hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
原発性胆汁性肝硬変モデルマウスにおける抑制性B細胞の同定と臨床応用への基礎検討

炎症抑制機能を有する可能性が示唆されているCD5陽性B細胞の局在を免疫組織化学的にCD20, CD5の二重染色を行い原発性胆汁性肝硬変患者およびC型慢性肝炎患者の肝臓組織にて検討した。両疾患において門脈域内の濾胞様細胞集簇におけるB細胞にはCD20CD5共陽性B細胞を認める一方、原発性胆汁性肝硬変患者にて見られる胆管浸潤B細胞にはCD20CD5陽性B細胞を認めなかったことから、原発性胆汁性肝硬変患者肝臓組織において胆管上皮傷害へのCD5陽性B細胞の直接的関与は否定的と考えられる結果を得た。本研究課題では、原発性胆汁性肝硬変動物モデルマウスにおいて炎症抑制機能を有するB細胞亜群を同定し、抑制性B細胞による原発性胆汁性肝硬変における自己免疫性胆管炎の効果的・効率的な治療戦略を提言することを目的とした。本課題実施計画は、CD8陽性T細胞植肝臓炎症モデルにおいて、腹腔内B細胞亜群(CD11 b陽性、陰性)およびCD11 b陽性CD5陽性B-1a細胞とCD11b陽性CD5陰性B-1b細胞のいずれの細胞群による炎症抑制作用が有意に優れているかを検討し、マウスB-1a細胞が最も優れた炎症抑制作用を示した場合には、ヒト原発性胆汁性肝硬変患者のCD5陽性B細胞の炎症抑制機能を検討し、B細胞をターゲットとした新規療法開発への礎を築くものであった。しかし、平成22年度は米国カリフォルニア大学ガーシュインラボよりのモデル動物搬入までにはMTA締結から1-2年の期間を要することが明らかとなったため、米国ジャクソンラボより原発性胆汁性肝硬変モデルマウスを輸入する方針に変更し、見積金額を平成22年度科学研究補助金繰越申請し承認を得た。平成23年度にモデルマウスを輸入し、炎症抑制性B細胞についての検討を進めている。一方、平成22年度より共同研究者らと共に、炎症抑制機能を有する可能性が示唆されているCD5^+B細胞の局在を免疫組織化学的にCD20,CD^5の二重染色を行いヒト原発性胆汁性肝硬変患者およびC型肝炎患者の肝臓組織にて検討を開始した。両疾患において門脈域内の濾胞様細胞集籏におけるB細胞にはCD5^+B細胞を認める一方、原発性胆汁性肝硬変患者にて見られる胆管浸潤B細胞にはCD5^+B細胞を認めなかったことから、ヒト原発性胆汁性肝硬変患者肝臓組織において傷害標的である胆管上皮へのCD5^+B細胞の直接的関与は否定的と考えられる結果を得た。本課題実施計画は、CD8陽性T細胞植肝臓炎症モデルにおいて、腹腔内B細胞亜群(CD11b陽性、陰性)およびCD11b陽性CD5陽性B-1a細胞とCD11b陽性CD5陰性B-1b細胞のいずれの細胞群による炎症抑制作用が有意に優れているかを検討し、マウスB-1a細胞が最も優れた炎症抑制作用を示した場合には、ヒト原発性胆汁性肝硬変患者のCD5陽性B細胞の炎症抑制機能を検討し、B細胞をターゲットとした新規療法開発への礎を築くものであった。一方、平成22年度より共同研究者らと共に、炎症抑制機能を有する可能性が示唆されているCD5^+B細胞の局在を免疫組織化学的にCD20,CD5の二重染色を行いヒト原発性胆汁性肝硬変患者およびC型肝炎患者の肝臓組織にて検討を開始した。両疾患において門脈域内の濾胞様細胞集籏におけるB細胞にはCD5^+B細胞を認める一方、原発性胆汁性肝硬変患者にて見られる胆管浸潤B細胞にはCD5+B細胞を認めなかったことから、ヒト原発性胆汁性肝硬変患者肝臓組織において胆管上皮傷害へのCD5+B細胞の直接的関与は否定的と考えられる結果を得た。以上の結果に他の検討結果も加えて、平成23年度、共同研究者らと共に米国肝臓学会誌であるHepatologyに論文を投稿し、現在Inpress(Epub ahead of print)の状態にある。

またウルソデオキシコール酸による標準療法への反応が不十分な原発性胆汁性肝硬変患者において抗CD20抗体によるB細胞除去療法を行ったパイロットスタディーについての論文を、共同研究者らと共にHepatologyに報告した。
ラボ量子ビーム複合利用小角散乱による鉄鋼材料の析出初期過程の研究

鉄鋼材料の析出初期段階に着目し、ナノサイズ析出物やその前駆体について、サイズや数密度だけでなく組成までを定量化することを目的とし、X線および中性子小角散乱(SAXSおよびSANS)の複合利用法を適用した。その結果、高窒素マルテンサイト鋼では焼き戻し初期段階で直径1nm程度でかつ後期とは組成の異なる相が形成することを明らかとした。さらにSAXSおよびSANS法を今後も材料研究に展開していくことを目指し、小型の中性子源を利用したSANS装置を作製し、その性能が大型施設のSANS装置に劣らない精度であることを証明した。本研究はナノサイズの析出物やその前駆体であるクラスターについてサイズ・数・組成を定量化し、未解明な点が多い鉄鋼材料の析出初期過程の詳細解明を目的とする。初期過程研究の難しさは透過電顕(TEM}では回折コントラストが小さなナノサイズ不均質(ヘテロ)組織を観察することが鉄合金では困難である点にある。そこで本研究ではマトリクスとヘテロ組織との原子数密度および組成の差を検出する小角散乱(SAS)法を利用する。これまでSAS法では組成情報を取得できなかったがX線と中性子を複合した新手法(合金コントラスト法)を活用することで、サイズ・数の情報に留まらず、組成情報にも踏み込んで解析する。これをX線および中性子ともインハウスの装置利用で進め、材料開発にタイムリーかつフレキシブルに対応し、析出初期過程の詳細に迫る。以上の目的の下、本年度はSCM440(炭素量0.4wm水準の鉄鋼材料について、中性子小角散乱測定を韓国原子力研究所の研究炉を使用して行った。この測定に使用した試料と同一のものを北大インハウス小型中性子源小角散乱で測定を行った。これは大型施設を用いた中性子小角散乱データに対してインハウス中性子システムのデータの質を検討することを目的としている。測定に先立ち、今年度は試料と検出器間にヘリウム置換した飛行管を設置し、バックグラウンドを低減させた。また、データ取得の回路システムを改修し、安定した測定を行えるようにした。以上の結果、インハウス測定により、十分なクオリティの小角散乱プロファイルを得られることを確認した。以上の結果を受け、今後の実験効率の向上に、ラボX線小角散乱装置をインハウス中性子測定装置に隣接させることが有効であると判断し、同装置の北大への移設を行った。ナノサイズの析出物やその前駆体のサイズや数密度を定量化できる小角散乱(SAS)法を利用し、特にX線と中性子を複合した新手法(合金コントラスト法)を活用することで、組成情報にも踏み込んで解析する。このための測定手段としてX線および中性子ともインハウスの装置利用で進め、材料開発にタイムリーかつフレキシブルに対応し、析出初期過程の詳細に迫る。今年度は申請者の所属変更(NIMSから北大)にともない、インハウス中性子源により容易にアクセス可能となり、合計5週間程度の中性子小角散乱実験を行った。この過程でインハウス小角散乱装置(iANS)のバックグラウンド低減を進め、析出初期段階の検出能を高めた。あわせて、合金コントラスト法には不可欠である絶対強度化を進め、多波長を使用する飛行時間型小角測定に適したdatareductionフローを確立した。この一連の作業を高窒素マルテンサイト鋼の析出初期過程について進めるとともに新規装置の実試料に対する測定妥当性を検討するために、インハウス小角で測定した絶対強化プロファイルと韓国の研究用原子炉HANAROに設置された18mSANSで得られた絶対強度プロファイルが一致することを確認した。以上の結果からインハウス小角散乱装置で金属系材料の析出初期過程の絶対強度測定を行えることを実証した。昨年度得られたラボSANS測定結果よりその有効性が明らかとなったため、一体型SANS測定用真空チェンバーを作製し、真空化によるバックグラウンドの減少および測定装置の恒久システム化を行った。高窒素マルテンサイトステンレス鋼について得られたラボ中性子小角散乱(SANS)データとラボX線小角散乱強度(SAXS)データの絶対強度比較を行い、熱処理温度に依存した強度比の変化について解析した。これら、ラボSANSおよびSAXSの複合利用結果を10月に韓国材料学会において招待講演として発表した。さらに強度比情報からより詳細な組織除法を得るために、ナノ微細不均質構造の相同定を透過電子顕微鏡(TEM)を用いて詳細に検討したところ、六方晶構造を有し、βTi合金でω相と呼ばれる相と同型である可能性を見いだした。新たに得られた情報をもとに、強度比の解釈を行い、450°Cで焼き戻しを行った試料では10at%程度の窒素を含むことで、また550°Cの焼き戻しでは窒素に加えてCrの濃化が進むことで強度比を説明可能であることがわかった。この結果を12月に行われたMaterials Research Society (MRS)fall meetingにおいて発表した。

さらに詳細な検討を行う上で、サブゼロ熱処理前の試料や600°C以上で焼き戻した試料についても検討を行った結果、急冷材でもナノ不均質が形成していることがラボSAXSおよびTEMにより明らかとなった。この結果を年度末の春の金属学会において平および大沼がそれぞれシンポジウムにおいて発表した。また、現在、1報を投稿中、2報が投稿準備中である。平行して進めていた、ラボSAXS利用研究およびSAXS/SANS複合利用研究のアルミ合金およびチタン合金における成果をそれぞれ学術誌に投稿論文として発表している。26年度が最終年度であるため、記入しない。材料科学26年度が最終年度であるため、記入しない。バックグラウンドの低減、回路の安定化によりインハウス中性子小角散乱システムの測定データの質が大幅に向上、X線・中性子複合解析に使用可能なレベルに計画通り、到達した。さらに、X線装置の移設により、X線および中性子小角散乱測定を徒歩1分圏内にある装置群で測定できる環境を整えた。析出初期過程の検討にあたり、析出無しの比較材として急冷材よりも低温で焼きなました試料が鉄鋼材料では適していることを見いだした。以上の理由により、開始年度の目標を達成した。インハウスX線小角散乱での測定とインハウス中性子小角散乱の測定を同一キャンパス内でともに絶対強度で測定できる環境を構築した。また、測定の容易な標準試料レベルではなく、実際に対象としている鉄鋼材料の析出初期過程に置いてインハウス小角散乱装置で正しく絶対強度測定ができていることを、大型施設での測定を並行して行うことで確認できた。代表者が北海道大学に移動したため、25年度からは北海道大学でX線および中性子小角散乱を、電子顕微鏡観測をNIMSで行うことなる。小角散乱解析は北大および京大で実施する。今年度は、25年度に得られた高窒素鋼の析出初期過程において、インハウス小角散乱装置で得られたデータ解析を進め、合金コントラスト法を適用し、初期過程のクラスター組成情報の抽出を試みる。さらに、今年度までのデータに見られたq<0.3nm^-1領域のデータクオリティのよりいっそうの向上を図るために、コリメーションから試料、ビームストッパーまでを一体の真空槽に収納可能な専用チェンバーを作製し、測定可能なq領域をq>0.1nm-1に拡大するとともに、ナノサイズの析出物に対応するq領域のS/N比向上を狙う。北海道大学へのX線装置移設に伴う、X線小角散乱装置冷却システムの改造が必要となり、これにおよそ300万円の費用が生じる。これにより、世界初のインハウスX線・中性子小角散乱測定環境を構築でき、小角散乱測定および解析の加速を図る。今年度までに得られたデータからさらにS/N比の向上を図るためにはこれまでのHe置換チェンバーに換えて、真空引き可能なチェンバーの使用が有効であると判断し、専用形状の設計を行ったが、年度内納品が難しかったため、繰り越しとして今年度前半で作製することとしたため。上述の通り、専用形状の真空チェンバーを作製する経費に充当する。
尿毒症物質の代謝・産生阻害を基軸とする腎障害進展阻止薬の新規創薬ストラテジー

腎機能障害・腎不全の病態進展並びに付随する尿毒症に関わる硫酸抱合型尿毒症物質インドキシル硫酸(IS)に焦点をあて、肝IS産生阻害物質を探索することを目的とした。IS産生阻害物質スクリーニング系を用いて調べた結果、ポリフェノール系薬物が強いIS産生阻害を示した。IS産生阻害薬の投与により、急性腎障害の発現・進展が抑制されることを見出し、腎障害治療法の新規創薬ストラテジーとして有用である可能性が示唆された。腎障害改善治療薬開発に繋がる新規インドキシル硫酸(IS)産生阻害物質を探索することを目的とし、ラット肝S9画分を用いたスクリーニング評価系を確立し、急性腎障害ラットにIS肝産生阻害物質を経口投与した場合の腎障害に及ぼす影響を精査した。ラット肝S9画分を用いたIS産生阻害物質スクリーニング評価系を用いて調べた結果、硫酸基転移酵素の阻害物質が強いIS産生阻害を示した。一方、Cytochrome P450 (CYP) 2A6及びCYP2E1の阻害物質ではIS産生阻害が認められなかった。Cisplatin誘発急性腎障害ラットにIS肝産生阻害作用を示す化合物Aを経口投与した結果、血清、腎臓及び肝臓中IS濃度が減少し、SCr、BUN、腎尿細管組織学的検査及び腎Kidney injury molecule (Kim)-1タンパク質発現量において光腎障害の軽減を認めた。一方、2,6-Dichloro-4- nitrophenol (DCNP)経口投与においては、血清、腎臓及び肝臓中IS濃度は減少するが、腎障害の更なる増悪を認めた。化合物A、化合物B及びDCNPの経口投与は、血清及び腎臓中Cisplatin濃度に影響を与えないことを確認した。Cisplatin誘発急性腎障害ラットにおいて、腎有機イオントランスポータOat1及びOat3のタンパク質発現量が減少し、化合物Aを経口投与することでその発現量減少が回復することを認めた。IS産生阻害薬の投与により、急性腎障害の発現・進展が抑制されることを見出し、新たな腎障害治療法の創薬ストラテジーとして有用である可能性が示唆された。腎機能障害の進展阻止並びに尿毒症治療薬の開発に繋がるインドキシル硫酸(IS)産生阻害物質を探索することを目的とし、ラット肝S9画分を用いたインビトロスクリーニング評価系を確立し、薬剤性並びに虚血性急性腎障害ラットにIS肝産生阻害物質を経口投与した場合の腎障害に及ぼす影響を精査した。新たに確立したIS産生阻害物質スクリーニング評価系を用いて調べた結果、硫酸基転移酵素に阻害作用を持つ薬物がIS産生阻害を示した。Cisplatin誘発急性腎障害ラットにIS肝産生阻害化合物を経口投与した結果、血清、腎臓及び肝臓中IS濃度が減少し、SCr、BUN、腎尿細管組織学的検査及び腎Kidney injury molecule (Kim)-1タンパク質発現量において、腎障害の軽減を認めた。一方、2,6-Dichloro-4-nitraphenal (DCNP)経口投与においては、血清、腎臓及び肝臓中IS濃度は減少するが、腎障害の更なる増悪を認めた。虚血性急性腎障害ラットを作成し、IS産生阻害薬物の経口投与による腎機能変化を比較精査した結果、一部のポリフェノール系薬物により血清中IS蓄積が低減すること、それに伴い腎障害が一部改善されることを見出した。IS産生阻害薬の投与により、急性腎障害の発現・進展が抑制されることを検証し、新たな腎障害並びに尿毒症治療法の新規創薬ストラテジーとして有用である可能性が示唆された。腎機能障害・腎不全の病態進展並びに付随する尿毒症に密接に関わる硫酸抱合型尿毒症物質インドキシル硫酸(IS)に焦点をあて、IS産生阻害物質を探索することを目的とした。ラット肝臓組織を用いたインビトロスクリーニング評価系を確立し、急性腎障害モデルラットにスクリーニングで見出されたIS肝産生阻害物質を経口投与した場合の腎障害に及ぼす影響を比較精査した。新たに確立したIS産生阻害物質スクリーニング評価系を用いて調べた結果、硫酸基転移酵素に阻害作用を持つ植物性ポリフェノール系薬物がIS産生阻害を示した。Cisplatin誘発急性腎障害ラットにIS肝産生阻害化合物を経口投与した結果、血清、腎臓及び肝臓中IS濃度が減少し、SCr、BUN、腎尿細管組織学的検査及び腎Kidney injury molecule (Kim)-1タンパク質発現量において、有意な腎障害の軽減を認めた。さらに、虚血性急性腎障害モデルラットを作成し、IS産生阻害薬物の経口投与による腎機能変化を比較精査した結果、一部のポリフェノール系薬物により血清中IS蓄積が著明に低減すること、それに伴い腎障害が一部改善されることを見出した。

腎組織中抗酸化ストレス因子Nrf2を調べた結果、腎障害ラットでは顕著にNrf2発現が亢進していること、IS産生阻害薬物投与によりNrf2発現の亢進が抑制されることを見出し、これら阻害薬物により腎組織中酸化ストレスが低減することが示唆された。IS産生阻害薬の投与により、急性腎障害の発現・進展が抑制されることを検証し、新たな腎障害並びに尿毒症治療法の新規創薬ストラテジーとして有用である可能性が示唆された。
CHILD症候群の皮疹形成メカニズムに基づいたケブネル現象の解析と他疾患への応用

CHILD症候群は、末梢コレステロール生合成経路のNSDHL変異により乾癬様の皮疹を呈するが、内因性のコレステロール中間代謝物と皮膚炎発症のメカニズムについての詳細な検討は未だ行われていない。培養HaCaT細胞にNSDHL阻害剤を添加し、48時間後に回収した。ガス・クロマトグラフィー(GC-MS)を用いてコレステロール代謝物を測定したところ、数種類の異常な中間代謝物を検出した。これらのコレステロール中間代謝物は、CHILD症候群患者病変部皮膚から抽出したGC-MS結果と一致していた。コレステロール合成経路に関わる阻害剤を培地に添加したところ、用量依存性に異常な中間代謝物の蓄積を抑制した。遺伝性コレステロール生合成経路の異常症であるCHILD症候群は、NSDHL酵素活性の低下によって片側性に紅斑、角化、落屑を伴う魚鱗癬様もしくは乾癬様の皮疹を生じる。片側性に乾癬様皮疹を認める患者の皮疹部および無疹部の皮膚生検を施行し、皮膚で発現しているNSDHLのmRNAをシークエンスしたところ、皮疹部と無疹部いずれも変異したアレルの発現が確認された。したがって、遺伝子変異を同側皮疹部と無疹部ともに確認できたことから、CHILD症候群の皮疹部では、遺伝子変異以外の要因によってコレステロール代謝異常を惹起している可能性が示唆された。NSDHLの上流でコレステロール代謝酵素に関わるCYP51の免疫染色を行ったところ、無疹部と比較して皮疹部表皮有棘層上層において発現の上昇が確認され、CYP51の過剰発現が異常なコレステロール中間代謝物の蓄積に関与をし、皮膚症状を引き起こしている可能性が考えられた。そこで、CYP51発現量増加とNSDHL酵素活性低下がCHILD症候群の皮膚症状のメカニズムに関与しているかを調べるため、HaCaT細胞にCYP51強制発現ベクターをエレクトロポレーションでトランスフェクションを行い、CYP51を強発現させた細胞株を作成し、コレステロール除去培地で培養し、細胞増殖に与える影響をMTSアッセイで測定したが、コントロールと比較して有意差は得られなかった。現在はGCーMSでコレステロール代謝物の測定を行うための条件設定を行っている。今後は、これらの実験系でNSDHLの阻害薬である17-αhydroxyprogesteroneを培地に添加することで、中間代謝物であるFF-MASやT-MASが蓄積するかどうか、GCーMSを用いて検討を加える。HaCaT細胞にCYP51を強発現させた細胞株の作成が予定より時間がかかったが、現在は完成することができ、GCーMSの実験条件も設定できている。CHILD症候群(Congenital hemidysplasia with ichthyosiform erythroderma and limb defects)は、末梢コレステロール生合成経路のNSDHL変異により、乾癬様の皮膚炎を生じる。in vitroの系でコレステロール代謝異常の条件を疑似的に作成するため、HaCaT細胞を10%FCS/DMEMにて培養し、70%コンフルエントになった状態で、コレステロール除去培地に変更し、NSDHLの阻害薬である17-αhydroxyprogesterone (17-OHP)を30uM添加し、48時間後に回収した。細胞から脂質を抽出し、ガスクロマトグラフィー質量分析法(GC-MS)にてコレステロール代謝物を測定したところ、17-OHP無添加群と比較して、4種類の異常なC28およびC29ステロールを検出した。この異常なコレステロール中間代謝物は、CHILD症候群患者の皮疹部の皮膚鱗屑から抽出した脂質のGC-MSでも検出されたが、患者の無疹部の鱗屑からは検出されなかったため、このin vitroの実験系がCHILD症候群の皮膚を疑似していることが確認できた。コレステロール合成経路にかかわるCYP51阻害剤やHMG-CoA阻害剤などを培地に添加して異常な中間代謝物を測定した。oxiconazole(抗真菌剤), ketoconazole(抗真菌剤), miconazole(抗真菌剤), terbinafine(抗真菌剤), atolvastatin(HMG-CoA阻害剤), simvastatin(HMG-CoA阻害剤), lovastatin(HMG-CoA阻害剤), minomycin(抗菌剤), clarythromycin(抗菌剤)のうち、oxiconazol, atolvastatin, simvastatin, lovastatinは用量依存的に異常な代謝中間代謝物の蓄積を抑制した。患者検体使用のための当施設倫理申請承認が遅れ、gene expression profilingなどの解析が遅れている。今後は、HaCaT細胞にCYP51を強発現させた細胞株を用いて、NSDHLの阻害薬である17-αhydroxyprogesteroneを培地に添加することで、中間代謝物であるFF-MASやT-MASが蓄積するかどうか、GCーMSを用いて検討を加える。4種類の異常な代謝中間代謝物(C28およびC29ステロール)がCHILD症候群の皮疹やケブネル現象に関わっているか確認する。

HaCaT細胞を培養して、70%コンフルエントになった状態でコレステロール除去培地に変更後、17-OHPを30uM添加して、48時間後に回収する。細胞から異常な代謝中間代謝物を含む脂質分画を抽出して、エタノールに溶解したものを作成する。これをB6マウスの耳介に塗布して皮膚炎が誘発できるか検討する。また、ヒトCD1aを発現させたトランスジェニックマウスにも同様に耳介に塗布し、皮膚炎が誘発できるか検討し、ヒトCD1aを介したヒトランゲルハンス細胞とT細胞との免疫応答の可能性について検討する。また、ケブネル現象との関連を調べるために、異常な代謝中間代謝物を塗布する際に擦過刺激などを加えて、皮膚炎が誘発できるかどうか検討を加える。さらにCHILD症候群の血清中に異常な代謝中間代謝物が含まれているかどうか検討するため、患者血清を用いてGC-MSを行い、皮膚と血清中の脂質代謝について比較検討する。さらにCHILD症候群患者の皮膚におけるgene expression profilingを行うため、3名の患者の検体を用いて健常部と病変部の表皮からmRNAを抽出し、皮膚炎に関連すると考えられる遺伝子発現に関して統計的に解析を行う。乾癬、遺伝性疾患HaCaT細胞においてYP51を強発現させた細胞株を作成に時間を要したため、GCーMSでのコレステロール測定が予定より遅れており、次年度の使用額が多くなった。申請者らの施設内で、患者検体を用いた臨床研究に対する倫理申請の承認が遅れたため、皮膚における遺伝子発現を解析するためのgene expression profileや、血清のELISAの実験に後れを生じたため。申請者らの施設内で、患者検体を用いた臨床研究に対する倫理申請の承認がなされたため、現在患者検体を集めて、未実施の実験を本年度中に行う。
核DNA定量による消化器腫瘍性病変の統一的分類の試み

1)切片法と細胞単離法の比較検討。大腸腺腫と潰瘍性大腸炎(UC)のDNA量測定に関して、切片法と単離法を比較検討した結果、aneuploid、diploidの検出には7hで十分であり、必要に応じて単離法を追加すればよいことが判明した。この方法論の確立により、以下の研究計画をスムースに行う道が開かれた。2)腺腫の異型度とDNA量の関係。70病変の腺腫のDNA量を主として切片法で測定した結果、non-diploid cell(aneuploidおよびpolyploid)の出現率は、mild dysplasiaで2.3%、moderate dysplasiaで30.8%、癌で53.9%であった。すなわち、良・悪性の境界領域に属するmoderate dysplasiaの中に構造異型を示さないがDNA量の上からは癌と考えられる病変が含まれていることが明らかになった。この方法によって、腺腫と癌の関係をより客観的な見地から検討する道が開けたと考えられる。3)UCに合併する癌、dysplasiaのDNA量測定。癌、dysplasiaを合併した例を含む60症例、100病変を対象とし、主として切片法によってDNA量を測定した結果、癌、dysplasiaの77%にnon-diploid cellがみられ、それらの背景粘膜には36%にpolyploid cellがみられた。non-displasticな粘膜は94%がdiploid cellのみであった。また、polyploid cellの出現率はdiysplsiaを客観的に把握する指標になり、UCのcancer sarveiblanceにDNA量測定が有用であることが判明した。現在、prospective studyがスタートしており、近い将来にその有用性が臨床的に立証されるると思われる。4)カルチノイドのDNA量測定。病変の大腸カルチノイドのDNA測定を行い、転移例のみにaneuploid cellの出現が認められた。カルチノイドの悪性度判定に、本法は有用であると考えられる。落射式螢光顕微鏡を用いての組織DNA定量法には、10μの厚切り切片を用いて組織標本上で行う定量法と、細胞をバラバラにして細胞単位で行う定量法とがある。前者には組織所見と一対一の対応をさせながらDNAが測定できるという長所があるが、測定可能な細胞数が少ないという欠点がある。一方、後者には多数の細胞のDNA測定が可能であるという長所の代りに、組織所見との一対一の対応が難しいという短所がある。組織DNA測定研究においては、両者の測定値の一致度を確認しておくことが大切であると考えられる。器械の購入以来、私共は先ずこの問題に焦点を絞り、観察細胞数の少い組織切片上のDNA測定法でも、分離期の細胞のみのDNAを測定すれば、ploidy patternが正確に表現されうることを確かめた。私共の中心的な研究課題の1つである大腸腺腫内の異型度のDNAによる再分類のために、組織標本上のどの部位のDNA値がいくらであるかを測定することが最も大切であるからである。現時点で以下の事が明かになった。(1)mild displasiaの腺腫の部分はdiplaidを示していた。(2)severe dysplasia(癌)の部分はaneuploidを示していた。

(3)amoderate dysplasiaの部分にはdiploidとaneuploidを示すものがあり、moderate dysplasiaが腺腫の組織レベルでの前癌病変であるという、従来からの私共の主張が裏付けられたが、今後より多くの症例による詳細な分析が必要であろう。de novo癌と考えられた陥凹型早期癌の一部にもdiploidを示す部分が含まれている例があり、この病変における腺腫の混存が示唆された。de novo癌の判定にもDNA測定は有力な方法となる可能性がある。昨年度に引き続き,大腸腺腫の異型度と核DNA量の関係について検討した.経度異型腺腫では1列を除いてすべてdiploid patternを示した.nonーdiploid patternを示した1例では,HE所見とnonーdiploidを示した部位とを対比した結果,微少な中等度異型腺管の存在が確認された. HE所見と対比して検索できる切片法の特色が,これによって実証された.中等度異型腺腫でanuploid patteinを示すのは約15%,高度異型(腺腫内癌)では約54%であった.組織学的に癌であってもdiploid patternを示す例があるが,中等度異型腺腫の中に少なくとも15%の癌が含まれていることが明かになった.flat adenomaについても同様に切片法(4μ)によって検討した.軽度異型腺腫は80%がdiploid,中等度異型に近い腺腫1ヶがnonーdiploidであった.この検索結果からは,flat adenomaの中の中等度異型を示すものの大多数はすでに癌である可能性が示唆された.いわゆる'denovo'癌の初期像として中等度異型を示すflat adenomaが重要であると考えられる.10年以上経過した潰瘍性大腸炎の内視鏡検査時に得られた生検標本の4μ,7μ切片について,核DNA定量を行っている.組織学的にdysplasiaが認められる病変部にはnonーdiploid pattrnが認められた.さらに,組織学的に炎症もdysplasiaも認められない切片にもnonーdiploid patteinの認められる症例があった.これが形態学的変化の現れる前のdysplasiaの初期像であるか否かは,われわれが以前より行っている粘液組成の成績と対比しつつ経過と追跡する必要があると考えられる.1)腺腫の異型度と核DNA量の関係70病変の腺腫のDNA量を主として切片法によって測定した結果、non-diploid cill(aneuplovdおよびpolyplovdを含む)の出現率は、mild dysplasiaで2.3%、modirate dysplasiaで30.8%、癌で53.9%であり、異型度とともにその率が増大した。また、良・悪性の境界領域に属すると考えられるmodirate dysplasiaの中に、構造異型を示されるがDNA量の上からは癌と考えられる病変が含まれていることが明了になった。本法を用いることにより、良・悪性の鑑別がより客観的に行えるようになり、腺腫と癌の関係をより詳細かつ客観的に検討することが可能になったと考えられる。2)UCに合併する癌、dysplasiaのDNA測定。
日本の近代化と華僑・印僑ネットワークとの相互連関についての歴史的分析

研究代表者の推計によれば、神戸港における華僑の対東南アジア向け輸出は1929年に7500万円を記録し、これは神戸港の対東南アジア全輸出額の7割を占めた。30年代には大不況や欧米のブロック政策の影響もあり、31年には2900万円(神戸港の対東南アジア輸出額において43%を占める-以下同様)に減少するが、36年には5500万円に回復する(37%)。他方、在神戸印僑の輸出額は29年には1680万円(神戸港の対英領インド輸出額の33%-以下同様)であり、32年には1288万円(21%)へと減少するが、36年には7865万円(80%)へと急激に回復する。36年の在神戸華僑/印僑の輸出額は神戸港の対東南アジア/英領インド輸出全額の約半分を占めたことになる。1929年の輸出額を基準(100)と考えれば、36年に華僑の輸出額は73にまで回復し、印僑のそれは466に拡大した。在神戸印僑の積極的な取引への進出が確認できる。また各1社当りの資本金を検討すると、在神戸華僑のそれは1925年5万7000円、32年9万5000円、38年17万3000円へと拡大基調にあるのに対して、印僑の場合は各年において20万円、8万4000円、7万円へと減少する。在神戸印僑は30年代を通して、1社当りの資本金を低下させながら取引額をふやしたことになり、これは30年代に比較的小さな資本金規模の印僑が新規に参入し、日本製品の取引に積極化したことを示していた。他方、在神戸華僑は20年代初頭からのメンバーが着実に規模を拡大させ、30年代に取引額を回復させたことを示唆していた。印僑は比較的流動的であり、状況の変化に敏感に反応する側面を有していたと考えられる。大不況と植民地経済のブロック化の時代と認識されてきた1930年代において、アジア通商網は崩壊するものと認識されてきたが、条件の変化に敏感に反応する華僑、印僑の通商活動によって日本製品のアジア市場における取引は停滞することなく、むしろ拡大したのであった。2年間にわたる研究成果は、講座『世界歴史-移動と交流』岩波書店、1999年近刊で発表する予定である。本研究の目的は、「国民国家」・「国民経済」という「公式」的な枠組の下位概念として、「地域」の連鎖をおさえ、1930年代に問題とされたるようになる「非公式」的な「地域主義」とそれを支えるネットワークの存在の歴史的根拠を、日本史の立場から考察することにある。日本において「地域主義」が議論されるようになったのは、1930年代の「満州国」創設に前後した時代であった。欧米帝国主義の存在と、1920年代以降の中国のナショナリズムの台頭に対抗する必要から、国家を越える新しいアジア国際秩序原理として地域主義が求められた。「満豪」・「大東亜」という表現を採りながら、国家の下位概念であるはずの「地域」が、地政学(geopolitics)を援用しながら20年代以降の内外の「国家主義」を超克する召的で動員された。それゆえ敗戦後日本は、戦後民主主義を希求する形で改めて「国家主義」に回帰し、こうした地域主義の形成を負の側面として、考察の対象外に置いたと言える。地域主義が主張された30年代において注目されたのが華僑、印僑の存在であった。彼らがナショナリズムを意識した排日運動は日本の驚異であったが、同時に地域主義の構成員として彼らを取り込む必要が彼らの存在への注視となった。満鉄・東亜研究所の調査報告が多く刊行された所以である。戦後日本の「国家主義」への回帰は、歴史学においても日本の「国民国家・経済」形成の普遍性と特殊性を後者に即して議論することに結果したが、他方で国家のような「纏まり」を持たない歴史的事象・主体を考察対象外とした。国家の後援をうけない経済主体である彼らの存在は近代化を指向することのない「停滞」性のなかで議論されるものの、環海の都市間にひろがる非日本人通商網の日本に与えた影響は等閑視されてきたと言える。

在神戸印僑の積極的な取引への進出が確認できる。また各1社当りの資本金を検討すると、在神戸華僑のそれは1925年5万7000円、32年9万5000円、38年17万3000円へと拡大基調にあるのに対して、印僑の場合は各年において20万円、8万4000円、7万円へと減少する。在神戸印僑は30年代を通して、1社当りの資本金を低下させながら取引額をふやしたことになり、これは30年代に比較的小さな資本金規模の印僑が新規に参入し、日本製品の取引に積極化したことを示していた。他方、在神戸華僑は20年代初頭からのメンバーが着実に規模を拡大させ、30年代に取引額を回復させたことを示唆していた。印僑は比較的流動的であり、状況の変化に敏感に反応する側面を有していたと考えられる。大不況と植民地経済のブロック化の時代と認識されてきた1930年代において、アジア通商網は崩壊するものと認識されてきたが、条件の変化に敏感に反応する華僑、印僑の通商活動によって日本製品のアジア市場における取引は停滞することなく、むしろ拡大したのであった。2年間にわたる研究成果は、講座『世界歴史-移動と交流』岩波書店、1999年近刊で発表する予定である。
新規生体危険信号因子ヌクレオフォスミン投与による生体反応の解析

ヌクレオフォスミン(NPM)は細胞の中では核小体に存在している。NPMの働きはリボソームの生合成、中心体複製、細胞周期、アポトーシス、そして細胞の分化に関与している。最近、NPMがエンドトキシン刺激のマクロファージより放出されそしてその放出されたNPMが細胞を刺激し炎症性サイトカインのTNF-αやIL-6を誘導する。この研究において、NPMをマウスに投与するために全長NPMベクターの構築そしてその活性を検討した。その結果、得られたリコンビナント(r)NPMはマウスマクロファージ様細胞RAW264.7を刺激し、TNF-αの産生を誘導した。このように、rNPMをマウスへ投与する準備ができた。最近、敗血症の病態の進行に伴い、細胞の核から生命維持に必須なタンパク質が放出され本来の生命維持機能とは全く逆の生体を死へ導く分子、すなわち生体危険信号因子(例High Mobility Group Box-1(HMGB1)、ヒストンなど)が報告された。この因子の制御機構の解明は新規敗血症の治療につながる。研究代表者らは新規の生体危険信号因子(アラーミン)、ヌクレオフォスミンを発見し、細胞レベルでの機能を解明した。しかしながら、個体レベルにおいてヌクレオフォスミンの機能は未だ解明されていない。よって本研究は、アラーミンとしてのヌクレオフォスミンを個体レベルで解決し、臨床応用へと展開するための研究基盤を確立する。平成28年度は研究計画書にもとづいて、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)をタグとした大腸菌用ベクター(pGEX6P-1)にヌクレオフォスミンを組み込んだ。具体的には、4つのベクターを確立した。すなわち、ヌクレオフォスミンの全長、ヌクレオフォスミンの一次構造からN末側、中心部、C末側である。さらにこれの発現条件を検討した。その結果、ヌクレオフォスミンの大量発現系を確立した。しかしながら、得られたヌクレオフォスミンの機能などに関しては行っていない。したがって、今後、研究代表者らは細胞にヌクレオフォスミンを刺激を行う。そして、1刺激後の培養上清中のサイトカイン(TNF-αなど)産生の検討、2マウス・ラットを用いて本課題の生体反応の解析を行う予定である。当初の研究計画書どおりに進んでいるため。世界において敗血症患者は年間約800万人が亡くなっている。これは34秒に1人、世界のどこかで亡くなっている計算になる。今なお敗血症の罹患率は増加傾向にある(世界敗血症デー2015)。したがって、敗血症の予防と治療法の対策は非常に急務である。最近、敗血症の病態の進行に伴い、細胞の核から生命維持に必須なタンパク質が放出され本来の生命維持機能とは全く逆の生体を死へ導く分子、すなわち生体危険信号因子(例HMGB1、ヒストンなど)が報告された。応募者らは新規の生体危険信号因子(アラーミン)、ヌクレオフォスミン(NPM)を発見し、細胞レベルでの機能を解明した。しかしながら、個体レベルにおいてNPMの機能は未だ解明されていない。よって本研究は、アラーミンとしてのNPMを個体レベルで解決し、臨床応用へと展開するための研究基盤を確立する。昨年度よりリコンビナントNPMの単離精製を試み、そしてそれに成功した。今年度は、そのリコンビナントNPMを用いて細胞レベルでの機能を解析した。その結果、単離精製したリコンビナントNPMもサイトカイン産生能、すなわち炎症性サイトカインであるTNFーαの産生を見出した。アラーミンの代表的な分子はHMGB1、ヒストンである。これらは細胞、個体レベルでの機能が解明されている。具体的には、1個体死の誘導、2炎症性サイトカインの産生惹起である。しかしながら、NPMは未だ細胞レベルまでしか機能解明されていない。よって上述の1、2の証明を行う。救急医学マウスの購入のために次年度への繰越額が生じた。カプランマイヤー法による生存曲線を用いて、ヌクレオフォスミンが個体死を誘導するかを調べるにはマウスの購入が必須なためである。
内部モデルを用いたセンサフュージョンシステムの研究

本研究は、複数のセンサからの情報に対し、柔軟性と信頼性の高い自律分散型の認識判断機構を実現することを目指した研究である。特にセンサフュージョンの構造を記述する手法として、対象の内部モデルを利用する方法を提案し、並列処理を用いて自律分散型センサ情報処理を実現するものである。また、実例として、視覚ー触覚ー運動系の融合を目指したセンサフュージョンシステムを試作し、内部モデルを利用した処理アルゴリズムを実現した上で、その情報処理機能を理論的・実験的に明らかにすることを目的とする。本年度は、階層型の自律分散処理機構として、主として非リアルタイムの知識処理的な処理を行う上位層とリアルタイムの信号処理的なセンサフィールドバックを主体とする下位層に分けた処理システムを試作した。このシステムでは、それぞれの処理構造並びにこれらの層間のインターフェイスを設計の焦点となるが、内部モデル記逆に基づく設計を行い、システム全体の動作も確認した。また、前年度試作したシステムに運動系(能動的センシングの実現)を付加し、動物体の形状の認識を実例に認識アルゴリズムのシミュレーションを行い、能動的センシングの有効性を確認した。さらに、最終的なシステムとして視触覚融合システムを完成させた。このシステムは、視覚及び運動系に取り付けられた触覚を感覚入力とした用い、これらの入力に対応した複数台のTransputerによる並列処理を実現したものである。このシステムを用い、3次元形状認識を実例として評価実験を行い、基本的な動作を確認した。最後に、本研究を通して得られた知見を整理し、内部モデルの有用性、内部モデルの実現手法、センサ情報処理おける自律分散型処理の意義等を明らかにした。
日本的地域概念と主体的課題化学習との連動に関する理論的実証的研究

本研究は、「地域」概念の日本的形態が日本社会における住民学習者の主体性形成をはかる上で有効性をもつという本研究の仮説を4つの実践事例に則して検証した。その日本的形態のモデルとして、次の4点を導き、農漁村ケースについては一定程度、妥当することを検証した。(1)「自然村的秩序」のもつ内発的エネルギーの存在、(2)「中央」勢力圏に対する自立志向、(3)生活圏の異心円的複合構造、(4)個人志向と集団志向との動態性を生み出す緊張力学の存在。本研究の目的は、2年間で、住民の主体的な課題化学習の成立条件と当該フィールド「地域」概念(日本的形態)との因果連関構造を解明することである。1年目の平成19年度には、下記の成果が得られた。1「理論研究1」(「地域」概念の日本的形態に関する理論分析)「課題化的認職」方法を提起した上原專祿の理論を分析し、固有の「地域」概念の分析を深めた。2「理論研究2」(「地域」概念の日本的形態のモデル化)1を基礎にして、かつ、大塚久雄の「共同体」概念及びR.M.マッキーヴァーの「コミュニティ」概念と上原「地域」概念との比較考察を行い、本研究の仮説である「地域」モデルを設計した。その構成要素(要件)は、次の4点である。(1)「自然村的秩序」のもつ内発的エネルギーの存在と再生産、(2)「中央」勢力圏に対する経済・政治・文化の自立志向、(3)生活・生産圏の異心円的複合構造-曼荼羅的世界観-、(4)個人志向と集団志向との動態性を生み出す緊張力学の備えその成果の詳細は、後記する日本社会教育学会第54回研究大会(平成19年9月9日)において発表した。3「実践分析と仮説の検証1」(内発的地域づくり実践の個別具体事例の調査研究・農漁村)次の2地域の調査研究を行い、前記2の「地域」モデルの検証を行った。・愛媛県宇和島市遊子地域(関連して、愛媛県宇和町に関する資料も収集)・長野県下伊那郡松川町本研究の目的は、2年間で、住民の主体的な課題化学習の成立条件と当該フィールド「地域」概念(日本的形態)との因果連関構造を解明することである。2年目である平成20年度には、下記の成果が得られた。(研究実施計画の1、2及び3は、平成19年度に実施済み)平成19年度の理論研究により仮設した「地域」概念の日本的形態のモデルの要件(要素)は、(1)「自然村的秩序」のもつ内発的エネルギーの存在と再生産、(2)「中央」勢力圏に対する経済・政治・文化の自立志向、(3)生活・生産圏の異心円的複合構造-曼荼羅的世界観-(4)個人志向と集団志向との動態性を生み出す緊張力学の備え、の4点である。平成20年度は、下記によりその検証を行った。4実践分析と仮説の検証2・内発的地域づくり実践の個別具体事例の調査研究(都市住宅地)大阪府貝塚市(福祉ネットワーク)及び奈良市富雄地区の2フィールドについて調査研究を行い、地域モデルの検証を行った。5地域概念の農漁村ケースと都市住宅地ケースとの比較検討による共通要素と個別要素の抽出共通要素:前記のモデル要素(要件)の(3)(4)農漁村ケースでは(1)(4)がほぼ検証された。住宅地の個別要素=(1)については高齢者福祉ケア及び児童安全見守りという個別課題に即したネットワークが機能し絆帯が構築されている。この絆帯ネットが内発的エネルギーを生み出す。(2)については、「死者との対話」、「苦い経験との対話」により学習の内発的エネルギーが生み出され、当該地域の「誇り」(=自律性)形成に接続している。6総括・地域概念の日本的形態と主体的課題化学習の成立との連関構造5で前記したケースの個別条件を前提して、前記連関構造が一定程度確かめられた。これらは、主体的な課題化学習の分析上、有効性をもつ視点として検討する価値がある。
高次統計量の組み合わせによるポアソンショット雑音の密度と要素波形の高精度な推定

本研究の理論的側面では,高次統計量利用のウィークポイントを補うべく信号生成モデル,すなわちパラメトリックモデルを導入して実用化への見通しをねらい,ポアソンインパルス過程で駆動される線形時不変システムを定係数微分方程式でモデル化することからはじまる.次に,線形システムの出力過程,即ち,ショット雑音を離散化して離散線形システムを得た後,抽出すべきポアソンインパルス列のパラメータの推定式表現を離散システムのパラメータと離散化過程の2つの異なった次数の統計量の組合わせにより得る.なお,統計量次数は2次以上を用いるものとし,また高次統計量の推定の信頼性を考慮して基本的に次数の低い統計量から順次用いるものとする.たとえば,2次と3次,2次と4次のような現実から逸脱しない範囲でのあらゆる組合わせを考え,その可能性を吟味した.また一方,要素波形の推定は微分方程式系パラメータの推定問題に置き換えて考えた.一方実際的側面では,開発された方法の妥当性及び有効性を検証するため,計算機による大規模なモンテカルロシミュレーションを行った.そこでは,ポアソンショット雑音のパラメータを離散化過程の異なった次数の統計量の組合わせによって推定する問題を取り上げた.特に2次と3次統計量の組合せと2次と4次統計量の組合せについて詳細に取り扱った.その結果,密度推定では,離散化過程の周辺分布が対象であるばあいでも,直観的な理解に反し2次及び4次統計量の組み合わせによる方法が,2次及び3次統計量の組み合わせによる方法と比較して,必ずしも優位ではないことが示された.このことは,おそらく密度推定式はキュムラント関数から導かれており,密度が高くなるに従って周辺分布がガウス型に近づくため,4次キュムラントが小さくなってしまうことに起因すると思われる.また,要素波形推定は,2次統計量を用いてそのパラメータ推定を行うので,良好な結果が得られた.その他の次数の統計量の組み合わせについては,今後の課題である.本研究の理論的側面では,高次統計量利用のウィークポイントを補うべく信号生成モデル,すなわちパラメトリックモデルを導入して実用化への見通しをねらい,ポアソンインパルス過程で駆動される線形時不変システムを定係数微分方程式でモデル化することからはじまる.次に,線形システムの出力過程,即ち,ショット雑音を離散化して離散線形システムを得た後,抽出すべきポアソンインパルス列のパラメータの推定式表現を離散システムのパラメータと離散化過程の2つの異なった次数の統計量の組合わせにより得る.なお,統計量次数は2次以上を用いるものとし,また高次統計量の推定の信頼性を考慮して基本的に次数の低い統計量から順次用いるものとする.たとえば,2次と3次,2次と4次のような現実から逸脱しない範囲でのあらゆる組合わせを考え,その可能性を吟味した.また一方,要素波形の推定は微分方程式系パラメータの推定問題に置き換えて考えた.一方実際的側面では,開発された方法の妥当性及び有効性を検証するため,計算機による大規模なモンテカルロシミュレーションを行った.そこでは,ポアソンショット雑音のパラメータを離散化過程の異なった次数の統計量の組合わせによって推定する問題を取り上げた.特に2次と3次統計量の組合せと2次と4次統計量の組合せについて詳細に取り扱った.その結果,密度推定では,離散化過程の周辺分布が対象であるばあいでも,直観的な理解に反し2次及び4次統計量の組み合わせによる方法が,2次及び3次統計量の組み合わせによる方法と比較して,必ずしも優位ではないことが示された.このことは,おそらく密度推定式はキュムラント関数から導かれており,密度が高くなるに従って周辺分布がガウス型に近づくため,4次キュムラントが小さくなってしまうことに起因すると思われる.また,要素波形推定は,2次統計量を用いてそのパラメータ推定を行うので,良好な結果が得られた.その他の次数の統計量の組み合わせについては,今後の課題である.
フット8コンディショナルノックアウトマウスを用いた肝癌悪性化責任分子の同定

α1-6フコース転移酵素(FUT8)は、肝癌の生物学的悪性度の指標とされるフコシル化AFP産生に関与しているが、その分子機構は解明されていない。我々は肝細胞特異的に遺伝子発現抑制を行い、発癌過程におけるFUT8蛋白機能を解析する手法として、コンディショナルノックアウトマウス(FUT8loxP/loxP-AlbCre+/-マウス)を作製した。このマウス肝臓において、Cre酵素切断特異的DNAフラグメントを確認し、FUT8mRNA遺伝子発現の低下を確認した。しかし、HPLCを用いた肝FUT8活性を測定では明らかな活性低下は確認できず、レクチンマイクロアレイを用いた肝糖蛋白糖鎖プロファイリングではα1-6フコースは対象マウスのそれに比較し有意なシグナル強度の変化は確認できなかった。平成24年度(最終年度)に実施した研究;コラゲナーゼ還流下にマウス肝実質細胞を分離しFUT8遺伝子発現の検討を行った。肝実質細胞RNAの検討ではFUT8loxP/loxP-AlbCre-/-マウス(Contマウス)に比し、FUT8loxP/loxP-AlbCre+/-マウス(KOマウス)のFUT8遺伝子発現は平均7%まで低下していた。HPLCを用いたマウス肝実質細胞のFUT8活性はノイズにより評価が困難であった。肝実質細胞蛋白質のレクチンマイクロアレイを用いた糖鎖プロファイリングを行い、α1-6フコースに関連するレクチンであるLTL、PSA、LCA、AOL、AALの信号変化に着目し糖鎖変化を比較した。結果、Contマウス分離肝実質細胞を1とするとKOマウス分離肝実質細胞は約0.9の輝度、すなわち、コンデイショナルKOマウス(FUT8loxP/loxP-AlbCre+/-マウス)の肝実質細胞の糖蛋白の糖鎖α1-6フコースは対象マウスのそれに比較し約90%のシグナル強度であった。研究期間全体の研究成果;α1ー6フコース転移酵素(FUT8)は、肝癌の生物学的悪性度の指標とされるフコシル化AFP産生に関与しているが、その分子機構は解明されていない。マウスFUT8遺伝子にloxP、ネオマイシン耐性遺伝子を含むターゲッティングベクターを組み込んだFUT8loxP/loxPトランスジェニックマウスを作製した。このマウスとアルブミン遺伝子のプロモーター下に遺伝子組み換え酵素Creを発現するトランスジェニックマウスを交配することにより、肝細胞特異的にFUT8遺伝子を抑制させたコンディショナルノックアウトマウス(FUT8loxP/loxP-AlbCre+/-マウス)を作製した。このマウスは、FUT8ノックアウトマウスに見られた外観上の成長障害は認めていない。このFUT8loxP/loxP-AlbCre+/-マウスの肝臓DNAからCre酵素切断特異的DNAフラグメントを確認し、loxP配列で挟まれたDNA領域がCre酵素により肝組織中で確かに切断されていることが確認された。次に、肝臓でのFUT8遺伝子発現を肝mRNA由来cDNAを鋳型に用い、リアルタイムPCR定量法(TaqMan probe法)で定量した。結果、FUT8loxP/loxP-AlbCre+/-マウスのFUT8遺伝子発現は、FUT8loxP/loxP-AlbCre-/-マウスを100%とすると平均32%まで低下していた。一方、HPLC(高速液体クロマトグラフィー)を用いてマウス肝臓のFUT8活性を測定した結果、FUT8loxP/loxP-AlbCre+/-マウスのFUT8活性はFUT8loxP/wt-AlbCre+/-マウスのものとほぼ同等であることが確認された。平成23年度は計画通りに達成した。平成23年度の研究計画どおり、FUT8loxP/loxP

トランスジェニックマウスにアルブミン遺伝子のプロモーター下に遺伝子組み換え酵素Creを発現するトランスジェニックマウス(C57BL/6-TgN-AlbCre; The Jackson Laboratory, BarHarbor, ME)を交配することにより、肝細胞特異的にFUT8遺伝子を抑制させたコンディショナルノックアウトマウス(FUT8loxP/loxP-AlbCre+/-マウス)を作製することが出来た。この観点から、達成度は満足できるものと考えられる。また、同年度は、付加的な目標として、作製したマウスの肝臓FUT8活性をHPLCにて測定することを挙げていたが、この目標も達成している。平成23年度の研究成果から、FUT8loxP/loxP-AlbCre+/-コンデイショナルFUT8ノックアウトマウス肝臓において、Cre酵素により、DNAレベルでの遺伝子制御は確認できたが、mRNAレベルでの十分なFUT8遺伝子発現抑制はなされていないことが確認された。蛋白機能の確認は今後の検討課題だが、HPLCの結果から、FUT8蛋白機能抑制も十分なものでない可能性が考えられる。発癌実験の前提として、マウス肝臓でのFUT8遺伝子発現と蛋白機能の抑制が必須条件であるため、次年度以降、肝組織由来蛋白質の糖鎖プロファイリングをレクチンマイクロアレイで検討しα1-6 Fucose認識レクチンのシグナル強度の変化を確認する、マウス肝臓から肝細胞のみを選択的に単離し、DNA・RNA・蛋白レベルでのFUT8発現・機能を確認する、マウス血清中トランスフェリンのフコシル化を計測し肝臓由来蛋白のフコシル化の有無を評価する、肝Cre酵素mRNA量を比較検討する等の解析を行い、作製したFUT8loxP/loxP-AlbCre+/-コンデイショナルFUT8ノックアウトマウスの詳細な評価を行う予定である。肝細胞での明らかなFUT8蛋白機能抑制効果が認められた場合、発癌実験を開始するが、研究期間を考慮し、マウス早期肝癌発症モデルであるストレプトゾトシン誘発方法(STAMマウス)を実験に使用する予定である。糖鎖プロファイリングのレクチンマイクロアレイ関連費用;50万マウス肝臓から肝細胞のみを選択的に単離し、DNA・RNA・蛋白レベルでのFUT8発現・機能解析費用;80万(マウス肝細胞単離は外部委託予定)マウス血清中トランスフェリンのフコシル化評価;50万(抗体購入費など)ストレプトゾトシン誘発マウス肝癌作製費用;300万(処置を外部委託し、観察・解析を実験申請者施行予定)