hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
母子家庭に関する貧困問題対策の実証的研究  －母子家庭支援策の構築を目指して－

本研究は、母子家庭において生じる生活上の諸問題を取り上げ、子どもや女性の“貧困問題"に焦点をあてつつ、母子家庭のwell-being(より良い生活)をめざす新たな政策展開を構想するための実証的研究の二年目である。2018年度においては、まず第1には、2017年度に実施した「母子家庭での生活実態を把握するための予備調査」を踏まえ、全国母子寡婦福祉団体協議会および加盟されている各ブロック諸団体等のご協力を得てアンケート調査を実施した。当初計画では全国12ブロックから20人ずつ計240人の方々に対してアンケート調査を実施する計画で進めていたが、当協議会からは本調査にご協力いただける方々が合計628人の方々にお声かけいただいた。急遽研究分担者との会議をもって検討した結果、628件すべての方々へのアンケート調査を実施することとした。実際の調査発送については、回答者へのプライバシー配慮の観点から、当協議会にまとめて送付し、協議会から各諸団体へ配送、各諸団体から該当の各回答者へ配送していただくという方法で実施した。返送については約1か月の期間を設け返送していただき、389件の返送があった。(回答率62%)そのうち2019年度実施予定のヒアリング調査を承諾いただいた方は、147名でそのうちから各ブロックからランダムに合計約26人の方々へのヒアリング調査を実施することとしている。第2には、我々が構想試案していく母子世帯に特化した「母子家庭総合支援サービスセンター」(仮称)構想の試案も提言することを目的として進めてきているが、児童館等の地域社会資源の訪問調査が十分にでできていない現状にある。それは、児童館等の諸施設の現状と我々が想定している「母子家庭総合支援サービスセンター」の諸機能とのターゲットとなる社会資源を早急に探し訪問して施設の諸機能分析調査を実施しなければならないと考える。本研究課題では、地域家庭、特に母子家庭において生じる子育てにまつわる諸問題を取り上げ、今日の「子どもや女性の“貧困問題"」に焦点をあてつつ、母子家庭のwell-being(より良い生活)をめざす新たな政策展開を構想するための実証的研究である。具体的には地域の拠点としての「母子家庭総合支援サービスセンター」構想を構築することである。そのために「子どもの生活」と「母親との関わり」や、「生活上の困りごと」に焦点を当て、母子家庭での生活実態に対するアンケート調査、ヒアリング調査等を活用した実証的研究を実施してきている。本研究のスケジュールとしては、母子家庭の生活実態を把握する側面では、おおむね順調に進展してきているといえる。平成29年度には、まず予備調査を実施し、20人の方へのアンケート調査とそのうちヒアリングについてご承諾したいただいた8人へヒアリング調査を実施した。そして平成30年度に全国アンケート調査を実施し、(財)全国母子寡婦福祉団体協議会および加盟諸団体の協力を得て、調査を実施した。当初240件のアンケート調査を予定していたが、当初予定を大幅に超えて628件の調査件数をご依頼することができ、そのうち389件のご回答を得ることができた。現在この貴重な調査結果を整理している最中である。今後ヒアリング調査にご協力を承諾いただいた約140人件の中から、ランダムに選出し、2020年度にヒアリング調査を実施する予定で進めている。第二点に我々が構想する「母子家庭総合支援センター」としての代替できうる諸地域社会資源としての研究については、今どこが担うことが可能なのか、現実的な調査が必要になってきているが、当初我々が想定していた機能を担う社会諸資源が非常に少なく、なかなか見当たらない状況である。この件については、早急により実証的研究として実際的な調査を実施していく。今後の推進方策としては、昨年度実施した全国アンケート調査についてのデータ整理及び分析考察等を行い、ひとり親家庭支援研究会等で、実証的研究を継続して実施していく。そして本年は、ヒアリング調査を承諾いただいた方の中からランダムに選び調査の依頼する計画である。その調査者は、大西及び研究分担者の流石教授、浦田教授等で分担し、調査研究協力者の高岡理恵准教授をはじめ新たに岩手県立大学の櫻幸恵准教授、及び藤上幸恵(現きくが丘保育園副園長)等々方々にご協力いただいき鋭意実施していく。共同研究者である流石智子教授が研究者代表されている科学研究費基盤研究(C)「母子家庭の介護実態調査から探る介護支援の構築」科研番号(c18K02053)という研究への研究協力者として、大西、浦田が参加し、本研究との共通性を見出した中での協力体制を組んでいく方向を進め、共通する交互の支援課題を共有化し、相互に協力しながら進めていく。本研究は、地域家庭、特に母子家庭において生じる子育てにまつわる諸問題を取り上げ、今日の「子どもや女性の貧困問題」に焦点をあてつつ「子どもの貧困」を防ぐ新たな政策展開を構想するため実証的研究を行う。本年度については、共同研究者等で組織している“ひとり親家庭支援研究会"を基本的に月一回のペースで開催し、以下の三点を中心に実証的研究を進めた。まず一つ目は、母子家庭の生活状況の把握として、「母子家庭の子どもを中心とした生活実態(ヒアリング)調査」(平成22年度)をさらに分析、整理して、母子家庭の生活実態を把握するために、K市母子寡婦福祉協議会とH市母子寡婦福祉連合会との二か所の関連団体に依頼させていただき、ご協力いただき、本調査前の予備調査(質問紙調査20名)を実施することができた。その中で、ヒアリング調査に協力いただける方々

7名(K市:2名、H市:5名)の方々に面接でのヒアリング調査を実施した。質問紙、ヒアリング調査内容については、神戸女子大学「人間を対象とする研究倫理委員会」での審査を経て実施し、子どもの生活状況と、母子家庭での家庭状況及び地域社会環境等の整備状況、また家庭経済の収支状況や、社会福祉サービス等の制度利用状況等について把握に努めた。二つ目は、本研究で明らかにしようとしている母子世帯に特化した「母子家庭総合支援サービスセンター」(仮称)構想構築である。今日の地域社会資源としての児童館を想定してきているが、平成27年に厚生労働省が実施した「子育て世代包括支援センター」の実施検証を踏まえて、全国的に概観しても十分に実施されているところは少なく、概観するところでは、母子保健法の枠内の存在であることが見えてきた。三つ目としては、平成28年度に我々が、京都府へ協力して実施した母子、父子家庭の生活実態調査についての検証分析等を行った。本研究課題としての進捗状況としては、その中で「子どもの生活」と「母親との関わり」や、「生活上の困りごと」に焦点を当て、母子家庭での生活実態に対する研究を実施した。それに合わせて過去において、行われている母子家庭調査の調査内容を分析し、平成30年度に実施する全国の質問紙調査項目内容を分析、考察を毎月行ってきているひとり親支援研究会において、検討を重ねほぼ質問紙の項目選定ができてきているところである。(財)全国母子寡婦福祉団体協議会の協力を得て、調査に向けての協力を得ることができ、今後のスケジュールの調整を行い、順調に進められている。平成30年5月に調査協力団体が明確化し、その後調査依頼を進めていく予定である。我々が構想する「母子家庭総合支援センター」としてのだいたいできうる地域社会資源としての研究については、今どこが担うことが可能なのか、現実的な調査が必要になってきている。その上で、児童館の役割を一方で検討する中で、地域社会資源として求められている本センターの機能分析としての今年度本格的実証研究を実施していく方向である。上記事項に合わせて、母子生活支援施設の施設長からの研修講義を受ける中で挙げられた諸課題について検討する中で、センターとして当該施設がその機能と合致しているかについて検討を加える必要があると考える。現行制度施策の検証として質問紙調査を踏まえ、質量ともに社会資源利用の実態を明確化できるように質問紙調査項目検討を行っている。この状況を踏まえる中で、制度利用として今後必要としているサービスの仮説建てを行っていく。本研究は、母子家庭において生じる生活上の諸問題を取り上げ、子どもや女性の“貧困問題"に焦点をあてつつ、母子家庭のwell-being(より良い生活)をめざす新たな政策展開を構想するための実証的研究の二年目である。2018年度においては、まず第1には、2017年度に実施した「母子家庭での生活実態を把握するための予備調査」を踏まえ、全国母子寡婦福祉団体協議会および加盟されている各ブロック諸団体等のご協力を得てアンケート調査を実施した。当初計画では全国12ブロックから20人ずつ計240人の方々に対してアンケート調査を実施する計画で進めていたが、当協議会からは本調査にご協力いただける方々が合計628人の方々にお声かけいただいた。
植物の新しい正の成長調節因子二酸化窒素のセンシング遺伝子の特定と受容機構の理解

大気中に含まれる二酸化窒素は光形態形成(光による胚軸伸長抑制など)、栄養成長(バイオマス蓄積)および生殖成長(花芽形成)を促進し、植物の成長を正に制御する因子であるとの作業仮説を提起している。二酸化窒素シグナルを受容し細胞内シグナルに変換するセンシング遺伝子は該制御において核心的役割を果たすと考えられる。その解明は、新しい植物生物学の展開や新規学術領域の創成、また画期的農業生産技術の開拓につながる可能性がある。そこで本研究では、まず二酸化窒素による胚軸伸長抑制形質を指標として、T-DNA挿入ラインを対象として同形質を欠損した二酸化窒素非感受性株を選抜して二酸化窒素シグナルを受容し細胞内シグナルに変換するセンシング遺伝子の特定を目ざした。二酸化窒素はシロイヌナズナの胚軸伸長を抑制するが、そのような形質を欠失した株は、二酸化窒素センシング遺伝子に不具合が生じた、二酸化窒素非感受性株であるとみなされる。そこで、これまでに二酸化窒素非感受性株およびその原因遺伝子(二酸化窒素センシング遺伝子)について解析した。野生株について該遺伝子の発現量は二酸化窒素有無で差がなかった。該遺伝子の制御下にある遺伝子群の発現応答は二酸化窒素の有無により差が見られた。故に、該遺伝子は二酸化窒素に応答して、その発現レベルを変えるのではなく、該遺伝子の制御下にある遺伝子群の発現応答を制御して、胚軸伸長を制御していると考えられる。平成30年度は、二酸化窒素によるバイオマス蓄積増加と該遺伝子の関連を明らかにするために、該遺伝子のT-DNA変異体を二酸化窒素有無の条件下で栽培して、バイオマス蓄積について調査した。その結果、該遺伝子の変異体は二酸化窒素存在下、非存在下でバイオマス蓄積に差が観察されなかった。以上の結果より、該遺伝子は二酸化窒素の胚軸伸張抑制に限らず、バイオマス蓄積にも関与することが示唆された。本申請者は、大気中に含まれる二酸化窒素は光形態形成(光による胚軸伸長抑制など)、栄養成長(バイオマス蓄積)および生殖成長(花芽形成)を促進し、植物成長を正に制御する因子であるとの作業仮説を提起している。該制御において、二酸化窒素シグナルを受容し細胞内シグナルに変換するセンシング遺伝子は核心的役割を果たすと考えられる。そこで本研究は、まず二酸化窒素による胚軸伸長抑制形質を指標として、T-DNA挿入ラインを対象として同形質を欠損した二酸化窒素非感受性株を選抜して二酸化窒素シグナルを受容し細胞内シグナルに変換するセンシング遺伝子の特定を目ざす。平成27年度は、明所、二酸化窒素存在下で胚軸が野生株より長くなる二酸化窒素非感受性株のスクリーニングを行った。実験材料として機能欠失変異体であり、機能欠失遺伝子の同定が比較的容易なシロイヌナズナT-DNA挿入ライン(Alonso et al. Science 301:653, 2003)(約50,000ライン)を用いた。既報(業績1)に従って、シロイヌナズナ種子を播種した後、NOxチャンバー内で発芽させ、播種後4日目から植物実生を50 ppb二酸化窒素に曝露、栽培した。曝露開始714日目に二酸化窒素存在下で、野生株に比べて胚軸が長い二酸化窒素非感受性個体(株)を選抜した。これまでに約10,000 T-DNA挿入ラインについて選抜を行い、野生株に比べて胚軸長が長い約400個の二酸化窒素非感受性個体(株)を取得した。選抜した個体は、人工気象器内で栽培して自殖種子を採取した。平成27年度に、植物の二酸化窒素暴露処理に必要なNOxチャンバーの冷凍機などが故障したため修理に時間を要した。そのため当初の予定より遅れている。本申請者は、大気中に含まれる二酸化窒素は光形態形成(光による胚軸伸長抑制など)、栄養成長(バイオマス蓄積)および生殖成長(花芽形成)を促進し、植物の成長を正に制御する因子であるとの作業仮説を提起している。平成28年度は、明所下で栽培した植物体の胚軸長について二酸化窒素存在下で栽培した植物と非存在下で栽培した植物の間で差が観られない変異体のスクリーニングを行った。実験材料として胚軸身長、光形態形成などに関与する遺伝子のシロイヌナズナT-DNA挿入ラインを用いた。既報に従って、シロイヌナズナ種子を播種した後、NOxチャンバー内で発芽させ、播種後2日目から植物実生を50 ppb二酸化窒素に曝露、栽培した。播種後12日目に胚軸長を測定して二酸化窒素存在下で栽培した植物と非存在下で栽培した植物で胚軸長に差が観られない二酸化窒素非感受性個体(株)を選抜した。

これまでに、二酸化窒素存在下、非存在下で胚軸長に差を示さない二酸化窒素非感受性個体(株)として合計4系統(胚軸伸長に関与する遺伝子変異系統など)のT-DNA挿入変異体を得た。平成28年度に、植物の二酸化窒素暴露処理に必要なNOxチャンバーのNOx濃度制御システムなどが故障したため修理に時間を要した。そのため当初の予定より遅れている。本申請者は、大気中に含まれる二酸化窒素は光形態形成(光による胚軸伸長抑制など)、栄養成長(バイオマス蓄積)および生殖成長(花芽形成)を促進し、植物の成長を正に制御する因子であるとの作業仮説を提起している。二酸化窒素シグナルを受容し細胞内シグナルに変換するセンシング遺伝子は該制御において核心的役割を果たすと考えられる。その解明は、新しい植物生物学の展開や新規学術領域の創成、また画期的農業生産技術の開拓につながる可能性がある。そこで本研究は、まず二酸化窒素による胚軸伸長抑制形質を指標として、T-DNA挿入ラインを対象として同形質を欠損した二酸化窒素非感受性株を選抜して二酸化窒素シグナルを受容し細胞内シグナルに変換するセンシング遺伝子の特定を目ざす。平成29年度は、前年度獲得した二酸化窒素存在下、非存在下で胚軸長に差を示さない二酸化窒素非感受性個体(株)および遺伝子について詳細な解析を行った。二酸化窒素存在下で栽培した野生株と非存在下で栽培した野生株の間で該遺伝子の発現応答を比較解析した。その結果、二酸化窒素の有無にかかわらず該遺伝子の発現に差は見られなかった。しかし、該遺伝子によって制御されることがわかっている複数の遺伝子の発現応答を調査したところ、二酸化窒素の有無により発現応答に差が見られる遺伝子が存在した。これらの結果は、該遺伝子が二酸化窒素センシング遺伝子の一つであることを示すものである。平成29年度に植物の二酸化窒素暴露処理に必要なNOxチャンバーのNOx濃度制御システムなどが故障したため予定通り実験を進めることができなかった。大気中に含まれる二酸化窒素は光形態形成(光による胚軸伸長抑制など)、栄養成長(バイオマス蓄積)および生殖成長(花芽形成)を促進し、植物の成長を正に制御する因子であるとの作業仮説を提起している。そこで本研究では、まず二酸化窒素による胚軸伸長抑制形質を指標として、T-DNA挿入ラインを対象として同形質を欠損した二酸化窒素非感受性株を選抜して二酸化窒素シグナルを受容し細胞内シグナルに変換するセンシング遺伝子の特定を目ざした。二酸化窒素はシロイヌナズナの胚軸伸長を抑制するが、そのような形質を欠失した株は、二酸化窒素センシング遺伝子に不具合が生じた、二酸化窒素非感受性株であるとみなされる。そこで、これまでに二酸化窒素非感受性株およびその原因遺伝子(二酸化窒素センシング遺伝子)について解析した。野生株について該遺伝子の発現量は二酸化窒素有無で差がなかった。該遺伝子の制御下にある遺伝子群の発現応答は二酸化窒素の有無により差が見られた。故に、該遺伝子は二酸化窒素に応答して、その発現レベルを変えるのではなく、該遺伝子の制御下にある遺伝子群の発現応答を制御して、胚軸伸長を制御していると考えられる。
膵ラ氏島アミロイドペプチド(IAPP)の細胞内分布ならびに生理機能の解明

膵ラ氏島アミロイドペプチド(IAPP)(islet amyloid polypeptide/amylin)は、インスリン非依存型糖尿病(NIDDM)およびインスリノーマ症例の膵アミロイドの主要な構成成分として単離されたペプチドで、病理学的存在様式から、NIDDMの病因に関与しているペプチドとして注目されている。しかし、その生理的、臨床的意義の詳細に関しては不明な点が多い。本研究はIAPPの細胞内分布ならびに生理機能の解明を行うことを主目的とした。本研究者らは、IAPPに特異的なRIAを開発し、それを用いてヒト、囓歯類の正常膵臓からIAPPを単離し構造決定した。その結果、IAPPは37個のアミノ酸からなりC末端がアミド化されたペプチドでCGRPと高い相同性をもちcalcitonin/CGRPfamilyに属することを明らかにした。さらに、CGRPが中枢、自律、感覚等の神経系に存在する神経ペプチドあるのと異なり、IAPPは神経系には全く見だされず、膵臓、胃、上部消火管に広く分布していることを明らかにした。また、ヒトの各種病態生理下における合成、分泌の変動を明らかにし、IAPPが膵臓B細胞分泌顆粒中にインスリンと共存し、かつ共に分泌される膵ホルモンであることを証明した。IAPPの膜受容体の存在の確認のため、膵臓ラ氏島B細胞膜成分と^<125>I-IAPPの結合実験を行い、さらに組織切片上でautoradiographyを行いBAS 3000にて画像解析を行なっているが、まだ充分な結果が得られていない。この実験系の開発にあたり用いた手技は塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)の膜受容体のbinding assay系の確立に非常に有用で、培養細胞でしか報告のなかったbFGFの膜受容体がin vivoの細胞で存在することを蛋白レベルで初めて明らかにすることができた。
高効率・高耐久性SOFC/SOEC電極のための結晶粒界構造と元素組成の最適化

SOFCの高効率化には、速い交換反応をもたらす結晶粒界の働きと構造の関係を明確にする必要があるこれらを明らかにするため、混合伝導体表面での酸素交換反応速度に対する結晶粒界を含むナノ構造の役割に関して評価を行った。PLD法で作製されたSr(Ti,Fe)O3-x膜の成長温度を上げると、結晶化度、結晶性、粒径、表面粗さ、酸素含有率が向上し、表面状態が改質された。膜の酸素表面交換反応速度(k)を連続的なIn situ光吸収法にて評価し、結晶性の高い膜が大きいkを示す事を明らかにした交換速度kとその経時劣化については、表面構造の変化と相関があり、粒界の局所的なドーピングがkを改善しないことを明らかにしたSOFCの高効率化には、速い交換反応をもたらす結晶粒界の働きと構造の関係を明確にする必要があるこれらを明らかにするため、混合伝導体表面での酸素交換反応速度に対する結晶粒界を含むナノ構造の役割に関して評価を行った。膜の酸素表面交換反応速度(k)を連続的なIn situ光吸収法にて評価し、結晶性の高い膜が大きいkを示す事を明らかにした交換速度kとその経時劣化については、表面構造の変化と相関があり、粒界の局所的なドーピングがkを改善しないことを明らかにした
引力相互作用するボース・アインシュタイン凝縮体における多体効果の研究

(1)平成15年度回転する中性原子は磁場中での荷電粒子と同じ振る舞いをする。従って、超伝導や磁場中での2次元電子気体で観測されたものと同じ現象が回転するボース・アインシュタイン凝縮体(BEC)においても観測されることが期待される。このような予測のもとに、我々は高速回転する二次元BECの性質を研究した。その結果、全角運動量がN(N-1)に等しくなると励起ギャップを持つゼロエネルギーのラフリン状態が現れることを見出した。更に、ラフリン状態の上にはロトン的な1粒子励起が現れることが見出された。ヘリウムとは異なり、このスペクトルはフォノン構造を持たない。長距離クーロン相互作用する分数量子ホール系においても同様にフォノンブランチを持たないロトンスペクトルが観測されているが、今回、短距離相互作用をする系において同様な構造が見出されたことは新たな知見をもたらすものと期待される。(2)平成16年度BECは通常、トラップポテンシャルに閉じ込められた状態で生成される。このため、集団モードなどのBECの基本的な性質は主としてトラップの周波数によって規定され、相互作用の効果はそれに対する補正として現れる。我々はトラップポテンシャルが存在しなくても、BECが自らの相互作用で凝縮する可能性について研究してきたが、今回、フェッシュバッハ効果により相互作用の強さを時間的に振動させることによりそのようなBEC dropletができることを見出した。これは、超流動状態の気体相における初めての自己束縛状態である。(3)平成17年度前年度に引き続き、引力相互作用するBECが閉じ込めポテンシャルがなくても安定に存在できるかどうかという問題に取り組んだ。昨年度にこれが2次元系の場合に可能であることを示したが、本年度は3次元系の場合について調べた。その結果、3次元系の安定化は、系に散逸がある場合は可能であるが、散逸がない場合は安定化できるパラメター領域を見出すことはできなかった。他方、密度をリアルタイムでプローブすることにより相互作用の強さをフィードバックすれば安定化できることが明らかになった。回転する中性原子は磁場中での荷電粒子と同じ振る舞いをする。従って、超伝導や磁場中で2次元電子気体で観測されたものと同じ現象が回転するボース・アインシュタイン凝縮体(BEC)においても観測されることが期待される。ヘリウムとは異なり、このスペクトルはフォノン構造をもたない。分数量子ホール系においても同様にフォノンブランチを持たないロトンスペクトルが観測されているが、これは長距離クーロン相互作用によるヒグスメカニズムであるという予測がなされている。今回、短距離相互作用をする系において同様な構造が見出された事は新たな知見をもたらすものと期待される。本年度の主な研究成果は以下のとおりである。(1)原子間相互作用を斥力にした状態でボース・アインシュタイン凝縮体(BEC)に渦を作った後に、相互作用を引力にしたときに量子渦がどのように崩壊するかを調べた。特に渦度が2以上の場合について調べ、BECが小片に分裂した後に崩壊するなどの現象を見出した。(2)BECは通常、トラップポテンシャルに閉じ込められた状態で生成される。

このため、集団モードなどのBECの基本的な性質は主としてトラップの周波数によって規定され、相互作用の効果はそれに対する補正として現れていた。我々はトラップポテンシャルが存在しなくても、BECが自らの相互作用で凝縮する可能性について研究してきたが、今回、フェッシュバッハ効果により相互作用の強さを時間的に振動させることによりそのようなBEC dropletができることを見出した。これは、超流動状態の気体相における初めての自己束縛系である。平成17年度は、引力相互作用するBECが閉じ込めポテンシャルがなくても安定に存在できるかどうかという問題に取り組んだ。周知のように、引力相互作用が一定の系では、閉じ込めポテンシャルが系の安定化のためには必要であるが、相互作用が時間的に振動変化している系では系を安定化できる可能性がある。われわれは、昨年度においてこれが2次元系の場合に可能であることを示したが、本年度は3次元系の場合について調べた。その結果、3次元系の安定化は、系に散逸がある場合は可能であるが、ない場合は安定化できるパラメター領域を見出すことはできなかった。他方、密度をリアルタイムでプローブすることにより相互作用の強さをフィードバックすれば安定化できることが明らかになった。
病原コレラ菌の自然環境における遺伝子動態

タイ国ノンタブリ県、サムットサコーン県、サムットソンクラーム県の試料から計152株のコレラ菌を得た。このうち、24株がプラスミドを保有していた。各種炭素源資化性に関する生理性状検定を行ったところ、従来のコレラ菌が資化することのできない糖を利用できるなど、興味深い株が確認された。抗生物質感受性試験についてはコントロールのN16961株が感受性である薬剤について、ナリジクス酸に1株、カナマイシンに12株、アンピシリンに21株の耐性菌が確認された。これらの付加的生理性状がプラスミドによるものであり、環境の常在菌に共有されているか否かについては、今後このプラスミドの解析よって確認することができる。世界的流行(パンデミック)を繰り返すコレラは、遺伝的変異によって人間の免疫機構を乗り越えて襲ってくる。この素早い変異は、沿岸域などの自然環境における遺伝子の水平伝達によるものである考えられ、自然環境におけるコレラ菌の遺伝子動態を明らかにするためには、水平伝達に関わる遺伝子プールを分割して解析する必要がある。コレラ菌に関して想定される水平伝達経路は、形質導入と形質転換であるため、本研究では環境水中の試料をプラスミド、ファージ、溶存態DNAの3つに分画して解析することを試みている。初年度は、環境サンプルから各遺伝子プールを取り出す手法の確立を主要課題として、ファージの分画手法を確立した。一方で、プラスミドおよび溶存態DNAの画分については検討中であり、そこにいくつかの解決しなければならない課題が残っている。環境サンプルの採取地点については、タイ国サムットソンクラーム県の河口域に定め、ここで定期的なフィールドワークを行っている。このフィールドは遠浅の海に淡水が緩やかに流入するため1-3%の塩分勾配が形成されており、また、年間を通じて水温が30度前後であるためVibrio choleraeの生息に適した環境が見つけやすくなっている。現在までに100を超える非病原性のVibrio cholerae株を分離し、保存している。河川の両岸には漁業民家が隣接しているが、コレラ発生の情報はない。ここで分離した株については、機能遺伝子の比較や複数のハウスキーピング遺伝子によるタイプ分け(MLST法)で今後の解析に有用な株を選別作業中である。本研究では、繰り返し起こるコレラ流行が遺伝子の変異を伴っているという点に着目して、環境中に生息するコレラ菌の可動遺伝子としてプラスミドおよびファージを調査することで我々の知らない環境中の遺伝子プールの存在を明らかにし、どのような遺伝子プールから、どのような機能を獲得した株が大流行を起こしたのかを解析することで病原菌の進化的経緯や拡散経路を解き明かし、未だ人類に猛威を振るう再興感染症コレラの流行メカニズムから今後の予防衛生を考える上で鍵となる知見を手に入れることを目的とした。タイのノンタブリ県、サムットサコーン県、サムットソンクラーム県の河川、運河より、暑季、雨季、乾季の時期に水試料を採取し、計152株のコレラ菌を得た。ただし、これらの株は、いずれも病原性を持つO1型もしくはO139型のいずれでもなく、また、PCR法によってctxAB遺伝子が確認されなかったことから、強い病原性は持たない環境常在菌であると推測される。各種炭素源の酸化・資化性能および酵素反応の有無に関する生理性状検定を行ったところ、従来のコレラ菌が持たない糖資化性や酵素を持つなど、興味深い株が確認された。26年度が最終年度であるため、記入しない。微生物生態学26年度が最終年度であるため、記入しない。コレラ菌に関して想定される水平伝達経路は、形質導入と形質転換であるため、本研究では環境水中の試料をプラスミド、ファージ、溶存態DNAの3つに分画して解析することを試みているが、現在までに手法が確立できたのはファージの分画手法のみである。残るプラスミドおよび溶存態DNAの分画手法は、本研究の完成にとって極めて重要な位置を占めており、今後早急の完成が必要と考える。一方、サンプル採取に関しては定期的に実施できており、今後の解析に供する試料が順調に蓄積されている。

本年度は、初年度からの課題を継続すると共に、環境水中から回収・精製したDNAを次世代シークエンサー(Ion PGM, Life Technologies社)を用いて網羅的に解読する。得られた配列は、過去の流行株との相同性や出現頻度など、定性的かつ定量的に解析することで、遺伝子動態を明らかにする。基本的には、初年度に確立したサンプリング手法を用いて継続的なアプローチを採るが、サンプリングフィールドは沿岸域、河口汽水域や生活排水流入域など、複数箇所に拡大することも検討する。研究期間内にコレラの流行が発生した場合は、流行地でもサンプリングを行い、流行株に生じた遺伝的変異を確認する。
正しい立体構造を持つ組換え蛋白を用いた天疱瘡の迅速診断法及び免疫吸着法の開発

本研究の目的は、生体内での天疱瘡抗原本来の3次元構造を有する組み換え蛋白を作成し、その組み換え蛋白を基質とする迅速簡便なELISA法による新しい診断法の開発をすることである。さらにその組み換え蛋白による吸着カラムを作成し、患者血中より病原性自己抗体のみ吸着除去する抗原特異的血漿交換療法の開発を行うことにある。本研究の推進により、分泌型の天疱瘡抗原組換え蛋白PV-His(Rc-Dsg3)およびPF-His(Rc-Dsg1)を組換え昆虫細胞(Baculovirus Expression System)を用いて発現させることに成功した。これらの組換え蛋白は、天疱瘡抗原本来の持つ3次元構造を正しく反映しており、in vivoにおける抗原決定基をすべて有していることが考えられた。3次元構造により決定される抗原決定基は、酸、アルカリ処理により不可逆的に、カルシウム除去により可逆的に失われるが、糖鎖除去の影響をうけない事が判明した。これらの組換え蛋白を抗原としたELISAにおいて、診断の確認されている血清に対し、特異性、感受性共に94%を越す信頼性の高い実用可能な診断薬が開発された。本ELISA法は、従来の正常ヒト皮膚切片を基質とする蛍光抗体法に比べ、特異度、鋭敏度ともに高く、また、各抗原蛋白に対する自己抗体の抗体価を特異的に測定できるために、血清反応からPVとPFを鑑別できる利点もある。さらに病勢との比較検討により、病勢のモニタリングにも役立つ可能性も示唆された。さらに、これらの組換え蛋白を充填したカラムにより、患者血清中に含まれる病原性自己抗体が特異的に除去され、カラム通過後の血清には病的活性を持つ自己抗体が含まれていないことが、新生仔マウスを用いた疾患モデルにより確認された。このことは、実験動物レベルではあるが、抗原特異的血漿交換療法が技術的に可能であることを明らかにしたものである。以上の成果により、臨床応用可能な新しい診断薬の開発が確実となり、また疾患特異的な新しい治療法の開発も示唆され、本研究の臨床医学に対する貢献は多大なものがあると考えられた。最近の分子生物学的研究により,天疱瘡の抗原はデスモソームに局在しているデスモソームカドヘリン蛋白であり、尋常性天疱瘡抗原はDsg3、落葉状天疱瘡抗原はDsg1であることが明らかとなった。本年度の研究では、まず、患者血清より精製したlgGを新生マウスに投与することにより患者病変同様の皮膚病変が引き起こされることを確認した。この動物実験より天疱瘡抗体は実際に病原性を有していることが判明した。次いで、Dsg1・Dsg3のcDNAを利用しバキュロウィルス発現系を用いて高次構造を有するリコンビナント蛋白を作成した。この蛋白を用いて尋常性天疱瘡および落葉状天疱瘡患者血清を吸収すると血中の抗表皮細胞間抗体が消失したことより、このリコンビナント抗原蛋白はすべてのエピトープを保持していることが確認された。さらに、新生マウスを用いた動物実験により、作製したリコンビンビナント蛋白による吸収でマススの病変誘発が阻止されることを示し、このリコンビンビナント蛋白が真の病原性エピトープを保持していることを確認した。さらに、Dsg1・Dsg3のリコンビナント蛋白を利用しカルシウムおよび糖鎖の影響を検討し、抗原蛋白上のエピトープはカルシウム依存性、糖鎖非依存性であることを見出した。

この結果は、将来、抗原特異的Affinityカラムを用いた血漿交換療法という新しい治療法の開発を約束するものである。さらに、これらのリコンビナント蛋白を用いたELISA法を確立し、この方法が非常に高い感度とほぼ100%の特異性を示すことを見出した。ELISA法は一度にたくさんの検体を処理することができ、また、より正確な抗体価の測定が可能なことより、このELISA法は従来の蛍光抗体法に代わる新しい診断法になると考えられた。これらの研究結果は単に自己免疫性水疱症に限らず他の多くの自己免疫性疾患の研究にも大きな影響を与えると思われる。本研究の目的は、生体内での天疱瘡抗原本来の3次元構造を有する組み換え蛋白を作成し、その組み換え蛋白を基質とする迅速簡便なELISA法による新しい診断法の開発をすることである。さらにその組み換え蛋白による吸着カラムを作成し、患者血中より病原性自己抗体のみ吸着除去する抗原特異的血漿交換療法の開発を行うことにある。平成7年度の研究成果をもとに平成8年度には、分泌型の天疱瘡抗原組換え蛋白PV-His(Rc-Dsg3)およびPF-His(Rc-Dsg1)を組換え昆虫細胞(Baculovirus Expression System)を用いて発現させることに成功した。これらの組換え蛋白は、天疱瘡抗原本来の持つ3次元構造を正しく反映しており、in vivoにおける抗原決定基をすべて有していることが考えられた。3次元構造により決定される抗原決定基は、酸、アルカリ処理により不可逆的に、カルシウム除去により可逆的に失われるが、糖鎖除去の影響をうけない事が判明した。これらの組換え蛋白を抗原としたELISAにおいて、診断の確認されている血清に対し、特異性、感受性共に94%を越す信頼性の高い実用可能な診断薬が開発された。本ELISA法は、従来の正常ヒト皮膚切片を基質とする蛍光抗体法に比べ、特異度、鋭敏度ともに高く、また、各抗原蛋白に対する自己抗体の抗体価を特異的に測定できるために、血清反応からPVとPFを鑑別できる利点もある。さらに病勢との比較検討により、病勢のモニタリングにも役立つ可能性も示唆された。以上の成果により、臨床応用可能な新しい診断薬の開発が確実となり、また疾患特異的な新しい治療法の開発を示唆され、本研究の臨床医学に対する貢献は多大なものがあると考えられた。
グラム陽性病原細菌のプロテインキナーゼを介するシグナル伝達の解明

K-Pが基質膜タンパク質(S)のThr-92のリン酸化調節で、同菌の生育・形態を制御すること、SはClostridium属に特異的に存在し、タンパク質相互作用領域を持つ新規シグナル伝達因子で、新規抗菌薬のTargetとして注目される非メバロン酸経路の必須酵素IspG、更に細胞壁生合成経路の必須酵素MurFとの相互作用を見いだした。我々は既に、K-Pが基質膜タンパク質(S)のThr-92のリン酸化調節により、同菌の生育・形態を制御していること、基質膜タンパク質はClostridium属に特異的に存在し、タンパク質相互作用領域を有する新規シグナル伝達因子であり、新規抗菌薬のTargetとして注目されている菌特異的な必須代謝経路(非メバロン酸経路)の酵素IspGとの相互作用を見いだしている。本研究では、基質膜タンパク質とIspGの分子・生理機能を解析し、K-Pシグナル伝達系の全貌を明らかにし、同属菌に起因する感染症治療に向けた分子微生物学的知見を得ることを目的とする。本年度は、以下について検討を行った。1) IspGの細胞内局在性、Sの膜トポロジーの解析2) IspGの各変異株における発現解析、菌の生育・形態形成へ影響の検討3) Sの新規相互作用因子の探索4) Kのシグナル分子の同定GFP融合Sの細胞内局在性解析から、Sは隔壁、両極に局在する。IspGは、細胞内タンパク質と思われるが、その局在性については不明である。Sは構造上Bi-topologicalと推定されるが、両末端HAタグS発現株のプロトプラストを用いた蛍光免疫染色を行い、Sの膜トポロジーを決定した。また、SのPhosphorylation Mimics(Thr-92-Glu): S (T92E)を作製し、発現解析を行った。更に各変異株でのIspG発現解析を行った。Kのシグナル分子として細胞壁分解物が推定されるため、細胞壁のEndolysin (Psm)分解物の調製を検討した。1)SのThr-92のリン酸化レベルと菌の形態との相関を解析するため、タグ付Sを野生株、P欠損株、K-P欠損株のゲノム上で付加、各増殖期における菌の形態及びSの発現量、リン酸化レベルをWestern Blotで解析した。2)これらの株のライセートをエンドリシンPsmを用いて調製し、Pull-down解析により、タグ付リン酸化S、タグ付非リン酸化Sと相互作用するタンパク質因子の同定を試みた。3)SおよびIspGの全体および各機能性領域(N末端、C末端領域)に分割しYeast Two-Hybrid Screenを行い、Sとの相互作用領域の特定と他の相互作用因子の探索を行った。1)その結果、全ての株において、Sの発現量はほぼ一定であること、野生株において、増殖初期で低いリン酸化レベル(0.7-5 %)を示し、K-P欠損株で見られる長い桿菌の比率が高い事、増殖が進むに従ってリン酸化レベルが上昇し、定常期後期(28-50 %)では、ほとんどの菌においてP欠損株様の短桿菌に変化することを見いだした。K-Pのシグナルとして細胞壁分解物が予想される事、増殖の進行に伴って分解物の量が増える故、Sのリン酸化レベルの上昇の原因と推定する。我々は、K-Pが基質膜タンパク質(S)のThr-92のリン酸化調節で、同菌の生育・形態を制御すること、SはClostridium属に特異的に存在し、タンパク質相互作用領域を持つ新規シグナル伝達因子で、新規抗菌薬のTargetとして注目される非メバロン酸経路の酵素IspG、更に細胞壁生合成経路の必須酵素MurFとの相互作用を見いだしている。本年度は、実際の菌体内におけるSとの相互作用を理解するためEGSによるCross-Linking解析を、親株、K-P欠損株、P欠損株で行った。その結果、リン酸化/非リン酸化Sで形成される高分子体の大きさ/量に相違が認められた。つまり、Sとの相互作用の強さ/タンパク質因子の種類が、リン酸化/非リン酸化型で異なることが予想された。この高分子S複合体をLC/MS/MS解析するため分画の検討を行った。更に、欠損株で認められた形態変化/Sのリン酸化レベルの変化は、野生株の試験管培養時にも見られた。増殖初期には長鎖桿菌の比率が極めて高く(低レベルリン酸化)、増殖の進行に伴い短くなり、正常桿菌→短桿菌→コンマ状短桿菌(高レベルリン酸化)へと変化した。このことから、Kの細胞外レセプターのリガンドの1つとして細胞壁の分解物が考えられ、増殖の進行に伴う分解物の蓄積がKの活性化、Sのリン酸化を亢進するものと推定された。しかし、分解物の添加によるリン酸化の亢進は、現在のところ検出できていない。もう一つの可能性として、細胞壁の架橋度をKが感知している可能性があり、現在、蛍光バンコマイシンによる染色観察を行なっている。

2)精製Hisタグ無Psmを協同研究者:玉井から提供を受けた。Ni2+-IMACレジンを用いたPull-down解析により、タグ付Sと相互作用するタンパク質因子の同定を試みた。ライセートに0.1 % TritonX100添加することで、高効率で膜タンパク質Sの回収が可能となった。しかし、レジンに非特異的に結合するタンパク質が多く、野生株、P欠損株、K-P欠損株間での比較が困難であった。また、Bufferの条件検討も行ったが改善は見られなかった。細菌学、生化学、分子微生物学、応用微生物学今後、1)協同研究者:玉井からのガス壊疽菌の細胞壁分解物画分を、増殖初期の低レベルリン酸化状態の菌に添加し、リン酸化の亢進またはその変化を確認する。2)バックグラウンドの低減のためDynaBeads-His-Tag Isolation & Pulldown (TALON)を用いたPull-down解析を行う。Sの膜トポロジーの解析のため、N末端HAタグSをXylose誘導発現ベクターpXCにクローンした。S欠損株の相補は成功したが、C末端HAタグSと比べ、ガス壊疽菌での発現量が極めて低く、その改良を検討した。RNA二次構造予測により、SのN末端4残基(MSKY)をTranslation Enhancing Element (TEE)として付加する事で、その発現量が大幅に改善した。これらの発現株のプロトプラストをPsmで調製し、間接免疫蛍光染色法により解析した。その結果、Sは、N-in/C-outの膜タンパクである事が示唆された。S (T92E)の発現解析を行った結果、S(T92A)同様、Kによるリン酸化は認められなかったが、S(T92A)とは異なり、非リン酸化S様の機能相補は認められなかった。IspG遺伝子は、必須遺伝子である。IspG遺伝子をXylose誘導発現ベクターにクローニングし、ガス壊疽菌の親株に形質転換し、C末端タグ付き/無しのIspGを発現させ、タグ抗体で検出し確認した。いずれの発現株においても、IspG発現により、菌の形態が伸長した。現在、S変異株等での発現解析を検討している。Sの新規相互作用因子の探索として、HisタグSによるFormaldehyde Cross-Linking (FACL)、Pull-Down (PD)解析を行った。しかし、FACLではPsmによる溶菌/可溶化が困難であり、プロトプラストでのFACLでも同様であった。PDでは、HisタグSの発現及び非発現株の菌体をHisタグなしPsmで処理し(0.5 % CHAPS存在下)、菌体ライセートを調製、Ni-IMACにより分画した。SDS-PAGE後、発現株分画に特異的なバンドについてN末端アミノ酸配列の決定を行った。現在のところ、有力な相互作用因子はまだ特定されていない。消耗品の購入量/使用量が幾分少なかった。今後、YFP融合IspG遺伝子を作製し、IspGの局在性を解析する。更に、GFP融合Sとの共発現株を用いたFRET解析を検討する。ガス壊疽菌より単離した細胞壁を、Psmを含めた酵素的に異なる複数のEndolysinで分解物し、HPLCによる分画の検討している。現在、別のタイプのEndolysinを同定、精製し解析を行っている(分担:玉井栄治/松山大学)。調製次第、添加実験を行い菌の形態とSのリン酸化レベルを解析する。試薬等の購入に充てる。
消化管癌の新規治療標的としてのＮＦ－κＢ　関連因子の検討

消化器癌の化学療法は、分子標的薬を始めとした様々な薬剤が使用されるが、その多くは5-FU等のようなDNA損傷を引き起こす薬剤を併用する。一方、DNA損傷は制御因子IKK複合体の活性化を通してNF-κBを活性化することが報告されており、DNA損傷によるIKK/NF-κB活性化の癌細胞における意義を解析することとした。細胞のDNA損傷応答において、ATMは重要な役割を果たす因子であり、DNA損傷時のIKK/NF-κBの活性化にも関連することが知られている。そこで、ATM/IKK/NF-κBの生理的役割について観察した。前年度に引き続き、IKKβがDNA修復に果たす役割を観察した。その結果、IKKβが細胞のアルキル化刺激に応じて核内へ移行し、ATMをリン酸化することによりDNA修復の補助的な役割を果たす可能性が示された。この現象については論文化し、報告した。一方、癌細胞の抗癌剤に対する抵抗性の獲得機序についても研究を進めた。5-FUを添加したメディウム中で大腸癌細胞株を培養し、5-FUの耐性化を誘導した。耐性を容易に獲得する細胞株ではAktのリン酸化およびERKのリン酸化の元進が観測された。それらのリン酸化はADAMS阻害薬の添加により減弱し、更にはADAMS阻害薬により耐性化能も減弱した。これらの機能については引き続き解析するとともに、動物モデルを使用した系も立ち上げ中である。本年度から種々の遺伝子改変マウスを利用できる環境で研究を遂行できることとなったため、データが出そろいつつある。本年度で最終年度であり、次の研究につながる重要な知見を得ることが出来た。癌の性質を規定する因子として、癌細胞自身の他、癌細胞周囲の線維細胞、免疫担当細胞なども大いにかかわっていることが示されつつある。これらの相互作用を理解することがより一層の研究の進展につながると考えられる。最終年度で予想以上に多くのデータが得られたため、論文化へ着手する。DNA損傷の種類としてはアルキル化について解析することとした。アルキル化を引き起こす抗癌剤は複数あるが、刺激を強力にするため、アルキル化剤は抗癌剤ではなく、主にMNUを使用した。ATMをsiRNAによりノックダウンしたところ、アルキル化剤によるDNA損傷の修復が抑制された。また、IKK複合体の主要因子であるIKKβをノックダウンしたところ、DNA修復が抑制された。そこで、IKKβをノックダウンした状態でのアルキル化損傷後のATMのリン酸化状態を観察すると、ATMのリン酸化(s1981)が刺激後6-9時間後にはコントロールに比べて減弱していることが判明した。IKKβによる被リン酸化部位を既報プログラムを用いて検索したところ、ATMのs1981も候補として挙がり、in vitroキナーゼアッセイにおいてもIKKβによるATMのリン酸化が観察された。更には、アルキル化刺激に応答してIKKβが核内に移行する現象も観察された。IKKβの核内移行を阻害したところ、ATMのリン酸化及びDNA修復が抑制された。これらの結果から、IKKβが細胞のDNA損傷応答時に、直接ATMを活性化しDNA修復を促す経路の存在が示唆され、抗癌剤耐性の一因である可能性が示された。6種類の大腸癌細胞株を用いて実験したところ、容易に耐性化を獲得する株と、耐性化獲得が困難な株とに分かれることが判明した。また、耐性化を獲得した株では、Aktのリン酸化およびERKのリン酸化の亢進が観測された。これらの現象については引き続き機序を探求しつつ、学会発表を行なった。

更には、胃癌の発癌・進展についても研究を進め、共同著者として論文を投稿することができた。消化器癌の化学療法は、分子標的薬を始めとした様々な薬剤が使用されるが、その多くは5-FU等のようなDNA損傷を引き起こす薬剤を併用する。一方、DNA損傷は制御因子IKK複合体の活性化を通してNF-κBを活性化することが報告されており、DNA損傷によるIKK/NF-κB活性化の癌細胞における意義を解析することとした。細胞のDNA損傷応答において、ATMは重要な役割を果たす因子であり、DNA損傷時のIKK/NF-κBの活性化にも関連することが知られている。そこで、ATM/IKK/NF-κBの生理的役割について観察した。前年度に引き続き、IKKβがDNA修復に果たす役割を観察した。その結果、IKKβが細胞のアルキル化刺激に応じて核内へ移行し、ATMをリン酸化することによりDNA修復の補助的な役割を果たす可能性が示された。この現象については論文化し、報告した。一方、癌細胞の抗癌剤に対する抵抗性の獲得機序についても研究を進めた。5-FUを添加したメディウム中で大腸癌細胞株を培養し、5-FUの耐性化を誘導した。耐性を容易に獲得する細胞株ではAktのリン酸化およびERKのリン酸化の元進が観測された。それらのリン酸化はADAMS阻害薬の添加により減弱し、更にはADAMS阻害薬により耐性化能も減弱した。これらの機能については引き続き解析するとともに、動物モデルを使用した系も立ち上げ中である。当初の計画とはやや違う方向ではあるが、抗癌剤耐性に関するNF-κB関連因子の新規的な役割の解明に至っている。また、結果報告として学会発表まで漕ぎ着けており、着実に進行している。一方で、実験動物の疾患等で、予想外の遅れを蒙ったこともあり、完全に順調に進行できたとは言えないため、評価を(2)とした。論文として投稿できるだけのデータを得ることができ、実際論文がpublishされたため。また、癌細胞の抗癌剤耐性化の機序および耐性化獲得の阻害に関して追及を進めることができている。更には、大腸癌のみならず胃癌に関する研究も進行しており、順調に進展していると判断した。本年度から種々の遺伝子改変マウスを利用できる環境で研究を遂行できることとなったため、データが出そろいつつある。本年度で最終年度であり、次の研究につながる重要な知見を得ることが出来た。動物の疾患については、動物を一掃したうえで清掃し、再度やり直す。動物が準備できるまで、癌細胞株や臨床検体等をもちいた解析が主となるため、それらの材料でできる限りのデータを採取しておく。癌の性質を規定する因子として、癌細胞自身の他、癌細胞周囲の線維細胞、免疫担当細胞なども大いにかかわっていることが示されつつある。これらの相互作用を理解することがより一層の研究の進展につながると考えられる。まずは、生体の免疫反応について理解を深めるべく、免疫関係の研究を専門とする海外の研究室で学ぶこととした。
生体幹細胞ニッチを保持した人工ECMによる自己幹細胞からの拍動心筋細胞分化誘導

心筋梗塞などに対して患者自身の間葉系幹細胞などを移植する再生医療が注目されている。しかしその効果は、細胞多産生する有用成分にもとづくものであり、また、その効果も十分ではない。そこで、さらに高い治療効果を目指して、iPS細胞から拍動する心筋細胞などの機能性細胞を誘導して移植する治療法が注目されている。本研究では、ブタ等の組織(心筋・肝・能)から細胞成分を取り除いた脱細胞マトリックスをiPS分化基材として用いることでその有用性を確認した。心筋梗塞に対する細胞移植療法では、リスクの低い自己由来幹細胞が望ましく、自己骨格筋芽細胞や自己骨髄由来間葉系幹細胞が選択されてきたが、安定して高い効果が得られているわけではない。さらに高い治癒効果を得るためには、拍動する機能性心筋細胞が期待されているが、鑑定供給が可能な細胞ソースの確保が重要である。従来から心筋細胞誘導に関する多くの報告があるが、GATA4など心筋マーカーは陽性になっても、多くの場合自己拍動はしない。一方、培養基材の力学特性が幹細胞分化に影響することが注目されている。Discherらは、ポリアクリルアミドハイドロゲルの弾性率が、間葉系幹細胞の神経・骨格筋・骨への分化誘導に影響することを報告したが、心筋分化は達成されていない。我々は、弾性率だけでなくECMの種類も分化効率に影響することを見いだしており、本研究では、生体内の心筋細胞ニッチを可能な限り正確に再現するために、心筋組織そのものを心筋分化ニッチとして利用した。ブタ等の心筋組織・肝臓組織・脳組織から細胞成分を除去してECM成分のみを残した脱細胞心筋・肝・脳組織を分化人工ニッチとして使用し、心筋細胞・肝細胞・神経細胞への分化誘導を処理を施した。組織によって細胞接着性が異なったために今回は、I型コラーゲンおよび細胞接着性合成ペプチドで表面を修飾した(特願2012-237258)。今年度は、脱細胞化組織がiPS細胞の心筋および肝分化に与える影響について主に評価した。マウスiPS細胞の心筋分化誘導後、心筋組織特異的遺伝子発現を解析した。拍動関連タンパク遺伝子については心筋組織で他組織上より高い発現量を示したが、Caイメージング法を用いた拍動細胞誘導評価では、いずれの組織上においても拍動細胞誘導効率の大きな改善は見られなかった。組織表面の修飾の影響など、詳細に検討する必要がある。心筋梗塞治療に対する細胞移植療法において、拍動する自己由来心筋細胞移植が有効と考えられているが、細胞の入手は困難である。本研究は、自己由来細胞から拍動心筋細胞へと高効率で分化誘導する人工ニッチ基材の開発を目的とする。自己由来細胞としては、移植におけるリスクが低い間葉系幹細胞(MSC)を第一選択とし、テラトーマ生成などのリスクを有するものの分化効率の高いiPS細胞を第二選択とする。近年、幹細胞の分化誘導ニッチとして1メカニカルキュー、および、2細胞外マトリックス組成が注目されている。そこで、両者を高度に再現することが可能な脱細胞化組織を人工ニッチ基材とすることで、高効率な自己心筋細胞分化誘導に挑戦した。MSCおよびiPS細胞を、ブタ由来の脱細胞心筋、脱細胞肝臓、および脱細胞脳組織上にて、心筋細胞、肝細胞、神経細胞への分化誘導を試みた。我々の高圧脱細胞システムでは、界面活性剤を用いないために、残存界面活性剤による細胞接着性の低下が阻止できることが、明確となった。しかしながら、脱細胞脳組織上では、その組成的特徴のために細胞接着性が十分ではなく、細胞塊を形成したために、ニッチ基材の影響が十分に評価できないと判断して、心筋および肝臓について詳細に検討した。それぞれ、特徴的遺伝子のRT-PCR定量により解析した結果、幹細胞の分化誘導効率は、対応する脱細胞組織上で高効率となることが示された。また、心筋細胞に関しては心筋関連転写因子による特徴付けと、拍動関連遺伝子による機能的特徴化を詳細に検討した。この両者は、異なるニッチ基材が適当である可能性が示され、生体内での発生挙動における細胞外マトリックス組成の経時的変化を再現する等の時系列的制御も可能と考えられた。プロジェクト終了後にも、この点に着目して、さらなる高効率分化誘導を進める計画である。脱細胞化組織がiPS細胞の心筋および肝分化に与える影響について評価した。残存DNA定量およびHE染色により細胞除去を確認し、マッソントリクローム染色および鍍銀染色によりECM成分を維持している事を確認し、さらに圧縮弾性率評価により脱細胞化処理前と同様の力学特性を維持していることを確認した。次に脱細胞化組織から25umの薄切切片を作製し培養基材として以降の実験に使用した。この時、予測されたとおり細胞接着性が十分ではなく、組織表面の修飾処理を施した。組織ECM組成を変化させることにつながると懸念されたが現状では必要な処理である。マウスiPS細胞の心筋分化誘導では、拍動関連タンパク