hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
核内受容体による肝毒性誘発機序の統合理解と毒性予測・評価系の構築

本研究では、異物応答性の核内受容体CARおよびPXRについて、それらの肝毒性と関連する機能について解析を行なった。その結果以下のことを明らかにした:(1)CARはマウスおよびヒトDHCR24遺伝子の転写を活性化する、(2)CARはマウス肝においてPPARαシグナルの抑制因子として機能する、(3)PXRの活性化はCARやPPARαを介したマウス肝細胞増殖を増強する。さらに、本研究では化学物質のCAR活性化作用評価系を構築した。薬物による肝毒性との関連が示唆されている異物応答性の核内受容体であるCARおよびPXRについて、毒性に関連する両核内受容体の細胞機能の解析を行ない、本年度は以下の成果を得た。1.CARおよびPXRの脂質代謝調節機能の解明:レポーターアッセイならびにゲルシフトアッセイにより、コレステロール合成の最終段階を触媒する24-デヒドロコレステロール還元酵素(DHCR24)は、核内受容体CARにより転写レベルでその発現が調節されていることを明らかにした。また、マイクロアレイ解析により、マウス肝において、CARはインスリンシグナルや脂肪酸代謝関連遺伝子の発現調節に関与している可能性が示された。2.CARおよびPXRの細胞周期に対する作用の解明:ヒトCAR発現アデノウイルスをマウスに感染させてヒトCARを活性化した場合と、マウスにCAR活性化薬物を投与した際の遺伝子発現プロファイルの違いをマイクロアレイにより解析した結果、CARが発現調節に関わる細胞周期関連遺伝子群には、マウスとヒトの間で種差が認められる可能性が示された。3.CARおよびPXRの炎症シグナルに対する作用の解明:ヒト単球系THP-1細胞を肝非実質細胞モデルとして利用するための予備検討として、ホルボールエステルによりマクロファージ様細胞へ分化させた後に核内受容体の発現プロファイルを解析した。その結果、分化したTHP-1細胞において、PXRを含む多くの化学物質応答性核内受容体が発現していることを明らかにした。4.CARおよびPXR活性化能評価系の構築:ヒトPXR、ラットPXRおよびヒトCARの活性化能評価系を確立した。また、ヒトCARおよびヒトPXRを安定的に発現する細胞株の樹立に成功した。1.CARおよびPXRの脂質代謝調節機能の解明:マイクロアレイ解析により、マウス肝において、CARはケトン体合成の律速酵素であるHmgcs2の発現を負に制御していること、またその抑制はPPARalpha依存的なHmgcs2の転写阻害によることが明らかになった。2.CARおよびPXRの細胞周期に対する作用の解明:マウスにCAR活性化物質またはPXR活性化物質を投与し、肝の細胞周期関連遺伝子の発現変動をPCRアレイ法を用いて解析した。その結果、CAR特異的に制御を受けている可能性がある遺伝子を複数同定することができた(論文投稿準備中)。現在これらの発現調節機序の解析を進めている。3.CARおよびPXRの炎症シグナルに対する作用の解明:ヒト単球系THP-1細胞をホルボールエステルで処置し、マクロファージ様細胞へ分化させた後にPXR、PPARalpha、PPARgamma、LXRalphaのリガンドを処置し、サイトカイン・ケモカイン関連遺伝子の発現変動を解析した。その結果、PPARalphaやPPARgammaのリガンド処置により、細胞障害性T細胞や樹状細胞の遊走に関わるケモカインの発現亢進や抗炎症性サイトカインの発現抑制が起ることを見出した。4.CARおよびPXR活性化能評価系の構築:ヒトCAR、マウスCAR、ヒトPXR、ラットPXRについて、化審法既存物質176物質による活性化作用のスクリーニングを行った。その結果、ヒトCARやヒトPXRを非常に強く活性化する物質を同定することができた(論文投稿準備中)。脂質ホメオスタシスにおける核内受容体CARの機能について、マウスを用いたインビボ解析およびインビトロ解析を行なった。その結果、CARはPPARalphaによる遺伝子発現を抑制すること、その抑制にはPGC1とPPARaとの高次複合体の形成が関与する可能性が示された。さらに、マウス肝におけるPPAralphaの活性化はCar mRNAレベルを増加させることを見出し、その分子機構を解析したところ、PPARalphaはマウスCar遺伝子プロモーター上のDR1配列を介してCar遺伝子の転写を活性化することを見出した。CARおよびPXRによるマウス肝細胞の細胞増殖調節機構について解析を進めた結果、PXRの活性化はCARだけでなく、PPARalpha依存的なマウス肝細胞のインビボにおける細胞増殖ならびに血清刺激依存的な培養マウス肝細胞の増殖を増強することを見出した。さらに、PXRの活性化は、マウス肝において細胞周期のG0期からG1期への移行を制御するp27やp130の遺伝子発現を抑制すること、また、これら遺伝子のFOXOを介した転写がインビトロレポーターアッセイにおいてPXRにより抑制されることを明らかにした。肝毒性を予測する評価系を構築するために、ラットのCAR、PXRおよびPPARalphaの活性化能評価系を構築した。

これらを用いて、ラットインビボでの毒性作用が公開されている約150の化学物質を用いてスクリーニングを行なった。その結果、これら受容体の活性化の程度と、肝脂質代謝異常や肝細胞肥大との関連性を示唆する結果が得られた。応募書類や交付申請書の計画通りに進展しているため。24年度が最終年度であるため、記入しない。応募書類に従い、CARおよびPXRの薬剤誘発性の肝毒性における機能に関する研究を進める。また、活性化能評価系の高度化を進める。
クロマフィン細胞の刺激-不泌連関機構におけるα2受容体アゴニストの作用機序

α2アゴニストが神経細胞においてそのストレス反応の結果放出するカテコラミンの分泌を抑制することはよくられている。副腎髄質のクロマフィン細胞はパラニューロンとしての性質を有し、神経機能を探る上で有用なモデルであり、同様にα2アゴニストがカテコラミン分泌を抑える。しかしそれがα2受容体を介するものか否かは議論が分かれており、さらにα2アゴニストの結合する新たなイミダゾール受容体がクロマフィン細胞で同定さその生理的役割が注目されている。これに加えて従来から神経細胞への作用としては受容体を介する特異的作用と特に受容体を介さない非特異的作用があげられておりこれを区別することも重要である。今回我々はα2選択が高く、またイミダゾール核を持つDexmedetomidineとその光学異性体でα2への作用が乏しいLevomedetomidineを用いこれら薬剤のクロマフィン細胞のカテコラミン分泌に対する影響を調べ、この作用が選択性の優れたα2ンタゴニストであるatipamezole(イミダゾール核を持つ)およびL-659,066(イミダゾール核を持たない)で拮抗されるか否かを調べた。カテコラミンの分泌刺激はアセチルコリンの投与により行った。Dexmedetomidineは量依存性にカテコラミンの分泌を抑制し、100μMにて約80%の抑制を示した。またLevomedetomidineも同様カテコラミンの分泌を用量依存性に抑制し、その程度はDexmedetomidineと有意差はなかった。またこれら薬剤よる抑制をatipamezoleおよびL-659,066いずれのアンタゴニストも拮抗しなかった。これらの結果からα2アゴニストによるクロマフィン細胞からのカテコラミンの分泌抑制はα2及びイミダゾール受容体を介する反応とはえ難く、非特異的に細胞に働いてカテコラミンの分泌抑制をしているものと考えられる。これらの結果はクロマフィン細胞での結果であり、これが他の神経細胞でも当てはまるか否かに関して、今後の研究が望まれる。
哺乳類神経堤発生におけるヘリカーゼ関連因子の機能

Sno1はマウス胚神経堤細胞で発現しており、神経堤細胞系譜でのSno1 KOマウス胚では細胞死が増加し、顔面の低形成を起こすことが観察された。また、Sno1はヒストン結合タンパク質と相互作用することが明らかとなった。Sno1は転写活性化能を有すること、Sno1タンパク質のC末領域は、DNA損傷部位に集積するということが明らかとなった。以上の結果から、Sno1は発生中の神経堤細胞において、遺伝子の転写活性化、DNAの損傷-修復に関与している可能性が示唆された。本研究ではヘリカーゼ関連因子であるStrawberry Notch1 (Sno1)に着目し、Sno1のマウス神経堤発生における機能について解析した。Sno1はマウス胚神経堤細胞で発現しており、神経堤細胞系譜でのSno1 KOマウス胚では細胞死が増加し、顔面部、鰓弓部の著しい低形成が観察された。インクインジェクションによって鰓弓動脈発生を観察した結果、鰓弓動脈の発生は遅延しており、胎生12.5日目で致死となる。これまでのin vitroの実験では、Sno1が転写活性化能を示すことも明らかとなっているが、その分子メカニズムは不明であった。Sno1の分子基盤を明らかにするために、Sno1と相互作用するタンパク質を検索したところ、ヒストン結合タンパク質と物理的に相互作用することが明らかとなった。また、in vitroの培養細胞を用いた解析では、HeLa細胞へDNA二本鎖切断を誘導したところ、Sno1タンパク質が、DNA損傷部位に集積するということが明らかとなった。さらに、DNAアルキル化剤処理した細胞では、Sno1ノックダウンにより細胞の生存率が有意に減少した。以上の結果から、Sno1は発生中の胚の神経堤細胞において、DNAの損傷-修復に関与している可能性が示唆され、Sno1非存在下ではDNA修復が適切になされずに、細胞死が起こっているのではないかと推測された。Strawberry Notch1 (Sno1)はマウス胚発生期において、神経堤細胞と神経堤細胞に由来する組織で発現している。本年度は、Sno1の哺乳類神経堤細胞における機能を解析するために、Sno1の神経堤細胞特異的ノックアウトマウス(Sno1;Wnt1-Cre cKO)を作製し、その表現型解析を行なった。その結果、胎生10.5日目11.5日目では、Sno1;Wnt1-Cre cKOマウスでは神経堤細胞の発生直後からの細胞死のため、顔面部、鰓弓部の著しい低形成が観察された。インクインジェクションによって鰓弓動脈発生を観察した結果、鰓弓動脈の発生は遅延していた。また、Neurofilament染色による神経系の観察では、三叉神経節と末梢神経節が低形成となっていた。その後、Sno1;Wnt1-Cre cKOマウス胚は、胎生12.5日目で致死となった。Sno1の機能の分子メカニズムを解明するために、システインクラスターを含むSno1-C末領域にHisタグを付加したものを精製し、磁性ナノビーズに結合した後に、胎生10.5日目胚から採取した細胞抽出液と反応させてSno1-C末領域と相互作用するタンパク質の同定を質量分析により解析した。同定されたタンパク質については、現在、共免疫沈降法によりSno1との結合を確認している。Sno1はヘリカーゼドメインを含む核タンパク質であるため、遺伝子の転写制御における機能について、ルシフェラーゼアッセイを用いて解析した。その結果、Sno1は非常に高い転写活性化能を示すことが明らかとなり、転写の制御に関与していることが覗えた。平成24年度の計画として、1Sno1タンパク質の結合タンパク質を同定、2Sno1と結合タンパク質の生化学的活性の解析を掲げていた。Sno1タンパク質の結合タンパク質を同定に関しては、計画どおり進行していると判断する。システインクラスターを含むSno1-C末領域に注目して、結合タンパク質の単離と同定を進めた。大腸菌にHisタグを付加したSno1-C末タンパク質を発現させて精製した後、磁性ナノビーズにHisタグ-Sno1-Cを結合させた後、胎生10.5日目胚からの細胞抽出液と反応させた。結合タンパク質を精製した後、質量分析にてタンパク質同定を行なった。以上の解析により幾つかのタンパク質を同定できた。現在は、同定タンパク質が共免疫沈降法によっても結合しているかどうかを確認中である。そのため、Sno1と結合タンパク質の生化学的活性の解析に関しては、まだ行なっていない段階である。その一方、ルシフェラーゼアッセイを用いた解析から、Sno1が高い転写活性を示すことが明らかとなり、Sno1が転写活性化因子であることが覗えた。また、このアッセイ系を用いて、様々な転写因子、転写コファクター、シグナリング因子などを加えて、Sno1の転写活性に影響を与える因子を検索中である。

平成25年度は、Sno1と相互作用するタンパク質を共免疫沈降法、プルダウン法によって確認した後、Sno1と相互作用するタンパク質の神経堤発生における発現パターンを観察し、Sno1との局在、分布比較を行う。また、Sno1が転写調節に関与するデータが得られているが、特異的な標的遺伝子を持つのか、相互作用するタンパク質とどのような関係で転写を制御するのかを解析する。Sno1はヘリカーゼ様のモチーフを含むため、転写に加えてDNA複製、修復の機能に関与する可能性も考えられるため、細胞周期におけるSno1の機能にも、相互作用するタンパク質と関連して解析を進める。平成25年度は、Sno1解析のための分子生物学、細胞生物学関連試薬などと共に、マウス胚への遺伝子導入解析を行うためのフェムトジェット購入に研究費の多くを充てる。その他、学会参加費や実験アルバイトの賃金、論文投稿を視野に入れた論文校閲費に使用する予定である。
「日本語としての自然さ」を追求した日本語教育のためのシラバス構築と教材開発

本研究の目的は、初級用日本語学習教材の構築である。目標としたことは、日本語学習者が、初級段階から「一表現者」として、自己の身の回りの出来事や、その際に湧き起こる感情を伝えることができ、また、他者とそれらを共有して人間関係を深めていけるような力として日本語を身につけていける教材の作成である。具体的には、日本語の実際の使用を踏まえ、「無助詞」「って(提題、引用)」や「終助詞」「んです(けど)」の文末用法など、従来の初級教材では提出を避けるか、会話文などに散発的に出現させるかに留まる傾向にあった要素を、日本語での会話をより相互的なものとするための重要な鍵と捉え、それらを「一文文法」としてではなく、明確な「状況・文脈」の中で学んでもらえるよう工夫した。このことによって、従来の教材に比べ、「つくりもの感」の薄い「生の日本語」の学習を、学習者に提供することが実現できた。また、例えば、終助詞の「ね」がその長さや上昇/下降などの音調の違いによって「確認・共感・詠嘆」など様々な機能を持ちうることなど、日本語の音声的な特徴も学習内容として積極的に扱った。これは、短い発話を中心としたやりとりの多い初級学習者にとって、小さい負担で大きな表現性を獲得することに繋がるとの考えによるものである。さらに、学習項目の配列について、初級段階の習得的負担とともに、初級終了後の拡張性の確保も考慮し、「んです(けど)」「ので」「の(準体助詞)」「名詞修飾」などの項目を、従来よりも早い段階で提出することの有用性を明らかにした。開発教材は、数回の改訂を行いつつ、代表者らの所属機関を中心にすでに500名以上の学習者に使用されている。また、教材開発の過程では、「んです(けど)」、「から/ので」をはじめとする学習項目についての基礎的な分析を進めることができ、学会等でそれらの知見を公表できた。当該年度(26年度)は、名大会話コーパス等の既存のコーパスを参照しつつ、文法項目の意味分析を中心に進めるとともに、これを踏まえた教材開発を行った。このほか所属機関内において、上記の開発教材を試用し、当該教材で学ぶ学習者らを対象とした「教室内発話データ」の収集を継続的に行った。具体的な検討項目で最も進展したものとしては、初級日本語学習の難所とされてきた「受身」についての意味分析・談話分析、及び、その学習者の使用実態の考察が挙げられる。その成果は、日本語教育学会のパネル等における発表として公開された。また「って」と「は」の違い、動詞文の目的語が無助詞となる場合、文末の「んですけど」や終助詞やとそのイントネーション等について、学習者の習得状況の観察等を踏まえ、相応しい提示方法について再考し、開発教材の改訂に反映させた。これらにより、学びやすさへの配慮の余り「日本語としての自然さ」を欠いた例文から成るような教材でなく、各学習項目が「話題に対する話者の関心の度合や感情の持ち方」の生きた表現手段となって他者とのインターアクションを促進するような日本語学習の実現を目指すという開発教材の方向性がより一層明確になった。これに伴い、教材内の各タスクについても、活発な教室内インターアクションに基づいた学習が展開されるよう配慮した。さらに、当初の予定にはなかったが、音声面を考慮した学習シラバスを構築しようとする過程において、漢字圏学習者の多くが、中上級段階になっても日本語の聞き取りや発音に対し、深刻な弱点を解消できずにいることへの手当てが別途必要となり、その方策を模索した結果、新たな知見を得ることができた。これについても、日本語教育学会、日本語教育方法研究会等においての発表を複数行った。当該年度(27年度)は、次のような成果を上げることができた。教材開発においては、「様態のそうだ」「たほうがいい/といい」「ようと思う」「受身」「ところだ」等の各種項目について、それらが埋め込まれるのに相応しい文脈の要件を項目ごとに考察し、その記述方法について検討した。その際、教師による指導内容、指導方法だけでなく、学習者同士の協働的な学びの様相を具体的に観察することを通して、実際の授業に活かすことのできる望ましい記述のあり方についての考察を深めた。これらにより、固定的な場面や話題に過度に縛られることなく、学習者が実際の生活で活かせる言語学習の実現を可能にする方向性を見いだすことができたものと思われる。なお、これらの知見についての成果発表は、当該年度中には行えなかったため、翌年度に行うこととする。前年度に引き続き、日本語学習の多くを占める「漢字圏学習者」を特に益する教育方法についての考察を行い、これについては学会等での成果を公開することができた。また、音声文法の知見を開発教材の教育内容に生かすための方法を検討するために、3月に研究会を開催し、「んですが」「って」などの項目の扱い方について活発な議論を行い、これらを開発教材内で、具体的な音声情報とともに示していくことの必要性をあらためて確認した。当該年度中に、研究代表者の健康上の問題が生じ、入院治療にあたっていたため、予定の研究計画の一部が遂行できなかった。当該年度(28年度)は、教材開発の基礎にあたる、文法項目の意味分析としては「ところだ」及び、伝聞の「そうだ」を中心に考察を進めた。

また、初年度から継続的に研究を進めてきた「んですけど/んですが」の日本語教育としての扱い方についての検討も進め、教育現場への提案をまとめた(書籍論文として、29年度内に発行予定)。その中での主張は、「話し言葉と書き言葉とでは、その使用傾向が異なり、話し言葉では「んですけど/んだけど」の使用に偏ること」「学習者が「んですけど/が」を使用できていない傾向にあること」を示し、その要因として、「日本語教育の教科書においては、複文の従属節中のものだけが学習項目として扱われ、文末に使用される用法は補足的な扱いでしかないこと」が大きいことを述べた。これらの考察により、従来は、いわゆる「言いさし」の文や、無助詞文を極力避けるなどして、日本語の自然会話とは乖離のある要素を積み上げて行われる傾向にあった初級日本語教育を、学習者への負担をそれほどかけずとも、加工的・人工的でないオーセンティックなものに変えていくための方向性がある程度示せたものと思われる。さらに、試用教材の改訂についても、他の日本語教育機関による外部コメントも得るなどし、その結果を反映させる形で作業を進めていった。特に、無助詞/有助詞の文の区別については、学習者に対する提示方法に改善が見られたことは大きな成果であったと考えられる。研究代表者の健康問題が主たる理由本研究の目的は、初級用日本語学習教材の構築である。目標としたことは、日本語学習者が、初級段階から「一表現者」として、自己の身の回りの出来事や、その際に湧き起こる感情を伝えることができ、また、他者とそれらを共有して人間関係を深めていけるような力として日本語を身につけていける教材の作成である。具体的には、日本語の実際の使用を踏まえ、「無助詞」「って(提題、引用)」や「終助詞」「んです(けど)」の文末用法など、従来の初級教材では提出を避けるか、会話文などに散発的に出現させるかに留まる傾向にあった要素を、日本語での会話をより相互的なものとするための重要な鍵と捉え、それらを「一文文法」としてではなく、明確な「状況・文脈」の中で学んでもらえるよう工夫した。このことによって、従来の教材に比べ、「つくりもの感」の薄い「生の日本語」の学習を、学習者に提供することが実現できた。また、例えば、終助詞の「ね」がその長さや上昇/下降などの音調の違いによって「確認・共感・詠嘆」など様々な機能を持ちうることなど、日本語の音声的な特徴も学習内容として積極的に扱った。これは、短い発話を中心としたやりとりの多い初級学習者にとって、小さい負担で大きな表現性を獲得することに繋がるとの考えによるものである。さらに、学習項目の配列について、初級段階の習得的負担とともに、初級終了後の拡張性の確保も考慮し、「んです(けど)」「ので」「の(準体助詞)」「名詞修飾」などの項目を、従来よりも早い段階で提出することの有用性を明らかにした。開発教材は、数回の改訂を行いつつ、代表者らの所属機関を中心にすでに500名以上の学習者に使用されている。また、教材開発の過程では、「んです(けど)」、「から/ので」をはじめとする学習項目についての基礎的な分析を進めることができ、学会等でそれらの知見を公表できた。当該年度(26年度)の計画としては、1)意味・音声の両面における文法項目の検討、2)上記1)を踏まえた教材開発の推進、3)開発教材の試用・効果検証の3点を掲げた。このうち、1)については、音声面の考察がさほど進展しなかったことを除けば、おおむね順調である。上記2)にあたる教材開発は、補助教材の作成を含めて順次行っている。
船上搭載型GNSSによる海上可降水量観測システムの構築

本研究では日本域の降水予測精度の向上を目指した技術開発として、海上での可降水量(水蒸気の鉛直積算量)観測をリアルタイムで実施するために、船舶から安定的に可降水量の情報を観測できるシステム開発と海上水蒸気量の予報に対するインパクトの検討を目的としている。平成30年度は、以下の2点について実施した。昨年度に構築した観測システムを船舶上のサーバで通年稼働させ、リアルタイムによるGNSS大気遅延量の算出を行った。可降水量の正確な計測にはGNSS大気遅延量の正確な推定が必須である。実験観測では、従来のPPP(単独精密測位)だけでなく、陸上の固定GNSS観測点から算出された補正値を用いるPPP-ARによる解析も同時に実施した。船舶の通信状況が悪いと解析に用いるデータが取得でないため、大気遅延量の算出成功率は通信状況に依存するが、大気遅延量の出力が得られた場合のみで判断するとおおむね良好な解析結果が得られた。海上水蒸気量の予報インパクトを評価するために、昨年度に検討したものよりもLETKFの局所化半径を拡大させた観測システムシミュレーション実験を行い、船舶搭載GPS観測の同化インパクトを再検証した。その結果、以前よりも海上水蒸気量の同化インパクトは明瞭になった。東西1列に船舶によるGPS観測が継続的に得られたと仮定した場合、32.5Nから34.5Nの間の緯度のうち33Nの水蒸気量が鬼怒川流域の降水量予測に最もインパクトが大きいことがわかった。当初の予定であるリアルタイム観測システムを用いた通年観測、観測システムシミュレーション実験がともに実施できたため。観測ではおおむね良好なデータが得られたと考えられるが今後は定量的な精度検定を実施する。観測システムシミュレーション実験の結果については学術論文等で発表する。本研究では日本域の降水予測精度の向上を目指した技術開発として、海上での可降水量観測をリアルタイムで実施するために、船舶から安定的に可降水量の情報を観測できるシステム開発と海上水蒸気量の予報に対するインパクトの検討を目的としている。平成29年度は以下の2点について着手した。これまで主に陸上固定観測点で行われていたGNSS可降水量解析を、船舶上でリアルタイムに行うために、速報の衛星情報と移動体で観測されたGNSSデータを用い大気遅延量の算出を精密単独測位(PPP)により実施した。陸上固定観測点で得られたGNSSデータも同様手順で大気遅延量解析を行い、双方の精度の比較を実施した。さらに既存のPPPだけでなく、陸上の固定GNSS観測点から算出された補正値を用いる(PPP-AR)ためのシステムを船上において開発した。次に、海上可降水量の日本域の降水量に与えるインパクトを調べるために、領域モデルWRF (Weather Research and Forecasting model)とアンサンブルカルマンフィルター(LETKF)を組み合わせたシステムにより、仮想的に船舶で観測された可降水量を同化した予報実験を行った。テスト事例として、豪雨(2015年鬼怒川洪水を引き起こした豪雨)の予測精度が向上することを確認した。さらに河川の洪水流量等に関するインパクトを評価するための降雨流出モデルも構築した。当初の予定であるリアルタイム解析手法の開発と精度検証と海上可降水量のインパクトの統計的評価にむけて、初年度は順調に準備をすすめ着手することができたため。引き続き、リアルタイム解析については、船舶で観測されたデータをPPPとPPP-ARリアルタイム暦で解析し、これまでの船上観測の可降水量の精度との比較を進める。海上可降水量のインパクト調査については、数値モデルを用い仮想船舶観測の数や位置と予測精度との関係について調査を進める。船舶上で使用するサーバとソフトウェア開発を優先したところ、サーバは既存品を流用したほうが効率的と判断されたため残金が発生した。当該予算は陸上受信側の設備増強に次年度以降使用する予定である。

船舶の寄港地が最寄り(代表者の勤務地)となった場合が多くデータ回収に行くための旅費が当初の見積りより少額であった。また今年度は観測とデータ収集が主だったため、当初購入を予定していた精度検定用の解析サーバは次年度以降に購入した方が効率的と判断し、残額をその費用に充てる計画である。
中エジプトにおけるアコリス遺跡の考古学的研究

昨年度発見した中王国時代(約4000年前)の岩窟地下墓の発掘調査を継続し、平成元年度それを完掘した。3m四方の墓室をうめた土のなかから各種の副葬品、また床面から木棺3基を発見した。副葬品のなかでとりわけ注目されるのは、木製葬送船模型である。昨年度これを発見しその一部を取上げるにとどめたが、既存の他例と比較して、本品は最大級の大きさをもち、かつ抜群の写実性をそなえた稀にみる優品であると判断された。このたびの発掘によって、全容と細部が明らかになった。その結果、全長2m、幅20cmをはかる船体は異例に細長いものであり、船舶構造上河川航行に適した形態をそなえている。その点で、当時ナイル河を航行した船舶にきわめて近いとみられる。船の甲板上に総数40体ほどの人物像が確認された。櫂をもつ漕ぎ手、舵手、水先案内人、被葬者のミイラ、近親者などが見わけられる。各種の船具模型も多数出土した。そのなかには、これまで用途の判明しなかったものがあり、このたびの調査によって、用途の一部が判明した。船を岸につなぐ杭及び杭打ち槌であり、今後の研究によって、こうした知見がさらに加わるものと思われる。以上の点で、この葬送船模型は、古代船舶の実体を復原するうえできわめて重要な資料であり、化学処理を加えながらそのとりあげに成功したことは、大きな成果として特筆されてよい。副葬品の内容は多岐にわたっている。そのなかで木製品はもっとも多様であり、筆記用パヒルスをのばす文具類、杖などは完形で出土した。断片のものまで含めて精細に復原すると木製品の品目がほぼ知られるが、その結果によれば、木製品のきわめて豊かな墓であったことが推測される。さらに、金属製品として、青銅製工具、石製品として水晶スカラベや用途不明の弧状品などが発見された。その他、中王国時代の土器類や玉類の出土もあった。墓室の床面には、木棺3基が据えられていた。残存状態は劣悪であったが、中王国時代特有の箱形木棺であり、うち1基は2重棺であることが、本調査によって判明した。この墓は、後世の撹乱をうけていたけれども、盗掘が不充分であったことが幸いし、死者を埋葬した当時の内容をかなり復原することができた。すでに公刊した昨年度の発掘結果と考えあわせると、この墓に葬られた人物は、中王国時代の州侯級の有力者であったことは疑いない。アコリスの所在する中エジプトは、中王国時代に上下エジプトの有力勢力にはさまれ、政治的攻防がくりかえされたところであったと推定されているが、州侯級の有力者はアコリス近傍で知られていなかった。その意味で、この存在を立証した今次の成果は、中王国時代の復雑な政治史を解明するうえで、貢献するものと思われる。また、墓の調査と関連して進めた神殿西端地区の発掘で、この地区を可能な限り深く掘り下げ、その結果、末期王国時代(約3000年前)の建築構造物を発見するとともに、神殿形成のあとを遺構や遺物によって追究することができた。なかでも末期王国時代遺構の発見は重要である。すなわち、末期王国時代においてもまた、中エジプトの地は上下エジプト勢力による攻防が絶えなかったところである。先年の調査で同時代の奉献碑2基が出土し、そのひとつは上エジプトの第2021王朝ピヌジェムI世により、もうひとつは下エジプトの第23王朝オソルコンIII世により奉献された碑文であった。古代エジプト史研究のなかで、上下エジプト勢力が並立した末期王朝時代は、なお不明な部分の多い時期であるが、中エジプトのこのアコリス遺跡で末期王朝時代と認定できる遺構が確認されたことは、奉献碑2基とならんで、末期王朝史研究に寄与するところが少なくない。また、葬送船模型や木棺など各種木製品を土中からとりあげるにあたって、保存化学の技術が駆使された。わが国で通常使用される木製品保存の技術は、湿潤な風土の関係上、水分の多い発掘木材を想定したものである。したがって、エジプトのような乾燥木材について、その技術を適用しうるのかどうか、不安を残していた。そのために、現地で実験と試行をくりかえしたが、結果として、乾燥木材用に薬剤配分を変えることで切りぬけることができた。出土乾燥木材の処理について、貴重なデ-タを得た。

櫂をもつ漕ぎ手、舵手、水先案内人、被葬者のミイラ、近親者などが見わけられる。各種の船具模型も多数出土した。そのなかには、これまで用途の判明しなかったものがあり、このたびの調査によって、用途の一部が判明した。船を岸につなぐ杭及び杭打ち槌であり、今後の研究によって、こうした知見がさらに加わるものと思われる。以上の点で、この葬送船模型は、古代船舶の実体を復原するうえできわめて重要な資料であり、化学処理を加えながらそのとりあげに成功したことは、大きな成果として特筆されてよい。副葬品の内容は多岐にわたっている。そのなかで木製品はもっとも多様であり、筆記用パヒルスをのばす文具類、杖などは完形で出土した。断片のものまで含めて精細に復原すると木製品の品目がほぼ知られるが、その結果によれば、木製品のきわめて豊かな墓であったことが推測される。さらに、金属製品として、青銅製工具、石製品として水晶スカラベや用途不明の弧状品などが発見された。その他、中王国時代の土器類や玉類の出土もあった。墓室の床面には、木棺3基が据えられていた。残存状態は劣悪であったが、中王国時代特有の箱形木棺であり、うち1基は2重棺であることが、本調査によって判明した。この墓は、後世の撹乱をうけていたけれども、盗掘が不充分であったことが幸いし、死者を埋葬した当時の内容をかなり復原することができた。すでに公刊した昨年度の発掘結果と考えあわせると、この墓に葬られた人物は、中王国時代の州侯級の有力者であったことは疑いない。アコリスの所在する中エジプトは、中王国時代に上下エジプトの有力勢力にはさまれ、政治的攻防がくりかえされたところであったと推定されているが、州侯級の有力者はアコリス近傍で知られていなかった。その意味で、この存在を立証した今次の成果は、中王国時代の復雑な政治史を解明するうえで、貢献するものと思われる。また、墓の調査と関連して進めた神殿西端地区の発掘で、この地区を可能な限り深く掘り下げ、その結果、末期王国時代(約3000年前)の建築構造物を発見するとともに、神殿形成のあとを遺構や遺物によって追究することができた。なかでも末期王国時代遺構の発見は重要である。すなわち、末期王国時代においてもまた、中エジプトの地は上下エジプト勢力による攻防が絶えなかったところである。先年の調査で同時代の奉献碑2基が出土し、そのひとつは上エジプトの第2021王朝ピヌジェムI世により、もうひとつは下エジプトの第23王朝オソルコンIII世により奉献された碑文であった。古代エジプト史研究のなかで、上下エジプト勢力が並立した末期王朝時代は、なお不明な部分の多い時期であるが、中エジプトのこのアコリス遺跡で末期王朝時代と認定できる遺構が確認されたことは、奉献碑2基とならんで、末期王朝史研究に寄与するところが少なくない。また、葬送船模型や木棺など各種木製品を土中からとりあげるにあたって、保存化学の技術が駆使された。わが国で通常使用される木製品保存の技術は、湿潤な風土の関係上、水分の多い発掘木材を想定したものである。したがって、エジプトのような乾燥木材について、その技術を適用しうるのかどうか、不安を残していた。そのために、現地で実験と試行をくりかえしたが、結果として、乾燥木材用に薬剤配分を変えることで切りぬけることができた。出土乾燥木材の処理について、貴重なデ-タを得た。
ラジカル酵素システムの動作原理の解明-酵素研究の新しいパラダイムを求めて-

これからの酵素科学はどこへ向かうのであろうか。本研究では(1)生物の知恵に学ぶシステム酵素学と(2)理論化学との連携による酵素学の非経験的学問化、が今後の酵素研究に重要なパラダイムであると考えて、ラジカル酵素システムを研究対象として、これらの方向への展開を目指した。酵素本体と(再)活性化蛋白質とを生化学、遺伝子工学、生物物理学、X線結晶学、理論化学の方法論を駆使して研究した結果、新しい眼界が拓かれた。(2)理論化学との連携による酵素学の非経験的学問化、が今後の酵素研究に重要なパラダイムであると考えて、ラジカル酵素システムを研究対象として、これらの方向への展開を目指した。1.エタノールアミンアンモニアリアーゼの結晶化ビタミンB12関与ラジカル酵素であるエタノールアミンアンモニアリアーゼは溶解度が低く、結晶化が困難であったが、N末端側数十残基を欠失させることで溶解度が増したので、シアノB12との複合体の結晶化条件を確立した。2.エタノールアミンアンモニアリアーゼの立体構造解析N末端側数十残基欠失エタノールアミンアンモニアリアーゼとシアノB12の複合体の結晶構造を解析し、(αβ)6のサブユニット構造を取ること、B12は塩基配位型で結合することなどを示した。また、アデニニルB12との複合体の構造も解き、モデリングにより補酵素のCo-C結合活性化機構やラジカルの基質への接近の機構を明らかにした。3.エタノールアミンアンモニアリアーゼの立体化学経路の解明2-アミノ-1-プロパノールのR体およびS体との複合体の結晶構造を解析し、モデリングによって求めた補酵素由来ラジカルの位置と合わせて、標識実験の結果を説明できる本酵素の立体化学経路を解明した。4.ジオールデヒドラターゼの基質結合金属イオンの同定ビタミンB12関与ラジカル酵素であるジオールデヒドラターゼは補酵素のアデニン部結合部位近傍と基質結合に関与する2つの金属イオンをもつ。これらはカリウムイオンと同定されていたが、後者は配位距離がカルシウムイオンに近かった。生化学実験の結果、基質結合金属イオンをカルシウムと再同定し、その役割も解明した。5.ジオールデヒドラターゼ再活性化因子の作用機構の研究ジオールデヒドラターゼ再活性化因子が複数の酵素分子から損傷コファクターを解離させることにより触媒的に再活性化することを示す証拠を得た。よって、この因子は「再活性化酵素」とも呼ぶべき酵素であると言える。また、酵素とこの因子の間の複合体形成はサブユニットスワッピングによって起こることも明らかにした。1.B_<12>補酵素関与ジオールデヒドラターゼにおける金属イオンの触媒的役割ジオールデヒドラターゼのX線結晶解析において、基質が直接配位している金属イオンは当初カリウムイオンと帰属された。しかし、全酵素モデルを用いた量子力学/分子力学計算の結果、これをカルシウムイオンとした方が配位距離がX線構造とよく合致し、実際に生化学実験によってその存在が確認された。カルシウムイオンはルイス酸性が強く、移動しない水酸基のGluα170による脱プロトン化を促進し、Aspα335の反触媒的効果を克服して、水酸基移動を促進することが計算により確認できた。2.B_<12>補酵素関与ジオールデヒドラターゼのグリセロールによる不活性化を受け難い酵素への再設計ジオールデヒドラターゼはグリセロールによる機構依存的不活性化を受ける。グリセロール結合型酵素-シアノコバラミン複合体のX線結晶解析を行い、本酵素のグリセロールによる不活性化の詳細なメカニズムを解明した。その結果に基づき、活性部位残基であるSerα301あるいはGlnα336をAlaで置換することにより、グリセロールによる不活性化を受け難い酵素が得られた。また、これらの二重変異型酵素はより長鎖の1,2-ジオールに作用するようになった。3.大腸菌のYgfDタンパク質はB_<12>補酵素関与メチルマロニルCoAムターゼの再活性化因子として働くヒトのB_<12>代謝システムの機能不全による代謝異常症は8つのクラスに分けられており、MMAAの遺伝的欠損はメチルマロン酸尿症を引き起こす。MMAAとホモロジーの高い大腸菌YgfDタンパク質の機能を調べた結果、YgfDはB_<12>補酵素、GTP、Mg^<2+>存在下で、不活性な酵素-メチルコバラミン複合体を活性化すること、その際に、酵素と複合体を形成してメチルコバラミンを解離させることから、YgfDは本酵素の再活性化因子として働くと結論した。1.エタノールアミンアンモニアリアーゼ(EAL)の精密触媒機構EALの活性部位アミノ酸残基に変異を導入した結果、Argα160、Glnα162、Asnα193、Gluα287、Aspα362はいずれも触媒機能に必須であることが分かった。補酵素活性化や酵素反応中間体安定化におけるこれらの残基の機能を解明した。

2.グリセロールによるジオールデヒドラターゼ(DD)の不活性化グリセロールはDDにGRコンホメーションで結合すると触媒作用を受け、GSで結合するとDDの機構依存的不活性化を引き起こす。基質ラジカルの転位反応の活性化エネルギーはGSの場合の方が高く、また、GRからの遷移状態がSerα301との水素結合により安定化された。よって、不活性化はGSから起こることが理論化学的に説明できた。3.ジオールデヒドラターゼ再活性化因子(DD-R)と活性維持システムDD-Rのマグネシウムイオン結合部位はサブユニットの界面にあり、これらの間の相互作用に関与する。また、ADP(ATP)結合部位はヌクレオチドスイッチに関与する。これらの部位への変異導入による解析の結果、両部位の重要性が明らかとなった。DDには補酵素交換による再活性化機構とは別に、損傷補酵素の修復による再活性化機構も存在することを発見した。交換促進因子であるDD-Rと補酵素再生系酵素(レダクターゼとアデノシル化酵素)とから構成されるシステムによりB12補酵素がリサイクルして酵素活性が維持されることが示された。4.新機能ラジカル酵素とその活性化蛋白質ピルビン酸ギ酸リアーゼ関連ラジカル酵素と予測されていた大腸菌PflDとS-アデノシルメチオニン関与活性化蛋白質と予測されたPflF、PflCの大量調製法を確立した。PflCによるラジカル導入が実証でき、また結晶構造解析の結果、PflDはグリシルラジカル酵素であることが裏付けられた。(2)理論化学との連携による酵素学の非経験的学問化、が今後の酵素研究に重要なパラダイムであると考えて、ラジカル酵素システムを研究対象として、これらの方向への展開を目指した。まだ論文化できていない研究成果もあるが、おおむね順調に進展していると言える。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成22、23年度の研究により順調に成果が得られてきているので、最終年度である平成24年度にはそれらの研究を完成させ、全てを論文化できるように努力する所存である。
飼料に添加されたセレンの農耕地生態系での動態と野菜による吸収

農耕地でのセレンの動態を調べるため,有機態セレンとしてセレノシステインおよびセレノメチオニンを含むセレン酵母を使用し,無機態セレンとして使用した亜セレン酸を比較した。これらを土壌に添加し,植物への吸収および植物・土壌でのセレンの形態別分析を行った。その結果,有機セレンは土壌中で無機化してから植物に吸収されることが明らかになった。一方,無機セレンは亜セレン酸のままで存在し,植物に吸収された。セレンは植物内では亜セレン酸,セレン酸,あるいはセレノメチオニンの形態で存在していた。このことは,亜セレン酸で吸収された後に,セレン酸さらにはセレノメチオニンに変化したことを意味している。各種形態別のセレンの測定方法を検討し,陰イオン交換型のカラムを用いたHPLCで分離後にICP-MSでセレンを検出する方法で行ったところ,無機ではセレン酸,亜セレン酸,有機ではセレノシステイン,セレノメチオニンの形態別の分析ができることを確認した。土壌に亜セレン酸およびセレン酵母を投与して小松菜を栽培し,土壌中での形態変化および野菜中でのセレンの形態を解析した。なお,セレン酵母中のセレンは,プロテアーゼでタンパク質をアミノ酸に分解して測定したところ,セレンのうち85%がセレノメチオニンで残り15%がセレノシステインであった。小松菜中のセレンの形態は,プロテアーゼでタンパク質をアミノ酸に分解して測定した。亜セレン酸投与区では,セレノシステインは検出されず,セレノメチオニン,亜セレン酸およびセレン酸が検出された。また,投与量を増やすとセレン酸の割合が増加した。跡地土壌のセレン形態をNaOHで抽出後に,分析したところ殆どが投与量が少ないとセレン酸がみられたが,投与量が多いときは殆どが亜セレン酸であった。このことから,亜セレン酸として投与された場合は,セレン酸にならずにそのまま亜セレン酸として存在し,吸収後はセレン酸に変化して蓄積したとみられた。セレン酵母を投与した区では,小松菜中のセレン形態は,亜セレン酸,セレノメチオニン,セレン酸がほぼ同じ割合で存在しており,投与量を増やしても割合は大きな変化はなかった。一方,跡地土壌では投与量が多いと亜セレン酸が殆どであり,有機のセレンはほとんどなかった。土壌中では,亜セレン酸に変化するものの,変化前に吸収された場合には,セレノメチオニンでも吸収することが考えられた。なお,形態別の分析では実試料のセレノシステインは分離が不十分な場合があり,濃度が低いこともあり精度がやや悪い。実試料での測定条件を再検討する必要がある。有機態と無機態のセレンの吸収の違いを,コマツナ,ほうれん草,コネギの3種類の野菜で検討を行った。栽培は1/5000aワグネルポットを用いて,有機態セレンとしてセレノメチオニンおよびセレノシステインをセレン化合物として含むセレン酵母,無機セレンとして亜セレン酸を用いて検討した。その結果,亜セレン酸がセレン酵母よりも植物の濃度を高める傾向があった。また,セレン投与量を土壌あたり0.1ppmおよび1.0ppm区を設けたが,セレン投与量が多いほど植物のセレン濃度を高めることがわかった。これは,3つの野菜について共通して認められた。研究期間を通じて明らかになったことは,土壌に亜セレン酸で投与された場合は土壌中での変化はほとんどおきずに植物に吸収され,植物ではセレノメチオニンなどの有機態に一部変化するが,亜セレン酸やセレン酸としても存在することである。一方,有機態のセレンとしてセレノメチオニンやセレノシステインを含むものを投与した場合は,土壌中で形態変化を受け栽培後には殆ど検出されなかった。この時,植物中のセレンはセレノメチオニン,亜セレン酸およびセレン酸が検出された。すなわち,セレノシステインは速やかに無機化されて,植物中にはそのままの形態では吸収されなかっとみられる。また,セレノメチオニンが無機化されてから吸収されたのかセレノメチオニンのまま吸収されたのかは不明であるが,亜セレン酸投与でもセレノメチオニンが検出されることから,無機化されたセレンを植物が吸収後にセレノメチオニンに変化したと推定した。このように,セレンの土壌での形態変化と植物による吸収を明らかにするという研究の目的の一つは達成した。セレンの毒性は形態により大きく異なることが知られており,本研究で明らかにしたような形態変化をさらに追跡することにより,安全でより健康に貢献できる作物生産に寄与できる。

本研究の目的は,堆肥由来の有機態セレンの植物による吸収を調べることであるが,本年度は堆肥の代替としてセレン酵母を用いて,植物に吸収されるセレンを検討した。使用したセレン酵母はセレンを0.21%含有し,その形態はセレノメチオニンであると考えられるものである。栽培実験は,大学圃場の土壌を使用し1/5000aワグネルポットを用いて行った。セレン酵母添加区はポット当たり3.6gの添加とした。植物はコマツナ(品種:双観)を用いた。ガラス室にて約2ヶ月の栽培の後,分析に供した。なお,生重および乾物重はコントロールとの差はなかった。植物の分析は,湿式分解後にセレンをICP-MSにて測定を行った。また,栽培後の土壌は全セレンを硝酸-可塩素酸-フッ化水素酸にて分解後に測定し,アルカリ抽出のセレンとしてTMAHにて抽出後に測定を行った。植物のセレン濃度は,コントロール区が0.038 ppmだったのに対してセレン酵母区では1.16 ppmと約40倍になった。土壌の分析結果は,全セレンがコントロール区で1.6 ppm,セレン酵母区で4.0 ppmであった。一方,アルカリ抽出のセレンは有機態と考えられるが,コントロール区で0.147 ppm,セレン酵母区で1.33 ppmであった。投与したセレンの量に比べると吸収されたセレンの量は極めて少なかったが,セレンの吸収割合は土壌にもともと存在するものよりも極めて高いことがわかった。当初の予定では,土壌中でのセレンの形態を調べることにしていたが,分析機器の導入が遅れその形態を調べることはできなかった。次年度以降に実施予定である。当初予定したガスでの形態変化は,測定法が十分に確立できていないため追跡ができていない。しかし,無機態および有機態での形態変化の検討はHPLCとICP-MSを組み合わせて行うことができた。また,有機態のセレンを土壌に投入した場合には,土壌中で亜セレン酸に変化することが明らかになった。また,たい肥については十分な検討を行うに至っていない。セレンを混入した牛糞堆肥の作成を予定していたが,予定した農家を始め当地方では福島第一原子力発電所の事故に伴う放射性セシウムに懸念があることから,平成23年度での作成を断念した。さらに,当初は予算の減額の可能性があることから,本研究の実施に必須である分析装置の購入が大幅に遅れた。これらの理由から,研究が予定通りに進まず遅れたものである。ガス態のセレンの測定については,引き続き検討を進める。今後は,土壌中でのセレンの形態変化のうち有機セレンが無機セレンに変化する速度を詳しく検討する。併せて,植物での有機セレンへの形態変化についても詳細に検討する。その際,有機態のセレンのうちセレノシステインの検出が難しいことが判明したので,実試料で分析条件をさらに検討する。遅れた原因のひとつである放射性セシウムの影響は,牛の飼料の切り替えが進んだため問題がなくなったと考えられ,当初予定した堆肥の作成を進める。また,セレンの形態別分析器に新たにHPLCを加え,より詳細な形態別分析を行いながら研究を推進する。消耗品で,アルゴンガスおよびカラムなどの購入を予定している。なお,次年度使用額が838,741円生じたが,放射性セシウムの影響により実験が一部遅れたことと分析装置の導入が遅れ,分析が予定通り進まなかったためである。放射性セシウムの影響は回避できており,また分析装置も動作する状況に至っている。次年度はこの次年度使用額に当初予定した研究費を加えて,分析を着実に進めながら実験を実施する。
血管平滑筋におけるカルシウムチャンネルの制御機構

私たちは、家兎大動脈より血管平滑筋細胞を培養し、serotoninに対する反応をphosphoinositide turnoverの面から解析した。serotoninはInMより濃度依存性にIP_3の産生を生じることを見出した。serotoninによるphospholipase C反応へのG蛋白の関与を調べる目的で、pentussis toxin(500ng/mi)で培養平滑筋細胞を24時間前処置しておくと、serotoninによるIP_3の産生は約50%抑制された。このことより、serotoninとカップルしたphospholipase C反応にはpertussis toxinに関受性のあるG蛋白の関与が示された。Protein Kinase Cは血管平滑筋細胞を含めた種々の細胞の増殖、分化などの細胞機能に重要な役割をはたしている。Protein Kinase Cの血管平滑筋の収縮に対する作用は極めて興味深い。培養平滑筋細胞をProtein Kinase Cのactivatorとして知られているTPA(10nM)で前処置すると、sertoninに対するIP_3の産生は約75%抑制された。このことより、Protein Kinase Cはserotonin receptorとカップルしたphospholipase C反応にnegative feedbackをかけていることが明らかとなった。次に、全体としての細胞内Ca^<2+>動員が先の細胞系においておこり得るかを調べる為に5μM fura-2 AMを40分間処置し、Nikon蛍光測光システムを用いてφ5μmのsampling pointでのCaのうごきを調べた。serotoninは10^<-8>Mより濃度依存性に細胞内Ca濃度を上昇させ10^<-4>Mでmaximumに達した。以上より、培養血管平滑筋においてserotoninはphosphoinositide tornoverを介してCaの動員をおこすことが示されたが、serotoninによるCa動員機構にCalcium channelの関与が存在するかを電気生理学的手法を用いて解析中である。私たちは、家兎大動脈より血管平滑細胞を培養し、serotonin(5HT)に対する反応をPhosphoinositide tornoverの面から解析した。5HTには1nMより濃度依存性にIP_3の産生を生じることを見出した。5HTによるPhospholipased(PLC)反応へのG蛋白の関与を調べる目的で、pertussis toxin(500ng/ml)で培養平滑筋細胞を24時間前処置をしておくと、5HTになるIPの産生は約50%抑制された。このことより、5HTとカップルしたPLG反応にはpertussis toxin sensitiveなG蛋白の関与が示された。Protein Kinase c(PKC)は血管平滑筋細胞を含めた種々の細胞の増殖、分化などの細胞機能に重要な役割をはたしているこよはよく知られている。PKCの血管平滑筋の収縮に対する作用は極めて興味深い。我々の培養細胞をPKCのactivatorとして知られているTPA(10nM)で前処置すると、5HTに対するIP_3の産生は約75%抑制された。このことよりPKCは5HTreceplorとカップルしたPLC反応にnegativefeed backをかけていることが明らかとなった。種々のreceplorとカップルしたPLC反応により産生されているIP_3は、細胞内のCaプールよりCaをreleaseさせることが知られている。又最近PI turnoverとCaチャンネルとの関連も議論されており、先に述べた我々のデータともあわせて考えると、reseptar operated calcium channelとG蛋白及びPKCとの関連を調べる意義は非常に大きい。現在、これらのことを明らかにする目的で、Caスパイクを記録する電気生理学的機器をset up中である。血管平滑筋細胞培養法は既に確立し、現在、血管平滑筋よりのsingle cellの分離も準備中である。

以上より、培養血管平滑筋においてserotoninはphosphoinositide tornoverを介してCaの動員をおこすことが示されたが、serotoninによるCa動員機構にCalcium channelの関与が存在するかを電気生理学的手法を用いて解析中である。私たちは家兎大動脈より血管平滑筋細胞を、ブタ大動脈より血管内皮細胞を培養し、種々の薬物に対するCa動員反応をはじめにfura2 signalを用いて解析した。培養平滑筋細胞に5μMfureー2 AMを40分間処置し、Nikon蛍光測光システムを用い、φ=5μmのsampling pointでCa signalの変化についてserotonin,phenylephrineを用いて調べた。serotoninは10^<-8>Mから濃度依存性に細胞内Ca濃度を上昇させ10^<-4>Mで最高に達した。一方Phenylephrineは10^<-7>より濃度依存性に細胞内Ca濃度を上昇させ10^<-4>で最高に達した。先に、私たちは培養平滑筋細胞でserotoninによりphosphoinositide turnoverが惹起されることを示したが、serotoninによるCa動員機構にcalcium channelの関与が存在するかを調べる為に、電気生理学的手法を用いて現在解析中である。近年、内皮細胞が血管平滑筋の収縮拡張に重要な役割を演じていることが明らかとなった。最近私たちは内皮依存性拡張反応がLysophospholipid,及びmodified LDLにより著明に抑制されることを見出した。EDRFの放出で刺激することが知られているbradykininは、培養内皮細胞において、10^<-10>Mより濃度依存性に細胞内Ca濃度を上昇させた。又serotonin,acetylcholineも同様な細胞内Ca濃度の上昇をおこすことが明らかとなった。現在、これらの刺激に対するlysophospholipidとmodified LDLの効果を検討中である。