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積雪地帯における伝統的有形民俗資料の比較研究

積雪地帯における伝統的有形民俗資料の比較研究調査は,カンジキと除雪具を対象に青森県,岩手県,福島県,秋田県,山形県,富山県,石川県,福井県,長野県,北海道を中心に調査を行った.カンジキは,いわゆる竹を曲げた単輪型が本州における共通した形態であった.中でも新潟県山間部,北陸地方を中心に分布するスカリとその類似型は最も大型のカンジキであり,スカリの上にさらに小型のカンジキをはくといった重複型は,豪雪地帯における最も大きな特色であった.これに対し,北海道では前輪と後輪で構成するいわゆる複輪型のカンジキが主流であった.また,新潟県山間部から移住した人々の場合も,単輪型のカンジキよりも複輪型カンジキを使用している.このことは,両地域における雪質の相異が最も大きな要因と考えられる.北海道アイヌが使用したヒョウタン型カンジキは,岩手県北部,青森県南部にも分布していた.しかし,この関連性については,今回の調査でも解明できなかった.また,八戸市是川遺跡出土のカンジキは,カンジキであるかどうかが問題であり,これらの問題を解明するてがかりにはならなかった.本州における除雪具は,一枚板で製作する雪ベラ,コスキ(木鋤)が主流であった.柄が2m前後ある長いものは,岩手県から北陸地方の山間部にみられ,屋根の雪おろしに使用するものであった.また,日本海沿岸部,山間部の雪ベラは,ブナ材を使用することも大きな特色であった.これに対し,北海道では,箱型状の雪ベラが主流であった.また, 1枚板のコスキを使用していた人々も移住後は箱状の除雪具を使用している.これらの要因もやはり雪質の相異によるものと考えられる.積雪地帯における伝統的有形民俗資料の比較研究調査は,カンジキと除雪具を対象に青森県,岩手県,福島県,秋田県,山形県,富山県,石川県,福井県,長野県,北海道を中心に調査を行った.カンジキは,いわゆる竹を曲げた単輪型が本州における共通した形態であった.中でも新潟県山間部,北陸地方を中心に分布するスカリとその類似型は最も大型のカンジキであり,スカリの上にさらに小型のカンジキをはくといった重複型は,豪雪地帯における最も大きな特色であった.これに対し,北海道では前輪と後輪で構成するいわゆる複輪型のカンジキが主流であった.また,新潟県山間部から移住した人々の場合も,単輪型のカンジキよりも複輪型カンジキを使用している.このことは,両地域における雪質の相異が最も大きな要因と考えられる.北海道アイヌが使用したヒョウタン型カンジキは,岩手県北部,青森県南部にも分布していた.しかし,この関連性については,今回の調査でも解明できなかった.また,八戸市是川遺跡出土のカンジキは,カンジキであるかどうかが問題であり,これらの問題を解明するてがかりにはならなかった.本州における除雪具は,一枚板で製作する雪ベラ,コスキ(木鋤)が主流であった.柄が2m前後ある長いものは,岩手県から北陸地方の山間部にみられ,屋根の雪おろしに使用するものであった.また,日本海沿岸部,山間部の雪ベラは,ブナ材を使用することも大きな特色であった.これに対し,北海道では,箱型状の雪ベラが主流であった.また, 1枚板のコスキを使用していた人々も移住後は箱状の除雪具を使用している.これらの要因もやはり雪質の相異によるものと考えられる.
琉球列島におけるメヒルギ林の衰退要因に関する研究

琉球列島のマングローブの重要な構成樹種の主要病害であるメヒルギ枝枯病の病徴進展・蔓延に影響する要因を明らかにするため、初期病徴形成すなわちシュート壊死に着目し、病徴形成の季節変化、関与する菌類、激害林の水分環境について検討した。本病激害林である沖縄島北部の汀間川メヒルギ林では、初期病徴形成は調査期間を通じて観察されたが、春から初夏に多発し、健全なシュートは1-2年以内にほぼ全てが損傷を受けた。同時期には、西表島の微害林でもメヒルギのシュート端の損傷が春初夏に促進されたが、シュート壊死枝枯の病徴への移行は少なく、両者の比較により本病の流行には春初夏の誘因の関与が大きいことが示唆された。汀間川河川水の水質の定常変化に異常値は見られなかった。また、穿孔・食害性の鱗翅目昆虫の影響は、激害林では一般に大きかったが、発病・進展に必須の誘因ではなかった。これに対して、マングローブの塩分濃度は満潮の冠水時には樹体上部と下部で大きく異なり、罹病木の部位により塩分ストレスの負荷に相違があることがわかった。また、激害林分である名護市真喜屋大川メヒルギ林では、病患部組織から多様な菌類が分離され、その一部は接種試験で病原性を示した。一部の菌株は、本病病原の強病原性菌株に匹敵する病原性を示した。本病病原Cryphonectrialikiuensis自身やこれら病原性を示す菌がシュート壊死を引き起こし、これを引き金にして本病が進展することが推測された。したがって、今後、これら菌類の初期病徴形成への関与を明らかにすれぱ、メヒルギ枝枯病の初期病徴の実験室的な病徴再現が容易となり、本病の激害化を促進する因子の特定につながるものと考えられた。琉球列島のマングローブにおいて広く認められるメヒルギの衰退現象に関与する因子を検討するため、個体の衰退の初期症状と考えられる、シュートへの付傷とシュート組織の壊死について検討した。九州本土から、種子島、奄美大島、沖縄島、石垣島、西表島にいたる地域のメヒルギ林で実態調査を行い、病徴進展に関わる因子を検討した。Shoot diebackを起こしている枝について、壊死部には小動物の食害・穿孔痕が広く認められたが、傷痍部が認められない個体も多数あった。また、それらの頻度と林分の衰退の進行程度との間には、明瞭な関係はなかった。シュートの壊死要囚として、昆虫、貝類などの加害や、植物病原菌類の関与など、多様な生物の関与が推測された。また衰退の進んだ集団が林縁部に多く、かつ、大潮の満潮時の水位よりも高い位置にある枝が強い影響を受けていることから、風などの機械的付傷要因の関与も強く推測される。一方、メヒルギ林衰退は、枝枯症状による林冠の退廃と種子生産の劇的な低下によるものであり、その主因は、常にCryphonectria liukiuensisであった。そこで、多様な因子によってまず若いシュートが壊死し、そこからC.liukiuensisが侵入・発病して枝枯症状に至るプロセスを経るものと考えられた。初期病徴としてのShoot diebackを引き起こす植物病原菌としては、C.liukiuensis自身の関与も観察されたが、ほかに患部からPestalotiopsis sp.など数種の菌株が分離されており、病原性の検討が進められている。また、C.liukiuensisによる枝枯病を促進する誘因として、環境ストレス因子の探索を行った結果、泥質の表土が侵食されている場所に生える個体において罹病が進行していた。

したがって、今後、これら菌類の初期病徴形成への関与を明らかにすれぱ、メヒルギ枝枯病の初期病徴の実験室的な病徴再現が容易となり、本病の激害化を促進する因子の特定につながるものと考えられた。
高等教育に於ける障害学生支援に関する実践的および規範的研究

立命館大学大学院先端総合学術研究科には2009年4月、3名の視覚障害者が同時に入学した。大学院では、「ディジタルデザイン」という、研究遂行上必要となる情報リテラシー能力を伝授するための科目が開設されており、当該新入生らもこの受講を希望したが、視覚障害者は画面を見ながらのマウス操作によってパソコンを使うのではなく、画面を音声で読み上げるソフトを用いてキーボードのみで操作している。こうした形式での情報リテラシー教育に担当教員が対応することはできなかったことから、同じ大学院で学んできた立場で振替受講の形式をとって彼らを受け入れた。しかし、ここで起きた問題はこの大学院固有の問題ではなく、たとえ入学者が一人であっても、学部であっても、共通するところは大きい。ここでの経験をふまえ、課題を検証しつつ、日本教育工学会では実践報告に基づいた口頭発表を行い、障害学会では課題の提示と検証を中心としたポスター発表を行った。障害学生支援に関する研究と実践は、身体障害、中でもとりわけ視覚障害・聴覚障害・肢体不自由の3障害を中心になされてきたため、発達障害・内部障害・精神障害をもつ学生たちは必要な支援が受けられず、あるいは、障害学生支援の対象者にすらなれなかった。この点は以前から問題点として指摘しては来たものの、具体的な検討には至らなかった。今年度は、障害学会の大会を立命館大学が主催して行うことができたため、障害学生支援でいうところの「障害」の意味を問い直すという視点から、障害学のテーマに適当と考え、大会シンポジウムの主題として採用していただいた。シンポジウムの企画から当日の司会まで行ったが、実際に支援を受けている、あるいは支援を必要としているが受けることができない学生たち(発達障害・内部障害・精神障害のいずれも当事者学生)をシンポジストとして、議論・検討を行った。高等教育(大学等)における障害者の受け入れは、近年になってようやく注目されてきた。日本学生支援機構を中心として全国規模の調査が実施され、また日本学生支援機構や筑波技術大学を中心とした大学支援室間のネットワークによって、その実態や問題点が徐々に明らかになってきた。受け入れに積極的な大学に共通することとして、こうした支援を大学内で制度化し、どういう学生に対してどういう支援を行うかを明示しているが、その「制度化」が招く問題点もある。この点を福祉社会学会で報告した。また、立命館大学での具体例を踏まえつつ、日本社会福祉学会の発表ではこれに加えて、現在の障害学生支援制度が学部に在籍する学生の授業を支援することを念頭に置いているが、大学院に在籍する障害をもつ院生の支援は想定しておらず、それによって具体的にどういう問題が生じているかをまとめた。とくに、立命館大学大学院で視覚障害のある院生の支援の実態を、支援を受けて学ぶ院生、支援に携わっている院生らと共にまとめたのが障害学会でのポスター発表である。障害学会第4回大会ではこのほか、「視覚障害学生支援の技法」と題して、視覚障害学生支援に関するこれまでの研究成果をまとめる形でポスター発表を行うとともに、視覚障害者が利用できる支援技術の現状を整理して報告した。これをさらに発展させ、技術面の議論をまとめ、2008年2月の研究会で報告を行った。また、2008年3月の立命館大学と北京大学・北京航空航天大学との交流会(北京にて開催)では、大学における障害者の受け入れ、およびその支援の現状について、日本の事例をまとめて報告し、そこでのやり取りを通して、中国では大学における障害者の受け入れがなされていないこと(それ故議論も起こっていない)、しかしその現状は、戦前の日本と似ていることを感じた。日本学生支援機構を中心として全国規模の調査が実施され、また日本学生支援機構や筑波技術大学を中心とした大学支援室間のネットワークが構築されてきたことにより、その実態や問題点が徐々に明らかになってきた。情報交換の場を設けると同時に、支援ノウハウを共有するためのセミナーが開催された。それらに参加し、具体的な取り組みが紹介し、障害者を受け入れたがどのように支援してよいか分からない大学などの参考にしていただくよう努めた。障害をもたずに教育を受けてきたが、入学の直前乃至在学中に事故や病気によって障害をもった学生は少なくない。そして、こうした学生たちには障害学生支援をはじめとした必要な情報が行き渡っていない。彼らと最初に関わることになる医療関係者やリハビリ関係者も、大学の障害者支援がどうなっているのか、どういう状態なら進学することができるか、情報をほとんどもっていないことも明らかになってきた。さらに、特別支援学校の進路担当者でさえも、大学進学に際して何を為すべきか、大学に何を働きかけていけばよいのか、分かっていない。その点を指摘した。また、これに関連して、障害者が自分の障害とどう向き合うか、障害をどう受容しているのか、そもそも障害は受容できるのかといった問題について考え、まとめた。障害者は、福祉行政からさまざまなサービスを受けて暮らしている。では、障害者自立支援法は、高等教育を受けている/受けようとする障害者の支援にどう関わっているのだろうか。その疑問に答えるべく、さしあたり視覚障害者の読書と通学を例にとってまとめ、日本社会福祉学会で報告した。また、読書に特化して、日本教育工学会における報告で論じた。上記を含め、これまでの取り組みをまとめた上で、立命館大学障害学生支援室とも共同し、そこに蓄積された視覚障害学生支援、とりわけ立命館大学で重点的に取り組んでいるテキスト校正のノウハウをまとめたガイドブックをも盛り込んで、『視覚障害学生支援技法』を生存学研究センターより刊行し、その編集に当たった。

立命館大学大学院先端総合学術研究科には2009年4月、3名の視覚障害者が同時に入学した。大学院では、「ディジタルデザイン」という、研究遂行上必要となる情報リテラシー能力を伝授するための科目が開設されており、当該新入生らもこの受講を希望したが、視覚障害者は画面を見ながらのマウス操作によってパソコンを使うのではなく、画面を音声で読み上げるソフトを用いてキーボードのみで操作している。こうした形式での情報リテラシー教育に担当教員が対応することはできなかったことから、同じ大学院で学んできた立場で振替受講の形式をとって彼らを受け入れた。しかし、ここで起きた問題はこの大学院固有の問題ではなく、たとえ入学者が一人であっても、学部であっても、共通するところは大きい。ここでの経験をふまえ、課題を検証しつつ、日本教育工学会では実践報告に基づいた口頭発表を行い、障害学会では課題の提示と検証を中心としたポスター発表を行った。障害学生支援に関する研究と実践は、身体障害、中でもとりわけ視覚障害・聴覚障害・肢体不自由の3障害を中心になされてきたため、発達障害・内部障害・精神障害をもつ学生たちは必要な支援が受けられず、あるいは、障害学生支援の対象者にすらなれなかった。この点は以前から問題点として指摘しては来たものの、具体的な検討には至らなかった。今年度は、障害学会の大会を立命館大学が主催して行うことができたため、障害学生支援でいうところの「障害」の意味を問い直すという視点から、障害学のテーマに適当と考え、大会シンポジウムの主題として採用していただいた。シンポジウムの企画から当日の司会まで行ったが、実際に支援を受けている、あるいは支援を必要としているが受けることができない学生たち(発達障害・内部障害・精神障害のいずれも当事者学生)をシンポジストとして、議論・検討を行った。
順序付きノルム空間の数域作用素空間への埋め込み

一般のノルム空間をヒルベルト空間上の作用素のなす空間(作用素空間)へ埋め込めるが、ノルム空間が順序を有する場合、順序とノルムの両方を保存して埋め込むことは、一般には成功していない。そこで正値性を保存するために、埋め込みと可換な作用素の研究が必要となった。本研究では、特に埋め込みと可換(テンソルの形)なテープリッツ作用素のなすテープリッツ環の重層構造(アップワードルッキング位相)を解析し、極大イデアルの形を決定した。数域半径作用素空間の視点から、作用素空間、ノルム空間(またその双対)を見ると、様々な問題を提出できるが、ここでの研究は、関数解析的アプローチに的をしぼり、いくつかのノルム空間を自然な条件下で数域半径作用素空間として具体的に表現することを目的としている.20年度は、有限次元可換C*-環の双対空間の具体的な表現(完全正値かつ完全等距離)の構成を目標としたが、その多様性を記述する具体的な表現と可換な作用素の解析が必要となった.特に、表現と可換な作用素としてテープリッツ作用素を考察する中で、Rizky Rosjanuardiの学位論文で扱われた半直積から作られるテープリッツ環のUpwards-Looking Topologyの持つ位相的性質が、研究を進める推進力となることから、Rizkyとの共同研究を開始した.Preprintとして「Noteson the upwards-looking topology」をまとめたが、今後更なる発展が期待できる.一方、表現の正値性を考察する上で新しい視点が必要となろうが、行列作用素システムと作用素空間で互いに扱うことができなかった性質(行列作用素システムでは、完全有界性.作用素空間では、完全正値性)を再考する必要が出てきた.70年代におけるChoi,Effrosの視点に立ち返り、具体的な作用素を用いたアプローチが必要となる.行列作用素システムと作用素空間を統合するこの方策は、Pisierによって提出された作用素空間的とルベルト空間の埋め込み問題にも直接ぐ接近する視点であることから、継続的に研究を推進している.Ruanによって導入された作用素空間が、抽象的作用素空間と具体的作用空間の2つの側面をもつように、伊藤-渚によって導入された数域半径作用素空間も2つの側面(伊藤-渚の公理を満たす空間)と(ヒルベルト空間上の数域半径ノルムをもった有界線形作用素からなる部分空間)をもっている。数域半径作用素空間の視点から、作用素空間、ノルム空間(またその双対)を見ると、様々な問題を提出できるが、ここでの研究は、関数解析的アプローチに的をしぼり、いくつかのノルム空間を自然な条件下で数域半径作用素空間として具体的に表現することを目的としている。これは、1.アラオグル-の定理を用いて一般のノルム空間を可換な連続関数環の中に等距離で埋め込むこと2.Ruanによる作用素空間のヒルベルト空間上の作用素ノルムをもった空間へ(完全有界の意味での)埋め込み3.C*-環の代数構造を含めたヒルベルト空間上の作用素ノルムをもった空間への埋め込みの3通りの埋め込みを等距離同型と順序同型の視点から見直す点に特徴をもつ。*構造を保存し、かつ順序も保存する構造の中に、Rizky Rosjanuardiの学位論文で扱われた半直積から作られるテープリッツ環のUpwards-Looking Topologyの持つ位相的性質が、有効性をもつことから、今年度、Rizkyの共同研究としてテープリッツ環の極大素イデアルの特徴付けを行った。既にプレプリントとしてまとめ、投稿中である。行列作用素システムと作用素空間で互いに扱うことができなかった性質(行列作用素システムでは、完全有界性、作用素空間では、完全正値性)を統合するという問題は、未解決なままであるので、Choi, Effrosの視点に立ち返り具体的な作用素を用いた例の作成を続けている。90年代、Effros-Ruan,Blecher-Paulsenらによって、一般のノルム空間Xに対しても、Xを作用素空間とする多様なノルムの列の存在(言い換えるといろいろなB(H)へめ埋め込み)が示された。しかしながらXが順序構造を持つ場合その埋め込みは、順序を保存していない。実際、*すら保存しない。一方、70年代後半、Choi,Effrosは、作用素システムが順序単位をもてば、XからB(H)の中への完全正値順序同型が存在することを示した。しかし、順序を保存しても、ノルムの保存は、得られない。順序とノルムの両方を保存するB(H)への埋め込みが課題となった。私と渚(千葉大)は、2004年、作用素空間の背後にある多様な数域半径作用素空間の存在を見出し、特に、行列空間上の最大数域半径ノルムの特徴付けを通じて、ヒルベルト空間上の有界線形作用素に定義される通常の数域半径ノルムが、数域半径作用素空間と見たとき最大であることを示し、*を保存する埋め込みを得た。そして、その多様性を記述する具体的な表現と可換な作用素の解析が必要となった。

表現と可換な作用素としてテープリッツ作用素を考察する中で、Rizky Rosjanuardiの半直積から作られるテープリッツ環のUpwards-Looking Topologyの持つ位相的性質が、研究を進める推進力となることがわかり、Rizkyとの共同研究を進めた。今年度の収穫のとしてUpwards-Looking Topologyに伴うテープリッツ環のイデアルの構造を解明し、特に、極大イデアルの形を決定した。
酸化的ストレスによる細胞死と消化管がん抑制機構におけるMUTYHの働き

1. 2-ヒドロキシアデニン/アデニンDNAグリコシラーゼをコードするMutyh遺伝子を欠損したマウス(16匹)と野生型マウス(15匹)にKBrO_3添加飲水(2gL,16週)の投与により酸化ストレスを負荷した。野生型マウスでは1個体当たり平均1個以下の腫瘍形成を小腸にに認めるのみであったが,Mutyh欠損マウスにおいては1個体当たり平均数十個以上の小腸腺腫の形成が認められた。2. rpsLトランスジーンを持つMutyh欠損マウスへのKBrO_3添加飲水の投与実験から,Mutyh欠損によりG : C→T : A突然変異が野生型の20倍以上高頻度に生じることが明らかになった。現在,1と2をまとめて論文を投稿中である。3. Ogg1欠損細胞は,野生型の細胞よりもメナジオンによる酸化ストレス負荷に高感受性でピクノーシスを呈する。Ogg1欠損細胞が示した酸化ストレス感受性はMUTYHのsiRNAによるノックダウンで回復したことから,DNA中に蓄積した8-oxoGに対して取り込まれたアデニンをMUTYHが除去することで細胞死を促進する可能性が示唆された。現在,論文準備中である。4.家族性大腸腺腫症患者でAPC遺伝子に変異を持たずMUTYH遺伝子に変異を持つ家系をのスクリーニングで見つかった新規のMUTYH変異の修復活性に及ぼす影響を解析し,機能欠損を見出した。5. MUTYHの生物学的機能解析を目的としてMUTYH欠損マウスよりマウス胎児繊維芽細胞株(MEF)を樹立し、更に野生型および変異型の組換えMUTYHを発現するMEF株の作成を開始した。
アデノウイルスベクターを用いた目的蛋白の新しい大量産生法の開発

COS細胞とSV40の複製起点(ori)を併用した蛋白の大量発現系は広く研究室レベルで用いられているが、トランスフェクションによる遺伝子導入法では全細胞の1020%しか利用することができない。一方組換えアデノウイルスはCOS細胞を始めとして各種細胞へ高い遺伝子導入効率を示すが、直鎖状の遺伝子のため単独ではSV40系の正確な複製をおこす環状分子は生成しない。そこで組換えアデノウイルスと部位特異的リコンビナーゼCreを併用し、100%のCOS細胞へ複製可能な環状分子を導入する大量発現系(Ad-COS法)の確率を目的として研究を行った。Creは34bpのloxP配列を認識し、相同組換えに必要な一連の反応を単独で行うことが知られている。そこでSV40 oriと発現マーカーであるB型肝炎表面抗原(HBs)発現単位の両側にloxP配列をもつ組換えアデノウイルス(環状分子生成ウイルス)とCre発現組換えアデノウイルスを作成しCOS-1細胞へ同時感染した。その結果Creが発現することにより、環状分子生成ウイルス上のloxP配列で特異的な相同組換えを起こし、100%の細胞で設計どうりの環状分子が生成していたことがサザン法により明らかとなった。また生成した環状分子は3日目に最高500コピーにまで複製していた。Ad-COS法は、100%のCOS細胞へ複製可能な環状分子を導入する系であることが示されたので、従来のトランスフェクション法とAd-COS法での発現量をHBsのELISA法で測定し比較した。従来法は環状分子生成ウイルスと同じインサートを有するプラスミドをカルシウム法により遺伝子導入した。導入7日目までの発現蓄積量を比較したところAd-COS法では従来法の約5倍の発現量である8mg/リットルにまで達していることが示された。組換えアデノウイルスは神経や肝細胞等へも高い遺伝子導入効率を示すので、今後Ad-COS法とSV40T抗原発現組換えアデノウイルスを併用することで各種細胞における大量発現系の確立への発展性が示唆された。
ヒストン翻訳後修飾パターンの複数同時検出を可能とするタンパク質プローブ分子の創成

ヒストンNおよびC末端に存在するヒストンテール(2030残基)におけるアセチル化、メチル化、リン酸化等の翻訳後修飾はクロマチンを構成する種々の生体分子の組成・分布に影響を与え、エピジェネティクスに基づく遺伝子発現制御において重要な役割を果たしている。以上の背景を踏まえ、分割型GFPフラグメントに対し、高次構造既知のヒストン翻訳後修飾認識ドメインを複合化することで、ヒストンテールペプチド上の特定翻訳後修飾パターンを特異的に検出可能な蛍光タンパク質型プローブの構築を達成出来た。ポストゲノムシーケンス時代において、従来のセントラルドグマやメンデルの法則の例外に位置する「エピジェネティクス」機構の解明および制御が重要な研究題材となりつつある。なかでも、ヒストンNおよびC末端に存在するヒストンテール(2030残基)におけるアセチル化、メチル化、リン酸化等の翻訳後修飾はクロマチンを構成する種々の生体分子の組成・分布に影響を与え、遺伝子発現制御において重要な役割を果たしている。以上の背景を踏まえ、平成25年度における研究においては、ヒストン翻訳後修飾パターンの特異的検出を可能とする新規蛍光タンパク質型プローブを開発することを目的とした。今回の実験では、214位分割型緑色蛍光タンパク質(Split-GFP)を基体として用いた。プローブ分子構築にあたって、分割されたタンパク質フラグメントに対し、高次構造既知のヒストン翻訳後修飾認識ドメインを複合化した。具体的には、ヒストンH3上の9位ならびに27位のトリメチル化Lys (KMe3)を特異的に認識するHP1およびCBX4由来クロモドメインを分割型GFPのNおよびC末側断片に複合化した。蛍光スペクトル測定の結果、9および27位に同時にKMe3を持つヒストンH3ペプチド存在下においてのみ再構成反応の促進とより高いGFP蛍光が観測された。以上の結果から、分割型GFPを利用することで、ヒストンテール上の特定翻訳後修飾パターンを特異的に検出可能な蛍光タンパク質型プローブの構築を達成出来たものと考えている。本申請課題では、生細胞内に存在する様々なヒストン翻訳後修飾パターン(ヒストンコード)の複数同時リアルタイム検出を可能とする新規蛍光および発光タンパク質型プローブ分子を開発することを目的とした。タンパク質型プローブ分子構築における基本的方法論として、人工的に切断した分割型タンパク質の再構成反応を利用する。具体的には、分割型緑色蛍光タンパク質類縁体や分割型ルシフェラーゼ等をタンパク質側の基体として用い、分割されたタンパク質フラグメントに対し、様々なヒストン翻訳後修飾認識ドメインを複合化を試みた。分子設計上、ヒストン翻訳後修飾認識ドメインの複合化によって、特定の修飾パターンを持つヒストンタンパク質分子存在下においてのみ、分割型タンパク質の再結合反応の進行とヒストン翻訳後修飾パターン特異的に依存した蛍光あるいは発光機能の回復が期待できる。以上の設計原理に基づき、任意のヒストン翻訳後修飾パターンを蛍光および発光タンパク質由来のシグナル強度を指標として特異的に検出・定量可能な分子認識システムの構築を行った。また、また、構築したヒストン翻訳後修飾認識プローブの性能評価を迅速かつ高精度に行うために、様々な翻訳後修飾を施したヒストンテールペプチドライブラリの化学合成を合わせて行った。成果の一部は、Chem. Commun., 49, 10323-10325 (2013)やPeptide Science 2013, 387-388 (2014)等に報告した。生物有機化学平成25年度の研究計画としては、ヒストン翻訳後修飾パターンの特異的検出を目的として、分割型蛍光タンパク質を利用した新規タンパク質型検出系の構築とその分光学的性能評価を目的としていた。この目的は、おおむね達成出来たものと考えている。分割型蛍光タンパク質を利用する第一世代プローブ分子は励起光を必要とするため、細胞への光損傷や生体組織による励起光吸収等の問題が予測される。従って、一細胞長時間観測や動物体内におけるヒストン翻訳後修飾パターン検出への応用には困難を伴う可能性がある。この点をふまえ、分割型発光タンパク質を用いた第二世代タンパク質型プローブ分子の開発を行う。プローブ分子設計における基本的な方法論は分割型蛍光タンパク質プローブ構築における戦略と同様であるが、分割型ルシフェラーゼをタンパク質側の基体として用いる。分割型ルシフェラーゼの自発的再結合を促すために、デザインしたcoiled-coil構造等の特異的ペプチド間相互作用モチーフを積極的に利用することも計画している。また、発光極大波長や基質特異性の異なるルシフェラーゼを活用することで、複数ヒストン翻訳後修飾パターンの同時検出システムの構築を達成する予定である。異なる翻訳後修飾パターンを施したヒストンテールペプチドライブラリを構築予定であったが、平成25年度はその一部のペプチドの調製で目的を果たすことが出来た。構築したヒストン翻訳後修飾認識プローブの性能評価さらに詳細に行うために、翻訳後修飾を施したヒストンテールペプチドライブラリの化学合成を拡張して行う。研究経費は、アミノ酸誘導体、ペプチド合成用試薬、合成・測定用器具、クロマトカラムおよび制限酵素等の消耗品は、本申請課題におけるペプチドの合成ならびに関連タンパク質の調製に使用する。
トリウム系燃料の湿式再処理に関する基礎研究

トリウム系の使用済燃料を対象とした湿式再処理におけるトリウムとウランの分離にパルスカラム抽出装置を利用することを想定した。この抽出装置では、分散液滴群の液滴径とその挙動にもとづく物質移動係数が、抽出装置の合理的設計あるいは抽出速度の決定に不可決なものとなっている。本研究では、まず分散液滴径の計測に対して新規な高分子電解質によるゲル固化法を提案した。このゲル固化法は、ほぼ静止状態から乱流状態で単孔ノズルから生成する分散液滴の液滴径の計測に適用され、その妥当性が明らかとなった。さらに、ボンド数とウェーバ数の関数形として分散液滴径を推算できる実験式を得た。これにより、ノズル流速に対する一連の滴化現象から生成する液滴径を統一的に取扱えることがわかった。次いで、このゲル固化法をパルスカラム内で生成する分散液滴群の計測に応用した。カラム内の分散液滴群の平均液滴路は、既住の文献値をも含め修正ウェーバ数と開孔率を使用した実験式で良好に相関できた。また液滴群の分散液滴は対数正規分布に従った分散であることおよび各測定値の液滴径を平均液滴径との比とすることにより、液滴群の分布状態を予測できる推算式を明らかにした。最後に、試作した小規模のパルスカラム抽出装置により2MH【NO_3】-30%TBP/Dodecane系での硝酸の抽出実験を行い、カラム内での硝酸の濃度分布を求めた。この濃度分布を分散液滴群の平均液滴径と分布の推算式による計算値と比較した。脈動強度の小さい場合には、測定した濃度分布は平均液滴径あるいは分布を考慮した計算値とほぼ一致した。一方、脈動強度の大きい場合には液滴径分布を考慮した計算値に近づいた。以上のことから、パルスカラム内での分散液滴群の平均液滴径と分布を考慮することにより、実際の抽出操作条件にそくした抽出成分のカラム高さに対する濃度分布が得られることが明らかとなった。
抗癌剤治療の卵巣機能への影響に関する研究

25日齢の雌ラットの発育卵胞を摘出して器官培養を行う系を用いて実験を行った。卵胞摘出前にequine chorionic gonadotropinを作用させると、TUNEL法によるアポトーシスの発現が有意に減少することが示された。同時にこのアポトーシス発現の減少に合わせてカスパーゼ3のmRNAの発現が減少していた。このことより、卵胞におけるアポトーシスの発現にはカスパーゼ3が関与していることが示唆された。さらに、Fas-Fas ligand系とnitric oxide (NO)系が卵巣アポトーシスを調節している可能性も示唆されているので、今回この2つの系が相互に関連しあっているか否かを、ラット卵巣顆粒膜細胞培養系を用いて検討した。Fas ligand添加により培養系細胞は細胞死を呈するが、同時にカスパーゼ阻害剤を添加すると細胞死を抑制することができた。また、NO供給剤であるインターフェロンγの同時添加によってもFas ligandの細胞死誘導を抑制することができた。これらより、卵巣局所において両系の間での調節が行われていることが推察できた。また、線虫における腫瘍抑制因子のヒトでのアナログであるhScribの癌組織における細胞死での役割を検討するため、Hela細胞を用いたアポトーシス発現の検討とhScribの関係を観察した。その結果、カスパーゼによるhScribの崩壊がアポトーシスに重要なステップとなっていることが推察された。本研究により、卵巣機能不全や排卵障害、早発閉経の病態の解明、さらには悪性腫瘍治療における生殖機能温存を考慮した治療法の開発が進むことが期待される。生後6、7週のB6C3F1雌マウスに抗癌剤のdocetaxelを腹腔内投与し、9週で卵巣を摘出、連続切片を作製しアポトーシスの有無を観察した。また4週齢でPMSによる過排卵刺激をした後、顆粒膜細胞を採取、docetaxel 10nM,100nM,1uM存在下に、24、48時間培養し、MTTアッセイ法で生細胞活性を測定した。さらに顆粒膜細胞の細胞周期からみたアポトーシス陽性率を、flow cytometryで観察した。その結果、9週で摘出した卵巣の卵胞数は、docetaxel 5、20、100mg/kg投与群でそれぞれ対照の70.0、56.4、47.6%に減少し、特に原始卵胞の減少が著明であった。培養顆粒膜細胞はdocetaxel 100nM存在下で24、48時間後にそれぞれ対照の79.4±2.4(mean±SEM)、70.3±2.0%と有意に減少した。Flow cytometryによる観察で、docetaxel投与群では対照に比しアポトーシス分画であるsubG1期の細胞数が、濃度(10nM1uM)と時間(2472時間)に比例して増加した抗癌剤投与がアポトーシス関連遺伝子に与える影響につき検討した。Paclitaxel、docetaxel、etoposideを投与したマウスにおいて、顆粒膜細胞、卵細胞でのbax遺伝子の分布を免疫組織化学的に観察し、対照群との比較によりbaxの関与の有無を検討している。種々の抗癌剤の顆粒膜細胞に与える作用の強度の差異を検討した。抗癌剤は、paclitaxel、docetaxel、vincristine、melphalan、etoposide、cyclophosphamideである。この検討は、マウスに対する抗癌剤投与すなわちin vivoの系とマウスから取り出した顆粒膜細胞を培養してのin vitroの系の両方で行った。B6C3F1雌マウスに生後6、7週で種々の抗癌剤を種々の用量で腹腔内投与し、9週で卵巣を摘出、連続切片を作製しアポトーシスの有無につき観察した。抗癌剤投与がアポトーシス関連遺伝子に与える影響につき検討した。

種々の抗癌剤を投与した4週齢のB6C3F1雌マウスにおいて、顆粒膜細胞、卵細胞でのbax遺伝子の分布を免疫組織化学的に観察し、対照群との比較によりbaxの関与の有無を検討した。Bcl-2タンパク、カスパーゼの分布についても同様に抗癌剤投与群と対照群との比較を行った。bcl-2遺伝子群では、bax遺伝子でコードされたタンパクBaxがアポトーシスを起こしつつある卵胞で強く発現することがマウスにおいて免疫組織化学的に示されたが、さらにマウスにおいてBaxの欠如した卵巣で卵巣の機能が延長することが示された。Bcl-2は卵胞アポトーシスを抑制することが知られているが、さらに卵細胞内にbcl-2を過剰発現させるとその卵胞の閉鎖が抑制されることも示された。逆にbcl-2遺伝子が欠如したマウスでは、卵細胞および原始卵胞の数が減少した。エストラジオールは黄体退縮を抑制するが、この時にbcl-2遺伝子の発現が増すことが示された。昨年度に引き続き、種々の抗癌剤の顆粒膜細胞に与える作用の強度の差異を検討した。抗癌剤は、paclitaxel、docetaxel、etoposide、cyclophosphamideである。この検討は、マウスに対する抗癌剤投与すなわちin vivoの系とマウスから取り出した顆粒膜細胞を培養してのin vitroの系の両方で行った。B6C3F1雌マウスに生後6、7週で種々の抗癌剤を種々の用量で腹腔内投与し、9週で卵巣を摘出、連続切片を作製しアポトーシスの有無につき観察した。次に、抗癌剤投与がアポトーシス関連遺伝子に与える影響につき検討した。Bc1-2タンパク、カスパーゼの分布についても同様に抗癌剤投与群と対照群との比較を行った。bc1-2遺伝子群では、bax遺伝子でコードされたタンパクBaxがアポトーシスを起こしつつある卵胞で強く発現することがマウスにおいて免疫組織化学的に示されたが、さらにマウスにおいてBaxの欠如した卵巣で卵巣の機能が延長することが示された。Bc1-2は卵胞アポトーシスを抑制することが知られているが、さらに卵細胞内にbc1-2を過剰発現させるとその卵胞の閉鎖が抑制されることも示された。逆にbc1-2遺伝子が欠如したマウスでは、卵細胞および原始卵胞の数が減少した。
次世代シーケンサーを用いたヌーナン症候群類縁疾患の網羅的遺伝子診断システムの確立（国際共同研究強化）

ヌーナン症候群は低身長、特徴的顔貌、先天性心疾患、発達の遅れなどを主徴とする先天性疾患である。その原因遺伝子は2001年にPTPN11が同定され、患者の約40%で同遺伝子に変異が同定されている。我々は2005年にヌーナン症候群の類縁疾患であるコステロ症候群およびCFC症候群の原因遺伝子がそれぞれHRASおよびBRAF,KRASであることを世界に先駆けて報告した。これらの発見により、細胞内シグナル伝達経路であるRAS/MAPK経路を構成する分子をコードするこれらの遺伝子の変異が、臨床的に類似した症候群を引き起こすという概念を確立した。その後ヌーナン症候群の原因遺伝子が次々に同定され、NGSの普及により現在では10以上の原因遺伝子の報告がある。基課題ではそれらの遺伝子の網羅的解析をNGSを使って行う手法の確立を行った。本研究課題では、これらの網羅的解析によって同定された遺伝子バリアントが病的意義を持つかを判断するため、国際共同研究により、その遺伝子バリアントを持つゼブラフィッシュモデルを確立し、その解析を行うことを目的とした。我々は全エクソーム解析により同定された新規原因遺伝子Xのバリアントに注目し、ゼブラフィッシュモデル確立を行った。まず遺伝子Xの野生型あるいは変異型cDNAを含むコンストラクトを作成し、それを鋳型としてRNA合成を行った。更にゼブラフィッシュ受精卵に野生型あるいは変異型RNAを注入し、受精後3日まで表現型の解析を行った。その結果、RNA非注入群と比較して野生型注入群では表現型の変化はなかったが、変異型注入群では顎部軟骨の発生に遅滞が認められた。また、体長に比した頭長は変異型注入群で長かった。以上より、変異型遺伝子Xの発現はモデル生物において発生に影響を与えることが示された。これらに培養細胞実験で得られた知見を加え、論文投稿中である。内定年度:2015次世代シークエンサーによる網羅的遺伝子解析の結果、病因としての報告がないバリアントを同定することが増えており、家系内でのsegregationを確認することもできずVUS(variants of uncertain significance)のままとなる場合も多い。その意義付けのための実験系として、モデル動物作成は有力な手法となりうる。そこでヌーナン症候群およびその類縁疾患患者の遺伝子解析で同定された遺伝子変異を持つゼブラフィッシュモデルを作成し、個体の表現型への影響を評価する実験系を確立することを目標として、平成28年7月より米国ノースカロライナ州ダーラムのDuke大学医学部Center for Human Disease Modelingに滞在し、共同研究の一環として指導を受けた。帰国後にも日本国内で同様の実験を行うために、まずゼブラフィッシュ胚へのインジェクション技術獲得を目指した。インジェクション用の針の作成、キャリブレーション、既知の表現型を示すMorpholinoの、胚への実際のインジェクションなどを繰り返すことを通じて、一連の技術を習得するとともに正常な胚の発生を学んだ。更に、基課題で同定された病的意義が明らかでない遺伝子変異を導入するためpCS2+ベクターに野生型および変異型cDNAを組み込み、それを鋳型としてRNAを合成した。それをゼブラフィッシュ胚にインジェクションし、経時的に表現型の評価を行った。RNA量などの条件検討や詳細に評価すべき表現型の検討、表現型評価のための染色法の習得などを継続している。ゼブラフィッシュ胚へのインジェクション技術の獲得は達成した。ヌーナン症候群およびその類縁疾患患者の遺伝子解析で同定された遺伝子変異を持つゼブラフィッシュモデルを作成し、個体の表現型への影響を評価する実験系を確立することを目標としたが、ほぼ達成に近づいている。帰国後に日本国内で同様の実験を行うために、トラブルシューティングなどより深い知識、技術を今後身につける予定である。次世代シークエンサーによる網羅的遺伝子解析の結果、病因としての報告がないバリアントを同定することが増えており、家系内でのsegregationを確認することもできずVUS(variants of uncertain significance)のままとなる場合も多い。そこでヌーナン症候群およびその類縁疾患患者の遺伝子解析で同定された遺伝子変異を持つゼブラフィッシュモデルを作成し、個体の表現型への影響を評価する実験系を確立することを目標として、平成28年7月より平成29年7月まで米国ノースカロライナ州ダーラムのDuke大学医学部Center for Human Disease Modelingに滞在し、共同研究の一環として指導を受けた。morpholinoなどの胚への実際のインジェクションなどを繰り返すことを通じて、一連の技術を習得するとともに正常な胚の発生を学んだ。更に、基課題で同定された病的意義が明らかでない遺伝子変異cDNAまたは同遺伝子の野生型を鋳型として合成したRNAをゼブラフィッシュ胚にインジェクションし、経時的に表現型の評価を行った。その結果をまとめ、更に実験を追加して論文を作成し発表予定である。さらに、帰国後にもゼブラフィッシュを用いた実験を行うため、飼育設備を整えゼブラフィッシュの飼育を開始し、顕微鏡やインジェクターなど必要物品を揃えた。ゼブラフィッシュ胚へのインジェクション技術の獲得は達成し、その表現型の評価法も習得した。

我々は2005年にヌーナン症候群の類縁疾患であるコステロ症候群およびCFC症候群の原因遺伝子がそれぞれHRASおよびBRAF,KRASであることを世界に先駆けて報告した。これらの発見により、細胞内シグナル伝達経路であるRAS/MAPK経路を構成する分子をコードするこれらの遺伝子の変異が、臨床的に類似した症候群を引き起こすという概念を確立した。その後ヌーナン症候群の原因遺伝子が次々に同定され、NGSの普及により現在では10以上の原因遺伝子の報告がある。基課題ではそれらの遺伝子の網羅的解析をNGSを使って行う手法の確立を行った。本研究課題では、これらの網羅的解析によって同定された遺伝子バリアントが病的意義を持つかを判断するため、国際共同研究により、その遺伝子バリアントを持つゼブラフィッシュモデルを確立し、その解析を行うことを目的とした。我々は全エクソーム解析により同定された新規原因遺伝子Xのバリアントに注目し、ゼブラフィッシュモデル確立を行った。まず遺伝子Xの野生型あるいは変異型cDNAを含むコンストラクトを作成し、それを鋳型としてRNA合成を行った。更にゼブラフィッシュ受精卵に野生型あるいは変異型RNAを注入し、受精後3日まで表現型の解析を行った。その結果、RNA非注入群と比較して野生型注入群では表現型の変化はなかったが、変異型注入群では顎部軟骨の発生に遅滞が認められた。また、体長に比した頭長は変異型注入群で長かった。以上より、変異型遺伝子Xの発現はモデル生物において発生に影響を与えることが示された。これらに培養細胞実験で得られた知見を加え、論文投稿中である。野生型及び変異型を導入したゼブラフィッシュの表現型の評価を確立した後、RAS経路を阻害する薬剤を投与することによって表現型が改善するかを評価することによって、RAS経路の活性化が表現型発現の原因であるかをより明確にするとともに、RAS経路以外の経路への影響を確認することを予定している。さらに治療法開発へ向けた薬剤スクリーニングでのゼブラフィッシュ活用法についても指導を受ける予定である。渡航先での結果に加えて帰国後にさらなる実験結果を加え論文投稿予定である。更に渡航先で習得した技術を用いて帰国後にもゼブラフィッシュを用いた実験を行うため、飼育設備の整備などを行っている。
三叉神経節の神経-免疫系をターゲットとした顎顔面痛覚異常の病態解明と治療法の開発

前年度はマウスの上顎神経を結紮して三叉神経節におけるIba-1標識マクロファージ様細胞の経時的な数の変化ならびに形態変化について調べた結果、神経を結紮後3ー5日で侵害刺激を受けた三叉神経節の神経細胞周辺にIba-1標識マクロファージ様細胞の増加が認められた。その後、今年度にかけて、そのIba-1標識マクロファージ様細胞が血管由来なのか三叉神経節内の既存のマクロファージ様細胞由来なのかを調べるために当初カエデマウスを使用して観察することを目指していたが、カエデマウスの蛍光はアルデヒド固定組織では使えないことが判明したため、代わりの方法としてGFP標識マウスの骨髄細胞を注入して血管を経由して三叉神経節内で増加するかどうかを調べた。その結果、神経結紮をして三叉神経内で増加するIba-1標識マクロファージ様細胞で血管由来のGFP陽性細胞はほとんどなく、既存の三叉神経内のIba-1標識マクロファージ様細胞が増えていることが明らかとなった。この結果は、結紮後BrdU陽性のIba-1陽性マクロファージ様細胞が結紮後3日程度で増えることでも確認できた。侵害刺激後のIba-1標識マクロファージ様細胞は細胞数とともにサイズも大きくなった。このことは何らかの因子により細胞増殖と活性化が同時に生じているものと思われた。この活性化したマクロファージ様細胞は刺激後7日程度で傷害を受けた神経細胞に近づき、神経細胞周囲を取り囲んでいる衛星細胞の間に割って入る様な形で神経細胞に接触を始め、時間が経つと複数のマクロファージ様細胞が神経細胞に直接接触していた。これらのマクロファージ様細胞が神経傷害的なものか保護的に働くものなのかCD抗原で調べた結果、これらのほとんどは神経保護的であることが明らかとなった。これらの結果より、末梢神経が傷害を受けると三叉神経節内で神経を保護するシステムがあることが明らかとなった。本年度の研究計画としてはマウスの上顎神経を結紮したのち、三叉神経節内での細胞の動態、特にマクロファージ様細胞の動態を詳細に調べることであった。マクロファージ様細胞は上顎神経結紮後、3日間で急激に増加しその後は1週間以上に渡って増加した状態で一定になった。また、増加した細胞が内在性のものが増殖したものか、骨髄由来の細胞が流入したものかを調べる為に、GFP発現マウスとのキメラマウスを使い同様の実験を行った。結果、ほとんどの細胞が内在性のマクロファージ様細胞が増殖したものであったが、一部血管からの細胞の流入も見られた。増殖したマクロファージ様細胞の動態を詳細に調べると、細胞傷害型もしくは貪食に至るマクロファージ様細胞と、一部突起を伸ばし三叉神経節の神経細胞に突起を伸ばし、衛星細胞と神経細胞の間に入り込む細胞保護型のマクロファージ様細胞が認められた。神経細胞を細胞死を検出するTUNEL法と細胞傷害のマーカーであるATF3で染色すると、多くの細胞がATF3陽性を示すが、細胞死を示すTUNEL陽性の神経細胞は少なかった。これらの結果より、三叉神経に慢性刺激を与えると、内在性のマクロファージが増殖し、活性化が誘導され三叉神経節神経細胞周囲の衛星細胞のバリアを突破してマクロファージ様細胞が接触し、何らかの保護作用をしていることが示された。一方、三叉神経節も内在性以外のマクロファージ様細胞の動態を調べるためにカエデマウスの導入を予定していたが、導入が遅れ次年度に導入がずれ込むことになった。現時点では、カエデマウスの代わりにキメラマウスを使って同様の実験を行った。計画ではカエデマウスを導入する予定であったが、手続きが遅れてまだ導入できていない。カエデマウスについては通常のホルマリン固定では蛍光が消失する欠点が見つかったので、その点についてもどのように研究に用いるか、検討が必要である。三叉神経節神経細胞とマクロファージ様細胞の相互作用を生じる分子についての具体的な検索が進んでいない。

この活性化したマクロファージ様細胞は刺激後7日程度で傷害を受けた神経細胞に近づき、神経細胞周囲を取り囲んでいる衛星細胞の間に割って入る様な形で神経細胞に接触を始め、時間が経つと複数のマクロファージ様細胞が神経細胞に直接接触していた。これらのマクロファージ様細胞が神経傷害的なものか保護的に働くものなのかCD抗原で調べた結果、これらのほとんどは神経保護的であることが明らかとなった。これらの結果より、末梢神経が傷害を受けると三叉神経節内で神経を保護するシステムがあることが明らかとなった。本年度はまずは進行しているマクロファージ様細胞の形態変化を詳細に検討し、傷害型なのか保護型なのかの検討を行う。また、傷害型なのか保護型かの種々のマーカーを用い再度確認する。次に、三叉神経節における神経細胞もしくは衛星細胞から出されるマクロファージの増殖因子が何かを確認し、また活性化したマクロファージ様細胞が神経細胞にコンタクトして何を認識しているのかを明らかにする。並行して、カエデマウスを導入し、侵害刺激授与後の細胞動態について調べる。最終的には疼痛閾値に対してどの様なファクターが働いているのか、動物の行動実験も含めて調べる。もし、カエデマウスを使った実験が当初の予定どおり進まなかった場合は、GFP発現マウスとのキメラマウスを用いて検討する。平成29年度にカエデマウスを導入する予定であったが、導入準備に時間がかかったため平成29年中の導入ができなかった。したがってその分の予算を平成30年度に残しておくことになった。平成29年度の残高は平成30年度のカエデマウスの導入として使う予定である。
ヒトサンプルでのアンギオテンシン変換酵素とアルツハイマー病の関連性に関する研究

アンギオテンシン変換酵素(ACE)がAβ1-42を1-40に切断する事をヒト、マウスで明らかにした。ACEには遺伝子多型(Isoleucine; I/Aspartic acid; D)が存在しItypeが発症リスクとされている。神経病理診断を行った488例でACE I/D多型とAlzheimer病(AD)との関連を検討した。165例がADと診断されACE多型はAD群DD 25(15%)/ID 73(44%)/II 67(41%)に対しnonAD群がDD 42(13%)/ID 141(44%)/II 140(43%)となりカイ二乗検定では統計的有意差はなかった。計画書に基づいてACEがAβ1-42断片のN末ジペプチドを切断することでアルツハイマー病の病態に影響を及ぼす可能性について臨床血液サンプルと病理脳組織を収集し解析を進めるとともに新たなサンプル収集体制も構築している。臨床血液解析:ボランティア、外来・入院患者を含めて310名から採血を行い、血清、血漿、血球を保管している。ACE定量は血漿を用いて310名全員の定量が終了した。今後、臨床情報の収集を行いアルツハイマー病との関連性について検討を行なっている。ACE活性は血漿を用いて310名全員の定量が終了した。ACE遺伝子多型は血球を用いて17番染色体ACE遺伝子イントロン16の287番目のAlu配列の挿入(insertion)/欠失(deletion)多型(I/D多型)が酵素活性に影響すると言われているがめb)で測定した酵素活性との相関、またそのアルツハイマー病との関連性について検討を行なっていく。病理脳解析:本年は現在10例の病理解剖が終了している。昨年は31例の病理解剖があり、福祉村ブレインバンク症例総数は606例となった。全例の固定脳、凍結脳が保管されている。ACE遺伝子多型はApoE多型を解析結果もある488例のACE I/D多型遺伝子解析を行った。病理診断・病理所見を照合しアルツハイマー病、ApoE4の保有状況等との関連性について解析を行っている。免疫染色は老人斑とACEの発現部位との形態学的関連性の検討を行っている。ACE定量は老人斑を形成するAβの各フラグメント、その中でもACEの基質としてのAβ42と分解産物のAβ40との量的な相関を生化学的手法を用いて行う。計画書に基づいてACEがAβ1-42断片のN末ジペプチドを切断することでアルツハイマー病の病態に影響を及ぼす可能性について臨床血液サンプルと病理脳組織を収集し研究環境を整えている。1)臨床血液解析:ボランティア、外来・入院患者を含めて310名から採血を行い、血清、血漿、血球を保管している。a)ACE定量:血漿を用いて310名全員の定量が終了した。今後、臨床情報の収集を行いアルツハイマー病との関連性について検討を行なっていく。b)ACE活性:血漿を用いて310名全員の定量が終了した。c)ACE多型:血球を用いて17番染色体ACE遺伝子イントロン16の287番目のAlu配列の挿入(insertion)/欠失(deletion)多型(I/D多型)が酵素活性に影響すると言われているが、b)で測定した酵素活性との相関、またそのアルツハイマー病との関連性について検討を行なっていく。2)病理脳解析:本年はすでに病理解剖が12例が終了している。昨年は36例の病理解剖があり、福祉村ブレインバンク症例総数は567例となった。a)ACE定量:症例を絞り、老人斑を形成するAβ、その中でもACEのサブストレートとしてのAβ42と分解産物のAβ40との量的な相関を今後行なっていく。b)ACE活性:活性においても各Aβ量との関係を検討する。c)ACE多型:491例のACE I/D多型遺伝子解析が終了した。今後、さらに解析症例を増やしていくとともに、これらの症例の病理診断・病理所見とを照合し老人斑の量的な問題にACE多型が関係するかを解析していく。d)形態的:ACEの抗体を入手する準備をしている。抗体が入手できれば老人斑との形態的な関係について検討していく。