hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ナノトライボロジー研究のためのエネルギー散逸顕微鏡の開発

本研究は、(1)高精度の水晶マイクロバランス(QCM)測定技術と、測定位置を定め、水平力を測定する接触型原子間力顕微鏡(AFM)の技術を組み合わせたエネルギー散逸顕微鏡を開発と、(2)単結晶基板上の希ガス吸着膜のQCM測定を行い,動摩擦のエネルギー散逸の滑り距離依存性と,動摩擦の基板及び吸着膜依存性の知見を得ることを目的とする.以下に主な成果を述べる.(1)引き続き,顕微鏡の動作確認として,様々な基板振幅でHOPG(高配向熱分解黒鉛)試料についてエネルギー散逸を測定した.エネルギー散逸はグラファイトの格子定数程度の基板振幅で最大となり,その振幅を境にエネルギー散逸の振る舞いの傾向が変化する.このことから、エネルギー散逸に関わる何らかの典型的な長さが存在していることが示唆される.(2)液体窒素温度にてマイカ基板上のKr吸着膜の滑り摩擦のQCM実験を行った.マイカ基板のa軸に対して平行に振動するもの(試料A),30°傾いた方向に振動するもの(試料B)を用意し,滑り方向依存性と基板振幅依存性に注目して,2つの試料に対して共振振動数の面密度依存性を調べた.測定の結果,基板振幅が0.4nmのとき,試料Aを用いた測定では,単層のKr/Micaは基板振動にほとんど追従しない.一方,試料Bを用いた測定では,よく追従する.さらに,基板振幅が4nmのときは,どちらの試料の測定でも,単層のKr/Micaは基板振動にほとんど追従しない.これらの結果より,Kr/Micaの滑り運動は,基板振幅と運動方向の次の吸着サイトまでの距離の関係に強く影響を受けることが明らかとなった.本研究は、(1)高精度の水晶マイクロバランス(QCM)測定技術と、測定位置を定め、水平力を測定する接触型原子間力顕微鏡(AFM)の技術を組み合わせたエネルギー散逸顕微鏡を開発と、(2)単結晶基板上の希ガス吸着膜のQCM測定を行い,動摩擦のエネルギー散逸の滑り距離依存性と,動摩擦の基板及び吸着膜依存性の知見を得ることを目的とする.以下に主な成果を述べる.(1)顕微鏡の動作確認として,様々な基板振幅でHOPG(高配向熱分解黒鉛)試料についてエネルギー散逸を測定した.エネルギー散逸はグラファイトの格子定数程度の基板振幅で最大となり,その振幅を境にエネルギー散逸の振る舞いの傾向が変化する.このことから、エネルギー散逸に関わる何らかの典型的な長さが存在していることが示唆される.(2)液体窒素温度にて,単結晶グラファイト基板上のKr吸着膜(Kr/Gr)、Xe吸着膜(Xe/Gr)の滑り摩擦の実験を行った,どちらの測定においても,単層膜では共振振動数はほぼ変化せず,二層膜となる付近で急激に振動数が減少することが明らかとなった.このことからKr/Gr,Xe/Grの単層膜は非常に滑りやすいと考えられる.さらに,摩擦力顕微鏡による摩擦力の滑り方向依存性の測定の際に使用するマイカ試料の作成技術の開発を行った.金銀合金をスパッタしたマイカを水晶振動子に圧着することで,高いQ値を持つ試料を作成することに成功した.本研究は、(1)高精度の水晶マイクロバランス(QCM)測定技術と、測定位置を定め、水平力を測定する接触型原子間力顕微鏡(AFM)の技術を組み合わせたエネルギー散逸顕微鏡を開発と、(2)単結晶基板上の希ガス吸着膜のQCM測定を行い,動摩擦のエネルギー散逸の滑り距離依存性と,動摩擦の基板及び吸着膜依存性の知見を得ることを目的とする.以下に主な成果を述べる.(1)引き続き,顕微鏡の動作確認として,様々な基板振幅でHOPG(高配向熱分解黒鉛)試料についてエネルギー散逸を測定した.エネルギー散逸はグラファイトの格子定数程度の基板振幅で最大となり,その振幅を境にエネルギー散逸の振る舞いの傾向が変化する.このことから、エネルギー散逸に関わる何らかの典型的な長さが存在していることが示唆される.(2)液体窒素温度にてマイカ基板上のKr吸着膜の滑り摩擦のQCM実験を行った.マイカ基板のa軸に対して平行に振動するもの(試料A),30°傾いた方向に振動するもの(試料B)を用意し,滑り方向依存性と基板振幅依存性に注目して,2つの試料に対して共振振動数の面密度依存性を調べた.測定の結果,基板振幅が0.4nmのとき,試料Aを用いた測定では,単層のKr/Micaは基板振動にほとんど追従しない.一方,試料Bを用いた測定では,よく追従する.さらに,基板振幅が4nmのときは,どちらの試料の測定でも,単層のKr/Micaは基板振動にほとんど追従しない.これらの結果より,Kr/Micaの滑り運動は,基板振幅と運動方向の次の吸着サイトまでの距離の関係に強く影響を受けることが明らかとなった.
C型肝炎患者血清における低温補体活性化機構の解明

C型肝炎患者血清における補体のCold Activation(以下CA)は、α2-プラスミンインヒビターの添加により濃度依存的に抑制されたが、完全抑制には至らなかった。トラネキサム酸にも若干のCA抑制阻害効果を認めたが、ブデリン,ウリナスタチンは無効であった。患者血清中の内在性α2-プラスミンインヒビター活性は健常者群のそれに比べ有意に低く、健常者の活性値は低温放置に伴い低下する傾向を示したが凝固第VII因子活性には有意差を認めなかった。さらに、プラスミン抗体の添加はCAを抑制する傾向を示した。患者血清を分子篩クロマトグラフィーを用い分子量分画し、各画分の健常者血清補体に対するCA惹起活性をスクリーニングしたところ、分子量10万以上の高分子画分に活性が検出された。また、限外濾過法により患者血清を分画し健常者血清に対するCA惹起活性を検索したところ、同様に高分子画分にのみ活性が認められた。そのCA惹起活性は濃度依存的であり、その活性はCA惹起後(補体消費後)の患者血清中にも残存していた。患者血清から分離されたクリオグロブリンの添加は健常者血清にCAを惹起させたが、一方、クリオグロブリン分取後上清の高分子画分にもCA惹起活性を認め、クリオグロブリン陰性のCA血清も存在した。以上の結果は、C型肝炎患者血清のCAには低温におけるプラスミン様酵素の活性化が関与している可能性を推察させるものであり、その原因の一つとしてα2-プラスミンインヒビター様の生理的阻害物質の低下も考えられる。また、その分子的本体を明確にするには至らなかったものの、C型肝炎患者血清中のいわゆるクリオグロブリンのみでは説明できない固有の高分子量物質が、CAの原因物質の1つとなっていることが示唆された。著明なCold Activation(以下CA)をきたすC型肝炎患者血清を用い検討したところ、α_2-プラスミンインヒビターはCAを濃度依存的に抑制することが明らかとなった。患者血清と健常者血清のα_2-プラスミンインヒビターならびに凝固第VII因子活性には低温インキュべ-ト前後ともに有意差を認めなかった。プラスミン抗体はCAを弱く抑制したが、非免疫性抗体でも同様の結果であった。患者血清を分子量分画したところ分子量10万以上の高分子画分に健常者血清血清にCAを惹起する因子が含まれており、そのCA惹起活性は濃度依存的であることが明らかとなった。また、その活性はCA惹起後も残存していることがわかった。以上の結果は、C型肝炎患者血清のCAには低温に於けるプラスミンの活性化が関与している可能性を推察させるものであり、またC型肝炎患者血清中の固有の高分子量物質がCAの原因物質であることを示している。今後、本物質とクリオグロブリンとの異同ならびにその詳細な分子的解析を行う予定である。C型肝炎患者血清における補体のCold Activation (以下CA)は、α_2-プラスミンインヒビターの添加により濃度依存的に抑制されたが、完全抑制には至らなかった。患者血清中の内在性α_2-プラスミンインヒビター活性は健常者群のそれに比べ有意に低く、健常者の活性値は低温放置に伴い低下する傾向を示したが凝固第VII因子活性には有意差を認めなかった。

患者血清を分子篩クロマトグラフィーを用い分子量分画し、各画分の健常者血清補体に対するCA惹起活性をスクリーニングしたところ、分子量10万以上の高分子画分に活性が検出された。また、限外濾過法により患者血清を分画し健常者血清に対するCA惹起活性を検索したところ、同様に高分子画分にのみ活性が認められた。そのCA惹起活性は濃度依存的であり、その活性はCA惹起後(補体消費後)の患者血清中にも残存していた。患者血清から分離されたクリオグロプリンの添加は健常者血清にCAを惹起させたが、一方、クリオグロプリン分取後上清の高分子画分にもCA惹起活性を認め、クリオグロプリン陰性のCA血清も存在した。以上の結果は、C型肝炎患者血清のCAには低温におけるプラスミン様酵素の活性化が関与している可能性を推察させるものであり、その原因の一つとしてα_2-プラスミンインヒビター様の生理的阻害物質の低下も考えられる。また、その分子的本体を明確にするには至らなかったものの、C型肝炎患者血清中のいわゆるクリオグロプリンのみでは説明できない固有の高分子量物質が、CAの原因物質の1つとなっていることが示唆された。
印象派物理学の精神に基づいた融合マテリアルの研究の展開

本研究の目的は、H23-24年度の「融合マテリアル」領域での研究交流をベースに、印象派物理学の精神に基づいて天然融合型マテリアルの強靭性について理解するために、これまでの研究をさらに発展させることである。具体的には、自然界に見られる驚くべき硬柔融合構造・階層構造・非線形性が、どのように強靭性に役立っているかを印象派物理学の視点から、実験、シミュレーション、理論を駆使して明らかにする。同様の視点で、本領域関連の他のグループから特色のある表面の提供を受けて濡れに関する研究も進め、スケーリング法則を確立し、領域内共同研究を展開する。本年度は、現在までの関連研究を総括する天然複合材料の強靭性に関するレビュー2報を発表した。このなかで、真珠層、ロブスター外骨格、クモの巣などの天然の複合材料の強靭性をシンプルなモデルで取り扱うことでシンプルで明確な物理的描像が得られ、これらの結果は、これから新しい融合マテリアルをデザインする際の指導原理となり得ることを専門性の異なる2つのレビュー論文として示した。さらに、領域内共同研究として行っている濡れの研究については、既に昨年度特許出願を行っているが、本年度は研究の仕上げを行い、投稿論文誌のレフェリーからの建設的指摘に従った改訂第2版がアクセプトされた。この他、ボイド構造を持つ物質の強靭性について、シンプルなネットワークを用いたシミュレーションから新しいスケーリング法則を明らかにした研究についても論文を投稿した。また、真珠層のネットワークモデルにおいて非線形性の重要性を明らかにする成果も得た。さらに、塑性の極めて強い高分子性固体のシートを使って系統的に破壊力学的な実験を行い今後の発展につながる興味深い結果も得ている。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、H23-24年度の「融合マテリアル」領域での研究交流をベースに、ロブスター外骨格、真珠層、クモの巣などの天然融合型マテリアルの強靭性について理解するために、これまでの研究をさらに発展させることである。また、さらに新しい領域内共同研究の発掘も目指す。本年度は、以下の1.ー3.の研究成果をインパクトのある国際学術誌に発表するに至った。なお、1.はスケーリング理論、2.はシミュレーション、3.は、実験と理論の研究である。これらの他にも、領域内共同研究として行っている濡れの研究にも特段の進展があり、所属大学主導で特許出願が決まった。1.ロブスターの外骨格の強靭性について:本代表者らが示してきている真珠層のスケーリング理論を応用し、ロブスターの外骨格の強靭性を構築した。導出したシンプルな法則から、ロブスターの外骨格が、力学的に見ても非常に合理的な構造であることが明らかになった。2.ボイド構造を持つ物質の強靭性について:本代表者らは、ボイド構造を持った物質が強靭であることを示してきているが、今回、誌シンプルなネットワークを用いたシミュレーションを行い、新しいスケーリング法則を明らかにすることで、この事実をさらに検証した。3.高分子性フォーム固体の強靭性について:非常に柔らかい緩衝材として使われる、高分子性フォーム固体のシートを使って系統的に破壊力学的な実験を行い、理論を構築して、シンプルで本質的な理解を示した。インパクトのある国際学術誌に3報の論文を発表できた。

特に、フォームの論文が掲載されたACS Macro Lett.誌は、Macromolecules誌のレター版として最近刊行された学術誌であり、まだ、インパクトファクター(IF)は出ていないが、恐らく、Macromolecules誌のIF5.521を上回ると予想される。しかも、この論文は2名のレフェリーから絶賛され、直ちに論文の掲載が決まった。この他にも、特許出願が決定するなど特段の進展があった。極めて順調に計画が進んでいるので、これを継続し、成果として発表することを目指す。
細胞リソグラフィーによる異種細胞配列体の形成と電気化学的機能評価

細胞サイズの微小孔を有するマイクロ電極を作製し,誘電泳動を利用して個々の細胞を捕捉,輸送および排出することにより,目的位置に再配置した.この手法を複数細胞に繰り返して適用することにより,自由度の高い細胞配列が可能となった.また,マイクロ電極を多孔質薄膜上で走査させることにより,薄膜表面に電極の走査軌跡に沿った細胞パターンを作製することができた.細胞をアルファベットの形状に配列できることを示し,本手法の自由度の高さを明確にした.また,薄膜表面に異なる種類の細胞パターンを作製することができた.ニードル型のマイクロ電極を細胞や微粒子の捕捉用プローブとして用い,正の誘電泳動をベースとしたフレキシブルなパターン作製技術の構築を行った.ITO電極上に30ミクロン厚のスペーサを介してポーラスアルミナ膜を配置しマイクロ流路構造を作製した.この流路内に細胞懸濁液を導入し,アルミナ膜上に,xyz方向に自由に稼働できるポジショナーに搭載したマイクロ電極を配置した.マイクロ電極ーITO電極間に正の誘電泳動の作用する交流電圧を印加すると流路内の微粒子や細胞をアルミナ膜の下側表面に誘導できた.この際,マイクロ電極をxy方向に走査すると,アルミナ膜表面に微粒子や細胞のパターン作製できた.パターン作製のための印加電圧,周波数,マイクロ電極走査速度およびz方向電極位置のパラメータに対する形成パターン精度および形成速度の関連を調査した.現在,2種類目の微粒子または細胞パターンの形成を行っている.2種類目の細胞をマイクロ流路内に導入する際の溶液流れによって第1パターンの崩壊がないように調整中である.また,ITO電極基板に10,000個のマイクロウェルアレイ構造を作製し,正の誘電泳動を用いると1秒以内に細胞アレイを作製できた.交流電圧の印加により細胞は電場強度の強いマイクロウェル内へと導入され,このマイクロウェルは,2個の細胞が縦方向に配列可能なサイズであるため,第1パターン形成後に洗浄工程を行っても,ほぼすべての捕捉細胞がウェル内に留まった.細胞の捕捉率は約90%と極めて高く,迅速で高効率な細胞アレイの構築を可能とした.現在,2種類目の細胞のパターニングを行っている.基板上に配列化したC2C12筋芽細胞を筋管細胞へと分化誘導し,ライン状に配列した筋管細胞を得た.さらに,電気化学顕微鏡を用いて単一細胞レベルでの呼吸に伴う酸素消費をイメージとして捉えることができた.誘電泳動法を利用して,各種異種細胞パターンの形成を行った.平面方向に走査可能であるニードル型のマイクロ電極を利用した正の誘電泳動によるパターン作製では,ポーラスアルミナ膜上に細胞や微粒子の配列体を作製できた.この手法は,誘電泳動のプローブであるマイクロ電極をxyz方向に自由に稼働できるポジショナーに搭載しているため,任意の細胞や微粒子パターンをポーラス膜上に形成できる.この手法を用いて,ポーラス膜上に細胞や微粒子を使って文字を書くことデモンストレーションを行った.シリコン基板上に規則性のある微細孔を有するポーラス基板を用いると個々の微細孔に微粒子や細胞を誘導し,微粒子の規則配列体を得ることができた.さらに,パターン作製後,異種類の細胞を導入することにより,異なる種類の細胞の任意配列体を得ることができた.マイクロウェル(25万個)アレイ電極を用いると,正の誘電泳動により各ウェル内に1分で異種細胞ペアを作製できた.異種細胞形成率は約70%であり,極めて迅速に15万の異種細胞ペアを形成できた.この異種細胞ペアに矩形波電気パルスを印加する電気融合法による高効率なハイブリッド細胞形成に着手した.また,ラインパターン電極を用いた異種細胞の交互配列パターニング,ステンシルを用いた細胞の海島状配列体およびライン配列体の作製を行った.基板上に配列化したC2C12筋芽細胞を筋管細胞へと分化誘導し,ライン状に配列した筋管細胞を得た.さらに,電気化学顕微鏡を用いて単一細胞レベルでの呼吸に伴う酸素消費をイメージとして捉えることができた.正の誘電泳動による細胞操作法を利用して異なる細胞のパターンを高い自由度で作製した.透明導電性基板を下面に,ポーラスアルミナ膜またはポーラスPET膜上面に用いたマイクロ流路構造を作製し,ポーラス膜状にニードル型のマイクロ電極を配置した.マイクロ電極と透明導電性基板間に交流電圧を印加すると正の誘電泳動により細胞をポーラス膜に集積化でき,マイクロ電極を走査することにより任意の形状の細胞パターンを作製できた.また,1種類目の細胞のパターン形成を行った後,異なる種類の細胞をパターニングできることを示し,異種細胞配列体をできた.骨格筋細胞であるC2C12細胞をライン配列化し,分化させることにより筋管細胞のライン配列体を得ることができ,電気化学顕微鏡を用いて筋管細胞の拍動に伴う酸素消費量の変化を経時的に捉えることができた.拍動の周波数に依存せず,1回の拍動あたりの酸素消費量がほとんど等しいことを示唆する結果を得ることができた.マイクロ電極を用いた誘電泳動ピンセットの開発を行った.ターゲットとする細胞の近傍にマイクロ電極を設置し,正の誘電泳動により個々の細胞をマイクロ電極先端に形成した微小孔内に捕捉できた.その後,電圧印加を停止しxyz方向に電極を移動させても細胞は微小孔から脱離することなく任意の位置に移動させることが可能であった.

その位置で負の誘電泳動を作用させると微小孔内に捕捉された細胞をその位置に再配置できた.この方法を繰り返すことにより,細胞の位置を高度に制御したパターンを作製することが可能であった.これら2つの細胞操作法を融合することにより,極めて高度に配列化した細胞アレイを得ることが可能となった.細胞サイズの微小孔を有するマイクロ電極を作製し,誘電泳動を利用して個々の細胞を捕捉,輸送および排出することにより,目的位置に再配置した.この手法を複数細胞に繰り返して適用することにより,自由度の高い細胞配列が可能となった.また,マイクロ電極を多孔質薄膜上で走査させることにより,薄膜表面に電極の走査軌跡に沿った細胞パターンを作製することができた.細胞をアルファベットの形状に配列できることを示し,本手法の自由度の高さを明確にした.また,薄膜表面に異なる種類の細胞パターンを作製することができた.初年度および2年目に予定していた研究項目をすべて遂行し,予想以上の研究成果を挙げることができた.ニードル型のマイクロ電極を用いた誘電泳動では,微粒子や細胞をパターン形成基板としたアルミナ膜上へ誘導し配列体の作製が可能であった.化学結合法および細胞接着性分子を利用することにより,配列後の細胞パターンをその場に固定化しパターンを維持することができた.パターンのフレキシビリティーを示すために,細胞や微粒子でアルファベットを描いた.また,鋳型電極パターンを用いた細胞リソグラフィーを行った.固体基板上に微粒子や細胞のパターン転写を行い,その基板を取り出すことにより異なる基板上に繰り返しパターン作製できた.この手法を応用し,マイクロウェルアレイ電極を用いたマイクロウェル内への細胞の迅速導入および異種細胞ペアリングを達成した.また,筋芽細胞のラインパターニングとライン状配列化筋芽細胞の分化誘導によるライン配列筋管細胞を取得できた.この筋管細胞に電気パルスを印加すると,パターン化細胞は物理的な収縮・緩和を繰り返し拍動させることができた.ニードル型マイクロ電極を用いた電気化学法によりこの拍動する細胞の酸素消費量の減少を計測し単一筋管細胞ラインの呼吸活性を評価できることを示した.これらは,当初予定していた研究項目から派生して創生されたあらたなテーマであり,これらについて鋭意積極的に検討を進め有意義な成果を得ることができた.よって,本研究は当初予定以上に研究が遂行できていると判断している.生物電気化学初年度に提案することができた各種の迅速で簡便な細胞アレイ形成手法について,2年目にはデバイスの作製,改良を繰り返し,異種細胞パターニングの手法として具象化することができた.最終年度は,「細胞配列化」と「細胞センサ」の融合を遂行する.誘電泳動による迅速で正確な基板上への細胞パターンの形成を行い,そのアレイ化細胞の遊走および呼吸活性を指標としたアッセイ系を構築する.ポーラスアルミナ膜上にニードル型マイクロ電極を用いた誘電泳動で細胞の任意ライン配列体を作製する.このシステムの上面チャンバーに微小管合成阻害剤,光合成電子伝達阻害剤等を導入し,配列化細胞の走行性および呼吸による酸素消費量を調査する.さらに,筋芽細胞の配列と分化によるパターン化筋管細胞を取得し,単一筋管細胞の拍動に伴う酸素消費量計測を行う.ポーラスアルミナ膜上にシロキサンポリマー製のマイクロステンシルを貼付する.
加齢黄斑変性症における光による酸化ストレスとLeptinの血管新生作用

(1)光刺激による網膜色素上皮の変性ラット網膜に光刺激を与えることで感覚網膜や網膜色素上皮が変性するか検討した。Wister Kyotoラットに強度の緑色光を24時間照射し、電子顕微鏡にて網膜を観察した。網膜の他の層に著変は無かったが、視細胞外節の蓄積と網膜色素上皮細胞の変形を認めた。光毒性による酸化ストレスや視細胞外節の蓄積で生じる酸化ストレスの影響で網膜色素上皮が変性し、加齢黄斑変性が誘導されると推測した。次に酸化ストレスが循環ホルモンであるレプチンによって誘導されることを検討したかったが、生体では困難であり、培養細胞で研究した。(2)レプチンによる酸化ストレス培養網膜色素上皮細胞と血管内皮細胞にレプチンが酸化ストレスを与えるか検討した。具体的には、網膜色素上皮細胞ARPE-19および血管内皮細胞EA hy926に活性酸素マーカーであるH_2DCFDAを導入した。その後様々な濃度のレプチンに曝露し、活性酸素を測定した。その結果、EA hy926においてレプチン1000ng/mlの曝露で活性酸素が有意に増加した。ARPE-19では活性酸素の増加はみられなかった。今回の研究では高濃度のレプチンが網膜色素上皮細胞ではなく、血管内皮細胞において酸化ストレスを生じることが示された。(3)色素上皮由来因子(PEDF)によるレプチン酸化ストレスの抑制レプチンの酸化ストレスを抑えるため、PEDFが有効か検討した。レプチンの溶液にPEDFを加え血管内皮細胞EA hy926の活性酸素を測定した。100nMのPEDFを加えると活性酸素の増加はみられなかった。PEDFは血管内皮細胞においてレプチンによる酸化ストレスを減少させる事がわかった。以上の研究により、色素上皮由来因子はレプチンによる酸化ストレスを減少し加齢黄斑変性を抑制する可能性がある事が示唆された。加齢黄斑変性における脈絡膜新生血管は、網膜への光照射の酸化ストレスが誘引となることが推測される。今研究の主眼は、網膜光障害から新生血管出現の過程を解明し、新生血管の抑制を図ることである。まず、光照射が網膜色素上皮に障害をきたすことをラットで示した。具体的にはラットに200-250 foot candleの緑色光を24時間照射し、眼組織を電子顕微鏡で観察し、網膜色素上皮細胞の形態変化を確認した。光照射後初期では、酸化ストレスの原因となる視細胞外節の断片が蓄積し、変形した網膜色素上皮細胞がそれを貪食し、マクロファージが網膜色素上皮層に遊走する像がみられた。後期には網膜色素上皮細胞の変性と壊死がみられたが、上述の照射条件では網膜色素上皮細胞の形態が正常化している部もあった。次に、細胞レベルでの酸化ストレス障害を評価するために、培養網膜色素上皮細胞で実験を行った。具体的には、網膜色素上皮細胞の培地に様々な濃度の過酸化水素を加え、細胞の形態変化、細胞の生存率、そして活性酸素量を検討した。細胞の形態変化は30分間の暴露では過酸化水素1mM以上でみられた。細胞生存率は10mM以上で急激に低下した。活性酸素測定では過酸化水素濃度依存的に活性酸素の増加が認められた。我々は血管新生にレプチンレセプターが関与していると想像しているが、現在までの実験ではレプチン投与では網膜色素上皮細胞の活性酸素は増加しないようだ。また、遺伝子導入実験に備え、非ウイルスベクターを作成しウサギ眼での遺伝子導入効率を調べた。

今後は酸化ストレス培養網膜色素上皮細胞と光障害ラットにおいて、抗酸化酵素、血管内皮細胞増殖因子やレプチンレセプターの発現を測定し、抗酸化物質の投与そして抗酸化酵素発現遺伝子やレプチンレセプターのantisense geneの導入により酸化ストレスが軽減されないか研究し、報告する予定である。(1)光刺激による網膜色素上皮の変性ラット網膜に光刺激を与えることで感覚網膜や網膜色素上皮が変性するか検討した。Wister Kyotoラットに強度の緑色光を24時間照射し、電子顕微鏡にて網膜を観察した。網膜の他の層に著変は無かったが、視細胞外節の蓄積と網膜色素上皮細胞の変形を認めた。光毒性による酸化ストレスや視細胞外節の蓄積で生じる酸化ストレスの影響で網膜色素上皮が変性し、加齢黄斑変性が誘導されると推測した。次に酸化ストレスが循環ホルモンであるレプチンによって誘導されることを検討したかったが、生体では困難であり、培養細胞で研究した。(2)レプチンによる酸化ストレス培養網膜色素上皮細胞と血管内皮細胞にレプチンが酸化ストレスを与えるか検討した。具体的には、網膜色素上皮細胞ARPE-19および血管内皮細胞EA hy926に活性酸素マーカーであるH_2DCFDAを導入した。その後様々な濃度のレプチンに曝露し、活性酸素を測定した。その結果、EA hy926においてレプチン1000ng/mlの曝露で活性酸素が有意に増加した。ARPE-19では活性酸素の増加はみられなかった。今回の研究では高濃度のレプチンが網膜色素上皮細胞ではなく、血管内皮細胞において酸化ストレスを生じることが示された。(3)色素上皮由来因子(PEDF)によるレプチン酸化ストレスの抑制レプチンの酸化ストレスを抑えるため、PEDFが有効か検討した。レプチンの溶液にPEDFを加え血管内皮細胞EA hy926の活性酸素を測定した。100nMのPEDFを加えると活性酸素の増加はみられなかった。PEDFは血管内皮細胞においてレプチンによる酸化ストレスを減少させる事がわかった。以上の研究により、色素上皮由来因子はレプチンによる酸化ストレスを減少し加齢黄斑変性を抑制する可能性がある事が示唆された。
歯髄血管新生過程におけるTPO/MPLシグナル制御機構の時空的解析

血管新生過程において内皮細胞および壁細胞の分化・成熟が時間的・空間的に制御されると考えられており、血小板造血機構が血管新生に関与しているとの報告もある。これまでc-Mpl受容体蛋白発現状況に関し、数種類の抗体を用いて解析したものの結果は得られなかった。そこで最終年度に際し、Abcam社製Anti-TPOR antibodyを用いてE11.5E18.5日齢におけるc-Mpl受容体蛋白の経時的発現状況の解析を行った結果、時期特異的、部位特異的に明瞭に発現していることが確認され、既に解析済みのE11.5E18.5日齢におけるc-mpl遺伝子の発現状況に一致する結果が得られた。従ってE11.5E18.5日齢の歯胚発生過程におけるTPO/MPLシグナルの関与が確認された。血管新生過程においては、血管新生ニッチ形成も含め、各組織ごとに内皮細胞、壁細胞の分化・成熟が時間的・空間的に制御されることか予想される。そこで、歯胚領域血管新生過程における血管内皮細胞および壁細胞間相互作用の分子メカニズムを解明することは歯の再生医療実現に向け急務であると考えられる。近年、血小板造血機構が血管新生に関与しているとの報告もあり、歯胚発生過程における血管新生の分化制御機構の解明は、歯髄再生医療具現化の基盤となる重要な情報を提供するものと考えられる。本年度は、血管新生に関与することが予想されるFlk1(VEGF-R2), Tie-2遺伝子に着目し、血管新生過程における経時的遺伝子発現パターンをin situ hybridization法を用いて詳細に解析を行い、Flk1(VEGF-R2), Tie-2遺伝子が胎生12.5日から18.5日齢のマウス胎児において、時期特異的、部位特異的に明瞭に発現していることが確認された。今後歯胚領域において血管新生に関与する可能性が高い他の遺伝子に関しても経時的発現状況を詳細に検討し、血管新生因子発現に関与する一連の遺伝子の同定および各遺伝子分子間相互作用の分子メカニズムを解明することにより、血管内皮細胞、壁細胞の分化・成熟に関する時間的・空間的制御機構の解明を行ってまいりたいと考えております。歯胚発生は、口腔上皮と神経堤由来間葉組織の相互作用により開始される。生体の様々な組織においては「幹細胞」の存在が既に確認されているが、歯髄形成能を有する幹細胞の分化制御機構を解明するには至っていない。一方、血管新生過程においては、血管新生ニッチ形成も含め、各組織ごとに内皮細胞、壁細胞の分化・成熟が時間的・空間的に制御されることか予想される。従って歯胚領域血管新生過程における血管内皮細胞および壁細胞間相互作用の分子メカニズムを解明することは歯の再生医療実現に向け急務であると考えられる。近年血小板造血機構が血管新生に関与しているとの報告もあり、歯胚発生過程における血管新生の分化制御機構の解明は、歯髄再生医療具現化の基盤となる重要な情報を提供するものと考えられる。本年度は血管新生に関与することが予想される遺伝子のうち各種angiopoietin1遺伝子に着目し、血管新生過程における経時的遺伝子発現パターンをin situ hybridization法を用いて詳細に解析を行った結果、歯胚発生過程において、エナメル器、歯乳頭、歯胚周辺部間葉細胞において、時期特異的、部位特異的発現が認められた。さらに、既に解析済みであるFlk1(VEGF-R2), Tie-2遺伝子の経時的発現状況と比較検討を行い相互間の発現状況の解析も同時に行った。今後歯胚領域において血管新生に関与する可能性が高い他の遺伝子に関しても経時的発現状況を詳細に検討し、血管新生因子発現に関与する一連の遺伝子の同定および各種遺伝子相互作用の分子メカニズムを解明することにより、血管内皮細胞・壁細胞の分化・成熟に関する時間的・空間的制御機構の解明を行ってまいりたいと考えております。本年度は血管新生に関与することが予想される各種遺伝子のうちangiopoietin遺伝子を中心にin situ hybridization法を用いて胎生期における経時的遺伝子発現状況の解析を行う予定でありましたが、解析するにあたり、本実験系で正常にworkするベストのプローブの選定に予想以上の時間を要したこと、さらには上顎・下顎の歯胚を同一切片上で揃えた切片を準備することが切片の枚数的に極めて困難であったこともあり、in situ hybridization法を用いた実験遂行に必要な切片の枚数確保にかなりの時間と労力を要する結果となりました。本年度に関しましては、各種angiopoietin遺伝子のうち、angiopoietin1遺伝子に関してのみ経時的遺伝子発現状況の解析を終了したという結果となりました。従いまして、「研究の目的」の達成度に関しましては「やや遅れている」と報告させて頂きたいと存じます。血管新生過程においては、血管新生ニッチ形成も含め、各組織ごとに内皮細胞、壁細胞の分化・成熟が時間的・空間的に制御されていると考えられる。歯胚において「幹細胞」の存在は確認されているものの、歯髄幹細胞の分化制御機構の解明には至っていない。従って、歯胚領域血管新生過程における血管内皮細胞および壁細胞間相互作用の分子メカニズムを解明することは、歯髄幹細胞の分化制御機構の解明につながり、歯髄再生医療具現化の基盤となる重要な情報を提供するものと期待される。

本年度は前年度に継続し、各種angiopoietin遺伝子に着目し、歯胚発生過程における経時的遺伝子発現パターンをin situ hybridization法を用いて詳細に解析を行ない、既に解析を終えているFlk1(VEGF-R2), Tie-2遺伝子の経時的発現状況と比較検討を行い、歯胚発生過程における血管新生の分子機構に関して検討を行った。前年度の解析において、angiopoietin1遺伝子が胎生12.5日から18.5日齢のマウス胎児において、歯胚周辺部間葉細胞、歯乳頭、エナメル器において、時期特異的、部位特異的に明瞭に発現していることが確認されているが、angiopoietin2遺伝子に関しては、angiopoietin1遺伝子とは異なる発現パターンが時期特異的に認められた。今後、各種angiopoietin遺伝子の発現状況の差異の意義について検討を行い、Flk1(VEGF-R2), Tie-2遺伝子の経時的発現状況の解析結果をふまえ、各遺伝子間相互作用の分子メカニズムの解明が急務であると考えられる。本年度は血管新生に関与すると予想される遺伝子のうち、各種angiopoietin遺伝子に着目し、in situ hybridization法を用いて胎生期における経時的遺伝子発現状況の解析を行う予定でありましたが、解析にあたり、とりわけ本実験系で正常にworkするangiopoietin遺伝子のベストのプローブの選定に予想以上の時間を要したこと、さらには上顎・下顎の歯胚を同一切片上で揃えた切片を準備することが極めて困難であったため、in situ hybridizationの実験遂行に必要な切片の枚数確保にかなりの時間を要しましたこともあり、「研究の目的」の達成度に関しましては「やや遅れている」と報告させて頂きたいと存じます。本年度はまず先ず初めに、前年度歯胚の形態に納得できなかった日齢のマウス(E11.5, E17.5)におけるAngpt1およびAngpt2の各遺伝子の経時的発現状況に関し、in situ hybridization法を用いて詳細に解析を行なった。次いで、Tie2、Vegfr2、c-mpl各遺伝子に関しても、E11.5E15.5日齢のマウスにおいて前年度歯胚の形態的に満足のいく結果の得られなかった各日齢における経時的遺伝子発現状況に関しin situhybridization法を用いて詳細に解析を行なった。そして今回得られた上記解析結果に関し、既に解析済のFlk1(VEGF-R2), Tie-2遺伝子の経時的発現状況と再度比較検討を行い、歯胚発生過程における血管新生の分子機構に関する検証を行った。angiopoietin1遺伝子は、胎生11.5日から18.5日齢のマウス胎児において、エナメル器、歯乳頭、歯胚周辺部間葉細胞等において時期特異的、部位特異的に明瞭に発現していることが確認され、angiopoietin2遺伝子とは異なる発現パターンが時期特異的に認められた。また、Tie2、Vegfr2、c-mpl各遺伝子にしては、前年度までに得られていた解析結果を裏付ける結果が得られた。
超音波による骨強度診断に関する新技術の確立

(1)海綿骨内の超音波伝搬現象の解明.海綿骨の骨梁は複雑な多孔性構造であるが,骨梁はほぼ一方向に揃った配列である.この海綿骨内では音速の異なる2種類の縦波(高速波,低速波)が存在することを明らかにし,この特異波動現象を詳細に解明した.本研究における理論解析と実験的検討の結果,高速波と低速波の各々の伝搬速度と減衰値の周波数特性を解析することにより海綿骨の骨密度と微視的な骨梁構造の推定できることが明らかとなった.さらに骨粗鬆症初期の骨量と骨梁構造の変化を検出できることが明らかとなった.(2)超音波による骨強度評価の新方式の確立.海綿骨内を伝搬する2種類の縦波の存在は海綿骨に固有の特異現象であるが,この現象は海綿骨内部構造の反映である.2種類の縦波(高速波と低速波)の伝達関数を測定し,実測した伝達関数と伝搬速度を用いて海綿骨の密度と弾性定数を非侵襲的に計測する手法を開発した.骨密度と弾性定数を用いて骨強度を推定し,骨強度を数値化することが可能となった.この数値化には多数の試料および被験者によるデータの収集と分析による指標の決定が必要である.(3)広分解能,広帯域超音波変換器の開発.本研究の手法を実現するためのkey deviceは超音波変換器である.超音波変換器のインパルス応答の理論解析,設計手法,製造法,校正手法を確立した.(4)本研究の今後の展開.本研究の成果の実現化を進めるには多数の臨床データを収集し解析を行って骨強度の実用指数を決定すると同時に,骨密度と骨強度の2次元または3次元画像表示が必要である.この次の段階の研究プロジェクトは文部省科学研究費補助金「地域連携推進研究」(平成11年度平成13年度)により展開を行っている.(1)海綿骨内の超音波伝搬現象の解明.海綿骨の骨梁は複雑な多孔性構造であるが,骨梁はほぼ一方向に揃った配列である.この海綿骨内では音速の異なる2種類の縦波(高速波,低速波)が存在することを明らかにし,この特異波動現象を詳細に解明した.本研究における理論解析と実験的検討の結果,高速波と低速波の各々の伝搬速度と減衰値の周波数特性を解析することにより海綿骨の骨密度と微視的な骨梁構造の推定できることが明らかとなった.さらに骨粗鬆症初期の骨量と骨梁構造の変化を検出できることが明らかとなった.(2)超音波による骨強度評価の新方式の確立.海綿骨内を伝搬する2種類の縦波の存在は海綿骨に固有の特異現象であるが,この現象は海綿骨内部構造の反映である.2種類の縦波(高速波と低速波)の伝達関数を測定し,実測した伝達関数と伝搬速度を用いて海綿骨の密度と弾性定数を非侵襲的に計測する手法を開発した.骨密度と弾性定数を用いて骨強度を推定し,骨強度を数値化することが可能となった.この数値化には多数の試料および被験者によるデータの収集と分析による指標の決定が必要である.(3)広分解能,広帯域超音波変換器の開発.本研究の手法を実現するためのkey deviceは超音波変換器である.超音波変換器のインパルス応答の理論解析,設計手法,製造法,校正手法を確立した.(4)本研究の今後の展開.本研究の成果の実現化を進めるには多数の臨床データを収集し解析を行って骨強度の実用指数を決定すると同時に,骨密度と骨強度の2次元または3次元画像表示が必要である.この次の段階の研究プロジェクトは文部省科学研究費補助金「地域連携推進研究」(平成11年度平成13年度)により展開を行っている.本研究グループでは、すでに約4年間の研究によって、海綿骨内の超音波伝播現象を解明し、海綿骨に固有の特異な伝播現象を見出している。すなわち海綿骨内では音速の異なる2種類の縦波が存在し、各々の縦波が海綿骨の多孔性骨格構造に固有のもので、骨の密度と弾性定数の推定の可能性を見出した。平成9年度においては下記の成果を得た。(1)海綿骨内の超音波伝播現象の解明:海綿骨の間隙率の大小は骨梁構造の変化を伴っていることを明らかにし、また間隙率が小さい範囲(β<0.81)ではBiotの理論と良く一致するが、間隙率が大きくなると(β>0.81)、Wyllieの理論、Urickの理論が適用できることを見出した。更に海綿骨の骨梁整列方向と2種類の縦波の音速と減衰についても明らかにした。これらの成果の一部はすでに論文として公表した。(担当:大谷、高井)(2)超音波伝播パラメータ計測装置:臨床計測を実現するために超音波伝播パラメータの計測装置の試作を完了した。S/N比については更に検討が必要であるが、臨床計測が可能となった。(装置の設計、製作は須崎が担当、送波器、受波器の感度校正は大谷が担当)(3)臨床計測:臨床計測装置が完成の後、約1ヶ月にわたり健常者、加齢者、疾患者の計測データを収集した(約70名)。若干の被検体についてはX線CTによる骨量計測とCT画像を計測した。

収集したデータは、これまでの知見と比べ十分に納得できるものであるが、更に精密に分析を行い、骨の等価弾性定数、骨強度指数を導くデータ処理手法の検討を進めている。(担当:高井、須崎、大谷)1998年度(平成10年度)においては下記の成果を得た。(1)海綿骨肉の超音波伝搬現象の解明:(a)海綿骨の骨梁は複雑な多孔性構造であるが、骨梁がほぼ一方向に揃った配列である。低速波は骨梁配列方向に関係なく、どの伝搬方向でもほぼl400m/sで一定であるが、振幅は配列方向から角度が増すと急激に減衰する。高速波は骨梁配列方向では約2500m/sであるが配列方向から角度を増すと伝搬速度が減少し角度60°では約1900m/s、直交方向では低速波の伝搬速度に漸近した。(b)海綿骨肉の高速波の伝搬速度は海綿骨の間隙率βに依存するが、更に骨梁の微細形状の影響を受けることを明らかにした。この結果によって海綿骨の病的構造変化を推定できる可能性が得られた(担当:大谷、高井)。これらの成果は論文及び国際会議にて公表した。(2)臨床計測:(a)ヒトの橈骨の超音波伝搬特性を平成9年度に試作した臨床計測装置を用いて計測した。のべ107名の骨粗鬆症患者と健常者のデーダを取得し、同時にX線によるpQCT法(peripheral Quatitative Computed Tomography)を用いて橈骨の海綿骨密度を計測し、両計測結果の相関関係とデータ処理法の検討を行った(担当:須崎、高井、大谷)。(b)海綿骨肉の超音波伝搬現象の基礎研究で得られた成果に基づいて、ヒトの橈骨の超音波伝搬経路をモデル化し、種々の間隙率βに対する伝達関数を求めた。臨床計測で得られたデータを解析し、被験者の伝達関数と比較検討した結果、伝達関数を用いるデータ解析によって骨密度の推定が可能なことを明らかにした(担当:大谷、須崎、高井)。1999年度(平成11年度)においては下記の成果を得た。(a)海綿骨内の超音波伝達関数の骨構造依存性の解明すでに1998年度までに海綿骨内を伝搬する2種類の縦波(高速波と低速波)の伝搬速度と減衰の周波数依存性を用いて海綿骨の間隙率を推定できることを明らかにしている。その成果を更に発展させて低速波および高速波の各成分ごとに海綿骨の超音波の伝達関数と間隙率(骨密度)の関係を実測値より算出して、骨構造と伝達関数の関係を明らかにした。(大谷)X線によるpQCT法(peripheral Quantative Computed Tomography)を用いて生体橈骨の海綿骨密度の計測を行った。また橈骨部位の軟組織皮質骨、海綿骨の寸法の推定値を用いて高速波および低速波の伝達関数の推定値を計算し実測値と比較した。健常者および骨粗鬆症患者の被検者の例について伝達関数の実測値を用いて海綿骨の骨密度を推定したところpQCT法で測定した骨塩量から推定する骨密度と良く一致する結果を得た。高速波と低速波の両成分を考慮した超音波伝達関数を用いて骨密度の推定が可能であることを明らかにした。(高井、大谷)(c)超音波伝搬パラメータによる骨強度評価手法の確立および骨強度評価システムの開発超音波伝搬波形により2種類の縦波(高速波、低速波)の音速および減衰定数を求め、また2種類の縦波の伝達関数および特性インピーダンスを推定しその結果より骨密度の評価を決定できることが明らかとなった。これらの成果によって骨強度評価の新しい手法の確立および骨強度評価システムの構築の見通しを得ることができた。(高井、須崎、大谷)
酵素の低温適応戦略

南極海洋性細菌FlavobacteriumfrigidimarisKUC-1のアルコールデヒドロゲナーゼ(FlaADH, EC 1.1.1.1)は耐熱性酵素にもかかわらず,好冷性酵素の特徴である低温条件下での高い反応効率(k_<cat>/X_m)と低い活性化エネルギーをあわせ持つ。本研究では,FlaADHのX線結晶構造解析を行うとともに,得られた立体構造に基づき各種変異酵素を調製し,本酵素の特性を解明することを目的としている。まずFlaADHの変異酵素N265Vの温度依存性を解析した。アレニウスプロットから活性化エネルギーを算出したところ,親酵素では約46.8 kJ/molであるのに対し,N265Vでは30°Cを境に二相性を示し,530°Cでは64.8 kJ/mol,3060°Cでは32.5 kJ/molであった。Geobacillus stearothermophilusの耐熱性アルコールデヒドロゲナーゼにおいてもこのように活性化エネルギーの二相性が確認されており,低温条件下では活性化エネルギーが高いという特徴が報告されている。またFlaADHのN265は他のアルコールデヒドロゲナーゼとは異なり,その側鎖の向きが大きく異なり主鎖のα-ヘリックスとは相互作用していない。したがってFlaADHではN265近傍のループ構造の柔軟性が大きく異なっていると考えられる。これらの結果から,N265はFlaADHの低温活性発現に大きな影響を及ぼすことが明らかとなった。南極海洋性細菌FlavobacteriumfrigidimarisKUC-1のアルコールデヒドロゲナーゼ(FlaADH,EC 1.1.1.1)は耐熱性酵素にもかかわらず,好冷性酵素の特徴である低温条件下での高い反応効率(k_<cat>/K_m)と低い活性化エネルギーをあわせ持つ。アレニウスプロットから活性化エネルギーを算出したところ,親酵素では約46.8kJ/molであるのに対し,N265Vでは30°Cを境に二相性を示し,530°Cでは64.8kJ/mol,3060°Cでは32.5kJ/molであった。
新規クロマチンリモデリング因子が関与する細胞内機能の解析と疾患との関連の検索

本研究は、遺伝情報を担う染色体の高次構造を制御することで癌化や老化の制御を行う可能性があるクロマチンリモデリング複合体に注目して研究を遂行した。申請者が特に着目した遺伝子産物は、触媒サブユニットで、helicase domainを持つことが特徴である。まず、出芽酵母INO80の哺乳類相同遺伝子に当たるKIAA1259に着目した。まず、ヒトのKIAA1259を特異的に認識するモノクローナル抗体を作製することができた。この抗体はマウスの相同遺伝子産物にも認識する事が判明した。そこで、この抗体を用いて細胞内での発現を検証した。細胞染色の結果から、このタンパク質は、レーザー光を照射することで核内に傷害を誘導した場所に特異的に存在していた。このことから、このタンパク質がDNA傷害部位に傷害発生の早い時間から召還されて、機能することが示唆された。現在、このタンパク質の質的な変動を解析すると共に、特定のDNA修復タンパク質との相互作用について解析を行っており、示唆的な結果を得ている。次に、マウスBrm isoformについて解析を行った。このisoformの局在は既知のBrmとは異なり、核小体にも局在することが明らかとなった。そこで、rDNAの転写制御機構との関係を調べたところ、過剰発現細胞におけるrDNAの発現量が低下する事が明らかとなった。さらに、このタンパク質と相互作用するタンパク質を探索したところ、rDNAのプロモーター領域に結合するタンパク質との相互作用が明らかとなった、これらのことから、このisoformは、細胞増殖の際のrDNAの転写を調節することに関与することが示唆された。最後に、ゲノム情報や正常繊維芽細胞の老化過程で発現が変動する遺伝子の解析から、幾つかの候補遺伝子を選定した。現在、それらの遺伝子産物の細胞内局在を検討している。本研究では、高次元に折りたたまれた染色体構造を必要に応じて弛緩・凝縮させるメカニズムに関わるクロマチンリモデリング因子の同定と機能解析を目的にして研究を遂行している。まず、この因子の中で、ヘリカーゼモチーフを持つ幾つかのタンパク質に注目した。出芽酵母のYfr038wタンパク質は機能未知の新規遺伝子産物であることから、その遺伝子破壊株を作製し、野生株と比較したが、明確な表現型は得られなかった。しかし、マイクロアレイによる網羅的な遺伝子発現変動を比較した結果、遺伝子破壊株ではリジン生合成遺伝子群の発現が低下していた。アミノ酸合成関連遺伝子の転写制御へのクロマチン構造変換因子の関与については、未だに多くの点で未知なため、今後もこのタンパク質が関与する転写制御遺伝子を同定する予定である。さらに、クロマチン構造変換には複数のタンパク質が複合体を形成して機能する必要があると考えられるため、Yfr038wタンパク質との複合体形成タンパク質を同定して、このタンパク質の発現制御ネットワークを解明する予定である。次に、出芽酵母Ino80タンパク質に注目した。今回の我々の解析から、この遺伝子の欠損細胞では、新たにcamptothecinのようなDNA topoisomerase阻害剤に対しても高感受性を示すことを明らかにした。この結果は、このタンパク質がDNA複製でのクロマチン構造変換に関与する事を示唆することから、このタンパク質の機能をその方面からも詳細に解析する。さらに、この遺伝子のヒト相同遺伝子KIAA1259についても、その機能を解析している。まず、KIAA1259遺伝子を3分割して、大腸菌で発現させた。この中で、C末タンパク質についてDNA結合活性があることを初めて明らかにした。現在、この遺伝子の過剰発現細胞や発現抑制細胞での表現型を解析している。本研究では、核内における染色体構造を弛緩・凝縮させる機構に関わるクロマチンリモデリング因子の同定と機能解析を目的にして研究を遂行しており、特にヘリカーゼモチーフを持つ幾つかのタンパク質に注目している。まず、出芽酵母INO80と、このヒト相同遺伝子KIAA1259について注目した。昨年度の解析から、ino80遺伝子の欠損細胞では、いくつかのDNA傷害剤に高感受性を示すことが明らかとなった。そこで、ino80遺伝子破壊株にヒトKIAA1259が発現するプラスミドを導入して、この表現型が抑制されるかを調べたところ、現時点では、表現型の抑制が観察されなかったが、発現量を調節する等の改良を行う必要があるため、継続して解析を行う。また、KIAA1259遺伝子をヒト細胞(HEK293等)で過剰発現させたところ、細胞核が染色されたものの、核小体の位置は染色されなかった。このことは、間期の細胞内で、KIAA1259は核内の広範に存在している可能性が考えられた。KIAA1259タンパク質のアミノ酸配列中には、ヘリカーゼモチーフ以外にも、いくつかのモチーフが存在していることから、これらのモチーフの持つ機能について、調べる予定である。次に、出芽酵母YFR038w遺伝子について着目した。クロマチン構造変換には複数のタンパク質が複合体を形成して機能する必要があると考えられる。そこで、Yfr038wタンパク質との複合体形成タンパク質を同定するため、タンパク質の精製に有利なタグ配列を付加した酵母細胞を作製し、大量培養により精製を行い、SDS-PAGEによりタンパク質を分離後、CBBもしくは銀染色により可視化した。その結果、複数のバンドの存在が認められた。しかし、Yfr038wタンパク質の発現量が少ないため、TOF-MSによるタンパク質同定に至る過程で、発現量の調節等の改良を行う予定である。

本研究は、遺伝情報を担う染色体の高次構造を制御することで癌化や老化の制御を行う可能性があるクロマチンリモデリング複合体に注目して研究を遂行した。申請者が特に着目した遺伝子産物は、触媒サブユニットで、helicase domainを持つことが特徴である。まず、出芽酵母INO80の哺乳類相同遺伝子に当たるKIAA1259に着目した。まず、ヒトのKIAA1259を特異的に認識するモノクローナル抗体を作製することができた。この抗体はマウスの相同遺伝子産物にも認識する事が判明した。そこで、この抗体を用いて細胞内での発現を検証した。細胞染色の結果から、このタンパク質は、レーザー光を照射することで核内に傷害を誘導した場所に特異的に存在していた。このことから、このタンパク質がDNA傷害部位に傷害発生の早い時間から召還されて、機能することが示唆された。現在、このタンパク質の質的な変動を解析すると共に、特定のDNA修復タンパク質との相互作用について解析を行っており、示唆的な結果を得ている。次に、マウスBrm isoformについて解析を行った。このisoformの局在は既知のBrmとは異なり、核小体にも局在することが明らかとなった。そこで、rDNAの転写制御機構との関係を調べたところ、過剰発現細胞におけるrDNAの発現量が低下する事が明らかとなった。さらに、このタンパク質と相互作用するタンパク質を探索したところ、rDNAのプロモーター領域に結合するタンパク質との相互作用が明らかとなった、これらのことから、このisoformは、細胞増殖の際のrDNAの転写を調節することに関与することが示唆された。最後に、ゲノム情報や正常繊維芽細胞の老化過程で発現が変動する遺伝子の解析から、幾つかの候補遺伝子を選定した。現在、それらの遺伝子産物の細胞内局在を検討している。