hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
心発生における転写因子-エピジェネティック因子による転写制御機構の解明

ゲノムにはおよそ20,000個の遺伝子が存在している。転写因子やエピジェネティック因子は遺伝子の選択を行う重要な因子である。これらの因子の異常によって先天性心疾患がおこる。しかし、これらの因子が心発生中にどの遺伝子を選択・制御しているか全く不明であった。今回、先天性心疾患の原因となる転写因子のゲノム上の存在領域を次世代シークエンサーによって同定し、これらの転写因子が制御している遺伝子群を明らかにした。心臓発生の基盤として機能する転写因子とエピジェネティック因子による転写制御メカニズムを明らかにすることにより、先天性心疾患の発症機構を理解し、新たな治療法開発の基盤を確立することを目的とし、A.転写因子Nkx2-5、Tbx5、GATA4のゲノムワイドな標的領域のChIP-Seq法による同定。B.転写因子Nkx2-5、Tbx5、GATA4と相互作用するエピジェネティック因子の免疫沈降法による同定。C.初代培養心筋細胞のsiRNAノックダウンのシステムによる転写因子-エピジェネティック因子転写調節メカニズムの解明。の3点について、2011年度より引き続き研究を行った。A.転写因子Nkx2-5、Tbx5、GATA4のゲノムワイドな標的領域のChIP-Seq法による同定。においては、マウス胎仔心臓を用いて、これらの転写因子が結合する標的ゲノム領域を同定した。においては、マウス胎仔心臓の核抽出液を用いて、転写因子に対する抗体で免疫沈降を行い、共免疫沈降してくるエピジェネティック因子を探索した。その結果、これまでに相互作用することが明らかになっているヒストンメチル化酵素Whsc1などが相互作用していることが明らかになった。については、マウス胎仔心臓から得た初代培養心筋細胞で転写因子のノックダウンを行い、RNA-seqによって発現変動する遺伝子を同定した。以上の結果より、先天性心疾患の原因となる転写因子が、どのように転写を制御し、正常な心発生に寄与しているか明らかにするための基盤を築くことができた。の3点について研究を行った。まず、A.転写因子Nkx2-5、Tbx5、GATA4のゲノムワイドな標的領域のChIP-Seq法による同定、においてはマウス胎仔心臓の核抽出液を作製し、それぞれに対する抗体を用いてクロマチン免疫沈降を行った。得られたDNA断片からライブラリーを作製し、高速シークエンサーSOLiDを用いて、配列の同定を行った。その結果、これらの転写因子は心臓で発現している遺伝子群に結合していることが明らかになった。B.転写因子Nkx2-5、Tbx5、GATA4と相互作用するエピジェネティック因子の免疫沈降法による同定、においては、それぞれの抗体でマウス胎仔心臓の核抽出液から免疫沈降を行い、ヒストンメチル化酵素Whsc1を始めとし、複数のエピジェネティック因子の相互作用を検出することに成功した。C.初代培養心筋細胞のsiRNAノックダウンのシステムによる転写因子-エピジェネティック因子転写調節メカニズムの解明、については、マウス胎仔心臓から得た初代培養心筋細胞における転写因子のsiRNAによるノックダウンを行うことに成功した。以上のことにより、今まで全く不明であった発生中の心臓における転写因子の結合領域、また相互作用する因子の同定できた。次世代シークエンサーを用いて、マウス胎仔心臓におけるChIP-seqを成功でき、また、発生中の心臓における転写因子と相互作用する因子を同定できたことから、当該年度の研究目的は十分達成することができたと考える。本年度の研究については、昨年度より引き続き、研究計画書に基づいて遂行する。本年度においては、引き続き分子生物学的な研究や、また学会出張費、論文校正などに研究費を使用したい。
蛋白質系分子シミュレーションのための新規エネルギー関数の開発

タンパク質系の分子シミュレーションにおけるエネルギー関数(力場)としては、現在、米国のハーバード大学を中心に開発されたCHARMM、カリフォルニア大学サンフランシスコ校を中心に開発されたAMBER、エール大学を中心に開発されたOPLS、オランダのグロニンゲン大学を中心に開発されたGROMOSなどが広く使われている。以前、我々は、拡張アンサンブルシミュレーションによって、これらのエネルギー関数の比較に成功した。我々の結論は既存のエネルギー関数で完璧なものはなく、改良が必要であるということである。本研究の目的は、より精度の高いエネルギー関数を開発することである。以前提唱した、2次元フーリエ級数を使った新しい主鎖のねじれエネルギー項の有効性を6つの既存のエネルギー関数(AMBER parm94, AMBER parm96, AMBER parm99, CHARMM27, OPLS-AA, OPLS-AA/L)において調べた。今回は29項でフーリエ級数を打ち切ったものを利用した。ラマチャンドラン空間において、αヘリックスとβシートを強調する領域でねじれエネルギーを減少させたエネルギー項を用いた小ペプチド(リボヌクレアーゼAのCペプチドとプロテインGのGペプチド)の折りたたみシミュレーションを実行し、αヘリックス構造とβシート構造がそれそれ得られることを示した。これによって、2次構造(αヘリックスやβシートなど)の形成傾向性を自由に調整できるようになった。また、我々は、PDB(Protein Data Bank)に登録されている実験で決定された、タンパク質の立体構造100個を使い、新しいエネルギーパラメターの最適化の方法を開発した。この新手法は主鎖の二面角の実験データからのずれを最小にする方法である。この方法をAMBER parm96に適用し、オリジナルの関数が改善されることを確かめた。
青少年を対象とする社会教育従事者(ユースワーカー)のための養成プログラムの開発

本研究の目的は、青少年を対象とする社会教育施設の職員(ユースワーカー)の力量形成を中心的課題に据え、職員に必要とされる力量を特定し、その力量形成に有効な養成プログラムのモデルを構築することである。先駆的な事例として、国家が定める職業資格を必要とするイギリスのユースワーカー養成制度に注目した。研究方法は、現地視察によってユースワーカー養成プログラムの教材の活用方法を調査すると共に、養成プログラムの教材およびカリキュラム分析を行った。視察先はYMCAジョージウィリアムスカレッジとデュモントフォート大学のユース・アンド・コミュニティ学科である。加えて、ユースワークの現場として、レディング市にあるコネクションズセンターも訪問した。調査の結果、イギリスの場合、専門職として認められるユースワーカーの資格は階層化されており、基礎学位レベルと学位レベルが存在すること、ならびに現在ではさらに高次の博士レベルでの養成プログラムが開発中であることが明らかになった。専門職としてのユースワーカーの資格を付与する機関としてはカレッジと総合大学があり、それぞれに性質が異なる。カレッジは、現職職員研修の役割も担っており職業訓練学校ないし専門学校のような存在であり、総合大学は、学問研究としてユースワークの領域を扱っている。YMCAジョージウィリアムスカレッジの基礎学位レベルの教材分析の結果、ユースワーカーの力量形成の基礎として、次の点が重要視されていることが明らかになった。(1)知識を伝授することが第一義ではないこと、(2)感情・思考・価値観の側面からワーカー自身が自己理解を深めること、(3)ユースワークにおける教育の目的は、若者が自由を獲得し自身の可能性を高めるための支援にあること、(4)分析力の育成に力点が置かれていること。
都市近郊における散策路事業の成立構造・計画思潮の変遷と縮退時代における活用可能性

本研究課題は、1)「散策路事業」の通史研究、2)特定地域における「散策路事業」の事例研究、3)「暮らし体験型散策路」の計画提案・実践・評価の3点を目的に掲げている。2018年度は、2)および3)に取り組んだ。2)では、戦前期から現代まで継承されている東京西郊多摩地域を通過する野猿峠コース(約13km)を対象として、その開発・活用の歴史的変遷を明らかにした。1930年代余暇活動が制限されるなか貴重なレクリエーション機会として注目した東京市や、旅客獲得に期待する鉄道会社(京王)により散策路が整備された。一方、これは東京緑地計画による景園地(東京府南多摩景園地)の利用策という側面もあった。戦後、野猿峠コース周辺は東京都により公園指定を受けるとともに、首都圏近郊緑地保全法に基づき、保全区域に指定され、都市近郊の手軽な日帰り観光として人気を博した。その後、70年代になると大規模住宅団地の開発が進み、コースは一部分断されてしまう。しかし、東京都が公園や動物園として整備を進めたことによりコースの大半は保全される。90年代以降、歴史文化や都市近郊の里山の価値が評価されるなかで、東京都は「かたらいの道」として当該コースを設定し整備を進めた。加えて、地元自治体や観光協会も案内板の設置やマップの発行によりその活用を促進している。このように、余暇活動や健康増進などの市民のライフスタイルのなかから生み出される要因と、郊外・行楽地開発や自然・文化資源の保全活用等の地域側が期待する環境形成に資する要因双方のバランスによって開発や活用が行われてきたことを明らかにした。3)では、大学の演習課題を経て提案された散策路の提案(アウトレットモール来訪者に周辺のニュータウン・里山を周遊してもらうためのテーマ・コースの提案)を受けて、アウトレットモール運営会社と産学連携の体制を組み、協働で企画を実践する計画を進めた。3つの研究課題のうち、1)「散策路事業」の通史研究に関しては、2)の特定事例の調査研究を先行させたため、今年度は実施できなかった。ただし、個別事例による知見から調査研究のフレームは明確になってきた。一方、3)「暮らし体験型散策路」の計画提案・実践・評価に関しては、初年度から大学と大学近隣の商業施設(アウトレットモール)と産学連携体制が組めたことで、次年度以降実践や評価の段階にスムーズに進んでいける状況である。よって全体としては、「おおむね順調に進展している」と評価した。「散策路事業」の通史研究に関しては、事例研究も含め戦後のハイキングブームや現代の健康増進などとの関係から、情報収集、分析、考察を進める。「暮らし体験型散策路」の計画提案・実践・評価に関しては、産学連携体制のもとで、来訪客への情報提供(テーマ・コースの設定、写真・地図などの伝達メディアの製作)を進め、その評価を行う。評価項目としては、地域住民に対しては、生活領域やプライベートな資源・領域を公開することに対する見解、来訪者に対しては、都市近郊の暮らしの理解や親しみの変化の度合い、移住可能性等を想定している。

よって全体としては、「おおむね順調に進展している」と評価した。「散策路事業」の通史研究に関しては、事例研究も含め戦後のハイキングブームや現代の健康増進などとの関係から、情報収集、分析、考察を進める。「暮らし体験型散策路」の計画提案・実践・評価に関しては、産学連携体制のもとで、来訪客への情報提供(テーマ・コースの設定、写真・地図などの伝達メディアの製作)を進め、その評価を行う。評価項目としては、地域住民に対しては、生活領域やプライベートな資源・領域を公開することに対する見解、来訪者に対しては、都市近郊の暮らしの理解や親しみの変化の度合い、移住可能性等を想定している。研究成果として国際学会への投稿を行ったが、これに関する参加経費は次年度支払いとなるために予算を繰り越した。また、研究補助に関する人件費を計上していたが、今年度は事例調査の実施に留まったために資料収集・整理のための費用は次年度へ繰り越すこととした。
自然発症てんかんラット海馬錐体細胞異常電流発生機構のパッチクラインプ法による解明

てんかん薬の開発のための有用なモデル動物と考えられる自然発症てんかんラット(SER)において、海馬切片を用いた研究で明らかになっているニューロンの異常興奮性についてカルシウムチャンネルの関与を検討した。1.海馬切片を用いた細胞内記録法による検討(1)苔状線維を刺激したときに誘発されるCA3野ニューロンの脱分極シフトと繰り返し発火はL型カルシウムチャネル阻害薬であるジヒドロピリジン系薬物のニカルジピンにより抑制された。(2)ナトリウム及びカリウムチャネル阻害下に記録しているCA3ニューロンに脱分極パルスを細胞内通電したときSERのほうが正常Wistarラットよりも持続の長居カルシウムスパイクが誘発された。(3)SER及びWistarラットのカルシウムスパイクに対してニカルジピンは抑制作用を示したが、SERのカルシウムスパイクの方が感受性が高かった。2.急性単離細胞を用いた実験(1)急性単離したCA3野ニューロンはSER、Wistarラットともにホールセルパッチクランプ法に用いることが可能であった。(2)ナトリウム及びカリウム電流を阻害し、電圧固定下にて脱分極パルスを細胞内に与えるとによりカルシウム電流を誘発した。SERのカルシウム電流の方がWistarラットのそれよりも小さい脱分極電位で流れはじめ、脱分極パルスをかけている間の不活性化の程度は少なかった。(3)ニカルジピンはSERのカルシウム電流をほぼ完全に抑制したが、Wistarラットのカルシウム電流に対しては約50%程度の抑制が観察されただけであった。以上の結果からSERの海馬CA3野ニューロンにおいて観察される異常な脱分極シフトはニューロンのカルシウムチャネルのうち特にL型のカルシウムチャネルの活性化閾値の低下とその不活性化の抑制が関与することとニューロンに存在するカルシウムチャネルのうちニカルジピン感受性のチャネルの相対的な割合が増加していることが示された。これらのことからてんかん発作におけるカルシウムチャネルの異常の関与とてんかん発作に対するカルシウムチャネル阻害薬の治療薬としての可能性が示唆された。
炎症性乳癌の可塑性に関わる分子機構解析と標的治療開発

今年度は、マウス炎症性乳癌モデルを作成し、発癌のメカニズムと、作成した乳癌の病態をになう細胞画分(cancer initiating cells)を同定することを目標とした。まず、癌抑制遺伝子のInk4a/Arfのノックアウトと、癌遺伝子変異型H-RAS(G12V)の組み合わせにより、マウス乳腺細胞から乳癌の誘導に成功した。また、Ink4a/Arfのノックアウトにより、in vitro、in vivoにおいてマウス乳腺細胞の分化能が阻害されることが明らかとなり、ヒト乳癌においてもInk4a/Arf遺伝子座の不活化に伴う分化不全が乳癌の発端である可能性が示唆された。また、誘導された乳癌は、悪性度が極めて高く、マイクロアレイ解析によれば、高い増殖能とインターフェロン応答(ウイルス感染や炎症により惹起されるシグナル応答)が際立っていた。よって、我々は臨床的な悪性度と分子的な観点から、誘導されたマウス乳癌は、ヒト炎症性乳癌に極めて類似した病態であると結論づけた。さらに、腫瘍細胞の分取とその後の同種間移植実験により、CD49fの発現の低い細胞分画(CD49f^<low>)が最も高い腫瘍活性を有していることを明らかにした。このCD49f^<low>分画はさらに静止期(細胞分裂していない)細胞と分裂期細胞に分けられ、驚いたことに静止期細胞がより高い腫瘍活性を有していた。この腫瘍活性の高いCD49f^<low>静止期細胞の分子特性をCD49f^<high>細胞を比較対照として、マイクロアレイにて発現解析を行うと、Endothelin Receptor Type Aが高発現していることが分かった。まとめると、我々の癌モデルにおけるcancer initiating cellはCD49f^<low>静止期細胞であり、Endothelin Receptor Type Aの高発現が特徴的であった。次年度は、我々が作成した癌モデルがヒトの癌にどのように適され得るかを、考察検討し、臨床応用への裏付けとなる理論の構築と、検証実験を行う予定である。
傾斜組成インサ-ト材による超硬合金と鉄鋼材料の拡散接合に関する研究

本研究は、WCーCo系超硬合金と鉄鋼材料との拡散接合に際して生じる熱応力を緩和し、接合強度を高めることを目的として、組成を傾斜させたNiーCo系インサ-ト材の適用を検討するものである。本年度においては、その第一歩として基礎的比較デ-タを得るために、純Ni箔をインサ-ト材として用いた拡散接合実験を行った。接合雰囲気は10^<ー4>Torr台の真空とし、通常1.5kgf/mm_2の圧力をかけ、1075°Cにて30min保持した。接合強度はNi箔の厚さの増加とともに増大したが、200μm以上の厚さではほぼ一定の値となった。これは、Ni箔が塑性変形しやすいため超硬合金表面に発生する熱応力を緩和するが、200μm以上の厚さになるとNi自体の強度が接合強度を支配するためと考えられる。接合後の試験片をそのまま引張試験を行った場合、200μm以上のNi箔を用いても28kgf/mm^2前後の接合強度しか得られなかった。しかし試験片の表面を切削加工後の接合強度は100μm以上のNi箔を用いると4042kgf/mm^2に達した。このような試験片の表面切削の有無による接合強度の変化は、切欠き効果に起因するものであり、表面部にわずかに残留する未接合部が表面切削により除去されるためと考えられる。本拡散接合系においては、炭素の拡散により脆弱な金属間化合物(η相;Co_3W_3C)が生成するとされている。しかし接合破断面のX線回折によっては、この相は検出されず、したがってNi箔によって炭素の拡散が防止されたと推定した。今年度はNiーCo合金箔の作製に手間取り、研究の進行に遅れをきたしたが、上記のように有益な基礎的知見が得られたので、次年度においてはこれらの知見を参考として当初の研究目的を達成する予定である。
時間経過に伴う視覚的意識の形成過程と脳内機構の検討

視覚的意識をもたらす注意機能には時間的な処理制約があるため、中心窩に投影された視覚刺激であっても見落とされることがある。これを実験的に示したのが注意の瞬き(AB)である。ABは、高速逐次視覚呈示を行うと、先行標的(T1)から約500 ms以内に呈示される後続標的(T2)の見えが阻害されるという現象で、ABに関わる脳内機序を明らかにすることは、意識の形成過程の理解に重要なヒントを提供すると考えられる。特に、後部頭頂葉の頭頂間溝(IPS)はトップダウン、下頭頂小葉(IPL)はボトムアップの視覚処理にそれぞれ関わると考えられている。もしこの仮説が正しければ、T1処理中にIPS活動を妨害すると、T1処理が中断されるためT2処理への干渉が低下してT2成績が向上すると予測できる。また、AB期間中に呈示されたT2の処理中にIPL活動を妨害すると、T2による注意の捕捉が干渉を受けるため、T2成績が一段と低下することが予測できる。この仮説は、限られた領域の神経活動を瞬間的に攪乱させる経頭蓋磁気刺激(TMS)を用いることで検証可能である。そこで、右半球のIPSやIPLに、T1あるいはT2呈示後にTMSを施行し、ABへの影響を観察した。実験の結果、T1オンセット後75225msの間に右IPSに3連発のTMSを施行するとABが小さくなる一方、T2オンセット後に右IPLに同様のTMSを施行すると、ABの増大が認められ、IPSによるトップダウンT1処理とIPLによるボトムアップT2処理がABに関与するという仮説と一致した。これは、T1処理そのものではなく、T1処理によって誘発される注意の一時的な機能不全や妨害刺激の抑制、あるいは注意の再定位の遅延がABの原因であるとする、最近提唱されたABモデルの枠組みと一致する。高速呈示中の視覚刺激の意識化には時間的制約があり、これを実験的に示したのが注意の瞬き現象(AB)である。頭頂後頭領域は注意配分に重要で、複数のイメージング・脳損傷研究によって、特に頭頂間溝近傍の神経活動がABに関与することが示唆されている。しかしながら損症例研究では行動に関わる脳領域の時空間的検討が困難であり、イメージング研究においては活動領域は相関による推測の域を出ない。これに対し、頭皮上に配置した磁気誘導コイルから、大脳皮質内に発生させる誘導電場で生じる過電流によって、一定領域内の神経細胞活動を瞬間的に撹乱させる経頭蓋磁気刺激(TMS)を用いると、行動機能と神経活動の時空間的因果関係を詳細に検証可能になる。そこで、ABに対する頭頂間溝の役割を明らかにすることを目的としたTMS実験を行った。その結果、先行標的-後続標的SOAが720msの時、右あるいは左頭頂間溝に先行標的呈示後350msに単発のTMSを施行すると、統制条件であるCz(頭頂部)に施行した場合およびTMS環境模倣のみで実際の磁気刺激はないSham条件よりも、後続標的の成績に優位な向上が認められ、ABが縮小した。以上の結果は、両側の頭頂間溝活動がABの原因である注意の時間的配分に重要であることを示唆する。ABは注意を向けられたT1がT2処理に干渉することが原因と考えられているが、そのT1処理には300-400ms後の頭頂活動の関与が示唆されている。また、単発のTMSは、該当部位の神経活動にノイズを加えて撹乱すると考えられている。したがって、本研究では、T1処理のために注意を配分するIPS活動がTMSで妨害されたため、T1処理からT2処理への干渉が低下し、ABが縮小したと考えられる。このことから、両側の頭頂間溝活動が、視覚刺激の意識化をもたらす注意処理の時間的制約に関与していることが明らかになった。

これは、T1処理そのものではなく、T1処理によって誘発される注意の一時的な機能不全や妨害刺激の抑制、あるいは注意の再定位の遅延がABの原因であるとする、最近提唱されたABモデルの枠組みと一致する。
柔道の投げ技に起因する重症頭頸部外傷発生要因の明確化

最終年度である平成30年度は,前年度までに実施予定としていた「自動車衝突試験用歩行者ダミーを用いた“頭部打撲の有無別"による頭部・頸部の衝撃力測定」が,実験で使用する柔道実験専用のダミー頭頸部モデル(特注機器)の完成にともない,合計2回にわたり実験を実施することができた.実験内容については,重症頭部外傷発生頻度が多いと報告されている,「大外刈り」と「大内刈り」の2種類の投げ技の測定データを取得することに成功し,なお頭部外傷受傷局面の再現性についても担保することができた.また,昨年度に引き続き「研究ボランティアによる受け身動作時に生じる頭部加速度及び頸部筋力・筋電測定」は介入研究実施機関の多大な協力もあり,2期間(各々3ヵ月間)にわたる介入実験研究を遂行することができた.なお,参加協力をしてくれた被験者の方々の真摯な取り組みもあり大変貴重なデータを取得することができた.上記実験を実施できたことにより,本研究課題としていた以下の3つの大きなテーマについて全て実験実施に漕ぎつけることができた.1:「自動車衝突試験用歩行者ダミーを用いた“頭部打撲の有無別"による頭部・頸部の衝撃力測定」, 2:「ダミー頭頸部単体での振り子試験器による頭頸部衝撃力測定」, 3:「研究ボランティアによる受け身動作時に生じる頭部加速度及び頸部筋力・筋電測定」.さらに,これらの測定データの解析作業も進めることができ,学会等で公表することができた.平成28年度は「自動車衝突試験用歩行者ダミーを用いた“頭部打撲の有無別"による頭部・頸部の衝撃力測定」の本実験を予定していたが,実験で使用する柔道実験専用のダミー頭頸部モデル作成の検討に時間を要してしまい、それがまだ完成に至らず実験が実施できていない.しかしながら,少しずつではあるが適切かつ慎重な準備作業を進めることができており,平成29年度内における実験実施についても見通しがついた.この実験が実施できれば,柔道で生じる重症頭部外傷発生の要因を明確化することができ,予防対策の考案にもつなげることができる.また,平成29年度以降に実験実施予定であった「ダミー頭頸部単体での振り子試験器による頭頸部衝撃力測定」については,実験施設の協力により予備実験を行うことができたため,実験実施の際の詳細部分を詰めることができた.その結果,実験実施に際し特段の支障を生じないことも確認できたことは重要な成果であり,本実験に望む体制が整いつつある.これについても,柔道における頭頸部外傷発生機序の解明にもつなげることができ,貴重な知見を得ることができる.さらに,「研究ボランティアによる受け身動作時に生じる頭部加速度及び頸部筋力・筋電測定」についても,協力いただく介入施設(機関)の選定作業もすでに進行させており,具体的内容を詰める段階まで漕ぎつけた.これについても本年度内の実施に向けてさらなる準備作業を推し進める.実験に使用する柔道実験専用のダミー頭頸部モデルを特注作成するにあたり,より正確な再現性を追求したことで,予想以上に時間を費やしている.したがって,平成28年度に予定していた実験を実施することができなかった.しかしながら,平成29年度以降に実施予定であった別実験の一部を平成28年度に着手できた事は,今後の実験遂行過程を考えればプラス部分として考えることができる.平成29年度は「ダミー頭頸部単体での振り子試験器による頭頸部衝撃力測定」について,昨年度実施した予備実験結果を踏まえ,予定通りに本実験をおこなうことができた.ついては,借用させていただいた実験施設及び職員らの多大なご協力もあり貴重な測定データを得ることができ,現在そのデータについて丁寧かつ綿密な解析作業に取り組むことができている..平成30年度に実施予定としていた「研究ボランティアによる受け身動作時に生じる頭部加速度及び頸部筋力・筋電測定」が,予定よりも早期に介入研究実施施設(大学機関)が決定したことにより,第1回目の介入研究を行うことができた.現在その解析作業についても鋭意進行させているところである.また今後についても,同施設の協力もすでに得られており,第2回目の介入研究を実施することが決定している.さらに,第3回目となる介入研究の実施についても計画思案中である.平成28年度に実験実施予定であった「自動車衝突試験用歩行者ダミーを用いた“頭部打撲の有無別"による頭部・頸部の衝撃力測定」が,実験で使用する柔道実験専用のダミー頭頸部モデル作成の検討に時間を要したこともあり、これまで予定通りに実験を行えなかった.しかし,綿密な検討を積み重ねた事もあり,十分に納得できうる“柔道実験専用のダミー頭頸部モデル"をオリジナルにて作成させることができた.そして,平成29年度末にこれらの実験機材の準備が整ったので,借用する実験施設の都合がつきしだい,なるべく早期に実験を行う予定となっている.本研究では,3つの大きな研究課題を掲げているが,それぞれ,予定よりも実験実施等において遅れ気味の課題テーマもあるが,予定よりも早く取り組めている課題テーマもある.

全体的な課題進行状況はやや遅れているものの,機材の準備等もすでに整っており,今後の進捗に支障を来すことはないと考える.最終年度である平成30年度は,前年度までに実施予定としていた「自動車衝突試験用歩行者ダミーを用いた“頭部打撲の有無別"による頭部・頸部の衝撃力測定」が,実験で使用する柔道実験専用のダミー頭頸部モデル(特注機器)の完成にともない,合計2回にわたり実験を実施することができた.実験内容については,重症頭部外傷発生頻度が多いと報告されている,「大外刈り」と「大内刈り」の2種類の投げ技の測定データを取得することに成功し,なお頭部外傷受傷局面の再現性についても担保することができた.また,昨年度に引き続き「研究ボランティアによる受け身動作時に生じる頭部加速度及び頸部筋力・筋電測定」は介入研究実施機関の多大な協力もあり,2期間(各々3ヵ月間)にわたる介入実験研究を遂行することができた.なお,参加協力をしてくれた被験者の方々の真摯な取り組みもあり大変貴重なデータを取得することができた.上記実験を実施できたことにより,本研究課題としていた以下の3つの大きなテーマについて全て実験実施に漕ぎつけることができた.1:「自動車衝突試験用歩行者ダミーを用いた“頭部打撲の有無別"による頭部・頸部の衝撃力測定」, 2:「ダミー頭頸部単体での振り子試験器による頭頸部衝撃力測定」, 3:「研究ボランティアによる受け身動作時に生じる頭部加速度及び頸部筋力・筋電測定」.さらに,これらの測定データの解析作業も進めることができ,学会等で公表することができた.本研究課題を遂行するべく,平成29年度は,以下に示す3つの実験実施について計画をしていている.前項でも述べた通り,計画当初の予定からは遅延気味ではあるものの,適切かつ慎重に準備作業を進められているので,研究そのものの質的部分の劣化等につながる心配はしていない.したがって,今後さらに関係者及び協力施設との連携を図りながら,実験遂行へ向けて鋭意努力していく.1「自動車衝突試験用歩行者ダミーを用いた“頭部打撲の有無別"による頭部・頸部の衝撃力測定」2「ダミー頭頸部単体での振り子試験器による頭頸部衝撃力測定」3「研究ボランティアによる受け身動作時に生じる頭部加速度及び頸部筋力・筋電測定」平成30年度は,本研究課題を遂行する最終年度となる.したがって,以下の研究課題についてスピード感を持って実施して行く.すでに,借用予定の実験施設の確保,介入研究実施機関の協力等々,準備は整っているので真摯に取り組んでいく.1「自動車衝突試験用歩行者ダミーを用いた“頭部打撲の有無別"による頭部・頸部の衝撃力測定」2「ダミー頭頸部単体での振り子試験器による頭頸部衝撃力測定」3「研究ボランティアによる受け身動作時に生じる頭部加速度及び頸部筋力・筋電測定」主な理由は,平成28年度に柔道実験用ダミー頭頸部(特注品)の購入を予定していたが,特注モデルのため,作成検討に時間を要しているため,年度内の発注には至らなかった.したがって,使用予定額を大きく下回っている状況となっている.主な理由は,「柔道実験用ダミー頭頸部(特注品)」の購入予定数量を「2」としていたが,購入金額等々の関係もあり,数量を「1」に変更した事もあり,その差額分が余剰している状況となっている.使用計画については,平成30年度も実験が通年にわたり実施される予定であり,それらに関する支出が増えることが予測できる.また,より正確かつ迅速に測定作業を遂行させるため,それに必要な実験機材およびデータ解析作業等での使途が想定される.平成29年度には,柔道実験用ダミー頭頸部(特注品)を発注する予定となっている.また,平成29年度は国際学会(米国)での発表が確定しており,それに関わる経費についても支出予定となっている.
内皮リパーゼを標的とした動脈硬化治療の新戦略-新規モデルによる臨床への橋渡し研究

善玉リポ蛋白として知られる高比重リポ蛋白(HDL)を増加させる新たな治療法の確立を目指し、HDL分解酵素のひとつである内皮リパーゼ(EL)の役割について、HDL代謝系がヒトによく類似したウサギを用いて検討を行った。その結果、血中のHDL-コレステロールが低いウサギでELが多く合成されていることが明らかになった。また、ELを減少させる処置によって、HDL-コレステロールが増加した。これにより、ELを標的とした治療法の有効性が示された。内皮リパーゼ(EL)は、高比重リポ蛋白(HDL)代謝への関与から、HDLを上昇させる次世代の動脈硬化治療薬の優れたtargetとして注目されている。本研究では、ELの脂質代謝および動脈硬化に対する役割を、ヒトに類似した脂質代謝系を有するウサギモデルによって解明し、EL制御による新たな動脈硬化治療戦略を確立し、臨床応用への橋渡しを実現させる。平成21年度の研究では、まず、我々が同定したウサギELの臓器別発現分布について検討を行った。リパーゼファミリーの他の酵素(リポ蛋白リパーゼLPL、肝性トリグリセリドリパーゼHTGL)の発現分布と比較した結果、肝臓での発現はHTGLと共通していたものの、LPLとHTGLが発現していない副腎や精巣などにもELの発現が認められた。その発現分布はヒトのELとも類似していた。免疫染色並びに生体内EL活性阻害に用いる抗体作成を試み、現在までに、Western blottingに使用可能なウサギ由来抗ウサギEL抗体の作成に成功している。本年度中にEL活性を阻害する抗体が作成できなかったが、代替策として、米国ISIS社と共同で、ウサギEL発現を阻害しうるアンチセンスを複数合成し正常ウサギに投与したところ、1種類のアンチセンスにおいてELの発現阻害を示唆する結果が得られた。また、ELを過剰発現するトランスジェニック(Tg)ウサギ作製のための遺伝子コンストラクトを作成した。当初、ELが最初に発見された内皮細胞での発現コンストラクトを計画していたが、ウサギEL発現分布解析の結果から、肝臓のEL発現が優位に認められたため、肝臓特異的にELを発現できるapoEプロモーター/apoE liver element(LE6)を用いて、ウサギEL cDNAを組み込み、その作製に成功した。現在、EL Tgウサギを作製すべく、マイクロインジェクションを行っている。高比重リポ蛋白(HDL)を上昇させる次世代の動脈硬化治療薬の標的として注目されるELの役割を解明する目的で、ヒト近い脂質代謝系を有するウサギを用いて検討を行った。本年度は、我々が同定したウサギELの配列情報をもとに、各種ウサギモデルのEL発現を解析した。Watanabe heritable hyperlipidemic (WHHL)ウサギは、血中の低比重リポ蛋白(LDL)-コレステロールの高値とHDL-コレステロール(HDL-C)の低値を合併する遺伝的脂質異常症モデルである。このモデルの肝臓におけるEL発現量を、正常ウサギ(日本白色種,JW)ならびに、食事性高コレステロール血症を示すJWウサギと比較した。その結果、低HDL-Cを示すWHHLウサギのみ肝臓のEL発現が著明に亢進していた。さらに、動脈硬化とELの関連性を検討する目的で、in situ hybridizationを行ったところ、正常な動脈の内皮細胞では軽度であったEL発現が、動脈硬化病変の内皮細胞では増加しており、さらにマクロファージにおいても強く発現していた。次に、ELと脂質代謝との直接的な関係性を明らかにする目的で、EL発現低下モデルとしてのウサギEL特異的アンチセンス投与実験を行った。EL特異的アンチセンスは、昨年度に効果的な配列が同定できたため、それをJWウサギに6週間投与(40mg/kg/week)した。その結果、肝臓におけるEL発現の著明な低下が認められるとともに、血中のHDL-Cが軽度に上昇し、詳細なリポ蛋白解析により、粒子径の大きなHDLのコレステロールならびにリン脂質含量が増加していた。
溶液内における放射、無放射遷移に関する理論研究

溶液内における励起エネルギー移動の解明は、発光効率の高い蛍光色素の開発などで必要不可欠である。励起状態からの緩和を測定するための分光学的手法は種々開発されているものの、励起エネルギーがどのように失われるかを明らかにすることは依然困難である。そこで本研究では、溶液内における放射、無放射遷移を量子化学・統計力学に基づき、原子・分子レベルで解明することを目指す。本研究課題では、溶液内での放射・無放射遷移を原子・分子レベルで理論的に明らかにすることを目的としている。本年度は励起状態における溶質の構造揺らぎを検討するために、(a)溶液内での励起状態における構造最適化法の開発と(b)構造揺らぎに着目した無輻射失活に関する応用研究を行った。(a)の理論開発においては、これまでに開発してきた溶液内電子状態計算法であるRISM-SCF-SEDD法と励起状態計算法の一つである時間依存密度汎関数法(TD-DFT法)を組み合わせた。式の導出においては、ラグランジュ未定乗数法を用いた自由エネルギーの定義を行い微分することで解析的なgradientの導出をおこなった。本手法の妥当性を調べるために、indoleと5-cyanoindoleの蛍光スペクトルの理論的検討を行った。実験で測定されているアセトニトリル、メタノール、水中の結果と比較するために、これらの溶媒中で第一励起状態における構造最適化を行い、蛍光スペクトルを算出した。比較のため、幅広く用いられている連続誘電体モデル(PCM法)でも同様の計算を行った。PCM法では、溶媒の変化に伴うスペクトル変化を再現できなかったのに対し、本手法は実験で得られた結果を良く再現できた。(b)の応用研究においては、9-anthryltriphenylstibonium cation、ならびに中心元素を置換した蛍光色素について、フッ素イオン有無でのオン・オフ制御について検討を行った。励起状態で構造最適化を行ったところ、明状態と暗状態の2状態が見つかった。さらに中心元素がアンチモンの場合、これらの状態間のエネルギー障壁が非常に低いことがわかった。これにより、9-anthryltriphenylstibonium cationは垂直遷移直後の明状態から、ほぼエネルギー損失無しに暗状態へ移行することが明らかとなった。H27年度は【研究実績の概要】でも述べたように、RISM-SCF-SEDD法とTD-DFT法を組み合わせた理論の開発を行った。これについては、論文投稿直前である。本手法を用いて、当初の計画にもあった4-(N,N-ジメチルアミノ)-ベンゾニトリル(DMABN)についても研究を始めている。H27年度に雇用した技術補佐員とともに、先行研究について理論、実験問わず文献調査を行った上で、量子化学計算法の検証を行った結果、長距離補正を加えたDFT法(CAM-B3LYP)で、正しい励起状態描像を得ることが出来ることを確認した。検証作業が順調に進んだため、H28年度以降に行う予定であった溶液内での励起状態計算をCAM-B3LYP法を用いて行っている。その結果、1重項励起状態だけでなく3重項励起状態も重要であることが判明したため、現在詳細な検討を行っている。H27年度は当初の計画以外に、DMABNの蛍光スペクトルの時間発展についても検討を始めている。蛍光スペクトル変化の時間依存性を検討するためには、溶媒分子の配向の時間発展だけで無く、溶媒分子の配向変化に伴う波動関数の変化も検討する必要がある。そこで申請者は、溶媒の時間発展を統計力学的に算出するSite-Site Smoluchowski-Vlasov (SSSV法)とRISM-SCF-SEDD法を組み合わせた手法の開発を行った。現在、開発した理論の検証作業を進めている。本年度は励起状態における溶質の構造揺らぎを検討するために、(a)溶液内での励起状態における構造最適化法と精度向上のための方法論の開発、ならびに(b)構造揺らぎに着目した4-(N,N-ジメチルアミノ)-ベンゾニトリル(DMABN)の無放射遷移に関する応用研究を行った。(b)の応用研究においては、DMABNの無放射遷移についてRISM-SCF-SEDD法を用いて検討を行った。従来の研究では1重項励起状態(S1)に着目した研究がほとんどであったのに対し、本研究では3重項基底状態(T1)の存在に着目し、S1からT1への項間交差によって無放射遷移が起こることを明らかにした。この交差は、S1とT1状態のエネルギー差が小さいときに促進されるが、実験的に無放射遷移が起きやすいと言われているアセトニトリル中では、このエネルギーさがほぼ0であることを計算で得た。このエネルギー差が小さくなる原因について、分子軌道に基づく解析を行うことで、励起に関与するフロンティア軌道どうしの項間積分がDMABNの無放射遷移の鍵を握っていることを示すことに成功した。H28年度は【研究実績の概要】でも述べたように、RISM-SCF-SEDD法とTD-DFT法を組み合わせた理論について学会誌で報告した。さらに、近年注目されつつあるCC2法と我々が開発してきたRISM-SCF-SEDD法を組み合わせることで、実験で得られた吸収、蛍光波長をより良く再現できることを確認した。このCC2を用いた手法を用いて、実験で得られた近赤外蛍光分子の解析を新たに進めている。

H28年度初めですでに、溶液内での励起状態計算をするための手法開発は終えていたため、DMABNの無輻射遷移に関する研究を本格的に始めた。前年度までの予備研究により、1重項励起状態だけでなく3重項励起状態も重要であることを明らかにしていたことから、本年度は両方の状態について気相中、アセトニトリル中で構造最適化を行い、ポテンシャルエネルギー曲面を得た。この曲面を解析することで、DMABNは励起後、速やかに構造変化を起こし、ジメチルアミノ基がベンゼン環に対して90度になったときに、S1とT1状態が近接することを明らかにした。この近接の程度は溶媒により左右され、極性が高いアセトニトリルにおいては、両者のエネルギー差がほぼ0になることがわかった。さらに、このエネルギー差は、励起に関与するフロンティア軌道どうしの交換積分で決定されることを示した。ここで得られた知見は研究協力者である技術補佐員の手でまとめられ、すでにアメリカ化学会誌(K. Suda and D.Yokogawa, J. Phys. Chem. B 121, 2164 (2017))に掲載済みである。本研究では、溶液内での放射・無放射遷移を原子・分子レベルで理論的に明らかにするために、申請者が開発してきた溶媒和理論に励起状態における溶質と溶媒の揺らぎを加えた新たな溶媒和理論の構築を目指す。前年度までに、研究計画に挙げていた4-(N,N-ジメチルアミノ)-ベンゾニトリル(DMABN)の無放射遷移を明らかにしたので、今年度はより複雑な分子である4'-N,N-ジエチルアミノ-3-ヒドロキシフラボン(DEAHF)の無放射遷移の理論的解明を目指した。DEAHFは励起状態においてプロトン移動を起こす系として知られ、様々な溶媒中において量子収率が実験的に測定されている。極性溶媒中での量子収率は非極性溶媒の量子収率の約半分になることが知られているが、その理由は明らかにされてこなかった。そこで、前年度までのDMABNに関する研究で得られた知見を元に、励起状態における1重項、3重項状態の自由エネルギー曲面を算出した。その結果、分子が大きく屈曲することで円錐交差を経た内部転換が起きることを明らかにした。さらに、この交差点での構造は大きな双極子モーメントを有しているため、溶媒効果による安定化を大きく受けることがわかった。さらにエネルギーのみの議論だけではなくスピンー軌道カップリングを計算することで、プロトン移動を起こした後、1重項と3重項の間で項間交差が大きくなる構造変化があることを見出した。上記の計算による解析以外に、高精度自由エネルギー算出法の提案、溶液内における構造決定法の提案も行なっている。溶液内における励起エネルギー移動の解明は、発光効率の高い蛍光色素の開発などで必要不可欠である。励起状態からの緩和を測定するための分光学的手法は種々開発されているものの、励起エネルギーがどのように失われるかを明らかにすることは依然困難である。そこで本研究では、溶液内における放射、無放射遷移を量子化学・統計力学に基づき、原子・分子レベルで解明することを目指す。H28年度はH27年度に得た知見、方法を基に以下の2つを進める。1つ目はDMABNの励起状態における溶媒の揺らぎに関する検討である。
高速粒子衝突による付着現象のマルチフィジックスシミュレーションと最適粒子設計

粉体の高速衝突現象を利用した材料付着現象を、平滑粒子法や分子動力学シミュレーションにより可視化し、解明した。その結果、粉体は基板に衝突後、10ns程度の短時間内で10nmオーダの微細粒子に粉砕され、直ちにクーロン力により再結合し、膜形成に至ることがわかった。この現象を応用し、次世代ハイブリッド自動車用2次電池用のシリコン粒子設計と負極成膜を行った。性能評価を行った結果、良好な充放電特性を示すことを明らかにした。本研究の目的は粒子を目標物に高速衝突させることにより堆積付着させる成膜法に関して以下の3点を明らかにし,その知見をもとに最適粒子設計および最適噴射条件の選定指針を得ることである.さらには具体的適用例としてアルミニウム箔に緻密炭素膜を成膜するハイブリッド自動車用高効率小型2次電池用電極製造等を取り上げ,実用化を目指す.今年度得られた成果をそれぞれ記す.(1)ノズル出口,並びに衝突基板近傍での固気2相流の流動ダイナミクス流体解析シミュレーションを用いた流動ダイナミクスの解析を可能とした.その結果,基板近傍における速度の低下が確認された.この速度低下を抑えるため,シミュレーション結果に基づく新たなノズル設計を行った.(2)衝突した直後の粒子と基板の変形,破壊ダイナミクス有限要素法の一種である平滑粒子法により粒子が基板に衝突する際の変形,破壊をシミュレートした.また実際に噴射実験を行った.その結果,粒子に大きな運動エネルギを与えた場合,基板が破壊された.一方,粒子が持つ運動エネルギが小さい場合,粒子の破壊等の現象は現れなかった.すなわち粒子に与える運動エネルギに最適値が存在することが明らかとなった.(3)衝突後の粒子と基板材料界面での化学反応,状態変化,物質移動等のダイナミクストライボロジーケミカル反応を利用した複合粒子製造装置を導入し,粒子の表面改質が可能となった.今後,分子動力学により最適条件を選定するとともに,複合粒子製造装置を用いた実験を行う基盤を整えた.本研究の目的は粒子を目標物に高速衝突させることにより堆積付着させる成膜法に関して以下の3点を明らかにし,その知見をもとに最適粒子設計および最適噴射条件の選定指針を得ることである.さらには具体的適用例として銅箔に緻密炭素膜を成膜するハイブリッド自動車用高効率小型2次電池用電極製造等を取り上げ,実用化を目指す.今年度得られた成果をそれぞれ記す.1.ノズル近傍の流動ダイナミクスシミュレーションノズル出口,並びに基板衝突点近傍の圧力分布,粒子の速度分布をシミュレーションし,粒子の速度分布に及ぼす噴射角度,噴射条件,ノズルギャップ,基板の表面形状等の影響を調べた.一方,既設のPIVを用いて実際の噴射粒子の速度分布を計測し,比較検討した.2.粒子平滑法による粉体破砕シミュレーション粒子が基板に衝突した直後の粒子と基板の変形,破壊現象を,平滑粒子法を用いてシミュレーションし,粒子径,粒子形状,粒子の速度分布が粒子の破砕状況に与える影響を調べた.3.界面での分子動力学シミュレーション実際の膜断面のTEM観察し,昨年度のシミュレーション結果と比較した.4.粉体表面改質法の開発と粉体の試作昨年度導入した複合粒子製造装置を用いて,粉体表面を機械的に改質する方法を確立した.処理条件と改質膜の構造を工夫することにより最適条件を求め,2重構造の複合粒子製作法を提案し,成膜することに成功した.5.成膜実験試作したPJD装置により,アルミニウム箔に代わり,銅箔上への炭素の成膜実験を行い,厚膜の成膜に成功した.本研究の目的は粒子を目標物に高速衝突させることにより堆積付着させる成膜法に関して,以下の点を明らかにした.これまでハイブリッド自動車用2次電池として通常使われている炭素膜負極を最終ターゲットとしていたが,昨年度の成果である複合粒子製造技術を応用し,シリコン膜負極を作成することとした.シリコン膜の場合,電池容量が3,4倍になると言われているが,シリコン膜の体積膨張により剥離する問題のため,実用化されなかった.本年度ではシリコン銅複合粒子を試作し,それを噴射衝突させることにより,箔に緻密シリコン膜を成膜することに成功した.さらにそれを用いて2次電池を試作し,その性能評価を行った.(1)噴流流動ダイナミクスシミュレーションと粉体破砕シミュレーション昨年度に引き続き,ノズル出口,並びに基板衝突点近傍の圧力分布,粒子の速度分布をシミュレーションし,PJD噴射装置の最適設計,試作を行った.また粒子が銅箔基板に衝突した直後の粒子と基板の変形,破壊現象を,平滑粒子法を用いてシミュレーションした.従来の2次元から3次元モデルに変更し,実際に近い条件でシミュレーションできるようになった.その結果,PJDに最適な衝突速度範囲があることがわかった.(2)シリコン銅複合粉体の試作本年度

導入したミルにより原料粉を微粉化した後,1年目に導入した複合粒子製造装置を用いてシリコン銅複合粒子を作成した.処理条件と改質膜の厚さ,強度等に関して検討するとともに,改質膜の構造を多層構造にするなどの工夫を行った.SEM,TEMにより複合粒子を観察し,改質膜の生成状況に関して,詳細に観察した.(3)成膜実験試作したPJD装置により,銅箔上へのシリコン銅複合粒子を成膜し,それを負極材を作製し,リチウムイオン電池を試作した.性能評価を行った結果,充放電の寿命が短い従来型電池と比較し,シリコン負極型ではより寿命が長くなることがわかった.
魚病細菌に対する赤血球膜糖タンパク質グリコホリンの生体防御機能の研究

赤血球膜糖タンパク質であるヒトグリコホリンの機能として、血液型決定基の他にもウィルスの接着能や細胞認識機能などが明らかとなっている。さらに病原菌の侵入防止や免疫等生体防御機構に重要な役割を果たしている可能性が大きい。そこで魚類グリコホリンの生体防御機能の探索とその機構を解明することを目的とした。平成11年までにコイおよびニジマス血液からのグリコホリン抽出法が確立できたため、本研究ではコイのグリコホリンを用いた生体防御機能の解明として種々の魚病性細菌を含む各種の細菌およびウィルスとの相互作用の観察およびその活性部位と思われるグリコホリン糖鎖の構造解明に重点をおいて研究を進めた。用いた細菌はAeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda, Vibrio anguillarum, Bacillus subtilisやMicrococcuss luteusなどであり、魚病性ウィルスはIPNを用いた。その結果、凝集反応は観察されなかったものの、電子顕微鏡で観察した結果、グリコホリンと思われるタンパク質分子が菌体と作用している様子が観察された。さらに、細菌性白雲病のPseudomonas fluorescensに感染したコイの赤血球膜と健常なコイの赤血球膜を比較した結果、赤血球膜の構造タンパク質に変化はなかったが、グリコホリン含量は顕著な減少が観察された。この結果より、血液中の病原菌にグリコホリンが作用して血球膜より遊離した可能性が強く示唆された。この現象はグリコホリンの糖鎖が作用した可能性が高く、糖鎖の構造解明の研究を併せて行った。大量に調製したグリコホリンより糖鎖を遊離させ、糖鎖用陰イオン交換カラムを用いたHPLCを用いて糖鎖を分画した。その結果、シアル酸が1つ結合したオリゴ糖と2つ結合したオリゴ糖に分別できた。これらの糖鎖をHPLCを用いて大量分取した。分取・脱塩の過程でシアル酸が脱落したが、この標品を用いてNMRスペクトルを測定した。その結果、今までの研究結果を裏付けるデータが得られたものの、メチル化およびGC/MSによる確認が必要となった。現在東レリサーチセンター(株)の解析待ちの状態である。健全なコイの背部動脈から血液をシリンジを用いて採取し、直ちに白血球および血漿を遠心分離によって分離した後、得られた赤血球から赤血球膜の調製を行った。得られた赤血球膜は冷凍保存し、ある程度集めた赤血球膜標品を凍結乾燥した後、LIS-フェノール法を用いてコイのグリコホリンを抽出した。SDS-PAGEで純度の検定したところ、脂質がほとんど混在しないシアル酸を含む糖タンパク質が検出された。このコイグリコホリンを用いてβ-脱離を行ってシアル酸含有糖鎖を遊離させ、遊離したシアル酸含有糖鎖のみを調製した。陰イオン交換型HPLCを用いてNaClで濃度勾配法を行い、糖鎖を溶出させたところ、全ての遊離糖鎖はモノシアリルオリゴ糖とジシアリルオリゴ糖の2種類に分離できた。クロロホルム-メタノールによる抽出による糖脂質の抽出を行ったが、ヒトと比較して少量であり、かつシアル酸は含まれていなかった。

コイグリコホリンを用いた種々のレクチン反応および薄層クロマトグラフィーを用いて検討した結果、含有糖鎖中にはNGNA(N-グリコリルノイラミン酸)とN-アセチルガラクトサミン、フコース、ガラクトースおよびグルコースであることが示唆された。そこで、糖に特異的な電気化学検出器を用いた糖分析用HPLCシステム(申請物件)を用いて検討したところ、上記の糖が高感度で検出され、コイグリコホリンの糖組成を確認した。コイグリコホリンを、魚病の病原菌を含む種々の細菌(Aeromonas hydrophila,Edwardsiella tarda, Vibrio anguillarum, Bacillus subtilisおよびMicrococcuss luteusを使用)に作用させたところ、凝集反応は観察されなかったものの、電子顕微鏡による観察ではコントロールとの差異が確認された。健全なコイの背部動脈から血液をシリンジを用いて採取し、直ちに白血球および血漿を遠心分離によって分離した後、得られた赤血球から赤血球膜の調製を行った。コイは常時蓄養し、1回に60-100mlの血液を分取し、その日の内に赤血球膜調製を行った。調製した赤血球膜は緩衝液に懸濁した後、-20°Cで凍結して保存した。集めた赤血球膜(血液約500ml分)を凍結乾燥した後、LIS-フェノール法を用いてグリコホリンを調製した。単離したグリコホリンをSDS-PAGEで純度を検討した結果、均一に単離されたと判断した。次に単離したグリコホリン標品を用いて病原性細菌との親和性を検討した。用いた魚病性細菌は、コイなどで発病する立鱗病、赤斑病、鰭赤病などの原因菌であるAeromonas hydrophila、細菌性白雲病のPseudomonas fluorescens、ウナギのパラコロ病などの原因病であるEdwardsiella tarda、ビブリオ病のVibrio anguillarum、グラム陽性で抗菌検査に用いられるBacillus subtilisやMicrococcuss luteusなどである。その結果、顕微鏡下では親和性が確認できなかったが、電子顕微鏡で観察した結果、グリコホリン凝集体が菌体と作用している様子が観察された。次に、得られたグリコホリンから糖鎖を遊離させ、糖鎖用陰イオン交換カラムを用いたHPLC法を用いて糖鎖を検出した。その結果、シアル酸が1つ結合したオリゴ糖と2つ結合したオリゴ糖に分別できた。これらの糖鎖をHPLCを用いて分取した。分取・脱塩の操作途中でシアル酸が脱落したが、最終的に各糖鎖を400μg程度調製する事が出来た。次いで調製した糖鎖の核磁気共鳴(NMR)スペクトルを測定した。その結果、中性糖が4つ結合したオリゴ糖であることが判明したが、それぞれの結合様式は推測の域を出ず、さらにメチル化およびGC/MSによる確認が必要であった。しかし、糖鎖の絶対量が最低でも200μg必要なため、現在シアル酸付加糖鎖の大量分取を鋭意行っている最中である。平成13年度までの研究で、グリコホリンと種々の病原性細菌の相互作用が電子顕微鏡による形態観察によって明らかとなった。また、グリコホリン糖鎖の構造も電気化学検出器を用いたHPLC法および種々のレクチンに対する吸着能や、核磁気共鳴(NMR)スペクトル(HNMR、CNMR、COSY-NMR、HOHAHA-NMR、HSQC等)より、糖鎖の構造式が推定可能となった。