hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
白金族クラスター錯体の合成

Pt^<III>に代表されるd^7系の金属イオンやMo^<II>に代表されるd^4系の金属イオンは,多様な有機系架橋配位子が架橋したランタン型二核錯体が数多く知られている.これらの錯体の金属間には単結合あるいは4重結合が存在し,・架橋配位子のbite distanceの違いによりPt-Pt距離は大きく変化するが,Mo-Mo距離はさほど変化しない.我々は,架橋配位子の金属間相互作用に与える影響に興味を持ち,それ自身が酸化還元に対して活性な金属酸化物イオンや金属硫化物イオンを架橋配位子として導入した多核錯体の合成を計画した.Ptの場合,一般に2価の原料を用いて酸化によりPt^<III>種を得るので,原料錯体として[PtCl(trpy)]Cl(trpy=2,2′:6′,2′′-terpyridine)および[PtCl_2(dmbpy)](dmbpy=4,4′-dimethylbipyridyl)を選び金属硫化物イオンとの反応を種々試みたが,常に有機溶媒に難溶性の錯体が得られ、結晶構造解析による構造の決定に至っていない.Rhの場合,d^8のRh^Iを用いても配位子によってはRh^<III>に簡単に酸化されるので,ランタン型の[Rh_2(CH_3COO)_4]にterpyridineを配位させて一旦[Rh_2(trpy)_2(CH_3COO)]^<3+>のような3座をブロックした錯体を合成し,それに金属酸化物イオン等を反応させようと考えた.しかし、予想に反し,通常3座のキレート配位子として作用するterpyridineが単座でRh_2(CH_3COO)_4ユニットの軸位に配位した極めて珍しい錯体,Rh_2(CH_3COO)_4(trpy-N)_2]の単離と構造解析に成功した.また,MoではWS_4^<2->が架橋した[Mo_2(PhCOO)_2(WS_4)_2]^<2->が既に知られているが,同様の合成法でMoS_4^<2->を用いて反応を試みたところ[Mo_2(PhCOO)_2(MoS_4)]^<2->と思われる錯体の合成,単離に成功した.残念ながらX線構造解析にはまだ成功していないが,元素分析,IR,uv-vis等の測定結果から,この錯体は[Mo_2(PhCOO)_2(MoS_4)_2]^<2->にほぼ間違いないと考えている.Pt^<III>に代表されるd^7系の金属イオンやMo^<II>に代表されるd^4系の金属イオンは,多様な有機系架橋配位子が架橋したランタン型二核錯体が数多く知られている.これらの錯体の金属間には単結合あるいは4重結合が存在し,・架橋配位子のbite distanceの違いによりPt-Pt距離は大きく変化するが,Mo-Mo距離はさほど変化しない.我々は,架橋配位子の金属間相互作用に与える影響に興味を持ち,それ自身が酸化還元に対して活性な金属酸化物イオンや金属硫化物イオンを架橋配位子として導入した多核錯体の合成を計画した.Ptの場合,一般に2価の原料を用いて酸化によりPt^<III>種を得るので,原料錯体として[PtCl(trpy)]Cl(trpy=2,2′:6′,2′′-terpyridine)および[PtCl_2(dmbpy)](dmbpy=4,4′-dimethylbipyridyl)を選び金属硫化物イオンとの反応を種々試みたが,常に有機溶媒に難溶性の錯体が得られ、結晶構造解析による構造の決定に至っていない.Rhの場合,d^8のRh^Iを用いても配位子によってはRh^<III>に簡単に酸化されるので,ランタン型の[Rh_2(CH_3COO)_4]にterpyridineを配位させて一旦[Rh_2(trpy)_2(CH_3COO)]^<3+>のような3座をブロックした錯体を合成し,それに金属酸化物イオン等を反応させようと考えた.しかし、予想に反し,通常3座のキレート配位子として作用するterpyridineが単座でRh_2(CH_3COO)_4ユニットの軸位に配位した極めて珍しい錯体,Rh_2(CH_3COO)_4(trpy-N)_2]の単離と構造解析に成功した.また,MoではWS_4^<2->が架橋した[Mo_2(PhCOO)_2(WS_4)_2]^<2->が既に知られているが,同様の合成法でMoS_4^<2->を用いて反応を試みたところ[Mo_2(PhCOO)_2(MoS_4)]^<2->と思われる錯体の合成,単離に成功した.残念ながらX線構造解析にはまだ成功していないが,元素分析,IR,uv-vis等の測定結果から,この錯体は[Mo_2(PhCOO)_2(MoS_4)_2]^<2->にほぼ間違いないと考えている.
多能性幹細胞とヒト凍結脳のタウ蛋白における網羅的リン酸化比較解析

アルツハイマー病、Kii ALS/PDC、及びFTDP-17といったタウオパチーでは、側頭葉内側面を中心としたリン酸化タウの蓄積を認めるが、タウのリン酸化の違いと疾患特異性の関係は不明である。よって、Kii ALS/PDCに特異的なタウのリン酸化状態を調べるために、健常者・患者凍結脳及びiPS細胞由来神経細胞からタウを精製し、質量分析法によってリン酸化レベルやリン酸化部位の網羅的解析を行う。また、「同一疾患でもタウのリン酸化状態が異なる」、「脳部位や細胞種特異的に促進されるタウのリン酸化状態が存在する」という仮説を立て、脳内の複数部位・複数細胞のリン酸化状態の検討も行う。
ヘキサアザフェナレニルアニオンを基盤にしたナノ配位空間の構築

本研究では、フェナレニルに六つの窒素原子を導入したヘキサアザフェナレニルを分子設計し、そのアニオン体の合成・単離および性質の解明を行った。また、ヘキサアザフェナレニルアニオンを有機配位子として用いたナノ配位空間を構築した。アニオンの前駆体であるヘキサアザフェナレンは市販品から四段階で合成し、これに水酸化カリウムを作用させることでカリウム塩を合成・単離した。このヘキサアザフェナレニルアニオンは、空気中でも安定なフェナレニル型アニオンの最初の例である。X線結晶構造解析からヘキサアザフェナレニルアニオンは、強固な平面構造と高い対称性を有する拡張π共役電子系アニオンであることがわかった。また、結晶水として含まれている水分子との放射状の相互作用による二次元シート構造と、ヘキサアザフェナレニル自身のカラム構造に基づく三次元ネットワークを形成していた。また、ヘキサアザフェナレニルアニオンの銅錯体の合成・単離にも成功した。X線結晶構造解析の結果、ヘキサアザフェナレニルは金属錯体中においても放射状に広がった相互作用とπ-πスタッキングを同時に取り得る新しい特徴を持った有機配位子であることがわかった。さらに、置換基導入型ヘキサアザフェナレニルの有効な合成法を開発した。ヘキサアザフェナレニルの周辺炭素骨格上にtert-ブチル基を導入した誘導体を市販の化合物であるトリシアノメタニド塩および対応するアミジン塩酸塩から一段階で合成することに成功した。同様の方法によりトリフェニル体も得られた。また、モノ-tert-ブチル-ジフェニル置換誘導体の合成にも成功した。
人工心肺中低頻度人工呼吸の肺保護効果の研究：臨床応用と未熟肺への基礎的アプローチ

開心術において人工心肺中に低頻度で人工呼吸を継続するLow Frequency Ventolation(LFV)法が術後肺機能を改善し患者に臨床上の利益をもたらすか研究した。LFV法は人工心肺後2時間における動脈血酸素分圧がcontrol群より有意に高く人工心肺直後の二酸化炭素分圧は有意に低値であった。肺からの乳酸流出は人工心肺後2時間でLFV群は有意に低く肺虚血再灌流障害が軽減していた。気管支粘液中IL-6, IL-8は人工心肺後2時間で有意にLFV群で抑制されていた。LFV群では術後人工呼吸時間は短い傾向があり、患者の術後経過にも有利である可能性が示唆された。我々はブタ基礎実験において人工心肺中の低頻度人工呼吸(Low Frequency Ventilation:LVF法)が著明に人工心肺後の肺障害を軽減することを報告した。本研究はLFV法を臨床応用し成人開心術における肺障害予防効果とその機序解明に取り組む目的で行っている。昨年度本研究が倫理委員会で認められ、今年度まず我々が行うのは成人開心術におけるLFV法の有用性の研究である。肺障害が重篤に見られる手術群(人工心肺約4時間の大動脈弓部置換術)と肺障害が軽度の手術群(同2時間以内の大動脈弁置換手術)に分けて研究する。評価項目はa)臨床経過(人工呼吸時間、ICU滞在時間), b)動脈血液ガス所見の変化,c)胸部X-p (無気肺、肺水腫他), d)スワンガンツカテーテルによる肺動脈圧・肺血管抵抗の術中・術後変化, e)肺動・静脈血中白血球数、乳酸値, f)気管支粘液中のinterleukin(IL)-6, basic FGF,補体価(C3, C4)である。本年度は23人の患者から本研究参加への同意が得られ、19人の患者からデータを採取することができた。現在検体から各検査項目の測定とデータ解析を進行中である。上記の如く本研究は人工心肺1-2時間の軽症群と3-4時間以上の重症群に分けて研究するが、今のところ重症群は2例のみであるため、来年度は重症例を中心にデータ収集を図る予定である。軽症群のデータ解析では、全ての症例で大きなeventや合併症なく経過し順調に人工呼吸器から離脱したが、一方で人工心肺後肺機能(血液ガス所見)は悪化し、肺動脈圧及び肺血管抵抗は上昇、気管支粘液中のC3, C4, IL-6は有意に上昇した。LFV群と非LFV群での比較は現在行っているところである。本研究は心臓・胸部大血管手術における人工心肺後肺障害に関するものである。人工心肺中の低頻度人工呼吸が肺障害軽減効果を示すかを調査することが目的であり、臨床研究と動物実験に分けられるが、主たる研究は臨床研究である。(臨床研究)人工心肺中の低頻度人工呼吸の有無によって術後の肺機能に差があるかを調査する。本研究開始に先立って倫理委員会の承認が必要であるが、これを得るのに予想以上の時間を要した。本研究では様々な評価項目があるが、倫理委員会で問題となったのは気管支洗浄液の採取と肺生検の患者に対するストレスの大きさであった。最終的に気管支洗浄液はストレスの少ない専用プローベを使用すること、肺生検は施行しないことで漸く承認された。肺生検はできなくなったがその他多くの評価項目は認められ、十分な研究の意義が見込まれる。(動物実験)生後2週、3-5Kgのブタに人工心肺を装着して行う、臨床に即した実験である。平成24年度は実験室の確保困難と人工心肺装置の故障などから準備だけに終わった。平成25年度から開始の予定である。本研究は人工心肺中の低頻度人工呼吸(Low Frequency Ventilation:LVF法)を臨床応用し成人開心術における肺障害予防効果とその機序解明を目的で行っている。評価項目はa)臨床経過, b)動脈血液ガス,c)肺動脈圧・肺血管抵抗, d)肺動・静脈血中白血球数、乳酸値, e)気管支粘液中のchemical mediatorである。本年度は24人からデータを採取した。昨年度は19人からデータを採取したが気管支粘液データ測定に問題があり最終的に評価が可能であった患者数は10人であり計34人が対象となっている。人工心肺時間は147.2±46.7vs143.7±42.4(control vs LFV)と両群に差はなく肺機能を含めた術前患者背景にも有意差はなかった。両群の比較では人工心肺後のPO2/FiO2に有意差が認められた。術前と比べてControl群では人工心肺後2時間において有意にPO2/FiO2の低下を認めたのに対してLFV群では有意な低下はなく、術前を100とした同値はcontrol群では71.0±22.4に対してLFVでは91.3±26.7と有意(p<0.05)にLFVで人工心肺後PO2/FiO2は保たれていた。肺からの乳酸の排出量の比較ではLFV群で人工心肺後2時間において低い傾向がみられ(p=0.1)、LFVの肺保護効果には肺組織の虚血再還流障害軽減が関与する可能性が示唆された。

気管支粘液中のchemical mediatorの変化を比較すると計20症例(control:12例、LFV:8例)では、IL-6は全体で人工心肺後に上昇する傾向(p=0.07)を示し、control群でより強い上昇傾向(contol: p=0.10, LFV: p=0.43)を示した。気管支粘液データの測定には時間を要する為、現在その評価を進めている。本年度は不足分データを補充すべく4人からデータを採取し同時にchemical mediator測定を完了させデータ解析を行った。対象は計40人(LFV群21人・control群19人)。人工心肺時間は162.5±64.0vs146.1±40.4(control vs LFV, p=0.4)と両群に差なく年齢や肺機能等術前背景にも有意差はなかった。人工心肺後2時間のPO2/FiO2はLFV群がよくcontrol: 67.5%, LFV: 94.1% (術前値に対する%, P=0.003)、AaDO2もLFV群で有意に良かった(control: 242.2±33.5, LFV: 165.5±27.4)。肺の乳酸排出は人工心肺後肺動脈乳酸値に有意差がない一方肺静脈ではLFV: 17.1±6.9, control:24.1±12.5mg/dlと有意にLFV群で乳酸流出が少なかった。Chemical mediatorはIL-6, IL-8, FGFを測定、何れも人工心肺前では2群で有意差はなかったが、人工心肺後ではIL-6はcontrol: 2604.6±1190.0, LFV: 1101.5±339.1 (p<0.05)と有意にLFV群で低く、IL-8も人工心肺後はLFV群で低値であった(control: 211050.0±74552.3, LFV: 48618±14193.3, p<0.01)。FGFは人工心肺前・後において両群間に有意差は認めなかった(人工心肺後control: 1854.4±550.5, LFV: 2343.9±712.1, p=0.60)。本結果からLFVは人工心肺後の肺機能障害を改善し、その機序としてはLFV群で乳酸流出が少ないことから人工心肺中の虚血障害の抑制、気管支粘液中のIL-6, IL-8の上昇抑制から炎症反応の軽減効果が関与していると示唆された。開心術において人工心肺中に低頻度で人工呼吸を継続するLow Frequency Ventolation(LFV)法が術後肺機能を改善し患者に臨床上の利益をもたらすか研究した。LFV法は人工心肺後2時間における動脈血酸素分圧がcontrol群より有意に高く人工心肺直後の二酸化炭素分圧は有意に低値であった。肺からの乳酸流出は人工心肺後2時間でLFV群は有意に低く肺虚血再灌流障害が軽減していた。気管支粘液中IL-6, IL-8は人工心肺後2時間で有意にLFV群で抑制されていた。LFV群では術後人工呼吸時間は短い傾向があり、患者の術後経過にも有利である可能性が示唆された。本研究が遅れている最大の要因は気管支粘液におけるchemical mediator測定の困難さにある。本研究では各症例において3回(人工心肺前、直後、2時間後)気管支粘液の採取を行っているが、それぞれにおいて気管支鏡下に特殊なプローべを使用して粘液を採取している。一回に採取される気管支粘液量は1-18mg程度であるがなかなか採取量が安定せず、さらにそこに含まれるタンパク量(アルブミン量)も各サンプルばらつきが大きく信頼のおける検体採取が簡単ではない。
本態性高血圧症患者の運動療法における降圧と糖代謝異常との関連

本研究の目的は本態性高血圧患者で認められる糖代謝異常がどの程度インスリン依存性及び非依存性糖取込み能の異常であるかをIVGTTを用いて判定することであった。すでに確立されている乳酸第一変移点に相当する軽い強度の運動療法(10週間)を施行後に、IVGTTを再検し糖取り込み能の改善程度を同定した。さらに、この改善に関係する可能性のある他の因子(一般採血、body mass index、waist-hip ratio、体内脂肪量の推定、総およびLDLコレステロール、中性脂肪、遊離脂肪酸、レプチン等)を測定した。このような研究の結果、本態性高血圧患者の糖取込み能異常はインスリン依存性及び非依存性の両成分の異常を介していた。しかし、インスリンの分泌自体も改善していたことより耐糖能の改善にインスリン分泌能及び糖取込み能の両方が関与することが明らかになった。関連する因子分析ではwaist-hip ratio、推定体内脂肪量、LDLコレステロール及び中性脂肪は減少傾向を示したが、遊離脂肪酸body mass index、総コレステロールおよびレプチンは変化を示さなかった。群ごとの症例数がまだ少なく、インスリン依存性及び非依存性糖取込み能との間に有意な相関関係を示した因子は見出せなかった。本研究結は今年度の体力医学会にて発表予定である。遺伝子解析(ACE、アンジオテンシノーゲン、AT1受容体)は施行したが、糖取込み能との間に有意な相関関係は認められていない。各遺伝子多型の頻度と表現型(降圧度等の過去のデータ)との因子分析を加えて施行予定し発表予定である。平成11年度の研究予定は高血圧者の運動療法の実施と糖負荷試験の実施であった。本態性高血圧患者のリクルートは予定どうり進行中であり、外来での6週間の観察期間後、自転車エルゴメーターによる漸増運動負荷試験による適切な運動強度設定を行っている。運動療法開始前にIVGTTによるインスリン感受性及び非感受性糖取り込み能の算定を行い、数人の本態性高血圧患者が運動療法を受けている。症例数がまだ少ないのでリクルートを強化する必要がある。遺伝子解析は過去に我々の研究室で運動療法を行った患者からのヘパリン採血は終了し、遺伝子解析が進行している。今後、各遺伝子多型の頻度と表現型(降圧度等の過去のデータ)との因子分析を行う予定である。平成12年度の研究予定は高血圧者の運動療法の実施と糖負荷試験の実施であった。

関連する因子分析ではwaist-hip ratio、推定体内脂肪量、LDLコレステロール及び中性脂肪は減少傾向を示したが、遊離脂肪酸、body mass index、総コレステロールおよびレプチンは変化を示さなかった。群ごとの症例数は少ないが、インスリン依存性及び非依存性糖取込み能との間に有意な相関関係を示した因子は見出せなかった。本研究結果は今年度の体力医学会にて発表した。遺伝子解析(ACE、アンジオテンシノーゲン、AT1-受容体)は施行したが、糖取込み能との間に有意な相関関係は認められていない。各遺伝子多型の頻度と表現型(降圧度等の過去のデータ)との因子分析も加えて施行した。
育児支援のための乳児用ベッドの開発に関する研究

平成20年度までに、乳児用ベッドの外観デザイン、ベッドに揺動運動を与える機構の設計、さらに保育者支援の立場から乳児の状態に応じて適切にベッドに揺動運動を与えるシステムの構築をおこない、これらの検討・設計を基に実用1号機を製作した。平成21年度は実用1号機を使用した約20名のユーザーの意見を踏まえて、改良型ベッドを設計・製作した。具体的実施内容は以下の通りである。1.保育者支援の観点から、保育者が操作しやすいリモコンインターフェースをデザインするとの目的に対して、タッチパネル式の大きなリモコンから、ボタン式の小さなリモコンに改良した。2.質量が大きすぎるとの意見に対し、個々の構成部品への要求を精査することにより、質量を65kgから45kgに小さくした。さらに4輪のうち2輪に使用していたホイールをキャスターに変更した。これらの改良の結果、女性でも容易に移動可能なベッドとなった。3.ベッドの安全性の向上については、とくに安全に対して意識が強い子どもプラザの職員の方々の意見を参考にして、角や凸部を排除したベッドケージ部を新設計した。また、モーター容量を40Wから25Wとして過負荷により自ずと停止するとの考え方で安全性を高めた。モーターに関しては当然ながら電流検知により逐次負荷は把握して上でベッドを揺動させることにしている。以上の改良を加えたものを、電動スウィングベッド「スイマスマート」と命名して製品化した。この製品は、育児負担の軽減に役立つものであり、少子化社会対策として有用なものであると考えている。まず、ベッドに求められる要求事項をまとめたりえで、企菜のテザイナーの協刀を得て、ベッドのタト観デザインをおこなった。例えば、家庭内を自由に移動できるようにという要求に対しては、ベッド本体にキャスターとホイールを取り付けるとともに、ベッド外寸は一般家庭のドアの寸法を考慮して決定した。ついで、すでに実験で明らかにしていた乳児が心地よく感じる揺動運動を、実際のベッドで再現するための機構設旨計をおこなった。さらに、保育者支援の立場から、乳児の状態に応じて適切な揺動運動をベッドに与えることが有用であることから、連携研究者の協力を得て、乳児の状態を泣き声センサーで検知することを特徴とする以下のシステムを構築した。1.ベッドに取り付けた単一指向性のコンデンサーマイクから音声信号を取り込む。2.取り込んだ音声信号を、周波数・パワー・検知時間を考慮してPICマイコンで処理し、泣き声のみを検知する。3.シーケンサーは、PICマイコンからの泣き声検知信号を受け、モーターを制御してあらかじめ設定したパターンでベッドを揺動させる。4.ベッド揺動中に、泣き声が一定時間検知されない状況になれば、あらかじめ設定したパターンで徐々にベッドの揺動を停止する。上記の検討・設計を基に試作機を製作し、実際の家庭で12名の乳児に使用してもらった。使用者からのヒアリングやアンケート調査の結果、ベッドは夜間の夜泣きのときに加えて、日中、料理や洗濯などの家事をおこなっているときにおいても有効に使用できることなどが分かった。このことは、核家族化が進んだ現代社会において、このベッドが子育てを支援するために有用であることを示している。なお、その他本年度に予定していた聴覚・視覚刺激を乳児に与えることの有用性の検討については予定を変更し、次年度に実施することとした。
機能性アンチセンス核酸オリゴマーの合成と性質に関する化学的研究

エイズ等の抗ウイルス、抗癌に対して効果的な手段として注目を集めているアンチセンスアプローチに有効な特異的かつ選択的活性を持つ機能性アンチセンスオリゴマーの合成とその性質に関する化学的研究を行い以下の幾つかの有用な知見と結果を得た。1・機能性分子として興味ある酸化還元能をもつビオローゲン誘導体とDNAとの反応を検討したところ環状類縁体であるジアザピレン誘導体は極めて低濃度でも光照射下DNA切断活性があることが判明した。2・ビオローゲン誘導体がリン酸バックボーン部ヘアミデート結合の形で共有結合した数種の核酸オリゴマーの合成に成功し、各種スペクトルデータや分析手法、酵素反応等によりそれらの構造の確認を行った。3・合成オリゴマーの2重螺旋形成能を調べたところジアザピレン分子の導入は著しい安定化の寄与をもたらした。これはジアザピレンのインターカレーターとしての機能がはたらいていると考えられる。4・修飾部位では予想通り耐エキソヌクレアーゼ活性が認められた。5・グルコピラノースを糖部としたヌクレオシドやニトロソ尿素誘導体及びそのジスタマイシン混成体を合成しDNAとの反応を調べたところ後者二者はグアニン塩基のところを選択的にアルキル化した。6・ジアザピレン修飾核酸オリゴマーの相補的塩基配列をもつ核酸オリゴマーの光切断反応を検討した結果、本品は塩基並びに位置選択的切断活性を持ち、優れた機能性アンチセンス分子であることが判明した。7・ビオローゲン修飾オリゴマーの切断活性は弱いものであったが、興味あることにビオローゲン分子はジアザピレンとは異なった位置と様式でDNA分子を切断することが観測された。8・上記の切断反応のメカニズムの考察を種々行ったが、詳細については現在なお検討中であり今後の課題として残った。
応力腐食割れ亀裂先端における空孔生成機構の解明と空孔－添加元素間相互作用の評価

応力腐食割れ対策鋼として開発された低炭素ステンレス鋼でもなお、原子炉環境の高温水(約300°C)中においては、応力腐食割れの発生が見受けられる。この高温水中での応力腐食割れ亀裂進展は亀裂先端部の結晶粒界への原子空孔の凝集に起因する粒界結合力の低下が誘発しているのではないかという説が近年提唱されている。本年度は高温純水腐食がステンレス鋼中の原子空孔形成に与える影響について陽電子消滅法を用いて調べた。始めに真空中で1150°C・2時間の溶体化熱処理を施したSUS316Lステンレス鋼試料を用意した。引張応力下では空孔生成エネルギーが低下するとの計算機シミュレーションに基づく報告があることから、一部の試料には曲げ変形により表面に7%の引張ひずみを付与した。これらの無ひずみ材・曲げひずみ付与材を脱気288°C純水中に1200時間置き腐食させた後、陽電子消滅測定を行い消滅ガンマ線ピーク強度の陽電子入射エネルギー依存性を計測した。その結果、高温純水腐食により表面から200mmまでの領域で原子空孔の生成を示唆する消滅ガンマ線ピーク強度の増大が観測された。また、無ひずみ材と曲げひずみ付与材との比較では消滅ガンマ線ピーク強度に大きな差は観測されなかった。次に、無ひずみ材腐食試料から取得した消滅ガンマ線スペクトルを、2MeV電子線照射により単原子空孔を導入した参照試料から取得したスペクトルと比較したところ、両者のスペクトル形状は高運動量領域で一致しなかった。これは腐食試料中に含まれる欠陥は単原子空孔ではないことを示している。そこで無ひずみ材腐食試料を1200°Cまで100°C刻みで30分ずつ加熱処理を行ったところ、消滅ガンマ線ピーク強度の減少は1100°Cまで観測されなかった。これは腐食処理で生じた消滅ガンマ線ピーク強度の増大は試料表面における酸化膜の形成に起因していることを示唆する結果である。近年、高温水中における応力腐食割れ亀裂進展は、亀裂先端部の結晶粒界への原子空孔の凝集が誘発しているのではないかという説が提唱されている。本年度は陽電子消滅法を用いて、(1)ステンレス鋼応力腐食割れ亀裂近傍に形成される原子空孔の欠陥種の同定と、(2)異種元素添加がステンレス鋼中の原子空孔の熱安定性に与える影響について調べた。(1)に関して、20keVの陽電子マイクロビームを用いてSUS304ステンレス鋼応力腐食割れ亀裂近傍領域からの陽電子消滅ガンマ線スペクトルを取得した。このスペクトルと2MeV電子線照射により単原子空孔を導入したSUS304鋼から取得した陽電子消滅ガンマ線スペクトル形状とを比較した結果、両スペクトル形状は良い一致を示した。これは両試料中に含まれる欠陥種が同一であることを示しており、応力腐食割れ亀裂近傍には単原子空孔が形成されることが見出された。(2)に関して、照射誘起偏析抑制効果が報告されているHf,Zr,Ti,Nbのオーバーサイズ原子をそれぞれ0.5at%ずつ添加したSUS316Lステンレス鋼を用意し、温度約50°Cで2MeV電子線を1.5×10^<18>e-/cm^2照射し原子空孔を導入した。これらの各合金試料を室温から600°Cまで50°C刻みで15分ずつ加熱後、陽電子寿命を測定し、原子空孔の回復挙動を調べた。その結果、無添加SUS316L鋼中の原子空孔は300°Cで移動し始めるのに対し、オーバーサイズ原子添加鋼中の原子空孔は300-350°Cまで安定に存在することが見出された。この結果はオーバーサイズ原子と原子空孔との間に働く相互作用のためにもたらされたと考えられる。

そこで無ひずみ材腐食試料を1200°Cまで100°C刻みで30分ずつ加熱処理を行ったところ、消滅ガンマ線ピーク強度の減少は1100°Cまで観測されなかった。これは腐食処理で生じた消滅ガンマ線ピーク強度の増大は試料表面における酸化膜の形成に起因していることを示唆する結果である。
水銀系銅酸化物超伝導体単結晶の作製と物性

本研究の目的は、より高いT_cを持つ銅酸化物高温超伝導体を合成するための指針を得るために、その第1歩としてHgBa_2CuO_<4+δ>の良質単結晶の作製に最適な結晶育成手法を決定し、実際にその育成を試みる事にあった。これまで報告されているのはすべて封管法を用いたものであり、HgOを含むプリカーサーの部分溶融状態から結晶が得られている。この方法で得られている最大の単結晶サイズはせいぜい0.1mm角である。本研究では、さらに大型の結晶を育成するために、VやTiの酸化物単結晶成長について有効な方法である化学輸送法を試みたが、残念ながら結晶は得られなかった。また、水熱合成法を適用するための準備実験として、CrO_2単結晶合成を試み、1mm弱の大きさの単結晶を得た。CrO_2は室温以上にキューリー点を有する強磁性金属であり、最近、Mnペロブスカイトとの関連で同様に2重交換相互作用により強磁性が発現していると主張されている。巨大磁気抵抗効果を示す可能性もあり注目されているが、単結晶によるデータは限られており、今後その物性を明らかにする上で良質単結晶が重要な役割を果たすと思われる。水熱合成法は銅酸化物を含む遷移金属酸化物単結晶育成に重要になると考えられる。また、水溶液中から興味深い物性を示すと期待される銅酸化物Cu_3V_2O_7(OH)_2・2H_2Oを合成し、その物性を磁化率、比熱、NMR、ESR測定を通して明らかにした。これは、典型的な2次元フラストレート系であるカゴメ格子を有し、その基底状態は長距離秩序ではなく、何らかのスピン液体状態と考えられる。また、新規な1次元銅酸化物の合成と磁性の研究も行った。種々の単結晶育成法により、HgBa@@S22@@E2CUO@@S24+δ@@E2の単結晶育成を試みている。本研究では、Hg分圧ともう一つの重要なパラメータである酸素分圧を別々に細密制御しながら、封じた石英管中でBa@@S22@@E2CuO@@S23@@E2プリカーサーのメルトとHgガスを反応させることにより、単結晶を析出させることを試みている。また、別の試みとして、VやTiの酸化物単結晶成長について有効な方法である化学輸送法を試みる。これは、封管中で原料を適当な輸送材(塩素ガスやヨウ素など)を用いて低温部に輸送し、反応析出させる気相反応法である。銅酸化物ではこれまでこの方法が用いられた例はないが、輸送材の選択と成長条件の設定がうまく行けば非常に高品質の結晶が得られる可能性がある。さらに水熱合成法を用いて水溶液中から単結晶を析出させることを試みている。これは水の超臨界状態を利用するものであり、条件が最適化できれば最も良質の単結晶が出来る可能性がある。どの方法においてもSrTiO@@S23@@E2などの単結晶基板を用いることで単結晶薄膜の作製も試みる。その他の成果として、Bi系超伝導体において多量のPbを置換した単結晶を作製し、その特性を調べた結果、非常に大きな臨界電流密度の増加を観測した。

この試料を電子顕微鏡で調べた結果、Pb濃度の異なる2相がラメラ状に交互に並んでいることがわかり、その界面が高温で有効なピニングセンターとして働いていることを示した。また、本年度購入したニコン社製偏光顕微鏡により試料の表面状態の検討を行った。この結果は、Bi系高温超伝導体を使った超伝導線材開発へのプレークスルーとなることが期待されている。本研究の目的は、より高いT_cを持つ銅酸化物高温超伝導体を合成するための指針を得るために、その第1歩としてHgBa_2CuO_<4+6>の良質単結晶の作製に最適な結晶育成手法を決定し、実際にその育成を試みる事にあった。これまで報告されているのはすべて封管法を用いたものであり、HgOを含むプリカーサーの部分溶融状態から結晶が得られている。この方法で得られている最大の単結晶サイズはせいぜい0.1mm角である。本研究では、さらに大型の結晶を育成するために、VやTiの酸化物単結晶成長について有効な方法である化学輸送法を試みたが、残念ながら結晶は得られていない。また、水熱合成法を適用するための準備実験として、CrO_2単結晶合成を試み、1mm弱の大きさの単結晶を得た。CrO_2は室温以上にキューリー点を有する強磁性金属であり、最近、Mnペロブスカイトとの関連で同様に2重交換相互作用により強磁性が発現していると主張されている。巨大磁気抵抗効果を示す可能性もあり注目されているが、単結晶によるデータは限られており、今後その物性を明らかにする上で良質単結晶が重要な役割を果たすと思われる。さらに水熱合成法による遷移金属酸化物単結晶合成の基礎データを蓄積し、経験を積むことによって、これを銅酸化物に応用するための予備実験を進行中である。また、水溶液中から興味深い物性を示すと期待される銅酸化物Cu_3V_2O_7(OH)_2・2H_2Oを合成し、その物性を磁化率、比熱、NMR、ESR測定を通して明らかにした。これは、典型的な2次元フラストレート系であるカゴメ格子を有し、その基底状態は長距離秩序ではなく、何らかのスピン液体状態と考えられ、現在多くの実験が進行中である。また、新規な1次元銅酸化物の合成と磁性の研究も行った。
プラズマを必要としないレーザー粒子加速の原理検証

光ビームの光軸方向電場(縦方向電場)を用いる粒子加速は、現在のキロメートルに及ぶ巨大施設を、わずか数メートルの大きさに縮小できる可能性を有している。偏光が放射状に分布した新しいタイプのレーザービーム(径偏光ビーム)を用いると、プラズマを用いないレーザー粒子加速に不可欠な光軸方向電場を、容易にかつ高強度で発生させることが可能であると期待されている。本研究では、径偏光発生技術をフェムト秒レーザーに適用して、強い光軸方向電場を発生させ、プラズマ不要のレーザー加速の原理検証を目指している。そのためには、十分な性能を有する光源の開発が不可欠であり、本年度は高次横モードを持つ各種ベクトルビームをレーザー共振器から直接かつ簡便に発生させる方法の原理検証実験を行った。レーザー光ビームの横モードが損失の空間分布に強く依存することを利用し、共振器に用いる反射鏡の中心に小さな点欠陥を施し、これによって強制的に中空の強度分布を有するレーザービームだけを発生させる方法をとった。その結果、ベクトルビームとして知られているラゲールガウスおよびベッセルガウスビームの発生が確認された。これらのモード選択は共振器長さやポンプ強度によって可能であることも実証された。さらに、ベクトルビームを物質に照射し、その強度および偏光分布に起因するユニークな相互作用が観測され、理論的予測とよく一致することが認められ、実際の加速実験に対する強力な基盤が形成できた。そのためには、十分な性能を有する光源の開発が不可欠であり、本年度は多重リング構造を持つ径偏光ビームをレーザー共振器から直接発生させる方法の原理検証実験を行った。レーザー光ビームの横モードが利得あるいは損失の空間分布に強く依存することを利用し、共振器に用いる反射鏡として偏光選択性を有し、また反射率が空間的に変調されたものを使用することによって横モードの選択を行った。その結果、反射率の低い領域では強度が低くなるような横モードが選択的に発振すること、また横モードの次数はレーザー共振器の長さを変えることにより選択可能であることが実証された。本方法は、反射鏡の反射波長領域を調整することによって別の波長で発振するレーザー媒質に対しても有効であり、利得幅が広く超短パルスレーザーを発生できる媒質でのレーザー発振の実現が期待される。
キメラ抗体を用いたバイオセンサーに関する蛋白質工学的研究

(1)抗ニワトリ卵白リゾチーム(HEL)抗体HyHEL-10の可変領域FvのVH/VL、およびHEL間の相互作用を表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いて速度論的に解析した。この結果、VH断片とVL断片は抗原HELの存在下では安定な結合(Ka=10^9)をするが、抗原非存在下ではほとんど相互作用しない(Ka<<10^6)ことが判明した。またVHと抗原との結合解離速度は遅いが、VLと抗原とのそれは早いことから両者の結合の質の違いが示唆された。VH, VLの共存下では結合速度は早く、解離速度は遅くなることがわかり両者の協働作用の新しいモデルが考えられた(投稿中)。(2) VH断片をM13ファージのgene3蛋白質と融合発現させる事によりファージ表面に提示し、VH断片を固定化したマイクロプレートにファージと抗原を含むサンプルの混合液を入れて固相化されるファージの量を測定する、新原理の抗原濃度測定法(通称オープンサンドイッチ法)を開発した。抗原がないときのバックグラウンドは充分低く、10ng/ml程度のほぼ通常のELISA法に匹敵する感度が得られた。さらにgene3蛋白質の代わりに大腸菌アルカリフォスファターゼと融合発現させる事により、更に高感度に従来法のほぼ半分の時間で抗原濃度測定が可能なことも見いだした(投稿準備中)。(3) VH, VL断片をエリスロポエチン受容体の細胞外部位の一部と交換したキメラ受容体を作製し、proB細胞株BA/F3に導入して導入株がHELに対する応答性を示すかどうかを検討中である。
遺伝子多型に基づく簡便な人参類生薬の同定法の開発

1.18S rRNA遺伝子の塩基配列に基づいたDNAマイクロアレイを作製し、その有用性を証明した。(1)前年度に作製した試作品における基礎検討の結果を踏まえ、汎用の人参類生薬同定用DNAマイクロアレイ(PNX-array)を作製した。PNX-arrayでは、18S rRNA遺伝子に認められる11箇所の塩基置換または欠失に対応するll区画を設け、その区画内で塩基の置換または有無を検出できるように各25プローブ(3スポットずつ)を配置した。解析結果をバーコードとして表示し、簡単に識別できるように設計した。(2)Panzx属植物から得られた18S rRNA遺伝子部分領域の、蛍光標識したPCR産物(ターゲット)をPNX-arrayにハイブリダイズさせ、マイクロアレイスキャンナーから得られる蛍光パターンが設計どおりであるかを確認した。(3)汎用の人参類生薬、薬用人参、西洋人参、三七人参、竹節人参などを用いで検証を行った。例えば、薬用人参をターゲットとした場合、11区画において、全て左から1番目のプローブに特異的な結合が確認され、P. ginsengに特異的なパターン「11111111111」と一致した。(4)市販の健康食品の薬用人参、西洋人参及び三七人参を含有する錠剤、カプセル剤、粉末剤について同様に検討した結果、基原種と一致する特異的な蛍光パターンが表示され、同定できた。2.trnK遺伝子及び18S rRNA遺伝子両領域におけるDNAマイクロアレイを作製した。全分類群を向定するため、両遺伝子の塩基配列に基づいた63種類のプローブを設計し、420スポット(3つのサブアレイを含む2組/スライド)の人参類同定用DNAマイクロアレイを作製した。蛍光ラベル化したtrnK遺伝子の部分領域2断片及び18S rRNA遺伝子の部分領域のPCR産物をターゲットとして検討を行った。(1)Panax属13分類群の18S rRNA遺伝子の塩基配列に基づいて40種類の合成オリゴを作製し、460スポット/スライド(5つのサブアレイを2組)の人参類同定用DNAマイクロアレイの試作品を作製した。(3)合成オリゴの長さやTm値、及び配列の方向による影響を検討し、最適値を見出した。また、蛍光プローブをDNAマイクロアレイにハイブリダイズさせる際の最適温度を見出した。(4)試作品での基礎検討を踏まえ、欠点が見つかった合成オリゴについて再度設計し直し、また検出の利便性を考え、DNAマイクロアレイ上のターゲットの配置を変え、新たに改良版を設計、作製した。現在、Panax属各種由来のプローブを用いた検証実験を行っている。2.SNPs解析(一塩基伸長反応)Panax属植物のmatK遺伝子の塩基配列に基づいて、9箇所の塩基置換を同時に検出できる、長さの異なる8種類のプライマーを設計、作製した。これらから構成された同定用プライマーセットを用いて一塩基伸長反応を行うことにより、Panax属13分類群は5グループに分けられ、さらにP.quinquefolius、P.notoginseng、P.vietnamensis、P.zingiberensisなどの6分類群が同定できた。
耐熱性を有する新奇なＤ－アミノ酸オキシダーゼの探索と機能解析

D-アミノ酸オキシダーゼ(DAO)は,D-アミノ酸の光学分割や医薬品中間体の合成など様々な応用的利用が可能なことから,安定性の高いDAOが強く求められている。申請者は,好熱菌Rubrobacter xylanophilusにDAOホモログ遺伝子(RxDAO)を見出し,大腸菌における発現産物の解析から,RxDAOが既存のDAOよりも非常に高い安定性を有することを明らかにした。さらに,他の好熱菌や好熱性真菌にもDAOホモログ遺伝子を見出し,新たな高い安定性を有するDAOが存在する可能性を示した。本研究により得られた成果により,DAOの産業的利用を推進するための基盤を築くことができた。本研究では、高い耐熱性を有する新奇なD-アミノ酸オキシダーゼ(DAO)を世界で初めて見いだし、その応用的利用へと展開するための基盤を築くことを目的としている。具体的には、種々の好熱性細菌および好熱性真菌においてDAOホモログ遺伝子を探索し、大腸菌で発現させたDAOホモログ遺伝子発現産物の耐熱性を含む酵素学的諸特性の解析を検討する。現在までに、我々は好熱性細菌Rubrobacter xylanophilusにDAOホモログ遺伝子(RxDAO)を見いだした。また、好熱性細菌Saccharopolyspora thermophila NBRC16346においても既知のDAOに高い相同性を示す部分DNA断片を得ることに成功した。さらに、好熱性真菌Talaromyces thermophilusに2つのDAOホモログ遺伝子(TtDAO1, TtDAO2)を見いだしている。RxDAOに関しては、大腸菌におけるRxDAO遺伝子の大量発現系を構築し、精製したRxDAOの耐熱性などの酵素学的諸特性の解析から、RxDAOは既知のDAOよりも非常に高い耐熱性を有する新奇なDAOであることを明かにした。また、大腸菌で発現させたTtDAO1とTtDAO2遺伝子発現産物は、TtDAO1はD-グルタミン酸に対してのみ作用するD-グルタミン酸オキシダーゼ(TtDEO)と呼ぶべき新奇な酵素であることを明らかにした。一方、TtDAO2はD-メチオニンに高い活性を示すDAO(TtDAO)であることを明らかにした。D-アミノ酸オキシダーゼ(DAO)は,D-アミノ酸の検出・定量,医薬品原料の合成や神経・精神疾患の診断など広範囲な生物工学的応用が可能である。このことから,安定性の高いDAOが求められている。我々は,原核生物ゲノムデータベースの探索により,好熱菌にDAOホモログ遺伝子を見出し,高い安定性を有するDAOが存在する可能性を見出した。そこで本研究では,高い耐熱性を有する新奇なDAOを世界で初めて見いだし,その応用的利用へ展開するための基盤を築くことを目的とした。最終の平成25年度では,既に組換えタンパク質として精製し,既知のDAOの中で最も高い安定性を有することが示された好熱菌Rubrobacter xylanophilus由来のDAO (RxDAO)の速度論解析や阻害剤感受性などの諸特性を解析した。他の多くのDAOは二量体として存在するが,RxDAOは単量体として存在した。RxDAOは,D-Valに高い分子活性(kcat)を示すものの,親和性(Km)はD-LeuやD-Ileよりも低いことから,触媒効率(kcat/Km)はD-Leuが最も高かった。また,RxDAOのD-アミノ酸に対する親和性は他のDAOよりも高かった。RxDAOは,DAO競争阻害剤により阻害されるが,DDO阻害剤により阻害されなかった。また,DAOを阻害することが知られているDTNB,ヨード酢酸やDEPCに対して耐性を示したが,PMSFにより活性が阻害されたことから,触媒活性におけるセリン残基の重要性が示唆された。以上研究期間全体を通して得られた結果より,我々は好熱菌に世界で初めてDAOを見出すことに成功した。また,本好熱菌DAOが応用的に有用な非常に高い安定性を有するDAOであることを明らかにした。今後,好熱菌DAOの耐熱機構を明らかにするとともに,D-アミノ酸検出や物質生産への応用を検討する予定である。D-アミノ酸オキシダーゼ(DAO)は,D-アミノ酸の検出・定量,アミノ酸ラセミ混合物の光学分割,医薬品原料の合成や神経・精神疾患の診断など広範囲な生物工学的応用が可能である。そこで本研究は,耐熱性を有する新奇なDAOを世界で初めて見いだし,その応用的利用へ展開するための基盤を築くことを目的とした。平成23年度は以下の実績をあげた。好熱性細菌Rubrobacter xylanophilus

DSM9941に見いだしたDAOホモログ遺伝子(DAO遺伝子)をゲノムDNAからPCRにより単離し,大腸菌における発現系を構築した。大腸菌においてDAO遺伝子産物の大部分は封入体として発現したため,発現温度や発現誘導剤などの発現条件を最適化し,ジャーファーメンターを用いた大量生産系を開発した。DAO遺伝子を発現させた大腸菌粗抽出液は,D-バリンやD-イソロイシンなどの分岐鎖中性D-アミノ酸に対して高い活性を示したが,そのL体や酸性D-アミノ酸には活性を示さなかった。このことから,好熱菌R. xylanophilusのDAO遺伝子がDAOをコードしていることが明らかとなった。大腸菌粗抽出液からの本酵素の精製条件を検討し,電気泳動的に単一にまで本酵素を精製した。精製した本酵素の至適温度は65°Cであり,60°Cで1時間保温した後でも活性の減少は観察されなかった。既知のDAOで最も高い耐熱性を有する真菌由来のDAOは60°C,1時間の保温でほぼ失活することから,好熱菌由来のDAOは非常に高い耐熱性を有する新奇なDAOであることが明らかとなった。本研究の研究計画書におけるH23年度とH24年度の研究計画では、好熱菌におけるDAOホモログ遺伝子の探索、その大腸菌における発現系の構築及び発現産物の精製および特徴解析を計画していた。我々は現在までに、好熱性細菌R. xylanophilusにDAOホモログ遺伝子を見いだし、大腸菌における発現系を構築するとともに精製発現産物の解析から、この好熱菌のDAOホモログ遺伝子(RxDAO)が、本研究で目的としている既知のDAOの中で最も熱安定性の高いDAOをコードしていることを明らかにした。また、好熱性真菌においてもDAOホモログ遺伝子を探索しTtDAO1とTtDAO2と名付けたDAOホモログ遺伝子を見いだした。これら遺伝子の大腸菌における発現解析から、TtDAO1はD-グルタミン酸に対して高い特異性を示すD-グルタミン酸オキシダーゼ(TtDEO)と呼ぶべき新奇な酵素であることを明らかにした。一方、TtDAO2はD-メチオニンに高い活性を示すDAO(TtDAO)であることを明らかにした。さらに、好熱性細菌S.thermophilaにおいても既知のDAOと高い相同性を示す遺伝子断片を得ることに成功している。以上の結果より、本研究は研究計画に基づきおおむね順調に進展しているといえる。本研究の目的は,高い耐熱性を有する新奇なDAOを世界で初めて見いだし,その応用的利用へ展開するための基盤を築くことである。現在までに,我々は好熱性細菌R. xylanophilusにDAO遺伝子を見いだすとともに,本遺伝子が非常に高い耐熱性を有するDAOをコードすることを明らかにした。したがって,我々は世界で初めて高い耐熱性を有する新奇なDAOの取得に成功したといえる。今後,取得した耐熱性DAOの酵素学的諸特性などを明らかにし,本酵素の応用的利用の可能性を検討する必要がある。また,耐熱性DAOの多様な応用的利用への展開を図るため,種々の好熱菌からDAO遺伝子を単離する必要がある。高い耐熱性が見いだされたRxDAOに関しては、耐熱性のメカニズムを解析する予定である。具体的には、他のDAOの解析において、多量体化や補因子FADとの結合強度が耐熱性に関与していることが報告されていることから、RxDAOの四次構造およびFADとの結合強度と耐熱性の関係を解析する予定である。
心筋特異的多蛍光発色マウスを用いた内因性心筋分裂促進因子の探索と治療応用

本研究は心筋特異的多蛍光発色マウスマウスモデル(Rainbow-Creマウス)を用いて、MI後に褐色脂肪組織(BAT)細胞の移植療法等を行い、それらによる心筋細胞分裂促進作用を調べる。さらに、再生出現部位を特異的に採取・解析することで新規心筋再生促進因子を同定し、あらたな再生医療につなげることを目的とする。平成29年度にはRainbow-Creマウス(Rb/Cre遺伝子)のRb/Rbホモ体を作成し、心筋梗塞(MI)群でsham群に比べ、再生頻度が増加していることを確認している。平成29年度から30年度にかけては、このマウスへの細胞移植療法を確立した。褐色脂肪粗機(BAT)細胞を、マウスの背部、および腋窩部より採取、増殖因子の入ったメソカルト等とともに10-14日培養し、その後いったん分離し、PuraMatrixとあわせて3次元培養を行った。MIを作成したモデルマウスを2-4週間後に再度胸腔を解放して、心筋梗塞ができていることを確認後、上記のBAT+ PuraMatrixT M移植群とVehicle単独移植群にわけ、移植処置を安定して行えるようになった。移植後4-8週後も細胞が残存することを確認しており、また心エコー・MRIによる評価では移植群で、コントロール群に比較して、心臓のリモデリングを抑制し、心機能を保持している傾向を確認した。この手法を上記Raibow-Creマウスに適応し、安定して心筋組織切片を得ることができた。この切片においても増殖マーカーによる免疫染色では難しかった、cytokinesisまで完遂した完全な増殖部位および頻度を探知できることを確認しており、心筋梗塞部位周辺で増加傾向であることを観察している。今後モデル数を増やして解析予定である。Rainbow-CreマウスRb/Rbのホモ体を安定的に産出させ、Tamoxifen投与後ランダムに6色の蛍光発色を観察するモデルを確立した。また、BAT細胞の採取・3次元培養の手技も確立し、安定的に施行可能となった。移植後4-8週後も細胞が残存することを確認しており、また心エコー・MRIによる評価も確立し、移植群で、コントロール群における心機能の違いについて確認できるようになった。そこでMIおよび慢性期の移植治療の手技をRainbow-Creマウスに施行した。Rainbow-Creマウスの心臓は切片を作成しており、再生増殖部位の撮影・解析を現在施行している状況である。上記モデルが確立したため、Rainbow-Creマウスにおける慢性期の移植治療による心筋再生の促進効果およびそのメカニズムについて検討していく。BAT細胞に分裂・増殖促進作用があることがわかったら、モデルマウスに於いて分裂・増殖部位を特異的に採取する。まず、慢性期心不全モデルにおいてBrdU・Ki67・AuroraBなどの従来のマーカーを用いて、最も分裂が進んでいる時期を同定する。次に同定した分裂期において、発現因子している因子を比較し、心筋分裂誘導候補因子を選別する。候補因子の中からin silico、およびqRT-PCRによる絞り込みを行う。絞り込んだ因子を成体マウスから採取した培養心筋細胞に投与し、増殖促進効果について細胞増殖マーカー等により検証し、もっとも効果のあるものを同定する。さらに同定された新規因子については、in vivoでの分裂誘導効果を評価する。促進因子の増産のために、cDNAの形でプラスミドに導入したあと、大腸菌を用いて増殖・精製を行い、マウスにプラスミドの形でトランスフェクションする、もしくはベクターウイルス等を用いて導入する。M後慢性心不全期に心機能改善効果をみると同時に、心筋分裂促進作用をこれまでと同じ手法で評価する。平成29年度にはRainbow-Creマウス(Rb/Cre遺伝子)のRb/Rbホモ体を抽出できるようにし、2つのRb遺伝子でTamoxifen投与後ランダムに3色発色する傾向の組み合わせにより、隣接細胞同士が6色の異なる発色を示すマウスモデルを確立した。蛍光発色を分離するための共焦点顕微鏡の設定を工夫し、最初に内因性の発色を観察した後、同切片で細胞増殖マーカー等の免疫染色を行い、比較する系を確立した。これにより増殖マーカーによる免疫染色では難しかった、cytokinesisまで完遂した完全な増殖を探知できるようになった。心筋梗塞(MI)群とsham群をMIから6週間後に比較することにより、MI群では再生頻度がshamに比べて増加しており、MIにより残存心筋由来の心筋再生が促進されることがわかった。さらに心筋再生の部位は、特にMI周辺領域に多いことが示され、部位による違いを示すことができた。また移植療法のために、褐色脂肪粗機(BAT)細胞を、マウスの背部、および腋窩部より採取、増殖因子の入ったメソカルト等とともに10-14日培養し、その後いったん分離し、PuraMatrixとあわせて3次元培養を行った。最適化した移植片をMI2-4週間後の慢性期モデルに投与するまでの過程を確立した。

今後、この手法を上記Raibow-Creマウスに適応し、慢性期での再生頻度および部位について検討をしていく予定である。Rainbow-CreマウスRb/Rbのホモ体を安定的に産出させ、Tamoxifen投与後ランダムに6色の蛍光発色を観察するモデルを確立した。また、BAT細胞の採取・3次元培養の手技も確立し、安定的に施行可能となった。さらに一度MI手術を施行した後、2ー4週間後に再度移植手技も、合併症なく行えるようになった。今後MIおよび慢性期の移植治療の手技をRainbow-Creマウスに施行していく予定である。本研究は心筋特異的多蛍光発色マウスマウスモデル(Rainbow-Creマウス)を用いて、MI後に褐色脂肪組織(BAT)細胞の移植療法等を行い、それらによる心筋細胞分裂促進作用を調べる。さらに、再生出現部位を特異的に採取・解析することで新規心筋再生促進因子を同定し、あらたな再生医療につなげることを目的とする。平成29年度にはRainbow-Creマウス(Rb/Cre遺伝子)のRb/Rbホモ体を作成し、心筋梗塞(MI)群でsham群に比べ、再生頻度が増加していることを確認している。平成29年度から30年度にかけては、このマウスへの細胞移植療法を確立した。褐色脂肪粗機(BAT)細胞を、マウスの背部、および腋窩部より採取、増殖因子の入ったメソカルト等とともに10-14日培養し、その後いったん分離し、PuraMatrixとあわせて3次元培養を行った。MIを作成したモデルマウスを2-4週間後に再度胸腔を解放して、心筋梗塞ができていることを確認後、上記のBAT+ PuraMatrixT M移植群とVehicle単独移植群にわけ、移植処置を安定して行えるようになった。移植後4-8週後も細胞が残存することを確認しており、また心エコー・MRIによる評価では移植群で、コントロール群に比較して、心臓のリモデリングを抑制し、心機能を保持している傾向を確認した。この手法を上記Raibow-Creマウスに適応し、安定して心筋組織切片を得ることができた。この切片においても増殖マーカーによる免疫染色では難しかった、cytokinesisまで完遂した完全な増殖部位および頻度を探知できることを確認しており、心筋梗塞部位周辺で増加傾向であることを観察している。今後モデル数を増やして解析予定である。移植後4-8週後も細胞が残存することを確認しており、また心エコー・MRIによる評価も確立し、移植群で、コントロール群における心機能の違いについて確認できるようになった。そこでMIおよび慢性期の移植治療の手技をRainbow-Creマウスに施行した。