hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日長感受性に関連するGLP遺伝子の転写制御機構の解析

日長感受性は生物の重要な性質であり、植物では花成などを制御する。申請者らが単離したGLP(germin-like protein)遺伝子は、日長感受性を反映した転写調節を受けることが判明した植物界で最初の遺伝子であり、日長感受性の分子機構を調べる手がかりになるものと考えている。本研究では、長日植物シロイヌナズナのAtGLP1,AtGLP2と短日植物アサガオのPnGLPの遺伝子プロモーターを比較して解析を行った。解析は、プロモーター領域の塩基配列の決定による構造の比較と、ルシフェラーゼをレポーター遺伝子として接続したキメラ遺伝子の形質転換植物を作成して、プロモーターの活性を調べることによって行った。その結果、構造の比較からは、顕著な相同性・類似性はなかったが、GATA様の配列が多数存在する共通の特徴が観察された。一方、プロモーターの活性はAtGLP2を中心に解析したが、転写開始点から上流-296389bpの約100bpの間に概日リズムの発現制御に必須なシス因子配列が含まれることが明かとなった。この約100bpには既知の概日リズム発現のシス配列は無く、GATA配列が2回並んでいることが特徴的であった。このシス配列は、明期開始から1416時間目にピークを示す概日リズム発現を制御する配列として新規のものと推測された。本研究の結果などから、概日リズム発現の分子機構のモデルとして、複数の転写因子が関与する機構が提案され、光周性花成誘導にも関与する可能性があるGATA結合性の転写因子の存在が示唆された。今後は、このGATA因子に結合するトランス因子の遺伝子の単離などを行って、概日リズム発現と光周性花成誘導の分子機構の研究を深めたい。日長感受性は植物では花成などを制御する、生物に重要な性質である。申請者らが単離したGLP(germin-like protein)遺伝子は、日長感受性を反映した転写調節を受けることが判明した植物界で最初の遺伝子であり、日長感受の分子機構を調べる手がかりになるものと考えている。本研究では、長日植物シロイヌナズナと短日植物アサガオのGLP遺伝子のプロモーターを比較して解析することを目的とした。シロイヌナズナのAtGLP1,AtGLP2のプロモーター領域の解析では、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ及びβ-glucuronidaseを接続して、シロイヌナズナの形質転換植物を作成した。その結果、AtGLP1,2は共に地上部、特に葉で強い発現を示すこと、概日リズムの発現制御に関しては、ルシフェリンの発光をモニターすることによってNorthernよりも明瞭な変動が観察されることなどが示された。現在、プロモーター領域を削り込んで詳細な検討を進めている。一方、アサガオのPnGLPに関しては、ゲノム遺伝子を核ゲノムライブラリーよりクローン化して解析した。PnGLPのcDNAをプローブとした核ゲノムのSouthernで検出していた3つのゲノム領域の全構造が明らかになった。1つは機能するPnGLPをコードする遺伝子と考えられるものであり、プロモーター領域にTAが15回繰り返す特異な構造があり、シロイヌナズナの遺伝子との相同性は極めて低かった。一方、残る2つは植物界でも新奇なトランスポゾンの中に全コード領域が含まれており、互いに構造が似ていることから比較的新しく転移・重複したものであると推測された。これらが発現しているかどうかなど、詳細な解析を進めている。昨年に引き続いて、シロイヌナズナのAtGLP2のプロモーターにレポーター遺伝子(ルシフェラーゼ)を接続してシロイヌナズナの形質転換植物を作成して解析した。その結果、転写開始点から上流-296389bpの約100bpの間に概日リズムの発現制御に必須なシス因子配列が含まれることが明らかとなった。

この約100bpには既知の概日リズム発現のシス配列は無く、GATA配列が2回並んでいることが特徴的であった。このシス配列は、明期開始から1416時間目にピークを示す概日リズム発現を制御する配列として新規のものであるばかりではなく、長日条件による花成誘導の制御と関連する可能性がある。ごく最近、明期開始から812時間目にピークを示す概日リズム発現を制御する配列としてEvening elementが報告された(Harmer et al.,2000)。Evening elementは逆方向のGATAが2回並び、AtGLP2の上述の配列と構造が類似していた。これらの結果は、概日リズム発現を制御するトランス因子が、ピークの時刻に特有な、しかし類縁のものであることを示す可能性がある。一方、AtGLP1とPnGLPのプロモーターにはこれらの配列に類似したものが複数存在した。概日リズム発現及び光周性花成に関連するトランス因子はGATA様の配列を認識する転写因子である可能性がある。本研究より、概日リズム発現の分子機構のモデルとして、複数の転写因子が関与する機構が提案され、光周性花成誘導にも関与する可能性のあるGATA結合性の転写因子の存在が示唆された。
無線通信基地局用 周波数・空間フィルタ一体型アンテナの研究

本研究では,周波数と空間のフィルタを併用することによって,フィルタ機構を小形化し,アンテナと一体に構成する方法について明らかにした.任意のアンテナ素子数のアレーアンテナ間の減結合効果を持つ給電回路構成法を提案し,送信アンテナからの強い干渉信号が受信アンテナポートに入力されることを防ぐことが可能になることを実験により明らかにした.本研究では,周波数と空間のフィルタを併用することによって,フィルタ機構を小形化し,アンテナと一体に構成する方法について明らかにした.任意のアンテナ素子数のアレーアンテナ間の減結合効果を持つ給電回路構成法を提案し,送信アンテナからの強い干渉信号が受信アンテナポートに入力されることを防ぐことが可能になることを実験により明らかにした.本研究は,携帯電話などの無線通信基地局用に対し,周波数・空間フィルター体型アンテナを適用することによって通信距離の伸長,伝送速度の向上を果たすことを目的としている.本年度は,小規模なアンテナ構成における減結合回路構成法を実現することを目的とし検討を行なった.この減結合回路によって基地局アンテナの送信信号が受信アンテナに回り込まないようにすることで,受信アンテナへ直接低雑音増幅器を取り付けが可能になり,受信信号の信号対雑音比を大きく改善し通信距離を伸長することができる.高アイソレーションを実現する減結合回路の構成法として,分布定数回路のみを用いた低損失・簡易減結合回路を提案した.アンテナのアドミタンス行列に着目し,相互アドミタンスのみを抑圧することで減結合回路を簡易に構成することが可能になった.そのため,集中定数素子の実装が不要になり,低コストに減結合回路を実現することが可能になった.また,本減結合回路は相互アドミタンスのみを抑圧することによって実現されるため,任意の素子数のアレーアンテナへの適用が可能である.そのため,本技術は高利得が要求される携帯電話基地局アンテナへの適用が可能である.本提案設計法の評価を行なうため,小型なアレーアンテナの試作を行い,減結合回路を設計し線路定数を決定した.数値解析の結果,提案減結合回路によって,アンテナの周波数帯域幅に影響を与えることなく高い減結合特性を実現できることが判明した.従来,減結合回路を適用した場合アンテナの帯域が狭くなり通信帯域に影響することが知られていたが,本成果はこれを覆すものであり,高い有効性を確認することができた.本研究は,携帯電話などの無線通信基地局用に対し,周波数・空間フィルタ一体型アンテナを適用することによって通信距離の伸長,伝送速度の向上を果たすことを目的としている.本年度は2素子以上の中型規模のアレーアンテナを試作しさらに,昨年度に考案した減結合回路の設計法をもとに実際の減結合回路を試作した.本設計法は,分布定数回路のみを用いた低損失・簡易減結合回路を実現するものであり,アンテナのアドミタンス行列に着目し,相互アドミタンスのみを抑圧することで減結合回路を簡易に構成することを可能にするものである.試作の結果,提案した減結合回路によって高い減結合効果が得られることが明らかになった.また,減結合回路が帯域幅に与える影響を評価したところ,整合特性には僅かな影響を与えるものの,概ね良好に動作することも明らかになった.従来より減結合回路の採用によってアンテナが狭帯域化することが知られているが,本測定結果は帯域への影響を与えないことを証明するものとなった.さらに,減結合回路の広帯域化法について検討を行った.その結果,マイクロストリップによるブリッジ回路の代わりに抵抗を使うことによって広帯域化が可能であることを数値解析によって明らかにしている.本構成法は,2素子以上のアレーアンテナへも適用可能である.このように,本年度は,減結合効果を実証し,さらにその改善検討として減結合回路の広帯域化が可能であることを明らかにした.無線通信の通信エリア拡大と通信容量の向上を目的として、基地局アレーアンテナ素子直下に受信用増幅器を実装可能とする周波数・空間フィルタ一体型アレーアンテナを実現した。比較的大きなアレーアンテナの試作を行い,実用に近い減結合回路の試作評価を行った。減結合回路の構成にはマイクロストリップライン(MSL)を用いる.MSLを用いることで低損失なリアクタンス素子を簡易に実現できる。本提案法では相互結合を相殺するMSLを減結合の対象とするアンテナポート間にブリッジサセプタンスとして接続し,相互結合の低減を行った。Sパラメータ,及び指向性の測定結果から提案する回路の評価を行い,その有効性を明らかにした。実験によって素子間結合を-30dB以下に抑制可能であることを示した。また,減結合の対象としないアンテナポート間の結合には影響を与えないことも示す.さらに,減結合回路接続によるアンテナの整合への影響も小さく,指向性にも影響を与えないことを実験的に確認し,本提案法によって多素子アレーアンテナに適用可能な減結合回路を簡易に実現できることを実証した。また,本技術を用いることによる通信容量向上効果を評価した。その結果,提案技術によってマルチアンテナの伝送容量を向上できることを明らかにした。平成24年度については,複数の学会発表を行うと共に,掲載論文2件(査読付き),レター1件(査読付き)という成果を得た。本課題の目標は2素子以上のアレーアンテナに適した減結合回路を実現することであり,今年度は実際にアレーアンテナを試作し減結合回路の有効性を実験によって確認している.そのため計画は達成していると考える.一方,減結合回路の広帯域化という新しい要求が生じており,これに対して現在の技術をさらに進展させ,新しい減結合回路構成法を提案している.そのため,本年度は目標以上に研究が進展したと考える.24年度が最終年度であるため、記入しない。

本研究課題を通して新しい減結合回路構成法を考案しており,帯域への影響が小さいなど,世界的にも新規性の高い成果である.本成果は海外に向けて論文としていち早く発表する.また,本研究課題はアナログ回路によって送受信間の回りこみを抑えるという技術であり,ディジタル技術と協調することによって更に高性能化が可能となる.この考え方を発展させると,アナログ制御によって通信品質をより改善することが可能になる.このように,アナログ・ディジタル協調技術として発展させ,革新的な通信技術を創出する.24年度が最終年度であるため、記入しない。
ヘリウムからウランまでの標準原子波動関数表の作成

原子のRoothaan-Hartree-Fock (RHF)波動関数は、それ自身、原子の電子状態の解明に基本的情報を与えるだけでなく、分子や分子系の電子状態研究の基礎となっている。ヘリウム(原子番号2)からキセノン(原子番号54)までの53個の原子に対するRHF波動関数は、1974年、ClementiとRoettiによって報告された。また、セシウム(原子番号55)からウラン(原子番号92)までの38個の原子に対する波動関数は、1981年、McLeanとMcLeanによって出版された。これらの波動関数は、今日まで長い間、標準的な原子波動関数として原子分子の研究分野において幅広く国際的に利用され続けている。しかしながら、これらの波動関数には、(i)原子の正しい基底状態に対応していないものがある、(ii)開殻を持つ原子で、角運動量の結合定数を誤っているものがある、(iii)変分パラメータの最適化が不十分である、(iv)正確な電子状態の記述に必要な基底の大きさが検討されていない、といった数多くの問題があることも知られている。本研究の目的は、これらの問題をすべて解決し、信頼できる正しい原子波動関数表をヘリウムからウランまでの91個の原子に対して作成する事である。ヘリウムからキセノンまでの原子に対しては、必要な基底の大きさを検討した上で、基底関数の変分パラメータの十分な最適化を行い、改良された波動関数を作成した。これらの波動関数の全エネルギーは数値的Hartree-Fock (NHF)法のそれをほとんど再現している。しかし、波動関数の性質を詳細に調べてみると、例えば、軌道動径関数の原子核近傍での挙動(カスプ挙動)や原子核から離れた点での挙動(遠距離漸近挙動)などに正しいHartree-Fock原子軌道の振る舞いからの誤差が見られた。そこで、さらに、真のHartree-Fock原子軌道が満たすべきいくつかの性質を制約条件として、変分パラメータの最適化をやり直し、真にnear-Hartree-Fcokと呼べるRHF原子波動関数の開発も行った。セシウムからウランまでの原子に対しては、正しい基底状態の検討から始め、必要な基底の大きさを決定した。McLeanとMcLeanの結果は、特に、dとfの対称性で基底が不足していることが明らかになった。パラメータの徹底した最適化により、波動関数の精度が格段に向上した。本研究で開発した一連の高精度な原子波動関数は、今後の原子・分子の電子構造の研究に基本的な情報を提供する重要な研究成果といえる。
熱帯アフリカにおけるタイレリア感染症の分子疫学的調査:家畜および野生動物に寄生する原虫の性状検討

牛由来Theileria Parvaのシゾント感染リンパ球株樹立と性状解析(主にザンビア大学、国際家畜研究所との共同調査・研究)ザンビア国内5地域の農場に飼育されていた東海岸熱(ECF)罹患牛から試料を得て原虫株分離を試みた結果、中部州(Kabwe)農場の2検体からシゾント感染細胞が樹立できた。これら2株をケニア(IRLI)に搬入し、Southern Provinceから既に樹立されていた株(Mazabuka株)と合わせDNAプローブによるサザンブロット解析ならびにモノクローナル抗体による間接蛍光抗体法により性状検索を行った。Mazabuka株は、その免疫学的、遺伝学的性状がケニアの牛から分離されたMuguga株(いわゆるT.parva parva)のそれと極めて類似しているが、既知のアフリカバッファロ-由来の原虫型(いわゆるT.parva lawrencei)とは明らかに異なっていることが明らかとなった。このことから,ザンビアの中部/南部州に存在するT.parvaは、牛間で伝播する原虫と考えられた。さらに、中部/南部州由来株と東部州由来株とは明らかに諸性状を異にしていることも明らかにできた(Nambota et al,1996)。また、ピロプラズマとシゾントステージに発現される表面蛋白質(p32およびPIM)遺伝子の解析をPCR-RFLPで行った結果からも、以上の成績が裏付けられた。T.parva以外の野生動物由来タイレリア・バベシアの比較(主に南ア獣医学研究所との共同調査・研究)(1)アフリカバッファロ-由来原虫種の遺伝子解析前年度南アのバッファロ-から得られた原虫DNA試料から、rRNA遺伝子ならびに主要ピロプラズマ表面蛋白質(p32)遺伝子をPCRにより増幅し、その塩基配列を決定した。rRNA遺伝子解析の結果から、バッファロ-血液試料中には、T.parva以外に少なくとも3種のタイレリアの存在が確認された。それらのうち1種は、牛由来良性タイレリア種(T.buffeli)と同一であり、牛-バッファロ-間の感染が成立しているものと考えられた。他2種はバッファロ-固有種と考えられ、牛との間での感染の成立はないと考えられた。それらのうち、1種のrRNA遺伝子塩基配列は既知のタイレリアのそれとは全く異なっており、新種と考えられた。また、バッファロ-固有種の主要ピロプラズマ表面蛋白質(p32)の遺伝子解析から、本種はアジアで見られる牛寄生性良性タイレリアの一群とはやや遺伝学的に離れたところに位置づけられた(角田ら、投稿中),ザンビアで採取したバッファロ-血液DNAからは既存のプライマーによるPCRでは増幅産物は得られなかった。(2)その他の動物における原虫感染状況の調査タイレリア感染の見られたセ-ブルアンテロープから樹立されたシゾント感染細胞試料からDNAを得て、遺伝子解析を行った。本種は既にrRNA遺伝子塩基配列から固有種と考えられているが,今回の主要ピロプラズマ表面蛋白質(p32相同分子)の遺伝子解析の結果からも、既知の牛由来タイレリア種とは全く独立した位置づけにあることが確認された(角田ら,印刷中)。猫科動物(ライオン、チ-タ、カラコル[野生猫の一種])の末梢血液の塗抹標本においてタイレリアもしくはバベシアと考えられる原虫を検出した。これらの多くは未記載、未分類の原虫であり、さらにrRNA遺伝子解析を継続して行い、既知の種との遺伝的関係を明らかにする必要がある。馬科動物においては、シマウマ末梢血液中にバベシア原虫を検出し、5株についてはその試験管内培養に成功した。これらは、形態学的にウマ由来のBabesia equiと同一原虫種と考えられた。南アのウマ由来Babesia equiについては、主要ピロプラズマ表面蛋白質(EMA-1)遺伝子の解析から、少なくとも4つの遺伝型が存在することが今回の調査で明らかになった。(須藤ら、印刷中)。今調査研究内では、馬由来株との遺伝学的な比較をさらに行うには至らなかったが、野生動物が共存する地域でのウマピロプラズマ感染症の疫学を明らかにする上で、EMA-1遺伝子解析をさらに行う必要がある。

また、ピロプラズマとシゾントステージに発現される表面蛋白質(p32およびPIM)遺伝子の解析をPCR-RFLPで行った結果からも、以上の成績が裏付けられた。T.parva以外の野生動物由来タイレリア・バベシアの比較(主に南ア獣医学研究所との共同調査・研究)(1)アフリカバッファロ-由来原虫種の遺伝子解析前年度南アのバッファロ-から得られた原虫DNA試料から、rRNA遺伝子ならびに主要ピロプラズマ表面蛋白質(p32)遺伝子をPCRにより増幅し、その塩基配列を決定した。rRNA遺伝子解析の結果から、バッファロ-血液試料中には、T.parva以外に少なくとも3種のタイレリアの存在が確認された。それらのうち1種は、牛由来良性タイレリア種(T.buffeli)と同一であり、牛-バッファロ-間の感染が成立しているものと考えられた。他2種はバッファロ-固有種と考えられ、牛との間での感染の成立はないと考えられた。それらのうち、1種のrRNA遺伝子塩基配列は既知のタイレリアのそれとは全く異なっており、新種と考えられた。また、バッファロ-固有種の主要ピロプラズマ表面蛋白質(p32)の遺伝子解析から、本種はアジアで見られる牛寄生性良性タイレリアの一群とはやや遺伝学的に離れたところに位置づけられた(角田ら、投稿中),ザンビアで採取したバッファロ-血液DNAからは既存のプライマーによるPCRでは増幅産物は得られなかった。(2)その他の動物における原虫感染状況の調査タイレリア感染の見られたセ-ブルアンテロープから樹立されたシゾント感染細胞試料からDNAを得て、遺伝子解析を行った。本種は既にrRNA遺伝子塩基配列から固有種と考えられているが,今回の主要ピロプラズマ表面蛋白質(p32相同分子)の遺伝子解析の結果からも、既知の牛由来タイレリア種とは全く独立した位置づけにあることが確認された(角田ら,印刷中)。猫科動物(ライオン、チ-タ、カラコル[野生猫の一種])の末梢血液の塗抹標本においてタイレリアもしくはバベシアと考えられる原虫を検出した。これらの多くは未記載、未分類の原虫であり、さらにrRNA遺伝子解析を継続して行い、既知の種との遺伝的関係を明らかにする必要がある。馬科動物においては、シマウマ末梢血液中にバベシア原虫を検出し、5株についてはその試験管内培養に成功した。これらは、形態学的にウマ由来のBabesia equiと同一原虫種と考えられた。南アのウマ由来Babesia equiについては、主要ピロプラズマ表面蛋白質(EMA-1)遺伝子の解析から、少なくとも4つの遺伝型が存在することが今回の調査で明らかになった。(須藤ら、印刷中)。今調査研究内では、馬由来株との遺伝学的な比較をさらに行うには至らなかったが、野生動物が共存する地域でのウマピロプラズマ感染症の疫学を明らかにする上で、EMA-1遺伝子解析をさらに行う必要がある。南アフリカ共和国で1995年10月26日-11月26日の間、調査を行った。Theileria感染の認められた2ケ所の国立公園の野性バッファロ-、アンテロープ類(ウオーターバック、セ-ブル・アンテロープ)、東トランスバ-ルで飼育されている牛、Babesia感染の認められた馬のDNAあるいは血液試料を収集した。現在DNA試料として日本に持ち帰り、それらの表面抗原遺伝子を遺伝子増幅(PCR)後、塩基配列を解析している。
新たなdrug delivery systemによる細胞保護法の開発

細胞内に有用蛋白を発現させる、あるいは取り込む方法としては、遺伝子導入、または細胞外空間に蛋白を投与してendocytosis、phagocytosisによって細胞に取り込ませる方法などが考えられる。最近、herpes simplex virus I由来のVP22蛋白は特異な性質を持つ事が報告された。VP22蛋白は殆どすべての細胞種で細胞外空間から細胞内に取り込まれるとされる。また、そのカルボキシ末端に他の蛋白を付加しても、共に細胞内に取り込まれる事が報告されている。この取り込みは通常のendocytosis、phagocytosisとは異なる機序によるとされており、その効率も良く、drug delivery systemとしての利用が示唆されていた。本研究では本来細胞内で働く有用蛋白とVP22との融合蛋白を作製し、細胞外空間から投与して、細胞内に取り込ませて、その機能を発揮させようと試みた。有用蛋白として、細胞保護作用が報告されている、ストレス蛋白(分子シャペロン)HSP27を用いて、VP22-HSP27キメラ蛋白を作製した。2種類のキメラ蛋白を作製したが、一方は発現はするものの不安定で、細胞内で速やかに分解された。もう一方は、発現し、VP22蛋白によって核に局在が誘導されたと考えられたが、侵襲に対する抵抗性は却って低下した。これは、キメラ蛋白のVP22部分によりHSP27の作用が阻害され、dominant negative変異蛋白として機能したと考えられる。今後は他の有用蛋白とのキメラ蛋白を作製しさらに検討を重ねたい。Heatshook protein(HSP)は、発熱、炎症、虚血、再灌流などの侵襲に反応してその産生が増大することが知られている。生理的な状態においても、新たに合成された蛋白の高次構造(folding)の形成、膜の通過、複合体形成、細胞内輸送、分解などを制御するchaperoneとして働き、細胞の成長、分裂に不可欠の存在であることが明らかになっている。侵襲下には異常な蛋白が集積するために、それを制御あるいは除去するchaperoneとしての需要が高まり、細胞にとっては合目的なstress responseとして、産生が増大すると考えられる。本研究ではHSPを細胞に発現させる方法として、HerpesSimplex Virus type1(HSV-1)由来のVP22蛋白を利用した、新たなdrug deliverysystemによって、HSPを侵襲に際して細胞内に導入し、細胞のstress responseを援助しapoptosis、necrosisを防ぎ、侵襲から細胞、延ては生体を保護する方法を開発する事を目的としている。そこで、細胞保護作用の報告されている、HSP27とVP22蛋白との融合蛋白を作製した。これを培養細胞に遺伝子導入した所、細胞質、核に強く発現し、HSP27と同様に、酸化ストレスに対して、細胞保護作用がある傾向が見られた。この融合蛋白は細胞外にも分泌され、培養液を介して、他の細胞内に進入発現した。ただ、この融合蛋白は野生型のHSP27に比べて、不安定で、分解されやすい傾向が見られた。今後、融合蛋白の設計を細部に渡って検討し、安定な蛋白を開発し、その細胞保護作用をさらに、培養細胞、動物実験で検討をする。この取り込みは通常のendocytosis、phagocytosisとは異なる機序によるとされており、その効率も良く、drug de1ivery systemとしての利用が示唆されていた。

本研究では本来細胞内で働く有用蛋白とVP22との融合蛋白を作製し、細胞外空間から投与して、細胞内に取り込ませて、その機能を発揮させようと試みた。有用蛋白として、細胞保護作用が報告されている、ストレス蛋白(分子シャペロン)HSP27を用いて、VP22-HSP27キメラ蛋白を作製した。2種類のキメラ蛋白を作製したが、一方は発現はするものの不安定で、細胞内で速やかに分解された。もう一方は、発現し、VP22蛋白によって核に局在が誘導されたと考えられたが、侵襲に対する抵抗性は却って低下した。これは、キメラ蛋白のVP22部分によりHSP27の作用が阻害され、dominant negative変異蛋白として機能したと考えられる。今後は他の有用蛋白とのキメラ蛋白を作製しさらに検討を重ねたい。
U(3)ファミリー・ゲージ対称性とTeVスケール物理の探求

荷電レプトンの質量公式に端を発する理論的研究は,山下の協力によりかなりの進展を見せてきている.しかし,まだ詰めるべき点があり,その完成を急いでいる.これに伴って,ファミリーゲージボソンの具体的モデルもまたも影響を受ける.より理論的にナチュラルなモデルの構築を目指して,より明確な(未知パラメターを含まぬ)ファミリーゲージボソンの予言を目指して,その構築を急ぐ.荷電レプトンの質量公式に端を発する理論的研究は,山下の協力によりかなりの進展を見せてきている.しかし,まだ詰めるべき点があり,その完成を急いでいる.これに伴って,ファミリーゲージボソンの具体的モデルもまたも影響を受ける.より理論的にナチュラルなモデルの構築を目指して,より明確な(未知パラメターを含まぬ)ファミリーゲージボソンの予言を目指して,その構築を急ぐ.
オートファジー制御に基づく効果的な癌免疫療法の確立

細胞は、飢餓・ストレス状態では生存するためにオートファジーを利用する。そして、癌細胞は、このオートファジーを治療抵抗性の獲得や癌局所での低酸素環境への適応に利用している。申請者は、ヒト膵癌細胞にTRAILでアポトーシスを誘導する場合にオートファジーが誘導されること、また、オートファジーをRNA干渉や分子標的薬で阻害することによりヒト癌細胞のTRAIL感受性が増加することを明らかにした。次年度は、癌細胞選択的に細胞死(アポトーシス)を誘導できるTRAIL分子のヒト膵癌細胞に対するアポトーシス誘導において、抵抗性機序として誘導されるオートファジーを抑制することにより、TRAIL誘導性アポトーシスが増強できるか検討した。オートファジーを抑制する分子として、heat shock protein (HSP) 70の機能を抑制すると同時に癌治療抵抗性に関与すると考えられるオートファジーを阻害することが報告されているpifithrin-mu (PFT-mu)を利用した。まず、4種類のヒト膵癌細胞株(MiaPaca-2、Panc-1、AsPC-1、BxPC-3)のいずれの細胞株にもTRAILの受容体であるdeath receptors (DR4、DR5)を発現していたが、AsPC-1はTRAIL抵抗性であった。他の3種類の細胞株は、TRAILまたはPFT-muの単独処理により濃度依存的なcell viabilityの低下とアポトーシスの増加が認められたが、両者を併用することにより有意な相加・相乗的な抗癌効果が観察された。また、MiaPaca-2とPanc-1において、オートファジー関連分子であるbeclin-1の発現をsiRNAで選択的に低下させると、TRAILに対する感受性が有意に増強された。また、PFT-muの作用として、癌細胞のNF-kBの活性を抑制することを明らかにした。以上の結果は、ヒト膵癌細胞に発現するdeath receptorsを標的としたTRAILによるがん治療において、PFT-muによりオートファジーを抑制することの有効性が示された。初年度は、ヒト乳癌、ヒト膵臓癌の細胞株を用いて、癌細胞特異的にdeathシグナルを介してアポトーシスを誘導するTRAIL、アジュバント受容体リガンドのtransfectにより誘導される癌細胞のアポトーシスとオートファジーの(相互制御の)関係を明らかにすることに取り組んだ。1)ヒト癌細胞でのオートファジーの発現の検証:種々のヒト癌細胞株でオートファジーが構成的、又は、誘導性に生じているかをLC3 type IIの発現をimmunoblot法で、GFP-LC3遺伝子を発現させた癌細胞ではGFP-LC3 fociの形成を共焦点顕微鏡で検証し、オートファジーが生じていることを確認し、その評価系を確立した。さらに、一部の癌細胞株では、GFP-LC3遺伝子を恒常的に発現させたstable transfectsを確立した。2)TRAILが誘導するアポトーシスとオートファジー:Death receptorを介するシグナルで癌細胞にアポトーシスを誘導するTRAILが、癌細胞にアポトーシスを誘導する場合に、オートファジーを誘導・増強または抑制することによりアポトーシスの程度が影響受けるかを、オートファジーに必須の分子であるBeclin-1やATG5をknock downすることにより検証し、確かにオートファジーがアポトーシスに対して防御的に作用していることを明らかにした。3)TLRリガンド刺激による癌細胞でのアポトーシスとオートファジーの検証:poly(I:C)transfectionで誘導されるアポトーシスでのオートファジーの役割を検証し、この実験系においてもオートファジーが防御的に作用していることを明らかにした。最終年度は、がん細胞選択的に細胞死(apoptosis)を誘導できるTRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand)分子が、ヒト膵がん細胞に対するapoptosisの誘導において、抵抗性機序として誘導されるautophagyを抑制することにより、apoptosis誘導が増強できるか検討した。autophagy阻害剤としてマラリア治療薬として臨床で使用され安全性が確認されているchloroquineを用いた。まず、ヒト膵癌細胞株(MiaPaca-2、Panc-1)のいずれの細胞株にもTRAILの受容体であるdeath receptor (DR4、DR5)を発現していたが、MiaPaCa-2はTRAILに高感受性だったがPanc-1はTRAIL低感受性だった。両細胞株はchloroquineに濃度依存的な感受性を示したが、それぞれのsuboptimal濃度でMiaPaCa-2はTRAILに対して相加的な抗癌効果を示した。その機序として、apoptosisの誘導とともにコロニー形成能を低下させることが確認された。また、chloroquine単独では、癌細胞にG2/M arrestを誘導することを確認した。さらに、MiaPaca-2とPanc-1において、autophagy関連分子であるbeclin-1の発現をsiRNAで選択的に低下させると、TRAILに対する感受性が有意に増強されることを細胞分子レベルでも確認できた。さらに、免疫不全マウスにヒト膵がん細胞MiaPaCa-2を皮下接種したモデルを用いて、TRAILとchloroquineの併用によりin vivoでも抗がん効果が増強されることをin vivoでも確認した。

以上より、ヒト膵癌細胞に発現するdeath receptorを標的としたTRAILに基づくがん治療にchloroquineを併用することの有効性が明らかになった。腫瘍免疫次年度は、heat shock protein (HSP) 70の機能を抑制すると同時にオートファジーを阻害することが報告されているpifithrin-mu (PFT-mu)を利用して、TRAIL感受性ヒト膵癌細胞株での、オートファジーの防御的役割を明らかにし、TRAILとPFT-muを併用することにより相加・相乗的な抗がん効果が誘導されることを明らかにできた。また、オートファジー関連分子であるbeclin-1の発現をsiRNAで選択的に低下させると、TRAILに対する感受性が有意に増強されることも明らかにした。また、PFT-muの作用として、癌細胞のNF-kBの活性を抑制することを明らかにできた。そして、これらの結果は論文として報告しており、次年度の目的はおおむね達成できたのではと考えている。初年度は、ヒト乳癌、膵臓癌の細胞株や手術切除した癌組織細胞を用いて、癌反応性キラーT細胞、TRAIL、アジュバント受容体リガンドのtransfectionにより誘導される癌細胞のアポトーシスとオートファジーの(相互制御の)関係を明らかにすることを目的としたが、実験に使用する癌反応性キラーT細胞の準備は困難であった。しかし、再現性をもって実験に使用するには癌反応性キラーT細胞と同様に癌細胞死を誘導するTRAILが有用であった。その後、TRAILを用いて、癌細胞のアポトーシスを検証し、オートファジーの役割を検討したが、予想通り、オートファジーは細胞防御的に作用していることを明らかにできた。一方、申請者らがすでに報告した、TLR3リガンドであるpoly(I:C)を癌細胞の細胞質内transfectし、細胞死を誘導する実験系においても、予想通り、オートファジーが防御的に働いていることを明らかにできた。これらの研究成果もすでに論文として報告したことから、初年度の研究目的はおおむね達成できたのではと考えている。最終年度は、免疫不全マウスに、オートファジー関連遺伝子(Beclin1)をshRNAでノックダウンしたヒト癌細胞を皮下注射するxenograftモデルで、TRAILによる治療に対する反応性を比較・検証する。また、マウス同系腫瘍モデル(BALB/c - colon26大腸癌とC57BL/6 - B16メラノーマ)を用いて、マウス癌細胞でのオートファジーを確認後、オートファジー関連遺伝子(Beclin1, ATG5 etc.)をknockdownさせた癌細胞をマウスに接種し、in vivoでの免疫療法に対する治療反応性の違いを検討する。また、in vivoでオートファジーを阻害するクロロキンを用いて、癌免疫療法との併用効果を検討する。
サイクリンA/cdK2の染色体凝縮に対する機能解析

今までの我々の結果から、培養細胞においては染色体凝縮がMPFによるのではなくむしろサイクリンA/cdk2であること、また、MPFの活性化にもサイクリンA(or E)/Cdk2が必要であることが強く示唆された。カエル卵においても、MPFの活性化・染色体の凝縮にサイクリンA/Cdk2(orサイクリンE/CDK2)が必要かどうかを、そのインヒビターであるP21(cip)タンパク質をカエルの2細胞期の両割球に注入し調べた。p21(Cip)をサイクリンA(or E)/Cdk2のみを阻害する濃度になるように受精卵に注入すると、細胞分裂は停止した。そして、この分裂阻害効果はp21(Cip)濃度に依存的であった。この時、生化学的にMPFの活性を調べると活性化していなかった。これらの結果から、初期胚において、in vivoにおいてもサイクリンA(or E)/Cdk2の活性が、MPFの活性化に必要であることが示唆された。また、中心体の複製サイクリンA/Cdk2(orサイクリンE/CDK2)が必要とされているが、今回、中心体の複製・分離にサイクリンB2が関与する事を見い出した。サイクリンB2のN末をアフリカツメガエルの卵母細胞に過剰発現させると第一減数分裂時に正常な紡錘体が形成されず単極の紡錘体が形成された。これはサイクリンB1のN末を過剰発現させた時には観察されず、サイクリンB2に特異的であった。さらにサイクリンB2のN末の欠失突然変異を用いた実験から、サイクリンB2のN末115番目から121番目の7アミノ酸が正常な紡錘体形成に必要である事を見い出した。中心体複製にはサイクリンA/cdk2が関与する事を考えると、中心体の分離にもサイクリンA/Cdk2がモータータンパク質やサイクリンB2のリン酸化を介して関与している可能性が示唆された。今までの我々の結果から、培養細胞においては染色体凝縮がMPFによるのではなくむしろサイクリンA/cdk2であること、また、MPFの活性化にもサイクリンA(orE)/cdk2が必要であることが強く示唆された。そこで、in vitroでS期、M期を交互にくり返すカエルの卵抽出液を用いて、サイクリンA/cdk2(またはサイクリンE/cddk2;カエルの初期胚では、サイクリンA/cdk2の機能がサイクリンE/cdk2で肩代わりされているという報告があるので)の活性とMPF活性・染色体凝縮の関係を明らかにするため解析を進めている。そのため昆虫細胞のタンパク質発現系を用いて、サイクリンA/cdk2(orサイクリンE/Cdk2の複合体を精製している。しかしながら、技術的な問題からまだ複合体としての精製に成功してない。それで現在、サイクリンA(orE)/cdk2のインヒビターであるp21(cip)タンパク質を大腸菌で作製・精製して、それをカエルの2細胞期の両割球に注入し、MPFの活性化・染色体の凝縮にサイクリンA/Cdk2(orサイクリンE/CDK2)が必要かどうかを、in vivoで調べている。そして、このMPF活性化の阻害効果も、P21(Cip)濃度依存的であった。この結果から、初期胚において、in vivoにおいてもサイクリンA(or E)/Cdk2の活性が、MPFの活性化に必要であることが派唆された。現在、この分裂の停止した胚の染色体の様子を、切片を作製して調べている。

さらにサイクリンB2のN末の欠失突然変異を用いた実験から、サイクリンB2のN末115番目から121番目の7アミノ酸が正常な紡錘体形成に必要である事を見い出した。中心体複製にはサイクリンA/cdk2が関与する事を考えると、中心体の分離にもサイクリンA/Cdk2がモータータンパク質やサイクリンB2のリン酸化を介して関与している可能性が示唆された。複製されたDNAが娘細胞に正確に分配されるためには、DNAが凝縮して染色体構造をとり、紡錘体が正確に構築されることが必須である。今回、中心体の複製・分離にサイクリンB2が関与する事を見い出したので報告する。サイクリンB2のN末をアフリカツメガエルの卵母細胞に過剰発現させると第一減数分裂時に正常な紡錘体が形成されず単極の紡錘体が形成された。これはサイクリンB1のN末を過剰発現させた時には観察されず、サイクリンB2に特異的であった。次にそのN末の部分にはnuclear export signal (NES)がある事が報告されたので、紡錘体形成にそのNESが関与するかどうかをその配列に点突然変異を導入して調べた所、正常な紡錘体が形成された。このことから、NESは紡錘体形成に関与しない事がわかり、それ以外の未知の配列が関与する事が示唆された。次に、この7アミノ酸のみが紡錘体形成に関与しているかどうか調べるため、この7アミノ酸のみをGSTにつないで過剰発現させたり、ペプチドを卵母細胞に導入した。しかしながら、単極の紡錘体は形成されなかった。これらの結果から、この7アミノ酸は正常な紡錘体形成に必要ではあるが、これの過剰発現で紡錘体が正常である事から、それ以外の何らかの配列が必要である事が明らかになった。さらに受精後の胚にたいして同様の実験を行った所、受精後の分裂にも紡錘体形成にサイクリンB2のN末が関与する事が示された。中心体複製にはサイクリンA/cdk2が関与する事を考えると、中心体の分離にもサイクリンA/Cdk2がモータータンパク質やサイクリンB2のリン酸化を介して関与している可能性があると考えている。
Aβオリゴマーカルシウムチャンネルに着目したアルツハイマー病神経変性機構の探索

アルツハイマー病モデルマウスと野生型マウスから調整した培養神経細胞にAβオリゴマーを投与すると細胞内カルシウム濃度の著明な増加と細胞死が観察された。しかし既存のカルシウムチャンネル阻害薬ではその抑制効果を認めず、Aβオリゴマー特異的抗体でのみ両者の顕著な抑制が可能であった。この結果はAβオリゴマー自体が細胞外からのカルシウム流入をきたす神経細胞膜障害を惹起することで、神経毒性を発揮していると推測された。前年度に得られた知見をアルツハイマー病患者脳の二大病理変化である老人斑と神経原線維変化を再現するアルツハイマー病モデルマウス(3x-AD Tg)から調整した培養神経細胞で再評価した。3x-AD Tg由来神経細胞はPS1変異に起因した細胞内カルシウム代謝異常を有するが、既存のカルシウムチャンネル阻害薬では細胞内カルシウム濃度の制御不能で、細胞死も抑制できなかった。Aβオリゴマー投与下では細胞内カルシウム濃度の著明な増加と細胞死が観察されたが、既存のカルシウムチャンネル阻害薬効果は認めぬが、Aβオリゴマー特異的抗体の存在下では両者の顕著な抑制が可能であった。この結果はAβオリゴマーにより惹起される細胞内カルシウム濃度増加は、細胞内でなく細胞外由来であり、Aβオリゴマー依存性変化であることを示している。昨年度得られた結果と総合し、Aβオリゴマー自体がカルシウム流入をきたす神経細胞膜障害を惹起することで、神経毒性を発揮すると推測された。我々の開発したAβオリゴマー特異的抗体の新規薬理作用として重要な知見と考えられた。平成23年度は、分子量で分画取得した100kDa以上のサイズの抗Aβオリゴマーがカルシウム流入効果を最大限に発揮し、細胞死を惹起することの傍証を得た。また培養神経細胞におけるこのカルシウム流入効果に起因した細胞死を既存のカルシウムチャンネル阻害薬(MK-801, D-AP5, Nifedipine)は阻害できず、我々の開発したAβオリゴマー特異的抗体のみが阻害可能であることを確認した。また市販の抗Aβ抗体(抗Aβオリゴマー抗体A11を含む)ではその阻害活性を認めず、我々の抗体が認識する構造体のみに、カルシウムチャンネル活性が存在すると考えられた。また、アルツハイマー病モデルマウスに施行した免疫療法でその記憶障害発症効果が確認されているが(Takamura A et al, Mol Neurodegener, 2011)、その治療マウス脳解析の結果、Ca2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ(CaMKII)の自己リン酸化が亢進していること、一方でNMDA受容体のNR2Bのリン酸化には著変を認めぬことが明らかとなり、NMDA受容体非依存的なカルシウム流入がアルツハイマー病モデルマウスにおける記憶障害発症に深く関与していることを明らかとした。一方、CREB自体の変化は明らかでなく、一方でPSD95の優位な維持効果が治療マウスで認められる点から、Aβオリゴマー自体が形成するカルシウムチャンネルの主座はシナプスと考えられ、Aβオリゴマーの神経毒性発揮部位として矛盾しない所見であると考えられた。当該年度の研究はおおむね順調であり、次年度へつながる成果が得られてる。アルツハイマー病の治療ではなく、先制医療を可能とするツール開発が最終目標であるが、本年度の研究成果はAβオリゴマー由来のカルシウムチャンネル阻害薬にその整合性が得られ、本研究遂行に意を強くしたものである。培養細胞実験において、Aβオリゴマー特異的抗体活性を有し、またカルシウムチャンネルブロッカー活性をあわせもつ持つ機能性ペプチドを設計・同定し、前臨床試験でその有用性を検証する。
配偶子操作(IVFーET,GIFT,IVFーETR,Micromanipulation)に関する研究

(1)IVFーET:全体の妊娠率(対胚移植)は29、0%(357/1231),分娩率(予想値を含む)は17、3%であった.IVFーETは精子受精能力異常(ZSPT≦30%)を除く,各種の難治性不妊に対してほぼ同等に有効であった.また妊娠率は1日目(前核期)の移植でも,2日目,3日目の移植でもほとんど同じであった。IVFーETは外来ベ-スで,しかも日曜祭日を避けて採卵,移植できることが明らかになった.(2)GIFT:GIFTの妊娠率は20、1%(49/244)で,当初予想したよりも低い成績であった.もっとも期待した男性不妊でもZSPT異常(≦30%)を伴り場合は,妊娠率は7、8%と極端に悪かった。GIFTはいずれIVFーETにとってかわられるものと思われる.(3)IVFーETR:妊娠率は28、5%(41/144)と比較的良好であった.とくに卵管内精子輸送障害を伴り免疫性不妊では56、3%(9/16)の高い妊娠率が得られた.IVFーETRは今後とも免疫性不妊に対して,また男性不妊に対しては顕微授精との組合せで活用させるものと思われる.(4)Micromanipulation:不妊患者3928例のZSPTの分析から,男性不妊の予後が悪いのはその多くが精子の受精能力異常や受精能力障害(ZSPT0%)を合併するためであることが再確認された.またZSPT>30%,回収運動精子>3×10^6/ml,Velocity≧55microus/secがIVF遍応の目安となることがわかった.IVFの非受精卵を用いて顕微授精の臨床応用について検討した.透明帯開孔術(串刺法),囲卵腔内精子注入は安全かつ有効で,十分臨床応用可能であることがわかった.これに対して,卵子内精子注入は受精率,分割率とも低く,前核形成過程に問題があることが示唆された。(1)IVFーETの成績:平成元年度々256例の不妊患者に計319回のIVFーETを行い、99例が104回妊娠した。対患者および付移植周期の妊娠率はそれぞれ38.7%、32.6%であった。昭和62年度(25%)、昭和63年度(27.4%)に比べてIVFの予後はかなり改善したが、これはGnRHaを併用した過排卵法の導入によるものではないかと思われる。なお適応別による妊娠率にはほとんど差は認められなかった。(2)GIFの予後と精子受精能力の関係:昨年まで187例の不妊患者に計244回のGIFTを施行し、49例(20.1%)が妊娠した。ZSPT正常・中間群(>30%)の妊娠率が23.3%(45/193)なのに対し、異常群(≦30%)のそれはわずか7.8%(4/51)であった(P<0.025)。この傾向は精液検査所見に関係なく認められた。GIFTの予後を左右する最大の因子は精子の受精能力であることが明らかになった。(3)Micromanipulationの成績:IVFで受精しなかったヒト卵子を用いてmicromanipulationを行った。

透明帯開孔術では酸性溶液(PH2.2)を用いる方法(Drilling)とmicropipettenによる串刺法を比較した。受精率はそれぞれ24.8%(26/105)、44.4%(79/178)で串刺法の方が良好であった。また多精子受精はDrillingの方が34.6%(9/26)と串刺法の5.1%(4/79)に比べてはるかに高率であった。ヒトの透明帯開孔術にはDrilling法は不適切と思われる。囲卵腔内精子注入では、75個の卵子中63個(84%)が生存し、このうち29個(46%)が受精した。注入精子数は平均2.8個(110)で、多精子受精は14個(48.3%)に認められた。卵子内精子注入では、24個の卵子中15個(62.5%)が生存し、うち5個(33.3%)が受精した。IVFーET:平成2年度は299各に382回のIVFーETを行い,新たに3日目の胚移植を導入した.対患者および対移植周期の妊娠率はそれぞれ,31.8%(95/299),25.9%(99/382)で,前年度に比べてやや低下した.1日目移植(前核期移植)の妊娠率が13.9%(20/144)と大巾に低下したためであった。なお,2日目移植,3日目移植の妊娠率はそれぞれ,31.9%(61/191),38.3%(18/47)と比較的良好であった。主な不妊原因別妊娠率は,卵管性27.1%(55/203),子宮内膜症26.4%(29/110)卵管内精子輸送障害25.9%(7/27),原因不明19.0%(8/42)であった.年令別妊娠率では,年令の増加とともに低下する傾向には変りなく,40才以上では,わずか3.7%(1/27)の妊娠率であった。Micromanipulation:IVFで受精しなかった卵子を患者の同意を得て実験に供した。精子はIVFに用いた天精子を使用した。串刺法と用いた透明帯開孔術では98.5%(192/195)の卵子が生存し,46.9%(90/192)が受精した.多精子受精は6.7%(6/90)で通常のIVFと変らなかった.囲卵腔内精子注入では,92.7%(102/110)の卵子が生存し,うち51.0%(52/102)が受精した,注入精子数は平均3.3(110)で,多精子受精は34.6%(18/52)とかなり高率であった.運動精子を注入した場合と非運動精子を使用した場合とでは,受精率にとくに差は認められなかった.卵子内精子注入では,64個の卵子中54個(84.3%)が子存し,うち7個(13.0%)に2個の前核形成を認めた.しかし分割したのはわずか1個(1.9%)であった.これに対して,圧電駆動で精子を注入し,術後SμH ionophore A23187で5分間処理した群では,91.8%(67/73)の卵子が生存し,このうち22.4%(15/67)に2個の前核を認め,16.4%(11/67)は24細胞期に分割した.(1)IVFーET:288名の不妊患者に355回のIVFーETを行った。結果は100名の患者が106回妊娠し,対移植周期の妊娠率は29.9%であった。過排卵は333回(93.8%)と大半がGnRHaーHMGーhCGで,その妊娠率は30.6%であった。採卵卵子数(6.9±3.8),受精卵数(5.6±3.4),正常胚数(2.6±2.0)はこれまでと変らなかった。移植時期別の妊娠率は,1日目(前核期)28.0%,2日目32.4%,3日目22.8%で大きな差はなかった。主要不妊原因別の妊娠率は,卵管性25.0%,子宮内膜症37.3%,卵管内精子輸送障害33.3%,原因不明25.8%でこれまでと同様の傾向を示した。年齢別の妊娠率は,20才台が42.1%ともっとも高く,以後は漸減し、40才以上では18.2%と低率であった。
マツノザイセンチュウ感染ウイルスの探索

本研究所で保存されているいくつかの系統のマツノザイセンチュウからウイルスの検出を行ったが、感染ウイルスを発見することはできなかった。また、他の生物を宿主とするウイルスを接種、あるいはエレクトロポレーション法により導入を試みたが、それでも感染するウイルスを見つけ出すことはできなかった。これらの結果から、マツノザイセンチュウはウイルス病に対してなんらかの強力な抵抗性を有していることが示唆され、まずはその解明が求められることとなった。マツ材線虫病は現在、北海道をのぞく日本全土に広がり、甚大な被害を起こしている。これまでに多くの防除策が開発されてきたが、いずれの防除法も完全ではなく、また、環境への影響の懸念や材質の低下、あるいはコストなど多くの問題を克服できていない。この現状を打開する新しい防除法として、本研究は、天敵微生物としてウイルスを利用したマツノザイセンチュウの生物防除法を開発することを最終目的とし、まずマツノザイセンチュウに感染する病原性ウイルスの探索を行った。全国各地から採集した、さまざまな形質を持ついくつかの系統のマツノザイセンチュウから、ウイルスゲノムの検出、あるいは電子顕微鏡を用いた観察によってウイルスの検出を行った。しかし、感染しているウイルスを発見することはできなかった。また、別の手段として、植物や昆虫など他の生物を宿主とする既知のウイルスを接種することにより、マツノザイセンチュウにも感染能をもつウイルスの発見を試みた。接種はエサとともに経口摂取する方法と、薬品をもちいて外皮に接種する方法を試みたが、マツノザイセンチュウに感染・増殖するウイルスを見つけ出すことはできなかった。さらにエレクトロポレーション法による導入も試みたが、それでも感染ウイルスを見つけ出すことはできなかった。本研究の全体構想は、ウイルスを用いたマツノザイセンチュウの生物防除法を開発することである。ただし、マツノザイセンチュウに感染するウイルスはまだ発見すらされていない。そのために今回研究費の交付を申請する期間内では、マツノザイセンチュウに感染する病原性ウイルスを探索・選抜し、性状の詳細な解析と病原性の評価を行って、安全な管理を可能にすることを計画している。初年度である本年度は、まず、マツノザイセンチュウに感染するウイルスを探索した。探索は、自然界でマツノザイセンチュウに感染している未知のウイルスを検出する方法と、マツノザイセンチュウに既知のウイルスを接種する方法との2つの方法で行った。自然界で感染している未知のウイルスを検出する方法では、各地からさまざまな系統のマツノザイセンチュウを幅広く採集し、電子顕微鏡によりウイルス粒子の確認を行った。しかし、マツノザイセンチュウに感染していると思われるウイルスは発見できなかった。また、マツノザイセンチュウに既知のウイルスを接種する方法では、各種のウイルスを接種し、その増殖を確認した。接種には、他の線虫で増殖が確認されているウイルスだけでなく、その他のウイルスも各種用いた。接種は、経口投与あるいは外皮からの接種により行った。しかし、マツノザイセンチュウ体内での増殖はいまだ確認されていない。マツノザイセンチュウには強力な抗ウイルス手段を有していることも考えられた。本年度は、マツノザイセンチュウに感染するウイルスを探索した。自然界でマツノザイセンチュウに感染している未知のウイルスを検出する方法と、マツノザイセンチュウに既知のウイルスを接種する方法との2つの方法で行ったが、どちらの方法を用いてもマツノザイセンチュウに感染するウイルスは発見できなかった。しかし、線虫がRNAiなど、優れた抗ウイルス手段を備えている可能性は当初から想定していたことではある。その抗ウイルス手段を把握し、それを打破するウイルスを継続して探索していく。ウイルスの感染・増殖が成功しないと次のステップへは進めない。だから、翌年度はまずウイルス接種の手法を徹底して改善する。接種の際の薬品の使用、あるいはマイクロインジェクションにより、接種効率の大幅な向上が達成されると考えている。増殖の見られたウイルスに関して計画通り病原性の評価、病原性因子の特定、作用機作の解明を行う。上記のように、実験計画には若干の見直しがあったものの、ウイルス接種の手法の改善に用いられる試薬・設備はすでに準備されているため、次年度の研究費の使用計画に変更はない。つまり、物品費として、遺伝子解析用試薬、マイクロアレイ作製費、プラスティック・ガラス器具、論文別刷り費など、旅費・人件費等として成果発表旅費、論文校閲料、投稿料などを使用する。