hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アデノウイルスベクターによる骨疾患遺伝子治療の基礎的研究

破骨細胞は骨吸収を中心的に担う細胞であり、正常な骨モデリング・リモデリングのみならず、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、あるいは癌骨転移など整形外科疾患のさまざまなアスペクトにおいて重要な役割を果たす。したがって破骨細胞の骨吸収メカニズムを分子レベルで明らかにすることによってこれらの疾患の新しい治療法を確立することが可能である。ある遺伝子の細胞における機能を調べる方法として遺伝子導入が極めて有効である。しかしながら破骨細胞は最終分化した分裂能のない細胞であり、通常の方法では遺伝子導入が不可能である。本研究においてわれわれはアデノウイルスベクターが破骨細胞への遺伝子導入法として極めて有用であることを明らかにした(Tanaka et al.,1998)。ノックアウトマウスを用いた研究から破骨細胞の活性化に非レセプター型チロシンキナーゼであるc-Srcが重要な役割を果たすことが知られている。そこでわれわれはc-Srcの活性をネガティブに調節するcsk遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクター(cskウイルス)を作成した。このウイルスによって破骨細胞にcsk遺伝子を大量発現することが可能であり、このとき破骨細胞のc-Src活性は強力に抑制された。またin vitroにおける破骨細胞の骨吸収能もcskウイルスによって強力に抑制されることが明らかになった。続いてわれわれはマウス頭蓋骨上へのインターロイキン1投与モデル、あるいはラットアジュバント関節炎における骨破壊がcskウイルスによって抑制されることを見出した(Miyazaki et al.,2000,Takayanagi et al,1999)。これらの結果よりアデノウイルスベクターが破骨細胞へのin vitroのみならずin vivoでの遺伝子導入法として有用であること、csk遺伝子導入によるc-Src活性の抑制が骨破壊抑制法として有用であることが明らかになった。本研究で確立された方法を用いて今後さらに破骨細胞の活性化メカニズムを明らかにすることができると考えている。まずlacZ遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターを用いて破骨細胞への遺伝子導入効率を調べた。LacZを発現する破骨細胞の割合はウイルス数を増加させるにともなって上昇し、1細胞あたり100個のウイルス粒子を感染させると85%以上の破骨細胞にLacZの発現が見られた。次にレセプター型のチロシンキナーゼであるEGF(上皮増殖因子,epidermal growth factor)レセプター遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターを作成し、EGFによる破骨細胞機能の調節を試みた。EGFレセプターウイルスを感染させると、破骨細胞においてウエスタンブロット、免疫染色にて明らかなEGFレセプターの発現が認められた。この細胞をEGFで刺激すると数時間で明らかな形態変化が認められ、細胞の収縮、巨大な空泡の出現が確認された。これと同時に破骨細胞の骨吸収能は低下し、象牙質切片上での吸収窩の形成はEGFの用量に依存して抑制された。一方コントロールウイルスを感染させた破骨細胞ではこのような効果は認められなかった。EGFレセプターと同じレセプター型のチロシンキナーゼであるM-CSF(マクロファージコロニー刺激因子,macrophagecolony stimulating factor)レセプターは破骨細胞に大量に発現し、M-CSFは破骨細胞の細胞死を抑制することが知られている。これと同様にEGFレセプターを発現させた破骨細胞はEGFによって細胞死が抑制されることが明らかになった。今後破骨細胞機能に重要であることがわかっている情報伝達経路を促進、抑制することによってin vitroのみならず、in vivoにおける骨吸収調節を考えている。破骨細胞は、生理的な骨吸収のみならず病的な骨破壊においても中心的な役割を果たす細胞である。

われわれは昨年、アデノウイルスベクターを用いて破骨細胞に効率よく外来遺伝子の導入が可能であることを明らかにした。また受容体型のチロシンキナーゼであるepidermalgrowthfactor(EGF)receptor遺伝子を導入することによって、破骨細胞の機能をEGFによって調節することに成功した。これまでわれわれを含むいくつかのグループによって非レセプター型のチロシンキナーゼであるc-Srcは破骨細胞機能に重要な役割を果たすことが明らかになってきた。本年度はc-Srcの機能をネガティブに調節する遺伝子であるCsk遺伝子を組み込んだアデノウイルスを作成し、これを用いて破骨細胞機能のin vitroでの調節を試みた。CskはSrcファミリーチロシンキナーゼのC末端のチロシン残基を特異的にリン酸化することによってその機能を抑制する分子として岡田らによって同定された細胞質型チロシンキナーゼである。まずCskおよびキナーゼ活性を欠損した変異型Csk遺伝子を組み込んだ組換えアデノウイルスを作製した。組換えウイルスの作製は斎藤らが開発したCOS-TPC法を用いて行った。またプロモーターとしては、様々な細胞で効率よい遺伝子発現が得られるCAG[cytomegalovirusIE enhancer+chicken β-actin promoter+rabbit β-globin poly(A)signal]プロモーターを用いた。このウイルスの感染により、破骨細胞にCskおよび変異型Csk遺伝子を大量に発現させることが可能であった。このとき破骨細胞のc-Srcキナーゼ活性の低下が用量依存性に認められた。破骨細胞へのCskの大量発現によって、破骨細胞の細胞骨格の破壊が観察され、これと同時に破骨細胞による骨吸収能の低下が認められた。一方変異型Cskウイルスは破骨細胞の細胞骨格に影響を与えなかったが、その骨吸収能を有意に上昇させた。これらの結果はCskウイルスを用いることによって破骨細胞の機能調節を行うことが可能であることを示している。現在さらにわれわれはin vivoにおけるCskウイルスの応用を試みている。破骨細胞の活性化には非レセプター型のチロシンキナーゼであるc-Srcが重要な役割を果たしていることがノックアウトマウスを用いた研究から明らかになっている。c-Srcのキナーゼ活性はそのC末端に存在するチロシン残基(chickではTyr527)のリン酸化、脱リン酸化によって調節されているが、Csk(C-terminus Src family Kinase)はTyr527を特異的にリン酸化し、Srcの活性を負に調節するキナーゼとして同定された。
10TeV領域ガンマ線放射天体の研究

中国と共同でチベットの羊八井(標高4,300m)に空気シャワー観測装置を設置し、宇宙から飛来する数数10TeV領域のガンマ線の系統的な探索と観測を行っている。宇宙線の起源と加速の問題を解明するのが主要な目的である。空気シャワー観測装置は面積0.5m^2のシンチレーション検出器789台を37,000m^2の領域に7.5m間隔で碁盤目状に配置したものであり、数数10TeV領域の宇宙線を精度よく観測できる世界で唯一の空気シャワー観測装置である。宇宙線観測における連続観測の重要性から、本装置は今後数年にわたって継続運転する必要がある。本年度はそのために必要となるメンテナンスを9月から11月にかけて行った。高地の強力な紫外線に曝され劣化が著しい検出器防水カバー、外的衝撃を受けた信号ケーブル、高圧ケーブル等を新品に交換した。また、検出器の較正、調整を行った。本年度は、以下の解析を行い、結果を論文にまとめた。1.宇宙線の太陽時異方性の解析。地球は東方的な宇宙線を受けながら太陽の周りを公転しているので、公転運動の進行方向(6時方向)は宇宙線の頻度が増え、反対側(18時方向)は頻度が下がる。このことは以前から知られていたが、その振幅が±0.04%程度なので、精度の良い観測は今まで困難であった。本研究では6.2TeV以上のエネルギー領域では期待通りの振幅が観測されたが、4TeVでは期待値より有意に大きな振幅が観測され、何か他の要因が示唆される結果となった。この結果はPhysical ReviewLettersに発表された。2.北天のガンマ線点源の探索。赤緯0度から60度の範囲で1TeV以上の定常ガンマ線点源の探索を行った。すでに知られている「かに星雲」と、この時期活動的になっていたMrk421以外に有意な信号は検出されなかった。この結果については現在Astrophysical Journalに投稿中である。昨年秋に、チベットのヤンパーチンで稼働している空気シャワー装置に245台のシンチレーション検出器を増設した。これにより、検出器間隔が7.5m、検出器総数が545台の高密度空気シャワー観測装置が完成した。検出器がカバーする有効面積は約20,000m^2であり、イベントのトリガー頻度は約680Hzである。観測可能な空気シャワーのエネルギーは約3TeVであり、3週間分の月の影のデータ解析から、装置の角度分解能は0.9度以下になると推定されている。昨年夏まで稼働していた空気シャワー装置で得られたデータの解析を集中的に行った。この解析から、カニ星雲からのガンマ線が500日の観測日数に対して約6σの有意さで検出された。また、3TeV-20TeVの領域でのガンマ線のエネルギースペクトルが求められた。これは、空気シャワー装置による宇宙ガンマ線の世界最初の観測であり、その物理的意義は非常に大きい。また、空気チエレンコフ装置で観測されたデータに与える影響も大きい。チベットで得られたデータは、月の影の地磁気による移動からシャワーのエネルギーが評価されているため、その信頼度は極めて高い。シャワーのエネルギー較正が行われたのは、宇宙線実験では初めてのことである。さらに、1997年の活動が活発になった活動銀河核Mrk501からのガンマ線フレアの検出にも成功した。新しい観測装置は、今までの装置の約2.5倍の感度も持っているため、カニ星雲からのガンマ線スペクトルが100TeV領域まで観測可能になる。このデータからカニ星雲での粒子加速について新たな結果が得られるはづである。中国と共同でチベットの羊八井(標高4,300m)に空気シャワー観測装置を設置し、宇宙点源から飛来する10TeV領域のガンマ線の系統的な探索と観測を行っている。空気シャワー観測装置は面積0.5m^2のシンチレーション検出器を7.5m間隔で碁盤目状に545台配置したもので、有効面積は約22,000m^2である。この装置は3TeV以上の宇宙線を精度よく観測できる唯一の空気シャワー観測装置である。平成12年9月から10月にかけて、15m間隔の検出器130台にダイナミックレンジの広い光電子増倍管を増設し、平成12年11月から観測を開始した。これにより、数10TeVから数100 TeV領域のエネルギー決定精度がシミュレーションの結果によると、約40%向上した。平成11年に、カニ星雲からの高エネルギーガンマ線を空気シャワー観測装置で初めて検出したが、昨年までのデータを解析してさらに統計量を増やし、カニ星雲からのガンマ線のエネルギースペクトルを精度良く求めた。それによるとガンマ線強度は現在チェレンコフ光観測装置で求められている値の約2倍になる。この高エネルギーガンマ線のスペクトルはSSCモデルで説明できるが、このモデルに従うと、カニ星雲近傍でガンマ線が発生している領域の磁場の強さは10nTと推定される。また、平成12年前半に、活動銀河核Mrk421がフレアを起こしているが、これに伴う高エネルギーガンマ線を3σレベルで検出した。この結果に関しては現在精密に解析中である。

このような活動的天体の時間変化を観測するには、空の明るさや天候によらず連続観測が可能な空気シャワー観測装置が最適である。中国と共同でチベットの羊八井(標高4,300m)に空気シャワー観測装置を設置し、宇宙点源から飛来する数数10TeV領域のガンマ線の系統的な探索と観測を行っている。宇宙線の起源と加速の問題を解明するのが主要な目的である。空気シャワー観測装置は面積0.5m^2のシンチレーション検出器を7.5m間隔で碁盤目状に545台配置したもので、有効面積は約22,000m^2である。この装置は3TeV以上の宇宙線を精度よく観測できる唯一の空気シャワー観測装置である。平成13から14年度にかけて、188台の検出器を増設し、当初予定の有効面積約37,000m^2の高密度空気シャワー観測装置を完成させる。本年度は増設に使用するシンチレータの性能測定を行った。また装置の大型化に伴ってイベント頻度が飛躍的に増えるので、死時間を減らすため、これまではADCで測定していた電荷量を時間情報と同じTDCで測定するための新しいフロントエンド回路の開発を行い、現地での長期安定性のテストを実施した。測定の結果、長期にわたり安定に動作することがわかり、回路の開発に成功した。平成11年に「かに星雲」からの高エネルギーガンマ線を空気シャワー観測装置で初めて検出したが、平成13年までのデータを解析してさらに統計量を増やし、エネルギースペクトルを精度良く求め、平成13年8月にハンブルクで開催された第27回宇宙線国際会議(ICRC)で発表した。また、平成12年1月から平成13年の5月までの期間、活動銀河核Mrk421がフレアを起こしたが、これに伴う高エネルギーガンマ線を7σレベルで検出した。この成果についても第27回ICRCで発表した。中国と共同でチベットの羊八井(標高4,300m)に空気シャワー観測装置を設置し、宇宙から飛来する数数10TeV領域のガンマ線の系統的な探索と観測を行っている。.空気シャワー観測装置は面積0.5m^2のシンチレーション検出器を7.5m間隔で碁盤目状に配置したものである。本年度は装置の拡張を行った。平成14年夏から秋にかけて188台の検出器を増設し、当初予定の検出器数733台、有効面積約37,000m^2の高密度空気シャワー観測装置が完成し、平成14年10月30日に運転を開始した。トリガ頻度は毎秒1,500イベントに達し、拡張前の2.2倍になった。また装置の大型化に伴ってイベント頻度が飛躍的に増えるので、死時間を減らすために、これまではADCで測定していた電荷量を時間情報と同じTDCで測定するための新しいフロントエンド回路の製作を行い、装置に組み込んだ。新しいデータ収集ソフトウェアも完成し、両者の効果により、装置の死時間は16%(推定)から11%になり、30%以上改善された。本年度は銀河面方向からの数TeV拡散ガンマ線の探索を行った。平成9年から平成13年までの観測データを用いて、銀河中心方向と銀河反中心方向からの拡散ガンマ線強度の上限値を3TeVと10TeV領域で求め、これらの結果をThe Astrophysical Journalに発表した。
口腔癌における癌幹細胞と腫瘍間質内間葉系幹細胞の細胞間ネットワークの機能解析

ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC)が産生するIL-6が、口腔扁平上皮癌(OSCC)細胞由来CD133陽性細胞および陰性細胞のsphere形成を亢進させた。IL-6RαのsiRNAによりOSCC細胞の細胞増殖能とsphere形成能は抑制された。IL-6の中和抗体およびIL-6Rαの中和抗体はCD133陽性細胞のsphere形成能には影響を及ぼさなかった。IL-6Rαの中和抗体は、CD133陽性細胞のsphereにおけるCD133発現を相対的に増加させた。前年度にヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC)の培養上清中に含まれるIL-6が、口腔扁平上皮癌(OSCC)細胞由来CD133陽性細胞および陰性細胞のsphere形成を促進することが明らかとなったことから、今年度はIL-6およびIL-6受容体がOSCC細胞およびその内のCD133陽性細胞の細胞増殖能およびsphere形成能に及ぼす影響について検討した。まず始めにRTーPCRにより今回の実験に用いた2種のOSCC細胞株がIL-6の受容体であるIL-6RのmRNAを発現していることを確認した。次にIL-6α受容体遺伝子のsiRNA(siIL-6Rα)を用いてOSCC細胞におけるIL-6α受容体遺伝子の発現を抑制した。その結果、controlと比較してsiIL-6Rαの導入により単層培養系でのOSCC細胞の増殖は抑制され、また浮遊培養系でのsphere形成も抑制された。続いてIL-6あるいはIL-6αの中和抗体が、OSCC細胞およびCD133陽性細胞のsphere形成に及ぼす影響について検討した。その結果、controlと比較してIL-6中和抗体およびIL-6α中和抗体はともに濃度依存的にOSCC細胞のsphere形成を抑制した。一方CD133陽性細胞のsphere形成能には影響を及ぼさなかった。更にIL-6中和抗体およびIL-6α中和抗体がOSCC細胞およびCD133陽性細胞のsphereにおけるCD133発現に及ぼす影響について免疫細胞染色を用いて検討した。IL-6中和抗体はOSCC細胞およびCD133陽性細胞のsphereにおけるCD133発現に影響を及ぼさなかった。しかし、IL-6Rα中和抗体はcontrolと比較してOSCC細胞およびCD133陽性細胞のsphereにおけるCD133発現を相対的に増加させた。ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC)の培養上清が、口腔扁平上皮癌(OSCC)細胞由来CD133陽性細胞および陰性細胞の特性に及ぼす影響について検討した。初めにhMSCの培養上清(hMSC-CM)が、OSCC細胞の特性に及ぼす影響について検討した。hMSC-CMは濃度依存性にOSCC細胞の細胞増殖を促進した。また、10%hMSCーCM存在下で、KO細胞のsphere形成能が促進された。続いて、hMSC-CM中に含まれるケモカインについて検討した。これまでにIL-6は腫瘍形成や腫瘍進展に関与することが報告されているため、hMSCーCMに含まれるIL-6の濃度をELISA法で検討した。hMSC-CM中には、OSCC-CMあるいはTIG-3(ヒト胎児線維芽細胞)-CMに比べ、高濃度のIL-6が含まれていた。またIL-6は濃度依存性にOSCC細胞の細胞増殖を促進した。次に、IL-6がOSCC細胞由来CD133陽性細胞および陰性細胞の特性に及ぼす影響について検討した。IL-6はCD133陽性細胞のsphere形成能を亢進させるのみならず、sphere形成能を持たないCD133陰性細胞においても、sphere形成を促した。また、IL-6産生に関するhMSCとOSCC細胞の相互作用について検討した。hMSC-CMを加えた培地中でOSCC細胞を一定期間培養した後、培地を交換し更に48時間培養し、その培養上清中のIL-6濃度をELISA法で検討した。また逆に。OSCC細胞の培養上清(OSCC-CM)を加えた培地中でhMSCを一定期間培養した後、培地を交換し更に48時間培養し、その培養上清中のIL-6濃度についても検討した。hMSC-CMはOSCC細胞のIL-6産生を促進し、OSCC-CMもhMSCのIL-6産生を促進した。前年度に、IL-6が口腔扁平上皮癌細胞(OSCC細胞)の細胞増殖やsphere形成を促進させ、siRNAによるIL-6受容体の抑制あるいはIL-6の中和抗体によりその作用は抑制されることを明らかにした。今年度はIL-6以外の液性因子がOSCC細胞の細胞増殖やsphere形成能に及ぼす影響について解析した。口腔外科本年度は、以下の項目についても検討予定であったが、達成できなかった。1、OSCC細胞がhMSCのIL-6産生に及ぼす影響について。2、CD133陽性細胞におけるIL-

6受容体下流に存在するシグナル解析3、CD133陽性細胞における未分化マーカー発現の検討本年度は、以下の項目についても検討予定であったが、達成できなかった。1.hMSCが産生するIL-6が、OSCC細胞由来のCD133陽性細胞および陰性細胞の生物学的特性に及ぼす影響。2.OSCC細胞が産生するIL-6がhMSCの生物学的特性に及ぼす影響について。3.IL-6あるいはIL-6受容体遺伝子のsiRNAを用いた、hMSCおよびCD133陽性細胞と陰性細胞におけるIL-6の機能解析。近年、癌細胞におけるエネルギー代謝経路についての研究が活発におこなわれているが、癌幹細胞のエネルギー代謝経路についての報告は少ない。今年度は、当初の予定を変更してCD133細胞におけるエネルギー代謝経路およびIL-6との関わりついて解析する予定である。平成24年度に計画していたが実行できなかった項目をまず行う。ついで、IL-6受容体下流に存在するシグナル伝達系について解析する。そして活性化していたシグナル伝達系の阻害剤を用いて、活性化していたシグナル伝達系がCD133陽性細胞およびCD133陰性細胞の細胞増殖能、sphere能に及ぼす影響について検討する。予定していた研究が当初の計画より遅れたため、実際の使用金額が使用予定金額を下回った。次年度の研究遂行のために必要な試薬、消耗品の購入等に使用する予定である。該当なし
公的年金制度の実効性と維持可能性に関する研究

本研究課題における核心的な学術的な「問い」は、「現時点で100年間の持続可能性と50%以上の所得代替率が保証されているとする年金制度およびその検証報告」は学術的にみて社会保障上の実効性と真の持続可能性を担保しているといえるのかという点である。このため、将来の代表的な世帯構成である「共働き世帯」の所得代替率がどのような状況であるか、マクロ経済スライドの実施により年金財政が100年維持されたとしても、低額な受給者側から見て実効的な年金水準と評価されるか、十分実用的な所得代替率という意味での年金の実効性は維持されないのではないかを定量的に明らかにする。
次世代高密度近接型光記憶に向けた導波路一体型フレキシブル光ヘッドスライダの開発

光の回折限界を超える光ディスク技術として注目されている近接場光記憶技術における、浮上スライダ方式の近接型光ヘッドのトラッキング方式について検討した。光スポットの形状が自由に選択できるという近接型光記憶の特性を利用したT形開口を用いたトラッキングエラー検出法を提案した。連続トラッキングエラー信号を得ることのできる方式として、サンプルサーボ方式のように記録マークをずらして配置する変わりに、T字型、あるいはL字型のように2つの長方形型開口を組み合わせた形の開口を読み取りに用いる方式を提案した。一方の長方形型開口はトラックのエッジに沿って移動し、そのためこの開口からの透過光はトラックずれに敏感に影響を受ける。もう一方の長方形型開口は円周方向に分解能を持ち記録データマークを再生する。検出される透過光はこれらの成分を加えたものになる。フレキシブル光ヘッドスライダを用いて本トラッキングエラー検出法の評価実験を行った。収束イオンビーム(FIB)加工により導波路コア上に長辺が3um,短辺の幅が0.5umのT字型開口を作製した。回転系にはエアスピンドルを用い、テストROM媒体を透過した光をNA0.4の対物レンズにより集光し、光電子増倍管(PMT)により検出した。0.5umのドットパターンの再生信号を用いたオフラインでの解析において、0.3um/p-pの信号感度が得られた。本手法の基本的な有効性を確認することができた。17年度には上記の研究の課程で副次的に得られた、フレキシブル光スライダの動的安定性に関する理論を、微小量の流体によるフレキシブルカンチレバーの振動をマイクロ静電発電機に発展的に応用するべく予備研究を行った。通常の光ディスクで用いられるトラッキングエラー検出法は、サンプルサーボ法など一部を除き多くが光の干渉を用いるため、近接型光記憶におけるトラッキング位置決めでは使用できない。このため、光スポットの形状が自由に選択できるという近接型光記憶の特性を利用したT形開口を用いたトラッキングエラー検出法を提案した。これまでに開発してきた有機樹脂製光導波路技術を用いた、浮上スライダ、サスペンション機構、光導波機構一体型のヘッド形態(フレキシブル導波路一体型光ヘッドスライダ)を用いてこの検出法の評価実験を行った。
曲率次元条件を満たす測度距離空間の研究とそのリーマン幾何への応用

当該年度は元々の予定とはかなり異なる研究を行っている.主なものは日本女子大学の藤田玄准教授,福岡大学の三石史人助教との共同研究である. Symplectic toric多様体上にはmoment mapと呼ばれる写像が存在する.このmoment mapの像はちょうど次元が半分の多面体になることが知られているが,さらに多様体の情報を豊富に含んでいる.例えば多面体を見ることで対応する多様体のBetti数などが組み合わせ的に計算出来る.ここでは特に二つのmoment mapの像が合同な場合は弱い意味で対応する多様体が同型であることについて注目する.我々はsymplectic toric多様体上に自然な計量を入れた時に多様体のGromov-Hausdorff収束と,多面体のなんらかの意味での収束が関係しないかと考え,共同研究を行った.単に多面体のHausdorff距離を入れるだけではうまく距離を定めることはできないが,ユークリッド空間上のWasserstein空間の構造を注意深く見ることで多面体の収束概念を定義することができた.低次元多様体では具体的な収束の間の関係がわかってきたが,その研究手法はsymplectic幾何,リーマン幾何,距離空間の幾何(特に最適輸送問題)を全て使い,今まであまり関係のなかった分野の横断的な研究になってきている.また高次元の多様体に関しても多様体がGromov-Hausdorff収束している場合に対応する多面体が収束していることは間違いないと考えている.しかしながら逆方向の収束は微分幾何学的な深い考察が必要であり,今後の課題として残っている.当初の研究予定とは異なるが,距離空間の幾何学のリーマン幾何学への応用(あるいは還元)と言った意味では順調に進んでいる.今後はまず共同研究をまとめて論文にする.また研究実績の概要欄には記入しなかったが,別のいくつかの共同研究も動き出しているのでそちらの方にも力を注ぎたい.こちらの方はRCD空間上でのある種のrigidity定理であるが,熱流やLaplacianの固有関数の解析が不可欠であり,元々の研究課題そのものでありこちらも進めていく.当該年度は元々の予定とはかなり異なる研究を行っている.主なものは日本女子大学の藤田玄准教授,福岡大学の三石史人助教との共同研究である. Symplectic toric多様体上にはmoment mapと呼ばれる写像が存在する.このmoment mapの像はちょうど次元が半分の多面体になることが知られているが,さらに多様体の情報を豊富に含んでいる.例えば多面体を見ることで対応する多様体のBetti数などが組み合わせ的に計算出来る.ここでは特に二つのmoment mapの像が合同な場合は弱い意味で対応する多様体が同型であることについて注目する.我々はsymplectic toric多様体上に自然な計量を入れた時に多様体のGromov-Hausdorff収束と,多面体のなんらかの意味での収束が関係しないかと考え,共同研究を行った.単に多面体のHausdorff距離を入れるだけではうまく距離を定めることはできないが,ユークリッド空間上のWasserstein空間の構造を注意深く見ることで多面体の収束概念を定義することができた.低次元多様体では具体的な収束の間の関係がわかってきたが,その研究手法はsymplectic幾何,リーマン幾何,距離空間の幾何(特に最適輸送問題)を全て使い,今まであまり関係のなかった分野の横断的な研究になってきている.また高次元の多様体に関しても多様体がGromov-Hausdorff収束している場合に対応する多面体が収束していることは間違いないと考えている.しかしながら逆方向の収束は微分幾何学的な深い考察が必要であり,今後の課題として残っている.当初の研究予定とは異なるが,距離空間の幾何学のリーマン幾何学への応用(あるいは還元)と言った意味では順調に進んでいる.今後はまず共同研究をまとめて論文にする.また研究実績の概要欄には記入しなかったが,別のいくつかの共同研究も動き出しているのでそちらの方にも力を注ぎたい.こちらの方はRCD空間上でのある種のrigidity定理であるが,熱流やLaplacianの固有関数の解析が不可欠であり,元々の研究課題そのものでありこちらも進めていく.打ち合わせのための出張などが急に入り途中で足りなくなりそうだったので物品購入などを控えていたら少し余ってしまった.来年度はもっと計画的に使用する.
小児1型糖尿病の病因-素因・環境・免疫の関連における内因性レトロウイルスの意義

小児1型糖尿病の病因をHLA抗原遺伝子に代表される素因と環境因子の両面より検討した。発症間もない患者血清、特に年少児血清からエンテロウイルス特異的mRNAが分離されたとの報告がなされた。更に、血清よりリンパ球からの分離率がよいことが報告された。小児インスリン治療研究会の協力の下、発症間もない患者血清、平成15年度からは血清とリンパ球を集め、エンテロウイルスに特異的なmRNAの分離を試みた。現在まで血清95例、リンパ球26例の発症早期の検体から分離を試みたが、分離はされていない。(2)内因性レトロウイルスIDDMK1,2-22のENV蛋白N末端にクラスIIMHC依存性スーパー抗原活性部位の多型:ENV蛋白N末端から339,510番目にアミノ酸配列の変化を伴うA→G変異を発見し、1型糖尿病と関連することを明らかにした。更に、ウイルスによって誘導されたα-interferonが内因性レトロウイルスを活性化し、これがVβ7T細胞を刺激して自己免疫を発症するとの仮説を報告した。Conradらはスーパー抗原をコードしているENV領域の多型に興味を持ち共同研究を申し込まれたが、相手の都合で実現できなかった。(3)緩徐進行型1型糖尿病(IDDM(S))の病態解析:SPIDDMの多くは学校検尿を契機に発見され、肥満を有せず、ケトアシドーシスは認めないが、インスリン依存性である病態を云う。自然経過も緩徐で、インスリン必要量も少なく、ケトアシドーシスを合併することも少ない。我々は小児IDDMをケトアシドーシスを伴って発症する急性発症型と緩徐進行型に分けて検討してきた。急性発症型は更に5歳未満発症の乳幼児型(IDDM(E))と5歳以上で発症するIDDM(A)に分けて検討した。NIDDM小児、正常対照を用いて検討した。SPIDDMのHLA抗原遺伝子はNIDDM、正常コントロールとは明らかに異なっていた。1型糖尿病の病因をHLA抗原遺伝子に代表される素因と環境因子の両面より検討している。発症時患者より血清を採取しmRNAを抽出し、そのmRNAを鋳型にc-DNAを合成する。現在までに60例ほどの初発症例で分離を試みたが、coxBmRNAの分離に成功したのは1例のみであった。この間、Diabetes 51:1964-1971,2002に掲載された論文「Enterovirus RNA is found in peripheral blood mononuclearcells ina majority of type 1 diabetic childrenat onset」によると1型糖尿病発症時の患者末梢血リンパ球内にエンテロウイルス遺伝子mRNAが50%(12/24)と高率に検出されるということが報告された。(兄弟からは26%(5/19)、健常人コンロトールは0%(0/24))。このため、我々の研究方法を急遽発症時患者血液から単核球を分離し、血清と一緒にCox BmRNAを分離する方法に切り替えた。この場合、VP4領域の系統解析が可能であり、特定のCox Bウイルスを同定することも可能である。この場合、DNAを取り扱うため、再度倫理委員会に申請し、承諾を待っているところである。(2)ウイルス分離とHLA抗原遺伝子、膵島関連自己抗体の同定:ウイルス分離を行った血清については、ウイルス抗体を測定すると同時に、GAD抗体、IA-2抗体、IAAを測定している。新しい研究では同時にHLA抗原遺伝子を測定し、ウイルス分離と発症の関連について検討する。

(3)内因性レトロウイルスIDDMK1,2-22のENV蛋白N末端にクラスII MHC依存性スーパー抗原活性部位の多型:ENV蛋白N末端から339,510番目にアミノ酸配列の変化を伴うA→G変異を発見し、1型糖尿病と関連することを明らかにした。この多型の意義はまだ十分明らかではないが、従来からの検討に合わせ、1型糖尿病児を急性発症5歳以上例(A),5歳未満例(E),ゆっくり進行するSPIDDM(S)及び正常対照(C)に分けて検討している。現在の所、3群間及び正常対照の間に大きな陽性率の差を認めて居ない。(4)発症感受性遺伝子の両親からの伝搬:我が国では1型糖尿病の1親等の家族歴は少ないが、母親に糖尿病、特に2型糖尿病を有する頻度は高い。これに対して発症率の高い欧米では、特に父親に糖尿病を有する頻度が高く、多くは1型糖尿病である。現在までに17家系について、両親、兄弟の血液か採取され、HLA遺伝子の発症感受性遺伝子がどちらの親から来ているか解析している。1型糖尿病の病因をHLA抗原遺伝子に代表される素因と環境因子の両面より検討した。発症時患者より血清を採取しmRNAを抽出し、そのmRNAを鋳型にc-DNAを合成する。しかし、後日末梢血単核球からの分離率が高いとの報告が得られたため(Diabetes 51 : 1964-1971, 2002)我々の研究方法を発症時患者血液から単核球を分離し、血清と一緒にCox BmRNAを分離する方法に切り替えた。現在までに現在まで血清95例、リンパ球26例の発症早期の検体から分離を試みたが、分離はされていない。(2)ウイルス分離とHLA抗原遺伝子、膵島関連自己抗体の同定:ウイルス分離を行った血清については、ウイルス抗体を測定すると同時に、GAD抗体、IA-2抗体、IAAを測定した。結果はGAD抗体陽性例は41/60(68.3%),IA-2抗体は39/60(65%)であった。従来の検討とほぼ同じ陽性率であり、対象が1型糖尿病である事が確認された。新しい研究では同時にHLA抗原遺伝子を測定し、ウイルス分離と発症の関連について検討する予定であった。分離が不成功であったので、この検討は出来なかった。ウイルスによって誘導されたα-interferonが内因性レトロウイルスを活性化し、これがVβ7T細胞を刺激して自己免疫を発症するとの仮説を報告した(Immunity 15 : 591-601, 2001)。ConradらはENV領域の多型に興味を持ち、E群に見られる510番目のG/Gホモ接合体、S群に見られた339番目G/Gホモ接合体に興味を持ち、共同研究が持ち込まれた。出来るだけ発症の早期の1型糖尿病患者より採血を行い、3次元FACSを行う計画を立てたが抗血清が送られてこず、共同研究は出来なかった。(4)SPIDDMの発症感受性遺伝子から見た特徴:我が国の小児1型糖尿病の特徴の一つに緩徐進行型のSPIDDMがある。
試料容積が大きく取れる新しい高温高圧発生装置の開発

近年、日本初の高温高圧中性子回折実験専用の実験ステーションを建設するプロジェクトが動き始め、これに対応する高圧実験技術の開発を進める事が重要になりつつある。本研究の目的は、中性子回折実験を行うために必要な試料体積(12mm^3以上)を確保しつつ、現在、中性子実験で広く使われている"PE(=パリ-エジンバラ)型"装置で今までに報告されている7GPa-1973Kを超える圧力領域で高温高圧実験を実行できる装置と実験技術を開発する事である。これまでに筆者自身が開発してきたドリッカマー型対向アンビル装置のアンビル、ヒーター部周辺の形状、及び、それらの構成に改良を加える事により、安価、かつ、小型で実験が簡単に行える装置を開発した。次にこの装置を使って上記目標の達成を試みた。得られた結果は以下の通りである。1.アンビルの直径を大きくし、かつ、円筒形ヒーターを用いることにより圧力発生効率をあまり落とすことなく試料体積を増やす事に成功した。更に、アンビル先端に適度な窪みを付けてヒーターと試料を包み込むように圧縮する事によって、極めて安定した高温高圧実験が可能になった。2.試料体積は、加圧前で約2.96mm^3(改良前の装置の100倍以上)、15.6GPa下で約1.6mm^3以上確保できた。なお、実験後のアンビルは無傷で回収できており、更に高い圧力を発生させる事も可能と考えられる。温度は、断熱材にジルコニアを用いた場合、ヒーターに投入する電力が175Wの時に約1473K発生させる事ができた。ヒートシンクとなる熱電対を挿入せず、断熱材にMgO-CoOを使用した場合は、最高で275Wまで安定して電力を加える事ができた。この時の温度は、放射光実験の時に得られた温度と投入電力の較正曲線から計算すると約1820Kと推定される。
JSAPによる染色体分配制御とその破綻がもたらすがんの発生・悪性化の分子機構

本年度は、昨年度に得られた研究成果をさらに発展させるとともに、JSAPによる染色体分配制御、および、その破綻がもたらす細胞への影響について検討を行った。昨年度までの研究成果により、細胞内輸送制御因子であるJSAPの発現亢進またはノックアウトされた細胞では、染色体の分配異常が引き起こされることを明らかにした。また、JSAPノックアウト細胞ではPLK1などの細胞分裂制御因子の細胞内局在性に異常が認められることから、JSAPが細胞分裂制御因子の細胞内局在性をコントロールすることで、正常な染色体分配が行われることを明らかにした。よって、本年度は、JSAPノックアウト細胞における、細胞分裂後の染色体の本数について検討を行うため、ギムザ染色により解析を行った。その結果、正常のMEF(マウス胎児線維芽細胞)では40本であるはずの染色体数が、JSAPがノックアウトされたMEFでは、40本より少ない、または多い細胞が多数観察され、がん細胞の特徴の1つでもある異数性を示すことが明らかとなった。また、昨年度にCRISPR/Cas9システムを用いて作製した、ヒト由来のJSAPノックアウト細胞を用いて、MEFと同様な現象が認められるかについて検討を行ったところ、MEFと同様、細胞分裂時における染色体の分配異常が認められた。以上の結果から、JSAPは細胞分裂期における染色体の分配を制御し、その機能の破綻は、がん細胞の特徴の1つである異数性を持つ細胞を生み出すことを明らかにした。また、この現象はマウス由来の細胞だけでなく、ヒト由来の細胞でも認められることから、普遍的なメカニズムであることを明らかにした。本年度は、JSAPによる細胞分裂制御因子の細胞内局在性への影響について検討するため、それらを蛍光標識したタンパク質発現レンチウイルスベクターの作製を行った。また、JSAPノックアウトによる染色体の分配異常が普遍的な現象であるのかについて検討するため、CRISPR/Cas9システムによるJSAPノックアウト細胞の作製を行った。これまでの研究成果より、細胞内輸送制御因子であるJSAPの発現亢進またはノックアウトにより染色体の分配異常が認められたことから、細胞分裂制御因子の細胞内局在性を検討するため、PLK1やShugoshinなどのGFP融合タンパク質発現レンチウイルスベクターを作製し、細胞へ遺伝子導入を行った。その結果、GFPの蛍光シグナルが、細胞分裂期では中心体や染色体へ局在し、内在性のタンパク質と同様の細胞内局在性が認められた。さらに、JSAPをノックアウトしたMEF細胞では、染色体の動原体において、PLK1によるGFPシグナルの過剰な集積が認められた。また、JSAPをノックアウトしたMEFでは、染色体の分配異常が認められたことから、MEF以外の細胞でも同様の表現型を示すかについて検討を行うため、CRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集によりJSAPノックアウト細胞の作製を行った。その結果、HCT116など、ヒト由来の細胞において、JSAPノックアウト細胞を獲得することができた。以上の結果から、JSAPは細胞分裂期における細胞分裂制御因子の細胞内局在に大きく影響を与えることが示唆された。また、本年度に作製したレンチウイルス発現ベクター及びJSAPノックアウト細胞を用いることで、次年度以降、JSAPによる細胞分裂制御メカニズムの解明、及び、未だに不明な点が多い、がん細胞の染色体不安定性獲得メカニズムの解明に向けた研究を大きく推進するものと考えられる。本年度は、各種細胞分裂制御因子を発現するレンチウイルスベクターを作製し、それを用いた解析を行うことができた。さらにはMEF以外のJSAPノックアウト細胞の作製に成功したことから、おおむね順調に進展していると考えられる。今後は、JSAPによる細胞分裂制御因子の細胞内局在性への影響について検討していく。また、これらの現象が様々な細胞で起こる普遍的なものであるのかについても、更なる検討を行っていく。
母子愛着行動の形成と表出にオキシトシン系が果たす役割の解析

下垂体後葉ホルモンのオキシトシンとその受容体は、社会行動と親和行動に重要であることが示されている。オキシトシン受容体遺伝子欠損マウスには母性行動低下が認められた。一方で幼若期のオキシトシン受容体遺伝子欠損マウスでは、母親から隔離したときの超音波発声がほとんど認められなかった。これらの結果は母仔親和行動において、母仔共にオキシトシン受容体が重要な因子であることを示している。また一方で、仔の成長後の行動は幼若期に母親から受けた愛着行動に強く影響をうけることが知られている。そこで、本研究では(1)母仔愛着行動においてオキシトシン系が活性化される脳部位の同定を行うこと、(2)幼若期のオキシトシン系活性化が仔の将来の行動を形成するという仮説を検証することを目的とした。母性行動誘発時にオキシトシン系が機能する脳部位を明らかにする目的で、神経活動マーカーであるc-Fosの免疫組織化学による解析を行った。仔に曝露して母性行動誘発刺激を与えたオキシトシン受容体遺伝子欠損マウスでは、外側中隔野、内側視索前野における神経活動が野生型に比べて顕著に少なく、これが母性行動低下に影響していることが示唆された。また、母仔分離をして仔が母への求愛行動を示す時にオキシトシン系が機能する脳部位を同定する目的で、オキシトシンとc-Fosの二重免疫染色による解析を行った。母と同腹仔から隔離した生後七日目のC57BL/6Jマウスにおいて、視索上核で神経活動マーカー陽性のオキシトシン産生ニューロンが多い傾向が認められ、室傍核のオキシトシン産生ニューロンにその傾向は見られなかった。また、C57BL/6J仔マウスに対して出生日から生後5日目までオキシトシン受容体アンタゴニストを連続投与し、成熟後の行動を解析した。Vehicle投与群と比較して情動行動には差が見られなかったが、社会行動において差が認められた。一方で幼若期のオキシトシン受容体遺伝子欠損マウスでは、母親から隔離したときに仔が発する超音波発声がほとんど認められなかった。しかし、これらの行動についてのオキシトシン/オキシトシン受容体系の作用機序についてはまだ明確でない部分が多い。そこで本年度、本研究では母仔愛着行動においてオキシトシン/オキシトシン受容体系が活性化される脳の部位についての解析を行うことを目的とした。母性行動誘発時にオキシトシン/オキシトシン受容体系が機能する脳部位を明らかにする目的で、神経活動マーカーであるc-Fosの免疫組織化学による解析を行った。仔に暴露して超音波発声またはニオイによる母性行動誘発刺激を与えたオキシトシン受容体遺伝子欠損マウスでは、外側中隔野、内側視索前野における神経活動が野生型に比べて顕著に少ない様子が認められ、これが母性行動低下に影響していることが示唆された。また、母仔分離によって仔マウスが母親への求愛行動を示すときにOXT/OXTR系が機能する脳部位を明らかにする目的で、オキシトシンとc-Fosの二重免疫染色による解析を行った。母親と同腹子から隔離した生後7日目のC57BL/6J仔マウスにおいて、視索上核のオキシトシン産生ニューロンに神経活動マーカー陽性のものが多い傾向が認められ、室傍核のオキシトシン産生ニューロンにはその傾向は認められなかった。さらに、超音波発声の解析装置を導入し、実験系を検討中である。

また、C57BL/6J仔マウスに対して出生日から生後5日目までオキシトシン受容体アンタゴニストを連続投与し、成熟後の行動を解析した。Vehicle投与群と比較して情動行動には差が見られなかったが、社会行動において差が認められた。
音楽的イメージの育成プログラムと評価システムの開発

最終年度にあたる平成17年度は,前年度までの研究成果を国内外の学会等において発表すること,および育成プログラムと評価システムを,学校現場の教育実践において試行していただくこと,の2点を中心に,研究活動を行った。まず,7月にワシントン大学で開催された《The 5^<th> Asia-Pacific Symposium on Music Education Research》では,日本人のピアノ学習者を対象とした指導事例に基づいて,音楽的イメージがどのように獲得されていくのか,そのプロセスについて報告を行った。また,11月には《日本ダルクローズ音楽教育学会第5回研究大会》において,大学生を対象としたハンド・クラッピングの実験とその結果について発表した。このほか,音楽童話を用いて育成プログラムと評価システムについての具体的な提案を行っている。さらに,高等学校教諭の協力を得て,世界の「声の技芸」を介した音楽的イメージがどのように形成されるのか,その実際について報告した。3年間にわたる本研究の成果は,次の4点に集約される,(1)「音楽的イメージ」にかかわる内容を整理し,その本質と形成過程に関する理論的枠組みを提出することができたこと,(2)「音楽的イメージの育成プログラム」を開発し,ピアノ学習者を対象としてその有効性を確認したこと,(3)ハンド・クラッピングという単純な音楽活動から,音楽的イメージと知覚の働きを知ることができるということ,また「学習者のつまずき」の場面を拾い上げることが,その発達過程を明らかにする上で有効な方法であるということを提案したこと,(4)評定尺度を用いた「音楽的イメージの評価システム」を開発し,高等学校においてその有効性を確認したこと。これらの概要と今後の課題を1冊の報告書にまとめ,この間に発表された5本の論文を再録した。本研究は,音楽的イメージの育成プログラムと評価システムを開発し,3年間をかけて,その有効性を実証していこうとするものである。初年度にあたる平成15年度には,まず,音楽教育学および音楽心理学の文献調査と情報収集を行い,音楽的イメージの働きと形成過程について,主に知覚との関わりから明らかにした。次に,小学校音楽科とピアノ・レッスンにおける活動を参観し,音楽的イメージが生起していると思われる場面を,ビデオと文章にて記録した。また,自らの演奏活動を通して得られた知見を,内省的報告によって記述した。その結果,音楽的イメージが生き生きと働くためには,(1)内在化された共振に基づいていること,(2)知覚からも,楽器操作の動作からも,独立して働いていること,(3)楽曲の生成構造に則ったまとまりをもっていること,を必要とすることが分かった。そして,実践に携わる研究者から指導・助言を受けるとともに,大学生を対象とした予備的実験を行い,仮説的枠組みに修正・変更を加えた。以上の研究成果を,報告書「音楽的イメージの評価システム(試案)-その理論的枠組み-」としてまとめ,(1)沈黙を活用した演奏,(2)ボディ・パーカッションとヴォイス・パーカッション,(3)即興演奏,(4)題名づけ,の4点から,評価システムの開発に向けた提案を行った。現在は,この報告書を研究協力者である学校教員とレスナーに配布し,実践の中で試行していただいている段階である。次年度には,いまだ断続的な取り扱いしかなされていない音楽的イメージの育成プログラムを,継続的な使用に堪えるものへと改善するべく,体系化に向けて,更なるデータを蓄積していきたい。本研究は,音楽的イメージの育成プログラムと評価システムを開発し,3年間かけてその有効性を検証しようとするものである。本年度は,その2年目にあたる。昨年度までの間に,音楽的イメージの働きとその形成過程が,共振,知覚,楽曲の生成構造等との関わりから明らかになっている。また,その評価システムとして,(1)沈黙の活用,(2)ボディ・パーカッションとヴォイス・パーカッション,(3)即興演奏,(4)題名付け,という4つの柱を提案した。これらの理論的枠組みに基づき,音楽指導の実践に携わる研究協力者と共同で,その有効性を検証しながら,育成プログラムを開発することが,平成16年度の課題であった。継続的な指導実践を通して,以下の3点について,具体的事例を収集することができた。1.演奏活動においては,楽器操作と知覚に先立って,緊張-弛緩の関係が想起されなければ,音楽的イメージは有効に作用しない。2.音楽的イメージが構造化されていく過程においては,前段階までに形成された運動プログラムがいったん分解され,再構成される。3.グループ活動においては,正確な拍の保持にかかわる能力と動きをイメージする能力との間に,正の相関関係がある。これらの事例に基づく育成プログラムについて,本年7月に開催される《The 5th Asia-Pacific Symposium on Music Education Research》で論文発表を行うことが決定している。あわせて,上述の成果報告を英文にて作成した。音楽的イメージを主たる研究テーマとしているイギリスの音楽心理学者に協力を仰ぎ,国際比較研究への発展可能性を模索中である。

また,11月には《日本ダルクローズ音楽教育学会第5回研究大会》において,大学生を対象としたハンド・クラッピングの実験とその結果について発表した。このほか,音楽童話を用いて育成プログラムと評価システムについての具体的な提案を行っている。さらに,高等学校教諭の協力を得て,世界の「声の技芸」を介した音楽的イメージがどのように形成されるのか,その実際について報告した。3年間にわたる本研究の成果は,次の4点に集約される,(1)「音楽的イメージ」にかかわる内容を整理し,その本質と形成過程に関する理論的枠組みを提出することができたこと,(2)「音楽的イメージの育成プログラム」を開発し,ピアノ学習者を対象としてその有効性を確認したこと,(3)ハンド・クラッピングという単純な音楽活動から,音楽的イメージと知覚の働きを知ることができるということ,また「学習者のつまずき」の場面を拾い上げることが,その発達過程を明らかにする上で有効な方法であるということを提案したこと,(4)評定尺度を用いた「音楽的イメージの評価システム」を開発し,高等学校においてその有効性を確認したこと。これらの概要と今後の課題を1冊の報告書にまとめ,この間に発表された5本の論文を再録した。
骨格筋前駆細胞分化に高度に特化した細胞外マトリックスの開発

骨格筋前駆細胞は、骨格筋の移植治療のリソースとして非常に重要であり、これを高効率に生産するプロセス開発が求められている。申請者は、優れた自己複製能と多分化能を有し、かつ、品質が保証されている多能性幹細胞(ES/iPS細胞)を出発細胞とし、これを分化誘導して骨格筋前駆細胞を安定かつ効率的に作製する方法確立を目指している。そこで先ず本研究では、細胞の増殖・生存・運命決定に大きな影響を与える培養細胞足場としての細胞外マトリックス開発を目的とする。平成30年度では前年度に引き続き、細胞の伸展を阻害して骨格筋細胞への成熟を抑制することを狙いとし、ファイバー状の培養細胞足場の構築を主に進めた。前年度ではコラーゲンファイバーを構築したが、本年度では、生分解性ポリマーを材料としたポリカプロラクトンナノファイバー(PCL-NF)をファイバー骨格とし、このファイバー骨格表面に細胞接着シグナルを有するタンパク質をコートしたファイバー状細胞足場の構築を試みた。具体的にはPCL-NFの作製条件の検討、骨格筋前駆細胞の増殖促進に働くことが知られるαvβ3インテグリン及び骨格筋前駆細胞分化促進能が知られるα6β1インテグリンに親和性を示す足場タンパク質の構築、足場タンパク質のPCL-NFコーティング条件の検討を行った。さらに、作製したファイバー細胞足場について細胞接着能評価、分化マーカー遺伝子の発現量を指標とした分化促進能評価を実施した。結果、作製した細胞足場において、コントロールと比較して分化マーカー発現量が有意な増加が観測された。以上より、おおむね研究計画の通り、平成30年度に細胞足場材料候補の構築を終え、さらに分化促進能を指標とし、目的に適した足場材料の選別を実施し、目的分化マーカー発現量に顕著な変化をもたらす候補を得た。前年度に作製したコラーゲンファイバーは、転写因子接着能、細胞接着能を示し、骨格筋前駆細胞分化の促進効果が期待された。しかし、ファイバー作製時の架橋反応が原因でナノファイバー構造が崩れており(直径が数&micro;m、表面粗さが数数十ナノメートル)、ファイバー構造の無い実験条件と比較し、骨格筋前駆細胞分化促進能、細胞形態にあまり大きな差異が観測されなかった。そこで、架橋反応を必要としないファイバー状の細胞足場として、ファイバー材料を生分解性の合成ポリマー(ポリカプロラクトン)に変更し、これにコラーゲンを表面コーティングして足場として利用することとした。これにより、ファイバーの作製条件の洗い出しから始めることとなり研究の遅れが若干生じた。また、上記の新たなファイバー細胞足場を採用するに伴い、研究内容に幾つかの変更を加えた。理由は、上記の足場の作製条件であればコラーゲン以外の細胞足場タンパク質を簡単に評価できるためである。ここでは、コラーゲン以外にゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、マトリゲルといった一般的に筋細胞培養足場として利用されるタンパク質、および、骨格筋前駆細胞の増殖促進が知られているαvβ3インテグリン、または、骨格筋前駆細胞分化促進が知られるα6β1インテグリンに親和性を有する足場タンパク質を、利用・構築して、それぞれをコーティングしたファイバー細胞足場を作製し、これらの分化促進能の比較も行うこととした。次年度では、本年度に構築した足場材料を引き続き用いて、さらに詳細な分化促進能評価を実施していく。具体的には、分化促進能に顕著な変化を示した幾つかの候補材料について、遺伝子発現だけでなくタンパク質マーカー発現の定性・定量解析を実施していくことに加え、マーカー分子の発現だけでなく骨格筋細胞への分化能を比較して骨格筋前駆細胞の総合的な品質を評価する。さらには、初年度に構築したヘリックス融合MyoD転写因子をヘリックスのヘテロ結合能を利用して足場に固定化し、骨格筋前駆細胞から骨格筋細胞への分化誘導の効率化を試みる予定である。ES/iPS細胞から分化細胞へ安全・安定・高効率に誘導するプロセス開発は喫緊の課題である。近年、転写因子の強制発現により、栄養因子を最適化した通常の分化プロセスに比べ非常に短い時間で高純度の目的分化細胞作製が可能であることが明らかとなった。先行研究では遺伝子導入による転写因子強制発現を行っていたが、本申請では「タンパク質」を直接導入することにより、更に高効率かつ簡便な分化プロセス開発を試みる。また、転写因子をはじめとする液性因子を細胞外マトリックス(ECM)と一体化することにより、液性因子の安定性、及び、細胞移行能の向上を狙う。平成29年度では、骨格筋細胞分化に働くMyoD転写因子タンパク質を大腸菌発現系より単離精製した。得られたMyoDタンパク質の機能については、代表的な筋芽細胞株C2C12細胞を用いて行った。MyoDタンパク質を添加することにより、骨格筋様組織の形成が促進されたことにより、その機能を確認した。また、骨格筋細胞分化を促進する配向性が揃った表面構造を有するECMを開発するため、本年度は電界紡糸法によりマイクロナノスケールの構造を有するファイバーの作製条件を検討した。ファイバーの材料としては骨格筋分化に適したコラーゲンを酸溶媒に溶解し、平均直径400 nmに制御されたファイバー状の構造を得た。架橋した当コラーゲンファイバーは数日間の細胞培養後でもその構造を保持し、コラーゲンと同程度の細胞接着能を示した。さらに現在、MyoDタンパク質とECMの一体化のため、ECMのコラーゲンコーティング条件の検討とMyoDタンパク質へのコラーゲン結合ドメインの融合を試みているところである。当初の研究計画の通り、骨格筋細胞分化を誘導する材料の作製及び評価が完了しつつある。