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磁気を応用したセンチネルリンパ節同定に基づく合理的な肺癌縮小手術の研究

【研究目的】センチネルリンパ節(以下SN)は腫瘍から流入する最初のリンパ節である.SN同定の意義は、このリンパ節に転移がなげれば他のリンパ節には転移は生じていないとする仮説が成立することにある.もしSNに転移がなければ郭清の省略が可能である.SN生検に基づく手術は,米国で乳癌や悪性黒色腫を中心に臨床応用が始まっているが,肺癌ではまだ研究が始まったばかりである.現在,SN同定法には色素法とアイソトープ法(以下RI法)がある.肺癌では色素法は,リンパ節の炭粉沈着のためSN同定は困難である.RI法は,SN同定率は高いが、使用は施設や場所が限られており,取り扱いが煩雑でる.これらの問題を解決するために,肺癌に使用可能な,RI法と比較してその検出率で遜色ない,安全なSN同定法である磁力を応用する方法を発案した.本研究では,非小細胞肺癌患者において新開発の磁力を用いた方法により,SNを同定し得るか検証することを目的とした.【研究方法】磁気を発する磁性体としてMRI用肝臓造影剤、フェルモキシデス注射液(FDX)を使用した.対象は非小細胞肺癌患者38例である、開胸後、腫瘍周囲にFDXを局注した.その後に肺葉切除及びND2aの系統的リンパ節郭清を施行した.郭清リンパ節は、我々が開発した携帯型高感度磁気センサーで磁力を測定した.【研究成績】SNの同定率は81.6%であった.正診率、敏感度、偽陰性率はそれぞれ96.8%、85.7%、14.3%であった.SNが磁気陽性となるまでの時間は、FDX投与後最短で22分,中央値85.7分であった.【結論】我々の開発した磁性体法による非小細胞肺癌患者におけるSN同定法は安全であり、RI法と同様に正確で鋭敏な方法である.今後さらに症例を重ね、本法の適正及び安全性の検証が必要である.【研究目的】センチネルリンパ節(以下SN)は腫瘍から流入する最初のリンパ節である.SN同定の意義は、このリンパ節に転移がなげれば他のリンパ節には転移は生じていないとする仮説が成立することにある.もしSNに転移がなければ郭清の省略が可能である.SN生検に基づく手術は,米国で乳癌や悪性黒色腫を中心に臨床応用が始まっているが,肺癌ではまだ研究が始まったばかりである.現在,SN同定法には色素法とアイソトープ法(以下RI法)がある.肺癌では色素法は,リンパ節の炭粉沈着のためSN同定は困難である.RI法は,SN同定率は高いが、使用は施設や場所が限られており,取り扱いが煩雑でる.これらの問題を解決するために,肺癌に使用可能な,RI法と比較してその検出率で遜色ない,安全なSN同定法である磁力を応用する方法を発案した.本研究では,非小細胞肺癌患者において新開発の磁力を用いた方法により,SNを同定し得るか検証することを目的とした.【研究方法】磁気を発する磁性体としてMRI用肝臓造影剤、フェルモキシデス注射液(FDX)を使用した.対象は非小細胞肺癌患者38例である、開胸後、腫瘍周囲にFDXを局注した.その後に肺葉切除及びND2aの系統的リンパ節郭清を施行した.郭清リンパ節は、我々が開発した携帯型高感度磁気センサーで磁力を測定した.【研究成績】SNの同定率は81.6%であった.正診率、敏感度、偽陰性率はそれぞれ96.8%、85.7%、14.3%であった.SNが磁気陽性となるまでの時間は、FDX投与後最短で22分,中央値85.7分であった.【結論】我々の開発した磁性体法による非小細胞肺癌患者におけるSN同定法は安全であり、RI法と同様に正確で鋭敏な方法である.今後さらに症例を重ね、本法の適正及び安全性の検証が必要である.センチネルリンパ節の検索法として従来の色素法やアイソトープ法を使用せず、磁気を応用した新たな方法を開発中である。まず磁性超微粒子としてフェリモキシデス、MzZnフェライト、Fe_3O_4マグネタイトの三種類を磁気マーカーの候補とし、センチネルリンパ節の同定に可能か否かを検討した。その結果、外部印加磁界10ガウスの条件下では、MnZnフェライトは高濃度でしか磁界変動を確認できず、Fe_3O_4マグネタイトは低濃度で急激に磁性が失われる欠点が認められた。従って三者の中ではフェリモキシデス(商品名フェリデックス)が最も適していると考えられた。次にブタを用いた動物実験を行った。ブタの乳腺ならびに右中葉肺実質にフェリデックスを2ml注入し、腋下リンパ節、右肺門リンパ節の磁気を測定した。その結果、右腋下リンパ節から5.5μT,肺門リンパ節から0.1μTの磁気が検出された。まだ地磁気、商用電源ノイズの除去の問題が完全には解決されていないが、手術室内でも使用可能なペンシル型のセンサーを試作し、臨床応用の段階に入った。乳癌において癌組織周囲にフェリデックス2mlと錫コロイド(アイソトープ)を注入し、40分から60分後に腋下リンパ節の磁気ならびにγ線量を測定した。

その結果、磁気測定法はアイソトープ法と比較してセンチネルリンパ節同定率になんら遜色ないことが判明した。平行して肺癌においてもフェリデックスを癌組織周囲に5ml注入し、およそ60分後にリンパ節を郭清して磁気を測定した。現在30数例に応用したが、およそ90%の症例においてリンパ節内の磁気が測定可能であった。うち一例では磁気検出が可能であったリンパ節のみに微小転移巣が認められ、センチネルリンパ節を同定している可能性が高いと考えられた。今後症例を重ねて磁気と微小転移巣の関係を検討していく予定である。【研究目的】センチネルリンパ節(以下SN)は腫瘍から流入する最初のリンパ節である.SN同定の意義は、このリンパ節に転移がなければ他のリンパ節には転移は生じていないとする仮説が成立することにある.もしSNに転移がなければ郭清の省略が可能である.SN生検に基づく手術は,米国で乳癌や悪性黒色腫を中心に臨床応用が始まっているが,肺癌ではまだ研究が始まったばかりである.現在,SN同定法には色素法とアイソトープ法(以下RI法)がある.肺癌では色素法は,リンパ節の炭粉沈着のためSN同定は困難である.RI法は,SN同定率は高いが、使用は施設や場所が限られており,取り扱いが煩雑でる.これらの問題を解決するために,肺癌に使用可能な,RI法と比較してその検出率で遜色ない,安全なSN同定法である磁力を応用する方法を発案した.本研究では,非小細胞肺癌患者において新開発の磁力を用いた方法により,SNを同定し得るか検証することを目的とした.【研究方法】磁気を発する磁性体としてMRI用肝臓造影剤、フェルモキシデス注射液(FDX)を使用した.対象は非小細胞肺癌患者38例である.開胸後、腫瘍周囲にFDXを局注した.その後に肺葉切除及びND2aの系統的リンパ節郭清を施行した.郭清リンパ節は、我々が開発した携帯型高感度磁気センサーで磁力を測定した.【研究成績】SNの同定率は81.6%であった.正診率、敏感度、偽陰性率はそれぞれ96.8%、85.7%、14.3%であった.SNが磁気陽性となるまでの時間は、FDX投与後最短で22分,中央値85.7分であった.【結論】我々の開発した磁性体法による非小細胞肺癌患者におけるSN同定法は安全であり、RI法と同様に正確で鋭敏な方法である.今後さらに症例を重ね、本法の適正及び安全性の検証が必要である.
書入れ注記による源氏物語享受の様態分析とそのデータベース化に関する研究

本研究は、源氏物語古写本(山岸文庫蔵公条本源氏物語と穂久邇文庫蔵源氏物語間書〈覚勝院抄〉)における物語本文と、そこに書入れられた注(書入れ注記)とを総合的に分析することによって、源氏物語享受の様態を明らかにし、併せて、書入れ注記データベース化の可能性を模索するという方針で続けられてきた。最終年度に行った作業は、以下の通りである。1両本における書入れ注記の成立過程と、そこに記された注記の位相を分析し、それぞれ論文にまとめた。2覚勝院抄の翻刻をし、データベース化のための書入れ注記の分類を行った。3前記1・2をもとに、それぞれデータベース化にむけての試案を提示し、併せて問題点の洗い出しを行った。4前記1・2・3をまとめて、報告書を作成した。本年度は、物語の本行本文と詳細な書入れ注記を併せ持つ『源氏物語』古写本として実践女子大学図書館所蔵の公条本の調査・分析を行った。その結果、公条本の本行本文は青表紙本系統に属し、しかも伝称の淵源の三条西家に関係する諸本、すなわち日本大学本・書陵部蔵三条西証本・肖柏本のグループと近接することが推測された。厖大な書入れ注記のうち、河海抄・花鳥余情など著名な古注釈書の引用の他に、「尭空説」が尭空(三条西実隆)の既成の注釈に見えない該本の独自性を示すこと、また「源語」が『源語類字抄』(1431成立)『続源語類字抄』(1639成立)と関連して、該本の書入れの下限を示す可能性のあることなどを明らかにした。次年度は、公条本の調査を継続するとともに『覚勝院抄』の調査・分析を行い、併せて『源氏物語』が書入れ注記とともに享受された室町期の様態を分析し、本行本文・注記本文のデータ蓄積に着手したい。本年度は、前年度に引き続き、物語の本行本文と詳細な書入れ注記を併せ持つ『源氏物語』古写本としての実践女子大学図書館所蔵公条本の翻刻・入力作業を行い、さらなる調査・分析に備えることとした。また、本年度の主眼点として『覚勝院抄』の調査・分析を行った。当該書は室町中期までの多くの『源氏物語』注釈とは違って物語の本行本文が全文掲載され、厖大・詳細な書入れを有しているところに特徴があり、さらに冷泉家伝流の物語本文との校合の痕跡が発見された。室町後期の三条西家源氏学の最盛期に藤原定家の衣鉢を継ぐ冷泉家との交流が見出せることは、連歌師との交流とともに『源氏物語』の伝流史・注釈史・研究史において重要な1頁を占めるものとして評価しうる。『源氏物語』注釈に連歌師が主導した時期が室町時代にあったことは名高いが、彼らは青表紙原本の再建にも取り組んでおり、その成果が堂上の三条西家に流れる一方で、覚勝院のような僧侶の中にも浸透した事実が、上記の調査・分析によって明らかになった。次年度は、平成1011年度にわたって調査した成果をひととおりまとめ、『覚勝院抄』の翻刻を含めて報告することにしたい。平成10年度は、物語の本行本文と詳細な書入れ注記を併せ持つ『源氏物語』古写本としての実践女子大学図書館所蔵公条本の翻刻・入力作業を行い、分析に備えるためのテキスト・データを作成する一方で、同書の本文の諸本間における位相を調査し、発表した。また、平成11年度は、公条本の分析をするのに並行して『覚勝院抄』の調査・分析を行った。該書はそれまでの『源氏物語』テキストや注釈とは相違して、物語の本行本文とともに厖大・詳細な書入れを有しているところに特徴があるものであり、本来はデータベース化に向けて最も至難な資料と考えられたが、あえてそれを整理することで、複雑多岐な『源氏物語』の伝流史・注釈史・研究史の素材たりうることに挑戦しようと考えた。本年度は、以上の内容をふまえ、研究終了年度であるので、平成1011年度にわたって調査した成果をまとめ、報告書を作成した。また、『源氏物語聞書覚勝院抄』(汲古書院刊)の別冊所収のもの(研究分担者・上野の作成)以来まったく試みられていない同書の翻刻テキストを、同時に公開することとした。
ミジンコの性決定を制御する長鎖ノンコーディングRNAの作動装置の解明

我々はこれまでにオオミジンコの性をオスに決定するダブルセックス1(Dsx1)遺伝子の活性化メカニズムの解析を行い、Dsx1のノンコーディングエキソンとオーバーラップするようにオス特異的に転写され、Dsx1遺伝子を活性化する長鎖ノンコーディングRNA、DAPALRを発見した。さらに我々はDAPALRのDsx1活性化エレメントはDsx1とオーバラープする205塩基であることをin vivoで明らかにし、このエレメントにRNA結合タンパク質が結合しDsx1活性化マシナリーが形成されているという仮説を提唱した。この仮説を検証する為に、平成29年度はミジンコ個体から調製したタンパク質抽出液を用いて活性化エレメントに結合するタンパク質の候補を複数リストアップすることに成功した。候補タンパク質の遺伝子発現に性差が認められなかったことから、DAPALR依存的にRNA結合タンパク質がオス特異的なDsx1活性化能を持つようになることが示唆された。一方で、標的遺伝子の近傍から発現する長鎖ノンコーディングRNAは、標的遺伝子と同様の遺伝子発現制御を受けることが知られているため、Dsx1の発現を活性化する幼若ホルモン及び転写因子ヴリルがDAPALRの活性化に必要か否かを解析した。RNA干渉、変異導入実験等を行うことにより、DAPALRはDsx1と同様にDsx1遺伝子上流のエンハンサー領域に存在するヴリル結合部位を介して幼若ホルモンにより制御されていることが明らかとなった。DAPALRに結合するタンパク質の候補を複数同定できたことに加えて、DAPALRが幼若ホルモン及び転写因子ヴリルにより制御されることを明らかにできたため平成29年度に見出したDsx1活性化エレメント結合タンパク質の候補の解析を進める。まず、in vitroでDAPALRへの結合の特異性を確認後、候補遺伝子の機能解析を行うためにCrispr/Casシステムを用いてノックアウト個体を作出する。変異体にオスの仔を産ませる条件で幼若ホルモンのアゴニストであるフェノキシカルブを曝露し、性決定への関与を確認する。変異が致死性の場合は、RNA干渉も検討する。さらに、RNA免疫沈降法とRNA-Seqを組み合わせたRIP-Seqを行うことによりタンパク質に結合する長鎖ノンコーディングRNAをリストアップする。そして、見出したRNAの機能解析を行うことでDAPALRの遺伝子活性化メカニズムが他のRNAでも共有されているか否かを明らかにする。
並列プログラミングのための反転授業向け学習支援ツールの研究

並列コンピュータが一般化し、そのための並列プログラミングの需要が増加している。並列プログラミングの学習においては、APIの理解およびスレッド制御やデータ依存関係を理解するために、一般に、大量の例題を用いた学習が有効である。今年度は、並列プログラミングのためのフレームワークとして、共有メモリ型並列システム向けのツールであるOpenMPプログラミング、及びプロセッサ内蔵のSIMD演算器のためのプログラミング手法の一つであるAVXプログラミングに対して、学習コンテンツの作成およびプログラミング演習の例題となるwebツールを作成した。この中でwebツールとしては、穴埋め問題、デバック問題、プログラム出力推定問題の3種類に加え、後述するように、少し大きめの穴埋め問題を実装し、疑似的な反転授業形式で、一部の検証を行った。検証においては、通常の講義形式の場合と、その講義と同じ時間で自習教材で学習する疑似的な反転授業を用いて講義を行う場合とで、課題の完成度を比較したが、両者には大きな差はなかった。よって、本方式を実際の反転授業で用いることにより、講義時間の短縮もしくは講義時間内でさらに応用問題を解くことができるなど、学習効果の改善が可能となる。さらに、プログラミングスタイルの全体像を理解させるための演習問題として、新たなwebツールを考案し、実装した。これは、キーワードなどを穴埋めするだけでなく、1行分のプログラムを実装させるものである。これまので穴埋め問題はキーワードを埋める程度の比較的軽いものであり、プログラムの全体を意識しなくても解答可能なものであったが、今回のツールは1行分の追加となるので、プログラムの流れを意識して記述することが必要となり、学習者のプログラミング理解を助けることが期待でき、並列プログラミング学習におけるプログラミング演習の強化を図ることができるものである。当初の予定通り進められている。演習問題として、1行分のプログラミングを書かせるツールを追加したことが予定外の進捗である。当初のスケジュールにしたがって進めているので大きな変更は予定していない。(理由)国内発表の件数が予定した数に達しなかったこと、及びサーバとなるコンピュータとその上で動作するソフトウェアを既存のもので代用したことによる。(使用計画)今後、より優れたソフトウェアを導入し研究環境の整備をすすめ、研究成果を積極的に公表することに努めていく。
発達障害の幼少期評価と早期介入のための遺伝子エピゲノム指標の確立

厚生労働省の知的障害児基礎調査により軽度発達障害児の増加が明らかにされ、その対応は重要な課題となっている。さらに保育・教育の現場の経験および脳科学的・分子生物学的見地から二次障害の予防に早期介入が重要であることが実証されてきた。しかしながら介入拒否の意向を示す保護者もあり、その子どもは発達の改善の機会を逸することが危惧されてきた。本研究の目的は、このような背景の下、保護者に対し説得できる客観的科学的発達障害指標を確立することであった。一方、幼少期の劣悪な環境が脳に及ぼす影響のメカニズムとしてエピゲノム(DNA上の化学修飾)の理解が進み、幼少期の精神ストレスが脳の遺伝子のエピゲノムを変化させ「脳機能」の低下を招くことがわかってきた。そこで、エピゲノム変化に基づく発達障害傾向の幼少期評価法の開発に着手した。幼児を対象とするため、侵襲や痛みを伴う血液採取は避け、口腔粘膜組織を用いて解析を行った。その結果、口腔粘膜では網羅的エピゲノム解析(2万超のヒト全遺伝子を網羅したイルミナ450Kビースアレイを用いたエピゲノム解析法)を行える十分量のDNAを安定的に採取することが難しいことが判明した。そこで非侵襲的に「脳機能」が測定できる光イメージング脳機能測定法(fNIRS法)を用いて発達障害の幼少期評価法を開発することにした。その結果、fNIRS法は装着が簡便で体動にも安定して所見を得ることができる非侵襲的で痛みのない方法であり、幼児にも装着可能であることが確認できた。本研究の初年度に当たる2018年度は、以下を実施した。幼少期環境によるエピゲノム変化や発達障害傾向のある児に特有のエピゲノム所見を獲得すべく、幼児を対象にサンプル採取を行った。この場合、血液採取は侵襲や痛みを伴うため、幼児を対象とした検査方法になりにくいと考え、侵襲性の少ない口腔粘膜組織を用いて解析を行った。その結果、口腔粘膜では網羅的エピゲノム解析に必要なDNA(0.2マイクログラム)を安定的に採取することが難しいことが判明した。そこで非侵襲的で痛みのない「脳機能」が測定できる光イメージング脳機能測定法(fNIRS法)に方法・装置を変更することにした。fNIRS法は神経細胞活動につながる脳血流中の酸素化されたヘモグロビンを測定する装置で、前頭部の各領域で脳活動が変化することが把握できること、課題を与えると活動パターンが変化すること、軽い運動時も測定可能であること、幼児にも装着可能で測定可能であり、発達障害の幼少期評価の指標開発に適した方法であることを確認した。また発達検査(WISC法)を本研究の対象となる幼児に実施し、それぞれの発達段階の評価を行った。今後の研究の推進方策は以下の通りである。2019年度入園児(年少児)に対し、発達検査(WISC法)を実施し各々の発達段階を把握する(健常児10名、発達障害傾向を認める児5名程度)。それらに対し、光トポグラフィー法(fNIRS法)による脳機能測定を行い、特に発達障害傾向を認める児それぞれに特有の所見を獲得する。発達障害傾向を認めた児に対しては、適切な保育を実施する。2020年度前年度に測定した対象児に対し、発達検査(WISC法)と光イメージング脳機能測定法(fNIRS法)による脳機能測定を行い、発達段階の変化による脳機能変化を明らかにする。特に発達障害傾向を認める児で脳機能が改善した児においては、それに貢献した保育方法を振り返り、発達改善につながる保育要素の候補を明らかにする。

その結果、口腔粘膜では網羅的エピゲノム解析に必要なDNA(0.2マイクログラム)を安定的に採取することが難しいことが判明した。そこで非侵襲的で痛みのない「脳機能」が測定できる光イメージング脳機能測定法(fNIRS法)に方法・装置を変更することにした。fNIRS法は神経細胞活動につながる脳血流中の酸素化されたヘモグロビンを測定する装置で、前頭部の各領域で脳活動が変化することが把握できること、課題を与えると活動パターンが変化すること、軽い運動時も測定可能であること、幼児にも装着可能で測定可能であり、発達障害の幼少期評価の指標開発に適した方法であることを確認した。また発達検査(WISC法)を本研究の対象となる幼児に実施し、それぞれの発達段階の評価を行った。今後の研究の推進方策は以下の通りである。2019年度入園児(年少児)に対し、発達検査(WISC法)を実施し各々の発達段階を把握する(健常児10名、発達障害傾向を認める児5名程度)。それらに対し、光トポグラフィー法(fNIRS法)による脳機能測定を行い、特に発達障害傾向を認める児それぞれに特有の所見を獲得する。発達障害傾向を認めた児に対しては、適切な保育を実施する。2020年度前年度に測定した対象児に対し、発達検査(WISC法)と光イメージング脳機能測定法(fNIRS法)による脳機能測定を行い、発達段階の変化による脳機能変化を明らかにする。特に発達障害傾向を認める児で脳機能が改善した児においては、それに貢献した保育方法を振り返り、発達改善につながる保育要素の候補を明らかにする。当初、脳機能に関係する遺伝子のエピゲノム解析のための受託費用を計上していたが、方法を光イメージング脳機能測定に変更したため、当初の使用予定額に比べ14万円程度の残金が発生した。これを次年度の発達評価等に係る費用に充てる予定である。
スズメバチのシルクが有するコイルドコイル構造の精密解析と構造形成機序の解明

スズメバチの幼虫が作るマユ(ホーネットシルク、以下ではHSと略す)が、Coiled-coil構造を主体とした構造を有していることを実験的に証明した。さらに、このCoiled coilの形成に伴うゲル形成能力を利用したCoiled coil構造から成る高伸縮性タンパク質素材を得ることに成功した。スズメバチの幼虫が作るマユ(ホーネットシルク、以下ではHSと略す)が、『Coiled-coil構造を主体とした、羊毛などのケラチンに近い構造を有し、βシートから成る従来のシルクとは全く異なった構造である』ことを実験的に証明することを目的とする。さらに、このCoiled coilの形成が、HS水溶液のゲル化を促進することの実証と、このゲル形成能力を利用したCoiled coil構造から成る高伸縮性タンパク質素材を得るための基礎的知見を得ることを目的としている。この目的を達成するために,平成21年度は以下に示す2課題について研究を行った.(1)HSがCoiled-coil構造を主体としていることを実証する(2)HSのゲル化がCoiled-coil形成を起点として進行していることを明らかにする本年度の研究の成果として、HSのゲルを圧縮乾燥して作製したフィルム(ゲルフィルム)が天然状態のHSと同様の構造を有することが固体NMRおよびX線回折測定より明らかになった。そこで、このゲルフィルムの構造および物性を詳しく調べることによって、HSの天然状態での構造や物性が明らかになると考えた。ゲルフィルムは比較的容易に延伸することができ、延伸したフィルムのX線回折測定からは、分子構造に関する詳細な情報を得ることができた。この結果、HSがCoiled-coil構造を主体としていることが明らかになった。さらに、複屈折や力学測定の結果を組み合わせることにより、ゲルフィルムの物性にCoiled-coil構造の形成が大きく寄与していることが分かった。このような結果は、HSがゲル化する過程において、Coiled-coilの形成が、ゲル化の起点となって進行していることを示唆するものと考えている。この目的の達成に向けて,平成21年度は以下に示す2課題について研究を行った(1)HSの安定同位体元素の導入に関する検討を行う(2)昨年度使用した固体NMR(磁場強度7T)よりも磁場強度が強い高磁場固体NMR(磁場強度14.1T)を用いて,スペクトルの分解能と感度の向上をはかる^<13>C同位体アミノ酸を混ぜた餌を与えて5齢スズメバチ幼虫を飼育する方法を検討した。その結果、^<13>C同位体元素を含むシルク蛋白質を幼虫体内で生合成させることに成功し、^<13>C標識HSを得ることが可能なった。このHSを固体NMR試料として用いることにより、同位体標識部位の構造を選択的、且つ、高感度で解析することが可能になった。さらに、昨年度よりも磁場強度が強い高磁場固体NMRを用いることにより、スペクトルの分解能と感度が大幅に向上した。これらの技術的な進歩により、HSの延伸過程における分子鎖配向挙動を詳細に解析することに成功した。この解析結果は、HS中にCoiled-coil構造が形成されていること、さらに、それらが剛直な分子鎖束を形成していることを示唆するものであった。これらの結果は、上記の目的を達成するための重要な手掛かりを与えた。この目的の達成に向けて,平成23年度は以下に示す2課題について研究を行った.(1)HSの安定同位体元素の導入に関する検討を行う昨年までに、^<13>C同位体元素を含むシルク蛋白質を幼虫体内で生合成させることに成功した。しかし、吐糸する前に死亡してしまい、繭として得ることはできなかった。今年度は、まず、幼虫に与える餌の検討から行い、^<13>C同位体標識された繭を得ることを可能にした。Alaを^<13>13C同位体標識した繭を使って固体NMR解析を行うことにより、ホーネットシルク中に存在するαヘリックス構造の割合を定量評価することに成功した。この結果と、バイオインフォマティックス計算からの結果を組み合わせることにより、ホーネットシルクの詳細な分子構造を解明することができた。

さらに、ホーネットシルクのハイドロゲルから円筒状に乾燥・収縮させてチューブを作製する技術を開発した。このチューブは、天然状態のホーネットシルクと同様のCoiled-coil構造を有し、さらに、高い伸縮性を示した。
人体生理モデルに基づく人体周辺微気象のCFD解析と吸入空気質の同定

本研究では、室内空気汚染およびエネルギー問題を解決することを目的とし、温熱快適性・呼吸空気質・省エネルギー性を考慮した空調システムおよび室内VOC濃度低減建材に着目した。そこで、パーソナル空調システムの最適設計に関する検討およびパッシブ吸着建材を用いた室内空気質改善に関する検討を行い、以下の知見を得た。(1)パーソナル空調システムの最適設計に関する検討(1)人体気流感特性;パーソナル空調により温熱快適性は向上するが、目を中心とした顔面や肌が露出している人体部位において気流の不快感が生じる。(2)人体温冷感特性;頭部の温冷感は全身温冷感に大きく寄与している。そのため頭部を局所的に冷却することによって、効率よく全身の温冷感を下げ、快適へ近づく傾向にある。(3)呼吸空気質特性:パーソナル空調の使用により、パーソナル空調からの新鮮な空気で人体は包み込まれ、特に顔面周辺の空気が新鮮な状態にある。(4)人間の熱的適応特性;歩行に伴い生じる熱的不快感をパーソナル空調により510分で緩和させることが可能であるが、緩和後2,3分すると寒さや目の乾燥が原因で快適感が低下する傾向にある。(2)パッシブ吸着建材を用いた室内空気質改善に関する検討(1)パッシブ吸着建材の使用により室内平均ホルムアルデヒド濃度は低減される。(2)パッシブ吸着建材の下流側で濃度境界層が発達している。(3)室内で全面に設置すると室平均濃度は低くなるが、濃度境界層が発達し、下流側での濃度低減効果が小さくなる。(4)使用面積が狭い場合でも、ホルムアルデヒドを効果的に除去できる。今後は、本研究で提案したパーソナル空調システムとパッシブ吸着建材を同時に適用した室内環境における呼吸空気質の検討および省エネルギー性の検討を行う予定である。本研究の最終的な目的のひとつであるパーソナル空調システムの最適設計のため、本年は被験者実験によるパーソナル空調の実態調査および被験者実験とCFD(Computational Fluid Dynamics:数値流体力学)によるパーソナル空調使用時の人体部位別温感特性の解明を行った。これにより、現行パーソナル空調の問題点を明らかにし、快適かつ省エネルギー的な新たなパーソナル空調システムを開発するための判断材料となる知見を得ることを目的とした。(1)被験者実験によるパーソナル空調の実態調査現行パーソナル空調の使用状況把握と問題点を解明することを目的として行った。ここでは被験者が自分の熱的好みに応じて風向・風速・温度を自由に制御する様子の統計的分析およびアンケート調査を行った。その結果、次のような問題点が判明した。(1)顔面に直接気流を浴びると、気流感や目の乾燥により全身の不快感が生じる。(2)コントロールが面倒という問題点からエネルギーの浪費が懸念される。(3)使用後の温冷感・快適感に男女差が見られる。(2)被験者実験とCFDによるパーソナル空調使用時の人体部位別温感特性の解明人体部位別温感特性を解明することを目的として、現行パーソナル空調の風向を変更させた場合の被験者実験による人間の生理・心理の影響の解明とCFD解析による人体周辺気流性状および温熱環境性状を検討した。その結果、次のような傾向が見られた。(1)効率的に人体を冷やすためには、特に顔面周辺を冷却するのが有利であり、顔面周辺以外の部位が高温であっても全身温冷感に大きな影響は及ぼさない。(2)手は気流に暴露されることによって皮膚温は大きく変化をするが温冷感には大きな変化はなく、全身温冷感にもあまり大きな影響を及ぼさない。(3)今後の展望今後はパーソナル空調システムにおける人体温冷感の快適性の向上のみならず、吸入空気質の向上にも焦点を当て研究を進めていく予定である。

本年度は(1)CFD (Computational Fluid Dynamics:数値流体力学)によるパーソナル空調使用時の呼吸空気質の検討(2)被験者実験によるパーソナル空調使用が熱的刺激緩和時間(熱的適応特性)と作業効率へ与える影響の検討(3)CFDによる呼吸空気質改善のためのVOC濃度低減効果の検討を行った。これにより、パーソナル空調システムの最適設計およびVOC吸入性状の実質的評価を目的とした。(1)パーソナル空調使用時の呼吸空気質の検討パーソナル空調使用時の受動喫煙リスクを検討した。その結果、パーソナル空調を使用することで、受動喫煙者の吸込気煙の濃度及び副流煙の吸引濃度が低減し、清浄空気を吸引する確率が高くなる。(2)パーソナル空調の使用が熱的刺激緩和時間と作業効率へ与える影響の検討活動変化に伴う熱的刺激緩和時間および作業効率を検討した。その結果、(1)歩行後にパーソナル空調を使用することにより、約510分程度の短時間で効率よく熱的中立状態に達する。しかし、(2)熱的中立状態に到達後2,3分経過すると快適感は低下する。(3)作業中のパーソナル空調の使用により熱的快適性及び空気質に対する室内環境満足度や作業効率が向上する。(3)呼吸空気質改善のためのVOC濃度低減効果の検討パッシブ吸着建材のVOC濃度低減効果を検討した。その結果、(1)室内全面にパッシブ吸着建材を設置することで室平均濃度は低くなるが、使用面積が狭い場合でもVOCを効果的に除去できる。(2)パッシブ吸着建材設置による呼吸空気質改善が望める。(4)まとめと今後の予定パーソナル空調を使用することで効果的な冷却および呼吸空気質の向上が権認でき、室内環境満足度や作業効率も向上する。また、パッシブ吸着建材設置によりVOC濃度の低減を確認することができ、今後はVOC濃度を考慮した呼吸空気質の詳細な検討を行う予定である。
水と緑の固有性を継承する沖縄らしい基地跡地利用の実現に向けた実践的研究

普天間飛行場跡地利用(約480ha)を進めていく中で、水と緑のネットワークを考えて、持続可能な地域環境を整えるために必要な事項として、流域圏における水収支と水利用を解明し、土地利用計画としてのあり方について研究を進めた。これまでの研究の成果をベースにしながら、今年度は、普天間飛行場が現在涵養源となっている宜野湾市の大山土地区画整理事業、および西普天間住宅地区土地区画整理事業との大規模開発事業間の調整の場面において、調査した結果を踏まえながら調整を果たし、研究策定支援型の成果を上げた。実際には、沖縄県庁企画部企画調整課、宜野湾市政策部まち未来課、宜野湾市市街地整備課、観光農水課、跡地利用計画請負コンサルタント、地主会等に対して調査結果を踏まえた地下水の流域圏単位での水の利活用計画及び表面の土地利用や涵養対策と連動し土地利用のあり方について、部局間調整及び対地権者勉強会、コンサルタントへの情報提供等を実施しながら計画調整を行ってきた。それにより、緑地計画をより効果的な位置に配置することなどを提案し、一部は行政計画に反映された。提案型研究として研究成果を実際の開発の中に位置づけられたのは有意義な成果だといえる。学会論文や学会発表も精力的に行った。また、緑化によるまちづくりの先進国であるシンガポールで開催される国際学会の機会に合わせて渡航し、HDBやNparksに緑化と都市づくりについてヒアリングを行った。学会発表も行い、また、当初予定していた海外事例視察にも行くことができ、さらに研究成果を還元すべき相手先(行政や地権者)との関係も築けているため普天間飛行場を含む宜野湾の5流域での地下水の水収支については、ほぼ正確な値が出てきており、また、地権者含め地域にも説明ができてきている。涵養量としてどの程度必要なのか、については説明しえたと考える。一方で、これを次にどのように地下水として涵養するか、緑地から涵養するのか、浸透桝などから涵養するのか、民有地の緑化規定まで盛り込むのか、等については、まだ合意が見られないことから、現在一番コストが低いと考えられる国立公園の緑地の取り方について、新規に生み出される市街地とのいい関係をどのようにするか等事例を集めて、整理していきたい。宜野湾市普天間飛行場跡地利用計画として、平成25年3月に「全体計画の中間とりまとめ」1)が策定され、その中で地下水保全の方針がまとめられた。しかしその後の検討の中で、地下水をどの程度保全すべきなのかという量的な検討や、流域別の検討については不十分であった。行政が策定する基地跡地利用基本構想について計画策定支援型の取り組みを著者が実施せざるを得なかった経緯は、大きく2点ある。1点目は平成24年3月に制定された「沖縄県における駐留軍用地跡地の有効かつ適切な利用の促進に関する特別措置法(以下、特措法)」における基地跡地利用特有の時間的制約である。2点目は、1点目の時間的制約を考慮すると環境配慮については返還前の早期の検討が重要にも関わらず基地内に立ち入れない事から、現在主流の地下水を含む水収支モデルの解析手法であるタンクモデルを使用できないという点である。実際の大規模開発では、法に基づく戦略的環境アセスメントが実施される。しかし、先行して返還された跡地利用計画では、返還後基本構想から基本計画へと急速に移行する為、戦略的環境アセスメントによって検討内容を根本から変更する事は難しい状況であった注4)。現状では普天間飛行場を涵養源とする地下水が、海岸段丘下で湧水となり、活発な農業用水利用がなされており、基地跡地の開発の仕方いかんでは多大な影響を与える事が明らかな為注5)、事実に基づく慎重な検討が求められる。しかし、1点目の特措法の時限縛りにより一度返還されてしまうと環境配慮を含めた時間をかけた協議が難しいという矛盾を抱える。以上より、返還前の立ち入りが不可能な基本構想検討段階において、可能な限りの環境配慮と検討が重要となる。将来にわたる水紛争を未然に防ぐ為、また現在主流の調査手法が使えない事より、大学の中立的で試行的な調査研究による計画策定支援が必要となった。普天間流域下において湧水量実測調査を継続した事で、1各湧水群の降水量と湧水量の関係を説明する応答モデルを作成し、日流量変化を概ね短期降水量累計と長期降水量累計、及び定数項で再現できるモデルが得られた事(R2=0.5100.77)、2、1によりタンクモデルを組めない現在においても仮想的なタンクモデルの推計が可能となり、現在ほぼ唯一の水収支と地下構造の合理的な推定根拠となっている事、3これにより、基地跡地利用の100haの大規模緑地計画の配置計画に対して、根拠のある配慮事項の提案を行える事、4及び計画策定支援研究としてこれらを調整し行政計画に反映してきたためである。また、国内の先進的な緑地を中心とした街づくり(アイランドシティ、幕張)、跡地が国営公園になった事例(海の中道海浜公園)などの事例調査も実施できた。実践的な研究として、これらの成果について地主や行政との勉強会も開催した。

これまでの研究の成果をベースにしながら、今年度は、普天間飛行場が現在涵養源となっている宜野湾市の大山土地区画整理事業、および西普天間住宅地区土地区画整理事業との大規模開発事業間の調整の場面において、調査した結果を踏まえながら調整を果たし、研究策定支援型の成果を上げた。実際には、沖縄県庁企画部企画調整課、宜野湾市政策部まち未来課、宜野湾市市街地整備課、観光農水課、跡地利用計画請負コンサルタント、地主会等に対して調査結果を踏まえた地下水の流域圏単位での水の利活用計画及び表面の土地利用や涵養対策と連動し土地利用のあり方について、部局間調整及び対地権者勉強会、コンサルタントへの情報提供等を実施しながら計画調整を行ってきた。それにより、緑地計画をより効果的な位置に配置することなどを提案し、一部は行政計画に反映された。提案型研究として研究成果を実際の開発の中に位置づけられたのは有意義な成果だといえる。学会論文や学会発表も精力的に行った。また、緑化によるまちづくりの先進国であるシンガポールで開催される国際学会の機会に合わせて渡航し、HDBやNparksに緑化と都市づくりについてヒアリングを行った。学会発表も行い、また、当初予定していた海外事例視察にも行くことができ、さらに研究成果を還元すべき相手先(行政や地権者)との関係も築けているため今年度は引き続き、地下水水位調査を実施し、仮想タンクモデルと実際の水位の変動についての相互関係について考察を進める。また国内外の事例を調べて、検討を進め、地主や行政に研究成果を還元しながら、跡地利用計画の計画策定支援にあたる。普天間飛行場を含む宜野湾の5流域での地下水の水収支については、ほぼ正確な値が出てきており、また、地権者含め地域にも説明ができてきている。涵養量としてどの程度必要なのか、については説明しえたと考える。一方で、これを次にどのように地下水として涵養するか、緑地から涵養するのか、浸透桝などから涵養するのか、民有地の緑化規定まで盛り込むのか、等については、まだ合意が見られないことから、現在一番コストが低いと考えられる国立公園の緑地の取り方について、新規に生み出される市街地とのいい関係をどのようにするか等事例を集めて、整理していきたい。海外事例の調査を予定していたが、海外調査は実施が不可能であったため。現在でも継続して研究を進めていくため、調査先との丁寧な調整を進めてから次年度以降に海外調査を実施する予定である。研究計画申請時に予定していた海外公演事例の視察2件について、1件が残っており、それを実施する予定である。
悪性脳腫瘍に対する新しい免疫療法の開発-各種cDNAを移入したeffector細胞を用いた養子免疫療法-

最初に、ヒト脳腫瘍における発癌遺伝子産物の発現を検索した所、EGFR,C-myc,ki-ras等の各遺伝子産物が、ヒト悪性神経膠腫の4060%に発現されていた。In situ hybridizationでも、これら発癌遺伝子の増幅が同程度、認められ、患者の予後、及び組織像と対比しながら、発癌遺伝子の意義に関しての検討を進める予定である。特に、発癌遺伝子の増幅と組織適合遺伝子産物の発現との間に相関関係を認める傾向も得られ、腫瘍増殖に伴う両者の関連性にも検討を加える予定である。一方、脳腫瘍に対する免疫応答が弱い原因の一つとして、この組織適合遺伝子産物の発現が乏しい点も考えられる事より、直接、脳腫瘍細胞に、これらの遺伝子を注入して異物化を図った所、腫瘍リンパ球混合反応は増大し、刺激リンパ球の抗腫瘍活性も、23倍強まる事実も判明した。更に、IL-2等のリンホカインも併用して、この活性リンパ球をより有効な腫瘍排除の方向に進め得るか否かも検討中である。更に、IL-2添加培養によるkiller細胞の誘導に際しては、Leu4単クロ-ン抗体でtriggringを図った後、三次元回転培養を行うと、より強力なkiller細胞が、より多量に得られる事実も判明し、今後、臨床面での応用も予定している。最後に、担脳腫瘍マウスを用いた実験より、担脳腫瘍の状態では、液性免疫の二次応答が減弱しており、免疫グロブリンのクラススウェッチが特異的に障害されている事実も観察され、その原因の一つとして、脳における抗原呈示能の障害が示唆された。今後、マウス間のリンパ球移入システムを用いて、脳腫瘍状態における免疫担当細胞間の異常に関しても検討を進め、脳腫瘍に対する免疫療法の可能性に関しての研究を予定している。
Effects of Runx1-associated lncRNA on asthma pathogenesis

Runx1欠損マウスはヒト喘息疾患様の気道炎症が自然発症するが、その機序は分かっていない。遺伝子座の分析結果、Runx1遺伝子上流に存在するロングノンコーディングRNA (long non-coding RNA (lncRNA))を発見した。Runx1-lncRNAは発現量が非常に少ないが、CD4T細胞特異的な発現を示し、遺伝子ノックダウンにより既知のRunx1標的遺伝子の発現異常が認められた。Runx1-lncRNA欠損マウスはRunx1欠損マウス様な喘息様疾患が発症することが明らかになった。この研究で「Runx1-lncRNAがRunx1の作用に影響を与えると考えられる」と結論される。医歯薬学
M期チェックポイント機構において分裂酵母Mis6動原体複合体が果たす役割の解明

M期チェックポイントは、スピンドルと動原体(キネトコア)が正しく結合するまでM期中期から後期への細胞周期の進行を抑制する制御機構です。本研究では、「動原体の構成要素であるMis6-Sim4複合体がM期チェックポイント機構においてどのような役割を果たしているか」に焦点を当てて解析を進めてきました。昨年度までに、Mis6-Sim4機能が損なわれるとM期チェックポイント機構の構成因子であるMad2蛋白質が動原体に局在化出来なくなることを見出しました。本年度は、この点をさらに明確にするため、動原体あるいは紡錘体とMad2蛋白質を同時に蛍光標識・視覚化して、生細胞中でのそれらの挙動を観察しました。その結果、Mad2は、野生株細胞ではM期prometaphaseにおいて核膜から動原体、そして紡錘体(紡錘極体)へと局在を変化させますが、Mis6、Sim4変異体では核膜から動原体を経ずに紡錐体(紡錘極体)へと局在を変化させることを明らかにしました。さらに本年度は、Mis6複合体とMad2蛋白質の物理的相互作用についての可能性を検討しました。細胞内で過剰発現したMis6蛋白質の部分断片とMad2が免疫共沈するか否かを調べたところ、Mis6がそのN末領域を介してMad2と結合している可能性が示唆されました。この結果は、Mad2が動原体上に集積するためのプラットフォームとしてMis6複合体が機能している可能性を示唆しています。これらの成果を、他の研究プロジェクトより得られた成果とあわせてMolecular Biology of the Cell誌に公表しました。Mis6は進化的に保存された動原体タンパク質で、分裂酵母Mis6はSim4タンパク質と複合体を形成しています。紡錘体形成阻害剤(CBZ)を分裂酵母の培養液中に添加すると、野生株細胞の場合ではM期チェックポイントの働きによりM期中期で細胞周期が遅延しますが、Mis6動原体タンパク質に欠損を持つmis6-302変異体ではM期チェックポイントが機能せず、細胞周期が遅延しませんでした。M期チェックポイントにはMad2経路およびBub1経路の二経路が存在します。Mad2タンパク質のM期動原体への一時的集積がmis6-302変異細胞およびsim4欠失細胞で起こらないことはすでに明らかにしていましたが、今回、Bub1タンパク質は、Mad2の場合とは異なり、両変異細胞でもM期動原体へ集積することを明らかにしました。遺伝的交雑によりmis6mad2二重変異体、mis6bub1二重変異体、mis6mad2bub1三重変異体を作成して準許容温度での生育を比較したところ、mis6bub1およびmis6mad2bub1変異体の生育はmis6単変異体に比べて顕著に悪化しました。これに対してmis6mad2二重変異体の生育はmis6単変異体とほぼ同等でした。これらの結果は、Mis6-Sim4がMad2経路にのみ特異的に関与している可能性を示唆しています。sim4欠失細胞中での染色体(動原体)の運動をライブ観察したところ、紡錘体と正常な結合していないと思われる動原体が高頻度で観察されました。mis6、sim4変異細胞では、そのような動原体と紡錘体の結合異常が生じるにもかかわらずMad2チェックポイントが働かないために、致死的異数体が高頻度で生じているものと考えられます。現在、これらの結果をまとめた論文を投稿中です。
ロシア西側周辺における環内海地域協力の研究

現在ヨーロッパにおいて進行中の環内海協力として環バレンツ海、環バルト海、環黒海を対象に、他の地域協力との関係とその影響を中心に研究することを目的としている本研究は、「計画研究」グループと連動しながら行う必要がある。本研究の初年度にあたる平成7年度は夏以降、「計画研究」グループと合同の研究会を以下のように開き、本研究の意図するロシア西側周辺地域における特殊性及び環内海地域協力の普遍的な意義の検討、さらに地域概念の再検討もあわせて行った。報告者はいずれも研究協力者である。11月4日小松久男「中央アジアにおける地域協力の試み」柴理子・高橋和「"東欧"概念の再検討」12月22日大庭千恵子「マケドニアの現状1994-1995年」小柏葉子「南太平洋フォーラムのAPECへの対応と関与」3月22日小泉裕美子「地域概念の再検討:ミクロネシアを例に」金顕真「日本海地域における環境協力:ロシアによる核廃棄物投棄問題」さらに1月には北海道スラブ研究センター開催のシンポジウムにおいて、研究代表者百瀬を司会者、研究分担者大島と菅原を報告者として本年度の研究成果のまとめとして1つの部会を形成した。報告のテーマは以下の通りである。1月26日大島美穂「環バレンツ海協力と北欧諸国」菅原淳子「バルカン諸国と環黒海協力」このほか今年度の大きな研究成果として、研究代表者百瀬、研究分担者大島および志摩の3人による岩波新書『環バルト海:地域協力のゆくえ』(95年9月)、及び百瀬を編者として3人の研究分担者と9人の研究協力者による『下位地域協力と転換期国際関係』(有信堂、96年2月)の出版がある。
次世代都市モデルの多数地震シナリオ統合地震シミュレーションに基づく被害推定

メタモデリング理論の構築に関して,1次元梁モデルと連続体モデルの比較を行った.1次元梁モデルは,1次元棒モデルについで最も簡単な構造力学の物理モデルである.しかし,連続体モデルが2階の微分方程式を支配方程式とすることに比べ,1次元梁モデルは4階の微分方程式を支配方程式とし,指定すべき境界条件の数も多く,数理的には複雑である.さらに,梁要素は,節点の自由度として変位の他,曲げ角を使い,計算力学の観点からみても複雑である.このため,梁モデルと連続体モデルの比較は,メタモデリング理論の第一歩として適当である.梁モデルから連続体モデルの精緻化に関しては,予想通り,対応する境界値問題を解く際こは,梁モデルで仮定された変位関数は,近似無しで使われる連続体モデルの正解にほぼ一致することが示された.両者の違いは,主に梁モデルで行われる境界条件の近似に起因する.この結果,梁モデルでは,変位関数に比べ,微係数(曲げ角)の精度が低くなる.また内力となる曲げモーメントとせん断力の精度が低い.この点を考慮し,梁モデルの変位関数が,連続体モデルの共役勾配法の優良な初期解として使えることが確認された.連続体モデルから梁モデルの単純化に関しては,連続体モデルの3次元変位関数から,それに対応する梁モデルの1次元変位関数が計算できることが示された.曲げ角関数も同様である.注目すべきは内力である.従来の断面の応力から算出するのではなく,対応する梁モデルの変位関数・曲げ角関数を使って,曲げモーメント関数とせん断力関数を計算することが効率的かつ正確であることが示された.25年度が最終年度であるため、記入しない。25年度が最終年度であるため、記入しない。
胃癌幹細胞同定のための３次元培養法の確立と、発癌機序解明及び分子標的治療への応用

胃癌の発癌機序解明や有効な治療法の開発に役立てることを目的として今回の研究を行った。3次元胃上皮細胞培養実験を用いて一正常細胞が進行癌に至る過程を幹細胞の遺伝子発現変化や腫瘍形成能に着目し解析を行った。その結果、1胃3次元培養オルガノイドの確立と、2胃発癌候補遺伝子の抽出、さらに3オルガノイドを用いた幹細胞の腫瘍化能の評価が可能となった。現在、抽出した遺伝子の発癌への関与をin vitroや遺伝子改変マウスで解析を継続中である。胃癌の発癌機序解明や有効な治療法の開発に役立てることを目的として、従来の遺伝子改変マウスを用いた発癌モデルなどin vivoの実験系に加えて、3次元胃上皮細胞培養実験を組み合わせることにより、一正常細胞が進行癌に至る過程を分子レベルで明らかにし、今後の胃癌早期発見や新規治療法開発研究につながる基礎研究を行った。まずマトリジェルを用いた胃3次元培養いわゆるオルガノイド形成に着手した。Sato, Barkerらの手法(Nature 2009,2010)を参考とし、まず野生型マウス胃から胃上皮細胞を単離、培養しin vitroにおける3次元培養系の確立を成功させた。その後Helicobacter感染マウス胃やMNU刺激後の胃からも3次元培養に成功した。得られた3次元培養胃組織において幹細胞候補タンパクを免疫染色にて解析したところ、Dclk1はHelicobacter感染オルガノイドにおいて陽性細胞数が増加している傾向が見られた。しかしながらこれらの炎症オルガノイドのヌードマウス移植実験では腫瘍形成能を認めなかったことから、慢性炎症のみで幹細胞におこる変化では腫瘍形成能獲得は困難であることが示唆された。感染後のマウス胃から作製した3次元培養オルガノイド細胞からmRNAを抽出し網羅的遺伝子発現解析を行い幹細胞候補遺伝子の絞り込みを行った(学会発表)。その結果Isxなどの新規腸管特異的分子の高発現を見出した。Isxについては更に胃発癌との関連をin vitroやヒト胃癌組織においても解析を進めている(学会発表)。以上の結果から、1胃3次元培養オルガノイドの確立と、2胃発癌候補遺伝子の抽出、さらに3オルガノイドを用いた幹細胞の腫瘍化能の評価が可能となった。今後は抽出した遺伝子の発癌への関与をin vitroや遺伝子改変マウスで解析し、さらに胃発癌機序の解明を行っていく予定である。Helicobacter pyloriが胃癌の発症に深く関与している可能性が示されているが、現在もなお、本邦における胃癌罹患率・死亡率はいまだ上位であり、その発癌機序解明や有効な治療法の開発は急務である。近年の臓器幹細胞および腫瘍幹細胞研究やゲノム解読技術の進歩はめざましく、それらの知見をもとにして、従来型の遺伝子改変マウスを用いた発癌モデルなどin vivo実験に加えて、3次元胃上皮細胞培養実験を組み合わせることにより、一正常細胞が進行癌に至る過程を、腫瘍幹細胞という観点から分子レベルで明らかにし、今後の胃癌早期発見や新規治療法開発に役立てることを目的とし、本研究を開始した。平成24年度はまずSato, Barkerらの手法(Nature 2009,2010)を参考とし、胃上皮細胞を単離、培養しin vitroにおける胃上皮細胞培養系の確立を行ってきた。まず野生型マウスから胃を採取し、EDTA溶液中で3時間振盪することにより、上皮の接着をゆるめ、物理的刺激を加えることにより胃腺上皮を分離採取し、マトリジェルを用いた3次元培養を開始した。この際、胃体部上皮細胞においてはいまだ正常幹細胞マーカーが明らかとなっていないため、胃体部、前庭部を含めた全胃上皮を使用した。ポジティブコントロールとしてLgr5陽性腸上皮細胞を用いるため、現在、Lgr5免疫染色を試験している。3次元培養系は再現性をもって確率しつつあるが、得られたin vitro胃上皮組織が、実際に正常胃上皮構成細胞である壁細胞、主細胞、ECL細胞、表層上皮細胞などに分化していることを、免疫染色により確認する点は、現在進行中である。今後は実験計画に基づき、当施設倫理委員会審査取得済みのヒトの胃癌検体を用いて3次元培養培養を行い、腫瘍幹細胞の同定や抗がん剤感受性の検討を進めていく。初年度、胃上皮細胞の3次元培養に着手してきたが、既報にもとづき10種類程の試薬を培養液として調整し上皮細胞に添加し実験を開始した。濃度の微妙な違いや培養時間の条件検討を行い、最適な条件を決定するために予想以上に時間を要した。確立されている癌細胞など株化細胞と異なり、新鮮な胃組織から細胞を単離・培養するため、動物の個体差などもあり、時間を要する結果となった。