hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ワイドスクリーニング用マイクロアレイCGH解析システム構築と肝癌責任遺伝子探索

(1)B型肝炎ウィルス(HBV)関連肝細胞癌よりDNAを抽出し、カセットライゲーション法によりHBV DNAの組み込みを検討し、HBV DNAに連続する塩基配列とヒトゲノムのホモロジーを検索した結果、組み込まれたヒトゲノム配列の染色体位置は1p、1q、2p、2q、3q、5p、6p、6q、7p、7q、10q、13p、13q、17q、19q、20qであり、その近傍には24個の蛋白をコードする遺伝子が存在した。一部症例ではMLL2遺伝子坐にHBV DNAの組み込みがみられた。HBV DNAの組み込みが肝発癌の重要な要因にある症例が存在することが予測されるとともに、B型肝癌では個々の症例、腫瘍における特性を解析する必要がある。(2)肝細胞癌細胞と非癌部肝組織におけるhigh mobility group A2(HMGA2)発現とその変化についてRT-PCRを用いて検討した結果、肝細胞癌のうち約1/3の症例において、HMGA2の発現がみられ、その現頻度は分化度が低下するほど増加した。またHMGA2の変異も低分化型肝癌において高頻度であった。したがって、HMGA2の発現や変異は肝細胞癌の脱分化や進展に関与していることが示唆された。(4)C型肝炎関連肝細胞癌切除例のうち、インターフェロン有効例での術後成績は極めて良好で、インターフェロン治療は再発抑制のみならず、肝機能を維持ないし改善し、たとえ再発をきたしてもより根治的な治療が可能となるため、肝細胞癌切除成績が向上すると考えられた。(1)肝細胞癌切除例においてHCVやHBVと発癌との関連性について検討した。その結果、HCV患者に対するinterferon治療後に発癌がみられる症例があるが、これら症例においてはHBV geneがすでに組み込まれていることが多く、その組み込みのパターンから周辺の各種遺伝子に影響を与えている可能性が示唆された。また、HBV感染既往症例の臨床的特徴に着いて検討した。現在、各症例において癌部および非癌部肝組織における遺伝子発現の相違について検討を進めている。(2)肝細胞癌や非癌部肝組織の各種遺伝子のメチル化について解析した。その結果、p16、COX2、ATMは肝細胞癌組織においてメチル化されていた。このp16のメチル化はHCV患者に多く、HBV患者に少ないことを明らかにした。(4)さらに、HCVやHBV以外の肝細胞癌発癌の要因としてのアルコール多飲の役割について検討し、本邦においては少数ではあるが、アルコール多飲が肝細胞癌発癌の要因となり、その際には高度な肝線維化が重要な因子であることを明らかにした。(1)B型肝炎ウィルス(HBV)による発癌には、HBVがコードする蛋白、特にHBV-X蛋白による発癌とHBV DNAのヒトゲノムへの組み込みによる発癌がある。肝細胞癌の癌部よりDNAを抽出し、カセットライゲーション法によりHBV DNAの組み込みを検討し、HBV DNAに連続する塩基配列とヒトゲノムのホモロジーを検索した。その結果、組み込まれたヒトゲノム配列の染色体位置は1p、1q、2p、2q、3q、5p、6p、6q、7p、7q、10q、13p、13q、17q、19q、20qであり、組み込まれた近傍には24個の蛋白をコードする遺伝子が存在した。また、一部症例ではMLL2遺伝子座にHBV DNAの組み込みがみられた。したがって、HBV DNAの組み込みが肝発癌の重要な要因にある症例が存在することが予測されるとともに、B型肝癌では個々の症例、腫瘍における特性を解析する必要があることが判明した。(2)胎生期細胞の成長に関与するhigh mobility group A2(HMGA2)は種々の癌細胞において発現されるが、肝細胞癌細胞と非癌部肝組織におけるHMGA2発現とその変化についてRT-PCRを用いて検討した。その結果、肝細胞癌のうち約1/3の症例において、HMGA2の発現がみられ、その発現頻度は分化度が低下するほど増加した。

また、HMGA2の変異も低分化型肝癌において高頻度であった。したがって、HMGA2の発現や変異は肝細胞癌の脱分化や進展に関与していることが示唆された。(4)C型肝炎関連肝細胞癌切除例における術後長期成績を見ると、インターフェロン治療歴を有する症例で、特にsustained viral responseやbiochemical remissionが得られた症例での成績は極めて良好で、インターフェロン治療は再発抑制のみならず、肝機能を維持ないし改善し、たとえ再発をきたしてもより根治的な治療が可能となるため、肝細胞癌切除成績が向上すると考えられた。なお、これらの肝細胞癌症例における死因の検討から、インターフェロン治療は肝臓関連死亡を減少させることが明らかとなった。(1)B型肝炎ウィルス(HBV)関連肝細胞癌よりDNAを抽出し、カセットライゲーション法によりHBV DNAの組み込みを検討し、HBV DNAに連続する塩基配列とヒトゲノムのホモロジーを検索した結果、組み込まれたヒトゲノム配列の染色体位置は1p、1q、2p、2q、3q、5p、6p、6q、7p、7q、10q、13p、13q、17q、19q、20qであり、その近傍には24個の蛋白をコードする遺伝子が存在した。一部症例ではMLL2遺伝子座にHBV DNAの組み込みがみられた。HBV DNAの組み込みが肝発癌の重要な要因にある症例が存在することが予測されるとともに、B型肝癌では個々の症例、腫瘍における特性を解析する必要があることが判明した。(2)肝細胞癌細胞と非癌部肝組織におけるhigh mobility group A2(HMGA2)発現とその変化についてRT-PCRを用いて検討した結果、肝細胞癌のうち約1/3の症例において、HMGA2の発現がみられ、その発現頻度は分化度が低下するほど増加した。またHMGA2の変異も低分化型肝癌において高頻度であった。(4)C型肝炎関連肝細胞癌切除例のうち、インターフェロン有効例での術後成績は極めて良好で、インターフェロン治療は再発抑制のみならず、肝機能を維持ないし改善し、たとえ再発をきたしてもより根治的な治療が可能となるため、肝細胞癌切除成績が向上すると考えられた。
熱交換器効率向上を目的とした高性能油分離器の開発

冷媒圧縮機から吐出される油量を低減するため,油ミストを帯電させ,クーロン力によって分離する方法について検討した.冷媒雰囲気中では,圧力が高くなるに従ってコロナ放電開始電圧は上昇するが,コロナ放電により油滴は帯電し,クーロン力による分離が可能であった.また,誘導帯電により油滴を帯電させた場合には,より低電圧でも分離可能であった.PAG油などの極性の大きな油の場合には,分極により油滴が変形する様子も観察された.冷媒圧縮機から吐出される油量を低減するため,油ミストを帯電させ,クーロン力によって分離する方法について検討した.冷媒雰囲気中では,圧力が高くなるに従ってコロナ放電開始電圧は上昇するが,コロナ放電により油滴は帯電し,クーロン力による分離が可能であった.また,誘導帯電により油滴を帯電させた場合には,より低電圧でも分離可能であった.PAG油などの極性の大きな油の場合には,分極により油滴が変形する様子も観察された.冷凍空調システムにおける熱交換器の伝熱性能は,圧縮機や膨張機から冷媒とともに吐き出される冷凍機油の混入により大きく低下するため,熱交換器効率の向上のためには,高性能な油分離器が必要となっている.本研究では,冷凍空調サイクルの熱交換器効率向上を目的として,冷媒圧縮機からの吐油量の減少およびクーロンカを利用した高性能油分離器の開発をめざしている.高性能油分離器の開発にあたり,圧縮機からどのような油ミストが発生しているかをまず明らかにする必要がある.そこで,平成22年度はまず,モデル圧縮機を用いて圧縮機シェル内における油ミストの発生メカニズムを可視化によって観察し,また,シェル内で発生する油滴径計測を行った.大気圧下のモデル実験では実機冷媒圧縮機と圧力および密度条件が異なるため,モデル圧縮機において流速を増加させ,実機とモデル試験でウェーバ数をあわせて試験を行った.その結果,油ミストは吐き出しポートや軸受け部から出た油がロータ部に衝突して微粒化することや,運転条件とミスト径との関係等が明らかとなった.一方,クーロン力を利用した油分離器の開発に関しては,大気圧下において平行平板電極間に電場を与え,電極間を通る油滴の帯電と,帯電により作用するクーロン力により油滴挙動を制御可能であることを実験的に確認した.平成23年度は,静電界場における油滴挙動の解析と,油分離器の試作を行い,クーロン力を利用した油分離器の要素試験を行う.冷凍空調システムにおける熱交換器の伝熱性能は,圧縮機や膨張機から冷媒とともに吐き出される冷凍機油の混入により大きく低下するため,熱交換器効率の向上のためには,高性能な油分離器が必要となっている.本研究では,冷凍空調サイクルの熱交換器効率向上を目的として,冷媒圧縮機からの吐油量の減少およびクーロン力を利用した高性能油分離器の開発をめざしている.平成23年度は主に1.圧縮機シェル内への吐き出し油量の見積もりとミスト挙動の把握2.配管内の液滴の帯電に適した帯電方法の検討とクーロン力の評価を行った.圧縮機シェル内のミスト挙動に関しては,圧縮機シェル内に吐き出される油量解析モデルを開発し,設計および運転パラメータがシェル内に吐き出される油量に及ぼす影響を明らかにするとともに,大気圧下での試験においてミストの発生にはウェーバ数より気液の見かけ流速比の影響が大きいことや,シェル内で発生するミスト径が数ミクロン程度であることが分かった.一方,クーロン力を利用した油分離器の開発に関しては,配管内の液滴の帯電方法として,正電極をブラシとし,コロナ放電により液滴を帯電させる方法が適していることが分かった.平成24年度は,コロナ放電が冷媒や冷凍機油の物性に与える影響を確認し,冷媒雰囲気におけるミストの帯電および分離について検討する.冷凍サイクルにおいて,熱交換器の伝熱性能は,圧縮機や膨張機から冷媒とともに吐き出される冷凍機油の混入により大きく低下するため,熱交換器効率の向上のためには,高性能な油分離器により圧縮機や膨張機から吐出される油量を低減することが求められている.しかし,冷媒とともにシェル内に吐出された油は細かなミストとなっているため,従来用いられている遠心式や重力式の油分離器では,微小なオイルミストの分離は困難であった.本研究では,微小なオイルミストの分離に対して,オイルミストを帯電させ,クーロン力によって分離する方法について検討した.圧縮機シェル内のミスト挙動に関しては,圧縮機シェル内に吐き出される油量解析モデルを開発し,設計および運転パラメータがシェル内に吐き出される油量に及ぼす影響を明らかにするとともに,大気圧下での試験においてミストの発生にはウェーバ数より気液の見かけ流速比の影響が大きいことや,シェル内で発生するミスト径が数ミクロン程度であることが分かった.一方,クーロン力を利用した油分離器の開発に関しては,冷媒雰囲気中では大気中に比べてコロナ放電が起きづらく,圧力が高くなるに従って放電開始電圧は上昇するが,冷媒雰囲気中でもコロナ放電により油滴は帯電し,クーロン力による分離が可能であることが確認できた.また,油滴発生時に誘導帯電により帯電させた場合には,より低電圧でも分離可能であり,誘導帯電が圧縮機内のミストに対して適用できれば,クーロン力による油分離がより容易であることが明らかとなった.また,PAG油などの極性の大きな油の場合には,分極により油滴が変形し,電極と接触することによって帯電・分離される様子も観察された.これらの研究成果により,冷媒圧縮機における微小なオイルミストの分離に対し,実現可能性を示すことができた.

配管内を流れる油滴の帯電に対してコロナ放電による帯電が有効であることが分かり,電極の構成に対しても設計指針が得られた.今年度は冷媒雰囲気内での試験を行う予定であり,試験装置の設計も終了している.24年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画の変更はなく,今年度は冷媒雰囲気における油分離挙動の確認,冷媒および冷凍機油物性に対するコロナ放電の影響確認.粒径の小さなミストの帯電分離,実サイクルにおける試作油分離器の評価等を行う予定である.本研究では本装置の実現可能性を明らかにすることを目的としており,その最適設計は次のステップにて検討する予定である.24年度が最終年度であるため、記入しない。
母体葉酸投与に起因する胎児遺伝子メチル化修飾の組織特異的全ゲノム解析

母体への葉酸投与により神経管閉鎖不全の発症が抑制される機構として、メチル供与体として葉酸が働き、神経管閉鎖に関与する細胞の転写プログラムがエピジェネティックに変更されているという仮説を検証するための実験系の開発を試みた。研究計画時には、H2A. Zのゲノム上での局在化はDNAメチル化と相互に排他的であるという報告をもとに、細胞種特異的にH2A. Zにタグを付加することにより、目的の細胞でH2A. Zのクロマチン局在を網羅的に解析することを計画した。しかしながら、H2A. ZのN末端側またはC末端側へタグを付加する試みは、付加したタグによるクロマチン局在の阻害やタグ付加のために発現させたビオチンリガーゼの細胞毒性などによって機能しなかった。そこで代わりの方法としてH2A. Zと似たクロマチン局在を示すH3.3のC末端へCre依存性にタグを付加することを試みたところ、この系は期待通りに機能することが示された。エピジェネティック機構にはDNAメチル化、ヒストン修飾、non-coding RNAなどが関与していると考えられている。これら三者は互いに独立しているわけではなく、密接な関連をもって働いている。ヌクレオゾームを構成するコアヒストンタンパクはH2A、H2B、H3、H4から成るが、それぞれの蛋白には働きの異なるいくつかのバリアントが存在する。このうちのH3バリアントであるH3.3とH2AバリアントであるH2A.Zは、他のバリアントと異なり転写活性化領域に存在する^(5)。特に最近H2A.Zのゲノム上での局在化はDNAメチル化と相互に排他的であるという報告がなされた^(6)。このことはH2A.Zのゲノム局在の変化はDNAメチル化の局在変化を反映していることを意味する。研究計画当初の予定では、N末端側に大腸菌ビオチンリガーゼ認識配列(BLRP)を付加したH2A.Zを付加したトランスジェニッマウスを作製する予定であった。しかし、作製したトランスジェニックベクターとビオチンリガーゼ発現ベクターを培養細胞に共発現させた結果、ヒストンH3も非特異的に一部ビオチン化されることがわかった。そこで計画を変更し、H2A.ZのC末端にCreリコンビナーゼ依存性に、HAまたはFlagタグをノックインできるコンストラクトを作製した。これは今後、神経管閉鎖にかかわるroof plate細胞におけるH2A.Zのゲノム局在を、母体への葉酸投与時・非投与時で比較する為に重要な工程である。このうちのH3バリアントであるH3.3とH2AバリアントであるH2A.Zは、他のバリアントと異なり転写活性化領域に存在する^<(5)>。特に最近H2A.Zのゲノム上での局在化はDNAメチル化と相互に排他的であるという報告がなされた^<(6)>。研究計画当初の予定では、N末端側に大腸菌ビオチンリガーゼ認識配列(BLRP)を付加したH2A.Zを付加したトランスジェニックマウスを作製する予定であった。【緒言】葉酸が神経管閉鎖不全予防に働く機序を検討するため、DNAメチル化に対し排他的に局在すると言われているH2A.Zにコンディショナルにタグを挿入可能なトランスジェニックマウスを作製し、葉酸存在下・非存在下の蓋板細胞におけるH2A.Zの局在パターンの違いを比較検討する計画であった。

ショウジョウバエにおけるタグ化H2A.Zの研究を参考に、前年度までにH2A.ZのC末端にタグを挿入することを試みたが、C末端タグ化H2A.Zはクロマチン局在能が著しく低いことがわかった,そこで本年度はN末端側にタグを付加する方法について検討した。【結果】H2A.ZのN末端側に大腸菌ビオチンリガーゼの認識配列(BLRP)を付加し蛋白を発現するベクターを作製し、大腸菌ビオチンリガーゼ発現ベクターとともにHEK293細胞に共発現させるとビオチンタグ化H2A.Zはクロマチンに局在した。次に、Pax3プロモーター下にCreを発現するトランスジェニックマウスという資産を活かすことを考え、CAGプロモーター下Cre依存性にBLRP-H2A.Zとヒト化ビオチンリガーゼ両者を発現するベクター(pCAG-BLRP-H2A.Z-IRES-BirA)を構築した。このベクターとCre発現ベクターをHEK293細胞に共発現させたところビオチンタグ化H2A.Zはクロマチンに局在した。さらに本年度はH2A.Zと共に転写活性化領域に局在することが知られているH3.3のC末端側にタグを付加するベクターも作製した。Cre非存在下ではCAGプロモーター下にHAタグ化H3.3を発現するが、Cre存在下ではFlagタグ化H3.3を発現するようにスイッチする構造を有するベクターを作製し、培養細胞において期待通りにスイッチがおこり、タグ化H3.3がクロマチンに局在することが確かめられた。
大動物を用いたCyclophosphamide誘導性免疫寛容の心臓移植への応用

我々はこれまでIn vivoのみならずIn vitroレベルにおいてもマウスレベルにおける薬剤誘導性免疫寛容系を開発してきた。6x10^7のresponderと2000radの放射線照射をした3x10^7のstimulator (Sti-1)を2日間のMixed Lymphocyte Culture (MLC)した後Harvestし、制癌剤である5-FU(9mg/ml in RPMI)溶液で9時間Cultureする。CyclophosphamideはIn vivoに投与後肝臓で代謝されて初めて活性型となるため直接組織培養液上に添加出来ず5-FUを用いた。5-FUとCulture後再びHarvestし得られたviable cellをResponder(5-FU-Res)として用いる。5-FU-ResをResponderとしSti-1あるいはThird partyのoutbred pig(Sti-3rd)をStimulatorとして、In vitro assayであるCytotoxic T lymphocyte(CTL)assay、Mixed lymphocyte reaction(MLR)あるいはMLR上清中のIL-2,IL-4活性を調べた時、Sti-1抗原に対して抗原特異的に不反応性が誘導される。以上がIn vitro tolerance系の概要である。しかしながら、マウスで確立されたこの実験系はNIHミ二ブタを用いたブタリンパ球においての解析では現在までには充分再現しえなかった。マウスにおいてIn vitro studyで解明されたEffector-Target PathwayのすべてがHuman及びPigで同様に存在することは確認されているものの、ミニピッグにおいて、In vitro薬剤誘導性免疫寛容をMHCの異なる組み合わせで誘導するにはCP投与後のdestruction,chimerisについて検討を進めたうえで、どの段階で作用していないかを解明し、CP投与量の変更、donor骨髄細胞の投与、別の免疫抑制剤の追加など寛容誘導法のmodifyを行うことが必要と思われた。今後、さらに検討解析を行い、大動物での寛容誘導を目指す予定である。
N-アセチルノイラミン酸骨格合成法の新展開

入手容易なキラル源であるD-マンニトールを出発原料とするシアル酸誘導体の合成法の確立を目的とする。特に,水酸基とアミノ基のマスクコントロールが可能となる合成法を追及する。本合成法は,必要な水酸基を有するアリルアミン,即ち3-アミノ-1-ヘプテン-4,5,6,7-テトラオール体(A)を鍵中間体とし,末端二重結合に対するニトリルオキシドの双極子付加反応により9炭素鎖を構築するものである。本年度は第一に,この基本計画が可能であることを,別途合成したジアステレオマ-混合物のAとシアノギ酸エチル-N-オキシドとの反応により確認した。第二にC(3)-アミノ基の立体選択的導入法の開発を検討した。アミノ基導入と同時にC(1)-オレフィンの構築が達成されれば理想的なので,[2,3]-シグマトロピィを検討した。即ち,4,5-O-ベンジリデン-6,7-O-ジベンジル-2-ヘプテン-1,4,5,6,7-ペンタオール体のC(1)-水酸基を,光延反応によってベンジルアミノオキシ基に変換し(R-CH=CH-CH_2O-NHBn),ブチルリチウムを作用させると,期待した[2,3]-シグマトロピィ転移反応が進行して3-アミノ-1-ヘプテン-4,5,6,7-テトラオール体[R-CH(NBnOH)-CH=CH_2]が得られた。C(3)-アミノ基の絶対構造は天然のシアル酸とは逆であった(90%de)。一方,R-基中の4,5-O-ベンジリデン部分を4,5-O-ビス(TBDMS)とし,R-CH=CH-CO_2EtにBnNHOHをマイケル付加させると,天然のシアル酸と同一の絶対構造を有するR-CH(NBnOH)-CH_2-CO_2Et体が得られた(>99%de)。現在,-CH_2-CO_2Et基の末端ビニル基への変換を検討中である。C(3)-アミノ基の立体選択的導入法の第三法として,ニトロンのビニルシランに対する分子内双極子付加反応が有効であることも見出した。
骨格筋糖取り込み機序における酸化ストレス及び筋収縮刺激の相互作用の解明

骨格筋は生体のグルコース調節の重要な器官である。運動刺激をはじめとする様々な刺激が骨格筋の糖取り込みを亢進させるが、そのメカニズムは明らかでない。本研究では骨格筋収縮により生じる酸化ストレスが、骨格筋糖取り込み亢進機序に関与するという仮説を検証した。その結果、過酸化水素刺激による骨格筋糖取り込みの亢進が認められた。そのメカニズムとしては、PI3キナーゼの下流にあるといわれるAktThr^<308>のリン酸化の関与が明らかとなった。本研究の目的は、骨格筋糖取り込みについて、インスリン刺激と酸化ストレス刺激の相互作用を明らかにするとともに相互作用を担う分子を探索することである。本年度はまず、実験1としてインスリン刺激と酸化ストレス刺激の相互作用を検討するために、SD系雄ラットのEDL筋を素早く摘出し、糸で両側を固定し改良した筋固定器具へ装着し、インスリン単独刺激、酸化ストレス刺激としてキサンチンオキシダーゼ単独、及びそれら両者を添加し骨格筋の糖取り込み速度を検討した。その結果、それぞれ単独刺激に比べ両者の刺激による相加的な効果が認められた。このような相加的な効果は、過酸化水素刺激+インスリン、過酸化水素刺激+AICARと同様な結果(平成18年度の研究成果)であり、キサンチンオキシダーゼ刺激+AICAR刺激の場合も確認できた。さらに、実験2としてキサンチンオキシダーゼ刺激がどのような分子を介して糖輸送の亢進を引き起こすか、その候補分子としてスーパーオキサイドを想定した実験を行った。キサンチンオキシダーゼ刺激でスーパーオキサイドが発生し、細胞内へのシグナルを伝達すると仮定すると、スーパーオキサイドの除去剤であるSODの存在下では、糖輸送の亢進が認められないと予想される。そこで、キサンチンオキシダーゼ刺激+SOD添加による糖輸送速度を測定した。その結果、SOD添加による糖輸送速度への影響は認められず、スーパーオキサイドは糖輸送亢進に関与するシグナル伝達分子である可能性は低いものと考えられた。本研究の目的は、骨格筋糖取り込みについて、酸化ストレス刺激、筋収縮刺激、一酸化窒素刺激の相互作用を明らかにするとともに相互作用を担う分子を探索することである。本年度の当初計画では、骨格筋糖取り込み刺激因子の相互作用により惹起されるAktのリン酸化以降のシグナル伝達分子を明らかにするために、LKB1, AS160, mTORなどのリン酸化状態を分析し、Akt/TRB3結合の可能性を検討することであった。しかしながら、本実施研究者が研究機関の異動に伴い、前任校である佐賀大学医学部より実験装置の搬入や実験システムのセットアップをする必要があり、本年度は、特に新たに組み立てた福岡大学医学部RIセンターの実験装置が前年度までに得られた実験データとの再現性と妥当性が認められるか、について研究時間と経費を費やした。本年度はまず、実験1として骨格筋の還流装置が機能するかどうか、また実験2として無刺激あるいはインスリン刺激に対する糖取り込み能が正確に評価できるか、検討した。C57BL/6マウスのEDL筋とSoleus筋を素早く摘出し、糸で両側を固定し改良した筋固定器具へ装着し、無刺激、インスリン単独刺激による骨格筋の糖取り込み速度を検討した。その結果、以前と同様な結果(平成18年度及び19年度の研究成果)が得られ、本実験システムの再現性が確認できた。そして、一部の予備実験を行った。平成19年度国民健康栄養調査の結果によると糖尿病が強く疑われる者及び可能性を否定できない者(予備)を合わせて2210万人と推定されており、一次予防あるいは糖尿病の治療に対する効果的な運動プログラムを開発する上で、糖輸送における骨格筋分子メカニズムの解明は重要である。平成21年度以降は、平成20年度の異動に伴う実験計画の遅延を取り戻す計画を立てている。酸化ストレスは筋収縮時に生じる。運動時の糖取り込み亢進に寄与するシグナル伝達系のひとつとして、酸化ストレスを生じさせるキサンチンオキシダーゼ→過酸化水素が関与する、との仮説を検証するために研究を継続してきた。意外なことに、その系は糖取り込み能について、インスリンシグナルの一部を介する可能性があることが判明した。そして、その経路の下流には一酸化窒素によって刺激される系が存在することから、本年度は、骨格筋の糖取り込み亢進のシグナル分子として一酸化窒素刺激の相互作用の分子メカニズムを明らかにすることを目的として、特に一酸化窒素合成酵素プロモーター領域に存在するCpGアイランドのメチル化について筋線維タイプ別の評価も加えて行った。遺伝子プロモーター領域でのDNAメチル化は、遺伝子発現を抑制していることが知られている(エピジェネティックな調節)。被検筋として、マウス下肢筋の赤色部と白色部、及びヒラメ筋を摘出した(他の研究で飼育しているマウスで実験を行った後、解析に用いない下肢筋を提供していただいた)。筋サンプルよりDNAを抽出した後、bisulfite(亜硫酸水素塩、BS)処理を行った。

BS処理はメチル化を受けていないシトシンはウラシルに変化するが、メチル化シトシンは構造上安定なため変化を受けず、メチル化DNAと非メチル化DNAに塩基配列の違いが生じる。この違いをパイロシークエンス法により定量化した。現在のところ、メチル化を起こすと考えられる領域の約10%について定量化を行い、メチル化を受けている領域は認められなかった。今後、定量化の領域を広げ、平成22年度も継続して研究を行う予定である。
転写制御因子SUZ12によるレドックス制御を介した足場非依存性増殖機構の解析

足場非依存性増殖能、すなわち『細胞外マトリックスへの接着を喪失した際に起こるアポトーシス(アノイキス)を回避する能力』は、がん細胞の代表的形質の一つであり、がん細胞が遠隔転移する際に必須の能力と考えられている。我々は最近、高転移性乳がん細胞の足場非依存性増殖に関わる因子として転写制御因子SUZ12を同定し、さらにSUZ12が活性酸素種(ROS)の制御に関わる可能性を見出した。本課題は、SUZ12によるレドックス制御を介したアノイキス抑制機構の詳細を明らかにし、酸化ストレス誘導による転移抑制治療の分子基盤を構築することを目的としている。1)接着喪失に伴う細胞内レドックス変化とアノイキスへの関与まず接着喪失に伴う細胞内レドックス変化及びそれに対するSUZ12の関与について検討を行った。細胞質またはミトコンドリアに局在するROS応答性蛍光タンパク質RoGFPを細胞に遺伝子導入し、接着喪失に伴う細胞内レドックス変化について調べたところ、いずれの細胞内画分でも時間依存的にROSの上昇が観察された。この結果と一致して、酸化型グルタチオンが顕著に増加していた。さらに、これらの変化はSUZ12のノックダウン(KD)によって増強された。2)SUZ12による酸化ストレス克服機構の解明当該酸化ストレス克服機構を調べるため、まず接着喪失によるROSの産生系への影響について、NADPHオキシダーゼ(NOX)とミトコンドリア呼吸鎖(OXPHOS)に注目してその発現を解析した。その結果、NOX及びOXPHOSを構成する遺伝子のいずれも誘導されていることが明らかになった。以上の結果から、接着の喪失はNOX及びミトコンドリアの呼吸鎖の構成因子を誘導することで、細胞内のROSの産生を上昇させる可能性が示唆された。平成30年度は概ね実地計画に従って解析を行った。1)接着喪失に伴う細胞内レドックス変化とアノイキスへの関与接着喪失に伴う細胞内レドックスの変化について、ROS応答性蛍光タンパク質RoGFPとグルタチオンの酸化状態を指標に細胞内コンパートメントごとに評価を行った。その結果、接着喪失に伴いミトコンドリア内での活性酸素の産生が高まり、さらにこの産生がSUZ12によって抑制されている可能性が示唆された。しかし、この産生された活性酸素のアノイキスへの関与については明らかになっておらず31年度の課題としたい。2)SUZ12による酸化ストレス克服機構と当該機構の人為的制御によるがん転移抑制の可能性まず接着喪失による活性酸素産生系に関わる遺伝子の発現の解析を行い、NOXとOXPHOSの構成因子ともに誘導されることを見出した。しかし、SUZ12のKDはこれらの誘導に影響を与えないことから、SUZ12はこれらの産生系を抑制することでアノイキスを抑制している可能性は低いと考えられる。そこで現在、転移過程のがん細胞で変化する可能性が示唆されているROS消去系に注目して解析を行っている。また、現段階では関与因子の同定には至っておらず、人為的制御によるがん転移抑制の可能性の検討は31年度の課題としたい。1)接着喪失に伴う細胞内レドックス変化とアノイキスへの関与昨年度の研究から細胞内でSUZ12により接着喪失時に生じる酸化ストレスが緩和されている可能性が示唆された。そこで今年度は抗酸化物質(N-アセチルシステイン、Trolox、MitoTEMPO etc)をSUZ12KD細胞に処理することで、SUZ12によるアノイキスの抑制にROSの上昇抑制が関与するかを解析する。さらに、カタラーゼやスーパーオキシドジスムターゼなどのROS消去酵素を各コンパートメントで過剰発現し、アノイキスへの影響を調べる。加えて、酸化ストレス抵抗性転写因子NRF-2を過剰発現させてアノイキスへの寄与を調べることで仮説を補強する。2)SUZ12による酸化ストレス克服機構まず接着喪失による活性酸素産生系に関わる遺伝子の発現の解析を行い、NOXとOXPHOSの構成因子ともに誘導されることを見出した。そこで、転移過程のがん細胞で変化する可能性が示唆されているROS消去系に注目して解析を行う。具体的には、グルタチオン系やチオレドキシン系や、これらの再還元の際に電子供与体として働くNADPHの産生系に関わる酵素の発現への影響を調べる。併せてSUZ12によるレドックス制御の全体像を得るために、SUZ12KD細胞を用いてRNAシーケンスによる網羅的発現解析を行う。3)当該機構の人為的制御によるがん転移抑制の可能性関与因子が同定次された際には、がん細胞でその遺伝子を操作し、免疫不全マウスへ移植することでがん転移への寄与を解析する。1)接着喪失に伴う細胞内レドックス変化とアノイキスへの関与

まず接着喪失に伴う細胞内レドックス変化及びそれに対するSUZ12の関与について検討を行った。細胞質またはミトコンドリアに局在するROS応答性蛍光タンパク質RoGFPを細胞に遺伝子導入し、接着喪失に伴う細胞内レドックス変化について調べたところ、いずれの細胞内画分でも時間依存的にROSの上昇が観察された。この結果と一致して、酸化型グルタチオンが顕著に増加していた。さらに、これらの変化はSUZ12のノックダウン(KD)によって増強された。2)SUZ12による酸化ストレス克服機構の解明当該酸化ストレス克服機構を調べるため、まず接着喪失によるROSの産生系への影響について、NADPHオキシダーゼ(NOX)とミトコンドリア呼吸鎖(OXPHOS)に注目してその発現を解析した。その結果、NOX及びOXPHOSを構成する遺伝子のいずれも誘導されていることが明らかになった。以上の結果から、接着の喪失はNOX及びミトコンドリアの呼吸鎖の構成因子を誘導することで、細胞内のROSの産生を上昇させる可能性が示唆された。平成30年度は概ね実地計画に従って解析を行った。1)接着喪失に伴う細胞内レドックス変化とアノイキスへの関与接着喪失に伴う細胞内レドックスの変化について、ROS応答性蛍光タンパク質RoGFPとグルタチオンの酸化状態を指標に細胞内コンパートメントごとに評価を行った。その結果、接着喪失に伴いミトコンドリア内での活性酸素の産生が高まり、さらにこの産生がSUZ12によって抑制されている可能性が示唆された。しかし、この産生された活性酸素のアノイキスへの関与については明らかになっておらず31年度の課題としたい。2)SUZ12による酸化ストレス克服機構と当該機構の人為的制御によるがん転移抑制の可能性まず接着喪失による活性酸素産生系に関わる遺伝子の発現の解析を行い、NOXとOXPHOSの構成因子ともに誘導されることを見出した。しかし、SUZ12のKDはこれらの誘導に影響を与えないことから、SUZ12はこれらの産生系を抑制することでアノイキスを抑制している可能性は低いと考えられる。そこで現在、転移過程のがん細胞で変化する可能性が示唆されているROS消去系に注目して解析を行っている。また、現段階では関与因子の同定には至っておらず、人為的制御によるがん転移抑制の可能性の検討は31年度の課題としたい。1)接着喪失に伴う細胞内レドックス変化とアノイキスへの関与昨年度の研究から細胞内でSUZ12により接着喪失時に生じる酸化ストレスが緩和されている可能性が示唆された。そこで今年度は抗酸化物質(N-アセチルシステイン、Trolox、MitoTEMPO etc)をSUZ12KD細胞に処理することで、SUZ12によるアノイキスの抑制にROSの上昇抑制が関与するかを解析する。さらに、カタラーゼやスーパーオキシドジスムターゼなどのROS消去酵素を各コンパートメントで過剰発現し、アノイキスへの影響を調べる。加えて、酸化ストレス抵抗性転写因子NRF-2を過剰発現させてアノイキスへの寄与を調べることで仮説を補強する。2)SUZ12による酸化ストレス克服機構まず接着喪失による活性
小地域における難病患者災害支援マニュアルの開発

静岡県内の15名のパーキンソン病療養者や7名の保健師を対象に、想定される避難所における生活障がいや必要とされる支援について半構成的面接を実施した。その内容を元に、小地域で活用できる災害支援マニュアルを作成した。災害時に予想されること、災害に備え準備すべきことなど自助実行が必要とすることが示唆された。今後もさらに改良をしていくことが必要である。医学中央雑誌Web ver.4において、『難病』と『災害』をキーワーズとし、1987年から2010年を検索対象年として検索した結果、96件抽出され、災害看護に関する原著文献は73件であった。その多くは、災害時の支援体制に関する研究であり避難支援プラン(個別計画)の対象者として難病患者も含まれるようになり、在宅人工呼吸器装着患者における災害時の支援について研究されている。『パーキンソン病』と『災害』を同様に検索した結果41件抽出されたが、災害看護に関する原著文献は2件でいずれも静岡県に関する文献で、林と今福であった。英文論文からは見つけることができず、パーキンソン病友の会会報によれば、2004年の新潟中越地震では、パーキンソン病として特定疾患認定を受けている人は長岡管内約150名でタンスが倒れて怪我をしたり、車中で寝泊りが続いたり、特に避難所では食事時間が不規則になり、薬の時間調整に苦労したり、慣れない場所で身体の動きが悪くなり転倒した人がいた。研究者は長岡保健所保健師に聞き取り調査を行った。保健師からは、パーキンソン病療養者は避難所ではなく、庭の小屋などで生活していたと説明があったが、なぜ避難所を利用できなかったのか、詳細な生活障がいがどのようなものであったのかについての調査や支援策の検討はなかったことがわかった。文献調査の結果、パーキンソン病療養者は日常生活に支障があり、災害の準備も課題があり、避難に対して不安を有している者が多いが、阪神淡路大震災・新潟中越地震における、被災直後のパーキンソン病療養者の生活の支援に関して文献を見つけることはできなかった。そのため、パーキンソン療養者に注目し、パーキンソン病療養者の避難所における生活障がいを調査し、それらに対する支援を研究することとする。被災地東北3県における難病患者の実態把握のために、以下の11か所へ聞き取り調査を行った。1.岩手県難病連2.岩手県保健福祉部健康国保課3.宮城県疾病感染症対策室特定疾患班4.宮城県難病医療連絡協議会広南病院5.宮城県難病連6.東北福祉大学通信教育部7福島県難病連8.(株)帝人在宅医療仙台営業所9.宮城病院ALSケアセンター10.茨城県難病相談支援センター11.日本ALS協会く主な聞き取り内容>安否確認と広域搬送と災害時要援護者名簿について、発災時の安否確認には限界があること、また避難を拒む人への説得や救助の為若い命を失った事実やメーリングリストが有効であったこと。携帯電話は停電後基地局のバッテリーが6時間位もったが、津波で倒壊したところは使用不可だったため停電対策の必要がある。重症患者搬送については、要請がないとDMATも動けなかったことや病院に患者が殺到することから、人工呼吸器装着患者は在宅で停電後72時間は耐えられる自助と広域搬送の場合のシステム構築、また情報について司令塔がないため物資やボランティア等の分配ができないなどシステムや外部支援の必要性が明らかになった。保健所では名簿への登録を勧めても難病患者が拒否するため情報を提供できないというジレンマもあり、必要な支援の提供にあたり改善が必要である。また保健師、訪問看護、ケアマネジャー等、患者家族と一度避難について話し合い、避難を望む人についてはその具体的方法を考えでいくことが必要である。福祉避難所について、仙台で52か所契約、機能したのは26か所であり、自然発生的な福祉避難所で物資不足があったり、難病患者や視覚障がい者にとって環境の問題があり、避難所にいられず自宅に戻った人も多かった。また災害時要援護者フロンティア(600人がボランティア)が重要な役割を持っていた。日頃から難病への理解者を作りいざという時に活動できるボランティアの育成が災害時に有効であると考える。目的:災害弱者として健康問題を持つ人々の災害支援の研究するために、パーキンソン療養者に注目し災害時の避難生活について、生じうると考えられる生活障がいについて調査し、支援策を検討した。結果:インタビューを質的記述的研究に分析した。パーキンソン病療養者の現在の自宅における生活障がいについては、【歩行障害・異常行動】【コミュニケーション障がい】【自律神経障がい】【精神の障がい】【睡眠の障がい】。想定する一般避難所生活における、パーキンソン病療養者が予測する生活障がいについては、【避難所における薬効低下による日常生活の障がい】【避難所内での転倒】【狭く密集している避難所環境による生活障がい】【他者への気遣いからの避難所におけるストレス】【避難所での弱者としての生活】。

保健師が提案する支援については、【病気を医師や保健師に伝え、継続した支援体制】【パーキンソン病の理解と支援を周囲に伝える】【災害に対する自助の重要性の説明】【体調悪化防止のため生活環境の整備】【日頃からの専門職や患者同士のネットワーク】【マニュアル等に避難所支援の内容を載せる】に集約した。研究を進めていく中で、静岡県パーキンソン病友の会(患者会)の会員が中心となり、静岡で全国大会を行う時にSOSカードをお土産として作成し、参加者へ配布することになった。このカードは平常時からも使えるカードで、支援を求めやすくなっている。考察:患者自身も病気を伝えたいが周囲の人に気遣うことや、難病であることを知られたくないなど、様々な社会的問題を抱えながら葛藤していることが明らかになった。しかし薬効低下により動けなくなることの不安は大きいため、SOSカードを静岡県で作られ全国に広がっている「介護マーク」同様、周知させていくことが今後の課題である。また、難病患者の平常時や災害時支援の必要性を周知させるためのミニブックを作成した。被災地の神経内科病院、難病連、患者・家族、在宅酸素業者、保健所に訪問し、聞き取り調査が行うことができた。内容の分析については、東日本大震災における難病患者支援においての課題や有効だったことや自助・共助・公助における課題等を現在も分析中である。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は聞き取りした内容をさらに分析していくことや、聞き取り内容を参考に、難病患者災害支援マニュアル作成を行う。実際に近隣に助けてもらった内容についてさらに分析していく。また今後患者会の協力を得ながら進めていく。
特発性肺線維症急性増悪の人種差に着眼した病態解明と新規バイオマーカー開発

本邦の指定難病の一つである特発性肺線維症には,急速に進行し短期間で死に至る急性増悪という病態がある.我々は日本人とドイツ人の特発性肺線維症患者群を解析し,急性増悪発症率に明らかな人種差があることを明らかにした.また,急性増悪発症には,TERT,Ang2といった特定の遺伝子多型が関与していることも明らかにした.さらに,GDF-15という発現タンパクが特発性肺線維症の診断・寿命予測に有用であることも証明した.【症例の追跡調査】本年度は,再び実際にドイツへ渡航し,患者の呼吸機能,HRCT画像,予後について追跡調査を行った.このことにより,呼吸機能の変化・・急性増悪の有無・予後情報をより詳細にアップデートすることが完了した.【画像の定量化】日独のIPF患者のHRCT画像を,DICOM規格のデータとして書き出す作業がほぼ完了した.解析手法は,現代のHRCT解析に,より適合した新しい手法を採用することに変更した.具体的には,Sumikawaらの手法(Am J Respir Crit Care Med 2008)とIwasawaらの手法(Eur Respir J 2014)を検討している.【特発性肺線維症急性増悪の病態ならびに人種的な相違の臨床像からの解明】本年度アップデートした新たなデータベースを解析することにより,日独の特発性肺線維症急性増悪には,明らかな人種差があることを明らかにした.日本人という人種そのものが,急性増悪発症の独立した危険因子であることが分かった.【特発性肺線維症急性増悪の病態ならびに人種的な相違の分子レベルからの解明】全血から抽出したゲノムDNAを用いて, MUC1,MUC5B,HER2,ELMOD2,IL8,TERTのSNP解析を行った.その結果,TERT SNPが急性増悪のリスク因子であることを明らかにした.【新たな血清バイオマーカー候補分子の選出方法】間質性肺炎の疾患感受性因子としての報告があるCCL18について,急性増悪における有用性を検討した.その結果,日独いずれの人種においても,CCL18は,急性増悪発症の予測因子としては有用でなかった.しかし,同時に評価を行ったKL-6は,急性増悪発症の予測因子として有用であることを明らかにした.【組織免疫染色・Morphometry解析】現時点では,特発性肺線維症急性増悪の予測因子として有用なバイオマーカーを,まだ新たに同定できていないため,肺組織免疫染色は実施していない.条件検討のみ行っている段階である.2014(平成26)年度は,昨年度の成果を発展させ,日本人とヨーロッパ人における特発性肺線維症急性増悪の発症頻度が異なることに基づき,その原因となる遺伝子の検索を継続した.間質性肺炎の患者肺組織をマイクロアレイ解析した結果から,特発性肺線維症において発現が上昇している分子を同定し,その中から,膜タンパク・分泌タンパクをコードしている遺伝子の選定を行った.また,日本人とヨーロッパ人の両人種のゲノムを用いて,両者で発現頻度の異なる遺伝子多型および特発性肺線維症急性増悪の発症頻度・生命予後との関連を比較検討した.その結果,細胞寿命に関与しているテロメラーゼ逆転写酵素(Telomerase Reverse Transcriptase (TERT))および血管新生に関与しているアンジオポエチン-2(Angiopoietin-2)の遺伝子多型発生頻度が,日本人とヨーロッパ人で異なっており,この多型は特発性肺線維症急性増悪の発症予測因子となることを見出した.また,臨床データにおける予測因子についても解析を継続しており,本年度は,高分解能CTにおける特定所見の発現頻度が両人種で異なり,かつ特発性肺線維症急性増悪の発症予測因子であることを明らかにした.本年度の主な成果は,1日欧の異なる人種のコホートおよびゲノムを用いた解析により,指定難病である特発性肺線維症の急性増悪には,日本人・ヨーロッパ人の間において明らかな人種差が存在していることを明らかにした点.2その原因として,TERT・Angiopoietin-2遺伝子多型が関与している可能性を明らかにした点,3高分解能CTの画像所見には,急性増悪の発症を予測する因子があることを明らかにした点の3点である.本年度の成果を踏まえて,特発性肺線維症急性増悪の疾患感受性分子の同定を進め,その分子を標的とした新規治療薬の開発を進めていく方針である.2015(平成27)年度は,前年度までの成果を集大成し,日本人とヨーロッパ人における特発性肺線維症急性増悪の人種差の原因となっている複数の遺伝子・分泌タンパクの検証を行った.特発性肺線維症患者の肺組織マイクロアレイ解析によって,患者肺組織に特異的に高発現している遺伝子を複数抽出し,その中から,特発性肺線維症急性増悪の疾患感受性因子,重症度,生命予後と相関を有するものを選別した.ANGPT2,DPP9,MUC5B,TOLLIP,VEGFA,TERT,HER2,HMOX1,ICAM1等を含む計17種類の遺伝子を同定した.このうち,HMOX1のA/Aジェノタイプ,TERTのA/Aジェノタイプが,特発性肺線維症急性増悪の独立した発症危険因子であることを明らかにした.しかし,これらの因子で補正してもなお,日本人という人種は独立した危険因子であることも明らかになったことから,今回の我々の研究ではまだ明らかにできていない発症危険因子が残っていることも分かった.

またこれと並行し,分泌タンパクの中からは,TGF-βスーパーファミリーに属するストレス反応タンパクであるGDF-15を同定し,これが日欧いずれの人種においても極めて精度の高い疾患感受性分子であり,同時に予後不良因子であることも同定した.3年間を通じて行った本研究の主な成果は,1人種の異なる日欧2コホートおよびゲノムを用いた解析により,致死性の指定難病である特発性肺線維症急性増悪には人種差が存在していることを明らかにした点,2その原因として,TERT・HMOX1遺伝子多型が独立した発症危険因子であることを明らかにした点,3TGF-βスーパーファミリーに属するストレス反応タンパクGDF-15は,特発性肺線維症の疾患感受性因子かつ予後規定因子であることを明らかにした点の3点である.本邦の指定難病の一つである特発性肺線維症には,急速に進行し短期間で死に至る急性増悪という病態がある.我々は日本人とドイツ人の特発性肺線維症患者群を解析し,急性増悪発症率に明らかな人種差があることを明らかにした.また,急性増悪発症には,TERT,Ang2といった特定の遺伝子多型が関与していることも明らかにした.さらに,GDF-15という発現タンパクが特発性肺線維症の診断・寿命予測に有用であることも証明した.本研究成果により,特発性肺線維症において急性増悪を繰り返すサブセットが存在する可能性を,人種の異なる2つのコホートを用いることにより,これまでの知見よりもより詳細に解明できた.そして,その原因因子の解明を臨床レベル・分子レベルの双方から進め,TERT・Angiopoietin-2遺伝子多型が強く関与していることを明らかにした.現在,特発性肺線維症急性増悪の原因遺伝子を特定することまで進められており,本研究の達成度はおおむね順調と考える.間質性肺炎急性増悪に伴う急性呼吸不全の病態解明および新規治療法開発日本人・ヨーロッパ人のゲノム解析をさらに継続して実施するのと並行して,現在,特発性肺線維症急性増悪患者の血清中に高発現しているタンパクの同定も行っているところである.今後は,同定されたタンパクと特発性肺線維症急性増悪の発症予測・重症化・致死性との相関解析を進め,新たなバイオマーカーとしての有用性を確立する予定である.特発性肺線維症急性増悪を予測しうる新たなバイオマーカーの同定が,若干遅れているものの,その他は計画どおりかそれ以上に進展している.予定額よりも安価に試薬を購入できたため.現在,スクリーニングを行っているSNP・バイオマーカーの中から,特発性肺線維症急性増悪の疾患感受性因子,予測因子となりうる候補分子を,引き続き同定していく.同定した後は,全患者サンプルを用いてこれらの測定・定量化を行い,臨床的有用性,人種との関連,肺における局在,機能解析等を行っていく.昨年度に引き続き,ELISA,SNP解析などの試薬費用として使用する予定である.試薬類を,最初の予定額よりも安価で購入することができたため.昨年度に引き続き,SNP解析・ELISAに必要な試薬購入費に充てる予定である.
クライオ電子顕微鏡法によるアクチンフィラメントの動的構造変化の追求

本研究課題を通して、主として以下の点が明らかとなった。1.アクチンフィラメントは、その結合しているリガンドによって大きくその構造を変化する。特に、結合しているヌクレオチドのγ位のリン酸の有無はその構造を大きく変え、アクチンの弾性を大きく変える。これは、アクチンの第二ドメインと内側ドメインに大きな変化が生じていることによると考えられる。これは、生物物理学会において報告した。2.アクチンフィラメントは、同一条件下でも大きくその構造を変化させることを、クラスター解析の手法を用いることによって、明らかにした。特に、アクチンの第二ドメイン及び内側のドメインの構造揺らぎが存在していることが分かった。この手法の開発により、タンパク質の動的構造変化を明らかにする事が出来るようになる。更に、定量的にこの構造揺らぎをあらわすことが出来るような手法へと発展させていく予定である。これは、物理学会において報告した。以上の結果を踏まえて、本研究で明らかとなったアクチンフィラメントの構造揺らぎや構造変化が、筋収縮などの滑り運動系でどの様な役割を果たしているかについて検討した。これにより、ミオシンとアクチンの相互作用している面での滑りの可能性とアクチンフィラメントの構造変化との関連がある可能性が示唆される。
多次元外力下でのRC柱および柱梁接合部のせん断破壊過程の究明とその防止設計法

鉄筋コンクーリート(RC)骨組の地震時挙動をできるだけ忠実に再現するために、RC立体部分骨組試験体の3方向静的加力実験を行なった。試験体は実物の1/2スケールを持ち、中層建物の最下層のうち隅柱と側柱の2本を東西および南北両方向の梁反曲点位置と2層柱の中央とで切り出した部分骨組2体である。柱のせん断破壊あるいは柱・梁接合部の破壊がそれぞれ先行するように1体づつ設計した。試験体は不静定構造であるため、このままでは柱や梁に作用する応力を算定できない。そこで両柱のあいだにある梁の中央に、せん断力および軸力を測定するための鋼鉄製分力計を設置した。分力計の性能確認とキャリブレーションのために、RC梁試験体に分力計を組み込んだ実験を行なった。その結果、分力計の存在がRC梁の挙動に悪影響を与えないこと、および作用する応力を十分な精度で検出できることを確認した。骨組実験では、両試験体とも想定した破壊を生じた。柱のせん断破壊が発生した試験体では、はじめに隅柱にせん断ひびわれが生じたが、その後の繰り返し載荷によって側柱の2方向せん断力による損傷が顕著となった。接合部のせん断破壊が発生した試験体では、外柱よりも内柱の接合部の損傷が激しかった。3方向加力を受ける立体部分骨組の挙動と比較するため、平面の柱・梁接合部試験体2体に1方向水平力載荷する実験を行なった。その結果、柱・梁接合部のせん断強度は加力方向による影響をほとんど受けなかった。また、立体部分骨組内の柱と同一形状・寸法の柱を別に2体作製して、水平1方向に逆対称曲げ・せん断載荷する実験を行った。水平2方向せん断力を受けた立体部分骨組内の柱のせん断強度は、内柱では1方向載荷の柱試験体に較べて22%低下し、外柱では14%低下した。以上の実験より、水平2方向せん断力と変動軸力とを同時に受ける柱あるいは柱・梁接合部の破壊性状が骨組全体の挙動に与える影響を詳細に検討することができた。当初は実験に用いるRC試験体を立体骨組とする計画であった。しかしその後、実験実施の可能性や得られる成果などを検討して、完全な立体骨組ではなく立体骨組の一部分を取り出した部分骨組試験体を使用することとした。具体的には柱2本に梁部材が主方向および直交方向から貫入する形態とし、応力の流れを明解にするためスラブは付けなかった。部分骨組試験体は2体とし、柱・梁接合部破壊あるいは柱せん断破壊が先行するように設計した。なお主方向中央の梁に生じるせん断力および軸力を測定するため、梁中央に鉄製のロードセルを挿入した。2本の柱頭にそれぞれ3軸1点クレビスを設置してジャッキを3台取りつけて、3方向地震動を模擬した加力を行なう予定である。柱脚は固定とした。柱断面は35cm×35cm、梁断面25cm×38cm、梁スパンは246cm、階高は120cm、とした。