hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Word2Vecによる医学用語の分散表現は疾患間の数学的距離を定量的に表現するか

病歴聴取は最も臨床診断に寄与する技術であるが人工知能・機械学習へは未だ置換されていない。疾患と疾患の類似度を定量的に評価する手法が無く、適切に学習やレコメンドできないことが一因である。病歴聴取を中心に診断困難例を診断している総合診療科のカルテの自然言語に「Word2VecやDoc2Vec」という単語の分散表現を適応することで、「疾患間距離」や「症状間距離」が計算できることが予想され、本研究はその実験研究である。今回得られる特徴量は日本語を解析させた情報であり、日本発の自動診断システム・診断推論補助システムの構築を推し進めることができ、悲劇的な見逃しや誤診を防ぐ未来につながると考える。
豊臣コレクションの歴史図像学的研究

本研究は、中近世日本における武家政権の宝物(絵画)コレクションとその歴史図像学的研究である。大坂城宝蔵にあった豊臣秀吉・秀頼の絵画コレクションを詳細に書き写した『豊臣御数寄屋記録』を翻刻・紹介した。本史料に掲載された作品の比定作業により、中近世武家政権の宝蔵とコレクションの継承と断絶の歴史を解明した。また、足利尊氏甲冑騎馬肖像画、豊臣秀吉像、東京藝術大学所蔵「聚楽第行幸図屏風」、徳川美術館所蔵「龍虎図」をとり上げ、豊臣政権の美術戦略を考察した。さらに、湯田中温泉よろづや所蔵「唐獅子図屏風」や金沢市内の板戸絵の調査により、中近世の獅子・虎図の歴史図像学的考察をすすめた。本年度は、基礎作業が中心であった。『豊臣御数寄屋記録』について、東京大学史料編纂所所蔵謄写本の閲覧と確認作業をすすめた。また近世の画譜類や近代の売立目録等を参考にしながら、国立国会図書館、早稲田大学図書館等の研究機関にて調査を行ない、データベース等の各種検索システムを利用するなどして、同史料に掲載された絵画作品を中心に現存作品との照合作業を行ない、伝来等の情報収集にとりかかっている。また、所収作品のなかでも「尊氏馬上図」をとり上げ、足利尊氏甲冑騎馬肖像画と15世紀後半の甲冑騎馬肖像画に関する口頭発表、論文執筆を行なった。これに関連して、17世紀の甲冑肖像画である「本多忠勝像」の制作背景について民衆史研究会大会にて報告し、論文を執筆した。さらに、16世紀の天皇・天下人の宝物コレクションについて論じる予定の『天皇の美術史』(吉川弘文館)について、執筆準備を進めつつある。そのほか『仏教文明と世俗秩序』(勉誠出版)、『歴史の「常識」をよむ』(東京大学出版会)、『日本美術全集』(小学館)、『日本「文」学史をひらく』、『里山の環境人文学』等に中世肖像画関連の調査と論文執筆を行なった。『豊臣御数寄屋記録』について、東京芸術大学図書館本の閲覧、校合を行ない、東京大学史料編纂所所蔵謄写本を底本として、史料翻刻をすすめ、『金沢大学学校教育学類紀要』8号に掲載した。昨年度にひきつづき、国会図書館・早稲田大学図書館、各種データベース等により、同史料所載の絵画作品の伝来等に関する情報収集を継続した。「天皇と天下人の美術戦略(仮)」(『天皇の美術史』吉川弘文館2017年予定)の執筆を中心に、「足利尊氏像と再生産される甲冑騎馬肖像画」(中島圭一編『14世紀論集(仮)』高志書院2016年予定)、『教育実践研究』41号、『歴史教育の中の絵画資料』(早稲田教育ブックレット14)、『里山の環境人文学』を執筆した。また『民衆史研究』89号、『日本「文」学史』、『日本美術全集』8が刊行された。『豊臣御数寄屋記録』の全文翻刻を公表できた。またこの史料を考察した論考や著書『天皇の美術史』の執筆が順調に進んでいる。湯田中温泉よろづや所蔵「唐獅子図屏風」は、狩野永徳筆の御物本を18世紀後半に狩野典信・惟信親子が忠実に模写したもので、今回、はじめて調査・撮影を実施した。額装打ちつけの現状から、写真撮影と画像処理はやや大がかりなものとなったが、近世狩野派による唐獅子図の模写、龍虎図の展開を考える上で貴重なデータとなった。東京藝術大学所蔵「探幽縮図」所収「聚楽第行幸図屏風」の熟覧・撮影を行なった。行幸後ほどなくしてつくられた本図は、実際の行列(『聚楽行幸記』)に改変を加えて豊臣秀吉・秀次とその親族筋の大名、直臣たちを強調して描き、後陽成天皇の鳳輦と秀吉の牛車との対表現を通して豊臣政権の栄華を賛美する目的で制作されたものであることを明らかにした。そのほか、毛利博物館より唐獅子図屏風関係史料の写真入手、国会図書館・早稲田大学図書館にて資料収集を行なった。『豊臣御数寄屋記録』所載の足利尊氏甲冑騎馬肖像画について、中島圭一編『十四世紀の歴史学』(高志書院)に論文を掲載した。そのほかの成果を、『天皇の美術史』3(高岸輝氏と共著書、吉川弘文館2017年4月刊行予定)の第2章「天皇と天下人の美術戦略」にまとめた。勿来関図や牛若丸図など、そのほかの作品についても、今後、研究・史料紹介を公表してゆく予定である。なお、金沢市承証寺・高岸寺・個人宅に所蔵される龍虎図板戸絵等の調査を実施し、一部を『日本海域研究』48号に史料紹介として掲載した。また『里山という物語』(結城正美氏と共編著)を編集、刊行予定である。

さらに、湯田中温泉よろづや所蔵「唐獅子図屏風」や金沢市内の板戸絵の調査により、中近世の獅子・虎図の歴史図像学的考察をすすめた。基礎作業はおおむね当初、予定していた主要な絵画作品について確認済みである。ただし、初年度に予定していた『豊臣御数寄屋記録』の全文翻刻を学術雑誌・紀要等に掲載できなかった。全文の確認作業に万全を期した上で、できるだけ早い掲載を目指したい。『豊臣御数寄屋記録』を考察した著書『天皇の美術史』の刊行をめざす。ひきつづき同史料所載の絵画について照合作業をすすめ、個別作品の考察を進めてゆく。中世末から近世にかけて制作された龍虎図、天神像、牛若丸図、勿来関図等を予定している。中近世日本文化史『豊臣御数寄屋記録』の公表を最優先の課題とする。引き続き、主要作品の照合作業をすすめながら、データベース作成のための準備をすすめることにしたい。豊臣コレクションの分析をもとに、『天皇の美術史』(吉川弘文館)を執筆するほか、数本の論文執筆、掲載を予定している。
関数形状のタイプ推定と関数近似を利用した効率的な制約付き最適化に関する研究

汎用的かつ効率的な制約付き進化的アルゴリズムを実現するために,次の項目について研究を行った。1目的関数の形状タイプを推定するために,直線上にサンプリングを行う方法と近傍グラフを構成して谷点を推定する方法を提案した。2Differential EvolutionとParticle Swarm Optimizationについて形状タイプに基づくアルゴリズムパラメータの自動調整法を提案した。3制約付き最適化を行うε制約法において,目的関数だけでなく制約逸脱度についても低精度近似モデルを導する方法を提案した。これにより,汎用性が高く探索効率の高い制約付き最適化アルゴリズムが実現できることを示した。本研究の目的は,進化的アルゴリズムを対象として,目的関数の形状タイプ推定によりアルゴリズムパラメータを自動調整する方法,近似モデルを用いた関数評価回数の削減方法,制約付き問題を解くε制約法の改良について研究を推進し,効率的で汎用的な制約付き最適化アルゴリズムを開発することである。本年度の研究内容と主な成果は次の通りである。1目的関数の形状タイプ推定:単峰性と多峰性を分類する方法として,昨年度はサンプリングに基づく方法を提案したが,今年度はグラフに基づく方法について検討した。探索点集合から近接グラフを構成し,接続された点における関数値の大小関係を判定する。隣接する全ての点よりも関数値が良好な点を谷点と推定する方法である。谷点の数が1ならば単峰性,そうでなければ多峰性と判定する方法を提案し,その有効性を確認した。2アルゴリズムパラメータの自動調整:本研究では,進化的アルゴリズムとしてDifferential Evolution (DE)を採用している。DEのアルゴリズムパラメータであるスケーリングファクターFと交差率CRについて,1の形状タイプ推定に基づき,単峰性の場合は収束速度を高めるためにFを小さくCRを大きくし,多峰性の場合は局所解を避けるためにFを大きくCRを小さくするという調整法を組み込んだNRDE(DE with Nest-building and Role-sharing)を提案した。ベンチマーク問題に対してNRDEを適用しその有効性を示した。3制約付き最適化の効率化:制約付き最適化の効率向上のために,低精度近似モデルを用いて関数評価回数を削減する比較推定法とε制約法を統合する方法について検討した。目的関数を低精度近似モデルであるカーネル回帰モデルにより近似して関数評価回数を削減するεDEkrを提案し,13のベンチマーク関数について実験を行い,その有効性を確認した。本研究の目的は,進化的アルゴリズムを対象として,目的関数の形状タイプ推定によりアルゴリズムパラメータを自動調整する方法,近似モデルを用いた関数評価回数の削減方法,制約付き問題を解くために提案してきたε制約法の改良について研究を推進し,効率的で汎用的な制約付き最適化アルゴリズムを開発することである。1目的関数の形状タイプ推定:本年度は,目的関数の形状タイプとして,単峰性と多峰性の判定について研究を進めた。探索点群の重心と最良探索点を結ぶ直線上に均等にサンプリング点を設定し,サンプリング点における目的関数値の増減により,増減回数が1回ならば単峰性,そうでなければ多峰性と判定するする方法を提案し,その有効性を確認した。2アルゴリズムパラメータの自動調整:本研究では,進化的アルゴリズムとしてDifferential Evolution (DE)を採用しているが,DEを効率的に実行するためには,アルゴリズムパラメータを適切に設定する必要がある。DEのアルゴリズムパラメータであるスケーリングファクターFについて,1の形状タイプ推定に基づき,単峰性の場合は収束速度を高めるためにFを小さくし,多峰性の場合は局所解を避けるためにFを大きくするという調整法を組み込んだLMDE(DE with detecting Landscape Modality)を提案した。13種類のベンチマーク問題と20種類の大規模問題に対してLMDEを適用しその有効性を示した。3制約付き最適化の効率化:我々は各探索点を目的関数値によってランク付けし,そのランク情報に基づきアルゴリズムパラメータを調整するRDE (rank-based DE)を提案している。ε制約法の汎用性を確認するために,ε制約法をRDEに組み込んだεRDEを提案し,探索効率が大きく向上することを示した。1目的関数の形状タイプ推定:単峰性と多峰性を分類する方法として提案したサンプリングに基づく形状推定法の汎用性を調べるとともに,サンプリング法の改良を行った。サンプリングに基づく形状推定法をParticle Swarm Optimizationにも導入し,形状に応じてgbestモデルとlbestモデルを切り換える方法を提案し,その有効性を示した。また,ある次元が縮退した場合にも形状推定ができるように,内積を用いてサンプリングの範囲を決定する方法を提案した。2アルゴリズムパラメータの自動調整:Differential Evolutionにおけるパラメータの自動調整法の一つとして,2つのパラメータFとCRの平均値を調整する方法がある。平均値を中心に正規分布などに基づき多様なパラメータ値を生成し,良い探索点が生成できたパラメータ値が生成しやすいように平均値を調整する方法である。従来の方法ではFとCRを独立に生成していたが,FとCRの相関関係に基づきパラメータ値を生成する方法を提案し,その有効性を示した。3制約付き最適化の効率化:低精度近似モデルを用いて関数評価回数を削減する比較推定法において,低精度近似モデルとしてGradient Boostingを用いる方法を提案し,その有効性を示した。

ただし,近似精度を向上するためには計算量が大きくなるという課題もあった。本研究の目的は,進化的アルゴリズムを対象として,目的関数の形状タイプ推定によりアルゴリズムパラメータを自動調整する方法,近似モデルを用いた関数評価回数の削減方法,制約付き問題を解くε制約法の改良について研究を推進し,効率的で汎用的な制約付き最適化アルゴリズムを開発することである。本年度の研究内容と主な成果は次の通りである。1目的関数の形状タイプ推定:単峰性と多峰性を分類する方法として提案した近傍グラフに基づく形状推定法の汎用性を調べるために,本手法をDifferential Evolution (DE)に加えて,Particle Swarm Optimization (PSO)にも導入し,単峰性景観ではgbestモデル,多峰性景観ではlbestモデルに動的に切り換える方法を提案し,その有効性を示した。2アルゴリズムパラメータの自動調整:近傍グラフに基づく形状推定法では,全ての隣接点より関数値の小さい谷点と全ての隣接点より関数値の大きい山点を認識していたが,形状タイプの判定には谷数が1かどうかという情報のみを使用していた。これに対して,谷点と山点の情報をさらに有効に活用するために,谷点に対しては局所探索を行うパラメータを選択し,山点に対しては大域探索を行うパラメータを選択するという方法を提案した。本手法をDEとPSOに適用し,その汎用性と有効性を示した。3制約付き最適化の効率化:低精度近似モデルを用いて関数評価回数を削減する比較推定法では,目的関数の近似を行うことにより評価回数を削減してきたが,制約逸脱度についても近似モデルを用いるために,探索点集合における実行可能解の割合が低いときは制約逸脱度を近似し,割合が高いときは目的関数を近似するという方法により,従来よりも関数評価回数が削減できることを示した。汎用的かつ効率的な制約付き進化的アルゴリズムを実現するために,次の項目について研究を行った。1目的関数の形状タイプを推定するために,直線上にサンプリングを行う方法と近傍グラフを構成して谷点を推定する方法を提案した。2Differential EvolutionとParticle Swarm Optimizationについて形状タイプに基づくアルゴリズムパラメータの自動調整法を提案した。3制約付き最適化を行うε制約法において,目的関数だけでなく制約逸脱度についても低精度近似モデルを導する方法を提案した。これにより,汎用性が高く探索効率の高い制約付き最適化アルゴリズムが実現できることを示した。本年度の成果は以下の通りである.
細胞表層機能多糖の構造精密設計

オリゴ糖や多糖の分子認識・細胞認識に基づく精妙な分子生体機能の本質を伊分子レベルあるいは細胞レベルで解明し、その基盤に立って新しい生医学材料や生理・薬理活性物質を創出することを目的に、次の糖質高分子物質を合成した。これらの高分子物質のいずれにも、糖鎖が認識信号として濃密に組み込まれているのが特徴である。低分子物質と異なった特有の動物精密構造認識のいくつかの発現も明らかにした。1.アンヒドロ糖誘導体の開環重合を経由して3-デオキシ-3-フルオロ-(1→6)-α-D-グルコピラナンを合成した。デオキシフッ素化した明確な構造をもつ多糖はいままで報告例がない。抗体や酵素への取り込みの解析のためのモデル物質として特異な機能を発揮するのではないか。2.酵素触媒合成法を活用して高い生理活性をもつオリゴ糖を合成する試みが盛んになっているが、糖鎖高分子合成への応用例をない。糖タンパク質や糖脂質のオリゴ糖成分であり、分化抗原やガン関連抗原として重要なN-アセチルラクトサミン糖鎖に着目して、p-アクリロイルナ網ノフェニル配糖体、およびp-ビニルベンジル配糖体の2種類のルートを経て糖鎖高分子を合成した。3.加リン酸分解酵素の逆反応により、任意の重合度からなるアミロースを酵素触媒合成する手法が開発されている。この方法を応用して、アミロース置換スチレンモノマーを合成し、そのラジカル単独および共重合を行って、多糖を側鎖にもつ構造の明確な高分子を合成した。4.グルコースの3位をエーテル結合を介してポリスチレンに結合した糖質重合体をコートした培養皿の上で、赤血球細胞が今まで全く知られていなかった特異な挙動をとることを見つけた。グルコース輸送体タンパク質との特異的相互作用によることを突き止めた。5.アシアロ糖タンパク質レセプターを経由する肝細胞の興味ある組織形成挙動を見出した。
黒潮続流循環系の形成・変動メカニズムと大気・海洋生態系への影響

本研究では、本新学術領域研究で注目した中緯度域の大気海洋相互作用の鍵となる海洋前線帯の形成・変動機構の理解を深め、その大気場や生態系への影響を解明することを目的とした。高解像度モデル等を駆使した研究により、日本南岸の黒潮の大蛇行や、その下流となる黒潮続流の形成・変動のメカニズム、また海洋中規模渦の形成やそれが生態系に及ぼす影響に関する理解に顕著な進展が得られた。一方、亜寒帯前線帯の十年規模変動が北太平洋海盆規模の大気場に影響を与えることを明確に示した他、夏季の海洋上層の熱容量が従来考えられていたものより遥かに大きいことを示し、中緯度域の大気海洋相互作用の理解を大きく進展させた。●黒潮続流の定常場形成について、高精度移流スキームを適用した準地衡流2層モデルを作成し、理想的状況下での続流ジェット緯度のパラメータ依存性に関する実験を開始した。また、西岸の渦位分布により駆動される東向きジェットの内部領域への侵入について考えた。更に、海洋渦の定常場形成への影響を考察する為、海洋渦を解像可能な高解像度海洋大循環モデル(OGCM)の出力から海洋渦による南北熱輸送を見積り、黒潮続流域ではそれが総量の約半分を説明することを示した。●経年変動機構に注目した解析では、観測データを同化したモデルおよび大気再解析値で駆動したOGCMなどを用いて黒潮の離岸機構を調べた。黒潮の正味の流量と続流域から西進する中規模渦が蛇行の維持と発生にそれぞれ重要であることが示唆された。また、異なる初期値から同一の外力を与えてOGCMを駆動し、黒潮続流に見られる自励的な変動の特性の解析を開始した。●経年変動が生態系に及ぼす影響を考えるため、栄養塩、植物・動物プランクトン、プランクトンの排出物や死骸、の4変数を扱う比較的簡単化した生態系モデルに、溶存酸素を追加してOGCMに組込み、低解像度モデルで動作を確認した。同時に、海洋渦よりも更に小規模の海洋現象による影響を考察するため、1/30度の水平解像度を持つ超高解像度OGCMの積分を開始した。●歴史観測データと大気海洋結合モデルを用いて、北太平洋亜寒帯前線帯の十年規模海面水温変動に対する大気応答を調べた。十年規模海面水温偏差と相関する大気循環の十年規模シグナルは、10月頃から出現し1月に最も強いシグナルとなって現れるものの2月に急速に減衰する、顕著な季節性を示すことを明らかにした。また、海盆規模の大気海洋相互作用に影響する春夏季の浅い混合層形成について、Argoフロート等の観測データを用いて解析を行い、その形成過程および海面熱フラックスとの関連に海域・季節依存性が存在することを示した。・黒潮続流の平均緯度の決定要因を探るために、準地衡流2層モデルの枠組みの中で、非線形性、粘性、境界条件などを変えた実験を多数行い、黒潮続流緯度はほぼ風応力の南北分布のみによることが明らかになってきた。また、渦解像海洋モデルの経年変動積分において、渦活動に起因する内部境界面変動に伴う鉛直下向きの鉛直運動量輸送が、黒潮続流上の亜表層(300m付近)において卓越し、黒潮続流の長期平均場へ影響していることが明らかとなった。・渦解像海洋大循環モデルを異なる初期値から同一の経年変動外力で駆動した複数の積分結果から、黒潮続流域においては外力に起因する経年変動と同程度に大きい顕著な初期値依存性が示された。・1/30度の水平解像度を持つ北太平洋域の超高解像度海洋大循環モデルの2年間積分結果から、運動エネルギーが弱い海域ではスケール間相互作用を把握するために小規模の海洋現象を含めた解析が必要であることを示唆し、現在より高解像度の海面高度衛星観測の必要性を提言した。・海洋モデル・データ同化システムを用いた長期変動再現実験や予測実験により黒潮大蛇行の安定性が黒潮流量に強く依存すること、および流量とともに、黒潮続流及び台湾沖の渦活動の状態を考慮することにより過去の大蛇行の履歴は概ね説明されることがわかった。また、続流域からの渦の切離が、海洋全層にわたる栄養輸送に大きく寄与していることがわかった。・観測データと大気海洋結合モデルを用いて、北太平洋亜寒帯前線帯の十年規模変動が、寒候期のストームトラック活動度と大規模大気循環に顕著な影響を及ぼすことを示した。・Argoフロートや衛星観測データを用いて、海盆規模の海洋混合層深度および熱交換過程の季節変動に関する解析を行い、春から夏の大気からの加熱効果に対し、表層混合層だけでなくその下層も熱交換過程に重要な役割を果たすことを示した。

黒潮続流に代表される東向きジェットの流下方向への平均場並びに擾乱場の構造変化の上流プロファイルと下流での条件に対する興味深い依存性を、準地衡流2層モデルから見出した。また、海洋大循環モデル出力から黒潮続流の上流(下流)で北向き(南向き)の渦による渦度フラックスが生じていることを示した。これは下流の渦度フラックスに伴う渦度偏差が黒潮続流の南北再循環の強化をもたらすことを示唆する。同化再解析データを用いた解析から、日本の沿岸水位と黒潮・黒潮続流の変動に密接な関係が、また、高解像度沿岸モデルを用いた事例解析から伊豆諸島付近の黒潮変動の励起した沿岸波動がこの水位変動の直接的な原因である可能性が示唆された。一方、黒潮続流がShatky Rise東方で分岐する現象について、黒潮続流がShatky Riseにぶつかる際に生じるRossby leewaveとそれが崩れることによる渦渦相互作用の重要性が示された。黒潮・黒潮続流域では上記のように渦が重要な影響を持つため、経年変動に顕著な自励変動が生じるが、対照的に太平洋熱帯域では外力によって海洋変動がほぼ一意に決まることも示された。更に、海洋生態系モデルを組み込んだ水平解像度1/30度の北太平洋域超高解像度海洋シミュレーションの2年間のデータセットを構築し、黒潮続流領域において大気擾乱が活発な冬季にサブメソスケールが活発になる季節変動に注目し、物理場、生態系の解析を開始した。一方、北太平洋中央部の風系変動を模した風応力偏差を与える大気海洋結合モデル実験を行い、人為的に南北変位させた海洋前線に対する海面水温、熱フラックス、降水に有意な局所応答を確認した。また、黒潮続流域における夏季海洋亜表層水温の経年変動について、観測データ解析を基に夏季の正味熱フラックスに対する海洋亜表層への熱浸透についての解析を進めた。黒潮・黒潮続流の形成・変動等に対する渦の効果について総括的に理解を進める基盤として活用するため、昨年度末に開催した渦と蛇行に関するシンポジウムの内容をWebページ上に取りまとめた。また、昨年度までに構築した水平解像度1/30度の北太平洋域超高解像度海洋シミュレーションの出力を解析し、混合層が深い冬季に活発になるサブメソスケール現象が中規模渦などの循環場に顕著に影響すると共に、表層の植物プランクトン分布にも影響することを示した。更に、このデータを水中グライダーの直接観測と比較し、黒潮続流域での水塊変質過程の解析を進めた。一方で、黒潮・黒潮続流に関する総合的な研究を継続し、理想化条件においてSverdrup流線の南北分布とジェットの強さとその中心流線が既知であれば、西岸境界流続流ジェットの緯度が理論的に求まることを示した。また、渦解像海洋大循環モデルOFESで、長期平均黒潮続流ジェットの東西変化は非地衡流と渦が引き起こす東西方向のレイノルズ応力でほぼ説明できることが示され、その非地衡流の一部は渦運動エネルギーで駆動されることが示唆された。更に、黒潮続流下流域で観測される分岐に関し、現実的及び理想化モデルを用いてメカニズムを調べた結果、続流の分岐は渦起源の複数の東西ジェットが背景流により南下するという遷移的な現象であることが示唆された。また、黒潮による栄養塩輸送に関する解析を進めると共に、北太平洋での海盆規模の表層・亜表層水温季節・経年変動を、Argoフロート等の観測データと高解像度数値モデルから解析し、特に北太平洋西部では黒潮続流分岐流が海面水温変動に影響しうることを示した。更に、大気海洋結合モデル実験の解析から、北太平洋亜寒帯前線帯の南北変位に伴う海面水温変動とそれに応答する大気循環変動の間に、海盆スケールの大気海洋間双方向フィードバックが存在しうることを示した。
酵母カルパインホモログCpl1の活性制御機構の解析

前年度に見出した、アルカリ刺激に応答してSnf7の局在が細胞質からエンドソームへと移行する現象を、蛍光免疫染色法を用いた顕微鏡観察で確認した。また、この移行が、Rim101経路上流のセンサー部構成因子の欠損変異株とエンドソーム・ソーティングを担うESCRT複合体構成因子の欠損変異株でも見られるかどうかを検討した。その結果、この移行はセンサー部には依存せず、ESCRT複合体機能に依存することが明らかになった。このことと一致して、アルカリ刺激によりエンドソーム・ソーティングが実際に一過的に阻害されることを、細胞膜に存在するアミノ酸トランスポーターの液胞への輸送を指標に確認した。これらの結果から、アルカリ刺激に応答したエンドソーム膜上における活性プロテアーゼ複合体の形成には、ESCRT複合体のターンオーバーの遅滞によるSnf7のエンドソーム膜上への貯留と、センサー部に依存したこれとは別の活性化ステップとが寄与していることが明らかになった。Rim101の切断で生じるC末端側断片のN末端は、何らかの修飾によりブロックされていてエドマン法による配列決定が困難であった。配列決定の困難を克服するため、Rim101のC末端に付加する精製用のタグを工夫し、さらに大量培養を採用することで、より精製度の高い切断産物を大量に調製する方法を確立した。しかしながら、十分量の標品を用いてもN末端配列を決定することはできず、修飾は切断後すみやかに起こる現象であることが示唆された。また、調製した切断産物をトリプシン消化して生じたペプチドを質量分析機によって解析したが、N末端に由来すると考えられる新規ペプチドは同定できなかった。活性プロテアーゼ複合体の構成因子全てのC末端に種々のエピトープ・タグを付加した一連の株を作製し、その内からタグの付加が構成因子の機能を損なっていない株を表現型を指標に選別し、以後の解析に用いた。構成因子の2つにそれぞれ異なったタグを付加した株を用い、アルカリ刺激に応答して、Snf7-Cpl1、Snf7-Rim20、Snf7-Vps20の相互作用がそれぞれ増加することを免疫共沈降法で確認した。また、アルカリ刺激に応答して、Snf7のエンドソームへの局在が増加することをショ糖密度勾配遠心法を用いて明らかにした。これらの観察は、アルカリ刺激に応答してエンドソーム上でプロテアーゼ複合体が形成されることを支持している。また、プロテアーゼ複合体の活性をin vitroで高感度に検出するアッセイ系を確立するため、基質であるRim101の切断の結果生じる末端構造を認識する特異的抗体の利用を構想した。そのために、まずRim101の切断産物の末端構造を明らかにしようとした。Rim101の切断で生じるC末端側断片を酵母から精製し、プロテインシークエンサーを用いたエドマン法に供したが、切断産物のN末端が何らかの修飾によりブロックされていて配列を決定できなかった。切断点の決定には、N末端側断片を精製してそのC末端配列を決定することが有効であると考えられる。また、この修飾の実体とその生理的意味についても明らかにする必要がある。
金属酵素による小分子変換反応を範とする高効率錯体触媒反応の開発

金属酵素活性部位の構造・作用機構に関する最新の情報をもとに、新規な金属錯体触媒を設計・合成し、区活性分子の代表である窒素を初めとする各種小分子を高効率のもとに有用な化合物へと変換する反応系を開拓する。(3)我々はこれまで窒素固定酵素活性部位モデルとしてキュバン型混合金属スルフィドクラスターの合成を詳細に検討してきている。今回、Irの三核スルフィド-ヒドロスルフィドクラスターにさらにルテニウムを導入し、3段階の反応を経て窒素配位クラスターの世界で初めての例となる[(Cp^*Ir)_3{Ru(N_2)(TMEDA)}S_4](TMEDA=Me_2NCH_2CH_2NMe_2)の単離同定に成功した。1.金属-スルフィドクラスター[(Cp*Ir)_3{Ru(N_2)(TMEDA)}S_4](Cp:η^3-C_5Me_5,TMEDA=Me_2NCH_2CH_2NMe_2)の合成単離に成功した。本化合物は、窒素分子を配位した安定な金属クラスターの最初の例であり、従来知られている各種遷移金属を含む窒素錯体と比べ、スルフィド架橋多核構造を有する、より優れた生体内酵素エトロゲナーゼモデルである。2.新規なスルフィド架橋三核クラスター[(Cp*Ir)_2{Mo(CO)_3}(S_2)]を単離し、そのモリブデンサイトの各種小分子に対する反応性や酸化還元挙動を明らかにした。本研究は、この三核クラスターを窒素固定に利用するための基礎研究である。3.生体内窒素固定酵素活性部位で鉄が重要な働きをしていることに鑑み、反応サイトに鉄を含むFeIr_3S_4キュバン型クラスターを合成し、その構造の詳細を明らかにした。そして、その鉄サイトにおける窒素分子の配位活性化能について、DFT計算により考察した。4.当研究室で開発した鎖状テトラホスフィンmeso-o-C_6H_4(PPhCH_2CH_2PPh_2)_2(P4)を有するモリブデンおよびタングステン0価錯体についてベンジルハライドと反応させることで、2価ジハライド錯体[MX_2(P_4)]が得られることを見出した。そしてこれら錯体がジアゾアルカンと反応して、新規なジアゾアルレカン錯体を与えることやジアゾアルカン由来のカルベンのカップリングを触媒することを明らかにした。また、[MoCl_2(P_4)]とCO、イソニトリル、アセチレンなどとの反応についても検討を行い、様々な構造を有する6配位または7配位Mo(II)錯体の単離同定に成功した。一方、一連の置換ヒドラジンとの反応では、N-N結合切断反応が容易に進行し、新規なニトリドおよびイミド錯体が誘導できた。また得られた錯体上のニトリド窒素およびイミド窒素原子の反応性の詳細も明らかになった。(1)当研究室で世界最初の例として得られた窒素配位金属硫黄クラスターについて、その反応性の検討を行った。その結果、Ir_3RuS_4キュバン型骨格に配位した窒素分子の変換は達成されなかったものの、プロトンと還元剤の共存下での水素発生を触媒することが明らかになった。すなわち、ニトロゲナーゼモデル反応は見いだせなかったが、ヒドロゲナーゼモデルとしての機能が判明した。なお、本クラスターについては、窒素分子の配位サイトをルテニウムからモリブデンやタングステンとすることで窒素活性化能が大きく改善されることがDFT計算から示唆された。(2)最近得られたIr_4S_2ヒドリドクラスターは、アミン共存下で水素ガスと反応し、水素分子をプロトンとヒドリドへと変換することが判明した。一方、ここに新たに生成したヒドリドクラスターはプロトンと反応して水素ガスを発生する。水素分子の常温常圧下での不均一な切断や、プロトンの水素ガスへの変換は今後の社会での水素の高度利用に向けて、重要な知見である。(3)当研究室で開発された新規なテトラホスフィンを補助配位子とするモリブデン錯体上において、末端アセチレンがカルビン配位子へと変換されること、そしてさらに配位力ルビンがイソニトリルとの錯体上でのカップリングにより置換アセチレンへと変換できることを見いだした。(4)ピラゾリルポレート配位子をもつロジウムの単核ジチオラート錯体においては、水素分子の温和な条件下での活性化と切断が進行し、不飽和結合の水素化、とりわけC=N結合において高い水素化反応活性が発現することが明らかとなった。
耐熱型逆転写酵素の耐熱化機構の解明

モロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)逆転写酵素(RT)は分子量75,000のモノマーで、5個のドメイン(Fingers、Palm、Thumb、Connection、RNase H)から成り、DNAポリメラーゼ活性とRNase H活性をもつ。両活性の活性部位はそれぞれPalmおよびRNase Hドメインに存在する。我々は大腸菌を宿主として、部位特異的変異導入により耐熱性が向上したMMLV RTを作製した。しかし、それらの耐熱化機構は不明な点が多い。本課題は、結晶構造解析と酵素化学的解析により、耐熱型MMLV RTの耐熱化機構を解明することを目的としている。平成27年度は、MMLV RTのRNase Hドメイン(I498ーL671)を調製し、性状解析を行った。完全長のもの(WT)および基質結合部位を含むI593ーL603あるいはG595ーT605が欠失したもの(それぞれΔC1、ΔC2)に、Strep-tag(WSHPQFEK)と(His)10をそれぞれNおよびC末端に付加させたものを大腸菌で発現させ、菌体から精製した。蛍光基質を用いたRNase H活性の測定では、WTは活性を示したが、ΔC1とΔC2は活性を示さなかった。蛍光増加量から、RNase Hドメイン単独の活性はMMLV RTのそれよりも著しく低いことが示された。放射性基質を用いたRNase H活性の測定の結果、WT、ΔC1およびΔC2では鎖長が異なる7ー16塩基のバンドが同程度の強度で検出された。これは、本基質にMMLV RTを作用させたとき、14ー20塩基のバンドが強く検出されたことと異なった。またΔC1とΔC2は活性を有したが、WTよりも著しく低かった。単独発現させたRNase H領域はDNA合成活性の活性部位をもたないために、基質との親和性が低く、切断部位が不特定になったと考えられる。現在、これらの結晶構造解析を行っている。平成27年度の当初計画は「1.RNase H領域の生産」、「2.RNase H領域単独および鋳型プライマー(T/P)との複合体の結晶構造解析」、「3.RNase H領域の活性測定」であった。このうち、1と3については十分達成され、学会発表および論文発表を行った。一方、2についてはよい結晶が作製されなかった。現在、精製条件や結晶作製条件をいろいろと変えて取り組んでいる。平成28年度は、兒島助教が米国NIHのDr. Robert Crouchの研究室で学んだ技術をもとに、ヒトRNase H2の酵素化学的解析に取り組んだ。ヒトRNase H2の酵素活性はナトリウム、カリウム、ルビジウムでは活性化され、リチウム、セシウムでは阻害されことから、カチオンの種類によりヒトRNase H2の酵素活性に対する影響が異なることが明らかとなった。また、熱失活の一次速度定数は、NaCl、KCl濃度が60 mMのとき、塩非存在下のときの半分にまで減少したことから、塩の添加によって熱失活が抑制され、安定性が高まることが示された。ヒトRNase H2の酵素活性のpHプロフィールは、活性解離基が酸性側で2つ、塩基性側で1つとしたとき、理論式によく一致した。酸性側、塩基性側の活性解離基のプロトン解離定数pKe (pKe1、pKe2)はそれぞれ7.3-7.6、8.1-8.8となり、脱プロトン化におけるエンタルピー変化は、pKe1で5 kJ/mol、pKe2で68 kJ/molとなった。熱力学的解析により活性解離基は、酸性側がAspまたはGlu、塩基性側がLysと推定された。こられのことから、ヒトRNase H2の活性解離基は、酸性側がDEDDモチーフとして保存されているAsp34、Glu35、Asp141のいずれか2つ、塩基性側がDSKモチーフとして保存されているLys69である可能性が考えられた。平成28年度はさらに、ゲノムプロフィリング「ゲノムプロフィリング法による変異原アッセイ(Genome profiling-based mutation assay (GPMA)法」(被験物質存在下で大腸菌を培養し、大腸菌の染色体DNAに入った変異の数を、PCRで増幅させたDNAの融解温度の変化に伴う「温度勾配ゲル電気泳動」のパターンの変化で定量する方法)を、動物細胞に適用させた。平成28年度の当初計画は「1.WT(全領域を含む全長酵素)の生産」、「2.WT単独およびT/Pとの複合体の結晶構造解析」「3.WTと変異体(いずれも全領域を含む全長酵素)の生産と活性測定」であった。一方、2については結晶が作製されなかった。平成28年度は計画外の課題としてGPMA法の動物細胞への適用に取組んだ。これについては十分達成され、論文投稿の準備が整った。

平成29年度は、Amesテストで変異原性が検出される化学物質(ベンゼン、硫酸ジエチル、抱水クロラール、酸化プロピレン)あるいは検出されない化学物質(無水酢酸、メタンスルホン酸)100 ppb存在下でNIH3T3細胞株を4世代培養し、ゲノムDNAを抽出し、PCRを行い、増幅産物を温度勾配ゲル電気泳動に供した。化学物質添加による特徴点の変化を求めたところ、大腸菌を用いた場合とよく相関した。このことから、GPMA法に任意の哺乳動物細胞が使用可能であることが示唆された。CRISPR/Cas9システムを用いて、RNase H2を欠損したマウス胎児由来NIH3T3細胞株(KO株)を樹立した。野生株およびKO株の細胞溶解液について、RNase H2のAサブニットに対する抗体を用いてウェスタンブロット解析を行ったところ、KO株ではAサブユニットが検出されなかった。1個のリボヌクレオチドを含む12 bpの二本鎖DNAを基質として、細胞溶解液のRNase H2活性を測定したところ、KO株では活性が検出されなかった。両株から抽出したゲノムDNAをアルカリアガロースゲル電気泳動に供したところ、KO株のゲノムDNAは野生株のそれよりも低分子側に移動したことから、RNase H2の欠損によりゲノムにリボヌクレオチドが蓄積されていることが示唆された。ヒトRNase H2と基質との複合体の立体構造モデルにおいて、基質の切断される結合の5'側ヌクレオチドの糖の部分にVal143が近接していた。Val143をTrp、Phe、Lys、Argに置換した変異体を作製し、1塩基のリボヌクレオチドを含む18 bpの二本鎖DNA(1R)および18 bpのRNA/DNAハイブリッド(18R)に対する加水分解活性を測定した。V143W、V143F、V143K、V143Rの1R分解活性は野生型(WT)の24%、13%、0.16%、0.05%であり、18R分解活性はWTの5.0%、6.7%、0.03%、0.03%であった。このことから、V143Wは、WTに比べて18Rより1Rを好むように基質特異性が変化したことが示された。平成27年度未達課題である「RNase H領域単独および鋳型プライマー(T/P)との複合体の結晶構造解析」に集中して取り組む。これが達成されれば、当初の計画に基づき、「野生型酵素(全領域を含む全長酵素)の生産」、「WT単独およびT/Pとの複合体の結晶構造解析」、「WTと変異体(いずれも全領域を含む全長酵素)の活性測定」に取り組む。本課題の研究分担者である兒島憲二助教は当初の計画どおり、平成27年4月1日から平成28年3月31日まで米国NIHのDr. Robert Crouchの研究室に滞在し、酵母のRNase H2に酵素化学的解析を行った。兒島は、平成28年は、NIHで学んだ技術をもとに、ヒトRNase H2の酵素化学的解析に取り組む。1)平成28年度未達課題である「RNase H領域単独および鋳型プライマー(T/P)との複合体の結晶構造解析」に引き続き集中して取り組む。2)リボヌクレアーゼH(RNase H)は、RNA/DNAハイブリッドのRNA鎖を切断する酵素であり、ゲノムDNAの完全性維持に寄与する。本酵素は、基質特異性に基づきI型とII型に分類される。II型のRNase H(RNase H2)は、RNA/DNAハイブリッドと二本鎖DNAに埋め込まれた1個のリボヌクレオチドを切断する活性を有する。兒島助教が留学したNIHのグループは、前者の基質を分解する活性を保持したまま、後者の基質を切断する活性を消失させる変異が見出した。
要求に基づいた再利用中心のソフトウェア開発に関する研究

ソフトウェアの再利用に基づいたソフトウェア開発では,再利用されるコードに着目した研究が数多く行われてきた.しかし,そもそもソフトウェアは「何か」を行うために開発する.この「何か」というのは要求仕様の中に記述されている.そこで,本研究では,要求に着目した再利用中心のソフトウェア開発環境の構築を目的とした.平成17年度は,平成16年度に開発した,要求に着目した再利用中心のソフトウェア開発支援ツールのプロトタイプの改良を行った.プロトタイプの基本的な部分は平成16年度開発時と変わらず,プロトタイプ利用者はユースケースを作成し,それをキーにして,再利用可能な成果物(クラス図やコードなど)を検索する.平成17年度は主に,各種成果物の間の関係,およびコードの統合の二つに着目した.まず,要求(ユースケース),設計(クラス図およびシーケンス図),そしてコードの各成果物の間に関係の取得と保守に着目した.関係の取得は,開発支援環境で新たなモデルを作成する際,それまで作成したモデルから抽出できる部分は自動的に行った.また,コードを変更した際,スライシングを用いてコード中の関係のある部分を取得し,そこからさらに関係のあるほかのモデルの部分を取得した.さらに,コードを統合するときの手法としてMixinを検討した.具体的には,C++においてMixinを通して二つのコード部分を統合したときの問題を検討した.その結果,メンバ名の衝突,タイプチェック機能の欠如,モジュールの意味的衝突の三種類の問題に絞り,それらが発生したときを検出する機構を提案した.ソフトウェアの再利用に基づいたソフトウェア開発では,再利用されるコードに着目した研究が数多く行われてきた.しかし,そもそもソフトウェアは「何か」を行うために開発する.この「何か」というのは要求仕様の中に記述されている.そこで,本研究では,要求に着目した再利用中心のソフトウェア開発環境の構築を目的とする.平成16年度は,要求に着目した再利用中心のソフトウェア開発支援ツールのプロトタイプを開発した.プロトタイプでは,ユースケース,クラス図,コードなどの各種成果物の間に関係があることに着目した.開発者は,ユースケースを作成し,それをキーにして,再利用可能な成果物を検索する.具体的には,まず,すでに開発済みのシステムのユースケース,クラス図,コードおよびそれらの間の関係を保持しているリポジトリを用意した.そして,開発者は初期ユースケースを作成する.ユースケースは,対象,方法,動作の三つのパラメータからなり,それらに値を与えることにより,ユースケースを作成する.初期ユースケースをキーにして,リポジトリから,開発中のシステムに有用と思われるユースケースを検索する.検索の結果,適切なユースケースがあった場合,それと関連のあるクラス図やコードをリポジトリから抽出する.その際,該当ユースケースと関連のある部分のみが抽出される.抽出されたクラス図とコードに対して必要な変更を行う.ユースケースごとに検索を行っているため,本来同じクラスが複数個存在するかもしれないので,それらを統合する.最後に,各種成果物をリポジトリに保存するが,一連の操作の記録をとっているため,開発中のシステムの各種成果物間の関係も保存される.ソフトウェアの再利用に基づいたソフトウェア開発では,再利用されるコードに着目した研究が数多く行われてきた.しかし,そもそもソフトウェアは「何か」を行うために開発する.この「何か」というのは要求仕様の中に記述されている.そこで,本研究では,要求に着目した再利用中心のソフトウェア開発環境の構築を目的とした.平成17年度は,平成16年度に開発した,要求に着目した再利用中心のソフトウェア開発支援ツールのプロトタイプの改良を行った.プロトタイプの基本的な部分は平成16年度開発時と変わらず,プロトタイプ利用者はユースケースを作成し,それをキーにして,再利用可能な成果物(クラス図やコードなど)を検索する.平成17年度は主に,各種成果物の間の関係,およびコードの統合の二つに着目した.まず,要求(ユースケース),設計(クラス図およびシーケンス図),そしてコードの各成果物の間に関係の取得と保守に着目した.関係の取得は,開発支援環境で新たなモデルを作成する際,それまで作成したモデルから抽出できる部分は自動的に行った.また,コードを変更した際,スライシングを用いてコード中の関係のある部分を取得し,そこからさらに関係のあるほかのモデルの部分を取得した.さらに,コードを統合するときの手法としてMixinを検討した.具体的には,C++においてMixinを通して二つのコード部分を統合したときの問題を検討した.その結果,メンバ名の衝突,タイプチェック機能の欠如,モジュールの意味的衝突の三種類の問題に絞り,それらが発生したときを検出する機構を提案した.
特殊細胞分化誘導性ペプチドの新規探索法の開発

本研究課題では、細胞現象に関与する様々なタンパク質と相互作用することを想定した人工ペプチドの集団(ペプチドライブラリー)を設計・合成すると共に、その中から、特定の細胞機能を誘導するペプチドを探索・同定する新たな手法の開発に取り組んだ。そして、本手法による新規ペプチドの創出の基礎原理の確立により、その生物学的応用を視野に入れた展開を見込めるに至った。本研究課題では、細胞現象に関与する様々なタンパク質と相互作用することで、特定の細胞機能を誘導するペプチド候補の集団(ペプチドライブラリー)を構築すると共に、それらの相互作用により誘導される細胞変化を検出する新システムを設計した。そして、本システムの開発により、生命科学や医療分野の推進に有用な細胞へと誘導する新規ペプチドを探索・同定することで、「ペプチドを利用した細胞機能誘導の原理」の基礎を確立することを目指して取り組んだ。これまでに、細胞質もしくは細胞核に局在化する「塩基性アミノ酸配列」と、細胞内に存在する様々なタンパク質と相互作用するための「ランダム化配列」を融合したペプチドライブラリーの構築とそれらの評価を行った。特に、塩基性アミノ酸のタンデム化配列による細胞毒性の影響を回避するため、ペプチド配列の長さやペプチドライブラリーの発現量の調整による独自の条件と工夫を新たに組み込んだ。これらの条件は、目標とする細胞機能を誘導するペプチドを探索する本システムの確立において必要不可欠であることが明らかとなった。また、今回の成果の一部は、学会や研究会などにおいて発表すると共に、本研究課題の特徴、発展性、今後の問題点などについて議論することができた。そして現在も、これまでに得られた知見を活かしたペプチドライブラリーの探索およびそれらを利用した技術の開発に関する特許化を視野に入れて取り組んでいる。本研究課題では、細胞内シグナル伝達に関与する様々なタンパク質と相互作用することで目的の細胞機能だけを誘導するペプチド集団(ペプチドライブラリー)を構築すると共に、それらによる細胞変化を短時間かつ自動的に検出するシステムを独自に構築する。そして、本システムを利用することで、次世代医療研究の推進に有用な細胞へと誘導する新規ペプチドを探索・同定して、「ペプチドを利用した細胞機能誘導原理の基礎」を独自に確立することを目指す。当該年度では、細胞膜を能動的に透過し、細胞質もしくは細胞核に局在化する「アルギニンリッチ配列」と、細胞内シグナル伝達に関与する様々なタンパク質群と相互作用するための「ライブラリー配列」を融合したペプチドライブラリーの設計と構築に取り組んだ。さらに、細胞機能の誘導を判別するための「細胞機能検出システム」とペプチドライブラリーを融合することで、細胞機能誘導性ペプチドを探索する原理の構築にも取り組んだ。これらの成果は、国内シンポジウムや研究会などにおいて発表するに至っており、本研究課題の独創性や革新性のアピールができただけでなく、今後の問題点などについても議論することができた。さらに、ペプチドライブラリーの構築法の一部は、国内特許として申請することができた。それゆえ現在は、それらペプチドライブラリーを利用したペプチド探索システムの原理までを特許化することを視野に入れて研究を展開している。当該年度は、平成23年3月に起きた東日本大震災の影響を受け、助成金が減額となる可能性が生じたことから、ペプチドライブラリーの構築に利用するDNAポリメラーゼ・逆転写酵素・無細胞タンパク質合成液などの購入に関わる予算を制限して研究を行った。それゆえ、試験管内におけるペプチドライブラリーの発現と評価に関する部分に遅れが生じた。しかしながら、ペプチドライブラリーの新規設計、細胞機能誘導性ペプチドを探索する独自戦略に関しては、国内シンポジウムや若手研究会などで発表することができただけでなく、ペプチドライブラリーの新規構築に関する一部を国内特許として申請することもできた。今後は、これらの結果を足掛かりとして、更なる成果を挙げられるように研究に取り組む計画である。今後は、平成23年度の研究費の未使用分を利用して、細胞内シグナル伝達に関与する様々なタンパク質群と相互作用するためペプチドライブラリーの試験管内合成とそれらの発現評価を行う。そして、実際に細胞機能誘導性ペプチドの探索が可能であることをモデル実験により証明する。さらに、目的の細胞機能を誘導する新規ペプチドの探索および配列同定を行った後、化学的手法により合成した各種ペプチドの細胞機能誘導性および細胞毒性などを詳細に評価することで、本システムの有用性・汎用性を立証する計画である。当該年度は、平成23年3月に起きた東日本大震災の影響を受け、助成金が減額となる可能性が生じたことから、ペプチドライブラリーの構築に利用するDNAポリメラーゼ・逆転写酵素・無細胞タンパク質合成液などの購入に関わる予算を制限して研究を遂行した。それゆえ、次年度は、平成23年度の研究費の未使用分を利用して、ペプチドライブラリーの構築及び、それらペプチドライブラリーの試験管内発現と機能評価を定量的に行うために必要な試薬類(DNAポリメラーゼ・オリゴプライマー・逆転写酵素・制限酵素・無細胞タンパク質合成液・マルチウェルプレート・化学発光試薬・検出用抗体など)の購入を計画している。
自然発症糖尿病ラット(WBN/Kob)の糖尿病網膜症に関する研究

長期に糖尿病状態を継続した雄WBN/Kobラットでは毛細血管の基底膜の変化を主とする超微形態変化が生じていることが明らかになるとともに、血管への白血球接着がこの変化に関与している可能性が明らかになった。またこの糖尿病ラットの虹彩では明らかに微小血管癌が増加しており、本モデルには糖尿病性のルビオーシス様の変化も誘発されていることが明らかとなった。したがって、本WBN/Kobラットはヒトの糖尿病網膜症のモデルとして有用性が高いことが判明した。長期間の血糖が網膜内血管の基底膜に与える影響について方法:糖尿病を発症した18ヵ月齢および24ヵ月齢のWBN/Kobの雄とその対照として18ヵ月齢および24同月齢のWBN/Kobの雌および12ヵ月(発症前)のWBN/Kobの雄および雌を用いた。10ヶ月齢から月に一回血糖および尿糖を測定し、血糖値が200mg/dl尿糖が陽性となり、この状態が継続したものを糖尿病動物として用いた。動物を麻酔した後グルタールアルデヒド、パラホルムアルデヒド混合固定液で全身灌流固定し、眼球組織を採取しエポン包埋光顕、透過型電顕標本を作製した。トルイジンブルー染色を施した光顕標本を詳細に観察し、その病変の頻度、程度を判定した。電顕的には、透過型電子顕微鏡をもちいて網膜各層の血管に関して定性的に観察し、その病変を見いだすとともに、頻度、程度を記録した。結果:雄WBN/Kobラットの網膜内の血管の基底膜は明らかに肥厚していた。また、色素上皮細胞層に最下層(外網状層)の毛細血管が侵入し、毛細血管瘤と一致すると思われる血管の集塊が観察された。電子顕微鏡的にもその基底膜の肥厚は明らかであり、内皮細胞の非薄化および周皮細胞の変性も観察された。まとめ:雄WBN/Kobラットでは糖尿病の長期化により、明らかに網膜内の毛細血管の基底膜の変化を主とする超微形態変化が生じていることが明らかになった。網膜内血管のコンカナバリンAを用いた血管内皮の3次元的解析と白血球接着およびトリプシン消化網膜血管および免疫組織を用いた内皮細胞および周皮細胞数の解析方法:1年齢以降のWBN/Kobラットを麻酔した後、コンカナバリンAを尾静脈から静脈内投与し、網膜を3時間固定後、スライド上で伸展し、蛍光実体鏡下で血管内皮の走行状態、口径を注意深く観察した。また片眼の網膜を低濃度トリプシンで消化し、網膜内毛細血管の伸展標本を作製し、光学顕微鏡下で観察した。結果:糖尿病を発症した雄のWBN/Kobラットでは非糖尿病の雌WBN/Kobラットに比較し、明らかに高い白血球の網膜内血管への接着が認められた。またトリプシン消化伸展標本では、周皮細胞のゴースト化に雌雄の差は認められなかったが、雄の微小血管瘤数は雌よりも有意に高かった1また、糖尿病が進行するとともに、雄の網膜内の細小血管(IRMA)は明らかに蛇行・変形し、その異常血管数は有意に上昇していた。まとめ:雄WBN/Kobラットでは糖尿病の長期化により、明らかに網膜内の毛細血管の変化を主とする形態変化が生じていることが明らかになるとともに、白血球接着がこの変化に関与している可能性が明らかになった。虹彩組織のFITCデキストランを用いた3次元的解析と色素漏出試験動物を麻酔した後、分子量4000のFITCデキストランを尾静脈から静脈内投与し、投与5分後にエーテル過麻酔で致死させた後、虹彩を採取し、4%パラホルムにて3時間固定した。虹彩をスライド上で伸展し、実体蛍光顕微鏡下で細血管の走行状態、口径、FITCの漏出の有無を注意深く観察した結果、糖尿病雄WBN/Kobラットの虹彩には明らかに微小血管瘤が増加しており、対照の非糖尿病のWBN/Kobラットにはそのような変化は認められず、本モデルには糖尿病性のルビオーシス様の変化も誘発されていることが明らかとなった。