hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
メチルセルロースを用いた角膜輪部上皮オルガノイドの長期培養法の確立

我々はこれまでに角膜上皮の幹細胞と幹細胞を維持する環境であるニッシェを分離し、オルガノイド培養法を用いることで長期培養を可能としてきた。これにより、輪部機能不全を伴った難治性の疾患に対する適応の拡大が期待される。本研究ではさらに再生医療として現実性を高めるため、すでに化粧品や医薬としても利用されているメチルセルロースを用いて、オルガノイドのさらなる長期維持培養法の確立を目指している。本年度においてはメチルセルロースを用いたオルガノイドの培養法について検討してきた。培養1ヶ月後においてメチルセルロースを用いても比較的小さいが、オルガノイドを形成することがわかった。このオルガノイドを回収しmRNAレベル並びにタンパクレベルでの発現を確認するため、免疫染色並びにRT-PCRを行ったところ、角膜輪部上皮のフェノタイプであるK15並びにp63の発現を維持していることがわかってきた。また、角膜上皮の幹細胞マーカーの一つとして考えられているN-cadherinにおいても、mRNAレベル並びにタンパクレベルで発現を確認することができた。さらに、形成したオルガノイドの増殖能を調べるため、コロニー形成能についても検討したとろ、増殖能を示すコロニーを形成することがわかった。来年度においてはさらに向上したオルガノイドの培養法について検討並びに解析を行うと共に、オルガノイドの保存法並びに移植法についても検討していく予定である。メチルセルロースを用いた培養方法で1ヶ月間培養を行っても、角膜輪部上皮のフェノタイプを維持したオルガノイドを作成できることがわかった。オルガノイドの培養方法はもう少し条件検討が必要ではあるが、概ね順調に進展していると考えられる。メチルセルロースを用いた培養方法で1ヶ月間培養を行っても、角膜輪部上皮のフェノタイプを維持したオルガノイドを作成できたが、もう少し条件検討が必要であると考えられる。例えば、ES細胞等を培養時に効果的なラミニン511などを用いるなどオルガノイド形成環境の改善を行なっていく予定である。また、これと並行してオルガノイドの保存法並びに移植法についても検討していく予定である。3月後半の学会に出席し、その分の旅費等を本年度に予定していたが、来年度に計上することになったため、また試薬を節約して使うことができたため、次年度使用額が発生いたしました。次年度においてはその分、旅費等ならびに試薬として合わせて使う予定である。
アジア系企業のネットワーク構築に関する比較研究

本年度の現地調査では、アジア企業のネットワーキングに関する分析枠組みをより精緻化し、各国の企業システムの全体像(system configuration)を包括的に比較分析することに力点をおいた。これまでの研究では、アジア企業間の企業システムを比較する際に、例えば生産システムや生産管理システムあるいは人事労務管理システムなど、全体としての企業システムの一部分(サブ・システム)のみに焦点を当てた研究が多かったのに対して、本研究ではより包括的な比較分析を試みた。各国企業のサブ・システムごとにどのような特徴があるのかを明らかにしそれらの相互比較のために、ヒアリング調査とアンケート調査を実施した。調査の結果、それぞれの国の企業で経営のサブ・システムごとに重要な差異が存在することが確認され、こうした差異が企業間ネットワークの形成・発展にも大きな影響を及ぼしていることが明らかとなった。アジア企業間で最も差異が顕著なのは、「経営目標・理念」及び「人事労務管理」である。これらは、各国の社会文化的背景が密接に関連し、それぞれの独自性が認められる。一方、アジア企業に共通しているのは、日本型システムと米国型システムの影響がみられることである。具体的には、「生産システムや設備」「生産品質管理」については、日本的システムが幅広く導入されている。そして「戦略策定プロセス」「組織構造」「リーダーシップと意思決定」のそれぞれのサブ・システムについては、近年(とくに通貨危機後)、米国的なシステムの導入が活発であり、より米国的な方向への変容が見られる。アジア企業間でのネットワークキングの可能性を検討した上で、このようなそれぞれの国ごとの企業システムの異同や変化の方向性を、サブ・システムのレベルから包括的に分析することが今後求められると考えられる。本年度は、文献研究及び予備的な現地調査(台湾、香港、韓国)を実施した。現地調査では、各国おける主な研究機関(大学を含めて)といくつかの企業へのヒアリング調査を行い、以下の成果を上げることができた。・まず、多くの現地研究者との議論やセミナーでの研究発表などを通じて本研究のテーマに対する様々なアドバイスが得られ、本研究の枠組みや概念規定を明確にすることができた。また、今後の現地におけるアンケート調査や共同セミナー開催の可能性について、訪問研究機関の研究者から具体的な指示及び支援申し出を引き出すことができた。・韓国、台湾、香港などアジア企業の多くはアメリカ的、日本的、現地的な特徴をミックスした複合的な経営システムを確立している。韓国企業と台湾企業は、同様に日本的経営システムを学習しながら、その受け入れの程度にはかなりの差異があった。韓国企業は日本的経営システムをより積極的に取り入れたのに対して、台湾企業は必ずしも積極的に採用しなかった。一方、企業間で差異は見られるものの、台湾企業・香港企業の多くはよりアメリカ的な経営システムを導入している。しかし、そこには現地的な要素も存在しており、経営システムに複合性が観察される。・この地域の企業経営の大きな特徴として、目に見えない人と人と関係のあり方が企業経営に重要な影響を及ぼしているという事実が確認された。例えば、韓国財閥企業におけるオーナー経営者間の「婚姻ネットワーク」がもつ競争制限性や中国系企業における「関係(クァンシ)」の機能など。本年度の優先課題は本研究の概念的枠組みを明確にすることであったが、現地調査(昨年;台湾・香港・韓国、今年;中国・韓国・タイ)の成果として、われわれは一つの理論的仮説(「デュアル・コンティンジェンシー・モデル」)を提示することができた。デュアル・コンティンジェンシー・モデルは、「組織の機能的な内部特性の設計において、外部環境要因と社会・文化要因からの二重の拘束を受ける」ということを基本的な命題とするものである。これまでのコンティンジェンシー理論は、組織内部の特性を外部環境特性(市場、技術などのタスク環境)との適合(congruence)という観点から捉えている。

しかし各国の現地調査を通じてわれわれが観察したところによれば、組織の内部特性は、単に外部環境特性のみではなく、当該組織がおかれた国特有の社会・文化特性によっても大きく規定されていることが確認できた。デュアル・コンティンジェンシー・モデルにおける基本的な仮説は、次の通リである。(1)仮説1;経営システム(組織構造や戦略)の設計において、外部環境特性と社会・文化特性の両者への配慮が高いほど、企業業績が高い。(1)H1-a:外部環境特性への適合のみに配慮している企業は、相対的に企業業績が低い。(2)H1-b:社会・文化特性への適合のみに配慮している企業は、相対的に企業業績が低い。(2)仮説2;地域(国)ごとの経営システムは、その国における外部環境特性と社会・文化特性の相違のために、それぞれ異質な特性を示す。(3)仮説3;高業績企業の経営システムは、国ごとに異なる。本年度の現地調査では、アジア企業のネットワーキングに関する分析枠組みをより精緻化し、各国の企業システムの全体像(system configuration)を包括的に比較分析することに力点をおいた。これまでの研究では、アジア企業間の企業システムを比較する際に、例えば生産システムや生産管理システムあるいは人事労務管理システムなど、全体としての企業システムの一部分(サブ・システム)のみに焦点を当てた研究が多かったのに対して、本研究ではより包括的な比較分析を試みた。各国企業のサブ・システムごとにどのような特徴があるのかを明らかにしそれらの相互比較のために、ヒアリング調査とアンケート調査を実施した。調査の結果、それぞれの国の企業で経営のサブ・システムごとに重要な差異が存在することが確認され、こうした差異が企業間ネットワークの形成・発展にも大きな影響を及ぼしていることが明らかとなった。アジア企業間で最も差異が顕著なのは、「経営目標・理念」及び「人事労務管理」である。これらは、各国の社会文化的背景が密接に関連し、それぞれの独自性が認められる。一方、アジア企業に共通しているのは、日本型システムと米国型システムの影響がみられることである。具体的には、「生産システムや設備」「生産品質管理」については、日本的システムが幅広く導入されている。そして「戦略策定プロセス」「組織構造」「リーダーシップと意思決定」のそれぞれのサブ・システムについては、近年(とくに通貨危機後)、米国的なシステムの導入が活発であり、より米国的な方向への変容が見られる。アジア企業間でのネットワークキングの可能性を検討した上で、このようなそれぞれの国ごとの企業システムの異同や変化の方向性を、サブ・システムのレベルから包括的に分析することが今後求められると考えられる。
ICA、ECDL、DBNを利用した、単一試行脳波によるBCIの開発

ICA(独立成分分析)、ECDL(脳内等価電流双極子推定)、DBN(ダイナミック・ベイジアン・ネットワーク)を利用した、単一試行脳波に基づくBCI(Brain-ComputerInterface)を開発した。カテゴリカルデータ向きの学習モデルとして、数量化分析II類とBNを採用した。その結果、前者では、イメージした手の左右識別に関して、7名の被験者で相関比が0.9以上、LOOCVの正解率が80%を超えた。後者では、"運動野"ノードの条件付き確率に着目した識別則を確立できた。更に、BNをDBNに拡張することにより、運動準備電位への適用を可能にし、識別則の精度向上につながった。単一試行脳波によるBCIを開発するために、本研究では「研究目的」に記載した6つ研究項目の中から、H20年度の「研究実施計画」に基づき、(1)他の被験者データへの適用、(2) ECDL結果の自動読取、(3) ECDL結果の時間的推移を考慮した分類法の確立、を予定通り実施した。(1)左手と右手の動作イメージ遂行中に32チャネルで計測したEEGにICA、ECDLを適用し、ECDL結果を数量化分析II類で学習させた。その結果、新たに3名の被験者で左手/右手イメージの良好な識別性能を得た(具体的には、相関比が、3名の被験者で、それぞれ、0.9909、0.9946、0.9748であった)。また、数量化分析II類に用いるカテゴリーとして、左右の運動野および運動前野に注目することが、他の脳内部位、例えば、左右の体性感覚野や視覚野と比べて、はるかに識別性能が高い事も明らかになった。(2)各被験者のMRI画像をTalairach標準脳に変換し、この標準脳に備わっている、脳内の3次元座標と対応する脳内部位名称のデータを利用して、ECDL結果を自動的に読み取るシステムを開発した。予備的な本システムの性能結果は、脳解剖学の本との一致率が約60%であった。(3) DBNを構築する前に、BNを構築するアルゴリズムを考案し、実際の単一試行脳波データの学習を行った。その結果、2名の右利き被験者データに対して、初期BNモデルとして、約15個のノード(脳内部位)から成るBNを構築した。更に、確率推論により、特に左右の運動野の活性に注目した。その結果、右手イメージの場合には左右の運動野の活性に有意な違いが認められたが、左手イメージの場合には有意な違いが認められなかった。この知見は、BNモデルにより左手/右手イメージが識別可能であることを示唆する共に、(1)の左右の運動野に注目することの妥当性を強く主張する。単一試行脳波によるBCIを開発するために、本研究では「研究目的」に記載した6つ研究項目の中から、H21年度以降の「研究実施計画」に基づき、(1)既存の被験者データ解析、(3)DBNアルゴリズム、(4)PCクラスタへのimplementation、(6)更なるEEGデータ収集、を予定通り実施した。(1)左手/右手の動作イメージ遂行中に32チャネルで計測した単一試行EEGにICA、ECDLを適用し、ECDL結果を数量化分析II類で学習させた。その結果、これまでに5名の被験者で左手/右手イメージの良好な識別性能を得た(具体的には、相関比が、5名の被験者すべてにおいて0.9以上であった)。また、数量化分析II類に用いるカテゴリーの数を増やすことにより、1被験者ながら、LOOCVにより正解率が約70%に到達した。学習モデルとしてBNを利用した場合には、4名の被験者でイメージすべき手の左右を識別するためのルールを確率推論により獲得し、t検定により実証することが出来た。また、silent speechを検出ためのBNモデルの構築にも成功している。(3)、(4)DBNモデルの例として、運動準備電位(BP)および運動関連電位(MP)に注目し、初期BP⇒NS'⇒動作直後のMP⇒post-MPの4状態を推移するDBNの構築を開始した。現在、各状態を表現するBNモデルにPCを割り当て、DBNとしてのPCクラスタへの移植を実施中である。(6)本BCIの応用範囲を拡大するために新たな単一試行脳波の計測を開始した。4種類の「ジャンケン」タスク(実動作、動作イメージ、発話、silentspeech)中の単一試行脳波を計測し、データ解析を開始した。単一試行脳波によるBCIを開発するために、H22年度は「研究目的」に記載した6つの研究項目ほとんどが最終目標まで到達した。主に、(1)既存の被験者データ解析、(5)Validation:分類モデルとしての数量化分析II類(QM2)とベイジアンネットワーク(BN)について共に被験者7名分のデータ解析結果を得た。

QM2では、7名全員で相関比が0.9以上となり、イメージすべき手の左右を明確に識別できた。更に、LOOCVにより、カテゴリー数は4で十分であり、試行数を増やすことにより正解率が向上することを確認した。BNでは、昨年度に確立した"識別則"がほとんどの被験者で有効であることが分かった。そして、試行数の関数としてt検定の有意水準を調べた結果、BNモデルでは試行数が25以上であれば、"識別則"が効果的であると結論付けられた。(2)ECDL結果の自動読取;標準脳への変換パラメータを変更して評価を試みたが、脳解剖学の本との一致率はあまり変化しなかった。欧米人の標準脳であることが本質的な欠点であると思われるので、標準脳そのものを見直さなければならない。(3)DBNへの拡張:earlyBP、NS'、MPなどの特徴的な成分を合わせ持つ運動関連電位を、DBNで表現可能であることを見い出した。この結果を参考に、P300の混入が避けられない、動作イメージ課題遂行時に計測された本脳波データを、刺激提示から0700msの区間を3区間(0200ms、200400ms、400700ms)に分け、それぞれでBNを構築し、これらを最上位ノードで結合してDBNモデルを得た。その結果、上記、"識別則"の精度が更に向上した。
共焦点内視鏡による胃癌組織型診断

本研究ではプローブ型共焦点内視鏡を本邦で初めて導入し、胃病変の腫瘍・非腫瘍の鑑別に有用か検討した。また、診断の再現性や術者の背景による診断精度の影響を検討するため日独8施設の参加する国際多施設共同研究を実施した。その結果、癌は良性腫瘍性病変や非腫瘍性病変に比して腺管構造が不整であること、分化度が下がるにつれて腺窩の不整、小型化、窩間部の距離が長くなることなどが明らかになった。共焦点内視鏡の腫瘍・非腫瘍の鑑別診断精度は通常内視鏡観察より有意に優れて、共焦点内視鏡や病理診断の経験によらず、日本の医師がドイツの医師より、消化器病医が病理医より優れていることが明らかになった。小型プローブ型共焦点内視鏡(フランスMaunaKea社製)を本邦で初めて臨床導入し、早期胃癌診断における有用性を検討した。まず、臨床導入にあったての読影精度を検討するため、臨床導入初期27病変を対象に、共焦点内視鏡検査未経験の消化器内科研修医5名および内視鏡専門医5名による共焦点内視鏡画像の腫瘍・非腫瘍鑑別診断精度の検討を実施した。全ての被験者は共焦点内視鏡画像読影前に20分間のウェブベースのセルフトレーニングを実施した。その結果、共焦点内視鏡検査の経験がないにもかかわらず、腫瘍性病変の精度は感度91.8%,特異度84.4%,陽性的中率80.2%陰性的中率93.8%と従来の内視鏡診断法や欧米での報告以上の診断精度であった.また、研修医と専門医別の成績を比較したところ、診断正答率は各85.9%と88.9%(p=0.56)と良好で、The fixed-marginal kappa valueは0.602と被験者間全体の回答一致率は高かったが、研修医/専門医別にみると各0.486と0.704であり、専門医の回答の一致率が高い傾向にあった。特に腸上皮化成を伴う病変の場合、非腫瘍を腫瘍性病変と読影される傾向が高かった。この結果から、本邦の内視鏡医にとって正確な共焦点内視鏡画像の読影に必要な知識を習得することは容易であり、また、共焦点内視鏡画像を用いた胃表層性病変の腫瘍・非腫瘍診断の信頼度は高いことが証明されと共に、共焦点内視鏡画像読影に従来の内視鏡診断の経験が何らかの影響を与えうることが判明した。本研究において、我々は、プローブ型共焦点内視鏡の本邦初の臨床導入に成功し、すでに49例、80病変を対象にフルオレセイン静脈投与下に共焦点内視鏡観察を行った。その結果、これまでのところ臨床的に明らかな偶発症は認められていない。また、癌は良性腫瘍性病変やその他の非腫瘍性病変やMALTリンパ腫などに比して、腺管構造が不整であること、また、腫瘍の分化度が下がるにつれて腺窩の不整、小型化、窩間部の距離が長くなることなどが明らかになった。特に未分化型癌では腺管構造の荒廃・消失が認められた。さらに、共焦点内視鏡による早期胃癌の診断精度の信頼性や再現性を評価するため、日独の本分野における先進8施設による共同研究チームを立ち上げ、読影者の臨床的背景によって読影精度にばらつきを生じるか検討した。本検討では18例の腫瘍性病変と12例の非腫瘍性病変の通常内視鏡画像および共焦点内視鏡画像を計39名のレビューワーが読影し、その精度を、消化器病医か病理医か、日本の医師かドイツの医師か、共焦点内視鏡や通常内視鏡の習熟度等の読影者の臨床的背景別に比較検討した。その結果、腫瘍・非腫瘍の鑑別診断精度は共焦点内視鏡や病理診断の経験によらず、日本の医師の読影精度がドイツの医師より、消化器病医の読影精度が病理医より優れていることが明らかになった。この結果から、共焦点内視鏡によるリアルタイム組織診断は、共焦点内視鏡の画像分解能は顕微鏡に近いにもかかわらず、静止画を詳細に観察する病理診断よりも通常内視鏡検査の読影に類似していると考えられた。本研究成果は欧州消化器病週間におけるシンポジウムにおいて口頭発表する機会を得た。消化器内視鏡小型プローブ型共焦点内視鏡(フランスMaunaKea社製)の臨床導入を本邦で初めて安全に達成し、すでに40病変以上の表層性胃病変を対象に共焦点内視鏡観察を行った。また、これまでの研究成果は欧州消化器病週間およびアジア太平洋消化器病週間・世界内視鏡学会、米国消化器病週間など主要な消化器関連国際学会で発表し、その他の消化器、病理専門誌においても報告した。

さらに、国内外6施設が参加する国際多施設共同研究チームを立ち上げた。国内外6施設が参加する国際多施設共同研究を主導し、胃表層性病変の共焦点内視鏡診断精度に与える被験者の背景の影響を検討していく。内視鏡切除し得た病変については切除標本と病理組織診断との対比を行い、新たな胃癌診断体系の確立を目指す。さらに、今後の国際多施設共同研究によって、胃癌有病率の低い欧米においても正確な胃癌診断を行うことができるよう、共焦点内視鏡診断の教育システムの確立を目指す。本研究全体の予定症例数は100例であり、その達成を目指す。特に、これまで未分化型や組織混在型胃癌症例が少なく、共焦点内視鏡診断の精度の向上には更なる症例集積が不可欠である。また、次年度では全体の研究成果をまとめ報告するため、関連経費を来年度使用予定である。共焦点内視鏡観察に不可欠なフルオレセインなどの蛍光色素の費用や病理標本作成費、論文作成・出版経費、学会発表経費に使用予定
野外における花形態変異創出メカニズムの解明:候補遺伝子を用いた包括的アプローチ

生物の多様性をもたらす進化プロセスを総合的に理解するためには、研究に適した対象生物と進化現象を選択して研究を行う必要がある。ツツザキヤマジノギク(以後ツツザキ)は、花形態が近縁種と大きく異なる上に、集団内で著しい変異がある。この変異にCYC相同遺伝子(以後C}°C)の関与が予測され、また、予備的な調査により、花形態の違いによって送粉者誘引効率効率が異なることによる自然選択が生じる可能性が考えられた。本研究ではまず、ツツザキにおいて、候補遺伝子を用いた形態変異の遺伝的基盤を明らかにし、形態間に適応度の差があるかどうかを確認することで、集団内変異が適応進化の文脈で理解できるかどうかを検討する。さらに、花形態変異がどのようなプロセスで生じているのかを理解するために、集団の歴史的背景の解明を行う。これらの研究からツツザキ集団の花形態進化プロセスを包括的に理解することを目的とする。具体的には以下の3つの問題設定に沿い研究を行う。:【1】花形態の変異に遺伝的基盤はあるか/【2】花形態の違いが適応度の差をもたらすか/【3】集団内の花形態のばらつきはどのように生じたのか【1】に対する成果ツツザキの筒状花個体と舌状花個体より、CYCの単離を行い、配列にアミノ酸変異があることが明らかになった。【2】に対する成果野外において、筒状花個体と舌状花個体の訪花昆虫の訪花頻度と結実率の調査を行った。解析の結果、筒状花個体よりも舌状花個体の方が訪花頻度、結実率が高いことが明らかとなった。花タイプによって適応度の違いがあることが示唆された。【3】に対する成果野外集団において、各パッチの増殖率や各花タイプの出現頻度の調査を行った。その結果、筒状花個体の頻度が減少していることが明らかとなった。パッチ間で環境が異なることや、筒状花個体の結実率が暗いパッチより明るいパッチで高くなることなどが、集団内変異の存在を可能にしていると考えられた。起源については、今後さらなる解析が必要である。研究は、「9.研究実績の概要」に示したように、計画通りに1頂調に進展した。本研究によって、未解明であった対象種の野外における花形態変異の適応度の差や集団の個体群動態を明らかにすることができた。これらの理由から、全体として「おおむね順調に進展している。」と評価する。今後の推進方策については、平成24年度含め野外調査により得られた結果は論文にまとめ投稿を予定している。遺伝解析の結果については追試やデータの補強を行った後に、論文にまとめ投稿することを予定している。この変異にCYC相同遺伝子(以後CYC)の関与が予測され、また、予備的な調査により、花形態の違いによって送粉者誘引効率効率が異なることによる自然選択が生じる可能性が考えられた。:【1】花形態の変異に遺伝的基盤はあるか/【2】花形態の違いが適応度の差をもたらすか/【3】集団内の花形態のばらつきはどのように生じたのか【1】に対する成果ツツザキの筒状花個体と舌状花個体より、CYCの単離を行い、配列に変異があることが明らかになった。さらに、近縁種群においてもCYCを単離し、種内・種間での配列比較を行うことで、ツツザキ形態とCYC配列の間に相関があるかどうかを検討した。【2】に対する成果筒状花個体と舌状花個体の結実率を算出中である。また、花タイプと相関する自然選択圧の候補として三つの現象を予測・調査した。その結果、花タイプによって各現象に対する有利さが異なることが明らかとなった。計画以上の成果ツツザキの系統的位置を解明するために、核ITS配列を用いて系統解析を行った。野外集団において、各花タイプの出現頻度を調査し、前年度と比較し顕著な違いはないことが明らかとなった。

本研究ではまず、ツツザキにおいて、候補遺伝子を用いた形態変異の遺伝的基盤を明らかにし、形態間に適応度の差があるかどうかを確認することで、集団内変異が適応進化の文脈で理解できるかどうかを検討する。さらに、花形態変異がどのようなプロセスで生じているのかを理解するために、集団の歴史的背景の解明を行う。これらの研究からツツザキ集団の花形態進化プロセスを包括的に理解することを目的とする。具体的には以下の3つの問題設定に沿い研究を行う。:【1】花形態の変異に遺伝的基盤はあるか/【2】花形態の違いが適応度の差をもたらすか/【3】集団内の花形態のばらつきはどのように生じたのか【1】に対する成果ツツザキの筒状花個体と舌状花個体より、CYCの単離を行い、配列にアミノ酸変異があることが明らかになった。【2】に対する成果野外において、筒状花個体と舌状花個体の訪花昆虫の訪花頻度と結実率の調査を行った。解析の結果、筒状花個体よりも舌状花個体の方が訪花頻度、結実率が高いことが明らかとなった。花タイプによって適応度の違いがあることが示唆された。【3】に対する成果野外集団において、各パッチの増殖率や各花タイプの出現頻度の調査を行った。その結果、筒状花個体の頻度が減少していることが明らかとなった。パッチ間で環境が異なることや、筒状花個体の結実率が暗いパッチより明るいパッチで高くなることなどが、集団内変異の存在を可能にしていると考えられた。起源については、今後さらなる解析が必要である。研究は、「9.研究実績の概要」に示したように、計画通りに順調に進展している。また、今後の研究においても重要となる計画以上の内容についても、順調に進展している。さらに、現在、論文執筆中であり、全体として「おおむね順調に進展している。」と評価する。研究は、「9.研究実績の概要」に示したように、計画通りに1頂調に進展した。本研究によって、未解明であった対象種の野外における花形態変異の適応度の差や集団の個体群動態を明らかにすることができた。これらの理由から、全体として「おおむね順調に進展している。」と評価する。今後の推進方策については、平成23年度に解明されたことをベースに、追試やデータの補強を行うこと、また、計画していたが取り組んでいなかった部分について進展させることを考えている。さらに、平成23年度、24年度のデータを統合させ、博士学位論文、学術誌への投稿論文の作成を行う。今後の推進方策については、平成24年度含め野外調査により得られた結果は論文にまとめ投稿を予定している。遺伝解析の結果については追試やデータの補強を行った後に、論文にまとめ投稿することを予定している。
キリシタン文献国字本総合データベースに基づく近世初期日本語用字規範の計量的研究

キリシタン版国字本総合データベースの構築の完成によって、その文字使用法の統計的処理を可能とした。更に、キリシタン版諸本の原本調査を行い、原本の子細な観察と文字使用統計の両方に基づいて、その印刷技法に就て、新たな知見を得た。更に、キリシタン版の印刷技法が、慶長期古活字版に受け継がれている証拠として「面付け」を見出した。この他、踊り字の用法、漢字使用率など、データベースに基づく統計的な処理によって初めて見出される諸指標に基づいて、キリシタン版と慶長期古活字本との対比を行った。カサナテンセ図書館(ローマ)蔵の「さとるむんぢ」(1598)の原本を子細に調査した結果、本書が2丁(4ページ)を一組版面に組み付けて一気に印刷する「面付け」(imposition)による印刷を行っている事を発見した。「面付け」が和書について発見されたのは初めての事である。「面付け」は、洋書版本では当然の如くに行われているが、版本を遡る洋書写本にも見られ、又キリシタン版写本にも見られる事から、和書古活字版の他例を探索した処、「解紛記」慶長十二年古活字本下巻(国会図書館)がそれである可能性を見出した。更に他例を探索中であるが、「面付け」技術が古活字本にも見出される事は、キリシタン版の製版技術・組版様式が古活字版にも受け継がれた事の強い証拠であり、キリシタン版と古活字版の連続を裏付ける強い事実となるものである。2)「古活字版」データを含めたデータベースの拡張既に運用中のキリシタン文献国字本データベースに、上記「解紛記」及び「大鏡」など、主要な調査対象の「古活字版」データベースを試験的に加えて拡張し、踊り字・漢字使用率などの類形分類を行った。これらと、その基礎資料となる「ぎやどぺかどる」「太平記」漢字使用対照表は、報告書に詳述した。1)国字本版本に於ける「面付け」(imposition)の発見カサナテンセ図書館(ローマ)蔵の「さとるむんぢ」(1598)の原本を子細に調査した結果、本書が2丁(4ページ)を一組版面に組み付けて一気に印刷する「面付け」(imposition)による印刷を行っている事を発見した。1)「キリシタン版」原本調査「朗詠雑筆」、「ぎやどぺかどる」のミュンヘン本など、原本調査が未了であった諸本の調査を行い、版式等を確認した。この結果、「ぎやどぺかどる」の版心に転倒が生じている事を発見し、版心自体も一つの「活字」として組版されていた事を推論し、従来、匡郭・版心を固定した中に金属活字を詰め込む形で行われたものと漠然と推定されていたキリシタン版国字本の組版が、実は版面の要素全てを「活字」として扱う、毎丁組み替えの組版であるとの新しい知見を得た。又、「ぎやどぺかどる」の組版進行に、二つの相異なる組版規範を持つ担当者があり、和欧混植ついてこの両者に顕著な規範差が見出され、これらが交互に組版を担当している(2台進行)事を確かめた。このような組版規範から推定される複数台進行は「朗詠雑筆」にも見出される。この件に就ては、次年度に更に研究を深め、研究成果を国際学会等で発表する予定である。2)国際学会での発表第二回「宣教に伴う言語学」国際会議(The 2nd International Conference on Missionary Linguistics、サン・パウロ大学[ブラジル]、2004年3月10日13日)にて、キリシタン版語学書について特に出版の見地から研究発表を行い、参加者と討論・情報交換を行って、知見を深めた。又、この機会を利用して在外語学書の原本調査を行った。

3)「古活字版」電子化画像の作成対照のために、主として漢字仮名交じりの和文でいくつかの版式の「古活字版」各種の電子化画像を作成した。4)データベースの試作過年度の研究成果であるキリシタン文献国字本データベースは既に運用中であるので、それと同一仕様で「古活字版」データベースを試験的に作成した。本格的な運用は次年度を期す。1)「キリシタン版」原本調査による組版様式調査カサナテンセ図書館(ローマ)蔵の「さるばとるむんぢ」(1598)の原本を子細に調査した結果、本書が2丁(4ページ)を一組版面に組み付けて一気に印刷する「面付け」(imposition)による印刷を行っている事を発見した。「面付け」が和書について発見されたのは初めての事である。2)「面付け」(imposition)の研究、及び古活字版に於ける他例の探索「面付け」は、洋書版本では当然の如くに行われているが、版本を遡る洋書写本にも見られ、又キリシタン版写本にも見られる事から、和書古活字版の他例を探索した処、「解紛記」、慶長十二年古活字本下巻(国会図書館)がそれである可能性を見出した。更に他例を探索中であるが、「面付け」技術が古活字本にも見出される事は、キリシタン版の製版技術・組版様式が古活字版にも受け継がれた事の強い証拠であり、キリシタン版と古活字版の連続を裏付ける強い事実となるものである。3)国際ワークショップでの発表国際ワークショップ「キリシタン版を印刷から考える」(平成16年7月11日)にて、主として用字法・組版様式からのキリシタン版と古活字版との連続性について研究発表・討論を行い、有益な知見を得た。ワークショップの成果は、別途出版を準備中である。4)「古活字版」データを含めたデータベースの拡張既に運用中のキリシタン文献国字本データベースに、上記「解紛記」及び「大鏡」など、主要な調査対象の「古活字版」データベースを試験的に加えて拡張を進めた。
細胞内小胞輸送を介する主要組織適合性抗原クラスⅡの発現調節機構の解明

主要組織適合抗原クラスII(MHC-II)は、樹状細胞に発現し、外来抗原をT細胞に提示することで獲得免疫応答を誘導する。MHC-IIの細胞表面発現量は厳密に制御されているが、その詳細は不明であった。本研究では細胞内小胞輸送による細胞表面MHC-IIの発現制御機構を解析し以下の成果を得た。(1)MHC-IIは細胞表面に発現後、E3ユビキチンリガーゼであるMARCH-Iの局在するエンドソームに輸送されることで、ユビキチン化され、リソソームで分解される。(2)MHC-IIはRab11およびRab35の制御するリサイクリング経路で輸送される。主要組織適合抗原クラスII(MHC-II)は、樹状細胞に発現し外来抗原に対する獲得免疫応答を誘導するが、その細胞表面発現の制御機構は不明である。本研究はMHC-IIの細胞内輸送機構を解明し、MHC-IIの発現制御機構を明らかとすることを目的とする。今年度は以下の成果を得た。1)HeLa細胞を用いた実験により、膜タンパク質の形質膜へのリサイクリングを制御する低分子量Gタンパク質であるRab4およびRab11の不活性化変異体の導入は細胞表面MHC-II発現量を抑制することを見いだした。これはMHC-IIが、Rab4およびRab11を介したリサイクリング経路で細胞表面へ発現することを示唆するものである。2)樹状細胞表面MHC-IIの架橋はMHC-IIのエンドサイトーシスを促進し、発現低下を誘導するが、ダイナミン阻害剤はMHC-IIの架橋による細胞表面発現低下に影響を与えなかったことから、MHC-IIは架橋されるとダイナミン非依存的経路でエンドサイトーシスされることが示唆された。3)インバリアント鎖MHC-II複合体および、抗原MHC-II複合体のユビキチン化および分解を検討し、インバリアント鎖MHC-II複合体は、クラスリン依存的エンドサイトーシスで輸送されるためユビキチン化されないのに対し、抗原結合MHC-IIはクラスリン非依存的エンドサイトーシスによって輸送され、初期エンドソームでユビキチン化され分解されることを見いだした。主要組織適合抗原クラスII(MHC-II)は、樹状細胞に発現し、外来抗原をT細胞に提示することで獲得免疫応答を誘導するが、その細胞表面発現の制御機構は不明である。本研究ではMHC-IIの細胞内輸送機構に着目し、MHC-IIの発現制御機構を明らかとすることを目的とした。1)HeLa細胞を用いた実験により、膜タンパク質の形質膜へのリサイクリングを制御する低分子量Gタンパク質であるRab11およびRab35の不活性化変異体の導入は細胞表面MHC-IIのリサイクリングを阻害することを見いだした。この結果よりMHC-IIがRab11およびRab35を介したリサイクリング経路で輸送されることを示唆された。2)樹状細胞においてMHC-IIの発現が亢進するLPS刺激によって、Rab11の発現が上昇することを見いだした。またRab11およびRab35はMHC-IIと共局在することを見いだした。これらの結果により樹状細胞においてRab11およびRab35がMHC-IIの発現を調節している可能性が示唆された。2)樹状細胞表面MHC-IIの架橋はMHC-IIのエンドサイトーシスを促進し発現低下を誘導する。このエンドサイトーシスは、細胞内カルシウムのキレート剤であるBAPTA-AMで阻害されたことから、クロスリンクによるMHC-IIのシグナルに細胞内カルシウム流入が関与することが示唆された。医歯薬学計画した研究項目の中では、想定以上に進捗したものと、予想より遅れているものがあるが、全体としてはおおむね順調に進展していると判断している。当初の計画通り、樹状細胞への刺激に伴うMHC-II発現変化における細胞内小胞輸送の役割を解析する。1)前年度明らかとした、Rab4およびRab11によるリサイクリング経路の役割に重点をおいて検討を行う。具体的には、siRNAによるRab4およびRab11のノックダウンを用いて、これらのRabを介する輸送経路のMHC-II輸送における役割を解明する。2)MHC-IIの架橋によって誘導される細胞内シグナル伝達に着目し、MHC-IIの架橋によるエンドサイトーシス促進を誘導する細胞内シグナルを阻害剤を用いて解明する。3)輸送の変化によるMHC-IIの発現変化が、樹状細胞による抗原提示が誘導するT細胞の分化・活性化に与える影響を解析する。今年度は、費用のあまりかからない、培養細胞による解析を優先しため未使用の予算が生じた。未使用額に関しては、次年度の樹状細胞における解析を遂行する上で適切に使用する。消耗品を中心に研究計画に沿って研究費を使用する予定である。
分子系統解析手法を用いた現生渦鞭毛藻シストと遊泳細胞対応関係の再検討

従来の研究でも生シストから遺伝子情報を取得する方法はあり,それによって栄養細胞(プランクトン)とシストの対応関係を明らかにする研究はあった.しかし,それらは人工培養が可能な独立栄養性種のみであり,従属栄養性種について遺伝子情報の抽出は困難とされてきた.本研究ではこの点を改良すべく単細胞PCR法を活用して渦鞭毛藻の生シストから遺伝子情報を取得する方法の確立に取り組んだ.その結果,独立栄養性,従属栄養性を含む8種について生シストから遺伝子情報を取り出すことができた.この方法を用いてより精度の高い,確実な遊泳細胞と休眠細胞との対応関係を確立することができた.上記の種に加え, Cochlodinium cf.geminatumの栄養細胞とシストの対応関係が明らかになった.従来の研究でも生シストから遺伝子情報を取得する方法はあり,それによって栄養細胞(プランクトン)とシストの対応関係を明らかにする研究はあった.しかし,それらは人工培養が可能な独立栄養性種のみであり,従属栄養性種について遺伝子情報の抽出は困難とされてきた.本研究ではこの点を改良すべく単細胞PCR法を活用して渦鞭毛藻の生シストから遺伝子情報を取得する方法の確立に取り組んだ.その結果,独立栄養性,従属栄養性を含む8種について生シストから遺伝子情報を取り出すことができた.この方法を用いてより精度の高い,確実な遊泳細胞と休眠細胞との対応関係を確立することができた.上記の種に加え, Cochlodinium cf.geminatumの栄養細胞とシストの対応関係が明らかになった.渦鞭毛藻シストは物理化学的な耐久性を持つ細胞外被で被われており,微化石として堆積物より産することから,生層序学,古海洋学,系統進化学の基礎情報として活用される。渦鞭毛藻のシストと遊泳細胞の対応関係は,形態観察と培養実験により明らかにされてきたが,この対応関係の不明な種も多く存在する。本研究は,形態学的知見に分子系統解析手法を組み合わせることで,シスト-遊泳細胞対応関係の確立を目的とする。今年度は,セディメントトラップを用いて渦鞭毛藻シストを採集し,単細胞PCRによるDNA配列決定を試みた。セディメントトラップ試料は長崎県大村湾で定期的(2定点,月2回ずつ)に採集し,カナダ・ビクトリアで形態・遺伝子比較のための堆積物とプランクトン試料を入手した。遺伝子解析には,遊泳細胞で単細胞からの塩基配列の増幅・決定についての実績があり,また,渦鞭毛藻では比較的多くの種の配列が決定・公開され,比較が容易なSSUrDNAを用いた。その結果,1,既にシスト-遊泳細胞対応関係の明らかなPyrophacussteiniiを用いて,シストの形態視察後に塩基配列を決定し,同種の配列であることを相同性検索で確認した。シスト1細胞から塩基配列増幅・決定が可能であることを確認した。2,セディメントトラップに補足された小型球形でシスト壁が無色・平滑であるシストの遺伝子解析を行い,Alexandrium hiranoiと部分配列が一致する結果を得た。形態形質のみでは種同定できないシストでも分子同定が効果を発揮することが確認できた。今年度はDNA抽出のためにPCRチューブ内でガラス針を用いてシスト壁を直接破砕する方法を用いた。しかし,渦鞭毛藻のシスト壁は種により厚さと色が異なるため耐久性の差異があり得る。この手法でDNA抽出が困難な種が出現した際には,凍結-解凍やマイクロマニュビレーターを用いた破砕を試みる。渦鞭毛藻シストは物理化学的な耐久性を持つ細胞外被で被われており、微化石として堆積物より産することか、生層序学、古海洋学、系統進化学の基礎情報として活用される。渦鞭毛藻のシストと遊泳細胞の対応関係は、形態観察と培養実験により明らかにされてきたが、この対応関係の不明な種も多く存在する。本研究は、形態学的知見に分子系統解析手法を組み合わせることで、シスト-遊泳細胞対応関係の確立を目的とする。今年度は、昨年度に引き続きセディメントトラップを用いて渦鞭毛藻シストを採集し、単細胞PCRによるDNA配列決定を試みた。セディメントトラップ試料は長崎県大村湾で定期的(1定点、月2回ずつ)に採集した、遺伝子解析には、遊泳細胞で単細胞からの塩基配列の増幅・決定についての実績があり、また、渦鞭毛藻では比較的多くの種の配列が決定・公開され、比較が容易なSSUrDNA、更にLSU r DNAを用いた。その結果、1、無殻渦鞭毛藻Polykrikos kofoidiiとPokykrikos schwartziiのシストと遊泳細胞の対応関係が逆であったことが判明した。すなわち、荒い網目で装飾されるシストはP.kofoidiiで、棚状突起物を備えたシストはP.schwazrtziiであることが遺伝子系統解析とシスト発芽実験によって確認できた。2、これまで二重膜で構成され、頂板発芽孔を持つ褐色球形のシストはこれまでProtoperidinium americanumにしか知られていなかった。大村湾で採取した同様の形態を持つシストはProtoperidinium parthenopisと同定される鎧板配列を持ち、P.americanumと異なっていた。この2種は遊泳細胞の分子系統解析結果でも明瞭に識別された。

渦鞭毛藻類は浮遊細胞と休眠細胞の形態が著しく異なるため,一つの生物が二つの異なる生物名-すなわち浮遊細胞と休眠細胞が異なった生物名を持つこととなったことが渦鞭毛藻シスト研究に混乱をもたらしてきた。この混乱を解消するために,両者の対応関係の解明は浮遊細胞と休眠細胞の形態形質を拠り所として研究が進められてきたが,必ずしも十分な結果が得られてきていなかった。本研究ではこれまで蓄積した形態情報に加えに,分子生物学的手法を組み合わせることによって,より精度の高い,確実な遊泳細胞と休眠細胞との対応関係を確立し,渦鞭毛藻の系統分類と進化過程の考察に寄与できた。今年度は平成18年度に確立した分析手法を用いた従属栄養種群のProtoperidinium属Monovela群やPolykrikos類,独立栄養種群のGymnodinium類, Cochlodinium類の遊泳細胞やシストの遺伝子解析を実施するともに走査型電子顕微鏡(JEOL JSM-5310LV)を用いた形態観察を行った。その結果,Polykrikos類では表面に編み目構造を持つシストをP. schwartzii,棒状から棚状突起物をも備えたシストをP. kofoidiiと同定してきたが,遊泳細胞との対応関係が全く逆であることを明らかにした.また, Protoperidinium属Monovela群ではProtop. americanumに形態的に類似したシストはP. partenopesも生産することを明らかにした.さらに,球形・褐色で表面が刺状突起物で覆われたシストを生産する種を発見し,Protoperidinium tricingulatumとして新種記載を行った.
モデルネにおける神秘主義のポテンツ-グスターフ・テオドール・フェヒナーの系譜

心理の動きを数量化する方法論の確立者として、今日ではもっぱら実験心理学の鼻祖の一人としてのみ記憶されているグスターフ・テオドール・フェヒナー(1801-1887)は、その実、心理学、哲学をはじめ、芸術一般にも深甚な影響を与えた思想家であった。本研究は翻訳がごく少数しかなく、またそもそも晦渋であるため、日本ではほとんど知られていないフェヒナーの思想を、特にその神秘主義的な傾向を軸に分析するものである。研究の初年度にあたる本年は、モデルネがポテンツとして胚胎する神秘主義的系譜の一源流を成すフェヒナー思想と生涯のアウトラインを描出するために、フェヒナーに関する代表的な評伝(ドイツ最初のSF作家といわれるクルト・ラスヴィッツ、実験心理学者のヴィルヘルム・ヴント、フェヒナーの甥であるヨハネス・クンツェ、作家ヴィルヘルム・ベルシェによる4点)、ならびに先行研究の伝記的記述に基づき、フェヒナーの思想と生涯のあらましを2回の口頭発表においてまとめた。これら口頭発表の原稿は21年度に活字にして発表する予定である。また、普通3期に区分されるフェヒナーの生涯のうち、その第1期に発表され、少ないながらも今なお読者を獲得しているフェヒナーの小論文『死後の生活に関する小冊子』を検討し、後期から晩年にかけて矢継ぎ早に出版された精神物理学的かつ汎神論・汎心論的な諸著作の萌芽が見られることを分析した。さらにフェヒナーに少し先行する時代の自然哲学、特にローレンツ・オーケンおよびシェリングのそれを検討し、それらがフェヒナーにどのような影響を与えたのかを検討した。ただしシェリングに関しては、ドイツ観念論哲学が非常に難解であるうえ、カント、フィヒテに遡って考察を加える必要があるため、まだ理解が不十分であり、さらなる検討が必要となる。フェヒナーの思想はフロイトやマッハを通じて、特にオーストリア=ハンガリー二重帝国(カカーニエン)の思想や文学に多大な影響を与えているにも関わらず、日本ではほとんど注目されることがなかった。本年度の研究において、この多大な影響を解明する端緒を、わずかではあるが開くことができた。ふつう3つの時期に区分されるフェヒナーの生涯(第I期:生誕-1840年-第II期:1840-1843年、重篤な神経症との闘病期間/第III期:1843年以降、病気克服ののちに神秘主義的な著作を爆発的に産み出していった晩年期)のうち、特に第II、第III期におけるフェヒナーの思想と著作の分析を当初の目標とした。それに関し二つの大きな成果を得た。(1)科学研究費補助金による海外出張(平成21年8月8日-同17日)。ドイツ連邦共和国ライプツィヒ大学所属の「フェヒナー協会」を訪れ、同大学文書館ならびに図書館、および「フェヒナー協会」本部(心理学研究所)で日本では入手困難な文献の調査および収集を行うことができた。また「フェヒナー協会」会長マイシュナー=メトゲ博士に、ドイツにおけるフェヒナー研究の現状や動向をうかがうとともに、今後の研究へのアドヴァイスをいただいた。(2)日本独文学会全国大会におけるシンポジウムの企画・司会・発表。「神秘主義的世界像と自然科学-もうひとつのモデルネー」をテーマとするシンポジウムを他3名と企画し、司会と発表を行った。19世紀中葉から20世紀前半のドイツ語圏に現れたいくつかの神秘主義的世界像を取り上げ、それらを当時の自然科学との関連において定位することによって、「モデルネ」を別様の光の中に浮かび上がらせることを目的とするこのシンポジウムで申請者は、自然科学的な合理性が世界把握の原則として絶対的な優位を占めていた19世紀の半ばに「魂は物理的に計測できるか」という問いを立て、実証主義的自然科学と、独特な神秘主義的信仰の間に整合性を見出そうとした思想家としてのフェヒナーを取り上げた。フェヒナーが、一般には非科学的とされる神秘主義的世界像と当時の実証主義自然科学的世界像の両者を架橋しようとして一身に体現したモデルネにおける「きしみ」を描出することを試みた申請者の発表に関しては、盛んな質疑応答があった。ふつう3つの時期に区分されるフェヒナーの生涯(第I期:生誕-1840年/第II期:1840-1843年、重篤な神経症との闘病期間/第III期:1843年以降、病気克服ののちに神秘主義的な著作を爆発的に産み出していった晩年期)のうち、本年度は第II期から第III期へ移行する時期に焦点を当てた。具体的にはフェヒナーの生命をも脅かした重篤な神経症に関するこれまでの研究を渉猟し、主要な病因の一つとして「ホーリスティックで調和的な世界把握(自然哲学)と、個別的で数学的・経験的な世界把握(自然科学)の分裂と葛藤をフェヒナー自身が体現していること」がある、という申請者(福元)の仮説を支持するいくつかの文献を紹介した。

また晩年に神秘主義的な著作を次々と発表していくにあたって、それらの劈頭をかざる画期的な著作となった『ナナ、あるいは植物の魂の生活について』を詳細に分析し、フェヒナー独自の「植物有魂論」に関する1.自然科学的根拠、2.美的根拠、3.目的論的根拠を指摘した。「植物有魂論」はフェヒナー以前からの伝統があるが、フェヒナーのそれは自然科学的な根拠を模索しながらもきわめて詩的・文学的な、やはり分裂や葛藤を体現したものであった。それゆえ『ナナ』は、例えばシュライデンなどの実証主義的な植物学者からは、厳しく批判された。「植物有魂論」は必然的に、「魂」の存在自体を承認するか、また「世界は魂に満ちているのか」という形而上的で自然神学的な問題へと移行する。独特な思想家フェヒナーを特定の系譜に定位することができるとすれば、スピノザから発するロマン主義的自然神学の後裔ということになるであろう。フェヒナーは「遅れてきたロマン主義者」だったのである。『ナナ』に関してはまた、その出版年がドイツに「三月革命」が勃発した1848年であることに注目し、まったく非政治的に見えるフェヒナーおよび『ナナ』とドイツの政治的混乱とのひそかな関連に言及した。
植物の減数分裂進行を支えるRNAを介した制御システムの研究

減数分裂は生物の遺伝的多様性創出を担う生命現象である。本課題では減数分裂進行に重要な3つのイネ蛋白質の機能を解析した。減数分裂移行に機能するMEL2について、結合RNA配列の同定と、制御下にある遺伝子の推定を行った。また生殖細胞特異的に機能するMEL1と葯タペート組織特異的転写因子EAT1の解析から、small RNAが減数分裂を細胞非自律的に制御し、染色体リモデリングを誘起する可能性を見出した。これらの結果から植物の減数分裂進行には、RNAを介したエピジェネティックな制御機構が重要な役割を担うことが明らかとなった。1.減数分裂の移行に必須のイネMEL2は、標的とするmRNAに直接結合して翻訳を制御する可能性が高い。MEL2蛋白質のRNA認識モチーフ(RRM)との結合が示唆される10塩基長の配列を保存する249の遺伝子を選抜し、少なくとも5つは試験管内で実際にMEL2 RRMと結合することを確認した。その他、生体内でMEL2と結合するRNA配列を同定するため、タグ付きMEL2蛋白質を発現する形質転換イネを作成した。2.イネの減数第一分裂の進行に必須のアルゴノート(AGO)蛋白質MEL1が減数分裂細胞で結合するmRNAを同定するため、動物細胞で報告があるCLIP法の適用を検討した。しかし細胞壁をもつ植物生殖細胞への適用は困難であり、他の方法を検討することとした。そこで今年度は、細胞抗体染色法によるMEL1機能解析を行い、MEL1が減数第一分裂初期に粗面小胞体上に凝集する傾向をみいだした。また、MEL1が一時的に核にも存在する可能性も示された。MEL1が減数分裂組換えなど減数分裂の主要イベントで必須の役割を果たすことを、細胞学的解析から明らかにした。エピジェネティックなクロマチン構造制御に深く関わるDNAメチル化を解析する目的で、レーザー照射によるイネ減数分裂細胞単離を試みた。しかし細胞ダメージが激しく、メチル化解析には不向きであり、他の方法を検討することとした。そこで、やはりクロマチン制御と関わりの深井ヒストン修飾を調べたところ、ヒストンH3の10番目セリンのリン酸化がmel1変異体の減数分裂細胞で異常に亢進しており、MEL1が減数分裂染色体のクロマチン修飾をゲノムワイドに制御する可能性が示された。3.イネの減数分裂への関与が予想されるOsAGO3蛋白質に対する抗体の作成を試みたが失敗に終わった。OsAGO3機能欠損が期待されたTos17挿入変異個体では、減数分裂で顕著な異常は認められず、種子稔性も正常であった。1.減数分裂の移行に必須のイネMEL2は、標的mRNAに結合して翻訳を制御する可能性が高い。そこで突然変異体の葯を用いた2次元電気泳動を行い、変異体で増加する6つ、および減少する7つの蛋白質スポットを同定した。質量分析によりそれぞれのスポットに含まれる蛋白質の部分アミノ酸配列を同定し、イネゲノム情報を用いて対応遺伝子をリストアップした。過去の報告から減数分裂での機能が推測される遺伝子も含まれていた。2.イネの減数第一分裂の進行に必須のアルゴノート(AGO)蛋白質MEL1を免疫沈降し、一緒に回収される蛋白質を質量分析したところ、RNA二次構造をほどく機能をもつRNAヘリカーゼなど、いくつかの興味深い蛋白質を同定した。また蛋白質の翻訳を担うリボソーム構成蛋白質が多数検出された。MEL1は粗面小胞体上のリボソームと結合する可能性を示す昨年の結果とよく一致し、MEL1が減数分裂で蛋白質の翻訳を制御する可能性が益々高まった。MEL1が減数分裂染色体のクロマチン構造に与える影響を調べるため、ヒストンH3の修飾や、転写を行うRNAポリメラーゼIIの細胞内局在を観察した。その結果、正常なイネ生殖細胞の減数第一分裂初期ではゲノムワイドに転写が不活化されており、不活化にはMEL1機能が必須であることを示した。3.減数分裂細胞を保育する周辺体細胞の層分化に機能する転写因子TTMが、生殖特異的small RNAの生合成に必要なDCL遺伝子や、small RNA前駆体遺伝子の転写を促進することを見いだした。特にDCL遺伝子については、TTMが直接上流の調節領域に結合して転写を促していることを明らかにした。TTMによって生合成が促進されるsmall RNAのなかには、MEL1結合small RNAに含まれるものもあり、生殖細胞と周辺体細胞との細胞間相互作用の観点から極めて興味深い結果が得られた。減数分裂組み換えは、生物の遺伝的多様性の創出を担う生命現象の一つであり、そのメカニズムの解明は育種効率の向上などにつながる重要課題である。本課題では、イネの減数分裂進行に重要な蛋白質の機能解析を目的とする。(1)本課題では、減数分裂移行を制御するイネRNA結合蛋白質MEL2が、200個以上の遺伝子のmRNAと結合し得る可能性を明らかにしてきた。今年度はその成果論文をPlant Molecular Biology誌で発表した。また、蛍光蛋白質GFPを融合したMEL2(MEL2-GFP)の細胞から、MEL2が減数分裂直前の生殖細胞の細胞質で斑点状に局在することを明らかにした。