hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト・フォンビルブランド因子の糖鎖の生理機能と活性化メカニズムの解明

1.フォン・ビルブランド因子(vWF)の新しい活性化因子であるビチセチンの一次構造を決定した。ビチセチンはα、βサブユニットがS-S結合したヘテロダイマーであるが、いずれのサブユニットもC型レクチン・モチーフを持ち、ボトロセチンとの相同性は比較的低く、約45%であった。ビチセチンはvWFのA1ドメイン内に結合し、競合実験からボトロセチン結合部位の近傍に結合すると考えられた。2. ABO不適合の同種骨髄移植、末梢血幹細胞移植、臍帯血幹細胞移植における赤血球及び血漿vWF上のABO血液型抗原と、抗血液型抗体の産生をモニターした。いずれの場合も赤血球表面抗原はドナーの血液型に移行したが、vWF上の血液型抗原は移植後数年をへてもレシピエントの従来の血液型を保持することが明らかとなった。3.タイコブラ毒から新しく精製されたvWF結合性タンパク質であるコーシャギンが、vWFの特定部位(Pro708-Asp709間)を切断する二価イオン依存性のメタロプロテアーゼであり、vWFによる血小板凝集能やコラーゲンとの結合能を消失させることを明らかにした。4.マムシ毒から血小板膜タンパク質GPlbに特異的に結合し、vWFによる血小板凝集を強力に阻害するマムシギンを精製し、cDNAクローニングにより推定一次構造を決定した。5.マムシ毒からフィブリノーゲンを切断する新しいセリンプロテアーゼ(ハリスターゼ)を見出し、一次構造を決定した。ハリスターゼはキニノーゲンを切断し、ブラジキニンを遊離することでラットの血圧を降下させる活性を示した。1.クサリヘビ科Bitis arietans蛇毒から精製された、vWFの活性化誘起因子であるビチセチンの全一次構造を決定した。ビチセチンはボトロセチン同様、C型レクチン様構造を持ったα、β二つのサブユニットがS-S結合を介してヘテロダイマーを形成していた。しかし、ボトロセチンとのアミノ酸配列の相同性は45%程度と低く、特にβ鎖で塩基性残基の割合が高かった。(Res.Commun.Biochem.Cell.Mol.Biol.1:1997,in press)。ビチセチンによるvWF活性化メカニズムを探るため、vWF上のビチセチン結合部位をvWFのドメイン認識抗体やプロテアーゼ断片を用いて調べたところ、ビチセチンはvWFのA1ループドメイン内に結合し、ボトロセチンの結合サイトに近いが同一ではないことが示唆された。2.HLA一致、ABO不敵合の同種骨髄移植患者における血漿vWF上のABO血液型抗原をELISA法で調べた。移植後60-90日で赤血球表面抗原はドナーの血液型に完全に移行したのに対して、vWF上の抗原は全くドナーの型には移行せず、レシピエンドの血液型を保持することが明らかになった。3.マムシ毒からハリスターゼと名付けた新しいセリンプロテアーゼを精製し、全一致構造を決定するとともに性質を調べた。ハリスターゼはヒト・フィブリノーゲンのBβ鎖とAα鎖を切断するが、トロンビンとは異なる部位で切断し、フィブリン・クロットを形成しないこと、血漿キニノーゲンからブラジキニンを遊離させ、血圧を降下させることなどが明らかになった(Eur.J Biochem.1998,in press)。1. ABO不適合の同種骨髄移植8例、末梢血幹細胞移植3例、臍帯血幹細胞移植1例、ABO適合同種骨髄移植3例における赤血球及び血漿フォン・ビルブランド因子(vWF)上のABO血液型抗原と、抗血液型抗体の産生をモニターした。

いずれの場合も赤血球表面抗原はドナーの血液型に移行したが、vWF上の血液型抗原はレシピエントの従来の血液型を保持していた。すなわち、ABO不適合血液幹細胞移植において赤血球と特定の血漿タンパク質間で血液型キメラとなることが明らかとなった。また、レシピエントの元の血液型に対する自然抗体は産生されていなかった(投稿中)。2. vWFのA1ドメインの親水性アミノ酸を逐次Alaに置換したcDNAを含むプラスミドを大量調製し、ヒト培養細胞へのトランスフェクションの条件検討を開始した。今後、順次ビチセチンの結合に関与するアミノ酸残基を特定する。3.マムシ毒から血小板膜タンパク質GPlbに特異的に結合し、vWFによる血小板凝集を強力に阻害するマムシギンを精製し、cDNAクローニングにより推定一次構造を決定した。マムシギンは、vWFを活性化するボトロセチンやビチセチンと相同性を示したが、全く異なる生理活性を示すことが明らかとなった(Thromb.Haemost.79,1199-1207,1998)。4.タイコブラ毒から新しく精製されたvWF結合性タンパク質であるコーシャギンが、vWFの特定部位を切断する二価イオン依存性のメタロプロテアーゼであること、vWFとの結合には二価イオンを必要としないことを明らかにした。また、コーシャギンはvWFによる血小板凝集能やコラーゲンとの結合能を消失させることを明らかにした(Thromb.Haemost.80,499-505,1998)。現在、一次構造の解析を行っている。
前立腺肥大症の発育および症状発現に関する前立腺間質の役割

本年度はヒト前立腺組織におけるα_1アドレナリン受容体サブタイプ(1a,1b,1d)の発現量をRNase protection assay法で、また局在をin situ hybridization法で検討し、臨床病理学的事項との相関を検討した。【症例】前立腺摘出術を施工した前立腺肥大症例12例(年齢±S.D,;68.7±7.6歳、前立腺重量;27gから100g)より、標本の採取を行った。また、膀胱腫瘍で、明らかな前立腺肥大症の無い症例4例(年齢±S.D.;61.3±9.56歳)の前立腺組織(非肥大前立腺組織)も採取した。標本は直ちに、またはOCTコンパウンドに包埋して、液体窒素にて凍結後、実験に使用するまで-130°Cに保存した。【方法】mRNAの定量実験にはα_1-アドレナリン受容体サブタイプについて、相同性の少ないC末端領域のDNA(それぞれ約300bp)をRNA転写用ベクターに組み込み、これを用いて[α-^<32>P]UTPで標識されたアンチセンスRNAプローブを作製した。このプローブを用い、ヒト肥大前立腺組織ならびに非肥大し前立腺組織から調整したpoly(A+)RNAのRNase protection assayを行った。mRNAの局在は、同じくC末端領域からdigoxigeninラベルのRNAプローブを作製し、10μmの凍結切片でin situ hybridizationを行い、digoxigenin-ELISA法にて検出した。【結果ならびにまとめ】ヒト肥大前立腺組織におけるアドレナリン受容体のサブタイプはα_<1a>が優位であり、α_<1a>(85%)>α_<1d>(15%)≫α_<1b>(ほとんど検出されない)の順に発現していた。しかし、前立腺重量ならびに年齢との相関は現在のところ認めていない。局在はα_<1a>、α_<1d>とも主に間質の筋組織に主に見られた。α_<1a>とα_<1d>の結合部位はこれら筋細胞では部位的差異ははっきりしない。また、非肥大前立腺組織ではα_<1a>(63%)>α_<1d>(29%)≫α_<1b>(8%)であった。全α_1mRNAの量は肥大前立腺組織が非肥大前立腺組織に比べて6倍であり、各サブタイプでは肥大前立腺組織の方がα_<1a>mRNA量で8倍、α_<1d>mRNA量で3倍で多く認められた。前立腺肥大症は間質の疾患であるが、前立腺肥大症の症状発現には、α1-アドレナリン受容体を介した間質内平滑筋の役割も大きい。近年、α1-アドレナリン受容体のサブタイプ(1A,1B,1C)の構造が解明された。本年度はまず基礎実験として、ラットの前立腺におけるα1-アドレナリン受容体の加齢による変化を検討した。

α1-アドレナリン受容体の阻害剤であるYM617のトリチュウムラベル体を用いた結果では、親和性は生後8週目のラット、52週目のラット、ならびに104週目のラット間には差が無かったが(それぞれ、115.8±9.1,100.5±5.8,116.4±9.8pM)、Bmaxは104週目のラット(11.0±1.2 fmol/mg protein)では生後8週目(37.0±4.3 fmol/mg protein)ならびに52週目のラット(37.2±3.4 fmol/mg protein)に比べて有意に低下していた(submit to Urological Reseach)。さらにヒト前立腺で尿道に対して垂直方向に摘出した標本でも、円周方向に摘出した標本でも各種α-アドレナリン受容体に対する収縮性に差が無いことを証明した(submit to General Pharmacology)。また、肥大前立腺におけるα1-アドレナリン受容体のサブタイプを検討するために、α1Bに選択的に結合すると云われているCECで前立腺組織をあらかじめpreincubationし、上記のYM617のトリチュウムラベル体を作用させた。その結果、オートラジオグラフィーによる局在実験でも、結合実験でもCECに感受性があるものは約30%すぎず、大半はα1Aないしα1Cであることが判明した(submit to Urological Reseach)。ラットは生後2年の段階で、前立腺組織内のα_1-アドレナリン受容体数が優意に減少することが判明した(Urol.Res.in press)。同様の加齢現象はラット腎でも証明された(Gen.Pharmacol.in press)ので、ヒトの場合でもおそらく同様のことが起こるであろう。ヒト肥大前立腺組織平滑筋の反応方向について検討したところ、同部の平滑筋はα_1-アドレナリン受容体刺激剤に対して尿道に平行方向でも垂直方向でもほぼ同様に反応することがわかった(Gen.Pharmacol.25:1459-1464,1994)。なおこれと付随して、α_1-アドレナリン受容体はヒト前立腺組織内に均等に局在する事をin vitroオートラジオグラフィーで確認した(Gen.Pharmacol.in press)。ヒト前立腺組織におけるα_1-アドレナリン受容体サブタイプについてはin vitroオートラジオグラフィー法でchlorethyclonide(1Bの不可逆性阻害剤)をpreincubationしたのち、^3H標識YM-617(主にIC選択性のα_1-阻害剤)を結合させると、約30%の結合減少を示した(Acta Histochem.Cytochem.27:219-225,1994)。またin situハイブリダイゼーションでも1Bの局在ははっきりしなかった。以上よりヒト肥大前立腺組織では1Bの存在は少ないことが判明した。現在、分子生物学的観点から、各肥大症例でのα_1-アドレナリン受容体のサブタイプを検討中である。また、国立小児病院小児医療研究センター小児薬理研究部の辻本らと協同研究で、本邦における前立腺肥大症例のα_1C-アドレナリン受容体遺伝子のpolymorphismを検討し、欧米人とは異なる事を見いだした(投稿準備中)。本年度はヒト前立腺組織におけるα_1アドレナリン受容体サブタイプ(1a,1b,1d)の発現量をRNase protection assay法で、また局在をin situ hybridization法で検討し、臨床病理学的事項との相関を検討した。
DNA構造特異的結合因子Orpheus/SSRP1による転写抑制機構の解析

申請者は、細胞老化・不死化過程におけるSSRP1の機能について2年間の研究期間に以下の成果を収めた。1.SSRP1は不死化前の若い細胞と不死化細胞において転写抑制活性を示した。この転写抑制活性は、細胞老化依存性転写抑制因子Orpheusの結合活性の有無と一致し、その結合部位を変異させると認められなくなった。2.SSRP1のmRNAの発現は細胞老化過程でほとんど変化せず、不死化後も老化期のたかだか1.5倍であった。これはサウスウェスタン・ブロットによって調べたSSRP1蛋白の発現量の変化と一致していた。3.SSRP1特異的ポリロリナ-ル抵抗でスーパーシフトアッセイを行ったところ、Orpheusのバンドには変化は認められなかった。つまり、Orpheusの結合活性中にSSRP1は含まれていないことが示唆された。4.chemical footprintによりISE2中のOrpheus結合配列の5′側に隣接した領域に弱りfootprintが認められた。その配列に2bpの置換変異を導入した結果、一つの変異体で野性型に比べ約4倍の転写活性の上昇が認められた。このもう一つの転写抑制因子がSSRP1である可能性を検討するため、SSRP1のレコンビナント蛋白のISE2に対する結合能をサウスウェスタン・ブロット、ゲルシフト・アッセイによって検討した。SSRP1のISE2への結合は、サウスウェスタン・ブロットでは検出可能であるにもかかわらず、ゲルシフト・アッセイではどうしても検出することができなかった。この理由は明らかでないが、SSRP1が分子内にDNA結合を抑制するドメインを持っている可能性、あるいは他の因子と相互作用しているときのみDNAに結合できるようになる可能性等を今後の研究において慎重に検討する必要がある。申請者は平成7年度に計画された研究を順調に遂行し、SSRPIの機能解析に必要とされる発現ベクター、レコンビナント蛋白、特異的ポリクローナル抗体を作製した。これらを用いて実験を行い、新たに以下の知見を得た。1.不死化感受性エレメントを含むcollagenase遺伝子上流域のCAT constructとSSRPIの発現ベクターを、老化前の比較的若い細胞、老化細胞、不死化細胞にコトランスフェクションしてCATアッセイを行った。その結果SSRPIは、collagenaseの発現が認められない老化前の若い細胞と不死化細胞でのみ転写抑制活性を示し、collagenaseの発現が高い老化細胞ではその活性は認められなかった。また、他の不死化細胞としてCOS7細胞でも、同様の転写抑制能が認められた。この活性は、Orpheus結合部位に変異を導入すると認められなくなった。SSRPIの転写抑制能の有無は、Orpheus結合活性の有無と一致していた。2.SSRPIのmRNAの発現は、細胞老化の過程でほとんど変化せず、不死化後も老化期のたかだか1.5倍であった。これはサウスウェスタン・ブロットによって調べたSSRPI蛋白の発現量の変化と一致していた。3.Orpheus結合配列をプローブとしたゲルシフトアッセイにおいて、SSRPI特異的ポリクローナル抗体によるOrpheusのバンドのスーパーシフトアッセイを行ったところ、バンドに変化は認められなかった。以上の研究結果から、SSRPIはOrpheusの本体ではなく、Orpheusとオーバーラップした結合部位を持ち、Orpheusのコファクターとして機能することにより転写抑制に寄与している可能性が考えられた。そこで、当初の研究計画を多少変更して、SSRPIとOrpheusの関係をさらに追究することによってSSRPIによる転写抑制のメカニズムを解析していく予定である。collagenase遺伝子上流のISE(immortalization-susceptible element)2についてchemical footprint analysisを行った結果、ISE2の中に2ケ所のfootprintが認められることが明らかとなった。

一つはOct-1であることが明らかになったOrpheusの結合部位である。もう一つはOrpheus/Ost-1結合配列の5′側に隣接した領域で、センス鎖ではGAAATTGが、またアンチセンス鎖ではCAATTの部分が弱くプロテクトされる。このfootprintが認められた配列を中心に2bpの置換変異を導入したところ、最も5′側のGAを変異させると約3.5倍の転写活性の上昇が認められた。この結果は、少なくともOct-1とはまた別の因子が、Oct-1結合部位のすぐ5′側に結合して転写抑制に寄与していることを示している。このfootprintの配列は、HMGボックスが認識するモチーフとしてあげられているYYATTGAAまたはYYTTGAAに極めてよく似ている。SSRP1はHMGボックスを持ち、ISE2に特異的に結合し、Oct-1結合部位に依存した転写抑制能を示す。そこで、SSRP1が目的の因子である可能性を検討するために、レコンビナント蛋白を合成してISE2に対する結合性を調べてみた。ところが、サウスウェスタン・ブロットでは結合が検出できるのにもかかわらず、EMSAでは条件をふっても全く結合を検出することができなかった。この理由は明らかでないが、SSRP1が分子内にDNA結合を抑制するドメインをもっている可能性も考えられ、他の因子、たとえばOct-1と相互作用しているときのみDNAに結合できるようになることも考えられる。一方でOct-1が転写抑制性の核内構造体を形成しているらしいことが明らかになっており、SSRP1はそのような構造体との相互作用を通してのみ機能していることも考えられる。SSRP1の細胞老化・不死化過程に依存した転写抑制能を解析するために、以上のような可能性を今後の研究において検討する必要がある。
日本の株式市場の「アノマリー」と投資家行動

機関投資家はアノマリーを活用して最終顧客に超過リターンをもたらすことが期待されている。我々は日本の株式市場を対象としてこの「洗練された機関投資家仮説」を検証した。我々の検証結果は仮説に対し非整合的であった。第一に、機関投資家の集計パフォーマンスは、CAPM及び一般的なマルチファクターモデルに対し正のアルファ値を生み出していない。第二に、機関投資家が各種「アノマリー」により超過リターンを生み出す銘柄群をオーバーウェイトする傾向があるかどうかを検証したが、大半のファクターについては、そのような安定した傾向が見られなかった。平成25年度は「ボラティリティ・アノマリー」及び「バリュー・アノマリー」についての論文を完成させる予定であった。実績としては、「ベータ・アノマリー」についての論文は"The Beta Anomaly in the Japanese Equity Market and Investor Behavior"と題する論文として完成、The International Review of Finance/日本ファイナンス学会共催のConferenceで発表するとともに、査読を経てInternational Review of Finance誌のVol.14-1に掲載された。「バリュー・アノマリー」については日本ファイナンス学会で発表を行ったが、論文は完成途上である。これ以外に、本研究からの派生研究である機関投資家の投資行動についての研究の一環として、証券経済学会で「世の中に機関投資家が存在する本当の理由」と題する発表を行った。平成26年度は「アノマリー」と投資家行動、特に機関投資家の行動との関係についてより一般的な研究を行う計画であった。実績として、平成26年12月の行動経済学会、平成27年1月のWaseda Organizational and Finance Seminar、平成27年3月の日本経営財務研究学会西日本部会で「アノマリーを活用しているのは機関投資家か、それとも個人投資家かー日本の株式市場における検証」と題する研究発表を行った。これ以外に、本研究からの派生研究である機関投資家の投資行動についての研究の一環として、証券経済学会年報第49号において「世の中に機関投資家が存在する本当の理由」と題する論文を発表した。平成27年度は本研究のまとめとなる研究論文「アノマリーを活用しているのは機関投資家か、それとも個人投資家か?日本の株式市場における検証」を日本ファイナンス学会(6月)、日本経済学会秋季大会(10月)、大阪大学経営研究会(11月)で発表した。本論文はその英語版を作成し、学術雑誌に投稿する予定である。また、本研究と関連するテーマを取り扱った論文"Hot Money and Cross-Section of Stock Returns during the Global Financial Crisis"をDaehwan Kim教授と共著で作成、経営財務研究学会(10月)で発表した。最後に、日本証券アナリスト協会と日本ファイナンス学会共同セミナーで、「ファクター投資の意義と有効性」と題する講演を行った。これは本研究の成果を一般に伝える機会となった。本研究課題の核となる論文である「アノマリーを活用しているのは機関投資家か、それとも個人投資家かー日本の株式市場における検証」は、3度にわたる研究会での発表を経て、平成27年度において英文ジャーナルへの投稿を行うことが可能な段階に達している。ファイナンス本研究課題の核となる論文である「アノマリーを活用しているのは機関投資家か、それとも個人投資家かー日本の株式市場における検証」の英文ジャーナルへの投稿を行うとともに、本研究課題の成果をよりわかりやすくまとめたものを、証券経済学会での学会発表、証券アナリストジャーナル誌への投稿などを通じ、一般の読者に読みやすい形で提供する計画である。このうち「ベータ・アノマリー」についての論文は完成し、「バリュー・アノマリー」についても学会発表を終え、論文の加筆修正の段階にある。平成26年度においては、論文の英文化、校正を行わなかったことが予算の摘み残しにつながった主たる要因である。平成26年度には「バリュー・アノマリー」についての論文作成を進めるとともに「収益予想修正アノマリー」、「IPO・POアノマリー」についての研究を開始する計画である。平成27年度には、研究を総括し、日本の株式市場において「どの投資主体の、いかなる投資行動が『アノマリー』を生み出しているのか」という問題を、特に機関投資家が、現実の市場において各種「アノマリー」にいかなる形で「関与」しているか、を中心のテーマとして明らかにし、このテーマを本としてまとめる計画である。平成27年度においては、論文の英文化、校正の機会が増加することに加え、海外開催の学会への参加が予定されており、そのための出費が増加する計画である。平成25年度の支出を計画していたデータベース「Quick Astra Manager」の使用を、研究の進捗状況に鑑みて先送りしたため。
顎関節MRIによる関節円板転位症例の長期予後評価と新規リスク因子の解明

MR画像評価者間のキャリブレーションを行い,MR画像の評価方法ならびにその信頼性について検証を行った。2回のキャリブレーションにより,3名の評価者間一致度は,下顎頭の位置と骨変形以外の評価項目において上昇傾向を示した。円板動態,円板転位,円板変形,下顎頭の骨変形,joint effusionに関する評価者間の一致度の平均値は, “かなりの一致"を,下顎頭の位置,偽円板形成では“中等度の一致"を示した。下顎頭の位置や偽円板の評価については,さらなる評価の精度の向上のために引き続きキャリブレーションを行っている。また,前年度に引き続き,被験者集積ならびに臨床診査,質問表および顎関節MRI撮像を行い,顎関節症についての追跡調査を行った。対象は,岡山大学病院クラウンブリッジ補綴科(旧第一補綴科)を2003年1月4日から2008年12月28日の間に,顎関節症状を主訴に初診受診した患者のうち,初診時に顎関節MRI撮像を行い,顎関節症III型と診断された全患者とした。これら全員に文書による本研究の趣旨を郵送し,同意が得られた者に臨床診査,質問表調査,MRI撮像を行った。MRI撮像条件は,開閉口位でプロトン密度強調画像,閉口位でT2強調画像とした。臨床診査は日本補綴歯科学会ならびに日本顎関節学会の専門医3名のうちいずれかが行った。診査項目は,開口量,咀嚼筋圧痛の有無・部位,関節雑音の有無・種類,随伴症状,口腔悪習癖の有無,顎関節部の主観的疼痛レベル(VAS)とした。初診時の臨床診査項目は,診療録より抽出した。現時点で研究同意が得られた70名のデータを集積している。前年度から引き続いて,MR画像の評価方法ならびにその信頼性について検証を行ってきたため,今年度予定していたデータの解析が遅れている。70名から得られた初診時と追跡調査時のデータの比較することにより,偽関節円板像の発現頻度や下顎頭骨変形の発症率,関節円板転位の進行率,臨床症状の悪化率の算出することで病態変化を把握する。偽関節円板形成に関連する因子について検討し,さらに顎関節症の病態変化に関連する因子の同定を行う。被験者集積ならびに臨床診査,質問票および顎関節MRI撮像を行い,顎関節症についての追跡調査を行った。これら全員に文書による本研究の趣旨を郵送し,同意が得られた者に臨床診査,質問票調査,MRI撮像を行った。MRI評価は,前述の専門医3名が,患者の症状,来院時期,それぞれの評価結果に関する情報を盲検化した状態で独立して行った。評価項目は,関節円板動態,円板前方転位の程度,関節円板変形の有無,下顎頭の位置,下顎頭骨変形の有無,顎関節包内の浸出液の貯留(Joint effusion)の有無および偽円板形成の有無とした。まず評価者間のキャリブレーションを行った。MRI画像は評価者に含まれていない研究代表者によって選択された20関節を用いた。まず最初に,3名の評価者がこれら20関節を別々に診断した。盲検化を確実にするために,これらの症例は番号のみで識別され,ランダムに並べられて評価した。その後,評価者間で評価が異なる画像については協議をして相互同意を得た。その後,再度20関節を同様の手順で診断した。キャリブレーション前後の評価者間の一致度をカッパ係数により算出した。今年度は被験者集積と追跡調査の実施予定であったが,研究を進めるにあたりを評価者間のキャリブレーションを行う必要があった。そのため先行研究にて評価者間の一致度を検討した。現在は被験者の集積を行っている。対象は,岡山大学病院

クラウンブリッジ補綴科(旧第一補綴科)を2003年1月4日から2008年12月28日の間に,顎関節症状を主訴に初診受診した患者のうち,初診時に顎関節MRI撮像を行い,顎関節症III型と診断された全患者とした。これら全員に文書による本研究の趣旨を郵送し,同意が得られた者に臨床診査,質問表調査,MRI撮像を行った。MRI撮像条件は,開閉口位でプロトン密度強調画像,閉口位でT2強調画像とした。臨床診査は日本補綴歯科学会ならびに日本顎関節学会の専門医3名のうちいずれかが行った。診査項目は,開口量,咀嚼筋圧痛の有無・部位,関節雑音の有無・種類,随伴症状,口腔悪習癖の有無,顎関節部の主観的疼痛レベル(VAS)とした。初診時の臨床診査項目は,診療録より抽出した。現時点で研究同意が得られた70名のデータを集積している。前年度から引き続いて,MR画像の評価方法ならびにその信頼性について検証を行ってきたため,今年度予定していたデータの解析が遅れている。被験者集積を引き続き行う。研究の同意が得られた者には臨床診査,質問票調査,MRI撮像を行う。初診時データと10年追跡時データの比較を行うことにより,偽関節円板像の発現頻度や下顎頭骨変形の発症率,関節円板転位の進行率,臨床症状の悪化率の算出することで病態変化を把握する。偽関節円板形成に関連する因子について検討し,さらに顎関節症の病態変化に関連する生物学的要因の同定を行う。70名から得られた初診時と追跡調査時のデータの比較することにより,偽関節円板像の発現頻度や下顎頭骨変形の発症率,関節円板転位の進行率,臨床症状の悪化率の算出することで病態変化を把握する。偽関節円板形成に関連する因子について検討し,さらに顎関節症の病態変化に関連する因子の同定を行う。評価者間のキャリブレーションを先行したために、被験者集積が遅れている。平成30年度は引き続き被験者集積と追跡調査を行う予定である。追跡調査にはMRI撮像費用等が必要となる。さらに,本研究を実施するための情報収集や研究成果発表のために国内外の関連学会への学会参加を予定しているため,旅費が必要となる。MR画像の評価方法ならびにその信頼性について再検討したために,データの解析が遅れている。統計解析には解析ソフト等が必要となる。
躁うつ病の連鎖領域および位置的候補遺伝子の解析

双極性障害の疾患感受性遺伝子の解明を目的として、21q22および22q12にマッピングされている候補遺伝子について多型解析を行った。脳に多く発現する新しいタイプのカルシウムチャネルTRPM2(transient receptor potential melastatin 2)は機能的、位置的に最も有力な候補遺伝子である。最近、双極性障害患者由来のBリンパ芽球細胞株の一群でそのmRNA量の有意な低下が報告されたことから、まず、この遺伝子の転写調節領域の解析を精密かつ徹底的に進めた。5'RACE法により新たに発見したTRPM2の第1エキソン周辺から欠失と挿入を伴う多型を同定した。次に、TRPM2はゲノム上約90kbにわたる32個のエキソンからなる遺伝子で1503アミノ酸残基よりなるが、このエキソンを中心にエキソン・イントロン境界領域を含んだ部位について、SSCP(single strand conformation polymorphism)法とdirect sequencing法により変異スクリーニングを行った。その結果得られた同遺伝子のプロモーター領域およびエキソン・イントロン領域の多型について、日本人双極性障害患者群(96名)と健常対照群(210名)において関連解析を行ったが、有意な結果は認められなかった。21q22および22q12にマッピングされている双極性障害の疾患感受性遺伝子の解明を目的として、有力な候補遺伝子について多型解析を行った。我々が以前に発見した脳に多く発現する新しいタイプのカルシウムチャネルTRPM2 (transient receptor potential melastatin 2)は機能的、位置的に有力な候補遺伝子である。最近、双極性障害患者由来のBリンパ芽球細胞株の一群でそのmRNA量の有意な低下が報告されたことから、この遺伝子の転写調節領域の解析を進めた。脳のmRNAを用いた5'RACEを行い、従来報告されている第1エキソンとは全く異なる位置に真の転写開始領域を見いだした。さらに脳の線条体(被殻、尾状核)に特異的に発現する第2のプロモーターを遺伝子内に発見した。後者から転写されるmRNAは、これまでに報告されていない線条体に特異的な短型TRPM2蛋白をコードしていたが、この短型蛋白もカルシウムチャネルとして機能していた。新しく発見した第1エキソン周辺から欠失と挿入を伴う多型を同定したが、日本人双極性障害患者群(96名)と健常対照群(210名)において有意な差は認められなかった。一方、2003年に22q12のADRBK2/GRK3 (adrenergic, beta, receptor kinase 2/G protein receptor kinase 3)遺伝子のプロモーター領域に疾患との関連が示唆される多型の報告が北欧の双極性障害家系で見られた。同遺伝子のプロモーター領域の多型と本邦における双極性障害の発症との関連を検討した。しかし、北欧の家系において疾患との関連が示唆されたプロモーター領域の多型は本邦の患者群、健常対照群のいずれにも認めなかった。また、その他のプロモーター領域の多型についても双極性障害との関連はなかった。双極性障害の疾患感受性遺伝子の解明を目的として、21q22および22q12にマッピングされている候補遺伝子について多型解析を引き続き行った。脳に多く発現する新しいタイプのカルシウムチャネルTRPM2(transient receptor potential melastatin 2)は機能的、位置的に有力な候補遺伝子である。新しく発見したTRPM2の第1エキソン周辺から欠失と挿入を伴う多型を同定した。さらに、TRPM2はゲノム上約90kbにわたる32個のエキソンからなる遺伝子で1503アミノ酸残基よりなるが、このエキソンを中心に、エキソン・イントロンの境界領域を含んで、SSCP(single strand conformation polymorphism)法とdirect sequencing法により変異スクリーニングを行った。その結果、アミノ酸の変化をともなうミスセンス多型を含んだ一塩基多型を20以上同定した。

次に、同遺伝子のプロモーター領域の多型と本邦における双極性障害の発症との関連を検討したが、日本人双極性障害患者群(96名)と健常対照群(210名)において有意な差は認められなかった。双極性障害では細胞内カルシウム動員の機能異常が病態整理として想定されており、大脳に発現するTRPM2については有力な候補遺伝子として、今後も検討を続けていきたい。双極性障害の疾患感受性遺伝子の解明を目的として、21q22および22ql2にマッピングされている候補遺伝子について多型解析を引き続き行った。脳に多く発現する新しいタイプのカルシウムチャネルTRPM2(transient receptor potential melastatin2)は機能的、位置的に最も有力な候補遺伝子であると考えている。最近、双極性障害患者由来のBリンパ芽球細胞株の一群でそのmRNA量の有意な低下が報告されたことから、まず、この遺伝子の転写調節領域の解析を精密かつ徹底的に進めた。5'RACE法により新たに発見したTRPM2の第1エキソン周辺から欠失と挿入を伴う多型を同定した。次に、TRPM2はゲノム上約90kbにわたる32個のエキソンからなる遺伝子で1503アミノ酸残基よりなるが、このエキソンを中心にエキソン・イントロン境界領域を含んだ部位について、SSCP(single strand conformation polymorphism)法とdirect sequencing法により変異スクリーニングを行った。その結果、アミノ酸の変化をともなうミスセンス多型を含んだ一塩基多型を20以上同定した。同遺伝子のプロモーター領域およびエキソン・イントロン領域の多型について、日本人双極性障害患者群(96名)と健常対照群(210名)において関連解析を行ったが、有意な結果は認められなかった。双極性障害では細胞内カルシウム動員の機能異常が病態整理として想定されており、大脳に発現するTRPM2については有力な候補遺伝子として、今後も検討を継続する予定である。
細胞のエネルギーフリー長期常温乾燥保存（細胞の乾物屋）を目指した基盤技術の開発

1)LEAタンパク質の非繰返しアミノ酸配列部位の機能を調べるため、ネムリユスリカのPvLEA4タンパク質のN末端側およびC末端側22-merのモデル化合物を設計・合成しin vitroの実験により機能を調べた。その結果、酵素(LDHや)やリポソームに対し乾燥保護活性を示すことが明らかとなった。2)PvLEA-22ペプチドの熱ストレス保護剤としてのメカニズムを解明するため、変性温度以上および室温におけるリゾチームとの相互作用をSIRAH力場を用いた粗視化分子動力学シミュレーションにより調べた。その結果、このペプチドはタンパク質表面に結合しシールディングすることにより変性に伴う凝集を抑制することが判明した。3)トレハロース脂質/DMPC混合二重膜の性質をAFM測定やall-atomおよびMARTINI力場による粗視化分子動力学シミュレーションにより調べた。その結果、この両脂質はゲルー液晶転移点以上では均一に混合し、トレハロース脂質の割合が増加するにつれて、親水性が増大し、弾性率も増大するが、脂質鎖の秩序性は減少することが明らかとなった。また、トレハロース脂質を70 %含む膜では、がん細胞モデル膜や正常細胞モデル膜と強く相互作用し融合の前兆現象と見られる挙動が観察された。4)CRISPR-PITCh法により、Pv11細胞においても、任意の配列をゲノム上に挿入することができるようになった。そこで、乾燥耐性能を保持したまま外来遺伝子を安定的に発現できる実験系の構築を行った。Pv11細胞において、恒常的に高発現している遺伝子の3'領域にAcGFP1およびzeocin耐性遺伝子をノックインすることで、上記の目的を達成できた。また、蛍光センサータンパク質の安定発現株の樹立にも成功し、Pv11細胞の乾燥耐性メカニズムの解明に有用な実験系であることが示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。Group3に属するLEAタンパク質(G3LEA)は、生物が乾燥耐性を獲得する際、必須のタンパク質であり、11個のアミノ酸(AKDGTKEKAGE)からなる繰返し配列を複数持つ。従来研究により、ネムリユスリカ由来のG3LEAの繰返し配列を2つ含む22残基ペプチド(PvLEA22)が、天然のG3LEAと同程度の機能をもつことが示されている。本研究では、このペプチドの乾燥保護機能のメカニズムを解明するため、以下の研究を行った。1)ターゲットとしてリゾチームとHybDを選択し、PvLEA22とこれらターゲットとの間の相互作用を、コンピュータシミュレーションを用いて調べた。その結果、PvLEA22は、静電的に相補的な残基の側鎖をターゲットの方向に配向させることによって静電的引力を得て接近・結合するということが示された。また、エネルギー的には長距離では内部エネルギー駆動、近距離ではエントロピー駆動であった。比較のため、PvLEA22とアミノ酸組成が同一で配列を乱したScrambledペプチドについても同様のシミュレーションを行った。このペプチドについてもほぼ同様の結果が得られ、11-merの配列よりもむしろ組成が重要であることが示唆された。2)in vitro実験により、PvLEA22は乾燥状態の酵素(LDHやBDG)の触媒活性を保持する機能があることが判明した。この機能は、乾燥保護剤としてよく知られているトレハロースより優れていた。3) PvLEA22がin vivoでもin vitro系と同様に、タンパク質凝集抑制活性をもつかどうかを調べるため、このペプチドを恒常的に発現する細胞株を作成し、さらにその細胞の中にGFP-polyQを一過的に発現させた。蛍光顕微鏡観察により、PvLEA22発現細胞内では、有意にpolyQの凝集が抑制されることが判明した。本年度当初計画に記した計画をほぼ100%近く達成できた。具体的には、以下の通り。1)哺乳類細胞内でLEAペプチドを発現し、アミロイド凝集抑制を観察することに成功したこと。2)細胞内混みあい状態を状態を想定した複数のタンパク質及びLEAペプチド混合系のシミュレーションを実行した。ただし、解析については現在進行中である。3) LEAペプチドが乾燥状態において酵素の触媒活性機能を保護することを実証することに成功したこと。4) LEAペプチドと細胞膜相互作用のMDシミュレーションから結合自由エネルギーを評価することに成功したこと。1) G3LEAペプチドのタンパク質凝集抑制機能を明らかにするため、ターゲットタンパク質としてリゾチームを選択し、乾燥過程の粗視化MDシミュレーションを行った。脱水するにつれ、2つのリゾチーム分子は互いにコンタクトできる程度まで重心間距離が近づいたが、これら2分子間にはG3LEAペプチド分子の集団が挟まり、リゾチーム同士の直接の接触が防がれ、乾燥誘導凝集が抑制される様子を観察することに成功した。2) G3LEAタンパク質の非繰返し部分の構造と機能を調べるため、ネムリユスリカのG3LEAタンパク質の非繰返し部分から、PvLEA4-nrN (LDQTRDQIKSATDRGADKLKEG)、PvLEA4-nrC (KEQMRDTKDETLESMKSDKNKN)をデザインし合成した。CD測定の結果から、いずれも水中ではランダムコイル構造をとることがわかった。しかし乾燥するといずれのペプチドもβシートリッチな構造をとることが、FT-IRスペクトルの解析結果からわかった。動的光散乱測定とカルセイン封入リポソームの実験から、これらペプチドにはリポソームの融合防止の機能がないことが判明した。

3)乾燥ストレスにより破壊された細胞膜に対して対してトレハロースが修復機能をもつかどうかを調べるため、高速原子間力顕微鏡による直接観察を行った。その結果、マイカ基板上の部分破壊された固定化二分子膜にトレハロースを添加すると、膜が修復される様子をリアルタイムで観察することに成功した。類似の二糖であるマルトースやスクロースにはそのような機能はなかった。4)当初予定していたin vivoでのG3LEAペプチドのpoly-Q凝集抑制効果の実験は再現性に問題があることが判明し断念した。5) CRISPR/CAS9システムを用いる遺伝子編集により、ネムリユスリカの乾燥耐性に関わる遺伝子の同定に向けて一歩を踏み出した。本年度当初計画に記した計画は80%程度達成した。20%程度達成できなかった部分があるが、その代わり、新規雇用した博士研究員の努力により、想定してなかったCRISPR/CAS9によるゲノム編集を用いた実験や、学内の共同研究者の協力を得て高速AFMによる細胞膜モデルのリアルタイム観察が可能になり、ネガティブな部分を十分にカバーした。計画通り進行したテーマは、1)粗視化シミュレーションによるG3LEAペプチドのタンパク質保護メカニズムの解明、2)G3LEAタンパク質の非繰返しアミノ酸配列部分の構造と機能の解明である。一方、達成できなかった部分は、哺乳類細胞内に一過性発現させたpoly-Q分子の凝集を同一細胞内に存在するG3LEAペプチドが抑制するかどうかという試験である。これについては、繰り返しの実験にもかかわらず、再現性のあるデータが得られず断念した。1)LEAタンパク質の非繰返しアミノ酸配列部位の機能を調べるため、ネムリユスリカのPvLEA4タンパク質のN末端側およびC末端側22-merのモデル化合物を設計・合成しin vitroの実験により機能を調べた。その結果、酵素(LDHや)やリポソームに対し乾燥保護活性を示すことが明らかとなった。2)PvLEA-22ペプチドの熱ストレス保護剤としてのメカニズムを解明するため、変性温度以上および室温におけるリゾチームとの相互作用をSIRAH力場を用いた粗視化分子動力学シミュレーションにより調べた。その結果、このペプチドはタンパク質表面に結合しシールディングすることにより変性に伴う凝集を抑制することが判明した。3)トレハロース脂質/DMPC混合二重膜の性質をAFM測定やall-atomおよびMARTINI力場による粗視化分子動力学シミュレーションにより調べた。その結果、この両脂質はゲルー液晶転移点以上では均一に混合し、トレハロース脂質の割合が増加するにつれて、親水性が増大し、弾性率も増大するが、脂質鎖の秩序性は減少することが明らかとなった。また、トレハロース脂質を70 %含む膜では、がん細胞モデル膜や正常細胞モデル膜と強く相互作用し融合の前兆現象と見られる挙動が観察された。4)CRISPR-PITCh法により、Pv11細胞においても、任意の配列をゲノム上に挿入することができるようになった。
ガス絶縁電力機器における絶縁破壊予知の技術開発

近年エレクトロニクスの発展と相まって,ワードプロセッサーやコンピュータなどのエレクトロニクス応用機器の普及が急速に進み,電力の安定供給の重要性が増している.本研究は,ガス絶縁電力用開閉装置の絶縁破壊の予知を破壊前に現れる微小放電のパターン認識から行おうとするもので,破壊前に現れる微小放電の検出とコンピュータによるデータ処理技術を開発した.更に実用のSF_6ガス絶縁開閉装置を模擬したモデル実験装置を用いて,開閉装置における絶縁破壊予知の研究を進め,次のような結果を得た.(1)開閉装置の電極接触部に微小放電が発生すると,この微小放電によって接触部と器壁間の破壊電圧が低下し,微小放電が破壊電圧の低下に重要な役割を演じている.(2)破壊電圧の低下の割合は,微小放電電流,接触部と器壁間の間隔などによって変化するが,一般的傾向としては間隔が減少する程,また微小放電電流が増す程,増加した.(3)接触部と器壁間の破壊の電気的位相は,微小放電が先行した破壊では,接触部が陰極,器壁部が陽極となる位相で起こる,などの重要な結果を得た.以上の結果を総合して, SF_6ガス絶縁電力用開閉装置における破壊の予知は,電極接触部における微小放電のパターン認識から行うことが可能であることが明らかになった.なお,この研究課題は,電力会社においても電力供給の立場からその重要性が認められ,昭和62年64年にわたって電力会社との共同研究が進められており,その研究成果が期待される.近年エレクトロニクスの発展と相まって,ワードプロセッサーやコンピュータなどのエレクトロニクス応用機器の普及が急速に進み,電力の安定供給の重要性が増している.本研究は,ガス絶縁電力用開閉装置の絶縁破壊の予知を破壊前に現れる微小放電のパターン認識から行おうとするもので,破壊前に現れる微小放電の検出とコンピュータによるデータ処理技術を開発した.更に実用のSF_6ガス絶縁開閉装置を模擬したモデル実験装置を用いて,開閉装置における絶縁破壊予知の研究を進め,次のような結果を得た.(1)開閉装置の電極接触部に微小放電が発生すると,この微小放電によって接触部と器壁間の破壊電圧が低下し,微小放電が破壊電圧の低下に重要な役割を演じている.(2)破壊電圧の低下の割合は,微小放電電流,接触部と器壁間の間隔などによって変化するが,一般的傾向としては間隔が減少する程,また微小放電電流が増す程,増加した.(3)接触部と器壁間の破壊の電気的位相は,微小放電が先行した破壊では,接触部が陰極,器壁部が陽極となる位相で起こる,などの重要な結果を得た.以上の結果を総合して, SF_6ガス絶縁電力用開閉装置における破壊の予知は,電極接触部における微小放電のパターン認識から行うことが可能であることが明らかになった.なお,この研究課題は,電力会社においても電力供給の立場からその重要性が認められ,昭和62年64年にわたって電力会社との共同研究が進められており,その研究成果が期待される.本研究は、ガス絶縁電力機器の絶縁破壊の予知を破壊前に現れるコロナのパターン認識から行おうとするもので、破壊前に現れるコロナの検出とその波形分析に重点がおかれ、高感度光センサによるコロナの検出とコンピュータによるデータ処理技術を開発した。更にこれらの装置を用い、破壊予知のモデル実験として圧力15気圧の針対平板不平等電界ギャップにおける破壊予知の研究を進め、次のような結果を得た。(1)コロナ開始電圧は、同一条件において、供試範囲内では負針の方が低かった。(2)絶縁破壊電圧は、同一条件において正針の方が低かった。(3)コロナパルスの波高値は、同一条件において正針の方が負針より約2倍高かった。(4)コロナが定在したギャップで、火花電圧に近ずくと、正針,負針とも波高値の大きなパルスの出現が目出ち、また、その出現頻度も増した。そして、絶縁破壊は波高値の大きなパルスから進展した。(5)2気圧以下ではコロナが安定に定在したが、ガス圧力を上昇させて電力会社がガス絶縁電力機器に現在使用しているガス圧力35気圧では、コロロナが不安定となってコロナの定在電圧幅が狭まった。これは、絶縁破壊予知をコロナの発生特性から行おうとする本研究にとって、注目しなければならない重要な問題であることが明らかになった。以上の結果を総合して、絶縁破壊前にコロナが出現するギャップにおける破壊は、コロナのパターン認識から行なうことが可能であることが明らかになった。なお、この研究課題は、電力会社においても電力の安定供給の立場からその重要性が認められ、昭和62年度は電力会社との共同研究を予定しておりその研究成果が期待される。
弓部大動脈血行遮断時経上大静脈逆行性脳灌流法による脳保護効果の検討

逆行性脳潅流法の実験的検討のため、犬を用い体外循環下上行大動脈遮断にて心停止を得た後、1)静脈弁や還流圧などの個体差からくる還流条件の定性的評価のため近赤外レーザー分光計を使用し脳組織酸素飽和度のモニタリングを確立した。2)電気的雑音環境下でも安定した大脳機能評価の可能な硬膜外脊髄刺激大脳誘発電位の測定法を確立した。3)上記の2項目および病理組織所見の面から常温循環停止群と常温逆行還流群を比較検討した。4)低体温逆行還流群につき同様の検討をした。1)犬では両側上頚静脈よりrolroartlculat veinに直接力ニュレーションするが還流圧と流量に個体差が大きく逆行性脳潅流が必ずしも行えるとは限らず、ヒトにも内頚静脈のcompitcutvalveが12割あることより近赤外レザー分光計による脳潅流状態のモニタリングは大変有効であるとともに臨床に応用されるべきである。2)全身麻酔下の大脳機能評価には誘発電位が有効であるが人工心肺響の電気的雑音環境下では休性感覚誘発電位は再現性が低く硬質外脊髄刺激大脳誘発電位の測定が有効であった。3)常温循環停止群(循環停止16分、再還流3060分、h=5)と常温逆行還流群(逆行還流15分、再還流3060分、h=5)の比較では、大脳誘発電位において電位、潜時、それらの消失時間、回復時間に2群間で有意義はなかった。組織学的には急性期虚血性変化を両群すべての調体に認めた。ただし循環停止群では全個体とも中等度の変化を均一に認めたのに対し逆行還流群では個体差および同一個体内の部位差を認めた。4)低体温逆行潅流群では虚血性変化は経路であった。以上より常温における逆行性脳潅流では大脳機能を維持するに足りるだけの酸素供給は行われず、また其の効果は個体差が大きくかつ部位による不均一性があると考えられた。近赤外線酸素モニタ-(特注)の完成が遅れ実験計画はやや遅れ気味である。本年度は、モニタ-としての1.近赤外線酸素モニタ-の安定した測定の確立、2.体性感覚誘発電位の(SEP)の確実な測定の確立と成犬を用いた脳虚血モデルの確立に対する基礎実験を行った。近赤外線モニタ-はプロ-ベの固定位置により測定値が変わるため、成犬の頭皮下筋膜上に固定する方法をとることとした。これにより比較的安定した脳内oxy Hb、deoxy Hb、total Hbの相対値の測定が可能となった。SEPは左腋窩神経刺激、頭皮測定により施行したが、実験室の雑音が多く必ずしも少ない平均加算では正確な波形分析は困難で安定性に乏しいため硬膜外刺激、頭部皮下筋膜測定により誘発電位を測定することとした。成犬は上大静脈に多数の静脈弁を有し単純に上大静脈に送血を行ってもヒトと異なり脳へは殆ど潅流されないため、静脈弁カッタ-を用いたが必ずしも安定した手技となり得ず、解剖を詳細に検討し内頸静脈まで露出し選択的カニュレ-ションを行うこととした。色素注入によりこの方法では脳内潅流が安定して可能であることが確認され、分布についても検討中である。

体外循環の施行法についても単純な方法を行うこととし、循環停止時は上行大動脈遮断、内頸静脈送血を行っている。脳虚血時間を37°C虚血で一応10分30分で検討したがモデルとしては常温では10分程度が望ましいことが判明した。現在までのところ逆行性脳潅流法を用いないモデルでSEP再潅流後30分程度で回復してくること、脳潅流の状態は、色素注入による確認によると近赤外線酸素モニタ-により非侵襲的に測定可能であることが判明している。弓部大動脈瘤などの循環停止を必要とする際の脳保護において上大静脈よりの送血を行う逆行性脳潅流法が考案されたがその有効性は不明である為その脳保護作用について基礎的・臨床的検討を加えた。予備実験として北大応用電気研究所で開発した近赤外線分光光度計の組織酸素モニタ-としての感受性について、成人延べ5人にLipo PGE1投与時の四肢組織へモグロビンの酸化・還元状態の変化を測定した。Lipo PGE1 10μg Divにて投与時の総ヘモグロビン前値および投与後20分値の平均は1.4x10-20d,6.8x10ー20D、酸化ヘモグロビンは同1.9x10-20D,7.3x10-20D、還元ヘモグロビンは同-4x10-20D,-7x10ー20Dであった。光路長を直線距離の4倍、ヒト筋肉の吸光度を0.10D/cmと仮定すると四肢組織における酸化ヘモグロビンおよび総ヘモグロビンは各々4.5%ずつ上昇し還元ヘモグロビンに有意な変化はなかった。この実験にて十分な感受性を有していると考えられた。成犬を用い大動脈送血、右房脱血による体外循環を行い、逆行性臓器保護法の一つとして循環停止時の上大静脈より送血する逆行性脳潅流法について近赤外線分光光度計および硬膜外刺激大脳誘発電位を用い有効性を検討した。犬の内頚静脈には静脈弁が存在し人と異なり上大静脈からの送血が不可能で両側内頚静脈直接潅流法を考案し施行した。潅流状態の経時的監視には開頭する事なく無侵襲に行える近赤外線分光酸素モニタ-を使用した。神経電気生理学的検討において当初の体性感覚刺激大脳誘発電位は不安定で雑音の多いところまでは導出できず、胸部硬膜外脊髄刺激大脳誘発電位(ECP)を脳機能の指標として用いた。体外循環は潅流量80ml/kg、体血圧50mmHg以上、逆行性脳潅流は潅流量120ー400ml,CVP30mmHg以下、体温は食道温および眼窩温をモニタ-した。食道温36°Cにおいて単純遮断時および逆行性脳潅流時の間にはECP消失時間、同回復時間、回復後amplitudeに有意差を認めなかった。現在は低体温時(眼窩温22°C)において検討中である。逆行性脳潅流法の脳保護効果を、電気的雑音環境下でも安定した大脳機能評価の可能な硬膜外脊髄刺激大脳誘発電位と、病理組織所見の2面から、単純循環停止と比較検討した。イヌを用い、体外循環下上行大動脈遮断にて心停止を得た後、常温循環停止群(常温循環停止15分、再潅流30-60分、n=5)と常温逆行潅流群(両側上顎静脈よりretroarticular veinに直接挿入したカニューレから常温逆行潅流15分、再潅流30-60分、n=5)を比較検討した。これとは別に低体温(22°C)逆行潅流90分、再潅流60分の群を設け同様に検討した。大脳誘発電位では、電位、潜時、それらの消失時間、回復時間に2群間で有意差はなかった。組織学的には急性期虚血性変化を両群すべての個体に認めた。ただし常温循環停止群では全個体とも中等度の変化を均一に認めたのに対し、常温逆行潅流群では個体差、及び同一個体内でも部位差が認められた。一方低体温逆行潅流群では虚血性変化は軽微であった。以上より常温における逆行性脳潅流では大脳機能を維持するに足るだけの酸素供給は行われず、またその効果も個体差が大きくかつ、部位による不均一性があると考えられた。