hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アミロイドβの膜局在・膜挙動による毒性メカニズムの解明

研究の目的は、アルツハイマー病原因ペプチドのアミロイドβ(Aβ)の膜局在・膜挙動を解析し、Aβの毒性機構を探ることである。前年度に膜面上におけるAβの局在観察を行った、今年度はAβの膜ダイナミクス観察として、膜物性変化測定を報告する。細胞膜に見られるドメイン構造(ラフト)を細胞サイズリポソーム膜上に再現し、重合度の異なるAβが膜吸着した際における膜の物性変化と膜ダイナミクスを解析した。脂質には、不飽和脂質DOPC,飽和脂質DPPC,コレステロール(Chol)の3種類を用いた。混合比率をDOPC/DPPC/Chol=40/40/20の割合で調整し、DOPCからなる無秩序液体相(Ld相)、DPPC,Cholからなる秩序液体相(Lo相)と2相からなるLo/Ld相分離ベシクルを作成した。Aβは膜局在(M.Morita,et al.Soft Matter 2012)の結果を基に、モノマーおよびオリゴマーを使用した。膜局在の結果では、モノマーおよびオリゴマーはLd相へ局在することが明らかになっている。そこで、初めに、ドメイン(Lo相)のブラウン運動を追跡、ドメインの拡散係数を導出することで、モノマーおよびオリゴマーがLd相の粘性にどの程度の影響を与えたか解析した。膜の粘性は通常0.1[Ns/m^2]であるが、モノマーでは0.20.4[Ns/m^2]、オリゴマーでは041.6[Ns/m^2]まで増加させることを明らかにした。さらに、膜ダイナミクスにおいて、オリゴマーは、膜面全体の揺らぎとドメインの曲率に依存しない出芽現象という浸透圧などの刺激とは異なるAβ特有の膜ダイナミクスを誘起した。これは、AβがLd相の粘性を増加し、ドメイン界面に働く線長力を低下させることで引き起こされた現象であることを考察した。本結果は、膜物性の観点から、Aβが膜に及ぼす毒性の効果を明らかにした成果である。本成果は、現在、国際誌への投稿論文準備中である。研究の目的は、アルツハイマー病原因ペプチドのアミロイドβ(Aβ)の膜局在・膜挙動を解析して、Aβの毒性機構を探ることである。計画として、1,Aβの局在観察、2,Aβの膜ダイナミクスの2つの観点から研究を行い、それぞれ以下の結果を得られた。1、相分離膜面におけるAβの選択的局在細胞膜に見られるドメイン構造(ラフト)をベシクル膜上に再現し、重合度の異なるAβ(オリゴマー、プレ線維、線維)の膜吸着挙動を解析した。DOPC/DPPC/Chol=40/40/20,50/50/0の濃度で混合し、無秩序液体相(Ld相)、秩序液体相(Lo相)、固体秩序相(So相)と3種の相状態を制御し、Lo/Ldベシクル(40/40/20)およびSo/Ldベシクル(50/50/0)の2種類を作成した。Lo/Ldベシクルでは、オリゴマーおよびプレ線維AβはLd相にのみ吸着し、線維Aβは膜に吸着しなかった。一方、So/Ldベシクルでは、オリゴマーAβはSo相とLd相の両方に吸着、プレ線維および線維AβはSo相のみに吸着した。つまり、膜の物性がAβと膜ドメインとの相互作用に重要であることを明らかにした。2、Aβとの相互作用による膜融合ダイナミクスこれまでの研究で、明らかにされた膜ダイナミクスに伴うベシクル表面積増加の分子メカニズムを探るため、Aβとの相互作用によるベシクルの膜融合について解析した。蛍光プローブをつけた脂質で作成した小さいベシクル(SUV,直径100nm)がAβ存在時に細胞サイズベシクル(GUV)に取り込まれGUVが蛍光し、AβがGUVとSUVの膜融合を引き起こすことを見出した。またGUV同士の膜融合についても実験を行い、同様にAβがGUV同士の膜融合を誘発することを明らかにした。

そこで、初めに、ドメイン(Lo相)のブラウン運動を追跡、ドメインの拡散係数を導出することで、モノマーおよびオリゴマーがLd相の粘性にどの程度の影響を与えたか解析した。膜の粘性は通常0.1[Ns/m^2]であるが、モノマーでは0.20.4[Ns/m^2]、オリゴマーでは041.6[Ns/m^2]まで増加させることを明らかにした。さらに、膜ダイナミクスにおいて、オリゴマーは、膜面全体の揺らぎとドメインの曲率に依存しない出芽現象という浸透圧などの刺激とは異なるAβ特有の膜ダイナミクスを誘起した。これは、AβがLd相の粘性を増加し、ドメイン界面に働く線長力を低下させることで引き起こされた現象であることを考察した。本結果は、膜物性の観点から、Aβが膜に及ぼす毒性の効果を明らかにした成果である。本成果は、現在、国際誌への投稿論文準備中である。上記の実績概要にも述べたが、本研究は2つの計画から成り立っている。それぞれで研究成果を挙げており、計画1の成果は国際論文誌に掲載済みであり、計画2の成果に関しても現在投稿中である。よって、本研究は順調に進行している。これまでは、細胞に近いモデル系(相分離リポソーム)でAβの膜局在を遂行してきた。今後は、研究計画にも記載しているが、相分離リポソームを用いた膜ダイナミクス解析を行う。得られた結果から、Aβの膜毒性機構の考察を行い、本研究の目的を達成する予定である。
慢性心理ストレスは脳由来ＣＲＦを介して膀胱知覚過敏・間質性膀胱炎を引き起こす？

ストレスと関連する膀胱機能障害においてCRF関与の可能性について検討した。慢性ストレスは1)闘争敗北ストレス2)水回避ストレス3)自然発生高血圧ラット(SHR)に対するコニュニケーションボックス法によるストレスとした。1),2)では排尿回数に変化はないが2)ではCRF protein低下がみられた。3)ではCRFとCRF receptor 1のmRNA発現増加がみられ、膀胱切片はCRF存在下でcarbachol投与により収縮反応の増加を認めた。しかしCRF単独、phenylephrine収縮後のCRF投与でも変化は認めなかった。CRFの膀胱に対する影響は高血圧などの病態で出やすいと推測された。過活動膀胱や間質性膀胱炎では、心理ストレスが症状の増悪因子であり、間質性膀胱炎・慢性骨盤痛症候群ではHPA axisの活性化が認められるという。視床下部の室傍核で合成される副腎皮質刺激ホルモン放出因子(CRF)は個体レベルのストレス反応の中核となる伝達因子であるが、その受容体が膀胱にも存在することが報告されている。膀胱ではCRFR2受容体が存在し、cyclophosphamide cystitisでは発現の増加がみられるという。われわれは、CRFを組織障害性の内因性物質としてCRFと膀胱機能について解析した。慢性心理ストレス負荷方法は以下の2つの方法を用いた。1水回避ストレス:水を張ったプールの中心に水面上に少し出る高さで1匹分の面積しかない台を置き、その上にラットを2時間置く。これを5ー10日間連続させた。ラット膀胱機能の評価に関しては、ラットを代謝ケージに入れ、1回排尿量、排尿回数をモニターした。その結果、1日当たりの排尿回数は増加せず、逆に有意に減少した。また膀胱組織由来のCRFは有意に増加していた。すなわち、ストレス負荷により膀胱自身がCRFを産生したが、これと膀胱容量の増大とはどのような関係があるのかは不明である。2闘争・敗北ストレス:強固な雄ラットに攻撃される雄ラットを作成し、30分間で1週間の連続するストレスがどのように排尿機能に影響を与えるか観察した。また膀胱瘻を作成し、覚醒下で膀胱内圧測定を行った。しかし、1日当たりの排尿量は有意に減少したが、1日当たりの排尿回数に有意な変化はみられなかった。ストレスが強いと排尿障害が生じてこないとの報告もあり、今後ストレスの種類を変えて再実験する必要があると考えられる。これまでにストレスの方法として水回避ストレス、闘争敗北ストレスを採用し、SDラットに負荷して排尿状態をモニターしてきたが、いずれも排尿反射の亢進には至っていなかった。したがって、ストレス関連ペプチドであるcorticotropin-releasing factor (CRF)の膀胱に対する影響は病態によって異なることが推定された。そこで最終年度である今回は、高血圧ラットSHRを使用してコニュニケーションンボックス法によるストレスを負荷して膀胱利尿筋に対する影響をin vitroで検討した。12週齢のSHR雄性ラットをコントロール群とストレス群に分けた。ストレス群にはコミュニケーションボックス法による心理的ストレスを負荷した。コントロール群とストレス群から膀胱を採取し、膀胱のCRF及びCRF受容体のmRNAをreal-time PCRで測定した。その結果、ストレス群ではCRFとCRF receptor1の有意な発現増加が認められた。ストレス負荷していないラットの膀胱切片にCRF(2.5 μg/ml)を投与しても収縮反応を示さなかった。また、phenylephrine収縮後のCRF投与でも変化は認めなかった。しかし、carbachol収縮後にCRFを投与すると膀胱切片のさらなる収縮を認めた。さらにストレス群の膀胱切片は、CRF存在下でのcarbachol投与により収縮反応の増加を認めた。コントロール群との間に有意差を認めた。以上の結果より、CRFは膀胱アセチルコリン収縮の増強に関与する可能性がある。前回の報告では、SDラットにストレス負荷しても膀胱CRFの増加はみられなかったことより、ラットの病態によりCRFの膀胱に対する影響が異なる可能性がある。高血圧は膀胱のストレス反応が出やすい病態と推測される。医歯薬学排尿機能に影響を与えるストレスの種類にはこれまで幾つかの報告があり、われわれはそのうち報告のあった水回避ストレスを採用した。しかし排尿反射は逆に抑制され、またCRFは膀胱で増加することが確認された。また闘争・敗北ストレスも同様に排尿反射に有意な変化を起こさなかった。慢性ストレスはその強度が問題で、軽度のストレスであれば排尿反射の亢進が起こり、強いストレスでは排尿に変化が生じないという報告もあり(2014JUA, abstract PP-289)、今後さらにストレスの種類と強度を調整する必要があると思われる。

しかし、ストレスと関連して膀胱でCRF発現が増加していたのは新知見であり、このCRFがどのような影響を膀胱機能に与えるのか、興味深い。排尿機能に影響を与えるストレスの種類にはこれまで幾つかの報告があり、今後われわれはミュニケーションボックス法によるストレス負荷を考慮する。これは透明なプラスチックで区切られた9×9の区画に1匹ずつラットを配置し、交互の床に電気刺激を加える。隣接する被電気刺激ラットの跳躍、悲鳴を観察させることにより心理ストレスを負荷する。ラットは8週齢の自然発生高血圧ラットを使用する。ストレス負荷を1分間に10秒2時間加え、これを5ー10日間連続する。2膀胱内圧測定による評価:cystostomyを作成し、その5日後に膀胱内圧測定を覚醒下で行う。その際、CRFR2 antagonistのAsstressin 2B、CRFR1 antagonistのAntalaminを投与してその効果を観察する。また、膀胱組織由来のCRFの濃度を測定して、関連を解析する。実験の進捗状況としてやや遅れていると思われ、次年度により多くの実験を予定しているために繰越金を計上した。実験動物(ラット)及び試薬等の購入費にあてる。
「都市圏における環境計画の体系化-基礎班-」

1.国土地理院土地利用細密情報の利用について。同情報の高度利用を開発することが環境計画自体にとってはもとより、社会的にも重要であるので、首都圏主要部の同情報を入手し、土地利用図の表示および土地利用データの集計を行うシステムをワークステーション上で開発した。2.都市環境予測・計画支援システムの開発状況このトータルシステムは、モデリング支援システム、政策策定支援システム、及び国立公害研究所が開発した知識・情報システムからなる。地域・情報システムには、基礎データと専門家によって想定された知識データがファイルされ、予測に必要な情報が検索できる。知識データは言語で表現された因果関係のシナリオとして命題及び事象の形で蓄積され、環境問題の理解あるいは数量モデル構築の支援を行う。モデリング支援システムは数値データ及び因果関係データから数式モデルと、命題モデルの混在する知識ベース型モデルの構築を支援する。政策策定支援システムは具体的な対象都市(川崎市)に関する各種政策による環境の長期的変動のシミュレーションを行うと同時に、政策提言型研究成果のモデルとして組み込み、政策策定を支援を目指すものである。3.昭和63年11月環境科学会シンポジウムにおいてN3領域シンポジウムを『大都市湾岸域の開発と環境保全』のテーマで開催した。4.共同利用可能なデータベース等環境総合解析データベースをワークステーション上で利用できるようにするためのプログラム変換作業に着手した。用途地域指定データはフォーマットが汎用的であり、様々なプログラムから利用できる。6.N3小領域報告会ならびに学際シンポジウムの開催3月11日、12日九州大学において学際シンポジウム『都市のウォーターフロントを考える』と、基礎班を含む全班の報告会を開催する。
極低温まで磁気秩序化を示さない初めての希土類フラストレート化合物の研究

希土類金属間化合物YbAl_3C_3が低温において、スピン一重項基底状態を示すことを発見した。中性子非弾性散乱実験によって観測された、10K以下で急激に発達する低エネルギー磁気励起の詳細な構造を調べることにより、その事実を実験的に明らかにした。4f電子系としては初の事例となる、スピンダイマー化に伴うスピン一重項基底状態は、Yb原子が形成する2次元三角格子による幾何学的フラストレーションの存在や、伝動電子濃度の低さがその発現の背景にある。放射光X線回折、核磁気・核四重極共鳴、比熱、磁化、電気抵抗、超音波実験を行いYbAl_3C_3の物性を明らかにした。本計画の研究対象である希土類金属間化合物YbAl3C3は4f電子系としては初めての例となる、結晶格子の幾何学的フラストレーションを背景としたスピンダイマー形成を生じる物質である。本年度の成果を下記に記す。・放射光X線回折実験を行い、80Kの相転移において微小な構造変化を発見した。80Kの転移温度を境に、六方晶から斜方晶へ対称性が低下するものの、Yb原子の変位は0.2%程度と僅かであることが構造解析より明らかになった。この微小な構造相転移が低温でのスピンダイマー形成に一役買っている可能性が高く、Yb,A1,Cの低温相での原子位置を確定できたことは今後、考察を進める上で大きな意義を持っている。[発表論文2件目]・27A1核による核磁気共鳴(NMR)/核四重極共鳴(NQR)実験を行い、80Kの相転移に伴うA1位置での内部磁場と電場勾配の変化を調べた。NQR測定からは対称性の低下に伴う共鳴線の分裂が観測され、放射光X線回折実験より明らかになった構造相転移モデルと矛盾の無いことが分かった。NMR測定からは80K以下で共鳴線のブロードニングが観測され、その特性温度が磁揚とともに高温側に移動することが明らかになった。これは、80Kの構造相転移で4f電子状態が変化していることを強く示唆する重要な結果である。[発表論文3件目]本計画の研究対象である希土類金属間化合物YbAl_3C_3は4f電子系としては初めての例となる、結晶格子の幾何学的フラストレーションを背景としたスピン二量体化現象を生じる物質である。本年度の研究成果を下記に記す。・強磁場極低温下での中性子回折実験Yb原子が作るスピン二量体(ダイマー)の秩序パターンを明らかにすることを目的とし、磁場を加えることで、ダイマー内の反強磁性相関を反映した磁気反射が誘起される事を期待して実験を行った。残念ながら、反強磁性相関を示す磁気反射を観測することはできず、秩序パターンの決定には至らなかった。しかしながら、磁化過程と同様の傾向を持つメタ磁性的な跳びを、強磁性成分の増加として観測することができた。・構造相転移温度近傍での中性子非弾性散乱実験温度80Kで生じる微小な構造相転移の起源や、転移が4f電子系に与える影響は未だ明らかにできていない。そこで、転移温度前後での詳細な中性子非弾性散乱実験を行った。その結果、分裂した結晶場準位間の単純な遷移とこれまで考えていた磁気励起のひとつが、転移温度を下回ると急激に成長し、その強度を増すことを見出した。このため、これまで考えていた結晶場モデルを再考する必要がでてきた。この実験事実は、構造相転移の起源とその影響を明らかにし、低温でスピンダイマーを形成する舞台を形作る要因を考察する上で重要なものとなり得る。本計画の研究対象である希土類金属間化合物YbAl_3C_3は4f電子系としては初めてとなる、結晶格子の幾何学的フラストレーションを背景としたスピン二量体化現象を示す物質である。・スピン二量体化現象を示す新たな希土類金属間化合物の探索4f電子系におけるスピン二量体化現象をより深く理解するためには、YbAl_3C_3に関する研究のみならず同様の基底状態を実現する物質を開発し、その発現機構を探っていく必要がある。探索指針としてはYbAl_3C_3が持つ結晶構造の2次元性と伝動電子濃度の低さ(少数キャリアー)という特徴を併せ持たせるために、軽元素ならびにプニクトゲン、カルコゲン等の電気陰性度の高い元素を構成元素に持つ物質系を中心に合成を試みた。その結果、Yb_3F_4S_2、RNiP(R=La-Er)を初めとする物性報告がなされていない新物質を数種類作成することができた。

スピン二量体化と考えられる現象を本年度内には観測するには至らなかったが、物質開発は今後も継続していく予定である。・強磁場下での超音波による弾性定数測定スピン二量体化現象を生じさせる背景となる、80Kにおける構造相転移での電子状態の変化の有無を観測するために、強磁場下での超音波実験を行った。その結果、20T以上で磁場の増加に伴い弾性定数のソフトニングが抑制される振舞を示した。これは以前行ったNMR等の結果とも整合し、電子系が深く寄与した相転移であることを改めて浮き彫りにした。
心筋細胞内オキシダントストレスと信号応答:細胞内酸素濃度分布の実時間測定法の開発

心筋組織はその収縮-弛緩活動の維持に絶えずATPの加水分解を必要とし、そのturnoverは極めて高いことが知られている。細胞はATPの供給を専らミトコンドリアによる酸化的リン酸化に依存しているため、この代謝反応には細胞内への酸素の供給が不可欠である。従って心筋細胞においては、この細胞質内酸素濃度分布の持つ意味は大きく、直接その代謝状況や細胞内シグナリングを制御している可能性がある。しかしながら細胞内酸素分庄を直接測定した研究はこれまでない。本研究において我々は、phosphorescenceのquenchingの定量化により共焦点レーザースキャン顕微鏡下に、細胞室質内酸素濃度分布を測定するシステムの開発を試みた、現在下記の実験設定をすすめている。単離細胞に細胞内透析法によりプローブ(PB-meso-tetra (4-carboxyphenyl) phorphyrin)を導入する。細胞を共焦点レーザースキャン顕微鏡上で400nmArgoneレーザー光によりスキャンする。プローブのemmisionは>635nmのlong-passフィルターを介して検出する。各スキャンポイントにおける酸素濃度はStern-Volmer関係に対して測定したquenching半減期を代入することで決定される。得られた酸素濃度分布は、画像処理システムにより疑似カラー化し表示する。現在までの開発によりプローブの細胞内導入が細胞障害なく行えるようになった。今後共焦点レーザースキャン顕微鏡を含むシステムの最終調整を行っていく必要がある。細胞はATPの供給を専らミトコンドリアによる酸化的リン酸化に依存しているため、この代謝反応には細胞内への酵素の供給が不可欠である。従って、ATP回転の高い心筋細胞においては、この細胞質内酸素濃度分布の持つ意味は大きく、直接その代謝状況や細胞内シグナリングを制御している可能性がある。しかしながら細胞内酸素分圧を直接測定した研究は皆無である。本研究において我々は、phosphorescenceのquenchingの定量化により共焦点レーザースキャン顕微鏡下に、細胞質内酸素濃度分布を測定するシステムの開発を試みる。現在下記の実験設定をすすめている。共焦点レーザースキャン顕微鏡下における単離心筋細胞内酵素濃度分布測定システムの開発:単離心筋細胞にマイクロパイペットを用い細胞膜にギガオームシールを作製、同部よりパイペットを介して細胞内透析法により、プローブ(Pb-meso-tetra(4-carboxyphenyl)phorphyrin)を細胞内に導入する。同細胞を共焦点レーザースキャン顕微鏡上に設置し、illuminationには、Argoneレーザー光を400±5nmフィルターを通して、細胞全域をスキャンする。ブロープのemissionは>635nmのlongpassフィルターを介して検出する。各スキャンポイントにおける酸素濃度はStern-Volmer関係(to/t=1+qkx to x Ps_2; toはO_2=0における半減期、qkはプローブの反応定数で、実験温度に依存している)に対して限定されたquenchingの半減期を代入することで決定される。半減期はμsecのオーダーであり、各スポットにおいて測定に要する時間はmsec以下と考えられ、細胞全域にわたっても1秒以内でキャナンは終了する。得られた酸素濃度分布は、画像処理システムで疑似カラー化されCTR上に表示される。画像取得が可能となれば、表在灌流溶液中の酸素濃度を窒素ガス添加により低下させた際の細胞内酸素濃度変化と細胞内分布を記録し、基本的な反応性を検討する。組織や血管内における酸素分圧の測定法は確立されているにもかかわらず、細胞内における酸素濃度測定については推定の域を出ず、直接測定して証明した研究は皆無である。細胞内酸素濃度分布がどのような形で心筋代謝に関与しているのかは、虚血などの病態を解明する上で極めて興味深い。本研究において我々は、最近報告されたphosphorescenceのquenchingの定量化によって組織あるいは溶液中の酸素濃度を測定する方法を単離心筋細胞に応用し、共焦点レーザースキャン顕微鏡下に細胞質内酸素濃度分布を測定するシステムの開発を試みている。
非コードRNAとがんゲノム解読との統合的解析による新たながんゲノム像の描出

第3並びに第2世代シークエンス技術融合について検討を進め、第2世代からのshort sequence dataを用いたエラー修正について情報解析パイプラインを確立した。またAgilent sureselectを母体としたlincRNA濃縮技術の開発を行なった。計画研究A02-4並びに公募研究A01-11-25と密接な連携の下で、全ゲノム変異情報からのlincRNAを含めたnon-coding領域変異検出のための解析パイプラインを構築し、recurrentな変異を同定し、検証できた。更に同一検体における全ゲノムバイサルファイトシークエンスデータとの比較によって、lincRNA発現状態、ゲノム変異頻度、染色体構造異常部位におけるメチル化状態を詳細に比較することができた。26年度が最終年度であるため、記入しない。1. Long non-coding RNA (lncRNA)プロファイルの同定並びに全長cDNA捕捉用プローブの作成:肝臓がんを例として、発現しているlncRNAのプロファイルを明らかにするために、複数例の臨床検体について全トランスクリプトーム解読を行ない、肝がん組織で発現しているlncRNAの検出を進めた。Coding RNAに比較して、lncRNAの発現量は総じて低いため、追加のランを行い、より包括的なlncRNAプロファイル作成を進める。同時に得られたデータを基にlncRNAcDNAを捕捉するプローブの設計を行なった。2.第2並びに第3世代シークエンス技術融合を用いたlncRNAシークエンス並びにその情報解析技術開発:ストランド(センス・アンチセンス鎖)の情報を含めて、第2世代シークエンサーによる短い(200bp)RNA配列情報からlncRNAのストランド別発現量の計測を行う手法の開発を行なった。同時に、第2世代の短鎖情報を用いて第3世代シークエンスによる長鎖データのエラーを修正する手法を実装した。3.全ゲノム変異解読データとの統合解析による新たながん関連lncRNAの同定:全ゲノムあるいはlncRNA領域の濃縮によるtarget sequencingによって、肝がん400症例におけるlncRNA領域の変異データを取得した。これらのデータから、複数症例でゲノム異常を来すlncRNAの同定を進める。lncRNAのプロファイルに必要な全RNAシークエンス並びに統合解析のための全ゲノム・全エクソン解読など必要なデータの取得を終了した。また第3世代シークエンサーの情報解析のためのアルゴリズムの実装を終了し、平成26年度は取得したゲノム情報を基に、新たながん関連lncRNAの同定やがんゲノム変異頻度との関連について検討を開始できる状態である。2.第2並びに第3世代シークエンス技術融合を用いたlncRNAシークエンス並びにその情報解析技術開発:2つの異なったシークエンス技術融合による長鎖発現データの取得を試みる。3.全ゲノム変異解読データとの統合解析:全ゲノム解読データとの統合解析によって、新規がん関連lncRNAの同定や、がんゲノム変異頻度との関連等について解析を進める。
人における呼吸性洞性不整脈が肺ガス交換能に及ぼす影響の検討

心拍変動周波数分析析上で高周波成分として表され、迷走神経活動の変調により生み出される呼吸性洞性不整脈(Respiratory Sinus Arrhythmia:RSA)の生理学的な役割は長らく不明であった。今後必要性が増加する心拍変動解析の向上のため、RSAのもつ肺におけるガス交換効率促進機能を人において検討した。1994年に共同研究者の早野らが犬における心臓ペーシング、横隔膜ペーシングのRSAモデルにおいて、RSAのガス交換効率促進能を示したが、生理的な状況下、人においてはその機能は証明されていない。その理由は、迷走神経活動の変調が保たれる自発呼吸下の生物において、呼吸および循環に対する純粋な呼吸性洞性不整脈のみの影響を調べることは困難であるためである。すなわち呼吸性洞性不整脈の大きさに影響する一回換気量、呼吸数、CO2分圧は同時に変動するため、個々の影響がガス交換効率に及ぼす影響を検討することができなかった。われわれは既存の呼吸モニター(Novametrics社製NICOTR)による一回呼吸CO2曲線による解剖学的死腔、肺胞死腔を測定しながら、自発呼吸下に呼吸数、一回換気量、動脈血CO2濃度のうち一つのパラメータのみを変化させ、その変化させたパラメータ単独のガス交換効率改善の影響を調べる実験系を確立できた。健康成人ボランティア10名で調査した結果、アトロピンによる迷走神経ブロックにより呼吸性洞性不整脈の発生を抑制すると肺における酸素交換効率に加え解剖学的死腔量、肺胞死腔量によって得られる換気効率低下することが明らかにできた。人における呼吸性洞性不整脈のガス交換能効率促進機能を明らかにしたことは、今後、心電図の2情報である心拍変動解析法の向上のために貢献できるものと考える。心拍変動周波数分析析上で高周波成分として表され、迷走神経活動の変調により生み出される呼吸性洞性不整脈の役割は長らく不明であった。この呼吸性洞性不整脈(Respiratory Sinus Arrhythmia : RSA)のもつ肺におけるガス交換効率を促進する機能を人において検討した。迷走神経活動の変調が保たれる自発呼吸下の生物において、呼吸および循環に対する純粋な呼吸性洞性不整脈のみの影響を調べることは困難である。すなわち呼吸性洞性不整脈の大きさに影響する一回換気量、呼吸数、CO_2分圧は同時に変動するため、個々の影響が死腔、肺内シャントなどの呼吸パラメータに及ぼす影響を検討することは難しい。自発呼吸下に呼吸数、一回換気量、動脈血CO_2濃度のうち一つのパラメータのみを変化させ、その変化させたパラメータの影響のみを調べる実験系を確立し解剖学的死腔、肺胞死腔、CO_2排泄に寄与する肺血流量を測定するシステムを確立中である。換気量増加時でもCO_2レベルを一定に保つ呼吸回路を用いて、呼吸数、一回換気量、動脈血CO_2濃度のうち一つのみを変化させる実験系を作り、既存の呼吸モニター(Novametrics社製NICO)で得られる測定値をもとにCO_2吸入下でも解剖学的死腔、肺胞死腔を測定する方法を、呼吸モニターからアナログデジタルボードを介してパソコンに取り込んだ一回呼吸CO_2曲線を使用して開発中である。現在までに、作成した換気パラメータ(解剖学的死腔量、肺胞死腔量、CO_2産生に寄与する肺血流量)を測定するシステムを用い意識下自発呼吸下での呼吸性洞性不整脈がガス交換能に及ぼす影響を調べた。健康成人ボランティアで調べた結果、アトロピンによる迷走神経ブロックにより呼吸性洞性不整脈の発生を抑制すると肺における酸素交換効率が悪化することが判明した。二酸化炭素の交換効率は現在継続調査中である。

心拍変動周波数分析上で高周波成分として表され、迷走神経活動の変調により生み出される呼吸性洞性不整脈(Respiratory Sinus Arrhythmia : RSA)の生理学的な役割は長らく不明であった。今後ますます必要性が増加する心拍変動解析の向上のため、RSAのもつ肺におけるガス交換効率促進機能を人において検討した。1994年に共同研究者の早野らが犬における心臓ペーシング、横隔膜ペーシング下のRSAモデルにおいて、RSAのガス交換効率促進能を示したが、生理的な状況の人においてはその機能は証明されていない。その理由は、迷走神経活動の変調が保たれる自発呼吸下の生物において、呼吸および循環に対する純粋な呼吸性洞性不整脈のみの影響を調べることは困難であるためである。すなわち呼吸性洞性不整脈の大きさに影響する、一回換気量、呼吸数、CO_2分圧は同時に変動するため、個々の影響がガス交換効率に及ぼす影響を検討することができなかった。われわれは既存の呼吸モニター(Novametrics社製NICO^<TR>)による一回呼吸CO_2曲線による解剖学的死腔、肺胞死腔を測定しながら、自発呼吸下に呼吸数、一回換気量、動脈血CO_2濃度のうち一つのパラメータのみを変化させ、その変化させたパラメータ単独のガス交換効率改善の影響を調べる実験系を確立した。健康成人ボランティア10名で調査した結果、アトロピンによる迷走神経ブロックにより呼吸性洞性不整脈の発生を抑制すると、肺における酸素交換効率に加え、解剖学的死腔量、肺胞死腔量によって表した換気効率が低下することを明らかにできた。人における呼吸性洞性不整脈のガス交換能効率促進機能が明らかになったことは、今後、心電図の二次情報である心拍変動解析法の向上のために貢献するものと考える。
悪性グリオーマにおける異常EGFRの解析とその抗体を利用した免疫化学療法の開発

異常EGFRはglioblastoma40例中の14例(35%)において確認され、そのうちextracellular domainのみの異常が8例、intracellular domainのみの異常が4例、両側の異常が2例であった。また正常EGFRのoverexpressionが7例(17.5%)において確認された。一方anaplastic gliomaにおいては17例中3例(17.6%)に異常EGFRが認められ、そのうち2例はextracellular domainのみの異常、1例は両側の異常であった。low grade gliomaでは16例中1例も異常EGFRを有していなかった。生存日数に関してはEGFRの正常な所見のみを有していたglioblastomaでは440日(18例)、正常EGFRでありながらもoverexpressionを有していたものでは354日(6例)異常EGFRでは318日(11例)であった。ついでLipofectin^Rにて包埋されたEGFR mRNAに対するantisense oligonucleotideの悪性グリオーマに対する抗腫瘍効果について検討した。結果はmRNA EGFRが発現している3種類のmalignant gliomacell lineにて濃度5mMで3日目でコントロールと比較し細胞数で1/3から1/10の抑制が確認された。さらにS期、G2+M期への蓄積、DNA合性能の抑制も確認された。また異常EGFRに対するモノクローナル抗体を作成するために、合成ペプチドから作成されたポリクローナル抗体の効果を現在検討中である。73例のgliomaにおいてEGFRの発現状態を検索し、16例のlow grade gliomaにおいては一例も異常EGFRを見いだすことができなかったが、anaplastic gliomaでは17例中3例(17.6%)に異常EGFRを見いだすことができ、さらにglioblastomaにおいては40例中14例(35%)に異常EGFRをみつけることができた。一方正常構造を有しているEGFRの過剰発現に関しては、40例のglioblastoma中7例(17.5%)に見つけることができた。ついで異常EGFRの種類に関しての分析では、glioblastomaにおいて見いだされた14例の異常EGFR中8例(57.1%)は細胞外領域の全く同一の欠損所見(mRNAレベルにおいて801塩基の欠損)を認めた。一方4例(28.6%)はtyrosine kinese domainを残しての欠損のパターンを示していた。そして2例(14.3%)は両側の欠損を示していた。一方生存日数の明らかである35例のglioblastomaにおいて異常EGFRの発現と生存日数との関係について調ベた。生存日数は第一回目の手術から死亡するまでの日数までとした。まず正常EGFRのみを有していた18例のglioblastomaにおいては平均440日、異常EGFRを有していた11例では平均318日、正常EGFRでありながら過剰なmRNAの発現を示していた6例では平均354日という結果が得られた。現在この細胞外領域における異常EGFRに対してモノクローナル抗体の開発を行っている。さらにtransmenbrane domain,tyrosine kinase domainにおける新たなEGFRの異常所見(point mutation)も検索中である。ついでEGFRmRNAに対するantisense oligonucleotideの悪性グリオーマに対する抗腫瘍効果について検討した。結果はmRNA EGFRが発現している3種類のmalignant gliomacell lineにて濃度5mMで3日目でコントロールと比較して細胞数で1/3から1/10の抑制が確認された。
電圧印加によるシリコン表面の親疎水変化を利用したマイクロ/ナノアクチュエータ

シリコン/液滴(水溶液)界面のぬれ広がりは,印加電圧の大きさにによって2つに分類されることを明らかにした。ひとつは,14Vで起こる電圧に依存した有限のぬれ広がりである.この電圧範囲で一定電圧を印加した場合に,液滴は電圧に依存した広さだけ広がり,静止する.他方,4V以上では一定の電圧であっても,ぬれは広がり続ける.この4Vを境としたぬれ広がりの違いはシリコン/液滴界面で起こる陽極酸化に関連することを示した.1Vまでの電圧で界面では数分子層の陽極酸化が起き,酸化シリコン膜が形成される,このとき水滴は広がらない.14Vでは酸化膜は数十原子層程度に達するが,この厚さは電圧に依存する,このとき酸化膜がある程度の静電容量を有するために界面では電荷が蓄積される.この蓄積された電荷により界面張力の平衡状態が変化するために水滴が広がる.このようにして,14Vでは電圧に依存したぬれ広がりが起こる.4V以上では電圧が一定であっても,酸化膜がある程度厚くなった段階で膜にき裂が断続的に発生,進展する.このき裂に液体が入り込むことで,陽極酸化はシリコン内部へと,また水滴円周から外方向へと進む.この断続的なき裂進展と陽極酸化の繰返しにより,一定電圧でも水滴は広がり続ける.陽極酸化膜は,逆電位を印加してもほとんど還元されないために,逆電位により界面のぬれ性が元に戻ることはない.以上の電位に依存したぬれ方の違いとは別に,4Vまでで陽極酸化を飽和させた後に,45Vの電圧を掃引(0.01V/s以下)すると,水滴円周から多数の微小液滴が分離し,放射状に移動する現象が観察された.微小液滴の移動後,元の液滴周囲のシリコン表面は疎水性を示した.この微小液滴の分離,移動の解明とマイクロアクチュエーションへの応用が今後の課題である.純水やイオンを含む水溶液の液滴をシリコン基板表面に滴下し,液滴-シリコン基板間に電圧を印加すると,ぬれの状態に変化が生じる.本研究ではこのぬれ変化を利用したマイクロ/ナノアクチュエータの実現を目指している.とのぬれ変化の解明のために,3電極法により,直流電圧の掃引速度を変化させた実験をおこなった.また,シリコン-液滴界面100nm以内の液中電位の測定と,この液中電位に対するシリコン基板電位の制御のために,微細加工技術により先端径50nmの電位測定用プローブと,プローブ先端の位置決め装置の試作を行った.液滴に浸漬した計測部径100μmの白金参照電極の電位に対して,シリコン基板の電位を速度を変えて掃引した.水滴のぬれ変化が起こる正電位の数ボルトの範囲で,時定数の大きなキャパシタンスとしての電気特性を示した.このときの充電速度は掃引速度に比例した.掃引速度が0.01V/s程度以下では,水滴のぬれ広がりは起こらず,充電電流は連続的である.一方,水滴のぬれ広がりが観測される0.02V/s以上の掃引速度では,スパイク状の電流変化とともに,水滴の断続的なぬれ広がりが観測される.本結果から,電圧印加による水滴のぬれ広がりには,熱力学的に不連続かつ不可逆な現象としてのモデル化が適当と推論した.先端径50nmの電位測定用プローブの試作を行った.市販の石英の近接場光プローブを利用して,表面に白金を蒸着し,さらにその外側に絶縁層としてふっ化マグネシウムを蒸着した.さらに先端部をイオン収束ビーム加工により削ることで,50nmの測定部を持つプローブを製作した.また,プローブの位置決め機構として,二つの圧電素子を直列に配置した素微動機構を有する小形の位置決め装置を試作した.今後,本装置によりシリコン-液滴界面100nm以内の液中電位の測定と,この液中電位に対するシリコン基板電位の制御を行い,界面近傍の特性を明らかにする.シリコン/液滴(水溶液)界面のぬれ広がりは,印加電圧の大きさにによって2つに分類されることを明らかにした。ひとつは,14Vで起こる電圧に依存した有限のぬれ広がりである.この電圧範囲で一定電圧を印加した場合に,液滴は電圧に依存した広さだけ広がり,静止する.他方,4V以上では一定の電圧であっても,ぬれは広がり続ける.この4Vを境としたぬれ広がりの違いはシリコン/液滴界面で起こる陽極酸化に関連することを示した.1Vまでの電圧で界面では数分子層の陽極酸化が起き,酸化シリコン膜が形成される,このとき水滴は広がらない.14Vでは酸化膜は数十原子層程度に達するが,この厚さは電圧に依存する,このとき酸化膜がある程度の静電容量を有するために界面では電荷が蓄積される.この蓄積された電荷により界面張力の平衡状態が変化するために水滴が広がる.このようにして,14Vでは電圧に依存したぬれ広がりが起こる.4V以上では電圧が一定であっても,酸化膜がある程度厚くなった段階で膜にき裂が断続的に発生,進展する.このき裂に液体が入り込むことで,陽極酸化はシリコン内部へと,また水滴円周から外方向へと進む.

この断続的なき裂進展と陽極酸化の繰返しにより,一定電圧でも水滴は広がり続ける.陽極酸化膜は,逆電位を印加してもほとんど還元されないために,逆電位により界面のぬれ性が元に戻ることはない.以上の電位に依存したぬれ方の違いとは別に,4Vまでで陽極酸化を飽和させた後に,45Vの電圧を掃引(0.01V/s以下)すると,水滴円周から多数の微小液滴が分離し,放射状に移動する現象が観察された.微小液滴の移動後,元の液滴周囲のシリコン表面は疎水性を示した.この微小液滴の分離,移動の解明とマイクロアクチュエーションへの応用が今後の課題である.
遺伝子導入による破綻プラークの安定化

【目的】Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)は血管内皮細胞の増殖や透過性を亢進し、新生血管の形成を促進する増殖因子である。我々は、アデノ随伴ウイルス(AAV)を用いてVEGF遺伝子を心筋細胞に導入し、心筋細胞より産生、分泌される内因性VEGFにより血管内皮細胞の増殖促進が可能か検討した。【方法】VEGF発現AAVベクター(AAV-VEGF)を作成し、新生仔ラット心筋細胞にVEGF遺伝子導入を行った。導入遺伝子の発現はImmunoblot法及び免疫染色により確認した。培養上清中のVEGF濃度はELISAにて測定した。ヒト臍疎帯静脈内皮細胞(HUVEC)の増殖能は3H-thymidineの取り込みにより評価した。【結果】Immunoblot法により培養心筋細胞にVEGFの発現が確認され、免疫染色では約60%の細胞が陽性に染色された。培養上清中に分泌されたVEGF濃度は、ベクターの濃度依存性に増加し、最大で10ng/mlに達した。この培養上清をHUVECの培養系に添加することによりHUVECの3H-thymidineの取り込みは対照の601.5%まで増加し、さらにこの細胞増殖促進作用はVEGF中和抗体の存在下で有意に抑制された。【結論】我々は既に、細胞障害性が無く、非分列細胞にも遺伝子導入可能であり、導入遺伝子の発現が長期間持続するAAVベクターが、心筋細胞に対して効率的に遺伝子導入が可能であることを報告している。今回、AAVベクターにより遺伝子導入された培養心筋細胞より分泌されるVEGFは血管内皮細胞の増殖活性を持つことが示された。このことより、AAVベクターによる心筋へのVEGF遺伝子導入は、血管内皮細胞の再生を促し、不安定プラークの破綻を予防する可能性があると考えられた。【緒言】レトロウイルスベクターは,導入遺伝子が染色体に組み込まれ,長期の遺伝子発現が得られることが利点であるが,遺伝子導入効率が低いこと,非分裂細胞には遺伝子導入ができないなどの欠点を持つ。一方,アデノウイルスベクターは,感染効率が良く,分裂,非分裂細胞にも遺伝子導入が可能であるが,遺伝子発現が一過性であり,また,アデノウイルス自体の細胞障害性や,免疫原性などの問題点を有している。これらの欠点を補う新しいウイルスベクターとしてアデノ随伴ウイルス(Adeno-associated virus : AAV)ベクターが注目されている。今回,培養ラット大動脈平滑筋細胞(VSMC)を用い,AAVベクターによる長期の遺伝子発現について検討するとともに,摘出ラット大動脈を用いたex vivo遺伝子導入法について検討する。【方法】β-galの発現はELISA法にて定量した。摘出ラット大動脈を用いたex vivo遺伝子導入はX-gal染色法にて解析した。【結果】VSMCにおけるβ-galの発現はmoi依存的に増加した。長期発現の検討では,遺伝子導入3週間後(6継代後)においてβ-galの発現量はtransientの発現量(3日後)の約1%でプラトーになり、4週後(8継代後)においても同じ発現レベルであった。摘出ラット大動脈を用いたex vivo遺伝子導入では,X-gal染色にて血管内皮細胞を血管外膜の細胞において遺伝子導入が確認された。【考案】AAVベクターは,動物実験ではパーキンソン病や脳腫瘍の遺伝子治療に有用であることが報告されている。今回の検討より,1ヶ月以上の長期の遺伝子発現が確認され,本ベクターによる遺伝子導入法の利点の1つと考えられた。Ex vivo遺伝子導入実験は,内皮細胞および外膜の細胞への遺伝子導入が可能であり,血管系への応用が可能であることが示唆された。

【目的】内皮障害によるNO産生能の低下は,血管トーヌスの亢進や血小板の凝集などを介して動脈硬化の進展や血管攣縮に関与する。ecNOOS発現AAVベクターを作成し,内皮剥離血管に遺伝子導入を行い,血管収縮反応への影響を検討する。【方法】Bovine ecNOS発現AAVを作製した。ecNOSの発現はWestern blot法,酵素活性は[^3H-L-arginineから[^3H]-L-citrulineへの変換能により解析した。Ex vivoにて摘出ラット大動脈にecNOS遺伝子導入を行い,血管の等尺性張力を測定した。【結果】DNA dot blot法に用ウイルス力価は,2.1×10^<10>PU/10cm dishであった。ecNOSの発現はWestern blot法により135KDaのバンドとして認められた。ecNOS酵素活性の指標である[^3H]-L-citrulineの合成能は,コントロール群263.9±152.5pmol/g/minに比しecNOS遺伝子導入群では705±91pmol/g/minと有意な増加を認めた。30mMK+による血管収縮反応の検討では,内皮を剥離すると30mM K+によるラット大動脈の収縮反応は増強したが,内皮剥離血管にecNOS遺伝子を導入すると,内皮を剥離していない血管と同程度まで収縮反応は抑制された。しかし,L-NMMA存在下では,このecNOS遺伝子導入による収縮反応の抑制効果は消失した。【考案】ecNOS発現AAVベクターを作成し,ラット大動脈にex vivo遺伝子導入を行った。内皮剥離(ecNOS阻害)に伴う血管収縮性の亢進は,AAVベクターによるecNOS遺伝子導入にて正常化した。このことより,ecNOS発現AAVベクターは,動脈硬化や血管攣縮の遺伝子治療に有用であると考えられる。【目的】Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF)は血管内皮細胞の増殖や透過性を亢進し、新生血管の形成を促進する増殖因子である。我々は、アデノ随伴ウイルス(AAV)を用いてVEGF遺伝子を心筋細胞に導入し、心筋細胞より産生、分泌される内因性VEGFにより血管内皮細胞の増殖促進が可能か検討した。【方法】VEGF発現AAVベクター(AAV-VEGF)を作成し、新生仔ラット心筋細胞にVEGF遺伝子導入を行った。導入遺伝子の発現はImmunoblot法及び免疫染色により確認した。培養上清中のVEGF濃度はELISAにて測定した。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の増殖能は3H-thymidineの取り込みにより評価した。【結果】Immunoblot法により培養心筋細胞にVEGFの発現が確認され、免疫染色では約60%の細胞が陽性に染色された。培養上清中に分泌されたVEGF濃度は、ベクターの濃度依存性に増加し、最大で10ng/mlに達した。
がん抗原特異的抗腫瘍免疫の増強と免疫抑制の是正を同時に実現するがんワクチンの開発

平成30年度、開発したがんワクチン候補材料のin vivo評価実験を中心として、in vivoでの抗がん免疫活性効果が認められるがんワクチン候補材料の探索を行った。一部の試料が平成31年度に予定した抗がんメカニズム解明を行った。その結果、シリコンドープヒドロキシアパタイトナノロッドを水熱合成し、免疫アジュバントとして評価した。シリコンドーピングは、Th1およびTh2サイトカイン分泌の両方を増加させ、シリコンドープヒドロキシアパタイトナノロッドは免疫アジュバントとして有望であることを示した。又は、形態および組成が制御可能なメソポーラスシリカ-酸化亜鉛マイクロロゼットを合成した。抗がん剤およびPoly (I:C)を担持したメソポーラスシリカ-酸化亜鉛マイクロロゼットは、治療された腫瘍増殖を阻害するだけでなく、腫瘍転移を抑制できることをしめした。本年度は、平成31年度に予定した一部試料の抗がんメカニズム解明を行った。当初の計画以上に進展していると自己評価した。平成29・30年度に合成した新規のがんワクチンの抗がん免疫活性や抗がんメカニズム研究を引き続き行う。具体的には、脾細胞、リンパ球などを、抗腫瘍免疫が成立したマウスから採取し、がん抗原、マウスインターロイキン-2の共存下で培養する。その後免疫細胞とがん細胞を共培養し、新規がんワクチンのがん抗原特異的抗腫瘍免疫を評価する。新規がんワクチン投与数日後、および抗がん活性試験の終了時、脾臓、リンパ節、投与部位で抗がん免疫に関連する細胞集団のフローサイトメトリー解析を行う。細胞内サイトカイン含量をフローサイトメトリー解析によって測定すると共に、脾臓などのサイトカインと抗体含量をELISAキットによって測定する。抗がん免疫活性や抗がんメカニズムの結果は逐一新規がんワクチンの作製行程にフィードバックさせる。本研究ではがん抗原特異的抗腫瘍免疫の増強と免疫抑制の是正を同時に且つ効果的に実現する新規のがんワクチンの開発を目指す。本年度は、組成・構造・形態・サイズのナノ粒子の制御(金属イオンをドープしたメソポーラスシリカ、中空の酸化亜鉛ナノ粒子、ヒドロキシアパタイト、金属有機構造体、ナノシート材料など)に挑みました。合成した材料の物理化学特性をX線回折装置、透過型電子顕微鏡、走査型電子顕微鏡、ゼータ電位測定装置等により評価した。さらに、がん抗原等をこれらの材料に担持し、新規がんワクチンの候補物質を開発した。担持がん抗原等の徐放特性と担持量を分光光度計等により評価した。新規がんワクチンの候補物質のin vivo評価も開始した。その結果、メソポーラスシリカの抗がん免疫効果を保ったまま、金属イオンのドープにより生分解性を促進した。また、メソポーラスシリカにPoly I:Cを吸着させると、Poly I:Cの抗がん免疫効果を維持したまま、動物実験でPoly I:Cの用量を1/4まで減らせることが確認した。本年度は、組成・構造・形態・サイズ等を制御できたナノ粒子の合成が比較的速やかに行なえた。このため、H30年度予定していた一部試料のin vivo評価がH29年度開始した。平成29年度に合成した新規のがんワクチンの物性評価、細胞試験、動物試験の結果を解析する。平成30年度、開発した新規のがんワクチン候補材料のin vivo評価実験を中心として、in vivoでの抗がん免疫活性効果が認められるがんワクチン候補材料の探索を行う。具体的には、腫瘍細胞をマウスへ播種し、新規がんワクチンをマウスへ投与した後、腫瘍サイズをノギスで測定し、新規がんワクチンの腫瘍成長抑制効果を評価する。新規のがんワクチン候補材料の構造、形態、サイズ等がワクチンの免疫活性に影響を与えるパラメータと考え、以後のワクチンデザインに反映させる。また、新規がんワクチンをマウスへ投与した後、投与部位、肝臓、脾臓、肺、心臓などの組織学的変化を観察し、新規がんワクチンのin vivo安全性を評価する。早期に有望な新規のがんワクチン候補材料が得られた場合には、平成31年度に予定の抗がんメカニズム解明を開始する。細胞内

サイトカイン含量をフローサイトメトリー解析によって測定すると共に、脾臓などのサイトカインと抗体含量をELISAキットによって測定する。抗がん免疫活性や抗がんメカニズムの結果は逐一新規がんワクチンの作製行程にフィードバックさせる。当初購入を予定していた、タンパク質等の購入費が少なく済んだため。次年度使用額が理化学用品なとの消耗品を使用する予定です。当初購入を予定した、抗体の購入費が少なく済んだため。次年度使用額が試薬等の消耗品を使用する予定です。
老年期脳損傷患者の自発語における喚語困難の分析

失語症患者の多くは、話し言葉の表出における障害を持っており、日常生活におけるコミュニケーションが大きく阻害されている。本研究の目的は、失語症患者の話し言葉の障害を分析するとともに、それに対する言語治療方法を確立することにある。本年度は、意味の理解が話し言葉の障害に与える影響を明らかにするという観点から、(1)意味理解障害のメカニズムの分析、(2)単語の意味と言い誤りの関係の分析、(3)対面呼称(絵を見て名前を言う)と定義からの呼称(説明を聞いて名前を言う)の関係の分析を行った。意味理解障害については、話し言葉の意味理解に特異的な障害を持つ語聾患者を対象とし、音声で呈示された単語に関する復唱・語彙判断・理解課題などを施行したところ、単語の理解障害とともに、単語・非単語の判断の障害、非単語の復唱の障害が認められ、理解障害は、音節の同定・単語の同定・意味の同定のいずれかのレベル、または、それら交互作用によって生じえることが示唆された。言い誤りについては、健常者を対象として、複数の無意味語を復唱させる系列再生課題を行った。従来、「ひじ」を「ひざ」といい間違うように、意味的に類似する単語間で音韻要素の入れ替わりがあることが指摘されているが、無意味語の系列再生課題でも音韻要素の入れ替わりが起こることが確かめられ、単語間の意味の違いが音韻要素の入れ替わりを防いでいることが示唆された。呼称に関しては、重度失語症患者を対象とし、絵を見て名前を言える単語について、絵の説明を聞いただけで名前を言えるのか、という問題を検討した。その結果、原則として、説明の理解ができれば名前が言え、できなければ名前は言えないことが判明したが、説明が理解できてもそれが曖昧な場合には名前が言えないことがあり、意味理解の程度が話し言葉の想起に影響を与えることが示唆された。