hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
SUMOによる紡錘体チェックポイント制御機構の解析

本研究では植物の紡錘体チェックポイントタンパク質に着目し、シロイヌナズナを用いた機能解析を行った。まず、artificial microRNAによるノックダウン系統を作製し、生長が遅延し異常形態を示す表現型を観察した。また、CRISPR/Cas9システムによりノックアウト変異体を作成し、ホモ接合体では致死になる可能性を見出した。次に、サイレント変異を導入したゲノム断片を用いて機能的な配列を確定し、SUMO-null型変異を導入することで機能性が失われることを明らかとした。さらに、葉肉細胞プロトプラストを用いた一過的発現系を利用し、SUMO E3 ligaseと相互作用することを明らかとした。細胞分裂を制御する分子メカニズムは非常に複雑であるが厳密である。本研究では植物細胞の染色体分離制御に着目し、チェックポイントタンパク質に対するSUMO翻訳後修飾の関わりを解明し、詳細な分子機構を明らかとすることを目的に研究を行った。本研究でチェックポイントタンパク質の一つとして着目したシロイヌナズナのオーロラキナーゼにはこれまで突然変異体の報告がされていない。そのため、artificial microRNAによるノックダウン系統を作製しており、複数の系統で生長の遅延と形態異常が観察されていた。本年度は今後の試験に用いるための系統選抜と2度の戻し交配を行った。確立された試験系統に関して、根の伸長度や花茎の高さなどを指標とした表現型の計測を行い、定量化した。さらに、チェックポイントタンパク質のゲノム配列を用いて、artificial microRNAに対する非感受型変異を導入したコンストラクトを作製した。アグロバクテリウムによる形質転換法を用いてこのベクターをシロイヌナズナに導入し、ノックダウン系統と交配して相補実験を行った。その結果、交配系統が野生型様の表現型を示し、機能相補していることを確認した。さらに、このゲノム配列にSUMO-null変異を導入し、同様に相補試験を行った。現時点では交配後F1世代であり安定した系統確立には次世代の育成を要するが、ノックダウン系統様の表現型であることを確認している。このことは、チェックポイントタンパク質が正常に機能するためにはSUMOによる制御が必要であることを示している。機能的なGFP融合タンパク質マーカーを作製するため、相補型ゲノム配列を用いてGFP融合タンパク質発現コンストラクトを作製し、シロイヌナズナに形質転換した。また、SUMO E3 ligaseであるHPY2との相互作用を検証するため、共免疫沈降実験に用いるベクターを作製した。本年度は確立されたノックダウン系統を用いて、DNA damage agentに対する感受性の検定を行った。DSBを誘起するZeocin、DNAの架橋を引き起こすCisplatinを用いた試験を行い、いずれのDNA障害に対しても、野生型植物体より低濃度の処理条件において矮化することを確認した。さらに、機能的なゲノム配列を用いて作成したGFP融合タンパク質発現コンストラクトによる形質転換体を確立し、観察を行った。定常状態において、両タンパク質のGFPシグナルは染色体上のセントロメア近辺と推定される個所で観察され、野生型の配列のものとSUMO-null型配列のものとで有意な変化は観察できなかった。また、本年度、当研究室においてCRISPR/Cas9システムによるジーンターゲッティングの動作を確認することができたため、本研究にもこれを適用し、ノックアウト株の作出を試みている。これまでに報告されている変異体コレクション中にはAUR3遺伝子を破壊するような形となるものは発見されていない。これまでに人工的にデザインしたsgRNA配列を作製し、Cas9配列と共にシロイヌナズナ野生株に形質転換し、T1植物体を作製している。本研究でチェックポイントタンパク質の一つとして着目したシロイヌナズナのオーロラキナーゼ3(AUR3)にはこれまで突然変異体の報告がされていない。本年度はCRISPR/Cas9システムによるジーンターゲッティングに取り組んだ。AUR3遺伝子のコード領域を標的としてgRNAを設計し、Cas9配列と共に発現ベクターを作製してシロイヌナズナ野生株に形質転換した系統の育成を行った。T1植物におけるCAPS法とシークエンシングによるGenotypingで標的部位に変異が導入されていることを確認した。これらの系統をさらに育成し、後代において単一の変異を持つ系統を複数取得した。このとき、トランスジーンを持たないnull-segregantを選抜し、今後の研究における柔軟性を確保した。AUR3は紡錘体の制御に関わる分子であり初期発生にも重要であることから、機能を完全に欠失した突然変異体では胚性致死になる可能性がある。そのため、ヘテロ接合体を優先的に選抜し、T3系統を得た。

興味深いことに、得られた複数のアリルで表現型が異なる様子が観察された。さらに、これらの変異体とゲノム配列を用いた相補性試験を行うため、T3ヘテロ変異体系統とGFP融合タンパク質発現コンストラクトによる形質転換体とを交配し、系統育成に取り掛かった。この系統育成には野生型AUR3と、SUMO-null型AUR3を用いてそれぞれCRISPR/Cas9による複数の変異体候補と交配した。当初計画とほぼ相違ないペースで相補実験が進んでいる。artificial microRNAによるノックダウン系統の作製と確立、相補コンストラクトによる機能検証を終了し、機能的なゲノム配列を確定させている。また、この配列を用いてGFP融合タンパク質発現コンストラクトを作製し、その観察も行っている。さらに、いくつかのDNA損傷試験を行い、その作用を確認することができている。前年度より新たに着手した、ゲノム編集による機能欠失変異体の作出の取り組みを進め、複数の候補系統作出に至っている。今後はこれらの系統を用いて、artificial microRNA系統と同様の研究を行うことで、当初計画よりも証明能力が高いデータを取得できるものと考えている。延長された研究期間で追加実験を行い、論文として発表する計画である。細胞分裂を制御する分子メカニズムは非常に複雑であるが厳密である。本研究は植物細胞の染色体分離制御に着目し、チェックポイントタンパク質に対するSUMO翻訳後修飾の関わりを解明し、詳細な分子機構を明らかとすることを目的としている。真核細胞で広く保存され、SUMO化による翻訳後修飾制御を受けることが報告されているオーロラキナーゼの研究を行った。オーロラキナーゼのSUMO化に関する知見の多くは主に動物細胞や酵母を用いて得られたものであるが、関連する分子の保存性が低いなど植物細胞ではその制御様式は異なる可能性が高い。これまでの研究から、シロイヌナズナのAUR3がSUMO化され得ることと、ノックダウンによって生長の遅延と形態異常が生じることを見出している。前年度に作成した、AUR3を標的とするgRNA及びCas9を導入した形質転換体の選抜を進め、T-DNA null-segregantかつAUR3変異のヘテロ接合体を複数系統取得した。これらの変異体系統からゲノムDNAを精製してシークエンス解析を行い、フレームシフト変異を生じpremature stop codonを含むようになったものを複数選び出した。さらにこれらの系統を育成し、次世代においてGenotypingを行った。野生型とヘテロ接合体がおおよそ1:2の割合で出現し、ホモ接合体は出現しなかった。このことは、ホモ接合体が致死であることを示唆している。さらにヘテロ接合体の未熟な果実を分解して種子を観察したところ、成長を止めているものが多数存在していた。
肺サーファクタント蛋白質のEGFシグナル制御を介した抗腫瘍作用の解明と臨床応用

研究代表者らはSP-DがEGFRの糖鎖に結合し、EGFRのリガンド結合を阻害することで、EGFシグナルを抑制することを報告した。本研究課題では、SP-AもEGFRのリガンド結合を阻害し、EGFシグナルを抑制することを示した。またSP-AはSP-Dとは異なり、糖鎖を介さずにEGFRに結合することを明らかにした。SP-AとSP-Dの抗腫瘍作用の機序を解明することが、肺がんに対する新たな治療戦略につながる可能性がある。CHOK1細胞を用いた発現系でリコンビナントヒトSP-AとリコンビナントヒトEGFR細胞外ドメイン(sEGFR)を調整し、下記の実験に用いた。まず125I-EGFとヒト肺線がん細胞株A549細胞を用いたbinding assayを行ったところ、SP-Aは濃度依存性にEGFとEGFRとの結合飽和度を低下させることがわかった。SP-AのEGFシグナル抑制作用は、SP-Dと同様にEGFRのリガンド結合を阻害するというメカニズムであることが示された。次にLigand Blotによって、SP-AはA549細胞由来のEGFRに直接結合することが分かった。さらにsEGFRを用いてSP-Aとの相互作用を詳細に検討した。Ligand BlotとELISAによって、SP-AはsEGFRに直接結合することが分かった。表面プラズモン共鳴センサーにおける検討でも、sEGFRとSP-Aの結合が確認され、KD = 2.4 ×10-7 Mであった。この結合は、EDTAやマンノースの添加によって阻害されることはなかった。またPNGase処理によってN型糖鎖を切断したsEGFRにもSP-Aは結合した。SP-AはEGFRの細胞外ドメインに直接結合することがわかったが、SP-Dが糖鎖認識領域を介してEGFRのN型糖鎖へ結合するのに対して、SP-Aはレクチン活性には依存せず、またEGFRのN型糖鎖を介さずに結合することが明らかになった。上皮増殖因子受容体(EGFR)は肺がん治療における標的分子として重要である。また肺サーファクタント蛋白質AとD(SP-AとSP-D)が抗腫瘍作用を持つことを示唆する臨床報告がある。我々はSP-DがEGFRの糖鎖に結合することで、EGFRのリガンド結合を阻害し、EGFシグナルを抑制し抗腫瘍作用をもたらすことを報告した。SP-Aにも同様のEGFシグナル抑制作用を認めることから、本研究ではSP-AのEGFシグナル抑制作用の機序を明らかにすることを目的とした。CHOK1細胞を用いた発現系でリコンビナントヒトSP-AとリコンビナントヒトEGFR細胞外ドメイン(sEGFR)を大量に調整し、以下の実験を行った。まず、125I-EGFを用いたbinding assayにより、SP-AはEGFとEGFRの結合飽和度を低下させることがわかった。SP-AのEGFシグナル抑制作用は、SP-Dと同様にリガンド結合の阻害というメカニズムであることが示された。次に、SP-AとsEGFRの相互作用をLigand Blot、ELISA、表面プラズモン共鳴センサーにより解析した。SP-AはsEGFRに直接結合したが、SP-Dが糖鎖認識領域を介してEGFRの糖鎖に結合するのに対して、SP-Aでは糖鎖を介さずに結合することがわかった。さらに、SP-Aのペプチドマッピングを行い、作用点を特定することを目指した。リコンビナントSP-Aをリジルエンドペプチダーゼで切断し、HPLCでペプチド断端を分離した上で、質量分析でペプチドを特定した。精製したSP-A由来ペプチドを肺線がん細胞株A549細胞に添加し、EGFシグナルや細胞増殖への影響を検討した。いずれのSP-A由来ペプチドもSP-Aのような抑制作用を示さなかった。SP-AのEGFシグナル抑制作用にはSP-Aの立体構造が重要である可能性が示唆された。これまでにSP-Aが肺がん細胞株のEGFシグナルを抑制し、増殖や浸潤を抑制することを明らかにしていたが、平成26年度はリコンビナントSP-A、sEGFRを大量に精製し、SP-AのEGFシグナル抑制作用の作用機序を解明すること、SP-AとEGFRの直接的な相互作用を解明することを目標とした。SP-AのEGFシグナル抑制作用は、SP-Dと同様にEGFとEGFRの結合を阻害するというメカニズムであることを明らかにした。またLigand BlotによってSP-AはA549細胞由来のEGFRに直接結合することが分かった。Ligand Blot、ELISA、表面プラズモン共鳴センサーにおける解析によって、SP-AはEGFRの細胞外ドメインに直接結合するが、SP-Dが糖鎖認識領域を介してEGFRのN型糖鎖へ結合するのに対して、SP-Aはレクチン活性には依存せず、またEGFRのN型糖鎖を介さずに結合することが明らかになった。以上より当初、予定していた実験計画は順調に進んでいると考えている。呼吸器内科

(1)SP-Aのペプチドマッピングを行い、SP-AのEGFシグナル抑制効果の作用点を特定する予定である。具体的にはまず大量に生成したリコンビナントヒトSP-Aをリジルエンドペプチダーゼで処理し、HPLCでペプチド断端を分離した上で、質量分析を用いて、それらのペプチドを特定する。いずれのペプチドが肺がん細胞のEGFシグナルに影響を与えるのかを検討したり、sEGFRと結合するかを検討する。(2)マウス肺線がん細胞株LLC細胞を野生型マウスとSP-Aノックアウトマウスへ皮下移植したり、尾静脈から投与し、形成された腫瘍の比較検討を行うことで、生体内でのSP-Aの抗腫瘍作用の意義について検討する。(3)(1)においてEGFシグナル抑制効果を持つペプチドを特定できれば、それを肺がんモデルマウスの血液中に投与することにより、抗がん剤として応用することが出来ないかを検討する予定である。
アズキゾウムシ-Wolbachiaにおける多重共生系の進化生態学

アズキゾウムシは、異なる2系統の細胞内共生細菌ボルバキアー(wBruComとwBruOri:以下、Con、Ori)が1個体に同時感染している(Kondo et al.2002)。本研究は、アズキゾウムシをモデルとし、宿主体内レベルから宿主個体群レベルにいたる「多重共生系の進化生態学」について総合的な探求を行うことを目的としている。本年度は、感染タイプ(=保有するボルバキア系統の組み合わせ:二重感染[CO]、Con単一感染[C]、Ori単一感染[O]、非感染の4タイプ)の違いが、宿主アズキゾウムシの適応度にどう影響するかを調べた。実験には、昨年度にマイクロインジェクションおよび抗生物質処理により作成した、宿主の遺伝的背景を同一とする系統を用い、産卵数、孵化率羽化重量などの適応度成分を測定した。その結果、非感染系統に比べて二重感染系統は産卵数や羽化重量などの低下が全般にみられ、逆に単一感染は非感染系統に比べて産卵数などが有意に増加する傾向がみられた。ただし、繰り返しによっては、感染タイプ間に有意な差は認めらず、ボルバキア感染の宿主に対する影響ははっきりしなかった。次に、2系統のボルバキアが体内において相互作用を示すかどうかについて、定量PCRによってボルバキアの存在量を測定し、調べた。その結果、虫体全体では、Con、Oriともに互いの存在によって存在量が有意に変化することがわかった。すなわち、二重感染個体における存在量が、それぞれの単一感染個体における存在量に比べて有意に低かった。ただし、単一感染時における存在量は、ConはOriが存在しない分増加したが、Oriは二重感染時に比べて増加はするものの、Conの不在分を補うほどには増加しなかった。従って、2系統のボルバキアは、存在量に関しては互いに影響を与える、すなわち競争関係にあること、また、互いの影響は非対称であることがわかった。アズキゾウムシは、異なる2系統の細胞内共生細菌ボルバキア(wBruConとwBruOri:以下、Con、Ori)が1個体に同時感染している(Kondo et al.2002)。本年度は、宿主の遺伝的背景を同一とし、保有するボルバキア系統の組み合わせ(感染タイプ:二重感染、Con単一感染、Ori単一感染、非感染の4タイプ)が異なる系統を作成した。すなわち、抗生物質処理による二重感染個体からの段階的ボルバキア除去、および非感染個体へのボルバキアのマイクロインジェクションを行った。本年度はまず、ボルバキア感染が宿主個体にどのような影響を及ぼすかを調べるため、ボルバキアの宿主生殖操作の1つである細胞質不和合性(CI)の有無を調べた。作成した系統を用いた交配実験により、(1)ConとOriは、非感染系統に対し、いずれも強いCIを示すこと、(2)ConとOriは、非対称性のCI(ConはOriによる不和合性を一部解除できる)を示すこと、(3)二重感染系統はどの感染タイプと交配しても高い孵化率を示し、CIに関して最も有利であること、が明らかとなった。実際に、日本の野外個体群において、二重感染個体は96%という高頻度で存在することがわかっている(Kondo et al.2002)。これらの結果は、第48回日本応用動物昆虫学会大会(京都)にて発表済みである。さらに、台湾、タイへの海外出張により、これまで入手していなかった野外寄主を利用しているアズキゾウムシ系統を発見した。その結果、野外個体群において初のOri単一感染系統を入手した。採集したアズキゾウムシは累代飼育を行っており、今後の実験で用いる予定である。
過酸化水素・オゾンの発生・分解システムの低環境負荷的分離分析への展開

本年度は、複数の金属を含むランタン共沈からの過酸化水素水溶離時の溶出金属の選択性について調査した。共沈担体としての硝酸ランタンを含む溶液に、金属標準液、金属塩試薬から調製したAl, Ca, Cu, Fe, K, Mn, Mo, Mg, P,V, W, Znを適宜希釈して添加し、アンモニアを添加して水酸化ランタンの沈殿を形成させた。沈殿をろ過後、沈殿を回収したろ紙上にH2O2ーNaOH水溶液を添加し、溶離液中の金属濃度をICP-AESにより定量した。その結果、溶離液中にMo, V, W, Al以外はほとんど検出されなかった。溶離されたMo, V, Wについてはペルオキソ錯体の形成が寄与しているものと思われる。Alについては水酸化物がアンモニア存在下で難溶性であることと、両性金属であることから、共沈殿相へ移行した後、溶離液の塩基性条件下で液相へ溶出したものと考えられる。Znも同様に両性金属であるが今回の条件下では溶離液中でほとんど検出されなかった。これは、Znが共沈していないこと(Znーアンミン錯体として溶液相で安定)に起因しているものと思われる。さらに、VとMo, Wを分離できる条件を見出しつつある。Vについては、H2O2ーNaOH系において、NaOH低濃度条件ではほとんど溶出せず、一方Mo, Wについては低濃度でも溶出した。このことは、ランタン固相に対する親和性に相関することが考えられるが、その機構については現在調査中である。このことは、複数の金属を含む溶液からのVの単離につながる知見である。V, Mo, Wの溶出率については、最大で50%前後にとどまっており、沈殿と溶離液の接触時間を増加させる条件の探索、溶離液量の最適化を行う必要があるものと思われる。当初の計画通り、ランタン共沈からの金属溶出挙動、特に金属選択性に関する調査結果として、過酸化水素が共沈固相からのMo,V,Wの選択的溶出に寄与していることを明らかに出来た。さらに、溶離液組成の調整(H2O2ーNaOH濃度)により、VをMo, Wから分離(単離)できる条件について見出すことができた。さらに、ペルオキシ化合物(過炭酸)の金属リサイクルへの適用についても国際誌への掲載があった。過酸化水素がランタン固相からのMo, V, Wの選択的溶出に寄与することが明らかとなったが、V, Mo, Wの溶出率については、最大で50%前後にとどまっている。本研究を金属リサイクルや分離分析用の技術として実用化するためには、溶出率の最適化を行う必要がある。これまでに、溶離液と沈殿の接触時間が短いことが課題として挙げられており、溶離時間、あるいは溶離液量の最適化を行う必要があるものと思われる。本年度は、過酸化水素水を溶出液とする水酸化物共沈殿からの金属溶出挙動について調査した。以前の研究において、d0電子配置のオキソアニオンであるバナジウム(バナジン酸(V))、モリブデン(モリブデン酸(VI)),タングステン(タングステン酸(VI))がランタン共沈殿から過酸化水素水相にに溶出することが明らかとなっている。ただ、当該金属イオンの固液分配挙動の詳細については未知であった。そこで、まずモリブデン酸(VI)を対象成分として、ランタン水酸化物共沈殿からの固液分配について調査した。モリブデン酸をランタン水酸化物に共沈させた後、上清を除去後、共沈殿を洗浄した。この共沈殿に過酸化水素水を添加したところ、溶液が淡赤色に変化し、溶液相へのモリブデン酸ーペルオキソ錯体の溶出が示唆された。そこで、モリブデンの液相への移動を定量的に確認するために、ICP-AES測定により溶液中のモリブデン濃度を測定した。その結果、過酸化水素濃度の増加に応じて溶出量も増加した。共沈担体であるランタンの溶出量も併せて調査したところ、この間にランタンはほとんど溶出していないことが判明した。このことは、水酸化物が溶出してモリブデンが溶出しているのではなく、ランタン共沈殿固相中の吸着(吸蔵)サイトと溶液中のペルオキソ錯体間での平衡移動により溶出が行われていることを意味している。さらに、バナジン酸(V)、タングステン酸(VI)の挙動についても調査したところ、タングステンはモリブデンとほぼ同様な分配挙動を示しており、一方、バナジウムはモリブデン、タングステンと比較して液相への移行割合が少ないことが判明した。本年度は、過酸化水素を溶出液とする共沈殿からの金属分配挙動について調査したところ、過酸化水素濃度を変化させることでバナジウム、モリブデン、タングステンの固液分配を制御できるとの新規な知見を得ることが出来た。本現象は、当該金属の分離、回収にとって有用である。このことは、科研費申請時のH28年度当初計画である「固相からのオゾン・過酸化水素による金属イオン溶離挙動の解析」の結果としてもたらされたものであり、進捗状況としては順調に進展しているものと思われる。本年度は、複数の金属種を共沈殿した水酸化物固相からの溶出挙動の把握、廃棄物からのペルオキシ化合物を利用した金属溶離、高塩濃度溶液からの金属分析法の開発について実施した。まず、モリブデン酸(VI)イオンを含むランタン水酸化物共沈殿に過酸化水素を添加した際の溶出状態の経時変化について調査した。

過酸化水素水添加直後から数分間は溶液は淡赤色であるが、10分を経過したところで徐々に酸素発生が減少し、溶液色も薄くなった。酸素発生がほとんど無くなった15分経過時の溶液相について誘導結合プラズマ発光分析法によりモリブデン濃度を調査したところ、この溶液中からはモリブデンは検出されなかった。酸素発生量から溶液中の過酸化水素残存濃度を換算したところ、15分経過時には当初添加した過酸化水素はほぼ全量が分解し、過酸化水素は残存していなかった。このことから、モリブデン酸(VI)イオンは過酸化水素濃度に応じて溶液相とランタン水酸化物固相の間で可逆的に分配されることが判明した。ペルオキシ化合物による廃棄物からの金属の溶出について検討を行った。タングステンとバナジウムが担持されたチタン酸化物脱硝触媒からのペルオキシ化合物(過炭酸ナトリウム(Na2CO3・H2O2)、過酸化水素水)による金属溶出について検討した。過炭酸ナトリウムは安価であり、過酸化水素と異なり固体かつ非劇物の試薬であることから、易取扱性の点からも産業利用上のメリットがある。その結果、炭酸ナトリウム水溶液及び過酸化水素水それぞれ単体で用いた場合と比較して、過炭酸ナトリウム水溶液はタングステンとバナジウムを効率的に溶出できることが判明した。さらに、高塩濃度試料からの金属分離技術の開発を行ったところ、固相抽出を利用した銅化合物の高度な分離を可能とした。本年度の冒頭に計画したランタン共沈殿と過酸化水素水液相との金属の分配については、過酸化水素濃度に応じてモリブデン酸(VI)イオンが水酸化物固相と溶液相間を可逆的に移行する現象が確認出来るなど、当初計画通りに進展している。固相と液相の元素移行を可逆的に制御できることで、対象となるモリブデン、バナジウム、タングステンなどの精密な分離技術への応用が可能となる重要な知見である。また、廃棄物からの金属の溶出についても、過炭酸ナトリウムのような非劇物かつ固体の試薬による効率的な溶離が達成されるなど、進展が見られている。本年度は、複数の金属を含むランタン共沈からの過酸化水素水溶離時の溶出金属の選択性について調査した。共沈担体としての硝酸ランタンを含む溶液に、金属標準液、金属塩試薬から調製したAl, Ca, Cu, Fe, K, Mn, Mo, Mg, P,V, W, Znを適宜希釈して添加し、アンモニアを添加して水酸化ランタンの沈殿を形成させた。沈殿をろ過後、沈殿を回収したろ紙上にH2O2ーNaOH水溶液を添加し、溶離液中の金属濃度をICP-AESにより定量した。その結果、溶離液中にMo, V, W, Al以外はほとんど検出されなかった。溶離されたMo, V, Wについてはペルオキソ錯体の形成が寄与しているものと思われる。Alについては水酸化物がアンモニア存在下で難溶性であることと、両性金属であることから、共沈殿相へ移行した後、溶離液の塩基性条件下で液相へ溶出したものと考えられる。Znも同様に両性金属であるが今回の条件下では溶離液中でほとんど検出されなかった。これは、Znが共沈していないこと(Znーアンミン錯体として溶液相で安定)に起因しているものと思われる。さらに、VとMo, Wを分離できる条件を見出しつつある。Vについては、H2O2ーNaOH系において、NaOH低濃度条件ではほとんど溶出せず、一方Mo, Wについては低濃度でも溶出した。このことは、ランタン固相に対する親和性に相関することが考えられるが、その機構については現在調査中である。
経口投与用リポソーム薬物キャリアのステルス機能向上のための研究

本研究課題は、ステルス機能を持った薬物キャリアであるミダゾラム封入リポソームを細粒化する条件について検討し、細粒化がミダゾラムの効果およびバイオアベイラビリティに及ぼす影響を調べることを目的として計画された。その結果、細粒化の方法によってリポソームの粒子径および封入率に影響があることがわかり、適切な条件を見出すことができた。さらに、リポソームを細粒化することで消化管からの吸収が高められたことによって、バイオアベイラビリティが高くなることが示唆された。クロロホルムとメタノール混合溶媒中に、脂質(ホスファチジルコリン、コレステロール、ジパミルトイルホスファチジン酸)とミダゾラムを混和し、ポリエチレングリコール(以下、PEG)を9%モル比になるよう加えて、ロータリーエパポレーターを用いて薄膜形成し、ボルテクスイング法によってPEG化ミダゾラム封入リポソームを作製した。作製されたPEG化ミダゾラム封入リポソームを超音波破砕装置を用いて細粒化(超音波処理)した。超音波処理での環境温度、処理時間、および出力を変化させ、動的光散乱システムを用いてリポソームの粒子径の分布を評価した。さらに、ゲル濾過処理で細粒化リポソームを抽出し、高速液体クロマトグラフィ(HPLC)を用いて、ミダゾラム濃度を測定し、ミダゾラムのリポソームへの封入率を評価した。その結果、室温下でPEG化ミダゾラム封入リポソームを超音波処理すると、処置時間とともにリポソームの凝集が起こり、粒子径が大きくなる傾向があることがわかった。一方、超音波装置の浴槽内の水温を10°C程度の低温にコントロールすることで凝集が回避できることが判明した。超音波処理の条件として、200Wで20KHzの下で、20分以上超音波処理することで、目標とする100nm程度の粒子径に保たれることがわかった。さらに、この条件下でのミダゾラムの封入率の低下はみられなかった。本研究課題は、静脈内投与用の鎮静薬であるミダゾラムを経口投与できるように当教室で開発したミダゾラム封入リポソームを、ナノレベルまで細粒化する際の、細粒化の方法(超音波処理の条件)の違いが細粒化後のリポソームの粒子径およびミダゾラムの封入率に及ぼす影響を調べること、PEG化の際のPEG濃度の違いが細粒化および封入率に及ぼす影響を調べること、細粒化およびPEG化がミダゾラムのステルス効果およびバイオアベイラビリティに及ぼす影響を調べることを目的として計画された。平成27年度の研究成果によって、細粒化の方法(超音波処理の条件)によって細粒化および封入率に影響があることがわかり、適切な条件を見い出すことができた。さらに、PEG濃度の違いについては、より高い濃度でステルス効果が期待できるため、当該年度では高濃度(9%モル比)で作製し、粒子径および封入率で良好な結果を得ていることから、全体として、概ね順調に進展していると判断できる。平成28年度は、ミダゾラム封入リポソームを細粒化することによる効果および機序に焦点を当てて研究を進めた。クロロホルムとメタノール混合溶媒中に、脂質(ホスファトジルコリン、コレルテロール、ジパミルトイルホスファチジン酸)とミダゾラムを混和し、平成27年度の研究で得られた条件で、細粒化ミダゾラム封入リポソームを作製した。ウサギに、リポソームに封入されていないミダゾラム溶液(ミダゾラム量として2mg/kg)、細粒化していないミダゾラム封入リポソーム溶液(ミダゾラム量として2mg/kg)、および細粒化ミダゾラム封入リポソーム溶液(ミダゾラム量として2mg/kg)をそれぞれ経口投与し、投与後の鎮静効果と血中ミダゾラム濃度の推移を比較したところ、ミダゾラムをリポソームに封入することによって、ミダゾラムのバイオアベイラビリティが高くなり、さらに細粒化することによってミダゾラムの鎮静効果が早く現れ、バイオアベイラビリティがより高くなった。次に、ミダゾラムを封入していないリポソーム溶液、ミダゾラム封入リポソーム溶液、および細粒化ミダゾラム封入リポソーム溶液をそれぞれウサギに経口投与し、アポリポ蛋白B-48(ApoB-48)の血中濃度の推移を評価した。その結果、ミダゾラムを封入していないリポソーム溶液およびミダゾラム封入リポソーム溶液では、血中ApoB-48濃度は投与前と比較して投与後低下したが、細粒化ミダゾラム封入リポソーム溶液では血中ApoB-48濃度が高値に維持されていた。ApoB-48は消化管からの脂質の吸収を反映している蛋白であることから、リポソームを細粒化することで消化管からの吸収が高められたことによって、ミダゾラムの鎮静効果が早く現れ、バイオアベイラビリティが高くなったのではないかと示唆された。

今後、ミダゾラム封入リポソームを細粒化することによる効果および機序に焦点をあてて研究を進める。平成27年度の研究で得られた条件で作製した細粒化ミダゾラム封入リポソーム溶液(ミダゾラム量2mg/kg)を、ウサギに経口役与し、リポソームに封入されていないミダゾラム溶液、細粒化していないミダゾラム封入リポソーム溶液の投与後の血中ミダゾラム濃度と比較することで、細粒化することによるステルス効果およびバイオアベイラビリティへの効果について評価する。細粒化することによってミダゾラム封入リポソームのステルス効果およびバイオアベイラビリティが高くなることが証明されたら、次に、細粒化ミダゾラム封入リポソームと細粒化していないミダゾラム封入リポソームの脂質の量を同量に調整してウサギに投与し、小腸からの脂質吸収に関与しているアポリポ蛋白-48(apo B-48)の血中濃度を測定し比較することで、細粒化することによって消化管からの吸収が高められているかどうかを証明する。歯科麻酔学ほぼ予定どおりに研究は遂行され、予定どおりに経費を使用したが、わずかな残額(62円)が生じた。繰り越された金額(62円)は、予定された平成28年度の使用金額と合わせて使用し、当初予定された研究計画を遂行する。
ダイオキシン受容体を介する遺伝子転写活性化を増強する核内因子の同定と機構解析

芳香族炭化水素化合物によって誘導されるシトクロムP450のCYP2A8は遺伝子のプロモーター上に芳香族炭化水素化合物受容体の結合塩基配列であるXenobiotics Response Element(XRE)を有している。このXREはCYP1A1の誘導機構と同様に芳香族炭化水素化合物によるCYP2A8遺伝子の転写活性化にきわめて重要な働きを果たしている。しかし、我々はCYP2A8遺伝子の転写活性化にはXRE以外にもPositive Regulatory Element for XRE(PREX)と命名した塩基配列が関与していることを既に明らかにしている。そこで、PREXに結合する核内因子を同定し特性を解析した。その結果、ハムスター肝臓細胞の核内抽出液中で見出した本核内因子は、マウスの肝細胞中にも存在していることを明らかにした。また、CYP1A2は芳香族炭化水素化合物によって誘導されるが、遺伝子のプロモーター上にはXREに相当する塩基配列は見出されておらず、その誘導機構は不明な点がおおい。そこで、マウスCYP1A2遺伝子のプロモーターを解析したところ、CYP1A2遺伝子のプロモーター上にXREは見出さされず、PREXに相当する配列が存在していることが明らかになった。従って、PREX結合因子はCYP2A8のみならずCYP1A2遺伝子の活性化機構に関与していることが示唆され、PREX結合因子は芳香族炭化水素化合物受容体と同様に芳香族炭化水素化合物による遺伝子転写活性化に重要な役割を果たしていると考えられた。シトクロムP450の1分子種であるCYP2A8はダイオキシン受容体のアゴニストである3-メチルコランスレン(3-MC)によって誘導されることが知られている。そこで、CYP2A8の遺伝子転写機構を明らかにするために、CYP2A8のゲノム遺伝子の5'上流域をクローニングし種々の長さの5'上流域をルシフェラーゼ遺伝子と結合させたレポータージーンを構築した。このレポーター遺伝子を初代培養肝細胞に導入し、3-MCの添加によって発現するルシフェラーゼの活性を測定した。その結果、CYP2A8ゲノム遺伝子上の5'上流域には転写開始点から-2366bpから-2349bpの間にダイオキシン受容体応答配列(XRE)が存在していることを見いだした。さらにその近傍を詳細に調べたところ、XREの上流に転写活性を4から5倍程度増強する配列を見いだした。肝細胞の核抽出液を用いてゲル移動度アッセイを行ったところ、この塩基配列に結合する核内因子を見いだした。この塩基配列はこれまでに明らかにされている転写因子の結合配列とは相同性は無く、新規の応答配列であることがわかりPREXと命名した。一方、昆虫由来のドロソフィラ細胞を用いてXREを介する転写活性に及ぼすPREXの影響を調べたところ、PREXによる増強作用は見られなかった。そこで、ドロソフィラ細胞の核抽出液を用いてゲル移動度アッセイを行ったところ、この核抽出液中にはPREXに結合する核内因子は無いことがわかった。以上の結果から、肝細胞の核内にはPREXと結合しXREを介する転写活性を増強する作用を有する因子が存在していることがわかった。ハムスター肝臓で発現しているシトクロムP450-2A8(CYP2A8)はダイオキシン受容体を介して遺伝子の発現が誘導される。我々は既にCYP2A8遺伝子の転写調節領域にダイオキシン受容体の応答配列であるXREが存在しており、CYP1A1と同様の機構で遺伝子の転写が調節されていることを見いだしている。CYP2A8の場合XREによる転写活性化機構に加えて、XREの50bp上流にダイオキシン受容体による転写活性化を増強する配列(PREX)が存在していることを我々は発見している。この機構はCYP1A1では見られないユニークな配列であったことから、本研究においてはPREXによる遺伝子転写活性の増強機構を調べることを目的とした。

まず、マウス肝臓の細胞核抽出液を用いてゲルシフトアッセイを行い、PREXに結合する因子の存在について調べた。その結果、マウス肝臓中にPREX結合因子が存在していることを見いだした。そこで、マウス肝臓cDNAライブラリーを用いたOne-hybrid screening法で結合因子のcDNAの同定を試みた。その結果、PREXに結合できる可能性のある核内因子のcDNAを2個クローニングすることができた。これらはいずれも既知の核内因子であったが、XREによる転写活性化に関する機能はこれまでに報告されておらず、新しい転写調節機構が示唆された。現在、酵母で発現させたタンパク質を用いたゲルシフトアッセイおよびCYP2A8遺伝子のレポーターアッセイ系を用いて、クローニングされた因子の機能の確認を行っている。芳香族炭化水素化合物によって誘導されるシトクロムP450のCYP2A8は遺伝子のプロモーター上に芳香族炭化水素化合物受容体の結合塩基配列であるXenobiotics Response Element(XRE)を有している。このXREはCYP1A1の誘導機構と同様に芳香族炭化水素化合物によるCYP2A8遺伝子の転写活性化にきわめて重要な働きを果たしている。しかし、我々はCYP2A8遺伝子の転写活性化にはXRE以外にもPositive Regulatory Element for XRE(PREX)と命名した塩基配列が関与していることを既に明らかにしている。そこで、PREXに結合する核内因子を同定し特性を解析した。その結果、ハムスター肝臓細胞の核内抽出液中で見出した本核内因子は、マウスの肝細胞中にも存在していることを明らかにした。また、CYP1A2は芳香族炭化水素化合物によって誘導されるが、遺伝子のプロモーターにはXREに相当する塩基配列は見出されておらず、その誘導機構は不明な点がおおい。そこで、マウスCYP1A2遺伝子のプロモーターを解析したところ、CYP1A2遺伝子のプロモーター上にXREは見出されず、PREXに相当する配列が存在していることが明らかになった。従って、PREX結合因子はCYP2A8のみならずCYP1A2遺伝子の活性化機構に関与していることが示唆され、PREX結合因子は芳香族炭化水素化合物受容体と同様に芳香族炭化水素化合物による遺伝子転写活性化に重要な役割を果たしていると考えられた。
呼吸トレーニングによる妊婦の冷え改善および異常分娩予防効果

産前産後休業および育児休業(産休・育休)の取得に伴い、2017年12月26日から2019年8月17日まで研究を中断している。「呼吸エクササイズによる冷え改善効果および異常分娩予防効果の検証」のための準備を行った。研究協力施設とは、研究者の産休・育休取得による研究スケジュールの遅延や変更についても打合せを行った。「非妊女性の呼吸エクササイズの冷え改善効果の検証」の発表準備を行った。現在、産休・育休取得に伴い、計画の遅延が生じている。育休取得期間の後に「呼吸エクササイズによる冷え改善効果および異常分娩予防効果の検証」を開始予定である。また、「非妊女性の冷えの定量化および呼吸エクササイズの効果の検証」の研究成果を、国際学会に応募し発表する予定である。若年女性の冷えの定量化および呼吸エクササイズの効果の検証対象は、健康かつ妊娠していない者で、研究に承諾を得られた神戸市のA大学に通う30名とした。冷えの自覚により冷え群と非冷え群に区分し、両群に対して、対照実験と呼吸実験を実施した。測定項目は、属性(年齢、生活状況、気分、身体計測値)、冷えの主観的評価(冷え評価尺度、冷え症質問紙、手足の冷えの自覚の程度の点数化評価)、冷えの客観的評価(腋窩温、手と足の末梢皮膚温、冷水負荷後の皮膚温回復率、末梢血流量、脈波)とした。分析対象者は29名(冷え群18名、非冷え群11名)であった。呼吸実験は、腹式呼吸(吸気:呼気=1:2、呼吸回数6回/分)とリラックス、自律訓練第2公式を参考にしたイメージ法で構成した。実験には、研究代表者の声によるインストラクションおよび効果音を収録したCDを使用した。さらに30名の中で同意の得られた9名に、自宅でもこのCDを用いて呼吸エクササイズを4週間実施してもらった(以下自宅トレーニング)。自宅トレーニング中は、1週間毎に実験室に来てもらい、計4回の呼吸実験を実施した。冷え群は非冷え群に比べて冷え症評価尺度得点、冷え症質問紙得点、足の冷えの自覚得点が有意に高値を示し、冷水負荷後の末梢血流量、冷水負荷5分後の皮膚温回復率が有意に低値を示し、腋窩温と末梢皮膚温との差が有意に高値を示した。また、両群で、足の皮膚温が、手の皮膚温に比べて有意に低値を示した。さらに、足の冷えの自覚が、手と足共に末梢皮膚温と有意な負の関連性を示した。得られた研究結果は、日本臨床神経生理学会学術集会およびEast Asian Forum of Nursing Scholarsで発表した。現在、論文投稿準備と呼吸エクササイズ効果の分析を実施している。ほぼ申請した計画書通りに進んでいるため。1.「非妊女性の冷えの定量化および呼吸エクササイズの効果の検証」平成27年度および平成28年度に実施した研究成果をまとめ、下記の論文および発表にて公表および公表予定である。(1)「若年女性の冷えの自覚および末梢皮膚温・末梢血流量の関連性」(母性衛生58[1])にて、若年女性の冷えの特徴の新知見として、足の冷えの自覚が、手と足両方の皮膚温と有意な負の相関が認められたことを公表した。(2)「若年女性における呼吸エクササイズの冷え改善効果」(母性衛生、掲載決定)にて、24週間の呼吸エクササイズは、若年女性の手と足の冷えの自覚を軽減し、足底深部温を上昇させる可能性が示唆されたことを公表した。(3)「Effect of breathing exercise on the degree of coldsensitivity and on peripheral skin temperature」(31st ICM Triennial Congress)が採択され、発表予定である。2.「妊婦の冷えの定量化」は、先行研究を再検討した結果、冷えの自覚、足底部皮膚温、足底部深部温で評価し得ることが明らかとなったため見合わせ、「呼吸エクササイズによる冷え改善効果および異常分娩予防効果の検証」(平成29年度予定)のための準備を行った。「呼吸エクササイズによる冷え改善効果および異常分娩予防効果の検証」は、神戸アドベンチスト病院倫理委員会(承認番号2016-10-1)および兵庫医療大学倫理審査委員会(承認番号16040)の承認を得たため、今後実施する予定である。「1.非妊女性の冷えの定量化および呼吸エクササイズの効果の検証」は実施済で、研究成果をまとめている。「2.呼吸エクササイズによる冷え改善効果および異常分娩予防効果の検証」の倫理審査の承認を得たため、予定通り平成29年度に研究を実施する予定である。「呼吸エクササイズによる冷え改善効果および異常分娩予防効果の検証」のための研究打ち合わせおよび物品等の準備を行った。研究協力施設とは、研究代表者の産休・育休取得による研究スケジュールの遅延や変更についても打合せを行った。「非妊女性の呼吸エクササイズの冷え改善効果の検証」の発表準備として、ポスターおよび発表原稿の作成を行った。「非妊女性の呼吸エクササイズの冷え改善効果の検証」のために、脈波解析を行った。平成29年12月より産休・育休取得に伴い、「呼吸エクササイズによる冷え改善効果および異常分娩予防効果の検証」を行う予定であった研究計画の遅延が生じているため。

研究協力施設とは、研究者の産休・育休取得による研究スケジュールの遅延や変更についても打合せを行った。「非妊女性の呼吸エクササイズの冷え改善効果の検証」の発表準備を行った。現在、産休・育休取得に伴い、計画の遅延が生じている。妊婦の冷えの定量化同意の得られた妊娠33週の初産婦を冷えの自覚に基づいて冷え群と非冷え群(15名ずつ)に区分する。測定項目や方法は、平成27年度の予備研究の結果をもとに、修正して実施する。妊婦や胎児への安全性を考慮し、冷水負荷試験は実施しない。群間比較によって妊婦の冷えを定量化する。「2.呼吸エクササイズによる冷え改善効果および異常分娩予防効果の検証」の倫理審査の承認を得たため、予定通り平成29年度に研究を実施する予定である。育児休業取得期間の後に「呼吸エクササイズによる冷え改善効果および異常分娩予防効果の検証」を開始予定である。また、「非妊女性の冷えの定量化および呼吸エクササイズの効果の検証」の研究成果を、国際学会に応募し発表する予定である。育休取得期間の後に「呼吸エクササイズによる冷え改善効果および異常分娩予防効果の検証」を開始予定である。平成27年度物品費のうち、レーザー血流計およびデータ収集装置(1,490,400円)は、以下の理由にて次年度購入とした(理由1本年度は借用可能となり計画通り研究を遂行できるため、2データ収集装置一体型の血流計が販売予定であり、これを購入できることによって、研究施設への持ち運びが容易となり、エクセルに直接出力できることによって処理速度が向上する点で望ましいと考えるため)。今年度に、レーザー血流計を購入予定であった。しかし、「1.非妊女性の冷えの定量化および呼吸エクササイズの効果の検証」の結果、冷えの客観的評価には、末梢血流よりも末梢皮膚温が有用であることが明らかとなったため、レーザー血流計の購入を見送ったことにより、未使用額が生じた。今年度に、末梢皮膚温測定に必要なサーモグラフィーを購入予定であった。しかし、今年度は産休・育休取得のため、研究が計画通り実施できなかったため、購入を見送ったことにより、未使用額が生じた。また、ICM Triennial Congressにて研究成果を発表予定であったが、次年度以降に発表することにしたため、未使用額が生じた。次年度以降に、サーモグラフィーの購入費用および国際学会研究成果発表費用に充当する予定である。サーモグラフィーを購入予定であった。しかし、産休・育児取得に伴い、研究が計画通り実施できなかったため、購入を見送ったことにより、未使用額が生じた。次年度以降に、購入費用等に充当する予定である。レーザー血流計およびデータ収集装置を購入予定である。末梢皮膚温測定に必要なサーモグラフィー(研究で一般的に使用されており、測定時間が短く、視覚的に捉えやすい)の購入費用等に充当する予定である。
人工股関節置換術後の骨溶解を制御する新規治療法の開発

マクロファージが摩耗粉と最初に反応し骨吸収反応を惹起することを踏まえ、我々はビタミンE添加超高分子量ポリエチレン(以下、ビタミンE添加UHMWPE)と共培養したマクロファージの網羅的遺伝子解析をRNAシークエンスを用いることにより行った。さらにビタミンEを添加しない従来のUHMWPEと共培養したマクロファージの網羅的遺伝子解析も行うことで、これらの比較を行った。ビタミンE添加UHMWPEと従来のUHMWPEとを添加したマクロファージでは、その反応や放出因子が異なると考えられる。従って、これらの条件の違う網羅的遺伝子解析の比較により、骨吸収性疾患に対する新規治療薬開発に繋がる因子の同定が出来ると考えている。我々はUHMWPEで刺激したマクロファージの遺伝子発現はビタミンE添加の有無により異なることを網羅的遺伝子解析により明らかにした。発現の上昇した遺伝子のうち、IL-27はビタミンE添加UHMWPEで刺激されたマクロファージで著明に発現上昇を認めた。そこで、マウス頭頂骨骨吸収モデルを用いてIL-27の骨吸収抑制作用について調べた。マウス頭頂骨にIL-27を投与することで、UHMWPEにより誘発された骨吸収は減少した。またin vitroにおいて、IL-27の添加は、UHMWPEにより誘導されるマクロファージの破骨細胞への分化を抑制するとともに、炎症反応を減弱させたことを示した。これらの結果から、ビタミンE添加UHMWPEが炎症性骨吸収を抑制する機序にIL-27が関与していることを示した。この一連の研究結果は、人工関節をはじめとする体内インプラントのバイオマテリアルの開発や、ポリエチレン摩耗粉が引き起こす炎症性骨溶解に対する新規治療薬の開発につながるものと考える。今年度、我々は炎症性骨溶解に対する治療薬開発のため、ビタミンE添加UHMWPE粒子の炎症性骨溶解を減弱させる分子メカニズムの解明に着手した。マクロファージがポリエチレン摩耗粉により活性化し炎症性骨溶解を惹起するが、我々はその機序を制御する新規因子としてIL-27を同定した。ポリエチレン摩耗粉が誘導する炎症性骨溶解において、IL-27が炎症性骨溶解を抑制する分子機序について、In vivoおよびIn vitroにおいて研究を行った。炎症性骨溶解や無菌性ゆるみにRANKL非依存的メカニズムが関与しているという本研究の知見に基づき、我々は骨溶解ならびに無菌性ゆるみの機序を明らかにすべく他の候補因子のスクリーニングを継続して行い、同定された新たな候補分子が破骨細胞の分化ならびに骨吸収を誘導する詳細な分子メカニズムについて研究を行う予定である。また、炎症性骨溶解の病態に対する好中球の機能解析も行う予定である。納期に時間を要することが判明した発注品があり年度をまたぐため発注をキャンセルしたため関連研究の消耗品を購入予定
六射サンゴの骨格形成様式および形態多様化の時空間解析‐生息場と系統進化史の解明‐

六射サンゴキサンゴ科の出芽(無性生殖)による群体形成様式を明らかにした.そして,単純な樹状形を示す当該サンゴから得られた「出芽の規則性」を,同科の複雑な群体形態(塊状や被覆状など)を呈するサンゴ体の成長型で検証し,「出芽の規則性と群体形成との関係性」を解明した.また,様々な底質環境に適応放散し,多様な成長形態を有するキサンゴ科の分子系統解析を行い,「系統関係と出芽の規則性の関係」や「適応進化史」を考察した.キサンゴ科イシサンゴ類における出芽様式を,形態計測・連続薄片作成などの古生物学的な手法のみならず,マイクロX線CTスキャナーなど最先端の解析法を適宜組み合わせ,遺伝的にプログラムされた「出芽の規則性」の存在を証明し,さらにこれらの規則性が多様な群体形態を示す同科複数種のサンゴにおいても成立することを見出した.また,キサンゴ科の規則性や変異性がどのような進化過程で生み出されたのかを明らかにするため,分子系統解析や祖先形質解析を行った.現在,見かけ上の群体形態が類似し,シノニム(異名)とされている種間でも,出芽部位に大きな差異が認められる.このことは,分子系統解析の結果からも支持される.今後,出芽部位の相違は,分類学的に重要な形質になることが示唆される.また祖先形質解析の結果より,出芽部位は潜在的には4箇所で,その箇所が適宜制限されることで,多様な形態が形成されている.群体形成のメカニズムに「成長段階によらない出芽の規則性」や「属や科を超える出芽の一般性」が存在することは,今後,サンゴで代表される群体性生物の形づくりの解明に直結する可能性が高い.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。サンゴを含む刺胞動物門は,原始的な無脊椎動物であり,その後の後生動物の進化を論じる際に重要な動物群である.本研究では,固着性と自由生活性,単体と群体,共生藻の有無などの様々な成長形態を有する六射サンゴキサンゴ科の多様性に注目する.化石種と現生種の両方で「どのようにあらゆる底質環境に適応放散し,多様な成長形態が獲得されたのか」,古生物学・地質学的(地質調査,形態,古環境,骨格微細構造,骨格形成速度の解析),分子生物学的(時計遺伝子,バイオミネラリゼーション,生態調査)を用いてミクロ-マクロ形態と短期-長期時間軸を含めた『六射サンゴの骨格形成様式及び形態多様化の時空間解析』を試みた.❶サンゴ化石の産出状況と現生サンゴの生息環境の観察を行い,さらに共産する他の無脊椎動物との生物間相互作用などから生息場と成長形態の関係性を研究し, (古)生息環境の詳細な復元を行った.❷化石種や現生種を用いて,薄片及び未固定非脱灰凍結切片作成を行った.❸非造礁性サンゴの時計遺伝子の発現パターンと骨格形成(周期性・成長線)の対応関係を明らかにするため複数の条件下で生体を飼育している.❹骨格微細構造などの観察から分類体系を再構築し,その進化史を化石種も含めて議論し,生活様式の変遷とその背景となる古環境の変動を地質記録に基づき解析を行った.本研究はマクロな骨格形成様式や形態解析,また,それらの分系統解析を行い,古環境や生息環境と比較しながら進化過程の解明を目的としている.非造礁性サンゴは,造礁性サンゴと同程度の多様性を有し,浅海から深海,熱帯から両極域までと,多様な環境に生息しているにも関わらず研究例が少ない.特に非造礁性サンゴ類の進化史や独自の骨格成長様式,古生態学的な研究は,ほとんど未着手の状態である.そのため,このような高い多様性が,どのような過程を経て生じたのかはほとんど明らかになっていない.本年度は,マイクロX線CTスキャナーを利用した内部構造の解析を行った論文1本,独自のプログラムでシュミレーションしたサンゴ形態と環境の関係を解析した論文1本の計2本の論文を国際誌に発表した.さらにそれらを造礁性サンゴに応用した論文1本を国際誌に投稿中である.さらに切片作成などの新たな手法を用いて骨格内部の形態形成様式を観察し,論文投稿に向けて準備中である.本研究ではサンゴの生体と骨格を用いた学際的研究により詳細な「骨格形成様式」の解明が期待されるが,その中でも次の点が特筆される.サンゴ骨格中に,概日リズム,概日時計遺伝子,石灰化過程によって裏付けられた,「1日刻みの目盛り」を設定でき,超高精度の古環境指標を提供できる.原理や方法論は,サンゴ以外での「石灰化プロセス」にも適用可能であり,関連分野の進展が大きく見込まれる.さらに,群体生物の構造的・発生学的な知見は,サンゴで代表される群体生物の「形づくりの仕組み」の解明に直結している.