hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
口腔内細菌の付着を抑制するインプラント材の開発

-uridineでラベリングしたA.actinomycetemcomitans ATCC43718(A.a.)を1時間培養し(37°C)、歯周病原菌の初期付着特性を検討した。さらに、分注した上記培養菌液に各試験片を浸漬し、37°Cにて48時間嫌気培養し、生菌数測定法による抗菌性を評価した。P.g.およびA.a.菌のin vitroでの初期付着試験の結果、Ca^+注入処理面で付着量が多く、Alumina被膜処理面で特異的に少なくなり、表面の荷電状態およびCaの存在が初期付着特性に関与していることが明らかとなった。また、F^+注入処理が両菌に対し有効な抗菌性を示した。現在のインプラントは、インプラント周囲炎が発症し易く脱落の危険性を孕んでいる。インプラント周囲炎の原因の一つに細菌感染がある。チタンは骨結合性に優れる反面、口腔内細菌も付着しやすく、表面を鏡面にしようとも粗面にしようとも、若干の量的差こそあれ細菌は付着しプラークが形成される。したがって、この部位は骨組織接触部に求められる性質とは異なる表面改質法が求められる。細菌の吸着特性は表面荷電に影響を受けやすいことから、主に表面荷電を考慮した表面設計を試みた。また、この部位は常時ブラッシングがなされることから、イオン注入法、イオンプレーティング法など耐磨耗性に優れた表面に改質できるドライプロセス法を採用した。鏡面の純チタン板に、イオン注入処理(Ca^+,N^+,F^+)、陽極酸化処理、チタニア低温溶射処理、イオンプレーティング処理(TiN、Alumina)、イオンビームミキシング処理(Ag,Sn,Zn,Pt)の耐摩耗性表面処理を施した。処理表面の物性をX線光電子分光法、薄膜X線回折法で評価するとともに、表面エネルギーおよびCaイオンの付着量を計測した。その後、表面改質された試料上で[^3H]-thymidineでラベリングしたP.gingivalis ATCC33277(P.g.)、および[^3H]-uridineでラベリングしたA.actinomycetemcomitans ATCC43718(A.a.)を1時間培養し(37°C)、歯周病原菌の初期付着特性を検討した。その後、唾液中に存在する抗菌性タンパク質(ペプチド)であるcystatin,lysozyme,lactoferrin,histatinやβdefensin-2をチタンに固定し、それらの発現を促すための表面改質法を検討した。現在のインプラントは細菌感染によるインプラント周囲炎が発症し易く、脱落の危険性を孕んでいる。
メタボローム解析を駆使した大規模コホートデータの応用研究：眼科疾患の病態解明

本研究は、鶴岡市で実施中のコホート研究の2012年度参加者の眼底写真を読影し、メタボローム分析結果と統合解析することを企図した研究である。男性1102名、女性1363名について、信頼性の高いメタボロームプロファイリング結果との突合が可能であった。そのうち、特に定量性が充分に担保されている82物質を使用して、加齢黄斑変性症(AREDS2以上)に特有のメタボローム・バイオマーカーを、PLS判別分析を用いて探索した。その結果、男性ではbeta-alanineが、女性ではmalateが、加齢黄斑変性メタボロームバイオマーカー候補として挙げられたが、男女共通のバイオマーカー候補は認められなかった。本研究の分担研究者である武林亨を中心としたグループは、メタボローム技術と疫学の融合を画策し、山形県鶴岡市にメタボロームコホート研究を立ち上げた。本研究は、このコホート参加者の眼底写真を読影、データ整備ののち、メタボローム分析結果と統合解析することにより、代謝からみた加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症等眼科疾患の病態解明や、これら疾患を予測するバイオマーカーの検索を行うことを企図した研究である。渉猟しうる限り、メタボローム解析技術を大規模疫学データに応用して、眼科疾患の病態解明を実施した研究はなく、世界初の知見をもたらすものと期待される。平成26年度は、メタボローム解析の対象となる眼科疾患及び網膜血管関連指標の選定、眼底デジタル画像の抽出、ファイル形式の変換作業、写真判定作業を実施。判定作業終了見込みは平成27年度第1四半期を予定している。本研究は、このコホートの2012年度参加者の眼底写真を読影、データ整備ののち、メタボローム分析結果と統合解析することを企図した研究である。眼底所見としては、まず加齢黄斑変性病変の読影を実施しデータを整えた。一方、メタボローム解析は、血漿分離して-80°Cで凍結保存しているサンプルを用い、山形県鶴岡市にある慶應義塾大学先端生命科学研究所において網羅的に行い、代謝物としての同定を行って、対象者のメタボローム・プロファイルを作成した。その結果、加齢黄斑変性症男性ではbeta-alanineが、女性ではmalateが、加齢黄斑変性メタボロームバイオマーカー候補として挙げられたが、男女共通のバイオマーカー候補は認められなかった。デジタル画像の変換作業に余計な時間がかかったものの、おおむね計画通りに進捗している。平成26年度の研究として、まず、メタボローム解析の対象となる眼科疾患及び網膜血管関連指標の選定を行った。画像解析としては、健診用に撮影された眼底写真アーカイブの中から研究対象者の眼底写真を抽出した。まず、眼底写真アーカイブの保存形式であるDICOM形式から、眼底デジタル画像のみを抽出した。DICOM形式には画像に加えて撮影状況などの情報が付記されているため、デジタル画像のみを網膜血管形態測定ソフトウェアに対応するファイル形式に変換する作業を行った。この結果、4020枚の眼底写真が抽出、変換された。現在、網膜血管径測定ソフトウェアを用い眼底写真判定を実施中である。平行して、臨床医による網膜病変の判定を平成27年度第1ー第2四半期に行う予定である。メタボロミクス疫学平成27年の平第1ー第2四半期を目途に、眼底写真の読影を終了する予定である。その後、データのクリーニング作業を行い、眼底データベースを整備する。一方、メタボローム解析は、血漿分離して-80°Cで凍結保存しているサンプルを用い、山形県鶴岡市にある慶應義塾大学先端生命科学研究所において網羅的に行い、代謝物としての同定を行って、対象者のメタボローム・プロファイルを作成する。このプロセスは、分担研究者(武林亨)が獲得している科研費基盤(B)により実施する計画となっている。本研究では、このメタボロームデータと眼底データ、その他個人の背景情報を統合したデータセットを解析用に構築する。平成27年度、眼底写真の読影を継続して実施するため、人件費分を持ち越した。また、読影方針や解析方針を決定するための会合を学会時など他の用事に合わせて実施できたので、この分を予定より少なくできた。

持ち越した助成金は、平成27年度の助成金と合わせ、読影、判定に係る人件費、データ解析用のソフト購入費、結果発表時の旅費等に充当する予定である。
天然変形岩から評価する地殻の塑性変形強度

石英や長石は大陸地殻の主要構成鉱物であり,両物質の塑性変形は内陸型地震発生の前駆運動となる.従って,塑性変形強度を試料組織,塑性変形機構と共に理解することは重要である.岩石鉱物の塑性変形は,応力,歪速度,粒子サイズ,水の効果,温度などをパラメータとして表され,これは流動則と呼ばれる.本研究では過去に断層運動により塑性変形を被った天然試料の組織観察,分析を通して流動則を適用し,塑性変形強度を評価することを目的とする.また,天然試料に関する結果も踏まえて,流動則中の各パラメータの関係性を新たに評価する.石英や長石は大陸地殻の主要構成鉱物であり,両物質の塑性変形は内陸型地震発生の前駆運動となる.従って,塑性変形強度を試料組織,塑性変形機構と共に理解することは重要である.岩石鉱物の塑性変形は,応力,歪速度,粒子サイズ,水の効果,温度などをパラメータとして表され,これは流動則と呼ばれる.本研究では過去に断層運動により塑性変形を被った天然試料の組織観察,分析を通して流動則を適用し,塑性変形強度を評価することを目的とする.また,天然試料に関する結果も踏まえて,流動則中の各パラメータの関係性を新たに評価する.
超効率的不斉反応のためのメディエーター修飾高分子マトリックス反応場の構築

基板電極であるグラファイトフェルトヘポリアクリル酸(PAA)膜を被覆し、その高分子マトリックス中に不斉認識能を有する電子移動メディエーターとして、強い酸化力を有するニトロキシル化合物の分子内にキラル残基を導入したスピロ環型キラルニトロキシル化合物を固定した修飾電極を用いることにより、ラセミの二級アルコール類およびアミン類に対し高いエナンチオ選択性を示した電解触媒酸化反応を達成した。またジオール類においては不斉ラクトン化反応が効率的に進行した。また、電子移動メディエーターとしてニッケルサイクラム誘導体を用いた修飾電極においては、脱ハロゲン反応、ラジカル還化反応、1,4-付加反応を効率的に達成した。一方、電子移動メディエーターとしてビオローゲン誘導体を用い、さらに高分子マトリックス中に遷移金属微粒子を担持させた修飾電極においては、オレフィン類の接触水素化反応を常温・常圧下で効率的に行うことができた。また、高分子の一種であるデンドリマーの最外郭にニトロキシルラジカル基を有するニトロキシルラジカルデンドリマーを合成し、その電極反応挙動をサイクリックボルタンメトリーにより検討したところ、分子の大きさや内殻の構造が電気化学的特性に影響を与えないことが分かった。さらにアルコール類の電解触媒酸化反応においては、外郭のニトロキシルラジカル基が増加するにつれて反応速度が加速した。
悪性グリオーマ普遍発現遺伝子の検索とそのプロモーターを用いた組織特異的遺伝子治療

悪性グリオーマに対する特異的遺伝子療法を開発する第一段階として、、ミエリン塩基性蛋白(MBP)遺伝子発現プロモータで殺細胞遺伝子を制御したレトロウイルスベクターを作製した(J Neurosci Res 36:472-479,1993)。しかし、そのプロモータ活性は、モロニ-白血病ウイルスのLTRやSV40プロモータなど組織非特異的プロモータと比較すると弱い。それ故、新しい遺伝子スクリーニング法であるSAGE(Serial analysis of gene expression)法を用いて、悪性グリオーマ普遍的発現遺伝子およびそのプロモータを検索し、より効率のよい遺伝子治療法の開発を計画した。今年度は、悪性グリオーマ患者の手術摘出組織やヒト悪性グリオーマ細胞株よりメッセンジャーRNA(mRNA)を抽出し、リバーストランスクリプターゼ(RT)法を用いてcDNAを合成した。さらに、poly A付加部位より9塩基のTagを作製し、これらを縦一列に配列した合計約500塩基からなるDNAを合成した後シークエンスを行い、グリオーマ手術摘出組織や各種細胞株より最も普遍的に発現している遺伝子をヒトゲノムデータベースより検索している段階である。今後は、悪性グリオーマ普遍的発現遺伝子を幾種類か決定し、それが既知のものであればその遺伝子プロモータを用いて、また未知の遺伝子であればそれをクローニングし、その遺伝子のプロモータ領域を用いて、1acZ遺伝子を制御する組換えベクターを作製する予定である。そして、このベクターを用いて、各ヒトグリオーマ細胞株におけるプロモータ活性を検討し、その中で一番活性の高いプロモータを用いて殺細胞遺伝子(HTK)を制御できるベクターを構築し、悪性グリオーマ特異的遺伝子治療の新たな基礎的研究を行う予定である。
肝硬変で出現するL-シスチン・L-グルタミン酸不均衡が抗原提示細胞に与える影響

腎機能は非代償性肝硬変患者の予後を決定する最重要要素である。非代償性肝硬変患者の腎機能低下時に出現する血漿中のL-Cysの増加とL-Gluの低下は輸送体xCTを介して単球に酸化ストレスを与え、TNF-alphaをはじめとした炎症性サイトカイン産生を増加させた。本研究結果は肝硬変非代償期の腎機能低下と感染症の病態に関与している可能性がある。これまで非代償性肝硬変患者では腎機能低下に伴い血漿中L-Cystine (L-Cys)が増加し、L-Glutamate (L-Glu)が低下すること、更に全20種類のアミノ酸の中で唯一L-Cysが非代償性肝硬変の腎機能(eGFR)と負の相関関係をもつことを明らかにした。非代償性肝硬変では腸管からの細菌移行(Bacterial Translocation)により急速に腎機能が悪化することが知られている。今回、細菌刺激による免疫反応にL-Cys / L-Glu不均衡が与える影響を解析することを目的とした。非代償性肝硬変患者の血漿アミノ酸濃度に一致した無血清培地ACM(Kakazu E et al : Hepatology 2009)のL-Cysに濃度勾配をつけ、健常人・非代償性肝硬変患者から採取したCD14+単球を培養した。サイトカイン産生能、細胞内外アミノ酸濃度、細胞内グルタチオン、L-Cys / L-Glu交換輸送体(xCT)の発現を解析した。ACM中のL-Cysは濃度依存性にLPS刺激に対する単球からのTNF-alpha, IL-10の産生を増加させた。LPS刺激後の単球は強くxCTを発現しL-Cys添加ACMでは有意に単球細胞内L-Cys,細胞外L-Gluの増加を認めた。更に細胞内の還元型・酸化型グルタチオン比はL-Cys添加ACM下で低下した。In vitroの結果に一致して、肝硬変患者(n=35)の血漿L-Cys / L-Glu比は血中TNF-alphaと有意な正の相関関係を認めた。非代償性肝硬変患者において血漿中のL-Cysの増加とL-Gluの低下はxCTを介して単球に酸化ストレスを与え、TNF-alphaをはじめとした炎症性サイトカインの過剰産生に関与していた。肝がん発生の背景に肝硬変が大部分存在するが、これまで我々は肝硬変で出現するアミノ酸不均衡が免疫機構に与える影響について解析してきた。当該年度は、進行した肝硬変患者に出現するL-シスチン(L-Cys)/L-グルタミン酸(L-Glu)不均衡に注目し免疫細胞(単球)に与える影響を解析した。研究成果として、1.肝硬変患者132人の血漿アミノ酸分析結果から、Cild-Pugh grade B, Cでは有意なL-Cysの増加、L-Gluの低下を認めた。2.進行した肝硬変(C-P grade B+C : n=79)において20種類の遊離アミノ酸の中で唯一L-Cysが末梢血単球数に正の相関を認めた。3.肝硬変血漿中のTNF-αがL-Cysと有意な正の相関を認めた。in vitroにおいて我々が開発した非代償性肝硬変患者の血漿アミノ酸濃度に一致した無血清培地(Hepatology 2009)ACMを用いてL-Cys / L-GluのCD14+単球に与える影響を解析した。1.L-Cysは濃度依存性にLPS刺激に対する単球からのTNF-αの産生を増加させた。またIL-10, GM-CSFの産生もL-Cys添加により増加した。2.単球のL-Cys / L-Glu交換輸送体xCTのmRNA発現が、L-Cys添加ACMで増加した。3.LPS刺激時における単球、THP-1細胞内・外のアミノ酸濃度をHPLCで評価した。L-Cys添加ACMでは有意にLPS刺激2時間後における細胞内L-Cys,細胞外L-Gluの増加を認めた。以上により、肝硬変で出現するL-Cys、L-Gluの不均衡はCD14+単球の機能・数にxCTを介して関与している可能性が示唆された。マウスを用いた実験計画は計画に遅れが生じているものの、それ以外は逆に平成24年度の計画にすでに着手している。マウスを用いた実験計画に遅れが生じているため、一部研究計画を変更し肝硬変での樹状細胞機能低下のメカニズム解析をin vitroでより深く行う。次年度使用額は、当初計画していたノックアウトマウスの実験を樹状細胞機能低下のメカニズム解析に変更したことにより生じたものであり、次年度以降に実施するメタボローム解析に必要な経費として、平成23年度請求額と合わせて使用する予定である。
口蓋裂・口唇裂児(者)の表情の検討

口蓋裂・口唇裂の幼児・小学生62名(男児31名・女児31名)と、同じく中学生32名(男児17名・女児15名)のコミュニケーション場面についてデジタルビデオによる撮影を行った。青年期・成人期の口蓋裂・口唇裂者46名(男性15名・女性31名)の表情表出場面についてデジタルビデオによる撮影を行った。これらの動画像を用いた実験から、以下の知見を得た。1.単なる発声場面や口角を引く場面に比べて、笑顔表出場面では、顔の動きがより自然なものと判断される。2.単なる発声場面や口角を引く場面に比べて、笑顔表出場面では、顔の形状がより自然なものに見える傾向が見られる。ただし、笑顔表出場面で顔の形状がより不自然なものに見える顔も存在する。3.顔の動きのない顔に比べて、笑顔表出時の顔では、「話しやすさ」「思いやり」「たくましさ」「元気のよさ」「魅力」の印象が、すべてポジティブな方向へと変化した。4.静止画像を用いて、口蓋裂・口唇裂者の顔と健常者の顔とで、笑顔と中立顔との弁別を行ったところ、笑顔であるという判断の速さにおいて、健常者の顔と口蓋裂・口唇裂者の顔とでまったく差は見られなかった。5.静止画像を用いて、笑顔と中立顔とで、顔に変形があるかどうかの判断(口蓋裂・口唇裂者の顔か健常者の顔かの弁別判断)を求めたところ、笑顔と中立顔で差異は見られなかった。また、変形があるかどうかの判断は非常に困難であることが示された。6.笑顔画像は、顔部品の検出において抑制的な効果を持つことが示された。これらのことから、顔に変形を有する口蓋裂・口唇裂児(者)においても、笑顔の表出は対人関係の形成・維持・発展にとって有用であると結論づけることができる。研究の基礎資料として、東北大学歯学部附属病院口腔機能治療部の協力により、口蓋裂・口唇裂児とその保護者とのコミュニケーション場面の撮影を行った。5歳から9歳の患児63名(男児33名、女児30名)コミュニケーション時の上半身像を約5分間にわたって撮影した。その後、ア・イ・ウ・エ・オの発音と、笑顔・怒った顔・悲しい顔をすることを求め、その状況についても撮影した。さらに対象群として健常児20名(男児8名、女児12名)についても同様の状況での撮影を行った。口蓋裂・口唇裂児のコミュニケーション場面と健常児のコミュニケーション場面について、(1)口の動き、(2)顎の動き、(3)鼻の形、(4)笑顔について、「自然な」印象か「やや不自然な」印象を受けるかを2名のナイーブな学生に評定させた。その結果、顎の動きについては口蓋裂・口唇裂児の約半数でやや不自然な印象が生じていたが、笑顔については口蓋裂・口唇裂児すべてについて自然な印象を与えていた。このことから、口蓋裂・口唇裂児のコミュニケーションにおいても笑顔がポジティブな影響をもたらすであろうことが推測された。表情表出活動の定量的測定を行うための準備として、口蓋裂・口唇裂児の鼻の形状に対して定量的な測定を行った。口蓋裂・口唇裂児の中には独特の形状の鼻をしたものがおり、そのことがからかいの対象となって彼らのコミュニケーション活動に悪影響を及ぼしていることが考えられる。そこでどのような鼻の形状が知覚的に目立つかについて検討した。

その結果、左右の鼻孔が垂直方向にズレていることが最も知覚的に顕著であり、さらに鼻の横幅が広い場合に形状の問題がより目立つことが明らかになった。昨年度の口蓋裂・口唇裂児(5歳から9歳)のコミュニケーション場面の撮影に引き続き、研究の基礎資料として、東北大学歯学部附属病院口腔機能治療部の助力により、成人口蓋裂・口唇裂者に表情表出場面の撮影の協力を得ることができた(18歳から31歳、男性9名、女性22名、現在も継続中)。ハーフミラーを用いた撮影装置を自作し、対象者が鏡に向かって眉・目・口を動かしたり、笑顔などの表情を作る様子を鏡の背後に置かれたデジタル・ビデオ・カメラで撮影した。その際、無意図的な笑顔が生起するよう話しかけを工夫した。同じ撮影条件での健常者(18歳20歳、女性10名)の映像と比較して、質的分析を行った。インコンプライアンスと思われる表情変化の乏しい者が31名中4名見られたが、多くの口蓋裂・口唇裂者で無意図的な笑顔を撮影することができた。無意図的な笑顔については口唇裂・口蓋裂児の場合と同様に、すべてのケースにおいて「自然」な印象であり、笑顔の表出において口唇部の裂の影響は比較的小さなものであることが示唆された。一方、笑顔や悲しい顔、驚いた顔などの意図的な表出については、対象群に比べて、顔の動きの変化が小さく、また表出の工夫をすぐにあきらめるなどの差異が見られた。口蓋裂・口唇裂者の無意図的笑顔についての質的分析において、無意図的笑顔の表出時には、裂の瘢痕や唇裂鼻と呼ばれる鼻の変形が目立たないという印象が報告された。これは口蓋裂・口唇裂者の社会適応という点で重要な意味をもつ知見と考えられ、印象の妥当性について検討する予定である。東北大学歯学部付属病院口腔機能治療部の協力を得て、ハーフ・ミラーに向かっての成人口蓋裂・口唇裂者の表情表出場面の撮影を本年度も継続して行い、合計で46名(男性16名、女性30名)の撮影を行うことができた。撮影した表情表出場面について、意図的な笑顔表出場面と無意図的な笑顔表出場面を用いて、それぞれについて印象の測定を行った。その結果、口蓋裂・口唇裂者では意図的な笑顔表出よりも無意図的な笑顔表出場面で、より「自然」で、よりポジティブな印象を受けることが示された。定性的な観察では、無意図的で自然な笑顔表出時には、中立的な表情時に比べて口唇部の裂の瘢痕や唇裂鼻と呼ばれる鼻の変形が目立たない印象が報告された。この点について定量的な検討を行うために、笑顔と中立顔の静止画を用いて裂の瘢痕や鼻の変形の検出にかかる反応時間を測定した。その結果、裂の瘢痕や鼻の変形の検出は中立顔に比べて笑顔で常に速いとはいえず、笑顔中で裂の瘢痕や鼻の変形の検出が速くなる条件も存在することが明らかになった。裂の瘢痕や検出が促進される条件と抑制される条件の違いを明確にすることが今後必要である。英国の口蓋裂・口唇裂者の支援団体であるCLAPAから資料を取り寄せ、口蓋裂・口唇裂者の社会適応に向けた支援について検討した。児童期から思春期にかけて顔貌に対する悩みが深刻化しやすく、自然な表情表出をサポートするプログラムはこの時期に行うことが望ましいと結論づけることができた。
ナノ構造材料による水素貯蔵技術の創製

炭素繊維強化樹脂(CFRP)を用いた水素貯蔵用高圧タンクの研究が国内外で進められているが、CFRP積層板の層間強度が低いために、き裂が発生すると水素漏れを引き起こすことが懸念されている。そこで、CFRP積層板の層間にカーボンナノチューブ(CNT)のような優れた力学的特性を有するナノ材料を分散させたナノ複合材料が開発できれば、これまでにない高破壊靭性複合材料となる可能性があり、水素貯蔵タンクの外板へ適用できる。しかしながら、CNTは樹脂との接着の弱さや樹脂中に均質に分散されないという問題がある。分散の問題については、製造時にCNTがお互いに絡まりあい、樹脂中で凝集したままの状態で存在してしまうことが原因の1つに上げられる。本研究では、分散性を向上させるために超音波を用いて多層カーボンナノチューブ(MWCNT)を切断し、複合材料を製作した。引張試験、摩耗試験を行い、製作した複合材料の力学的特性を評価した。超音波処理したMWCNTのSEM画像から、超音波処理を行うことでMWCNTが切断され、大きな凝集がなくなったことが確認できた。試験片として、(1)エポキシ樹脂試験片、(2)超音波処理をしていないMWCNTをエポキシ樹脂に混ぜた試験片(MWCNT/epoxy)、(3)超音波処理したMWCNTをエポキシ樹脂に混ぜた試験片(超音波MWCNT/epoxy)の3種類を製作した。MWCNTの含有量は1重量パーセントとした。引張試験の結果から、MWCNT/epoxyおよび超音波MWCNT/epoxyのヤング率は、エポキシ樹脂単体よりもそれぞれ10%と2%向上した。一方、MWCNT/epoxyの引張強度はエポキシ樹脂よりも12%低下し、超音波MWCNT/epoxyでは3%増加した。ヤング率の向上はMWCNTを含有させた効果と考えることができる。超音波MWCNT/epoxyのヤング率がMWCNT/epoxyよりもかなり低くなっている原因としては、CNTの分散が促進されたことと、ボイド率が増加したことの2点が上げられる。また、MWCNT/epoxyではCNTが凝集したままになっており、引張強度は大きく低下している。超音波処理したMWCNTをエポキシ樹脂に混ぜると樹脂の粘性が上がり、ボイドの除去が大変難しくなるという問題が発生した。摩耗試験では、超音波MWCNT/epoxyの比摩耗量がエポキシ樹脂に比較して11%低下しており、CNTの含有と分散性の向上による効果と考えられる。カーボンナノホーン(Carbon Nanohorn, CNH)をエポキシ樹脂に混入させたナノ複合材料を作製し、力学特性を評価した。作製したナノ複合材料は、熱硬化性エポキシ樹脂(Kyowa EP-34B, 2液混合常温硬化)に重量分率3%のCNHを混入させたものである。数通りの混入法を試行したところ、ボイドを含まずCNHを最も均一に分散させることができたナノ複合材料作製法は次のようなものであった。すなわち、(1)EP-34B主剤にCNHを混入し約10分間混練後、気泡が出なくなるまで約0.1気圧の低圧状態におく、(2)その後EP-34B硬化剤を添加し、23分間混練後、再び約0.1気圧の低圧状態におき常温で24時間以上の硬化時間を与える。このような方法により、長さ45mm、幅3mm、高さ2mmの試験片を作製し、3点曲げ試験を行った。その結果、重量分率3%のCNHを混ぜたナノ複合材料では曲げ弾性率は11%向上したが、曲げ強度は9%低下した。このように弾性率は上昇するが強度が低下する傾向は、国内外の他の研究機関から報告されているナノ複合材料の力学特性と一致したことではあるが、ナノ複合材料の強度特性はナノ強化材料の存在により理論的には上昇することが予想され、ナノ材料の表面改質法などを含めて次年度さらに検討を加える必要がある。一方、既存の炭素繊維強化複合材料(CFRP)を用いて貯蔵圧70MPaの水素貯蔵タンクの初期設計を行った。基本となる積層構成は擬似等方性とした。今後ナノ複合材料を層間に分散させた構造材料を利用してタンク設計を行う。CFRP製タンク成形用オートクレーブの制御プログラムを完成させ、CFRP積層板の力学特性測定用試験片を作製した。カーボンナノ材料を強化材として樹脂中に分散させたナノ複合材料の問題点、(1)ナノ材料が分子間によって凝集する、(2)ナノ材料と樹脂の界面強度が弱い、を解消するために、R.Bandyopadhyayaら(2002)やO.Regevら(2004)が報告した方法を参考にしてナノ複合材料を製作し、その力学的特性を評価した。この方法を用いて製作したナノ複合材料の力学的特性を評価した研究はこれまでに発表されていない。本年度開発されたカーボンナノ複合材料の制作方法は次の通りである。(1)アラビアゴム(Gum Arabic, GA)水溶液にカーボンナノ材料(CN)を添加(純水:GA:CN=100:3:3)する。(2)ナノ材料含有GA水溶液の沈殿物を加熱(100°C)固化させ、カーボンナノ材料の固形物を乳鉢で粉砕する。(3)そのカーボンナノ材料をエポキシ樹脂主剤(エピコート807)に添加する。(4)50°C温浴で90分超音波処理した後、硬化剤(エピキュアW)を添加(主剤:硬化剤=100:25)する。(5)脱泡のため減圧環境下50°Cで90分間混練する。

(6)あらかじめ100°Cに加熱した型に材料を注型し、プリキュア、キュアともに175°C、2時間ずつで硬化させる。(7)常温になるまで放置する。製作した複合材料中のナノ材料重量比率は3%である。長さ100mm幅10mm厚さ4mm試験片に仕上げ、3点曲げ試験法を用いて力学的特性を評価した。エポキシ樹脂のみの試験片から得られた特性と、カーボンナノ材料を添加した試験片(CN)、上記のGA処理したカーボンナノ複合材料試験片(GA)、それぞれから得られたものを比較したところ、曲げ弾性率がCN、GAそれぞれで11%、14%向上、強度がCN、GAそれぞれで30%、37%向上し、本方法の有用性が示された。代表要素を用いてカーボンナノ材料分散型複合材料をモデル化した有限要素解析と、実験から得られた曲げ弾性率を比較したところ、GA処理した試験片ではナノ材料の分散が促進されていることがわかった。炭素繊維強化樹脂(CFRP)を用いた水素貯蔵用高圧タンクの研究が国内外で進められているが、CFRP積層板の層間強度が低いために、き裂が発生すると水素漏れを引き起こすことが懸念されている。そこで、CFRP積層板の層間にカーボンナノチューブ(CNT)のような優れた力学的特性を有するナノ材料を分散させたナノ複合材料が開発できれば、これまでにない高破壊靭性複合材料となる可能性があり、水素貯蔵タンクの外板へ適用できる。しかしながら、CNTは樹脂との接着の弱さや樹脂中に均質に分散されないという問題がある。分散の問題については、製造時にCNTがお互いに絡まりあい、樹脂中で凝集したままの状態で存在してしまうことが原因の1つに上げられる。本研究では、分散性を向上させるために超音波を用いて多層カーボンナノチューブ(MWCNT)を切断し、複合材料を製作した。引張試験、摩耗試験を行い、製作した複合材料の力学的特性を評価した。超音波処理したMWCNTのSEM画像から、超音波処理を行うことでMWCNTが切断され、大きな凝集がなくなったことが確認できた。試験片として、(1)エポキシ樹脂試験片、(2)超音波処理をしていないMWCNTをエポキシ樹脂に混ぜた試験片(MWCNT/epoxy)、(3)超音波処理したMWCNTをエポキシ樹脂に混ぜた試験片(超音波MWCNT/epoxy)の3種類を製作した。MWCNTの含有量は1重量パーセントとした。引張試験の結果から、MWCNT/epoxyおよび超音波MWCNT/epoxyのヤング率は、エポキシ樹脂単体よりもそれぞれ10%と2%向上した。一方、MWCNT/epoxyの引張強度はエポキシ樹脂よりも12%低下し、超音波MWCNT/epoxyでは3%増加した。ヤング率の向上はMWCNTを含有させた効果と考えることができる。超音波MWCNT/epoxyのヤング率がMWCNT/epoxyよりもかなり低くなっている原因としては、CNTの分散が促進されたことと、ボイド率が増加したことの2点が上げられる。また、MWCNT/epoxyではCNTが凝集したままになっており、引張強度は大きく低下している。超音波処理したMWCNTをエポキシ樹脂に混ぜると樹脂の粘性が上がり、ボイドの除去が大変難しくなるという問題が発生した。
低ノイズlncRNA検出システムの開発と複合体分析による分化スイッチ機構の解明

長鎖ノンコーディングRNA (lncRNA)は多様な制御メカニズムで生体内の多様な機能を司っていることが明らかになってきたが、機能について詳しく調べられたlncRNAのほとんどは核内に存在するlncRNAであり、細胞質に存在するlncRNAについてはその機能まで詳しく調べられたものは限られている。申請者らは、真核多細胞微生物である細胞性粘菌の細胞質に存在するlncRNAであるdutA RNAが、発生におけるオーガナイザー(形成体)領域で中心的なシグナル分子として機能する転写因子STATaの活性を調節することで未分化状態を維持していることを明らかにしてきた。本研究では、発生におけるdutA RNAの機能を詳しく知るために、発生時期に依存した経時的な局在について解析して正確に把握し、それを補完する目的での生体組織中でdutA RNAの動態を知るために可視化を試みることとした。今までの実験において、核内でのdutA遺伝子からの転写を蛍光スポットとして捉えることには成功したが、検出に用いたGFPのノイズが高くてdutA RNAの動態を追跡するには不向きであった。そこで本研究では、ノイズの殆どない或いは極めて低い新規のRNA動態検出法を立ち上げてdutA RNAのダイナミズムを把握することを目指した。また、同時にlncRNAの機能解析には欠かせないRNA結合タンパク質を同定し、dutA RNAータンパク質複合体組成を分析することで、dutA RNAがどのような機序でオーガナイザーから消失するかを解明し、細胞質lncRNAの組織特異的な消失によるダイナミックな分化スイッチのメカニズムを提唱することを最終的な目標とした。2018年度は上手く進捗しなかった部分と予想以上に進捗した部分が混在し、総じておおむね順調に進展していると言える。まず、進捗しなかった部分はイメージング技術の開発である。今までのシステムではノイズが高くて使えなかったことから、MS2-GFPを低レベルに発現する株を選抜することに成功した。この株を用いてノックイン株のdutA RNA分子そのものをRNA FISHで、そこに結合するMS2-GFP融合タンンパク質を免疫染色で共局在を調べた。その結果、以前の株よりノイズは軽減して改善し、RNAとGFPが共局在しているところも見られた。しかしながら、依然として局在が一致しないノイズが見られた。その他の試みとして行ったスプリット蛍光タンパクを用いた解析では、上手くシグナルが見られなかった。一方で、その他の研究計画は予想以上に進展した。まず、コントロールとしての内在dutA RNAの経時的な局在変化をSTATaの局在と共に正確に記述した。その結果、dutA RNAは今まで知られていた以上に発生とともに局在を劇的に変化させることを見出した。また、STATaとの共局在はほとんど見られなかった。dutA RNA結合タンパク質の精製では、ChIRP法によってある程度複合体の精製が可能であったが、精製量が不足してノイズを完全に除くことができなかった。その改善策として、イメージング用に作製したノックイン株をそのまま用いてMBP-trap法で精製を試みた。その結果、多くのタンパク質を高純度に精製出来、そのうち4つのタンパク質について質量分析によって同定に成功した。また、これらのタンパク質にタグを付加してRNA免疫沈降(RIP実験)を行った結果、dutA RNAが特異的に検出されたことから、これらのタンパク質が実際にdutA RNAに結合することが確認された。本研究で提案した方法でdutA RNAの動態を観察することは容易ではないと思われる。しかしながら、目印となるMS2-GFPタンパク質を細胞内で均一に発現させることでS/N比が改善するという報告がある。その報告で用いられているベクターを入手し、既存のノックイン株に導入することで、dutA RNAとの共局在が見られるかを観察する。充分な共局在が見られれば、その株を用いてイメージングを行う。dutA RNAがどの様にSTATaの活性化状態に作用しているかについて調べるために、新規のノックアウト株、過剰発現株を作製した。これらの表現型を現在解析中であり、予備実験のデータとしてSTATa関連シグナル遺伝子のmRNAの量が変動することを見出した。そこで、網羅的に変動するmRNAを同定する目的で、新学術領域先進ゲノム支援の協力を得て、現在これらの株から得られたRNAサンプルを使ってRNA-seqを依頼中である。今後、これによって得られた遺伝子がどの様な振る舞いをするかについて解析する。特に、遺伝子の破壊株作製やmRNAとdutA RNAとの共局在の様子を調べる。dutA RNA結合タンパク質の精製では、ノックイン株のようにMS2結合部位が24回反復しているような大きなタグではなく、dutAの内部にMS2結合部位を3コピーのみ挿入した発現ベクターを用いる方が、量的にも質的にもより多くのタンパク質を精製出来ることがわかった。これによって、今までに同定した4種類以外のdutA RNA結合タンパク質の同定も行う。同じようにRIP実験による確認を行うほか、2018年度に同定された4種類についてもin vitroでdutA RNAに結合する能力があるかどうかをpull downやゲルシフト法などを用いて確かめる。また、それぞれの遺伝子の機能やdutA RNAとの共局在についても調べる長鎖ノンコーディングRNA (lncRNA)は多様な制御メカニズムで生体内の多様な機能を司っていることが明らかになってきたが、機能について詳しく調べられたlncRNAのほとんどは核内に存在するlncRNAであり、細胞質に存在するlncRNAについてはその機能まで詳しく調べられたものは限られている。

申請者らは、真核多細胞微生物である細胞性粘菌の細胞質に存在するlncRNAであるdutA RNAが、発生におけるオーガナイザー(形成体)領域で中心的なシグナル分子として機能する転写因子STATaの活性を調節することで未分化状態を維持していることを明らかにしてきた。本研究では、発生におけるdutA RNAの機能を詳しく知るために、発生時期に依存した経時的な局在について解析して正確に把握し、それを補完する目的での生体組織中でdutA RNAの動態を知るために可視化を試みることとした。今までの実験において、核内でのdutA遺伝子からの転写を蛍光スポットとして捉えることには成功したが、検出に用いたGFPのノイズが高くてdutA RNAの動態を追跡するには不向きであった。そこで本研究では、ノイズの殆どない或いは極めて低い新規のRNA動態検出法を立ち上げてdutA RNAのダイナミズムを把握することを目指した。また、同時にlncRNAの機能解析には欠かせないRNA結合タンパク質を同定し、dutA RNAータンパク質複合体組成を分析することで、dutA RNAがどのような機序でオーガナイザーから消失するかを解明し、細胞質lncRNAの組織特異的な消失によるダイナミックな分化スイッチのメカニズムを提唱することを最終的な目標とした。2018年度は上手く進捗しなかった部分と予想以上に進捗した部分が混在し、総じておおむね順調に進展していると言える。まず、進捗しなかった部分はイメージング技術の開発である。今までのシステムではノイズが高くて使えなかったことから、MS2-GFPを低レベルに発現する株を選抜することに成功した。この株を用いてノックイン株のdutA RNA分子そのものをRNA FISHで、そこに結合するMS2-GFP融合タンンパク質を免疫染色で共局在を調べた。その結果、以前の株よりノイズは軽減して改善し、RNAとGFPが共局在しているところも見られた。しかしながら、依然として局在が一致しないノイズが見られた。その他の試みとして行ったスプリット蛍光タンパクを用いた解析では、上手くシグナルが見られなかった。一方で、その他の研究計画は予想以上に進展した。まず、コントロールとしての内在dutA RNAの経時的な局在変化をSTATaの局在と共に正確に記述した。その結果、dutA RNAは今まで知られていた以上に発生とともに局在を劇的に変化させることを見出した。また、STATaとの共局在はほとんど見られなかった。dutA RNA結合タンパク質の精製では、ChIRP法によってある程度複合体の精製が可能であったが、精製量が不足してノイズを完全に除くことができなかった。その改善策として、イメージング用に作製したノックイン株をそのまま用いてMBP-trap法で精製を試みた。その結果、多くのタンパク質を高純度に精製出来、そのうち4つのタンパク質について質量分析によって同定に成功した。
不正咬合者の咬合終末経路における接触、滑走状態の画像解析

本研究課題は、平成元年度科研費(一般B)支援による「咬合終末経路の動態画像解析」と題する研究成果の延長線上にあるものである。すなわち、平成元年度交付金の支援により、顎運動の三次元座標値デ-タと非接触型三次元ディジタイザ-から得られた上下咬合模型の三次元座標値マトリックスとを合成し、咬合終末期の剛体としての上下顎の位置的関係を精細に捉え得ることを確認し、本研究に対する基本的アルゴリズムを確立した。そこで、本研究ではその研究成果の臨床的応用の手始めとして、各種不正咬合者に特有の咬合終末経路における接触、滑走状態に対し、特にその咬合終末位近傍の上下顎歯間距離を計測し、得られた歯間距離デ-タと上下顎歯列の形態デ-タとを合成し、コンピュ-タ-三次元画像処理技術を駆使することにより、咬合状態を歯列全体からも、また部分的にも定性的ならびに定量的に評価することが可能となった。この結果、歯の早期接触や咬頭干渉もしくは咬合誘導の状態等が、任意の時点で、任意の方向から、任意の部分で抽出され画像として表現されることにより、不正咬合の様態およびその成因が明確になり、その成果は矯正の診断や治療上に活用できることが確認された。さらに、平成3年度(一般B)「上下第一大臼歯の咬合終末位にいたる応力解析」と題する研究計画により本研究を一歩進め、矯正臨床で歯列再排列の基準となる上下第一大臼歯を対象として、咬合終末位にいたる上下歯間に生ずる咬合応力の動態解析を有限要素法や流体力学的手法を用いておこなうことにより、歯の早期接触や咬頭干渉もしくは咬合誘導等、ならびに咬合終末期における咀嚼物の状態が精細に検討され、形態学的にも生理学的にも多くの新しい知見が得られるものと思量される。
近世後期地方知識人の「家」と教育

本年度は、主として史料の所在調査とその収集に当たる計画であった。はじめに、研究の対象としたい「近世における地方知識人の家」の所在を知る方法を考えた。近世のある地方での歴史を知るためのもっとも基本である、地方自治体が刊行したそれぞれの自治体史で目当てとするような「家」が、通史編に書かれてないか、あるいは史料編の史料としてそういう家の史料が収録されてないかを、都道府県史のレベルで調査した。その結果分ったのは、研究対象としようと考えているような「家」は取り上げられていないことであった。日本史の分野で、社会史の観点を導入した研究成果が発表されるようになって20年近い歳月が流れた。ところが、都道府県史レベルに反映できるような、近世の地域社会の中で教育者の再生産がどのようになされていたのか分析した研究成果はほとんど無いということだ。そこで、市町村史のレベルまで下がれば地域により密着した自治体史として記述があるかと思い、2年前に翻刻を出版した近世女性日記の筆者と親交のあったことが確認できる人が生活していた各地へ出かけ、県立図書館などで市町村史や郡誌を調査した。残念ながらこれも大きな成果はなかった。本年度の調査では、歴史研究では欠くことのできない史料を得ることの難しさが浮き彫りになった。しかし、来年度も、いくつか収集できた史料の解読・分析を進めながら、いましばらく史料調査を続けたい。
人工心肺を用いない内視鏡下心臓内手術の基礎的研究

本研究は,従来不可能とされていたASD・VSD・TR・MS・MRなどの心臓内手術を人工心肺を用いず心拍動下に行うことを目的とし,ドーナツ型心臓固定装置を改良した心臓局所固定技術と内視鏡手術手技について,研究を施行した.特にASD(心房中隔欠損閉鎖術)を最初の対象疾患として心房用の内視鏡下心拍動心臓内手術装置の開発を行った.装置の開発(1)内視鏡挿入用の心固定装置の開発内視鏡手術器具は何度も出し入れが必要であるため,ドーナツ型心臓固定器具を改良し,中心円に内視鏡器具挿入が可能となる出血防止弁付き心固定装置を制作した.雑種成犬にて右心房に装置を吸着固定し,内視鏡用手術器具を出し入れし,心臓内に空気が入らないか,また,出血しないかを実験した.ドーナツの部分は従来通り底面(心表面接触部位)に溝があり,空気吸引にて心表面に吸着固定される.(2)心臓内観察用内視鏡の開発心臓内は循環する血液で充満し,通常の内視鏡では観察困難である.内視鏡カメラの先端部位に透明のバルーンを装着し膨らませることで心臓内を観察可能とする.バルーンには針が刺入しても簡単に破裂しないよう肉厚のある破れにくい素材を用いる.見えにくい場合の対策として,周囲の血液を生食にて吹き飛ばす装置を開発中である.動物実験全身麻酔下に右開胸にて心臓を露出する.内視鏡挿入用の心固定装置を右心房に固定する.ヘパリン投与後,ドーナツ中心円を切開し出血防止弁付き心固定装置を装着する.内視鏡を心臓内に挿入し,バルーンを膨らまし心臓内を観察した.現段階では,内視鏡にて継続的に明瞭な画像を得ることは困難であることが判明した.内視鏡の先端部バルーンの形状をさらに工夫し改良する必要がある.本研究は,従来不可能とされていたASD・VSD・TR・MS・MRなどの心臓内手術を人工心肺を用いず心拍動下に行うことを目的とし,ドーナツ型心臓固定装置を改良した心臓局所固定技術と内視鏡手術手技について,研究を施行した.特にASD(心房中隔欠損閉鎖術)を最初の対象疾患として心房用の内視鏡下心拍動心臓内手術装置の開発を行った.装置の開発(1)内視鏡挿入用の心固定装置の開発内視鏡手術器具は何度も出し入れが必要であるため,ドーナツ型心臓固定器具を改良し,中心円に内視鏡器具挿入が可能となる出血防止弁付き心固定装置を制作した.雑種成犬にて右心房に装置を吸着固定し,内視鏡用手術器具を出し入れし,心臓内に空気が入らないか,また,出血しないかを実験した.ドーナツの部分は従来通り底面(心表面接触部位)に溝があり,空気吸引にて心表面に吸着固定される.(2)心臓内観察用内視鏡の開発心臓内は循環する血液で充満し,通常の内視鏡では観察困難である.内視鏡カメラの先端部位に透明のバルーンを装着し膨らませることで心臓内を観察可能とする.バルーンには針が刺入しても簡単に破裂しないよう肉厚のある破れにくい素材を用いる.見えにくい場合の対策として,周囲の血液を生食にて吹き飛ばす装置を開発中である.動物実験全身麻酔下に右開胸にて心臓を露出する.内視鏡挿入用の心固定装置を右心房に固定する.ヘパリン投与後,ドーナツ中心円を切開し出血防止弁付き心固定装置を装着する.内視鏡を心臓内に挿入し,バルーンを膨らまし心臓内を観察した.現段階では,内視鏡にて継続的に明瞭な画像を得ることは困難であることが判明した.内視鏡の先端部バルーンの形状をさらに工夫し改良する必要がある.
ステロイド抵抗性を示すＴ細胞の特性解析

重症喘息を特徴付けるT細胞レベルのステロイド抵抗性のメカニズムを解析し、治療介入の前提となる前臨床研究を行う目的に、ステロイド抵抗性喘息モデルを樹立した。OVAで感作したマウスからT細胞を選択的に単離し、抗原刺激、限界希釈を行い、T細胞をクローニングした。in vitroにおけるT細胞クローンのステロイド感受性と、T細胞クローン移入マウスに抗原チャレンジを行うT細胞移入喘息モデルを用いて、in vivoでのステロイド感受性を評価した。さらに治療介入をめざして、costimulatory signal阻害薬、および、低分子量シグナル伝達阻害薬のステロイド抵抗性改善効果を確認した。OVAで感作したBALB/cマウスやDO11.10マウスからT細胞を選択的に単離し、抗原刺激、限界希釈を行い、T細胞をクローニングした。in vitroにおけるT細胞クローンのステロイド感受性と、T細胞クローンを無処置マウスに移入した後に抗原チャレンジを行うT細胞移入喘息モデルを用いて、in vivoでのステロイド感受性を評価した。in vitroでの増殖応答については、T細胞クローンBF7、T6-2、T6-10の増殖は用量依存的に抑制されT5-1、T6-4、T6-7の増殖は、抑制されないステロイド抵抗性クローンとされた。ステロイド感受性クローンを移入した場合、dexamethasone (Dex)の投与によって、BALF中好酸球数、リンパ球数は用量依存的に低下した。一方、ステロイド抵抗性クローンを移入した場合には有意な低下を認めなかった。すなわち、培養系(in vitro)でのステロイド感受性・抵抗性が、喘息モデル(in vivo)におけるステロイド感受性・抵抗性と一致することが確認できた。T細胞のステロイド感受性に基づくステロイド抵抗性喘息の樹立は世界ではじめての快挙と言える。次いで、分子生物学的見地からT細胞クローンのステロイド抵抗性の機序を明らかにするため、DNAマイクロアレイを用いて、遺伝子発現の網羅的解析を行った。ステロイド抵抗性T細胞クローン(T6-4, T6-7)と、ステロイド感受性T細胞クローン(BF7、T6-2、T6-10)について、無刺激と固相化CD3抗体刺激下での発現遺伝子を解析した。多数の遺伝子の候補がピックアップされたので、validationを実施した。さらに、将来の治療介入をめざして、costimulatory signal阻害薬、および、低分子量シグナル伝達阻害薬につき、in vitroおよびin vivoの両面から同時に解析し、ステロイド抵抗性改善効果を確認した。OVA特異的T細胞クローンの増殖応答によって、ステロイド感受性クローン(BF7, T6-2, T6-10)と抵抗性クローン(T5-1, T6-4, T6-7)を選んだ。ステロイド感受性および抵抗性クローンを抗原提示細胞、OVAと共培養し、終濃度1, 10, 100, 1000 nMとなるようにデキサメタゾン(DEX)を添加し、48時間後に上清を回収、ELISA法によりサイトカイン濃度を測定し、サイトカイン産生のステロイド感受性を調べた。IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γを測定した。DEX濃度01000 nMにおけるサイトカイン産生量からIC50を求めた。ステロイド感受性クローンBF7は、IL-4、IL-5、IL-13を産生し、IC50は31.9 nM、28.9 nM、6.3 nMだった。T6-2は、IL-13、IFN-γを産生し、IC50は6.3 nM、13.1 nMだった。T6-10はIL-5、IL-13を産生し、IC50は5.7 nM、3.8 nMだった。ステロイド抵抗性クローンT5-1は、IL-13、IFN-γを産生し、IC50は27.3 nMと20.9 nMだった。T6-4は、IL-13、IFN-γを産生し、IC50は24.5 nM, 114.6 nMだった。T6-7は、IFN-γを137.2×103 pg/ml産生し、IC50は43.3 nMだった。増殖反応がステロイド抵抗性のクローンも、サイトカイン産生はステロイド感受性であることが明らかになった。また、T細胞クローンをマウスに移入し、抗原チャレンジ、DEX皮下投与を行い、気管支肺胞洗浄液(BALF)に含まれる炎症細胞の計測とサイトカインのアッセイにより、in vivoにおけるサイトカイン産生のステロイド感受性を評価した。ステロイド抵抗性クローンと感受性クローンの樹立、大量培養系を安定的に実行でき、初年度に予定していた実験のすべてを実施出来た。ステロイド感受性クローンと抵抗性クローンの選別と、in vitroサイトカイン産生におけるステロイド感受性の判定も実行できた。

さらに、in vivoにおけるサイトカイン産生レベルのステロイド抵抗性/感受性評価を開始できた。また、ステロイド抵抗性のメカニズムを解明する目的に、遺伝子発現解析(ジーンチップ)を開始できた。以上のことから、初年度の研究達成度は十分に高いと考える。初年度に引き続き、T細胞クローン移入喘息モデルマウスを用いたin vivo実験系において、T細胞クローンのステロイド感受性および抵抗性の違いによるDEX投与時の気道炎症治療効果について評価する。抗原チャレンジとDEX投与を施したT細胞クローン移入喘息モデルマウスよりBALFを採取し、単球・好中球・好酸球・好塩基球・リンパ球数の計測とサイトカインのアッセイを行う。同時に肺・気管支組織を採取し、HE染色により組織の好中球・好酸球浸潤について評価する。前年度には行わなかった気道過敏性の評価を加える。in vitro研究では、ステロイド存在下におけるOVA特異的T細胞クローンの遺伝子発現解析を行う。分子生物学的見地からT細胞クローンのステロイド抵抗性の機序を明らかにするため、DNAマイクロアレイを用いて、ステロイド存在下における遺伝子発現の網羅的解析を行う。抗原提示細胞(APC)の影響を排除するため、抗原刺激をAPCではなく抗CD3抗体と抗CD28抗体によって行う。各T細胞クローンを固相化抗CD3抗体と抗CD28抗体により活性化させ、DEXを終濃度1000 nMとなるように添加して培養する。培養開始24時間後に細胞を回収して、総RNAの抽出を行い、DNAマイクロアレイを用いて遺伝子発現解析を行う。3種類のステロイド抵抗性T細胞クローン(T5-1, T6-4, T6-7)について、ステロイド存在下での発現遺伝子を比較し、共通または特徴的な遺伝子発現の関連付けを行う。ステロイド抵抗性T細胞で、ステロイド存在下において特徴的に発現量の増加または抑制が起こる遺伝子を選出する。さらに、RT-PCRにより発現の確認を行い、経時的及び定量的な発現の変化を追う。本研究では、動物実験を行うため、実験に用いるマウスの購入費用(1500円x 200匹)と実験に用いるまでの飼育にかかる経費(飼料、床敷等)を計上した。プラスチック類と細胞培養用試薬は、T細胞クローンの培養に用いる細胞培養用プレート、滅菌ピペット、液体培地である。その他試薬は、T細胞クローンの抗原刺激やマウスの抗原チャレンジに用いるOVA、ステロイド薬、各種バッファー類である。T細胞クローンの遺伝子発現解析に用いるDNAマイクロアレイやハイブリダイゼーションキット、RT-PCRに用いるポリメラーゼ、プライマー等を遺伝子発現解析関連に計上した。
都市直下地震を想定した入力地震動の考え方と地域防災計画のあり方

本研究の目的は、従来の被害評価手法が都市直下の地震にはそのまま適用できないことを数値シミュレーションから指摘し、都市直下に地震が想定される場合の被害評価法のあり方を、札幌市を例に具体的に与え、被害評価の際に、起震断層が特定できず震源パラメータが一意に絞り込めない場合、または起震断層に不確定要素が多い場合、あるいは多くの起震断層が想定される場合に防災上対処できるべく、直下地震による被害評価の結果をいかにして地域防災計画へ反映させ得るかについて言及することにある。研究初年度は、被害評価シミュレーションを行い、直下地震で不確定性が問題となる震源パラメータの評価結果への影響を数量的に明らかにした。震源パラメータの内、特に断層破壊開始点の影響が大きく、被害量で約10倍の格差を生じることが確認でき、防災計画立案への問題点として指摘した。その結果を承け、札幌市を事例として評価結果を防災計画に反映させる場合に検討すべきルールを、地震学的観点・地震工学的観点・防災行政的観点からそれぞれ提示した。平成11年度は最終年度にあたり、昨年度の成果を一般市町村へ拡張し、複数の被害シナリオが想定される場合に対策重要度決定ルール則を提案し、それをもとに北海道全市町村を対象として防災対策の是非の診断を行った。具体的には、北海道全市町村の防災担当官に対策意識に関する一対比較型アンケート調査を実施した。得られた成果として、本方法により防災担当官の対策意識が浮き彫りにされること、そしてそれに基づいて各自治体ごとに防災対策の方向性の是非が診断され得ることが判明し、今後の本邦における地域防災計画策定のためのツールとして有効活用の道が開けた。また、成果の一部を学会誌等に発表した。そのための研究期間を2カ年に設定した。平成10年は初年度に相当し、目的遂行のために以下のサブテーマを設定した。(1)サブテーマ1:直下地震被害評価の問題点発掘(2)サブテーマ2:直下地震の被害評価法の提案成果とし、サブテーマ1に関しては、研究フィールドである札幌市の自然環境・社会環境資料を収集し、データベース化が完了した。それにもとづいて、被害評価シミュレーションを行い、直下地震で不確定性が問題となる震源パラメータの評価結果への影響を数量的に明らかにした。サブテーマ2に関しては、1の結果を承け、札幌市を事例として評価結果を防災計画に反映させる場合に検討すべきルールを、地震学的観点・地震工学的観点・防災行政的観点からそれぞれ提示した。以上の成果を学会誌へ投稿すべく準備中である。ほぼ計画通りの遂行状況にあり、次年度は、本年度の成果の一般化に主目的が移行する予定である。