hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
軸対称偏光炭酸ガスレーザーによる炭素繊維強化樹脂(CFRP)加工

入射エネルギー18mJという条件においては,アジマス偏光のみがしきい値を充分に上回り,他の偏光はちょうどしきい値程度だったため,アジマス偏光のみが容易に穴あけが進行した.入射エネルギーを変え,穴あけにかかる時間を計測したところ,アジマス偏光は30%程度小さいエネルギーで穴あけが可能であることがわかった.電子顕微鏡による加工面の観察から,CFRPの繊維が切れたところがアンテナになり,レーザー光電場と結合していることが示唆された.アジマス偏光は繊維方向に対して電場が垂直であるため,炭素繊維と結合せず,反射して底の加工に寄与するため穴あけが早い.精電舎工業のUPL-01試作機(波長10.6μm,最大100pps,エネルギー1020mJ)の貸与を受け,トリプルアクシコン光共振器を組み込んだ.パルスエネルギー18mJ,繰り返し70pps(平均1.3W)の条件で,厚さ0.24mmの単相CFRP板の切断試験を行ったところ,アジマス偏光とラジアル偏光がほぼ同等の1.1mm/sで切断できたのに対して,ランダム偏光は0.6mm/sと性能が劣った.一見すると軸対称偏光の優位性が示されたように見えるが,ラジアル偏光とアジマス偏光は互いに直交しており,これらが同時に切断性能を向上させる理由はすぐには説明できない.今後は,軸対称偏光が切断加工に与える影響を多角的な試験により検証していくことになる.代表者が開発した「トリプルアクシコン(T-axicon)光共振器」を用い,軸対称偏光で発振するパルス炭酸ガス(CO2)レーザーを開発した.開発したレーザーを用いて炭素繊維強化プラスチック(CFRP)加工の基礎研究を行った.ラジアル偏光,アジマス偏光,ランダム偏光の3種類の偏光のパルスレーザーで0.45mm厚の2層CFRP板の穴あけを行ったところ,アジマス偏光のみ25%小さいエネルギーで穴あけが可能であった.切断試験の結果は,ラジアル偏光,アジマス偏光の両方がランダム偏光に対して2倍の速度で切断可能という結果を得た.補助金減額により本研究の大前提となるレーザー開発に黄信号が灯った.しかし,宇野助教の献身的な協力により,ほぼ目標とする出力およびパルス特性を持つレーザーの開発に成功した.現在のところ,CFRPへの穴あけ加工で見られた,ラジアル偏光の特異的な性能向上を合理的に説明できる理屈を我々は持ち合わせていない.しかし,幸いにして現象の再現性は良好である.また,昨年度実施した他の材料とCFRPの違いは,材料の著しい非等方性である.平成28年度は,これを手がかりにして,現象を説明できるモデルを構築することが急務と考える.また,研究計画書にあるように,スケールアップした装置でのより実際的な加工試験も実施する予定である.レーザー,波動光学27年度は予定通り開発したレーザーを用いたCFRP加工試験に入る.また,大学教員であり研究者である宇野助教が共同研究者となったことで,宇野助教が持つレーザー加工の研究テーマに申請者の軸対称偏光を組み合わせたらどうなるか,という新たな興味が広がる.今後も,互いの持ち味を活かした相乗効果で,有意義な研究成果を出すよう鋭意努力したい.山梨大学に分担したした交付金がほぼ半分余っている.初年度にレーザー作成のために100万円を配算したが,相当額の余りが発生した.研究に使用するレーザーを市販品購入から大学の一品製作(開発)に切り替えたため,使用しきれない予算が発生した.3年めの加工試験,出張旅費に充てる予定である.1年めの積み残し,および2年目の目的に沿った以下の費目にて使用の予定.具体的には◆加工試料の購入◆
tRNA特異的なリボヌクレアーゼの分子認識機構の解明

(1)コリシンDは全長697アミノ酸で、C末端側がtRNA(Arg)を特異的に切断するリボヌクレアーゼドメイン(以下CRD:Carboxyl-terminal RNase Domain)である。CRDとtRNA(Arg)が結合した複合体の立体構造を明らかにし、コリシンDの反応機構を明らかにする事を目的とした。CRDと基質RNAの安定した複合体を形成させるために、tRNA切断活性を低下させたCRD変異体と、CRDに切断され難い変異型RNAを用いた。これらを用いて結晶化を行ったが、結晶は得られていない。そこで計算機を用て、CRDと基質tRNAのドッキングシミュレーションを行った。その結果、tRNAの38番目のアデニンがフリップアウトし、CRDのTrp679と相互作用する事が示された。これは今までの生化学的実験の結果と合致するものであった。これまでの結果を元にコリシンDの反応機構を推測した。(2)酵母Pichia inositovoraが生産するキラートキシンを構成するサブユニット(以下Piγとする)は、酵母Kluyveromyces lactisが生産するtRNA特異的リボヌクレアーゼzymocinのγ-subunit(以下K1γとする)と、アミノ酸レベルで約19%の相同性がある。K1γはtRNA(Glu)3を特異的に切断し、この切断にはアンチコドン1文字目の修飾塩基mcm5s2Uが重要である。PirのRNA切断活性を確かめたところ、全RNA全体をスメア状に分解する、RNA特異的リボヌクレアーゼであった。また、Piγは修飾塩基mcm5s2UがあるtRNAは切断できなかった。さらに、K1γとPiγの活性に重要なアミノ酸を探索したところ、Arg,Glu,Hisの3つのアミノ酸が保存されていた。His,Gluは触媒残基、Argは負に帯電するRNAと相互作用しやすいと考えられる。
腎集合管水輸送におけるＶ１ａＲシグナル伝達分子の同定

バソプレシンV1a受容体(V1aR)は、集合管主細胞のV2R-PKA-AQP2軸を修飾し、AQP2活性を抑制し水再吸収を阻害すると考えられてきた。しかし、V1aRは腎集合管において主細胞ではなく間在細胞(type-A, type-B, non-A, non-B)のみに発現し、V1aR mRNAは、酸負荷時に髄質外層内帯のヘンレループおよび髄質集合管間在細胞type-Aにおいて増加した。V1aR KOマウスへの各種負荷実験から、V1aRは髄質集合管間在細胞における酸分泌亢進、主細胞AQP2の基礎的発現量の維持に寄与していることが示唆された。本年度は、アシドーシス時にAQP2の管腔膜移行が阻害される機構におけるV1aRシグナルの関与を調べるために、実験的に代謝性アシドーシスを誘発し、水電解調節分子の発現変化をV1aR KOとWTで比較した。代謝性アシドーシスは、KO、WTマウスに2.5%NH4Cl食を6日間負荷することにより誘導し、血液・尿成分を比較し、AQP2はwestern blotting法により発現量を定量し、免疫染色法により細胞内局在を調べ、V1aR、V2Rは高感度in situ hybridization法により発現量を解析した。AVP-V1aR (IC)を介したシグナルは、V2R (PC)の発現/活性化とAQP2の管腔膜から細胞質への移行に影響し、代謝性アシドーシス時の尿濃縮能低下をもたらすと考えられた。V1aR KOマウスは、水電解質調節分子AQP2、V2Rの発現量が少なく、尿濃縮能が低下していることが明らかになった。本研究は、V1aR KOマウスの水電解質調節能について解析を行った。V1aR KOマウスの標準飼育下における血漿のpH、電解質濃度、浸透圧、血漿VP濃度の値は、WTマウスと比べて有意な差はなかったが、尿浸透圧は有意に低かった。水電解質調節分子である腎集合管のAQP2発現量は、V1aR KOマウスで有意に低下しており、集合管管腔膜上のAQP2も少なかった。また、集合管主細胞のV2R mRNAの発現量も、V1aR KOマウスにおいて有意に少なかった。次に、V1aR KOマウスを24時間絶水し、尿濃縮能を解析した。絶水後、V1aR KOマウスの血漿浸透圧、血漿VP濃度の値は、WTマウスより有意に高かった。また、尿浸透圧の値は、WTマウスより有意に低かった。この時の集合管AQP2は、絶水によりWT、V1aR KOマウス共に管腔膜側へ移行していたが、V1aR KOマウスのAQP2発現量はWTより少なかった。また、V2R mRNA発現量は、WTマウスでは増加していたが、V1aR KOマウスでは増加していなかった。さらに、代謝性アシドーシス時の尿濃縮能低下について、V1aRシグナルの関与を調べた。実験的アシドーシス誘導後、WTマウスのAQP2、V2R発現量は増加したが、AQP2は細胞質内に限局した。V1aR KOマウスではAQP2、V2R発現量は低下し、AQP2は管腔膜に局在した。V1aRシグナルは、V2Rの発現量、AQP2の管腔膜から細胞質への移行に影響すると考えられた。V1aRは集合管主細胞ではなく間在細胞に発現しているが、主細胞のV2R、AQP2の基礎的発現量維持に寄与し、AQP2の管腔膜から細胞質への移行に関与することが明らかになった。腎生理平成25年度は、1.アシドーシス時にV1aRの発現量が変化する細胞の同定、2. V1aR KOの水電解質調節分子の解析、3.アシドーシス時のV1aR KOの血漿、尿成分、水電解質調節関連分子の解析を計画した。1.アシドーシス時にV1aRの発現量が変化する細胞の同定:アシドーシスを誘導する条件は、0.28M NH4Cl / 2% sucroseをマウスに飲水させる方法が最も多く使われている方法であるが、アシドーシスを誘導すると同時に血漿浸透圧を上昇させ血漿AVP濃度の上昇も引き起こす。血漿AVP濃度を上昇させないでアシドーシスを誘導させるため、NH4Clを飲水させるのではなく、餌に混ぜることにより(2.5% NH4Cl)、条件を確立した。

アシドーシス誘導後、WTマウスの腎V1aR mRNA発現量を尿細管の部位別、細胞別にISH法により定量し、髄質部TALとOMCDの間在細胞typeAで増加していることを明らかにした。(達成度100%)3.アシドーシス時のV1aR KOの血漿、尿成分、水電解質調節関連分子の解析:WTとKOのアシドーシス誘導時の血漿pH、HCO3-、pCO2、電解質濃度、AVP濃度を調べ、比較した。プロスタグランジン量の比較、AQP2の発現量を制御すると考えられているインスリン、TNFα、CREB、AP-1の発現量の比較は平成26年度に行う予定である。(達成度60%)1. V1aR KOマウスの水電解質調節能の解析:標準飼育下のWTとKOの血液・尿成分の比較を行い、標準飼育下では有意な差がないことを示した。また、水電解質調節分子AQP2、V2Rの発現量を免疫染色法、western blotting法、TSA-ISH法により調べ、KOで有意に少ないことを示すことが出来た。(達成度100%)2. V1aR KOの水電解質調節分子の解析:WT、KOマウスを24時間絶水し、水電解質調節分子を解析した。絶水時、全腎におけるAQP2発現量、集合管管腔膜上のAQP2量はKOで有意に少ないことを示すことが出来た。また、V2R mRNA量は、絶水時WTでは増加するが、KOでは変化しないことを示すことが出来た。アシドーシス時における水電解質調節分子の解析は、平成25年度に行う予定である。(達成度80%)3.アシドーシス誘導条件の検討:アシドーシス誘導の定法である0.28MNH4Cl飲水による酸負荷は血漿浸透圧、血漿VPを増加させ、脱水による反応が混在するため、NH4Cl飲水ではなく酸添加食によるアシドーシス誘導を検討した。2.5%NH4Cl添加食は、血漿浸透圧、血漿VPの増加を抑え、アシドーシスを誘導出来ることを確認した。(達成度100%)集合管におけるV1aRシグナルの解明するために、V1aR KOマウス、集合管主細胞の培養細胞を用いて解析を行う。・アシドーシス時・脱水時のV1aR KOの血漿、尿成分の解析:プロスタグランジンおよびAQP2の発現を制御すると考えられているインスリン、TNFα、CREB (cAMP-responsive element binding protein)、AP-1 (activator protein 1)、NF-kBなどの遺伝子、蛋白の発現量を解析する。・V1aRによるV2R、AQP2の発現調節分子の同定:脱水及び酸負荷後のV1aRによるV2R, AQP2発現調節分子を調べるため、WTとKOの腎蛋白の発現を比較し解析する。・V1aRによる水透過性に関与する分子の同定:上記の実験によりWTとKOで発現の違いがあった腎蛋白のうち、腎集合管に発現しているものを特定する。腎集合管培養細胞に過剰発現させ、脱水時(VPに添加)、アシドーシス時(細胞外液を酸性化)にAQP2の膜移行が変化するか解析する。V1aRシグナルを解明するために、引き続きV1aR KOマウスを用い、WTマウスと比較する。平成25年度は、アシドーシス時にAQP2の管腔膜への移行が阻害される機構についてV1aRシグナルの関与を調べる。・V1aR KOの水電解質調節分子の解析:アシドーシス時における腎集合管のAQP2発現量、細胞内局在、V2R mRNAの発現量を、免疫染色法、western blotting法、TSA-ISH法により調べる。また、血液・尿成分を比較する。・V1aR発現量が変化する細胞の同定:アシドーシス誘導後の腎尿細管V1aRの発現量変化を解析する。発現量が変化した細胞において産生・放出される蛋白やイオンが、AQP2の発現や膜移行に関与する可能性がある。
侵害刺激に対する三叉神経主感覚核並びに脊髄路核での応答性と伝達物質について

三叉神経系の体性感覚の第一次中継核は主感覚核と脊髄路核から構成され、脊髄路核はさらに三つの亜核、吻側亜核、中間亜核、尾側亜核に分類される。最近の解剖学領域の研究では、歯髄神経には比輔的太い神経線維が存在し、いずれのタイプの線維も尾側亜核を含む三叉神経感覚核に広く投射することを明らかにしている。それ故、本年度は歯牙疾痛に対する三叉神経感覚核で応答性と伝達物質との関連をpush-pull cannula法を用い検討した。実験動物として2.5kg前後の雄性家兎を用いた。HRPを歯髄に注入し三叉神経脊髄路核の各亜核で歯髄神経の密な投射が観察される部位にpush-pull cannulaを挿入し潅流を行い、潅流液中でのサブスタンスP(SP)、酸性アミノ酸(グルタミン酸、アスパラギン酸)をラジオイムノアッセイおよび高速液体クロマトグラフィー蛍光検出器により測定した。歯髄刺激により三叉神経主感覚核の背側部では、SP、グルタミン酸、アスパラギン酸の遊離増加が観察された。吻側亜核ではグルタミン酸、アスパラギン酸の遊離は増加したがSPの変動は観察されなかった。尾側亜核浅層領域では、SP遊離の増加およびグルタミン酸、アスパラギン酸の遊離増加傾向が観察された。以上の結果より、三叉神経感覚核の各部位で、歯髄刺激に伴って遊離される伝達物質は一様でないことが示唆された。
歯周病による中枢機能障害の基盤となるストレス応答性亢進機構の解明研究

近年、歯科領域において歯周病罹患と中枢機能の関連性が明らかとなってきている。本研究の目的は、歯周病原性菌感染がストレス応答性などの中枢機能に与える影響とそのメカニズムについて、マウスおよび培養細胞を用いて解明を行うことである。歯周病原性細菌(Porphyromonas gingivalis)由来のリポポリサッカライド(PgLPS)を腹腔内投与したマウスの海馬において、投与24時間後に炎症性サイトカインおよびミクログリア活性化マーカーであるIba1の遺伝子発現が有意に上昇した。PgLPSは培養ミクログリア細胞(MG6)における炎症性サイトカインの遺伝子発現上昇およびNF-kBシグナル活性化(IKKのリン酸化亢進とIkBのDegradationの増大)を引き起こした。加えて、PgLPS処置したMG6の順化培地(CM)は培養神経細胞(N2a)のPgLPS非処置群に比べて有意に細胞死を上昇させた。抗うつ薬であるイミプラミンはPgLPSによるMG6の炎症応答を抑制し、またCMによる神経細胞死を抑制した。さらに、イミプラミンはマウス海馬におけるPgLPS投与による炎症性サイトカインの遺伝子発現を有意に抑制した。マウスを用いた行動試験において、PgLPSによる有意な影響は得られておらず、追加実験を行う予定である。今後、行動試験などの動物実験に加えて、培養細胞を用いて、ミクログリア-神経間の相互作用に着目、歯周病原性細菌感染による炎症応答が引き起こすストレス応答性の解明を試みる。PgLPSによる脳内炎症がミクログリア活性化を伴うことからミクログリアとの関連性の可能性を示した。また、イミプラミンはPgLPS刺激によるミクログリアによる神経細胞死を抑制した。このことから、in vitroにおいて、PgLPS刺激によるミクログリア-神経細胞間の相互作用のメカニズムの一端を解明した。次年度は、行動試験の追加実験を行うとともに、in vitroの系を用いて、より詳細なミクログリア-神経細胞間の相互作用の機序解明に取り組む。歯周病は末梢炎症を引き起こし、糖尿病などの末梢性疾患のリスクファクターであることが明らかとなっている。近年、臨床および動物を用いた研究により、末梢炎症と中枢機能障害の関連性も報告されている。そこで、歯周病が中枢機能障害を引き起こすリスクファクターとなりうると仮説を立て、歯周病モデルを用いて歯周病による末梢炎症と中枢機能障害の関連性を解明することが本研究の目的である。歯周病菌を含む綿球を臼歯歯髄腔に6週間留置して作製した歯性感染モデルマウスの肝臓と海馬において炎症性サイトカイン(インターロイキン-1β、TNF-α)の遺伝子発現が軽微に上昇した。より強い炎症反応を引き起こす目的で、歯周病原性細菌(Porphyromonas gingivalis)由来のLPS(PgLPS)を腹腔内投与した。PgLPSを投与したマウスでは肝臓および海馬において投与2時間後に炎症性サイトカインの遺伝子発現は上昇し、24時間後に対照群と同程度まで低下した。その一方で、海馬における脳由来栄養因子(BDNF)の発現が低下した。PgLPS刺激により、培養ミクログリア細胞(MG6)における炎症関連遺伝子の発現が上昇した。この培養上清で刺激されたアストロサイトの炎症応答は、PgLPS単独刺激時よりも顕著に増大された。また、抗うつ薬であるイミプラミンの前処置はMG6におけるPgLPS刺激による炎症応答を抑制し、この培養上清刺激によるアストロサイトの炎症応答はPgLPS単独刺激時の培養上清刺激に比して低下した。よって、PgLPSはグリア細胞間の情報伝達を介した脳内炎症を引き起こし、抗うつ薬はこれを抑制する可能性が示された。歯性感染モデルによる全身炎症は軽微であったが、PgLPSを投与することで全身炎症及び、脳内炎症を引き起こすモデルを作製した。現在このモデルを用いて行動試験を行い解析中である。また、抗うつ薬は培養ミクログリアにおけるPgLPSによる炎症応答を抑制することで、グリア細胞間の情報伝達を抑制した。これまでに歯周病原性細菌由来のPgLPSを用いた炎症モデルの作製に加えて、in vitroにおいて、抗うつ薬による抗炎症効果を明らかにしたため、おおむね順調に進展していると考える。

マウスを用いた行動試験において、PgLPSによる有意な影響は得られておらず、追加実験を行う予定である。今後、行動試験などの動物実験に加えて、培養細胞を用いて、ミクログリア-神経間の相互作用に着目、歯周病原性細菌感染による炎症応答が引き起こすストレス応答性の解明を試みる。PgLPSによる脳内炎症がミクログリア活性化を伴うことからミクログリアとの関連性の可能性を示した。また、イミプラミンはPgLPS刺激によるミクログリアによる神経細胞死を抑制した。このことから、in vitroにおいて、PgLPS刺激によるミクログリア-神経細胞間の相互作用のメカニズムの一端を解明した。本年度は、PgLPSによる炎症モデルを用いた行動実験を行い、歯周病モデルマウスが中枢機能障害様の行動を示すか、また、抗うつ薬投与がこれを抑制できるかを検討する。さらに、このモデルにおいてミクログリアが活性化されているかを検討する。さらに、in vitroにおいて、PgLPS刺激により活性化されたミクログリアの培養上清が神経細胞に対して障害性を示し、抗うつ薬がこれを抑制するかを検討する。加えて、PgLPSによるグリア間情報伝達や神経障害性のメカニズムの解明を分子生物学的手法等を用いて試みる。次年度は、行動試験の追加実験を行うとともに、in vitroの系を用いて、より詳細なミクログリア-神経細胞間の相互作用の機序解明に取り組む。転出が決定したため、マウスを用いた行動試験を年度内に終えることが不可能となった。このため、転出先で行動試験を行う予定に切り替え、予算を次年度へと繰り越すことになった。繰り越し金はマウス、PgLPSおよび解析のために必要な試薬の購入費用にあてる。
高分子多成分系における融体中の相分離と結晶化によるミクロ多相構造の形成と御御

結晶性-非晶性ブロック共重合体であるポリスチレン-ポリエチレンブロック共重合体(PS-PE)を含むブレンドにおいて、融体の相構造および非晶性成分がガラス状態における状況下からの結晶化におけるミクロ相構造形成と結晶化挙動を、小角X線散乱法(SAXS)とDSCを用いて検討した。PS-PEブロック共重合体とPSホモポリマー(PSH)とのブレンドにおける融体のミクロ相構造は、PSHの添加量とともにラメラ・シリンダー・スフェア状へと変化した。また、組成の異なるブロック共重合体同士のブレンドにおいては、融体のミクロ相構造の構造周期が数平均分子量によってスケール出来ることが認められた。このような相構造を有する融体からの結晶化において、PS-PE/PSHブレンドは、PSの添加により見かけの活性化エネルギーが大きくなった。特にPEドメインがシリンダーおよびスフェア状である場合、観察した温度範囲において結晶化が観察されなかった。これはPEドメインがガラス状PSに囲まれリジッドで孤立したドメインであるためと考えられる。また、PEホモポリマーを加えたブレンドにおける結晶化においては、ミクロ相分離中に導入されたPEホモポリマーによってPEドメインが部分的に連結されるという、ミクロ相構造の構造欠陥によって、結晶化挙動はPEホモポリマーのそれに近くなる傾向を示した。以上の結晶化において、結晶化する場合は、SAXSのピーク位置は融体と結晶状態で変わらず融体のミクロ相構造を保持したまま結晶化することが示されたが、ある場合には結晶状態で、ミクロ相構造由来のピークの他に広角側にブロードなピークが観察され、ミクロ相構造内で複数の結晶ラメラを形成していることが示唆された。結晶性-非晶性ブロック共重合体の結晶化において、融体中のミクロ相分離構造を維持したまま結晶化しミクロ相構造内で結晶化するなら、そのミクロ相構造をテンプレートとして、結晶相をナノスケールで規則的に配置することが可能である。その条件を明らかにすることを目的とし、以下の2種類のブロック共重合体について、結晶化時におけるミクロ相構造の維持・破壊を、放射光を線源とする時分割小角X線散乱により検討した。(1)非晶性成分がガラス状態において結晶性成分を結晶化させ得る系である、ポリエチレン-ポリスチレンブロック共重合体(PE-PS)において、ラメラ状およびPEシリンダー状ミクロ構造からの結晶化において、完全にミクロ相構造を維持して結晶化した。しかし、PSホモポリマーをブレンドし、PEがシリンダー内に閉じこめられた場合は、結晶化が認められなかった。これは、リジッドな孤立したミクロドメインからの結晶化は非常に困難であることを示している。(2)非晶性成分がゴム状において結晶化させる場合として、ポリエチレングリコール-ポリブタジエンブロック共重合体(PEG-PBd)およびそのブレンドを用いて、検討した。その結果、結晶化における維持・破壊は、分子量すなわちミクロ相分離の偏斥のみならず、ミクロ相分離の構造や結晶化温度に依存した。このことはミクロ相分離構造下からの結晶化における構造形成において、キネティクスも重要な因子であることを示唆している。
超伝導重力計南北両半球ネットワークによる地球深部ダイナミックスの研究

マイスナー効果を応用した超伝導重力計は、重力の時間的変化を求める高精度・高分解能の相対重力計であり、従来からのスプリング型の重力計に比べて23桁感度が高く、10^<-12>(ngal)の感度と、ドリフトはわずかに数μgal/年という優れた特性を有する。この型の重力計の出現により、コア・アンダートーンなどの地球深部に起源をもつ微弱な信号を検出できると期待されるようになった。わが国は、これまで、江刺、松代、京都、阿蘇の国内4ヶ所と南極昭和基地において超伝導重力計による連続観測を実施してきたが、1997年1月には新たな超伝導重力計をキャンベラ(オーストラリア)に設置し、1997年12月には京都大学が保有する2基のうちの1基をバンドン(インドネシア)に移設した。さらに1999年には、北極・スバルバード諸島のスピッツベルゲン島、ニーオルセン(ノルウェイ領)新しい超伝導重力計を設置した。その結果、ニーオルセン、江刺、松代、京都、阿蘇、バンドン、キャンベラおよび昭和基地の8ヶ所を結ぶ北緯79°から南緯69°に至る南北両半球超伝導重力計ネットワークを構築することができた。平成910年度に引き続き、平成11年度もこれらの観測点における観測を継続し、とくに京都においては、FG5型絶対重力計を用いた超伝導重力計のキャリブレーションを実施し、1999年12月には、京都で本研究のとりまとめの集会を開催したが、地球潮汐の観測に及ぼす海洋潮汐の荷重影響、潮汐日周潮帯に見られる流体核共鳴効果、極運動に伴う重力変化及び常時地球自由振動などを検出することができた。地球深部ダイナミクスの研究において、われわれの超伝導重力計ネットワークの果たした役割はきわめて大きかったことが明らかになった。わが国では、これまで、江刺、松代、京都、阿蘇の国内4カ所と南極昭和基地において超伝導重力計による連続観測を実施してきたが、1997年1月には新たな超伝導重力計をキャンベラ(オーストラリア)に設置し、1997年12月には京都大学が保有する2基のうちの1基をバンドン(インドネシア)に移設した。その結果、江刺、松代、京都、阿蘇、バンドン、キャンベラおよび昭和基地の7カ所を結ぶ北緯39°から南緯69°に至る南北両半球超伝導重力計ネットワークを構築することができた。流体核に起因するきわめて微弱な信号は核の扁平率に強く依存していると考えられることから、このネットワークの構築は、地球深部ダイナミックスの今後の研究発展におおいに貢献するものと期待できる。本研究では、微弱な重力変化を少しでも明瞭にとらえるため、ネットワークを構成する7カ所の観測点に共通の高性能フィルターを配置するとともに、ソフトウェアを改良することにより、データ収録システムおよびデータ・フォーマットの標準化を行った。1998年1月には京都で本研究の研究打ち合わせ集会を実施し、本格的にデータが蓄積される次年度以降に備えて、観測システムに付随する問題点や観測点固有の問題点の検討を行った。

マイスナー効果を応用した超伝導重力計は、重力の時間的変化を求める高精度・高分解能の相対重力計であり、従来からのスプリング型の重力計に比べて23桁感度が高く、10^<-12>(ngal)の感度と、ドリフトはわずかに数μgal/年という優れた特性を有する。この型の重力計の出現により、コア・アンダートーンなどの地球深部に起源をもつ微弱な信号を検出できると期待されるようになった。わが国では、これまで、江刺、松代、京都、阿蘇の国内4カ所と南極昭和基地において超伝導重力計による連続観測を実施してきたが、1997年1月には新たな超伝導重力計をキャンベラ(オーストラリア)に設置し、1997年12月には京都大学が保有する2基のうちの1基をバンドン(インドネシア)に移設した。その結果、江刺、松代、京都、阿蘇、バンドン、キャンベラおよび昭和基地の7カ所を結ぶ北緯39゚から南緯69°に至る南北両半球超伝導重力計ネットワークを構築することができた。平成10年度もこれらの観測点における観測の維持を続けた。1999年1月には、京都で本研究の研究打ち合わせ集会を実施し、微弱な重力変化を少しでも明瞭にとらえるためのフィルター特性の改良や観測点固有の問題点などの検討を行った。その結果に基づいて、超伝導重力計ネットワークのデータ収録システムの標準化をさらにすすめずことができた。流体核に起因するきわめて微弱な信号は核の扁平率に強く依存していると考えられることから、このネットワークの構築は、地球深部ダイナミックスの今後の研究発展におおいに貢献するものと期待できる。わが国は、これまで、江刺、松代、京都、阿蘇の国内4ヶ所と南極昭和基地において超伝導重力計による連続観測を実施してきたが、1997年1月には新たな超伝導重力計をキャンベラ(オーストラリア)に設置し、1997年12月には京都大学が保有する2基のうちの1基をバンドン(インドネシア)に移設した。さらに1999年には、北極・スバルバード諸島のスピッツベルゲン島、ニーオルセン(ノルウェイ領)新しい超伝導重力計を設置した。その結果、ニーオルセン、江刺、松代、京都、阿蘇、バンドン、キャンベラおよび昭和基地の8ヶ所を結ぶ北緯79゚から南緯69゚に至る南北両半球超伝導重力計ネットワークを構築することができた。平成910年度に引き続き、平成11年度もこれらの観測点における観測を継続し、とくに京都においては、FG5型絶対重力計を用いた超伝導重力計のキャリブレーションを実施した。1999年12月には、京都で本研究のとりまとめの集会を開催したが、地球潮汐の観測に及ぼす海洋潮汐の荷重影響、潮汐日周潮帯に見られる流体核共鳴効果、極運動に伴う重力変化などの研究において、われわれの超伝導重力計ネットワークの果たした役割はきわめて大きかったことが明らかになった。
肺腫瘍における微小環境 : 腫瘍間質相互作用による増殖シグナルおよび薬剤耐性への影響

非小細胞肺癌(NSCLC)細胞と間質細胞との解析から見出されたチロシンキナーゼ受容体Axlの活性化と癌の進行について解析を進めている.NSCLC症例について,昨年度は活性化Axlの染色を行ったが,本年度は不活性型Axlの発現について検討した.肺腺癌患者の臨床検体52例を用いてリン酸化(活性型)Axlと不活性型Axlの患者の臨床予後他にどのような影響があるのかを検討した.本研究では, Axlの細胞外ドメインを認識する抗体を用いて検討を行った.その結果,興味深いことに一部のNSCLC患者において, Axlの細胞外ドメインの有無に関わらず, Axlが活性化しているという症例が認められた.細胞外ドメインが存在したままAxlが活性化する症例では,これまでのチロシンキナーゼ受容体と同様に,リガンドにより活性化が誘導されたと考えられる.しかしながら,細胞外ドメインが存在しないにもかかわらずAxlが活性化している症例では, 2つの可能性が考えられた.すなわち,リガンドGas6による活性化と同時に, Axlの細胞外ドメインが切断されるという可能性,またはGas6以外の何らかの条件において, Axlの活性化と切断が同時に引き起こされた可能性が考えられた.これらの可能性について,肺腺癌培養細胞を用いて検討を行った.前者に関しては,充分な検討は行えていないが, Gas6によるAxlの活性化,およびその後の切断誘導の可能性が認められている.後者に関して,過去の文献を検索した結果,酸化ストレスによる効果の可能性が認められた.文献に基づいて,酸化ストレスによる効果について検討した結果,酸化ストレスはAxlの活性化と切断が同時に誘導する可能性が認められた.この活性化はSrcを介していることが示唆された.また, Axl細胞外ドメインの切断は内因性メタロプロテアーゼ阻害因子TIMPsの発現減少によるものである結果が得られた.本研究結果から, AxlはリガンドGas6により活性化と切断,あるいは酸化ストレスによるAxlの活性化と切断の可能性が認められた.(抄録なし)非小細胞肺癌(NSCLC)細胞と間質細胞との解析から見出されたチロシンキナーゼ受容体AxlおよびそのリガンドGas6の役割について,解析を進めている.NSCLC症例において,活性型Axlの発現を解析し,細胞増殖および予後不良と相関関係が認められた.今回,同じ症例を用いて不活型Axlの発現を同様に解析した.その結果,不活型Axlは癌細胞の細胞膜および血管内皮細胞に発現していることが判明した.また,活性型Axlが発現しているにも関わらず,不活型Axlが発現していない症例が認められた.続いて,Axlの活性化による影響を,NSCLC培養細胞を用いて解析した.今回の実験に用いた培養細胞は,Gas6の発現が高いPC9と,Gas6添加により顕著なAxl活性化を示したNCI-H23を選択した,PC9に対し,Axl阻害抗体(中外製薬より供与)を添加した結果,細胞増殖を有意に抑制し,同時にAxlの活性化および細胞内増殖シグナル経路における因子の一つERKの活性化を抑制した.これに対し,NCI-H23にGas6を添加した結果,増殖は誘導されたが,Axl阻害抗体によるその抑制は認められなかった.同様に,蛋白質レベルにおいて,Gas6によるAxlの活性化が認められたが,Axl阻害抗体によるAxlおよびERKの活性化抑制は認められなかった.また,NSCLC細胞と間質細胞との解析から,Axlと共にチロシンキナーゼ受容体EGFRが検出されたことから,EGFR阻害剤に対する耐性獲得のメカニズムとして,Axlが関与している可能性が示唆された,このことから,EGFR阻害剤耐性獲得細胞の確立を計画した.NSCLC培養細胞A549およびPC9,EGFR阻害剤gefitinibおよびerlotinibを用いて,過去の文献と同程度の耐性を獲得した細胞を確立した.非小細胞肺癌(NSCLC)細胞と間質細胞との解析から見出されたチロシンキナーゼ受容体Axlの活性化と癌の進行について解析を進めている.NSCLC症例について,昨年度は活性化Axlの染色を行ったが,本年度は不活性型Axlの発現について検討した.肺腺癌患者の臨床検体52例を用いてリン酸化(活性型)Axlと不活性型Axlの患者の臨床予後他にどのような影響があるのかを検討した.本研究では, Axlの細胞外ドメインを認識する抗体を用いて検討を行った.その結果,興味深いことに一部のNSCLC患者において, Axlの細胞外ドメインの有無に関わらず, Axlが活性化しているという症例が認められた.細胞外ドメインが存在したままAxlが活性化する症例では,これまでのチロシンキナーゼ受容体と同様に,リガンドにより活性化が誘導されたと考えられる.しかしながら,細胞外ドメインが存在しないにもかかわらずAxlが活性化している症例では, 2つの可能性が考えられた.すなわち,リガンドGas6による活性化と同時に, Axlの細胞外ドメインが切断されるという可能性,またはGas6以外の何らかの条件において, Axlの活性化と切断が同時に引き起こされた可能性が考えられた.これらの可能性について,肺腺癌培養細胞を用いて検討を行った.前者に関しては,充分な検討は行えていないが, Gas6によるAxlの活性化,およびその後の切断誘導の可能性が認められている.後者に関して,過去の文献を検索した結果,酸化ストレスによる効果の可能性が認められた.

文献に基づいて,酸化ストレスによる効果について検討した結果,酸化ストレスはAxlの活性化と切断が同時に誘導する可能性が認められた.この活性化はSrcを介していることが示唆された.また, Axl細胞外ドメインの切断は内因性メタロプロテアーゼ阻害因子TIMPsの発現減少によるものである結果が得られた.本研究結果から, AxlはリガンドGas6により活性化と切断,あるいは酸化ストレスによるAxlの活性化と切断の可能性が認められた.EGFR阻害剤耐性細胞の確立に関して,申請書の研究計画では,EGFR阻害剤耐性細胞を確立するために,A549およびLK87を用いることを計画していた.しかし,どちらも同様の性質(野生型EGFR)を有していたことから,性質の異なる細胞株として,LK87の代わりにPC9(変異型EGFR)に変更することとした,計画変更に伴い,耐性細胞の確立が遅れることが危惧されたが,計画以上に早く耐性細胞を確立させることができた.NSCLC症例を用いた検討から,Axlを発現していないにも関わらず,活性型Axlが発現している症例が認められた,今回用いたAxl抗体は,Axlの細胞外ドメインを認識する抗体であることから,何らかの原因により細胞外ドメインが切断された可能性が示唆されたため,今後検討を進める。また,培養細胞を用いた実験において,Axl阻害抗体による効果の違いが認められたが,今後Gas6の供給源や,上記のAxl細胞外ドメイン切断の関与等,解析を進める予定である.更に,耐性獲得におけるAxlの関与について解析する予定である.(抄録なし)
有毒節足動物の捕食者体内における耐性機構：いかにカエルの消化液に耐えられるか？

節足動物には捕食者から身を護るために防衛物質を分泌する種が多い。しかし、被食者の毒物質によって捕食者から解放されたとしても、捕食者による噛み付きや攻撃、消化液によって被食者はダメージを受けるかもしれない。このような捕食者に対する耐性はこれまでほとんど注目されてこなかった。申請者は最近、オサムシ科甲虫の一種が捕食者の消化管内で長時間生存し体外に脱出することを発見した。この観察をもとに「有毒な節足動物は捕食者の消化液に対して耐性を持つ」という仮説を提唱した。本仮説を検証するために、有毒節足動物とその潜在的捕食者(カエル類)を用いて、化学防衛にともなう捕食者の消化液に対する耐性機構を明らかにする。
細菌感染におけるNLR 分子によるオートファジー制御機構の解析

本研究によって、NLRP4分子がオートファジー誘導の基軸分子である、Beclin1に結合し、オートファジーを負に制御していることが明らかとなった。NLRP4の発現を抑制することによって、A群連鎖球菌の感染に呼応して誘導されるオートファジーが増強され、細胞内に侵入したA群連鎖球菌数が、感染後早期に排除されることが観察された。NLRP4とBeclin1の相互作用を調節する薬剤が、オートファジー亢進を利用した抗細菌薬の候補となりうる可能性が示唆された。1.NLRP4が、インフラマソーム形成に関与するか、HeLa細胞を用いて検討した結果、NLRP4はHeLa細胞におけるインフラマソーム形成やインターロイキン1産生に関与しないことが示唆された。2.A群連鎖球菌をHeLa細胞に感染させた際の、インフラマソーム形成やインターロイキン1産生を評価した結果、GAS感染時に、HeLa細胞からインターロイキン1産生は検出限界以下であった。3.NLRP4は、NLRファミリーに属するが、HeLa細胞やHuVEC細胞などの上皮細胞においては、オートファジー誘導に強く関与し、インターロイキン産生やインフラマソーム活性化にはほとんど関与していないことが示唆された。1.Beclin1の既知の相互作用分子としてVps34、Ambra1、UVRAG、Bcl-2、Atg14L、Rubiconが報告されているため、NLRP4-Beclin1複合体は巨大な複合体を形成していると考えられ、他の分子との相互作用が示唆される。そこで、免疫沈降法によりNLRP4とVps34、Ambra1、UVRAG、Bcl-2、Atg14L、Rubiconの相互作用について解析した。その結果、NLRP4はAmbra1と相互作用する可能性があきらかとなった。2.オートファジーは免疫抑制剤であるRapamycin、栄養飢餓状態、微生物感染においても誘導されるため、NLRP4によるオートファジー誘導制御がGAS感染に特異的であるのかを検討した。オートファジーの誘導は、オートファジー誘導マーカーであるII型LC3レベルと蛍光顕微鏡を用いたLC3の細胞内局在により評価した。その結果、NLRP4によるオートファジー制御が、GAS感染により誘導されるオートファジーに特異的であることが示唆された。3.これまでの結果より、NLRP4は細菌分解排除を担うオートファゴソーム形成より早くGAS感染を感知することが示唆された。GAS感染におけるNLRP4の細胞内局在変化とNLRP4のオートファジー制御機能を関連づけるために、GAS感染前後におけるNLRP4とBeclin1の相互作用レベルを免疫沈降法により解析した。その結果、NLRP4とBeclin1の相互作用量は、GAS感染に応じて一過性に減少することが観察された。本研究は、オートファジーとインフラマソーム活性化のクロストークを担う分子の機能解析を目的とする。具体的には、1.既知のBeclin1複合体構成分子とNLRP4の相互作用を解析する、2. NLRP4におけるオートファジー制御機構がA群連鎖球菌(GAS)感染に特異的なものであるかを検討する、3. NLRP4とBeclin1の相互作用が細菌感染に伴いどのように動態変化するのか検討する、4. NLRP4がインフラマソーム形成、または他のインフラマソーム活性化に関与するかを検討する。平成23年度の研究結果から、(1)NLRP4は、Beclin1構成分子であるAmbra1と相互作用する可能性が示唆された、(2)NLRP4によるオートファジー制御が、GAS感染により誘導されるオートファジーに特異的であることが示唆された、(3)NLRP4とBeclin1の相互作用量は、GAS感染に応じて一過性に減少することが観察された、との知見が得られた。上記に示したように、申請内容に記載した目的に沿って、計画通りに進展している。また、申請課題から派生した新規プロジェクトに関しても研究が進んでおり、本研究は順調に進展していると認識している。平成23年度の研究結果から、上記1から3までは検討済みであるため、平成24年度は計画通り、NLRP

4とインフラマソーム形成の関連性に焦点を当て解析を進める。具体的に、インフラマソーム構成分子とNLRP4の分子間相互作用や、IL-1beta産生におけるNLRP4の関与などを検討していく。また、更なる自然免疫シグナル解明に向けて、新たなプロジェクトの発案も視野に入れて研究を進める。平成24年度は、平成23年度と同様、多くは消耗品の購入に使用する。また、研究内容を公示するための、論文投稿費、そして学会発表の旅費に充てる。本研究室では免疫および分子生物学に関する研究を長年にわたって行ってきており、既に種々の設備・機器および手法が確立されている。本研究で行う予定の実験手法については、本研究室で既に行われているものが多く、したがって設備備品については新しいものを購入する必要はないと考えている。
電流及びスピン密度汎関数法に基づく相対論的バンド理論の構築とf電子系への適用

従来の電子エネルギーバンド理論においては、電子の軌道運動の影響は無視されてきた。このような近似は、固体内の電子状態が自由電子に近い状態にあるときには許されるが、希土類化合物やアクチニド化合物におけるf電子のように、局在に近い状態にある電子の軌道角運動量は決して小さくはない。本研究はf電子系の電子構造に対する軌道電流の影響を調べることを目的とし、電磁場の中におかれた相互作用する電子系に対する半古典的な量子電磁力学のハミルトニアンから出発し、相対論的電流スピン密度汎関数理論を構築した。この新しい理論の枠組の中では、基底状態および基底状態エネルギーは電荷密度と磁気密度により一意的に決まる。一般化されたHohenberg-Kohn定理が成立することを示した。変分原理に基づき、これらの基本変数に関して基底状態エネルギーを最小化することにより、新しいKohn-Sham-Dirac型のセルフコンシステント一電子方程式を導いた。この一電子方程式の有効性を確かめるために、孤立した希土類3価イオンの電子状態の計算に適用した。セルフコンシステントに決められた内部磁場により、磁気方位量子数による縮退は完全に解ける。すべての占有準位について加えて得られたスピン磁気モーメントと軌道角運動量磁気モーメントはHund則をよく再現する。この結果は、Hund則にはスピン分極効果とスピン軌道相互作用が本質的に重要な役割を果たしていることを示す。定量的に言えば、軌道電流の効果はHund則にわずかな影響しか及ぼさないが、各エネルギー準位のエネルギーをかなり修正する。この結果は、重い電子系のf電子系化合物では軌道電流が電子構造に及ぼす影響は無視できないことを示している。本研究は、電子構造に対する軌道電流の影響を調べる上での出発点になるものである。f電子系の電子構造に対する軌道電流の影響を調べることを目的とし、電磁場の中におかれた相互作用する電子系に対する半古典的な量子電磁力学のハミルトニアンから出発し、相対論的電流スピン密度汎関数理論を構築した。一般化されたHohenberg-Kohn定理が成立することを示すことができる。セルフコンシステントにきめられた内部磁場により、磁気方位量子数による縮退は完全に解ける。この結果は、Hund則にはスピン分極効果とスピン軌道相互作用が本質的に重要な役割を果たしていることを示している。定量的に言えば、軌道電流の効果はHund則にわずかな影響しか及ぼさないが、各エネルギー準位のエネルギーをかなり修正することが明らかにされた。この結果は、この方程式を結晶内電子状態の計算に適用したとき、軌道電流が電子構造に及ぼす影響は無視できないことを示している。フェルミオロジーの観点からも、軌道電流のフェルミ面に対する影響を調べることは興味深い。特に、UPt_3のフェルミ面については未だ未知な面が多いが、この物質ではスピン軌道相互作用が大きく、軌道電流の影響も大きいことが予想されるので、軌道電流の効果を考慮に入れてバンド計算を行うことは今後の重要な課題と考えている。従来の固体電子論、特に電子エネルギーバンド理論においては、電子の軌道運動の影響は無視されてきた。

このような近似は、固体内の電子状態が自由電子に近い状態にあるときには許されるが、希土類化合物やアクチニド化合物におけるf電子のように、局在に近い状態にある電子の軌道角運動量は決して小さくはない。本研究はf電子系の電子構造に対する軌道電流の影響を調べることを目的とし、昨年度からの成果として、電磁場の中におがれた相互作用する電子系に対する半古典的な量子電磁力学のハミルトニアンから出発し、相対論的電流スピン密度汎関数理論を構築することに成功した。この結果は、電子構造に対する軌道電流の影響を調べる上での出発点になるものである。この新しい理論の枠組の中では、基底状態および基底状態エネルギーは電荷密度と磁気密度により一意的に決まる。一般化されたHohenberg-Kohn定理が成立することを示すことができる。変分原理に基づき、これらの基本変数に関して基底状態エネルギーを最小化することにより、新しい一電子方程式を導いた。その有効性を確かめるために、孤立した希土類3価イオンの電子状態の計算に適用した。スピン磁気モーメントと軌道角運動量磁気モーメントはHund則をよく再現する。従来の相対論的APW法により、ウラン化合物UCの電子構造の再検討を試みた。これまでのバンド計算では、化合物におけるAPW球の半径の選び方に指針はなかったが、この新しいバンド計算では、与えられた格子定数に対してUとCのAPW球の半径を全エネルギーが最小になるという条件から決定し、さらに格子定数を変えて全エネルギーが最小となる値を求めた。このようにして決定された電子エネルギーバンド構造から導かれた電子及びホールのフェルミ面は実験結果よりも少し大きいが、この不一致は局所密度近似に特有な性質である。本年度、大阪大学及び日本原子力研究所の実験グループと協力し、5f電子系の標準物質と考えられる常磁性炭化ウランUCの電子構造とフェルミ面の性質を解明した。フェルミ面は、炭素のpバンド内のホール面と、Uのfバンド内の電子面から成ることは以前から予想されていた。電子面の全貌を確認することが今回の主要な課題である。最近、両実験グループは試料育成及び測定技術の分野で格段の進歩をとげた。育成された試料の残留抵抗率は0.17μΩcm、残留抵抗比は230であり、過去国内外でつくられたどの試料よりも高い純度を保持している。測定装置の改善により、ド・ハース-ファン・アルフェン(dHvA)効果の測定は30mKの極低温及び17テスラの強磁場のもとで測定された。測定の結果、電子面に対して理論的に予測されたすべてのdHvA効果の周波数ブランチが観測された。さらに、その最大周波数ブランチに対し自由電子質量の15倍のサイクロトロン有効質量が<100>磁場方向で観測された。この結果はバンド質量の約4倍である。これまで化合物に対するマフィンティン(MT)近似によるバンド計算では、MT球の半径の選び方に明確な指針はなかった。従来、交換・相関ポテンシャルは交換・相関エネルギーの密度関数による変分として決定されていたが、これをポテンシャル関数による変分とみなして定式化し直した。
酸化的ストレス時におけるシトクロムP450とストレス応答タンパク質の変動

本研究は、酸化的ストレス時での肝臓シトクロムP450(CYP)変動とその変動に影響を与える防御的ストレス応答としてのヘムオキシゲナーゼ(HO-1)誘導におけるサイトカインの役割を解明する目的で各種サイトカイン遺伝子ノックアウト(KO)動物を用い検討したものである。本研究課題は順調に進行し、研究実績として以下のようなことを中心に解明が進んだ。本研究により、LPSによるHO-1遺伝子の発現誘導は、TNFαが重要な役割を担っており、その発現には、転写因子AP-1が必要であるが、その活性化に関与するMAPKを検索した結果、JNKやp38を介して伝達していることが明らかになった。一方、コカインによるHO-1誘導はTNFαだけでなくIL-6も重要な役割を果たすことが明らかとなった。さらにBCGによるCYP3A遺伝子の調節にはIL-6が重要であることを明らかにし、フェノバルビタールによるCYP2Bの発現調節においてもIL-6が関与することが明らかとなった。さらにCYPのダウンレギュレーションにおいてもLPSとBCGでは大きく相違し、LPSはIL-6KOでもCYPを減少させるが、BCGでは認められず、この差はシグナル伝達系におけるSTAT系のリン酸化の差異が一部関与することが示唆された。以上のように、サイトカインKOマウスを用いることにより、in vivoにおける個々のサイトカインの役割解明が可能であることが判明し、遺伝子KO動物を用いる研究の意義が益々大きくなってきている。本研究課題を通して、今後さらに薬物応答性としての酵素誘導や防御系応答を包括的に解析し、さらに情報伝達系を解明することにより、個々のサイトカインの果たしているin vivoでの役割解明に期待がもたれる。生体には酸化的ストレスに対する防御機構として、HO-1の誘導、またはCYPの下方制御が行なわれている。これらの生体内応答はサイトカインによる制御を受けているとされるが、ネットワークを形成するサイトカイン個々の機能を明確にすることは容易でない。本研究は個々のサイトカインの酸化的ストレス応答における役割を解明する目的で、IL-1α/β、IL-6およびTNFαの各KOマウスを用い、HO-1およびCYPの変動を指標に解析を行なった。その結果、LPSによるHO-1遺伝子の発現にはTNFαがBCGによるCYP遺伝子の発現にはIL-6が重要な役割を担っていることが明らかになり、更にこれらサイトカインのシグナル伝達を検討した。LPSによるHO-1遺伝子の発現は、転写因子AP-1の活性化が必要とされることから、AP-1を活性化させるMAPK系の活性化を検討した結果、TNFαKOマウスでは、Wildマウスに比較しp38およびJNKの活性化が明らかに減弱していた。以上の結果より、HO-1遺伝子発現にはTNFαが重要な働きを担い、そのシグナルはp38やJNKを介して伝達されていることが明らかとなった。一方、BCG投与によるCYPダウンレギュレーションはIL-6KOマウスでは起きなかったが、LPS投与ではIL-6KOマウスにおいてもCYPダウンレギュレーションが引き起こされた。そこで、IL-6にシグナル伝達に重要なSTAT1/3の活性化を検討したところ、IL-6KOマウスへのBCG投与によるSTAT1/3のリン酸化は認められなかった。しかし、LPS投与では、STAT3のリン酸化は引き起こされなかったが、弱いながらもSTAT1のリン酸化を上昇させていることが明らかとなった。以上の結果より、BCGとLPSのCYPダウンレギュレーション効果の違いはSTAT1リン酸化が一部関与していることが明らかとなった。本研究は、生体が酸化的ストレスを受けた時の肝臓のシトクロムP450(CYP)変動とその変動に影響を与える防御的ストレス応答としてのヘムオキシゲナーゼ(HO-1)誘導を中心に、正常動物と遺伝子ノックアウト(KO)動物とを比較し、その役割を明らかにすることを目的としたものである。

本研究課題は順調に進行し、研究実績として以下のようなことを中心に解明が進んだ。本研究により、リポポリサッカライド(LPS)やクルタチオン低下剤など各種の酸化的ストレスにより、ストレス応答たんぱく質で、ヘム分解の律速酵素であるHO-1遺伝子発現が顕著に誘導されることを明らかにした。また各種サイトカインKOマウスを用いた研究により、LPSによるHO-1遺伝子の発現誘導は、TNFαが重要な役割を担っていること、さらにBCGによるCYP遺伝子の調節にはIL-6が重要であることを明らかにした。またLPSによるHO-1遺伝子発現には、転写因子AP-1が必要であるが、その活性化に関与するMAPKを検索した結果、JNKやp38を介して伝達していることが明らかになった。さらにCYPのダウンレギュレーションにおいてもLPSとBCGでは大きく相違し、LPSはIL-6KOでもCYPを減少させるが、BCGでは認められず、この差はシグナル伝達系におけるSTAT系のリン酸化の差異をが一部関与することが示唆された。以上のように、サイトカインKOマウスを用いることにより、in vivoにおける個々のサイトカインの役割解明が可能であることが判明し、遺伝子KO動物を用いる研究の意義が益々大きくなってきている。本研究課題を通して、今後さらに薬物応答性としての酵素誘導や防御系応答を包括的に解析し、さらに情報伝達系を解明することにより、個々のサイトカインの果たしているin vivoでの役割解明に期待がもたれる。