hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
過疎地域の生活構造分析による人口減少に対応する地方社会モデルの再構築

・家族安定基盤・生活ネットワーク・生活安定基盤の現状を、調査票を用いた社会調査と聞き取り調査をもとに分析してきた。調査対象地域は鹿児島県大島郡伊仙町である。伊仙町は、離島であり、就業環境などは特段恵まれている地域ではないが、合計特殊出生率2.8前後を維持し、人口再生産力が高く、青壮年層のUターンなどの人口還流が持続している。つまり、空間アスペクト、経済アスペクトの観点からすれば不利な状況にあるにもかかわらず、社会関係アスペクト、あるいは人々の生活時間の構成である時間アスペクトが、そうした不利な条件を補完している可能性がある。実際には伊仙町全体としてみれば人口減少傾向にはあるのだが、社会関係アスペクトを軸に社会調査の準備を進め、2017年度に社会調査を実施した。調査の概要として、調査対象者は伊仙町在住の住民とし、住民基本台帳名簿からの無作為抽出を行った(2000名で総人口の3割程度)。また、郵送法で実施した。調査期間中にハガキ送付による回収依頼等を行ったが、低回収率に留まったため、原因を検討し、2018年度に追加調査実施の可能性を検討中である。現在、データ入力が完了し分析を進めている。以上から得られた知見は研究班で共有し、2018年度には一部の成果を論文、学会報告などによって公表する予定である。2017年度は研究代表者(高野)と研究分担者による研究会を5回開催した。研究会では、2016年度から検討を進めてきた一ヶ所目の調査対象地域を鹿児島県大島郡伊仙町とすることを決定し、伊仙町で実施する社会調査の調査票の検討などを中心に行った。また、徳之島でフィリピン女性の結婚移民について調査研究を行っている科研研究班との共同研究会も11月に実施した(16K04073、研究代表者:野入直美)。双方の社会調査結果を共有することで、総合的な生活構造分析の実現可能性が確認されたように思う。社会調査の調査票には、生活環境評価、生活圏、地域意識、家族に関する意識、別居家族との交流頻度、地域社会との交流状況、子育てに関する行動と意識、居住歴、Uターン等の状況、老後の生活不安、地域範囲の意識、生きがい、死に対する意識など多岐にわたる総合的な設問を登載した。また、これらを分析するために、属性要因に関する設問に関しては、別居家族との関係把握、地域集団への参加状況など、家族や地域社会の持つ影響力を評価できるよう丁寧に検討を行った。実査は、2018年12月に実施した。調査対象者は伊仙町在住の住民(18歳以上)であり、伊仙町役場の協力も得て住民基本台帳名簿からの無作為抽出を行った2000名とした。また、郵送法で実施し、調査期間中にハガキ送付による回収依頼等を行ったが、低回収率(21.7%)に留まった。このため、原因を検討したうえで、2018年度に追加調査が実施できないか検討中である。また、研究分担者は、伊仙町の母子保健担当者や乳幼児検診に参加した親に対して聞き取り調査を行い、子育て世代の状況把握を行った。以上のことから、おおむね順調に進展していると判断した。本研究の目的は、人口減少社会に対応する総合的な社会モデルの再構築を行うことにある。そのため、九州および中国地方の離島地域を対象とした生活構造分析を実施し、住民の生活実態を動態的に把握し、自律的な地域社会の形成の可能性を探った。最終年度は、以下の研究活動を実施した。
家禽盲腸の生体防御機構に関する形態学的解析

本研究では、ニワトリ盲腸における生体防御機構の総合的解析の一環として、盲腸全域におけるリンパ組織の分布、脈管支配および腸管内腔からの抗原情報の摂取経路を明らかにするための実験をおこない、以下の成果を得た。1.盲腸粘膜におけるリンパ組織の分布を組織学的に精査した結果、従来リンパ組織の好発部位として知られる盲腸底および盲腸尖に加えて盲腸底から盲腸体への移行部にも高頻度に出現することが明らかになった。また左右の盲腸のリンパ組織の分布は量的にも全く一致せず、左右の盲腸の粘膜防御機構は独立した活動をおこなっていることが示唆された。2.腹腔臓器の血管鋳型標本を作製して盲腸の血管支配を調べた結果、リンパ組織が高頻度に存在する上記の3部位へは前腸間膜動脈、腹腔動脈ないし一部後腸間膜動脈からの枝が分布し、漿膜への侵入部位と粘膜リンパ組織の局在との間に関連性が考察された。3.盲腸の粘膜上皮によるカ-ポンの取り込みを経時的に観察した結果、特定のリンパ小節を覆うM細胞にカ-ボン摂取をみとめた。その取り込みは盲腸体以降のリンパ小節で多く見られた。このことは盲腸内の微生物環境のチェックを常時おこなうリンパ組織と盲腸内に侵入してくる新たな異物に対する警戒を主におこなうリンパ組織とに機能的に分れる可能性を示唆しており、現在その詳細について検討中である。またカ-ボン投与後、上皮を通過した遊離のカ-ボンが循環血中に入り、脾臓および肝臓等で捕捉されたことは、哺乳動物の粘膜防御機構では起こり得ない現象であり、現在その抗原(異物)移動経路の詳細について検討中である。これらの成果については近日中にまとめて公表する予定である。
ナノ粒子化免疫調節剤の呼吸器疾患への治療応用の研究

本研究では、粒子化した合成核酸の経気道投与による呼吸器疾患制御の検証を行った。同所性移植による原発性肺癌モデルの検証では、Th1刺激性合成核酸の経気道投与により得られた治療後長期生存モデルにおける残存腫瘍結節の免疫組織学的解析で、CD3(-)Foxp3陽性細胞を多数認め、未治療群にみられるCD3(+) Foxp3陽性細胞との機能上の差異が示唆されたほか、未治療群にみられるPD-1陽性細胞の著明減少が確認され、長期間の抗腫瘍免疫効果が示唆された。実際に治療生存群では、腫瘍細胞の同所再移植後も無治療で100%の長期生存を達成した。これらの検証により、肺癌に対する局所免疫治療の意義を明らかとした。炎症性肺疾患モデルの解析においては、肺気腫モデルの検討を精力的にすすめた。特に、創傷治癒にも関係があるToll-like receptor 9欠損マウスの肺気腫モデルは、野生型における肺気腫モデルと比較して、呼吸機能の低下が高度であることを見出した。この結果は、気道細菌叢に対する自然免疫応答と肺組織破壊の関連を示唆する興味深いもので、2016年5月開催の米国胸部疾患学会総会(Am J Respir Crit Care Med 2016:A6324)で発表予定である。また、pH依存性ナノ粒子の臨床応用をすすめるに際して、病巣における気道酸性化の臨床研究を報告した(PeerJ 2015;3:e1448)。平成27年度研究実績の概要でも述べたように、原発性肺がん長期生存モデルの作成および解析は予定通り進行している。現在解析が終了している治療後1年生存モデル(n = 8)では、平均8.2個/最大肺冠状断面の残存腫瘍結節を確認している。本研究で使用する原発性肺癌モデルは腫瘍関連傍気管支リンパ組織(Tumor-induced bronchus associated lymphoid tissue;T-BALT)の発達がみられ、ヒト原発性肺癌のモデルとして最適であるが、治療早期モデル(治療後20日)の残存腫瘍結節の解析と比較して、興味深い差異が確認された。すなわち、治療後1年生存モデルではCD3(-)Foxp3陽性細胞を多く認め、治療後早期にみられるCD3(+) Foxp3陽性細胞との機能上の差異が示唆される。現在、これらのFoxp3陽性細胞がB細胞由来との仮定に基づき、平成28年度の継続研究内容として、その検証と機能解析を行っている。炎症性肺疾患モデルの解析においては、平成27年度の研究実績の概要でも述べたように、興味深い結果が得られたToll-like receptor 9欠損肺気腫モデルに焦点を絞り、治療介入に用いるODNの選定を終え、呼吸機能の低下をきたす要因について分子生物学的・病理学的解析を開始し、平成28年度の継続研究内容として実施中である。上記経過にて、現在までの進捗状況は当初予定通りおおむね順調に進展していると考えている。平成28年度は、1原発性肺癌モデルの治療後長期生存例の腫瘍微小環境評価、ならびに2炎症性肺疾患モデルとして、Toll-like receptor 9(TLR9)欠損マウス肺気腫モデルにおける肺気腫進行に関わる生理学的・分子生物学的解析を行った。これまでの成果として、抗腫瘍効果を担うナノ粒子化Th1 potentiator核酸の局所投与による腫瘍微小環境の改変による治療後長期生存効果ついて、米国テキサス大学MDアンダーソンがんセンターにおいて口演発表を行った(Young Investigator Workshop 2017)。これらの成果に基づき、臨床応用に向けて有益な共同研究体を構築するに至り、産官学共同研究として「経気道治療用ナノマイクロ粒子包埋医薬品の創出」を目指したより汎用性の高い研究内容として開始した(平成29年度日本医療研究開発機構・創薬基盤推進研究事業・研究開発代表・横浜市大・佐藤隆)。さらに、経気道治療キャリアーに最適化した圧電素子デバイスの研究開発も開始し、臨床応用に向けて多角的な取り組みを開始するに至った。平成28年度の成果として炎症性肺疾患モデル、特に肺気腫モデルでの成果が大きい。我々は、TLR 9が創傷治癒過程にも関与することを示したが(Sato T. Wound Repair Regen 2010;18:586)、TLR9欠損マウスを用いた肺気腫モデルでは、呼吸機能の低下が大きいことを示した。また、野生型マウスを用いた肺気腫モデルでは、早期からTLR9の発現が低下することが示され、経年呼吸機能の低下が大きい肺気腫群では、TLR9の発現低下が関与する可能性が示唆され、2017年5月開催の米国胸部疾患学会総会で報告予定である。平成28年度は、本研究で目指すナノ粒子化製剤の臨床応用を目指し多面的な取り組みを開始した。平成28年度は、当初予定通り原発性肺がん長期生存モデルの解析をすすめた。治療後1年生存モデルでは、平均8.2個/最大肺冠状断面の残存腫瘍結節を確認しており、残存腫瘍結節の増大を制御するメカニズムの解析をすすめた。すなわち、治療後1年生存モデルではCD3(-)Foxp3陽性細胞を多く認め、治療後早期にみられるCD

3(+) Foxp3陽性細胞との機能上の差異が示唆される。これらのFoxp3陽性細胞の多くはB細胞由来であることが示唆され、CD3(+)Foxp3(+)の制御性T細胞の腫瘍内分布を制御することで、抗腫瘍効果を維持し残存腫瘍の進展増大を抑制している可能性が示唆され、現在追試による確認を行っており最終年度に検証を終える予定である。本年度はまた、炎症性肺疾患モデルの解析を予定通りすすめた。特に初年度に興味深い結果が得られたTLR9欠損肺気腫モデルを用いて、本年度はTLR9非依存性に肺気腫増悪抑制効果を示す免疫抑制性核酸を選定し治療薬としての評価を施行し、2017年5月開催の米国胸部疾患学会総会で発表となった。この免疫抑制性核酸を用いた治療効果の機序として、酸化ストレスに関わるNADPHオキシダーゼの活性化を抑制する機序が考慮され、引き続き最終年度に検証を行う。本研究は、ナノ粒子化免疫調節剤の経気道投与による、1原発性肺癌モデルの治療後長期生存解析(平成2729年度)。並びに、2呼吸器炎症性疾患モデルにの治療効果解析(平成2829年度)を行った。今回使用したketal-linkageナノマイクロ粒子キャリアーは、中分子の合成核酸(ODN)を包埋することで、通常は経気道投与で速やかに肺外に排除されるODNの肺内定着が向上し、間欠的投与を可能とした(米国特許取得No.9,919,058)。このナノ粒子化免疫調節剤を使用した検討結果を概説する。1原発性肺癌モデルの治療後長期生存モデルでは平均8.2個/最大肺冠状断面の残存腫瘍結節を確認した。この残存腫瘍結節の免疫組織学的解析で、CD3(-)Foxp3陽性細胞を多数認め、未治療群にみられるCD3(+) Foxp3陽性細胞との機能上の差異が示唆されたほか、未治療群にみられるPD-1陽性細胞の著明減少が確認され、長期間の抗腫瘍免疫効果が示唆された。実際にナノマイクロ粒子キャリアー包埋Th1刺激性ODNによる治療生存群では、腫瘍細胞の同所再移植後も無治療で100%の長期生存を達成した。これらの検証により、肺癌に対する局所免疫治療の意義を明らかとした。2呼吸器炎症性疾患モデルの検証では、Th1/Th2抑制性ODNの経気道投与による治療効果解析過程で、創傷治癒に関与するTLR9の欠損マウスが肺気腫進展と関与する可能性が示唆されたが、実際のヒト肺気腫組織の検証では健常肺組織との比較で有意なTLR9の発現差は確認できなかった。またTLR7の高刺激下でTLR9の発現低下が見出され、ウイルス感染後の2次細菌感染の重症化につながる自然免疫応答が示唆され、Th1抑制性ODNの投与によりTLR9の発現低下が抑制されることが肺気腫モデルの増悪抑制に関係する可能性が考慮された。本研究では、粒子化した合成核酸の経気道投与による呼吸器疾患制御の検証を行った。同所性移植による原発性肺癌モデルの検証では、Th1刺激性合成核酸の経気道投与により得られた治療後長期生存モデルにおける残存腫瘍結節の免疫組織学的解析で、CD3(-)Foxp3陽性細胞を多数認め、未治療群にみられるCD3(+) Foxp
微生物酵素を用いるDーパントテン酸の合成に関する研究

酵素反応の有する高い立体選択性を利用して,Dーパントテン酸あるいはその合成中間原料であるDーパントイルラクトンなどの光学活性アルコ-ル類の新しい生産方式を確立するために,(1)化学的合成法で得られるケトパントテン酸,ケトパントイルラクトン類のDーパントテン酸またはDーパントイルラクトン類への不斉還元,(2)脱水素酵素または酸化酵素によるLー体基質の立体選択的酸化反応を含むラセミ型パントテン酸またはパントイルラクトン類のDーパントテン酸またはDーパントイルラクトン類への変換について検討した。(1)については,グルコ-スを還元のエネルギ-源としてCandide属やSporobolomyces属酵素母のあるものが,ケトパントイルラクトンあるいはケトパントテン酸エステル類を,Agrobacterium属細菌がケトパント酸をそれぞれ特異的に対応するDー体アルコ-ルへと変換することを認め,培養条件および反応条件の検討を行った結果,光学的に純粋な生成物を80120g/lの収量(変換率90%以上)で得ることができた。また,これらの還元反応に関与する酵素の糖製単離を行い,それぞれが基質特異性を異にするNAPH依存性のカルボニルレダクタ-ゼであることを明らかにした。(2)については,NocardiaやRhodococcus属の細菌にLーパントイルラクトンの酸化活性が高いこと,またRerythropolisではLーパントイルラクトンの酸化によって生成したケトパントイルラクトンがさらにDーパントイルラクトンにまで還元する能力を併せて有することを認めた。最適条件下では20gIlのラセミ体パントイルラクトンをほぼ定量的にDーパントイルラクトンへと変換できた。上記の酸化反応に関与する酵素を均一に精製し,FMN依存性の新規な脱水素酵素であることを明らかにした。酵素反応の有する高い立体選択性を利用して、D-パントテン酸あるいはその合成中間原料であるD-パントイルラクトンなどの光学活性アルコ-ル類の新しい生産方式を確立するために、(1)化学的合成法で得られるケトパントテン酸、ケトパントイルラクトン類のD-パントテン酸またはD-パントイルラクトン類への不斉還元、(2)脱水素酵素または酸化酵素によるL-体基質の立体選択的酸化反応を含むラセミ型パントテン酸またはパントイルラクトン類のD-パントテン酸またはD-パントイルラクトン類への変換について検討した。(1)については、グルコ-スを還元のエネルギ-源としてCandida属やSporobolomyces属酵母のあるものが、ケトパントイルラクトンあるいはケトパントテン酸エステル類を、Agrobacterium属細菌がケトパント酸をそれぞれ特異的に対応するD-体アルコ-ルへと変換することを認め、培養条件および反応条件の検討を行った結果、光学的に純粋な生成物を80120g/lの収量(変換率90%以上)で得ることができた。また、これらの還元反応に関与する酵素の精製単離を行い、それぞれが基質特異性を異にするNADPH依存性のカルボニルレダクタ-ゼであることを明らかにした。(2)については、NocardiaやRhodococcus属の細菌にL-パントイルラクトンの酸化活性が高いこと、またR.erythropolisではL-パントイルラクトンの酸化によって生成したケトパントイルラクトンがさらにD-パントイルラクトンにまで還元する能力を併せて有することを認めた。最適条件下では20g/lのラセミ体パントイルラクトンをほぼ定量的にD-パントイルラクトンへと変換できた。

酵素反応の有する高い立体選択性を利用して,Dーパントテン酸あるいはその合成中間原料であるDーパントイルラクトンなどの光学活性アルコ-ル類の新しい生産方式を確立するために,(1)化学的合成法で得られるケトパントテン酸,ケトパントイルラクトン類のDーパントテン酸またはDーパントイルラクトン類への不斉還元,(2)脱水素酵素または酸化酵素によるLー体基質の立体選拓的酸化反応を含むラセミ型パントテン酸またはパントイルラクトン類のDーパントテン酸またはDーパントイルラクトン類への変換について検討した。(1)については,グルコ-スを還元のエネルギ-源として<Candida>___=属や<Sporobolomyces>___=属酵母のあるものが,ケトパントイルラクトンあるいはケトパントテン酸エステル類を,<Agrobacterium>___=属細菌がケトパント酸をそれぞれ特異的に対応するDー体アルコ-ルへと変換することを認め,培養条件および反応条件の検討を行った結果,光学的に純粋な生成物を80120g/lの収量(変換率90%以上)で得ることができた。また,これらの還元反応に関与する酵素の精製単離を行い,それぞれが基質特異性を異にするNADPH依存性のカルボニルレダクタ-ゼであることを明らかにした。(2)については,<Nocardia>___=や<Rhodococcus>___=属の細菌にLーパントイルラクトンの酸化活性が高いこと,またR.erythropolisではLーパントイルラクトンの酸化によって生成したケトパントイルラクトンがさらにDーパントイルラクトンにまで還元する能力を併せて有することを認めた。最適条件下では20g/lのラセミ体パントイルラクトンをほぼ定量的にDーパントイルラクトンへと変換できた。上記の酸化反応に関与する酵素を均一に精製し,FMN依存性の新規な脱水素酵素であることを明らかにした。
嚥下機能と義歯口蓋形態との関連に関する研究

本研究は,口蓋形態と嚥下機能,さらに,ドンダース空隙を含めた3者の関連について,正常者歯顎者と全部床義歯装着者での違いを明確にし,嚥下機能を含めた口腔3大機能に適したよりよい口蓋形態を義歯に付与できるように臨床に生かすことを目的としたものである.嚥下機能は口蓋部での舌接触圧と口腔周囲筋の筋活動を同時に測定することによって評価した.口蓋形態は上顎人工口蓋床あるいは上顎義歯の矢状,前頭断面から口蓋部の研磨面の形態および義歯床の厚みを計測し分類した.ドンダース空隙は,下顎安静位におけるMRI画像を用いて測定した.正常有歯顎者と上下顎全部床義歯装着者を被験者に嚥下運動を測定したところ,嚥下時の舌接触圧および口腔周囲筋の活動量は,被験者によって異なるものの比較的安定した値を示した.しかし,有歯顎者と義歯装着者との違いは認められなかった.舌接触圧の時間関係を分析したところ,舌接触開始から舌接触終了までの舌圧発現時間が,有歯顎者に比べて義歯装着者で明らかに長いものが認められた.これは,歯牙喪失にともなう舌の弛緩あるいは加齢に起因する口腔期の延長傾向があったものと考えられる.なお,口蓋形態およびドンダース空隙空隙の測定はともにCCDカメラで画像を取り込み,画像解析装置で分析をおこなっているところである.今後,以上のデータをそれぞれ統計処理し検討をさらに加えていく予定である.本研究は,口蓋形態と嚥下機能,さらに,ドンダース空隙を含めた3者の関連について,正常者歯顎者と全部床義歯装着者での違いを明確にし,嚥下機能を含めた口腔3大機能に適したよりよい口蓋形態を義歯に付与できるように臨床に生かすことを目的としたものである.嚥下機能は口蓋部での舌接触圧と口腔周囲筋の筋活動を同時に測定することによって評価した.口蓋形態は上顎人工口蓋床あるいは上顎義歯の矢状,前頭断面から口蓋部の研磨面の形態および義歯床の厚みを計測し分類した.ドンダース空隙は,下顎安静位におけるMRI画像を用いて測定した.正常有歯顎者と上下顎全部床義歯装着者を被験者に嚥下運動を測定したところ,嚥下時の舌接触圧および口腔周囲筋の活動量は,被験者によって異なるものの比較的安定した値を示した.しかし,有歯顎者と義歯装着者との違いは認められなかった.舌接触圧の時間関係を分析したところ,舌接触開始から舌接触終了までの舌圧発現時間が,有歯顎者に比べて義歯装着者で明らかに長いものが認められた.これは,歯牙喪失にともなう舌の弛緩あるいは加齢に起因する口腔期の延長傾向があったものと考えられる.なお,口蓋形態およびドンダース空隙空隙の測定はともにCCDカメラで画像を取り込み,画像解析装置で分析をおこなっているところである.今後,以上のデータをそれぞれ統計処理し検討をさらに加えていく予定である.
低所得層における食事選択の意思決定メカニズムに関する研究

わが国では所得格差が拡大しつつあり、所得格差と生活習慣の関連や低所得層において野菜の摂取量が少ないことが指摘されている。そのような状況において食料消費の実態を解明し、低所得層の食事改善の糸口を見つけることは喫緊の課題である。本研究では、脳活動計測や視線軌跡計測といった生体情報を取り入れて、低所得層の食事選択時の意思決定メカニズム(課題1:低所得層における食事選択時の意思決定プロセスの解明、課題2:低所得層における食事選択時の認知的不協和の発生状況に関する研究)を解明することを目的とする。
細胞内品質管理機構とケモカインＣＸＣＬ１Ｌ遺伝子の進化

カニクイザルには重複で形成されたケモカイン遺伝子CXCL1とCXCL1Lが存在するが、ヒトなどの他のほ乳類ではCXCL1しか持たず、CXCL1Lは偽遺伝子となっている.しかし、カニクイザルのCXCL1LはmRNAには転写されるが、タンパク質はほとんど合成されない.そこでこのタンパク質発現抑制紀行を解明するために、細胞内で合成されたタンパク質の品質管理機構が関与している可能性を調べた.その結果、CXCL1 mRNAと比べてCXCL1L mRNAには結合しているリボソーム数が少ないことが分かったが、品質管理機構は関与していないと考えられた.カニクイザル特異的ケモカイン遺伝子CXCL1Lは、mRNAは発現されるが、タンパク質はほとんど発現されない.そのタンパク質発現抑制にはCXCL1L遺伝子の第4エクソンが関与していることが明らかとなっている.その抑制機構を明らかにするために、昨年度に引き続き実験を行った.(A)昨年度、CXCL1L遺伝子とは関係のないルシフェラーゼ遺伝子の3'端に第4エクソンを結合させると、タンパク質発現が抑制されることを観察している.また以前にCXCL1L遺伝子を細胞にトランスフェクションして細胞抽出液を調製し、しょ糖密度勾配遠心によりポリソーム解析を行ったが、mRNAの長さが短かったためか明確な結果は得られなかった.そこで、ルシフェラーゼ遺伝子に第4エクソンを結合させたコンストラクトを細胞にトランスフェクションし、ポリソーム解析を行った.その結果、明らかにmRNA一分子当たりのリボソーム結合数の減少が観察された.(B)以前CXCL1Lを用いた欠失ミュータントを作成し、ウエスタンを用いて解析している.ルシフェラーゼ遺伝子を用いたポリソーム解析がうまくいったので、第4エクソン配列のどの領域が抑制しているのかをポリソーム解析を用いて調べ、ウエスタン解析結果と比較するために、様々な欠失ミュータントを作成した.(c)カニクイザルと同様、同じマカク属に属するアカゲザルもCXCL1L遺伝子を持っている.このサルの遺伝子の第4エクソン配列と同じ配列になるようにカニクイザルのCXCL1L遺伝子の第4エクソン配列を改変し、トランスフェクション後ウエスタンで解析した.その結果、カニクイザルの第4エクソンも翻訳抑制作用を持っていた.カニクイザル特異的ケモカイン遺伝子CXCL1Lは、ヒトなどには存在せず、カニクイザルやアカゲザルなどマカク属のサルにのみ存在する.この遺伝子では、mRNAは発現されるが、タンパク質はほとんど発現されない.そのタンパク質発現抑制にはCXCL1L遺伝子の第4エクソンが関与していることが、我々の以前の解析から明らかとなっている.その抑制機構を明らかにするために、昨年度に引き続き解析した.(A)昨年度、ルシフェラーゼ遺伝子3'端にカニクイザルCXCL1L遺伝子第4エクソンを結合させたコンストラクトを細胞にトランスフェクションし、ポリソーム解析を行った.その結果、明らかにmRNA一分子当たりのリボソーム結合数の減少が観察された.そこで、CXCL1L遺伝子第4エクソンの欠失ミュータント3種類を用いて同様に解析したが、明確な結果は得られなかった.これはウエスタンの結果とも一致し、欠失ミュータントでは第4エクソンのどの領域がタンパク質発現抑制に必須であるか同定できなかった.原因は今のところ不明である.(B) CXCL1L遺伝子第4エクソンによるタンパク質発現抑制がin vitroでも見られるのかどうかを調べるために、カニクイザルCXCL1遺伝子3'端にCXCL1L遺伝子第4エクソンを結合させたDNAを鋳型にmRNAを合成した.作製した成熟mRNAをもとにウサギライゼート抽出液を用いてタンパク質の合成を行い、ウエスタンブロッティングにより解析した.その結果、CXCL1単独に比べ、第4エクソンを結合させたCXCL1はタンパク合成量が減少していた.よってタンパク質発現抑制をin vitroで再現することができ、また翻訳段階で抑制されていることが判明した.カニクイザルには重複で形成されたケモカイン遺伝子CXCL1とCXCL1Lが存在するが、ヒトなどの他のほ乳類ではCXCL1しか持たず、CXCL1Lは偽遺伝子となっている.しかし、カニクイザルのCXCL1LはmRNAには転写されるが、タンパク質はほとんど合成されない.そこでこのタンパク質発現抑制紀行を解明するために、細胞内で合成されたタンパク質の品質管理機構が関与している可能性を調べた.その結果、CXCL1 mRNAと比べてCXCL1L mRNAには結合しているリボソーム数が少ないことが分かったが、品質管理機構は関与していないと考えられた.カニクイザル特異的なケモカイン遺伝子CXCL1LはmRNAは存在してもタンパク質発現は抑制される.その機構を明らかにすることを目的に,23年度は以下の実験を行った. (A) siRNAを用いた小胞体ストレス応答の確認.小胞体ストレスに関与する転写因子XBP1に対するsiRNAを用いて解析した結果,XBP1 mRNAは分解されたが,細胞質中のCXCL1Lタンパク質は増加せず,また培養上清中にタンパク質はほとんど検出されなかった.したがって,CXCL1Lタンパク質発現抑制への小胞体ストレスの関与は否定された. (B) Ex4による他遺伝子の発現抑制の確認.CXCL1L遺伝子によく似たアカゲザルケモカイン遺伝子CXCL1にCXCL

1L遺伝子の第4エクソン(Ex4)を結合させると,CXCL1のタンパク質発現が抑制されることを見出していたが,今回はケモカインとは関係のない遺伝子,即ちルシフェラーゼ遺伝子にEx4を結合し,その発現を調べた.その結果,ルシフェラーゼ・タンパク質発現の抑制をウエスタンを用いて確認した. (C)ポリソーム解析を用いた翻訳抑制の確認.CXCL1LとCXCL1を細胞にトランスフェクションし,細胞質抽出液を用いてしょ糖密度勾配遠心法により,ポリソーム解析を行った.その結果,mRNA一分子に結合するリボソーム数に顕著な変化は見られなかったが,翻訳領域が短かったためとも考えられるので,今後ルシフェラーゼ遺伝子を用いて再度解析する予定である. (D)無細胞翻訳系を用いた解析.ウサギ網状赤血球ライセートを用いて,in vitroでタンパク合成を行い,ウエスタンで解析したが,Ex4配列が存在してもタンパク質発現に変化は認められなかった.翻訳抑制に関わる第4エクソン配列中の領域の同定は欠失ミュータントの作成段階で、実際のトランスフェクションおよびその後のウエスタンあるいはポリソーム解析はまだ行っていない.その他の解析についてはほぼ順調に進行している.当初計画では5つの点において解析する予定であり,そのうちの4点においては結果を得たが,「Ex4による翻訳停止の検証」については発現ベクター構築に蛍光遺伝子DsRedを用いていたために,発現されたタンパク質の一部が核に移行するという異常な結果となってしまった.今後ベクターのデザインを再考し,実験をやり直す予定である.作成した様々な欠失ミュータントを用いて細胞にトランスフェクションし、ポリソーム解析やウエスタン解析によって翻訳抑制に関わる領域を同定する.その結果と、これまでの様々な解析結果とを総合して、考察を加える.23年度予定で結果を出せなかった「Ex4による翻訳停止の検証」および「ポリソーム解析を用いた翻訳抑制の確認」で遺伝子をルシフェラーゼに置き換えた実験を再度行い,さらに,申請書に記載した「翻訳および転写抑制に関わるEx4配列中の領域の同定」や「アカゲザルのEx4との比較」,「C-端が伸長した重複遺伝子の探索」を予定通り実施し,CXCL1L遺伝子のEx4配列によるタンパク質発現抑制機構について,さらに解析を進める.結果を学会や論文として発表するために、パソコンを一台購入する予定である.また、細胞培養用培地や、RNAおよびDNA調製試薬、ノーザンおよびウエスタン用のフィルターや抗体等試薬、ポリソーム解析用のしょ糖や超遠心機用チューブ等を購入する.設備備品としてウエスタン用のトランスブロットTurboシステム(Bio-Rad社)を購入予定である.これにより,ウエスタン実験の迅速化が図れる.また分子生物学会(福岡)で成果を発表予定であり,そのために,旅費を使用する.
ボルトの立体構造情報を基盤としたナノカプセルの開発

ボルトは78個のMVPが39回対称で配置することによって形成される樽型粒子で、粒子内部には大きな空間がある。本研究では、ボルト粒子の構造情報に基づいた新規ナノカプセルの開発を目指した。MVPのN末端にロイシンジッパーを付加することで安定化したLZ-ボルトの結晶は、SPring-8のBL44XUで2.8A分解能の反射を示した。また本粒子は、溶液条件を変化させることでVPARP_INTを取り込んだ。幅広い真核生物が持つ分子量約1000万の巨大粒子ボルトは、主成分であるMVP(Major Vault Protein)が78個集まることで樽型中空の特徴的な基本骨格を形成する。半分のボルトは、39個のMVPが集合することでお椀のような形を形成しており、2つの半分のボルトが、お椀の縁と縁を合わせるようにして(向かい合ったMVPのN末端で)会合することで樽型の粒子を形成する。本粒子は、強酸性条件下では卵を割るように半分に割れることが知られており、この特性を活かしてpH依存で粒子の開閉を制御することができるようなナノカプセルを開発することができれば、DDS(Drug Delivery System)などの新規材料としても期待できる。本研究では、X線結晶構造解析による詳細な立体構造情報に基づいて新規ナノカプセルを開発することを目指した。すでにMVPのN末端にロイシンジッパーを付加することで、ボルトのウェスト部位の会合を強固にしたLZ-ボルトの発現系構築に成功しており、これを基盤としてpH依存で可逆的に開閉可能なカプセルの開発を進めている。先行研究により、MVP・N末端にロイシンジッパーを導入したボルト粒子(LZボルト)の昆虫細胞による大量発現系構築に成功し、非常に安定なLZボルトが高収量(野生型ボルトの15倍)で得られるようになった(特願2012-253031)。本研究では、このLZボルトを基盤としたナノカプセルの開発に取り組むと同時にLZボルトの高分解能での構造決定を目指した研究にも取り組んだ。LZボルトの結晶はSPring-8のBL44XUでの回折実験で2.8A分解能の反射を示し、複数の結晶を用いてデータ収集を行った。現時点では4A程度のデータしか集まっていないが、今後、より多くの結晶を用いることで2.8A分解能のフルセットデータ収集を目指す。ナノカプセルの開発においては、溶液中のpHを弱酸性にしてから中性に戻すことでVPARP_INTの取り込みが確認できた。今後、より大きな物を内包できるよう、さらに粒子の改変を進める。本研究は平成26年度にボルトの発現、精製および結晶化の経験のある研究補助員を雇用して効率よく進める予定であったが、雇用予定者の都合により雇用することができなくなった。新たに別の研究補助員を探したが、専門的な技術を要する業務内容のため、適当な人材を確保することができなかった。そのため、予定していた本研究での昆虫細胞発現系構築の進捗に遅れが生じた。蛋白質結晶学、構造生物学平成27年度は研究補助員の雇用が確定しており、LZ-ボルトを基盤としたナノカプセルの発現系構築に取り組む。また、高分解能で決定したLZ-ボルトの構造情報からボルトの自己組織化メカニズムの解明を行い、ナノカプセル開発に役立てる。平成27年度は研究補助員の雇用が確定しており、LZ-ボルトを基盤としたナノカプセルの発現系構築に取り組む。
嫌気性微生物を用いた創エネルギー・低炭素型下水処理システムの開発

本研究は嫌気性膜分離法と担体添加型一槽式アナモックス(ANAMMOX)法を融合して工夫することで、水質確保とエネルギー回収の両立を実現できる省エネルギー・低炭素型で下水処理システムの確立を目指す。嫌気性古細菌群を分離膜によって高濃度に保持することで、下水からの直接的なエネルギー回収、余剰汚泥の削減などの利点を持ちながら、良好な水質も確保できる。前段の嫌気性膜分離法によりバイオガスを下水から直接得ることが可能であり、従来の汚泥消化法で得られる電力の約1.5倍のバイオガスを取り出すことが可能である。また後段の機能性単体を用いた一槽式アナモックスにより窒素除去も可能な高度処理の機能を実現する。下水処理技術革新として、嫌気性膜分離法と担体添加型一槽式アナモックス法を融合して工夫することで、水質保全とエネルギー回収の両立を実現できる省エネルギー・低炭素型の下水処理システムの確立を目指す研究である。バイオガスを下水から直接得ることが可能であり、そのエネルギー量も従来の汚泥処理過程で得られる電力の約1.5倍相当である。嫌気性膜分離法の欠点である窒素除去を担体添加型一槽式アナモックス法と組み合わせて、省エネルギーかつエネルギー創出型の下水処理法を開発する研究であり、水処理技術の新しい方法を提案する有意義な研究である。汚泥が発生する従来の下水処理技術に比べると、エネルギー回収に繋がるため、実現できた場合の社会的意義は大きい。
血管平滑筋細胞の増殖促進因子Gas6の作用機構の解析

私達は、受容体型チロシンキナーゼSkyを同定し、さらにそのリガンドがGas6(product of growtharrest-specific gene 6)であることを明らかにした。Gas6は、抗血液凝固因子であるプロテインSに類似した構造を持ち、Skyばかりではなく、Skyに類似した構造を持つAxlやMerとよばれる受容体に対してもリガンドとして機能する。Gas6は、ラット血管平滑筋細胞のトロンビンやリゾホスファチジル酸による増殖を強化するgrowth potentiating factor活性を持つ。本研究では、Gas6による血管平滑筋細胞の増殖促進作用の分子機構を明らかにするとともに、Gas6の有効なアンタゴニストを開発し、血管平滑筋細胞の過増殖を抑制する拮抗阻害剤を開発することを目的として、以下の研究を行った。1)血管平滑筋細胞にはAxlが発現していることを見い出した。2) Axlの細胞外ドメインとlgGのFc領域の融合蛋白質Axl-Fcを発現、精製した。Axl.Sky発現CHO細胞株に対して、Gas6添加によるAxl,Skyのチロシン自己リン酸化促進能をAxl-Fcが阻害するか検討した。その結果、4nM Gas6の添加によるSkyの自己リン酸化促進能は、1-2nM程度の低濃度のAxl-Fcにより著しく阻害されることを見い出した。3)ラット血管平滑筋細胞に対する、Axl-Fcの存在、非存在下でのトロンビンの増殖促進効果を検討した。その結果、Axl-Fc(2nM)を同時添加することによって、トロンビンによる血管平滑筋細胞の増殖促進効果は著しく阻害されることを見い出した。以上の結果から、Gas6の受容体の中で、最も親和性の高いAxlの可溶型受容体であるAxl-Fcは、Gas6をsequesterすることにより、内在性Gas6に対する有効な阻害剤として機能することが示唆された。
超話導相分散バルク金属ガラスの超伝導特性と線材化

超伝導相分散金属ガラスの超伝導特性の改善するために、超伝導相分散金属ガラスの超伝導相の組織制御を試みた。Zr_<55>Al_<10>Cu_<30>Ni_5金属ガラスにNb元素を添加することで、超伝導相分散バルク金属ガラスの作製を行った。Ar雰囲気中でアーク溶解した母合金を型締め鋳造法を用いてZr_<55>Cu_<(30-x)>Al_<10>Ni_5Nb_x(x=0、1、3、5 at.%)バルク金属ガラスを作製した。作製された金属ガラスはX線回折装置を用いて構造解析,高分解能透過電子顕微鏡(HRTEM)を用いて組織観察、示差熱分析装置を用いて熱的特性を評価した。電気的特性は四端子法を用いて評価した。x=0の合金はアモルファス単相であったが、x=1、3、5の合金ではナノサイズの結晶がアモルファス母相中に分散していることがわかった。Nb元素の添加量が増加するにともない、アモルファス中に分散するナノ結晶の粒径が大きくなり、Zr_<55>Cu_<(30-x)>Al_<10>Ni_5Nb_x合金はアモルファス単相から結晶化が進むことがわかった。示差熱分析測定において、全ての合金がガラス転移を示した。合金の過冷却液体温度領域(ΔTx)は77K86Kであった。これにより、Zr_<55>Cu_<(30-x)>Al_<10>Ni_5Nb_x合金は金属ガラスであった。x=0のZr_<55>Al_<10>Cu_<30>Ni_5金属ガラスはアモルファス単相であるため、2Kまでアモルファス特有の高抵抗を示したが、一方、x=1、3、5のZr_<55>Cu_<(30-x)>Al_<10>Ni_5Nb_x金属ガラスは超伝導相を含んでいるため、約2.2K2.7Kの温度範囲で急激に電気抵抗が減少した。金属ガラスに混在する超伝導相としては、Tc=2.2KのZr_2Cu、Tc=2.7KのZr_2Niであると考えられる。Nb元素の添加量が増加するにしたがって、Zr_<55>Cu_<(30-x)>Al_<10>Ni_5Nb_x金属ガラスの電気抵抗が急激に減少し始める温度(Tc_<ON>)が、高温側にシフトした。これは、Nb元素の添加量が増加するにしたがって、金属ガラス中に晶出する超伝導相がTc=2.2KのZr_2Cu合金からTcの高いZr_2Ni合金へと変化していることに起因すると考えられる。本研究により、Zr_<55>Al_<10>Cu_<30>Ni_5バルク金属ガラスにNb元素を添加することで、超伝導性Zr-Cu-Al-Ni-Nbバルク金属ガラスを作製することができることを明らかにした。Zr_<55>Al_<10>Cu_<30>Ni_5バルク金属ガラスへのNb元素の添加は、金属ガラス中の超伝導相の制御に有効であることがわかった。Nb元素の添加量を最適化することで、Zr-Cu-Al-Ni-Nbバルク金属ガラスの超伝導特性をより改善することができる。超伝導相分散Zr_<55>Al_<10>Cu_<30>Ni_5バルク金属ガラス中の臨界温度Tc=約3Kの超伝導相を解明し、その超伝導特性を明らかにすることを試みた。金属ガラスは、結晶化開始温度Tx以上では結晶化が起こる。この結晶化過程において、Zr_<55>Al_<10>Cu_<30>Ni_5金属ガラスの場合、金属ガラス中に核生成される幾つかの結晶の中で超伝導特性を示す合金が含まれる可能性があると考えられる。本研究では、Zr_<55>Al_<10>Cu_<30>Ni_5バルク金属ガラスを温度Tx近傍で熱処理した後、熱処理を行なったZr_<55>Al_<10>Cu<30>Ni_5のX線回折法による結晶構造解析、TEMによる組織観察、四端子方法による電気抵抗測定等から、超伝導特性を発現する結晶相の同定を行なった。本研究により、超伝導相分散Zr_<55>Al_<10>Cu_<30>Ni_5バルク金属ガラスの約3Kでの超伝導現象は金属ガラス中のZr_2Ni相により発現していることを示唆する結果が得られた。Zr_2NiがTc=2.7Kの超伝導合金であることがわかった。また、Zr_2Niが超伝導特性を示すためには合金中に固溶する酸素量が重要なパラメータであることがわかった。Zr_2Ni合金は酸素と固溶して超伝導特性を示すと考えられる。超伝導相分散金属ガラスは、アモルファス中に超伝導相が分散した金属ガラスである。また、金属ガラスの特徴は、結晶化温度の前に過冷却液体状態領域が存在することである。金属ガラスの過冷却液体状態領域の超粘性流動を利用することで、金属ガラスは比較的容易に線材化加工が可能である。高易加工性を有するZr基超伝導相分散バルク金属ガラスは線材化応用の観点から魅力的な材料である。

特に、金属ガラスの線材化プロセスでは、アモルファス単相の金属ガラスを過冷却液体状態領域で熱処理することで、超伝導相を金属ガラス中に導入し、そして同時に超粘性流動を利用した延性処理ができれば、超伝導性金属ガラス線材の生産性の面では、非常に生産効率を上げることになる。本研究では、Zr-Al-Cu-Ni系バルク金属ガラスの過冷却液体状態領域での延性特性を調べることした。実験では、Zr_<55>Cu_<30>Al_<10>Ni_5金属ガラスを過冷却液体状態領域で、一定荷重のもとで引っ張ることで伸び率を測定した。この過冷却液体状態領域での金属ガラスの一連のプロセスにより、Zr_<55>Cu_<30>Al_<10>Ni_5金属ガラスは約2.7Kでゼロ抵抗になり、超伝導特性を示した。また、Zr_<55>Cu_<30>Al_<10>Ni_5金属ガラスは最大で約1.5倍の伸びを示した。今年度の研究により、金属ガラスの過冷却液体状態領域での超粘性流動を利用した超伝導線材化は有効な手段であることが示された。超伝導相分散金属ガラスの超伝導特性の改善するために、超伝導相分散金属ガラスの超伝導相の組織制御を試みた。Zr_<55>Al_<10>Cu_<30>Ni_5金属ガラスにNb元素を添加することで、超伝導相分散バルク金属ガラスの作製を行った。Ar雰囲気中でアーク溶解した母合金を型締め鋳造法を用いてZr_<55>Cu_<(30-x)>Al_<10>Ni_5Nb_x(x=0、1、3、5 at.%)バルク金属ガラスを作製した。作製された金属ガラスはX線回折装置を用いて構造解析,高分解能透過電子顕微鏡(HRTEM)を用いて組織観察、示差熱分析装置を用いて熱的特性を評価した。電気的特性は四端子法を用いて評価した。x=0の合金はアモルファス単相であったが、x=1、3、5の合金ではナノサイズの結晶がアモルファス母相中に分散していることがわかった。Nb元素の添加量が増加するにともない、アモルファス中に分散するナノ結晶の粒径が大きくなり、Zr_<55>Cu_<(30-x)>Al_<10>Ni_5Nb_x合金はアモルファス単相から結晶化が進むことがわかった。示差熱分析測定において、全ての合金がガラス転移を示した。合金の過冷却液体温度領域(ΔTx)は77K86Kであった。これにより、Zr_<55>Cu_<(30-x)>Al_<10>Ni_5Nb_x合金は金属ガラスであった。x=0のZr_<55>Al_<10>Cu_<30>Ni_5金属ガラスはアモルファス単相であるため、2Kまでアモルファス特有の高抵抗を示したが、一方、x=1、3、5のZr_<55>Cu_<(30-x)>Al_<10>Ni_5Nb_x金属ガラスは超伝導相を含んでいるため、約2.2K2.7Kの温度範囲で急激に電気抵抗が減少した。金属ガラスに混在する超伝導相としては、Tc=2.2KのZr_2Cu、Tc=2.7KのZr_2Niであると考えられる。Nb元素の添加量が増加するにしたがって、Zr_<55>Cu_<(30-x)>Al_<10>Ni_5Nb_x金属ガラスの電気抵抗が急激に減少し始める温度(Tc_<ON>)が、高温側にシフトした。これは、Nb元素の添加量が増加するにしたがって、金属ガラス中に晶出する超伝導相がTc=2.2KのZr_2Cu合金からTcの高いZr_2Ni合金へと変化していることに起因すると考えられる。本研究により、Zr_<55>Al_<10>Cu_<30>Ni_5バルク金属ガラスにNb元素を添加することで、超伝導性Zr-Cu-Al-Ni-Nbバルク金属ガラスを作製することができることを明らかにした。Zr_<55>Al_<10>Cu_<30>Ni_5バルク金属ガラスへのNb元素の添加は、金属ガラス中の超伝導相の制御に有効であることがわかった。Nb元素の添加量を最適化することで、Zr-Cu-Al-Ni-Nbバルク金属ガラスの超伝導特性をより改善することができる。
生殖細胞移植を用いた有用魚類及び希少種の保全・資源回復に関する研究

本研究では、有用水産魚類の効率的種苗生産や絶滅危惧種および希少種の保全・資源回復の技術開発の一環として、成熟可能な発生段階にあるレシピエント(成魚)の生殖腺にドナー由来の生殖細胞を移植し、レシピエントからドナー由来配偶子を得るまでの時間の短縮化を図る。具体的には、内在性生殖細胞を消失した成魚レシピエントの効率的作出法、および、カニューレを用いた生殖孔からの生殖細胞移植技術の確立を目指している。平成27年度では、引き続き小型魚類(メダカなど)における本技術の開発を行った。まず、昨年度確立した手法に従い、内在性生殖細胞を持たないレシピエントのメダカを作成した。次に、この不妊レシピエントの生殖孔より、カニューレを用いて蛍光標識したドナーゼブラフィッシュ由来の精原細胞と卵原細胞を移植した。移植の経過を確認するため、移植後1、3、6および12週に雄雌レシピエントの生殖腺における移植細胞を観察したところ、移植細胞はレシピエント生殖腺内に順調に生着・増加・分化(配偶子形成)していると考えられた。また、移植後12週に、レシピエント雄個体から得られた精子を遺伝子解析した結果、ドナー由来と考えられる精子が確認された。最後に、移植を施した雄雌レシピエント同士の交配で得られた受精卵、および移植した雌レシピエントから得た卵と通常のゼブラフィッシュ雄から得た精子を用いた人工授精によって得られた受精卵の発生観察と遺伝子解析を行った。その結果、雄雌のレシピエントメダカ生殖腺内では受精能を保持したドナー由来配偶子が形成され、受精後も受精卵は正常な発生能を保持していると考えられた。本研究では、小型魚類を用いて生殖細胞の成体移植が可能であること、異なる目に分類される魚種間(メダカ:ダツ目、ゼブラフィッシュ:コイ目)で卵の借り腹生産が可能である可能性を示したが、今後、さらなる詳細な解析が必要であると考えられた。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、有用水産魚類の効率的種苗生産や絶滅危惧種および希少種の保全・資源回復の技術開発の一環として、成熟可能な発生段階にあるレシピエント(成魚)の生殖腺にドナー由来の生殖細胞を移植し、レシピエントからドナーの配偶子を得るまでの時間の短縮化を図る。具体的には、内因性生殖細胞を消失した成魚レシピエントの効率的作出法、および、カニューレを用いた生殖孔からの生殖細胞移植技術の確立を目指している。平成26年度ではまず、内因性生殖細胞を持たないレシピエントの効率的作出法を確立するために、本研究のモデル魚種の一つであるメダカ成魚に対し、高水温処理(38°C下で4、8週間)とDNA複製の阻害剤(Busulfan)処理(0週目と2週目、または0週目と4週目の各2回注射)の併用による不妊化の効果を比較した。その結果、4週間処理区では、生残率が8週間処理区より有意に高く、生殖腺組織切片の観察結果から、雄では処理個体の約60%、雌では約40%が完全な不妊状態になることが明らかとなった。次に、この不妊レシピエントの生殖孔より、カニューレを用いて蛍光標識したドナーペヘレイの精巣由来の精原細胞を移植した。移植の成功を裏付けるためには、レシピエントの生殖腺における移植細胞の移動・生着・増加・分化(配偶子形成)を経過観察し、得られた配偶子がドナー由来生殖細胞であるかを遺伝子レベルで鑑定する必要がある。本実験では、移植8週間後に移植細胞を蛍光顕微鏡下で観察したところ、蛍光標識された移植細胞の増殖が確認された。さらに、移植3ヵ月後に移植を施したレシピエント生殖腺からDNAを抽出し、PCR法によりドナー生殖細胞特異的なvasa遺伝子の検出を試みたところ、雌雄のレシピエント生殖腺において陽性反応が確認された。

本研究では、小型魚類を用いて生殖細胞の成体移植が可能であること、異なる目に分類される魚種間(メダカ:ダツ目、ゼブラフィッシュ:コイ目)で卵の借り腹生産が可能である可能性を示したが、今後、さらなる詳細な解析が必要であると考えられた。研究着手から半年ほどの短い期間にも拘らず、不妊化したレシピエントの作出法や生殖孔カニューレによる生殖細胞移植技術の確立など、実施予定の課題については確実に成果を挙げ、本研究成果を学会発表することができたことから概ね順調と判断した。27年度が最終年度であるため、記入しない。現時点では、特に推進方策の変更が必要はないと判断しており、概ね当初計画の通り実施する予定である。
イオン流駆動型べん毛モーターの生化学的解析

【研究目的】ビブリオ菌のNa^+駆動型べん毛の回転は、膜蛋白質であるPomA/PomB複合体、MotXならびにMotYによって行われる。Na^+チャネルでもあるPomA/PomB複合体が行う構造変化が、べん毛モーターを回転させると考えられる。本研究はPomA/PomB複合体、MotXならびにMotYの生化学的解析を目指している。平成14年度は、PomA/PomB複合体のNa^+透過活性の検討とMotYの精製の検討を行った。【研究成果】1.精製PomA/PomB複合体のNa^+透過活性:平成13年度の研究において精製したPomA/PomB複合体を再構成したプロテオリポソームを用いて、拡散電位に依存した^<22>Na^+取り込みの検出を試みたが、有意な結果を得ることはできなかった。2.PomA/PomB複合体を大量発現した膜標品のNa^+透過:三種類全てのNa^+/H^+アンチポーターを欠失した大腸菌に野生型PomA/PomB複合体、ならびにNa^+透過活性の上昇が期待されたPomA/PomB複合体を大量発現した膜画分を用いて、拡散電位に依存した^<22>Na^+の取り込みを試みたが、有意な結果を得ることはできなかった。3.水溶性MotYの精製:MotYはMotX非存在下にはペリプラズムに可溶性蛋白質として局在する。この水溶性MotYを大量に調製するため、大量発現系の構築を行った。ペリプラズム画分より、ヒスチジンタグを付加した水溶性MotYを金属アフィニティーカラムにより、ほぼ純粋な状態まで精製することができた。1Lの培養から約1mgの精製標品を得ることができた。構造解析に向けて一歩踏み出すことができた。【研究目的】Na^+で駆動するバクテリアベん毛の回転は、膜蛋白質であるPomAとPomBの協同的な働きによって行われている。PomA/PomB複合体はN^+透過活性を有しているが、その時引きおこされるPomA/PomBの構造変化が、べん毛モーターの回転子を回転させると考えられている。本研究は本質的な因子でありながら解析の遅れているPomA/PomB複合体の生化学的解析を目指している。平成13年度はその基盤となる大量調整と精製の検討を行った。【研究成果】1.PomA/PomB複合体の大量調製:精製を容易にする目的で、PomAあるいはPomBにヒスチジンタグを付加し、機能的な融合蛋白質を作成した。本研究では、精製のために従来用いられてきた界面活性剤ではPomA/PomB複合体が解離しやすいことを見いだした。そこで、複合体を安定に保つ界面活性剤を検索したところ、CHAPSがより適していることが判明した。2.MotA/MotBの精製:CHAPSを用いてPomA/PomB複合体の精製を行った。いくつかのカラムクロマトグラフィーを用いて、ほぼ純粋な状態まで精製することができた。この精製標品に含まれるPomAとPomBの量比は過去の報告とほぼ一致したが、全体の大きさが過去の報告よりも数倍大きかった。従来用いていた界面活性剤がPomA/PomB複合体を解離しやすいという性質を反映しているのかもしれない。【平成14年度】平成13年度の研究においては精製したPomA/PomB複合体の活性を確認することはできなかった。よって平成14年度は活性の検出と精製標品の生化学的性質を中心に解析を進める予定である。

ペリプラズム画分より、ヒスチジンタグを付加した水溶性MotYを金属アフィニティーカラムにより、ほぼ純粋な状態まで精製することができた。1Lの培養から約1mgの精製標品を得ることができた。構造解析に向けて一歩踏み出すことができた。