hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
放射線物理と分子化学を融合した液体シンチレータの発光・消光シミュレータ開発

液体シンチレーションカウンタ(LSC)装置のモデル化を行い、核種崩壊で放出されるβ線によって起こるシンチレーション発光とその伝搬、そして光電子増倍管で観測される波高分布を計算するシミュレータを構築した。そして、計算と測定の波高分布を比較することにより、液体シンチレータの発生光子数を求めた。また、発生光子数、計数効率、消光効果の指標ESCR(外部標準チャネル法)、TDCR(Triple to doule coincidence ratio)との相関を解析した。これらの成果から、従来の標準線源試料を用いて計数効率の校正曲線を測定する手法に対して、シミュレーションが代替できることを示した。放射線物理シミュレーションツールキットであるGeant4を基盤として,日立アロカメディカル(株)社製の液体シンチレーションカウンタ装置LSC-5100をモデリングして,ベータ崩壊核であるH-3とC-14のシンチレーション波高分布を計算するシミュレーションを構築した。試作したシミュレーションの信頼性を確認するために,装置校正に用いる商用の試料や自作試料を用意して測定を行い比較した。特に,消光効果が非常に小さいアンクエンチドのH-3およびC-14の標準試料での測定値とシミュレーション結果の出力波高分布と比較により,シミュレーションの信頼性を確認した。更に,消光効果による出力波高分布および計数効率への影響を調査するために,液体シンチレータにおけるベータ線によるエネルギー付与からシンチレーション発光における過程で,化学的な要因によって生じる消光効果(ケミカルクエンチング)のモデル化について検討を行った。シミュレーションでは,ケミカルクエンチングを考慮するモデルとして,経験則に基づくBirksモデルとStern-Volmerモデル(B.Ravat et. al., Comp. Phys. Com. 127, 2000)を適用して比較し,Stern-Volmerモデルが測定値を再現することを確認した。来年度の研究開発として,消光効果のモデルを詳細化するとともに,試作したシミュレーション・ソフトウェアの再構築を行う予定である。放射線物理シミュレーションツールキットであるGeant4を基盤とする液体シンチレーションカウンタ(LSC)のシミュレーションを用いて、ベータ崩壊核であるH-3とC-14の計数効率を見積もり、測定値との比較を行った。測定は市販の標準試料を用い、それぞれ消光効果の異なる10個の試料からなる。シミュレーションでの消光効果は、昨年度の成果からシンチレータの発生光子数を調整することにより行い、光電子増倍管の達したシンチレーション光の波高分布を再現する発生光子数での条件下で、測定と一致する計数効率が得られることを確認した。この成果により、クエンチ指標の1つである外部標準線源チャネル比と発生光子数、そして計数効率の対応を導くことができた。更に、測定とシミュレーションでの波高分布を比較する際の指標として、波高分布の特徴点についての検討を行った。設定した特徴点で、シミュレーションと測定の波高分布が一致することを条件としたとき、計算による計数効率は測定値の1.3%の範囲内で得られることを確認した。この成果により、測定された波高分布の特徴点の値と発生光子数、そして計数効率が対応付けされ、系統的かつ効率的にシミュレーションによる計数効率の導出ができることを示した。その他の核種への応用例として、電子捕獲崩壊のI-125のシンチレーション波高分布のシミュレーションを行った。液体シンチレーションカクテルの含有物により波高分布が変化すること、そして計数効率が変化することを示した。当初開発のシミュレーションソフトウェアは、日立アロカメディカル(株)社製のLSC装置(LSC-5100)をモデリングしたが、汎用性の向上と最新装置への対応を目指し、リファクタリングを行った。新開発のソフトウェアは、TDCR(Triple to Double Coincidence Ratio)法にも対応可能な基盤となった。本研究課題の進捗状況は、当初の研究計画に照らし合わせて、おおむね順調に進展している。本研究では、LSCの高精度・高度化へのシミュレーション展開を目指して、シンチレーション発光・消光モデルを新に加えた液体シンチレーションカウンタ(LSC)のシミュレータを開発することである。昨年度までの成果を発展させて、本年度は次にあげる新な成果が得られている。(1)試作したシミュレータを用いてH-3およびC-14の波高分布と計数効率を見積もった。消光効果を含む試料に対しても、測定と一致する計数効率を得られることが確認できた。(2)化学的要因による消光効果を、シンチレーション光の発生光子数としてモデル化した。外部標準線源チャネル比(ESCR)法によるクエンチング指標、発生光子数、計数効率の関係を対応付けすることができた。(3)波高分布の特徴量を導入することにより、系統的に波高分布を比較して発生光子数を見積もり、その結果として計数効率を導出する手法を開発した。(4)I-125のように電子捕獲によって連鎖的に特性X線/オージェ電子が発生する複雑な過程を経る核種においても、計数効率の見積もりに利用可能であることを示した。特に液体シンチレーションカクテルの組成が計数効率へ与える影響を評価できることを示した。(4)ソフトウェアの再構築を行い、最新のLSC装置への対応可能な基盤を作成した。これらの成果から、消光効果を含むシミュレータの開発が計画通りに進展しており、開発したシミュレータがLSC装置の特性および高精度化のための評価に応用可能であることを示す実績を示せたことが、進捗状況の判断理由である。

放射線物理シミュレーションツールキットGeant4を基盤とする液体シンチレーションカウンタ(LSC)のシミュレーションを用いて、H27年度までにH-3とC-14のシンチレータ発生光子数と計数効率の関係を明らかにした。H28年度は、この結果を検証するために、外部標準線源チャネル比(ESCR)法によって測定されたESCR値を、シミュレーションと比較した。ESCR値は測定波高分布測定に基づいて、信号波形の最小閾値(Lowest Level: LL)と変換係数Kを用いて計算される。シミュレーションでは、LLとKをフリーパラメタとし、ESCR測定値と比較することによって値を推定した。求めた値は、LSC装置で用いられている値と一致することが確認できた。これらにより、シンチレータ発生光子数、計数効率、クエンチ効果の指標ESCR値を全てシミュレーションで関連付けすることが可能となった。更に、シミュレーションソフトウェアの高度化として、昨年度に引き続きTDCR(Triple to Double Coincidence Ratio)法に対応するソフトウェア開発を進めた。ソフトウェアの変更なしにパラメタ設定が実行時に可能となっており、これまでの2本の光電子増倍管を用いたLSC装置のシミュレーションの他に、3本の光電子増倍管を用いるTDCR法のLSC装置をシミュレーション可能な基盤が整った。このシミュレーションに、H27年度までの研究で得られているH-3とC-14の発生光子数の範囲を適用し、TDCR値と計数効率の関係を求めた。求めたTDCR値を解析することにより、ベータ線のエネルギー分布との関係や、装置の計測条件の違いが計数効率等に与える影響を評価することが可能となった。本研究では、液体シンチレーションカウンタ装置(LSC)の高精度・高度化へのシミュレーション展開を目指して、シンチレーション発光・消光モデルを検証可能なシミュレーションを開発することを目標としている。本研究課題の進捗状況は、当初の研究計画に照らし合わせて概ね順調に進展していることに加え、ソフトウェアの再構築を行うことにより、近年のLSC装置で導入されているTDCR(Triple Double Coincidence Ratio)法への対応が可能となっている。これらの開発成果として、(1)化学的要因による消光効果をシンチレーション光の発生光子数でモデル化できることを示した、(2)クエンチング指標の外部標準線源比(ESCR)法によるESCR値をシミュレーションで確認した、(3)C-14, H-3, I-125等の核種についての評価方法を確立した、(4)TDCR値と計数効率との関係を解析するためのシミュレーション開発とその展開計画の立案が得られている。これらの成果および展開状況から、シンチレーション発生光子数、計数効率、クエンチ指標(ESCR)の関係が明らかになっており、当初の目的を順調に進めることができたと自己点検している。更に、TDCR法に関するシミュレーション開発および解析においても新たな知見が得られており、成果をまとめて論文等で発表を行う予定としている。
p53とNF-κBのクロストークによる放射線誘発アポトーシスの制御

昨年度までの研究により、放射線高感受性のマウス胸腺リンパ腫由来3SB細胞は、X線誘発アポトーシスに高感受性であり、X線照射後に一過性のp53蛋白質の蓄積とNF-κBの機能低下が生じることがわかった。この種のp53とNF-κBの相反する反応(クロストーク)は正常マウス胸腺細胞においても確認され、放射線誘発アポトーシスが両基本転写因子によって密接に制御されていることが示唆された。そこで本研究では、X線とは全く異なるDNA損傷を誘発する紫外線においても同様の反応が見られるか否かについて調べた。実験には、p53が正常に機能する3SB細胞と、3SB細胞から分離したp53欠損細胞(1B1C4細胞)を用いた。既に報告したように、3SB細胞に5GyのX線あるいは20J/m^2の紫外線を照射すると、照射後24時間の培養で100%の細胞がアポトーシスで死滅した。一方、1B1C4細胞に5GyのX線を照射し24時間培養しても10%以下の細胞しかアポトーシスを起こさないのに対して、20J/m^2の紫外線照射では24時問後には約60%の細胞が死滅した。このことは1B1C4細胞の紫外線誘発アポトーシスはp53に依存しないことを示している。また、紫外線照射された1B1C4細胞ではNF-κBの機能低下が観察されなかったことより、変異型p53蛋白質はNF-κBとの共通なクロストーク因子に影響を与えないものと思われる。実際に、紫外線照射された1B1C4細胞についてアポトーシス阻害因子c-IAP1及びc-IAP2の量を測定したが、有意な変化は認められなかった。以上の結果より、マウス胸腺リンパ腫由来細胞の紫外線誘発アポトーシスを誘起するシグナル伝達経路には、p53やNF-κB及びそのクロストーク因子が関係しないことが示唆された。マウス胸腺リンパ腫由来3SB細胞のX線誘発アポトーシスには、がん抑制遺伝子産物p53の発現上昇とNF-κBの機能低下が起こり、このようなp53とNF-κBの相反反応はp53ノックアウトマウス由来の胸腺細胞においても観察されている。本研究では、放射線誘発アポトーシスにおける両者の関与、特にp53とNF-κBに介在する共通の因子を同定し、これらのクロストークの実態を明らかにする。まず、p53が機能しているヒト舌癌由来SAS/neo細胞と変異型p53遺伝子を導入したSAS/mp53細胞を用いて、X線照射後のp53及びNF-κBの発現について調べた。その結果、X線照射によりSAS/neo細胞ではSAS/mp53細胞に比べて高い頻度でアポトーシスに特徴的な核変化を起こした細胞が出現し、p53やp21タンパク質も蓄積することがわかった。しかし、これらの細胞ではNF-κBの発現が低く、X線照射後の発現量や機能変化について解析することは不可能であった。そこで3SB細胞を用いて、転写コアクチベーターp300に関わる因子について調べることにした。既に、p300はp53とNF-κBの両方と結合すること、さらにその活性はサイクリン依存性キナーゼCdk2によって制御されることが報告されている。X線を照射した3SB細胞では、アポトーシス様の核変化に先立ってCdk2によりリン酸化したH1ヒストンが検出され、そのリン酸化H1ヒストン量は照射線量に依存して上昇した。しかし、アポトーシス抵抗性のと突然変異細胞では、Cdk2キナーゼによるH1ヒストンのリン酸化は観察できなかった。最近、Cdk2は転写因子E2F-5を強力にリン酸化し、その結果E2F-5がp300と結合して転写活性化能を示すようになることが証明された。このことは、X線照射された3SB細胞内ではCdk2の活性化によりp300が欠乏状態になることを意味している。つまり、X線照射後に見られたNF-κBの機能失活は、p53の蓄積に加えCdk2の活性化に起因していることを示唆する。

また、紫外線照射された1B1C4細胞ではNF-κBの機能低下が観察されなかったことより、変異型p53蛋白質はNF-κBとの共通なクロストーク因子に影響を与えないものと思われる。実際に、紫外線照射された1B1C4細胞についてアポトーシス阻害因子c-IAP1及びc-IAP2の量を測定したが、有意な変化は認められなかった。以上の結果より、マウス胸腺リンパ腫由来細胞の紫外線誘発アポトーシスを誘起するシグナル伝達経路には、p53やNF-κB及びそのクロストーク因子が関係しないことが示唆された。
緑内障における網膜神経節細胞死に対するCDP-cholineの影響について

緑内障における網膜神経節細胞の細胞死には、グルタミン酸毒性やアポトーシスが関わるとされ、本疾患の治療における神経保護は命題である。CDP-choline(Citicoline)は、リン脂質の産生に重要な内因性ヌクレオシドで、膜安定化作用、アセチルコリンの生合成促進およびドーパミン代謝回転の改善作用等を有する薬剤であり、脳虚血において、アポトーシスの一部の系を抑制し、ドーパミンを増加させる。本研究においては、Citicolineが、緑内障性視神経症に対して神経保護作用を有するかを明らかにするため基礎的検討を行った。網膜への分化能を有する培養細胞にアポトーシスを誘導しCiticolineがこれを抑制するかについて検討したところ、Citicolineは濃度依存性にアポトーシス抑制効果を呈する傾向にあった。また、疾患モデル動物として、ラット高眼圧モデルを作製し、(1)Citicolille投与高眼圧群、(2)Citicoline投与眼無処置群、(3)対象高眼圧群および(4)対象群とした。網膜神経細胞死について、眼球から、網膜を摘出し、一眼は固定後スライドグラス上に伸展標本を作製し、TUNEL(terminal dUTP nick end labeling)染色を行った。また、他眼は固定後カスペース3免疫染色を行い、スライドグラスに伸展標本を作製した。光学顕微鏡下でTUNEL陽性細胞、蛍光顕微鏡下でカスペース3免疫組織陽性細胞数を全網膜にわたりカウントし単位面積あたりの陽性細胞数を各群間で比較したところ、in vivoにおいてアポトーシスを抑制する傾向にあった。これらについて次年度に引き続き例数を蓄積した上で統計学的検討を行うとともに、慢性高眼圧モデル、虚血再灌流モデルなど各緑内障モデルでの効果についても検討する。
労働力の維持と安心できる介護の両立を目指して―家族介護者における就労の背景要因

国民生活基礎調査の世帯票、健康票、介護票のデータを、厚生労働省より統計法第33条に基づき、提供を受けた。データは、一世帯内の世帯員が横ならびになる構成であり、一個人が一行に収まるようにデータを加工する必要があった。世帯票と健康票のリンケージには、県番号、地区番号、単位区番号、世帯番号、世帯員番号を用いた。一方、提供を受けた介護票のデータには、世帯員番号が付与されていなかったため、世帯票(健康票)と介護票とのリンケージには県番号、地区番号、単位区番号、世帯番号に加えて対象の性別および出生年月を用いた(そのため、同世帯内で同じ性別・出生年月の要介護者を含む場合は、その対象を除外した。対象は要介護者(介護票回答者)の同居している主介護者(以下、主家族介護者)とした。対象の特定には、要介護者の世帯票にある「主な介護者の状況」(以下、主家族介護者)として回答された「世帯員番号」を用いた。この主家族介護者において、同世帯内の要介護者1人以上を介護している者もおり、今回は対象の均質化を図るため、介護対象の要介護者が1人のみの者に絞った。就労できる、あるいは就労できない背景要因を探索するため、主家族介護者の中で、就労している群と介護のため就労できていない群とに分け、関係するとみられる因子について、分析した。その結果、これらの有意な関連がみられた項目を同時に投入した多変量モデルに(基本属性は投入済み)では、主家族介護者の性別(女性が就労無しの傾向)、要介護者の要介護度区分、主家族介護者が世帯主であること(世帯主が就労有りの傾向)、が有意な関連をみせた。本研究は、国民生活基礎調査の個票データを用いる。データは、統計法第33条に従って個票利用申請を行って承認を受け利用する。申請するデータは、介護票の調査が始まった平成13年から最新の平成28年までの計6回を予定しており、各年の世帯票、健康票、介護票かを参照して、利用申請する調査項目を設定した。家族介護者と要介護者の組み合わせ同定には、世帯票の「主に手助けや見守りをしている方」の世帯員番号を用いる。また、家族介護者の世帯票・健康票、要介護者の世帯票・健康票・介護票のデータの突合には、調査年、都道府県番号、地区番号、単位区番号、世帯番号をキーとして突合するものであり。こうした突合キーとなる調査項目も利用申請するリストとしてまとめた。また、本研究では、家族介護者の中で、就労している者としていない者の状況の比較が主な分析目的であるが、就労においては、世帯票の中で調査年5月の仕事の状況として、仕事あり(1主に仕事している、2主に家事で仕事あり、3主に通学で仕事あり、4その他)、仕事なし(5通学のみ、6家事(専業)、7その他)と調査されている。さらに、1週間の就業日数、就業開始時期、仕事の内容(職業分類)、勤めか自営かの別、勤め先での呼称(勤務形態)、勤め先の企業規模・官公庁の別、が調査されている。こうした調査項目を基に、1就労の有無、2就労の程度(就労頻度と勤務形態による重み付け)を変数化しアウトカム変数とする。なお、勤めか自営かの別や勤め先の企業規模・官公庁の別は、就労実態に対する背景要因の変数として扱うこととしているが、介護のみの時間や、就労に介護を合わせた時間が、一般的な1日就労時間8時間を超えるケース(例えば、8時間の就労のあと、介護をさらに行っているケース)があることが想定され、就労あるいは介護に費やされている時間の1日上限を設定することの必要性が考えられた。使用するデータの当局へのデータ利用申請がまだ終わっていないためである。しかし、コンピュータやメモリ等の分析のための物的な環境を整えることができた。また、研究実施場所筑波大学での倫理審査を受け、本研究はその承認を受けることができた。本研究では「介護と仕事を両立している者がなぜ両立できているのか」への問いに答えるべく、家族介護者の就労実態に関連する要因を多変量解析により明らかにすることを試みた。データは厚生労働省から国民生活基礎調査の提供を受け、介護票による調査が開始された平成13年より平成25年までの計5回分のデータを用いた。まずは、平成22年分の調査データを用いて、家族介護者の世帯票・健康票および要介護者の世帯票・健康票・介護票を、調査区・世帯番号・世帯員番号を用いて突合し、一つのデータセットとした。特に、要介護者と主家族介護者のペアリングについては、要介護者の世帯票にある補問9-4 (主に手助けや見守りをしている方の)同別居の状況(同居している場合は、その世帯員番号)を用いて世帯内の要介護者に対する世帯員を特定した。これにより、要介護者と主家族介護者における両者の変数を同時に分析することが可能となった。就労実態は、主家族介護者の世帯票の就労の有無および就労時間や勤務形態よりを用いた。その結果、平成22年の介護票の集計客体6,342人(公表値)のうち、世帯票および健康票と突合できたのは6,340人、そのうち独居者を除外(家族介護者と同居の者のみを選択)すると4,883人であった。さらに主家族介護者の世帯員番号が特定可能であったペア(主家族介護者が同じ世帯で同居しているケース)は4,069人であった。

性別の組み合わせは、要介護者:主家族介護者において、男:男142ペア、男:女1,410ペア、女:男1,098ペア、女:女1,419ペアであった。主家族介護者の年齢は、30歳未満0.46%、30歳以上60歳未満31.5%、60歳以上68.09%であった(2名欠損)。そして、仕事・通学をしていない主家族介護者は61.09%であった。データ利用申請の承諾を得て、データの提供を受けるまでに時間を要した。また、その後のデータクリーニングや突合方法の探索のために時間がかかってしまったため。国民生活基礎調査の世帯票、健康票、介護票のデータを、厚生労働省より統計法第33条に基づき、提供を受けた。データは、一世帯内の世帯員が横ならびになる構成であり、一個人が一行に収まるようにデータを加工する必要があった。世帯票と健康票のリンケージには、県番号、地区番号、単位区番号、世帯番号、世帯員番号を用いた。一方、提供を受けた介護票のデータには、世帯員番号が付与されていなかったため、世帯票(健康票)と介護票とのリンケージには県番号、地区番号、単位区番号、世帯番号に加えて対象の性別および出生年月を用いた(そのため、同世帯内で同じ性別・出生年月の要介護者を含む場合は、その対象を除外した。対象は要介護者(介護票回答者)の同居している主介護者(以下、主家族介護者)とした。対象の特定には、要介護者の世帯票にある「主な介護者の状況」(以下、主家族介護者)として回答された「世帯員番号」を用いた。この主家族介護者において、同世帯内の要介護者1人以上を介護している者もおり、今回は対象の均質化を図るため、介護対象の要介護者が1人のみの者に絞った。就労できる、あるいは就労できない背景要因を探索するため、主家族介護者の中で、就労している群と介護のため就労できていない群とに分け、関係するとみられる因子について、分析した。その結果、これらの有意な関連がみられた項目を同時に投入した多変量モデルに(基本属性は投入済み)では、主家族介護者の性別(女性が就労無しの傾向)、要介護者の要介護度区分、主家族介護者が世帯主であること(世帯主が就労有りの傾向)、が有意な関連をみせた。データ利用申請の準備を進め、状況が整い次第、当局に利用申請を開始する。同時に先行研究のレビューを進め、分析に用いる統計モデルや共変量として用いるべき調査項目を整える。データは当局への申請・承認をもって提供されるため、データの到着に時間を要する場合が想定される。計画の遅延を出来るだけ防ぐために、事前にデータ突合および変数化のプログラムを用意しておく。各調査票のPDFファイルが厚生労働省のWebページで公開されており、用いる調査項目の様子を把握できる。調査項目は同じ調査票であっても各年異なり、3種の調査票の5年分のデータ突合・変数化プログラムを事前に準備しておくことは有利である。また申請者はこれまでも国民生活基礎調査を初めとする大規模踏査データ(介護保険給付実績、市町村調査データ等)の二次利用の経験があり、そうした経験から予想されるバグ等への対応も可能な限り事前にプログラム化する。これまでの作業で、データの様子は概ね把握できた。今後は平成22年以外の調査年のデータにも着手し、さらに分析モデルのための変数の記述そして解析を進めていきたい。研究実施に遅延があり、学会等で発表できる結果をまとめるまでに至っていないため、その発表機会のための旅費や投稿費等の支出がなかったためである。
上皮細胞の形態形成と増殖・分化の制御機構

本研究は、ヒトのがんの最大の標的である上皮組織について、その形態形成、増殖、分化の制御機構の解析を目的とする。対象とする上皮組織は、表皮ケラチノサイト、子宮頚部扁平上皮、肺胞上皮、胃上皮などである。1)形態形成;マウス皮膚は胎生13日から16日の間に表皮の多層化、角化、毛のう原基の形成という組織構築の基本構造が作られる。このとき発現する遺伝子をDifferental RNA display法によって分離した胎盤から組織浸潤関連遺伝子を探索した。2)増殖制御;ヒト重層扁平上皮の上皮細胞をintegrin β1,integrin β4, EGFR, p75NGFR, bcl-2, BP-180, Ki-67をマーカーに分画し、有力な幹細胞の候補と考えられるp75NGFR強陽性でIntegrin β1陰性細胞サブセットを分離同定した。増殖停止機構の解析、上皮系のアポトーシス機構、パラクリン増殖因子の同定などを進めた。3)細胞分化;シグナル伝達に関わるCキナーゼ分子種を明らかにし、その遺伝子操作動物を作成した。ケラチノサイトの終末分化の際のG1 arrestはCキナーゼn分子種(PKCn)がcdk-2/cylin E複合体と結合し、cdk-2活性を阻害、Rb蛋白のリン酸化を抑えるためであることを見いだし、終末分化においてG1停止と分化の誘導が独立したメカニズムによって進行することを明らかにした。ヒトのがんの90%は上皮細胞に由来するがん腫(carcinoma)である。本研究は上皮組織の形態形成、増殖、分化などの分析を通じて、ヒトがんの発生と進展のメカニズムを明らかにすることを目的に設定された。具体的には次の項目を明らかにする。2)上皮細胞系の増殖制御:上皮細胞のパラクライン増殖因子、HGF,KGFのうち、三次元系ではKGFのみがパラクライン増殖因子として働くことを見出した。ヒト胃由来線維芽細胞から新たな増殖因子(TR)をクローニングした。増殖停止に関わる遺伝子、ets-1をクローニングした。3)上皮細胞系の分化制御:シグナル伝達に関わるCキナーゼ11分子種のうちh分子種が分化のシグナル伝達に関わることを明らかにし、その遺伝子操作動物を作成した。1.上皮系細胞の発生と形態形成:重層扁平上皮系における幹細胞候補を、p75NGFR,Integrinなどの分子の発現により同定した。候補細胞は培養条件下で増殖能を示した。皮膚の発生において胎児期に発現する遺伝子をDifferential RNA Display法によって数種クローニングした。2.上皮細胞系の増殖制御:胃粘膜のパラ分泌増殖因子TRを分離、その作用機序を明らかにした。子宮頸部扁平上皮を用い、上皮細胞の増殖停止に高発現する遺伝子を分離した。3.上皮細胞系の分化:扁平上皮細胞系の終末分化において、分化の誘導とG1期停止がそれぞれ異なるメカニズムによってシグナル伝達されることを見いだした。
在宅医療用可搬型X線撮影装置の開発

在宅医療において、早期発見、早期治療のためのX線診断は重要であるが、従来のX線撮影装置は、ポータブル型のものでさえ大きな装置になり、家屋等での使用には困難を伴う。本研究では、X線撮影装置を大幅に小型化するため、焦電性結晶によるX線源を用いたX線撮影装置の可能性について調べた。焦電性結晶によるX線源は、臨床用X線撮影装置のものと同等のX線強度が得られ、X線撮影装置として使用可能であることが示された。在宅医療において、早期発見、早期治療のためのX線診断は不可欠である。しかし、従来のX線撮影装置は、高電圧電源とX線管球が必要なため、ポータブル型のものでさえ大きな装置になり、家屋等でのX線撮影は困難を伴う。一方で、高電圧電源とX線管球を使わずにX線を発生させる方法に、焦電性結晶を用いる方法がある。これを用いれば、X線撮影装置を大幅に小型化できる可能性がある。本研究では、従来とは全く異なる原理により、X線撮影装置を大幅に「小型化することによって、AED(自動体外式除細動器)のように持ち運びが可能で、撮影場所を選ばない、在宅医療、救急医療等において撮影可能な可搬型X線撮影装置の開発を目指す.今年度は、基礎実験を行うための装置を作製し、焦電性結晶雰囲気の気圧と温度変化率をパラメターとして、焦電性結晶により発生するX線の測定を行った。気圧を10から25 Paまで変化させてX線の測定を行ったところ、気圧が低いほどX線のエネルギーが高く、強度も高くなることがわかった。また、温度変化率を0.5から2.7K/sまで変化させてX線の測定を行ったところ、1.5K/sのときにX線のエネルギーと強度が最大になり、適切な温度変化率が存在することがわかった。焦電性結晶表面に発生する電圧は、簡単な式から計算できるため、計算値と実験で得られた値を比較すると、ほぼ一致することがわかった。このことから、焦電性結晶のc軸方向の厚さを変化させることにより、発生エネルギーを制御できることが示唆された。現在のところ、得られたX線の最大エネルギーは20keV程度であるため、X線撮影を行うためには、焦電性結晶のc軸方向の厚さを現在の5から10倍程度にすればよいことがわかった。本研究では、従来とは全く異なる原理により、X線撮影装置を大幅に小型化することによって、AED(自動体外式除細動器)のように持ち運びが可能で、撮影場所を選ばない、在宅医療、救急医療等において撮影可能な可搬型X線撮影装置の開発を目指す。今年度は、焦電性結晶によるX線の発生に関して、気圧に対するX線の発生効率、X線発生の持続時間を調べた。気圧を10Paから25Paまで変化させたとき、気圧が低いほど、発生電荷に対するX線の発生効率が高いことがわかった。また、X線発生の持続時間は、10Paから15Paでは数十秒、20Paから25Paでは3秒以下であることがわかり、気圧を変化させることでX線発生の持続時間、すなわちX線撮影時間を制御できることがわかった。また、焦電性結晶のc軸方向の厚さが0.5mmの場合、最大発生電圧は20kV程度であったが、結晶のc軸方向の厚さを5mmにすると60kV程度の電圧が得られ、X線撮影が可能な電圧を得ることができた。焦電性結晶により、最大エネルギー60kVのX線を発生させてエネルギースペクトルを測定し、臨床用X線撮影装置で測定したエネルギースペクトルと比較すると、同等の強度のX線が得られていることがわかった。これにより、焦電性結晶によるX線撮影装置の作製が可能であることを示した。
プロテオミクス分析による小児特発性微小変化型ネフローゼ症候群発症原因蛋白質の同定

小児特発性ステロイド感受性ネフローゼ症候群(ISSNS)では大量の蛋白漏出の原因となる何らかの液性因子の存在が疑われており、今回その同定を試みた。液性因子の主体は蛋白質である。今回の研究ではプロテオーム解析という大量の蛋白解析法のうち、SELDI TOF-MS法を用いてISSNS患者血清中に特異的に高発現している蛋白質を同定した。寛解期および二次性ネフローゼ患者と比較して、ネフローゼ期に特異的に高発現していた蛋白質として、アポリポプロテインC1を同定した。ISSNSとの関連を述べた報告はこれまでなく、その病態形成にどのように関連しているか、今後の検討課題である。(具体的内容)本研究の第一の目的は、我々が先の研究で特定した小児特発性ステロイド感受性ネフローゼ症候群(ISSNS)の4つの病因候補一次質量ペプチドイオンの情報を用いて、病因候補蛋白質を同定することである。これら4つのうち2つに関しては、ペプチドシークエンスタグ法を用いた、H2324年度の研究にて、アポリポプロテインA-2、アポリポプロテインC-1、C-2、アポリポプロテインC-1のフラグメントであることが判明した。(意義・重要性等)これまでの報告でネフローゼ症候群とこれらのアポリポプロテインの上昇に関するものは散見されるが、その機序はネフローゼ症候群において続発するとされる高脂血症に伴うものであると一般的に理解されている。つまりネフローゼ症候群に伴う二次的な変化であるという考え方である。しかしながら、今回の研究では、ISSNS群と二次性ネフローゼ群との間で、これらのアポリポプロテインの値に統計学的な有意差を認めており、これらがネフローゼ症候群に続発する高脂血症によるものとは断定できず、ISSNSの病態に特異的に起こっている変化である可能性が考えられた。このようなアポリポプロテインのプロファイリングの変化が、ISSNSにおける糸球体の透過性亢進に一次的に関連しているのか、あるいはISSNSで生じている何らかの異常の結果であるのか、何れにしても、いまだ不明であるISSNSの病態形成を解明していく手がかりになると思われる。【研究の成果】最終年度に実施した研究の成果:H2324年度に実施した、小児特発性ステロイド感受性ネフローゼ症候群(ISSNS)患者血清のプロテオミクス分析の結果、Apolipoprotein A2およびC1の特異的上昇がみられた。従来の計画では、病因候補蛋白の同定に伴い、マウスへの投与実験を経て確定する予定であったが、生理的な状況でも血中にある程度認められる蛋白であること、プロテオミクスの測定からどの程度の高値であったかが不明であったことなどから、ネフローゼ急性期におけるこれらの血中濃度を実測する必要があると判断した。このため、H2425年度にかけては従来の予定を変更して、ISSNS患者血清を用いたApolipoproteinのプロファイリングを実施した。具体的には、Apolipoprotein A2,C1の他に、蛋白尿との関連の報告のある、Apolipoprotein E,Jに関しても同時に測定を行った(ISSNS急性期患者血清、二次性NS急性期患者血清)。この結果、Apolipoprotein C1のみがISSNS急性期患者血清で有意な上昇を認めていた。【意義】小児特発性ステロイド感受性ネフローゼ症候群(ISSNS)では大量の蛋白漏出の原因となる何らかの液性因子の存在が疑われており、今回その同定を試みた。具体的には、患者血清から各種クロマトグラフィーを用いて、特定している病因候補一次質量ペプチドイオンの質量電荷比の情報に基づき、病因候補蛋白質を精製した。これをペプチドシークエンスタグ法により、質量分析を行い、最終的に病因候補蛋白を同定した。これら4つのうち2つに関しては、H23年度の研究にて、アポリポプロテインA-2、アポリポプロテインC-1であることを同定した。

このようなアポリポプロテインのプロファイリングの変化が、ISSNSにおける糸球体の透過性亢進に一次的に関連しているのか、あるいはISSNSで生じている何らかの異常の結果であるのか、何れにしても、いまだ不明であるISSNSの病態形成を解明していく手がかりになると思われる。本来、H24年度までに、同定した病因候補蛋白を用いて動物実験を行う予定であったが、同定された蛋白が全てアポリポプロテインであったため、まずは、これらのアポリポプロテインの上昇が小児特発性ネフローゼ症候群における特異的変化であること(つまり他の二次性ネフローゼ症候群では認められない変化であること)の裏付けをとることとした。つまり、ISSNSと二次性ネフローゼ症候群(二次性ネフローゼ症候群の症例に関しては総コレステロール値がISSNSと有意差がないことが前提)、およびISSNS寛解期の症例の血清アポリポプロテインプロファイリングを行い、ISSNS急性期症例で有意に高値であることを確認する。H23年度中に、4つのうち2つの病因候補蛋白質を同定した。現在、残りの2つに関しても同定を進めている。現在、小児ISSNS症例のアポリポプロテインのプロファイリングを行っており、二次性ネフローゼ症候群やISSNS寛解期のそれと比較するための実験を施行中。これにて有意な差が見られれば、ISSNSの病態形成に強い関与が推定されている免疫系、特にTリンパ球のプロファイリング(Th1、Th2、Th17、Treg)とこれらアポリポプロテインのプロファイリングの変化に相関があるのか検討する。残りの2つの病因候補蛋白の同定を進めるとともに、アポリポプロテインのプロファイリングの異常とISSNSの病態との関連に関する考察を進める。まずは、これらのアポリポプロテインの上昇がネフローゼ症候群に伴う低蛋白血症が原因で生じる二次性の変化であるか否かを再確認するために、再発直後で低蛋白血症を呈さず、高脂血症も来していないISSNS症例の血清アポリポプロテインの定量を行い、寛解期のそれとの比較を行い高値であることを確認する。これにて、二次性の要因が否定できれば、ISSNSの病態形成に強い関与が推定されている免疫系、特にTリンパ球とこれらアポリポプロテインとの関連の有無を確認する。具体的には、2つの仮説の下、研究を進めていく。(1)アポリポプロテインのプロファイリングの変化がISSNS患者のTリンパ球の機能に変化をもたらし、糸球体透過性因子の産生を誘導する、(2)何らかの要因によりISSNS患者のTリンパ球の機能に変化が生じ、これらのアポリポプロテインの産生が亢進する。(1)に関しては、ISSNS患者由来の血清から精製したこれらのアポリポプロテインと尿所見正常群から精製したこれらのアポリポプロテインをそれぞれ、ISSNS患者リンパ球培養液中に添加し、その上清中の蛋白の質量分析を行い、患者血清由来のアポリポプロテインを添加した群で有意に上昇している蛋白を同定する。(2)に関しては、ISSNS患者リンパ球の培養上清と対照となる尿所見正常例のリンパ球の培養上清における、これらアポリポプロテインの定量を行い比較する。アポリポプロテインのプロファイリングのためのELISA kitやTリンパ球のプロファイリングのためのフローサイトメトリー用kit、および、これらの測定や検体保存用の消耗品等を購入する予定。
甲殼類神経節ニューロンのバースト形成のイオン機構

甲殻類神経節ニューロンのバースト活動のイオン機構の概要を報告する。イセエビ心臓神経節及びシャコ口胃神経節のニューロンを膜電位固定し、電流を調べた。心臓神経節の細胞体はバースト発火に導く再生的電位を発生する。この電位はテトロドトキシン耐性でCa依存性である。膜電位固定下の膜電流は電位依存性の内向き電流と外向き電流から成る。内向き電流はCaイオンによって運ばれるが、維持電位-50mvから-40mvで活性化され、20mvで最大になり、徐々に不活性化される。遅延外向き電流は-20mvで活性化され、テトラエチルアンモニウムで阻止される。初期外向き電流は維持電位-50mvから-30mvで活性化され、4-アミノピリジンで抑制され、維持電位変化に応答する。-90mv以上で最大に活性化される。遅い外向き電流はCa依存性であり、MnやCdで抑制されるが、TεAでは抑制されない。これらの内向き,外向き電流は再生的電位の発生機構を知る上に充分である。口胃神経節のニューロンは持続の長いプラトー電位を再生的に発生し、これがバーストを発火する。プラトー電位のTTX-抵抗性は常にみられる由ではない。幾つかのニューロンで観察されたプラトー電位はMnによって抑制される。抑制後興奮応答でみられるリバウンド電位は細胞体膜の能動的応答であるが、TTX塩溶液下では電流刺激で発生しない。幾つかの単離細胞体で膜電位固定ができた。内向き電流はMn感受性,非感受性の二成分から成り、外向き電流については二成分が明らかになった。Ca依存性後外向き電流については調べなかった。膜電位依存性,時間依存性の内向き,外向きコンダクタンスがバースト形成電位に寄与している。Caコンダクタンスの増大は細胞体膜を脱分極させ、脱分極電位の振幅・期間は遅れて活性化されるKコンダクタンスにより決まる。残り二つのKコンダクタンスはこの電位の長い不応期に関連している。
血管と諸器官のワイアリング機構

Flk1陽性中胚葉細胞群は、VEGFの入力シグナルに応じて、血球・血管内皮・心筋その他の中胚葉細胞由来組織への配分がなされ、(中胚葉由来の)各臓器・組織のサイズが決定されるというBody Planの新しいメカニズムを検証することを目的とした。H26年度では、このモデルを検証するためにVE-cadherin promoter/enhancerを用いて、Flt1 cDNAを血管内皮細胞においてのみ発現させ、血管内皮細胞におけるFlt1が心臓発生を制御していることを直接的に検証することを目標として行ったが、Flt1 KO ES細胞へ導入したところ、血管内皮細胞においてFlt1を発現するようなクローンを得ることは出来なかった。一方、血管内皮細胞を可視化するマウスは、今年度は膜結合性のmCherryを発現するFlk1 BACトランスジェニックマウスの樹立を試みたが、多数のTg個体は得られたものの、mCherryの部分を含んだ正常なトランスジーンを有する動物は殆ど無く、欠失したような個体が大部分であった。さらに、新規血管内皮細胞特異的遺伝子の一つとして、Lrrc33という膜タンパク質の解析を行っているが、腫瘍を移植すると、ノックアウトマウスにおける腫瘍サイズが小さいことが分かった。腫瘍内皮細胞と腫瘍マクロファージを単離したところ、血管内皮細胞だけでなく、腫瘍マクロファージにおいても強く発現が認められることが分かった。26年度が最終年度であるため、記入しない。Flk1陽性中胚葉細胞群は、VEGFシグナルの入力に応じて、血球・血管内皮・心筋その他の中胚葉由来組織への配分がなされ、(中胚葉由来の)各臓器のサイズが決定されるというBody Planの新しいメカニズムを検証する。H25年度では、このモデルを検証するためにVE-cadherin promoter/enhancerを用いてFlt1 cDNAを血管内皮細胞においてのみ発現させ、血管内皮細胞におけるFlt1が心臓発生を制御していることを直接的に検証することを目標としていた。実際、VE-cadherin promoter/enhancer-soluble Flt1 cDNAベクターを構築することを終了した。また、Flt1ヘテロマウス同士を交配し、胚盤胞を回収し、Flt1 KO ES細胞を樹立した。一方、血管内皮細胞を可視化するマウスは、生理的・病的血管新生の研究、神経系研究に極めて有効なモデル動物であることが示されているが、当該年度では、膜結合性のmCherryを発現するFlk1 BACトランスジーンを構築し、受精卵へ導入した。スクリーニングの結果、ラインを樹立することが出来なかったため、現在受精卵へ再導入実験を行っている。血管内皮細胞は均一の細胞集団ではなく、同じ血管中から新生する血管内皮細胞集団中にTip細胞、Stalk細胞などが存在し、役割およびそれを支える分子基盤が大きく異なっていることが示唆されている。Flk1-GFP :: Flt1-tdsRed BACトランスジェニックマウス9.5日胚のFACS解析を行ったところ、CD31陽性の血管内皮細胞の中にも、Flk1・Flt1何れも発現していない画分があることを見出した。また、Flk1のみ、Flt1のみを発現する血管内皮細胞集団が存在することが分かった。H25年度では、このモデルを検証するためにVE-cadherin promoter/enhancerを用いてFlt1 cDNAを血管内皮細胞においてのみ発現させ、血管内皮細胞におけるFlt1が心臓発生を制御していることを直接的に検証することを目標としていたが、VE-cadherin promoter/enhancer-soluble Flt1 cDNAベクターを構築することが出来ている。さらに、Flt1 KO ES細胞を樹立できており、この研究項目の進行状況は概ね順調である。膜結合性のmCherryを発現するFlk1 BACトランスジーンを構築し、受精卵へ導入し、スクリーニングの結果、ラインを樹立することが出来なかったため、現在受精卵へ再導入実験を行っている。

この研究項目の進行状況は概ね順調である。Flk1-GFP :: Flt1-tdsRed BACトランスジェニックマウス9.5日胚のFACS解析を行ったところ、CD31陽性の血管内皮細胞の中にも、Flk1・Flt1何れも発現していない画分があることを見出しており、概ね順調に進んでいる。膜結合性のmCherryを発現するFlk1 BACトランスジェニックマウスをPCRによりスクリーニングし、各組織において発現しているラインを選定し、他の班員へ供与することで、班全体の底上げに繋がるようにする。Flk1-GFP :: Flt1-tdsRed BACトランスジェニックマウス9.5日胚からのFlk1陽性、Flt1陽性細胞をソートし、マイクロアレイ解析を行い、遺伝子発現のヘテロ性と血管機能の相関解析を行う。
タウ蛋白のリン酸化とアポトーシスおよび重合阻害に関する研究

アルツハイマー病(AD)脳では多量の異常リン酸化タウ蛋白の存在が知られているが、この異常リン酸化機構は明らかではない。我々の今までの検討ではPI3K(phosphatidylinosito13-kinase)の阻害剤wortmanninをを培養細胞に添加すると、アポトーシス刺激によるPKC活性化によるGSK3の活性抑制がおこり、最終的にはタウ蛋白は脱リン酸化される。また、この系をcaspase-3の阻害剤であるz-DEVD-fmkの存在下でおこなうと、アポドーシスは進行せずにタウ蛋白は高度にリン酸化された状態となる。そこで、z-DEVD-fmkの代わりに内因性のcaspase阻害剤であるXIAP(X-chromosome-linked inhibitor of apoptosis protein)を強制発現させた系を用いて同様の結果が得られるかどうかを検討した。タウ蛋白を発現させた培養細胞にXIAPを強制発現しwortmanninを添加したところ、アポトーシスはほとんど進行しないが細胞死はゆっくりと進行しタウ蛋白は高度にリン酸化されたままとなった。以上のことより、z-DEVD-fmkによって認められたリン酸化タウ蛋白を伴う神経細胞死過程は内因性阻害蛋白によって置き換えることが可能であり、ADの神経変性過程のひとつのモデルとなりうる可能性が示唆された。さらに、我々はタウ蛋白のある部位(Ser214)のリン酸化が14-3-3蛋白というscaffold proteinとの結合を増強することを見出した。これらのことから、タウ蛋白はリン酸化のみによって微小管重合能の制御を受けているだけではなく、リン酸化によって誘導された蛋白結合がさらに何らかの機能制御にはたらいている可能性が示唆された。アルツハイマー病脳においてはタウ蛋白リン酸化が亢進していることが知られているが、この機序は不明である。近年アルツハイマー病を含む神経変性疾患ではアポトーシスが関与する可能性が示唆されているが、我々の研究ではアポトーシスを誘導した神経系細胞においては、タウ蛋白が逆に脱リン酸化することが示されてきており矛盾があることが判明した。そこでアルツハイマー病の神経変性メカニズムにはアポトーシスを逆に阻止するファクターも同時に関与しているのではないかと想定して、内因性カスパーゼ阻害因子であるXIAPおよびNAIPの発現について検討をおこなった。ウエスタンブロットによる解析ではXIAPおよびNAIPはともにアルツハイマー病において発現量が増加しており、さらにXIAPについては断片化フラグメントが増加していることが判明した。また、免疫組織化学的検討においてはXIAPおよびNAIPはともにグリア細胞ではなく神経細胞に発現しており、アルツハイマー病脳における増加はタウ蛋白のリン酸化亢進と関係がある可能性が示唆された。さらに、XIAP遺伝子とタウ遺伝子を同時に強制発現させたHEK293T細胞はタウ遺伝子のみを発現させたHEK293T細胞に比べて、アポトーシスへの耐性が強く、さらに細胞にストレスを誘導した状態においてタウ蛋白のリン酸化が亢進していることが判明した。これらのことは、アルツハイマー病の神経変性では細胞死を誘導する何らかのストレスと同時にアポトーシスを逆に阻止するための内因性カスパーゼ阻害因子(XIAPおよびNAIPなど)が発現して拮抗関係となって、ゆっくりと神経変性が進行するという考え方をおおむね示唆するものである。
郊外居住環境におけるインドア化に関する研究

本研究は郊外の居住環境において,自家用自動車を媒介として,住居内部と郊外大型店舗が境目なく繋がり,公私が混在したひとつながりの生活領域を形成している状況を「郊外のインドア化」と定義し,その全国的な展開状況と調査するものである.調査は全国の代表的な郊外大型店舗集積地(ロードサイド銀座)を対象とし,その配置形態や自動車との接続状況調査から,郊外のインドア化が全国的な現象であることが分かった.インドア化にはいくつかのタイプが認められ,開発前の土地の形状や用途がその要因となっており,タイプによって街路景観の差が生じていることが指摘できた.本研究は郊外の居住環境において,自家用自動車を媒介として,住居内部と郊外大型店舗が境目なく繋がり,公私が混在したひとつながりの生活領域を形成している状況を「郊外のインドア化」と定義し,その全国的な展開状況と調査するものである.調査は全国の代表的な郊外大型店舗集積地(ロードサイド銀座)を対象とし,その配置形態や自動車との接続状況調査から,郊外のインドア化が全国的な現象であることが分かった.インドア化にはいくつかのタイプが認められ,開発前の土地の形状や用途がその要因となっており,タイプによって街路景観の差が生じていることが指摘できた.本研究はインドア化された郊外居住環境の質の向上に資する建築計画,施設計画手法を確立することを念頭に置きながら,その基礎的研究として以下の2点を行った.(1)郊外のインドア化の全国的な展開大都市から郊外に延びる幹線道路を対象とし,郊外大型店舗の沿線毎の配置状況をプロット調査した.郊外型店舗は,幹線道路に沿って分布しているだけでなく,幹線道路から引き込んだ立地に巨大な駐車場を設け,その駐車場を囲むように配置されるタイプなど,自動車利用の利便と消費者の囲い込みをより強く意図した形態が出現しており,インドア化の様態もいくつかのタイプ分けが可能であることが分かった.郊外店舗の道路との関係性は以前の土地形態にも影響を受けており,田園地域,旧街道など,元々の地域性とロードサイドの配置状況に一定の関係性があることが明らかになった.(2)郊外のインドア化による生活領域,公私領域の変化自動車交通を媒介に住居と都市がシームレスにつながるインドア化が,生活領域,公私領域に及ぼす影響は,自動車が住戸や店舗に対してどれくらいの親和度で接触しているかが大きく関わってくると考えられる.調査では,郊外店舗や住宅(戸建て住宅)の敷地内駐車場など,自動車のために供された空間と道路を一つに併せた領域を「道域」と定義し,6つの幹線道路を対象に道域の広がりを調査した.それぞれの道域の広がりには,幹線道路周辺地域の元々の土地形状が大きく作用しており,公私領域や生活領域の展開形態にはいくつかのタイプが存在することが明らかになった.本研究はインドア化された郊外居住環境の質の向上に資する建築計画,施設計画手法を確立することを狙いとした基礎的研究であり,その研究計画の2年目(最終年)として以下を行った.(1)郊外施設によるインドア化に関する追加調査昨年度の調査で不十分であった県外のエリア(九州,関西,中部,北関東)から新たに郊外ロードサイド店舗の集積地(ロードサイド銀座)を抽出し,追加調査を行った.調査では各種施設(商業施設・地域施設)に対し,建物単体を車との空間的な接続性を中心に分析・評価を行った.(2)まとめ19年度, 20年度に実施した事例調査のうち,特に郊外化が顕著であった全国21カ所の郊外を選定し,郊外店舗の空間的形状や分布状況,開発前の土地形状などを中心に比較を行った.郊外居住環境のインドア化は全国の事例でも指摘でき,郊外居住環境のインドア化という現象は全国的に発生している現象であるといえる.また,そのインドア化に関して詳細に比較することで,地域によって差が生じていることが分かった.差を生じる要因としては,開発前の土地の形状や用途が主な要因として挙げられ,それによって街路景観に差が生じていることが指摘できた.郊外ロードサイドの景観は「没場所性」の典型としてあげられることが多く,こうした環境下で如何に場所性の感じられる環境を構築していくかが一つの課題となっており,今回の研究で得られた知見を活かし,地域差を最大化するデザイン手法につなげていくことが次の研究展開として考えられる.