hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
東アジアにおける小売商業と家族従業経営に関する実証研究

現在は、実証研究のフレームの構築及び国際比較の方法論等について精緻化を進めている。なお、以上の研究成果については、来年度4月に開催される日本商業学会関西部会例会において、第一回目の報告を行う予定である。本年度は、研究の中間年度として、初年度から行ってきた現地調査を継続するとともに、最終成果への準備を進めた。具体的な実施事項は主に次の3点である。第1が、中国(広州、長春)におけるヒアリング調査の実施である。広州は中山大学、長春は吉林大学の協力を得つつ調査を進めた。調査メンバーは本研究組織に関連領域を専門とする学識者を加えた17名である。広州では5箇所、長春では3箇所の商業集積・施設において現地の商人を対象としたヒアリング調査を行った。第2が、研究会の実施である。本研究組織に関連領域の学識者なども加えた約20名のメンバーの参加のもとに4回の研究会を開催し、調査研究の結果報告、仮説構築や分析枠組み・方法論等に関する議論等を行った。なお、そのうちの1回は、部外の専門家による研究講演会を開催し専門的知識の提供を受けた。第3が、学会における研究成果の報告と問題提起である。日本商業学会関西部会において、「東アジアにおける商人家族継承と商業政策」を統一テーマとした研究報告を行った。内容は、研究枠組みと問題意識の提示(高室他)、韓国・台湾の小売商の事業継承と商業政策に関する研究成果の報告(崔・簡他)、方法論の提示(坂下、他)、そして、学会員を交えたディスカッション(石原・石井・加藤他)である。これにより、我々の調査研究の仮説や得られた知見を広く学会に公表するとともに、今後の調査研究の展開に関する議論を深めた。以上のような調査研究を通して、同じ東アジアの国々ではあっても小売商人の経営行動や意識には微妙ではあるが大きな差異があるということが明らかになってきている。そうした知見から一つの仮説と研究フレームを整理した成果の一つが石井他(2007)である。これらも含め、最終的な検証と成果の提示を行うことが来年度の目的となる。最終年度にあたり、東アジア各国における大規模な質問票調査を実施した。また、これまでの調査研究を総括するべく研究会を行うとともに研究成果の公表を行った。具体的に行った事項は主として次の3点である。第1が、東アジア各国における質問票調査の実施である。調査対象国及び地域は、日本(大阪、神戸)、韓国(ソウル、釜山)、中国(温州、吉林、大連)、台湾(台北)の4カ国8地域である。本研究組織のメンバーによる直接実施に加えて各地域の各種団体への業務委託等による協力を得ることで、質問票の総配布数は合計5722票(日本:2477、韓国:2273、中国:672、台湾:300)、回収数は合計3372票(日本:1436、韓国:1184、中国:552、台湾:200)に及ぶ大規模なデータの取得を実現した。なお、これらのデータについては全てデータベース化するとともに集計結果をとりまとめている。第2が、上記質問票の最終的な設計と実施に関する調整、及びこれまでの研究の総括、並びにこれまでに残された課題であった日本の現状に関する専門知識の提供、以上を主たる目的とした研究会の実施である。
単毛髪微小断片の超高感度質量分析による毛髪内薬物挙動の解明及び薬物摂取日の特定

従来の毛髪中薬物の分画分析では、十分な検出感度を得るために数十本の毛髪を束ねた上で数cm間隔に分画するので、数か月レベルでの薬物摂取時期の推定しかできない。本研究では、単毛髪を0.5 mm以下(1日の成長速度に相当)の微小断片に輪切りにし、超高感度な質量分析計を用いて各断片から薬物を検出する。血中濃度推移との比較により、日数レベルでの毛髪内薬物挙動を解明する。さらに、毛髪採取の数週間前に一定間隔で指標物質を摂取し、薬物(摂取日不明)及び指標物質(摂取日既知)が検出される断片間の距離から、毛髪の成長速度も加味して薬物の摂取日を特定する。これにより、被疑者の供述等によらず科学的に日数レベルでの薬歴を把握でき、毛髪中薬物鑑定の証明力を向上できる。平成30年度は、倫理審査委員会の承認の下、被験者に市販薬(ジフェンヒドラミン等)を摂取させ、一定期間経過後、指標物質(クロルフェニラミン等)を2週間以上の間隔を空けて複数回摂取させた。更に数週間経過後、毛髪を採取した。1本の毛髪を0.4 mmに分画し、各断片をチューブに回収した。各断片に抽出液を添加し、10分間の超音波処理及び1日の浸漬により薬物を抽出し、質量分析計を用いて薬物濃度を測定した。各断片中の薬物濃度と毛髪部位情報を統合し、毛髪内薬物分布曲線を描いた。分布曲線上の指標物質のピーク間距離と摂取間隔から毛髪の成長速度を算出した。次に、薬物と指標物質のピーク間の距離と毛髪の成長速度をもとに薬物の摂取日を推定した。摂取薬物、被験者、毛髪の採取日等に関わらず、推定値と実際の薬物摂取日との誤差は2日以内であった。指標物質を用いることにより、薬物の摂取日を精度よく特定できることが実証された。計画どおり、薬物及び指標物質を摂取させた被験者の毛髪を分析し、異なる薬物、被験者、毛髪の採取日等においても、毛髪内の薬物と指標物質の分布間隔をもとに薬物摂取日を精度よく特定できるか検証できたため。薬物摂取から半年以上経過した後に採取した毛髪においても、薬物摂取日を精度よく特定できるか評価する。平成27年度は、単毛髪の0.5 mm以下の微小断片を正確に作製して容器に採取する方法、効率的に薬物を抽出する方法、薬物を高感度に検出する方法等を検討し、各条件を最適化した。計画どおり、単毛髪の微小断片から薬物を検出し、毛髪内薬物分布を可視化する方法を開発できたため。平成28年度は、倫理審査の承認の下、被験者に様々な市販薬(メチルエフェドリン、ジヒドロコデイン等)を摂取させ、毛髪及び血液を定期的に採取した。単毛髪を0.4 mmに断片化し、各断片から3段階の方法(表面洗浄、超音波処理、浸漬)により薬物を抽出し、質量分析計を用いて薬物濃度を測定した。各断片中の薬物濃度と毛髪部位情報を統合し、毛髪内薬物分布を2次元画像化した。また、血中薬物濃度を測定し、血中薬物濃度推移と毛髪内薬物分布の結果を比較することで、毛髪内の分布がどの程度血中濃度を反映しているか(毛髪への取り込み時期や量、毛髪内での拡散や脱落等の毛髪内挙動)を評価した。計画どおり、薬物摂取者の血液と毛髪を採取し、血中薬物濃度推移と毛髪内薬物分布との相関を調べることができたため。

従来の毛髪中薬物の分画分析では、十分な検出感度を得るために数十本の毛髪を束ねた上で数cm間隔に分画するので、数か月レベルでの薬物摂取時期の推定しかできない。本研究では、単毛髪を0.5 mm以下(1日の成長速度に相当)の微小断片に輪切りにし、超高感度な質量分析計を用いて各断片から薬物を検出する。血中濃度推移との比較により、日数レベルでの毛髪内薬物挙動を解明する。さらに、毛髪採取の数週間前に一定間隔で指標物質を摂取し、薬物(摂取日不明)及び指標物質(摂取日既知)が検出される断片間の距離から、毛髪の成長速度も加味して薬物の摂取日を特定する。これにより、被疑者の供述等によらず科学的に日数レベルでの薬歴を把握でき、毛髪中薬物鑑定の証明力を向上できる。平成29年度は、倫理的に摂取可能で、かつ毛髪から顕著に検出される物質を指標物質として選定するため、倫理審査の承認の下、被験者に様々な市販薬(ジヒドロコデイン、クロルフェニラミン等)を摂取させ、毛髪を採取した。1本の毛髪を0.4 mmに分画し、各断片をチューブに回収した。各断片に抽出液を添加し、10分間の超音波処理及び1日の浸漬により薬物を抽出し、質量分析計を用いて薬物濃度を測定した。各断片中の薬物濃度と毛髪部位情報を統合し、毛髪内薬物分布曲線を描いた。摂取日を反映して毛髪から顕著に検出されたジヒドロコデイン、クロルフェニラミン等の市販の風邪薬中の成分は、指標物質として適当であった。また、これらの薬物を一定間隔で摂取させ、そのいずれかを薬物又は指標物質とみなし、毛髪内の薬物と指標物質の分布間隔をもとに薬物摂取日を特定する方法を確立した。計画どおり、倫理的に摂取可能で、かつ毛髪から顕著に検出される物質を指標物質として選定し、毛髪内の薬物と指標物質の分布間隔をもとに薬物摂取日を特定する方法を確立できたため。平成30年度は、倫理審査委員会の承認の下、被験者に市販薬(ジフェンヒドラミン等)を摂取させ、一定期間経過後、指標物質(クロルフェニラミン等)を2週間以上の間隔を空けて複数回摂取させた。更に数週間経過後、毛髪を採取した。分布曲線上の指標物質のピーク間距離と摂取間隔から毛髪の成長速度を算出した。次に、薬物と指標物質のピーク間の距離と毛髪の成長速度をもとに薬物の摂取日を推定した。摂取薬物、被験者、毛髪の採取日等に関わらず、推定値と実際の薬物摂取日との誤差は2日以内であった。指標物質を用いることにより、薬物の摂取日を精度よく特定できることが実証された。計画どおり、薬物及び指標物質を摂取させた被験者の毛髪を分析し、異なる薬物、被験者、毛髪の採取日等においても、毛髪内の薬物と指標物質の分布間隔をもとに薬物摂取日を精度よく特定できるか検証できたため。平成28年度は、倫理審査の承認の下、被験者に様々な市販薬を摂取させ、毛髪及び血液を定期的に採取する。
学習意欲の喚起や持続に焦点をあてた教育用ソフトの評価手法の開発

本研究では、教育用ソフトの魅力を、学習意欲に関係する4つの要素(注意、関連性、自信、満足感)の支援の適切性としてとらえた。そして、学習者によるソフトの印象報告と学習者特性を組合せて分析することで、各要素の支援の適切性を計量的に評価する手法の開発を目指した。研究の次の手順で進めた。1.各要素でのソフトの支援の度合いを表す指標を求めた。(1)各要素に関係する印象の強さを学習者に評定法で答えさせる質問紙を作成した。(2)質問紙の試行結果に主成分分析を適用し、評定から各要素の支援の度合いを計算する式を求めた。2.各要素での学習者の支援必要度を表す指標を求めた。(1)各要素に関する学習者の特性を評定法で調べる質問紙を作成した。(2)質問紙の試行結果に主成分分析を適用し、評定から各要素の支援必要度を計算する式を求めた。3.各要素での支援の適切性を評価する手法の開発を試みた。1と2の質問紙を用いて、数種のソフトの評価情報を収集した。それをもとに、支援の度合いと学習者の支援必要度を算出をした。それらを2次元分割表で整理し、支援の適切性を評価する方法を考案した。これからは、本研究で開発した手法をさらに多くのソフトの評価へ適用し、その妥当性と信頼性を検討し、研究成果をまとめたいと考えている。
魚肉の死後軟化はストレス応答反応により誘発されるか?

本研究では,冷蔵中の魚肉におけるストレス応答性遺伝子と軟化関連遺伝子およびタンパク質の発現変動解析について検討した。特に1年目に冷蔵中のヒラメ筋肉での遺伝子発現変動が観察されたTIMP-2aおよびTIMP-2bに注目して,タンパク質レベルでの発現変動の検討を試みた。昆虫細胞系を用いた両TIMP-2の組み換えタンパク質に対して,それぞれを特異的に認識する抗血清を得ることができたが,ヒラメ筋肉抽出液を添加したウェスタンブロット分析を行った結果,目的のシグナルを観察することができなかった。TIMP-2aとTIMP-2bのアミノ酸配列は68%の相同性を持つほど高い類似性を有している。わずかに配列の異なる21-25アミノ酸程度の部位をグルタチオン-S-トランスフェラーゼとの融合タンパク質として作成し,抗血清の精製と濃縮を試みた。また,筋肉抽出液中のTIMP-2をReactive Red樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーで吸着,濃縮したが,両TIMP-2タンパク質のバンドを検出することはできなかった。一方,低酸素誘導性因子であるHIFおよび低栄養誘導性因子であるRaptorといったストレス応答性遺伝子については顕著な発現変動は観察されなかった。以上のことから,死後冷蔵中には,少なくとも低酸素や低栄養応答性因子の劇的な発現変動は生じないこと,またそれらのシグナルが軟化関連遺伝子の発現変動へ直接影響している可能性が低いこと,さらに軟化関連遺伝子産物の発現量は極めて低レベルであることが明らかとなった。本研究では,1.冷蔵中の魚肉におけるストレス応答性遺伝子と軟化関連遺伝子およびタンパク質の発現変動解析,2.培養細胞へのストレス負荷による誘導遺伝子の解析を目的としており,1年目は主に1.について検討した。まず,ストレス応答性遺伝子として低酸素応答性遺伝子(HIF)に注目した。遺伝子発現解析のプローブ調製とタンパク質発現解析のための抗体調整を目的として,10種以上のDegenerateプライマーを設計してPCRを試みたが,ターゲットとしたヒラメでは,断片の増幅は見られなかった。そこで,すでにニジマスでクローン化された遺伝子配列利用することとし,組換えタンパク質を作製して抗原にし,特異的抗体を調製した。一方,低栄養ストレス応答性遺伝子としてRaptorの遺伝子クローニングを試み,遺伝子断片を得ている。2年目にこれらのプローブを用いて,死後冷蔵中に生じる遺伝子およびタンパク質の発現変動を解析する予定である。また,軟化関連遺伝子として,マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)とその組織阻害タンパク質(TIMP)に注目し,冷蔵中に生じる遺伝子発現の変動について検討した。用いたプローブの設計の問題のためか,MMP-9は発現遺伝子を検出することが出来なかった。それ以外のMMP-2,TIMP-2a,TIMP-2bの3種とも死後1日以内に遺伝子発現の減少が観察されたが,2種のTIMP-2と比較してMMP-2の減少程度は少なかった。今後タンパク質レベルでの発現変動を検討する。
黄色ブドウ球菌の糖代謝系の薬剤感受性に及ぼす影響についての研究

黄色ブドウ球菌のメチシリンおよびバンコマイシン感受性と糖の代謝系との関連性について明らかにするため、以下の点について検討を行った。1)PTSシステム欠損株の作製および薬剤感受性:黄色ブドウ球菌ゲノム上に存在するグルコース、グルコサミン等のPTSシステム17個欠損株の作製を行った。種々の薬剤に対する感受性について検討した結果、著名に感受性が変化した株は認められなかった。2)CcpA変異株の作製および発現解析:グルコース代謝のグローバル調節性因子のCcpAの変異株を作製し、薬剤感受性試験を行った。結果、メチシリンの耐性度の減少が認められた。また、マイクロアレイ解析によりCcpAの結合配列(Cre配列)を有する遺伝子の中で実際にCcpAにより発現に変化を及ぼす因子が同定できた。また、CcpAの欠損により影響を受ける遺伝子群の同定ができた。3)GlmSリボザイムの解析:RNAレベルでどの部分が分解活性に必要かを検討するため、orf上流域における種々の長さのプロモーター領域を作製し、XylEリポーターシステムベクターに組込みこんだ株を作製し検討した結果、プロモーターとorf開始点の間およそ300bpの領域が重要である事が判明した。また、N-アセチルグルコサミン添加によるglmS-mRNAのリボザイム活性による特異的部位切断活性について定量性PCR法で検討した結果、N-アセチルグルコサミン添加により切断活性は増大したが、glmS-mRNAそのものの分解能も増大していることが明らかになった。4)種々の糖添加によるマイクロアレイ解析:グルコース、フルクトース、ラクトース等の種々の糖を添加した際の発現解析をマイクロアレイにより検討し、それぞれの糖に関与するPTSを明らかにした。また、種々の糖存在下での特異的に変化する因子についてもスクリーニングが行えた。黄色ブドウ球菌のメチシリン耐性度の多様性およびバンコマイシン低感受性の機序の解明を目的として、糖の代謝系の関与について検討を行った。1)PTSシステム欠損株の作製および薬剤感受性:黄色ブドウ球菌ゲノム上に存在するグルコース、グルコサミン等のPTSシステム17個および糖の取り込みに関与するグローバル調節性因子であるCcpAの欠損株の作製を行った。CcpA変異株については種々の薬剤に対する感受性について検討した結果、メチシリン耐性ブドウ球菌におけるβラクタム剤の感受性が減少した。PTSシステム変異株は一部作製中であり、作製後種々の検討を行う予定である。2)GlmS転写調節に影響を与える因子の解析:タンパクレベルではN-アセチルグルコサミン添加により発現量の減少が認められたが、GlmSのmRNAレベルでの発現量に変化があるかについて検討した。リボザイム活性部分を除いたプロモーター領域を組込んだレポーターシステムによる検討の結果、発現量の著名な変化は認められなかった。以上より、GlmSの発現レベルは主としてmRNAができた後に分解を受けることにより起こる事が示された。したがって、トランスポゾンによるGlmS転写活性変異株の分離は困難である事が予想され、リボザイムとしての解析に重点をおくことにした。3)GlmSリボザイムの解析:mRNAレベルでどの部分が分解活性に必要かを検討するため、orf上流域における種々の長さのプロモーター領域を作製し、XylEリポーターシステムベクターに組込みこんだ株を作製し検討した結果、プロモーターとorf開始点の間およそ300bpの領域が重要である事が判明した。今後さらに詳細に検討していく予定である。このような結果を踏まえ、次年度はPTSシステムの関与、GlmSのリボザイム解析についてさらに検討していきたい。

黄色ブドウ球菌のメチシリンおよびバンコマイシン感受性と糖の代謝系との関連性について明らかにするため、昨年度に続き以下の点について検討を行った。1)GlmSのリボザイム解析:昨年度のglmSプロモーター解析の結果に基づき、種々のリボザイム領域の欠損したglmS遺伝子を作製し、黄色ブドウ球菌の系でGlmSの発現解析を行った。その結果、リボザイム領域を一部でも欠損することでN-アセチルグルコサミン添加によるGlmSの発現量の減少は抑制された。また、N-アセチルグルコサミン添加によるglmS-mRNAのリポザイム活性による特異的部位切断活性について定量性PCR法で検討した結果、N-アセチルグルコサミン添加により切断活性は増大したが、さらに特異的部位のみではなくmRNAそのものの分解能も増大していることが明らかになった。2)PTS変異株の作製・性状解析:昨年度に引き続きPTS欠損株の作製を行った。結果、12株についての欠損株を作製した。メチシリン等の薬剤感受性試験を行ったが通常の顕著に変化した株は認められなかった。3)CcpA変異株の作製および発現解析:グルコース代謝のグローバル調節性因子のCcpAの変異株を作製し、薬剤感受性試験を行った。結果、メチシリンの耐性度の減少が認められた。また、マイクロアレイ解析によりCcpAの結合配列(Cre配列)を有する遺伝子の中で実際にCcpAにより発現に変化を及ぼす因子が同定できた。また、併せてCcpAの欠損により影響を受ける遺伝子群の同定ができた。4)種々の糖添加によるマイクロアレイ解析:グルコース、フルクトース、ラクトース、ガラクトース等の種々の糖を添加した際の発現解析をマイクロアレイにより検討し、それぞれの糖に関与するPTSを明らかにした。また、種々の糖存在下において特異的に変化する因子についてもスクリーニングが行えた。
微小乳頭肺腺癌の生物学的特性の解明と腫瘍特異的マーカーの獲得

肺の微乳頭腺癌(MPPAC)の生物学的特性の解明とその鑑別マーカー獲得のため、MPPAC細胞株の癌幹細胞様細胞を樹立し、2次元電気泳動法による解析を行った。同定されたタンパク質であるNAP1L1について、肺癌における診断的有用性を評価するため、肺癌組織を用いて免疫染色を行った。その結果、腺癌でのNAP1L1発現は分化度、腫瘍径、病理学的ステージ、リンパ節転移、リンパ管侵襲、血管侵襲、そして予後不良と有意に相関していた。多変量解析の結果からNAP1L1は独立した予後不良因子であった。以上より、NAP1L1は腺癌の悪性度や予後予測マーカーとして有用であることが示唆された。MPPAC細胞と非MPPAC細胞の遺伝子発現の比較を行うため、A549、LC2/ad、及びMPPAC細胞を用いて、GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0による遺伝子発現アレイ解析を行った。結果、MPPACのみで発現していた遺伝子は1430個検出され、神経内分泌特性と関わりの深いINSM1やASCL1といった遺伝子が高発現していた。また、上記で検出した遺伝子群の制御機構を確認するため、同じ細胞株のtotal RNAを用いてmicroRNAを対象としたアレイ解析を行った。結果、MPPACのみに発現が認められたmicroRNAは34種、一方、MPPACのみに発現が認められなかったのは26種であった。MPPAC細胞で高発現していたmicroRNAには肺腺癌でRhoGDI1やALCAMを標的として浸潤や転移を促進するmiR-483-5pも含まれていた。遺伝子発現アレイ解析とmicroRNA array解析の結果の関連性についてはデータベース検索と文献を中心に鋭意調査中である。さらに、MPPACの発生のメカニズムや起源などの生物学的特性の解明や肺癌の癌幹細胞マーカーの獲得を目的として、山中4因子であるSox2、KLF4、Oct3/4、c-Mycをウイルスベクターを用いてMPPAC細胞に導入するという手法を用いた癌幹細胞化の検討を行った。これら4因子を加えた細胞は親株であるMPPAC細胞に比べ、癌幹細胞性の指標となるアルカリフォスファターゼやアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ABCG2、nestinといった発現が高く、また肺の発生の初期にしか発現しないpodoplaninを発現していたことから、この細胞を癌幹細胞の特徴を有するMPPAC-4F細胞として樹立した。このMPPAC-4F細胞と親株であるMPPAC細胞を比較することで、癌幹細胞の特徴を示す遺伝子あるいはタンパク質が同定可能であると考え、現在、両者のタンパク質を用いた2次元電気泳動法による発現解析を行っている。その結果、両者で発現量に1.2倍以上の差を認めたタンパク質スポットは96個存在した。現在、これらのスポットのタンパク質同定を進めている。昨今、癌組織中に存在する癌幹細胞は治療や浸潤・転移など癌の悪性度に関与していることが多くの論文で報告されている。しかしながら、組織中の癌幹細胞は非常に少数であり、組織を用いた検討では純粋な癌幹細胞の研究は難しい。そこで我々はMPPACの生物学的特性の理解を深めること、さらに肺癌の癌幹細胞マーカーの獲得を目的として、山中4因子であるSox2、KLF4、Oct3/4、c-MycをMPPAC細胞にウイルスベクターを用いて導入したMPPAC-4F細胞株の樹立を行った。樹立したMPPAC-4F細胞の癌幹細胞性を確認するため免疫染色や免疫ブロット法などの検討やマウス移植腫瘍を用いた確認実験など、これらの検討に時間を割く必要があった。そのため、アレイ解析により選出された個々の遺伝子に対する浸潤や転移との関連性の評価を行うまでには至らなかった。27年度に山中4因子を微小乳頭肺腺癌細胞株に導入することで作製した癌幹細胞様細胞(MPPAC-4F)とその親株(MPPAC)のタンパク質発現を二次元電気泳動法にて比較した結果、発現量に1.2倍以上の差を認めた96個のタンパク質スポットを検出した。28年度はまずこれらのタンパク質スポットを質量分析装置を用いてタンパク質を同定した。その中で、MPPAC-4F細胞で高発現していたCofilin-1、NAP1L1、ARF1、ZFAND3について、肺癌組織マイクロアレイを用いて肺腺癌における発現を免疫染色法にて評価した。Cofilin-1は核陽性症例と分化度に関して有意な相関が認められた。また、NAP1L1発現は分化度、腫瘍径、病理学的ステージ、胸膜浸潤、リンパ管浸潤、血管浸潤と有意な相関が認められた。さらに、ARF1発現はリンパ節転移とリンパ管浸潤で有意な相関が認められた。一方、ZFAND3発現は臨床病理学的因子と有意な相関が認められないものの、ZFAND3高発現群が低発現群に比して予後不良であることが分かった。多くの臨床病理学的因子との高い相関性を示したNAP1L1発現について、予後との関連を調べるため、多数例の新たなコホートにおける肺癌組織を用いてNAP1L1発現を検証した。その結果、肺癌組織マイクロアレイを用いた場合と同様にNAP1L1発現は分化度、病理学的ステージ、リンパ節転移、胸膜浸潤、リンパ管浸潤、血管浸潤と有意な相関を示した。

また、肺腺癌症例をNAP1L1染色スコアの中央値を境に2群に分けて予後を評価したところ、NAP1L1低発現群に比して、高発現群では有意に予後不良であった。さらに、COX比例ハザード回帰モデルを用いた多変量解析の結果、NAP1L1発現は独立した予後不良因子であることも分かった。癌幹細胞様細胞を用いたプロテオーム解析の結果、両者で発現量に差のあるスポットを同定し、いくつかのマーカー候補タンパク質を検出した。その中でNAP1L1はその発現が各種臨床病理学的因子と相関しており、予後不良とも関連していることが明らかとなり、多変量解析の結果からもNAP1L1が独立した予後不良因子であることが示された。実験計画では選出された分子について、増殖能や浸潤能、遊走能などをsiRNAを用いた実験により評価する予定でいたが、そこまでには至らなかった。2017年度までの研究において癌幹細胞様細胞(MPPAC-4F)とその親株(MPPAC)の二次元電気泳動法を用いたプロテオーム解析により、MPPAC-4F細胞で高発現していたNAP1L1を見出し、193例の肺癌組織を用いた免疫染色により肺腺癌において、分化度、腫瘍径、病理学的ステージ、胸膜浸潤、リンパ管浸潤、血管浸潤と有意な相関が認め、さらに独立した予後不良因子であることが分かった。本年度はNAP1L1発現と肺腺癌における悪性度との関係を明らかにすることを目的として、siRNAを用いてNAP1L1の発現抑制実験を行った。初めにsiRNA処理条件の至適化を行うため、リアルタイム定量RT-PCR法、並びにウエスタンブロット法による確認を行い、NAP1L1の発現が十分に抑制される処理濃度と処理時間を決定した。次にその条件を用いて、細胞の増殖能を測定するためのMTSアッセイと細胞の遊走能(運動能)の変化を調べるためのWound healing assay(創傷治癒アッセイ)を行った。MTSアッセイでは、NAP1L1発現を抑制していないコントロール細胞に比して、NAP1L1の発現を抑制した細胞では有意な増殖速度の低下を認めた。また、創傷治癒アッセイでは、コンフルエントな状態の単層培養細胞に一定の幅の引っかき傷をつけ、その後、傷の修復具合を測定し比較したところ、コントロール細胞に比べNAP1L1の発現を抑制した細胞では有意に遊走能が低下していた。これらのことから、NAP1L1は肺腺癌の診断マーカーとしてだけでなく、増殖能と遊走能に直接的に寄与している可能性が示唆された。さらに、NAP1L1はMPPAC-4F細胞の培養上清タンパク質を用いたウエスタンブロット法の結果から、培養上清中へのNAP1L1の分泌が確認され、今後、血清診断マーカーとしての有用性についても検討していく。肺の微乳頭腺癌(MPPAC)の生物学的特性の解明とその鑑別マーカー獲得のため、MPPAC細胞株の癌幹細胞様細胞を樹立し、2次元電気泳動法による解析を行った。同定されたタンパク質であるNAP1L1について、肺癌における診断的有用性を評価するため、肺癌組織を用いて免疫染色を行った。その結果、腺癌でのNAP1L1発現は分化度、腫瘍径、病理学的ステージ、リンパ節転移、リンパ管侵襲、血管侵襲、そして予後不良と有意に相関していた。多変量解析の結果からNAP1L1は独立した予後不良因子であった。以上より、NAP1L1は腺癌の悪性度や予後予測マーカーとして有用であることが示唆された。
水素結合分子集団の量子振動状態に関する新規高精度シミュレーション手法の開発

水分子系を念頭におき、水素結合分子集団の量子状態の計算を厳密に実行するシミュレーション手法の開発を行った。このシミュレーション手法は変分経路積分法にその基礎をおき、本研究では運動方程式を用いて計算を実行する分子動力学法およびハイブリットモンテカルロ法の開発を行った。またシミュレーションパラメータの探索に有用と考えられる、調和振動子系に対する解析解の導出もあわせて行った。本手法は、水素分子クラスターおよび水1分子の系に対して適用され、その有効性が明らかになった。このことにより本シミュレーション手法は水素結合分子集団に対する大いに有望な量子シミュレーション手法であることが示された。水分子に対して変分経路積分分子動力学計算を実施した。水分子の振動状態を記述するための試行関数に関していくつかの変分パラメータのセットを準備し,各セットに対する計算を実行することにより,試行関数の質の計算効率等への影響を検討した。変分経路積分法は,たとえ貧弱な試行関数を用いても,自動的に正しい基底状態を取り出すことが理論的にわかっている。実際,計算を実施して驚いたことは,水分子が解離してしまい束縛状態を記述できないような試行関数を用いても,変分経路積分計算を行うことにより数値的な正解が得られたということである。このような数値的な頑強さは,自由度が大きくなり精密な試行関数の構築が難しくなるような場合にも,安心してこの手法を適用することができることを意味しており,大きな利点の一つとなる。一方,最適化が進んだ変分パラメータのセットを用いると,予期されたことではあるが,計算効率は大幅に改善されることがわかった。つまり,効率的に多自由度系の計算を実施するためには,試行関数の最適化が重要であることを定量的に示した。変分経路積分法の効率的な実施のために、調和振動子の系に対して解析的な表式を導出した。特に計算機シミュレーションの観点からは、密度行列の離散化した表示が重要な役割を果たすのであるが、いままで知られている2次近似の表現をもちいて擬分配関数および物理量を閉じた形で求めて、シミュレーションの数値結果と比較検討をした。さらに4次近似のもとでの密度行列を新たに導出し、擬分配関数等を求めることに成功した。解析的な表式から、今まで経験的に知られていた、4次近似の計算効率に関する性質を確認することができた。これらの解析的な表現は、最適なシミュレーション条件の探索指針となることが期待される。水素分子クラスターの変分経路積分分子動力学計算を実施した。クラスターのサイズは、N=3のような小さなところからN=20程度の中規模サイズ領域までをカバーしている。古典的な計算からは、N=7, 13が安定な構造であることが示されており、いわゆる魔法数に対応する。量子効果を取り込むと、運動エネルギーの寄与によりN=7にあった化学ポテンシャルの極小が消失した。計算した範囲内ではN=13には浅い極小が存在しているので、このサイズは魔法数のクラスターと呼んでもよいであろう。またこの計算では、射影演算子の離散化した経路積分表示を得る際に高次分解の方法を用いており、この手法の有効性が水素分子クラスターに対しても示されている。このような非調和性が強くまた量子効果が大きい系は、振動SCF法のような基底関数ベースの方法では信頼性のおける結果を得ることができないために、本研究で開発されている方法の重要性が明確に示された。またプロトン化した水クラスターの経路積分分子動力学計算を実施した。本研究は、通常の経路積分計算であり、変分経路積分計算を実施するための予備計算も兼ねている。計算を実施した温度は、室温に近い高い温度領域であるが、特にプロトン移動を記述する反応座標に関する分布には強い量子効果が見られた。構造に関しては、古典近似および量子化した場合、共に開いた構造が主であったが、低温になると大きく異なってくることが予想される。低温での計算が待たれるところである。水分子クラスターに代表される水素結合クラスターの基底状態の効率的なシミュレーション手法として変分経路積分ハイブリットモンテカルロ法の開発を行った。計算コストを支配しているパラメータのひとつに虚時間スライスの数があげられるが、本研究では通常用いられるものより高次の近似を採用することにより、精度を下げることなく虚時間スライスの数を減らすことを可能とした。また高次近似に基づく分子動力学法・ハイブリットモンテカルロ法ではポテンシャル関数のヘッセ行列の情報が必要である。これは変分経路積分サンプリングをする際の有効相互作用の部分にポテンシャルの勾配の情報が含まれていることによる。本研究では、粒子間の相互作用と相互作用のグラディエント部分を分割して取扱い、運動方程式によるシステム自由度のアップデートには前者の相互作用の部分を用い、メトロポリス関数による配位の採択・棄却のステップではグラディエントの情報を含む完全な有効相互作用を用いるマルチレベルのハイブリットモンテカルロ法を構築した。

これにより運動方程式を数値的に解く際にヘッセ行列の計算を回避することができる。分子動力学法、ハイブリットモンテカルロ法、マルチレベルのハイブリットモンテカルロ法を水分子に適用し、計算効率の検討をすることにより、効率的なパイブリットモンテカルロパラメータの探索を実施した。経験ポテンシャルを用いた少数分子の系では、大きな効率の差は認めれなかったが、電子状態を同時に計算する場合や、多分子クラスターに対しては、マルチレベルのハイブリットモンテカルロ法が大いに役立つことが期待される。理論分子科学量子振動状態を記述する試行波動関数の質が、変分経路積分計算の効率に及ぼす影響については、水分子に対して実施し、この方向の努力はおおむね順調に進展している。一方、多分子系での試行関数の構築に関して、実装に向け問題点を検討中である。振動子系に対する変分経路積分の擬分配関数等の解析的な表式を得ることに成功し、シミュレーションに関する最適なパラメータに関する知見が蓄積しつつあり、多分子系のシミュレーションの準備はおおむね順調に進展している。現在は、多分子系の効率的なシミュレーション手法の構築に向け、準備中である。試行関数から厳密解を取り出す射影演算子を構成するための近似について、水素分子クラスターに対して適用してその有効性は示されており、この方向の努力はおおむね順調に進展している。一方、水クラスターを念頭おいた試行関数の構築に関しては、実装に向けて現在問題点を検討中である。今後は、多分子系の試行関数の構築を進めるとともに、分子系を記述する断熱ポテンシャル面を電子状態理論を用いて系統的に改善する手法について検討する。今後は、水クラスターの対して本量子シミュレーション手法を適用するためのプログラムの拡張を実施する。また、計算効率に大きく影響をおよぼす試行関数について詳細に検討する。水素分子クラスターを中心に方法の開発・応用はおおむね順調に進展している。今後はガウス関数をもとにした水素結合分子系の試行波動関数の構築に注力する。今年度までに得られた結果を発表するための旅費に主にあてる予定である。昨年度に水分子集合体の量子状態に関するシミュレーションを実施するとともにシンポジウムにおいて発表する予定であったが、事前に計算条件を詳細に確定する必要性が生じたため、計画を変更しまずは水1分子および解析的に解けるモデルの詳細な解析をおこなうこととしたため、未使用額が生じた。このため、水分子集合体の量子振動解析とシンポジウムでの発表を本年度に行うこととし、未使用額はその経費にあてる。今年度までに得られた結果を発表するための旅費を中心に使用する予定である。
骨芽細胞分化時におけるアルカリフォスファターゼ遺伝子の特異的転写調節領域の同定

骨芽細胞とその前駆細胞を区別する基本的な性質の一つにアルカリフォスファターゼ(ALP)の発現があげられる。今回の研究で、クローン化したALP遺伝子の転写調節領域を骨芽細胞およびその前駆細胞で検討した。マウスALP遺伝子の1Aエクソンの5′上流配列1.9kbをルシフェラーゼ遺伝子の上流に繋ぎ、骨芽細胞様細胞MC3T3-E1(E-1)細胞、その前駆細胞モデルであるC3H10T1/2(10T1/2)細胞,線維芽細胞株NIH3T3細胞(NIH)に導入し、ルシフェラーゼ活性によってその転写活性能を検討した。E-1,10T1/2,NIHの何れにおいてもALP1A-1.9kb領域は転写活性を有し、その転写促進能は主に-625bpから-660bpの間(segment A)、および-250bpまで(segment B)の2カ所に依存していた。ゲルシフト法により、segment Aに結合する物質がE-1,10T1/2,NIHの何れにも存在することが確認された。一方、Bone morphogenetic protein 2(BMP-2)は10T1/2細胞にALP遺伝子の発現を誘導するが、その作用を代替できるBMP受容体タイプ1Aの構成的活性化変異体を同時に細胞に発現させるとsegment Aの転写活性はむしろ低下し、segment Bでの転写活性は増強した。以上から次のように結論した。1)ALP遺伝子の骨芽細胞特異的な転写は上流1.9kbまでのDNA配列のみに依存するのではなく、異なる転写制御機構があると考えられる。2)ALP遺伝子の高発現にはsegment Aが重要であり、今回検討した細胞株に結合するトランス因子が存在する。3)ALP遺伝子の発現にBMP-2のシグナリングはsegment Aを介して、抑制的に、segment Bを介して促進的に働く可能性が示唆される。
時間領域透過法（ＴＤＴ）による土壌水分・ＥＣ計測手法の検討

時間領域透過法(TDT)による土中の体積含水率およびバルク電気伝導度(EC)の同時計測システムの構築・実用化を図るために,1システム設計のための土壌電磁物性データの取得,2TDT計測システムの構築,3システムの有効性検討などを段階的に実施しだ。また,得られた知見に基づき,SDI-12プロトコル対応の低価格TDT計測システムを構築したところ,極端な高EC条件や低EC条件を除けば,同システムを用いて広範な水分・EC条件下における水分量・ECの同時計測が可能であることが判明した。また,適切な校正を行えば,問題が生じたEC条件においても同システムを適用することが可能であることを見出した。H.24年度は,以下の点について検討を行った。1広帯域信号を用いたTDTの性能評価:H.23年度に製作したガイド付きセンサー,計測システム,チャンバー等を用いて,(a)水分量と電気伝導度を調整した砂を対象に,TDTによる信号計測実験を行った。条件の異なる様々な砂の透過信号を解析した結果,信号の伝播速度と水分量,また信号強度とバルク電気伝導度との間に,相関性が認められることが明らかになった。2土壌水分およびECの同時計測モデルの構築:1の実験結果に基づき,TDTによる土壌水分および溶液電気伝導度の同時計測モデルを構築し,構築したモデルに基づく両者の測定精度・測定限界を実験的に明らかにすることができた。この取り組みを通じて,極端な高バルク電気伝導度条件を除けば,TDTは従来のTDRよりもはるかに単純な信号解析アルゴリズムに基づき,両者を比較的高い精度で決定することが可能であることが判明した。H.25年度は,土壌水分・EC計測技術としての時間領域透過法(TDT)の実証を目標として,以下の3項目について検討を行った。1SDI-12型TDT計測システムの構築:SDI-12プロトコルを利用して,高性能マイクロチップを搭載したTDTセンサーと通信できるインターフェイスおよびTDT波形解析プログラムを開発し,同システムによる土壌水分およびバルク電気伝導度(EC)の同時計測の可否と,その測定限界・精度について実験的に明らかにした。2TDT計測システムの適用限界の改善:構築したTDT計測システムは,極端に高いECを示す土壌においては機能せず,また低EC条件においては精度よくバルクECを決定することができなかった。そこで,特殊コーティングをセンサー感知部表面に施した特殊TDTセンサーを開発するとともに,信号解析アルゴリズムの改良を図り,測定限界の拡大とバルクEC計測の高精度化の両者を実現した。3TDT観測システムのフィールド観測への応用:当初の計画よりも早くTDT計測システムを構築することができたため,同システムを重粘土水田土壌のモニタリングに適用し,その有効性を検討した。特殊な誘電特性を示す粘土-水混合系には,TDRを含めたあらゆる技術が通用しないことが知られているが,本システムを適用することにより,重粘土のような特殊土壌においても,水稲生育初期段階における不可逆的な土壌の乾燥・収縮現象の効果的に捉えられることが判明した。3年計画の初年度にあたる平成23年度は,時間領域透過法(TDT)による土壌水分・EC計測法を確立するための基礎知見の収集,すなわち次の(1)(3)の検討を行った。(1)ガイド付き小型TDTセンサーの製作:同軸ケーブル,コネクタ類,ステンレス鋼等を用いて,小型TDTセンサーを製作した。センサーの感知部長は5cm,10cm,20cmの3種類とし,以後,これらをガイド付きセンサーと称する。(2)ガイド付きセンサーの影響領域の評価:誘電特性の異なる種々の薬品で満たした容器内に自作したガイド付きセンサーを設置し,高周波マイクロ波信号発生器およびオシロスコープを用いて,各薬品のTDT波形を取得した。そして,波形から信号伝播速度(v)を算出するとともに,容器内壁面-センサー間距離とvとの関係より,各センサーの影響領域を評価した。(3)土壌中のマイクロ波信号の複素誘電スペクトルの計測:誘電分光法を利用して,水分量および導電性の異なる土壌の複素誘電率を,50GHzを計測の上限値として測定した。粒径の大きな土粒子を多量に含む砂質土壌においては,センサーとサンプルとの接触が不十分であったことが原因で,高精度の複素誘電スペクトルを得ることができなかった。しかし,粘土画分を多量に含み,流動性の高い粘土質土壌においては,異なる水分量・EC条件下で複素誘電スペクトルの計測に成功した。このスペクトルに基づき,v値が特異な応答を示す周波数を探索した。当初の予定に沿って概ね順調に研究は進んでいること,また学会発表(2件)や論文を投稿中であるなど成果も挙がっているため。一部の土壌において,計測上の問題が生じたが,概ね当初の計画通りに研究がすすんでいるため。H.25年度は,以下の2点について検討を行うこととする。

1TDTの利便性向上のためのソフト・ハードウェアの整備:マイクロ波・ミリ波工学分野の間瀬淳特任教授(九州大学産学連携センター),伊藤直樹博士(宇部高等専門学校),Scott Anderson会長(Acclima社)らと共同で,野外計測に適したTDTセンサーおよびその観測システム(インターフェイス,プログラムなど)を開発する。2開発したTDTシステムの有効性の検討:1の取り組みを通じて開発した計測システムを水田・畑地に設置し,土壌モニタリング法としてのTDTの有効性を実証する。本研究は,時間領域透過法(TDT)による土壌水分・EC計測法の確立を目標として,(1)基礎知見の収集,(2)計測システムの開発およびその実証,(3)実用化に向けたハードウェア開発の順に,3ヵ年計画で段階的に研究を推進するものである。平成23年度は,概ね当初の計画通りに研究がすすんだことから,平成24年度は,研究計画に従って(2)の内容について検討を行う予定である。本年度は,1TDT計測システムの構築およびその実証と,2研究成果の公開に研究費を充てる予定である。特に,本年度は3ヵ年計画の最終年度にあたることから,土壌物理学会(2件),日本生物環境工学会(1件),米国土壌科学会(1件)において研究発表を行うとともに,農業農村工学会論文集に学術論文を投稿するなどし,研究成果の発表・報告に可能な限り多くの研究費を充てたいと考える。平成24年度は,TDT計測システムの開発およびその実証を目的として,次の2項目について検討を行う予定である。(1)広帯域信号を用いたTDTの性能評価:前年度に製作・利用したガイド付きセンサー,計測機器,チャンバー等を用いて,(a)広帯域信号を利用したTDTによる土壌水分・EC計測実験を行い,モニタリング手法としてのTDTの有効性を検討する。(2)狭帯域信号を用いたTDTの実証試験:前述((1))の計測システムの信号伝送路上に,所定の周波数成分のみの通過を許すフィルターを設置して,信号調整機能を有するTDT計測システムを構築したうえで,(1)と同一の計測実験を反復する。そして,誤差評価・校正,計測限界評価などを行うとともに,広帯域信号を用いたTDT((1))との比較を行う。
インスリン/IGFシグナルを修飾するIRSのモノユビキチン化の制御機構の解明

代謝調節/成長促進に重要なインスリン/インスリン様成長因子(IGF)の細胞内シグナルは、インスリン受容体基質(IRS)を介して伝達される。申請者らは、「IRS2がモノユビキチン化を受けるとインスリン/IGFシグナルが増強する」という現象を見出し、さらに、IRS2のモノユビキチン化の過剰な減弱/増強がインスリン/IGFシグナルの過剰な減弱/増強を引き起こし、これが糖尿病やがんの発症や進行に寄与することを示してきた。また、ユビキチンリガーゼNedd4がIRS2をモノユビキチン化する、脱ユビキチン化酵素USP15がIRS2のモノユビキチン化を除去することも明らかにしていた。本研究では、IRS2のモノユビキチン化の制御機構を解析し、IRS2のモノユビキチン化量を調節することによりインスリン/IGFシグナルを修飾する手法を開発することを目的とする。2018年度は、栄養条件を変動させた際のNedd4の活性調節機構を明らかにするために、低栄養培地(アミノ酸除去培地)で培養した細胞におけるNedd4の分子修飾や結合タンパク質の変動をLC-MS/MSなどを用いて解析した。その結果、低栄養条件ではNedd4の自己ユビキチン化量が増加し、Nedd4のユビイチンリガーゼ活性が上昇することが示された。また、低栄養条件ではNedd4と複数のタンパク質の結合量が増加した。結合量が増加したNedd4結合タンパク質の中には、アミノ酸刺激によるmTORの活性化に関わるユビキチンリガーゼTRAF6が含まれていた。一方、Nedd4の基質認識機構を明らかにするため、Nedd4とIRS2の部分欠損変異体を用いた結合実験を進め、結合領域を絞り込んだ。その結果、Nedd4のC2ドメインとIRS2のPHドメインおよびPTBドメインが互いの結合領域であることが明らかとなった。2017年度は、USP15のIGFシグナルの調節に果たす役割を明らかにすることができた。今年度は、USP15がインスリンシグナルの調節に果たす役割も、肝細胞H4IIEなどを用いて詳細に解明する予定であった。しかし、他の解析や論文投稿に多くの時間を要したため、こちらの解析を十分検討することができず、来年度以降に実施することとなった。そのため、進捗状況は「やや遅れている」と評価した。インスリン標的細胞として培養肝細胞H4IIEを用い、高栄養条件で培養することによりインスリン抵抗性を誘導した際の、USP15の脱ユビキチン化活性や発現量の変化を解析する。また、この細胞でUSP15の発現を抑制しIRS2のモノユビキチン化を増加させた時に、インスリンに応答した細胞内シグナルや糖代謝酵素の発現変化が回復し、糖放出が強く抑制されるようになるか検討する。このような解析から、USP15がインスリンシグナルの調節に果たす役割を明らかにする。栄養条件を変動させた際のNedd4やの活性調節機構を明らかにするために、低栄養条件で結合量が増加することがわかったNedd4結合タンパク質について、過剰発現/発現抑制などを行い、Nedd4の活性に及ぼす影響を検討するなどの解析を行う。その後、明らかとしたNedd4の活性調節機構や基質認識機構の知見に基づき、Nedd4の活性化状態をモニターする系、Nedd4と基質であるIRS2との結合を簡便にモニターする系を開発する。これを用いて、Nedd4の酵素活性や基質結合を変化させる低分子化合物を探索する。また、以上と同様の解析をUSP15についても進め、USP15の酵素活性や基質結合を変化させる低分子化合物を探索する。最終的に、これらの低分子化合物を用いて、IRS2のモノユビキチン化量を調節し、インスリン/IGFシグナルの強さを変化させることによりインスリン抵抗性を改善できるか、あるいはがん細胞の増殖を抑制できるか検討する予定である。成就すれば、全く新しい作用点で働く抗糖尿病薬・抗がん剤の開発に向けたシーズとして提案できる。IRS2を脱ユビキチン化するUSP15のインスリン/IGFシグナルの調節に果たす役割は不明であった。そこで、2017年度は、前立腺がん細胞PC-3を用いてUSP15の発現抑制を行い、USP15がIGFシグナルを抑制する役割を果たしていることを確かめた。IRS2をユビキチン化するNedd4は、細胞を低栄養条件で培養すると活性化することがわかっていた。Nedd4の活性調節機構を解明するため、低栄養条件でNedd4に結合するタンパク質を共免疫沈降-質量分析法を用いて解析し、複数のタンパク質の結合量が増加することを見出した。

今後、Nedd4やUSP15の結合タンパク質や分子修飾の解析を進め、これらの酵素の活性調節機構を解明し、IRS2のモノユビキチン化量の調節を介したインスリン/IGFシグナルを修飾法の開発につなげていく予定である。研究実績の概要で示したように、USP15のIGFシグナルの調節に果たす役割は明らかにすることができた。具体的には、前立腺がん細胞を用いて、USP15の発現抑制により、IGF刺激に応答したIRS2のチロシンリン酸化が増強し、IRS2の下流で起こるPI3K-Akt経路やMAPK経路の活性化も促進することがわかった。一方、当初の予定では、USP15がインスリンシグナルの調節に果たす役割も、肝細胞H4IIEなどを用いて詳細に解明する予定であった。しかし、他の解析や論文投稿に多くの時間を要したため、こちらの解析を十分検討することができず、来年度以降に実施することとなった。そのため、進捗状況は「やや遅れている」と評価した。代謝調節/成長促進に重要なインスリン/インスリン様成長因子(IGF)の細胞内シグナルは、インスリン受容体基質(IRS)を介して伝達される。申請者らは、「IRS2がモノユビキチン化を受けるとインスリン/IGFシグナルが増強する」という現象を見出し、さらに、IRS2のモノユビキチン化の過剰な減弱/増強がインスリン/IGFシグナルの過剰な減弱/増強を引き起こし、これが糖尿病やがんの発症や進行に寄与することを示してきた。また、ユビキチンリガーゼNedd4がIRS2をモノユビキチン化する、脱ユビキチン化酵素USP15がIRS2のモノユビキチン化を除去することも明らかにしていた。本研究では、IRS2のモノユビキチン化の制御機構を解析し、IRS2のモノユビキチン化量を調節することによりインスリン/IGFシグナルを修飾する手法を開発することを目的とする。2018年度は、栄養条件を変動させた際のNedd4の活性調節機構を明らかにするために、低栄養培地(アミノ酸除去培地)で培養した細胞におけるNedd4の分子修飾や結合タンパク質の変動をLC-MS/MSなどを用いて解析した。その結果、低栄養条件ではNedd4の自己ユビキチン化量が増加し、Nedd4のユビイチンリガーゼ活性が上昇することが示された。また、低栄養条件ではNedd4と複数のタンパク質の結合量が増加した。結合量が増加したNedd4結合タンパク質の中には、アミノ酸刺激によるmTORの活性化に関わるユビキチンリガーゼTRAF6が含まれていた。一方、Nedd4の基質認識機構を明らかにするため、Nedd4とIRS2の部分欠損変異体を用いた結合実験を進め、結合領域を絞り込んだ。その結果、Nedd4のC2ドメインとIRS2のPHドメインおよびPTBドメインが互いの結合領域であることが明らかとなった。2017年度は、USP15のIGFシグナルの調節に果たす役割を明らかにすることができた。今年度は、USP15がインスリンシグナルの調節に果たす役割も、肝細胞H4IIEなどを用いて詳細に解明する予定であった。