hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グリセロールに対するL. reuteriの遺伝子発現様式のin vivo解析

Lb.reuteriは、グリセロールを基質として3-ヒドロキシプロピオンアルデヒド(3-HPA)を生成する。菌体外に放出された脱水型の3-HPAは、液体培地中では可逆性のある3-HPA水和型や二量体などの形態をとり(HPAシステム)、それら3-HPAはロイテリンと総称されている。ロイテリンは、グラム陽性菌、グラム陰性菌、酵母、カビ、原生動物、ウイルスに至るまで非常に広い抗菌スペクトルを示し、その生育を抑制する。それら微生物への抗菌機序は、その広い抗菌スペクトルから、微生物のリボヌクレオチド還元酵素活性の抑制によるものと推察され、酵素結合部位へのリボヌクレオチドとの競合やリボヌクレオチド還元酵素のスルフヒドリル基への作用などが考察されている。3-HPAは反応性に富んだ物質であるため、消化管内でLb.reuteriがロイテリンを産生している報告はなかった。そこで、無菌マウスにLb.reuteri JCM 1112の1菌株を定着させ、^<13>C_3-グリセロールを用いた二次元核磁気共鳴法によりマウス盲腸内で3-HPAをin vivo検出した。さらに、^<13>C_3-グリセロールを自由摂取させたマウス消化管から回収したLb.reuteriでは、グリセロールからの3-HPA産生に関与する遺伝子が、グリセロール無摂取群と比較して有意に発現していた。特に、グリセロールトランスポーター遺伝子であるpduFの発現量は、グリセロールを摂取していない群との有意差を認めた。腸内フローラ構成細菌に対し、消化管内で産生される抗菌物質の作用がプロバイオティクスの整腸効果として示唆されているが、in vivoでそのような抗菌物質を検出した報告はなかった。Lb.reuteriの産生した3-HPAのin vivo検出により、プロバイオティクスが哺乳動物の消化管内で抗菌物質を産生していることが初めて証明された。L. reuteriを用いた抗菌性試験は数多く報告されているが、in vivoでのロイテリン産生はこれまで証明されていなかった。研究代表者と連携研究者の福田は、ループアッセイ法によるL. reuteriノトバイオートmonoassociate(消化管内L. reuteri単一フローラ)マウスの盲腸内容物から1H,13C-2次元核磁気共鳴(NMR)法によりロイテリンを高感度でin vivo検出できるシステムを構築した。ノトバイオートマウスは、特定の微生物の生体影響やプロバイオティクス効果を検討できる有効な実験材料である。当該年度では、ヒト消化管由来の乳酸菌Lactobacillus reuteri JCM 1112T株(親株)のノトバイオートマウスに、13C3-グリセロールを自由摂取させた各々のマウス消化管内容物から2次元核磁気共鳴法を用いて糞便中のロイテリンを検出し定量した。その抗菌物質(ロイテリン)合成酵素遺伝子群の破壊(〓gupCDE)株によるmonoassociateマウスからは、ロイテリンは検出されなかった。また、JCM 1112T株によるノトバイオートマウスの消化管内容物で増殖したL. reuteriのRNAを精製し、グリセロールデヒドラターゼ遺伝子(gupCDE)などロイテリン合成に関わる遺伝子の発現解析を行った結果、その発現においてグリセロール無投与群との有意差が認められた。

Lactobacillus reuteri JCM 1112^T(親株)と、そのgupCDE遺伝子破壊(ΔgupCDE)株のノトバイオートマウスを用いて、^<13>C_3-グリセロールの代謝産物であるロイテリンおよび1,3-プロパンジオールのin vivo検出と定量を行った。その産生に関連するL.reuteriの5つの遺伝子についてトランスクリプトーム解析を行い、宿主消化管内のグリセロールの有無が、本菌株の遺伝子発現に与える影響を検討した。L.reuteriのΔgupCDE株およびL.reuteri JCM 1112^T(親株)をgerm-freeマウスへ経口投与し、それぞれのノトバイオートマウスを作出した。各ノトバイオートマウスに^<13>C_3-グリセロールを含む飲料水を自由摂取させ、^1H,^<13>C-2次元NMR法により、消化管内容物および糞便中のロイテリンを検出・定量に成功した。さらに、各ノトバイオートマウスの腸管内容物からL.reuteriのRNAを精製し、トランスクリプトーム解析を行い、各菌株おいてグリセロールの有無による遺伝子発現プロファイルを比較した。その結果、グリセロールの自由摂取により、マウス消化管内のL.reuteriのもつグリセロール輸送遺伝子およびロイテリン合成に関与する5つの遺伝子発現が強くなる傾向を得た。すなわち、消化管に到達したグリセロールによりそれらの遺伝子が誘導されており、in vivoでのロイテリン産生を裏付ける知見を得ることができた。以上のことから、経口摂取したプロバイオティクスが、消化管内で抗菌物質を産生している証明となる。今後、食中毒細菌を生菌摂取し、抗菌性が発揮されるかどうかを試験する予定である。Lb.reuteriは、グリセロールを基質として3-ヒドロキシプロピオンアルデヒド(3-HPA)を生成する。菌体外に放出された脱水型の3-HPAは、液体培地中では可逆性のある3-HPA水和型や二量体などの形態をとり(HPAシステム)、それら3-HPAはロイテリンと総称されている。ロイテリンは、グラム陽性菌、グラム陰性菌、酵母、カビ、原生動物、ウイルスに至るまで非常に広い抗菌スペクトルを示し、その生育を抑制する。それら微生物への抗菌機序は、その広い抗菌スペクトルから、微生物のリボヌクレオチド還元酵素活性の抑制によるものと推察され、酵素結合部位へのリボヌクレオチドとの競合やリボヌクレオチド還元酵素のスルフヒドリル基への作用などが考察されている。3-HPAは反応性に富んだ物質であるため、消化管内でLb.reuteriがロイテリンを産生している報告はなかった。そこで、無菌マウスにLb.reuteri JCM 1112の1菌株を定着させ、^<13>C_3-グリセロールを用いた二次元核磁気共鳴法によりマウス盲腸内で3-HPAをin vivo検出した。さらに、^<13>C_3-グリセロールを自由摂取させたマウス消化管から回収したLb.reuteriでは、グリセロールからの3-HPA産生に関与する遺伝子が、グリセロール無摂取群と比較して有意に発現していた。特に、グリセロールトランスポーター遺伝子であるpduFの発現量は、グリセロールを摂取していない群との有意差を認めた。腸内フローラ構成細菌に対し、消化管内で産生される抗菌物質の作用がプロバイオティクスの整腸効果として示唆されているが、in vivoでそのような抗菌物質を検出した報告はなかった。
共和分の存在するシステムにおける構造変化の検定理論

平成18年度においては「構造変化を伴う共和分関係が存在する場合」を帰無仮説に対して「共和分関係が存在しない」という対立仮説に対する検定理論の研究を行った。平成19年度においてはここまでの研究において厳密に導出された検定理論に基づいて実際にデータを用いて実証分析を考えた。まずは近年の日本経済におけるGDPとマネーサプライあるいはマネタリーベースの間の関係に構造変化を伴う共和分関係が存在するかを検証した。近年の金融政策、特にゼロ金利政策の下ではGDPとマネーサプライの関係が把握するのが困難になっている。特に金融政策を遂行する日本銀行などは量的緩和政策を導入する以前は、その関係がないと明確に主張しマネーサプライを十分に増加させようとしていなかった。しかしGDPとマネーサプライの間に構造変化を伴う共和分関係が存在していると考えるとGDPとマネーサプライの関係は弱くなっているであろうが依然として存在すると推測できる。この状況の下では日本銀行はマッシブにマネーサプライを増加させるする努力をするべきだったという事になる。しかしこの場合においても日本銀行はマネーサプライを直接増減できる訳ではないのでマネーサプライとマネタリーベースの間の関係を明らかにする事も重要となる。以上の推論を提案された検定理論を下に検証した。そして1990年代から2007年までの月次、四半期データを用いて上の推論を統計的に裏付けることができた。本年度の研究においては最も基本的と思われる方法により、共和分の存在するシステムにおける構造変化の検定理論を研究した。まず考えた検定はシステムの中の一つの回帰式のみに基づくモデルにおける検定理論である。また帰無仮説は「構造変化を伴った共和分関係が存在する」というもので、これは共和分のあるシステムにおける構造変化を検討するにあたり統計学的には一番自然な帰無仮説であるが未だこの帰無仮説を考えた研究は存在していなかった。方法としては、まずダミー変数を用いて構造変化を伴う回帰式を推定してその残差を求める。そして次にその残差が定常であるかどうかを検定するという手順を提案した。これは今までの「(構造変化なしの)共和分がある」という帰無仮説の検定の自然な拡張である。ただその拡張の際に構造変化を導入するにあたり1.構造変化が既知の時点で起こった場合、2.構造変化が未知の時点で起こった場合、という2つの場合を区別することが重要となることがわかった。1の構造変化が既知の時点で起こった場合は既存の方法を自然な形で拡張ができるのであるが、2の構造変化が未知の時点で起こった場合には構造変化の時点をその推定値で置き換える必要がある。そしてその推定値の漸近的な性質が検定統計量の漸近分布、また検定の一致性を示すにあたり重要な役割を担うことがわかった。そのために既存の文献では明らかになっていない、構造変化の時点の最小2乗推定量の漸近的性質を導出した。そしてこの最小2乗推定量に基づいて検定統計量を提案し、統計量の漸近的性質も明らかにした。本年度の研究においては、昨年度の研究において提案された共和分の存在するシステムにおける構造変化の検定理論をさらに発展させた。昨年度の研究においては、「構造変化を伴った共和分関係が存在する」という帰無仮説を「共和分関係が存在しない」という対立仮説に対して検定するための理論を提案した。特に構造変化の時点が未知の場合には、構造変化の時点を推定してその推定量を検定統計量の一部とするため漸近理論は構造変化の時点が既知の場合と較べかなり複雑になる。昨年度の研究においては特殊ケースのみを想定していたが、本年度の研究においては非常に一般的な状況における検定理論を導出した。本年度の研究においては構造変化の大きさが検定理論に与える影響を厳密に議論を行った。本研究で想定している非常に一般的な枠組みでは構造変化点の漸近的な性質さえ明らかになっていないため、まずは変化点の漸近的性質を分析した。そこでは構造変化の大きさと推定量の収束速度との関係も明らかにされた。次に変化点の推定量の漸近的性質を基にして検定統計量と構造変化の大きさの漸近的性質を厳密に議論した。そこでは構造変化点の一致推定量が得られる限り提案された検定理論は有効でありあたかも構造変化点が既知であるように振舞うことが出来るということが明らかになった。しかし構造変化の大きさが標本数に比べ非常に小さい場合構造変化の時点の推定量は一致性を持たず、さらに検定も一致性を持たないことが示された。以上のことが厳密に理論的に明らかにされたということが本研究の貢献である。これらの結果は実際にデータを用いて実証分析を行った際に、その結果がどの程度信頼できるものかということを考える際において指針となる。

しかしGDPとマネーサプライの間に構造変化を伴う共和分関係が存在していると考えるとGDPとマネーサプライの関係は弱くなっているであろうが依然として存在すると推測できる。この状況の下では日本銀行はマッシブにマネーサプライを増加させるする努力をするべきだったという事になる。しかしこの場合においても日本銀行はマネーサプライを直接増減できる訳ではないのでマネーサプライとマネタリーベースの間の関係を明らかにする事も重要となる。以上の推論を提案された検定理論を下に検証した。そして1990年代から2007年までの月次、四半期データを用いて上の推論を統計的に裏付けることができた。
役務提供契約の再構成-東アジア比較民法-

(1)建築請負契約において当該建築物に瑕疵がある場合、その建て替えを必要とするときに限り、注文者は契約を解除することができるというように、日本民法を改正すべきである。(2)請負契約において仕事の目的物に瑕疵があるときは、修補請求権と報酬減額請求権とは同列の救済策と考えるべきである。(3)任意後見契約法は、法定後見との関係などにつき改正の必要がある。成年後見制度全体については、中長期的には「人の法」として民法典の一部を再編成する可能性も検討すべきである。今年度は、請負の瑕疵担保責任(とりわけ土地工作物の瑕疵の場合の解除の可能性)と委任の無理由告知についての東アジア各国の判例・単説を調査した。とりわけ、台湾民法の改正(解除権を明記)の理由がよりはっきり理解できたことは今回の調査の成果である。いずれ最終報告書で分析し、日本民法改正案作成の資料としたい。つぎに、売買でも同様の問題があるが、請負ではより一層切実な問題の1つとして、瑕疵ある物が給付された場合に注文者はまず修補請求をしなければならないのか(これはドイツの債務法現代化法の立場)、それとも報酬減額請求権と同列で、注文者の選択が可能と考えていいか(岡の見解)という問題がある。韓国、中国ではまだ問題意識はないようであるが、台湾では、孫森炎教授が岡の問題意識に呼応して研究し、昨年の講演会でこれは信義則に反するかどうかの問題で、信義則に反しない限り注文者の自由な選択に任すべきだと報告した。岡は、信義則の問題もあろうが、原則は注文者の選択に任すべきだという見解である。瑕疵ある物を請負人が製作した以上、注文者としては請負人の力量に対する信頼感を失うかもしれない。修補が果たして完全になされるかどうかも疑わしいだろう。こういうときには、注文者は報酬減額だけで従前の請負人と関係を絶ち、後は他の信頼できる業者に修補を依頼するという可能性が保障されるべきだと思う。来年度は、もう少し具体例を挙げつつ韓国、中国の研究者にもインタビューしてみたいと思っている。なお、台湾では目下成年後見制度の導入が予定されており、その概要(翻訳)も入手した。参考になる点もあるが、いくつか問題点もあり、それについてさらに質問をしようと思っている。今回は法定後見のみの改正だけを考えており、任意後見は時期尚早だとして見送ったと聞いている。どのような議論があったのか、来年度さらに調査を進めたいと思っている。今年度は、主に法定後見を含む成年後見制度の比較法的研究をおこなった。(1)2008年5月に台湾の民法中成年監護制度(成年後見制度)が改正されたので(施行は2009年12月)、台湾法務部法律事務司司長張清雲氏に新法の解説を論文形式で依頼し、その翻訳などをもとにして「台湾における成年後見制度の改正について」という論文をまとめた。(2)6月14日科研費研究会(東アジア比較民法研究会。代表は岡)と学習院大学東洋文化研究所の共催で、「東アジアにおける成年後見制度の将来像」と題するミニシンポジウムを行った。台湾、韓国から研究者を招聘し、中国法、日本法の報告も踏まえて、比較法的検討を行った。(3)12月20日には同じく東文研との共催で、「国際シンポジウム・東アジアにおける成年後見制度」を開いた。台湾からは裁判官と法務部の立案担当者、韓国、中国からは研究者を招いて、さらに詳しく成年後見制度の比較をおこなった。この(3)の報告原稿は、2010年3月末刊行予定の「東洋文化研究12号」に特集として掲載する予定である。上記(1)の成果は、2009年2月刊行の『東アジア私法の諸相』(東洋文化研究叢書。勁草書房)に収録されている。台湾、韓国、中国では任意後見制度の導入は将来の課題であり、上記のシンポジウム等を通して立法のさいの問題点を指摘できた、と思う(詳細は上記論文参照)。このような交流を通して、2009年秋には台湾から任意後見制度、委任などを含めた日本民法改正の問題点について報告をするよう要請されている。(2)の報告原稿は、来年度末の研究成果報告書に参考資料として添付する予定である。(1)今年度はまず、ヨーロッパにおける役務提供契約を巡っていかなる議論があるかを調査した。DCFR(共通参照枠組)で規定されている役務提供契約・総論の意義について(委任は別の章立てで規定がある)、2009年10月9日ドイツ・オスナブリュック大学法学部のシュミット・ケッセル教授に講演をしていただいた(報告原稿が完成しておらず、未だ補充されていないため、翻訳の公表が遅れている)。

質疑応答では、役務提供契約の総論を規定することによって民法における委任の規定が形骸化してしまうのではないかという点がもっぱら中心的な論点であった。私自身、委任契約の規定を豊富化することが先決ではないか、と感じた次第である。つぎに、昨年度に引き続き東アジア各国の成年後見制度について比較検討をおこなった。(2)ソウルでの日韓民法改正についてのシンポジウムでの報告・討論(昨年11月14日)岡は「自然人について」というテーマで報告し、かつ、先方の依頼により、韓国成年後見制度改正案についてコメントを発表。12月にはこの改正案が民法の一部改正案として国会に上程された。その国会提出法案について、翻訳に依拠しながら、詳細に分析検討した。その成果は、本年6月頃刊行予定の須永醇先生傘寿記念論文集(酒井書店刊)に発表の予定だが、韓国改正案でとりわけ重要と思われるのは、身上監護に関する規定である。特に成年後見人による医療行為の代諾は日本法にとっても参考になると思われる(「成年後見制度の課題-医療行為の代諾の可能性-」と題して銀行法務21・本年2月号に「法務時報」(1頁)としてこの点を論じた)。(3)「東アジアにおける成年後見制度の現状と課題」の研究会(昨年12月23日。韓国から2名の研究者、日本法としては司法書士2名を招聘)任意後見契約と同時に締結した通常の委任契約に基づいて事務処理をおこない、要件が充足された以降も任意後見契約に移行しようとしないケースが散見されるという報告に基づいて、どのようにしてこの弊害を除去あるいは未然に防ぐかについて議論をした。
PDMホスファタ-ゼによる加水分解反応の立体化学

植物病原菌Fusariummoniliformeから単離された特異なリン酸エステル加水分解酵素,PDMホスファタ-ゼの加水分解時の立体化学を解明する目的で,次の研究を行った。1.フェニルチオホスホン酸pーニトロフェニル(1__)を既知の方法で合成した。2.(1__)はP原子まわりのキラル化合物で,Rp体とSp体のラセミ混合物である。これに蛇毒ホスホジエステラ-ゼを作用させ,<1S>___を立体特異的に加水分解,<1R>___を残した。3.上の反応経過は遊離pーニトロフェノ-ル(2__)を定量する比色分析で追える。しかし,より直接の分析を目指し,高速液体クロマトグラフィ-(HPLC)による分析法を確立した。ODSーシリカカラムを用い,1%トリフルオロ酢酸水溶液:アセトニトリル=40:60を溶媒にするイソクラティック溶出で,生成物の2__とフェニルチオホスホン酸(3__)および基質(1__)の三者をきれいに分離できた。4.上で確立したHPLCを用い,1__の蛇毒ホスホジエステラ-ゼ消化物から<1R>___を単離した。5.1__がPDMホスファタ-ゼで分解されることは比色分析で明らかにされている。しかし,反応が極めて遅く,1__の非酵素的脱硫反応が先行,生じたO含有類似体フェニルホスホン酸pーニトロフェニルが酵素的に加水分解され2__を生じるのではとの疑念があった。しかし,今回開発したHPLC分析法で,1__が直接酵素作用を受け,2__と3__を生じることを証明できた。当該年度内に目的の研究は,研究代表者の転任に伴う研究の遅れのため,ここまでしか進行しなかった。しかし,純粋の<1R>___は得られたので,これを基質に当初の計画に従い反応の立体化学を調べる予定である。
カニクイザルを用いた遺伝性網膜疾患モデルの作製：病態機序の解明と治療法の開発

ヒトは情報の約8割を視覚情報に頼っており、これが障害されると通常の生活に著しい影響を及ぼす。日本人の主な失明原因である緑内障、加齢黄斑変性、一部の遺伝性網膜疾患はヒトを含む高等霊長類にのみ存在する眼球部位で発症しており、通常使われる実験動物(マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタなど)ではより厳密な疾患モデル動物を作製することは困難である。また、多くの眼疾患はゲノム配列と強く相関しており、原因遺伝子や感受性遺伝子は眼疾患のリスク因子として作用する。眼疾患と関連するゲノム配列を高等霊長類で再現することが可能になれば、ヒトの眼疾患を再現し、病態の解明や治療法の開発に必要な動物モデルとして利用できる。本研究は最新のCRISPR/Cas9遺伝子改変技術をヒトと眼球構造がきわめて類似するカニクイザルに応用し、ヒトの難治性眼疾患を再現して、病態の解明や治療法の開発に利用することを目的とする。緑内障、加齢黄斑変性、遺伝性網膜疾患に関わる遺伝子のノックインカニクイザルの作製をめざす。この研究によって、より患者の病態に近い眼疾患モデル動物の作製が期待され、これまでのマウスを中心とした遺伝子解析動物よりも精度の高い情報が得られると期待される。カニクイザルモデルに対してGnRH agonist、FSHおよびhCGを用いたホルモン投与方法により成熟卵の採取を行ったところ、成熟卵採取において効果的に採取できたり、あるいはできなかったことがあった。カニクイザルではマウスの系統とは異なり、遺伝的背景が揃っていないことや個体の年齢や状態も個々に異なることによって、適した採卵方法ではない可能性が示唆された。また、採卵個体の体重変化において、GnRH agonist投与開始から採卵時までのおよそ一ヶ月の間に、顕著な減少が見られ、本採卵方法による個体の健康状態への影響が考えられた。一方、GnRH antagonistを利用したホルモン投与方法では、GnRH agonistを用いた場合よりも投与から採卵までの期間の短縮および体重減少がほとんど見られないことから、より効率的な卵採取が可能と考えられた。卵数が十分に準備でき、その質に問題がないと確認されたときに顕微授精によって受精卵の作成を行った。その結果作出された前核期受精卵の細胞質中に黄斑ジストロフィの病因遺伝子(A遺伝子とする)あるいは網膜色素変性の病因遺伝子(B遺伝子とする)を改変するように設計されたCRISPR/CAS9タンパク質あるいはmRNAおよびgRNAを同時に微量注入した。注入された前核期受精卵を体外培養後、正常に分割した質の良いと考えられる受精卵を仮腹となる雌カニクイザルへ胚移植を行った。胚移植後約1ヶ月に超音波画像診断により妊娠を確認した。また、一部の注入胚においては、体外培養の継続後、胚盤胞への発生が確認された。昨年度よりCas9のmRNAとタンパク質の両方で個々に胚注入を行ってきたが、タンパク質は凍結できないために、gRNAなどと別途注入が必要であった。マウスとは異なり、カニクイザルでは受精卵を数百単位で準備することは困難であり、今後はCas9 mRNAを中心にgRNAと混合物を適当濃度に調整して、注入受精卵数を増加させたい。妊娠中の胎児おいて遺伝子改変が行われているか否かを確認するために、妊娠中に羊水を採取し、ここからゲノムDNAを抽出し、目的遺伝子が改変されているか否かを確認したものの遺伝子検査をPCR、PCR産物のTAクローニング、およびDNAシークエンスによって実施した。出産時においても胎児由来産物(血液や胎盤など)をサンプルとした遺伝子検査を行い、羊水DNAサンプルとの一致を確認した。残念ながらゲノム編集後に複数個体が生まれているが、目的とする遺伝子改変カニクイザルは作製されていない。作製されれば、哺育および生育状況を見ながら対象個体の眼底観察を実施する。また、成熟卵を採取する方法としてGnRH agonist、FSHおよびhCGを用いたホルモン投与方法に加え、GnRH antagonistを用いた方法あるいはhCG投与から採卵までの時間について卵採取法を行い、受精卵作成の効果や採卵個体への影響について検討する。A遺伝子およびB遺伝子の改変を平行して実施し、CRISPR/CAS9注入胚の胚移植を実施するとともに、胚移植を行わなかった胚において、遺伝子改変の有無を解析する。また一部の胚においては、発生した胚盤胞から内部細胞塊を摘出し、ES細胞の樹立を計る。カニクイザルに対して、GnRH agonist、FSHおよびhCGを用いたホルモン投与方法により成熟卵の採取を行ったところ、成熟卵採取において効果的に採取できたり、あるいはできなかったことがあった。後者の場合、採取された成熟卵が非常に少なく、CRISPR/CAS9システムを用いたゲノム編集に足る受精卵数を準備することができないことがあった。これらのことはカニクイザルでは遺伝的背景が揃っていないことや個体の年齢や状態も個々に異なること、あるいは適した採卵方法ではない可能性があることなどを示唆するものであった。

その結果作出された前核期受精卵の細胞質中に黄斑ジストロフィーの責任遺伝子(A遺伝子とする)を改変するように設計されたCRISPR/CAS9タンパク質およびgRNAを同時に微量注入した。注入された前核期受精卵を体外培養後、正常に分割した質の良いと考えられる受精卵を仮腹となる雌カニクイザルへ胚移植を行った。胚移植後約1ヶ月に超音波画像診断により妊娠を確認した。また、一部の注入胚においては、体外培養の継続後、胚盤胞への発生が確認された。これらのことはA遺伝子を改変するように設計されたCAS9 + gRNAの注入は、胚の初期発生に対して負の影響はないものと考えられた。受精卵を作成するためには雌個体から成熟卵を採取するためには、ホルモン投与により卵の発育および卵の成熟を誘導する必要がある。カニクイザルに対して、GnRH agonist、FSHおよびhCGの投与により成熟卵の採取を行ったところ、成熟卵採取において効果的に採取できたり、あるいはできなかったことがあった。後者の場合、採取された成熟卵が非常に少なく、CRISPR/CAS9システムを用いたゲノム編集に足る受精卵数を準備することができないことがあった。また、採卵個体の体重変化において、GnRH agonist投与開始から採卵時までのおよそ一ヶ月の間に、顕著な減少が見られ、本採卵方法による個体の健康状態への影響が考えられた。これらのことは、カニクイザルでは遺伝的背景が揃っていないことや個体の年齢や状態も個々に異なること、あるいは適した採卵方法ではない可能性があることなどを示唆するものであった。一方、GnRH antagonistを用いた方法では、GnRH agonistを用いた場合よりも投与から採卵までの期間の短縮および体重減少がほとんど見られないことから、より効率的な卵採取が可能と考えられた。質および量ともに問題がないと確認されたときに顕微授精によって受精卵の作成を行った。作出された前核期受精卵の細胞質中に黄斑ジストロフィーのA遺伝子を改変するCAS9タンパク質およびgRNAを同時に微量注入した。注入された前核期受精卵を体外培養後、正常に分割した受精卵を雌カニクイザルへ胚移植した。その約1ヶ月後に超音波画像診断により妊娠していることを確認し、出産に至るのを待っている状況にある。また、胚移植されずに残った注入胚では、胚盤胞への発生が確認された。これらのことはA遺伝子を改変するように設計されたCAS9 + gRNAの注入は、胚の初期発生に対して負の影響はないことを示唆した。ヒトは情報の約8割を視覚情報に頼っており、これが障害されると通常の生活に著しい影響を及ぼす。日本人の主な失明原因である緑内障、加齢黄斑変性、一部の遺伝性網膜疾患はヒトを含む高等霊長類にのみ存在する眼球部位で発症しており、通常使われる実験動物(マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタなど)ではより厳密な疾患モデル動物を作製することは困難である。また、多くの眼疾患はゲノム配列と強く相関しており、原因遺伝子や感受性遺伝子は眼疾患のリスク因子として作用する。
直交関数展開に関する調和解析の研究

古典的なハーディの不等式を,エルミート展開とラゲール展開に対して考察し類似の不等式を得ることに成功した.特筆すべき点は,得られた不等式が,古典的な場合とは異なり,可積分関数の空間で成り立つことである.もう1つの成果は,積分変換に関するペーリーの不等式を得たことである.これは,特殊な場合としてフーリエ変換を含む有用な積分変換であるハンケル変換に対して,古典的なペーリーの不等式が成り立つことを示したものである古典的なハーディの不等式を,エルミート展開とラゲール展開に対して考察し類似の不等式を得ることに成功した.特筆すべき点は,得られた不等式が,古典的な場合とは異なり,可積分関数の空間で成り立つことである.もう1つの成果は,積分変換に関するペーリーの不等式を得たことである.これは,特殊な場合としてフーリエ変換を含む有用な積分変換であるハンケル変換に対して,古典的なペーリーの不等式が成り立つことを示したものである平成19年度に発表された主要研究実績は,積分変換に関するペーリーの不等式である。研究の動機は古典的なペーリーの不等式が,特殊な場合としてフーリエ変換を含む有用な積分変換であるハンケル変換に対して成り立たないだろうかというものである。古典的なペーリーの不等式とは,実ハーディ空間に属する関数のフーリエ級数展開を考えたとき,第n番目のフーリエ係数の絶対値の2乗をアダマール間隙を持つnに渡って総和したものは収束し,その和は元の関数の実ハーディ空間のノルムの2乗で押さえられるというものである。我々は,この古典的なパーリーの不等式が,ハンケル変換に関して類似の形で成り立つことを示し,Hokkaido Math.J.に発表した。今年度研究し,次年度成果をまとめることが出来ると考えられる研究実績は,エルミート展開とラゲール展開に関するハーディの不等式である。これは,古典的なハーディの不等式を,エルミート展開とラゲール展開に対して考察したものである。古典的なハーディの不等式とは,実ハーディ空間に属する関数のフーリエ級数展開を考えたとき,第n番目のフーリエ係数の絶対値を|n|+1で除したものを,すべてのnに渡って総和したものが収束し,その和は元の関数の実ハーディ空間のノルムで押さえられるというものである。古典的な場合は,実ハーディ空間より広い可積分関数の空間では成り立たない。ところが,エルミート展開とラゲール展開に対しては,可積分関数の空間に関して成り立つという注目すべき結果が得られる見通しがたった。次年度成果としてまとめたい。平成20年度における特筆したい研究成果は,エルミート展開とラゲール展開に関するハーディの不等式の研究である.これは,古典的なハーディの不等式を,エルミート展開とラゲール展開に対して考察したものである.古典的なハーディの不等式とは,実ハーディ空間に属する関数のフーリエ級数展開を考えたとき,第n番目のフーリエ係数の絶対値を|n|+1で除したものを,すべてのnに渡って総和したものが収束し,その和は元の関数の実ハーディ空間のノルムで押さえられるというものである.古典的な場合は,実ハーディ空間より広い可積分関数の空間では成り立たない.ところが,エルミート展開とラゲール展開に対しては,可積分関数の空間に関して成り立つという注目すべき結果が得られた.この成果は学術雑誌に投稿中である.もう1つの研究実績は,積分変換に関するペーリーの不等式である.研究の動機は古典的なペーリーの不等式が,特殊な場合としてフーリエ変換を含む有用な積分変換であるハンケル変換に対して成り立たないだろうかというものである.古典的なペーリーの不等式とは,実ハーディ空間に属する関数のフーリエ級数展開を考えたとき,第n番目のフーリエ係数の絶対値の2乗をアダマール間隙を持つnに渡って総和したものは収束し,その和は元の関数の実ハーディ空間のノルムの2乗で押さえられるというものである.我々は,この古典的なパーリーの不等式が,ハンケル変換に関して類似の形で成り立っことを示した.この成果はHokkaido Math. J.に発表され,印刷中である.
パンコムギにおける染色体欠失系統の作製と物理的遺伝子地図の構築

研究代表者遠藤は、パンコムギの近縁種、Aegilops cylindricaのある染色体を添加すると、パンコムギに欠失などの染色体構造異常が高頻度に出現することを発見し、この現象を利用して、これまでにパンコムギの21種類の染色体すべてにわたって436の欠失染色体を同定し、それらの欠失系統を育成してきた。ところが、これらの欠失系統には、背景の染色体構成が異常なもの、欠失染色体自体に疑問のあるものが含まれている恐れがあった。そこで、本研究では、(1)欠失系統の詳細な細胞遺伝学的調査、(2)ホモまたはヘミ接合系統の育成、(3)欠失系統を利用した欠失地図作成(deletion mapping)を目的として研究を進めた。平成5、6、7年度の研究によって、パンコムギの3ゲノム、7同祖群の21染色体すべてについての欠失染色体の細胞学的調査と、系統育成を一通り完了し、以下のようなことが明らかになってきた。(1)Dr. E. R. Searsが育成したditelosomic系統で、存在しないか、不稔になる系統の染色体腕のもう一方の染色体腕における欠失は、一定以上の大きさになるとホモ接合にならない。(2)ホモ接合が期待されないのにそのような固体が得られた場合、必ず転座染色体が存在し、欠失した染色体部分がそこに含まれていると思われる。(3)細胞学的調査で、転座などの構造異常はほとんど確認できたが、小さな中間部の欠失を見つけることは困難であった。このようにパンコムギのかなりの数の欠失系統が育成され、その全体の染色体構成も明らかになってきたので、これから、これらの系統を用いた染色体地図作製が本格的に進展するものと思われる。パンコムギの第14同祖群の12染色体においてこれまでに同定、単離された約220の欠失染色体について、それらを含む欠失系統の染色体構成をC-バンド分染法によって研究した。その結果、それまでに明らかになっていたものを含め、1A染色体で8、1B染色体で33、1D染色体で10、2A染色体で4、2B染色体で25、2D染色体で15、3A染色体で11、3B染色体で19、3D染色体で11、4A染色体で16、4B染色体で12、4D染色体で18の欠失染色体がホモ接合の状態になっていて、それらの欠失ホモ接合系統は自殖稔性があり、系統として育成できた。欠失部分の他の染色体への転座が疑われる系統は2、3系統のみであった。他の欠失染色体はまだヘテロ接合の状態であるが、2Aと4Bの短腕の欠失はホモ接合になるが、植物が不稔になるため、ヘテロ接合系統で維持されている。1Aの長腕の欠失と1Bの二次狭窄付近の欠失については、rDNAをプローブとしたin situ hybridizationを行い、1A短腕末端のシグナルからC-バンドマーカーのない1A染色体の欠失を確認し、また、1B染色体の仁形成体の有無を明らかにした。1B染色体の欠失系統を用いた物理的地図作製の研究は、Dr.Gi11との共同研究により、行われ、結果は発表されている。第2、3、4同祖群の欠失染色体を利用した物理的地図作製も、同じ共同研究で、現在進行中である。欠失染色体ヘテロ接合系統は、現在栽培中で、翌春に異数体との交配を予定している。

PCR法によるRAPDを染色体マーカーとして遺伝子地図作製に利用する計画をしたが、各方面からの情報によると、まだPCRの結果が安定しておらず、染色体マーカーとしてはあまり期待が持てないようであったので、当面は、この計画を保留することにした。前年度および本年度におけるCバンド法による選抜で、パンコムギChinese Springの21染色体すべてについて欠失染色体の選抜を完了した。その結果、ホモ接合になったものが348、ヘテロ接合のままのものが88、合計436の欠失染色体が同定、分離されて欠失系統として確立した。ホモ接合になった系統は、自家受精によって、子孫を得ることができた。2Aおよび4B染色体の短腕の欠失では、ホモ接合体が得られたが、それらは不稔になった。そのため、それらの欠失染色体はヘテロ接合の状態で維持することになった。その他のヘテロ接合の欠失染色体は、主に1DL,4AL,5AL,5BL,5DLの欠失であった。これまでの研究から、これらの染色体腕は、花粉稔性もしくは植物の生存に必須の遺伝子をもっていることが明かになっており、ホモ接合体が得られそうになかった。そこで、これらのヘテロ接合系統を異数体のNullisomic-tetrasomic系統と交配し、その子孫からヘミ接合体が得られる状態にした。これら欠失染色体すべての顕微鏡写真を撮り、それらの短腕、長腕の比率の計測を行なった。これらの写真と計測データに基づき欠失染色体の写真一覧図と模式図を作成した。また、これらの欠失系統とDNAマ-カを利用した欠失地図作製(Deletion mapping)を、米国カンザス州立大学のDr.B.S.Gill研究室との共同研究によって行ない、パンコムギ7同祖群すべてについて完了した。その結果は、一部はすでに論文として発表され、残りについては論文を投稿中である。本研究は、欠失地図作製によってパンコムギの物理的遺伝子地図を構築することを目的とした。前年度までにパンコムギの21種類の染色体すべてにわたって436の欠失染色体を同定し、それらの欠失系統を育成してきた。ところが、これらの欠失系統には、背景の染色体構成が異常なもの、欠失染色体自体に疑問のあるものが含まれている恐れがあった。そこで、本年度は、以下のような研究を行った。(1)細胞学的調査で背景の染色体構成に転座が認められた欠失系統についての転座を除くための選抜及び交配:転座ヘテロ系統では自家受精子孫から転座染色体のない個体を選抜し、転座ホモ系統には純系Chinese Springを交配した。(2)欠失染色体の細胞学的データの取りまとめ及びパンコムギ欠失染色体アトラスの作成:各欠失染色体の顕微鏡写真を撮影し、5-10枚の写真で染色体腕の比を計測して、欠失割合を算出して、欠失点を示す模式一覧図を作成した。同時に、全欠失染色体の見本写真も作成した。(3)欠失系統の減数分裂を調査し、欠失以外の構造異常がないことの確認:第5同祖群の欠失系統について、純系Chinese Springを交配した欠失ヘテロ個体の花粉母細胞の減数分裂を調査した結果、欠失部分の転座を示唆する多価染色体は観察されなかった。(4)欠失系統の形態形質の調査:第5同祖群の欠失ホモ系統について、実験計画法に基づいて形質調査を行った結果、どの染色体でも長腕の半分以上が欠失すると生育力、捻性が極端に悪くなるが、短腕の欠失はこれらにあまり影響がないことが明らかになた。
コンタクトスライダのナノダイナミクス現象と完全接触・安定走査条件の解明

1点接触のモノパッド形コンタクトスライダの跳躍振動および動的接触力解析研究と2つの浮上面を有し後端に1つの接触記録パッドを有する3パッド空気膜混成形コンタクトスライダの跳躍振動および摩擦励起自励振動に関する理論的および実験的研究を行い、以下のようにコンタクトスライダの動的接触現象の基本特性と完全接触追従条件と安定走査条件を明らかにした。(1)モノパッド形スライダの跳躍振動と動的接触力を接触剛性・減衰およびスライダ質量を大きく変化させて解析し、跳躍振動を抑制するには接触剛性を小さくする必要があるが接触剛性を小さくすると接触面積が小さくなり摩耗信頼性が低下することから、追従性と摩耗信頼性の両条件を満たす接触パッド形状が存在することを明らかにした。(2)実ディスク表面のスペクトルを模擬し、かつヘルツ接触を仮定した1自由度スライダのシミュレーション結果は、モノパッド形スライダの実ディスク表面に対する跳躍振動特性と定量的によく一致することを明らかにした。(3)空気膜反力をスライダ前後に支持点をもつ空気膜ばねに仮定した3パッド空気膜混成形コンタクトスライダの2自由度モデルと調和うねりディスク表面モデルを用いて、接触剛性・減衰、摩擦係数および前後の空気膜剛性を大きく変化させ、スライダの固有振動モードにも注目して跳躍振動解析を行い、(a)接触剛性を10^5N/m程度に小さく、接触減衰比を0.1程度に大きく、また前側空気膜剛性を10^3N/m程度に小さくし、後側のそれを10倍程度にすれば跳躍振動が生じない、(b)0.3程度の接触パッド・ディスク面間の摩擦係数は跳躍振動にほとんど影響しない、(c)(a)の条件下では磁気ヘッドを有するスライダ後端接触パッド部の振動は等価的な1自由度振動とみなせることを明らかにした。(4)3パッドコンタクトスライダの自励振動現象を支持部を弾性片持ち梁とした多自由度モデルで解析し、そのメカニズムと安定走査条件を明らかにすると共に、後端に接触パッドを有する空気膜混成形スライダは本質的に安定であることを示した。(5)新たに空気軸受けスピンドルおよびスライダ取付け微動台をもつ実験台を製作し、レーザードップラー振動計、FFTアナライザおよびクリーンブ-スからなる実験装置を製作した。供試3パッドコンタクトスライダを2.5インチディスク上で接触走査させたときの振動を測定分析し、(4)で示した安定領域において自励振動が生じないことを確認した。1点接触のモノパッド形コンタクトスライダおよび2つの浮上面を有し、後端に1つの接触記録パッドを有するトライパッド形コンタクトスライダの跳躍振動および自励振動に関する理論的および実験的研究を行い、以下の様にコンタクトスライダの動的接触現象の基本特性および完全接触条件と安定走査条件を明らかにした。(1)中点変位法に基づき磁気ディスク表面をコンピュータにより模擬する手法を提案し、任意の振幅分布と周波数特性を持つランダムディスク表面の生成手法を確立した。(2)空気軸受

スピンドル、レーザードップラ振動計、FFTアナライザ、クリーンブ-スからなるコンタクトスライダ実験装置を製作した。スライダ材料をガラスと鉛、質量を2水準、支持ビームの減衰を2水準、スライダ荷重を2水準変えてモノパッドスライダの3.5インチディスクに対する跳躍振動を測定分析し、接触剛性が2桁小さいことによる現象を除き定性的には調和うねり面に対する解析結果と一致することを明らかにした。(3)モノパッド形コンタクトスライダのランダムディスク表面に対する解析から、スライダの跳躍振動特性およびディスク面への接触追従条件を解明し、基本的設計指針を示した。また、(2)項の基礎的実験研究との比較からスライダの周波数特性において解析と実験とは一致し、本解析の妥当性を示した。(4)コンタクトスライダの自励振動のメカニズムを上下・ピッチの2自由度スライダとばね支持モデルで解析し、摩擦自励振動が発生する条件を明確にし、トライパッドスライダ構造は本質的に安定であることを示した。(5)トライパッド形コンタクトスライダを並進および回転の2自由度振動系にモデル化し、調和うねり表面およびランダムディスク表面に対するスライダの跳躍振動および接触追従性のシミュレーション解析からスライダの跳躍振動特性を明らかにするとともに、スライダ・ディスク面の接触剛性、空気膜剛性および静荷重に対する静的接触力の割合が磁気ヘッドを有するスライダ後端接触パッド部のディスク面への追従性に及ぼす影響を明らかにし、トライパッド形スライダの基本的設計指針を示した。(6)トライパッド形スライダでは、2自由度モデルによる解析範囲では、後端接触パッド部とディスク面との摩擦力(摩擦係数0.3)は跳躍振動に対してほとんど影響しない。ただし接触ばねによる復元モーメントが変動摩擦モーメントより小さく逆方向となるような場合(復元モーメント中心がスライダ中心近傍)では、設計条件によって摩擦励起自励振動が生じることを示した。1点接触のモノパッド形コンタクトスライダの跳躍振動および動的接触力解析研究と2つの浮上面を有し後端に1つの接触記録パッドを有する3パッド空気膜混成形コンタクトスライダの跳躍振動および摩擦励起自励振動に関する理論的および実験的研究を行い、以下のようにコンタクトスライダの動的接触現象の基本特性と完全接触追従条件と安定走査条件を明らかにした。(1)モノパッド形スライダの跳躍振動と動的接触力を接触剛性・減衰およびスライダ質量を大きく変化させて解析し、跳躍振動を抑制するには接触剛性を小さくする必要があるが接触剛性を小さくすると接触面積が小さくなり摩耗信頼性が低下することから、追従性と摩耗信頼性の両条件を満たす接触パッド形状が存在することを明らかにした。(2)実ディスク表面のスペクトルを模擬し、かつヘルツ接触を仮定した1自由度スライダのシミュレーション結果は、モノパッド形スライダの実ディスク表面に対する跳躍振動特性と定量的によく一致することを明らかにした。(3)空気膜反力をスライダ前後に支持点をもつ空気膜ばねに仮定した
高線量原爆被爆者血液細胞の分子・細胞遺伝学的研究

本研究は昭和43年から45年に行った原爆被災復元調査により確認された78名の500m以内原爆被爆者を基軸にしての細胞遺伝学的ならびに分子生物学的研究を行ったものである。2年間の研究実績の概要は以下のとおりである。I.爆心地域原爆被爆者の追跡調査毎年行っている追跡調査では、この2年間に2名死亡(2名とも大腸癌)と3名の新たな癌(膀胱癌,大腸癌)の発生をみた。78名中、生存者は27名である。II.髄膜腫に関する疫学的調査1 Gy以上被曝した追跡調査の対象となっている34名の被爆者の中に平成4年度と平成7年度に各1例、計2例の髄膜腫の発生をみたため、1975年より1992年の18年間における髄膜腫発生状況について検討したところ、原爆被爆者では髄膜腫発生が非被爆者に対して有意(p<0.05)に高く、また、被曝線量と強い相関のあることを見出した(Lancet349,1369,1997)。III.被爆者血液のWTl遺伝子蛋白量測定500m以内原爆被爆者10名の末梢血採取が可能であった。測定の結果、4名はRNAの質的問題により検査が不能であり、6名に関しては測定中を得た。6名中2名は感度以下で蛋白量の増加は認められなかったが、4名では中等度増加が2名、高度増加が1名にみられた。陽性症例率は高いようであるが,被曝線量との間に直接的な関連はみられなかった。症例の追加が今後も必要である。2 Gy以上の高線量被爆者白血病8名について、通常法による染色体分析と同時にFlSH法によるサブクローンの検出を行ったところ8名中6名に-7,17p-,20q-異常の単独ないし複数個の異常サブクローンが見出された。また、MYC遺伝子およびP53遺伝子のいずれかの遺伝子増幅が8名中4名にFISH法で検出された。非被爆者白血病15名についても同様の検討を行ったが、6名にサブクローンの存在が明らかとなった。高線量被爆者白血病の複雑な核型異常を反映するものと思われる。本年度はWT1遺伝子異常検出のための資料蒐集とがん抑制遺伝子の欠損に関する実験を行った。1.近距離原爆被爆者のWT1遺伝子検索用資料蒐集500m以内原爆被爆者5名より末梢血10mlと採血し、リンパ球を分離後-80°Cに保管した。症例が追加されたら測定に入る予定である。2.がん抑制遺伝子の欠損に関する研究昨年度までに染色体分析を行った高線量被爆者白血病24症例についてRB遺伝子、p53遺伝子BRCA遺伝子欠損の有無をFISH法で観察した。同時にMYC遺伝子およびp53遺伝子の増幅の有無も検討した。その結果、1Gy以上被爆白血病では染色体レベルでは観察されない微小欠損がこれらがん抑制遺伝子に有意に多く発生していることが判明した。

本研究は昭和43年から45年に行った原爆被災復元調査により確認された78名の500m以内原爆被爆者を基軸にしての細胞遺伝学的ならびに分子生物学的研究を行っているものである。本年度はWT1遺伝子異常検出のための資料蒐集とがん抑制遺伝子の欠損に関する実験を行った。これまでに蒐集された被爆者血液のWT1遺伝子蛋白量を測定するとともに、FISH法を用いて原爆被爆者白血病細胞のサブ・クローンの存在について検討した。1.被爆者血液のWT1遺伝子蛋白量測定500m以内原爆被爆者10名の末梢血採取が可能であった。測定の結果、4名はRNAの質的問題により検査が不能であり、6名に関しては測定中を得た。6名中2名は感度以下で蛋白量の増加は認められなかったが、4名では中等度増加が2名,高度増加が1名にみられた。陽性症例率は高いようであるが,被曝線量との間に直接的な関連はみられなかった。症例の追加が今後も必要である。2. FISH法によるサブクローンの検出2Gy以上の高線量被爆者白血病8名について、通常法による染色体分析と同時にFISH法によるサブクローンの検出を行ったところ8名中6名に-7,17p-,20q-異常の単独ないし複数個の異常サブクローンが見出された。また、MYC遺伝子およびp53遺伝子のいずれかの遺伝子増幅が8名中4名にFISH法で検出された。非被爆者白血病15名についても同様の検討を行ったが、6名にサブクローンの存在が明らかとなった。高線量被爆者白血病の複雑な核型異常を反映するものと思われる。
2次元Stein多様体上の解析関数の研究

今年度の研究の主な目標は、代数的な性格を持つ解析関数の種々の構造を解明することであった。得られた結果の主なものは次の通りである。1、Thiillen型の解析面の解析接続について2次元Stein多様体上のある領域Dから,高々対数容量0の閉集合になるような解析面の族Fを除いた所に、別の解析面Sが与えられており、それがFの各面の1点に解析接続出来るならば、Sの閉包はD全体での解析面であることを見出した。Fが有限個の解析面であるときがThiillenの定理である。この結果は今後の研究に重要な役割を演ずるものと思う。2、乗法公式を持つ解析写像の値分布の研究これについては、変数ごとに乗法公式を持つ解析写像で、2つの座標軸をそれ自身に1=1に写すようなものを具体的にすべて決定することが目標であったが、この目標はある特殊な條件を持つ場合を除いて一般的には解決した。なおその特殊な條件をもつ場合については、当初予想していなかった興味ある問題が提起され、今後の研究課題である。なおこの問題で座標軸の像が一般な場合は既に解決している。3、代数的リ-マン面族上の解析函数の研究この課題は一つのリ-マン面Rの上の代表的な開リ-マン面の解析的な族が、Stein多様体をなすとき、この族の各ファイバ-のモデュライがR上の解析関数となるかと云う問題である。これについて先ずファイバ-の種数が1のときは、肯定的に解決された。しかし一般な場合はThiillen型の解析面の解析接続等の重要な手がかりが得られたにもかゝわらず解決には至らなかった。今年の我々の主要な研究課題である。
飲水行動制御のためのNa+濃度感知の脳内機構

血液脳関門を欠いた感覚性脳室周囲器官(sCVOs)は、体液のNa+濃度や浸透圧のセンサーをはじめ、体液成分のモニタリングに関わる分子が特異的に発現し、生命維持に不可欠である体液恒常性維持の根幹を担っていると考えられている。最近研究代表者らは、sCVOsのグリア細胞おいて発現するNaチャンネル分子Naxが、水分摂取行動制御を担うNa+濃度センサーであることを明らかにした。さらに飲水行動全体を説明するには、Naxばかりではなく未知のNa+濃度センサーからのシグナルも必要であることが新たに判明した。本研究は、この未知のNa+濃度センサー分子の実体を明らかにすることを目的としている。平成30年度は飲水行動に関わるNa+濃度感知部位を決定するために、野生型マウスにおいてsCVOsの部位特異的破壊を行い、高浸透圧溶液を脳室内注入したときの水分摂取量を測定した。その結果、sCVOsのうち終板脈管器官(OVLT)を破壊すると、食塩水やソルビトール溶液を脳室内へ注入したときの飲水行動が、ほぼ消失することが判明した。これに対して脳弓下器官(SFO)を破壊した場合では、飲水行動への影響が見られなかった。以上の結果は、飲水行動に関わるNa+濃度や浸透圧の感知部位がSFOであることを示している。さらにNaxノックアウトマウスのOVLTにNaxを発現するアデノウィルスを注入して部位特異的に発現を回復させると、食塩水脳室内投与時の飲水量が野生型マウスと同程度まで回復した。この結果から、NaxがOVLTにおいてNa+濃度センサーとして機能していることが判明した。現在、Na+濃度センサー候補分子とNaxシグナルとの関係を調べるために、NaxノックアウトマウスにおけるNa+濃度センサー候補分子の発現抑制実験を行っている。他の研究での需要もあってNaxノックアウトマウスの生産が間に合わず、Naxノックアウトマウスを使った実験に遅れがでた。現在は産仔用ペアを増やしたこともあり、必要数を確保できている。Na+濃度上昇時の飲水行動制御の脳内機構の解明を目指し、平成31年度は以下の実験を行う。(1)Na+濃度センサー候補分子とNaxとの間の関係の解明Na+濃度センサー候補分子とNaxシグナルとの関係を調べるために、NaxノックアウトマウスにおけるNa+濃度センサー候補分子の発現抑制を行い、食塩水の脳室内投与時の飲水量を測定する。この結果をNaxノックアウトマウスやNa+濃度センサー候補分子の発現抑制を行った野生型マウスの結果と比較する。さらに、エポキシエイコサトリエン酸(EETs)の飲水量回復・増強効果に対するNa+濃度センサー候補分子の発現抑制の効果を検討する。(2)Na+濃度センサー候補分子の発現細胞の同定センサー分子による飲水行動制御機構を知るためには、センサー分子が発現している細胞種の同定が必須である。そこでNa+濃度センサー候補分子について、OVLT内のどの細胞種に発現しているかを、免疫染色や単細胞RT-PCR等を用いて明らかにする。この結果をNaxノックアウトマウスやNa+濃度

センサー候補分子の発現抑制を行った野生型マウスの結果と比較する。さらに、エポキシエイコサトリエン酸(EETs)の飲水量回復・増強効果に対するNa+濃度センサー候補分子の発現抑制の効果を検討する。(2)Na+濃度センサー候補分子の発現細胞の同定センサー分子による飲水行動制御機構を知るためには、センサー分子が発現している細胞種の同定が必須である。そこでNa+濃度センサー候補分子について、OVLT内のどの細胞種に発現しているかを、免疫染色や単細胞RT-PCR等を用いて明らかにする。