hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遷延する高血糖が膵β細胞の分化転換を誘導する機序の解明

高脂肪食とストレプトゾトシンの少量投与によって作成した肥満糖尿病モデルマウスで、高血糖状態にさらされたβ細胞が他細胞に分化転換することを検討している。膵β細胞はPP細胞に分化転換することがlineage tracing法でわかってきており、そのメカニズムとしてPDX1・Nkx6.1・MafAなどの主要転写因子の発現減弱が関与していることを示してきた。しかしながらPPはPPファミリーのNPYやPYYと相同性が高く、市販の抗PPポリクローナル抗体論文では真にPP細胞を検出しているのかが疑問視され、PP-Creノックインマウスや抗PPモノクローナル抗体を作出し、さらなる検討を行っている。昨年度においてわれわれはPP細胞特異的な抗体を作成した。これまでにヒト膵臓におけるPP細胞数は報告により異なる。この原因として、PPタンパクは他のPPファミリーと呼ばれるNPY(Neuro Polypeptide Y), PYY(Peptide-YY)と高い相同性を示すため、抗体が交叉性を示すことが挙げられる(Guo L. Diabetes. 62: 3459, 2013)。前回の報告においてわれわれが用いている抗PP抗体はPYYやNPYなど他のPPファミリータンパクと交差ないと報告したが、PYYとわれわれの使用している抗体においてPP抗体の特異性に問題があることがわかった。そのため、われわれは特異的モノクローナル抗体を作成した。また、徳島大学病院の消化器移植外科の協力の元、病変によって切除された膵標本を用いてこれに対してPP細胞数の変化を評価した。また、以前より作成を行っていたPP-Creノックインマウスの作成が完了したため、本マウスをRosa26-stop-YFPマウスと交配することにより、PPプロモーター活性を有する細胞が膵β細胞に分化転換するか否かを今後の課題として評価する。昨年度われわれはJournal of Biological Chemistryに本研究成果を提出した。先方からのリバイスなどを実施したが、査読の過程で拒否された。拒否の理由は抗PP抗体の特異性が焦点となった。この理由として、PPタンパクは他のPPファミリーと呼ばれるNPY(Neuro Polypeptide Y), PYY(Peptide-YY)と高い相同性を示すため、抗体が交叉性を示すことが指摘された(Guo L. Diabetes. 62: 3459, 2013)。そこでわれわれはモノクローナル抗PP抗体を作成した。前回の報告においてわれわれが用いている抗PP抗体はPYYやNPYなど他のPPファミリータンパクと交差ないと報告したが、新規モノクローナル抗体を用いると、PYYとわれわれの使用している抗体において膵組織の免疫染色にてPP抗体の特異性に問題があることがわかった。本抗体を作成したため、ヒト組織標本の免疫組織染色を実施した。これまでPP特異的な抗体がなかったために、ヒト膵ランゲルハンス島における正しいPP細胞の比率は知られていなかったためである。徳島大学病院の消化器移植外科の協力の元、病変によって切除された膵標本を用いてこれに対してPP細胞数の変化を評価した。本研究では高脂肪食と酸化ストレスによって膵β細胞を障害するストレプトゾトシンの少量投与によって作成された糖尿病モデルマウスで、高血糖状態にさらさらた残β細胞が他細胞に分化転換することを検討している。検討した結果、膵β細胞はPP細胞に分化転換することがlineage tracing法でわかってきている。しかしながら、PPはPPファミリーのNPYやPYYと相同性が高く、市販の抗PPポリクローナル抗体論文投稿した際にEGFPをマーカーとするlineage tracingの正確性に疑問を提示され、受理されなかった。そのため、今年度はPPに特異性の高い抗PP特異的モノクローナル抗体を作成した。また、Rosa26-stop-EGFPマウスではGFP染色が薄く解析が難しかったことから、今年度はRosa26-stop-YFPマウスとRIP(Rat Insulin Promoter)-Creマウスと交配することでlineage tracing法による解析を行った。その結果、従来のポリクローナル抗体陽性細胞で、新たなPPモノクローナル抗体では陰性となる細胞が一部散見され、従来のポリクローナル抗体が他PPファミリーを検出していた可能性が示唆された。しかし、最終的な結果は前回までと同様で、RIP-Creが活性化されたEYFP陽性細胞の一部は、インスリン陰性・PP陽性となっており、障害された膵β細胞がPP細胞に分化転換することが示された。次年度はこの研究の妥当性を学会や論文投稿を通じて他研究者からの意見を求めていく。現在は論文報告にむけて準備を行っている。昨年までで今回と同様の結果を得られているが、使用していた抗体の再作成が必要になったために、約半年の進捗が遅延している。本研究では高脂肪食と酸化ストレスによって膵β細胞を障害するストレプトゾトシンの少量投与によって作成された糖尿病モデルマウスで、高血糖状態にさらされた残β細胞が他細胞に分化転換することを検討している。

また、Rosa26-stop-EGFPマウスではGFP染色が薄く解析が難しかったことから、今年度はRosa26-stop-YFPマウスとRIP(Rat Insulin Promoter)-Creマウスと交配することでlineage tracing法による解析を行った。その結果、従来のポリクローナル抗体陽性細胞で、新たなPPモノクローナル抗体では陰性となる細胞が一部散見され、従来のポリクローナル抗体が他PPファミリーを検出していた可能性が示唆された。しかし、最終的な結果は前回までと同様で、RIP-Creが活性化されたEYFP陽性細胞の一部は、インスリン陰性・PP陽性となっており、障害された膵β細胞がPP細胞に分化転換することが示された。本研究を論文投稿しようとしたが、自己で作出したPPモノクローナル抗体について、前回と同様に信憑性に疑問が持たれ、まだ論文報告することができていない。そこで、市販の複数のPPポリクローナル抗体との比較をマウスにくわえて、膵腫瘍切除を行ったヒト標本を加えてさらに詳細に作出したPPモノクローナル抗体との比較を行い、さらにIn situハイブリダイゼーションでPP mRNAと完全に一致することを示し、これらの結果をBiochemical and Biophysical Research Communications誌に提出している。高脂肪食とストレプトゾトシンの少量投与によって作成した肥満糖尿病モデルマウスで、高血糖状態にさらされたβ細胞が他細胞に分化転換することを検討している。膵β細胞はPP細胞に分化転換することがlineage tracing法でわかってきており、そのメカニズムとしてPDX1・Nkx6.1・MafAなどの主要転写因子の発現減弱が関与していることを示してきた。しかしながらPPはPPファミリーのNPYやPYYと相同性が高く、市販の抗PPポリクローナル抗体論文では真にPP細胞を検出しているのかが疑問視され、PP-Creノックインマウスや抗PPモノクローナル抗体を作出し、さらなる検討を行っている。共同研究先の順天堂大学において、以前からPP-Creノックインマウスを作成し、解析を進めている。昨年度、PP-Creノックインマウスが誕生した。これとRosa26-stop-YFPマウスと掛け合わせることで、本マウスにおいてPP細胞がどのような細胞運命をたどるのかは昨年度から検討を開始したため、その結果がまとまり次第論文報告などを行う予定である。これまでに得られた知見をまとめ、信用のできる研究結果であることを示すために査読付き海外雑誌に投稿する。代謝内分泌学本年度はヒト膵標本を用いたり、すでに作成済のノックアウトマウスの解析などが中心であり、またモノクローナル抗体についても他大学と共同で作成したためにコストがかかっていない。そのために余剰金が発生した。新たなモノクローナル抗体を作成し、マウスをRosa26-EGFPからRosa26-YFPに変更するために交配をしなおすなどで、昨年は待つ時間が長く予算が使用しきれなかった。細胞培養用の顕微鏡と遠心機が昨年度末に使用できなくなったために、本年度の未使用予算を使用してこれらの購入を行う。
骨代謝におけるOsteocalcinの機能に関する実験薬理学的研究

オステオカルシンはビタミンK依存性の骨組織特異的な蛋白質で、骨芽細胞により分泌される。従来の研究では、オステオカルシンは種々の代謝性骨疾患において骨芽細胞の活性を示す感度の良い特異的な指標とされており、骨リモデリングの活性を反映することが推察されている。しかしながら、変化に富んだ代謝性骨疾患においては、血清中のオステオカルシンのレベルの意義について、いくつかの矛盾する見解が示されている。これは、おそらく循環血液中のオステオカルシン分子の免疫化学的な不均一性によるものと考えられている。本研究では我々はオステオカルシン分子のN末端のアミノ酸配列に着目し、オステオカルシン分子のN末端20残基の合成ペプチドに対するモノクロナール抗体を作製した。このモノクロナール抗体と同分子C末端8残基に対するポリクロナール抗体を用いることによって、我々はラットオステオカルシンに対する分子構造特異的な酵素免疫測定法、すなわち完全分子型ラットオステオカルシン(IOC)測定系とN末端ラットオステオカルシン(NOC)測定系を確立した。本測定系の有効性と測定感度を評価する目的で生理学的なデータを得るため、すでにラットの骨代謝回転に変化を及ぼすことが知られているいくつかの実験系を応用し血清オステオカルシンレベルの変化について検索を行った。加齢の影響を検討した結果、8、15、30、60週齢ラットにおいてIOC、NOCともに加齢とともに減少し、骨代謝回転の加齢的減少をよく反映していた。また骨代謝回転が上昇する低カルシウム食飼育ラットでは、IOC、NOCともに上昇したが、IOCに比べてNOCの方がより鋭敏に変化することが明らかとなった。さらに一過性に骨代謝回転を低減させるカルシトニンの作用についても検討した。その結果カルシトニンの投与後一過性に低下するのはNOCのみであり、IOCには顕著な変化は認められなかった。一方骨吸収の指標として用いられているコラーゲン架橋物質の尿中排泄量との相関性についても検討を行った。その結果、NOCがより高い有意の正の相関を示した。以上の結果から血清中のIOCレベルおよびNOCレベルはそれぞれ骨形成および骨吸収の指標として用いられる可能性が示された。本研究で確立されたラットオステオカルシンの分子構造特異的な酵素免疫測定法により、動物実験に汎用されるラットをもちいた骨代謝に関連する実験において、有用な情報が得られることが期待される。まず最初にラット脛骨、大腿骨よりosteocalcinを大量に精製しN末端10残基のアミノ酸配列を同定して確認した後、酵素免疫測定法の標準物質として、また完全分子型のosteocalcinとして本研究に供した。Osteocalcinの酵素消化に用いる、cathepsin B,Lをラット腎臓のライソゾーム画分から精製を行ったが、酵素活性を維持させることが困難であることもあり、まずこれらの精製が完了する前に、消化実験の実験条件を設定する目的で、類似の酵素特性を持つpapainによるラットosteocalcinの消化実験を行った。

得られた断片化osteocalcinのアミノ酸配列を決定した結果、骨から精制したラットosteocalcinのアミノ酸配列は、従来報告されているラット骨肉腫細胞のcDNAから予測されたものとは一部異なることが示された。この点については、さらに切断する部位の異なる酵素を用いてアミノ酸配列の違いについて検索をすすめる予定である。一方in vivoの実験系として血清中osteocalcinの生理的な変動として日内変動、日周期性、加齢の影響を検討した。ラットの血清中osteocalcinレベルは昼間高く、夜間低い周期性のある日内変動を示し、成長とともに減少してゆくことが明らかにされた。また分子構造特異的な酵素免疫測定法の性格づけのため、低Ca食飼育およびカルシトニン投与実験を行った。その結果、本測定系で定量されるN末端領域osteocalcinの変化は骨吸収の局面を反映しうることが示唆された。さらにヨウ素ラベルしたラットosteocalcinを静脈内注射し、各々の実験条件における血漿クリアランスを検索した結果、実験条件による血漿中半減期に有意差は認められず、我々がこれまでに行ってきた実験において観察されるosteocalcinの変動が、代謝速度の違いによるものではなく、骨改造現象に伴って血清中に出現する分子構造の異なるosteocalcinの変動を検出していることが確認された我々はラットの完全分子型osteocalcin(IOC)測定系およびN末端osteocalcin(NOC)測定系をそれぞれについて構築しを確立し、IOCおよびNOCの骨代謝マーカーとしての意義づけを明確にする目的で種々の実験を行ってきた。これまでの実験結果より、我々の確立した分子構造特異的な酵素免疫測定系で検出されるNOCレベルあるいはFrOC(=NOC-IOC)レベルは骨代謝における骨吸収の局面を反映して変化する可能性を示した。さらにこの点を明確にする目的で骨代謝回転の変化が著明に起こる低Ca食飼育から正常食飼育に切り替える実験系を用いて、ラット血清中IOCおよびNOCの変化を測定し、近年骨吸収のマーカーとされているコラーゲン架橋物質pyridinoline(PYD)およびdeoxypyridinoline(DPYD)の尿中排泄量の変化との関連性について検討を行った。その結果、実験群では、低Ca食飼育により血清中IOCレベルは、14日まで経日的に徐々に上昇したの対して、血清中NOCの変化はIOCより早期にかつ大きな変化として認められた。低Ca食から正常食に切り替えると、その3日後には血清中IOCおよびNOCの値は対照群のレベルまで減少した。PYDおよびDPYD尿中排泄量は、対照群において実験経過とともに減少傾向を示し、実験群では対照群と比較して有意(P<0.001)に増加していた。しかし、いずれも実験開始後7日目でplateauに達し、14日目ではほぼ同レベルを維持していた。その後正常食に切り替えると、その7日後にはPYDおよびDPYDは対照群のレベルにまで減少した。また実験期間を通じて、全体的にPYDの変化に比較してDPYDの変化がより著明であった。
4次元超対称共形場の理論と超弦双対性

1.4次元N=2超対称ゲージ理論のクーロン相における低エネルギー有効作用の研究を進め、Seiberg-Witten理論とADE単純特異点の理論との関係を明らかにした。Seiberg-Witten曲線を周期型戸田格子方程式のスペクトル曲線により与え、低エネルギー有効ポテンシャルのインスタントン補正を計算した。ADE型ゲージ群すべての場合で、結果は微視的インスタントン法で求められたものと一致することを示した。以上の結果は、4次元Seiberg-Witten理論が2次元位相的重力理論と深い関連にあることを示唆する。2.随伴表現の物質場と結合したADE型ゲージ群をもつ4次元N=1超対称ゲージ理論においてU(1)光子の閉じ込め相における低エネルギー有効超ポテンシャルを導いた。その結果、N=2超対称ゲージ理論を記述する複素曲線や、E_6ゲージ群をもつ4次元N=2超対称QCDにおいてハイパー多重項が有質量の場合のSeiberg-Witten幾何を、球面上のALEファイブレーションとして決定した。さらに、E_6群をSU(6)、SO(10)へ破り、SU群の反対称表現やSO群のスピノル表現のハイパー多重項をもつN=2ゲージ理論のSeiberg-Witten幾何を決定した。3.ADE型グローバル対称性をもつ4次元N=2超対称共形場の理論の質量変形の問題をD3-brane探索の方法により詳しく解析した。これを拡張して、E型アフィン・リー環のルート格子をつくるIIB超弦の7-brane配位を記述する楕円曲線を有理楕円曲面を表す3次式から系統的に導いた。その結果は、円周上にコンパクト化された5次元のE型理論の質量変形を与えるSeiberg-Witten理論のものと一致することが示された。さらに、有理楕円曲面の特異点、Mordell-Weil格子、そしてトーションの構造をIIB型超弦理論の7-brane背景中のストリング接合を用いて解析し、Mordell-Wei1格子の分類と完全に一致する結果を得た。1.随伴表現の物質場と結合したADE型ゲージ群をもつ4次元N=1超対称ゲージ理論においてU(1)光子の閉じ込め相における低エネルギー有効超ポテンシャルを導いた。これより、種々のゲージ不変量の真空期待値が得られ、その結果N=2超対称ゲージ理論を記述する複素曲線が球面上のファイブレーションとして求められた。2.4次元N=2超対称ゲージ理論に現れる周期積分の満たすPicard-Fuchs型微分方程式を調べた。ゲージ群がADE型の場合、微分方程式はADE型特異点理論で導入された平坦座標を用いて系統的に記述される。この結果は4次元N=2ゲージ理論と2次元位相的場の理論の間に興味深い関連があることを示唆するものである。3.4次元N=2超対称ゲージ理論を記述する複素曲線を周期型戸田格子方程式のスペクトル曲線により与え、低エネルギー有効ポテンシャルのインスタント補正を計算した。4.4次元N=2超対称ゲージ理論の厳密解について総合報告した。とくに、厳密解によって明らかにされたソリトン粒子とその幾何学的記述に焦点を当て、さらに、11次元M理論を用いてN=2厳密解の幾何を再現する方法を示した。1. E_6型ゲージ対称性をもつ4次元N=2超対称QCDにおいて、ハイバー多重項が有質量の場合の低エネルギー有効理論を記述するSeiberg-Witten幾何を、球面上のALEファイブレーションとして決定した。

さらに、E_6ゲージ対称性をHiggs効果によってSU(6)、およびSO(10)対称性へ破ることにより、SU型ゲージ群の反対称表現やSO型ゲージ群のスピノル表現に属するN=2ハイパー多重項と結合するN=2超対称ゲージ理論のSeiberg-Witten幾何を与える方程式を導いた。2. ADE型ゲージ対称性をもつ4次元N=2超対称ゲージ理論のプレポテンシャルがWDVV方程式を満たすことの簡潔な証明を与えた。このことから、4次元におけるWDVV方程式は、2次元位相的場の理論におけるカイラル環の結合則に由来することが明らかとなった。また、この理論の低エネルギー有効作用の量子モジュライ空間の原点近傍のふるまいが、2次元位相的ストリング理論の相関関数の無限和によって表されることを見いだした。3.ゼロ質量のクォーク自由度が入ったN=2SU(2)超対称ゲージ理論をツイストして得られる位相的ゲージ理論の経路積分測度を解析し、4次元多様体についてのDonaldson-Witten不変量の一般化を試みた。K3曲面の場合は、得られた不変量は一般単純型と分類されるものと類似の性質をもつ。さらに、この結果より得られるSeiberg-Wittenモノポール方程式の多成分版についても解析を行い、消滅定理を示すことができた。2.E型アフィン・リー環のルート格子をつくるIIB超弦の7-brane配位とストリング接合を記述する楕円曲線を有理楕円曲面を表す3次式から系統的に導いた。その結果は、ひとつの次元が円周上にコンパクト化された5次元のE型超対称共形場の理論の質量変形を与えるSeiberg-Witten理論のものと一致することが示された。すなわち、円周上コンパクト化された5次元E型理論についてもD3-brane探索のアイデアが有効であることを示唆するものである。3.有理楕円曲面の特異点、Mordell-Weil格子、そしてトーションの構造をIIB型超弦理論の7-brane背景中のストリング接合を用いて解析した。その結果、ストリング接合の生成する格子の分類は、従来数学者により得られていたMordell-Weil格子の分類と完全に一致することが示された。とくに、Mordell-Weil群のトーションはE_9型ループ代数の虚のルート・ベクトルを表すループ型ストリング接合により理解することができた。さらに、保存電荷をもつ非BPS接合を与える7-brane配位も決定した。
含ヘテロ原子複合反応剤の開発とその展開

医薬として汎用されつつも、いまだ活発な開発研究が続けられているプロスタグランジン(PG)類の新規合成法の開発を目的として、新しい複合系による立体選択的炭素-炭素結合生成反応を開発した。即ち、シクロペンタジェンから1工程で得られるメソ-シクロペンテンジオール(2)を出発物質とする方法を検討した。このメソジオール2は本質的に光学不活性である。我々の方法は、2のオレフィン面と等価なオレフィン炭素を区別しながら、ω-鎖3を導入しようとするものである。このようなメソ体の潜在不斉を発現させるばかりでなく、更にその不斉誘起自体を触媒反応によって実現し、この際望む立体配置をもつ化合物へ誘導する。本法では、光学活性源が1つで新たに2個所の炭素原子上で不斉を誘起させることができる。まず、シクロペンテノール(1)を用いて当該反応を検討した結果、望ましい立体配置を有する生成物4aを92/8の選択性で得ることができた。この結果を基に、メソ体2の区別反応を行なったところ、望む5aのみが生成し、その選択性は99/1以上であった。更に、いくつかの保護基について検討したところ、5a/5bの比が4a/4bの比の二乗に増幅されるという興味ある新しい現象を見いだした。ところで、反応機構を考察すると、中間体のアルキルパラジウム種を如何に用いるかによって、さらに適用範囲が広がり、1段階で2つの炭素鎖を導入できる。そして、潜在不斉2つと共に新しい不斉炭素を2つ加えることができる。即ち、1つのキラリティーで4つのキラリティーを制御できる。この新しい直接3成分連結法について次年度で検討する。
腫瘍マーカーGST−π、p53を用いた口腔癌の補助診断と化学療法効果の検討

上皮増殖因子(epidermal growth factor:EGF)とその受容体(EGFR)は、多くの細胞の増殖・分化を調節する重要な増殖因子系である。特にEGFR蛋白はチロシンリン酸化に関係する遺伝子産物で、扁平上皮癌に特異的に過剰発現することが報告され、扁平上皮癌の悪性度に関わることが予想されている。本研究では口腔癌におけるEGFR過剰発現と個々の症例における既知の臨床病理学的所見、予後との関係、さらに細胞核内増殖因子MIB-1の発現との関係についても検索した。86例の口腔癌症例から得られた生検組織におけるEGFR、とMIB-1の発現を免疫組織化学を用いた蛋白レベルにて検索した。EGFR発現細胞10%以上をEGFR陽性とし、MIB-1の発現は陽性細胞の標識率で示した。EGFRの陽性率は32.5%で、陽性例は腫瘍の大きさ、臨床病期、分化度と相関しなかったが、リンパ節転移ならびに癌の浸潤様式とは有意の相関が認められた。特に腫瘍の発育先進部において高度のびまん性浸潤を示す癌細胞に強いEGFRの過剰発現がみられた。また、概びてMIB-1標識率はEGFR陽性例におけるEGFR陰性例よりも有意に高かった。これらEGFR陽性例では陰性例よりも再発が多く、また術後生存率に関しても有意に不良であった。Cox比例ハザードモデルによる検索では、EGFRの発現はリンパ節転移とならび、生存率に強く影響する高度危険因子として評価され、EGFRは口腔癌の悪性度因子としての有用性が示唆された。現在、同じチロシンリン酸化に関係する接着因子β-カテニンの発現、mutationとの関係について検索するべく、予備実検をすすめている。、上皮増殖因子(epidermal growth factor:EGF)とその受容体(EGFR)は、多くの細胞の増殖・分化を調節する重要な増殖因子系である。、
機能的設計に基づいた人工アジュバントの開発

ウシ結核菌弱毒化ワクチン株の細胞骨格成分(BCG-CWS)は、Toll-like receptor (TLR)のリガンドであり、微生物成分アジュバントとして癌免疫療法に臨床応用されている。この抗癌免疫応答に重要な細胞傷害性T細胞(CTL)誘導には、樹状細胞の特殊な抗原提示・クロスプレゼンテーションが必須である。これは細胞内に局在するTLR3/9の核酸系リガンドが引き起こすため、リガンドの貪食が必須とされている。昨年度、報告者は、樹状細胞に貪食されるBCG-CWSがCTL誘導を起こす事を報告し、CTL誘導の重要な共通点は「貪食されるTLRリガンド」である事と予想した。そこで、報告者は既知のTLRリガンドとしてMALP-2 (Macropharge activating lipopeptide-2)を、貪食サポートドメインとしてインテグリン結合配列を、既知のB16メラノーマ癌抗原としてTRP-2(Tyrosinase related(protein-2)ペプチドを結合した人工アジュバント(リポペプチドの配列に癌抗原を延長したもの)を作製し、樹状細胞活性化とC57BL6-B16腫瘍移植モデルでの有効性を検討した。その結果、人工アジュバントはTLRリガンド+癌抗原の混合物と比較して、樹状細胞の成熟化やT細胞増殖活性(in vitro)には差を認めないが、わずかに強い腫瘍縮小効果と延命効果(in vivo)をもたらした。すなわち、TLRリガンドは抗原との混合投与でも十分な抗癌活性を示し、抗原貪食のサポートのみではなく、リガンド貪食がクロスプレゼンテーションの特殊シグナルを樹状細胞に与えていることが示唆された。また、今回採用したインテグリン結合配列に有効性は認められなかったが、これはTLRリガンドであるMALP-2が既に貪食される潜在的な活性(配列)を含んでいるためと予想している。ウシ結核菌弱毒化ワクチン株(Bacillus Calmette Guerin:BCG)の細胞骨格成分(Cell Wall Skeleton:CWS)は古くからアジュバントとして知られ、当センターで術後の癌患者さんに臨床応用している。BCG-CWSはToll-like receptor(TLR)-2及び-4を介して樹状細胞を成熟化させることが当研究室から報告されており、これが臨床での抗癌効果のメカニズムと想定されている。報告者は今回、C57BL6マウスと同種由来B16メラノーマ細胞を用いた腫瘍移植モデルにおいて、BCG-CWSと不活化B16を癌抗原として事前免疫を行うと、B16に対するCytotoxic T Lymphocyte(CTL)を効果的に誘導し、移植したB16の退縮効果が認められること、また、ノックアウトマウスを用いた実験から、これらの効果がTLRのadaptor分子であるMyD88に依存的であることを報告した(Cancer Res.64:757,2004)。また、武田薬品・発酵研の微生物化合物ライブラリーを用いた検討では、in vitroでTLR2のリガンドとして既知のLipopeptide様の構造に樹状細胞活性化能が認められ、BCG-CWSよりも高用量ではあったが、in vivoにおいても腫瘍の退縮効果・CTL誘導を示す化合物があった。投与用量を考慮するとBCG-CWSにはさらに効果的なドメインが存在することになり、我々はこれがBCG-CWSの持つ糖鎖による貪食サポート構造であると予想している。また、BCG-CWSと同時投与する抗原について検討するため、B16で既に同定された癌抗原であるTyrosinase related protein -2のペプチドを用いて、同様の実験を行ったところ、腫瘍退縮およびCTL誘導効果を確認することができた。これより、アジュバントに付与する癌抗原は既存のペプチドワクチンとの併用で補えることが示唆された。今後、MyD88経路を活性化するTLRリガンドに人工的に貪食サポート構造(糖鎖や抗体のFc領域など)を融合したものを設計し、アジュバント活性を検討していく予定である。
最先端技術における日本の研究体制と企業組織の流動化:継続性と革新の融合を求めて

日本のハイテク産業は、90年代において欧米に劣勢になった。なぜなのか。技術体制そのものが原因なのか。だとすれば、研究所や企業は如何に対処しているのか。Northの制度理論をもとに技術体制と組織戦略における継続と流動化に注目した。この取り組みは、制度学派と経営学者が、それぞれのアプローチを尊重しつつ、体制と組織戦略の相互作用に注目することにより、より実情に適した日本産業の失敗と成功要因を把握し、問題点における解決策を模索しようと言う新しいトランスディッシプリナリーなアプローチである。日本に基礎技術力が存在する半導体やテレコム産業と存在しないバイオ産業では、革新の原動力や変革課程が違っている。前者においては、旧体制からの脱皮は、大組織の分解と組織間の合理的再融合であり(i-modeや半導体産業における国内企業間での協力が良い例)、その触媒となったのは、新しい発想からなる企業間や企業・政府間の協力活動と法制度や大学・国立研究機関等の変革の動きであった。反対に、後者においては、既存技術力の再構築ではなく、製薬型旧体制から、ゲノム時代に合った新制度の構築に動いており、国内の動きと同時に、研究開発活動の国際的連携により、先進地域に革新の源泉を求め、その圧力をフルに利用し国内政府施策が展開され、又、その変革が企業のより活発な革新を可能にしている。技術体制と企業戦略とは、両産業において相互に影響を及ぼし合っている。しかし、変革のきっかけは、国内技術依存型においては国内既存組織間の新しい協力活動であり、国内技術欠乏型においては、市場依存型を取る。前者では、体制的変革が先行し、後者では、企業変革が先行する。現在新体制への移行が成功裏に終わるか、また、それが市場の動きに合っているのかの判断は、時期尚早である。基本的には、企業と技術体制の再構築とその両者の相互作用が起こるかどうかが、解決の鍵である。なぜなのか。日本のハイテク産業は、90年代において欧米に比べ劣勢になった。なぜなのか。Northの体制理論をもとに技術体制と組織戦略における継続と流動化に注目した。文献調査と並行し、面接調査を半導体(岡田が日本の企業や他の組織51;Metheが日本7、米国6、台湾5、韓国6、計24)、バイオ(淺川が日本17)、マルチメディア(村山が日本8)の合計100組織において実施した。新しい知見として、半導体産業においては政府が重要な役割を演じた技術体制が日米摩擦により部分的に崩壊し、企業においては連続的革新を主流とした過去の戦略から脱皮できず、発想の転換から来る非連続的革新(必ずしも革新的な技術とは限らない)をもとにした米台韓からの新しい動きに追い抜かれた。体制の限界は、非連続的革新が大切なバイオ産業において顕著で、企業の知的基盤の限界や組織的慣性ゆえに内部資源だけでは対処できなくなった。しかし、マルチメディア産業の最近の成功例では、日本的な協力にアメリカ的な個人の自由を融合し成功している。半導体産業では、官民や民民プロジェクトで協力関係のオープン化や競争化、企業間関係の選別化と多様化により技術体制を再構築しようとしている。この点、協力にも新しい方法や価値観が模索されつつある。このような動きは、国内資源が多く存在する半導体・マルチメディア産業で見られ、資源の蓄積に遅れをなしているバイオ産業では海外の大学・企業・ベンチャー企業とのアライアンスで対処している。しかし、非連続的革新の源であるべき大学や国立研究所においては、旧体制や組織内慣性からの脱皮にはほど遠い。

総じて、研究目的に応じて内外資源を流動的に活用できる多層化、又は、複合化された体制の構築が模索されている。更なる面接と情報の緻密な分析を平成13年度の助成で行う。日本のハイテク産業は、90年代において欧米に比べ劣勢になった。なぜなのか。技術体制そのものが原因なのか。だとすれば、研究所や企業は如何に対処しているのか。Northの体制理論をもとに技術体制と組織戦略における継続と流動化に注目した。昨年に続き文献調査を行い、カバーできなかった残りの面接調査(昨年の実施数100組織)を半導体(Metheが国内企業32、国内技術支援機関14、韓国企業10、韓国技術支援機関7、計63)、バイオ(浅川が日本6)、マルチメディア(村山が日本2)において実施した。本年は特に文献やインタビューの分析に重点を置いた。その結果、日本の国際競争力を確保するための研究開発体制に特定の新しい動きがあることが判明した。クローズド・システムからオープン・システムへ、国内研究活動中心型から国外リソースの活用型へ、縦の組織内や組織間関係から横の関係へ、知識の組織内在型から組織外利用型、リスクの組織内対応型から外部リスク・ヘッジ型へ、基礎知識の国外依存型から国内開発型へ、組織間協力の単層型から多層型へ、ビジネスモデル固定型から変革型へと変わってきており、国のマクロと組織のミクロの両レベルにおいて起こっている。このような動きは、台湾企業の速い変革を除き米国や韓国企業も同じような変革を実現しようとして苦戦している。日本の場合、これらの動きはまだ始まったばかりであり、伝統的な日本のシステムと相対立する性格を持ち、伝統的な体制による阻害、古い体制と新しい体制との対立、マクロとミクロレベルのミスマッチ等が起こっている。ハーモナイズされたガヴァナンスの構造には程遠い状態であり、相互作用は起こっていない。しかし、新しい体制と古い概念が融合し、新しい体制の正当化や実情への適応も起こっている。例えば、情報通信分野では、iモードやプレイステーションはオープンシステムと「場」の概念が融合した結果生まれたと理解できる。半導体産業では組織間の横の関係に伝統的な協力関係を導入し、産学のような今まで協力関係が弱かった領域においても、競争的手法を使いながらも協力関係を強化するという日本の伝統的な競争と協力の概念が適応されている。すなわち、新しい体制と古い体制が融合し、より実情に即した新しい体制が生まれようとしている。昨年の各産業弱体化の分析に続き、今年は新体制の構築の動きに注視し、分析を続けている。日本のハイテク産業は、90年代において欧米に劣勢になった。なぜなのか。Northの制度理論をもとに技術体制と組織戦略における継続と流動化に注目した。この取り組みは、制度学派と経営学者が、それぞれのアプローチを尊重しつつ、体制と組織戦略の相互作用に注目することにより、より実情に適した日本産業の失敗と成功要因を把握し、問題点における解決策を模索しようと言う新しいトランスディッシプリナリーなアプローチである。
極小未熟児における亜鉛および銅必要量に関する研究

極小未熟児の亜鉛およひ銅必要量を検討する際に基本的事項となると考えられる次の3点に関し研究を行った。1.亜鉛欠乏症を示した極小未熟児症例亜鉛失望症を示した超未熟児を経験したので過去の自験例6例と合わせて報告する。超未熟児は,在胎30週、出生体重874g、母乳栄養であったが重症感染症のため授乳はしばしば中断。日令45に発症。血漿亜鉛濃度22.0μg/dlと著明な低下。亜鉛投与(0.9aμg/g/日)により短期間で全治。2.低出生体重児を出生した母体の乳汁中亜鉛および銅濃度の推移母乳中亜鉛濃度は、分娩後1週間以内は、19.11μg/g(平均値、以下同じ)と高値であったが、その後急速に低下し、3週以後には、2.303.76μg/gとなった、母乳中銅濃度は、分娩後7日までは、0.72μg/gであり、その後漸減し、71日以後は0.40μg/gであった。3.亜鉛添加を行った極小未熟児における血漿および毛髪中の亜鉛およひ銅濃度の推移母乳栄養児と人工栄養児とに分け、さらに亜鉛添加量により、前者を1.0、0.7、0.5、0(非添加)mg/kg/日(以下同じ);後者を1.5、1.0、0(非添加)の各群に分けた。血漿亜鉛濃度は、母乳栄養児では、修正2831週、3235週で各群の間に差はなく(3235週の1.0群と0.5群の間の場合を除く)、修正3639週で添加量の多い群が少い群より高かった(非添加群と0.5の間の場合を除く)。人工栄養児では、修正3235週で各群の間に差はなく、修正3639週で添加群は非添加群より高かった。血漿銅濃度は、添加群は非添加群に比べ低値を示す傾向にあった。毛髪亜鉛濃度は人工栄養児群より母乳栄養児群で高い傾向にあった。毛髪銅濃度は14.030.5μg/gの間にあった。日令45に発症。極小末熟児では、種々の理由により亜鉛(Zn)および銅(Cu)の欠乏状態に陥り易いと考えられる。今回、極小末熟児を対象としてZn添加を行い血漿ZnおよびCu濃度の推移を追求したのでその結果を報告する。Zn添加量は、毋乳栄養群1.0mg/kg/日、人工栄養群(粉乳のZnおよびCu含有量は標準調乳時それぞれ350μg/dl,40μg/dl)1.5mg/kg/日とした。1.血漿Zn濃度(μg/dl)の推移以下の記載順序は、日令(毋乳栄養群のみ記す。他は省略するがその順序は本群と同じ):血漿Zn濃度(平均値)(それぞれ亜鉛無添加の毋乳または人工栄養群の血漿ZnまたはCu濃度の平均値),である。

(1)毋乳栄養群(1.0mg/kg/日のZnを添加)013:83.6(113.1),1427:93.7(105.2),2841:93.2(75.6),4255:110.5(71.6),5669:97.0(60.7),7083:92.6(59.1),8497:84.1(58.7)。血漿Zn濃度は、日令28以降はZn添加群は無添加群に比べより高値を示し、その漸減傾向も緩かであった。(2)人工栄養群(1.5mg/kg/日のZnを添加)97.0(112.3),71.8(108.8),70.2(88.7),61.7(69.7),73.5(57.5),92.3(58.5)。日令56以降は、毋乳栄養群と同様の傾向がみられた。2.血漿Cu濃度(μg/dl)の推移(1)毋乳栄養群(1.0mg/kg/日のZnを添加)34.6(38.2),32.1(47.7),32.9(53.7),32.5(43.2),32.3(60.3),38.3(62.7),33.5(69.8)。血漿Cu濃度はZn添加群では無添加群に比べより低値を示した。(2)人工栄養群(1.5mg/kg/日のZnを添加)35.2(40.1),32.2(43.6),30.4(47.5),37.2(52.5),39.1(62.9),28.3(67.3)。毋乳栄養群と同様の傾向がみられた。極小未熟児に種々の量の亜鉛(Zn)添加を行い血漿Znおよび銅(Cu)濃度の推移を追跡したのでその結果を報告する.対象は栄養の種類, Zn添加量により次の5群に分けた(括弧内数値は添加量,単位はmg/kg/日). 1群:母乳栄養(1.0),2群:母乳栄養(0.7),3群:人工栄養(GPT,1.5),4群:人工栄養(GPT,1.0),5群人工栄養(BFL,1.0)である.なお, 4群, 5群は症例数が少ないため今回の研究では統計的には検討しなかった.1.結果(1)血漿Zn投与濃度1群ではZn投与開始後(一部は生後2週までに,生後4週までには全例にZn投与),血漿Zn濃度は,平均84.1110.5μg/dl,2群(一部は生後2週までに,生後6週までには全例にZn投与)では74.992.2,3群(一部は生後2週までに,生後4週までには全例にZn投与)では65.8100.4であり,有意差を認めたものは少なかった.(2)血漿Cu濃度1群ではZn投与開始後,血漿Cu濃度は平均31.438.3μg/dl,2群では40.951.3,3群では26.638.8であった. 1群は2群と比較すると有意に血漿Cu濃度は低い傾向があった.2.まとめ母乳栄養群では, 1.0mg/kg/日のZn投与を行うと,血漿Zn濃度は成人正常値と同等に保たれるが,血漿Cu濃度は低値のまま経過し, Znmg/kg/日の投与では血漿Zn濃度は前者と同等であったが血漿Cu濃度は前者よりも高く保たれた(成人正常値よりは低値).極小未熟児の適正血漿Zn, Cu濃度は不明であり今後さらに検討を要する.極小未熟児に種々の量の亜鉛添加を行い、血漿および毛髪中の亜鉛および銅濃度の推移を追跡したのでその結果を報告する。対象を母乳栄養児と人工栄養児とに分け、さらに、亜鉛添加量により、前者を1.0、0.7、0.5、0(非添加群)mg/kg/日、後者を1.5、1.0、0(非添加群)、の各群に分けた。1.血漿亜鉛および銅濃度の推移本年度は、母乳栄養児が0.5添加群および人工栄養児1.0添加群において測定した。(1)血漿亜鉛濃度(μg/dl、平均値)母乳栄養児0.5添加群では、修正週数で(以下すべて修正週数)、2831週:80.5(母乳非添加群99.1、以下括弧内は同様事項)、3235週:73.2(81.8)、3639週:61.4(55.9)、4043週:72.6(62.8)で、いずれの修正週数でも非添加群との間に有意の差を認めなかった。

人工栄養児1.0添加群では、それぞれ、2831週:75.3(106.5)、3235週:78.0(73.6)、3639週:76.0(56.9)、4043週:91.2(50.5)で、3235週では非添加群との間に有意差を認めなかったが、3639週、および4042週では、1.0添加群は非添加群に比べ有意に高値を示した。
トルク検出器を用いない交流電動機の高精度トルク推定法

交流電動機全般を研究の対象とし、トルク検出器を用いることなく電圧と電流の情報のみから負荷運転時のトルクを高精度にオンラインで推定する新しい方法を提案する。提案法の確立によって、トルク検出器の取り付けが困難な場合のトルク計測に有効な手段を与える他、メーカとユーザの双方の工場現場におけるコスト、人手、作業時間の低減に寄与する。理論および実験的な検討をして、実用的で高精度な交流電動機のトルク推定法を確立することを目的とする。
メカノバイオロジカルなインプラント周囲骨形成における分子機構の解明

我々はこれまでに,骨芽細胞の分化と細胞死を制御するメカニカルストレスのモードとシグナル伝達機構を明らかにしてきた.そこで用いた実験系は細胞外からその培養基質を伸展または圧縮することにより細胞の張力を変化させるものであった.一方,生体親和性材料であるジルコニア上では,骨芽細胞は自律的に強い張力を発揮した状態で接着しており,細胞の形態が分化状態を制御する可能性が示唆された.これらのことから,基質と細胞とのインターフェイスを構成する接着斑および細胞骨格が極めて重要であることが考えられたが,ジルコニアと骨芽細胞の接着の分子メカニズムは不明であった.そこで本研究では,セリア安定型ジルコニアであるNANOZR,イットリア安定型ジルコニアであるY-TZPおよび純チタンCpTiを用い,骨芽細胞の接着と形態が分化に与える影響を検討した.いずれの材料表面もぬれ性は同等であったがRoughnessは異なっていた.骨芽細胞はいずれの材料にもよく接着し,血清蛋白存在下で顕著な細胞突起を形成した.RGDペプチドによるインテグリンの阻害は細胞突起とストレスファイバー形成に影響を与えつつ細胞増殖を阻害した.一方,non-RGD型インテグリンであるα2β1インテグリンはY-TZPおよびCpTi上において増殖を負に制御していた.また,NANOZR上ではヘパリン感受性蛋白が増殖を制御していることが明らかになった.これらの結果は,各材料間において接着の様式に分子的な差異が存在することを示すとともに,骨芽細胞は異なる接着基質に対する接着へのバリエーションを備えており,細胞増殖や分化などセルコンテクストを何らかの機構で統合していることが示唆された.我々はこれまでに,骨芽細胞の分化を促進するメカニカルストレスのモードとそのシグナル伝達経路を明らかにしてきた.それらの検討の中で,本年度は特に1.メカニカルストレスにより活性化されるERK経路上流のMAP3Kの同定2.前項にて同定したMAP3Kによる骨芽細胞分化制御のメカニズムについて検討を行った.RNAiによるスクリーニングおよびその後の検討により,A-RafおよびC-Rafの両者をERK経路上流のMAP3Kとして特定した.A-RafおよびC-Rafそれぞれに対するRNAiは骨芽細胞の分化を抑制した.ところが,以前に我々がERK経路上流の細胞膜におけるメカノセンサーであるP2X7に対するRNAiはA-Rafの活性化を選択的に阻害するもC-Rafの活性化は抑制しなかった.また,P2X7のRNAiにより骨芽細胞分化は抑制されたことからP2X7-A-Raf-ERK経路はメカニカルストレスによる骨芽細胞分化を正に制御していることがわかった.さらに,A-Rafのノックダウンは細胞死シグナルに影響を与えなかった.ところが,C-Rafのノックダウンにより骨芽細胞はERKを活性化する微弱なメカニカルストレスに対し脆弱性を示しアポトーシスを誘導した.これらの結果から,メカニカルストレスに対しC-Raf-ERK経路は細胞生存を担保し,この状況下においてP2X7-A-Raf-ERK経路が直接的に骨芽細胞分化を誘導する構図が明らかとなった.RNAiスクリーニングによるERK上流MAP3Kを複数同定し,それぞれの機能の違いにより骨芽細胞の分化制御が精緻に行われていることを明らかにした.またその成果を論文化し国際誌に報告した.また,細胞自身の形態変化による分化制御機構に着目して研究展開を行っている.我々はこれまでに,骨芽細胞の分化を促進するメカニカルストレスのモードとそのシグナル伝達機構を明らかにしてきた.これまでは細胞外からマトリックスを動かすことによる骨芽細胞の活性化出会ったが,本年度は,骨芽細胞が分化しやすいマトリックス上,例えば生体親和性の高いセラミックス上では,骨芽細胞は強い張力を発揮した状態で接着しており,細胞それ自身が力を発揮することにより活性化していることを示唆する所見が得られた.これに関する検討として,ceria-stabilized zirconia/aluminananocomposite (NANOZR),yttria-stabilized zirconia (3Y-TZP)およびcommercially pure titanium (CpTi)の試験片上に骨芽細胞を播種しその形態に関する評価を行った.いずれの試験切片上でも骨芽細胞は極性の強い紡錘型となっていた.そこで代表的な細胞接着因子であるインテグリンへの阻害を行った.予想に反し重篤な接着阻害は観察されなかったが,細胞の極性がやや損なわれ立方状の形態を呈した.また,CCK-8アッセイでは細胞生存も低下していた.arginine-glycine-aspartic acid (RGD)型のインテグリンがこれらの反応に重要であることが示唆されたため,Non-RGD型インテグリンであるα2β1インテグリンの阻害を行ったところ,3Y-TZPおよびCpTiでは細胞生存が上昇したがNANOZRでは変化が認められなかった.これらのことから,1ジルコニアや純チタンでの細胞生存は基本的に培養皿よりも厳しい条件下にある2iNANOZR上での細胞接着条件は3Y-TZPおよびCpTiと異なるということが示唆された.現在,NANOZRにおける細胞の接着機構および骨芽細胞の形態と接着による張力が,骨芽細胞自身の分化に与える影響を検討している.これに際し,インテグリン以外の接着分子に着目し,これまでに一次スクリーニング系を確立し探査を行った.これにかかった分子標的に対し現在,RNA干渉法による二次スクリーニングを行っており,関連分子の特定を行っている.

我々はこれまでに,骨芽細胞の分化と細胞死を制御するメカニカルストレスのモードとシグナル伝達機構を明らかにしてきた.そこで用いた実験系は細胞外からその培養基質を伸展または圧縮することにより細胞の張力を変化させるものであった.一方,生体親和性材料であるジルコニア上では,骨芽細胞は自律的に強い張力を発揮した状態で接着しており,細胞の形態が分化状態を制御する可能性が示唆された.これらのことから,基質と細胞とのインターフェイスを構成する接着斑および細胞骨格が極めて重要であることが考えられたが,ジルコニアと骨芽細胞の接着の分子メカニズムは不明であった.そこで本研究では,セリア安定型ジルコニアであるNANOZR,イットリア安定型ジルコニアであるY-TZPおよび純チタンCpTiを用い,骨芽細胞の接着と形態が分化に与える影響を検討した.いずれの材料表面もぬれ性は同等であったがRoughnessは異なっていた.骨芽細胞はいずれの材料にもよく接着し,血清蛋白存在下で顕著な細胞突起を形成した.RGDペプチドによるインテグリンの阻害は細胞突起とストレスファイバー形成に影響を与えつつ細胞増殖を阻害した.一方,non-RGD型インテグリンであるα2β1インテグリンはY-TZPおよびCpTi上において増殖を負に制御していた.また,NANOZR上ではヘパリン感受性蛋白が増殖を制御していることが明らかになった.これらの結果は,各材料間において接着の様式に分子的な差異が存在することを示すとともに,骨芽細胞は異なる接着基質に対する接着へのバリエーションを備えており,細胞増殖や分化などセルコンテクストを何らかの機構で統合していることが示唆された.これらの実験の過程で,インプラント材料であるチタン上において検討を行ったところ,通常培養と異なるメカニズムで骨芽細胞形状が制御されている可能性を示唆する知見を得た.このことは,細胞自身の形態変化による骨形成シグナル伝達機構の制御の可能性を示している.今後,形態変化を制御する細胞膜上の分子インターフェイスの同定と,これによるシグナル伝達経路の制御機構について集中的な検討を行う予定である.「細胞が発揮する張力が細胞自身の分化を制御する」という,いわゆるメカノバイオロジーの理論はそれほど新しいものではなく,この10年ほど,メカノバイオロジー分野の研究者によりまことしやかに唱えられてきた.一方でこれが科学全体に対しそれほど市民権を得られていない(=多くの科学者を納得させるエビデンスがない)ということは,細胞の張力を直接に測定する方法が無い以上無理からぬことである.本研究はより実学的な方向性を持って展開したい.すなわち,新規生体材料上において,骨芽細胞が良好な生体親和性を示すそのメカニズムについて,具体的な分子の特定により分子生物学的に明らかにする.現在,候補分子に関するRNA干渉法スクリーニングを展開しており,ここで得られた候補分子の機能をより詳細に解析していきたい.本年度において,RNAiに使用するはずであった経費を大幅に削減できたこと,および次年度において細胞培養用のチタンおよびジルコニア製ディスクの購入が大量になることが予想されたため。