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光学活性な有機ケイ素化合物の創製と応用

多様な光学活性有機ケイ素化合物の不斉合成素子として重要なキラルシラノール類の不斉合成法について検討し,ジアステレオ選択的手法とエナンチオ選択的手法を開発した.また,本法で得られる光学活性なキラルシラノールの立体特異的な官能基変換法の開発に成功した.さらに,ビニルシラン類のオゾン酸化によるアシルシラン合成法を開発した.一方,面不斉を賦与したキラルケイ素化合物の創製についても検討し,その合成と立体化学挙動の解明に成功した.多様な光学活性有機ケイ素化合物の不斉合成素子として重要なキラルシラノール類の不斉合成法について検討し,ジアステレオ選択的手法とエナンチオ選択的手法を開発した.また,本法で得られる光学活性なキラルシラノールの立体特異的な官能基変換法の開発に成功した.さらに,ビニルシラン類のオゾン酸化によるアシルシラン合成法を開発した.一方,面不斉を賦与したキラルケイ素化合物の創製についても検討し,その合成と立体化学挙動の解明に成功した.1)キラルシラノールの効率的不斉合成法の開発光学活性有機ケイ素化合物群のキラル合成素子として重要なキラルシラノール類の不斉合成法を開発した、具体的には、調製容易なアキラル環状ジアルコキシシランに対して不斉塩基を作用させることで、不斉非対称化を伴うδ-脱離反応を行い、キラルシラノールを立体選択的に得ることに成功した。さらに、本手法で得られたキラルシラノールの各種変換法を開発した。2)新規キラルケイ素化合物の創製2-1)ケイ素不斉を有するキラルカルボン酸の合成と反応光学活性なキラルシラノールの水酸基を立体特異的にハロゲンに変換し、さらにハロ-リチウム交換、カルボキシル化を行うことでキラルカルボキシシランを光学活性体として得ることに初めて成功した、さらに、そのカルボキシル基をエステル基に変換することにも成功した。2-2)面不斉とケイ素中心性不斉を共に有する環状ケイ素化合物の創製と反応「面不斉を賦与したキラルケイ素化合物」の創製を検討した。まず、E-オレフィン部位を有する8員環環状ジアルコキシシランを合成し、この分子に室温下安定な面不斉が存在することを明らかにした。さらに、ケイ素上に非等価な置換基を導入することで、面不斉とケイ素中心性不斉を有する新規なキラル分子を創製した。これらの分子は、ケイ素部位、オレフィン部位ともに多様な変換が可能であることから、多様な機能を有する不斉合成素子として有用と考えられる。1)キラルシラノールの効率的不斉合成法の開発多様な光学活性有機ケイ素化合物の共通キラル合成素子として重要なキラルシラノール類の不斉合成法として,今回新たに2つの手法を開発した.第1に,環状ヘミアセタール系の1,4-アリール移動反応が高立体選択的に進行することを見出し,これを応用してキラルシラノール類をジアステレオ選択的に不斉合成することに成功した.第2に,アキラルな環状ジアルコキシシランに対して不斉配位剤と有機リチウムを作用させると不斉非対称化を伴う求核置換反応が高立体選択的に進行することを見出し,これを応用してキラルシラノール類をエナンチオ選択的に不斉合成することに成功した.2)新規キラルケイ素化合物の創製2-1)ケイ素不斉を有する有機ケイ素化合物の合成と反応光学活性なキラルシラノールの官能基変換法として,新規な活性化基を開発するとともに,それを導入したケイ素エーテルの求核置換反応が円滑かつ立体特異的に進行することを見出した.一方,アルコキシ基が置換したビニルシラン類のオゾン酸化反応が,対応するアシルシランを収率良く与えることを見出した.これら2法を適切に活用することで,従来合成困難であった多様な有機ケイ素化合物の不斉合成が可能になった.2-2)面不斉とケイ素中心性不斉を共に有する環状ケイ素化合物の創製と反応「面不斉を賦与したキラルケイ素化合物」の創製を目的として,E-オレフィン部位を有する9員環ジアルコキシシランを合成し,その立体化学挙動を精査した.その結果,この分子に動的面不斉が存在することを明らかにした.
先天性視覚障害児の歩行指導のための空間認知能力評価システム開発

今年度の主な研究実績は、新たに生じた課題について追加の調査を行い結果をまとめたことと、関連する研究会ワークショップにおいて本研究で検討しているアセスメント方法に関する報告を行ったことである。追加の調査では、視覚障害特別支援学校に在籍する先天性視覚障害の児童生徒を対象として、手の届く範囲の空間において、自己と物、物と物、空間における物の位置関係をどのように言語的に表現するか用いる空間参照枠に着目して明らかにすることを目的として実施した。その結果、晴眼児の用いる空間表現は、学年が高いほど「斜め」を用いたり場所を特定する表現を用いたりして、物の位置に関する曖昧性が減少していく傾向がみられた。また、物と物との位置関係や空間における物の位置を説明する場合に、外部参照枠を表現する場合が多くみられた。それに対して、先天性視覚障害児は、低学年の段階から場所を特定する表現を用いる傾向があり、小学部児童と中学部生徒では用いる空間表現に大きな違いはないと考えられた。また、空間参照枠については、言語的には表現されない場合が多かった。現在、調査結果の分析を終え、学会での発表と学会誌への論文投稿を準備しているところである。また、関連する研究会において、先天性視覚障害児の空間認知に関するアセスメント法を紹介し、参加者で実際に体験をするという機会を持ち、成果を得た。今年度は、新たに生じた課題に対して追加の調査を行って検討を進めつつ、国内学会への発表エントリーを行うことができた。また、指導法に関する研究成果を学会誌に投稿することができた。さらに、研究報告等まとめに向けた研究活動を進めつつある。学会誌への論文掲載が課題としてあるが、次年度重点的に取り組むこととしている。以上により、おおむね順調に進展していると考える。次年度、先天性視覚障害児の空間認知に関するアセスメント方法と指導法について総合的な報告書を作成する予定である。そのために、今後も、学会発表、投稿論文等として研究発表を行い、他者からの批評を得たり先行研究の知見を踏まえたりしながら修正を加え、視覚障害教育の場で活用できるものとしてまとめを行う。本研究は、先天性視覚障害児の歩行指導において必要となる、空間認知と空間イメージ操作能力を評価するためのシステムを開発することを目的とする。まず、先天性視覚障害児の空間認知とそのイメージ操作能力の特徴を把握し、次に、得られた基礎的知見からシステムを構成する。また、構成されたシステムに基づき歩行指導の実践を行い、最終的に評価システムの完成を目指す。なお、本研究は研究実施者がこれまで取り組んできた研究を継続・発展させて行うものである。2017年度は、対象者を追加して基礎的知見を得るための実験と指導実践を中心に実施し、以下のような成果を得た。今年度、先天性視覚障害児3名(幼稚部幼児A、小学部児童B、中学部生徒C)を対象として、空間認知と空間イメージ操作に関するアセスメントを実施し、各担当教員から日頃の歩行の様子等を把握するための面接調査を行った。また、中学部生徒Cに対して、未知の教室内の空間認知と移動を促進することを目的とした指導実践を行った。事例的に得られた結果ではあるが、これまでの実験結果をふまえると、年齢に対して空間イメージ操作課題の成績が低い場合に移動行動等に何らかの困難性がみられることが推察された。具体的には、小学校高学年以上の年齢で心的回転課題の成績が低い場合、普段よく知った教室内や校舎内の移動に特段の困難は見られないが、未知の教室の空間認知の様子を調査すると、物の位置はほぼ正確に把握できるが物の向きの理解が不正確である傾向がみられた。また、こうした場合、向かい合う他者から見たときの左右が判断できないなど他者の左右認知に困難性があることも考えられた。今後、さらに対象者数を追加して実験と指導実践を行い実証することが必要であるが、これまでの研究結果を考慮すると、本研究で行う実験課題等が先天性視覚障害児の歩行指導のためのアセスメントツールとなり得る可能性が見出された。今年度(2017年)の予定は、空間認知と空間イメージ操作能力に関する実験を行って基礎的知見を得ることであった。当初の計画と比べて、実験の実施が遅れたために対象者数が限られ、十分なデータを得ることができなかった。一方で、次年度(2018年)実施予定であった指導実践を今年度に行えたため、全体として大きな遅れとしては捉えていない。また、得られたデータの一部を国内学会で発表したり、関連分野の実践家・研究者との協議を行ったりして、研究の方向性について検討できたことも今年度の成果であると考える。

それに対して、先天性視覚障害児は、低学年の段階から場所を特定する表現を用いる傾向があり、小学部児童と中学部生徒では用いる空間表現に大きな違いはないと考えられた。また、空間参照枠については、言語的には表現されない場合が多かった。現在、調査結果の分析を終え、学会での発表と学会誌への論文投稿を準備しているところである。また、関連する研究会において、先天性視覚障害児の空間認知に関するアセスメント法を紹介し、参加者で実際に体験をするという機会を持ち、成果を得た。今年度は、新たに生じた課題に対して追加の調査を行って検討を進めつつ、国内学会への発表エントリーを行うことができた。また、指導法に関する研究成果を学会誌に投稿することができた。さらに、研究報告等まとめに向けた研究活動を進めつつある。学会誌への論文掲載が課題としてあるが、次年度重点的に取り組むこととしている。以上により、おおむね順調に進展していると考える。次年度、先天性視覚障害児の空間認知に関するアセスメント方法と指導法について総合的な報告書を作成する予定である。そのために、今後も、学会発表、投稿論文等として研究発表を行い、他者からの批評を得たり先行研究の知見を踏まえたりしながら修正を加え、視覚障害教育の場で活用できるものとしてまとめを行う。当初の支出予定に対し、旅費の支出が多くなることがわかったため、主に物品費と人件費で調節することとした。人件費の未使用については、実験補助者を依頼せず研究実施者のみで行うように努力したためである。次年度使用額については、今年度の購入を見送った実験等の記録・撮影用機材の購入に充てる計画である。消耗品等の購入や学会費等で支出する予定であったが、運営費交付金等によってまかなうことができたため、若干の残額があった。次年度、早い段階で支出させていただきたいと考えている。
新しい概念に基づく遺伝子操作マウス創出基盤の確立

これまで、センダイウイルスの組換え系(rSeV)の研究を進め、この世界初のベクターによる臨床研究を実施してきた。また、最近の基盤技術研究の結果、少なくともいくつかの分化誘導系では、rSeVの感染そのものは細胞分化へ影響しないことが明らかとなった。更に、rSeV感染ES細胞より、臓器発生に異常な表現系を示すことなく、個体が発生することが明らかとなった。しかしながら、生後数時間で全個体が死亡した。結果、RNAヘリカーゼのノックダウンでは長期生存を認められず、RNAヘリカーゼ以外の何らかの要因が長期生存に関連していると考えられた。本年度は、rSeVを用いた遺伝子操作マウス構築を主として検討した。1)使用するベクターシステムの最適化:以下の3種のベクターに対し、rSeVを用いた遺伝子操作マウスの構築を試みた。いずれにおいてES細胞への高効率遺伝子導入、遺伝子発現細胞の多能性について維持されていることを確認した。2)RNAヘリカーゼノックダウンベクターの構築:これまでの検討ではRIG-Iのdominant-negative変異体(RIG-IC)をrSeVにて発現させることにより個体発生まで至ることを見出した。このRIG-ICの必要性について、特に長期生存時における表現型の修飾について検討を進めた。本年度は、これまでに進めてきたrSeVベクターを用いたES細胞への遺伝子導入技術及びその多能性維持についての検討に加え、疾患モデルの開発に関わる基礎検討を進めた。1). ts-rSeV/dF(温度感受性変異挿入+F遺伝子欠損型ベクター)、rSeV/dFdMdHN(ウイルス膜タンパク構成遺伝子全てを欠損するベクター)、ts-rSeV/dFneo他(薬剤耐性遺伝子を持つベクター)を用い、遺伝子操作マウス構築技術の最適化を進めた。2).アルツハイマー病モデルマウスについて、既存のAPPマウスでは神経細胞へのアミロイド沈着までに6ヶ月以上を要することを鑑み、この期間が短縮可能なモデルの作成について検討を行った。3).新たな動脈硬化モデルマウスとして、siRNAによりsystemicにApoE遺伝子をノックダウンすることで、既存モデルとの差異が生じるかの基礎検討を行った。昨年度までに、これまでに進めてきたrSeVベクターを用いたES細胞への遺伝子導入技術及びその多能性維持についての検討に加え、疾患モデルの開発に関わる基礎検討を進めてきた。本年度は、ts-rSeV/dF(温度感受性変異挿入+F遺伝子欠損ベクター)、rSeV/dFdMdHN(ウイルス膜タンパク構成遺伝子全てを欠損するベクター)、ts-rSeV/dFneo他(薬剤耐性遺伝子を持つベクター)を用い、遺伝子操作マウス構築技術の最適化を進めると共に、アルツハイマー病モデルマウス、動脈硬化モデルマウスの基礎検討を進めた。個体発生に最も適していると考えられるrSeV/dFdMdHN(ウイルス膜タンパク構成遺伝子全てを欠損するベクター)の製造法の最適化が順調に進んでいること。また、疾患モデルとして既存のApoEマウスの動脈硬化巣形成に関する新たな知見を得たこと。遺伝子治療学・血管病態学3年目は、特に動物疾患モデルの作成と解析を主とする。本遺伝子操作マウスは「全身で外来遺伝子を高発現する」ことを特徴としており、特定のタンパクの過剰発現に起因する疾患のモデルが最も適していると考えられる。1).アルツハイマー病モデルマウスの構築:Aβアミロイドの沈着により発症する「アルツハイマー病モデルマウス」の構築及びその病態解析を目標とする。既報のAPPマウスは明確に神経細胞へのアミロイド沈着が認められるまでにおよそ半年以上を要することが知られているが、本技術によって少なくともその期間を3ヶ月以内にまで短縮することを目指す。2).新しい動脈硬化モデルマウスの構築:siRNAを高発現させることにより、systemicにLDLR或いはApoE遺伝子をノックダウンすることにより、新しい動脈硬化モデルマウスを構築する。このモデルと既存のApoEKOマウスの動脈硬化巣の形態学的・組織学的な違いについて、精査する。特にrSeV/dFdMdHN(ウイルス膜を構成する膜蛋白遺伝子全てを欠損する)については、ベクター作成回収においてタイターが低い。現時点で原因は不明であるが、製造法の仔細を現在検討中であり、その点でやや遅れている。このタイプのベクターは、個体発生に最も適していると考えられるため、特に集中して実施している。2年目は、特に動物疾患モデルの開発に力点を移す。本遺伝子操作マウスは「全身で外来遺伝子を高発現する」ことが特徴であるため、特定の蛋白にて惹起される疾患モデルが最も適していると考えられる。(1)アルツハイマー病モデルマウスの構築:Aβアミロイドの沈着により発症する「アルツハイマー病モデルマウス」の構築を目標とする。これまでに存在するAPPマウスは明確に神経細胞へアミロイド沈着を認めるまで半年以上要することを確認しているが、これが少なくとも3ヶ月以内に短縮するか、について検討する。

(2)新しい動脈硬化モデルマウスの構築:siRNAによりsystemicにLDLRあるいはApoE遺伝子をノックダウンすることにより、新しい動脈硬化モデルマウスを構築する。これと既存モデルとの動脈硬化巣の形態学的な違いについて、検討する。
一般化された不変部分空間とロバスト外乱除去問題の研究

線形システムは物理的な立場から大きく,集中定数システム(有限次元システム)と分布定数システム(無限次元システム)に分けられる.これらのシステムに外乱が入りシステムの出力に影響を与えた系に対して,フィードバック制御により外乱を除去することが可能かどうかに関する研究が欧米の研究者及び申請者らによってこれまで,多くの研究がなされてきた.しかしながら,システムのパラメータに誤差を含んでいたり,温度や経年変化などによってパラメータが変動した場合には,これまでの研究成果を用いることができない状況にある.このような背景の中で,平成11,12年度の研究計画は,以下の5つに大別されていた.(1)一般的な不確かさを有する有限次元線形システムに対して,一般化された不変部分空間の概念とそのシステムの基本的な構造を調べ,システムの族に関する共通の概念について考察し与えられたシステムとの関係を明らかにする.さらに幾何学的な構造の解析を行う.(2)(1)に基づいて,基本的な事実を証明し,出力フィードバック及び動的補償器を用いた外乱除去問題の定式化とその可解条件を調べる(3)不確かな無限次元システムに対して,一般化された不変部分空間の概念を導入し,その性質について詳細に調べる.(4)(3)におけるシステムに対して,状態及び出力フィードバックを用いた外乱除去問題を定式化し,その可解条件について調べる.(5)(3)におけるシステムに対して,動的補償器を用いた外乱除去問題を定式化し,その可解条件について調べる.その結果,不確かな有限次元及び無限次元システムに対して,それぞれ一般化された不変部分空間の概念が導入され,その性質について調べられ基本的な事実が明らかにされた.さらに,状態フィードバック,出力フィードバックさらには動的補償器を用いたを用いた外乱除去問題が定式化され,その可解条件が与えられた.得られた結果は,学術雑誌に掲載された.また,無限次元システムに対する動的補償器を用いた外乱除去問題も定式化されたが,その可解条件については,今後の問題として残された.線形システムは物理的な立場から大きく,集中定数システム(有限次元システム)と分布定数システム(無限次元システム)に分けられる.これらのシステムに外乱が入りシステムの出力に影響を与えた系に対して,フィードバック制御により外乱を除去することが可能かどうかに関する研究が欧米の研究者及び申請者らによってこれまで,多くの研究がなされてきた.しかしながら,システムのパラメータに誤差を含んでいたり,温度や経年変化などによってパラメータが変動した場合には,これまでの研究成果を用いることができない状況にある.このような背景の中で,平成11,12年度の研究計画は,以下の5つに大別されていた.(1)一般的な不確かさを有する有限次元線形システムに対して,一般化された不変部分空間の概念とそのシステムの基本的な構造を調べ,システムの族に関する共通の概念について考察し与えられたシステムとの関係を明らかにする.さらに幾何学的な構造の解析を行う.(2)(1)に基づいて,基本的な事実を証明し,出力フィードバック及び動的補償器を用いた外乱除去問題の定式化とその可解条件を調べる(3)不確かな無限次元システムに対して,一般化された不変部分空間の概念を導入し,その性質について詳細に調べる.(4)(3)におけるシステムに対して,状態及び出力フィードバックを用いた外乱除去問題を定式化し,その可解条件について調べる.(5)(3)におけるシステムに対して,動的補償器を用いた外乱除去問題を定式化し,その可解条件について調べる.その結果,不確かな有限次元及び無限次元システムに対して,それぞれ一般化された不変部分空間の概念が導入され,その性質について調べられ基本的な事実が明らかにされた.さらに,状態フィードバック,出力フィードバックさらには動的補償器を用いたを用いた外乱除去問題が定式化され,その可解条件が与えられた.得られた結果は,学術雑誌に掲載された.また,無限次元システムに対する動的補償器を用いた外乱除去問題も定式化されたが,その可解条件については,今後の問題として残された.線形システムは物理的な立場から大きく、集中定数システム(有限次元システム)と分布定数システム(無限次元システム)に分けられる。これらのシステムに外乱が入りシステムの出力に影響を与えた系に対して、フィードバック制御により外乱を除去することが可能かどかに関する研究が欧米の研究者及び申請者らによってこれまで、多くの研究がなされてきた。しかしながら、システムのパラメータに誤差を含んでいたり、温度や経年変化などによってパラメータが変動した場合には、これまでの研究成果を用いることができない状況にある。このような背景の中で、平成11年度の研究計画は、以下の2つに大別されていた。(1)一般的な不確かさを有する有限次元線形システムに対して、一般化された不変部分空間の概念とそのシステムの基本的な構造を調べ、システムの族に関する共通の概念について考慮し与えられたシステムとの関係を明らかにする。さらに幾何学的な構造の解析を行う。(2)(1)に基づいて、基本的な事実を証明し、出力フィードバック及び動的補償器を用いた外乱除去問題の定式化とその可解条件を調べる。その結果、一般化された不変部分空間の概念とそのシステムの基本的な構造が調べられた。さらに幾何学的な構造の基本的な事実が明らかにされ、出力フィードバック及び動的補償器を用いた外乱除去問題の定式化とその可解条件が与えられた。

線形システムは物理的な立場から大きく,集中定数システム(有限次元システム)と分布定数システム(無限次元システム)に分けられる.これらのシステムに外乱が入りシステムの出力に影響を与えた系に対して,フィードバック制御により外乱を除去することが可能かどうかに関する研究が欧米の研究者及び申請者らによってこれまで,多くの研究がなされてきた.しかしながら,システムのパラメータに誤差を含んでいたり,温度や経年変化などによってパラメータが変動した場合には,これまでの研究成果を用いることができない状況にある.このような背景の中で,平成12年度の研究計画は,以下の2つに大別されていた.(1)不確かな無限次元システムに対して,一般化された不変部分空間の概念を導入し,その性質について詳細に調べる.(2)(1)における不確かな無限次元システムに対して,状態フィードバック及び出力フィードバックを用いた外乱除去問題を定式化し,その可解条件について調べる.(3)(1)における不確かな無限次元システムに対して,動的補償器を用いた外乱除去問題を定式化し,その可解条件について調べる.その結果,不確かな無限次元システムに対して,一般化された不変部分空間の概念が導入され,その性質について調べられ,基本的な事実が明らかにされた.さらに,状態フィードバック及び出力フィードバックを用いた外乱除去問題が定式化され,その可解条件が与えられた.得られた結果は,学術雑誌に掲載された.また,動的補償器を用いた外乱除去問題も定式化されたが,その可解条件については,今後の問題として残された.
新規開発ステップ関数型チャネルロドプシンの遺伝子導入によって得られる視覚特性評価

オプトジェネティクス技術を用いた視覚再生法は、失明者の視覚を回復させる治療法として期待されている。今回、新たに、照射する光波長によりイオンチャネルの開閉を制御できるタンパク質を開発することに成功し(SFO:ステップ関数型チャネルロドプシン)これを用いることにより、より高度な視機能を遺伝導入によって作り出せる可能性がある。本研究では、性質の異なるSFOを遺伝盲ラットの神経節細胞に導入し、視覚誘発電位を測定し、視覚特性の差異を明らかにする。最も視覚再生に有用な遺伝子についてはトランスジェニックラットを作製し、行動解析により、より詳細な視覚特性を明らかにする。
心外膜腔補助循環法“Pericardial pumping"の基礎的研究

平成10年度は血圧計カフを用いた補助循環法の循環動態検討のために、計画に従って家兎を用いた定量的心マッサージ法を施行した。【方法】心臓を包みこみ、定量的人工呼吸器で伸縮する血圧計カフ(3cm幅)を装着し、左室圧、大動脈血流量、カフ圧モニター下に心室細動を誘発した。最大カフ圧が得られる一回換気量で、カフを伸縮させた。【結果】左室圧、一回拍出量は対照に比し高値を呈し、補助循環としての有用性が判明した。マッサージ中カフの離脱は認めず、心停止後の剖検でも肉眼的異常は呈さなかった。【結論】血圧計カフを装着し、人工呼吸器を空気圧駆動装置として用いる心外膜補助循環法は十分かつ安定した血行動態を示し、明らかな心筋障害もなく、補助循環としての有用性が判明した。本法は1960年代に報告された心臓周囲カップに比し、柔軟性に勝る故に装着性に優れている。以上の結果は心外膜腔補助循環法の基礎データになると共に、他の補助循環法にも役立つと考え、現在投稿中である。今後、上記の基礎研究より臨床応用に直結するには、人間に最も類似した豚の心臓を用いて、洞調律下で心電図トリガーを用いた循環補助を行い、血行動態的に評価する。さらに心外膜腔内においてカフを伸縮させ、血行動態及び心外膜の耐久性を検討する。1.平成9年度は計画に従って、雑種成犬を用いた種々の用手心マッサージ法を施行した。(1)【方法】大動脈圧、右心房圧及び経食道心エコーのモニター下に心室細動を誘発し、前後(腹背)方向圧迫と左右方向圧迫の比較検討を行なった。僧帽弁逆流は経食道ドップラー心エコーにおける、逆流面積/左房面積を用いて定量化した。(2)【結果】前後方向圧迫による逆流面積/左房面積は平均0.08と微量であったが、左右方向圧迫では0.76と大量の逆流を呈した。この時、急性期の大動脈圧は逆流量が加わるのを反映してむしろ高値を呈した。(3)【結論】直接的心マッサージ法としては、前後方向圧迫を主とし、左右方向は避けるのが望ましい。この結果は心外膜腔補助循環法の基礎データとなると共に、広背筋を用いた補助循環法にも役立つと考え、現在投稿中である。2.さらに平成10年度の計画であった、心臓を包みこみ空気で伸縮するサックの予備実験を施行中である。心臓を包みこむサックとして血圧計のマンシェットを用い、用手的に加圧することにより十分な動脈圧及び血流(超音波血流計を用いた)が得られている。血圧、血流に加えマンシェット圧を同時記録し、実験中である。3.平成10年度の計画として(1)人工呼吸器を拍動流ポンプとして用いることにより、マンシェット加圧の定量化をはかる。(2)心膜腔中にマンシェットのゴム部分が挿入可能か、さらに心外膜がマンシェットの圧に耐用可能かを豚の心臓を用いて検討し、心外膜腔補助循環法の確立を目指す。

本法は1960年代に報告された心臓周囲カップに比し、柔軟性に勝る故に装着性に優れている。以上の結果は心外膜腔補助循環法の基礎データになると共に、他の補助循環法にも役立つと考え、現在投稿中である。今後、上記の基礎研究より臨床応用に直結するには、人間に最も類似した豚の心臓を用いて、洞調律下で心電図トリガーを用いた循環補助を行い、血行動態的に評価する。さらに心外膜腔内においてカフを伸縮させ、血行動態及び心外膜の耐久性を検討する。
有機絶縁材料のトラッキング劣化における酸性雨の影響

有機系絶縁材料は,電気的・機械的特性が優れているため、無機系材料に代わって配電機器材として広く使用されている.しかし有機絶縁材料は,トラッキング劣化やトリ-イング劣化などの有機系材料特有の絶縁劣化と絶縁破壊現象を起こすことが知られている.特にトラッキング劣化は,有機絶縁材料の信頼性と寿命特性を検討する上で非常に重要である.一方で,環境問題として公害の悪化,汚染物質の長距離越境輸送などによる酸性雨問題が注目され,これが屋外で使用される有機絶縁材料に及ぼす影響が懸念されている.本研究では以上の点を考慮し,有機絶縁材料の耐トラッキング性に及ぼす酸性雨の影響,劣化過程を総合的に検討し,その劣化機構を解明することを目的とした.その結果,酸性雨は有機絶縁材料の耐トラッキング性を大きく低下させることを示し,酸性雨が汚染物質としての外的要因で作用する場合と,荷電時の電解液として作用する場合の双方の影響とその劣化過程を明らかにした.また,それぞれのパラメータの経時変化を実験的見地から検討し,それぞれの劣化機構を明らかにした.有機系絶縁材料は,電気的・機械的特性が優れているため、無機系材料に代わって配電機器材として広く使用されている.しかし有機絶縁材料は,トラッキング劣化やトリ-イング劣化などの有機系材料特有の絶縁劣化と絶縁破壊現象を起こすことが知られている.特にトラッキング劣化は,有機絶縁材料の信頼性と寿命特性を検討する上で非常に重要である.一方で,環境問題として公害の悪化,汚染物質の長距離越境輸送などによる酸性雨問題が注目され,これが屋外で使用される有機絶縁材料に及ぼす影響が懸念されている.本研究では以上の点を考慮し,有機絶縁材料の耐トラッキング性に及ぼす酸性雨の影響,劣化過程を総合的に検討し,その劣化機構を解明することを目的とした.その結果,酸性雨は有機絶縁材料の耐トラッキング性を大きく低下させることを示し,酸性雨が汚染物質としての外的要因で作用する場合と,荷電時の電解液として作用する場合の双方の影響とその劣化過程を明らかにした.また,それぞれのパラメータの経時変化を実験的見地から検討し,それぞれの劣化機構を明らかにした.屋外に使用される有機絶縁材料は,様々な外的要因によって劣化を受けるが,その中でも公害の悪化等による酸性雨の影響は非常に大きいと思われる。本研究では,(1)酸性雨が電解液として作用した場合の有機絶縁材料の耐トラッキング性,(2)酸性雨により表面が劣化した試料の耐トラッキング性について検討を行った。以下にそれぞれの結果をまとめる。(1)酸性雨が電解液として作用した場合耐トラッキング性試験法はIEC Publication 587に従って行った。試験電圧は4.5kVとし,試料としてはポリプロピレン,ポリカーボネート,ABS樹脂,ポリスチレン,ポリエンカビニルを用いた。これらの試料に人工酸性雨溶液を電解液として流し,材料がトラッキング破壊に至るまでの時間について比較を行った。その結果,いずれの試料においても規定汚損液に比べ非常に短時間で破壊に至り,酸性雨は耐トラッキング性に非常に大きな影響を与えることが分かった。また,試験開始後30秒程度で試料表面に数百μmの亀裂が多数確認され,これは通常トラッキング破壊直前に試料表面に起こる現象であることから,人工酸性雨汚損液がトラッキング劣化現象を急速に加速していることを確認した。(2)酸性雨により劣化した試料の耐トラッキング性実験方法は(1)と同様であるが,汚損液には規定のものを用い,試料を(1)で用いたのと同様のものを20日間,45日間人工酸性雨中に浸漬し実験を行った。その結果,人工酸性雨に浸漬した全ての試料において耐トラッキング性の低下が認められた。また,人工酸性雨の影響は,表面の撥水性の低下およびクラックのような材料表面に生じる物理的損傷が中心であることを確認した。有機系絶縁材料は,電気的・機械的特性が優れているため,無機系材料に代わって配電機器材として広く使用されている.しかし有機絶縁材料は,トラッキング劣化やトリ-イング劣化などの有機系材料特有の絶縁劣化と絶縁破壊現象を起こすことが知られている.特にトラッキング劣化は,有機絶縁材料の信頼性と寿命特性を検討する上で非常に重要である.一方で,環境問題として公害の悪化,汚染物質の長距離越境輸送などによる酸性雨問題が注目され,これが屋外で使用される有機絶縁材料に及ぼす影響が懸念されている.本研究では以上の点を考慮し,有機絶縁材料の耐トラッキング性に及ぼす酸性雨の影響,劣化過程を総合的に検討し,その劣化機構を解明することを目的とした.その結果,酸性雨は有機絶縁材料の耐トラッキング性を大きく低下させることを示し,酸性雨が汚染物質としての外的要因で作用する場合と、荷電時の電解液として作用する場合の双方の影響とその劣化過程を明らかにした.また,それぞれのパラメータの経時変化を実験的見地から検討し,それぞれの劣化機構を明らかにした.
利用権設定による都市農地保全システムの研究

本年度は、昨年度に入力作業を行った、データベース(農地利用関係)を、利用し、都市農地の利用状況を分析した。その結果、農村部と都市部に共通して農地の作業委託の要求が多く、また受託組織の必要性が大きいことがわかった。そこで、主に農村において認定されている、特定農業法人の土地集積機能を都市農地の保全及び有効利用の為に生かせないか検討した。また、その視点での調査を行った。研究実績の概要作成時点では、最終的な分析が終わっていないが、できるだけ近いうちに結果を公表する予定である。今年度は、実施計画に基づき、特に(1)農地の持つ保全機能の明確化、(2)自治体へのヒアリング、(3)ヒアリング等で得られたデータの分類・整理を行った。当初予定していた農地が都市部に与えた影響の調査、および諸外国における都市内農地の活用事例の検討については、今年度の結果を踏まえた上で、来年度検討することにする。今年度の具体的な研究実績は、(1)農地の持つ保全機能としては、一番に保水あるいは治水能力があるという点、および都市環境(景観等)が維持される点を具体的データに基づいて明確化させた点である。(2)自治体としては、すでにヒアリング済みである埼玉県の草加市や越谷市、また都市部ではないが、農地の保全を法人がどこまで行えるかを検討するために島根県柿木村の特定農業法人の調査を行い多くのデータを得ることができた。そして、今年度最終的に一番力を注いだ作業は、(3)以上で得られたデータの分類整理(データベース化)であったが、これは来年度に都市農地保全システムの本格的検討を行う上で大変重要かつ必要なものとなる。
細胞形態・運動を基盤とした器官形成のロジック

神経管形成に着目し、個々の細胞レベルでのどのような変化がそのダイナミックな組織リモデリングを可能にするのか、その背景を分子、細胞、組織レベルに加え、物理的な力の生成をも含めて理解することを試みた。そして、神経管形成においては神経板内の細胞でアクチンおよび細胞接着分子の協同作用によって起こる頂端収縮、微小管の安定化・束化によって起こる細胞伸長が神経板の折りたたみに重要であることを明らかにした。加えて、神経板の外側(非神経外胚葉)では深層細胞が両側から積極的に背側正中線に向かって移動し、それにともない上層の細胞が背側に移動することが完全な神経管形成に必要であることを明らかにした。われわれヒトを含めた脊椎動物は、頭から体の背中側にかけて脳と脊髄から成る中枢神経系を持っている。中枢神経系の形成は、体の背中側にできる神経板と呼ばれる板状の組織が体の内側にくぼんで溝(神経溝)を作り、神経管と呼ばれる管状の構造に変形が引き金となっている。この神経管の形成運動はヒトからトリ、カエルに至る脊椎動物でほぼ同じように起こり、多くの脊椎動物に共通する、中枢神経系を作るための重要なステップであると考えられている。神経管形成時の神経板では、細胞の表層近くが大きく収縮してくさび形に変形する。この変形が個々の神経板細胞で起こることによって、神経板全体が体の内側にくぼんで神経溝を作る運動に変わる。本研究ではこの細胞形態の変化(細胞形態形成)の分子・細胞機構を明らかにし、神経管形成時に発生する力の予測をすることを目的とした。この細胞形態形成の過程では、アクチンタンパク質が頂端(表層)側に集積して、それが収縮することで神経板細胞がくさび形になると考えられている。本研究では、細胞膜上にある2種類の細胞接着タンパク質ネクチンとN-カドヘリンが相互作用すること、またそれらの協調によって神経板の細胞のアクチンが表層側に集積する仕組みを明らかにした(Morita, et al., Development, 2010)。また、それ自身は神経にはならない非神経外胚葉の管形成における役割についても解析を行い、非神経外胚葉の深層の細胞集団の背側への移動が神経管閉鎖に重要であることを見出した(論文準備中)。器官形成の基盤には個々の細胞の形態や機能の制御がある。したがって、マクロな器官形成現象のしくみを理解するためには、その背景にあるミクロな細胞や細胞骨格、集団としての運動ダイナミクスを理解し、そしてそれらがその上位の階層にある細胞集団としての組織・器官レベルの変化にどうつながるのかを読み解く必要がある。本研究ではこの階層を超えた制御機構のしくみを明らかにするために、神経管形成という脊椎動物の中枢神経系の根幹をなすダイナミックな形態形成運動をモデルとして、また管形成過程の観察が容易なアフリカツメガエルを用いて、細胞と組織・器官をつなぐ形態形成現象に着目して研究を進めた。本年度得られた成果のひとつは神経管形成における細胞運動と器官形成の力学的相互作用である。神経管の形態形成(管形成)の主たる原動力は神経上皮細胞の形態形成、すなわち立方体の形状からくさび型への変化であると考えられている。しかしながら、この細胞形態変化を阻害しても管形成はかなり進行することを見出した。これはニワトリではすでに報告されていたことであるが、本年度我々はその背景となる管形成の原動力の存在を直接神経系にはならない非神経外胚葉に求め、それを検証する研究を行った。その結果、上層、深層の二層からなる非神経外胚葉の上層は速いスピードで背側正中線に向かって移動しており、その際に細胞形態が変化し背腹軸方向に著しく伸長することを見出した。さらに、この上層運動の原動力は深層細胞が背側に自律的に移動しており上層は細胞接着を介して深層によって背側に牽引されていることを示した。この際、上層が深層から力学的な影響を強く受けていることをレーザー焼灼法による引張力開放実験などによって明らかにした。これらの結果により深層細胞の「動く歩道」モデルを提唱することができた(Morita,H.,Development 2012に報告)。H24年度途中から開始した、基礎生物学研究所・小山宏史博士との共同研究によって構築されたヴァーテックス(Vertex)モデルを用いた数理モデルの妥当性について、実際の実験・観察結果との整合性を検証するとともに、実データを数理モデルに還元し、in vivo現象を反映するより適切で、汎用性の高いモデルへ質を高めるための「観察データ-数理モデル循環」を目指して研究を進めた。H25年度はアフリカツメガエル胚を用いた実験による観察データの収集を中心に実施し、細胞骨格、とくにアクチン動態に着目した研究を行った。その結果、細胞内カルシウムの一過的上昇後、数分以内に細胞内の中央部にファイラメント上のF-アクチン(LifeActで観察可能)が観察されることがわかった。

また、細胞間接着とカルシウム伝播および細胞変形の関係について、モルフォリノによるE-カドヘリンのノックダウン実験を行った。このカドヘリン機能阻害により、カルシウム伝播および集合的細胞変形が阻害されたことから、F-アクチンの集積と同様に細胞間接着は細胞辺長に必須であることが分かった。現在、このF-アクチンダイナミクスを定量化し、数理モデルに取り入れることや、細胞接着の強度を変化させたシミュレーションを行っている。カルシウム結合時の蛍光変化が大きい遺伝子コード型プローブGECOを用いて、脊椎動物のモデルとしてのアフリカツメガエル神経管閉鎖時の細胞内カルシウム動態を観察し、その動態と閉鎖運動に大きく寄与する神経上皮細胞の変形(細胞形態形成)との関連について研究した。その結果、細胞内カルシウム上昇と頂端側の細胞辺が短くなり頂端側の細胞表面積が縮小する頂端収縮の間には時空間的に密接な相互相関があることがわかった。また、ケージドIP3を胚細胞内に注入し、その後紫外線(UV)照射によるアンケージングでIP3を活性化させ、局所的に細胞内カルシウムを上昇させることによって、人為的に細胞表面積を縮小させることができることを確認した。これらの結果より、カルシウム動態は神経管閉鎖時の細胞変形と機能的連関があることを示すことができた。H24年度はヴァーテックスモデルを用いてカルシウムによる細胞辺変形の数理的な力学モデルを構築することに注力し、細胞辺の長さに「ゆらぎ」を生じさせることによって、安定的に表面積が小さくなることがわかった。また、実際の神経上皮細胞の観察においてもショウジョウバエの原腸形成で観察されているような細胞辺長のゆらぎと細胞表面積の一方向性の縮小を確認した。加えて、同じくアフリカツメガエル胚を用いて原腸形成において組織間に生じる力の定量化に成功し、陥入する中胚葉を先導する細胞集団が後方に連結する中軸中胚葉を牽引し、中胚葉内に引張力を生んでいること、この引張力は正常な脊索形成に必須であることなどが明らかになった。H26年度は、細胞内カルシウム動態変化による頂端収縮(apical constriction)の駆動メカニズムを解明するための研究を行った。H25年度までに新規蛍光カルシウム検出プローブGECOを用いて、蛍光強度と細胞収縮率との相関、Ca2+の伝播と細胞収縮との時空間的相関およびオシレーションパターン(振動数/波長)と細胞頂端収縮との関連などについても詳細に解析された。とくに、ATP分解酵素を用いた実験から数十細胞にも広がる伝播性のカルシウム上昇には細胞外ATPを必要とすることも明らかになった。とくにアフリカツメガエル胚内に顕微注入したケージドATPをUV照射によってアンケージすることによって、細胞内カルシウム上昇を時空間制御可能な誘導系を確立し、限られた細胞、あるいは細胞集団だけに頂端収縮を誘導することを可能にした。当該年度(最終年度)はとくに、1.細胞内カルシウム上昇、2.細胞骨格ダイナミクス、3.細胞変形(頂端収縮)の3現象の相関に着目した観察・解析を行った。
右心不全に対するiPS細胞由来心筋細胞シートの有効性の検討

本研究では、右心不全に対するヒトiPS細胞由来心筋細胞シート移植による心筋再生治療の有効性を検討することを目的とする。ラットの肺動脈を絞扼することで右心室に圧負荷をかけ、これにより右心不全モデルを作成する。この右心不全モデルの右心室表面にiPS細胞由来心筋細胞シートを移植し、右心機能の改善効果を証明する。右室機能の改善を示すことができれば、小児重症心不全ならびに成人先天性心疾患合併心不全に対する新たな治療法として応用されることが期待される。
遺伝子解析による四肢先天異常・頭蓋骨早期癒合症の解明

頭蓋骨早期癒合症症候群のなかでも頻度が高く、四肢の異常も生じるApert症候群の遺伝子治療の検討を行った。遺伝子変異によって生じる異常タンパクに対する抗体の作製を行った。この抗体の中和活性を評価し、中和活性の認められた抗体を用いてApert症候群モデルマウスに対する治療効果を評価していく予定である。本研究では抗体の中和活性を評価する実験系の作製を行った。平成19年度の研究計画では頭蓋骨早期癒合症とその症候群の症例の血液検体、または組織検体を用いて遺伝子解析を行うことと、動物実験であった。1.当初の計画では本年度のApert症候群をはじめとする頭蓋骨早期癒合症と頭蓋骨早期癒合症症候群の方やご家族に研究目的を十分に説明した上で、血液検体を採取し、当院のDNA医学研究所にて遺伝子解析を行い責任遺伝子の変異を解析するものであった。しかし本年度は頭蓋骨早期癒合症の症例がいなかったため、動物実験を中心に研究をすすめた。遺伝子解析に関しては来年度も引き続き行う予定である。2.動物実験では実験動物に対しての遺伝子導入と、それによる実験動物の解剖学的組織学的変化の分析を予定しており、責任遺伝子の変異が既に報告されているApert症候群の遺伝子導入を予定していたが、他の研究グループが同様の動物実験を発表した。そのため研究方法を見直し、遺伝子変異を発現させた実験動物の治療後の解剖学的・組織学的変化を分析する手法に変更した。治療法としてはApert症候群の遺伝子変異のうち、第253番Pro残基がArgに置換されたマウスのFGFR2由来のペプチドに対して反応し、野生型ペプチドに対しては反応しない抗体の作製を考案した。MorphoSys社のファージディスプレイ人工抗体ライブラリー(HuCAL)のスクリーニングを行い、野生型FGFR2由来のオリゴペプチドに結合せず、P253R変異FGFR2由来のオリゴペプチドに特異的に結合する、4つのモノクローナル抗体株を得た。本研究の目的は、頭蓋骨早期癒合症症候群のなかでも頻度が高く、四肢の異常も生じるApert症候群の新たな治療法の検討である。平成20年度の研究実施計画は、前年度から行っている遺伝子変異によって生じる異常タンパクに対する抗体の作製と、その抗体を用いて治療効果を評価することであった。1.前年度から引き続き、Apert症候群の遺伝子変異のひとつである線維芽細胞増殖因子受容体2(FGFR2)P253R変異について、変異タンパクに特異的に結合する抗体の作製を行った。結果としてP253R変異をもつオリゴペプチドに対して特異的に結合し、野生型には結合しないモノクローナル抗体を4種類作製した。2.モノクローナル抗体の中和活性を評価できる培養細胞実験系の確立を行った。遺伝子内にFGFR2を含まない培養細胞を作製し、変異型のFGFR2と野生型のFGFR2のそれぞれを組み込む。それぞれの培養細胞の内、FGFR2が1カ所のみ組み込まれた培養細胞を選出し、培養した。現在は、培養細胞にモノクローナル抗体を作用させ、それぞれのモノクローナル抗体の中和活性の評価中である。今後は培養細胞を用いて、それぞれのモノクローナル抗体の中和活性を評価し、中和活性を認めたモノクローナル抗体を、Apert症候群モデルマウスに投与し、モデルマウスの胎仔の治療効果を評価していく予定である。本研究は、抗体を用いたApert症候群の子宮内治療の試みであり、モデルマウスによる治療効果が確認できれば、比較的迅速に臨床への応用が期待できると考える。
求核中心-ルイス酸中心集積型触媒による極性結合の協奏的活性化

本研究では,求核性およびルイス酸性という基本的な触媒機能を原子・分子レベルでの設計により複合化することで,両機能の協奏的発現を可能とし,従来の単一機能触媒を凌駕する高性能触媒を創出することを目的としている.本年度は,炭素-ハロゲン結合および炭素-酸素結合の活性化について反応機構および合成化学検討を行い,以下にまとめる成果を挙げることができた.(1)NiおよびPd触媒クロスカップリング反応におけるハロゲン化アリールの活性化機構:ハロゲン化アリールの低原子価遷移金属への酸化的付加は,触媒的クロスカップリング反応に含まれる重要な素反応であり,これまで錯体化学的な検討が精力的に行われてきた.一方で,実際の触媒反応の条件下における反応機構研究はほとんど行われていない.今回,ニッケルおよびパラジウム触媒によるハロゲン化アリールとグリニャール試薬のカップリング(熊田カップリング)における酸化的付加の機構について,速度論的同位体効果(KIE)を用いて検討した.その結果,酸化的付加の段階に金属と配位子の及ぼす影響を明らかにし,炭素-ハロゲン結合切断の遷移状態に関する知見を得た.(2)フェノール誘導体の高効率熊田カップリング反応:芳香族トリフラートは,反応性の高い擬ハロゲン化物としてクロスカップリング反応に汎用されるが,加水分解に弱く,かつ高価であるなどの欠点がある.そのため,トリフラートをより安価かつ安定なフェノール誘導体に置き換える試みが精力的に行われている.今回,ヒドロキシホスフィン配位子が芳香族カルバメートおよびホスフェートの熊田カップリングを著しく促進することを見出した.カルバメート,ホスフェートいずれの場合においても,以前報告されたNi(acac)_2のみを用いる条件に比べて触媒活性及び選択性の面で格段の向上が実現できた.本研究では,求核性およびルイス酸性という基本的な触媒機能を原子・分子レベルでの設計により複合化することで,両機能の協奏的発現を可能とし,従来の単一機能触媒を凌駕する高性能触媒を創出することを目的としている.本年度は,炭素-ハロゲン結合および炭素-酸素結合の活性化について反応機構および合成化学検討を行い,以下にまとめる成果を挙げることができた.(1)NiおよびPd触媒クロスカップリング反応におけるハロゲン化アリールの活性化機構:ハロゲン化アリールの低原子価遷移金属への酸化的付加は,触媒的クロスカップリング反応に含まれる重要な素反応であり,これまで錯体化学的な検討が精力的に行われてきた.一方で,実際の触媒反応の条件下における反応機構研究はほとんど行われていない.今回,ニッケルおよびパラジウム触媒によるハロゲン化アリールとグリニャール試薬のカップリング(熊田カップリング)における酸化的付加の機構について,速度論的同位体効果(KIE)を用いて検討した.その結果,酸化的付加の段階に金属と配位子の及ぼす影響を明らかにし,炭素-ハロゲン結合切断の遷移状態に関する知見を得た.(2)フェノール誘導体の高効率熊田カップリング反応:芳香族トリフラートは,反応性の高い擬ハロゲン化物としてクロスカップリング反応に汎用されるが,加水分解に弱く,かつ高価であるなどの欠点がある.そのため,トリフラートをより安価かつ安定なフェノール誘導体に置き換える試みが精力的に行われている.今回,ヒドロキシホスフィン配位子が芳香族カルバメートおよびホスフェートの熊田カップリングを著しく促進することを見出した.カルバメート,ホスフェートいずれの場合においても,以前報告されたNi(acac)_2のみを用いる条件に比べて触媒活性及び選択性の面で格段の向上が実現できた.
ヒトPeptide YY遺伝子の構造と染色体座位の決定

Peptide YYは消化管機能の調節因やインスリン分泌の抑制因子として働くペプチドルホルモンである。本研究の目的は、これまで不明であったヒトのPeptide YYの前駆体および遺伝子の構造を明らかにすることである。平成5年度の研究計画は、計画どおりに進行し、以下の様に期待された成果が得られた。1.ヒト結腸から抽出したRNAよりcDNAライブラリーを作製し、合成DNAをプローブとしてヒトPeptide YY前駆体cDNAを単離した。ヒトPeptide YY前駆体cDNAの全塩基配列をdideoxy法により決定した。これにより、ヒトPeptide YY前駆体の構造がはじめて明らかとなった。3.ヒトPeptide YY前駆体cDNAをプローブに、ヒトの種々の組織から抽出したRNAに対してnorthem blot analysisを行った結果、結腸ではPeptide YY遺伝子の発現が認められたが、これまで免疫染色等によりPeptide YYの存在部位とされてきた膵臓、胃粘膜では明らかな発現は認められなかった。ヒトのgenomic DNAライブラリーを作製し、ヒトPeptide YY前駆体cDNAをプローブにPeptide YY遺伝子を単離した。ヒトPeptide YY遺伝子の全塩基配列をdideoxy法により決定し、Neuropeptide Y、Pancreatic Polypeptideの遺伝子の構造と比較した。その結果、これら3つのペプチドルホルモンの遺伝子エキソン・イントロンの構成がよく保存されており、共通の祖先型遺伝子の重複によって生じたものと考えられた。
TDP43の自己調節機能に注目したALSの病態機序の解明

TDP-43はALSの病態の主体であるが,その機序の詳細は不明である.我々は, TDP-43の機能障害説にたち,その機能について解析し,ALSの脊髄運動神経細胞では,TDP-43の異常に伴い,核内小体が減少し,その機能障害によりU snRNAが減少することを示した.しかし,TDP-43が異常をきたす機序については解明できていない.本研究にてTDP-43の自己制御機構について検討し,TDP-43が自身のpolyadenylation signalを抑制し,その結果として,自己のスプライシングを誘導し,その量的制御を行っていること.患者運動神経細胞では,その制御が亢進していることを示した.TDP-43の蛋白量の制御機構として,TDP-43 mRNAの制御機構の理解が必須である.この機構として1エクソン6内のスプライシングによるナンセンス依存性mRNA分解機構polyAサイトの使い方をかえることにより細胞内局在を変化させ,2蛋白質として産生されるTDP-43の量を制御する,3mRNAの安定性を変化させる,という機構が考えられる.まず,エクソン6内のスプライシング機構に関わるシス(塩基配列),トランス因子(TDP-43を含むスプライシング因子)の解明を目的とした.特に本症の組織特異性を説明するためには,運動神経細胞のトランス因子の解明は重要である.まず,同領域のスプライシング多様体を解明するために,ヒト運動神経細胞,神経組織でTDP-43 mRNA多様体の有無を検討した.これで認められた多様体が,培養細胞でも再現することが可能か,同領域のミニジーン(TDP-43のエクソン6とその周囲のイントロン配列をもち,両端はSMN遺伝子のエクソンイントロン配列を持つ人工遺伝子)を作成し,培養細胞内でスプライシング,polyAサイトの決定機構を検討し.この制御機構を秋果かとした.さらに同領域のスプライシングに関係するシス因子を解明するために,スプライシングに重要な部位に変異を導入し,その影響を検討し,シス因子について明らかとした.また,ナンセンス依存性mRNA分解機構の関与について,ナンセンス依存性mRNA分解機構阻害剤であるシクロヘキシミド投与下,もしくは同機構に関連するUPF1の発現抑制下でTDP-43 mRNA量を検討しナンセンス依存性mRNA分解機構へ依存していることを示した.さらにこれらの制御機構について患者組織において検討を加えた.筋萎縮性側索硬化症(ALS)におけるTDP-43の病態を,TDP-43 mRNAの自己調節機構の障害から解明することを目的とする.TDP-43はALSの病態の主体であるが,その機序の詳細は不明である.我々は, TDP-43の機能障害説にたち,その機能について解析を進め,ALSの脊髄運動神経細胞では,TDP-43の異常に伴い,核内小体が減少し,その機能障害によりU snRNAが減少することを明らかにした.しかし,これらの異常の根本にあるTDP-43が機能障害をきたす機序についてはいまだ解明できていない.本研究ではTDP-43 mRNAの制御機構に焦点をあてて,その障害機序を解明し,ALSに対して“TDP-43 mRNAの制御"という,全く新しい治療法を提案するものである.今年度は,TDP-43のpolyadenylation signalの制御機構について検討し,TDP-43が自身のpolyadenylation signalの一部を抑制し,その結果として,自己のスプライシングを誘導するという知見を得た.その制御機構には,複数のスプライシング多様体が関与しており,その各々について,詳細な検討を加え.polyadenylation signalとsplicingを活用した自己蛋白量制御機構を明らかとした.小核酸を用いて,このスプライシングを阻害することにより,実際にTDP-43蛋白が増加することを,細胞を用いた実験にて明らかとした.筋萎縮性側索硬化症(ALS)におけるTDP-43の病態を,TDP-43 mRNAの自己調節機構の障害から解明することを目的とする.TDP-43はALSの病態の主体であるが,その機序の詳細は不明である.我々は, TDP-43の機能障害説にたち,その機能について解析を進め,ALSの脊髄運動神経細胞では,TDP-43の異常に伴い,核内小体が減少し,その機能障害によりU snRNAが減少することを明らかにした.しかし,これらの異常の根本にあるTDP-43が機能障害をきたす機序についてはいまだ解明できていない.本研究ではTDP-43 mRNAの制御機構に焦点をあてて,その障害機序を解明し,ALSに対して“TDP-43 mRNAの制御"という,全く新しい治療法を提案するものである.昨年度までは,TDP-43のpolyadenylation signalの制御機構について検討し,TDP-43が自身のpolyadenylation signalの一部を抑制し,その結果として,自己のスプライシングを誘導するという知見を得た.その制御機構には,複数のスプライシング多様体が関与しており,その各々について,詳細な検討を加えpolyadenylation signalとsplicingを活用した自己蛋白量制御機構を明らかとした.本年度は小核酸を用いて,このスプライシングをin vivoで阻害し,実際にTDP-43蛋白が増加することを明らかとしたTDP-43はALSの病態の主体であるが,その機序の詳細は不明である.我々は, TDP-43の機能障害説にたち,その機能について解析し,ALSの脊髄運動神経細胞では,TDP-43の異常に伴い,核内小体が減少し,その機能障害によりU snRNAが減少することを示した.しかし,TDP-43が異常をきたす機序については解明できていない.