hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分散処理環境における動的最適化制御のための知的ネットワークシステムの研究

大規模な分散処理環境において性能を最大限に引き出すためには、ソフトウェア及びハードウェア両面からのチューニングが重要である。本研究では、様々な性能のノードが混在する非均質環境に加え、実行時に生じる実効性能差も考慮して、それらの分散処理環境で動的に最適化制御を行う方式を提案する。この制御に必要な情報は実行時に収集する必要があるため、従来はオーバヘッドの大きさが問題であった。提案方式は、ネットワーク装置でシステムの管理情報を適切に付加することによって、最適化制御に伴うオーバヘッドを抑制する。今後、より複雑な動的最適化制御を開発し管理情報の量が増加する場合にも対応可能な基盤技術の一つを確立した。本研究は、非均質なノードから構成される分散処理環境において、明示的なノード間通信に依存せずに、局所的な情報共有を実現するネットワークシステムを開発するものである。ネットワーク集線装置に対しても一定の情報処理能力を付与し、ネットワークを高度に知的化することで、分散処理環境の動的な最適化に要する情報を低オーバヘッドかつ低遅延で共有できるようにする。これにより、通信路上のトラヒック量が最適化されるため、実効通信性能の向上が期待できる。本研究で提案するネットワークシステムでは、管理情報の交換にかかるオーバヘッドを大幅に軽減できるため、高度な動的最適化手法の進展に繋がる可能性がある。本年度は、ネットワークノード間で交換する管理情報の詳細、およびその伝送に用いるパケットの構造を決定した。また、分散ストレージシステム上に保存したデータブロックの配置を動的に最適化する目的で、管理情報の交換方式を決定した。ここでは、管理情報を通常のノード間通信で用いるユニキャストフレームにマージすることで、独立したネットワークフレームが生成されないように考慮した。シミュレーションによる評価の結果、大規模な分散処理環境においても管理情報の鮮度を低下させずにトラヒック量を抑制できることを確認した。また、管理情報の交換頻度を高めた場合でも、本来必要となるネットワーク通信を阻害しないことを確認した。管理情報の定義および交換方式については研究計画通りに詳細まで検討が進み、一定の性能評価を行えたものの、ネットワークスイッチにおける管理情報の抽出・融合機能に関する設計がやや遅れ気味である。これは、管理情報の交換方式を設計する段階において、ネットワークトラヒックの量を大幅に削減する新たな方式を詳細に評価する必要が生じたためである。ここで得られた知見は、ネットワークスイッチの内部設計に大きな影響を与える可能性があったため、若干の遅れが生じることとなった。本年度はオープンソースUNIX環境の一つであるFreeBSDをベースに評価用環境を実装した。その上で、分散処理環境の各種ノードおよびネットワークスイッチでの動的最適化制御にかかる実際の処理量を様々な状況下で計測した。ここでは、収集した管理情報を基に、各ノードの判断で分散処理環境の部分再構成を行うためのアルゴリズムを検討した。このアルゴリズムは、実行中の処理内容に適したノードを動的に選択し、非均質な処理環境のリソースを有効活用することを目指したものである。実機環境で計測した処理時間を用いてシミュレーションによる評価を行った結果、動的な最適化制御を行うことで、静的な指標のみを用いて最適化を行うよりも実行性能を改善できることが分かった。計画通りに動的最適化制御方式の詳細設計が進展しており、実機をベースとした評価環境の構築も進んでいる。知的化されたネットワーク装置とネットワークノードの協調により、分散処理環境の動的な最適化に要する情報を低オーバヘッドかつ低遅延で共有できるようにする。本研究で提案するネットワークシステムでは、管理情報の交換にかかるオーバヘッドを大幅に軽減できるため、これまでにない高度な動的最適化手法の進展に繋がる可能性がある。前年度までに、ネットワークノード間で処理環境の管理情報を低オーバヘッドで交換する方式を決定した。大規模処理環境においてもトラヒック量を抑制でき、同時に、管理情報の交換頻度を高めた場合においても、本来必要となるノード間通信を阻害しないことが確認できた。さらに、収集した管理情報にもとづき各ノードの自律的な判断で処理環境の部分再構成を行うアルゴリズムを検討した。これは処理内容に適したノードを動的に選択し、非均質なリソースを有効活用することを目指したものである。性能評価の結果、動的最適化制御が適切に動作することで実行性能を改善できることが分かった。本年度は実行環境ごとのパラメータチューニングを回避する新しいパラメータ設定方式を導入することで、多様な実行環境へ容易に適用できるように改良した。また、これまでよりも詳細な性能評価を行うことで、提案方式の有効性を確認した。本研究により、分散処理

環境内でシステムに関する新鮮な管理情報を低コストで共有できる技術が確立でき、より高度な動的最適化制御を行うための基盤技術を構築することができた。大規模な分散処理環境において性能を最大限に引き出すためには、ソフトウェア及びハードウェア両面からのチューニングが重要である。本研究では、様々な性能のノードが混在する非均質環境に加え、実行時に生じる実効性能差も考慮して、それらの分散処理環境で動的に最適化制御を行う方式を提案する。この制御に必要な情報は実行時に収集する必要があるため、従来はオーバヘッドの大きさが問題であった。提案方式は、ネットワーク装置でシステムの管理情報を適切に付加することによって、最適化制御に伴うオーバヘッドを抑制する。今後、より複雑な動的最適化制御を開発し管理情報の量が増加する場合にも対応可能な基盤技術の一つを確立した。平成27年度に行った評価結果をもとに、ネットワークスイッチの内部設計を継続して行う。特に、ネットワークフレームからの情報抽出および複数の管理情報を融合した上で、ネットワークフレームにマージする機構を設計する。また、提案方式の有効性を確認するために、実機による評価環境を構築し、性能評価を行う。ネットワークスイッチ上で動作するソフトウェア部分の検証には、オープンソースUNIXを用いてエミュレートすることで行う。本研究計画の最終年度として、平成29年度では平成28年度に行った方式設計をもとに詳細な性能評価を行うことで、本方式の有効性を検証する。特に、実行環境をモニタしながら処理環境を最適化する本方式では、実行時のオーバヘッドを低いレベルに抑えることが性能を引き出す上で重要になる。そのため、ハードウェアによる支援機構を組み込むことを検討するが、性能面での評価だけでなく、実装規模の見積も行う。情報工学一部の性能評価の実施に遅れが生じており、そのために必要な機材の購入を次年度に遅らせることで、より高性能な機材を導入するため。性能評価に用いる予定の機材が平成29年度の初めに更新される情報があり、その更新内容を確認してから発注を検討する予定であるため。評価の遅れは速やかに取り戻した上で、評価用の機材を購入する。その他については、次年度の研究計画に従って執行する。新年度の開始に伴い速やかに機材を購入する。その他については、平成29年度の研究計画に従って執行する。
悪性黒色腫の転移抑制遺伝子の同定

本年度は、転移抑制遺伝子KiSS1のin vivoにおける重要性を検証するために、メラノサイト系腫瘍51病巣(母斑細胞母斑4、原発性黒色腫20、黒色腫の転移27)におけるKiSS1 mRNAの発現をin situ hybridizationで法で検討した。さらに、転移腫瘍におけるKiSS1 mRNAの発現と6q16.3-q23のLOHの関連を検討した。その結果、母斑細胞母斑4例と厚さ4mm未満の原発性黒色腫8例の全例においてKiSS1 mRNAの発現が認められた。しかし、厚さ4mm未満の原発性黒色腫および転移腫瘍ではそれぞれ50%(6/12)1・44%(12/27)でKiSS1 mRNAの発現は消失していた。一方、転移腫瘍の52%(14/27)で6q16.3-q23のLOHが検出され、KiSS1 mRNAの発現消失と6q16.3-q23のLOHの間には有意の相関が認められた(P=0.03)。これらの成績から、KiSSのin vivoにおける転移抑制遺伝子としての重要性が強く示唆され、さらに6q16.3-q23の未知の癌抑制遺伝子がKiSS1の発現を制御しているというWelchらの仮説が裏づけられた。一方、ごく最近、KiSS1遺伝子はG蛋白共役受容体hOT7T175のリガンドであるメタスチンをコードしていること、マウスの実験系ではメタスチンの投与により黒色腫の転移が抑制されることが明らかにされた[Ohtakiら、Nature,2001]。そこで、現在さらにin vivoの黒色腫サンプルを用いてKiSS1およびOT7T175のmRNAの発現量を定量的PCR法により、腫瘍組織におけるメタスチンの発現を免疫組織化学により検討中である。本研究は6番染色体長腕(6q)6q16.3-q23領域に存在することが予測される黒色腫の転移抑制遺伝子の同定と単離を目的としている。今年度は、まず、黒色腫の切除組織標本30検体を選び、6q16.3-q23領域のLOHを調べた。その結果15例(50%)の検体に同領域のLOHが検出された。さらにこれらの15例につき、6q16.3-q23にマップされた13種類のマイクロサテライト多形マーカーによるfine deletion mappingを施行したところ、D6S268からD6S292までの40cMの領域に欠失が集中していることが明らかとなった。一方、6qの未知の遺伝子は、黒色腫の転移抑制遺伝子Kiss1の発現を調節していることが推測されるので、同一のサンプルにおけるKiss1遺伝子mRNAの発現をRT-PCR法により検索中である。現在のところ、対象例はKiss1発現陽性例と陰性例に別れるようであり、この成績と6qのLOHとの関連を今後さらに検討していく予定である。なお、将来的なより詳細な検討のために、現在黒色腫切除標本から細胞株の樹立を試みている。
クオリアとしての気付きを測定する生活科学習評価法の開発

本研究では,生活科授業において生起するクオリアとしての気付きの検討,国内外での面接調査,質問紙調査などの結果,オノマトペなどの言語表現がクオリアとしての気付きの評価の手がかりとなり得ることを明らかにした。これに基づいて,クオリアとしての気付きの想定や評価の方法として「生活科において表現される主なクオリア理解のための枠組み」や「クオリアとしての気付きを引き出す発問例」などを提示した本研究では,生活科授業において生起するクオリアとしての気付きの検討,国内外での面接調査,質問紙調査などの結果,オノマトペなどの言語表現がクオリアとしての気付きの評価の手がかりとなり得ることを明らかにした。これに基づいて,クオリアとしての気付きの想定や評価の方法として「生活科において表現される主なクオリア理解のための枠組み」や「クオリアとしての気付きを引き出す発問例」などを提示した本研究の目的は,生活科授業における子どもの気付きを捉え,位置付けるための評価法を開発することである。具体的には,3年間の研究期間内に,脳科学の知見や子どもの気付きの実態調査などに基づき「モデル評価シート」及び事例としての「単元別評価シート」を開発するとともに,それらを用いた評価法の手順を開発することを目的としている。平成21年度内の研究成果等については次のとおりである。〔研究整理〕文献等により,生活科教育,脳科学,言語学などにおける,気付き,クオリア,言語獲得などに関する先行研究の調査,分析,整理を行った。〔質問紙調査準備〕クオリアを表現する言語に関する質問紙調査の準備,及び「モデル評価シート」の作成のために,小学生用学習国語辞典から,クオリアを表現する語彙を抽出する作業を行った。また,米国ノースカロライナ州において収集した小学校低学年用教材(ポスター,教科教育指導書等)を訳出し,米国ノースカロライナ州小学校教諭への面接を踏まえて,米国ノースカロライナ州ピット郡内におけるクオリアに関係する言語の使用状況を整理した。これらを統合して,小学校低学年児童のクオリアを表現する言語を一覧にするための作業を進めている。〔生活科学習で実際に得られた気付きのデータ収集〕広島県内の小学校において第2学年生活科学習における子どもの気付き(植物の栽培に関する単元のワークシートへの記述)を収集し,分類,整理を行った。〔成果発表〕本年度は,本研究の方法論と展望について発表し,質疑応答により発表内容の確認や精査を行った。本年度は,主として実際の生活科学習における気付きの収集とその分析,整理,考察を行い,生活科におけるクオリアとしての気付きの状況を明らかにするとともに学習評価法の枠組みを構築することを目的として以下のとおり実施した。1研究整理:文献等により,生活科教育,脳科学,言語学などにおける,気付き,クオリア,言語獲得などについて調査し,分析,整理した。2質問紙調査:クオリアを表現する言語に関する質問紙を作成し,その妥当性や簡便性などについて検討した。3生活科学習で実際に得られた気付きのデータ収集:実際の生活科学習における子どもの気付きを収集し,授業実施者の実感や意見も参考にしながら,その分析,整理,検討を行った。クオリアとしての気付きの発現については,自然観察,学校や町の探検,おもちゃなどの製作など単元による特徴がみられることや子どもの活動時の構えがクオリアとしての気付きの発現に関係することなどが明らかになった。とくに製作活動においては,対象に対する子どもの働きかけが,クオリアとしての気付きを断続的に生み,螺旋的な学習活動の進展が行われることを認めることができた。4モデル評価シートの作成:実際に得られたクオリアとしての分類及び脳科学における分類の検討を通して,モデル評価シートの基礎となる枠組みを仮説的に提示した。5情報収集・情報発信:生活科における気付きや学習評価に関して,学会等で情報を収集した。また,昨年度および本年度の研究成果を学会発表,論文などで発信した。平成23年度(第3年次)は,最終年度として,次のとおり,1研究整理,2事例研究及び研究総括,3情報発信を行った。1研究整理:先行研究や本研究のこれまでの研究結果について,整理,分析,考察を行った。また,文献研究や学会参加などを通して,生活科教育,脳科学,言語学などにおける気付き,クオリア,言語獲得などについて,引き続き情報収集を行った。2事例研究及び研究総括:クオリアを表現する言葉の使用状況について,小学校児童および大学生を対象に調査,分析し,考察した。また,生活科授業におけるクオリアとしての気付きの状況や交流による質の高まりの様子を捉えて考察した。これらの研究結果を踏まえ,クオリアとしての気付きを測定する生活科学習評価法として「生活科において表現される主なクオリア理解のための枠組み」や「クオリアとしての気付きを引き出す発問例」を提示し,その意義や可能性,留意点などについて考察した。3情報発信:研究経過及び成果について,日本生活科・総合的学習教育学会において学会発表を行った。また,研究総括として,研究報告書(序章研究の目的と方法,第1章概念規定,第2章クオリアを表現する言葉,第3章クオリアに関する言葉の使用状況,第4章米国におけるクオリアに関する教育状況,第5章生活科学習におけるクオリアとしての気付き,第6章クオリアとしての気付きを測定する評価法,終章研究の成果と課題)を作成した。本研究において,生活科における気付きの本質である「クオリア」を測定する一方法を提示したこと,及びこの研究課題に関する研究や実践上の困難点や課題を明らかにしたことは,本研究の成果である。
培養心室細胞由来基質上でのES細胞の分化促進による 心室モデルの創出

本研究は、ES/iPS細胞の心筋症治療の早期実現における二つの重要な課題:心筋細胞への効率的分化誘導と体外での再生組織の構築、を取り組んで、幹細胞工学、タンパク質工学及び細胞組織工学の融合により、新たな細胞分化培養基質支持層を開発し、この支持層上にマウスES細胞の分化促進と心筋組織単層の作成を行い、多数単層の積層によって心筋再生組織を構築した。上記の実験研究により、ES細胞の心筋細胞への分化誘導、培養基質の力学特性およびそのES細胞の分化に及ぼす影響、並びに体外心筋再生組織構築における新知見を得、課題の更なる進展に関する重要な方法を示した。近年再生医療の飛躍的な発展によって心筋再生治療はすでに臨床試験の段階に進展した。しかしこれまでの治療方法のメカニズムはあくまでも移植された細胞から分泌するサイトカインの影響により自己の組織修復能を賦活化し、心機能が改善したと推測された。失われた心筋組織の修復・再生、心臓ポンプ機能の補助はまだ実現されていない。そこで、本研究は幹細胞工学、タンパク質工学及び細胞組織工学の融合により応用基礎研究として、ES細胞の心筋細胞への分化誘導からタンパク修飾した細胞培養基質による分化促進・組織構築を行い、生体機能を有する心室モデルの創出を目指す。本研究は、心筋再生医療領域における新たな展開と心筋発生学・心筋生理学に大きなインパクトをもたらすことが期待できる。本年度は研究計画に従って、以下の研究結果を得た。(1)ラット胎児心室由来細胞を培養し、培養液・期間の調整によりES細胞の分化促進に対する最適な細胞外基質を分泌した培養細胞monolayerをglutaraldehydeにより固定化する後、Triton X-100で透過し、残った細胞外基質に、分化したマウスES細胞を播種、心筋細胞の分化を促進する実験を行った。まだ、豚羊膜を脱細胞と酢酸処理による構造改良を行い、その上に分化したマウスES細胞を播種し細胞組織工学的心筋単層を作成した。(2)既に開発した電気-応力バイオリアクタに基づきその電気刺激装置を改良し、構築した心筋再生組織に電気刺激を印加し、心筋細胞の同期拍動を実現した。まだ、培養システムに灌流ポンプを設置し、積層した心筋単層の間に培養液の灌流を作り出す試みを行っている。本年度は以上の結果から当初の研究計画を概に達成した。1.豚羊膜を脱細胞と酢酸処理による構造改良を行い、その上に分化したマウスES細胞を播種し細胞組織工学的心筋単層を作成し、この心筋単層を二層積層して、二層の間の培養液灌流bioreactorを開発し、この灌流システムを利用して、積層の間に毛細血管と同じ流速の灌流流れを確認した。この成果は、積層による3次元心筋再生組織の構築に当たる組織内部の栄養の供給と老廃物の排除の問題を解決する手かかりになる。2.分化・誘導したES細胞胚様体を羊膜に播種・培養し、酢酸で処理したサンプルが処理していない方に比べ拍動比率が高い傾向を示した。また、酢酸の濃度が高くなると拍動比率の上昇の遅れが見られた。この研究結果は培養基質の力学特性がマウスES細胞の心筋細胞への分化に重要な影響を与えることを示唆され、心筋細胞の高効率な分化・誘導につながる。本年度は研究計画に従って、以下の研究成果を得た。1.ES細胞の心筋細胞への分化誘導に関して、マウスES細胞の未分化状態のマーカーであるSSEA-1を発現している細胞(SSEA-1+)と分化誘導され発現していない細胞(SSEA-1ー)を分離・培養したところ、SSEA-1+の分化割合がSSEA-1ーよりも高い値を示した。この結果について、分化過程を示す特異マーカーであるBryT、Mesp1、Islet1、Nkx2.5、Hand2、および心筋細胞への分化促進因子であるp300、SRFのmRNA発現量をRT-Real Time PCR法を用いて比較・検討した。

その結果、分化促進因子p300、SRFの特定時期の高い発現がES細胞の心筋細胞への高効率な分化誘導に重要であることを示唆した。2.心室モデルの構築に関しては、組織構築の足場素材としての豚羊膜の部位・方向性を考慮しその粘弾性と強度特性を引張実験で詳細に検討した。その結果豚羊膜の等方性と部位による異質性を判明した。この結果はES細胞の心筋細胞への分化・成熟における足場素材の力学特性の及ぼす影響についてより定量的な検討・評価ができ、組織構築の基礎構造である心筋単層の機能最適化の重要影響要素を定量的に特定した。3.心室モデルを培養する積層灌流培養バイオリアクタの開発では、前年度の結果を踏まえ、灌流装置を更に小型化し、インキュベータ内の培養とインキュベータ外の培養状況の観察を無菌状態で行うことが実現した。また、積層間の細胞・足場融合部分の適切な圧力の印加方法と強度を検討した。このような積層灌流培養バイオリアクタはこれまで報告されていない革新的な培養装置であり、これによって3次元的な機能組織の構築が期待できる。本年度の目標は概に達成したが、計画した動物移植実験には実験経費と研究期間の原因で行えなかった。今年度は研究計画従って、心筋単層を二層積層し、二層の間の培養液灌流実験を行った。また、培養基質の力学特性がマウスES細胞の心筋細胞への分化に重要な影響を与えることを示唆した。よって、本年度は当初の研究計画を概に達成した。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後の研究は24年度の研究計画に従い実施する。特に、心筋サックの作製とその機能測定、また動物への移植実験を精力的に行う。
神経膠腫およびその幹細胞の新規メチル化マーカーの確立と個別化療法への応用

神経膠腫と脳腫瘍幹細胞について、パイロシークエンス法を用いてメチル化の解析を行い、新規メチル化マーカーの検索を行った。既知の予後予測因子であるMGMTに加えて、新規メチル化マーカーとなるIGFBP2について解析を行った。IGFBP2のメチル化が、神経膠腫の悪性度を反映するマーカーであることがわかり、また腫瘍幹細胞でメチル化が低下することから、幹細胞形成と関連していることが示唆され、治療標的としても有望な分子と考えられた。神経膠腫の新規メチル化マーカーを確立するため、パイロシークエンス法を用いて神経膠腫臨床検体、脳腫瘍幹細胞のDNAメチル化について解析を行った。まずは既知のマーカーであるMGMTのメチル化について、自験例神経膠腫検体において解析し、従来のMSP法との比較を行った。特に、再発前後の神経膠腫検体において、MGMTのメチル化がMSP法で変化しているものについて、パイロシークエンス法でより精密な解析を行ったところ、テモゾロミドによる治療後の悪性転化についてより正確に予測することができた。MGMTメチル化に伴うテモゾロミドの耐性、悪性転化に関してはミスマッチ修復酵素がMGMTと共に重要な働きを示すことが近年示されているが、自験例においてミスマッチ修復酵素の発現とDNAプロモーター領域のメチル化も解析し、MGMT非メチル化の腫瘍でミスマッチ修復酵素の欠損を認める場合、テモゾロミドに強い耐性をもつことが示唆された。MGMT、ミスマッチ修復酵素以外の新規メチル化マーカーとなりうる遺伝子について、メチル化網羅的解析データから候補となりうる遺伝子、CpGサイトをいくつか選出してプライマーを設計して条件設定を行った。今後、多数の臨床検体および脳腫瘍幹細胞を用いてマーカーとしての有用性について検証していく予定である。また、神経膠腫幹細胞においては、杏林大学脳神経外科教室で膠芽腫の手術検体から今年度新たに12例樹立しており、以前から樹立済みのものと合わせて全部で20例解析可能である。幹細胞の由来である腫瘍検体との比較や、臨床経過との比較解析を行っていく予定である。MGMTに関しては、パイロシークエンス法によるメチル化解析を行うことができて、テモゾロミド治療後の悪性転化との一定の相関を示すことができた。また、ミスマッチ修復酵素に関する解析を追加して、MGMTと合わせて解析することでテモゾロミド治療に強い耐性を示す症例予測につながるデータを得ることができた。しかしながら、テモゾロミド耐性に関わるMGMT以外の遺伝子のメチル化に関してはまだパイロシークエンス法により安定した結果が得られておらず、まとまったデータの解析ができていない。さらに、その他の新規メチル化マーカーの候補として、いくつかのメチル化プライマーを設計したものの、まだ条件設定をしている段階で多数の臨床検体や細胞株を用いた本解析はできていない。また、腫瘍幹細胞を安定して樹立、継代することができているものの、DNAを用いたメチル化解析はまだ行っていない。以上より、現在までの達成度としてはやや遅れていると判断する。悪性神経膠腫の新規メチル化マーカーを確立するため、パイロシークエンス法を用いて神経膠腫腫瘍検体、脳腫瘍幹細胞のDNAメチル化についての解析を行った。166例の悪性神経膠腫検体において、MGMTメチル化をパイロシークエンス法にて詳細に解析した。30例において、腫瘍内の性質の異なる部位のサンプルを複数(25か所)解析して、腫瘍内のheterogeneityを評価した。MSP法とパイロシークエンス法との高い相関が認められるが、パイロシークエンス法のcutoffなどを工夫することで最も高い相関が得られる条件を検証した。また、予後や化学療法反応性に関して、MSP法よりもパイロシークエンス法の方が正確に予測できることがあり、予後予測のための最適な条件についても検証した。テモゾロミド治療を行った前後の初発/再発腫瘍検体の解析により、治療に伴う腫瘍の分子機構の変化について検討をしたところ、テモゾロミド治療に伴いMGMTのメチル化が増加していく傾向にあり、さらにMGMTのメチル化がテモゾロミド治療後の遺伝子変異蓄積および悪性転化に関与することが示唆された。膠芽腫由来腫瘍幹細胞を今年度新たに10例樹立して、これまで樹立した20例と合わせて30例程度において幹細胞のメチル化プロファイルについて解析していくことができる。また、血清中腫瘍由来DNAのメチル化解析を行うため、悪性神経膠腫を中心に96例の血清を蓄積して腫瘍由来のDNAの抽出を行っている。まずはMGMTメチル化からパイロシークエンス法にて解析して、腫瘍検体の結果との比較を行う。網羅的メチル化解析データから新規メチル化マーカーとなりうる遺伝子、CpGサイトをいくつか選出してプライマーを設計し、条件設定を行った。今後、多数の神経膠腫腫瘍検体および脳腫瘍幹細胞、血清中腫瘍由来DNAを用いてマーカーとしての有用性について検証していく予定である。本研究では、神経膠腫の予後や化学療法感受性を予測する新規メチル化マーカーの確立を目指しているが、新規メチル化マーカーに関しては選出と条件設定の段階であり、多数の腫瘍検体や幹細胞、血清中腫瘍由来DNAにおける検証がこれからという段階である。パイロシークエンスを用いて神経膠腫腫瘍検体および脳腫瘍幹細胞のメチル化解析を行い、新規メチル化マーカーの検索を行った。メチル化マーカーの候補として、Infinium450Kのゲノムワイドメチル化解析のデータから神経膠腫の悪性転化に関わると考えられるIGFBP2に注目して、この遺伝子のメチル化についても解析を行った。

既知の予後予測因子であるMGMTメチル化については300例以上でメチル化解析を行い、条件検討を行い最適なcutoffについて検証したところ、各グレードの神経膠腫においてパイロシークエンス法がMSP(methylation specific PCR)法よりも正確に予後予測ができることを確認した。IGFBP2のメチル化は、211例の神経膠腫腫瘍検体および21例の脳腫瘍幹細胞で解析を行ったところ、神経膠腫のグレードが上がるにつれてIGFBP2のメチル化が有意に低下し、さらに幹細胞ではグレード4の膠芽腫よりも低メチル化であった。この所見はMGMTなど他の遺伝子では見られず、IGFBP2が悪性度を予測するマーカーとして有用であると考えられた。腫瘍検体と幹細胞のペアで解析しても、IGFBP2メチル化は幹細胞で有意に低下していたことから、この遺伝子が幹細胞の維持や形成に関与することが示唆された。神経膠腫の生存期間、無増悪生存期間に関しては、最適なメチル化cutoffを設定することによりメチル化群の方が有意に予後良好であることが確認された。また、MGMTメチル化と組み合わせて予後解析すると、予後良好なMGMTメチル化群の中でもIGFBP2のメチル化が予後予測因子であった。本研究により、グリオーマの悪性度および予後を予測する神経メチル化マーカーを発見することができて、さらに幹細胞に特に重要な分子であることが示唆されたことから、治療標的としても有望と考えられた。神経膠腫と脳腫瘍幹細胞について、パイロシークエンス法を用いてメチル化の解析を行い、新規メチル化マーカーの検索を行った。既知の予後予測因子であるMGMTに加えて、新規メチル化マーカーとなるIGFBP2について解析を行った。IGFBP2のメチル化が、神経膠腫の悪性度を反映するマーカーであることがわかり、また腫瘍幹細胞でメチル化が低下することから、幹細胞形成と関連していることが示唆され、治療標的としても有望な分子と考えられた。MGMTのメチル化解析に関しては、より多くの臨床検体および腫瘍幹細胞について解析を行い、パイロシークエンス法によるメチル化解析のマーカーとしての有用性を確立させる。その他の薬剤耐性に関わる遺伝子のメチル化および発現について、解析のための至適条件を確立させて、MGMT同様に多数の検体について解析を行い、メチル化と臨床情報とを合わせて単変量・多変量解析することで、予後やテモゾロミド感受性と相関する遺伝子や遺伝子の組み合わせを明らかにする。それ以外の新規メチル化マーカー候補に関しても引き続き条件検討を行い、多数検体での解析ができるようにする。また、血清中の腫瘍由来微量circulating DNAを抽出して解析を行う、いわゆるliquid biopsyに関しても研究を行っていく。まずは血清中のDNAを抽出し、確立したDNAメチル化マーカーに関して解析を行い、腫瘍検体DNAとの比較を行う。パイロシークエンス法で解析が可能かどうか判断するため、数例はdigital PCRによる解析を行い、パイロシークエンス法との比較を行う。
新たに同定した肝類洞内皮細胞のB細胞免疫制御機構の解明と抗体性拒絶制御法への展開

血液型不適合移植において散見されている免疫寛容誘導のメカニズムを解明することを目的として研究行った。肝臓の類洞内皮細胞は糖鎖抗原を強く表出していることで糖鎖抗原応答性B細胞に対して免疫寛容誘導していることがわかり、この現象はPDL-1/ PD-1 pathwayが重要であることを明らかにした。この肝類洞内皮細胞の持つ抗原特異的B細胞に対する免疫寛容誘導能は世界で初めての報告である。初めに肝類洞内皮細胞の持つ免疫寛容誘導能はこれから抗原を認識して抗体産生細胞になるであろう未熟なB細胞とすでに抗原に暴露され抗体産生能を持つ成熟B細胞のどうちらかもしくは両者に対して効果があるのかを調べた。LSEC移入キメラマウスに放射線照射を行った後にsyngeneicの骨髄移植もしくは骨髄細胞とともに成体マウスより得た脾細胞を同時に移入したモデルを作成した。両モデルに対して免疫再構築が確立されたことを確認後、免疫し、抗体価と抗体産生細胞の有無を評価した。すると骨髄移植したモデルにおいては抗体産生が抑制されていたが、脾細胞を同時に移入したモデルでは抗体が産生されてた。抗体産生細胞についても骨髄移植モデルでは消失していたにもかかわらず、脾細胞を同時に移入したモデルでは抗体産生細胞が存在していた。つまり、肝類洞内皮細胞のもつB細胞免疫寛容誘導能は未熟B細胞についてのみ有効であり、すでに抗体産生細胞になってしまった成熟B細胞にはあまり有効でないということであった。未熟B細胞は全身循環にのり移植したLSECに触れることがあるが脾臓中に存在する成熟B細胞はLSECに接触する機会がないという理由でなくそれぞれの細胞の性質にあるものであることが示された。さらにこれまで肝類洞内皮細胞のT細胞への免疫寛容誘導能にはFas-FasL pathwayが関与していることが報告されているので、この肝類洞内皮細胞とB細胞の間にもFas-FasLが関与しているかどうかを確認するためにFasL-KOマウスをLSECドナーとして同様のLSEC移入モデルを作成し免疫後、抗体価の評価、抗体産生細胞の有無を検討した。Fas-FasLがもしこのB細胞に対する免疫寛容誘導に関与しているのであれば抗体産生抑制がブレイクスルーされるはずであるが抗体産生は抑制されたままであった。このことから本免疫寛容誘導のメカニズムにはFas-FasL pathwayは関与していないことがわかった。第二の経路として現在PDL-1分子について評価するために抗体精製をおこなって準備を進めている。血液型不適合移植ではグラフト内表出血液型糖鎖抗原が標的となり、激しい抗体性拒絶反応が生じる。ヒト肝組織では、肝類洞内皮細胞(LSEC)に血液型糖鎖抗原が強く発現している。これまでに、LSECがアロ応答性T細胞を細胞間接触により寛容化することを我々は報告している。そこで、血液型糖鎖抗原発現LSECが、糖鎖抗原認識B細胞に対しても寛容化を誘導する可能性について検討した。血液型糖鎖抗原と構造が類似したGal抗原ノックアウトマウス(GalT-/-)と野生型マウス(GalT+/+)を用いた。GalT-/-マウスの血清中には、抗Gal自然抗体が検出される。野生型マウスから分離した抗原表出GalT+/+LSECをGalT-/-マウスへ移入し、移入後4週目にGal抗原で免疫した。GalT-/-LSEC移入群では著しく抗体が産生されIgMからIgGへのクラス変換も確認された。しかし、GalT+/+LSEC移入群では抗体産生は優位に抑制された。また、これまでアロ応答性T細胞に対する肝類同内皮細胞の免疫寛容のメカニズムとしてFas-Fas ligand pathwayが示唆され、この経路の活性化に伴い応答性T細胞が細胞死に陥るとされている。しかし、Fas ligandノックアウトマウスのLSECを用いても抗体産生は抑制されたままであった。また、近年、肝臓に関わる疫寛容能にはPDL-1/PD-1 pathwayが寄与しているという報告が散見されることから、抗PDL-1抗体を用いて検討を行った。結果、肝類洞内皮細胞のB細胞に対する免疫寛容のメカニズムはFas-Fas ligand pathwayよりもPDL-1/PD-1 pathway優位であることがわかった。今日臓器移植におけるドナー不足は慢性的であり本問題を可及的に解決するための一助としてABO不適合移植の標準化が求められている。これまでABO不適合移植については技術の進歩や新規免疫抑制剤の開発により成績向上が見られるが適合移植の成績には及ばずグラフトロスに陥るケースが少なくない。しかし、不適合移植においては移植後早期の免疫反応を乗り越え寛容化が誘導されると以後は安定した経過をたどるという臨床結果が散見されている。この免疫寛容誘導のメカニズムを解明し、またコントローラブルにすることを目的として研究を進めてきた。これまで我々は若年小児血液型不適合移植においてB細胞性免疫寛容が誘導されることを示している。

血液型糖鎖抗原に類似のalpha Gal antigenをもつ野生型マウスおよび同抗原が欠損しているノックアウトマウスを用い肝類洞内皮キメラマウスモデルを確立した。作成したマウスに同抗原が強発現しているウサギ赤血球で免疫すると同抗原に対する抗体は肝類洞内皮細胞非移入群では産生されたが移入群では優位に抑制された。この肝類洞内皮細胞の有する免疫寛容誘導能がどのようなB細胞に対して効果があるのかを調べるために次の検討を行った。肝類洞内皮キメラマウスに対し放射線を照射し同系syngeneicの骨髄細胞を移入した群、および骨髄細胞と同時に脾細胞を移入したマウスを作成し同様の免疫実験を行った。すると骨髄移入群においては抗体産生は抑制されていたが脾細胞移入群では抗体が産生されていた。この結果より肝類洞内皮細胞は骨髄より新規に出現してくるB細胞を特異的に寛容化するが成熟B細胞に対してはその効果は弱いことが証明された。この肝類洞内皮細胞の寛容化メカニズムにはどのような分子が関与しているのかFas ligand KOマウスやantiPDL-1 monoclonalantibodyを用いたブロッキングの検討を行ったところ、肝類洞内皮細胞がアロ応答性T細胞を免疫寛容誘導するのに必要なFas/Fas ligand pathwayは必須ではなくPD一1/PDL-1pathwayが重要であることがわかった。今回の検討ではこのB細胞性免疫寛容に、血液型糖鎖抗原を発現した肝類同内皮細胞が重要な役割を果たしていることを世界で初めて明らかにした。
一酸化窒素合成酵素PETプローブの開発

本研究では、一酸化窒素合成酵素(NOS)のPETイメージングを目的として、その分子プローブ開発およびプローブ合成における標識反応の開発を行った。反応開発として、PET標識条件下における炭素-炭素結合、特に最も反応性の低いsp^3-sp^3カップリング反応を放射条件下において行うことに成功した。現在、所属研究室ではsp-sp^3、sp^2-sp^3カップリング反応を効率的に行うことができているが、sp^3-sp^3カップリング反応に成功したことにより、さらに多くの化合物への標識が可能となるものである。一酸化窒素(NO)は様々な生理機能を持っていることが明らかとなっている。主な役割として神経伝達物質、血圧調節因子、免疫応答分子としての役割がある。生体内でNOはアルギニンを基質として一酸化窒素合成酵素(nitric oxide synthase;NOS)により産生される分子である。しかしながら、生体内でのNOの量が過剰、あるいは不足などのNOSによる産生異常により様々な疾患をもたらすことも知られている。今回、申請者はNOの過剰産生による神経因性疼痛に着目し、従来は医師の経験に基づいて診察が行われていた「痛み」の定量化を目指したPET(陽電子画像診断法)プローブの開発を行うこととした。NOSには大きく分けて三種類のイソ酵素(nNOS、eNOS、iNOS)が存在する。神経因性疼痛を引き起こす際には、nNOSが亢進し、過剰のNOを産生することが考えられており、ターゲットとしてnNOSに高い親和性を持つ化合物を開発することとした。NOSに対する高い親和性を持つ化合物として、NOS阻害剤を基本骨格とした設計と合成を行い、酵素阻害活性の高い化合物を探索するための合成を行った。阻害剤にはいくつかの骨格が考えられるが、NOSはアルギニンを基質としてシトルリンとNOを産生する酵素であること、および、最終的な製剤の溶解性に着目し、基質類縁体であるアミノ酸骨格をプローブの基本構造とすることとした設計を行った。アミノ酸側鎖末端部にアミノピリジン環を配置し、脂溶性を高めることで生体内での動態の向上を目指すとともに、高速メチル化反応によりポジトロン放出核である11C核を、クロスカップリング反応を用いた高速メチル化反応により芳香環に導入することが可能な設計とした。本年度は、数種の阻害剤を合成中であり、酵素阻害活性の測定により、良好な活性を持つ化合物に対してプローブ前駆体であるスズ化合物、およびホウ素化合物の合成およびPETプローブ化を来年度以降行う予定である。一酸化窒素合成酵素(nitric oxide synthase;NOS)は生体内において、アルギニンを基質として様々な生理活性を示す一酸化窒素(NO)を産生する酵素である。NOSによるNOの過剰産生、あるいは不足など異常が起きた場合に様々な疾患を誘発する場合がある。その疾患の一例として、NOの過剰産生による痛みの伝達がある。申請者は痛みの度合いをPETにより定量化し痛みの程度を数値的に把握し診断に役立てることを目的とし、NOSの可視化を行うためにPETプローブの開発を行うこととした。本年度は昨年度に引き続きプローブ前駆体の合成および反応の検討を行った。PETプローブの構造としてはアミノ酸とヘテロ芳香環および高速メチル化に対応したピナコールボランを分子内に持つ化合物を設計した。設計したPETプローブ前駆体はパラジウム(Pd)を用いたクロスカップリング反応を用いて標識化を行うものであるが、分子内に窒素原子を持つ化合物では触媒のPdが配位するために反応の阻害が予測された。そのために、所属研究室でいくつかの条件検討を行うことにより高速化学反応に適応可能な条件を見出した。さらに、[^<11>C]ヨウ化メチルと芳香環等のsp^2-sp^3反応では標識可能な分子が限定されるために、さらなる応用を求め放射性条件下でsp^3-sp^3反応の検討も行った。反応収率は60%前後と従来型の高速化学メチル化と比較して高くはないものの、実際のPETプローブに適応可能な反応条件を見出し、実際の放射条件下での反応に成功した。これらの反応条件は、今後様々な高速化学反応において様々な基質に対して応用が可能と考えられ、PRTプローブ化の範囲を広げるものである。
水稲幼苗期耐冷性に関する変異の創成と耐冷性機構の生化学的解析

耐冷性評価の確立を目的に、これまで茎葉部の低温反応を指標とする耐冷性の評価を行ってきたが、本年度はこれに加えて、種子根の発育状態や冠根の発生程度など、根部の低温反応を指標とする耐冷性の評価を試みた。その結果、根部に示される耐冷性は、茎葉部に示される耐冷性と弱いながらも有意な相関を示し、初期の耐冷性イネの選抜は、観察容易な茎葉部の耐冷性について行えばよいと考えられた。また、根部においても茎葉部と同様、幼苗の発育ステージに伴う耐冷性発現の変化が認められた(日本育種学会第88回講演会において発表)。つぎに、茎葉部の耐冷性に基づいて、日本国内で育成されたジャポニカ型水稲70余品種の耐冷性を評価したところ、北海道地域および東北地域で育成された品種では、耐冷性が多様で極強の品種が多く認められたが、北陸以西の地域で育成された品種では多様性に乏しく、極強の品種はみられなかった(日本育種学会第89回講演会において発表予定)。また、mutator(突然変異誘発遺伝子)によって誘発された固定型突然変異80余系統の耐冷性を評価したところ、耐冷性に系統間差が認められ、mutatorを用いても耐冷性の強化が可能と考えられた。一方、耐冷性獲得機構の生化学的解析を進めるために、カラムクロマトグラフ、薄層クロマトグラフおよびガスクロマトグラフを用いて、少量試料(種子、根および葉)からリン脂質および糖脂質を抽出し、同定する方法を検討した結果、1グラム程度の試料があれば各脂質を構成する脂肪酸の分子種を明らかにし得ることが判明した。
教育実践経験への意味づけと教師としての成長－自伝的推論の観点から

「教育実践経験への意味づけと教師としての成長ー自伝的推論の観点から」という主課題のもと、平成30年度の研究計画に従い4つの柱で研究を進行させた。第一に、3050歳代の現職教員を対象に教育実践に関わる成功・失敗経験の想起を求め、自伝的推論尺度や自尊感情、教職アイデンティティ尺度への回答を求めた。第二に、本学の教育実習委員会の協力のもと、教育実習を終えた学部3年生に質問紙調査を行った。調査内容は第一のものと同じである。第三に、本学教職大学院を過去10年間に修了した者に質問紙調査を行い、研究への取り組みをどう意味づけているのか、どのような職能成長を実感しているかを検討した。十数名には面接調査も実施し、意味づけや職能成長の内容についてのナラティブデータを収集した。第四に、教職大学院2年次の院生3名の実践に際して参与観察を行い、授業参観、研究会参加、実践終了後の面接調査を通して、教員自身の学びや職能成長の様子を観察した。また院生だけでなく勤務校の校長にも面接を行い、職能成長について別の立場から評価を聞きとった。第一・第二の検討から、ネガティブ経験を重視する従来の知見とは異なり、成功も失敗も強く意味づけられていること、意味づけの程度と教員としてのアイデンティティとの間に関連があることが見出された。第三の検討から、教職大学院2年次には研究と勤務の両立というきわめて忙しい状況にありながら、研究を「ストレッチ経験」と捉えていること、この経験を通して職能成長を実感していることが見出された。第四の検討から、理論に基づく特定の手立てを授業に半年間継続して生かすことで、教員自身が学ぶこと、手立ての有効性が高まること、生徒の学びが深まることが見出された。教員自身が感じる職能成長は、管理職による評価とおおむね一致していた。前年度の報告書に記した「今後の研究の推進方略」通りに進捗している。学部実習生、3050歳代の現職教員、教職大学院在学生と修了者、さらに学校長という幅広い協力者を対象に、質問紙調査と面接調査を実施できた。2018年度までに、学部実習生、3050歳代の現職教員、教職大学院在学生・修了者、学校長という幅広い協力者を対象に、質問紙調査と面接調査を実施できた。そこから個別に得られた知見を整理するとともに、教職課程現職教員(若手)現職教員(ミドルリーダー)というキャリア発達の軸に沿って、成果を統合的に整理する。また、その際には、混合研究法の枠組みに基づき、量的データと質的データを関連付けた整理を行う。教育経験のリフレクションや教師の成長は、教師教育学で検討されているが、本研究は自伝的記憶・自伝的推論の観点から、教育実践経験に対する意味づけが教師の成長にどのようにつながるのかを検討する。29年度は研究計画に沿って、以下の研究を実施した。第一に、30代50代の教員を対象に、自伝的推論尺度を用いて、教育実践の成功・失敗経験の意味づけを問うとともに、適応やアイデンティティとの関連を検討した。その結果、成功も失敗も強く意味づけられること、最近の経験の場合は成功に対する意味づけが適応やアイデンティティと関連するが、過去の経験の場合は成功も失敗も適応・アイデンティティが関連すること等が見出された。また質問紙調査回答者の一部に半構造化面接を実施し、意味づけの内実を聴き取った。第二に、教育実習を終えた教育学部生に半構造化面接を実施し、実習中の成功・失敗経験の意味づけを検討した。教員志望の強弱にかかわらず、学生は実習中の経験を強く意味づけていた。またその意味づけは、自己像の確認や新たな自己の発見、経験を次に生かす指針、実習中の指導教員との関係維持など、自伝的記憶の自己機能・方向づけ機能・社会機能につながるものであった。一方で、自らの経験を十分に意味づけられない学生もおり、実習後の支援のあり方に示唆を与える知見が得られた。第三に、教員によるリフレクションの実態を捉えるために、教職大学院の修了者が在学中に取り組んだ実習の実習記録の内容分析を試みた。その結果、実習生個々人によって独自のテーマがあり、それが実習記録に「主題的一貫性」をもたらしているのではないかとの着想を得た。そこで修了生の一部に面接調査を実施し、その点を確認した。このように、29年度は若手からベテランまで様々な層の教員を対象に、教育実践の意味づけとその影響を、複数の手法で検討した。当初計画していた検討のうち、「自伝的推論尺度を用いて、成功・失敗への意味づけと適応への関連を探る」という事項は計画通りに進捗している。また経験からの時間経過の影響というあらたな知見も得られた。「面接調査」は複数校種の教員に実施し、成功・失敗について聴き取ることで、質問紙では十分に捉えられない意味づけの内実を知ることができた。さらに学部生の教育実習に関わる面接も行い、自伝的推論と自伝的記憶の3機能の関連について理論的にも意義深い知見を得ることができた。さらに「実習録の内容分析」という新たな手法を考え、実績に記したような一定の成果を得ることができた。このように、29年度は量的・質的という2方向の検討を行い、教育実践に対する意味づけとその影響を検討した。ただしいずれの検討もデータ数がやや不足しており30年度も継続が必要なこと、質的分析については分析手法の洗練が望まれることから、表記の通り判断した。「教育実践経験への意味

づけと教師としての成長ー自伝的推論の観点から」という主課題のもと、平成30年度の研究計画に従い4つの柱で研究を進行させた。第一に、3050歳代の現職教員を対象に教育実践に関わる成功・失敗経験の想起を求め、自伝的推論尺度や自尊感情、教職アイデンティティ尺度への回答を求めた。第二に、本学の教育実習委員会の協力のもと、教育実習を終えた学部3年生に質問紙調査を行った。調査内容は第一のものと同じである。第三に、本学教職大学院を過去10年間に修了した者に質問紙調査を行い、研究への取り組みをどう意味づけているのか、どのような職能成長を実感しているかを検討した。十数名には面接調査も実施し、意味づけや職能成長の内容についてのナラティブデータを収集した。第四に、教職大学院2年次の院生3名の実践に際して参与観察を行い、授業参観、研究会参加、実践終了後の面接調査を通して、教員自身の学びや職能成長の様子を観察した。また院生だけでなく勤務校の校長にも面接を行い、職能成長について別の立場から評価を聞きとった。第一・第二の検討から、ネガティブ経験を重視する従来の知見とは異なり、成功も失敗も強く意味づけられていること、意味づけの程度と教員としてのアイデンティティとの間に関連があることが見出された。第三の検討から、教職大学院2年次には研究と勤務の両立というきわめて忙しい状況にありながら、研究を「ストレッチ経験」と捉えていること、この経験を通して職能成長を実感していることが見出された。第四の検討から、理論に基づく特定の手立てを授業に半年間継続して生かすことで、教員自身が学ぶこと、手立ての有効性が高まること、生徒の学びが深まることが見出された。教員自身が感じる職能成長は、管理職による評価とおおむね一致していた。前年度の報告書に記した「今後の研究の推進方略」通りに進捗している。学部実習生、3050歳代の現職教員、教職大学院在学生と修了者、さらに学校長という幅広い協力者を対象に、質問紙調査と面接調査を実施できた。第一に、「自伝的推論尺度を用いて、成功・失敗への意味づけと適応への関連を探る」という事項については、29年度と同じ質問紙を用いて、データ数を増やし、29年度に得られた知見の信頼性を高めたい。第二に、「面接調査により実践経験の意味づけを探る」という事項についても、協力者を増やすとともに、自伝的推論・自伝的記憶の3機能・ライフストーリーにおける主題的一貫性など、理論的に関連する概念の統合的理解に向けてモデルを構築していく。その際に、実習録などのドキュメントも活用していく。第三に、「実践ーリフレクションー実践」のサイクルに参与することで、経験の意味づけとその影響をオンラインで検討していく。2018年度までに、学部実習生、3050歳代の現職教員、教職大学院在学生・修了者、学校長という幅広い協力者を対象に、質問紙調査と面接調査を実施できた。そこから個別に得られた知見を整理するとともに、教職課程現職教員(若手)現職教員(ミドルリーダー)というキャリア発達の軸に沿って、成果を統合的に整理する。また、その際には、混合研究法の枠組みに基づき、量的データと質的データを関連付けた整理を行う。音声データの文字化に必要と判断して200,000円を前倒し請求した。面接調査の総時間数が予想よりも短くなったために、42,130円の次年度使用額が発生した。
SNAREタンパク質の品質管理、膜挿入、膜融合の統合的理解

小胞輸送はホルモンや消化酵素の分泌、細胞増殖因子の取り込みなど種々の生命現象に極めて重要な役割を果たしている。全ての小胞輸送はSNAREタンパク質により規定されている。小胞おけるv-SNAREタンパク質とそのターゲット膜におけるt-SNAREタンパク質の量の違いにより、小胞融合速度が調節されている。私どもはSNAREタンパク質の膜挿入装置CAML複合体を発見している。そこで、膜挿入の調節機構を明らかにするために、CAMLに結合するタンパク質としてp47を発見した。さらに、SNAREモチーフを持たないSNAREタンパク質のひとつであるSec22Cの細胞内局在化機構を明らかにした。小胞輸送は神経伝達物質の放出のみならず、ホルモンや消化酵素、血漿タンパクの分泌、ホルモンや細胞増殖因子の取り込みなど種々の生命現象に極めて重要な役割を果たしている。全ての小胞輸送はテイルアンカー型タンパク質であるSNAREタンパク質により規定されている。これまで、私共は、SNAREタンパク質を小胞体膜に挿入する膜挿入装置CAML複合体を発見している。本年度は、CAML複合体について解析し、以下の結果を得た。1)CAMLの全長タンパク質を精製した。2)CAML複合体を構成するWRBの全長タンパク質を精製した。3)CAMLの全長タンパク質とWRBの全長タンパク質を人工リポソームに組込んだ。4)セミインタクト細胞を用いたSNAREタンパク質の膜挿入アッセイ系を開発した。これらのことから、CAML複合体の再構成系、新しいSNAREタンパク質の膜挿入アッセイ系の開発に成功した。このように本年度は、SNAREタンパク質の膜挿入機構について当初の計画とおりの成果をあげることができた小胞輸送は神経伝達物質の放出のみならず、ホルモンや消化酵素、血漿タンパク質の分泌、ホルモンや細胞増殖因子の取り込みなど種々の生命現象に極めて重要な役割を果たしている。すべての小胞輸送はテイルアンカー型タンパク質であるSNAREタンパク質により規定されている。本年度はCAML複合体の活性制御機構について解析し、以下の結果を得た。1)CAMLに結合する膜タンパク質p47を同定した。2)p47は小胞体に局在した。3)p47はC末膜貫通領域を介してCAMLと結合していた。4)p47はCAMLとWRBに競合的に結合した。これらのことから、p47が小胞体膜上に存在すると,p47はCAMLあるいはWRBと複合体を形成し,CAML複合体の形成を阻害すると考えられた。このように本年度はSNAREタンパク質の膜挿入制御機構について成果を挙げることができた。本年度は、昨年度同定したCAML結合タンパク質p47の性状解析を行い、以下の結果を得た。1)p47は精巣特異的に発現していた。2)p47は精巣の中でも精原細胞に強く発現していた。3)p47の過剰発現は膜挿入を抑制した。4)小胞体膜においてp47はfreeのCAMLと共局在したが、CAML複合体とは共局在しなかった。これらのことから、p47はCAML複合体の形成過程に関与しており、p47による膜挿入制御は精子形成に重要な働きをしている可能性が示唆された。本年度は、SNAREタンパク質の膜挿入機構について当初の計画とおりの成果をあげることができた。CAML結合タンパク質p47の性状解析が進み、精子形成と膜挿入制御の機能関係が示唆されたことから、おおむね順調に研究が進捗している。SNAREタンパク質の一つにSNAREモチーフを持たないC末端側に複数の膜貫通領域をもつ膜タンパク質Sec22Cがある。CAML複合体がSec22Cの膜挿入を行っているかは不明である。Sec22Cには膜貫通領域の数が異なるアイソフォームがある。そこで、本年度は、Sec22Cの膜貫通領域の数による細胞内局在を解析し、以下の結果を得た。1)1つあるいは2つの膜貫通領域を持つSec22Cは小胞体に局在し、4つの膜貫通領域を持つSec22Cはシスゴルジに局在した。2)4つの膜貫通領域のみでシスゴルジに局在した。3)4つの膜貫通領域に結合し、2つの膜貫通領域に結合しないタンパク質として、ARF4を同定した。4)ARF4をノックダウンすると、4つの膜貫通領域のシスゴルジへの局在が減少した。これらのことから、C末端側の膜貫通領域の数による膜タンパク質の細胞内局在化機構の存在を明らかにすることができた。このように本年度は、SNAREモチーフを持たないSNAREタンパク質の膜局在化機構について当初の計画とおりの成果をあげることができた。