hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脂質ベシクルを利用した生体適合性酵素マイクロリアクターの開発に関する基礎研究

その後、外水相溶液を加えてベシクルを調製した結果、モデル内包物である蛍光物質がベシクル内部水相で蛍光を発しているごとが確認され、目的物質を内包したベシクルが形成できることがわかった。粒径は元のエマルションの大きさをある程度反映していた。本課題で得られた成果を基に、今後さらに検討を進めることで、内包率が高く、均一な大きさのベシクルが調製できる新規技術として期待される。
電解生成超活性ダイアニオン有機分子の分子化合物生成能に関する研究

非水溶媒中の電極過程で生成するπ電子系ダイアニオンは、電子移動のみによって一次的に生成する超活性種であり、母体化合物に比べて著しく強い電子供与体となる。本研究では、この特殊電子状態であるπ電子系ダイアニオンのπ-π型電荷移動相互作用能を明らかにした。テトラシアノエチレン(TCNE)のような電子受容性能の高い分子を電解によってダイアニオンにし、これらとオクタメチルジフェニレン(OMB)(4nπ電子系)およびヘキサメチルベンゼン(HMB)((4n+2)π電子系)とのπ-π型電荷移動錯体生成能について研究した。TCNEのサイクリックボルタモグラムの還元第一波および第二波は、HMB濃度の増加に伴いそれぞれネガティブおよびポジティブにシフトした。この現象は、TCNEがアニオンラジカルになるとそのアクセプター性が著しく減少し、またπ-ダイアニオンとなると逆にドナー性を示しHMBがアクセプターとなった分子化合物を生成することに起因する。一方、OMBを共存させた場合にはこの効果は更に大きくなった。そして、TCNEダイアニオンとHMB、TCNEダイアニオンとOMBとのπ-π型電荷移動錯体生成定数を評価した結果、4nπ系OMBが(4n+2)π電子系HMBよりTCNEダイアニオンと強く相互作用することが明らかとなった。この相互作用能の違いを、Huckelの芳香族安定化に関する(4n+2)π則との関連から議論した。また、OMBあるいはHMBは中性のTCNEと相互作用するときはHOMOが、TCNEダイアニオンと相互作用するときはLUMOが活性軌道となる。したがって、これらの相の違いから、生成する錯体はTCNE中性の場合とダイアニオンの場合で形を変え、電極過程で分子スイッチ現象が起きていることを明らかにした。
睡眠の細胞内分子カスケードを担う新規制御分子の網羅的な探索と解析

睡眠は脳を持つ動物に普遍的に観察される行動でありながら、その生理的な意義や制御機構の大部分は未解明である。本研究では、申請者が所属する研究室で新規睡眠制御分子として発見された、プロテインキナーゼSIK3の基質の探索を通して、睡眠覚醒を制御する細胞内分子機構の全容を明らかにする。SIK3の基質を探索するため、KIOSSと呼ばれるin vivo基質スクリーニングを行う。このスクリーニングにより得られた基質候補について、in vitro、in vivo両方の解析での絞り込みの後に、マウスの脳波筋電図測定を用いた解析により、睡眠覚醒制御に関わっているものを特定する。本研究では、申請者が所属する研究室で新規睡眠制御分子として発見された、プロテインキナーゼSIK3の未知の下流分子カスケードを、網羅的に探索・解明する。申請者が所属する研究室と筑波大学IIISのリウ研究室との先行研究により、睡眠覚醒制御においてSik3遺伝子変異脳では約4000のリン酸化部位のリン酸化状態が変化することが分かったため、本年度は以下の2つの方法で、これらの部位の中からSIK3が直接リン酸化する部位を探索した。所属研究室におけるこれまでの研究から、申請者らは、SIK3は睡眠覚醒制御以外にも様々な生命機構に関与していると推測している。そこで、申請者は所属研究室において見出された責任神経細胞集団特異的にSik3遺伝子変異を導入したマウスにおいて、リン酸化状態が変化しているリン酸化部位を調べることで、より睡眠に特化したリン酸化部位の候補のリストを得ることを試みた。その結果、上記の変異型マウスでは約500か所のリン酸化部位のリン酸化状態が変化していることが分かった。次に、Sik3の機能獲得型変異脳とノックアウトマウス脳で逆のリン酸化状態の変化を示すリン酸化部位を探索することで、SIK3により直接リン酸化される部位を探索した。しかし、比較の結果、2種の変異型マウス脳でのタンパク質のリン酸化レベルは、非常に強い正の相関を示し、逆のリン酸化状態を示す部位は見つからなかった。このことは、Sleepy変異型マウスの表現型はSIK3の単純なキナーゼ活性の変化だけでは説明できず、例えば変異によって複合体形成などに変化が生じたことなども表現型の表出に影響を与えている可能性があることを示唆している。本研究は、睡眠覚醒制御を担う細胞内分子機構の解析という、神経回路と睡眠物質に着目してきたこれまでの睡眠研究とは一線を画す研究であり、今年度の研究成果はその実体の一端を明らかにするものである。概ね計画通りに進展している。プロテオーム解析やインタラクトーム解析による様々な変異型マウス脳を用いたデータの蓄積が進んでいる。前年度までの研究に加えて、培養細胞系を用いたSIK3の基質の探索を合わせて行う。これらの結果を受け、1)同定した基質について、基質のさらに下流の分子カスケードをin vitro、in vivoで検証し、SIK3の下流の分子カスケードを同定する。2) 1)の解析で同定したSIK3の下流の分子カスケードの中から、マウスの脳波筋電図測定を用いた解析によって、睡眠覚醒制御で機能しているものを選抜する。以上の解析により、睡眠覚醒制御における細胞内分子機構の全容を明らかにしていく。

本研究は、睡眠覚醒制御を担う細胞内分子機構の解析という、神経回路と睡眠物質に着目してきたこれまでの睡眠研究とは一線を画す研究であり、今年度の研究成果はその実体の一端を明らかにするものである。概ね計画通りに進展している。プロテオーム解析やインタラクトーム解析による様々な変異型マウス脳を用いたデータの蓄積が進んでいる。前年度までの研究に加えて、培養細胞系を用いたSIK3の基質の探索を合わせて行う。これらの結果を受け、1)同定した基質について、基質のさらに下流の分子カスケードをin vitro、in vivoで検証し、SIK3の下流の分子カスケードを同定する。2) 1)の解析で同定したSIK3の下流の分子カスケードの中から、マウスの脳波筋電図測定を用いた解析によって、睡眠覚醒制御で機能しているものを選抜する。以上の解析により、睡眠覚醒制御における細胞内分子機構の全容を明らかにしていく。
DNAメチル化酵素の配列認識変換の機構解明とエピゲノム育種への応用

原核生物が保有するDNAメチル化酵素のトランスクリプトーム制御能力を利用して細菌の形質を操作する「エピゲノム育種」の確立を目指し、そのために必要な基盤情報を得た。特に、ピロリ菌の遺伝子ノックアウトを用いた計画においては、特定のII型DNAメチル化系がトランスクリプトーム制御に関わり、酸化ストレス耐性をなどの多面的な形質に影響を与えているという証拠を得た。また特定のDNAメチル化酵素の導入により大腸菌のトランスクリプトームを変化させることができることを発見した。ゲノムメチル化パターンの変化が細菌の形質とトランスクリプトームに与える影響を調べるため、メチル化標的配列が既知のDNAメチル化酵素遺伝子複数種類をクローニングし、大腸菌に導入した。構築株それぞれからRNAを抽出し、RNA-seq法によるトランスクリプトーム解析を行った。遺伝子配列にマップされたリード数の比較から、いくつかの株で、大腸菌野生株と比較して発現レベルが有意に変動した遺伝子群が同定できた。さらに、ピロリ菌のメチル化酵素遺伝子破壊株のトランスクリプトーム解析を行い、特定のメチル化酵素遺伝子の欠損により、発現レベルが変動する遺伝子群を同定した。発現変動する遺伝子の数や種類は、導入または欠損させたメチル化酵素遺伝子の種類によって大きく異なっていた。よって、エピゲノム育種に必要となるトランスクリプトームに影響を与えるメチル化酵素をスクリーニングすることに成功した。ピロリ菌標準株のDNAメチル化酵素遺伝子ノックアウト株のトランスクリプトームプロファイルを詳細に解析し、その結果に基づいて幾つかのピロリ菌の形質を解析した。その結果、あるピロリ菌のDNAメチル化酵素はグローバルに遺伝子発現に影響を及ぼし、それがピロリ菌のストレス耐性に寄与していることを発見した。これは配列特異的DNAメチル化酵素の有無が微生物の環境適応に影響をあたることを示唆する重要な発見である(2015年ゲノム微生物学会発表)。一方、DNAメチル化が遺伝子発現への影響を与える仕組みはプロモーターのメチル化では説明できないものがほとんどであった。大腸菌を用いて、DNAメチル化酵素の遺伝子水平伝播が細胞の形質に与える影響を解析した結果、あるDNAメチル化酵素は大腸菌の特定の培地条件での成長パターンに影響を与えることを発見した。ゲノムメチル化が微生物のトランスクリプトームと形質に影響を与える仕組みを解明し、得られた知見を利用して、細胞の表現型を操作するエピゲノム育種の実現可能性を検討した。前年度までに得られた、ピロリ菌のメチル化酵素遺伝子ノックアウト株のトランスクリプトームと基本的な適応形質の解析結果から、あるII型メチル化酵素遺伝子がトランスクリプトームと酸化ストレス耐性などの形質に影響を与えていることが示唆されていた。最終年度において、構築した遺伝子ノックアウト株にII型メチル化酵素遺伝子を再び導入し、構築株の表現型を解析したところ、ピロリ菌の酸化ストレス耐性が導入した遺伝子に依存して向上することが判明した。これにより、特定のII型メチル化酵素がピロリ菌の適応形質に寄与していることを証明できた。遺伝子ノックアウト株のトランスクリプトームデータを詳細に解析することで、本II型メチル化酵素が、遺伝子の中でも特に他の制限修飾系の遺伝子発現に影響を与えることが明らかになったが、その機構の解明は今後の課題として残された。大腸菌に可動遺伝因子由来のメチル化酵素を発現させたところ、幾つかの条件で成長パターンに変化が見られた。これはエピゲノム育種実現の可能性を示唆するものである。現在メチル化系導入株や、遺伝子ノックアウト株のメチーローム解読を試みている。そのデータをもとに、1塩基解像度でのメチル化レベルとトランスクリプトーム状態の関係に法則性を見出すことができれば、エピゲノム育種の実現可能性がより一層高まるだろう。ピロリ菌の培養や形質解析の手法を確立できたことが大きい。これまでに構築したノックアウト株の形質を網羅的に解析すれば、異なる形質に影響を与えるより多くのDNAメチル化酵素を同定できる可能性が有る。大腸菌の形質操作に関しても大腸菌内でメチル化酵素の有無に反応して活性が変化するプロモーターを幾つか同定できたので、それらの解析からメチル化による転写制御の機構の詳細を解明できると考えている。応用微生物学ピロリ菌におけるメチル化が果たす生物学的役割やその仕組みの解明は現在のトランスクリプトーム解析法と形質解析法をより多くのノックアウト株に当てはめることによって順調に進むと予想される。これまでの研究結果から大腸菌の可動遺伝因子由来のメチル化酵素を大腸菌に導入することは大腸菌の生育に負の影響はもたらさないことが判明している。メチル化が影響をあたえる遺伝子やプロモーターが幾つか同定されてきているので、特定の環境条件で大腸菌の形質を解析することで、メチル化による大腸菌の環境適応を実現できると考えている。大腸菌株とピロリ菌株の全RNAシーケンシングを行ったが、菌株作製とトランスランスクリプトーム解析は研究協力者らの助言により順調に進んだ。このトランスクリプトーム解析から大腸菌やピロリ菌の表現型に影響を与える可能性のあるメチル化酵素遺伝子のスクリーニングをすることができた。

また大腸菌の適応度を調べるための、成長曲線解析や競争実験の方法を確立できた。トランスクリプトームに影響を与えるメチル化酵素を持つ細菌の形質解析と、RNA-seq解析から得られた知見の妥当性の検証ができ次第、研究成果を発表することができると考えられる。大腸菌メチル化酵素導入株やピロリ菌ノックアウト株のメチーローム解析、トランスクリプトーム解析がすべて完了していないためである。トランスクリプトーム変化の度合いは、導入または欠損させたメチル化酵素遺伝子の種類によりに異なること、ゲノムメチル化が遺伝子発現に影響を与えるしくみは多様であるという知見が得られた。次年度はRNA-seq解析から得られた知見の妥当性をqPCRにより検証し、情報解析により遺伝子発現変動の機構を推定し、さらにトランスクリプトーム変化の表現型への影響の解析を行う。遺伝子発現変動がもっとも顕著に観察された大腸菌株を優先的に解析していき、その成果をまとめて発表する。さらに大腸菌のデータ解析に用いた手法をピロリ菌に応用し成果を発表する。研究期間を延長し次年度に実験とデータ解析を行う予定である。研究協力者に次世代シーケンサー関連の試薬を一部負担していただいたこと、国際会議での研究発表を控えたのが、主な理由である。より多くのサンプルの解析のための試薬の費用、国際会議での研究発表のための旅費として使用する予定である。
生体吸収性素材を使用する再生血管・弁の作成

組織工学(Tissue Engineering)は、工学(Engineering Science)と生物学(Biological Science)を伴に応用した学際的な新しい概念で、吸収速度の制御が可能な生体吸収性ポリマーを足場として培養細胞から目的組織を作成しようという新しい学際的研究分野である。歴史的には1980年代後半に臓器移植医療における臓器提供者不足が深刻化している米国で提唱された。その最大の利点としては播種、生着した細胞が細胞外間質を完成させた時点で足場としてのポリマーが完全に生分解され、移植後長期的な異物の残存を認めないという点にある。心臓血管外科、特に小児心臓血管外科領域における理想的な補填材料・人工血管は未だ発展途上にあり、移植後長期にわたる生体適合性、成長能を有し、移植後の再手術が不要である生きた補填物の開発が模索されている。我々はすでに1)雑種犬において、組織工学的手法を用いて自己の静脈壁細胞からなるTissue Engineered Vascular Autograftのin vivoでの作成に成功しており、2)2000年5月以降東京女子医科大学倫理委員会の承認下に、骨髄幹細胞を主として使用する方法での再生血管による血行再建術を47例に行っている。本研究の目的はこの成果をさらに発展させ、骨髄細胞を自己細胞として用いて補填材料・人工血管を作成し、既存の素材との比較検討よりこのグラフトを評価し、さらにヒトにおける至適ポリマー、至適培養法、至適細胞数を明らかにすることであった。骨髄細胞を用いたこの分野での研究は過去になく、また骨髄間質細胞の生分解性ポリマーへの接着、ポリマー上での分裂増殖能の研究は不可欠であった。これらに関する基礎研究の総括は、MatsumuraらがTissue Engineering誌(2006;12(11):3075-)に報告した。我々は種々の細胞に分化可能な骨髄細胞を用いて、Tissue Engineered Vascular Autograftの作成が可能であると考えている。さらに、この技術の応用によって、臓器提供者不足が問題となっている凍結保存同種組織の代用素材(代用弁)の開発、虚血性心疾患に対するバイパス手術用の小口径人工血管の開発も期待されているため、今後さらに探究を続けていく。根治手術時,全身麻酔下に骨髄穿刺を行い、体重あたり2ccの骨髄液を採取した。血液成分分離装置により完全清潔下に操作を施行した.直ちに生分解性ポリマーの導管に播種した後,自己血清中に浸漬し,手術室内の細胞培養室にて細胞のviabilityを維持しつつ保存した.細胞培養液は使用せず全て自己血清を使用した.培養液に浸漬する目的は、骨髄細胞ができるだけ多くポリマー繊維に接着するように誘導すること、患児の体温まで細胞温を上昇させるためである.播種前にポリマーをフィブリン弼で処理することにより細胞とポリマーの接着性は向上した。播種細胞数は10^6個/cm2とし,細胞播種後,約2-3時間のインキュベーションで移植手術を行った.このティッシュエンジニアリングで作成した導管を移植する際には,助手は導管を培養液に浸漬させながら移植を行った.術後約1ヶ月後に、心臓カテーテル、造影検査、心臓超音波検査を行いフォローアップは6ヶ月毎に心臓超音波検査またはCT検査を用いて形態学的検索及び組織過形成の有無等を経過観察した.術後遠隔期にも心臓超音波検査を施行した.

今後、再手術例がでれば、再手術時に肺動脈移植部の組織片を客観的に評価した後、小組織を採取し、人工肺動脈組織と自己心肺動脈織を生化学的、生力学的、免疫組織学的に比較検討する予定である。現在まで44症例での移植が終了している。組織工学(Tissue Engineering)は、工学(Engineering Science)と生物学(Biological Science)を伴に応用した学際的な新しい概念で、吸収速度の制御が可能な生体吸収性ポリマーを足場として培養細胞から目的組織を作成しようという新しい学際的研究分野である。歴史的には1980年代後半に臓器移植医療における臓器提供者不足が深刻化している米国で提唱された。その最大の利点としては播種、生着した細胞が細胞外間質を完成させた時点で足場としてのポリマーが完全に生分解され、移植後長期的な異物の残存を認めないという点にある。心臓血管外科、特に小児心臓血管外科領域における理想的な補填材料・人工血管は未だ発展途上にあり、移植後長期にわたる生体適合性、成長能を有し、移植後の再手術が不要である生きた補填物の開発が模索されている。我々はすでに1)雑種犬において、組織工学的手法を用いて自己の静脈壁細胞からなるTissue Engineered Vascular Autograftのin vivoでの作成に成功しており、2)2000年5.月以降東京女子医科大学倫理委員会の承認下に、骨髄幹細胞を主として使用する方法での再生血管による血行再建術を47例に行っている。本研究の目的はこの成果をさらに発展させ、骨髄細胞を自己細胞として用いて補填材料・人工血管を作成し、既存の素材との比較検討よりこのグラフトを評価し、さらにヒトにおける至適ポリマー、至適培養法、至適細胞数を明らかにすることであった。骨髄細胞を用いたこの分野での研究は過去になく、また骨髄間質細胞の生分解性ポリマーへの接着、ポリマー上での分裂増殖能の研究は不可欠であった。これらに関する基礎研究の総括は、MatsumuraらがTissueEngineering誌(2006;12(11):3075-)に報告した。我々は種々の細胞に分化可能な骨髄細胞を用いて、Tissue Engineered Vascular Autograftの作成が可能であると考えている。さらに、この技術の応用によって、臓器提供者不足が問題となっている凍結保存同種組織の代用素材(代用弁)の開発、虚血性心疾患に対するバイパス手術用の小口径人工血管の開発も期待されているため、今後さらに探究を続けていく。
平安時代の五大明王像に関する研究ー彫像を中心にー

今回の科学研究費補助金により美術作品13件、文献4件を実査することができた。五躯完存する一具像については所蔵者の意向との関係で東寺・醍醐寺・奈良国立博物館の3例の調査に留まったが、奈良・吉祥草寺像(降三世明王足下の大自在天に僅かに当初部を遺し、他は改作・補作される)、京都・禅定寺大威徳明王像(『権記』に藤原行成が発願したと伝える同寺五大明王像の遺像と見られる)、兵庫・温泉寺降三世・金剛夜叉両明王像等当初五大明王であった蓋然性の高い群像の部分的遺存例を見出すことができたのは大きな収獲であったと言えよう。確認された範囲内では兵庫県から岩手県に至る本州の広い地域にわたって分布しており、護国的・国家主導的性格一辺倒でとらえられがちであった五大明王像の造立が、実際には護国の徒を自認する地方有力層の私的発願によりかなり広く行なわれたことを物語るものと推考される。ともあれ実査可能な一具像が限られたこともあり、その代替として五大明王を形成する各明王(特に不動明王)の単独像の調査にも重点を置くこととなった。この面では滋賀・神照寺像、群馬・総持寺像等、図像上五大明王像の重要な典拠となった空海請来仁王経五方諸尊図の不動明王と通じる立像の古例を重点的に調査した。なお中国における五大明王像の遺存例は仏像鈴等の特殊なものを除いて殆ど知られず、また空海渡唐に先立つ8世紀後半に唐都長安では空海請来様に見られない天地眼の不動明王像が既に出現しており、(西安大安国寺址出土白玉像、科研費とは別に独自に平成5年8月、調査を行った)、東アジア全体の中での空海請来図像の特殊性と普遍性の解明を今後も継続したいと考えている。更に不動明王の台座(瑟瑟座・岩座)が須弥山と同一視されるという文献の検討結果に立脚して、台座の周囲に平安後期から表現されはじめる海波の意味や須弥山の造形表現全体の中での位置づけを明らかにすることも及ぶ予定である。
上皮管腔形成におけるRacGAP因子FilGAPの機能解析

平成30年度には、管腔形成においてRho/ROCKシグナルの下流でFilGAPが果たしている役割を分子レベルで明らかにすることを目的に研究を行い以下の知見を得ることができた。1)細胞間相互作用に重要で、管腔構造の形成にも関わっているE-カドヘリンとFilGAPの関係を解析した。管腔形成後期には、細胞間接着部位にE-カドヘリンが観察されたのに対して、ROCK阻害剤の添加によりE-カドヘリンの局在が消失した。また、恒常活性化型FilGAP ST/D変異体を発現させた細胞でのE-カドヘリンの局在を調べたところ、ROCK阻害剤を添加しても、管腔構造の先端部では、E-カドヘリンは細胞接着部位に局在していることが明らかになった。以上の結果から、FilGAPの管腔構造の安定化は、細胞間接着部位におけるE-カドヘリンの局在の安定化によることが示唆された。2)FilGAPのリン酸化がHGFの添加により細胞内で変化するか抗リン酸化FilGAP抗体を用いて検討した。FilGAPの6箇所のリン酸化部位のうち402番目のセリン残基のリン酸化がFilGAPの活性化に重要であることがわかっている。そこでリン酸化されたセリン402を認識する抗体を用いて、リン酸化FilGAPの細胞内局在を解析した。2次元でMDCK細胞を培養し、FilGAPの細胞内局在を観察した。その結果、リン酸化状態に依存しない抗FilGAP抗体で細胞を染色したところ、FilGAPは細胞間接着部位と細胞質に観察されたが、リン酸化されたFilGAPを認識する抗体で染色したところ、リン酸化FilGAPのより強い局在が、細胞間接着部位に観察できた。以上の結果から、リン酸化されたFilGAPは細胞間接着部位に局在し、E-カドヘリンの安定化に関与していることが示唆された。FilGAPは、Rho/ROCKシグナルの下流で細胞接着の安定化と一定の方向に動く細胞運動の持続性を促進させる。これは、分子レベルではリン酸化されたFilGAPがE-カドヘリンの細胞間接着部位での働きを行進させることで管腔構造の安定化に関与していることが明らかになってきた。現在までの知見をもとに論文を投稿中である。今後は、FilGAPの管腔構造の形成における役割を分子レベルで明らかにする予定である。特に細胞間相互作用に重要で、管腔構造の形成にも関わっているE-カドヘリンとFilGAPの関係を解析する。E-カドヘリンが細胞間接着部位に局在するメカニズムを明らかにする。可能性として、FilGAPによりE-カドヘリンと細胞内アクチン細胞骨格の連絡が強くなることが考えられる。また、E-カドヘリンの細胞内輸送をFilGAPが制御している可能性も検討したい。さらに細胞間接着部位に局在しているFilGAPとE-カドヘリンの相互作用を分子レベルで明らかにする。具体的には、FilGAPとE-カドヘリンが直接結合しているのか、あるいは介在分子を介して相互作用しているのか、検討する予定である。1)HGF添加によるMDCK細胞の管腔構造の形成過程のどのステップにFilGAPが係っているか明らかにした。嚢胞にHGFを添加すると、嚢胞から突起の形成、細胞鎖の形成を経て、内腔をもった管腔が形成される。そこで、FilGAPがROCKの下流でどのステップに関与しているか恒常活性化型変異体FilGAP ST/Dを発現させた細胞でできた嚢胞にHGFを添加しROCK阻害剤の効果を検討したところ、FilGAP ST/Dは、突起形成を抑制したが、それ以降の管腔構造を安定化することが明らかになった。2)FilGAP ST/Dを発現させたMDCK細胞が形成する管腔構造の特徴を詳細に解析した。FilGAP ST/Dはコントロールに比べて長い管腔を形成し、さらに内腔も繋がったものが多いことがわかった。これからFilGAP ST/Dは管腔構造の形成を促進し、成熟を促す働きがあることが明らかになった。更に、タイムラプス顕微鏡観察で解析したところFilGAP ST/Dは細胞の運動速度には影響しないが、細胞運動の方向持続性を上昇させ、細胞の集団遊走を促進させることがわかった。3)ROCK阻害剤存在化での管腔形成のタイムラプス顕微鏡による解析を行った。嚢胞にHGF添加し管腔を形成させ48時間後にROCK阻害剤を加え、管腔形成に与える影響を詳細に解析した。その結果、ROCK阻害剤を加えないものでは、コントロール細胞、FilGAP ST/D発現細胞ともに管腔から離脱する細胞は50%以下なのに対して、ROCKを加えるとコントロール細胞では、80%程度の細胞が管腔から離脱するのに対して、FilGAP ST/D発現細胞では40%程度の細胞しか離脱しないことがわかった。また、タイムラプス顕微鏡観察からROCK阻害剤は、細胞間の接着を阻害することで細胞が離脱することが明らかになった。管腔形成におけるFilGAPが果たしている役割は、タイムラプスによる顕微鏡観察で重要なことが明らかになった。即ちFilGAPは、Rho/ROCKシグナルの下流で細胞接着の安定化と一定の方向に動く細胞運動の持続性を促進させることが明らかになった。現在までの知見は、2017年度に複数の学会で報告した。現在までの知見をもとに論文投稿の準備をしている。

平成30年度には、管腔形成においてRho/ROCKシグナルの下流でFilGAPが果たしている役割を分子レベルで明らかにすることを目的に研究を行い以下の知見を得ることができた。1)細胞間相互作用に重要で、管腔構造の形成にも関わっているE-カドヘリンとFilGAPの関係を解析した。管腔形成後期には、細胞間接着部位にE-カドヘリンが観察されたのに対して、ROCK阻害剤の添加によりE-カドヘリンの局在が消失した。また、恒常活性化型FilGAP ST/D変異体を発現させた細胞でのE-カドヘリンの局在を調べたところ、ROCK阻害剤を添加しても、管腔構造の先端部では、E-カドヘリンは細胞接着部位に局在していることが明らかになった。以上の結果から、FilGAPの管腔構造の安定化は、細胞間接着部位におけるE-カドヘリンの局在の安定化によることが示唆された。2)FilGAPのリン酸化がHGFの添加により細胞内で変化するか抗リン酸化FilGAP抗体を用いて検討した。FilGAPの6箇所のリン酸化部位のうち402番目のセリン残基のリン酸化がFilGAPの活性化に重要であることがわかっている。そこでリン酸化されたセリン402を認識する抗体を用いて、リン酸化FilGAPの細胞内局在を解析した。2次元でMDCK細胞を培養し、FilGAPの細胞内局在を観察した。その結果、リン酸化状態に依存しない抗FilGAP抗体で細胞を染色したところ、FilGAPは細胞間接着部位と細胞質に観察されたが、リン酸化されたFilGAPを認識する抗体で染色したところ、リン酸化FilGAPのより強い局在が、細胞間接着部位に観察できた。以上の結果から、リン酸化されたFilGAPは細胞間接着部位に局在し、E-カドヘリンの安定化に関与していることが示唆された。FilGAPは、Rho/ROCKシグナルの下流で細胞接着の安定化と一定の方向に動く細胞運動の持続性を促進させる。これは、分子レベルではリン酸化されたFilGAPがE-カドヘリンの細胞間接着部位での働きを行進させることで管腔構造の安定化に関与していることが明らかになってきた。現在までの知見をもとに論文を投稿中である。今後は、FilGAPの管腔構造の形成における役割を分子レベルで明らかにする予定である。特に細胞間相互作用に重要で、管腔構造の形成にも関わっているE-カドヘリンとFilGAPの関係を解析する。具体的には、管腔形成の後期におけるE-カドヘリンの局在を間接傾向抗体法で検討し、この局在がROCKの阻害剤で影響を受けるか検討する。更に、恒常活性化型FilGAP ST/D変異体を発現させた細胞でのE-カドヘリンの局在がROCK阻害剤でどのように変化するか調べる。また、FilGAPのリン酸化がHGFの添加により細胞内で変化するか抗リン酸化FilGAP抗体を用いて間接傾向抗体法及びウエスタンブロット法で検討する。E-カドヘリンが細胞間接着部位に局在するメカニズムを明らかにする。可能性として、FilGAPによりE-カドヘリンと細胞内アクチン細胞骨格の連絡が強くなることが考えられる。
高速応答性高精度多波長光高温計を用いた高温熱容量測定装置の試作

1.高温熱容量測定装置の試作(1)光強度から試料の放射率と真温度を同時に計算し記憶するコンピューターソフトは62年度に開発したが、63年度は、それらの記憶したデータを用いてステファンボルツマンの熱輻射の式から試料の熱容量を温度の関数で計算するプログラムソフトを開発した。(2)試料を所定の温度まで均一に加熱する誘導加熱炉を設計試作した。(3)試料を落下させるのと同時に測定が開始する様に、測定系にトリガーを与えるシステムを設計・試作した。(4)多波長光高温計と加熱炉および放物面鏡とから成り、加熱後落下する試料の温度変化を追跡測定する高温熱容量測定装置を設計した。(5)当初使用を予定していた光学スキャナーが科学研究費で認められなかった為、放物面鏡のみを用いて光高温計の石英受光面への集光を検討した。しかしながら、集光誤差が大きく光強度が弱く、温度の測定誤差が大きかった。現在、石英ファイバー束径の大きさと配置また試料の落下時の横方向のぶれを減らす工夫を検討している。
高度な情報集約化能力をもつ人工ニューラルネットワークの基礎的研究

本研究課題では脳に匹敵する高度な情報集約化能力をもつ人工ニューロン結合体の開発を目指し、その基礎的な研究をハードウエアおよびソフトウエアの両面から推進した。本研究成果の概要を箇条書きに纒めれば次の通りである。(1)生体における知的な営みが脳神経回路網による情報集積化能力(感覚情報の融合・統合)に依って発揮されることを念頭に置き、人工ニューラルネットワーク情報処理における技術課題を明確にした。とくに、実時間処理を伴う制御課題を処理するには、人工ニューラルネットワーク自体のダイナミクスを考慮する必要性があることを示唆した。(2)高度な情報集約化機能を発揮する人工ニューラルネットワークは可塑的な活動関数(出力関数)をもつ人工ニューロンを構成要素とすることで実現できる。そこで、電子回路用CADシステムを用いてアナログMOS回路からなるパルス伝送型人工ニューロン(PFM型人工ニューロン)を設計し、ディスクリート回路でニューロボードを試作した。また、ニューロボードの応答特性を解析し、学習回路の働きによって、入力パルス頻度に応じて活動関数の形状が変容することを確かめた。(3)ニューロボードの多様な活動関数が有理曲線で模擬できることを確かめ、有理曲線型活動関数をもつニューロン数理モデルを提案した。つぎにこのニューロン数理モデルを構成要素とする3層ニューラルネットワークをワークステーションで構築し、これを情報集的化のツールとして多次元情報間での統合や融合を図り、情報の圧縮、変換を試みた。その結果、文字情報の座標変換や非線形制御系の制御器など多用途に適用できることを数理的に検証した。今後、本研究の成果は情報集約化が可能なアナログMOS型ニューロチップやニューロマッピングツールの数理設計などに役立つであろう。本研究課題では脳に匹敵する高度な情報集約能力をもつ人工ニュ-ラルネットワ-クの開発を目指し、アナログMOS型ニュ-ロン群からなる小規模ニュ-ロ・シミュレ-タの基礎的な研究を進めている。本年度における研究成果はつぎの通りである。1.ニュ-ロ・シミュレ-タのハ-ドウエア開発:ニュ-ロ・シミュレ-タに高度な情報集約化機能を持たせるには、まず単一の人工ニュ-ロンにおいて可塑的な活動関数(応答特性)を実現することが重要である。そこで、アナログMOS回路からなるパルス信号伝送型の人工ニュ-ロンを基板上で構成し、このアナログMOS型ニュ-ロンに神経パルス列に相当するポアソンパルス列の入力を行い、その結果バイオニュ-ロンに近い活動関数を得た。また、アナログMOS型ニュ-ロンに組み込まれた学習回路の働きにより、入力パルス頻度に応じて活動関数の変更が可能であることを確かめた。現在、複数個のアナログMOS型ニュ-ロンを搭載したニュロ・シミュレ-タによるセンサ情報処理について検討を進めている。2.ニュ-ロ・シミュレ-タのソフトウエア開発:ニュ-ロ・シミュレ-タにおける高度情報集約化機能の実現を促進するにはソフトウエアの面からの検討も必要である。そこで、アナログMOS型ニュ-ロンの数理モデルを主な構成要素とする3層ニュ-ラルネットワ-クをCADシステムで構成し、これを同質な情報間での統合や異質情報間での融合のための高度なマッピング・ツ-ルとして用いる検討を進めている。現在、ニュ-ラルネットワ-クの学習法の検証を終え、同次元情報であれば回転座標変換が可能であるとの結果を得ている。次年度は[1],[2]の研究項目についてさらに推進するとともに、研究成果の取りまとめと公表を予定している。

(1)生体における知的な営みが脳神経回路網による情報集積化能力(感覚情報の融合・統合)に依って発揮されることを念頭に置き、人工ニューラルネットワーク情報処理における技術課題を明確にした。とくに、実時間処理を伴う制御課題を処理するには、人工ニューラルネットワーク自体のダイナミクスを考慮する必要性があることを示唆した。(2)高度な情報集約化機能を発揮する人工ニューラルネットワークは可塑的な活動関数(出力関数)をもつ人工ニューロンを構成要素とすることで実現できる。そこで、電子回路用CADシステムを用いてアナログMOS回路からなるパルス伝送型人工ニューロン(PFM型人工ニューロン)を設計し、ディスクリート回路でニューロボードを試作した。また、ニューロボードの応答特性を解析し、学習回路の働きによって、入力パルス頻度に応じて活動関数の形状が変容することを確かめた。(3)ニューロボードの多様な活動関数が有理曲線で模擬できることを確かめ、有理曲線型活動関数をもつニューロン数理モデルを提案した。つぎにこのニューロン数理モデルを構成要素とする3層ニューラルネットワークをワークステーションで構築し、これを情報集約化のツールとして多次元情報間での統合や融合を図り、情報の圧縮、変換を試みた。その結果、文字情報の座標交換や非線形制御系の制御器など多用途に適用できることを数理的に検証した。今後、本研究の成果は情報集約化が可能なアナログMOS型ニューロチップやニューロマッピングツールの数理設計などに役立つであろう。
センダイウイルス膜融合蛋白質の遺伝子発現による細胞融合の解析

センダイウイルスによる細胞融合反応に関与するF,HNタンパク質の役割をウイルスの遺伝子レベルで明らかにすることを目的とし、以下の結果を得た。(1)F遺伝子の開裂部位の構造を易開裂型であるニューカッスル病ウイルス(強毒株)の開裂部位の構造(-AGRRQKR/FF-)へ変換し、変異F遺伝子を作成した。COS細胞の発現系を用いて解析した結果、変異Fタンパク質は細胞内の内在性プロテアーゼによりF1とF2へ開裂した。細胞融合にはHNタンパク質と変異Fタンパク質が共に細胞表面へ出現し、同時にFタンパク質の開裂が必要であることが示された。(2)Fタンパク質のS-S結合の機能を明らかにする目的で12ヶ所のCysをSerに変換した変異F遺伝子を作成し、COS細胞の発現系を用いて、発現と細胞融合活性を解析した。いずれのシステイン変異Fタンパク質も正しい高次構造が形成されず、小胞体内(ER)にとどまっていることが示唆された。(3)F遺伝子の3ヶ所の糖鎖付加部位へ変異を導入した。即ち付加モチーフ(Asn-X-Ser/Thr)のAsnをGlnに変換させたF遺伝子を作成し、糖鎖の役割を解析した。その結果、Fタンパク質の融合ペプチド領域近傍に存在する糖鎖付加部位の欠失F遺伝子は、HN遺伝子との共発現で非常に効率よく細胞融合を誘導することを明らかにした。(4)HN遺伝子の5ヶ所の糖鎖付加部位へ変異を導入し、糖鎖の役割を解析した。糖鎖が付加されうる部位はN末端から1、3、5番目の3ヶ所であること、特に細胞膜外に突出したglobular headに存在する糖鎖付加部位3、5に糖鎖が付加することがHNタンパク質のフォールディングや細胞内輸送に重要な役割を果していることが強く示唆された。F及びHNタンパク質の細胞内輸送機構を明らかにする目的で、小胞体(ER)の分子シャンペロンであるBiP及びcalnexin抗体を用いて解析した。両タンパク質の高次構造形成にはcalnexinとの相互作用が必須であること、また不正確な高次構造を有する分子種はBiPと相互作用することによりERに留められていることが推定された。本研究は細胞融合反応におけるF,HN蛋白質の役割、FとHN分子の生合成過程における相互作用(認識)と細胞膜表面での会合体形成の確認、最終的にFとHN分子がどの様にして細胞膜と相互作用して融合反応を誘起するか等、分子レベルでの多くの未解決の問題を解明することを目的とする。F分子の細胞融合やHN分子との相互作用に関与する領域を同定するため、F1とF2とのS-S結合部位、糖鎖付加部位、膜貫通領域、ロイシンジッパー領域、F1のN末端の膜融合ドメインへ変異、欠失を導入し細胞融合の発現について解析する。一方HN分子に関しても、Fと相互作用する部位の同定を行うと共に、糖鎖付加部位、膜貫通領域、ロイシンジッパー領域へ変異を導入し、これまで不明だったHN分子特性を明らかにする。今回F蛋白質のS-S結合の機能を明らかにする目的で開裂の結果生ずるF1及びF2サブユニットのCysをSerに変換したシステイン変異F遺伝子(F_1C→S,F_2C→S)を作成し、COS細胞の発現系を用いて、発現と細胞融合活性を解析した。

いずれのシステイン変異F蛋白質も、プロセシング酵素によるF_0→F_1+F_2の開裂を受けず、細胞表面への発現も抑制されており、HNとの共発現による細胞融合は検出されなかった。両変異F蛋白質はアグレゲートの形成が認めれ、おそらくミスフォルディングによりER内に留まっていると推定される。Fタンパク質分子のプロセシング酵素による開裂反応は正しい位置でのS-S結合形成の後に始めておきると推定された。F及びHN蛋白質の細胞内輸送機構を明らかにする目的でERの分子シャペロンの1つであるBip及びcalnexin抗体を用いた解析から、HNはBip及びcalnexinと共沈降するのに対し、Fはcalnexinと選択的に共沈降することが明らかになった。また、calnexinとの結合時間は両タンパク質で異なりHNはチェイス2030分、Fは約510分で半減した。さらに、castanospermineで処理すると、HNとBipの結合は阻害されるのに対し、FはBipと共沈降し、Fは合成直後calnexinと相互作用する前にBipと結合していることが示された。ER内での両タンパク質の輸送機構が異なることを示唆している。センダイウイルスによる細胞融合反応に関与するF,HNタンパク質の役割をウイルスの遺伝子レベルで明らかにすることを目的とし、以下の結果を得た。(1) F遺伝子の開裂部位の構造を易開裂型であるニューカッスル病ウイルス(強毒株)の開裂部位の構造(-AGRRQKR/FF-)へ変換し、変異F遺伝子を作成した。COS細胞の発現系を用いて解析した結果、変異Fタンパク質は細胞内の内在性プロテアーゼによりF1とF2へ開裂した。細胞融合にはHNタンパク質と変異Fタンパク質が共に細胞表面へ出現し、同時にFタンパク質の開裂が必要であることが示された。(2) Fタンパク質のS-S結合の機能を明らかにする目的で12ケ所のCysをSerに変換した変異F遺伝子を作成し、COS細胞の発現系を用いて、発現と細胞融合活性を解析した。いずれのシステイン変異Fタンパク質も正しい高次構造が形成されず、小胞体内(ER)にとどまっていることが示唆された。(3) F遺伝子の3ケ所の糖鎖付加部位へ変異を導入した。即ち付加モチーフ(Asn-X-Ser/Thr)のAsnをGlnに変換させたF遺伝子を作成し、糖鎖の役割を解析した。その結果、Fタンパク質の融合ペプチド領域近傍に存在する糖鎖付加部位の欠失F遺伝子は、HN遺伝子との共発現で非常に効率よく細胞融合を誘導することを明らかにした。(4) HN遺伝子の5ケ所の糖鎖付加部位へ変異を導入し、糖鎖の役割を解析した。糖鎖が付加されうる部位はN末端から1、3、5番目の3ケ所であること、特に細胞膜外に突出したglobular headに存在する糖鎖付加部位3、5に糖鎖が付加することがHNタンパク質のフォールディングや細部内輸送に重要な役割を果たしていることが強く示唆された。(5) F及びHNタンパク質の細胞内輸送機構を明らかにする目的で、小胞体(ER)の分子シャペロンであるBiP及びcalnexin抗体を用いて解析した。両タンパク質の高次構造形成にはcalnexinとの相互作用が必須であること、また不正確な高次構造を有する分子種はBiPと相互作用することによりERに留められていることが推定された。
粒子分散強化合金の高温変形と拡散緩和

高温での拡散緩和の基礎的な知見を得ることは粒子分散強化合金の高温変形の本質を理解するために必須のことと考え,モデル合金を用いた高温変形の研究と拡散緩和現象の解析を本研究の主題とした.実験的には方位制御されたCu-SlO_2,Cu-GeO_2及びCu-Fe合金単結晶・双結晶の高温変形試験を行い,室温から高温までの粒子分散強化合金の応力-ひずみ曲線についての基礎的知見を得ると共に,粒界の方位差角に依存して粒界脆性破壊の起こり易さに相違があることを見出した.さらに,電子顕微鏡によるステレオ観察によって高温変形中の分散粒子の形状変形を正確に追究するめに必要な解析法を提案し、[001]対称傾角粒界の粒界エネルギーを方位差角の関数として求め,高温変形及び破壊挙動の粒界方位差依存性を抽出することに成功した。理論的には力学,熱力学,速度論などの手法を駆使して分散粒子まわりでの拡散緩和現象を解析し,緩和の速度式を解析的に導出することに成功した.さらに,弾性論(マイクロメカニックス)を用いた解析法によって,与えられた条件下での分散粒子や析出粒子の安定形状を明確に議論することができた.高温変形との比較試験として,分散粒子を含むCu-Fe合金単結晶のひずみ制御疲労試験を行い,転位組織の発達過程を追った.その結果,高温変形中の組織の発達過程との類似点(安定転位組織の形成に及ぼす分散粒子の影響)と相違点(疲労試験を特徴づける転位組織の発達)を明らかにすることができた.以上のように,本研究は粒子分散強化合金の高温変形機構の解明に大きな貢献をしたのみならず,拡散緩和の理解のためには関連する多方面からの研究を同時進行させることが望ましいことを明らかにし,当初の計画より多くの研究テーマを開発に繋がるものとなった.高温での拡散緩和の基礎的な知見を得ることは粒子分散強化合金の高温変形の本質を理解するために必須のことと考え,モデル合金を用いた高温変形の研究と拡散緩和現象の解析を本研究の主題とした.実験的には方位制御されたCu-SlO_2,Cu-GeO_2及びCu-Fe合金単結晶・双結晶の高温変形試験を行い,室温から高温までの粒子分散強化合金の応力-ひずみ曲線についての基礎的知見を得ると共に,粒界の方位差角に依存して粒界脆性破壊の起こり易さに相違があることを見出した.さらに,電子顕微鏡によるステレオ観察によって高温変形中の分散粒子の形状変形を正確に追究するめに必要な解析法を提案し、[001]対称傾角粒界の粒界エネルギーを方位差角の関数として求め,高温変形及び破壊挙動の粒界方位差依存性を抽出することに成功した。理論的には力学,熱力学,速度論などの手法を駆使して分散粒子まわりでの拡散緩和現象を解析し,緩和の速度式を解析的に導出することに成功した.さらに,弾性論(マイクロメカニックス)を用いた解析法によって,与えられた条件下での分散粒子や析出粒子の安定形状を明確に議論することができた.高温変形との比較試験として,分散粒子を含むCu-Fe合金単結晶のひずみ制御疲労試験を行い,転位組織の発達過程を追った.その結果,高温変形中の組織の発達過程との類似点(安定転位組織の形成に及ぼす分散粒子の影響)と相違点(疲労試験を特徴づける転位組織の発達)を明らかにすることができた.以上のように,本研究は粒子分散強化合金の高温変形機構の解明に大きな貢献をしたのみならず,拡散緩和の理解のためには関連する多方面からの研究を同時進行させることが望ましいことを明らかにし,当初の計画より多くの研究テーマを開発に繋がるものとなった.1.平成7年度では、主眼を最も基本的な設備である高温雰囲気炉の設計と製作に置いた。交付いただいた金額の都合によって、真空下での実験が十分に可能な装置はできなかったが、加熱炉に赤外線イメージ炉を用いたことによって、当初予定していたより均熱部のより長い装置を作ることができた。この装置を用いることによって、今まで本研究組織内では不可能であった、より高い温度での変形試験が可能となった。2.各種のモデル合金の試料の製作・準備は順調に行われている。さらに、Bi脆化の実験は最も進展が早く、系統的なデータが出つつある。理論的には、拡散緩和前後の分散粒子の弾性状態を評価する研究が進みつつある。3.本研究の性格上、系統的なデータが揃わないと実験結果の評価と解析は困難であるが、それでも、例えば、Biの偏析の影響については、双結晶に含まれる粒界の種類によって顕著な相違があることなど、興味深い事実を見出している。また、変形応力、破壊応力、破断伸びの温度・ひずみ速度依存性に関するデータも蓄積されつつある。4.得られた実験データのいくつかのものは、結晶粒界上の分散粒子が粒界すべりを束縛する効果を考えると理解できるものであるが、それだけでは説明が困難なものもある。さらに詳細かつ系統的な実験を継続して行う必要がある。1.平成7年度の設備備品費で作製した高温雰囲気炉を用いて、Cu基合金の高温変形試験が可能となった。本年度は、とくにCu-Bi合金およびCu-Fe合金の方位制御された双結晶試料を用いた研究を精力的に行った。さらに、基礎データの蓄積の目的で、Cu-SiO_2内部酸化合金単結晶の室温から高温までの広い温度域での変形試験を行った。2.Cu-Bi合金では、結晶粒界に偏析したBiによるぜい化の程度が、粒界の種類によって大きく異なることを見出し、この結果を国際会議に発表した。

さらに、Cu-Fe合金では、内部酸化分散強化合金とは異なり、中間温度ぜい性を示す温度域が変形速度によってシフトするという新しい現象を発見した。このことは、粒子まわりでの拡散による応力緩和のみならず、析出Fe粒子が変形中に動的に成長していることを示唆しており、現在、それを明確に検証するための実験も遂行中である。以上の実験的研究と合わせて、マイクロメカニックスを用いた理論的研究にも多くの成果があった。まず、拡散の起こる前のミスフィットひずみを持つ粒子の安定形状を弾性エネルギー最小条件より予測し、その形状が拡散緩和によってどのように変化するかについて理論的・解析的に評価することができた。そして、前者の粒子については、ミスフィットを横軸に、粒子硬度を縦軸にとった二次元平面内に粒子の最適形状を記述した「最適形状図」を作製することに成功した。1.方位制御されたCu-SiO_2やCu-GeO_2合金単結晶・双結晶の育成,およびBiを添加して脆化させた試料の作製を行った.2.上記試料の高温変形試験を行い,室温から高温までの粒子分散強化合金の応力-ひずみ曲線についての基礎的知見を得た.さらに,粒界の方位差角に依存して粒界脆性破壊の起こり易さに相違があることを見出した.3.分散粒子及び結晶粒界のキャラクタリゼーションを行った.具体的には,電子顕微鏡によるステレオ観察によって高温変形中の分散粒子の形状変化を正確に追究するために必要な解析法を考案した.さらに,[001]対称傾角粒界の粒界エネルギーを方位差角の関数として求め,2.の研究の解析に利用した.4.高温変形との比較試験として,分散粒子を含むCu-Fe合金単結晶のひずみ制御疲労試験を行い,転位組織の発達過程を追った.その結果,高温変形中の組織の発達過程との類似点(安定転位組織の形成に及ぼす分散粒子の影響)と相違点(疲労試験を特徴づける転位組織の発達)を明らかにすることができた.5.最終年度である本年度は,以上のような個々の研究の他に,転位論,弾性論,熱力学を用いた総合解析を行った.その結果,外力の有無に依存した分散粒子の安定形状を求める理論研究などを新規に開拓することができた.さらに,高温での拡散緩和の理解のためには,高温変形試験のような直接的な試験のみならず,関連する多方面からの研究を同時進行させることが望ましいという結論に達した.したがって本研究は,当初の計画より多くの研究テーマの開発に繋がるものとなった.
粘土を主成分とする機能性分子を坦持したハイブリッド膜の分子設計と作製

粘土(モンモリロナイト)の層間に、活性ラジカル種を捕獲し、安定な付加体(ラジカル付加物)を形成する能力を持つ機能性有機分子(ラジカル捕獲剤)を坦持させたハイブリッド膜を作製し、実験室系及び実環境中に存在するラジカル化学種の捕獲とスペクトル分析による確実な同定を行える分析法を確立した。本方法を用いれば、環境中に存在する人体に悪影響を及ぼす環境微粒子の捕獲・定量や同定等、広範囲にわたる環境分析を効果的に実施することが可能である。モンモリロナイトを主成分とした粘土膜にラジカル捕獲剤として、スピントラップ剤PBN(α-Phenyl-N-Tert-butylnitrone)か、安定ニトロキシルラジカルを坦持させたラジカル捕集膜を作成し、実験室系で様々なラジカルを発生させて、ラジカル捕集膜で捕獲し、ラジカル捕獲物の安定性、捕獲したラジカルの定量をESR分析により行った。従来の方法では、ラジカル付加物の寿命が数秒程度であり、ラジカルの同定が困難であった・OHラジカルや・CH_2OHでもラジカル捕集膜を用いることで、ラジカル捕獲物の安定性が飛躍的に増大し、数ヶ月にわたって粘土膜中にそのままの状態で存在することを確認することができた。この事より、環境中の活性酸素に由来する生体への毒性が高いことが知られている・OHラジカルの分析や定量への応用が可能であることを確認することができた。また、ディーゼル排ガス中に含まれる粒径が50nm以下の環境ナノ粒子は、喘息や腫瘍の発現に深く関わっていることが、国立環境研での生物実験で明らかにされており、その生体毒性の原因解明の必要性が言及されているので、ラジカル捕集膜を用いて、ディーゼル排ガス中の環境ナノ粒子にラジカル成分が存在するか実験を行った。粘土膜作成時にゼオライトを加えることで、膜表面に数μ程度の孔を有することが可能であり、ラジカルが分子全体にできるだけ非局在化した安定ニトロキシルラジカルを粘土膜中に坦持させておけば、環境ナノ粒子中を効率的に捕獲し、数ヶ月にわたって安定にラジカル付加物を保存できることを確認することができた。ラジカル捕獲剤としてDPPH(1,1'-diphenyl-2-picrylhydrazyl)や安定ニトロキシル分子のような安定ラジカルを用い、ラジカル捕獲剤を粘土膜中に坦持させたラジカル捕集膜を使って短寿命活性ラジカルを捕獲した場合、得られた反磁性物質のラジカル捕獲物は粘土膜中で少なくとも1ケ月の安定性を保ち、同定やラジカル濃度の測定分析の間に変性、分解が起きないため、環境中の活性ラジカル種の分析に極めて有用であることが分かった。特に、ラジカル捕獲剤としてDPPHのように芳香環を分子内に多く持ち、可視部に吸収極大を持つ安定ラジカルを用いた場合、LDI-Mass(Laser Desorption Ionization-Mass Spectrometry)法によるソフトイオン化による質量分析が可能であることが確認でき、活性ラジカル種の同定に極めて役に立つことが分かった。また、ラジカル捕集粘土膜の環境分析への応用を広げるためには、活性ラジカルに対する捕獲能の向上とラジカル付加物の安定性を向上させることが重要になってくるが、このためのラジカル捕獲剤の分子設計の指針としては、安定ニトロキシル基の両側に存在することとなる官能基の立体障害の大きさと、不対電子を非局在化により安定化させることを上手にバランスさせることが肝要であることが分かった。そこで、今年度の研究では、ニトロキシル基の片側は立体障害の大きなt-butyl基、反対側には不対電子の非局在化がスムースに起こると考えられるAnthryl基を持つ安定ニトロキシル分子を合成してラジカル捕獲剤として用い、これまでの実験で用いてきたラジカル濃度よりも低い、実際の環境中で存在するであろうラジカル濃度での捕獲分析実験を行い、生体毒性を持つ活性ラジカル種の環境中での分析が可能となるようラジカル捕集膜の改良に努めたいと考えている。安定ニトロキシルラジカルをラジカル捕獲剤として用い、粘土層間中に坦持させることで作製した"ラジカル捕集膜"は、・OHラジカルのような活性ラジカル種を捕獲して安定性が増大したラジカル付加物を形成し、その付加物の安定性が1ケ月以上持続する優れた特徴を持つが、環境中に存在する微量なラジカル化学種を効率的に捕獲するには反応性が十分でないという欠点を持っていた。本研究において、この"ラジカル捕集膜"を粉末化する(粒径:53100μm)ことで、ラジカル付加物の安定性を損なうこと無く、活性ラジカルの捕獲能力を10倍程度向上させることができた。また、気相でCl_2ガスにYAGレーザー(λ=355 nm)を照射してCl・ラジカルを発生させ、安定ラジカルのDPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)で捕獲し、生成するラジカル付加物の同定をアルカリ金属を付着させてイオン化を行うIA-TOF (Ion Attached-Time of Flight)

Mass測定のようなソフトイオン化質量分析(Mass)で行うと、ピクリル基中のNO_2基とCl基の置換が起きた化学種が生成することを確認することができた。さらに、ラジカル捕獲剤として、(1)水溶性の安定ニトロキシルラジカル、(2)アントラセン骨格を持つニトロキシルラジカル、を用いて粘土層間に坦持させたラジカル捕集粘土膜を調製しておけば、環境中の活性ラジカル種を捕獲したラジカル捕集粘土膜をそのままソフトイオン化Mass測定で活性ラジカル種の同定確認ができ、さらに、ESR強度の変化のみならず、蛍光強度の増大から環境中のラジカル化学種の定量が可能になる分析技術を確立した。今後、この研究成果を応用すれば、人体に有害な環境中の活性ラジカル種等の環境ナノ粒子の分析が可能であり、放射線の有機物への照射によりラジカルが発生することを利用すれば、環境中の「放射線の見える化」研究に発展させることができることを示した。"放射線の見える化フィルム"は2012年度nanotech2012(東京ビックサイト)でナノテク大賞特別賞を受賞した。