hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
シナプス前終末におけるCa^<2+>チャネルの分布と機能

1.Cacophony Ca^<2+>チャネルの分布ショウジョウバエのシナプスにおけるCa^<2+>チャネルのαサブユニットはcacophony(cac)と呼ばれる遺伝子によってコードされている。このcacCa^<2+>チャネルに蛍光標識・EGFPをつけた形質変換株がKawasaki et al.(2004)によって作製された。この形質変換株(cac^<EGFP>)を用いてcacCa^<2+>チャネルの分布を調べシナプス小胞の分布と比較した。高K^+液によってシナプス小胞内に蛍光色素FM4-64を取り込ませると、シナプス前終末boutonの末梢、すなわち表面に近い部分に蛍光が見られる。この分布はcac^<EFGP>の分布と相関している。このことは、この条件下ではエンドサイトーシスが小胞放出部位の近傍で起こっていることを示している。2.cacCa^<2+>チャネルの機能cac^<null>幼生においては速いシナプス伝達はほとんど起こらない。ただし、外液中のCa^<2+>濃度を5mMに増加すると遅延した放出(delayed release)が起こる。このdelayed releaseは合成クモ毒、PLTX IIによって抑制される。このことからcacCa^<2+>チャネル以外のCa^<2+>チャネルから入るCa^<2+>によってdelayed releaseは起っていると考えられる。cac^<null>変異株にcac遺伝子を導入すると速いシナプス伝達は回復する。ただしcontrolに比してこの変異株におけるシナプス電流の振幅は44%で完全な回復ではない。このような不完全な回復はsynaptotagminIの変異株においても得られたことから、人工的に導入した遺伝子は正常な遺伝子ほど有効に活性化されないと考えられる。シナプス前終末にあるCa^<2+>チャネルは多種類あり、エクソサイトーシスとエンドサイトーシスに関与している。我々はショウジョウバエの神経筋シナプスにおいて3種類のCa^<2+>チャネルを区別し、それぞれの機能と分布を研究している。そのうちの一つcacophony(cac)Ca^<2+>チャネルはcacophony遺伝子によってコードされていて、エクソサイトーシスの際に働いている。この遺伝子に蛍光標識EGFPをつけたトランスホーマントを用いて、その前終末における分布を調べ、次のような所見を見出した。1)cac Ca^<2+>チャネルは小さなクラスターを作り、前終末のシナプスの中央部に存在する。したがってこのCa^<2+>チャネルが開口することによっておこるCa^<2+>の流入は小さな部位に限局していることが推測される。2)cac Ca^<2+>チャネルのクラスターは均一の大きさではなく、その大きさ、すなわちCa^<2+>チャネルの数に大きなばらつきがある。このことはそれぞれのシナプスにおいてCa^<2+>流入量が異なり、分泌確率が異なっていることを示唆している。3)またその分布は一様ではなく、シナプスブートンのわきの方に多く、上下の面には比較的少ない。このことはシナプス小胞の分布と関連している。Exo/Endocycling poolに属するシナプス小胞がブートンのまわりに集まりドーナツ状になることが知られているが、その分布にcac Ca^<2+>チャネルの分布とには密接な関係がある。

また、cac Ca^<2+>チャネルの完全欠失株の幼生を用いてシナプス伝達を調べたところ神経刺激によっておこる同期した小胞の放出は完全に欠失していた。このことはcac Ca^<2+>チャネルのみがエクソサイトーシスに関与していることを示している。ただし非同期のシナプス小胞放出はこの完全欠失株においてもおこることから、他の種のCa^<2+>チャネルも放出部の近傍に存在することをうかがわせる。同期性、非同期性放出はともにクモ毒、PLTII、によって抑制される。一方エンドサイトーシスを主として抑制するLa^<3+>はシナプス伝達に関与しない。したがってLa^<3+>感受性チャネルは放出部位から離れたところにあると思われる。エクソサイトーシスに関与するCa^<2+>チャネルの一つのクラスター内の数は、たかだか数十個であると推定されている。この数がシナプス伝達の効率を支配する因子の一つである可能性が大きい。我々はショウジョウバエを用いて神経系におけるシグナル伝達のメカニズムの解明につとめ、平成18年度には以下3つの分野において成果が得られた。1.シナプトタグミンIの機能シナプス伝達におけるCa^<2+>センサーと考えられているシナプトタグミンI分子に関する研究において、Ca^<2+>が結合すると思われる部位の特定を行った。シナプトタグミンI分子の特定の部位にアミノ酸置換をおこした形質変換株を用いて、神経刺激によって誘発されるシナプス伝達を詳しく調べた。このような変異は、動物が動けなくなるために、幼生致死である。そのため実験はすべて幼生を用い、パッチクランプ法によって行った。その結果、シナプトタグミンIのC2Bドメインの中で、アスパラギン酸が並んで負に荷電した部位にCa^<2+>が結合すると結論された(業績1)。2.ショウジョウバエにおける糖感受のシグナル伝達経路我々は先にショウジョウバエの糖受容体を同定し、7回膜貫通型のG蛋白結合分子であることを発表した。そこで今回はそのG蛋白の同定を行い、アデニルサイクレースにつながるGs-alphaであることを見出した。したがってこのシグナル伝達経路はcAMPをメッセンジャーとしていることがわかった(業績2)。3.自発的運動による神経筋シナプス伝達増強のメカニズム我々は以前からHeidelberg大学のSchuster教授のグループと共同研究を行っている。同グループはショウジョウバエ幼虫に自発的運動をさせることによってシナプス伝達が増強することを見出した。今回はそのメカニズムに関する研究を行い、シナプス伝達物質の増加がシナプス前終末における2つのメカニズムが継時的におこるためであることを見出した(業績3)。
海洋生物由来の医薬シーズとしての生体機能分子の探索

細胞情報伝達系に特異的に作用する活性天然物質(生体機能分子)を発見して広く世に供給することができれば、その活性物質がツール(生化学試薬)として利用されるとともに、新たな医薬品開発に展開することが期待される。本研究では、1)特にがんと神経変性疾患に着目し、これら疾患に関わる細胞内情報伝達系に特異的に作用する活性天然物質を探索するアッセイ系を構築し、これまでに集めた海綿を中心とする海洋生物の抽出エキスライブラリーから探索する。2)そして新たに発見した阻害物質とそれらから設計・合成した光親和性放射性標識体やビオチン標識体などの各種の天然分子プローブを用いて標的分子を同定し、細胞内情報伝達系への作用機構を解析する。本年度は、以下の成果を得た。1)ヒト月臍帯静脈内皮細胞HUVECに対して3000倍以上の選択性を持って増殖抑制活性を示す活性成分cortistatin類を見出した海綿の抽出エキスを精査し、合計11個の類縁体を見出し、それらの化学構造を明らかにするとともに、構造と活性の相関を調べた。2)Cortistatin Aの簡単なモデル化合物では血管新生阻害活性が発現しないことが判明したため、その全合成研究に着手し、CD環セグメントの合成に成功した。3)p21プロモーター領域を活性化する物質を探索する活性試験法を用いて、アユルベーダ薬草からcryptolepineを、海洋微生物の培養物エキスからsecalonic acid Dを活性物質として見出し、それらの作用を詳しく解析した。4)潜伏期間の結核菌に対しても生育阻害活性を示す抗菌物質を探索し、海綿から強力な活性物質halicyclamine Aを見出し、その作用機構について解析した。がんの細胞情報伝達系に特異的に作用する活性天然物質(生体機能分子)を発見して広く世に供給することができれば、その活性物質がツール(生化学試薬)として利用されることにより、がんの分子機構の解析が大きく進展するとともに、新たな医薬品開発に展開する可能性を秘めている。3)また、他班で合成された生体機能分子についても活性評価を担当し、新しい治療薬シーズの開拓研究を共同で展開する。本年度は、以下の成果を得ている。1)海洋Streptomyces属放線菌の代謝産物から、神経芽細胞腫(Neuro2A)に神経突起を進展させる化合物としてkomodoquinone Aと命名した新規アントラキノン型配糖体を見出し、その全化学構造を明らかにした。2)ヒト慢性骨髄性白血病細胞K562を赤芽球様細胞へ分化させる分化誘導物質として海綿から見出したセスキテルペンキノンsmenospongineについて、構造と活性の相関を解析するとともに、分化誘導作用のメカニズムについて解析した。3)ABCトランスポーターP-gpを過剰発現する多剤耐性がん細胞KB-C2の多剤耐性を克服する化合物として、海綿からkendarimide Aを見出し、機器分析と化学合成によりその全化学構造を解明した。がんの細胞情報伝達系に特異的に作用する活性天然物質(生体機能分子)を発見して広く世に供給することができれば、その活性物質がツール(生化学試薬)として利用されることにより、がんの分子機構の解析が進展するとともに、新たな医薬品開発に展開する可能性を秘めている。1)海綿Ianthellabastaから単離したブロモチロシン誘導体bastadin類が、HUVECの増殖を選択的に阻害するとともに、HUVECの遊走や管腔形成も抑制し、さらにin vivo試験でも血管新生を阻害することを見出した。また、bastadinの効率的全合成を達成するとともに、種々のアナログ合成を行い、構造と活性の相関を詳細に解析した。2)海綿Aaptos suberitoidesから早出したaaptamineが、p21プロモーター領域を活性化し、細胞周期をG2/M期で停止させることを明らかにした。3)ABCトランスポーターのP-gpとMRP1の両方の薬剤耐性を克服するagosterol Aから合成した分子プローブを用いて薬物排出膜蛋白の機能解析をさらに推進した。

2)そして新たに発見した阻害物質とそれらから設計・合成した光親和性放射性標識体やビオチン標識体などの各種の天然分子プローブを用いて標的分子を同定し、細胞内情報伝達系への作用機構を解析する。本年度は、以下の成果を得ている。1)海綿Corticium simplexからヒトさい帯静脈血管内皮細胞HUVECに対して3000倍以上の選択性を持って増殖抑制活性を示す4種の活性成分cortistatin類を見出した。Cortistatin類は、側鎖にイソキノリンを有する特異なステロイドアルカロイドで、HUVECの遊走や管腔形成も抑制し、血管新生阻害剤のリード化合物として期待される。さらに、同種の海綿から6種の類縁体を見出し、構造と活性の相関を調べた。2)p21プロモーター領域を活性化する物質を探索する活性試験法を用いて、海洋微生物の培養物エキスをスクリーニングした結果、数種の活性物質を見出した。細胞情報伝達系に特異的に作用する活性天然物質(生体機能分子)を発見して広く世に供給することができれば、その活性物質がツール(生化学試薬)として利用されるとともに、新たな医薬品開発に展開することが期待される。本研究では、1)特にがんと神経変性疾患に着目し、これら疾患に関わる細胞内情報伝達系に特異的に作用する活性天然物質を探索するアッセイ系を構築し、これまでに集めた海綿を中心とする海洋生物の抽出エキスライブラリーから探索する。本年度は、以下の成果を得た。1)ヒト月臍帯静脈内皮細胞HUVECに対して3000倍以上の選択性を持って増殖抑制活性を示す活性成分cortistatin類を見出した海綿の抽出エキスを精査し、合計11個の類縁体を見出し、それらの化学構造を明らかにするとともに、構造と活性の相関を調べた。2)Cortistatin Aの簡単なモデル化合物では血管新生阻害活性が発現しないことが判明したため、その全合成研究に着手し、CD環セグメントの合成に成功した。3)p21プロモーター領域を活性化する物質を探索する活性試験法を用いて、アユルベーダ薬草からcryptolepineを、海洋微生物の培養物エキスからsecalonic acid Dを活性物質として見出し、それらの作用を詳しく解析した。4)潜伏期間の結核菌に対しても生育阻害活性を示す抗菌物質を探索し、海綿から強力な活性物質halicyclamine Aを見出し、その作用機構について解析した。
院内感染起因菌の消毒薬耐性の全体像の解明

院内感染の起因菌の一つであるセラチア・マルセッセンスの消毒薬耐性因子の一つとして多剤排出ポンプSdeXYを我々はすでに同定している。本研究では、継代培養法により得た消毒薬耐性株を用いて更なる新規因子を同定する解析を進めた。その結果、多剤排出ポンプSdePQ-OmsAを見出した。このポンプは野生株ではほとんど発現していないが、消毒薬耐性株では発現が上昇していた。この変化には2成分制御系であるCpxAが関与する可能性を示した。また消毒薬クロルヘキシジンの耐性因子としてこれまで機能が明らかにされていないMipAを同定した。院内感染の起因菌の一つであるセラチア・マルセッセンスの消毒薬耐性機構について明らかにするために、以下の解析を進めた。昨年度までに高度消毒薬耐性を示す変異株を単離した。そして本株で昨年度見出した突然変異が、経代培養のどの段階で起こったのかについて、11段階の各段階での分離株を用いて解析を進めた。その結果、4箇所の変異は、3段階目で2箇所、6段階目で1箇所、10段階目で1箇所生じていることがわかった。3段階目と10段階目では、多剤排出ポンプ遺伝子sdePQの発現が上昇していることを昨年度明らかにしている。変異が見出された4つの遺伝子のうち、ホモロジー解析からリプレッサーとしての機能を持つことが予想された遺伝子Aについてまずは解析を進めた。遺伝子Aの変異は10段階目で起こっていた。そこで野生株及び高度消毒薬耐性株から遺伝子のクローニングを行った。野生株に野生型及び変異型の遺伝子Aを導入しても変化は見られなかった。高度耐性変異株に変異型の遺伝子Aを導入しても変化が見られなかった。しかし、高度耐性株に野生型の遺伝子Aを導入したところ、消毒薬のMICが著しく低下した。高度耐性株で見られた突然変異では、その塩基配列から正常な(機能しうる)遺伝子Aが産生されないと予想されるため、この遺伝子AはsdePQの発現を抑制しているリプレッサーであることが強く示唆された。別の遺伝子Bは細胞内でのシグナル伝達に深くかかわっていると考えられる2成分制御系に関するものであることが強く予想された。また遺伝子Cについてはペプチドグリカン合成に関与するタンパク質に結合するタンパク質をコードすると考えられた。いずれも本菌の消毒薬耐性にどのように関わっているかは不明である。遺伝子Dに関しては、正常な遺伝子を導入しても消毒薬のMICに変化が見られなかったことから、消毒薬耐性には関わっていないと考えられた。本年度は、まずこれまでに作成していた多剤排出ポンプ遺伝子sdeXYを破壊した株を親株として、消毒薬耐性変異株を単離した。耐性変異株の単離は継代培養により行ったが、途中段階での培養液を馴化株が含まれたもの(馴化株混液)としてその後の解析に用いた。馴化株混液には消毒薬クロルヘキシジンに対する耐性度が異なる株が混在しており、継代を重ねるごとに、高い耐性度を持つ株の存在比率が明らかに上昇していった。最も高い耐性度を示した株は、臨床で用いられる濃度のクロルヘキシジンに対して高い生存率を示した。この株はクロルヘキシジンだけではなく、塩化ベンザルコニウムやトリクロサンなどの消毒薬に加えて、ノルフロキサシンやエリスロマイシンなどの抗菌薬に対する耐性も顕著に増大していた。耐性パターンから多剤排出ポンプ遺伝子sdePQの関与が考えられたため、その遺伝子発現を調べたところ、実際に発現上昇が起こっていることが確認できた。sdePQ遺伝子は親株では発現が見られていないが、11段階の継代の過程のうち3段階めで発現が見られるようになり、10段階めでさらなる発現上昇が見られた。同様にして得られたクロルヘキシジン耐性株において作成したsdePQ遺伝子破壊株ではその耐性が消失したことから、SdePQも消毒薬耐性に深く関係していることが示唆された。sdePQ遺伝子の発現上昇機構を解明するために、最も高い耐性度を示した株について次世代シークエンサーを用いて変異部位を同定した。その結果、少なくとも4箇所での変異が同定された。当該変異と耐性の因果関係について解析を進めている。前々年度に単離した高度消毒薬耐性株においての変異箇所を前年度までに4カ所同定した。前年度に解析を進めた1カ所(遺伝子A)に加えて、今年度は2カ所の解析(遺伝子B,C)を行った。遺伝子Bについては2成分制御系のうちのセンサーキナーゼと考えられる遺伝子である。

変異が生じていた株に野生型の遺伝子Bを導入すると、消毒薬クロルヘキシジンへの耐性度が減弱した。このことから遺伝子Bが多剤排出ポンプSdePQ-OmsAの発現を制御している可能性が強く示唆された。しかし耐性度の変化が軽度であったこと、そして変異が入る直前の株に変異型遺伝子Bを導入すると、色素系抗菌薬の耐性度が少し上昇したことなど、解釈が難しい点が出てきた。遺伝子Bの変異はミスセンス変異であるため、変異により活性を失ったのか増強されたのかは判断が難しい。そこでさらに詳しく解析を行うために遺伝子破壊株の構築を行った。理由は不明であるが、遺伝子破壊株は単離できていない。遺伝子Cについては、耐性変異株においてナンセンス変異が起きていた。遺伝子Cについても上記と同様に、変異株に野生型の遺伝子Cを導入した。その結果、クロルヘキシジン曝露に対しての生存率が100分の11000分の1低下し、感受性化していた。そこで野生株から遺伝子Cの破壊株を構築した。予想に反して破壊株においてもクロルヘキシジンに対する耐性度は低下していた。この矛盾を説明するために、耐性変異株のゲノム上の変異型遺伝子Cを野生型遺伝子Cと組換えた株を構築して解析を進めている。微生物学本年度計画に示していた「SdePQの発現上昇メカニズム」については一定の進展が見られた。一部の遺伝子についてはクローニングに手間取った。この理由としてその遺伝子発現が菌の生育に影響を及ぼす可能性が考えられた。また遺伝子の発現が安定しないといった現象も見られたが、消毒薬耐性の評価法を一部改良することで正しく評価できるようになった。また当該遺伝子の破壊株の作成も進めており、順調に進捗している。一方で、脂質組成の検討については、上記の遺伝子クローニングを先に進めたために、進捗度はよくなかった。よって総合的に見て「おおむね順調に進展している」とした。本年度同定した遺伝子は、知的財産権に関係する可能性が排除できなかったため、学会発表及び論文発表を控えた。本年度計画に示していた「遺伝子破壊株からの消毒薬耐性変異株及び馴化株の単離」「耐性株及び馴化株の性質決定」については解析を進めることができた。そして次年度以降に計画していたSdePQの発現上昇メカニズムについて、前倒しして変異部位を同定できた。一方で、脂質組成の検討については、上記変異部位の同定を先に進めたために、進捗度はよくなかった。ここまでの結果を論文にする作業を進めている。今年度はこれを最優先し、脂質組成の検討や耐性株・馴化株からの復帰株の単離を並行して進める。本研究を進める上で必須である遠心分離機が経年劣化により使用不可能となった。遠心分離機がない状態では本研究の進捗に多大な影響が出るため、一部の予算を遠心分離機購入にあてる。また遺伝子クローニングや遺伝子は買い株の作成など恒常的に行っているものが今年度は多い。
種子散布から発芽までに2年を要する北方景観植物の発芽フェノロジーと種子休眠機構

本研究は、北方地域における鑑賞価値の高い自生植物の中でもとくに種子が散布されてから,子葉が地上に出芽するまでに2度の冬を必要とする植物について、それらの発芽生態と種子休眠機構を明らかにするとともに、種子から人為的に増殖する際の実用的な知見を得ようとした。オオウバユリは,種子散布時には未発達の胚を持ち,種子散布から発根までに18ケ月,そして子葉の出芽までに19ケ月を必要とし,その休眠はDeep simple morphophysiological dormancyに分類できた。25/15°C(60日)→15/5°C(30日)→0°C(120日)→15/5°Cの温度推移によって,自然条件下では18ケ月を必要とする播種から発根までの期間を,78ケ月に短縮することができた。秋に採取した種子を乾燥5°Cで貯蔵しておき,翌年の7月までに播種した種子は,次の年の春に88%以上が出芽した。しかし,翌年の8月以降に播種すると,翌年の春にはわずかしか発芽しなかった。オオウバユリの種子は,胚が生長して発根に至るまでに,高温→中温→低温→中温という一連の温度条件を必要とするために,8月以降に播種した場合は,十分な高温の期間が与えられないことによって,発芽できなかったと考察した。これらの結果はウバユリ属の種子休眠タイプを世界で始めて決定したものであり,種子生態学の分野に大きな貢献を果たすと同時に,人為的増殖を目的とした場合の貴重な情報ともなる。オオバナノエンレイソウも,形態生理的休眠をもつ種子であった。しかし,発芽フェノロジーは,オオウバユリとは異なっていた。7月下旬に散布された種子は,翌年の夏の間に胚成長してそのまま発根し,出芽は2回目の冬を経た春となった。このような発芽過程に必要な温度条件を決定するために,恒温器を用いて33もの温度区を設定したが,現在の所,恒温器内で発根させることに成功していない。日本の北方地域、とくに北海道の植生は本州のそれと大きく異なっており、都市周辺部においても北方地域特有の美しい野生草花の大群落を目にすることができる。本研究は、北方地域における鑑賞価値の高い自生植物の中でもとくに種子が散布されてから,子葉が地上に出芽するまでに二度の冬を要する植物を取り上げ、それらの発芽生態と種子休眠機構を明らかにするとともに、種子から人為的に増殖しようとする際の実用的な知見を得ようとするものである。今年度は,現地調査によって,種子を採取するためのオオバナノエンレイソウとオオウバユリの個体群の位置を確認するとともに,実験に必要な種子を確保し,野外でのフェノロジー観察と室内での発芽に関する実験を開始した。1.オオバナノエンレイソウの結実時期は7月下旬であり,1果実あたり161±50.0(平均値±標準偏差)個のエライオソームを持つ種子が含まれていた。エライオソームを除去し表面をキムワイプで拭き取った直後の千粒重は3.4g±0.06であった。採取直後の胚長は0.3±0.05mmであり種子の全体長の約11%であった。2.オオウバユリの結実時期は10月初旬であり,1さく果当たり498±65.7粒の翼をもつ種子が含まれていた。

翼の付いた種子の千粒重は5.2±0.06gであった。胚長は0.66±0.07mmであり,種子の全体長の約8%であった。3.野外での胚成長のフェノロジー観察を開始した。上述したように本研究で取り扱う2種は未発達の胚を有する。両種を野外に埋土し約一か月毎に堀りあげて胚の成長を観察した。1月現在,胚の成長は認められなかった。4.室内での恒温器を用いた胚成長および発根に関する実験を開始した。実験は,温度勾配恒温器を用いて,光と様々な温度条件を相互に組み合わせた20-30処理区の条件のもとで,シャーレにロ紙を敷いたものを播種床として実施した。日本の北方地域、とくに北海道の植生は本州のそれと大きく異なっており、都市周辺部においても北方地域特有の美しい野生草花の大群落を目にすることができる。本研究は、北方地域における鑑賞価値の高い自生植物の中でもとくに種子が散布されてから,子葉が地上に出芽するまでに二度の冬を要する植物を取り上げ、それらの発芽生態と種子休眠機構を明らかにするとともに、種子から人為的に増殖しようとする際の実用的な知見を得ようとするものである。1.オオウバユリの種子は,散布直後では,胚長は種子長の約8%であった。野外調査によって,秋に散布された種子は,その年の第1回目の冬と夏を経た秋に胚が生長し,2回目の冬を経だ3月下旬から発根を開始し,4月上旬の雪解け後に子葉を展開(以下,出芽)した。すなわち,種子散布から出芽までに19ヶ月もの期間を要した。種子散布から出芽までにこのような長期間を要するオオウバユリ種子の,発芽のために必要な温度とはどのようなものであろうか?このことを明らかにするために恒温器を用いて68もの温度処理区を設定した。その結果,胚成長から発根までに必要な温度は,高温(25/15°C)→中温(15/5°C)→低温(0°Cまたは5°C)→中温(15/5°C)の温度推移であり,これらの温度のうちどの温度段階が欠落しても発根はしないか,50%以下の低い発根率にとどまった。2回目の中温で発根した種子はまもなく出芽した。また,GAの効果は,高温の代わりとなったが低温の代わりにはならなかった。このことから,オオウバユリの種子は散布直後には未発達の胚を持ち,発芽には複雑な温度要求を必要とする形態生理的休眠をもつ種子であり,その中でもDeep Simple morphological dormancyに分類されることが示された。2.オオバナノエンレイソウ種子もオオウバユリと同様,形態生理的休眠をもつ種子であり,早春に出芽するこことが確認できた。しかし,野外での胚発達,発根,出芽などの発芽フェノロジーは,オオウバユリとは異なっていた。7月下旬に散布された種子は,翌年の夏の間に胚成長してそのまま発根した。しかし,出芽は2回目の冬を経た春となった。このような発芽過程に必要な温度条件を確認するために,恒温器を用いて33もの温度区を設定したが,現在の所,恒温器内で発根させることに成功していない。本研究は、北方地域における鑑賞価値の高い自生植物の中でもとくに種子が散布されてから,子葉が地上に出芽するまでに2度の冬を必要とする植物について、それらの発芽生態と種子休眠機構を明らかにするとともに、種子から人為的に増殖する際の実用的な知見を得ようとするものである。
嗅球新生顆粒細胞の匂い入力依存的な回路への組み込み様式の解明

齧歯類の嗅覚系の一次中枢である嗅球では、成体においても抑制性介在ニューロンが新生され続けており、投射ニューロンとのシナプス形成を経て、既存の回路に組み込まれている。この組み込みのメカニズムについては先行研究の知見から、「新生細胞は、匂い入力に依存的して回路へ組み込まれる。」という仮説が提唱されていた。しかし、技術的な制約からその検証は行われてこなかった。本研究では、この仮説を検証する為に光遺伝学を用いた実験系を立ち上げ、新生細胞の組み込み様式の解明にアプローチした。今年度は、マウス主嗅球において、嗅覚入力を模した嗅球投射ニューロンの発火を効率的に引き起こす為に、optogeneticsを用いた投射ニューロンの活性化の手法を確立し、実験を行った。嗅球において投射ニューロン特異的にCreタンパク質を発現するProtocadherin21-Creマウスの嗅球に、チャネルロドプシンと蛍光タンパクの逆向きの配列がloxpで挟まれたアデノ随伴ウィルスを注入し、2週間待ち、嗅球の投射ニューロン特異的にチャネルロドプシンと蛍光タンパクであるmCherryを発現させた。まず、光刺激によって嗅球投射ニューロンの発火が引き起こせるかという点を調べた。その為に、in vivo麻酔下のマウスにおいて光刺激よって嗅球投射ニューロンの活動電位が引き起こされることを電気生理学的手法によって確認した。さらに、匂い入力によって引き起こされる活動と同様の嗅球投射ニューロン群の発火活動を引き起こすのに適した光刺激のパラメーターを決める為に、光刺激を行いながらLFPを計測した。これにより、200msecの光刺激が、匂い入力時に似たLFPの変動を引き起こすことを明らかにした。次に、GFPをコードするレンチウィルスによって、この遺伝子改変マウスの嗅球新生顆粒細胞を蛍光標識し、200msecの光刺激を用いて投射ニューロンを活性化した。嗅球における新生顆粒細胞が、投射ニューロンの活動依存的に既存の嗅球神経回路に組み込まれるかという点について、スパインの形態観察といった解剖学的な手法を用いて調べた。本研究では、成体マウスで新生される嗅球新生顆粒細胞の入力依存的な組み込みメカニズムを明らかにする為に、新生顆粒細胞が投射ニューロンの細胞体に形成するperisomatic-targeting spine(以下、Pt spine)に着目し、研究を行っている。当該年度は、Pt spineにシナプスが形成されるかをシナプスマーカーを用いて解析した。まず、投射ニューロンから新生顆粒細胞のPt spineへ興奮性のシナプスが形成されているかを、ポスト側の興奮性シナプスマーカーであるPSD95の抗体を用いて調べた。その結果、新生顆粒細胞が生まれて10日の時点では約60%のPt spineが、4週の時点では90%の以上のPt spineがPSD95を発現していた。次に、新生顆粒細胞のPt spineから投射ニューロンへ抑制性のシナプスが形成されているかを調べる為に、プレ側の抑制性シナプスマーカーであるGAD65に対する抗体を用いて調べた。その結果、新生顆粒細胞が生まれて10日の時点では約20%のPt spineが、4週の時点では約80%のPt spineがGAD65を発現していた。以上の結果から、新生顆粒細胞はPt spineにおいて投射ニューロンの細胞体とシナプスを形成していることが明らかになった。これまでの先行研究では、新生顆粒細胞のシナプス形成は、主に投射ニューロンの樹状突起に作られるものが着目されてきたが、本研究において、新生顆粒細胞は投射ニューロンの細胞体との間にもシナプスを形成していることが明らかになった。Pt spineが投射ニューロンの細胞体とシナプスを形成することが確認できたことから、このPt spienを組み込みの指標とすることができる。次の段階として、このPt spineに着目し、新生顆粒細胞の嗅球回路への組み込みメカニズムを調べることが可能になる。本研究では、大きく分けて2つの目的がある。1つ目は、「Ptスパインのシナプス形成をシナプスマーカー分子を用いて確認する」ことであり、2つ目は、「新生顆粒細胞は入力に依存して組み込まれるのかという点について、Ptスパインを指標に明らかにする」ことである。当該年度は、シナプスマーカーを用いた解析により、Pt spineが投射ニューロンの細胞体から興奮性のシナプス入力を受け取り、また投射ニューロンの細胞体へ抑制性のシナプス出力を出していることを明らかにしたことから、1つ目の目的が達成された。今後は、嗅覚入力を模した投射ニューロンの発火を効率的に引き起こす為に、optogeneticsを用いた嗅球投射ニューロンの活性化の手法を確立し、実験を進める。嗅球の投射ニューロンである僧帽細胞や房飾細胞がチャネルロドプシンを発現するマウスを準備する。

まず、光刺激によって投射ニューロンの発火が引き起こせるかを電気生理学的手法を用いて確認するとともに、匂い入力を模した発火活動を引き起こすのに適した光刺激のパラメーターを決める。次に、このマウスの嗅球新生顆粒細胞をウィルスによって蛍光標識し、光刺激を用いて投射ニューロンを活性化する。新生顆粒細胞が活動依存的に既存の嗅球神経回路に組み込まれるかという点について、形態観察といった解剖学的な手法を用いて調べる予定である。さらに、光刺激と報酬や電気ショックなどを組み合わせた関連学習を動物に行わせ、新生顆粒細胞が学習依存的に組み込まれるかという点についても調べる予定である。パイロット実験の数が、当初計画していた回数よりも少なくて済んだ為、抗体の購入量が抑えられ、次年度に使用する予定の研究費が生じた。次年度には、チャネルロドプシンを用いたoptogenetics関連の消耗品や機器が多数必要になる為、その購入に使用する予定である。また、次年度には解析するサンプル数が増える為、抗体の購入にも研究費を使用する予定である。
腎被膜下移植法によるヒト子宮筋腫の新しい実験モデルの作成とその応用

超免疫不全マウスの腎被膜下にヒト子宮筋腫細胞を移植し、エストロゲン・プロゲステロン投与下に増大する、新しい動物実験モデルを作成した。このモデルを用いて抗プロゲステロン剤であるRU486の筋腫に対する縮小効果を検証し、このモデルが薬剤効果判定スクリーニングに有用であることを示した。さらに、超免疫不全マウスに代えて重症免疫不全マウスを用いうることを示し、より廉価で扱いやすい実験モデルを開発した。重症免疫不全マウスを用いた子宮筋腫の腎被膜下移植モデルを作成した。このモデルではヒト筋腫組織から分離・培養した子宮筋腫細胞にコラーゲンゲルを混ぜた筋腫細胞移植片を、卵巣を摘除したマウスの腎被膜下に挿入した。次にエストロゲン・プロゲステロンの徐放ペレットをマウス頸部皮下に挿入し、ホルモン投与方法の違いによる移植片の変化を観察した。移植片は腎被膜下で筋腫様組織の再構築を認め、エストロゲン受容体は高い発現レベルを保持していた。また、エストロゲン存在下でプロゲステロン受容体の発現が誘導され、エストロゲン・プロゲステロンの同時併用投与で移植片が増大した。この時、細胞増殖マーカーであるKi67指数が有意に上昇するとともに、個々の細胞が肥大し、細胞周囲の細胞外マトリックスも増加した。このエストロゲン・プロゲステロン同時投与による移植片増大効果は、抗プロゲステロン剤であるRU486の同時投与により、完全に阻害された。この時、Ki67指数は有意に減少し、移植片の細胞増殖が阻害された。以上より子宮筋腫の発育・増大にはエストロゲン・プロゲステロンが同時に必要であることが示された。次年度はエストロゲン・プロゲステロンの周期的投与が筋腫移植片の増大に及ぼす影響を調べるとともに、このモデルが薬剤効果判定モデルとして有用であるかどうかを、エストロゲン合成酵素であるアロマターゼ阻害剤を用いて検討していく予定である。ヒト子宮筋腫組織ならびに組織から分離・培養した子宮筋腫細胞を、超免疫不全マウスである、NOD/SCID IL-2Rγnull(NSG)マウスの腎被膜下に移植し、卵巣を摘除した後、エストロゲンとプロゲステロンを投与した。移植片はエストロゲンやプロゲステロンの単剤投与では増大しなかったが、エストロゲンとプロゲステロンの同時併用投与にて増大した。この時、移植片ではエストロゲン受容体・プロゲステロン受容体は高いレベルで発現しているとともに、個々の細胞肥大がみられた。また、細胞増殖マーカーのKi67指数が高値を示し、細胞増殖も亢進していた。この増大は抗プロゲステロン剤であるRU486の併用投与で有意に抑制され、Ki67指数も有意に低下した。次に、NOD/SCIDマウス・SCIDマウス・BALB/cヌードマウスを用いて、このモデルを再現することができるかどうかを検討した。その結果、NOD/SCIDマウスではNSGマウスと同様、エストロゲン・プロゲステロン同時併用投与にて移植片が増大したが、SCIDマウス、BALB/cヌードマウスでは移植片は増大しなかった。以上の結果から、子宮筋腫の発育・増大にはエストロゲン・プロゲステロンが同時に必要であることが示された。すなわち、筋腫移植片ではエストロゲンによりプロゲステロン受容体の発現が誘導され、プロゲステロンが作用する可能性が示された。また、NSGマウスよりも廉価で日和見感染に強い、NOD/SCIDマウスを用いたヒト子宮筋腫の腎被膜下移植モデルの作成に成功したことで、このモデルを用いた、新しい筋腫治療薬の効果判定試験の汎用性が広がることが期待される。
口腔がんにおける血液循環がん細胞の存在意義

遠隔転移は早期診断が困難であり、その後の治療成績は不良である。われわれのこれまでの研究で、血管内皮細胞増殖因子(VEGFーFamily)の発現量と腫瘍内血管新生が関連していることが明らかとなり、微小血管やリンパ管増生ががんの転移には不可欠であることが証明された。遠隔転移は主に血行性に起こるとされており、早期の段階において循環血中に存在する癌細胞(血液循環がん細胞:CTC)を検出することで治療効果判定や生命予後予測が可能となると考える。Lymphopepを用いたFicoll法とPAXgene Blood RNAシステムを用いてCTCの濃縮・検出を行っている。これまでLymphopepを用いたFicoll法によるCTCの濃縮分離と検出を試みており、その結果、口腔扁平上皮癌細胞を一定数混和した健常人血液内からRTnestedPCR法によって10個/mlのCTCが検出されている。口腔癌患者におけるCTCは110個/ml程度と考えられており、更なる検出感度の向上が必要と考える。そのため、口腔扁平上皮癌細胞を一定数混和した健常人血液内のCTCをreal time RTーPCR法を用いて定量を行っているが、110個/mlの検出においては、定量が不安定であり、更なる準備実験が必要である。現在BDバキュテイナCPT単核球分離用採血管を用いて少量の血液から癌細胞の分離濃縮を行うと同時にがん患者さんの血液からのCTCの検出を行っている。初年度までに安定したCTC検出方法の確立を予定し、臨床検体でのCTC検出を計画していた。しかし、CTCの濃縮・検出の段階で110個/mlのCTC検出が安定していなかった。現在、BDバキュテイナCPT単核球分離用採血管とスピンカラムを用いたCTC濃縮・分離の基礎実験を行っているが、昨年より10個/ml程度の検出は安定してきた。それに伴い昨年度末より臨床検体を用いたCTCの検出を開始している。BDバキュテイナCPT単核球分離用採血管とスピンカラムを用いたCTC濃縮・分離の基礎実験を継続し、CTC濃縮・分離・検出の安定性を図ると同時に、臨床検体を用いたCTCの定量評価を行う。われわれのこれまでの研究で、血管内皮細胞増殖因子(VEGF-family)の発現量と腫瘍内血管新生が関連していることが明らかとなり、微小血管やリンパ管増生ががんの転移には不可欠であることが証明された。今回、Lymphoprepを用いたFicoll法とPAXgene Blood RNAシステムを用いてCTCの濃縮・検出を行っている。これまでLymphoprep&#8482;を用いたFicoll法によるCTCの濃縮分離と検出を試みており、その結果、口腔扁平上皮癌細胞を一定数混和した健常人血液内からRT-nested PCR法によって10個/mlのCTCが検出されているが、がん患者におけるCTCは1001個/ml程度と考えられており、更なる検出感度の向上が必要と考える。そのため、口腔扁平上皮癌細胞を一定数混和した健常人血液内のCTCをreal time RT-PCR法を用いて定量を行っているが、1001の検出においては、定量が不安定であり、更なる準備実験が必要である。本年度では、CTCの濃縮、分離法の確立を行う予定であったが、CTCは1001個/mlの検出が安定せず、確実なCTCの検出方法が確立できていない。そのため、CTCの濃縮方法を検討しながら更なる準備実験を行う必要がある。

現在、BDバキュテイナCPT単核球分離用採血管とスピンカラムを用いたCTC濃縮・分離の基礎実験を行っているが、昨年より10個/ml程度の検出は安定してきた。それに伴い昨年度末より臨床検体を用いたCTCの検出を開始している。使用カラムの変更やPCRプロトコルの見直しを行い、早期にCTC濃縮・検出方法の確立を行い、口腔扁平上皮患者におけるCTCの定量評価を行う。BDバキュテイナCPT単核球分離用採血管とスピンカラムを用いたCTC濃縮・分離の基礎実験を継続し、CTC濃縮・分離・検出の安定性を図ると同時に、臨床検体を用いたCTCの定量評価を行う。本年度は以前までに使用していた試薬および消耗品を使用していたため試薬、消耗品の購入が少額となっていた。現在、試薬および消耗品が不足しているため試薬および消耗品の購入が必要となる。初年度経費の使用が以前の試薬等を用いて実験遂行可能であったため残額が発生した。昨年度予定経費は全額使用し、初年度経費残額も使用しているが、残額が生じている。本年度も引き続き基礎研究および臨床研究を継続するため、昨年度購入分では試薬等消耗品が不足するため購入が必要不可欠となる。そのため、昨年度残額と本年度残額で試薬等消耗品購入を行う予定である。
3次元自律走行クレーンの知能制御に関する研究

天井クレーンシステムの,メインフレーム部,オフライン用センサ部,コントローラ部、シミュレータ部を完成した.システム構成は,オフライン障害物認識と環境地図作成部,経路計画部,そしてオンライン振れ止め,位置決め制御部の3つの部分からなる.オフラインでの環境地図の作成については,クレーンを動かすことにより,工場の全環境中における障害物に順次レーザを照射し,三角測定原理を用いて2個のCCDカメラによりレーザラインをとらえ,画像処理ボードにより画像処理することで工場内の環境地図をオフラインで作成することを完成させた.また,経路計画については,ポテンシャル法と,分枝限定法の2つの方法により行った.いずれも長所,欠点があり,目的に応じて使い分けることが重要であることを明らかにした.また,振れの生じにくい経路を見つけることが,クレーン経路計画問題の独自性であり,それを合理的に経路計画探索に導入することが重要ポイントであり,本研究では,分枝限定法,ポテンシャル法ともにそれについて独自の方法を提案した.さらに,振れ止め,位置決めの運動制御については,極固定可変ゲイン最適サーボ制御系の構築を行った.これにより,ロープ長変化に対しても,安定性の保証された,しかも,オンライン計算が比較的容易な制御系の提案を行うことができた.実験室のクレーン装置に適用し,本システム構成の有用性を実証した.今後の課題は,オンラインでの障害物認識と障害物回避を行うことで,これにより自律走行化が完成する.天井クレーンシステムの,メインフレーム部,オフライン用センサ部,コントローラ部、シミュレータ部を完成した.システム構成は,オフライン障害物認識と環境地図作成部,経路計画部,そしてオンライン振れ止め,位置決め制御部の3つの部分からなる.オフラインでの環境地図の作成については,クレーンを動かすことにより,工場の全環境中における障害物に順次レーザを照射し,三角測定原理を用いて2個のCCDカメラによりレーザラインをとらえ,画像処理ボードにより画像処理することで工場内の環境地図をオフラインで作成することを完成させた.また,経路計画については,ポテンシャル法と,分枝限定法の2つの方法により行った.いずれも長所,欠点があり,目的に応じて使い分けることが重要であることを明らかにした.また,振れの生じにくい経路を見つけることが,クレーン経路計画問題の独自性であり,それを合理的に経路計画探索に導入することが重要ポイントであり,本研究では,分枝限定法,ポテンシャル法ともにそれについて独自の方法を提案した.さらに,振れ止め,位置決めの運動制御については,極固定可変ゲイン最適サーボ制御系の構築を行った.これにより,ロープ長変化に対しても,安定性の保証された,しかも,オンライン計算が比較的容易な制御系の提案を行うことができた.実験室のクレーン装置に適用し,本システム構成の有用性を実証した.今後の課題は,オンラインでの障害物認識と障害物回避を行うことで,これにより自律走行化が完成する.天井クレーンシステムのメインフレーム及び駆動系,CCDカメラ,画像処理部,エンコーダなどからなるセンサ部,コントローラ部,シミュレータ部の全システムの構築を行い,3次元自律走行クレーンシステムの実験装置製作を完成された.走行クレーンの直線走行やカーブ走行での運動方程式の導出を,ラグランジェの方程式より行いモデリングを完成させた.また,アニメーション化したシミュレータを構築した.搬送軌道が完全に決まっているとき(これを,難易度Aとする),代表的と考えられる次の3つの動的制御モジュール(DCC;Dynamic Crane Control Moduleと呼ぶ)に対して最適制御系を構築した.(DCC1)巻き上げ,等速,巻き下げ区間での,振れ振幅の低減化と,等速区間や停止時での振れ止め制御.(DCC2)カーブ区間での振れ止め制御.(DDC3)壁に囲まれたコーナ部での障害物回避と振れ止め制御.制御方法としては,極固定可変制御方式を用い,安定性を証明した.マクロ的な障害物の位置が事前情報としてわかり,クレーン走行中には障害物の移動はない場合のグローバル制御方策のシステム構築(これを,難易度Bとする)を行った.レーザラインセンサを用い,CCDカメラより障害物のマクロ的認識をオフラインで行う方式行った.最適経路探索としては,分枝限定法,ファジィ推論報,拡散方程式によるポテンシャル法による3つの方法で検討を行った.グローバルレベルでの,障害物認識,最適経路計画,搬送制御からなる制御方式のシステムを完成させ,制御実験により有効性を確認した.移動障害物や,環境変化に対する,オンラインでのローカル方策の構築が次年度の課題である.天井クレーンシステムの,メインフレーム部,オフライン用センサ部,コントローラ部、シミュレータ部を完成した.システム構成は,オフライン障害物認識と環境地図作成部,経路計画部,そしてオンライン振れ止め,位置決め制御部の3つの部分からなる.オフラインでの環境地図の作成については、クレーンを動かすことにより,工場の全環境中における障害物に順次レーザを照射し、三角測定原理を用いて2個のCCDカメラによりレーザラインをとらえ,画像処理ボードにより画像処理することで工場内の環境地図をオフラインで作成することを完成させた.また,経路計画については,ポテンシャル法と,分枝限定法の2つの方法により行った.いずれも長所,欠点があり,目的に応じて使い分けることが重要であることを明らかにした.また,振れの生じにくい経路を見つけることが,クレーン経路計画問題の独自性であり,それを合理的に経路計画探索に導入することが重要ポイントであり,本研究では,分枝限定法,ポテンシャル法ともにそれについて独自の方法を提案した.さらに,振れ止め,位置決めの運動制御については,極固定可変ゲイン最適サーボ制御系の構築を行った.

これにより,ロープ長変化に対しても,安定性の保証された,しかも,オンライン計算が比較的安易な制御系の提案を行うことができた.実験室のクレーン装置に適用し,本システム構成の有用性を実証した.今後の課題は,オンラインでの障害物認識と障害物回避を行うことで,これにより自律走行化が完成する.
脳動脈瘤とendoglin遺伝子の連鎖解析・関連解析

【目的】われわれは、以前から罹患同胞対連鎖解析法を用いて、脳動脈瘤感受性遺伝子座のマッピングを行い、その情報を基に候補遺伝子を検索し、関連解析により感受性遺伝子の同定を試み報告してきた。一方、endoglin遺伝子のイントロン7にある6塩基のinsertion polymorphismを用いた関連解析から、この多型と脳動脈瘤の相関の報告がある。endoglinは血管内皮細胞で構成的に発現している膜糖蛋白で、transforming growthfactor-betaと結合し、血管壁の発生、維持に関連する分子で、hereditary hemorrhagic telangiectasia type Iの原因遺伝子である。今回の研究の目的は、詳細にendoglin遺伝子が脳動脈瘤感受性遺伝子であるか検討することにある。【方法】1)罹患同胞対連鎖解析により第9番染色体長腕(endoglin遺伝子は9q34にマッピングされている)に連鎖があるか、2)endoglin遺伝子にあるSNP (single nucleotide polymorphism)を検索し、3)これらを遺伝マーカーとした関連解析により脳動脈瘤との関連を検索した。連鎖解析には85家系、179患者、104罹患同胞対を、関連解析には172患者、192コントロールをサンプルとした。統計解析は、連鎖解析にはノンパラメトリック連鎖解析法を、関連解析にはカイ二乗検定を用いた。【結果】1)脳動脈瘤と第9番染色体長腕(9q34)に有意な連鎖は認めなかった。2)以前から報告されていた6塩基のinsertion polymorphismと4つのSNPを用いた関連解析で、脳動脈瘤とendoglin遺伝子に明らかな相関を認めなかった。【結論】日本人を対象とした脳動脈瘤とendoglin遺伝子との連鎖解析、関連解析で明らかな陽性結果は得られず、endoglin遺伝子は脳動脈瘤の主な感受性遺伝子ではないと考えられた。(目的)これまでにendoglinがくも膜下出血の原因である脳動脈瘤の責任遺伝子との報告がなされている(J Neurosurg 1999;90:935-938)。これに対し、白人では否定的な報告がなされている(Stroke 2001;32:2689-2694)。今回の研究の目的は、日本人においてendoglin遺伝子が真に脳動脈瘤感受性遺伝子であるか決定することにある。そのために1)罹患同胞対連鎖解析により第9番染色体長腕(endoglin遺伝子は9q34にマッピングされている)に連鎖があるか、2)endoglin遺伝子のエクソン、アクセプター・ドナー部位、プロモター領域、3'非翻訳領域などを対象に、SNPs(single nucleotide polymorphism)を検索し、3)これらを遺伝マーカーとしたケース・コントロールスタデイにより脳動脈瘤との関連を検索する。4)仮に関連があった場合は、機能解析により動脈瘤発生のメカニズムの糸口を検討する。(結果)1)脳動脈瘤と第9番染色体長椀(9q34)に有意な連鎖は認めなかった。(結語)以上のことから、日本人でもendoglinは脳動脈瘤感受性遺伝子の可能性は低いと考えられた。
人種差別撤廃条約と日本社会の変容

本研究の目的は、「人種差別の撤廃に関する国際条約」(「人種差別撤廃条約」又は「条約」)の日本への影響に注目し、同条約による日本社会の変容の現状を検証することにある。その背景には、日本による同条約への加入以降、日本の裁判所や、国及び地方の行政機関及び立法機関、さらに社会一般において人種差別に対してより厳しい目が向けられるようになったことがある。この目的を達成するため、より具体的には、私人間の人種差別の禁止、ヘイトスピーチの規制及び被害者の救済(人種主義的動機に基づく行為に対する民事上の損害賠償額や刑事上の量刑の問題)を主たる検討対象とした。このような研究は、やがて訪れるであろう、日本社会の多民族化や多文化共生社会化のより一層の深化を見据えながら、人種差別撤廃条約を契機として、又はそれを媒介として、日本社会が変容しつつある、その現在を描き出し、将来を展望するという重要な意義をもつ。本研究は、国際法的研究と国内法的研究からなるが、平成30年度は、国際法的研究の側面では、関係資料の収集と分析にあたった。焦点は、前年度に引き続き、欧州評議会の「反人種主義・不寛容に関する欧州委員会(ECRI)」の実行と、欧州人権裁判所の関係事例である。ECRIについては、すでに関係資料を入手し、分析も進行中である。また、欧州人権裁判所についても関係裁判例の収集はほぼ終わり、その分析を進めている。また、国内法的研究の側面では、私人間の人種差別の禁止とヘイトスピーチ、加害者に対する量刑及び被害者に対する損害賠償額にかかわる裁判例の収集と分析にあたった。平成30年度は、前年度の長期の入院(平成30年1月4日3月19日)の他、5月及び8月にも入院を余儀なくされ、その結果、研究の進展に影響を及ぼすことになった。特に、代表者が海外に赴き、研究活動(資料収集その他の情報収集など)を行うことができなかった。ただ、特に、資料の収集及び分析、海外の専門家の招請などの側面では、研究計画に従いおおむね研究計画通りの成果を得た。国際法的研究においては、平成29年度及び30年度の研究活動の結果、必要な資料はおおむね得たことから、その分析を引き続いて行う。分析する資料は、ECRI及び人種差別撤廃委員会の関係資料(当該機関の決定を示す文書、各国の報告書など)であり、取り扱う事項は、私人間の人種差別の禁止、ヘイトスピーチ及び被害者の救済の全般に及ぶ。ただし、本年度の力点は、被害者の救済の問題に置かれる。また、可能な限り、他の条約履行監視機関の実行(特に米州人権裁判所や自由権規約委員会の実行など)や、若干の国の実行(重要な立法・政策など)の分析も試みる。国内法的研究についてはも、被害者の救済に関する裁判例などの分析を中心に研究をすすめていく。なお、本研究では、本研究が当初の計画通りにすすまない場合には、本研究の核心部分以外のところにおいて、適宜、検討範囲の限定を行うことによって対処することとしている。しかし、現在のところ、研究範囲の縮少など、研究計画の変更が必要であるとは考えていない。本研究は、国際法的研究と国内法的研究からなるが、平成29年度は、主に国際法的研究を行うこととし、関係資料の収集と予備的分析にあたった。焦点は、欧州評議会の「反人種主義・不寛容に関する欧州委員会(ECRI)」の実行と、欧州人権裁判所の関係事例である。ECRIについては、ECRIの一般的勧告を網羅的に収集し、事項毎に若干の分析を行った。また、同委員会による、欧州評議会構成国内の関係立法・政策に関する監視活動にかかわる関係文書も一部収集した。欧州人権裁判所については、Nachova v. Bulgaria [GC](2005年、Reports 2005-VII)に関係する裁判例を広く収集した。なお、本年度では、私人間の人種差別の禁止とヘイトスピーチに関する裁判例の収集も開始し、判例集や判例情報誌には掲載されているものの他、関係した弁護士に研究への協力を依頼し、いくつかの裁判例も入手した。上記のように、平成29年度は、研究第1年目ということもあり、関係資料の入手と予備的分析にあてられた。資料の収集という面では、おおむね研究計画通りの成果を得たが、その分析及びそれに基づく資料のさらなる収集という面は十分ではなかった。それは、研究代表者が、平成29年10月頃より体調が優れず、結局、平成30年1月4日から3月19日まで、約2ヶ月半にわたって入院生活を余儀なくされたことが最大の理由である。