hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト動原体蛋白質Mis12複合体の異常とがん化

申請者は、最近ヒトの動原体タンパク質Mis12複合体を精製し、構成因子の同定に成功した。その中には低分化度の腫瘍で高発現していることが知られているHEC1/KNTC2およびAF15q14が含まれていた。本課題は、ヒトMis12複合体の構成因子の機能発現異常とがん細胞の形質の変化との共役についてアプローチすることを目的とした。本年度は、M期チェックポイントで重要な役割を果たすBub1、BubR1が、それぞれのTPRモチーフを介して、Mis12複合体の構成因子であるBlinkin/AF15q14のN末端領域と結合することをみいだした。また、その結合を阻害することにより、チェックポイント機能の欠損、微小管結合能の欠損を示す表現型が得られた。これらの結果は、M期チェックポイントネットワークの動原体側の分子基盤を初めて明らかにしたものであり、がん化との関わりにおいて大変価値の高いものであると思われる。また、Blinkin/AF15q14はMis12、Zwint-1、HEC複合体と直接結合することが明らかとなり、微小管と相互作用するとの報告もあることから、キネトコアの構造的、制御的な要の因子であることが示唆された。また、Mis12複合体の構成因子のhMis14/DC8は、HP1、Blinkin/AF15q14、hMis13/c20orf172の3者と相互作用することから、Mis12複合体の中で染色体とouter kinetochoreを結ぶ要の分子であることが示唆された。その中には低分化度の腫瘍で高発現していることが知られているHEC1/KNTC2およびD40/AF15q14/KIAA1570が含まれていた。これを踏まえて本課題では、ヒトMis12複合体の構成因子の機能発現異常とがん細胞の形質の変化との共役についてアプローチすることを目的とした。本年度は、特にMis12複合体とヘテロクロマチン蛋白質であるHP1との相互作用について解析を行った。HP1との結合にはMis12コア複合体の構成因子であるDC8が直接的に寄与していること、また、その責任アミノ酸を同定した。この情報に基づき、HP1と結合できない変異Mis12複合体を内在性のものと置き替えて細胞内で発現すると、M期に染色体が赤道面に並ばないという、典型的な染色体の分配異常の表現型を示した。また、この細胞では動原体が完全に構築できていないことが明らかとなった。これまで、HP1はRad21などと相互作用してセントロメア領域の染色体合着に寄与することが知られていたが、本研究により、HP1が動原体装置そのものと協調的に働き、染色体分配に寄与することが明らかとなった。ヘテロクロマチンは様々な染色体上の機能装置の構築に寄与し、遺伝情報の安定維持に寄与していることが示唆されていたが、その具体的なリンクは不明であった。本年度の課題で、その重要なパスウェイの具体的なリンクのひとつを初めて示すことができたと考えている。
口腔癌における細胞接着、増殖、転写関連因子の遺伝子解析

研究I:外科的に治癒切除された口腔癌140例における分子マーカー(p53、cyclinD1、EGFR)の発現を免疫組織化学的に検索し、既存の臨床病理学的因子や患者の予後成績との関係について検討した。各分子マーカーの発現は臨床病理学的因子や予後に関係しなかったが、各分子マーカーの累積発現は予後と有意に相関し、独立した予後因子となることが明らかになった。研究II:外科的に治癒切除された口腔癌64例における癌抑制遺伝子Rbファミリー(Rb2)の遺伝子突然変異と遺伝子産物の発現を免疫組織化学的に検索し、既存の臨床病理学的因子や患者の予後成績との関係について検討した。Rb2遺伝子突然変異との関連が示唆される細胞質内蛋白発現をみる例を含め、38例全例にRb2遺伝子の突然変異は認められなかった。しかし細胞質内蛋白発現をみる例は有意に予後不良で、Rb2遺伝子の変化は癌の悪性形質に関与している可能性が示唆された。研究III:上皮細胞の細胞接着機能と細胞のシグナル伝達の活性化機能を併せ持つβ-catenin遺伝子の突然変異と遺伝子産物の発現を検索した。β-catenin遺伝子突然変異との関連が示唆される核内・細胞質内蛋白発現をみる例を含め、38例全例にβ-catenin遺伝子の突然変異は認められなかった。β-catenin蛋白の細胞膜減少型・細胞質発現例は細胞膜保存例や核内発現例より有意に予後不良であった。口腔癌一次症例190例から得られた癌の生検ならびに手術材料、口腔癌39例の-80°C保存凍結癌組織、口腔癌樹立細胞8株を用いて以下の研究を行い、個々の症例の臨床所見と対比した。1.口腔癌122例において癌抑制遣伝子Rb2/p130蛋白発現陽性例は有意に予後良好、は予後不良で、多変量解析にてRb2/p130は独立した予後因子として選択された。しかし遺伝子変異が想定される減弱例を含め、39例の口腔癌にはRb2/p130遺伝子変異は認められなかつた。2.口腔癌38例におけるβ-カテニン減弱例は有意に予後不良であつたが、遺伝子変異が想定される核/細胞質発現例は予後に関係しなかつた。また、遺伝子変異の想定される核/細胞質発現例はを含め、口腔癌細胞には遺伝子変異は認められなかつた。癌細胞核/細胞質発現は増殖因子EGFR、癌抑制遺伝子p53、蛋白分解酵素MMP-9の発現と正の相関を示したが、cyclin D1の発現と無関係であつた。β-カテニン発現には蛋白リン酸化関連シグナル伝達因子の関係が重用と考えられた。3.p53遺伝子変異は口腔癌83例中26(31%)にみられ、必ずしもp53蛋白発現(54%)と相関しなかつたが,予後ならびに化学療法効果予測因子として重要であつた。4.口腔癌におけるp53蛋白発現様式と予後との関係につて検索した。p53び慢性分布型(p53陽性率50%以上)はp53散在型(陽性率10%以下)、中間型(陽性率10-50%)に比し、有意に予後不良であつた。5.口腔癌と同様の組織像を示す肺癌細胞におけるアデノウイルス関連因子E1AF、関連転写因子Ets-1の浸潤能について検索した。E1AFは癌細胞の運動、浸潤に本質的に関与することが示唆された。

各分子マーカーの発現は臨床病理学的因子や予後に関係しなかったが、各分子マーカーの累積発現は予後と有意に相関し、独立した予後因子となることが明らかになった。研究II:外科的に治癒切除された口腔癌64例における癌抑制遺伝子Rbファミリー(Rb2)の遺伝子突然変異と遺伝子産物の発現を免疫組織化学的に検索し、既存の臨床病理学的因子や患者の予後成績との関係について検討した。Rb2遺伝子突然変異との関連が示唆される細胞質内蛋白発現をみる例を含め、38例全例にRb2遺伝子の突然変異は認められなかった。しかし細胞質内蛋白発現をみる例は有意に予後不良で、Rb2遺伝子の変化は癌の悪性形質に関与している可能性が示唆された。研究III:上皮細胞の細胞接着機能と細胞のシグナル伝達の活性化機能を併せ持つβ-catenin遺伝子の突然変異と遺伝子産物の発現を検索した。β-catenin遺伝子突然変異との関連が示唆される核内・細胞質内蛋白発現をみる例を含め、38例全例にβ-catenin遺伝子の突然変異は認められなかった。β-catenin蛋白の細胞膜減少型・細胞質発現例は細胞膜保存例や核内発現例より有意に予後不良であった。
トランスポゾンによる線毛変異株の分離とその解析

Porphyromonas gingivalisに応用可能なBacteroides属のトランスポゾン(Tn4351:Tnと省略)を使って線毛欠損変異株を多数単離し、これを順次解析する事によって、線毛形態形成に必須な染色体領域を同定し解析する事を計画した。この研究のなかで、パルス・フィールド・ゲル電気泳動によって染色体の巨大DNA断片を分析し、主要構成蛋白質をコードする遺伝子fimAは、780kbNotI断片上にある事が分かった。少なくとも8つのTn変異株は、fimAの存在する780kbNotI断片とは別の約300kbNotI染色体断片上に変異が入っていることを明かとした。これら変異株は近接した特定のDNA領域上にTnが挿入されており第二の必須領域と考えられたので、一つの変異株からTn挿入領域をクローン化し、塩基配列の決定を進めた。得られた塩基配列を使って本菌株ゲノム配列(インターネット上に公開されている)との相同性検索を行うと、Tnが転位している第二の領域には、細菌の二成分情報伝達系の一つが存在することが判明した。この二成分系は、fimSとfimRと名付けた2つの遺伝子で構成されていた。すなわちこの二成分系が線毛の発現において正の調節因子として働いているらしい事が分かった。これは本菌では初めて機能に関連して見つかった二成分情報伝達系である。その後この領域の塩基配列を完成させた。配列情報を使って、残る7つの変異株のTn挿入位置を決定すると、6つがfimSに、1つの変異株はfimRに変異が見つかった事から、2つの遺伝子共に線毛の形成に必須であると推測できた。本菌で初めて見つかった二成分情報伝達系の働きについてさらに検討を進めている。Porphyromonas gingivalis線毛の主要構成蛋白質(fimbrilin)をコードする遺伝子(fimA)の近傍約10kbに存在するいくつかのオープン・リーディング・フレーム(ORFs)の研究を行なってきた。特に遺伝子とその産物の分析を通して、これらORFsが線毛形成と線毛の機能にどのように関与しているのか、その役割を探索してきた。現時点では、いずれも線毛形成に必須の成分という確たる証拠が得られていない。そこで、トランスポゾン(Tn4351:Tnと省略)を使って、線毛欠損株を作製し、これを解析することを通して、線毛形成に必須な遺伝子の探索と同定を広範囲に進めてきた。多数のTn変異株を分離した後に線毛が欠損している株を免疫学的に選択した。その結果、22株の線毛欠損株を得た。そのうち8つの変異株はfimAの内部にTnが挿入されていた。残る14の変異株は、上記のfimAを含む10kb領域の外にTnが挿入されていた。これらTn挿入領域の未決定な5つの変異株は、通常のゲル電気泳動とパルス・フィールド・ゲル電気泳動および各種の制限酵素を使った分析によって、同じDNA断片上にTnが挿入されていると考えられる結果が得られた。つまり線毛形成に必須な新しい領域が存在する事が推測された。現在Tn挿入領域をTnを含めてクローン化した。この領域はまったく新しい領域であることが判明した。今後は親株から同じ領域をクローン化し、その塩基配列の決定などの解析を行ない、fimA以外の線毛形成に必須な領域の解明を行なう計画である。

特に遺伝子とその産物の分析を通して、これらOFRsが線毛形成と線毛の機能にどのように関与しているのか、その役割を探索してきた。現時点では、いずれも線毛形成に必須の成分という確たる証拠が得られていない。そこで、今回の研究計画ではトランスポゾン(Tn4351:Tnと省略)を使って、線毛欠損株を作製し、これを解析することを通して、線毛形成に必須な遺伝子の探索と同定を広範囲に進めてきた。前年に引き続き、Tn挿入領域の未決定な複数の変異株の解析をさらに進めた。通常のゲル電気泳動とパルス・フィールド・ゲル電気泳動および各種の制限酵素を使った分析によって、近接したあるDNA領域上にTnが挿入されていると考えられる結果が得られた。これらの一つの変異株から、線毛形成に必須な新しい領域をクローン化し、部分塩基配列を決定した。これにより、この領域はまったく新しい領域であり、未完成ながら、インターネット上に公開された本菌W83株ゲノム配列との相同性検索から、細菌の二成分情報伝達系の一つであることが判明した。上流にセンサー・キナーゼ遺伝子及び、すぐ下流に調節遺伝子がタンデムにあたかもオペロンであるかのごとくに並んでおり、いずれも線毛の形成に必須な領域である事が、7つの変異株のTn挿入位置の解析から推測できた。今後はこの領域の完全な塩基配列を決定し、その遺伝子産物の解析を行ない、fimA以外の線毛形成に必須な領域の解明を行なう計画である。あわせて本菌で初めて見つかった二成分情報伝達系の働きについて検討を加えたい。Porphyromonas gingivalis線毛の形態形成に必須な遺伝子の同定をトランスポゾン(Tn4351:Tnと省略)を使って、線毛欠損株を作製し、これを解析することを通して、進めてきた。Tn挿入領域の決定を、各種の制限酵素を使った通常のゲル電気泳動とパルス・フィールド・ゲル電気泳動によって分析し、少なくとも8つのTn変異株は、線毛の主要構成蛋白質(fimbrilin)をコードする遺伝子(fimA)の存在する780kbNotI断片とは異なる染色体に変異が入っていることを明かとした。これら変異株は近接した特定のDNA領域上にTnが挿入されていると考えられる結果が得られたので、一つの変異株から、線毛形成に必須な新しい領域をクローン化し、部分塩基配列を決定した。本菌W83株ゲノム配列(未完成ながら、インターネット上に公開されている)との相同性検索から、細菌の二成分情報伝達系の一つであることが判明した。上流にセンサー・キナーゼ遺伝子(fimS)、すぐに下流に調節遺伝子(fimR)がタンデムにあたかもオペロンであるかのごとくに並んでいた。その後この領域の塩基配列を完成させた。配列情報を使って、7つの変異株のTn挿入位置を決定すると、6つがfimSに、1つの変異株はfimRに変異が見つかった事から、2つの遺伝子共に線毛の形成に必須であると推測できた。本菌で初めて見つかった二成分情報伝達系の働きについてさらに検討を進めている。
高アルベドサツマイモによる熱環境緩和効果の高い屋上緑化技術の開発

1日当たりの潅水量を同一にした条件で、潅水の頻度と時間を変化させた3つの潅水方法でサツマイモ品種テラスライム(丸葉黄葉)とベニアズマを栽培し、植被展開速度と物質生産を比較した。島根大学生物資源科学部3号館屋上に設置した高さ0.1mの木枠内に屋上緑化用軽量土壌をいれ栽培圃場とした。供試サツマイモ品種を5月下旬に、栽植密度2.5株/m^2で移植した。潅水は点滴潅水チューブに潅水タイマーを用いて日当たり約8mm/dayとなるよう与えた。朝1回潅水を行う区(朝1回区)、朝と昼に行う区(朝昼区)、約20分間隔に1分間潅水を行う区(常時潅水区)の3つの潅水処理を行った。植被展開速度をデジタルカメラによる画像解析法で求めるとともに、8月下旬から熱収支式各項(Rn、LE、H、G)、地温、気孔伝導度、土層毎の体積土壌水分含量を測定し、収穫期にバイオマス調査を行った。いずれのサツマイモ品種も葉面積が拡大する時期の植被展開速度は朝1回区に比較し、朝昼区、常時潅水区で大きく、常時潅水区が早期に植被を確立した。収穫期のバイオマス量も朝昼区、常時潅水区は朝1回区に比較して大きかった。朝1回区の気孔伝導度は午前中高いものの午後に急激に減少したのに対して、朝昼区、常時潅水区の気孔伝導度は午後も高く維持されていた。このことは、朝1回区の畝の表層土壌水分含量が午後に低下することに加えて、サツマイモの根長密度が表層に多く、下層には少ない根系特性を持つことから水分ストレスが生じ、物質生産が抑制されたものと示唆された。従って、日中の畝表層の土壌水分含量が高く維持されるよう、頻繁に灌水を行うことにより、日蒸発量程度に使用水量を限定した場合でもサツマイモの植被展開と熱低減が効率化できると結論された。屋上緑化におけるセダムの代替植物として、植物群落の反射率(アルベド)が高いことで、植被が受ける放射エネルギー(純放射量・Rn)が小さい黄緑色系の「高アルベドサツマイモ」を導入し、形態・生態学的比較と熱収支解析とを組み合わせ、気温と地温(建物内温度)を効率的に低減させる機作を明らかにした。従来品種の沖縄100号、コガネセンガン、すいおう、なると金時、ベニアズマ、ベニコマチ、葉身の色・形状が従来品種と異なるテラスライム(黄緑丸葉)、テラスブロンズ(紫丸葉)、切葉緑系統、切葉紫系統、黄緑新系統を5月下旬に、栽植密度2.5株/m^2で移植した。潅水は自動潅水器を用い約8mm/dayを与えた。地表面が受ける純放射量・Rnは潜熱伝達量(LE)、顕熱伝達量(H)及び地中熱伝導量(G)として消費される。そこで、8月下旬から熱収支式各項(Rn、LE、H、G)、地温、体積土壌水分含量を測定するとともに、個体群構造を測定した。高アルベドサツマイモであるテラスライムと黄緑新系統は従来品種と比較して葉色値が低く、反射率が2025%高いことにより日射吸収率が小さくRnが少なかった。一方、LE、H、GをRnとLE/Rn、H/Rn、G/Rnの積としてそれぞれ表すと、LE/Rnは約8%の品種間差があり、高いLAIによるLE/Rnの増加によってH(気温)は低下した。地温(建物内温度)は高いLAIによるG/Rnの減少によって低減できた。従って、Rnが従来品種よりも一貫して小さく、且つ高いLAIを維持した高アルベドサツマイモは、気温・地温を効率的に低減した。ただし、過密な葉群構造による蒸散の抑制が問題となる場合があった。過密な葉群構造から蒸散が抑制されていることが前年の研究結果から示唆された黄緑色系の「高アルベドサツマイモ」であるテラスライムについて、人為的に群落構造(植被高)を改変した場合の潜熱量の増大と気温の低減効果を明らかにした。葉身の色・形状が従来品種と異なるテラスライム(黄緑丸葉)を5月下旬に、栽植密度2.5株/m2で移植した。植被が完全に覆われる前の7月中旬から仮設資材を用いて植被の高度を変化させるための棚を作成し、サツマイモの蔓を誘引した。棚の高さは高(80cm)・中(60cm)・低(40cm)の3段階とした。8月下旬から熱収支式各項(Rn、LE、H、G)、地温、体積土壌水分含量を測定するとともに、群落構造を測定した。人為的に植被高を変化させた場合、サツマイモ収穫期の群落構造は異なった。

棚を高くした揚合の葉数は一般的な栽培管理(低)に比較して葉数が48%増加した。ただし、棚に蔓を誘引した場合には個葉の葉面積は小さくなった。地上部バイオマス重は誘引によって増加したが、反対に塊根収量は減少し、その結果、全乾物重にはほとんど差が見られなかった。誘引による熱収支への影響は、棚によって群落高度を増加させた場合、潜熱量がわずかながら増加し、群落高度が高い場合の気温はわずかに低くなった。ただし、もともとの気温プロファイルの影響は除外できないので、今後誘引によって群落高度を増加させた場合の効果をさらに解析する必要がある。1日当たりの潅水量を同一にした条件で、潅水の頻度と時間を変化させた3つの潅水方法でサツマイモ品種テラスライム(丸葉黄葉)とベニアズマを栽培し、植被展開速度と物質生産を比較した。島根大学生物資源科学部3号館屋上に設置した高さ0.1mの木枠内に屋上緑化用軽量土壌をいれ栽培圃場とした。供試サツマイモ品種を5月下旬に、栽植密度2.5株/m^2で移植した。潅水は点滴潅水チューブに潅水タイマーを用いて日当たり約8mm/dayとなるよう与えた。朝1回潅水を行う区(朝1回区)、朝と昼に行う区(朝昼区)、約20分間隔に1分間潅水を行う区(常時潅水区)の3つの潅水処理を行った。植被展開速度をデジタルカメラによる画像解析法で求めるとともに、8月下旬から熱収支式各項(Rn、LE、H、G)、地温、気孔伝導度、土層毎の体積土壌水分含量を測定し、収穫期にバイオマス調査を行った。いずれのサツマイモ品種も葉面積が拡大する時期の植被展開速度は朝1回区に比較し、朝昼区、常時潅水区で大きく、常時潅水区が早期に植被を確立した。収穫期のバイオマス量も朝昼区、常時潅水区は朝1回区に比較して大きかった。朝1回区の気孔伝導度は午前中高いものの午後に急激に減少したのに対して、朝昼区、常時潅水区の気孔伝導度は午後も高く維持されていた。このことは、朝1回区の畝の表層土壌水分含量が午後に低下することに加えて、サツマイモの根長密度が表層に多く、下層には少ない根系特性を持つことから水分ストレスが生じ、物質生産が抑制されたものと示唆された。従って、日中の畝表層の土壌水分含量が高く維持されるよう、頻繁に灌水を行うことにより、日蒸発量程度に使用水量を限定した場合でもサツマイモの植被展開と熱低減が効率化できると結論された。
ロータフラップ角制御による超ロバストなスタビレス無人ヘリコプタの実現

サブテーマ(1)ロータブレードのフラップ角推定機構では,レーザ変位計測によりロータブレードのフラッピング運動を計測するシステムを開発し,飛行実験によりその検証を行った.その結果,ヘリコプタの飛行中に,ロータブレードだけでなくスタビライザブレードのフラッピング運動の計測にも適用できることを示した.さらに,ヘリコプタの動力学を基にした航法システムを構築のために,系を連続時間システムと離散時間システムが複合するハイブリッドシステムとしてモデル化し,一般化Tellegenの定理を適用し,観測データとモデルの同化を行うために必要なシステムの感度を求める方法を導出した.さらに,計算速度・効率の大幅な向上を目的としてシステムの二次感度を効率よく求める方法も導出した.サブテーマ(2)フラッピングダイナミクスの散逸性による陰的制御では,ロータブレードのフラップ角を陽に用いない飛行制御系を構築する方法を提案した.従来のようにロータブレードのフラップ角を考慮せずに設計した制御系では,フラップ角の共振が原因となって,飛行が不安定化することを明らかにした.さらに,提案法をスタビレス化した機体だけでなく,スタビライザを有する産業用無人ヘリコプタに対して適用できるよう拡張する方法を提案した.スタビライザを有する場合,スタビライザのロック数がロータブレードと比較して小さいことが原因となって,スタビライザのフラップ角共振が問題となりやすいが,スワッシュサーボのダイナミクスが入力を帯域制限することにより適切に制御可能であることを明らかにした.これら構築した飛行制御系の制御特性やロバスト性をフライトシミュレータにより確認した.開発したフラッピング運動計測システムは,ロータブレードだけでなくスタビライザブレードのフラッピング運動の計測にも適用できることが判明した.また,観測データとモデルの同化を行うために必要となる連続時間・離散時間システムの感度を求める方法も導出した.これらの成果は,これまでの研究により構築した運動モデルの検証と改善を図る基盤として活用できる.また,本研究で提案したフラップ角制御を内在する飛行制御系によれば,スタビレス化した無人ヘリコプタ(スタビレス機)の制御を実施できることを数値シミュレーションにより明らかにした.このため,2018年度の研究目標は達成され,順調に研究が進展しているといえる.予定通り,サブテーマ(1),(2)について研究を進める以外に,今後はサブテーマ(3)適応フラッピング制御に基づく超ロバスト性の実現についても研究を開始する.また,開発したフラッピング運動計測システムでは,用いたマイコンCPUの能力制限のために,サンプリングレートをさらに向上させる必要がある.さらに,飛行実験により,構築した飛行制御系の性能の確認を実施する.サブテーマ(1)ロータブレードのフラップ角推定機構では,レーザ変位計測によりロータブレードのフラッピング運動を計測するシステムを開発し,飛行実験によりその検証を行った.その結果,ヘリコプタの飛行中に,ロータブレードだけでなくスタビライザブレードのフラッピング運動の計測にも適用できることを示した.さらに,ヘリコプタの動力学を基にした航法システムを構築のために,系を連続時間システムと離散時間システムが複合するハイブリッドシステムとしてモデル化し,一般化Tellegenの定理を適用し,観測データとモデルの同化を行うために必要なシステムの感度を求める方法を導出した.さらに,計算速度・効率の大幅な向上を目的としてシステムの二次感度を効率よく求める方法も導出した.サブテーマ(2)フラッピングダイナミクスの散逸性による陰的制御では,ロータブレードのフラップ角を陽に用いない飛行制御系を構築する方法を提案した.従来のようにロータブレードのフラップ角を考慮せずに設計した制御系では,フラップ角の共振が原因となって,飛行が不安定化することを明らかにした.さらに,提案法をスタビレス化した機体だけでなく,スタビライザを有する産業用無人ヘリコプタに対して適用できるよう拡張する方法を提案した.スタビライザを有する場合,スタビライザのロック数がロータブレードと比較して小さいことが原因となって,スタビライザのフラップ角共振が問題となりやすいが,スワッシュサーボのダイナミクスが入力を帯域制限することにより適切に制御可能であることを明らかにした.これら構築した飛行制御系の制御特性やロバスト性をフライトシミュレータにより確認した.開発したフラッピング運動計測システムは,ロータブレードだけでなくスタビライザブレードのフラッピング運動の計測にも適用できることが判明した.また,観測データとモデルの同化を行うために必要となる連続時間・離散時間システムの感度を求める方法も導出した.これらの成果は,これまでの研究により構築した運動モデルの検証と改善を図る基盤として活用できる.また,本研究で提案したフラップ角制御を内在する飛行制御系によれば,スタビレス化した無人ヘリコプタ(スタビレス機)の制御を実施できることを数値シミュレーションにより明らかにした.このため,2018年度の研究目標は達成され,順調に研究が進展しているといえる.予定通り,サブテーマ(1),(2)について研究を進める以外に,今後はサブテーマ(3)適応フラッピング制御に基づく超ロバスト性の実現についても研究を開始する.また,開発したフラッピング運動計測システムでは,用いたマイコンCPUの能力制限のために,サンプリングレートをさらに向上させる必要がある.さらに,飛行実験により,構築した飛行制御系の性能の確認を実施する.
モルモット分離肝細胞におよぼす揮発性吸入麻酔薬の影響

モルモットを使用し,タンパク分解酵素灌流法により分離肝細胞を作成した。分離肝細胞を37°Cで2時間培養したのち,Fura-2AMを添加し,さらに40分間培養した。ついで細胞外のFura-2AMを洗浄したのち,日本分光社のCAF-100 Ca^<2+>analyzerを使用して,励起波長340nmおよび380nm,蛍光波長500nmにおける蛍光強度比により,静止期肝細胞内Ca^<2+>濃度を測定した。ついで,揮発性吸入麻酔薬を注入して,同様の方法で肝細胞内Ca^<2+>濃度の測定をおこなった。また,トリパンブルー染色を,肝細胞分離後,Fura-2AM添加後,揮発性吸入麻酔薬注入後におこない,肝細胞の生存率を評価した。平成4年度は,静止期肝細胞内Ca^<2+>濃度の測定法が確率し,その濃度は約150nMであることがわかった。平成5年および6年度は,揮発性吸入麻酔薬のハロセン,イソフルラン,セボフルランを添加し,肝細胞内Ca^<2+>濃度の測定をおこなった。その結果,ハロセンの添加により,肝細胞内Ca^<2+>濃度はハロセン濃度依存性に増加し,肝細胞生存率はハロセン濃度依存性に低下した。つまり,ハロセンによって肝細胞内Ca^<2+>濃度は上昇し,しかも,その上昇と肝細胞生存率の低下には相関関係がみられ,ハロセン濃度依存性に肝障害の生じることが明らかになった。つぎに,この原因を明らかにするため,Ca^<2+>無添加の培養液を用いて,上記と同様の実験をおこなった。その結果,肝細胞内Ca^<2+>濃度,肝細胞生存率はハロセン濃度依存性に低下した。これらより,ハロセンによる肝細胞内Ca^<2+>濃度の上昇は,肝細胞膜がハロセンにより障害を受けたために生じることが明らかになった。さらに,イソフルランおよびセボフルランを添加した場合も,ハロセンと同様に肝細胞内Ca^<2+>濃度は添加した吸入麻酔薬の濃度依存性に上昇した。タンパク分解酵素潅流法により、モルモット肝から分離肝細胞を作製した。分離肝細胞浮遊液にFura-2 AMを負荷したのち、蛍光強度比により、細胞内Ca^<2+>濃度を測定した。ハロセンは1,3,5,10MACに相当する量を注入した。また、トリパンブルー染色を肝細胞分離後、Fura-2 AM負荷後、ハロセン注入後に行ない、肝細胞の生存率を評価した。その結果、(1)静止期肝細胞内Ca^<2+>濃度は約150nMであり、細胞生存率は86.5%であった。(2)ハロセン添加により、細胞内Ca^<2+>濃度はハロセン濃度依存性に増加し、肝細胞生存率はハロセン濃度依存性に低下した。つまり、ハロセンによって細胞内Ca^<2+>濃度は上昇し、しかも、その上昇と細胞生存率の低下には相関関係がみられ、ハロセン濃度依存性に肝傷害の生じることが明らかになった。また、ハロセン臨床使用濃度でも、細胞内Ca^<2+>濃度の上昇と細胞生存率の低下を認め、肝傷害の生じる可能性のあることが示唆された。しかし、その原因については、小胞体のCa^<2+>ポンプの機能

障害によるとする意見や、肝細胞膜の傷害により細胞外からCa^<2+>が流入するという意見などがあり、現在のところ明確な機序は明らかではない。従って、今後は細胞膜のCaチャンネルや小胞体の脂質過酸化などの面からも検討を行ないたい。タンパク分解酵素潅流法により、モルモット肝から分離肝細胞を作製した。分離肝細胞浮遊液にFura-2AMを負荷したのち、蛍光強度比により、細胞内Ca^<2+>濃度を測定した。ハロセンは1,3,5,10MACに相当する量を注入した。また、トリパンブルー染色を肝細胞分離後、Fura-2AM負荷後、ハロセン注入後に行ない、肝細胞の生存率を評価した。その結果、(1)静止期肝細胞内Ca^<2+>濃度は約150nMであり、細胞生存率は86.5%であった。(2)ハロセン添加により、細胞内Ca^<2+>濃度はハロセン濃度依存性に増加し、肝細胞生存率はハロセン濃度依存性に低下した。つまり、ハロセンによって細胞内Ca^<2+>濃度は上昇し、しかも、その上昇と細胞生存率の低下には相関関係がみられ、ハロセン濃度依存性に肝傷害の生じることが明らかになった。次に、この原因を明らかにするため、Ca^<2+>無添加の培養液を用いて、上記と同様の実験を行なった。その結果、(1)静止期肝細胞内Ca^<2+>濃度は約280nMであり、細胞生存率は59.8%であった。(2)ハロセン添加により、細胞内Ca^<2+>濃度肝細胞生存率はハロセン濃度依存性に低下した。以上より、ハロセンによる肝細胞内Ca^<2+>濃度の上昇は、肝細胞膜がハロセンにより傷害を受けたために生じることが明らかになった。タンパク分解酵素灌流法により,モルモット肝から分離肝細胞を作製した.分離肝細胞を37°Cで2時間培養したのち,Fura-2AMを添加し,さらに40分間培養した.ついで細胞外のFura-2AMを洗浄したのち,日本分光社のCAF-100Ca^<2+>analyzerを使用して,励起波長340nmおよび380nm,蛍光波長500nmにおける蛍光強度比により,静止期肝細胞内Ca^<2+>濃度を測定した.つぎに揮発性吸入麻酔薬であるイソフルランまたはセボフルランを注入して,同様の方法で肝細胞内Ca^<2+>濃度の測定をおこなった.その結果,(1)イソフルランの場合,0.2および0.6μlの注入では肝細胞内Ca^<2+>濃度は全く増加せず,1.0μlでやや増加し始め,2.0μlではっきりと増加が認められた.(2)セボフルランの場合,0.21.0μlの注入では肝細胞内Ca^<2+>濃度は全く増加せず,2.0μlでわずかに増加傾向がみられた.したがって,我々が前回おこなったハセロンの場合と同様に,揮発性吸入麻酔薬イソフルランまたはセボフルランの添加によっても,肝細胞内Ca^<2+>濃度は吸入麻酔薬の濃度依存性に増加するものと思われた.
分子状窒素からのシリルジアゼンの合成とそのラジカル発生剤としての物性研究

1.我々は先に窒素錯体[W(N_2)_2(L)_4](L=三級ホスフィン)とMe_3SiIの反応により配位窒素がシリル化されたシリルジアゼニド(MNNSiMe_3)およびシリルヒドラジド(MNNHSiMe_3)錯体が得られることを報告したが,同様な反応は収率はやや低いもののMoの類似錯体においてもより温和な条件下で進行することが判明した.また, Me_3SiSO_3CF_3によっても配位窒素のシリル化が進行した.2.シリルジアゼニドおよびシリルヒドラジド錯体はメタノールや水と反応し,シリル基の脱離と末端窒素のプロトン化によるジアゼニドやヒドラジド錯体を与えた.シリルアニオンの攻撃によるシリルジアゼンの生成は今のところ成功していない.一方シリルヒドラジド錯体mer-[WI_2(NNHSiMe_3)(PMe_2Ph)_3]をNa還元すると,窒素錯体cis-[W(N_2)_2(PMe_2Ph)_4]の再生がおこるとともに,低収率ながらHN(SiMe_3)_2とNH_3が生成していることが明らかとなった.3.窒素下Me_3SiClとNaをcis-[Mo(N_2)_2(PMe_2Ph)_4](1)存在下で反応させるとN(SiMe_3)_3とHN(SiMe_3)_2が触媒的に生成することを見出した.本反応においては,還元剤としてはLiよりNaが,触媒としては錯体1がそのW類似錯体よりはるかに高い活性を示した.また,反応温度は30°C付近が最もシリルアミンの選択率がよい.粒径810μのNa微粒子を用いた典型的な例では,触媒量はMe_3SiClおよびNaの0.5モル%, 30°C4時間の条件で,基質転化率ほぼ100%,シリルアミン収率は21%, Moあたりのターンオーバー数はおよそN(SiMe_3)_3が14, HN(SiMe_3)_2が1である.主たる副生成物はMe_3SiSiMe_3であり,系をより希釈した条件にすれば反応速度は遅くなるものの, Me_3SiSiMe_3の生成が抑えられシリルアミンの選択率が向上することも明らかになっている.本反応条件下では目的のシリルジアゼンの生成は認められていないものの,今後さらに反応条件等を改善することにより触媒的なシリルジアゼン合成反応へと展開できるものと期待される.1.我々は先に窒素錯体[W(N_2)_2(L)_4](L=三級ホスフィン)とMe_3SiIの反応により配位窒素がシリル化されたシリルジアゼニド(MNNSiMe_3)およびシリルヒドラジド(MNNHSiMe_3)錯体が得られることを報告したが,同様な反応は収率はやや低いもののMoの類似錯体においてもより温和な条件下で進行することが判明した.また, Me_3SiSO_3CF_3によっても配位窒素のシリル化が進行した.2.シリルジアゼニドおよびシリルヒドラジド錯体はメタノールや水と反応し,シリル基の脱離と末端窒素のプロトン化によるジアゼニドやヒドラジド錯体を与えた.シリルアニオンの攻撃によるシリルジアゼンの生成は今のところ成功していない.一方シリルヒドラジド錯体mer-[WI_2(NNHSiMe_3)(PMe_2Ph)_3]をNa還元すると,窒素錯体cis-[W(N_2)_2(PMe_2Ph)_4]の再生がおこるとともに,低収率ながらHN(SiMe_3)_2とNH_3が生成していることが明らかとなった.3.窒素下Me_3SiClとNaをcis-[Mo(N_2)_2(PMe_2Ph)_4](1)存在下で反応させるとN(SiMe_3)_3とHN(SiMe_3)_2が触媒的に生成することを見出した.本反応においては,還元剤としてはLiよりNaが,触媒としては錯体1がそのW類似錯体よりはるかに高い活性を示した.また,反応温度は30°C付近が最もシリルアミンの選択率がよい.粒径810μのNa微粒子を用いた典型的な例では,触媒量はMe_3SiClおよびNaの0.5モル%, 30°C4時間の条件で,基質転化率ほぼ100%,シリルアミン収率は21%, Moあたりのターンオーバー数はおよそN(SiMe_3)_3が14, HN(SiMe_3)_2が1である.主たる副生成物はMe_3SiSiMe_3であり,系をより希釈した条件にすれば反応速度は遅くなるものの, Me_3SiSiMe_3の生成が抑えられシリルアミンの選択率が向上することも明らかになっている.本反応条件下では目的のシリルジアゼンの生成は認められていないものの,今後さらに反応条件等を改善することにより触媒的なシリルジアゼン合成反応へと展開できるものと期待される.1.我々は既に[M【(N_2)_2】【(Ph_2PCH_2CH_2PPh_2)_2】]および[M【(N_2)_2】【(PMe_2Ph)_4】](M=W,Mo)の配位窒素が【Me_3】SiIによりトリメチルシリル化されてトリメチルシリルジアゼニド(NNSi【Me_3】)またはトリメチルシリルヒドラジド(NNHSi【Me_3】)

配位子に変換できる事を報告したが、本反応は異種三級ホスフィンやニトリルなどを含む窒素錯体、例えばtrams-[W【(N_2)_2】(【Ph_2】【PCH_2】【CH_2】【PPh_2】)【(PPh_2Me)_2】]、[W(【N_2】)(【^nPr】CN)【(Ph_2PCH_2CH_2PPh_2)_2】]などにも適用でき、同様にトリメチルシリル化されたジアゼニドやヒドラジド錯体がさらに広汎に合成できる事が判明した。2.トリメチルシリルジアゼニド錯体[WI(NNSi【Me_3】)【(Ph_2PCH_2CH_2PPh_2)_2】]は弱酸であるメタノールと反応する事によりジアゼニド錯体[WI(NNH)【(Ph_2PCH_2CH_2PPh_2)_2】]に、また[WI(NNSi【Me_3】)【(PMe_2Ph)_4】]およびトリメチルシリルヒドラジド錯体[【WI_2】(NNHSi【Me_3】)【(PMe_2Ph)_3】]はメタノールや水と反応してヒドラジド錯体【[WI(NNH_2)-(PMe_2Ph)_4]^+】や[【WI_2】(【NNH_2】)【(PMe_2Ph)_3】]に変換される事が判った。いずれの場合もSi-N結合がすみやかに切断され、含窒素ケイ素化合物は生成しなかった。3.トリメチルシリルジアゼニドおよびトリメチルシリルヒドラジド錯体のサイクリックボルタモグラムを測定した結果、例えば[WI(NNSi【Me_3】)【(PMe_2Ph)_4】]では+0.6Vと-1.5Vに、また[WI(NNHSi【Me_3】)【(Ph_2PCH_2CH_2PPh_2)_2】]Iでは+1.0Vと-1.5V付近に-電子酸化および還元過程を有する事が明らかとなった。アルキルジアゼニドやアルキルヒドラジド錯体の反応性との比較から、特に還元条件下では含窒素ケイ素化合物が生成している可能性が高いため、現在生成物の検討を行なっている。4.不均一系アンモニア合成触媒であるFe-【Al_2】【O_3】-【K_2】Oを用いて、400°C、常圧下で窒素ガスとHSi【Et_3】とを流通法で反応させ生成物の検討を行なったがシリルアミン等は得られなかった。今後は加圧条件下での反応を試みる予定である。
AdministrativeDataを用いたリスク調整と医療の評価手法の開発

DPCデータは我が国の急性期病院から収集される業務データで、医療の質の評価や病院機能評価に大きな有用性を秘めている。本研究では、DPCデータを用いた医療の質の評価手法の開発を目的とした。その結果、DPCプロセスデータを用いたケースミックス補正によって、冠動脈治療後の入院中死亡率や大腿骨頸部骨折手術後の在院日数などを含むアウトカム評価が可能であることを示した。DPCデータは医療の質評価と臨床疫学研究に大変有用であると考えられた。臨床研究のための総合的で代表性のあるDPCデータベースを構築し維持することは、我が国の良質な臨床研究と根拠に基づく医療政策のために必須であると考えられた。医療の質に対する関心が高まり医療の評価が求められているが、我が国では分析に利用できるデータが乏しく研究は進んでいない。諸外国では患者登録、医療費支払い、厚生統計等のために収集されているAdministrative Data(医療業務データ)を二次的用いた研究が成果を挙げているが、わが国でも急性期医療に関してDPC(Diagnosis Procedure Combination)診断群分類を用いた調査データが収集されるようになり、医療業務データの医療評価研究への応用が可能となってきている。そこで、本研究では、我が国における医療業務データの研究利用を促進するために、我が国の医療業務データの質の評価、医療業務データを用いた分析手法の検討、およびDPC調査データを用いた患者リスク調整の妥当性の検証を行った。DPC調査データ、厚生労働省のDPC調査公表データ、地域医療データ等の医療administrativedataより地域疾病データベースを構築し、以前に報告した方法(Sundararajan et al, Medical Care, 2007)により傷病名情報と診療プロセス情報のアウトカム予測力を、多重ロジスティック解析とC統計値を用いて検討した。わが国のデータでは傷病名情報量が少ないため、主傷病を除いた副傷病等に基づく院内死亡予測のC統計値は0.72程度とカナダ、フランス、スウェーデン、スイス等の結果よりやや低値であった。これに対して中心静脈注射、人工呼吸、留置カテーテル等の診療プロセス情報を追加すると予測精度の改善を認めた。本研究結果は、入院患者の日々の診療行為を表す電子的にコード化されたデータを含むわが国の診療プロセス情報の特徴を活かし、医療業務データを用いた医療評価研究の基礎が築かれ、研究データの質の確保とともにさまざまな医療研究への応用に結び付くことが期待される。諸外国では患者登録、医療費支払い、厚生統計等のために収集されているAdministrative Data(医療業務データ)を二次的用いた研究が成果を挙げているが、わが国でも急性期医療に関してDPC (Diagnosis Procedure Combination)診断群分類を用いた調査データが収集されるようになり、医療業務データの医療評価研究への応用が可能となってきている。DPC調査データ、厚生労働省のDPC調査公表データ、地域医療データ等の医療administrativedataより地域疾病データベースを構築し、以前に報告した方法(Sundararajan et al. Medical Care, 2007)により傷病名情報と診療プロセス情報のアウトカム予測力を、多重ロジスティック解析とC統計値を用いて検討した。傷病構造が異なる我が国のデータを用いた解析から、副傷病の影響をあらわすCharlson係数について,我が国独自の係数を開発する必要性があることが示唆された。DPC調査データ、厚生労働省のDPC調査公表データ、地域医療データ等の医療administrative

dataより地域疾病データベースを構築し、以前に報告した方法(Sundararajan et al, Medical Care, 2007)により傷病名情報と診療プロセス情報のアウトカム予測力を、多重ロジスティック解析とC統計値を用いて検討した。傷病構造が異なる我が国のデータを用いた解析から、副傷病の影響をあらわすCharlson係数について,我が国独自の係数を開発する必要性があることが示唆された。本研究結果は、入院患者の日々の診療行為を表す電子的にコード化されたデータを含むわが国の診療プロセス情報の特徴を活かし、医療業務データを用いた医療評価研究の基礎が築かれ、研究データの質の確保とともにさまざまな医療研究への応用に結び付くことが期待される。
太陽極近傍放射輝度分布を考慮した日射量データの作成

日射の直散分離は建築熱環境予測においては欠かせない手段であるが、現時点において実現象を忠実に再現することは難しく誤差を含んだ推定モデルが存在するにとどまっている。また現実には傾斜面日射量は直達日射量成分と拡散日射量成分の合成により求められているが、厳密な直達日射量成分を天空領域においてどこまで含めるかによって値そのものが変わってしまうという定義そのものに対しての問題をも含んでいる。また、直散分離の誤差を生み出している要因にどんなものがあり、その出現特性の地域性や時期変動を捉えることは重要である。本年度、本研究において、昨年から開始した詳細な日射の観測の継続と気象台観測の詳細気象データの統計的解析により、特に直散分離の誤差要因として放射輝度の分布やその不規則性、日射の短時間変動性に着目し、誤差との関連性を明らかにした。また、気象データと建築との関連性から建物周囲の微気候の形成について、実測により検討を行った。その結果、日射の影響による建築外壁表面温度の上昇や風向により建物周囲の外気温度に差が生じる結果が得られた。建物における外気取入口、空調室外機の性能への影響が懸念される結果となった。本年度は研究の基礎となる基礎的な日射量データの収集を目的として太陽追尾式の日射日照計およびデータ収集用のデータロガーを購入し、短い時間間隔での日射量データの収集を開始した。選定した日射日照計は現在気象台で標準的に使用されている機器と同種のものとし、1Hzにて全天日射量、法線面直達日射量を観測し1分ごとに各日射量の平均値、日照時間をデータベースとして保存するように設定している。直達日射計の開口角はWMOで規定されている半角2.5度である。データ収集は現在も継続中である。また、地域性の検証として大阪府堺市での短期実測も行った。以上からこれらの観測データに加え、以前から測定を行っているスカイスキャナーによる放射輝度分布測定、日射量の10分データ、公開されている気象台観測データ等を用いて、特に全天日射量から直達日射量・拡散日射量を推定する直散分離式の精度について誤差を与える要因(例えば日射の短時間変動成分、天空放射輝度分布の不規則性など)の詳細な検証を本年度は行った。その一部は、IBPSA Japanのシンポジウム(査読付)にて発表した。次年度は日射計の開口角を強制的に変化させる工夫を施し、より詳細をデータ収集を行い本題である放射輝度分布を考慮した日射量データの整備を進める。
NMDA受容体のリン酸化に伴う神経可塑性に関与する機能分子の探索

NMDA受容体NR2A、NR2Dをはじめとするさまざまなノックアウトマウスに神経因性疼痛モデルを作製し、疼痛行動を解析した結果、FynキナーゼによるNMDA受容体NR2BサブユニットのTyr1472のリン酸化とnNOSの細胞質から細胞膜へのトランスロケーションがnNOSの活性化と神経因性疼痛の維持に必要であることがわかった。NR2Bサブユニットは長い細胞内部分のC末端にPDZ結合モチーフESDVとその近傍にインターナリゼーションシグナルYEKLをもち、後者に含まれるY(=Tyr1472)のリン酸化は、NR2Bサブユニットを後シナプス肥厚(PSD)に留めることとnNOSの活性化、すなわちシナプス終末からの情報の「受容の場」と「シグナル変換」の2つの機能に関与することを明らかにした。NR2BサブユニットのC末端の重要性を明らかにするためTyr1472をPheに置換したノックインマウスNR2BY1472Fで行動解析を行い、神経因性疼痛が生じないことを確認した。nNOSはN末端のPDZ domainに続くoxygenase、dehydrogenase domainから成り立っている。nNOSのトランスロケーション機構を明らかにするために、nNOSのPDZ-GFPを培養細胞にトランスフェクションする系を確立して解析を進めている。さらに、NR2BのTyr1472のリン酸化による機能分子の探索を行うために、Ettan-DIGE二次元電気泳動に用いるサンプルを調製するために、野生型マウスとNR2BY1472Fノックインマウスからサンブルを調製すべく、1000匹を目標に繁殖を進めている。
珪藻殻形成にヒントを得たシリカ自己組織化塩基性ペプチドの創成

珪藻が有する整列シリカ構造自己組織化には、殻に分泌される塩基性ペプチドが関与する。本研究ではこれを模倣した人工ペプチドの作製とその作用の特徴付けを行った。その結果、単純なヘリックス構造ペプチドにリジンやアルギニンなどの塩基性アミノ酸を導入した様々な人工ペプチドの作製・大腸菌による大量発現に成功した。これら塩基性ペプチドは全て強いシリカ固体化活性を有し、反応環境の制御により生成されるシリカ粒径の制御が出来た。また、反応時に特異的抗体を混合することで、平板状のシリカ固体作製に成功した。一方、このペプチド反応場として、SiC系等の基板を試作し、限られた空間内での構造充填パターンモデル化を試みた。珪藻の殻は数十ナノメートル単位のメゾスコピックなサイズの整列構造を自己組織化する最も精密なバイオミネラリゼーションである.この作用は,近年の研究から殻に分泌される塩基性ペプチドとポリアミン鎖の作用によることが分かってきている.本研究では,この作用にヒントを得,人工的に作った様々なパターンの塩基性ポリペプチドによるシリカバイオミネラリゼーションの可能性を探ることを目的としている.最終的に,基板表面上に珪藻殻に見られるようなナノメートル単位の整列構造を自己組織化するペプチドのセットを開発すること,およびその作用原理を明らかにすることを目標としている.平成25年度は計画に従い,以下のサブプロジェクトを行った.1.平成24年度より引き続き,単純な2次構造に塩基性アミノ酸を埋め込んだ様々なペプチドの設計を行い,大腸菌にて生産させ,精製した.また,より安価・効率的な生産を目指して黒麹カビの菌体外タンパク生産系に設計したDNAを導入し,大量生産を試みた.2.精製した人工ペプチドを順次シリカ固体形成反応の確認に供した。3.この人工塩基性ペプチドと相互作用するペプチドとして,まずは本ペプチドに親和性を有する抗体を作製し,反応系に混入する実験を開始した.4.生産,精製,および機能を確認したペプチドについてpH,塩濃度,ケイ酸濃度,ケイ酸源,ペプチド濃度等を変え,精製するシリカの構造を定性的,定量的に解析した.その結果,ケイ酸の粒径,形状の制御は可能であるが,繊維状や平板上の構造を作ることが困難であった.5.平成24年度に試作した人工塩基性ペプチドを吸着するGa/As基板上での反応にはまだ至っていない.相互作用ペプチドと基盤の設計による高度な形状制御とその原理のモデル化はまだ出来ていないが,シリカバイオミネラリゼーション作用を持つ人工ペプチドの種類が増えることにより,シリカ形状とペプチド構造のデータの蓄積がなされている.珪藻が有する整列シリカ構造自己組織化には、殻に分泌される塩基性ペプチドが関与する。珪藻の殻は数十ナノメートル単位のメゾスコピックなサイズの整列構造を自己組織化する最も精密なバイオミネラリゼーションである。この作用は、近年の研究から殻に分泌される塩基性ペプチドとポリアミン鎖の作用によることが分かってきている。本研究では、この作用にヒントを得、人工的に作った様々なパターンの塩基性ポリペプチドによるシリカバイオミネラリゼーションの可能性を探ることを目的としている。最終的に、基板表面上に、珪藻殻に見られるようなナノメートル単位の整列構造を自己組織化するペプチドのセットを開発すること、およびその作用原理を明らかにすることを目標としている。平成24年度は計画に従い、以下のサブプロジェクトを行った。1.単純な2次構造に塩基性アミノ酸を埋め込んだペプチドの設計を行い、大腸菌に生産させることに成功した。2.生産した人工ペプチドを精製し、シリカ固体形成反応を確認した。3.この人工塩基性ペプチドと相互作用するペプチドの生産を全体計画に入れているが、当該年度の実施計画はない。4.生産、精製、および機能を確認したペプチドについてpH、塩濃度、ケイ酸濃度、ペプチド濃度等を変え、精製するシリカの構造を定性的、定量的に解析した。また、ケイ酸源を様々なタイプのものに変え、この影響を見た。その結果、ケイ酸の粒径、形状をある程度制御することに成功した。5.人工塩基性ペプチドを吸着するGa/As基板など試作した。相互作用ペプチドと基盤の設計による高度な形状制御とその原理のモデル化にはまだ遠いが、シリカバイオミネラリゼーション作用を持つ人工ペプチドの設計と生産に成功し、その活性確認および制御の可能性を示す成果を得た。珪藻の殻は数十ナノメートルのメゾスコピックなサイズの整列シリカ構造を自己組織化する最も精緻なバイオミネラリゼーションである。この作用は近年の研究から殻に分泌される塩基性ペプチドとポリアミン鎖の作用によることが分かってきている。

最終的に、基板表面上に珪藻殻に見られるようなナノメートル単位の整列構造を自己組織化するペプチドのセットを開発すること、およびその作用原理を明らかにすることを目標としている。平成26年度は計画に従い以下のサブプロジェクトを推進した。1.平成25年に引き続き、単純な二次構造に塩基性アミノ酸を埋め込んだ様々なペプチドの設計と、その大腸菌を用いた生産を行った。2.精製した人工ペプチドを順次シリカ固体形成反応の確認に供した。3.この人工塩基性ペプチドと相互作用するペプチドとして、本ペプチドに親和性を有する抗体を作製し、反応系に混入して精製するバイオシリカの形状に与える影響を分析した。4.生産、精製、および機能を確認したペプチドについて、pH、塩濃度、ケイ酸濃度、ペプチド濃度等を変え、さらに3で述べた抗体との混入系を併用しながら生成するシリカの構造を定性的、定量的に解析した。その結果、バイオシリカの粒径制御の他に、特異的抗体と血清成分であるアルブミンの併用により、再現性よく平板状の構造を作製することが出来た。5.連携研究者の協力を得、Ga/As系基板に加えSiCおよびSiCグラフェン系の基板構造を作製し、バイオシリカ形成ペプチドの反応をこの表面で行いつつある。また、空間充填パターンが形成される数学モデルの構成と解析を行った。このモデルの微少化を行う段階まで到達している。植物分子生理学様々な塩基性ペプチドの設計を行い,これを様々なリピート数に繋げるなどの加工を行い,順次生産・精製を行っており,この部分は順調に推移している.しかし,このような人工ペプチドから作られるシリカがほとんどの場合,球形になってしまい,複雑な構造形成に至っていない.この部分で,球状以外の構造を作る鍵となる因子を見つけることが出来ていないため,ペプチド構造と生成するシリカの相関関係をモデル化し,その機構を探る段階に入っていない.この問題は本プロジェクトの最も難解な部分であることを予測していたため,想定されたことではあるが,今後反応環境を液相界面にするなどしてブレイクスルーが必要である.本研究前半期の最大の目標は珪藻殻形成機構にヒント得て、その原理に基づく人工ペプチドを設計・生産・精製し、そのシリカバイオミネラリゼーション活性を確認することであったため、その目的は十分達成できていると考える。遅れている部分に対処しつつ,当初の研究計画にあげた項目に従って以下のように進める予定である.1.引き続き,体系的に設計したペプチドの生産と精製を行う.一方,活性確認や機能特性の解析に於いては,液中の環境でペプチド物性のみを駆動力とした構造形成反応だけに頼らず,二層界面を反応場に利用したり,反応液表面の大気との接触部分を反応場として利用するなど,シリカ個体成長方向が制限されるような環境を積極的に選び球状以外のシリカを作りやすい反応環境を明らかにしてゆく.この結果をフィードバックして,新たな設計理論を構築し,第二世代以降のペプチドを設計,生産する.2.これまでに生産したペプチドについても新たな反応環境での挙動を確認し,ペプチドの構造と生成シリカ構造の相関データを蓄積する.