hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
波長可変紫外プローブによる電子共鳴マルチプレックスSFG分光

本研究によって、紫外から可視までの広い範囲で波長可変化したプローブが使用可能なマルチプレックス赤外可視和周波発生(SFG)分光装置を開発した。開発は、広島大学が現有する可視光波長可変マルチプレックスSFG分光装置を拡張することによって行った。作製したシステムの概要:光源部分に関しては、光パラメトリック増幅器(OPA)の後に非線形結晶を設置し、OPAのシグナル出力の基本波と倍波の利用によって、波長範囲で800-470nmと400-235nmのプローブが使用可能となった。分光部分の拡張としては、低分散なプリズム分光器の迷光除去用フィルター分光器としての利用を新しく試みた。性能評価の結果、プリズム分光器によって迷光が有効に除去できている事が確認された。迷光除去率はプローブ波長に依存する。例えばUV波長289nm、IRプローブ波数1600cm^<-1>の場合、迷光除去率は約99.96%と見積もられた。測定は、289nmと334nmの二種類の波長で行った。SFG信号の波長が試料の溶液の電子吸収のピーク波長に近い場合、強度の大きいSFG信号が得られ、SFG信号が電子共鳴によって増強していることが確認された。本研究の目的は、紫外から可視までの広い範囲で波長可変化したプローブが使用可能なマルチプレックス赤外可視和周波発生(SFG)分光装置を開発し、感度と選択性に優れた電子共鳴SFG分光を、ほとんどすべての有機薄膜に適用可能な一般的手法として確立させることである。SFG分光の高感度化に有効な手法は、SFG分光法のマルチチャンネル化(マルチプレックス方式)と電子共鳴によってSFG信号を増大させることである。現状では可視プローブ光の波長は可視光領域に限定されており、電子共鳴増大の適用範囲は、比較的大きな色を持ついわゆる色素分子に限定されている。この限界を打破し、より広い範囲の表面分子種に対して電子共鳴増大によるSFG分光を適用可能とすることを目指す。本年度は、装置の基本的部分の紫外拡張化を中心に行った。光源部分の拡張:現有のシステムの狭帯域可視光は、400nm、470-800nm(シグナル)、800-2700nm(アイドラー)で波長可変である。これをもとに、非線形光学効果を利用し狭帯域可視プローブの可変域を紫外領域まで拡張した。200および217-400nmの範囲において連続波長可変でパルスエネルギーが数μJ以上の出力を新たに得ることができた。拡張した光源とプローブ光カット用のバンドパスフィルターを用いて、標準試料であるGaAsを用いて、紫外光(270nm)と赤外光(3400nm)の和周波信号を得た。紫外プローブを用いた電子共鳴条件下でのSFG測定では、紫外プローブ光の影響による酸化などの劣化が問題になることがあると予想される。貴重なサンプルの劣化を避けながら、良好で再現性のある測定を実行するために、測定は窒素ガスでパージ可能なサンプル箱を作製しその中で行った。しかし、分子の電子吸収は金基板上と溶液とで、バンド幅などに関して異なっている可能性が高い。今後、より多くの波長を用いてSFGスペクトルを測定することで、この点を明らかにしていく予定である。その結果、電子振動二重共鳴SFGの測定によって、通常は測定が困難な不透明基板上の単分子膜の電子吸収スペクトルの測定が可能となることが実証できると期待される。
リズムを刻むタンパク質の相互作用機構の解明

BMAL1とCLOCKはほ乳類の生物時計において転写因子として働く.通常BMAL1:CLOCKのBhlhドメインはヘテロ2量体を形成するが、ホモ2量体を形成することも知られている.そこでヘテロ2量体、ホモ2量体とE-BOX配列との相互作用をITCにより解析したところ、E-box配列に対する親和性はヘテロ2量体の方がホモ2量体よりもよいことが判明した.次にBhlh PAS-Aドメインにおいて会合に重要であると考えられるアミノ酸について部位特異的変異導入を行い、ヘテロ2量体の会合に与える影響を調べた.その結果、ヘテロ2量体の形成はPAS-Aドメインに較べ、Bhlhドメインの方が重要であることが示唆された.BMAL1とCLOCKはほ乳類の生物時計において転写因子として働く.通常BMAL1:CLOCKのBhlhドメインはヘテロ2量体を形成するが、ホモ2量体を形成することも知られている.そこでヘテロ2量体、ホモ2量体とE-BOX配列との相互作用をITCにより解析したところ、E-box配列に対する親和性はヘテロ2量体の方がホモ2量体よりもよいことが判明した.次にBhlh PAS-Aドメインにおいて会合に重要であると考えられるアミノ酸について部位特異的変異導入を行い、ヘテロ2量体の会合に与える影響を調べた.その結果、ヘテロ2量体の形成はPAS-Aドメインに較べ、Bhlhドメインの方が重要であることが示唆された.地球上の生物は時を刻む能力を進化的に獲得してきた。このリズムを刻む中心となっているものはタンパク質であり、その発現、相互作用、分解をうまく繰り返すことによりリズムを刻んでいるものと考えられている。ほ乳類において、その中心を担っているのが、BMAL1-CLOCKおよびCRY-PER複合体である.BMAL1-CLOCK複合体は転写因子としての働きを持っており、cry, per遺伝子のプロモーター領域にあるE-Box配列に結合すると転写が開始され、CRY, PERタンパク質が合成される。CRY-PER複合体はBMAL1-CLOCKと相互作用し、その転写活性を抑制する。このようにタンパク質同士もしくはタンパク質-DNA間の相互作用を巧みに利用し周期的なリズムを形成している。BMAL1、CLOCK共に相互作用に関わるPASドメインが2つ存在する。まずはこのドメインがどのように相互作用するのかを明らかにするために、それぞれのドメインを単離し大量発現を試みた。その結果、両蛋白質ともにアミノ酸配列上、前半部にあるPAS-Aドメインについては大量発現でき、1L培養あたり数mgの精製蛋白質を得ることができた。そこで相互作用をNative PAGEにより観測したところ、相互作用を観測することができた。また相互作用の際、還元剤を入れておくと相互作用が観測されなかったことからCys残基が相互作用に関わっていることが示唆された。またDNA結合ドメインを含めたPASドメインの発現をGFP融合蛋白質として発現させた。N末端にGFPを融合させたときはわずかに可溶性蛋白質として発現したものの、C末端側に融合させたときはほとんど発現しなかった。ほぼすべての生物は体内に生物時計をもち、この時計に支配されて様々な生理現象が約1日周期の概日リズムを示す。この時計発振系の基本的な分子骨格は転写・翻訳を介した負のフィードバック機構であり、哺乳類においては時計タンパク質BMAL1およびCLOCKが正の因子、PERおよびCRYが負の因子としての役割を果たす。BMAL1、1-CLOCKヘテロ二量体はbHLHドメインを介して、PerやCryなどの時計遺伝子上流に存在するE-box配列あるいはE-box様配列に結合し、転写を活性化する。BMAL1、CLOCKは生体内においてヘテロ二量体を形成してその機能を発揮するが、BMAL1はホモ二量体を形成する可能性がある。そこでBMAL1,CLOCKについてヘテロ二量体およびホモ二量体に対するE-box,E-box様配列との相互作用の定量的な評価を行った。BMAL1、CLOCKともにbHLHドメインを含む領域でGSTとの融合タンパク質として発現させたところ、様々なDNAが結合していることが判明した。そこで条件検討を行い、400mM NaCl存在下においてタンパク質とDNAが乖離することがわかった。これらホモ二量体を混合し、ゲルろ過を用いて分析したところホモ二量体以外にヘテロ二量体を示すピークが観測でき、DNAを加えたところヘテロ二量体のみのピークが得られた。そこで認識配列を含む18塩基対の6種類のDNAを用いてITCによる結合実験を行った。その結果、ヘテロ二量体のKdは50nMから140nM程度であった。これに対してBMAL1では80nMから830nM,CLOCKでは300nMから2600nMであった。すなわちヘテロ二量体を形成することにより認識配列前後の違いによらず一定の結合力を維持できるような仕組みができていることが判明した。BMAL1- CLOCKヘテロ二量体はbHLHドメインを介して、PerやCryなどの時計遺伝子上流に存在するE-box配列あるいはE-box様配列に結合し、転写を活性化する。BMAL1、CLOCKは生体内においてヘテロ二量体を形成してその機能を発揮する。

この全体構造はHuangらによりマウスのBMAL1:CLOCK複合体の立体構造が決定された。そこで、bHLHドメインおよびPAS-Aドメインにおけるヘテロ2量体形成に及ぼす影響を調べた。BMAL1:CLOCKの共発現を行うためにBMAL1,CLOCKともにPAS-AドメインまでをpETDuetベクターに導入しN末端側にHisタグ、さらにはCLOCKのN末端側にMaltose binding proteinを融合させて発現させた。CLOCK, BMAL1のbHLHドメイン、PAS-Aドメインに存在するLeu残基をGluあるいはAspに変異させ、2量体形成能を野生型と比較することにより、相互作用に重要な残基を調べた。その結果、bHLH上に変異を入れた場合、明らかに野生型よりも2量体形成能が約1/4に落ちたにも関わらず、PAS-Aドメインでは変化がないものから約6割程度の変化であった。このことから2量体形成にはbHLHドメインが重要であることが示唆された。BMAL1およびCLOCKそして転写活性化を抑えるのはPERによる直接的な影響よりはむしろそれぞれのタンパク質における様々な修飾によるもところが大きい。そこでBMAL1とCLOCKが具体的にどのような立体構造をしており、いかにして様々な修飾を受けるかを明らかにする必要がある現在BMAL1-CLOCKにおいてはそのDNA結合能やPASドメインに関する相互作用の可能性を示すことができており、ヘテロダイマーの立体構造解析にむけた基礎データが取得できているものと考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。BMAL1およびCLOCKともにbHLHおよび2つのPASドメインから構成されると推定されている。PERとの直接的な相互作用をうまく捕らえられていないため、多岐にわたる修飾サイトの'状態を明らかにするためにもBMAL1-CLOCKヘテロダイマーの構造を明らかにすることが重要である。N末端、C末端のフレキシブルな領域がある程度判明しているものの、その適した領域を判別するまでには至っていない。N末端側の領域は構造決定できているため、結晶化に適した領域をほぼ決定できるが、C末端は不確定な要素が多いため、限定加水分解による領域の決定を行う必要性がある。また平行して結晶化しやすい領域の断片化サンプルの調製も併せて行う必要がある。
幼児における客観的評価に基づいた身体活動促進と座位行動抑制方策の構築

幼児期に遊びや運動をはじめとする身体活動の促進を図ることはその持ち越し効果の観点からも極めて重要である.近年,身体活動量のみならず座位時間や姿勢変化も健康指標と関連することが報告されているが,客観的な測定方法により,その実態を評価している研究は少なく,日本の実態は不明であり,姿勢変化を促し座位時間を減らす効果的な介入方法も不明である.そこで最終年度までに客観的計測が可能な姿勢計と加速度計を用いた研究にて,保育時間中の姿勢変化を促す事で座位時間を減らし,身体活動量を高めるための方策を構築することを目的とする.幼児期に遊びや運動をはじめとする身体活動の促進を図ることはその持ち越し効果の観点からも極めて重要である.近年,身体活動量のみならず座位時間や姿勢変化も健康指標と関連することが報告されているが,客観的な測定方法により,その実態を評価している研究は少なく,日本の実態は不明であり,姿勢変化を促し座位時間を減らす効果的な介入方法も不明である.そこで最終年度までに客観的計測が可能な姿勢計と加速度計を用いた研究にて,保育時間中の姿勢変化を促す事で座位時間を減らし,身体活動量を高めるための方策を構築することを目的とする.
ニュ-ジ-ランド及びタスマニア島の自然環境と菌類相に関する研究

本研究の遂行によって,以下のような成果が得られた。I.植物病原菌に関する成果種子伝染性植物病原菌の種類・分布調査は農薬作用削減の観点からみても,大変重要であるが,我国では大変立遅れいてる。日本産の十字科作物種子から検出されるAlternaria属菌に関し,A.cheiranthiがニュ-ジランドで,ニオイアラセイトウと同一の種に属することが確認できた。近年,我国にはニュ-ジランド産青果類が多量に輸入されているが,店頭でかびるポストハ-ベスト劣化が目立っている。当地の店頭あるいは貯蔵施設で,腐敗に関与する糸状菌の調査を行った。潜在感染菌については,今後より詳しい調査が必要である。また,ニュ-ジランド,タスマニア,ニュ-カレドニア各地から,基礎資料となる病害標本,菌株を多数採集できた。II.植物内生菌(エンドファイト)に関する成果エンドファイトの活用にあたっては,まず,その分布を明らかにする必要がある。今回の調査の結果,ニュ-ジランドにおける分布の概容,研究上の問題点に関する情報が得られた。我国の帰化イネ科植物から検出されるものとの異同について現在検討中である。木本植物内生菌に関しては,ノトファグス類のcyttariaゴ-ルに生息する糸状菌の分離を計画中である。予備実験の結果,ニュ-ジランド及びタスマニア島産のものから,同一の培養性状を示すものを確認している。ブナ類の分化との関係を明らかにする必要がある。III.動物相に関与するアンモニア菌の生態研究南半球ではじめて,土壌への尿素またはアンモニア施用によって特異的に発生する菌類相の調査を行った。さらに,森林害獣として捕殺されたポッサムの分解過程と発生菌類のサクセッションを調査した。この結果,発生菌類相は,北半球と基本的に同じであることを確認した。ほかに,未同定の菌数種も得られ,南半球に特有なものの関与も考えられる。動物種,林分を異にして,実験を継続する必要がある。IV.菌根性菌類に関する成果数種の大型キノコに関して,南半球ではじめて,シロの調査を行った。Hebeloma victorienseは典型的な外生菌根菌,cortinariusaustraliensisは地中に厚い菌糸層をもち,環状に広がるほか,その菌根はこれまでにない形態的特徴をそなえていた。北半球におけるマツタケ類と生態的同位の関係が示唆された。タスマニアのユ-カリ林,ニュ-ジランド,ニュ-カレドニア島で採集したものについては,現在同定作業を行っているが,多数の新種と思われる資料が含まれている。V.有用菌類に関する成果ニュ-ジランド南島において,シイタケ,ショウロなどの発生地が確認できた。ガノデルマをニュ-ジランド,タスマニア,ニュ-カレドニア各地から多数採集した。これらから,いづれも純粋培養を得えDSIRに保存した。これらは,いずれも,食用あるいは,リグニン分解用の微生物遺伝資原となるものである。Trichoderma=Hypocreaも,また,セルロ-ス分解能はじめ,その活用が注目される酵素群を保持するものである。とくに南太平洋地域のものは,近年,注目されている。ニュ-カレドニアで5点採集できた。現在,コスミッド・ライブラリ-を作製中である。VI.その他の成果とくに,ニュ-カレドニアでの成果を挙げれば,以下のようである。1)日本には,ニュ-カレドニアの顕花植物及びシダ植物の標本は少なく,固有種が75%を超えるという同地の貴重な標本が集積された。2)固有種に寄生,あるいは基質とする菌類が多数採集できたが,同島新産種,学界新種がかなり含まれている。VII.招へい研究者との共同研究タスマニア大学ミルズ博士を招へいし,講演会を3回行った。以上のように,上記地域から得られる成果は極めて大きい。今後継続して調査を行ない,遺伝資原の収集に努めるとともに,地球生物環境の保全に関する基礎資料を集積する必要がある。

ブナ類の分化との関係を明らかにする必要がある。III.動物相に関与するアンモニア菌の生態研究南半球ではじめて,土壌への尿素またはアンモニア施用によって特異的に発生する菌類相の調査を行った。さらに,森林害獣として捕殺されたポッサムの分解過程と発生菌類のサクセッションを調査した。この結果,発生菌類相は,北半球と基本的に同じであることを確認した。ほかに,未同定の菌数種も得られ,南半球に特有なものの関与も考えられる。動物種,林分を異にして,実験を継続する必要がある。IV.菌根性菌類に関する成果数種の大型キノコに関して,南半球ではじめて,シロの調査を行った。Hebeloma victorienseは典型的な外生菌根菌,cortinariusaustraliensisは地中に厚い菌糸層をもち,環状に広がるほか,その菌根はこれまでにない形態的特徴をそなえていた。北半球におけるマツタケ類と生態的同位の関係が示唆された。タスマニアのユ-カリ林,ニュ-ジランド,ニュ-カレドニア島で採集したものについては,現在同定作業を行っているが,多数の新種と思われる資料が含まれている。V.有用菌類に関する成果ニュ-ジランド南島において,シイタケ,ショウロなどの発生地が確認できた。ガノデルマをニュ-ジランド,タスマニア,ニュ-カレドニア各地から多数採集した。これらから,いづれも純粋培養を得えDSIRに保存した。これらは,いずれも,食用あるいは,リグニン分解用の微生物遺伝資原となるものである。Trichoderma=Hypocreaも,また,セルロ-ス分解能はじめ,その活用が注目される酵素群を保持するものである。とくに南太平洋地域のものは,近年,注目されている。ニュ-カレドニアで5点採集できた。現在,コスミッド・ライブラリ-を作製中である。VI.その他の成果とくに,ニュ-カレドニアでの成果を挙げれば,以下のようである。1)日本には,ニュ-カレドニアの顕花植物及びシダ植物の標本は少なく,固有種が75%を超えるという同地の貴重な標本が集積された。2)固有種に寄生,あるいは基質とする菌類が多数採集できたが,同島新産種,学界新種がかなり含まれている。VII.招へい研究者との共同研究タスマニア大学ミルズ博士を招へいし,講演会を3回行った。以上のように,上記地域から得られる成果は極めて大きい。今後継続して調査を行ない,遺伝資原の収集に努めるとともに,地球生物環境の保全に関する基礎資料を集積する必要がある。
細胞刺激にともなうリポコルチンの分子修飾反応の解析

リポコルチンはステロイドによって誘導される抗炎症性蛋白質として記載された、カルシウム依存性に細胞膜あるいはリン脂質膜に結合する一連の蛋白質の総称である。我々は、リポコルチンのカルシウム感受性が、そのN末端部分を修飾(架橋および限定分解)することによって著しく高められることを見出した。特に架橋反応の効果が著しい。今年度の研究によって、適切な条件下でリポコルチンIにトランスグルタミナ-ゼを反応させると、架橋反応の結果、リポコルチンIの2量体,4量体,6量体....にあたる分子量をもつ産物が生ずることが明らかとなった。形成された架橋リポコルチンIと酸性リン脂質との結合はたいへん強固であり、50%結合に必要なCa^<2+>濃度は3μMと算定された。すなわち、intactリポコルチンI,リン酸化リポコルチンI,限定分解リポコルチンIのいずれよりも低濃度のCa^<2+>により、十分に酸性リン脂質に結合する活性を有する。また、リポコルチンIを多量に含むことが判明しているヒト扁平上皮癌細胞株A431細胞をEGFで刺激すると、架橋反応によって生じると考えられる74kDaのリポコルチンI2量体と、加水分解反応の結果と考えられる34kDaのリポコルチンIが、EGF刺激の強さに比例して出現するのが観察される。すなわち、リポコルチンIの架橋や加水分解反応は、in vitroで精製リポコルチンIに精製酵素を加えた実験のみならず、生理的条件下の細胞内でもin situに観察されることが明らかとなった。さらに、in vitroで精製リポコルチンIをトランスグルタミナ-ゼによって架橋する際に、酸性リン脂質を加えると架橋反応が著しく促進することを見出した。刺激をうけた細胞においては、リポコルチンIが細胞膜に結合し、その後細胞内トランスグルタミナ-ゼによって架橋反応をうけるものと考えられた。
Notch遺伝子の転写後調節による造血幹細胞の自己複製およびT細胞分化機構の解明

本研究では、造血幹細胞の自己複製とT細胞分化とを決定づけるメカニズムを明らかにするため、Notch1遺伝子の転写後調節(Post-transcriptional control)機構の解析を行った。われわれは造血幹細胞において、T細胞分化に必須であるNotch1遺伝子が強い転写後抑制を受けることを見出し、その責任領域はNotch1-3'UTRに存在するATTTAモチーフであることを明らかにした。さらにこの転写抑制にはたらくRNA結合タンパク(RBP)の同定に成功した。一方、造血幹細胞を胸腺組織へ直接注入するとこの転写後抑制が速やかに解除されることを見出し、胸腺環境において転写後抑制を解除するシグナル探索を行っている。また、Notch1-3'UTRの遺伝子改変マウスの作成および転写後調節の制御ベクターを開発し、造血幹細胞におけるNotch1遺伝子転写後調節の生物学的意義を解析することを可能とした。同時に、造血幹細胞システムでの遺伝子転写後調節の役割を解明するため、さらに複数の新規転写後抑制遺伝子を同定している。これらの成果は、造血系における転写後調節の持つ役割・意義の解明に役立つとともに、本研究テーマにとどまらず造血系における骨髄ニッチ(niche)や、がん幹細胞(Cancer stem cell)と転移の問題などに共通したメカニズムの解明へつながっていくことが期待される本研究では、造血幹細胞の自己複製とT細胞分化とを決定づけるメカニズムを明らかにするため、Notch1遺伝子の転写後調節(Post-transcriptional control)機構の解析を行った。これらの成果は、造血系における転写後調節の持つ役割・意義の解明に役立つとともに、本研究テーマにとどまらず造血系における骨髄ニッチ(niche)や、がん幹細胞(Cancer stem cell)と転移の問題などに共通したメカニズムの解明へつながっていくことが期待されるNotch1遺伝子は造血幹細胞の自己複製およびT細胞分化に重要な役割を果たしている。マウス造血幹細胞におけるNotch1遺伝子のmRNAおよびタンパクの発現解析から、Notch1遺伝子が造血幹細胞で強い転写後抑制を受けることを見出した。GFP遺伝子下流にUTRを含むNotch1遺伝子の断片をクローニングし各分化段階の血液細胞へ遺伝子導入することにより、この抑制効果が造血幹細胞に特異的であること、責任配列が3'UTR領域内に存在することを明らかにした。さらにNotch1遺伝子3'UTRの各種欠失変異の発現抑制活性の解析から、その責任領域が3'UTRに存在するATTTAモチーフであることを明らかにした。このATTTAモチーフはRNA結合タンパクの認識配列であり、pull-downアッセイから、2種類の責任RNA結合タンパクを同定することに成功した。一方、造血幹細胞の胸腺への直接注入により、この転写後抑制が速やかに解除されることから、胸腺環境において転写後抑制を解除するシグナルが存在することが推測され、抗体スクリーニング法による探索を行っている。また、Notch1遺伝子の転写後抑制の生物学的意味を明らかにするために、RNA結合タンパクを阻害する新たな転写後抑制解除ベクターを構築しており、造血幹細胞におけるNotch1遺伝子の転写後抑制の役割をin vitro、in vivoの双方で解析している。これらの研究によりNotch1制御の機序および生体における役割を明らかにするとともに、T細胞分化の人為的制御法の確立をすすめている。本研究は、造血幹細胞およびT細胞分化におけるNotch1遺伝子の転写後調節の役割を解明することを目的としており、これまでにNotch1遺伝子の転写後抑制に機能するタンパク質を同定し、T細胞への分化制御機構の一端を解明することに成功した。そこで、Notch1遺伝子の転写後抑制の人為的解除によるNotch1遺伝子の役割解明として、責任タンパクの制御によるNotch1遺伝子の転写後調節の変化による造血幹細胞の自己複製およびT細胞分化に与える影響を検討した。その結果、責任タンパクのノックダウンによりT細胞系列への分化が促進され、Notch1遺伝子の転写後抑制が実際に造血幹細胞からT細胞への分化抑制に機能していることが明らかとなり、遺伝子の転写後抑制が細胞分化制御に重要な役割を果たしていることが示された。一方、Notch1遺伝子の転写後抑制は胸腺内で速やかに解除されることから、胸腺環境におけるNotch1の転写後抑制解除のメカニズムを解明するため、試験管内での責任分子のスクリーニングを開始している。現時点では、Notch1転写後抑制解除の責任分子は同定されていないが、新たにGFP-(Notch1)3'UTRベクターの蛍光強度を指標とすることで探索を継続している。また、ヒトの造血幹細胞およびT細胞性白血病(T-ALL)におけるNotch1の転写後調節の役割の解明として、特にT-ALLにおけるNotch1

-3'UTR領域の遺伝子変異スクリーニングを開始しており、現在のところ変異・欠失等の遺伝子異常は見出されていないが、引続きヒト疾患におけるNotch1転写後調節領域の解析を継続し、疾患との関連につき検討してゆく。本研究は、造血幹細胞およびT細胞分化におけるNotch1遺伝子の転写後調節機構および役割を解明することが目的である。すでに、Notch1遺伝子の転写後抑制に機能するタンパク質を同定しT細胞への分化制御機構の一端を解明するとともに、責任タンパク制御によるNotch1遺伝子の転写後抑制の人為的解除による造血幹細胞の自己複製およびT細胞分化に与える影響を示し、Notch1遺伝子の転写後抑制がT細胞分化制御に重要な役割を果たしていることを明らかにした。また、このNotch1遺伝子の転写後抑制は胸腺内で速やかに解除されることから、胸腺環境におけるNotch1の転写後抑制解除のメカニズムを解明するため、主に中和抗体を用いた試験管内での責任分子のスクリーニングを行ったが、胸腺環境の責任分子の同定には至っていない。現在、転写後抑制解除の責任分子探索を継続しており、どのようなシグナルがNotch1遺伝子の転写後抑制解除に作用するかを探索していく。同時に、ヒト疾患との関連としてT細胞性白血病(T-ALL)におけるNotch1-3'UTR領域の遺伝子解析を施行したが、未だ変異・欠失等の遺伝子異常は見出されておらず、さらにTリンパ系疾患においてNotch1転写後調節領域の解析を継続し、疾患との関連につき検討する。一方、個体レベルにおいてNotch1の転写後抑制がどのように造血幹細胞およびT細胞分化に関与しているかを詳細に検討するため、Notch1の転写後調整に機能する責任3'UTR領域をコンディショナル・ノックアウトできる遺伝子改変マウスを作成した。実際このマウスでは、Cre遺伝子発現によりNotch1転写後抑制にはたらく3'UTRの責任領域が欠失しTリンパ球増加が認められており、引き続きNotch1遺伝子の転写後抑制機構のin vivoでの造血およびT細胞分化への役割を明らかにしていく。Notch1遺伝子の転写後抑制に機能するタンパク質を同定しT細胞への分化制御機構の一端を解明できており、次のステップである胸腺環境の実験に進むことができている。一方で、Notch1制御配列のコンディショナル・ノックアウトマウスはES細胞の段階に至り、これから個体におけるNotch制御の役割の研究により力を注ぐことが求められる。これらから全体として、(2)おおむね順調に進展している、と評価した。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後の研究の推進方策として次の研究を実施してゆく。まず、胸腺環境におけるNotch1遺伝子転写後抑制の解除機構のシグナルの探索として、胸腺環境を試験管内で確立し中和抗体による責任分子のスクリーニングを行ってゆく。
ピルビン酸含有酸性糖鎖の生物界における分布および生合成と生理的役割の解明

本研究では特に真核生物におけるピルビン酸含有糖鎖の分布と生理的役割の解明を目的としている。これまでピルビン酸含有糖鎖がどのように自然界で分解されていくのか全く不明であった。そこで土壌サンプルよりピルビン酸化ガラクトースを糖鎖から遊離することのできる微生物を単離し、その全ゲノム塩基配列を決定することで新規酵素の探索を行った。その結果、GH1ファミリーに属する酵素が糖鎖よりピルビン酸化ガラクトースを遊離する新規酵素であることを同定した。また本酵素の立体構造を明らかにして、特にピルビン酸がどのように本酵素で認識されているか、その詳細を明らかにすることができた。さらにピルビン酸化糖鎖を構成成分に持つSchizosaccharomyces属間で細胞表層糖鎖がどのように異なるのか構造解析を行った。その結果、S. pombe, S. octosporus, S. japonicus, S. cryophilus4種全てにピルビン酸化糖鎖を有することが糖鎖のNMR解析からわかった。そこで各種のピルビン酸転移酵素Pvg1ホモログタンパクを大腸菌で生産させて、その酵素学的諸性質の解析を行った。その結果、S. pombe以外のPvg1ホモログはp-ニトロフェニル-ガラクトースへピルビン酸を付加する活性が極めて低いことがわかった。今後は糖鎖構造と各ピルビン酸生合成酵素との関連をさらに明らかににしていく予定である。またピルビン酸化ガラクトースを認識する分裂酵母凝集素Gsf2の糖鎖結合性についてレクチンマイクロアレイ解析を行った。その結果、Gsf2のN-末端領域はα結合したガラクトースを特異的に結合することを明らかにすることができた。これまで全く明らかにされていなかったピルビン酸含有糖鎖を分解する新規酵素を同定することができた。さらに本酵素の立体構造を明らかにして、ピルビン酸と相互作用するいくつかの酵素のアミノ酸を明らかにすることができたことから、本申請研究は順調に進展していると考えている。今後は分裂酵母のピルビン酸付加に関与する4つのタンパク質Pvg1,2,3,5がどのようにゴルジ体において相互作用して生合成に関わっているのか、その分子メカニズムを明らかにする予定である。さらに酵母以外の糸状菌の細胞壁糖鎖構造解析を行い、実際にどの程度微生物がピルビン酸含有糖鎖を有しているのかについても明らかにしたい。本研究は真核微生物ではほとんど報告のない、糖鎖へのピルビン酸の付加機構と生理的役割について明らかにすることが目的である。今年度は以下の項目について明らかにすることができた。1.分裂酵母にはモデル生物として最も良く知られているSchizosaccharomyces pombeの他に、S. cryophilus, S. octosporus, S. japonicusと3種が報告されている。pombe以外の分裂酵母にもピルビン酸化糖鎖が付加されているかを確認するために、アルシアンブルー染色により細胞表層糖鎖の酸性化の定量を行った。その結果、pombe以外の3種はピルビン酸付加に重要な遺伝子が全てゲノム上に存在するにもかかわらず、ピルビン酸化糖鎖の量は極めて低いことがわかった。今後は遺伝子の発現と糖鎖の構造解析を行うことにより、そのことをさらに明らかにしたい。2.分裂酵母のピルビン酸化した糖鎖を遊離する酵素を土壌微生物から検索を行った。その結果、Bacillus属と同定した細菌がピルビン酸化ガラクトースを遊離する酵素活性を持っていることがわかった。どのような酵素であるかを明らかにするため、本細菌の全ゲノム塩基配列を決定した。これらの中から候補グリコシダーゼ遺伝子を大腸菌で発現させて酵素活性について調べた。候補遺伝子の中からピルビン酸化ガラクトースを遊離するグリコシダーゼファミリー1(GH1)に属する酵素が本酵素活性を示すことを証明できた。本酵素がなぜピルビン酸化ガラクトースを遊離できるかを明らかにするために立体構造解析を行った。構造解析の結果、ピルビン酸が付加するガラクトースの6位付近の重要ないくつかのアミノ酸を同定することができた。分裂酵母の糖鎖へのピルビン酸付加に重要な複数のPvgタンパク質については、そのゴルジ体局在を証明することができたため、分裂酵母において糖鎖へのピルビン酸化がゴルジ体内腔で起こっていることを明らかにすることができた。しかし従来報告されているタンパク質とはほとんど相同性のないPvg2とPvg5というタンパク質については、未だ酵素活性などの機能を明らかにすることができていない。分裂酵母以外の真核微生物からピルビン酸転移に重要と考えられる遺伝子の調製に複数成功した。そしてこれらの遺伝子を大腸菌で発現させて、タンパク質を生産することには成功している。ただし、これらの酵素活性については明らかにすることができていない。この結果は、分裂酵母で使用した基質であるパラニトロフェニルガラクトースが分裂酵母以外では基質ではない可能性がある。そこで真核微生物由来のピルビン酸転移酵素の基質を検索したいと考えている。

また本酵素の立体構造を明らかにして、特にピルビン酸がどのように本酵素で認識されているか、その詳細を明らかにすることができた。さらにピルビン酸化糖鎖を構成成分に持つSchizosaccharomyces属間で細胞表層糖鎖がどのように異なるのか構造解析を行った。その結果、S. pombe, S. octosporus, S. japonicus, S. cryophilus4種全てにピルビン酸化糖鎖を有することが糖鎖のNMR解析からわかった。そこで各種のピルビン酸転移酵素Pvg1ホモログタンパクを大腸菌で生産させて、その酵素学的諸性質の解析を行った。その結果、S. pombe以外のPvg1ホモログはp-ニトロフェニル-ガラクトースへピルビン酸を付加する活性が極めて低いことがわかった。今後は糖鎖構造と各ピルビン酸生合成酵素との関連をさらに明らかににしていく予定である。またピルビン酸化ガラクトースを認識する分裂酵母凝集素Gsf2の糖鎖結合性についてレクチンマイクロアレイ解析を行った。その結果、Gsf2のN-末端領域はα結合したガラクトースを特異的に結合することを明らかにすることができた。これまで全く明らかにされていなかったピルビン酸含有糖鎖を分解する新規酵素を同定することができた。さらに本酵素の立体構造を明らかにして、ピルビン酸と相互作用するいくつかの酵素のアミノ酸を明らかにすることができたことから、本申請研究は順調に進展していると考えている。分裂酵母以外の真核微生物ゲノムに存在する、糖鎖へのピルビン酸転移に重要な遺伝子が本当に活性を有しているのか、以下の項目について検討を行う予定である。1.FusariumやTrichodermaなどの糸状菌の糖タンパク質や細胞壁に実際にピルビン酸が含まれているのか解析を行う予定である。各種微生物から菌体を調製して、糖タンパク質を精製する。そしてNMR分析によりピルビン酸特有なピークが糖鎖中に存在するかを解析したい。2.分裂酵母のピルビン酸付加が起こらない変異株(pvg変異株)に分裂酵母以外の候補遺伝子を導入することにより、酵母細胞内でのこれらホモログ遺伝子の機能解析を試みたい。もし活性を示した場合には、さらにその諸性質について検討を行う予定である。今後は分裂酵母のピルビン酸付加に関与する4つのタンパク質Pvg1,2,3,5がどのようにゴルジ体において相互作用して生合成に関わっているのか、その分子メカニズムを明らかにする予定である。さらに酵母以外の糸状菌の細胞壁糖鎖構造解析を行い、実際にどの程度微生物がピルビン酸含有糖鎖を有しているのかについても明らかにしたい。
顎骨における組織誘導再生療法に関する実験的研究

α-TCP(α型リン酸三カルシウム)を主成分とする骨セメント材は四肢や頭蓋顎顔面領域において今日、応用が広がりつつある材料である。今回、歯科インプラント治療における有用性を検討するため、特にサイナスリフトへの応用に関する実験的研究を行った。その結果、本材料の良好な操作性、硬化後の物性、組織適合性、骨伝導性はサイナスリフト時の補填材料として有利な性質であると認められ、その有用性が強く示唆された。平成19年度はまず国内外の学会参加等を通じ他施設の研究状況の情報収集等を行い、本研究を実施するための下地づくり、すなわち骨再生研究についての現状を踏まえつつ本研究計画の再検討を行った。その結果、より良好な骨の再生を得るにあたっては、いわゆる人工骨補填材料の応用が現在最も効率的と考えられた。そこで実際の動物実験ではまずこれら補填材料を生体とくに顎骨に応用した際の経時的変化を辿り、そのメカニズムを骨移植あるいは骨延長を行った場合と比較検討し、より効率的な用法を探索することとした。骨補填材料としてはα-TCP(α型リン酸三カルシウム)製剤およびHA(ハイドロキシアパタイト)製剤を選択した。実験動物は日本白色種家兎(雄、2.5kg)を使用し、実験グループをA)α-TCP群、B)HA群、C)コントロール群の3群に分けた。基本的には家兎の鼻背部を剃毛、切開、骨膜まで剥離し、慎重に骨削して鼻腔粘膜を損傷しないように小孔をあけ、鼻腔粘膜を骨面から剥離しつつ圧下させた状態で長さ8mm、直径2mmのチタン製スクリュー型インプラント体を植立した。すなわち骨面と鼻腔粘膜との隙間にスクリューが露出するようにし、小孔よりA)群ではα-TCP、B)群ではHAをスクリュー周囲に充填した。C)群はインプラントのみ植立し材料は充填しなかった。各群において手術後4、8、12週経過時に屠殺、当該部位について形態的・X線学的評価を行った。その結果、経時的な補填材料の骨組織への置換が示唆された。平成20年度はさらに組織学的評価、免疫組織化学的評価を加え、補填材料が骨組織に置換していくメカニズムを詳細に解析する予宇である。前年度に引き続き、骨補填材料を家兎顎骨に応用した際の経時的変化を観察した。材料はα-TCP(α型リン酸三カルシウム)製剤を使用。実験グループはα-TCP群およびコントロール群に大別した。家兎の鼻背部を切開、骨膜まで剥離し、慎重に骨削して鼻腔粘膜を損傷しないように小孔をあけ、鼻腔粘膜を骨面から剥離しつつ圧下させ長さ8mm、直径2mmのチタン製スクリュー型インプラント体を植立した。すなわち骨面と鼻腔粘膜との隙間にスクリューが露出するようにし、小孔よりα-TCP製剤をスクリュー周囲に充填した。コントロール群ではインプラント周囲にコラーゲンスポンジを充填した。各群において手術後4、12、24週経過時に屠殺、当該部位について形態的・組織学的評価を行った。その結果、経時的に補填材料周囲から骨組織の新生が進行していくのが確認された。すなわち時間が経つほど周囲の骨梁は多くなり、補填材料を取り巻くようになっていった。また材料内部へ骨梁が侵入している所見や、材料の粒子が崩壊しそれを骨組織が取り込んでいる所見も経時的に多くなった。骨組織周囲には常に多くの骨芽細胞がみられた。コントロール群では、総じてこれらの所見は乏しかった。また組織標本において画像解析を行い、補填材料が圧下した鼻腔粘膜に接する箇所における新生骨組織の面積を計測、各時点で比較したところ、経時的に有意差をもって増加しており、コントロール群との差も明らかであった。平成21年度はさらに免疫組織化学的評価を加え、補填材料が骨組織に置換していくメカニズムを詳細に解析し、学会ならびに論文発表にて結果報告したい。前年度は骨補填材料を家兎顎骨に応用した際の経時的変化について形態的・組織学的評価を行い興味深い知見を得たが、今年度は骨補填材料が骨組織に置換していくメカニズムを更に詳細に解析するべく、免疫組織化学的評価を加えて実施した。材料はα-TCP(α型リン酸三カルシウム)製剤を使用し、実験グループをα-TCP群およびコントロール群に大別、家兎の上顎洞粘膜を圧下させた上で鼻骨よりチタン製インプラント体を植立し、骨面と上顎洞粘膜との隙間に露出したインプラント体周囲にα-TCP製剤を充填(コントロール群はコラーゲンスポンジを充填)、術後4、12、24週で屠殺、評価を行ったのは前年度と同様である。これまでの研究より、当該部位における強い骨誘導機転の存在が示唆されたことから、免疫組織化学的評価はBMP(Bone Morphogenetic Protein:骨誘導タンパク)について行うこととし、特に抗BMP-2モノクローナル抗体を用いて免疫組織化学的染色を実施した。

その結果、α-TCP塊に近接した上顎洞粘膜組織において、期間を通して多数のBMP-2陽性細胞が観察され、陽性細胞数は術後4、12週ではコントロール群との有意差が認められた(P<0.05)。これは形態的・組織学的に旺盛な新生骨形成がみられる時期と一致していることから、早期より同部位にBMP-2が特異的に発現し、結合組織中の前駆細胞を骨芽細胞等に分化させることなどにより、骨形成が強く誘導されていると考えられた。以上の結果は、歯科インプラント治療、特に上顎臼歯欠損部の骨量が不足する場合の上顎洞底挙上術(サイナスリフト)におけるα-TCP製剤の有用性を示唆するものであると考えられた。
ミトコンドリア脳筋症の発症に関する分子生物学的研究

ミトコンドリア脳筋症の発症の分子機構を解明するために、剖検組織の解析と培養細胞を用いた解析を併用した。剖検組織の解析では、組織によって変異ミトコンドリアDNAの比率が変化することを明らかにした。培養細胞の解析では、患者の培養細胞とミトコンドリアDNAを完全に欠くHeLa細胞を融合し核の効果を除去して変異ミトコンドリアの効果を調べた。変異ミトコンドリアの比率、酵素活性、タンパク質合成、複合体の形成の有無を解析した。乳児致死性の心筋症患者にミトコンドリアtRNA-Ileのacceptor stemの塩基番号4269に塩基置換が見つけられていた。変異tRNA-Ileの機能を調べるためにミトコンドリア内のタンパク質合成を測定した。方法は細胞質タンパク質合成の阻害剤エメチン存在下でアイソトープ標識アミノ酸をとりこませ、SDS-PAGEで解析した。するとtRNA-Ileの点変異によってタンパク質合成は著しく低下し、4269変異によって心筋症が発症することが強く示唆された。この変異は3243,8344変異に続くタンパク質合成を低下させることが証明された第3の変異である。MELASでは3243と3271に変異が見つかっているが、3243変異ではミトコンドリア内のタンパク質合成速度が低下し、特に高分子のタンパク質合成速度が低下していた。一方、3271変異では全体のタンパク質合成速度はほぼ正常細胞と同じであったが、間違ったアミノ酸を取り込んだと示唆される結果が得られた。また、複合体の形成では3243変異では複合体形成に顕著な異常が認められたが、3271変異では特に顕著な変化は認められず、3243変異と3271変異に共通の性質は認められなかった。ミトコンドリアDNA(mtDNA)の変異が原因であるミトコンドリア脳筋症では、発症するには変異mtDNAが増加4なければならない。mtDNAの点変異が原因のMELASにおける発症機序を探るためには、何故変異mtDNAが増加するかを明らかにする必要がある。MELAS患者筋細胞をSV40DNAで形質転換し、クローン化した細胞で変異mtDNA94%、正常mtDNA6%を用いた。この細胞をグルコースを含まずピルビン酸とガラクトースを含む培地(DM170)で培養すると大部分の細胞は死滅する。ところが、一ケ月培養を続けると生育する細胞が出現した。この細胞は正常mtDNAの割合は20%に増加していた。そして、DM170で培養を続けるとこの割合は不変であった。ところが、グルコースを含む培地であるHamF12で培養を続けると変異mtDNAの割合が次第に増加し、四ケ月で元の割合にまで回復した。この変化の原因としては、1)細胞内の変異mtDNAの割合が増加する。2)変異mtDNAを多く持つ細胞がより増加する。のふたつの可能性が考えられる。そこで、各段階の細胞を用いて、ミトコンドリア内のタンパク質合成速度を測定した。すると各段階で低分子タンパク質と高分子タンパク質の合成の割合が変化し、1)によるものであることが判明した。したがって、原因は不明であるがMELASの塩基番号3243A-Gの変異をもつmtDNAは見かけ上の複製は正常mtDNAより有利であることが判明した。何故、変異mtDNAが見かけ上の複製に有利であるかは、今後解明する必要がある。ミトコンドリア遺伝子のコードされるタンパク質はすべて核遺伝子産物のサブユニットと複合体を形成してはじめて機能を持つ。そこで、実際上は複合体の形成状況が重要となってくる。そこで複合体の形成状況を一度に解析する方法を開発した。mtDNA3243変異では複合体IIIの移動度が速くなり、複合体が小さくなっていることを示唆した。また、量的にも少なくなっていた。

複合体Vのサブユニットも少なくなっており、複合体が正常に形成されていないことを示す。その他複合体IVにおいても同様に形成されているサブユニットは少なくなっていた。一方、3271変異では複合体IIIの形成量はやや少ない傾向を示したがその他の複合体の量は対照に比して顕著な差異は認められなかった。すなわち、3271変異ではタンパク質合成だけでなく複合体まではほぼ正常に形成するが酵素活性は低下していた。3243変異と同様に3271変異によっても酵素活性が低下し、MELASの原因遺伝子変異であることが証明された。3243変異ではミトコンドリアのタンパク質合成速度が低下し、複合体形成にまで影響を及ぼした。一方、3271変異では全体的なタンパク質合成速度はほぼ正常で複合体もほぼ正常に形成した。これはロイシンの代わりに別のアミノ酸を運ぶために酵素活性に影響を及ぼすものと推定された。
中央アジア(タジキスタン)における仏教と異思想の交渉に関する調査・研究

タジキスタンの遺跡発掘調査を通して仏教とゾロアスター教習俗との交渉を検証した。仏教寺院遺構の存在が確認されている遺跡において、ゾロアスター教の方形拝殿(チャルタク遺構を検出し、その付属工房から仏像の表現形式をもったゾロアスター教神像(ミトラ神を発見した。これによって、イスラーム化以前の中央アジアではゾロアスター教が強い影響力を持ち、仏教との重層信仰が存在していたことを明らかにすることができた。タジキスタン国立歴史考古博物館のデータベース構築について:2005年前期はタジキスタン国立歴史考古博物館カタログ(ロシア語)の英訳・日本訳完成に専念した。インターネットでボボムローエフ館長と原稿ファイルを交換しながら校正を進めていった。8月にタジキスタン現地調査の折、ウエッブ・サイト公開に関する最終的打ち合わせを実施。9月中旬に龍谷大学内に代理サイトを開設した。これで博物館収蔵品データベースの構築の第一段階を達成することができた。URLはhttp://www.afc.ryukoku.ac.jp/tj/タジキスタン現地調査について:2005年8月には2名がタジキスタン南東部イシュカシム地域調査を実施。仏教僧院遺構と見られるヴラング遺跡と仏塔・スヴァースティカ(卍)を刻んだペトログリフ(岩絵)のあるランガール遺跡を視察した。2006年2月には2名がつくば市所在の(株)応用地質研究所において地中レーダのトレーニングを受講。2006年3月には、研究協力者である京都市埋蔵文化財研究所吉崎伸氏も含めた3名が現地調査を実施、今後の調査の進め方を検討した。具体的には、アジナ・テパ、クヒール・カラ、カレ・コファルニホンの3遺跡を視察し画像記録をとった。前二者はユネスコと東京文化研究所(山内教授)が中心となって保存・調査が実施されることがきまっているとのことであった。カレ・コファルニホン遺跡は古代街道の渡河地点であったとみられ、要衝のひとつであったと考えられる。小規模な遺跡ではあるが、特徴的な性格をもっているものと期待される。この遺跡は現在のウズベキスタンとの国境に位置しており、ウズベキスタン遺跡群との関連も視野に入れながら調査を進めていく必要がある。この遺跡調査に関連しては、2006年3月24日付けで、タジキスタン科学アカデミー長官マーソフ氏との間で3年間にわたる「カレ・コファルニホン城砦・僧院遺跡における調査」実施の合意書を取り交わしている。2006年10月4日から18日(14泊15日)までの調査では、蓮池利隆(研究代表者)と小野田豪介の2名がカレ=コハルニホン遺跡における地下レーダ探査を実施、佐野東生助教授(研究分担者)はタジキスタン国立歴史考古民族博物館においてイスラーム化後の文化に関する調査を実施した。地下レーダ調査はGeophysical Survey System, Inc.(GSSI社)を3週間のレンタルで持ち込み、カレ=コハルニホン遺跡の10ヶ所において探査をおこなった。今回の調査では400MHzのアンテナを使用して、地下約3メートル前後の深さまでの探査をおこなうことができた。収集したデータは解析ソフトのRadam6.5で処理、3D画像(観測地のスライス画像を連続的に表示し、埋蔵構造物の検出を可能にする)を作成することができた。このデータの中、2ヶ所において埋蔵構造物と思われる影が認められた。来年度の発掘調査に向けての具体的資料が得られたことになる。2007年3月14日から28日(14泊15日)までの調査では、蓮池利隆(研究代表者)がカレ=コハルニホン遺跡における測量調査を実施した。これは10月の地下レーダ探査で調査した10ヶ所の平面図を作成する目的で、平板測量器材一式を持ち込んでの作業である。10月の調査時には、タジキスタンで充分な器材が揃わないために、測量を延期せざるを得なかった。タジキスタンの若手研究員も測量作業に協力し、技術習得にも役立ったように思う。タジキスタンの習俗の中にはゾロアスター教由来のものが多く認められ、今回の調査においても、新年(ナヴルーズ)の行事にその痕跡を見ることができた。ハゾリ=スパンと呼ばれる香草を燃した煙で邪気を払うための道具は、仏具の柄香炉との類似性を示しているように思われる。仏教学における多角的研究がおこなわれるにともなって、仏教文化学的調査の必要性も益々高くなっている。特に、庶民を中心に展開した大乗仏教に関しては、文献学的研究のみではその全体を把握することは困難であり、仏教考古学や民族学的アプローチが不可欠となる。例えは、当研究の目的の一つである阿弥陀仏の起源解明などは、文献学的に結論を得ることは不可能であり、都城址内の仏教遺跡発掘などを通してはじめて明らかになる課題である。当該研究、カレ=コファルニホン遺跡調査もそのような目的をもって実施している。前年度に実施した地下レーダー調査のデータにもとづいて試掘調査予定地

2ケ所を設定し、本年度9月に地形図作成及び試掘調査を実施した。地形図作成は遺跡の全体像を知る上でも必須のものである。平板とレベルを用いて遺跡北西部の図面を作成した。この作業によって旧発掘遺構との位置関係を確認することができた。また、衛星写真との対照によって偏角が+6.5°であることもあきらかとなった。次に、2ケ所の試掘調査でトハーラ期(78世紀)の日干し煉瓦による壁を検出、都城内の工房址であることを確認した。この試掘によって、土器片やその他多数の遺物も採取することができた。特にテラコッタの仏像を作成するための型の出土は本件研究のテーマに相応しいものである。高さ10センチほどの小品ではあるが、それだけに庶民の間に普及したものであったことを推測できるものである。眉間に描かれた白毫(びゃくごう)相と二段に描かれた頂髻(ちょうきつ)相は三十二相の中の二つで、仏陀像の特徴をよく示している。また、この仏像の膝元にはゾロアスター教の拝火檀が配されており、仏陀はそれに手をかざす姿勢として描だれている。「仏陀と異思想の交渉」を示す格好の資料である。成分検査のための試料10点をタジキスタン科学アカデミーの依頼で持ち帰っている。当研究では城砦遺跡であるカレ=コファルニホン遺跡の発掘調査を実施している。この遺跡は、ウズベキスタンとタジキスタンの仏教遺跡をつなぐ要衝の地に位置し、時代的にもクシャーン期・トハラ期・ソグド期にわたる重要な遺跡である。かつて旧ソ連主導で行われた発掘調査において、この遺跡から方形仏堂が発見され、仏教的遺物が多数出土している。我々が実施した平成20年の発掘調査において同遺跡内でゾロアスター教遺構チャルタクが発見された。チャルタクとはゾロアスター教の方形拝殿で、中央に基壇を置く回廊形式の遺構である。チャルタク遺構の回廊からはゾロアスター教の儀式で用いられるハオマ(インドのソーマに相当)を搾る乳鉢や聖火を保つための聖火炉も出土し、ゾロアスター教信仰の実態が明らかとなった。発掘の記録として遺構の測量・図化を実施、現地スタッフにも作図指導をおこなった。この発見の意義は、方形仏堂の伝播ルート解明に関わるものである。日本に伝来した常行三昧堂は方形のプランを持つ。常行三昧は初期浄土教信仰を考える上で重要な修行方法である。研究代表者がこれまでに参加した調査中、西域南道の仏堂も方形プランであり、常行三昧の原初形態が確認されている。今回の発掘調査で方形仏堂と並行してゾロアスター教のチャルタクが存在していたことが明らかとなり、方形仏堂の起源についての重要な資料となると考えている。また、昨年度の発掘調査では、チャルタク付属工房から白毫相と肉髻相を備えた小仏像(ゾロアスター教神像)が出土した。仏像の特徴を備えたミフル神が拝火壇に手を差し伸べている姿は、仏教とゾロアスター教の重層信仰を象徴している。今年度の調査の一環として、シリコーンゴムによる複製作成を試み、より詳細な検討を行った。さらに、発掘試料のカーボン14検査を依頼し、遺跡の年代考察をも実施することができた。