hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
産婦人科医療における相互行為の組織

妊婦の定期健診における,妊婦と保健医療専門家との相互行為の録画を詳細に分析した.その結果,(1)妊婦による心配事の自主的な提示の機会が,体系的に与えられていること,(2)超音波検査においては,モニターの画像を識別するための発話ペアが核となり,それが「胎内の胎児」の把握に向けて束ねられること,(3)相互行為への参加は,(視線の動きのような)微細な振舞いにより,発話ごとに調整されること,が明らかとなった.妊婦の定期健診における,妊婦と保健医療専門家との相互行為の録画を詳細に分析した.その結果,(1)妊婦による心配事の自主的な提示の機会が,体系的に与えられていること,(2)超音波検査においては,モニターの画像を識別するための発話ペアが核となり,それが「胎内の胎児」の把握に向けて束ねられること,(3)相互行為への参加は,(視線の動きのような)微細な振舞いにより,発話ごとに調整されること,が明らかとなった.2005年度より集め始めている「産婦人科医療における相互行為」のビデオデータの分析を進めた.研究代表者の主要方法論である会話分析に耐えうる精度の高いトランスクリプト(転写)を進めるとともに,分析も進めた.とくに,12月からUCLAに滞在しているとき, Charles Goodwin教授から貴重なアドバイスをもらいながら,妊婦健診における「問題提示」についての英語論文の最初の草稿を完成することができた.また,超音波検査における相互行為についても,2008年7月に「言語・文化・精神」学会(デンマーク)にて発表する機会があり,現在,英語論文としてまとめているところである.2008年11月には,日本社会学会の大会において,研究協力者らとともに,産婦人科医療における相互行為をテーマにした2つの部会を持つこともできた.そのほか,産婦人科相互行為のデータから,複数の身体を含む相互行為の一般的な組織についての分析も行ない,日本語論文を2008年の8月に『認知科学』(日本認知科学会)に投稿した.これは2009年3月に同誌において発表されている.また,「複数の身体」に関して,懸案だった研究代表者の著書を,校正において,大幅に見直したあと,2008年9月についに刊行することができた.2009年3月には, John Heritage教授(UCLA)とPaul Drew教授(ヨーク大学)を講師に招き,会話分析のスキル向上のための5日間にわたる集中セミナーを持った.2005年度より集め始めている「産婦人科医療における相互行為」のビデオデータの分析を進めた.研究代表者の主要方法論である会話分析に耐えうる精度の高いトランスクリプト(転写)を進めるとともに,分析も進めた.その成果として,2つ論文を投稿することができた.1つは,妊婦健診において,妊婦が心配事をどのように提示するかの研究("Self-Initiated Problem Presentation in Prenatal Checkups : Its Placement and Construction")で,とくに,妊婦が医師・助産師から心配事の有無を尋ねられることがないときに,自ら進んで心配事提示を行なうための手続きを解明した.これは,Research on Language and Social Interaction誌に投稿され,秋に採択された(2011年の最初の号に掲載予定).もう1つは,妊婦の定期健診における超音波検査で,「胎児」がリアルタイムにそこに存在するものとしてどのように知覚されるか,その手続きを解明したものである("The embodied organization of a real-time fetus : The visible and the invisible in ultrasound prenatal examinations").これは,現在審査中だが,最初の審査では,「微修正後に採択」という結果を得ている.現在,修正稿の審査を待っている.そのほか,2010年のアメリカ社会学会の年次大会に,妊婦の問題提示を扱った別の論文(医師・助産師の質問に対する返答のなかに,自分の心配事を滑り込ませるための手続きを解明したもの)を投稿して,採択された.昨年度に引き続き,会話分析の方法を用いて,ビデオデータの転写および分析を進めた.その成果は,以下のとおりである.1.妊婦の定期健診における問題の提示の自己開始(2010年アメリカ社会学会年次大会):このテーマは,2010年に「Research on Language and Social Interaction」誌発表された論文を引き継いでいる.論文では,保健医療専門家が計測・検査などを開始しつつある地点が,妊婦の問題提示自己開始の体系的な位置であることを示したが,この報告では,保健医療専門家がしばしば行なう「ありふれた(問題に関ゆる)質問」,すなわち,むくみや食欲などに関する質問への返答に対して,妊婦自身が一定の操作を加えることで,その返答を拡張すること,そして,その返答の拡張が,妊婦の問題提示自己開始の体系的な機会となることを,示した.2.超音波検査における対象指示(2010年Society for Social Studies of Science年次大会):この報告は,現在「Social Studies of Science」誌に採択が決まった論文の一部を拡張したものである.妊婦の定期健診において超音波診断装置を用いて胎児の個別部位を捉える試みが,胎児全体を捉える試みのなかにどう埋め込まれているかを,検討した.3.超音波検査における保健医療専門家の視線(2011年アメリカ社会学会年次大会[採択済]):超音波検査において,保健医療専門家が,妊婦の顔を見ることはほとんどない(基本的に,超音波モニターもしくは妊婦の腹部を見る).しかし,それでも,特定の発話とともに,まれに妊婦の顔を見るときがある.その発話は,多くの場合,妊婦の振舞いへの何らかの反応として構成されることを,示した.
Identification of neuron-glia signaling mechanisms required for synaptic plasticity and memory formation

ヒトは年を取ると記憶力が減退する(加齢性記憶障害)。我々はショウジョウバエを用いて、長期記憶の加齢性記憶障害の原因解明を試みた。先ず、通常の長期記憶の形成には、学習後の蛋白合成を伴って短期記憶が長期記憶に転換される期間中に、ドーパミン性ニューロンの活性が低下することが必要なことを見出した。更に、ドーパミン性ニューロンの活性阻害による長期記憶の増強は、若いハエに比べ老化したハエにおいて著しいことを明らかにした。また、ドーパミン性ニューロンの内、長期記憶の加齢性記憶障害に関わるサブクラスを同定し、このニューロン活性が加齢によって増進することを示す予備的実験結果を得た。当初予定していた予算より物品費については安価に入荷できたため、その分は翌年に繰り越すこととした。また、旅費については予定していた学会参加等を本年は見合わせ翌年に参加することとしたため。来年度は行動実験に利用する遺伝子組換えバエ作成にかかわる物品費用として利用し、学会に参加予定があるため次年度使用額から充当する予定である。
体育大学生の睡眠の量と質－抑うつとの関係およびQOLに及ぼす影響

大学生アスリートの睡眠状態を評価し、それが主観的健康状態、抑うつ、及び健康関連QOLと関連するか検討した。質問票により睡眠の質、抑うつ状態、及び健康関連QOLを評価し、腕時計型加速度センサーを用いて睡眠の量を測定した。学部生アスリートの睡眠時間は平均6.1時間と短く、25%に睡眠障害を認めた。男子新入生アスリートでは、睡眠の質の悪化は主観的健康度の悪化と、女子では健康関連QOLの障害と関連していた。2)体育大学生の睡眠障害の有無・程度・種類の評価:PSQIにより主観的睡眠の質を測定し、携帯型加速度センサーActigraphを1週間装着することにより睡眠・覚醒状態を客観的に評価した。また、BDI-II,BDNFにより抑うつ状態を、SF-36により健康関連QOLを評価した。現在、30名程度測定が終了しており、3年間で100名程度のデータを収集する予定である、解析では、睡眠障害の有無と程度を評価し、それらと抑うつ状態の程度や健康関連QOLとの関係を検討する。1)体育大学新入学生の睡眠状況と抑うつ状態との関連体育大学新入学生を対象として、昨年度に引き続き入学時に主観的睡眠の質を評価するPittsburg Sleep Quality Index (PSQI)と抑うつ状態を評価するベック抑うつ質問票(Beck Depression Inventory-Secondedition, BDI-II)、及び健康チェック票THI (Total Health Index)に回答してもらった。平成26年度と27年度新入学生357名(男263、女94)のデータにより、PSQIスコアを目的変数として重回帰分析(ステップワイズ法)を行った。その結果、睡眠状態に関連する要因として、男子ではTHI下位尺度の抑うつ、目と皮膚の症状及び生活不規則性が、女子ではSF36下位尺度の全体的健康感が採択された。体育大学新入学生の睡眠状態は、男子では抑うつを含む主観的健康状態と、女子では健康関連QOLと関連していることがわかった。2)体育大学生の睡眠障害の有無・程度・種類の評価PSQIにより主観的睡眠の質を評価し、同時に、携帯型加速度センサーActigraphを1週間装着することにより、睡眠・覚醒状態を客観的に評価した。この研究は次年度まで継続する予定のもので、本年度までに目標症例数100名のうち50名強の測定が終了した。解析は、次年度測定終了後に実施する予定である。1)体育大学新入学生の睡眠状況と抑うつ状態との関連データ収集は完了した。学会発表も行っている。論文作成に向けて、詳しいデータ分析と文献検索を行っている。2)体育大学生の睡眠障害の有無・程度・種類の評価本年度までに症例を70名程度集める予定であったが、まだ53名しか測定できていない。研究テーマ:体育大学生の睡眠障害の有無・程度・種類の評価、及び睡眠障害と抑うつ・健康関連QOLの関連性[目的]大学生アスリートの睡眠の質と量を評価することにより、睡眠障害の頻度・程度・種類を明らかにし、抑うつ状態と健康関連QOLとの関連を検討すること。[方法]体育大学学部生92名(男68名, 74%;年齢19.7±1.2歳)を対象として、ピッツバーグ睡眠質問票(PSQI)により睡眠の質を主観的に評価し、同時に腕時計型加速度センサー(Actigraph)を1週間装着することにより客観的な睡眠指標も測定した。抑うつ状態はBDI-II、健康関連QOLはSF-36により評価した。[結果]1) PSQIにおける睡眠の質は「非常に良い」が13名(14.1%)、「かなり良い」が66名(71.8%)、「かなり悪い」が12名(13.0%)、「非常に悪い」が1名(1.1%)だった。睡眠障害有は31名(33.7%)であった。2) PSQIによる睡眠時間は、7時間以上が35名(36.5%)で最も多かった。また、6時間未満のものが25名(26.0%)認められた。入眠障害有が31名(32.3%)、中途覚醒有は55名(61.8%)であった。3) Actigraphによる平均睡眠時間は365.4±56.0分(6.1時間)、入眠潜時は10.6±5.9分、睡眠効率は92.4±5.4%、中途覚醒回数は1.8±2.6回であった。4)睡眠障害の程度は、抑うつ状態の程度及び健康関連QOLの障害の程度と相関していた。[結論]大学生アスリートの睡眠時間は短かく、約3割に睡眠障害が認められ、入眠障害より中途覚醒の頻度が多かった。さらに、睡眠障害は抑うつ状態と健康関連QOLに影響を及ぼしていた。大学生アスリートの睡眠障害を早期に発見し介入を行うことは、学生生活を支援するための重要の方策の一つと考えられる。1)睡眠状況と抑うつ状態との関連:データ収集は終了し、詳しい解析を行う予定である。

2)体育大学生の睡眠障害の有無・程度・種類の評価:3年間かけてデータ収集を行う。初年度は30名程度のデータを収集できた。2)体育大学生の睡眠障害の有無・程度・種類の評価目標症例数に達するために、次年度は50名程度のデータ収集が必要となる。Actigraphは4台しか保有していないため、測定できるのは週に4名のみである。そのため、次年度は、できるかぎり早い時期より測定を始める予定である。心身医学1)睡眠状況と抑うつ状態との関連:今年度に学会発表を行い、その後、論文にまとめていく予定である。2)体育大学生の睡眠障害の有無・程度・種類の評価:今年度末にデータの中間集計を行い、できれば最終年度に学会発表を行い、その結果を論文にまとめたい。
動的パターンの遍歴による単細胞生物の脳機能発現メカニズム

巨大アメーバ様の単細胞生物である真性粘菌の変形体の特徴を生かし、情報中枢をもたない単細胞生物における脳的機能の発現原理の解明を目的とした。粘菌は心臓のような周期的な収縮運動により原形質を輸送し、移動し、環境に応じて細胞の形を自由自在に変形させて適応する。本研究の成果により、細胞運動を駆動する代謝反応レベルから、細胞移動の制御に関わる物理化学的機構、細胞形状の設計原理という様々な階層で環境変化にたいする情報処理機構を動力学的観点から明らかにした。アクチン繊維の可視化アクチン・ミオシンは配向性のある太い束をつくり、それらを全方位偏光顕微鏡下で複屈折繊維として観測することに成功し,生きている状態で細胞骨格の分布パターンの変遷を追跡することができた。全長200μmの変形体は先端部一つと尻尾一つという単純な形態をとる.このような場合アクトミオシン繊維の分布は先端部で細かいメッシュワーク,後部では進行方向に向かって垂直方向に太いバンドルを形成する.アクトミオシン繊維のバンドルは収縮弛緩運動と同期して太さが変化し,収縮期には太く,弛緩期には細くなる.また,一つのバンドルに着目すると,観察視野内でのその絶対位置はほぼ変化せず,つまり,細胞内での相対位置が後方へ移動して行く.つまり,変形体において外側のゲル相の原形質は外部の基質に対してほぼ固定されており,ゾル状の原形質を前方に輸送することで移動することが明らかになった.回転ラセンの外部刺激による消滅巨大な変形体から抽出した原形質ドロップは収縮弛緩運動の多様なパターンを示し,その中でも回転ラセン波は周期的な安定したパターンである.この回転ラセン波の外部刺激に対する応答を調べる事により,振動場に発生した回転ラセン波およびパターン遷移の性質を明らかにした.直径およそ1mmの円盤状の変形体は調整後およそ1, 2時間で安定な回転波を示す.変形体のおよそ1/4の部分に円形に青色光パルスを与える.照射領域が最大収縮期付近の時だけ振動パターンは不連続的な変化を示す.照射領域が回転波の中心に近い場合,回転波の消滅または移動が起こる,一方,照射領域が回転波の中心から離れている場合,新たな回転波が生成する.これらの結果から,粘菌の収縮弛緩振動は強い光刺激に対して最大収縮期付近で位相応答が遅延から先進に不連続に変化するtype0の位相応答性を示すと考えられる.本研究の目的は、粘菌を非平衡開放系で時間発展するシステムとしてとらえ、その高度な情報処理能力とその原理を調べ、生命現象を包括的に理解することであり、本年度は刺激に対する細胞の振動パターンの変化と細胞骨格の動態に焦点を当てた。1.収縮弛緩運動の位相応答曲線真正粘菌の振動パターンの光に対する応答メカニズムを明らかにするため、刺激のタイミングと振動の位相の変化の関係(位相応答曲線)を調べた。回転ラセン波が発生している場合、一つの系に全ての位相が分布しているので、全体を刺激することで刺激前後の位相変化の対応を調べることができる。その結果、最大収縮時期の手前で位相応答が遅延から先進に変わることが分かった。この結果は局所刺激による回転ラセン波の消滅の機構が、いわゆるtype0の位相リセットであることを裏付ける。粘菌の刺激応答のダイナミクの一部が明らかと成った。2.アクチンの構造ダイナミクス全方位偏光顕微鏡によりアクチン線維をライブイメージとして可視化し、移動に伴う繊維の動態を長時間(8時間)観察した。一様環境下で粘菌(大きさは数百μm)の形態はオタマジャクシ様の比較的規則的な形とより不規則な形の間で変化を繰り返す。オタマジャクシ様の形態の場合、細胞の後部(尻尾のような部分)には進行方向にたいして垂直に明確な繊維構造ができ、その繊維は収縮弛緩運動と同期して生成消滅を繰り返す。これにより、原形質を前方に輸送していると考えられる。一方、不規則な形状で移動する際には太く明確な線維構造が先端から中央付近に多数現れ、その構造変化は収縮弛緩運動とは連動しておらず、それとは別の機能を果たしていると考えられる。これらの結果により粘菌の運動様式には少なくとも二種類あることがわかり、それに対応して細胞骨格の形態が大きく変化していることが明らかになった。葛藤する状況において粘菌の示す逡巡行動の解明真正粘菌の変形体を細長いレーン状の寒天の途中に忌避物質を置いた系に粘菌を這わせると粘菌は忌避物質に出くわす。すると、粘菌は忌避物質上で移動を止め数時間留まり(個体により時間は異なる)その後移動を再開するが、その際、忌避物質濃度に応じて3通りの行動を示す。忌避物質の濃度が低い場合には粘菌は忌避領域を通り抜け、濃度が高い場合は忌避領域を通り抜けずにもと来た道を引き返してゆく。これらの中間の濃度では、忌避領域を通り抜ける部分と引き返す部分に分裂する個体が現れ、この条件ではこれら3種類の行動のうち、どれが出現するかは個体によって異なる。

モデル構築にあたって変形体の移動メカニズムを探るため粘菌の移動運動中に収縮弛緩する部分(粘菌の後方部分)を切断し、粘菌先端部の運動の変化を確かめたところ、先端部は切断後しばらく切断前とほぼ同じ速度で伸展を続けることが観察された。この結果から、収縮弛緩運動が先端部の伸展運動に直接寄与しているのではなく、間接的に影響していると予想することができる。この結果をふまえて収縮弛緩運動による原形質(ゾル)の輸送と先端におけるゾル-ゲル変換にともなう自己触媒的な偽足形成反応を相互作用させた数理モデルを構築した.これにより粘菌のしめす長時間忌避領域でとどまる、いわば逡巡のような振舞いとその後に現れる行動を再現することに成功した.その結果,進行端における不応状態と活性状態の間を遷移するオンオフ的な生化学反応が粘菌の逡巡行動において重要な役割を担っていることが分った.
RLGS法による癌DNA変化のスクリーニングと癌抑制遺伝子単離システムの開発

従来のRLGS法を根本的に改良したRLGS Ver.1.8の開発とその応用-マウスがん組織のDNA変化の系統的検出システムの開発を行った。RLGS Ver.1.8は、RLGS prototype(RLGS VEr.1.0)に比してラベリングの反応系の縮小化を行ない、フェノール抽出によるバッファー系の置換の必要性をなくしたため高速にRLGSパターンの生産ができるようにデザインしてある。マウスがん組織のDNAは、易発癌性のSV40T-antigenのトランスジェニックのC57BL/6とM.spretusのF1の肝臓ガン組織を用いた。コントロールとして正常の肝臓組織を用いた。マウスにおいてNotI-PvuII-PstIの制限酵素をセットを用いて、我々がすでに染色体上にマッピングした323個に加えて、今回新たに229個のspotsをマッピングした(計552個)。これらのspotsは、一画面上で検出でき、一枚のフィルムにより全染色体上の552個の座位をスキャニングできる。また非多型spotではLOHの領域でかりにがん細胞が100%としてもの濃度が半分になる。しかし、マップしたspotsは、多型spotであるためspotの出現消失で識別できる。このマーカーを用いて、マウスの肝がん組織において、4番等に染色体高率に共通する欠失を検出することができた。(結果)RLGSVer.1.8は従来の原法に比して約10倍のコストダウンとスペースの縮小化を可能とし、一日の処理能力も約10倍にあげることができた。RLGSVer.1.8を用いて1枚のゲルでマウスの全染色体を552個のspotsでスクリーニングできる地図を作成した。全ての生物種にも有効に適用可能なRLGS高速ゲノムマッピング法をさらに加速化した。RLGSspot mapping法は他の全ての生物種にも有効に適用可能であり、さらにC57BL/6とM.spretusのF1のがんDNAのRLGS画像を用いて、たった1枚のゲルで552個のmapped lociを系統的にloss of heterozygosity(LOH)および増幅(amplification)で検出することができた。以上のようにマウスのガン組織を用いて高速かつ効率的にLOHを検出することのできる系を確立し、これを用いると高速に全ゲノムのLOH amplification mapをマウスで作成できる。
卵胞発育および黄体形成と低酸素ストレス:卵巣過剰刺激症候群の予知予防に向けて

(目的)interleukin-8(IL-8)は血球走化性とともに血管新生作用を有するサイトカインであり、排卵や鼓体形成等、卵巣の生理的機能に深く関与していることが知られている。これまで、IL-8は種々の炎症性サイトカイン刺激や低酸素状態において、その発現が充進することが諸家により報告されている。今回、我々はヒト卵胞でのIL-8の発現に対する低酸素状態の関与について検討した。(方法)体外受精患者の採卵時に、卵胞液を個別に採取し、それぞれの酸素分圧値・各種サイトカイン値(IL-8,IL-1β,TNF-α)・ステロイドホルモン値(エストロゲン、プロゲステロン)をガス測定器・ELISA・EIAキットを用い測定した。ヒト卵胞液より穎粒膜細胞を分離後、低酸素環境下で培養し、細胞上清中のIL-8値を測定した。(結果)体外受精患者19名より計79個の卵胞液を採取した。卵胞液中のIL-8値と酸素分圧値に負の相関を認めた。(r=0.45,p<0.0001)しかし、IL-8は卵胞液量・IL-1β・TNF-α・エストロゲン・プロゲステロンいずれとも相関を示さなかった。穎粒膜細胞の培養上清中IL-8は、低酸素刺激によりコントロールの1.8倍の発現を認めた。(p<0.05)(結論)ヒト卵胞、願虹膜細胞培養において、砥酸素刺激によりIL-8分泌が九進することを認めた。卵巣の生理的機能の調節に低酸素環境が関与していることが示唆された。以下のように、低酸素ストレスがヒト卵巣におけるangiogeninの発現に与える影響を明らかにした。[目的]血管新生は卵胞発育、黄体形成において重要な役割を担っている。重要な血管新生物質であるangiogeninのヒト卵巣における発現ならびにその制御機構につき検討した。[方法]体外受精・胚移植施行患者より、同意のもとに採卵時に卵胞液を採取し、さらに卵胞液中から顆粒膜細胞を単離した。卵胞液と顆粒膜細胞中のangiogeninの存在をウエスタンブロッティング法により同定した。また、顆粒膜細胞の培養系にhCG(150ng/ml),cAMP(lmM),低酸素刺激(0.2%O_2)を加え、24時間後の培養上清中のangiogenin濃度をELISA法にて測定し、細胞中のmRNAレベルをリアルタイムPCRにて定量した。145個の卵胞液中のangiogenin濃度を測定し、プロゲステロン、エストラジオール、テストステロン濃度との相関につき検討した。[成績]ウエスタンブロッティング法にて、卵胞液および顆粒膜細胞中のangiogeninの存在が14.3kDのバンドとして検出された。培養顆粒膜細胞からのangiogeninの分泌は、hCGで3倍,cAMPで3倍,低酸素刺激で5.5倍と有意に促進された。低酸素刺激で12.5倍のmRNAレベルの上昇も認められた。卵胞液中のangiogenin濃度はプロゲステロン濃度と有意に正の相関(r=0.36,p<0.0001)を示したが、エストラジオール、テストステロン濃度とは相関を示さなかった。[結論]angiogeninはヒト卵胞液中に高濃度に存在し、卵胞における重要な局所調節因子であるhCG,cAMPおよび低酸素刺激により産生が促進されることを証明した。このことからangiogeninは卵巣において局所の血管新生因子としての生理的意義を有することが推測された。
Lineage tracingを用いたシリコンインプラント被膜形成機構の解明

造血幹細胞特異的にCre recombinaseを発現するTie2CreマウスとCre recombinase発現細胞においてのみ赤色蛍光色素tdTomatoを発現するAi14マウスを交配することにより、造血幹細胞の系譜追跡ができるTie2Cre;Ai14マウスを作製した。さらに、Collagen type 1発現細胞が緑色蛍光色素EGFPを発現するCOL/EGFPマウスとTie2Cre;Ai14マウスを交配することにより、Tie2;Ai14;COL/EGFPマウス(以下TAGマウス)を作製した。TAGマウスの背部皮下にプレオマイシン入り浸透圧ポンプを埋入することにより、マウス被膜モデルを作製した。術後4週にて被膜組織を採取し、免疫蛍光染色によってtdTomato陽性細胞の局在を解析した。その結果、ほとんどの被膜構成細胞はtdTomato陽性CD31陰性であり、被膜構成細胞が造血幹細胞由来であることが証明された。また、被膜における一部のtdTomato陽性細胞はEGFP陽性であり、造血幹細胞由来の被膜構成細胞が、被膜の細胞外基質を産生していることが示された。
開水路粗面及び移動床上の組織乱流に関する研究

約20年前に滑面乱流境界層流れの壁面近傍にバ-スト現象が発見され、これが乱れエネルギ-の発生機構であり、組織立った渦構造をもつものとして流体力学の分野で注目され、現在、「組織乱流」と命名されて精力的に研究されている。滑面開水路流れにも同様なバ-スト現象が存在することが筆者ら(J.Fluid Mech,1977)によって解明されたが、粗面乱流さらには移動床上での組織乱流の構造は、現在でも不明な点が多い。2年間にわたって遂行された本研究は、河床条件を(1)滑面、(2)不完全粗面及び(3)完全粗面に系統的に変化させ、レ-ザ-流速計で流速変動成分を高精度に、計測することによって、粗度が流連分布、乱れ特性値などに及ぼす影響を検討したものであり、多くの知見が得られた。瞬間レイノルズ応力の内部構造を筆者が開発したQuadrant理論を用いて解析し、半値しきい値法を導入して、ejection及びsweep運動の発生周期や滞在時間を解析した。これまで論争の中心であったバ-スト周期の内部変数・外部変数依存説を検討した所、バ-スト周期は外部変数によって支配され、壁面粗度の影響を受けないことが明らかとなった。瞬間レイノルズ応力の発生に寄与するejection及びsweepの寄与率を計算すると、バッファ-層(Y^+=YV*/D【less than or similar】)以上ではejection運動がsweep運動より大きく、すなわち前者は約77%、後者は60%の寄与率となった。粗面乱流になると、sweep運動が強くなり、ejectionとsweepのバ-スト現象に及ぼす寄与率はほぼ同程度になることがわかっ本研究では、さらに、滑面から粗面に、また逆に粗面から滑面に河床条件が変化する場合の乱流構造の解明まで研究を発展させた。以上の研究成果は、成果報告書で印刷物として出版される。約20年前に滑面乱流境界層流の壁面近傍にバースト現象が発見され、これが乱れエネルギーの発生機構であり、組織立った渦構造をもつものとして注目され、現在「組織乱流」という新しい分野で精力的に研究されている。滑面開水路流れにも同様なバースト現象が存在することを筆者らは示したが、粗面乱流さらには移動床上での組織乱流の構造は不明な点が多い。本年度の研究では、河床の粗度を不完全粗面、完全粗面と系統的に変化させ、レーザ流速計で乱流構造を詳細に計測し、滑面乱流の特性と比較し、粗度の影響を検討した。瞬間レイノルズ応力をQuadrant理論を用いて解析し、半値しきい値法を導入し、ejection,sweepの発生周期及び滞在時間を解析した。ejectionの発生周期とsweepの発生周期は、壁面粗度に無関係に外部変数表示されることが確認された。1つのバースト運動中にejectionとsweepとがほぼ同一個現われ、ejection-sweep-ejectionという周期性をもつことがわかった。瞬間レイノルズ応力の発生に寄与するejectionとsweepの寄与率を計算すると、buffer局(y^+>30)以上ではejectionはsweepより大きく、すなわち前者は約77%、後者は約60%の寄与率となった。粗面乱流になると、sweepの寄与率が増大し、ejectionとsweepの瞬間レイノルズ応力に及ぼす寄与率はほぼ同程度になった。

次に、滑面から粗面へと河床条件が急変する場合や、逆に粗面から滑面へと河床条件が急変する場合の組織乱流の構造を検討した。急変前にレーザ流速計を固定してバーストの発生を検出し、この下流側の水路中央断面内にhot-filmを格子状に移動して、バースト構造の時間・空間構造を解明した。ejection運動も、sweep運動も流下方向に約20°30°傾斜している渦構造(ヘアピン)が解明された。しかし、粗度急変に伴う変化はあまり大きくはなかった。約20年前に滑面乱流境界層流れの壁面近傍にバ-スト現象が発見され、これが乱れエネルギ-の発生機構であり、組織立った渦構造をもつものとして流体力学の分野で注目され、現在、「組織乱流」と命名されて精力的に研究されている。滑面開水路流れにも同様なバ-スト現象が存在することが筆者ら(J.Fluid Mech.,1977)、によって解明されたが、粗面乱流さらには移動床上での組織乱流の構造は、現在でも不明な点が多い。本年度は、河床条件が滑面から粗面あるいは逆に粗面から滑面へ急変する開水路流れの乱流構造や組織乱流への解明へと研究を発展させた。その結果、バ-スト周期は、水床と最大流速とで支配させるという外部変数依存性が確認された。レ-ザ-流速計を固定位点での、組織乱流の検出器として使用し、ホットフィルム流速計を移動プロ-ブとしてサンプリング器として同時に計測し、組織乱流の時間・空間構造を解明した。最後に、以上の実験室で得られた知見がレイノルズ数が大きい実河川にも適用できるかを検討する目的で、京都市を流れる琵琶湖疏水の乱流構造を電磁流速計で実測した。その結果、実験室で得られた特性が普通表示を行えばレイノルズ数が10^610^7程度の実河川までスケ-ルアップして適用できることがわかった。
下降流における二相流の熱水力学的分安定性に関する研究

軽水炉や、新型転換炉の安全解析において、入口管破断等を想定するとき、炉心内で下降二相流が生じうる。あるいはこの時、炉心上部よりECC水が注入されるが、上部に吹き上げる蒸気と、下降する冷却水との間で、蒸気一水対向流(CCFL)による炉心の再冠水阻害が起きることがある。この時炉心内流れは振動し、あるいは不均一流になるなどいわゆる不安定状態にあるが、しかし、現象は極端に非定常、かつ非線型的性格を有し、その複雑さのために現象の類別、支配パラメータの抽出、あるいは発生機構の解明は出来なかった。よって、本研究において、既設の並列多流路二相流実験装置を改造し、下降二相流の不安定現象について、以下の二種類の体系について系統的実験を行い、あわせて解析を行うことにより、本現象の発生機構、条件を調べた。(1)実験その1(第二上昇管付並列管)各々三本の加熱管(第一上昇管,下降管,第二上昇管)からなる並列二流路実験装置とし、実験を行い次の三種類の不安定現象を観察した。(a)発生蒸気が下降管を経て第二上昇管に流入した際に大きな循環駆動力が生じ流量が増加することが繰返される"静圧項支配型密度波不安定"。(b)下降管内に蒸気が流れにさからって滞留するが、これは静特性上は不安定な現象であり、並列二流路系で、一方の流路で全流量相当分が流れ、他方では流量が零となる"逸走型不安定"が生じた。(c)下降管内で発生蒸気が流れに逆らって上昇し上部でこれが凝縮する際に、"凝縮介在型振動"が発生した。(2)実験その2(第二上昇管無並列管)並列四本の加熱下降管のみを有し、第2上昇管を無くした体系につき実験を行い、次の二種類の不安定現象を観察した。(d)低流量域で流れに逆らって上昇し、上部で気相が滞留することによる液位の成長。(e)高流量域で、下端で発生するフラッディング。両者とも著しい流量低下、ドライアウトを引起す。
脱ユビキチン化酵素UBPYによる増殖因子受容体のダウンレギュレーションの調節機構

(1)脱ユビキチン化酵素UBPYによる上皮細胞増殖因子(EGF)受容体のダギュレーションの調節UBPYはHrs-STAM複合体によって選別されたEGF受容体をエンドソーム上で脱ユビキチン化すること、そして"選別輸送シグナル"をはずして受容体のリソソームへの輸送を阻害することにより、そのダウンレギュレーションを抑制することを明らかにした。(2)脱ユビキチン化酵素UBPYによる初期エンドソームの形態調節UBPYが初期エンドソーム膜上で様々なタンパク質を脱ユビキチン化すること、そしてUBPYによるエンドソーム上のタンパク質のUb化レベルの調節がエンドソームの形態維持に不可欠であることを明らかにした。(3)14-3-3タンパク質によるM期における脱ユビキチン化酵素UBPYの酵素活性の調節Ser-680のリン酸化依存的な14-3-3タンパク質の結合によりUBPYの脱ユビキチン化酵素活性が抑制されること、細胞分裂期M期にSer-680が脱リン酸化されてUBPYから14-3-3タンパク質が解離し、UBPYの酵素活性が上昇することを見出した。(4)脱ユビキチン化酵素AMSHの初期エンドソームへの局在化機構AMSHとそのホモログであるAMSH-LPが新規の結合モチーフを介してクラスリン重鎖と結合すること、そしてこの結合を介してこれら脱ユビキチン化酵素がエンドソーム膜上に繋ぎ止められていることを明らかにした。増殖因子により活性化された増殖因子受容体は細胞内に取り込まれ、エンドソームを経てリソソームに運ばれ分解される。この受容体のダウンレギュレーションは、活性化された受容体を除去し過度の細胞増殖を防ぐための負の増殖調節機構である。活性化された増殖因子受容体はユビキチン(Ub)化を受け、このUb化がエンドソームからリソソームへの選別輸送シグナルとして働く。そして、2つのUb結合蛋白質HrsとSTAMがエンドソーム膜上で複合体を形成し、Ub化された受容体を認識することによりそのリソソームへの選別輸送因子として機能している。STAMには脱Ub化酵素UBPYが結合する。そこで上皮細胞増殖因子(EGF)受容体のダウンレギュレーションにおけるUBPYの機能解析を行い、次の結果を得た。1)UBPY過剰発現細胞で、EGF刺激時のEGF受容体のUb化レベルが低下し、その分解が遅延する。2)逆にUBPYノックダウン細胞で、EGF刺激時のEGF受容体のUb化レベルが上昇し、その分解が促進される。3)精製UBPYは、Ub化されたEGF受容体をin vitroで脱Ub化する。4)UBPYはエンドサイトーシスされたEGF受容体と細胞内で結合し、その結合にはHrs-STAM複合体が必要である。5)UBPYはHrs-STAM複合体に非依存的にエンドソームに局在する。以上の結果から、UBPYはHrs-STAM複合体によって選別されたEGF受容体をエンドソーム上で脱Ub化すること、そして"選別輸送シグナル"をはずして受容体のリソソームへの輸送を阻害することにより、そのダウンレギュレーションを抑制することが明らかになった。すなわち、Ub化を介したEGF受容体のダウンレギュレーションにおいて、一度Ub化された受容体を脱Ub化することによりその進行を遅延させる負の調節機構の存在が解明された。活性化された増殖因子受容体のリソソームへの選別輸送(ダウンレギュレーション)において、受容体のユビキチン化がエンドソームからリソソームへの選別輸送シグナルとして働く。そしてエンドソーム膜上のユビキチン結合タンパク質複合体Hrs-STAMがユビキチン化された受容体を認識することにより、その選別輸送因子として機能している。本研究課題では、Hrs-STAM複合体と相互作用する脱ユビキチン化酵素UBPYのエンドソームにおける機能解析を行った。

UBPYと共免疫沈降するタンパク質をペプチドマスフィンガープリント法で同定することにより、14-3-3タンパク質がUBPYと結合することを見出した。UBPYにはSer-680周辺に14-3-3結合コンセンサス配列が存在し、14-3-3タンパク質はSer-680のリン酸化依存的にこのコンセンサス配列に結合することが明らかになった。さらに、14-3-3タンパク質の結合によりUBPYの脱ユビキチン化酵素活性が抑制されること、細胞分裂期にSer-680が脱リン酸化されて14-3-3タンパク質がUBPYから解離してUBPYの酵素活性が上昇することを明らかにした。これらの結果から、タンパク質のユビキチン化/脱ユビキチン化によって細胞分裂期におけるエンドソームの機能が調節されていることが示唆された。またUBPYノックアウトマウスを作製し、その欠損胚が受精後8.59.5日目に耐性致死となることを明らかにした。胚切片の組織学的解析の結果、UBPY欠損月杢の細胞は中胚葉誘導がおきる前に増殖を停止することが明らかになった。またUBPY欠損胚由来の初代培養細胞の免疫染色の結果から、UBPY欠損細胞では初期エンドソームへのユビキチン化タンパク質の蓄積とその形態変化が引き起こされていることが明らかとなり、エンドソーム機能が胚発生に必須であることが示された。
アンチレクス負荷ダイナミックMR涙道造影によるシェーグレン症候群の涙腺機能評価

シェーグレン症候群が疑われる患者48名に対して、塩化エドロホニウム(アンチレクス)急速静注によるダイナミックMR涙道造影を施行した。使用したMRIは臨床用1.5テスラ装置であり、SN比向上のため受信用コイルとして直径約4cmの小径コイルを用いた。撮像プロトコールは健常ボランティアによる基本的検討の結果設定したものを用いた。パルス・シークエンスは、高分解能MRI用としてTGSE法(512マトリックス、撮像時間28-35秒)、ダイナミックMR涙道造影用としてsingle-shot RARE法(256マトリックス、撮像時間7.1秒)を使用した。ダイナミックMR涙道造影から流涙による涙嚢から鼻涙管の描出の状態を経時的に観察し、その描出の程度をnormal、delayed、non-visualizedの3群に分類した。さらにこれらの対象患者に対して、口唇腺生検によるシェーグレン症候群の診断と病期判定および眼球乾燥試験(Schirmer's test)による涙腺分泌機能障害の判定を行った。得られたデータからダイナミック脈涙道造影所見と、口唇腺生検および眼球乾燥試験との比較検討を行った。その結果、ダイナミックMR涙道造影所見とシェーグレン症候群の重症度および涙腺分泌機能との間に有意な相関関係が認められた。今回の検討の結果、ダイナミックMR涙道造影がシェーグレン症候群における涙腺分泌機能の客観評価法として有用であることが示された。基礎的検討として正常ボランテイア5名に対して塩化エドロホニウム(アンチレクス)静注によるダイナミックMR涙道造影を施行した。臨床用1.5テスラ装置を使用し,SN比向上のため受信用コイルとして直径4cmの小径コイルを用いた。撮像パルスシークエンスは,高分解能TGSE法(撮像時間28-35秒)およびsingle-shot RARE法(撮像時間7.1秒)を用い、ダイナミックMR涙道造影の経時的な変化から流涙による流嚢がら鼻涙管の描出の状態を観察した。この基礎的検討結果から塩化エドロホニウム(アンチレクス)の至適投与量と至適撮像パルスシークエンスを設定した。ついで基礎的検討で設定した撮像プロトコールを用い、シェーグレン症候群が疑われる患者15名に対してダイナミックMR涙道造影を施行した。これらの症例に対して、さらに口唇腺生検によるシェーグレン症候群の確定診断と病期判定,眼球乾燥試験(Shirmer test, Rose bengal test)および涙腺生検による涙腺分泌機能障害の判定在行った。これらのデータから、ダイナミックMR涙道造影所見と、口唇腺生検、涙腺生検の病理組織所見と眼球乾燥試験所見との比較検討を行った。検討症例数はまだ限られているが、ダイナミックMR涙道造影が涙腺分泌機能の客観評価法として有用であることが示唆された。シェーグレン症候群が疑われる患者48名に対して、塩化エドロホニウム(アンチクレス)急速静注によるダイナミックMR涙道造影を施行した。パルスシークエンスは、高分解能MRI撮像用としてTGSE法(512マトリックス、撮像時間28-35秒)、ダイナミックMRI撮像用としてsingle-shot RARE法(256マトリックス、撮像時間7.1秒)を使用した。ダイナミックMR涙道造影から流涙による流嚢から鼻涙管の描出の状態を経時的に観察し、その描出の程度をnormal、delayed、non-visualizedの3群に分類した。さらにこれらの対象患者に対して、口唇腺生検、涙腺生検によるシェーグレン症候群の診断と病期判定および眼球乾燥試験(Shirmer's test、Rose bengal test)による涙腺分泌機能障害の判定を行った。得られたデータからダイナミックMR涙道造影所見と、口唇腺生検、涙腺生検所見および眼球乾燥試験所見との比較検討を行った。

その結果、ダイナミックMR涙道造影所見とシェーグレン症候群の重症度および涙腺分泌機能障害との間に有意な相関関係が認められた。今回の検討の結果、ダイナミックMR涙道造影がシェーグレン症候群における涙腺分泌機能の客観評価法として有用であることが示された。
幹細胞医療の倫理的・法的・社会的側面についての研究

(1)再生医療等安全性確保法の課題抽出:国内で細胞治療を提供する自由診療クリニックのWebサイトを分析、74クリニック247治療を同定し、国際ガイドラインから逸脱した治療や、広告規制の点で不適切なHPが多数存在すること等が分かった。(2)iPS細胞技術の倫理的課題に関する意識調査:一般市民520名とiPS細胞研究者105名に質問紙調査を行い、6割の一般市民と8割の研究者がヒトーブタキメラ動物の作製を許容すると答えたこと等が分かった。(3)幹細胞研究の倫理支援体制に関する調査:米国3大学で倫理審査に関わる事務職員と生命倫理学の研究者に聞き取りを行った限り、両者の業務棲み分けは比較的明確であった。(1)自由診療で幹細胞治療を提供する国内クリニックのホームページ分析:2014年から「再生医療等の安全性の確保等に関する法律」によって、営利目的の細胞治療が規制されることになった。こうした治療は国内でも問題視されてきたが、実態は不明であった。営利目的で細胞治療を提供する国内クリニックのホームページ情報を集めて分析したところ、多くのクリニックが再生医療等の専門性を謳い、多彩な疾患に体性幹細胞等を用いた治療を行い、医療広告規制に違反していた。成果は投稿準備中である。(2)一般成人を対象にした自由診療の幹細胞治療に関する質問紙調査:上記の研究結果から、多くの一般成人が安全性や効果が立証されていない営利目的の細胞治療を受けている実態が示唆された。これを検証すべく、国内外の文献レビューや研究デザイン/仮説の構想、質問項目の内容に関する検討を開始した。(3)一般成人を対象にした特別な配慮が必要となる細胞に関する質問紙調査:国の専門委員会等では、動物の胚にヒトiPS細胞を入れて動物胎内に戻すことや、ヒトiPS細胞から作製した生殖細胞の受精を認めるかどうかの議論が佳境に入ろうとしているが、世論の動向は明らかではない。本年度は、国内外の文献レビューや研究デザイン/仮説の構想、質問項目の内容に関する検討を開始した。(4)幹細胞研究の実施を倫理的側面から支援する体制についての調査:米国では2000年頃より、生命倫理学の研究者が「研究倫理コンサルテーション」ー研究過程で生じる倫理問題等の解決において、生物科学の研究者を支援することーを行うようになった。しかし、日本では生命倫理学の研究者が倫理審査に伴う事務支援をも行うことが多く、人材不足は深刻である。そこで、研究倫理コンサルテーション発祥の地である米国で、生命倫理学の研究者と事務職員との役割・機能分担に関する視察を開始した。(1)ホームページ分析は英語論文として投稿準備中、途中経過は複数の学会等で報告した。(2)(3)質問紙調査も研究員を雇用して文献レビューを開始、(4)研究倫理支援体制の調査も米国の大学で聞き取りを行っている。この他、複数の関連領域(「包括同意」等)での論文も出版できた。(1)再生医療等安全性確保法の課題抽出:2014年に「再生医療等の安全性の確保等に関する法律」が施行され、効果や安全性が検証されていない細胞治療を自由診療で提供することが規制されることになった。そこで、国内クリニックのホームページ情報を分析し、次の点を明らかにした。1少なくとも74施設で247件の細胞治療の提供がうたわれていた。24施設が法で「高リスク」に分類される臍帯血等の投与をうたっていた。3国際ガイドラインから逸脱した治療が日本で合法的に提供される可能性があった。4広告規制の観点から不適切なホームページが数多く存在した。また、上記2の結果を受け、治療を目的とした臍帯血の譲渡、保存、提供に関する国内の実態を明らかにすべく、分娩取扱医療機関を対象にした質問紙調査の準備に着手した。この他、幹細胞治療を受けた患者がクリニックを訴え勝訴した判例の分析を行った。(2) iPS細胞技術の倫理的課題に関する意識調査:動物の胚にヒトiPS細胞を入れて動物胎内に戻すこと(動物性集合胚研究)や、ヒトiPS細胞から作製した生殖細胞の受精を認めるかどうかが国内外で議論されているが、世論の動向は明らかでない。本年度は、「動物性集合胚研究」に関する一般市民の意識調査を実施した。また、iPS細胞や再生医療に関するTwitterの発言を分析した。(3)幹細胞研究の実施を倫理的側面から支援する体制についての調査:米国では2000年頃より、生命倫理学の研究者が「研究倫理コンサルテーション」ー研究過程で生じる倫理問題等の解決において、生物科学の研究者を支援することーを行うようになった。しかし、日本では生命倫理学の研究者が倫事務支援まで担うことも多く、人材不足は深刻である。本年度は、米国テキサス大学の研究倫理コンサルテーション担当者に研究者と事務職員との役割・機能分担等についてインタビューした。(1)再生医療等安全性確保法の課題抽出:ホームページ分析は国際誌に2本の論文が掲載され(うち1本は予定)、判例分析にてついては国際誌に1本、国内誌に1本の論文が掲載された。いずれの研究も国際学会で果を報告し、国内学会でも企画シンポジウムとして採用された。研究の進展に伴いに生じた新たな問いー国内クリニックは治療目的の臍帯血をどのようにして入手しているのかーに答えるべく、当初の計画にはなかった質問紙調査の準備に着手した。(2) iPS細胞技術の倫理的課題に関する意識

調査:一般市民を対象にした質問紙調査を実施し、データの集計まで行った。同じ調査を研究者にも行って、結果が比較できるよう準備中である。iPS細胞や再生医療に関するTwitterの発言分析は、当初の計画になかった研究だが、質問紙調査よりリアルタイムかつ低コストで大規模な民意を把握、検討することが可能になると考え、実施を判断した。研究成果の一部はすでに論文としてまとめ、国際誌へ投稿するに至っている。(3)幹細胞研究の実施を倫理的側面から支援する体制についての調査:前年度に引き続き、研究倫理支援体制の調査も米国で聞き取り等を行っている。この他、複数の関連領域(「ゲノム編集」「包括同意」等)に関する学会発表等もできた。本助成を受けて雇用した若手研究員のなかには、国内外の学会報告や学術誌への論文掲載を積極的に行い、次の職を得た者もおり、本プロジェクトが研究のみならず、若手研究者のスキル・アップやキャリア形成の場として効果的に機能していることが示唆される。(1)再生医療等安全性確保法の課題抽出:1効果や安全性が検証されていない細胞治療の問題が指摘されて久しいが、患者受診の契機となるクリニックのWebサイトがどのような情報を提供しているのかは不明であった。現在、Webサイト情報は医療広告の規制対象ではないものの、2016年、厚生労働省はWebサイトの監査体制も強化する法改正の方針を示した。本研究で国内クリニックのWebサイト情報を分析したところ、現行の広告規制の対象がWebサイトに拡張された場合、広告として表示不可とされる「再生医療」の文言を使用するなど、8割以上のクリニックが取り締まりの対象になり得ることが示唆された。2前年度までの研究で、国内複数のクリニックが法で「高リスク」とされる臍帯血の投与をWebサイト上でうたっている実態が明らかになったが、その入手経路については不明であった。そこで今年度は、全国の産科医療機関を対象に臍帯血の取り扱いに関する現状調査を実施すべく、質問紙を作成・送付するところまで実施した。(2) iPS細胞技術の倫理的課題に関する意識調査:1動物の胚にヒトiPS細胞を入れて動物胎内に戻すこと(動物性集合胚研究)認めるかどうかが国内外で議論されているが、世論の動向は明らかでない。そこで、一般市民520名とiPS細胞研究者105名に対する質問紙調査を実施したところ、8割以上の一般市民と9割以上の研究者が、ヒトiPS細胞を注入したヒトーブタキメラ胚の作製を、6割以上の一般市民と8割以上の研究者が、ヒトのすい臓を持つヒトーブタキメラ動物の作製を許容し得ることが明らかになった。2ヒトiPS細胞から作製した生殖細胞の受精を認めるかどうかが国内外で議論されているが、世論の動向は明らかでない。そこで一般市民約4,000名を対象に、当該研究の許容度を明らかにする質問紙を作成するところまで実施した。(1)再生医療等安全性確保法の課題抽出:国内で細胞治療を提供する自由診療クリニックのWebサイトを分析、74クリニック247治療を同定し、国際ガイドラインから逸脱した治療や、広告規制の点で不適切なHPが多数存在すること等が分かった。(2)iPS細胞技術の倫理的課題に関する意識
随意運動における小脳機能モジュールの作動原理

1)苔状線維活動の可視化による運動情報の解読:苔状線維特異的にG-CaMPを発現するマウスを用い、前肢によるレバー引き課題実行中の苔状線維活動を観察した。レバー引き運動にともなって、活動が増加するもの、減少するものなど様々なパターンの活動を示す苔状線維終末があることが明らかとなった。運動を開始する直前から活動が見られる終末は、運動指令の遠心性コピーまたは運動前の前肢の状態を伝える感覚フィードバックであると考えられた。一方で、レバー引き運動とは時間的にみて直接関わりがなくむしろ報酬を受取るタイミングで活動を示すものも観察され、これは、最近報告のあった、報酬関連活動を示す顆粒細胞に入力する苔状線維であると考えられる。また、これらの活動パターンの異なる苔状線維がどのような空間分布を示すかを調べたところ、明らかな機能的クラスターは見られておらず、顆粒細胞においてこれらの異なる情報が統合されている可能性も考えられる。2)苔状線維と登上線維の活動同時可視化による運動情報と誤差情報の相互作用解明:運動情報や運動指令を伝えていると考えられる苔状線維と誤差情報を伝えていると考えられている登上線維の相互作用を明らかにするため、蛍光波長の異なる2つのGECIによって苔状線維入力と登上線維入力を同時に可視化する実験を行った。苔状線維の活動を可視化するThy1-G-CaMPマウスは、発現マーカーとして赤色蛍光タンパクを同時に発現しているため、緑赤同時活動イメージングは困難であった。そこで、ウィルスベクターを用いて顆粒細胞およびプルキンエ細胞特異的にそれぞれ緑、赤のGECIの発現を試みたが、ウィルスのセロタイプの組み合わせや発現プロモーターの活性などにより、同時に活動を観察するためのさらなる条件検討が必要であった。登上線維と苔状線維の同時計測については、さらなる条件検討が必要であるが、レバー引き運動課題実行中の苔状線維活動について、新たな知見が得られておりおおむね順調に進んでいる。レバー引き運動中の苔状線維活動についてデータ収集を継続し解析を進めるとともに、登上線維活動と苔状線維活動の同時計測について、条件検討を完了した上で実験を進める。本研究では、運動制御・運動学習における小脳皮質の機能単位(機能モジュール)の役割を解明するため、各小脳機能モジュールへの入力である登上線維と苔状線維が伝える情報を運動課題実行中のマウスで可視化して明らかにすることを目的としている。まず小脳苔状線維に蛍光カルシウムセンサータンパク質のGCaMPを発現するマウスにおいて、GCaMPが苔状線維特異的に発現していること、これらの苔状線維に橋核や楔状束核由来の線維が含まれていることを組織学的に確認した。次にこのマウスにレバー引き運動課題を学習させその際の小脳活動をマクロ蛍光顕微鏡で観察したところ、運動に同期した活動を小脳背側部の様々な部位で同定した。これらの実験で同定した部位を2光子顕微鏡で観察し、運動に関わると思われる苔状線維終末の活動を単一終末レベルで同定した。登上線維入力については、これまでに行ってきたプルキンエ細胞のカルシウムイメージングによる複雑スパイクの検出によって観察を行う。小脳皮質にGCaMPを発現するためのウィルスを注入してプルキンエ細胞に発現させることによって慢性イメージングを行った。レバー引き運動課題実行中のマウス小脳皮質において、レバー引きに関連した複雑スパイク活動を解析した。レバー引きの開始時に同期した活動を示す細胞や、レバー保持中に活動が増加または減少する細胞が観察され、登上線維シグナルがレバーの軌跡に関する情報を符号化していることが示唆された。運動課題の学習における、苔状線維および登上線維のシグナルの役割を明らかにする目的で、薬理遺伝学的な手法を用いる。今年度は、苔状線維および登上線維選択的にDREADD受容体を発現させるためのウィルスベクター作製および注入についての検討を行った。運動課題実行中の苔状線維および登上線維活動の観察については、当初の計画通り順調に実験が進展している。薬理遺伝学的な活動操作については現在のところ検討段階であるが、活動イメージング実験の進展状況に応じて実験を開始する予定である。苔状線維の活動を可視化するThy1-G-

CaMPマウスは、発現マーカーとして赤色蛍光タンパクを同時に発現しているため、緑赤同時活動イメージングは困難であった。そこで、ウィルスベクターを用いて顆粒細胞およびプルキンエ細胞特異的にそれぞれ緑、赤のGECIの発現を試みたが、ウィルスのセロタイプの組み合わせや発現プロモーターの活性などにより、同時に活動を観察するためのさらなる条件検討が必要であった。登上線維と苔状線維の同時計測については、さらなる条件検討が必要であるが、レバー引き運動課題実行中の苔状線維活動について、新たな知見が得られておりおおむね順調に進んでいる。苔状線維および登上線維シグナルの運動関連情報のコーディングを明らかにするために今後も引き続き実験を継続する。また、小脳モジュールを可視化できるマウスを組み合わせて用いることで、本研究の最終目標である小脳モジュールごとの機能を明らかにする。レバー引き運動中の苔状線維活動についてデータ収集を継続し解析を進めるとともに、登上線維活動と苔状線維活動の同時計測について、条件検討を完了した上で実験を進める。