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哺乳類由来のD型アミノ酸合成酵素

分泌器官や内分泌器官には、高濃度のD型アスパラギン酸(D-Asp)が存在している。D-Aspは、ホルモンの合成・分泌に関与することが徐々に明らかになっている。D-Aspが哺乳類体内で合成されるかどうかは最近まで明らかではなかったが、我々は、哺乳類由来の培養細胞株を用いてD-Aspが生合成されることを証明した。しかし、その合成酵素の実体は不明のままであり、詳しい解析が期待されている。細菌、古細菌や下等動物では、D-AspはL-AspからAspラセマーゼによって合成されると考えられている。哺乳類でも、D-AspはAspラセマーゼによって作られると考えられるが、活性が微弱なために活性測定の試みは上手くいっていなかった。我々がこれまで活性測定に用いてきたHPLC法は、アミノ酸を蛍光誘導体に変換して検出するため比較的感度の良い方法であるが、試料の調製時に損失が避けられないという欠点を持っていた。今回我々は、その点を改良し、さらに新規な蛍光誘導体化試薬を創製して、Aspラセマーゼ活性の高感度自動化分析装置を開発した。新規な蛍光誘導体化試薬として、N-(tert-butylthiocarbamoyl)-L-cysteine ethyl ester(BTCCと命名)を創製した。D-Aspは、この試薬およびo-phthalaldehyde(OPA)と室温で瞬時に反応して蛍光誘導体を生成する。この蛍光誘導体を逆相HPLCにより分離し、蛍光検出するシステムを構築した。その際、試薬は室温で瞬時に反応することから、蛍光誘導体化操作は試薬を混合するだけで行うことができ、自動化が可能であった。また、HPLCにおける再現性や確実性を向上させるためにisocratic溶出法で分析できるように、BTCCの化学的性質が工夫されている。Aspラセマーゼ反応によって生成したD-Aspを試料として、必要な試薬を自動で混合してHPLCに注入する高感度自動化分析システムを構築した。我々は古細菌Thermoplasma acidophilumの菌体中にAspラセマーゼ活性を発見しているが、この活性は非常に微弱である。開発したシステムを用いて、このAspラセマーゼの活性測定を行ったところ、十分な感度をもって検出することができた。したがって本法は、Aspラセマーゼの活性測定法として高感度な方法であり、かつ簡便な方法として多数の試料の測定に適した方法と考えられる。哺乳類の神経内分泌組織や内分泌組織には、高濃度のD型アスパラギン酸(D-Asp)が含まれており、ホルモンの合成・分泌に関与することが徐々に明らかになっている。このようなD-Aspが哺乳類体内で合成されているかどうかは最近まで明らかではなかったが、我々は、哺乳類由来の培養細胞株であるpheochromocytoma(PC)12細胞を用いてD-Aspが生合成されることを証明した。今回我々は、このPC12細胞内で生成したD-Aspが、細胞外へ分泌される経路として、性質の異なる2つの経路が存在することを明らかにした。一つ目の経路は、細胞外Ca^<2+>に依存しており、特に刺激のない条件下でも恒常的にD-Aspを分泌する経路である。SNARE
皮膚拡散モデル解析に基づく新規経皮吸収促進法の設計理論の確立

近年、コントロールドリリース型DDSとして経皮治療システムへの評価の高まりと共に、多くの難吸収性薬物の吸収促進を目的として、経皮吸収促進剤やプロドラッグ修飾法の開発などのアプローチが、活発に進められている。しかし、これらの大部分は試行錯誤的に進められ、吸収とその促進を総合的に議論するための学問を欠いていたため、促進効果も不十分であり、in vitroとin vivo間の違いや種差あるいは基礎検討から処方設計への展開時のギャップ等、製剤設計上の隘路の克服を可能とする設計理論も構築されていない。本研究では以上を背景に、皮膚拡散モデル解析を基盤とし、プロドラッグ化修飾と、皮膚透過特性を修飾する吸収促進法を合理的に組み合わせることによって成立する新しい吸収促進法の設計理論を構築することを試みた。研究の第一段階として、各種作用機作を有する吸収促進剤と、物理化学的特性の異なるプロドラッグを組み合わせた際の吸収動態をコンピュータシミュレーションにより予測した。次に、既に確立している皮膚拡散モデルに基づき、吸収促進が可能であると予想される水溶性薬物acyclovirを対象に合計7種の脂肪酸エステル型プロドラッグを合成し、厳密な理論解析に耐え得る精度の良いデータが得られる系として確立したflow-through型拡散セルを用いて経皮吸収実験を行ったところ、吸収促進剤との併用により吸収が有意に改善されることを見い出した。また得られたデータを、プロドラッグの皮膚透過性を親薬物への変換を含めて解析するため新たに構築した代謝過程を組み込んだ皮膚拡散モデルを用いて解析した結果、プロドラッグの脂溶性、親薬物への変換効率、吸収促進剤の効果を総合的に明らかにすることができた。以上本研究では、プロドラッグ化修飾と吸収促進法との合理的な組み合わせにより薬物の皮膚透過性改善法を理論的に構築するための指針を確立した。近年、コントロールドリリース型DDSとして経皮治療システム(TTS)への評価の高まりと共に、多くの難吸収性薬物の吸収促進を目的として、経皮吸収促進剤やプロドラッグ修飾法の開発などのアプローチが、基礎および応用の両面から活発に進められている。本研究では以上を背景に、皮膚拡散モデル解析を基礎とし、プロドラッグ化修飾と、皮膚透過特性を修飾する吸収促進法を合理的に組み合わせることによって成立する新しい吸収促進法の設計理論を構築することを試みた。引き続き、既に確立している皮膚拡散モデルに基づき、現実的に吸収促進が可能であると予想されるacyclovirの8種々の脂肪酸エステルを合成した。得られたプロドラッグの溶解度、融点などの物性を測定し、各種製剤中でのプロドラッグの活動度を予測することができた。構築された拡散モデルの条件を再現し、厳密な理論解析に耐え得る精度の良いデータが得られる実験系として、flow-through型拡散セルを用いた系を確立することができた。確立した経皮吸収実験システムを用いて、経皮吸収実験を行い、プロドラッグ化の効果を明らかにすると共に、吸収促進剤との併用によりプロドラッグの吸収が有意に改善されることを見い出した。

しかし、これらの大部分は試行錯誤的に進められ、吸収とその促進を総合的に議論するための学問を欠いていたため、促進効果も不十分であり、in vitroとin vivo間の違いや種差あるいは基礎検討から処方設計への展開時のギャップ等、製剤設計上の隘路の克服を可能とする設計理論も構築されていない。そこで本研究では、皮膚拡散モデル解析を基盤とし、プロドラッグ化修飾と、皮膚透過特性を修飾する吸収促進法を合理的に組み合わせることによって成立する新しい吸収促進法の設計理論を構築することを試みた。昨年度は、既に確立している皮膚拡散モデルにより吸収促進が可能と予想されたacyclovirを対象に種々の脂肪酸エステル型のプロドラッグを合成し、プロドラッグ化の効果を明らかにすると共に、吸収促進剤との併用によりプロドラッグの吸収が有意に改善されることを見い出した。そこで本年度は、プロドラッグから親薬物への変換速度の影響を明らかにする目的で、同程度の脂溶性を持ちながらエステラーゼによる代謝速度の異なる3種のプロドラッグを新たに合成し、単独あるいは吸収促進剤併用時の皮膚透過性を検討した。さらに、代謝過程を組み込んだ新規皮膚拡散モデルを構築し、得られたデータを解析した結果、変換速度の速いプロドラッグほど吸収促進剤により皮膚透過性が改善されることが明らかとなった。以上、本研究では、プロドラッグ化修飾と吸収促進法との組み合わせによる薬物の皮膚透過性改善のアプローチを合理的に設計するための指針を確立することができた。
3Dアニメーションを中心としたCG表現指導法の開発

本研究は,美術教育教材としての3Dアニメーション制作を普通教育課程において実施可能とするための基礎研究の一部である。その成果として,3DCG表現の教育的機能・内容の整理,2DCGに比した3DCG表現指導の困難さについての「学習方略のタイプ」「知覚の流動モデル」による理解,その困難さを克服する適切な指導法としてのPBLチュートリアルを援用したピア・サポートの設計および,その実践による効果,等を示した。本研究は,小学校高学年の図画工作科および中学校の美術科などの普通教育の課程における正課の授業において,3Dアニメーションの制作を教材として広く実施可能とするための基礎研究である。その方法として,PBLチュートリアルに着目し,それを実現するために,指導を受けた経験のある上級生などをチュータとすることを想定し,いわゆる学習者どうしのピア・サポート的なチューティングの導入を目指すことがその具体的な目的である。その目的に沿って,本年度は,以下を実施した。・PBLチュートリアルおよび,ピア・サポートの概念と,その関連事項を明らかにし,3Dアニメーション制作の教育活動との関係を考察した。その結果,表現技術の指導のあり方にっいての指標を得た。・従来からのシステムを引き継ぎ,教育必要な教育環境システム(ハードウエア・ソフトウエア・指導法)を改良した。・学習者の同僚を(学習経験者)をチュータとした実験授業を行い,ピア・サポート的なチューティングに必要なデータを収集した。特に「3Dアニメーション制作のチューティングに必要な能力,知識」「チューティングのコーディネート方法」「制作の指導を通してのチュータ養成の方法」等を明らかにするための指標を得た。これらの内容は,途中経過として,美術教育学(美術科教育学会誌)第29号に論文として投稿し掲載された。また,群馬大学で開催された第30回美術科教育学会全国大会にて,平成20年3月30に口頭にて発表した。・実写映像の視点移動と3DCG映像の視点移動とを相対的に同一の軌跡上に同期させて得られる錯視的効果に着目し,「知覚の流動モデル」にて,その説得力の理由を説明し,3DCG表現指導が,視覚認知一般性の深部にも及ぶリテラシー獲得につながることを示した。・上の知見をもとに,空間認知を助けるチュートリアル教材を用いた指導法を企画・実施した。・昨年度に引き続き,当該の教育活動に必要な環境システム(ハードウエア・ソフトウエア・指導法)を改良し構築した。・昨年度に引き続き,上のシステムを用いて,学習者の同僚を(学習経験者)をチュータとした実験授業を行い,ピア・サポート的なチューティングに必要なデータを収集した。特に学習者の同士のサポート関係の履歴を記録・分析し,実際のチューティングをコーディネートするための指標を得た。これらの内容は,途中経過として,美術教育学(美術科教育学会誌)第30号に論文として投稿し掲載された。また,佐賀大学で開催された第31回美術科教育学会全国大会にて,平成21年3月29に口頭にて発表した。・10名の中学生を対象者としたピア・サポートの援用による授業形式の3DCG表現学習活動を実施し,その活動の履歴情報から,その指導法としての有効性を検証した。・これまでの一連の議論を総合的に考察することで,通常の学校教育現場を想定した3DCG表現指導法のプロトタイプを示した。これらの内容は,途中経過として,美術教育学(美術科教育学会誌)第31号に論文として投稿し掲載された。また,せんだいメディアテーク(宮城教育大学運営)で開催された第32回美術科教育学会全国大会にて,平成22年3月27に口頭にて発表した。この三年間の研究成果を主に学会誌に投稿した論文内容の統合したものとして,研究成果報告書を作成した。これをPDFファイルにし,付属の動画データを同梱したものをCD-ROMとして400枚余りプレスした。そのうちの約300枚を金沢大学にて3月25-26日に開催された第29回美術科教育学会全国大会にて参加者に配布した。
若手看護系大学教員のキャリア開発を支援するためのキャリアパスモデルの構築

本研究の目的は、看護系大学教員の質的・量的充実に貢献するために、とくにライフステージの影響を受けやすく、将来ビジョンが描きにくい若手看護系大学教員に焦点を当て、1)キャリアの実態について明らかにする、2)キャリアの実態に関する国際的な動向を明らかにする、以上に基づいて、3)キャリアパスモデル試案を開発する、4)その試案に対する評価を得て、キャリアパスモデルを構築する、ことである。研究計画は目的に則して、1)国内の若手看護系大学教員のキャリアの実態に関する質的・量的調査、2)海外での実態調査、3)キャリアパスモデル試案の作成、4)キャリアパスモデルの評価の四段階で構成している。平成30年度は平成29年度に引き続き、キャリアの実態を明らかにするための質的研究として、若手看護系大学教員を対象に、大学教員としての教育・研究におけるキャリア開発の実際と困難やライフイベントの影響についてキャリアパスに則して半構造化面接を実施した。最終的に22名の協力を得ることができ、教育活動や研究活動に伴う困難については内容分析を用いて分析を行った。若手教員では、教育活動や研究活動について経験不足であるために、それぞれに多くの時間を要し、教育活動と研究活動の両立に困難を抱いていた。キャリアパスについては複線径路・等至性モデル(TEM)分析にヒントを得て分析を進めた。また、全国の看護系大学における教員の充足状況について統計データに基づいて分析を行った。令和元年度にはこれらの成果について国内外での研究発表や交流集会を持ち意見交換を行う。さらに、国際的な動向調査のための訪問先との調整を行い、中国を訪問した。タイには令和元年度に訪問をする予定である。アメリカは広大で地域差も大きいことから、看護教員の動向に関する複数の報告書の分析を教示されたため、それらの資料の分析を行った。現在、本研究の第一段階である看護系大学における若手看護教員のキャリアの実態について質的研究の成果をまとめているところであり、進捗状況としては若干遅れている。これは、若手看護系大学教員のインタビュー可能な時期が限定され、インタビューが年度末から新年度の前期に集中したことや、大学の設置主体や専門領域の偏りを調整するために調査期間が長期化したことがあげられる。さらに、研究の目的に合致した分析手法として、内容分析だけではなく、軌跡を明らかにする手法であるTEM分析に着目し。TEM分析を取り入れて対象者のキャリアパスについて1例ずつ丁寧に分析を行うこととしたため、予定よりも分析に時間を要している。これらの分析に時間を要したが、これらの分析結果に基づいて若手看護系教員のキャリア開発上の課題について、全国規模の調査の実施に向け、調査用紙の作成を計画している。海外の実態については、現地調査を行ったのは中国だけであるが、タイの訪問についても内諾を得て調整をすすめており、アメリカの現状についての資料分析も進んでいる。これらもキャリアパスモデル開発への有用な示唆が得られるものである。このように研究の進捗状況としては、若干遅れているが大きな問題なく進行している。これまでに得られた研究成果に基づき、若手看護系教員のキャリア開発上の課題について、全国規模の調査の実施に向け、調査用紙の作成を計画している。年度内に調査を完了する予定である。また、研究成果を学会で発表するとともに、交流集会という形式で研究者に開示して意見交換を行い、キャリアパス開発への示唆を得る予定である。アメリカの看護教員不足とその対策に関する資料分析や中国の現地調査の結果についても論文化を進めている。海外の実態調査としてはタイを訪問する予定である。本研究の目的は、看護系大学教員の質的・量的充実に貢献するために、とくにライフステージの影響を受けやすく、将来ビジョンが描きにくい若手看護系大学教員を対象とし、1)キャリアの実態について明らかにする、2)キャリアの実態に関する国際的な動向を明らかにする、以上に基づいて、3)キャリアパスモデル試案を開発する、4)その試案に対する評価を得て、キャリアパスモデルを構築する、ことである。平成29年度は第一段階であるキャリアの実態を明らかにするための質的研究として、若手看護系大学教員8名を対象に、大学教員としての教育・研究におけるキャリア開発の実際と困難、課題、およびキャリア開発におけるライフイベントの影響についてキャリアパスに則して半構造化面接を実施した。大学教員としてのキャリア開発には上司の支援が影響していること、学位の取得がキャリアパス上、重要なターニングポイントであることがが窺えた。データの飽和をめざし、平成30年度もインタビューを継続している。30年度度前期までに分析を終了し、国内外での発表と全国調査のための調査票の作成に着手する予定である。また、29年度は看護系大学の教員不足について、その実態を把握するために全国の看護系大学の教員数を調査し、職位ごとに整理した。今後、設置主体・地域性等による傾向の分析を実施する予定である。さらに、第二段階の国際的な動向調査のための訪問先との調整等、30年度中の調査の準備を行っている。現在、本研究の第一段階である看護系大学における若手看護教員のキャリアの実態について質的研究の実施途中であり、進捗状況としては若干遅れている。これは、若手看護系大学教員は実習指導が主であり、インタビュー可能な時期が限定され、インタビューが年度末に集中したためである。

まず、研究計画に先立ち、大学教員のキャリア開発・キャリアパス、看護師のキャリア開発・キャリアパスについて文献検討を実施した。これをもとに「現在までのキャリアパス」「教育上のキャリア開発の実際と困難」「研究上のキャリア開発の実際と困難」「キャリア開発におけるライフイベントの影響」「キャリア上の目標」をインタビュー項目を設定した。そして、29年度は8名を対象にインタビューを実施し、その中で大学教員としてのキャリア開発には上司の支援と学位の取得が影響していることが窺えた。しかし、看護の専門領域に偏りがあったため、30年度にもインタビューを継続しているが、前期までに終了し、量的研究に向けた課題を整理する予定である。また、看護系大学の教員不足について、その実態を把握するために全国の看護系大学の教員数を調査し、職位ごとに整理した。このように研究の進捗状況としては、若干遅れているが大きな問題なく進行している。本研究の目的は、看護系大学教員の質的・量的充実に貢献するために、とくにライフステージの影響を受けやすく、将来ビジョンが描きにくい若手看護系大学教員に焦点を当て、1)キャリアの実態について明らかにする、2)キャリアの実態に関する国際的な動向を明らかにする、以上に基づいて、3)キャリアパスモデル試案を開発する、4)その試案に対する評価を得て、キャリアパスモデルを構築する、ことである。研究計画は目的に則して、1)国内の若手看護系大学教員のキャリアの実態に関する質的・量的調査、2)海外での実態調査、3)キャリアパスモデル試案の作成、4)キャリアパスモデルの評価の四段階で構成している。平成30年度は平成29年度に引き続き、キャリアの実態を明らかにするための質的研究として、若手看護系大学教員を対象に、大学教員としての教育・研究におけるキャリア開発の実際と困難やライフイベントの影響についてキャリアパスに則して半構造化面接を実施した。最終的に22名の協力を得ることができ、教育活動や研究活動に伴う困難については内容分析を用いて分析を行った。若手教員では、教育活動や研究活動について経験不足であるために、それぞれに多くの時間を要し、教育活動と研究活動の両立に困難を抱いていた。キャリアパスについては複線径路・等至性モデル(TEM)分析にヒントを得て分析を進めた。また、全国の看護系大学における教員の充足状況について統計データに基づいて分析を行った。令和元年度にはこれらの成果について国内外での研究発表や交流集会を持ち意見交換を行う。さらに、国際的な動向調査のための訪問先との調整を行い、中国を訪問した。タイには令和元年度に訪問をする予定である。アメリカは広大で地域差も大きいことから、看護教員の動向に関する複数の報告書の分析を教示されたため、それらの資料の分析を行った。現在、本研究の第一段階である看護系大学における若手看護教員のキャリアの実態について質的研究の成果をまとめているところであり、進捗状況としては若干遅れている。
新しい非線形分光計測法による界面超高速ダイナミクスの研究

受け入れ研究室である理研・田原分子分光研究室が開発したヘテロダイン検出マルチプレクス振動和周波分光(HD-VSFG)を用いて研究を行った。VSFG分光法では、赤外光(振動数ω_1)と可視光(振動数ω_2)を界面に照射し、界面から発する和周波信号(振動数ω_1+ω_2)を検出する。この和周波信号は、赤外光が界面分子の振動準位に共鳴すると強度が増大するので、これを利用して界面選択的な振動スペクトルを測定することが出来る。われわれはこのVSFG測定において、発生する和周波信号を参照光と位相関係を確定して混合することによってヘテロダイン検出(HD-VSFG)測定を実現し、二次非線形感受率の自乗(|χ^<(2)>|)ではなく、二次の非線形感受率そのもの(χ^<(2)>)の実部と虚部のスペクトルの測定を可能にした。脂質膜-水界面は生体膜のモデル系であり、そこにおける水の状態を明らかにすることは生体膜界面の性質を知るうえできわめて重要である。そこでまず、Mondal博士は空気水界面に荷電をもつヘッドグループを有する脂質の単分子膜を作成し、脂質/水界面の振動スペクトル(χ^<(2)>の虚部スペクトル)の測定を行った。その結果、荷電の正負によって界面水のOH伸縮振動のバンドの正負が逆転すること、すなわち界面の水分子の平均的絶対配向が逆転することがわかった。この発見を論文として発表するとともに、さらに複雑なヘッドグループを持つ脂質び脂質/水界面の研究に進み、その振動スペクトルをHD-VSFG法で測定した。これによって双性イオン性ヘッドグループを持つ脂質と水の界面における水分子は複雑かつ特徴的な構造をとっていることがわかった。Mondal博士はフェムト秒時間分解吸収分光を用いた溶液中の光化学反応研究には豊富な研究経験をもつが、界面研究や非線形分光に関する研究の経験はない。そこで、受け入れ研究室である理研・田原分子分光研究室が開発したヘテロダイン検出マルチプレクス振動和周波分光(HD-VSFG)法を用いて、非線形分光の装置と測定に関して習熟するとともに、これを用いた新しい研究をスタートした。われわれは、このVSFG測定において、発生する和周波信号を参照光と位相関係を確定して混合することによって、ヘテロダイン検出(HD-VSFG)測定を実現している。このHD-VSFG測定によって、二次の非線形感受率の自乗(|χ^<(2)>|)ではなく、二次の非線形感受率そのもの(χ^<(2)>)の実部と虚部のスペクトルが測定できるようになった。マルチプレックス測定によって、χ^(2)の実部と虚部のスペクトルを一度に測定することができるのは現在のところ世界でわれわれの研究室のみである。Mondal博士はまず、HD-VSFG測定の原理と装置を学び、自分自身で測定ができるように技術を磨いた。それをもとに、空気水界面に脂質の単分子膜を作成し、脂質膜-水界面の振動スペクトルの測定をスタートさせた。脂質膜-水界面は生体膜のモデル系であって、この研究は生体膜界面の水の状態を明らかにする重要な研究である。
温度敏感性ゲルを用いた細胞培養による細胞の応力応答の研究

本年度に行った研究とその成果を以下にまとめた。1)温度敏感性ゲルの相転移を利用した、細胞への応力印加の実験。:これについては、ゼラチンを混入したNIPAゲルを用いて、試行実験を行った。結果は、膨潤相から収縮相への変化に関しては目立った効果は見られなかった。現在、細胞に有効に力を印可する方法を開発すると共に、収縮相から膨潤相への転移の効果も調べつつある。2)化学架橋ゼラチンゲル基盤の合成:細胞接着性が良好で、しかも比較的自由に弾性的性質を調節出来る基盤として、ゼラチンとコハク化ゼラチンの混合物をカルボジイミドで架橋したゲルを開発した。ゼラチンとコハク化ゼラチンの混合比を変えることにより、弾性率が同じで、膨潤率が異なるゲルを得ることが出来た。3)ゲルの弾性率測定:電子天秤を利用してゲルに一定の加重を印可し、その変形から、ゲルの静的弾性率(ヤング率、合成率、および体積弾性率)を決定した。4)ゲル基盤の弾性的性質と培養細胞の形状との関係基盤(足場)と細胞との力学的相互作用が、細胞の機能、増殖能、形状などに与える影響を理解するためには、基盤の弾性的性質が細胞に与える効果を調べる必要がある。上記の方針で、弾性率を測定したゲルで、マウス3T3繊維芽細胞を培養してその形状を調べた結果、細胞形状は基盤の堅さに強く依存することが分かった。具体的には、基盤ゲルのヤング率が1x10^4[dyn/cm^2]以上の場合、7x10^31x10^4[dyn/cm^2]、7x10^3[dyn/cm^2]以下の場合のそれぞれに応じて、細胞の外径および増殖のパターンに顕著な相違が見られた。より詳しい解析を実行中である。生理温度に近い34°Cに体積相転移を持つ、N-イソプロピルアクリルアミド(NIPA)ゲルは、生体に対する毒性は持た無いので、細胞培養基盤の材料として利用できるが、そのままでは細胞接着性の点で不十分であることが明らかになった。そこで本年度は、このゲルに良好な細胞接着性を持たせること、およびゲルの堅さ(架橋密度)と細胞形状との関係を明らかにすること、の2点を中心として実験を行った。(1)良好な細胞接着性を持つNIPAゲルの開発:NIPA網目にコラーゲン(Co)又はゼラチン(Ge)を絡み合わせる方法と、逆にCo又はGeの網目にNIPAを導入する方法の2つを試みた。前者については、Co又はGe溶液中でNIPAを架橋する方法と、架橋したNIPA網目に後からCo又はGeを加える方法を共に行ったが、両者とも良好な細胞接着性を持つゲルが得られた。両方法を比較すると、基盤の透明性と調整の容易さの点で後者の方法が優れていることが分かった。(2)ゲル基盤の堅さと培養細胞の形状との関係:架橋密度を変化させることにより、上記の関係を調べた。標準的なNIPAゲルは、NIPA700mMに対して架橋材BIS8.6mMであるが、この組成の場合には、細胞形状はシャーレ上で培養した場合とほぼ同じ多極性平板状であった。架橋密度を少なくするにつれて細胞形状はコラーゲンゲル上で培養した場合と同じ紡錘形に近づいた。BIS10mM付近からその効果が現れる。一方、ゼラチンに永久架橋を入れたゲルでも、同様な関係を調べた。その結果、架橋密度を減少させるに伴って、細胞は紡錘形になる点はNIPA網目と同様であるが、それと同時に細胞が直線上に連なって増殖するという、NIPAには見られない現象が見られた。以上の結果の分子的なメカニズムを調べると共に、温度変化に伴うゲルの膨潤・収縮を利用して細胞に力を印加する事が今後の課題である。具体的には、基盤ゲルのヤング率が1x10^4[dyn/cm^2]

以上の場合、7x10^31x10^4[dyn/cm^2]、7x10^3[dyn/cm^2]以下の場合のそれぞれに応じて、細胞の外径および増殖のパターンに顕著な相違が見られた。より詳しい解析を実行中である。
ヒートアイランド現象の緩和に有効な表面凹凸再帰構造を持つ舗装体の開発

本研究では,入射してきた光を反転させて入射方向に反射するという光学特性(再帰反射性)を,既存のプリズム反射方式や球状レンズ(ガラスビーズ)集光方式ではなく,表面凹凸再帰構造という全く新しい方式で実現する新素材を開発する。そして,その素材を道路舗装体として利用し,日中,道路面に降り注ぐ太陽光を,周辺に照り返すことなく,太陽の方向に反射させることで,夏場,道路面が高温化することを防ぎ,快適な道路周辺環境を構築するとともに,ヒートアイランド現象の緩和を通じて,都市型災害の抑制,及び,省エネルギー社会の実現を目指した。研究期間の最終年度となる本年度は,最適な表面凹凸再帰構造の探索を継続するとともに,実用化に向けた取り組みとして,施工された後の表面凹凸再帰反射体の屋外(現場)での反射特性の測定装置の開発を行った。そして,照射光源をハロゲンランプからLED光源に変え,さらに,測定装置の光学系を反射ミラーを使ったものから,光ファイバーを使ったものに置き換えることで小型・省電力化し,バッテリー駆動が可能で可搬しやすいものとした。その結果,従来の測定装置に比べて,明度の高い試料については測定精度は劣るものの,舗装道路で使われる低明度の試料面であれば,遜色ない測定精度が得られることを確認した。さらに,その研究過程で,日射反射率の算出の際に用いる基準太陽光の数値について,工業規格間に矛盾があることを突き止め,その要因を明らかにした。本研究では,入射した光を入射方向に反射する再帰反射という光学特性を,既存のプリズム反射方式や球状レンズ(ガラスビーズ)集光方式ではなく,表面凹凸再帰構造という全く新しい方式で実現する新素材を開発する。そして,その素材を道路舗装体として利用し,日中,道路面に降り注ぐ日射を周辺に照り返すことなく,天空方向に効率よく反射することで,夏場,道路面が高温化することを防ぎ,快適な道路周辺環境を構築するとともに,ヒートアイランド現象の緩和を通じて,都市型災害の抑制,及び,省エネルギー社会の実現することを目指す。研究初年度となる本年度は,主に,表面凹凸再帰の光学設計に必要となる光学シミュレーション技術の確立を行った。従来技術のプリズム反射方式,球状レンズ集光方式は,予測が容易な鏡面反射,及び,屈折の組み合わせであったため,光学設計が比較的簡便に行えた。しかし,表面凹凸再帰は,複雑な表面形状における相互拡散反射という予測が難しい光学現象によって再帰反射を実現しているため,定量的な設計には,光学シミュレーションの利用が欠かせない。本年度は,照明分野で定評のある光学シミュレーションソフトを,日射に含まれれる近赤外線領域まで拡張した上で,この現象を再現することを行い,シミュレーションで得られた予測値を,舗装体模型で得た実測値と比較した。その結果,両者は良好に一致し,光学シミュレーション技術の妥当性を検証することができた。初年度は,光学シミュレーションソフトの改良が主な課題であり,とくに技術的な困難もなく,計画通りに進んでいる。そして,その素材を道路舗装体として利用し,日中,道路面に降り注ぐ太陽光を,周辺に照り返すことなく,太陽の方向に反射させることで,夏場,道路面が高温化することを防ぎ,快適な道路周辺環境を構築するとともに,ヒートアイランド現象の緩和を通じて,都市型災害の抑制,及び,省エネルギー社会の実現を目指す。研究2年目となる本年度は,光学シミュレーション計算による最適な表面凹凸構造を探索するとともに,市販の道路舗装材と舗装塗料を組み合わせた表面凹凸構造を有する試験体を試作し,その反射特性を測定した。そして,既存のプリズム反射方式や球状レンズ集光方式の再帰反射体の反射特性と比較した。その結果,再帰反射率は低いものの,構造の崩れに強く堅牢性に優れているなどの表面凹凸方式の再帰反射材の特徴を明らかにした。これらの特徴は,通行時の視認性を阻害することのないように,過度に明度を高める必要がなく,また,車両等の通行により常に荷重がかかり変形しやすい環境で使われるという道路舗装体に適していることから,今後実用化に向けて研究を進めていきたい。さらに,実際の屋外道路面の再帰反射率測定に向けた準備として,試料面の拡散反射率及び鏡面反射率を非接触で測定する装置を試作した。とくに技術的な困難もなく,計画通りに進んでいる。

そして,照射光源をハロゲンランプからLED光源に変え,さらに,測定装置の光学系を反射ミラーを使ったものから,光ファイバーを使ったものに置き換えることで小型・省電力化し,バッテリー駆動が可能で可搬しやすいものとした。その結果,従来の測定装置に比べて,明度の高い試料については測定精度は劣るものの,舗装道路で使われる低明度の試料面であれば,遜色ない測定精度が得られることを確認した。さらに,その研究過程で,日射反射率の算出の際に用いる基準太陽光の数値について,工業規格間に矛盾があることを突き止め,その要因を明らかにした。研究2年目となる次年度は,確立した光学シミュレーション技術を用いて,再帰反射に最適な表面凹凸構造の探索を行う。研究最終年度となる次年度は,確立した光学シミュレーション技術を用いて,引き続き再帰反射に最適な表面凹凸構造の探索を行うとともに,屋外道路面の再帰反射率測定法を確立していく。
腹側被蓋野ド-パミンニュ-ロンにおけるDー1とDー2レセプタ-の役割および相互作用

ド-パミン含有ニュ-ロンに富む腹側被蓋野は側坐核などの辺縁系に投射する。腹側被蓋野にはド-パミンDー1受容体とDー2受容体の両者が存在するが、これらの機能的役割についてはなお不明な点が多い。本研究ではこの両受容体の機能と両者の相互関係を明らかにするために電気生理学的手法により研究を行った。麻酔ラットを用い、7極ガラス管にはり合せた微小ガラス管電極を用い腹側被蓋野ニュ-ロン活動を記録し、微小ガラス管にはド-パミンDー1アゴニストのSKF38393、Dー2アゴニストのキンピロ-ル,Dー1アンタゴニストのSCH23390,Dー2アンタゴニストのドンペリドン,オ-トレセプタ-アゴニストのOPCー4397などを充填し、これらを記録ニュ-ロンに電気泳動的に投与した。腹側被蓋野ニュ-ロンは側坐核を逆行性に刺激することによりド-パミンニュ-ロン(長潜時,スパイク持続が長い)と非ド-パミンニュ-ロン(短潜時,スパイク持続が短い)の2者が存在することが明かとなった。ド-パミンニュ-ロンはド-パミン,キンピロ-ル、OPCー4397により抑制され、この効果はドンペリドンにより拮抗された。一方、SKF38393はド-パミンニュ-ロンに影響を与えなかったが、キンピロ-ルと同時に投与した場合、キンピロ-ルによる抑制を増強した。また、ド-パミンニュ-ロンに対するド-パミンおよびキンピロ-ルによる抑制はSCH23390によって影響を受けなかった。非ド-パミンニュ-ロンはDー1およびDー2アゴニスト、あるいはド-パミンにより影響を受けなかった。これらの成績から、腹側被蓋野ド-パミンニュ-ロンはド-パミンによりDー2受容体を介して抑制を受け、Dー1受容体はこの作用を増強する方向に働いていると考えられる。一方、非ド-パミンニュ-ロンにはド-パミン受容体は存在しないと思われる。
蛋白質結晶の電子線回折データ収集システムの開発

本研究では、X線結晶解析にかからないような薄い結晶からでも蛋白質の構造決定を行えるよう、電子線回折用回転カメラとその関連技術の開発を目標とした。生物学的に重要な膜蛋白質では特に数層しかない結晶が得られることも多いからである。この目的のために、(i)既存の電子顕微鏡の大幅な改造、(ii)コンピューター制御ソフトウェアの開発、(iii)高傾斜角低温試料ホルダーの開発を行った。また、同時に、電子線回折パターンの指数付、反射点の積分強度の計算回折強度のスケーリングのためのソフトウェアの開発も行った。このような開発は、数層から成る結晶の場合、X線回折にはかからないことと、回折パターンは三次元結晶からのものとして扱わなければならないが既存のX線結晶解析用ソフトウェアでは処理できないためである。回転カメラの最初のものは、DCモーターと内蔵ロータリーエンコーダー、スロースキャンCCD検出器を用いて実現された。これは、大幅な改造を必要とするわけではないので、現代の電子顕微鏡の大部分のものに設置可能である。このシステムの性能を検定するため、カルシウムATPaseの超薄結晶に適用し、傾斜角±30°までのデータを収集した。本研究で開発した「最低電子線量電子線回折法」を用いることにより、100枚もの回折パターン(回転写真)を同じ結晶から得ることが出来るようになった。さらに精度を上げるために、第2のものを作製した。これはハイデンハイン社の高精度ロータリーエンコーダーとパルスモーターを用いたものである。ハードウェアは完成したが、制御ソフトウェアは未完成の部分を残している。しかしながら、これまでに得られた予備的結果は大変期待が持てるものである。超薄三次元結晶の電子線による解析技術の開発が本研究の目標であるが、具体的には、(1)電子線回折データ収集のためのハードウェア(特に回転カメラ)の開発、(2)電子線回折パターン(特に回転カメラを用いて得られた回転写真)の解析ソフトウェアの開発、(3)試料を大きく傾斜し得る低温試料ホルダーの開発が本年度の目標であった。(1)に関しては、これ迄の電子顕微鏡が電子線回折に最適化されてはいないこと、特に試料の傾斜(回転)機構がごく初歩的であり精度も悪いことの2点を改良するため日立製作所と協力し、高精度回転カメラの開発と本体の改造を行った。特に、傾斜(回転)角の読み取りに関してはこれ迄モーターの回転を読んでいたものを、試料ホルダーの回転ドラムを直読するようにしたため、0.001゚以下の読み取り精度が実現できた。また、電子線回折の最低電子線量化を実現するためのソフトウエアの開発・実装を行った。まだ駆動ソフトウェア等改良すべき点はあるが、近日中に完全なものとなろう。これによって電子顕微鏡は電子線回折計としての測定器の機能を備えたと言える。(2)に関しては、新しいアルゴリズムに基づくソフトウェアの開発が必要であり時間がかかっているが、三次元逆空間を回転写真から再構成できるようになり、各反射点の積分強度も求められるようになった。今後は複数の回折パターン間のscalingの手法を開発し、X線結晶解析と同等の解析を可能にする予定である。(3)に関しては、一方向に80゚迄傾斜できるクライオホルダーが一応完成した。次年度は以上の三つの開発項目を有機的に結合し、カルシウムATPaseの電子線結晶解析を行う予定である。予備的結果は国際電子顕微鏡学会で発表し生物系のみならず材料系の研究者からも非常に高い評価を得た。本研究の目的は、簡単に言えば、電子線を使ってX線結晶解析と同じことが出来るシステムを開発しようというものである。

そのメリットは、電子線とものとの相互作用が強いため、結晶がごく薄くてよいこと(電子線で問題なく扱えるのは0.102μmまで)、シンクロトロン並の短い時間でデータ収集が可能なことである。また、電子顕微鏡像から位相情報を直接得ることも可能である。そのためハードウェア(特に回転カメラ)とソフトウェア(特に回転写真法よる回折強度データの収集)の開発を進めてきた。昨年度までに回転カメラの読み取り部分は十分な精度(0.001°)が得られることがわかったが、実装してみると多くの問題点が明らかになった。回転の動力としてパルスモーターを使うことで位置の再現性は非常に良くできたが、今度はギア精度の問題が判明し、結局のところ装置の完成には時間がかかってしまった。一方、この結果、予備的装置で得たデータにはかなりの誤差が含まれることが判った。ソフトウェアの方は順調に進行し、多くのデータセットを統合して回折点の積分強度を求められるまでになった。これは予備的装置によるデータを使ったものであり、統計的にはまだ十分とは言い難いが、新開発のハードウェアを使えば著しい改善が期待できる。これらの結果に関しては1999年6月の「高分子の三次元電子顕微鏡法」に関するゴードン会議で招待講演として報告した。もう一つのテーマは高傾斜のクライオホルダーの開発であった。これはこれ迄のクライオホルダーが傾斜角45°程度しか許さなかったため回折データの収集不可能な領域が大きいという問題を解決するためのものである。実効傾斜角80°が可能なホルダーを開発したが、冷却に問題があり、現在試作3号機になっている。今少し時間が必要である。
天然有機化合物の生物活性発現機構解明に向けての総合的研究

1、分子内の近傍に複数のアルヒデト基を有するテルペイノドには多様な生理活性が見出だされている。本研究者は天然より大量に入手可能な(+)-ゲニピンを出発物質に用い、新しい生物活性物質の発掘を目標に、複数のアルデヒド官能基を有する多官能性イリドイド類や海産ジテルペン類の合成を行なってきたが、今回はその研究の一環として分子内に10π系ヘテロ芳香環を含む新規な海産ジテルペン、ハリチュナ-ルの合成を行なった。ハリチュナ-ルは抗ウイルス活性が報告されているほか抗腫瘍性や抗炎症活性が期待される化合物である(磯江)。2、紅藻ウラソゾより単離された8員環エーテルの(+)-ローレンシンの最初の合成を達成した。また、その成果をもとにして(+)-ローラレンの全合成を積極的に推し進めている(村井)。3、シガテラ中毒の毒素シガトキシンの抗体調整への合成的プロ-チとしてのヘプテン-プロテンコンジュゲートの合成に成功した(平間)。4、魚類の発する対捕食防御物質の活性発現機構の研究の一環としてミナミウシノシタの分泌液より魚毒成分として一連のステロイド配糖体類と疎水性ペプチドを単離した(橘)。5、ワラビの究極発癌物質の合成に成功するとともにそのDNA切断機構を解明した。また海洋動物アメフラシの抗腫瘍性物質アプリロニンAの単離、構造決定と合成に成功した。さらに、タツナミガイの細胞毒性物質ドリキュライドの構造決定ならびに合成にも成功している(山田)。6、複合型糖鎖の生物学的機能の合成化学的手法による解明には複雑な糖鎖の精密合成が必要であるが、そのためには糖鎖の選択的保護が重要である。簡便なα-選択的グリコシル化法を開発しそれを用いて複合糖質類の合成を行なった(楠本)。1、海洋生物由来活性天然物質に関する研究。ヒメシロレイシガイダマシ中腸腺から活性ポリアセチレンの単離、構造決定(越智)、Xenia属ソフトコーラルよりXenicane型ジテルペンの単離(上江田)、細胞毒性脂肪酸の溶液中のコンホメーションの決定(楠見)、ステロイド配糖体の膜透過性に及ぼすペプチドの相乗効果の定量(橘)ローラレン、オブツセニンの合成の最終段階(村井)カリウムイオンの膜透過性への合成アゲラシンBアナローグの効果を調べた(野老山)、シガトキシンAB環に対応するハプテンとそのアルブミンコンジュゲートの合成(平間)オカダ酸のFlexible Cavity構造の解明(上村)、トートマイシンの光学活性セグメントの合成を達成(磯部)。2、神経毒、神経伝達物質関連の有機化学。神経興奮作用物質アクロメリン酸Bの合成(白濱)、ベッコウバチ毒液より神経興奮活性なベンゾイルコリン、サリチルコリンの単離(奥村)、ヤエヤマシキミから神経突起伸展促進物質Tricycloillicinone,Bicycloillicinoneを単離(児玉)。3、生物活性天然物質の合成と活性発現機構。抗腫瘍性ブリオスタチンの上半球の合成(山村)、ワラビ究極発癌物質の両対掌体の合成とDNA切断の分子機構の解明(山田)、チオグリコシドを用いるグリコシド化で種々の糖質の合成(楠本)、ウドテアトリアールの合成と抗腫瘍性の発見(磯江)、beta-ピネン、ベルベノンからセスキ、ジテルペン合成の鍵中間体の合成(加藤紀元)、光学活性アレーンクロム錯体不斉触媒による不斉Diels-Alder付加反応の実現(林)

4、活性天然物質の単離、コシダ根茎から新クレロダン型ジテルペン配糖体の単離(菅)ヒマワリ種子殻より抗酸化活性物質の単離(加藤忠弘)、アベマキの枝からルパン型トリテルペンの単離とそん構造決定(中山)。1、分子内の近傍に複数のアルデヒド基を有するテルペノイドには多様な生理活性が見出だされている。本研究者は天然より大量に入手可能な(+)-ゲニピンを出発物質に用い、新しい生物活性物質の発掘を目標に、複数のアルデヒド官能基を有する多官能性イリドイド類や海産ジテルペン類の合成を行なってきたが、今回はその研究の一環として分子内に10π系ヘテロ芳香環を含む新規な海産ジテルペン、Halitunalの合成を行なった。Halitunalは抗ウイルス活性が報告されているほか抗腫瘍性や抗炎症活性が期待される化合物である。(磯江)。2、紅藻ウラソゾより単離された8員環エーテルの(+)-ローレンシンの最初の全合成を達成した。また、その成果をもとにして(+)-ローラレンの全合成を積極的に推し進めている(村井)。3、シガテラ中毒の毒素シガトキシンの抗体調整への合成的プロ-チとしてのHepten-Protein Conjugateの合成に成功した(平間)。4、魚類の発する対捕食防御物質の活性発現機構の研究の一環としてミナミウシノシタの分泌液より魚毒成分として一連のステロイド配糖体類と疎水性ぺプチドを単離、構造決定した(橘)。5、ワラビの究極発癌物質の合成に成功するとともに、そのDNA切断機構を解明した。また海洋動物アメフラシの抗腫瘍性物質アプリロニンAの単離、構造決定と合成に成功した。さらに、タツナミガイの細胞毒性物質ドリキュライドの構造決定ならびに合成にも成功した(山田)。6、複合型糖鎖の生物学的機能の合成化学的手法による解明には複雑な糖鎖の精密合成が必要であるが、そのためには糖鎖の選択的保護が重要である。簡便なα-選択的グリコシル化法を開発し、それを用いて複合糖質類の合成を行なった(楠本)。
地域高齢糖尿病患者の「病い」の認知と療養行動障壁の関連について

糖尿病治療から認知症治療への移行には、「病いの経験」をどのようにとらえているのかが深く関わっている。健康信念、認知症というステイグマなど、トランジッションにはさまざまな文化的背景からの制約を受けている。今回の研究では、個別の患者の「病いのものがたり」の質的分析をおこなうことで、糖尿病治療から認知症治療への移行における共通した認識タイプを抽出し、提供すべき認識のフレームを作り出したいと考える。
心臓局所のネプリライシンがANP系のパラクライン作用を減弱する機序の解明

NEP阻害薬が心不全の予後を改善したかについては、ホルモンとしてのANP・BNPの作用を亢進させた事によると考えられているが、心臓局所におけるANP・BNPの局所組織濃度が血中よりもはるかに高い事を考えると、autocrineとしてのNPの作用を増強させた可能性がある。本研究の目的は、NEP遺伝子改変マウスを用いて心筋細胞におけるNEPの作用を検討し、心臓リモデリングに対する心臓局所でのNPとNEPの相互作用を明らかにする事である。そこで、我々は心筋特異的ネプリライシン過剰発現マウスを作製し以下の検討を行った野生型マウス(WT)、心筋特異的ネプリライシン過剰発現マウス(aMHC-NEP Tg)と全身のネプリライシン欠損マウス(NEP KO)のbaselineでの血漿・心臓組織でのcGMP濃度はaMCH-NEP TgではWTに比べて有意に低く、NEP KOではWTに比べて有意に高かった。大動脈縮窄術(TAC)による圧負荷を加えたところ、aMHC-NEP TgではWTに比べて有意に心重量、肺重量、心臓間質の線維化が増悪し、心エコーでは心収縮能の低下を認めた。蛋白電気泳動ではSerca2aの発現がTAC後のaMHC-NEP Tgで著明に低下していた。圧負荷モデル作製により、仮説の通り、ネプリライシン過剰マウスでは心臓リモデリングの増悪を認めた。ネプリライシン過剰発現マウスでは血中のANP濃度が低下している。組織でのcGMP低下が心臓リモデリングに影響を与えることを確認するため、血中のANPを補正するためにhANP持続投与しながら圧負荷による心臓リモデリングを検証する。
必須アミノ酸による食品有害細菌の増殖抑制効果：作用機構の解明と予測モデルの開発（国際共同研究強化）

新たな微生物制御手法として,より効果的な利用を可能にするためにはD-Trpの作用機序を明らかにすることが重要である。本研究ではD-Trpによって細菌の増殖が抑制されるメカニズムを解明することを目的として,D-Trpが細菌体内部に取り込まれて作用する可能性と,細菌体外部で作用する可能性の2つの仮説を検証した。(1)菌体内部での検証培養時の食塩濃度に関わらずE. coli内部からTrpが検出され,条件2NaCl 0%-D-Trp40 mM,4NaCl 1%-D-Trp40 mM(増殖可能条件)において多量のTrpが検出された。増殖可能条件においてもE. coliはD-Trpを取り込むことが示され,D-TrpそのものにE. coliの増殖を阻害する働きはないものと考えられる。代謝物は食塩の影響を強く受け,増殖可能条件5NaCl 3%- D-Trp 0 mM,および増殖抑制条件6NaCl 3%- D-Trp 40 mMで培養したE. coli細胞内の代謝物の検出量はほとんど同様であった。検出量の異なるいくつかの物質にグアノシン4リン酸(ppGpp)があり,この物質の合成が増殖抑制の一因であると考えられる。これらの結果から菌体内部で作用して代謝阻害を誘導している可能性は低いことが示唆された。(2)菌体外部での検証増殖不能な条件6で培養したE. coliを増殖可能な条件35の培地に移植すると,すべての条件で増殖し,増殖抑制条件6の培地に移した場合は増殖が抑制された。すなわち,D-Trp環境下で増殖抑制されていたE. coliの外部環境からD-Trpを取り除くと再増殖することが明らかとなったため,D-Trpは菌体外部で作用しE. coliの増殖に何らかの影響を及ぼしていることが示された。内定年度:2015近年,非侵襲の微小電極を用いたイオン流束計測技術,Microelectrode Ion Flux Estimation(MIFE)法が発達して,動物,植物,酵母,カビ類さらには組織細胞における細胞膜機能の測定が活発に行われている。なかでも,微生物に適用したのはProfessor Rossの研究グループが2001年にShabala et al. (J. Microbiol. Methods 46: 119-129)として報告したのが世界初である。高塩分ストレス,低pHストレスといった化学的な環境条件に対する微生物の反応はMIFEで研究実績があることから,今回の申請研究で検討するD-トリプトファンの影響を解明することが大いに期待できる。MIFEによる評価は細胞膜のイオン輸送能を膜電位変化として非侵襲in situで定量評価できることから,「その細菌細胞自体において何が起きているのか?」を解明可能な点が本研究の大きな特色である。本年度は実際の実験評価系を構築して,基礎的なデータを取得しつつある。また,Professor Rossの研究グループでは近年,微生物のストレス応答をGenomicsやProteomicsといったいわゆるOmicsデータからの解析を進めており,微生物のより詳細なストレス応答機構の解明に注力している。この部分ではD-トリプトファンの微生物細胞への作用メカニズムを明らかにできるものと期待でき,基礎的な検討を始めている。以上のように本年度はD-トリプトファンの微生物に対する作用機序の解明のための多角的な視野からのアプローチによって,明らかにしつつあり,今後の研究展開の基礎を確立することができた。当初想定していたように,Microelectrode Ion Flux Estimation(MIFE)法による高塩分ストレス,低pHストレスといった化学的な環境条件に対する微生物の反応評価系の構築が順調に進んでいる。これによって,D-トリプトファンの影響を解明することが大いに期待でき,本年度は実際の実験評価系を構築して,基礎的なデータを取得しつつある。さらに,微生物のストレス応答をGenomicsやProteomicsといったいわゆるOmicsデータからの解析を進めており,微生物のより詳細なストレス応答機構の解明に注力している。また,もう一つの協力研究機関であるAristotle University of Thessaloniki, GreeceのProfessor Kostas Koutsoumanis,とはモデル構築のための理論に関して,議論を深めつつあり,来年度以降の実験結果の活用方法を明確にできている。以上のように,本研究は概ね計画どおりに順調に進展している。本年度はD-トリプトファンの作用機序を明らかにするための手法の一つとして,大腸菌の代謝経路における影響を明らかにするために,メタボローム解析結果を主成分分析したところ,D-Trpの添加により代謝物が変化すること,食塩の添加により代謝物が変化することが明らかになった。また,代謝経路外において食塩およびD-Trpを添加した実験系で検出されたグアノシン5'-ニリン酸3'-ニリン酸(ppGpp)とアジピン酸の2つの物質に着目した。ppGppはアミノ酸欠乏時に細胞内で生成されタンパク質の合成を抑制する緊縮応答と呼ばれる反応を引き起こす物質である。ppGppが検出されたため,タンパク質の合成が抑制されていると考えられ,タンパク質の合成が抑制されることにより細菌の増殖が抑制された可能性が示唆された。

またアジピン酸は有機酸の1つでありpH 5以下においてE. coliの増殖を抑制したとの報告がある。通常,有機酸による細菌の増殖抑制効果を検証する場合には培地に有機酸を添加する形で行われるためその効果の発現には非乖離の有機酸が細胞内に取り込まれる必要があるが,今回の場合アジピン酸は細胞内にて生成されており取り込まれる必要がないため低pH環境でなくとも増殖抑制効果が現れたものと推察される。基礎メカニズムの解明を進める一方で,D-トリプトファンを用いた実際の食品の微生物制御への展開を進めた。特に,生カキにおける腸炎ビブリオの増殖抑制に関して,世界的にも高品質なカキを出荷することで知られるタスマニアでの試験を進めた。その結果,海水中にD-トリプトファンを添加することで,生カキ中の腸炎ビブリオの菌数増殖を抑制するだけでなく,大幅に減少させることを見出さした。以上のように,基礎メカニズムと実用面の両面において顕著な研究成果が現れている。D-トリプトファンによる細菌制御のメカニズムの一端を解明すべく,本年度は新たにメタボローム解析を取り入れて研究を進めた。一方で,共同研究先であるギリシャテッサロニキ大学のKoutsoumanis教授のもとでは,single cellレベルでの作用機序を蛍光顕微鏡下でリアルタイムでの観察を続け,今年度は途中から当研究室の大学院生がインターンシップで滞在して,観察技術を習得している。また,当研究室で開発したsingle cellレベルでの細菌細胞の不活化挙動のバラツキを数理モデルで記述するモデル化手法が観察結果にも適用可能であることが示されつつある。これは,およそ研究開始当初に予想した範囲内の研究成果を得ることができた。D-トリプトファンの作用メカニズム解明を進める一方で,非常に実用的な利用方法を実際のカキ養殖現場,収穫直後の生カキを対象として試験することができたことは非常に有意義な研究成果である。一方で,非侵襲の微小電極を用いたイオン流束計測技術,Microelectrode Ion Flux Estimation(MIFE)法を微生物に適用しているProfessor Rossの研究グループとの研究を進めたが,MIFEによる評価は細胞膜のイオン輸送能を膜電位変化として現時点では定量評価できる可能性を示唆する実験結果が出始めてきた。以上のことから,研究全体としては概ね順調に研究は進捗しているものと考えられる。新たな微生物制御手法として,より効果的な利用を可能にするためにはD-Trpの作用機序を明らかにすることが重要である。本研究ではD-Trpによって細菌の増殖が抑制されるメカニズムを解明することを目的として,D-Trpが細菌体内部に取り込まれて作用する可能性と,細菌体外部で作用する可能性の2つの仮説を検証した。(1)菌体内部での検証培養時の食塩濃度に関わらずE. coli内部からTrpが検出され,条件2NaCl 0%-D-Trp40 mM,4NaCl 1%-D-Trp40 mM(増殖可能条件)において多量のTrpが検出された。