hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
シスプラチン誘発ラット急性腎不全モデルに対する脂肪酸乳剤の効果に関する研究

本研究において、n-3系多価不飽和脂肪酸であるEicosapentaenoic acid(EPA)、Docosahexaenoic acid(DHA)の静注可能な乳剤を作成し、シスプラチン誘発ラット急性腎不全モデルへの効果を検討した。結果は有意な腎不全抑制効果を認めなかった。しかし他の腎炎モデルに投与試みたところ、ラット馬杉腎炎モデルにおいて尿蛋白抑制効果が認められた。この結果より、脂肪酸乳剤の腎疾患治療薬としての可能性が示唆された。本年度はシスピラチン誘発ラット急性腎不全モデルの作製とエイコサペンタエン酸(EPA)の脂肪酸乳剤の準備、予備実験を行った。急性腎不全モデルは、シスプラチンの投与量を2.5mg/kg,5.0mg/kg,7.5mg/kgとして検討、また投与法も静注と腹腔内投与と二通りで検討した。この結果、投与量は5.0mg/kgが最も適当であり、それ以下では安定して急性腎不全を発症せず、またそれ以上では死亡例もみられることが明らかとなった。また静注法がより確実に急性腎不全を発症することが明らかとなった。脂肪酸乳剤の準備は、研究実施計画に記載したとおり、EPAを抽出し、それをグリセオールと反応させてEPA-TGを生成した。これらを卵黄レシチン、αトコフェロールとともに乳化して、EPA-TG乳剤を作製した。6週齢(体重約200g)の雄のSDラット12匹を、EPA群、ダイズ油群、生食群に分け、EPA群には2mL(10mL/kg)のEPA乳剤を、ダイズ油群にはEPA乳剤と同様の方法で作製したダイズ油乳剤を2mL(10mL/kg)、生食群には生理的食塩水を2mL(10mL/kg)腹腔内に投与した。24時間後5mg/kgのシスプラチンを静注し、引き続きEPA乳剤、ダイズ油乳剤、生理的食塩水を連日5日間投与した。代謝ケージで飼育して蓄尿し尿を採取した。また5日後に屠殺して採血および腎を採取した。その結果、EPA群で血中クレアチニン値が低値傾向を示しており、EPA乳剤のシスプラチン誘発急性腎不全の予防効果の可能性が示唆された。今後、数を増やして検討すること、腎組織の変化についても検討を加えていく予定である。また血漿および腎組織の脂肪酸分析も行う予定である。本年度はシスプラチン誘発ラット急性腎不全モデルの作製とドコサペンタエン酸(DHA)の脂肪酸乳剤の準備、予備実験を行った。急性腎不全モデルは、シスプラチンの投与量を5.0mg/kgとして、静注で投与した。脂肪酸乳剤の準備は、EPAと同様に、DHAを抽出し、それをグリセオールと反応させてDHA-TGを生成した。これらを卵黄レシチン、αトコフェロールとともに乳化して、DHA-TG乳剤を作製した。6週齢(体重約200g)の雄のSDラット12匹を、DHA群、ダイズ油群、生食群に分け、DHA群には2mL(10mL/kg)のDHA乳剤を、ダイズ油群にはDHA乳剤と同様の方法で作製したダイズ油乳剤を2mL(10mL/kg)、生食群には生理的食塩水を2mL(10mL/kg)腹腔内に投与した。24時間後5mg/kgのシスプラチンを静注し、引き続きDHA乳剤、ダイズ油乳剤、生理的食塩水を連日5日間投与した。その結果、DHA群で血中クレアチニン値が低値傾向を示しており、DHA乳剤のシスプラチン誘発急性腎不全の予防効果の可能性が示唆された。今後、数を増やして検討すること、予防効果のみならず治療効果についても検討すること、そして腎組織の変化についても検討を加えていく予定である。また酸化ストレスマーカーの測定や血漿および腎組織の脂肪酸分析も行う予定である。そして最終的にEPAとDHAとの効果の比較検討を行う予定である。本研究の目的は、n-3系多価不飽和脂肪酸であるEicosapentaenoic acid(EPA)、Docosahexaenoic acid(DHA)の静注可能な乳剤を開発し、シスプラチン誘発ラット急性腎不全モデルへの効果を検討して、臨床応用への可能性を模索するものである。EPA、DHAをαトコフェロール、卵黄レシチンとともに乳化して脂肪酸乳剤を作成した。ラット急性腎不全モデルは、5mg/kgのシスプラチンを腹腔内投与して作成した。今回EPA、DHA乳剤をシスプラチン投与24時間前に尾静脈から静注して発症予防効果を検討したが、EPA、DHAのいずれも有意な予防効果はみられなかった。投与量、投与期間を変えて検討したが同様な結果だった。

このため、Thy1.1腎炎モデル、馬杉腎炎モデル、ピューロマイシンネフローゼモデルに関して脂肪酸乳剤の効果を検討した結果、ラット馬杉腎炎モデルにおいて尿蛋白減少効果が認められた。この結果を詳しく解析したところ、組織学的検討では有意な効果はみられておらず、おそらく馬杉腎炎の病態を考えると、病態の初期にみられる白血球の遊走を脂肪酸乳剤が抑制することによってもたらされる可能性が示唆された。脂肪酸乳剤の投与は体内の脂肪酸を変化させることが可能であり、経口投与よりも迅速な効果発現が期待できると考えられ、急性疾患への応用が可能であると考えられる。また脂肪酸は生体内に元々存在する物質であるため、安全性は高いと考えられる。さらにDrug delivery systemの観点から脂肪酸乳剤は、炎症巣に選択的に取り込まれ長時間留まると考えられており、有用性は高いと思われる。今回は当初の予定のモデルであるシスプラチン誘発急性腎不全モデルにおいては脂肪酸乳剤の効果を確認できなかったが、その他の腎炎モデルにおいて効果がみられており、本研究の結果は脂肪酸乳剤の今後の臨床応用への可能性を示唆するものと考えられる。
発芽期の子葉に特異的に発現するエンドペプチダーゼ:多段階にわたる翻訳後プロセシングの機構とその役割

マメ科ケツルアズキ発芽種子の子葉のみに特異的に活性を表わし、種子タンパク粒中のグロブリン分解に作用するチオール型エンドペプチダーゼは、すでに我々により、その翻訳後プロセシングが45Kd→43Kd(シグナルペプチド切断)→39Kd→36Kd→33Kd(成熟型)という多段階にわたる過程であることが明らかにされている。本研究課題ではこの多段階にわたる翻訳後プロセシングの分子機構を解明することを最終目的として研究をおこない、以下のような研究結果を得た。1.エンドペプチダーゼ活性が最も高まる発芽3日目のケツルアズキ子葉よりフェノール法により全RNAを抽出し、これよりオルゴdTカラムを用いてmRNA画分を調整した。これを鋳型にしてcDNAを合成して、発現ベクターλgt11に組み込みcDNAライブラリーを作製した(5.2×10^6pfu,組換え体の割合97%)。このライブラリーより本酵素の特異抗体を利用して免疫学的スクリーニングを行ない、最終的に2つのクローンを選別した。2.2つのクローンは各々pUC18プラスミドにサブクローニングし、pEP60およびpEP70とした。このうちpEP60ーcDNAをM13ファージにサブクローニングして、ジデオキシ法により塩基配列を決定した。またそれからアミノ酸配列を導き出した。3.pEP60をプローブとしてノーザンブロット法により同酵素のmRNAのサイズは約1.6Kbと推定された。また、このmRNAは発芽時に新合成され、子葉中のエンドペプチダーゼ活性化がピークに達する発芽34日目にそのmRNA量も最大になることがわかった。胚軸中にはこのmRNAは検出されなかった。それゆえ、同酵素の器官特異的、生長段階特異的発現はmRNAレベルで制御されていると考えられる。
気泡崩壊現象における極限物理の解

非球形気泡の崩壊現象を解明するため,界面での非平衡相変化等を考慮した新しい計算手法(改良Ghost Fluid法)を開発した.本手法では,気泡の体積変化と並進運動に応じて,格子解像度を変化させるAdaptive Zonal Gridsの利用により,気泡崩壊時の界面の微細構造を精度良く捕えることができ,仮想流体の利用により相変化に伴う界面での圧力・温度の不連続を鋭く捕えることができる.本手法を用いた衝撃波と気泡との干渉やチャンネル内での気泡群の崩壊に関する数値計算,ならびに,ベンチュリ管内における気液二相流中での気泡崩壊や圧力波の伝播に関する実験を通して,非平衡相変化が気泡崩壊に及ぼす影響や気泡振動に起因する圧力波の特性等を明らかにした.非球形気泡の崩壊現象を解明するため,界面での非平衡相変化等を考慮した新しい計算手法(改良Ghost Fluid法)を開発した.本手法では,気泡の体積変化と並進運動に応じて,格子解像度を変化させるAdaptive Zonal Gridsの利用により,気泡崩壊時の界面の微細構造を精度良く捕えることができ,仮想流体の利用により相変化に伴う界面での圧力・温度の不連続を鋭く捕えることができる.本手法を用いた衝撃波と気泡との干渉やチャンネル内での気泡群の崩壊に関する数値計算,ならびに,ベンチュリ管内における気液二相流中での気泡崩壊や圧力波の伝播に関する実験を通して,非平衡相変化が気泡崩壊に及ぼす影響や気泡振動に起因する圧力波の特性等を明らかにした.修正Ghost Fluid法による圧縮性流体中の非球形気泡の数値解析手法に,マルチグリッド法(多重格子法)を融合し,二次元軸対称気泡の崩壊末期の挙動を解析可能な数値解析手法を開発した.本手法を用いて,種々の特性を有する壁面近傍での入射衝撃波と気泡との干渉問題を解析した結果,本手法により液体ジェットが下流側の気泡表面に衝突した後のトロイダル気泡界面の微細構造を捕らえられること,壁面損傷が気泡から生成される衝撃波による力積に依存すること等が示された.また,直線状に配置された複数気泡と衝撃波との干渉を解析し,気泡間相互作用により気泡崩壊が促進される条件を示すとともに,入射衝撃波通過後の気泡収縮による圧力波の伝播速度が,均質気液二相流を仮定した平均化方程式による伝播速度とよく一致することが示された.さらに,分子動力学法を用いて薄い液膜の気液界面における気体論境界条件を検証し,本数値解析手法に界面での相変化を導入するための基礎的な知見を得た.移動または変形境界近傍での気泡の崩壊挙動を,三次元境界要素法を用いて解析し,気泡崩壊時の並進移動特性とケルビンインパルスとの関係を明らかにした.ベンチュリ管または縮小管のスロート部を通過する数ミリ程度の微小気泡の変形挙動および圧力回復部での気泡の崩壊挙動を,高速度ビデオカメラを用いて観測した.その結果,複数の気泡が連続的にスロート部を通過する際には,通常見られる後方気泡界面に形成される進行方向の液体ジェット(順方向ジェット)のほかに,前方気泡界面に形成される進行方向と逆向きの液体ジェット(逆方向ジェット)が発生すること,また,順方向ジェットの速度はスロート部に流入する気泡間の距離が短くなるほど遅くなるのに対して,逆方向ジェットの速度は,気泡問距離が短くなるほど速くなること等が示された.適合格子を用いたマルチグリッドGhost Fluid法を提案した.本手法では,仮想流体の概念を応用することにより,界面での物理量不連続に起因する数値的不安定が生じない多重格子のレイヤー間での物理量の補間が可能となった.本手法を衝撃波と気泡との干渉により引き起こされる水中での気泡の崩壊問題に適用した結果,本手法により,計算時間の短縮を図りつつ,気泡崩壊時における気泡形状を高解像度で捕らえられることが示された.また,本手法を,変形壁面近傍での衝撃波と気泡との干渉問題に適用した結果,本手法を用いて,気泡崩壊時に形成される衝撃波により壁面がくぼみ,その中に気泡が進入していく様子を,界面の微細変形を考慮しつつシミュレート可能であることが示された.さらに,複数気泡と衝撃波との干渉問題を扱い,気泡間相互作用が気泡崩壊を助長する条件を明らかにした.マルチグリッドGhost Fluid法を用いて熱伝導を扱う手法を構築し,本手法が軸対称二次元解析に適用可能であることを示すとともに,界面での熱移動が気泡崩壊に及ぼす効果を検討した.ベンチュリ管または縮小管のスロート部を通過する数ミリ程度の微小気泡の変形挙動を,高速度ビデオカメラを用いて観測した.その結果,管のスロート部を通過する数ミリ程度の微小気泡には,気泡間の相互干渉により,二種類の液体ジェット(進行方向と同じ向きの順方向ジェットと進行方向と逆向きの逆方向ジェット)が発生する場合があることが示された.また,数値解析により,逆方向ジェットの主要因は,二個の気泡間に形成される液体中の圧力勾配であることが示された.気泡内部気体に対してGaussian-BGK Boltzmann方程式を用いて,気液界面での相変化を考慮した数値計算を行った結果,気液界面での凝縮係数の値が1の場合,気泡半径が気泡初期半径の1/100以下になると,気液界面での温度の飛びは初期温度の5倍以上になることが示された.

気液界面での境界条件を,仮想流体を用いて満足させることにより,界面での非平衡熱物質移動を解析し得るGhost Fluid法に基づく新しい数値計算手法を構築した.本手法は,現象の複雑さに応じて格子解像度を変化させる適合格子の利用により,界面を効率的かつ高精度に捕えることができる.本手法を気泡崩壊問題に適用した結果,本手法により,既存の手法では解像できなかった界面の微細構造を捕えた上で,非平衡相変化(蒸発・凝縮)を解析し得ることが示された.また,蒸気相が急激に圧縮される液体ジェットの衝突時や気泡の再膨張時において気泡内から周囲液体に向かう大量の熱拡散が生じること,気泡崩壊時に微細な界面構造が形成されることにより界面における相変化量が増大すること等の知見を得た.さらに,流体の粘性を考慮したGhost Fluid法を構築し,粘性が気泡崩壊に及ぼす効果を検討するとともに,蒸気と非凝縮性気体の混合気体を含む気泡の崩壊現象を解析する手法を提案した.Ghost Fluid法を用いて,チャンネル内に分布する円筒気泡群と衝撃波との干渉問題を数値計算した.様々なボイド率に対して,数値計算で得られた圧力波の伝播速度を,等温均質気液二相媒体において定義される圧力波の伝播速度と比較した結果,いずれのボイド率においても,数値計算で得られた伝播速度は,等温気液均質媒体を仮定して得られた伝播速度と10%以内の誤差で一致した.壁面近傍で高強度パルスレーザを集束させることにより生成したレーザ気泡の挙動を高速度ビデオカメラで観測し,気泡と壁面間の距離と気泡の変形および移動特性との関係を明らかにした.また,微小気泡群を含む気液二相縮小拡大管流れ中にレーザ気泡を生成し,その生成時に放射される圧力波の伝播を高速度ビデオカメラで観測した結果,気泡数密度の増加に伴い,ボイド波の振幅が減衰し,その伝播速度が低下することが示された.界面での非平衡熱物質移動と表面張力を考慮したGhost Fluid法に基づく新しい数値計算手法を開発し,壁面近傍での蒸気泡の崩壊現象を解析した.非平衡相変化により気泡崩壊が助長されること,壁面と気泡中心との距離が短いほど気泡の崩壊周期が長くなり,気泡内の最高圧力と最高温度が低下すること,気泡収縮時の凝縮による質量減少の変化率は,気泡と壁面との距離が短いほど低下することが示された.また,衝撃波と蒸気泡との干渉を気液界面において生じる非平衡相変化を考慮して数値解析した.その結果,気泡から放射される衝撃波の強度や気泡中心の初期位置からの並進移動量が実験と良く一致すること,気泡が収縮している過程で入射衝撃波が作用する場合,気泡崩壊時に強い衝撃波が発生する条件が,入射衝撃波が作用する気泡収縮過程の位相に依存することなどの知見を得た.また,気泡崩壊を利用した治療性分子の輸送機構の解明のために,生体壁近傍での気泡の崩壊を数値解析した.その結果,生体内への治療性分子の輸送が,壁の音響インピーダンスと気泡崩壊時の界面形状に依存し,柔らかい壁の方が生体内への輸送量が増加することが明らかとなった.強い衝撃波の発生源としてレーザ誘起気泡生成時の球面衝撃波を用いることにより,狭い流路内での衝撃波と気泡群との干渉を解析した.その結果,高速度ビデオカメラによる観測画像の輝度値を空間平均することにより,気泡の体積振動に起因する圧力波の伝播速度を算出でき,その速度からボイド率が推定可能であることが示された.また,狭い流路内およびU型壁面近傍でのレーザ誘起気泡の崩壊挙動を高速度ビデオカメラで観測し,流路幅および壁面形状が気泡崩壊に及ぼす影響を調査した.
卵黄の加工特性に関する研究

卵黄の加工特性のうち泡立ち性と熱凝固性について,その構成タンパク質成分の機能特性との関連をも含めて研究を行い,つぎのような結果を得た.1.卵黄より調製したグラニュールはNacl0.3M以上で溶解し,泡立ち性を示した.既報の低密度リポタンパク質(LDL)に比べ,起泡力は低いが泡沫安定性は高かった.またpH4以下で沈澱を生じて泡立ち性が消失した.卵黄の泡立ち性は,グラニュールよりLDLの泡立ち性に類似していた.2.砂糖,ゼラチンは添加量および起泡温度によっては卵黄の起泡力を低下させずに安定性を高めたが,添加量が多くなると起泡力を低下させ,特にゼラチンでは低下が著しかった.牛乳添加も起泡力を低下させたが,起泡温度や添加後の経過時間による差が大きかった.卵黄の泡立ち性の特徴として,かなり多量の油を乳化しながら泡立つことが認められた.3.全卵の泡立ち性は卵白より卵黄に似ており,また卵白の起泡力は卵黄の混入により低下するが,卵黄の起泡力は卵白が混入しても低下せず,安定性はむしろよくなるなどのことから,全卵の起泡力は主として卵黄によるものであり,卵白は安定性を高めるのに役立っていると推察した.4.卵黄タンパク質成分のうち, r-リベチンの凝固力は極めて小さかった.グラニュールの凝固力は塩濃度による影響を強く受け, Nacl1.02.5%の間で急激に増加したが, LDLの凝固力に対する塩濃度の影響は小さかった.卵黄は1.5%添加で凝固力が増大した.各試料の凝固力のpHによる変化は塩濃度によって異なり,卵黄の凝固力はNacl無添加の場合はLDLと, 2%添加の場合はグラニュールとそれぞれ似た変化を示した.今後は,卵黄および各構成タンパク質成分の非加熱状態でのゲル化に対する塩, pH,糖の影響,凝固性における各種タンパク質の相互作用などについて研究を進める予定である.卵黄の加工特性のうち泡立ち性と熱凝固性について,その構成タンパク質成分の機能特性との関連をも含めて研究を行い,つぎのような結果を得た.1.卵黄より調製したグラニュールはNacl0.3M以上で溶解し,泡立ち性を示した.既報の低密度リポタンパク質(LDL)に比べ,起泡力は低いが泡沫安定性は高かった.またpH4以下で沈澱を生じて泡立ち性が消失した.卵黄の泡立ち性は,グラニュールよりLDLの泡立ち性に類似していた.2.砂糖,ゼラチンは添加量および起泡温度によっては卵黄の起泡力を低下させずに安定性を高めたが,添加量が多くなると起泡力を低下させ,特にゼラチンでは低下が著しかった.牛乳添加も起泡力を低下させたが,起泡温度や添加後の経過時間による差が大きかった.卵黄の泡立ち性の特徴として,かなり多量の油を乳化しながら泡立つことが認められた.3.全卵の泡立ち性は卵白より卵黄に似ており,また卵白の起泡力は卵黄の混入により低下するが,卵黄の起泡力は卵白が混入しても低下せず,安定性はむしろよくなるなどのことから,全卵の起泡力は主として卵黄によるものであり,卵白は安定性を高めるのに役立っていると推察した.4.卵黄タンパク質成分のうち, r-リベチンの凝固力は極めて小さかった.グラニュールの凝固力は塩濃度による影響を強く受け, Nacl1.02.5%の間で急激に増加したが, LDLの凝固力に対する塩濃度の影響は小さかった.卵黄は1.5%添加で凝固力が増大した.各試料の凝固力のpHによる変化は塩濃度によって異なり,卵黄の凝固力はNacl無添加の場合はLDLと, 2%添加の場合はグラニュールとそれぞれ似た変化を示した.今後は,卵黄および各構成タンパク質成分の非加熱状態でのゲル化に対する塩, pH,糖の影響,凝固性における各種タンパク質の相互作用などについて研究を進める予定である.1.卵黄から分離調製したグラニュールの泡立ち性を調べ、すでに明らかにした低密度リポタンパク質(LDL)の泡立ち性と比較した。(1)グラニュールはLDLに比べて、起泡力は小さいが泡沫安定性は高い。(2)LDLの泡立ち性に対するpHや塩(塩化ナトリウム)濃度の影響は小さいが、グラニュールはpH4以下または塩濃度0.2M以下では溶解性が悪く、そのためほとんど起泡しない。(3)10%までの油の添加による影響は、LDL,グラニュール共小さい。(4)LDLに少量のグラニュールを混入した場合より、グラニュールに少量のLDLを混入した場合の方が、混入による影響が大きく表われる。(5)卵黄の泡立ち性の主体はLDLであり、グラニュールは補助的に特に安定性に関与するものと推察される。2.卵黄(タンパク質濃度5%液)の泡立ち性に対する共存物質の影響を調べた。(1)砂糖は起泡力を低下させるが、安定性は向上させる。(2)ゼラチンも安定性をよくするが、3%以上の添加では起泡力の低下が著しい。しかし卵黄濃度を高めると起泡力の低下は小さくなる。(3)牛乳(30,50%添加)は著しく泡立ち性を阻害する。

(4)油脂の添加により起泡力は低下するが、コーン油20%の添加でもかなり高い起泡力を示す。これは卵白泡との大きな相違点であり、卵黄の乳化性によるものと考えられる。安定性は増加する。バターはコーン油より起泡力を低下させる。3.ババロアのような気泡を含有するゼラチンゼリーへの起泡剤としての利用,油脂を含んで起泡する性質の利用等について検討したが、特記すべき用途を見出すにはいたらなかった。
実海域掘削データ融合シミュレーションの構築による掘削効率向上に関する研究

海洋掘削においては,ドリルパイプ強度,およびStick-Slipなどのドリルビット挙動の2つの問題があり,これらを評価・表現するための数理モデルを構築した.しかし,本質的に重要な解析条件を未知として含んでいるため,暫時解析に留まる.そこで,暫時解析結果を拡張子,未知の解析条件を掘削データで表現する式を導出した.そして,船上で得られる掘削データを活用して未定解析条件を決定し再度数理モデルを解く,掘削データ融合シミュレーション手法の構築を行った.海洋掘削においては,ドリルパイプ強度,およびStick-Slipなどのドリルビット挙動の2つの問題があり,これらを評価・表現するための数理モデルを構築した.しかし,本質的に重要な解析条件を未知として含んでいるため,暫時解析に留まる.そこで,暫時解析結果を拡張子,未知の解析条件を掘削データで表現する式を導出した.そして,船上で得られる掘削データを活用して未定解析条件を決定し再度数理モデルを解く,掘削データ融合シミュレーション手法の構築を行った.当該年度は以下の項目を実施した.(1)実海域掘削データ取得,および統計解析掘削船「ちきゅう」の実海域掘削操業の掘削データの取得および統計解析を行い,その解析結果から掘削作業の問題点の抽出,および掘削効率向上に向けた検討を実施した.(2)ドリルパイプ疲労解析および実海域データより累積疲労推算東北地方太平洋沖地震調査掘削(2012年4月7月実施)においては大深度掘削を行うため,ドリルパイプの強度検討が必要であった.最大応力の観点に加えて,疲労強度の観点からも強度解析を行い,操業計画策定を行った.更に,その掘削データを用いて,実際の操業における累積疲労の推算を行う手法の構築を図った.(3)ドリルパイプ動的挙動の把握長大なドリルパイプにおいては動的挙動の把握が重要であり,更に,その挙動をドリルパイプ上端の状態のみで把握できることは非常に有益である.その第一歩として,実験および解析の両面にて動的挙動の抽出を図った.従来から懸念されている縦振動,回転挙動であるStick-Slip,渦励振(VIV)に加えて,ドリルパイプの自励回転であるDrill Pipe Whirlが認められた.本研究は,掘削データの分析およびシミュレーションを行った上で,それらを融合させて掘削状況を把握し,掘削効率を向上させることに主眼を置いている.平成25年度は,主として以下を実施した.1.これまでに取得した地球深部探査船「ちきゅう」における掘削データの統計解析を行い,掘削作業情報や採取した地層サンプルから得られた地層データの分析を行うことで,掘削効率や地層分析を行う上で有用な掘削データの抽出,およびシミュレーション対象の確認を実施した.これにより,船上掘削データを活用することで,掘削作業中にリアルタイムで掘削効率の向上,更には掘削地点での地層情報の一部が得られる可能性を確認した.2.大深度掘削を行う上で大きな問題となるドリルパイプの疲労累積につき,実際のドリルパイプの疲労試験,並びに船体動揺を考慮した掘削作業に伴うドリルパイプ疲労累積の理論構築を行い,数値解析を実施し,その上で,過去の掘削データを活用して,実際の掘削作業で蓄積した累積疲労の推算を行った.3.長大線状構造物であるドリルパイプの掘削に伴う回転により惹起される自励振動に関する模型試験を実施し,その発現過程の観察,挙動特性,および掘削パラメータによる依存性の把握を行った.4.地球深部探査船「ちきゅう」における掘削制御システムの大規模システム更新が進められており,それに伴い,新システムに対応した新規の掘削データ取得装置のソフト開発およびシステム構築を行った.本研究は,掘削データ取得装置の構築,並びに,船上で得られた掘削データとシミュレーションを融合させて掘削状態の把握を行い,掘削効率の向上を図ることに主眼をおいている.前年度までに,掘削データ取得装置の構築,ドリルパイプStick-Slip数理モデル構築,ドリルパイプ自励振動観測実験,および船体動揺を考慮したドリルパイプ累積疲労推算手法の構築を行った.平成26年度は主に以下を実施した.1. Stick-Slipの模型実験を実施し,パラメータ依存性の確認や数値解析適用性の確認を行い,更に,掘削データに相当する上部回転トルク変動をもとにStick-Slipを表現する数理モデルを構築し,模型実験結果を用いてその検証を行った.これにより,船上掘削データとシミュレーションを融合した,実海域でのStick-Slip把握の可能性を示した.2.船上掘削データに相当する上部回転を用いて,ドリルパイプ自励振動を表現する数理モデルを構築し,実験で得られた特徴を表現できることを確認した.これにより,船上掘削データとシミュレーションを融合した,ドリルパイプ自励振動把握の可能性を示した.3.前年度までに実施したドリルパイプ累積疲労推算手法を拡張し,船上掘削データを用いてドリルパイプ累積疲労を推算する手法の構築を行い,実海域掘削データを用いて実操業中に累積した疲労を推算し,運用への提言を行うとともに,今後のリアルタイムでの監視の可能性を示した.4.掘削データを用いたドリルビット回転挙動の把握に加えて,挙動による地層コア採取効率への影響について考察した.更に,回転挙動から掘削地層の摩擦特性を把握する手法を検討し,掘削中に地層特性の把握を行う新たな研究テーマを創出した.過去の掘削データを用いて推算した地層特性が採取した地層サンプルを用いた分析結果とよい一致を示すことを確認し,この新たな研究指針の有効性を示した.海洋工学実海域掘削データを用いて掘削作業の問題点の抽出や掘削効率の向上に検討をまず第一に行い,本研究の方針の確認や重要性の認識を行った.

その上で,近々に直面する課題であった大深度掘削で問題となるドリルパイプの疲労解析の実施し,更には掘削データを用いて実施に累積した疲労の推算手法の確立を行った.これは,実海域掘削データを用いた掘削効率向上に関する本研究の成果であるとともに,実際の掘削操業へ寄与するものであった.一方,当初予定していたLWDデータ取得に関しては,掘削船「ちきゅう」の運航計画変更に伴い,次年度以降に実施することとした.また,現在は暫定で装備している掘削データ取得装置を用いており,研究目的に沿った装置の構築を行う予定であったが,掘削データを管理している掘削制御装置の更新計画が持ち上がり,その更新に合わせて掘削データ取得装置の構築を来年度行う.本研究の核となる実海域掘削データ取得に関して,地球深部探査船「ちきゅう」の掘削制御システムの大規模システム更新を行うこととなり,それに伴い,従来のシステムでの掘削データ取得が実施できなくなる見通しとなった.このため,平成25年度は当初の研究計画に含まれていなかった,ソフト開発を含めた新たなデータ取得装置の構築の必要が生じた.一方で,この新しいデータ取得装置構築には当該研究を活用した,取得データを用いたシミュレーションを追加できる機能も入れており,当該研究の一部を前倒しで実施した側面もあるため,全体計画としては大きな遅れではない.掘削データを元に抽出した掘削効率向上に向けた複数の具体的課題に対して,実験的および解析的なアプローチにて研究を進める.主眼となる目的および課題は以下である.目的・方針(1)掘削データとして取得可能なドリルパイプ上端の情報のみでドリルパイプ挙動を把握(2)掘削データを用いて挙動の推算,更には制御へと進める課題(1)疲労強度:ドリルパイプ曲げ応力の発現確率の推算(2)Stick-Slip:ドリルパイプ下端のビット挙動の推算(3)縦振動:変動張力の推算およびドリルパイプ下端への伝搬特性の把握(4)自励振動(Drill Pipe Whirl)の把握これに加えて,実海域掘削データ取得装置の構築,LWDデータの取得,更には,実海域掘削データを用いて船上でドリルパイプ挙動のリアルタイムでの把握へ向けた検討を行う.これまでの研究を通じて,掘削データを用いたシミュレーションの活用の方向性を確認できたため,その方向に注力すると共に,若干の進捗遅れを補完する.具体的には,当該年度実施予定であった数値シミュレーションにおいては,平成26年度早期完了させるとともに,一部のシミュレーション計算作業や結果の検証などを行う研究分担者を追加し,更に,これまでの研究で判明した数値モデルの構築の考察のために,研究分担者を追加し,研究を加速させる.掘削データ分析およびシミュレーションを行った上で,それを融合させて掘削状況を把握させることに主眼を置いており,最終段階となる平成26年度は以下を中心に実施する.1.これまでに理論構築し一部シミュレーションを行ったドリルパイプおよびドリルビット挙動に関して,パラメータを変動させてシミュレーションを実施しパラメータ依存性の確認を行う.
4NQO誘発ラット舌癌の発生過程におけるp53遺伝子変位の解析

以前の研究において,4-Nitroquinoline l-oxide(4NQO)誘発ラット舌癌の発生過程におけるp53タンパクの発現を免疫組織化学的方法およびイムノブロッティング法により検索した.その結果,p53タンパクは経時的に増加することが明らかになり,その質的あるいは量的な異常がこのモデルにおける発癌過程と密接に関連していることが示唆された.そこで本研究では同じモデルを用い,組織学的な変化と対比しつつp53遺伝子の異常をPCR-SSCP法で検討した.実験には1群5匹のSD系ラットを用いた.各群に50ppm4NQO水溶液を投与し,投与開始後4週,8週,12週,16週,20週,および24週で4%PFA溶液にて灌流固定したのち舌を採取した.p53遺伝子の検索には,各標本のパラフィン切片からTaKaRaDEXPATを用いて抽出したDNAを用いた.これを鋳型としてexon5,6,7,8についてPCRで増幅した.次にSSCP法としてPCR反応液をホルムアルデヒド存在下で80°C,5分間加熱し,そのまま室温で冷却した.DNAを一本鎖に解離した後,低温下でポリアクリルアミド電気泳動を行った.泳動終了後ゲルを銀染色し,各エクソンにおける変異の有無を検索した.病理組織学的には4NQO投与開始後8週から舌根部に過形成上皮,12週から異形成上皮が出現し始め,16週ないし20週で初期の発癌がみられた.SSCP法による遺伝子検索では,exon5,6,7では変化がみられなかったものの,12週以降のグループでexon8に変異がみられた.すなわち,発癌が観察される直前の時期からP53遺伝子の変異が証明され,4NQOによる発癌にP53遺伝子が関与する可能性が示唆された.以前の研究において,4-Nitroquinoline l-oxide(4NQO)誘発ラット舌癌の発生過程におけるp53タンパクの発現を免疫組織化学的方法およびイムノブロッティング法により検索した.その結果,p53タンパクは経時的に増加することが明らかになり,その質的あるいは量的な異常がこのモデルにおける発癌過程と密接に関連していることが示唆された.そこで本研究では同じモデルを用い,組織学的な変化と対比しつつp53遺伝子の異常をPCR-SSCP法で検討した.実験には1群5匹のSD系ラットを用いた.各群に50ppm4NQO水溶液を投与し,投与開始後4週,8週,12週,16週,20週,および24週で4%PFA溶液にて灌流固定したのち舌を採取した.p53遺伝子の検索には,各標本のパラフィン切片からTaKaRaDEXPATを用いて抽出したDNAを用いた.これを鋳型としてexon5,6,7,8についてPCRで増幅した.次にSSCP法としてPCR反応液をホルムアルデヒド存在下で80°C,5分間加熱し,そのまま室温で冷却した.DNAを一本鎖に解離した後,低温下でポリアクリルアミド電気泳動を行った.泳動終了後ゲルを銀染色し,各エクソンにおける変異の有無を検索した.病理組織学的には4NQO投与開始後8週から舌根部に過形成上皮,12週から異形成上皮が出現し始め,16週ないし20週で初期の発癌がみられた.SSCP法による遺伝子検索では,exon5,6,7では変化がみられなかったものの,12週以降のグループでexon8に変異がみられた.すなわち,発癌が観察される直前の時期からP53遺伝子の変異が証明され,4NQOによる発癌にP53遺伝子が関与する可能性が示唆された.化学発癌剤4-nitroquinoline1-oxide(4NQ0)を用いて誘発したラット舌癌の発生過程におけるp53遺伝子の変異の検討を行った.実験方法として,50ppmの4NQ0を12週間投与し,投与開始後0週,4週,8週,12週,16週,20週,24週で舌を採取し,4%PFAで固定した後,パラフィン切片を作成した.組織学的には4NQ0投与開始後8週から舌根部に過形成上皮,12週から異型性上皮が出現し始め,16週ないし20週を過ぎたころから初期の発癌が見られた.p53遺伝子の検索として,各標本の10μmパラフィン切片を10枚マイクロチューブにとり,タカラDexpatを用いてゲノムDNAを抽出した.これを鋳型とし,PCRを用いて各エクソン(exon5,6,7,8)ごとにホットスタート法で増幅を行った.first PCR 40 cycle,second PCR 30 cycleを行った後,試料をアガロースゲル上に5μlずつ電気泳動し,エチジウムブロマイドで発色して,増幅を確認した.その結果,今回設計したプライマーで十分な増幅が行えることを確認した.次に,SSCP法としてPCR反応液をホルムアミド存在下で80°C,5分間加熱し,そのまま室温で冷却した.DNAを一本鎖に解離した後,低温下でポリアクリルアミド電気泳動を行った.泳動終了後ゲルを銀染色し,各エクソンにおける変異の有無を調べた.現在,0週,4週,8週,12週,16週,20週,24週のラットについて各週齢3例ずつ,SSCP法でp53エクソン5,6,7の変異を検索したところ,まだ遺伝子変異の確証は得ていない.今後はラットの数を増やし,変異時期を確認する予定である.

以前の研究において,4-Nitroquinoline 1-oxide(4NQO)誘発ラット舌癌の発生過程におけるp53タンパクの発現を免疫組織化学的方法およびイムノブロッティング法により検索した.その結果,p53タンパクは経時的に増加することが明らかになり,その質的あるいは量的な異常がこのモデルにおける発癌過程と密接に関連していることが示唆された.そこで本研究では同じモデルを用い,組織学的な変化と対比しつつp53遺伝子の異常をPCR-SSCP法で検討した.実験には1群5匹のSD系ラットを用いた.各群に50ppm 4NQO水溶液を投与し,投与開始後4週,8週,12週,16週,20週,および24週で4%PFA溶液にて灌流固定したのち舌を採取した.p53遺伝子の検索には,各標本のパラフィン切片からTaKaRaDEXPATを用いて抽出したDNAを用いた.これを鋳型としてexon5,6,7,8についてPCRで増幅した.次にSSCP法としてPCR反応液をホルムアルデヒド存在下で80°C,5分間加熱し,そのまま室温で冷却した.DNAを一本鎖に解離した後,低温下でポリアクリルアミド電気泳動を行った.泳動終了後ゲルを銀染色し,各エクソンにおける変異の有無を検索した.病理組織学的には4NQO投与開始後8週から舌根部に過形成上皮,12週から異形成上皮が出現し始め,16週ないし20週で初期の発癌がみられた.SSCP法による遺伝子検索では,exon5,6.7では変化がみられなかったものの,12週以降のグループでexon8に変異がみられた.すなわち,発癌が観察される直前の時期からp53遺伝子の変異が証明され,4NQOによる発癌にp53遺伝子が関与する可能性が示唆された.
急性白血病における予後因子の分子レベルでの解析

急性骨髄性白血病(AML)にみられる遺伝子異常は疾患の病態を規定し、中でもFLT3-ITD、NPM、CEBPA遺伝子異常は予後と強く関連する。一方,遺伝子異常以外に染色体核型,白血球数,AML病型も予後と関連し,さらに我々はMPO発現が予後と関連することを明らかにしてきた。本研究では、AMLの予後因子であるMPOとこれら遺伝子異常との相関関係を検討した。93症例の白血病細胞から抽出したgenomic DNAをPCR法で増幅させ、直接シークエンス法を用いて、FLT3-ITD、NPMおよびCEBPA遺伝子の同定を行った。FLT3-ITDは16症例(17。7%)、NPM遺伝子異常は21症例(22.6%)、CEBPA遺伝子異常は15症例(16.1%)に認めた。AMLの重要な予後因子の1つである染色体核型別に解析を行ったところ、遺伝子異常は予後中間群である正常核型症例(60症例)に多く認めた。染色体正常核型症例において、FLT3-lTDは11症例(18.3%)、NPM遺伝子異常は19症例(31.7%)、CEBPA遺伝子異常は11症例(18.3%)に認めた。遺伝子異常とAML予後因子の相互関係の解析では、CEBPA遺伝子異常がある症例ではMPO陽性率が有意に高値であった。一方、FLT3-ITDやNPM遺伝子異常とMPO陽性率との相関関係には有意差を認めなかった。染色体正常核型AMLにおいて、CEBPA遺伝子異常はMPOの発現に関与している可能性があり、CEBPA遺伝子異常とMPO発現の分子生物学的関係を明らかにすることで,AMLの発症機序や治療反応性の違いの解明に繋がるものと考えられる。急性骨髄性白血病(AML)にみられる遺伝子異常は疾患の病態を規定し、中でもNPM、FLT3、C/EBPa遺伝子異常は予後と強く関連する。一方、遺伝子異常以外に染色体核型、白血球数、AML病型も予後と関連し、さらに我々はMPO発現が予後と関連することを明らかにしてきた。MPOを含む種々のAML予後因子とこれら遺伝子異常との関係を明らかにすべく研究を進めている。また、予後と関連するNPM遺伝子を例としてどのような機序によってAMLの治療反応性が規定されているのか、転写制御の側面から詳細な検討を行っている。[1]臨床検体を用いたAMLにおける予後因子の検討これまでに、NPM遺伝子exon12、FLT3遺伝子exon11-12、exon17の塩基配列解析の方法を確立し、さらにFLT3遺伝子internal tandem duplication同定が可能となった。現在、患者検体での遺伝子異常同定が進んでおり、MPO発現、染色体所見、臨床因子と合わせて統合的に予後因子を検討している。[2]ETSファミリー転写因子MEFとNPMとの関連の検討NPM遺伝子異常はNPM蛋白質の核内移行シグナルを破壊する。AMLに同定された変異NPM及び野生型NPMの発現プラスミドを作成し、293T細胞に導入した。ウエスタンブロット法及び共焦点レーザー顕微鏡を用いて検討したところ野生型NPMは核内に、変異NPMは細胞質に局在することが確認できた。また、MEF転写活性検討のため、MEFの結合コンセンサスDNA配列を持つルシフェラーゼレポーターを作製し、MEF転写活性の測定条件を設定した。今後これらを用い、MEFの転写活性に対する野生型及び変異NPMの影響やその機序、AMLにおける意義について検討する。急性骨髄性白血病(AML)にみられる遺伝子異常は疾患の病態を規定し,中でもNPM,FLT3,CEBPa遺伝子異常は予後と強く関連する。また,予後と関連するNPM遺伝子を例としてどのような機序によってAMLの治療反応性が規定されているのか,転写制御の側面から詳細な検討を行っている。臨床検体を用いたAMLにおける予後因子の検討これまでに,NPMおよびFLT3遺伝子の異常については50症例,CEBPα遺伝子の異常については15症例で解析を行い,NPMは10症例(20%),FLT3は6症例(12%),CEBPαは1症例(6.7%)でそれぞれ遺伝子異常を認めた。FLT3-ITDがある症例とMPO<50%である症例との相関関係には有意差を認めなかったが(p=0.3849),メディアン検定では,FLT3-ITDがある症例はMPOが低い傾向にあった(p=0.0944)。また,NPM遺伝子異常がある症例とMPO<50%である症例との相関関係には有意差を認めなかったが(p=0.0836),メディアン検定では,NPM遺伝子異常がある症例はMPOが低い傾向にあった(p=0.0420)。CEBPα遺伝子異常は1例認めたが,MPOの陽性率との関連については症例数が少なく解析不能であった。今後,更に症例を蓄積し,遺伝子異常とMPOを含めた予後因子との関連を検討する。

一方,遺伝子異常以外に染色体核型,白血球数,AML病型も予後と関連し,さらに我々はMPO発現が予後と関連することを明らかにしてきた。本研究では、AMLの予後因子であるMPOとこれら遺伝子異常との相関関係を検討した。93症例の白血病細胞から抽出したgenomic DNAをPCR法で増幅させ、直接シークエンス法を用いて、FLT3-ITD、NPMおよびCEBPA遺伝子の同定を行った。FLT3-ITDは16症例(17。7%)、NPM遺伝子異常は21症例(22.6%)、CEBPA遺伝子異常は15症例(16.1%)に認めた。AMLの重要な予後因子の1つである染色体核型別に解析を行ったところ、遺伝子異常は予後中間群である正常核型症例(60症例)に多く認めた。染色体正常核型症例において、FLT3-lTDは11症例(18.3%)、NPM遺伝子異常は19症例(31.7%)、CEBPA遺伝子異常は11症例(18.3%)に認めた。遺伝子異常とAML予後因子の相互関係の解析では、CEBPA遺伝子異常がある症例ではMPO陽性率が有意に高値であった。一方、FLT3-ITDやNPM遺伝子異常とMPO陽性率との相関関係には有意差を認めなかった。染色体正常核型AMLにおいて、CEBPA遺伝子異常はMPOの発現に関与している可能性があり、CEBPA遺伝子異常とMPO発現の分子生物学的関係を明らかにすることで,AMLの発症機序や治療反応性の違いの解明に繋がるものと考えられる。
視覚障害児の包括的アセスメントの開発と発達段階に応じたカリキュラムモデルの構築

本研究では、海外における視覚障害児のアセスメントに関する調査を行い、知的障害等を併せ有する重複障害児を含めた視覚障害児に適用可能な認知機能評価ツール、ADL評価ツール、空間認知と移動・歩行能力評価ツールからなる「視覚障害児用包括的アセスメントツール」を開発する。それらを研究協力校(盲学校3校程度)において実際に活用し、包括的アセスメントから個別指導計画立案までのプロセスにかかわる帰納的研究を実施し、重複障害児を含む「視覚障害児包括的アセスメントシステム」を構築する。それらの研究の知見に基づいて、「視覚障害児の発達段階に応じたカリキュラムモデル」を提案する。
ゼータ関数,L関数の平均値定理の研究

今年度は,平均値理論におけるAtkinsonの方法の研究を中心課題としたことは計画通りであるが,当初の主目的であったHurwitzゼータ関数のパラメーターに関する2乗平均については前年度の研究の若干の整理にとどまり,それよりも,思いがけない方向へのAtkinsonの方法の発展という成果を得た.そのひとつは,ζ^2(S)の近似関数等式の残余項の2乗平均についての木内氏の結果を精密化して,ζ(s)そのものの2乗平均の場合に研究代表者とMeurmanが提出していた予想に対応する結果を,証明しえたことである.もうひとつは,Atkinsonの方法がBarnesの二重ゼータ関数や二重ガンマ関数にも有効に応用できることの発見で,全く期待されていなかった方向への新展開である.この方向は新谷氏の結果を介して,実2次体のHeckeのL関数のs=1での値のある種の漸近式を得るという応用も見出された.また,当初もうひとつの目標としていたζ(s)の誤差項(2乗平均の)の評価についても,これをDirichletのL関数に一般化した形で,σ(=Res)=1/2における本橋氏の結果の1/2<σ<1への拡張が桂田氏との共同研究によって完成した.共同研究の推進や研究成果の学会・シンポジウムでの公表のため,今年度は旅費が相当に必要となり,当初計画していたパーソナルコンピュータの購入を中止して,科研費の大半を旅費にあてる結果となった.今年度は,平均値理論におけるAtkinsonの方法の研究を中心課題としたことは計画通りであるが,当初の主目的であったHurwitzゼータ関数のパラメーターに関する2乗平均については前年度の研究の若干の整理にとどまり,それよりも,思いがけない方向へのAtkinsonの方法の発展という成果を得た.そのひとつは,ζ^2(S)の近似関数等式の残余項の2乗平均についての木内氏の結果を精密化して,ζ(s)そのものの2乗平均の場合に研究代表者とMeurmanが提出していた予想に対応する結果を,証明しえたことである.もうひとつは,Atkinsonの方法がBarnesの二重ゼータ関数や二重ガンマ関数にも有効に応用できることの発見で,全く期待されていなかった方向への新展開である.この方向は新谷氏の結果を介して,実2次体のHeckeのL関数のs=1での値のある種の漸近式を得るという応用も見出された.また,当初もうひとつの目標としていたζ(s)の誤差項(2乗平均の)の評価についても,これをDirichletのL関数に一般化した形で,σ(=Res)=1/2における本橋氏の結果の1/2<σ<1への拡張が桂田氏との共同研究によって完成した.共同研究の推進や研究成果の学会・シンポジウムでの公表のため,今年度は旅費が相当に必要となり,当初計画していたパーソナルコンピュータの購入を中止して,科研費の大半を旅費にあてる結果となった.
心筋細胞の容量性Ca^<2+>流入チャネルにおける活性化機構のノックアウトマウス解析

細胞内Ca^<2+>ストアの小胞体のCa^<2+>枯渇シグナルが形質膜越えにCa^<2+>を流入させ、小胞体へCa^<2+>を充填させるチャネルとして、様々な種類の容量性Ca^<2+>流入(CCE)チャネルが報告されている。これまで、CCEチャネルは非興奮性細胞の他に興奮性細胞においても存在するが、その存在は平滑筋細胞や骨格筋細胞に限るとされてきた。本研究の目的は、native心筋にもCCEチャネルが存在するのか、また存在するとすれば、そのチャネル活性化の機構はどうなっているのかを電気生理学的手法(パッチクランプ法と細胞内Ca^<2+>濃度の蛍光測定法)と分子生物学手法を駆使して明らかにすることである。心筋細胞において小胞体Ca^<2+>枯渇剤を投与すると細胞内Ca^<2+>濃度上昇と内向き電流が誘発されることから、心筋細胞にもCCEチャネルが存在することがわかった。次に、小胞体膜と細胞表面膜との接合構造が同チャネル活性化機構に必須かを、同接合構造が異常になる同接合蛋白ジャンクトフィリン(JP2)欠損マウスの心筋native細胞を用いて検討した。その結果、活性化機構に接合構造は必ずしも必要でなく、細胞表面膜と小胞体膜は構造的に連関していないと考えられた。また、リアノジン受容体(RyR2)が同活性化機構に果たす役割についても、RyR2欠損マウスの心筋native細胞を用いて検討したところ、RyRの同活性化機構への関与は少ないと評価された。更に、心筋細胞のCCEチャネルの薬理学的特性は、他の興奮性細胞の場合と異なっており、心筋細胞のCCEチャネルは、これまで報告されたCCEチャネルと異なる分子種と考えられた。小胞体の貯蔵Ca^<2+>が枯渇すると、ある形質膜Ca^<2+>チャネルを通過して容量性のCa^<2+>流入が生じ、小胞体内腔へのCa^<2+>再充填がおこるとされる。その機構を容量性Ca^<2+>流入(CCE)と呼ぶ。心筋細胞にもCCE機構が存在するか否かを決定し、CCE活性化の分子機構を解明する目的で、生理学的手法と分子生物学的手法を組み合わせた解析を行った。同現象は、パッチクランプ法による内向き全細胞電流と、蛍光指示薬(Fura, Fluoその他)を用いた細胞内Ca^<2+>濃度によりモニタした。分子生物学的材料として、今回は、竹島(東北大生化学)らが作成した、小胞体のCa^<2+>動員蛋白RyR2および小胞体膜-表層膜接合接蛋白のジャンクトフィリンJP2の2種類のノックアウトマウスの心臓を用いた。2カ年計画の初年度は、予定していた実験を遂行し以下の結果を得た。(1)CCE機構が心筋細胞膜に存在することを確認した。(2)活性化機構モデルのうち、構造的連関説、構造的非連関説のうち、心筋細胞の場合のCCE機構では、何れのモデルが適当かノックアウトマウスを用い検討した。実験結果は全て、心筋細胞では構造的非連関説があてはまることが判った。既に報告されている他の、非興奮性細胞や興奮性細胞におけるCCE機構群との生理学的、薬理学的特性との比較を行い、心筋細胞との共通、相違点を検討した。その結果、心筋細胞のCCE機構は、他のどれとも異なる特有の特性を示した。心筋細胞の容量性Ca^<2+>

流入(CCE)チャネルの活性化の分子機構の解明を目指して、本基盤研究(C)の2カ年計画を遂行してきた。初年度の平成14年度においては、CCEチャネルの存在の証明をはじめ、活性化機構を説明するのに適した作業仮説の検討を行った。最終年度の平成15年度においては、CCEチャネルの活性化機構を更に詳しく明らかにすることや、CCEチャネルの生理学的な役割を知ることなどを主な目的として、次のような仕事を行った。(1)容量性Ca^<2+>流入に小胞体膜-表層膜接合構造が必要か否かを、接合蛋白のジャンクトフィリンJP2欠損マウスの心臓を用い調べた。(2)胎児、新生児、アダルトにおける個体発生学的なCCEチャネル発現密度の変化を調べた。(3)形質膜受容体刺激に始まるCCEチャネル現象を、様々な実験条件下に観察することにより、CCEチャネルの生理学的、病態生理学的意味を探った。(4)心筋CCEチャネルを介する形質膜越えのCa^<2+>流入過程の興奮収縮連関機構における仕組みを探るため、細胞内Ca^<2+>濃度と同時に単一心筋細胞の単収縮も測定した。以上の実験から、容量性Ca^<2+>流入において、心筋細胞に特有な中心的な分子機構が明らかにされた。心筋細胞のCCEチャネルの活性化機構としては、構造的非連関モデルが最も適していると考えられた。また、少なくとも心筋細胞の場合、生理学的および病態生理学的な状態において、興奮収縮連関機構にCCEチャネルが一役買っている可能性が強く示唆された。
天然および人工由来の臭素化ビフェノールのヒト曝露と体内動態研究

1)海藻由来の2,2'-diMeO-BB80, tetrabromoveratroleおよび2,4-diMeO-tetrabromobenzeneを用いて、ラットおよびヒト肝ミムロソームによるin vitro代謝実験を行った。いずれの成分も、2個のメトキシ基の1つが脱メチル化してmonoOH体を生成し、脱メチル化に関与する分子種は主にCYP2B6であると推定された。これらの脱メチル化体は抗酸化活性、抗菌活性(抗MRSA)および弱いグルクロニダーゼ阻害活性を有することから、食事中のMeO-PBDEは、ヒト曝露後、脱メチル化により抗菌・抗酸化などの機能性が増すことが示唆された。2) OH-PBDE関連物質の残留調査から、食事による曝露量の評価およびヒト母乳中のOH-PBDE量の実態を調べた。食事由来のOH-PBDEは主に海藻食品から、一方、MeO-PBDEは魚介類に由来すると推定された。日本における海藻(S. fusforme)の加工食品中のOH-PBDEは未検出2 ug/gdryの範囲で検出され、地域差が大きく、ヒトのOH-PBDE摂取量は大きくばらつくと思われた。日本人の血液・母乳から人工PBDEと同レベルの天然OH-PBDEが検出されており、そのデータを検証している。3魚介類や鯨類にはOH-PBDEの前駆物質であるMeO-PBDEがPOPsの1つであるPBDEと同レベルで残留することがわかったので、今回、環太平洋沿岸(日本近海、アラスカおよびカリフォルニア)のマダラに残留する有機フッ素化合物(PFASs)の蓄積状況を調べた。その結果、長鎖PFCA(主成分:炭素数11のカルボン酸)が日本海域に高く、PFOS(炭素数8のスルホン酸)がアメリカ西海岸に分布していることが分かった。このPFASsの地域差と天然由来OH-PBDEの分布について関連性を調査している。ヒトの生体試料として母乳および食事試料から臭素化合物を検出し、その由来を調査するためのデータ解析に時間を要している。さらに目的物質の抗酸化作用について調査中であるが、サンプル数を増やす必要がある。また現在、海藻の抽出条件を再検討している段階であり、その結果によって計画を少し変える可能性がある。海藻種を分類して、天然由来成分の分布を市販食品および東アジア海域で採取する海藻を調査し、機能性成分の利用を含めて検討していく。具体的には、1)日本産(沖縄、三重県)の海藻のほかに、台湾産(基隆、澎湖島)の海藻中のOH-PBDE関連物質について、LCMSMS(ESI法)およびGCMS(ENCI法)により探索を行うとともに海藻および魚介類について、OH-PBDEの分布に関するデータベースを作成する。MeOH、酢酸エチルによる抽出区分ごとの抗酸化活性、グルクロニダーゼ活性を測定し、機能性を有する海藻臭素成分を検索する。2)魚介類からの天然由来MeO-PBDEおよびPOPsの濃度比較、海藻由来のOH-PBDEおよびPOPsについてデータベースを作成する。3)食事経由によるMeO-PBDEおよびOH-PBDEのヒト曝露の長期トレンドを予測する。さらに、天然および人工由来のPBDE関連化合物の摂取量とヒト体内負荷量の経年変化を比較するとともに、MeO-PBDEの代謝活性化による影響評価を行う。1.海藻食品中の臭素化ビフェノール(OH-PBDE)の分析法として、従来のGC-MS(ECNI)による分析に加えて、LC-MS/MS(ESI)による方法を確立した。すなわち、試料から脂肪分を除いた後、KOH/EtOH溶液とヘキサンで分配し、フェノール分画をLC-MS/MSのESI法でイオン化しMRMによる定量法を確立した。また、そのメチル化体(MeO-PBDE)および人工の残留性臭素化合物は、GC-MS(ECNI)により分析する系を確立した。3.京都大学ヒトサンプルバンクを用いて、OH-PBDEの食事曝露量とヒトの血液・母乳中のOH-PBDE量の実態を調べた。食事由来のOH-PBDEは主に海藻食品から、MeO-PBDEは魚介類に由来すると考えられた。日本ではS. fusformeの加工食品が流通しており、そのヒト曝露量は地域差が見られ摂取量に依存すると推測される。日本人の血液・母乳から人工PBDEと同レベルのPBDEが検出されており、現在そのデータを検証している。ヒト血液・母乳試料中からOH-PBDEを検出し、その定量データを検証中で、追加試料による実験が残っているため。日本における海藻(S. fusforme)の加工食品中のOH-PBDEは未検出2 ug/g