hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経筋接合分子欠損症におけるmRNA病態研究と治療法開発研究

先天性筋無力症候群において同定をしたアセチルコリン受容体αサブユニット遺伝子CHRNA1のスプライシング変異部位にスプライシング抑制因子hnRNPLが結合をすることを同定した。次に、先天性筋無力症候群の一型である終板アセチルコリンエステラーゼ欠損症モデルマウスに対してAAV-COLQウィルスによるタンパク標的治療法が著効を示すことを、行動解析に加えて電気生理学的、組織化学的、生化学的に検証し報告した。神経筋接合部においてアセチルコリンエステラーゼ(AChE)をシナプス基底膜に係留するcollagen Q(CoLQ)の欠損は先天性筋無力症候群の一型である終板AChE欠損症を惹き起こす。終板AChE欠損症においては神経筋接合部シナプスにおける過剰なアセチルコリンが終板アセチルコリン受容体を脱感作し、同時に過剰なアセチルコリン受容体の開口により終板膜電位を脱分極させることにより神経筋信号伝達障害が起きる。本研究ではColQがシナプス基底膜への係留シグナルを有する細胞外構造タンパク質であることを利用し、Colq遺伝子欠損モデルマウスの骨格筋にヒトCOLQ遺伝子を導入し、AChEのシナプス基底膜への係留を行った。ヒトCOLQをAAVベクターに組み込み、骨格筋と肝臓に親和性の高いserotype 8 capsidを用いて作成をしたAAV8-COLQウィルス粒子をColqノックアウトマウスに静注ならびに筋注投与した。いずれの投与方法でも組織化学的検討・生化学的検討によりAChEのシナプス基底膜への係留が証明できた。一側下肢へのAAV8-COLQの筋注にて上肢においてもAChEの発現を認めAChEは細胞外分手である特徴を生かして血流を介して上肢に移行することが証明できた。静注後の電気生理学的検討にて神経筋接合部信号伝達の改善を認めた。同様に静注後のマウスの行動試験にて顕著な運動障害改善効果を認めた。研究代表者は先天性筋無力症候群においてアセチルコリン受容体αサブユニット遺伝子CHRNA1においてsplicing変異を同定してきた。変異はexon P3Aの23番目の塩基をGからAに変異をさせる。本研究ではこの23G>Aの部位に結合をするsplicing trans-factorの同定を行なった。UV crosslinking後のSDS-PAGE、及び、RNA affinity purificationにて結合タンパクの分子量を推定し、hnRNP Lを候補分子としてWestern blottingにより確認をした。同時に23G>A変異はhnRNP LLの結合能を獲得することを同定した。人工的に塩基配列を置換することにより23G>A変異はhnRNPLとの結合能を保持するにも関わらず新たにhnRNPLL結合能を獲得するためにhnRNPLとhnRNP LLの競合によりhnRNP Lが結合できなくなることを実証した。さらにhnRNP LとhnRNP LLのノックダウンならびに抗体によるこれら因子の吸着実験によりhnRNP Lはexon P3Aのスキッピングを誘導し、hnRNP LLはexon P3Aの認識を誘導することを実証した。さらにMS2-coat proteinとhnRNP L/hnRNP LLのフュージョン遺伝子を作成することによりこれらの因子は23G>Aの部位に特異的に作用することを明らかにした。さらにhnRNP LとhnRNP LLの各種ドメイン欠失変異を導入することにhnRNPLにのみ存在するproline-rich regionがhnRNPLによるexon P3Aスキッピングに関与することを証明した。先天性筋無力症候群に対するタンパク標的治療法(protein-anchoring therapy)の開発を行った。先天性筋無力症候群の一型である終板アセチルコリンエステラーゼ(AChE)欠損症はAChEをシナプス基底膜に係留するcollagen Q(ColQ)分子の先天的な欠損によっておきる。本症に対する特異的な治療法は存在しない。研究代表者らはヒトCOLQをAAVベクターに組み込み、骨格筋と肝臓に親和性の高いserotype 8 capsidを用いて作成をしたAAV8-COLQウィルス粒子をColqノックアウトマウスに尾静脈より投与した。電気生理学的検討にてMEPP減衰時間の正常化、反復神経刺激におけるCMAP減衰の改善、筋終板電位の正常化を認め、組織化学的検討にて観察をしたすべての神経筋接合部においてAchE/ColQ複合体の発現を認めた。さらに生化学的検討にて骨格筋AChE/ColQ複合体は正常の89%まで回復をしており、その分子構成も正常化していた。さらに運動機能も正常マウスと同等まで治療後3週で回復し、最高1年半効果が持続した。次に、全身への移行が少ないAAVl-COLQを作成し一側下肢に筋注を行いAChE/ColQ複合体の四肢筋への分布を確認した。さらに精製AchE/ColQ複合体を大量に作成しColq-/-マウス臀筋に持続的に筋肉注射を行いAChE/ColQ複合体の前肢を含む全身骨格筋への分布を確認した。タンパク分子自身が標的組織への親和性を持つ細胞外分子の特徴を生かしたprotein-anchoring
電気けいれん療法の急性期作用期機序解明に関するマルチモーダルでの縦断的観察研

2019年4月19日現在、15症例が登録されている。本年度は1年間で7症例の登録を行った。研究遂行にあたって有意な有害事象は認められていない。本課題と関連した研究としてECT施行前後での安静時脳波の変化を計測することにより、うつ病で重要と考えられているデフォルトモードネットワークの主要な結節点の電気的活動をECTが修飾する事を明らかとした。この結果は過去のfMRIやPETの知見と矛盾しない。また、ECT後のせん妄リスクに関して文献的検討も行った。その結果、ECT後のせん妄に関して緊張病症状、脳血管障害、パーキンソン病、認知症、両側電極配置、高刺激、痙攣時間は危険因子となること、デクスメデトミジンの事前投与と超短矩形波は予防的因子になることを明らかとした。本年度は画像解析の講習会に積極的に参加し、本研究にて行う画像解析技法並びに機械学習を用いた解析技法を習得した。現在ECT前後での脳波変化をmicrostate解析を用いて解析中であり、ECT施行前の脳波を用いた効果予測のための予備的解析も行っている。2018年4月19日現在、2年間で15症例が登録されている。当初は1年間に10症例の登録を目指していたため概ね順調に進行していると判断される。また、研究遂行にあたって有害事象は認められていない。また、先端バイオイメージング支援プラットフォームのMRI画像講習会への参加、世界的に標準的な画像解析ソフトとされるSPMの講習会に参加して最先端の脳画像解析技術を習得した。また、ECT施行前の脳波を用いた効果予測のための予備的解析を行っている。概ね順当に遂行されている。4年計画の2年目であり、有意な結果を得るまで症例数が至っていない。このため次年度も引き続き症例登録を遂行していく。また、症例登録が円滑に行われるために広く対象症例を募っていく。また、脳波、MRI、NIRSに関して得られたデータをもとに解析を開始する。解析においては、機械学習の手法も取り入れ、高度な解析を行っていく。8症例を用いた機能的Magnet Resonance Imaging(MRI)における機能的結合性解析においては、機能的結合性がECT施行前後で変化する傾向が確認された。また、MRIの構造画像解析では海馬を中心として灰白質の容積がECT施行前後で増加する傾向、白質が変化する傾向が確認された。(ただし、いずれの解析においても関心領域を設定し解析を行ったものである)。これらの結果はいずれも、先行研究と合致するものであり現時点でのECT施行の信頼性、妥当性ならびにMRI検査の信頼性ならびに妥当性を示唆していると考えられる。また、語流暢性課題下での近赤外線光トポグラフィー検査、脳波データに関しては解析前の前処理を終了しており、今後統計解析を施行していく予定である。今後も症例登録を行っていくとともに、本年度においては最先端の脳画像解析手法の習得に務めるとともに最終的に行う解析技法の確立を行なった。また、ECTの治療反応性に関して文献的検討を行った。研究開始にあたり、慶應義塾大学医学部倫理委員会の承認を得た。2018年4月26日現在、8症例が登録されている。また、先端バイオイメージング支援プラットフォームのMRI画像講習会に参加する等して最先端の脳画像解析技術習得に努めた。研究開始初年度であり、有意な結果を得るまで症例数が至っていない。

このため次年度も引き続き症例登録を遂行していく。一方で、海外も含め画像講習会に参加する等して最先端の脳画像解析技術習得に努めていいき、得られたデータでのマルチモーダルでの解析を施行していく。概ね順当に遂行されている。4年計画の2年目であり、有意な結果を得るまで症例数が至っていない。また、症例登録が円滑に行われるために広く対象症例を募っていく。また、脳波、MRI、NIRSに関して得られたデータをもとに解析を開始する。解析においては、機械学習の手法も取り入れ、高度な解析を行っていく。本年度10症例登録の予定であったが、8症例の登録であったこと。想定よりMRIの撮像費用が必要とされなかったこと。また、データ整理等のための補助員の雇用が年度後半からと遅れたこと等の理由により次年度使用額が生じた。次年度は、本年度登録症例数に達しなかったことも含めて、症例登録を増やす予定であり、次年度使用額と翌年度分を合わせて使用し研究を遂行していく。本年度10症例登録の予定であったが、7症例の登録であったこと。また、データ整理等のための補助員の雇用が通年とならなかったこと等の理由により次年度使用額が生じた。
3次元積層造型技術によるテーラーメイドタイプのコンピュータ支援股関節手術の開発

本研究の目的は、人工股関節手術を受ける患者個々の症例に、術前Computed tomography(以下CT)を用いて3次元術前計画を立案することでテーラーメイドに対応し、なおかつ3次元積層造型技術によって計画通りに人工関節を設置できる新しいコンピュータ支援股関節手術ガイドの開発とその手術法の妥当性・有用性を評価することである。今年度の課題は、2つあった。1つは臼蓋コンポーネント(以下カップ)を従来法によって設置した従来群に比べて、上記のテーメイドのガイド使用したガイド群で、カップの設置角度のばらつきを少なくすることができるかを明らかにする比較検討であり、実際の臨床症例を用いて行った。結果、ガイド群のほうが正確に設置できることが明らかとなった。この結果は国際整形外科雑誌の中で著名なClinical Orthopaedic Related Researchに採択された。2つ目は、大腿骨コンポーネント(以下ステム)設置のためのガイド作成であり、これは屍体骨を用いて検討した。ステム設置には大腿骨頚部骨切りを行う必要があるが、これを正確に行う事がステム設置におけるサイズ選択、挿入方向を正確に行える一つの因子になる。屍体骨大腿骨を用いて一方はガイドを用いて、他方は用いずに頚部の骨切りを行い、その骨切り精度を比較した。この結果は、コンピュータ支援外科関連で有名な国際コンピュータ支援放射線外科学会議(CARS;Computer Assisted Radiology and Surgery)で報告した。本研究の目的は、人工股関節手術を受ける患者個々の症例に、術前Computed tomography(以下CTを用いて3次元術前計画を立案することでテーラーメイドに対応し、なおかつ3次元積層造型技術によって計画通りに人工関節を設置できる新しいコンピュータ支援股関節手術ガイドの開発とその手術法の妥当性・有用性を評価することである。今年は主として、人工股関節の内、寛骨臼に設置する"臼蓋コンポーネント(カップ)"のための手術ガイドの開発と精度評価が課題であった。屍体骨を用いた予備実験、臨床例を用いてガイドの適合性を光学式ナビゲーション機器を用いて評価し、安全に精度よく設置できることを確認した後、実際の臨床例でカップ設置に関して手術ガイドを使用し、術後CTを用いてカップ設置の精度評価を行った。約20例での精度評価では従来法(過去の報告より渉猟しえたデータ)より精度よく、また新しい手術機器の課題でもある手術時間の延長に関しても平均で約3.5分の延長のみで従来の手術時間(1時間半から2時間)に影響しないことを明らかにした。臨床例を用いた精度評価についての原著論文がコンピュータ外科系分野では著名な雑誌「THE INTERNATIONAL JOURNAL OF MEDICAL ROBOTICS AND COMPUTER ASSISTED SURGERY」に採択された。来年度は、同一術者による従来群とガイド使用した群の比較試験を行うこと、また残りの大腿骨コンポーネント設置のためのガイドの開発とその精度評価を行う予定である。この手術ガイドの有用性が示され、作成が自動化されれば(これはまた別の課題になるが)、多くの病院で使用される汎用性の高い手術ガイドになると考える。
血管新生遺伝子含有マトリックスを基材とした骨誘導活性システムの生物検定

VEGF分泌シグナル領域を含む165のアミノ酸配列をコードするcDNA断片を作製した.遺伝子活性マトリックスとして,0.3%ウシ真皮由来酸可溶性I型アテロコラーゲン溶液を使用した.本溶液(3.3mL,乾燥重量10mg)とVEGF plasmid DNA溶液(1.0mgのplasmidを含む)を混和して凍結乾燥後,4週齢ウィスター系雄性ラット背部皮下組織内に埋入した.その結果,明らかな血管新生誘導の効果は認められなかった.コラーゲン自体の血管新生能にVEGF plasmid DNAの効果がマスクされた可能性や細胞への導入率の低さ,VEGF plasmid DNA至適濃度の問題と考えられた.BMP-2 plasmid DNAを使用しても効果は得られなかった.一方,血管新生遺伝子を併用しなくともBMP-2単独タンパク療法で十分な骨誘導現象が認められた.これらを背景にタンパク質単独投与実験とした.BMP-2(2μg)/I型アテロコラーゲン(10mg)複合物をウィスター系雄性ラット(4週齢,10か月齢,18か月齢)背部皮下組織内に埋入した.1,2,3週後に摘出し,IV型コラーゲン免疫染色(血管の指標)とヘマトキシリン-エオジン染色を行い,光学顕微鏡で観察した.埋入2週後,4週齢と10か月齢ラットで誘導骨が観察された.18か月齢ラットでは3週後に局所的に骨誘導が認められた.2週後の血管数(埋入物中央部)は4週齢,10か月齢,18か月齢で,それぞれ34本,19本,1本であり優位差を認めた.以上より,加齢によりrhBMP-2による異所性骨誘導は遅延して硬組織形成量は減少を示したが,老齢期ラット(18ヵ月齢)でも本タンパク質システムで骨誘導能が維持されることが示された.VEGF分泌シグナル領域を含む165のアミノ酸配列をコードするcDNA断片を作製した.遺伝子活性マトリックスとして,0.3%ウシ真皮由来酸可溶性I型アテロコラーゲン溶液を使用した.本溶液(3.3mL,乾燥重量10mg)とVEGF plasmid DNA溶液(1.0mgのplasmidを含む)を混和して凍結乾燥後,4週齢ウィスター系雄性ラット背部皮下組織内に埋入した.その結果,明らかな血管新生誘導の効果は認められなかった.コラーゲン自体の血管新生能にVEGF plasmid DNAの効果がマスクされた可能性や細胞への導入率の低さ,VEGF plasmid DNA至適濃度の問題と考えられた.BMP-2 plasmid DNAを使用しても効果は得られなかった.一方,血管新生遺伝子を併用しなくともBMP-2単独タンパク療法で十分な骨誘導現象が認められた.これらを背景にタンパク質単独投与実験とした.BMP-2(2μg)/I型アテロコラーゲン(10mg)複合物をウィスター系雄性ラット(4週齢,10か月齢,18か月齢)背部皮下組織内に埋入した.1,2,3週後に摘出し,IV型コラーゲン免疫染色(血管の指標)とヘマトキシリン-エオジン染色を行い,光学顕微鏡で観察した.埋入2週後,4週齢と10か月齢ラットで誘導骨が観察された.18か月齢ラットでは3週後に局所的に骨誘導が認められた.2週後の血管数(埋入物中央部)は4週齢,10か月齢,18か月齢で,それぞれ34本,19本,1本であり優位差を認めた.以上より,加齢によりrhBMP-2による異所性骨誘導は遅延して硬組織形成量は減少を示したが,老齢期ラット(18ヵ月齢)でも本タンパク質システムで骨誘導能が維持されることが示された.プライマーの選択は既知のヒトVEGFシークエンス(GenBank)とDNA解析ソフト(TaKaRa)に基づいた。PCR産物(VEGF DNA断片)をベクター(pUC118 vector)に組み込んだ後,大腸菌に導入してplasmidの複製を行った。単一コロニーをアンピシリン添加LB培地に植菌し,精製後回収されたplasmid DNAの構造解析を自動シークエンサー(Applied Biosystem 373A)で行った。その結果、VEGF分泌シグナル領域を含む165のアミノ酸配列をコードするcDNA断片であることを確認した。遺伝子活性マトリックスとして,ウシ真皮由来凍結乾燥アテロコラーゲン(10mg)を調整して,異なる濃度のplasmid DNA溶液(0,1.0mgのplasmidを含む)内に含浸させ,直ちに動物実験に使用した。生物検定法として,4週齢ウィスター系雄性ラット背部皮下組織内に埋入した.1,3週後に摘出し,ヘマトキシリン-エオジン染色標本を作製した。光学顕微鏡観察結果より,コントロール群(plasmid DNAを含まぬ)に対して,実験群(plasmidを含む)では幼弱な血管の新生がコラーゲンマトリックス内に認められた。プライマーの選択は既知のヒトBMP-2シークエンス(GenBank)とDNA解析ソフト(TaKaRa)に基づいた.PCR産物(BMP-2 DNA断片)をベクターに組み込んだ後,大腸菌に導入してplasmidの複製を行った.単一コロニーをアンピシリン添加LB培地に植菌し,精製後回収されたplasmid DNAの構造解析を自動シークエンサーで行った.その結果,BMP-2分泌シグナル領域を含むアミノ酸配列をコードするcDNA

断片であることを確認した.遺伝子活性マトリックスとして,ウシ真皮由来凍結乾燥アテロコラーゲン(10mg)を調整して,BMP-2plasmid DNA溶液を滴下して,直ちに動物実験に使用した、なお,陽性コントロールとしてBMP-2タンパク質(10μg)溶液をアテロコラーゲン(10mg)溶液と混和後,凍結乾燥・複合化して動物実験に使用した.生物検定法として,4週齢ウィスター系雄性ラット背部皮下組織内に全身麻酔下で埋入した.3週後に摘出し,ヘマトキシリン-エオジン染色標本を作製した.光学顕微鏡観察結果より,陽性コントロール群(BMP-2タンパク質含有)に骨誘導が確認されたが,実験群(BMP-2遺伝子含有)では血管の新生がコラーゲンマトリックス内に認められたものの骨・軟骨誘導を確認することができなかった.次年度は,BMP-2plasmid DNAの添加量を増加して硬組織誘導を評価する予定である.PCR産物(BMP-2 DNA断片)からBMP-2分泌シグナル領域を含むアミノ酸配列をコードするcDNA断片を調整した.遺伝子活性マトリックスとして,ウシ真皮由来凍結乾燥アテロコラーゲン(10mg)とポリ乳酸-グリコール酸共重合体の2種類を使用した.BMP-2 plasmid DNA溶液含有マトリックス(BMP-2遣伝子含有アテロコラーゲン群,BMP-2遺伝子含有ポリ乳酸-グリコール酸群)を調整した.なお,陽性コントロール1としてBMP-2(10μg)溶液(1μg/μl;10μl)を0.3%アテロコラーゲン溶液(3.33ml)と混和後,凍結乾燥・複合化して使用した.陽性コントロール2としてBMP-2(10μg)/ポリ乳酸-グリコール酸共重合体を使用した.陰性コントロール1としてアテロコラーゲン単独群,陰性コントロール2としてポリ乳酸-グリコール酸単独群を設定した.生物検定法は,4週齢ウィスター系雄性ラット背部皮下組織内に全身麻酔下で試料を埋入した.3週後に摘出し,ギ酸脱灰後ヘマトキシリン-エオジン染色標本を作製した.光学顕微鏡観察結果より,BMP-2遺伝子含有アテロコラーゲン群において,血管の新生がコラーゲンマトリックス内に認められたものの骨・軟骨誘導を確認することができなかった.また,BMP-2遺伝子含有アテロコラーゲン群の血管数はアテロコラーゲン単独群よりも多いものの優位ではなかった.陽性コントロール1,2群に骨誘導が確認された.BMP-2/アテロコラーゲン群がBMP-2/ポリ乳酸-グリコール酸よりも旺盛に骨が誘導され,炎症反応が少なかった.陰性コントロール1,2群には骨誘導はみられなかった.BMP-2遺伝子の添加量を増加しても,本生物検定系では,BMP-2遺伝子の硬組織誘導に関する効果は明らかでなかった.BMP-2タンパク単独療法で確実な骨誘導が得られ,遺伝子・タンパク融合療法の優位性は認められなかった.
胎内プログラミングによる腎発育異常におけるmTOR経路の役割

本研究では胎内プログラミングによる腎発育異常におけるmTOR(Themammalian target of rapamycin)経路の役割の解明する。母体低栄養、ステロイド投与によりラット胎児の新生児早期後腎は大きさ、糸球体の数共に有意に減少した。これら後腎の遺伝子および蛋白発現の網羅的解析で、mTOR経路を含む多くの遺伝子・蛋白の発現の変化を確認し、免疫組織染色、ウエスタンブロットでもmTOR経路の抑制を確認した。現在関連遺伝子のメチル化解析中であり、mTOR経路抑制から腎発生異常に至る機序の詳細はまだ検討中である。本研究の目的は胎内プログラミングによる腎発育異常におけるmTOR(The manmmalian target of rapamycin)経路の役割を解明することである。近年、生活習慣病発症の危険因子として子宮内発育遅延(IUGR)、母体への薬物投与が挙げられ、高血圧発症機序として母体の低栄養、ステロイド(グルココルチコイド)投与によるネフロン数減少が報告されているが、詳細な機序は未解明である。mTORはセリン・スレオニンキナーゼでその経路は低栄養やステロイド投与で活性が抑制され、細胞のmacroautophagy(以下autophagy)を呈す。Autophagyは2型programmed cell deathを伴い、発生過程において重要な役割を果たす。プログラミングによる腎発育異常に関与する可能性が高いと考えられ、ネフロン数減少にmTOR経路の関与が示唆される。平成21年度はin vivoで母体低栄養、ステロイド投与により後腎が受ける影響を検討した。母胎に栄養制限またはステロイド投与を行った胎児の新生児早期後腎は大きさ、糸球体の数共に有意に減少した。これら後腎の遺伝子および蛋白の発現を網羅的に解析し、発生、シグナル伝達、mTOR経路、細胞増殖、アポトーシス、トランスポーター、イオンチャネルを含む多くの遺伝子・蛋白の発現が変化することを確認した。この結果から腎の成長・糸球体形成に加え、尿細管機能も影響を受けることが示唆された。さらにmTOR経路、MAPキナーゼ経路を含む腎発生に重要な細胞内信号伝達経路が受ける影響を後腎の免疫組織染色、ウェスタンブロットなどで検討した。低栄養では初期にこれらの経路は抑制されたが、その後活性化され、かつ生後日数が経つと対照とほぼ同等になることが判明し、早期の低栄養に対する代償反応が起きている可能性が示唆された。ステロイド投与によるmTOR経路への影響は後腎の免疫組織染色を行い、mTOR活性が抑制されることを確認した。ウェスタンブロットでは有意な結果が得られておらず、検証中である。本研究の目的は胎内プログラミングによる腎発育異常におけるmTOR(The Manmmalian target of rapamycin)経路の役割を解明することである。さらにmTOR経路、MAPキナーゼ経路を含む腎発生に重要な細胞内信号伝達経路が受ける影響を後腎の免疫組織染色、ウエスタンブロットなどで検討した。ウエスタンブロットでは有意な結果が得られておらず、検証中である.本研究の目的は胎内プログラミングによる腎発資異常におけるmTOR(The manmmalian target of rapamycin)経路の役割を解明することである。mTORはセリン・スレオニンキナーゼでその経路は低栄養やステロイド投与で活性が抑制され、細胞のautophagyを呈す。

Autophagyは2型programmed cell deathを伴い、発生過程において重要な役割を果たす。プログラミングによる腎発育異常に関与する可能性が高いと考えられ、ネフロン数減少にmTOR経路の関与が示唆される。平成21-22年度はin vivoで母体低栄養、ステロイド投与により後腎が受ける影響を検討した。母胎に栄養制限またはステロイド投与を行った胎児の新生児早期後腎は大きさ、糸球体の数共に有意に減少し、これら後腎の遺伝子および蛋白の発現を網羅的解析で、発生、シグナル伝達、mTOR経路、細胞増殖、アポトーシス、トランスポーター、イオンチャネルを含む多くの遺伝子・蛋白の発現が変化することを確認した。後腎の免疫組織染色、ウエスタンブロットではmTOR経路、MAPキナーゼ経路が低栄養で初期に抑制、その後活性化され早期の低栄養に対する代償反応を示唆する結果であった。ステロイド投与のmTOR経路への影響は後腎免疫組織染色でmTOR活性の抑制を確認したが、ウエスタンブロットでは有意な結果が得られなかった。平成23年度は、前述の網羅的検索で変化が見られた遺伝子のうち個体発生における重要性が報告されているTBX2を含む複数の遺伝子につきrt-PCRを行ったが、有意な結果は得られなかった。
胚盤胞補完法を用いたウサギ/カニクイザル異種間キメラ動物の作製

本研究計画の過程で、カニクイザルのナイーブ様変換を成し遂げ(真のナイーブ変換には至らなかった)、実際にウサギとの異種間キメラ胚を作製した。他方、本研究計画から派生したテーマで、絶滅危惧種アマミトゲネズミのナイーブ型iPS細胞の樹立と、マウスとの異種間キメラの作成、そして生殖細胞への分化までを成し遂げ、アマミトゲネズミ生殖細胞における、性的柔軟性を見いだす研究成果に恵まれた。iPS細胞から異種間キメラの作成に至ったのはマウスとラットに次いで三例目であり、ナイーブ型iPS細胞により異種間キメラを作出することを目指した本研究課題にとって、予想外の大きな成果となった。カニクイザルのES細胞およびiPS細胞にキメラ形成能を獲得させることを目的として、ナイーブ化し、その特徴を詳細に解析した。具体的にはヒトES細胞のナイーブ様変換として報告されている複数の論文のうち、もっとも信憑性の高いことが客観的に証明されている論文を参考に、我々独自の培地を開発しナイーブ様に変換した。コロニーの形態、多分化能、LIFへの反応性、代謝経路などからナイーブ様に変換されていることを確認するに至った。またカニクイザルのES細胞だけでなくiPS細胞も独自に樹立し、ナイーブ様変換を行った後に体外での神経系分化誘導に供し、その効率をナイーブ変換前後およびES細胞とiPS細胞で比較することも行った。その結果、試した全ての細胞株において、プライム型の状態よりもナイーブ様に変換した後の方が神経系細胞(オリゴデンドロサイト)への分化効率が優れている事、およびiPS細胞よりもES細胞の方が効率良く分化誘導が可能になることを証明した。最も体外分化能に優れていると判断されたナイーブ様カニクイザルES細胞を、マウス初期胚やウサギ初期胚に注入して異種間キメラ胚を作製し、異種間としてキメラになるか否か検討を行った。マウスを宿主にした場合、異種の細胞が胚に寄与することによる細胞毒性が強く、仮に寄与したとしても着床直後に発生が停止あるいは脱落してしまうことが判明した。ウサギを宿主にした場合はマウス胚を宿主にした時のような細胞毒性は見られなかったものの、キメラとして寄与しているという証拠はほとんど得られなかった。これまでナイーブ化を施したカニクイザルのES/iPS細胞を詳細に解析した結果、比較的質の高いナイーブ状態に変換している証拠が得られている。ただし、そのような幹細胞を用いても異種間でキメラを作製するのは困難であることがわかってきた。本研究はカニクイザル多能性幹細胞を真のナイーブ型幹細胞に変換し、マウスやウサギとの異種間キメラを作製するのが狙いである。現状までにカニクイザル多能性幹細胞をナイーブ様に変換し、異種間キメラ作製を行ったが、極めて困難であることが明らかになり、誌上発表した。特にナイーブ型多能性幹細胞については想定外の大きな成果にも恵まれている。具体的には、これまで私たちが構築してきたウサギのナイーブ様変換方法を、さらに改良を加えてカニクイザル多能性幹細胞のナイーブ変換に発展させて、その特徴を詳細に解析した。ナイーブ状態というカテゴリーは様々な証拠を積み上げて確認するが、その中でも特にトランスクリプトーム解析が極めて重要であることを発表した。さらに、完全なナイーブ型への変換とは言えない状態であっても、神経系への分化誘導能力が有意に増加することや、マウスとの異種間キメラ作製が困難であることなども発見した。ゲノム編集については、マウス個体、野生ネズミ個体、およびヒト培養細胞などでのゲノム編集関連論文に関与し、多数の共著発表に至った。今後もゲノム編集の技術普及に努めながら、私たちの研究(特にウサギ固体を用いた疾患モデル動物作製)も発展させる。本研究の遂行上、ナイーブ型iPS細胞の樹立は極めて重要な要素であるが、その課程において絶滅危惧種から真のナイーブ型iPS細胞の作製に至り、誌上発表が決定している。今後もナイーブ型幹細胞を活用した橋渡し研究や絶滅危惧種由来iPS細胞の研究を発展させる。また、ナイーブ型多能性幹細胞の樹立や培養および異種間キメラ作製の知識と経験が功を奏し、絶滅危惧種から真のナイーブ型多能性幹細胞を樹立することに成功した。異種間キメラや生殖細胞の作製にも発展し、絶滅危惧種に特徴的な生命現象の解明にも至った。この研究もすでに論文掲載が決定している。iPS細胞から明確な異種間キメラが作出されているのはマウスとラットのみであり、本研究は計画以上に効率良く進展し、研究費を節約することができたことが理由として挙げられる。本研究計画はカニクイザルの多能性幹細胞とウサギの胚を用いて異種間キメラを作出し、臓器の再生などに役立てようとした研究である。特にキメラ形成能を有する真のナイーブ型幹細胞の樹立と、異種間キメラ作成が本研究の肝と認識していた。

しかし、ウサギ胚はホストとしてナイーブ型幹細胞を受け入れにくいことを見いだした。一方、カニクイザルES/iPS細胞のナイーブ様変換により、神経系などへの体外分化誘導能が亢進することを見いだし、誌上発表に至った。本研究ではゲノム編集を活用し胚を作製して、異種間キメラ作りのホストにすることを目的としていたが、その過程でゲノム編集関連技術を発展させて、多数の共同研究と誌上発表に至った。他方、本研究計画から派生したテーマで、絶滅危惧種アマミトゲネズミのナイーブ型iPS細胞の樹立と、マウスとの異種間キメラの作成、そして生殖細胞への分化までを成し遂げ、アマミトゲネズミ生殖細胞における、性的柔軟性を見いだす研究成果に恵まれた。iPS細胞から異種間キメラの作成に至ったのはマウスとラットに次いで三例目であり、ナイーブ型iPS細胞により異種間キメラを作出することを目指した本研究課題にとって、予想外の大きな成果となった。今後も橋渡し研究や絶滅危惧種由来iPS細胞の研究に反映させて発展させる。本研究計画の過程で、カニクイザルのナイーブ様変換を成し遂げ(真のナイーブ変換には至らなかった)、実際にウサギとの異種間キメラ胚を作製した。どのようにすれば、より質の高い幹細胞への変換が可能なのか検討すると同時に、本当に質の高いナイーブ状態の幹細胞であれば、どの動物胚をホストにしても異種間でキメラとして寄与することができるのか否かを検討する予定である。すでに我々は絶滅危惧種のiPS細胞を用いて異種間キメラの作出に成功した。次は生殖細胞の体外分化誘導に発展させる予定である。実験動物学昨年度に、我々が実験動物として購入しているウサギが感染症に汚染されていることが判明し、その原因がウサギの繁殖施設(業者)で感染が発生したものが、我々の施設に持ち込まれてしまったことであることが明らかとなった。その結果、当実験施設で飼育していた実験用ウサギの全頭殺処分をせざるを得なくなってしまったため、動物を用いた実験の予定に変更が生じ、予算の次年度使用をすることとなった。本研究が予想以上に進展し、異種間キメラの作製から生殖細胞の作製にまで発展したため。マウスやウサギを宿主胚としてナイーブ状態にある多能性幹細胞を注入し、異種間キメラを作製する。絶滅危惧種アマミトゲネズミのiPS細胞に、生殖細胞の発生に関与する遺伝子発現マーカーをCRISPR/Cas9システムを用いてノックインし、その細胞を体外で生殖細胞に分化誘導する。
ERストレスと蛋白合成品質管理からみた術後肝再生に関する研究

肝再生は高度にコントロールされたシステムにより統合されており、複雑な細胞内クロストークによって再生情報が伝達される。その情報伝達には無数の蛋白が時間・空間的に制御され合成される必要がある。硬変肝などの障害肝では、蛋白合成の場である小胞体に慢性的な障害(ERストレス)が存在する。このような肝臓では細胞内で再生に必要な蛋白質を作れず、再生過程が中断され再生不良を招来しうる可能性がある。この研究ではERストレスが肝再生に与える影響を検討し、術後の肝不全を未然に防ぐ新たな治療戦略を模索することに主眼を置いた。雄性C57BL/6Jマウスを用い、Tunicamycinl.0mg/kgを腹腔内投与し肝臓へERストレスを誘導した。投与48時間後、Higgins and Anderson法による70%肝切除を施行し、その48時間および72時間後の再生肝の重量を測定したところ、Tunicamycin非投与群と同じ肝重量であった。再生率を求めてもほぼ同等の値を示し、72時間後には両群とも2倍になっていた。しかし、PCNA染色にて肝細胞の増殖を検討したところ、Tunicamycin非投与群では肝切除48時間後に27%、72時間後には43%の肝細胞がPCNA陽性となったが、Tunicamycin投与群(1mg/kg)では3%、%4の肝細胞のみが陽性であり、細胞増殖がほとんど起こっていないことが判明した。この結果からERストレスにより細胞増殖に必要な蛋白合成が阻害され、細胞肥大によって肝切除後の肝重量が単に見かけ上、増加することが示された。これは臨床の場で遭遇する、術後肝体積が十分回復しているにもかかわらず、低肝機能によりを示すことと一致する。現在は残存胚の細胞死および増殖因子の発現を検討しており論文の投稿を目指している。
国際海運網におけるホットスポットの人為・自然災害リスク・マネジメント手法の開発

本研究は、国際海運網におけるホットスポットである重要海峡・運河・港湾の災害リスクを定量的に評価し、そのマネジメント手法を開発するものである。研究は、1国際海運網のホットスポットの機能停止・低下状況の分析、2ホットスポットの機能停止・低下の経済被害の評価方法の確立、3人為・自然災害リスクに対するホットスポットの輸送活動の脆弱性評価、4リスクマネジメント計画・政策の提案・評価の4つのパートで構成されている。平成30年度は、20142015年の米国西岸港湾の労使交渉に伴う混乱状況について、間接被害を含めた世界全体での損失額の精度を向上させ、論文として公表した。合計損失額は100120億ドルとの結果であり、ホットスポットの機能停滞の影響が、世界貿易・経済に大きな影響を及ぼしたことが改めて確認された。また、我が国のバルク貨物輸入について、具体のインシデントを想定しながらリスクシナリオを作成し、箇所別の脆弱性を評価し、対策案の提示をした。研究期間全体においては、国際海運網のホットスポットの機能停止・低下による輸送への影響を、特にこれまで分析例が少ない人為災害を対象として、米国西岸港湾の混乱及び韓進海運破綻について詳細に分析し、代替経路・輸送機関の使用状況を推計した。さらに、機能停止・低下による経済被害を、波及効果も含めて評価する方法を構築した。加えて、国際輸送全体としてのリスクアセスメントも実施しており、国際海運網のリスクマネジメントを推進する上で、一定の学術的な貢献が出来たものと考えられる。研究は、1国際海運網のホットスポットの機能停止・低下の状況分析、2ホットスポットの機能停止・低下の経済被害の評価手法の確立、3人為・自然災害リスクに対するホットスポットの輸送活動の脆弱性評価、4リスク・マネジメント計画・政策の提案・評価の4つのパートで構成されている。平成28年度は、20142015年の米国西岸港湾の労使交渉に伴う混乱状況について分析し、その経済被害の評価を行い、対応策の検討を行った。混乱状況については、スローダウンや夜間荷役中止等により当該港湾での荷役効率が平常時の約4割まで低下し、大量の沖待ちが発生し、東京湾→米国西岸港湾のコンテナ輸送の所要日数がピーク時には平常時に比べて2週間も増加したことを明らかにした。これに対応するため、日本の自動車メーカーは航空輸送を、韓国の自動車メーカーは東岸港湾を主要な代替ルートとしていた。経済被害の定量化については、輸送取りやめ量、東岸港湾・航空輸送へのシフト量を推計し、コンテナ貨物の価値及び時間価値の推計結果等を用いて、米国及び東アジア諸国合計の損失額は約70億ドルと推計した。対応策としては、荷主サイドでは、効率性が落ちない範囲で、平常時より代替ルートを利用しておくこと、港湾・船会社サイドでは、港湾の相互補完・代替協定を提案した。国際海運網のホットスポットの人為・自然災害の例として採りあげた20142015年の米国西岸港湾の労使交渉に伴う混乱については、その混乱状況の分析、経済被害評価、対応案の策定まで行っており、当初の予定通りの進捗をしている。平成29年度は、国際海運網のホットスポットにおける過去の人為・自然災害全般を把握・整理した。20142015年の米国西岸港湾の労使交渉に伴う混乱状況については、前年度に引き続き分析を進め、間接被害を含めた世界全体での損失額を推計した。さらに、2016年の韓進海運の破綻についても、同社運航船の積載コンテナの荷卸し完了に約3ヶ月を要したこと、荷卸しが行われた港湾は当初の仕向港ではなく"安全な"中継港にコンテナが滞留したことを把握した。さらに、推計総価値110128億ドルの積載コンテナ貨物は、ほぼ全損したものと推察した。加えて、リスクマネジメント対応の計画・政策として、日本の鉄道会社のように、船会社や港湾が災害時に一時的な代替輸送経路を提供するとの案を提案した。国際海運網のホットスポットの災害例2つについて分析を済ませ、経済被害を評価し、対応政策の提案も行っており、当初の予定どおり進捗している。

また、我が国のバルク貨物輸入について、具体のインシデントを想定しながらリスクシナリオを作成し、箇所別の脆弱性を評価し、対策案の提示をした。研究期間全体においては、国際海運網のホットスポットの機能停止・低下による輸送への影響を、特にこれまで分析例が少ない人為災害を対象として、米国西岸港湾の混乱及び韓進海運破綻について詳細に分析し、代替経路・輸送機関の使用状況を推計した。さらに、機能停止・低下による経済被害を、波及効果も含めて評価する方法を構築した。加えて、国際輸送全体としてのリスクアセスメントも実施しており、国際海運網のリスクマネジメントを推進する上で、一定の学術的な貢献が出来たものと考えられる。今後は、国際海運網のホットスポットの人為・自然災害について、他の事例を採りあげて同様の分析を行い、その結果を用いて、国際海運網の途絶や停滞を起因とした経済被害の評価手法を構築する。さらに、災害のリスク・シナリオ化を試み、リスク・マネジメント計画・政策の提案に繋げる。今後は、国際海運網のホットスポットの災害影響について、コンテナ貨物だけでなくバルク貨物をも対象とし、災害のリスク・シナリオを検討してホットスポットにおいて今後発生し得る災害影響の規模を概略把握すると共に、リスクマネジメント計画・政策については高度化を図る。出張旅費や物品購入等において出た端数を有効活用するために、次年度に使用することとなったもの。出張旅費や物品購入等において出た端数を有効活用するため、次年度に使用することとなったもの。平成29年度の研究経費と合わせて、効率的に執行する計画である。
腎結石発生機序における腎尿細管細胞と蓚酸カルシウム結晶の結合付着病態の解明

犬の遠位尿細管の性質をもつMDCK細胞を定量的に培養し蓚酸カルシウム結晶がその細胞表面に付着する形態を位相差顕微鏡および走差型電子顕微鏡で観察し、極めて短時間に洗浄しても剥れない、強固である種の有機的な付着がみられることを確認した。定量倍養されたMDCK細胞と蓚酸カルシウム結晶を一定条件で接触させた後に、付着する結晶量を原子吸光分析で定量的に測定するシステムを考案し、その付着は濃度依存的および時間依存的なものであることが認められた。また、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ペントサン硫酸あるいはコンドロイチン硫酸等のglycosaminoglycanでMDCK細胞の表面を前処理することで、蓚酸カルシウム結晶の付着が濃度依存的に強く抑制されることを形態学的および生化学的に確認した。さらに、Toriton×100や稀塩酸で細胞表面を前処理することにより、蓚酸カルシウム結晶の付着が、前処理の時間依存的に抑制されることが認められた。尿細管細胞に対して毒性を示すといわれているゲンタマイシンの混入する細胞培養液で培養することによって、MDCK細胞表面の蓚酸カルシウム結晶の付着は有意におさえられることも確認した。
2300K高温環境下で300hに耐えられるハイブリッド型長寿命炭素フォイルの開発

研究代表者らが開発した制御型直流アーク放電法を用いて厚さ300-400.ug/cm^2のHBC-フォイルを作成し東工大の3.2MeVのDCネオンビーム、KEKの650KeVのDC負水素イオンビーム、それに米国ロスアラモス研究所の800MeVのパルス負水素イオンビームを用いて照射性能試験を行った。結果はいずれの場合でも1800K-2300Kの高温環境下に加熱されたHBC-フォイルは市販のフォイルの250倍、ナノダイヤモンドフォイルの100倍以上の寿命を示した。初年度は申請研究計画に基づいて次の2件を実行した。1)高温耐久性水冷式傾斜型蒸発源の製作、2)高周波RFシステムとアンテナの真空蒸着装置への設置。1)の蒸発源はボロンをドープした直径の異なる大きさの炭素ロッドをアーク放電法で蒸発させるために製作した。厚さ300ug/cm2以上の厚い膜厚の炭素膜を成膜する過程でアークの高温輻射熱により周辺からの不純物混入、蒸発炭素ロッドの高温度による炭素ロッドを支持する銅電極の酸化による蒸発混入を避けるため水冷パイプ径を8mmから10mmに太くした。又周辺からの不純物混入を避けるためステンレス板で遮蔽板を設けた。超高温度環境下でも炭素ロッド同士の接触によるアーク放電をスムーズに往復運動をさせるために駆動連携システムに工夫を加えた。2)高周波RFシステムにより窒素ガスをプラズマ状態にして上記の製作した蒸発源からの炭素粒子に窒素を化合せるための装置を作った。即ち13.5MHrzの高周波RF電源、マッチング回路をEBX-2000Cの真空装置の外側に又水冷式ステンレス製アンテナは真空装置内に取り付けた。アンテナは蒸発源の上方30cmにして窒化炭素が効率的に蒸着ガラス基板にデポジッションするようにした。真空装置に組み込んだ上記2件の装置を用いて実際に窒化炭素フォイルの試作をした。その結果厚さ300ug/cm2の炭素フォイルに8%前後の窒素が化合していることが判った。22年度は高再現性で厚さ300ug/cm^2以上のHBCフォイルを作成する目的でアーク放電輻射熱に対して十分耐熱性を持つ新型水冷式傾斜型蒸発源2台(オーバーホール1台含む)を製作しEBX-2000Cの真空チャンバーの両サイドに2台設置した。この蒸発源は蒸発炭素ロッドの長さを旧来の500mmから700mmに長くし一回の炭素ロッドで上記目的の厚膜が作れるようにした。東海村のJ-PARCの第3荷電変換部に使用する大型炭素フォイル(240mmx400mm)の開発に向けて100mmx510mmの大型蒸着基板を製作した。ピンホールの抑制に向けてボロンドープ量の他に蒸発炭素粒子のサイズ効果によるそのピンホール発生量を緩和する炭素粒子蒸発のみの蒸着用水冷なしの平行型炭素蒸発源を上記2台の真ん中に設置した。HBCフォイルのメカニカルの強度を増す目的で窒素高周波RFプラズマ装置を設置した。直径45mm,1ターンのステンレス製アンテナを蒸発源から300mmの蒸着基板の上に設置した。上記の諸改善した蒸着装置で各種類のHBCフォイルを作成した。最大膜厚さは450ug/cm^2.HBC-フォイルの元素組成分析は京大(宇治)の2MeVのα粒子を用いてRBS法で測定した。HBCフォイに窒素を印加するために設置した高周波RFは窒素ガス圧が10^<-2>Paでも蒸発源からのアーク放電によりプラズマの継続が途切れ不安定であったのでこの方法によるHBCフォイルの窒化膜作成の試みは取りやめた。以上の準備を行い厚さ300-450ug/cm^2のシングルHBCフォイルを作成し、東工大(理)の3.2MeVのネオンイオンビームとKEKの650KeVの負水素イオンビームを用いて変形と寿命の試験を行った。今年度ではピンホール抑制法は見いだせなかったが製膜法と寿命の改善は進んだ。最大製膜できるHBC-フォイルの厚さの製膜試験をした。炭素中のボロン混合量20%の場合、最大700ug/cm^2の厚さのフォイルが出来ることが分かった。HBC-フォイルの密度、熱伝導率、室温抵抗、スパッタ率についての特性評価試験を行い他のテストした他の炭素フォイル、例えばCM,CNT(カーボンナノチューブ)フォイル,それにダイヤモンドフォイル等と比較した。この中でHBC-フォイルの密度と熱伝導率はもっとも低かった。

HBC-フォイルの寿命評価試験は照射イオンビームのエネルギーとイオンの異なる3種を用いて即ち米国ロスアラモス研究所の800MeV120uAの線形加速器のパルス負水素イオン,KEKの650keV、200uA DCコッククロフト加速器の負水素イオン、それに東工大(理)の3.2MeV DCヴァンデグラーフ加速器のネオンのイオンビームを用いて測定した。テストしたフォイルの厚さは約340ug/cm2のシングルとダブル(170ug/cm2x2)のHBC-フォイル,併せて市販のCM,ナノ結晶ダイヤモンド、DLCそれにCNTフォイルを比較のために測定した。その結果イオンビームのエネルギーとイオン種に関係なくHBCフォイルはシングルとダブルフォイル共に250h以上の寿命を持つことが分かった。CMとDLCフォイルは約1h,ナノ結晶ダイヤモンドフォイルは20hを示した。ただしシングルHBCフォイルはビーム照射面に於いてわずかのピンホールが観測されたがダブルは全く観測されなかった。又HBCフォイルは大きな変形は見当たらず膜厚減少は20%以内であった。東工大とKEKの場合、ビーム照射時間に制限があったので測定は約250hで一時停止した。HBCフォイルの寿命は市販とDLCフォイルのの200倍、ナノ結晶ダイヤモンドフォイルの100倍以上の長寿命を呈した。このテスト結果からHBCフォイルは2000±300Kの高温環境下でも高耐熱性であることが分かり、MWクラスのビーム出力を出す大強度陽子加速器の荷電変換フォィルとして使用できることが立証された。
N-Heterocyclic Carbene-modified Gold Nanoclusters: Novel Materials with Potential Biological Applications

金属ナノ粒子、ナノクラスターはバルク金属、金属錯体とも異なる物性を示すことから新規金属材料として注目を集めている。その中でも金ナノ物質は生体イメージングとしての応用が期待されてきたが、生体環境下での安定性が大きな課題であった。これまでにN-ヘテロサイクリックカルベン(NHC)を用いることで金表面、金ナノ粒子を極めて安定化させることを見出している。本研究では安定性に優れたNHCで修飾された新規金ナノクラスターの創製を目指した。本年度は二座NHC配位子を有する金錯体からのボトムアップ合成による金ナノクラスターの創製を行った。昨年度に二座NHC配位子を用いることで温度やチオールに対して非常に安定な金ナノ粒子を得ることに成功している。この知見を基に、アルキル基で架橋したイミダゾリウム塩を合成した。次に塩基存在下、塩化金ジメチルスルフィド錯体と反応させることで二座NHC-金錯体を得た。得られた金錯体を水素化ホウ素ナトリウムを用いて還元することで、金ナノクラスターを得ることに成功した。質量分析(ESI-TOF)によって、得られた金クラスターは金原子を14個、二座NHCは5つ有するものが主生成物であることがわかった。興味深いことに、得られた金クラスターはアセトニトリル中80Cで1日加熱してもクラスター構造が保たれており、温度に対して極めて高い安定性が示唆された。また金クラスターはオレンジ色の蛍光を示すことも明らかとなった。生体内での安定性評価には至っていないが、本研究の目標である安定な金ナノクラスターの創出に向けた非常に重要な研究成果が得られたと考えている。
インテグリンMac-1を介する白血病細胞表面の凝固開始機構

本研究では、白血球細胞上のMac-1を介した凝固活性化機序を解明するために、患者白血病細胞上Mac-1発現率と臨床的な凝血学的所見について検討し、以下の結果を得た。1.末梢血白血病細胞上のMac-1発現率白血病患者28例:急性骨髄性白血病(AML)18例(M13例、M29例、M32例、M43例、M61例)、急性リンパ性白血病(ALL)3例、LGL白血病1例、急性混合性白血病2例、骨髄異形性症候群1例、慢性骨髄性白血病急性転化2例を対象とした。平均Mac-1発現率はALL(16.3%)に比べてAMLの方が高く、特にM2(36.2%)、M4(35.7%)で高率であったが、臨床的にDICを合併しやすいM3(7.5%)では最も低値であった。2.凝血学的所見とMac-1M3の2例を含むDIC合併例8例と非合併例20例における白血病細胞上Mac-1発現率を比較すると、合併例では17%、非合併例では38%であり有意差を認めず、非合併例では高値であった。Mac-1発現率と、凝固線溶系パラメータPT、APTT、FDP、D-dimer、TAT、PICとの間には有意な相関は認められなかった。CD14はLPSレセプターとしての機能を有しており、今回同時に発現率を検討したが、Mac-1と同様にDIC非合併例の方が高率に発現していた。一方、Mac-1発現率が90%と高値であったM4では、TAT、PICの増加はわずかであった。3.結論以上の結果より、白血病細胞上のMac-1を介した凝固活性化機序が、臨床的な凝固亢進状態を引き起こす可能性はきわめて少ないと考えられる。少なくとも、M3症例におけるDICの発症には、Mac-1の関与よりも白血病細胞中の組織因子による凝固活性化が重要な要因になっているといえよう。1.成績:(1)Procoagulant activity(PCA)の測定:白血病細胞ホモジネートに正常血漿Ca2^+を加え凝固時間を測定した。骨髄系白血病細胞ではリンパ系腫瘍に比べて、PCAは高値傾向を示した。特に、DICを合併した急性前骨髄球性白血病(APL)では著しい高値を示す症例が多く、その他の急性骨髄性白血病(AML)例でも高値を示した。一方、慢性骨髄性白血病(CML)ではchronic phaseでは低値であるが、急性転化を示すと高値となった。(2)第X因子活性化能の測定:白血病細胞ホモジネートに第X因子を加えインキュベート後、発色合成基質S2222を加え、吸光度の変化により活性化第X因子の生成を測定した。AMLやALLでやや増加していたが、各病型で有意な差はみられなかった。また、DIC症例と非DIC症例との比較においても差を認めなかった。(3)患者白血病細胞上でのMac-1の発現をフローサイトメトリーにて測定:急性白血病患者11例(AML7例:M01例,M1 1例、M23例、M4 1例:ALL3例、LGL白血病1例)、骨髄異形成症候群(RAEB-T)1例を対象とした。AMLでは、M4にてMac-1発現率が40%と著明に上昇していたが、他のタイプでは113%程度であった。ALLも315%程度であったが、LGL白血病では33%と高値であり、臨床的にも凝固亢進状態を認めた。今後、Mac-1発現を高率に認めた白血病細胞上の、Mac-1を介したXa活性について検討する予定である。

3.結論以上の結果より、白血病細胞上のMac-1を介した凝固活性化機序が、臨床的な凝固亢進状態を引き起こす可能性はきわめて少ないと考えられる。少なくとも、M3症例におけるDICの発症には、Mac-1の関与よりも白血病細胞中の組織因子による凝固活性化が重要な要因になっているといえよう。