hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
泌尿器がんでのEBAG9による微小環境変化、腫瘍増殖メカニズムの解明と臨床応用

EBAG9は複数のがんで過剰発現しており患者の予後不良と相関しているが、その作用機序は不明な点が多い。本研究において、Ebag9ノックアウト(Ebag9KO)マウスを宿主とした際に、膀胱がん細胞の増殖と肺転移が抑制され、腫瘍内への細胞傷害性T細胞の浸潤が増加することが明らかになった。さらに、このT細胞は細胞傷害活性が増大しており、別個体に移植しても腫瘍形成を阻害した。また、EBAG9発現量は前立腺がん細胞の移動能と関連していた。本研究により、EBAG9は宿主側の免疫系細胞ならびにがん細胞の両面において機能を発揮しており、腫瘍免疫において重要な役割を担っていることが示唆された。前立腺がんは男性の健康を脅かす重大な疾患である。がん細胞の増殖・転移はこれを取りまく微小環境との相互作用によって制御されている。特に、免疫細胞はがん細胞を認識して排除するがん免疫反応に関与するのに対し、がん細胞はがん免疫を逃れる(エスケープ)メカニズムを有している。我々は、estrogen receptor-binding fragment-associated antigen 9 (EBAG9)を性ホルモン応答遺伝子として同定し、男性泌尿器がん(前立腺がん、精巣がん、腎がん、膀胱がん)をはじめとする様々ながん種において過剰発現し、予後不良因子となることを明らかにしてきた。しかしながら、腫瘍周囲の微小環境におけるEBAG9の作用は明らかではない。がんと微小環境との相互作用におけるEBAG9の機能を明らかにするため、本年度は、Ebag9ノックアウトマウス(Ebag9KO)にがん細胞を移植する系を用いて、がんに対しては宿主側となる生体におけるEBAG9の機能を解析した。その結果、Ebag9KOマウスにおいて皮下移植された膀胱がん細胞の腫瘍増殖と肺への転移が抑制され、さらに、この形成された腫瘍組織内へのT細胞の浸潤が増加していることがわかった。また、腫瘍内のT細胞を分離して解析したところ、IFNγなどの免疫関連遺伝子の発現が増加していること、細胞外への顆粒物質の放出を示す脱顆粒反応が亢進していること、細胞傷害性が亢進していることが認められた。さらに、このEbag9KOマウスで形成された腫瘍内から分離したT細胞は、別個体に移植しても腫瘍形成の阻害能力が大きいことを明らかにした。これらのことより、宿主側のEBAG9はがん免疫を制御することによって、がん増殖に関与していることが示唆された。性ホルモン応答遺伝子として同定されたEBAG9 (estrogen receptor-binding fragment-associated antigen 9)は、種々のがんで過剰発現している。EBAG9のがん細胞における作用として、がん細胞の免疫系からの回避に関与していることが明らかになっている。一方で、我々はCD8陽性T細胞において発現するEBAG9は、グランザイムなどの免疫関連遺伝子の発現調節や脱顆粒反応に関わり、細胞傷害活性を負に調節することを明らかにした。このようにEBAG9は、宿主側からもがん細胞に対して作用すると考えられているがそのメカニズムは不明な点が多い。今年度の本研究では、Ebag9ノックアウト(Ebag9KO)マウスにおける腫瘍形成を解析し、宿主側におけるEBAG9の役割をin vivoで解析した。Ebag9KOマウスとがん自然発症モデルマウスとを交配したところ、Ebag9KOマウスにおいて、がんの形成は著明に抑制され、宿主側のEBAG9はがん免疫に関与していることが示唆された。また、がん細胞株を用いて、EBAG9の発現抑制系と過剰発現系を構築し、in vitroの細胞培養系における細胞増殖と移動能に対する影響を解析した。その結果、細胞移動能はEBAG9発現量と相関関係にあることが明らかになった。以上のことより、EBAG9は宿主側の免疫系細胞ならびにがん細胞の両面においてそれぞれの機能を制御しており、腫瘍免疫において重要な役割を担っていることが示唆された。個体レベルにおけるEBAG9の機能を解析するために、我々はEBAG9 flox/floxマウスを作製し、このマウスと胎児期から全身で発現するAyu-1遺伝子のプロモーター下流にCreを発現するAyu-1 Creマウスとを交配することにより、全身でEBAG9を欠失しているノックアウトマウスを作製した。このEbag9KOマウスに膀胱がんMB-49細胞を皮下移植したところ、腫瘍増殖と肺への転移が抑制されることが明らかになった。さらに、CD3、CD4、CD8の細胞表面マーカーに対する抗体を用いた免疫染色法により、形成された腫瘍組織内にT細胞の浸潤が増加していることがわかった。腫瘍内のCD8陽性T細胞を分離して遺伝子発現を解析したところ、IFNγなどの免疫関連遺伝子の発現が増加していることが示された。また、腫瘍内のCD8陽性

T細胞において、細胞表面抗原CD-107に対する抗体で染色し、FACSを用いて解析することにより、細胞外への顆粒物質の放出を示す脱顆粒反応が亢進していることを明らかにし、MB-49細胞との共培養実験により細胞傷害性が亢進していることが認められた。さらに、Ebag9KOマウスで形成された腫瘍内から分離したT細胞は、別個体に移植しても腫瘍形成の阻害能力が大きいことを明らかにし、宿主側のEbag9はがん免疫を制御することを解明した。これらの成果は国際誌に論文として発表した(Oncogenesis, e126, 2014)。さらに、前立腺がん細胞におけるEBAG9の機能に関して、発現抑制と過剰発現の両面から検証できる系を構築し、解析を行っている。これらの解析よりEBAG9の発現が、がん細胞と周囲環境との相互作用に影響を及ぼすメカニズムをin vitroの細胞培養系とin vivoのEbag9KOマウスを用いて解明をおこなっており、ほぼ計画通りに研究が進展していると考える。医歯薬学引き続き、前立腺がん細胞におけるEBAG9の過剰発現系または発現抑制系による細胞周期、細胞増殖、アポトーシス、移動能、ならびに細胞増殖や移動能に関与するシグナル伝達などを解析する。また、Ebag9KOマウスに形成された腫瘍塊、ならびに周囲間質細胞や浸潤している免疫細胞への影響を解析し、腫瘍細胞と周囲の細胞に分けて遺伝子発現解析を行う。以上の解析を前立腺がん細胞もしくは膀胱がん細胞で行い、EBAG9の発現がもたらす微小環境変化と腫瘍増殖メカニズムの統合的な解明を進める。次年度の研究費の使用計画マウスを用いた腫瘍移植モデルの作製に必要な細胞の培養、実験動物マウスの維持・管理に必要な飼料、床敷など、形成された腫瘍塊からのT細胞や腫瘍細胞の単離などに使用する。また、これら組織や細胞からのRNAとタンパク質の抽出、ならびに遺伝子発現解析、定量的PCRに必要な試薬とキットなどに使用する。さらに、前立腺がん細胞におけるEBAG9の過剰発現系または発現抑制系による細胞周期、細胞増殖、アポトーシス、移動能、ならびに細胞増殖や移動能に関与するシグナル伝達などを解析するための試薬類、プラスチックチューブ、血清・培地に充当する。成果の発表に際し、論文投稿時の印刷代に使用する予定である。当研究計画よりも進展があり、論文としてまとめる見通しが立ってきており、平成27年度に購入予定であった皮下腫瘍モデル用の実験動物や免疫系細胞を単離、精製するための試薬を購入する必要があったため。同型のマウス、Ebag9KOマウス、Tgマウスに構築したがん細胞を移植し、形成された腫瘍、周辺組織ならびに転移部分から免疫系細胞を単離しマイクロアレイ法により遺伝子発現プロファイルを網羅的に探索する。候補遺伝子について、EBAG9誘導性の前立腺がんと膀胱がん腫瘍免疫特異的発現を検証し、細胞内局在やEBAG9との共局在や結合を検証する。Ebag9KOマウスまたはTgマウスとTRAMP
新規ヒト多能性維持機構の解明と、それを利用した分化誘導方法の開発

成体多能性幹細胞は、胚性多能性幹細胞と異なる多能性維持機構を有すると考えられるが、詳細は明らかでなかった。我々は、多能性維持と分化方向決定に関与する一つの遺伝子領域を同定し、さらに、その因子が神経細胞特異的な遺伝子発現制御とスプライシング制御に関与することをつきとめた。この研究結果に基づいた、新たな多能性制御モデルによる神経細胞の新規分化誘導方法の開発が期待される。申請者は、多能性維持因子として一つの遺伝子領域(以下、「P因子」と呼ぶ)を同定することに成功し、さらに、P因子のエキソン4、6、又は7をノックダウン(KD)することにより、細胞の形態が神経、肝、又は骨格筋細胞様にそれぞれ変化することを既に明らかにしている。本年度は、P因子KDによる細胞の形態変化が、どのような機構により誘導されているのかを明らかにする目的で、P因子KD前後の遺伝子発現及びスプライシングフォームを網羅的に解析し、それらの経時的変化を調べた。その結果、細胞には、3胚葉に属する遺伝子がもともと多数発現していることが明らかになった。これは、細胞の多能性は、未分化および分化を規定する特異的な因子によって制御されているというよりは、全ての胚葉に属する遺伝子が発現している結果、どの胚葉にも分化しないというpassiveな形で制御されている可能性を示唆するものである。また、Ex4-KD細胞においては、中胚葉および内胚葉に属する遺伝子の発現が減少し、外胚葉に属する遺伝子、中でも、神経細胞特異的な遺伝子発現が上昇することが明らかとなった。一方、Ex6-KD及びEx7-KD細胞においては、肝細胞や骨格筋細胞のマーカーの顕著な発現上昇は認められなかった。さらに、P因子KD前後で多数の遺伝子のスプライシングフォームが変化しているという意外な結果が得られた。特に、Ex4-KD細胞では、MAP2Cのような神経細胞特異的なスプライシング産物が新規に発現してくることが明らかになった。以上の結果は、細胞にはもともと神経関連遺伝子のいくつかが発現しているが、それらは機能しないフォームであるために神経への分化が誘導されることはないが、P因子KDによって、それらのフォームが機能型に変化することにより神経細胞への分化が開始するという、新たな多能性制御モデルが存在する可能性を示唆するものである。本研究は平成27年度から29年度までの3年継続助成で申請しているものであり、当初の予定では、申請者は東北大学・医学系研究科に所属して3年間の本研究を行う予定であった。しかし、今年度の11月の時点で、平成28年度から申請者が東北大学から秋田大学・医学部に移ることが決まり、所属研究室の専門分野が異なるため、研究環境が全く異なる状況になることになった。このことは申請当初の計画では予定していなかったことである。本研究の継続のために総合的に考慮した上で、秋田大学において分子生物学的実験及び細胞培養実験を行う環境を整える必要が生じたことなどから、今年度の予算消化を抑え、来年度からの研究環境構築に使用する必要があると判断した。以上の理由により、今年度は予定していた実験計画のうち、次年度以降に行う予定であったバイオインフォマティクス解析を優先して行うことにより、研究進捗の遅延を最小とするようにした。これまでの研究過程において、P因子は成体多能性幹細胞に特異的なものではなく、驚くべきことに正常ヒト繊維芽細胞のP因子のエキソン4をノックダウンすると、成体多能性幹細胞と同様に短期間のうちに神経細胞様細胞への形態変化が起こることがわかった。これは、P因子が分化多能性において当初予期していたより普遍的な機能を担っていることを示唆する。そこで、P因子の発現様式について、マウス胎児(胎生17日目)の頭部におけるP因子遺伝子発現をin situハイブリダイゼーション(ISH)により調べた。その結果、マウス脳冠状断面の耳介、外耳道、中咽頭、毛嚢等で特に強い染色像が得られた。マウス新生児(生後0日目)では、脈絡叢、脳軟膜にP因子の陽性反応が見られた。これらのことから、上記組織においてP因子が発現している可能性を明らかにした。現在、さらにP因子の分化多能性における普遍性を調べるために、P因子のノックアウトマウスを作製中であり、このノックアウトマウス、またはノックアウトマウス由来細胞を解析することにより更なる研究の進展が見込まれる。また、本研究に関連し、マウスに異種移植したヒト多能性幹細胞を、霊長類に特異的な短鎖散在配列であるAluを標的として高感度に検出する方法を開発したが、調査の結果、既存の方法の23桁感度が高く、現在世界一鋭敏な系を開発できたことが分かった。これは予定外の産物ではあるが、当該年度内に、学会発表、特許出願を行った。本年度の研究計画の進捗に関し、東北大学から秋田大学への異動に伴う実験計画の再申請、レンチウイルスベクターに関するMTAの再締結、P2実験室の確保等、当初予定していたいくつかの実験は研究環境の整備を待つ必要があった。また、研究の進捗によって、当初考えていたより普遍的なP因子の可能性が示唆された。これらのことから、当初予想していた進捗より若干遅れが出た。しかし、当該年度において、学内で最終年度に向けたノックアウトマウス作製における研究協力体制を構築できたため、今後の研究の加速が見込まれる。

我々は、その機構が、再生能力の高い下等生物からヒトまで進化的に保存されているのではないかという仮説を立て、プラナリアの成体多能性幹細胞(ネオブラスト)とヒト多能性幹細胞とに共通する因子を探索し、多能性維持と分化方向決定に関与する一つの遺伝子領域(P因子)を同定した。実際にヒト細胞でP因子を抑制すると、P因子抑制前後で中胚葉および内胚葉に属する遺伝子の発現が減少し、外胚葉に属する遺伝子、中でも、神経細胞特異的な遺伝子発現が上昇した。さらに、P因子抑制前後で多数の遺伝子のスプライシングフォームが変化し、MAP2Cのような神経細胞特異的なスプライシング産物が新規に発現してくることが明らかになった。以上の結果は、P因子抑制によってスプライシングが制御され、神経関連遺伝子が非機能型から機能型に変化することにより神経細胞への分化が開始するという、新たな多能性制御モデルが存在する可能性を示唆するものである。一方で、P因子は成体多能性幹細胞に特異的なものではなく、正常ヒト線維芽細胞、およびマウス細胞においても、P因子を抑制すると、成体多能性幹細胞と同様に短期間のうちに神経細胞様細胞への形態変化が起こることがわかった。このことは、P因子が分化多能性において当初予期していたより普遍的な機能を担っていることを示唆する。本研究に関連し、マウスに異種移植したヒト多能性幹細胞を高感度に検出する方法を開発したが、調査の結果、既存の方法より鋭敏な系を開発できたことが分かった。これは予定外の産物ではあったが、並行して論文執筆、学会発表、特許出願を行った。成体多能性幹細胞は、胚性多能性幹細胞と異なる多能性維持機構を有すると考えられるが、詳細は明らかでなかった。我々は、多能性維持と分化方向決定に関与する一つの遺伝子領域を同定し、さらに、その因子が神経細胞特異的な遺伝子発現制御とスプライシング制御に関与することをつきとめた。この研究結果に基づいた、新たな多能性制御モデルによる神経細胞の新規分化誘導方法の開発が期待される。今年度に行った解析結果から、本研究で示唆される多能性の制御機構は普遍的なものであることが示唆されている。このことを受け、当初は特定の細胞に関して解析を行っていたが、今後は様々な細胞種においてもP因子およびスプライシングによる多能性制御機構を検討するとともに、現在の所属研究室で強い分野である組織学的・発生学的な観点を取り入れた形で、研究を推進していく。報告者は、P因子による細胞分化調節機構は多能性幹細胞に限定されたものではなく、一般的な体細胞にも存在していると推測している。そして、入手や培養が容易なP因子発現細胞を用いて、新たな神経細胞及び肝細胞への誘導方法を確立することができれば、創薬研究や再生医療に必要不可欠な神経細胞及び肝細胞を低コストで大量に供給することが可能となり、これらの研究分野の発展に大きく貢献できる可能性があると考えた。そこで、今後は、生体内におけるP因子の局在を詳細に調べるとともに、P因子を発現する培養マウス細胞を特定し、かかる培養細胞を用いて、P因子のノックダウンによる神経細胞への分化誘導が可能であるかを確認する。また、得られたノックダウン細胞とマウス生体由来の神経細胞の遺伝子プロファイルを次世代シークエンスにより比較検討する。さらに、P因子ノックアウトマウスを作製して発生段階におけるP因子の役割を調べる。
新しい光学活性大環状ポリアミンを配位子とする金属錯体の合成と性質

当該研究は、硬い骨格構造をもつ光学活性大環状ポリアミンの金属錯体を系統的に合成し、それらの構造解析、および分光学的、磁気的性質を明らかにすることを目的として始めた。ピペラジン環を含む光学活性な18員環ポリアミン(2S,8S,11S,17S)-2,8,11,17-tetraisobutyl-1,4,7,10,13,16-hexaazatricyclo[14,.2.2.2^<7,10>]docosaneはN,N′-エチレン架橋-(S)-ロイシル-(S)-ロイシンとグリシンを構成単位とした大環状擬ペプチドの全てのアミド基をジボランで還元して得た。そのリガンドは脂溶性に富み、シリカゲル、および活性アルミナカラムを用いると高純度で精製できた。このB_2-[18]-aneN_6型大環状ポリアミンのCu(II)錯体は塩素イオンと水酸化物イオンで架橋された複核錯体であり、それぞれのCu(II)イオンにピペラジン環の二つの三級窒素と一つの二級窒素が配位していることがX-線結晶構造解析により明らかになった。ピペラジン環を含まない18員環ポリアミンが金属イオンと錯形成すると単核構造をとるのに対し、ピペラジン環と光学活性な骨格構造で形成されるラグビ-ボール状の空孔は複核構造をとるのに適していることがわかる。架橋しているこの塩素イオンは銀塩として取り除くことができ、塩素が架橋した錯体と、そうでない錯体について磁気的性質をESR、SQUIDを用いて詳細に調べ、それらの構造変化を推定した。また、グリシンの代わりにβ-アラニンをリンカーとして用いた大環状擬ペプチドからは炭素数が二つ多い20員環ポリアミンが効率よく合成でき、さらにその複核銅(II)錯体を得た。構造解析はまだできていないが、Cu(II)-Cu(II)間距離が18員環ポリアミンの錯体より長い錯体が得られていると思われる。このように原料となるアミノ酸を工夫することで異なるサイズのキラルな大環状ポリアミン、およびそれらの複核銅錯体が得られることを明らかにした。以上の結果は今のところ三つの論文にまとめ報告した。
水ストレス下のイネ根系発育に関わる炭素収支解析

本研究では、イネの水ストレス条件下における生産性の向上を目指し、それに必要な根の形質として、根系の可塑性発揮における炭素収支について解明することを目的とした。日本晴とKasalath、系統50番(日本晴/Kasalath染色体部分置換系統群)を用いて、湛水条件(対照)と軽度な乾燥ストレス条件下で栽培した。その結果、根の通気組織形成量は呼吸速度に密接に関与していることが明らかとなった。また、土壌乾燥ストレスに対する適応性の高いイネは、同条件下において、積極的に通気組織を形成することで根の代謝コストとなる呼吸量を減らし、根系発育とくに側根の発育に光合成産物を利用している可能性が示唆された。水不足を主体とする水ストレスは、イネ生産性低下の主要な環境ストレス要因である。そのような水ストレスに対する適応性や耐性において、根系機能は重要な役割を果たしているが、炭素収支の点から考えると、根における発達や機能の促進と収量とはトレードオフの関係にある。そこで、根系における炭素収支を、根呼吸の特徴とその生理的意義に注目して解明することを目的とした。本年度は、乾燥ストレス下の根呼吸量と根系発育との関係を定量的に評価した。日本晴とカサラスの染色体断片置換系統群54系統(N/K CSSL 54系統)のうち、軽度な乾燥ストレス下で生育の優れる系統50番と、日本晴、カサラスを用いて、水耕と土耕で生育させた。その結果、系統50番は、湛水条件では、日本晴とくらべ地上部生育・根系発育ともに差はないが、軽度な乾燥ストレス条件下において、日本晴とくらべ地上部生育・根系発育が有意に優れており、系統50番の根呼吸速度は、湛水条件では、日本晴とくらべ差はないが、軽度な乾燥ストレス条件下において、日本晴とくらべ有意に小さかった。以上の結果より、乾燥ストレス条件に対する適応性の高いイネは、乾燥ストレス条件下において、根呼吸量を減らして根系発育に光合成産物を使っていることが示唆された。さらに、根系を構成する根の中でも、比較的新しく発根した根は、種子根とくらべて、根呼吸量が非常に高いことが明らかとなった。現在、通気組織形成量について解析しており、その結果と根呼吸量と根系発育との関係についても明らかにする。通気組織形成量の解析方法について、重量法による空隙率の算出と横断切片画像を用いた画像解析の両方で評価しており、解析に時間がかかっているため。養水分ストレス下において根の皮層に形成される通気組織は、根の呼吸による代謝コストを減らすことで、収量増加に貢献することが、トウモロコシのような畑作物において報告されている。イネの土壌乾燥ストレスに対する根系の可塑性発揮においても、積極的に通気組織が形成される可能性があると考え、根系の可塑性発揮には、通気組織形成→呼吸量の減少→側根発育の促進が関与している、という仮説を立てた。塩ビチューブを用いて、土耕条件で人工気象機内にて21日間イネを栽培した。根齢による根呼吸速度の違いを評価するため、種子根と上位から発根した側根の少ない節根を対象にして、根呼吸速度、根長、分枝程度(単位根軸あたりの側根長)、皮層空隙率を測定した。根呼吸速度は、サンプリング後根を水で洗い、その後赤外線CO2アナライザー(GMP314、ヴァイセラ社製)を用いて、チャンバー内のCO2上昇速度を計測し、単位根重あたりの呼吸速度として求めた。供試したいずれの品種・系統においても、根齢に関わらず、土壌乾燥ストレスによって根呼吸速度が増加した。土壌乾燥ストレス区にくらべ湛水区(対照区)では、皮層空隙率が有意に高かったことから、根の呼吸速度には根の通気組織形成量が密接に関与していると考えた。乾燥ストレスに対して根系の可塑性を発揮するイネは、可塑性を発揮しないイネとくらべ、同条件で空隙率が高く、根呼吸速度が小さく、さらに分枝程度が高いといった特徴を有していたことより、上記の仮説を支持していた。また、根軸の中央部から先端部にかけて空隙率の増加が確認さたのに対し、基部から中央部において側根発育が促進されたことから、皮層空隙形成と側根発育反応は必ずしも一致しないことが明らかになった。根齢によって呼吸量が大きく異なっていたことより、とくに、生育が進んだイネを対象に呼吸量を測定する際は、根齢の違いを考慮する必要がある。そのことを踏まえ、イネの水ストレス条件下における下において、光合成産物がソース器官からシンク器官に移動する様子を追跡して、植物体内中の炭素動態を明らかにする。作物生産科学
光増感反応による局所的循環障害末梢性顔面神経麻痺モデル

モデル動物となるWistar系雄性ラット(11週令、体重230250g)の耳周囲及び側頭骨を解剖した結果、同系統ラットの顔面神経は茎乳突孔から側頭骨外へ出た後に中耳骨胞下面を走行するため、同骨胞を露出・削開する際に損傷されやすいことが判明した。しかし注意深く手術すれば顔面神経を損傷せずに骨胞を露出できることもわかった。大腿静脈から生理食塩水に溶解したRose Bengal(20mg/kg体重)をマイクロインジェクターにて持続的に注入しながら、キセノンランプを光源とした緑色光(波長ピーク:450nm)を照度65007500ルクスで約20分間にわたって側頭骨表面から顔面神経管水平部膝部に照射することで光増感反応による血栓性循環障害によって生じたと思われる顔面神経麻痺を作成することに成功した。しかも同時に迷路機能も障害されるため、照射直後より激しい眼振と平衡障害という合併症も出現していまうことも明らかになった。より選択的に顔面神経のみが障害されるモデルを作成するためにはレーザー光を用いるなど照射の出力を増加させ、さらに特殊レンズを用いて径1mm程度に集光することが必要ではないかと考えられた。肉眼的に閉眼や髭の動きの有無を観察することて、ある程度顔面神経麻痺の程度をスコア化することが可能であると思われた。誘発電位記録装置で平均加算して得られた複合活動電位の振幅を健側と比較することで顔面神経麻痺の程度をより客観的に評価し、組織学的検討及び薬理学的検討も行う予定とした。
エキシマレーザーによる中枢神経再生の実験モデルの作成

I.導光装置の作製と手術顕微鏡への組込み最終年度は、エキシマレーザーを導光して、手術顕微鏡下に直視しながら組織の微小部分を切断できる装置を作り,脊髄組織の切断を試みた。装置の概略は、ビーム形成光学系、四関節ミラー方式マニプュレーター、手術用顕微鏡組込み、の3つの主要部分からなる。集光レンズは顕微鏡の直前にあり、集光されたビームは顕微鏡内の反射ミラーによって、顕微鏡の視野方向に曲げられる。この際、顕微鏡の焦点とビームの集光点とが一致するように集光レンズの位置を決めた。集光されたビームの形状は、スリット状で、短軸(巾)は集光点で0.10.4mmであった。スリットの長軸は5mm20mmの範囲で加変である。この装置の詳細については別紙報告書に記した。II.照射の実際上記の導光装置を用いて、ラット脊髄後索の組織を切断することを試みた。照射条件はスリット状の照射野の短軸(巾)が0.10.4mm、エネルギー密度が0.170.79J/cm^2/pulse、パルス数は502000。同じ条件でも出血などがあれば脊髄組織はほとんど切断されない。また軟膜のような薄い結合組織でも切れずに残るため、脊髄にまでビームが達しない場合がある。これは導光によってビームのエネルギーが低下しているためでもある。切断された脊髄後索の光顕および電顕の詳しい所見については別紙報告書に記した。a.この装置によって、微細にコントロールされた組織の切断が可能である。b.組織表面の結合組織の除去、止血処理に注意する必要がある。c.中枢神経の修復・再生のモデル実験ができる。d.神経以外の組織の切断に対しても有効であろう。本年度はエキシマレ-ザ-の発振装置(C3470ーX11)を購入し、基礎実験を始めた。実験はラットの頚髄後索または錐体路において、レ-ザ-による切断後の組織修復を電子顕微鏡で調べた。いずれの部位についても、まず適当なレ-ザ-の強さを決めるためパルス当り10mJから70mJのエネルギ-で、1パルス照射することにより50mJが適当であると判定し、以後このエネルギ-で実験を行なった。まず脊髄後索ではC_<1ー2>の頚椎間を開き、硬膜を切開して後索を露出させた。その後、経時的に動物を固定し照射部位の変化を見た。切断直後の組織を観察すると、神経線維は非常に鋭利に切断されており、切断部位周辺への影響はほとんど見られなかった。しかしグリア細胞は照射部位を中心に破壊像が認められた。7日では、切断部位に無髄軸索が多数あらわれ、星状膠細胞がそれらの一部を囲んでいた。一部の軸索は、ミトコンドリアや多数の小胞を含み再生像を思わせた。また血管の増生も認められた。14日では表層にある軸索はシュワン細胞によって、深部にある軸索は稀突起膠細胞によって髄鞘形成がなされていた。照射後28日まで観察したが、組織修復は良好で、空洞の形成は見られなかった。この事実はエキシマレ-ザによる後索の破壊が、従来の実験方法による場合と違って、中枢神経系の再生実験に有力な武器になる得ることを示している。一方錐体路の切断実験も同様にして3回の実験を行なった。この場合も同様に、空洞の形成がなく,組織の修復は良好であった。錐体路は延髄を露出させて照射するため、照射の影響によって死亡する動物が多いことが問題であった。

また中枢神経の再生実験につきものの、『損傷軸索の識別』という問題が今後の大きな課題として残されている。ラットの脊髄後索、錐体路および視神経を材料として、エキシマレ-ザ-による切断とその後の修復を調べた。エキシマレ-ザ-は波長248nm、パルス巾15nsec、周波数5Hzとし、脊髄後索の切断ではパルス当たり30mJのエネルギ-レベルを用いた。ビ-ム巾0.2mmで5パルスの照射を行なった。頸髄レベルで後索の切断される深さは約100μmであった。この条件では軸索や髄鞘は鋭利に切断され、損傷の20-40μmの範囲内にあるグリア細胞には空胞などの変化が現われた。修復については上の条件で照射して1-5日の時間経過で調べた。組織の修復は非常によく、空洞形成などの変化は見られなかった。しかしながら再生神経の伸長についてははっきりした指標がなく判定できなかった。錐体路は、延髄の腹側表面下で錐体交叉前のレベルで露出させて、脊髄の場合と同様に照射した。照射後のラットの一般状態が良好な場合でも、手術後1-2日で死亡する例が多かった。これは照射の影響がたとえ形態学的に明らかでない時でも、かなり広い範囲にわたり神経が傷害されているためと考えられた。このために錐体路の切断実験は中止された。視神経は細い神経束で、全周を切断することができるので再生神経の伸長を調べるには都合の良い材料である。照射は2J/cm^2/パルスのエネルギ-レベルで2秒間行なった。切断後3、7、14、28日における修復を見ると、中枢側に再生神経と思われる無髄軸索が現われ、髄鞘を持つに至った。このような所見は末梢側にはなかった。また血管の侵入も良好であった。網膜の神経節細胞は28日で45%が生存していた。これらの所見は鋏による切断の場合よりも良好であった。以上、限られた実験ではあるが、エキシマレ-ザ-による切断と修復は実験モデルとして、また臨床応用の可能性の面からも有効であると考えられた。今後は照射装置に改良を加えて更に調べていきたい。I.はじめに:エキシマレーザーは、CO_2レーザーやYAGレーザーとちがって、熱の発生なく組織を切ることができるのが特徴である。この性質を利用して、中枢神経特に脊髄の組織を切り、ナイフや凍結処理による損傷の場合と比較して、損傷後の修復がどのように改善されるかを調べた。用いたレーザーはKr-Fで波長248nmである。II.照射条件:パルスあたりのエネルギー密度、パルス数、照射面積の3要素について脊髄組織の切断の程度との相関を調べた。動物はラット(ウィスター、体重250-300g)を用い、脊髄後索を実験材料とした。その結果、損傷実験には、30mJ/pulse,5Hz×1sec,16mm×0.2mm(つまり4.69J/cm^2)を標準条件とした。このとき切開創の深さは約100μmであった。エネルギー密度がこれより低いと切開の程度が浅すぎ,これより高くなれば切開が十分深くないにも拘らず,切られた組織が飛び出して大きくカールしてしまう。神経線維の切断面は一般に鋭利であった。切断部近傍では、軸索と髄鞘が開離し,グリア細胞が破壊されていた。これは照射によって発生する弾性波のためと考えられる。III.損傷組織の修復:上の実験条件の下で、切開された脊髄の修復を3日28日にわたり経時的に調べた。損傷部は軸索と髄鞘が破壊され、出血がある。時に脱髄して裸となった軸索も見られた。
Sox9の生殖腺遠位エンハンサーの同定と機能解析

胎仔期の生殖腺は精巣にも卵巣にも分化することができる。その胎仔期生殖腺でSox9遺伝子が発現すると精巣に分化し、発現しないと卵巣に分化する。ヒトではSOX9遺伝子変異はキャンポメリックディスプラジアとなり、核型XYのキャンポメリックディスプラジア症例では約2/3で性分化疾患となる。キャンポメリックディスプラジア症例では、SOX9のコード領域に変異がなく、その上流領域に転座が見つかることもあり、SOX9遺伝子自体から離れたところにSOX9の胎仔期生殖腺でのエンハンサーが存在すると考えられている。ヒトではSOX9の上流0.6 Mbに存在するXYSRと呼ばれる32.5 kbの配列がその一つである。これまでにヒトのXYSRに相当するマウスでの配列をバイオインフォマティクスにより推定し、ゲノム編集技術とマウスをモデルに用い、XYSRの機能に重要である配列を711 bpまで絞り込んでおり、初年度にはさらに106塩基までその責任領域を絞った。今年度はさらに絞り込みを続け、9塩基にまで絞り込み、さらにその9塩基内に点変異を導入することにより、1塩基にまで絞り込むことに成功した。来年度はこの配列を含む周辺配列から結合因子の同定を実行する。この配列の生殖腺でのエンハンサーとしての機能は他のグループから報告されたが、その中の責任配列は報告されておらず、本研究により新規の分子機構の解明へと繋がると期待している。計画していた責任配列を同定するための詳細マッピングが進み、1塩基にまでマッピングできているため。来年度は同定した配列を含む周辺配列から結合因子の同定を実行する。Sox9遺伝子は精巣分化の初期で発現し、精巣分化に必須である事が知られている。実際にヒトではSOX9遺伝子に変異が生じるとキャンポメリックディスプラジアを発症し、核型XYのキャンポメリックディスプラジア症例では約2/3で性分化疾患となることが知られている。ヒトの症例解析により、SOX9のコーディング領域に変異がなくても、その上流領域に転座があるとキャンポメリックディスプラジアや性分化疾患になることが明らかにされており、SOX9のコーディング領域から離れたところに存在するエンハンサーがSOX9の発現に重要であると考えられている。ヒトではSOX9の上流0.6 Mbに存在するXYSRと呼ばれる32.5 kbの配列がその一つであると考えられている。これまでにヒトのXYSRに相当するマウスでの配列をバイオインフォマティクスにより推定し、ゲノム編集技術とマウスをモデルに用い、XYSRの機能に重要である配列を711 bpまで絞り込んだ。この711 bpがエンハンサーであることを検討するため、プロモーター、LacZ、711 bpをトランス遺伝子としたトランスジェニックマウスを作製したが、エンハンサーの活性は確認されなかった。来年度以降に他の方法を試みることにより証明する。711 bpの制御について明らかにするためには、その制御因子の同定が重要である。そのため、711 bp領域中の責任配列を詳細にマッピングする必要がある。本年度は711 bp領域を小さく欠失した変異マウスをゲノム編集により作製した。その結果、一度目の実験で300 bp程に、二度目の実験で106 bpにまで責任領域を狭めることができた。今後、より詳細にマッピングを行う。計画していた責任配列を同定するための詳細マッピングが二段階進み、106 bpにまでマッピングできているため。106 bpよりさらに詳細なマッピングを行い、責任配列を数塩基にまで同定することを目指す。エンハンサー活性の測定については通常の方法とは異なった実験系を考え、検討する。責任領域の絞り込みを今年度もう一段階行いたかったが実施できなかった。そのため、来年度実施する。責任配列の絞り込みが思いのほか順調に進んだため
IL-7/IL-7レセプターネットワークの人為的制御による慢性大腸炎治療法の開発

本研究は、腸管免疫機構の破綻により発症すると考えられる慢性大腸炎、骨髄移植後移植片対宿主反応、サイトメガロウイルス腸炎等における病態解明および免疫異常の追求を行い、それを元に正常の腸管免疫組織の発生・分化、免疫抑制機構を追求する新しい試みを行うことを目的とするものである。本研究では、当初の研究計画に示した項目につき、下記に示すごとく大きな研究成果が得られた。骨髄移植後に移植片対宿主反応(GVHD)を早期発見するために大腸内視鏡によるスクリーニングを行った際、男性ドナーから骨髄移植を受けた女性レシピエントの腸管上皮生検組織を採取し、腸管上皮stem cellが骨髄由来であるかを確認するために性染色体XおよびYをFISHにより染色により追求した結果、女性レシピエントめ腸管上皮生検組織にはYFISH陽性細胞、すなわち男性ドナー由来の腸管上皮細胞が存在していることが明らかとなった。さらに、GVHDによる炎症部位では、男性ドナー由来の腸管上皮細胞が多数認められた。次に、この細胞がどのような細胞に分化しているかを検討した。GVHDを認めなかった検体では骨髄由来上皮細胞は吸収上皮で占められていたのに対し、急性もしくは慢性GVHDを認めた検体では神経内分泌細胞、肺細胞およびバネット細胞が増加していることを見いだした。次に、腸管局所免疫機構の特殊性を利用した新しい治療法の開発を目的として、慢性大腸炎モデルマウスの局所に浸潤しているIL-7レセプター(IL-7R)高発現の活性化粘膜内T細胞を標的として、抗IL-7R抗体に植物毒であるサポリンを結合させた抗体を作った。このサポリン結合抗IL-7R抗体を慢性大腸炎モデルマウスに投与したどころ著しい改善が認められた。この結果から、炎症局所に浸潤しているIL-7R高発現細胞を標的とした新規治療法の可能性が示唆された。今後は、さらなる新規治療法の開発や上皮細胞と粘膜内リンパ球の相互作用などを検討していく予定である。
統合失調症脆弱因子としてのPACAP遺伝子の分子基盤解析

多くの精神疾患は,遺伝的要因に環境要因が加わり発症する.本研究では,神経ペプチドPACAPの遺伝子欠損マウスが示す統合失調症関連の表現型が,様々な環境因子の負荷により可塑的に変化することを明らかにした.また同マウスの分子病態として,統合失調症患者でも認められる,セロトニン2A受容体の機能異常や神経突起スパインの形成異常を同定し, PACAP遺伝子の統合失調症脆弱因子としての意義を確立した.多くの精神疾患は,遺伝的要因に環境要因が加わり発症する.本研究では,神経ペプチドPACAPの遺伝子欠損マウスが示す統合失調症関連の表現型が,様々な環境因子の負荷により可塑的に変化することを明らかにした.また同マウスの分子病態として,統合失調症患者でも認められる,セロトニン2A受容体の機能異常や神経突起スパインの形成異常を同定し, PACAP遺伝子の統合失調症脆弱因子としての意義を確立した.本研究は、これまでに明らかにしてきた統合失調症脆弱因子としてのPACAPの分子基盤を確立することを目的として計画・実施し、平成21年度は以下の成果を得た。1)幼若期の豊かな環境飼育によりPACAP欠損マウス(PACAP-KO)の精神異常行動が改善されたが、感覚情報処理機機能障害は、改善効果を示さなかった。この改善効果のうち、学習・記憶障害に対する改善は、2週間の持続作用が確認できた。海馬におけるBDNFは、豊かな環境飼育により両遺伝型とも発現上昇を示したが、新生神経細胞の生存数では、PACAP-KOマウスで減少していた。2)マウス海馬由来神経培養細胞を用いて、PACAPにより神経細胞の突起の伸展、数の増加を確認した。3)交雑形式が仔マウスの表現型に影響を及ぼす可能性が見出されたため、期間の延長を行い、追加実験を実施した。その結果、母親マウスの遺伝子型の違いにより、仔マウスの行動量に差が認められることを確認した。遺伝子型に依存せずに、外部要因によってその行動に変化が生じることを示唆しており、遺伝子/環境相互作用を反映した興味深い結果である。この変化は、仔マウスを野生型継母マウスに養育させたところ、改善効果が示されなかったため、胎児期の母胎内暴露や母親由来のエピジェネティクスな変化が考えられる。引き続き検討を行う。4)定常状態では異常を示さないPACAPヘテロマウスにDOIによる5HT-2入力を行った結果、幻覚作用の増強や感覚情報処理機能障害を引き起こすことが認められた。これは、遺伝的素因だけでは発症せず外部の要因がさらに加わることで発症するという精神疾患の発症仮説にも合致した結果である。本研究は、これまでに明らかにしてきた統合失調症脆弱因子としてのPACAPの分子基盤を確立することを目的として計画・実施し、平成22年度は以下の成果を得た。1)統合失調症の病態の一部を反映したマウスであるPACAP欠損マウスの神経回路構築における異常を検討するため、初代培養神経細胞を用いて、神経発達の成熟期で見られるスパイン関連タンパク質PSD-95を指標とし免疫細胞染色を行ったところ、培養21日目のPACAP欠損マウス由来海馬神経細胞においてPSD-95陽性スパインの数の減少が認められた。また、8週齢のマウスの海馬CA1領域にてゴルジ染色を行ったところ、PACAP欠損マウスでは、野生型と比べ、スパイン数が減少するとともに異常な形態を持つスパインが多い傾向を示した。これらの結果は、PACAPが神経細胞の構築及び神経回路形成に関与している可能性を示すものである。2)これまで、5-HT2A/2C受容体作動薬であるDOIの投与により一部の表現型について野生型マウスとPACAPヘテロ欠損マウス間でその反応性に違いが生じることを見出している。そこで、神経活性化マーカーであるc-fosを指標にPACAP欠損により反応性が変化している脳領域の特定を行った。その結果、両遺伝子型ではmPFC, SSCx, BLA, PVNにおいてc-Fos陽性細胞数が上昇した。とくに、SSCxでは野生型に比べPACAPヘテロ欠損マウスにおいて有意に上昇しており、PACAP欠損によりDOI腹腔内投与に対する神経細胞活性化が亢進していることが示唆された。SSCxにおける異常と統合失調症との関連が示唆されていることから、PACAP欠損によるSSCxの機能変化は精神疾患の脆弱性に関与する可能性があると考えられる。本研究は,これまで明らかにしてきた統合失調症脆弱因子としてのPACAPの分子基盤を確立することを目的とし,23年度は以下の成果を得た.1)発達期における豊かな環境飼育でのPACAP欠損マウス学習記憶障害抑制作用は,少なくとも再び通常飼育とした14日後まで持続することを明らかにした.また生化学的検討から,PACAP欠損マウスの海馬特異的にNR2B発現量の増加,ERKおよびCaMK IIシグナルの活性化が生じることを明らかにした.以上の結果は,豊かな環境飼育によるPACAP欠損マウスの学習記憶障害抑制作用の分子機序として,海馬でのNR2B含有NMDA受容体の機能変化を介したERK,CaMK IIシグナルの活性化の関与を初めて示唆したものである.2)5-HT2AR・mGluR2/3複合体へのPACAPの関与を解析するために,5-HT2ARの細胞膜上での可視化を試み,刺激による細胞内動態を測定した.その結果,PACAPにより5-HT2ARの細胞内局在変化が認められた.

このことは,PACAPが特異的受容体PAC1を介して5-HT2ARに関与することを示唆する.3)5-HT2A/2CR作動薬DOIによりc-Fos陽性細胞数の上昇がみられたPACAPヘテロ欠損マウスの大脳皮質体性感覚野(SSCx)において,c-fosと5-HT2ARとの相関を調べた結果,増加したc-fosは,5-HT2ARを発現していない神経細胞であることが分かった.このことは、DOIによるhallocinogenicな作用が直接的にSSCxに作用するのではなく,他の神経回路や伝達物質を介した変化である可能性を示す.4)神経細胞のスパイン動態の分子基盤解明を目的として,PSD-95に蛍光蛋白質を融合させたプラスミドを作製し,生理的活性を持った発現を確認した.これを用いて,今後イメージング解析へと発展させることができる.
日本語と朝鮮語における文法化の生起要因に関する対照言語学的研究

日本語と朝鮮語における複合格助詞や複合動詞について詳しく考察すると,朝鮮語よりも日本語における方が文法化が生じている状況にあることが明らかになるが,文法化に関する両言語間のこの相違は,朝鮮語は語なら語,節・文なら節・文といったように,基本的には語と節・文の地位を区別する仕組みになっているのに対して,日本語は語と節・文が重なって融合している性質のものが存在する仕組みになっている,といった両言語間における形態・統語的仕組みの相違が起因していることが証明される。研究代表者の塚本は,特に日本語の複合格助詞「にとって」とそれに対応する朝鮮語の表現に着目して考察し,文法体系における複合格助詞と単一格助詞の位置づけについて次のことを明らかにした。(1)朝鮮語では,日本語の単一格助詞「に」に対応する単一格助詞ey; eykeyあるいは単一格助詞hantheyを用いて表現できるところを,日本語では単一格助詞「に」のみでは表現しきれない。(2)日本語の複合格助詞「にとって」は,それに含まれている「とる(取る)」という動詞が元々有する〈奪取〉という実質的な意味が失われ,〈関係〉という意味に転じてはいるものの,その動詞が有する意味により,単一格助詞「に」のみでは表現しきれないところをカバーしている。(3)朝鮮語の単一格助詞ey; eykeyは,文法体系の中心を占め,安定した様態となっているのに対して,日本語の単一格助詞「に」は,文法体系の中心からやや外れ,不安定な様態となっている。(4)上記(3)における両言語間の相違は,上記(1)(2)で指摘した両言語間の文法化の相違が大いにかかわっている。研究分担者の堀江は,次のことを明らかにした。第一に,日本語と朝鮮語の文法化のプロセスのどこまでが平行しており,どのような相違点があるかを明らかにすべく,両言語の文末名詞化構文(例:「のだ」)の機能拡張を言語類型論及び対照言語学の観点から分析した。第二に,両言語の連体形(例:「みたいな」)が定着して文法化するプロセスに着目し,連体形が終止形化することでどのような語用論的機能を獲得するに至っているかを歴史語用論の観点から分析した。第三に,両言語の受領動詞(「もらう/patta」)の補助動詞化の過程について機能類型論の観点から分析を行った。第四に,「見る」という動詞が抽象的な事態の発生を表す構文を構成している現象(例:「実現を見る」)に着目し,考察した。研究代表者の塚本は,特に日本語と朝鮮語における複合動詞の相違点に着目して考察し,次のことを明らかにした。(1)日本語の複合動詞には,後項主要部タイプの形態構造の場合と,前項主要部タイプの形態構造の場合があり,日本語においては,そのいずれの場合でも複合動詞として成立する。(2)朝鮮語では,後項主要部タイプの形態構造の場合には複合動詞として成立するのに対して,前項主要部タイプの形態構造の場合には,非常に限られた少数のものを除き,複合動詞としての成立が不可能である。(3)上記(2)は,新影山説に基づき,日本語と対照しながら朝鮮語の複合動詞について考察することによって導き出された帰結である。(4)上記(1)(2)にかかわる日本語と朝鮮語の間の相違は,これまで諸言語現象について考察して明らかにした,「文法化」を誘発する根本的な要因の一つとなっている「形態・統語的仕組みの違い」に依拠していると考えられる。(5)日本語における〈交替・交換〉を表す複合動詞「替える」とそれに対応する朝鮮語の表現にかかわる両言語間の相違についても,新影山説に基づいて適切に記述・説明することが可能となる。(6)日本語と朝鮮語における従属節と主節の相互関係,及び従属節のうち,特に名詞化を伴う文末の構文に着目すると,従属節と主節の間に双方向の機能拡張現象があるが,朝鮮語よりも日本語の方が双方向で機能拡張が生産的になされている。(7)日本語と朝鮮語における文末名詞文の談話機能やモーダル機能について分析を行うと,談話においては,日本語の「の(だ)」,朝鮮語の"kes(-ita)"が最も生産的に用いられるが,前者には,後者に見られない機能として,会話参与者が相互に同じ文末名詞文を繰り返して使用することより連帯感・共感を強化する,といった現象が見出される。研究代表者の塚本は,次のことを明らかにした。日本語では,文法化が生じている言語現象が比較的多いのに対して,朝鮮語では,文法化が生じている言語現象が比較的少なく,両言語間で文法化の進度の違いがある。朝鮮語は,基本的には語と節・文の地位を区別する仕組みになっているのに対して,日本語は,語と節・文が重なって融合している性質のものが存在する仕組みになっている,といった両言語間における形態・統語的仕組みの違いがある。

また,両言語間における文法化の進度の違いは,さらに根本的な要因である形態・統語的仕組みの違いと強く結び付いており,これに起因した結果のものがある。文法化は,このように形態・統語的仕組みが大いにかかわっている。両言語間における形態・統語的仕組みの違いは,次の2点が影響を及ぼしており,一要因となっている。1点は,文法体系における動詞連用形の位置づけが両言語間で異なる,ということである。動詞連用形は,朝鮮語では先行する節・文が一旦中止しながらも,後続する節・文にかかっていき,両者が接続される,といった用法が基本的であるのに対して,日本語ではそういった用法以外に,いろいろな文法現象に姿を現し,多様な用法を有する。もう1点は,動詞の接続形式の一つである中止形の種類が両言語間で異なる,ということである。日本語における動詞の中止形は,(A)「動詞連用形」と(B)「動詞連用形+接続語尾『て』」の2種類である。一方,朝鮮語では,動詞の中止形は,日本語の場合と同様である(A)「動詞連用形」と(B)「動詞連用形+接続語尾se」の2種類に加えて,(C)「動詞語幹+接続語尾ko」と(D)「動詞語幹+接続語尾mye」の2種類もある。研究分担者の堀江は,従属節の主節化については両言語ともに生産的であるのに対して,主節の従属節への浸透現象については朝鮮語よりも日本語の方が生産的であることを明らかにした。入手した言語学関係の図書・論文によって,これまでに行われてきた理論的なアプローチからの考察を検討し,入手した日本語と朝鮮語に関する参考書によって,まずは記述されている範囲内でそれぞれの言語の事実を確認した。研究代表者及び研究分担者の直感が効かない朝鮮語に関しては,それぞれの所属研究機関で母語話者に対して入念なインフォーマント調査を行い,従来の参考書には記述されていなかったり記述が詳しくなかったりする言語事実を明らかにした。それによって得られたデータと情報については,研究代表者と研究分担者の間でその都度,連絡をとって提供し合い,検討するとともに,思索中の研究代表者及び研究分担者自身の考えについて意見交換を行った。国内及び海外での学会に出席した際,またアメリカ合衆国の研究者のところ(ハーバード大学)に直接,出向くことによって,思索中の研究代表者及び研究分担者自身の考えについて研究者と議論し,また助言を仰いだ。また,研究代表者及び研究分担者の直感が効かない朝鮮語に関しては,それぞれの所属研究機関で母語話者に対して入念なインフォーマント調査を行い,従来の参考書には記述されていなかったり記述が詳しくなかったりする言語事実を明らかにした。さらに,それによって得られたデータと情報については,研究代表者と研究分担者の間でその都度,連絡をとって提供し合い,検討するとともに,思索中の研究代表者及び研究分担者自身の考えについて意見交換を行った。平成23年度と平成24年度に行った,基礎となるものを作り上げる作業((1)先行研究の検討,及び参考書に記述された言語事実の確認,(2)朝鮮語のインフォーマント調査による言語事実の解明)を継続して行う。そういったことにより,次のことを行う。
大脳皮質ニューロンの分枝・シナプス形成過程の研究

神経回路の基本的枠組みが発生プログラムに従って形成されるのに対して、細部構築は神経活動により修飾されると考えられている。後者の形成機構を研究するために、我々は大脳皮質2/3層での神経細結合に着目している。これまでの研究から、発達期に2/3層の錐体細胞から発する軸索側枝(水平軸索、horizontal axon)は同じ層に沿って伸長しながら、枝分かれを形成することが示されている。さらに、水平軸索の分枝形成には神経細胞の電気的活動が関与することも示唆されている。しかしながら、軸索の枝分かれ形成を引き起こす神経活動の特性や、それを仲介する分子機構についてはほとんど知られていないのが現状である。この問題に取り組むために、我々はラット大脳皮質切片を長期間培養し、GFP標識法を用いて個々の軸索の分枝形成を解析できる系を確立することによって、以下の問題に対して実験を行った。1)培養下においてもin vivoで形成されるのと同様な枝分かれが生ずるか?2)電気的活動度の増減によって枝分かれ形成が変化するか?3)軸索の形態変化を担う細胞内骨格タンパクの動態を制御する分子機構の関与は?実験を通して、次の3点が明らかになった。1)培養2週間で脳内で生ずるのと似た軸索分枝が形成される。2)チャネルブロッカーなどの慢性的投与により自発的発火活動を抑制することによって、分枝形成が減少する。3)small GTPaseの一種であるRhoの活性化体の遺伝子導入によって分枝形成が促進される。以上より、水平軸索の分枝形成は神経活動度の増減によって修飾されること、その細胞内機構としてRhoAが促進的に作用することが示唆された。大脳皮質における神経回路の構築において細部における最終的な枝分かれからシナプス結合までの過程は神経活動を介する因子によって制御されると考えらる。特に皮質の2/3層のニューロンから発する水平軸索はニューロンの活動度によってその結合パターンが変化し得ることが示唆されており、この問題を解明するのに適した系である。本研究では、まずその前段の研究として、枝分かれの形成機構をスライス培養下で個々の軸索の枝分かれを数日間追跡することによって調べた。また、本研究では双極電極を用いた新たなエレクトロポレーション法を開発し、それによって培養したラットの大脳皮質切片内の少数の細胞に蛍光タンパクのベクターを導入することを可能にした。生後0-1日目のラット大脳皮質切片を切り出し、無血清培地下で培養した。培養1-2週間後に、2/3層を水平方向に伸長する軸索(水平軸索)を蛍光タンパク質GFPによって標識し、共焦点レーザー顕微鏡を用いて経時的に(24時間ごと)観察した。その結果、以下の所見が得られた。i)培養1-2週間で表層の細胞から発する軸索は層と平行に走行し、1-2mm程度離れた場所で終末分枝を作り始める。ii)個々の枝は伸長・退縮を伴ってダイナミックに変化する。iii)培養13、14日目からはほとんど動かない固定化された枝が一部出現するようになった。以上のことから、水平軸索の分枝形成は成長や後退を含む動的な過程であることが示唆された。