hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脊髄損傷後の内因性神経幹細胞単離・抽出の試み

セッシ圧迫法で作成した脊髄損傷の3日後から細胞を分離培養したところ、蛍光法を用いた細胞免疫染色やRNAを用いた解析では脳傷害誘導性多能性幹細胞(injury-induced multipotent stemcells: iSCs)や血管周皮細胞と似た性質を有し、多能性幹細胞の可能性が示唆された。)および血管周皮細胞に近い遺伝子背景を有していることが確認できた。今後、分化能や幹細胞マーカーの発現の解析を予定としている。また、脊髄損傷時、神経線維延長を阻害する一つとして瘢痕形成(Scar formation)部にペリサイトが集積していることは報告されており、それらとの相違も検討する。今年度は脊髄損傷モデル作成のために手術場所の確保、麻酔器の準備などから始めた。また脊髄損傷モデル作成の手順について論文を収集し、現在多数あるモデルのうちから頻用されており、かつ一般的なモデルを採用した。その作成手順を元に脊髄損傷モデル作成装置を業者に依頼して、複数の候補を試したうえで購入した。実際にマウス(CB-17)を用い、脊椎損傷モデルを作成して神経障害の検討を行った。手技に慣れないうちは、手技時間が長くかかるため、過鎮静となり死亡することもあったが、手技の習熟に伴い死亡例は著明に減少した。周術期の問題が無ければ、神経症状としての両下肢の麻痺症状の出現を確認することができた。次に実際に組織に与えられた衝撃・傷害に不均一性が生じていないかについて、作成装置上で、圧計測を行い確認した。手技としては問題なく、圧挫傷モデルの作成が可能であることを確認した。現在は本来の目的である、脊髄損傷部位からの傷害誘導性神経幹細胞の分離培養を開始したが、神経幹細胞の分離には至っていない。そこで、この分離培養実験の元となっている脳梗塞組織からの細胞障害性神経幹細胞の分離培養手順についてもう一度見直し、実際に脳組織からは神経幹細胞が得られることを再確認した。同様の手順を用い脊髄損傷組織からの分離培養を行う予定としている。また、行動学的評価の基盤形成のため、姉妹校である兵庫医療大学へ訪問し、神経機能評価系の研究分担者とプロトコルの協議、確認を行った。脊髄損傷モデルは多数存在するため、臨床に近いモデルの選定に時間を要した。また脊髄損傷を確実に作成するため、機器の選定にも時間を要した。脊髄損傷モデルの作成自体は容易と考えていたが、実際に行うと意外と時間を要し、その手技習熟までにも時間を要した。さらに実際に脊髄損傷モデルを作成し、傷害誘導性神経幹細胞の培養を行ったが、うまく誘導することに成功できていない。培養条件などの再確認を行ったためにここでも予定より遅れが生じている。本年度はCB-17/Icr-+/+Jclマウス(日本クレア)を用い、圧挫傷脊髄損傷モデルを作成した。昨年度のような手技習熟不足に起因する、麻酔・過鎮静による死亡は減少した。また周術期に特に問題が無ければ、神経症状としての両下肢の麻痺症状の出現を確認することができた。上記より、実験モデル動物の作成は概ね完了したと考えられる。また本年度は本来の目的である、脊髄損傷部位からの傷害誘導性神経幹細胞の分離培養を目指した研究を開始している。現在は脊髄損傷後3-4日後に損傷脊髄を採取し、分離培養を試みているが、傷害誘導性幹細胞の分離同定には至っていない。この分離培養実験の元となっている脳梗塞組織からの傷害誘導性神経幹細胞の分離培養法においては、脳梗塞後3日から5日の間の脳梗塞組織の培養により傷害誘導性神経幹細胞が得られる。その細胞は神経幹細胞マーカーであるNestinおよびSox-2を発現しているため、これらのマーカーを指標としている。また頭部外傷後の細胞傷害性神経幹細胞の誘導については、当科ではその分離培養について確認していないが、同様の報告は認められることから、理論上は分離培養可能と考えられる。次年度は、組織採取時期の検討(受賞後1週間程度)、現在のインパクターの他、鉗子を用いたモデルや切断モデルといった、他の脊髄損傷モデルでの検討を追加する。また外傷というメカニズム自体で傷害誘導性幹細胞が誘導されるか否かを検討するため、脳挫傷モデルにより神経外傷後に傷害誘導性幹細胞が誘導されるか否かの検討も考慮している。脊髄損傷モデルの作成に関しては、概ね問題ないと考えているが、傷害誘導性幹細胞の同定には至っていない。C57BL/6Jマウスを用い、セッシ圧迫法にて再現性の高い脊髄損傷モデルを確認した。脊髄損傷3日後と7日後の損傷脊髄を採取し、分離培養したところ、損傷3日後から細胞群を抽出することができた。脊髄傷害誘導性幹細胞の可能性があり、蛍光法を用いた細胞免疫染色では、Nestinを強く発現し、その他Tuj1やSox2の発現も一部認められ、ペリサイトマーカーであるPDGFRβもNestinと共発現を認められた。同様の再現性実験にても、脊髄損傷組織から細胞群を分離培養が確認できている。また、Sham群では細胞群は分離できず、幹細胞誘導には傷害が必要であることを確認した。脳では脳虚血で誘導されていたが、今回は外傷に伴う刺激でも誘導されかつ脊髄でも作成できることの証明となり得る。また神経管周囲に存在するとされている神経幹細胞とiSCsの区別のためにペリサイトマーカーなどを用いて検討を加えると共に、分化能につき解析を予定としている。

一方、脊髄損傷時、神経線維延長を阻害する一つとして瘢痕形成(Scar formation)部にペリサイトが集積していることは報告されており、それらとの相違も検討し脊髄損傷時のメカニズム解明についても考察していく予定である。セッシ圧迫法で作成した脊髄損傷の3日後から細胞を分離培養したところ、蛍光法を用いた細胞免疫染色やRNAを用いた解析では脳傷害誘導性多能性幹細胞(injury-induced multipotent stemcells: iSCs)や血管周皮細胞と似た性質を有し、多能性幹細胞の可能性が示唆された。)および血管周皮細胞に近い遺伝子背景を有していることが確認できた。今後、分化能や幹細胞マーカーの発現の解析を予定としている。また、脊髄損傷時、神経線維延長を阻害する一つとして瘢痕形成(Scar formation)部にペリサイトが集積していることは報告されており、それらとの相違も検討する。今後手術手技の標準化、安定したモデルマウスの作成のため、他施設への研修を含め、検討している。脳梗塞モデルにては発症数日程度で脳梗塞部位および境界領域に神経幹細胞の集簇を確認しているため、脊椎損傷モデルマウス作成手技が確立後、損傷数日を目処に病理学的検討及び、脊髄組織からの幹細胞分離培養を行う予定である。神経管周囲に存在するとされている神経幹細胞と傷害誘導性幹細胞(injury induced-Neural Stem/Progenitor Cells: iNSPCs)の区別のためにペリサイトマーカーなどを用いて検討を加える予定としている。さらには髄鞘を形成するアストロサイトやオリゴデンドロサイトへの分化の検討を行い、脊髄損傷の際の自己修復能の有無および修復機構を検討する予定である。脳梗塞モデルにおいては発症数日程度での脳梗塞周囲への神経幹細胞の集簇を確認しているため、脊髄でも傷害誘導性幹細胞は理論上、得られるはずである。今後は、組織採取時期の検討(受賞後1週間程度)、現在のインパクターの他、鉗子を用いたモデルや切断モデルといった、他の脊髄損傷モデルでの検討を追加する。また、外傷というメカニズム自体で傷害誘導性幹細胞が誘導されるか否かを検討するため、脳挫傷モデルでの検討も考慮している。また幹細胞が得られれば神経管周囲に存在するとされている神経幹細胞と傷害誘導性幹細胞(injury induced-Neural Stem/Progenitor Cells: iNSPCs)の区別のためにペリサイトマーカーなどを用いて検討を加える予定としている。脊髄・脊椎の外科的治療脊椎損傷モデル作成後、蛍光染色法等で評価を行う予定であったが、細胞の分離培養に成功していないため、必要試薬を全て購入しなかったため。概ね使用計画通りに予算執行できたが、予想より試薬が安かったため若干の次年度使用額が生じた。試薬等消耗品に使用する予定。次年度はより広範囲の実験を予定しており、そちらに使用していく。
小児の咬合機能の客観的評価基準に関する研究

本研究においては、デンタルプレスケールによる測定の客観性をより高めるために測定方法の規格化を行った。1)デンタルプレスケールのシートの選択デンタルプレスケールのシートの選択においては30H(313MPa)と50H(5120MPa)ではその測定範囲に差があり、成人においては測定範囲の広い50Hが多く用いられている。そこで小児においてどちらを用いるのがより有効であるかを検討するため、両者の測定値の比較を行った。正常咬合の4歳12歳の小児12名に対して100%クレンチングで2秒間咬頭嵌合位で咬んでもらい資料を採得した。その結果、測定範囲内の圧力の有効性を示す有効圧は30Hでは82.4%に対して50Hでは98.1%となり、小児においても30Hではその測定範囲内では咬合圧をカバーできないため50Hの使用が適切であることがわかった。2)クレンチング時間の選択クレンチング時間を変えることによって測定値のどのような影響ができるかについての検討を行い、測定の際の適切なクレンチング時間の選択を行った。正常咬合の6歳13歳の小児14名に対し、50H-Rタイプを用い100%クレンチングで1、2、3、4秒間咬頭嵌合位で咬んでもらい測定値を比較した。その結果、1、2、3、4秒間で測定値に統計学的有意差は認められなかったものの、変動係数が最小で安定した咬合力を発揮できる2秒間が適切であるとし、クレンチング時間を決定した。このように測定方法の規格化を行い、乳歯列正常咬合の小児26名、平均年齢4.7歳(3.3歳5.8歳)を対象に歯種別の咬合力を測定し、歯列全体の咬合力に対する各歯の咬合力を百分率で表し、乳歯列における咬合力分布について測定した。その結果、咬合力に左右差はなく、また各歯における咬合力分布に男女差はなかった。乳歯列正常咬合におる咬合力分布は第2乳臼歯58%、第1乳白歯24%、乳犬歯11%、乳側切歯4%、乳中切歯3%であり、82%が乳白歯部に集中しており、特に60%近くを占める第2乳白歯の役割が大きいことがわかった。
食物アレルギーと腸管免疫性疾患:特に腸管求心性知覚神経の役割について

食物アレルギーや炎症性腸疾患などの疾患では、腸管での知覚過敏状態がこれらの疾患の病因や疾患の進展に深く関与していることが報告され、腸管求心性知覚神経の異常が注目されている。そこで、キャプサイシン(CAP)感受性知覚神経の生理的及び病態生理的役割を解明するため、機能及び形態の両面より検討した。CAPは空腸及び近位結腸では弛緩反応を誘起し、この弛緩反応はTRPV1(CAP受容体)拮抗薬であるキャプサゼピンで強く抑制され、さらに、CGRPの反復投与によるCGRP受容体の脱感作によっても強く抑制された。従って、CAPの作用がTRPV1を介すること、CAPはCGRPを遊離させることによりその作用を発現させることを薬理学的に初めて明らかにした。また、TRPV1抗体を用いる免疫組織化学的検討では粘膜下神経叢と筋層間神経叢にvaricosityを持ったTRPV1陽性神経線維が多数認められたが、陽性神経細胞体は腸管壁内神経節には見られなかった。また、TRPV1陽性神経線維のほとんどはCGRP陽性であり、substance P陽性ではないことがわかった。さらに、腸管外来神経を外科的に除神経すると、CAPによる弛緩反応及びTRPV1陽性神経線維は全て消失した。従って、腸管のTRPV1陽性CAP感受性知覚神経は、腸管外来性神経であり、CGRPを主な神経伝達物質としているとともに、末梢側では軸索反射などによりCGRP受容体を介して作用することが明らかとなった。さらに、食物アレルギー病態モデルでの検討のため、ラットに卵白アルブミンを投与し、感作ラットを作製した。感作ラット摘出腸管では卵白アルブミンの投与により持続的収縮が惹起されたが、この反応はCAPの反復投与によるTRPV1の脱感作やキャプサゼピンでは抑制されなかった。一方、この持続的収縮反応はCyclooxygenase(COX)-2阻害薬のみならずCOX-1阻害薬によっても強く抑制され、構成型酵素と考えられているCOX-1の新たな病態生理学的役割が示唆された。今年度はまず、ラット腸管におけるvanilloid receptor subtype 1(VR1:キャプサイシン受容体)の局在、性質について、生理学的および組織学的に検討した。ラットの腸管を摘出してマグヌスバス中に懸垂し、capsaicin (1μM)の縦走筋に対する作用、それに対するVR1拮抗薬capsazepineとruthenium redの効果を検討した。Capsaicinは、回腸および遠位側結腸では明らかな反応を誘起しなかったが、空腸では弛緩反応を誘起し、近位側結腸では自発性律動収縮を強く抑制した。これらは、VR1拮抗薬の前投与で強く抑制されたが、洗浄後capsaicinの効果は再出現し、capsaicinによる脱感作も観察された。また、空腸および近位側結腸の筋層間神経叢および粘膜下神経叢のwhole moumet標本でのラットVR1 N端およびC端抗体を用いる免疫組織化学的検討では、粘膜下神経叢と筋層間神経叢にvaricosityを持ったVR1陽性神経繊維が認められたが、VR1陽性神経細胞体は腸管壁内神経筋には見られなかった。

また、腸間膜神経を外科的に切除して2週間後に除神経空腸とその近位および遠位部の正常空腸のcapsaicinに対する反応性を検討したところ、正常部位のみに弛緩反応が観察され、除神経部位ではほとんど地緩反応は認められなかった。さらに、正常部位ではVR1陽性神経線維が多数見られたが、除神経部位ではVR1陽性神経線維はほとんど消失していた。従って、capsaicinはVR1を介してラット胆管に抑制性の反応を誘起すること、反応には部位特異性があること、腸管神経にVR1陽性神経繊維があること、VR1陽性神経は外来性神経であることが示唆された。ラット腸管におけるvanilloid receptor subtype 1(VR1:キャプサイシン受容体)の局在、性質について検討した。ラット空腸の筋層間神経叢および粘膜下神経叢のwhole mount標本を用いて、ラットVR1抗体(N端およびC端抗体)およびカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)抗体あるいはサブスタンスP(SP)抗体による二重免疫組織化学的検討を行った。その結果、粘膜下神経叢と筋層間神経叢に多くのvaricosityを持ったVR1陽性神経線経が認められた。このVR1陽性神軽線経のほとんどはCGRP陽性神経線維であったが、SP陽性神経線維ではなかった。また、ラット摘出空腸におけるcapsaicin(1μM)誘起弛緩反応は、CGRP受容体の脱感作により強く抑制された。従って、VR1陽性キャプサイシン感受性腸管外来性知覚神経はSPではなくを主な神経伝達物質としているとともに、末梢側では軸索反射などによりCGRPを放出し腸管のCGRP受容体を介して作用することが示唆された。さらに、食物アレルギーモデル作製のため、オブアルブミン(10μg/ラット)を水酸化アルミニウムゲルに混和してラット腹腔内に投与し、オブアルブミンに感作させた。オブアルブミン投与二週間後に、空腸および結腸を摘出し、オブアルブミンに対する反応性を検討した。対照の水酸化アルミニウムゲルのみを投与したラットの腸管はオブアルブミンに反応しなかったが、感作ラット腸管ではオブアルブミンの投与により空腸および結腸は収縮した。この収縮反応はVR1拮抗薬キャプサゼピンでは抑制されなかったが、インドメタシン(1μM)により強く抑制された。現在、オブアルブミン感作ラットを用いて、キャプサイシン感受性腸管外来性知覚神経の知覚過敏状態の病態への関与を検討している。食物アレルギーや炎症性腸疾患などの疾患では、腸管での知覚過敏状態がこれらの疾患の病因や疾患の進展に深く関与していることが報告され、腸管求心性知覚神経の異常が注目されている。そこで、キャプサイシン(CAP)感受性知覚神経の生理的及び病態生理的役割を解明するため、機能及び形態の両面より検討した。CAPは空腸及び近位結腸では弛緩反応を誘起し、この弛緩反応はTRPV1(CAP受容体)拮抗薬であるキャプサゼピンで強く抑制され、さらに、CGRPの反復投与によるCGRP受容体の脱感作によっても強く抑制された。従って、CAPの作用がTRPV1を介すること、CAPはCGRPを遊離させることによりその作用を発現させることを薬理学的に初めて明らかにした。また、TRPV1抗体を用いる免疫組織化学的検討では粘膜下神経叢と筋層間神経叢にvaricosityを持ったTRPV1陽性神経線維が多数認められたが、陽性神経細胞体は腸管壁内神経節には見られなかった。また、TRPV1陽性神経線維のほとんどはCGRP陽性であり、substance P陽性ではないことがわかった。
イメージ生成能力の個人差が心的イメージ変換に及ぼす影響およびその神経基盤の解明

本年度は,心的イメージの変換過程を必要とする認知機能として三次元物体認知に注目し,イメージ生成能力の個人差と身体との関わりについて検討を進めた.まず,物体を手で操作することで物体の外観の変化を観察すること(能動的観察)によって,物体の外観のイメージ変換過程において手の回しやすさという生体力学的制約が影響するが,受動的に観察するとその影響が見られないという知見について,Experimental brain research誌において論文発表を行った.この成果は三次元物体の既知の外観に基づいて未知の外観を般化するという一種のイメージ変換過程において,個人の物体に対する経験の違いが及ぼす影響を明らかにしたものである.この点において,イメージ生成能力の個人差が心的イメージ変換に及ぼす影響を明らかにするという本研究の基礎的知見となる成果といえる.さらに,本年度は3Dプリンターで作成した実物体の能動的観察を行うことによる効果について検討した行動実験データについて分析を進めた.能動的観察を行った被験者群(能動群)と能動群の被験者の視点から録画した能動的観察の動画を観察した被験者群(受動群)の間の違いに注目して分析を行ったが,能動群と受動群との間に有意な群間差が見られず,またイメージ生成能力の個人差との交互作用も十分に見出すことができなかった.以上の結果を受けて,本年度は先行研究で生体力学的制約の効果が確認されている手や身体の線画を用いた心的回転課題や視点取得課題を用いて,イメージ変換過程におけるイメージ生成能力の個人差の影響を効率的に検出できるような実験パラダイムの検討を行い,本実験に向けた準備を進めた.これについては,2019年度より本実験を行い,イメージ変換過程におけるイメージ生成能力の個人差の影響を検討する.現在までの取り組みにおいて,本研究における前提であるイメージ変換過程における個人差を生み出す経験の効果については再現できている.一方で,経験による差,およびそれを生み出す脳内メカニズムを明らかにするには,現在の実験方法では効果量が小さい可能性があり,実験パラダイムの十分な再検討が必要である.そのため,先行研究において,明らかに生体力学的制約の効果が生じることが確認されている,手や身体の線画を用いた心的回転課題(Sekiyama 1982; Parsons 1987, 1994)や視点取得課題(Parsons 1987)を用いる.さらに,近年の手の線画を用いた心的回転課題を用いた研究(Vannuscorps, et al., 2012)では,脳内で運動イメージを用いたシミュレーションによるイメージ変換過程と知覚的な分析による過程の二つが存在することが主張されており,それらの過程が利用されるバランスが個人によって異なることでイメージ変換過程に個人差が生じていることが推測される.以上の取り組みを進めることにより,身体や手のイメージ変換過程におけるイメージ生成能力の個人差の影響を効率良く検出することを目指す.現在までの進捗状況を踏まえ,実験パラダイムの再検討を行う.具体的には,これまで明確な生体力学的制約の影響が報告されている,Vannuscorps, et al. (2012)による手の線画を用いた心的回転課題や,Parsons (1987)による身体の線画を用いた視点取得課題を用いることで,イメージ変換過程におけるイメージ生成能力の個人差の影響を効率的に検出できるような実験パラダイムを検討する.本年度は,心的イメージの変換過程を必要とする認知機能として三次元物体認知に注目し,イメージ生成能力の個人差と身体との関わりについて検討を進めた.まず,物体を手で操作することで物体の外観の変化を観察すること(能動的観察)によって,物体の外観のイメージ変換過程において手の回しやすさという生体力学的制約が影響するが,受動的に観察するとその影響が見られないという知見について,Experimental brain research誌において論文発表を行った.この成果は三次元物体の既知の外観に基づいて未知の外観を般化するという一種のイメージ変換過程において,個人の物体に対する経験の違いが及ぼす影響を明らかにしたものである.この点において,イメージ生成能力の個人差が心的イメージ変換に及ぼす影響を明らかにするという本研究の基礎的知見となる成果といえる.さらに,本年度は3Dプリンターで作成した実物体の能動的観察を行うことによる効果について検討した行動実験データについて分析を進めた.能動的観察を行った被験者群(能動群)と能動群の被験者の視点から録画した能動的観察の動画を観察した被験者群(受動群)の間の違いに注目して分析を行ったが,能動群と受動群との間に有意な群間差が見られず,またイメージ生成能力の個人差との交互作用も十分に見出すことができなかった.以上の結果を受けて,本年度は先行研究で生体力学的制約の効果が確認されている手や身体の線画を用いた心的回転課題や視点取得課題を用いて,イメージ変換過程におけるイメージ生成能力の個人差の影響を効率的に検出できるような実験パラダイムの検討を行い,本実験に向けた準備を進めた.これについては,2019年度より本実験を行い,イメージ変換過程におけるイメージ生成能力の個人差の影響を検討する.現在までの取り組みにおいて,本研究における前提であるイメージ変換過程における個人差を生み出す経験の効果については再現できている.一方で,経験による差,およびそれを生み出す脳内メカニズムを明らかにするには,現在の実験方法では効果量が小さい可能性があり,実験パラダイムの十分な再検討が必要である.

そのため,先行研究において,明らかに生体力学的制約の効果が生じることが確認されている,手や身体の線画を用いた心的回転課題(Sekiyama 1982; Parsons 1987, 1994)や視点取得課題(Parsons 1987)を用いる.さらに,近年の手の線画を用いた心的回転課題を用いた研究(Vannuscorps, et al., 2012)では,脳内で運動イメージを用いたシミュレーションによるイメージ変換過程と知覚的な分析による過程の二つが存在することが主張されており,それらの過程が利用されるバランスが個人によって異なることでイメージ変換過程に個人差が生じていることが推測される.以上の取り組みを進めることにより,身体や手のイメージ変換過程におけるイメージ生成能力の個人差の影響を効率良く検出することを目指す.現在までの進捗状況を踏まえ,実験パラダイムの再検討を行う.具体的には,これまで明確な生体力学的制約の影響が報告されている,Vannuscorps, et al. (2012)による手の線画を用いた心的回転課題や,Parsons (1987)による身体の線画を用いた視点取得課題を用いることで,イメージ変換過程におけるイメージ生成能力の個人差の影響を効率的に検出できるような実験パラダイムを検討する.実験パラダイムの大きな変更を行い,2019年度に実験に必要な物品(300千円程度)を購入する必要が出てきたため,2018年度の予算を一部繰り越した.
悪性腫瘍における高カルシウム血症誘導因子の究明に関する研究

1.悪性腫瘍のうち、特に、固型癌において骨転移なく高カルシウム血症をきたした、卵巣癌,腎癌,肺癌,膀胱癌のそれぞれより、骨芽細胞のサイクリックAMP上昇能を指標として、骨吸収因子の精製を行った。最終的に精製された因子は、インビトロにて骨吸収活性を有し、分子量約13000の塩基性蛋白であり、骨芽細胞の副甲状腺ホルモン受容体に結合することが確認された。ただ、当初予定していたアミノ酸構造の決定に関しては、精製物質の量が少なく、腫瘍抽出による方法では困難であることが判明した。最近になり、高カルシウム血症をきたした食道扁平上皮癌の腫瘍細胞の培養上清中に極めて強い骨吸収因子並びに骨芽細胞のサイクリックAMP上昇能を有する細胞系を得、この培養上清中よりの高カルシウム血症誘導因子の精製を続けている。2.高カルシウム血症をきたした肺癌の1例において血中活性型ビタミンD様物質の高値を認め、腫瘍中より同様の因子を抽出し、この因子がインビトロにて骨吸収活性を持っていることを示し、高カルシウム血症の一因と考えられた。3.血液系悪性腫瘍、特に、成人型T細胞性白血病は高率に高カルシウム血症をきたすことが知られているが、この成人型T細胞性白血病患者よりの白血病細胞の培養細胞を用い、その培養上清中に、極めて強い骨吸収活性の存在することを認め、その分画の精製を試みた。活性分画は分子量約1500020000の間に認められた。この因子に際しても現在培養規模を拡大し精製を試みているが、同様にインビトロで強い骨吸収活性を有するインターロイキン1とは異なる物質であると考えている。また、この研究と並行して実際に、高カルシウム血症をきたした成人型T細胞性白血病患者の骨X線所見、骨組織所見につき検討した。
学級共同体を基盤とした教育方法の基礎的研究―K.G.シャイベルトに光を当てる試み

研究成果は、従来、大きな注目を浴びてこなかったK.G.シャイベルトの業績を評価したことにある。その評価の点は、K.G.シャイベルトは新教育運動以前に学級を共同体として組織することの必要性を認識していたということにある。従来、個人主義、画一的と評されてきた旧教育の時代においてすでに学級への注目が開かれていたことが明らかとなった。本研究は、19世紀プロイセンの教育実践家・教育思想家であるシャイベルト(Karl Gottfried Scheibert)の学級共同体形成論の構造と特質を明らかにすることで、従来の教育史、教育思想史、教育方法史において看過されてきた「学級教育の忘れられた歴史」に光をあてること、およびそれを通じて、公共空間に参画する市民を育成するために、共同体としての学級が持つ教育力やその展開方法を考察するものである。平成25年度においては、国内において文献を収集・講読するとともに、平成26年3月ドイツに渡航し、大学図書館等にて資料収集を行った。その成果として、19世紀半ばのドイツにおける有力雑誌『教育評論』の複写を行った。当該雑誌は、シャイベルトが編集に携わり、彼の長編連載論文が経済されたものであり、国内には蔵書されておらず、本研究課題にとって必要不可欠なものであった。この講読を通じて、これまで公刊されていた著作に描かれてこなかったシャイベルトの教育論が立ち現われてきた。具体的には、(1)彼の学級共同体形成論の理論的基盤にはヘルバルトの実践理念の批判的継承が強く表れていること、(2)その批判的形象には、『教育評論』編集の前任者であるマーガー(Karl Mager)の弁証法的教育論が影響を及ぼしていること、(3)学級共同体形成論の具体的方法として、「発問」による集団思考を重視していたこと、などである。前年度の渡独およびそこで収集された文献の講読をふまえて、平成26年度は研究成果の整理および学会発表を行った。具体的には、日本教育方法学会第50回大会(広島大学)において、「近代教育方法史における学級共同体論の形成と展開ーK.G.Scheibertに光を当てる試み」と題して自由研究発表を行った。そこで明らかとなったことは、本研究の主要な考察対象であるシャイベルトの学級共同体形成論を検討していくと、1授業や学校生活の実践基盤として学級の意義を承認し、学級を教育的意図をもって「組織」する課題を明示した点において、シャイベルトの構想は学級経営・学級指導の必要性を先駆的に承認したものとして評価できること、および2その共同体論に立ち入っていくと、後にテンニースが提示したような家族的共同体理念ではなく、市民社会における組合や自治をモデルとした対話と互助に基づく共同体観が存在していたこと、の二点があげられる。こうした検討を通じて、従来の教育方法史において看過されてきた「学級教育の忘れられた歴史」に光を当てるとともに、旧教育ー新教育という対立的枠組みの問い直しの作業を行った。教育方法学初年度に予定した文献の収集は順調に進んでおり、必要と予想される文献もおおむね手元に集まっている。今後は、収集した文献の講読をすすめるとともに、それらをまとめ学会発表および論文化する作業をすすめていく。
レーザトップラ法による脳微小血管血流の精密計測

本研究は、我々が開発したレーザドップラ流速計システムを脳微小循環計測に応用し、動物実験によりその有効性を確かめるとともに、生理的条件下及び頭蓋内圧が上昇した場合の脳軟膜微小血管における血流動態を定量的に解析することを目的とする。ラット頭頂部に脳軟膜微小血管観察用の閉窓を作成し、単一微小血管における血流速度をレーザドップラ法を用いて計測した結果、直径10から230μmの細動静脈において血流速度の精度良い計測が可能であり、本システムの脳微小循環計測への有効性が実証された。時間平均血流速度は血管径と共に増大し、直径10及び50μmの細動脈でそれぞれ平均的に3.5、14mm/sであった。細動脈における血流速度は心拍と同期して拍動し、上流から下流に向かって位相は増大し、10-115cm/sの速度で脈波が細動脈に沿って伝播していることが示された。次に、閉窓内の圧力を0から50mmHgの範囲で変化させることによって、頭蓋内圧変化に伴う血流速度及び血管径の変化を解析した。頭蓋内圧の生理的条件(5mmHg程度)下での値で規格化すると、頭蓋内圧が0から50mmHgまで上昇した場合、細静脈血管径は1.1から0.78へと単調減少し、平均流速は0.85から1.91へと単調増大した。細動脈での変化は細静脈と比較して小さかった。この結果から、細静脈の変化は血管外圧の変化に伴う受動的なものであるのに対して、細動脈の変化は受動的な変化と筋原性の能動的な変化とが組みあわさったものであることを示唆している。更に、血流速度の拍動振幅は、頭蓋内圧がある閾値を越えるとステップ状に増大し、この閾値は血管径と共に増大し、上流から下流に向かって減少する傾向にあった。この実験結果及びモデル計算の結果を合わせ考えると、頭蓋内圧が増大し血管内圧に近づくと血流拍動が急激に増大するものと推測される。本研究では、これまでに我々が開発したレーザドップラ流速計システムを脳微小循環計測に応用し、動物実験によりその有効性を確かめるとともに、脳軟膜微小血管網における血流動態を定量的に解析することを目的とする。今年度は、ラットを用いたin vivo実験を行い以下のような結果を得た。ラット頭頂部に閉窓(closed cranial window)を作成し、脳軟膜上の単一微小血管における血流速度を光ファイバ型レーザドップラ流速計顕微鏡を用いて計測した結果、直径10から230umの細動脈、細静脈において血流速度の精度良い計測が可能であり、本システムの脳微小循環計測への有効性が実証された。時間平均血流速度は血管径と共に増大し、直径10及び50umの細動脈でそれぞれ平均的に3.5、14mm/s、直径20及び200umの細静脈でそれぞれ0.6、4mm/s程度であった。細動脈における血流速度は心拍と同期して拍動し、その振幅は大きいもので時間平均流速の46%に達した。同時計測した大腿動脈圧を基準として脳微小血管血流の時間遅れを求めた結果、細動脈の上流から下流に向かって時間遅れが増大し、脈波が細動脈に沿って伝播していることが示された。

脈波伝播速度として10-115cm/sの値が得られた。これらの結果を腸間膜での結果と比較すると、細動脈の平均血流速度は2-3倍程度大きく、脈波伝播速度は同程度であることが分かった。次年度は、閉窓内の圧力を制御することによって頭蓋内圧を変化させ、血流速度の動静脈分布や脈波伝播速度に与える頭蓋内圧の影響を調べる予定である。本研究は、我々が開発したレーザドップラ流速計システムを脳微小循環計測に応用し、その有効性を確かめるとともに、脳軟膜微小血管網における血流動態の定量的解析を目的とする。今年度は、脳微小循環に対する頭蓋内圧の影響について以下のような結果を得た。ラット頭頂部に作成した脳軟膜微小血管観察用の閉窓に人工脳脊髄液を満たし、この圧力を変化させることによって頭蓋内圧を制御した。このようにして頭蓋内圧が0から50mmHgまでの範囲で、脳軟膜上の単一微小血管における血流速度をレーザドップラ法により精密に計測し、頭蓋内圧変化に伴う血流速度及び血管径の変化を解析した。頭蓋内圧は生理的条件下で5-7mmHgであるので、5mmHgでの値と比較した結果をまとめると、頭蓋内圧が0から50mmHgまで上昇した場合、細静脈血管径は1.1から0.78へと単調に減少し、時間平均血流速度は0.85から1.91へと単調に増大した。細動脈では0mmHgで0.97、50mmHgで1.05と、細静脈と比較して小さい変化であった。この結果から、細静脈の変化は血管外圧の変化に伴う受動的なものであるのに対して、細動脈の変化は受動的な変化と筋原性の能動的な変化とが組みあわさったものであることを示唆している。また開窓での脳微小血管の観察は頭蓋内圧がほぼ0mmHgであることから、特に細静脈の径及び血流速度について生理的状態と有意に異なることが予想される。次に、微小血管血流速度の拍動振幅の頭蓋内圧による変化を解析した。その結果、頭蓋内圧がある値(ICP_<cr>Sとする)を越えると拍動振幅がステップ状に増大する例が多く見られた。ICP_<cr>Sは血管径と共に増大し、上流から下流に向かって減少する傾向にあった。この実験結果及び微小血管血流のモデル計算の結果を合わせ考えると、ICPが増大し血管内圧に近づくと血流拍動が急激に増大するものと推測される。
関係学的視点に基づく協同調査の可能性：東アジア＝アフリカ間の人の移動を事例として

本研究では、東アジアとアフリカを結ぶ人の移動に注目し、移動を契機としたアフリカ系移民と中国系移民の相互関係について研究を行う。ナイジェリア研究を専門とする研究代表者が、中国研究者である研究協力者とともに、中国広州およびナイジェリア・ラゴスにおける二つの移動主体を対象とした協同調査を実施する。それによって、複数の移動主体の関係性を動的に把握するための協同型フィールド調査の可能性を検討することが、本研究の課題である。
高等植物におけるオーキシン極性輸送機構の解析

シロイヌナズナのゲノム中に存在するMAB4と高い相同性を示す7つの遺伝子群をMAB4/ENP-LIKE1-7(MEL1-7)遺伝子として名付け、機能解析を行った。まず、MEL1-4遺伝子の発現解析を行った。発現解析にはin situhybridization法および自身のプロモーター制御下でGUSレポーターを発現させる系を用いた。その結果、MAB4、MEL1およびMEL2遺伝子のみが器官原基および茎頂分裂組織で発現していた。一方、根系においては、MAB4およびすべてのMEL遺伝子の発現が確認された。これらの結果から、MAB4およびMEL遺伝子群は、部分的に発現領域を重複させながら機能していることが示唆された。また、それぞれの機能欠失変異体を入手し表現型解析を行ったところ、mel単独変異体は表現型を示さなかった。そこで、これらの変異体間で交配を行い、多重変異体を作製した。mab4 mell me12三重変異体は器官形成に重篤な欠損を示しピン状の花茎を示した。一方、mell me12 me13 me14四重変異体は根の重力屈性に異常を示した。これらの結果から、MAB4およびMEL遺伝子は機能重複的に器官形成および根の重力屈性に機能していることが示唆された。また、MAB4およびMELタンパク質の細胞内局在を調べるために、それぞれの遺伝子にGFP遺伝子を融合させ、自身のプロモーター制御下で発現させた。その結果、MAB4およびMELタンパク質は細胞膜近傍に極性をもって局在することが明らかとなった。これらの局在様式はこれまでに報告されているPINタンパク質の極性と極めて一致するものであった。このことは、MAB4およびMELがPINを介したオーキシン極性輸送に強くそして直接的に関与していることを強く示唆するものである。当該年度(平成21年度)は、NPH3様タンパク質MAB4ファミリーによるPIN局在制御機構の一端を明らかにした。MAB4ファミリー遺伝子の欠損変異体において、PINタンパク質の詳細な局在解析を行い、細胞膜上のPINタンパク質の減少そして極性の脆弱化が確認された。また、PINタンパク質は細胞膜から内部移行し、一部は細胞膜にリサイクリングされ、残りは液胞へと輸送され分解される。変異体において、それらのPIN動態に関して異常があるか薬理学的手法を用いて調べた。その結果、PINの液胞への輪送および細胞膜へのリサイクリングには異常が見つからなかったが、細胞膜からのPINの内部移行に異常が確認された。変異によって野生型よりも内部移行が促進されていた。さらに、MAR4ファミリータンパク質の局在解析を詳細に行ったところ、細胞膜にPIN極性とほぼ同じ極性を持って局存化することが明らかとなった。これらのことから、MAB4ファミリータンパク質はPINタンパク質の細胞膜からの内部移行を阻害することが示唆された。このことから、MAB4ファミリー遺伝子がPINの極性制御機構においてこれまで予想もされてこなかった機能を持つことが明らかとなった。そして、本年度得られた結果をもとに、次のようなPIN極性形成モデルを提唱している。PINタンパク質は翻訳後いったん細胞膜全面に極性を持たずに局在する。その後、MAB4ファミリーが局在するという細胞膜上ではPINの内部移行が阻害され細胞膜に保持される。一方、MAB4ファミリータンパク質が局在しない細胞膜ではPINの内部移行により細胞膜に存在せず、PINタンパク質の局在MAB4ファミリータンパク質と同様の局在様式を示すようになる。今後はこのモデルめ検証を行っていくとともに、MAB4極性の確立機構の解明を目指す。
アレキシサイミアにおける身体感覚に関する脳機能画像研究

心身症患者に特有な性格傾向であるアレキシサイミア(失感情症)の研究により、感情の働きと痛みなどの身体感覚の関係を明らかにした。自分の感情をうまく認識できないアレキシサイミアでは、腸を刺激したときに、より強く腹痛や腹部不快感を感じ、それに伴う脳の反応、ホルモン分泌反応もより強くなることを示した。これは、感情の働きと体からの信号の感じ方に関係があることを示唆するものであり、心身症のメカニズムの一端と考えられる。研究計画に基づき、公募にて対象被験者の募集を行い、また東北大学病院外来通院中、入院中の患者に対してTAS-20にてアレキシサイミア傾向を有する健常対象者、および機能性消化管障害患者の対象者の抽出を行った。統計的な解析レベルまでには至らなかったが、機能性消化管障害患者、および心療内科通院者では比較高いアレキシサイミア傾向が認められた。PET検査の候補者に対して病歴、身体的、神経学的診察、ならびに患者群に対しては血液検査、尿検査等を試行してスクリーニングを行い、body perception questionnaire、MMPI(ミネソタ多面人格テスト)、STAI(不安スケール)、SDS(抑うつスケール)、自覚ストレス検査の心理検査を施行し、心理面での評価を行った。数名に対し、圧トランスデューサーを装着したシリコンバルーンを被験者の大腸に留置し、トランスデューサーを携帯型内圧計、シリコンバルーンを圧インフレーターに接続、インフレーターによりバルーンを拡張して腸管に刺激を与え、内臓知覚を誘発した際の自覚評価をordinate scaleにより評価させた。その内数名に対してPET検査を試行したが、人数が少なく本年度は統計的解析レベルには至っていない。予備的実験の途中経過を第66回アメリカ心身医学会にて発表し、一部について過去の研究データと合わせて論文化した。また、本研究を将来的にロンドン大学の神経消化器病学研究所のアジズ教授、コーエン博士と共同研究として発展させるべく研究打ち合わせを行った。平成20年度より、これまですでにfMRIを用いて消化管刺激により内臓感覚を誘発した際の脳機能画像研究を積極的に行っているロンドン大学、ウィンゲート研究所のアジズ教授と共同研究を開始した。平成20年度中に研究課題について得られた中間データを海外の学会で報告する予定であったが、研究に使用する予定の食道バルーン刺激装置が故障し、進行に遅れが生じたために20年度中には発表できず、学会参加旅費を繰り越した。平成21年度は、アジズ教授のグループとともにfMRIを用いた実験を終了させ、ロンドン、キングスカレッジ、ニューロイメージングセンターのブランマー統計学教授の指導をうけつつ、研究結果の解析を行った。32名の被験者における食道刺激により誘発した内臓知覚の脳処理過程の変化を、同様に、性格傾向、自律神経反応との関連の観点から解析し解析し、共同演者として、アメリカ消化器学会、神経消化器運動学会、ヨーロッパ消化器学会にて発表した。また、ASLによる静止時の脳血流状態の解析も行い、アレキシサイミア傾向、神経質傾向、外向性傾向などの個人的な性格傾向や男女差により静止時の脳血流状態が異なること、静止時の自律神経活動状態の個人差により脳血流状態が異なることが明らかにした。結果を第68回米国心身医学会で発表した。さらに同被験者において、共同演者として2009年度のまた、アレキシサイミアにおける意思決定機構、セロトニントランスポーター多形との関連を論文化して投稿した。これまですでにfMRIを用いて消化管刺激により内臓感覚を誘発した際の脳機能画像研究を積極的に行っているロンドン大学、ウィンゲート研究所のアジズ教授と共同研究としてプロジェクトを進め、平成21年度は。アジズ教授のグループとともにfMRIを用いた実験を終了させ、ロンドン、キングスカレッジ、ニューロイメージングセンターのブランマー統計学教授の指導をうけつつ、研究結果の解析を行った。まず、arterial brain labeled(ASL)perfusionの解析を行った。fMRIを用いた脳機能画像解析は通常、バックグラウンドあるいはcontrol状態に比較して課題を施行しているときの変化分を扱うが、本来は、正常群と疾患群などの比較をする際には両群のresting状態の比較をしておくことが必要である。このresting状態を、MRIを用いた脳血流情報として提供できる手法がASLである。32名の解析を行い、アレキシサイミア傾向、神経質傾向、外向性傾向などの個人的な性格傾向や男女差により静止時の脳血流状態が異なることが明らかになり、また、静止時の自律神経活動状態の個人差により脳血流状態が異なることが明らかになった。さらに同被験者において食道刺激により誘発した内臓知覚の脳処理過程の変化を、同様に、性格傾向、自律神経反応との関連の観点から解析し、共同演者として2009年度のヨーロッパ消化器学会にて発表した。また、アレキシサイミアにおける意思決定機構、セロトニントランスポーター多形との関連を論文化して投稿した。
国際間ヴァーチャル教室活動を取り入れた院生教育-多文化・多言語意識開発に向けて-

本研究の目的は、ヴァーチャル映画討論会の参加者の多文化・多言語意識を「言語の社会化」の観点から分析・考察することである。下記の4点が主な結果である。1)活動の理論的枠組みと協働的学習活動設計の有効性が検証された。2)これまでのCMC活動の問題点を5つの新たな方法により改善した。3)「言語の社会化」の視座からCMCの実際使用実態を明らかにした。4)参加者の多文化・多言語意識に変容が見られた。平成19年度(2007年度)は、国際間ヴァーチャル教室活動(映画討論会)プロジェクト(平成19年度21年度)の初年度に当たり、下記のようなプロジェクト活動を実施し、実践過程で採取したデータの整理・記述にもとづき基礎的研究を行った。【ヴァーチャル映画討論会の実施】<第1段階>桜美林大学、香港中文大学、香港理工大学の院生60名余は、指定映画数本のうちから一本を選び視聴した。<第2段階>参加者はペア・グループに編成され、電子メールで未知の相手とヴァーチャル映画討論会を実施(文字言語)。<第3段階>参加者はテレビ会議システムを通して初めて対面し、映画討論会を行った(音声言語・非言語)。<第4段階>参加者は、テレビ会議の印象や映画批評を電子メールで交換し(文字言語)、映画討論会を終了した。<活動評価>参加者全員(80名)に評価アンケートを実施し、うち数名に詳細なインタビューを行った。【プロジェクト実践過程で採取したデータに基づく基礎研究】1)電子メールのテクスト・データの電子コーパス化(2008年2月現在)。2)テレビ会議の録画データの、文字おこしを完了(2008年2月)。3)参加者を対象とした活動評価アンケートおよびインタビューの実施、および結果の分析・考察(2008年2月現在)【研究成果】国内外の査読つき学術誌に4件の論文を出版。海外の学会で論文2件を発表(下記の表を参照のこと)。【2008年度の研究における計画と目標】第二年目にあたる平成20年度(2008年度)は、初年度のヴァーチャル映画討論会の問題点を改善し実施する。研究面では、上述の1)、2)、3)のデータの分析・考察を進め、研究成果を国内外の学会で発表し、他地域の研究者との討論や意見交流に積極的に取り組みたい。平成20年度(2008年度)は、国際間ヴァーチャル教室活動(映画討論会)プロジェクト(平成19年度21年度)の2年目にあたり、下記のようなプロジェクト活動を実施し、実践過程で採取したデータの整理・記述にもとづき活動評価、分析・考察を行った。【ヴァーチャル映画討論会の実施】<第1段階>桜美林大学、香港理工大学、台湾東海大学の院生70名余は、指定映画数本のうちから一本を選び視聴。「メディア・リテラシー」「カルチュラル・スタディーズ」の理論に沿って、各人が映画批評をまとめる。<第2段階>参加者はペア・グループに編成され、電子メールで未知の相手とヴァーチャル映画討論会を実施(文字言語によるヴァーチャル討論会)。<第3段階>参加者はスカイプ通話会議を通して初めて対面し、映画討論会を実施(音声言語・非言語・映像によるヴァーチャル討論会)。<第4段階>参加者は、テレビ会議の印象や映画批評を電子メール交換(文字言語によるヴァーチャル討論)し、映画討論会を終了した。〈活動評価〉参加者全員(70名)に評価アンケートを実施し、桜美林院生の15名に詳細なインタビューを実施。【プロジェクト実践過程で採取したデータに基づく基礎研究】1)電子メールのテクスト・データの整備。2)テレビ会議の録画データの、文字おこし。3)参加者を対象とした活動評価アンケート・インタビューの実施、結果の分析・考察(2008年2月現在)【研究成果】国内外の査読つき学術誌に5件の論文を出版。海外の学会で論文6件を口頭発表(11.参照)。平成21年度(2009年度)は、国際間ヴァーチャル教室活動(映画討論会)プロジェクト(平成19年度21年度)の最終年度にあたり、下記のことを行った。1) 2009年秋にヴァーチャル映画討論会の実施を行い、活動のプロセスと成果についてデータ収集を行った。(1)電子メールのテクスト・データの整備。(2)テレビ会議の録画データの、文字おこし。(3)参加者を対象とした活動評価アンケート・インタビューの実施、結果の分析・考察2) 3年間の実践活動から収集したデータの分析・考察を深め、4編の論文の執筆を行った。3) 1)の投稿済み論文で、ヴァーチャル映画討論会の汎用モデルの提案をした。4) 1)の投稿済み論文で、理論的枠組みの検証を行った。

5) 1)の現在執筆中の論文で、先行研究に指摘された遠隔接触場面(CMC)の問題点を改善する手法として、下記のことを検証し提案じた。(1)言語の社会化理論の応用の有効性、(2)緩衝材としての映画の有効性、(3)ブレンディドラーニングの有効性、(4)CMCにおける交信の「公開性」と「宛名性」の導入、(5)タスク達成型活動汎用モデルの提案、(6)参加者の協働かつ自律的参加の有効性などを検証した。【研究成果】国内外の査読つき学術誌に2編の論文を投稿済み(採否の返事待ち)である。加えて2編の論文を現在執筆中である。日本語教育学会でパネル発表(2010年5月22日-23日)を行う。年度初めには、海外の学会(ドイツ、イギリス、オーストラリアの国際学会で論文発表を予定しており、論文4本を執筆した。しかしながら、本務における教育、院生の論文研究指導、行政などのワークロードが超過重となったため、海外の学会出席の時間の捻出が物理的に不可能となった。発表の貴重な機会を断念せざるを得ず、残念であった。本プロジェクトの成果は論文投稿など形で今後発表していきたい。
Caによる細胞膜Naチャネル発現調節機序:サブユニットmRNA変動と細胞内輸送

1.Conventional protein kinase C-α(cPKC-α)とnovel protein kinase C-ε(nPKC-ε)の分子種特異的Na^+チャネルdown-reulation機序:cPKC-αは、細胞膜Na^+チャネルの細胞内へのinternalizationを促進した。nPKC-εは、半減期の短い蛋白質合成に依存してNa^+チャネルα-サブユニットmRNAの崩壊促進・レベル低下をまねいた。Na^+チャネルβ_1-サブユニットmRNAレベルは上昇した。2.[Ca^<2+>]_i上昇の程度・持続時間の違いによる特異的Na^+チャネルdown-reulation機構:(1)中程度・比較的長期の[Ca^<2+>]_i上昇は、cPKC-α、calcineurin、calpainを活性化し、clathrin-coated vesicleによるNa^+チャネルのinternalizationを促進した。(2)さらに高濃度・長期の持続的[Ca^<2+>]_i上昇は、Na^+チャネルα-およびβ_1-サブユニットmRNAレベルを低下させた。他方、(3)急速・一過性[Ca^<2+>]_i上昇は、Na^+チャネルdown-regulationを起こさなかった。また、(4)calcineurinによる脱リン酸化反応とFKBP-and rapamycin-associated protein (FRAP)によるリン酸化反応は、新しく合成されたNa^+チャネルのtrans-Golginetworkから細胞膜への輸送を抑制的に制御していた。(5)down-regulationされたNa^+チャネルにおいて、^<22>Na^+流入量は低下したが、native Na^+チャネルと同様に、ヴェラトリジン、α-およびβ-サソリ毒、ブレベトキシンによるNa^+チャネルのアロステリックな開孔増強機構は保持されていた。3.神経保護薬NS-7によるNa^+チャネル阻害とNa^+チャネル-reulation : NS-7は、Na^+チャネルα-サブユニットのドメインIのトランス・メンブレン・セグメント6に結合し、Na^+チャネル開孔を可逆的に阻害し、Ca^<2+>チャネル開孔・カテコールアミン分泌を低下させた。他方、NS-7の慢性投与は、Na^+チャネルα-およびβ1-サブユニットmRNAレベルを上昇させることなく、Na^+チャネルのtras-Golgi networkからのexternalizationを促進し、また、Na^+チャネルinternalizationを低下させ、細胞膜Na^+チャネル量をup-regulationした。しかし、lipophilicなNS-7は、Na^+チャネル、および、その近傍の細胞膜脂質に非可逆的に結合しており、^<22>Na^+流入量は、むしろ、低下した。アロステリック開孔機構は阻害されなかった。

ウシ副腎髄質クロマフィン細胞(発生学的に神経堤に由来する)の培養系において、虚血・低酸素による細胞障害に関与する細胞内Caシグナル伝達系や神経保護薬が、Naチャネル遺伝子の細胞膜発現に対して、どのような影響を与えるか、3H-サキシトキシン結合、細胞内への22Na流入、ウエスタン・ブロット、ノザン・ブロット、細胞内[Ca]_iやカルシニューリン活性測定などにより、解析した。1.[Ca]_iによる細胞膜Naチャネルdown-regulation-[Ca]_i上昇パターンの違いによるmultipleな機序:Caイオノフォア、小胞体Ca-ATPase阻害薬(タプシガルギン、DBHQ)により、(1)中程度・比較的長期の[Ca]_i上昇は、conventional protein kinase C-αやカルパインを活性化することにより、Naチャネルの細胞内へのinternalizationを促進し、また、(2)さらに高濃度・持続的[Ca]_i上昇は、Naチャネルα-およびβ_1-サブユニットmRNAレベルを低下させ、いづれの[Ca]_i上昇も細胞膜Naチャネル量のdown-regulationをおこした;(3)down-regulaitonされたNaチャネルにおいて、22Na流入量は低下したが、ネイティブNaチャネルと同様、ヴェラトリジン、α-およびβ-サソリ毒、ブレベトキシンによるアロステリックなチャネル開孔機構は保持されていた;他方、(4)急速・一過性[Ca]_i上昇は、Naチャネルdown-regulationをおこさなかった。2.カルシニューリンによるNaチャネル細胞内輸送:サイクロスポリンA、FK506は、カルシニューリン活性を阻害し、トキシンによるアロステリック開孔機構を示すNaチャネルの細胞膜発現量をup-regulaitonした。これは、Naチャネルのtrans-Golgi networkからのexternalizationの促進とNaチャネルinternalization低下によるものであり、Naチャネル蛋白やNaチャネル・サブユニットmRNAの細胞レベルは変動しなかった。Naチャネルup-regulationにより、Caチャネル開孔・カテコールアミン分泌は増強された。3.神経保護薬NS-7のNaチャネルへの短期および長期効果:NS-7は、Naチャネルα-サブユニットのドメインIのトランス・メンブレン・セグメント6に結合し、Naチャネル開孔を可逆的に阻害し、Caチャネル開孔・カテコールアミン分泌を低下させた。他方、NS-7の慢性投与は、細胞膜Naチャネル量をup-regulationした。