hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
EBUS-TBNAによる生検組織の分子生物学的解析に基づく個別化治療法の開発

EBUS-TBNAを1000例以上に施行し、それらの微量サンプルからDNA・RNAを抽出、基礎実験を行う系を確立した。突然変異解析、異常メチル化解析、RNA発現解析、蛋白発現解析が可能となった。肺癌に対するEBUS-TBNAを取り入れた、治療戦略を確立し、臨床試験を開始した。本年度は研究実施計画に基づき,以下の研究を行った。1.EBUS-TBNA検体バンクの構築:肺癌症例に対する肺門・縦隔リンパ節転移診断目的にて年間約230症例に対してEBUS-TBNAを施行したが,そのうちリンパ節転移を有した症例において,凍結およびホルマリン固定サンプルを保存。またEBUS-TBNAサンプルからRNAを抽出しcDNAを得,同時にDNAも抽出した。遺伝子解析に耐えうる量および高品質のRNA,cDNA,DNAを安定して得ることのできる実験系を確立した。現在までで約40症例よりサンプルを採取し検体バンクを構築してきた。2.EBUS-TBNA検体を用いた遺伝子変異解析:EBUS-TBNA検体を用いた遺伝子変異解析として,EGFR遺伝子変異についての解析を行った。EGFR exon 19,20,21を対象に遺伝子変異解析を行い,微量サンプルでもEGFR遺伝子変異解析が可能であるとともに,変異を有する症例ではGefitinibに対し高い感受性を示すことを報告した(日本臨床細胞学会,国際肺癌学会,ACCP)。3.EBUS-TBNA検体を用いたDNA異常メチル化解析:EBUS-TBNA検体においてもメチル化の検出が可能であり,さらにメチル化頻度が高い症例において,シスプラチンを含んだ化学療法に対し,高感受性であることを示し,その研究成果を報告した(ATS,日本肺癌学会総会)。EBUS-TBNA検体を用いた遺伝子解析が,肺癌治療におけるバイオマーカーとなりうることを示した。4.EBUS-TBNA検体を用いた免疫組織学的検討:EBUS-TBNAにより得られたホルマリン固定標本に関して,病理学的に転移の確認された検体に対して,細胞周期調節,細胞分裂,組織低酸素,血管新生等に関連する蛋白の発現を免疫組織学的手法を用いて評価するための基礎実験系を確立した。本年度は研究実施計画に基づき、以下の研究を行った。(1)EBUS-TBNA検体バンクの構築:現在まで、肺癌症例に対する肺門・縦隔リンパ節転移診断目的にて約1000症例に対してEBUS-TBNAを施行した。EBUS-TBNAサンプルからRNAを抽出しcDNAを得、同時にDNAも抽出した。遺伝子解析に耐えうる量および高品質のRNA、cDNA、DNAを安定して得ることのできる実験系を確立した。(2)EBUS-TBNA検体を用いた遺伝子変異解析:EBUS-TBNA検体を用いた遺伝子変異解析として、EGFR遺伝子変異についての解析を行ったり変異を有する症例ではGefitinibに対し高い感受性を示すことを報告した。(4)EBUS-TBNA検体を用いた免疫組織学的検討:EBUS-TBNAにより得られたホルマリン固定標本を用いて、細胞周期調節、細胞分裂、組織低酸素、血管新生等に関連する蛋白発現を検討する実験系を確立した。(5)約1000例のEBUSエコー所見から、転移リンパ節の特徴を、サイズ、内部エコー、形状等の観点から明らかにした。(6)非小細胞肺癌症例に対し、EBUS-TBNAを行い、リンパ節転移症例を対象とした術前導入療法を行う、臨床試験を開始した。本研究の到達目標である個別化医療に寄与すると考えられる。
代謝カスケード調節遺伝子KLF14の転写制御機構・生理機能の解明

KLF14は代謝関連遺伝子群のマスター制御因子であり、近傍SNPが複数の代謝関連疾患感受性を示す。脂肪組織におけるKLF14の生理機能を明らかにすること、Mest-Klf14インプリント遺伝子クラスターの発現制御機構を解明する体制を整えること、を目的として研究を実施した。ノックアウトマウス解析により、KLF14が肥満誘導時の白色脂肪組織リモデリング制御に関与することを発見した。ゲノム編集技術により、Mest-Klf14クラスターのインプリント制御領域を欠失させたマウス系統の作出に成功した。1. Klf14の発現プロファイル:胎仔期・新生仔期・成体期におけるKlf14の発現プロファイルを定量RT-PCR法により取得した。Klf14は胎仔期では複数の臓器で高いレベルで発現していること、成体期の白色脂肪組織では胎児期に匹敵する高レベルで発現していることを明らかにした。2. Klf14ノックアウトマウス由来白色脂肪組織の発現アレイ解析:米国Knockout Mouse Projectより入手したKlf14ノックアウト(KO)マウス系統のKOアレルではKlf14のコーディングエクソンがLacZに置換されており、LacZはKlf14内在性プロモーター依存的に発現する。ベータガラクトシダーゼアッセイによる胎仔でのKlf14発現解析により、Klf14は皮下組織で強く発現していることを明らかにした。Klf14-KOマウスおよび野生型コントロール(各3個体)由来の白色脂肪組織からtotal RNAを抽出し、発現マイクロアレイデータを取得した。発現変動遺伝子群のGene Ontology解析およびGSEA解析から、Klf14-KOマウス由来白色脂肪で発現が低下している遺伝子群に炎症・免疫関連遺伝子が高頻度に含まれることを明らかにした。3. Mest-DMRノックアウトマウス作出: Klf14のインプリント発現はMest-DMRにおけるDNAメチル化により制御されていると予想されるが、直接的な証明が待たれる。また、そのようなlong-range制御を担う分子機構については一切不明である。そこで、Mest-DMR KOマウス作出実験を開始した。当初計画のES細胞でのジーンターゲティングからCrispr-Cas9システムによる受精卵ゲノム改変に方法を変更し、得られた58個体をスクリーニングし、Mest-DMR欠失候補を2個体同定した。1.マウスKlf14遺伝子の発現解析これまでに、マウスKlf14遺伝子は胎仔期の複数の臓器と成体期の白色脂肪組織で高レベルで発現していることをRT-PCRにより明らかにしていた。今年度は、Klf14-ノックアウト(KO)マウス系統(KOアレルではKlf14ORF配列がLacZに置換されている)を使ったベータガラクトシダーゼアッセイにより、Klf14は胎仔期においては主に中胚葉系由来組織で強く発現していること、成体期の白色脂肪組織においては、成熟した白色脂肪細胞で発現していることを確認した。2. KLF14の白色脂肪組織における生理機能解析Klf14-KO系統を用いて、Klf14遺伝子の代謝関連機能を個体レベルで検討した。Klf14-/-♂・Klf14+/+♂各8個体に8週間(9-16週齢)、高脂肪食を与え、期間中あるいは高脂肪食負荷終了後に、各種表現型(食物摂取量、体重、身体組成、経口ブドウ糖負荷試験、インスリン耐性試験、自発運動量)を解析した。それらの項目については二群間で有意な差は認められなかった。両群の白色脂肪組織を対象とした発現アレイデータを取得・解析したところ、Klf14-KOマウス由来白色脂肪組織で発現が低下している遺伝子群に炎症・免疫関連遺伝子が高頻度に含まれることが見出された。KLF14はアディポカイン遺伝子群の発現制御を介して肥満に伴う炎症時のマクロファージ集積を調節している可能性が考えられる。Klf14のインプリント発現はMest-DMRにおけるDNAメチル化により制御されていると予想されるが、直接的な証明が待たれる。当初計画のES細胞でのジーンターゲティングからCrispr-Cas9システムによる受精卵ゲノム改変に方法を変更し、得られた58個体をスクリーニングし、Mest-DMR欠失系統を2系統、Mest-DMR逆位系統を1系統樹立することに成功した。1.マウスKlf14遺伝子の発現解析:これまでに、マウスKlf14遺伝子は、胎仔期においては主に中胚葉系組織で、成体期では白色脂肪組織の成熟白色脂肪細胞で特に強く発現していることを明らかにしている。今年度はKlf14が成体の下垂体ならびに視床でも発現していることを見出した。2. KLF14の白色脂肪組織における炎症制御への関与:Klf14-/-♂個体群並びにコントロール(Klf14+/+♂)群に高脂肪食を与え、8週間の投与期間後の両群の白色脂肪組織を対象とした発現アレイ解析を行い、Klf14-KOマウス由来白色脂肪組織で炎症関連遺伝子群、細胞周期関連遺伝子群の発現が高頻度に低下していることを見出している。KLF14が肥満誘導時の白色脂肪組織リモデリングに必要な炎症の制御に関与する可能性が示唆される。今年度は、高脂肪食負荷再現実験を実施し、さらに通常食餌下で飼育した個体由来白色脂肪組織の発現アレイデータを含めた統合的解析を行い、これまでの結論・仮説と矛盾の無い結果を得た。

更に、白色脂肪組織のメタボローム解析を実施し、Klf14-/-♂個体由来の脂肪組織において複数の代謝経路の活性が低下していることを見出した。3. Mest-DMRノックアウトマウスの解析:Crispr-Cas9システムによる受精卵ゲノム改変により、Mest-DMR欠失系統を2系統、Mest-DMR逆位系統を1系統樹立した。Mest-Klf14のクロマチン相互作用を野生型マウス・Mest-DMRノックアウトマウスで解析するための準備として、マウスES細胞をモデルに4C-seq法(遠距離クロマチン相互作用を検出する方法の一つ)の実験・データ解析プロトコールを整備した。KLF14の白色脂肪組織における生理機能解析に関する論文投稿を平成27年度中に予定していたが、同年度後半に実施した白色脂肪組織メタボローム解析で、Klf14ノックアウトマウス由来の脂肪組織において多くの興味深い変化(主に代謝活性レベル低下を示唆する)を見出した。これらの結果を追加した論文をH28年度中に国際誌に投稿する。KLF14遺伝子はヒト・マウスでインプリント制御を受けており、母方アレル特異的に発現する。マウスKlf14遺伝子は、胎仔期においては主に中胚葉系由来組織で強く発現しており、成体期では白色脂肪組織で特に強く発現している。ヒト集団を対象とした大規模eQTL解析・GWAS解析から、KLF14は代謝関連遺伝子群のマスター制御因子であり、KLF14遺伝子近傍にII型糖尿病を含む複数の代謝関連疾患感受性を示すSNPが同定されている。一方でKLF14の生理機能に関する知見は限られている。本研究ではKLF14の白色脂肪組織における機能の解明を目指して、KLF14ノックアウトマウスの表現型を解析している。これまでに、高脂肪食負荷(投与期間8週間)後のKlf14-/-♂個体群並びにコントロール(Klf14+/+♂)群由来の組織を対象とした発現アレイ解析から、Klf14-/-マウス由来白色脂肪組織で炎症関連遺伝子群、細胞周期関連遺伝子群の発現が高頻度に低下していることを見出している。このことはKLF14が肥満誘導時の白色脂肪組織リモデリングに関与しており、KLF14ノックアウトマウスでは肥満誘導時の白色脂肪前駆細胞の増殖能が低下している可能性が考えられた。H27年度中にKlf14-/+♂個体(母方アレルKlf14が欠失しており、父方アレルKlf14は発現しない)並びにコントロール(Klf14+/+♂)群に対してより長期間の高脂肪色負荷実験(投与期間24週間)を実施した。H28年度にそれらの個体の白色脂肪組織の解析を継続し、Klf14-/+♂個体由来の脂肪組織では、コントロールと比較して脂肪細胞サイズ分布が異なること、具体的には小型細胞(前駆細胞)が減少し、成熟細胞が肥大化していることを見出した。KLF14ノックアウトマウスにおいては、高脂肪食負荷時の白色脂肪組織における脂肪蓄積能が低下している可能性が考えられる。KLF14は代謝関連遺伝子群のマスター制御因子であり、近傍SNPが複数の代謝関連疾患感受性を示す。
食餌性肥満ゼブラフィッシュを用いた糖代謝異常ゲノムメカニズムの解明研究

糖代謝異常とは、糖尿病または糖尿病にはなっていないが血糖が高めである状態である。その原因はインスリン作用の不足によるものだが、その詳細な発症までのゲノムメカニズムまだ明らかになっていない。本研究では、食餌性肥満ゼブラフィッシュの肝膵臓における遺伝子発現が次世代シーケンサーを用いて網羅的に解析した。バイオインフォマティクス解析によりヒト糖尿病と共通するパスウェイを確立し、さらに複数の新規治療標的遺伝子候補の抽出に成功した。また、遺伝子発現抑制実験や糖尿病治療薬の投与により、ゼブラフィッシュがヒトの糖代謝異常症モデルに十分なりうることを証明した。本研究の目的は、糖代謝異常ゲノムメカニズムを明らかにすることである。発症要因として遺伝因子と環境因子が存在するが、多くについては特定の遺伝子異常はまだ証明されていない。本研究では、まず過剰給餌によるゼブラフィッシュ肥満モデルを作製し、糖代謝異常ゼブラフィッシュの作製を試みた。肥満ゼブラフィッシュの体重、血漿中性脂肪、内臓脂肪量は正常ゼブラフィッシュより有意に増加し、肝臓脂肪の蓄積も確認された。また、ゼブラフィッシュの個別識別を行い、肥満誘導期間中(8週間)2週間ごとに空腹血糖値を測定し、持続血糖モニタリングを行った。正常群の表現型に対し、肥満誘導されたゼブラフィッシュでは、持続的に高い血糖値を表現した個体(High blood glucose, HBG)と、正常群と差がなく安定的に表現した個体(Medium blood glucose, MBG)が分けられた。次に、糖代謝異常ゼブラフィッシュ(HBG)と正常ゼブラフィッシュの肝臓組織からトータルRNAを抽出し、次世代シーケンサーを用いた網羅的トランスクリプトーム解析(RNA-seq)を行った。抽出した発現変動遺伝子群をヒト先祖遺伝子(Ortholog)に変換し、In silicoにおけるネットワーク解析の結果、脂質代謝や糖質代謝関連パスウエイを中心に変動していたのが明らかになった。なお、有意な発現変動を認めた遺伝子群(P < 0.01)に対して、リアルタイムPCR法によるバリデーション実験を行い、糖代謝調節候補遺伝子を決定した。今後これらの候補遺伝子に対し、遺伝子操作により糖代謝異常との関係についてより詳細な研究を行う予定である。本研究は、食餌性肥満ゼブラフィッシュを用いて、糖代謝異常ゲノムメカニズムを解明することを目的とした。今年度は、1)空腹血糖に影響を及ぼすと予想される遺伝子群の機能解析、および2)ヒト臨床で使用されている糖尿病治療薬が本疾患モデルゼブラフィッシュにおいても有効かどうかの検討を行った。まず、初年度の次世代シーケンサーを用いた網羅的トランスクリプトーム解析にて抽出された糖代謝異常関連遺伝子群に対し、これらの発現を抑制するためモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチド(MO)を合成した。次に、週2回各遺伝子のMOを肥満ゼブラフィッシュ腹腔内へ注入し、遺伝子発現抑制実験を行った。投与実験終了時(8週間)に、空腹血糖値の測定を行った。また、糖尿病治療薬を肥満ゼブラフィッシュに投与し、本疾患モデルゼブラフィッシュにおける薬剤応答性を検討した。その結果、1)実験検討した遺伝子のうち、インスリン遺伝子(insa)の発現抑制により空腹時血糖値の有意な上昇を確認した。また、糖尿病の進行に伴い、体重減少傾向も確認した。ゼブラフィッシュにおいても哺乳類同様に、インスリンが耐糖能機能に深く関与していることを証明した。さらにこれまで未報告であった新規候補遺伝子群に対しても同様の実験を行い、その一部に耐糖能機能の改善、コレステロール低下作用を認めた。2)ヒト臨床で使用されている糖尿病治療薬メトホルミン、ピオグリタゾン、グリベンクラミドの腹腔内投与を行い、糖代謝異常への影響を検証した。その結果、メトホルミンとピオグリタゾンは肥満ゼブラフィッシュの血糖値の上昇を抑制し、本肥満ゼブラフィッシュが人間の薬にも反応することを確認した。以上の結果より、この糖代謝異常症モデルともいえる肥満ゼブラフィッシュの病態メカニズムが、オミックスレベルでのヒトの疾患モデルに十分なりうることを証明した。医学本研究は平成25年度の研究実施計画通り遂行されており、特に遅滞はない。また、研究成果も前述の糖代謝調節候補遺伝子が遺伝子操作のターゲットとして見つかっており、おおむね研究計画立案通り順調に進展している。平成26年度は遺伝子操作により糖代謝に影響を及ばす遺伝子の解明を中心に行う。まず、前述の糖代謝調節候補遺伝子に対し、モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチド(MO)を合成する。次に、MOを肥満モデルゼブラフィッシュの腹腔内へ導入し、糖代謝異常への関与を検証する。また、前述の糖代謝異常モデルに対して試験化合物の経口投与により治癒効果を検証し、糖尿病治療候補薬物スクリーニングを行う。
筋肉内投与薬物の筋中拡散動態に関するリアルタイム解析

in vivo ESRを用い、薬物の体内挙動を無侵襲かつリアルタイムで測定し画像解析するため以下のことを検討した。1.マウス大腿部にニトロキシド化合物を投与したところ、濃度の異なる数種のシグナルが重なり合ったスペクトルが観測された。この解析を行なった結果、ニトロキシド化合物が投与部位から拡散し、次第に低濃度のシグナルへと変化していく様子をモニターすることができた。また、スピン標識化合物の種類により筋肉内から血中への拡散が速いものと、比較的筋肉内に留まりそこで還元されるものに大別されることが明かになった。2.次に、in vivo ESR-イメージングを用いて、筋肉内に投与したニトロキシドの一次元画像化を試みた。その結果、投与直後から大腿部に大きな山が現われ、次第に小さくなっていく画像が得られ、in vivo ESR-イメージング法が薬物の体内動態の研究に広く応用できる可能性が示唆された。3.マウス大腿部の虚血再潅流モデルを作成し、ニトロキシドの消失機序を検討した結果、Amino-TEMPOの消失はSODやアロプリノールの添加により抑えられた。したがって、筋肉内でニトロキシドラジカルは、スーパーオキシド由来の活性種の相互作用しその常磁性を消失することが示唆された。4.ESR-CTシステムの改良:濃度の異なる複数のESRシグナルが、空間的に異なった位置に混在する場合の画像化法について、空間分離スペクトル表示法の開発を行い、ほぼ満足できるシステムを完成した。以上より本研究では、スピン標識化合物の筋肉内拡散ならびに筋肉内での常磁性の消失に及ぼす生理的諸因子について、無侵襲かつリアルタイムで測定し画像解析する系を確立した。本法は広く薬物の体内動態及び病態時の生体内フリーラジカル反応の研究に応用できる可能性を示唆している。薬物の体内挙動を無侵襲かつリアルタイムで測定する新しい方法として、LーバンドESRスペクトルをコンピュ-タ解析し、画像解析するための基礎研究として、以下のことを検討した。1.筋肉内での薬物の挙動のシュミレ-ションによる解析:ESRスペクトルはスピン濃度によりシグナルが変化する。4種のニトロキシド誘導体(HydroxyーTEMPO,AminoーTEMPO,CarbamoylーPROXYL,CarboxyーPROXYL)の水溶液をマウスの大腿部に投与し、ESR測定を行った。このスペクトルは複数のスピン濃度のものの示すシグナルが重なりあったものであり,経時的にその形状が変化した。スペクトルを数種の濃度のシグナルを用いシュミレ-ションを行い、スピン標識化合物の筋肉内拡散や筋以外への移行を分単位で解析・推定することができた。2.病態モデルとしての炎症のスピンクリアランスへの影響:マウス後肢を結索して虚血足浮腫マウスを作成し、その大腿部にスピンラベル剤水溶液を投与しESR測定を行った。虚血時には、CarbamoylーPROXYLはシグナルの減少が認められなかったのに対し、AminoーTEMPOでは認められ、前者は筋肉内でスピンが消失され難く、後者は消失されることが示された。また虚血再潅流後では、CarbamoylーPROXYLの消失速度がコントロ-ルと有意な差が認められないが、AminoーTEMPOでは、ほとんどシグナルが観測されず、速やかにスピンが消失した。3.画像化のためのコンピュ-タプログラムの開発:複数のシグナルからなるinvivoESRスペクトルを用い薬物の挙動をより詳細に検討するためにはスペクトルを分離する必要があり、新たにプログラムの開発を試みた。スピン化合物の濃度によるシグナルの変化は非常に複雑で、幾つもの解決すべき因子があり、それらを検討しながら、プログラムの開発を行っている。

薬物の体内挙動を無侵襲かつリアルタイムで測定し、画像解析する新しい方法を開発する目的で、以下の検討を行った。1.画像化のためのコンピュ-タプログラムの開発:in vivo ESRより得られるシグナルは複数のシグナルよりなるため、これを空間的に分離(SpectralーSpatial Analysis)する必要がある。今回は、観測不可能の角度(missing angle)の解決法について検討した。安定ラジカルのファントムを用いて従来の逆投影法と反復法の比較検討を行ったところ、逆投影法では画像の裾部分の欠損した粗雑な画像が得られたのに対して、反復法では反復回数の増加に伴って欠損部の画像が修復された。しかし、ファントムの形状によっては輪郭に沿って鋭いノイズが現われることや計算時間に逆投影法の十倍の時間を要する等、新たに解決しなければならない問題が生じた。2.筋肉内投与したリポソ-ム封入薬物の動態:リポソ-ムに封入できるスピンラベル剤を検討したところ、四級アミンであるCatlの封入率が高いことがわかった。Catl筋肉内挙動に対するリポソ-ム封入の効果をin vivo ESRを用いて解析した結果、リポソ-ム末封入のCatlは投与後直ちに拡散が始まったが、リポソ-ムに封入したものは2日たってもそのほとんどがリポソ-ムに封入された形で投与部位に存在していることがわかった。この結果は、封入薬物とリポソ-ム構成脂質との放射性同位元素による二重標識による実験結果と一致するものであり、無侵襲で測定できるin vivo ERSの薬学領域に於ける大いなる利用性を暗示した。当該年度は、昨年度に引き続き以下の検討を行なった。1.筋肉内におれるスピン標識化合物の消失メカニズムの検討:スピン標識化合物間で認められたシグナル消失速度の違いについて更に詳しく検討するため、マウス大腿部を結紮し血流を止めた状態で投与し、in vivo ESRで測定を行なった。AminoーTEMPOとCarbamoylーPROXYLで検討したところ、AminoーTEMPOでは筋肉を結紮してもシグナルは消失はしたが、CarbamoylーPROXYLではほとんど消失しなかった。このことから、AminoーTEMPOは、筋肉内で還元されニトロキシドがその常磁性を消失することにより、またCarbamoylーPROXYLは筋肉から血流へ拡散することにより大腿部からシグナルが消失することが明かとなった。2.AminoーTEMPOのシグナル消失機構の検討:筋肉を結紮し血流を止めた後、再潅流を行ない、ニトロキシドの消失速度を測定した。その結果、虚血再潅流障害によりニトロキシドの消失速度は増加し、この増加はSODやアロプリノールの添加により抑えられた。したがって、生体内に投与されたニトロキシドは、体内で生成されるスーパーオキシド由来の活性種と相互作用しその常磁性を消失すると考えられる。3.ESR-CTシステムの改良:濃度の異なる複数のESRシグナルが、空間的に異なった位置に混在する場合の画像化法について、空間分離スペクトル表示法の開発を行い、ほぼ満足できるシステムを完成した。
遺伝性脳変性疾患の遺伝子治療に関する研究-特に胎児血液幹細胞移植による治療法の開発

本研究では(A)人ニーマンピック病タイプC(NPC)の病因解明と(B)NPC原因遺伝子クローニングの為の基礎実験及び(C)ラット胎児遺伝子治療の試みを行った。(A)人NPCの病因は依然不明であるが、NPCで外因性コレステロールのエステル化のプロセスに障害が存在し、コレステロールが細胞内に蓄積することが見いだされた。また正常細胞で細胞内カルシウム濃度を変化させると、細胞内にコレステロールが蓄積する事も報告されている。以上より我々は人NPCの病因解明の為、細胞内カルシウム代謝を検討した。(1)細胞内へのLDLの取り込みに際し、培養正常細胞で細胞内カルシウム濃度が約2倍に上昇する対し、NPC細胞では50%に抑制されていた。(2)カルシウムチャンネルアゴニスト投与により、培養NPC細胞内カルシウム濃度が有意に上昇し、コレステロールのエステル化障害も同時に改善されることが見いだされた。以上細胞内カルシウム代謝異常がNPCに存在し、本症の病態生理に大きく関与していることが明らかになった。(C)人アリルサルファターゼA(ASA)遺伝子挿入レトロウイルスベクターの開発とラット胎児遺伝子治療の試み。(1)人ASAcDNAをMFGベクターに挿入し、Iate infantile typeMLD線維芽細胞にtransform。ASA活性の著しい上昇を認めることができた。(2)amphotropic ASAベクターを日令15,16,17のラット胎児の羊膜静脈及び羊水中に注入。生後1日で脳、肝臓、腎臓等各臓器をホルマリン固定後、人ASA抗体を用い免疫組織染色を行いASA蛋白の発現を検討したが、現時点では有意な発現を認めることができなかった。しかしながら本ベクターは培養系で有意に発現しており、今後さらに種々の改良を加え検討する予定である。A)アデノウィルスベクターを用いたラット胎児におけるLacZ遺伝子の発現〈方法〉在胎13日令ラット胎児肝臓及び羊膜静脈を用い、LacZ遺伝子を組込んだアデノウィルスベクターを注入し、在胎20日令でのLacZ遺伝子の発現を酵素活性,タンパク質,DNAの各レベルで検討。〈結果及び考察〉beta-galactosidaseは、4MU-beta-galactosidaseを用い肝臓,脾臓,腎臓で測定。弱汗の活性上昇を確認したが、脳では明らかでなく、本ペクターが脳血液関門を通過しうるかを明らかにしえなかった。さらに、在胎日令をさげて検討したい。又、酵素タンパク発現は抗体を用い、組織染色にてDNA発現は、サザンブロッティング法を用い検討中。B)ニーマンピック病タイプC(NPC)におけるCa代謝動態と病因解明へのアプローチ〈方法〉ニーマンピック病タイプC皮膚線維芽細胞を用い1)細胞内Ca動態をCa^<2+>-Fura-2を用い螢光法で測定し、細胞内コレステロールエステル(CE)化率と比較2)Caアゴニスト及びアンタゴニストを用い細胞内Ca濃度がCE化に与ぼす影響を検討。〈結果及び考察〉NPCでは、コレステロールに比べ細胞内Caの増加がCE化障害を平衡し抑制されかつCaアゴニストにより、CE化障害が改善されることを見出した。このことより、NPCにおける細胞内代謝障害が本症の病因を強くかかわっていることを初めて見出した。以上より我々は人NPC病因解明の為、細胞内カルシウム代謝を検討した。

(1)細胞内へのLDLの取り込みに際し、培養正常細胞で細胞内カルシウム濃度が約2倍に上昇する対し、NPC細胞では50%に抑制されていた。(2)カルシウムチャンネルアゴニスト投与により、培養NPC細胞内カルシウム濃度が有意に上昇し、コレステロールのエステル化障害も同時に改善されることが見いだされた。以上細胞内カルシウム代謝異常がNPCに存在し、本症の病態生理に大きく関与していることが明らかになった。(C)人アリルサルファターゼA(ASA)遺伝子挿入レトロウイルスベクターの開発とラット胎児遺伝子治療の試み。(1)人ASAcDNAをMFGベクターに挿入し、late infantile type MLD線維芽細胞にtransform。ASA活性の著しい上昇を認めることができた。(2)amphotropic ASAベクターを日令15,16,17のラット胎児の羊膜静脈及び羊水中に注入。生後1日で脳、肝臓、腎臓等各臓器をホルマリン固定後、人ASA抗体を用い免疫組織染色を行いASA蛋白の発現を検討したが、現時点では有意な発現を認めることができなかった。しかしながら本ベクターは培養系で有意に発現しており、今後さらに種々の改良を加え検討する予定である。
腹結合型増殖因子による細胞機能制御

EGFファミリーの細胞増殖因子であるHB-EGFの細胞増殖促進作用、癌での発現と臨床的意義、癌治療の分子標的としての可能性を検討した。その結果、HB-EGFの増殖促進効果をin vitroで調べるためには細胞培養系の選択が重要であることを明らかにした。またHB-EGFは卵巣癌等の増殖・悪性化に大きく関与していることを明らかにし、HB-EGFを分子標的とする癌治療薬の有効性を示すと同時に、HB-EGF阻害薬の臨床開発を開始した。細胞増殖因子HB-EGFは、癌細胞の増殖過程でEGFファミリーの中でもとりわけ重要な因子であることが明らかになってきたが、未だその作用機構については不明の点が多い。膜型から分泌型への転換調節がどのような分子機構で行われているのか、その責任プロテアーゼは何か、分泌型HB-EGFがなぜ腫瘍形成を促進するのか等、多くの疑問が残されている。また、HB-EGFは、細胞外マトリックスなどの存在状態に影響を受けて、増殖促進だけでなく、増殖抑制に関わることもわかってきており、その分子機構とその意義についても興味が持たれる。本研究では、HB-EGFの膜型から分泌型への転換の分子機構とその破綻による細胞の異常増殖機構を詳しく解析すると同時に、この異常が原因で過剰な増殖能を獲得しているがん細胞を明らかにし、HB-EGFがどのようにしてがん細胞の増殖に関わるのかを明らかにし、その成果をもとに新しいがん治療法の開発を目指す。平成17年度は、HB-EGFによる腫瘍形成促進機構について特に詳しく解析し、卵巣がん細胞の腫瘍形成にはHB-EGFが必須であり、HB-EGFの発現レベルが高いものほど腫瘍形成速度は早いことを明らかにした。一方、通常の単層培養系において卵巣癌細胞の細胞増殖速度はHB-EGFの発現レベルの違いでほとんど変化しない。なぜHB-EGFの発現が腫瘍形成を促進するのか、単層培養での細胞増殖速度に影響を与えないのか、この点を詳しく調査した。その結果、HB-EGFはコラーゲンゲルや軟寒天など三次元環境で細胞が増殖するときに特に強く要求されることが判った。また、EGFRリガンドによる癌細胞の増殖促進機構を理解するためには、これまでの単層培養での実験に加えて、三次元環境下での細胞の振る舞いについて、さらに詳しく調べる必要があることがわかった。膜結合型増殖因子HB-EGFは癌細胞の増殖過程で重要な役割を果たしていることが明らかになってきたが、未だその作用機構については不明の点が多い。また、HB-EGFは、増殖促進だけでなく、増殖抑制に関わることもわかってきており、その分子機構とその意義についても興味が持たれる。本研究では、HB-EGFの膜型から分泌型への転換の分子機構とその破綻による細胞の異常増殖機構を詳しく解析すると同時に、この異常が原因で過剰な増殖能を獲得しているがん細胞を明らかにし、その成果をもとに新しいがん治療法の開発を目的としている。具体的には、1)膜型から分泌型への転換に関わる分子機構、2)HB-EGFによる腫瘍形成促進機構の解析、3)細胞外マトリックスによるHB-EGFの機能調節、の3項目について解析を行った。その結果、1)の目的のためにsiRNAライブラリーを用いた新規遺伝子探索システムの構築を試み、エクトドメインシェディングに関わる遺伝子スクリーニングを開始した。2)3)に関連しては3次元増殖におけるHB-EGFの役割を詳しく解析し、2次元増殖と3次元増殖における細胞内シグナル分子の活性化状態の違いを明らかにした。また、2次元増殖ではインテグリンシグナルが細胞内に強く入ることでEGFR下流のシグナルが活性化されており、HB-EGFからのシグナル依存性が少ないこと、反対に3次元増殖においてはインテグリンシグナルが減少しており、HB-EGFからのEGFR活性化が増殖に必要となることを明らかにした。本研究では、EGFファミリーの膜結合型細胞増殖因子であるHB-EGFの膜型から分泌型への転換の分子機構とその破綻による細胞の異常増殖機構を詳しく解析すると同時に、この異常が原因で過剰な増殖能を獲得しているがん細胞の増殖機構を明らかにし、その成果をもとに新しいがん治療法の開発を目的としている。増殖因子HB-EGFの作用機構と癌細胞の増殖における役割について明らかにするために、1)膜型から分泌型への転換に関わる分子機構、2)HB-EGFによる腫瘍形成促進機構の解析、3)HB-EGFと関連して3次元環境下での細胞増殖に関わる分子の同定、4)HB-EGF阻害剤CRM197に関するトランスレーショナルリサーチ、を行った。1)に関しては、shRNAライブラリーを用いた新規遺伝子探索システムの構築を行い、シェディングに関わる遺伝子の網羅的スクリーニングを開始した。2)に関してはHB-EGFが3次元環境での細胞増殖にとりわけ必要であることを明らかにし、2次元増殖と3次元増殖における細胞内シグナル分子の活性化状態の違いを明らかにした。

また,腫瘍形成におけるHB-EGF/EGFRの役割を知る上で、あるいは新規抗癌剤スクリーニングにおいて、3次元培養での評価システムの重要性を示唆した。さらに、2)の成果をもとに3)項の実験を開始し、新たながん標的分子の同定を目指して、3次元増殖特異的に必要な因子の同定を開始した。4)については、CRM197を用いた治験実施の準備がおおむね整った。本研究は、HB-EGFの膜型から分泌型への転換の分子機構とその破綻による細胞の異常増殖機構を詳しく解析すると同時に、この異常が原因で過剰な増殖能を獲得しているがん細胞の増殖機構を明らかにし、その成果をもとに新しいがん治療法の開発を目的としている。これまでに、増殖因子HB-EGFの作用機構と癌細胞の増殖における役割について明らかにするために、1)膜型から分泌型への転換に関わる分子機構、2) HB-EGFによる腫瘍形成促進機構の解析、3) HB-EGFと関連して3次元環境下での細胞増殖に関わる分子の同定、をすすめてきた。木年は、1)に関しては、shRNAライブラリーを用いた新規遺伝子探索システムの構築を行い、シェディングに関わる遺伝子の綱羅的スクリーニングを開始した。2)3)に関してはHB-EGFが3次元環境での細胞増殖にとりわけ必要であることを明らかにし、2次元増殖と3次元増殖における細胞内シグナル分子の活性化状態の違いを明らかにした。これに続いて新たに導入したshRNAライブラリーによるスクリーニングを実施し、HB-EGFと協調して3次元環境下での細胞増殖に関わる分子の候補として、6種類の候補遺伝子を同定した。現在これらの遺伝子が、HB-EGFによる3次元環境下での細胞増殖にどのように関わるのか、詳しく検討を行っている。今後は明らかになった分子が癌治療の新たな分子標的となるかどうかについても検討する予定である膜結合型増殖因子HB-EGFは癌細胞の増殖過程で重要な役割を果たしていることが明らかになってきたが、未だその作用機構については不明の点が多い。本研究では、HB-EGFの膜型から分泌型への転換の分子機構とその破綻による細胞の異常増殖機構を詳しく解析すると同時に、この異常が原因で過剰な増殖能を獲得しているがん細胞を明らかにし、その成果をもとに新しいがん治療法の開発を目的としている。本年度は、1)HB-EGFと関連して3次元環境下での細胞増殖に関わる分子の同定、2)がん組織間質で発現するHB-EGFの解析とその病理的意義、について研究を進めた。まず1)の研究テーマに関して、shRNAライブラリーシステムを用いて、EGFファミリー増殖因子と関連して3次元環境下での細胞増殖をポジティブ(もしくはネガティブ)に作用する分子群の同定を行った。その結果2次元増殖にはほとんど影響を与えないが、3次元増殖には必要な候補遺伝子9種類をスクリーニングし、さらにそれらを個別に検討し現在6種類に絞ってさらなる解析を行っている。これらの中にはMAPKカスケードの下流に位置すると考えられる遺伝子も含まれるが、その機能が全く予想できない遺伝子も含まれていたので、その遺伝子の役割を明らかにすべくさらに研究を続行中である。
１ユニット再構成系を用いたタンパク質膜透過マシーナリーの動的精密探査

細菌におけるタンパク質の膜透過は,チャネルSecYEG,モータータンパク質SecA ATPase,脂質,基質タンパク質を用いることで膜透過を再現できる.これまでのX線結晶構造解析により各Sec因子の理解は深まってきてはいるが,実際の構造変化がどのように起こっているのか不明な点は多く,またタンパク質の膜透過の再現には必要な因子が多いため系が煩雑であり解析が困難である.そこで,安定なサンプルをつくるために、まずアミノ酸リンカーを用いてSecYEGとSecAの融合タンパク質を作成した・その融合タンパク質の機能解析および1ユニット再構成系であるナノディスクに再構成を行ない,基質タンパク質を加えた評価を行った。結果として,融合タンパク質はタンパク質膜透過活性を持ち,ナノディスクに再構成した1ユニット再構成系も基質タンパク質と相互作用をすることを確認した.これらの結果を論文にまとめて発表した。つづいて、この単純化された1ユニット再構成系のナノディスクを,高速原子間力顕微鏡を用いて観察を進めた.まずはナノディスクを1方向に基板へ固定化する方法を確立した.固定化したタンパク質膜透過中間体の観察では,基質タンパク質が引き込まれているような動画が得られており,より詳細な膜透過の可視化にも期待できる.また異なる2種類の基板を用いて別角度から測定できることを明らかにした.この測定系は,他の膜タンパク質に応用可能なものである.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
データ圧縮技術を援用したメモリーベースド動作学習

人間は、自らを取り巻く環境を視覚、聴覚、触覚などを用いて知覚し、環境に応じて適切な行動を決定し、それを確実にこなす。この知覚と行動の密な融合は、ロボットをはじめとする知能機械にも不可欠であり、そのタスク遂行能力を左右する重要なファクターである。知能機械に望まれる多くのタスクでは、知覚と行動の間に静的な対応関係が成り立つ一方、知覚結果を短時間で行動に結び付けるリアルタイム性が要求される。本研究は、知能機械の知覚と行動の関係(sensorimotor map)に焦点を絞り、このようなタスクを遂行するために必要なsensorimotor mapをでき得る限り経験から獲得する方法について考察したものである。すなわち、マップの入出力を特定する以外に何ら事前知識を必要とせず、行動の前後に知覚される環境情報を集約することによってマップを洗練させていく方法であり、メモリーベースドを学習の範疇に属する。本研究では、特にLWR(Locally Weighted Regression)とKD-Tree(K Dimensional Tree)に注目し、非線形マップの表現能力、ノイズに対するロバスト性、実装性、学習効率などの観点から評価するとともに、上記のタスクに最も適したメーモリーベースド学習の一つとしてLWRとKD-Treeを融合したバケツ付きKD-Treeについて検討し、実機を用いた以下の2つのタスク例によってその効果を確認した。(1)誘導タスク(移動ロボット使用)(2)卓球タスク(アーム型ロボット使用)なお、事前情報を用いてsensorimotor mapを表現する手法も本研究と並行して検討し、実用的観点からの比較評価も行った。本研究では、高次元の入出力を有するマッピングの効率的な学習アルゴリズムの導出を目指しているが、同時に実際問題への適用可能性も重視している。本年度は、適用対象の一つに「対人型卓球ロボット」を採用し、様々な学習アルゴリズムの適用可能性について検討した。「卓球タスク」は、ロボットに対する外部環境に相当するボールの運動状態のセンシング(知覚)とボールの打ち返し動作(行動)からなる。行動の問題については、すでにGaussian Kemelに基づく学習方法を提案し、ボールのコースやスピード、球質の変化が限られる場合には、適切な打ち返し動作が学習可能であることを実証している。ただし、行動の学習はボールが打ち返されることが前提であり、ボールの状態予測が適切に為されなければならない。そこで本年度は、特に知覚の問題に対して学習的アプローチを試みた。ボールが打ち出されてから卓球台に衝突するまでの観測結果を用いて、跳ね返ったボールの打ち返し地点とそのときのボール速度を予測する問題であり、特にボールがスピンしている場合には、ボールの回転運動を定量化し、状態変数の一つに加えなければならない。状態変数の選び方の工夫などにより、スピンがボールの軌道に影響を及ぼしやすいスピンボールに対して状態予測が可能であることを実証した。以上の結果、本研究の主目的であるInverse Mappingの新しい学習方法を実システムに適用する準備が整い、現在、“K-D tree"アルゴリズムをGaussian Keemelに基づく学習アルゴリズムに組み込んだInvcrse Mapingの学習方法について検討を重ねている。なお、「対人型卓球ロボット」以外に視覚サーボ系も学習の適用対象と考えており、本年度は、荒いオプティカルフローに基づく視覚サーボシステムを実現し、学習問題の定式化を行った。

すなわち、マップの入出力を特定する以外に何ら事前知識を必要とせず、行動の前後に知覚される環境情報を集約することによってマップを洗練させていく方法であり、メモリーベースド学習の範疇に属する。本研究では、特にLWR(Locally Weighted Regression)とKD-Tree(K Dimensional Tree)に注目し、非線形マップの表現能力、ノイズに対するロバスト性、実装性、学習効率などの観点から評価するとともに、上記のタスクに最も適したメーモリーベースド学習の一つとしてLWRとKD-Treeを融合したバケツ付きKD-Treeについて検討し、実機を用いた以下の2つのタスク例によってその効果を確認した。(1)誘導タスク(移動ロボット使用)(2)卓球タスク(アーム型ロボット使用)なお、事前情報を用いてsensorimotor mapを表現する手法も本研究と並行して検討し、実用的観点からの比較評価も行った。
変形性関節症の構造改善薬シーズの探索を目指した滑膜間葉系幹細胞遊走モデルの開発

変形性膝関節症(OA)に対する治療法の開発は、現在社会的に喫緊の課題となっている。申請者らはこれまでに、1滑膜間葉系幹細胞(滑膜MSC)は関節内組織の損傷・炎症に応答して関節液中へ遊走する、2滑膜MSCを関節内に補充することでOAの進行が抑制されるというメカニズムを示してきた。本研究では、OA構造改善薬シーズの探索を目指し、スクリーニングに適した新たな滑膜MSC遊走モデルを開発する。
光による概日時計の周期調節の分子機構とその適応的意義の解析

原核生物であるシアノバクテリアは、概日リズムを持つことが知られており、光合成活性や細胞分裂が約24時間周期で自律的に振動する。シアノバクテリアの多くの遺伝子の発現は概日時計に制御されており、24時間周期リズムでもって発現していることが知られている。シアノバクテリアの概日時計は、KaiA, KaiB, KaiCという三つの時計タンパク質によって構成されている。本研究では、概日的な遺伝子発現制御の大元である概日時計本体の周期が、どのような仕組みで調節されているのかを解明することを目的としている。概日時計の周期は、一般的に光照度に依存して変化するという性質を持つ。シアノバクテリアは照度が高くなるほど、周期が短縮する。平成27年度は、kai遺伝子に点変異を導入し、その周期が24時間から変化したシアノバクテリアを複数選別し、その周期変異体群から解析に適したものを探した。さらに、変異部位を同定し、光照度に依存した周知長変化の観察および遺伝子発現活性の測定を行った。平成27年度は、周期の調節機構を解析するために、おもにkaiC遺伝子に点変異が入った変異体の選別と、周期調節に寄与する可能性がある因子の破壊株の作成を行った。一部の遺伝子では平成26年度の解析から、おそらく生育に必須であるため破壊は出来ないことがわかったため、点変異導入を実施したところ、一部については変異体が得られた。これらの変異体について、機能解析実験を進めることができた。今後は平成27年度に作製および選別した変異株を用いて、周期決定機構についてリズムの解析を行うと同時に、タンパク質を精製し、生化学的な解析を進める。光合成をおこなうシアノバクテリアは、概日時計(約24時間周期で振動する内在性の計時機構)を持つ唯一の原核生物として知られている。シアノバクテリアでは、概日時計タンパク質である3つのKaiタンパク質によって概日時計が構成されているおり、概日時計からのシグナルを受けて様々な遺伝子が24時間周期のリズムを持って発現するように、制御されている。しかし、昼夜環境において、どのように概日リズムの周期が調節されているのか、その適応的な意義については不明な点が多いため、本研究ではこれらを解明することを目的とする。平成26年度は、解析に用いる細胞培養条件の検討と遺伝子破壊体の作製を主におこなった。また、周期変異体群から解析に適したものを探すため、培養条件を変化させて選別をおこなった。平成26年度は、周期調節機構を解析するために必要となるおもな変異体の作製を行ったが、一部の変異体については破壊株を作製できなかった。その原因は生育に必須であること推察されたため、ノックダウンや点変異導入の検討を実施する必要が生じたため。周期変異体については選別をすすめ、細胞培養方法、解析方法の予備実験を進めることができた。今後は破壊株の作製できなかった候補遺伝子の変異体について、機能欠損や過剰発現体を作製することで、解析を進めることができるかを検討する。平成26年度に作製および選別した変異株を用いて、周期決定機構についてリズムの解析を行うと同時に、ラジオアイソトープを用いた生化学的な解析も進める。変異体の作製に時間がかかっているため、予定した解析の一部が勧められなかったことと、平成26年度の経費執行において、より効率的に物品購入を行ったため。次年度は主に物品費と旅費として使用予定である。シアノバクテリアおよび大腸菌を培養するための培地、ガラス器具やプラスティック器具などの消耗品、生化学実験、分子生物学実験のための酵素や試薬、ラジオアイソトープを主として購入する。また、研究成果発表および資料収集のための旅費、論文投稿費を使用予定である。
ヒッグス場有効理論を用いた新物理の探索

2012年にLHC実験でヒッグス粒子が発見されて以降,ヒッグス粒子の背後に潜む新物理現象を探ることを目的とした,有効理論の方法が精力的に研究されている.従来の研究では,標準模型に含まれない粒子はTeVスケール以下に存在しない,といった特殊な状況が仮定されていたが,この仮定は現在までの実験結果と無矛盾な全ての新物理模型に適応されるものではない.そこで本研究では,新物理をより包括的に探索していくために,あらゆる拡張ヒッグス模型を一般的に記述する有効理論を確立させる.また,本研究によって得られる一般的知見,およびこれまでの実験結果や将来実験から得られる情報を総動員し,素粒子の質量起源を明らかにする.2012年にLHC実験でヒッグス粒子が発見されて以降,ヒッグス粒子の背後に潜む新物理現象を探ることを目的とした,有効理論の方法が精力的に研究されている.従来の研究では,標準模型に含まれない粒子はTeVスケール以下に存在しない,といった特殊な状況が仮定されていたが,この仮定は現在までの実験結果と無矛盾な全ての新物理模型に適応されるものではない.そこで本研究では,新物理をより包括的に探索していくために,あらゆる拡張ヒッグス模型を一般的に記述する有効理論を確立させる.また,本研究によって得られる一般的知見,およびこれまでの実験結果や将来実験から得られる情報を総動員し,素粒子の質量起源を明らかにする.
反応活性種の構造に対する超臨界流体の効果

本研究は、溶液および凝縮系における溶質一溶媒間の強い相互作用が溶質の電子構造に及ぼす効果について研究し、これらの成果を基に超臨界流体のような弱い相互作用系に研究を発展させることを目的としている。次に示す成果を得た。1.フタロシアニン錯体の励起三重項状態の時間分解ESR研究いくつかの反磁性フタロシアニン錯体(Na_2Pc,MgPcZnPc)のT_1状態の時間分解EPRスペクトルを初めて検出し,緩和過程に対する金属イオンの効果を明らかにした。Na_2PcとMgPcのEPRスペクトルは,低磁場側がマイクロ波の発光で,高磁場側が吸収であることから,面内副準位への優先的項問交差緩和である。一方、ZnPcではスピン分極パタ-ンが逆であることから,最低面外副準位への項問交差緩和速度が最大となっている。これらのフタロシアニン錯体では,零磁場分裂定数のE値が零でないことから,励起状態で4回対称をもたないことが明らかである。2.ピリジン誘導体の励起三重項状態に対する溶媒極性の効果4ーアセチルピリジンのT_1状態は,主としてカルボニル^3nπ^*の性格をもち,スピン軌道相互作用により^3ππ^*が混合している。混合の割合は溶媒極性に著しく依存することが、77KにおけるT_1状態時間分解EPRスペクトルから明らかにされた。他の電子吸引基をもつピリジン誘導体では,ピリジン^3ππ^*状態との混合状態である。このために,面外副準位が中間副準位になっているのが特徴である。これらの電子状態の混合のために,励起状態における構造の歪みがひき起される。3.ピリジニルラジカルの不対電子軌道に対する溶媒効果種々の溶媒中におけるラジカルの超微細構造が解析され,不対電子の入った分子軌道の係数が溶媒から受ける影響を求めた。これから,真空中のラジカルの不対電子軌道を求めることができた。次に示す成果を得た。
本邦散発性基底細胞癌における体細胞Ptc突然変異の頻度を探る

本邦散発生基底細胞癌おけるPtc突然変異の頻度を探るため,平成14年度散発性基底細胞癌と診断された症例31例と有棘細胞癌11例のホルマリン固定パラフィン標本より5μmの薄切切片を10枚ずつ作成した.基底細胞癌の1例においてPtcのExon14をPCRにて増幅することに成功した.平成15年度は引き続き他の症例においてもExon14,Exon19,Exon20の増幅を試みたが失敗に終わった.原因を究明するため正常人リンパ球DNAを用いてPCR条件の確認を行なったところExon14とExon20はシングルバンドがExon19は複数のバンドが検出された.引きつづいてホルマリン固定パラフィン標本よりDNAが抽出,濃縮されていることを確認するため,ベータグロビンが増幅されるか確認したところ多くのサンプルでベータグロビンを増幅することができなかった.標本サンプルの大きさと核酸の保存状態に問題があるものと思われた.このため手持ちのサンプルでPCR-SSCP解析を遂行することは困難であると結論づけた.そこでBCC発生におけるPtc蛋白質の関与を調べるために残った薄切切片を用いて免疫組織科学的にPtc蛋白質の過剰発現を検討することに方針を変更した.Ptc蛋白質とp53蛋白質の発現を免疫組織化学染色で検討したところ,基底細胞癌では31例中6例が陽性で有棘細胞癌では11例中全てが陰性であった.p53蛋白質は基底細胞癌31例中4例,有棘細胞癌11例中8例で陽性であった.基底細胞癌でPtc蛋白質とp53蛋白質が同時に陽性のものはなかった.基底細胞癌とPtc蛋白質の過剰発現は関連が深く,有棘細胞癌とは関連が乏しいことが示唆された.またPtc蛋白質とp53蛋白質が同時に陽性のものはなかった所見はおのおのを介する癌抑制作用が別の経路をとることが示唆された.私はPCR-SSCPの手法を用いて本邦散発性基底細胞癌における体細胞Ptc突然変異の頻度を探るために研究を実施している.平成14年度の進捗状況を報告する.1.鳥取大学医学部倫理委員会に本遺伝子解析研究の実施をはかり,承認された.2.鳥取大学医学部皮膚科で過去に手術され,臨床病理組織学的に散発性基底細胞癌と診断された症例30例のホルマリン固定パラフィン標本より5μmの薄切切片を5枚ずつ作成した.3.DEXPAT(宝酒造株式会社)を用いてDNAを含んだ溶液を作成した.4.PCRにあたり上記3.で抽出した溶液をイソプロピルアルコールを用いて精製,濃縮した.5.Aszterbaum Mら(J Invest Dermatol 110,885-888,1998)によって変異のある症例が示されたPtcのExon14をPCRにて増幅することに成功した.今後PCRによるExon19,Exon20の増幅を行い,その増幅産物についてPCR-SSCP解析を全症例について行う予定である.本邦散発生基底細胞癌おけるPtc突然変異の頻度を探るため,平成14年度散発性基底細胞癌と診断された症例31例と有棘細胞癌11例のホルマリン固定パラフィン標本より5μmの薄切切片を10枚ずつ作成した.基底細胞癌の1例においてPtcのExon14をPCRにて増幅することに成功した.平成15年度は引き続き他の症例においてもExon14,Exon19,Exon20の増幅を試みたが失敗に終わった.原因を究明するため正常人リンパ球DNAを用いてPCR条件の確認を行なったところExon14とExon20はシングルバンドがExon19は複数のバンドが検出された.引きつづいてホルマリン固定パラフィン標本よりDNAが抽出,濃縮されていることを確認するため,ベータグロビンが増幅されるか確認したところ多くのサンプルでベータグロビンを増幅することができなかった.標本サンプルの大きさと核酸の保存状態に問題があるものと思われた.このため手持ちのサンプルでPCR-SSCP解析を遂行することは困難であると結論づけた.そこでBCC発生におけるPtc蛋白質の関与を調べるために残った薄切切片を用いて免疫組織科学的にPtc蛋白質の過剰発現を検討することに方針を変更した.Ptc蛋白質とp53蛋白質の発現を免疫組織化学染色で検討したところ,基底細胞癌では31例中6例が陽性で有棘細胞癌では11例中全てが陰性であった.p53蛋白質は基底細胞癌31例中4例,有棘細胞癌11例中8例で陽性であった.基底細胞癌でPtc蛋白質とp53蛋白質が同時に陽性のものはなかった.基底細胞癌とPtc蛋白質の過剰発現は関連が深く,有棘細胞癌とは関連が乏しいことが示唆された.またPtc蛋白質とp53蛋白質が同時に陽性のものはなかった所見はおのおのを介する癌抑制作用が別の経路をとることが示唆された.