hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マウス肺移植モデルを用いた慢性拒絶、線維化機構の分子学的病態解明

慢性拒絶反応(慢性閉塞性細気管支炎(OB))のため、肺移植の長期予後は他臓器の移植より不良で、いまだに病態は不明で治療法が確立していない。我々はマウスの同所性肺移植モデルを開発し、さらにマイナー抗原の不一致を利用して、臨床の慢性拒絶反応をよく模倣したマウスのOBモデル作成に成功した。このモデルを用いて、サイトカイン、遺伝子発現網羅的解析や遺伝子改変マウスを用いた移植実験によるOB病態解明を行い、OB新規治療法の開発へと結びつくtranslational studyを計画した。マウスC57BL/6にC57BL10をドナーとして同所性肺移植を行うことで、移植後21日目に約50%にOB(Obliterative Bronchiolitis)を発症する事を確認し、病理組織学的にOBを認めた群をOB群、OBを認めない非OB群、またコントロールをsham群とし、それらの肺に対するマイクロアレイ、PCR法を用いた網羅的遺伝子発現解析を行った。OB群の肺においては、Natural killer細胞の他、TLRなどの自然免疫に加え、獲得免疫としてMHC class IIを介した抗原提示、Bcell、抗体産生に関するプロセスの上昇を有意に認め、抗体関連拒絶も疑われる結果であった。OB肺で発現上昇を認めた遺伝子を抽出し、さらに縦隔リンパ節や脾臓における遺伝子発現解析をReal-time PCRにて行い、OBのリンパ節でOB肺と共通して発現上昇を認める複数の遺伝子を同定した。また免疫染色により、T細胞に加え、B細胞の浸潤のほか、気管支上皮にMHC classII分子の過剰発現を認め、気管支上皮、ドナーの気管支上皮に対して特異的な免疫反応が生じている可能性が示唆された。今後はマーカー遺伝子の経時的変化を検討し、Western blot等を用いたタンパク質解析を検討している。肺移植は慢性進行性肺疾患患者に対する唯一の根治的治療方法として確立した。しかし慢性拒絶反応(慢性閉塞性細気管支炎(OB))のため、その長期予後は他臓器の移植より不良で、いまだに病態は不明で治療法が確立していない。我々はこれまで用いてきたラットの肺移植手技を応用し独自にマウスの同所性肺移植モデルを開発し、さらにマイナー抗原の不一致を利用して、臨床の慢性拒絶反応をよく模倣したマウスのOBモデル作成に成功した。このモデルを用いて、サイトカイン、遺伝子発現網羅的解析や遺伝子改変マウスを用いた移植実験によるOB病態解明を行い、また、臨床応用されている抗線維化薬Pirfenidon, Nintedanibを用いてそれらのOB抑制効果を病理学的、分子生物学的に検証し、OB新規治療法の開発へと結びつくtranslational studyを計画した。前年度までの研究でマウスC57BL/6にC57BL10をドナーとして同所性肺移植を行うことで、移植後21日目に約50%にOB(Obliterative Bronchiolitis)を発症する事を確認した。上記モデルにて病理組織学的にOBを認めた群をOB群、OBを認めない非OB群、またコントロールをsham群とし、それらの肺に対するマイクロアレイ、PCRを用いた網羅的遺伝子発現解析を行った。OB群の肺においては、Natural killer細胞の他、TLRなどの自然免疫に加え、獲得免疫としてMHC class IIを介した抗原提示、Bcell、抗体産生に関するプロセスの上昇を有位に認め、抗体関連拒絶が疑われる結果であった。マウスの同所性肺移植に関しては手技を確立し、実際にマイクロアレイにおける網羅的解析を行い、Real-timePCR法による検証も行い、OBにおけるマーカー遺伝子を同定し、遺伝子発現解析においては当初の予定通り、進行している。フローサイトメトリーやELISAを使用したサイトカイン解析に関しては、サイトカイン量が低値で測定困難であり、実験系を再検討している。次年度は免疫染色やフローサイトメトリーによる検討を追加し、どの細胞でマーカー遺伝子の発現が見られているのかをより詳細に検証する。

また計画書の予定通り、中和抗体やノックアウトマウスによる機能解析、PirfenidoneやNintedanibによる予防効果の検証を行う。当初の計画通り、同所性肺移植による慢性拒絶モデルを作成し、約50%に慢性閉塞性気管支炎(OB)が生じる事を確認した。OB群に加え、OBを生じなかったものをnon-OB群とし、isograft群,sham群に対して、mRNAに対するマイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現解析を行った。その結果、OB群ではMHC classIIを介した特異的免疫反応に加え、toll-like receptorなどの自然免疫反応を検出し、さらには抗体関連拒絶を示唆する遺伝子の発現上昇を認めた。今後、肺以外のリンパ節検体や血清などに対してPCRによる検証、またアレイキットを用いたサイトカイン解析の開始のため、前倒し請求を行った。
光学活性環状エーテル類の触媒的不斉合成

キラル環状工一テルを部分骨格とする有機化合物は自然界に広く存在し、様々な生物活性を示す。これらの合成において、光学活性α一アルケニル環状工一テル類は柔軟な官能基変換特性から重要合成中間体の一つとして広く認められている。その不斉合成に対する注目度は高く、とくに原子効率や操作性の観点から、触媒法の開拓が求められている。ω一ヒドロキシ基とプロキラルなアルケニル関連基とのエナンチオ面選択的分子内環化のアプローチがいくつか報告されているが、過剰量の酸化剤や添加剤の必要性、共生成物の発生、低反応性、低基質汎用性、基質合成の煩雑性等、の問題があり、未だ改良の余地は大きい。本研究では、新しくω一ヒドロキシアリルアルコール類の脱水的不斉環化に注目した。触媒以外の添加剤を加えることなく、ジオール類を無保護で直接的に光学活性α一アルケニル環状工一テルへ変換できれば、理想的な合成手法となろう。共生成物は水のみである。独自に開発した脱水的アリルエーテル合成触媒CpRu/2一ピリジンカルボン酸を起点に調査した配位子構造/活性・選択性相関の結果を基に、Cl-Naph-PyCOOHおよびそのアリルエステルを設計・合成した。これをCpRuと組み合わせると、ω一ヒドロキシアリルアルコール類を定量的かつθxo一画g選択的に目的とする環状工一テルへと変換できる。様々な置換様式のアリルアルコール基質を用いることができ、四置換炭素中心を立体制御することもできる。ω一ヒドロキシ部には一級、二級、三級アルコールからフェノールまで適用できる。エナンチオ選択性は最大> 99 : 1に及ぶ。反応性、選択性、基質汎用性のいずれの観点からも従来法に優る。有用物質合成への今後の展開が期待される。光学活性環状エーテルは、生理活性天然化合物に基本骨格として広く存在する。エーテル結合のα位に様々な化学変換が可能なビニル基を有する環状アリルエーテルは、それらの合成にむけた重要中間体として注目される。ジオールを活性化する事なく脱水的に、求電子部や求核部の構造適用範囲も広く、高い収率かつエナンチオ選択性で環状エーテルへと変換できれば理想的な供給法として期待される。本研究では、独自に開発したアリルアルコール活性化触媒CpRu/2-キノリンカルボン酸混合錯体を足がかりに、これらを満足する新しい触媒的合成法の開発を目指した。標準反応として、(E)-ヘプテン-1,2-ジオールの2-ビニルテトラヒドロピランへの変換反応を取り上げて、2-ピリジンカルボン酸を基本骨格とした誘導化配位子を調製し、それらの触媒活性を調査した。その結果、反応場に近接するピリジン6位への置換基効果が大きく反応性に影響することがわかった。2-ピリジンカルボン酸や2-キノリンカルボン酸系で反応をおこなうと、標準条件下30分以内に定量的に反応は進行するのに対し、立体要請度の高い6-tert-ブチルピリジンカルボン酸や8-メチルキノリンカルボン酸を用いると、反応は全く進行しない。これら予備的情報のもと、エナンチオ選択性獲得にむけて光学活性配位子ライブラリを構築した。予備的結果ではあるが、6位に2-クロロナフチル基をもつ5-メチル-2-ピリジンカルボン酸系触媒が高い選択性を示すことを確認している。最大でエナンチオマー比99:1以上のアルケニルエーテルが定量的に得られる。エーテル結合のα位に様々な化学変換が可能なビニル基を有する環状

アリルエーテルは、それらの合成にむけた重要中間体として注目される。ジオールを活性化する事なく脱水的に、求電子部や求核部の構造適用範囲も広く、高い収率かつエナンチオ選択性で環状エーテルへと変換できれば理想的であろう。前年度までに、ピリジンカルボン酸/CpRu触媒法を足がかりとして、ω-ヒドロキシアリルアルコールの脱水的な分子内環化反応触媒を探索した結果、6位に2-クロロナフチル基をもつ5-メチル-2-ピリジンカルボン酸系触媒が高い選択性を示すことを見いだした。この結果を基盤として、6-アリールピコリン酸を基礎骨格に設定し、アリール部に種々の置換基を有する20種を超えるピコリン酸配位子ライブラリーを構築し、反応性・選択性調査をおこなった。その結果、2位クロロ基が高反応性獲得に重要であること、クロロ基の代わりにメチル基を導入すると、活性は二桁低下し、エナンチオ面選択性が逆転することがわかった。フェニルにとすると反応は全く進行しない。本法は一般性が高く、基質のオレフィン上に置換基があってもよく、アルコール部は一級、三級、フェノールいずれも用いることができる。テトラヒドロピランやクマラン、テトラヒドロフランやクロマンを、定量的に、最大で>99:1のエナンチオマー比で合成できる。さらに、ビタミンEの合成原料となるクロマン型化合物や、アセトゲニン合成原料となるビスTHF化合物の合成にも適用し、本反応の有用性を示すことができた。核磁気共鳴実験および基質の置換基による標識実験から、本反応はπ-アリル錯体経由で進行すること、π-アリトル錯体の異性化を伴うこと、求核攻撃にはカルボキシラト部の水素結合が重要であることが予想される。
肺がんの発生と悪性化に関与するがん遺伝子とがん抑制遺伝子の解析

第三染色体短腕(3p)の欠失の頻度は、小細胞性肺癌の100%に、また非小細胞性肺癌の50-70%にも及び、3p上に存在するがん抑制遺伝子の不活性は、我々が見い出したp53遺伝子の異常とともに肺癌の発生と悪性化に密接に関与していると考えられる。我々が既に3p欠失の共通欠失領域として同定した3p25,3p21.3及び3p14-cenの三領域のなかで、最も高頻度に欠失の見られる3p21.3に特に集中してさらに検討を進めた結果、positional cloningにおける重要な手がかりになる微視的ホモ欠失を我々の樹立した細胞株中に見いだし、同領域より標的がん抑制遺伝子を同定すべく詳細な解析を進めつつある。その過程において、新しいインテグリンalphaサブユニット遺伝子を単離したが、興味深いことに肺癌において癌胎児性に高発現が見られ肺癌の進展に関与している可能性が示唆された。また、遺伝子異常と臨床像との関連について検討を行った結果、p53変異を持つ症例は有意に短い術後生存期間を示し、p53変異が病期と独立かつ重要な予後因子となり得ることが明らかとなり、肺癌術後患者における高危険群の同定や治療方針の選択に有用である可能性が示唆された。また、がん家族集積を示すLi-Fraumeni症候群における臨床像の多様性には、germlineにおけるp53遺伝子異常のタイプと環境因子がともに関与していることを示唆する結果を得た。
東アジア地域形成と「小国」行動原理の相互浸透モデルに関する研究―ラオスを事例に

複雑系の東南アジアとその下位地域(サブリージョン)としてのインドシナ地域における小国の役割を明らかにした。これまで大国間関係の力学の中で論じられてきた国際関係に対し、あえて小国をアクターに位置づけて、ラオスと地域形成の関連から調査してきた。とくに1990年代以降、広域アジアへと協力関係を「深化・拡大」させてきたASEAN(東南アジア諸国連合)リージョナリズムに積極的に呼応することにより、小国でありながらも東アジア国際関係のアクターとして自律的、主体的な役割を果たすメカニズムを明示した。そのなかで、緩衝剤としてASEANの役割の重要性が明らかになった。東アジアをめぐる国際政治は、中国の台頭と国際秩序で覇権的な地位を占めてきた米国の影響力の相対的低下が進行するなど、パワーシフトの兆候を呈している。従来、大国間関係の力学の中で論じられてきた東アジアにおける政治主体として小国の役割をラオスと地域形成の関連から明らかにするために、平成27年度は理論・実証研究の双方において、ラオスと周辺国ミャンマーとの比較・考察を実施した。小国研究は、小国の概念を定義することの困難さや小国に関する一般理論が不在であるため、国際関係の理論研究における主要なテーマから後景化する傾向にある。それに対し、リージョナリズム論および比較政治学との方法論的な連携により、「大国の権力に働きかける客体」としての小国を、メコン川流域のサブリージョン形成と、2015年発足のASEAN経済共同体に象徴される小国のリージョナリズムの中に位置づけて、政治主体としての機能を整理した。この理論的考察結果を検証するために、ラオス・ミャンマー比較研究に着手した。軍事独裁政権から緩やかな民主化放策を展開するミャンマーの選挙監視を兼ねて調査を実施(2015年11月。両国ともに貿易・投資の両面において経済開放策を展開し対外関係を深める一方で、他方ではASEANリージョナリズムを他のインドシナ諸国と連携しながら主体的に関与する。これにより、大国間のバランスを図るバランシング政策でもなく、大国に安全保障を依存するバンドワゴン政策のいずれもでもない独自の中立政策と、地域形成、そして国家統合の三位一体の政策を可能にしている実態を浮き彫りにした。これらの研究成果は、研究協力者とともに、ミャンマー選挙監視報告として記録するとともに、早稲田大学サブリージョン研究会(座長・多賀秀敏教授)で口頭報告し成果集に日本語論文を投稿し、平成28年度にRoutledge社から英文出版する書籍に収録予定である。平成27年度は、1980年1990年代の小国論に関する国内外の先行研究の整理と、東アジアとくに東南アジアにおけるリージョナリズム研究についての文献サーベイを主体し研究に取り組んだ。その成果を検証するためにミャンマーの現地調査結果とラオスとの比較研究を実施した。これにより、本研究の主軸となる理論研究と実証研究の双方で掲げてきた(1)境界を画定し中立性を維持しようする政治的意思、(2)開発援助・協力を通じて隣国との政治経済的な結びつき強め地域を形成するー「国家統合と国家の相対化」という二つの対立するベクトルの所在を確認した。この理論・実証研究の成果によって次年度以降に取り組むべき小国研究の仮説(地域形成・中立政策・リージョナリズムの連繋)を導き、本研究の方法論的枠組みを提示することができた。大国の力学によって論じられてきた東アジアの国際関係を小国の行動原理から分析し、非西欧型国際関係理論の構築について予備的考察を加える。この研究目的に対し、1ラオスの国民統合とASEAN地域形成をテーマにした事例研究、2小国をアクターにして非西欧の視点から国際秩序の構成を分析するための理論研究ーという実証と理論の連携研究を進めてきた。平成29年度は、研究目的2を中心に国際関係理論、リージョナリズム、小国論の3つについての理論研究の成果を、海外での研究報告、学会報告に加えて、およびその成果を論文としてまとめた。研究実績は下記の通りである。・「国際関係理論の<社会科学化>への課題ー存在論・認識論・方法論の時空論的な架橋と応用について」『多文化社会研究』Vol.3,2017,105-117頁。・口頭報告「国際社会変動とメタ理論について」第9回日中社会構造研究会(愛知大学)『中国研究方法論の諸次元』、平成28年7月21日。平成28年度、ラオス政府および現地研究者のインタビュー、2011年から継続的に定点観測してきたビエンチャン地区、サワナケット地区の現地調査を計画していた。現地受け入れ先の事情があり、平成29年度の前期に延期を余儀なくされた。このため、当初研究計画に対し若干の遅れが生じている。最終年度の平成29年度、台頭する中国とラオスの二国間関係の実態を把握するために、本科研スタート前(平成20年度25年度)に実施した予備調査の対象地(ラオス北部中国ラオス国境周辺地域、ビエンチャン・タートルアン湿地帯開発地域、南部タイ国境周辺地域)を二度にわたり再訪し定点観測するとともに、ラオス政府(計画投資省)担当者に中長期の開発構想と中国の対外投資の位置づけをインタビュー調査を実施した。過去10年間の現地調査結果と比較し、中国の「一帯一路」構想と連動した雲南省地域との交通網の連接性が飛躍的に向上するとともに、政治、経済、社会文化の各領域で対中依存度が増大傾向にあることが明らかになった。

ラオスの対中経済依存度の拡大は、ASEAN(東南アジア諸国連合)およびADB(アジア開発銀行)による1990年代末からのGMS(大メコン・サブリージョン)開発に代表されるインドシナ地域の総合開発の浸透効果と表裏一体の現象である。既存の「小国の政治学」によれば、一国家を超越した地域の形成は、小国の主権的な権力を相対化するベクトルと、小国の国民経済の統合を加速する、という相反する力学が作用する。ラオスの調査結果は、小国連合ASEANのリージョナリズムのインドシナ地域への浸透が国際安全保障面での安定に寄与し、ラオスが小国としての存在被拘束性を克服するダイナミズムを明瞭に示している。複雑系の東南アジアとその下位地域(サブリージョン)としてのインドシナ地域における小国の役割を明らかにした。これまで大国間関係の力学の中で論じられてきた国際関係に対し、あえて小国をアクターに位置づけて、ラオスと地域形成の関連から調査してきた。とくに1990年代以降、広域アジアへと協力関係を「深化・拡大」させてきたASEAN(東南アジア諸国連合)リージョナリズムに積極的に呼応することにより、小国でありながらも東アジア国際関係のアクターとして自律的、主体的な役割を果たすメカニズムを明示した。そのなかで、緩衝剤としてASEANの役割の重要性が明らかになった。理論研究においては、これまでの研究成果を練磨するために、欧州の経験則に基づく小国に関する理論研究に加えて、アジア研究者による国際理論およびリージョナリズム研究を悉皆的に網羅し系統的に比較分類する。これらの調査研究を通じて小国論の研究の新しい視座を体系化する。実証研究面では、中老国境、中国タイ国境の両地域の開発状況を調査するととともに、ラオス政府関係者を含むインタビューを実施し、ラオスの「ASEAN地域統合ーCLV地域協力ー二国間援助(中国)」の重層的な開発プログラムの実践内容と政策の志向性を明らかにする。最終年度となる平成29年度、8月、10月の二回に分けて現地調査・インタビューを実施する。当初計画では1回の予定であった。調査計画を練り直す。これに加えて、現地研究者とのワークショップを開催し、理論研究・実証研究双方の研究成果の検証を行う。国際関係平成28年11月に10日間の予定で計画していたラオス・ビエンチャンとサワナケットの視察・インタビュー調査を、調査協力・受け入れ先の日程変更依頼があり延期したため。平成29年度8月に、前年度延期になった調査を実施するほか、現地で予定した関係者を招聘したワークショップを開催する。
鞭毛・繊毛軸糸における高次規則構造の形成機構

鞭毛・繊毛の内部は9本の周辺微小管が円筒状に並んだ構造を持ち、縦方向には96nmの繰り返し周期がある。このような構造の形成機構に迫るため、緑藻クラミドモナスを使って、軸糸微小管の結合蛋白質を検索するとともに、構造形成異常変異株の原因遺伝子を決定した。その結果、新規軸糸構成蛋白質10種を発見するとともに、軸糸の9回の対称性の起源に関して重要な知見を得た。真核生物鞭毛・繊毛の軸糸は9本の周辺微小管が2本の微小管を囲んだ円筒状構造もち,内部構造は96nmの周期で繰り返す.本研究はそのような規則構造の形成機構を解明するために,軸糸を形成する基本蛋白質群を同定し,試験管内でその構造の一部を再現することを目的とする.本年度は,軸糸微小管内の安定なリボン構造を構成する蛋白質Rib72を可溶性蛋白質として発現し、オーバーレイ法によって相互作用する蛋白質を検索した。その結果、マウス鞭毛で軸糸蛋白質として知られるPacrgのホモログと新規蛋白質(EF39と命名)の2種がRib72結合蛋白質として同定された。免疫電子顕微鏡法および選択的溶出実験により、それぞれ周辺微小管のチューブ内に存在しており、周辺微小管同士の結合に関与していることを示唆する結果を得た。さらに、周辺微小管の結合に関与する他の蛋白質を同定する目的で、軸糸を段階的に解体した際に微小管間結合の切断と同時に失われる蛋白質群を探索したところ、分子量120kと187kの新規蛋白質2種が同定された。それぞれについて、アミノ酸配列決定、cDNAクローン化、配列決定を行った結果、いずれも新規蛋白質であることが確認された。また、組み換え蛋白質を得て抗体を作製し、間接蛍光免疫顕微鏡法で局在を調べたところ、120k蛋白質は軸糸全長(11μm程度)のうち、根本付近1μm程度を除いた部分に局在し、逆に187k蛋白質は根本の0.5μmの小部分にのみ局在することが判明した。それらの電子顕微鏡レベルの軸糸内局在はまだ検討中であるが、これらの結果は、鞭毛軸糸の根本付近とそれ以外の部分で、これまで認識されていなかった大きな構造的差異があることを示唆している。軸糸の構造形成と運動機構の理解にとって、重要な発見である可能性がある。真核生物鞭毛・繊毛の軸糸は9本の周辺微小管が2本の微小管を囲んだ円筒状構造もち,内部構造は96nmの周期で繰り返す.本研究はそのような規則構造の形成機構を解明することを目的とする.昨年度までに,軸糸微小管内の安定なリボン構造を構成する蛋白質Rib72と相互作用する蛋白質を検索し、Pacrgと呼ばれる蛋白質のホモログとCa結合性新規蛋白質(EF39と命名)の2種を同定した。また、微小管間を架橋しているネキシンリンク構成タンパク質を探索して、分子量120kと187kの新規蛋白質2種を同定した。今年度の大きな成果は、電子顕微鏡観察により120k蛋白質が実際に微小管間の架橋構造に局在することを見出したことである。このタンパク質は軸糸の構築だけでなく、運動機構にとっても重要である可能性が大きい。一方187kタンパク質は、昨年度得た抗体を精製して再度局在を検定した結果、軸糸全長にわたって存在するものの架橋構造には存在しないことが判明した。その機能は不明である。本年度はさらに、Pacrgがin vitroでチューブリン結合能と微小管束化活性を持つことを見出した。免疫電子顕微鏡観察により、微小管間に局在することが示唆されたので、上記の120kタンパク質とあわせて、ネキシンリンクの構築に関わっている可能性が示唆される。また、今年度の新たな試みとして、軸糸細胞骨格をカオトリピック塩で解離した試料から微小管結合性のあるタンパク質を網羅的に検索し、分子量15kから260kにわたる9種の新規タンパク質を同定した。それらの一部について組み換えタンパク質を作製し、試験管内での微小管結合能を検定した結果、少なくとも3種にその活性があることが確認された。このように、軸糸細胞骨格構成タンパク質が多数同定されたので、今後9+2構造の構築機構の研究は急速に進むものと期待される。真核生物鞭毛・繊毛の軸糸は9本の周辺微小管が2本の微小管を囲んだ円筒状構造もち,内部構造は96nmの周期で繰り返す.本研究はそのような規則構造の形成機構を解明することを目的とする.昨年度までに,軸糸微小管の縦の周期性を決定している要素の候補として,複数種のタンパク質を同定した.今年度はそれらの存在状態の解析とともに,新たに軸糸の9本対称性形成機構に迫るために,鞭毛基部体(基底小体)形成に本質的なタンパク質の探索と解析を行った.

基部体は動物細胞一般に見られる中心子に相同な細胞器官で,9本の三連微小管が円筒状に配置した構造をもつが,その構築機構は全くわかっていない.我々は,2つのクラミドモナス突然変異体の解析により,カートホイールという構造が対称性の確立に働くことを初めて明らかにした.カートホイールは中心子内腔にある構造で,ハブと9本のスポークから構成される.中心子を完全に欠失する突然変異株bld10の変異遺伝子産物(Bld10p)はこのカートホイールに局在する.分子長を短くしたBld10pを発現させると,スポークが短くなって,微小管8本からなる中心子が高頻度で形成された.また,もう一つの突然変異株bld12は,カートホイールの中央部分を欠失するために中心子微小管の本数が一定せず,8本から11本まで変動することがわかった.これら2つの解析結果は,カートホイールが中心子微小管形成の足場となっており,この構造が正しく構築されることが中心子9回対称性の確立に必須であることを示している.カートホイールは多くの生物の中心子にみられる構造であり,またBld10pもBLD12遺伝子産物のSAS-6も真核生物に広く保存されたタンパク質であることから,この機構は普遍的なものと考えられる.鞭毛・繊毛の軸糸は9本の周辺微小管が2本の微小管を囲んだ円筒状構造もち、内部構造は96mの周期で繰り返す。本研究はそのような規則構造の形成機構を解明することを目的とする。昨年度までに,軸糸微小管の縦の周期性を決定している要素の候補として、PACRG,Tektin,Rib72などのタンパク質を同定するとともに、鞭毛軸糸基部体の9回対称構造の形成に重要なカートホイール構造を構成する蛋白質Bld10pとSAS-6を同定した。今年度はそれらのうち、PACRGに注目して研究を行った。この蛋白質は以前トリパノゾーマを使った研究において、微小管間の架橋構造ネキシンリンクを形成すると報告されていたことがあり、軸糸構造の決定に重要であると考えられたからである。まず、鞭毛運動が異常になった変異株を検索した結果、鞭毛打の振幅が異常に大きくなっているpf12変異株がPACRGの変異を持つことが明らかになった。さらに、pf12の軸糸では、塩抽出によって蛋白質p20が容易に抽出されるようになることがわかり,PACRGがp20と何らかの分子複合体を形成していることが示唆された。興味深いことに、このp20を欠損した変異株が単離され、その変異株も鞭毛打振幅が異常になっていることが判明した。すなわち、PACRG-p20は、鞭毛内の微小管の往復滑り運動の滑り量を規定する機能を持つ蛋白質複合体である可能性がある。そのような機能は従来ネキシンリンクに想定されていたものである。また、化学架橋実験により、PACRGと相互作用する2種の新規蛋白質が発見された。すなわち、今年度の研究により、微小管間を架橋する蛋白質複合体の構成に関する大きな手がかりが得られたと考えられる。
金属近傍での不斉ラジカル反応場の創出：かさ高い光学活性アミノ酸とアザスピロ環合成

本研究ではαブロモカルボニルを使い金属近傍で第3級アルキルラジカル種を効率的に発生させることで、アミンとのカップリング反応の検討を行った。その結果、銅触媒存在下に室温で非常にかさ高いカルボニルのα位にアンモニア、アルキルアミン、芳香族アミン、インドールなど一連の窒素化合物の導入に成功した。得られた生成物は非天然アミノ酸誘導体であるため価値は高い。さらに、エナミドとαブロモカルボニルとの反応からアルデヒド化合物である1,4-ジカルボニルを生成することに成功した。1,4-ジカルボニルとアミンを反応させることで、本研究のもう一つの目標であるアザスピロ環をこの物質から変換することで得ることに成功した。本研究では金属触媒近傍でラジカル種の反応場を創出し、それを利用してニトロソ化合物へのかさ高いアルキル基のエナンチオ選択的導入により、光学活性アミノ酸及びアザスピロ環の合成法開発を行うのが本研究の目的である。具体的には、鉄触媒のハロゲン化アルキル(R-X)への一電子移動によりアルキルラジカル(R・)を生成し、続くニトロソ化合物(R-N=O)への付加ー還元により反応の達成を目指すものである。本年度は新規アミノ化反応の開発を目的として、現在までの研究で次のことが明らかとなった。2ーブロモカルボニル化合物とニトロソ化合物を金属触媒下で反応後に、ヨウ化サマリウムで還元することでアミノ酸誘導体を得ようと計画していたが、様々な検討を行うと、ニトロソ化合物ではなくアミンを用いることでカルボニルのアルファ位のアミノ化に成功した。アミンを用いることができることが分かったため、アミノ酸を得るためにニトロソ化合物との反応後に還元反応を行わずに済む点は、当初の予想と反してすぐれた点である。具体的な反応条件は、銅触媒、トリフェニルホスフィン、リン酸カリウム、tBuNH2と2-BrMe2CONHPhをトルエン中室温で20時間撹拌すると、対応するアミノ化体を99%で得ることに成功した。トリフェニルホスフィンは2-BrMe2CONHPhから副生するオレフィンの生成を抑えることができる。リン配位子なしでも反応は進行するが、オレフィン生成が目立った。また、1級アミンだけでなく2級アミンやアニリン、アミドとの反応も円滑に進行することが分かった。得られたアミノ化体は非常にかさ高い4級炭素中心をもち、本方法以外でのこの構造の合成は立体障害のため非常に困難である。今後は、アンモニアとの反応や不斉反応への展開、そして、薬理活性物質glucocorticoid receptor modulator intermediate(III)の合成を検討している。研究実績にも記載したが、当初の予想とは大幅に優れた結果がでており、進捗状況は計画以上のものがある。まず、当初は反応後にアミノ酸を誘導するために還元操作を必要とするニトロソ化合物を反応剤として想定していた。しかし、検討を進めていくと、ニトロソ化合物が還元されたアミンで反応が進行することが分かった。もし、アンモニアと反応させることができればさらに簡便なアミノ酸合成法になりうる。この反応で得られるアミノ化体はかさ高い点も特筆すべき点である。通常は、かさ高い基質に対するアミノ化はSN1反応を行うのが一般的であるが、電子不足な2ーブロモカルボニル化合物ではこのような置換反応は行いにくい。それにもかかわらず、銅触媒存在下、室温という非常に穏やかな条件で生成物が得られる点は特筆すべき点である。希少金属触媒による炭素ー窒素結合形成反応は非天然アミノ酸とその誘導体や、アルカロイドに多く見られるアザスピロ環合成に欠かせない重要な反応のひとつである。しかしながら、かさ高いアルキル基を資源豊富な非貴金属触媒を用い、かつ立体選択的に窒素上に導入することは難しい。アミンに3級アルキル基を導入する際にはSN1反応、CurtiusやRitter反応など古くから知られている反応が利用できるが、反応条件が厳しい、E1脱離反応が先行してしまう、さらに立体選択的な合成ができないなど制限が多い。このような背景のもと、本研究ではαブロモカルボニルを使い金属近傍で第3級アルキルラジカル種を効率的に発生させることで、アミンとのカップリングが進行しないか検討を行った。当初、本研究では、窒素化合物としてアミンではなくニトロソ化合物との反応を検討していた。しかし、ニトロソ基は最終的に還元処理することで目的のアミンへと変換しなければならず、合成化学的な効率は良くない。そこで、アミンとの直接的カップリングを本年度に検討を行った。すると、銅触媒存在下に室温で非常にかさ高いカルボニルのα位にアンモニア、アルキルアミン、芳香族アミン、インドールなど一連の窒素化合物の導入に成功した。さらに、ここで得られた知見を活かすと、エナミドとαブロモカルボニルとの反応からアルデヒド化合物である1,4-ジケトンを生成することに成功した。1,4-ジケトンは合成化学的に重要なビルディングブロックであり、本研究のもう一つの目標であるアザスピロ環をこの物質から変換することで得ることに成功した。以上のように、本年度は当初の目的である非天然アミノ酸の室温での効率的な合成反応開発に成功した。非常にかさ高い置換基をアミン上に導入できた画期的成果である。

本研究ではαブロモカルボニルを使い金属近傍で第3級アルキルラジカル種を効率的に発生させることで、アミンとのカップリング反応の検討を行った。その結果、銅触媒存在下に室温で非常にかさ高いカルボニルのα位にアンモニア、アルキルアミン、芳香族アミン、インドールなど一連の窒素化合物の導入に成功した。得られた生成物は非天然アミノ酸誘導体であるため価値は高い。さらに、エナミドとαブロモカルボニルとの反応からアルデヒド化合物である1,4-ジカルボニルを生成することに成功した。1,4-ジカルボニルとアミンを反応させることで、本研究のもう一つの目標であるアザスピロ環をこの物質から変換することで得ることに成功した。今後は、中間体として想定される銅アミドを合成して反応機構の解明や反応に関するさらなる知見をえる。また、本反応ではリン配位子が効果的であることから不斉リン配位子を用いることで不斉第4級炭素中心が構築できるか挑戦し、最終的にはアンモニアを今回の不斉アミノ化に用いることで、非天然アミノ酸の効率的な合成を実現する。有機合成化学当該年度の予算は当初の計画とは違ったものになった。その理由は、報告書にも記載したが、当初計画していた研究内容よりも優れた結果が得られ、研究の方向性が少し変わったためである。購入試薬や発表を想定していた学会への参加も次年度に見送られることになったため、使用額に変更があった。約145万円の残額は次年度に繰り越し、当初の計画以上に得られた結果を残りの年度で円滑に終了させるための費用および本プロジェクトのまとめとして学会発表するために使用予定である。
タンパク質間相互作用の解析と予測法の開発

昨年度は、精鎖結合部位の情報と、ホモロガスなドメイン同士の比較により得られた欠失/挿入部位の情報を組み合わせることで、バーシカンにおけるリンクモジュール同士の相互作用様式が推定できることを示した。特に欠失/挿入部位の情報は、これまでにタンパク質間相互作用部位との関係があまり議論されていない。今年度は、1つの遺伝子から注じるタンパク質間の欠失/挿入である、選択的スプライシング(以下、ASと略)による欠失/挿入部位とタンパク質間相互作用部位との関係について解析を行った。ASは、スプライシングのパターンが変化することで1つの遺伝子から複数の成熟mRNAを作る機構である。これまでに、ASにより欠失するドメインの内、タンパク質間相互作用に関わるドメインが有意に多いという報告が存在する。しかし、球状ドメイン内の一部がASによって欠失/挿入する場合についてはほとんど解析されていない。そこで、ドメイン内でおきるASとタンパク質間相互作用部位の関係を調べた。まず、ヒトの完全長cDNAのデータベースであるH-Invのデータを用いて、平均約な球状ドメインのアミノ酸配列長よりも短い100アミノ酸残基未満の長さで欠失/挿入が起きるAS領域のデータを得た。次に、AS領域にタンパク質の立体構造をアサインした。立体構造の情報からタンパク質間および、サブユニット間の相互作用部位を求め、アサインされたAS領域上にマップした。その結果、AS領域に相互作用部位が含まれていたのは、解析した全AS領域の23%だった。これは、基質や補因子との相互作用部位よりも多い割合である。この結果とこれまでの報告を合わせると、ASによりタンパク質間相互作用が変化する場合が多いことを示している。今後は、タンパク質間相互作用の変化が、シグナル伝達などのタンパク質相互作用ネットワークにどのような影響を与えるかを調べていく必要がある。マルチドメインタンパク質は、もともとは独立したタンパク質が重複・融合することにより形成されると考えられる。そのため、ドメイン間相互作用の解析は、タンパク質間相互作用を理解する上でも重要である。今年度は、ドメイン間相互作用様式を予測する手法を開発し、その手法をリンクモジュール(以下、LMと略)と呼ばれるドメインの相互作用予測に適用した。ヒアルロン酸結合タンパク質の1つであるバーシカンは、重複したLMが一次構造上隣り合って存在している。生化学的な実験結果から、重複したLM同士のドメイン間相互作用が、ヒアルロン酸結合に重要であると考えられる。そのため、LM同士がどのような様式で相互作用するかを知ることは、バーシカンの機能解析に重要である。まず、ホモロジーモデリングにより重複したLMそれぞれの分子モデルを作成した。次に、LMが単独で存在するタンパク質において調べられている、ヒアルロン酸との結合に重要なアミノ酸残基の情報を用いて、重複したLMそれぞれにおけるヒアルロン酸結合面を予測した。さらに、LMの分子系統学的な解析を行い、それぞれのLMに固有の挿入部位および欠失部位が存在することを明らかにした。これらの挿入・欠失は、ドメインの重複に伴って生じ、ドメイン間相互作用に関わる部位と推定された。以上の情報を組み合わせることでLM間の相互作用様式を予測し、重複したLM全体の分子モデルを構築した。モデルから予測された重複したLMが形成するヒアルロン酸結合面の大きさは、実験的に調べられている重複したLMが結合する最短のヒアルロン酸の大きさとよく一致しており、このことは構築したモデルが妥当であることを示している。以上の結果は、機能部位情報および進化上の保存・非保存領域(特に挿入・欠失)の解析を組み合わせることにより、ドメイン間相互作用様式が予測できることを示している。今後は、同様の考え方が、タンパク質間相互作用様式の予測にも適用できるか解析する必要がある。
身体不活動及び運動トレーニングが身体機能に及ぼす宇宙医学的研究

ヒトが宇宙で滞在することによって生じる身体機能の減退を防ぐため,どのようなトレーニングが効果的であるのかについて地上モデルを用いて検討した。実験期間中に片脚に体重をかけないようにする宇宙滞在モデルを用いて,高強度インターバルトレーニングを一日おきあるいは二日おき,高強度インターバル+筋力トレーニングを一日おきに行った。その結果,一日おきに高強度インターバル+筋力トレーニングを行うと筋力,筋量,呼吸循環系などの運動機能を全般的に維持できることが示された.ヒトが宇宙で滞在することによって生じる身体機能の減退を防ぐため,どのようなトレーニングが効果的であるのかについて地上モデルを用いて検討した。その結果,一日おきに高強度インターバル+筋力トレーニングを行うと筋力,筋量,呼吸循環系などの運動機能を全般的に維持できることが示された.本年度の実験の目的は,片足サスペンジョン(ULLS)、が身体機能に及ぼす影響について検討することであった.被検者は健康な成人男性8名であった.被検者は松葉杖を使って20日間の日常生活を送り(Bergら(1991),左脚の体重支持活動および筋活動を限りなく少なくした.実験の前後には膝伸展による等尺性最大筋力(MVC),MRIによる下肢の筋体積,外側広筋の筋生検から得られたサンプルより分子生物学的手法による成長因子のタンパク量,片足の自転車運動中の最高酸素摂取量(VO_2peak)について検討した.膝伸展による等尺性最大筋力はULLS脚(実験脚)で555.7±75.5Nから426.1±67.6Nに有意に低下したが,nonULLS脚(非実験脚)においては有意な変化は認められなかった(前:592.5±68.8N,後:569.4±82.9N).大腿部の筋体積ではULLS脚の大腿四頭筋に有意な減少(1244.3±151.0cm^3から1147.0±119.1cm^3)が認められ,ハムストリングと内転筋群およびnonULLS脚においてはいずれも有意な変化は認められなかった.筋成長因子に関しては,筋肥大を誘導するSerum Response Factor(SRF)のタンパク量がサスペンジョン後に有意に低下した(39%の低下).呼吸循環応答については,ULLS脚のVO_2peakが35.1±4.5から31.5±3.8ml・kg^<-1>・min^<-1>(-9.7±10.0%)に有意に低下したが,nonULLS脚においては有意な変化は認められなかった.以上のことから,片足サスペンジョンは先行研究で報告されているような筋機能低下や筋萎縮をもたらし,また呼吸循環系機能の低下も引き起こすモデルであることが明らかとなった.本年度の目的は,身体不活動中の運動トレーニングが身体機能に及ぼす影響について検討した.成人男性11名が実験に参加し,片足サスペンジョン中にトレーニングをする群(6名)と片足サスペンジョンのみの群(5名)に分けられた.片脚サスペンジョンは実験脚の体重支持活動と筋活動を限りなく少なくするモデルである.トレーニングは片脚自転車運動で,最高酸素摂取量(VO_2peak)の40%80%の運動負荷を計25分間行うものであった.実験脚の随意最大膝伸展筋力においては,コントロール群で有意に低下した(548Nから444N,-18%)がトレーニング群では有意な変化は見られなかった(535Nから460N,-11%).大腿部の筋体積についてはトレーニング群の実験脚では,有意な筋体積の変化は認められなかったが,コントロール群では大腿四頭筋,ハムストリング,内転筋群それぞれにおいて-7%,-2%,-6%の有意な低下(全てP<0.05)が認められた.最大下での動的膝伸展中の骨格筋fMRIについては,トレーニング群では両脚に運動後のシグナル変化に有意な差は認められなからたが,コントロール群の非実験脚では運動後のシグナル変化が実験前のそれと比較して有意に増加した(38.2msecから40.7msec).サスペンジョン前後における実験脚でのVO_2peakは,トレーニング群では変化を示さなかったが(35.1±3.2から37.8±5.2ml/kg/min;+7.9%),コントロール群においては有意に減少した(32.8±4.4から28.5±4.1ml/kg/min;-13%,P<0.05).以上の結果から,本研究で用いたトレーニングは,不活動中の筋機能の一部および呼吸循環系の維持のための運動プログラムとして適していることが示唆された.不活動中にどのような運動処方を行えば筋機能・形態に効果的であるのかについては十分に明らかになっていない.本年度も昨年度と同様の片脚サスペンジョンによる不活動モデルを用いて,不活動中の低頻度インターバルトレーニング(IT)が,筋機能・形態に及ぼす影響について検討した.成人男性16名(本年度の被検者は12名)が実験に参加し,20日間の実験期間中に5日間トレーニングをする群(Tr群)8名と非運動群(Cont群)8名に分けられた.トレーニングは自転車エルゴメータによる片脚ペダリングで,最高酸素摂取量の40%80%の運動負荷を計25分間行うものであった.結果:随意

最大膝伸展筋力では,Tr群とCont群ともに有意に低下した(Tr群;536.6±83.7Nから443.8±64.6N,Cont群;536.8±118.6Nから451.2±104.6N).磁気共鳴映像法を用いた筋体積では,Tr群では維持され(-1.3%),Cont群では有意に低下した(-7.4%).動的膝伸展運運動時の骨格筋fMRIについては,Tr群では運動前と比較して運動後の信号変化が維持され(Pre,14%;Post,15%,P=0.71),Cont群では運動後が有意に増加した(Pre,13%;Post,19%,P=0.002)が,両群間に統計的な差は認められなかった.以上の結果から,本研究で用いた不活動中の低頻度ITは,最大筋力には効果が認められなかったが筋量の維持に対しては効果的であった.しかし,最大筋力を維持することができないのは大きな問題であるので,来年度に向けて最大筋力を維持できるトレーニングメニューを考える必要性がある.平成18・19年度の研究において,不活動中に行った2つの異なるトレーニング頻度でのインターバルトレーニング(ITr)は,筋萎縮を抑制することはできたが,最大筋力の低下抑制をすることはできなかった.したがって,本年度の研究では最大筋力を抑制するための手段としてITrに筋力トレーニング(RTr)を加え,不活動中のITrおよびRTrが身体機能に及ぼす影響について検討した.成人男性12名が実験に参加し,20日間の実験期間中に10日間トレーニングをする群(Tr群)6名と非運動群(Cont群)6名に分けられた.ITrは自転車エルゴメータによる片脚ペダリングで,最高酸素摂取量の40%80%の運動負荷を計25分間行い,RTrは最大挙上重量の70%の負荷で,10回を4セット行った.随意最大膝伸展筋力では,Tr群とCont群ともに有意に低下した(Tr群;532±178Nから453±131N, Cont群;495±167Nから394±114N)が,最大挙上重量においては,Tr群では維持され,Cont群では有意に低下した(Tr群;138±33kgから152±39kg, Cont群;141±38kgから115±32kg).大腿四頭筋の筋体積は,Tr群では維持され(-0.9%), Cont群では有意に低下した(-8.7%).動的膝伸展運運動に対する骨格筋fMRIの信号変化については,Tr群およびCont群ともに不活動前と不活動後に有意な信号変化は見られなかった(Tr群;Pre, 7.8%;Post, 8.5%, Cont群;Pre, 11.0%;Post, 19.7%).以上の結果から,今回のITrとRTrは,筋機能の一部および筋量の維持には有効な手段であることが示され,今後の宇宙開発における宇宙飛行士や一般人の宇宙観光旅行に対するトレーニングメニューを考慮する際の重要な資料になることが示唆された.
ＭＯＦ／金属ナノ粒子界面の構造解析に基づく相乗的機能の発現

昨年度までの研究により、多孔性金属錯体(MOF)に吸着された水分子はバルク水より高い水性ガスシフト反応活性を有すること、さらにMOF細孔の化学環境を合理的にデザインすれば、吸着水の化学反応性を系統的に制御可能であることを見出した。そこで今年度はその機構解明のためMOFに吸着された水分子の化学状態とその反応性との相関について、分光学的手法を駆使し理解を目指した。MOFに吸着された水の化学状態を調べるために、in situ IR、固体NMR測定を行ったところ、その化学状態はMOFの細孔環境に大きく依存し、細孔が親水的になると吸着水の酸性度は増加し、細孔が疎水的になるとその酸性度は減少することがわかった。この結果を基に、水性ガスシフト反応を促進させるエッセンスを抽出すると、疎水的な細孔環境を構築し、吸着水の酸性度を低下させることが鍵となることを明らかにした。また、ゲスト分子に応答した細孔環境の制御を目指し、構造柔軟性を有するMOFと金属ナノ粒子との複合化を試みた。これにより、MOF細孔の構造変化に連動した金属ナノ粒子の触媒機能の発現を目指した。具体的には、ゲスト分子の吸着に応答して柔軟に構造変化させるMOFに着目し、金属ナノ粒子との複合化を行った。複合体合成は既存のワンポット合成法を改善し、予め加熱された金属ナノ粒子溶液中に、MOF前駆体溶液をシリンジポンプで徐々に滴下し、MOFの結晶核を瞬時に形成させることにより行った。また吸着測定により、得られた複合体はCO2等の様々なゲスト分子の吸着に応答して、細孔構造を変化させることがわかった。これより、得られた複合体は単一物質でありながら、外部環境に応答した柔軟な細孔環境の変化が可能であると明らかになった。今後、この柔軟に細孔環境を変化させる複合体を様々な化学反応に適用することにより、ゲスト分子に応答した反応性制御への展開が期待される。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。多孔性金属錯体(MOF)は金属イオンと有機配位子の自己集合により構築される多孔性材料であり、高い水分子吸着性を有することが知られる。MOFの特徴としては金属イオンと有機配位子の選択・配置の多様性による細孔環境の高い設計性が挙げられる。この設計性を生かして、MOFのナノ細孔のサイズ・化学環境を系統的に変化させることにより、水分子の吸着挙動、さらにはMOF細孔内部に吸着された水分子の性質を精密に制御することができる。そのため、MOF中の水分子の物性研究は盛んであり、MOF中の水分子はバルク状態では実現できない物理的・化学的性質を有することが知られている。しかし、この特殊な性質を持つMOF中の水分子自体の化学反応性に関する知見は未だ乏しい。そこで本研究ではMOF中の水分子の化学反応性を調べることを目的とした。この目的の実現のため、MOFと金属ナノ粒子を複合化するというアプローチを用いた。この複合体において、MOFは反応原料となる水分子を提供し、金属ナノ粒子は反応触媒としての役割を果たす。金属ナノ粒子存在下でMOF前駆体を反応させることにより、金属ナノ粒子がMOFで被覆された複合体を合成した。得られた複合体の化学反応性を、水性ガスシフト反応をプローブとして調べたところ、複合体は既存の金属ナノ粒子触媒を凌駕する反応性を示した。このように、MOF中の水分子はバルク水より高い反応性を有することを見出した。さらに、MOFを構成する配位子を系統的に変化させて複合体を合成し反応活性を評価したところ、配位子の種類に依存した反応性を有することがわかった。これはMOF中の水分子がMOF配位子の種類の違いを認識し、その反応性を変化させたことを示唆している。このようにMOFが持つ高い設計性を生かし、細孔の化学環境を合理的にデザインすれば、水分子の化学反応性を系統的に制御可能であることを見出した。当初の計画ではMOFと金属ナノ粒子の複合化により、高活性触媒を開発するという応用化学的な目標を掲げていた。しかし、当該年度においては応用面での成果に加えて、基礎学問的に意義深いを知見を得ることに成功した。具体的には(1)MOFに吸着された水分子はバルクの水とは異なる化学反応性を有すること、(2)MOFの高い設計性の活用によりMOF中の水分子の反応性を制御可能である、という2つの概念を世界に先駆けて確立することができた。これらの概念は水分子の新たな活性化手法を提案するものであり、将来的に「水系反応場としてのMOF」という新たな研究分野を開拓する可能性も秘めている。以上のことから、当初の計画以上の結果が見込めると考え、計画以上に進展しているとした。

MOFに吸着された水の化学状態を調べるために、in situ IR、固体NMR測定を行ったところ、その化学状態はMOFの細孔環境に大きく依存し、細孔が親水的になると吸着水の酸性度は増加し、細孔が疎水的になるとその酸性度は減少することがわかった。この結果を基に、水性ガスシフト反応を促進させるエッセンスを抽出すると、疎水的な細孔環境を構築し、吸着水の酸性度を低下させることが鍵となることを明らかにした。また、ゲスト分子に応答した細孔環境の制御を目指し、構造柔軟性を有するMOFと金属ナノ粒子との複合化を試みた。これにより、MOF細孔の構造変化に連動した金属ナノ粒子の触媒機能の発現を目指した。具体的には、ゲスト分子の吸着に応答して柔軟に構造変化させるMOFに着目し、金属ナノ粒子との複合化を行った。複合体合成は既存のワンポット合成法を改善し、予め加熱された金属ナノ粒子溶液中に、MOF前駆体溶液をシリンジポンプで徐々に滴下し、MOFの結晶核を瞬時に形成させることにより行った。また吸着測定により、得られた複合体はCO2等の様々なゲスト分子の吸着に応答して、細孔構造を変化させることがわかった。これより、得られた複合体は単一物質でありながら、外部環境に応答した柔軟な細孔環境の変化が可能であると明らかになった。今後、この柔軟に細孔環境を変化させる複合体を様々な化学反応に適用することにより、ゲスト分子に応答した反応性制御への展開が期待される。今年度までにMOF中の水分子はバルク水とは異なる化学反応性を有することを見出してきた。しかし、何故MOF中の水分子の反応性がバルク水と異なるかの理解には未だ至っていない。そこで、次年度はMOF中の水分子の吸着状態と、その化学反応性の相関の解明を目指す。具体的には、in situ IR測定やNMR測定等の分光学的手法や、加熱発生ガス分析等の熱分析を駆使して、MOF中の水分子の吸着状態の理解を試みる。それにより、観測された化学反応性向上のメカニズムの解明を進めていく。さらに、得られた知見を複合体合成にフィードバックすることにより、更なる化学反応性の向上や、反応活性の精密制御手法の確立を目指す。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
海洋共生コンソーシアムからの有用性体分子のナノビーズスクリーニング及び解析

近年,海洋共生系は微生物の多様性,抗ガン剤・抗菌物質の新規性から新たなスクリーニング対象として注目されている。そこで,海洋共生系としてサンゴ,海綿に焦点を当て,少量のサンゴ,海綿サンプルからの単一細胞分離システムの確立および共生コンソーシアムの多様性解析,培養微生物の分子同定と単一細胞からの全ゲノム情報の確保,さらには微量スクリーニングシステムの確立に関して検討を行った。(1)単一細胞分離システムの確立および共生コンソーシアムの多様性解析フローサイトメーターを用いた共在バクテリアの分離,回収を行い,さらに16S rDNAに基づいて評価した。この結果,分画したサンプルのDGGEでは,分画前では検出されなかったバンドが認められ,多様性も増加していた。これにより,細胞分離を行うことでゲノムライブラリーの構築が可能となると考えられた。(2)難培養微生物の分子同定と単一細胞からの全ゲノム情報の確保MDA法により,Synechocystis sp.PCC6803の10^5 cellsからライブラリー構築が可能な約20μgのDNAが得られた。さらに増幅産物をクローニングし,シークエンスしたところインサートの導入が確認され,MDA法によりライブラリーを構築できることが示された。また,アミノ基修飾磁気粒子を用いて高分子DNAを回収することも可能であった。(3)超微量スクリーニングシステムの確立マイクロデバイスを作製し,表面処理することによって,非特異吸着を抑制することが可能であった。細胞の回収を試みたところ,90%以上の孔に細胞が捕捉されることが確認された。マイクロキャピラリーを配したマイクロデバイスを構築し,真菌胞子を導入したところ,簡便に胞子の特定が可能であった。また,蛍光物質を本デバイスに導入したところ,蛍光強度の勾配が観察され,標的物質を濃度依存的にスクリーニングすることが可能であることが示された。近年、海洋共生系は微生物の多様性、抗ガン剤・抗菌物質の新規性から新たなスクリーニング対象として注目されている。これまで、多様性の宝庫であるサンゴ礁生態系に生息する無脊椎動物等から医薬品、研究試薬となるような様々な天然物が見いだされてきた。しかし、堅い炭酸カルシウム骨格を有する造礁サンゴや無脊椎動物からの有用物質のスクリーニングにおいては大量のサンプルを必要とし、見出されている生理活性物質は少ない。さらに、共生の開始・保持するためのシグナル物質は未だ明らかとなっていない。そこで、本研究では、海洋共生系としてサンゴ、カイメンに焦点を当て、少量のサンゴ、海綿サンプルから単一細胞レベルでの微生物の分離・培養する技術を開発し、海洋共生コンソーシアムからの有用生体分子の活性評価を行うことを目的とする。本年度は、沖縄阿嘉島に生息しているカイメンの共生コンソーシアムからセルソーターを用いて微生物を単一細胞レベルで分離し、分子系統的解析や、ゲノム増幅検討を行った。フローサイトメーターを用いてカイメン共在バクテリアをサイズ分画し、各画分に存在するバクテリアの解析を行ったところ、DGGE解析の結果、分画前のサンプルでは認められなかったバンドが各画分から認められ、多様な細菌の存在が明らかとなった。次に、モデル微生物としたシアノバクテリアのゲノムのMCA法による増幅を検討した。Synechocystis sp.PCC6803を遠心回収し5.0×10^5cellsに調整し、細胞破砕の条件として90°Cで5min熱処理をした後に超音波処理を行った。sample bufferを加え、95°Cで熱変性を行った後にreaction bufferおよびenzyme bufferの混合液を加え、30°C16時間インキュベートした。ITS領域をPCRによって増幅することでゲノムの増幅を評価した。