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前期破水の治癒機構の解明と新規治療法の開発

本年度は前期破水と羊水中のマクロファージを中心とした自然免疫機構とのかかわりにつき検討を行った。母体ストレスや自己免疫疾患などに対する妊娠中のステロイドの使用は前期破水や早産のリスクとなることが知られている。妊娠中にプレドニゾロン(>6.5mg/日)を服用している妊婦では対照群に比べて羊膜の間葉細胞層が有意に薄かった。妊娠マウスにグルココルチコイド(GC)を投与すると、同様に羊膜の間葉細胞層の菲薄化を認めた。この卵膜ではコラーゲン含有量の低下とその分解酵素のマトリックスメタロプロテナーゼ(MMP)の発現亢進、さらにプロスタグランジンE2 (PGE2)とその律速酵素のCOX2の産生が増加していた。組織学的にはGC投与により羊膜へのマクロファージの遊走が亢進し、マクロファージよりIL-1βが放出されていた。ヒト羊膜間葉細胞にGCを投与すると、コラーゲン遺伝子の発現を抑制しCOX2発現を増加させ、一方IL-1βの投与はCOX2とMMPの発現を著明に増加させた。以上よりGCは羊膜間葉細胞へ直接作用しコラーゲン産生の抑制とPGE2の産生を増加させる。一方、GCは羊膜へM1型の炎症性マクロファージを遊走させ、放出されたIL-1βがMMPの増加によりコラーゲンを分解していることが示唆された。妊娠中のグルココルチコイド投与、あるいは母体への多大なストレスは羊膜を脆弱化し、前期破水や早産のリスクとなることが考えられる。以上の結果はEndocrinology誌に掲載された。1)前期破水の羊膜の組織学的観察:まずヒト前期破水症例の卵膜を組織学的に観察した。破綻部の羊膜間質にはCD68陽性のマクロファージの集積を多数認めた。さらに破水部の羊膜上皮細胞にはKi67陽性細胞が存在し、羊膜上皮の細胞増殖が盛んなことが示された。さらに蛍光二重染色にてE-cadherin陽性の羊膜上皮細胞層にvimentin陽性細胞が多数認められ、増殖している羊膜上皮で、上皮間葉転換(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)が生じていることが示唆された。このように、ヒトではマクロファージが羊膜上皮細胞に何らかの働きかけを行い、上皮の増殖とEMTにより羊膜の創傷治癒が促進されている可能性が示唆された。2)マクロファージと羊膜細胞の相互作用:次にヒト腹腔内より単離したマクロファージとヒト羊膜上皮細胞とを用いて、マクロファージが羊膜上皮へ与える影響を検討した。マクロファージと羊膜上皮細胞とを共培養しscratch assayを行ったところ、共培養群では、上皮細胞単独群と比べ羊膜上皮細胞の遊走が有意に促進された。さらにマクロファージと共培養した羊膜の上皮細胞は、その創部の辺縁で形態が間葉細胞様に変化しており、ここでもEMTが生じている可能性が示唆された。3)マウス前期破水モデルにおける破水の治癒機構:我々が作成したマウス前期破水モデルにおいて、羊水中のマクロファージのlineageをフローサイトメトリーにより検討した。羊水中のマクロファージは、非破水群に比べて破水群で有意に増加しており、これらのマクロファージは、胎仔肝臓由来であった。破水部卵膜の遺伝子発現を定量PCR法で検討したところ、TGF-β2, 3の発現が破水群で有意に亢進していた。これらのTGF-βシグナルが羊膜に治癒機構に関与している可能性が示唆された。1)胎生期マクロファージ欠損マウスの解析による破水治癒機構の解析胎生期にマクロファージを欠損したコンディショナルノックアウトマウスを作成して、卵膜の創傷治癒におけるマクロファージの機能について解析する。マクロファージ特異的に発現されるCx3Cr1遺伝子のプロモーター領域にCre-ERT2を結合したCx3Cr1CreERマウスを、マクロファージcolony stimulatingfactor-1 receptor (CSF1r)のfloxed mutantマウス、すなわちCsf1r flox/floxマウスと交配する。これにより出生したヘテロ(Cre/wild, flox/wild)同士を交配して妊娠マウスを作成し、その胎仔のジェノタイピングを行い、ホモ(Cre/Cre, flox/flox)を選択。ホモ同士を交配して妊娠マウスを作成する。作成した妊娠マウスに妊娠8日目よりタモキシフェンを投与し、マクロファージを欠損させた後、下記の破水実験に供する。妊娠15日目のマウスを吸入麻酔下に開腹し注射針を用いて卵膜を破綻させる(マウス前期破水モデル)。閉腹後、経時的に卵膜の破綻部位を計測してその治癒を観察する。また卵膜、子宮筋、子宮頸部の採取を行い成長因子やサイトカインなどの解析を行う。2)羊膜治癒におけるメカニズムの解析羊膜の創傷治癒過程における上皮細胞の上皮間葉転換(EMT)のメカニズムにつき検討を行う。具体的には、IL-1β, TNFなどの炎症性サイトカインなどが、羊膜においてEMTを促進させるかどうか検討する。一方、TGF-βはフィブロネクチンやコラーゲンなどの細胞外マトリックス蛋白と相互作用して、細胞の遊走などを促進する可能性がある。これをヒト羊膜細胞およびヒトマクロファージを用いて、TGF-βシグナルによる羊膜治癒の可能性につき検討を行う。

本年度は前期破水と羊水中のマクロファージを中心とした自然免疫機構とのかかわりにつき検討を行った。母体ストレスや自己免疫疾患などに対する妊娠中のステロイドの使用は前期破水や早産のリスクとなることが知られている。妊娠中にプレドニゾロン(>6.5mg/日)を服用している妊婦では対照群に比べて羊膜の間葉細胞層が有意に薄かった。妊娠マウスにグルココルチコイド(GC)を投与すると、同様に羊膜の間葉細胞層の菲薄化を認めた。この卵膜ではコラーゲン含有量の低下とその分解酵素のマトリックスメタロプロテナーゼ(MMP)の発現亢進、さらにプロスタグランジンE2 (PGE2)とその律速酵素のCOX2の産生が増加していた。組織学的にはGC投与により羊膜へのマクロファージの遊走が亢進し、マクロファージよりIL-1βが放出されていた。ヒト羊膜間葉細胞にGCを投与すると、コラーゲン遺伝子の発現を抑制しCOX2発現を増加させ、一方IL-1βの投与はCOX2とMMPの発現を著明に増加させた。以上よりGCは羊膜間葉細胞へ直接作用しコラーゲン産生の抑制とPGE2の産生を増加させる。一方、GCは羊膜へM1型の炎症性マクロファージを遊走させ、放出されたIL-1βがMMPの増加によりコラーゲンを分解していることが示唆された。妊娠中のグルココルチコイド投与、あるいは母体への多大なストレスは羊膜を脆弱化し、前期破水や早産のリスクとなることが考えられる。以上の結果はEndocrinology誌に掲載された。1)前期破水の羊膜の組織学的観察:まずヒト前期破水症例の卵膜を組織学的に観察した。破綻部の羊膜間質にはCD68陽性のマクロファージの集積を多数認めた。さらに破水部の羊膜上皮細胞にはKi67陽性細胞が存在し、羊膜上皮の細胞増殖が盛んなことが示された。さらに蛍光二重染色にてE-cadherin陽性の羊膜上皮細胞層にvimentin陽性細胞が多数認められ、増殖している羊膜上皮で、上皮間葉転換(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)が生じていることが示唆された。このように、ヒトではマクロファージが羊膜上皮細胞に何らかの働きかけを行い、上皮の増殖とEMTにより羊膜の創傷治癒が促進されている可能性が示唆された。2)マクロファージと羊膜細胞の相互作用:次にヒト腹腔内より単離したマクロファージとヒト羊膜上皮細胞とを用いて、マクロファージが羊膜上皮へ与える影響を検討した。マクロファージと羊膜上皮細胞とを共培養しscratch assayを行ったところ、共培養群では、上皮細胞単独群と比べ羊膜上皮細胞の遊走が有意に促進された。さらにマクロファージと共培養した羊膜の上皮細胞は、その創部の辺縁で形態が間葉細胞様に変化しており、ここでもEMTが生じている可能性が示唆された。3)マウス前期破水モデルにおける破水の治癒機構:我々が作成したマウス前期破水モデルにおいて、羊水中のマクロファージのlineageをフローサイトメトリーにより検討した。羊水中のマクロファージは、非破水群に比べて破水群で有意に増加しており、これらのマクロファージは、胎仔肝臓由来であった。破水部卵膜の遺伝子発現を定量PCR法で検討したところ、TGF-β2, 3の発現が破水群で有意に亢進していた。これらのTGF-βシグナルが羊膜に治癒機構に関与している可能性が示唆された。1)胎生期
『トルコへの旅』とオスマン帝国

特別研究員DC2の二年目となる平成18年度は、オスマン帝国を対話形式で記述した16世紀中葉のスペイン語テクスト『トルコへの旅』(Viaje de Turquia)の同時代的意味と独自性を探求する第二段階として、16世紀スペインのキリスト教改革思想に関する研究に取り組むと同時に、同時代のオスマン帝国の歴史・内情を記述した16・17世紀スペインの諸文献に関する研究も引き続きおこなった。いずれも、『トルコへの旅』が執筆された時期前後の重要なスペイン語テクスト及びそれらと密接な関連をもつイタリア語・フランス語テクストの調査分析と、文学史的・理論的な先行研究の検証という、二つの方向からおこなった。今年度交付分の科学研究費補助金(特別研究員奨励費)は、上記テーマに関連する書籍類の購入及び、マドリードの国立図書館をはじめとするスペインの主要図書館で平成18年6・7月におこなった資料・文献収集のために費やした。スペインでは、日本で接することのできない多くの貴重な文献にあたることができ、きわめて有意義な研究滞在となった。こうした研究の結果、エラスムス主義の系譜に連なる先鋭なキリスト教改革思想が『トルコへの旅』におけるオスマン帝国の表象に独特の複雑さを与えていることを明らかにすることができた。今年度の研究は、オスマン帝国を対話形式で記述した16世紀中葉のスペイン語テクスト『トルコへの旅』(Viaje de Turquia)の同時代的意味と独自性を探求する第一段階として、類似した形式・テーマを持つ同時期のテクスト群、すなわち「対話」というジャンル、及びオスマン帝国の歴史・内情を記述した作品群に関する研究を中心的な課題としていたが、いずれのジャンルの研究も、『トルコへの旅』が執筆された時期前後の重要なスペイン語テクスト及びそれらに先行するイタリア語テクストの調査分析と、文学史的・理論的な先行研究の検証という、二つの柱からなっていた。平成17年度交付分の科学研究費補助金(特別研究員奨励費)の2割を、日本で上記テーマに関連する書籍類を購入することに充て、残り8割を、平成17年7月から8月にかけて、スペインの主要図書館(国立図書館、高等学術研究院(CSIC)図書館)でおこなった調査のために費やした。スペインでは、上記の領域に関連する、日本では入手困難な数々の文献に接し、かつ幾人かの著名なスペイン人研究者からの助言を得ることで、『トルコへの旅』が書かれた当時のスペインにおける異文化認識のあり方や、文学潮流について知見を深めるとともに、そうした思潮の中に『トルコへの旅』のオスマン帝国記述を位置づける足がかりを得ることができ、非常に有意義な研究滞在となった。具体的には、『トルコへの旅』が先行するオスマン帝国記述を多くの面で継承しつつも、「対話」という柔軟性に富んだ形式を導入し、その可能性を十二分に引き出すことで、新たな表現の活力を得たという点を明らかにすることができた。
大脳皮質抑制性神経回路の秩序構造の解明

大脳新皮質からの出力を担う5層の興奮性ニューロンは縦一列に並んでマイクロカラムを形成しており、マイクロカラムが皮質情報処理の単位である可能性が提唱されていた。本研究では、抑制性ニューロンがこの神経回路の機能をどのように調節しているのか明らかにするため、皮質5層の抑制性神経回路構造の規則性を調べた。ニューロンの配列構造およびシナプス結合規則を解析した結果、抑制性ニューロンに規則的な神経回路構造は見られなかった。その一方で、マイクロカラムを構成する細胞の種類とマイクロカラム配列の周期性が明らかとなり、皮質情報処理の基盤となる神経回路構造の理解が進んだ。大脳新皮質の複雑な神経回路は、単純な機能単位の集合体である可能性が考えられている。本研究課題では、皮質5層の主要な興奮性ニューロンである皮質下投射ニューロンが細胞単位でカラム状に配列した構造(マイクロカラム)が機能単位を形成していると考え、抑制性ニューロンとの関係に注目して、機能単位の構造と情報処理様式を解明することが目的である。本年度の研究計画では、大脳新皮質5層に存在する興奮性・抑制性ニューロンの細胞配置規則を解析し、マイクロカラムと他のニューロンに規則的な神経回路が存在する可能性を検証する計画であった。そこでまず、脳透明化技術と二光子顕微鏡を用いて、蛍光ラベルされたニューロンの観察を行い、細胞の3次元座標の解析を行う方法を開発した。この方法によって、脳組織をスライスすることなく、広範囲の細胞配置を解析することが可能になり、実験効率の向上と3次元解析によってこれまで見ることができなかった皮質構造の規則性を解析することが可能になった。細胞配置の3次元解析を行った結果、興奮性ニューロンのうち皮質下投射ニューロンのみがカラム状の配置をとっていること、皮質下投射ニューロンが形成するマイクロカラム構造は皮質の広範囲に見られることが明らかとなった。これは、マイクロカラムが皮質5層の普遍的な構造単位であることを示唆する結果である。また、皮質下投射ニューロンと他のニューロンの相対位置関係の解析も進めた。また本年度は、大脳新皮質5層ニューロンのin vivoカルシウムイメージングを行う設備の立ち上げや条件検討も行った。ウイルスベクターを用いてカルシウム感受性蛍光タンパク質を発現させることにより、皮質5層の数百個のニューロン活動を同時に計測することが可能になった。この技術を用いて次年度の研究を効率的に進める。大脳新皮質5層から他の脳領域に投射する皮質下投射ニューロンは縦一列に並んでマイクロカラムを構成しており、マイクロカラムが皮質の機能単位として働いている可能性がある。しかし、大脳新皮質5層に存在するその他のニューロンにも規則的な配列構造が存在するのかは不明であった。本研究課題では、マイクロカラムの構造に対応した規則的な抑制性神経回路が存在するのか解明することを主な目的とした。蛍光ニューロントレーサーや遺伝子組換えマウスを用いて大脳新皮質5層に存在する興奮性・抑制性ニューロンを細胞タイプ選択的に蛍光標識をし、組織透明化法を用いて大脳新皮質標本を透明化することで、大脳新皮質の広い範囲を二光子顕微鏡観察した。細胞タイプごとの3次元配置を解析した結果、大脳新皮質5層マイクロカラムは特定種類のニューロンのみによって構築されており、マイクロカラム構成ニューロン以外の細胞タイプはカラム配列から排除された細胞配置をとっていることを発見した。また、マイクロカラムは大脳新皮質の広範囲に普遍的に存在し、大脳新皮質5層平面上に周期的に配列していることも明らかになった。大脳新皮質急性スライス標本を作製し、スライスパッチクランプ法によって抑制性ニューロンと皮質下投射ニューロンのシナプス結合の規則性を解析することで、抑制性シナプス結合の規則性を見いだした。細胞配置の3次元解析の結果とシナプス結合規則から、大脳新皮質にはマイクロカラムと関連した規則的な抑制性神経回路が存在する可能性が考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。神経科学26年度が最終年度であるため、記入しない。科研費の交付から半年間の研究期間であったが、遺伝子組換え動物等の実験材料や設備を事前に整えてあったので、順調に実験が進んだ。また、解析手法の改良により、研究の効率も向上したことも大きい。本年度行った細胞配置の3次元解析結果ふまえて、特定細胞タイプ間の規則的な神経回路構造を明らかにするため、脳スライス標本での電気生理実験を進める。また、本年度立ち上げたin vivoカルシウムイメージングの実験系を用いて、in vivoでの機能を解析するためのイメージング実験を進める。研究はおおむね当初の予定どおり進んでいるので、次年度も当初の研究計画に沿った内容で研究を進める。
クリスタルビームの基礎物性に関する研究

昨年度まで使用していた分子動力学コード"SOLID"に大幅な改良を加え、実際のレーザー冷却過程がほぼ正確にシミュレートできるようにした。具体的には、単位数値積分ステップ当たりのレーザーフォトン吸収回数を算定した上で、モンテカルロ計算を行っている。これにより、フォトンの吸収および放出時における確率的な拡散加熱効果(一種のランダムウォーク)が導入可能になった。また、冷却セクション中でのレーザービーム径の変化も取り入れている。この改良型コードを用いて、とくに線密度の低いビームのレーザー冷却シミュレーションを系統的に実行してきた。データはまだ予備的であるが、(1).共鳴結合法を適用しない限り、横方向自由度を効率良くレーザー冷却するのはきわめて困難であること、(2).運動量分散効果による結晶状態の不安定化が予想通り厳しく、現実の蓄積リングでビーム結晶化を達成するためには、非常に綿密なラティスの最適化が必要であること、などが強く示唆されている。SOLIDの改良バージョンによる数値計算にはかなりの時間を要する上、ルンゲクッタ積分法が用いられているためロングタームの粒子トラッキングには不向きである。この点に鑑み、現在全く新しい分子動力学コードの開発を行っている。新コードは改良版SOLIDの利点をすべて含んでいるだけでなく、数値積分はシンプレクティックに実行する。また、様々な初期分布の設定や、ビームとラティスの整合も自動的に達成できるルーチンも加わっている。他方、本研究で得られた知見に基づき、京都大学で建設中の小型クーラー蓄積リング(LSR)のラティス特性を吟味した。低次共鳴現象の発生条件や結晶基底状態の安定性等を考慮し、LSRの基本パラメータを設定すると同時に、SOLIDを使ったシミュレーションも行った。ビームの結晶化を実現する上で問題となり得る効果のうち、「外部集束場の周期性に起因する共鳴不安定性現象」および「双極磁場が生み出す運動量分散効果」の二つについて詳細な検討を加えた。クーラー蓄積リングTARNIIのラティス構造を具体的に考慮したシミュレーション研究によって、以下のような知見が得られた:(1).共鳴不安定性によって、ビームの性質が著しく劣化する。とくに、2次と4次の共鳴が問題である。(2).ビームを冷却する過程で半整数共鳴(2次共鳴)の禁止帯に遭遇した場合、それ以上の冷却は困難である。(3).単一ラティス周期構造当たりのベータトロン振動位相の進みが90度以下であれば、共鳴不安定性による冷却阻害はほとんど起こらない。(4).高周波電場によってバンチされたビームが結晶化された場合、蓄積リング固有の運動量分散の影響で、結晶構造全体が水平方向に周期振動する。このため、結晶化したビームの温度がレーザー冷却のドップラー限界を大きく上回ることがある。(5).バンチされたクリスタルビームの結晶構造転移は、連続ビームの場合とは異なる閾値で発生する。尚、使用したコードは分子動力学コード"SOLID"およびPICコード"SIMPSONS"で、いずれも粒子間クーロン相互作用を近似的に導入することが可能である。極低温領域におけるビーム物性を調べる目的には主に前者を用い、冷却初期の高温状態をシミュレートするのには後者を使うことによって計算時間の短縮をはかった。
基底細胞から味蕾へ：コンディショナル遺伝子改変による分化とターンオーバーの解明

味覚受容器である味蕾は30100個の長く伸びた細胞と基底部にある少数の丸い形の細胞とからなる。味蕾の基底細胞は進化的に保存されたシグナル分子であるShhを発現している。本研究では、細胞種特異的な遺伝子組換えを誘導し、LacZあるいはEGFPのマーカータンパク質の発現によってShhを発現する細胞を遺伝的に標識した。マーカー分子の発現解析により、Shh発現基底細胞は、(1)分裂終了細胞であること、(2)グリア様のType I、甘味/うま味/苦味受容細胞のType II、酸味受容細胞のType IIIの全ての細胞種に分化することが明らかになった。前年度までに、タモキフェン投与によって味蕾基底部のShh発現細胞で誘導したEGFPレポーターの発現に基づき、味蕾基底部Shh発現細胞が、味蕾内の全ての細胞種、すなわち甘味・うま味・苦味の受容を担当するII型細胞、酸味と塩味の受容を担当するとされるIII型細胞、グリア細胞の性質を有するI型細胞に分化することが確認された。本年度は、Shh発現細胞から、味蕾の3つの細胞種がどのような割合で出現するかを、舌の茸状乳頭、有郭乳頭、そして軟口蓋の部位差に着目し、定量的に解析を進めた。タモキシフェンによるレポーター発現の誘導には、1) 4日間のタモキシフェン処理と7日間のチェイス、2) 21日間の連続タモキシフェン処理の2種類の方法を用いた。その結果、レポーターを発現する細胞の出現は、口腔内のいずれの部位の味蕾でもI型細胞が最も多く、III型細胞が最も少ないことが明らかになった。また、レポーターを発現するIII型細胞は、有郭乳頭に最も多くみられた。これは、各部位の味蕾に含まれるI, II, III型細胞の存在比を程度反映していた。しかし、III型細胞にはII型細胞と比較して、存在比から予想されるよりも少ないことが明らかになった。最近、味蕾細胞のターンオーバーにおいて、III型細胞はII型細胞に比べて2倍以上の長い半減期を持つと報告された。今回、EGFPレポーターを発現する細胞の出現がII型細胞に比べてIII型細胞で少なかったのは、III型細胞では長い半減期のために、タモキシフェン誘導時間内に新生される細胞がII型細胞と比べて少なかったからだと推測される。これらの結果は、味蕾基底部のShh発現細胞は、特定の細胞種に偏らずに全ての細胞種に分化することを示している。タモキシフェン投与によって味蕾基底細胞でShhを発現する細胞に選択的に遺伝子組換えを誘導し、構成的にEGFPを発現させて、Shh基底細胞から分化する味蕾細胞種を解析した。グリア細胞の性質を持つI型,甘味/苦味/うま味の受容を担当するII型,酸味の受容を担当するIII型のそれぞれの細胞種に選択的に発現する分子に対する抗体を用いて、EGFP発現細胞の細胞種を解析した(I型細胞: NTPDase2、II型細胞:PLCβ2、III型細胞:Snap25)。II型細胞とIII型細胞の解析は組織切片を用いて行った。一方、II, III型細胞が紡錘形であるのに対して、I型細胞は薄く広がって周囲の細胞に巻き付いた形態をとる場合があるため、組織切片を使った免疫染色では定量的に解析することが困難であった。そこで、味蕾を含む上皮を剥離した後、味蕾細胞を解離し、ガラススライドに貼り付けて免疫染色を行い、I型細胞を解析した。その結果、軟口蓋、茸状乳頭、有郭乳頭いずれの味蕾でも、EGFPを発現する細胞の約50%がI型細胞であることが明らかになった。次いでII型細胞の割合が多く、III型細胞は最も少なかった。これまでの解析の結果は、短い周期で細胞が置き換わる味蕾では、味蕾周囲で増殖する細胞が増殖を停止してShhを発現する味蕾基底細胞となり、その後、I, II, III型全ての味蕾細胞に分化することが明らかになった。ヒトを含むほ乳類の味蕾では、一生涯、短い周期で細胞が置きかわっている(ターンオーバー)。この味蕾細胞のターンオーバーでは、味蕾周囲で増殖した細胞が増殖を停止して味蕾の基底細胞となり、この基底細胞が伸長して味覚受容機能を有する細胞に分化すると考えられている。しかし、味蕾基底部の細胞の性質は充分には明らかになっていない。私たちは、成熟した味蕾の基底部で細胞増殖・分化因子であるSonic hedgehog (Shh)が発現することを明らかにした。本研究では、このShhを発現する基底細胞で特異的にタモキシフェン誘導型のCreリコンビナーゼを発現するマウスを利用して、味蕾基底細胞特異的に遺伝子組換えを誘導することで、味蕾の細胞系譜と味蕾細胞の分化における味蕾基底細胞の役割の解明を進める。

タモキシフェン誘導型のCreリコンビナーゼは、エストロジェン受容体のエストロジェン結合部位とCreリコンビナーゼの融合タンパク質で、タモキシフェンが結合すると活性化される。本年度は、マウスにタモキシフェンを投与して、味蕾の基底細胞で構成的にEGFPを発現する遺伝子組換えを誘導した。EGFPの発現を解析したところ、味蕾を構成する全ての細胞種、すなわち甘味・うま味・苦味の受容を担当するII型細胞、酸味と塩味の受容細胞とされているIII型細胞、そして、グリア細胞の性質を有するI型細胞でEGFPの発現が確認された。また、舌先端側の茸状乳頭、舌基部の有郭乳頭、そして軟口蓋の3箇所、どの部位の味蕾においても、味蕾内にEGFPの発現が確認された。これらの結果は、味蕾基底部のShh発現細胞が味蕾の全ての細胞種に分化することを示している。2種類のタモキシフェン投与条件により、味蕾基底部のShh発現細胞が味蕾内のどの細胞腫に分化するか定量的に解析を進めた。現在、この結果を論文にまとめているところである。また、味蕾基底部でProx1遺伝子のコンディショナルノックアウトの実験を進め、Prox1がノックアウトされた細胞が味蕾内に検出されることを確認した。当初計画通り、効率的に遺伝子組換えを誘導するタモキシフェンの投与条件を検討し、これまでに成体のマウスでの条件を確立した。また、EGFPが味蕾のどの細胞種にどのくらいの割合で発現するか、口腔内の部位ごとに定量的な解析を進めている。Prox1のコンディショナルKOを行った細胞の細胞種の解析を進める。また、効率良くコンディショナルKOを行うために、定常的に上皮領域でcreリコンビナーゼが活性化されているマウスを利用して解析を進める。EGFPを発現する細胞の定量的解析を終えて論文にまとめる。当初計画どおり、これまでに見いだした遺伝子組換えの誘導の条件をコンディショナルKOマウスに利用して解析を進める。当初予定通りの研究費の使用を予定している。この使用計画には、組織化学解析を行うための試薬の費用、実験動物の経費、また、論文印刷費が含まれる。今のところ、当初計画通りの研究費の使用を予定している。この使用計画には、組織化学解析を行う試薬の費用、実験動物の費用が含まれる。また、成果発表のための費用として、ISOT (国際嗅覚味覚シンポジウム)に参加するための旅費、論文印刷費が含まれる。
圧縮・吸収複合サイクル用新作動媒体の熱物性に関する研究

本研究の成果は, (1)アンモニア水溶液の熱物性値の評価および各種熱力学線図の作成, (2)水溶液の熱力学性質測定装置の開発,(3)トリフルオロエタノ-ル水溶液の熱力学性質の測定に大別できる。アンモニア水溶液の熱物性値については,まず文献検索を実施し,デ-タベ-スを整理し,従来提案されてい状態式・混合則について実測値との比較,各種状態式間の比較等を詳細に実施した。その結果,エンタルビ-・組成線図の作成にはZieglerーTreppの式,気液平衡線図の作成にはPRーSoave式を使用することが現状では適当であるとの結論を得た。これにより両線図を作成した。また,PVTX性質,飽和液体密度,エンタルピ-等の実測値情報の不足,臨界曲線の各種実測値間の大きな相違などを明らかにし,輸送性質を含め今後実測する必要性の高いことを指摘した。水溶液の熱力学性質測定装置の開発については,PVT性質・気液平衡・飽和密度・臨界定数・過剰体積・各種微分量などを高精度で測定し得る実験装置を製作し,520K,200MPaまでの温度・圧力範囲において所期の測定精度が実現できることを確認した。本実験装置は,溶触塩を熱媒として用いることにより700Kまでの高温において使用可能である。また,トリフルオロエタノ-ルの飽和蒸気圧力を320400K(30589kPa)の範囲において測定し,86点の実測値を得た。これらの実測値に基づいて,その標準沸点を347.03±0.10Kと決定した。さらに,トリフルオロエタノ-ルのPVT性質および飽和液体密度の測定を313413K,200MPaの範囲で実施した。今後各種組成のトリフルオロエタノ-ル水溶液に対し各種熱力学性質の測定を実施する計画である。本研究では、CFCに代る新しい作動媒体としての各種水溶液に注目し、その熱力学性質測定を高精度で実施するため、本年度は測定装置の性能試験を行った。また、比較的実測値の豊富なアンモニア水溶液に対して、従来提案されている各種状態式・混合則の比較検討を行った。水溶液の各種熱力学性質を測定する装置に関しては、配管等を圧力計と接続するなど測定装置を計測機器と接続し、各種の測定を可能とした後、各種の性能試験を実施した。この試験結果により目標の性能が達成できていない部分についは必要な改良を行い、(1)350Kまでの範囲において±1mKの変動幅で温度制御を可能とした、(2)ベロ-ズ変位量を±1.5μmの精度で測定することを可能とした、(3)ベロ-ズ内外の圧力差の検定を行い、その再現性が±0.5kPaであること、温度および変位に対する依存性はあるが、圧力依存性は無視し得ることなど所定の性能および精度が実現できることを確認した。このことにより、次年度においてトリフルオロエタノ-ル溶液のPVTX性質、気液平衡性質、臨界定数、各種微分量、過剰量などの測定が可能となった。アンモニア水溶液の熱物性値に関しては、文献検索を実施し、既に作成ずみであるデ-タベ-スを補充・整備した。このデ-タベ-スを利用して、従来提案されている状態式・混合則について、実測値との比較、各種状態式間の比較等を詳細に実施した。

その結果、気液平衡の実測値は比較的多いものの、PVTX性質、エンタルピ-などの実測値はほとんどないことが明らかとなった。各種状態式・混合則については、気液平衡の計算には十分であるが、エンタルピ-組成線図の作成については十分な精度が得られていないことが明らかとなった。今後、気液平衡のみならずエンタルピ-およびPVTX性質の計算に対して十分な精度をもつ状態式・混合則の開発の必要性を指摘することができた。本研究では、圧縮・吸収複合サイクル用作動媒体として注目されている各種水溶液の熱物性を明らかにする目的で、アンモニア水溶液の熱物性値に対し厳密な評価を行い、熱力学線図を作成し、水溶液の各種熱力学性質を測定する実験装置を完成させ、トリフルオロエタノ-ル水溶液の成分物質の熱力学性質を高精度で測定した。アンモニア水溶液については、本年度新たに公表された文献情報をデ-タベ-スに加えて整備し、各種の実験値および状態式等の評価を継続し、エンタルピ-・組成線図の作成にはZieglerーTreppの式、気液平衡線図の作成にはPRーSoave式を使用することが現状では適当であるとの結論を得た。これにより両線図を作成した。また、PVTX性質、飽和液体密度、エンタルピ-等の実測値情報の不足、臨界曲線の各種実測値間の大きな相違などを明らかにし、輸送性質を含め今後実測する必要性の高いことを指摘した。さらに、気液平衡、エンタルピ-等の計算のみならず、液液固3相平衡等の多相平衡の推算が可能である状態方程式の開発に着手した。水溶液の各種熱力学性質を測定する装置については、520K,200MPaまでの温度・圧力範囲において所期の測定精度が実現できることを確認し、さらに、溶触塩を熱媒として用いることにより700Kまでの高温において使用可能であることを示した。また、トリフルオロエタノ-ルの飽和蒸和圧力を320400K(30589kPa)の範囲において温度測定精度±6mK、圧力測定精度±0.6kPaで測定し、86点の実測値を得た。これらの実測値に基づいて、その標準沸点を347.03±0.10Kと決定した。さらに、トリフルオロエタノ-ルのPVT性質および飽和液体密度の測定を313413K,200MPaの範囲で実施した。今後各種組成のトリフルオロエタノ-ル水溶液に対し各種熱力学性質の測定を実施する計画である。
運動神経分化の過程で機能単位選択的に働く遺伝子群の探索と解析

新たに単離されたLMCm選択的に発現する因子群から、これまでに4種の新規遺伝子を同定し、それぞれの完全長cDNAの単離を終了した。2つは進化上高度に保存された膜タンパクであり、うち一つはカドヘリン様構造と、新規で特徴的な細胞質領域をもっており、細胞間のコミュニケーションに関わっていることが推測された。その機能発現にかかる機構解析への手がかりをつかむために、この細胞質領域と相互作用する因子を探索し、これまでにscaffold proteinであるMINT2と結合することを明らかにしている。もう一つはpore domainがtandemにつながったユニークな構造を持つK+channelであった。残りの2つは分泌性のタンパクであり、一つはIgGドメインをもつが、一つには既存の構造モチーフは見られない。発生過程において、前者はLMCmに加えて、notochordやfloor plateといった、神経管の背腹軸形成や軸索経路選択においてsignaling centerとしての役割を果たしている細胞群にも発現が見られ、また、後者も脳の一部特定領域にのみ発現が見られることから、運動神経のみならず、他の神経群の機能分化、経路選択においても重要な役割を果たしていることが考えられた。さらに、これら因子群のin vivo機能解析を比較的簡便に行うために、ニワトリ胚の運動神経のみに目的の遺伝子を発現させるシステムを構築した。通常法では介在神経や後根神経節にも遺伝子が導入され、特に末梢において運動神経の挙動のみを観察することが困難であったが、これにより、導入遺伝子の影響を受けた運動神経のin vivo解析を容易に行うことを可能にした。
フォークヘッド転写因子Foxoによる白血病幹細胞の維持機構の解明

ヒト慢性骨髄性白血病(Chronic myeloid leukemia;CML)の治療にはチロシンキナーゼ阻害剤イマチニブが広く用いられているが,イマチニブ抵抗性の白血病幹細胞の残存はCMLの再発を引き起す原因となる.本研究では,CMLマウスモデルより純化した白血病幹細胞を用いて,TGF-・-FOXOシグナルが白血病幹細胞の維持,並びにイマチニブ抵抗性の制御に関わっていることを解明した.さらに,TGF-・阻害薬がイマチニブ抵抗性の白血病幹細胞に対して治療効果を有していることを発見したヒト慢性骨髄性白血病(Chronic myeloid leukemia;CML)の治療にはチロシンキナーゼ阻害剤イマチニブが広く用いられているが,イマチニブ抵抗性の白血病幹細胞の残存はCMLの再発を引き起す原因となる.本研究では,CMLマウスモデルより純化した白血病幹細胞を用いて,TGF-・-FOXOシグナルが白血病幹細胞の維持,並びにイマチニブ抵抗性の制御に関わっていることを解明した.さらに,TGF-・阻害薬がイマチニブ抵抗性の白血病幹細胞に対して治療効果を有していることを発見したがん幹細胞は,自己複製能,分化したがん細胞を供給する能力,並びに移植実験において腫瘍発症能を有するがん細胞であると定義されている.がん幹細胞は,がん細胞の増殖・浸潤・転移における細胞起源になると考えられており,がん治療法を開発する上で重要な標的細胞になる可能性を有している.これまでにがん幹細胞は,免疫不全マウスへの異種移植実験により,ヒト急性骨髄性白血病,乳がん,脳腫瘍,並びに結腸がんなどのヒトがんでその存在が報告されている.しかし,最近,高度免疫不全を呈するNOG(NOD/SCID/Il2rg^<-/->)マウスを用いた悪性黒色腫患者細胞の移植実験により,実際の造腫瘍能を有するがん細胞の存在頻度は高く,特定のがん幹細胞は存在しないのではないかとする報告もなされている.従って,今日,がん幹細胞の存在の有無,並びにその生物学的特性は明らかではない.我々は本研究において急性骨髄性白血病,及び慢性骨髄性白血病マウスモデルを用い,未分化造血細胞の細胞表面マーカーを用いた解析により白血病幹細胞(leukemia-initiating cells)としての性質を有する細胞の特定に成功した.一方,フォークヘッド転写因子Foxoは正常造血幹細胞の維持に必須な役割を担う転写因子である.しかし,これまでに白血病幹細胞の維持におけるFoxoの役割は明らかではない.そこで上述のマウスシステムを用いて,白血病幹細胞の自己複製能の維持におけるFoxoの役割を解析した.野生型マウス,並びにFoxo3aノックアウトマウス由来の急性骨髄性白血病,及び慢性骨髄性白血病モデルから純化した白血病幹細胞の自己複製能を解析した結果,Foxo3aは急性骨髄性白血病の白血病幹細胞の抑制に,反対に骨髄性白血病の白血病幹細胞では生存維持に関わっていることが明らかとなった.従って,Foxoは白血病幹細胞の自己複製能の制御機構に重要な役割を担っており,白血病幹細胞は白血病の発生母細胞や原因遺伝子に依存して異なる自己複製制御機構を有していると考えられる.がん幹細胞は多様ながん細胞の供給源となる細胞であり,抗がん剤や放射線治療後のがん幹細胞の残存はがんの再発の原因となる.慢性骨髄性白血病(CML)は活性化型チロシンキナーゼBCR-ABLの発現によって発症する骨随増殖性疾患であり,CML患者の治療にはチロシンキナーゼ阻害剤イマチニブが広く用いられている.しかし,イマチニブ抵抗性の白血病幹細胞の残存がCMLの再発を引き起こすことが明らかとなり,白血病幹細胞はCMLを根治するための重要な標的細胞に位置づけられている.本研究課題において研究代表者は,CML様骨髄増殖性疾患のマウスモデルを用いてフォークヘッドO型転写因子(Foxo3a)のCMLの白血病幹細胞の維持における役割を解析してきた.昨年度.Foxo3a欠損マウス由来の白血病幹細胞の連続移植実験を行い,Foxo3aの欠損は白血病幹細胞の能力を著しく低下させることを報告した.今年度は,イマチニブ抵抗性の白血病幹細胞におけるFoxo3aの役割を解析した.In vitroにおいて,イマチニブ含有条件下,白血病幹細胞のコロニー形成能を解析したところ,Foxo3a欠損マウス由来の白血病幹細胞では,野生型マウス由来の白血病幹細胞に比べて,コロニー形成能が低下していた.さらに,Foxo3a欠損マウス由来の白血病幹細胞を移植したマウスにイマチニブの投与を行ったところ,野生型マウス由来の白血病幹細胞を移植したマウスにイマチニブを投与した場合と比べ,CMLの再発が有意に改善された.

従って,Foxo3aは白血病幹細胞の維持・イマチニブ抵抗性に重要な役割を担っていると考えられる.慢性骨髄性白血病(CML)は活性化型チロシンキナーゼBCR-ABLの発現によって発症する骨髄増殖性疾患であり,CML患者の治療にはチロシンキナーゼ阻害剤イマチニブが広く用いられている.しかし,イマチニブ抵抗性の白血病幹細胞の残存がCMLの再発を引き起こすことが明らかとなり,白血病幹細胞はCMLを根治するための重要な標的細胞に位置づけられている.本研究課題において研究代表者は,CML様骨髄増殖性疾患のマウスモデルを用いてフォークヘッドO型転写因子(Foxo3a)のCMLの白血病幹細胞の維持における役割を解析してきた.昨年度までに,Foxo3a欠損マウス由来の白血病幹細胞の連続移植実験を行い,Foxo3aが白血病幹細胞の自己複製能の維持とイマチニブ抵抗性に重要な役割を担っていることを明らかにした.そこで,FOXOを抑制することで,白血病幹細胞を排除する新しいCML治療法を開発できないか検討を行った.その結果,白血病幹細胞においてTGF-βがFOXOを活性化しており,TGF-β阻害薬によってFOXOを抑制できることを見いだした.また,in vitroにおけるTGF-β阻害薬処理は白血病幹細胞のコロニー形成能を低下させた.さらに,白血病幹細胞を移植したマウスに対するTGF-β阻害薬とイマチニブとの併用投与は,イマチニブ単独投与に比べ,CMLを発症したマウスへの治療効果を向上させることを解明した.以上の結果から,TGF-β-FOXOシグナルは白血病幹細胞のイマチニブ抵抗性の制御に重要な役割を担っており,TGF-β阻害薬は,FOXOの抑制を介して,イマチニブ抵抗性の白血病幹細胞を治療できると考えられる.従って,TGF-β阻害薬は白血病幹細胞を治療する分子標的薬として期待される.
二次元電気泳動及びLC/MS/MSによる糖タンパク質糖鎖の構造と機能解析法の開発

細胞・組織発現糖タンパク質の機能と構造を解析するために,2次元電気泳動法を用いた糖タンパク質のプロファイリング,及びLC/MSによる糖鎖プロファイリングと糖ペプチドマッピングからなるゲル内糖タンパク質の構造解析法の開発を行った.はじめに,モデル糖タンパク質として肝細胞増殖因子,トロンボモジュリン及び組織プラスミノーゲンアクチベータを用い,微量糖タンパク質構造解析法の開発を行った.まず,結合糖鎖の構造と分布を解析するために,グラファイトカーボンカラムを用いたキャピラリーLC/MS(CapLC/MS)による遊離糖鎖のプロファイリング法を開発した.タンパク質部分はトリプシン消化し,LC/MS/MSによるタンパク質同定に利用できることを確認した.また,同定された糖タンパク質を適当な酵素で断片化し,CapLC/MSを用いてペプチド・糖ペプチド混合物の中から糖ペプチドだけを描き出す糖ペプチドマッピング法を開発し,各糖鎖の結合位置を明らかにすることが可能となった.つぎに,2次元電気泳動法による細胞・組織発現糖タンパク質のプロファイリングと,糖鎖プロファイリングのゲル内糖タンパク質の糖鎖構造解析への応用を検討した.ラット脳からTritonX114による分画とPIPLC消化によりGPIアンカー型糖タンパク質画分を調製し,2次元電気泳動により,脳内GPIアンカー型糖タンパク質のプロファイルを作成した.泳動ゲル上のスポットを切り出し,ゲル内PNGaseF及びトリプシン消化を行い,N結合糖鎖とペプチド断片をそれぞれ回収した.ペプチド断片を用いてLC/MS/MSを行い,NCAM, LAMP, NTM, OBCAM, kilon,及びprionが同定された.このうち糖鎖構造未知のLAMP, NTM, OBCAM, kilonを含むスポットから抽出された糖鎖部分をCapGCC-LC/MSで分析し,脳特異的糖鎖BA-2,高マンノース型糖鎖,及びフコースやシアル酸を複数含む複合型糖鎖等であることが示唆された.本分析法は,今後,異なる細胞・組織(正常と病態等)間のプロファイルの比較による糖タンパク質の役割や機能の解明,及び差異の見られた糖タンパク質の構造の解析に役立つものと期待される.細胞・組織発現糖タンパク質の機能と構造を解析するために,2次元電気泳動法を用いた糖タンパク質のプロファイリング,及びLC/MSによる糖鎖プロファイリングと糖ペプチドマッピングからなるゲル内糖タンパク質の構造解析法の開発を行った.はじめに,モデル糖タンパク質として肝細胞増殖因子,トロンボモジュリン及び組織プラスミノーゲンアクチベータを用い,微量糖タンパク質構造解析法の開発を行った.まず,結合糖鎖の構造と分布を解析するために,グラファイトカーボンカラムを用いたキャピラリーLC/MS(CapLC/MS)による遊離糖鎖のプロファイリング法を開発した.タンパク質部分はトリプシン消化し,LC/MS/MSによるタンパク質同定に利用できることを確認した.また,同定された糖タンパク質を適当な酵素で断片化し,CapLC/MSを用いてペプチド・糖ペプチド混合物の中から糖ペプチドだけを描き出す糖ペプチドマッピング法を開発し,各糖鎖の結合位置を明らかにすることが可能となった.つぎに,2次元電気泳動法による細胞・組織発現糖タンパク質のプロファイリングと,糖鎖プロファイリングのゲル内糖タンパク質の糖鎖構造解析への応用を検討した.ラット脳からTritonX114による分画とPIPLC消化によりGPIアンカー型糖タンパク質画分を調製し,2次元電気泳動により,脳内GPIアンカー型糖タンパク質のプロファイルを作成した.泳動ゲル上のスポットを切り出し,ゲル内PNGaseF及びトリプシン消化を行い,N結合糖鎖とペプチド断片をそれぞれ回収した.ペプチド断片を用いてLC/MS/MSを行い,NCAM, LAMP, NTM, OBCAM, kilon,及びprionが同定された.このうち糖鎖構造未知のLAMP, NTM, OBCAM, kilonを含むスポットから抽出された糖鎖部分をCapGCC-LC/MSで分析し,脳特異的糖鎖BA-2,高マンノース型糖鎖,及びフコースやシアル酸を複数含む複合型糖鎖等であることが示唆された.本分析法は,今後,異なる細胞・組織(正常と病態等)間のプロファイルの比較による糖タンパク質の役割や機能の解明,及び差異の見られた糖タンパク質の構造の解析に役立つものと期待される.【目的】本研究の目的は、疾患等に関与する糖タンパク質を探索し、その糖鎖の構造と機能を明らかにするために、LC/MS及びLC/MS/MSを用いた、二次元電気泳動法で分離精製された糖タンパク質糖鎖の迅速・簡便・高感度な糖鎖解析法を開発することである。本年度は、モデル糖タンパク質及び糖鎖としてトロンボモジュリン及び標準糖鎖を用いて、微量糖タンパク質の糖鎖構造解析法の開発を検討した。【実験及び結果】トロンボモジュリンをトリプシンで消化し、ペプチド混合物をミクロカラムMAGIC C18(1.0×150mm)で分析した。ペプチドマップ上糖ペプチドは、糖鎖の構造が未知であることに加え、糖鎖が不均一性を示すことから特定が困難になることが多い。そこで、糖ペプチドを識別するために、特定のフラグメントを持つ親イオンだけを測定するLC/MS/MSのprecursor scanを検討した。N結合糖鎖の一部NeuAc-Gal-GlcNAc(m/z657)とGal-GlcNAc(m/z366)を有するペプチドの検出を行ったところ、4本のピークのみが検出され、N結合糖鎖結合ペプチドを特定することができた。

また、結合している糖鎖はフコシルバイアンテナ型で、シアル酸結合数に不均一性があることが明らかになった。さらに詳細に糖鎖の分布と構造を解析するためには、糖鎖を切り出し、先に報告したLC/MSによる糖鎖マッピングを行う必要がある。そこで、標準糖鎖を用いて、ミクロLC/MSによる糖鎖マッピングを検討し、微量糖鎖の分析にも応用できることを確認した。【考察】ミクロLC/MS/MSによって、N結合糖鎖が付加したペプチドの同定が可能であること、また、ミクロLC/MSによる糖鎖マッピングは、微量糖鎖の解析に有用であることを確認した。今後は、さらに複雑な糖鎖の解析に応用できることを確認する必要があると思われる。昨年度は、2次元電気泳動法で分離された微量糖タンパク質の糖鎖の構造を解析することを目的とした、ミクロボアグラファイトカーボンカラムを用いたLC/MSによる糖鎖マッピングの開発を検討し、モデル糖鎖の構造解析に応用できることを示した。本年度は、さらに本分析法の微量化を図るため、キャピラリーLC/MS及びLC/MS/MSによる糖鎖構造解析法の開発を検討した。まず、糖鎖構造既知のエリスロポエチンの糖鎖をN-グリコシダーゼFで切り出し,NaBH_4で還元して糖アルコールとした.この糖アルコールを内径0.2mmのキャピラリーカラムを用いたLC/MSで分析したところ、ミクロボアLC/MSによる分析に用いたサンプル量の10分の1で、同様な結果が得られることが確認された。そこで、本分析法を糖鎖構造が未知のマウス骨髄腫細胞NSO株産生組換え型ヒト肝細胞増殖因子(HGF)のN結合糖鎖の解析に応用した.HGF(200ng)から得られた糖アルコールをキャピラリーLC/MSで分析したところ,2本の大きなピークと複数の小さなピークが検出された.これらの糖鎖についてLC/MS/MS分析を行った結果,HGFの主な糖鎖は,非還元末端ガラクトースにガラクトース,及びN-グリコリルノイラミン酸が結合したフコシル複合型3本鎖であることが示唆された.以上のように,グラファイトカーボンカラムを用いたキャピラリーLC/MS及びLC/MS/MSは,構造未知の微量糖タンパク質の糖鎖を迅速かつ簡便に解析できることが確認された。今後、本分析法を細胞培養液中の微量糖タンパク質糖鎖の構造解析に応用する予定である。2次元電気泳動法(2D-GE)を用いた細胞発現タンパク質のプロファイリングによる目的糖タンパク質の機能解析と単離,及びLC/MSとLC/MS/MSを用いたゲル内糖タンパク質の糖鎖プロファイリングと糖配列解析に基づく糖タンパク質糖鎖の機能及び構造解析法の開発を行った.平成12及び13年度は,2D-GEで分離された目的糖タンパク質を想定した微量タンパク質の構造解析法の開発を行った.すなわち,グラファイトカーボンカラムを用いたキャピラリーLC/MS(CapGCC-LC/MS)による糖鎖プロファイリング法,及びCapGCC-LC/MS/MSによる糖配列解析法を開発し,2D-GEで回収可能な量(1μg程度)の糖タンパク質の糖鎖構造解析が可能であることを確認した.
ネットワークポリマーの可溶化反応の動力学検討

本研究では、使用済み太陽電池から温和な条件下で有用資源を回収するため、架橋化EVAの可溶化反応の速度定数や活性化エネルギーおよび反応機構を検討した。初めにEVASKY S11(ブリジストン社製)を150160°Cで30分間加熱し、架橋化率8392%の架橋化EVAを作成した。可溶化実験では、40メッシュのステンレス製のカゴに入れた架橋化EVA試料を所定の温度に加熱した溶媒に挿入し、一定時間経過後にカゴを引き上げて反応を停止させた。可溶化率は、回収した試料を70°Cで12時間減圧乾燥して溶媒を十分除去した試料重量から算出した。架橋化EVAに水酸化カリウムを添加して1ーヘキサノール中157°Cで60分間加熱すると架橋化EVAの可溶化率は水酸化カリウムの濃度に比例して増加し、架橋化EVAに対して25wt%以上の水酸化カリウムを添加するとほぼ完全に可溶化した。架橋化EVAを2-エチル-1-ヘキサノール中157°Cで加熱すると、1ーヘキサノールを用いた場合よりも早く可溶化され可溶化反応速度は溶媒の性質も大きく影響することが明らかにされた。2-エチル-1-ヘキサノールの沸点184°Cでは、架橋化EVAの可溶化率は15分で90%以上に達した。可溶化初期では、可溶化率の対数値ln(1-X)は可溶化時間に対して直線的に減少し、疑似一次反応と見なすことができた。可溶化速度(v)は、水酸化カリウム濃度に対して直線的に増加し、可溶化反応速度をv=k[EVA][KOH](1) (可溶化速度定数(k),架橋化EVA濃度[EVA]、水酸化カリウム[KOH])で表すことができることを明らかにした。可溶化反応の活性化エネルギーから、架橋化EVAの可溶化は1ーヘキサノール中ではエステル交換反応および引き続く水酸化カリウムによる鹸化で、2ーエチルー1ーヘキサノール中では主に鹸化で進行すると考えられる。3次元の網目構造を有するネットワークポリマー(熱硬化性樹脂)は、堅牢で絶縁性が高い等材料として優れた性能を有しているために電子基板や複合材料の基材として工業製品に広く利用されている。一方、使用済み工業製品に含まれているネットワークポリマーは加熱しても可塑化せず、300°C以上で熱分解すると大部分が固体の残渣となるためにリサイクル際の大きな障害となっていた。本研究グループでは、これまでエポキシ樹脂やフェノール樹脂等をアルコール系溶媒中で可溶させる研究、いったん可溶化したエポキシ樹脂を熱分解し可溶化溶媒として再利用する研究、およびリグニン等のバイオマス由来の高分子を液化して可溶化溶媒として利用する研究等を行ってきた。太陽電池は再生可能エネルギーとして世界的に広く普及し、2030年後に大量の使用済み太陽電池は廃棄されると推算されている。太陽電池はシリコン半導体を架橋化EVAで封止する構造のものが最も広く普及しており、使用済み太陽電池から銀やシリコン等の有用資源を回収するには架橋化EVAを効率的に除去する技術開発が重要で、粉砕等の機械的手法あるいは剥離等の化学的手法が検討されている。当研究グループでは、これまでの研究から架橋化EVAが1-ヘキサノールや2-エチル-1-ヘキサノール等のアルキル系アルコール中に水酸化カリウム等のアルカリ化合物を添加すると可溶化され、可溶化率は架橋化EVAに対する水酸化化合物の量(NaOH/EVA)に比例することを見出した。本研究の初年度では、所定の温度に加熱された溶媒に試料を挿入および引き上げ、反応時間を明確にできる反応装置を用いて架橋化EVAの可溶化速度に対する反応温度、時間、溶媒、試料濃度、アルカリ添加物濃度の影響を検討した。本研究では反応時間を明確にするため、体積500 mlのセパラブルフラスコに1-ヘキサノールを200 g入れ、水冷乾溜器が付いたフタをして135157°Cの範囲の所定の温度まで加熱し、40メッシュのステンレス製のカゴに入れた架橋化EVA試料を溶媒に挿入して反応を開始し、所定の時間経過後にカゴを引き上げて反応を停止させた。また試料を溶媒へ挿入後に速やかに所定の温度に達するよう、厚さ約2.0 mmの架橋化EVAシートを5 mm四方に切断して用いた。試料を入れたカゴを溶媒へ挿入すると溶媒温度は低下するが、5分程で所定の温度に戻った。反応後にステンレス製のカゴの中に残った試料をテトラヒドロフランの中で超音波洗浄した後、110°C2時間減圧乾燥させた後に秤量し可溶化率を算出した。架橋化率の異なるEVAを上述の手法で可溶化させると、可溶化率の対数値は反応時間に対して直線的に減少し、架橋化EVAの可溶化反応は擬一次反応として処理できることが分かった。溶媒に対する架橋化EVAの濃度が2%の場合、可溶化速度は共存する水酸化カリウム濃度にほぼ比例して増加した。これに対して架橋化EVAの濃度が5%および8%の場合、水酸化カリウム濃度が低い範囲では観測された可溶化速度は2%の場合と同様に水酸化カリウム濃度にほぼ比例したが、水酸化カリウム濃度が高くなると可溶化速度は急速に大きくなった。また、可溶化した架橋化EVAを熱分解ガスクロマト質量分析計や熱天秤で分析すると、架橋化EVAの可溶化過程で初めにアセチル基が溶媒に置換され、可溶化された架橋化EVAにはカリウムが取り込まれていることが示唆された。