hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
HIV潜伏感染モデル動物の構築と潜伏化メカニズムの解明

Human immunodeficiency virus(HIV)を感染者体内から完全除去する事は、現在の薬剤療法では不可能である。HIVの潜伏感染がその原因であると考えられているが、その潜伏化機構はいまだに明らかになっていない。そこで本研究では、HIV潜伏感染決定メカニズムの解明を目的として、以下の研究を行った。H22年度は生体内におけるHIVの潜伏感染実験モデル動物の構築を目的として、ヒト化マウヌに非増殖型HIVベクター(single round-HIV, SR-HIV)を感染させ、抹消血に含まれる潜伏1染細胞の解析を行った。BH2s年度はHIVの潜伏化を誘導しやすい組込み経路をin vitroの実膨により明らかにした。具体的には、INを介さずに組込まれたHIVプロウイルスはウイルス発巧量が弱い事、そして、そのウイルス発現量の違いは、HIVの組込み位置によって決定されてレることを明らかにした(Virology. 201225 ; 427(1): 44-50)Human immunodeficiency virus(HIV)を感染者体内から完全除去する事は、現在の薬剤療法では不可能である。具体的には、INを介さずに組込まれたHIVプロウイルスはウイルス発巧量が弱い事、そして、そのウイルス発現量の違いは、HIVの組込み位置によって決定されてレることを明らかにした(Virology. 201225 ; 427(1): 44-50)HAART(highly active anti-retroviral therapy)療法が発達した現在でも、エイズ根治は不可能である。その理由として、エイズの原因ウイルスであるhuman immunodeficiency virus (HIV)の潜伏感染が挙げられる。しかしながら、HIVが潜伏化するメカニズムは明らかになっていない。そのため、本研究はHIV潜伏感染決定メカニズムの解明を目的としている。H22年度は、生体内におけるHIVの潜伏感染を再現するために、ヒト血液幹細胞移植マウス(ヒト化マウス)を用いた感染実験を行った。ウイルスは、LTRプロモーターよりウイルスの転写調節因子TatとGFPの発現のみを行う非増殖型HIVベクター(single round-HIV, SR-HIV)を用いた。SR-HIV感染2週間後のヒト化マウスの抹消Tリンパ球において、少数(1%以下)の恒常的GFP陽性細胞が検出された。また、感染マウスより分離した抹消リンパ球をCD3とIL-2の増殖刺激環境下で培養したところ、GFP陽性細胞の増加も確認された。すなわち、ヒト化マウス内で潜伏感染細胞が構築されている事が確認された。また、これまでの培養細胞を用いたin vitroの研究によると、HIVプロウイルスの組込み位置がHIVの潜伏化のひとつの要因であることが明らかになっている。そこでH22年度はHIV感染ヒト化マウスの抹消Tリンパ球におけるプロウイルスの組込み位置解析を行うためのlinker PCR法の確立に成功した。今後、本年度確立したプロウイルスの組込み位置決定法を用いて、HIV感染ヒト化マウス抹消血中の恒常的GFP陽性細胞、並びに、潜伏感染細胞におけるプロウイルスの組込み位置解析とエピジェネティクス解析によって、in vivo環境でHIVの潜伏感染を誘導する主要な原因を突き止める。Human immunodeficiency virus (HIV)を感染者体内から完全除去する事は、現在の薬剤療法では不可能である。そこで本研究では、HIV潜伏感染決定メカニズムの解明を目的とした。H22年度は、生体内におけるHIVの潜伏感染を再現するために、LTRプロモーターよりウイルスの転写調節因子TatとGFPの発現のみを行う非増殖型HIVベクター(singl eround-HIV, SR-HIV)を用いて、ヒト血液幹細胞移植マウス(ヒト化マウス)で感染実験を行った。SR-HIV感染2週間後のヒト化マウスの抹消Tリンパ球において、恒常的GFP陽性細胞と、CD3とIL-2の増殖刺激環境下でGFP発現が誘導される細胞が検出された。しかしながら、分離解析できるほどの感染細胞数は得られなかった。さらなる解析のためにはSR-HIVのヒト血液幹細胞への導入効率を増加させる手法を用いる必要がある。H23年度はHIVプロウイルスの組込み位置とHIVの潜伏化の相関を解析することを目的として、linker PCR法を用いたHIVの組込み位置解析方法を確立した。これまでの我々の研究で、インテグラーゼ(IN)非依存的に組込まれたHIVプロウイルスからのウイルス発現量は、IN依存的に組込まれたものに比して低い事が明らかになっていた。H23年度はこの方法を用いて、ウイルス組込み経路の違いにより誘導されるウイルス発現量の違いが、HIVの組込み位置によって決定されていることを明らかにした(Virology. 2012 25;427(1):44-50)。
葉緑体と核のクロストークに関わるプラスチドシグナル伝達系の解析

これまでの研究により、1)Mg-chelataseの3つの異なるサブユニット(H,I,D)のうち、最も大きなサブユニットであるHサブユニット(ChlHまたはGun5と呼ぶ)がプラスチドシグナル伝達に関わること、2)Iサブユニット(ChlI)はプラスチドシグナル伝達に関わらないこと、が明かとなった。本年度は、残るDサブユニットがこのシグナル伝達系に関わるか調べるため、かずさDNA研究所との共同研究でシロイヌナズナタグラインからDサブユニット遺伝子(CHLD)の破壊株を検索した。その結果、破壊株と思われる2ラインの候補(chlD-1およびchlD-2)が得られた。chlD-1はCHLD遺伝子の第13エクソンにT-DNAが挿入されており、またchlD-2では第5エクソンの末端にT-DNAが挿入され、それ以降が大きく欠失していた(欠失の範囲は未同定)。chlD-1変異をホモに持つ個体はアルビノ表現型を示し、スクロース非存在下では生育不能であった。このアルビノ個体について、δ-アミノレブリン酸および2,2′-dipyridyl存在下でのMg-Protoporphyrin IXの蓄積量を調べると、野生型株に比べて著しく低下していた。従って、光合成細菌やオオムギで知られるように、CHLD遺伝子産物がMg-chelatase活性に必須であることが分かった。一方、chlD-2変異体はホモ個体が得られず、ヘテロ個体がつけた胚を観察したところ、約1/4の割合で胚の発達が著しく阻害されており、これらの胚は成熟種子を形成しなかった。chlD-2変異体はCHLD遺伝子の大部分と、その3′側に続くゲノム領域を欠失しているため、その領域に胚発生致死表現型の原因となる遺伝子が含まれている可能性が高い。chlD-1変異をホモに持つアルビノ個体についてプラスチドシグナル伝達系について検討したが、現在のところ正常に機能することを示唆するデータが得られている。
安価な砂鉄、珪砂等を用いた自然系液体用しゅう動材料の開発

Fe-Si系合金についてエタノール中で低摩擦・低摩耗の得られる組成を調べ、Fe-66.7at%SiよりSiが高濃度の領域で低摩擦の得られることを明らかにした。またαFeSi2に5vol%グラファイトを添加するとさらに摩擦係数を下げられることを明らかにした。Fe-Si合金の低摩擦機構はXPSなどの表面分析の結果、SiO2がエタノールと反応してできる低摩擦ゲル状化合物及び鉄系酸化物両方の効果と考えられる。さらに拡散処理によるコーティング実験の結果、Si拡散処理試料については良い値が得られなかったが、Cr-B拡散処理試料については、良好な耐摩耗性及び低摩擦の得られることがわかった。平成23年度までに低摩擦(摩擦係数0.10程度)・低摩耗(比摩耗量10-610-7mm3/Nm程度)であることを明らかにしているFeSi2系合金について、エタノール中でさらに低摩擦・低摩耗である条件を探索し、その結果、摩擦係数0.50.7、比摩耗量10-610-7mm3/Nmになる組成のバルク状焼結体を作成することができた。一方でパックセメンテーション法を用いて、シリサイド、アルミナイド、ボライド及びクロム炭化物を鋼や片状黒鉛鋳鉄試験片全面に形成させ、このうちアルミナイド、ボライド及びクロム炭化物被覆試験片については、高硬度で密着性の良い被膜を得ることができた。さらにこれらの試験片は、添加物無添加の潤滑油での摩擦試験中、しゅう動表面に水酸化アルミニウムやホウ酸など低摩擦化合物を生じることで低摩擦・低摩耗になることがわかった。しかしシリサイド被覆試験片については高硬度で密着性の良い被膜を得ることができなかった。そのためホットプレス中で拡散処理を行うなどの工夫も行ったが、あまり改善は見られなかった。この原因としては、鉄原子が基板内部から基板表面に拡散し、カーケンドールボイドが形成されやすいことが考えられ、今後、二重拡散法などを用いたり、拡散処理を行う基板の組成を変えるなどの改善が必要であると考えられる。これらの改善を行いながら、上記で述べたような摩擦係数0.50.7、比摩耗量10-610-7mm3/Nmになる組成の被膜試験片作成法を開発する予定である。砂鉄と炭素と硅砂との反応で鉄シリサイドを作成する方法について、砂鉄と炭素と硅砂混合粉末のDTAによる昇温実験及び生成物のXRDによる分析の結果、1178°Cで砂鉄と炭素によるαFeの生成反応が起き、シリサイドやSiCの形成は1400°C以上であることが分かった。このことは鉄成分の生成とシリコン成分の生成温度が数百度異なっていることを意味しており、混合物から鉄シリサイドを生成する場合、均質に生成させることが課題であることがわかった。一方拡散処理によるシリサイドコーティングについて、二重コーティングなどを試みたもののボイドの問題を解決することはできなかった。しかしクロマイジング及びボロクロマイジングしたSS400鋼がエタノール中0.10.2の摩擦係数を示し、後者については10-6mm3/Nmオーダーの比摩耗量及びマイクロビッカース硬さ16GPaを示すことを明らかにした。さらに硬質材料の多いホウ化物についても低摩擦・低摩耗の材料があるかどうか探索を行い、その結果ホットプレスで作成したアルミナ、チッカケイ素より高硬度のAlB12、SiB6基合金が水などの自然液体に対して低摩擦・低摩耗であることを発見した。砂鉄等によるFe-Si系合金の最適製造条件の探索については、砂鉄ー硅砂ー人造黒鉛混合粉末をアルゴンガス雰囲気下1600°CまでDTA分析を行い、1200°C付近に大きな吸熱ピークが生じることを明らかにした。その他周辺温度域にも小さな吸熱、発熱反応が若干見られたが、各々の反応については今後XRD分析などで詳細に確認する予定である。Fe-Si系合金の低摩擦機構の解明については、Fe-Si系以外の遷移金属シリサイド(MoSi2、ReSi1.8など)の摩擦試験結果の比較より、Feにも摩擦低減作用のあることを明らかにした。摩擦試験中Fe成分は層状構造をもつFe(OH)2などになっている可能性があるが、確認する方法については今後検討する予定である。エタノール中で最も低摩擦・低摩耗になるFe-Si系合金の組成解明については、組成Fe-(66.796.0)at% SiのFeSi2-Si系が最も低摩擦になることを明らかにした。またこのFeSi2-Si系について、マイクロビッカース硬さはSi濃度が高くなるほど増大するが、耐摩耗性は逆に悪化するという一般の摺動材料とは異なる特異な現象も見られた。

さらにAl-Si系合金の摩擦試験結果より、エタノール中ではAl成分も摩擦低減効果のあること、及びガソリンーエタノール混合液を模したヘキサンーエタノール混合液中、Al-Si系合金はエタノール濃度が高いほど低摩擦、低摩耗になることを明らかにした。今後Fe-Si系合金についてもヘキサン-エタノール混合液中での摩擦摩耗特性を確認する予定である。さらにこれらの硬質材料をコーティングする方法についても検討を行い、片状黒鉛鋳鉄が基板の場合はパックセメンテーション法が有望な方法であることを明らかにした。パックセメンテーション法などによるコーティングについては改善が必要であるが、前年度までより低摩擦(摩擦係数0.50.7程度)・低摩耗(比摩耗量10-610-7mm3/Nm程度)のFeSi2系バルク状材料を得ることができたため。砂鉄ー硅砂ー人造黒鉛の熱処理による鉄シリサイドの作製についてはまだ熱処理条件を詰め切れていないが、低摩擦機構の解明や低摩擦・低摩耗組成の解明などについてはほぼ順調に進んでおり、またパックセメンテーション法などによるコーティングも条件等が明らかになってきていることから、おおむね順調に進展していると考えられる。平成24年度は単なるシリコン拡散で高硬度かつ密着性の良いシリサイド被膜を得ることができなかったため、平成25年度は二重拡散法などを用いたり、拡散処理を行う基板の組成を変えるなどの改善を行う。このような改善により平成24年度に明らかにした摩擦係数0.50.7、比摩耗量10-610-7mm3/Nmになる材料組成の被膜試験片を作成する。また同時にアルミニウム、ボロン、クロム拡散を今回の低摩擦・低摩耗コーティング開発に応用できるかどうかについても検討する。平成23年度で得られた結果などを基に、さらに適正条件を詰めた低摩擦・低摩耗材Fe-Si系合金の組成を明らかにし、かつこの合金の砂鉄、硅砂などからの適切な製造方法を明らかにする。さらにこの合金をパックセメンテーション法やスパッタ法を用いて、それぞれ鋳鉄やアルミニウム合金基板に被膜として形成させる方法を明らかにする。パックセメンテーション法などによる鋼、鋳鉄基板へのコーティングについて、より改善が必要なことがわかったため、平成25年度に行うコーティング法の改善、及び平成25年度に得られる予定の高硬度・高密着性試験片の摩擦試験を平成24年度予算の一部を平成25年度予算と合わせることで実施することにした。平成24年度以降鋳鉄やアルミニウム合金基板へのコーティング処理が重要になってくるが、平成23年度のパックセメンテーション法で使用した電気炉は、炉の内壁の材質が金属で腐食しやすく、年度末にセラミックス製が好ましいことが明らかになった一方、平成23年度予算、あるいは24年度予算のみで新規に電気炉を新たに準備するのは他にも使用予定があるなど非常に難しいため、平成23年度予算の一部を残し、平成24年度予算と合わせることで、電気炉を準備することにした。
代数幾何・代数解析に基づく特異点を持つ学習モデルの予測精度の解明

神経回路網、混合正規分布、ベイズネットワーク、隠れマルコフモデル、縮小ランク回帰など、階層構造を持つ学習モデルは、情報学における多くの実問題に適用されている。しかしながら、これらの学習モデルは、パラメータから確率分布への写像が1対1ではなく、フィッシャー情報量が縮退する特異点を多く持つために、その予測精度の解析には従来からよく知られた統計的正則モデルの方法を適用することができず、学習誤差や汎化誤差などが未解明であるためにモデル選択や検定などの最適設計法が確立されていない。この学習理論における特異点の問題において、我々は、特異点の代数幾何学的な性質と予測精度との数学的な関係を世界で初めて発見・証明し、その後、いくつかの学習モデルにおいて具体的な予測精度を解明してきた。平成14年度の研究成果としては次の3点がある。1.真の分布と特異点が一致せず、そのカルバツク距離が、サンプル数の(-1/2)乗に比例する場合において、特異点が予測精度に及ぼす影響を解明し、真の分布が特異点からずれている場合にも、特異点の存在によって正則モデルよりも優れた予測能力を持つことを明らかにした。2.特異点を持つ学習モデルの選択において、真の分布が有限の大きさのモデルに含まれている場合にはジェフリーズの事前分布がモデル選択の一致性および予測精度の両面で優れていること、一方、真の分布が有限の大きさのモデルに含まれていないときにはジェフリーズの事前分布は適さないことを明らかにした。3.特異点を持つ学習モデルの一例であるボツルマンマシンについて、代数幾何学的な方法によって、その予測精度を解明した。本研究により、特異点を持つ学習モデルの予測精度の解明および実問題への応用において、数学的基盤が構成された。複雑な構造を持つ学習モデルにおいては,パラメータの集合から学習モデルへの写像が1対1でなく,学習モデルのふるまいからパラメータを特定することができないという問題がある.この問題は神経回路網や混合正規分布などのいわゆる階層構造を持つ学習モデルの共通の問題である.パラメータが特定可能でない学習モデルでは,フィッシャ情報量から導入される学習モデル族の計量が縮退し,通常の統計的漸近理論が利用できない.本研究では,代数幾何および代数解析などの現代数学の方法に基づいて,特定不能な学習モデル,言いかえれば,特異な計量を持つ学習モデルの性質を解明する.この研究は,研究代表者が独自に創始したものであり,諸外国で行なわれた研究の輸入ではない.これまでの研究において,特異な計量を持つ学習モデルのベイズ推測における漸近的な性質は,カルバック情報量と事前分布とから定まるゼータ関数の極により記述できることが解明されている.本年度の成果としては,真の分布が学習モデルに含まれていない場合には,学習サンプル数が増えるにつれて,適切な特異点が選ばれ,それにより正則な統計モデルよりも遥かに小さい誤差で予測が可能になることを証明した.また,真の分布がモデル族に含まれているときには,ジェフリーズの事前分布を用いる場合のみ正則な統計モデルと同等のモデル選択が可能であることを明かにした.さらに,カルバック情報量が一定値以下になるパラメータ空間の体積の次元によって予測精度が計算できることを明かにした.来年度への課題としては,与えられた具体的な学習モデルの予測精度を計算すること,および,予測精度最良と真のモデル選択に関するシミュレーション実験を行ない,本研究の実用性を明らかにすること、さらに、経験確率過程論に基づいて,確率的複雑さの高次展開を行ない,予測誤差の漸近形を巌密に導出することがあげられる.神経回路網や混合正規分布などの情報学で用いられる学習モデルは,パターン認識や時系列予測などに広く用いられているが,パラメータ集合に特異点を持ちフィッシヤー計量が特異となるために,従来の統計的漸近理論が適用できない.

このため,これらの学習モデルの予測精度のふるまいは未解明な点が多く,学習モデルの最適設計法は確立されていない.本研究では,代数幾何・代数解析で現れる特異点論を応用して,複雑な構造を持つ学習モデルの予測精度を明らかにすることを目的とする.平成13年度は,次の事柄を解明した。1.確率的複雑さから学習サンプル数の対数関数および重複対数関数を減算した式が、ある確率変数に法則収束することを証明した.これより,従来は学習サンプルの出方についての平均についてのみ解明されていた現象を,一組のサンプルについて成り立つように拡張することができ,与えられたサンプルからのモデル選択への応用に著しい進展が得られた.2.カルバック情報量のゼータ関数にブローアップによる特異点解消を適用することにより混合正規分布の予測誤差の上限を与えた.これは統計学においても,従来から不明であった問題を本研究で得られた理論に基づいて解決したものである.3.カルバック情報量のゼータ関数にブローアップによる特異点解消を適用することによりランク縮小写像の予測誤差の上限値を解明した.また計算機シミュレーションにより,理諭により得られた上限値が真の値に近いものであることを示した.今後の課題としては,本研究の成果を実問題に適用する場合に必要となる事後確率分布の高精度な実現法を確立することと,真の分布が特異点から,わずかにずれている場合に起こる現象を明らかにすることなどがある.神経回路網、混合正規分布、ベイズネットワーク、隠れマルコフモデル、縮小ランク回帰など、階層構造を持つ学習モデルは、情報学における多くの実問題に適用されている。しかしながら、これらの学習モデルは、パラメータから確率分布への写像が1対1ではなく、フィツシャー情報量が縮退する特異点を多く持つために、その予測精度の解析には従来からよく知られた統計的正則モデルの方法を適用することができず、学習誤差や汎化誤差などが未解明であるためにモデル選択や検定などの最適設計法が確立されていない。この学習理論における特異点の問題において、我々は、特異点の代数幾何学的な性質と予測精度との数学的な関係を世界で初めて発見・証明し、その後、いくつかの学習モデルにおいて具体的な予測精度を解明してきた。平成14年度の研究成果としては次の3点がある。1.真の分布と特異点が一致せず、そのカルバック距離が、サンプル数の(-1/2)乗に比例する場合において、特異点が予測精度に及ぼす影響を解明し、真の分布が特異点からずれている場合にも、特異点の存在によって正則モデルよりも優れた予測能力を持つことを明らかにした。2.特異点を持つ学習モデルの選択において、真の分布が有限の大きさのモデルに含まれている場合にはジェフリーズの事前分布がモデル選択の一致性および予測精度の両面で優れていること、一方、真の分布が有限の大きさのモデルに含まれていないときにはジェフリーズの事前分布は適さないことを明らかにした。3.特異点を持つ学習モデルの一例であるボツルマンマシンについて、代数幾何学的な方法によって、その予測精度を解明した。本研究により、特異点を持つ学習モデルの予測精度の解明および実問題への応用において、数学的基盤が構成された。
低酸素シグナル抑制分子IPASの発現制御法の開発とがん治療への応用

固形腫瘍内の低酸素は、腫瘍細胞の増殖、転移、放射線や抗がん剤へ抵抗性などの獲得・成立に密接に関与する。低酸素で活性化される転写因子HIF-1は、腫瘍細胞の低酸素適応に重要な役割を果たし、がん治療標的としての有用性が臨床的にも注目されている。申請者は、HIF-1機能抑制分子IPASを介した生体内HIF-1活性の制御法の確立を目指している。IPASは、組織特異的な低酸素応答制御に関わるHIF-1拮抗分子であり、腫瘍血管新生抑制・腫瘍増殖抑制ツールとしての有用性も実証されている。申請者はIPASの発現が、低酸素依存性の遺伝子転写ならびに低酸素依存性選択的スプライシング機構によりmRNAのレベルで誘導されること、腫瘍細胞では逆に発現が抑制されていること、を見いだし、その制御機構の究明に一貫して取り組んでいる。本年度研究では特に腫瘍細胞におけるHIF-1-IPAS相互作用を中心とした低酸素応答制御の分子機構を解明するとともに、HIF-1を標的とした新たながん治療法開発の基盤を確立することを目的とし、(1)IPAS発現の入為的制御法/抗HIF-1療法の確立、(2)腫瘍細胞におけるIPAS発現異常の分子機構の解明とその克服法の開発、(3)IPAS高発現、低発現動物モデルを用いた抗がん療法in vivo検定システムの構築、を具体的な目標とし、あらたな抗腫瘍分子標的療法開発を目指す。本年度は以下の研究成果を得た。(1)IPAS発現制御法/抗HIF-1療法の確立IPAS発現制御機構に関して、IPASmRNA選択的スプライシング制御機構の解析を進めた。選択的スプライシング制御に関わるIPASmRNA結合蛋白p75と相互作用する蛋白としてU2AF65を同定した。P75-U2AF65相互作用は低酸素下で増強した。かかる相互作用には低酸素によるp75のリン酸化状態の変化が重要であることが示唆された。(2)遺伝子改変動物を用いたIPASの抗血管新生療法における有用性の検討。IPASを過剰発現するトランスジェニックマススを作成しHIF-1標的遺伝子の発現が抑制されていることを確認した。創傷治癒モデルを用いた解析でIPASトランスジェニックマウスでは血管新生が抑制されていることを見いだした。固形腫瘍内の低酸素は、腫瘍細胞の増殖、転移、放射線へ抵抗性などの成立に密接に関与する。低酸素で活性化される転写因子HIF-1は、腫瘍細胞の低酸素適応に重要な役割を果たし、がん治療標的としての有用性が注目される。HIF-1拮抗分子IPASは、腫瘍血管新生抑制・増殖抑制ツールとしての有用性も実証されている。申請者はIPASの発現が、低酸素依存性の遺伝子転写ならびに選択的スプライシング機構により誘導され、腫瘍細胞では逆に抑制されていることを見いだしている。本研究では特に腫瘍細胞におけるHIF-1-IPAS相互作用による低酸素応答制御の分子機構の解明を通じHIF-1を標的とした新たながん治療法開発の基盤を確立することを目的とし、(1)IPAS発現の入為的制御法/抗HIF-1療法の確立、(2)腫瘍細胞におけるIPAS発現異常の分子機構の解明、(3)IPAS高発現、低発現動物モデルを用いた抗がん療法in vivo検定システムの構築、により抗腫瘍分子標的療法開発を目指す。(1)IPAS発現制御法の確立1)IPAS遺伝子転写調節機構の解明:ChIPアッセイによりIPASプロモーターの低酸素応答性配列にHIF-1が結合することを明らかにした。HIF-3αのプロモーターでは低酸素応答性が欠如していた。2)IPASmRNA選択的スプライシング制御機構の解明:IPAS mRNA結合蛋白p70を細胞内で過剰発現させることにより、IPAS型スプライシングが増強し、p70 SiRNA導入により減少した。(2)腫瘍におけるIPAS発現異常の分子機構の解明IPASプロモーター活性は腫瘍細胞内で低下しており、HRE近傍にメチル化候補配列が二ヵ所存在した。(3)IPAS高発現動物モデルを用いた抗がん療法検定システムの構築固形腫瘍内の低酸素は、腫瘍細胞の増殖、転移、放射線や抗がん剤へ抵抗性などの獲得・成立に密接に関与する。本年度研究では特に腫瘍細胞におけるHIF-1-IPAS相互作用を中心とした低酸素応答制御の分子機構を解明するとともに、HIF-1を標的とした新たながん治療法開発の基盤を確立することを目的とし、(1)IPAS発現の入為的制御法/抗HIF-1療法の確立、(2)腫瘍細胞におけるIPAS発現異常の分子機構の解明とその克服法の開発、(3)IPAS

高発現、低発現動物モデルを用いた抗がん療法in vivo検定システムの構築、を具体的な目標とし、あらたな抗腫瘍分子標的療法開発を目指す。本年度は以下の研究成果を得た。(1)IPAS発現制御法/抗HIF-1療法の確立IPAS発現制御機構に関して、IPASmRNA選択的スプライシング制御機構の解析を進めた。選択的スプライシング制御に関わるIPASmRNA結合蛋白p75と相互作用する蛋白としてU2AF65を同定した。P75-U2AF65相互作用は低酸素下で増強した。かかる相互作用には低酸素によるp75のリン酸化状態の変化が重要であることが示唆された。(2)遺伝子改変動物を用いたIPASの抗血管新生療法における有用性の検討。IPASを過剰発現するトランスジェニックマススを作成しHIF-1標的遺伝子の発現が抑制されていることを確認した。創傷治癒モデルを用いた解析でIPASトランスジェニックマウスでは血管新生が抑制されていることを見いだした。
三角格子を有する混合原子価化合物における電荷フラストレーションの効果の解明

当該年度は、電荷のフラストレーション効果を検証するモデル物質としてNaFe2O3に着目し、研究を進めた。反応容器や雰囲気等の条件を検討した結果、NaFe2O3の合成を再現性良く行うことに成功した。さらに、大量の試料の合成に成功し、その結果、NMR測定や共同研究であるμSR測定が可能となった。さらにNMRにより、NaFe2O3の磁気・電荷状態を微視的に研究した。まず、得られた試料のNMRスペクトルからディスオーダー等のない純良試料であることが確認された。さらに配向試料の作成に成功し、得られた単結晶スペクトルを解析したところ、高温相から中間相への相転移で電荷秩序が、中間相から低温相への相転移で磁気秩序が起こることが明らかとなった。秩序相の電荷・磁気秩序パターンを決定し、これらの結果から電荷のフラストレーションが高次の相互作用により解消されたことが示唆された。加えて、核スピン-格子およびスピン-スピン緩和率の解析を行ったところ、前者が磁気秩序において、後者が電荷秩序において大きく変化することが明らかになった。これは、核磁化緩和のT2過程を通して電荷のゆらぎを検出しているからであり、スピン-スピン緩和率の測定が電荷のゆらぎを検証する上で適した手法であることを示唆している。さらに、昨年度に引き続き、混合原子価酸化物の純良試料の合成を行うための酸素分圧精密制御炉の作成を進めた。その結果、この炉の小型化に成功し、グローブボックスにこの炉自身を持ちこむことが可能となったため、大気中で不安定な化合物の試料合成が可能となった。しかしながら、循環システムが不十分であるため、炉内の酸素濃度勾配が非常に大きくなり、酸素濃度の調整が困難になった。今後より濃度差を縮小できる循環システムを確立することで、さまざまな混合原子価酸化物の試料合成に適用できる合成手法となることが期待できる。上記の結果を国内および国際学会において発表した。27年度が最終年度であるため、記入しない。当該年度に申請者は、電荷のフラストレーションの効果の検証に用いるための、混合原子価遷移金属酸化物を純良に合成するシステムの開発を行った。その結果、固体電解質のZrO2を酸素濃度測定器および酸素ポンプとして使用した酸素分圧制御炉の作成に成功し、種々の混合原子価の遷移金属酸化物の合成を行うことができた。作成した酸素分圧制御炉の性能のテストを行うために、2元型鉄酸化物の合成を行い、焼成時の酸素分圧を酸素ポンプにより連続的に調整することで、Fe2O3、Fe3O4、FeO、Feの4つを作り分けることができた。特に、焼成中の酸素濃度をモニターすることで、平衡反応の進行度を合成進行中に知ることが可能になった。その他にも、バナジウム酸化物などの合成も成功した。さらにこの手法で合成可能な物質群を増やすため、大気中で不安定な試料を合成する新しいシステムの開発に着手している。また、電荷フラストレーションの効果を検証するためのモデル物質として、2.5価の鉄が三角格子を形成したNaFe2O3の合成を行った。試料合成を酸素分圧制御炉を用いて行ったが、この試料が大気中で不安定なため、純良試料は得られていない。今後、上述した新しい酸素分圧制御炉を用いて合成を行うことで純良試料が得られると考えられる。一方、封管による固相反応法を用いることで、わずかに試料依存がみられるものの純良試料を得ることに成功した。NaFe2O3の物性を詳細に調べ、電荷秩序を示唆する結果を得た。磁化率測定において2段階の異常を観測し、これらのうち高温の異常が構造変化と関係していることが明らかになった。この異常は、電気抵抗率の急激な増大を伴うため、電荷秩序が起きていると考えられる。ただし、物性に試料依存がみられ、これは酸素欠損の影響だと推定している。今後は酸素欠損の影響を明らかにするため、酸素分圧制御炉を用いて種々の酸素分圧でNaFe2O3を合成し、その物性を詳細に調べる予定である。

さらに、昨年度に引き続き、混合原子価酸化物の純良試料の合成を行うための酸素分圧精密制御炉の作成を進めた。その結果、この炉の小型化に成功し、グローブボックスにこの炉自身を持ちこむことが可能となったため、大気中で不安定な化合物の試料合成が可能となった。しかしながら、循環システムが不十分であるため、炉内の酸素濃度勾配が非常に大きくなり、酸素濃度の調整が困難になった。今後より濃度差を縮小できる循環システムを確立することで、さまざまな混合原子価酸化物の試料合成に適用できる合成手法となることが期待できる。上記の結果を国内および国際学会において発表した。当初の予定通り、ZrO2センサーを搭載した酸素分圧制御炉の作成に成功し、様々な遷移金属酸化物を合成することができた。加えて、試料を急冷により取り出す機構の作成に成功した。さらに、大気中で不安定な試料を取扱うためのシステムの開発に着手し、その設計と炉の大部分の部品の作成を終えている。したがって、酸素分圧制御炉の装置開発は当初の計画以上に進展したと評価している。また、NaFe2O3の磁化率、電気抵抗率、構造変化などの巨視的な物性の測定および予備的なNMR測定を行うことができた。一方で、試料依存の原因が明確になっていない。この試料依存の原因は、試料にわずかに存在する酸素欠損によるものだと推定される。そこで、酸素分圧制御炉によりさまざまな酸素分圧でNaFe2O3を合成し、その物性測定を行うことで、酸素欠損と物性の関係性を系統的に調べる予定である。これらの得られた成果の一部を国内学会で発表した。また、今後国際学会で発表し、論文発表という形でまとめる予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。最初に、大気中で不安定な混合原子価の遷移金属酸化物を合成するために開発した新しい酸素分圧制御炉を本格的に稼働させる。この炉の性能を調べるため、これまでと同様にテスト物質を用いた合成を行う。その後、新しい酸素分圧制御炉を用いて、大気中で不安定な試料であるNaFe2O3の合成を試みる。特にこの化合物においては試料依存がみられており、それは酸素欠損の影響であると推定される。焼成時の酸素分圧を変化させることで、このような酸素欠損を制御することが可能になると考えられる。そこで、酸素分圧制御炉を用いて、様々な酸素分圧においてNaFe2O3の合成を行い、物性を詳細に調べることで、酸素欠損の影響を明らかにする。また、このようにして得られた純良試料を用いて、NaFe2O3のNMR測定を行い、秩序状態の微視的な解明を目指す。さらに、酸素分圧制御炉を用いて、混合原子価の遷移金属元素をもつ酸化物の物質探索を進める予定である。現在は鉄酸化物を中心に研究を展開しているが、それに加えてチタン、バナジウム等の他の遷移金属元素をもつ混合原子価酸化物の合成を試みる予定である。このようにして得られた結果を、学会発表、論文発表としてまとめる予定である。
「畳室にかかわる住様式の新動向」と「畳空間の発展方向」に関する研究

日本の都市住宅における今後の畳空間の平面計画とインテリア計画に資するため、大都市圏域である首都圏、関西圏、名古屋圏、福岡圏と、地方都市の熊本圏に立地する住宅の居住者を対象とし、畳空間の現況と住意識に関する調査を実施した。平面における畳室の現況については、例えば、首都圏では畳数は少なく、関西圏では相対的に多いというように顕著な地域差が認められた。畳室の使われ方については、熊本圏では畳室の接客機能が他地域よりも認められるというように地域による違いを明らかにした。畳空間に対する居住者の意識についても、地域と年齢階層などによる差異が明らかになった。畳の必要性や愛着意識などに対し、首都圏ではその薄らぎが他地域よりも認められた。しかし、全地域をとおして畳に対する根強い愛着意識の存在を明らかにした。「畳空間の新しいデザインのあり方」を文献調査から検討し、次世代に継承しうる新しい畳空間のデザインの必要とそのあり方を提示した。さらに、新しい畳空間デザインの居住者の嗜好性を検討した結果、地域差なく、新しいデザインの受け入れが認められた。今後の日本の都市住宅における畳空間の発展方向として、生活機能面からは、接客機能やくつろぎ機能を有する空間としての方向を提示し、そのデザインについては、伝統性を踏まえながら現代性をとりいれた新しいデザインの必要とそのあり方を提示した。平成11年度(初年度)は,福岡に立地する戸建注文住宅の居住者を対象とした「畳空間の住み方とその意識に関する調査」の結果のデータ整理と分析を行い,地方大都市の福岡における以下のような,居住者の畳空間にかかわる住み方と住意識の動向が明らかになった.住宅平面の中に1室のみ残された畳室に着目すると,その半数は客間ないし予備室として存在するが,実際の接客には畳室よりLやLDのほうがよく使われ,また,宿泊客のない世帯が2割弱存在し,客間としての存在意義が薄らいできている.さらに,改まった客はあまり存在せず,また,法事や結納,正月,節句,クリスマスなどの行事や集まりごとにも畳室を使用することは減少している.以上のように行事・接客空間としての生活機能面から考察すると,畳空間の存在意義は薄らいでいることが明らかになった.意識面では,若年層ほど畳の必要性や愛着意識の薄らぎは否めないが,心がやすらぐ,落ちつくなど,心理的,精神的なものを畳空間に求める意識が強く存在することがわかった.また,畳室のインテリア計画に対しては,伝統的なものばかりでなく,新しいデザインや素材を用いた畳空間に対する志向性が認められた.さらに本年度は,首都圏等における住宅の居住者に対する同種の調査を実施し,データの整理,分析を行っている.平成12年度(2年目)は,(1)首都圏に立地する戸建注文住宅の居住者(有効サンプル数世帯票328,個人票651)を対象とした「畳空間の住み方とその意識に関する調査」の結果のデータ整理と分析を行い,平面型の特徴,住み方,住意識の動向を明らかにした.さらに,(2)インテリア計画における新しい畳空間デザインの動向の分析を進めた.首都圏の戸建注文住宅における,畳空間からみた平面型の特徴は,畳空間のない住宅が一定の割合(7.4%)で存在し,他地域よりもその割合は高い.

平面の中に畳室を1室もつ住宅が57.1%と最も多く,2室をもつ住宅27.6%,3室以上8.0%である.平均1.4室(cf.関西圏の結果は1.7室)であり,他地域と比較すると,最も少ない.畳室1室の平面型に着目すると,玄関横の畳室と,リビングに隣接する畳室の2種の平面型に大別される.前者の室機能は客間が多く,後者の室機能は居間,客間,主寝室に分けられ,LやLDなどに隣接した第2の居間として存在することが認められた(住み方と住意識については割愛).次世代の継承しうる生活空間としての,新しい畳空間デザインを考察,検討するために,『新建築・住宅特集(j.t)』の創刊号から1995年12月号(なお,1996年1月2000年12月号についても,現在データ整理分析中)の全作品1778の中から,畳空間に「新しい試み」のある住宅作品(636)を対象とし,1.畳空間構成の型分類,2.その要素空間(床の間〔床,棚,書院〕,畳〔縁の有無,敷き方,形状,色彩など〕,天井・壁〔コンクリ-ト打ち放し,和紙,ペンキなど〕,建具〔襖,障子の意匠〕,照明,空調,材料〔自然素材/人工素材,伝統素材/近代素材〕,3.起居様式等々のデザイン上の試み(約200アイテム)について集計整理を行い,その分析を行っている.平成13年度は、以下のような研究内容を遂行した。(1)中部圏(有効サンプル数世帯票324、個人票484)および熊本圏(有効サンプル数世帯票195、個人票322)に立地する戸建注文住宅の居住者を対象とした「畳空間の住み方とその意識に関する調査」の結果のデータ整理と分析を行い、各地域の平面型の特徴、住み方、住意識の動向を明らかにした。さらに最終年度のあたり、これまでの調査対象地域(首都圏、関西圏、中部圏、富山圏、福岡圏、熊本圏)における調査結果について、畳室の平面における動向、畳空間に対す住意識について、地域差の検討を行い、日本の都市住宅における地域性を考慮した、住宅計画における畳空間の在り方を示唆した。(2)『新建築・住宅特集(j.t)』の創刊号から2000年12月号の全作品2362の中から、畳空間に「新しい試み」のある住宅作品(994)を対象とし、a.畳空間構成の型分類、b.その要素空間(床の間、畳、天井・壁、建具、照明など)、c.起居様式等々のデザイン上の試みとデザイン動向を分析し、次世代に継承しうる生活空間としての、新しい畳空間デザインを考察、検討した。さらに、これらの新しい畳空間のデザインについて居住者のデザイン志向からの検証を行い、今後のインテリア計画における畳空間デザインの在り方を示唆した。(3)国内のイグサの主産地、熊本におけるイグサ生産の現状とその問題点を把握し、生産面から、畳空間にかかわる住様式発展の可能性を検討した。
コミュニティセンタ-の住民管理の効果測定に関する研究

今年度は、前年完了した現地調査のデ-タの集計と分析の作業を行った。名古屋市,仙台市,三鷹市の3地区において回収した684名のアンケ-トのデ-タをもとに「コミュニティセンタ-の住民管理」と「コミュニティの形成」との関連、とくに両者の相互効果がガンマ係数、カイ2乗検定などの統計的手法を用いて分析した。これらの数値から、明瞭で有意な関連のパタ-ンが多数えられた。1.コミセンに関する指標としてその認識度、利用度、管理運営参加度、住民管理意識度などの尺度を作成し、これらを独立変数とし、コミュニティ形成に関する諸指標を従属変数として関連を見ると、前者の変数の後者におよぼす効果は大であった。とくに管理運営への参加度の強化は地域の活性化に効果がある。利用度と地域形成とは擦違う部分があり、その効果は屈折したものがあった。2.コミュニティ形成の指標として、地域集団参加度、地域リ-ダ-度、地域活性化度、近隣交際度、コミュニティ意識度などの尺度を作成し、これらがコミセンの認識、利用、運営参加におよぼす効果をみたところ、いずれも大であった。成熟したコミュニティが、センタ-の自主運営の基盤となっている。3.管理運営に積極的に参加する層は地付き層であるが、住民管理の理想を支持しながらも、現実の運営の在り方には極めて批判的な意識をもち、行政の関与の仕方にも批判的であった。利用度の高い層は新しいタイプの住民層であるが、やはり実態には批判的で、自主運営の在り方は改善の余地が大である。4.コミセンの効果とは、経済的効果ではなく社会的効果の意味で使われているが、地付き層の補強効果と覚醒効果、新しい住民層の参加のによる改変効果などを指摘できる。なお、資料補充のための現地調査を実施する予定であったが、その経費をコンピュ-タの集計費に当てたため、調査は断念せざるをえなかった。今年度は、コミュニティセンタ-の住民管理の実績をあげている愛知県名古屋市亀島地区(駅前商工業地区・コミセン開設昭和58年)宮城県仙台市中山地区(ニュ-タウン地区・コミセン開設昭和56年)東京都三鷹市新川・中原地区(市街地住宅地区・コミセン開設昭和57年)の3地区を選定し、一般住民と住民リ-ダ-を対象とする質問紙調査を実施したところ、それぞれ288名、175名、221名の有効回答数を得た。次に、平成元年度の知見を、名古屋、仙台、三鷹の3地区の順で示す。第1にコミュニティセンタ-の住民管理と利用の実態では、1.コミュニティセンタ-の知名度は81.6%、78.3%,86.0%で、相当の知名度があった。2.利用度は50.3%、57.7%、69.6%で、多くの住民が利用していた。3.管理への参加度は43.7%、34.3%、25.3%で、地区の差が大きかった。4.住民管理意識度の高い者は51.4%、47.5%、42.5%で、参加度と同一の地区差が見られた。第2にコミュニティ活動と意識の実態では、5.コミュニティ団体への参加度は、61.1%、64.0%、57.5%で、いささか地区差があった。6.コミュニティ意識度の高い者は47.9%、49.7%、45.3%で、参加度と同一の地区差が見られた。7.コミュニティ活動評価の高い者は44.1%、43.4%、28.1%で、三鷹地区のみが低かった。第3にコミュニティセンタ-の住民管理がコミュニティ活動に及ぼす効果をみると、名古屋市では両者のあいだに正の相関がみられるが、仙台市では後者の活発さが前者へ波及せず、三鷹市では前者が高い割に後者が活性化していないという傾向が見られた。次年度は、これらのデ-タを多変量解析の手法によって処理し効果測定のさらに詳しい分析を行うとともに、リ-ダ-から入手した現地資料の解釈も加えて、コミュニティセンタ-管理とコミュニティ活動の相互効果の解明を行う。

3.管理運営に積極的に参加する層は地付き層であるが、住民管理の理想を支持しながらも、現実の運営の在り方には極めて批判的な意識をもち、行政の関与の仕方にも批判的であった。利用度の高い層は新しいタイプの住民層であるが、やはり実態には批判的で、自主運営の在り方は改善の余地が大である。4.コミセンの効果とは、経済的効果ではなく社会的効果の意味で使われているが、地付き層の補強効果と覚醒効果、新しい住民層の参加のによる改変効果などを指摘できる。なお、資料補充のための現地調査を実施する予定であったが、その経費をコンピュ-タの集計費に当てたため、調査は断念せざるをえなかった。
大腸癌肝転移におけるラミニンとテネイシンの組織化学的研究

進行直腸癌の局所再発について、癌細胞の浸潤能が関与していることから直腸癌治癒切除標本をもちいて細胞外マトリックスであるテネイシンと癌細胞のTGFβ-1発現が局所再発の危険因子のひとつである神経浸潤とどのような関連があるかを検討した.進行直腸癌切除標本についてテネイシンの免疫組織化学染色を行なったところ、染色性は従来報告されているように陽性例では癌間質にびまん性に認められ、癌細胞自身に染色されるものは認められなかった.TGFβ-1発現は癌細胞細胞質に微細顆粒状に認められた.神経浸潤はラミニン染色とヘマトキシリン・エオジン染色により判定した.103例中局所再発は15例(14.6%)に認められ、神経浸潤は34例(33.0%)に認められた.局所再発例の60.0%に神経浸潤が認められたのに対し、無再発例では28.4%で有意に局所再発例で神経浸潤が高率であり、神経浸潤は局所再発の危険因子であった.次にテネイシン発現をみると局所再発例では66.7%、無再発例では36.4%で有意な相関が認められ、神経浸潤については神経浸潤陽性例の70.6%に発現が認められたのに対し、神経浸潤陰性例では26.1%であり有意差が認められた.さらにTGFβ-1発現は局所再発および神経浸潤とは相関は認められなかったが、テネイシン発現との間に有意な相関が認められた.これらの結果から直腸癌の局所再発因子として神経浸潤は重要であり、テネイシン発現は神経浸潤を促進している可能性が示唆された.またTGFβ-1は細胞外マトリックスのひとつであるテネイシンに作用して神経浸潤を含めた癌細胞の局所進展に関与していると考えられた.進行直腸癌の局所再発について癌細胞の局所浸潤が関与していることから直腸癌治癒切除標本をもちいてテネイシンとTGFβ-1の発現が局所再発の危険困子のひとつである神経浸潤とどのような関連があるかを検討した.テネイシンの免疫組織化学染色を行なったところ、染色態度は従来報告されているように癌間質にびまん性に認められ、癌細胞自身に染色されるものは認められなかった.TGFβ-1発現は癌細胞質に微細顆粒状に認められた.神経浸潤はラミニン染色とヘマトキシリン・エオジン染色により判定した.直腸癌切除l03例中局所再発は15例(14.6%)に認められ、神経浸欄は34例(33.0%)に認められた.局所再発例の60.0%に神経浸潤が認められたのに対し、無再発例では28.4%で有意に局所再発例で神経浸潤が高率であった.次にテネイシン発現をみると局所再発例では66.7%、無再発例では36.4%で有意な相関が認められ、神経浸潤については神経浸潤陽性例の70.6%に発現が認められたのに対し神経浸潤陰性例では26.1%であり有意差が認められた.さらにTGFβ-1発現は局所再発、神経浸潤とは相関は認められなかったが、テネイシン発現との間に有意な相関が認められた.これらの結果から直腸癌の局所再発困子として神経浸潤は重要であり、テネイシン発現は神経浸潤を促進している可能性が示唆された.またTGFβ-1は細胞外マトリックスのひとつであるテネイシンに作用して神経浸潤を含む局所進展に関与していると考えられた.進行直腸癌の局所再発について、癌細胞の浸潤能が関与していることから直腸癌治癒切除標本をもちいて細胞外マトリックスであるテネイシンと癌細胞のTGFβ-1発現が局所再発の危険因子のひとつである神経浸潤とどのような関連があるかを検討した.進行直腸癌切除標本についてテネイシンの免疫組織化学染色を行なったところ、染色性は従来報告されているように陽性例では癌間質にびまん性に認められ、癌細胞自身に染色されるものは認められなかった.TGFβ-1発現は癌細胞細胞質に微細顆粒状に認められた.神経浸潤はラミニン染色とヘマトキシリン・エオジン染色により判定した.103例中局所再発は15例(14.6%)に認められ、神経浸潤は34例(33.0%)に認められた.局所再発例の60.0%に神経浸潤が認められたのに対し、無再発例では28.4%で有意に局所再発例で神経浸潤が高率であり、神経浸潤は局所再発の危険因子であった.次にテネイシン発現をみると局所再発例では66.7%、無再発例では36.4%で有意な相関が認められ、神経浸潤については神経浸潤陽性例の70.6%に発現が認められたのに対し、神経浸潤陰性例では26.1%であり有意差が認められた.さらにTGFβ-1発現は局所再発および神経浸潤とは相関は認められなかったが、テネイシン発現との間に有意な相関が認められた.これらの結果から直腸癌の局所再発因子として神経浸潤は重要であり、テネイシン発現は神経浸潤を促進している可能性が示唆された.またTGFβ-1は細胞外マトリックスのひとつであるテネイシンに作用して神経浸潤を含めた癌細胞の局所進展に関与していると考えられた.
セロビオース脱水素酵素の機能と分子構造の解析

セルロース分解糸状菌PhanerochaetechrysosporiumおよびHumicola insolensが生産する反応pH依存性の異なる2つのセロビオース脱水素酵素をカラムクロマトグラフィーを用いて多量に精製した。得られた酵素をパパイン処理して切断分離されたフラビンドメインとヘムドメインを同様に精製した。得られた酵素を.パパイン処理して2つの活性中心として存在するフラビンおよびヘムの酸化還元電位の測定,ストップドフロースペクトロメトリ法による酵素分子内における電子ならびにプロトン伝達機構の反応速度の解析を行った。その結果として,CDHにおける酸化還元反応の速度支配因子はFADからHemeへの電子伝達であることを明らかにした。さらに,その過程での電子伝達速度が両補欠分子間の酸化還元電位差による熱力学的な因子ではなく、両補欠分子間の距離の変化に基づく因子によって決定される可能性を示唆した。一方,P. chrysosporiumのセルロース分解系からmRNAを抽出し,これを基にCDH遺伝子をcDNAとしてクローニングした。さらに,これをメタノール資化性酵母Pichia pastoris系ベクターに挿入し,発現を試みた。その結果,1800U/L(79mg/L相当)のCDHを組換え体として得ることに成功した。組換え体CDHは物性的にも,また活性的にも野生CDHとほぼ同じ性質を示した。以上のことから,P. pastorisで発現さたCDHは今後の生化学的研究ならびに分子生物学的研究において非常に有用であると考えられた。ウプサラ大学のC. Divneらの研究グループとの共同研究で,Humicola insolens由来のCDHヘムドメインの3次元構造を解析するために,結晶化を試み成功した。得られた,ヘムドメインの構造は基本的にはすでに明らかにされているP. chrysosporium由来のヘムドメインの場合と類似性が高かった。セルロース分解糸状菌PhanerochaetechrysosporiumおよびHumicola insolensが生産する反応のpH依存性の異なる2つのセロビオース脱水素酵素をカラムクロマトグラフィーを用いて多量に精製した。インタクトのセロビオース脱水素酵素ならびに2つのドメインに対して活性中心として存在するフラビンならびにヘムの酸化還元電位の測定、スットプドフロースペクトロメトリー法による酵素分子内における電子ならびにプロトン伝達機構の反応速度の測定を行ない、セロビオース脱水素酵素活性中心における酵素分子内での電子ならびにプロトン伝達機構について解析を行った。その結果、両セロビオース脱水素酵素の酸化還元反応のpH依存性の差はフラビンの機能ならびにフラビンからヘムへの電子伝達機能の差異にもとづくことを明らかにした。一方、ヘムの機能については両者で大きな差は認められなかった。さらに、H.insolens由来のセロビオース脱水素酵素のフラビンは大部分が6-OH-FADの誘導体の形で存在することが明らかにした。なお、フラビンの誘導化と酵素機能の関わりについてはさらに研究中である。また、P.chrysosporiumのセロビオース脱水素酵素遺伝子をcDNAとしてクローニングし、大腸菌中で発現させることを試みた。ウエスタンブロッティングによってセロビオース脱水素酵素のポリクローナル抗体に対して陽性なタンパクが検出できたが、これにはフラビンやヘムなどの補欠分子族は含まれておらず、リフォルディングによっても補欠分子族を導入することはできなかった。セルロースを炭素源とする培地で培養した白色木材腐朽菌PhanerochaetechrysosporiumからmRNAを抽出した。これを,既往の遺伝子情報に基づいて設計したプライマによるPCR法によって,セロビオース脱水素酵素(CDH)の全長をコードする遺伝子領域をcDNAとしてクローニングした。

さらに,これを発現ベクターpPIC9KのEcoRIサイトに組み込み,メタノール資化性酵母Pichia pastorisに形質転換した。得られた形質転換体を培養し,メタノール存在下で組換えCDHを分泌型タンパク質として発現させた。その結果,5日間の培養で約65mg/Lという非常に高収量で完全に活性型の組換え体としてCDHが得られることが分かった。また,得られたCDHはセルラーゼ活性が全く含まれない。したがって,今後のCDH研究ならびに利用にとって,この組換え体は非常に有用であると考えられる。この研究結果については,近々公表予定である。また,ウプサラ大学構造分子生物学科のC.Divneらのグループとの共同研究により,P.chrysosporium由来CDHの3次元結晶構造解析を進め,ほぼ全容を明らかにした。その結果,CDHを構成する2つのドメイン構造は互いに向かい合ったU字型構造をとっていることが明らかとなった。また,この間に基質の結合サイトが存在することが示唆された。さらに,CDH中のフラビンからヘムヘの電子伝達のpH依存性が,pHに基づくCDHの3次元構造変化による両補欠分子族間の距離的な問題に帰結することを示した。