hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗腫瘍免疫活性能を増強したウイルス療法戦略の基礎研究

G47Δは、正常細胞では複製できず、がん細胞のみを破壊する、強力な抗腫瘍効果と高い安全性を併せ持つがん治療用ウイルスであり、現在、前立腺がん・嗅神経芽細胞腫・悪性中皮腫を対象とした臨床研究、更には膠芽腫に対する第二相の医師主導治験が所属研究室にて展開されている。このウイルス療法は様々ながん腫に対して有効であり、既存の治療に抵抗性を示すような難治性がんに対する新規治療法として適応拡大に向けて開発が進められている。ウイルス療法においては感染したがん細胞に対して特異的な抗腫瘍免疫を惹起できるため、がんワクチンとしての効果をも併せ持つ。そこで、G47Δを基本骨格として、抗腫瘍免疫惹起能を更に増強させるようなウイルスを開発し、ウイルス療法の治療効果の増強を目指して本研究を進めている。昨年度作製した、抗腫瘍免疫惹起能を更に増強させる分子を搭載したウイルスおよびCRISPR/Cas9ゲノム編集システムを用いて作製した新規がん治療用HSV-1を用いて、同系マウス片側皮下腫瘍モデルにおける抗腫瘍効果の検証を行った。更に、In vivoで用いたマウス細胞株における新規がん治療用HSV-1の殺細胞効果、ならびに複製能や感染効率に関して、in vitroでG47Δと比較し、評価した。また、殺細胞効果に関しては、バイオイメージングシステムを用いて、経時的にイメージングを行い、G47Δと比較することができた。同系マウス皮下腫瘍モデルにおける抗腫瘍効果の検証には、所属研究室にて日常的に使用している実験系として確立しており、先行研究あるいは予備実験にて使用する細胞数、G47Δの効果などの基礎データもあるため、順調に検証を進めることができた。引き継ぎ、同系マウス皮下腫瘍モデルにおける抗腫瘍効果の検証を行う。マウス両側皮下腫瘍モデルを用いて、片側の皮下腫瘍のみにウイルス投与を行った場合に、遠隔の非投与側腫瘍に対しても抗腫瘍効果を示すかどうかを見ることで抗腫瘍免疫が惹起されているかどうかを検討する。また作製したウイルスをカクテルとして同時投与し、その併用効果を検討し、より効果的な治療法を探索する。G47Δは、正常細胞では複製できず、がん細胞のみを破壊する、強力な抗腫瘍効果と高い安全性を併せ持つがん治療用ウイルスであり、現在、前立腺がん・嗅神経芽細胞腫を対象とした臨床研究、更には膠芽腫に対する第二相の医師主導治験が所属研究室にて展開されている。まず、G47Δを基本骨格として抗腫瘍免疫惹起能を更に増強させる分子を搭載したウイルスを作製した。ウイルスの作製には所属研究室で開発された任意の遺伝子カセットを確実に挿入し、短期間で作製可能なbacterial artificial chromosome (BAC)システムを利用した。作製したウイルスのゲノム構造確認、およびELISAにて搭載した分子の発現確認を行った。また、CRISPR/Cas9ゲノム編集システムを用いて、既存のがん治療用HSV-1ゲノムに新たな欠失変異を作成して新規がん治療用HSV-1を作製し、ゲノム編集技術がHSV-1作製に応用可能であることを実証した。遺伝子欠失の確認は、欠失部位のPCRやシーケンスにより行った。遺伝子改変HSV-1は、正常細胞におけるウイルス複製能が必ず減弱する。一方、がん細胞におけるウイルス複製能はゲノムの設計に依存するため、新規HSV-1の感染能・複製能をin vitroでG47Δと比較し、評価した。ウイルスの作製には所属研究室で開発された任意の遺伝子カセットを確実に挿入できる、G47Δを基本骨格とするbacterialartificial chromosome (BAC)システムを利用することで、短期間で新規ウイルスを作製することができた。また、新規ウイルスの構造確認、搭載分子の発現確認なども、早い段階で予備実験を行っていたため、順調に進めることができた。

同系マウス皮下腫瘍モデルにおける抗腫瘍効果の検証には、所属研究室にて日常的に使用している実験系として確立しており、先行研究あるいは予備実験にて使用する細胞数、G47Δの効果などの基礎データもあるため、順調に検証を進めることができた。作製した新規ウイルスを用いて、同系マウス皮下腫瘍モデルにおける抗腫瘍効果の検証を行う。使用する同系マウスモデルとしては、乳がん細胞4T1・Balb/cマウス、悪性黒色腫cloneM3・DBA/2マウス、大腸がん細胞CT26・Balb/cマウス、腎細胞がんRenca・Balb/cマウス、神経芽腫Neuro2a・A/Jマウスを用いる。これらのマウスモデルは所属研究室にて日常的に使用されているため実験系が確立しており、先行研究あるいは予備実験にて使用する細胞数、G47Δの効果などの基礎データもあるため、比較検討が容易にできる。まずは作製したウイルスの抗腫瘍効果をマウス皮下腫瘍モデルにてG47Δと比較検討する。正常免疫マウスの両側皮下腫瘍モデルを用いて、抗腫瘍免疫を介する治療効果の評価を行い、遠隔の抗腫瘍効果に寄与する免疫メカニズムを検討する。引き継ぎ、同系マウス皮下腫瘍モデルにおける抗腫瘍効果の検証を行う。マウス両側皮下腫瘍モデルを用いて、片側の皮下腫瘍のみにウイルス投与を行った場合に、遠隔の非投与側腫瘍に対しても抗腫瘍効果を示すかどうかを見ることで抗腫瘍免疫が惹起されているかどうかを検討する。また作製したウイルスをカクテルとして同時投与し、その併用効果を検討し、より効果的な治療法を探索する。
医工連携による視線追尾システム開発で無影灯調整を自動化する

歯科治療を安全に行うには術野である口腔内への的確な光の照射が求められる。無影灯による光照射の位置調整を自動化するために、治療する歯の部位により無影灯の位置をパターン化することが可能か検討した。口腔内を6ブロックに分け、それぞれに配置した切削模型歯の頬側面、舌側面を切削する際の「術者の頭」、「無影灯」の三次元座標を計測した。20個の計測値を用い統計分析ソフトJMP上で三次元散布図を作成し、「歯」、「術者の頭」、「無影灯」の大よその位置関係を明確にした。無影灯の照射位置を術者の視線に追尾させることに対する有効性を検討するために、コンポジットレジン修復をする際の術者の視線移動について視線解析装置(tobii pro glass2)を用い計測した。10段階の操作手順を要するコンポジットレジン修復を歯科医師10名が行った結果、歯以外への視線移動は総修復時間の約50%を占めた。これにより無影灯を常に視線追尾させる必要がないことが示唆された。近年、LED技術の進化により、歯科治療時に小型LEDヘッドライト(以下、小型LED)を装着する歯科医師が増加している。小型LEDは術者の目に近い位置に装着することで、頭部のわずかな角度変化で照射位置を調整でき、視線とほぼ同軸の光照射により影のない術野を確保できる。小型LEDは術者が求める位置にフリーハンドで照射可能な無影灯の機能を有する。今回、小型LEDを常用する歯科医師にアンケートを行った結果、小型LEDは光源としての機能性が高いことがわかった。本研究では視線解析装置から術者が注視する歯の座標を抽出し、視線追尾機能を有する無影灯の実機製作することが達成できなかったことが反省点である。今後は小型LEDの使用者が今後さらに増加することが予測され、術者の視線情報だけではなく、他の情報による無影灯の照射位置の自動化も検討する必要がある。本研究は歯科治療時の口腔内への光照射を効率よく行うために、これまで主に術者や歯科衛生士が行ってきた無影灯の調整を術者の視線を追尾し自動化することを目的とする。平成27度の研究計画と成果について以下に示す。1、資料収集、研究計画立案、実験前準備実験前準備として歯科治療時の術野への光照射の現状を数値化するための実験方法について再考し、必要とされる実験器材を購入した。歯科治療の中でも特に光照射を要する歯の切削時の無影灯操作時間計測を今年度の研究計画の一つとし、切削用模型歯、顎模型と分析に用いるパーソナルコンピューターを購入した。また、平成28年度に計画している歯科治療時の術者の視線追尾測定、分析に使用する実験機材について数社から機材の基本性能、分析ソフトが有する分析項目、価格について情報収集を行った。2、無影灯操作時間の測定一般的に術野に光照射が必要な歯科治療では歯科ユニットに組み込まれた多関節ワームに設置してある無影灯を歯科衛生士などの介助者や術者が手で操作し術野に光を供給する。今年度の研究では歯を切削する歯科治療の中で歯の全面を切削する必要がある全部金属冠による治療を想定し、学生実習に用いる切削用模型歯を顎模型に設置したものと実習用のマネキンを用い全部金属冠支台歯形成のシミュレーションを行い無影灯操作について調査した。切削用模型歯の切削には実際に歯科治療で使用する歯科用ユニットに設置した高速切削器具とダイヤモンドバーを用いた。左側下顎第一大臼歯の切削用模型歯を歯科医師5名が各5回支台歯形成を行い、切削中の術者をビデオカメラで撮影し支台歯形成時の術者による無影灯時間、回数について測定を行った。平成27年度の研究計画は切削用模型歯を用い全部金属冠支台歯形成時の無影灯操作分析である。目標は切削する切削用模型歯の位置は口腔内を右側上顎臼歯、上顎前歯、左側上顎臼歯、右側下顎臼歯、下顎前歯、左側下顎臼歯の6ブロックに分割し1ブロックあたり5本の切削模型歯を削る。これを長崎大学病院に勤務する歯科医師20名、介助者20人を対象に無影灯操作時間と歯の位置について統計分析を行うとしていた。しかし今年度に測定した切削シミュレーションは左側下顎臼歯1ブロックに対し歯科医師5名が切削模型歯を各5本切削しただけで計測数が目標に対し不足している。また、平成27度は切削時の術者による無影灯操作時間の測定のみを行っており、介助者による無影灯操作について計測していないため、更に計測に必要な歯科医師、介助者を募集する必要がある。無影灯操作測定の被験者である介助者には歯科医師、歯科衛生士を必要とするが切削シミュレーションを行う時間帯が測定者や被験者の都合や歯科治療用チェアーの使用状況などから就業時間外になることが多く、歯科衛生士に関しては特に研究の協力を得ることが困難なことが計測数が不足している原因の一つである。また、平成27年度に切削シミュレーションに参加協力した歯科医師に対し謝礼を設定していなかったことも参加者が不足した原因の一つではないかと考えられる。1.資料収集の継続平成28年度は平成27年度に行った基礎的研究としての無影灯の操作時間の測定数がやや少なかったこともあり、さらに測定数と切削部位を追加した。左下第一大臼歯の全部金属冠用支台歯形成に加え右側上顎

中切歯の全部金属冠と右側第一大臼歯の前装冠支台歯形成を追加した。右側上顎中切歯、右側上顎第一大臼歯の切削用模型歯を歯科医師5名が各5回支台歯形成を行い、切削中の術者をビデオカメラで撮影し支台歯形成時の術者による無影灯操作時間、回数について測定を行った。切削用模型歯の切削には実際に歯科治療で使用する歯科用ユニットに設置した高速切削器具とダイヤモンドバーを用いた。その結果、上顎前歯部切削時の無影灯操作時間は左側下顎大臼歯切削時の無影灯操作時間とほぼ同等であることがわかった。右側第一大臼歯切削における無影灯操作は他の2種よりも操作時間、回数ともに増加することがわかった。2.視線測定器の実機試用視線測定器の選択にあたり2社の測定器において実際に歯科臨床実習用のデンタルシミュレーターと切削模型歯を用い、歯の全面の切削を必要とする全部金属冠用支台歯形成時の術者の視線測定についてデモンストレーションを行い比較した。視線検出能力に大きな変化はなかったが、測定前の被験者の瞳孔の位置を設定するキャリブレーション時間に大きな差があった。また、視点追尾機能については被験者の睫毛の状態に左右される可能性があることが示唆された。購入予定の視線測定器と解析ソフトウェアの機種をまだ決定できていないため、予定していた歯を切削する術者の視線と無影灯の位置のパターン化が進行していない状況で予定よりもやや遅れていると考えられる。1,視線測定器の購入無影灯により照射された口腔内を撮影可能な視線測定器を選定し購入した。2,視線測定器を用いた歯科研修医教育現在,研究代表者は主に歯科研修医教育を行っており,購入した視線測定器の試用を兼ね,歯科治療における術者と診療補助者間の共同動作の実習に視線測定器を用いた。歯科臨床実習用のデンタルシミュレーター上で右側下顎第一大臼歯咬合面のI級窩洞にCR修復を行う術者の視線の動きを視線測定器により動画として記録し,診療補助者との共同動作に関するフィードバックに,記録した動術者の視線動画を用いた。フィードバック後に再び同じ術者にCR修復を行わせ,視線測定器により術者の視線を動画として記録した。フィードバック前後の術者の視線動画から,術者の視線が口腔内にとどまっている時間とCR修復に要する総実習時間のうち,口腔内を見る割合,口腔内から視線をはずす回数,時間,総実習時間について測定し,比較検討した。同実習内容,検討結果に関して日本総合歯科学会学術大会でポスター発表を行った。視線測定器から注視点の座標の抽出のためのプログラムに対する知識不足もあり視線と切削部位のパターン化が予定より遅れており,そのため工学部での機器製作に関する予定がすすんでいない。歯科治療を安全に行うには術野である口腔内への的確な光の照射が求められる。無影灯による光照射の位置調整を自動化するために、治療する歯の部位により無影灯の位置をパターン化することが可能か検討した。口腔内を6ブロックに分け、それぞれに配置した切削模型歯の頬側面、舌側面を切削する際の「術者の頭」、「無影灯」の三次元座標を計測した。20個の計測値を用い統計分析ソフトJMP上で三次元散布図を作成し、「歯」、「術者の頭」、「無影灯」の大よその位置関係を明確にした。無影灯の照射位置を術者の視線に追尾させることに対する有効性を検討するために、コンポジットレジン修復をする際の術者の視線移動について視線解析装置(tobii pro glass2)を用い計測した。10段階の操作手順を要するコンポジットレジン修復を歯科医師10名が行った結果、歯以外への視線移動は総修復時間の約50%を占めた。
都市住民における循環器疾患の危険因子の集積と血管部位別の動脈硬化進展度との関連

都市部の循環器ドック受診者を対象として、様々な血管部位の動脈硬化度を測定するとともに、それらの関連要因を検討した。その結果、壮年男性を中心にメタボリックシンドローム等が原因となって進行する粥状硬化(じゅくじょうこうか)を頸動脈などに認める者の割合が多いこと、逆に、高齢者を中心に高血圧等が原因となって進む細動脈硬化(さいどうみゃくこうか)を眼底動脈等に認める者の割合が多いことなどが明らかになった。本研究は、都市住民を対象として、循環器疾患発生の基盤となる動脈硬化性病変を血管部位別に検査し、血管部位による動脈硬化進展度の相違ならびに危険因子の集積との関連を明らかにすることを目的とする。平成19年度は、評価法が未だ確立されていない頭蓋内内頸動脈の石灰化について、動脈硬化性所見としての意義を検討するため、医療機関に脳梗塞で入院した患者49例(男22例、女27例。平均年齢57.4歳)を対象として、単純CT検査で評価した内頸動脈の石灰化とCT Angiography検査より評価した同血管の狭窄度との関連を検討した。石灰化の評価にあたっては、冠状動脈の石灰化の定量化法として確立しているAgatston法を用い、内頸動脈の石灰化スコアを算出した。石灰化の評価部位は、左右の血管を別血管として計98本の血管について、内頸動脈が前床突起部を縦走する部位(以下、C1)と海綿静脈洞部を横走する部位(以下、C4)のうち、画像再構成スライス厚1mmで肉眼的に石灰化の面積が最も大きい部位とした。その結果、C1において石灰化を認めなかった68本の血管のうち、66本(97%)において狭窄は認められなかったのに対し、石灰化を認めた30本の血管のうち、狭窄無しは13本(43%)、25%未満の狭窄は10本(33%)、25%以上の狭窄は7本(23%)と非石灰化血管に比し有意に狭窄の割合が高かった(P<0.001)。さらに、石灰化血管のうち狭窄を認めた血管の割合は、石灰化スコアか10未満の群、10以上50未満群、50以上の群の順に、40%、67%、100%となり、石灰化スコアが大きい群ほど狭窄を有する割合が高かった。この傾向は、C4でも同様であった。以上より、頭蓋内内頸動脈の石灰化は、同部位の狭窄と正の関連があり、動脈硬化所見の指標となることが定量的に示された。今回関発した石灰化スコアは、造影剤を使用しない単純CT検査における脳動脈硬化スクリーニング法として有用であることが示唆された。本研究は、都市部のドック受診者を対象として、循環器疾患発生の基盤となる動脈硬化性病変を血管部位別に検査し、血管部位による動脈硬化進展度の相違ならびに関連因子を明らかにすることを目的とした。最終的な解析人数は男女計2756人(平均年齢59±11歳)となった。性別にみた各動脈硬化所見の頻度は、冠状動脈石灰化は男で41%、女で28%、脳底部内頚動脈石灰化は男で60%、女で71%、総頸動脈壁肥厚は男で34%、女で22%、内頸動脈壁肥厚は男で44%、女で31%、網膜細動脈の高血圧性変化または動脈硬化性変化は男で32%、女で21%、脈波伝搬速度高値は男で68%、女で61%であった。各々の動脈硬化所見の関連因子を検討した結果、血管部位により動脈硬化の促進要因の影響力が異なることが示唆された。また、壮年男性では高齢男性や女性よりも、網膜細動脈硬化、頸動脈硬化および冠動脈石灰化を有する者の割合が大きく、その原因として、高血圧、糖代謝異常、メタボリックシンドロームを有する者の割合が比較的高いことが影響していると考えられた。さらに、男女ともに、肥満の有無に関わらず、リスク因子(高血圧、高血糖、脂質異常)の集積個数が多いほどいずれの動脈硬化所見の頻度も高くなることも明らかとなった。本研究により、都市部の壮年男性では、高血圧、糖代謝異常等のリスクの集積とも関連し、眼底動脈の細動脈硬化ならびに冠状動脈や頸動脈の粥状硬化か進展している者の割合がより大きいことが明らかとなり、都市部の壮年男性に対する動脈硬化進展の予防対策の重要性と重点的に介入すべき危険因子が示された。また、肥満していないリスク集積者における動脈硬化進展者の割合も少なくないことから、今後、多様な危険因子の集積パターンをもつ個人に対し動脈硬化所見を総合的に評価することの重要性が示された。
推論空間モデルに基づくｅクチコミ文の態度変容効果仮説の検証

近年、ソーシャルメディアの普及に伴って、ネット上のクチコミ(eクチコミと呼ぶ)への接触による態度変容効果の研究が精力的に行われている。研究代表者は、これまでに、メッセージの表現形式の違いから態度変容効果の大小を説明する「推論空間モデル」を構築した。本研究の目的は、推論空間モデルから導かれる未検証仮説を実験的に検証することにある。実験を通して、eクチコミについては、推論量のより小さいメッセージの方が、より大きな態度変容効果をもつことが示唆された。推論空間モデルは、送り手の態度レベルを導くのに必要なエフォートの程度を「推論量」として数値化し、推論量の大小比較からメッセージ間の態度変容効果の差異を説明しようとするものである。今期は、eクチコミメッセージの態度変容効果について、最も基本的な研究課題に取り組んだ。具体的には「書き手の態度を明示するメッセージ(推論量小)は、明示しないメッセージ(推論量大)より態度変容効果が大きい」という仮説を構築し、質問紙調査による仮説検証を行った。調査の課題数や回答のサンプル数の点で、限定的な検証ではあったが、仮説が支持されることを確認した。匿名の書き手が情報発信するeクチコミでは、書き手がどの商品をどれくらい気に入っているかを明示するメッセージの方が、単に便益を述べるメッセージより態度変容効果が大きくなることを意味する。これまでの広告効果研究では、推論の動機と知識がある読み手にとっては、推論量が大きいメッセージほど態度変容効果が大きいとされてきた。今回の検証では逆の結果、つまり、推論量が小さいメッセージほど態度変容効果が大きいという仮説が支持された。こうした効果の差異は、広告とeクチコミとでは読み手の行う推論が本質的に異なることを示唆する。2.実験環境の設計と構築:E-Primeの実行環境を整備した。簡単な動作確認を終えたものの、実験コンテンツの作成完了には至らなかった。3.学会発表:日本認知心理学会ディスコース心理学研究部会にて研究発表を行った。平成28年度は、平成27年度に得られた結果をまとめて、国際会議Society for Text & Discourse(ST&D)にてポスター発表を行った。また、国際会議International Conference on Thinking (ICT)に参加し、思考研究に関する動向調査を行った。これらの研究活動を通して、本研究のモデルと実験方法に関して改善を行った。具体的には、「見つからなかった」と「ないと言われた」の違いを確率表現で区別する方法や、メッセージ中の微妙な言い回しが解釈に与える影響の調査などの先行研究の考えを本研究に導入する検討を行った。さらに、消費者が推論により導く「結論」のレベルを分けて実験するアプローチの検討を行った。結論のレベルを分けて実験することは、本研究で提案するモデルの一般性を主張するうえで重要となる。平成29年度は、これらの視点も取り入れて実験を実施する。1.実験環境の設計と構築:E-Primeの実行環境を整備した。2.学会発表:日本認知心理学会ディスコース心理学研究部会にて口頭発表を行った。国際会議Society for Text & Discourseにてポスター発表を行った。平成29年度は、二つのテーマについて研究を行った。(1)結論非明示効果仮説をeクチコミメッセージについて検証した。結論非明示効果仮説とは、結論をあえて言わないメッセージは説得の効果をもつとする仮説である。実験により、eクチコミについては、結論非明示効果が制限されることを示した。この結果は、日本認知心理学会ディスコース心理学研究部会にて口頭発表した。さらに、国際会議Society for Text & Discourse(ST&D)に投稿し、ポスター発表として採択された。(2)最上級表現されたeクチコミメッセージについて、推論空間モデルから導かれる仮説の検証を行った。検証は、被験者がメッセージを見てから反応するまでの時間を計測する方法で実施した。

メッセージの種類は、程度表現(ずいぶん良い)、最上級表現(もっとも良い)、最上級の程度表現(ずば抜けてもっとも良い)、比較集合付きの最上級表現(・・・の中でもっとも良い)に、コントロールメッセージ(良い)を加えた5種類とした。近年、ソーシャルメディアの普及に伴って、ネット上のクチコミ(eクチコミと呼ぶ)への接触による態度変容効果の研究が精力的に行われている。研究代表者は、これまでに、メッセージの表現形式の違いから態度変容効果の大小を説明する「推論空間モデル」を構築した。本研究の目的は、推論空間モデルから導かれる未検証仮説を実験的に検証することにある。実験を通して、eクチコミについては、推論量のより小さいメッセージの方が、より大きな態度変容効果をもつことが示唆された。推論空間モデルによる態度変容予測/説明では、推論量が大きいメッセージと小さいメッセージのどちらがより大きな態度変容効果をもつのかを明らかにすることは極めて重要となる。平成28年度は、この研究課題について引き続き取り組み、結果を国際会議にて発表することを目指す。平成29年度は、平成27、28年度に得られた結果を踏まえて、推論空間モデルの未検証仮説の検証に取り組み、結果の論文化を目指す。応用人工知能実験環境の構築については、外注によるシステム構築を計画したが、情報収集の結果、市販品である心理実験用ソフトウェアE-Primeを利用したシステム構築に変更を行った。このため、経費が削減された。Webアンケート調査の外部委託を実施する計画であったが、実験デザインの再検討を行ったため、発注に至らなかった。平成28年度は、国際会議での発表を予定することから、外国旅費としての使用を計画する。平成29年度は、Webアンケート調査の外部委託を実施する。
修飾塩基を含むRNAの高速化学合成法の開発

本研究は修飾塩基を含むRNAの高速化学合成をめざすものである。そこで、本研究ではすぐれた光クロスリンク能をもつと考えられる6-チオグアノシンをRNA中に組み込むために、それらの合成ユニットの構築をおこなった。その結果、6-チオ基を2-シアノエチル基で保護し、エキソアミノ基をフェニルアセチル基でそれぞれ保護したアミダイト合成ユニットを構築することができた。一方、別途合成した4-チオウリジンと6-チオイノシンおよび今回の6-チオグアノシンの3'、5'-ビスホスフェート体を2'位にTBDMS基を用いて保護し、最後に3'、5'水酸基をビス(シアノエトキシ)ホスホリル化することによって合成することができた。これらのビスホスフェート体はRNAリガーゼを用いて、別途合成したU1RNAの5'末端部位のオリゴヌクレオチドの3'末端に導入することができた。一方、修飾された塩基をもつRNAは酸・アルカリに極めて不安定なものが多いため、RNAの塩基部の保護基はできれば、全く保護せずに、インターヌクレオチド結合が形成できる方法の開発が必要である。そこで、RNAの高速化学合成をおこなう、予備実験として、塩基を全く保護しないで、DNAの化学合成をおこなうことを検討した。その結果、いわゆるホスホネート法を用いて、縮合剤としては我々が今回開発した新しい縮合剤であるBOMPを用いたところ、ほとんど塩基部位への副反応がおこらず、15量体のDNAフラグメントが得られることを見いだした。これは修飾塩基を含むRNAの高速合成を初めて可能にする重要な知見であり、現在RNA合成に応用を検討中である。そこで、本年度では、現在分子生物学の分野でもっとも需要度が高い、光クロスリンク活性をもつチオオヌクレオシドを含むRNAの化学合成の検討を詳しくおこなった。チオヌクレオシドのなかで、すぐれた光クロスリンク能をもつ、4-チオウリジンと6-チオイノシンをRNA中に組み込むために、それらの合成ユニットの構築をおこなった。その結果、前者の場合、水を含む塩基性条件で4-チオウリジンが分解しやすいことが明らかになり、また、4-チオ基の強い求核性による副反応を防ぐため、4-チオ基を2-シアノエチル基で保護したアミダイト法に適した合成ユニットを構築することができた。2-シアノエチル基は有機強塩基であるDBUによって簡単に除去することができ、しかも分解反応は全く起こらないことがわかった。一方、6-チオイノシンの合成ユニットも2-シアノエチル保護法を用いて、同様に合成することができた。また、将来RNAライゲ-スを用いる酵素法で4-チオウリジンをRNAに組み込む基本的な合成法も合わせて開発するために、4-チオウリジンの3'、5'-ビスホスフェート誘導体も合成することができた。このものについては、U1RNAの5'末端部位のオリゴヌクレオチドのシュードウリジンのかわりに4-チオウリジンを組み込み光クロス実験に供するべく、研究が進行している。また、4-チオウリジンを液相法をもちいて、4sUpGを合成し、このものが、DNAを鋳型にしてT7RNAポリメラーゼの基質となり、5'-末端が4sUpGになるRNAを得ることにも成功した。現在、4-チオウリジンと6-チオイノシンをRNA組み込むため、固相支持担体としてCPGゲルをもちいるポリマーサポート合成を検討している。そこで、本年度はすぐれた光クロスリンク能をもつと考えられる6-チオグアノシンをRNA中に組み込むために、それらの合成ユニットの構築をおこなった。

一方、昨年度合成した4-チオウリジンと6-チオイノシンおよび今回の6-チオグアノシンの3′、5′-ビスホスフェート体を2′位にTBDMS基を用いて保護し、最後に3′、5′水酸基をビス(シアノエトキシ)ホスホリル化することによって合成することができた。これらのビスホスフェート体はRNAリガーゼを用いて、別途合成したU1RNAの5′末端部位のオリゴヌクレオチドの3′末端に導入することができた。一方、修飾された塩基をもつRNAは酸・アルカリに極めて不安定なものが多いため、RNAの塩基部の保護基はできれば、全く保護せずに、インターヌクレオチド結合が形成できる方法の開発が必要である。そこで、RNAの高速化学合成をおこなう、予備実験として、塩基を全く保護しないで、DNAの化学合成をおこなうことを検討した。その結果、いわゆるホスホネート法を用いて、縮合剤としては我々が今回開発した新しい縮合剤であるBOMPを用いたところ、ほとんど塩基部位への副反応がおこらず、15量体のDNAフラグメントが得られることを見いだした。これは修飾塩基を含むRNAの高速合成を初めて可能にする重要な知見であり、現在RNA合成に応用を検討中である。
アディポネクチン受容体の生理・病態生理的意義の解明と生活習慣病治療の分子標的同定

我々は発生工学的手法によりアディポネクチン受容体AdipoR1、AdipoR2の遺伝子欠損マウスを作成し、AdipoR1とAdipoR2の両方をノックアウトすると、アディポネクチンの結合と血糖降下作用等が消失すること、すなわち、AdipoR1、AdipoR2が生体内におけるアディポネクチンの主要な受容体であることを示した(Nat.Med.13:332,2007)。またAdipoR1欠損マウスが耐糖能障害とインスリン抵抗性を、AdipoR2欠損マウスがインスリン抵抗性を、AdipoR1・R2ダブル欠損マウスは両者を足し合わせたようなより顕著な糖尿病とインスリン抵抗性を呈した。そのメカニズムとしてAdipoR1・R2ダブル欠損マウスでは、インスリンの標的器官において、中性脂肪含量・炎症・酸化ストレスの増加が存在し、クランプ試験において糖新生の亢進と糖取り込みの低下の両方が認められ、全身での糖利用の低下が認められること、すなわち肝臓、骨格筋両方のインスリン抵抗性を示すころを明かにした(Nat.Med.13:332,2007)。さらに、メタボリックシンドロームモデル動物においては、このAdipoRの量が低下していてメタボリックシンドロームの原因の一部になっていること、及び、AdipoR1の発現量をアディポネクチン存在下に増加させることはAMPKの活性化をもたらす事、AdipoR2の量を増加させることはPPARαの活性化、抗炎症・抗酸化ストレス作用を介して、実際に生体内においてメタボリックシンドロームを改善させることを示した(Nat.Med.13:332,2007)。さらに、絶食や飢餓によって増加したアディポネクチンの中で中分子量のアディポネクチン、ヒトにおいてはアルブミンと結合した3量体アディポネクチン(Clin. Chem.53:1541,2007)、が視床下部弓状核にあるAdipoR1を介してAMPキナーゼを活性化し、摂食を亢進させることを示した(Cell Metab.6:55,2007; FEBS Lett.582:74,2008)。(1)糖・脂質代謝、動脈硬化におけるアディポネクチン受容体の機能・役割の解明:マクロファージ及び血管内皮細胞のモデル培養細胞においてアディポネクチンの作用が、AdipoR1・R2の発現増減により、どのように影響されるかを解析し、LPSやTNFα刺激による動脈硬化促進性の反応をアディポネクチンは抑制するが、この抑制効果はAdipoR1・R2の発現増により増加、発現抑制により低下することを見出した。全身のAdipoR1・R2ノックダウンマウスを、カフ傷害の系を用いてAdipoR1・R2の個体レベルでの意義を明にすることを試み、現在内膜肥厚の程度を評価中である。(2)アディポネクチン受容体シグナル伝達機構解明:ノックダウンマウスの解析により、アディポネクチンの細胞内情報伝達におけるAdipoR1・R2の役割分担や経路の違いを明らかにすることを試み、野生型マウスにAdipoR1あるいはAdipoR2をノックダウンさせるアデノウイルスを感染させてAdipoRの発現を肝臓特異的に低下させたところ、耐糖能がそれぞれ増悪するのが認められた。

AdipoR1の発現抑制ではAMPK経路が不活化され、糖新生に関わる分子の発現増加、ピルビン酸負荷試験で評価した糖新生の亢進、脂肪酸合成に関わる分子の発現増加と脂肪酸燃焼の低下を介して、肝細胞内中性脂肪含量の増加傾向を認めて、インスリン抵抗性が惹起されているのが認められた。AdipoR2の発現抑制ではPPARα自体の低下とその標的遺伝子である脂肪酸燃焼やエネルギー消費に関わる分子の発現低下と脂肪酸燃焼活性の低下を介して肝細胞内中性脂肪含量の増加傾向を認めた。さらに炎症性サイトカインや酸化ストレス消去に関わる分子の発現抑制とTBARSの増加傾向を認めてインスリン抵抗性が惹起されているのが認められた(Nature Medicine 13:332-339,2007)。(3)アディポネクチン受容体の中枢における機能・役割の解明:我々は髄液中にアディポネクチンが存在すること、更に、アディポネクチンに中枢作用があり、直接レプチン作用を制御していることを発見した。さらにAdipoR1・R2が中枢神経系に発現していることを見出し、組み換えアデノウイルスを用いたRNAiの視床下部への投与により、この作用が主にAdipoR1を介していることを見出した(Cell Metab.in revision)。我々は発生工学的手法によりアテイホネクチン受容体AdipoR1,AdipoR2の遺伝子欠損マウスを作成し,AdipoR1とAdipoR2の両方をノックアウトすると,アディポネクチン結合と血糖降下作用等が消失すること,すなわち,AdipoR1,AdipoR2が生体内におけるディポルクチンの主要な受容体であることを示した(Nat.Med.13:332,2007)。またAdipoR1,R2ダブル欠損マウスが耐糖能障害とインスリン抵抗性を,AdipoR2欠損マウスがインスリン抵抗性を,AdipoR1,R2ダブル欠損マウスは両者を足し合わせたようなより顕著な糖尿病とインスリン抵抗性を,呈した。そのメカニズムとしてAdipoR1,R2ダブル欠損マウスです,インスリンの標的器官において,中性脂肪含量,炎症,酸化ストレスの増加が存在し,クランプ試験において糖新生の亢進と糖取り込みの低下の両方が認められ,全身での糖利用の低下が認められること,すなわち肝臓,骨格筋両方のインスリ抵抗性を示すころを明かにした(Nat.Med.13:332,2007)。さらに,メタボリックシンドロームデル動物においては,このAdipoRの量が低下していてメタボリックシンドローム原因の一部になっていること,子及び,AdipoR1の発現量をアディポネクチン存在したに増加させることはAMPKの活性化をもたらす事,AdipoR2の量を増加させることはPPARaの活性化,抗炎性,抵酸化ストレス作用を介して,実際に生体内においてメタボリックシンドロームを改善させることを示した(Nat.Med.13:332,2007)。さらに,絶食や飢餓によって増加したアディポネクチンの中で中分子量のアデイポネクチン,ヒトにおいてはアルブミンと結合した3量体アディポネクチン(Clin.Chem.53:1541,2007)が視床下部弓状核にあるAdipoR1を介してAMPキナーゼを活性化し,摂食を亢進させることを示した(CELLMetab.6:55,2007;FEBSLett.582:74,2008)。
水素結合受容型有機リン触媒の創製と不斉合成反応への利用

真に有用な高度分子変換に基づく有機合成反応を開拓する上で高活性機能性触媒の開発は急務であり、新規概念に立脚した触媒構造・機能の提案による、従来に無い触媒系構築が待たれる分野である。本研究課題では、近年高い注目を集める水素結合型分子認識能を特徴とする触媒系開発の新たな局面として、リン酸の窒素誘導体であるトリアミノイミノボスホランを機能性部位の中心とする、新規水素結合受容型-Bronsted塩基-触媒の創製を試みた。既存の有機強塩基触媒の代表例であり、アミノ酸の側鎖としてタンパクの分子認識部位となるグアニジン骨格を機能性中心とする人工小分子触媒が平面構造を有し、反応場の制御を指向した分子設計が困難であったのに対し、本ボスホラン系触媒では中心元素であるリンが四面体配座であるがゆえの本質的に立体的な骨格を有しており、多様な触媒構造創出への展開が容易であることに注目して研究を推進した。イミノホスホランの直接的な合成法は汎用性の低いものしか知られていなかったため、前駆体としてボスホニウム塩を経るルートによる合成を採用した。条件検討の結果、最終的に1級アミンと五塩化リンを3級アミン塩基の存在下に混合するのみで、簡便かつ収率良く水素結合供与部位を持つ種々のボスホニウム塩を合成することができた。得られたボスホニウム塩は、溶液中でKOtBuにより脱プロトン化することで目的のイミノボスホランに導き、NMRを用いてその構造を確認した。さらに、得られたイミノホスホランを触媒とする反応系の開発に着手し、モデル反応として取り上げたHenry反応やMichael反応を極めて効率よく促進することを明らかにした。
混合標数における代数多様体の特異点解消問題の研究

平成16年度は,これまで得られた研究結果の整理を行い,そのうちの一部は発表した.(1)整数係数の1変数多項式の特異点をすべて求める実用的なアルゴリズムを発表した.これは多項式の判別式の平方素因子pと,この素因子に関する多項式の重複因子から特異点の候補を計算して,これらの各候補について実際に特異点になるための条件,これは簡単な合同式条件であるが,を確かめればよいもので,きわめて初等的な計算である.(2)完備化という超越的な方法を許せば,この多項式を係数をp進整数とみなして因数分解したものと,係数をpを法として因数分解したものを比較することにより,特異点を決定することもできる、このときは特異点ばかりでなく分岐の様子も知ることができる.p進整数上の因数分解はニュートン多角形で記述できるので,この方法も実用的であるが詳細は未発表である.(3)係数が有理整数でない場合の研究は継続中である.(4)その他の成果としては,局所代数体の有限次拡大の定義方程式の特異点解消である.現時点では拡大がガロアであるかどうかが特異点の性質にどのように反映されるかは不明であるし,アーベル拡大に特徴的な特異点の型も不明であるが,基礎体が1のベキ根を含むかどうかは特異点の重複度などと関係があることが分かっている.定義方程式が非特異ならば分岐の様子が詳しく分かるので,定義方程式が特異点をもつ場合は特異点解消をして得られる例外集合の性質から分岐の様子をある程度知ることもできる.これらについてはまとまり次第発表する予定である.エクセレントなデデキント環Aの商体をKとする.Kの有限次分離拡大Lは,Aの元を係数とする1変数多項式F(x)で与えられる.多項式環A[x]から決まる2次元の非特異なエクセレントスキームにおいてF(x)は1次元の閉部分スキームCを定める.Cは最も簡単な混合標数の代数多様体の例になる.AのLにおける整閉包をBとすると,BはCの非特異モデルの関数環であるから,Cの特異点を解消すればBを求めることができる.Cの特異点解消が具体的に記述できればBの構造も具体的に求めることができる本年度の研究において,Aが剰余標数がPである標数零の完備離散付値環であって,LがK上のp次2項拡大のときに,上の方法でBのA基底を具体的に計算することができた.特異点解消を用いると従来の整数論による方法よりも制限を減らすことができる.弱めることのできた条件として,(1)LはK上でガロア拡大である必要がない,(2)Kは1のP乗根を含まなくてもよい,(3)Aの剰余体は完全体である必要がない,等である.なお,完備性はヘンゼル性まで弱めることができるがエクセレント性の仮定は必要である.上記の結果は1971年のNagoya Math. Journalの第41巻,149-168頁のSusan Williamsonの結果の別証明を与え,一部はその拡張になっている.これらのことから,代数拡大における分岐理論において,拡大を定義する多項式が具体的に与えられると混合標数の代数多様体が得られるので,その特異点や,その無限に近い特異点の重複度列から分岐の不変量を計算することができると予想されるが,まだ分からない.特異点の情報だけで十分かどうかについても研究を続ける必要がある.昨年度に続いて整数環上の代数的スキームの特異点の研究を行った.本年度は次元が1の場合,すなわち有理整数環上の1変数多項式1つで定義される1次元スキームの特異点について研究した.その結果,この1次元スキームの特異点と,このスキームの有理関数体である有限次代数体の判別式の保因子との間に関係があることが分かり,新たな例を無限個発見することができた.1878年にデデキントが発見した3次式x^3-x^2-2x-8を拡張して,素数pについての定めるp+1次の代数体を考える.この体において素数pがp+1個の1次の素イデアルに完全分解することが定義方程式の特異点解消を用いて簡単に確かめることができる.したがってこの体ではpは判別式の仮因子となることが分かる.この結果は小論にまとめて現在投稿中である.代数体の定義方程式の定める特異点の幾何学的構造と,この方程式の定める代数体の整数論的構造との間の関係については判別式の仮因子以外にも存在する可能性がある.たとえば標数ゼロの代数多様体の場合,ガロア分岐被覆の分岐点集合が単純正規交叉であれば被覆はアーベル拡大で,特異点はいわゆるトーリック特異点になる.このようなアーベル拡大と特殊な特異点との関係が混合標数においても存在するかどうかの研究を次年度に続けて行う.平成16年度は,これまで得られた研究結果の整理を行い,そのうちの一部は発表した.(1)整数係数の1変数多項式の特異点をすべて求める実用的なアルゴリズムを発表した.これは多項式の判別式の平方素因子pと,この素因子に関する多項式の重複因子から特異点の候補を計算して,これらの各候補について実際に特異点になるための条件,これは簡単な合同式条件であるが,を確かめればよいもので,きわめて初等的な計算である.

(2)完備化という超越的な方法を許せば,この多項式を係数をp進整数とみなして因数分解したものと,係数をpを法として因数分解したものを比較することにより,特異点を決定することもできる、このときは特異点ばかりでなく分岐の様子も知ることができる.p進整数上の因数分解はニュートン多角形で記述できるので,この方法も実用的であるが詳細は未発表である.(3)係数が有理整数でない場合の研究は継続中である.(4)その他の成果としては,局所代数体の有限次拡大の定義方程式の特異点解消である.現時点では拡大がガロアであるかどうかが特異点の性質にどのように反映されるかは不明であるし,アーベル拡大に特徴的な特異点の型も不明であるが,基礎体が1のベキ根を含むかどうかは特異点の重複度などと関係があることが分かっている.定義方程式が非特異ならば分岐の様子が詳しく分かるので,定義方程式が特異点をもつ場合は特異点解消をして得られる例外集合の性質から分岐の様子をある程度知ることもできる.これらについてはまとまり次第発表する予定である.
骨組織維持機構の解明による新規骨粗鬆症治療戦略の構築

前年度までに、Ihh fl/flマウスとRANK-Cre;ihh-fl/wtマウスを交配してRANK-Creを持たないがIhh-fl/flを持つマウスをコントロールとしてRANK-Creが導入されたIhh-fl/flマウス、すなわちコンディショナルノックアウトマウスの骨量を比較する予定であったが、出生後、何らかの理由により長期生存せず、また、出生率もメンデルの法則に合致しないことから、何らかの異常が生じている可能性が示唆されていた。実際にはマウスにおいてRANK(Tnfrsf11a)とIhhが同一染色体上に存在しており、Creプロモーター領域とloxP領域が近接する場合に発現量の低下や組換え効率の低下が起こりうる事が考えられた。その結果、予期しない異常の出現により今回目的としていた骨量の比較解析が行いにくい結果となってしまった。(Tnfrsf11aは1qE2.1 105780723-105747981にあり、Ihhは1qC4 749453315-74951672に存在する)現在、破骨細胞に特徴的に発現するカテプシンKを用いたCathepsinK(Ctsk)-Creマウスをあらたに導入し、破骨細胞での組織特異的ノックアウトマウスを作製すべく繁殖を行なっている段階である。(Ctskは3qF2.1 95499210-95509387に存在する。)カテプシンKは分化した破骨細胞で発現され、酸により溶解された骨のI型コラーゲンを強力に分解するシステインプロテアーゼとして知られており、成熟した破骨細胞において特に強い発現を示すため、本研究の目的を逸脱せずに解析可能と考えている。当初計画していたノックアウトマウス作製が予想通りの結果とはならず、Creのプロモーター分子を変更した上でノックアウトマウスを再度作製しているため、大幅に遅れている。現在、Ctsk-CreマウスとIhh-fl/flマウスの交配により破骨細胞特異的ノックアウトマウスの作製を行なっている。繁殖は順調に進みつつ在り、解析に十分な個体数を確保している段階である。解析予定週齢に達したマウスより順次計測を開始する予定となっている。現在までに、入手可能であったRANK-CreマウスとIhh-floxマウスを交配し、破骨細胞特異的にIhhをノックアウトするマウスを作製している。当初の計画では、Ihh fl/flマウスとRANK-Cre;ihh-fl/wtマウスを交配してRANK-Creを持たないがIhh-fl/flを持つマウスをコントロールとしてRANK-Creが導入されたIhh-fl/flマウス、すなわちコンディショナルノックアウトマウスの骨量を比較する予定であったが、出生後、何らかの理由により長期生存せず、また、出生率もメンデルの法則に合致しないことから、何らかの異常が生じている可能性が示唆された。生後、成体となる8ー10週の個体で骨量を比較したところ、RANK-Cre;Ihhflox/wtでは全くのwtマウスでに比較して骨量が低いものの、本来のコントロールであるIhh-fl/flマウスと比較すると骨量が多くなっていることがわかった。しかし、遺伝的バックグラウンドが異なり、直接の比較検討ができるマウスは解析に十分数を確保できていないこともあり、RANK-Creマウスを遺伝的バックグラウンドに持つマウスでIhh-wt/wtとIhh-fl/wtのヘテロマウスを比較する方針に変更し、現在マウスの作製を順次進めている段階である。当初計画していたノックアウトマウスを作製したところ、いままであまり注目されていなかった表現型を観察している可能性が示唆されている一方で、研究目的を遂行する上で適切と考えられるマウスの作製方法を再検討する必要があり、方針の修正が必要となっている。)

カテプシンKは分化した破骨細胞で発現され、酸により溶解された骨のI型コラーゲンを強力に分解するシステインプロテアーゼとして知られており、成熟した破骨細胞において特に強い発現を示すため、本研究の目的を逸脱せずに解析可能と考えている。当初計画していたノックアウトマウス作製が予想通りの結果とはならず、Creのプロモーター分子を変更した上でノックアウトマウスを再度作製しているため、大幅に遅れている。マウスの作製RANK-Creマウスをバックグラウンドに持つマウスの交配を進めている。一方で、次年度の計画にあったin vitroでの解析の準備を進めることで、研究期間の無駄がないように計画を調整している。現在、Ctsk-CreマウスとIhh-fl/flマウスの交配により破骨細胞特異的ノックアウトマウスの作製を行なっている。繁殖は順調に進みつつ在り、解析に十分な個体数を確保している段階である。解析予定週齢に達したマウスより順次計測を開始する予定となっている。研究協力施設において円滑に研究遂行を行う目的でマウスの維持費を捻出しており、現段階ではマウス維持費がかかっていないことが理由としてあげられる。しかし、今後は費用負担することとなっており、さらに、マウスの維持を本研究施設でも行う計画となっていることから、次年度使用額を用いてこれらの費用を捻出する計画である。(理由)研究協力施設において円滑に研究遂行を行う目的でマウスの維持費を捻出しており、現段階ではマウス維持費がかかっていないことが理由としてあげられる。現在、目的とするマウスが作出困難であったことから遅れが生じており、予定している研究が遅れている事が理由としてあげられる。(使用計画)トランスジェニックマウスの輸送費用を含め、本施設(獨協医科大学)での維持・飼育に必要な費用として使用する予定であり、また、解析に必要な費用を捻出する予定である。トランスジェニックマウスの輸送費用を含め、本施設(獨協医科大学)での維持・飼育に必要な費用として使用する。また、現状で研究協力施設で飼育を継続する分に対する費用も捻出する予定である。
重症感染症に伴う中枢神経障害の発生機序解明と治療戦略開発

重症感染症にしばしば伴う意識障害をはじめとした中枢神経障害の発生機序解明と有効治療の足がかりを得る目的で、マウスの感染症モデルを使用し研究を行った。中枢神経障害時に伴う事のある脳浮腫に目を付け、感染症時に脳の水分の恒常性に重要な役割を果たしていると考えられる水チャネルaquaporin4と中枢神経障害の関連性を検討したが、有効な手がかりはまだ得られていない重症感染症にしばしば伴う意識障害をはじめとした中枢神経障害の発生機序解明と有効治療の足がかりを得る目的で、マウスの感染症モデルを使用し研究を行った。中枢神経障害時に伴う事のある脳浮腫に目を付け、感染症時に脳の水分の恒常性に重要な役割を果たしていると考えられる水チャネルaquaporin4と中枢神経障害の関連性を検討したが、有効な手がかりはまだ得られていない(1)培養アストロサイトにおける炎症によるAQP4発現の変化単純なアストロサイト培養系を用い、エンドトキシンや各種サイトカインによってAQP発現がどのように変化するかを検討した。培養アストロサイトにエンドトキシンあるいは炎症性サイトカイン(IL-1β、TNF-α、IL-6)を投与し、AQPの発現量をmRNA・蛋白質のレベルで、それぞれRT-PCR、ウエスタンブロットにてそれぞれ評価した。エンドトキシンによってAQP4の発現が低下した。また、IL-1β、TNF-αにより、AQP4の発現が増強した。(2)敗血症マウスにおけるAQP4発現の変化と高次脳機能障害への関与動物モデルにおいても同様の現象を確認する。盲腸結紮穿刺腹膜炎マウスモデル(cecal ligation and perforation ; CLPモデル)を作成し、重症感染症が起こった際に、脳におけるAQP4の発現が低下するかどうかを検討する。現在、モデルの作成は安定した状態となったので、AQP4の発現を、ウエスタンブロット法と免疫化学組織染色により検討している。重症感染症に伴う中枢神経障害の発生機序解明と治療戦略開発の研究にあたり、まず、盲腸結紮穿刺腹膜炎マウスモデルを作成し、重症感染症を発症させた後、その脳のサンプルを収集し、採取した中枢神経系でのAQP4の発現変化をウエスタンブロット法にて解析している。また、同じモデルのマウスを使用した高次脳機能検査を行い、蛋白の発現量と高次脳機能障害の発症率や障害の程度など、両者の関連性を検討しているところである。高次脳機能障害の程度、あるいは発症率と、AQP4の大脳皮質での発現量との関連性の検討から、AQP4が高次脳機能障害の発症に際し、何らかの重要な役割を果たしている可能性も推察している。なお、薬物療法やその他の介入によるAQP4の発現の調節や、チャネル機能の調節、または感染自体の程度による影響の有無についても検討の価値があると考えている。そのような対処によって、重症感染症に付随して起こるかもしれない高次脳機能障害の発症率を抑綱したり、あるいは高次脳機能障害を発症した場合でもその重症度を軽減したりすることができる可能性もあるからである。感染軽快後に社会復帰を果たそうとするにもかかわらず、何らかの高次脳機能障害の残存により正常な復帰が果たせなかったり、あるいはリハビリなどを含めた慢性期の長期療養を余儀なくされたりする患者の数を減少させることができる可能性があり、本結果のもたらす医学的、社会的意義、重要性は大きいものと考えている。重症感染症に伴う中枢神経障害の発生機序解明と治療戦略開発の研究にあたり、盲腸結紮穿刺腹膜炎マウスモデルを作成し、重症感染症を発症させた後、その脳のサンプルを収集し、採取した中枢神経系でのAQP4の発現変化をウエスタンブロット法にて検討しているが、現時点で発現のパターンを十分解析するには至っていない。盲腸結紮穿刺腹膜炎マウスモデル作成後、脳サンプル採取と同時に、血清の炎症性サイトカインの測定、脳の水分量変化の測定など、重症感染の指標となりうる様々なデータも検討し、脳においてAQP4の発現変化に大きな影響を与える条件の検討を通じて、より適したモデルの確立を目指しているところである。最適な条件のモデルを確立した後には、高次脳機能検査を行って蛋白の発現量と高次脳機能障害の発症率や障害の程度など、両者の関連性を明確にする事が可能と思われるため、引き続き検討していきたいと考えている。さらに、薬物療法やその他の介入によるAQP4の発現の調節や、チャネル機能の調節、または感染自体の程度による影響の有無についても検討の価値があると考えている。そのような対処によって、重症感染症に付随して起こるかもしれない高次脳機能障害の発症率を抑制したり、あるいは高次脳機能障害を発症した場合でもその重症度を軽減したりすることができる可能性もあるからである。盲腸結紮穿刺腹膜炎マウスモデルにおいて、ウエスタンブロット法、免疫化学組織染色で水チャネルAQP4の発現を確認し、高次脳機能の検査、すなわち活動性、水迷路、恐怖条件付け、運動調節能の評価を順次施行しているところである。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初計画に従い、動物実験を行ってサンプルを収集し、また各種試験を行って、順次評価、解析を行っていく予定である。