hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
東アジアの森林生態系におけるエアロゾルの沈着量と動態の評価

いずれのサイトにおいても、十分な精度で測定できたときの微小粒子成分は沈着のフラックスを示した。特に、寒帯林サイトにおいて実施した3週間サンプリングによる長期観測から、微小粒子だけでなく低濃度の粗大粒子成分の濃度勾配(沈着フラックス)もとらえることができた.3緩和渦集積(REA)法に基づくサンプリング装置(試作機)の開発を行った。超音波風速計のセシサー近くに吸引口を設置し、吸引したエアロゾルを、PM2.5サイクロン(VSCC)通過後に、3ライン(鉛直上向風時、鉛直下向風時、両者の中間(Dead band))のいずれかのフィルターへ捕集するよう設計した。4本計画研究の研究成果の集約と今後の連携強化を目的として、タイの共同研究者を招聘し、2011年3月7日、北海道大学にて国際ワークショップを開催し、計13件の発表がなされた。東アジアの熱帯、温帯、寒帯にそれぞれ属するサケラート(タイ)、北佐久(長野)、天塩(北海道)の森林においてエアロゾル成分の沈着観測を実施し、沈着プロセスの解明および沈着量の把握を行った。1フラックス直接測定天塩における硫酸塩粒子の長期の濃度勾配測定の結果、北佐久と同様、理論値を大きく上回る沈着速度が得られた(平均0.36cm s^<-1>湿度による粒子成長を考慮した経験的なパラメタリゼーションにより、同レベルの沈着速度を推定することができた。また、フラックス測定法の精度向上を目的として、北佐久において緩和渦集積法測定装置のテストを実施した。大気中濃度が高いサンプルにおいて上向時より下向時が高濃度になることが確認され、硫酸塩粒子の沈着をとらえた結果であると考えられた。2沈着量把握サケラートにおけるブラックカーボン(BC)の年間沈着量を推計した。乾性沈着は、濃度と沈着速度がともに高い24月に多く、湿性沈着量は、濃度が高く雨季が始まる3月に最も多かった。前者は、バイオマス燃焼に伴う高濃度と風速が大きい時期が一致したこと、後者は、当該高濃度時の降雨によるウォッシュアウトが効いたことによるものと考えられた。一方、繁茂期である6月11月の沈着量は、落葉期に比べ少なかった。年間沈着量は、乾性沈着が湿性沈着の10倍程度と推計され、測定の不確実性を考慮しても、当該森林においては顕著に乾性沈着が多いことが明らかとなった。3葉面エアロゾル沈着量の解析上記3地点に多摩丘陵(東京)および加治川(新潟)の森林を加えた5地点において、葉面に付着したエアロゾル中のBC量を比較した。それぞれの森林における葉面BC量の年間最大蓄積量を見積り、同研究項目(植物影響)で検討されている樹木活性への影響を評価する上で有益なデータを得た。東アジアの森林に対するエアロゾルの沈着速度、葉面へのエアロゾル付着量、年間沈着量等の知見が蓄積されており、最終年度の統合評価に向けて準備が整ったと考えられる。最終年度である平成24年度は、これまで得られた知見の統合と不確実性の把握を行う。エアロゾル沈着の長期観測を続けている天塩およびサケラートの森林サイトにおける観測を継続し、年々の差を把握すると共に、平成23年度までの調査において得られた沈着速度および葉面付着量に関する知見に基づき、当該地域における広域のエアロゾル沈着量と葉面への沈着の実態を明らかにする。
鍼を用いた心臓副交感神経の賦活化とその糖尿病、心不全への応用

副交感神経の低下と交感神経の亢進が心不全に大きな影響を与えていいることから、デバイスによる副交感刺激療法の前臨床試験が始まっている。しかし、同方法は高価で侵襲的である欠点がある。そこで、心不全ラットの自律神経反応性を有する経穴である「足三里」に鍼電気刺激を行い、心拍変動法を用いて自律神経機能評価を行った。その結果、不全心の自律神経介入治療の目標である副交感神経機能改善の可能性を示唆する所見が得られた。H25年度は、若年糖尿病ラットと老年長期糖尿病ラットにおける交感神経の周波数分布について検討を行った。自律神経系のバランスの評価は、H24年度と同様にHRV(心拍変動)の自律神経機能パラメーターを用いた。また、心エコー法を用いて心機能(EF)も計測した。雄性Wistar rat5週齢(n=6)と40週齢(n=6)にStreptozotocin(STZ,65 mg/kg 1回、皮下注)を投与し、糖尿病を作成した。また、対照群としてそれぞれ5週齢(n=6)と40週齢(n=6)に生食を注射した。若年糖尿病ラットではSTZ投与4週間後に計測し、老年糖尿病ラットではSTZ投与20週間後に計測した。血糖値、体重はそれぞれ、若年対照群(57±20mg/dl、310±24g)、若年糖尿病群(456±45mg/dl、303±11g)、老年対照群(74±25mg/dl、757±12g)、老年対照群(519±70mg、367±18g)であった。HRVの交感神経機能指標であるLF/(LF+HF)と心機能の指標であるEFはそれぞれ、若年対照群(0.0062±0.0057、69±8%)、若年糖尿病群(0.0115±0.0122、73±5%)、老年対照群(0.0086±0.0097、79±9%)、老年対照群(0.0644±0.0339、58±7%)であった。交感神経指標は若年ラットの4週間の高血糖では、上昇する傾向を示したものの統計的に有意ではなかった。一方老齢ラットの20週間の高血糖では、交感神経指標は有意に増加した(p<0.01)。この群の比較では、血糖の上昇に加えて、体重の減少、EFの減少が有意であった(それぞれp<0.01、p<0.01)。これらの結果は、糖尿病における自律神経系の変化には、栄養障害、心機能障害が連動していることを示唆している。HRVの計測は、解析機器PowerLabを用いた。心電計測は、針電極を使用し,II誘導の位置(右肩:ー極,左肋骨下縁:+極,右側腹部:不関電極)に対して、連続500心拍を記録した。HRVの解析にはChart Ver.5.5.6を用い、心電図RR間隔の周波数解析(高速フーリエ変換)を行い、X軸をfrequency(Hz),Y軸をPower(ms2)とした周波数解析図を作成した。低周波数成分(LF)、高周波数成分(HF)の周波数帯はそれぞれ、0.04Hz<LF<0.67 Hz、1.0 Hz<HF<1.5 Hzと定義した。交感神経指標はLF/(LF+HF)、副交感神経指標はHF/(LF+HF)と定義した。【結果】交感神経指標のLF/(LF+HF)は、Control (0.054), DM4W (0.092), DM20W (1.49)と糖尿病が進行するにしたがって増加した。一方、副交感神経指標のHF/(LF+HF)はControl (0.946), DM4W (0.908), DM20W (0.851)と減少する傾向を示した。糖尿病ラットモデルの自律神経機能をHRVで評価すると、交感神経緊張は亢進し、副交感神経緊張は相対的に低下することが示された。高血圧ラット(SHR)に対して鍼電気刺激を行い、心臓自律神経の変化を心拍変動法で検討した。ラットはSHRと対照(各n=5)を用いた。【方法】刺激場所は両側の「足三里」(膝蓋骨下脛骨外側5mm)で、鍼を刺入後15分間通電した(5 Hz)。刺激前、刺激中、刺激15分後の3点で心電図心拍変動法の自律神経指標を比較した。心電図のRR間隔を時間領域解析指標(Total Power, RMSDD)、周波数領域解析指標(HF, LF/HF)を用いて検討した。心拍の間隔の揺らぎ(Total Power)が小さいほど交感神経の緊張が高い。また、RMSDDが大きいほど副交感神経活動が大きい。HFは副交感神経活動、LF/HFは交感神経活動を示す。

【結果】SHR群では、対照群に比べ電気刺激前では有意にtotal powerが低く(6±5 vs. 92±128 ms2)、心拍変動が低調であり、自律神経活動の大幅な低下がうかがわれた。また、RMSDDからみた副交感神経活動は抑制されていた(4.4±4.0 vs 7.2±4.8)。周波数解析領域の交感神経と副交感神経指標の変化を、電気刺激前、電気刺激終了直前、電気刺激終了15分後で比較すると、交感神経指標のLF/HFはSHR群では(0.77→0.83→1.10)、対照群では(0.17→0.12→0.52)であった。また副交感神経活動指標のHFはSHR群では(28→42→46 nu)、対照群では(30→30→39 nu)であった。【考察】鍼治療において足三里の刺激は自律神経調整機能があるとされている。今回、大きな自律神経機能の低下がみられたSHRモデルにおいて、自律神経調整特異点(例えば足三里)の鍼の電気刺激は自律神経活性化作用を示した。とくに、副交感神経の回復度が対照群より大きかったことに注目し、今後さらなる特異点の開発とその応用を目指したい。総合領域H25年度は、糖尿病のHRV変化の意味について検討を行い、糖尿病における心臓自律神経の変化は、単に自律神経活動の変化を示すのみならず、糖代謝異常に基づく栄養障害、また、心機能障害を同時に伴っていることを示すことが判明した。交感神経の持続的亢進が病態を悪化させることは、糖尿病に限らず心不全においても知見が蓄積されつつあり、交感神経機能に対する介入の意義もβ遮断剤を中心に検討が行われている。一方、副交感神経を刺激することにより、自律神経系のリバランスを得ようとする試みも一部では行われ始めている。H25年度は、鍼刺激による有効な副交感神経反応を得ることが出来なかったが、H26年度は鍼刺激による副交感神経に対する有効作用部位を得て、研究の進展を図りたい。H24年度は、まず糖尿病ラットの作成とそれに対する心拍変動(HRV)による評価が行った。糖尿病ラットは、Streptozotocinの腹腔内投与により安定して作成することができた。高血糖であることはStreptozotocin投与35日後には確認できたが、糖尿病として安定させるため、4週間モデルと20週間モデル2群を作成した。心拍変動(HRV)の周波数解析を用いた検討では、交感神経指標(LF/(LF+HF))は、糖尿病群では対照群に比べて20週に至るまで順次増加した。一方、副交感神経指標(HF/(LF+HF))は、糖尿病の病期が延びるに応じて、低下した。臨床研究においても、糖尿病では、副交感神経成分が減少し、周波数解析のpowerは低周波数側にshiftしており(Vinik AL, et al. Diabetes Care 2003;26:1553)、本モデルは臨床における糖尿病の自律神経変動をよく反映しているものと考えられた。このモデルに対して、副交感神経を賦活する鍼刺激を行い、自律神経のバランスの不均衡を是正し、糖尿病合併症(腎症)発症の遅延もしくは改善を検討するはずであったが、鍼刺激装置の選定と購入が遅れたため、次年度に繰り越しとなり、計画の進捗がやや遅れた。H25年度は糖尿病および心筋梗塞ラットを作成し、HRV周波数解析を行い、それぞれ交感神経優位なHRVの特性が記録されたが、鍼をラットに刺入し自律神経変化(副交感神経刺激)を得る最適点を得ることができなかった。そこでH26年度は副交感神経刺激最適点を確認し、初期の研究目的を達成したい。H24年度は、糖尿病の病的ラットモデルの適正な作成とHRVによる自律神経障害モデルとしての妥当性の評価にとどまった。H25年度は、副交感神経刺激を行い、次の評価を行う。1)ラットの下腿に鍼刺激(通電)を行い、心拍数の低下を指標とした副交感神経の有効刺激部位を同定する。
経皮質性誘発筋電図と手指運動巧緻性との関連性

霊長類は、大脳皮質運動野手指領域の発達とともに、五指をそれぞれ独立して動かせるようになった。本研究では、指から大脳皮質への感覚性情報が手指運動巧緻性と関連するものと考え以下の実験を行なった。1手指皮膚刺激による手指筋誘発筋電図のE2成分の神経経路の解析刺激強度を、感覚閾値の3倍で各指皮膚刺激を行なう事により、3つの興奮性成分(E1,E2,E3)より構成される誘発筋電図が記録された。このうち、E1成分は脊髄反射であることがGarnett('80)により報告されている。そこでE2成分(潜時75msec)が大脳皮質運動野を経由することを以下の実験で明かにした。運動野へ磁気刺激を与えmotor evoked potential(MEP,潜時19msec)を手指筋から記録した。MEPがE2電位とほぼ同時になるように刺激すると、筋電図に促通がみられた。しかし、皮質への電気刺激では、MEPの潜時は磁気刺激より2msec速いが皮膚刺激との組合せで促通が見られず、磁気と皮膚刺激による促通は皮質レベルで起きている事が推察された。即ち、手指皮膚刺激による誘発筋電図のE2成分は大脳皮質運動野を経由していることが明かになった。2 E3成分の神経経路の解析:MRI撮影により、頭頂部に萎縮がみられたヒトで、手指筋誘発筋電図を調べたところ、E1,E2成分は誘発されたが、E3成分が消失していた。すなわち、E3成分は、E2とは異なった大脳皮質部位が関与していることが明かになった。3 E2とE3成分の振幅比を指毎に比較した。親指と第四指では後者の成分の方が、他の指では前者のほうが優位であった。上記2とを考え合わせると、指により皮質の関与の仕方が異なる可能性が示唆された。5今後、E2とE3成分がどの様な指運動と機能的に対応しているかを明かにしたい。
内分泌かく乱物質による脳内アミンへの影響

ラット脳組織ホモジネートから、膜画分および細胞質画分を調製し、ビスフェノールA (BPA)結合能を指標に、BPA受容体の探索を行った。その結果、神経細胞膜画分(P2画分)に高い特異的なBPA結合活性がみられ、この画分にBPA結合タンパク質が存在していることを見いだした。BPA-sepharose affnityクロマトグラフィーによって、BPA結合タンパク質の単離・精製を試み、SDS-PAGE解析で単一バンドとなるタンパク質の単離・精製に成功した。単離したタンパク質のN末端アミノ酸配列解析を行なったところ、得られたN末端33残基のアミノ酸配列は、Protein Disulfide Isomerase (PDI)と相同性を示した。PDIの全長cDNAをクローニングし大腸菌を用いて、PDIタンパク質(rPDI)を発現させた。発現PDIタンパク質(rPDI)を用いて、BPA結合活性について検討を行い、PDIがBPA結合活性を有していることが明らかとなり、P2画分でみられたBPA結合タンパク質がPDIであると考えられた。BPAのPDIへの結合は、甲状腺ホルモンのPDIへの結合を競合的に阻害することから、BPAがPDIを介して細胞内の甲状腺ホルモン動態に影響を与えている可能性が考えられた。また、ラット副腎髄質褐色細胞種由来の樹立細胞株PC12細胞を用いたドパミン放出実験系を確立した。BPAをPC12細胞への短期曝露させると、PC12細胞内のドパミンがBPA濃度依存的に放出される事が明らかとなり、この検出系は、BPAの神経作用の簡便なin vitro検出系として有用であると考えられた。内分泌かく乱化学物質の一つであるビスフェノールA(BPA)の胎児期投与によって、新生仔の脳内のアミンが減少することを我々は既に明らかにしている。本年度の研究で、BPAによるこの作用の機序を明らかにするために、神経細胞に存在するBPA受容体の探索を行った。様々な内分泌かく乱化学物質は、細胞質内に存在するエストロゲンレセプターを介して、生殖器異常を引き起こすことが明らかになっている。しかし、BPAはエストロゲンレセプターに対する親和性は低いため、我々は神経系へのBPAの作用は、エストロゲンレセプターとは異なる受容体を介していると考え、神経細胞膜画分を新規受容体探索の材料とした。ラット脳60匹からシナプトゾーム画分を含む粗P2画分を調製した。放射性標識したBPAのこの画分への結合活性を測定したところ、特異的結合活性が見られた。この結合活性は、エストロゲンの添加によっても阻害されないことから、エストロゲンの受容体やその類似蛋白質でないことが示された。そこで、この画分からの受容体蛋白の精製を開始した。様々な膜可溶化剤、可溶化条件の検討の後、粗P2画分を非イオン型界面活性剤で可溶化し、その後イオン交換クロマトグラフィーAffinityクロマトグフフィーを行うこととした。Affinityクロマトグフフィーでは、BPAにスペーサーを付けた化合物を3種合成し、それらをsepharose樹脂に共有結合させた我々独自のBPA-Affinityカラムを作成した。このBPA-Affinityカラムに結合し、BPAによって溶出されてきた蛋白質は、SDS-PAGE上、たった2本の蛋白質バンドとなった。このように、神経細胞の膜画分に含まれる、BPA受容体と考えられる蛋白質の精製に成功した。現在、この蛋白質がBPA受容体蛋白であることを確認するために、これらの蛋白質のアミノ酸N末の配列を解析すると共に、その情報からこの蛋白質のクローニングおよび異種細胞内発現を開始しようとしている。ビスフェノールA (BPA)を胎児性に暴露すると、脳内ドーパミンが低下し、ドーパミンのD_2リセプターは低下、D_4リセプターが増加することを見出した。

BPAを用いた結合実験からBPA受容体が脳神経に存在することが予測されたので、そのタンパク質の精製を行った。ラット脳シナプトゾーム(P2画分)を可溶化し、DEAEセルロースクロマトグラフィーを行い、0.2M NaCl画分を得る。この画分をさらに、BPAをリガンドとしたセファローズカラムを作製し、そのカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーを行った。BPAで溶出されるタンパクはシングルバンドで53KDを示した。N-末端アミノ酸配列を決定し、データベースから検索した結果、精製した53KDタンパク質はprotein disulfide isomerase (PDI)と一致した。リコンビナントPDIを作製し、BPAとの結合実験を行った結果、BPAはPDIに特異的に結合することが明らかになった。PDIは、甲状腺ホルモン結合タンパク質で、甲状腺ホルモンのリザーバーとして知られている。したがって、BPAは甲状腺ホルモンを変動させることによって、生体に異常をもたらすと考えられる。リコンビナントPDIと^<125>I-T_3を結合させておき、BPAを加えて、^<125>I-T_3の解離を測定することによって、BPAのPDIに対する結合の強さを測定した。この方法は、各種内分泌かく乱化学物質の中枢神経系への作用を測定するスクリーニング法として有用である。これまで内分泌かく乱化学物質は主にエストロゲンリセプターに結合し、エストロゲン様作用を発現し、主に生殖器に異常を起こしていたが、内分泌かく乱化学物質による中枢神経系への作用は、本研究によって初めて甲状腺ホルモンに影響を与えることが推察された。
血中8-イソプロスタン値とがん罹患に関する前向きコーホート研究

8-イソプロスタンは生体内酸化ストレス状態のバイオマーカーである。2002年に実施した仙台市鶴ヶ谷地区在住高齢者(70歳以上)を対象とする総合的心身機能評価(Comprehensive Geriatric Assessment : CGA)参加者で追跡調査可能な者(国民健康保険加入者)を対象に、研究に際して測定された血中8-イソプロスタン値とがん罹患との関連を、採録調査による追跡調査にもとづき検討した。890名を2年間追跡し、総観察人年1713.9人年で38例のがん罹患を観察した。血中8-イソプロスタン値によって対象者を3群に分け、低値群を基準とし、Cox比例ハザードモデルを用いて各群の相対危険度を算出した。性、年齢、body mass index、糖尿病、高血圧、非食事性抗酸化物質の摂取、喫煙、飲酒、自己健康感、身体機能を補正した全がん罹患に関する相対危険度(95%信頼区間)は、8-イソプロスタン低値群を基準とすると、8-イソプロスタン中間群では0.79(0.36-1.72)、8-イソプロスタン高値群では0.42(0.18-1.00)(傾向性のP値=0.049)と統計学的に有意な負の関連がみられた。以上の結果から、血中8-イソプロスタン値は、がんリスク予測バイオマーカーとしてその低値が意義を持つことになる可能性が示唆されたが、がん罹患総数38例であるためこの結果が偶然である可能性は否定できない。
コミュニティー(集落)の防災力と避難行動に関する実証的研究

長野県飯山市および栃木県茂木町における水害時の住民行動分析より以下の諸点が解明された。(1)水害経験と避難率・避難時期の関係経験の有無という形でなく、経験した年代・頻度・被害の程度によって異なった行動がとられる。古い経験や、軽微な経験は事態を過少評値する傾向にある。一方、三十年に二度程度の頻度をこえると、対応は敏速になってくる。なお、経験が集落として蓄積されている場合には、想談活動も活発になり全体として、対応が早められる。(2)集落の結束度と避難行動(災害時の想談度,協力度)災害時における集落内の情報交換や協力関係が避難行動に影響するとされているが本研究では水害時の情報交換の実体と協力関係についてアンケート調査に基づき解明した。災害時の情報交換を想談度として定量化し、水片づけや避難行動での協力関係を示す協力度と共に避難行動との関係を考察した。想談度と協力度は高い相関があり想談活動が避難行動そのものの協力関係を強めている。又、避難率は想談度・協力度と正の相関を示した。さらに協力度は避難途中の安全度を避難先での安全度を高める傾向にある。避難場所までの距離、及び避難路安全度等の物理的条件と共に災害経験、集落の結束度(災害時想談度・協力度)がコミュニティー(集落)の防災力を構成する重要な要素であることが示された。なお各々の要素は互に密接に関連しておりその内部構造の検討が今後の課題とされる。
胎土分析を用いた葬送行為にともなう弥生土器動態からみた社会複雑化過程の研究

本研究の目的は、弥生時代における社会複雑化過程を明らかにすることである。具体的な対象は、北部九州地域の弥生時代中・後期である。特に、集落と墓域の両方の場を媒介する土器に着目し、考古学と地球科学の分析手法を併用することで、地域社会の形成基盤となる交流を反映する物質文化動態を検討した。また、酸化焔焼成土器と還元焔焼成土器の比較分析を行い、土器胎土データベースの適用範囲を確認した。今後もさらなる分析データの蓄積が必要である。本研究の目的は、集落と墓域の両方の場を媒介する土器に着目し、考古学的分析手法による型式学的検討と、地球科学的分析手法による胎土分析を併用することで、地域社会の形成基盤となる日常的交流および葬送行為をはじめとする祭祀儀礼的コンテクストにともなう交流を総合化する物質文化動態を捉え、弥生時代における社会複雑化過程を明らかにすることである。平成27年度は、調査項目A(葬送行為関連土器と集落出土土器の生産体制の比較)とB(葬送儀礼時における遠隔地移動土器の析出と在地土器様式との関係)を中心に実施し、胎土分析に着手する前段階のデータ収集・整理を行った。対象遺跡は、吉野ヶ里遺跡(佐賀県)と幅・津留遺跡(熊本県)である。資料保管機関での熟覧に基づく土器観察を通して型式学的検討や土器編年作成を行うとともに、胎土分析を実施する資料の絞り込みを進めている。現段階では、集落出土土器と比較して、墓域で使用された土器には遠隔地に由来する土器が含まれる比率が高いことを確認した。形態・文様・胎土などの土器諸属性の特徴から土器そのものが搬入された可能性が高いが、土器の使用にかかわる痕跡(煮沸痕跡、穿孔・打ち欠きなどの破砕痕跡)は搬出推定地とは異なるパターンを示す。次年度以降に胎土分析を実施することで、土器の搬入ー搬出関係にかかわる地域間交流や集団関係のより正確な把握を目指す。研究成果は、学会での口頭発表・ポスター発表で報告し、考古学や文化財科学を中心とする関連分野の研究者との議論を通じて、分析やデータ解析の方法の洗練化を図った。所属機関の変更にともない、分析試料作成のための研究室や器具・機器類の確保が新規で必要となった。研究環境の整備に時間を要することから、本年度は胎土分析を実施する前段階の考古学的データの収集・整備に重点を置き、次年度以降に対象とする予定であった他遺跡の検討を前倒しで開始した。なお、本研究では、発掘調査報告書等に掲載されていない未報告資料の活用も重視していることから、資料保管機関での資料の熟覧が不可欠である。当初の予定以上に長期間の時間確保が困難であったが、短期間で複数回調査に行くことで、基本的なデータを収集することができた。本研究の目的は、考古学的分析手法による型式学的検討と地球科学的分析手法による胎土分析を併用することで地域社会の形成基盤となる交流の実態を検討し、弥生時代における社会複雑化過程を明らかにすることである。平成28年度は、前年度に引き続き、調査項目A(葬送行為関連土器と集落出土土器の生産体制の比較)と調査項目B(葬送儀礼時における遠隔地移動土器の析出と在地土器様式との関係)を中心に、胎土分析に着手する前段階のデータ収集・整理を行った。中心対象遺跡および周辺関連遺跡の土器観察、型式学的検討、土器編年の作成を進めた。また、土器の型式学的検討を踏まえた胎土分析資料のサンプリングを行った。さらに、弥生土器を中心に構築している土器胎土データベースの適用範囲の確認と窯業生産物との違いを明らかにすることを目的として、須恵器の胎土分析を併行して実施した。現段階では、酸化焔焼成土器と還元焔焼成土器では、焼成諸条件や埋没環境の影響の受けかたが異なる見通しを得ている。今後もデータを蓄積することで、精密なデータベースの構築を図る。研究成果は、学会での口頭発表・ポスター発表で報告した。関連分野の研究者との議論を通じて、分析方法やデータ解析方法の改善および洗練化を進めている。研究環境の整備および資料保管機関での資料の熟覧がおおむね終了した。考古学的検討が順調に進んでいるため、次年度の胎土分析の実施に速やかにとりかかる基礎ができている。本研究の目的は、考古学的分析手法による型式学的検討と地球科学的分析手法による胎土分析を併用することで、地域社会の形成基盤となる交流の実態を検討し、弥生時代における社会複雑化過程を明らかにすることである。特に、北部九州地域の弥生時代中後期を対象に、葬送行為にともなう土器移動現象の把握と社会変化の関係を検討している。平成29年度は、前年度に引き続き胎土分析に着手する前段階の考古学的データ収集・整理を行うとともに、対象遺跡の土器観察や型式学的検討などの情報整理を進めた。また、土器の型式学的検討を踏まえた胎土分析資料のサンプリングも継続して行った。本年度は特に、埋葬専用土器である大型専用甕棺のサンプリングを進めた。分析を終えていない資料に関しては、今後胎土分析を実施予定である。葬送儀礼で使用された赤彩土器と無塗彩の日常土器を分析した結果、原材料の点では両者は明確に区分できないこと、むしろ土器製作時の丁寧度(器種、塗彩、文様、胎土調整)の点で両者の差別化が図られていること、在地で製作された土器が多数を占めるが搬入された可能性のある資料が少数存在することが分かった。

しかしながら現時点では分析資料数が少ないため、時期差や地域差、集落の性格などを考慮したさらなる検討が今後必要である。研究成果については、関連分野の研究者との議論を通じて、分析方法やデータ解析方法の改善および洗練化を進めている。本研究の目的は、弥生時代における社会複雑化過程を明らかにすることである。具体的な対象は、北部九州地域の弥生時代中・後期である。特に、集落と墓域の両方の場を媒介する土器に着目し、考古学と地球科学の分析手法を併用することで、地域社会の形成基盤となる交流を反映する物質文化動態を検討した。また、酸化焔焼成土器と還元焔焼成土器の比較分析を行い、土器胎土データベースの適用範囲を確認した。今後もさらなる分析データの蓄積が必要である。本年度に進めた考古学的検討成果を踏まえて、胎土分析を実施する。当初の予測以上に、墓域で用いられる土器が多様な地域から搬入されている状況が明らかになったため、適宜周辺地域出土土器の資料調査を進める。胎土分析に関しては、研究環境の整備を速やかに完了して分析試料作成に着手するとともに、一部は研究協力者に測定を依頼して対応する予定である。前年度・本年度に進めた考古学的検討成果を踏まえて、胎土分析を実施する。中心対象遺跡の資料のサンプリングを現在進めており、今後は周辺関連遺跡の資料の型式学的検討および胎土分析資料のサンプリングを行う。現在進めている胎土分析の分析試料の作成を継続して行うとともに、一部は研究協力者に測定を依頼する。以上の分析成果をまとめるとともに、調査項目C(遠隔地との関係で入手された副葬品類の動態との比較)の検討を加えることで、弥生時代における社会複雑化過程に対して、葬送行為にともなう土器動態が果たした役割について考察する。考古学所属機関の変更にともない、分析試料作成のための研究室や器具・機器類の確保が新規で必要となった。研究室の確保や手続き、研究環境の整備に時間を要したことから、分析試料作成から機器測定までの胎土分析は、次年度以降にまとめて実施するよう計画を変更した。申請している物品費は、大半が胎土分析を実施する際に必要な消耗品類(ガラス器具類・精密分析試料作成用機材・顕微鏡備品など)であるため、本年度は使用できなかった。前年度から継続して研究環境の整備を進めている。本年度は、分析に用いる機器類の設置を中心に行った。申請していた物品費の大半が胎土分析の実施に必要な消耗品類(ガラス器具類・精密分析試料作成用機材など)であるため、本年度は使用できなかった。また、機器測定の際に必要な人件費・謝金は、次年度以降の使用に変更した。現所属機関において研究室を確保したため、年度当初に速やかに研究環境の整備を完了する予定である。その際、胎土分析の分析試料作成に必要な消耗品類・器具類を準備する。また、現所属機関では実施困難な分析があり、一部は研究協力者に測定を依頼して対応する必要があることから、そのための人件費・謝金として利用する予定である。分析試料の作成に必要な器具類・消耗品類を準備することで研究環境の整備を終え、速やかに胎土分析の実施に着手する。現所属機関では実施可能な分析については、一部は研究協力者に測定を依頼して対応する必要があり、人件費・謝金として利用する。
QCDの極限環境におけるアンダーソン局在と量子準位統計の探求

本年度において、過去の研究代表者の研究では解析的に扱うことができなかった、多フレイバーカイラルシンプレクティック型アンサンブルを含む幅広いカイラルランダム行列集団の個別準位分布を、初めて導出することに成功した。ここで用いられた技法は、統計数理の分野で古くから知られていた行列式点プロセスのヤノッシ密度の公式を引用し、これを実数のクォーク質量パラメータに解析接続した上で、ニューストレーム法を用いて数値評価するというものである。私たちが得た表式は、固有値相関関数の行列式表示と、ギャップ確率のフレドホルム行列式表示を統一する、新規な成果である。私たちは更にこの解析的結果を、スタガード型ディラック演算子を用いたNc=2, Nf=4の格子ゲージシミュレーションで得たディラック固有値分布の数値結果と対比し、完全な一致を得た。これらの解析的および数値的成果は、43ページに及ぶ単一の論文arXiv:1903.07176 [hep-lat]として発表され、JHEPにアクセプトされた。今回のランダム行列理論からの解析的成果を今後、ヒッグズ粒子のテクニカラー模型の候補である多フレーバーのゲージ理論(Nc=2, Nf=8など)の格子シミュレーションから得られるディラック固有値の個別分布と比較することにより、あるゲージ理論が通常のQCDと同じくカイラル対称性の破れた相にあるのか、あるいはテクニカラー模型として好ましいウォーキング型であるのか(この場合はランダム行列理論の結果と齟齬する)の精密な判定が可能となる点において、高い学術的意義を有する。上記の【研究実績の概要】に記載の通り、ランダム行列理論の解析的研究と大規模シミュレーションによる数値的研究を併用する本研究計画の通りに進行しているため、順調な進捗と判断する。本年度は、有限温度+有限密度におけるNc=2, Nf=2ゲージ理論について、ランダム行列理論側の解析的手法とシミュレーションによる数値的手法を併用して、研究計画に沿った研究を遂行する。具体的な観測対象としては、複素平面でのディラック固有値分布、および固有関数の逆参加比などを採る予定である。私は山本託也氏(大学院D3)と共同して、格子2色QCD+QEDの極めて広いパラメータ領域(SU(2)ゲージ結合定数:β=0, 0.25, 0.5, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75, 2.0, 2.1, U(1)ゲージ結合定数: e=2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 24, 28 *10^-4, Aharonov-Bohm flux: φ=1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5. 5, 6 *10^{-2},格子サイズ: V=4^4, 6^4)について数値シミュレーション(各パラメータ設定について14*10^4個の配位を生成)の実行とディラック演算子の厳密対角化を完了した。ここで得られた膨大なデータからディラック個別準位統計を導出し、これが先にNishigaki-Yamamoto, PoS LATTICE 214, 067 (2014)で発表した、遷移ランダム行列模型に基づく解析式によって完全にフィットできることを見出した。この手法により、2色QCD+QEDの広いパラメータ領域において、その有効理論に含まれる2つの低エネルギー定数(カイラル凝縮Σおよび崩壊定数F)をそれぞれ10^{-4}, 10^{-3}の精度で詳細決定することに成功した。この成果は、2色QCDをテクニカラー模型の候補として考える場合に、複合Higgs粒子の現象論的パラメータの決定への応用などが期待される。私たちはこの成果をYamamoto-Nishigaki, Prog. Theor. Exp. Phys. 2018, 023B01 (2018)にて出版するとともに、私を含む日韓の主催者が韓国ACTCPにおいて主催した国際会議において私が登壇発表した。この出版および国際会議発表により、本計画の当初の目的を達成することができた。研究実績の概要に記載の通り、順調に進行している。

今回のランダム行列理論からの解析的成果を今後、ヒッグズ粒子のテクニカラー模型の候補である多フレーバーのゲージ理論(Nc=2, Nf=8など)の格子シミュレーションから得られるディラック固有値の個別分布と比較することにより、あるゲージ理論が通常のQCDと同じくカイラル対称性の破れた相にあるのか、あるいはテクニカラー模型として好ましいウォーキング型であるのか(この場合はランダム行列理論の結果と齟齬する)の精密な判定が可能となる点において、高い学術的意義を有する。上記の【研究実績の概要】に記載の通り、ランダム行列理論の解析的研究と大規模シミュレーションによる数値的研究を併用する本研究計画の通りに進行しているため、順調な進捗と判断する。昨年度を引き継ぎ、提出した研究計画に従って進める。本年度は、有限温度+有限密度におけるNc=2, Nf=2ゲージ理論について、ランダム行列理論側の解析的手法とシミュレーションによる数値的手法を併用して、研究計画に沿った研究を遂行する。具体的な観測対象としては、複素平面でのディラック固有値分布、および固有関数の逆参加比などを採る予定である。当初購入を予定していたタワー型サーバ2台分と同等の性能を持ち、より安価で使い勝手が良いiMacProが発売されたため、これを購入したことにより残額が生じた。残額は今後、メモリアップグレードやGPGPUカードの購入に使用する。昨年度の研究成果を、研究計画に記載の国際会議ではなく国内会議にて発表することとしたため、旅費に余剰が生じた。本年度は成果をECT*(トレント、イタリア)において発表する予約をしており、前年度の余剰額はこの旅費に充てる。
プレニルトランスフェラーゼの構造機能相関と代謝工学への応用

p-ヒドロキシ安息香酸(PHB)プレニルトランスフェラーゼ(PPT)ファミリーの酵素機能を解明するため、昨年度はLithospermum erythrorhizon p-hydroxybenzoic acid geranyltransferase(LePGT)をモデルにして、分子内に存在する三カ所の高保存領域(R-(x)_5-N-(x)_3-D-(x)_4-R-(x)_3-RP、W-(x)_4-DxxY-(x)_3-D-(x)_3-D-(x)_6-S)及びY-(x)_3-KRへ部位特異的変異導入を行った。各変異酵素を酵母をホストとした発現系に導入発現させ、酵素活性を測定を測定したところ、PPTファミリーの酵素活性において中心的な役割を担っているのが、高保存領域中の高度に保存されたアスパラギン酸残基(D87、D91、D208)であることを明らかにできた。これらの部位特異的変異導入酵素に加えて、プレニル基質としてGPPに高い特異性を示すLePGTと、長鎖のプレニル二リン酸を基質にできる大腸菌のユビキノン生合成系のUBIAとのキメラ酵素を7種類作成し、酵素活性測定、並びに酵母によるユビキノン生成を指標とした相補試験を行った。その結果、両酵素のプレニル基質特異性の相違がN末端側の領域に由来することを明らかとした。またキメラ酵素の基質に対するKm値などの生化学的データから、N末端領域のアミノ酸が直接プレニル二リン酸との結合に寄与していることが示唆された。一方で、結合型プレニル転移酵素の構造生物学的解析を目指したLePGTの大量発現系及び精製条件の検討も行い、昆虫細胞をホストに用いてC末端にHis-tagを付与したLePGTを大量発現させ、発現した組み換えLePGTの界面活性剤による可溶化の最適化、Ni-NTAアガロースを用いたアフィニティー精製条件の最適化を行い、酵素活性を保ったままCBB染色レベルでほぼ単一のバンドにまで精製することに成功した。本年度は、この精製酵素を用いて、酵素機能のキャラクタライズを行った。その結果、精製LePGTは可溶化などの精製ステップにより、その酵素化学的性質に大きな変化を受けていないことを確認した。以上のように本年度はLePGTとUBIAとのキメラ酵素の作成とその解析によりプレニル基質の鎖長を認識する領域を明らかにするとともに、立体構造解明にむけた精製LePGTの基礎的な酵素化学的データの蓄積を行った。p-ヒドロキシ安息香酸プレニルトランスフェラーゼ(PPT)ファミリーの保存性の高いアミノ酸を絞り込むために、Lithospermum erythrorhizon p-hydroxybenzoate geranyltransferase (LePGT)、および類似の反応を行うことが知られているubiquinone生合成経路のPPTのアミノ酸配列のマルチプルアライメントを行った。その結果、本酵素ファミリーには二ケ所の高保存領域が存在することが明らかとなった(RxxxxxNxxxDxxxxRxxxRP及びWxxxxDxxYxxxDxxxDxxxxxxS)。この二ケ所の高保存領域は、疎水性の高い膜結合性タンパク質であるLePGTの分子内にあって親水性ループの部分に存在している。また、二ケ所の親水性ループに挟まれた中央付近の別のループ上の親水性領域にYxxxKRという高保存性配列を見いだした。まずは、これらの親水性ループ中の高保存性アミノ酸をそれぞれアラニンに置換した変異酵素を作成し、酵母をホストとして発現させた組み替え酵素の機能解析を行った。また、膜結合型プレニル転移酵素の構造生物学的解析を目指したLePGTの大量発現系及び精製条件の検討も行った。その結果、昆虫細胞をホストに用いてC末端にHis-tagを付与したLePGTを大量発現させることに成功した。また、発現した組み換えLePGTの界面活性剤による可溶化の最適化、Ni-NTAアガロースを用いたアフィニティー精製条件の最適化を行い、酵素活性を保ったままCBB染色レベルでほぼ単一のバンドにまで精製することに成功した。本年度はLePGTの部位特異的変異導入により酵素活性そのものに重要なアミノ酸、基質との結合に重要なアミノ酸を明らかにするとともに、立体構造解明にむけたLePGTの大量発現・精製プロトコールを確立した。これらの部位

特異的変異導入酵素に加えて、プレニル基質としてGPPに高い特異性を示すLePGTと、長鎖のプレニル二リン酸を基質にできる大腸菌のユビキノン生合成系のUBIAとのキメラ酵素を7種類作成し、酵素活性測定、並びに酵母によるユビキノン生成を指標とした相補試験を行った。その結果、両酵素のプレニル基質特異性の相違がN末端側の領域に由来することを明らかとした。またキメラ酵素の基質に対するKm値などの生化学的データから、N末端領域のアミノ酸が直接プレニル二リン酸との結合に寄与していることが示唆された。一方で、結合型プレニル転移酵素の構造生物学的解析を目指したLePGTの大量発現系及び精製条件の検討も行い、昆虫細胞をホストに用いてC末端にHis-tagを付与したLePGTを大量発現させ、発現した組み換えLePGTの界面活性剤による可溶化の最適化、Ni-NTAアガロースを用いたアフィニティー精製条件の最適化を行い、酵素活性を保ったままCBB染色レベルでほぼ単一のバンドにまで精製することに成功した。本年度は、この精製酵素を用いて、酵素機能のキャラクタライズを行った。その結果、精製LePGTは可溶化などの精製ステップにより、その酵素化学的性質に大きな変化を受けていないことを確認した。以上のように本年度はLePGTとUBIAとのキメラ酵素の作成とその解析によりプレニル基質の鎖長を認識する領域を明らかにするとともに、立体構造解明にむけた精製LePGTの基礎的な酵素化学的データの蓄積を行った。
ヒアルロン酸をキーワードに新たな早産予知と治療に挑む

ヒアルロン酸(HA)は子宮頸管の主要構成成分で、このHAの急増により頸管は軟化開大し急速に分娩に向かう。切迫早産においても同様の変化が起こることからHA合成の抑制が切迫早産治療となり得る。そこでHA合成阻害剤4-methylumbelliferone(MU)の切迫早産治療薬としての臨床応用の可能性について基礎的研究を行った。ヒト子宮頸管培養線維芽細胞ではMUの投与によりHA合成は有意に抑制され、またMUは濃度依存的にHA合成を抑制した。またラット早産モデルを作成しMU皮下持続投与を行ったが有意な妊娠期間の延長はみられなかった。臨床応用には投与経路(腟座薬や経口)や投与量の検討などが必要である。本研究は、切迫早産の主因の一つである子宮頸管無力症の治療法を主眼としている。Key wordはヒアルロン酸(HA)である。HAはコラーゲンや他のグリコサミノグリカン(GAG)と共に子宮頸管の主要構成成分であるが、妊娠末期に他のGAGとは全く異なる挙動を示し、数時間のうちにそれ以前の10倍以上に急増しながら分娩終了と共に素早く元に復する。このHAの急増により子宮頸管は膨潤化され、コラーゲンによるネットワークが破壊されて頸管はどんどん軟化開大し急速に分娩に向かうことが知られている。従って、このHA合成を抑制できれば切迫早産を治療できる可能性がある。切迫早産・子宮頸管無力症治療薬として4-methylumbelliferone(MU)の臨床応用の可能性について研究を進めている。本年度はヒト子宮頸管培養線維芽細胞を用いた実験において、MU 0.5mM/L、1.0 mM/Lを各々添加し、48時間まで培養した後に、培養液中のHA産生量をELISA法を用いて測定した。その結果、1子宮頸管線維芽細胞におけるHA合成量は経時的に増加した、2MUを投与することによりHA合成はコントロール群に比較して有意に抑制された、3MUは濃度依存的にHAの合成を抑制した。以上のことが判明し、MUは子宮頸管無力症の治療薬となり得る可能性が示唆された。また、次年度のラビット実験に使用予定であるMU腟坐薬の作成に成功すると共に、ラビット実験の研究プロトコールを作成した。本研究は切迫早産の主因の一つである子宮頸管無力症治療を主眼としている。HAは子宮頸管の主要成分で妊娠末期に数時間のうちに10倍以上に急増しながら分娩終了と共に素早く元に復する。このHA急増により子宮頸管は膨潤化され、頸管を固く保持して妊娠維持に働いているコラーゲンによるフレームワークが破壊され頸管は急速に軟化開大し分娩に向かう。切迫早産においても同様の変化が起こると考えられ、HA合成を抑制できれば頸管の軟化開大が抑制され頸管無力症を治療できる可能性がある。そこで本学が発見した世界初のHA合成阻害剤4-methylumbelliferone(以下MU)を用いて切迫早産治療薬開発のため基礎的研究を行った。ヒト子宮頸管培養線維芽細胞はHAを他細胞に比べ極めて活発に合成する。この細胞の培地中にMU 0.5mM/L、1.0mM/Lを各々添加し48時間培養後、HA産生量をELISA法にて測定した。その結果、同細胞におけるHA合成量は経時的に増加したが、MU投与によりコントロール群に比して有意に抑制された。またその抑制は濃度依存的であった。続いてラットを用いた動物実験では、妊娠ラットに対し抗プロゲステロン剤RU486を皮下注することにより早産モデルを作成し、以下の4群に分けた。生食皮下持続投与(1群)、RU486+生食皮下持続投与(2群)、RU486+MU 10μg/kg/min.皮下持続投与(3群)、RU486+MU 20μg/kg/min.皮下持続投与(4群)。娩出時間は1群では満期産、24群ではいずれも早産となり、有意な妊娠期間の延長は得られなかった。MUは難溶性のため溶媒にうまく溶解できていなかった可能性やRU486の投与量が多すぎた可能性が考えられた。今後は薬剤量や投与経路(腟座薬や経口)について再度検討を行いたい。本研究は、切迫早産の主因を絨毛膜羊膜炎(chorioamnionitis; CAM)におく立場とは異なった視点から、早産の予知・治療に取り組むものである。

HAはコラーゲンや他のグリコサミノグリカン(GAG)と共に子宮頸管の主要構成成分であるが、妊娠末期に他のGAGとは全く異なる挙動を示し、数時間のうちにそれ以前の10倍以上に急増しながら分娩終了と共に素早く元に復する。このHAの急増により子宮頸管は膨潤化され、コラーゲンによるネットワークが破壊されて頸管はどんどん軟化開大し急速に分娩に向かうことが知られている。従って、このHA合成を抑制できれば切迫早産を治療できる可能性がある。具体的には、早産予知マーカーとして子宮頸管分泌物中のプロゲステロン(P4)、切迫早産・子宮頸管無力症治療薬として4-methylumbelliferone(MU)の臨床応用の可能性について研究を進めている。本年度はヒト子宮頸管培養線維芽細胞を用いた実験で、(1)培地中のinterleukin (IL)-6、IL-8はlipopolysaccharide(LPS)添加により経時的に増加したが、P4添加により各々減少した。(2)Real-time PCR法でもP4の添加によりIL-6、IL-8の発現が抑制された。(3)Toll-like receptor(TLR)4の発現はLPSの添加により増強し、P4を添加することで抑制された。(4)MUはヒアルロン酸合成をほぼ完全に抑制する。以上のことが判明した。4-methylumbelliferone(MU)がヒト子宮頸管培養線維芽細胞においてヒアルロン酸の合成を経時的に抑制することが確認でき、MUの切迫早産・子宮頸管無力症治療薬としての可能性が示された。また次年度施行予定であるラビットを用いた動物実験の準備を進めている。プロゲステロン(P4)が、ヒト子宮頸管培養線維芽細胞において抗炎症作用を有することが示され、P4の低下が早産を惹起する可能性が示唆された。また4-methylumbelliferone(MU)もヒト子宮頸管培養線維芽細胞においてヒアルロン酸の合成を経時的に抑制することが確認できた。以上の結果から、in vitroにおいてP4の切迫早産治療薬としての可能性、MUの切迫早産・子宮頸管無力症治療薬としての可能性が示されたため、現在のところおおむね順調と考える。妊娠22日に抗プロゲステロン剤であるRU486を筋注することによりラビット早産モデルを作成する。この早産ラビットにRU486投与前日(妊娠21日)より分娩時までMU腟坐薬を毎日同時刻に投与する。コントロール、MU投与群、MU非投与群に分けてRU486投与から分娩までの時間を比較する。MU投与の有無により子宮頸管にいかなる組織学的差異が生じているかについて病理学的に観察し、MUの早産抑制効果を検討する。P4は、(1)子宮頸管の軟化、開大に主要な働きをするヒアルロン酸の分解を促進し、産生を抑制するほか、(2)COX-2をdown regulationすることで、子宮収縮作用をもつプロスタグランジン分解酵素活性を高めること、(3)頸管細胞中で頸管熟化に促進的に働くIL-8産生を抑えることも報告されている。こうしたことから、早産に至る患者では子宮におけるP4の活性が低下している可能性がある。そこで切迫早産患者と早産兆候のない対照群について、子宮頸管分泌液中のプロゲステロン濃度をELISA法により測定し比較検定することで、P4の早産予知マーカーとしての可能性を検討する。
双胎妊娠からみた絨毛細胞DNAメチル化異常と胎児発育不全についての研究

二絨毛膜二羊膜双胎の胎盤絨毛DNAメチル化プロファイルを作成し解析した。1児は正常発育でもう一方の児は胎児発育不全(以下FGR)であった双胎間でDNAメチル化の程度に有意差を認め、かつ、2児ともに発育が正常であった双胎間でDNAメチル化の程度に有意差を認めなかったCpG siteは250ヶ所あった。このうち1児は正常発育でもう一方の児はFGRであった2症例で共通の傾向を示したCpG siteは123ヶ所であった。胎盤絨毛細胞における、これらのCpG siteのDNAメチル化異常はFGR発症に関連している可能性が示唆された。陣発および破水前に選択的帝王切開術で分娩となった2絨毛膜2羊膜双胎の患者から採取した胎盤から絨毛組織を採取し、絨毛のDNAメチル化プロファイルを作成した。2児とも胎児発育が正常であった3症例(6胎盤)と1児は正常発育であったがもう一方は胎児発育不全であった3症例(6胎盤)を対象とした。12胎盤の絨毛DNAメチル化パターンを比較検討した結果、母親が同じである双胎間でパターンが近似しているCpG sitesと、DNAメチル化の程度に有意差を認めるCpG sitesが存在することが明らかとなった。未陣発かつ未破水で選択的帝王切開術で分娩となった2絨毛膜2羊膜双胎の患者から採取した胎盤から絨毛組織を採取し、絨毛のDNAメチル化プロファイルを平成25年度に作成した。対象は2児とも胎児発育が正常であった3症例(6胎盤)と1児は正常発育であったがもう一方は胎児発育不全(FGR)であった3症例(6胎盤)であった。平成26年度は得られたプロファイルを解析した。はじめに、「環境因子の影響を排除して比較することでFGRの発症に関連するDNAメチル化異常を発見する」ために、1児は正常発育であったがもう一方はFGRであった症例でそれぞれ双胎間の比較を行った。双胎間でDNAメチル化の程度が近似しているCpG siteと有意差を認めるCpG siteが存在することが確認された。後者は、「環境の影響によらない、FGR発症に関連するDNAメチル化異常」の候補CpG siteと考える。次に「環境の影響によるものではなく、かつ胎児発育には影響を及ぼすものではないDNAメチル化変化を明らかにする」ために、2児とも胎児発育が正常であった3症例において双胎間で比較した。その結果、DNAメチル化の程度が近似しているCpG siteが多く確認されたが、有意差を認めるCpG siteも存在し、「環境の影響によるものではなく、かつ胎児発育には影響を及ぼすものではないDNAメチル化変化」が存在することが確認された。「環境の影響によらない、FGR発症への関与が示唆されるDNAメチル化異常」の候補CpG siteが抽出された。しかし対象とした2絨毛膜2羊膜双胎は1卵性と2卵性の両方の可能性があり、抽出された変化には2卵性である故に双胎間にDNAメチル化の差異が生じたものが含まれている可能性が考えられた。そこで、双胎間輸血症候群の発症が否定的である1絨毛膜2羊膜双胎症例も対象に再評価する方針とした。未陣発かつ未破水で選択的帝王切開術で分娩となった2絨毛膜2羊膜双胎の患者から採取した胎盤から絨毛組織を採取し、絨毛のDNAメチル化プロファイルを作成した。対象は2児とも胎児発育が正常であった3症例(6胎盤)と、1児は正常発育であったがもう一方の児は胎児発育不全(FGR)であった2症例(4胎盤)であった。はじめに、1児は正常発育であったがもう一方の児はFGRであった2症例の絨毛DNAメチル化プロファイルをそれぞれの双胎間で比較し、双胎間でDNAメチル化の程度に有意差を認めるCpG siteを抽出した。さらに2児ともに胎児発育が正常であった3症例では双胎間でDNAメチル化の程度に有意差を認めなかったCpG siteのみを抽出した結果、250ヶ所のCpG siteが抽出された。このうち、1児は正常発育であったがもう一方の児はFGRであった2症例のいずれにおいても、FGR児のほうが正常発育児と比較しDNAメチル化が高かったCpG siteは51ヶ所、一方、FGR児のほうが正常発育児と比較しDNAメチル化が低かったCpG siteは72ヶ所であった。今回抽出された123のCpG siteの絨毛DNAメチル化異常は、胎児発育不全の発症に関連している可能性が示唆された。次に、2児ともに胎児発育が正常であった3症例において、双胎間で絨毛DNAメチル化プロファイルを比較した結果、1症例以上でDNAメチル化の程度に有意差を認めるCpG siteは9,890 sites存在した。これらのCpG siteの絨毛DNAメチル化変化は、環境の影響によるものではなく、かつ、胎児発育に影響を及ぼすものではないと考えられた。