hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
固定化複合酵素バイオリアクターによる高機能化光学活性医薬品の開発

膜型酵素バイオリアクターを用いた連続的配糖化による光学活性医薬品生産法を確立するため,テルペンおよびフラボノイドを基質として糖加水分解阻害による生産性向上の検討を実施した。1.各種のテルペン(ステロイド)化合物やフラボノイド類の酵素的グルコシル化前年度開発した膜型固定化酵素バイオリアクターを利用して,ニチニチソウ培養細胞由来のUDP-glucosyltransferase活性画分,可溶性画分,膜画分,膜結合型酵素画分,および,顆粒型酵素画分を固定化した後,それぞれの基質特異性を検討した結果,多種類にわたる芳香族化合物やフェノール性物質のグルコシル化を触媒することが確認された。さらに,ステロイドホルモンの一種であるテストステロン還元体の他に,標準反応条件下において,UDP-glucoseを糖供与体として,アンドロステノン還元体の効率的なグルコシル化も触媒し,対応するモノグルコシドを平均変換率40%以上で生成した。また,標準反応条件下において膜画分のUDP-glucosyltransferaseを用いた,植物色素である各種のフラボノイド類への位置選択的なグルコシル化も可能であった。しかし,カテキン,ペラゴニジン,コウジ酸,および,ポリフェノール等については,今回,設定した酵素反応条件下においては優位にグルコシル化されなかった。2.グルコシダーゼ活性の制御による生産性の向上膜型固定化酵素バイオリアクターによって生産されたモノグルコシドが,ニチニチソウ培養細胞由来の膜画分や可溶性画分に共存するbeta-グルコシダーゼにより加水分解されることが確認されたことから,モノグルコシドの反応混合液中での分解を防止することを目的として,beta-グルコシダーゼの基質であるイノシトールを添加して反応させることにより,添加しない場合に比べて約1.5倍増加させることが可能であった。固定化複合酵素バイオリアクターを構築するため、配糖化酵素を用いた膜型酵素バイオリアクターによる配糖体生産の条件検討、ならびに本酵素の酵素化学的性質の解明を実施した。1.酵素的配糖化反応の最適化と酵素化学的諸性質基質として2-ブタノールを用いた酵素的配糖化反応の反応条件を確立するため、50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)標準反応混合液中(1ml)に添加するUDPG量、酵素量、および反応時間について検討した。その結果、反応時間の経過とともに酵素的配糖化が進行し、10μmolブタノール、および70μmol UDPGを酵素画分0.01mgと共に、50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)中で37°C、24h振とう反応させた際、配糖体が最大20%の変換率で生成し、酵素的配糖化反応における最適反応条件であると考えられた。酵素化学的性質を解析するため、2-ブタノール、2-オクタノールおよびフェノール類のアグリコンに対する反応性を、UDPGを糖供与体として標準反応条件下(1ml)で検討した結果、1級水酸基について配糖化され、フェノール性水酸基に対する配糖化は確認されなかった。次に、2-ブタノールの配糖化反応における糖供与体を標準条件下で検索したところ、UDPGを糖供与体とした場合にのみ活性がみられ、TDPGやADPGからの糖転移反応はまったくみられなかった。2.膜型酵素バイオリアクターの構築2-ブタノール配糖体の効率的な酵素的生産方法を確立するため、配糖化酵素を固定化した膜型酵素バイオリアクターを構築した。限外ろ過膜を反応容器の底部に取り付けたslurry reactor内で、UDPGを糖供与体として、1回あたりの反応において標準反応混合液10mlを用いて配糖化反応に供したところ、平均変換率15%の配糖体生産が可能であった。
中枢性疼痛におけるグリア細胞を介した軸索再編成機構と血管新生機構の解明

現代社会においてガン性疼痛、糖尿病性神経障害性疼痛、脳卒中後疼痛など、未だにモルヒネも効かない痛み「神経障害性疼痛」で苦しむ患者は増える一方である。対して、痛みを引き起こす機構が不明のため、有効な治療法は確立されていない。例えば、脳卒中発症後に痺れ、末梢での痛みを引き起こす視床痛では、抗うつ薬などの内科的治療、電気刺激療法などの外科的治療が行われているが、症状が持続する症例も少なくなく、難治性疼痛として苦しんでいる患者も多い。本研究課題では、中枢系の唯一の免疫細胞であるミクログリアに焦点をあて、痛みを引き起こす分子機構の解明と治療法を確立することを目指した。脳卒中後のグリア細胞の役割に着目し、脳虚血モデルと脳出血モデルを用いてグリアの挙動と役割について研究を行った。過去の知見からうち立てた仮説、失われた回路を補うように新しく構築された回路、すなわち代償性の回路による間違った回路の形成が、長く続く疼痛を引き起こす事を示した。脳出血後に代償性回路が形成されると、体性感覚野の神経活動が異常に高い状態が維持され続け、軽微な刺激でも痛みとして感じてしまう。さらにRNA sequenceを用いて関連遺伝子を探索し、グリア細胞特異的に発現する遺伝子の欠損マウスにおいては、脳出血後も疼痛が発症しない可能性を示唆する結果を得た。しかし、当該遺伝子の詳細な働きについてはさらなる研究を必要としている。また、脳梗塞を模したモデル動物を用いることで、グリア細胞は活性化により炎症性のサイトカインを分泌し、マクロファージやT細胞の浸潤を引き起こし、炎症拡大を引き起こすことを見出した。さらに共同研究を行い、脳梗塞中、そして再灌流後のMRIを用いた継時的なイメージングにより、病態の進行とペナンブラの回復を可視化し、固定脳では得ることのできなかった知見を得るとともに、臨床治療への応用を念頭に研究を進めた。30年度が最終年度であるため、記入しない。未だにモルヒネも効かない痛み「神経障害性疼痛」で苦しむ患者は増える一方である。しかしながら、痛みを引き起こす詳細なメカニズムが不明のため、有効な治療法は確立されていない。例えば、脳卒中発症後に痺れ、末梢での痛みを引き起こす視床痛が知られている。抗うつ薬などの内科的治療、電気刺激療法などの外科的治療が行われているが、症状が持続する症例も少なくなく、難治性疼痛として苦しんでいる患者も多い。本研究課題では、中枢系の唯一の免疫細胞であるミクログリアに焦点をあて、痛みを引き起こす分子メカニズムの解明とその治療法を確立することを目指す。本年度は、目的とした視床出血モデルにおいて、数週にわたり痛みが発症する疼痛モデルを確立することができた。この視床出血モデルマウスに対し、ミクログリアの活性を経口投与による薬剤により抑えることで、疼痛の発症を抑えることに成功した。現在は、病態発症後もグリアの活性を抑えることで痛み発症を抑制できるのか、また痛み発症に繋がる分子メカニズムについて検討している。また、中大脳動脈の一過性の閉塞モデルを用いても、ミクログリアが炎症の拡大を引き起こし、結果的に病態が悪化してしまうが、ミクログリアを一過性に除去してやることで、病態の回復を早めることができた。さらに、梗塞のペナンブラと呼ばれる脳梗塞によりすぐに細胞死にいたるほどではないが、損傷を受けており、徐々に回復もしくは細胞死に至る部位に着目し、ミクログリアによる炎症拡大は特にペナンブラ部位にダメージを与え、細胞死に至らしめてしまうことを突き止めた。重要なのは、発症直後には未だ失われておらず、そのため、発症後であろうと積極的に治療介入を進めることで回復できるという点にある。今後は臨床応用を視野に、MRIのイメージングも行っていく予定である。脳卒中後のグリア細胞の役割に着目し、脳虚血モデルと脳出血モデルを用いてグリアの挙動とその役割について精力的に研究を行った。その結果、脳卒中発症初期においてグリア細胞は脳を守る役割を果たすが、結果的には炎症拡大を引き起こし、予後をより悪くしてしまうことを見出した。また、中枢性疼痛モデルの確立とグリア細胞の関与を見出した。さらに積極的に共同研究を行い、脳梗塞中、そして再灌流後のMRIを用いた継時的なイメージングにより、病態の進行と回復を可視化し、固定脳では得ることのできなかった知見を得るとともに、臨床治療への応用を念頭に研究を進めている。これらの得られた結果は、次年度国内外の学会で発表を予定しているとともに、現在論文としてまとめているところであり、期待以上の研究の進展があった。本年度は、昨年度に確立した視床出血後の神経障害性疼痛モデルマウスを用いて、疼痛発症のメカニズムを追求した。昨年度、経口投与によるミクログリアのCSF-1受容体阻害剤を用いることで、ミクログリアの除去と疼痛発症の抑制に成功し、疼痛発症にはミクログリアが関与していることを示した。そこで、視床出血後の体性感覚野において神経回路再編成が起こっているのではないか、そしてミクログリアの除去により再編成が起こらなくなるのではないかという仮説を検証するために、出血を起こした視床に隣接する部位にトレーサーを導入し、隣接部位に由来する神経細胞の軸索の可視化を行った。その結果、仮説の通り、出血により死んでしまった神経細胞の軸索を補うように、隣接する神経細胞の軸索より側枝が形成されること、またミクログリアの除去によりこの側枝形成が抑制されることを突き止めた。

続いて神経回路の変化により、神経活動の変化が起こっている脳部位を遺伝子発現の変化から特定した。以上の結果より、視床出血により失われた神経軸索を補うために、隣接する軸索から軸索側枝が形成され、体性感覚野内で間違ったループが出来てしまい、神経活動が常に高い状態が維持されていることがわかった。最終年度となる次年度は、神経活動を抑制することで痛み発症後でも疼痛抑制を行えるのか、また、ミクログリア由来の軸索側枝形成を促す分子について、RNA secの結果を解析し、明らかにしていく予定である。グリア細胞の挙動を制御することにより、脳卒中後の疼痛発症の抑制に成功した。また、疼痛発症が脳卒中により失われてしまった神経回路を補うように、隣接する神経細胞の軸索が側枝を形成し、この新しい神経回路により体性感覚野の一部の神経細胞の興奮状態が維持され続けてしまうループが形成されてしまうことを見出した。当初の実験計画に沿って順調に進展している。現代社会においてガン性疼痛、糖尿病性神経障害性疼痛、脳卒中後疼痛など、未だにモルヒネも効かない痛み「神経障害性疼痛」で苦しむ患者は増える一方である。対して、痛みを引き起こす機構が不明のため、有効な治療法は確立されていない。例えば、脳卒中発症後に痺れ、末梢での痛みを引き起こす視床痛では、抗うつ薬などの内科的治療、電気刺激療法などの外科的治療が行われているが、症状が持続する症例も少なくなく、難治性疼痛として苦しんでいる患者も多い。本研究課題では、中枢系の唯一の免疫細胞であるミクログリアに焦点をあて、痛みを引き起こす分子機構の解明と治療法を確立することを目指した。脳卒中後のグリア細胞の役割に着目し、脳虚血モデルと脳出血モデルを用いてグリアの挙動と役割について研究を行った。過去の知見からうち立てた仮説、失われた回路を補うように新しく構築された回路、すなわち代償性の回路による間違った回路の形成が、長く続く疼痛を引き起こす事を示した。脳出血後に代償性回路が形成されると、体性感覚野の神経活動が異常に高い状態が維持され続け、軽微な刺激でも痛みとして感じてしまう。さらにRNA sequenceを用いて関連遺伝子を探索し、グリア細胞特異的に発現する遺伝子の欠損マウスにおいては、脳出血後も疼痛が発症しない可能性を示唆する結果を得た。しかし、当該遺伝子の詳細な働きについてはさらなる研究を必要としている。また、脳梗塞を模したモデル動物を用いることで、グリア細胞は活性化により炎症性のサイトカインを分泌し、マクロファージやT細胞の浸潤を引き起こし、炎症拡大を引き起こすことを見出した。さらに共同研究を行い、脳梗塞中、そして再灌流後のMRIを用いた継時的なイメージングにより、病態の進行とペナンブラの回復を可視化し、固定脳では得ることのできなかった知見を得るとともに、臨床治療への応用を念頭に研究を進めた。RNA arrayなどを用いてミクログリアを介した病態変化に寄与する分子のスクリーニングをおこない、とれてきた因子の疼痛発症の抑制、炎症抑制効果を検証を行う。これまでは、脳卒中発症以前にグリア細胞を減らす操作を行っておくことで、疼痛発症自体を抑制してきたが、より現実の状態を反映し、疼痛発症確認後に痛みを抑制する機構を解明し、創薬へとつなげていきたい。
生物時計の圧力応答研究

概日周期は、細胞や個体で見られ、細胞分裂、行動や睡眠など重要な生命活動を制御している。本研究では、シアノバクテリアおよびヒトの概日時計の圧力応答について研究し、概日周期(システム、個体)と周期長を制御する酵素活性(分子)に圧力補償性(耐性)があるのかを解明する。幅広い圧力・温度範囲での周期長、酵素活性の測定を行い、周期長-酵素活性相関を検証する。また、耐圧製の発光観測装置を作製し、シアノバクテリア個体内(in vivo)での周期長観測を行う。細胞の概日周期を圧力や温度により制御できれば、新しい科学技術の創出につながる概日周期は、細胞や個体で見られ、細胞分裂、行動や睡眠など重要な生命活動を制御している。細胞の概日周期を圧力や温度により制御できれば、新しい科学技術の創出につながる
選択的3'末端プロセシングによる長鎖非コードRNAの機能獲得機構の解明

NEAT1 lncRNAの選択的3'末端プロセシングがどのように発動・制御されてRNA機能の多様性が生み出されているのかを明らかにするために、NEAT1の選択的3'末端プロセシング制御因子であるHNRNPKに着目し、それと相互作用し、プロセシング制御機能を調節する因子を複数発見した。また、NEAT1 lncRNAの選択的3'末端プロセシングが、MAPキナーゼ経路の1種であるJNK経路によって調節されている可能性が示された。本研究計画は、長鎖非コードRNA(lncRNA )機能の多様性を生み出す仕組みである選択的3'末端プロセシングが、どのように発動・制御されているのかを明らかにし、lncRNAの機能獲得機構を解明することを目的としている。本計画では特にNEAT1という細胞内構造体構築機能を持つlncRNAの選択的3'末端プロセシングによる機能獲得機構を13'末端プロセシング因子の翻訳後修飾、2シグナル応答、3転写と共役した制御に注目し、それらの未解決な問題点を明らかにしていくことで本研究目的を達成しようとしている。今年度は、NEAT1 lncRNAの選択的3'末端プロセシングの制御因子であるHNRNPKの機能を制御するような翻訳後修飾や相互作用因子の探索を試みた。HNRNPKは、リン酸化、アセチル化、アルギニンメチル化、ユビキチン化、SUMO化など多様な翻訳後修飾を受けることが知られており、その修飾酵素が明らかになっているものもある。そこで、HNRNPKの既知のリン酸化、アセチル化、アルギニンメチル化、ユビキチン化、SUMO化の付加酵素および脱修飾酵素の情報を利用し、それらとNEAT1 lncRNAとの共局在およびHNRNPKとの結合、RNAiノックダウンによる機能阻害を行った時のNEAT1アイソフォーム生成の変化を調査した。その結果、タンパク質アルギニンメチル化酵素の1つであるPRMT1が、NEAT1 lncRNAと一部共局在することが明らかになった。また、PRMT1をRNAiによりノックダウンするとNEAT1ロングアイソフォームの生成が減少した。これらのことから、PRMT1がHNRNPKの機能を正に調節する因子であると考えられるとともに、HNRNPKのアルギニンメチル化は、NEAT1ロングアイソフォーム生成に重要な役割を担う修飾であることが示唆された(長沼、未発表データ)。本研究はNEAT1 lncRNAの選択的3'末端プロセシングが、どのように発動・制御されてRNA機能の多様性が生み出されているのかを明らかにし、lncRNAの機能獲得機構を解明することを目的としている。本研究では、NEAT1の選択的3'末端プロセシング制御因子であるHNRNPKのプロセシング制御機能が、どのように調節されているのかを明らかにする。また、NEAT1の選択的3'末端プロセシングを変化させるような生理条件やシグナル伝達経路を明らかにする。平成26年度は、HNRNPKのプロセシング制御機能調節因子を新たに探索していくなかで見出したUSP10という脱ユビキチン化酵素活性を有するタンパク質に着目し、HNRNPKのプロセシング制御機能への役割を検討した。まずHNRNPKの特異抗体を用いて免疫沈降実験を行ったところ、USP10が共沈降してくることが確認された。また、USP10の特異抗体を用いた免疫沈降によりHNRNPKの共沈降が確認された。次に免疫蛍光染色によりUSP10の局在を確認したところ、パラスペックルと部分的に共局在することが明らかになった。USP10とNEAT1の相互作用を検証するためにFLAGタグ融合USP10を発現させた細胞から抗FLAGタグ抗体を用いてRNA免疫沈降を行ったところ、NEAT1の共沈降が確認された。さらに、USP10とHNRNPKとの相互作用にRNAが仲介する可能性を検証するためにFLAGタグ融合HNRNPKを発現させた細胞から抗FLAGタグ抗体を用いてRNase A存在下で免疫沈降を行ったところ、RNase A処理により相互作用が弱まることが明らかになった。今後は、USP10がHNRNPKのプロセシング制御機能を調節する分子機構を明らかにしていく。また、HNRNPK、USP10、NEAT1の3者間の相互作用の機能的意義を明らかにしていく。分子生物学今年度は、申請者の研究実施場所の移転(産業技術総合研究所から筑波大学)に伴い、研究環境のセットアップ等に時間を費やしたため、しばらく実験が停止したこともあり、やや遅れ気味である。現所属先がユビキチン化修飾の研究室である強みを生かし、HNRNPKに結合し、そのNEAT1 lncRNAの選択的3'末端プロセシングへの機能を制御するようなユビキチン化酵素や脱ユビキチン化酵素の探索を中心に行っていく予定である。現在、予備的な実験ながらHNRNPKと相互作用する脱ユビキチン化酵素の候補を得てきている。
変分原理に基づいた界面張力の概念の普遍化と測定への応用

平衡状態にある系においては界面張力の概念は確立しており、それを基盤として現象を変分問題として数学的に定式化できる。しかしながら、界面張力に空間的な勾配や空間的な不均一がある系に関しては、まだ確定的な知見がない。そのため、界面張力が異方的な液滴系、基板との接触面と自由表面とで界面張力が異なるような楔形基板に挟まれた液滴、表面で界面活性剤が移動することにより変形する界面、などについて、モデルを構築しその数理的解析や数値計算をすることにより研究を進めた。本研究においては、界面張力に空間的な勾配がある液滴系について、物理学の立場と数学の立場から運動と変形をどのように記述できるかにアプローチすることを目的とする。特に物理学の立場からは、流体力学の立場で考え、界面張力勾配は界面におけるストレスとしてとらえることで議論ができる。そこで、本年度は、界面張力勾配のある非圧縮液体の液滴を考え、その界面に界面張力勾配がある場合についての考察を行った。具体的な実験系としては、Belousov-Zhabotinsky反応の液滴系がある。この系において、自発的に化学波が発生することで界面に界面張力勾配ができ、運動することをこれまでに報告した。その発展として、本年度は、理論的に予測されている液滴内部でのマランゴニ対流を可視化し、液滴の運動の向きの変化とともにその対流の向きが変わることを見出し、報告した。さらに、理論的に、マランゴニ対流のために起こるエネルギー散逸が、界面でのストレスにより得られる仕事とバランスすることも導いた。また、界面張力の測定法として知られている懸滴法に関して、微分幾何学で得られる知識を用い、液滴形状を考察することで精度を上げることができると考えている。そのための予備段階として、測定した液滴形状から液滴の母線の長さを精度よく測定するための方法についての考察が必要であることが明らかになった。そこで、物体の周長を精度よく測定するための画像処理方法についての考察を行った。具体的には、画像処理において、物体の内部の最近接点からの距離が一定値以内である領域の面積を求めることで、精度よく周長が測定できるのではないかと考え、実装し検証した。本研究においては、界面張力に空間的な勾配があるような系について、物理学と数学の立場両方からアプローチすることを目的として進めている。27年度においては、界面張力勾配がある液滴についての液滴の安定な形状に関する理論的、実験的研究を行うこと、そして、微分幾何学を用いて、液滴形状から表面張力を決定する方法に関する理論的研究を行うことを予定し、それに沿って研究を行った。それにより、以下にあげる研究成果が得られた。(1)界面張力差により自発的に運動する液滴に関して、界面張力や重力エネルギーを考慮して、液滴形状の汎関数として自由エネルギーを考え、その自由エネルギーを減らす方向に動くという解釈のもと、液滴の運動を記述するモデルを考案した。一般的に数理モデルで液滴の融合や分裂を記述するのは困難であるが、界面をうまく扱うことにより、液滴が分裂、融合する現象も再現することができた。本結果は、論文として執筆し、国際誌に投稿、採択された。(2)基板に張り付いた液滴の安定な形状について変分原理の立場から理論的な研究を行った。具体的には、楔形の基盤を考え、その基板に任意の接触角で濡れる液体を考えその液体の安定形状を変分原理をもとに考察した。その結果、濡れ性および楔の開き角によって安定な形状が異なることが明らかとなった。現在その結果を論文として執筆している。また、そこから得られた知見を懸滴法に応用に重力エネルギーも考慮した変分原理に応用する予定である。界面張力勾配を持つ液滴の運動に関する研究は順調に進んでおり、論文としても発表しており、予想以上に進捗した。一方、液滴を構成するえきたいの界面張力を測定するための懸滴法の改良に関する研究については、その基礎となる楔形形状の基板上の液滴の形状に関する研究は進んだが応用へと結びつけるところは、少し遅れ気味である。そのような意味で、トータルにみるとおおむね順調に進展していると言える。本研究においては、界面張力により規定される物理現象について、微分幾何学を用いた変分原理による数学的定式化と界面現象に関する物理的知見を統一的に理解すること、そして、それを応用へとつなげることを目標とした。微分幾何学を専門とする研究分担者の小磯教授と非線形物理学を専門とする研究代表者の北畑が分野間協働を行うことにより研究を進めてきた。その結果、次に示すような成果が得られた。(1)27年度に引き続き、楔形に配置された2枚の基板の間に挟まれた液滴の形状に関する議論を進めた。27年度までにほぼ議論の枠組みは完成していたが、厳密な安定性条件について議論を深めた。具体的には、楔形の開き角と液体と基板との濡れ角をパラメータとして楔に沿った液滴の安定性を議論した。その結果、液滴が安定に存在できる必要十分条件を変分原理から決定することができた。たとえば、楔の間に凹形状で満たされる液体は、その表面が円筒面の一部となり、常に安定であることを示した。現在、得られた内容を論文として執筆中である。(2)基板上にある液滴の形状を実験的に測定することを目指した系の構築を試みた。

具体的には、液滴を作る液体の屈折率の違いを用いて、格子状の模様がどのように歪んで見えるかを測定することによって、液滴の形状を計算した。その結果、平衡形状では、理論的に予想される形状であることが明らかになった。また、基板を傾け重力によって滑り落ちる液滴の形状を計算し、形状を簡単な近似式で近似することにより、その形状の特徴を記述することができた。平衡状態にある系においては界面張力の概念は確立しており、それを基盤として現象を変分問題として数学的に定式化できる。しかしながら、界面張力に空間的な勾配や空間的な不均一がある系に関しては、まだ確定的な知見がない。そのため、界面張力が異方的な液滴系、基板との接触面と自由表面とで界面張力が異なるような楔形基板に挟まれた液滴、表面で界面活性剤が移動することにより変形する界面、などについて、モデルを構築しその数理的解析や数値計算をすることにより研究を進めた。液滴の界面において界面張力勾配があるときに引き起こされるマランゴニ対流に関して、実験的に可視化することができた。また、その際のエネルギーの流れに着目した議論を行い、界面張力がする仕事と、マランゴニ対流によるエネルギー散逸がつり合っていることを明らかにした。この内容は、査読付き国際誌に投稿し、採択され、予定以上に進展しているといえる。一方で、分担者である小磯との共同研究については、議論の時間を十分にとれなかったため、十分に進んでいるとは言えない。そのため、全体とすればおおむね順調な進み具合であると考えられる。おおむね順調に進捗しているので、多少遅れ気味である懸滴法の改良に関して、研究分担者である小磯氏とともにより積極的に共同研究を進めていきたいと考えている。具体的には、液滴形状と界面張力の関係について微分幾何学と物理学の立場から考え、現在進めている楔状基板上の液滴の形状についての研究をまとめた後、懸滴法での液滴形状の記述について研究したいと考えている。非線形物理学実質、研究が後期から始まったこともあり、分担者である小磯としっかりと議論をし共同研究を進める時間はあまりとれなかった。本課題のメインテーマは、代表者である北畑が物理学の立場から、分担者である小磯が数学の立場から、界面張力勾配のある液滴の形状や運動の決定の原理に迫り、かつそこで得られた知見を界面張力測定法の開発に生かすところであるため、代表者・分担者間のコミュニケーションをしっかりと図り、共同研究を進め、論文などの成果として発表していく予定である。数値計算のための計算機の購入や、小磯氏との共同研究のための旅費による支出を考えていたが、既存の計算機で十分計算できたこと、ほかの出張との連続で小磯教授と議論する機会が何度か得られたことから、予定よりも使用する金額が少なくなった。液滴内部での対流の可視化のための実験に、可視化粒子を購入し、画像処理が可能な動画が撮影できるかを試す必要があったが、初期段階で購入した粒子で可視化が可能であったので、購入費用が当初よりも少なく済んだ。また、代表者、分担者の予定があわず、研究打ち合わせの日程をとれなかったために旅費が予定よりも少なくなった。ほぼ予定通り計画が進んでいる。分担者である小磯氏との共同研究を推進したいため、共同研究のための出張の旅費に充てる予定である。代表者である北畑と分担者である小磯が頻繁に議論することが共同研究の進展のために必要であるため、共同研究打ち合わせのための旅費として使用する予定である。
グルカゴンシグナルを指標とした食餌性亜硝酸塩による抗糖尿病効果の解明

空腹時血糖値の制御には、膵臓α細胞から分泌されるグルカゴンが引き起こす糖新生が重要な役割を果たしている。我々はこれまでに、亜硝酸塩を経口投与したラットの空腹時血糖値が低下することを示してきたが、その詳細なメカニズムは未だ不明である。そこで本研究では、亜硝酸塩による空腹時血糖値低下のメカニズムを解明することを目的として、亜硝酸塩による膵臓α細胞からのグルカゴン分泌と肝臓での糖新生に注目して検討を行った。マウス膵臓α細胞由来のα-TC細胞において、亜硝酸塩の刺激によりグルカゴン分泌が減少することを見出していたが、続いて亜硝酸塩よるグルカゴン分泌減少のメカニズムを解明するため、本年度は糖脂質代謝における重要なエネルギーセンサーであるAMPK ( 5'AMP-activated protein kinase )に注目して検討を行った。AICAR及びmetformin ( AMPK活性化剤)の刺激によってグルカゴン分泌が減少することを明らかにした。また、亜硝酸塩の刺激によりAMPKのリン酸化の亢進を認めた。さらに、亜硝酸塩の刺激によるグルカゴン分泌の減少とAMPKのリン酸化の亢進はCompound C ( AMPK阻害剤)により阻害された。一方、肝臓においてAMPKが活性化することにより糖新生のような同化作用は抑制されるため、ラット肝実質細胞由来のFao細胞においてもAMPKに注目して検討を行った。亜硝酸塩刺激によりAMPKのリン酸化の亢進が認められた。また、亜硝酸塩の刺激により糖新生が抑制され、この作用はCompound Cにより阻害されることを見出した。前年度は、αーTC細胞からのグルカゴン分泌に対する亜硝酸塩の濃度依存性・時間依存性を検討し、亜硝酸塩によってグルカゴン分泌が抑制されること、また、その作用にAMPKが関与することを明らかにした。またFaO細胞にグルカゴンで刺激した時のグルコース分泌が亜硝酸塩で阻害される所までを明らかにしていた。今年度はこれらの点を更に解明するため、α-TC細胞にAMPK刺激剤であるAICAR及びmetforminを添加し、グルカゴン分泌に与える影響を検討し、AMPKの関与を明確にした。またFaO細胞における亜硝酸による糖新生もはAMPK阻害剤で抑制されることを明らかにし、亜硝酸塩による抗糖尿病効果における、細胞内メカニズムの解明をさらに進めることができた。これまで、αTC細胞に対する亜硝酸塩の効果を検討してきたが、今後は亜硝酸塩による抗糖尿病効果について、早急に動物実験に着手し、これまでに解明した細胞内メカニズムのin vivoでの実証を行うことにしている。また、硝酸塩による膵臓α細胞の形態に与える影響についても検討したい。さらには、膵臓以外の臓器に対する亜硝酸塩の効果についても展開を図り、亜硝酸塩の糖脂質代謝に対する生理作用に関する研究を発展させていきたい。具体的には、脂肪細胞ではグルカゴンによってリパーゼが活性化し脂肪分解が促進され、遊離脂肪酸が放出されることから、脂肪細胞からの遊離脂肪酸放出に対する亜硝酸塩の影響についても検討していきたい。食餌性亜硝酸による生理的役割解明研究において、これまでの動物実験の結果から、亜硝酸塩を含んだ飲水をマウスに長期間与えることにより、空腹時血糖値が低下することが明らかになった。

空腹時血糖をコントロールしている主要な因子としてグルカゴンが挙げられることから,亜硝酸がグルカゴンの作用を抑制、もしくはグルカゴンの分泌を抑制していることが考えられたことから、両者の関連について検討した。培養膵α細胞であるαTCに亜硝酸塩を添加したところ、濃度依存的なグルカゴン分泌の低下が確認された。さらに、AMPKのリン酸化が亜硝酸塩の添加で観察され、濃度・時間依存的であった。AMPK阻害剤であるBML275共存ではグルカゴンの分泌養成がキャンセルされたことから、グルカゴン分泌にはAMPKの関与が示唆された。一方、グルカゴンによる血糖上昇は肝細胞からの糖新生によって起きることから、培養肝細胞にグルカゴンを添加したときの培養上清へのglucose分泌に対する、亜硝酸塩の作用を検討した。ヒト培養肝細胞であるFaO細胞にグルカゴンを添加したところ培養上清へのglucoseの分泌が見られ、ここに亜硝酸を10μM加えておくと、グルカゴンによるglucose分泌は亜硝酸塩の作用時間に応じ、長時間(6時間)作用させた場合ではglucoseの分泌低下、短時間(2時間)の刺激では逆にlucoseの分泌を促進した。以上の結果から、亜硝酸塩にはグルカゴンによる糖分泌に2相性に作用することが考えられた。平成28年度はαTC細胞を用い、AMPK経路、および培養上清へのグルカゴン分泌を特殊なグルカゴン測定キットを用いて測定することにしており、それらの実験を計画通り進めることが出来た。一方で、siRNAを使った実験は未実施であったが、その代わりにヒト培養肝細胞を用い、グルカゴンによる糖新生に与える効果を確認した。以上の結果より、一部の遅れはあるが、一方で計画以上の結果も得られたことから、進捗状況を上記と判断した。これまで、αTC細胞に対する亜硝酸塩の効果を検討してきたが、今後は亜硝酸塩による抗糖尿病効果について、早急に動物実験に着手し、これまでに解明した細胞内メカニズムのin vivoでの実証を行うことにしている。また、硝酸塩による膵臓α細胞の形態に与える影響についても検討したい。さらには、膵臓以外の臓器に対する亜硝酸塩の効果についても展開を図り、亜硝酸塩の糖脂質代謝に対する生理作用に関する研究を発展させていきたい。具体的には、脂肪細胞ではグルカゴンによってリパーゼが活性化し脂肪分解が促進され、遊離脂肪酸が放出されることから、脂肪細胞からの遊離脂肪酸放出に対する亜硝酸塩の影響についても検討していきたい。平成29年度は、実験動物を用いた組織学的検討、および血中インスリン濃度、グルカゴン濃度と食餌中亜硝酸塩濃度との関連について検討を行う。具体的には、Wistar系雄性ラットおよびddy系雄性マウスに高脂肪食を与え、更に亜硝酸塩を飲水に100mg/L添加して3週間飼育し、血中インスリン濃度、グルカゴン濃度と食餌中亜硝酸塩濃度のほか、膵臓の免疫組織学的検討を行う。さらには、全身および膵臓の酸化ストレスマーカー(4HNE,8-OHdG)の変化も検討する。
ヒトの把持運動計画における最適化規範と対象物の脳内表現に関する計算論的研究

ヒトのTripod Graspタスクにおける力分配と手姿勢決定の計算原理を調べるために,力センサの取り付け位置を自由に選択できる円形,正三角形,正方形,水滴形の把持対象物を設計・製作し,様々な把持位置拘束における指先力と手姿勢を計測できる計測システムを構築した.この実験システムを用い,身体からの向きが異なる条件におけるヒトの指先力,手姿勢,把持位置を計測した.その結果,すべての被験者においてこれらの運動情報は対象物の向きに関する情報を含んでいた.視覚情報と複数の運動情報を統合する5層の神経回路モデルを構築し,実験データを学習させたところ,その第3層は対象物の向きに関する情報と把持戦略に関する情報を内部表現として獲得していた.さらに,学習後のネットワークは対象物の視覚情報のみが入力されたときに,単純な力学的・幾何学的な制約条件を満たすように運動戦略に対する表現を選択することで,その対象物に対する複数の運動情報を同時に計算することができた.このことは指先力に関しては,その分配に関する情報を評価関数のパラメータとして与えなくとも分配問題を解く能力が神経回路モデルに備わっていたことを示し,学習過程では一種の逆最適化問題を学習していたことを示している.これらの結果はヒトのTripod Graspにおいても視覚情報と運動情報を統合することで対象物の特徴と運動戦略に関する脳内表現が獲得され,その内部表現に基づいて視覚-運動変換が行われることを計算論的な証拠となる.さらに,指先力と手姿勢の決定問題は独立に解かれるのではなく,関連しながら同時に解かれることを示唆する重要な証拠となる.また,新奇対象物に対する運動計画は既知対象物の内部表現を利用して遂行されるという仮説を検証するために心理物理実験を行った.実験では,新奇対象物を水滴形の対象物,既知対象物を正三角形,円形,四角形の対象物とし,既知対象物の学習状態の違いによる新奇対象物に対する運動計画の違いを調べた.その結果,新奇対象物に含まれる2つの特徴である正三角形と円形を学習した被験者において新奇物体に対する運動計画が最も良く,新奇対象物の特徴を全く含まない四角形のみを学習した被験者は運動計画が最も悪かった,円形か正三角形のどちらか一方を学習した被験者は中程度の運動計画の良さを示したが,学習していない特徴の部分でうまく計画できていなかった.これらの結果は,内部表現が獲得されていない新奇対象物への運動計画は既知対象物の内部表現を組合せることで達成されることを示唆する.ヒトの把持運動における計算問題である,把持位置の決定,指先力の決定,手形状の決定の関係を調べるための実験システムを構築した.設計・作製したひずみゲージ式小型3軸力センサの精度は負荷力の5%未満に押さえることができ,把持運動における指先力計測に十分なものであった.心理物理実験では,拇指,示指,中指による物体保持タスクにおける指先力を計測した.その結果,被験者が自然に選んだ把持位置において総把持力が最も小さくなり,その把持位置から遠ざかるにつれて総把持力が大きくなることがわかった.また,拇指と対向する示指と中指の位置が物体の質量中心に対して対称である把持位置においてもその分配が等しくならないことがわかった.この力分配に関する結果を再現するために手形状の特徴を考慮した最適化モデルを定式化し計算機シミュレーションを行った.評価関数や拘束条件に力分配の情報を直接含んでいないにも拘らず,そのモデルは物体表面に対して法線方向の指先力だけではなく,鉛直方向の指先力もよく再現した.これまでに鉛直方向の指先力を再現した最適化モデルは報告されておらず,この手形状の特徴を含めた力分配の最適化モデルは有力なモデルとなると確信する.さらに,最適化モデルにおける評価関数の重み係数を実験データに基づいて逆最適化計算によって解く手法を提案した.試行錯誤的に決定する方法とは異なり,この方法によって計算された重み係数は被験者の戦略を説明する上で十分な信頼性を持つ.この研究成果は2003年6月に開催される国際会議ICANN/ICONIP 2003において発表される.ヒトの把持運動における計算問題である指先力決定および手姿勢決定は脳内に獲得された把持対象物の内部表現に基づいて相互に関連して解かれているという仮説の妥当性を検証した.心理物理実験では,3軸力センサ,CyberGlove, FASTRAKを組合せ,拇指,示指,中指による物体保持タスクにおける指先力,把持位置,手姿勢を同時に計測できる装置を構築し,それぞれの関係を調べた.その結果,手姿勢と指先力は密接に関係しており,その関係には手指の筋骨格構造の違いに起因する個人差が見られた.また,被験者は実際に指先力と手姿勢の多くの組合せで保持タスクを遂行できたが,自然な保持タスクにおいてはある特定の組合せを選択した.シミュレーションでは,被験者の運動生成の戦略を説明するために,与えられた手姿勢に対して最適な指先力を計算するモジュールと与えられた指先力に対して最適な手姿勢を計算するモジュールから成る最適化モデルを構築した.前者のモジュールは心理物理実験における自然な保持タスク以外のタスクから得られた指先力と手姿勢の統計的な関係を目的関数に持ち,後者は各指関節トルクを最小にする戦略を採り,相互に入出力情報をやり取りすることで互いが拘束条件となる.このモデルは自然な保持タスクに関する情報を持っていないにもかかわらず,自然な保持タスクと同様な指先力と手姿勢を出力した.

この結果から対象物の内部表現が物体と運動情報のステレオタイプなマッチングを表現しているのではなく,運動情報をある目的関数に基づいて計算するための感覚運動変換を表現していることを示唆する.これまでに指先力と手姿勢の相互作用を考慮して,そのどちらも再現した最適化モデルは報告されておらず,このモデルはこの分野において有力なモデルとなると確信する.この研究成果は2003年6月の国際会議ICANN/ICONIP 2003,10月の生体・生理工学シンポジウム,2004年3月のニューロコンピューティング研究会において発表された.ヒトのTripod Graspタスクにおける力分配と手姿勢決定の計算原理を調べるために,力センサの取り付け位置を自由に選択できる円形,正三角形,正方形,水滴形の把持対象物を設計・製作し,様々な把持位置拘束における指先力と手姿勢を計測できる計測システムを構築した.この実験システムを用い,身体からの向きが異なる条件におけるヒトの指先力,手姿勢,把持位置を計測した.その結果,すべての被験者においてこれらの運動情報は対象物の向きに関する情報を含んでいた.視覚情報と複数の運動情報を統合する5層の神経回路モデルを構築し,実験データを学習させたところ,その第3層は対象物の向きに関する情報と把持戦略に関する情報を内部表現として獲得していた.さらに,学習後のネットワークは対象物の視覚情報のみが入力されたときに,単純な力学的・幾何学的な制約条件を満たすように運動戦略に対する表現を選択することで,その対象物に対する複数の運動情報を同時に計算することができた.このことは指先力に関しては,その分配に関する情報を評価関数のパラメータとして与えなくとも分配問題を解く能力が神経回路モデルに備わっていたことを示し,学習過程では一種の逆最適化問題を学習していたことを示している.これらの結果はヒトのTripod Graspにおいても視覚情報と運動情報を統合することで対象物の特徴と運動戦略に関する脳内表現が獲得され,その内部表現に基づいて視覚-運動変換が行われることを計算論的な証拠となる.さらに,指先力と手姿勢の決定問題は独立に解かれるのではなく,関連しながら同時に解かれることを示唆する重要な証拠となる.また,新奇対象物に対する運動計画は既知対象物の内部表現を利用して遂行されるという仮説を検証するために心理物理実験を行った.実験では,新奇対象物を水滴形の対象物,既知対象物を正三角形,円形,四角形の対象物とし,既知対象物の学習状態の違いによる新奇対象物に対する運動計画の違いを調べた.その結果,新奇対象物に含まれる2つの特徴である正三角形と円形を学習した被験者において新奇物体に対する運動計画が最も良く,新奇対象物の特徴を全く含まない四角形のみを学習した被験者は運動計画が最も悪かった,円形か正三角形のどちらか一方を学習した被験者は中程度の運動計画の良さを示したが,学習していない特徴の部分でうまく計画できていなかった.これらの結果は,内部表現が獲得されていない新奇対象物への運動計画は既知対象物の内部表現を組合せることで達成されることを示唆する.
低酸素環境が拓く細菌感染―宿主応答機構の新機軸

ヒトを含むほぼ全ての多細胞生物は、酸素を失えば生命を維持できない。その一方で生体内の酸素分圧は末梢に向かって低下し、さらに生理的環境要因(歯肉溝や大腸管腔など)や疾患(感染症やがんなど)によって定常的にあるいは一過性の低酸素状態(hypoxic condition, hypoxia)になっている。細菌の中には低酸素環境でのみ増殖できる菌(嫌気性菌や微好気性菌)がいるが、こういった細菌の感染を調べる実験系にそういった低酸素環境が考慮されていなかった。そこで本研究では嫌気性および微好気性菌に焦点を絞り、新たに見出された低酸素環境における細菌感染と宿主の応答機構を解明する。
薬理ゲノミクスを基軸とした突発性味覚障害発症の分子基盤の解明

突発性味覚障害は、「味がしない、いつも苦い」などの症状を示し、生活の質だけでなく栄養状態も著しく低下させる。しかし、その発症機序はほとんど不明なため、治療法は亜鉛投与などの対処療法しかない。近年我々は、昇圧ホルモン・アンジオテンシンIIが塩味を抑制することを明らかにし、これが降圧剤による薬剤性味覚障害の原因である可能性に気づいた。そこで本研究では、逆の発想で、様々な薬剤の薬理作用と新3次元幹細胞組織培養法“味蕾オルガノイド"を切り口として原因分子を探索し、その遺伝子欠損マウスを解析することで味覚障害発症の分子基盤の解明を試みる。本研究により味覚障害の新たな予防・診断・治療法の開発が期待される。
造血幹細胞移植におけるガンシクロビル誘導型骨髄抑制のリスク因子の探索

1.研究の目的本研究は、骨髄移植(BMT)、臍帯血移植(CBT)および末梢血移植(PBSCT)の3種類の移植を対象として、造血幹細胞移植時のガンシクロビル(GCV)投与に際して白血球減少、好中球減少および血小板減少の発現が移植治療の種類によって違いがあるか否かの検証、また、血球減少のリスク因子の解明を目的とした。2.研究の方法当院の診療録情報を用いて2010年1月から2016年12月の間に造血幹細胞移植を行い、その後1年以内にGCVを7日間以上投与した患者を抽出した。GCVの投与前と投与期間中の白血球数(WBC)、好中球数(Neu)、血小板数(PLT)を比較し、悪化の見られた患者の割合を移植群ごとに算出した。評価の方法はCTCAE4.0に従った。統計解析にはJMP12.2を用いた。3.研究の成果BMT群(21例)、CBT群(21例)およびPBSCT群(14例)におけるWBCのグレード3、4への悪化の割合はそれぞれ42.9%、9.5%、21.4%、Neuのグレード2、3、4への悪化の割合はそれぞれ61.9%、23.8%、42.8%、PLTのグレード3、4への悪化の割合はそれぞれ38.1%、4.7%、35.7%であり、これらの血球減少はBMT群で好発していた。WBCのグレード3、4への悪化は投与期間、総ビリルビン値と正の相関を示したが、総蛋白(TP)、血清アルブミン(ALB)との間では負の相関を示した(p<0.05)。Neuのグレード2、3、4への悪化は投与期間と正の相関を示したが、TP、ALBとの間では負の相関を示した(p<0.05)。PLTのグレード3、4への悪化はALB、生着日、CRPと負の相関を示した(p<0.05)。以上の結果から、BMTにおいては、GCVによる血球減少の発生により注意が必要であることが示された。この血球減少は投与期間が長いほど、またTP、ALBが低いほど起こりやすい可能性が示唆された。
ハロゲン化多環芳香族炭化水素の遺伝子発現解析による生体への影響評価

多環芳香族炭化水素(PAHs)は、様々な燃焼過程で生成され、環境中に排出されているが、近年、塩素や臭素が付加したハロゲン化PAHsも検出されている。これらの生体影響を評価するため、遺伝子発現レベルの変化を2種の乳がん細胞(MCF7、MDA-MB-231)を用いて調べた。PCRアレイでの網羅的解析では、ハロゲン化物では、親物質とは発現レベルの変化が異なる遺伝子もあった。また、実験に用いた2種の乳がん細胞で、発現レベルに差も見られた。多環芳香族炭化水素(PAHs)は、ダイオキシン類と同様、様々な燃焼過程で生成され、環境中に排出されている。また、近年PAHsに塩素や臭素が付加した塩素化、臭素化多環芳香族炭化水素(ClPAHs、BrPAHs)も、環境中から検出されている。これらのハロゲン置換体は、難分解性、蓄積性が増すとされ、生体への影響も危惧される。しかしながら、その生体に対する影響については、ほとんど解明されていない。そこで、生体影響を評価するための基礎的なデータを得るため、遺伝子発現レベルの変化を網羅的に調べることにした。ハロゲン化PAHsの合成及び精製は、一部を除いて、問題なくできた。Brの二置換体の収量が悪かった。それらの合成試料の中で、PCRアレイによる遺伝子発現レベルの網羅的解析は、これまでのCl体に加えて、Br体に注目し、BaPのBr付加体である6-BrBaPについて行った。今回は、Human Cancer Drug Resistance and Metabolismのパスウェイ解析を目的としたPCRアレイで調べた。アレイ上の約90遺伝子のうち、BaPと6-ClBaPとの結果と比較して、Br体でCl体と同様に発現が増加、あるいは減少した遺伝子は2種ずつであった。一方、Cl体よりも発現が増加した遺伝子が9種あった。従って、これらの遺伝子については、Br体の方が遺伝子発現に影響を与えるという可能性も考えられた。が、個々のprimerを合成し再度real-time PCRを行う必要があると考えられた。また、これらの遺伝子発現がどのように相互に関わっているのかも考察していく必要がある。さらに、他の試料についても調べていく予定である。6-BrBaPについてPCRアレイを行ったところ、アレイ上の約90遺伝子のうち、BaPと6-ClBaPとの結果と比較して、Br体でCl体と同様に発現が増加、あるいは減少した遺伝子もあったが、Cl体よりも発現が増加した遺伝子もいくつか認められた。従って、Br体は、遺伝子発現においてCl体とは異なる作用をすることも考えられた。また、PheとPyのBr体については、親物質とそれほど発現量に変化が認められなかった。さらに、炎症マーカーであるInterleukin6(IL-6)についてreal-time PCRを行ったところ、エストロジェンでは変化が認められないのに対し、上記8検体について、増加が認められた。特に、BaP、6-BrBaP、BaA、7-BrBaAについては高レベルであった。AhR標的遺伝子であるCyp1a1については、上記4検体について、遺伝子発現が高まり、Br体ではやや低くなる傾向が見られた。さらに、エストロジェン応答遺伝子であるpS2では、Phe、9-BrPhe、Py、1-BrPyでやや上昇する傾向が認められた。多環芳香族炭化水素(PAHs)は、様々な燃焼過程で生成され、環境中に排出されているが、近年、塩素や臭素が付加したハロゲン化PAHs(ClPA、Hs、BrPAHs)も検出されている。ハロゲン化PAHsは、構造的にダイオキシン類とPAHsとの共通類縁化合物と考えられ、生体への影響が大きいものと考えられる。また、ハロゲン置換体は、難分解性、蓄積性が増すとされ、親物質以上に生体への影響について解明することが求められる。これまでも、乳がん細胞MCF7を用いて、その作用について調べてきたが、本研究では、エストロジェンレセプター(ER)を発現していないとされる、エストロジェン(E_2)に非応答性の乳がん細胞MDA-MB-231も加えて、ハロゲン化PAHsのうち、特にbenzo[a]pyrene(BaP)のハロゲン化物について、E_2やビスフェノールA(BPA)と比較しながら、細胞増殖や遺伝子発現に及ぼす影響を調べた。細胞増殖については、MCF7細胞では、E_2と同様にBaPやハロゲン化BaPでも増殖能が高まり、エストロジェン様作用があると考えられたが、MDA-MB-231細胞では、E_2やBPAと同様に増殖促進作用が認められなかった。これは、MDA-MB-231細胞では、ERを発現していないためと考えられた。遺伝子発現については、AhR標的遺伝子であるCYP1A1では、両細胞とも、BrBaPよりもBaPやClBaPで、発現量が高まった。しかし、そのレベルは、MCF7細胞の方が約10倍高かった。

ER標的遺伝子であるpS2の発現レベルは、MCF7ではBrBaP以外で高くなった。MDA-MB-231細胞では、いずれの物質でもほとんど変化が認められなかった。炎症マーカーであるIL-6については、MCF7細胞では、BaPとハロゲン化BaPで増加していたが、MDA-MB-231細胞では、それに加えてBPAでもやや高くなる傾向が見られた。BrBaPでは、CYP1A1とpS2の発現量が、BaPやClBaPに比べて低く、Br化によって細胞に対する作用が明らかに変化したことがわかった。
長鎖DNA分子の高次構造-相転移現象と構造制御

本研究課題の目的は長鎖DNA分子の高次構造の特性解析を押し進めることであった。こでまでに本研究室では、DNA単一鎖の相転移挙動の蛍光顕微鏡を用いた直接観察による解析と、その相転移産物の電子顕微鏡観察による微細構造解析の両者を照合することにより、『長鎖DNAの単分子結晶は一次相転移を通じて形成される』ことを明らかにしてきた。本研究期間中の研究成果を集約すると1.長鎖DNAの単分子結晶の形成過程を溶液中での直接観察によって捉え、それが核形成・核成長の一次相転移プロセスであることを明らかにした。2.さらにそのダイナミクスをモンテカルロ・シミュレーションによって理論的に再現することに成功した。3.結晶形成の速度論に関する理解に加え、結晶の平衡論的な安定条件を理論的に予測し、実験によって検証を行なった。4.DNAが分子内相分離を引き起こす凝縮条件を同定した。これはゲルでは似た現象が知られているが、単一の線状高分子内で観察されたのが初めてである。5.遺伝子導入効率に対するpoly-arginine濃度依存性と、DNA複合体の構造との相関を明らかにした。することを明らかにした。6.また、遺伝子導入に用いるDiotadecylamidoglycylspermin(DOCS)とDNAとの相互作用を、蛍光顕微鏡ならびに電子顕微鏡を用いて調べた。DNA/DOCSの凝縮構造と、遺伝子導入の効率の関連性を明らかにした。今年度得られた上述の知見によって、相転移現象の動因に対する理論的理解が一段と深まったことに加え、相転移を通じて形成される構造の制御に関しても、実験と理論の両面について新しい地平を拓くこととなった。さらに遺伝子導入へその理論と実験結果を応用することに成功した。以上6点の知見は全て平成8年度から9年度中の国際学術誌に掲載された。本研究課題本年度の目的は長鎖DNA分子の高次構造の特性解析を押し進めることであった。具体的には既に発現していた単一高分子鎖の相転移挙動を実験・理論両面からさらに追究するとともに、その相転移現象と関連させることにより、高分子鎖の折り畳みの制御の方法を確立することを目指した。本年度の研究成果は次の6点に集約される。(1)DNA単一鎖の相転移挙動の蛍光顕微鏡を用いた直接観察による解析と、その相転移産物の電子顕微鏡観察による微細構造解析の両者を照合することにより、「長鎖DNAの単分子結晶は一次相転移を通じて形成される」ことを明らかにした。(2)長鎖DNAの単分子結晶の形成過程を溶液中での直接観察によって捉え、それが核形成・核成長の一次相転移プロセスであることを明らかにした。(3)さらにそのダイナミクスをモンテカルロ・シミュレーションによって理論的に再現することに成功した。(4)結晶形成のダイナミクスに関する理解に加え、結晶のスタティックな安定条件を理論的に予測し、実験によって検証を行なった。(5)凝縮状態DNAの構造に分子内相分離を引き起こす凝縮剤を同定した。(6)長鎖DNAの高次構造に溶液の履歴を反映した制御が観察される具体的現象を特定し、その効果の原因として、共存化学種のDNAへの競争的結合の速度過程と、系の自由エネルギーの多重安定性とが関係することを理論的に検討し実験との定性的な一致を得た。今年度得られた上述の知見によって、相転移現象の動因に対する理論的理解が一段と深まったこと((1)(3))に加え、相転移を通じて形成される構造の制御に関しても、実験と理論の両面について新しい地平を拓くこととなった((4)(6))。以上6点の知見は全て平成8年中の国際学術誌に掲載された。今年度所定の目的は充分達成されたと考えられる。

本研究課題の目的は長鎖DNA分子の高速構造の特性解析を推し進めることであった。これまでに本研究室では、DNA単一鎖の相転移挙動の蛍光顕微鏡を用いた直接観察による解析と、その相転移産物の電子顕微鏡観察による微細構造解析の両者を照合することにより、『長鎖DNAの単分子結晶は一次相転移を通じて形成される』ことを明らかにしてきた。本年度の研究成果を集約すると1.長鎖DNAの単分子結晶の形成過程を溶液中での直接観察によって捉え、それが核形成・核成長の一次相転移プロセスであることを明らかにした。2.さらにそのダイナミクスをモンテカルロ・シミュレーションによって理論的に再現することに成功した。3.結晶形成の速度論に関する理解に加え、結晶の平衡論的な安定条件を理論的に予測し、実験によって検証を行った。4.遺伝子導入効率に対するpoly-arginine濃度依存性と、DNA複合体の構造との相関を明らかにした。することを明らかにした。5.また、遺伝子導入に用いるDiotadecylamidoglycylspermin(DOCS)とDNAとの相互作用を、蛍光顕微鏡ならびに電子顕微鏡を用いて調べた。DNA/DOCSの凝縮構造と、遺伝子導入の効率の関連性を明らかにした。今年度得られた上述の知見によって、相転移現象の動因に対する理論的理解が一段と深まったことに加え、相転移を通じて形成される構造の制御に関しても、実験と理論の両面について新しい地平を拓くこととなった。さらに遺伝子導入へその理論と実験結果を応用することに成功した。以上5点の知見は全て平成9年度中の国際学術誌に掲載された。本年度所定の目的は充分達成されたと考えられる。