hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ソフトインターフェースの高分子鎖構造直接観察と解析

高分子ソフトインターフェースの2次元状態の極限モデルとして、高分子単分子膜の構造、物性について、主として原子間力顕微鏡(AFM)を用いて検討した。その結果、(1)高分子2次元結晶の融解挙動をin situで分子鎖レベルで直接観察することに成功し、融点が著しく低下していることを見出した。また、(2)ガラス転移温度の大きく異なる相溶系ブレンド単分子膜を用い、片一方の成分を少量添加とすることで、単分子膜に可溶化した孤立鎖の形態を直接AFM観察することに初めて成功した。他にも、(3)ブレンド単分子膜がスピノーダル分解により相分離することを初めて見出した他、(4)孤立鎖の高温in situ観察、(5)基板上の気相ラジカル重合のAFM観察等、について検討を行った。ソフトインターフェースは、各種環境や作用物質の存在により柔軟に応答する表面である。従来、巨視的な方法で検討が行われてきたが、この応答を直接分子レベルで観察できれば、ソフトインターフェースの構造・機能解明が飛躍的に進歩すると期待される。原子間力顕微鏡(AFM)は、材料を分子・原子レベルで観察できる顕微鏡であるがソフトマテリアルを分子鎖レベルで観察するのは容易ではない。代表者らは、高分子の2次元膜である高分子単分子膜を用いることで分子鎖レベルの観察が可能になることを初めて示し、高分子孤立鎖、結晶、らせん高分子構造等を分子レベルで観察することに成功し報告してきた。本研究計画では、ソフトインターフェースのモデルとして高分子単分子膜を取り上げ、その構造を分子鎖レベルで観察する検討を進めるが、特に各種環境下(高温、高湿度、有機ガス等)での応答挙動を分子レベルで観察する手法の確立に注力する。従来、巨視的な方法で検討が行われてきたが、この応答を直接分子レベルで実像観察できれば、ソフトインターフェースの構造・機構の解明が飛躍的に進歩すると期待される。本研究では、ソフトインターフェースのモデルとして高分子単分子膜を取り上げ、原子間力顕微鏡(AFM)を用いて各種環境処理および各種環境下(高温、高湿度、有機ガス等)で分子レベルでの観察を行い、ソフトインターフェースの分子レベルでの挙動を明らかにすることを目的として検討を進めている。初年度は、(1)高分解能で高分子単分子膜を観察するために必要な超低速圧縮を可能としたLangmuir-Blodgett(LB)膜製造装置、(2)熱処理による構造変化をバッチ処理で観察するための顕微鏡用加熱ステージを導入し、高分子単分子膜の熱処理による構造変化の観察に着手した。サンプルとして、イソタクチックポリメチルメタクリレートの2次元折りたたみ鎖結晶を用い、各種温度での結晶構造変化を検討した。その結果、比較的低温で結晶ラメラ構造が変化することが分かってきた。今後、熱処理条件やサンプルの分子量依存性等を検討し、ラメラの厚化現象等の解明に結びつけたいと考えている。また、有機ガス存在下に於ける高分子鎖の構造変化についても、検討に着手している。さらに、ソフトインターフェースの2次元状態の極限構造として高分子単分子膜をとらえ、その構造をAFMで観察し検討を進めている。高分子多成分系LB膜を用いて、相分離の形成過程を検討し、相溶性を議論する上で膜の圧縮速度が極めて重要であること等の知見を得た。本研究では、ソフトインターフェースの2次元状態の極限モデルとして高分子単分子膜を取り上げ、原子間力顕微鏡(AFM)を用いて各種環境処理および各種環境下(高温、高湿度、有機ガス等)で分子レベルでの観察を行い、ソフトインターフェースの分子レベルでの挙動を明らかにすることを目的として検討を進めている。本年度は、以下の結果を得た。1.Langmuir-Blodgett法で作成したイソタクチックポリメチルメタクリレート(it-PMMA)の2次元折りたたみ鎖結晶の融解挙動を、サンプルを予め所定の温度で熱処理した後、室温で観察する方法(バッチ法)で検討し、3次元結晶に比べて30100°Cと大きく融点が低下していることを見出した。さらに、本年度新たに導入した環境対応型AFMを用いて融解挙動をin situで直接観察することを試み、分子レベルで融解挙動をin situ観察することに成功した。in situ観察では、バッチ処理では不可避である後結晶化の影響を受けないため、(1)2次元結晶の真の融点がさらに低温であること、(2)結晶融解の分子レベルでの詳細な構造変化が観察できること、が明らかになり、in situ観察が極めて有効であることがわかった。今後はさらに、熱処理条件や分子量依存性等の検討を進め、結晶中での高分子鎖のパッキング構造についても明確化して行きたいと考えている。

2.PMMAとポリノニルアクリレートのブレンド単分子膜を検討し、低表面圧では均一で、高表面圧では、一方の成分が下層で、もう一方の成分がその上に積層した階層的な相分離構造を可逆的に形成することを見出した。さらに、均一一相領域を詳細に観察することで、ブレンド単分子膜中での一本の高分子鎖のコンフォメーションを初めて明確に観察することに成功した。高分子2次元膜中での分子の状態を直接観察できることになった訳で、2次元状態の高分子の挙動を研究する上で極めて有効であると考えられる。本研究では、ソフトインターフェースの2次元状態の極限モデルとして高分子単分子膜を取り上げ、原子間力顕微鏡(AFM)を用いて各種環境処理および各種環境下(高温、高湿度、有機ガス等)で分子レベルでの観察を行い、ソフトインターフェースの分子レベルでの挙動を明らかにすることを主たる目的として検討を進めている。本年度は、以下の結果を得た。1.Langmuir-Blodgett法でマイカ上に作成したイソタクチックポリメチルメタクリレート(it-PMMA)の2次元折りたたみ鎖結晶の融解挙動を、高温AFMを用いてin situ観察し、3次元結晶に比べて融点が4070度近く大幅に低下することを初めて見出している。本年度は、融点の大幅な低下の原因を知るために、マイカの代わりにサファイア基板を用いて検討を行い、融点がマイカに比べて、1030度さらに低下することを見出した。この結果は、融点の低下が薄膜になったことにより膜が不安定になったこと以外に基板の影響を大きく受けていることを示している。また、本法で測定される融点の妥当性を検証するために、昇温降温サイクルで結晶転移の可逆性を検討し、昇温降温時とも、ほぼ同じ転移温度を示すことを確認し、本法で測定している融点が意味のある測定値であることを明確にした。2.PMMAとポリノニルアクリレート(PNA)のブレンド単分子膜は、低表面圧では相溶であり、PMMA成分の少量添加系を用いると、PNAに可溶化されたPMMA孤立鎖を観察できることを初めて見出している。本年度は、PMMA分子鎖の広がりを検討し、PMMAの2次元の理想鎖に比べて分子鎖が大きく広がっており、マトリックスのPNA鎖と相互に強く侵入していることが分かった。このことは、de Gennesが提案した強くsegregationした2次元膜のモデルとは大きく異なっていることを示している。また、表面圧を増加させるに従い、分子の広がりが低下し、16mN/mではPNA単分子膜上にPMMA鎖が析出するが、再度圧力を低下させると、再びPNA膜中に可溶化され、元の広がりに一致し、ここで評価している広がりが平衡状態のものであることを確認した。既に、(1)高温顕微鏡を用いてイソタクチックポリメチルメタクリレート(it-PMMA)2次元折りたたみ鎖結晶の融解挙動を分子レベルでin situ観察できること、(2)相溶性ブレンド単分子膜を用いて単分子膜に可溶化した
電子豊富なカチオン性遷移金属錯体を用いたC-H結合の活性化と官能基化

光学的に発生させたカチオン性レノセン[Cp_2Re](BF_4)(1)とチオフェンとの反応では,2位のC-H結合が選択的にレニウムに酸化的付加した生成物を与えたが,2位に水素を持たない2,5-ジメチルチオフェンおよびジベンゾチオフェンとの反応では,様々な位置のC-H結合が酸化的付加した生成物の混合物を与えた。これらはアセトン中で還流すると硫黄で配位した錯体に異性化したが,これに光照射すると再びC-H結合が酸化的付加した生成物に戻るのが見られた。また1とピロールとの反応では,2位のC-H結合が酸化的付加した生成物を選択的に与えた。既知の錯体ではN-H結合の酸化付加がほとんどであり,これは前例のない極めて珍しい反応である。また,カチオン性レノセンによるC-H結合の活性化には対アニオンの選択も重要であり,I^-を対アニオンとして用いるとその配置が優先し,C-H結合活性化は起こらなくなることが分かった。キュバン型四鉄クラスターCp'_4Fe_4(μ_3-CO)_4(Cp'=Cp,MeCp)は,LiAlH_4で処理するとCO配位子が還元され,C-C結合形成を伴ってアセチレンクラスターCp'_4Fe_4(HCCH)_2が生成することを見出した。この反応の中間体の単離を目的として,LiAlH_4の量を減らし,反応を短時間行なった後,反応溶液を空気酸化したところ,CO配位子が1個,2個,3個および4個還元された四鉄クラスターの酸化生成物が全て得られた。このうちCO配位子が2個還元して中性体にすると2つのメチン配位子がカップリングし,アセチレン配位子に変わる現象が可逆的に起こることを見出した。これはクラスター骨格の酸化還元に伴ってクラスター上でC-C結合の形成と切断が可逆的に容易に起こることを示した初めての例である。
巨大DNA断片特異的PCRによる家族性アルツハイマ-病遺伝子の追究

常染色体優性遺伝の早発型家族性アルツハイマ-病遺伝子(AD1)をクロ-ニングするために2つの方向からアプロ-チを試みている。1つは現在までにAD1との最も密接な連鎖が報告されているD21S16周辺から新たに多数のDNAマ-カ-を分離することである。このために、ヒトBリンパ球培養細胞からセルソ-タ-を用いてソ-ティングした純粋な第21染色体から巨大DNAを損傷なく抽出し、<Not>___/Iなどの低頻度切断制限酵素で切断後生じた巨大DNA断片をパルスフィ-ルド電気泳動で分離、次に目的とする巨大DNA断片に特異的なクロ-ンをPCRを用いて増幅しクロ-ニングする技術(ショットガンPCR)の確立を試みた。<Alu>___/PCRでは単一コピ-配列のものはほとんど得られなかったが、巨大DNA断片をさらに<Nsp>___/(7524)Iを用いて小断片化し、合成DNAアダプタ-を連結後PCRで増幅する方法では、プロ-ブとして有効なクロ-ンを得られるようになった。もう1つのアプロ-チはメンブレン上に固定した第21染色体DNAへの特異的なハイブリダイゼ-ションとPCRによる増幅を利用して、脳cDNAライブラリ-からAD1候補遺伝子のcDNAをクロ-ニングするというものである。サザンブロット法を用いてハイブリダイゼ-ションの前後でのcDNAの構成比を解析した結果、(1)第21染色体にマップされている遺伝子由来のcDNA(SOD、S100β、APP)はすべて濃縮されており、同時に構成比の均一化の傾向が認められた。(2)他の染色体由来のcDNA(脳型クレアチンキナ-ゼ、ATP合成酵素βサブユニット)はいずれも顕著に減少した。(3)高頻度反復配列(<Alu>___/:5×10^5コピ-、<Kpn>___/Iファミリ-:1×10^4コピ-)を含むcDNA及び28SrRNA由来のcDNAの構成比にはほとんど変化が認められなかった。現在、得られたcDNAクロ-ンの性状を解析中である。
関節リウマチの局所炎症に対する電気穿孔法の治療効果と安全性

関節リウマチ(RA)において、全身での疾患コントロールは良好であるにもかかわらず、局所関節に炎症が残存する症例が存在する。RA患者に対して、メソトレキサート(MTX)の局所注射に電気穿孔法を併用した第2相臨床研究を行い、26週後に関節エコーを用いて評価を行った。併用群3例のうち2例で活動性滑膜炎の軽減が確認された。一方、MTX関節注射単独群2例では、滑膜炎の消退は見られなかった。本治療法がMTX単独群と比較して有用である事を証明するには、20例ずつ計40例が必要であったが、対象患者が少なく、研究期間内では十分な症例数を集めることができなかった、今後症例数を増やして有用性を検討する必要がある。本年度は、電気穿孔法に用いる電極の作成を行った。手指PIP関節及びMCP関節にフィットするように試作品を作成し、皮膚への刺激ができるだけ少なくなるように工夫を行った。手指PIP関節に関しては、関節を挟み込むように電極を弯曲させることで、関節と電極がフィットするように改良を加えた。MCP関節に関しては、関節の形態的な理由から、電極の先が皮膚に食い込むため、フィットする形状の電極を作るのが困難で、試作をくり返し行った。今後臨床試験を行うにあたり、患者への侵襲を如何に低侵襲にするかが重要である。この観点から、皮膚熱傷及び疼痛刺激を生じない電気条件を設定する必要があった。健常人の手指PIP関節及びMCP関節に様々な条件で電気穿孔法を行い、皮膚熱傷及び疼痛刺激の有無を確認した。具体的には、通電時間と電圧、パルス回数を変更し、条件設定を行ったが、この条件がMTXの細胞内移行率を上昇させる設定であるかに関しては今後の検討を要する。また、通電効率を良くするため、電極と皮膚との間に用いるジェルを決定するため、数種類のジェルの選定(堅さ、量)を行った。一方、臨床試験を行うにあたり、本臨床試験の計画をUMINに登録した(登録番号UMIN000016606)。また、侵襲を伴う介入試験と位置付けられる臨床試験であることから、当院倫理委員会に第1相第3相試験の臨床試験計画を提出している。現在承認待ちの状態である。本年度は、当院倫理委員会の承認を得て、臨床研究を開始した。また、臨床研究を開始するに当たり、株式会社カイトーを通じ損保ジャパン日本興亜社と臨床保険研究保険の締結を行った(症例数40例、平成29年3月31日まで)。MP関節、PIP関節用の電極は、数度の試作を繰り返した後、MP関節、PIP関節にフィットし、皮膚に食い込まない形状の電極を最終モデルとして採用した。また、臨床試験時の電気条件を設定するため、私自身が実験台となって、通電の電気条件を設定した。電気穿孔法の効果を最大限発揮し、有害事象(熱傷、疼痛)を生じない設定を電圧30ボルト、通電ON time 100m秒、通電OFF time 150m秒、4パルスとした。実際、皮膚表面に心電図用ゼリーを塗り、この条件で4方向から通電を行っても、有害事象の発生はなく、安全面はクリアーできた。研究計画全体から考えると進達度は遅れている状態である。倫理員会、臨床保険契約は終了しているが、被検者のリクルートに苦労している状態である。比較的、疾患活動性が落ち着いているまたは、多関節の腫脹圧痛があり、本研究にマッチする患者が予想よりもやや少ないことが影響している。深達度はやや遅れているものの、計画自体に問題が発生しているわけではないので、試験計画自体の変更は考えていない。5人のRA患者(女性4人、男性1人)に対して、手技を施行した。ランダム化二重盲検下に患者を割り振ったところ、MTX・電気穿孔法群(MTX関節内注射後電気穿孔法)が3患者、MTX単独(MTX関節内注射後プローベのみで通電なし)が2患者となった。部位はMP関節が2関節、PIP関節が3関節であった。電気穿孔法の電気設定に関しては、通電時の疼痛を感じない電圧30ボルト、4パルスとした。MTX・電気穿孔法群の局所疼痛は、研究開始時疼痛VAS 37.7±27.4が最終経過観察時に24.1±10.2と軽快していた。また、関節エコーのgray scaleは2.7±0.6から1.5±0.4へ、power dopplerは2から1.3±0.6へ改善していた。本報告書作成時点では、全例が経過観察期間を終了していないこと、症例数が併せて5例と少ないことから、2群を比較検討することはできていない。MTX・電気穿孔法の効果に関しては、26週経過後最終的に評価を行う予定である。有害事象に関しては、1症例1回の手技で電気穿孔法施行時に軽い疼痛を訴えたのみで、それ以外はなかった。電気設定に関しては、安全性を第一に考えたため、効果を得るのに十分な電気パルスを負荷できていない可能性がある。低疾患活動性で、MP、PIP関節のみ腫脹している患者に対するMTX・電気穿孔法は、有害事象もなく、関節エコー評価にて一定の滑膜炎減少をみた。しかし、症例数が少ないこと、26週の経過観察期間が終了していないこと、MTX関節内注射単独との比較ができていないことから、最終的な効果判定をするには、現状では至っていない。

今後、引き続き症例数を追加し、26週までフォローを行った後、効果について判定を行う。関節リウマチ(RA)において、全身での疾患コントロールは良好であるにもかかわらず、局所関節に炎症が残存する症例が存在する。RA患者に対して、メソトレキサート(MTX)の局所注射に電気穿孔法を併用した第2相臨床研究を行い、26週後に関節エコーを用いて評価を行った。併用群3例のうち2例で活動性滑膜炎の軽減が確認された。一方、MTX関節注射単独群2例では、滑膜炎の消退は見られなかった。本治療法がMTX単独群と比較して有用である事を証明するには、20例ずつ計40例が必要であったが、対象患者が少なく、研究期間内では十分な症例数を集めることができなかった、今後症例数を増やして有用性を検討する必要がある。倫理委員会での承認を得るために、数回にわたり臨床計画の修正・見直しを余儀なくされ、予想以上に時間を費やした。研究計画全体から考えると進達度はやや遅れている状態である。また、侵襲を伴う介入試験であることから、倫理委員会の承認が得られた後、臨床試験保険の契約を締結する予定である。これらがクリアーされれば、速やかに臨床研究を開始する。進達度はやや遅れているものの、計画自体に問題が発生しているわけではないので、試験計画自体の変更は考えていない。日常診察にて、患者さんに試験への参加をこれまで以上に促す。電気穿孔法による局所滑膜炎による治療効果の可能性を説明し、参加をお願いする。また、説明時に安全性についても十分なインフォームドコンセントを行い、不安の軽減を図る。病院内で、適応する症例があれば、紹介して頂けるように周知を徹底する。いずれにしても、被検者のリクルートに力を入れ、症例数を増やすよう努力を行う。被検者のリクルートがあまりにも少ない場合は、少額を謝金に充てる事も検討している。関節リウマチ倫理委員会にて臨床研究計画が承認されれば、速やかに臨床試験を施行する予定である。具体的には第1相試験で健常人3人6関節(手指PIP関節、MCP関節各3関節)に対して電気穿孔法を行い、安全性を検証する。次に第2相試験でMTXの用量・電気穿孔法の条件設定を関節リウマチ患者の12関節(手指PIP関節、MCP関節各6関節)にて検討を行う。第1、2相試験の結果を踏まえ、第3相試験を関節リウマチ患者の60関節(手指PIP関節、MCP関節各30関節)で施行する予定である。被検者のリクルートに難航し、症例数が少ないため。当大学倫理委員会に本研究がまだ承認されておらず、臨床研究が開始されていないため。MTX購入費用。被検者があまりにも少ない場合は、少額を謝金に充てることも検討している。電極購入費用及び試薬購入費用。また、臨床試験を行うにあたって、臨床試験用の保険費に使用する計画である。
多階層テンソル因子分解法を用いたオミックスデータ統合型関連解析手法の開発と応用

昨年度に引き続きオミックス解析ツールの開発を進め、小規模の試験的データを用いたアルゴリズムの検証と実装整合性の確認作業が完了し、実データへの解析に移行している。解析対象の複雑系疾病群の検体からは、昨年度解析した遺伝子発現情報・代謝物情報に加え、ゲノム情報(肺高血圧症175検体、HTLV-1関連疾患6,444検体、IgG4関連疾患891検体、好酸球性消化管疾患336検体の網羅的一塩基多型タイピング)を収集した。比較対照群として利用するながはまコホート検体についても、約8,000検体の代謝物測定、300検体の遺伝子発現解析が完了しており、患者群・対照群のオミックスデータ収集が順調に進んでいる。対照群の代謝物情報を用いた相関解析およびゲノムワイド関連解析からは、主要な代謝物ネットワークの存在や、各代謝物量との強い関連を示すゲノム領域の存在が示唆された。また、疾患間の代謝物量の比較分析により、特に好酸球性消化器疾患と関連する代謝物が検出されている。本代謝物量は治療介入前後においても変動が認められることから、病態を把握する上で重要なバイオマーカーとなる可能性がある。また、同様の解析によってHTLV-1関連疾患やIgG4関連疾患においても、疾患との関連するゲノム領域が認められている。次年度も引き続き、各対象疾患の検体とオミックス情報の継続的な収集に努め、必要に応じて全ゲノム解析やターゲットシークエンス解析等の追加実験および解析アルゴリズムの改良によって当該結果を検証し、複雑系疾患群の病因・病態の解明を進める。当初の研究計画に沿って、JAVA言語をベースとした多階層テンソル因子分解アルゴリズムの実装、変分ベイズ法に基づくモデル実装を行い、複雑なオミックスデータ情報を柔軟に統合・圧縮し、複雑系疾病の解明に有用な特徴量を抽出するための、新規方法論の開発とアルゴリズムの実装を進めた。本年度は、試験的データを用いて実装整合性の検証が完了し、実データを用いた解析に移行している。解析対象の複雑系疾病については、肺高血圧症172検体(44症例)、HTLV-1関連疾患4,515症例、IgG4関連疾患214検体(83症例)、好酸球性消化管疾患471検体(367症例)の時系列検体を収集した。収集検体の一部については、発現解析(IgG4関連疾患:91検体、肺高血圧症:171検体、好酸球性消化管疾患:102検体)、代謝物解析(IgG4関連疾患:154検体、肺高血圧症:172検体、好酸球性消化管疾患:208検体)、ゲノム解析(肺高血圧症175検体、HTLV-1関連疾患6,444検体、IgG4関連疾患891検体、好酸球性消化管疾患336検体の網羅的一塩基多型タイピング)が終了しており、ツール開発ならびに各解析対象疾患の検体収集・オミックス解析が順調に進んでいるため。ツールの開発と検証はほぼ完了したため、各対象疾患の追加検体の収集とオミックス解析に注力し、既に関連が示唆されている代謝物やゲノム領域について更なる検討を進め、複雑系疾病群の病因・病態を解明に有用な知見の導出を目指す。本年度は、複雑なオミックスデータ情報を柔軟に統合・圧縮し、複雑系疾病の解明に有用な特徴量を抽出するための、新規方法論の開発とアルゴリズムの実装を進めた。具体的には、JAVA言語をベースとした多階層テンソル因子分解アルゴリズムの実装、変分ベイズ法に基づくモデル実装を行い、単体で解析可能なツールとしてのプロトタイプが完成した。現在、小規模の試験的データを用いた検証を行っており、問題がなければより規模の大きい複数のデータを用いた検証に移行する。解析対象の複雑系疾病については、肺高血圧症172検体(44症例)、HTLV-1関連疾患4,024症例、IgG4関連疾患215検体(82症例)、好酸球性消化管疾患416検体(380症例)の時系列検体を収集した。収集検体の一部については、発現解析(IgG4関連疾患:91検体、肺高血圧症:171検体、好酸球性消化管疾患:102検体)、および、代謝物解析(IgG4関連疾患:154検体、肺高血圧症:172検体、好酸球性消化管疾患:208検体)を実施しており、ツール開発ならびに各解析対象疾患の検体・データ収集が順調に進んでいる。引き続き、各対象疾患の検体収集を継続すると同時に、オミックス解析データの収集に努める。データセットが揃った段階で、各複雑系疾患の時系列オミックスデータに本解析手法を適用し、ツール開発へのフィードバックを行う。フィードバックが完了した時点で大規模オミックス実データを用いた解析へと移行し、当該疾患の病因・病態を解明に有用な知見の導出を目指す。解析対象の複雑系疾病については、肺高血圧症172検体(44症例)、HTLV-

1関連疾患4,024症例、IgG4関連疾患215検体(82症例)、好酸球性消化管疾患416検体(380症例)の時系列検体を収集した。収集検体の一部については、発現解析(IgG4関連疾患:91検体、肺高血圧症:171検体、好酸球性消化管疾患:102検体)、および、代謝物解析(IgG4関連疾患:154検体、肺高血圧症:172検体、好酸球性消化管疾患:208検体)が終了しており、ツール開発ならびに各解析対象疾患の検体・データ収集が順調に進んでいる。昨年度に引き続きオミックス解析ツールの開発を進め、小規模の試験的データを用いたアルゴリズムの検証と実装整合性の確認作業が完了し、実データへの解析に移行している。解析対象の複雑系疾病群の検体からは、昨年度解析した遺伝子発現情報・代謝物情報に加え、ゲノム情報(肺高血圧症175検体、HTLV-1関連疾患6,444検体、IgG4関連疾患891検体、好酸球性消化管疾患336検体の網羅的一塩基多型タイピング)を収集した。比較対照群として利用するながはまコホート検体についても、約8,000検体の代謝物測定、300検体の遺伝子発現解析が完了しており、患者群・対照群のオミックスデータ収集が順調に進んでいる。対照群の代謝物情報を用いた相関解析およびゲノムワイド関連解析からは、主要な代謝物ネットワークの存在や、各代謝物量との強い関連を示すゲノム領域の存在が示唆された。また、疾患間の代謝物量の比較分析により、特に好酸球性消化器疾患と関連する代謝物が検出されている。本代謝物量は治療介入前後においても変動が認められることから、病態を把握する上で重要なバイオマーカーとなる可能性がある。また、同様の解析によってHTLV-1関連疾患やIgG4関連疾患においても、疾患との関連するゲノム領域が認められている。次年度も引き続き、各対象疾患の検体とオミックス情報の継続的な収集に努め、必要に応じて全ゲノム解析やターゲットシークエンス解析等の追加実験および解析アルゴリズムの改良によって当該結果を検証し、複雑系疾患群の病因・病態の解明を進める。当初の研究計画に沿って、JAVA言語をベースとした多階層テンソル因子分解アルゴリズムの実装、変分ベイズ法に基づくモデル実装を行い、複雑なオミックスデータ情報を柔軟に統合・圧縮し、複雑系疾病の解明に有用な特徴量を抽出するための、新規方法論の開発とアルゴリズムの実装を進めた。本年度は、試験的データを用いて実装整合性の検証が完了し、実データを用いた解析に移行している。解析対象の複雑系疾病については、肺高血圧症172検体(44症例)、HTLV-1関連疾患4,515症例、IgG4関連疾患214検体(83症例)、好酸球性消化管疾患471検体(367症例)の時系列検体を収集した。収集検体の一部については、発現解析(IgG4関連疾患:91検体、肺高血圧症:171検体、好酸球性消化管疾患:102検体)、代謝物解析(IgG4関連疾患:154検体、肺高血圧症:172検体、好酸球性消化管疾患:208検体)、ゲノム解析(肺高血圧症175検体、HTLV-1関連疾患6,444検体、IgG4関連疾患891検体、好酸球性消化管疾患336検体の網羅的一塩基多型タイピング)が終了しており、ツール開発ならびに各解析対象疾患の検体収集・オミックス解析が順調に進んでいるため。試験的データを用いてツールの検証を進め、アルファ版を完成させる。各対象疾患の検体収集を継続すると同時に、オミックス解析データの収集に努める。データセットが揃った段階で、各複雑系疾患の時系列オミックスデータに本解析手法を適用し、ツール開発へのフィードバックを行う。
可変振幅フィルタによる音色可変・環境適応型ディジタル補聴器の実現

補聴器はアナログからディジタルへ主流になりつつある。ディジタル補聴器は、アナログ素子のものと比べると、入力されてきた音声信号に多様な処理を施すことが容易に実現できるため、「fitting」の際に要求される細かい調節が可能である。しかし、補聴器を必要とする難聴者の聴力特性は千差万別であり、おのおのの聴力に適したfittingが行える従来のディジタル補聴器は、計算量・電力消費が多くて、コストが高いなどの問題点が挙げられる。本研究では、低次数でも比較的特性の優れた3種類の可変IIRディジタルフィルタ(可変低域通過ディジタルフィルタ、可変帯域通過ディジタル、可変高域通過ディジタルフィルタで構成される3チャンネル可変ディジタルフィルタバンク(variable filter-bank : VFB)を設計し、消費電力とコストパフォーマンスの悪さの要因になっている計算量を軽減し、かつ最適なfittingが可能なディジタル補聴器の設計法を開発した。本研究の目的は補聴器ユーザー自身が自分の聴覚特性と環境音に応じて補聴器の周波数特性を自由自在に調整できるような音色可変・環境適応型"聞きやすい"ディジタル補聴器を実現することである。この場合、振幅特性が連続可変なディジタルフィルタ(振幅可変フィルタ)の最適設計を行う必要がある。本年度は以下の2つのアプローチで可変振幅フィルタの実現を目指して研究を進めてきた。アプローチ1:可変非整数遅延(variable fractional-delay : VFD)フィルタを用いて可変振幅フィルタを構成する。この場合、VFDフィルタの最適設計と高速実現に関する研究が基礎となる。本年度では、任意次数(奇数次と偶数次)のLagrange型VFDフィルタの一般式を導出し、その高速実現を目指して係数対称性を証明した。結局、係数対称性を利用すれば50%の計算量削減を実現でき、高速フィルタリングが可能となる。アプローチ2:アナログフィルタに関する研究が昔から盛んに行われてきたため、様々な研究成果の蓄積がある。もしアナログフィルタを様々な帯域幅をもつディジタルフィルタ(低域通過フィルタ、帯域通過フィルタ、高域通過フィルタ)に簡単に変換できれば、アナログフィルタの蓄積を有効にディジタルフィルタの設計に生かすことができ、容易に様々なディジタルフィルタを設計できる。本年度では、任意の高い次数のアナログフィルタを計算機によって自動的にディジタルフィルタへの変換を行う基礎研究として、一般化パスカル行列とその逆行列の導出と証明を行った。一定の成果が既に出たが、これから順次に発表する予定である。これからはアナログ遮断周波数が1である正規アナログフィルタを計算機によって自動的に様々な帯域幅をもつディジタルフィルタ(低域フィルタ、帯域フィルタ、高域フィルタ)への変換アルゴリズムを導出する予定である。音色可変・環境適応型"聞きやすい"ディジタル補聴器を実現するため、振幅特性が連続可変なディジタルフィルタ(振幅可変フィルタ)の最適設計を行う必要がある。本年度では、以下の2つのことについて研究を行ってきた。(1)アナログフィルタの設計法に関する研究蓄積が膨大であるため、アナログ周波数変換法とs-z変換を行えば、可変低域通過ディジタルフィルタ、可変帯域通過ディジタルフィルタ、可変高域通過ディジタルフィルタを得ることができる。その基礎研究として、まずKang's一般化1次s-z変換モデルを用いて、アナログフィルタをディジタルフィルタに変換するための一般化パスカル行列の導出とその要素表現式、一般化パスカル行列の境界要素から内部要素を再帰的に計算するための漸化式の導出と桁落ち問題、様々な逆行列の証明、一般化パスカル行列の性質の証明を行った。(2)通過域端周波数=1rad/秒のアナログプロトタイプフィルタ(正規フィルタ)を様々な可変ディジタルフィルタに変換するため、まず様々なアナログ周波数変換を行い、通過域端周波数が規定された別のタイプのアナログフィルタに変換する必要がある。本年度の研究では、任意の次数のアナログ低域通過フィルタ、アナログ帯域通過フィルタ、アナログ高域通過フィルタのコンピュータによる自動変換アルゴリズムを導出した。この変換は変換行列の演算で行う。次のステップは得られた様々なアナログフィルタ(低域通過、帯域通過、高域通過)をs-z変換(特にBL変換と呼ばれる双1次s-z変換)によって可変低域通過ディジタルフィルタ、可変帯域通過ディジタルフィルタ、可変高域通過デイジタルフィルタに変換することである。このステップでは、基礎研究としての一般化パスカル行列の利用が必要となる。

よって、本年度の研究実績としては、主に一般化パスカル行列およびアナログ周波数変換による様々なアナログフィルタの自動変換アルゴリズムの導出である。平成20年度の研究では、低次数でも比較的特性の優れた3種類の可変IIRディジタルフィルタ(可変低域通過ディジタルフィルタ(LPF)、可変帯域通過ディジタル(BPF)、可変高域通過ディジタルフィルタ(HPF)で構成される3チャンネル可変ディジタルフィルタバンク(variable filter-bank:VFB)を設計し、消費電力とコストパフォーマンスの悪さの要因になっている計算量を軽減し、かつ最適なfittingが可能なディジタル補聴器の設計法を開発した。3種類の可変フィルタの設計の基本的な考え方はディジタル周波数変換に基づき、プロトタイプ低域通過ディジタルフィルタ(LPF)から通過域端周波数が異なる別のLPF、BPFとHPFへの変換を行うことである。このように、可変フィルタの通過域端周波数が分かれば、ディジタル周波数変換に基づき、3種類の可変フィルタを設計できる。難聴の原因が様々でオージオグラムのパターンも様々である。与えられたオージオグラムに対して、最適なfittingを得るためには、3種類の可変フィルタの通過域端周波数とゲインを求める必要がある。VFBの振幅特性と与えられたオージオグラムの理想特性との最大絶対値誤差を最小化することによって、最適なパラメータを求める。これは非線形最適化問題でNelder-Meadシンプレックス法のアルゴリズムを用いて求めることができる。これらのパラメータが決まれば、3種類の可変フィルタを設計でき、3チャンネルVFBを構成できる。構成された3チャンネル可変フィルタバンク(VFB)を用いて低消費電力・高精度ディジタル補聴器の新しいfittingが可能となる。VFBの次数が非常に低いため、全体の計算量が従来の固定幅のフィルタバンクより遥かに少ない。一つの出力信号サンプルを得るため、11回の乗算と14回の加算だけで済む。また、様々なオージオグラム(難聴パターン)を用いて提案した3チャンネルVFBの有効性を実証した。
地域社会少年層における話しことばの実態と教育に関する基礎的研究

ことばをめぐる環境は大きく変容し,共通語化の波が大きく押し寄せている。一方で,教育場面では共通語と方言,世代間によることばの違いを意識,理解させることが求められている。しかし,現状では残念ながら地域のことばの理解を進める教育は十分ではない。そこで,本研究では山形県鶴岡市を対象として,1地域社会少年層における話しことばの実態を調査から明らかにし,そこから2話しことばの教育実践法について探っていく。
超音波ノイズ解析による微小クラック群の定量的評価に関する研究

本研究は、脆性材料中の微小クラックの定量的評価を目的として超音波ノイズ解析を理論的および実験的に実施したものである。1.理論的研究まず、単一クラックによる散乱波動の近似解を以下のように誘導した。対象とするクラックは入射超音波の波長に比べて十分小さいと考えられるため、低周波数域出の近似法である準静的近似が成立するものと仮定した。また、波動の検出点は微小クラックの寸法に比べて十分離れた位置にあると仮定できるため、遠方場近似を採用した。これらの近似から得られたクラック開口変位を散乱波動の積分表現に代入して、単一クラックによる遠方散乱場に対する解析的表現を得ることができた。次に、モンテカルロ-シミュレーションによりクラックの位置と向きを乱数により発生させ、上述の単一クラックによる散乱波形を重ね合わせることにより人工的な超音波ノイズのシミュレーションを行った。なお、ここではクラック相互間の干渉による影響は無視した。2.実験的研究まず、単一クラックを有する供試体を作成し、波動の散乱実験を実施した。その結果、理論解とほぼ同様の散乱パターンを得ることができた。次に、クラック群を配置した供試体を作成し、クラックの向きや間隔等が散乱波動に及ぼす影響を調べた。検出された波形の周波数成分を検討した結果、理論解との相関にある程度の定性的傾向を得ることができた。しかし、ここで作成した人工クラックの寸法はかなり大きく、検出された波形は超音波ノイズレベルをはるかに越えるものであった。したがって、本解析法が実際の超音波ノイズに含まれる散乱成分にどの程度適用できるかについては今後さらに詳細に検討する必要がある。また、ノイズとクラック群の幾何パラメータとの関係の定量化についても今後の研究課題として残された。
北極海海氷域における基礎生産とエネルギ-移動の時系列的変動の研究

「北極海海氷域における基礎生産とエネルギ-移動の時系列的変動の研究」は昭和63年度からの3年計画であった。本研究はこれまでの研究では空白地帯となっている季節的に海氷におおわれる海域を対象とし、海表層の基礎生産過程およびその深層への沈降過程を時系列的に明らかにすることを目的とした。同時に、エネルギ-移動の過程における動物プランクトンの役割を明らかにすることであった。北部ベ-リング海及びチャクチ海は季節的な海氷域とし、また、海洋生産力が高い海域として知られており、アラスカ大学海洋研究所を中心として、「大陸棚上における物質・エネルギ-の移送と循環」の研究計画(ISHTAR計画と略)が米国科学財団のDPP計画として行われていた。ISHTAR計画では北部ベ-リング海から、アナディ-ル海流の北方流にそって、ベ-リング海峡を通り北極海チャクチ海へかけて海洋基礎生産が高いことを観測していた。しかし、基礎生産から底生生物への物質エネルギ-の流れは実測されておらず、両者間のカップリングが不明であった。本研究ではセントロ-レンス島とベ-リング海峡との間にあるチリコフ海盆にて、自動観測システムの長期係留実験を主体とした。同システムは時間分画式連続採水器、デ-タロガ-、セディメント・トラップ(沈降粒状物採集器)から構成され、ある期間海中に係留した後、回収するものである。6月から9月にかけての実験で、8日毎に合計12のトラップサンプルを得た。これより有機炭素量や窒素量を測定したところ、炭素量は253654mg/m^2/dayであり、海洋の沈降炭素フラックスとしてはかなり高い値であった。また、炭素と窒素の元素比(C/N比)は、4.97.4とかなり低く、これは観測期間を通して、かなり新鮮な有機物が表層から海底へ向かって沈降していることを示した。同海域における豊富な底生生物群集の存在、また、それを餌とする鯨類の濃密分布は、とりもなおさず基礎生産の約1/4が連続して沈降することによることが明らかとなった。また、トラップ内のサンプルには、動物プランクトンの糞粒が多量に見られ、炭素フラックスに換算すると、全フラックスの約45%が糞粒によって占められていた。残りの部分は自然沈降した植物プランクトンによって占められ、主要な珪藻類は11属31種であった。長期係留実験に並行して、3年間で合計5研究航海が実施され、北緯62度から69度、西経165度から172度の範囲内において、合計77観測点から動物プランクトン標本が得られた。動物プランクトンの出現個体数において、橈脚類が最優占しておりとりわけPseudocalanus minutusが優先種であった。橈脚類については底生生物の幼生(フジツボ)が多量に出現した。橈脚類について観測点間で類似度指数を用いたクラスタ-分析を行った結果、同海域に3つのグル-プが検出された。3グル-プの地理的な拡がりは、東西方向にアラスカ沿岸水、大陸棚水、アナディ-ル海流の水塊区分に対応していた。セディメント・トラップ内に混獲された動物プランクトンの時系列的変化を質的に解析すると、3水塊の東西方向の空間的拡がりに対応することが指唆された。

同海域における豊富な底生生物群集の存在、また、それを餌とする鯨類の濃密分布は、とりもなおさず基礎生産の約1/4が連続して沈降することによることが明らかとなった。また、トラップ内のサンプルには、動物プランクトンの糞粒が多量に見られ、炭素フラックスに換算すると、全フラックスの約45%が糞粒によって占められていた。残りの部分は自然沈降した植物プランクトンによって占められ、主要な珪藻類は11属31種であった。長期係留実験に並行して、3年間で合計5研究航海が実施され、北緯62度から69度、西経165度から172度の範囲内において、合計77観測点から動物プランクトン標本が得られた。動物プランクトンの出現個体数において、橈脚類が最優占しておりとりわけPseudocalanus minutusが優先種であった。橈脚類については底生生物の幼生(フジツボ)が多量に出現した。橈脚類について観測点間で類似度指数を用いたクラスタ-分析を行った結果、同海域に3つのグル-プが検出された。3グル-プの地理的な拡がりは、東西方向にアラスカ沿岸水、大陸棚水、アナディ-ル海流の水塊区分に対応していた。セディメント・トラップ内に混獲された動物プランクトンの時系列的変化を質的に解析すると、3水塊の東西方向の空間的拡がりに対応することが指唆された。
電子移動反応を用いる新規二置換フラーレン類の合成と構造

電子移動反応によってC_<60>のアニオンラジカルを生じる経路は非常に容易であり、いくつかの例が知られている。しかしながら、電子移動によってC_<60>のカチオンラジカルを生成する反応は、C_<60>の酸化電から考えてかなり起こり難いと予想され、これまでにこのような反応を合成に用いた例は全くない。我々はこれまでにフルオロアルキル基の置換した過酸無水物が容易に電子移動を起こして、芳香族化合物のカチオンラジカルとフルオロアルキルラジカルおよびフルオロアルキルカルボン酸アニオンになり、さらに反応して芳香族化合物のフルオロアルキル化体を収率良く与えることを見出している。そこで、この反応をフラーレンのフルオロアルキル化に適用したところ、C_<60>のカチオンラジカルを経由した生成物であるフルオロアルキルヒドロキシフラーレンを得た。また、この反応では、C_<60>と過酸無水物がイオン反応を起こしたと予想されるジオール誘導体およびラジカル反応を起こしたと予想されるフルオロアルキル化されたC_<60>二量体をも得た。生成物の構造は、各種スペクトルデータから決定したが、フルオロアルキルヒドロキシフラーレンおよびフルオロアルキル化されたC_<60>二量体に関しては、それぞれをトリブチルスズヒドリドで還元し、両者から同じフルオロアルキル化フラーレンが生成することによってもその構造を確認した。
ストレスおよび炎症応答転写因子の相互作用による転写活性化／抑制決定メカニズム

Nrf2は活性酸素種などによって生じる酸化ストレスからの細胞保護に必須の転写因子である。Nrf2は炎症の抑制にも重要であることが知られていたが、そのメカニズムについては明らかでなかった。Nrf2は多くの抗酸化遺伝子の発現を活性化するため、これまではNrf2によって発現した抗酸化遺伝子群が間接的に炎症を抑制すると考えられてきた。これに対して申請者はマクロファージを用いたNrf2のクロマチン免疫沈降シークエンス解析(ChIP-seq)を行い、インターロイキン(IL)6、IL1b、IL1a遺伝子などの近傍にNrf2が結合することを見出した。これらの遺伝子の発現は、マクロファージに病原体の成分であるリポポリサッカロイドを投与すると転写レベルで急激に上昇する。しかし、Nrf2を遺伝的、薬剤的方法によって活性化すると、これらの遺伝子の発現上昇は強力に阻害された。Nrf2の既知の機能である活性酸素種の除去がこの炎症性サイトカイン遺伝子の転写抑制に必要かどうかを検討したところ、N-アセチルシステイン投与により活性酸素レベルを軽減させても炎症性サイトカイン遺伝子の発現に顕著な変化がみられなかったことから、Nrf2による炎症性サイトカイン遺伝子の転写抑制は活性酸素種の除去に依存しないことを見出した。これらの結果から、Nrf2は活性酸素種の除去とは独立に、炎症性サイトカイン遺伝子の転写制御を介して炎症を抑制することが明らかになった。Nrf2は活性酸素種などによって生じる酸化ストレスから細胞を保護することで知られる転写因子で、炎症の抑制にも重要である。Nrf2による炎症抑制のメカニズムについて、従来は、Nrf2による抗酸化遺伝子群の転写活性化が間接的に炎症を抑制すると考えられてきた。これに対して申請者は、マクロファージを用いたNrf2のクロマチン免疫沈降-シークエンス(ChIP-seq)解析から、インターロイキン(IL)6、IL1b、IL1a遺伝子などの近傍にNrf2が結合することを見いだした。これらの遺伝子は病原体の成分であるリポポリサッカライド(LPS)投与によって転写レベルで発現が誘導されるが、遺伝的・薬剤的方法によるNrf2活性化はこれらの遺伝子の転写を強力に阻害した。Nrf2による炎症性サイトカイン遺伝子転写抑制を継時的に解析したところ、炎症性サイトカイン遺伝子の転写抑制は、Nrf2の既知の標的遺伝子の活性化と同時に始まっており、Nrf2活性化後早期におこる現象であることが明らかになった。このことは炎症性サイトカイン遺伝子の転写抑制がNrf2による直接の効果であることを示唆する。次にNrf2の既知の機能である活性酸素種の除去がNrf2による炎症性サイトカイン遺伝子転写抑制に必要かどうかを検討した。その結果、Nrf2による炎症性サイトカイン遺伝子の転写抑制はNrf2の既知の機能である活性酸素種の除去に依存しないことを見いだした。Nrf2による炎症性サイトカイン遺伝子転写抑制の分子機構を明らかにするため、これらの遺伝子の近傍でNrf2活性化によって変化する転写関連イベントを探索した。転写活性化に関わるヒストン修飾としてアセチル化ヒストンH3リジン27(H3K27Ac)、転写抑制に関わるヒストン修飾としてトリメチル化ヒストンH3リジン27(H3K27me3)およびトリメチル化ヒストンH3リジン9(H3K9me3)の修飾レベルをChIPによって解析したところ、これらのヒストン修飾はNrf2の活性化によって変化していなかった。さらに、炎症性サイトカイン遺伝子の転写を促進する因子として、NF-kappaB p65およびC/EBPbetaの結合をChIPによって検討した。その結果、これらの炎症応答転写因子群の遺伝子近傍への結合はNrf2の活性化によって変化しないことが明らかになった。一方、RNAポリメラーゼIIのChIPから、Nrf2の活性化はIL6およびIL1bの転写開始点におけるRNAポリメラーゼIIのリクルートメントを阻害することが明らかになった。これらの結果から、Nrf2は炎症応答転写因子群のリクルートやヒストン修飾変化以外の方法で、炎症性サイトカイン遺伝子近傍へのRNAポリメラーゼIIのリクルートメントを阻害することを明らかにした。また、Nrf2による炎症性サイトカイン遺伝子転写抑制の重要性を検討するため、マウス個体を用いた炎症性疾患モデルにおいてNrf2の欠失および活性化を行った。Nrf2の分解に必須の因子であるKeap1の顆粒球系細胞特異的欠失により、マクロファージなどの顆粒球系細胞でNrf2が恒常的に活性したマウスでは、多発性硬化症のマウスモデルである実験的脳脊髄炎の症状が改善し、中枢神経系でのIL6発現が抑制された。これらの成果は論文として投稿中である。

しかし、Nrf2を遺伝的、薬剤的方法によって活性化すると、これらの遺伝子の発現上昇は強力に阻害された。Nrf2の既知の機能である活性酸素種の除去がこの炎症性サイトカイン遺伝子の転写抑制に必要かどうかを検討したところ、N-アセチルシステイン投与により活性酸素レベルを軽減させても炎症性サイトカイン遺伝子の発現に顕著な変化がみられなかったことから、Nrf2による炎症性サイトカイン遺伝子の転写抑制は活性酸素種の除去に依存しないことを見出した。これらの結果から、Nrf2は活性酸素種の除去とは独立に、炎症性サイトカイン遺伝子の転写制御を介して炎症を抑制することが明らかになった。これまでに、Nrf2による炎症性サイトカイン遺伝子の転写抑制がNF-kappaBとの相互作用を介しているかどうか検討するため、恒常活性化型Nrf2とNF-kBの構成因子であるp65を過剰発現させた細胞を用いてレポーターアッセイ解析を行った。その結果、Nrf2はNF-kappaBによるIL6の転写誘導を阻害することが明らかになった。そこで、Nrf2による炎症性サイトカイン遺伝子の転写抑制メカニズムを明らかにするため、Nrf2活性化およびNF-kappaB活性化による、それぞれの転写因子を含む転写因子複合体の構成因子の変化を解析する。具体的には、Nrf2およびp65に対する抗体を用いた免疫沈降を行い、Nrf2を活性化させた時、およびNF-kappaBを活性化させた時に、Nr2およびp65との結合が報告されている因子が複合体に含まれるかどうかを検討する。また、Nrf2結合配列変異マウスの作製を進め、マウス個体を用いた炎症性疾患モデルにおいてNrf2による炎症抑制効果がキャンセルされるかどうかを検討する。Nrf2結合配列変異マウスよりも作製が容易な、Nrf2結合配列周辺の領域を欠失したマウスはすでに作製できており、今後このNrf2結合配列欠失マウスのホモマウスを得るための交配を行う。Nrf2結合配列変異マウスが作製できた場合、Nrf2結合配列欠失マウスと同様に、ホモマウスを得るための交配を行う。これらのNrf2結合配列変異/欠失ホモマウスが得られた後、実験的脳脊髄炎などの炎症性疾患モデルを作製し、Nrf2結合の欠失によって炎症性疾患が増悪するかどうか検討する。Nrf2結合部位変異マウスの作製に時間がかかったため平成27年度中に解析が行われず、試薬購入費が当初の予定より小額で済んだため。Nrf2結合部位変異マウスの作製およびNrf2結合部位欠失マウスのホモマウス化、作製した変異・欠失マウスの解析、今年度から引き続き行う転写抑制機構の検討に当該助成金を使用する。
急性肺障害における肺胞マクロファージを中心とした細胞間シグナル伝達の検討

本研究により肺胞マクロファージを中心とした炎症性サイトカインのネットワーク、iNOSの変動等について新しい知見を得ることができた。特にクロドロネート包括リポゾームを吸入させて肺胞マクロファージを根絶したラットそしてマウスモデルを開発できた。本法は95%以上の肺胞マクロファージを根絶でき、従来の気管支内直接投与法(70%程度の根絶)よりすぐれたモデルである。平成9年度はこのモデルマウスを用いて緑膿菌生菌を肺内投与する亜急性肺障害実験を行った。肺胞マクロファージ根絶マウスでは当初肺障害の程度も少なく、死亡率も低かったが7から10日前後にかけてほとんどのマウスが死亡した。それに対して無処置マウスは緑膿菌投与直後の死亡率が高かったにもかかわらず半数近いマウスが生存した。また根絶マウスでは腎等の遠隔臓器の障害程度が少なくiNOS,やTNFa, MIP2,CINCなどの炎症性サイトカインの発現が著明に抑制されていた。これらの所見は肺胞マクロファージが生菌の除去に必須であるが炎症初期の過剰反応が時に生体に不利な反応を引き起こす可能性を示唆している。これらの諸事実は一方ではARDSが全身炎症症候群の肺分画症であることの証左でもあり、その過程において肺胞マクロファージが重要な役割を果たしていることが判明した。臨床面においては急性呼吸窮迫症候群を罹患した患者の肺洗浄液中の肺胞マクロファージ中および血清中のiNOS, IL-1b, TNFa, IL-6,IL-8活性について検討を加え、急性期において肺胞マクロファージ表面にこれらの蛋白が高度に発現していることを示し、また肺胞マクロファージにこれらの蛋白が高度に発現していることを蛍光抗体法により示した。さらにRT-PCRを用いて肺胞洗浄液中での上記蛋白のmRNA発現を検討したところ、早期よりこれらのmRNAが発現し、かつステロイド投与により強く発現が抑制されることが示された。本研究in vivoおよびin vitro両面から急性肺障害の発症機序を研究するものである。特に肺胞マクロファージを中心とした炎症性サイトカインのネットワーク、iNOSの変動等について新しい知見を得ることにより急性肺障害における単球系の役割を解明することを目的としている。初年度である平成7年度はin vivoの系でクロドロネート包括リポゾームを吸入させて肺胞マクロファージを根絶したラットモデルを用いて、緑膿菌生菌を静脈内投与(敗血症モデル)および経気管肺内投与(肺炎モデル)して肺胞マクロファージの有無による反応の相違について検討を加えた。この結果、ラットにおいては肺胞マクロファージの産生するMIP-2蛋白(人におけるIL-8ファミリー)が全身の多核白血球の肺への凝集に関与していることが示された。ラットにおいては塩酸による肺障害モデルにおいても同様に検討中である。さらに現在マウスを用いて同様のモデルを作り、iNOS,やTNFα,MIP2,CINCなどの炎症性サイトカインの肺における発現についても検討中である。また臨床面においても成人呼吸窮迫症候群を罹患した患者の肺洗浄液中の肺胞マクロファージ中のiNOS活性についても検討を加え急性期において高度に発現していることを示した。この現象は高度の侵襲を伴う食道癌根治術後の患者の肺胞マクロファージにおいても観察されたが、さほどの侵襲を伴わない手術患者においては発現はみられなかった。このことより臨床面においても肺胞マクロファージのiNOS発現が肺障害に強く関与している可能性が示された。