hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肺癌のＥＧＦＲ－ＴＫＩ耐性機序における低酸素環境と幹細胞およびＥＭＴの関与

我々はEGFR活性型変異を有する非小細胞肺癌細胞株を用いて、Gefitinib暴露後に残存し、薬剤抵抗性を示すGefitinib-resistant persisters (GRPs)は、癌幹細胞因子を高発現し、マウスへの高い腫瘍生着率やsphere形成促進を認める極めて幹細胞性の高い細胞集団であることを見出した。低酸素環境ではGRPsにおけるIGF1Rは活性化され、肺癌幹細胞マーカーCD133陽性GRPsの比率も増加した。また幹細胞性因子であるOct4遺伝子の強制発現は有意にGefitinib耐性を誘導し、この耐性は低酸素環境においてより顕著であった。EGFR活性型遺伝子変異を有する非小細胞肺癌(NSCLC)に対するGefitinib (EGFR-TKI)の効果は既知のものであるが、その一部は自然耐性を示し、治療の大きな障壁となっている。一方、癌の微小環境、特に低酸素環境は癌幹細胞性の維持やEMT誘導と密接な関連があり、治療抵抗性に寄与していると考えられる。我々は現在までに、Gefitinibに高感受性・NSCLC細胞株であるPC9を用いたIn vitro細胞培養系において、Gefitinib治療後に残存し抵抗性を示すDrug-tolerant persisters (DTPs)は、肺癌幹細胞マーカーCD133や山中因子であるOct4, Sox2などを高発現し、マウスへの高い腫瘍生着率を示す極めて幹細胞性の高い細胞集団であること、また低酸素環境は著明なEMTを誘導し、Gefitinib耐性DTPsの比率を顕著に上昇させることを見出した。そしてEMT誘導因子の中で、転写因子であるZEB1発現が著明に上昇しており、ZEB1遺伝子のknockdownはGefitinib曝露後のDTPsの比率と幹細胞性を有意に低下させ、低酸素誘導性Gefitinib耐性もReverseすることを確認した。本研究において、我々はNSCLCのGefitinib耐性機序を幹細胞Nicheと考えられる低酸素環境とCD133陽性DTPsやZEB1、またZEB1を直接標的遺伝子とするmiR-200cなどのmicroRNAsの解析を通して詳細に検証する。我々は現在までに、gefitinib感受性NSCLC細胞株であるPC9細胞が低酸素環境においてgefitinib耐性を示すこと、また著明なEMTを引き起こし、EMT誘導因子の中でもZEB1発現が上昇していることを確認した。現在、我々はこのgefitinib耐性機序を低酸素環境とCD133陽性DTPs、およびZEB1とmiR-200familyなどのmicroRNAsの解析を通して詳細に検証しており、DTPsを標的としたEGFR-TKI耐性克服の新たな戦略構築を目標としている。我々は現在までに、gefitinib感受性NSCLC細胞株であるPC9細胞が低酸素環境においてgefitinib耐性を示すこと、また著明なEMTを引き起こし、EMT誘導因子の中でもZEB1発現が上昇することを確認した。また低酸素環境によりgefitinib曝露後の幹細胞マーカーCD133陽性のDrug-tolerant persisters (DTPs)の比率は著明に上昇すること、またZEB1 knockdownによりCD133陽性DTPsの比率は有意に低下し、低酸素誘導性gefitinib耐性もreverseすることを確認した。またEGFR遺伝子変異陽性NSCLC 18症例のGefitinib治療前および治療後に再発・耐性化後の腫瘍組織を採取し、ZEB1発現を免疫染色で検討している。本研究において、我々はこのgefitinib耐性機序を低酸素環境とCD133陽性DTPsやZEB1の解析を通して詳細に検証し、DTPsを標的としたEGFR-TKI耐性克服の新たな戦略構築を目標とした。近年、gefitinib治療後に残存する幹細胞マーカーCD133陽性のDrug-tolerant persisters (DTPs)の存在がEGFR-TKI耐性機序において注目されているが、低酸素環境によりgefitinib曝露後のCD133陽性DTPsの比率は著明に上昇すること、またZEB1 knockdownによりCD133発現は有意に低下し、低酸素誘導性gefitinib耐性もreverseすることを確認した。

またEGFR遺伝子変異陽性のNSCLC症例のGefitinib治療前および治療後に再発・耐性化した腫瘍組織を用いて免疫染色も施行し、ZEB1発現は治療後に再発・耐性化した腫瘍組織において高い発現を認めた。我々はEGFR活性型変異を有する非小細胞肺癌細胞株を用いて、Gefitinib暴露後に残存し、薬剤抵抗性を示すGefitinib-resistant persisters (GRPs)は、癌幹細胞因子を高発現し、マウスへの高い腫瘍生着率やsphere形成促進を認める極めて幹細胞性の高い細胞集団であることを見出した。低酸素環境ではGRPsにおけるIGF1Rは活性化され、肺癌幹細胞マーカーCD133陽性GRPsの比率も増加した。また幹細胞性因子であるOct4遺伝子の強制発現は有意にGefitinib耐性を誘導し、この耐性は低酸素環境においてより顕著であった。我々は現在までに、Gefitinibに高感受性NSCLC細胞株であるPC9を用いたIn vitro細胞培養系において、Gefitinib治療後に残存し抵抗性を示すDrug-tolerant persisters (DTPs)は、肺癌幹細胞マーカーCD133や山中因子であるOct4, Sox2などを高発現し、マウスへの高い腫瘍生着率を示す極めて幹細胞性の高い細胞集団であること、また低酸素環境は著明なEpithelial mesenchymal transition (EMT)を誘導し、Gefitinib耐性DTPsの比率を顕著に上昇させることを見出した。そしてEMT誘導因子の中で、転写因子であるZEB1発現が著明に上昇しており、ZEB1遺伝子のknockdownはGefitinib曝露後のDTPsの比率と幹細胞性を有意に低下させ、低酸素誘導性Gefitinib耐性もReverseすることを確認している。またEGFR遺伝子変異陽性NSCLC 18症例のGefitinib治療前および治療後に再発・耐性化後の腫瘍組織を採取し、ZEB1発現を免疫染色で検討している。補助事業期間延長承認:平成27年3月20日肺癌現在までの我々の基礎および臨床的検討は、EGFR-TKI耐性におけるEMTや癌幹細胞の関与を積極的に示唆するものと考えるが、EGFR-TKI治療耐性に直接関与しているCD133陽性の幹細胞集団とEMT、そしてZEB1を制御するmicroRNAsとの相互関連、および幹細胞のnicheとも考えられている低酸素環境との関連をさらに網羅的に解析してゆく必要性がある。現在までに我々は、Gefitinib感受性PC9細胞が低酸素環境においてGefitinib耐性を示し、CD133陽性DTPsの比率が著明に上昇することを確認した。CD133陽性DTPsはCell cycle解析でほぼG1期に静止しており、またマウスにおいて非常に少ない細胞数で腫瘍生着を示し、自己複製能を反映するSphere forming abilityも亢進していた。また低酸素環境は、著明なEMTを引き起こし、EMT誘導因子の中でもZEB1発現が上昇することも見出した。
亜熱帯沖縄、熱帯アジアに産する薬用資源植物の有効利用

沖縄県で採集したオオバギ、マルヤマカンコノキ、シロミミズ、ヤマモガシ、ハマセンダンの成分研究を行った。マルヤマカンコノキとハマセンダンからは多数のメガスティグマン配糖体がえられた。それらの構造は核磁気共鳴スペクトルの解析と、絶対構造はモッシャー改良法を用いて決定した。シロミミズについて今回は枝部の成分検索を行い、葉部より得られていた変形ジテルペンの類縁体が既知化合物として、また新規化合物としても得られた。それらの生物活性私見を行った。KB細胞を用いてMTT assayを行ない、KB細胞に対する増殖抑制活性を検討したところスティグマスデロール誘導体に強いKB細胞増殖抑制活性が見られた。ヒト白血病細胞K562の多剤耐性株であるK562/Adrを用いて、Calcein-AMを用いたP-gp阻害活性を検討した。変形ジテルペンの一部には強い活性が見られた。これらの植物よりフェノール性化合物の配糖体、メガスティグマン配糖体等多数の化合物を単離同定した。今後これらの化合物の生物活性を検討したい。ベトナム産の以下の植物成分についても検討した:Scoparia dulcis, Curcuma aff. aeruginosa。これらの植物よりジテルペン及びセスキテルペンを単離した。沖縄県で採集したマルヤマカンコノキの葉部成分の検索を行った。常法に従い、メタノール抽出物のブタノール可溶画分を用いて、配糖体の単離を試みた。その結果、多くの新規メガスティグマン配糖体の単離に成功し、その平面構造は、主に核磁気共鳴スペクトルの解析を以って行い、絶対構造の決定には、円偏光二色性スペクトルの解析、並びに加水分解後のアグリコンにモッシャー変法を適用して、化学的、スペクトル的解析を以って行った。単離した新規化合物の構造を総て決定した。沖縄県で採集したシロミミズの成分検索を引き続き行った。これまで多くの転移型エントカウラン型ジテルペンの配糖体を単離してきたが、今回は非糖体の単離を行った。そのうちトリカリシオライドGはX-線結晶解析を行い、構造を確定するに至った。また、エントカウレン型ジテルペンの単離にも成功し、構造決定を行ない、新規物質であったのでトリカリシオールAおよびBと命名した。シロミミズには更に多くの新規エントカウレン型ジテルペンの配糖体の含有が見込まれ、鋭意単離を繰りかえして、5種を超える化合物を単離している。それらの構造は現在、スペクトル解析を行い、新規化合物であるとの確信をえている。KB細胞、ブラインシリンプを用いて抗癌活性、RBL2H3細胞を用いた抗ヒスタミン遊離活性、現在特に抗がん剤に対する多剤耐性の忌避を目的としてK562/ADM株を用いたP糖タンパク質の活性の阻害剤の探索、DPPHを用いて抗酸化活性等のスクリーニングを行い、ターゲット植物を絞込み、次年度に向けての展開を開始した。沖縄県で採集したシロミミズの枝部成分の検索を行った。常法に従い、メタノール抽出物の酢酸エチル可溶画分を用いて、化合物の単離を試みた。その結果、多くの化合物の単離に成功し、その平面構造は、主に核磁気共鳴スペクトルの解析を以って行った。それらはエントカウラン型ジテルペン、ステロール、リグナン、クマリンなどと同定され、エントカウラン型ジテルペンのうち2種については新規化合物であることが判明した。シロミミズ材の酢酸エチル可溶分画から単離した11種の化合物について、KB細胞を用いてMTT assayを行ない、KB細胞に対する増殖抑制活性を調べた。MTT assayの結果、スティグマステロール誘導体に強いKB細胞増殖抑制活性が見られた(IC_<50>=35.0±3.3μM)。また新規化合物2種(1、2)はカフェストール型エントカウラン型構造であり構造が類似しているが、50μMにてそれぞれ17%,32%の増殖抑制活性を示し、化合物2の方が抑制率が高いことが示された。このことは、化合物2は化合物1にパルミチン酸がエステル結合してという構造から、脂溶性が増したことが活性の差に影響している可能性が考えられる。

これまでに様々な多剤耐性の機構が解明されてきたが、その主要なメカニズムとしてトラスポーターのP-糖タンパク質(P-gp)の関与が知られており、P-gpの発現の亢進が耐性の主要な理由であることが報告されている。ヒト白血病細胞K562の多剤耐性株であるK562/Adrを用いて、Calcein-AMを用いたP-gp阻害活性を検討した。カフェストール型エントカウラン型の一部には強い活性が見られた。
デフレ・円高・財政危機：バブル経済の後遺症に関する包括的理論・実証分析と政策対応

実証的には、世界的なデフレ傾向が明らかになってきた中で行われてきている量的緩和政策の問題を考察し、インフレ目標の採用の有無が、金融危機後の経済パフォーマンスに与えた影響を検討し、実質為替レートの変動メカニズムを分析した。また、アジア新興諸国の景気循環に関する傾向や特徴を検討し、さらには、高橋財政期の為替レート調整、金融緩和、財政出動によるそれぞれの波及効果も包括的に分析した。理論的には、バブルが発生しないための条件等を明らかにするとともに、金融システムの破たん伝播モデルを修正し、各銀行がリスク性の外部資産を保有する状況を分析した。現在日本経済が直面しているデフレ・円高・財政危機という深刻な問題は90年代初頭のバブル崩壊に原因を求めることができる。本研究では、バブルの発生・崩壊、さらにデフレ・円高・財政危機といったバブル経済の後遺症を理論・実証の双方向から包括的な分析を進めている。平成24年度は、80年代以降の日本を中心に、欧米・新興諸国、両大戦間期の日本も含み、適応性・普遍性の高い理論・実証結果を導き出せるよう、「貨幣・政府債務は本質的にはバブルである」との認識に立ち、バブル・貨幣・政府債務に関する統合的な理論の構築を目標に取り組んだ。また、活動としては、以下の研究会・ワークショップを開催した。平成25年2月15日(金)研究会:上東(代表者)、敦賀・小林(分担者)報告、3月11日(月)ワークショップ:吉野直行(現:アジア開発銀行研究所所長、当時:慶應義塾大学経済学研究科教授)、高橋(分担者)報告、4月5日(金)・8(月)・15日(月)ワークショップ共催(RIEBセミナー/六甲フォーラム):Jonathan H. HAMILTON(フロリダ大学ウォリントンカレッジ教授)報告、5月17日(金)ワークショップ:深尾光洋(慶應義塾大学商学部教授)、柴本(分担者)報告、5月28日(火)ワークショップ共催(RIEBセミナー/神戸大学金融研究会): Markus K. BRUNNERMEIER(プリンストン大学教授)報告、6月21日(金)ワークショップ共催(RIEBセミナー/神戸大学金融研究会/神戸大学社会科学系教育研究府):清滝信宏(プリンストン大学経済学部教授)報告、6月24日(月)25日(火)ワークショップ:清滝信宏(プリンストン大学経済学部教授)、高槻泰郎(神戸大学経済経営研究所准教授)、上東(代表者)、柴本(分担者)報告。現在日本経済が直面しているデフレ・円高・財政危機という深刻な問題は、90年代初頭のバブル崩壊に原因を求めることができる。本研究では、バブルの発生・崩壊、さらにデフレ・円高・財政危機といったバブル経済の後遺症を理論・実証の双方向から包括的に分析を進め、グローバル化の進む世界経済において、日本経済が長期低迷に喘ぎ巨額な政府債務を抱える中、今後取るべき金融・財政政策に関する具体的かつ現実的な提言できるよう取り組んだ。平成25年度は、平成24年度開始した理論プロジェクトおよび実証プロジェクトの分析結果に基づき、デフレ・円高・財政危機を理論・実証の双方向から包括的に分析を行った。また、活動としては、以下のワークショップを開催した。平成25年9月3日(火)4日(水)ワークショップ共催第10回Modern Monetary Economics Summer Institute (MME SI) in Kobe、9月9日(月)ワークショップ(共催):堀井亮(現:大阪大学社会経済研究所教授、当時:東北大学経済学研究科准教授)柴本昌彦(分担者)、9月9日(月)ワークショップ共催特別公開講座:浜田宏一(イェール大学名誉教授、内閣官房参与、神戸大学経済経営研究所リサーチフェロー)講演、9月17日(火)ワークショップ(共催):Lise CLAIN-CHAMOSSET-YVRARD(エクス・マルセイユ大学スクール・オブ・エコノミクス(GREQAM))、菊地朋生(シンガポール国立大学経済学部准教授)報告、11月11日(月)ワークショップ:吉川洋(東京大学経済学研究科教授)報告、2月1日(土)ワークショップ(共催):柴本昌彦(分担者)、髙槻泰郎(神戸大学経済経営研究所准教授)、鎮目雅人(現:早稲田大学政治経済学術院教授、当時:日本銀行金融研究所)報告。本研究では、バブルの発生・崩壊、さらにデフレ・円高・財政危機といったバブル経済の後遺症を理論・実証の双方向から包括的に分析した。平成26年度は、25年度に開始したプロジェクト1政府債務の上限に関する実証分析(柴本、上東、立花、北野)、2バブル・貨幣・政府債務に関する統合理論の確立(上東、北野、敦賀、小林)、3デフレ・通貨高・財政危機に関する包括的実証分析(高橋、地主、立花、柴本)、4デフレ・円高・財政危機に対する包括的金融・財政政策(構成員全員)に引き続き取り組んだ。また、最終年度である平成26年度は、以下の研究会・ワークショップを開催した。

平成26年5月9日(金)ワークショップ(共催):堀井亮(現:大阪大学社会経済研究所教授、当時:東北大学経済学研究科准教授)報告、7月15日(火)ワークショップ(共催):Yiannis VAILAKIS(グラスゴー大学アダム・スミスビジネススクール教授)報告、7月21日(月)ワークショップ共催:Tack YUN(ソウル大学校教授)報告、10月24日(金)ワークショップ(共催):蓮井康平(神戸大学経済学研究科・博士課程)、渡辺寛之(神戸大学経済経営研究所当時学術研究員、現特命助教)、柴本昌彦(分担者)、黒住卓司(日本銀行金融研究所企画役)、廣瀬康生(慶應義塾大学経済学部准教授)報告、10月25日(土)ワークショップ(共催)「マクロ財政・金融政策効果の実証的評価」:柴本昌彦(分担者)、塩路悦朗(一橋大学経済学研究科教授)、山岡浩巳(日本銀行金融市場局局長)、大矢俊雄(財務省大臣官房総合政策課課長)報告、平成27年2月10日(火)ワークショップ(共催):Ronaldo CARPIO(対外経済貿易大学金融学院准教授)報告。26年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度は、平成24年度に開始した個別プロジェクトに引き続き取り組むとともに、各プロジェクトで得られた分析結果に基づき、以下のプロジェクトを行った。1政府債務の上限に関する実証分析(柴本、上東、立花、北野)2バブル・貨幣・政府債務に関する統合理論の確立(上東、北野、敦賀、小林)3デフレ・通貨高・財政危機に関する包括的実証分析(高橋、地主、立花、柴本)4デフレ・円高・財政危機に対する包括的金融・財政政策(構成員全員)上記プロジェクトが予定通り進んでいることから、おおむね順調に進展している。経済学平成24年度に開始した個別プロジェクト、平成25年度に開始した上記プロジェクトを引続き行う予定である。1政府債務の上限に関する実証分析(柴本、上東、立花、北野):財政安定化ルールに基づき各国の財政余地を推計した先行研究はあるが、同様の手法で日本経済の持続可能性を検証した研究からは、定まった結果が得られていない。本プロジェクトでは、財政安定化ルールに基づく日本の債務上限と、政府債務、金融・財政政策、財政破綻に関する理論モデルから得られる内生的債務上限を推計・比較・検証する。2バブル・貨幣・政府債務に関する統合理論の確立(上東、北野、敦賀、小林):これまでの分析結果に基づき、バブル・貨幣・政府債務の相互関係を分析する。特に、バブルの発生・崩壊が金融市場の安定性に影響し、バブル崩壊後にデフレ・通貨高・政府債務の増大が起こるような開放経済モデルを構築する。さらに、バブル崩壊後の最適な金融・財政政策の性質を明らかにする。3デフレ・通貨高・財政危機に関する包括的実証分析(高橋、地主、立花、柴本):これまでの実証分析と既存研究に基づき、金融・財政政策がデフレ、為替、政府債務、実物経済、金融市場の安定性に与える影響を、地域・時代に共通する普遍的傾向とそうでないものに分けて整理する。
MRSによる薬物代謝経路直接追跡 -反応・生成系間磁化移動の活用-

本研究は薬物代謝経路の新規な無侵襲追跡法として、薬物消長の追跡に留まらず、NMRの特徴を活かして定常状態での反応経路追跡法を確立する。本法は通常の医薬品に限らず、NMR測定可能な核でラベルした試薬による機能診断にも応用できるが、定常状態測定によりNMR法の感度の低さ=時間分解能の低さを補う点に特徴がある。1.このような研究では体内の低濃度物質の反応を対象とするため、測定感度向上が重要である。その対応として高磁場(9.4T)の装置を用いた。高磁場測定の問題は磁化率の不均一に基づく画像強度の乱れであるが、その影響の定量的評価を行った。結果としてT_2評価を併用した高速スピン-エコー法の場合、T_2が30msより長い場合には満足すべき定量結果が得られた。この成果をフッ素標識糖に応用し、1999年1月の国際超高速MRIシンポジウム(日本磁気共鳴医学会主催)で公表した。2.速い交換反応の存在下ではT_2短縮がおきるためにエコーを用いた画像取得は不利と考えられ、通常の高速撮像法よりもいわゆるCSI法が有利であると考えた。その結果、抗がん剤、5-FUでは交換が早い腸内での信号検出に成功した。この成果は1998年9月の第26回日本磁気共鳴医学会(京都)で発表した。3. ^<31>P-CSI法により高エネルギーリン酸化合物間の磁化移動直接測定を行った。定常状態飽和移動法によるクレアチンキナーゼの評価を空間分解能5mm^2で行った。得られた満足すべき結果を1998年10月の第37回NMR討論会(横浜)で発表した。本研究は薬物代謝経路の新規な無侵襲追跡法の確立を目的とする。薬物消長の追跡に留まらず、NMRの特徴を活かして定常状態での反応を捉える方法を確立する。これは通常の医薬品のみならず、NMR測定可能な核でラベルした試薬による機能診断にも応用できるが、定常状態測定によりNMR法の感度の低さ=時問分解能の低さを補うものである。本研究では体内の低濃度物質の反応を対象とするため、測定感度向上が重要である。その対応の1点目として高磁場(9.4T)の装置を用いた。第2点目は最高の検出感度が期待できるサーフェスコイルによる検出を行った。ここで、NMR情報への空間情報付加に備え、磁場勾配の印可とRFパルスの正確さを確保する目的でボディコイル発信、サーフェスコイル受信の形式を採用する。本年度購入物品であるデチューニングサ-キットはこれら2つのコイル間のカップリングを外す為のものである。速い交換反応の存在下ではT_2短縮がおきるためにエコーを用いた画像取得は不利と考えられる。モデルとして高pHの5-FU系化合物のファントムならびにFU投与マウスを用いて各種化学シフト画像シーケンスの比較検討を行った。高磁場で小動物を対象とした場合にも信号強度の信頼性の点では通常の高速撮像法よりもいわゆるCSI法が有利であることが示唆された。現在、磁化移動の直接測定を行っている。以上の成果は1997年9月の第36回NMR討論会で発表した。
加齢による胚中心応答を介した免疫システム破綻機構の解明

これまで、自己免疫疾患の一つであるシェーグレン症候群(Sjogren's syndrome;SS)の発症機序について研究を進めてきた。抗体産生機構に重要な役割を果たしている胚中心反応においてキーとなる細胞分画である濾胞ヘルパーT細胞(Follicular helper T cell;Tfh)のSS病態への関与について、今年度もさらなる検討を行ってきた。これまでと同様、SSモデルマウスを用い、脾臓および頸部リンパ節について病理組織学的及び免疫学的評価を行った。その結果、SSモデルの脾臓や頸部リンパ節では、Tfhや胚中心B細胞が増加しており、胚中心反応が亢進していることが示唆された。さらに、Tfh分化に重要な転写因子の1つであるAscl2がCD4陽性T細胞中で発現亢進しており、Tfhの過剰な分化に寄与している可能性が示唆された。過去の報告で、関節リウマチ患者などに対して用いられているリツキシマブ(CD20を発現するB細胞を阻害する免疫抑制剤)をSS患者に投与することで、Tfhの減少に伴って病態の改善が認められたとの報告があるため、我々は、SSモデルに抗CD20抗体を静脈内投与し、解析を行った。その結果、顎下腺導管周囲に浸潤する単核リンパ球数が有意に減少し、自己免疫病態の改善を認めた。加えて、脾臓においては胚中心領域の面積が縮小し、Tfhや胚中心B細胞の有意な減少が認められた。さらには、唾液腺における自己免疫病変の程度とTfhの細胞数との間で有意に相関していることを見出し、TfhがSSの病態増悪に寄与している可能性を示した。また、SS患者の口唇腺組織においても、異所性の胚中心の形成やTfhの浸潤が観察され、臨床的にもSSの病態とTfhは密接な関係があることが示唆された。自己免疫疾患発症には、加齢変化に伴う細胞と抗原との親和性の低下、および自己抗体の増加が関与することが示唆されてきている。本研究では、自己免疫疾患のひとつであるシェーグレン症候群のモデルマウス(SSモデルマウス)を用いて、加齢に伴う自己抗体の産生機序を解明し、自己免疫疾患の病態機序を明らかにすることを目的とした。B細胞からの抗原特異的な抗体産生の誘導には、二次リンパ組織内での胚中心反応が重要な働きをしていることが知られており、濾胞性T細胞(Tfh)と胚中心B細胞が安定的に相互作用することで胚中心を形成し、効率良くB細胞の活性化と抗体産生を促すことができる。そこで、SSモデルマウスを用いて、経時的に二次リンパ組織内におけるTfh細胞(CD4+CD62LーCXCR5+PD-1+)の割合・細胞数をフローサイトメーターにて解析した。その結果、SS病態を発症しているSSモデルマウス(3ヶ月齢♀)では、コントロールマウスと比較して、脾臓と頚部リンパ節のリンパ濾胞内におけるTfh細胞の割合および細胞数の有意な増加が認めらた。また、加齢に伴ってTfhの細胞数も有意に上昇することが明らかとなった。さらに、組織切片を用いた検討から、SS病態を発症しているSSモデルマウス(3ヶ月齢♀)では、コントロールマウスと比較して、リンパ節における濾胞形成が過剰であることも明らかとなった。このことから、異常に分化または増殖したTfhは、自己反応性のB細胞に過剰な活性化シグナルを与え、自己抗体の産生を促進している可能性が示唆される。当研究室で樹立したSSモデルマウスで、Tfhの異常を含む胚中心応答の亢進がみられた。よって、このSSモデルマウスが自己免疫疾患の病態解明に非常に有用なことが示された。また、112月齢のSSモデルを用いてTfhの機能を検討することで、加齢に伴うSS発症のメカニズムを評価することができる。さらに加齢的に著しく上昇する分子があれば、その分子を特定し、siRNAでノックダウンするなどの評価系を用いてその病態形成に関与しているかを明らかとすることができる。これまでの検討から、シェーグレン症候群(SS)病態を発症しているSSモデルマウスでは、コントロールマウスと比較して、脾臓と頚部リンパ節のリンパ濾胞内におけるTfh細胞の割合および細胞数の有意な増加が認められている。さらに、加齢変化に伴ってTfh細胞が増加することを見出してきている。そこでTfh細胞が活性化し機能が亢進している可能性を検討するために、Tfh活性化の指標であるTfh関連分子のmRNA発現が上昇しているか評価したところ、Bcl-6を含むいくつかのTfh関連分子のmRNA発現が上昇していることが分かった。引き続き、Tfh細胞の分化異常の可能性を検討するために、脾臓由来ナイーブCD4+T細胞をMACSビーズを用いて単離した後、Tfh細胞分化に必須であるIL-6 / IL-21の存在下にて培養し、Tfh分化能を検討している。また、IL-6のシグナル伝達の下流で働くJAK・STAT3・gp130、およびIL-21シグナル伝達の下流で働くJAK1・JAK3・STAT3の発現やリン酸化の有無を解析しているところである。さらに、これらの実験結果をふまえ、病態に関与しているであろうBcl-6を含むTfh関連分子をなくす、あるいは補うことで、SS病態が改善するかを検討するため、Tfh関連分子欠損マウスとSSモデルマウスを掛け合わせることによって、候補遺伝子と病態との関係を明らかにするため、現在Tfh関連分子ノックアウトを作成中である。

SSモデルマウスでは、いくつかのTfh関連分子のmRNA発現が上昇していることが示された。これらの候補遺伝子欠損マウスを作成し、SSモデルマウスと掛け合わせることで、候補遺伝子と病態との関係を明らかにすることを目的に、現在Tfh関連分子ノックアウトを作成中であるが、まだ得られていない。これまで、自己免疫疾患の一つであるシェーグレン症候群(Sjogren's syndrome;SS)の発症機序について研究を進めてきた。抗体産生機構に重要な役割を果たしている胚中心反応においてキーとなる細胞分画である濾胞ヘルパーT細胞(Follicular helper T cell;Tfh)のSS病態への関与について、今年度もさらなる検討を行ってきた。これまでと同様、SSモデルマウスを用い、脾臓および頸部リンパ節について病理組織学的及び免疫学的評価を行った。その結果、SSモデルの脾臓や頸部リンパ節では、Tfhや胚中心B細胞が増加しており、胚中心反応が亢進していることが示唆された。さらに、Tfh分化に重要な転写因子の1つであるAscl2がCD4陽性T細胞中で発現亢進しており、Tfhの過剰な分化に寄与している可能性が示唆された。過去の報告で、関節リウマチ患者などに対して用いられているリツキシマブ(CD20を発現するB細胞を阻害する免疫抑制剤)をSS患者に投与することで、Tfhの減少に伴って病態の改善が認められたとの報告があるため、我々は、SSモデルに抗CD20抗体を静脈内投与し、解析を行った。その結果、顎下腺導管周囲に浸潤する単核リンパ球数が有意に減少し、自己免疫病態の改善を認めた。加えて、脾臓においては胚中心領域の面積が縮小し、Tfhや胚中心B細胞の有意な減少が認められた。さらには、唾液腺における自己免疫病変の程度とTfhの細胞数との間で有意に相関していることを見出し、TfhがSSの病態増悪に寄与している可能性を示した。また、SS患者の口唇腺組織においても、異所性の胚中心の形成やTfhの浸潤が観察され、臨床的にもSSの病態とTfhは密接な関係があることが示唆された。今後の検討予定として、リンパ濾胞内における胚中心形成が過剰でないかを詳細に検討するために、それらのマーカであるIgD, PNA抗体を用いて免疫組織染色し評価する。また胚中心B細胞の特異的なマーカー(B220+ Fas+ GL7+)を用いて、胚中心B細胞の割合・細胞数を経時的に評価する。さらに、Tfh細胞と胚中心B細胞の局在に偏りなどの異常がないかを検討する。特にB細胞では、胚中心を形成する前の濾胞外縁部に局在する段階でBcl-6の発現が上昇することが胚中心形成に重要であることが知られているため、濾胞外縁部におけるBcl-6の発現が過剰でないかも合わせて検討する。加えて、B細胞の胚中心への移動に要する日数を経日的に評価すると共に、T細胞領域に局在するTfh細胞と胚中心B細胞とが、うまく相互作用できているかどうかについてもライブイメージングを用いて検討する予定である。引き続き、胚中心B細胞の内因性の異常も合わせて検討予定である。通常、二次リンパ組織内で抗原に反応したB細胞はヘルパーCD4+T細胞からのCD40LやIL-4を介した刺激により増殖して、一部は短期生存プラズマ細胞に、一部はIL-21シグナルを受けてさらに増殖し胚中心を形成する。
エジプトの文化財危機管理における画像アーカイブシステムの研究

現地のエジプト人が、文化財の学術的な画像データを、写真を撮るように収集することができ、開発途中ではあったが、クラウド上のアーカイブシステムの構築も可能であることが判明した。さらに、小規模な遺構だけでなく、ピラミッドのような大規模遺跡もデジタルカメラを用いた写真測量で記録することも可能であり、場合によっては、レーザー計測機器との併用も有効であることが示された。特に、数理的な三次元計測計画を用いることで、適切な作業と記録のアーカイビングも可能であることが分かった。2011年に起こった「アラブの春」以後、エジプトでは非合法の発掘や博物館での遺物の略奪が相次いだが、文化財の被害状況を確認したり、修復作業に使用したりすることが出来る画像システムは、エジプト当局には存在しなかった。そこで、その対応策のひとつとして、本研究では高価なレーザー計測機器の導入や、考古写真の専門家を育てることではなく、エジプト人の遺跡査察官や修復専門家が「写真を撮る気軽さ」で遺物や遺構の三次元データを収集し、ネット上でアーカイブ化し、自由に使える画像システムを開発することにした。本年度は、現地予備調査をメンフィス・エリアの2箇所の遺跡で行った。一箇所は、4500年間の都市遺構が発見されているギザのヘイト・エル=グーラブ遺跡である。ここで発掘調査を行っているアシュラフ・アブデル・アジーズ氏に、デジタル画像を用いた三次元記録の有用性と方法を伝え、テストとして、発見された「台座の遺構」の三次元モデルの生成を行ってもらった。結果、デジタル画像からPhotoScanを用いて3D化を行うことに成功し、この発掘調査隊では2016年度からテスト的に、デジタル撮影による三次元データを収集することが決まった。もう一箇所は、南サッカラにあるジェドカラー・イセシィ王のピラミッド複合体である。ここの発掘隊長であるサイード・モハンマド氏のリクエストにより、第一塔門の床面の線画生成を行う際、通常の測量方法ではなく、デジタル写真を用いた3Dモデルの生成、そしてそこから高解像度の床面の画像を生成することとなった。この実際の試みは、今シーズンから行われる予定である。本研究は、「現地のオペレーションシステム」の確立と、クラウド上の「アーカイブシステム」の開発の2本柱から成る。現地のオペレーションシステムの開発は、現場のニーズに合わせるべく、申請者らが関わりの深いギザやサッカラなどのメンフィス・エリアのリサーチから始めた。ギザ査察局の写真記録班の隊長でもあり、ヘイト・エル=グーラブ遺跡(別名:「ピラミッド・タウン」)のエリア・スーパーバイザーでもあるアシュラフ・アブデル・アジーズ氏に協力のもと、三次元形状データ生成用の撮影、データのアップロード、三次元モデルの生成を行った。三次元データ生成のための撮影は、対象物の形状を網羅的に、映像や写真のデジタルデータを取得するだけでなく、ID、場所や日時、対象の名称、方角など基本的な記録も行わなければならない。この作業は、ギザの『中央墓地』で行う予定であったが、現地の要望に合わせ、上述のヘイト・エル=グーラブ遺跡という都市遺構で行った。2015年度は、アーカイブシステムの開発に着手したばかりであることから、アップロード後の三次元モデル生成は、既製ソフトであるPhotoScanで行った。結果、遺構の三次元モデルが生成された。さらに、その三次元データのシェア方法としてAdobe AcrobatによるPDFの報告書として、一部、用いられた。これに加え、南サッカラにあるジェドカラー・イセシィ王のピラミッド複合体では、現地のニーズに合わせた遺跡の撮影方法を、発掘隊長であるサイード・モハンマド氏と協議し、通常の線画生成ではなく、デジタル画像から三次元モデルを作り、その後、高解像度のオルソ画像を生成することで、新しい記録方法を用いるテストを行うことにした。本研究は、高価な三次元レーザー計測機器の導入や考古学写真の専門家に頼ることなく、エジプトの遺跡査察官や修復の専門家が、簡単なガイドラインに従って写真を撮るだけで、三次元化が可能なデータを収集でき、それをネット上でアーカイブ化できる画像システムを開発することにある。昨年度行った遺物の3D化は、今年度も引き続きアシュラフ・アブデル・アジーズ氏の協力のもと、ギザのヘイト・エル=グラーブ遺跡で行われた。小型の遺物の三次元化は、Agisoft PhotoScanが廉価だが、すぐれたソフトとして考古学の分野で一般的に用いられており、撮影方法も確定している。ヘイト・エル=グラーブ遺跡でも三次元データの収集を、本年度もこのPhotoScanを用いて行った。これに加え、本年度は小型の遺物だけでなく、遺構全体の三次元化に焦点を合わせ、ギザではヘイト・エル=グラーブ遺跡の西に位置する「クローマーのゴミ捨て場」と呼ばれる4500年前の遺構と女王のピラミッドでの3次元データの収集を行った。さらに、ギザから11キロ南に位置するアブシールではニウセルラー王のピラミッドの三次元データの収集、そしてそこからさらに5キロほど南の位置する南サッカラのジェドカラー・イセシィ王のピラミッドでも三次元データを収集した。これらの調査の結果、小型の遺物の比較的容易であった三次元化が、大型の遺構では、かなりの撮影をしなければ三次元化できないことが分かった。そのため、補助として映像を撮影することで、そこから画像を抽出して用いるか、あるいはGoPro HERO5のように連続写真を撮りつつ、全ての画像にGNSSの位置情報が付与されるものが好ましく、撮影するエジプト人にとっても簡単であると考えられた。

こういった上記の現場調査に加え、ネット上でのアーカイブ化は、それぞれ遺構と遺跡の両面からの開発を継続した。本研究は「現地のオペレーションシステム」の確立と、クラウド上の「アーカイブシステム」の2本柱からなる。現地のオペレーションシステムは、当初、ギザ台地のヘイト・エル・グラーブ遺跡(通称「ピラミッド・タウン」)だけを考えていたが、現地からの様々な要請に合わせるべく、ギザではヘイト・エル・グラーブ遺跡の西に位置する「クローマーのゴミ捨て場」とクフ王のピラミッドの東側に位置する女王のピラミッドの一基。ギザから南11キロに位置するアブシールでは、ニウセルラー王のピラミッド。そこからさらに南5キロに位置する南サッカラのジェドカラー・イセシィ王のピラミッドなど、いくつかの遺跡で遺構の三次元化をエジプトの研究者と共に試みた。結果、ギザやアブシールに関しては、日本の研究者と共に画像データ/映像データを撮影したために、幾分かの困難さは伴ったが、三次元化は完遂できた。しかし、ジェドカラー・イセシィ王のピラミッドに関しては、撮影から三次元化まで現地の研究者であるモハンマド・メガヘッド氏のみでおこなったため、考古学的に満足いく結果は得られなかった。この理由のひとつには、やはり画像の枚数が少ないことが上げられる。そのため、ギザやアブシールで行ったのと同様に、映像データを補足的に撮ることを推奨すべきだという結論に達した。そして、こういったトライ・アント・エラーからシステム全体をどのように構築するかが本年度は明らかになった。本研究は、写真を撮る気軽さで、文化財の学術的な画像データを収集することができ、ネット上で三次元アーカイブ化するシステムを開発することにある。これは現地のニーズに合わせたオペレーションシステムの確立と、クラウド上のアーカイブシステムの開発の2本柱からなっており、最終年となる29年度は、これまで行った小規模な遺構だけでなく、ピラミッドのような大規模遺跡もデジタルカメラを用いた写真測量で記録することを試みた。対象としたピラミッドは、比較的小規模で、上部構造はほとんど残っていないギザの衛星ピラミッドGI-dと、中規模のアブシールのニウセルラーのピラミッドだった。適切な機材の種類を明らかにすることも現地のオペレーションシステムの確立の一環であるが、GoProのHERO05を用いて記録した。GI-dでは、小型でハンディなこのカメラを持ち、撮影インターバルを予めセットすることで、遺構の周りを回るだけで、適切な記録がスムーズに可能になった。ニウセルラーのピラミッドでは、エジプトのドローン会社と共同で、DJI Phantom 3を用いて写真記録を試みた。クラウド上のアーカイブシステムの開発では、通常であればサーバとなるコンピュータ側で、画像から3次元生成を行うために、SFMを実施するために、システムを組く必要があるが、VisualSFMを用いることで、ネットワーク越しに起動することができることを確認した。これに加え、Agisoftware PhotoScanといったコンシューマーソフトも用い、現地の遺跡査察官による画像からの3次元生成も引き続き行った。
タガログ語の焦点体系と動詞分類

タガログ語を含むフィリピン諸語は「焦点体系」と呼ばれる世界でもこの地域の言語だけにしか見られない特徴を持っている。本研究課題では、動詞分類すなわち動詞の意味的・形態的グループに注目することによって、この焦点体系に関する諸問題に取り組んだ。その結果、動詞分類に注目することで、ヴォイス現象、項交替現象、重複・反復、移動表現などの諸現象を解明することができた。この動詞分類を用いた言語研究の成果は単にフィリピン諸語の研究および一般言語学に貢献しただけでなく、東京外国語大学を中心とするフィリピン諸語教育でも役に立っている。タガログ語を含むフィリピン諸語は焦点体系と呼ばれる動詞形態論を持ち、一つの語根から複数の動詞が派生される複雑なヴォイス現象・項交替現象を示す。申請者の考えでは、この動詞形態論に関する従来の研究には動詞分類という観点が欠けていた。しかし、Levin (1993)による英語の動詞分類の先駆的研究からも明らかなように、ヴォイス現象や項交替現象においては、動詞分類の観点が有効である。そこで本研究計画では、二種類の動詞分類、すなわち、(i)動詞語根の意味的クラス、および(ii)動詞語根の形態論的クラスをとりあげ、その動詞分類が[I]焦点体系による動詞派生をどのように制限し、[II]ヴォイス現象・項交替現象にどう影響するのかを解明する。本研究計画は主に二つの段階からなっている。第一に、文献調査を踏まえて調査すべき500個の語根を選定する段階である。第二に、選定された500個の語根についてフィールド調査でデータを収集し、データベースを構築する段階である。平成25年度は、文献調査と調査語根選定を中心に行った。まず、ヴォイス現象、項交替現象や動詞分類に関する研究を参照し、どのような意味的観点からの動詞分類が有効であるか検討し、調査対象とする語根を選定した。そのうえで、平成26年3月に短期フィールドワークを行い、いくつかの語根に関するデータを収集した。さらに、データベース構築にむけてどのようなデータベースにするのがよいか検討を行った。平成25年度の研究成果は26年度から本格的にデータベースを構築する上で重要な基礎となるものである。また、この研究計画の基礎的研究を行う過程でえられたデータや知見は、研究代表者の研究全体にも貢献し、重要である。そこで本研究計画では、動詞分類が[I]焦点体系による動詞派生をどのように制限し、[II]ヴォイス現象・項交替現象にどう影響するのかを解明する。平成26年度は、平成25年度に行った基礎的調査に基づいて、フィリピンでフィールド調査を行い、データを収集した。3人の言語コンサルタントの補助のもと、選定した語根に関連する項交替現象やヴォイス現象の形式と意味について集中的に調査した。その上で、収集したデータを整理し、データベース化を試みた。タガログ語の辞書データも補助的に利用することでデータベースのサイズを大きくした。以上の研究の結果、本年度はタガログ語について以下の言語現象に動詞分類が大きく関わっていることを明らかにした:(a) pa-分詞構文、(b)移動表現、(c)重複構文と反復構文、(d) naka-結果状態構文。さらに、タガログ語と同じオーストロネシア語族に属するラマホロット語の複他動詞構文についても動詞分類の考え方を用いて論文を発表し、動詞分類に注目する本研究計画の方針が他の言語の研究にも有用であることを示すことができた。こうして本研究計画は、語根に注目した動詞分類という方法が、タガログ語を含むオーストロネシア語族の研究において重要な役割を果たすことを実証的に明らかにした。この点で意義が大きく重要である。26年度が最終年度であるため、記入しない。言語学26年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度は、文献調査を踏まえて調査すべき500個の語根を選定することを目標とし、実際この目標が達成できただけでなく、短期のフィールドワークである程度のデータが得られたので、研究はおおむね順調に進展している。本研究課題は平成25年度から26年度までの計画である。最終年度である平成26年度は、25年度の基礎的研究を前提に、データ収集作業を徹底的に行う。さらに、それにもとづくデータベースを構築し、焦点体系と動詞分類の関係について考察を行い、研究成果として発表する。
KCNQチャネルの小脳での役割を脳スライス電気生理と行動実験で包括的に解明する

電位依存性カリウムチャネルは電気的興奮性細胞の生理機能に中心的な役割を果たす。カリウムチャネルに属するKCNQチャネルは中枢神経系にも発現しており重要な役割を果たすと推測されるが、その機能的意義は殆ど不明である。そこで、急性小脳スライス標本にパッチクランプ法とKCNQ選択的阻害剤・開口剤を適用し、小脳神経細胞におけるKCNQチャネルが果たす生理機能を検討した。その結果、KCNQチャネルは小脳神経細胞において静止膜電位と電気的興奮性を調節する働きを担っていることが明らかとなった。KCNQチャネルが小脳神経細胞で果たす生理学的役割を神経細胞レベルで解明するため、KCNQの阻害剤を用いて、電気生理学的特性への影響を検討した。具体的にはマウス小脳より新鮮脳スライスを作成し、パッチクランプ法を用いて電位固定下で細胞膜の興奮性への阻害剤の影響を記録・解析を行った。KCNQチャネルは電位依存的な不活性化が無く、静止膜電位付近の-60mVでも約10%開いている。そこで、電流固定下で膜電位を連続的に記録を行うと同時に、KCNQ阻害剤を脳スライスチャンバー内に灌流投与した。その結果静止膜電位の変化(数mV)が観察された。通電刺激により誘発される活動電位へのKCNQチャネルの関与を同様の方法で検討した。ランプ波型の通電刺激により膜電位を脱分極させて活動電位を誘発し、阻害剤を投与した。阻害剤により活動電位の発生頻度は低下した。KCNQチャネルが小脳神経細胞で果たす生理学的役割を神経細胞レベルで解明するため、KCNQ機能を調節する薬剤を用いて、電気生理学的特性への影響をパッチプランプ法を用いて記録し(H26年度に実験を実施)、H27年度は、このデータを詳細に解析して結果を得た。具体的にはマウス小脳より新鮮脳スライスを作成し、パッチクランプ法を用いてカレントクランプモードで活動電位発生に対するKCNQ開口剤の影響を記録した生データを、Clampex(Molecular Device社)とIgor (Wavemetrics社)等のソフトウェアを用いて記録後解析を行った。その結果、静止膜電位が約5mV過分極する事を見いだした。これに伴い、通電刺激で誘発される活動電位の発火頻度が30%程度まで減少するという事も発見した。この結果は、てんかん病態に関連するKCNQチャネルと小脳運動機能失調によるてんかんに伴う運動機能への影響を考察する上で重要な所見となると考えられる。本研究は平成26年度が初年度であり、今年度から本格的に実験を開始した。その中で実験計画に記載した内容の実験を実施し、有用なデータを取得する事が出来た。したがっておおむね順調に進展していると考える。神経生理学今後は阻害剤に加えて、KCNQの開口剤も併用して実験を進める事で、より確かな実験を行う方針を考えている。また、KCNQチャネルの神経細胞における局在を検討するために、免疫染色法による局在検討と、薬物の局所投与(ガラスパイペットによるパフ投与)を行いたいと考えている。これにより、KCNQチャネルの小脳神経細胞における機能意義を解明したい。学会出張予定を取りやめた、使用する試薬をより安価なメーカーから調達するなどを行った結果、次年度使用額が生じた。薬物パフ投与を行うために、新規にマイクロマニピュレータ(MP-385、米国Sutter社製、100万円)の購入を計画している。これ以外にはKCNQ開口剤や実験に使う動物の購入、学会出張旅費などへの使用を計画している。
ヒトｉＰＳ細胞を用いた革新的三次元肝・膵組織創出法の開発

本研究では、ヒトiPS細胞の肝細胞への分化誘導研究において、異なった細胞系譜の時空間的な相互作用を活用した、「臓器の再構成に基づく分化誘導」を実現化した革新的な三次元培養技術を新たに開発し、ヒト臓器創出を可能とする基盤技術を確立した。本法を用いて創出した肝臓原基や、膵島原基を免疫不全マウスに移植することにより、ヒト血管網を有した機能的な組織が構築されることが判明した(Takebe, et al. Nature, Cell Stem Cell)。本法を基盤技術として、様々なヒト臓器再構成系を開発していくことにより、多くの患者を救済する革新的な再生医療を実現化できるものと期待される。現在、末期臓器不全症に対しては、臓器移植による臓器置換が極めて有効な治療法として実施されている。しかしながら、年々増大する臓器移植のニーズに対し、ドナー臓器の供給は絶対的に不足している。したがって、臓器移植に代わる治療法の開発は、多くの患者救済のために必須である。また、臓器不全症に対する待機的治療には莫大なコストを要することから、医療経済学的観点からもその開発ニーズが非常に高まっている。研究代表者らは、ヒトiPS細胞を用いた再生医療研究において、従来の「細胞の分化誘導」という開発概念から脱却し、異なった細胞系譜の時空間的な相互作用を活用した、「臓器の再構成に基づく分化誘導」を実現化した革新的な三次元培養技術を新たに開発し、ヒト臓器創出を可能とする細胞操作技術を確立した。すなわち、肝発生の初期プロセスを人為的に再現することのできる新たな三次元培養系により、ヒト肝臓原基の創出を可能とする基盤技術を確立した(PCT/JP2012/074840:組織及び臓器の作製方法)。本法を用いてヒトiPS細胞から創出したヒト肝臓原基(肝芽)を免疫不全マウスに移植することにより、血管網を有した機能的なヒト臓器が構築され、様々なヒト肝臓特有の機能を発揮可能であることが判明している。このようなヒト臓器構成を可能とする技術は世界中に類を見ず、極めて独自性の高い基盤技術を開発できたものと考えられる(Takebe T, et al. Nature, Accepted)。本法を基盤技術として、本研究開発が対象としている膵臓をはじめ様々なヒト臓器構成系を開発していくことにより、将来的に莫大な社会的医療ニーズに応え、多くの患者を救済することが可能な再生医療実現化へ向けて革新的な手法を確立できるものと大いに期待される。昨年度において、ヒトiPS細胞を用いた再生医療研究において、従来の「細胞の分化誘導」という開発概念から脱却し、異なった細胞系譜の時空間的な相互作用を活用した、「臓器の再構成に基づく分化誘導」を実現化した革新的な三次元培養技術を新たに開発し、ヒト臓器創出を可能とする細胞操作技術を確立した。本年度においては、研究代表者らが開発した手法により作製したヒトiPS細胞由来肝臓原基の治療効果の検証を目的として、重篤な免疫不全状態で異種細胞や組織の生着・分化が格段に優れるNOGマウスにおいて肝細胞が選択的・特異的に破壊される、というAlb-Tk-NOGマウスへの移植実験を行った。驚くべきことに、iPS細胞由来肝臓原基の異所性移植群において、肝不全モデルマウスの生存率が著名に改善することを見出した。さらに、従来実施されてきたようなヒト成体肝細胞移植治療との比較実験の結果、血管系を有する臓器原基を移植することにより優れた治療効果を発揮可能であることが示唆された。臓器原基を移植する、という新たな治療概念によって、従来の細胞を移植するという治療を凌駕する革新的な再生医療を提供できるものと大いに期待される。成果は本年度において、著名な学術雑誌であるNatureおよびNature Protocols誌に発表を行った。本年度では、このようなヒト肝臓原基の人為的構成法の拡張を目指し、膵臓を含む他器官の構成系への活用可能性を検討した。具体的には、研究代表者らが開発した手法により、マウス膵β細胞株、マウス胎児膵臓細胞、マウス・ヒト膵島組織などのいずれにおいても、3次元的な膵臓原基の作製が実現できることを示した。さらに、腎組織など他器官の再構成系としても利用できることを発見した。

一方、血管系を含む本培養系を用いることで、インスリン分泌機能や、移植後の生着効率に優れることを確認した。治療効果の検証を目的として、免疫不全状態で膵β細胞が選択的・特異的に破壊されるInsulin-TRECK-scidマウスへの移植実験を行ったところ、膵臓原基の異所性移植群において、肝不全モデルマウスの生存率が著名に改善することを見出した。ヒトiPS由来膵臓内胚葉細胞については、他グループの既報プロトコルを用いて作製したところ充分な機能性は確認されなかったものの、移植可能な組織形成が可能であることを示したことから、今後再現性の高いプロトコルが確立され次第、本培養系の優位性が示されるものと期待される。成果の一部は本年度において、著名な学術雑誌であるCell Stem Cell誌(in press)に受理され、その他の成果も論文発表を準備中である。器官原基を移植する、という新たな治療概念によって、従来の細胞を移植するという治療を凌駕する革新的な再生医療を提供できるものと大いに期待される。本法を基盤技術として、本研究が対象としている膵臓をはじめ様々なヒト臓器構成系を開発していくことにより、将来的に莫大な社会的医療ニーズに応え、多くの患者を救済することが可能な再生医療実現化へ向けて革新的な手法を確立できるものと大いに期待される。26年度が最終年度であるため、記入しない。再生医学26年度が最終年度であるため、記入しない。当初計画では、H25、26年度での実施を予定していた、ヒトiPs細胞由来肝臓を用いたin vivo機能解析および治療効果の確認をすでに達成している。したがって、計画を大幅に超える進捗状況にあるといえる。当初計画では、H25、26年度での実施を予定していた、ヒトiPS細胞由来肝臓を用いたin vivo機能解析および治療効果の確認をすでに達成している。今後は、ヒト臓器を対象とした再生医療技術を実用化するために必要な様々な要素技術の開発を進めるとともに、膵臓を対象とした研究開発も加速化する。(次年度の使用計画)iPS細胞の維持、肝・膵臓細胞分化誘導に必要な培地やサイトカイン等に必要な消耗品費に使用する。得られた細胞の評価のための、遺伝子発現解析試薬やFACS解析用蛍光標識モノクローナル抗体などの試薬にも経費が必要となる。また、研究の推進に必要な研究補助員の人件費にも利用する。ips細胞の維持、肝・膵臓細胞分化誘導に必要な培地やサイトカイン等に必要な消耗品費に使用する。また,研究の〓〓に必要な研究補助員の人件費にも利用する。消耗品が想定よりも安価に購入できたため,端数が生じ次年度に49円分繰り返す必要性が生じた。今年度使用したサイトカイン試薬の調達コストが、一括購入などに伴い想定よりも安価に購入できたため。ヒト膵臓前駆細胞をヒトiPS細胞からルーティンに分化誘導し、品質評価するための検証に用いる。
ホスホリパーゼDに着目したかゆみメカニズムの解明

野生型マウスおよび種々の温度感受性TRPチャネル欠損マウスで痒み行動を解析し、マウス頬に化合物を投与して後肢で引っ掻く行動が痒み特徴的であることを見いだした。また、温度感受性TRPチャネルに作用する新規脂質を見いだそうとスクリーニングを始め、胆汁うったい(痒みを伴う)病態時に濃度上昇が知られているリソフォスファチジン酸が新規TRPA1の刺激物質であることを見いだした。痒み行動を観察して、TRPA1チャネル欠損マウスでリソフォスファチジン酸による痒み行動が有意に減弱していることを確認した。次に、リソフォスファチジン酸が直接TRPA1を活性化するかを検討するために、HEK293細胞にTRPA1を発現させてインサイドアウト法による単一チャネル電流記録を行い、TRPA1チャネルがリソフォスファチジン酸の濃度依存的に活性化されること、その活性がTRPA1特異的阻害剤で抑制されることを観察し、TRPA1がリソフォスファチジン酸によって直接活性化させることを発見した。加えて、リソフォスファチジン酸が先ず、代謝型LPA5受容体に作用し、細胞内で種々の酵素によってLPAが再合成されて細胞内からTRPA1を活性化することを見出した。そして、リソフォスファチジン酸の作用標的としてのリジンとアルギニン残基を同定した。