hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肝細胞発癌性機序における癌遺伝子および細胞増殖因子膜レセプターの関与について

肝癌における癌遺伝子および増殖因子レセプターの存在様式を検討した.ヒト肝癌培養細胞株PLC/PRF/5およびHep G2を用いて, ^<125>Iで標識したEGF(epdlermal growth factor),insulin,IGF-I(insulin-growth factor-I)によるラジオレセプダーアッセイを行った.その結果,両細胞株ともEGFは高い結合率を, insulinは低い結合率を示した. IGF-IはPLC/PRE/5細胞においてHep G2細胞より有意に高い結合率を示した.次にこの両細胞を用いてdot blot法によりDNAおよびmRNAをントロセルローズ膜に固着させ, ^<32>Pで標識した12種類の癌遺伝子プローブとハイブリダイゼイションを行った.その結果,両細胞株とも12種類の癌遺伝子が全て発現しており,そのうちablとfesのmRNAが比較的増加していたが,肝癌細胞に持異的ではなかった.培養液中にEGFを添加したところ,肝癌細胞のDNA合成は促進されたが,癌遺伝子発現に変化はなかった.タンパクレベルの検討では,上記2種類のヒト肝癌細胞株と肝癌手術材料を用いて癌遺伝子産物と増殖因子関連蛋白の免疫組織化学的検討を行った.その結果,肝癌10列中4列でEGFレセプターが細胞膜に染色され,癌部で陽性の列では非癌部でも陽性であったが,染色度は癌部の方が非癌部に比し強い傾向にあった.培養細胞株でも膜型に弱陽性であった. myc産物は肝癌10列中2列で核に陽性であり,培養細胞でも同様であった.ras産物は培養細胞でのみ細胞質に陽性であった.EGF,TGFのが陽性の列はみられなかった.以上より肝癌に特異的に発見される癌遺伝子はなく多種類の癌遺伝子が多段階発癌過程に関与している可能性が示唆され,また増殖因子については自己分泌の可能性は否定し得ないが,今回の成績からは考えにくかった.EGFレセプターが癌化に伴い変化する可能性が考えられた.肝癌における癌遺伝子および増殖因子レセプターの存在様式を検討した.ヒト肝癌培養細胞株PLC/PRF/5およびHep G2を用いて, ^<125>Iで標識したEGF(epdlermal growth factor),insulin,IGF-I(insulin-growth factor-I)によるラジオレセプダーアッセイを行った.その結果,両細胞株ともEGFは高い結合率を, insulinは低い結合率を示した. IGF-IはPLC/PRE/5細胞においてHep G2細胞より有意に高い結合率を示した.次にこの両細胞を用いてdot blot法によりDNAおよびmRNAをントロセルローズ膜に固着させ, ^<32>Pで標識した12種類の癌遺伝子プローブとハイブリダイゼイションを行った.その結果,両細胞株とも12種類の癌遺伝子が全て発現しており,そのうちablとfesのmRNAが比較的増加していたが,肝癌細胞に持異的ではなかった.培養液中にEGFを添加したところ,肝癌細胞のDNA合成は促進されたが,癌遺伝子発現に変化はなかった.タンパクレベルの検討では,上記2種類のヒト肝癌細胞株と肝癌手術材料を用いて癌遺伝子産物と増殖因子関連蛋白の免疫組織化学的検討を行った.その結果,肝癌10列中4列でEGFレセプターが細胞膜に染色され,癌部で陽性の列では非癌部でも陽性であったが,染色度は癌部の方が非癌部に比し強い傾向にあった.培養細胞株でも膜型に弱陽性であった. myc産物は肝癌10列中2列で核に陽性であり,培養細胞でも同様であった.ras産物は培養細胞でのみ細胞質に陽性であった.EGF,TGFのが陽性の列はみられなかった.以上より肝癌に特異的に発見される癌遺伝子はなく多種類の癌遺伝子が多段階発癌過程に関与している可能性が示唆され,また増殖因子については自己分泌の可能性は否定し得ないが,今回の成績からは考えにくかった.EGFレセプターが癌化に伴い変化する可能性が考えられた.近年、肝細胞癌の発生にB型肝炎ウィルスなどの関与が明らかにされつつあるが、発癌の機序に関しては、未だ不明な点が多い。一方、癌遺伝子が細胞増殖、分裂の制御に重要な役割を果たしていることが示唆されている。そこで、今回、肝細胞癌と癌遺伝子、ならびに各種細胞増殖因子膜レセプターとの関連を検討するため、各種ヒト肝細胞癌由来培養細胞(PLC/PRF/5,Hep G2)における癌遺伝子の発現状況、さらにinsulin,EGF(epidermal growth factor)およびIGF-I(insulin like growth factor-I)などの細胞増殖因子の細胞膜レセプターを検討した。1.各種ヒト肝癌細胞における癌遺伝子のmRNAとDNAの検出はQuick-【Blot^(TM)】Kitを用い、癌遺伝子のうちmyc,erbB,erbA,fos,Hras,Kras,Nras,sis,abl,raf,fes,srcをプローベとしてautoradiographyにより測定した。また各細胞においてヒトEGFを100mg/mlの濃度で培養液中に添加し、各細胞の各種癌遺伝子の発現量の変化を経時的に検討した。

その結果、PLC/DRF/5細胞,HepG2細胞とも検索した全ての癌遺伝子のmRNA,DNAが検出され、そのうちablおよびfesではmRNA,DNAとも他の癌遺伝子に比しやや増加していたが、両細胞間で有意な差は見られなかった。またEGF添加による各癌遺伝子発現の経時的変化の検討では、DLC/PRF/5細胞HepG2細胞いずれにおいても有意な変化は認められなかった。2.PLC/PRF/5細胞およびHepG2細胞において【^(125)I】-insulin,【^(125)I】-EGF,【^(125)I】-IGF-Iを用いたradioreceptor assayでの検討では、PLC/PRF/5細胞およびHepG2細胞いずれの細胞株でも【^(125)I】-EGFの結合率は高く、【^(125)I】-insulinの結合率は低かった。一方、【^(125)I】-IGF-Iの結合率は、PLC/PRF/5細胞においてHepG2細胞より有意に高値を示した。以上、肝癌細胞での癌遺伝子発現が明らかであり、また細胞により膜レセプター動態に差を認めたことから、これらと癌化とが何等かの関連性を有することが示唆された。
マスメディアによる人権侵害の救済システムのソフトロー的展開に関する比較制度研究

比較制度的な研究を通じて明らかになったのは、マスメディアによる人権侵害の救済システムがソフトロー的な性格をもち、それによって適切に機能している部分と限界が存在することである。また、ソフトローとしての機能する条件についてもいくつかの軸が見えてきた。すなわち、まず第一に、イギリスや韓国等において、苦情処理機関が行った仲裁や裁定の措置が、報道機関によって一般によく遵守されていることは注目に値する。この背景には、もし自主規制がうまくいかない場合の規制立法に対する警戒もあるが、報道機関が自己規律に対する意識が明確にあることの反映でもあり、それがこの分野でのソフトローを機能させる条件となっていると見ることが出来る。それと同時に、とくにイギリスで指摘される、和解的な感覚の社会的普及も、ソフトローを機能させる上で重要なファクターとなりうることが示唆されている。第二は、苦情処理機関において適用されるルールには、法規制と重なる内容と、法では規制されていない内容の双方が含まれていることである。この後者の観点から言えば、法規制よりも幅広い対象について、柔軟な調整をソフトローが行いうることを意味する。第三に、上記の前者の観点からすれば、ソフトローは法と同じ対象を規律するため一見リダンダントに見えるが、内容は同じであっても、例えば迅速な処理や軽微な費用など、執行のコストや効果において独自の意味をソフトローが持ちうることがあることを、メディアの救済制度の経験は示唆する。以上のような検討を通じ、マスメディアによる人権侵害の救済システムを素材として、ソフトローが成立・機能しうる条件、またソフトローが一般の法に比して有する固有の意義の一端が示され、人権侵害の救済システムの研究とともに、ソフトローの研究に資する成果が得られた。3年計画の第1年度として、本年度は申請した研究計画にしたがって、順次次のような活動を行い、以下のように、第2年度以降の研究の基盤となる研究成果をあげた。1.研究の前提として、各国の関連文献・資料・判例の収集を行い、とくにデジタル・ベースでの資料の入手にも努めた。この結果、3年にわたる予定の研究のための、基本的な文献・資料・判例を入手し、検討枠組みの形成のための基本的データ整理を行った。2.とくに国内の判例資料については、ソフトローの内容的モデルを探るための関係判例データベースの作成作業を行っており、まずデータベースの基本的な項目フォーマット及び公開方式の検討を兼ねて、平成16年度分の判例についてデータベースの構築を行った。この成果は、ほかの年度の判例及び自主規制ルール等の資料とともに、研究の終了とともにネット上での公開を予定しているが、プライバシーないし個人情報保護の観点から一定のアクセス制御が必要になる。3.さらに、ソフトローの具体的モデルを探るがめ、当初の予定通り、国内の関係者に対するヒアリング調査をすすめるとともに、イギリスにおけるプレス苦情委員会及びコミュニケーション庁を整理したが、とくに、侵害の存否についての判断基準のみならず、苦情処理に携わる者の選任方法や判断プロセスも、ソフトローの組織・活動・基準等に関する調査を行った。これらに基づいて、今後の考察のための基本枠組みの要素として考慮することが適切であること等がそこから示唆された。昨年度に引き続き、名誉毀損・プライバシー侵害関係判例の内容分析を行い、判例分析の概要も含むデータベース化の作業も継続し検索の手法についても検討をくわえた。判例は全般に、名誉毀損の違法性阻却などのケースで取材過程に立ち入った検討が増加傾向にあり、ソフトローを考える時には、表現の基準だけでなく取材等の基準も視野に入れて考察する必要が示唆された。また、放送分野における自主規制機関「放送と人権等権利に関する委員会(BRC)」の委員でもある右崎が、これまでのBRCの決定を整理するにあたって監修を行い、その中で、法律の適用とは異なる自主的な判断基準としてソフトロー的アプローチの素材となる事例の要点抽出と分析を行った。

また、海外の動向については、ドイツのマスメディアにおける苦情処理制度についての文献研究を行うとともに、関係機関に対する調査を行った。新聞に関してはドイツ新聞評議会(Presserat)を中心に、苦情処理の基本的な理念、処理の基準、処理にあたっての問題点等について調査を実施した。また、放送分野では西部ドイツ放送(Westdeutscher Rundfunk)の事例を中心に検討を行い、とくに放送特有の規制の考え方やメディア特性に応じた放送分野における苦情処理の考え方の特質、判断基準の新聞との相違等に重点を置いて分析を行った。これまでの2年度にわたる研究状況を踏まえて、最終年度において、研究成果の取り纏めを行う予定である。研究の最終年度である本年度においては、研究計画中未調査であった韓国の状況について調査を行うとともに、研究全体のとりまとめにあたっての内容評価・検証のために、この分野での実務の蓄積を最も多く有しているイギリスにおいて、プレス苦情処理委員会やロンドン大学のスタッフと意見交換を行った。また、メディア判例のデータベース構築もあわせて継続した。この3年間にわたる研究において、マスメディアによる人権侵害の救済システムがソフトロー的な性格をもち、それによって適切に機能している部分と限界が明らかになり、また、ソフトローとしての機能する条件についてもいくつかの軸が見えてきた。すなわち、まず第一に、英独韓各国において、苦情処理機関が行った仲裁や裁定の措置が、報道機関によって一般によく遵守されていることである。この背景には規制立法に対する警戒もあるが、報道機関が自己規律に対する意識が明確にあることの反映でもあり、それがこの分野でのソフトローを機能させる条件となっていると見ることが出来る。第二は、苦情処理機関において適用されるルールには、法規制と重なる内容と、法では規制されていない内容の双方が含まれていることである。これは、後者の観点から言えば、法規制よりも柔軟に幅広い調整をソフトローが行いうることを意味する。第三に、この前者の観点からすれば、ソフトローは一見リダンダントに見えるが、内容は同じであっても、例えば迅速な処理や軽微な費用など、執行のコストや効果において独自の意味をソフトローが持ちうることがある。これらの検討において、マスメディアによる人権侵害の救済システムを素材として、ソフトローが成立・機能しうる条件、またソフトローが一般の法に比して有する固有の意義の一端が示され、人権侵害の救済システムの研究とともに、ソフトローの研究に資する成果が得られたと考える。
分子の集合化を利用したサーモクロミズム

プロトン互変異性は,プロトンの移動とともに共役系の組み替えを起こすので,サーモクロミズムやフォトクロミズムの原因となりうる.その代表例の一つがサリチリデンアニリン類であり,約半世紀近くのあいだに多くの研究が行われてきた.その研究から,これまでサリチリデンアニリン類のサーモクロミズムは,主として固体中でのみ起こるとされてきた.しかし,最近,申請者らはサリチリデンアニリン類が溶液中で顕著なサーモクロミズムを示す場合のあることを見いだした.本研究では,この現象の一般性を明らかにするために,一連のサリチリデンアニリン誘導体の飽和炭化水素溶液について,室温から77Kまでの温度範囲で紫外可視吸収スペクトルの測定を行った.その結果,いずれの溶媒中でも,室温ではサリチリデンアニリン類はOH形としてのみ存在し,可視部には吸収を示さないが,イソペンタンないしイソペンタン・メチルシクロヘキサンを溶媒にした場合には,検討を行つたほぼすべてのサリチリデンアニリン類が,低温でNH形に由来する吸収を示し,その強度は温度の低下とともに著しく増大することを見出した.すなわち,サリチリデンアニリン類は固体中だけでなく,溶液中でも一般にサーモクロミズムを示すことが分かつた.さらに,NH形の検出される温度は濃度が大きいほど高いことが分かった.このことから,このサーモクロミズムは,低温で会合体が形成され,そのなかでNH体が安定化されるころによって出現することが分かった.プロトン互変異性は,プロトンの移動とともに共役系の組み替えを起こすので,サーモクロミズムやフォトクロミズムの原因となりうる.その代表例の一つがサリチリデンアニリン類であり,約半世紀近くのあいだに多くの研究が行われてきた.その研究から,これまでサリチリデンアニリン類のサーモクロミズムは,主として固体中でのみ起こるとされてきた.しかし,最近,申請者らはサリチリデンアニリン類が溶液中で顕著なサーモクロミズムを示す場合のあることを見いだした.本研究では,この現象の一般性を明らかにするために,一連のサリチリデンアニリン誘導体の飽和炭化水素溶液について,室温から77Kまでの温度範囲で紫外可視吸収スペクトルの測定を行った.その結果,いずれの溶媒中でも,室温ではサリチリデンアニリン類はOH形としてのみ存在し,可視部には吸収を示さないが,イソペンタンないしイソペンタン・メチルシクロヘキサンを溶媒にした場合には,検討を行つたほぼすべてのサリチリデンアニリン類が,低温でNH形に由来する吸収を示し,その強度は温度の低下とともに著しく増大することを見出した.すなわち,サリチリデンアニリン類は固体中だけでなく,溶液中でも一般にサーモクロミズムを示すことが分かつた.さらに,NH形の検出される温度は濃度が大きいほど高いことが分かった.このことから,このサーモクロミズムは,低温で会合体が形成され,そのなかでNH体が安定化されるころによって出現することが分かった.
マウスコロナウイルスによる腫瘍融解を目的とした細胞標識アダプターの開発

マウス肝炎ウイルス(MHV)はマウスの細胞によく感染し、細胞傷害を引き起こす。このウイルスはマウスCEACAM1aをレセプターとして感染するが、蛋白分子の中でウイルスレセプターの機能をもつ部位は74アミノ酸と比較的小さい。本研究では、細胞とウイルスの間に入り、ヒト細胞へのMHV感染を可能にする「細胞標識アダプター」の作成を試みた。実際に作成したのは、IgGにCEACAM1aを固定したものである。このアダプターを培養細胞に添加し、もともとレセプターの無い細胞にMHVの感染を試み、MHVを腫瘍溶解性ウイルスとして利用するための可能性を探った。現在までに効率の良いアダプターの作成には至っていない。本研究の目的は、マウス肝炎ウイルス(MHV)を腫瘍溶解性ウイルスとして利用するための道具として、CEACAM1aアダプターを作成し、機能解析をおこなう事である。初年度の計画は、まずCEACAM1aがMHVレセプターとして機能するための、最小単位のアミノ酸配列を特定することであった。現在までに、大腸菌発現系大量に合成したCEACAM1aのNドメイン(74アミノ酸)が、ウイルスのレセプターとして機能することを確かめた。具体的には、MHVはレセプター非存在下では細胞に感染しないが、このNドメインを培養細胞に添加することにより、感染を誘導することを確認した。さらに、スピノキュレーション(培養細胞を3000rpm30分遠心する)により、ウイルスを物理的に細胞に吸着させ、更にNドメインを加えることにより、レセプターの無い細胞へ感染を誘導することができた。このことはNドメインにウイルスを活性化する機能があり、ウイルスを細胞に吸着しさえすればNドメインを使って感染を成立させることができることを示している。さらに、この蛋白は、解明活性剤存在下で煮沸しても、レセプター活性を失わないこと、つまり、リニアエピトープにより、ウイルスとの結合活性を持つことを、Viral Overlay Protein Blot Assayにて確かめた。マウスのコロナウイルス(マウス肝炎ウイルス、MHV)を腫瘍融解性ウイルスとして利用するための、基礎的研究をおこなった。これまで腫瘍溶解性ウイルスには、ワクシニアウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、麻疹ウイルス、単純ヘルペスウイルスが採用され研究されている。本研究はこれにMHVを加える試みである。腫瘍融解を目的とした新たなウイルス種を開発することは、用途に応じた使い分けの選択肢を増やすことにおいて、価値があると思われる。MHVは、細胞侵入のレセプターとして免疫グロブリンスーパーファミリーに属するCEACAM1aという糖蛋白を利用する。CEACAM1aはMHVへの結合特異性が高く、レセプター機能をもつ部位が74アミノ酸と比較的小さい上に、熱変性した後でもウイルス結合能を維持するという特徴をもつ。本研究計画では、CEACAM1aの特徴を利用して、細胞とウイルスの間に入り様々なヒト細胞へのMHV感染を可能にする「細胞標識アダプター」を作成を試みた。まず、CEACAM1aの中でウイルスレセプターとしての機能の最小単位を解析し、N末端74アミノ酸部分に強いMHV結合活性が認められた。当初はもっと小さい分子に活性が認められるを期待したが、実際はこれまで報告されてきた74アミノ酸部位よりも小さくすることはできなかった。続いて、IgGにCEACAM1aの74アミノ酸を固定した、「細胞標識アダプター」を作成した。腫瘍学ウイルス学中東でのMERSコロナウイルスの発生に伴って、他の仕事に携わる業務が増え、本研究に関わるエフォートが下がってしまったため、進行が遅れてしまった。計画にある、抗体と結合したNドメインにより細胞へのMHV感染を誘導させる実験はまだ行っていない。現在までの計画の遅れを取り戻すために、連携研究者の日本獣医生命科学大学の田口文広教授の協力を得て、実験に携わる者を増やし、今後半年を目処に、集中的に実施する予定である。2013年の中東でのMERSコロナウイルス感染者の急増に伴って、本研究以外の仕事に携わる義務が増え、エフォートが下がってしまったため、本研究の進行が遅れてしまった。今後半年を目処に、遅れた研究を取り戻すべく研究を行い、それに伴い昨年度分の額を使用する予定である。
フタバガキ科種(Shorea属)の多芽体および不定胚誘導法に関する研究

1.茎頂および腋芽からの多芽体誘導条件の検討Shorea.multifloraについて、苗木から茎頂を切り出し、滅菌後に液体培地(旋回培養)にて多芽体誘導を試みた。MS培地を基本とし、その改変効果を調べたほか、サイトカイニン系のIBAやBAP, Zeatin, 4PU等の植物調節物質の効果(各種濃度およびオーキシンとの組み合わせ)を検討した結果、1/2MS培地で、BAPの3μMを単独添加した条件では、培養開始から3週間以内に顕著な鱗片葉の開葉や茎頂の伸長が認められた(25%)。多芽体は誘導されなかったが、不定芽誘導には比較的低濃度のサイトカイニンが効果的であることが明らかとなった。2.カルスの誘導条件、カルスの分化能評価法及びカルスからの初期不定胚の誘導条件の検討S.multifloraについては葉から分化能を有するカルスの誘導を試み、主にオーキシン(各種濃の2,4-D)とサイトカイニン(各種濃度のBAP,4PU, zeatin, TDZ)の単独、あるいは組み合わせ効果、糖(3,6%のスクロース、マルトース)効果、さらにCO_2の暴露効果について検討した。この結果、MS培地で2,4Dが10μM、BAPが3μMの組み合わせにおいて100%の誘導率と質の良いカルスを誘導することができた。誘導されたカルスの中には頂端分裂組織様の組織がみられ、また不定胚初期の球状胚に似た組織も観察された。糖はマルトースが効果的であり、またTDZの効果やCO_2の暴露効果が確認された。3.誘導した多芽体のシュート化条件及び発根誘導条件の検討多芽体が誘導されなかったため、この課題については大きな成果は得られなかった。発根に関して、さらにサシキをモデルにして、培地の改変、NAA, IBA単独あるいは組み合わせ、およびサイトカイニン類の効果を調べることによって、不定芽シュートへの発根誘導条件を明らかにできると考える。4.初期不定胚の成熟化条件の検討S.multifloraの葉から誘導されたカルスから、球状胚に似た組織が形成され、さらに不定胚の発達を促すためオーキシンとサイトカイニンの効果、およびMS培地の改変の効果を調べたが、完全な不定胚が形成されるまでには至らなかった。1.茎頂および腋芽からの多芽体誘導条件の検討S.multiforaについて、苗木から茎頂および腋芽を切り出し、滅菌後個体および液体培地(旋回培養)にて多芽体を誘導する試みを行っているところである。特に、MS培地を基本とし、窒素源の効果を調べたほか、サイトカイニン系のIBAやBAP,Zeatin,4PU等の植物調節物質の効果(濃度および組み合わせ)を検討している。2.カルスの誘導条件、カルスの分化能評価法及びカルスからの初期不定胚の誘導条件の検討S.multiforaについては葉を、Paraserianthes falcataria(追加)については種子胚を用いてMS培地にてカルスを誘導することができた。

また、一般に用いられている生・乾重量法に加え、細胞形態、細胞質活性およびタンパク質活性の観察(DAPIによるオルガネラ染色、核染色による蛍光顕微鏡観察)によって、高い分化能を有するカルスの選抜を試みている。3.誘導した多芽体のシュート化条件及び発根誘導条件の検討誘導された多芽体については、シュート化の後に発根を試み、それぞれの条件を精査しているところである。特に、培地の改変、およびオーキシン類(NAA, IBA単独あるいは組合わせ)、サイトカイニン類の効果を調べている。発根の検討にまでは現在至っていないが、多芽体およびそのシュート化に関して成果が得られた後発根条件の検討を行うことにしている。4.初期不定胚の成熟化条件の検討S.multiforaの葉から誘導されたカルスには、予備実験で観察された球状の組織が認められた。この組織が初期不定胚であるかについて顕微鏡等によって確認しているところである。また、不定胚の発達を促すためオーキシンとサイトカイニンの効果、およびMS培地の改変の効果を調べている。1.茎頂および腋芽からの多芽体誘導条件の検討S.multiforaについて、苗木から茎頂および腋芽を切り出し、滅菌後個体および液体培地(旋回培養)にて多芽体誘導を試みた。MS培地を基本とし、窒素源の効果を調べたほか、サイトカイニン系のIBAやBAP,Zeatin,4PU等の植物調節物質の効果(濃度および組み合わせ)を検討した結果、MS培地で、BAP3μMを単独添加した条件では、培養開始から3週間以内に、総供指数8の25%にあたる2個に顕著な鱗片葉の開葉や茎頂の伸長が認められた。多芽体は誘導されなかったが、不定芽誘導にはサイトカイニンの低濃度が効果的であることが明らかとなった。2.カルスの誘導条件、カルスの分化能評価法及びカルスからの初期不定胚の誘導条件の検討S.multiforaについては葉を、Paraserianthes falcatariaについては種子胚を用いてMS培地にてカルスが誘導され、さらに幾つかのカルスから、球状の初期不定胚様の組織が形成された。初期不定胚を誘導したカルスの分化能を評価するため、生・乾重量法に加え、顕微鏡によって細胞形態や細胞質を観察した。この結果、分化能を有するカルスの組織的特性が概ね明らかとなった。3.誘導した多芽体のシュート化条件及び発根誘導条件の検討多芽体が誘導されなかったため、この課題については大きな成果は得られなかった。発根に関して、さらにサシキをモデルにして、培地の改変、NAA,IBA単独あるいは組合わせ、およびサイトカイニン類の効果を調べることによって、不定芽シュートへの発根誘導条件を明らかにできると考える。4.初期不定胚の成熟化条件の検討S.multiforaの葉、Paraserianthes falcatariaの種子胚から誘導されたカルスから、球状の組織が形成され、さらに不定胚の発達を促すためオーキシンとサイトカイニンの効果、およびMS培地の改変の効果を調べたが、完全な不定胚が形成されるまでには至らなかった。
心筋細胞間刺激伝播の分子機構の検討と抗不整脈治療への応用

Gap junctional Protein(GJP)は心筋細胞間の細胞膜に存在し細胞間に架橋を形成し、細胞間の物質及びイオン伝達に重要な役割を持つ。このGJPを介する細胞間相互作用は心筋や平滑筋のような電気的興奮性細胞ではその電気的同期性を決定する。GJPは細胞膜に存在し、6個のサブユニットより形成され隣接する細胞膜に存在するGJPに結合し細胞間の連絡孔を構成している。Connexinの基本構造は同一で、細胞膜を四回通過することにより、細胞膜外、細胞膜内、及び細胞質内のドメインを構成する。この細胞外のドメイン同士が接着することにより細胞間の連絡孔を形成する。Connexinの蛋白構造と機能解析にはDNAの部位特異的変異導入法を用いてConnexinの変異蛋白を作製し、これを細胞株に安定発現させる。このようにして得られた細胞株を使って細胞間の物質及びイオン伝達におけるGJPの役割を解析する。心筋細胞間のカルシウム伝達はカラーイメージィングシステムを使用することにより、カルシウムとそれ以外の蛍光発色物質でラベルした分子の移動を30ミリ秒単位で三次元表示することにより解析した。電気的同期性はパッチクランプ法を併用することにより、定量的解析を行った。細胞膜外ドメインに存在するcysteine残基が細胞間の連絡孔を形成する際の細胞膜外ドメイン同士の接着に重要であることを明らかにした。さらに、細胞膜内ドメインがZO-1に結合することによりconnexin-43の細胞膜への移送に関与することを報告した。我々はGJP(gap junctional protein)の解析のための新しいシステムの開発とGJPの構成蛋白質であるconnexin-43の蛋白構造と機能の関連を分子生物学的手法による解明を行った。GJPの解析のための新しいシステムとして内因性GJPを発現しない哺乳動物細胞株を用いる。GJPの蛋白構造と機能解析にはDNAの部位特異的変異導入法を用いてconnexin-43の変異蛋白を作製し、これを細胞株に安定発現させる。最近、我々はカラーイメージイングシステムを使用し、細胞間の物質移動を三次元表示で定量的に解析した研究を開始したが、さらに、今回申請したパッチ・クランプシステムを使用することにより、定量化を行った。隣接する二細胞にそれぞれ微少電極針を挿入し、細胞間電位差に対する細胞間電流変化を測定しGJPを介した細胞間コンダクタンスを計算する。この細胞間コンダクタンスは細胞間イオン伝達の指標として用いられる。現在のところ、細胞膜外ドメインに存在するcysteine残基が細胞間の連絡孔を形成する際の絹胞膜外ドメイン同士の接着に重要であることを明らかにした。Gap junctional Protein (GJP)は心筋細胞の細胞膜に存在し細胞間に架橋を形成し、細胞間の物質及びイオン伝達に重要な役割を持つ。心筋細胞間のカルシウム伝達はカラーイメージィングシステムを使用することにより、カルシウムとそれ以外の蛍光発色物質でラベルした分子の移動を30ミリ秒単位で三次表示することにより解析した。

電気的同期性はパッチクランプ法を併用することにより、定量的解析を行った。細胞膜外ドメインに存在するCysteine残基が細胞間の連絡孔を形成する際の細胞膜外ドメイン同士の接着に重要であることを明らかにした。さらに、細胞膜内ドメインがZO-1に結合することによりconnexin-43の細胞膜への移送に関与することを報告した。
病態ウサギにおける重粒子線の心房細動抑制作用と電気生理学機序の解明

心房細動(AF)は不整脈の中でもっとも頻度が高く,脳卒中の主な原因である.治療はカテーテルアブレーションが一般的で,成功率は7085%に達するが,心外膜基質病変に対しては有効性が乏しい.ウサギ・イヌを用いた重粒子線(炭素線)の体外照射では,興奮伝導を司るギャップ結合蛋白コネキシン43 (Cx43)の発現による心室不整脈の抑制効果が得られている.しかし,心房に対する作用および心房の主要なギャップ結合蛋白コネキシン40 (Cx40)の変化は不明である.本研究では, “重粒子線によるAF抑制作用について",免疫組織学,電気生理学,生体情報の観点から解明したい.心房細動(AF)は不整脈の中でもっとも頻度が高く,脳卒中の主な原因である.治療はカテーテルアブレーションが一般的で,成功率は7085%に達するが,心外膜基質病変に対しては有効性が乏しい.ウサギ・イヌを用いた重粒子線(炭素線)の体外照射では,興奮伝導を司るギャップ結合蛋白コネキシン43 (Cx43)の発現による心室不整脈の抑制効果が得られている.しかし,心房に対する作用および心房の主要なギャップ結合蛋白コネキシン40 (Cx40)の変化は不明である.本研究では, “重粒子線によるAF抑制作用について",免疫組織学,電気生理学,生体情報の観点から解明したい.
生物エネルギーの利用と開発(総括班)

研究目的本研究は農林産資源及び未利用資源の有効エネルギー化を目的として、1)エネルギー資源としての植物の検索・選定と栽培・収穫の方法2)化学的、物理的および生物的手法による有効エネルギー化合物への転換手法に関する基礎研究を行うものである。研究成果の概要本年度は、当班研究者全員参加の全体会議1回、各グループの討論会4回、総括班会議3回、拡大総括班会議1回を開催した。全体会議では本年度の成果発表と討論を公開で行い、得られた成果については成果報告書を作成し取り纏めた。総括班会議では本年度ならびに来年度の研究全体計画、推進方法などにつき討議し、拡大総括班会議では最終年度を迎えるに当って班全体の最終成果の取り纏めと長期的観点からのバイオエネルギー生産の展望を得るためにグループ間の情報交換、研究協力をより積極的に行う方向で討論した。本年度の主な研究成果は次の通りである。1.高エネルギー植物の研究:ユーホルビア属のカルス誘導に成功し、ユーホルビアの葉からポリプレノールを単離した。コパイオフェラのオイル成分の発熱量は約10,000kcal/kgであること、根菜類及び【C_4】型植物のエネルギー産出・投入比を明らかにした。2.林産資源のエネルギー化の研究:木粉の連続的マイクロ波加熱処理でリグニンが70%可溶化すること、多段式爆砕の有効性等を明らかにした。マングローブ胎生種子からのタンニンの膜分離、リグニンの燃料化、裏スギの精油収量、リグニン分解酵素の単離について成果が得られた。3.発酵によるバイオマスの有効エネルギー化の研究:セルラーゼの相乗作用の検討、耐熱性アビセラーゼの分離、アルコールやメタン発酵の最適化の検討と経済的評価が行われた。遺伝子工学的手法によって、澱粉あるいはセロビオース資化性酵母の育成、キシラナーゼ生産菌、リグニン関連物質分解菌の改良等の成果が得られた。
生命金属動態解析を目指したタンパク質のネイティブ質量分析

微量試料でも生体高分子複合体を丸ごとイオン化し正確に質量決定できるネイティブMS法を駆使して、生命金属動態の解析を推進する研究を行う。実験手法の高度化および基盤構築を進めた上で、領域内の研究者と積極的に連携研究を展開し、金属を配位したタンパク質の正確な質量決定、金属イオンの結合に伴う構造変化の解析、さらには膜タンパク質の測定も挑戦し、シグナル伝達や転写に関わる種々のタンパク質の機能メカニズムの解明に有用な情報を提供する。
ブタモデルを用いた冠微小血管攣縮性狭心症の病態解明と治療

本研究の目的は、我々の開発したブタ冠微小血管攣縮モデル(Cardiovasc Res 1998;38;772-781,J Am Coll Cardiol 2001;37:308-315)を用いて冠微小血管攣縮に関与する因子を血管内皮機能不全と血管平滑筋過収縮の両面から検討し、その本態に迫ることである。2年間の研究成果は以下の通りである。ブタ冠動脈左前下行枝(LAD)の血管内皮細胞を2週間毎に4回バルーン損傷し、0.05μg/kgの少量のアセチルコリン(ACh)を冠動脈内投与すると、LADバルーン損傷部では冠血管の狭窄は起こらずに著明な冠血流低下を認めた。これらの結果より、ACh投与により何らかの因子を介して冠微小血管の攣縮が誘発されたことが強く示唆された(Coronary Artery Disease,2004;15:137-145)。その誘因を検討したところ、バルーン損傷による時間経過とともに冠状静脈洞でのエンドセリン-1(ET-1)とACh投与にるET-1の濃度が有意に増加していることが判明した。さらに、冠微小血管レベルでeNOS発現も低下し、活性酸素種(ROS)産生が増加していた。ET-1 A型受容体拮抗薬を内皮損傷モデルに投与したところ、ACh誘導による冠血流低下、eNOS発現低下、ROS産生が阻止された。これらの事実はLAD血管内皮細胞損傷はその末梢微小血管の内皮細胞不全を引き起こし、ROS産生も巻き込んでET-1産生を高め、ET-1が冠微小血管攣縮の一因と考えられた。末梢の微小血管レベルでROS産生源を調べたところ、p22phoxやgp47phoxが冠攣縮モデルで活性化しており、太い血管での内皮損傷が末梢の微小血管でのNADPHoxidase活性化を誘導すると考えられた。さらに、冠攣縮にCa2+感受性亢進のRhoA活性化が関与することが知られており、アゴニスト刺激によるゲラニルゲラニル化を介する極めて迅速なRhoA活性化の存在を明らかにした(J Biol Chem 2005;280;10182-10188)。しかし、この迅速なRhoA活性化と冠攣縮における血管内皮細胞不全との関連は今後検討する必要がある。冠微小循環障害の原因として、冠微小血管の攣縮が注目されているが、その病因、病態、治療は不明な点が多い。本研究の目的は、我々の開発したブタ冠微小血管攣縮モデル(Cardiovasc Res 1998;38;772-781,J Am Coll Cardiol 2001;37;308-315)を用いて冠微小血管攣縮の発現に関与する因子を明らかにし、その本態に迫ることである。本年度の研究成果は以下の通りである。

ブタ冠動脈左前下行枝(LAD)の内皮細胞を2週間毎に4回バルーン損傷し、LAD血流と体表面心電図をモニターしたところ、心電図にてST低下を伴う冠血流の低下を認め、自然発症の冠攣縮が内皮損傷の繰り返しにより誘発されたと考えられた。その冠攣縮における微小血管床の関与をさらに検討するために、同モデルに0.05μg/kgの少量のアセチルコリン(ACh)を冠動脈内投与したところ、LADバルーン損傷部では冠血管の狭窄は起こらず心電図のST低下を伴う著明な冠血流低下を認めた。これらの所見より、ACh投与により何らかの因子を介して冠微小血管の攣縮が誘発されたことが強く示唆された(Coronary Artery Disease, in press)。そこで、そその誘発因子を同定する為にACh投与前後にて冠状静脈洞にて各種因子を測定したところ、ACh投与によりエンドセリン-1(ET-1)が有意に増加していることが判明した。さらに、冠微小血管レベルでeNOS発現も低下していた。また、バルール4回損傷モデルではベースラインの活性酸素種(ROS)産生が増加していた。そこで、ET-1 A型受容体拮抗薬を内皮損傷モデルに投与したところ、ACh誘導による冠血流低下、eNOS発現低下、ROS産生が阻止された。これらの事実はLAD内皮損傷はその末梢微小血管の内皮細胞不全をひきおこし、ROS産生も巻き込んでET-1産生を高め、ET-1が冠微小血管攣縮の一因と考えられた。これらの成果は本年の日本循環器学会総会で発表した。本研究の目的は、我々の開発したブタ冠微小血管攣縮モデル(Cardiovasc Res 1998;38:772-781,J Am Coll Cardiol2001;37:308-315)を用いて冠微小血管攣縮に関与する因子を血管内皮機能不全と血管平滑筋過収縮の両面から検討し、その本態に迫ることである。本年度の研究成果は以下の通りである。ブタ冠動脈左前下行枝(LAD)の血管内皮細胞を2週間毎に4回バルーン損傷し、0.05/μg/kgの少量のアセチルコリン(ACh)を冠動脈内投与すると、LADバルーン損傷部では冠血管の狭窄は起こらず著明な冠血流低下を認めた。これらの結果より、ACh投与により何らかの因子を介して冠微小血管の攣縮が誘発されたことが強く示唆された(Coronary Artery Disease,2004;15:137-45)。その誘因を検討したところ、バルーン損傷による経過とともに冠状静脈洞でのエンドセリン-1(ET-1)とACh投与後のET-1の濃度が有意に増加していることが判明した。冠微小血管レベルでeNOS発現も低下し、活性酸素種(ROS)産生が増加していた。ET-1 A型受容体拮抗薬をこのモデルに投与したところ、ACh誘導による冠血流低下、eNOS発現低下、ROS産生が阻止された。これらの事実はLAD血管内皮細胞損傷はその末梢微小血管の内皮細胞不全を引き起こし、ROS産生も巻き込んでET-1産生を高め、ET-1が冠微小血管攣縮の一因と考えられた。末梢の微小血管レベルでROS産生源を調べたところ、p22phoxやgp47phoxが冠攣縮モデルで活性化しており、太い血管での内皮損傷が末梢の微小血管でのNADPHoxidase活性化を誘導すると思われた。さらに、冠攣縮にCa^<2+>感受性亢進の機序としてRhoA/Rho-kinase活性化が関与することが知られているが、今回、トロンビン刺激によるゲラニルゲラニル化を介する極めて迅速なRhoA活性化の存在を明らかにした(J Biol Chem2005;280;10822-8)。この迅速なRhoA活性化と冠攣縮における血管内皮細胞不全との関連は不明であり、今後検討していく予定である。
立体構造情報に基づいたCTX-M型β―ラクタマーゼの基質特異性拡張機構の解明

DNA配列、及び構造の比較から、CTX-M型βーラクタマーゼの基質特異性の変化に関与するのは、3つのループ部分、Ωループ、VNYNPループ、α/βドメインを繋ぐループに生じたアミノ酸置換であることが示唆された。α/βドメインを繋ぐループ中に存在するAla-219に対し、A219V、A219L、A219F、の変異型酵素を作成し構造を解析した。その結果、野生型に対し、A219Lの主鎖は最大0.42 nmという大きな変位を示したことから、CTX-M型βーラクタマーゼの構造は潜在的に柔軟性があり、ループ部分のアミノ酸置換により、全体構造と活性が大きく変化することが示された。1.PCRを用いたCTX-M型ESBLsのサブグループの鑑別ー奈良県立医科大学附属病院で分離された、CTX-M型ESBLを保有する大腸菌の鑑別を行ったところ、CTX-M-9型が最も多く、CTX-M-1型、CTX-M-2型が散見された。2.大腸菌が保有するCTX-M型ESBLのDNA配列の決定方法の確立ー奈良県立医科大学附属病院で分離された、CTX-M型ESBLを保有する大腸菌のほとんどは、複数種類のプラスミドを保有することが判明した。そのため形質転換によって、ESBLをコードするプラスミドのみを持つ大腸菌を分離する方法を確立した。さらに、PCRによりサブグループを鑑別する際に使用するプライマーと、その逆鎖の合成プライマーを用いて、ターゲットとなる遺伝子の全配列を決定することに成功した。3.CTX-M-2型ESBLの高発現化方法の確立ー高発現化方法を確立する目的で、日本で最もよく研究されているサブグループであるCTX-M-2型ESBLを用いて実験を行った。開始コドンを除く5'末端、及び3'末端の下流にBamHIサイトを付加したプライマーセットを合成し、CTX-M-2型ESBL全遺伝子をPCRにより取得した。これをpET28aのNcoIーBamHIサイト間に挿入して、BL21(DE3)を形質転換した。この菌株を用いて培養条件、及びIPTGによるインダクションの条件の検討を詳細に行ったところ、培養温度20°C、最終濃度0.02mMのIPTGでインダクションを行うことにより、可溶性画分にESBLが大量発現することを見出した。以上の結果から、大腸菌が保有するCTX-M型ESBLのDNA配列の決定、大腸菌へのクローニング、大腸菌におけるESBLの大量発現までをルーチンで行う方法が確立された。1.高純度のCTX-M-2型ESBLを精製する方法の確立ー平成25年度において大腸菌においてESBLを大量発現できるようになったので、簡便に精製できる条件を検索した。その結果、20 mM MES pH 6.5で平衡化した陽イオン交換樹脂・CM-Toyopearlを使用し、0ー0.2 M NaCl直線勾配で溶出させることにより、1ステップで電気泳動的に単一にまで生成する方法を確立した。最終収量は1L培養当たり、約30mgであった。3.基質特異性に関与するアミノ酸の抽出ーアミノ酸配列、及び、構造相同性の網羅的検索により、基質特異性に関与するアミノ酸の候補を検索した。その結果、活性が拡張されるためには、ループ部分の柔軟性の変化が関与していることが示唆された。特に、VNYNPループ、及び、活性部位の上部に位置するα/βドメインをつなぐループが重要である。そこで、活性部位の上部に位置するα/βドメインをつなぐループにおいて、もっとも影響を及ぼすと考えられるAla219について、ループの動きを制限する目的で、Val, Leuのアミノ酸置換を導入した。これらの変異型酵素についても大腸菌内で高発現することを確認した。前年度の研究より、活性が拡張されるためにはループ部分の構造の柔軟性が重要であることが示唆された。そこで、活性部位の上部に位置し、α/βドメインをつなぐループにおいて柔軟性に影響を与えると考えられるAla219について、柔軟性が低下すると考えられる一連のアミノ酸置換、A219V, A219L, A219Fを導入した変異型酵素を作成し、大腸菌より精製した。すでに構造が決定されているToho-1の構造を初期モデルとした用いた分子置換法により、野生型CTX-M-2、A219V, A219L, A219Fの構造を決定し互いに比較したところ、野生型に対して、A219V, A219Fの主鎖の構造変化はr.m.s.d=0.1Å程度と微小であったが、A219Lの構造変化はr.m.s.d=0.5Å、最大4.2Åと大きいことがわかった。このことから、CTX型βーラクタマーゼでは、ループ部分に生じたアミノ酸置換が全体の構造に大きな変化を及ぼし、活性に影響を与えることが示唆された。

その結果、野生型に対し、A219Lの主鎖は最大0.42 nmという大きな変位を示したことから、CTX-M型βーラクタマーゼの構造は潜在的に柔軟性があり、ループ部分のアミノ酸置換により、全体構造と活性が大きく変化することが示された。精製条件の決定において、大腸菌破砕液の状態では陽イオン交換樹脂に目的タンパク質が結合しないという現象がみられた。そのため、緩衝液の種類、濃度、pH等の精製条件を最適化するのに時間を要した。結晶化条件の検索において、X線回折データが測定できる程度の大きさに結晶が成長するためには、約1カ月を要した。そのため、結晶化条件の最適化に時間を要した。以上の理由により、平成26年度の達成度は少し遅れていると判断した。しかしながら、当該年度において、短時間で大量の精製タンパク質を得る手法、及び結晶化条件の決定が行えたこと、非常に良好なX線回折データが得られたこと、及び変異型酵素の大腸菌内での高発現が行えたことから、平成27年度は計画通りに研究を遂行できるものと考えている。タンパク質工学活性部位の上部に位置するα/βドメインをつなぐループの重要性を構造学的に解明するため、Ala219に対して、ループの柔軟性を下げるような一連のアミノ酸置換を導入した変異型酵素を作成する。作成した変異型酵素はこれまでに確立した手法を用いて結晶化し、構造解析を行う。得られた構造の比較、及び様々な抗生物質をドッキングさせたコンピュータシュミレーションを行い、基質特異性の拡張機構を解明する。また、VNYNPループとよばれる部分へのアミノ酸置換は、基質特異性に影響を与えるとされているが、なぜ影響を与えるのかは全く解明されていない。そこでこの部分についてもアミノ酸置換を導入し、なぜ基質特異性に影響を与えるのかを構造学的に解明する。CTX-M-2では1.3Åという超高分解能のデータが得られているため、原子レベルでの議論が期待できると考えている。本研究課題の第1関門は、CTX-M型ESBLのDNA配列決定と可溶性タンパク質の大量発現をいかにルーチンで行うかであり、これが平成25年度の主目的であった。当該年度において、我々は、元株が複数種類保有するプラスミドの中から、ESBLをコードするプラスミドの単離方法を確立したほか、CTX-M型ESBLのDNA配列の決定、大腸菌へのクローニング、大腸菌におけるESBLの大量発現までをルーチンで行う方法を確立できたので、研究はおおむね順調に進展していると判断した。平成26年度に購入予定であった、遺伝子解析ソフトウェアのバージョンアップが、Windows10のリリースが発表されたため延期されている。そのため、購入を見合わせた。また、実験に使用している薬用冷蔵ショーケースが製造後35年を経過し、経年劣化で不調となったために急遽購入を検討したものの、年度末迄に購入決定ができなかった。以上の理由のために次年度使用額が生じたものである。1.高純度のCTX-M型ESBLを精製する方法の確立ー結晶化を行うためには、通常10mg/mL程度の高純度タンパク質が1020mL必要である。この量のタンパク質を効率よく、かつ高純度で精製するする方法を確立する。平成25年度の結果では、予想以上の発現効率でタンパク質が得られるようになったため、陽イオン交換カラムクロマトグラフィーのみでの精製で十分と予想している。2.CTX-M型ESBLの結晶化条件の検索ーこれまでに確立したシステムで精製したタンパク質を用いて、結晶化を行う。結晶化条件の検索には市販の結晶化条件検索キットを用い、タンパク質濃度、結晶化剤濃度、温度等の条件を変えて、数百数千条件の検索を行う予定である。
トランスジェニック技術を用いた末梢性寛容の研究

末梢性寛容の一形態であるアナジーに陥ったヘルパーT細胞は、CD28副刺激伝達系の麻痺をきたす。前年度は、トランスジェニック技術でマクロファージ特異的にI-EクラスIIMHC抗原を発現させると、I-E分子により抗原提示される内因性スーパー抗原反応ヘルパーT細胞のアナジーが誘導されることを報告した。本年度は、アナジーにより障害を受けるシグナル伝達系を明らかにする目的で、研究を進めた。第一に、マクロファージ特異的にI-E分子を発現するトランスジェニックマウスME2と内因性スパー抗原反応性のTCRVβB11を発現するTCRトランスジェニックマウスF5のF1を作製した。平成7年度にF1マウスのアナジーの解析を進める。第二に、B6マウスに外来性スーパー抗原SEBを投与してVβ8陽性CD4T細胞のアナジーを誘導し、アナジーによって障害を受けるシグナルを検討した。その結果、アナジーに陥ったヘルパーT細胞では、CD28副刺激を加えてもIL-2およびIL-4mRNAの安定化が誘導されないことが判明した。アナジーを誘導するとIL-2mRNAの発現レベルは低下するが、IL-4mRNAの発現レベルは逆に高くなる。発現レベルが高くなったIL-4mRNAでもCD28副刺激によるmRNA安定化が起こらないことにより、アナジーによりCD28副刺激伝達系の異常が起こることが判明した(Int.Immunol.7:37,1995)。従来より、アナジーによりTh1ヘルパーT細胞ではIL-2産生障害が、Th2ヘルパーT細胞ではIL-4反応性の低下(IL-4自体の産生は障害されない)が引き起こされることが報告されている。McAurtherにより、Th2クローンのIL-4反応性はCD28副刺激によるIL-1αmRNAの発現により制御されていることが明らかとなってきた。McAurtherの報告と私たちの実験結果を総合すると、CD28副刺激伝達系の障害により、Th2クローンのIL-4反応性低下が引き起こされると理解される。第三に、上記の推論が正しいとするならば、外来性にIL-1を加えるとTh2クローンのアナジー誘導が阻害されることが予想される。そこで、SEBでアナジーを誘導する際にrhIL-1を同時にin vivo投与した。すると、IL-1投与によって確かにIL-4産生ヘルパーT細胞のアナジー誘導が阻害されることが証明された。この結果、炎症に伴って産生されるIL-1が、high zone toleranceを阻害することにより自己免疫病を引き起こす可能性を有することが示唆された(論文投稿中)。
日常生活度分類による医療処置を伴う在宅療養患者の寝たきり予防法の開発

1.目的:医療処置を伴う在宅療養患者、今回は特に在宅酸素療法(以下HOT)患者に焦点を当て、日常生活度分類(厚生省)を用いて在宅医療の拘束による寝たきり化の予防方策を検討する。2.方法:当院管理中の成人・老人HOT患者16例(男性9例56.3%、女性7例43.8%)に家庭訪問を各2回ずつ行い、酸素飽和度(以下Spo_2)測定・生活とQOL調査・聞き取り調査・観察等を行った。結果:1)対象の日常生活自立度-「ランクJJ」18.8%、「ランクJ-8」18.8%、「ランクJ-7」25.0%、「ランクA-6」12.5%、「ランクA-5」18.8%、「ランクB-4」6.3%で、「ランクC(寝たきり)」の者はいなかった。2)「ランクJJ・J」「ランクA・B」群間の比較-外出可能な「ランクJJ・J」群(N=10)と、寝たきり予備群の「ランクA・B」群(N=6)に分け、訪問時及びカルテから収集した全データをt検定及びX^2検定を用いて(有意水準5%未満)比較した。自立度がより低いことに関係した変数は「性別(女性)」、「日常生活での階段移動なし」、「Spo_2平均95.6%」、「日中Spo_290%以下の時間11%程度」、「握力低い」、「調査日歩数少ない」、「消費Cal少ない」、「体重少ない」、「Vcp2.17L」、「Hb12.3mg/dl」、「Ht36.9%」、「長生きできる可能性、余暇活動及び旅行能力の満足度が低い」、「仕事や職業の重要度が低い」、「幸福な老後に対する重要度が低い」ことであった。酸素使用時間や生活時間、家族構成などには差がみられなかった。考察:以上から、医療処置特に、酸素吸入を在宅で行う患者の寝たきりを防ぐ方策として、(1)身体的には、ヘモグロビン・体重を指標にした栄養状態の維持・低下予防の管理、肺活量・握力・一日歩行数を指標にした在宅での呼吸筋トレーニング及び肺理学療法の実施、酸素飽和度の低下を防ぐ動作方法の患者家族教育、(2)心理的には、HOT患者自身が幸福感をのもち前向きに過ごせるような援助、(3)社会的には、満足した余暇を過ごすための地域サービスシステム作りと遠方旅行時の酸素供給体制が特に重要であると示唆された。