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インドネシアにおける障害児教育開発の国際協力に関する研究

本研究の目的は、インドネシアで実施した実際の教育協力に基づいて、障害児教育における教育協力モデルを開発することであった。2004年12月、インドネシアのバンドン市にある知的障害養護学校と聾学校において協働研究授業を実施した。この協働研究授業では、日本とインドネシアの教師が互いに知的障害または聴覚障害のある児童生徒に授業を実施し、合計102名のインドネシアの障害児教育関係者(大学教員、校長、教諭、保護者)に公開した。授業後の協議会では、授業を参観した参加者が両国のgood practiceに目を向けて、よい授業の条件について検討した。参加者への事後アンケート調査の結果から、この協働研究授業が教師の質を向上させる手段として大変参考になったことが明らかとなった。上記のような協働研究授業に基づいた教育協力の方法を「協働研究授業方式」とし、国際教育協力の一つのモデルとして提案した。また、この「協働研究授業方式」を推進する方略として「拠点校方式」を提案した。「拠点校方式」とは、日本との協働研究授業を実施した学校が拠点校として近隣の学校を巻き込んで協働研究授業を開催し、広めていく方式である。本研究では、インドネシアでの経験を踏まえ、「協働研究授業方式」と「拠点校方式」に基づく次のような教育協力モデルを開発した。1.日本の大学で、途上国からの留学生等を受け入れ、将来のコーディネーターを育成する。2.帰国したコーディネーターの協力によって途上国の教育関係機関との協力関係を形成する。3.途上国の教育関係機関と協力して、協働研究授業を実施し、拠点校を育成する。4.途上国において、教育大学の障害児教育教員養成課程の充実やワークショップの開催を支援することでコーディネーターと拠点校を増やしていく。今後は、インドネシアでのデータ収集を継続するだけでなく、他の途上国において本教育協力モデルの有効性を検証する必要がある。本研究の目的は、インドネシアにおける障害児教育の状況を調査し、国際教育協力のあり方を検討することである。研究分担者を2グループに分け、8月と10月に実施した。8月の調査では9名が参加した。そのうちの5名は附属学校教諭であった。インドネシア教育省で障害児教育に関する基本的なデータを入手し、インドネシアにおける障害児教育の全体像を把握した。また、ジャカルタ、バンドン、スラバヤで合計8つの特殊教育諸学校を訪問した。その主な結果は以下のとおりである。1)就学している障害をもつ児童が全国で約5万人、全体の約5%であること。2)授業形式が講義型であること。3)施設・設備が未整備であること。例えば、補聴器、点訳用コンピュータと点字プリンタなどの機器の不足。4)就学している児童生徒の障害が軽度であること。5)早期教育が全体的に手薄であること。6)特殊教育諸学校は、公立よりも私立が多いこと。7)インクルーシブ教育を推進中であること。8)体育・スポーツに関する知識や情報が不足していること。10月の調査には研究協力者2名が参加し、教育省、ジャカルタ及びバンドンの4つの特殊教育諸学校で調査を行った。1名はインドネシアにおける障害児教育の歴史と教育制度を調査し、他の1名は盲学校で児童生徒の視力測定を実施した。その主要な結果は以下のとおりである。1)障害の重い児童生徒の教育機会を保障すること。2)僻地や離島の障害児教育を推進すること。3)非公務員の教師が約3割を占めていること。4)保有視力の有効活用が不十分であること。

インドネシアへの教育協力の1つとして、わが国の関係者が主導的するアジア障害者体育・スポーツ学会を2004年8月にバリ島で共同開催することになった。来年度は、今回の調査結果を踏まえて、国際教育協力の具体的な方策を検討する。本研究の目的は、インドネシアにおいて障害児教育分野の教育協力を推進するための方法及び方略を検討することであった。インドネシア教育省の発表では、障害のある児童生徒の就学率は約5%(5万人)であり、障害のある児童生徒の就学率がきわめて低い。特殊教育諸学校の大多数は私立学校であり、財団で運営されている。8月にバンドンのタルマサリ小学校を訪問し、障害のある児童生徒が健常の児童生徒と一緒に学習していることがわかった。タルマサリ小学校と盲学校で児童生徒にスポーツテストを実施した。9月には、バンドンの通常小学校で発達性協調運動障害について検査した。平成17年2月には、インドネシアにおける法整備に関する調査を実施した。以上のことから、学校間に格差があるばかりでなく、施設・設備も多様であること、教育環境に必ずしも恵まれていないが、財団の理事や校長、教員の教育に対する熱意は高いことがわかった。とくにわが国の指導案や研究授業に対して興味を示した。関係者との話し合いで、近い将来日本とインドネシアの教員が協働で研究授業を開きたいということになった。インドネシア教育省特殊教育局、インドネシア教育大学、西ジャワ教育委員会を訪れて意見交換をする中でも協働でわが国の研究授業方式を実施できる可能性がでてきた。その矢先に平成16年12月に文部科学省拠点システム構築事業(代表者:中田英雄)の一環として、バンドンの知的障害養護学校と聾学校で研究授業を開催した。研究授業の結果、教育協力モデル試案を作成することができた。この研究授業は2年間の科学研究費の研究活動が実って実現したといえる。平成16年9月に第42回日本特殊教育学会自主シンポジウムで成果を発表し、2005年5月に第6回発達性協調運動障害国際会議で成果を発表する。また、平成17年9月の第43回日本特殊教育学会自主シンポジウムで成果について協議する予定である。
チロシンキナーゼ阻害薬によるオートファジー調節作用の分子基盤と薬理応用

がんの分子標的薬として使用されるチロシンキナーゼ阻害薬TKIsには、オートファジー調節作用があることが報告されている。ゲフィチニブは上皮成長因子受容体EGFRに対するTKIsであり、オートファジー調節作用についてもEGFRを介した作用であると考えられてきた。しかし本研究者は、ゲフィチニブによるオートファジー調節が、EGFRを介した作用ではないことを明らかとし、さらに、ゲフィチニブによるオートファジー調節に関わる分子標的候補としてGAKを見出した。そこで本研究では、「TKIsによるオートファジー調節作用に関する分子機構の解明」を第一の目的とし、平成30年度には、以下の解析を行った。1)オートファゴソーム形成の解析のため、蛍光標識LC3B安定導入細胞株を用いた経時的なアッセイを行い、GAK発現を抑制することにより、細胞あたりのオートファゴソーム数が増加することが示された。2)オートファジーに関連する既知のシグナル経路(AKT, mTOR, AMPK, ULK1など)の変化について、特異的抗体を用いたイムノブロット法により解析を行い、GAKはオートファジーフラックスに対して抑制的な作用を示すことが示唆された。3)FLAGタグ付GAKを強制発現した細胞から、抗FLAG抗体での免疫沈降によって結合タンパク質を単離し、マススペクトル解析により、複数の結合因子を同定した。4)また、以上の解析とは別に、TKIsによるオートファジー調節作用を統合的に理解するため、機能性ナノビーズを用いて新規分子標的の探索を行い、マススペクトル解析により、複数の候補因子を同定した。オートファジー調節作用の分子標的候補GAKに関する解析が、当初の計画以上に進展しつつあったが、必要な消耗品のメーカー欠品や、血清切り替え後の確認実験の必要が生じたことから、平成30年度は結果的に、ほぼ計画通りの進捗状況となった。解析が進行しているGAKについて、オートファジーなどに関わる分子メカニズムの解析を進めるとともに、ゼブラフィッシュやモデルマウスでの検証も行う予定である。本研究は、オートファジーに関する学術的な発展だけでなく、TKIsの抗がん作用とオートファジー調節作用の切り分けを可能とし、神経変性疾患などに対する「オートファジー誘導療法」の確立にも結びつくと期待される。故障したPCの購入と、消耗品の追加購入のために前倒し申請を行った。PCの購入は済ませたが、予定していた消耗品がメーカー欠品となったため、年度内の購入は出来なかった。次年度、欠品している消耗品が調達され次第、購入する予定である。
微小管機能を制御する超分子形成とリガンド機能の解析

本研究では、微小管機能を制御する超分子形成について、コルヒチン部位およびリゾキシン/メイタンシン部位リガンドについて、チューブリン・阻害剤複合体の構造を解析して微小管機能を解明すること、および、作用機作に基づいた分子設計により新規生理活性物質の創製を図ることを目的としている。本年度は、リゾキシン/メイタンシン部位リガンド'ウスチロキシン'についての分子認識機構の解析を目指し、化学変換、化学合成研究を計画した。まず、フォモプシンAを含むこれら13員環ペプチド抗生物質中で最小のウスチロキシンDは、最小活性構造の解明を目的とする対象として最適な化合物であるので、これの供給のため、最も収量の多いAからの変換を試み、酢酸中PtO_2触媒存在下の還元により約50%の収率で得た。この還元反応ではベンジル位水酸基の脱離や芳香環の飽和した成績体も得られており、これらの反応を利用した構造/活性相関も検討中である。また、13員環ペプチド構造の各種ヴァリエーションを可能にするため、全合成法開発に着手し、最も単純なアミドエーテル13員環の構築に成功した。一方、強い細胞毒性を示す化合物として海洋らん藻から単離されたキャラシンA(J.Org.Chem.,59,1243(1994))は、4ヵ所の不斉を持つ比較的単純な構造の、全く新規なタイプの有糸分裂阻害剤である。そこで、未決定な立体構造の確定と作用機構解明および生理活性類縁体の開発を目指して全合成を企画し、3ヵ所の不斉を含む部分構造の立体異性体を4種(2ヵ所の相対配置は決定されている)を合成した。NMRおよび施光度から天然物の立体配置を限定し全合成への指針とするとともに、これらの活性の限定を行っている。
コンポジット生体触媒の構築と機能解析

コンポジット生体触媒の構成要素である鉄硫黄クラスターの形成機構の詳細を明らかにするとともに、新しいコンポジット生体触媒を開発し、種々の光学活性化合物の生産法を開発した。また、ピリドキサルリン酸を補酵素とするアミノ酸ラセミ化酵素など、コンポジット生体触媒の精密反応機構を解析した。主な研究成果は以下の通りである。1.鉄硫黄クラスターを構成する硫黄原子は、システインデスルフラーゼが触媒するL-システインからの硫黄脱離反応によって供給される。Escherichia coliのシステインデスルフラーゼIscSとSufS、ラン藻Synechocystis sp.PCC6803のシステインデスルフラーゼSsCsd3が関与する鉄硫黄クラスター形成機構の詳細を解析した。特に、クラスター前駆体形成の足場と考えられるタンパク質と、各種システインデスルフラーゼの相互作用を解析した。2.新奇NADPH酵素であるN-メチル-L-アミノ酸デヒドロゲナーゼを単離し、諸性質を明らかにするとともに、遺伝子をPseudomonas putida ATCC12633からクローニングして、高発現系を構築した。本酵素を用いて、医薬品、殺虫剤に含まれる光学活性N-メチル-L-アミノ酸をα-ケト酸とメチルアミンから合成するシステムを開発した。3.ハロゲン化不飽和化合物の炭素-炭素二重結合を不斉還元する新奇NADPH酵素を単離して諸性質を明らかにし、世界で最大級の需要がある除草剤の一つ、フェノキシプロピオン酸系除草剤の合成前駆体L-2-クロロプロピオン酸の新しい不斉合成法を開発した。本年度は、まず天然のコンポジット生体触媒と考えられ、呼吸や光合成における電子伝達などの機能を持つ鉄-硫黄クラスター形成機構について検討した。システインデスルフラーゼ(IscS)はL-システインから元素状の硫黄とL-アラニンを生成する反応を触媒する。その際、酵素の活性中心近傍に存在するループ上のシステイン残基が基質の硫黄を奪い、システインペルスルフィド中間体が生成する。この後、種々のタンパク質などにこの硫黄が転移し、最終的に鉄-硫黄クラスターなど様々な含硫化合物に硫黄が挿入される。一方、iscSと同じオペロン上にあり、鉄-硫黄クラスター形成に必須であるiscUの遺伝子産物(IscU)は、不安定で一時的な鉄-硫黄クラスターを持ち、同クラスター形成の足場となることが知られている。本研究では、iscSとiscUの共発現系の解析や、表面プラズモン共鳴により、IscSとIscUの間のタンパク質ムタンパク質相互作用の存在を明らかにした。さらに部位特異的変異などから、IscSとIscUが、IscSのCys328とIscUのCys63がジスルフィド結合を介して複合体を形成することを見いだした。以上の結果から、鉄-硫黄クラスター形成の初期過程では、(1)IscUとIscSはジスルフィド結合を介さず相互作用しており、(2)IscSがシステインを分解すると、IscSのループ上のCys328にペルスルフィドが形成され、(3)IscUのCys63とIscSのCys328の間にジスルフィドが生成するのに伴い、この硫黄が元素状硫黄として放出され(4)IscU上に鉄-硫黄クラスターが形成される、といった機構が考えられた。本年度はまたピリドキサルリン酸誘導体をハプテンとした抗体酵素の作製も試みた。本年度は、まず天然のコンポジット触媒と考えられる鉄硫黄タンパク質の形成機構について検討した。鉄硫黄クラスター形成の初発反応はシステインからの硫黄の遊離であり、システインデスルフラーゼと呼ばれるピリドキサル酵素によって触媒される。植物の葉緑体には、独自の鉄硫黄クラスター形成装置が存在し、葉緑体特有のシステインデスルフラーゼが中心的な役割を担うと考えられるが、その詳細は不明である。

そこで、葉緑体の起源であると考えられるラン藻を用いてクラスター形成機構の詳細の解明を試みた。そのため、ゲノム解析が完了したSynechocystis sp.PCC6803の持つ、葉緑体システインデスルフラーゼの相同酵素(SsCsd3)の諸性質を検討するとともに、鉄硫黄タンパク質への硫黄転移を仲介すると示唆されるNifUホモログ、IscAホモログとの相互作用を調べた。その結果、SsCsd3は、フェレドキシンの鉄硫黄クラスター形成において、Synechocystis sp.PCC6803の持つNifUホモログSyNifUと相互作用する可能性が示された。本年度はまた、新奇NADPH酵素であるN-メチルアミノ酸デヒドロゲナーゼ(NMAADH)の酵素学的研究を行った。NMAADHは、医薬品、殺虫剤に含まれる光学活性N-メチルアミノ酸をα-ケト酸とアルキルアミンから合成する反応を触媒する。本年度は、NMAADH遺伝子をPseudomonas putida ATCC12633から単離し、大腸菌にクローニングするとともに、遺伝子産物の大量発現と精製を行った。精製したNMAADHを用いて、基質特異性や各種基質に対する速度定数などを求めた。本年度は、まず鉄硫黄クラスター含有タンパク質の構築原理を明らかにすることを目的として、E.coliのSufタンパク質群による鉄硫黄クラスター形成機構の解析を行った。鉄硫黄クラスター形成においては、足場タンパク質SufA上に形成される不安定な鉄硫黄クラスターが、他のアポ型鉄硫黄タンパク質に転移されると考えられている。そこで、SufAの鉄硫黄クラスター再構成において、SufA以外のSufタンパク質群がどのような影響を与えるかを調べた。SufS+L-システインまたはNa_2Sを加えたものに比べて、SufS+SufE+L-ジステインを加えた場合に最も鉄硫黄クラスターの形成効率が高いことが明らかとなった。また、SufS+SufE+SufBCD複合体+L-システィン+ATPを加えた場合、一旦形成されたSufAの鉄硫黄クラスターが減少することが示唆された。このことは、SufAの鉄硫黄クラスターが他の鉄硫黄タンパク質に移行する過程にSufBCD複合体が関与する可能性を示唆すると考えられた。本年度はまた、新規鉄硫黄タンパグ質であるb2146とYeiAをE.coliに見出し、その機能解析を行った。b2146とYeiAを大腸菌により高発現させ、ニッケルキレートカラムにより精製した結果、ほとんどのタンパク質は鉄硫黄クラスターを保持していないアポ型タンパク質として発現された。スペクトル解析の結果、b2146は鉄硫黄クラスターとFADを、YeiAは鉄硫黄クラスターをタンパク質中に保持していた。嫌気条件下で鉄硫黄クラスターを再構成したb2146-YeiAはNADH依存性のジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ活性を示した。大腸菌野生株由来のタンパク質と、鉄硫黄クラスター形成能を欠くiscS欠損株由来のタンパク質を2次元電気泳動により分離し、比較した。その結果、iscS欠損株において発現量が低下している2つのタンパク質を見出した。N末端アミノ酸配列の解析の結果、それらのタンパク質はCytidine deaminaseとUridine phosphorylaseであった。
植物の光環境認識と低温応答のクロストーク機構

植物にとって重要な環境情報因子である光は単に明暗の識別だけでなく季節の変化や他の植物との競合を感知するためにも利用されている。我々はシロイヌナズナを用いてフィトクロム相互作用因子VOZ(Vascular plant one zinc finger protein)を単離し、その花成制御や低温応答における機能を解析した。細胞内局在の実験から核内に存在する転写因子VOZがフィトクロム下流における花成制御に関与することを示した。また、VOZは低温順化経路とは独立する経路を通して花成抑制因子FLCの発現を抑制し、最終的に花成の統合因子FTの機能を上昇させることを示した。植物にとって光は重要な環境因子であり、光を感度良く正確に識別する光受容体システムを発達させてきた。一方で、温度は光と密接に関連しながらも独自に変動する。光環境と温度環境を植物が感知し、統合して応答する仕組みの解明を目指した。光受容体フィトクロムは、相互作用因子を介して核内で転写因子の転写制御活性を調節する作用モデルが提唱されている。従来の研究は芽生えを中心に解析されてきた。我々は成長後期に作用する因子としてVOZを同定した。今年度は、この因子の環境における挙動を詳細に調べた。この分子と蛍光タンパク質との融合タンパク質の挙動から、蓄積するタンパク質の大部分が細胞質に存在すること、細胞の種類によって核局在が観察される場合もあることがわかり、転写因子としての単純な振る舞いとは異なるという結果を得た。細胞内局在の機能的な評価をするため、突然変異体が示す遅咲きの表現型の相補を指標に、核局在シグナルおよび核搬出シグナルを付与した遺伝子を突然変異体に導入して機能解析した。その結果、核の局在が変異体の相補、すなわち、分子機能には必須であった。これは、核内で積極的なタンパク質分解の機構があること、または、核外への搬出機構がありことを示唆した。そこで、次にプロテアソーム依存的タンパク質分解の阻害剤を与えて、ウエスタンブロットによってタンパク質の挙動を観察した。その結果、タンパク質分解によってタンパク質の蓄積が制御されていることがわかった。一方、低温順化能の有無、中温度域での低温誘導遺伝子発現、凍結耐性を指標に低温条件でのVOZタンパク質の機能を解析した。これらの解析は、安定した温度環境の設定が結果の再現性に重要であるため比較的時間がかかる。そこで、低温および凍結による電解質漏出の評価系を導入したところ、低温耐性と電解質漏出の減少の相関が見られた。移動能は環境を正確に識別し応答することで成長の最適化をはかる。この応答には発生の遺伝的プログラムの制御、つまり遺伝子発現制御を伴うものがある。生存を光合成に依存する植物にとって、光は種々の環境因子のなかでも最も主要な環境因子である。日長は、植物にとって季節変化を知るための安定した情報となりうる。また、自然界では光が単独の情報として変化することは少なく、温度変化も伴う。長期の低温である冬の訪れや夜間の温度低下は、光情報にもとづいて予想することが可能となる。これまでにシロイヌナズナのフィトクロムB相互作用因子として、Vascular Plant One-Zinc Finger Protein (VOZ)を単離し、栄養成長から生殖成長への転換である花成における機能を昨年度報告した。今年度は、VOZの花成における作用の低温経路との関連と低温耐性獲得における機能を中心に今年度の解析を進めた。VOZ1とVOZ2は冗長性にFLC遺伝子の発現抑制を介して、花成促進に機能すると考えられていた。これは長期の低温曝露による春化処理を与えることによって、voz1 voz2二重変異体の開花遅延が抑圧されたことから支持された。しかしながら、flc変異はvoz1 voz2表現型を抑圧しなかった。この原因はFLCのパラログの存在にあると考えられた。そこで、FLCパラログのMAF1からMAF5遺伝子の発現を解析したところ、FLCと同様の制御を受けていることがわかった。今回の結果はFLCクレードに属する遺伝子によって春化処理とVOZからの信号を統合することを示している。次に、voz1 voz2変異体の凍結耐性を調べたところ、長日低温順化条件において野生型より高い凍結耐性を示した。野生型では長日低温順化処理によってVOZタンパク質量の蓄積には変化がなかったことから、この過程にVOZタンパク質の安定性は関与しないことが示された。以上の結果からVOZが花成および低温順化の過程での成長制御に関与することが明らかとなった。植物にとって重要な環境因子である光は、単なる明暗の識別だけでなく、光質や季節の変化を感知するために利用されている。フィトクロム相互作用タンパク質VOZの遺伝子破壊系統の解析から、VOZが光質依存的な花成制御のみならず、環境応答に広く関わることを見出した。

VOZは転写因子として機能が期待されているが、タンパク質の局在観察では主として細胞質に局在していた。変異体の相補を指標に、核と細胞質のどちらの局在が機能に重要であるかを評価したところ、核の機能が重要であることが示された。つまり、安定に細胞質に局在するVOZが環境に応じて核移行するモデルが考えられた。次に抗体を利用してVOZのタンパク質としての安定性と挙動を調べた。VOZは細胞質では安定であるが、リン酸化によって制御されている可能性が示された。遠赤色光光照射により不安定化すること、この安定性にはフィトクロムが関与すること、phyA分子とphyB分子が共に関与することがわかった。VOZタンパク質の分解は、プロテアソームの阻害剤により抑制されたことから、積極的なタンパク質分解が制御に機能していることが示唆された。共免疫沈降およびBiFC法を利用してフィトクロムとVOZの相互作用部位を検出した。植物体内での相互作用が検出されるとともに、相互作用が細胞質で見られることがわかった。これらの成果は、The Plant Cell誌に論文として発表した。次に、生理学的および分子遺伝学的にVOZを介する生長相制御機構を解析した。遺伝学的解析から低温や個体齢による花成制御に関与するFLCを介する経路との関わりが示された。また、これまでの光質に加えて、光質と温度のクロストーク機構が注目し研究を進めた。花成および低温馴化表現型にVOZが影響を与える可能性が示された。光応答に関して細胞内局在の解析が順調に進展した。低温表現型の観察で低温枯死を指標にした実験では実験条件の設定に手間取っているが、溶液中の凍結処理を用いた電解質漏出測定法によって当初の目的は達成できた。25年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画では、1)VOZの作用機構の解明、2)VOZを介する生長相制御機構の解明、3)光と温度のクロストーク機構の解明、4)光受容システムを介する複合的環境応答機構の低温ストレス耐性への応用を計画した。研究期間の前半で計画した項目は、基本的に完了した。具体的には、項目1)では、VOZの細胞内局在の生化学的解析、VOZの細胞内局在の可視化による細胞学的検出、VOZ細胞内局在の機能的検証、VOZの時空間的発現の機能的検証を実施した。項目2)では、自律経路のFLC mRNAの発現解析、その遺伝学的検証を行った。もう一つの経路であるCOについてはmRNAレベルでの解析は完了したが、当初計画したタンパク質の検出は技術的に困難であった。項目3)では、a)光質と低温適応の生理的解析とVOZの遺伝解析を行った。その結果、低温感受性と概日リズムに関しては、低温誘導遺伝子の鍵となる転写因子CBFの発現が報告されているようなデータが得られず、明瞭な結果が得られていない。今後、実験条件の見直しを行う予定である。タンパク質の安定性に関与するアミノ酸残基の特定をすすめることによって研究をさらに深く展開する計画である。低温耐性についても、生育条件と低温耐性の関連に注目して展開する予定である。
ナノ表面構造によって光キャリア制御された高性能光触媒粒子の開発

「なぜ,特定の露出結晶面を有する形状制御された酸化チタン粒子が高い光触媒活性を示し,表面形態によって活性が変化するのか」を明らかにするために,我々によって開発された二重励起光音響分光法を用いることによって励起電子挙動の解析を行った。その結果,形状制御された粒子が高活性である理由は欠陥量のみでは説明できないこと,および,形状制御された粒子上では電子が蓄積した状態が形成されても,それが再結合中心として働いておらず,このことが高活性化の一因であると考えられる.「なぜ,特定の露出結晶面を有する粒子が高い光触媒活性を示し,表面形態によって活性が変化するのか」を明らかにするために,表面構造制御されたアナタース・ルチル・ブルッカイト型の酸化チタン粒子を水熱合成法により調製し,その表面形態(露出結晶面の種類・比率・粒子サイズ)がどのように光触媒反応の特性に寄与するかを考察した.本年度は,二重励起光音響分光法を粒子サイズ制御されたアナタース型十面体酸化チタンに適用し,その電子挙動の解析を行った.まず,結晶性の指標となる結晶欠陥量の定量を行ったところ,粒子サイズと欠陥量の間に市販の球状粒子と同様の負の相関関係がみられた.このことは,表面構造にかかわらず欠陥量は粒子サイズ(比表面積)によって主に支配されることを示唆している.従来,アナタース型十面体酸化チタンをはじめとする表面構造制御された粒子には結晶欠陥が少なくこれが高活性の一因と考えられてきたが,今回得られた結果は形状制御された粒子が高活性である理由は欠陥量のみでは説明できないことを意味している.一方で,電子の還元反応性についても検討を行ったが,粒子サイズとの還元反応性の間に明確な相関関係は見られなかった.また,赤外領域における電子の過渡吸収の情報を取得するための二重励起光音響分光法の改良にも着手した.近赤外領域の発光ダイオードを用いることにより,より浅い準位にトラップされた電子を検出することに成功した.今後,本手法を表面構造制御された酸化チタン粒子に適用していくとともに,より浅いエネルギー順位にトラップされた電子を検出するべくフーリエ変換型赤外分光装置と組み合わせた解析を行っていく予定である.「なぜ,特定の露出結晶面を有する形状制御された酸化チタン粒子が高い光触媒活性を示し,表面形態によって活性が変化するのか」を明らかにするために,我々によって開発された二重励起光音響分光法を用いることによって励起電子挙動の解析を行った。その結果,形状制御された粒子が高活性である理由は欠陥量のみでは説明できないこと,および,形状制御された粒子上では電子が蓄積した状態が形成されても,それが再結合中心として働いておらず,このことが高活性化の一因であると考えられる.表面構造制御されたアナタース・ルチル・ブルッカイト型の酸化チタン粒子を水熱合成法により調製し,その表面形態(露出結晶面の種類・比率・粒子サイズ)がどのように光触媒反応の特性に寄与するかを考察した.表面構造制御されたアナタース・ルチルの調製法においてはこれまでの研究結果より知見が得られているため,先ずブルッカイト型酸化チタンの調製法と,その表面形態とアセトアルデヒドの気相分解反応の活性の相関について検討を行った.表面構造制御されたブルッカイト型酸化チタンは,既報の調製法を改良することによって,{210}と{211}を露出結晶面として有するナノロッド形状の粒子を,アスペクト比を変化させて得ることに成功した.また,そのアセトアルデヒドの気相分解反応の光触媒活性は,ナノロッドのアスペクト比が変わることによって変化することを明らかにした.これは酸化反応面と還元反応面の比率が変わることに起因していると考えられる.さらに,二重励起光音響分光法を粒子サイズ制御されたアナタース型十面体酸化チタンに適用し,その光キャリア挙動を解析し,結晶性の指標となる結晶欠陥量の定量,および,還元反応性の評価をおこなった.しかしながら,表面形態と結晶欠陥量・還元反応性の間に相関関係は見られなかった.そこで,赤外領域における電子の過渡吸収の情報を取得し光キャリア挙動のさらなる解析を行うために,二重励起光音響分光法の改良に着手した.「研究の目的」の一つである酸化チタン光触媒の特定の露出結晶面の制御には成功しているが,その光キャリア挙動の解析においてはまだ不十分であるため,「現在までの達成度」はやや遅れていると判断した.今後の推進方策について,未検討の試料の評価とさらに以下の二項目を主軸に検討を行う.[光触媒活性評価]犠牲剤(硝酸銀,2-プロパノール)存在下における水分解の半反応(酸素生成,水素生成)を行うことによって,酸化反応・還元反応活性の評価を行う.[光キャリア挙動の解析]赤外領域における電子の過渡吸収の情報を取得し光キャリア挙動のさらなる解析を行うために,二重励起光音響分光法の近赤外領域への拡張およびフーリエ変換赤外二重励起光音響分光法の開発を行う.主に,本研究を推進するための消耗品費として利用することを予定している.
シロイヌナズナCGS1遺伝子における翻訳停止とmRNA分解機構の研究

リボソームで合成された新生ペプチドは,大サブユニットを貫く出口トンネルを通って出てくるが,出口トンネルを1/3ほど進んだところで,リボソームの大サブユニットを形成するタンパク質のうちRPuL4とRPuL22が出口トンネルに突き出ており,狭窄部位と呼ばれる。狭窄部位はリボソームと新生ペプチドとの相互作用部位として注目されている。RPuL4は,シロイヌナズナにおいて2つのパラログ遺伝子によってコードされる。シロイヌナズナCGS1遺伝子の翻訳停止における狭窄部位の重要性を調べるため,パラログ遺伝子の片方のノックアウト株に,FLAGタグを付けた野生型および変異型のRPuL4遺伝子を導入したトランスジェニック・シロイヌナズナ株を作出している。変異型のRPuL4遺伝子では,狭窄部位を構成するRPuL4のβ-ループのステムの両側部分にそれぞれ1アミノ酸欠失を導入している。昨年度に引き続き,シロイヌナズナCGS1遺伝子の,S-アデノシルメチオニンに応答した翻訳停止における出口トンネル狭窄部位の関与を,これらのトランスジェニック・シロイヌナズナ株に由来する試験管内翻訳系を用いて解析した。その結果,出口トンネル狭窄部位の関与を示すデータが得られた。このほか,真核生物で知られているそのほかのリボソームの停止系についても解析し,類似の結果を得た。また,これとは別に,パルス・チェース実験でリボソームの停止のタイムコースを追う実験系を確立した。この実験系を用いて,CGS1遺伝子のほか,真核生物で報告されているリボソームの停止について解析を行い,リボソームの停止を引き起こす遺伝子ごとに性質が異なることを明らかにした。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。リボソームで合成された新生ペプチドは,大サブユニットを貫く出口トンネルを通って出てくるが,出口トンネルを1/3ほど進んだところで,リボソームの大サブユニットを形成するタンパク質のうちRPuL4とRPuL22が出口トンネルに突き出た構造になっており,狭窄部位と呼ばれる。狭窄部位はリボソーム出口トンネルと新生ペプチドとの相互作用部位として注目されている。RPuL4は,シロイヌナズナにおいて2つのオルソログ遺伝子によってコードされる。片方のオルソログ遺伝子のノックアウト株に,FLAGタグを付けた野生型および変異型のRPuL4遺伝子を導入したトランスジェニック・シロイヌナズナを用いた解析を進めた。これまでの研究に引き続き,シロイヌナズナCGS1遺伝子のS-アデノシルメチオニンに応答した翻訳停止における出口トンネル狭窄部位の関与をシロイヌナズナ試験管内翻訳系を用いて解析した。これに加えて,CGS1以外の翻訳停止,ならびにリボソームの停滞に関する解析を行った。これにより,CGS1以外の遺伝子における新生ペプチドが関与したリボソームの停滞においても,出口トンネル狭窄部位が重要な役割を担っていることが示唆された。CGS1遺伝子の翻訳停止におけるシス配列であるMTO1領域と翻訳停止が起こるSer-94の間の数アミノ酸残基の領域の機能の解析を行った。この領域について,様々なアミノ残基の置換ならびに残機数を変えた変異を導入して,S-アデノシルメチオニンに応答した翻訳停止の効率を解析した。その結果,この領域がMTO1領域と翻訳停止位置の距離を決めるスペーサーとして機能する事を示唆する結果を得た。これまで翻訳停止もしくはリボソームの停滞において,出口トンネル狭窄部位の重要性が生化学的に示された例はない。これは,そのための実験系が存在しなかったためである。翻訳停止もしくはリボソームの停滞がおきた時に,新生ペプチドと出口トンネル狭窄部位が相互作用をしていると考えられることは,構造生物学的な解析によって示唆されていたが,いわば現象論の解釈であり,因果関係を考察するためには生化学的解析が必要である。本研究により,変異型リボソームを持つトランスジェニック・シロイヌナズナ株に由来するシロイヌナズナ試験管内翻訳系をもちいることで,生化学的な検証の道を開くことができた。

このほか,真核生物で知られているそのほかのリボソームの停止系についても解析し,類似の結果を得た。また,これとは別に,パルス・チェース実験でリボソームの停止のタイムコースを追う実験系を確立した。この実験系を用いて,CGS1遺伝子のほか,真核生物で報告されているリボソームの停止について解析を行い,リボソームの停止を引き起こす遺伝子ごとに性質が異なることを明らかにした。これまでに行ってきたCGS1遺伝子のS-アデノシルメチオニンに応答した翻訳停止の解析における生化学的解析の方法論を,出口トンネル狭窄部位に変異を導入したトランスジェニック・シロイヌナズナ株を利用した研究に摘要することで,翻訳停止における出口トンネル狭窄部位の関与を明確にする。また,これまでに作成したもの以外の変異をもつトランスジェニック・シロイヌナズナ株に広げた解析を推進する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
植物におけるアミロイド様蛋白質の金属生理学的役割の解明

アミロイドは、脳神経系疾患に関与する蛋白質である。金属イオンの存在下、天然変性状態からアミロイド凝集体へ変化する。しかし、生物におけるアミロイド形成の意義に関する定説はない。本研究は、植物にアミロイドに似た特性を有する蛋白質が存在し、それが、植物の重金属耐性に関与することを示した。すでに、本蛋白質は植物の種子に含まれ、種子が長期間乾燥に耐える現象に関わることが知られている。従って、アミロイド様蛋白質は、植物を含む生物に広く分布し、ストレス耐性に関わることが示唆される。本研究は、植物からアミロイド様の物性を示すタンパク質を見出し、その凝集メカニズムと生理機能を解明して、生物におけるアミロイドの意義を拡張しようとする試みである。H25は、本研究の中心的な年度である。計画通り、アミロイド候補遺伝子を10種選定したが、そのうち、大腸菌での発現に成功したのは3種であった。そのうち、比較的多量に調製できたAtHIRD11とRsDHNについて、凝集メカニズムとラジカル静止活性を調査した。まず、重金属存在下での二次構造変化を、円二色性、フーリエ変換赤外分光光度計で調査した。結果、意外なことに、植物の推定アミロイド様タンパク質は、重金属の存在下、不定形状態を保ったまま凝集することがわかった。これは、動物のアミロイドが、シート構造を形成しながら凝集することと対照的であった。一方、植物の推定アミロイド様タンパク質は、高いラジカル静止活性を示した。この凝集とラジカル静止との関連を、配列上の特性から解明するため、急きょ、すべてのヒスチジンをアラニンに変化させた変異AtHIRD11タンパク質を作出した。調査の結果、上記の凝集反応とラジカル静止活性がほぼ完全に失われた。これは、AtHIRD11のアミロイド的な性質は、配列中のヒスチジンの存在に依拠することを意味している。アルツハイマー病の原因の一つアミロイドβもまた、凝集にヒスチジンの関与が疑われており、アミロイド様タンパク質の物性変化には、おそらくは、動物と植物間で共通のメカニズムがあることが本研究で初めて推察された。このように、ヒスチジンが植物アミロイド様タンパク質の特性の鍵になっていることが予想できた。そこで、当初の予定通り、植物アミロイド様タンパク質の特性強化を目指し、ヒスチジン含量を高めたAtHIRD11を高発現させたシロイヌナズナを作出しており、現在、生理的実験に適したホモ化に取り組んでいる。H24年度では、植物アミロイド候補遺伝子データベースの完成を中心に行った。われわれが研究中のデハイドリン及び既知のアミロイド蛋白質の配列特性から、Hisを高含有する天然変性蛋白質は、植物アミロイドの良い候補遺伝子といえる。この観点から、シロイヌナズナの遺伝子データベースを利用し、His含有率の指標にしたアルゴリズムを適用し、シロイヌナズナの高His含量序列リスト、高His含量ドメインをもつ遺伝子リストを完成させた。このリストから、His残基が多く、天然変性スコアが高く、発現量が多いものを5個選択し、大腸菌発現用ベクターに組み込んだ。次年度では、これらの発現を進めたい。さて、今回、初めて作出された、シロイヌナズナの高His含量序列リストは、大変有用である。高His含量トップ10の遺伝子には、His含量が12%から19%に至る風変わりな遺伝子が列挙された。同時に、天然変性タンパク質と予測されたものが8遺伝子あった。Hisは重金属と結合する性質があるため、これらのタンパク質は、重金属結合型の天然変性タンパク質といえる。ところで、動物の脳神経疾患等の原因となるアミロイドもまた、重金属と結合して物性を変化させる天然変性タンパク質である。従って、上述の植物タンパク質は、アミロイドとしての特徴を有すると予想される。H25年度は、これらのタンパク質において、凝集メカニズムとラジカル静止作用について調査する。本研究は、植物からアミロイド様の蛋白質を見出し、その凝集メカニズムと生理機能を解明して、生物におけるアミロイドの意義を拡張しようとする試みである。本年度は最終年度に当たり、計画通り、植物アミロイドのモデルであるデハイドリンについて、凝集とラジカル静止に関与するHisリッチドメインが反復するよう分子設計した変異蛋白質を植物体内で発現させ、重金属耐性の強化が可能かを調査した。結果、野生株に対し、オリジナルのデハイドリンAtHIRD11を過剰に発現させると、銅に対する耐性が強化されたが、Hisリッチドメイン反復変異蛋白質を過剰に発現させても、銅に対する耐性は強化されず、むしろ、野生株と同等の銅耐性しか示さなかった。一方、His/Ala変換AtHIRD11を過剰発現させると、野生株と同等の銅耐性であった。

以上の結果は、優れた銅耐性を発揮するには、AtHIRD11が概ね最適であり、Hisリッチドメインの反復を増やすと、むしろ毒性が出ることを示している。つまり、植物アミロイドには、正負の二面性があり、His含有率が適度(H25年度の結果では1015%)である必要がある事を意味する。さらに、植物アミロイドの重金属耐性に関するメカニズム研究の一環として、重金属で失活した酵素の活性を、デハイドリンが回復するかを調査した。その結果、銅によって失活したLDHにアミロイド様蛋白質AtHIRD11を与えると、LDHの活性が元のレベルにまで回復することが分かった。しかし、HisをAlaに変換したAtHIRD11には、そのような活性は見られなかった。植物アミロイド様蛋白質には、重金属によって阻害される酵素の活性回復に役立つものがあることが示唆された。関連成果は、専門誌のレビューなどで積極的に報告した。植物ストレス生理学植物の推定アミロイド様タンパク質は、重金属の存在下、不定形状態を保ったまま凝集するという、これまでの動物で議論されてきたアミロイドの凝集メカニズムとは異なる特性を発見できた。さらに、計画では想定できなかったヒスチジンの関与が見えてきたので、急きょ、ヒスチジンに変異を加えた変異タンパク質を作出し、アミロイド的な特性の抑止を初めてとらえることができた。これらは、想定以上の発展である。一方、10遺伝子すべてをタンパク質として調製しようとしたが、3種のみとなった点が不十分といえる。しかし、タンパク質発現の成功の可否には不確定な要素があり、やむを得なかったとみている。総じて、上記の評価とした。本研究のスタートとして、植物アミロイド候補遺伝子データベースを完成させる必要があり、H24年度はその完成を目標とした。期間内にデータベースが完成し、具体的な植物アミロイド候補遺伝子を選択することが出来たので、概ね順調と評価した。H25年度では、当初の計画通り進めることができた。多少意外な展開もあったが、大変興味深い結果が出たとみている。次年度は、基本的に、計画に即して進めたい。現在、植物アミロイド様タンパク質に関し、ヒスチジンの含量を変化させた変異遺伝子を作出し、それを高発現させた植物の育成が最終段階にある。26年度には、その形質転換植物の重金属に対する生理反応を調査し、植物アミロイドの生理的意義を打ち立てたい。上記のように、研究は、概ね計画通りに進んでいる。現状では、H25年度以降、研究計画を変更する必要はないと考えている。H25年度では、計画通り、候補タンパク質の凝集化メカニズム試験とラジカル静止活性の測定を実施する。経費は、主に消耗品(試薬、キット、プラスチック器具類)に充てる。次年度の終盤には、本研究の前半にあたる部分の成果がまとまるので、学会発表と英語論文執筆を行いたい。従って、旅費と英文校正に関する経費を計上する。
モジュライ空間と可積分系の新しい展開

当該研究期間において,稲場,岩崎,齋藤は,射影直線上の高々n点で確定特異点をもつ階数2の安定放物接続のモジュライ空間とそのコンパクト化を定義し,モジュライ空間の非特異性をしめした.またn点を除いた射影直線の基本群の表現のモジュライ空間を構成し,接続のモジュライ空間から表現のモジュライ空間へのリーマン・ヒルベルト対応が全射かつ固有な双有理写像であることをしめした.さらに稲場は,プレプリントにおいて,任意の非特異曲線の一般階数の安定放物接続のモジュライ空間についても上記の結果を拡張し,確定特異点の場合のモノドロミー保存変形の基本定理を完成させた.さらに不確定特異点を許す場合の理論の完成が期待される.山田,野海は,太田,増田,梶原らとともに楕円差分パンルヴェ方程式の幾何的な記述と,それを用いた楕円超幾何解の構成,および,その退化した場合への拡張を行った.岩崎は,上原崇人(九大数理)と共同で,パンルヴェ第VI方程式の代数幾何学的定式化と代数曲面上のエルゴード理論をリーマン・ヒルベルト対応で結びつけることにより,パンルヴェ第VI方程式の非線形モノドロミーが殆どのループに沿ってカオス的であることを示した.細野はDoranとの共同研究では,あるクラスのカラビ・ヤウ超曲面について,その周期積分の振動積分表示(ランダウ・ギンツブルグ表示)を作り,それが満たす不確定特異点型の微分方程式を決定した.さらに,積分に付随する接続問題(ストークス係数)を解き,ミラー対称性の視点から自然な解釈が成立することを観察した.吉岡は,中島啓とインスタントン数に関するネクラソフ予想を証明を得た.また,Lothar Gottsche,中島啓との共同研究において,Donaldson不変量の壁越え公式を有理曲面でかつモジュライが滑らかな場合に得て,さらにその結果の拡張を行った.深谷は,小野,太田,Ohとともにラグランジュ部分多様体のフレアー理論についての書物を書いておりほぼ完成している.当該研究期間において,稲場,岩崎,齋藤は,射影直線上の高々n点で確定特異点をもつ階数2の安定放物接続のモジュライ空間とそのコンパクト化を定義し,モジュライ空間の非特異性をしめした.またn点を除いた射影直線の基本群の表現のモジュライ空間を構成し,接続のモジュライ空間から表現のモジュライ空間へのリーマン・ヒルベルト対応が全射かつ固有な双有理写像であることをしめした.さらに稲場は,プレプリントにおいて,任意の非特異曲線の一般階数の安定放物接続のモジュライ空間についても上記の結果を拡張し,確定特異点の場合のモノドロミー保存変形の基本定理を完成させた.さらに不確定特異点を許す場合の理論の完成が期待される.山田,野海は,太田,増田,梶原らとともに楕円差分パンルヴェ方程式の幾何的な記述と,それを用いた楕円超幾何解の構成,および,その退化した場合への拡張を行った.岩崎は,上原崇人(九大数理)と共同で,パンルヴェ第VI方程式の代数幾何学的定式化と代数曲面上のエルゴード理論をリーマン・ヒルベルト対応で結びつけることにより,パンルヴェ第VI方程式の非線形モノドロミーが殆どのループに沿ってカオス的であることを示した.細野はDoranとの共同研究では,あるクラスのカラビ・ヤウ超曲面について,その周期積分の振動積分表示(ランダウ・ギンツブルグ表示)を作り,それが満たす不確定特異点型の微分方程式を決定した.さらに,積分に付随する接続問題(ストークス係数)を解き,ミラー対称性の視点から自然な解釈が成立することを観察した.吉岡は,中島啓とインスタントン数に関するネクラソフ予想を証明を得た.また,Lothar Gottsche,中島啓との共同研究において,Donaldson不変量の壁越え公式を有理曲面でかつモジュライが滑らかな場合に得て,さらにその結果の拡張を行った.深谷は,小野,太田,Ohとともにラグランジュ部分多様体のフレアー理論についての書物を書いておりほぼ完成している.稲場、岩崎、齋藤は,射影直線上の高々n点で確定特異点をもつ階数2の安定放物接続のモジュライ空間とそのコンパクト化を定義し,モジュライ空間の非特異性をしめした.また、同様に射影直線からn点を除いた直線の基本群の表現多様体を構成し,接続のモジュライ空間から表現のモジュライ空間へのリーマン・ヒルベルト対応が全射かつ固有な双有理写像であることをしめした.接続のモジュライ空間の非特異性、正則シンプレクテック構造の存在からリーマン・ヒルベルト対応が表現のモジュライ空間のシンプレクテック特異点解消を与えている事が示される。さて、確定特異点の位置を動かすことによって,接続のモジュライ空間のファミリーの上に,モノドロミー保存変形のフローが得られ,それから非線形の微分方程式系が得られるが、この微分方程式系が良い性質(パンルベ性)を持つことの幾何学的かつ自然な証明が得られた.さらに稲場は、任意の非特異曲線の一般階数の安定放物接続に結果を拡張し,確定特異点の場合の基本定理は完成した.これにより、点付曲線のモジュライ空間を独立変数の空間と思う非線形微分方程式が原理的には得られるが、その具体的解析は未解決である.野海・山田は、qパンルベ方程式の超幾何的特殊解の構成とその詳しい記述に成功した.深谷はFloer理論の研究を発展させた.

また、齋藤と深谷はミラー対称性の幾何学的根拠を説明するStrominger・Yau・Zaslow予想に関するKontsevichの論文を検討するセミナーを主催した.また齋藤は,大学院生とともに放物Higgs場のモジュライ空間の構成,およびその上の可積分系について研究した.齋藤は,上記の結果について韓国高等研究所における2回の国際研究集会において研究発表を行った.稲場・岩崎・齋藤は前年度までに、すでに射影直線上の高々n点で確定特異点をもつ階数2の安定放物接続のモジュライ空間とそのコンパクト化を定義し,モジュライ空間の非特異性をしめし、また射影直線からn点を除いた直線の基本群の表現多様体を構成し,接続のモジュライ空間から表現のモジュライ空間へのリーマン・ヒルベルト対応が全射かつ固有な双有理写像であることをしめした.接続のモジュライ空間の非特異性、正則シンプレクテック構造の存在からリーマン・ヒルベルト対応が表現のモジュライ空間のシンプレクテック特異点解消を与えている事が示される.さて、確定特異点の位置を動かすことによって,接続のモジュライ空間のファミリーの上に,モノドロミー保存変形のフローが得られ,それから非線形の微分方程式系が得られるが、この微分方程式系が良い性質(パンルベ性)を持つことの幾何学的かつ自然な証明が得られた.さらに稲場は、任意の非特異曲線の一般階数の安定放物接続に結果を拡張し,確定特異点の場合の基本定理は完成した.これにより、点付曲線のモジュライ空間を独立変数の空間と思う非線形微分方程式が原理的には得られるが、その具体的解析は未解決である.現在、稲場、岩崎、齋藤は熊本大学の原岡、オランダ、Groningen大学のMarius van der Putらと、これらの結果を非特異曲線上の不確定特異点を持つ場合に拡張する試みを行っている.不確定特異点の形式標準形の理論、Stokes乗法因子のモジュライの構成が代数幾何的に整備されつつある.野海・山田は、qパンルベ方程式の超幾何的特殊解の構成とその詳しい記述に成功した.齋藤、野海、山田は国内外の可積分系研究者を集めて神戸大学で国際ワークショップを開いた.深谷はFloer理論の研究を発展させ、またミラー対称性との関係を研究した.吉岡は、中島啓とインスタントン数の数え上げに関するNekrasov予想を解決した.齋藤は,上記の結果についてイタリアのTriesteのSISSAにおける国際学会で招待講演を行った.また、ドイツのMannheim大学のC.Hertlingと,Groningen大学のMarius van der Putを訪問し、主催するセミナーで講演し、上記研究について討論を行った.稲場,岩崎,齋藤は確定特異点のみをもつ安定放物接続のモジュライ空間およびモノドロミー表現のモジュライの構成,そしてリーマン・ヒルベルト対応の解析における前年度までの基本理論の完成を受けて,本年度は理論を不確定特異点の場合に拡張する事を行った.しかしまだ論文を完成させるに至っていない.一方,齋藤は微分方程式のパンルヴェ性について,相空間のコンパクト化について幾何学的な解釈を得た.また,幾何学的ラングランズ対応との関係を,ペンシルベニア大学のRon DonagiおよびTony Pantevと議論した.山田,野海は,太田,増田,梶原らとともに楕円差分パンルヴェ方程式の幾何的な記述と,それを用いた楕円超幾何解の構成,および,その退化した場合への拡張を行った.
涙液油層の動態特性を決定するマイボーム腺脂質の分子機構の解明

ソフィア大学のGeorgiev博士の研究協力により、マイボーム腺脂質の粘弾性特性を調べ、健常な脂質では、弾性が優位であり、異常な脂質では粘性が優位であることを見出した。これは、涙液油層が蒸発亢進を抑制することにより涙液層の破壊を防ぐという説に再考を求めるものである。また、涙液層が下方視から正面視に戻る眼球運動時に破壊しやすいことおよび涙液層の破壊パターンに5つの種類があることを見出し、5つの破壊パターンを定量的に評価するトポグラフィーのシステムを開発した。眼表面を構成する涙液層は、最表面の油層とその直下の液層とからなり、油層は主にマイボーム腺の脂質に由来し、非極性脂質と極性脂質との2層で構成される。涙液油層は、早い瞬目運動に呼応して再現性よく伸展・収縮を繰り返し、涙液層の形成およびその安定性の維持、液層の水分の蒸発抑制に働き、眼表面の上皮細胞の乾燥保護、平滑な眼光学面の形成、ひいては視機能の維持に重要な役割を果たしている。平成25年度は、健常眼ならびにマイボーム腺機能不全の涙液層を含む眼表面の解析後、採取した脂質をソフィア大学生化学教室にて解析し、健常な脂質においては、そのレオロジー(粘弾性)特性において、弾性成分の割合が大きく、粘性の成分の割合が小さいこと、一方、マイボーム腺機能不全眼の脂質においては、その比率が逆転していることを見出し、このことが涙液油層動態ならびに涙液破壊に関係しているのではないかという仮説を打ち立てることができた。また、健常眼において、瞬目運動や眼球運動における涙液層の動態解析を行うと共に、各種のドライアイを対象として、涙液層の安定性解析法の比較検討や涙液破壊パターンの分類とその解析を行った。その結果、健常眼においては、水平方向の眼球運動に対して、油層と液層からなる涙液層が角膜表面と一体化しているという涙液層の『Fluid shell』仮説を打ち立てることができた。その一方で、下方視から正面視に戻る眼球運動においては、角膜下方の液層がしばしば急速な菲薄化を示すという新事実を発見した。さらに、涙液層の安定性解析法の比較では、フルオレセインによる評価法が最も感度が高く、トポグラフィーによる方法が低いこと、ならびに、涙液破壊の分類では、4つの涙液破壊が区別でき、それらが独立している可能性を明らかにした。角膜表面を覆う涙液層は、表面の油層と直下の液層に分けられるが、液層には、結膜の杯細胞から分泌される分泌型ムチンが混じり、開瞼時には、ゲル層を形成している可能性がある。平成25年度の研究により、角膜上の涙液層の液層が油層をその表面に乗せたまま、水平方向の衝動性眼球運動(サッケード)に対しては、一体(Fluid shellと命名)として振る舞うこと、ならびに下方のサッケードに対しては、涙液層の安定性が影響を受けることを見出したが、平成26年度は、健常眼を対象に、液層の水分増加(水分の点眼により与えた)における、油層および液層の振る舞いについて検討し、水分増加により、水平方向のサッケードでも油層、および、液層に動きが生じることが見出された、また、トポグラフィーにより、サッケードが視機能に及ぼす影響を検討し、下方のサッケードにおいて、有意に視機能への影響が大きいことを明らかにした。一方、平成25年度に見出した4つの涙液層の破壊パターン分類を平成26年度にはさらに進め、もう一つの破壊パターン(dimple break)を見出し、それが、BUT(breakup time)短縮型ドライアイの一型をなす可能性を明らかにした。さらに、涙液層のトポグラフィーは、広い範囲で、涙液層の表面形状の異常を検出でき、視機能評価につながるため、平成26年度は、涙液層の破壊パターンの分類が可能なビデオトポグラファーの開発にも着手した。一方、涙液油層動態のin vitroでの検討では、平成26年度も引き続きソフィア大学生化学教室の協力を得ながら、界面化学の手法を用いて、ヒトと同様の瞬目を示す動物(ネコとイヌ)のマイボーム腺脂質の粘弾性特性を解析し、同様の挙動を示すことを見出した。また、角膜上皮の水濡れ性や涙液蒸発量の評価についての新しい方法の開発についても着手した。角膜上の涙液層は、油層と液層からなり、液層には、結膜の杯細胞から分泌される分泌型ムチンが混じり混むことで、開瞼時に、ゲル層として振る舞う可能性がある。平成25年度の研究により、角膜上の涙液層の液層が油層をその表面に乗せたまま、水平方向の衝動性眼球運動(サッケード)に対して、一体(Fluid shellと命名)として振る舞うこと、ならびに、下方のサッケードに対しては、涙液層の破壊が引き起こされやすくなることを見出した。平成26年度は、液層の水分増加(水分の点眼で生じうる)における、油層および液層の振る舞いについて検討し、水分増加により、水平方向のサッケードでも、涙液層に流動性が生じ、ゲルとして振る舞わなくなることを見出した。また、サッケードが視機能に及ぼす影響をビデオトポグラファーで検討し、下方のサッケードにおいては、視機能への大きな影響が生じうることを明らかにした。