hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
出芽酵母の前胞子膜形成におけるリン脂質代謝制御機構とその役割の解明

出芽酵母の前胞子膜形成をモデルに、生体膜の形態形成の分子機構に関する研究を行った。前胞子膜の適切な伸長に必要な遺伝子の遺伝学的解析から、膜のリン脂質の一つであるPI4Pの合成酵素の複合体がこの過程に関与することが示された。また、PI4Pとその合成酵素、そしてPS, PAが前胞子膜に局在することが示され、さらに、PI4P合成酵素複合体の形成阻害、PI4P合成酵素の活性を持つサブユニットの分解、そして前胞子膜上のPI4Pの減少が、前胞子膜伸長に重要であることが示唆された。これらのことは、前胞子膜の伸長においてPI4Pの調節が重要であることを示し、生体膜形態形成の分子機構の一端が明らかになった。出芽酵母前胞子膜形成過程におけるリン脂質代謝制御機構とその役割を解明するため、以下の研究を行った。1前胞子膜形成におけるリン脂質の細胞内局在変化の解析を行った。遺伝学の実験で関係が示唆されたPI4Pを中心に、各種酸性リン脂質検出用バイオマーカー(PA: Spo20-GFP, PS: lact-C2-GFP, PI4P: Osh2-PH-GFP, PI(4, 5)P2: PLC-PH-GFP)について野生株を用いて胞子形成時の細胞内局在を観察した。以前に報告のあるPA、PI4Pに加えて、PSも前胞子膜形成の初期から前胞子膜に局在することが明らかになった。PI(4, 5)P2については、前胞子膜形成の初期には前胞子膜上に観察されず、伸長後の大きな前胞子膜にのみ観察されることが示された。2リン脂質代謝系酵素のいくつかについて、前胞子膜形成時における細胞内局在の変化を、GFP融合タンパク質を用いて解析した。PI4-kinase複合体を形成するタンパク質のうちStt4pとEfr3p、PI4P 5-kinaseであるMss4pが前胞子膜上に局在することを明らかにした。また、spo73破壊株においてこれらの局在は変化しないことが示された。3前胞子膜上のリン脂質の組成を操作するため、前胞子膜伸長に欠陥のあるspo73株においてPI4-kinaseおよびPI4-phosphtaseを前胞子膜上に局在化させた。その結果、予想に反してPI4-phosphataseを発現したspo73株において胞子形成の回復が観察され、前胞子膜上のPI4Pのレベルの低下が前胞子膜の伸長と関係する可能性が示唆された。現在この可能性について検討を行っている。1前年度の研究で、以前の予想に反して、前胞子膜上のPI4Pの減少がその伸長において重要であることを示唆する結果を得ている。これについて検討するため、まず、Stt4およびEfr3がspo73の表現型を回復するのに必要なドメインを、欠失変異体を作製することにより調べた。その結果、いずれにおいてもYpp1との相互作用に必要な領域が重要であることが明らかになり、PI4-kinase複合体の形成を阻害することによりspo73の表現型を抑圧している可能性が考えられた。2さらなる確証を得るため、Auxin-inducible Degronのシステムを用いて、PI4-kinaseのcatalytic subunitであるStt4を胞子形成時特異的に分解する系を構築した。野生株では胞子形成に大きな影響は見られなかったのに対し、spo73変異株においては、胞子形成が部分的に回復することが明らかになった。Stt4が前胞子膜上に局在することを考えると、この結果は、胞子膜上のPI4P合成量の減少がspo73変異株で前胞子膜が伸長できない表現型を回復することを示している。3物理的に相互作用するタンパク質の探索のため、Spo73, Spo71その他関連因子にタグを付加して、胞子形成時に発現させる系を構築した。Pull-down-MSによる相互作用タンパク質の同定を試みている。1昨年度までに得られた結果より、PI4Pのレベルを下げることにより、前胞子が伸長するという、今まで考えられていたのとは逆の、新たなモデルをたてている。しかしながら、一般に使われているPI4Pマーカーでは、前胞子膜上でのPI4Pレベルの変化を検出することができていなかった。そこで、既存の2種類のPI4Pマーカーをタンデムに結合させることにより、新しいPI4Pマーカーを作製し、これを用いて前胞子膜上のPI4Pレベルの変化を可視化することに成功し、モデルをさらに支持する結果を得た。2前胞子膜上のPI4Pの量の変化に局在が影響を受ける因子の候補としてSNAREタンパク質やエンドソーム系タンパク質が考えられたので、各種マーカーについて、SPO73遺伝子の破壊の局在への影響を調べた。SNARE系の因子の中に、SPO73遺伝子の破壊により、前胞子膜に強く局在化するなる因子が見出された。このことから、輸送小胞の融合に関与する因子のリサイクリングが、Spo73に依存しており、その回復のために前胞子膜上のPI4Pレベルの低下が必要なのではないかと推測された。3 PP1の関与する膜伸長の系とSpo73およびPI4Pの関与する膜伸長の系の関係を明らかにするため、遺伝学関係を調べた。

その結果、この2つの経路は独立に前胞子膜伸長に寄与していることが明らかになった。出芽酵母の前胞子膜形成をモデルに、生体膜の形態形成の分子機構に関する研究を行った。前胞子膜の適切な伸長に必要な遺伝子の遺伝学的解析から、膜のリン脂質の一つであるPI4Pの合成酵素の複合体がこの過程に関与することが示された。また、PI4Pとその合成酵素、そしてPS, PAが前胞子膜に局在することが示され、さらに、PI4P合成酵素複合体の形成阻害、PI4P合成酵素の活性を持つサブユニットの分解、そして前胞子膜上のPI4Pの減少が、前胞子膜伸長に重要であることが示唆された。これらのことは、前胞子膜の伸長においてPI4Pの調節が重要であることを示し、生体膜形態形成の分子機構の一端が明らかになった。おおむね研究は順調に進んでいるが、昨年の予想に反する結果を検証することを優先して行っている。そのため、相互作用タンパク質の探索がまだ途中となっており、早くその結果を得たいと考えている。応用微生物学昨年得られた結果より、PI4Pのレベルを下げることにより、前胞子が伸長するという、新たなモデルをたてている。このモデルでは、Spo73がSpo71とともに、前胞子膜上のPI4Pのレベルを下げ、それによって前胞子膜が伸長可能となるというものである。Spo73がどのようにしてPI4Pのレベルに影響を与えるのか、また前胞子膜上のPI4Pの量が変化したときに局在が影響を受けるタンパク質の探索、そしてSpo71, Spo73との相互作用タンパク質の同定と解析を通して、新たなモデルを検証して行きたい。これらを通して、リン脂質の関与する普遍的な生体膜形態形成機構にせまりたい。おおむね計画通りに研究は進んでいるが、一部最初にたてたモデルと合わない、興味深い結果も得ている。これを、解析することにより、新たな展開が期待される。今回得られた結果の一部は、前胞子膜上のPI4Pのレベルの低下が前胞子膜の伸長を促進することを示唆しており、最初の予想とまったく逆であった。まず、今回の結果について、様々な確認を行う必要がある。前胞子膜上のリン脂質の組成を操作する実験系が実際に機能しているのかを、バイオマーカー等を用いて確認することや、PI4-kinaseをデグロンを用いて特異的に分解する等、前胞子膜上のPI4P量を操作する別の方法を用いることが考えられる。以前の結果と今回の結果から、PI4Pと前胞子膜伸長が関係することは確実なので、必要に応じて、前胞子膜伸長とリン脂質の関係についてのモデルを修正し検証していく必要がある。また、タンパク質の相互作用の実験や脂質との結合の詳細な検討についても行って行きたい。これらを通じて、出芽酵母前胞子膜形成過程におけるリン脂質代謝制御機構とその役割を明らかにしていきたい。そのため、これについて検討する実験を優先的に行う必要が生じたため、相互作用タンパク質の解析を、次年度にまわすこととした。そのため、次年度使用額が生じた。基本的には、最初の計画通り使用するが、次年度使用額分については、相互作用タンパク質の解析に使うことを予定している。
DSA+V2Vのためのネットワーク/クロスレイヤ協調型トランスポートプロトコル

各周波数のライセンスユーザ(PU)が時間的・空間的に未使用の周波数を通信に利用するコグニティブ無線(CogMANET)では,PUを検知した際に通信チャネルを切り替える必要があり,チャネルの帯域幅及び到達距離が変化する事が予想される.この場合,周波数資源の有効利用を実現するためにTCPが切替に伴い輻輳ウィンドウサイズ(cwnd)を適切に更新する必要がある.そこで,本研究ではボトルネックノードの位置を考慮したcwndの更新を行う新たな輻輳制御手法を提案し,シミュレーション評価を通じて,有効性を示した.本研究ではマルチホップ車車間(V2V)通信をコグニティブ無線ネットワークで提供する状況に着目し,頻発する利用可能なデータレート,及びパケットエラー率の変化を検知するために「エンドノード/NW内部ノード間の柔軟な連携」と「上位/下位レイヤ間連携(クロスレイヤ制御)」の双方を用いる新しいトランスポートプロトコルの提案を目指す.本年度はまず、昨年度調査した有線/無線を対象とする既存トランスポートプロトコル,特にコグニティブ無線アドホックネットワークを対象としたTCP-CRAHNの評価結果を基に、問題点を解決可能な新しいトランスポートプロトコルであるTCP CoBAを提案した。コグニティブ無線ネットワークにおけるチャネル切替によってエンドツーエンド間のボトルネック帯域やRTTが変化するため、エンドノード間の転送量を適切に変更する必要がある。TCP CoBAは昨年度提案したPLC環境を対象とした中継端末からのフィードバックを用いるトランスポートプロトコルを基にした手法であり,チャネル切替後の転送量決定においてTCP送信ノードは帯域遅延積だけでなく,切替ノードのバッファ残量も考慮する.この手法では,チャネル切替ノードの下位レイヤの情報を基に,TCP送信ノードの上位レイヤであるトランスポート層が送信量を制御するため,「上位/下位レイヤ間連携」,及び「エンドノード/NW内部ノード間の柔軟な連携」を実現している.その後,マルチフローが混在するネットワークにおいて効率的な通信を提供できる事をシミュレーション実験によって明らかにした.加えて,上述のチャネル切替時の適切な転送量の決定手法を無線LAN間のハンドオーバ時に適用するための検討も進めており,マルチレート環境の無線LANのハンドオーバ決定アルゴリズムの提案を行い,その有効性をシミュレーション実験によって明らかにした.各周波数のライセンスユーザ(PU)が時間的・空間的に未使用の周波数を通信に利用するコグニティブ無線(CogMANET)では,PUを検知した際に通信チャネルを切り替える必要があり,チャネルの帯域幅及び到達距離が変化する事が予想される.この場合,周波数資源の有効利用を実現するためにTCPが切替に伴い輻輳ウィンドウサイズ(cwnd)を適切に更新する必要がある.そこで,本研究ではボトルネックノードの位置を考慮したcwndの更新を行う新たな輻輳制御手法を提案し,シミュレーション評価を通じて,有効性を示した.本研究では,マルチホップ車車間(V2V)通信をコグニティブ無線ネットワークで提供する環境に着目し,頻発する利用可能なデータレート,及びパケットエラー率の変化を検知するために「エンドノードとNW内部ノード間の柔軟な連携」と「上位/下位レイヤ間連携(クロスレイヤ制御)」の双方を用いる新しいトランスポートプロトコルの提案を目指す.本年度はまず、有線/無線さらにはアドホック無線ネットワーク環境を対象とする既存のトランスポートプロトコルについて詳細に調査し,有線環境のSACK,無線環境のTCP-Westwoodに加え、コグニティブ無線アドホックネットワーク環境を対象とするTP-CRAHNに着目した.その上で,本研究で対象とするV2V通信にDSA技術を適用した際の通信性能についてシミュレーション実験を通じて評価した.その結果,データレート及びパケットエラー率の変化が各手法の通信性能に与える影響について明らかにした。加えてマルチホップ通信において頻発する上記の影響を軽減する手法として,TCP Proxyを用いた「コネクション分割手法」に着目し,GNU Radio/USRP2を用いた実機環境にTCP Proxyを導入した上で,実環境での通信性能を評価した.その結果,想定するDSA+V2V環境におけるコネクション分割の有効性,及び解決すべき課題について明らかにできた.最後に,ネットワーク/クロスレイヤ協調型手法の基礎検討として,比較的実装が容易なフィードバック(内部ノードから送信ノードへの通知)手法を検討し,先行して研究を進めていたPLC環境を対象とする新トランスポートプロトコルの提案を行った.提案手法では, NW内部の状態に応じて適切な送信量を送信側に明示的に通知するexplicit手法を用いており,その有効性をシミュレーション実験によって明らかにできた.平成23年度に予定していた項目全てにおいて,当初の予定通り研究が進捗している.具体的には,まず既存トランスポートプロトコルの想定環境(コグニティブ無線技術をV2V通信に適用する)における通信性能についてシミュレーション実験を通じて評価できた.加えて,「エンドノードとNW内部ノード間の柔軟な連携」と「上位/下位レイヤ間連携(クロスレイヤ制御)」の双方を実現可能な手法としてexplicit手法によるフィードバック制御に着目した上で,シミュレーション実験を通じてその有効性を評価できた.加えて,「利用可能なデータレート,及びパケットエラー率」の頻繁な変化の影響を最小限に抑える手法としてTCP Proxyを用いたコネクション分割手法に着目し,その有効性をGNU Radio/USRPを用いた実機環境において評価できた.以上に示す通り,当初の予定通り研究が進捗していると考える.平成24年度はエンド/NW内部ノード間連携,及びクロスレイヤ制御を実現する手法として,平成23年度に提案したフィードバック手法に加えて,NW内部ノード自身がデータ転送をサポートするコネクション分割手法の概念に近い「アクティブ協調」手法も視野に入れる.

その上でこれら各手法の有効性についてシミュレーション実験により詳細に評価する事で,各手法が適用可能なケースについて検討する.加えて,有効性が確認できた手法をGNU Radio/USRPを用いた実機に実装し,実環境で実験を行う事で,手法の実用性について検証する.昨年度予定していた研究会への参加が困難な状況となったため,少額ではあるものの研究費に余剰が発生した.そこで次年度においては,23年度に行った研究成果をより積極的に国内研究会,及び国際会議において発表するために必要な旅費及び参加費を計上している.加えて,提案手法の実環境での有効性について実証実験を通じて検証するために,GNU Radio/USRPを1セット追加購入するための費用を計上している.また,海外への研究成果の効率的なアピールを目的として,質の高い国際会議/論文誌への採録のために英文添削費を計上している.最後に,研究をスムーズに進捗させるためにシミュレーション,及び実機を用いた実証実験のための補助要員として研究支援者を2名(各1名)雇用するための予算を計上している.
フッ素糖代謝物を標的としたがんのMRI診断

本研究はNMR試薬であるフッ素標織糖の体内動態を使った新規ながんの質的診断法開発を目的とした。ここで用いる2-デオキシ-2-フルオロ-D-グルコース(FDG)はポジトロンCT用に開発され、現在は脳機能の他に心筋とがん診断の標準的方法である。我々はFDGの代謝物の織別に優れたMRSを用い、がんでのNDP-FDM体の長時間保持を発見した。平成8年度はこのNDP-FDM体を用いてがんの画像描出を試み成功した。本年度は画像の高速化および実験腫瘍の多様化を行い本研究目的の達成を図った。本年度はまず小動物中での微量物質画像の高精度撮像に必須な測定シークエンスの改良を行ったが、これにより測定時間短縮を達成し、F画像検出限界を向上させた。本年度購入備品であるウエーブフォームジェネレータは第2RFチャネル用である。実験腫瘍移植マウスおよび自然発症がんマウスを作成の上でFDGを投与し、NMR代謝物画像によるがん診断を行った。FDG集積及びFDM誘導体へのエピマ-化をがんの指標とした場合、1cm程度のがんの検出には例外なく成功した。一方で、筋肉での高濃度保持が認められた。これはFDG-PET法でも問題とされる点であり、更なる検討が必要と結論した。筋取り込みの問題はフッ素置換ガラクトース(FDGal)を用いて解決できる可能性が大きく、将来の重要なプロジェクトと考える。なお、以上の成果は1997年4月のISMRMおよび9月の日本磁気共鳴医学会等で口頭発表した。本課題は動物実験に向けた新たな無侵襲がん診断用造影剤の開発研究である。2-デオキシ-2-フルオロ-D-グルコース(FDG)はポジトロンCT用に開発された化合物であり、脳機能、心筋の診断と並びがん診断法としても標準的方法として検討されている。我々はFDGの代謝物は安定な^<19>F核を用いたNMRでのみ容易に追跡できることを示したが、その1つであるマンノース体(FDM)ががんに長時間保持されることを見いだした。ここでは悪性腫瘍の指標となる物質NDP-FDMを^<19>F NMR画像として描出するという新法を提案している。本年度は投与物質であるFDGと代謝生成物であるFDMとを化学シフト画像により識別画像化することおよび物質の正確な時間変化追跡のために2化合物の同時画像化の技術確立を行った。FDGとFDMはNMRスペクトル上で5ppm(本実験のNMR装置9.4Tでは2kHz)離れて位置するが、識別画像化には化学シフト選択を適切に行う必要がある。まず、ウェーブフオームジェネレータを設置することにより任意の形のラジオ波を発生させ、近接した信号の選択励起ならびに選択照射を可能とした。さらにソフトウエアの改善によって時間的なロスなく2信号を同時測定することに成功した。これらを実験腫瘍マウスに適用し診断を行った結果、FDG投与2日目のFDM画像が最も選択性高く腫瘍を描出することが示された。この成果の一部はNMR in Biomedicineに投稿印刷中である。現在、代謝物の同定および低出力プロトン照射と麻酔深度の条件を探索中である。本研究はNMR試薬であるフッ素標識糖の体内動態を使った新規ながんの質的診断法開発を目的とした。我々はFDGの代謝物の識別に優れたMRSを用い、がんでのNDP-FDM体の長時間保持を発見した。

本年度はまず小動物中での微量物質画像の高精度撮像に必須な測定シークエンスの改良を行ったが、これにより測定時間短縮を達成し、F画像検出限界を向上させた。本年度購入傭品であるウエーブフォームジェネレータは第2RFチャネル用である。実験腫瘍移植マウスおよび自然発症がんマウスを作成の上でFDGを投与し、NMR代謝物画像によるがん診断を行った。FDG集積及びFDM誘導体へのエピマ-化をがんの指標とした場合、1cm程度のがんの検出には例外なく成功した。一方で、筋肉での高濃度保持が認められた。これはFDG-PET法でも問題とされる点であり、更なる検討が必要と結論した。筋取込みの問題はフッ素置換ガラクトース(FDGal)を用いて解決できる可能性が大きく、将来の重要なプロジェクトと考える。なお、以上の成果は1997年4月のISMRMおよび9月の日本磁気共鳴医学会等で口頭発表した。
芳香族ニトロ化合物を用いた縮環型ヘテロ環化合物の合成とその物性

芳香族ニトロ化合物にDBUの存在下で、イソニトリルを反応させると縮環型ピロールが生じることを報告しているが、ヘテロ環化合物に同様の方法を適用したところ、予想に反してピロールではなくピリミジン-N-オキシドが生じる場合があることがわかった。例えば、4-ニトロベンゾチアジアゾールを基質として用いたところ、対応するピロールが生成したが、5-ニトロベンゾチアジアゾールを用いた場合には対応する縮環型ピリミジン-N-オキシドが生じた。このようにニトロ基の位置の違いだけで生成物が異なる生成物が得られる反応はきわめて珍しいものである。この反応の反応機構に関してはニトロ化合物にイソニトリルのアニオンがマイケル付加してできる中間体がニトロ基のアンビデント性により2つの共鳴構造をとることに起因していることを明らかにした。すなわち、炭素原子上のアニオンがイソニトリル部分と反応すればピロールとなり、酸素原子上のアニオンが反応すればピリミジン-N-オキシドとなる。従ってニトロ基が立体的な要請から芳香環と共平面上に位置することができない基質の場合にはこの共鳴が不可能であり、アニオンは炭素原子上に局在化しているためにピロールが生じると考えられる。このほか、ニトロベンゾチアジアゾールのセレン誘導体であるニトロベンゾセレナジアゾールや、5-ニトロキノリン及び6-ニトロキノキサリン等の反応では対応するピリミジン-N-オキシドが得られた。
MHCクラスIテトラマーを用いた同種移植における拒絶反応の解析

近年、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を特異的に認識するMHCクラスIテトラマー(四量体MHCクラスI/ペプチド複合体)の有用性が明らかになりつつある。本研究では、MHCクラスIテトラマーを作製し、移植拒絶反応におけるCTLのアロ認識反応を解析しようとするもであり、平成13年度には以下の成果が得られた。1.当初、ペプチドを含まないMHCクラスIテトラマーの作製を試みたが、MHCクラスI分子とβ2ミクログロブリンのみではrefoldしないことが判明した。このことは、今まで報告されていたように、生体内では、MHCクラスI上に常にペプチドを含有していることを示唆する。したがって、アロ認識における拒絶反応にテトラマーを使用することが困難となった。2.すでに腫瘍特異的ペプチドが同定されているマウス白血病細胞RL♂1に対するCTLを認識するMHCクラスIテトラマーを作製した。MHCクラスIテトラマーは、クローン化したCTLとin vivoにおけるCTLを認識することが明らかとなった。更に、この腫瘍細胞を系統の異なるマウスに免疫し、生じるCTLをペプチドを含むMHCクラスIテトラマーで解析すると、同系でないマウスにおいても同系と同じCTLが生じるという興味ある結果が得られている(論文投稿中)。3.また、MHCクラスIテトラマーによって、CD8陽性キラー細胞を定量的に、同定することが可能で、現在、行われているELISPOTと比較し検討し、ELISPOT陽性細胞が、腫瘍特異的ペプチドを認識するキラー細胞であることが判明した(論文投稿中)。本研究では、MHCクラスIテトラマーを作製し、移植拒絶反応におけるCTLのアロ認識反応を解析しようとするもであり、平成12年度には以下の成果が得られた。3.現時点ではペプチドを含まないMHCクラスIテトラマーの作製が不可能なので、すでに腫瘍特異的ペプチドが明らかになっている腫瘍細胞を系統の異なるマウスに免役し、生じるCTLをペプチドを含むMHCクラスIテトラマーで解析し、その認識機構を解明する予定である。
翻訳後修飾に着目した分泌型ペプチドミクス

植物のかたちづくりには様々な内生のペプチドホルモンが関与している.本研究では,in silicoおよび生化学的解析を統合して,翻訳後修飾ペプチドホルモン候補を探索し,その生理機能解梼を行なった.その結果,複数の新規ペプチドホルモン候補を見出すことに成功した,また,翻訳後修飾のひとつであるチロシン硫酸化酵素の精製とクローニングを行ない,その遺伝子破壊株が様々な成長異常を示すことを見出した.植物のかたちづくりには様々な内生のペプチドホルモンが関与している.本研究では,in silicoおよび生化学的解析を統合して,翻訳後修飾ペプチドホルモン候補を探索し,その生理機能解梼を行なった.その結果,複数の新規ペプチドホルモン候補を見出すことに成功した,また,翻訳後修飾のひとつであるチロシン硫酸化酵素の精製とクローニングを行ない,その遺伝子破壊株が様々な成長異常を示すことを見出した.近年,シロイヌナズナゲノム解析の完了に伴い,機能未知ながら多数の受容体様キナーゼおよび分泌型低分子ペプチドをコードする遺伝子群が見出され,それらの機能およびリガンド-受容体ペアの同定に大きな注目が集まっている.そこで申請者は,分泌型ペプチドのプールである植物細胞培養液を材料として,生物検定に依存しないペプチドリガンドの網雁的な解析・同定を行なうことを計画した.(1)培養液中に含まれる高濃度の二次代謝産物や多糖類からペプチド群を純化する手法を見出し,LC-MSおよびプロテインシークエンサーを用いて高精度にペプチド群を順次同定する系を確立した.この系を用いて,シロイヌナズナ,イネ,およびアスパラガス培養細胞の培養液を解析したところ,数種類のリガンド候補分子を同定することができた.これらについて,生理機能の解析を進めている.(2)培養液中には分泌型酵素などに由来する多数のタンパク質分解断片が共存しており,これらが微量に含まれるであろう生理活性ペプチドのさらなる検出を妨げていることも明らかとなつた.そこで,独自に確立した硫酸化ペプチドの選択的濃縮法と組み合わせて解析を行なったところ,シロイヌナズナおよびイネ培養細胞の培養液から新規の硫酸化ペプチドを同定することに成功した.これらはPSKペプチドと同様に短鎖の前駆体ペプチドのC末端付近から切り出されて分泌されていた.この遺伝子の過剰発現株では,個々の細胞の肥大化が観察されており,継続して生理機能の解析を進めるとともに,受容体の同定を目指したいと考えている.この結果は,エネルギーコストの高い翻訳後修飾を受けて分泌されるペプチドには,生理機能が内包されている可能性が格段に高いことを再認識させるものであった.1.エネルギー的にコストの高い特殊な翻訳後修飾やプロセシングを経て生産されるペプチド群には,重要な生理的機能が付与されている可能性が高いと考え,チロシン硫酸化ペプチドをターゲットとした選択的濃縮とLC-MS解析を行なった結果,シロイヌナズナ細胞培養液中に新しい18アミノ酸硫酸化ペプチドPSY1を同定した。様々な機能解析の結果,PSY1はPSKと酷似した細胞増殖促進活性を示し,2つあるPSK受容体のホモログのひとつがその認識に関わっている可能性が高いことが明らかとなった.合計3つあるPSK受容体ファミリー遺伝子をすべて破壊した多重破壊株では,メリステム領域を含む全身的な細胞増殖活性の顕著な低下が観察された.2.LRR XIファミリーに属するCLV1は,翻訳後修飾を受けた短鎖ペプチドであるCLV3の受容体と予想されていたが,これまで生化学的な証拠はなかった.CLV1のように細胞増殖を負に制御する受容体分子はしばしば過剰発現が難しいが,キナーゼ領域をタグ置換型として過剰発現することにより,解析に十分な発現株を取得した.[3H]CLV3を用いた結合アッセイと[125I]光反応性CLV3類縁体によるフォトアフィニティーラベルにより,CLV3ペプチドはCLV1細胞外領域に結合定数17.5nMで直接結合することを見出した.この結果は,CLV3とCLV1がリガンドー受容体ペアとして機能していることを示す決定的な証拠である.3.PSK受容体(PSKR1)をモデルとした実験から,受容体細胞外領域固定化ビーズを充填した小カラムを用いて,分泌型ペプチドのプールである細胞培養液から対応するリガンド(PSK)を1段階で精製・同定できることを示した.これは,受容体側からの直接的リガンドフィッシングを可能にする新しい技術である.(1)翻訳後修飾やプリロセシングを伴うペプチドホルモン群に共通した前駆体ペプチド構造に着目し,類似のモチーフを持つペプチド群を,シロイヌナズナのゲノムデータベースよりin silico抽出し,それらの実際の成熟型構造を決定するという戦略で,複数の翻訳後修飾・プロセシング依存型ペプチド群を見出した.それらのひとつ,CEP1は前駆体ポリペプチドから翻訳後修飾とプロセシングを経て15アミノ酸ペプチドとして分泌されるが,低濃度で根端メリステム活性を低下させ,根の成長を顕著に抑制する生理活性を示すことが明らかとなった.CEP1は側根原基のみで発現していることから,根系の形成に何らかの役割を果たしていると期待できる.(2) PSKやPSY1などのペプチドホルモンの生産に重要な翻訳後修飾酵素であるチロシン硫酸化酵素(TPST)の精製を行ない,PSY1前駆体ペプチドの硫酸化モチーフ周辺のペプチドを固定化したアフィニティーカラムを用いて,シロイヌナズナ培養細胞由来ミクロソーム画分より,1回膜貫通領域を持つ62kDの酵素タンパク質の精製・同定に成功した.AtTPSTは,ゴルジ体に局在しており,植物体全体で発現していた.T-

DNA挿入遺伝子破壊株(tpst-1)の解析を行なった結果,根端メリステム領域の無秩序な細胞分裂および細胞肥大に起因する根の成長不全,植物体全体の矮小化,維管束分化の不全などが観察された.AtTPSTはマウスTPSTと機能的には全く同じ硫酸基転位反応を触媒するが,配列上の類似性は全くない.このことは,植物と動物は進化の過程で独立してチロシン硫酸化酵素を獲得したことを意味しており,進化的に興味深い.
子の居所をめぐる法制度―離婚後の「子の利益」と「親の利益」の間の距離と相克―

近時、日本でも、離婚後の共同親権・監護法制の導入が提唱されている。本研究は、離婚後の共同養育法制の一端という観点から、監護親による子の居所移動、端的には子連れ転居を制限し得る仕組みの創設を中心に、子の居所に関する新たな法制度の提案を目指す。平成30年度は、前年度に引き続きオーストラリア(豪州)・英国における監護法制全般、子連れ転居紛争処理、および、いわゆるハーグ子奪取条約の運用に関する比較法的検討を進めた。これらに関しては、以前に論稿をまとめたが、掲載予定書籍の刊行が令和元年度へ延期となったため、アップデート作業を行った。日本法制に関しては、ハーグ子奪取条約の批准・運用が日本法制に及ぼした影響について検討を加えた。計画当初は予定していなかった作業であるが、同条約は、平成26年の批准後、日本における子の監護・居所・引渡しをめぐる立法・実務を大きく動かしている。そこで、同条約に関する初の公表最高裁判例である最判平成30年3月15日家判15号65頁の判例解説の依頼を受けたため、その執筆という形で研究に取り組んだ。同判決は、子奪取条約の実施に関する法律に基づく返還決定に従わない監護拘束に対する人身保護請求を認めた。人身保護請求に条約事件の返還決定の補完的な執行手段としての役割を託したものである。その論理は基本的には従来の人身保護請求事件の判例法理を踏襲しながら、条約事件としての特殊性を、請求が認容される方向で作用させたと評価される。特に、子を米国から連れ帰った母親の返還決定に反抗する悪質な行為態様を重視し、当事者や他の条約締約国の日本司法への信頼確保を図ったとみられる。従来、日本の裁判所は、いわゆる「子連れ里帰り」に寛容な立場をとっていたが、本判決は条約事件に限らず、国内外の連れ去り一般に関する判断に対し間接的な影響を及ぼす可能性があると考えられる。本研究は、平成26年・29年の2回の出産とそれに伴う育児休職のために、中断を重ねてきた。平成30年度も引き続き研究中断期間となった。その中でも、上記のように、主に依頼を受けた現行の執筆に取り組む中で、本研究も当該執筆作業に沿う形で変更を加えながら進めることができた。令和元年度途中より研究再開となり、予算の執行が可能になるとともに、令和2年度への延長申請も認められた。研究再開後は、特に子奪取条約等の最新の動向に留意しつつ、当初計画の内容を遂行していく予定である。平成26年度は、研究代表者が出産に伴い休職し、「研究中断」となったため、当初の計画の遂行は困難となった。したがって、計画を変更し、既に資料収集等の前提作業が最も進んでいる、豪州法の比較法的検討から着手した。豪州連邦家族法は、父母双方が子の養育に関わることによる「子の利益」を掲げ、離婚後の共同養育を積極的に推進しており、それが裁判における子連れ転居制限の強化をもたらしている。監護親が一方的に子を遠くに連れ去るような転居は、共同養育を現実的に困難なものとするからである。しかしながら、子連れ転居の制限は監護親側における人生の再構築の自由を阻害し、ひいては監護親の許で暮らす子にも悪影響を及ぼし得るという点も問題視されている。そこで、本研究は、特に共同養育による「子の利益」と父母の権利・利益の葛藤という視角から、豪州における子連れ転居の問題の難しさを捉え、その対応を追っている。特に、子連れ転居紛争に関して、1別居親が監護親の子連れ転居を争う局面、および、2その法的根拠を整理し、3裁判における転居許否の判断基準を明らかにするという課題を設定し、立法資料・裁判例の収集・精読作業を進めている。作業は年度内には完了できず、進行中である。また、それと並行して、近時の豪州における離婚後の共同養育の法的推進の取組みをまとめ、共著書籍の中で刊行した。転居紛争を直接取り扱うものではないが、そもそも共同養育における「子の利益」とは何か、豪州におけるそのイメージと実現へのアプローチに対する理解を深化させた。本研究は、離婚後の共同養育法制の一端という観点から、監護親による子の居所移動、端的には、子連れ転居を制限し得る仕組みの創設を中心に、子の居所に関する新たな法制度の提案を目指す。平成27年度も研究代表者の育児休職に伴う「研究中断」となり、当初の計画の遂行は困難となった。そこで、前年度に引き続きオーストラリア(豪州)の監護法制の検討を進めるとともに、英国の監護法制にも検討の対象を広げ、両国間の比較法的検討を行った。その結果、英国も豪州と同様に離婚後の共同養育推進を図る中で、1養育事件解決における実体的な規範を「共同養育は子の利益に合致する」という形で具体化するとともに、2共同養育に伴い生じる多様な争点に対応するために紛争解決手続が複雑化・精緻化していくという豪州と共通の傾向が見られること、ただし、3英国は豪州よりも緩やかに共同養育を推進していることを確認した。

これらの点を踏まえて英国の子連れ転居紛争処理の現況を眺めるに、子の居住場所は共同養育の前提として重要な争点と位置付けられ(2)、豪州程ではないにせよ、共同養育規範の強化に比例する形で、裁判所による子連れ転居許可の厳格化が進みつつある(1・3)。英国法の特徴は国内転居と国際転居とで異なる処理枠組みを持つ点にあり、従来、特に国内転居では、子連れ転居の否定はごく例外的な場合に限られていたが、近時、国際転居の処理枠組みに接近するという形で、国内転居でも子連れ転居への厳格化へ向かう兆しが見られる。また、子の居所移動に密接にかかわる問題として、両国における、いわゆるハーグ子奪取条約の運用に関しても調査検討を行った。以上の英国及び豪州両国の法制に関する検討結果をまとめるため、現在、論稿を執筆中である。研究代表者の育児休職により「研究中断」となった。したがって、当初予定していたスケジュールで研究を進めることができなかった。近時、日本でも、離婚後の共同親権・監護法制の導入が提唱されている。本研究は、離婚後の共同養育法制の一端という観点から、監護親による子の居所移動、端的には、子連れ転居を制限し得る仕組みの創設を中心に、子の居所に関する新たな法制度の提案を目指す。平成28年度は、前年度に引き続き、オーストラリア(豪州)・英国における監護法制全般、子連れ転居紛争処理、および、いわゆるハーグ子奪取条約の運用に関する比較法的検討を進め、最新状況について論稿をまとめた。論稿は平成2930年度に共著書籍の中で刊行予定である。その他には、いわゆる「友好的な親」ルールに関し検討を行った。友好的な親ルールとは、養育紛争の判断基準として、離婚後に他方親の養育参加に対して協力的な姿勢を示す親を好ましい親と見るというものである。日本の家裁実務では、平成28年、離婚後の子の親権紛争において、同ルールの下、母親との面会交流に積極的な姿勢を示していることを理由に父親に親権を認めた事件があり、異例の判断として注目を集めた。母親については、父親との面会交流に消極的であったことに加え、別居時に、父親に無断で子を連れて転居したことが否定的に評価されたと考えられた。当該事件は第二審で判断が覆され、母親に親権が認められたものの、今後、日本でも共同養育の推進・普及が進み、同ルールが実務上普及した場合、子連れ転居の問題についても新たな対応が迫られる契機となる。友好的な親ルールについては、特に豪州の動向が注目される。豪州では2006年の連邦家族法改正において、共同養育規範の明確化の観点から、養育命令を行う際の至高の判断基準である「子の最善の利益」の一内容として同ルールを盛り込みながら、諸批判を受け、2012年の同法改正により削除したという経緯がある。そこで、同ルールの意義と問題点について、日本の実務・立法の手がかりとするべく検討した。前年度、研究代表者の育児休職により「研究中断」となったところ、それによる遅れを十分に取り戻すことができなかった。加えて、日本での最新の実務動向を受けて、計画を一部変更し、当初予定していなかったテーマの検討作業に相当の時間を要したことから、当初のスケジュール通りの遂行が困難となった。
アワビの成長促進因子の同定と成長促進機構の解明

本研究は、成長ホルモン遺伝子が無脊椎動物に起源する仮説およびサケ成長ホルモンがエゾアワビ稚貝の成長を促進する発見に基づいて、軟骨魚類と無顎類の成長促進に関与するホルモン受容体を同定した。また、アワビの脳神経節にサケの成長ホルモン抗体に対する免疫反応陽性細胞群を検出し、その組織から成長促進因子および遺伝子を単離するとともに成長促進因子受容体を探索した本研究は、成長ホルモン遺伝子が無脊椎動物に起源する仮説およびサケ成長ホルモンがエゾアワビ稚貝の成長を促進する発見に基づいて、軟骨魚類と無顎類の成長促進に関与するホルモン受容体を同定した。また、アワビの脳神経節にサケの成長ホルモン抗体に対する免疫反応陽性細胞群を検出し、その組織から成長促進因子および遺伝子を単離するとともに成長促進因子受容体を探索した申請者は、魚類および四肢動物の成長ホルモンおよび同族のプロラクチンとソマトラクチンの構造比較に基づいて、これらホルモンの分子進化と機能分化を考察し、成長ホルモン分子族の祖先遺伝子は、成長ホルモンであり、無脊椎動物に起源を有すると推定した。この仮説を基にして、サケ成長ホルモン抗体に対する免疫陽性細胞をエゾアワビの脳神経節に認めた。このことは、エゾアワビの脳神経節に成長ホルモンに類似の成長促進因子が存在することを強く示唆する。そこで本年度は、エゾアワビの成長促進因子を探索した。1.エゾアワビの成長促進因子の探索エゾアワビの脳神経節(殻長5cm、300個)を採取した。2gの脳神経節を200mMの酢酸アンモニウム(pH9.0)で抽出し、その上清をゲル濾過および陰イオン交換クロマトグラフィーで分画し、高性能液体クロマトグラフィーで精製した。その結果、サケ成長ホルモン抗体に対して免疫反応陽性の分子量、18kDaおよび20kDaのタンパク質を検出した。これらタンパク質のアミノ末端の配列(15残基)を決定したが、既知の成長ホルモンの構造に対して相同性は認められなかった。現在、分子内の構造を決定するために、18kDaおよび20kDaのタンパク質の精製を進めている。また、構造情報を基に作製した縮重プライマーを用いて、これらタンパク質cDNAのPCRによる増幅を行なっている。2.エゾアワビの成長促進因子受容体の探索サケ成長ホルモン抗体に免疫陽性反応を示す組織を特定するために、殻長1cmのエゾアワビ稚貝に10μgのサケ成長ホルモンを注射した後、12時間毎に48時間目まで5個のアワビをプアン液で固定した。現在、免疫組織染色を進めている。また、成長促進因子受容体cDNAをPCRにより増幅するために、魚類の成長ホルモン受容体の構造比較を基にしたプライマーを設計した。魚類から四肢動物まで脊椎動物の成長ホルモン、プロテクチンとソマトラクチンの分子進化に基づいて、成長ホルモン分子族の祖先遺伝子は、成長ホルモンであり、無脊椎動物に起源を有すると推定した。昨年度、エゾアワビ脳神経からにサケ成長ホルモン抗体に対して陽性反応有する分子量20kDaのタンパク質を精製し、アミノ末端の配列を明らかにした。本年度は、20kDaのタンパク質を構造を解析するとともに、成長促進因子受容体の探索を行なった1.エゾアワビの成長促進因子の構造解析エゾアワビの脳神経節(2g)200mMの酢酸アンモウウム(pH9.0)で抽出しその上清をゲル濾過および高性能液体クロマトグラフィーで精製した。その結果、サケ成長ホルモン抗体に対して免疫反応陽性を有する分子量,20 kDaのタンパク質を精製した。そその収量は40μgであった。このタンパク質のトリプシン消化フラグメントのアミノ酸配列を解析した。現在、得られたフラグメントペプチドの配列を基に作成したプライマーを用いたPCRにより、分子量20kDaのタンパク質cDNAのクローニングを行なっている。2.エゾアワビの成長促進因子受容体の探索エゾアワビ稚貝(殻長1cm)に10μgのサケ成長ホルモンを注射した結果、注射後、12時間目にエゾアワビの肝膵臓の一部に、サケ成長ホルモン抗体に対する免疫陽性反応が認められた。この組織から一本鎖cDNAを調製し、魚類の成長ホルモン受容体の構造比較を基にしたプライマーを用いたPCRにより、約250bpのcDNAを増幅した。現在、PCR増幅cDNAの塩基配列を解析している。脊椎動物の成長ホルモン、プロラクチンおよびソマトラクチンの祖先遺伝子が成長ホルモン型であり、無脊椎動物に起源を有する仮説に基づいて、エゾアワビの脳神経節および肝膵臓から魚類の成長ホルモンおよび成長ホルモン受容体に構造が類似するホモログの探索を行なった1.エゾアワビの成長促進因子の構造解析エゾアワビの脳神経節(2g)を200mMの酢酸アンモニウム(pH9.0)で抽出し、その上清をゲル濾過および高性能液体クロマトグラフィーに付して、サケ成長ホルモン抗体に対して免疫反応陽性を有する分子量18kDaおよび20kDaのタンパク質を精製した。精製した18kDaおよび20kDaタンパク質のアミノ末端部、それぞれ15残基および10残基の構造を決定した。脳神経節一本鎖cDNAを鋳型として、決定したアミノ酸配列および魚類の成長ホルモンの構造比較を基に作成したプライマーを用いたPCRによりcDNA断片を増幅してクローン化し、塩基配列を決定した。2.エゾアワビの成長促進因子受容体の探索

エゾアワビ稚貝(殻長、約5cm)に100μgのサケ成長ホルモンを注射した後、12時間目に肝膵臓を採取した。この組織から調製した一本鎖cDNAを鋳型として、魚類の成長ホルモン受容体の構造比較を基にしたプライマーを用いたPCRによりcDNA断片を増幅してクローン化し、塩基配列を決定した。3.プロラクチンとソマトラクチン産生細胞の探索サケのプロラクチンとソマトラクチン抗体を用いた免疫組織染色により、これら抗体に対する免疫反応陽性細胞を脳神経節に認めた。これらの陽性反応は抗原で吸収した吸収抗体では染色されなかったので抗原に特異的といえる。また、脳神経節に生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン抗体に対する免疫反応陽性細胞も存在した。
fNIRSによる新情報伝達法の研究

二種類の実験を行ったところ、ヒトの協調作業においては種々の脳機能状態が存在することが示唆されたが、予測行動が非常に重要であり、それに関連する脳機能部位とネットワークが確認された。人間のコミュニケーション能力を評価するにはアンケートのような定性的な手法のみ使用されていきた。本研究では、まず、定量的な評価を人間の生理的データである脳活動を用いる手法を提案した。また、コミュニケーション時の脳の中での情報処理についてまだ明らかになっていない。複数の人間間で、脳機能情報を交換することで、新しい情報伝達を実現する。本研究では、コミュニケーションのうち協調作業に焦点を当て、fNIRS (functional near infrared spectroscopy)を用いて協調作業時の脳活動について調査した。本研究の目的を達成するために2つの段階があると考えた。第一段階として、脳における関心領域を決定するため、機械に対する協調作業時の脳活動について調査した。第二段階として、実際の人間同士の協調作業時の脳活動について調査した。現在は第二段階において研究を進めている。第一段階では、協調作業を調査するために、機械と人の間でタッピングを行うシステムをタスクに用いる。提案システムでは、機械から音刺激が提示され、被験者はその音刺激と同期するようにタッピングを行う。本実験の結果より、機械に対する協調作業では、上前頭回と下前頭回が関心領域であると決定された。第二段階では、2人の被験者が協調作業を行っている際の関心領域における脳活動を1台のfNIRS装置を用いて同時に計測している。また、被験者によってコミュニケーション能力が異なるため、心理的指標のKiSS-18を用いた。2人の人間同士で同期タッピングを行うシステムをタスクに用いる。現段階では、被験者ペアのタッピング成績が良いほど上前頭回での脳血流に負の相関が見られることが分かっている。本研究では、ある伝達目標を持つ情報伝達を脳機能イメージングデータの交換で実現する手法の開発を行う。2013年度に引き続き、2014年度はヒトー機械モデルおよびヒトーヒトモデルにおいて協調作業(タッピング課題)を行い、その際に重要となる脳部位を調査したまず、人ー機械モデルにおける同期タッピング課題を行った際の脳活動をfNIRSを用いて検討した。その際、人が一方的に合わせるモデルと、人と機械が互いに協調するモデル(機械が他者モデルを有するモデル)の2つのモデルを用いた実験を行った。両モデルで、両側頭部と前頭部に着目し、脳活動の比較を行った。その結果、下前頭回において同期モデルで賦活の傾向が見られた。特に左下前頭回で同期モデルの方が賦活の傾向が見られた。また、協調度の高い被験者は両モデルの前頭極において賦活の傾向が見られなかったため、協調に優れる人は前頭極において賦活を必要としないことが示唆された。次に、ヒトーヒトモデルにおいて同期タッピング課題を行った際の検討を行った。各被験者ペアを協調できているペアとできていないペアに分類した。そして協調時の脳血流変化を算出した。上手く協調して同期協調タッピング課題を遂行できたペアにおいて,下前頭回,側頭葉,右の中前頭回の一部,左の頭頂葉の一部において脳血流の増加が見られた。協調できないペアではこれらの部位での活動は小さく、活性しなかったため、協調できなかったことが示唆された。本研究では、ある伝達目標を持つ情報伝達を脳機能イメージングデータの交換で実現する手法の開発を行っている。これまでに協調課題としてタッピング課題を採用し、ヒト同士が協調作業を行う際の脳活動の検討を行い、ヒトに内在するモデル構築の検討を行った。実験では、タッピング課題時の音提示間隔を変化させ、それによりヒトが同期する際の脳活動をfNIRS (functional near-infrared spectroscopy)(ETG-7100、日立メディコ製)を用いて測定した。被験者は2126歳の健常者16名(男性、左利き:2名右利き:14名)で実験を行った。プローブは、前頭部(22CH)、両側頭部(各24CH)に脳波電極配置の国際基準である国際10-20法に従って設置した。刺激提示には,雑音源をできるだけ除去するためにノイズキャンセラー付イヤホン(ATH-ANC23、オーディオテクニカ)を使用した。本実験では、刺激提示を行うプログラムをPresentationソフトを用いて作成し、提示音刺激には、100 ms、500 Hzのsin波を用いた。協調性と脳活動の関連を検討するために、活性部位の特定を行った。被験者の80%以上の人が活性した部位は、前頭部では前頭前野背外側部、左側頭部では角回に相当した。前頭前野背外側部の機能は行動制御、また角回の機能は行動の予測に関係していると言われている。以上より、音刺激間隔を変化させると、ヒトはタイミングを合わせようとする。その際に,次の音刺激を予測して行動するため、前頭前野背外側部と角回が活性したことが考えられる。これにより、本タスクを行う際の情報伝達のためには、前頭前野背外側部と角回の脳機能情報を基にした情報の交換が有効であることが示唆された。2014年度に引き続き、ヒトー機械およびヒトーヒトの協調作業時の脳機能の検討について行い新しい知見を得た。すなわち、情報伝達を行うためには、前頭前野背外側部と角回の脳機能の状態を相手に伝える必要がある。

本研究では、自身の脳機能情報を変換して相手に伝える必要があるが、情報の変換方法についての検討はまだ着手できていない。今後の課題である。これまでの研究に引き続き、基礎的な検討として、ヒトとヒトとが協調作業を行う際の脳機能の検討を行った。最終的には、ヒトとヒトとが協調作業を行っている際の脳活動を計測し検討する必要があるが、ヒトの脳活動はあらゆる要因によって変化するために、ヒトとヒトとが作業を同時に行うとどの要因が脳活動に影響を及ぼすかを明確にすることが難しい。そのため、まず、ヒトがあらかじめ行動の決められた機械(コンピュータ)に協調する際にどのような脳活動を行うかについて検討している。使用した脳機能イメージング装置はfNIRSである。課題は、先行研究に基づき、同期タッピング課題を用いた。音刺激は4種類の音間隔(ISI)を用いてリズムを変化させる実験を2度行った。ISI変化後から変化前のDegreeの差分から被験者を分類した結果、GroupAからGroupJの10種類のグループに分類された。一方で、EQSとKiSS-18のアンケートを利用し、そのスコアを協調性の指標として活用した。両アンケートで上位5名の被験者の活性部位を検討することとした。共通して活性部位として挙げられたのは、上側頭回であった。上側頭回は聴覚野の一部であり、また社会的認知にも関わると言われている。この上側頭回が活性部位に含まれるグループはGroupA、GroupC、GroupF、GroupJの4グループであり、アンケートや行動データに関してはグループ間で有意差は見られなかった。一方、脳機能から検討すると上側頭回の結合先はグループ間で異なっていた。このように脳の状態が異なることから、グループ間で異なるリズム処理を行っていたことが考えられる。これらの結果をまとめると、協調性が高いと考えられるグループは上側頭回が活性することが示唆される。また、行動データやアンケートに違いが見られなくても脳状態が異なることも明らかとなった。二種類の実験を行ったところ、ヒトの協調作業においては種々の脳機能状態が存在することが示唆されたが、予測行動が非常に重要であり、それに関連する脳機能部位とネットワークが確認された。ヒト-機械およびヒト-ヒトの協調作業時の脳機能の検討については、おおむね予定どおり遂行されている。一方で、2014年度に検討する予定であった、伝達アルゴリズムの開発については、着手することができなかった。検討課題である。これまでの成果として、脳機能の情報伝達を行うためには、前頭前野背外側部と角回の脳機能の状態を相手に伝える必要があることが明らかとなった。今年度は、自身の脳機能情報を変換して相手に伝える際の、情報の変換方法についての検討を行う必要がある。また、これまで協調課題として、タッピング課題を中心に行ってきたが、他の協調課題についても検討を行う。脳機能情報処理引き続き、ヒトー機械モデルおよびヒトーヒトモデルにおいて、協調作業時に脳のどの部位が重要となるかについて実験的検討を行う。特に、機械に多種の他者モデルを持たせることで、ヒトが実際にどのようなモデルで協調作業を行っているかについても検討する。
水疱性類天疱瘡におけるT細胞サブセットの解析と治療法の開発

水疱性類天疱瘡(BP)モデルマウスおよびサイトカインノックアウト(KO)マウスを用いて、BPにおけるT細胞サブセットの役割を解析した。IL-12KOマウスおよびIL-4KOマウスを用いてアクティブBPマウスモデルを作成した。IL-12KOマウス脾細胞レシピエントではIgG1の沈着が強く見られ(Th2型反応)、IL-4KOマウス脾細胞レシピエントではIgG2の沈着がより強く見られたが(Th1型反応)、補体の沈着や皮疹の程度はほぼ同等であった。以上より、サイトカインのノックアウトは抗体サブクラスに差異をもたらすものの、抗体産生量やBPマウスモデルの表現型、補体活性化に明らかな差をもたらさないことが示唆された。1)アクティブ水疱性類天疱瘡(BP)マウスモデルの血清サイトカイン量の測定:ヒトCOL17発現マウスの皮膚を野生型マウス植皮して免疫し、脾細胞をRag-2KO/COL17ヒト化マウスに静注することでアクティブBPマウスモデルを作製した。移植後、モデルマウスの血清を採取し、各種サイトカインを測定した。脾細胞移植後一過性のIFN-γの上昇がみられたが、IL-4の上昇は見られなかった。以上より、アクティブBPマウスモデルの抗体産生誘導過程においてTh1優位の反応が生じている可能性が示唆された。2)IL-12KOマウスおよびIL-4KOマウスを用いた抗体産生誘導:各KOマウスに植皮し、血清の抗ヒトCOL17 IgG抗体価を測定した。植皮野生型マウスの抗体価と比較したところ、各群間で抗体価に有意差は見られなかった。抗体サブクラスを比較したところ、IL-4KOマウスはIgG2高値のTh1型の反応を示した。一方、IL-12KOマウスはIgG1高値IのTh2型の反応を呈した。3)サイトカインKOマウスの脾細胞を用いたBPマウスモデルの作成(今年度実施):各KOマウスに植皮で免疫し、脾細胞をRag-2KO/COL17ヒト化マウスに移植した。いずれの系においてもほぼ同程度の抗体産生と皮疹の発症が観察された。抗体および補体の皮膚への沈着を観察したところ、IL-12KOマウス脾細胞レシピエントではIgG1の沈着が、IL-4KOマウス脾細胞レシピエントではIgG2bの沈着がより強く見られたが、補体の沈着には明らかな差は見られなかった。以上の結果より、サイトカインのノックアウトは抗体サブクラスに差異をもたらすものの、抗体産生量やBPモデルマウスの表現型、補体活性化に明らかな差を誘導しないことが示唆された。1)アクティブBPマウスモデルの血清サイトカイン量の測定ヒトCOL17発現マウスの皮膚を野生型マウス背部に植皮して免疫し、そのマウスの脾細胞を精製、Rag-2KO/COL17ヒト化マウスに静注することでアクティブBPマウスモデルを作製した。移植後、抗体産生ピークまでの期間(Day2-Day9)にモデルマウスの血清を連日採取し、各種サイトカインを測定した。脾細胞移植後Day4-5にかけて一過性のIFN-γの上昇がみられたが、予想に反しIL-4の上昇は見られなかった。2)IL-12KOマウスおよびIL-4KOマウスを用いた抗体産生誘導IL-12KOマウスおよびIL-4KOマウスの脾細胞を精製しPMAとIonomycinで5時間刺激し、ELISA法で培養上清のサイトカインを測定した。IL-4KOマウスにおいてTh2サイトカインであるIL-5の産生は低いながらも見られ、IL-12KOマウスにおいてTh1サイトカインであるIFN-γの産生が十分に見られた。以上より、IL-4のKOはTh2サイトカイン全般の抑制には至らず、同様にIL-12のKOはTh1サイトカイン全般の抑制には至らないことが示された。次に、ヒトCOL17発現マウス皮膚を各KOマウスに植皮し、血清の抗ヒトCOL17 IgG抗体価を正常ヒト皮膚を用いた蛍光抗体間接法を用いて経時的に5週間測定した。植皮した野生型マウスの抗体価と比較したところ、各群間で抗体価に有意差は見られなかった。抗ヒトCOL17IgG抗体サブクラスを比較したところ、IL-4KOマウスはIgG1低値IgG2高値のTh1型の反応を示した。一方、IL-12KOマウスはIgG1高値IgG2低値のTh2型の反応を呈した。1)アクティブBPマウスモデルの血清サイトカイン量の測定