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就業形態の多様化と労災補償制度についての日欧比較法研究

日本の労災保険制度は、労働基準法が定める使用者の災害補償義務を確実に実施させるための制度として発足したものであるが、その後、被災労働者・遺族の生活保障を図るために、保険事故と給付内容の両面にわたり拡充されてきた。その結果、労災保険の適用対象者に含まれるか否か、という違いが、実務上大きな意味をもつことになったが、他面、就業形態の多様化に伴い、従来労災保険の適用対象者とされてきた「労働者」の判断が次第に困難なものとなり、数多くの紛争を招来することになった。かかる事態は、ヨーロッパ各国においても見られるところであったが、その対応方法は給付のあり方とも関連して様々であり、又、この問題は、労働法のその他の規制の適用対象範囲をめぐる議論とも関連させて議論されてきた。したがって、我が国と安易に比較することは許されず、我が国の特色に対して配慮する必要がある。我が国の場合には、労災保険の給付が他の社会保険に比較してかなり有利であるとともに、労災保険給付がなされる場合に民事賠償が排除されない、という特徴があり、この点をも考慮して、適用対象範囲に関しても議論を行う必要がある。すなわち、労働関係とは認めにくい就業形態にまで労災保険の適用を拡大するためには、給付内容をそれに見合ったものに調整し、他の社会保険とのバランスを保つようにすることが必要である。今年度は比較法研究のための基礎調査ということで、外国訪問調査、関連文献の収集等により、ヨーロッパ諸国の労災補償法制の現況ならびに動向の把握に努めた。まず、外国訪問調査では、稲森が11月13日から21日まで、フランスの労災補償制度の調査にフランス共和国へ赴き、パリの社会連帯省で開催された社会保障制度60周年記念シンポジウムに参加してパリ第2大学のプレト教授による労災補償法制に関する報告や同じくパリ第2大学のボルゲット教授らによる戦後のフランス社会保障制度史に関する諸報告を聞き、また資料収集を行った。次いで西村が12月15日から20日まで、ドイツの労災補償制度の調査にドイツ連邦共和国へ赴き、マックス・プランク国際社会保障法研究所前所長のマイデル教授からドイツ労災保険の現況、ドイツ労災保険の自治、財政調整について、労災保険中央会のヤコブ研究員から事業主の労災認定、事業主が労災保険料を滞納した場合の取扱い、アスベスト被害の補償等について、ミュンスター大学のシュタインマイヤー教授からドイツの労災保険改革について、それぞれヒアリングを行い、また資料収集を行った。また、ドイツの労災保険法コンメンタールをはじめとして、フランス、ドイツ、オーストリアを中心に、ヨーロッパの労働法及び社会保障法関係の文献等の収集を進めた。研究会は3回開催した。まず11月23日に同志社大学寒梅館6階会議室にて開催し、西村が「ドイツの労災補償制度」について報告した。次いで12月17日には京都大学旧工学部4号館3階法科第7演習室にて開催し、皆川が「ドイツの労働者概念」について報告した。最後に2月5日に同志社大学博遠館1階会議室にて開催し、日本の労災補償制度の諸課題について討論した。わが国の労災補償法の重要課題の検討に関しては、以上の研究会等の場で議論したほか、稲森が九州や東京での社会保障法関係の研究会に参加してリハビリテーションに関する報告をした。わが国の労災保険制度に、比較法的な観点で従来、重要な役割を果たしてきたドイツ法を深く研究・検討するという観点から、日独シンポジウムを企画した。ドイツの労災保険は、労災補償という点で、わが国と共通する側面が多いが、事業主の業種別の団体である労災保険組合によって自治的に運営されているという点、また、労災保険の公的給付によって、使用者の私法上の損害賠償責任が大幅に排除・免責されているという点で、わが国と異なっている。今回のシンポジウムでは、ドイツの社会保障法・労災補償法の研究者3人(前マックスプランク国際社会法研究所所長・マイデル教授、マックスプランク研究所国際社会法研究所所長・ベッカー教授、ドイツ労災保険団体連合会研究員・クラーニッヒ博士)を京都に招いて、村中教授の司会で行われた。

日本側から、西村(「わが国の労災保険の状況と課題」)、稲森(「日本の労災保険給付-特に医学的リハビリテーションの課題」)、皆川(「わが国の労災保険の適用一労働者概念」)が、それぞれ上記の報告を行うとともに、ドイツ側からは、クラーニッヒ博士が「ドイツの法状況」を、ベッカー教授が「労災保険者の組織変動」を、マイデル教授が「ドイツ労災保険における給付-特に予防の課題」をそれぞれ報告した。その後、質疑・意見交換を行うとともに、わが国の実際の状況を知るために、岡山労災病院を見学し、労災患者のリハビリテーションがどのように行われているかについて、ヒアリングと意見交換を行った。2007年度には、ドイツで、残された労災補償の諸課題(通勤災害の補償、業務関連疾患の労災認定、労災保険の財政-特に年金の積み立て等)について、さらにシンポジウムを行い2006年度の成果とあわせて、他の国の研究をも含めて研究を総括する予定である。本年度は研究の最終年度にあたるため、補充的な調査や検討を行うとともに、総括の作業を行った。具体的には、ウィーン大学のマーツァール教授が9月に来日した際に、ヨーロッパにおける労災補償に関する議論について補充的な議論を行うとともに、西村と村中がミュンヘンのマックスプランク社会法研究所において開催された日独労災補償比較法シンポで報告を行うとともに、討論を行った。これらの成果を基礎に、研究成果報告書をまとめた。内容面に言及するならば、日本とヨーロッパの比較において、日本の労災補償がその補償範囲において高水準にあること、それだけに日本法においては、補償範囲の画定作業をより明確にする必要があること、保険料負担の正当性に関する議論を今後深める必要が大きいこと、他の社会保障制度とのリンクを図る必要性が大きいことなどが解明された。これらの課題は引き続き検討すべき問題であり、とりわけ社会保障法や労働法の分野において生活保障という観点から、あらためて問題をとらえ直す必要がある。その際、現代社会において労働者、あるいは国民がおかれた具体的状況に目を向けるとするならば、個人ではなく、家族や生活単位の中で生活する労働者というとらえ方をした上で議論を行う必要があり、今後はこのような視点に立って研究を継続する予定である。
βアミノ酸導入によるエラスチンフラグメントの医療基剤への応用

エラスチンフラグメント(EF) VAPGVGはヘキサペプチドでありながら,エラスチンにみられる性質をいくつか継投している.EFにβアミノ酸を導入することで,構造や特有の性質がどのように変化するか検討した.その結果,CDスペクトルで220 nm付近に観測された負のコットンは,βアミノ酸導入によって反転したスペクトルをえた.このことは,βアミノ酸の導入は,EFに大きな構造変化をもたらすことを示した.さらに,もう一つのEFである(PVGVG)_4はペンタペプチドがくり返す配列であり,CDスペクトルでは顕著な構造の存在は示唆されなかった.しかし,3位のGlyをβすることで,大きな構造変化を誘導することを明らかにした.また,関連ペプチドであるBoc-Pro-Hyp-OMeの結晶構造を明らかにし,主鎖コンホメーション(ψ,φ)の値が,コラーゲン3重鎖の値と類似していることを明らかにした.エラスチンフラグメント(EF) VAPGVGはヘキサペプチドでありながら,エラスチンにみられる性質をいくつか継投している.EFにβアミノ酸を導入することで,構造や特有の性質がどのように変化するか検討した.その結果,CDスペクトルで220 nm付近に観測された負のコットンは,βアミノ酸導入によって反転したスペクトルをえた.このことは,βアミノ酸の導入は,EFに大きな構造変化をもたらすことを示した.さらに,もう一つのEFである(PVGVG)_4はペンタペプチドがくり返す配列であり,CDスペクトルでは顕著な構造の存在は示唆されなかった.しかし,3位のGlyをβすることで,大きな構造変化を誘導することを明らかにした.また,関連ペプチドであるBoc-Pro-Hyp-OMeの結晶構造を明らかにし,主鎖コンホメーション(ψ,φ)の値が,コラーゲン3重鎖の値と類似していることを明らかにした.エラスチンフラグメント(EF)誘導体は,Glyひとつの欠損に対して4種類のβ化誘導体が考えられ,もとのGly部位付近の側鎖位置に大きな違いが生ずるが,その部分から離れるに従って他のアミノ酸側鎖の位置の差が縮まる.申請者らはもともとコアセルベート能よりも細胞遊走性が大きなヘキサペプチドVAPGVGに注目し,誘導体を合成した.親ペプチドとして,t-butyloxycarbonyl基(Boc基)とmethyl ester基(OMe基)を有するBoc-VAPGVG-OMeと,これらを除去したH-VAPGVG-OHを合成した.合成は通常の液相法を用い,シリカゲルカラムクロマトで精製した.後者ペプチドは取扱いが容易であることから塩酸塩として得た.6残基目のGlyを除去した誘導体4残基目のGlyを除去した誘導体一部の誘導体については収率が低くかった.これらのペプチドの確認はTOF-MSで行った.また,CDスペクトルの測定を数種のペプチドに行い,予備的な構造変化に関する情報を得ることができた.昨年までに合成したエラスチンフラグメント(EF)誘導体について結晶化を試みている.現在のところ,針状の微結晶が得られたサンプルもあるが,X線回折に適した結晶は得られていない.そのため,結晶化を実現する方法の一つとして両末端保護基を除去した塩酸塩タイプも作成した.例えば,Boc-VA-βP-βG-βV-OMeはHC1・NH2-VA-βP-βG-βV-OHと誘導することで,比較的析出しやすい塩としての性質が結晶成長を促進することを期待している.EF誘導体は引き続き結晶化を試みるとともに,これら塩酸塩も新たに結晶化しているところである.EF配列が45回繰り返した20残基程度のペプチドについては,固相法を用いることで(PVGVG)4を合成した.また,βアミノ酸誘導を含む誘導体も2種類合成できた.いづれも,液相法の合成と比較し,微量であるので結晶化には用いることができなかった.エラスチンはカルシウムイオンとの親和性が報告されている.このため,カルシウムイオン存在下におけるEF誘導体のCDスペクトルを測定した.カルシウムイオン濃度の上昇にともない,CDスペクトル変化が誘導されるケースが存在することが判明した.このような測定は,一部のEF誘導体でしか行っていないが,αヘリックスなどの高次構造の含有量が増加するような変化ではないと推測される.構造変化の詳細については検討中である.CDスペクトル測定も引き続き測定を行っている.合成したエラスチンフラグメント(EF)誘導体について結晶化を試みた.昨年試みたBoc-VA-βP-βG-βV-OMeに加え,Boc-V-βA-βP-βG-V-OMe, Boc-βV-βA-βP-G-V-OMe,及び,全アミノ酸をβアミノ酸に置換したBoc-βV-βA-βP-βG-βV-OMeも対象として結晶化を試みた.また,それらのBoc基とメチル基を脱保護した両イオン形のフラグメントも作成し,分子内または分子内間で塩を形成させることによる結晶化の促進を試みた.これらの結晶はまだ得られていないが,関連するコラーゲン様の配列をもつBoc-Pro-Hyp-Gly-OMeについては構造解析まで行い,結果を公表した(Anal. Sci., X-Ray Structure Analysis Online 26, 53-54).このペプチドは結晶中に2分子存在し,互いによく似た構造であるが,両者はHyp残基の5員環のパッカリングの差(up-packerとdown-packer)によって区別された。Pro残基はともにdown-packerであった.これらの分子は3重鎖は形成していないが,

(φ,ψ)はポリプロリンの(-51,153)よりも,(Pro-Pro-Gly)9などのコラーゲンモデル構造に近い値をとっていた.このことは,コラーゲンの主鎖構造は3重鎖をとって初めて形成されるのではなく,イミノ基をもつ5員環が連続した配列は,たった3残基であっても自発的にそのような構造にフォールディングする傾向もつことを明らかにした.
5d遷移金属酸化物におけるスピン軌道相互作用と電子相関の協奏物性の開拓

本研究では、4d,5d遷移金属を用いて物質を合成することにより、4d,5d電子系の物性を開拓することを目的としている。4d,5d電子系はスピン軌道相互作用・電子相関・結晶場の複合物性が期待できる有望な舞台である。1.4d遷移金属ニクタイドRuPとRuAsにおける金属絶縁体転移の発見4d遷移金属ニクタイドにおいて、構造相転移を伴う新規金属絶縁体転移を発見した。これまで4d遷移金属ニクタイドは物性研究の対象として注目されてこなかったが、本研究での金属絶縁体転移の発見により、4d遷移金属ニクタイドが多様な物性を示し、物性研究の舞台として有望であることが示された。この金属絶縁体転移は結晶の構造相転移を伴っており、スピン・軌道の自由度が4d,5d電子系においても重要な役割を果たしていることが明らかになった。上述の金属絶縁体転移を示す4d遷移金属ニクタイドにRhを置換することで、超伝導を発現させることに成功した。超伝導転移温度はそれぞれ、(Ru,Rh)Pで3.7K(Ru,Rh)Asで1.8KさらにRuSbで1.16Kと低いが、相転移の臨界点における超伝導という観点から、非常に興味深い特徴を持つ発見といえる。臨界点における超伝導には、高温超伝導体などが含まれ、学術的にも、実用面からも重要な分野である。特に今回の超伝導は、非磁性絶縁体相の臨界点における超伝導という、これまでに報告のない新たな分野である可能性があり、重要な発見であると考えられる。本研究では、5d遷移金属を用いて新物質を合成することにより、5d電子系の物性を開拓することを目的としている。5d電子系はスピン軌道相互作用・電子相関・結晶場の複合物性が期待できる有望な舞台である。5d遷移金属リン化物に着目し物質合成を行った結果、2つの新超伝導体BaIr2P2、BaRh2P2を発見した。それぞれ超伝導転移温度(Tc)は2.1Kと1.0Kであり、BaIr2P2はThCr2Si2型構造を持つ5d遷移金属ニクタイドで初の超伝導質である。これまで反応性が低く物質のバリエーションが限られていたため、5d遷移金属は物性研究の対象として注目されてこなかった。しかし、これらの超伝導体の発見により、5d遷移金属が新規物性開拓の舞台として有望であることが示された。今後、5d遷移金属特有の強いスピン軌道相互作用が超伝導機構にどのようにかかわっているかなどに興味が持たれる。2.新超伝導体SrIr2As2の発見と新物質EuIr2As2の合成に成功リン化合物をもとにさらに物質合成を進めた結果、新超伝導体SrIr2As2と新物質EuIr2As2の合成に成功した。SrIr2As2はリン系の化合物に比べて高いTc=2.9Kを持つ超伝導体である。一方でEuIr2As2はユーロピウムが磁気モーメントをもち反強磁性体となる。SrIr2As2の発見は、5d遷移金属特有の強いスピン軌道相互作用を有する系での超伝導という観点からだけではなく、近年発見された鉄系超伝導体の関連物質としても重要である。今回発見した新超伝導体は、代表的な鉄系超伝導体であるBaFe2As2と同じThCr2Si2型の結晶構造を持つ。同じ結晶構造を持ちながら、大きく転移温度の異なる超伝導を発現するSrIr2As2は鉄系超伝導体の特異性を検証するうえで重要な比較対象であると考えられる。
光誘起プロトン・電子移動に基づく高度光応答性分子集合体の開発

本研究は光誘起電子移動、プロトン移動、構造異性化を組み合わせることによって、多段階連鎖光反応系の開発を目指した。新たに設計したアンスラノール骨格とアクリジン骨格を直接結合した分子を研究期間内に合成し、光誘起電子移動の発現を確認した。ただし電子移動後のアクリジン骨格が高すぎる還元力をもつこと、それによって溶媒分子との副反応が優先することが判明した。また、当初設定した多段階反応の一部である大きな構造変化を伴う異性化については単独で実現することができた。特に、一方の異性体のみがもつ双性イオン構造に由来した分極によって、溶媒極性に応答して分子構造が大きく変化する新たな機能を見出すことができた。従来研究されてきたフォトクロミック分子は、光励起による電子移動や構造変化といった単一の化学変化を利用したものであった。本研究は光誘起電子移動と分子間でのプロトン移動を複合的に組み合わせることによって、単一過程ではなし得なかった特異な化学変化の実現を目指している。そこで、電子・プロトンドナーとしてアンスラノールを、電子・プロトンアクセプターとしてアクリジンを直接結合したAcr-Ant-OHを設計した。この分子は、光励起状態からの電子移動と分子間プロトン移動を連鎖的に発現することで、高エネルギーの電荷分離状態を経て大きな活性化障壁をもつ分子の構造変化を高効率で達成することができると予想される。光反応過程で重要となるAcr-Ant-OHの電荷分離状態および分子間プロトン移動に関して知見を得ること、さらに目的に沿った最適な分子を見出すためにそれぞれのユニットに様々な置換基を導入した誘導体を数種類合成し、比較検討することとした。これまでにアンスラノールとアクリジンの無置換体同士をカップリングさせた基本骨格となる分子、およびアンスラノール側に電子供与性と溶解度の向上が見込めるtBu基を導入した誘導体の2分子について合成を完了した。それぞれ希薄溶液中での吸光スペクトルおよび蛍光スペクトルの測定を実施し、光誘起によるユニット間電子移動を確認している。ただし、光誘起電子移動後、つまり電荷分離状態におけるアクリジンユニットの還元力が非常に高く、溶媒などと副反応することが判明した。そこで現在、還元力を弱めるための置換基導入を実施している。本年度に計画していた対象分子の合成を完了することができた。また誘導体についても数種類合成することができ、分光学的測定と解析による比較検討から今後の分子設計に関しての知見を得ることができている。このように申請書に記載した計画の通り研究はおこなえており、研究目的に向けて着実に前進している。本研究は光誘起電子移動、プロトン移動、構造異性化を複合的に組み合わせることによって、単一過程ではなし得なかった特異な化学変化の実現を目指している。そこで、電子・プロトンドナーとしてアンスラノールを、電子・プロトンアクセプターとしてアクリジンを直接結合した直交交差型分子を設計した。光励起状態からの電子移動反応と分子間プロトン移動反応を連鎖的に発現させることで、直交構造からねじれ構造、さらには折り畳み構造へと大きな分子構造の変化を高効率で達成することを期待している。これまでに標的化合物の合成、および最初のステップにあたる光誘起電子移動反応を実現している。そこで本年度は目的の光反応系の後半部分にあたる、ねじれ構造から折り畳み構造への異性化反応を採り上げ、このステップを他から独立させることで詳細に調査することとした。そのため今回注目したこの構造異性化反応ステップには上に述べたプロトン移動は直接関与しない。したがって解離性プロトンをメチル基に置換した誘導体を新たに合成して検討を行った。合成したメチル基置換体はビアントロンの類縁体でもあり、ビアントロンの性質を反映した構造異性化反応を示すことを確認することができた。特にビアントロンでは準安定状態として過渡的な不安定化学種としてしか観測されていないねじれ構造が極性溶媒中で支配的かつ安定的に存在させることに成功した。最終年度はメチル基を本来の解離性プロトンに戻して、目的の連鎖反応系全体を達成する予定である。本年度に計画していた光反応系の最終ステップとなる構造異性化反応の調査に関して、解離性プロトンに換えてメチル基を置換した誘導体を用いることで反応が進行する可能性があることを実験的に確認することができた。ねじれ構造と折り畳み構造の存在比が温度に応じて変化することを吸光スペクトルの変化およびNMRスペクトルの変化から捉えることでき、構造異性化反応の熱力学的パラメーターを決定することができた。また本研究の副産物として、この誘導体自身が興味深いソルバトクロミズムを示すことも見出すことができた。非極性溶媒中では折り畳み構造、極性溶媒中ではねじれ構造が支配的となることを確認している。以上のように本来の研究目的は当然のことながら、そこから派生した成果についても産み出しつつ、最終年度に向けて着実に研究計画は前進している。従来のフォトクロミック分子は、光励起による単一の化学変化を利用したものであった。そこで、電子・プロトンドナーとしてアンスラノールを、電子・プロトンアクセプターとしてアクリジンを直接結合した分子を設計した。これまでに標的化合物の合成を行い、光誘起電子移動反応、さらに構造異性化反応をそれぞれ単独で達成している。本年度はプロトン移動を加えた連鎖的光反応の実現を目指して研究を実施した。

これまでの研究から、アンスラノール・アクリジン直結型分子は光誘起電子移動後にアクリジンユニットが高すぎる還元力をもつこと、それによって溶媒分子との副反応を引き起こすことがわかっている。また次ステップであるプロトン移動が律速段階になるために、この状態の長寿命化が必要であることもわかっている。そこで本年度はアクリジンの3,6位に電子吸引基であるトリフルオロメチル基を導入することで励起状態での還元力を弱めたユニットの合成を達成した。また、アンスラノールの2,7位または3,6位または全ての位置にメトキシ基を導入して電子供与性を向上させたユニットの合成も実施した。また合成した各ユニットの物性測定から狙いの電子状態変化を確認した。これらのユニットを直結した分子については現在合成中である。また、上記のメトキシ基を導入したアンスラノールユニット二つを10位同士で連結させたビアントロン誘導体も合成した。ビアントロンは二種の構造異性体が存在し、そのうちねじれ構造が相対的に不安定であるため単離不可能であることが以前から知られている。今回、メトキシ基を導入したことによって共役系の拡張および電荷分布の不均一化といった電子状態変化が起き、ねじれ構造を大幅に安定化することができた。本研究は光誘起電子移動、プロトン移動、構造異性化を組み合わせることによって、多段階連鎖光反応系の開発を目指した。新たに設計したアンスラノール骨格とアクリジン骨格を直接結合した分子を研究期間内に合成し、光誘起電子移動の発現を確認した。ただし電子移動後のアクリジン骨格が高すぎる還元力をもつこと、それによって溶媒分子との副反応が優先することが判明した。また、当初設定した多段階反応の一部である大きな構造変化を伴う異性化については単独で実現することができた。特に、一方の異性体のみがもつ双性イオン構造に由来した分極によって、溶媒極性に応答して分子構造が大きく変化する新たな機能を見出すことができた。次年度は現在得られている化合物での問題点の克服、特にアクリジンユニット側での高い還元力が原因で起こる副反応を抑えるために置換基の導入を行う。また昨年度から引き続き、合成が完了した分子については光照射による分子内電子移動と分子間プロトン移動の連鎖反応を実現させるべく検討を行う。光照射による構造変化した化合物の単離と同定を行うことで光反応の進行を確認することができると考えている。また過渡吸収測定を学内および学外の研究者と連携することで実施することを計画している。さらに希薄溶液以外の状態での光反応、具体的には固相である単結晶状態での光誘起プロトン電子移動の発現についても次年度から検討を開始する。最終年度はこれまでに構造異性化反応が達成できた化合物を基に発展させていく。はじめにメチル基の脱保護をおこない、解離性プロトンとする。この時、構造異性化とプロトン移動が連鎖的に発現可能なのかについて調べる。そして以上の反応を光照射下の元でおこない、反応系全体の進行を評価する。
インドネシア都市近郊の空間構造とその変容

本研究は,日本とインドネシアの共同研究であり,日本側からは延べ8名がインドネシアへ出かけるとともに,インドネシアからは6名の研究者を招聘して3年間の研究活動を行った。得られた成果の概要は以下のとおりである。1.空間計画法に基づくインドネシアの土地利用計画制度を通観し,各種計画制度の現状,地方分権との関係,ならびに拡大首都圏(JABODETABEK-PUNUR地域)における計画策定・実施の現状と問距点を考察した。2.インドネシア全土の県単位の社会・経済データベースを構築し,公開できる形式に作り上げた。また,全国町村センサスのディジタルデータを収集・整理しカタログ化を行った。3.LANDSAT衛星画像を利用し,画像処理と地理情報システムによる分析により,ジャカルタ市およびその近郊域(JABOTABEK地域)の土地利用変化の状況を定量的に明らかにした。4.JABOTABEK地域を対象にした農地転用モデルを開発し,「優良農地を保全する」等の様々な土地政策の下での土地利用変化をシミュレーションする手順を示した。5.衛星画像を用いてボゴール県山間地域の土地利用変化を分析するとともに,土地保全のための支払い意思額について住民アンケート調査を行った。その結果,住民の土地保全に関する意識は,先進諸国の事例に見られるものとは大きく異なり,教育水準,収入水準,土地価格とも支払意思額との相関はそれほど高くないことが判明した。6.首都圏近郊農村における農地転用の実態とそのメカニズムを把握するため,ボゴール市郊外の山間農村(チアンペア郡)において聞き取り調査を行った。所有者および購入者の行動(農地売却・購入・利用)の要因を多項ロジットモデルにより分析し,農地転用に関わる意思決定プロセスを明らかにした。7.最後に,JABOTABEK地域と日本の首都圏の土地利用変化について比較論的に考察を行った。本年度は,研究開始にあたって海外共同研究者・国内研究協力者らとの研究推進体制ならびに現地調査の支援体制を確立するとともに,分析に用いる空間情報データベースおよび統計データベースの整備をおこない,またジャカルタ首都圏を対象にした土地利用変化モデル構築のための現地調査を実施した。インドネシアからはボゴール農科大学(IPB)Ernan Rustiadi氏ならびに同国航空宇宙局(LAPAN) Ratih Dewanti氏の2名をそれぞれ約3週間京都大学に招聘し,研究のフレーム,事例地域の選定,モデリング手法等について討議するともに,衛星画像ならびに各種地図情報のGISデータベース化をおこなった。また,これまで研究代表者らが収集した統計書等を基に,インドネシア全土の県レベル統計データベースの構築を進めた。ジャカルタ首都圏における調査は,2001年10月12月にかけて小林,水野ならびに研究協力者の大学院生2名により,IPB, LAPANおよび住宅/地域整備省などの協力・支援を得て実施した。今回は1)衛星画像によるジャカルタ首都圏(Jabotabek)の広域的な土地利用・被覆変化の把握, 2)近郊農村における土地利用変化の実態把握と所有者アンケートによる農地転用ミクロモデルの開発,の二つを主な課題とした。1)についてはLAPAN所蔵の衛星画像データを処理するとともに,Bekasi県を中心に分類のためのグランドトゥルース情報の収集をおこなった。2)については,近年宅地開発が進んでいるボゴール近郊のCiampea郡を対象に,土地取引ならびに農地転用の過程を調査したうえで,住民および土地所有者を対象としたアンケート調査をインタビュー形式でおこない,土地の利用意向を土地ならびに個人の属性によって説明する非集計モデルの構築を試行的におこなった。本年度は,前年度に引き続きジャカルタ首都圏における土地利用変化の分析を進めるとともに,他の都市圏域における事例研究の検討,空間計画法を中心とした制度面からの考察,データベース構築などを行った。

ジャカルタ周辺地域(JABOTABEK)における土地利用変化分析は,前年度に実施した現地調査ならびに衛星画像解析に基づいて,ジャカルタ東部、ブカシ県における1988年2000年の土地利用・被覆分類を行い,都市的土地利用の拡大過程を明らかにするとともに,空間的重心および分散指数を用いて都市化進行の空間的傾向を定量評価した。また,同じく前年度に実施したボゴール近郊のチアンペア郡における農地転用実態についての聞き取り調査結果を分析し,農地所有者の土地取引や購入者の土地利用に関する意思決定構造を,多項ロジットを用いて明らかにする研究をとりまとめ,農村計画学会誌に投稿した。さらに,地方都市圏域における土地利用変化の実態分析を行うにあたり,03年1月2月に西ジャワ州チアンジュール県,中部ジャワ州ジョグジャカルタ市周辺,バンカブリトゥン州パンカルピナン市周辺などにおいて現地調査と基礎データ収集を実施した。また,居住・地域整備省国土計画局において,1992年制定の空間計画法に基づく、拡大ジャカルタ首都圏(JABODETABEK-PUNJUR)を対象とした特定地域空間計画策定の現状を聞き取り調査し,土地利用変化が地域環境にもたらす影響の評価と,それに対する法的制御のあり方を検討した。また,02年10月および03年2月に海外共同研究者のEko Cahyono氏(パンカルピナン市計画局長),Bambang Trisasongko氏(ボゴール農科大技官),Muhammad Dimayti氏(居住・地域整備省国土計画局)をそれぞれ2週間京都大学に招聘し,空間ならびに統計データベースの構築,斉地域における事例研究の報告などを行った。昨年度までに実施したジャカルタ首都圏(JABOTABEK地域)、ジョグジャカルタ特別市、西ジャワ地域等での現地調査ならびに画像解析、各種モデル分析の結果を総括し、インドネシアの大都市および地方都市周辺部における土地利用変化の実態とその要因を明らかにすると共に、海外共同研究者(ボゴール農科大学農学部Sunsun講師)を招へいし、同国における空間計画制度や地域開発施策についての現状と課題を整理した。具体的な研究実施内容は以下の通りである。(1)空間・統計データベースの整備(小林、西前、Dimyati、Ratih):前年度に引き続き、衛星画像、航空写真、ディジタル地図、統計資料などのGISデータベース化と、その汎用的利用に向けたインターフェイス開発を進めた。(2)西ジャワにおける生産配置モデルの開発(水野、Sunsun、Rustiadi):昨年度実施した西ジャワ地域における農地利用の実態調査ならびに各種統計資料、GISデータにより、高原野菜を中心とした付加価値の高い作物生産が盛んな同地域において、もっとも効率よく地域の農業収益を向上させるための産地形成のあり方を示すモデルを構築し、それを核とした農村土地利用秩序の確立について検討した。
T細胞系腫瘍とNK(ナチュラル・キラー)系腫瘍の未分化段階における鑑別の研究

未分化段階由来のT細胞腫瘍について詳細な研究を行って来た(Blood 82:207,1993;Am J Hematol 45:150,1994;ibid45:310,1994;ibid49:6,1995)結果、CD7+CD2+の群、即ち、旧来は、前胸腺段階由来のT細胞腫瘍の1病型とされて来たものの中にNK文科経路の未分化段階由来の腫瘍が含まれていることを推測して来た(Blood 89:4665,1997)。この事を本格的に証明するのが本研究の目標であった。T分化経路に検出されNK分化経路には検出されないという意味でpreTα(pre T-cell receptor)分子のRT-PCRによる検出を作業に含めた。CD7+CD2+群は、CD7+CD5+群に比較して頻度が低く、従って、T-ALL/LBL全体の中での頻度も極めて低い。本研究の実施期間中に該当の症例に遭遇できなかった。(本報告書の執筆中に漸く、1例から材料を得て、検索中である。)ただ、10年度報告書に記載したように、(1)α・β鎖の発現される段階でもpreTα発現が十分に残存している、(2)(β鎖遺伝子再構成のある)γ・δ鎖発現のT-ALL株細胞3種についてもpreTα発現が認められ、これに該当する正常細胞もある可能性がある、の2つの新知見を得た。見かけ上、T-ALL/LBLに分類されている未分化段階由来のNK腫瘍をいかに分離するか、というのが今回の研究である。CD7+CD2+の発現があり、しかも受容体(T細胞受容体及び免疫グロブリン)遺伝子が胚細胞型であった症例を、NKの未分子化段階由来腫瘍として報告した(Hematol Oncol 13:1-11,1995)。以後の症例の集積があったので、集計し、前胸腺段階では、CD7+CD5+が一般的な形質であり、CD7+CD2+例は少数であり、しかも、CD45RA/ROの発現のパターンが、RO型であり、一般の前胸腺段階のCD45RA型とは違っていたので、このCD7+CD2+の前胸腺段階とされる症例群の中に、NK由来のALL/LBLがある推察し発表した(発表1及び2)。T細胞の分化成熟に際し、T細胞受容体(TCR)のβ鎖遺伝子が発現されていて、TCRα鎖が発現されない段階でpreTαが発現され、β鎖とヘテロ2量体を形成するとされている。これは、NK分化経路やγ・δTCR発現のT細胞には決して発現されることはない。従って、未分化段階由来のNK腫瘍の信頼できる陰性マーカーである。実際に、ALL/LBL材料に適用できるかどうかの検討を、株細胞にRT-PCR法により行った。未分化急性白血病由来株(1株)では陰性、CD3+4+8+5株に内1株を除いて陽性、成熟段階T細胞腫瘍2株では陰性、NK細胞1株で陰性、濾胞性リンパ腫3株の内1例で陽性2例で陰性、AML株1例で陰性、前B細胞ALL株6例の内1例陽性5例陰性であった。結論は、これらのpreTα遺伝子発現は現在のpreTα発現の分布の通説に概ね一致し、NK由来ALL/LBLの探索に有用と思われた。しかし、濾胞性リンパ腫株1例や前B細胞ALL株1例での発現や、TCRα鎖の分子レヴェルの発現が十分に発現があるにもかかわらず発現のある方が胸腺段階由来T-ALL株では通例であること、予想外に前B細胞ALLと濾胞性リンパ腫株のそれぞれ1例で発現があり、今後の検討が必要と思われた。preTα発現はヒトリンパ球系統で知見がまだなく、それ自体の研究の余地があると思われた(発表3)。(膜表面にTCR発現のある)胸腺段階

由来の株細胞には、強い発現が認められた。又、γ・δ鎖を発現する株細胞3種類の総てにβ鎖の単クローン性再構成と弱い発現を認め、総てpreT αの発現を認めた。YTでは発現を認めなかった。膜表面にTCR α鎖が認められるようになれば、preT α発現は消失するとされているのが、通説なので、α・β鎖を発現する株細胞でのpreT αの発現は、第1の新知見である。又、3つのγ・δ鎖発現のT-ALLは、β鎖遺伝子の単クローン性再構成があり、若干のβ鎖分子が生じている可能性があるが、それらで、preT αの発現が認められたことも、β鎖分子の産生が少しでもあれば、γ・δ鎖を発現する分化経路に属していてもpreT αを発現する場合があることになり、通説とは異なる。これが第2の新知見である。これら2つの新知見が、preT αの発現分布を調べることにより明らかになった。、しかし、NKの未分化段階由来と目されるC7+CD2+の症例に遭遇することはこの間なかった。しかし、この報告書の執筆中に1例を認め、検索中である。
大規模分子シミュレーションによる直鎖アルカン薄膜の表面融解・表面固化機構の解明

直鎖アルカンは、バルク融点より数度高い温度域で、分子鎖が表面に対して垂直に単分子膜を形成するという特異な現象を示すことが知られている。この現象は、低分子系における表面融解と対照的な現象で、表面固化現象と呼ばれている。本研究では、分子動力学シミュレーションにより、n-ノナンおよびn-ノナデカン超薄膜の融解過程を調べた。その結果、n-ノナンでは表面融解が起こるのに対して、n-ノナデカンでは内部から融解し、表面固化状態が実現することが明らかになった。直鎖アルカンは、バルク融点より数度高い温度域で分子鎖が表面に対して垂直に単分子膜を形成するという、かなり特異的な現象を示すことが知られている。この現象は、低分子系における表面融解と対照的な現象で、表面固化現象と呼ばれており、炭素数が15程度から50の間でのみ観察される。本研究では、直鎖アルカン薄膜の表面融解・表面固化機構を系統的に解明するため、直鎖アルカン超薄膜の分子動力学(MD)シミュレーションを行い、融解過程に対する鎖長の影響を調べる。直鎖アルカンの分子モデルとして、ユナイティッド・アトムモデルを採用する。粒子間の相互作用は、共有結合によるものと非共有結合によるものに分けられる。共有結合ポテンシャルとして、伸縮ポテンシャル、変角ポテンシャル、及び、内部回転ポテンシャルを考える。また、非共有結合ポテンシャルとして、レナード-ジョーンズポテンシャルを考える。鎖長の異なる直鎖アルカンとして、n-nonane(C_9H_<20>)とn-nonadecane (C_<19>H_<40>)を用い、温度・圧力一定のMDシミュレーションを行う。初期配置として、一層あたり168分子を39層並べた結晶を用意し、MDセルに納める。分子鎖軸方向(膜に対して垂直な方向)に二層分の厚さの真空領域を用意し、周期境界条件を適用する。系の温度を徐々に上げ、融点の特定および融解過程の解析を行う。一次元密度プロファイルや各層における二次元動径分布関数、配向秩序パラメータなどを詳細に解析することにより、n-nonaneの場合は表面から、n-nonadecaneの場合は内部から融解することが明らかになった。このような鎖長の違いによる融解様式の違いは、実験結果と一致している。昨年度に引き続き、本年度も、直鎖アルカン薄膜の表面融解・表面固化機構を系統的に解明するため、自由表面を持つ直鎖アルカン超薄膜の分子動力学(MD)シミュレーションを行い、融解過程に対する鎖長の影響を調べた。また、水中における直鎖アルカン超薄膜のMDシミュレーションにも取り掛かった。非共有結合ポテンシャルとして、レナードージョーンズポテンシャルを考える。また、水の分子モデルとして、水分子を剛体回転子として扱う3点電荷モデルTIP4Pを用いる。鎖長の異なる直鎖アルカンとして、n-nonane(C_9H_<20>)とn-nonadecane(C_<19>H_<40>)を用い、温度・圧力一定のMDシミュレーションを行う。分子鎖軸方向(膜に対して垂直な方向)に二層分の厚さの真空あるいは水の領域を用意し、周期境界条件を適用する。自由表面を持つ直鎖アルカン超薄膜の場合、n-nonaneは表面から、n-nonadecaneは内部から融解することが明らかになった。膜厚が変化しても融解様式は変化しないことから、分子鎖長が融解様式を決定する重要な因子であると考えることができる。

非共有結合ポテンシャルとして、レナード-ジョーンズポテンシャルを考える。鎖長の異なる直鎖アルカンとして、n-ノナンとn-ノナデカンを用い、温度・圧力一定のMDシミュレーションを行った。初期配置として、一層あたり168分子を39層並べた結晶を用意し、MDセルに納めた。分子鎖軸方向(膜に対して垂直な方向)に二層分の厚さの真空領域を用意し、周期境界条件を適用した。系の温度を徐々に上げ、直鎖アルカン薄膜の融解過程の解析を行った。その結果、n-ノナンでは表面融解が起こるのに対して、n-ノナデカンでは内部から融解し、表面固化状態が実現することが明らかになった。また、この表面固化状態では、分子鎖のトランス配座の割合が高くパッキングが密な表面層を持ち、内部層が融解することにより系全体が安定化したことが分かった。現在、水中における直鎖アルカン薄膜のMDシミュレーションを行い、自由表面の場合との比較検討を行っているところである。直鎖アルカン超薄膜の分子動力学シミュレーションを行い、融解過程に対する鎖長の影響を系統的に調べた結果、n-nonane(C_9H_<20>)の場合は表面から、n-nonadecane(C_<19>H_<40>)の場合は内部から融解することが明らかになったため。24年度が最終年度であるため、記入しない。引き続き、直鎖アルカン薄膜の表面融解・表面固化機構を系統的に解明するため、自由表面を持つ直鎖アルカン超薄膜、及び、水中における直鎖アルカン超薄膜の分子動力学(MD)シミュレーションを行い、融解過程に対する鎖長の影響を系統的に調べる。また、表面固化現象の普遍性を追求するため、直鎖アルカン薄膜の水との界面における界面活性剤誘起表面固化現象をMDシミュレーションにより解析する。特に、表面固化状態における界面活性剤分子の凝集構造を明らかにする。
初期発生における細胞分裂制御機構

ヒトデ卵母細胞から卵核胞を効率よく大量に分離する方法を確立し、それを用いて細胞分裂周期に伴う卵の「かたさ」の変化、卵成熟促進因(MPF)の増幅因子、および精子前核誘導因子等を生化学的に解析するための実験系が確立した(根本)。ヒトで成熟卵から得たサイクリンmRNAを注射すると、同種卵のみならずカエルの卵成熟も誘導される。このmRNAを基にサイクリンcDNAをクロン化してその塩基配列を決定した。サイクリンは未成熟卵に既に存在し、リン酸化型cdc2蛋白質と複合体をつくって不活性MPFを形成しているが、cdc2蛋白質の脱リン酸化によりこの複合体がヒストンH1キナ-ゼ活性をもつに至ったのがMPF活性である。サイクリンの蛋白質分解によりMPFは不活化され、分裂期の終了がもたらされる(岸本)。カエル成熟卵抽出物を用いた無細胞系に界面活性剤処理した精子を加えて前核を誘導し、プロタミンが体細胞型ヒストンに置換される過程を解析した。ブロタミンは卵細胞質に含まれる卵核胞由来のヌクレオプラズミンによって精子核から非酵素的にすバやく離脱し、代わりに体細胞型ヌクレオソ-ムコアヒストン群が加わるが、H1は前核および卵割期を通じて特異なサブタイプHIXから成る(片桐)。細胞質分裂の際に現われる収縮環は、軽鎖をリン酸化されたミオシンが集合してアクチン繊維を組織化することにより形成される。収縮環の形成を調節する蛋白質のひとつデパクチンがアクチント結合する部位を決定し、またGーアクチンの重合を阻害するプロフィリンの一次構造を決定した(馬渕)。両生類の卵割溝形成の誘導および分裂溝の進行のいずれもがコルヒチン、ウ“ィンブラスチンにより阻害され、微小管が分裂面での収縮構造の形成に直接関与することが示唆された(沢井)。ヒトデ卵母細胞をプロナ-ゼ及びサイトカラシンBで破砕後、ショ糖密度勾配遠心により卵核胞(GV)を大量に分離する方法を確立した。分離されたGVの100kxg上清を無核卵片に注入すると、卵成熟分裂周期に同調して起こる卵のかたさの変化が注入量に依存して回復した。同様のGV誠料をGV除去卵に由来する細胞質抽出液に加えることによって、in vitroで卵成熟促進因子(MPF)の増幅をひきおこす系を確立し、GV中にはcdc2蛋白質、サイクリンのいずれとも異るMPF増幅因子が含まれることがわかった。他方、カエル卵では、GV除去した卵片でも有核卵と同じく成熟分裂と同調して卵のかたさの変化及びMPFの出現が2度起こる。しかし成熟分裂終了後は卵のかたさ、MPFともに卵割に同調した消長を示さず、高い種を保ちつづける。MPFについては、ヒトデ卵由来のサイクリンmRNAを注入することにより、同種のみならずカエル卵の成熟をも誘導することができた。(片桐・岸本・根本)卵内での分裂装置(MA)の空間的配置及び分裂溝形成における表層細胞質の役割を検討した。イトミミズ4細胞期胚のMAを遠心によって割球の一方の極に寄せておくと、MAは常に割球内の本来存在すべき位置(動物極)に戻ることがわかった。分裂開始直前のウニ卵のMAを顕微手術的に表層に押しつけると、MA自体は著しく変形するにもかかわらず表層は殆んど変形しなかった。他方、単離した表層でも分裂溝が形成された。これらのことは、分裂準備期、分裂期いずれにおいても表層細胞質が重要な働きをしていることを示す。

更に、分裂溝形成に関与する表層アクチンの分布をウニ卵について調査したところ、分裂溝が形成される前にアクチン繊維が分裂予定域に畜積し、しかも繊維は束を形成していることがわかった。このアクチン繊維束の形成過程にミオシンが関与することも明らかとなった。(馬淵、平本、清水)(1)ヒトデ未成熟卵ではサイクリンとリン酸化型cdc2蛋白質との複合体が不活性型MPFとして既に存在し、この複合体中のcdc2蛋白質の脱リン酸化によりもたらされるヒストンH1キナ-ゼ活性が活性MPFの実体である。cdc2蛋白質は未成熟卵の細胞質・核の双方に存在するが、サイクリンは細胞質にのみ局在しGVBDの直前に卵核胞内に移行する(岸本)。(2)カエル卵細胞質抽出物に精子核を加えるという無細胞系で核蛋白質の動態を調べ、a)精子核特異的塩基性蛋白質は卵細胞質中の熱耐性酸性蛋白質(おそらくヌクレオプラズミン)によって非酵素的に除去されること、b)前核および卵割期の核には後期胚や成体の核には無い特殊なH1ヒストンが存在すること、が見出された(片桐)。(3)抗チュ-ブリン単クロン抗体を用いてウニ卵分裂装置の蛍光抗体法による観察を行い、紡錐体と星状体では微小管を構成するチュ-ブリンのアイソフォ-ムが異なること、また微小管の密度が動物極側で大きいことが分裂装置の偏在をもたらす要因になることが示唆された(浜口)。(4)ウニ卵で収縮環の形成にミオシンのリン酸化が伴うことを見出し、また収縮環の形成と消滅に関与していると考えられるアクチン調節蛋白質プロフィリンのアミノ酸配列を決定した(馬淵)。(5)イモリおよびカエル卵の分裂溝形成の誘導および分裂溝の進行がコルヒチン、ヴィンブラスチンのいずれによっても阻害され、微小管が収縮溝の形成に直接的に関与することが示唆された(沢井)。(6)ウニの雄性核卵片の第一回目の核分裂が正常卵よりも遅くなるのは、雄性前核のS期が雌性前核のそれに較べて長い、という事情に基ずくことが証明された(米田)。
分裂装置内におけるG蛋白質とγ-チュープリンの局在と分子機能

(1)ウニ卵の中心体は分裂装置の形成中心として機能し、分子量51、000のG蛋白質(P51)がチュープリンの重合核を構成する蛋白質成分として役割を果たしている。この蛋白成分は中心体のMTOG(微小管形成顆粒)に含まれている。一方、γ-チュープリンやRan-GTP結合蛋白が中心体にあり、微小管形成の中心となるという報告もある。そこで、MTOG分画をウニ未受精卵と受精卵から分離して、そこに含まれるp51の局在をウエスタンブロット法によりまず、確かめた。次いで、ネズミで作成した抗γ-チュ-ブリン抗体を用いて調べたところ、MTOG分画からγ-チュープリンを検出することができなかった。このp51分画はラテックスビーズの表面に結合してチュープリン重合の核を形成するので、ラテックスビーズに結合するMTOG分画中の成分にγ-チュープリンが含まれる可能性を検討したが、これもネガティブな結果しか得られなかった。現在用いた抗γ-チュープリン抗体をウサギの抗体かえて検討中であるが、生物は重複した機能蛋白質を持つ可能性は否定出来ない。(2)ラテックスビーズにp51を結合させ、チュープリンを添加して星状体を構築する反応系を濁度測定で定量化する方法を確立し、p51とγ-チュープリンのそれぞれの抗体の効果を調べたところ、抗p51抗体の阻害活性は著しいが、抗γ-チュープリン抗体は殆ど阻害しないことが明らかになったので、ウニ卵ではγ-チュープリンは微小管形成の核として機能していない可能性がある。いずれにしても、抗体を代えて再検討の必要がある。ウニ卵の中心体は分裂装置の両極に位置し、星状体微小管、紡錘体微小管、キネトコア微小管の形成中心として機能することが知られている。また、中心体には微小管形成顆粒(MTOG)が中心子を取り囲んで存在する。MTOG顆粒や紡錘体の極に近い部分には分子量5万1千のG蛋白質(P51)が局在しており、チューブリンから微小管への重合の核を形成する重要な蛋白質であることが証明されている。この研究課題では、そのG蛋白質とともに微小管形成中心としての分子機能を発現すると考えられているγ-チューブリンの局在も調べ、それらの分子機能を明らかにすることを目的とした。そのために、中心体のモデルとして、ラテックスビーズにP51を結合させ、チューブリンを添加して星状休を形成させるシステムを構築し、自記分光光度計を用いてい定量化することに成功した。そのシステムを用いて、(1)GTPや非氷解アナログのGMP-PNPはP51の微小管形成能を促進するが、GTP-γSやGDPは阻害効果を持つことが証明された。(2)微小管毒のコルヒチンとポドフィロトキシンはこの試験管内の星状体形成を著しく阻害することが明らかになった。(3)抗p51抗体や抗γ-チューブリン抗体は星状体形成を著しく阻害することが証明された。(4)27種類のGTPアナログを合成し、それぞれの微小管形成促進活性を測定した結果、グアニンヌクレオチドの構造とチューブリン重合促進能との関わりについての重要な知見が得られた。(5)分裂装置から得られるMTOG中にP51とともに、γ-チューブリンが含まれていることが抗γ-チューブリン抗体を用いたウエスタンブロットにより明らかになった。現在細胞内でのγ-チューブリンの局在を免疫電顕法により調べている。(1)ウニ卵の中心体は分裂装置の形成中心として機能し、分子量5万1千のG蛋白質(p51)がチューブリンの重合核を構成する蛋白質成分として役割を果たしている。

一方、γ-チューブリンやRan-GTP結合蛋白が中心体にあり、微小管形成の中心となるという報告もある。そこで、MTOG分画をウニ未受精卵と受精卵から分離して、そこに含まれるp51の局在をウエスタンブロット法によりまず確かめた。次いで、ネズミで作成した抗γ-チューブリン抗体を用いて調べたところ、MTOG分画からγ-チューブリンを検出することが出来なかった。このp51分画はカルボキシル基をコートしたラテックスビーズの表面に結合してチューブリン重合の核を形成するので、ラテックスビーズに結合するMTOG分画中の成分にγ-チューブリンが含まれる可能性を検討したが、これもネガティブな結果しか得られなかった。現在用いた抗γ-チューブリン抗体をウサギの抗体に代えて検討中であるが、生物は重複した機能蛋白質を持つ可能性を否定出来ない。(2)ラテックスビーズにp51を結合させ、チューブリンを添加して星状体を構築する反応系を濁度測定で定量化する方法を確立し、p51とγ-チューブリンのそれぞれの効果を調べたところ、抗p51抗体の阻害活性は著しいが、抗γ-チューブリン抗体は殆ど阻害しないことが明らかになったので、ウニ卵ではγ-チューブリンは微小管形成の核として機能していない可能性が有る。いずれにしても、抗体を代えて再検討の必要がある。
テロメアの1本鎖DNA領域に結合するPot1蛋白質のテロメア調節機構の構造的基盤

Pot1のN末端側182アミノ酸残基がテロメア1本鎖DNA領域との特異的な結合に必要なドメイン(DBD)であることを既に明らかにしている。大腸菌内での大量発現系を用いたPot1DBDの調製方法についても既に確立しており、この系を用いてPot1DBDを調製した。本研究では、Pot1DBDとd(GGTTAC)の複合体の3次元構造を詳細に解析した。複合体中のPot1DBDの3次元構造は3本のαヘリックスと8本のβストランドを有するOB(oligonucleotide/oligosaccharide binding) foldのファミリーに属することが明らかとなった。複合体中のd(GGTTAC)は、ランダムな構造ではなく屈曲した独特の構造を有していることが明らかとなった。また、Pot1DBD側のK124,D125がd(GGTTAC)側のG1と、Pot1DBD側のT111,S123がd(GGTTAC)側のG2と、Pot1DBD側のT62,K90がd(GGTTAC)側のT3と、Pot1DBD側のS58,D64がd(GGTTAC)側のT4と、Pot1DBD側のR56,L59がd(GGTTAC)側のA5と、Pot1DBD側のY115,Q120がd(GGTTAC)側のC6と水素結合で特異的に結合していることを明らかとなった。次に、d(GGTTAC)とは長さや塩基配列の異なる一連の変異型テロメア1本鎖DNAのオリゴヌクレオチドをDNA合成機で合成し、逆相HPLCで精製した。これらと野生型Pot1DBDとの結合能をゲルシフト法で解析した。6塩基いずれについても他の塩基に置換したり、6塩基より短くしたりすると、Pot1DBDとの結合能が低下した。これより、d(GGTTAC)がPot1DBDとの特異的な結合に必要である、テロメア1本鎖DNA側の最適な塩基配列であることを明らかにした。さらに、複合体の3次元構造からd(GGTTAC)との複合体形成への関与が考えられるPot1DBD側のアミノ酸残基に点変異を導入するため、点変異導入用発現プラスミドを構築し、大腸菌内での大量発現系を用いて変異型Pot1DBDを調製した。これらとd(GGTTAC)との結合能をゲルシフト法で解析した。S58A, K90AおよびD125Aは野生型と比較してd(GGTTAC)との結合能がほとんど変化しなかったが、D64A,Q120LおよびK124Aは野生型と比較してd(GGTTAC)との結合能が有意に低下した。複合体の3次元構造からd(GGTTAC)との複合体形成への関与が示唆されているアミノ酸残基の中でも、複合体形成への関与の度合が大きいアミノ酸残基と小さいアミノ酸残基があることが推察された。また、複数のアミノ酸残基が1つの塩基を認識している場合には、片方のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されても他方のアミノ酸残基がd(GGTTAC)との結合能を保持し得るように補償する場合があることが推察された。

さらに、複合体の3次元構造からd(GGTTAC)との複合体形成への関与が考えられるPot1DBD側のアミノ酸残基に点変異を導入するため、点変異導入用発現プラスミドを構築し、大腸菌内での大量発現系を用いて変異型Pot1DBDを調製した。これらとd(GGTTAC)との結合能をゲルシフト法で解析した。S58A, K90AおよびD125Aは野生型と比較してd(GGTTAC)との結合能がほとんど変化しなかったが、D64A,Q120LおよびK124Aは野生型と比較してd(GGTTAC)との結合能が有意に低下した。複合体の3次元構造からd(GGTTAC)との複合体形成への関与が示唆されているアミノ酸残基の中でも、複合体形成への関与の度合が大きいアミノ酸残基と小さいアミノ酸残基があることが推察された。また、複数のアミノ酸残基が1つの塩基を認識している場合には、片方のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されても他方のアミノ酸残基がd(GGTTAC)との結合能を保持し得るように補償する場合があることが推察された。