hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Test Mining : リポジトリマイニングによる組合わせテスト品質最適化

昨年度に開発したアルゴリズムを,パラメータの重み付け,及び,テストの品質向上のために活用し、評価する手法の提案を行った.まず,パラメータの重み付け手法開発では、マイニングフレームワークによって抽出したパラメータに対して,品質予測モデルを用いてテスト品質に影響する度合いに基づく重要度分析を行い、重み付けする手法の開発を進めた.更に,テストケースの優先度付けによって品質を最適化する手法の開発を行っている.これを国内のワークショップにおいて口頭発表している.また,評価用データとしてテストケースを含むソフトウェアプロジェクトを大量に取得する必要があり,効率的なプロジェクト探索手法を実装している.また,カナダクイーンズ大学のYin Zou教授を招聘し,研究の打ち合わせを行い,助言を得た.また,研究協力者がカナダのZou教授の研究室を訪問し,効率的な探索手法の共同での実装を行うことになった.研究代表者が7月に体調を悪化させ,9月以降休業している.そのため,研究期間を1年延長し,研究分担者のサイトにおいて,評価データ取得手法の検討を中心に行っている.また,国際学会に向けて論文投稿の準備を進めている.研究代表者の休業が明けるのを待ち,予定していたアルゴリズムの評価等を実施予定である.テストマイニングフレームワークの開発に向けてのタスクを次のように実施した.まず,マイニングフレームワーク開発のために,(1)公開レポジトリSIR(Software Infrastructure Reposiory)の3つのCプログラムのプロジェクトFlex, Grep, Makeを対象に,必要なテストコード,テストモデル(パラメータ,値,制約条件式),バグ履歴,テスト結果を,半自動で抽出できるところまで実施した.(2)また,公開のパッケージ管理システムMacPortsに対しては,その設定ファイルから構成テスト用のテストモデルとペアワイズテストを全自動生成するプログラムと,テスト実行環境を開発した.次に,マイニングフレームワークを用いたテストの品質向上へ向けて設計・評価に関しては,まず,(3)1で抽出した情報を用いて,テストとバグ履歴を入力としたベイズ推定に基づいてテストモデルのパラメータと値に対して優先度を表す重みを自動的に計算する基本アルゴリズムを開発した.提案法は幾つかのプログラムバージョンに対する初期評価を行い,その結果を国際会議のポスター論文にまとめ,発表した.また,(4)与えられたパラメータの重み付けを入力として異なる戦略で組み合わせテストを生成したときのテスト効果(バグ検出率とコード網羅率)を1のレポジトリから抽出した情報を用いて比較した評価実験を行った.その結果は,国際会議と国際ワークショップで発表した.また,(5)組み合わせテストの効果をさらに向上させるためにテスト間の距離を考慮した新たなテスト設計法を考案し,その評価結果を国際会議で発表した.また,テスト結果をデバックとテスト最適化へフィードバックさせるために(6)テストの結果から回帰分析と機械学習の手法に基づいて不具合組み合わせを特定するアルゴリズムを開発し,国内ワークショップ等で発表した.研究分担者,学生(リサーチアシスタント含む)と協力して,計画通りにおおむね順調に進展している.テストマイニングフレームワークの開発に向けてのタスクを次のように実施した.まず,マイニングフレームワーク開発のたに,(1)公開レポジトリSIR(Software Infrastructure Reposiory)の3つのCプログラムのプロジェクトFlex, Grep, Makeを対象に,必要なテストコード,テストモデル(パラメータ,値,制約条件式),バグ履歴,テスト結果に加えて,開発履歴における各プログラムのコードカーバレッジも自動で抽出するプログラムを作成した.次に,マイニングフレームワークを用いたテストの品質向上へ向けて設計・評価に関しては,まず(2)1で抽出した情報を用いて,前年度に開発したテストとバグ履歴を入力としたベイズ推定に基づいてテストモデルのパラメータと値に対して優先度を表す重みを自動的に計算する基本アルゴリズムを更に発展させ,テストとバグの履歴に加えてプログラムのコードカバレッジ情報も追加してテストの優先度付けができるプログラムを開発し,提案法の評価実験を進めている.次に,テスト結果をデバッグとテスト最適化へフィードバックさせるために(3)前年度に開発したテストの結果から回帰分析と機械学習の手法に基づいて不具合組み合わせを特定するアルゴリズムを発展させ,必要な探索空間を大幅に削減しながら効率よく不具合特定を可能にしたアルゴリズムの開発と評価を行い,国内ワークショップと国際会議で発表を行った.更に(4)テスト結果をプログラムの自動デバッグへ応用する研究に関して国際連携し,国際ワークショップで発表を行った.研究分担者,学生(リサーチアシスタント含む)と協力して,計画通りにおおむね順調に進展している.昨年度に開発したアルゴリズムを,パラメータの重み付け,及び,テストの品質向上のために活用し、評価する手法の提案を行った.まず,パラメータの重み付け手法開発では、マイニングフレームワークによって抽出したパラメータに対して,品質予測モデルを用いてテスト品質に影響する度合いに基づく重要度分析を行い、重み付けする手法の開発を進めた.更に,テストケースの優先度付けによって品質を最適化する手法の開発を行っている.これを国内のワークショップにおいて口頭発表している.また,評価用データとしてテストケースを含むソフトウェアプロジェクトを大量に取得する必要があり,効率的なプロジェクト探索手法を実装している.また,カナダクイーンズ大学のYin Zou教授を招聘し,研究の打ち合わせを行い,助言を得た.また,研究協力者がカナダのZou教授の研究室を訪問し,効率的な探索手法の共同での実装を行うことになった.研究代表者が7月に体調を悪化させ,9月以降休業している.そのため,研究期間を1年延長し,研究分担者のサイトにおいて,評価データ取得手法の検討を中心に行っている.

また,国際学会に向けて論文投稿の準備を進めている.次年度も,研究分担者と打ち合わせを密に行い,大学の学生たち,リサーチアシスタントとも協力して研究を遂行し,研究発表も積極的に行っていく方針である.最終年度も,研究分担者と打ち合わせを密に行い,大学の学生たち,リサーチアシスタントとも協力して研究を遂行し,研究発表を積極的に行っていく方針である.研究代表者の休業が明けるのを待ち,予定していたアルゴリズムの評価等を実施予定である.予定していた国内出張ができなかったので次年度に繰り越して使用する予定です.病気休業につき,予定されていた国際会議等への出席ができなかった.休業復帰後に,論文投稿やワークショップ出席に利用する予定である.
分子病としての血漿アポ蛋白異常症の病態とそのリポ蛋白代謝における意義に関する研究

1.アポE同位体と動脈硬化:アポEにはE4,E3,E2の遺伝的な同位体が存在し、それぞれリポ蛋白代謝における作用の異なることが示唆されている。一般健常者でアポEの同位体別にリポ蛋白を検討すると、E2では有意にVLDLが上昇し、逆にLDLは低下していた。一方、E4ではDLDLの上昇傾向が示された。虚血性心疾患の症例ではE4症例の高頻度、E2症例の低頻度が認められ、E4素因は動脈硬化を促進させ、E2素因は防御的に働いているものと考えられた。2.変異アポEとリポ蛋白代謝:アポE5・アポE7の変異アポEについて、リポ蛋白代謝に及ぼす影響、特にLDLレセプタ-に対する結合能を検討した。アポE5はLDLとよく競合し、E5は野生型E3よりも約2倍、LDLレセプタ-への親和性の高いことが示された。このため、アポE5症例では高コレステロ-ル血症が出現し、動脈硬化を発症しやすいものと考えられる。一方、アポE7ではアポE3に比べ、LDLレセプタ-結合活性が約1/4に低下していることが明らかにされた。3.小児におけるアポE同位体とリポ蛋白代謝:血清を直接、等電点電気泳動にかけ、イムノブロッティング法を用いてアポE同位体の分析を行なう簡便法を開発した。この方法を用いて、小児におけるアポE同位体とリポ蛋白代謝を検討した。小児において、成人において観察されていたアポE同位体による血清リポ蛋白・アポ蛋白に及ぼす影響がすでに小児において出現してた。早期にアポE同位体を決定し、食餌指導を行うことにより、高脂血症の予防の可能性が示唆され、将来この方向へ進めることが望まれる。1.動脈硬化症におけるアポリポ蛋白E同位体急性心筋梗塞あるいは狭心症により当センタ-CCUに入院中の症例199例(CCU群)および人間ドックを受診した一般健常者211例(健常群)を対象とし、血清リポ蛋白・アポE同位体を分析した。虚血性心疾患の症例ではEー4症例の高頻度、E2症例の低頻度が認められ、これはCCU群の女性において最も顕著であった。また、男性でもリポ蛋白代謝異常の関与が強いとされる若年者において同様の傾向が認められた。しかし高齢の男性ではアポE同位体の分布は健常群と類似し、血清リポ蛋白異常以外の因子の関与が大きいものと思われる。以上のように、E4素因は動脈硬化を促進させ、E2素因は防御的に働いているものと考えられた。2.変異アポE5とリポ蛋白代謝アポE5について、リポ蛋白代謝に及ぼす影響、特にLDLレセプタ-に対する結合能を検討した。アポE5はLDLとよく競合し、E5は野生型E5よりも約2倍、LDLレセプタ-への親和性の高いことが示された。レセプタ-への親和性を欠如するアポE2の症例ではカイロミクロンレムナントの肝臓への取り込みに障害があり、このため肝細胞では相対的にコレステロ-ルが不足し、LDLレセプタ-にアップ・レギュレ-ションがかかる。また、VLDLからLDLへの変換の効率も悪く、結果的に血漿LDL濃度の低下が導かれると考えられている。それゆえ、今回のE5に関する成積から、E2の場合とちょうど正反対の機構によって、血漿LDL濃度の上昇が来すことが予想される。実際、アポE5症例では高頻度に高LDL血症を伴っており、これが本症における動脈硬化症と関連しているものと考えられる。

1.アポE同位体と動脈硬化:アポEにはE4,E3,E2の遺伝的な同位体が存在し、それぞれリポ蛋白代謝における作用の異なることが示唆されている。一般健常者でアポEの同位体別にリポ蛋白を検討すると、E2では有意にVLDLが上昇し、逆にLDLは低下していた。一方、E4ではDLDLの上昇傾向が示された。虚血性心疾患の症例ではE4症例の高頻度、E2症例の低頻度が認められ、E4素因は動脈硬化を促進させ、E2素因は防御的に働いているものと考えられた。2.変異アポEとリポ蛋白代謝:アポE5・アポE7の変異アポEについて、リポ蛋白代謝に及ぼす影響、特にLDLレセプタ-に対する結合能を検討した。アポE5はLDLとよく競合し、E5は野生型E3よりも約2倍、LDLレセプタ-への親和性の高いことが示された。このため、アポE5症例では高コレステロ-ル血症が出現し、動脈硬化を発症しやすいものと考えられる。一方、アポE7ではアポE3に比べ、LDLレセプタ-結合活性が約1/4に低下していることが明らかにされた。3.小児におけるアポE同位体とリポ蛋白代謝:血清を直接、等電点電気泳動にかけ、イムノブロッティング法を用いてアポE同位体の分析を行なう簡便法を開発した。この方法を用いて、小児におけるアポE同位体とリポ蛋白代謝を検討した。小児において、成人において観察されていたアポE同位体による血清リポ蛋白・アポ蛋白に及ぼす影響がすでに小児において出現してた。早期にアポE同位体を決定し、食餌指導を行うことにより、高脂血症の予防の可能性が示唆され、将来この方向へ進めることが望まれる。
水田土壌の自律的な窒素肥沃度維持を担う微生物メカニズムの解明

I.窒素無施用水田における窒素動態と窒素固定・DNRA微生物、その制御要因の解析1.窒素動態解析:新潟県農業総合研究所内の肥料長期連用試験水田の窒素無施用区(NN区)と化学肥料施用区(CF区)土壌を用いて有機物(稲わら)添加の有無や温度、水管理を変化させた様々な条件のマイクロコズムを構築し、それらの窒素固定活性への影響とその変動をアセチレン還元活性法によって調べた。その結果、有機物を添加して土壌Ehが下降し還元された鉄の量が増加している際に活性が最大となった。これらのことから、本章において検出された窒素固定活性は鉄還元菌に由来する可能性が高く、冬季期間にも鉄還元菌による窒素固定が行われていると考えられた。2.窒素固定・DNRA微生物解析:前年度に取得した窒素固定遺伝子を保有しているAnaeromyxobacter sp.の窒素固定活性を、培地条件下および水田土壌マイクロコズム条件下において調査した。その結果、どちらの条件においてもこれらは窒素固定活性を示し、土壌中においても窒素固定を行っていることが示唆された。II.脱窒反応で生成したN2Oの固定反応の検証Bradyrhizobium 46を用いて15N2Oを添加・培養し、気相部の15N2O濃度、15N2濃度、菌体の15N同位体比を経時的に測定した。培養時間と共に15N2Oは減少し、15N2が増加した。気相部において、15N2O減少量と15N2生成量の差分と、菌体に同化された15N量について比較してみると、どの培養時間においても、還元された15N2Oの量と生成された15N2の量の差分の方が菌体に同化された15Nの量よりも多いことが確認された。これらはN2Oがnif遺伝子を有する脱窒菌株によって同化的に還元されていることを強く支持する結果である。いずれの項目についてもほぼ計画通りに進行しており、おおむね順調に進展していると判断される。水田土壌における鉄還元細菌の窒素固定活性は、土壌への鉄の添加により高まることが期待される。このことを、室内系土壌ミクロコズム試験ならびに圃場試験で確かめる。これまでに水田土壌から分離してきた、窒素固定活性を有する鉄還元細菌について性状解析を進める。N2Oを同化することが確かめられたBradyrhizobiumについて、nosならびにnif遺伝子破壊株を作成して、N2O同化経路を明らかにする。I.窒素無施用水田における窒素動態と窒素固定・DNRA微生物、その制御要因の解析1.窒素動態解析:新潟県農業総合研究所内の肥料長期連用試験水田の窒素無施用区(NN区)と化学肥料施用区(CF区)土壌の酸化還元電位(Eh)、アンモニア濃度、Fe2+濃度、硝酸濃度、全窒素・炭素量を経時的に測定した。その結果、NN区とCF区において土壌理化学性は同様に変動していること、両区土壌において収穫後に少なくなっていたアンモニアが冬季から春季にかけての還元条件下で回復していることが明らかとなった。2.窒素固定・DNRA微生物:上記の圃場の土壌RNAを用いて窒素固定遺伝子nifDとDNRA遺伝子nrfAそれぞれの転写産物を対象とした定量PCR解析を行い、それらの季節変動を調査した。

両区の水田土壌において年間を通してAnaeromyxobacter属、Geobacter属の鉄還元細菌による窒素固定が行われており、また、主に水稲栽培期にDNRA反応が起きていると考えられた。滅菌水田土壌を培地とした集積培養法を用いて、Anaeromyxobacter属細菌を10株以上、およびGeobacter属細菌を100株以上単離することに成功した。これらの株について16S rRNA遺伝子配列を解読し、系統関係を調べたところ、3株のAnaeromyxobacter属細菌、14株のGeobacter属細菌が新規株であることがわかった。また、Geobacter属細菌の新規株について窒素固定活性を測定したところ、全ての株で高い活性が確認された。これら細菌はこれまで水田土壌から単離されておらず、本研究は極めて重要な新規株の取得に成功した。II.脱窒反応で生成したN2Oの固定反応の検証水田土壌から脱窒菌として分離し、窒素固定能を有することも確認したBradyrhizobiumを、気相にN2Oを添加した無窒素培地で培養し、菌体の増殖とN2Oの減少を調べた。Bradyrhizobium 46が最も高いN2O減少率を示した。ほぼ計画通りに進行しており、順調に進展していると判断した。水田土壌における鉄還元細菌の窒素固定活性は、土壌への鉄の添加により高まることが期待される。このことを、室内系土壌ミクロコズム試験ならびに圃場試験で確かめる。これまでに水田土壌から分離してきた、窒素固定活性を有する鉄還元細菌について性状解析を進める。N2Oを同化することが確かめられたBradyrhizobiumについて、nosならびにnif遺伝子破壊株を作成して、N2O同化経路を明らかにする。水田土壌における窒素動態と機能遺伝子解析については、室内系土壌ミクロコズムを構築して、より詳細に解析する。鉄還元菌の分離については、得られた分離菌株を用いて、窒素固定活性に及ぼす環境因子についての解析を進める。
１４－３－３タンパク質のリン酸化依存性結合阻害物質の探索

14ー3ー3タンパク質結合を阻害する物質のハイスループット探索系を構築し理研天然化合物ライブラリーの探索を行った。一次スクリーニングでは7種の14ー3ー3タンパク質の結合のいくつかを阻害する物質が取得された。それらのヒット化合物から2次スクリーニングを行い、7種の14ー3ー3タンパク質の結合のうち全てを阻害出来る物質がひとつ取得出来た。この物質はがん細胞の増殖も阻害した。これまで得られている14ー3ー3阻害物質で全ての14ー3ー3タンパク質を阻害する物質は報告されていない。14ー3ー3タンパク質の阻害物質を取得することでがん細胞の増殖を阻害する物質を取得することが出来ることが示された。24年度に構築した探索系を用いて結合を阻害する物質の探索を開始した。阻害剤の候補化合物群は研究室にすでに保有している化合物ライブラリーから本年度は約1万の精製化合物を利用した。蛍光タンパク質を用いたアッセイ系で約40の化合物が14ー3ー3σタンパク質と標的リン酸化ペプチドの結合を50%以上阻害した。そこで、これらの化合物について、HEK293細胞で発現したヒトWEE1タンパク質と14ー3ー3σタンパク質との結合を阻害する活性によって二次評価を行った。ヒトWEE1タンパク質はGSTタンパク質との融合タンパク質としてHEK293細胞で発現し、その細胞抽出液を、14ー3ー3σタンパク質を発現させた大腸菌の抽出液と混ぜた後にグルタチオンビーズによってプルダウンし、結合した14ー3ー3σタンパク質をSDS電気泳動、CBB染色によって定量した。この二次評価系で7つの化合物が終濃度10μMで結合を50%以上阻害した。次にこれらの化合物について他の6種類のヒト14ー3ー3タンパク質について結合を阻害するか否かの評価を行った。他の6種類のヒト14ー3ー3タンパク質をコードするcDNAを単離し、大腸菌発現ベクターに導入し、タンパク質の発現を行い上述の14ー3ー3σと同様の結合評価系を構築した。7つの化合物については、どれも他の14ー3ー3も同様に阻害することが確認された。しかし、目標とする1μMより低い50%阻害濃度の化合物は現在までのところ得られていない。しかし、探索系は期待通りに機能していることが確認できたので26年度も探索を行いより強い活性を有する物質取得を目指すこととした。14-3-3タンパク質のリン酸化ペプチドへの結合測定系を構築した。蛍光タンパク質融合14-3-3タンパク質(7種のアイソフォーム全て)と標的リン酸化ペプチドの結合は、これまでに他のタンパク質で確立した測定系、すなわち標的ペプチドを共有結合した96穴プレートに蛍光標識タンパク質をいれて結合する蛍光を測定する系を応用することで構築した。以下はその詳細である。1蛍光標識14-3-3タンパク質発現ベクターを構築し融合タンパク質を大腸菌で発現した。ヒト14-3-3タンパク質およびその変異体(アミノ酸点変異体およびドメイン欠失体)のN端側に蛍光タンパク質を融合させたタンパク質を大腸菌で発現させるベクターを構築した。214-3-3タンパク質結合配列リン酸化ペプチドを96ウェルプレートの各ウェルに共有結合させた。14-3-3タンパク質結合配列リン酸化ペプチドは、セリン642をリン酸化したヒトWee1A由来のペプチド配列(CRTSRLIGKKMNRSVpSLTIY; pSはリン酸化セリン)を用いた。リン酸化していないスレオニンを有するペプチドも合成し、結合しない対照として用いることとした。3mVenus-14-3-3タンパク質融合タンパク質発現大腸菌抽出液をリン酸化ペプチドを共有結合した96ウェルプレートに入れ、結合しなかったタンパク質を洗浄後、結合したタンパク質をmVenusの蛍光として定量することができた。種々のアミノ酸点変異体やドメイン欠失体を用いることによって、14-3-3に依存した結合が測定可能であることも検証した。4結合配列リン酸化ペプチドは結合を阻害するはずであり、それを実際に確認し、リン酸化ペプチドへの14-3-3タンパク質結合を測定する系が、14-3-3タンパク質結合の阻害物質探索系としての利用可能なことを証明した。24年度に構築した探索系を用いて結合を阻害する物質の探索を25年度に引き続き実施した。阻害剤の候補化合物群は研究室にすでに保有している化合物ライブラリーから本年度は約1.5万の精製化合物を利用した。蛍光タンパク質を用いたアッセイ系で約30の化合物が14-3-3σタンパク質と標的リン酸化ペプチドの結合を50%以上阻害した。そこで、これらの化合物について、HEK293細胞で発現したヒトWEE1タンパク質と14-3-3σタンパク質との結合を阻害する活性によって二次評価を行った。ヒトWEE1タンパク質はGSTタンパク質との融合タンパク質としてHEK293細胞で発現し、その細胞抽出液を、14-3-3σタンパク質を発現させた大腸菌の抽出液と混ぜた後にグルタチオンビーズによってプルダウンし、結合した14-3-3σタンパク質をSDS電気泳動、CBB染色によって定量した。この二次評価系で3化合物が終濃度10μMで結合を50%以上阻害した。次にこれらの化合物について他の6種類のヒト14-3-3タンパク質について結合を阻害するか否かの評価を行った。他の6種類のヒト14-3-3タンパク質をコードするcDNAを単離し、大腸菌発現ベクターに導入し、タンパク質の発現を行い上述の14-3-3σと同様の結合評価系を構築した。

3つの化合物については、どれも他の14-3-3も同様に阻害することが確認された。しかし、目標とする1μMより低い50%阻害濃度の化合物の存在に関しては、再現性が得られていない。しかし、探索系は期待通りに機能していることが確認できたので27年度に研究期間を延長し探索を行い、より強い活性を有する物質取得を目指すこととした。27年度には、24年度に構築した探索系を用いて結合を阻害する物質の探索を25・26年度に引き続き実施した。阻害剤の候補化合物群は研究室にすでに保有している化合物ライブラリーから本年度は約1万の精製化合物を利用した。蛍光タンパク質を用いたアッセイ系で約25の化合物が14ー3ー3タンパク質と標的リン酸化ペプチドの結合を50%以上阻害した。これらについては最低2回の評価を行い、結果の再現を確認している。これらの化合物について、HEK293細胞で発現したヒトWEE1タンパク質と7種の14ー3ー3タンパク質との結合を阻害する活性によって二次評価を行った。ヒトWEE1タンパク質はHEK293細胞で発現し、その細胞抽出液を、GSTタンパク質との融合タンパク質として14ー3ー3タンパク質を発現させた大腸菌の抽出液と混ぜた後にグルタチオンビーズによってプルダウンした。結果、1つの化合物については、全ての14ー3ー3も同様に阻害することが確認された。この結合阻害についてさらに解析を行い、化合物が存在するときにのみ、他の特定のタンパク質との結合をより強めることが明らかになった。すなわち化合物は特定のタンパク質と14ー3ー3タンパク質の結合を高めることで、他の標的(ここではヒトWEE1タンパク質)との結合を阻害・減少させるといういうしくみが明らかになった。以上、構築した探索系は期待通りに機能し、14ー3ー3タンパク質の結合を阻害する物質を取得することができた。さらにその阻害メカニズムについても明らかにすることができ、当初の目標を達成できた。14ー3ー3タンパク質結合を阻害する物質のハイスループット探索系を構築し理研天然化合物ライブラリーの探索を行った。一次スクリーニングでは7種の14ー3ー3タンパク質の結合のいくつかを阻害する物質が取得された。それらのヒット化合物から2次スクリーニングを行い、7種の14ー3ー3タンパク質の結合のうち全てを阻害出来る物質がひとつ取得出来た。この物質はがん細胞の増殖も阻害した。これまで得られている14ー3ー3阻害物質で全ての14ー3ー3タンパク質を阻害する物質は報告されていない。14ー3ー3タンパク質の阻害物質を取得することでがん細胞の増殖を阻害する物質を取得することが出来ることが示された。上述のように、構築した阻害物質探索系を用いて化合物探索を行い期待される化合物が得られてきているが、活性の強さが期待よりも弱い。そこで研究期間を延長しより強い物質の探索を目指すこととした。分子細胞生物学探索系が構築できて弱いながらも期待される活性を有する化合物が得られてきているので、さらに強い活性を有する化合物取得を目指して探索を行う。
不連続面の破壊に関する動力学的研究

不連続面破壊の物理過程、なかんずく動力学的プロセスの詳細に関し、理論解析、数値計算、動的破壊実験の手法を複合的に組み合わせて追究するとともに、不連続面破壊に伴い発生しうる自然災害、構造物被害の定量的評価などを試みた。縦ずれ断層面の上盤側と下盤側で観測される地震動が大きく異なる物理的根拠につき応用力学的手法も組み入れて考察し、その一端を解析的かつ実験的に明らかにしたことが研究成果の一例として挙げられる。地質学的不連続面の力学的な不安定化は、地震や斜面崩壊などの甚大な災害をもたらしうる現象に直結していると考えられているが、不連続面の動力学的特性については未だ解明されていない点が多い。本研究課題では不連続面の力学的不安定化の発生機構の解明及び影響の定量的評価に関する研究代表者自らの理論・実験研究を継続発展させ、不連続面破壊の動力学に関わる諸現象の発生メカニズムを究明するとともに、それによる構造物や都市の被災リスクを評価することを目的としている。研究初年度である平成25年度は、非接触レーザ変位計や光弾性実験装置、高速度デジタルビデオカメラなどの実験システムと理論解析を複合的に組み合わせつつ、脆性固体不連続面や斜面モデルの動的破壊の解析を進めたほか、破壊に伴い発生する波動と周囲の固体、流体との動的干渉について検討を行った。結果については、2013 Seismological Society of Japan Fall Meeting(横浜)、2013 Fall Meeting, American Geophysical Union(米国・サンフランシスコ)などにおいて逐次最新研究成果を発表している。なお、地震に伴う「海震」の発生に関する非線形波動理論解析およびその成果に対し、平成25年11月にシンガポールで開催されたInternational Conference on Shock and Impact Loads on Structures(構造物に作用する衝撃荷重に関する国際会議)にて「Highly Commendable Paper Award(優秀論文賞)」が与えられている。地質学的不連続面の力学的不安定化は、地震や斜面崩壊など、甚大な災害をもたらしうる現象に直結しているとみなされているが、不連続面の動力学的な特徴については未解明の点が多々ある。本研究課題では、不連続面の力学的不安定化の発生機構の解明及び影響の定量的評価に関する研究代表者自らのこれまでの理論・実験研究を継続発展させ、不連続面破壊の動力学に関する諸々の現象の発生メカニズムを解明すると同時に、それによる構造物や都市の被災のリスクを評価することを目的としている。研究二年度目である平成26年度は、前年度までに構築、整備した動的破壊実験装置と数値解析システムを複合的に組み合わせつつ、縦ずれ断層と横ずれ断層の動力学の根本的な相違点に関する考察を深め、縦ずれ断層面の上盤側と下盤側で観測される地震動が大きく異なる物理的根拠の一端について明らかにした。研究成果については、International Journal of Protective Structures, Procedia Materials Sciences誌のほか、2014 Seismological Society of Japan Fall Meeting(新潟)や17th U.S. National Congress on Theoretical and AppliedMechanics(米国・East Lansing)、ISRM (International Society for Rock Mechanics)International Symposium(札幌)等の影響力の大きな国際会議などにおいても逐次最新のものを発表している。地質学的な不連続面の破壊は、地震や斜面崩壊などの深刻な被害をもたらしうる現象に直接関わっているものとされているが、不連続面の動力学的な性質そのものについては未解明点が多く存在する。本研究課題では、不連続面の力学的不安定化の発生メカニズムの究明及び影響の定量的評価に関する研究代表者自身の理論・実験研究を継続して発展させ、不連続面破壊の動力学に関係するさまざまな現象の発生機構を考察し、かつ、それらの現象による構造物や都市の被災の危険性を評価することを目的としている。研究最終年度である平成27年度は、本プロジェクトで整備した動的破壊実験装置と数値解析システムを組み合わせた、統合的な破壊実験・解析を推進し、縦ずれ断層破壊時に生じると理論的に予想されていた、一旦地表面近くに到達した破壊が地中に向かって逆戻りする現象をはじめて実験的に示した。研究成果に関しては、Engineering Failure Analysis誌のほか、EGU (European Geosciences Union) General Assembly(オーストリア・ウィーン)や2015 Seismological Society of Japan Fall Meeting(神戸)、AGU (American Geophysical Union)Fall Meeting(米国・サンフランシスコ)等の影響力の大きな国際会議などにおいて逐次最も新しいものを発表している。なお、研究代表者の一連の研究成果に対して、平成28年2月24日に日本学術振興会賞が授与されている。前年度までに構築、整備した動的破壊実験装置及び数値計算システムを駆使した解析を行い、複数の分野にまたがって学際的に研究の成果を公表できているため。破壊動力学予定通り、平成26年度に引き続いて実験及び計算機システムを用いた解析を推進する。特に、デジタル破壊実験システムによる脆性材料不連続面動的破壊実験や室内で地震を模擬する実験を行う。非接触

レーザ変位計の導入が予定通り順調に進み、平成25年10月に開催された2013 Seismological Society of Japan Fall Meetingでその使用成果を発表できているなど、確実に理論及び実験の研究を学際的に進めている。査読つき論文集への掲載が決定されている論文が「平成25年度の研究成果」欄記載のほかに既にあり、平成26年度は平成25年度よりも多くの研究成果発表が期待される。計画通り、平成26年度は、縦ずれ断層と横ずれ断層の動力学の根本的な相違点に関する考察を深め、傾斜している縦ずれ断層面の上盤側と下盤側で観測される地震動が大きく異なる物理的根拠について明らかにする予定である。
正中線を越える細胞移動とそのメカニズム

脳の構築の過程では多くの神経細胞は特定の時期に特定の経路を通って移動し、目的の場所で停止する。我々はこれまで脳における細胞移動分子メカニズムを解明するために、小脳前核神経細胞(PCN)群を研究モデル系として用い、細胞移動を制御する分子のにスクリーニング進めてきた。その際に機能解析の系として後脳展開培養標本に利用を試みたが、培養系は結果にばらつきがあり、これが障害となっていた。この問題を解決するためにexo utero電気穿孔法で遺伝子を胎仔に導入する方法を開発した。これを用いることでPCN群の移動の様子を高い再現性で、PCN群の移動の詳細に解析できることが明らかになった。昨年までの研究で、胎生12日目(E12)頃のマウス後脳菱脳唇ではECN/LRNの細胞群の分裂が盛んに起こっていること明らかにした。そこでこの時期のマウス胎仔を母体内で子宮外に出し、電気穿孔法を用いてEYFP遺伝子を片側の菱脳唇に導入した。その後母体の腹腔内で胎仔を生育させ、適当な期間の後取り出して固定を行った。その結果、EYFPによって標識されたECN/LRN細胞と思われる神経細胞が接線方向に移動し、2日後には正中線を越え、更にその1-2日後には反対側で核を形成している様子を観察する事ができた。またこれらの細胞はPCNの分子マーカーであるMBH2遺伝子を発現しているのを確認した。これに加えて別の細胞群が少し遅れて吻一腹側方向に向かって移動して行くことが確認された。これらの細胞は橋に向かい、橋で2つの核を形成した。その位置に加えて、MBH2遺伝子を発現していたことなどからこれらは橋核と橋被蓋網様核と考えられる。興味深いことにこれまでの報告とは異なり、これらの細胞の一部は正中線を交叉して反対側に核を形成していた。以上の様な結果は極めて再現性よく得られた。今後はこの系を用いて候補分子の遺伝子の過剰発現、発現の抑制によって機能の解析を進める。
ジュニア期における球技スポーツ選手の効果的指導法に関する基礎的研究

本研究の目的は,状況判断,相手とのかけ引き,味方とのあわせといった戦術的な要素が指導場面で強調されることが多い球技スポーツにおいて,一流競技選手の持つ動きのコツ(「どのような感じで動くとできるのか」といった主観的な情報)をインタビュー調査し,(1)一流競技選手の持つ実践知を知識化すること,(2)実践知をジュニア期における球技選手の効果的な指導に役立つ知見としてまとめることであった。調査協力者は,国際レベルで活躍したハンドボール競技選手10名であった。主な研究成果は以下の3点であった。(1)ゴールキーパーの動きのコツをスポーツ運動学的な立場から検討した結果,一流競技選手の動きのコツは指導現場に有用な知見となること,動きのコツは選手間で異なるが,プレー理念は共通していること,動きのコツはプレー理念を具体化させる「手段」であること,一流競技選手の動きのコツを参考にプレーの改善を望むためにはプレー理念に共感する必要があることなどを明らかにした。(2)ゴールキーパーとシューターにおけるシュート局面の動きのコツを現象学的な立場から質的に検討した結果,個人戦術の実践知を明らかにする場合,個人戦術の最小単位は対峙する選手間の関係にあるととらえる必要があること,シュートの最終局面では,ゴールキーパーもシューターもリアクションの行為を志向していること,卓越した選手における個人戦術とは,対峙する選手と相互主体的関係を結び,間主観的に相手選手と「対話」しながら,行為の中で知を働かせ,その行為自体を変化させていくことができる前意識的な営みであることなどを明らかにした。(3)調査協力者の動きのコツの事例を冊子にまとめ,主にジュニア期の指導者に配布した。また,調査の一部をハンドボールの専門月刊誌で発表し,ジュニア期における球技選手の効果的な指導に役立つ知見を,広く実践現に提供した。本研究の目的は、状況判断、相手との駆け引き、味方とのあわせといった戦術的な要素が指導場面で強調されることが多い球技スポーツにおいて、一流競技選手の持つ動きのコツ(「どのような感じで動くとできるのか」といった主観的な情報)を、アンケートとインタビューによって調査し、(1)一流競技選手の持つ実践知を知識化すること、(2)ジュニア期における球技選手の効果的な指導に役立つ知見をまとめ、実践現場に提供することである。平成18年度の研究実績は、以下のとおりである。1.過去の調査研究の検討これまでに行った一流競技選手の動きのコツに関するインタビューを現象学的な観点から再検討した。2.調査用紙の作成球技に特有の動きのコツを一流競技選手から引き出せるように、また、調査協力者の負担をできるだけ少なくするように、アンケート調査の質問項目を精選した。3.アンケート調査およびインタビュー調査の実施オリンピックや世界選手権大会に出場し、国際レベルで活躍した元一流競技選手(調査協力者6名)に対して、アンケート調査およびインタビュー調査を行った。発言内容およびデモンストレーション内容を、ICレコーダーおよびデジタルビデオカメラレコーダーを用いて記録した。4.調査内容のまとめインタビュー調査終了後、VTR記録からすべての発言内容を文章におこすとともに、身体を使って表現された動きをイラストにした。調査協力者ごとに、調査内容を、獲得したコツ、コツ獲得のプロセス、コツ獲得前後の変化、ジュニア期の指導への示唆の4つの項目に分類し、まとめた。5.研究成果の発表研究実績の一部を、(財)日本ハンドボール協会主催第5回ハンドボールコーチング研究会(2007年3月・東京)において発表した。本研究の目的は,状況判断,相手との駆け引き,味方とのあわせといった戦術的な要素が指導場面で強調されることが多い球技スポーツにおいて,一流競技選手の持つ動きのコツ(「どのような感じで動くとできるのか」といった主観的な情報)を,アンケートとインタビューによって調査し,(1)一流競技選手の持つ実践

知を知識化すること,(2)ジュニア期における球技選手の効果的な指導に役立つ知見として実践現場に提供することである。平成19年度は,これまでに行ったインタビュー調査結果を検討し、まず,国際レベルで活躍したハンドボールのゴールキーパーの動きのコツを知識化し,効果的な指導に役立つ知見を明らかにした。〔掲載:「国際レベルで活躍したゴールキーパーの動きのコツに関する事例研究」(財)日本ハンドボール協会ハンドボール研究,9:69-74.〕次に,国際レベルで活躍したハンドボールのゴールキーパーとシューターの動きのコツを,現象学的態度を持ち合わせて質的に分析し,卓越した選手の個人戦術の実践知について明らかにするとともに,個人戦術の達成力の向上に寄与できる知見を導いた。〔掲載:「ハンドボールのシュート局面における個人戦術の実践知に関する質的研究:国際レベルで活躍したゴールキーパーとシューターの語りを手がかりに」体育学研究,53(1):61-74.〕さらに,国際レベルで活躍したハンドボール選手の動きのコツの事例を冊子にまとめ,主にジュニア期の指導者に配布した。また,調査結果の一部をハンドボールの専門月刊誌で発表し,ジュニア期における球技選手の効果的な指導に役立つ知見を,広く実践現場に提供した。〔掲載:(株)スポーツイベント「ハンドボール」(2007年7月号,2007年12月号)〕
地球温暖化緩和をめざした全原子構造情報に基づくヒドロゲナーゼ反応機構の全容解明

「水素の合成・分解」を触媒するヒドロゲナーゼの機能を真に理解するためには、反応中の各状態の水素原子を直接観測することが必須であるため、水素原子の直接観察に長けたプローブである「中性子」を中核に据え、X線を相補的に組み合わせた構造解析からヒドロゲナーゼ触媒サイクルにおける活性状態(Ni-R還元型, Ni-C還元型, Ni-SIa還元型)の全原子構造情報を高精度に取得する。
葉の後期器官発生を司る統御系

葉原基における細胞分裂後の分化、細胞伸長、形態形成に関わる諸現象のしくみについて、シロイヌナズナ及び新規モデル系のイグサ属及びアスパラガス属を使って解析を進め、従来の理解を覆す新知見を数多く明らかとした。その論文の多くが関連分野のトップジャーナルに掲載され、成果中、4本がF1000に選ばれた。葉の初期原基は、茎頂メリステムを遙かにしのぐ活発な細胞増殖をおこなっている。これは、やがて先端部から基部に向けて発せられる、あるいは移動すると想定されている未知の前線、「arrest front」によって抑えられ、やがて停止すると共に、個々の細胞が分化・伸長に向かうと考えられてきた。そこで本研究では未開拓のテーマとして、(1)arrest frontによって、細胞の分裂と伸長がどのような制御を受けるのか。(2) arrest frontという仮想"前線"の実体は何か(3)arrest front作用前の、葉原基における高い細胞分裂活性は何によるのか。(4) arrestfrontを境として空間的に切り分けられる細胞分裂領域と細胞伸長領域とは、互いに独立なのかの諸点を解明し、葉という器官の後期発生を、一体としてまとまりのあるものに統合するシステムの理解を実現する。初年度の今年は、以下の準備を行なうと共に、いくつかの成果を上げることができた。(1)葉原基における正の細胞増殖促進因子AN3および負の制御因子ROT4の機能の解明an3の表現型を抑圧/強調する変異体を複数単離すると共に、マイクロアレイデータに基づく下流遺伝子候補の、葉原基での発現パターンを解析し、絞り込みを行なった。またAN3の発現部位とarrest frontとの関連を知るため、AN3遺伝子を葉原基の特定の部位で、異所的に発現誘導する系を構築し、パイロット実験まで完了した。一方ROT4はペプチドの機能上、必要とされるドメインの範囲の同定を、truncatedペプチドの作成により進めた。(2)葉柄/葉身の境界および有限増殖性決定機構の解析とBOP1,BOP2の機能葉が無限成長しarrest frontの作用を示さない植物種モノフィレアから、その機能欠失がシロイヌナズナにおいて葉の無限成長をもたらす遺伝子BOP1,BOP2のホモログを単離し、シロイヌナズナbop1/2変異体に対して形質転換したどころ、正常な機能を有することが分かった。一方これと関連して、シロイヌナズナ葉柄の発生様式を詳細に解析したところ、従来の理解と異なる重要な知見を得た。(3)葉の極性軸がシロイヌナズナと大きく異なる単面葉における葉の発生の制御系解明イグサ属における単面葉の発生を、各種極性軸マーカーにより解析した。その結果、単面葉は葉身に背軸側の性質しか有さないこと、それにもかかわらず、単子葉植物に固有の遺伝制御系を使って葉に平面性を与えることが可能となっているらしいこと、すなわち背腹性に基づく平面性構築モデルは一般則でないこと、また向軸側の性質を与える遺伝制御系のうち、microRNA関係の制御が異常となっている可能性などが強く示唆された。これまで解析してきたいわゆる補償作用と逆に、細胞数が増加して細胞体積が減少するような表現型を示すmsc変異体の原因遺伝子のクローニングの結果、これらはいずれもheteroblastyの異常をもたらすmiR156-SPL系に含まれる遺伝子の変異であった(Usami et al., 2009)。そこでheteroblasty制御に関診るもう一つの経路、tasiR-ARP系について調べたところ、こちらの変異体では、細胞数・細胞体積の変化が見られなかった。したがって特定の葉位における葉の中の細胞数・細胞体積はmiR56-SPL系によって制御されていることが判明した。(2)葉原基における正の細胞増殖促進因子AN3および負の制御因子ROT4の機能の解明an3の表現型を強調する変異体として#2047を同定した。an3#2047二重変異体は、子葉の形成される領域に不定数の根を作るという、特異な表現型を示す。現在、#2047変異の原因遺伝子について、確認中である。またan3がas2の葉の背腹性異常を強調することを見いだし、その原因として、リボゾーム関連遺伝子群を同定した(Fujikura et.al., in press)。一方ROT4については、ペプチドの機能上、必要とされるドメインを明らかとした。さらにROT4を葉の中でキメラ上に発現させたところ、ROT4は領域自律的に作用することが判明した。(2)葉の極性展開制御系の解明ANについては、既知のモチーフ以外の領域がその機能に重要であるらしいこと(Cho et.al., 2008)、その産物が細胞質とゴルジ体近傍の膜とに局在することを明らかとした。またANのホモログをダフリアカラマツから単離し、シロイヌナズナan変異体の表現型を相補することを示した(Li et.al., 2008)。

またrot3-1についてはその染色体上の欠失領域を正確に決定し、タイリングによるマッピングのケーススタディーとして検証に供した結果、十分な分解能を持つことが確認された(Nagano et.al., 2008)。(3)葉柄/葉身の境界および有限増殖性決定機構の解析とBOP1, BOP2の機能bop1 bop2の葉の形成を詳細に再検討した結果、見かけと異なり葉柄を欠くことを見いだした。さらに鋸歯形成に伴う葉身での局所的な細胞増殖についても、従来の理解が間違っていたことが判明した。(4)葉の極性軸がシロイヌナズナと大きく異なる単面葉における葉の発生の制御系解明イグサ属における単面葉の発生に関し、各種極性軸関連遺伝子群について解析した結果、この背景には、背腹性制御系の変化や、尻相同遺伝子の発現制御の変化があったことが明らかとなった。(5)ゲノム倍加による葉の細胞数・細胞体積の変動各種の葉サイズに関する変異体を親株として、4倍体のシリーズを作成した。また8倍体も選抜して解析したところ、8倍体では細胞体積が増加しながら、細胞数はむしろ減少することが認められた(Tsukaya 2008)。(1)葉原基における正の細胞増殖促進因子AN3の機能の解明an3の表現型を強調し、二重変異体のとき子葉の形成される領域に不定数の根を作るという、特異な表現型を示す#2047変異の原因遺伝子を同定した。またan3がas2の葉の背腹性異常を強調することを見いだした。その原因としてリボゾーム関連遺伝子群を同定し、その解析から補償作用は、ある閾値を越えて細胞分裂に異常を持つときだけ発露することを確認した(Fujikura et al. 2009)。さらにan3変異体の葉原基中でAN3をキメラ状に発現させる系を確立し、AN3の機能欠損に起因する補償作用が、細胞非自律的に制御されていることを初めて証明した。(2)葉の極性展開制御系の解明ANについては、GFP等で可視化できる系統を確立し、東大の中野明彦・上田貴志両博士との共同研究により、各種マーカーを用いて局在を確認したところ、TGNのごく近傍にあることが判明した。またC端の短いヒメッリガネゴケのホモログPpAN2や、それに相当するC端欠損型ANもan-1変異を相補できることを見いだした。(3)葉柄/葉身の境界およびその他葉の形成を司る遺伝子群の解明これまでの解析から、シロイヌナズナ葉原基には、相反する方向に向かう2つのarrest frontが存在することが明らかとなった。またその合流点に特異的に発現する遺伝子マーカーを見いだし、その一つはSPTであることを同定した(Ichihashi et al., 2010)。さらに鋸歯の形成に関わる遺伝経路の同定を行なった(Kawamura et a1., 2010)。さらにElongatorが、オーキシン関連遺伝子の制御を介して葉の形態制御をすることを見いだした(Nelissen et al., 2010)。また染色体転座による表現型が、単一の原因遺伝子の作用の総和では説明しきれないほどの葉の大型化をもたらすことを報告した(Horiguchi et al. 2009)。
EMGを用いたガン骨転移患者の寝返り支援機器の開発

がんの末期に骨転移が起こると,患者の骨は極めて脆弱になり,寝返り動作に伴う体幹の回旋動作などによって激しい疼痛や骨折が発生する.本研究では生体計測とメカトロニクスの知見を活かし,ターミナル・ケアにおけるペインマネジメントを実現するために,生体信号である筋電位や動作を支援用の空気圧ゴム人工筋を用いたがん骨転移患者の寝返り支援機器の開発を行った.がんの末期に骨転移が起こると,患者の骨は極めて脆弱になり,寝返り動作に伴う体幹の回旋動作などによって激しい疼痛や骨折が発生する.本研究では生体計測とメカトロニクスの知見を活かし,ターミナル・ケアにおけるペインマネジメントを実現するために,生体信号である筋電位や動作を支援用の空気圧ゴム人工筋を用いたがん骨転移患者の寝返り支援機器の開発を行った.がんの末期に骨転移が起こると,患者の骨は極めて脆弱になり,寝返り動作に伴う体幹の回旋動作などによって激しい疼痛や骨折が発生する.本研究では生体計測とメカトロニクスの知見を活かし,ターミナル・ケアにおけるペインマネジメントを実現する「EMGを用いたガン骨転移患者の寝返り支援機器の開発」を行う,患者の寝返り動作をEMGの解析,およびニューラルネットワークの認識によって検知し,痛みを引き起こす体幹の捻りだけを体幹に配置された空気圧ゴム人工筋を駆動させることで抑制するという寝返り動作を受動的にアシストするもので,この機器の開発により末期ガン患者のQOL向上とADL獲得の実現を目指す.本年度は,寝返り支援機器の入力信号となる筋電位に関して,寝返り動作時の筋電位発生順序の解明を行い,筋電位そのものの若年者と高齢者の違いや,連続使用による影響などを実用化に至る際に重要となる部分について基礎的な検討した.また,筋電位をもとに寝返り動作を認識するアルゴリズムに関しては,独自のミクロ・マクロ・ニューラルネットワークを開発し,その最適構造決定手法を確立することにより,既存のアルゴリズムで問題となっていた応答性,安定性に関して高い有効性を示した.さらに,空気圧ゴム人工筋を用いた体幹回旋可動域を制限する機構の開発を行い,従来のジュレット型の硬性コルセットと性能の比較をまず光学式位置計測装置により行い,さらに,レントゲンを用いて脊椎の各関節の挙動を解析しその有効性を示した.これにより開発した寝返り支援機器の各要素において,要求性能を満足していることが確認された.がんの末期に骨転移が起こると,患者の骨は極めて脆弱になり,寝返り動作に伴う体幹の回旋動作などによって激しい疼痛や骨折が発生する.本研究では生体計測とメカトロニクスの知見を活かし,ターミナル・ケアにおけるペインマネジメントを実現する「EMGを用いたガン骨転移患者の寝返り支援機器の開発」を行う.患者の寝返り動作をEMGの解析,およびニューラルネットワークの認識によって検知し,痛みを引き起こす体幹の捻りだけを体幹に配置された空気圧ゴム人工筋を駆動させることで抑制するという寝返り動作を受動的にアシストするもので,この機器の開発により末期ガン患者のQOL向上とADL獲得の実現を目指す.本年度は,寝返り支援機器の入力信号となる筋電位に関して,素早く,正確に寝返り動作時の筋電位を検出し,動作認識を行うために,代表者らが提案・開発したミクロ・マクロ・ニューラルネットワークに対して,その最適構造決定方法をアルゴリズム化し,寝返り動作以外の緩慢な動作の動作認識にも適用可能となるように汎用性を高めた.また,実際の環境を想定した評価実験を行い,寝返り動作と起き上がり動作を識別する排他的論理和を用いたアルゴリズムを開発し,筋電位の電気機械的遅延(EMD)などを用いて認識性能を評価した.さらに,ハードウエアに関しては寝返り動作時の回旋可動域抑制性に関して,工学的評価を行った.これにより開発した寝返り支援機器の各要素において,要求性能を満足していることが確認された.
自然免疫を基軸としたウイルス性肝炎治療抵抗性機序の解明と新規治療法の創成

C型肝炎治療不応例では、肝内のIFN誘導遺伝子(ISGs)はむしろ高発現しているが、特にIFNλ4を肝内に発現している症例では有意に治療抵抗性となる。その機序として、IFNλ4はISGsを誘導するが、外因性IFNに対するISGsの誘導能を低下させ、ウイルス減衰が抑制されることが明らかとなった。IL28BSNPのリスク・アリルにおいて発現するIFNλ4が治療不応性と密接に関連することが示唆された。末梢血単核球(PBMC)におけるIFN不応性に関わる宿主因子の探索: III型IFNとして新規に発見されたIFNλ4はIL28BSNPのマイナーアレルの症例のみに発現し、これまでの検討では肝内におけるIFNλ4の発現は治療不応性への関与が示唆された。そこで免疫担当細胞であるPBMCにおけるIFN不応性に関わる機序を解明するために、50例のC型慢性肝炎患者のPBMCにおいてIL28BおよびIFNλ4発現とIFN治療応答性の関連について検討した。PBMCを採取後IFNα+poly I:C刺激を行い、無刺激時・刺激時のIFNλ発現、他の自然免疫関連分子発現をRT-qPCRおよびRT-PCRにて解析し、前治療効果(Virological Responder(VR) vs NR)との関連をみた。その結果、無刺激時のIL28B発現レベルはIL28BSNPおよび治療効果との関連を認めなかったが、IFNα+poly I:C刺激によるIL28Bの発現誘導は前治療NR群が再燃例に比して有意にIL28B誘導が低値であり、SNPに関わらずNR群はVR群に比べ有意に低値であった。またMinor群のうち12名でPBMC中にIFNλ4 mRNAの発現が認められ、うち7名では無刺激時のPBMCに発現が認められた。そこで、Minor群のうち、無刺激のPBMC中にIFNλ4発現が検出された群(n=7)と非検出群(n=19)でIL28B発現誘導を比較したところ、IFNλ4検出群で有意にIL28B発現誘導が低値であり(p=0.04)、IFNλ4発現は治療不応性と関連していた。従って、PBMC中のIL28Bの発現誘導能はIFN治療応答性を規定すると考えられ、PBMCに発現するIFNλ4はIFN不応性機序へ関与することが示唆された。これまで本研究では、IFN治療不応例では肝内のIFN誘導遺伝子(ISGs)の発現はむしろ高く、III型IFNとして新規に発見されたIFNλ4を肝内に発現している症例では有意に治療抵抗性となることを明らかとしてきた。また、免疫担当細胞である末梢血単核球(PBMC)におけるIFNα+poly I:C刺激時のIFNλ3の発現誘導は治療抵抗例で有意に低値であり、特にIFNλ4が発現している症例ではIFNλ3の発現誘導が有意に低いことから、IFNλ4発現が治療不応性と密接に関連していることが示唆された。そこで、IFNλ4の治療抵抗性に関わる機序を解明するために、IFNλ4(p179)およびその他のsplicing variantからなるIFNλ4強制発現系でのin vitro解析を行った。Huh751におけるp179の強制発現によりISG15が誘導されたが、他のsplicing variantではISG誘導は見られなかった。一方、p179を強制発現後にIFNα刺激によるISGの誘導能を評価したところ、p179の存在下でISG誘導の減弱が見られた。また、同様の検討をHCVレプリコン細胞で行ったところ、p179の強制発現単独でレプリコン活性の低下が見られたが、IFNα刺激時のHCV減衰はp179存在下の方が弱かった。in vitroにおいて、自然免疫シグナルによるIFNλ3転写活性化能をIFNλ4の存在下・非存在下で検討したところ、p179の共発現によるIFNλ4の存在下ではIRF7が誘導するIFNλ3転写活性の上昇は有意に抑制された。これらのことから、IL28B SNPのリスク・アリルにおいて発現するIFNλ4(p179)はISGを誘導する活性を有するが、外因性のIFNαによるISG誘導及び抗HCV効果を減弱することが、治療不応性と関連すると考えられた。PBMCを用いた研究はおおむね順調に進展している。27年度が最終年度であるため、記入しない。消化器内科学新規に発見されたIFNλ4はIL28BSNPのマイナーアレルの症例のみに発現しており、IFN不応性と関連している。しかし、IFN促進系・抑制系に関わるシグナル伝達に与える影響やIL28Bプロモーターに与える影響は不明であり、その受容体も同定されていない。今後さらいIFNλ4が治療不応性に関わる機序について解明し、治療標的としての意義を検討する。