hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グローバル・ネットワーク型企業における競争基盤と資源展開に関する実証研究

さらに、マーケティング資源のなかで、ブランド資源と関係的資源のマネジメントの理論的な問題を考察し、研究開発における顧客関係資源の重要性を実証的に明らかにし、製造企業と小売企業の関係的資源をベースにした相互作用のなかで実現する複線型開発という概念を提起した。平成16年と平成17年の中国における日米欧企業と中国現地企業に関する調査データとフィールドリサーチの成果に基づいて、さらに中国の内陸部都市を訪問し,選定した企業の現地法人の担当者にヒアリングを実施した。また、日米欧企業の親会社や本社でのヒアリング調査も実施した。おもな研究の成果としては、次のようなテーマに関する研究論文または専門書籍を発表した。1)中国企業の東南アジアでの直接投資の現状およびその競争力基盤の分析2)日米欧企業の中国事業の現地化と経営業績の関係に関する実証分析3)韓国企業の中国での事業展開および日本企業との競争協調関係の分析4)東アジア諦国を中心としたグローバル視点からのネットコミュニティのデザインに関する分析5)企業間の関係性を考慮したマーケティング理論の新たな展開についての再検討6)顧客関係管理における情報技術および企業と消費者との関係性の構築に関する理論と実証7)マーケティングの取り組みによって市場を作り上げ、未来が作られる企業のケース分析8)価値を生むマーケティング・プロセス、日本におけるマーケティング・マネジメントの展開ならびにその特徴の検討9)マーケティングにおけるブランドの価値(有用性)についての理論的検討10)企業の競争基盤と資源展聞に関する複数の教育用ケース平成18年度において、研究調査した成果を米国、欧州および中国などで開く学会や会議で報告し、日本企業のイノベーション管理、ブランド管理、グローバル調達活動、市場情報管理と顧客管理に関する研究成果を発表した。
日本人の関係性重視についての文化心理学的研究

本研究課題は平成26年度が最終年度の為、記入しない。1.自己認識に対する東アジア人(日本人、韓国人)とウェスタン文化(ヨーロピアンオーストラリア人)の比較文化研究:2012年1月データー分析の相談のため、広島大学の清水ひろし先生と打ち合わせをした。2012年の夏から修正を続けて、2013年1月論文がJournal of Cross-Cultural Psychologyにアクセプトされた。この研究は自己自身が他人と比べて、より理想的だと思うself-enhancement effectは文化や場合によって違う一方、自己自身をより人間的だと思うself-humanizing effectは文化や場合にあまり変わらなく、一貫的に存在することを見つけた。2.日本人と韓国人の関係性の比較研究のため、韓国(インハ大学)でデーターを集まった。分析した結果、その二つのアジアングループは同じな集団主義文化に入っているが、全晩的な自己意識や、家族主義等で有意味な差があることが明らめた。2012年6月京都大学の内田有紀子先生と打ち合わせをして、それに関する研究を相談することが出来た。その違いはグローバル化に対して行ってる別々の社会(日本、韓国)の対応方式とともに、その内面に存在する根本的な心理の分化差に基底するのだと思われる。3.東京大学社会心理学科山口先生のラブで行ってる日本人のコントロールオリエンテーションに対する研究に協力することになって、論文の共同執筆や実験の設計などの仕事をし始めた。1.2012年8月オーストラリアクィンズランド大学で行った研究者Paul Bainとの打ち合わせの以降、日本と韓国で、『未来に可能な社会の変化に関する認知的特性』研究をコラボレーションし始めることになった。特に、日本では、社会的に重要なイシューになっている原発の問題に対して、学生達に(筑波大学、京都大学)日本全国で原発が完全になくなった場合の2030年の社会と、原発が進んでいる場合の2030年の社会の二つのグループに分けて、その社会と人々の性格を想像させてもらった後研究を行った。集まったデーターは今分析中だ。韓国(インハ大学)では同じな形で、南北統一の問題に注目して、2030年まで統一が行った場合とそうじゃない場合の韓国の社会と人々の性格を想像させてもらうことにした。その結果は2013年8月インドネシアで行うアジア社会心理学会で発表される予定である。2.日本人の関係的な自己の特性に関する研究は韓国人と比較したデーターを分析して、その結果は2012年11月18日日本社会心理学会で発表された。関係的な自己を自分中心と他人中心の二つに分けて分析した結果、その二つはハッピーネスに違う影響を受けることが明らめた。つまり、自分中心の関係的な自己はネガティブな影響を、他人中心の関係的な自己はポジティブな影響を受けるのが見つかれた。なお、日本人学生達は韓国人学生達と比べ、他人中心の関係性が低いこと等が見つけられた。その結果は2013年5月の内論文を書いてアジア社会心理学会のジャーナルに出す予定である。3.イスラエルのJenny Kurman達のラブと行ってるコントロールに関する比較文化研究は2012年春頃実験設計を終わって、日本(東京大)とイスラエル(ハイファ大学)でデーターが集まったそうである。1.コントロールオリエンテーションに対する比較文化研究のため、韓国(仁荷大学校)でデータを集めた。その結果は6月にアメリカで行った国際文化心理学会で共同研究者(Jenny Kuman)により発表された。日本、韓国、イスラエル、ニュージーランドの研究者たちとの協力により進んでいるこの研究は、個人のコントロール戦略が個人差と文化によりどう違い普遍的な特徴は何かに関する問いに答えられるだろう。2.自己認識についての東アジア人(日本人、韓国人)との比較研究のため、5月に共同研究者(橋本博文)にアメリカ(メリーランド大学)でデータを集めてもらった。この結果はアメリカ人の自己性や、関係的自己性の普遍性などを理解する上で意味のある資料となる。3.東アジア人が社会構造と未来社会の変化を考える時に使っているドメインを調べるために続けている研究プロジェクトのうち、韓国人のデータ分析結果を8月にアジア社会心理学会で発表するため、発表の準備を続けてきた。これは、共同研究者(Paul Bain)が発表する予定である。日本人のデータはひとまず予備分析をしたが、これから本格的に分析をする必要がある。4.グローバリゼーションが様々な文化と個人達に与える影響を研究するため、共同研究者(Brock Bastian)と一緒に実験のデザインを続けている。たとえば、伝統的に集団主義社会(日本)がグローバリゼーションの影響で個人(現代の日本人)に個人主義を促すと、個人の自己観は実際にどのように変わっていくのか、などを調査するための質問紙の実験を発展させて来た。計画通り、日本と韓国でデーターを集まることが出来て、基本的な心理文化差を分析してるところである。なお、self-humanizingに関する研究も順調に進んで来た。計画通り、日本人の関係性に関する研究をデーターを集まって、分析して、発表して、論文を書いてる段階である。東アジア人の関係性に関する研究の分析と原稿執筆を続け、その結果をアジア社会心理学会のジャーナルに投稿する予定だったが、まだ執筆が順調に終わってない。

東アジア人の関係性に関する研究の分析を続いて、その結果をアジア社会心理学会のジャーナルに出す予定である。コントロールオリエンテーションの研究は日本とイスラエルでデーターを集まって2013年夏まで分析する予定である。1.日本人と韓国人の比較文化の論文をかく。2.コントロールに関する比較文化研究のため、データーを分析して結果を出す。3.社会変化に対する日本人の認知的な特徴に関する研究のため、データーを分析して結果を出す。東アジア人の関係性に関する研究の分析と原稿執筆を続け、その結果をアジア心理学会のジャーナルに投稿する予定である。東アジア人の社会構造と未来社会に対する自覚の研究を続け、日本と韓国でデータを集める予定である。コントロールオリエンテーションの研究データを分析し、原稿執筆を進める予定である。
クモ膜下出血後の攣縮血管に於けるnitric oxdieの関与

くも膜下出血後、一酸化窒素(NO)代謝は急性期から亢進し、髄液中のNO代謝物濃度は上昇し、慢性期まで持続する。これは神経や血管組織を含めた脳全体のNO代謝の亢進を反映したものと思われる。くも膜下出血後の出血量が最も影響を与える因子であり、出血量が多ければNO代謝も影響されやすい。攣縮を起こした血管では慢性期には一酸化窒素合成酵素(NOS)の活性は低下し、NOの拡張作用は消失している。血管支配神経終末内のNOS活性も同様に減少している。反面、攣縮血管の末梢領域では代償的に血流を増やすよう内皮型NOSや神経型NOSの誘導発現が増え、活性が上がっているものと思われる。くも膜下腔に存在するヘモグロビン、特にオキシヘモグロビンは放出されたNOに親和性が高く、簡単にNOを吸着しニトロシールヘモグロビンとなり不活化しNO_3に変換する。特に、オキシヘモグロビンは血管収縮作用もあり、このNOの拡張作用を抑制することから、攣縮発生に貢献しているものと推測される。くも膜下出血後髄液中の炎症性サイトカインの上昇も明らかにできた。これらの炎症性サイトカインが誘導型NOSを発現させる可能性は低いものと推測された。内皮の機能傷害が攣縮発生に関与していることは疑いもなく、くも膜下出血後という条件下では脳梗塞で指摘されているNOの細胞傷害よりも細胞保護作用のほうが重視される。今後はくも膜下出血後内皮機能を出来るだけ保つため、NOドナーの局所投与や遺伝子治療の手法を用いて攣縮血管のNOS活性を上げNOを増やす治療などが必要になるであろう。NOS量測定について、その活性度は3H-L-arginineを3H-L-citrullineに変換する量を示標とした。培養細胞を用いた実験において、血管内皮のNO合成遊離促進物質では、NOS活性は上昇し、NO合成阻害剤を加えることによりその活性は抑えられることがわかった。現在、実際の脳血管を用いた検討を行っているところである。また、NOS抗体を用いた免疫組織染色において、ラット髄腔内にLipopolysaccharide(LPS)を投与することにより、血管平滑筋層にinducible type NOSの染色の増加を認めた。そこで、次に血管攣縮モデルを用いた染色を行うとともにその量的変化をWestern blottingにより検討を行っていきたい。NO測定に関して、脳表プローブを用いたNO-analyzerによる測定において、adrenomedulin等の血管拡張作用のあるペプタイド投与により、脳内NO産生量が減少することがわかった。NOセンサーの信頼性を確実にするためにELISA法を用いたNO代謝物の測定及び、抗体を用いた測定の検討を行っている。サイトカインの変動においては、クモ膜下出血イヌモデルにLPSを投与することによりTNF-αが一過性に上昇するがIL-1β,IL-6では変化を認めなかった。サイトカインの変動も血管攣縮の解明に関与していると考えられ今後もその変化の検討も行っていきたい。31例のくも膜下出血患者の手術後、脳槽ドレナージより採取した脳脊髄液(CSF)中のNO代謝物(NO2,NO3)を測定したところ、発症直後よりNO代謝物が高い値を示し、慢性期まで継続した。これはNO代謝がくも膜下出血後14日間にわたり亢進していることを意味しているものと思われる。術前のHunt & Hess分類やCTスキャン上のFisher分類などとの相関を調べてみたが、特に有意な関係は得られなかった。また脳血管攣縮発生患者でも統計的に差は認められなかった。特にCSF中のNO3の値が高くこれはくも膜下腔に存在するヘモグロビンによる吸着が主な代謝経路になっている可能性を示した。

また大量のステロイド(メチールプレドニゾロン)を投与した群とそうでない群を比較してもNO代謝物の濃度差は認められなかった。ステロイドがinducible NOS(iNOS)の合成を抑制することが知られており、今回の結果はくも膜下出血後のNO代謝の亢進にはiNOSの発現は少ないか、あまり大きく貢献していないことが示唆された。我々はこれらの結果をまとめ、現在Neurosurgeryへ投稿中である。次のステップとしてマウス脳血管内皮の培養細胞を用い、サイトカインによるiNOSの発現を検討中である。CSF中のサイトカイン、特にIL-1β,IL-6,IL-8はくも膜下出血後著しく上昇することは確認済みであり、またこれらのサイトカインが脳血管に与える影響も既にin vivoの実験で観察した。これらのサイトカインが血管内皮constitutiveNOSやiNOSにどのような影響を与え、脳血管攣縮発生にどのように関与しているのか、さらに検討を加えたい。くも膜下出血後髄液中の炎症性サイトカイン濃度が上昇することは、臨床例から採集した髄液を用いたデータから明らかにできた。とくにインターロイキン6、インターロイキン8、インターロイキン1βの上昇が急性期から顕著であった。これらのサイトカインが炎症及び免疫過程を刺激する段階で、誘導型一酸化窒素合成酵素(NOS)を発現させるかどうかイヌを用いて検討した。イヌの大槽内にそれぞれのサイトカインを投与し、髄液中のNO代謝物濃度に与える影響を検討した。しかし、最も可能性のあったインターロイキン1β投与後でもNO代謝物濃度は全く変化なく、誘導型NOSの関与は否定的であった。一方、プロスタグランディンの合成酵素であり、immediate early geneと同様、病的状態で発現するcyclooxyegenase2(COX-2)が発現し、プロスタグランディンカスカードを活性化させていることがウエスタンブロット法で明らかにされた。このプロスタグランディンカスカードの活性化は選択的COX-2阻害剤で抑制でき、薬理的にも証明できた。くも膜下出血後のNO代謝亢進に誘導型NOSの関与が否定的な点は高用量のステロイド(メチルプレドニゾロン)を使ってNO代謝物濃度への影響を検討した以前の臨床結果とも良く一致した。つまりくも膜下出血後ではラットやマウスなどのゲッシ類では簡単に発現する誘導型NOSが病態に貢献している可能性は少なく、COX-2の誘導を介してプロスタグランディンの活性が増え、くも膜下出血後の血流動態に影響を与えているものと推測された。
アジアの口腔病変の比較検討と今後の展開(日本口腔病理学会主催国際シンポジウム)

1999年8月2527日に第10回日本口腔病理学会総会(松戸市市民劇場)において、中国第四軍医科大学のWu Junzheng教授、韓国京城大学のSam-Pyo Hong教授、台湾高雄医科大学のLi-Min Lin教授、インドNagpur大学のVenay K.Hazarey教授を招聘し、アジアにおける口腔病変の比較調査の集計及び検討状況を当学会で報告し、活発なディスカッションが行われた。本学会はアジア各国の口腔病理医の相互交流や共同研究の発展を図り、ひいては欧米と比較してアジアに高い発生頻度を有するとされる種々の口腔病変の病因・病態の解明に寄与した。発表抄録はOral Medicine and Pathology 4(2):p87-89,1999(日本口腔病理学会会誌)に掲載した。さらに学会会期中にアジアの口腔病理医機構設立に向けて準備会議を主催し、ドイツReutlingen病理研究所のArne Brukhardt教授を招聘し、ドイツにおける整備された病理組織診断コンピューターネットワークを紹介し、アジア病理ネットワークの開設計画などについて具体的に合議し、発展性ある展望が得られた。また1999年10月1417日に日本大学松戸歯学部の山本浩嗣は韓国京城大学を訪問し、日本における口腔病理学の現状および研究実績を報告した後、アジア口腔病理医機構の準備会議およびシンポジウム開催に向けての打ち合せを行った。
VTRを導入した術後看護用CAI教材の開発および臨床実習に活用した学習効果の検証

本研究は、VTRを導入した術後看護用CAI教材を開発し、臨床看護実習のための自己学習に活用することを目指して取り組んだものである。さらに開発したCAI学習による認知領域と精神運動領域における学習効果を検証することを目的とした。全身麻酔で手術を受けた患者の呼吸器合併症を予防するために必要な援助のうち、今回は「術後の吸入法」に関する知識と技術の学習に焦点を当て、VTR映像および音声による解説、写真などを取り入れ、従来のCAI教材よりも聴覚と視覚を刺激した、臨場感ある学習が可能なCAI教材を開発した。次に、「全身麻酔で手術を受ける患者の看護」に関する講義を履修し、対象別臨床看護実習に出る前の看護学生で、研究同意書による同意が得られた1020名を対象として学習効果の検証を行った。その結果は以下の3点である。(1)開発したCAI教材を用いた学習のポストテスト結果は、プレテスト結果よりも有意に高く(p<0.01)、認知領域の学習効果が高まるということが検証された。(2)開発したCAI教材を用いて自己学習を実施した後、臨床実習において実際の患者ケアをチェックした結果は、ゴデブデル訓練方式の有効基準による、80/80基準を満たしており、精神運動領域の学習効果が高まることが示唆された。(3)学習者はCAI学習を好意的に受けとめ、今後もCAI学習を希望しているということが明らかになった。「全身麻酔で手術を受ける患者に対する呼吸器合併症予防の看護」のテーマでPart IからPart IVの6教材の1つ-吸入法-の教材を開発した。Part I:呼吸器系のフィジカルアセスメントPart II:呼吸器合併症予防の基本的援助(深呼吸法・排痰法)Part III:薬剤や器具を用いた援助(吸入法・吸引法)Part IV:事例による援助の実際本CAI教材の特徴は以下の2点である。(1)VTR映像・静止画・動画・音声など、実際の病院での映像を取り入れ、従来あるCAI教材よりも臨場感のある学習ができる。(2)手術前後に必要な呼吸器合併症予防の看護の一連の流れを考慮して設計しており、基本的看護技術から事例の展開までが学習できる。特徴(1)については、Andrew J.Gleydura(1995)によると聴覚のみを刺激された人が20%の記憶ができるのに対して、聴覚と視覚を刺激された人は40%の記憶ができ、聴覚・視覚の刺激を受けて行動した人は75%の記憶ができると報告されており、この結果に基づいて本CAIもマルチメディアを活用することにした。特徴(2)については、先行研究の多くは、基礎看護技術などの単独テーマの教材開発が多く、技術・知識・事例展開という一連の流れで開発されたものは見あたらなかった。今後開発したCAI教材を用いた学習が従来の教育方法よりも学習効果が高く、よりよい看護が提供できるということを検証していく必要がある。本研究の目的は、昨年開発したVTRと音声を導入したCAI教材による学習効果を検証することである。「全身麻酔で手術を受ける患者の看護」に関する講義を履修し、臨床地実習に出る前の看護学生で、研究同意書による同意が得られた1020名を対象として、以下のような方法で実施した。1.認知領域の学習評価とCAI学習に関する意見各学校において、同一日時に一斉にプレテストを実施した後、1人1台の携帯型コンピュータでCAI学習を実施した。その後、CAI学習を終了した者から順にポストテストおよび、コンピュータ学習に関するアンケートを実施した。2.臨床実習における精神運動領域の評価学生が手術直後の受け持ち患者に実践した最初の吸入法について、指導に当たった臨床指導者がチェックリストに基づいて評価した。これらによって得られたデータを、統計学的検定およびゴデブデル訓練方式の有効基準に基づいて検討し、以下の結果を得た。

(2)開発したCAI教材を用いて自己学習を実施した後、臨床実習において実際の患者ケアをチェックした結果は、ゴデブデル訓練方式の有効基準による、80/80基準を満たしており、精神運動領域の学習効果が高まることが示唆された。(3)学習者はCAI学習を好意的に受けとめ、今後もCAI学習を希望しているということが明らかになった。
選択反応時間と手のふるえ測定により環境有害物質の神経影響評価を精緻化する研究

有害物質の神経運動系機能への影響評価に用いられる測定法について、反応時間についてStroop条件を含む刺激呈示を可能とし時間計測は1 msecまで計測できるようにした上で、手のふるえの計測は従来(0.915 Hz)より高い周波数範囲(1580 Hz)までが検討できるよう改変を行った。これらの方法を高齢者も含む健康な成年男女に応用したところ、喫煙の急性曝露を反映すると考えられる呼気中一酸化炭素濃度の上昇している者ほど右手のふるえ強度が大きい量ー影響関係が認められた。環境中有害物質は、人に健康影響を及ぼさない曝露量の最大値(NOAEL)またはこれに相当する量(BMDL)を考慮して制御する必要がある。これまでに有機溶剤や重金属の神経運動機能影響を定量的に検討するために用いられてきた方法に、手のふるえ検査と反応時間検査がある。この2つの検査について時間分解能を上げることによって、周波数特性の異なるふるえを検出できる可能性、反応時間変化の検出感度が上がる可能性を検討し、手のふるえや反応時間への影響が疑われる曝露集団に応用を試みることを計画している。手のふるえは、これまではサンプリング周期32msで測定していたところ、圧電素子を用いた市販の加速度センサーからの出力をサンプリング周期1msで取り出して周波数解析を行うことが可能となった。しかし現在は測定結果からセンサーや回路の特性による成分と手のふるえ自体とを分ける方法を有していないことから、さしあたり今回新規に導入した「測定結果」をそのまま影響指標とみなし、環境温度や動脈内酸素分圧に対する生理的変動が手のふるえ測定結果に及ぼす影響を検討を進める予定である。また1Hz以下のふるえについては、血管脈波が混入している可能性も指摘されておりその扱いが問題とされる事もあるため、センサーを複数用意し、大きな血管の近くを含む複数の場所に貼付し比較してふるえの低周波成分の測定評価法確立にむけて解析を進めていく。反応時間については、パソコン画面上への刺激提示を行う市販ソフトと、タイマーを内蔵する入力機器を導入できた。単純な視覚や聴覚の刺激に応じて運動を開始するまでの時間である単純反応時間には軽度の飲酒の影響が認められにくいとされてきたが、時間精度を上げることで影響が認められるかを検討する。また、選択反応時間測定において、短時間で測定でき、かつ十分な再現性の得られる条件の検討を進める予定である。これまで有機溶剤や重金属の神経運動機能影響を定量的に検討するために用いられてきた方法に、手のふるえ検査と反応時間検査がある。すなわち、手のふるえには大脳基底核、扁桃体から末梢の神経・筋、血管の脈動等までが影響しており、反応時間には知覚、注意、認知、運動に関わるシステムが影響している。当研究は手のふるえ、反応時間の測定精度を上げたうえで、有害環境物質の影響を詳細に検討する。手のふるえ、反応時間の測定精度を上げ、測定値に影響する要因を検討する過程で、次の事が明らかになった。呼気の再呼吸によって末梢動脈酸素濃度が5%低下するまでの40秒間の経過中に手のふるえを測定したところ、10Hz以下のふるえ強度が増加し、1014Hzのふるえ強度には変化が認められなかった。すなわち抹消組織の酸素濃度低下もしくは二酸化炭素濃度上昇は特定の周波数の手のふるえ強度増加をひきおこす可能性がある。反応時間の測定条件を検討する一環として古典的なストループ課題に対するエタノール摂取(呼気中濃度0.25mg/L)の影響を対象者10名に対して検討した。摂取前後の反応時間差にエタノールとジュース間の差は認められず、これまでエタノール摂取による急性影響に単純反応時間の影響が出にくいとされている事が再確認された。このような場合に対してより困難な課題を用いる必要のあることが知られた。今後、これらの指標に及ぼす環境中有害物質の影響を検討する。鉛、水銀等の金属、およびエタノール、トリクロロエチレン等の有機溶剤の神経運動機能に及ぼす影響を検討する目的で、振動センサーを用いた手のふるえ測定、聴覚刺激に応じてスイッチを押すまでの反応時間測定が用いられている。手のふるえに関しては、スチレンを含む混合溶剤や金属水銀への曝露によって10-14 Hz領域の強度が大きくなる事から、サンプリング周期を短くしてより高周波領域でも影響を検討する必要があると考えられていた。また反応時間は単純な刺激に対するよりも選択課題を含む刺激の方がエタノール等による影響を受けやすい事、呈示される課題の違いを比較するためには十分な時間精度を要する事から、反応時間測定についても改良を行った上で、これらの機能に対する有害物質の影響を検討する事を目的とした。手のふるえ測定については新規に圧電型振動センサーと記録装置を導入してこれまでの測定の上限であった14 Hzを越える周波数領域も含めてふるえ強度を検討したところ、1480 Hzのふるえ強度は全体の2040%を占めることが知られた。パソコン画面上に視覚刺激を呈示してからスイッチが押されるまでを反応時間とし、ストループ課題も呈示したところ、これまでの聴覚刺激による反応時間は、単純な視覚刺激による反応時間よりストループ課題による反応時間と相関が高いことが示された。

有害物質の影響検討に関しては、対象者設定に時間を要したために現在なおデータ取得中であるが、性・年齢を考慮して比較したところ喫煙者は非喫煙者より右手ふるえ強度が大きく、二次喫煙も含めて喫煙の短期影響を反映すると考えられている呼気中一酸化炭素濃度が高いほど右手1-6 Hzのふるえが大きい関連が認められている。有害物質の神経運動系機能への影響評価に用いられる測定法について、反応時間についてStroop条件を含む刺激呈示を可能とし時間計測は1 msecまで計測できるようにした上で、手のふるえの計測は従来(0.915 Hz)より高い周波数範囲(1580 Hz)までが検討できるよう改変を行った。これらの方法を高齢者も含む健康な成年男女に応用したところ、喫煙の急性曝露を反映すると考えられる呼気中一酸化炭素濃度の上昇している者ほど右手のふるえ強度が大きい量ー影響関係が認められた。測定対象者を依頼する予定であった企業との連携がうまくいかなかったため、調査の開始が遅れている。産業医学有機溶剤曝露作業者を対象に、曝露指標としての作業歴、尿中代謝物濃度、気中濃度の測定値と、手のふるえおよび反応時間との関連を、生活習慣に関わる交絡要因も考慮しつつ検討する。被検者との時間調整が困難であったため、さらに、基本的な測定法を確立する上で検討すべき条件が多く存在するため。環境要因の変動、具体的には環境温度や動脈内酸素分圧に対する生理的変動が手のふるえの大きさ特に周波数解析結果に及ぼす影響を検討する。また指背だけでなく同時に複数の箇所に振動センサーを貼付して1Hz以下のふるえを比較することでこの帯域のふるえの解析を進める。時間分解能を上げた単純反応時間測定法によって、飲酒の影響が検出できるかを検討する。また、刺激提示法を変えて選択反応時間測定を行ない結果を比較する。重金属等に曝露された集団について影響が検討できるよう準備を行なう。次年度の調査対象者数を増やして検討する。また、尿中代謝物、血清脂質濃度等、曝露や交絡因子についてより有効な情報が得られる項目を追加して測定する。
チロシンキナーゼシグナルの制御機構

細胞増殖因子の受容体の多くは細胞内ドメインにチロシンキナーゼを内在しているかもしくはサイトカインの受容体のようにJAK型チロシンキナーゼが非共有結合によって会合している。慢性骨髄性白血病の原因遺伝子Bcr-Ab1から明らかなようにチロシンキナーゼの恒常的活性化は腫瘍や白血病の発生、悪性化に密接に関連している。さらにその下流で働くRasおよびSTATは細胞内シグナル伝達系できわめて重要な位置を占める。一方サイトカインのシグナルは単に細胞増殖のみならず免疫系の制御を通じて発がんやがんの進展に重要な役割を担っている。癌の約2割が炎症から発生すると言われているが、炎症性サイトカインとそのシグナルと癌の発生については不明な点が多い。最近TNF/NF-kB経路については多くの報告が見られるが、我々は炎症性サイトカインのシグナルに中心的な役割を果すSTAT転写因子群とその制御系であるSOCS分子、およびRas/MAPキナーゼ制御因子Sprouty/Spredファミリーとがんに関する研究を行ってきた。まず肝がんにおいてSOCS1は遺伝子のメチル化によって発現が低下するが、肝炎の前がん状態ですでに遺伝子のメチル化が起きていることを見い出した。また動物実験によってSOCS1遺伝子の発現低下が肝がんの発症率を上げることも確かめた。またHPVのがん遺伝子産物E7に結合してこれを分解することでE7の機能を抑制し子宮頸癌細胞の増殖を抑制することを見いだした。SOCS1は炎症とがん化を制御する新しいタイプのがん遺伝子であることが示された。またSpred-1がRhoと会合し細胞運動やがん細胞の転移を抑制することを見い出した。造血因子やサイトカインの受容体はJAK型チロシンキナーゼが非共有結合によって会合しシグナルを細胞内に伝える。それらのシグナル伝達機構は近年著しい勢いで解明がすすめられているが、チロシンキナーゼの活性制御機構に関しては未知の領域が多い。我々はCIS3,JABがJAKに結合しJAKチロシンキナーゼを抑制する活性があることを明らかにした。本研究ではJABによる活性化型チロシンキナーゼがん遺伝子TEL-JAK2の抑制機構について研究を行った。TEL/JAK2をstableにtransfectionしIL-3非依存性に増殖するBaF-TEL/JAK2にJABをtransfectionすると死滅した。このときC末側のSOCS-boxが重要な働きをしていることが明かとなった。pulse-chase実験によりJABによるTEL-JAK2の分解の促進を認めた。SOCS-boxを欠く変異JABではTEL-JAK2の分解は促進せず、SOCS boxがTEL-JAK2の分解に必要なことが示唆された。これらよりJABによるTEL-JAK2の活性化の抑制には、JH1へのJABの直接会合による抑制だけでなく、TEL-JAK2の分解も関わっていることが示唆された。実際TEL-JAK2の分解にユビキチン、プロテアソーム分解系が関わっていることを見だした。一方Cblは120KDaの細胞内蛋白を産生する原癌遺伝子であるが、チロシンキナーゼからのシグナルを負に調節する働きがあることが分かっている。しかしその抑制のメカニズムは明らかではなかった。我々はc-CblがRINGフィンガードメインを介してユビキチンリガーゼE2と会合することを発見しチロシンキナーゼの新たな負の制御機構を提唱した。実際にIn vivo及びIn vitroの実験においてCblとUbcH7が協同してEGF受容体のユビキチン化を促進することを示した。一方70ZCblのRINGフィンガーはUbcH7との結合が見られず、PDGF受容体やEGF受容体のユビキチン化を促進しないのみならずそれを抑制することが分かった。

これらによりCblのE3ユビキチンリガーゼとしての機能の損失はチロシンキナーゼ及びその下流のシグナルのダウンレギュレーションを阻害し、持続的な活性化に結びつき,その結果細胞のトランスフォームに寄与すると考えられた。Rasは細胞内シグナル伝達系できわめて重要な位置を占める。RasはC末を脂質で修飾されており細胞膜に存在し増殖因子など様々な外界の刺激で活性化される。Rasの恒常的活性化型変異は約30%の癌にみられ、細胞増殖と密接な関係があることがわかる。活性化されたRasは主にRafを細胞膜にリクルートしそこでRafはりん酸化(特にセリン388)され活性化される。活性化されたRafはMEKを、MEKはMAPキナーゼを活性化するカスケードを形成する。このようにRas/MAPキナーゼ経路の正のシグナル経路は近年かなりの理解が進んだが負の制御メカニズムに関しては未だ不明な点が多い。特にMAPキナーゼの下流に存在するいわゆるネガティブフィードバック制御因子はMAPキナーゼフォスファターゼであるMKP遺伝子群やショウジョウバエのEGF受容体アンタゴニストargos、EGF受容体の活性を抑制する膜タンパク質Kekkon1など以外はあまり知られていない。我々はレセプター型のチロシンキナーゼであるc-fmsやc-kitの新たな基質や制御因子を検索する目的でキナーゼドメインをbaitとしたyeast two-hybrid screeningを行ってきた。最近破骨細胞cDNAライブラリーより新たな分子を見いだした。N末端にEVH-1(Ena/Vasodilator-stimulated phosphoprotein homology-1)ドメインをC末端にSproutyと相同性のあるSprouty(SPR)ドメインをもっており、Spred(Sprouty-related protein with EVH-1 domain)と命名した。データベース検索によりSpredと類似するSpred-2もクローニングした。Spredは細胞膜に局在し活性化されたRas, Rafと複合体を形成することで、チロシンキナーゼからのRas/MAKキナーゼ経路を選択的に阻害する活性を有していることを明らかにした。またSproutyはFGFシグナルによるMAPキナーゼの活性化を特異的に阻害すること、保存されたチロシン残基に変異を導入することでドミナントネガティブ型になることを見いだした。今年度は以下のように多くの成果を得ることができた。(1)Ras/MAPキナーゼ系のネガティブフィードバック制御因子として発見されたSproutyが血管内皮細胞成長因子(VEGF)によるMAPキナーゼ活性においてはRasに依存しない経路をRafに結合して抑制することを発見した。またこのときN末端領域は必要無いことを示した。これはSproutyのMAPキナーゼ抑制機構の新たな発見である。(2)チロシンキナーゼシグナル伝達に重要なアダプター分子としてSH2-BとSTAP-2のノックアウトマウスの作成と解析を行った。SH2-Bノックアウト
デンドリマーを鋳型とした量子サイズへテロ金属微粒子の合成

4置換コアを有する第4世代フェニルアゾメチンデンドリマー(TPMG4)に対する金属集積を試みた。まず、塩化白金(IV)と塩化金(III)それぞれの集積挙動を紫外・可視吸収スペクトル(UV-vis)測定によって確認した。デンドリマーのクロロホルム:アセトニトリル=1:1溶液に対して金属塩化物のアセトニトリル溶液を滴下していった所、錯体吸収の増加とアゾメチン由来の吸収の低下が見られた。この反応における等吸収点を詳細に分析した所、最初の4当量に続いて8当量、16当量、32当量の金属の滴下に従って等吸収点がシフトしていることが明らかとなった。この等吸収点のシフトに要した金属塩化物の当量とデンドリマーの内層からのイミン数が一致したことから2種の金属塩化物がそれぞれデンドリマーに対して内層から放射状段階的に錯形成可能であることが明らかとなった。次に、塩化白金(IV)と塩化金(III)の複合的な集積を試みた。塩化金(III)をデンドリマーの内層(1から3層目)、塩化白金(IV)をその外層に集積するというヘテロな集積が様々な割合で可能であることが明らかとなった。得られた金-白金バイメタリック集積体に対して水素化ホウ素ナトリウムによる還元を行いバイメタリックナノ粒子を作成した。得られた粒子のTEM画像から単分散なナノ粒子が生成している事を確認し、XPS測定から金属原子が0価に還元されていることを確認した。これらのデンドリマー内包バイメタリックナノ粒子をグラッシーカーボン電極上にキャストし酸素還元触媒能を測定した。一定の割合までは金の含有量の増加に伴って白金原子当たりの触媒活性が増加することが明らかとなった。当初計画していた、バイメタリックナノ粒子の創製とその触媒能評価を行なっていることからおおむね順調に進展した。今後は、次のステージに向けてより精密な触媒能の評価と分子計算なども用いたナノ粒子のモデルも活用して、バイメタリックナノ粒子の構造解明に進めるとよい。四塩化チタンによる脱水縮合と過マンガン酸カリウムによる酸化反応を繰り返すことで精密金属集積能を有するフェニルアゾメチンデンドロンを合成した。続いて小さな4置換コアであるテトラフェニルメタンと脱水縮合することでクラスター保持能に優れると期待される第4世代のデンドリマー(TPMG4)を合成した。TPMG4とルイス酸との錯形成挙動の観測を紫外・可視吸収スペクトル(UV-vis)測定によって確認した。デンドリマーのクロロホルム:アセトニトリル=1:1溶液に対して塩化白金(IV)のアセトニトリル溶液を滴下していった所、錯体吸収の増加とアゾメチン由来の吸収の低下が見られた。この等吸収点のシフトに要した塩化白金(IV)の当量とデンドリマーの内層からのイミン数が一致したことから塩化白金(IV)がデンドリマーに対して内層から放射状段階的に錯形成していることが明らかとなった。次に、同様のUV-visタイトレーションを滴下金属を塩化金(III)に変更して行った。塩化白金(IV)の場合と同様に金属の滴下に従って錯体吸収の増加とアゾメチン由来の吸収の低下が見られた。等吸収点の分析から塩化金(III)もTPMG4デンドリマーに対して内層から放射状段階的に錯形成していることが明らかとなった。当初計画通りに、デンドリマーの合成と複数金属の放射状段階的錯形成の確認に成功しており、当初計画通りにおおむね順調に進展していると評価できる。

当初計画通りにデンドリマー内に複数の金属を同時に集積するヘテロ集積に関しての研究を推進する。さらに、白金を中心として集積金属の還元とクラスター作製を行ってその触媒能などの性質を明らかとする。今後は、次のステージに向けてより精密な触媒能の評価と分子計算なども用いたナノ粒子のモデルも活用して、バイメタリックナノ粒子の構造解明に進めるとよい。
胆汁酸代謝からみたクロストリジウム・ディフィシル関連下痢症の制御に関する研究

clostridium difficile関連下痢症(CDAD)の発症は、C. difficileに対して抗菌活性を有する二次胆汁酸の減少が一因とされている。その二次胆汁酸は、肝臓由来の一次胆汁酸を基質にして、大腸内でClostridium subcluster XIVa (XIVa)によって生成される。申請者らは作年度までに、極微量の糞便(肛門部拭い綿棒)または血清を用いて、大腸内XIVaの多寡を1時間以内に判定する新しい方法を確立した。本研究はこの方法を応用し、1)CDADの新規発症・再発の危険度を評価する方法の開発、2)難治例となるメカニズムの解明、さらに3)胆汁酸代謝からみたCDAD予防法の確立を目指す。平成30年度は、基礎実験として健常人での抗生剤(LVFX,ST合剤)投与前後の血清および糞便由来サンプルの胆汁酸分画を測定した。その結果、健常人に1週間程度LVFX,ST合剤を投与しても胆汁酸分画に有意な変化が認められないことが明らかになった。また、腸内細菌叢の変動因子を明らかにするため、ヒト型の胆汁酸組成を持った遺伝子改変マウスの飼育・繁殖を行った。さらに来年度以降の準備として、CDAD高リスク群の血清および糞便サンプルの収集を開始した健常人を使った基礎実験を行い、予定していたCDAD高リスク群の血清および糞便由来サンプル収集も開始した。平成31年度は、CDAD高リスク群のサンプル収集をさらに進める。また、収集したサンプルの胆汁酸分画測定を開始する。来年度(令和2年度)中には、既に所有している健常者の分析データと比較して、リスク群で有意に胆汁酸分画に違いがあるか否かを明らかにする。さらにヒト型の胆汁酸組成を持った遺伝子改変マウスを用いて、各種薬剤投与時に胆汁酸組成がどのように変化するかを検討する。平成30年度に注文した物品の納品と請求が遅れて、平成31年度になってしまったため。
擬似的な一細胞ダイナミクスの再構成による時空間的な遺伝子発現制御機構の解明

本研究では、一細胞トランスクリプトーム解析に不足した時間情報をデータ自身から推定し、並び替えた一細胞プロファイルを用いて系の時間発展を表す作用素の推定法を構築する。さらに推定した作用素の主要なモードを取り出すことで、分化や組織損傷等の環境変化に対するエピゲノム・トランスクリプトームの応答の低コストなシミュレーションを可能にできる技術基盤の開発を目指す。
酸素欠損型六方晶BaTiO_3における巨大誘電応答のメカニズム解明と制御

酸素欠損型六方晶BaTiO_3の巨大誘電率発生のメカニズムを解明するため、酸素欠損以外の方法で、Ba^<2+>を一部La^<3+>で置換する方法でTi^<3+>を生成させるアプローチにより、巨大誘電率を有する六方晶Ba_<1-x>La_xBaTiO_3単結晶の作製に成功した。Ti^<3+>の量はLa^<3+>の添加量により正確に規定されるため、巨大誘電応答とTi^<3+>量との定量的相関関係を明らかにした。さらに、実用化に向けた誘電率制御のプロセスを確立するため、酸素拡散率の温度依存性を測定した酸素欠損型六方晶BaTiO_3の巨大誘電率発生のメカニズムを解明するため、酸素欠損以外の方法で、Ba^<2+>を一部La^<3+>で置換する方法でTi^<3+>を生成させるアプローチにより、巨大誘電率を有する六方晶Ba_<1-x>La_xBaTiO_3単結晶の作製に成功した。さらに、実用化に向けた誘電率制御のプロセスを確立するため、酸素拡散率の温度依存性を測定した六方晶BaTiO3単結晶が酸素欠損により、室温で10万以上の巨大誘電応答を示すことを見出した[1-3]。この巨大誘電率材料を用いて積層コンデンサを実用化すれば、積層コンデンサのサイズと容量を飛躍的に向上できると期待される。本研究では、六方晶BaTiO3の巨大誘電率発生のメカニズムを解明し、これに基づいて誘電特性の精密制御の構築及び新規の巨大誘電率物質の探索指針をする。さらに実用化に向けた誘電率制御のプロセスを確立する。酸素欠損型六方晶BaTiO3の巨大誘電率発生の起源は、酸素欠損により生じるTi3+イオンに関連ことに着目し、酸素欠損以外の方法でTi3+を生成させるアプローチとして、Ba2+を一部La3+で置換する方法を試み、誘電率の変化について調べた。BaCO3、TiO2、La2O3を化学量論比で混合した後、FZ法で六方晶Bal-xLaxBaTiO3(x=0.001、0.003、0.005)単結晶を育成した。La3+の効果を明確にさせる為,育成した単結晶を空気中1273K、200時間以上のアニールにより酸化させ、酸素欠損の影響を除く。アニールしたx=0.003、0.005の単結晶では、室温での誘電率は10万以上であり、巨大誘電応答が保持されている。この結果から、La3+の置換によってTiの価数を制御することで、巨大誘電応答が得られることを確認した。この手法では、Ti3+の量はLa3+の添加量により正確に規定されるため、誘電応答とTi3+量との定量的相関関係を明らかにすることができ、結果として巨大誘電応答の精密制御が可能になる[1]J.Yu, et. al., Chem.Mater., 16(2004)3973-3975[2]J.Yu, et. al., Appl Phys. Lett., 87(2005)252904[3]余野建定,石川毅彦,伊藤満,符徳勝,固体物理41(2006)148六方晶BaTiO_3単結晶が酸素欠損により、室温で10万以上の巨大誘電応答を示すことを見出した[1-3]。19年度の研究により、Aサイトを置換したBa_<1-x>La_xBaTiO_3(x<0.5%)の単結晶も巨大誘電応答が観察された。その結果から、六方晶BaTiO_3系の巨大誘電率発生のメカニズムは従来の強誘電体のメカニズムと異なり、構造相転移に関連していない、酸素欠損と元素置換により生じるキャリヤとTi^<3+>イオン濃度に依存することは明らかになった。20年度では、実用化に向けて、キャリヤ濃度と誘電特性を定量的に制御するため、酸素拡散率の温度依存性を精密測定した。同位体置換用電気炉を用いて、酸素O_<18>雰囲気下で六方晶Ba_<1-x>La_xBaTiO_3(x=0,0.5%)単結晶を1173Kまでに加熱して、同位体置換を行った。質量分析装置(SIMS)により、同位体置換した試料の酸素O_<18>の濃度分布の測定に成功した。1173Kにおける六方晶BaTiO_3単結晶の(0001)結晶面と(1000)結晶面の拡散係数はそれぞれD_v=6.28X10^<-11>[cm^2/s]とD_v=7.18X10^<-11>[cm^2/s]である。これから、SIMS測定法により573-1273K温度範囲における六方晶BaTiO_3単結晶の酸素拡散率を確定すると共に、最適酸素濃度分布を達成するための熱処理方法を明らかとし、最適製造方法設計法を開発する。
真に臨床応用可能な細胞移植治療法の開発

『低ホスファターゼ症』は、全身で重度の骨形成不全を示す、難治性骨疾患の1つとして知られている。胎児期・新生児期に発症する周産期型は、最も重症なタイプであり、遺伝子変異によっては致死性も高く、予後不良な疾患である。そこで本研究では、全身での治療が必要となる『低ホスファターゼ症』をモデルとして、「真に臨床応用可能な細胞移植治療法」を開発することを目的としている。具体的には、1分化・増殖能・遊走能が極めて高い、超高純度間葉系幹細胞を用いた細胞移植治療の基盤技術開発、2遺伝子改変血球細胞を用いた細胞移植治療技術の開発を行う。いずれも、低ホスファターゼ症のモデルマウスである、Alplノックアウトマウスを治療対象として基盤技術を確立する。今年度は、上記の研究計画のうち、特に超高純度間葉系幹細胞を用いた研究を中心に実施した。移植する超高純度間葉系幹細胞の生着効率を高めるためには、レシピエントとなるマウスへ放射線照射を行うことが必要となる。野生型のC57BL/6マウスを用いて、放射線照射量の条件検討を行った。週齢(新生児、および4週齢)による放射線感受性の差は特に認められなかったが、メスでは10.5Gy,オスでは12Gy前後が致死量の閾値であることが明らかとなった。一方、研究で使用している低ホスファターゼ症モデルマウスは、C57BL/6マウスとは一部異なる遺伝的背景を持つためか、放射線感受性がやや低めであることが明らかとなった。現在は、放射線照射を行った低ホスファターゼ症モデルマウスに対する、超高純度間葉系幹細胞の移植を行っているとこである。また、遺伝子改変血球細胞を用いた計画についても着手し、研究を進めている。当初の研究計画通り、概ね順調に進捗している。今後も、当初の研究計画に沿って研究を実施する。予期せぬトラブルなども考えられるため、予定通りの結果や進捗が得られない場合には、多角的なアプローチを行い、原因の解明と対処を行う計画である。科研費等の限られた予算で研究を効率的に遂行するため、研究室内の他の研究者らと効率的な予算運用を行った。その結果、消耗品を安価に購入したり、消耗品の過剰な在庫を保有する必要がなくなったため、当初の予定よりも消耗品にかける予算を削減することが可能となった。
色素性乾皮症フェノタイプ多様性と酸化的DNA損傷修復能との関連に関する研究

本邦色素性乾皮症(XP)患者の約半数に合併し、患者予後に深く関わる神経学的異常の発症メカニズムは未だ不明である。今回、in vitroでルシフェラーゼ発現ベクター(pLuc)にローズベンガル、可視光線処理して光力学反応によりプラスミドDNA内に酸化的DNA損傷を誘発し、その損傷の修復力を宿主細胞回復能を指標にして解析した。材料としては研究代表者が長年所持している各群XP細胞(XPA細胞10系統、非XPA細胞22系統)を用いた。その結果XPA群細胞では紫外線性DNA損傷の修復に重要な機能を果たしているヌクレオチド除去修復能のみならず塩基除去修復系にも異常があることが判明した。XPA群以外のXP細胞においても一部で修復能の低下が見られた。この結果は酸素を最も消費する部位である脳神経細胞内に残存する酸化的DNA損傷がXP神経症状の発症に関わっている可能性を示唆する。色素性乾皮症(xeroderma pigmentosum;XP)は本邦において比較的高頻度(1/5万人)の遺伝性高発癌性光線過敏症である。特に欧米症例では稀な進行性の神経変性(中枢末梢神経)が約60%に出現し、その重症度が予後に深く関与するが、この分子機構は未だ不明である。XPは紫外線性DNA損傷を修復する主なパスウェイであるヌクレオチド除去修復機構(NER)に異常がある疾患であるが、XP神経症状はNERの異常では説明できない。そこでまず、XP神経症状との関連が最近示唆されている酸化的DNA損傷の修復能を細胞レベルで解析する鋭敏なシステムをローズベンガル処理+可視光線(キセノンランプ)照射したルシフェラーゼ発現ベクター含有のレポータープラスミドを細胞に遺伝子導入することで確立した。次いで、同法を用いて研究者が保管している18系統のXP細胞、3系統のCS細胞、6系統の正常細胞(いずれも患者あるいた健常人皮膚由来の初代培養線維芽細胞)を用いて検討したところ、重篤なXP神経症状が必発するXPA細胞では酸化的DNA損傷(主として8オキソグアニン)に対する修復能が正常細胞における修復能の約40%であり有意に低下しているという所見を得た。XPD細胞でも低下する傾向がみられたが、XP神経症状との関連は見いだせなかった。XPC、XPF、XPG、CS(Cockayne syndrome;XP)細胞では低下はみられなかった。この結果はXPA群において酸化的DNA損傷と神経症状との関連を示唆するものである。我々は近年、酸化的DNA損傷の蓄積が色素性乾皮症(XP)の臨床症状の多様化にも関与しているのではないかという仮説のもと、酸化的DNA損傷の修復能(塩基除去修復能base excision repair;BER)を定量化するシステムを確立した。まずローズベンガル処理と可視光線照射により人工的に酸化的DNA損傷のひとつである8OHdGをレポータープラスミド(ルシフェラーゼ発現プラスミド)に誘発し、その損傷プラスミドを色素性乾皮症などの患者由来線維芽細胞に導入する。その後宿主細胞回復能を指標にして、各細胞における酸化的DNA損傷の修復能力(DNA repair capacity;DRC)を算出した。その結果、ほとんどの重症XPA患者由来細胞(8/10症例)でDRCの有意な低下を認め、その低下はXPA遺伝子導入により軽度だが有意に回復した。さらにXPA細胞におけるDRC値は臨床的重症度、XPA遺伝子変異と関連性がみられた。XPC細胞では1/3例、XPD細胞は5/6例、XPF細胞は3/5例、XPG細胞では2/2例、XPV細胞では2/6例にDRCの低下をみたがXP各群間には差がみられなかった。XPF遺伝子導入では低下したXPF細胞のDRCの回復はみられなかった。A群以外のXPにおいてはDRCと臨床的重症度との関係は見いだせなかったが、この点については患者の現年齢、XP確定診断年齢、遮光開始時期、遮光の程度などを加味して再考する必要がある。今回の結果は、(1)これまでNER特異的と言われていたXPA因子がNERにのみならずBERにも関わっている可能性、(2)XP細胞のBER機能は様々であり低下している症例も多く存在する、(3)XPの臨床的多様性にBER機能が関与している可能性を示唆する。
レーザ・マニプレーターを組込んだ細胞工学用顕微鏡の開発

研究方法:1.昭和60年度に試作した「レーザ・マープレーターを組込んだ細胞工学用顕微鏡」は、1種類のレーザ光しか導光できないので、最終年度である本年度は新たに「レーザ光路切換装置」を設計・試作し、複数のレーザが導光できるシステムとする。2.この「レーザ光路切換装置」を介して、新たにアルゴン・イオンレーザを顕微鏡に組込み、前年度のヘリウム・ネオンレーザによる本システムの細胞工学的応用の基礎実験と同様の実験を、培養悪性黒色腫細胞を対象に行ない、アルゴン・イオンレーザの生物学的効果について検討し、あわせて、レーザの線源による作用効果の相違についても検討を加えた。研究成果(新たな知見):試作した「レーザ光路切換装置」によれば、ガラスファイバーで導光できるレーザであれば、普遍的に本システムに組込むことができる。したがって、当面の課題であるアルゴン・イオンレーザやNd:YAGレーザばかりでなく、将来、医学的応用にとどまらず生物学的応用(すなわち細胞工学的応用)が期待される半導体レーザや色素レーザについても導光し組込むことができる。また、この装置によってレーザ光の選択はレバーの切換えで簡単に行なえるので、同一細胞(照準)に複数のレーザを照射することもできるなど、その応用範囲は極めて広くなり画期的なものとなった。本システムによるアルゴン・イオンレーザの細胞工学的応用に関して検討を加えた結果、ヘリウム・ネオンレーザと同様に、超微細工学的な細胞の外科的手術(穿孔、切断)が可能であることが示された。今後の研究の展開に関する計画:レーザ照射によって、細胞の形質が変わることを細胞レベルで明らかにすることができれば、細胞外科的な応用にとどまらず、レーザによる細胞生物学的な細胞工学の新分野が開拓されるものと考え、研究を推進している。研究実施計画1.恒温槽付きの培養倒立顕微鏡((株)日本光学製)に、ヘリウムネオンレーザ発振装置((株)日本電気製)からのレーザ光を導光し、培養細胞に照準・照射できるように設計・試作する。2.試作したレーザ・マニプレーターを組込んだ細胞工学用顕微鏡を用いて、ヒト悪性黒色腫培養細胞(HMV-【I】,【II】)に試験照射する。3.レーザ被照射細胞を形態学的・機能的に検索し、レーザの細胞学的効果を検討し、あわせて試作機の改良点を検討する。研究成果1.レーザ光を培養顕微鏡に導光する方法は、レーザビームを落射照明する方式とし、対物レンズによって培養皿の焦点位置にレーザを集光してマイクロ・ビームを得るように設計・試作した。試作機は、特に以下の機能を具備している。レーザ光による網膜損傷の安全対策として照射時には観察光路が遮断されること。被照射培養細胞へのレーザ・マイクロ・ビームの照準は、TVモニター上で行うようにし、画面上で経時的観察もできること。レーザの照射時間を設定できること。被照射部でのレーザ・パワー・エネルギーを測定できること。2.黒色腫培養細胞の色素形成能と多核細胞化(細胞融合)を指標として、レーザの細胞工学的効果をみると、色素の脱落や多核細胞が得られることがあるが、未だ再現性に乏しい。今後の研究方針現在の導光系では、レーザの発振線源が一つに限定されてしまうので、複数の発振線源からの異なるレーザ光(特に、アルゴンイオンレーザ)を選択・変換できる導光系を開発する。また、培養細胞の微小細胞外科的処置や形質変換を得るレーザ照射条件を明らかにし、レーザの細胞工学的応用技術の基礎を確立する。