hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
東京地域における都市地下温暖化の形成過程解明と将来予測に関する研究

東京地域における地下温暖化の形成過程を明らかにするため,都市域地下温度の高精度モニタリングを実施して,地下温度の微細な変動を観測した。この結果,多くの地点で地下温度の継続的な上昇が確認され,当該地域では地下温暖化が進行していることが明らかとなった。推定された地下温度上昇率は都心で高く郊外で低い傾向がある。地下温暖化の形成には,地表面付近の温度上昇だけでなく,地下構造物からの排熱や人為的な地下水流動の変化が影響を与えていると考えられた。東京地域における地下温度上昇の実態を解明するため,平成25年度においては東京首都圏の観測井の中からモニタリングポイントを選定し,地下温度長期モニタリングを開始した。地下温度の変化は微細であることが予想されたが,日-季節-経年の時間スケールで区分して変動傾向を把握することが本研究の目的を達成するためには欠かせない。したがって,全てのモニタリングポイントで精度や確度を統一させるため,モニタリング開始に先立ち,実験室において高精度温度計や水位計の動作確認と校正作業を実施した。モニタリングポイントについては,10地点を選定した。地点選定においては,都市化の影響を評価するため,土地利用と変遷に関する情報を収集し,都市中心部のみに限定せず,比較対象とするため郊外にも配置するように工夫した。また,地域による地下水流動の違いが地下温度分布どのような影響を与えるか評価するため,地下水利用の実態の違いを検討できるようにも工夫した。全てのモニタリングポイントには,観測井孔内の水位変化の影響を検討するため,水圧計も温度計に併せて設置した。また,モニタリングポイントの選定には,既存のモニタリング地点も含めた。これら既存地点についてはモニタリング機器の性能や確度が統一されておらず地点間の広域的なデータ比較が困難である問題点があったが,本研究によりこの問題点を解消することができた。これにより来年度以降,再解析による過去データの活用も期待できる。地下温度長期モニタリング開始の際には,併せて地下温度プロファイルの測定も実施し,当該データを得ることができた。このデータは温度計設置深度の検討に適用しただけでなく,今後のデータ解析にも活用する予定である。東京地域における地下温度上昇の実態を解明するため,平成26年度においては,前年度に選定した地下温度モニタリングポイント10地点(東京都内6地点,埼玉県内4地点)について観測を継続し,研究期間の中間成果として当該データを取得した。取得した地下温度モニタリングデータには,観測した全ての地点において継続的な上昇傾向が確認され,東京地域の広範囲に地下温暖化が生じていることが確認された。本研究においては地下温暖化に対する都市化の影響を評価するため,都市中心部だけでなく郊外においても観測できるようにモニタリング地点を選定したが,地下温度の上昇傾向は都心中心部に位置する地点で大きく,郊外に位置する地点で小さい傾向が認められた。また,同一地点においては深部よりも浅部で温度上昇が大きい傾向が認められたが,都心中心部の地点においては,特定の深度で特に温度上昇が大きいケースも確認された。さらに地下温度モニタリング結果においては,前述した地下温度の上昇傾向だけでなく,地下温度の微細な変動が観測され,上昇傾向が一様ではないことが確認された。この変動は,都市中心部に位置する地点だけでなく,郊外に位置する地点においても認められた。データ解析の結果,このような変動は,東京地域の地下温暖化が,従来から要因とされてきた地表面温度上昇の影響だけでなく,地下構造物からの排熱や地下水開発の影響を受けていることを示唆していると考えられた。地下温度モニタリングに併せて,平成26年度においては地下温度プロファイルの測定を平成25年度から継続して実施し,当該データを得ることができた。このデータはモニタリングデータの検証に適用するだけでなく,過去データとの比較検討に活用することで,長期の地下温度環境の変化の解明に取り組む予定である。東京地域における地下温度上昇の実態を解明するため,平成27年度においては,平成25年度に選定した地下温度モニタリングポイント10地点(東京都内6地点,埼玉県内4地点)について観測を継続してデータを取得した。また,これら観測データの解析を実施して,研究成果として取りまとめた。また,同一地点においては深部よりも浅部で温度上昇が大きい傾向が認められた。この結果から,地下温度の上昇は地表付近からの排熱が地下に影響に影響を及ぼすことによって生じており,都市中心部と郊外の温度上昇率の差異は,ヒートアイランド現象の都市特有の熱環境が地下環境にも影響を与えていることが明らかとなった。一方,特定の深度で局所的に温度上昇率が大きい事例も観測された。このような事例は,都市中心部に位置する地点で確認され,都市インフラである大規模な地下構造物の近傍にある。温度上昇率の解析結果から,季節的な変動パターンを有することが確認されており,地表付近からの排熱だけではなく,地下構造物からの排熱の影響を受けていることが示唆された。また,郊外に位置する地点においても,地下温度の微細な変動が観測された。この変動は,都市中心部に認められた変動パターンとは異なる。

水理水頭変化には地下水揚水の影響によって本地域周辺の地下水の流動が変化していることが示されており,このような人為的な地下水流動が,地下温度の微細な変動の要因であると考えられた。東京地域における地下温暖化の形成過程を明らかにするため,都市域地下温度の高精度モニタリングを実施して,地下温度の微細な変動を観測した。この結果,多くの地点で地下温度の継続的な上昇が確認され,当該地域では地下温暖化が進行していることが明らかとなった。推定された地下温度上昇率は都心で高く郊外で低い傾向がある。地下温暖化の形成には,地表面付近の温度上昇だけでなく,地下構造物からの排熱や人為的な地下水流動の変化が影響を与えていると考えられた。平成26年度計画の実施項目は次の5項目が含まれる。1地下温度モニタリングの継続(43月)23次元地下モデルの構築(412月),3シミュレーションの実施(13月),4学会発表(5,10月)。1については,計画通り継続して実施してデータを取得すると共に,取得データのデータベース化に取り組んだ。2,3については,1の中間報告の結果を踏まえて,取得したモニタリングデータをより活用できる方法を検討し,当初予定した広範囲を対象としたシミュレーションではなく,モニタリング地点を対象とした数値解析を実施することにより当該研究の目的である地下温暖化の評価と将来予測に取り組むこととした。今年度内は都市中心部と郊外の中間に位置するモニタリング地点を選定して地下モデルの構築に取り組み(2に相当),数値解析と観測データの比較検討(3に相当)を開始した。本地域においては地下水揚水等の人為影響を受けた地下水流動の影響を検討する必要があるが,数値解析においては,この影響が相対的に少ないと期待できる浅部の沖積層のデータに着目することで,都市化に伴う地下温暖化の影響評価に取り組んだ。これにより研究の目的である都市地下温度の実態(都心ー郊外・深度による温度上量率や特徴・地下ヒートアイランド)の解明を進め,最終年度の取りまとめを行う予定である。4については,地球惑星科学連合(5月),Asia Oceania Geosciences Society(国際学会,7月),International Association of Hydrogeologists(国際学会,9月)において研究成果の一部を中間報告した。これらの本年度の研究内容は,年次計画に沿って実施されており,大きな問題や遅延は認められない。そのため研究目的の達成に向けて概ね順調に進展していると判断できる。水文地質学平成27年度は取得したデータ解析を進め,研究成果を取りまとめる。実施計画は下記の通り。1地下温度モニタリング結果と数値解析結果の比較と検証(46月),2地下温暖化の形成過程の検討,将来予測の実施(511月)3まとめ,報告書の作成(122月)4学会発表(5,10月)
下水汚泥と都市ごみ有機成分(OFMSW)の一括バイオガス化技術の開発と評価

下水処理場の消化槽に下水汚泥とともに未利用バイオマスを投入し,バイオガス量を増産させる混合嫌気性消化技術の更なる適用拡大が期待されている。本研究では,その殆どが焼却処理されている都市ごみ有機成分(OFMSW)に着目し,下水汚泥との一括バイオガス化技術を開発,評価する。29年度は,OFMSWの中で潜在的エネルギー量が生ごみを上回る紙類に特に焦点を当て,回分メタン発酵実験を実施し,都市ごみを構成する主要な紙類は生ごみに匹敵するバイオガス化活性を有していることを示した。30年度は,実際の都市ごみから機械処理により選別して得られたOFMSWを基質に用いた実験を行った。選別OFMSWの主要構成物が生ごみと紙類であることを確認後,回分実験を行った結果,OFMSWのVS(有機物)基準のメタン生成活性は時期によらず下水汚泥よりも高かった。次に下水汚泥に対してOFMSWを重量比で5%,10%,15%追加投入した系列で混合消化の連続運転を実施し,同時に運転した下水汚泥単独系の結果と消化特性を比較した。すべての系列において安定した消化が行われ,OFMSWの投入量が5%,10%の運転では,OFMSWの投入VS(有機物)当たりの正味のガス発生量はそれぞれ657NL/kg-VS,635NL/kg-VSと算出され,連続運転においても高い分解性を示すことを実証した。OFMSWの投入量が15%の場合は投入VS当たりの正味のガス発生量は532NL/kg-VSに低下したが,汚泥単独系に対する消化ガス発生量の増加率は最も高かった。30年度の当初の予定は,下水汚泥単独系(対照系),および下水汚泥にOFMSWを混合した系(混合系)の2系列の消化槽の連続運転を行い,各条件で定常状態におけるガス発生や固形分分解の消化特性データを得ることを目標としていた。当初予定通り,濃縮下水汚泥の投入量は一定とし,対照系を消化日数約30日で運転し,混合系は同量の下水汚泥の投入に加えてOFMSWの投入量を段階的に上昇させた。各負荷条件において2滞留日数以上の期間連続運転を行い,安定した運転を確認し,運転後半のデータから消化特性を得ることができ,OFMSW投入の影響を明確に示すことができたため。最終年度の令和元年度は,連続実験を継続し,特に高負荷における消化特性データを得る。最大投与負荷は,当該下水道整備地域における可燃ごみの排出量を参考に決定する。さらに,以下に示すLCA評価を実施し3年間の研究を総括する。1提案システムのLCA評価モデル都市を設定し,本システムを適用した場合のエネルギー生産量やCO2削減効果等をLCAの観点から評価する。種々のシナリオを設定するが,現在の動向により,発生バイオガスはガスエンジン発電に使用し,混合消化で増大する汚泥は脱水ケーキを焼却処分するシナリオを軸とし,これらを現状のOFMSW全量焼却シナリオと比較することを基本とする。29年度は,OFMSWの中でも研究例が少なく,さらに潜在的エネルギー量は生ごみを大きく上回る紙類に特に焦点を当て,主に回分メタン発酵実験を実施した。紙類の種類として,一般的な可燃ごみ区分として収集される都市ごみ中の紙類を調査して種類を選定した。代表的な実験では,ティッシュ,新聞紙,オフィス系雑紙,段ボールを基質バイオマスとし,比較として下水汚泥と実際の家庭系生ごみも試験した。回分実験の結果,種汚泥の自己分解分を差し引いて算出した投入VS(有機物)あたりの正味のガス発生量は,試験終了時(20日目)において生ごみ及び下水汚泥の754,513(mL/g-VS)に対して,それぞれ703,429,756,580(mL/g-VS)となった。したがって,易分解性の生ごみほどは高くないが,マテリアルリサイクルが困難なティッシュやオフィス系雑紙は生ごみに匹敵するガス化ポテンシャルを有していることが明らかとなった。バイオガス中のメタン比率は生ごみの約63%に対して約5559%と若干低かった。一方で,生ごみと比べて上澄み中の溶解性有機物濃度は顕著に低い傾向を示した。回分実験は複数回行い,種汚泥の種類(下水消化汚泥または生ごみメタン発酵施設の消化汚泥)に関わりなく最終的な消化特性は同等であった。29年度は,可燃ごみ組成の調査(可燃ごみ中の紙ごみの種類や比率,1人当たりの発生量の概略を把握),および代表的紙類の成分分析(各種の紙類をサンプルとした固形分量(TS),有機物量(VS),C/N比等の測定)により基礎データを得た後に,紙類の回分式メタン発酵実験を実施し各種紙類のガス化や固形分分解ポテンシャルを把握することを当初の研究実施計画としており,それらの検討事項をおおむね順調に進捗できたため。

特に研究計画の中心としていた各種紙類の回分式メタン発酵実験では,紙類正味のガス発生量,メタン含有率,固形分分解率,溶解性COD,アンモニア性窒素等で評価し,各種紙類の分解性やその差異などを明らかにすることができた。回分実験では種汚泥の種類に関わりなく再現性の高いデータが得られている。また,混合消化システムにおいて同時に投入する下水汚泥と生ごみについても回分実験を実施し,紙類との比較を含めてその消化特性を明らかにした。下水処理場の消化槽に下水汚泥とともに未利用バイオマスを投入し,バイオガス量を増産させる混合嫌気性消化技術の更なる適用拡大が期待されている。本研究では,その殆どが焼却処理されている都市ごみ有機成分(OFMSW)に着目し,下水汚泥との一括バイオガス化技術を開発,評価する。29年度は,OFMSWの中で潜在的エネルギー量が生ごみを上回る紙類に特に焦点を当て,回分メタン発酵実験を実施し,都市ごみを構成する主要な紙類は生ごみに匹敵するバイオガス化活性を有していることを示した。30年度は,実際の都市ごみから機械処理により選別して得られたOFMSWを基質に用いた実験を行った。選別OFMSWの主要構成物が生ごみと紙類であることを確認後,回分実験を行った結果,OFMSWのVS(有機物)基準のメタン生成活性は時期によらず下水汚泥よりも高かった。次に下水汚泥に対してOFMSWを重量比で5%,10%,15%追加投入した系列で混合消化の連続運転を実施し,同時に運転した下水汚泥単独系の結果と消化特性を比較した。すべての系列において安定した消化が行われ,OFMSWの投入量が5%,10%の運転では,OFMSWの投入VS(有機物)当たりの正味のガス発生量はそれぞれ657NL/kg-VS,635NL/kg-VSと算出され,連続運転においても高い分解性を示すことを実証した。OFMSWの投入量が15%の場合は投入VS当たりの正味のガス発生量は532NL/kg-VSに低下したが,汚泥単独系に対する消化ガス発生量の増加率は最も高かった。30年度の当初の予定は,下水汚泥単独系(対照系),および下水汚泥にOFMSWを混合した系(混合系)の2系列の消化槽の連続運転を行い,各条件で定常状態におけるガス発生や固形分分解の消化特性データを得ることを目標としていた。当初予定通り,濃縮下水汚泥の投入量は一定とし,対照系を消化日数約30日で運転し,混合系は同量の下水汚泥の投入に加えてOFMSWの投入量を段階的に上昇させた。各負荷条件において2滞留日数以上の期間連続運転を行い,安定した運転を確認し,運転後半のデータから消化特性を得ることができ,OFMSW投入の影響を明確に示すことができたため。30年度は下水汚泥とOFMSWの混合消化の連続実験を中心に研究を実施する。実際の適用においては,紙ごみ以外に生ごみも投入することが現実的であり,本研究のOFMSW利用システムでも想定している。そこで,紙類を生ごみとともに混合した連続実験を実施する。下水汚泥単独系(対照系),および下水汚泥にこれらのOFMSWを混合した系(混合系)の2種類のラボスケール消化槽の連続運転を行う。用いる下水汚泥は標準活性汚泥法の混合濃縮汚泥(TS約3.6%)である。消化汚泥の引抜きと基質の投入を定期的に行い,対照系の滞留日数を標準的な30日とする。なお,可燃ごみ中での存在割合が高い紙類は裁断のみで比較的高いガス発生を示したため,コスト面を考慮し,薬品を用いた前処理は行わない方針とする。各条件で定常状態におけるガス発生や固形分分解の消化データを得る。下水汚泥の投入量は一定とし,OFMSWの投与負荷は排出量を考慮して段階的に上昇させる。最終年度の令和元年度は,連続実験を継続し,特に高負荷における消化特性データを得る。最大投与負荷は,当該下水道整備
DNAメチル化を介した、精巣幹細胞から前駆細胞への運命決定制御機構の解析

これまで、他の組織幹細胞と同じように、精巣の幹細胞も、より未分化な細胞に発現している分子などを検索し、これを指標に幹細胞の同定、純化を行う試みが成されてきた。その結果、Oct4,Neurogenin3,PLZFなどの新たな分子マーカーが明らかになった。一方、昨今の急速な方法論の進展により、高次の遺伝子発現制御の視点から、クロマチンの様々な修飾を認識する抗体が次々に樹立され、さらにはクロマチン免疫沈降法などにより、より詳細な解析が可能となった。本研究では、この2つの成果を融合し、精巣幹細胞に特徴的クロマチン修飾構造があるか否か、あるとしたらどのようなものであるかを明らかにする研究である。主にNeurogenin3を指標とした解析によれば、精巣の幹細胞は比較的低メチル化を示し、denovoのDNAメチル基転移酵素を発現しない細胞集団であることがわかってきた。また、H3Me2K9といった抑制性のヒストン修飾も認められなかった。一方、ポリコム遺伝子群が修飾するH3Me3K27といった修飾は、分化度に関わらず変化が無かった。ゲノム局所における、これら修飾の変化を検証するために、クロマチン免疫沈降法を用いて、主にc-Kit遺伝子周辺を検索したところ、c-Kitを発現する以前からクロマチンはオープンになっているとともに、発現の必要がない遺伝子の発現調節領域には、H3Me3K27の修飾が強く認められた。このように、精巣幹細胞に特徴あるクロマチン修飾が認められることが明らかとなった。今後、これらの修飾の変化を手がかりに、ゲノムワイドで検証を行う必要があると考えられる。さらには、その修飾がもたらす幹細胞活性に対する影響の生物学的意義についても、さらなる解析が必要であると考えられた。これまで細胞の分化制御機構の解析は、幹細胞特異的分子や前駆細胞特異的分子を想定し、これを同定し解析することが中心に行なわれてきた。しかしながら、幹細胞、前駆細胞における遺伝子発現が明確に分かれるような分子はなかなか見つかってこない。このことから、細胞分化の運命決定制御機構は、特定のマスター遺伝子によって制御されているという考えに加え、もつとグローバルなクロマチン構造を変換させる事により、同時多発的な遺伝子発現制御機構が働いているのではないかと考えた。そこで精巣の幹細胞、前駆細胞それぞれ特異的なクロマチン構造があり、それが変化する事と細胞分化が密接に関連しているのではないかと推測し以下の研究を行なった。これまで報告して来たDNAのメチル化を介した細胞分化に加え、今年度はヒストン修飾を重ね合わせ検討を加えた。精巣における組織幹細胞であるKit陰性精原細胞は、ユークロマチン状態を反映する修飾に富み、またポリコム遺伝子群が介在する修飾を受けているが、ヘテロクロマチン状態を反映する修飾に乏しい。このことから、Kit陰性精原細胞の遺伝子発現抑制は、ポリコム分子が中心となって行なっていることが推測された。一方Kit陽性精原細胞への移行に伴い、H3K9を中心とする修飾が加わることが今回の解析で判った。このことは、H3K9を介する遺伝子抑制系が、前駆細胞レベルで起こり、より強固、かつ、不可逆的な遺伝子発現抑制ももたらしていることが示唆された。
TLR2による結核菌表層成分の認識機構の解明

Toll-like receptor(TLR)は病原体のさまざまな成分をパターン認識することにより、自然免疫に重要な役割を果たしている。マクロファージに発現したTLRを介してシグナルが伝達されることにより、種々のサイトカインやケモカイン産生が誘導される。昨年の検討で結核菌の「表層に存在する糖脂質lipoarabinomaman(LAM)がTLR2によって認識されることが示唆された。本研究では、野生型およびTLR2欠損マウスの骨髄由来マクロファージ(BM-Mφ)を、Mycobacterium tuberculosis Aoyama BのLAM(AoBLAM;alabinoseにmannose capが結合している)および.M.smegmatisのLAM(SMGLAM;mannose capがない)で刺激し、TLR2の集積、培養上清中のサイトカイン産生、mRNAの発現、シグナル伝達について検討を行った。共焦点レーザー顕微鏡を用いた検討により、AoBLAMもしくはSMGLAMでBM-Mφを刺激すると、ラフトの集合が多くなり、ラフト上にTLR2の集積が認められることが分かった。しかしTLR2欠損マウスのBM-Mφを刺激しても、ラフト集合の増加は認められなかった。また野生型BM-Mφを刺激した培養上清中でIL-6産生が認められ、TNF-αmRNAおよびIL-6mRNAの発現が認められた。さらに、NF-κBの消化、p38およびAKTのリン酸化がAoBLAMもしくはSMGLAM刺激で認められた。以上の結果から、AoBLAM,SMGLAMともにTLR2によって認識され、ラフトにTLR2が集積することによりシグナルを細胞内へ伝達することが分かった。Toll-like receptor (TLR)は病原体のさまざまな成分をパターン認識することにより、自然免疫に重要な役割を果たしている。結核菌を含むミコバクテリアの細胞壁にはミコール酸含有糖脂質のtrehalose dimycolate(TDM)、trehalose monomycolate(TMM)等に加えて、phosphatidylinositolにmannoseが結合したphosphatidylinositol mannoside(PIM)、さらにmannoseとarabinoseが結合したlipoarabinomannan(LAM)など種々の糖脂質が存在する。これら糖脂質はマクロファージ活性化能を有し、結核病態形成に重要な菌体成分である。本研究では、各TLRのトランスフェクタントやTLR2欠損およびTLR4欠損マウスの骨髄由来マクロファージ(BM-Mφ)を用い、結核菌の各種糖脂質について、NF-κB依存的ルシフェラーゼアッセイや培養上清中のTNF-αおよびIL-6産生の検討を行った。その結果、TDM,TMM,PIMおよびLAMはTLR2を介してシグナル伝達することが明らかとなった。また、TLR2欠損マウスBM-Mφに刺激を与える糖脂質もあった。さらに、LAM刺激時に脂質ラフトが集積するか、TLR2がラフトに集積するか共焦点レーザー顕微鏡を用いて検討したところ、細胞膜上にラフトマーカーであるGM1の集合が観察され、ラフト部分にTLR2の集合も認められた。以上の結果から、LAMはTLR2によって認識され、ラフトにTLR2が集積することによりシグナルを細胞内へ伝達することが示唆された。これらの結果について、さらに詳細に検討中である。
河川陸封性カワヨシノボリにおける巣石利用の実態

ハゼ科ヨシノボリ属魚類の繁殖様式は基質産卵性で雄が卵の見張り保護を行う。ヨシノボリ属魚類にとって川床の礫石は産卵基質となる重要な繁殖資源である。さらに,礫石サイズは保育できる卵数を決定するので,雄の繁殖成功上重要な形質である。ヨシノボリ属魚類では,大型の巣石獲得をめぐる雄間競争が種内・種間レベルでみられ,大型の個体が優位に立つ。河川性カワヨシノボリは同所的に生息する両側回遊性ヨシノボリ類に比べて小型で,巣石獲得競争上不利であると考えられる。一方,カワヨシノボリは両側回遊性ヨシノボリ類に比べ極めて大卵少産なので,前者の巣石サイズが後者より小さくても問題は少ない可能性がある。仮に,カワヨシノボリが必要な巣石サイズが両側回遊性ヨシノボリ類より小さいなら,かれらが共存する場合,巣石獲得をめぐる種間競争は緩和されることが予測される。本研究ではこの予測を検証するため,まず,カワヨシノボリと両側回遊性ヨシノボリ類の共存地点において,各種がどのようなサイズの巣石を利用しているのか調査した。次に,カワヨシノボリについて巣石サイズ選択実験をおこない、同一河川に生息する,既に巣石サイズの選好性が明らかになっている両側回遊性ヨシノボリ類とその選択性を比較した。野外調査の結果、カワヨシノボリは両側回遊性ヨシノボリ類より小さな礫石を巣として利用し、その産着卵面積も小さかった。巣石サイズ選択実験の結果、雄体サイズが巣石サイズ選択性を決定する要因であり,種の違いは無関係であることが明らかになった。カワヨシノボリは共存する両側回遊性ヨシノボリ類より体サイズが小さいので、結果として小さな礫石を巣として利用していることになる。以上の結果より,河川性カワヨシノボリと両側回遊性ヨシノボリ類とは巣石獲得をめぐっては激しい競争関係にないことが示唆された。
軟骨魚類の骨硬化ホルモン〈カルントニン〉:細胞レベルにおける生理作用の解明

本研究は平成7年度と8年度に渡って研究された。しかしながら、当初に目的とするところまでは、残念ながら達していない。これは7年度の配分が10月末日に補正予算として遅れて来たこと、その額が予定をした物品の購入にはるかに及ばない為、自分で装置の手作りから始めねばならなかったことによる。さらに、日本海における原油流出という全く不足の事態が発生して漁船が出ず、アカエイ等の軟骨魚類の入手がかなり困難になってしまったことも原因の一つである。現在、本研究で申請した細胞内イオン測定装置(日本分光:CAM230型)に相当する、細胞内のCa濃度の変化を調べる装置を、倒立顕微鏡と落射蛍光装置及び光電子倍増管を組み合わせて完成させた。これはニコンTMD300という倒立顕微鏡に蛍光カルシウム指示薬Indo-1用の落射蛍光装置(EF-S/Ca)を組み込み、細胞を380nmの波長でたたき、そこから出る蛍光をダイクロイックミラーDM455により2つの波長に分け、波長405と485のフィルターを通して細胞内Ca濃度の盛衰を見るという装置である。実際は、倒立顕微鏡のサイドポートへ光電子倍増管(浜松ホトニクスR1477)を2本組み込んだ装置を取り付け、2ペンのレコーダーへシグナルを導き、記録した。すなわちCa濃度が高いときは405nmのピークが高く、低いときは485nmのピークが高くなる。軟骨細胞の培養は試みてはいるが現在、上手く行かない。最近、神経細胞の細胞膜は軟骨細胞が生産する軟骨基質に似た硫酸プロテオグリカンからなるという報告がある。従って、上記の装置の有効性を試すため、軟体動物のアメフラシの腹部神経節より過去に、申請者らがカルシトニンに反応する事を見いだしたR9と名付けられている細胞で細胞内Ca濃度の変化を検出を試みた。しかしながら、うまく細胞内Caの変化を捕らえらず、その原因をやっきとなって調べている。カルシトニンは硬骨に作用して破骨細胞の活性を抑制し、結果として骨を硬くするホルモンである。しかしながら、申請者等は軟骨魚類のアカエイも大量のカルシトニンをもち、何らかの生理作用を担っていることを明らかにしてきた。本研究は、将来の医薬品の開発に向けて、軟骨魚がもつカルシトニンの細胞レベルの作用の解明を目指すものである。本申請は補正予算で認められたため、現在、研究の進行は遅れている。また、申請額の縮小があった為、申請した設備を完全には揃えられなかった。本研究の実験の主たる部分は細胞内外でのCaの動態の把握であり、それにカルシトニンがどのように関与するかを明らかにすることである。その為に細胞内イオン測定装置を申請してあった。しかしながら、上記の事情でそのものは購入できなくなった。従って、予算の範囲内で手作りで同等な機能をもった装置を作りつつある。すなわち、万能倒立顕微鏡を購入しそれにCaと結合した蛍光色素を励起させることが出来る落射蛍光装置を取り付け、さらに検出の為の光電管をもつ測光部とそれを増幅させる部品を取り付けた。これらは黒田氏との共同作業による。また、実際に測光可能か否かを試しつつあるが、試みにウニの卵内のCaの検出装置と比較したところ、軟骨細胞の大きさはウニ欄より小さいため、さらに検出感度上げる必要が出てきた。現在、それを検討しているが、部品を換えるだけの問題なのでほぼ測定装置は完成に近づいたと言える。また、当初は哺乳類の細胞から始める予定であったが、予算の都合でCO2インキュベータ-がすぐには買えない。しかしながら、魚類の軟骨細胞を培養している研究者よりそのノウハウを教えて貰えることになった。従って、まずはその細胞でCaの動態を調べ、続いて哺乳類の細胞で調べる予定である。

従って、上記の装置の有効性を試すため、軟体動物のアメフラシの腹部神経節より過去に、申請者らがカルシトニンに反応する事を見いだしたR9と名付けられている細胞で細胞内Ca濃度の変化を検出を試みた。しかしながら、うまく細胞内Caの変化を捕らえらず、その原因をやっきとなって調べている。本研究は平成7年度と8年度に渡って研究された。しかしながら、当初に目的とするところまでは、残念ながらに達していない。これは7年度の配分が10月末日に補正予算として遅れて来たこと、その額が予定をした物品の購入にはるかに及ばない為、自分で装置の手作りから始めねばならなかったことによる。さらに、日本海における原油流出と言う全く不足の事態が発生して漁船が出ず、アカエイ等の軟骨魚類の入手がかなり困難になつてしまったことも原因の一つである。現在、本研究で申請した細胞内イオン測定装置(日本分光:CAM230型)に相当する、細胞内のCa濃度の変化を調べる装置を、倒立顕微鏡と落射蛍光装置及び光電子倍増管を組み合わせて完成させた。これはニコンTMD300という倒立顕微鏡に蛍光カルシウム指示薬Indo-1用の落射蛍光装置(EF-S/Ca)を組み込み、細胞を380nmの波長でたたき、そこから出る蛍光をダイクロイックミラーDM455により2つの波長に分け、波長405と485のフィルターを通して細胞内Ca濃度の盛衰を見るという装置である。実際は、倒立顕微鏡のサイドポートへ光電子倍増管(浜松ホトニクスR1477)を2本組み込んだ装置を取り付け、2ペンのレコーダーへシグナルを導き、記録した。すなわちCa濃度が高いときは405nmのピークが高く、低いときは485nmのピークが高くなる。軟骨細胞の培養は試みてはいるが現在、上手く行かない。最近、神経細胞の細胞膜は軟骨細胞が生産する軟骨基質に似た硫酸プロテオグリカンからなるという報告がある。
せき止め湖堆積物から探る有史以前の地震・豪雨災害と将来予測

(1)富山市八尾町桐谷および小井波集落は,大規模地すべりにより形成されたせき止め湖が埋積された平坦面上にある.これらの地すべりは,せき止め湖堆積物・地すべり移動体中の木片の14C年代より約2500 BPに発生したもので,跡津川断層が引き起こした地震によると推定される.(2)岐阜福井県境をつくる越美山系には多くの山体重力変形地形が認められ,それらは最終氷期直後および最終氷期中の温暖期に形成されたものであり,その後は安定していることが明らかになった.(3)紀伊半島東部のせき止め湖堆積物,山体重力変形地形がつくる凹地の埋積堆積物には,地震・豪雨と推定されるイベントが記録されている.平成24年度には,岐阜福井県境の冠山地域,能郷白山地域,三重県多気郡大台町薗川流域および同県熊野市ツエノ峰地域において調査・研究を行った.冠山地域の二重山稜については,平成23年度に,3試料の放射性炭素同位体年代測定,鬼界アカホヤ火山灰の同定などを行ったが,平成24年度にはさらに多くのボーリング掘削を行い年代測定等を行った.その結果,凹地の発達過程に制限を与えることができた.能郷白山地域では,主として野外調査とGIS解析を行った.その結果,(1)地すべりの前兆現象と考えられる山体重力変形地形は,斜面の方位と地質構造に規制されて発達していること,(2)山体重力変形地形は,解析前線の直上の平坦な斜面上に集中して発達することが明らかとなった.本研究費および他の研究費により薗川流域で掘削されたボーリング試料を用い,放射性炭素同位体年代測定および走査型X線分析顕微鏡による元素マッピングを行った.その結果,本地域のせき止め湖は,25,000 cal BP頃形成され,1,000年間ほど存続したことが明らかになった.また,元素マッピングの結果,FeとMnの濃集する葉理が特徴的にみられることが明らかとなったが,その解釈については来年度の課題としたい.平成23年度に,ツエノ峰地域の二重山稜の間の凹地を埋める堆積物のボーリング掘削を行い,平成24年度にはこの試料の解析を行った.その結果,約8 mの凹地埋積堆積物に3層のテフラが含まれており,火山ガラスと角閃石の屈折率の解析から,上位から,姶良Tnテフラ(約28,000-30,000年前),九重第1テフラ(約50,000年前),鬼界葛原テフラ(約95,000年前)に対比されることが明らかになった.また,その下位にあるせき止め湖堆積物のパーカッションボーリングを行い堆積物を得た.平成25年度にはその解析を行いたい.平成25年度には,岐阜福井県境の冠山地域・若丸山地域・能郷白山地域,三重県多気郡大台町薗川流域,同県熊野市ツエノ峰地域,北アルプス蝶が岳周辺,南アルプス北岳周辺,山梨県山梨県南巨摩郡天子山地で山体重力変形地形の調査研究を行った.冠山地域では冠山峠西方の県境稜線南側にある複数列の山向小崖地形の凹地においてピット掘削を行い,凹地埋積堆積物の岩相を記載し,木片の放射性炭素同位体年代を測定し,挟まれるテフラの同定を行った.その結果,これらの山向小崖は最終氷期中の温暖期あるいは最終氷期直後の温暖化期に形成されたことが明らかとなった.若丸山地域の研究は千葉大学との共同研究として行った.稜線上の二重山稜凹地でハンドオーガーボーリングを実施した.能郷白山地域で最後まで空白域であった白谷上流部を調査するため,水資源公団所有の船舶により徳山湖奥までアクセスしキャンプを設営,地形・地質調査を行った.薗川上流で掘削したせき止め湖堆積物のボーリングコアについて,薄片観察・元素マッピングを行い,マイクロ層序を確立しイベントの周期性について考察した.ツエノ峰地域のせき止め湖堆積物のパーカッションボーリングコアのテフラ分析を行い,このせき止め湖堆積物が過去数千年間で堆積したものであることを明らかにした.蝶ヶ岳・北岳では地形・地質調査を行い,平成26年度にボーリング掘削を行うための許可申請に必要な情報を収集した.天子山地の調査はJR東海コンサルタンツ(株)との共同研究として行った.以上の調査結果は,地球惑星科学連合2013年大会,日本地質学会などで発表し,2014年にはイタリアで開催される国際応用地質学会で発表する(発表論文は受理されている).また,Environmental Earth Sciences誌に投稿した論文は出版され,Engineering Geology誌に論文を投稿した.(1)富山市八尾町桐谷および小井波集落は,大規模地すべりにより形成されたせき止め湖が埋積された平坦面上にある.これらの地すべりは,せき止め湖堆積物・地すべり移動体中の木片の14C年代より約2500 BPに発生したもので,跡津川断層が引き起こした地震によると推定される.(2)岐阜福井県境をつくる越美山系には多くの山体重力変形地形が認められ,それらは最終氷期直後および最終氷期中の温暖期に形成されたものであり,その後は安定していることが明らかになった.(3)紀伊半島東部のせき止め湖堆積物,山体重力変形地形がつくる凹地の埋積堆積物には,地震・豪雨と推定されるイベントが記録されている.

平成23年度には,三重県多気郡大台町池ノ谷,薗川流域および同県熊野市ツエノ峰地域にあるせき止め湖埋積堆積物をボーリング掘削する予定であったが, 9月上旬の台風12号および15号災害により,同上地域へのアクセス林道が大きな被害を受け掘削が不可能となった.このため,次のような研究を行った.産業技術総合研究所により池ノ谷流域で掘削されたボーリング試料を用い,走査型X線分析顕微鏡による元素マッピングを行った.その結果,肉眼的に確認できる明暗および粗粒・細粒の縞に対応して,Al, Si, S, K, Caなどの元素が増減すること,その変動は構成粒子である砕屑粒子,有機物片,珪藻化石,粘土鉱物などの増減に支配されていることが明らかとなった.台風被害のなかった岐阜・福井県境の冠山地域において,地すべりの前兆現象と考えられる山体重力変形地形の形成過程の検討を行った.二重稜線の間の凹地を埋める堆積物をハンドオーガーボーリングにより掘削した結果,(1)凹地埋積堆積物は地すべりの移動方向に向かい薄くなる非対称な層厚分布をもつこと,(2)下部に鬼界アカホヤ火山灰(K-Ah, 7.3 ka)を挟むこと,(3)深度82 cm, 138 cm, 195 cmからは木片が得られ,そのAMS 14C年代は,それぞれ1210+-25 BP (1234-1060 cal BP), 5320+-30 BP (6191-5996 cal BP), 6990+-30 BP (7931-7731 cal BP)であることが明らかとなった.これらの年代値から,凹地埋積堆積物の平均堆積速度は約0.25 mm/年となる.平成24年3月には,ツエノ峰地域で二重山稜の間の凹地を埋める堆積物のボーリング掘削を行った.平成24年度にはこの試料の解析を行う予定である.平成23年9月上旬に紀伊半島を襲った台風12号の災害により,三重県・奈良県・和歌山県南部の山間地域の多くの林道が破壊され,ボーリング掘削に支障をきたしたが,平成24年度には遅れを取り戻すとともに,調査地域を岐阜福井県境地域にも広げ,成果をあげることができた.平成23年9月上旬に紀伊半島を襲った台風12号の災害により,三重県・奈良県・和歌山県南部の山間地域の多くの林道が破壊され,本研究によりボーリング掘削を予定していた地域でも,ボーリング資材の搬入が困難となった.このためボーリング掘削が平成24年3月まで実施することができなくなり,本研究はやや遅れている.平成23,24年度に予定していた業者に委託してのボーリング掘削は,平成23年度の災害などの影響もあり,十分に実施できなかった.その分,ハンドオーガーボーリングやパーカッションボーリングなど,自前のボーリング掘削を行い試料を確保してきた.それらの試料を用いた解析は,平成24年度になって順調に進んでいるので,今後もこの方針で研究を進めたい.研究対象を紀伊半島に限らず,中部地方にまで広げているのは当初の研究計画とは若干異なる.これは,平成23年度の紀伊半島災害のために,十分な研究を行うことができなかったことによる.しかし,研究対象地域が広がっても,当初の目的である,有史以前の地震・豪雨災害の歴史を明らかにし,将来予測を行うことは達成できると考えている.また,せき止め湖堆積物の研究を推進する中で,天然ダムを形成した地すべり移動体の上部には二重山稜,山向き小崖などの山体重力変形地形が発達することがわかってきた.
ラット皮膚創における血管新生の研究

皮膚創における血管新生過程の研究は、法医学における創傷鑑定にとって重要である。皮膚では時間遺伝子のmRNAの日内変動リズムが存在していることが報告されている。そこで本研究では、時間遺伝子のPER2ノックアウトマウスとそのコントロールマウスを用いて、健常皮膚と創部における血管新生因子のmRNAの日内変動をRTPCR法により検討した。その結果、時間遺伝子per2 mutantマウスにおいて、創部の血管新生因子mRNA発現がコントロールマウスと異なることを示し、血管新生が日内リズムにより影響を受けるという新知見を得た。ラットの皮膚創における血管新生過程の研究は、法医学における創傷鑑定にとって重要である。本研究では、これまで、ラットの皮膚に切創を作成し、創作成1ないし3日後の早期の種々の血管新生因子のmRNAの定量を行ってきた。そこで、遺伝的に種々の因子の欠損が作成されているマウスにおいて、皮膚創作成後の血管新生因子のmRNAを検討中である。また、マウスの皮膚創における血管新生の過程を、組織切片のCD31免疫染色により定量化することを検討中である。これまでの研究結果その結果、PER2依存性、及び非依存性の皮膚及び創部の血管新生因子mRNAの日内変動が観察され、血管新生因子mRNAの日内変動メカニズムについて、新しい知見が得られた。これまでの検討により、当初予定していた、ラット皮膚創における種々の血管新生因子のmRNAの検討結果が得られた。さらに、時間遺伝子PER2ミュータントマウスを用いて、血管新生因子の日内変動の存在及びそのPER2依存性の存在という新知見を得ることができた。これまでの本研究者らの研究結果そこで、遺伝的に種々の因子の欠損が作成されているマウスにおいて、皮膚創作成後の血管新生因子のmRNAを検討してきた。特に、皮膚では時間遺伝子のmRNAの日内変動リズムが存在していることが報告されているため、時間遺伝子のPER2ノックアウトマウスとそのコントロールマウスを用いて、健常皮膚と創部における血管新生因子のmRNAの日内変動を検討した。その結果、PER2依存性、及び非依存性の皮膚及び創部の血管新生因子mRNAの日内変動が観察され、血管新生因子mRNAの日内変動メカニズムについて、新しい知見が得られた。すなわち、時間遺伝子per2 mutantマウスにおいて、創部の血管新生因子mRNA発現がコントロールマウスと異なることを示し、血管新生が日内リズムにより影響を受けるという新知見を得た。今後は、種々の遺伝子欠損が存在するマウスにおいて、皮膚創を作成し、血管新生因子定量を行う。さらに、創部の血管新生を解析するため、CD31による免疫染色を行い、定量化する予定である。マウスの皮膚創において、血管新生をCD31免疫染色により、形態学的に明らかにし、3Dによりステージを明らかにする予定である。法医学すでに購入していた試薬、消耗品により、当初予定していた実験を行ったため、来年度使用額が生じた。少額が残額として残ったものである。mRNA定量のための酵素試薬は、高額であるため、次年度にまとめて購入する。また、組織作成のための試薬も次年度に購入する。次年度の試薬代として使用する。
糖鎖遺伝子とその生物活性

複合糖質(糖蛋白質、糖脂質、プロテオグリカン)の「糖鎖」は多種多様な構造をとり、一大分子ファミリーを形成する。これらの「糖鎖」の担う生物機能、すなわち、細胞増殖・分化の調節、戦疫機能の修飾、血中蛋白分子の寿命決定、血管内皮細胞と白血球の接着、細菌・ウイルスの接着などが、本研究班員らを含む国内外の研究者によって近年急速に明らかにされつつある。この多彩な糖鎖機能の理解には糖鎖遺伝子、特に糖鎖合成を司る糖転移酵素遺伝子の理解が不可欠である。本研究では、主と島て糖転移酵素遺伝子の構造と発現制御の分子生物学的な解析を中心にして、遺伝子レベルでの糖鎖機能解析を総合的に推進するための企画調査、予備的実験並びに共同研究を推進した。具体的には、(1)糖転移酵素の遺伝子構造の系統的解明と転写制御因子の探索、その他の糖鎖発現制御因子の解析、(2)発生や細胞増殖・分化調節における糖鎖機能とその分子機構、細胞-細胞間或いは細胞-細胞外マトリックス間の認識・接着に関与する糖鎖蛋白の解析、糖鎖異常・接着分子異常など病態の解析を通じての糖鎖機能解析、(3)糖鎖及び糖鎖複合体の高次構造-機能相関の解析、機能性糖鎖の化学合成、糖鎖プローブの開発など、3項目全体を関連づけて予備実験、総合的調査、共同研究等を推進し、平成5年度発足予定の重点領域研究の研究領域として発展させることができた。なお2回の班会議とシンポジウム1回を開催し活発な討議を行った。
近視動物モデルを用いた網膜内グルカゴン含有アマクリン細胞の解析

視覚遮蔽によるラット実験近視モデルを用いて、近視発症において網膜の主にアマクリン細胞でのグルカゴンファミリーの発現変化を検討した。凍結切片を用いた免疫染色では、網膜内アマクリン細胞にて、正常眼と近視誘導眼の両方でGIPとVIPの発現が見られた。網膜組織を用いたRT-PCRによるmRNAの検討と、ウエスタンブロットによるタンパク量の検討では、正常眼と比較して近視誘導眼においてGIP、VIPともにmRNAとタンパク発現量の低下が見られ、近視発現に関与する分子である可能性が示唆された。今後の近視抑制治療に繋げられる可能性が期待される。1.実験近視モデルの作成と小動物での近視度測定法の確立生後10日のC57/BL6マウスに対して右眼の-15Dレンズの縫合による視覚遮断法にて近視誘導を行った。もう左眼はコントロールとして用いた。レチノスコープによる屈折度測定とACマスターを用いての眼軸長の測定を行い、近視が誘導できていたかを評価した。レチノスコープを用いての屈折度測定では、有意差を持って近視誘導ができていることを確認できた。眼軸長延長の評価では、過去の文献で使用されているレーザーを用いた眼軸帳測定装置(ACマスター)や光干渉断層計での計測を試みたが、測定精度が不十分で有意差も得られていない。今後は超音波や核磁気共鳴画像法(MRI)での計測を試み、小動物の眼球に対しての眼軸長計測を確立していくことを見込んでいる。2.マウス眼球におけるグルカゴンファミリーの同定C57/BL6マウス網膜でのグルカゴンファミリー発現の同定では、マウス眼球の凍結切片を作成して免疫染色を行い、過去の文献と同様グルカゴンの発現は確認できなかったが、GIPとVIPの発現が同定できた。また培養アマクリン細胞を用いてのPCRでのグルカゴンファミリーの同定を試みているが、過去の文献を参照にしてのマウス網膜からのアマクリン細胞の抽出に難渋しており、現在はまだアマクリン細胞の培養に成功していない。今後試薬の変更などで対応してくことを考慮している。全体として当初の計画と比較して遅延しており、今後は上記の対応にて実験を進めていき、本年度の予定実験に進んでいけるようにする。1.実験近視モデルの作成と小動物での近視度測定法の確立C57/BL6マウスに対しての片眼マイナスレンズ装用による視覚刺激遮断にて、レチノスコープによる屈折度測定では近視化の確認が可能であった。しかし眼球サイズが小さく、安定した眼軸長測定が困難だった。当研究室で眼軸長測定に使用可能な機器では、マウスの眼球サイズでは安定した測定は困難と判断し、動物種をC57/BL6マウスより眼球サイズの大きいwistarラットに変更したところ、超音波Aモードにて眼軸長測定が安定して可能となった。また眼瞼縫合を用いた視覚刺激遮断での眼軸長延長効果も確認できた。ラットでの近視度測定と実験近視モデル作成は達成できた。2.正常眼と近視眼におけるグルカゴンファミリーの同定wistarラットの眼球を用いて凍結切片を作成し、免疫染色にてグルカゴンファミリーの同定を行った。アマクリン細胞に対する抗体との二重染色で、正常眼ではアマクリン細胞にグルカゴン自体の発現は見られなかったものの、グルカゴンファミリーであるGIPとVIPの発現が同定できた。近視作成眼でもアマクリン細胞にGIPとVIPの発現が見られ、組織切片上では正常眼との明らかな差は確認できなかった。また、過去の文献を参照にラット網膜からのアマクリン細胞の分離培養を試みているが、アマクリン細胞の抽出に難渋している。代替案として、今後網膜組織全体を用いたPCRとウエスタンブロットにて、正常眼と近視作成眼でmRNAとタンパク質の発現量に差が生じているかを確認していく必要があると考えている。全体として当初の計画と比較し遅延しており、1年の研究期間延長をいただき、速やかに実験を進めていく。1.実験近視モデルの作成と小動物での近視度測定法の確立当初C57/BL6マウスを用いて研究を開始したが、眼球のサイズが小さく、眼軸長の測定が困難であったため、Wistarラットに動物種を変更して研究を継続した。Wistarラットでは検影法で屈折度測定、超音波Aモードで眼軸長測定が可能であった。Wistarラットに対して眼瞼縫合による視覚刺激遮断にて近視誘導を試みたところ、正常眼と比較して視覚遮断眼では眼軸長延長を伴う近視化が認められた。更に透過型電子顕微鏡による強膜組織の観察を行ったところ、この実験近視モデルは強膜コラーゲン線維の狭細化も生じており、強膜の構造変化を伴う実験近視モデルであることが分かった。2.正常眼と近視眼におけるグルカゴンファミリーの同定Wistarラットにて正常眼と近視誘導眼の凍結切片を作成し、免疫染色にてグルカゴンファミリーの発現を検討した。アマクリン細胞に対する抗体を用いた二重染色による検討では、正常眼、近視誘導眼ともにアマクリン細胞にグルカゴンの発現は見られなかったものの、グルカゴンファミリーであるGIPとVIPの発現は認められた。しかし、組織切片上で発現量の差がほとんど見られなかった。正常眼と近視誘導眼でのアマクリン細胞のみのグルカゴンファミリー発現量の比較は困難であったため、網膜組織全体を用いてRT-PCRにてmRNA量を、ウエスタンブロットにてタンパク量の比較を行ったところ、近視誘導眼ではGIPとVIPの発現量の低下が見られた。これらの結果を元に論文を作成し投稿を行った。

(現在査読中)視覚遮蔽によるラット実験近視モデルを用いて、近視発症において網膜の主にアマクリン細胞でのグルカゴンファミリーの発現変化を検討した。凍結切片を用いた免疫染色では、網膜内アマクリン細胞にて、正常眼と近視誘導眼の両方でGIPとVIPの発現が見られた。網膜組織を用いたRT-PCRによるmRNAの検討と、ウエスタンブロットによるタンパク量の検討では、正常眼と比較して近視誘導眼においてGIP、VIPともにmRNAとタンパク発現量の低下が見られ、近視発現に関与する分子である可能性が示唆された。今後の近視抑制治療に繋げられる可能性が期待される。小動物での近視度測定と実験近視モデルの作成は、動物種をC57/BL6マウスからwistarラットに変更したことにより、当初の予定よりは遅れたものの達成できた。またグルカゴンファミリーの同定については、免疫染色にてGIPとVIPの発現がラット網膜アマクリン細胞で確認できているが、近視作成眼と正常眼との差が確認できていない。免疫染色では定量的な比較が困難であり、PCRやウエスタンブロットなど定量的な比較が可能な手法での検討を行う予定であったが、アマクリン細胞の分離培養が困難であったため進行が遅れている。強度近視免疫染色では網膜アマクリン細胞に発現しているグルカゴンファミリーの近視作成眼と正常眼との差が確認できていない。またアマクリン細胞の分離培養が困難であるため、今後は網膜組織全体を使用してウエスタンブロットやPCRを行い、グルカゴンファミリーのmRNAとタンパク質量の定量的評価を網膜組織全体で行う。その後にラットを用いてグルカゴンアゴニストとアンタゴニスト投与による近視抑制の実験に進む予定である。小動物での近視度測定法については屈折度での近視度測定法に関しては概ね良好な結果が出ている。しかしながら眼軸長での近視度測定法に関してはさらに別の方法を試みる必要がある。また、グルカゴンファミリーの同定についてはGIPとVIPの発現がマウス網膜にて同定できたが、次段階であるアマクリン細胞の培養に成功していない。動物種をマウスからラットに変更したことにより、近視度測定と小動物での近視モデル作成に当初の予定より時間を要した。また、ラット網膜でのアマクリン細胞分離培養が困難であり、アマクリン細胞を用いてのPCRやウエスタンブロットの実験に進めず、研究が遅延した。近視度測定に対しては超音波AモードやMRIの使用を試みる予定である。また、アマクリン細胞の培養では、抽出に用いる試薬を変更することを考慮している。2.グルカゴンアゴニストとアンタゴニスト投与によるラット近視モデルでの近視進行抑制実験(約60万円)アマクリン細胞の培養に成功せず当初の研究計画が停滞したため、予定使用額を下回った。2.免疫染色法・real-time PCRによる、実験近視モデル眼・アマクリン細胞におけるグルカゴンファミリーの発現の解析(約50万円)3.グルカゴンアゴニストおよびアンタゴニスト投与による近視モデルにおける抑制効果実験(約70万円)