hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
臍帯血幹細胞の生物学的特性の解明とヒト造血幹細胞のIn vivo測定法の確立

TEK+細胞移植群では虚血部平滑筋内に血管様構造をとる免疫染色陽性細胞がみられた。肝類同内皮細胞にもヒト血管内皮表面抗原の発現が認められ、TEK+細胞が血管内皮分化能をもつことが示された。今年度は種々のサイトカインによりヒト造血幹細胞のex vivo増殖を試みた。臍帯血より分離した単核球を各種単クローン抗体で反応後、Coulter社のEPICS HyPerSortSystemのFACSを用いてclone sortingしその増殖、分化能につき解析している。CD34^+細胞を分離しIL-3,IL-6,SCF,Thrombopoietinなどの組み合わせにより未分化造血前駆細胞の増幅が得られている。しかし新規に購入したFACSの設定条件の検討やオペレイターの技術習得に時間を費やし当初予定していたCD34^+細胞以外の造血幹細胞を認識する細胞表面抗原陽性細胞を分離しIL-3,IL-6,可溶性IL-6receptor,SCF,Thrombopoietinなどの組み合わせによる未分化造血前駆細胞の増幅については現在検討中である。また臍帯血から有核細胞を有効に回収するための試みについて発表予定である。一方、臨床面では非腫瘍性疾患の内ハンター症候群IIA,IIB,Morquio症候群,ADSに対する造血幹細胞移植を施行し、中でもハンター症候群IIAの臍帯血移植例は臨床的にも酵素学的にも改善が見られ班会議などで報告している。平成12年度の研究は臍帯血中の造血幹細胞と血管内皮細胞の共通祖先細胞であるヘマンジオブラストを同定することを目標とし(1)螢光活性化細胞分離装置(FACS)を用いて、ヒト臍帯血中のCD34陽性細胞を、種々の細胞表面マーカーで単細胞分離すること、(2)分離された細胞の造血細胞及び血管内皮細胞へのin vitroでの分化能を、コロニーアッセイ法および血管内皮培養法で検討し、臍帯血ヘマンジオブラストの表面形質を明らかにすること、(3)同定されたヘマンジオブラスト分画をNOD/SCIDマウスに移植し、ヘマンジオブラストのin vitroでの造血再構築能および血管内皮細胞への分化能を検討することである。以下に得られた結果を列記する。(1)ヒト臍帯血中のTIE,TEKの発現臍帯血より単核球を分離し、抗ヒトCD34抗体、抗TIE抗体、抗TEK抗体を用いて、CD34陽性細胞上のTIEおよびTEKの発現を検討した。CD34陽性細胞のうち、50.7±7.5%(n=12)にTIEの発現を、26.5±4.5%(n=16)にTEKの発現を認めた。(2)CD34+TIE+細胞、CD34+TIF-細胞、CD34+TEK+細胞およびCD34+TEK-細胞のin vitroでの増殖能・分化能Lin-CD34+細胞をTIEまたはTEKの発現強度によりCD34+TIE+細胞・CD34+TIE-細胞分画、CD34+TEK+細胞・CD34+TEK-細胞分画に分け、各々の細胞分画をFACSにて分離し、有血清メチルセルロースクローナル培養をSCF,IL-3,IL-6,G-CSF,EPO存在下で行った。CD34+TIE-細胞からは混合コロニーや赤芽球バーストが多数形成されたが、GMコロニーの形成は少なかった。一方、CD34+TIE+細胞からは、混合コロニーやGMコロニーが多数形成されたが、赤芽球バースト形成は少なかった。CD34+TEK+細胞およびCD34+TEK-細胞からの混合コロニーや赤芽球バースト形成は両者間で差はなかった。また、両分画ともGMコロニーは多数みられたが、CD34+TEK+細胞からの方が多く形成された。(3)CD34+TIE+細胞、CD34+TIE-細胞、CD34+TEK+細胞およびCD34+TEK-細胞のin vivoでの造血再構築
少子化時代の育児援助としてのコミュニティの再建に関する研究-仲間サポートの側面から-

出産後における女性の心の健康尺度について、テスト再テスト信頼性の検討を行った結果、2ヶ月以上の間隔を空けて使用すれば信頼性が確保されることが明らかになった。一方、H地域において、環境教育の専門家と臨床心理士、子育て中の女性らの協力を得て、「子育て元気アップ講座」を企画して実施した。内容は、「関わることつながること」、「夫婦関係を見直そう」、「心と体の気功体験」、「子育て情報メディアリテラシー」、「自由企画」で、参加者同士がその日のテーマについて、気づいたことを語り合うグループワークを設けた。1998年12月から翌年2月にわたって上記のプログラムを実施した。参加者は生後2ヶ月から10才までの子どもを持つ、女性35名と男性4名であった。この実施前後において、参加者にインフォームドコンセントを得た上で、日常生活ストレス尺度、自尊感情尺度、社会的ネットワークにおける孤独尺度で調査し、その変化のt検定から、企画した介入の効果の有無を検討した。その結果、両方の調査に協力が得られた参加者は8名であった。日常生活ストレスでは、「話し相手がいないストレス」、「息抜きの時間がないストレス」、「家事のストレス」といった対人関係的なストレスが5%水準で統計学的に有意な減少を示した。また、孤独尺度の下位概念である相互理解得点においては0.01%水準で、個別性得点においては5%水準で有意に増加していた。しかし、自尊感情には変化が認められなかった。この結果から、地域社会で仲間サポートを形成する企画介入は、少なくとも日常生活のストレス軽減と、相互理解を深め個別性を認め合うという点で効果があることが示唆された。日本とアメリカにおいて文献検索およびレビューを受け、仲間サポートとその理論的裏付けとなる理論を検討中である。また、15件のインタビューを終え、逐語禄におこし、研究目的にそって内容分析を行った。内容分析の結果は、以下のとおりである。1.仲間サポートが必要な理由結婚、引っ越しなどで地縁が断たれることがある。妊娠中は暇な時間を持て余している。社会とのつながりが断たれるように感じる。子どもがいると活動範囲が限られる。子どもの成長発達に不安を持っている(正常がわからない)。実際に役立つ身近な育児の情報がない。育児に関する悩みは子どもの成長発達とともに変わっていく。夫と話をする時間がない。自分のしていることに自信が持てない。不必要に自分で自分を責めてしまう。日々のちょっとしたストレスも、たまると爆発しそうになる。虐待する人の気持ちがわかってしまう自分が怖い。2.子育て仲間と行っているサポートの内容生活の場で、仲間と合えるとホッとする。成長発達に伴う悩みを共有する。お互いの育児上の智恵を受け取ったり与えたりする。季節の行事を一緒に楽しむ。住んでいる場所での実用的な育児に関する情報交換。ちょっと預かる、ちょっと預ける。3.子育て仲間のメリット楽しみが持てる。行動範囲が広がり、冒険ができる。身近で有用な情報が得られる。気分転換・息抜き。自分の育児に対する保証を得る。自分を外から見つめ直す。仲間とのつながりを感じる。4.子育て仲間のデメリット自分の育て方を避難される。さらに、試験的に地域における仲間サポートを妊娠中から開始し、効果測定のための質問紙のテストリテスト信頼性をはじめ、評価尺度の検討を行っている。
ステロイド誘発骨壊死分子機構の実証：Cre依存性細胞特異的遺伝子欠損マウスの応用

Angiogenesis-csteogenesis coupling障害が発生してから12時間から24時間で骨細胞壊死に陥ることが考えられた。また、骨は、心臓、肝臓、腎臓、血管に比較し、壊死の誘因である酸化ストレスに陥りやすいこと、および、ステロイド投与により抗酸化酵素やミトコンドリア機能の有意な低下が示された。SMS-1/SMS-2ダブルノックアウトマウスの骨組織形成における組織学的検討により、長管骨と脊椎の成長板での骨芽細胞の配列異常による骨組織の低形成ならびに石灰化障害を認め、骨代謝、特に骨芽細胞の機能におけるスフィンゴミエリンの関与が考えられた。各細胞特異的遺伝子欠損マウスでのステロイド短期大量投与大腿骨壊死量の比較検討とVEGF, BMPs, G-CSFによるリバース効果の検討。実験動物は血管内皮細胞、骨・骨芽細胞、マクロファージ各細胞特異的スフィンゴミエリン合成酵素欠損マウスを用いて、SMS-2遺伝子欠損マウス(非致死)にSMS-1遺伝子(この遺伝子欠損マウスは致死性)両端にジーンターゲティング法によりloxP配列を挿入しlox-flanked coditionalleleを有する遺伝子改変マウスを作製した。骨芽細胞におけるSMS-1/SMM-2の機能解析:骨芽細胞におけるSMS-1/SMS-2の働きに関するデータはなく、ステロイド短期大量投与大腿骨壊死におけるSMS-1/SMS-2の役割の解析の基礎データとして、骨芽細胞におけるSMS-1/SMM-2のin vitroでの機能解析を行ない、以下の成績を得た。1)SMS-1/SMS-2コンディショニングダブルノックアウトマウスは、pigmy mouse化を認めた。SMS-1及びSMS-2のコンディショナルノックアウトは、野生型との差異は認めなかった。2)SMS-1/SMS-2ダブルノックアウトマウスの組織学的検討により、長管骨と脊椎の成長板での骨芽細胞の配列異常による骨組織の低形成を認めた。3)骨芽細胞の機能におけるスフィンゴミエリンの関与が初めて明らかになった。4)骨芽細胞の増殖、基質接着能、移動能におけるスフィンゴミエリンのin vitroにおける詳細な機能解析を、マウス間葉系組織幹細胞から分化誘導した骨芽細胞と樹立マウス骨芽細胞におけるSMS-1/SMS-2遺伝子のsiRNA実験とSMS-1/SMS-2ノッカウトマウスから培養した骨芽細胞へのSMS-a/SMS-2遺伝子のリバース実験による確認を行っている。モデルの作成に難渋し、時間を要しているため。各細胞特異的遺伝子欠損マウスでのステロイド短期大量投与大腿骨壊死量の比較検討とVEGF, BMPs, G-CSFによるリバース効果の検討を行った。また、現存する骨壊死モデルでは約40-60%の骨壊死発生率のため、100%に近い骨壊死発生を目指して、まず通常のマウスおよびラット、ラビットでの外傷性骨壊死モデルおよびステロイドの複数回の投与などによるモデル作成を行っており、以下の成績を得た。ステロイドの複数回の投与では骨壊死発生率はほぼ変化を認めなかった。ラットの大腿骨頭から頚部にかけて熱凝固を行うことで、ほぼ100%の骨壊死発生率を確認した。現在モデルの作成を重点的に行っており、マウスにも応用段階である。また、抗酸化酵素に関してステロイド投与家兎モデルを使用して、もともと骨および骨髄細胞について他臓器と比較した。その結果、ステロイド投与前から他臓器よりも低く、ステロイドの投与によってさらに減少することが示された。本結果もふまえて本実験にも応用を考えている。骨壊死モデルの発生率を増加させるための作業や確認に難渋し、時間を要しているため。ステロイド関連骨壊死の原因の一つとして、酸化ストレスやAngiogenesis-csteogenesis coupling(AOC)障害が挙げられる。AOC障害から壊死までの発生のタイミングについての検討、酸化ストレスやその制御にかかわる抗酸化酵素の状態およびAOC障害に伴う骨壊死発生の実証を行った。培養骨細胞をAOC障害に似た環境を再現したところ、1時間、3時間、6時間と比較し、12時間以降で骨細胞死の有意な増加を認めた。骨細胞死の割合に関しては、同様に12時間以降でNecrosisの割合がApoptosisの割合よりも有意な増加を示した。また、ステロイド投与動物モデルにおける骨、心臓、腎臓、肝臓、血管における抗酸化酵素の状態と時間的経過を調査したところ、無処置での骨、心臓、腎臓、肝臓、血管での抗酸化酵素及びTFAMは骨においてもともと少ないことが示された。したがって、他臓器と比較して骨内は様々な刺激により酸化ストレスに陥りやすく、ミトコンドリア機能も障害をうけやすい環境であることが考えられた。また、細胞増殖、機能、細胞死に重要な役割を演じることが推定される細胞膜活性化脂質であるスフィンゴミエリンの骨形成、代謝や骨壊死における役割はこれまで知られていないことから、骨壊死の原因であるAOCの破綻に焦点をあて、血管内皮細胞、骨・骨芽細胞、マクロファージの機能に重要なスフィンゴミエリン合成酵素遺伝子の各細胞特異的なコンディショナルノックアウトマウスを用い、骨組織の状態や骨芽細胞の機能について検討を行った。

これまでにSMS-1/SMS-2ダブルノックアウトマウスの骨組織形成における組織学的検討により、長管骨と脊椎の成長板での骨芽細胞の配列異常による骨組織の低形成ならびに石灰化障害を認め、骨代謝、特に骨芽細胞の機能におけるスフィンゴミエリンの関与を示唆する所見が得られた。Angiogenesis-csteogenesis coupling障害が発生してから12時間から24時間で骨細胞壊死に陥ることが考えられた。また、骨は、心臓、肝臓、腎臓、血管に比較し、壊死の誘因である酸化ストレスに陥りやすいこと、および、ステロイド投与により抗酸化酵素やミトコンドリア機能の有意な低下が示された。SMS-1/SMS-2ダブルノックアウトマウスの骨組織形成における組織学的検討により、長管骨と脊椎の成長板での骨芽細胞の配列異常による骨組織の低形成ならびに石灰化障害を認め、骨代謝、特に骨芽細胞の機能におけるスフィンゴミエリンの関与が考えられた。各マウスからの培養血管内皮と骨芽細胞を用いたステロイドと酸化ストレスによるアポトーシス、細胞増殖、ECM産生、移動能への影響とリバース効果の解析。血管内皮細胞及び骨・骨芽細胞特異的スフィンゴミエリン酵素欠損マウスから血管内皮細胞、骨芽細胞を各々採取し培養する。対照として遺伝子非欠損マウスの血管内皮細胞、骨芽細胞を同様に培養する。抗CD31、ALP抗体を用いた蛍光抗体法により細胞性格と純度を確認する。培養液へのmethylpredonisolone高濃度投与(500nM)による血管内皮細胞(SM-1 -/-, SM-2 -/-)、血管内皮細胞(SM-1 +/+, SM-2 +/+)、骨芽細胞(SM-1 -/-, SM-2 -/-)、骨芽細胞(SM-1 +/+, SM-2 +/+)のアポトーシス、細胞増殖、細胞移動能、EMC産生能の解析を行う。対照としてmethylpredinisolone非投与群を用いて行う。同時に既存の本疾患動物モデルであるステロイド投与ウサギで、ターゲットとなりうる蛋白などをvivoで検討を行う。各マウスからの培養血管内皮と骨芽細胞を用いたステロイドと酸化ストレスによるアポトーシス、細胞増殖、ECM産生、移動能への影響とリバース効果の解析を行う。培養液へのmethylpredonisolone高濃度投与(500nM)による血管内皮細胞(SM-1 -/-, SM-2 -/-)、血管内皮細胞(SM-1 +/+, S M-2 +/+)、骨芽細胞(SM-1 -/-, SM-2 -/-)、骨芽細胞(SM-1 +/+, SM-2 +/+)のアポトーシス、細胞増殖、細胞移動能、EMC産生能の解析を行う。
ヒトおよびチンパンジーにおける非音声的コミュニケーション

本年度は、ヒトを対象として、視覚的共同注意の影響や視線探知器(Eye Direction Detecor:EDD)の検討、そしてチンパンジーを対象として、指さしと関連があると考えられる物のつかみ方(以下pincer gripとする)の発達についての検討を行った。まず、乳幼児を対象とした刺激注視場面で、母親の指さしや声かけによるある特定の刺激に対する注意の喚起と、刺激自体の物理的変化による注意の喚起との比較を試みた。注意の喚起という機能的な作用は同じであるが、後続して同一の刺激事象に対した場合、母親の注意の喚起の方が、物理的な変化による注意の喚起の場合よりも、より乳幼児の注視行動に影響を与えることがわかった。こうした方法で、視覚的共同注意の質的側面に踏み込めるこもしれないことが示唆された。われわれは、目や目様の刺激に対して特に高い感受性(EDD)を有しているとされ、それは進化論的な産物であるとされる。habituation/dishabituation法を用いて、乳幼児のEDDを検討した。顔の線画や顔写真の各パ-ツ(目、鼻、口)をひとつずつ変化させた刺激では、目を変化させたものに対して、もっとも長い注視時間の増加が見られた。これはEDDの機能的な存在をうかがわせる結果である。また、チンパンジーを対象としてpincer gripの発達の実験的分析を行った。3種類の大きさのリンゴ片をチンパンジーに呈示し、そのつまみ方を詳細に分析した。その結果、従来まではチンパンジーには見られないとされていたpincer gripがチンパンジーにもみられたこと、しかしながら、その頻度は若い個体ではきわめて少なく、ある程度の成熟(今回は8歳以上)がなければ出現しないことがわかった。ヒト乳児のデータと比較すると、チンパンジーでは発達のスパンがかなり遅いことわかった。
イネ科植物と共生するエンドファイトの新規有用菌株育種法の確立

植物体内で共生的に生活している微生物はエンドファイトと総称されている。Epichloe属エンドファイトはイネ科植物の細胞間隙で生育し、共生関係を確立する糸状菌であり、植物内で様々ば生理活性物質を生成し、宿主植物に動物や昆虫による捕食の抑制、耐乾性、耐病性などの効果をもたらすことが報告されている。本研究では、Epichloe属菌のHybrid菌株を人工的に作出することで、有用なエンドファイト菌株を人工的に作出する方法の確立を目指している。Epichloe属エンドファイトは、貧栄養培地上で菌糸間融合が認められる。これまでに、核をGFP標識したエンドファイトの観察により、隣り合った菌糸の融合、融合部位を介した核の移行、移行した核の融合を観察している。また、異なる薬剤耐性マーカー遺伝子を導入した2種のE. festucae菌株を対峙培養し、疑似有性生殖を介したHybrid菌株の作出に成功している。得られた5種のHybrid菌株の染色体構成をパルスフィールドゲル電気泳動およびゲノム配列の解析により調査し、それぞれのHybrid菌株で親株には見られない染色体が現れているものが見出され、それぞれのHybrid株の異なるゲノム領域でゲノムの欠損や組み替えなどが検出された。さらにミトコンドリアゲノムにおいても組み替えが起こっている菌株が見出された。以上の結果から、エンドファイトでは擬似有性生殖様の現象により、ランダムでダイナミックなゲノム再構築が起こっていることが示された。また、2つの親株に致死遺伝子を導入し、それらの対峙培養による擬似有性生殖の誘導と新規菌株の作出に取り組んだ。このHybrid株の作出に成功し、形質転換マーカーを持たない新規菌株の人工的な作出法の確立が完了した。Epichloe属エンドファイトは、貧栄養培地上で頻菌糸間融合が認められる。得られた5種のHybrid菌株の染色体構成をパルスフィールドゲル電気泳動で調査したところ、それぞれのHybrid菌株で、親株には見られない染色体が現れているものが見出された。これら5種のHybrid菌株のゲノムを次世代シークエンスを用いて詳細に解析したところ、それぞれのハイブリッド株の異なるゲノム領域で、ゲノムの欠損や組み替えなどが検出された。また想定外であったが、ミトコンドリアゲノムにおいても組み替えが起こっている菌株が見出された。また、2つの親株に致死遺伝子を導入し、それらの対峙培養による擬似有性生殖の誘導と新規菌株の作出に取り組んでいる。このHybrid株の作出に成功すれば、形質転換マーカーを持たない新規菌株の人工的な作出法の確立が完了する。本研究では、人工的に有用な活性をもつエンドファイト菌株を育種する方法の確立を目指している。平成29年度は、異なる薬剤耐性マーカー遺伝子を導入した2種のE. festucae菌株から疑似有性生殖を介して作出した5種のHybrid菌株の全ゲノム配列を解析し、それぞれのHybrid株で異なるゲノム領域におけるゲノムの欠損や組み替えなどが検出された。また、ミトコンドリアゲノムにおいても組み替えが起こっている菌株を見出すなど、エンドファイトの疑似有性生殖によるゲノムの再構築の実態を明らかにすることに成功した。これまでの結果と合わせて、自然界から単離されるゲノム構造の複雑な、あるいは重複がランダムに起こっているエンドファイトの不完全菌がどのようにして出現しているのか、かなりの部分で明らかに出来たと考えている。また、本研究の1つの目標である形質転換マーカーを持たない新規菌株の人工的な作出法の確立に着手し、順調に進行しており、最終年度である平成30年度には目標を達成できる見込みである。

また、異なる薬剤耐性マーカー遺伝子を導入した2種のE. festucae菌株を対峙培養し、疑似有性生殖を介したHybrid菌株の作出に成功している。得られた5種のHybrid菌株の染色体構成をパルスフィールドゲル電気泳動およびゲノム配列の解析により調査し、それぞれのHybrid菌株で親株には見られない染色体が現れているものが見出され、それぞれのHybrid株の異なるゲノム領域でゲノムの欠損や組み替えなどが検出された。さらにミトコンドリアゲノムにおいても組み替えが起こっている菌株が見出された。以上の結果から、エンドファイトでは擬似有性生殖様の現象により、ランダムでダイナミックなゲノム再構築が起こっていることが示された。また、2つの親株に致死遺伝子を導入し、それらの対峙培養による擬似有性生殖の誘導と新規菌株の作出に取り組んだ。このHybrid株の作出に成功し、形質転換マーカーを持たない新規菌株の人工的な作出法の確立が完了した。A.新規Hybrid菌株のゲノム構造の詳細解析これまでにHybrid株には高い遺伝的多様性があることが明らかとなった。しかし、親株の1つであるFl1株が全ゲノムが決定しているのに対してもう一方の親株であるE437株では、本研究で解読したショートリードの解析によるデータがあるのみで、その全体像が明らかではない。そこで、ロングリードによる配列解析で、完全長E437株ゲノム配列を決定し、その配列をもとにHybrid菌株のゲノム構造を再解析する。B. Hybrid菌株のゲノム構造の安定性の解析新規に作成したHybrid菌株ではゲノムの重複を含む多様なゲノム構造が認められたが、そのゲノムが培養時あるいは植物への感染時に安定して維持されるかは明らかではない。そこで、2つの親株の染色体のマーカーを作出し、Hybrid菌株のゲノムの安定性を調査する。この解析によって新規菌株が長期利用が可能であるかどうかを確認する。C.異種エンドファイトのHybrid菌株の作出とゲノム構造の解析これまでに、ヤマカモジグサ由来のE. sylvaticaを得て、Fl1株とのHybrid菌株の作出を試みている。この組み合わせでも菌糸の融合が認められており、これまでに報告のない異種間の擬似有性生殖の誘導に成功したと考えられる。そこで、異種間Hybrid菌株のパルスフィールドゲル電気泳動によるゲノム構造の調査、次世代シークエンスによるゲノム配列の詳細解析を行う計画である。D.新規菌株の人工的な作出法の確立既に2つの親株に致死遺伝子を導入し、それらの対峙培養による擬似有性生殖の誘導と新規菌株の作出に取り組んでいる。得られたHybrid株から致死遺伝子が取り除かれた菌株を選別することで、形質転換マーカーを持たない新規菌株の人工的な作出法を確立する。
実験的自己免疫性筋炎におけるICOSの病態関与とICOS阻害治療

今回我々は、6週齢の雌Lewisラットにヒト組換えC蛋白フラグメントを週1回、計3回免疫すると共に、抗ICOS抗体またはコントロール抗体を初回免疫の1週間後から週2回投与した。最終免疫の2週間後にラット後肢筋組織を採取し、HE染色を行い、炎症スコアを測定した。各種1次抗体を用いて免疫染色を行った。リンパ節と脾臓からリンパ球を分離し、C蛋白に対する反応性を検討した。屠殺時に採血を行い,抗C蛋白抗体の血清中濃度をELISA法で測定した。コントロール抗体を投与したC蛋白免疫ラット筋組織では無治療ラットEAMでの検討と同様な激しい筋炎所見を認め、筋炎組織へのCD8陽性T細胞とCD11b/c陽性マクロファージの浸潤と、CD8陽性T細胞におけるICOSの発現を認めた。一方、抗ICOS抗体投与群ではコントロール抗体投与群に比べて組織学的炎症スコアの有意な改善を認めた。また、筋組織においてICOSの発現は認めなかった。しかし、C蛋白で刺激したリンパ節細胞や脾細胞の^3H-thymidineの取り込みとIFN-γ産生は、両群で用量依存性に増加し、抗ICOS抗体投与によっては低下しなかった。ラット血清中の組換えC蛋白フラグメントに対する抗体価も,両群とも無処置ラット群に比べて上昇しており,2群間で有意な差は認めなかった。上記の結果は本EAMの病態形成におけるICOS-ICOSリガンドの相互作用の重要性を示すと考えられた。抗ICOS抗体による病態改善の機序として抗原刺激によるT細胞増殖の抑制や自己抗体産生の抑制を想定したが,今回の研究では確認できなかった。今回我々は、6週齢の雌Lewisラットに、ヒト組換えC蛋白フラグメントを週1回、計3回免疫すると共に、抗ICOS抗体またはコントロール抗体を、初回免疫の1週間後から週2回投与した。最終免疫の2週間後(day28)にラット後肢筋組織を採取し、HE染色・鏡検を行い、炎症スコアを測定した。また、各種1次抗体を用いて免疫染色を行った。また、リンパ節と脾臓からリンパ球を分離し、C蛋白に対する反応性を検討した。また、リンパ節細胞や脾細胞においては、C蛋白の刺激によって、用量依存性に^3H-thymidineの取り込みが増加し、C蛋白反応性T細胞が誘導されていると考えられた。上記の結果は本EAMモデルの病態形成におけるICOS-ICOSリガンドの相互作用の重要性を示すと考えられた。
マウス体細胞における相同組換えと遺伝子修復の解析

本研究ではマウス体細胞における特定遺伝子座近傍の相同組換えを鋭敏に検出し、その領域を分子レベルで解析する系を確立することを第一の目的とした。まずneo-tkカセットを利用した系でマウスp53遺伝子座にHSV-tkを導入したアリルTを確立し、その野生型とのヘテロ接合体W/TをGANC選択でW/Wおよび高濃度G418でT/Tホモ接合体の組換え修復体を得る系を用いた。これをC57BL/6とCBAのF1細胞株であるTT2において確立することにより、組換え修復を分子レベルで解析できる基礎系を確立した。実際にTT2株においては調べた多型マーカーのうちやく半数が利用可能であることを示した。さらに系の精度を高めるために、Eco-gpt遺伝子の有効性も検討し、HSV-tk遺伝子より優れていることを確認した。Eco-gptをマーカーとした場合、ヘテロ接合体の6-tg感受性株を、組換え修復によって6-tg耐性株となったホモ接合体を単離するわけであるが、この場合はHSV-tkとGANCの系に見られた感受性株の残骸が残らず、短時間で多くの耐性株を正確かつ効率良く得ることができた。このEco-gptを利用するために必要であった6-tg耐性となったES細胞株CCHの樹立、CCH株のp53遺伝子座へのneo-gptカセットの導入にも成功した。この成果に基づき、今後、片方のアリルにはEco-gptをneo遺伝子とのカセットで、また、もう片方にはHSV-tkをピュアロマイシン耐性遺伝子とのカセットで導入した細胞を構築することができ、それぞれ6-tg、GANC選択で、gptからtkへ、また、tkからgptへと両方向への相同組換えによる遺伝子修復を分子レベルにおいて解析できる可能性を開いた。本研究は、マウス第11染色体のp53遺伝子座にneo-tkカセットを標的導入したマウス胚幹(ES)細胞を用いて、染色体の相同組換えに関与する一連の現象を分子レベルにおきて解析できる系の確立と利用を目指している。野性型アリル(W)とneo-tkアリル(T)をもつヘテロ接合体(W/T)のES細胞において2つのアリル間で両方向に、しかも再現性をよく組換え修復が生じることはすでに平成6年度に発表した。この組換え修復の作業仮設として、〔1〕比較的限られた領域での除去修復タイプのジーンコンバージョン、〔2〕相同染色体のDNA複製後の染色分体(sister chromatids)間の相同組換え、〔3〕単一親由来の二染色体性(uniparental disomy)にみられるような染色体不分離によるホモ接合化を提唱し、実験的に検証する。平成7年度は、申請者が九州大学から東海大学に転出したため、まず、その移動に伴う実験系の設置を行った。大幅な改修をすでに完了し、移動および備品の設置もほぼ整った。この間、材料となるES細胞株は、九州大学生体防御医学研究所の勝木元也教授のご協力のもと、現在、G418およびGANCによる選択を始める段階である。また、SSLPマーカーに関しては、国立遺伝学研究所の城石俊彦教授に多大な援助を頂き112対入手した。コントロールとなるCBA近交系マウス、C57BL/6近交系マウスおよびTT2ES細胞株のゲノムDNAは、すでに大量に抽出した精製した。予備実験において調べたSSLPマーカー8個のうち丁度半分に、CBA近交系マウスとC57BL/6近交系マウスの間の多型が確認された。入手したSSLPプライマー対112個のうち、約50対は、多型の検出できるマーカーと推定される。

検定対象となる耐性細胞株が得られ次第、多型の確認できたSSLPマーカーで、順次、解析を始める。本研究ではマウス体細胞における特定遺伝子座近傍の相同組換えを鋭敏に検出し、その領域を分子レベルで解析する系を確立することを第一の目的としている。最終年度として平成8年度では、特定遺伝子座における組換えを検出するためのマーカーとして新たにEco-gpt遺伝子の有効性を検討し、実際にこれまで利用してきたHSV-tk遺伝しよりも多くの点において優れていることがわかった(Ito,Gondo et al.,in preparation)。まず、HSV-tk遺伝子をマーカーとした場合、GANC選択を用いて、両アリルが野生型に復帰した組換え修復体を検出するわけであるが、親株であるヘテロ接合体がGANC感受性であるにも関わらず残骸をプレート上に残すため、鋭敏に耐性株を単離する場合、労力と正確性に難点をもたらしていた。Eco-gptをマーカーとした場合、同様にヘテロ接合体である6-tg感受性株を、組換え修復によって耐性株となったホモ接合体を6-tgを用いて単離するわけであるが、この場合はHSV-tkとGANCの系に見られた感受性株の残骸が残らず、短時間で多くの耐性株を正確かつ効率良く得ることができた。今年度は、このEco-gptを利用するために必要であった6-tg耐性となったES細胞株CCHの樹立、CCH株のp53遺伝子座へのneo-gptカセットの導入に成功した。また、二段階の相同組換えを用いて実際にp53遺伝子座を点突然変異および欠失突然変異に置換することにも成功し、得られたすべてのES細胞のアリルを、キメラマウスの生殖細胞を通してマウス個体に伝えることにも成功した。この成果に基づき、今後、片方のアリルにはEco-gptもう片方にはHSV-tkを導入した細胞を構築し、それぞれ6-tg、GANC選択で、gptからtkへ、また、tkからgptへと両方向への相同組換えによる遺伝子修復を解析できる可能性を開いた。
染色体テリトリーと発がん

細胞機能の発現の主要な源泉である「核」には、遺伝子の本体であるDNAが高度に折りたたまれた染色体として存在する.近年、この染色体が細胞間期において特定の領域に存在するという染色体テリトリーの存在が明らかになってきた.申請者らは最近、粘液型脂肪肉腫の染色体転座が脂肪分化における染色体テリトリーの変動と密接な関係がある事を示した(J Cell Sci., 117:5897-5903, 2004).また、申請者らが単離した子宮頸癌の新規癌遺伝子hWAPL (Cancer Res., 64:3545-3549, 2004 ; Cancer Lett., 221:21-28, 2005 ; Br.J.Cancer, 92:290-293, 2005.)は、染色体テリトリーに影響を及ぼし、染色体不安定性を誘導するという可能性の証拠を得ている.これらの事実は、染色体テリトリーの維持機構の不調が発がんを促すことを示唆する.そこで、本研究においては、hWAPLの発現異常から染色体テリトリーの破綻への分子メカニズムを明らかにするとともに、発がんにおける染色体テリトリーの関与がどの程度の頻度で癌細胞に起こっているのかを検討していく.今年度は、強力な発がん化学物質としても知られるダイオキシンがhWAPLを誘導することから、ダイオキシンが染色体テリトリーに影響をおよぼす可能性を検討した.その結果、ダイオキシンが12番染色体と16番染色体の相対的核内配置を変化させることを発見した.一般にダイオキシンの細胞毒性は、ダイオキシン受容体(AhR)を介してエストロゲン受容体に影響したり下流遺伝子群の転写制御をすることで生じることが知られている.現在我々は、ダイオキシンの染色体テリトリーに与える影響が、AhRの経路に依存しているか、非依存の新規経路に拠るものかも検討している.細胞機能の発現の主要な源泉である「核」には、遺伝子の本体であるDNAが高度に折りたたまれた染色体として存在する.近年、この染色体が細胞間期において特定の領域に存在するという染色体テリトリーの存在が明らかになってきた.申請者らは最近、粘液型脂肪肉腫の染色体転座が脂肪分化における染色体テリトリーの変動と密接な関係がある事を示した(J Cell Sci., 117:5897-5903, 2004).また、申請者らが単離した子宮頸癌の新規癌遺伝子hWAPL (Cancer Res., 64:3545-3549, 2004 ; Cancer Lett., 221:21-28, 2005 ; Br.J.Cancer, 92:290-293, 2005.)は、染色体テリトリーに影響を及ぼし、染色体不安定性を誘導するという可能性の証拠を得ている.これらの事実は、染色体テリトリーの維持機構の不調が発がんを促すことを示唆する.そこで、本研究においては、hWAPLの発現異常から染色体テリトリーの破綻への分子メカニズムを明らかにするとともに、発がんにおける染色体テリトリーの関与がどの程度の頻度で癌細胞に起こっているのかを検討していく.今年度は、強力な発がん化学物質としても知られるダイオキシンがhWAPLを誘導することから、ダイオキシンが染色体テリトリーに影響をおよぼす可能性を検討した.その結果、ダイオキシンが12番染色体と16番染色体の相対的核内配置を変化させることを発見した.一般にダイオキシンの細胞毒性は、ダイオキシン受容体(AhR)を介してエストロゲン受容体に影響したり下流遺伝子群の転写制御をすることで生じることが知られている.現在我々は、ダイオキシンの染色体テリトリーに与える影響が、AhRの経路に依存しているか、非依存の新規経路に拠るものかも検討している.
抗炎症性脂質を内包化したナノ粒子による血管疾患治療における新たな治療戦略開発

1)ナノ粒子の物性特性を検討し、In vitroでの抗炎症効果の判定を行った。動的/静的光散乱法による粒径の検討、血中や漿液中での安定性の検討が行われた。平滑筋細胞との相互作用の検討も施行した。ナノ粒子の挙動はほぼ予想通りであるが、収率が予想よりあまり高くないことが問題となっている。合成経路の再検討も行い、抗炎症脂質のカルボン酸とポリエチレングリコール化のためのエステル結合以外の反応経路の検討も行なった。これにてやや収率の上昇をみた。ナノ粒子の基礎的検討、構造のブラッシュアップは引き続き行っていく。2)ラットバルーン傷害内膜肥厚モデル作成を行い、病理学的検討や抗炎症脂質そのもののin vivoでの作用を検討した。とくにレゾルビンD2以外の抗炎症脂質(プロテクチンD1など)についても検討を進めた。やはりレゾルビンD2の内膜肥厚抑制作用は強いが、ナノ粒子としても有用かどうかは今後の課題となった。また他の炎症性脂質の活用も検討の余地があることが考えられた。本検討はコントロール実験として有用で基礎データが整理された。3)ナノ粒子の血中滞留性、安定性、効果発現、内膜肥厚血管における分布を検討した。これは、内膜肥厚モデル以外のラット動物実験モデル(ラット下肢動脈閉塞モデル)で検討された。このモデルは急性炎症をベースとするもので内膜肥厚モデルと一致するものである。必ずしも粒子サイズ100nmよりもやや小さい60ー80nmのものが病変部位に滞留することもあり、これは新たな知見となった。内膜肥厚モデルによるIn vivo実験は引き続き進めていく。開発されたナノ粒子が、予想通りの収率を示していないことから一定量のナノ粒子を安定的に得ることが時として困難なことがあった。このため、工学系研究科と共同の開発段階に戻ることがあり、動物実験にも進みにくい現状があったためと考える。抗炎症脂質に関する検討は引き続き行い、本年度に得られた知見を元次年度は最終年度となるため、システム構築まで進めていく。それとともに抗炎症物質(核酸等も含め)にナノ粒子化を行う対象を広げ、新たなDDS/治療システム開発を推進する。
難治性前立腺癌におけるAkt経路とアンドロゲン受容体経路の制御による新規治療戦略

前立腺癌の治療抵抗性の原因にAR axisとPI3K/Akt経路の相補排他的フィードバック機構がある。そこで、去勢抵抗性前立腺癌細胞株C4-2、C4-2をアンドロゲン除去下で培養し有意にドセタキセル抵抗性を示すC4-2AT6細胞株にてPI3K/mTOR阻害剤(NVP-BEZ235)とAR阻害剤(アビラテロン、MDV3100)の併用療法を検討した。C4-2AT6はC4-2と比較しアンドロゲン受容体(AR)の亢進を認め、NVP-BEZ235の使用は濃度依存的にARの発現を亢進させた。またアビラテロン・MDV3100とNVP-BEZ235の併用でのC4-2AT6に対する殺細胞効果は有意でなかった。当教室では去勢抵抗性前立腺癌細胞株であるC4-2をアンドロゲン除去下で培養し、C4-2AT6細胞株を樹立した。去勢抵抗性前立腺癌に対する標準治療はドセタキセルを用いた抗癌化学療法であるが、C4-2AT6はC4-2と比較し有意にドセタキセルに対して抵抗性を示す。ドセタキセルがPI3K/Akt pathwayを活性化する事に着目して、C4-2AT6に対するPI3K/mTOR阻害剤の有効性について検討した。PI3K/mTOR阻害剤はドセタキセル抵抗性であるC4-2AT6において高い抗腫瘍効果を示し、ドセタキセル抵抗性の改善に寄与する可能性を示唆した。PI3K/mTOR阻害剤の問題点の一つに、フィードバック経路がある。とりわけ前立腺癌においてはアンドロゲン・アンドロゲンレセプター軸(AR axis)とPI3K/Akt pathwayとの相補排他的フィードバック経路が挙げられる。そこでPI3K/mTOR阻害剤とAR阻害剤との併用療法に着目して検討を行った。C4-2AT6はC4-2と比較してアンドロゲンレセプターの亢進を認め、PI3K/mTOR阻害剤(NVP-BEZ235)の使用は濃度依存的にアンドロゲンレセプターの発現を亢進させた。続いて、アビラテロンやMDV3100等の抗アンドロゲン剤とNVP-BEZ235の併用によるC4-2AT6に対する殺細胞効果をWST assay法を用いて評価した。しかし、アビラテロンとの併用において若干の殺細胞効果の上昇を認めたものの、仮説と反してMDV3100とNVP-BEZ235の併用療法はC4-2AT6に対して有効性を示さなかった。アンドロゲン感受性前立腺細胞株であるLNCaPではこれらの薬剤の併用の有効性が報告されている。これらの結果は、高い悪性度を獲得した前立腺癌細胞ではAR axisとPI3K/Akt pathwayの同時阻害は有効性を示さないこと示唆する。ドセタキセルがPI3K/Akt pathwayを活性化する事に着目したところ、PI3K/mTOR阻害剤はC4-2AT6において高い抗腫瘍効果を示し、ドセタキセル抵抗性の改善に寄与する可能性を示唆した。これらの結果は、高い悪性度を獲得した前立腺癌細胞ではAR axisとPI3K/Akt pathwayの同時阻害は有効性を示さないこと示唆した。

その抵抗性を克服するため、薬剤濃度や投与のタイミング、RAS-MAPK pathwayやJAK/STAT pathwayとの関連についても追加で検討中である。また現在はMDV3100とNVP-BEZ235に加えドセタキセルを併用した際の殺細胞効果を調べて相加相乗効果を検討しているほか、それら併用療法のin vivoでの検討を続けている。医学系泌尿器科C4-2AT6はC4-2と比較してアンドロゲンレセプターの亢進を認め、PI3K/mTOR阻害剤(NVP-BEZ235)の使用は濃度依存的にアンドロゲンレセプターの発現を亢進させたが、併用について検討したところ、アビラテロンとの併用において若干の殺細胞効果の上昇を認めたものの、仮説と反してMDV3100とNVP-BEZ235の併用療法はC4-2AT6に対して有効性を示さなかった。アンドロゲン感受性前立腺細胞株であるLNCaPではこれらの薬剤の併用の有効性が報告されていることから、高い悪性度を獲得した前立腺癌細胞ではAR axisとPI3K/Akt pathwayの同時阻害は有効性を示さないことを示唆し、併用効果についての評価はできているものと考える。当初の予想と反し、アンドロゲン受容体シグナル伝達阻害剤とPI3K/mTOR阻害剤の併用療法はC4-2AT6に対して有効性を示さなかったが、それを今後in vitro(皮下腫瘍モデル)でも検討する。また上記併用療法が有効性を示さなかった機序、抗腫瘍効果を得られる新規方法に関しても検討していく。
中世後期フランドル都市における宗教活動と宗教心性 -ブルッヘの教会と兄弟団から-

本年度は、8月にブルッヘの司教文書館および国立文書館で敢行した史料調査をもとに、1438年に行われたブルゴーニュ公フィリップの弟ジャンによるシント・ドナース教会参事会長就任儀礼についての研究を進めた。本研究の主要な目的として、様々な社会集団が活動した中世都市ブルッヘにおいて、教会組織や兄弟団などの信心団体がいかなる社会的機能を果たしたのかを明らかにすることがあげられるが、ブルッヘにおける政治的・社会的・文化的中心地であるシント・ドナース教会参事会長の就任儀礼には、君主の政治的指導層から都市エリートまで、広範な階層の人々が数多く参加したのであり、以上のような目的を遂行するためには格好の研究対象であった。また、同教会は都市ブルッヘにおいてもっとも高いステータスを誇る墓所であったが、その指導者に君主側の血縁の者が就任するということは、都市民のアイデンティティにとっても重大な作用をおよぼす出来事であった。埋葬や死者記念のあり方を分析することによって都市ブルッヘにおける宗教心性の様態を明らかにすることも本研究の目標および計画に含まれているが、この点でも、シント・ドナース教会参事会長の就任儀礼に考察を加えることは重要な意義をもつといえるだろう。こうした研究成果の一部は、2008年3月29日、中世英仏史研究会にて報告された。また、こうした現地調査の成果も駆使しつつ、中世後期のフランドル地方を理解するための前提として中世盛期の宗教組織の分析や政治文化の解明も試みたが、これらの成果はそれぞれ2008年3月に論文およびシンポジウムにおける口頭報告の形で発表された。本年度は、中世後期フランドル都市において、死者の記憶を媒介としていかなる社会的結合関係が築かれ、これが都市民のアイデンティティのあり方にいかなる影響を及ぼしていたのかを明らかにしようとした。またこの際、死者記念から浮かび上がる社会関係の静的な側面のみならず、現実の政治的・社会的変動のプロセスにおいて死者の記憶がどのように取り扱われ、これをめぐって象徴的な権力闘争がいかに繰り広げられたのかについても考察を加えた。とりわけ焦点となるのは1436年から2年間続いた都市ブルッヘによるブルゴーニュ公家への反乱である。反乱鎮圧後の1438年、シント・ドナース教会の新参事会長に君主の弟が選出され、入市式が執り行われたが、ブルッヘの都市エリートのネクロポリスである同教会に君主家系の者が送り込まれた意味を、入市式やその後に行われた死者典礼、そしてこれと同時に行われた君主側戦死者の死者移葬の分析などから明らかにした。その際ブルッヘにて現地調査を行い、刊行史料とともにブルッヘ市立図書館所蔵の『フランドル年代記』写本なども閲覧し、またルーヴァン・カトリック大学所蔵のR・ド・ケイザーによるジント・ドナース教会をめぐる未刊行のプロソポグラフィー研究の成果をも参照した。こうした分析により、君主家系が教会支配と死者の記憶の管理を通じて都市との支配関係を結び、都市民のアイデンティティに重要な作用を及ぼそうとした過程が明らかになった。なおこの成果は、2006年11月3日の京都大学西洋史読書会大会において学会報告の形で公表された。また上記の現地調査の際、文書史料の欠落を補う歴史叙述史料の網羅的調査の必要性から上記の『フランドル年代記』群やその他修道院年代記などの刊行本および未刊行写本の調査を行ったが、その成果を活かし、都市民の記憶文化のあり方を明らかにした論稿も発表した。
精巣特異的遺伝子movo遺伝子の精子形成に関する研究

まず、われわれがこれまでに作製したmovo遺伝子にloxP配列を導入したマウスを精原細胞で特異的に発現するStra8-Creマウスと交配させ、Movo蛋白の発現を確認したがコンディショナルノックアウトマウスにならなかった。これはStra8の発現時に十分なCreの発現が認められなかった為と考えられる。そこで、GFP-Cre配列を持ったレンチウイルスを精巣に直接トランスフェクションする事でCreの発現を誘導しようと試みたが、精巣組織の免疫染色切片でGFPの蛍光は確認出来なかった。Germ lineへのCre導入を試みるべく、次にプラスミドベクターを用いたin vivoでのElectroporationを試みた。pCAG-nlsCRE-IRES2-EGFPプラスミドを作製。Capillary syringeを精巣網へ穿刺、精細管内に逆行性にプラスミドを注入した後、ピンセット型円形電極を用いてelectroporationしプラスミドをトランスフェクションした。今後、トランスフェクション後の精巣組織切片を用いて、movoを欠損した精巣組織での精子形成における表現型の確認、既に作製したOvol2/MOVOに特異的な抗体、Germ lineの各時期特異的抗体や他のXY body特異的抗体との共染色によりMovo蛋白の機能解析を試みる予定である。同時に、自然科学研究機構・基礎生物学研究所生殖細胞研究部門・教授・吉田松生先生の御厚意により精巣幹細胞に発現するNGN3-Creマウスを提供頂いた。NGN3-Creマウスとmovo遺伝子にloxP配列を導入したマウスを交配させることで再度コンディショナルノックアウトマウスを作製しMovoの機能解析を行う予定である。
「かかわり合い」の成り立ちを重視したカリキュラム開発のための実践的研究

本研究では,第一に,「関係論的な学習観」の中核として位置づく,「自己(学習者)」と「他者(人・モノ・自然など)」の関係性,すなわち「かかわり合い」に焦点をあて,その必要性や成り立ちについて考察を行った。そこでは,「かかわり合い」とは,「働きかけられるかかわり(受動的志向性)」によって,「働きかけるかかわり(能動的志向性)」がたち現れることで成り立っていることが明らかにされ,現在の学校教育・学校体育においては,積極的な「受動的志向性」に焦点をあてた授業を構想することの必要性が浮かび上がった。また,「かかわり合い」の成り立ちから導き出した,5つの局面(〔情報〕〔傾聴〕〔受容〕〔発動〕〔表現〕)を観点にしながら学習者のからだが置かれている状況・状態を見定め,授業を構成していくことの重要性が明らかにされた。第二に,「かかわり合い」の成り立ちを重視した授業(大学教育実践研究:小学校専門体育,小学校教育実践研究:三重県四日市市立K小学校(主として体育授業))を構想し,実践を行った。そこでは,積極的な「受動的志向性」に一貫して光をあてたテーマ設定,並びに「かかわり合い」の成り立ちから設定した「〔情報〕局面〔表現〕局面」に基づいた授業の構成は,受講生や子どもの「いまのからだを開く」「他者の関係を拓く」「運動や学習の意味を劈く」ことに,深く影響を与えていることが考察された。また,新学習指導要領に明記されている「心と体の一体」化の成立のためには,他者(人・モノなど)の存在は欠かすことができず,他者からの働きかけこそが<わたし=からだ>を揺さぶり,成長を促してくれることが,授業実践によって検証された。以上のことから「かかわり合い」の成り立ちから導き出した視点は,「関係論的な学習観」に立脚した体育のカリキュラムと授業を構想していく際の一つの手がかりとして,有効性があることが検証された。また,「かかわり合い」の成り立ちから導き出した各局面の相互性を明らかにすることで,関係論的アプローチによる体育授業の構想のための具体的ポイントについて提示した。また、「かかわり合い」の成り立ちから導き出した,5つの局面(〔情報〕,〔傾聴〕〔受容〕〔発動〕〔表現〕)を観点にしながら学習者のからだが置かれている状況・状態を見定め,授業を構成していくことの重要性が明らかにされた。以上のことから,「かかわり合い」の成り立ちから導き出した視点は,「関係論的な学習観」に立脚した体育のカリキュラムと授業を構想していく際の一つの手がかりとして,有効性があることと検証された。

また,新学習指導要領に明記されている「心と体の一体」化の成立のためには,他者(人・モノなど)の存在は欠かすことができず,他者からの働きかけこそが<わたし=からだ>を揺さぶり,成長を促してくれることが,授業実践によって検証された。以上のことから「かかわり合い」の成り立ちから導き出した視点は,「関係論的な学習観」に立脚した体育のカリキュラムと授業を構想していく際の一つの手がかりとして,有効性があることが検証された。また,「かかわり合い」の成り立ちから導き出した各局面の相互性を明らかにすることで,関係論的アプローチによる体育授業の構想のための具体的ポイントについて提示した。
免疫監視細胞マクロファージを用いた急性炎症応答の評価

集中治療管理において、生体炎症の程度は病態の予後に大きな影響を与える。生体細胞を用いて炎症等を定量的に解析することが出来れば、生体急性炎症メカニズムの解明ひいては臨床応用に非常に有用と思われる。本研究では、生体急性炎症のモニター指標として血球細胞に着目し、細胞内情報伝達制御因子ジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)ファミリーの発現変化を検討した。ヒト血球系細胞株を用いて、DGKファミリーの発現パターン、ならびにLPS、IL2刺激における発現変動を解析した。その結果、DGKファミリーのうち、DGKεが炎症応答初期に発現増強を示すことが明らかになった。集中治療管理過程における生体炎症のモニターは病態予後の予測に大いに役立つと考えられている。現在の周術期モニターシステムは、薬物の投与時間と連動して血圧や血ガス等の変動を経時的にモニタリングすることを可能にしているが、惹起される炎症応答は個体により大きく異なるので、生体細胞を用いて炎症等を定量的に解析することが出来れば、生体急性炎症メカニズムの解明ひいては臨床応用に非常に有用と思われる。本研究では、生体急性炎症のモニター指標として、生体免疫機能の最前線に位置し、生体炎症応答を監視するマクロファージを含めた血球細胞に着目し、炎症応答の評価法を検討する。これまでの研究により、申請者らがこれまで解析してきた細胞内二次メッセンジャー代謝酵素ジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)は生体ストレス応答に関与する可能性が示唆されているので、この分子ファミリーの動態を指標とした生体急性炎症のモニタリングを行う。昨年度にヒト正常血球細胞におけるDGKファミリーの発現を検討した結果、正常ヒト血液サンプルから、好中球、単球、CD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞、B細胞を分離し、RT-PCR法を用いて、DGKファミリー分子の発現を解析した。その結果、DGKαはCD4陽性T細胞およびCD8陽性T細胞に豊富な発現が認められた。DGKγは単球に、またDGKζはB細胞以外の細胞での発現が観察された。一方、DGKεも大部分の細胞に発現が認められたが、とくにT細胞系における発現が顕著であった。本年度は、炎症応答における動物モデルを作製し、免疫細胞が豊富に見られる脾臓の解析を行った。その結果、グラム陰性菌細胞壁外膜の構成成分リポ多糖(LPS)投与群においてDGKεmRNAの発現が有意に増加することを見出した。今後は、ヒト血球系細胞株を用いて、細胞毎の炎症応答解析を行う予定である。外科的手術、種々の要因による人工呼吸管理、および重症肺炎等において集中治療が選択される場合、その過程における生体炎症の程度が病態の予後に大きな影響を与えることが少なくない。本年度はまず、ヒト正常血球細胞におけるDGKファミリーの発現を検討した。正常ヒト血液サンプルから、好中球、単球、CD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞、B細胞を分離し、RT-PCR法を用いて、DGKファミリー分子の発現を解析した。本研究では、生体急性炎症のモニター指標として、生体免疫機能の最前線に位置し、生体炎症応答を監視する血球細胞に着目し、炎症応答の評価法を検討している。

昨年度までは、ヒト正常血球細胞におけるDGKファミリーの発現パターンを検討し、さらに、LPS投与動物モデルの脾臓においてDGKεmRNAの発現が増加することを見出した。今年度は、ヒト血球系細胞株を用いて、LPS、インターロイキン2 (IL-2)、12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate (TPA)の各刺激におけるアイソザイムmRNAの発現変化を検討した。その結果LPS刺激およびIL-2刺激によりDGKεmRNAの発現量が著しく増加した。一方、TPA刺激ではいずれのDGKアイソザイムでもmRNAの発現に変化は認められなかった。DGKεは、アラキドン酸含有DGに基質特異性を示し、イノシトールリン脂質(PI)代謝に特異的に関与すると考えられている。本研究により、LPS等に対する炎症反応において、免疫担当細胞におけるDGKεmRNAが早期に発現増強を示すことが明らかとなり、PI代謝が亢進する可能性が示唆された。また細胞内におけるDGKεの小胞体局在化メカニズムと小胞体ストレスにおける役割について解析を進めた。麻酔科学、救急医学本研究では、生体急性炎症のモニター指標として、生体免疫機能の最前線に位置し、生体炎症応答を監視するマクロファージを主とした血球細胞に着目し、炎症応答の評価法を検討することを目的としている。昨年度は血液細胞の分離とmRNAの抽出、RT-PCR法によるDGKファミリーの発現解析を行った。今年度は、炎症の動物モデルを作製し、免疫細胞が豊富に見られる脾臓を用いてDGK mRNAの発現解析を行った。正常細胞の実験から、個体レベルに実験に研究が進展しているので、研究計画はおおむね順調に進行していると評価した。本研究では、生体急性炎症のモニター指標として、生体免疫機能の最前線に位置し、生体炎症応答を監視するマクロファージに着目し、炎症応答の評価法を検討することを全体の目的とする。この目的を達成するために、本年度は血液細胞の分離とmRNAの抽出、RT-PCR法によるDGKファミリーの発現解析を行った。マクロファージは、正常血液の単球が炎症反応に応答して分化したものであるので、まず単球およびその他の血液細胞の解析が必要であると考えた。今年度は、正常細胞を用いた基礎実験系を整えることができたので、おおむね研究計画は順調に進行していると評価した。昨年度および今年度に得られた研究データを基に、今後は分離した血球細胞、あるいは各々の血球細胞の培養株を用いて、細胞レベルでの経時的な炎症応答を解析する。さらに、得られた知見を基に、DGKノックアウトマウスを用いて、再び個体レベルにおける炎症応答を解析する。これまで得られた研究データを基に、今後は炎症応答におけるDGKファミリーの発現変化を解析する。とくに、グラム陰性菌に含まれ生体炎症を惹起するリポポリサッカリド(LPS)を用いて、血球細胞および各々の血球細胞の培養株における経時的な変化を解析する。さらに個体レベルの実験として、ラット腹腔内にLPSを投与し、全身炎症モデルを作製する。