hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膵星細胞の立体培養法確立応用による膵がん難治性の要因解明

手術適応のない進行性膵がんでは抗腫瘍剤が主な治療法だが、平均予後が6か月未満と特に短く、投与薬剤が十分有効には奏功していないと考えられる。最近ナノ薬剤であるアルブミンパクリタキセル(アブラキサン)が予後延長を示し臨床認可されたが、どのような患者では奏功しにくいのかまだ十分には明らかではない。この現状を踏まえ、本研究では、抗腫瘍薬剤の奏功程度を左右する原因を薬剤送達経路としての腫瘍細胞以外の腫瘍組織構築因子すなわち腫瘍間質に求め、ヒト膵癌間質由来の膵星細胞(pancreatic stellate cell; PSC)を用いた新規三次元培養系の構築を通じて、仮説の実証を進めることを目的とする。本年度は、特許出願した新規三次元培養法を用い、ヒト膵癌で典型的にみられる間質組織の厚みを複数PSCで再現することに成功したが、昨年度に行ったこれらの三次元組織の分子生物学的解析では、三次元培養によるPSCの多層化に伴いコラーゲン分泌などがむしろ減少することが再現良く示された。ただし、追加で行った初期的な検討では膵がん細胞との共培養系において、三次元培養したときにのみPSCのコラーゲン分泌が増加する場合も存在することがわかった。以上のことは、まず膵癌の間質組織を三次元培養法によってモデル化するにあたり、膵がん患者間質組織由来PSCのみを用いるのでは十分に病態を反映しきれない可能性を示唆している。また、三次元培養時にPSCの腫瘍由来液性因子に対する応答性が平面培養時とは変化することから、PSCの活性化機序に関してこれまで得られてきた知見が不十分である可能性を意味するように思われた。本研究の目的は、膵がんの治療効果はここ30年来ほとんど改善しておらず、とくに手術適応のない進行性膵がんでは抗腫瘍剤が主な治療法だが、平均予後が6か月未満と特に短く、投与薬剤が十分有効には奏功していないと考えられることのメカニズムを、新規実験系の構築を通じて解析することである。この現状を踏まえ、本研究では、抗腫瘍薬剤の奏功程度を左右する原因を薬剤送達経路としての腫瘍細胞以外の腫瘍組織構築因子すなわち腫瘍間質に求め、PSCを用いた新規三次元培養系の構築を通じて、仮説の実証を進めることを、目的としている。これにたいして、おおむね順調な進展があった。膵がんの五年生存率は1割前後であり30年来改善していない。とりわけ手術適応のない進行性膵がんでは、抗腫瘍剤が主な治療法となるものの予後は6か月未満と特に短い。すなわち投与薬剤が有効に奏功していないことが考えられる。このように抗腫瘍薬剤の奏功程度が低い原因を腫瘍細胞以外の腫瘍組織構築因子に求める視点から、本研究では、ヒト膵癌由来細胞を用いた新規三次元培養系の構築を通じて、薬剤送達経路である1)腫瘍血管と2)腫瘍線維組織に求める仮説の実証を進めてきた。平成29年度には、膵がんにおいて腫瘍血管周囲に存在する壁細胞に着目した実験モデルを作成し、これら壁細胞が血管構造を安定化することを通じて腫瘍内への薬物の送達を阻害することを報告した。また、膵がんにおける線維組織は膵星細胞(pancreatic stellate cell; PSC)により構成されるため、PSCは膵がんにおける薬剤送達へ関与することが考えられる。しかし、このような申請者の研究視点からPSCの関与を探る研究はこれまでなかった。
古代都城における宅地内建物配置の規格性の研究

古代都城のうち、発掘調査がもっとも進展している平城京について、報告書・概報等により公表されている遺構データを、数値情報および遺構平面図の形で、条坊ごとに収集・整理した。この基礎データに基づく条坊復元と宅地内建物配置の本格的解析は、次年度以降に実施する予定である。上記の基本作業と並行して、本年度は、とくに柱位置の決定に際して方眼を利用したと考えられるものを抽出し、方眼設定の状況と、その時期的な変化について分析を行った。対象としたのは、平城京左京三条二坊の長屋王邸、平城宮第II期内裏、平城宮中央区大極殿地域第II期(西宮)である。これらは、いずれも一辺長がほぼ10尺の方眼を用いており、かつ区画全体の東西長が10尺の偶数倍となる関係から、中軸線上に柱がくるのを避けるために、方眼の交点をずらす工夫がなされている。しかし、三者を比較すると、その処理方法には明確な相違があり、奈良時代の中での技法上の進歩をたどることができる。まず奈良時代初頭に位置づけられる長屋王邸では、機械的な10尺方眼を設定しているが、正殿の桁行総長を80尺(8方眼)とし、両端の柱間のみ15尺(1.5方眼)にとる。これは、ほぼ同時期の平城宮第I期内裏正殿にも認められる、原初的な手法である。次に、奈良時代前半中頃の平城宮第II期内裏では、南北630尺、東西600尺の区画内部を、南北は63方眼、東西は59方眼に分ける。このため、柱間は等間となったが、方眼の一辺長は、南北10尺に対し、東西は10.169尺と異なることになり、部材寸法の統一性という点で問題を残した。これを解消したのが、奈良時代後半の平城宮西宮である。ここでは、築地回廊内側柱間576尺を57方眼、南北303尺を30方眼に分割して、方眼の一辺長を東西10.105尺、南北10.100尺と、事実上一致させることに成功したのである。
彩色材と和紙からなる紙質文化財における和紙の劣化機構

紙質文化財の劣化を促進する要因のひとつに、顔料等に由来する金属イオンの影響がある。顔料を塗布し加速劣化させた和紙のモデル試料を作製し、紙中のセルロース及びヘミセルロースの金属イオンの影響による劣化反応の進行部位を検討することにより、紙の劣化機構の一端を明らかにするとともに、よりよい保存処置や修復および保存環境を検討することを目的とする緑青顔料は、粒度によって色味が異なり、文化財資料に用いられている緑青顔料の粒度も様々である。緑青中の銅成分は、緑青焼けの主要因とされているが、その粒度が小さいほど顔料の表面積が大きくなることから、銅成分の安定性に影響を与えることが考えられる。粒度の異なる緑青顔料中の顔料膠溶液中の銅イオン含有量を測定し、その安定性を検討した。顔料の膠水溶液中においては、いずれの顔料においても、銅イオンが検出され、特に粒度の最も小さい白緑顔料では、銅イオン量が最も多かった。緑青顔料の粒度により銅成分の安定性が異なっていたことから、和紙に粒度の異なる緑青顔料を塗布し、湿熱加速劣化処理により緑青焼けの劣化を再現した。これらの紙試料における、セルロース分子量を測定し、劣化の評価を行った。劣化前の対照試料の楮紙では、M(分子量)= 2.0×106にピークトップをもつ分子量分布を示す。湿熱劣化後、分子量分布は全体的に低分子側にシフトした。緑青焼けのみられる緑青9番塗布の楮紙試料では、さらに楮紙のみよりも分子量が低下し、粒度の最も小さい白緑顔料塗布の試料は、セルロースの分子量低下が最も大きかった。これらの結果から、緑青顔料の水溶性銅イオン量は、粒度に依存し、緑青焼けの促進にも影響を及ぼす可能性が示唆された。28年度が最終年度であるため、記入しない。彩色材および和紙からなる紙質文化財について、よりよい保存方法(保存処置、修復、保存環境)が望まれている。本研究では、顔料が和紙の劣化に与える影響を明らかにし、1)劣化機構の解明、2)修復現場への適用を目的とする。第1年度目は、上記1)について、研究計画の通り、各種加速劣化試料(3種の和紙、2種の金属イオン処理、3種の加速劣化)の半分を作製し、分析、評価の一部を行った。これらの結果のうち、Fe^<2+>を含む楮紙(那須楮、機械漉き)の湿熱および紫外線照射による劣化挙動をGPC-MALLS-蛍光ラベリング測定の結果より比較検討した。湿熱劣化と紫外線劣化では、いずれも紙のセルロースの分子量分布は形状変化を伴いながら低分子側にシフトした。分子量が同程度に劣化した2種の加速劣化試料において、紫外線劣化のほうが湿熱劣化よりも低分子領域が大きく広がった分布を示した。また、紫外線劣化試料では酸化反応により生成したカルボニル基が多いことが示された。鉄イオンおよび酸処理を施した楮紙試料では、分子量及び分子量分布の経時変化から、紫外線劣化より湿熱劣化では低PHおよびFeイオンの影響が大きいことが示された。2種の加速劣化による影響を比較すると、紫外線劣化した楮紙は、酸化反応が進行しやすく、湿熱劣化では、Feイオンおよび低pHが分子量低下に及ぼす影響が大きいことが示された。一方、2)の修復現場への適用については、実際の室町時代の資料で、緑青焼けの現象がみられる絹本資料の調査を行う機会が得られ、修復工程に用いた吸取り紙の分析を行った。本紙、裏打ち紙、および修復過程で用いる吸取り紙について、元素分析を行った結果、これらの箇所では、肌裏紙、総裏紙、吸取り紙の全てから銅が検出され、本紙の顔料由来の銅の移動が示唆された。日本の文化財紙資料においては、和紙からなる書物や絵画などが現存し、劣化が進行しているものもある。本研究では、和紙の劣化機構を明らかにすることを目的とする。紙の主成分であるセルロースの劣化を検討するうえで、セルロースの分子量の低下および分子量分布の変化は劣化の重要な指標となる。一方、和紙は古くから用いられ多くの種類がある。時代や資料の種類により、様々な和紙が用いられてきた。今年度前半は、原料の異なる和紙として、主要な楮、雁皮、三椏紙および竹紙について、セルロースの分子量分布をGPC(Gel Permeation Chromatography)により測定し、分子量情報の特徴を明らかにした。和紙の主成分セルロースのピークトップはlogM=6.2付近であり、対照試料のろ紙よりも分子量が高い。また、楮紙の分子量分布はほぼ1山であるのに対し、雁皮紙、三極紙、竹紙は2山である。低分子側のピークは、第二成分であるヘミセルロースに由来すると考えられる。各種和紙の分子量分布は大きく異なっていた。次に、楮紙および雁皮紙について、湿熱による加速劣化処理を行った。劣化時間の経過に伴い、ピークトップの低分子化およびピーク形状のブロード化が進行した。さらに、雁皮紙では、高分子側のセルロースのピークが、楮紙のそれと比較すると、低分子化の速度が緩やかであった。雁皮紙は、楮紙にはほぼ含まれないヘミセルロース成分が多く含まれており、低分子側のヘミセルロースに由来するピークも低分子側にシフトしていく。直鎖で高分子量のセルロースに比較し、ヘミセルロースは側鎖をもち低分子量である。

劣化因子とのアクセシビリティーはヘミセルロースのほうが高いことから、雁皮紙では、ヘミセルロースの劣化が先行し、セルロース成分の劣化を遅らせる結果となっていることが示唆された。前年度には、緑青顔料により劣化した実資料、絹本曼荼羅図の状態の調査を始め、本年度は、引き続き、本資料の裏打紙の劣化状態の詳細な分析を行った。絹本作品の本紙では、緑色部分の裏面が褐色に変色する「緑青焼け」の現象が、肉眼観察でも顕著にみられた。最初に、これらの箇所では、元素分析により銅(Cu)が検出され、本紙には緑青あるいは銅含有彩色材が使用されていることを確認した。次に、修理工程にあった本資料では、取り外した旧裏打紙を修復工房よりご提供いただき、これを分析に供した。「緑青焼け」の現象は、該当箇所において裏打紙第一層目の「肌裏紙」および第二層目の「総裏紙」にも及んでいる。総裏紙では、「緑青焼け」の箇所で、より暗い褐色への変色を色測定により確認した。さらに、紙中のセルロース分子量については、肌裏紙、総裏紙ともに、「緑青焼け」の箇所では無着色部分に比較し1/2程度に分子量が低下していることがわかった。これら2種の裏打紙、および水洗浄時に用いた吸取り紙の元素分析を行った結果、「緑青焼け」の影響がみられる部分の裏打紙中において、Cuの検出量は、肌裏紙>総裏紙>吸取紙であることから、Cuは本紙表面より肌裏紙、総裏紙と裏面の方向に拡散し、洗浄の際には吸取紙へも移動したことが示唆された。後者は、Cu成分の一部が水溶性であることを示している。顔料に由来するCuは、肌裏紙、総裏紙にも移動し、これらが、裏打紙の分子量低下をも促進していることが示唆され、絹本絵画の修復における、裏打紙の交換工程の有効性を裏付ける根拠の一部が示された。以上の実資料の調査のまとめと共に、新たな展開として、緑青焼けの洗浄についての研究を進めるため、現在、加速劣化により緑青焼けの再現試料を作製し、検討を始めている。初年度には、顔料などに由来する遷移金属イオンとして、銅イオン、および鉄イオンの影響、また紙資料の環境による金属イオンの影響、和紙の種類に及ぼす金属イオンの影響について調査し、結果をまとめた。その後、銅イオンの影響として実例が数多くみられ、よく知られている緑青焼けの劣化現象の調査に研究を絞った。ここで、修理途中の緑青焼けが顕著にみられる実資料の調査をさせて頂く機会に恵まれ、修理工程で取り外した裏打紙を、分析試料にご提供頂き、いくつかの分析ができたことから、緑青焼けの銅イオンによる影響について、銅イオンの移動、および緑青焼けによる紙のセルロース分子量の低下を中心に成果をまとめた。当初の計画では、劣化の調査のみならず、修理・修復の現場における処置工程に活かせる処置方法の開発に着手することを考えていた。当初は、一部において、具体的な計画ではなかったが、上記の緑青焼け実資料および裏打紙の調査の成果より、銅イオンの移動の様子が明らかとなったことから、緑青焼けの処置工程について、検討項目が具体化できた。現在、これに向けて、新たに緑青顔料を和紙(楮紙)に塗布した試料を作製し、加速劣化処理を行っている。1カ月2カ月程度の加速劣化処理により、緑青焼けを再現する試料ができることを確認した。現在、処置検討用の模擬「緑青焼け」試料を作製しているところである。作製できたものから、処置を施し、これを分析に供する予定であり、採用終了までには、データが揃い、結果が得られる予定である。
有孔虫化石の群集解析によるペルム系・三畳系石灰岩の起源と搬入・定置過程

日本のペルム紀から白亜紀前期付加体中の石灰岩ブロックは多種多様なペルム紀-三畳紀有孔虫化石を産し、パンサラッサ起源の海山のプレート運動や東アジアの中・古生代テクトニクスや古生物地理の考察に制約条件を与える。環太平洋の中・古生代有孔虫化石研究の最適地である日本の各地帯で、調査地域をしぼり、石灰岩ブロックごとにそれらの産状・岩石学的特徴・化石群集を把握し、有孔虫化石の生層序分布や群集組成と石灰岩相との関係を明らかにした。また、これまでの筆者の未公表資料や海外の文献調査結果を追加し、分類群の系統関係・時空分布・特徴種や群集組成の相違を検討し、多くの関連分野の文献情報を考慮に入れ、古生代後期有孔虫古生物地理や石灰岩や含石灰岩層の形成場とその後の造構過程を議論した。本課題研究の最終的な結論に至るまではさらに時と情報を要するが、本研究課題を筆者が長年取り組んできた一連の研究の延長上に位置づけ、精力的に推進した結果、公表論文18編と多くの新知見が得られた。沖縄本島の本部半島から北端の辺戸岬に至る秩父帯石灰岩分布域で、新たに三畳紀有孔虫化石を2地点から検出した。従来無化石だがペルム系とされていた巨大石灰岩はすべて外来性のブロックであり、野外ではほとんど無化石にみえる三宝山帯の石灰岩に岩相が酷似すること、産出は稀であるが三畳紀有孔虫化石が得られたことから、それらの大半は三畳系になる可能性が高い。それらは岩相の多様性に富んでいて、今後の化石産地の追加と化石群集組成の解明が待たれ、本研究課題の遂行、とりわけ古生代後期から中生代前期のパンサラッサにおける有孔虫古生物地理を考察する上で重要である。舞鶴帯では、兵庫県西部、龍野-相生地域のペルム系-三畳系の層序を改訂し、上部ペルム系龍野層と中部三畳系平木層を再定義し、アニシアン前期の有孔虫化石群集の組成と年代を議論した、この群集は既知の黒瀬川帯の群集よりも古く、属種の多様性に乏しい。一方、日本の三畳紀の群集はテーチス海域のものと非常によく似ていて、地域性に富んだペルム紀の群集とは対照的である。その成果はKobayashi(2008)にまとめられている。兵庫県の下部白亜系篠山層群下部層の礫岩層に含まれている石灰岩礫と結晶片岩礫を詳しく研究した。有孔虫化石群集から石灰岩礫はすべて秋吉帯の石灰岩に由来し(Kobayashi and Adachi,2007,Nature and Human Activitiesに掲載)、泥質片岩礫の白雲母は2.7億年のK-Ar年代を示す(測定に19年度科研費使用、地質学雑誌に投稿中)ことが判明した。これらの新知見から篠山層群堆積時の後背地の地質は現在のものとは大きく異なっていたと考えられ、日本の先白亜系ナップ構造の形成過程の議論に無視できない制約条件を与えることになる。これらのほか、トルコ共和国タウルス山地の石炭紀後期とペルム紀前期の有孔虫化石の群集解析の結果は地中海西アジア地域の古生物地理の復元に大きく貢献し、"Greater Indea Concept"に一石を投ずるものでもある(Kobayashi and Altiner,2008)。赤坂石灰岩では、有孔虫化石の全貌がほぼ解明し、一連の論文投稿の準備に入っている。(1)下部白亜系篠山層群下部層の石灰岩礫中、ならびに兵庫県下の上部白亜系火山砕屑岩類に介在する岩屑堆積層に含まれる石灰岩礫中の有孔虫化石の年代分布と群集組成を明らかにした。その結果、石灰岩礫のほとんどすべては現在の含礫層分布域から50150km離れた秋吉テレーンと舞鶴テレーンに由来することが判明した。これら白亜系陸成層は丹波帯・超丹波帯の付加体を不整合に被うが、明確に両帯に由来すると考えられる岩片は見出されなかった。

西南日本内帯の先白亜紀付加体は褶曲波面がほとんど水平なナップ構造をつくっていることから、秋吉・舞鶴テレーンは白亜紀には現在の分布域よりもはるかに南側に張り出していたと推定され(Kobayashi,2008,2編)、その後の浸食により現在ではクリッペとして残存するという見解(小林,1996)を指示する。篠山層群下部層から新たに見出された2.7億年前の結晶片岩礫(小林・後藤,2008)からも同様なことがいえ、篠山層群下部層堆積時の後背地の地質や西南日本基盤岩類の構造発達史の考察に重要である。(2)南部北上テレーン、気仙沼地方の中部ペルム系上八瀬層と細尾層の岩相層序とフズリナ化石の研究から従来の南部北上ペルム系生層序と対比論は一部、大改定を要することが明らかになった。堆積場や堆積過程についても新たな解釈を示した(椎野ほか,2008; Kobayashi et al., Paleontological Research印刷中)。(3)ジュネーブ大学のRossana MartiniとJerome Chablaisとの共同研究で、関東山地南部の数地域で御前山層(ジュラ紀後期白亜紀前期付加体)の巨大石灰岩ブロックの地質調査と高精度サンプリングを行った。ヨーロッパ各地の三畳紀石灰岩の多様な石灰岩相と有孔虫化石群に詳しいスイス人との野外調査研究の経験は他の日本の三畳紀石灰岩の調査研究にも活用されると考えられ、非常に有益であった。室内作業は現在進行中であり、得られた知見を連名でヨーロッパの国際誌に投稿する予定である。(4)イタリアドロミテ地方のペルムー三畳系境界層やジュラ山地のジュラ系石灰岩の詳細路頭観察は堆積過程や起源を異にした同時代の日本の石灰岩研究に大いに役立つ。関連分野の諸問題の究明にも有効であると想定されることから、地質学雑誌口絵に前者の重要路頭とそのもつ地質学的意義の概要を紹介した(Kobayashi & Martini,地質学雑誌印刷中)。(5)トルコ、タウルス山地の石炭紀とペルム紀の有孔虫群集組成を明らかにし、それらの年代と対比をグローバルに論じた。得られた成果は石炭紀ペルム紀の汎世界的な海水準変動と連動した生物多様性の変遷過程、ならびにテーチス西域と東域の古生物地理の研究進展に貢献する(Kobayashi & Altiner, 2008)。*ペルム紀化石、特にフズリナ化石の産出で汎世界的に有名な岐阜県大垣市赤坂石灰岩のフズリナ類を体系化したモノゲラフを取りまとめ、Review de Paleobiology誌に投稿、現在審査を受けている。詳しい野外地質調査と石灰岩岩石薄片約4,000枚をもとにした労作であり、大幅な修正が求められなければ、印刷ページは150くらいになると思われる。このモノグラフは交付申請書に掲げられている5つのキーワードを含み、環太平洋ジュラ紀付加体の石灰岩ブロックの起源・搬入・定置過程の考察に直結し、その研究進展に寄与するところが大きい。*秋吉石灰岩ならびにその周縁相(常森層、別府層群)のフズリナの野外調査資料や岩石薄片はこの3年間にさらに山積し、近い将来、これらに関する総括的な研究成果を公表する目処がついた。また、これまで三畳系美祢層群に含められていた基底部の石灰岩礫岩や石灰岩ブロックはペルム系常森層に属することが判明し、砕屑粒子の組成から秋吉石灰岩周辺のペルム系砕屑岩相と三畳系の堆積環境の相違がこれまで以上に鮮明になった。*南部北上テレーンのペルム系上八瀬層のペルム紀有孔虫化石の研究成果を公表した。フズリナ化石層序・年代・対比などで多くの新知見が得られた。南部北上テレーンの構造発達史を再構築するため、模式地の下部ペルム系坂本沢層と中部ペルム系叶倉層の層位関係の再検討が望まれる。*愛媛県の三畳系田穂石灰岩の三畳紀中期洞窟堆積物、板取川の石炭系石灰岩ブロック、上川の遠洋性白亜系石灰岩ブロックの再調査を行った。*平成19年度の沖縄本島に続き、奄美大島の秩父帯と四万十帯の石灰岩ブロックの調査とサンプリングを行った。奄美大島では、期待している三畳系石灰岩ブロックの発見には至っていない。四万十帯の石灰岩ブロックの年代は明らかにできなかった。
新しいカルシウムシグナリングに関する分子細胞薬理学的研究

カルシウム結合蛋白質は、細胞内セカンドメッセンジャーであるカルシウムイオンの作用分子として様々な役割を果たしていることは周知の事実である。これらの細胞内情報が、遺伝子発現機構にも関与することから、各疾患における役割について注目され、その機能など新たに見直されている。しかしながら、我々が発見した新しいカルシウム結合蛋白質S100Cについては、各疾患との関連性については報告されていない。我々は、S100CのcDNAクローニングに成功し、その一次構造を明らかにしている。そこで我々は、S100Cの生理的、薬理的および病態的役割について詳細に検討した。β-ブロッカーであるプロプラノロールは、多くの心疾患の治療に用いられており、その心筋保護作用が認められるもののそのメカニズムは不明な点が多い。そこで我々は、プロプラノロールの新しい作用分子としてS100Cを見い出した。また、プロプラノロールのS100Cに対する親和性は、プロプラノロールに結合すると報告されているカルモデュリンやトロポニンCに比らべ高く、プロプラノロールが心筋保護作用を発現する濃度にほぼ等しいことが明らかとなった。これらのことから、プロプラノロールの心筋保護作用においてS100Cの関与が強く示唆された。さらに我々は、ラット心筋梗塞後の心不全時においてS100Cの遺伝子発現が変化するという新たな知見を得ている。すなわち、S100Cが心疾患の病態において重要な働きを示唆するものである。また我々は、同じS100ファミリーに属するS100Lが、好酸球の新しい走化性因子であることを明らかにした。すなわち、S100Lで気管支喘息のモデル動物として広く使用されているモルモットの好酸球を刺激したところ、S100Lは強い走化活性を持つことが示された。すなわち、好酸球の新しい走化性因子として我々が再発見したS100Lは、気管支喘息やアレルギーの病態に重要な役割を果たす可能性が示唆された。また、共同研究者であるC.W.Heizmannらは、癌細胞でS100Lの遺伝子発現が変化する知見を得ている。さらに我々は、S100Cの細胞周期依存性発現変化を見い出しており、S100Cの癌細胞における遺伝子発現変化が十分予想される。すなわち、S100CおよびS100Lが種々の病態において何等かの重要な役割を果たしていることが考えられ、今後その詳細な検討をする予定である。そこで我々は、S100Cの生理的、薬理的および病態的役割りについて詳細に検討した。

β-ブロッカーであるプロプラノロールは、多くの心疾患の治療に用いられており、その心筋保護作用が認められるもののそのメカニズムは不明な点が多い。そこで我々は、プロプラノロールの新しい作用分子としてS100Cを見い出した。また、プロプラノロールのS100Cに対する親和性は、他のカルシウム結合蛋白質よりも高く、プロプラノロールに結合すると報告されているカルモデュリンやトロポニンCに比らべ低く、プロプラノロールが心筋保護作用を発現する濃度にほぼ等しいことが明らかとなった。これらのことから、プロプラノロールの心筋保護作用においてS100Cの関与が強く示唆された。さらに我々は、ラット心筋梗塞後の心不全時においてS100Cの遺伝子発現が変化するという新たな知見を得ている。すなわち、S100Cが心疾患の病態において重要な働きを示唆するものである。また我々は、同じS100ファミリーに属するS100Lが、好酸球の新しい走化性因子であることを明らかにした。すなわち、S100Lで気管支喘息のモデル動物として広く使用されているモルモットの好酸球を刺激したところ、S100Lは強い走化活性を持つことが示された。すなわち、好酸球の新しい走化性因子として我々が再発見したS100Lは、気管支喘息やアレルギーの病態に重要な役割を果たす可能性が示唆された。また、共同研究者であるC.W.Heizmannらは、癌細胞でS100Lの遺伝子発現が変化する知見を得ている。さらに我々は、S100Cの細胞同期依存性発現変化を見い出しており、S100Cの癌細胞における遺伝子発現変化が十分予想される。すなわち、S100CおよびS100Lが種々の病態において何等かの重要な役割を果たしていることが考えられ、今後その詳細な検討をする予定である。
細胞密度依存的な遺伝子発現とヒストン修飾

本研究では、細胞密度依存的にヒストン修飾のレベルが変化することに着目し、細胞密度依存的なエピジェネティクス制御と遺伝子発現調節の解明を目標とした。これまで作製したヒストン修飾抗体を用いて、細胞密度依存的な変化を調べたところ、培地中にヒストンアセチル化を上昇させる物質があることが分かった。特にこれは3時間以内で起こる、比較的早い反応であった。一方で、メチル化修飾では短時間では変化がみられず、24時間以上の培養によって減少した。つまりアセチル化とメチル化ではその制御が異なることが示唆された。さらに、これらヒストン修飾を変化させる物質のひとつに乳酸が挙げられることが分かった。エピジェネティクスは、後天的遺伝情報とも呼ばれ、分化・老化・癌化など様々な生命現象に深く関わる。ヒストン修飾はその一端を担い、遺伝子の発現調節に大きな影響を及ぼすことが分かっている。本研究では、細胞密度依存的にヒストン修飾のレベルが変化することに着目し、細胞密度依存的なエピジェネティクス制御と遺伝子発現調節の解明を目指す。予備的実験から、細胞密度を通常の培養条件よりも1030分の1にすると、ヒストンH3K9ジメチルおよびトリメチル修飾が上昇することが分かっていた。そこで平成25年度では、様々なヒストン修飾のレベルを低密度細胞と通常の細胞密度の場合とで比較した。その結果、他のヒストンH3メチル化修飾(K4トリメチルやK27トリメチル、K36トリメチル)などでも、低密度培養の細胞のほうが高いレベルを示すことが分かった。一方、アセチル化のレベルは、低密度修飾で減少することが分かった。そこで次に、免疫染色での染色効率による懸念を考慮し、通常よりも10倍以上の高密度で一日以上培養した細胞の培地上清を、低密度培養の細胞に加え、ヒストン修飾がどのように変化するのかを調べた。その結果、試みたすべてのヒストンアセチル化は上昇し、またヒストンメチル化は減少した。したがって、この現象は、細胞密度による培地からの影響によるものであると考えることができる。そこで高細胞密度から培養したときの培養上清を50、30、10、3 kDaのサイズで分画し、どの画分にヒストン修飾を変化させるものがあるのかを調べた。その結果、アセチル化およびメチル化ともに、3 kDa以下の画分に寄るものであることがわかった。また細胞周期との関わりを調べたところ、培養上清の添加は、特定の細胞周期における修飾レベルを変化させているというよりは、全体のレベルを変えていることが分かった。エピジェネティクスは、後天的遺伝情報とも呼ばれ、細胞周期・分化・癌化など様々な生命現象に深く関わる。ヒストン修飾はDNAメチル化と共にエピジェネティクス形成に関わり、遺伝子の発現調節に大きな影響を及ぼす。本研究では、細胞密度依存的にヒストン修飾のレベルが変化することに着目し、細胞密度依存的なエピジェネティクス制御と遺伝子発現調節の解明を目標とする。昨年度までに、細胞密度を通常の培養条件よりも1030分の1にすると、様々なヒストンH3メチル化修飾(K4、K9、K27、K36などのトリメチル)などで、低密度で培養した細胞のほうが高いメチル化レベルを示すことが分かった。一方、アセチル化修飾は、低密度培養では低下することが分かった。また、このヒストン修飾の変化は、細胞接触などによるものというよりは培養培地の影響によるものであることも突き止めた。そこで本年度では、高細胞密度から培養したときの培養上清を50、30、10、3 kDaのサイズで分画し、どの画分にヒストン修飾を変化させるものがあるのかを調べた。面白いことに、アセチル化では数時間の処理で変化が見られたものの、メチル化では丸一日処理をしないと変化が見られないことも分かった。そこで高密度培養で分泌する低分子量物質として探索したところ、乳酸が考えられた。そこで、乳酸を培地に加えて数時間経ったところで細胞を回収しヒストン修飾の変化を確かめたところ、試したすべてのアセチル化が上昇することが分かった。乳酸には、脱アセチル化酵素阻害剤として働くことが報告されており、これが濃度依存的なヒストン修飾の変化を導く一因であろうことが考えられた。一方で、メチル化の変化は短時間では見られないことから、メチル化修飾の変化にはさらに別の機構が関わると考えた。ヒストン修飾は、DNAメチル化と共にエピジェネティクス形成に重要であり、遺伝子の発現調節に大きな影響を及ぼすことが分かっている。昨年度までに、細胞密度を通常の培養条件よりも1030分の1にすると、様々なヒストンH3メチル化修飾(K4、K9、K27、K36などのトリメチル)などで、低密度培養の細胞のほうが高いレベルを示すことが分かった。一方、アセチル化修飾は、低密度培養で減少することをつきとめた。またこの現象は、細胞密度による培地からの影響によるものであり、主に細胞の代謝産物である乳酸によるものであることを突き止めた。本年度では、乳酸によるヒストン修飾への影響に着目した。アセチル化は、乳酸濃度依存的に少なくとも3時間以内には大きく上昇することが分かった。

一方で、メチル化の変化は短時間では見られないが、24時間以上の培養によってメチル化修飾も減少することを確かめた。したがって、高密度細胞培養では、代謝産物である乳酸の濃度が上昇するによって、ヒストン修飾が変化すると考えられる。並行して、細胞密度の異なる細胞集団を回収し、それぞれChIP-seqを行った。その結果、低密度培養では、ヒストンH3K9トリメチル化修飾は、テロメア周辺のメチル化が上昇する一方で、ヒストンH4K16アセチル化修飾は、遺伝子の転写開始点を中心に減少することを確認した。本研究では、細胞密度依存的にヒストン修飾のレベルが変化することに着目し、細胞密度依存的なエピジェネティクス制御と遺伝子発現調節の解明を目標とした。これまで作製したヒストン修飾抗体を用いて、細胞密度依存的な変化を調べたところ、培地中にヒストンアセチル化を上昇させる物質があることが分かった。特にこれは3時間以内で起こる、比較的早い反応であった。一方で、メチル化修飾では短時間では変化がみられず、24時間以上の培養によって減少した。つまりアセチル化とメチル化ではその制御が異なることが示唆された。さらに、これらヒストン修飾を変化させる物質のひとつに乳酸が挙げられることが分かった。これまでのところ、順調に計画を遂行している。平成26年度の研究により、細胞密度依存的な変化をもたらす因子のひとつとして、乳酸が考えられることが分かった。乳酸は脱アセチル化阻害剤として働くことから、そのメカニズムとしてアセチル化の急な上昇の原因とも一致することが分かった。細胞生物学今後は、培養条件の違いが生じるヒストンメチル化の変化を焦点にあて、どのような制御機構があるのかを明らかにしたい。また乳酸がどの程度ヒストン修飾を変化させるのかを詳しく検討する。さらにいくつかのヒストン修飾に関しては、ChIP-seqを用いることにより、細胞密度に依存的にどのような遺伝子の発現が変化するのかを明らかにしたい。まず、平成25年度の研究計画のひとつである、[細胞密度の変化と細胞周期との関わり]については、あまり相関がないことが確認できた。さらに、細胞密度依存的に、[どのヒストン修飾が変化するか]を調べることについては、ほとんどすべてのメチル化およびアセチル化が変化することが結論づけられた。現在、[細胞種間における相違の検出]について進めており、現在のところ、2種類の細胞に対して試みたが、概ね同様の傾向がみられることが分かった。予定していたChIP-seqに関わる研究を来年度に行うことにしたため。平成25年度の研究により、細胞密度依存的な変化をもたらす画分が、高密度培養による培養上清の3kDaにあることが分かった。そこで今後は、具体的に何が原因であるかを同定していきたい。併せて、その因子が変化することで、ヒストン修飾に変化をもたらす機構の解明に迫りたい。また、当初の予定通り、平成26年度以降には、ChIP-seqなどを行うことにより、細胞密度が変化することによって、どのような遺伝子の発現が変化するのかを明らかにしたい。次年度にChIP-seqに関する研究を行う。
ＥＭＡによる日常生活下での多面的調査を用いた肥満成人における食行動関連要因の同定

肥満の食行動変容において、心理社会的因子がどのように食行動に関連しているかを把握することは重要である。本研究では、成人の肥満群および普通体重群を対象に、日常生活下調査(ecological momentary assessmentおよび携帯情報端末を用いた食事記録評価システムなど)を実施し、生態学的妥当性および栄養学的正確性の高いデータに基づき、毎食の摂取エネルギー量が食事前のストレス・渇望度・外食・同伴者の有無と関連することを明らかにした。また、摂取塩分量が食事後のストレスや不安の軽減と関連していることも示した。さらに今後個人差に注目した解析や食行動異常群で検討する重要性も示唆された。本研究は、日常生活下での自覚症状などの記録方法であるecological momentary assessmentと、同じく日常生活下で記録・評価の可能な携帯情報端末を用いた食事記録評価システムを中心に用いて、肥満成人の食行動関連要因についてこれまでには把握が困難であった生態学的妥当性の高いデータを用いて明らかにすることを目指すものである。今年度は、昨年度に引き続き、予備調査データの解析、研究実施環境の整備及び調査予行を実施した。健常若年者における予備調査データの解析の結果、食欲評価についての信頼性妥当性を確認した。また、調査に使用する機器の設定プログラム準備、解析プログラム・手順の準備と、本調査プロトコルに基づく調査の予行を行った。今年度は、昨年度の予備実施の結果を受け、調査を実施した。この際、被験者募集については、病院での診療状況の変化により通院患者からの募集が困難となったため、他の医療機関への協力依頼や、Web以外のメディアへの被験者募集の掲載、近隣公共施設へのチラシの掲示などによるコミュニティサンプルからの募集を順次実施した。平成25年末までに肥満群3名、普通体重群4名の同意を得て調査を実施した。マルチレベル解析による、毎食の摂取エネルギー量と食直前の心理的因子、環境要因との関連についての予備的解析で、食直前のストレスおよび抑うつのそれぞれと摂取エネルギー量の関連、外食時と非外食時での摂取エネルギー量の差が示された。また、多変量のモデルで、ストレスおよび抑うつのいずれも環境要因と独立して摂取エネルギー量に関連することが示された。特にストレスは環境要因(外食か否か)との交互作用も有意であった。今年度は、予備調査データの解析、研究プロトコルの確定、倫理委員会申請、調査使用機器などの研究実施環境の整備を実施した。健常若年者における予備調査データの解析の結果、外食や抑うつ気分と摂取エネルギー量の関連にはBMIによる交互作用があり、BMIが高いほど、摂取エネルギー量は環境要因や気分の影響を受けやすいことが示唆された。また、マルチレベルパス解析により、外食と摂取エネルギー量の関連は気分を介するものではない可能性が示された。これらの結果は健常群での結果としての意義をもつだけでなく、今後肥満成人の調査で同様に解析を行い検討していく必要を示唆する重要な結果であった。そのほか、予備調査で用いた食欲に関する質問項目について、冗長性が懸念されたことから、マルチレベル因子分析を行い因子構造を明らかにし項目数を厳選することを検討した。これらの解析に基づき、被験者の負担を軽減しながら必要十分な情報が得られるように調査プロトコルの詳細を決定し、倫理委員会申請を行い承認をうけた。さらに、調査に使用する携帯情報端末や呼気ガス分析装置、自律神経機能検査装置などを整備して、設定プログラムや検査手順の確定、解析方法の検討と解析プログラムの準備など、調査を円滑に進めるための準備を行った。本研究は、日常生活下での自覚症状などの記録方法であるecological momentary assessment (EMA)と、同じく日常生活下で利用可能な携帯情報端末を用いた食事記録評価システムを中心に用いて、肥満成人の食行動関連要因について生態学的妥当性の高いデータを用いて明らかにすることを目指したものである。調査の実施に先立ちEMA用の食欲評価尺度の検討を行い、同尺度を含め調査を実施した。コミュニティサンプルからの募集を行い、平成26年末までに肥満群12名、普通体重群18名の同意を得て調査を実施した。最終年度は調査の実施と以下の解析を行った。

マルチレベル解析による、毎食の摂取エネルギー量と食直前の心理的因子、環境要因との関連についての解析では、食直前のストレス・渇望度と摂取エネルギー量の間にそれぞれ負と正の関連が、また外食時や同席者がいるときに摂取エネルギー量が有意に多いことが示された。また、多変量モデルでは、ストレスと外食は独立して摂取エネルギー量に関連することが示された。さらに、毎食の摂取エネルギー量と食直前の心理的因子・環境要因との関連にBMIや肥満群・普通体重群の群別による交互作用がみられるか解析したところ、若年普通体重群における予備調査とは異なりいずれも交互作用は有意ではなかった。以上の結果から、普通体重群・肥満群に共通して摂取エネルギー量が多くなりやすい心理社会的要因が明らかになり、今後日常生活下での介入を考えるうえでハイリスクタイミング同定の手掛かりとなると考えられた。また、BMIとの交互作用は有意ではなかったが、BMIだけでまとめることのできない多様性によるものである可能性も高く、集団としての議論だけでなく、特に臨床的には日常生活下調査データに基づき個人ごとに食行動関連要因のモデルを同定していく必要性や意義を示唆する結果であると考えられた。行動医学、心身医学本調査プロトコルに基づく調査の予行を行った結果食事記録評価システムに不具合があり、その修復を待ったことや、研究代表者の部分的育休の取得により、当初の予定よりも調査準備に多くの時間を必要とした。所属する機関内の病院での診療状況の変化により病院での被験者募集は困難になったが、その後ほかの医療機関への協力依頼や、Web以外のメディアへの被験者募集の掲載、近隣公共施設へのチラシの掲示などによるコミュニティサンプルからの募集を順次実施し、調査が進展している。また、並行して予備解析を実施中である。調査を実施するに当たり、日常生活下調査における被験者の負担を考えた慎重な調査プロトコルの検討が必要であると考えられたため、予備調査データの解析をまず行うこととした。これらの予備調査データの解析において、肥満成人への外挿の検討が必要と思われる意義深い結果が得られたことと、予備調査データの解析や検査装置の整備により調査準備が整ったこと等から、上半期に産前産後休暇および育児休業にて研究が一時中断されたことを考え合わせ、おおむね順調に進展しているものと考えられる。再度本調査予備実施を行い、支障がないことを確認したのち、肥満成人及び対照群での調査を実施し解析を進めていく予定である。引き続き被験者募集と調査を実施し、単変量モデルから多変量モデルへ、また被験者レベル変数を含む解析へと解析を行い、成果を発表する予定である。今後は被験者募集を開始し、肥満成人及び対照群での調査を実施し解析を進めていく予定である。本年度に実施予定であった調査の謝金が、次年度に繰り越されているため、予定通り次年度調査の謝金として使用する。またそのほか調査準備中に新たに解析に必要と考えられたソフトウェアの整備など、本研究の目的がより充実して達成されるように使用する予定である。
慢性圧迫による脊髄白質病変の実験的検討-遅発性軸索変性と脱髄の関与-

慢性持続圧迫による脊髄障害の病態を検討するため,緩徐に膨張する子宮頚管拡張剤Dilapan(Gynotech INC.)を圧迫材に用いた脊髄持続圧迫モデルを作成し,主として脊髄白質の病変を組織学的に検討した.1.圧迫後7日までの急性期では,後索と隣接する灰自質に限局した軽度の壊死を認めた以外には組織破壊は明らかではなかった.前角や側索・前索の壊死はなかった.2.自質では,海綿状変化が2日目から出現し,特に圧迫部位とは関係なく脊髄白質全体に観察され,以後3ヶ月までみられた.3.電顕所見(1)側索では,2日目以降,軸索は浮腫性膨化し,ミエリン解離も伴っていた.軸索が脱落しアクソンボールも多数観察された.この軸索変性の所見は,程度は軽減するが圧迫後90日目まで継続して観察された.(2)側索及び前索には,軸索変性の他に,髄鞘の菲薄化ないし脱落した軸索が多数観察された.4.稀突起膠細胞に対する免疫組織化学所見で,白質における細胞数の減少が1週以降で明らかであった.この変化は,2週1ヶ月で最も著しかった.また,TUNEL法による観察では,白質に陽性細胞が圧迫後2448時間で認められ,72時間で最も多く観察された.以上の結果から,脊髄持続圧迫による白質病変の主体は,圧迫期間中持続する軸索変性と残存軸索に生ずる脱髄と考えられた.また,脱髄の機序として稀突起膠細胞のapoptosisが示唆された.慢性持続圧迫による脊髄障害の病態を検討するため,緩徐に膨張する子宮頚管拡張剤Dilapan(Gynotech INC.)を圧迫材に用いた脊髄持続圧迫モデルを作成し,主として脊髄白質の病変を組織学的に検討した.1.圧迫後7日までの急性期では,後索と隣接する灰自質に限局した軽度の壊死を認めた以外には組織破壊は明らかではなかった.前角や側索・前索の壊死はなかった.2.自質では,海綿状変化が2日目から出現し,特に圧迫部位とは関係なく脊髄白質全体に観察され,以後3ヶ月までみられた.3.電顕所見(1)側索では,2日目以降,軸索は浮腫性膨化し,ミエリン解離も伴っていた.軸索が脱落しアクソンボールも多数観察された.この軸索変性の所見は,程度は軽減するが圧迫後90日目まで継続して観察された.(2)側索及び前索には,軸索変性の他に,髄鞘の菲薄化ないし脱落した軸索が多数観察された.4.稀突起膠細胞に対する免疫組織化学所見で,白質における細胞数の減少が1週以降で明らかであった.この変化は,2週1ヶ月で最も著しかった.また,TUNEL法による観察では,白質に陽性細胞が圧迫後2448時間で認められ,72時間で最も多く観察された.以上の結果から,脊髄持続圧迫による白質病変の主体は,圧迫期間中持続する軸索変性と残存軸索に生ずる脱髄と考えられた.また,脱髄の機序として稀突起膠細胞のapoptosisが示唆された.慢性持続圧迫による脊髄障害の病態を検討するため,緩徐に膨張する子宮頚管拡張剤Dilapan(Gynotech INC.)を圧迫材に用いた脊髄持続圧迫モデルを作成し,主として脊髄白質の病変を組織学的に検討した.1.圧迫後7日までの急性期では,後索と隣接する灰白質に限局した出血性壊死を認めた。前角や側索・前索の壊死はなかった。2.白質では海綿状変化が2日目から出現し,特に深部に強く圧迫部位とは関係なく脊髄全体に観察された。またこの所見は圧迫を解除しない限り90日以降までみられた。3.電顕所見(1)側索では,2日目以降,軸索は浮腫性膨化し,ミエリン解離も伴っていた。軸索が脱落しミエリンが小魂状に変性したアクソンボールも多数観察された。この軸索変性の所見は,程度は軽減するが圧迫後90日目まで継続して観察された。(2)側索及び前索には,軸索変性の他に,髄鞘の菲薄化ないし脱落した軸索が多数観察された。4.TUNEL法による観察では,白質に多数の陽性細胞が圧迫後72時間から観察され,1週後に最も多く観察された。以上の結果から,脊髄持続圧迫による白質病変の主体は,圧迫期間中持続する軸索変性の他に,残存軸索に脱髄性変化が生じており,この変化は稀突起膠細胞がapoptosisに陥ったための変化と推測された。脊椎症,靭帯骨化症,転移性脊髄腫瘍など硬膜外からの慢性圧迫による脊髄障害の病態を検討するため,緩徐に膨張する子宮頚管拡張剤を圧迫材に用いた脊髄持続圧迫モデルを作成し,主として脊髄白質の病変を組織学的に検討した.ラットの下位椎弓下硬膜上に圧迫材Dilapan(Gynotech INC.)を留置して持続圧迫し,圧迫部脊髄の光顕および電顕による組織学的検討を行った.【結果】1)圧迫後

7日までの急性期では,後索と隣接する灰白質に限局した出血性壊死をわずかに認めたが,多くは組織破壊はなかった.灰白質前角や側索・前索の壊死はなかったが,3日7日目に前角細胞のChromatolysisが一部に観察された.2)白質では,浮腫が24時間後から出現し,圧迫部位とは関係なく白質全体に観察された.軸索変性を伴う海綿状変化が12週間で著しく,同時に脱髄も伴っていた.3.電顕による観察では,側索で2日目以降,軸索は浮腫性膨化しミエリン解離も伴っていた.軸索変性も同様に観察された.側索及び前索には,軸索変性の他に,髄鞘の菲薄化ないし脱落した軸索が多数観察された.4.稀突起膠細胞に対する免疫組織化学所見で,白質での細胞数の減少が1週以降で認められた.5.TUNEL法による観察では,白質に陽性細胞が圧迫後2448時間で認められ,72時間で最も多く観察された.【結論】本モデルは,急性圧迫モデルとは異なり,脊髄灰白質も含めて破壊性壊死はほとんどなく,慢性圧迫による脊髄障害の検討モデルとして妥当と考えられた.本モデルでの脊髄持続圧迫による病変は,主として白質における持続する軸索変性と脱髄性変化であった.残存軸索における脱髄性変化の原因として,稀突起膠細胞がapoptosisに陥いり,脱髄が生ずる可能性が示唆された.
新規シグナル分子単離を目指した遺伝学的スクリーニング法の開発

哺乳類細胞の場合、劣性遺伝子を単離したい時、多くの遺伝子がdiploidで存在することが障害になる。このため、既にchickenDT40細胞において、chromosomeのcetromere,telemere周辺の遺伝子配列は決定されているので、相同組換えを利用してある特定のchromosome(chickenには5本存在する)の長腕、短腕を特異的にdeletionすることが可能である。既にこの方法を用いてchickenに存在するchromosomeの1、2、3のdeletion作成した。次にchromosome dessectionにより、1、2、3のchromosomeのgenomic bank (約20-50kb/clone)をつくり、その際in vitroで化学変異源を用いそれぞれのgenomic cloneに変異をいれると同時に哺乳類薬剤markerであるneo遺伝子を導入した。一方、DT40細胞のアッセイ系をGFPで光学的に容易に検出できるようシステムを構築した。Bcl-2遺伝子は、NF-KB径路により強く制御されているので、Bcl-2遺伝子プロモーター領域にGFP遺伝子をノックインの方法を用いて導入した。実際、NF-KB径路を活性化するシグナルをこの細胞に加えるとGFPの顕著な上昇が認められ、システムとして用いることができることを判明した。又、このBcl-2/GFPを導入したDT40細胞を用いて、変異を導入し、かつneo遺伝子を導入したgenomic bankをトランスフェクションして約1000個のクローンを得た。
咀嚼運動におけるヒスタミンの役割についての研究

本研究では、光刺激によりヒスタミンを放出するマウスを作製し、より実際の生体に近い状況で、咀嚼運動に対するヒスタミンの役割を検討する研究を行った。マウスから脳幹を摘出し、脳幹スライス標本を作製した。三叉神経運動ニューロンに記録電極を置き、パッチクランプ法をもちいて膜電位を記録した。その状態で三叉神経運動核を青色光にて光刺激し、ヒスタミンの放出を起こしてその変化を記録した。その結果、三叉神経運動ニューロンの細胞体の膜電位上昇がみられた。この膜電位の上昇は、光の強度を変化させると上昇の割合も変化し、強度依存性であることがわかった。本研究の目的は、咀嚼運動を含む顎運動の調節に、ヒスタミンがどのように関与するか明らかにすることである。ヒスタミンは中枢神経系において神経伝達物質として、睡眠、摂食、情動の調節に関わり、特に摂食において抑制の働きをすることが知られている。また、咀嚼運動を司る三叉神経中脳路核ニューロンへのヒスタミンニューロンの投射が見られることから、咀嚼運動へのヒスタミンの関与が示唆されているがその詳細は明らかになっていない。我々はこれまで、幼若ラットの脳幹スライス標本を用いて、ヒスタミンが閉口反射を抑制することを見出した。しかしこれまでの実験系ではスライス全体にヒスタミンを環流投与するため、受容体が発現していれば、ヒスタミンニューロンの投射に関係なくヒスタミンの効果が表れてしまうため、実際の現象と異なる可能性がある。そこで本研究では光刺激によりヒスタミンニューロンが活動するマウスを作製し、このラットの脳幹スライス標本を用いることにより、実際の現象により近づけた状態で咀嚼運動へのヒスタミンの関与を明らかにすることを計画した。本研究で使用予定のラットが、研究費申請時には購入可能であったが、研究費交付直前に受精卵が凍結されてしまったため、受精卵の解凍、購入、繁殖に長期間かかってしまったため。ヒスタミンは中枢において、摂食抑制に働く物質として広く知られている。また、ヒスタミンは咀嚼運動の調節にも関与することが知られているが、その詳細は分かっていない。本研究は神経伝達物質であるヒスタミンが、咀嚼運動にどのように関与しているのかを電気生理学的に明らかにすることが目的である。これまで研究者らはラットを用いて脳幹スライス標本を作製し、咀嚼運動を構成する閉口反射に関わるニューロンを電気刺激して、その活動を記録していた。そこにヒスタミンを灌流投与することでその活動の変化を調べていたが、標本全体にヒスタミンが投与されてしまうため、実際の減少を再現しているとは言い難かった。そこで研究者らは光刺激によりヒスタミンニューロンが活性化するマウスを交配により作製し、このマウスを用いて実験することにより、より生体に近い状態でヒスタミンの働きを調べることができると考えた。このマウスを用いて、これまでと同様の実験を行うことで、研究者らが証明してきたヒスタミンが咀嚼運動を抑制するという研究を証明できることになる。当該年度では、目的のマウスの安定的な交配に成功した。そこで、このトランスジェニックマウスから脳幹を摘出、スライス標本を作製した。光刺激によりヒスタミンニューロンが活性化することを確認できたため、神経活動を記録し、その状態で光刺激を行い神経活動にどのような変化がみられるのかを記録した。今後はその変化をこれまで研究者らが得たデータと比較、検討していく予定である。理由としては第一に、申請時には使用可能であった遺伝子改変マウスの受精卵が、採択前に凍結されてしまい、交配を開始するのに数か月を要したことが挙げられる。また、研究担当者が平成28年度に所属を異動になり、異動先での実験準備等に予想よりも時間がかかったことが挙げられる。我々は、生体内における咀嚼運動を含む顎運動に対するヒスタミンの作用を明らかにすることを目的として本研究を行った。これまで、ヒスタミンの受容体が咀嚼運動に関わる三叉神経中脳路核ニューロン、および三叉神経運動ニューロンにあることがわかっており、中枢ヒスタミンが咀嚼運動に関わっている可能性が示唆されてきた。しかし、その詳細については不明なままであった。我々はこれまで、三叉神経中脳路核ニューロンおよび三叉神経運動ニューロンの細胞体にヒスタミン受容体があり、ヒスタミンはこれらの細胞の膜電位を上昇させる働きがあること、また咀嚼運動を構成する閉口反射の反射弓にヒスタミンが作用すると、その反射を抑制する働きがあることを証明してきた。これまでの実験では、脳幹スライス標本にヒスタミンを灌流投与していたが、これは生体でのヒスタミンの作用を再現したものとはいえない。そこで本研究では光刺激によりヒスタミンを放出するマウスを作製し、より実際の生体に近い状況で咀嚼運動に対するヒスタミンの役割を検討する研究を行った。実験はこのマウスから脳幹を摘出し、脳幹スライス標本を作製し行った。この時、三叉神経運動ニューロンの細胞体の膜電位上昇がみられた。

この膜電位の上昇は、光の強度を変化させると上昇の割合も変化し、強度依存性であることがわかった。本研究では、光刺激によりヒスタミンを放出するマウスを作製し、より実際の生体に近い状況で、咀嚼運動に対するヒスタミンの役割を検討する研究を行った。マウスから脳幹を摘出し、脳幹スライス標本を作製した。三叉神経運動ニューロンに記録電極を置き、パッチクランプ法をもちいて膜電位を記録した。その状態で三叉神経運動核を青色光にて光刺激し、ヒスタミンの放出を起こしてその変化を記録した。その結果、三叉神経運動ニューロンの細胞体の膜電位上昇がみられた。現在は繁殖に成功しており、実験を行うのに十分な状態になったため、今後は問題なく研究が行えると考える。遅れていたラットの交配も安定し、実験を進めると同時に、現所属のでの実験準備もほぼ完了したことから、今後は実験を進めていくことに大きな問題はないと考える。口腔生理学旅費が予算よりも大幅に少なかったためと考えられる。研究担当者の所属の異動により、異動先での実験設備の整備等に予想よりも時間がかかり、研究が中断、遅延したため。次年度は、遅れていたラットの繁殖も進み、実験が大幅に進むことが予測され、それに伴う成果の発表、論文作成により、予定通りの予算の使用を計画している。現所属での実験準備がほぼ完了したので、研究を再開できると考えている。