトステンレス鋼SS304についてJIS規格疲労試験試料を複数枚作製し、それぞれの試験片を低サイクル疲労させ、陽電子消滅測定を行った。鉄は格子欠陥の素性がわかりやすく陽電子寿命からの欠陥種の特定が可能であり、また実用鋼のシミュレーションとしてSS304を用いた。その結果、両試料における疲労に対する陽電子寿命、ドップラー測定の傾向ともほぼ一致しており、陽電子による疲労欠陥検出に汎用性が高いことが示された。また、0.01%Nf(破断繰返し負荷回数=100%Nf)という疲労量でも敏感に欠陥を検出した。以上から極低疲労量での微小欠陥分布の陽電子による可視化の有効性が示された。一方、疲労初期段階での欠陥の成長過程については以下のことが分かった。空孔型欠陥が試験片の応力集中箇所と同じ部位に観察され、その後の疲労によって空孔は転位に捕獲され、10%Nf程度のサイクルでそれらと同等の部分に急激に空孔が成長し、そこで破断が起こることがわかった。すなわち陽電子消滅法により亀裂発生の前駆現象を捕らえることが可能であることが示された。これらの欠陥評価方法として、測定の簡単なドップラー拡がりで測定しピークハイトによる解析で比較的簡便に疲労による亀裂発生の前駆現象を部分的に検出することが可能であることを示し、本手法による疲労亀裂発生予知の有効性を示した。種々のサイズの高純度の鉄JIS規格疲労試験試料を加工し更に純化および焼鈍し、これらの試料の陽電子寿命測定により未疲労状態での格子欠陥が陽電子消滅法で検出限界以下であることを確認し、一部試料に対して疲労試験をおこない試料の広い範囲にわたって陽電子寿命・ドップラー拡がり測定を行った。低疲労領域での欠陥の分布について測定した結果、欠陥分布が試料の中心付近にピークを持ちその両端では少ないガウス分布的な拡がりを持つことが確認され、このうち特定部位に10%Nf(100%=破断)前後の疲労サイクルで急激に3次元的な空孔集合体が形成されることなどがわかり陽電子測定に敏感に反映されることがわかった。また、ピーク以外の部分での欠陥は転位と転位線上に捕獲された原子空孔の陽電子寿命計算とも一致し、疲労においても転位の発生が支配的であり、転位上での空孔の拡散・成長が亀裂発生の重要な要因であることが示唆された。これらの結果は他の合金系でも同様の傾向を持つ結果が得られた。現在はさらに試料サイズの異なる試験片についても同様の実験を継続中である。一方、陽電子ビーム装置の設計はほぼ終了し、工作・作製および陽電子ビームの軌道計算を現在進行中である。

また、放射性同位元素から発生した陽電子の加速電圧および、到達陽電子数についても現在計算を行っており生成される陽電子ビームのエネルギー等を考慮しながらビームの加速管の加工などもおこなっている。本実験を行うにあたり、陽電子線源として陽電子ビーム装置の開発を行った。今回、本装置による疲労試験片の測定はできなかったが、50x30x30cm^3程度の小型の陽電子銃を設計・作成し、数10kVの高電圧により陽電子ビームを取り出し、2次元光子計数装置を用いて陽電子イメージングを行った。また、計算機シミュレーションにより本装置を用いて0.23mm程度までビーム系を収束できることがわかった。今回作製した陽電子ビーム装置を用いた疲労試験片の測定はできなかったが、そのシミュレーション実験として従来の薄膜で密封した陽電子線源による測定を行い、以下の結果を得た。純鉄およびオーステナイトステンレス鋼SS304についてJIS規格疲労試験試料を複数枚作製し、それぞれの試験片を低サイクル疲労させ、陽電子消滅測定を行った。鉄は格子欠陥の素性がわかりやすく陽電子寿命からの欠陥種の特定が可能であり、また実用鋼のシミュレーションとしてSS304を用いた。その結果、両試料における疲労に対する陽電子寿命、ドップラー測定の傾向ともほぼ一致しており、陽電子による疲労欠陥検出に汎用性が高いことが示された。また、0.01%Nf(破断繰返し負荷回数=100%Nf)という疲労量でも敏感に欠陥を検出した。以上から極低疲労量での微小欠陥分布の陽電子による可視化の有効性が示された。一方、疲労初期段階での欠陥の成長過程について以下のことが分かった。空孔型欠陥が試験片の応力集中箇所と同じ部位に観察され、その後の疲労によって空孔は転位に捕獲され、10%Nf程度のサイクルでそれらと同等の部分に急激に空孔が成長し、そこで破断が起こることがわかった。すなわち陽電子消滅法により亀裂発生の前駆現象を捕らえることが可能であることが示された。これらの欠陥評価方法として、測定の簡単なドップラー拡がりで測定しピークハイトによる解析で比較的簡便に疲労による亀裂発生の前駆現象を部分的に検出することが可能であることを示した。
ヒトiPS細胞と霊長類モデルを用いた治療開発の基盤整備

本年度は、タウタンパク質における異常リン酸化についてさらに検討を行った。リン酸化タウ抗体を用いてウェスタンブロットを試みたところ、R406W変異型株由来神経細胞においては、タウのスレオニン181 (T181)のリン酸化レベルが低下していることが明らかになった。さらに、名古屋大学・貝淵研究室との共同研究により、R406W変異型タウはRhoキナーゼ、PKA、GSK3βなどのキナーゼによるリン酸化を受けにくくなっており、セリン409 (S409)におけるリン酸化レベルが低下していることを新しく同定した。以上の結果から、R406W変異型タウはWTタウと比べて低リン酸化状態にあることを見出した。次に、変異型タウによる神経変性の徴候の有無を検討した。前年度において、変異型株由来神経細胞では軸索変性が起きていることを明らかにした。今年度では、軸索で見られる表現型の追求を行った。βIII-tubulinやタウ抗体の染色を行った結果、変異型株由来神経細胞の軸索が細切れになり、正常株由来神経細胞と比べ、粒状構造体(puncta)が有意に増えたことを見出した。しかし、微小管の安定化剤を投与することで表現型がレスキューされることから、ここで見られる軸索の構造異常は、変異型タウの微小管の安定化の作用の異常が原因で起こっていることが考えられる。さらに、軸索のミトコンドリア輸送能を検討したところ、変異型神経細胞においてミトコンドリアの逆行性の輸送が増えており、その結果、軸索におけるミトコンドリアの数が低下していることが示された。輸送能に関しても、微小管の安定化剤の投与で正常に戻ることから、変異型神経細胞で見られる軸索の異常は、R406W変異型タウと微小管の異常な作用を介して起こっていることが示唆された。これまでの結果をまとめ、国際学術誌への投稿を完了した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では患者iPS細胞由来神経細胞を用いたin vitroモデル系の構築、及びトランスジェニック霊長類作出技術を用いたin vivo疾患モデル系を構築する。更に、これらの独立したモデル系を相互に連携させることで、脳タンパク質老化の分子機構から認知症発症に至る全体像を明らかにし、治療開発に繋げる。まず、ヒト体細胞からのiPS細胞誘導法の改良を進めた。健常人由来抹消血単核球(PBMC)、及び単離したT細胞に、それぞれエピソーマルベクター法により再プログラム化因子を加え、フィーダー細胞上に播種した。フィーダー細胞にはマウス胎児線維芽細胞(MEF)あるいはSTO細胞を用いた。その結果、単離T細胞を用いてMEF上で樹立した際にiPS細胞誘導効率が最も高かった。患者iPS細胞については、新潟大学脳研究所・池内健博士らと共同で患者体細胞の採取を進めている。既に、慶應義塾大学及び新潟大学の倫理審査委員会において本研究の倫理申請を行い、承認を得た。そこで、R406W変異を有するFTDP-17患者及びその家族の同意の元、採血を行った。患者2名の血液を用い、iPS細胞樹立を開始した。先行する1ラインについては、既に複数のiPSクローンを得た。トランスジェニックマーモセットについては、P301L変異型タウ遺伝子をドキシサイクリン(Dox)誘導性に発現するレンチウイルスベクターと、Dox依存的転写活性因子(tTA)を神経細胞特異的に発現するレンチウイルスベクターの二種類のウイルスベクターをマーモセット初期胚に感染させることで、作出を進めている。ウイルスベクターを顕微注入した胚の一部において、ウイルスベクターが導入されたことを示す蛍光レポーター遺伝子の発現が認められたものの、いずれも発生を停止したため子宮移植には至っていない。引き続きウイルスベクターの顕微注入を行っている。倫理申請の承認及びR406W変異を有するFTDP-17患者2名からの採血を完了し、末梢血単核球及びT細胞の増幅を行った。これらのT細胞にリプログラミング因子を発現するエピソーマルベクターの導入を行い、iPS細胞の樹立を試みるに至った。先行して得られた患者1名の血液に関しては、既に複数のiPSクローンを得ることに成功した。これらの細胞の増幅及びPCRによりベクターが除去されていることの確認を現在行っており、研究は概ね順調に推移していると言える。トランスジェニックマーモセットの作出については、P301L変異型タウ遺伝子をDOX誘導性に発現するコンストラクトと、tTAを神経系において発現するコンストラクトを作製し、それぞれレンチウイルスベクターを調製した。これらのレンチウイルスベクターを、マーモセット初期胚へ感染させる実験を開始するに至っている。現在、感染の指標とする蛍光レポーター遺伝子の発現がみられないか、あるいは蛍光レポーター遺伝子の発現がみられても途中で胚発生が停止しており、子宮移植には至らなかった。引き続きマーモセット初期胚へのウイルスベクターの感染実験を進めている。本年度は、R406Wタウ遺伝子変異をもつFTDP-17家系の患者2名よりiPS細胞の樹立を行った。数十クローンを拾った後、継代によるエピソーマルベクター消失、未分化能の維持、正常核型の保持を指標とし、それぞれの患者につき3クローンずつ選別した。さらに、それぞれの患者由来iPS細胞から、CRISPR/Cas9のゲノム編集技術を用いて、患者の遺伝的背景で野生型Tau遺伝子をもつiPS細胞を作製した。

次に、これらのiPS細胞クローンから、低分子化合物を用いてWntシグナル伝達系の制御を行うことで、大脳皮質神経細胞への二次元分化誘導系やオルガノイド誘導系を確立した。今後、タウ変異を持つiPS由来神経細胞での分子生物・生化学的解析、及び細胞生物学的な病態表現型を検討していく。タウオパチーin vivoモデルとして、独自の遺伝子改変技術を駆使し、変異型タウ遺伝子を発現するトランスジェニックマーモセットの作出を行っている。まず、FTDP-17家系で同定されたP301L変異を持つタウ遺伝子を、神経細胞特異的及びテトラサイクリン誘導依存的に発現させるレンチウイルスベクターを構築し、高力価のレンチウイルスを得た。マーモセット初期胚へ感染させた後、変異型タウと2A配列で繋げたKusabira Orange(KO)の蛍光発現を外来遺伝子導入の指標としたが、このレンチウイルス系では蛍光が確認された初期胚は得られなかった。したがって、発現調節の様式を変更し、P301S変異を持つタウ遺伝子を恒常的に発現するレンチウイルスベクターを再構築した。このレンチウイルスを産生し、マーモセット初期胚への感染を行ったところ、KOの蛍光を示す外来遺伝子の導入のみられた初期胚が複数得られた。現在、この変異タウを発現する初期胚を仮親のマーモセット子宮へ移植し、トランスジェニックマーモセット作出を目指している。当初計画通り、R406Wタウ遺伝子変異をもつFTDP-17家系の患者2名よりそれぞれ3クローンずつiPS細胞を樹立することに成功した。これらのiPS細胞が正常な多能性幹細胞としての性質を有すること、また正常核型を維持することを性状解析により確認した。更に、CRISPR/Cas9のゲノム編集技術を用い、タウ遺伝子を健常型へと修復したIsogenic iPS細胞株の作出も成功した。これらの細胞は、今後の解析において同一の遺伝的背景を有するコントロール細胞株として重要な役割を果たすことが期待される。以上から、今後の表現型解析に必要な材料の調製が完了しており、概ね順調に研究が進行していると言える。更に、上記に並行し今後の表現型解析に必要となる、iPS細胞からの大脳皮質ニューロンの分化誘導系について改良を進めた。従来の2次元培養系に加え、より成熟したニューロンが得られるとされる3次元培養系も確立した。また、変異型タウを発現するトランスジェニックマーモセットの作出においても進捗があった。従来使用していた薬剤誘導型発現系においては、レンチウイルスベクター感染の指標としている蛍光タンパクの発現誘導が確認されず、移植には至らなかった。そこで、計画を変更し、ユビキタスプロモーターにより発現するコンストラクトへ再構築を行った。このコンストラクトを用い、レンチベクターを産生し、マーモセット初期胚への感染を再度試みた。その結果、蛍光を示す初期胚を複数得ることに成功した。これらの胚を妊娠マーモセット子宮へ移植を行い、個体作出を試みるに至っている。
シクロオキシゲナーゼ-2の遺伝子発現を抑制するオレイン酸エステルオゾニド

ヒトやウシで発症する外表病変に高い治療効果を発揮するオゾン化オリーブ油の成分組成を明らかにするとともに、その作用メカニズムの一つとして既に明らかにしているシクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)の発現抑制作用についてオゾニドの構造と活性の関連を検討し、以下の成果を挙げることができた。1.オゾン化オリーブ油および、オリーブ油の主成分であるトリオレインのオゾン化生成物の成分とその構造について検討し、主成分のトリオレイントリオゾニド(6種類の立体異性体)の他に、脂肪酸部位の二量体化による低分子クロスオゾニド、トリグリセリドの二量体化および三量体化をともなった高分子クロスオゾニドも含まれていることを証明し、オゾン化オリーブ油の成分組成の全体像を明らかにすることができた。(日本分析化学会北海道支部夏季研究発表会で発表、2005年7月)、Anal.Sci.に投稿中2.マクロファージ様ヒトTHP-1細胞をLPSで刺激した場合に誘発されるCOX-2の発現をオゾン化オリーブ油が抑制するが、このような作用はオレイン酸メチルから合成したシスおよびトランス体のオゾニドや、他の官能基を有しないオゾニドでも認められたことから、オゾニドー般に共通する作用であることが示唆された。また、これらの作用はIKKαによるリン酸化の阻害を介するNFκBの活性化阻害によるものであり、オゾニドはMAPキナーゼ系には影響しないことも明らかにした。(第17回世界オゾン会議で発表、Strasbourg,2005年8月)投稿準備中3.マウスRAW細胞株をLPSで刺激するとNFκBの活性化を介してTNFαが誘導されるが、各種オゾニドはこの誘導も阻害した。また、LPS無刺激の条件では、オゾニド類は逆にTNFαの産生を有意に上昇させた。このようなオゾニドによるNFκB活性の調節作用は、オゾニドの創傷治癒作用に関係する興味深い現象である。オレイン酸を主要構成脂肪酸とするオリーブ油のオゾン反応物(オゾン化オリーブ油)はヒトやウシの各種皮膚疾患に高い治療効果を示すが、我々は、その作用メカニズムの一つとして、オゾン化オリーブ油やオゾン化オレイン酸メチルがプロスグガランジン産生酵素であるシクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)の遺伝子発現を抑制することを見出した。平成16年度の研究では、この作用がオレイン酸エステルオゾニド(OEO)に特有のものか、オゾニド一般に共通する作用であるかを明らかにすること、COX-2発現に至るいくつかの細胞内シグナル伝達系のどの系にOEOが作用するかを明らかにすることを目的とし、以下の成果を挙げることができた。1.マクロファージ様ヒトTHP-1細胞をLPSで刺激した場合に誘発されるCOX-2の発現は、オゾン化オリーブ油がNFκBの活性化阻害(IKKαによるリン酸化の阻害)を介して抑制することを明らかにしたが、このような作用は、トリオレイントリオゾニドや合成単離したオレイン酸メチルオゾニドのシスおよびトランス異性体のいずれにも認められた。しかし、やや作用は弱いものの、極性官能基の多いオゾニドや他の官能基を有しないオゾニドでも同様な作用が認められたことから、NFκBの活性化阻害を介したCOX-2発現抑制作用はオゾニド一般に共通する作用であることが確認できた(日本統合医療学会で発表)。