hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗精子抗体産生に関与する免疫遺伝的背景の解明特にHLA遺伝子との関連の検討

精子不動化抗体以外に不妊症の原因が見あたらない不妊症患者36人についてHLA-DRB1,HLA-DQB1及びHLA-DQA1遺伝子の型を決定した。統計処理の対象として、第11回国際組織適合抗原Work Shopでみとめられた正常日本人(Wajinn)の遺伝子頻度を用いた。その結果、精子不動化抗体を持った不妊症患者でHLA-DRB1^*0901に日本人集団に対してp<0.0085と強い有意な頻度上昇がみられ、またHLA-DRB1^*1501においても、有意な頻度上昇を認た(p<0.025)。しかしそれ以外の遺伝子頻度には一般の日本人集団頻度と比べて有意な違いのあるものは認められなかった。HLA-DQB1遺伝子については、HLA-DQB1^*0303に有意な頻度上昇(p<0.0018)がみられ、またHLA-DQB1^*0602においても、有意な頻度上昇(p<0.0089)を認めた。これら以外の遺伝子頻度には一般頻度と有意な違いのあるものは認められなかった。HLA-DQA1は、いずれの遺伝子も一般日本人とのそれと有意差は認められなかった。日本人において、精子不動化抗体の疾患頻度がCaucasianよも高いことが指摘されているが、この研究で明らかになった2つのHLA haplotypeについて、HLA-DRB1^*1501-DQA1^*301-DQB1^*0602はCaucasianに比して特に高くないが、もう一方のHLA-DRB1^*0901-DQA1^*301-DQB1^*303は他民族に比べて特異的に高いことより考えて、日本人の精子不動化抗体の頻度がCaucasianに比し高い原因でないかと推定される。精子不動化抗体が陽性である不妊症婦人29人より同意を得て、末梢血からリンパ球を採取し常法に従いgenomic DNAを抽出した。その結果HLA-DRlocusについてはHLA-DRB1^*0901が58allele中14allelあり、正常日本人対照群に比較して明らかに増加していた(p<0.027)。またこれほど著名ではないがHLA-DRB1^*1501も増加していた(p<0.047)。HLA-DRA1遺伝子はどのphenotypeも一般日本人集団と有意な増減は見られなかった。しかし、HLA-DRB1遺伝子座と連鎖不平衡が存在するHLA-DQB1に付いてはHLA-DRB1^*0901及びHLA-DRB1^*1501と各々強い連鎖不平衡にあるHLA-DQB1^*0303とHLA-DQB1^*0602についてはそれぞれp<0.039,p<0.016と明らかな有意な増加がみられた。

HLA-DQB1遺伝子については、HLA-DQB1^*0303に有意な頻度上昇(p<0.0018)がみられ、またHLA-DQB1^*0602においても、有意な頻度上昇(p<0.0089)を認めた。これら以外の遺伝子頻度には一般頻度と有意な違いのあるものは認められなかった。HLA-DQA1は、いずれの遺伝子も一般日本人とのそれと有意差は認められなかった。日本人において、精子不動化抗体の疾患頻度がCaucasianよりも高いことが指摘されているが、この研究で明らかになった2つのHLA haplotypeについて、HLA-DRB1^*1501-DQA1^*301-DQB1^*0602はCaucasianに比して特に高くないが、もう一方のHLA-DRB1^*0901-DQA1^*301-DQB1^*303は他民族に比べて特異的に高いことより考えて、日本人の精子不動化抗体の頻度がCaucasianに比し高い原因でないかと推定される。
集合値計画法におけるゲーム論的評価基準の研究

近年の集合値解析学の発展、および価値観の多様化が進んだ今日の社会の発展に伴い、集合値最適化理論の確立が求められ、研究されつつある。本研究の目的は、集合値最適化問題における解の評価基準をゲーム理論の立場から分類し、それぞれの基準に対する体系的、統一的な理論の構築、および最適解へのアプローチ方法を確立することが目的である。本年度においては、以下のことを行った。【ゲーム論的な評価基準の検証】協力ゲーム、非協力ゲームの立場から定義された評価基準に基づく集合値最適化問題を考察し、様々な例を用いて、評価基準の意義、妥当性、有用性について検証した。【ゲーム論的な評価基準をもつ集合値最適化問題に関する基礎理論の研究】これらの新しい評価基準に対する集合値最適化問題を考察し、体系的、統一的な土台となるような集合値解析理論の構築を目指し、研究を行った。特に最適解の存在性、最適性の条件、および双対性に関する理論を研究する際の方法を再検討し、よりよい手法により構築された理論の見直しを行った。【ゲーム論的な評価基準をもつ集合値最適化理論の応用】得られた基礎概念、基礎理論は、従来の最適化理論の拡張のみならず、ゲーム理論への応用、および集合値関数に対する鞍点概念の再検討に際して応用し、本研究の広い拡張性、有用性を示すことができた。【研究会等における発表を通じた意見交換】本年度の研究成果は、国際会議WCNA2000(World Congress of Nonlinear Analysis)をはじめとするいくつかの研究集会で発表し、国内外を問わず本研究に対する意見を広く求めることが出来た。同時にWWW、e-mailを通じて、多くの研究者との意見交換を行った。本研究の目的は、集合値最適化問題における解の評価基準をゲーム理論的な立場から分類し、それぞれの基準に対する体系的、統一的な理論の構築、および最適解へのアプローチ方法を確立することが目的である。【ゲーム理論的な評価基準の確立】特に、協力ゲーム、非協力ゲームそれぞれの立場から生じる評価基準での集合値最適化問題を導入し、その意義について論じた。また、従来の概念を改良、拡張する新しい評価基準を導入した。【集合値解析学的な基礎理論の確立】上記で定義された評価基準から生じた種々の概念(凸性、下半連続性)についての基礎的な理論を構築した。【集合値最適化問題に対する基礎理論の確立】導入した評価基準に対する集合値最適化問題を定義し、最適解の存在性、最適性の条件、およびいくつかの双対性に関する定理を証明した。【集合値最適化問題の応用】特にベクトル値ミニマックス問題に適用し、鞍点概念の再考察、再評価を行った。【研究会等における発表を通じた意見交換】近年の集合値解析学の発展、および価値観の多様化が進んだ今日の社会の発展に伴い、集合値最適化理論の確立が求められ、研究されつつある。
NKT細胞によるT細胞の恒常性維持機構の解析

私はこれまでに、NKT細胞がT細胞のホメオスタティック増殖にどのような影響を与えているかを検討するために、α-GalCerを用いてNKT細胞を活性化させ、T細胞のホメオスタティック増殖の変化を調べてきた。その結果、α-GalCerを投与することでCD8+細胞のホメオスタティック増殖が促進することが分かり、この現象にはIL-4が直接関与していることを明らかにしてきた(Ueda.et.al.Int.Immunol.18:1397-1404,2006.Aug16)。本年度は、さらに分子レベルで記憶CD8+T細胞の維持のメカニズムを明らかに目的で、化学変異原であるENU(エチルニトロソウレア)をマウスに投与することで点変異導入マウスを作製し、T細胞の記憶・活性化マーカーであるCD44の発現に変化が認められる変異マウスのスクリーニングを行った。その結果、T細胞、特にCD8+T細胞上のCD44が高発現している、ある変異マウス家系が存在することが分かった。この変異マウス家系で認められた、T細胞におけるCD44高発現という表現型は、メンデルの遺伝の法則に従って劣性遺伝することもわかった。また、骨髄移植実験により、造血系の細胞に点変異が入っていることがこの変異マウスの表現型に必要であることが分かった。さらに責任遺伝子の同定を試みたところ、ある遺伝子Xに点変異が認められた。さらに、in vivoにおいて変異マウスの造血系細胞に正常な遺伝子Xを過剰発現させると、変異マウスで認められたCD44高発現は回避できることが分かった。以上の結果より、遺伝子XがT細胞の恒常性の維持に関与していることか明らかとなった。この知見は、T細胞恒常性維持の分子レベルでのメカニズム解明に非常に重要なものであると考えられる。NKT細胞はマウスではVα14-Jα18、ヒトではVα24-Jα18にコードされたTCRを発現しており、抗原提示細胞(APC)上のCD1d分子に提示された糖脂質を認識し活性化する。NKT細胞はそれらα-galactosylceramide(αGC)等の糖脂質によって活性化すると、多量のIFNγ、IL-4等を産生し、免疫系を調節する。これまでに、さまざまなモデルマウスを用いた実験によって、NKT細胞は自己免疫疾患を抑制することが明らかにされている。また、成熟T細胞の減少した環境(胎生時、ウイルス感染等)においておきる、末梢のT細胞の自律的分裂(homeostatic proliferation(HP))は我々が発見したF759マウスの自己免疫性関節炎あるいは糖尿病モデルマウスNODマウスの原因になりうることが最近判っている。私はまず、NKT細胞がT細胞のHPにどのように関与しているかを検討することにした。そのために、αGCをマウスに投与することでNKT細胞を活性化させると、CD4+T細胞のHPは抑制され、逆にCD8+T細胞のHPが促進することが分かり、この現象は、NKT細胞の欠損したJα18KOマウス、CD1dKOマウスをホストマウスに用いると認められなかったことから、CD1d拘束性NKT細胞依存的であること明らかとなった。今年度はαGCによるCD8+T細胞のHP促進のメカニズムについて詳細に解析した。IL-4の関与について見当した結果、αGCを投与後のCD8+T細胞のHP促進にはIL-4が必要であることが明らかとなった。さらに、移入実験からNKT細胞が産生するIL-4が重要であることがわかり、IL-4受容体α鎖のKOマウスおよび、IL-4受容体の下流のシグナル分子であるSTAT6のKOマウス由来のCD8+T細胞を用いた実験から、IL-4がCD8+T細胞に直接作用したHPを促進していることが明らかとなった。以上の結果より、NKT細胞が活性化すると、CD4+T細胞のHPは抑制され、CD8+T細胞のHPが促進すること、さらにCD8+T細胞のHPの促進はNKT細胞由来のIL-4によって引き起こされていることを明らかにすることができた(Ueda et al. International Immunology 2006)。本研究室では、インターロイキン(IL)-6ファミリーサイトカインの細胞内シグナル伝達分子であるgp130の759番目のチロシンをフェニルアラニンに置換したノックインマウスであるgp130^<F759/F759>(F759)マウスを作製し、このマウスはSTAT3のリン酸化が亢進していること、さらに自己免疫性の関節炎を発症することを報告してきた(Atsumi, et. al. J. Exp. Med. 2002)。さらに私はこれまでに、ナチュラルキラーT(NKT)細胞を活性化させるとIL-4依存的にCD8+T細胞の自律的分裂が促進することを報告してきた(Ueda, et. al. Int. Immunol. 2006)。また、二重変異マウスの作製により、NKT細胞はF759マウスの関節炎を抑制していること、さらにはCD8+T細胞もF759マウスの関節炎を抑制していることが示唆されていたので、NKT細胞はIL-4を介してCD8+T細胞の自律的分裂を促進することでF759マウスの関節炎を抑制している可能性を考え、実験をおこなった。はじめにIL-4ノックアウトF759二重変異マウスを作製し、関節炎発症の程度を調べた。

その結果、関節炎が増悪するのではないかという予想に反して、コントロールF759マウスと比較してほとんど差は認められなかった。次に、F759マウスにαgalactosylceramide(αGC)を投与してNKT細胞を活性化させ、関節炎の発症について検討をおこなった。こちらの実験においても、予想に反して、NKT細胞を活性化させてもF759マウスの関節炎が抑制されることはなかった。以上の結果と、NKT細胞の存在しないF759マウスでは関節炎が増悪するという結果と合わせると、F759マウスの関節炎は定常状態のNKT細胞によってIL-4非依存的に抑制されていることが考えられる。私はこれまでに、NKT細胞がT細胞のホメオスタティック増殖にどのような影響を与えているかを検討するために、α-GalCerを用いてNKT細胞を活性化させ、T細胞のホメオスタティック増殖の変化を調べてきた。その結果、α-GalCerを投与することでCD8+細胞のホメオスタティック増殖が促進することが分かり、この現象にはIL-4が直接関与していることを明らかにしてきた(Ueda.et.al.Int.Immunol.18:1397-1404,2006.Aug16)。本年度は、さらに分子レベルで記憶CD8+T細胞の維持のメカニズムを明らかに目的で、化学変異原であるENU(エチルニトロソウレア)をマウスに投与することで点変異導入マウスを作製し、T細胞の記憶・活性化マーカーであるCD44の発現に変化が認められる変異マウスのスクリーニングを行った。その結果、T細胞、特にCD8+T細胞上のCD44が高発現している、ある変異マウス家系が存在することが分かった。この変異マウス家系で認められた、T細胞におけるCD44高発現という表現型は、メンデルの遺伝の法則に従って劣性遺伝することもわかった。また、骨髄移植実験により、造血系の細胞に点変異が入っていることがこの変異マウスの表現型に必要であることが分かった。さらに責任遺伝子の同定を試みたところ、ある遺伝子Xに点変異が認められた。さらに、in vivoにおいて変異マウスの造血系細胞に正常な遺伝子Xを過剰発現させると、変異マウスで認められたCD44高発現は回避できることが分かった。以上の結果より、遺伝子XがT細胞の恒常性の維持に関与していることか明らかとなった。この知見は、T細胞恒常性維持の分子レベルでのメカニズム解明に非常に重要なものであると考えられる。
心筋細胞分化における時期特異的クロマチンリモデリング制御に関する研究

多能性細胞から心筋細胞への分化に伴う過程で、DNAメチル化、ヒストン修飾等のエピゲノム標識データに加えて、ヒドロキシメチル化シトシンの局在をhmeDIP-seq法によって調べたところ、時期特異的に増加する領域を同定した。先に得られたFAIRE陽性領域とも重なることが判明し、developmental enhancer領域においてDNA脱メチル化が生じていると考えられた。すなわち、転写因子が安定的に結合するためには、ヌクレオソームを除去し、脱DNAメチル化を行い、HATなどをリクルートしてdevelopmental enhancerを活性化することが明らかとなった。さらに一細胞のトランスクリプトーム解析を各タイムポイントで実施した。トランスクリプトーム解析は1細胞を単離後、得られた全RNAからoligo(dT)プライマーを用いてSMARTer法でcDNA合成を行い、トランスポゼースを用いてライブラリーを作成して次世代シーケンサーでRNA-seqを実施した。各データポイント内においての細胞毎の遺伝子発現の不均一性が示された一方で、それぞれの細胞を分化の時間軸に沿って配置することができ、β-cateninやBrachyuryなどの転写因子のChIP-seqデータから想定される遺伝子転写カスケードをよく反映していた。すなわち、細胞分化のプロセスにおいてdevelopmental enhancerが転写因子により認識され、安定的に活性化されるためにはクロマチンリモデリング複合体やDNA脱メチル化関連酵素、ヒストンアセチル化酵素などをリクルートしていることをゲノムワイドに示した。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、多能性細胞から心筋細胞への分化系をモデルとして、DNAメチル化やヒストン修飾等のエピゲノム標識,クロマチン状態の動的変動データに基づいてその制御機構を明らかにすることである。EC細胞あるいはES細胞からの心筋分化誘導系を用いて、FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements)解析によるクロマチンへのアクセス性(accessibility)を測定し、各分化段階に特異的なオープンになると同定されたクロマチン領域に、有意に高頻度に出現する結合配列モチーフから分化制御因子を推定した。従来心筋分化の制御因子として知られるβ-cateninやBrachyuryなどの転写因子の結合モチーフが中胚葉段階の細胞では高頻度に出現したので、それらの結合部位をChIP-seq解析により同定した。さらにSWI/SNF複合体の存在領域についてもChIP-seqにより決定した。エピゲノム標識については活性化クロマチン領域に特徴的なヒストン修飾であるK4me1およびK27Acに加えて、DNA脱メチル化に関わるヒドロキシメチルシトシンの局在をhmeDIP-seqにより検出した。さらに細胞集団内には多様性があるため、1細胞でのトランスクリプトーム解析を実施することにより、発現遺伝子間の相関関係を検出することが可能となった。領域内での連携研究の推進にも貢献すべく、新たなエピゲノム解析技術を立ち上げた。時期特異的にchromatin accessbilityが向上するエンハンサー領域候補を特定できた。心筋分化に重要であるといわれたβ-cateninやBrachyuryの結合領域をChIP-seq法によって同定したところ、両因子は近接して結合することが判明した。いわゆるスーパーエンハンサーを形成していると考えられた。ヒドロキシメチルシトシンはこれらの時期特異的エンハンサーが使われる時期にほぼ一致して局在することも認められた。1細胞のトランスクリプトーム解析データを合わせることにより、遺伝子間相互の相関関係も明らかになるなど、予定を上回る進捗が得られたと考えられる。時期特異的に活性化されるエンハンサー領域候補を特定できたので、ヌクレオソームがフリーとなりDNAの脱メチル化が生じるために、SWI/SNF複合体やTETタンパクが同領域に動員されることをChIP-seq解析に加えてタンパクレベルでも明らかにする。また、中胚葉段階への移行に際しては、幹細胞性の喪失と連動せねばならない。

一方、心筋特異的に発現する遺伝子群については幹細胞段階では発現せぬような抑制機構が働いている可能性も想定されることから、それらの遺伝子領域のエピゲノム標識の特徴について検討する。
ニューロン樹状突起にあるBC-IRNAタンパク複合体の機能と局在機構

BC-IRNAはゲッ歯類に特異的なID反復遺伝子の転写産物で、神経細胞で選択的に転写される。このRNAは特定のタンパクと複合体を形成し、樹状突起に運ばれる。このような特質を持つRNAは他に例がない事からも、このRNAの転写メカニズムや、神経細胞内の特定のコンパートメントに輸送されるメカニズム、更には樹状突起後シナプス部における役割について解析する事は夫々に重要なテーマである。我々は、平成6年から7年度の研究年度にわたり、主に次の2点について解析を行った。1.BC-IRNAの発現に関与する生理的因子の解析:BC-IRNAは動物の誕生後、脳が成熟する過程で増加するが、この意味を更に理解するため、我々は骨格筋をモデルとして解析を行った。その結果、a.BC-IRNAは筋肉が運動神経の支配を受ける胎児期に増え、出生後シナプスが成熟する過程で減少した。これらの結果と、脳の結果を合わせ考えると、BC-IRNAは中枢、末梢を問わずシナプスの形成過程や、それにともなった後シナプス細胞の分化過程で機能している事を示唆している。b.運動神経の除神経により増加した。この増加には、筋肉の活動度や神経に由来する栄養因子が関与していると思われる。アセチルコリン受容体mRNAは除神経でup-regulationされるのに対し、アセチルコリンエステラーゼmRNAはdown-regulationされる事を考えると、BC-1RNAはシナプスの形成や、再生過程で機能していると考えることができる。更に、詳細に解析を行っているが、骨格筋で得られた結果はBC-IRNAの発現が、中枢神経系にあっても神経細胞相互の伝達過程と密接な関係を持って調節されている事を示唆している。BC-IRNAの機能について理解を深める為には、その細胞内における局在部を知る事が大切である。現在、in situ法により骨格筋細胞における局在部分について調べている。2.BC-IRNAの細胞内輸送に関する解析:BC-IRNAには、TB-RBP (Testis-Brain-RNA-Binding-Protein)の認識配列がある。このタンパクはmRNAを微小管へ結合させる活性を持つ事が報告されている。現在、BC-IRNAを2次構造上の特徴的なドメイン構造に分け、それらの各部分にTB-RBPを含めどのようなタンパクが結合するか解析している。TB-RBPの認識配列がある事は、BC-IRNAが微小管と相互作用しながら樹状突起に輸送される事を示唆しており、そのメカニスムについて考える上で重要な知見である。BC-1RNAはケッ歯類の神経系で発現する分子量の小さいRNAである。樹状突起にあり、Spine synapse部にある事から情報受容の過程で機能していると考えられている。殊にdendritic mRNAsのシナプス部への輸送や、当該部での翻訳反応に関与すると考えられ解析が進められている。

このRNAは神経系に特異的であるばかりでなく、シナプス形成の盛んな時期に著しく増加する事から神経系の形成ばかりでなく維持や、再生、可塑的変換過程でも桟のうしている事が考えられる。従ってそのRNAが果たす役割や、シナプス部への輸送機構を調べる事は大変に重要でかつ興味ぶかい。これまで神経由来の初代培養系、株化細胞を用いて主に解析を試みて来たが、種々の困難があった。解析過程で、このRNA(RNP)が骨格筋細胞で発現している事を見出したので本年度半ばに実験系を変更した。その結果、次の事柄が観察された。(1)骨格筋が運動神経の支配(多重支配)をうける胎生期に多く、誕生後のシナプスの成熟に伴い減少した。この発現の様式は時間経過的には脳とまったく異なる(脳では生後2wks4wksで)(著しくふえる)が、シナプス形成という点からはまったく同じである。(2)除神経操作をおこなうと、Pセチルコリン受容体αサブユニットmRNAのup-regulationと同一の時間経過で増加した。(3)その増加は速筋で大きくおこり遅筋では殆どおこらない。この事はPセチルコリン受容体mRNAの場合とまったく同じである。以上の事から我々はこのRNAが、シナプス形成にかかわる反応-例えばポストシナプス部での役割や、プレシナプス部運動神経へのガイド、栄養的因子を介した働き等-を想定している。最近このRNAは成熟した筋の中の恐らくはtupeII筋中で、発現している事を示すinsituのhybridizationの結果をえている。ヒト筋でもヒトAluをもつBC-200RNAが発現している事と合せ、大変に興味ぶかい。輸送機構については現在十分な解析が進んでいないが、in vitroで神経筋接合部形成を行なわせた上で実施する予定である。BC-1RNAは動物の誕生後脳が成熟する過程で増加する。この現象を更に理解するため、我々は骨格筋をモデルとして解析を行った。その結果、a.筋肉が運動神経の支配を受ける胎児期に増え、出生後シナプスが成熟する過程で減少した。これらの増減と脳の結果とを合わせ考えると、BC-1RNAは中枢、末梢を問わずシナプスの形成過程や、それに伴った後シナプス細胞の分化過程で機能している事を示唆している。b.運動神経の除神経により増加した。この増加には、筋肉の活動度あるいは神経由来の因子が関与していると思われる。アセチルコリン受容体mRNAが除神経でup-regulationを受け、アセチルコリンエステラーゼmRNAはdown-regulationされる事を考えると、BC-1RNAはシナプスの形成や再生過程で機能していると考えることができる。2.細胞内の局在性。in-situ法で調べた。adultではback groundを有意にこえるシナプスを得ることができなかった。これは、RNAの量が少ないことによると思われる。そこで、横隔膜をつかい、それをシナプスを含む部分とそうでない部分に分け、BC-1RNAの分布を調べた。その結果、BC-1RNAが神経筋接合部(NMJ)に局在する事はなかった。
エピジェネティクスを介した超音波による細胞の分化制御

破骨細胞と骨芽細胞が共存する魚類のウロコに対する低強度パルス超音波(LIPUS; 30 mW/cm2, 20分)の照射により,破骨細胞活性化の重要な分子であるRANKL,MMP-9やカテプシンKのmRNA発現レベルが有意に上昇することが明らかとなった.また, 1日1回2週間LIPUS照射したサンプルでは,骨芽細胞の酵素活性やウロコの再生比率が有意に上昇した.他方,マウス前骨芽前駆細胞において,LIPUS照射細胞では,トリメチルヒストンH3 (Lys9)のタンパク質発現レベルが有意に上昇した.得られた結果は,骨関連の細胞におけるLIPUSの作用メカニズムを理解するための分子基盤になる.低出力パルス超音波(LIPUS)は長年骨折治療に利用されているが,その作用の分子メカニズムは不明な点が多い.同じゲノムを持つ未分化な幹細胞が様々な機能の異なる細胞へ分化できるのは,ゲノムによらないエピジェネティック制御があるからである.今年度は,以下の実験結果を得た.間葉系幹細胞株ST-2細胞を用いた時,LIPUS (30 mW/cm2, 20 min)の連続照射(一日一回)は,細胞の増殖を有意に亢進させることが明らかとなった.LIPUSの効果を評価するために,ST-2細胞の分化誘導条件の詳細を検討している.アスコルビン酸等の骨芽細胞誘導試薬により細胞の石灰化(カルシウムの沈着)やアルカリフォスファターゼ活性が上昇することを確認した.また,LIPUSの影響を評価するラット口腔上皮細胞株ROE2において,小胞体ストレス(フッ化ナトリウムで誘導)によって誘導される遺伝子群を明らかにし,その中でDDIT3やHSPA5が細胞障害の誘導に密接に関与していることを明らかにした.低出力パルス超音波(LIPUS)は臨床の場で骨折治療に使用されている.しかしながら,その作用メカニズムは完全には解明されていない.今年度は,以下の実験結果を得ることができた.超音波発生装置(帝人社製)を用いて細胞にLIPUSを照射した.強度ISPTA (空間ピーク時間平均強度)は30 mW/cm2,照射時間は20分間とした.骨折治癒過程に繊維芽細胞が関与するので,ヒト由来のHs68等の繊維芽細胞を用いた.LIPUS (30 mW/cm2, 20 min)の照射は細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)を活性化した.また,細胞増殖に対しても促進作用がある可能性が示された.骨芽細胞様細胞株MC3T3-E1細胞は幾つかの亜株がある.MC3T3-E1細胞とMC3T3-E1 clone 4細胞に対する骨芽細胞の分化誘導薬アスコルビン酸とベータグリセロリン酸の効果を比較した.その結果,後者の細胞の方がオステオカルシンや転写因子Runx2等のmRNAレベルをより上昇させることが示された.今後は応答性の良いMC3T3-E1 clone 4細胞を用いてLIPUSの効果を検討する予定である.魚類のウロコには骨芽細胞や破骨細胞が存在し,骨の形成・再生を評価する有用なモデルである.金魚とゼブラフィッシュウロコに対するLIPUS (30 mW/cm2, 20 min)の照射は破骨細胞に作用し,破骨細胞のマーカー遺伝子である酒石酸耐性酸フォスファターゼとカテプシンKのレベルを低下させた.また,DNAの断片化が増加したので,LIPUSによりアポトーシスが誘導されることが示された.平成27年度は,繊維芽細胞や骨芽細胞様細胞株,さらには魚類のウロコを用いて低出力パルス超音波(LIPUS)の応答を検討した.LIPUSの種々の作用を確認することが出来たので,研究は概ね良好に進捗したと判断した.マウス頭頂骨に持続的伸展刺激(0.2 g)を3または6時間負荷し,発現変動する遺伝子を調べた.本刺激により数多くの遺伝子の発現が変動することが示され,それらの中でBMP4とCCN1を含む15遺伝子の発現が進展刺激により上昇することを定量的リアルタイムPCR法で確認した.さらに,CCN1タンパク質が進展刺激により発現が増加することを免疫組織化学法で明らかにした.このタンパク質は,アルカリフォスファターゼ(ALP)陽性の細胞,即ち,骨芽前駆細胞で発現レベルが高いことが明らかとなった.金魚のウロコの破骨細胞に対する低出力パルス超音波(LIPUS)の効果を検討した.破骨細胞の活性化にはRANK,そのリガンドであるRANKLとそれらの結合を阻害する可溶性デコイ受容体であるOPGが関連するシグナル伝達系が重要である.LIPUSはRANKの発現には影響を与えなかったが,RANKLの発現は照射後6と12時間後に有意に増加した.一方,OPGの発現はLIPUS暴露6時間後のみ発現レベルが一過性に上昇した.RANKの下流の分子であるTRAF6とNFATc1のmRNA発現レベルはLIPUS照射の6時間後に有意に上昇し,さらにその下流の酵素カテプシンKとMMP9は照射の6と12時間後に有意に上昇した.LIPUSの単回照射後,初期の段階で破骨細胞が活性化されることが示された.また,金魚の個体に1日1回2週間LIPUSを連続照射したウロコのサンプルでは,破骨細胞のTRAP活性はLIPUSにより影響を受けなかったが,骨芽細胞のALP酵素活性やウロコの再生比率が有意に上昇した.

LIPUSは破骨細胞と骨芽細胞を活性化し,骨の形成を促進すると考えられる.破骨細胞と骨芽細胞が共存する魚類のウロコに対する低強度パルス超音波(LIPUS; 30 mW/cm2, 20分)の照射により,破骨細胞活性化の重要な分子であるRANKL,MMP-9やカテプシンKのmRNA発現レベルが有意に上昇することが明らかとなった.また, 1日1回2週間LIPUS照射したサンプルでは,骨芽細胞の酵素活性やウロコの再生比率が有意に上昇した.他方,マウス前骨芽前駆細胞において,LIPUS照射細胞では,トリメチルヒストンH3 (Lys9)のタンパク質発現レベルが有意に上昇した.得られた結果は,骨関連の細胞におけるLIPUSの作用メカニズムを理解するための分子基盤になる.平成26年度は,新規に導入した超音波発生装置の効果を検討することに注力した.低出力パルス超音波(LIPUS)の効果を安定させるにはもう少し検討が必要ではあるが,LIPUSの細胞増殖亢進効果を確認した.研究実績の概要に示したように,研究は概ね良好に進捗した.種々培養細胞とウロコ組織モデルを用いて,LIPUSの影響を検討する.ヒストンの修飾状態やそれに関連する標的遺伝子の発現を調べる.研究成績をまとめて,エピジェネティクスを介した超音波による細胞の分化制御機構を明らかにする.細胞生理学3.ウロコ組織モデルにおける発現の解析キンギョのウロコは骨形成・再生の非常に有用な組織モデルである.骨の分化等に関連する候補遺伝子の発現をリアルタイム定量的PCR法で確認する.また,骨芽ー破骨細胞相互作用に重要なRanklやOpgの発現を調べる.さらに,in situ hybridization法を用いて,組織レベルで遺伝子の発現量や発現部位を明らかにする.効率的に予算を執行することが出来たので,研究費の使用が予定金額よりも少なかった.これにより,次年度の繰越金が発生した.現有する試薬類や培養器具を使うことができたので,研究費の使用が予定金額よりも少なかった.これにより,次年度の繰越金が発生した.次年度の研究を実施するために以下の使用を計画している.試薬類:300千円.培養器具類:300千円.抗体類:200千円.網羅的遺伝子発現解析試薬類:500千円.国内旅費:100千円.謝金等:100千円.その他(論文投稿費など):100千円..次年度,研究を実施するために,以下の使用を予定している.試薬類:700千円,培養器具類:300千円,抗体類:420千円,遺伝子発現解析試薬類:2000千円,旅費:200千円,謝金:100千円,その他(論文投稿料):200千円.
生体親和性と抗菌性を有する傾斜機能型バイオセラミックスの開発

傾斜機能を保持する材料のうち,生体適合性の良好だと考えられるルチル型二酸化チタン焼結体を使用した.これまでにルチル型二酸化チタン焼結体におけるマウス線維芽細胞における細胞増殖およびマウス骨芽細胞様細胞の良好な細胞増殖を確認している。生体材料として特にインプラント材料などの骨細胞と適合性の大きいBioactiveな性質の有無を検討するため、ルチル型二酸化チタン焼結体上で,マウス骨芽細胞様細胞を培養し,生細胞数およびアルカリフォスファターゼ(ALP)活性を比較した.1300°Cで焼成し作製したルチル型二酸化チタン焼結体を用いて細胞培養実験を行った.MC3T3-E1細胞をルチル型二酸化チタン焼結体上で培養し,7,14,21,28日間後の生細胞数ならびにALP活性を測定した.各日数において,ルチル型二酸化チタン焼結体の増殖が対照群よりも高い値を示し,21日および28日は統計学的に有意に増大した.ALP測定では、対照群を基準としルチル型二酸化チタン焼結体の変化を算出した.培養14日目では110%,28日目では126%といずれも多い値を示した。ルチル型二酸化チタン焼結体は,ALP活性を促しマウス骨芽細胞様細胞の分化に影響を与える可能性が示唆された。現在、アナターゼ型二酸化チタンの焼成温度を変え、傾斜機能の変化や割合について検討している。またルチル型二酸化チタンと共に、アナターゼ型二酸化チタン焼結体上でマウス骨芽細胞様細胞の分化と挙動のについて追究を行っている。試料作製条件や原料性状を検討を行って細胞培養試験に適する形状を確立できた.生体材料としての評価を行ている.いくつかの機械的性質の計測が難しい場合は,材料力学的知識および研究方法を習得するため、共同研究者に専門知識を教示をいただきながら研究を遂行する.引き続き条件を変化させながら試料を作製を行い、傾斜機能をコントロールや焼結体形状を検討する.細胞培養試験や光触媒作用を計測する試験や抗菌作用試験を行う。二酸化チタンはその触媒作用が注目され歯科材料へ応用を試みるための研究が行われている.我々は,触媒作用を有し,かつ生体適合性の良好な二酸化チタン焼結体を歯科生体材料として応用することを目的に,傾斜機能を保持する材料の検討を進めている.出発材料の形状が異なる二酸化チタン粉末から,実験用試料となる焼結体を作製した.生体材料としての機械的強度を調節するため、材料力学的観点から検討できるよう試料の作製および計測法を検討している。本研究の目的である,ルチル型およびアナターゼ型二酸化チタン焼結体におけるマウス線維芽細胞およびマウス骨芽細胞様細胞の細胞増殖について計測を行っていく.アナターゼ型二酸化チタンについてはさらに焼成温度を変えて焼結体を作製したときの結晶相の変化や細胞の増殖に与える影響および色素分解能の変化について計測している.ルチル型二酸化チタン焼結体では,マウス骨芽細胞様細胞を培養し,生細胞数およびALP活性を比較を行う実験をした.コーティング剤である水溶性二酸化チタンにも着目し光触媒作用を計測した.触媒作用を有し,かつ生体適合性に優れる二酸化チタンの特性を発揮させる傾斜機能材料の検討を進めている.これまでの研究から作製したルチル型およびアナターゼ型二酸化チタン焼結体は,焼成温度によって色素分解能力および細胞増殖能が異なることが判明し,傾斜機能を付与できる生体材料としての有用な材料であることを確認している.二酸化チタンのこれらの特性を応用して,ぬれ性・防汚性・細胞接着性に優れる材料開発を目指した研究を遂行している.焼結条件を変えたり,異なる形状の出発原料で試料を作製しているため、多くの組み合わせ条件が考えられるが,その中で機械的強度試験および細胞培養試験に適する形状を確立できた。さらに水溶性二酸化チタン材料を使用し触媒作用の計測が行った。焼成した試料と水溶性二酸化チタンともに比較的強い光触媒作用があることを評価できた。ルチル型二酸化チタン焼結体では,マウス骨芽細胞様細胞を培養し,生細胞数およびALP活性を比較を行った。アナターゼ型二酸化チタン焼結体の細胞培養試験の予備実験を行っている。

ルチル型二酸化チタン焼結体は,ALP活性を促しマウス骨芽細胞様細胞の分化に影響を与える可能性が示唆された。現在、アナターゼ型二酸化チタンの焼成温度を変え、傾斜機能の変化や割合について検討している。またルチル型二酸化チタンと共に、アナターゼ型二酸化チタン焼結体上でマウス骨芽細胞様細胞の分化と挙動のについて追究を行っている。試料作製条件や原料性状を検討を行って細胞培養試験に適する形状を確立できた.生体材料としての評価を行ている.いくつかの機械的性質の計測が難しい場合は,材料力学的知識および研究方法を習得するため、共同研究者に専門知識を教示をいただきながら研究を遂行する.アナターゼ粉末から焼成条件を変えた試料を多く作製し、機械的強度の変化を材料力学的観点から計測する。それとともに現在臨床で使用されているハイドロキシアパタイトやジルコニアとの比較が必要であると考え、同形状の試料作製を行う。これに伴いハイドロキシアパタイトやジルコニアの焼結条件を設定するための予備実験が必要である。これらの試料を材料力学的知識および研究方法を獲得するため、専門知識の教示をいただき、実験方法を考案する。細胞培養試験や光触媒作用を計測する試験や抗菌作用試験を行う。引き続き条件を変化させながら試料を作製を行い、傾斜機能をコントロールや焼結体形状を検討する.細胞培養試験や光触媒作用を計測する試験や抗菌作用試験を行う。セラミックスの物性を細かく検討するため、限られた試料片の形態から詳細なデータを出し、入念な試験方法の検討が必要であった。知識の教示のため愛知学院大学に通い、その物性をさらに詳しく検討できる実験方法を検討していた。セラミックスは金属材料と異なり、形態を自由に形成するには難しい。セラミックスはプレスなどで型に圧接してから焼結するが収縮が大きくまた陶材の様に釉薬などのほかの物質は使用できないため、試料片の形態を自由に調整することは困難である。現在ある物性試験は、ある程度試料片の形態が決められている。本実験で使用する二酸化チタン焼結体をその試料片形状にするのは現時点では難しい。材料試作や研究は行って実験データも出ているが、力学的データ解析を行っていたため、現時点まで大きな材料費が必要ではなく、多くの試料の作製を中心に行っていた。現時点で、一つの方法としてひずみ計を使用して物性を計測することを検討している。その他のデータは実験を行い出ているため、研究発表および論文執筆を行っていたため、執行状況が低かった。今後の使用計画は、細胞培養実験や抗菌実験、論文執筆および学会発表の費用として使用する予定である。機械的強度計測のための試料焼成過程における形状の安定性が得られず、当初計画より時間がかかってしまったため、使用する物品の一部の購入が遅れ差額が生じた。差額は計画していた物品および機械的強度計測用試料を作製するために必要な物品をを購入する予定である。
金属錯体を主鎖に持つ非天然型アミノ酸及び新規ペプチドの合成

ビピリジン骨格を有する非天然型アミノ酸配位子の合成、及びその金属錯体は3量体までの単離に成功し、5,5'-位の方向に伸長したオリゴペプチドでは、各種スペクトル測定、理論計算の結果からπ共役系が拡がった電子状態を示すことが明かとなった。本年度より新たに始めたターピリジン-ルテニウム(II)錯体型アミノについてはホモペプチドでは反応性の低さから2量体までとなったが、L-ロイシンと逐次交互共重合することでターピリジン錯体型アミノ酸5つ、L-ロイシン4つから成るナノペプチドの合成に成功した。この錯体はルテニウム間での電子的相互作用は無いが、CDスペクトルを測定するとキラルなロイシンからの誘起CDがルテニウム錯体の配位子とMLCTの領域に観測された。しかも興味深いことにルテニウム当たりのCD強度はペプチド鎖長が長くなるに従い大きく増加した。^1H NMRスペクトルと分子動力学を用いた溶液構造解析の結果、このペプチドは右巻きのヘリックス構造をとっていることが明らかとなった。また、コパルトセニウム型のアミノ酸は両端をアセチル基、メチルアミノ基で修飾することで対アニオンであるPF_6^-と非常に強い分子間NH...F水素結合を形成することが明らかとなった。この他、テトラフェニルポルフィリン型のアミノ酸、オリゴペプチドの合成にも成功した。これらの成果は今後の金属を主鎖に持つ非天然型ペプチドの化学の基礎として有用なものであり、今後これらを融合した新たな物質群の創製を図る。2,2'-ビピリジンの4,4'-位または5,5'-位にアミノ基とカルボキシル基を非対称に導入した非天然型アミノ酸を合成し、保護基の導入・脱離及び縮合反応の手法を確立した。逐次縮合反応により、トリペプチドの合成に成功した。両端をアミドで修飾したモノマーも比較のために合成した。シス-ジクロロビス(ビピリジン)ルテニウム(II)との反応により、配位子のモノマー、ジペプチドに対しトリスビピリジンルテニウム(II)錯体の誘導体を得た。錯体のアセトニトリル溶液の吸収スペクトルを測定すると、5,5'-誘導体ではモノマーからジペプチドにすることで配位子のπ-π^*に基づく吸収が350nm付近に長波長シフトして観測された。また、MLCTバンドはジペプチドの方がより長波長に観測された。^3MLCTに帰属される発光スペクトルバンドも長波長に観測され、ビピリジンとアミド基のπ系が共役し、π^*軌道のレベルを低下させていることが明らかとなった。モノマーのサイクリックボルタモグラムを測定すると、酸化側にルテニウム中心の酸化還元に伴う1つの可逆な酸化還元波が観測された。ジペプチドの場合も同様な1つの酸化還元波を示す。還元側には通常、配位子の還元に伴う3つの酸化還元波を示す。ジペプチドの場合は1つめの還元波が2つに分かれ、電流値は約半分で観測された。即ち、アミドで架橋した配位子が最も還元されやすく、架橋部分で共役している為に、1電子目と2電子目で酸化還元電位に差が生じ、2つに分かれたものと解釈できる。これは先の結果とも一致する。現在、錯体のアミノ酸を単離し、錯体での縮合反応を行い、より重合度の高い非天然型ペプチドの語合成を試みている。
典型金属化合物の関与する化学反応設計に対する理論的研究

典型原子を含む化合物の化学反応は有機化合物から金属化合物の化学反応の連続的な変化に対する一般性を見いだすうえで重要であり、近年実験および理論の両面から注目を集めている。また、化学反応の正確な解析を行い、理論的に、化学反応に対する定量的予測を可能にするための方法を探る必要がある。本研究では1、2-水素脱離に対するsymmetry rulesからの擦れについて、またZiegler-Natta反応に対する補助触媒の役割について非経験的分子軌道法を用いて研究した。A.1、2-水素脱離に対する軌道対称性則からの擦れ化学反応を理解するうえでorbital symmetry rulesは反応許容、禁制を決める有効な方法である。しかしながらこのrulesから反応の活性化エネルギーを予測することは出来ない。また、symmetryからずれた反応系についての予測も困難である。本研究においては化学反応の活性化エネルギーに対する対称性の影響について、1、2-水素脱離反応に対し調べた。ここで取り扱った反応はC_<2v>、C_s、C_1対称性での遷移状態、反応の活性化エネルギーを求めた。その結果C_<2v>対称性からC_s対称性にずれてもエネルギー障壁は大きく変化しないことがわかる。今その結果この反応はバイラジカル性とイオン性のキャラクターで表わせることが明らかになった。オレフィンの重合反応として良く知られているZiegler-Natta型の触媒反応は基本的にはCosseeモデルによって説明されている。また我々は電子論的な観点からこの反応のメカニズムを調べ、反応がpull-push機構で起こることを示した。
精神分裂病患者の視覚探索課題におけるpriming現象について

対象は統合失調症患者20名,健常者20名で,研究の意義を説明し書面で同意を得たのち検査を行った。呈示図版は,多数の妨害刺激(T字型)の中に一つの標的刺激(L字型)をランダムに配置したスライドを24枚,妨害刺激のみで標的を含まないスライドを24枚用意した。標的を見つけたらすぐにボタンを押すよう被検者に指示し,ランダムな順序で呈示を行った。図版は,コンピュータと液晶プロジェクタを用いて,被検者の1.5m前方のスクリーン上に呈示した。図版の呈示には,独自に開発したソフトウエアを用いた。検査中の被検者の眼球運動を,アイカメラ(nac製,EMR-7型)を用いてビデオテープに録画し,解析を行った。解析はとしては,誤答数(お手つきと見逃しの数),標的のない図版呈示直後の眼球運動の象限と一つ前の図版の標的の象限が一致する割合(一致率)などを算出した。その結果,誤答数についてはお手つき数(健常対照群0.07±0.26,統合失調群0.13±0.35),見逃し数(健常対照群0.80±O.77,統合失調症群1.53±1.25)ともに両群間に有意差はなかった。次に,一致率を両群間で比較したところ,統合失調群は70%,健常群は47%で,統合失調症群で有意に高かった。なお,一致率と服薬量(CP換算),臨床症状との間に相関は認めなかった。このことから,統合失調症患者は課題遂行の際,ひとつ前の図版の影響を過大に受けていることがわかり,統合失調症におけるhyper-primingを示していると推察された。プライミングとは,先行刺激(プライム刺激)が後続刺激(プライミング課題)の処理におよぼす影響のことを指す。本研究は,視覚探索課題遂行時の統合失調症患者のpriming現象を調べることを目的とするが,そのためにまず健常者におけるプライミングの程度を確認した。対象は健常者20名とした。解析は,誤答(お手つきと見逃し)率,図版呈示から最初の眼球運動が生じるまでの時間(saccade潜時),図版呈示から視点が標的成分に移動するまでの時間(視点到達時間),図版呈示からボタンが押されるまでの時間(ボタン押し時間),標的のない図版呈示直後の眼球運動の象限と,一つ前の図版の標的の象限との一致率(一致率)などを算出した。実験の結果,図版呈示直後の視点の移動象限がひとつ前の図版の標的の象限と一致する割合は約47%であった。課題遂行時に先行刺激の影響を受けている様子が窺え,このことから健常者でもある程度のプライミングが生じていることがわかった。
唾液中の多型性プロリンリッチプロテインと遺伝子座位との相関関係の検索

1.日本人に認められた4種のslowーmigrating Gl(Gl4J、5、6、7)を精製し、そのアミノ酸組成を調査し、Gl蛋白と同種のものであることを明らかにした。2.Azenらとの共同会究でGlの変異(G18)を見いだしたが、これはかつてPRH3に1塩基の挿入がおこり、stop codonが生じたnulla lleleを見いだした。偏.中国人、マレ-人、インド人、フィリピン人について、slowーmigrating Gl調査したところ、いずれもモンゴロイドに偏って出現するが、各形質はアジアでも偏りがあった。白人のGl4はアジア人種のものとは異なり、フィリピン人にGlの新しい変異G110を見いだした。GlはPRB3の産物であるが、現在のところ、PRB3は12の形質があることになる。4.家系資料を用いてPmF、PmS、PS、Gl、Pmo1、Pmo2、P3のそれぞれの遺伝子を調査し、塩基性PRPが4つの座位を持つことを前提にこれらを分類したところ、PmF・PmS・Pmo1、Gl、Ps・Pmo2、P3の4グル-プに分類できた。5.酸性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法の改良と、抗Gl抗体を用いた、免疫学的検出法の併用により、新しい4種の多型性PRPを見いだした。これらは既知の多型当PRPとは異なり、PRB4の産物である可能性がある。今後は申請者らが見いだした多型を含めて、家系資料の分類とDNAの解析を併用し、塩基性PRPとPRB座位との関連を解明していきたい。またPRPは多型性に富み、法医学上の個人識別、人類学的応用に役立てていきたいと考えている。唾液の多型に関する当初の研究においてPh蛋白として検討していた蛋白は、日本人のみに見いだされるGl蛋白の変異型であると考えられた。そこでこれら4種のGl蛋白を精製し生化学的性質の比較を行なった。その結果いずれもGl蛋白と類似したアミノ酸組成を示していた。これらは中国人、マレ-人にも高頻度に認められていることを見いだし、モンゴロイドに偏って出現するものということがわかった。本研究過程においてウィスコンシン大学のAzenらと共同研究をおこない、新たにユダヤ人に認められたGlの変異蛋白と、われわれのGl蛋白との相違を明らかにする過程で、日本人のGl4は白人のGl4とは異なるものと思われる結果を得た。これらはいずれもPRB3座位の産物と考えられ、PRB3は少なくとも現在までに9つの形質があることがわかった。酸性ゲルによるPmF、PmS、Pmo1、Pmo2、Ps蛋白などの塩基性プロリンリッチプロテイン(PRP)の比較において、多型性PRPの分離法を改良し、少なくとも3種の新しい変異蛋白が存在することを見いだした。これらは今までの泳動法では分離できなかったものであるが、免疫学的にいずれも塩基性PRPであり、PRB座位との関連を明らかにして行くために、集団調査、家系調査を検討中である。これらは他の塩基性PRPとのprecursor relationshipの有無を検討する予定である。顎舌下腺唾液の塩基性PRPの発現比較についても続行中であるが、多人数にわたる調査において現在までのところほとんど発現されていないと思われる結果を得ている。1、日本人に認められた4種のPh蛋白(仮称slowーmigrating Gl)のうち3種のもの(Gl4J、Gl5、G17)についてはすでにその生化学的性質がGl蛋白と非常に類似している結果を得ていたが、残る1種の蛋白(Gl6)について再度精製し、その生化学的性質がGl蛋白に類似していることを明らかにした。

Gl蛋白について中国人、マレ-人、フィリピン人、インド人について調査したところ、中国人、マレ-人、フィリピン人は日本人と同様にGl5、6の頻度が高く、インド人、中国人にはGl4と思われる変異が認められ、フィリピン人、中国人にはGl9、Gl10の新しい変異が認められた。つまりGlをコ-ドするPRB3座位は現在までに少なくとも12の形質があることがわかった。2、家系資料を用いてPmF、PmS、Pmo1、Pmo2、Ps、P3、G1のそれぞれの遺伝関係を調査し、塩基性PRPが4つの座位を持つことを前提にこれらを分類したところ、PmF・PmS・Pmo1、Gl、Ps・Pmo2、P3の4つのグル-プに分類することができた。つまりPmF・PmS・Pmo1はPRB1に、GlはPRB3に、Ps・Pmo2はPRB2に、P3はPRB4に関連するものと考えられた。3、酸性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法の改良とGlに対する抗体による免疫学的検出法により見いだされた多型性PRPは4種類存在することがわかり、そのうち1種類はPs蛋白と相関を持って出現することがわかった。他の3種については、既知のPRPとの相関を認めてはいないが、Kauffmannらの塩基性PRPに含まれていないことから、PRB4に関連することが推測される。4、塩基性PRP間のprecursor relationshipについては新しい多型が発見されたため今後の研究として残された。今後はさらにこれらの多型とPRB座位のRFLPとの相関を検索し、蛋白とDNA座位との関連を明らかにしていきたい。
Tal-l遺伝子の小児T細胞性白血病における特異的異常とその機能

TAL1遺伝子の部位特異的欠失について、小児および成人のT細胞性腫瘍99例の臨床検体を用いて、サザンブロッティングとPCR法により検討した。この欠失は小児T細胞型急性リンパ性白血病(T-ALL)44例中10例で認められたが、小児T細胞型非Hodgkinリンパ腫20例および成人T細胞性腫瘍35例では認められず、小児T-ALLに特異的な遺伝子変化と考えられた。これらの10例は、表面マーカーではCD1-,CD2+,CD4-,CD7+,CD10-の共通点を持ち、この欠失をもたないT-ALLに比べ、有意に良好な予後を示した。また、この欠失を利用して2症例においてPCR法による微少残存腫瘍(MRD)の検出を行った。1例では寛解期にも持続的にMRDが検出されたが、他の1例では白血病クローンは初診時にのみ検出された。この欠失を有する症例が小児のT-ALLの中で、一つのsubgroupと思われる。表面マーカーを解析したところ、Tal^dを有する9例のうち7例がCD3^+、CD4またはCD8^+で、stagel thymic differentiationであった。これはT-NHLではまれにしか報告されておらず、T-ALLとT-NHLが異なる成熟段階の細胞に由来している可能性が示唆された。さらにこの時期はT cell receptorの遺伝子再構成が生ずる時期である。欠失部位付近の遺伝子配列解析を行ったところ、再構成をおこなうrecombinaseの認識部位で欠失が起こっており、上記事実を裏付けるものとなった。karyotypeは7例中4例で正常であった。T-ALLでは約25%に正常核型がみられその多数がstage l thymic differentiationであるが、一方でT-NHLでは正常核型はまれであること、T-NHLでみられる染色異常でT-ALLではみられないものがあることなどから、両者のtumorigenesisが異なることが示唆された。今年度は症例の増加によるtal-1の特異性、発現頻度の検討、予後因子としてのtal-1、mRNAについての検討を行った。PCRによるtal-1欠失の方法については前年度に報告したが、それを用いて多数例で頻度の解析を行った。小児のT-ALL39例、T-NHL18例、AMLL4例、B-precursorALL47例、さらに成人のT-ALL25例、adultT-cell leukemia10例(すべて患者検体)について解析した。tal-1欠失は小児のT-ALL39例中9例(23.1%)に検出できた。これは今までの報告とほぼ同じ頻度であり、人種差は認められなかった。他の種類の疾患細胞では検出されなかった。次に予後因子としてのtal-1欠失であるが、欠失のないT-ALLに比べ欠失のあるT-ALLの方Kaplan-Meyerでは有意に予後が良いことがわかった。ただし、最近、治療がより強力になれば2グループに差がでないとの報告もあり今後の検討が必要である。最後に、mRNAについて検討する予定であったが、現在のところ明確な結果が出ず今後の課題として残ることになった。