hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
運動器分野の検診と理学療法指導体制の包括的連携を実現する医療情報システムの開発

また、直接検診時にストレッチングやアイシングの直接指導をその場で実施し、運動器障害の進行予防に有意義であると思われた。高校野球新入生に対する肘・肩を中心とした運動器検診を3校、69名に対して実施した。平成24年26年までに計191名の選手の運動器検診を行い、エコー検査や直接検診・各関節の可動域検査等を行い、中学時の硬式や軟式野球の経験による関節可動域や肘・肩傷害の違いについて検討した。限界集落の高齢者の運動器検診では、これまでのデータをまとめ、島しょ部と中山間部の高齢者の運動機能や身体的特徴の比較検討を行った。上記の検診で得られたデータは、コンピューター入力し統計解析を行ったが、検診データと病院カルテへの情報の共有するには、情報管理面やソフト面の充実をさらに図る必要があると思われた。整形外科各種の運動器検診事業は順調に行い、検診対象者数も増加し、理学療法士との連携による運動器障害に対する早期診断と運動療法などの治療や予防啓発活動は一定の成果を挙げています。しかし、コンピューターを介したデータ管理を実施することと近隣の病院との情報共有としてのデータの相互共有に対しては、情報のセキュリティの問題やソフトの開発の面から今後さらに改善し、実現できるように努力したいと考えています。運動器検診事業は、順調に行っていますが、コンピューターを導入し、近隣の病院とのコンピューターとデータを相互に共有するには、ソフトの開発を充実する必要があります。今年度は、各病院との連携を行いながら、上記の開発やデータの共有できる環境を創生していきたいと考えています。また、運動器検診事業において、理学療法士との連携は極めて順調に行うことができており、さらに協力関係を維持しながら、検診事業の発展に努めたいと考えます。理学療法士とともに整形外科医による運動器検診事業は、今年度も予定しており、これまでの所、順調に進んでいます。タブレット環境の改善を図り、検診事業に導入することができるように整備・充実をさらに進めていきます。今年度も、運動器検診事業を積極的に行うことを予定しており、すでに現在進行中であり、実施対象を増やすことを予定している。特に、中学校に対しての検診は、愛媛県下約60校に対して予定しており、現在の所順調に遂行できている。今後は、さらにタブレット環境での入力ができるように整備・充実する予定です。運動器検診の結果報告のための、学会参加の経費やコンピューター環境の改善を要します学会発表のための旅費や英語論文作成のための校正や資料収集のためおよびコンピューターソフト開発費に使用する予定ですコンピューターやタブレット入力のソフト面の充実に資金を投入することが必要と考えています。
中高一貫教育における「物質学習」の系統的段階化と適時性

平成15,16年度の『中等教育における「イオン学習」の適時性』の研究成果を踏まえ,中高一貫教育を含む中等教育段階における「物質学習」の内容および系統性・適時性について研究した。1.粒子概念を基軸とした小・中・高一貫物質学習カリキュラムの提言「物質を構成する粒子」という粒子概念を小学校段階の物質学習から導入するのが適当であり,児童・生徒の発達段階を十分考慮して段階的導入を図る必要があると結論した。中高6年間において全ての生徒が身につけるべき科学的素養としての学習内容を精選・系統化した。また,学習内容とともにどのようなプロセス・スキルを獲得するのか,という達成目標を明確化した。2.児童・生徒の粒子概念-実態調査-小・中・高・大生の粒子概念獲得の現状調査から,上記の提言に繋がることとなった。3.物質学習カリキュラムの国際比較-科学的リテラシーの視点から-科学的リテラシーの視点から,4カ国のカリキュラムを調査し,上記提言に生かした。4.小学校・中学校における授業実践と評価提案している物質学習カリキュラムを検証するために,いろいろな授業実践を行った。これらの研究成果を学会および本研究グループ主催の公開シンポジウムで発表した。・日本理科教育学会第56回全国大会(8月,奈良教育大学)・公開シンポジウム「これからの理科教育を考える-小・中・高を見通した物質学習カリキュラム-(1月,お茶の水女子大学)前年度までの『中等教青における「イオン学習」の適時性』の研究成果を踏まえ,本研究の目的を達成するための研究課題等を次のように整理し,検討してきた.2年目はこれらの成果をまとめて報告書を作成することとした.(1)中等教育での物質学習の内容と系統性中高6年間で採りあげたい物質学習の内容(必修とすべき内容と選択あるいは発展でよい内容を明確化する)の系統性と適時性について具体案を作成・検討している.同時に,生徒に興味関心を持たせ理解を深めさせるための実験・観察,およびこれらの学習により育成すべき科学的思考力についても考慮することとした.また,教科書等による物質学習の国際比較からも,中等教育における望ましい学習内容・カリキュラム等を検討することとした.(2)科学的リテラシーとの整合性中等教育における学習内容は我が国一般社会の科学レベルを決定づけるものと考え,全米科学教育スタンダードやPISA等の科学的リテラシーの観点からも吟味している.(3)児童・生徒の物質観に関するアンケート調査2年目の初めに,物質についての知識,物質のとらえ方や理解の仕方(粒子概念,質量保存など)を,岩手県と東京都の小・中・高の児童・生徒および大学生を対象にアンケート調査し,望ましい物質学習カリキュラムを考える基礎資料とすることとした.(4)中高一貫教育校の調査中高6年間を通した望ましい物質学習カリキュラムを作成する参考にするため,中高一貫教育校に指定されている中等教育学校等における教育理念およびカリキュラムを調査した.(5)教育実践お茶の水女子大学の研究会メンバーを中心に,同大学附属中学校・高校における通常授業および小・中・高連携授業・研究会等で「物質学習」カリキュラムに関連する種々の教育実践を行った.平成15,16年度の『中等教育における「イオン学習」の適時性』の研究成果を踏まえ,中高一貫教育を含む中等教育段階における「物質学習」の内容および系統性・適時性について研究した。・日本理科教育学会第56回全国大会(8月,奈良教育大学)・公開シンポジウム「これからの理科教育を考える-小・中・高を見通した物質学習カリキュラム-(1月,お茶の水女子大学)
抗癌剤イブルチニブの感受性を予測するB細胞受容体リン酸化の部位特異抗体による検出

B細胞悪性腫瘍の治療のために、イブルチニブなど様々なB細胞受容体シグナル伝達に関与するリン酸化酵素群の阻害剤が開発されている。しかし、その治療効果は、標的リン酸化酵素の発現やリン酸化状態とは必ずしも相関せず、適切な治療薬選択法は確立されていない。B細胞受容体のリン酸化状態を解析することが、治療薬選択に通じる病態メカニズム解明のために重要であるが、B細胞受容体にはリン酸化が可能なチロシン残基が複数存在しているため、定量的に正確な解析を行うためには、各チロシン残基のリン酸化を特異的に検出する抗体の作製が必須であった。前年度までの研究で、我々が新しく作製したB細胞受容体CD79AのY188、CD79BのY196の2つの配列特異的リン酸化抗体は、市販の抗体に比較し、疑似配列や非リン酸化抗原に対する交差反応性が低いことが判明している。そこでH30年度は、我々の取得抗体を用い、各部位特異的にリン酸化のB細胞シグナル伝達における役割を解析した。その結果、種々のB細胞株では刺激後に誘導されるY188とY196残基の部位特異的リン化は、互いに相関して変動する結果が得られた。一方、市販の抗リン酸化Y188抗体では、両残基のリン酸化の変動が相反する場合もあった。この結果は、市販の抗リン酸化ペプチド抗体の反応性が、B細胞受容体のリン酸化だけでなく、リン酸化以外のコンフォメーションも認識し、リン酸化による下流のシグナル伝達因子のリクルート状況などに依存する可能性を示していた。本研究では、我々が初めて作製に成功したB細胞受容体CD79BのY196配列特異的抗リン酸化モノクローナル抗体を用い、Y196のB細胞シグナル伝達における役割とイブルチニブ感受性相関のメカニズムを解析する。平成28年度の研究実施計画の主眼は、精製抗体の調整と蛍光標識の他、免疫組織染色と多色フローサイトメトリーの染色の条件の至適化、リン酸化酵素阻害剤に対する感受性試験などの材料と方法の確立であった。実際には、B細胞受容体複合体の6つのチロシン残基のうち、CD79AのY188残基、および、CD79BのY196残基のリン酸化を特異的に検出する抗体を産生する細胞の大量培養を行い、これらの抗体の大量精製と蛍光標識に成功した。これらの抗体を用いたフローサイトメトリーでは、B細胞受容体シグナル伝達研究に用いられる様々なB細胞株によって、B細胞受容体刺激後のこれらのチロシン残基のリン酸化のパターンが異なることを初めて見出した。今後、これらのB細胞株について、イブルチニブを含む様々なリン酸化酵素阻害剤に対する耐性細胞を樹立しつつあり、薬剤耐性の異なる細胞株の解析により、B細胞受容体の部位特異的リン酸化と阻害剤感受性との連関の解析が進むことが期待される。28年度に目指した、今後の研究のための材料と方法の確立が順調に進展している。特にフローサイトメトリーを用いた解析では、これまでの市販の抗体では得られなかった部位特異的リン酸化の状態を検出することに初めて成功しており、またその状態が個々のB細胞株によって異なることがわかった。今後は、B細胞受容体の下流シグナルの主要構成要素であるSyk、BTK、ERK1/2、NFkBなどのリン酸化を個々の細胞レベルで多色フローサイトメトリーにより測定し、CD79B Y196のリン酸化との関係を調べることにより、これらのリン酸化の意義を解析する方向へと進んでいくことができる。また、いくつかのB細胞株について、イブルチニブを含む様々なリン酸化酵素阻害剤存在下での長期培養により、イブルチニブ耐性細胞を樹立しつつある。これらの細胞株は、CD79B Y196のリン酸化とB細胞受容体の下流シグナルの動きと、各種阻害剤感受性の関係を探るためのモデルとなり得る。免役組織染色については、研究協力者であるKristi Egland博士(米国サンフォード研究所)の協力を得て現在検討中であるが、現在までのところ、染色には成功していない。しかし、仮に免疫組織染色に成功しないとしても、フローサイトメトリーによる解析により、本研究を進め、目的の達成を計ることは可能であると考えられる。そこで本研究では、B細胞受容体複合体の6つのチロシン残基のうち、我々が初めて作製に成功したB細胞受容体CD179BのY196配列特異的抗リン酸化モノクローナル抗体を用い、Y196のB細胞シグナル伝達における役割とイブルチニブ感受性相関のメカニズムを検討している。

平成29年度の研究では、当初の予定通り、すでに大量精製と蛍光標識が完了している我々独自の抗リン酸化抗体2種を用い(CD79AのY188残基、および、CD79BのY196残基のリン酸化に特異的に検出する抗体)、B細胞受容体シグナル伝達研究に用いられる様々なヒトB細胞株において、他の細胞同定マーカーと同時に用い、多色フローサイトメトリーの染色する条件について至適化を行った。来年度は同一の条件でヒト抹消血単核球の染色を行う予定である。また、いくつかのB細胞株のうち、イブルチニブ感受性であったSU-DHL-4細胞について、低濃度のイブルチニブの存在下で長期に培養し、イブルチニブの処理濃度を段階的に上昇させる馴化方法により、イブルチニブ耐性SU-DHL-4細胞の樹立に成功した。今後、この細胞株を用いた解析により、これらの部位特異的リン酸化のイブルチニブ感受性との連関の解析を進める。29年度までに目指した、今後の研究のための材料と方法の確立がおおむね順調に進展している。特にフローサイトメトリーを用いた解析では、我々の抗体を用いたB細胞受容体の部位特異的リン酸化に加えて、B細胞受容体の下流シグナルの主要構成要素であるいくつかのシグナル伝達分子のリン酸化を個々の細胞レベルで同時に検討できる抗体パネルを構築した。既に、B細胞受容体の部位特異的リン酸化は我々の抗体によって検出可能であり、そのリン酸化状態は、個々のB細胞株によって異なることがわかっている。今後は、この多色フローサイトメトリーにより、CD79B Y196のリン酸化と下流シグナルの関係を調べることにより、それぞれのリン酸化の意義を解析することができる。また、イブルチニブ感受性であったSU-DHL-4細胞について、イブルチニブ存在下での長期培養により、イブルチニブ耐性細胞を樹立することに成功した。今後、この細胞株を用いて、CD79B Y196のリン酸化とB細胞受容体の下流シグナルの動きと、イブルチニブ感受性の関係を探って行くことが可能となった。免役組織染色については、現在までのところ、我々の抗体を用いた染色には成功していない。研究協力者であるKristi Egland博士(米国サンフォード研究所)の協力を得て、引き続き検討中である。しかし、仮に免疫組織染色に成功しないとしても、フローサイトメトリーによる解析により、本研究を進め、目的の達成を計ることは可能であると考えられる。B細胞悪性腫瘍の治療のために、イブルチニブなど様々なB細胞受容体シグナル伝達に関与するリン酸化酵素群の阻害剤が開発されている。しかし、その治療効果は、標的リン酸化酵素の発現やリン酸化状態とは必ずしも相関せず、適切な治療薬選択法は確立されていない。B細胞受容体のリン酸化状態を解析することが、治療薬選択に通じる病態メカニズム解明のために重要であるが、B細胞受容体にはリン酸化が可能なチロシン残基が複数存在しているため、定量的に正確な解析を行うためには、各チロシン残基のリン酸化を特異的に検出する抗体の作製が必須であった。前年度までの研究で、我々が新しく作製したB細胞受容体CD79AのY188、CD79BのY196の2つの配列特異的リン酸化抗体は、市販の抗体に比較し、疑似配列や非リン酸化抗原に対する交差反応性が低いことが判明している。そこでH30年度は、我々の取得抗体を用い、各部位特異的にリン酸化のB細胞シグナル伝達における役割を解析した。その結果、種々のB細胞株では刺激後に誘導されるY188とY196残基の部位特異的リン化は、互いに相関して変動する結果が得られた。一方、市販の抗リン酸化Y188抗体では、両残基のリン酸化の変動が相反する場合もあった。
沖縄の暴走族・ヤンキー若者たち、その後――5年にわたる参与観察と生活史調査から

本研究は、沖縄の下層若者を対象とする追跡調査である。調査を始めた2007年、沖縄の暴走族・ヤンキーの若者の多くは、家族関係が不安定で、中学にほとんど通学しておらず、安定した仕事に就いていなかった。彼・彼女らがその後、誰と、どこで、どのようにつながり、そこでどのような経験を重ねたかのか、そして現在の仕事と生活について追跡調査することが、第1の課題である。続いて、そこで明らかになった沖縄の下層若者の仕事と生活の実態を分析するための概念や枠組みを構築することが、第2の課題である。予定していた参与観察、生活史調査は順調にすすみ、その成果は学会報告、論文、書籍として公開した。本研究「沖縄の暴走族・ヤンキー若者たち、その後ー5年にわたる参与観察と生活史調査から」は、2007年から継続している沖縄の下層若者を対象とする追跡調査である。2007年当時、沖縄の暴走族・ヤンキーの若者の多くは、家族関係が不安定で、小学校・中学校に通学した実績がほとんどなく、安定した仕事に就いていなかった。彼・彼女らがその後の7年間でだれとどのようにつながり、どのような経験を重ねたかのか、そして現在、どのような仕事(違法就労を含めて)に就き、どのような世界に住んでいるのかについて追跡調査することが、第一の目的である。続いて、そこで明らかになった沖縄の下層若者の仕事と生活の実態に即して、先行研究で用いられている概念や枠組みの転換転換・発展を図ることが、第二の目的である。2007年度時点で、予定していた参与観察、生活史調査は無事に進んでおり、その成果の一部は学会報告、論文として成果を公開している。本研究「沖縄の暴走族・ヤンキー若者たち、その後ー5年にわたる参与観察と生活史調査から」は、沖縄の下層若者を対象とする追跡調査である。調査を開始した2007年当時、沖縄の暴走族・ヤンキーの若者の多くは、家族関係が不安定で、小学校・中学校に通学した実績がほとんどなく、安定した仕事に就いていなかった。彼・彼女らがその後、どこで、誰とどのようにつながり、どのような経験を重ねたかのか、そして現在、どのような仕事(違法就労を含めて)に就き、どのような世界に住んでいるのかについて追跡調査することが、第一の目的である。続いて、そこで明らかになった沖縄の下層若者の仕事と生活の実態に即して、先行研究で用いられている概念や枠組みの転換・発展を図ることが、第二の目的である。こちらも研究費で購入した図書や資料を中心に順調にすすんでいる。3年にわたる計画の2年目終了時で、予定していた参与観察、生活史調査は無事にすすんでおり、その成果の一部は学会報告、論文として成果を公開している。申請段階で予定していた、以下の3つの計画を予定通り実施できたため。(1)沖縄での生活史調査(8月、12月)。調査対象は、1)金融系の違法就労に就いている20歳前後の男性たち(宜野湾市のファーストフード店)、2)違法性風俗店を経営する20代前半の男性(沖縄市の繁華街)、3)キャバクラ店で働く10代の女性たち(うるま市の喫茶店)、4)キャバクラ店で働く20代前半の女性たち(沖縄市の喫茶店)の4つである。これらの調査対象者に、それぞれ少なくとも2回は調査を実施した。(2)沖縄での参与観察(8月、12月)。調査対象は、1)建築業に就いている10-20代の男性たち(沖縄県内の建築現場)、2)不安定就労状態にある20代前半の男性たち(北中城村バイク倉庫)の2つである。(3)学会報告(2014年9月、生活指導学会、2016年6月、子ども社会学会)。ポール・ウィリスの再生産論「なぜ野郎どもは一見不利に見える親が就いている製造業に就くのか」を、現在の沖縄で展開することが主題である。沖縄の下層労働(建築業・風俗経営業、違法就労業)の再生産が可能となるために、移動も制限され、往々にして暴力を含むつながりのあり方が形成されていることを指摘した。そのようなつながりのあり方を描くことで、彼らが下層労働に主体的に就く過程の再生産論として展開した。当初は3年の計画であったが、研究代表者の生活の変化から1年延長となった。現時点で、予定していた参与観察、生活史調査は無事にすすんでおり、その成果の一部は学会報告、論文として成果を公開している。申請段階では3年計画であったが、4年に延期されたため。研究代表者は、28年度に研究課題を遂行しながら、臨時雇用の職に就いた。それにより28年度の研究活動が著しく遅れた。

29年度は大学非常勤へと転職し本研究課題に重点的に取り組む。なお本課題の進捗状況は以下の通りである。(1)沖縄での生活史調査(8月、12月)。調査対象は、1)金融系の違法就労に就いている20歳前後の男性たち(宜野湾市のファーストフード店)、2)違法性風俗店を経営する20代前半の男性(沖縄市の繁華街)、3)キャバクラ店で働く10代の女性たち(うるま市の喫茶店)の3つである。これらの調査対象者に、それぞれ少なくとも2回は調査を実施した。(2)沖縄での参与観察(26・27年度の8月、12月)。調査対象は、1)建築業に就いている10-20代の男性たち(沖縄県内の建築現場)、2)不安定就労状態にある20代前半の男性たち(北中城村バイク倉庫)の2つである。(3)学会報告(2014年9月、生活指導学会、2016年6月、子ども社会学会)。本研究「沖縄の暴走族・ヤンキー若者たち、その後ー5年にわたる参与観察と生活史調査から」は、沖縄の下層若者を対象とする追跡調査である。調査を開始した2007年当時、沖縄の暴走族・ヤンキーの若者の多くは、家族関係が不安定で、小学校・中学校に通学した実績がほとんどなく、安定した仕事に就いていなかった。彼・彼女らがその後、どこで、誰とどのようにつながり、どのような経験を重ねたかのか、そして現在、どのような仕事(違法就労を含めて)に就き、どのような世界に住んでいるのかについて追跡調査することが、第一の目的であった。これについては、計画していた聞き取り調査はもちろん、そこから芋づる式に調査対象者を紹介してもらい、想定以上の調査が遂行できた。続いて、そこで明らかになった沖縄の下層若者の仕事と生活の実態に即して、先行研究で用いられている概念や枠組みの転換・発展を図ることが、第二の目的である。ポール・ウィリスの再生産論「なぜ野郎どもは一見不利に見える親が就いている製造業に就くのか」を、現在の沖縄で展開することが主題である。沖縄の下層労働(建築業・風俗経営業、違法就労業)の再生産が可能となるために、移動も制限され、往々にして暴力を含むつながりのあり方が形成されていることを指摘した。そのようなつながりのあり方を描くことで、彼らが下層労働に主体的に就く過程の再生産論として展開した。予定していた参与観察、生活史調査は無事にすすみ、その成果の一部は学会報告、論文、書籍として成果を公開した。本研究は、沖縄の下層若者を対象とする追跡調査である。調査を始めた2007年、沖縄の暴走族・ヤンキーの若者の多くは、家族関係が不安定で、中学にほとんど通学しておらず、安定した仕事に就いていなかった。彼・彼女らがその後、誰と、どこで、どのようにつながり、そこでどのような経験を重ねたかのか、そして現在の仕事と生活について追跡調査することが、第1の課題である。続いて、そこで明らかになった沖縄の下層若者の仕事と生活の実態を分析するための概念や枠組みを構築することが、第2の課題である。予定していた参与観察、生活史調査は順調にすすみ、その成果は学会報告、論文、書籍として公開した。申請段階で予定していた、以下の3つの計画を予定通り実施できたため。調査対象は、1)金融系の違法就労に就いている20歳前後の男性たち(宜野湾市のファーストフード店)、2)違法性風俗店を経営する20代前半の男性(沖縄市の繁華街)、3)キャバクラ店で働く10代の女性たち(うるま市の喫茶店)、4)キャバクラ店で働く20代前半の女性たち(沖縄市の喫茶店)の4つである。
介護用パワーアシストシステムの開発

介護者の肉体労働の負荷が大きい、ベッドから被介護者を移し替える作業に着目し、ハードウェアの面から患者の抱き上げ・抱き下ろし作業をサポートし、介護者の負担を軽減することを目的とし、人とユニットを一体化した介護用パワーアシストシステムの開発を行った。本研究で開発したものは、マスター(人)とスレーブ(ユニット)を一体とするコンセプトに基づくもので、駆動源に空気圧を用い、マスター(人)側の抱き上げ動作をセンシングし、スレーブ(ユニット)からのカフィードバックを直接マスター(人)に伝え、人がその感覚を確かめながら作動させるパワーアシストスーツである。センシングは、介護者の意志をセンサで感知し、それに従った動作をするというコンセプトに基づき、介護者が力を入れようとするとスーツがなめらかに補助し、力を緩めようとする時は、スーツが力を滑らかに減少させるような検知システムを実現する方法として、小型感圧センサを用いた筋肉の硬さセンサを開発し、最適な測定筋肉を選定し測定方法を開発した。ユニットは患者に威圧感を与えないためにスーツの前面に機械的構造物が無いように背後より補助する形をとりスーツの重量及びスーツが分担する分の過重は装着者に感じさせないものを設計制作した。アクチュエータは、アルミ板とアルミ板との間に血圧測定用カフを挟み込んだ単純なものである。カフに空気圧を供給しカフを膨張させることによって、アルミ板を扇形に展開し回転力を発生させるものである。パワーアシストスーツの肘、膝、腰関節部それぞれの用途に応じたカフの大きさ、数を選択する事によって、設計、制作した。以上の研究成果により、実現性のある介護用パワーアシストシステムの基本コンセプトを開発した。介護用パワーアシストシステムは,アーム,ウエスト,レッグからなり,介護者が直接患者と触れ合える様,肢体の前面には構造物のない設計とした。本年度は,実用化を目差したシステムを設計・試作する過程において,新たな技術上の改善がなされた。即ち,肢体の動きのセンシングにおいて,初期に開発された空気圧式の筋肉硬さセンサの耐久性の不足という欠点を解消するものとして,新たに薄型ロードセルを利用したセンサを開発し,これを用いたセンシングポイントの適正なものを見出した。また,空気圧式アクチュエータにおいて,初期に開発した低摩擦スライドボックス式ロータリアクチュエータの重量軽減の困難さを解決するものとして,新たに力つを積層した形式のロータリアクチュエータを開発し,これの最適操作手法と,その特性を調べた。さらに,感性評価によるシステムの最適設計を行なう為に必須な感性スペクトル解析装置による脳波,筋電の測定・解析手法を構築した。来年度は,改良されたシステムを製作し,これを用いて実用化に向けた最適設計,制御回答設計,駆動パワー源の簡略化,軽量化を進める。介護者の肉体労働の負荷が大きい、ベッドから被介護者を移し替える作業に着目し、ハードウエアの面から患者の抱き上げ・抱き下ろし作業をサポートし、介護者の負担を軽減することを目的とし、人とユニットを一体化した介護用パワーアシストシステムの開発を行った。本研究で開発したものは、マスター(人)とスレープ(ユニット)を一体とするコンセプトに基づくもので、駆動源に空気圧を用い、マスター(人)側の抱き上げ動作をセンシングし、スレーブ(ユニット)からのカフィードバックを直接マスター(人)に伝え、人がその感覚を確かめながら作動させるパワーアシストスーツである。

ユニットは患者に威圧感を与えないためにスーツの前面に機械的構造物が無いように背後より補助する形をとりスーツの重量及びスーツが分担する分の過重は装着者に感じさせないものを設計制作した。アクチュエータは、アルミ板とアルミ板との間に血圧測定用カフを挟み込んだ単純なものである。カフに空気圧を供給しカフを膨張させることによって、アルミ板を扇形に展開し回転力を発生させるものである。パワーアシストスーツの肘、膝、腰関節部それぞれの用途に応じたカフの大きさ、数を選択する事によって、設計、制作した。以上の研究成果により、実現性のある介護用パワーアシストシステムの基本コンセプトを開発した。
蚊を模倣した超低侵襲採血機能を有するバイオセンシングチップの構築

超低侵襲血液分析を目的として、蚊を模倣したマイクロセンシングシステムの開発を行った。白金黒電極上で水素バブルを生成・消滅を利用したマイクロポンプを作製した。絶縁体である水素バブルの蓄積に伴う影響を低減するため、壁構造を電極上に形成した。また、微小針を通して全血のサンプリングを行った。さらに、ここにグルコースセンサを集積化し、その応答を調べた。超低侵襲血液分析を目指したマイクロポンプの試作と評価を進めてきた。本研究で作製したマイクロポンプは、水の電気分解により水素ガスを発生させ、これを電位印加により酸化・収縮させる。この際の水素バブルの体積変化により溶液の押し出しと吸引を行う。デバイスは、電極パターンが形成されたガラス基板と、流路が形成されたポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)から構成される。ガラス基板には白金黒作用極、銀/塩化銀参照極、白金対極からなる3電極系を形成した。作用極には発生した水素ガスによる電解液の断絶を防ぐための微小壁構造を形成した。流路に0.5 MのHClを満たしたのち、ポテンショスタットを用いて作用極に-1.2 Vおよび0 V (vs. on-chip Ag/AgCl)を印加し、水素バブルを発生および収縮させた。また、流路の末端に微小針を取り付け、水素バブルの収縮によってサンプルの吸引を行った。デバイスの評価を行ったところ、電位の制御によるマイクロポンプの動作が確認された。吸引速度は印加電位を正にするほど速くなることが確認された。また、デバイスからリード線を取り外しても水素ガスの収縮が確認された。これは、白金黒電極上で水素ガスがデバイス外から流入した酸素により酸化されるものと考えられる。このことは酸素の流入を遮断した場合に水素と酸素の反応による混成電位の上昇が抑えられたことにより確認された。さらに、流路の末端に取り付けた外径180 μm (34G)の無痛針から約500 nLのサンプルを吸引することができた。これは、デバイス内におけるセンシングが可能な量である。近年、ポイントオブケア(POCT)が注目を集めているが、これにはセンサチップを備えた携帯型測定器が必要となる。ここでは被検液や試薬の送液が必要になるが、送液機構の導入が課題となる。この点において、電気化学的原理に基づくポンプは有望である。本研究では、超低侵襲採血を最終的な目標に、電気化学的に水素バブルを生成・消滅させることにより駆動するマイクロポンプを作製した。このマイクロポンプは、白金黒作用極、銀/塩化銀参照極、白金対極からなる3電極系を形成したガラス基板と微小容器・流路構造を形成したポリジメチルシロキサン(PDMS)基板を接合することにより形成した。これらの電極は薄膜パターンとしてリフトオフにより形成した。電極を含む微小容器には0.5 M塩酸を満たし、ポテンショスタットにより作用極に一定電位を印加し、水素ガスを生成および消滅させた。これに伴う微小流路内の圧力変化により内部液を排出し、外部液を吸引した。作用極には壁状構造を形成し、作用極容器中にバブルが充満した場合でも壁底部に表面張力により電解液が残り、水素バブルにより回路が切れないようにした。電位をより負にするほど水素ガスの生成速度が増大することが確認された。逆に、水素バブル生成後、電位をより正にするほど水素バブルの消滅速度が増大することが確認された。流路末端に外径180 μmの無痛針を取り付け、外部液の吸引を試みた。水素バブルの収縮に伴い、約500 nLの外部液の吸引を確認した。また、このマイクロポンプとアンペロメトリックグルコースセンサを集積化したデバイスを作製し、標準液および全血を無痛針を通して吸引後、グルコース濃度を測定する実験を行った。標準液を用いた場合、直線的な検量線が得られた。全血を用いた吸引・濃度測定実験も行ったが、現状では血液分析装置で求めた値と隔たりが大きい。この点については今後改良を加えてゆく。電気化学的原理を利用することにより、単純な構造・原理により、微小針を通して外部溶液を吸引できるところまで確認した。平成27年度は、センサの集積化、全血を用いた評価、マウス等の小動物からの採血へと展開してゆくが、ポンプ自体の試作・評価が最も時間を要するところであり、この意味で計画は概ね順調に進んでいると言って良い。センサ・マイクロマシン平成26年度はポンプの作製と特性評価を行い、微小針を装着して外部液を吸引することもできた。平成27年度はポンプとともにグルコース(血糖)を検出する電気化学センサを集積化し、マウス等の小動物から微小針を通して吸引した全血中のグルコースを検出する実験を試みる。デバイスの試作・評価に必要な資材は平成26年度末までに使用する分については間に合っていた。

保存中に劣化する試薬もあり、繰り越し可能であるため、平成26年度中に無理に購入することはせず、平成27年度、必要になった際に補充することとした。必要になった時点で、デバイスの試作・評価に必要な資材の購入にあてる。
浮腫脳における局所循環動態と粘弾性特性の検討

脳浮腫モデルを作成し浮腫脳における粘弾性特性と脳循環動態の変化を検討した。実験には成猫を用い、浮腫脳および正常部において脳組織圧、脳血流(CBF)、および脳血液量(CBV)を経時的に測定した。また脳室内に留置したカテ-テルから定期的にきわめて少量の髄液をbolusにて注入あるいは排出し頭蓋内の環境圧に変動を与えた時の髄液圧の変化と組織圧の変化を計測し、この比PVIーratio(PPV:Pressure volume index)の変化を観察した。また浮腫作成後、マンニト-ルを静脈内に投与しその作用機序を検討した。浮腫の進行にしたがいCBFは軽度で一過性の低下を示した。CBVは持続的に低下した。浮腫形成終了により浮腫水の供給圧が消失すると、CBF、CBVともに早期に正常化した。PVIーratioは、コントロ-ルでは1.2であったが、浮腫脳では低値(1.0)であった。マンニト-ル投与によりCBF,CBVともに増加を認めたが、浮腫脳では正常脳より常に低い増加率であった。PVIーratioは浮腫脳で低下し、マンニト-ル投与により増加(約1.3)した。脳組織内への水分の貯留そのものはCBFを減少させないが、浮腫水の供給圧の存在は、CBF,CBVに影響を与えることが明らかとなった。マンニト-ルは頭蓋内圧を減少させる際に脳血管床を増加させ、このことが頭追内の圧容積関係の改善に意味を持つと考えられた。PVIーratioは理論的には、頭蓋内全体のコンプライアンスに影響され、髄液圧変化の組織圧変化への反映率を示している。この値は脳組織の病態により変化し組織性状、特にその粘弾性因子が関与していると考えられる。今後、より感度の高いセンサ-を用いれば、組織内の微量の圧環境の変化をとらえることができ、病態の理解や薬剤効果の検討がより詳細に可能になると考えられる。脳浮腫形成過程における脳組織の粘弾性特性および圧伝播性と局所循環動態の変化を検討するために、成猫を用いた実験を行った。カテ-テル型圧力計により脳組織圧を測定し、新たに購入したレ-ザ-ドップラ-血流計により脳血流および脳血液量を計測した。浮腫はbrain infusion法により作成した。浮腫の進展にしたがって脳血流は軽度で一過性の減少を認めたが、浮腫作成終了により速やかに正常化した。すなわち、組織の水分含有量の増加だけでは脳血流の変化は軽度にとどまることが観察された。一方脳血液量は徐々に低下することが認められた。この際、組織圧は上昇し、組織局所の潅流圧は減少すると考えられたが、血液流速の増加により代償性に脳血流は変化が少ないものと考えられた。また、脳室内に一定量の容積負荷を加えたとき、すなわち環境圧変化時の組織圧の変化は、浮腫形成過程を通じて、正常および浮腫脳において有意な相違は認められなかった。本実験では脳浮腫作成過程における局所の循環動態の変化をレ-ザ-ドップラ-血流計により経時的に観察することが可能であった。しかしながら、組織の粘弾性特性および圧伝播性の測定には、本実験で用いたカテ-テル型圧力計では有意な変化を捉えることが困難であった。この目的のためには、より感度の高いセンサ-が必要と考えられ、検討中である。

また、本実験システムにおいて、脳神経外科領域で頻繁に使用される高浸透圧利尿剤マンニト-ルの脳循環に対する効果を検討した。その結果、マンニト-ルは顕蓋内圧を下降させるとともに、脳血液量を増加(脳血管を拡張)させ頭蓋内圧容積関係を改善することが明らかとなった。脳浮腫形成過程における脳組織の特性(粘弾性および圧伝播性)と局所循環動態の変化を検討するために、成猫を用いた実験を行なった。脳組織圧はカテ-テル型脳圧計により計測し、脳血流および脳血液量は、レ-ザ-ドップラ-血流計により行なった。脳浮腫はbrain infusion法により作成した。浮腫の進展にしたがって、脳血流は軽度で一過性の減少を認めたが、浮腫作成後すみやかに正常化した。しかし脳血液量は徐々に低下することが認められた。脳室内に一定量の容積負荷を加えた時・すなわち環境圧変化時の組織圧変化は、正常脳よりも浮腫脳で低値の傾向を示した。また、本実験システムにおいて脳外科領域で頻用される利尿剤マンニト-ルの脳循環および脳圧に対する効果を検討した。その結果、マンニト-ルは頭蓋内圧を下降させると同時に、脳血液量を増加させ(脳血管拡張)、頭蓋内の圧容積関係を改善させることが明らかとなった。この際、環境圧変化時の脳組織圧変化率は上昇し、この値が頭蓋合体のコンプライアンスと組織固有の粘弾性および圧伝播性により影響をうけて変化することが明らかとなった。今回組織の粘弾性特性の測定に用いたカテ-テル型圧力計は、圧応答性は良好であったが、感度の点が充分とはいいがたく、より軽度の変化がとらえられるセンサ-が必要と思われた。今後は、センサ-の改良を含めて実験システム全体を見直し、更にステロイド、虚血保護剤、バルビタ-ル等の脳外科領域で使用される薬剤の作用機序を検討する予定である。
ニュートリノで探究する大統一理論の物理

素粒子の標準模型(SM)には、「何故、ニュートリノの質量は、他のクォーク・レプトンに比べて遥かに小さいのか?」、「何故、陽子と電子の電荷の絶対値は21桁以上の精度で等しいのか?」などの大いなる謎が存在する。これらの謎は、SMの背後の「より根本的な新しい物理(BSM)」の存在を強く示唆する。大統一理論は、陽子と電子の電荷の絶対値が等しいことを数学的に保証するBSMの有力な候補であり、陽子崩壊を予言する。本研究では、ニュートリノ振動などで測定される物理量と陽子崩壊の相関などを理論的に調べ、大統一理論の情報を得ることを目標にする。更に、得られた相関から、観測可能な新たな予言ができないか調べる。
神経細胞のインスリン受容体シグナル:薬物による発現制御と新たな神経保護薬の探索

神経のインスリン受容体シグナルが、神経新生や神経機能の維持・修復、学習・記憶に重要な役割を果たすこと、アルツハイマー病などの神経変性疾患において脳におけるインスリン抵抗性が起こっていることが明らかになってきた。本研究では、臨床で用いられている様々な薬物や生理活性物質、食事中に含まれている成分などが、神経系のインスリン受容体シグナルに及ぼす影響について、詳細な解析を行い、以下(1-4)の研究成果を得た。また、インスリン受容体シグナルに伴う細胞機能の変動の一つとして、電位依存性Naチャネルの機能、細胞膜発現量の変動を解析し、派生的に(5-6)の研究成果を得た。(1)神経保護作用が報告されている薬物や生理活性物質(エストラジオール、クルクミン、ドコサヘキサエン酸、レスヴェラトロールなど)は、インスリン受容体の下流のシグナル分子であるIRS-1/IRS-2の発現増加を介してインスリン受容体シグナルを増強させた。(2)ニコチンの長期処置は、Protein kinese C-α-Extracellular signal- regulated kinaseを順次活性化させ、インスリン受容体の下流のシグナル分子であるIRS-1/IRS-2を増加させる。(3)免疫抑制薬であるサイクロスポリンやFK506は、糖尿病や神経毒性などの副作用を有するが、これらは、カルシニューリン抑制を介して、IRS-2の発現のみを選択的に低下させ、インスリンシグナルを著しく減弱させた。(4)インスリンやリチウムにより、Glycogen synthase kinase-3β(GSK-3β)が抑制されると、インスリン受容体、IRS-1/IRS-2、Aktは、negative-feedback機構により発現が減少する。(5)リチウムは、GSK-3β非依存的にNav1.7電位依存性Naチャネルを抑制する一方で、GSK-3β依依存的に電位依存性Naチャネルの発現を増加させる。(6) Nav1.7電位依存性Naチャネルの活性化は、GSK-3βの活性を抑制し、タウのリン酸化が減少する。以上の研究成果は、英文原著論文5報、英文総説3報、日本語総説1報の合計9編の論文で報告した。本申請テーマで得られた一連の研究成果は、神経系のインスリンシグナル分子群の発現調節機構を明らかにするだけでなく、痴呆や神経変性疾患の発症を未然に防ぐ、あるいは、その進行を遅らせるような、新たな予防法・治療法に関する重要な基礎情報を提供しうるものであり、今後の展開が期待される。1.ニコチンの長期処置は、Protein kinese CαExtracellular signal-regulated kinaseを順次活性化させ、インスリン受容体の下流のシグナル分子であるInsulin receptor substrate (IRS)-1/IRS-2を増加させる。2.インスリンやリチウムにより、Glycogen synthase kinase-3β(GSK-3β)が抑制されると、インスリン受容体、ならびにIRS-1/IRS-2は、negative-feedback機構により発現が減少する。3.免疫抑制薬であるサイクロスポリンやFK506は、カルシニューリン抑制を介して、IRS-2の発現のみを選択的に低下させる。

4.リチウムは、GSK-3β非依存的に電位依存性Naチャネルを抑制する一方で、GSK-3β依存的に電位依存性Naチャネルの発現を増加させる。神経のインスリン受容体シグナルが、神経新生や神経機能の維持・修復、学習・記憶に重要な役割を果たすこと、アルッハイマー病などの神経変性疾患において脳におけるインスリン抵抗性が起こっていることが明らかになつてきた。本研究では、臨床で用いられている様々な薬物や生理活性物質、食事中に含まれている成分などが、神経系のインスリン受容体シグナルに及ぼす影響について、詳細な解析を行い、以下(1-3)の研究成果を得た。また、インスリン受容体シグナルに伴う細胞機能の変働の一つとして、電位依存性Naチャネルの機能、細胞膜発現量の変動を解析し、派生的に4-5の研究成果を得た。1.神経保護作用が報告されている薬物や生理活性物質(ニコチン、エストラジオール、クルクミン、ドコサヘキサエン酸、レスヴェラトロールなど)は、インスリン受容体の下流のシグナル分子であるinsulin receptorsubstrate(IRS)-1/IRS-2の発現増加を介してインスリン受容体シグナルを増強させた。2.免疫抑制薬であるサイクロスポリンやFK506は、糖尿病や神経毒性などの副作用を有するが、これらは、カルシニューリン抑制を介して、IRS-2の発現のみを選択的に低下させ、インスリンシグナルを著しく減弱させた。3..インスリンやリチウムにより、Glycogen synthase kinase-3β(GSK-3β)が抑制されると、インスリン受容体、IRS-1/IRS-2、Aktは、negative-feedback機構により発現が減少する。4.リチウムは、GSK-3β非依存的にNav1.7電位依存性Naチャネルを抑制する一方で、GSK-3β依依存的に電位依存性Naチャネルの発現を増加させる5.Nav1.7電位依存性Naチャネルの活性化は、GSK-3βの活性を抑制し、タウのリン酸化が減少する
光・熱ストレス下での光化学系II D1タンパク質凝集の分子機構の解明

光化学系IIの品質管理に関する3年間の研究成果は以下のように要約できる。(1)光や熱ストレス下では脂質の過酸化と活性酸素の発生が起こり、それが光化学系IIの反応中心結合タンパク質D1の酸化的損傷、凝集および分解の原因の一つとなることが明らかになった。(2)光や熱ストレス下では、光化学系IIでの光化学反応や脂質過酸化の結果生じる活性酸素の発生量を減らし、光化学系IIへの損傷を防ぐために、チラコイド膜がunstackingを含む種々の構造変化を起こすことが分かった。(3)チラコイド膜ではグラナに多く存在する光化学系IIが強光で損傷を受けると、グラナ、恐らくグラナマージン、に存在する金属プロテアーゼのFtsH hexamerの作用によって損傷D1タンパク質が分解されることが明らかとなった。本研究では、ホウレンソウ葉緑体のチラコイド膜を使って、熱ストレス下での脂質過酸化と光化学系II反応中心結合タンパク質D1の酸化的損傷の関係を検討した。その結果、40°C、30分の穏やかな熱処理で、光化学系II周辺で活性酸素分子(一重項酸素分子およびヒドロキシルラジカル)が発生し、それが脂質過酸化を引き起こすこと、また、この脂質過酸化がD1タンパク質の損傷の原因となることを明らかにした。その後、この原因脂質を特定する実験を行っている。さらに、同じくホウレンソウチラコイド膜を用いて光ストレスによって引き起こされるチラコイド膜のunstackingの生理的意義の解析を行ない、unstackingが活性酸素の発生を抑制し、また損傷D1タンパク質の速やかな分析を可能にする重要な役割を果たしていることを明らかにした。本研究では、光合成の光化学系IIの品質管理に関連して、強光ストレスとホウレンソウ葉緑体チラコイド膜のunstackingの関係を調べる実験を行った。予めチラコイドを低濃度のMgCl_2溶液中でインキュベートしてstackさせ1,000μmol photons m^<-2>s^<-1>の強光を照射すると、チラコイド膜が不可逆的にunstackした。チラコイド膜がunstackする原因を調べるために、酸素発生活性、EPR spin trapping法による活性酸素の検出、D1タンパク質の強光による損傷・分解・架橋の測定を行った。その結果、stackedチラコイド(+MgCl_2条件)ではunstackedチラコイド(-MgCl_2条件)に比べて(1)強光照射で酸素発生活性が阻害され易い、(2)強光照射で一重項酸素が発生し易い、(3)強光照射でD1タンパク質が損傷を受け易く、その結果D1タンパク質の分解とアンテナクロロフィル結合タンパク質CP43やD2タンパク質との架橋反応が起こり易い、などの諸点が明らかとなった。以上の結果は、強光照射で起こるチラコイドのunstackingが、強光照射下での一重項酸素の発生を抑制し、その結果、光化学系IIの光損傷、特にD1タンパク質の損傷を抑える効果があることを示している。また、チラコイドのunstackingによって、膜上でのタンパク質複合体の移動が容易となり、損傷D1タンパク質を含む光化学系II複合体とD1を分解するFtsHプロテアーゼの反応が容易になる可能性もある。今回の研究は、in vitroでのunstackingの解析であったが、in vivoで同じ強光照射でチラコイドのunstackingが起きるかどうかを確認する必要がある。そのため、現在、ホウレンソウleaf discを用いた実験系の確立、電子顕微鏡によるチラコイドstacking/unstackingの確認の準備を進めている。これらの研究によって、D1タンパク質の強光による損傷・分解・架橋の過程の背景にある構造的特徴が明確になることが期待される。強光・高温ストレス下での光化学系IIの品質管理機構の解明を目指して、前年度に引き続き研究を行った。今年度は特に光や熱ストレス下で損傷を受けた光化学系II反応中心結合タンパク質D1の分解に関与する金属プロテアーゼFtsHのチラコイド膜での存在場所、存在状態およびプロテアーゼの活性化機構について検討した。FtsHは葉緑体チラコイド膜に単量体から六量体までの形で存在するが、活性のある六量体はグラナ、恐らくグラナ周辺部(グラナマージン)、に比較的多く安定に存在していることが表面活性剤dodecylmaltosideで可溶化したチラコイドのclear native gel電気泳動とWestern解析の結果明らかとなった。また、化学架橋の結果から、FtsHは光化学系IIのLHCIIの周辺に存在することも分かった。

これらの結果から、FtsHは光や熱で損傷を受けた光化学系IIの阻D1タンパク質を速やかに分解するために、光化学系IIが沢山存在するグラナに存在している可能性を示した。次に、FtsHの活性化の可能性について検討した。活性化にはFtsHサブユニットの集合による六量体化が必要であるが、その過程を進める上で幾つかの可能性が示唆された。例えば、光照射による膜電位の形成やチラコイド内腔の酸性化、光照射で生じた活性酸素によるサブユニットの構造変化、光照射で形成されるATPによる構造変化などが考えられた。また、FtsHサブユニットにはAB二種類があることが分かっているが、これらのサブユニットの量比や集合の様式も興味深い問題で、現在研究を進めている。
新規多次元淘汰法によるタンパク質連結構造体形成を可能にするペプチドリガーゼの創製

生化学反応を担う様々なタンパク質を人工的に設計、配置し、生化学反応ネットワークを再構築する技術が期待されている。本研究では、タンパク質やペプチドの分子間連結、固相上への集積化を可能とするペプチドリガーゼを創製する手法を提案し、必要な基盤技術の開発と検証を行った。グラム陽性菌由来のタンパク質転移酵素であるSortaseを用いて無細胞合成タンパク質を固相上に固定化する技術を研究し、無細胞翻訳系とSortase反応系を共存させる際の課題を明らかにし、解決策を議論した。これらの知見は、マイクロアレイ化技術と組み合わせることによりSortase変異体のスクリーニング法開発に資すると期待される。生体内で起こっている高効率・高収率な生化学反応ネットワークを人気的に再構築することはバイオエンジニアリングの重要目標の一つである。その実現のためには生化学反応を担う様々なタンパク質を人工的に設計、配置し生化学反応ネットワークを構築するデバイスへの期待は大きい。しかしながら、タンパク質を、その機能を保ったまま思い通りに配置、集積化する技術は確立されていない。グラム陽性菌由来のタンパク質転移酵素であるSortaseは、あるペプチド配列同士を選択的に連結することから、任意のタンパク質同士の連結や、タンパク質を固相に固定化するためのツールとして用いられている。現在、連結できるペプチド配列は一組しかないが、認識配列の異なるペプチドリガーゼ改変体を複数種開発できれば、複数タンパク質の連結制御や基板上への集積化などのこうどな分子操作が可能になると考えられる。そこで、本研究では、タンパク質やペプチドの分子間連結、固相への集積化を可能とするペプチドリガーゼを創製する手法を提案し、その効果を実証する。本年度は、Sortaseのペプチド基質を融合したタンパク質を無細胞翻訳系で合成し、Sortaseによるペプチド連結反応を利用して、基板上へ無細胞合成タンパク質を固定化する技術の開発を行った。まず、Sortaseのペプチド基質を融合した緑色蛍光タンパク質(GFP)の遺伝子を作成し、無細胞合成した。そのペプチド融合GFPと、別途合成したテトラメチルローダミン(TMR)修飾ペプチドの、Sortaseによる連結反応の確認と改良を行った。連結反応の確認は、反応の経時変化をSDS-PAGEによって追跡し、GFPおよびTMRの蛍光を発する連結体の生成を確認することで行った。また、Sortaseによるタンパク質の基板上固定のために、ペプチド基質を修飾した基板の作製方法の検討も行った。Sortaseによる無細胞合成タンパク質のペプチド連結反応、およびその反応を利用した無細胞合成タンパク質の基板上固定化の検討が当初計画書に沿って進められているため。生体内の高効率・高収率な生化学反応ネットワークを人為的に再構築することはバイオエンジニアリングの重要目標の一つである。その実現のため、生化学反応を担う様々なタンパク質を人工的に設計、配置し生化学反応ネットワークを構築するデバイスが期待されている。しかし、タンパク質を、その機能を保ったまま思い通りに配置、集積化する技術は確立されていない。現在、連結できるペプチド配列は一組しかないが、認識配列の異なるペプチドリガーゼ改変体を複数種開発できれば、複数タンパク質の連結制御や基板上への集積化などの高度な分子操作が可能になると考えられる。昨年度までに、Sortaseによって、無細胞合成したタンパク質がペプチド連結反応の基質となりうることを液相反応において確認している。本年度は、Sortaseによる無細胞合成タンパク質を固相上に固定化する技術の開発を行った。ガラス基板上をシランカップリング剤によってアミノ化し、Fmocでアミノ基を保護したオリゴグリシンペプチド基質をカルボジイミド架橋反応によって修飾し、Fmocを脱保護することにより、オリゴグリシンペプチド基質修飾ガラス基板を作製した。蛍光修飾ペプチド基質とSortaseの混合液をオリゴグリシンペプチド基質修飾ガラス基板上に滴下し反応させることで、蛍光修飾ペプチド基質がガラス基板上に固定化されることが確認でき、Sortaseによるタンパク質固相化に適用できるオリゴグリシン修飾ガラス基板の作製法を確立した。当初計画していたオリゴグリシンペプチド修飾基板の作製法およびペプチドの固相化によるコンセプト実証を達成した。本研究では、タンパク質やペプチドの分子間連結、固相への集積化を可能とするペプチドリガーゼを創製する手法を提案し、その効果を実証する。昨年度までに、ペプチドリガーゼSortaseによるタンパク質固相化に適用できるオリゴグリシン修飾ガラス基板の作製法を確立した。本年度は、タンパク質の無細胞合成反応と、無細胞合成されたタンパク質の基板上固定化反応のカップリング技術を開発した。小麦胚芽由来無細胞翻訳系にSortaseを添加することにより、緑色蛍光タンパク質(GFP)の無細胞合成と、無細胞合成されたGFPにペプチド基質を付加するSortase反応が1液中で進行することを確認した。しかし、その連結効率はSortaseの至適反応条件と比べ10倍以上低かった。これは、小麦胚芽由来無細胞翻訳系に添加されているEGTAがSortase反応に必須のカルシウムイオンをキレートするためと考えられた。次に、無細胞合成とSortase反応のカップリングによる無細胞合成タンパク質の固相上固定化反応を試行した。その際、無細胞合成するタンパク質としてリン酸化酵素を用い、固相上に固定化された酵素の活性を観測し、固相化の有無を判断した。

また、連結効率向上のため、Sortaseおよびそのペプチド基質を酵素に融合させるとともに、EGTAが添加されていない無細胞翻訳系であるPUREsystemを用いた。オリゴグリシンを修飾した固相担体存在下でSortase/ペプチド基質融合酵素を無細胞合成した後、固相担体上の酵素活性を観測したところ有意に触媒活性を示し、タンパク質の無細胞合成とSortaseによる固相化が為されたことを確認した。これらの知見を無細胞合成タンパク質のマイクロアレイ化に発展させることで、連結活性の向上や認識ペプチド配列の改変を指標にしたSortase変異体のスクリーニング技術の開発に繋がるものと考えられる。生化学反応を担う様々なタンパク質を人工的に設計、配置し、生化学反応ネットワークを再構築する技術が期待されている。本研究では、タンパク質やペプチドの分子間連結、固相上への集積化を可能とするペプチドリガーゼを創製する手法を提案し、必要な基盤技術の開発と検証を行った。グラム陽性菌由来のタンパク質転移酵素であるSortaseを用いて無細胞合成タンパク質を固相上に固定化する技術を研究し、無細胞翻訳系とSortase反応系を共存させる際の課題を明らかにし、解決策を議論した。これらの知見は、マイクロアレイ化技術と組み合わせることによりSortase変異体のスクリーニング法開発に資すると期待される。Sortaseによる無細胞合成タンパク質のペプチド連結反応および基板上への固相化反応の効率向上に努めるとともに、Sortase改変体の淘汰方法の検討を進める。Sortaseによる無細胞合成タンパク質の基板上への固相化反応の検討を進めるとともに、Sortase改変体の淘汰方法についても検討を進める。ナノバイオテクノロジー