hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
プランクトン・パラドックスに挑む：珪藻類の協働的な有機態窒素・リン利用機構の解明

海洋の主要基礎生産者である珪藻類は,必須栄養塩(窒素・リン)を巡り,種間で熾烈な競合を展開しているように見えながらも,実際には共存共栄を果たしている。この生態学の一般法則に矛盾する「プランクトン・パラドックス」の合理的説明を果たすため,本課題では,珪藻による種協働的な栄養塩利用について明らかにしようとした。その結果,いくつかの珪藻は有機態窒素/リンの一つ核酸を協働的に分解し,その結果,群集としての共存繁栄を図るのではないかと示唆された。これにより,「プランクトン・パラドックス」を合理的に説明可能な一つの新規現象が提唱された。海洋の主要基礎生産者である珪藻類は,必須栄養塩(窒素・リン)を巡り,種間で熾烈な競合を展開している。通常こうした競合の過程では,生態学の一般原則に従い,栄養塩利用能に勝る一部の限られた種が勝ち残り,他種を排除するものと考えられてきた。しかしながら実際の沿岸海水中では,きわめて多くの珪藻が共存を果たしている。この矛盾は半世紀前から「プランクトン・パラドックス」と呼ばれ,海洋生態学の大きな謎の一つとされてきた。研究代表者は,「様々な有機物と複雑に結合した窒素・リン原子を利用するには,複数の珪藻種が協働的に窒素・リンの切り出し(分解)を行う必要がある」という仮説を構築した。この仮説を検証するために,本課題では,複数種の珪藻の有機態窒素・リン分解能とその種間差異を明らかにする。今年度は,有機態の窒素/リン化合物を分解可能な海産珪藻を探索しようとした。本邦沿岸水中の植物プランクトン群集は,環境水中のリン酸塩が欠乏すると,核酸(DNA・RNA)・リン脂質の分解に不可欠な種々のフォスファターゼを産生することがわかった。プランクトン群集の中で優占した珪藻に焦点をあて,それらの培養株の有機態リン/窒素の利用能を調べたところ,いくつかの珪藻は,核酸は分解できないものの,核酸構成要素ヌクレオチドをリン源としてのみならず窒素源としても利用できることがわかった。一方で,他のいくつかの珪藻は,核酸を分解でき,それによって生ずる当該要素をリン源としては利用できるものの,窒素源としては利用できないこともわかった。これらをあわせると,珪藻種間において有機態リン/窒素の利用能は大きく異なると考えられる。これらの珪藻種が,有機物と複雑に結合した窒素・リン原子を利用するには,複数の珪藻種が協働的に窒素・リンの分解を行う必要があるのではないかと示唆される。これまで独自に得た知見に基づき代表者は「様々な有機物と複雑に結合した窒素・リン原子を利用するには,複数の珪藻種が協働的に窒素・リンの切り出し(分解)を行う必要がある」という仮説を構築した。最終年度は,窒素・リン原子が複雑に結合した有機窒素・リン化合物のうち「核酸」に焦点をあて,珪藻種による核酸利用能の詳細を明らかにしようとした。まず,核酸構成要素の利用活性評価系を新たに確立しようとした。ここでは,分光プレートリーダーを用いることで,核酸構成要素を高速・簡易に検出・定量可能な系を確立した。沿岸試料から,核酸の分解に関わるであろう各種フォスファターゼ活性とともに核酸構成要素の利用活性を検出することができた。しかし一方で,当初,協働利用すると考えられた珪藻種は,いずれも細胞形態が類似しており,それらの共存下では各種を区別して検出することができないと判断された。そこで,珪藻複数種の共存機構を実証するため,細胞形態の明らかに異なる珪藻培養株を確立することができた。研究期間全体を通じて,いくつかの珪藻の核酸分解・利用能は大きく異なることが判明した。これらは,核酸をはじめとする有機態窒素/リンを協働的に分解し,その結果,珪藻群集としての共存繁栄を図るのではないかと示唆される。目的としていた,有機態の窒素/リン化合物を分解可能な海産珪藻の探索に成功し,また,分解・利用能が全く異なる培養株を確立することができた。

これらにより本年度の実施予定課題を早期に達成し,次年度の課題達成に向けた重要材料を確保できたことから,本研究課題はおおむね順調に進行していると判断した。海洋環境微生物学珪藻の核酸分解・利用を詳細に解析可能な実験系を構築する。核酸の分解・利用能が異なる珪藻種を共培養し,有機態の窒素・リンの協働利用性をそれらの増殖に基づいて明らかにする。本年度の実施予定課題に取り組んだ結果,早期に目標をおおむね達成することができ,それによって当初計上していた基金に残が生じた。一方で,当初予定していた研究小課題を次年度に余裕をもって達成することを視野に入れ,今年度の基金残額については繰り越す必要があると判断した。予算は新たな実験器具の購入などに充てる予定である。
手術中に腫瘍の生化学情報をモニタリングするシステムの開発

本研究では各種生化学マーカーを同時に検出するsurface plasmon resonance(SPR)を応用したプローブ型バイオセンサーを開発し、これを腫瘍周辺に挿入することにより各種生化学マーカーを術中に迅速に検出するシステムの開発を目指した。開発したプローブ型バイオセンサーを用いて、腫瘍マーカーの一つであるC-reactiveprotein(CRP)の測定を行った。この結果、最小5μg/mlのCRPを測定できることが可能になった。また、悪性腫瘍細胞において濃度が高まっているグルコースを計測する手法の検討を行った。本センサープローブに応用可能な吸収極大波長を持つ呈色試薬を選択したところ、反応の中間体である過酸化水素の濃度を再現性良く定量できることがわかった。さらに、過酸化水素の定量範囲がグルコースの生体内濃度を計測するのに適していることもわかった。腫瘍周辺の酸化ストレスの指標となる8-ヒドロキシー2'-デオキシグアノシン(8-OHdG)に結合するDNAアプタマーの探索を行った。得られた24クローンのDNAアプタマーの配列解析を行ったところ、すべてのクローンに、8-OHdGとの結合に関与すると考えられる26塩基の共通配列が見出された。この共通配列をSPRセンサープローブと組み合わせることにより、腫瘍周辺の酸化ストレスの評価が可能と考えられる。センサープローブの空間上の位置と、手術中に撮影されたMRI画像との間の座標統合をおこなうシステムの操作を単純化する方法を検証した。具体的には、MRI受信コイルにハイブリッドマーカーを一体化した。ハイブリッドマーカーは空間位置計測とMRI造影剤を組み合わせた。ハイブリッドマーカーの設置場所を検討した結果、受信コイルから50mm以内とし、鉛直下方に対して4069度の角度に症例の80%が含まれることがわかった。本研究では腫瘍マーカーのタンパク質を特異的かつ迅速に測定するための、抗腫瘍マーカー抗体を利用したバイオセンサーの開発を行なっている。表面プラズモン共鳴(Surface Plasmon Resonance : SPR)現象を利用した方法は、被測定物質の標識を必要としないため、腫瘍周辺の生化学マーカーの直接モニタリングに最適である。我々の研究グループではすでに、光ファイバーと微小なグラスロッドを組み合わせたSPRプローブを用いたバイオセンサーの開発に成功している。そこで今年度は、開発したSPRプローブを用いたバイオセンサーの高感度化の検討を行った。高感度化の方法は次ぎの2つについて検討した。(1)SPRに伴う光の吸収スペクトルの半値幅をより小さくし、安定した光信号を得ることで、装置のS/N比を向上させる、(2)装置内に偏光板を挿入し、吸収スペクトルの吸収極大を強くし安定したスペクトルを得る。上記(1)を達成するために微小センサープローブの再設計を行った。具体的には、従来直径3mm、長さ15mmであったセンサープローブを、直径1.5mm、長さ50mmのセンサープローブとした。直径を小さくすることで、より平行化された光のみをセンサー面に入射でき、また長くすることで迷光を除去できると考えた。この再設計によって、従来スペクトルの半値幅が約100nmであったのに対し、約60nmに改善された。上記(2)を達成するために、装置内に偏光板を挿入した光学系の設計を行なった。ここで設計した光学装置と、先の改良後のセンサープローブを用いてSPR吸収のスペクトルを測定したところ、吸収極大が2倍以上に改善された。以上の改良をあわせて、開発したSPRプローブの測定感度の評価を行なった。この結果、改良前に比較し約10倍程度の感度上昇が確認できた。昨年度に引き続きSPRプローブ型バイオセンサーの高感度化及び応用のための検討を主に行った。高感度化では屈折率分解能1×10^<-5>を目標の測定感度とした。

まず、最適なセンサープローブ形状をコンピューターシュミレーションにより設計した。最適な光の入射角度を68度と求め、センサープローブを作製した。次にセンサープローブからの反射光の検出方法を検討した。目標とする測定感度を得るには、0.04nm以下の波長分解能が必要であった。現状のシステムでは0.04nmの分解能の安定な取得は困難であると考え、今年度は光源に波長670nmのレーザーダイオードを使用し、検出器からの電気信号を増幅器で増幅して測定した。上記2つの検討を基に開発したプローブ型SPRセンサーの測定感度を評価した結果、屈折率分解能が1.3×10^<-5>となり、ほぼ目標の値が達成された。続いて作製したプローブ型SPRセンサーを用いてタンパク質の相互作用を測定した。モデルタンパク質としてウシ血清アルブミン(BSA)をセンサー表面に固定化し、抗BSA抗体を測定した結果、抗BSA抗体を50ng/mlの検出下限で測定できることがわかった。一方、SPRプローブ型バイオセンサーの先端位置と腫瘍の画像情報を位置合わせするための器具について検討を進めた。システムの要素であるハイブリッドマーカは磁気共鳴画像法(MRI)の造影剤と光学式位置計測装置用の反射膜の2層構造となっている。臨床使用において問題となるハイブリッドマーカの固定、反射膜の血液による汚染を回避するため、MRI撮影用コイルとマーカーを一体型にした。新しい器具の形状を明確にするため、過去の脳腫瘍摘出手術の臨床データ62例から開頭範囲の大きさや水平からの角度を求めた。その結果、大きさは15cm、MRI撮影用コイルとの角度は90140度の範囲にあれば80%の例に対応可能であることがわかった。昨年度10倍の高感度化に成功したSPRセンサープローブを用いて、腫瘍マーカーの1つであるC reactive protein(CRP)の測定を行った。実験では、抗CRPポリクローナル抗体をアミンカップリング法によりセンサープローブ表面に固定化した。この結果、1.3ng/mm^2の抗体を固定化することができた。つぎにこのセンサープローブを用いてCRPの測定を行った。この結果、最小5μg/mlのCRPを測定できることが可能になった。また、悪性腫瘍細胞において濃度が高まっているグルコースを計測する手法の基礎検討を行った。この手法は吸光度の変化を反射率の変化として捉えるもので、本センサープローブに応用可能な吸収極大波長を持つ呈色試薬を選択したところ、反応の中間体である過酸化水素の濃度を再現性良く定量できることがわかった。さらに、過酸化水素の定量範囲がグルコースの生体内濃度を計測するのに適していることもわかった。腫瘍周辺の酸化ストレスの指標となる8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシン(8-OHdG)に結合するDNAアプタマーの探索を行った。
骨格筋間質由来幹細胞を用いた自家細胞移植による尿道機能再建

本研究は骨格筋間質由来幹細胞の持つ、筋肉・血管系・末梢神経系細胞への分化能及びその再構築能を根治的前立腺全摘除術々後合併症である尿道括約筋及びその周囲に存在する神経血管束の損傷回復に利用する、即ち、自己の体性幹細胞移植治療で再生さようとするプロジェクトである。本年度はマウスを用いた基礎細胞生物学的実験及びトランスレーショナルな実験を行った。前者においては、これまでのCD34+/CD45-(Sk-34)細胞に関する報告に加え、CD34-/CD45-(Sk-DN)細胞の多分化能に関する報告を行った。即ち、Sk-DN細胞もSk-34細胞同様に筋肉・血管系・末梢神経系細胞への分化能を持ち、それら損傷組織を活発に再構築し、有意な機能回復を助長することを報告した(発表論文1,2)。また、実際にヌードラットの尿道・神経血管束損傷モデルを作成し、GFP-Tgマウス骨格筋から得たSk-34、Sk-DN細胞を移植、その組織再構築能と機能回復に対する貢献度を検討した。その結果、移植細胞は損傷した尿道周囲の括約筋群を再構築すると同時に、尿道壁及び周囲の血管、さらに周辺断裂神経のミエリン再構築を行った。加えて、in situの電気刺激を用いた尿道括約筋の収縮能を検討したところ、細胞移植群で飛躍的な回復(80%、対照群は40%)が示されたことを報告した(発表論文3)。これらの成果は、骨格筋間質由来多能性幹細胞が生体内で揚所を変えても(骨格筋内から尿道周囲)筋肉・血管・末梢神経をユニットとして再構築できる細胞であることを示していると同時に、自家細胞移植治療の細胞ソースとして、根治的前立腺全摘除術々後合併症である尿道括約筋及びその周囲に存在する神経血管束の損傷回復に利用できる体性幹細胞であることを示しており、今後臨床応用に向けて期待が持たれる。
記憶学習において働くインスリンシグナル伝達の時空間的動態の解明

これまでの研究から、線虫の示す飢餓と化学物質とを結びつけて記憶する学習(飢餓学習)には外界の化学物質を受容する感覚神経におけるインスリンシグナル伝達経路の働きが重要であることが示唆されていた。本研究により、線虫の感覚神経内の異なる部位(細胞体と軸索)では異なるインスリン経路が協調的に働き、それらの間のクロストークが記憶の形成に必要であることが明らかになった。学習記憶の異なる過程において働くインスリン様ペプチドの同定、シナプス部位において記憶の呼び出しに関わる可能性があるユビキチンシステムの同定により、学習記憶をダイナミックに制御するインスリン経路の制御機構の一端が明らかになった。本研究の目的は、線虫C. elegansの神経系において記憶学習の各過程(獲得・保持・想起)で働くインスリンシグナル伝達の動態を明らかにすることである。線虫には約40個のインスリン様ペプチドをコードする遺伝子が存在するが、その中で記憶の想起において重要な働きをする分子として、INS-1を同定している。記憶の想起の際のINS-1の放出パターン、及びINS-1放出に依存した運動パターンの変化を調べる予備実験として、記憶学習時にINS-1の放出が起こる細胞の確認を行った。過去に我々は感覚神経との間に相互にシナプス結合をもつ介在神経からのINS-1の放出が記憶学習において重要であることを報告している。今回、本研究で行う記憶学習パラダイムにおいても、過去に同定した介在神経からのINS-1の放出が重要であるという結果を得た。過去の研究で、C. elegansのインスリン受容体のアイソフォームのうち、特定のアイソフォームのみ記憶・学習を制御できることを明らかにしている。このアイソフォームは選択的スプライシングにより作られる。今回、記憶・学習に必要なアイソフォームの生成が条件付けにより変化する可能性を検討した。その結果、条件付けに依存したインスリン受容体の選択的スプライシングの変化は観察されなかった。逆遺伝学的スクリーニングにより、記憶学習において働くPI3キナーゼ/AKT経路の下流因子の候補遺伝子を同定し、細胞特異的レスキュー実験によりこの遺伝子は神経系で働くことを明らかにした。線虫C. elegansは、飢餓情報と環境に含まれる化学物質の情報を統合し飢餓を経験した環境を避けるという学習行動(飢餓学習)を示す。この学習行動にインスリン/PI3キナーゼ経路が必要であることが明らかになっていた。本研究では、インスリン経路の記憶学習の各過程(獲得・保持・想起)における動態を詳細に明らかにすることを目的とした。まず、餌の有無に依存して発現量の変化する8種のインスリン様ペプチドが餌の情報を神経系へと伝える役割をもつ可能性を検証した。餌により発現上昇の見られる2種のペプチドを過剰発現させたところ、飢餓時に起こる行動パターンに異常が見られた。更に、そのうち1種のペプチドの変異体においては、満腹時に起こる行動パターンに異常が見られた。以上の結果より、餌の情報を伝え、行動パターンを切り替えるために必要な新規インスリン様ペプチドが明らかになった。一方、これまでの研究から、インスリン様ペプチドINS-1は、餌に依存した発現量変化を示さないが飢餓学習には必要であることが明らかになっていた。INS-1を飢餓条件付け時、若しくは条件付け後の行動時(記憶の読み出し時)に選択的に分泌させたところ、行動時のINS-1の分泌により飢餓条件付け後に特徴的な行動パターンが誘導された。従って、記憶の形成時と読み出し時で異なるインスリン様ペプチドにより学習行動が制御されるというモデルが示唆された。飢餓学習において、インスリン受容体/PI3キナーゼ経路は化学物質を受容する感覚神経で働く。遺伝学的スクリーニングにより、この経路の下流で働く候補分子を同定した。すなわち、神経で発現するE3ユビキチンリガーゼによる神経機能の調節がインスリン受容体/PI3キナーゼ経路に依存した飢餓学習において働く可能性が示唆された。学習記憶の過程(記憶の獲得→保持→想起)においてインスリン経路が神経細胞の働きを制御する仕組みを明らかにするために、線虫の飢餓学習に注目した。これは、飢餓環境下で経験した化学物質を記憶し、その化学物質を忌避するようになる現象である。・記憶の獲得・保持に関わる機構:本研究により、インスリン経路により機能調節をうけるDAF-16(FOXO型転写因子)は飢餓学習に異常を示すことが明らかになった。さらに、DAF-16は飢餓条件付けに依存して神経細胞の細胞質から核内に移行しインスリン受容体の選択的スプライシングや軸索輸送を制御する可能性が示唆された。この機構は、飢餓を経験した記憶の獲得や保持に関わると考えられる。・記憶の想起に関わる機構:飢餓条件付けにより発現変動するインスリン様ペプチド遺伝子を3種類同定した。それらのうちの1種類は既に飢餓学習に関わることが明らかになっていたINS-1をコードする遺伝子である。飢餓学習において、INS-1を記憶の想起時に分泌させることで飢餓時に経験した化学物質を避ける行動が引き起こされた。一方、INS-1を記憶の獲得時に分泌させると飢餓記憶の形成を阻害した。以上より、INS-1を含むインスリン様ペプチドは飢餓条件付け時に発現が変動し、適切な量のインスリン様ペプチドが記憶の想起時に分泌されていることが飢餓学習に必要であるといえる。記憶の想起の際にはINS-1の分泌に加えてシナプス部位で働くインスリン受容体の働きが必要である。しかし、シナプス部位でインスリン受容体が飢餓学習を制御する詳細な機構は不明である。本研究では、遺伝学的スクリーニング等を用いることによりインスリン経路の下流で機能する分子の解析を行った。

その結果、インスリン経路が主導する飢餓学習には複数種のE3ユビキチンリガーゼの働きが必要である可能性が明らかになった。これまでの研究から、線虫の示す飢餓と化学物質とを結びつけて記憶する学習(飢餓学習)には外界の化学物質を受容する感覚神経におけるインスリンシグナル伝達経路の働きが重要であることが示唆されていた。本研究により、線虫の感覚神経内の異なる部位(細胞体と軸索)では異なるインスリン経路が協調的に働き、それらの間のクロストークが記憶の形成に必要であることが明らかになった。学習記憶の異なる過程において働くインスリン様ペプチドの同定、シナプス部位において記憶の呼び出しに関わる可能性があるユビキチンシステムの同定により、学習記憶をダイナミックに制御するインスリン経路の制御機構の一端が明らかになった。本研究課題は、線虫の示す学習行動において、インスリン経路が記憶学習の各過程(獲得・保持・想起)においてどのような働きをするのかを明らかにすることを目的としている。現在までに、記憶の獲得及び想起に関わることが予想される新規分子を同定し、それらによるインスリン経路に依存した学習行動の制御モデルが明らかになりつつある。今後の研究の推進により、記憶学習の際に働くインスリン経路の時空間的動態が明らかになる見通しがついた。分子遺伝学飢餓経験を外部環境と結び付けて記憶する学習(飢餓学習)に必要であることが明らかになった新規インスリン様ペプチドが学習の成立に必要な飢餓の情報を神経系へと伝える可能性、及びその仕組みを検証し、複数種のインスリン様ペプチドによる飢餓学習の制御モデルを確立する。飢餓学習においてインスリン受容体/PI3キナーゼ経路を介して働く可能性が示唆されたE3ユビキチンリガーゼが機能する神経細胞及び神経機能調節機構を明らかにし、神経可塑性を制御する新たな分子機構を確立する。交付申請書に記載した内容と同様の研究が他のグループから報告されたことから一部研究計画を変更したが、変更した計画に従って概ね順調に研究結果を得ている。平成2526年度にかけて実施した線虫を用いた行動解析により、飢餓学習に関わるインスリン様ペプチド遺伝子を同定した。これらの遺伝子の飢餓条件下における発現パターンの変化を既存の形質転換線虫を用いて行ったが、過去の知見に反して大きな発現変動は観察されなかった。そのため、計画を変更して発現変動を観察しやすい形質転換体を作成し遺伝子発現変動の解析を行うこととしたため未使用額が生じた。研究計画に従い以下のことを明らかにする。C. elegansの神経系において記憶の獲得及び保持に働くインスリン様ペプチドを同定する。記憶の想起の際に働くINS-1の動態、及び役割について明らかにする。本年度同定したPI3K/AKT経路の下流で働くことが予測される分子について、記憶のどの過程において働くのか、記憶学習の際の分子の挙動などを明らかにする。
少子高齢社会におけるディジーズ・マネージメントの国際比較研究

患者の自己管理能力の向上策としては、北米では、個々の患者の特徴を重視、電話で看護師に相談できる体制、アクションプランによる急性悪化への早期対処など、豪州は北米型だが、知識拡大の支援、患者教育の地域化・在宅化を推進、アジアでは退院指導、手技の教育、疾病管理の構造化の開発段階であった。看護師はチーム連携医療のなかで、他職種間の調整、患者への教育的な介入、フォローアップで重要な役割を担っていた。<目的>各国のディジーズ・マネージメントの実態を調査し、慢性疾患など長期対応の必要な患者に対して、家族や社会、医療コミュニティが一団となって取り組むケア提供方法について検討する。また、ディジーズ・マネージメントの先進国である米国と他国との相違点や、独自のケア提供モデルについても調査検討する。<方法>本年度は、ディジーズ・マネージメントの実態調査に向けての準備として、国内外の実践報告や学術書、先行研究者からの情報収集、収集するデータの検討、事前調査を行った。各国において、ディジーズ・マネージメントの取り組みを行っている医療機関や大学(医学部・看護学部)、行政機関などと連絡をとり、研究協力の要請を行い、研究協力者との連携の下、事前調査を実施した。調査内容は、ディジーズ・マネージメントを行う組織や対象者、プログラム編成や責任者、患者教育のカリキュラムやスタッフ教育、アウトカム指標などであり、ディジーズ・マネージメントの構造や機能について幅広く研究協力者にインタビューを行った。<結果>事前調査は、海外では米国(カリフォルニア州、コロラド州)、豪州、韓国、タイでそれぞれ実施した。各国の主要な施設に赴き、ディジーズ・マネージメントに従事している専門看護師、医師等にインタビューを行った。国内では、福岡県のリハビリテーション施設において、地域連携を行っている担当者にその地域で行われているケア提供システムの実態についてインタビューを行った。その結果、各国のディジーズ・マネージメントを行っている組織の特徴や対象者、ケア提供システムなど、全般的な大きな枠組みを捉えることができたところである。<検討>次年度は、事前調査に基づき、より詳細なディジーズ・マネージメントの展開方法、現時点での効果についても調査対象国を追加して明らかにして予定である。<目的>諸外国でのディジーズ・マネージメントの実態を調査し、慢性疾患など長期療養を必要とする人へのケア提供方法、対策について検討する。調査内容:(1)Chest Instituteでは、慢性呼吸器疾患外来で、医師を総括とする看護師、栄養士、理学療法士による地域連携システムを用いた慢性疾患の急性増悪予防プログラムの機能状況、(2)St George病院では,英国独自の医療政策による患者費用負担の少ない医療内容と増加する糖尿病患者の看護師による外来指導(Walk-in Clinic)、訪問サービスの実状、(3)ドイツでは老人福祉とケア、神経障害に伴うリハビリテーション機器の開発、助産師活動の実際。<成果>慢性疾患管理は各国の医療制度に基づいた疾病管理プログラムとそれに必要な医療職種が活用または訓練されていた。地域連携が重視され、中核病院と地域医と看護師の役割分担、地域で患者を看る構造が築かれつつある状況であった。また看護職の職域拡大の傾向がみえた。これらは、先進諸国に共通し、患者の慢性疾患自己管理能力を促進する方法を見出す試みであり、米国発の疾病管理モデルを国情に合わせ適用する努力過程といえる。老人ケア、助産活動では福祉政策見直し、出産時からの家族支援が検討されていた。<目的>米国の糖尿病ディジーズ・マネージメントの情報把握のために、ミシガン大学附置のMichigan Diabetes Research and Training Center(MDRTC)での取組みを視察する。これら情報に基づき、糖尿病ディジーズ・マネージメントの特にフォローアップについて検討する。<方法> MDRTCの取組みについては、看護師で糖尿病療養指導士であるMs. Funnellの行う、協会や地域のコミュニティーセンター、MDRCT内での糖尿病教室に参加した。特に、糖尿病患者のフォローアップ検討のために、従来の講義形式の教室とエンパワーメント概念による教室の両方に参加した。<結果>ミシガン州の低所得層黒人社会におけるディジーズ・マネージメントは、治療継続の動機づけを高めるためのフォローアップ体制の構築過程にみることができた。協会での糖尿病教室は、協会が住民の集会所であり、患者の集合を助けていた。知識豊富から初期レベルまでの様々な患者を、2名程度のリーダー格患者が先導する患者主体の教室であった。教室には2名の看護師ファシリテータが参加するが、ほぼ発言はなく、患者自らが語る糖尿病生活を傾聴する姿勢であった。また、糖尿病患者自身を教室のトレーナーとする取組みが実行に移されていた。患者.トレーナーはエンパワーメントによる指導法を療養指導士より訓練され、インスリン管理、運動・食事療法の患者主体での維持を実地訓練で学んでいた。中流所得層白人は従来型の講義形式の教室に参加、その質問内容から低所得層に比べ治療動機づけが高かった。<検討>治療動機の低い患者の治療継続を阻む要因は、治療者主体のアプローチでは解明は困難である。

患者のコミュニティーに看護師が入り、患者自身を糖尿病教室の指導者とするなど、患者自身と医療者双方によるフォローアップ共同体制が解明へのステップとなる可能性がある。
虚血再灌流性末梢神経傷害の局所低体温療法による保護効果に関する研究

低体温療法の虚血再灌流性末梢神経傷害に対する保護効果については,これまでの実験成績から,時間内に28°Cの局所低体温を導入すると、十分な神経保護効果が認められることをあきらかにしてきたが,再灌流時の局所低体温では,ある程度の神経保護効果を認めるものの,虚血時間内の低体温療法に比べると,その保護効果は不十分であった.本研究では,再灌流時の局所低体温療法を長時間(6時間以上)施行することにより,その保護効果を検討することを目的とした.まず,従来のモデル同様3時間虚血のモデルにおいて,再灌流後,28°Cの局所低体温を0時間,3時間,6時間,9時間施行し,各群での保護効果を比較検討した.その結果,3時間,6時間の局所低体温では,電気生理学的指標,病理学的指標のいずれでも,有意の保護効果を得られなかった.さらに9時間の局所低体温群では,実験終了後,1週間の死亡率が高く十分な比較検討ができなかった.次に6時間の局所低体温群において,24°C,20°Cとさらに低体温を試みたが,24°Cでは,有意な改善はなく,20°C群では死亡率が高く十分な検討ができなかった.上記のように再灌流時の局所低体温療法は,長時間に及ぶ場合あるいは極端な低体温の場合は全身的に無視できない合併症を引き起こす可能性が示唆された.再灌流時の低体温療法は,実際の臨床応用となると問題があると考えられる.現在,低体温療法によらない神経保護療法として,再灌流時の炎症細胞の作用を抑制する目的で,免疫抑制剤による治療を考えている.そのの根拠として,我々はこれまでに,虚血再灌流性末梢神経障害において,再灌流時に炎症性サイトカイン(IL-1,TNF-α)のmRNA発現が増加することを報告した.これらの知見は免疫抑制剤,抗炎症療法の臨床応用への可能性を示しており今後の研究課題としたい.本研究は虚血再灌流性末梢神経障害に対する低体温療法の保護効果を検討する目的で行われている.これまでの研究において,虚血時間中に施行する低体温療法の神経保護効果は確立されているが,再灌流中の低体温,特に長時間の低体温療法については,十分な検討がなされていない.この目的に沿って,本年度は,以下のように研究を進めた.1.虚血再灌流性末梢神経障害モデルの再確立従来,本実験系において用いていた3時間および5時間虚血のモデルについて,その再現性を,電気生理学的,病理学的に確認した.さらにそれよりも短時間の2時間虚血においても,より軽度ではあるが,同様の所見が認められることを確認した.2.様々な虚血時間における神経障害の程度と低体温療法の効果予備的に若干数のラットを用いて,3時間虚血,5時間虚血のモデルにおいて,虚再灌流時間中,各々3時間,6時間の局所低体温療法を施行したが,3時間,5時間虚血群ともに3時間,6時間の低体温療法では,十分な神経保護効果は認められなかった.3時間,5時間の虚血では侵襲が強すぎるために不可逆的な変化に陥っている可能性があるので,現在,2時間虚血の比較的経度の障害を来すモデル動において,再灌流時の局所低体温療法の効果を検討している.一方,3時間および5時間虚血モデルにおいて,9時間,12時間の長時間の低体温療法の効果についても検討している.ただし,長時間の局所低体温を施した場合,実験動物の死亡率が高いため,十分数の検討は実施できていない.低体温の方法などに工夫が必要であるかもしれない.次年度は,神経保護効果を確認するための適切の虚血時間,侵襲の程度の設定,再灌流時の低体温を施す時間の安全な領域の設定に主眼をおいて研究を進める予定である.低体温療法の虚血再灌流性末梢神経傷害に対する保護効果については,これまでの実験成績から,時間内に28°Cの局所低体温を導入すると、十分な神経保護効果が認められることをあきらかにしてきたが,再灌流時の局所低体温では,ある程度の神経保護効果を認めるものの,虚血時間内の低体温療法に比べると,その保護効果は不十分であった.本研究では,再灌流時の局所低体温療法を長時間(6時間以上)施行することにより,その保護効果を検討することを目的とした.まず,従来のモデル同様3時間虚血のモデルにおいて,再灌流後,28°Cの局所低体温を0時間,3時間,6時間,9時間施行し,各群での保護効果を比較検討した.その結果,3時間,6時間の局所低体温では,電気生理学的指標,病理学的指標のいずれでも,有意の保護効果を得られなかった.さらに9時間の局所低体温群では,実験終了後,1週間の死亡率が高く十分な比較検討ができなかった.次に6時間の局所低体温群において,24°C,20°Cとさらに低体温を試みたが,24°Cでは,有意な改善はなく,20°C群では死亡率が高く十分な検討ができなかった.

上記のように再灌流時の局所低体温療法は,長時間に及ぶ場合あるいは極端な低体温の場合は全身的に無視できない合併症を引き起こす可能性が示唆された.再灌流時の低体温療法は,実際の臨床応用となると問題があると考えられる.現在,低体温療法によらない神経保護療法として,再灌流時の炎症細胞の作用を抑制する目的で,免疫抑制剤による治療を考えている.そのの根拠として,我々はこれまでに,虚血再灌流性末梢神経障害において,再灌流時に炎症性サイトカイン(IL-1,TNF-α)のmRNA発現が増加することを報告した.これらの知見は免疫抑制剤,抗炎症療法の臨床応用への可能性を示しており今後の研究課題としたい.
C型肝炎ウイルス表面抗原超可変領域に対するキラーT細胞の誘導ワクチンの開発

C型肝炎ウイルスの表面抗原超可変領域HVR1は中和抗体の標的と考えられている。患者由来および既報のC型肝炎ウイルスの表面抗原超可変領域をカバーするアミノ酸配列に基づく合成ペプチソの作製と精製を行った。また、野性型vaccinia birusへのTk遺伝子相同置換による挿入によるHVR1抗原発現遺伝子組換え型Vacciniavirusの作製を行った。T細胞のHVR1の認識とその抗体反応性の役割を検討するため作製したVaccinia virusで免疫したMHC遺伝子のことなるH-2d,H-2b,H-2kの3種類のMHCタイプのマウスの脾細胞や、種々のHLA遺伝子型の慢性C型肝炎患者由来の末梢血リンパ球を用いて、私どもはHVR1に特異的なヘルパーT細胞を作製することを試みた。マウスとヒトの両者においてHVR1は複数のクラスIIMHC分子によってHVR1特異的CD4+ヘルパーT細胞に抗原提示されていた、また、おどろくことに株間の交差反応を示した。HVR1特異的CD4+ヘルパー細胞はほとんどの患者で、抗原であるHVR1のエピトープ特異的のにインターロイキン2を産生していた。HLA DR4養成の2人の患者の同エピトープはDR4結合モチーフを含むことより保存されたC末端の配列にマップされ、おそらくこのことが株間の交差反応生を説明している。顕著なこととして、全ての患者が表面抗原に対する抗体を保有しているにしても、患者自身のHVR1のアミノ酸配列にたいする抗体の反応はHVR1へのT細胞の応答をみた患者にのみみられた。従って、HVR1に特異的なT細胞は機能的にHCVに対する中和抗体を誘導することにおいて重要であるかもしれない。これらの結果は、ヘルパーT細胞エピトープがヒトの疾患の発症における抗体のエピトープの特異性を決定しているT細胞-B細胞の相互関係状態のはじめての例であるかもしれない。患者由来および既報のC型肝炎ウイルスの表面抗原超可変領域をカバーするアミノ酸配列(30株以上)に基づく合成ペプチドの作製と精製を行った。また、同部位を含む領域をコードするcDNAの作製とそれを挿入した発現プラスミドベクターの作製と、野性型vaccinia virusへのTk遺伝子相同置換による挿入によるHCV抗原発現遺伝子組換え型Vacciniavirusの作製を行った。作製したVaccinia virusで免疫したマウス脾細胞やいろいろなstageのHCV感染患者より採取した末梢血リンパ球を用いた抗原ペプチド特異的T細胞の増殖、サイトカインの産生、キラーT細胞活性の検索を行った。その結果、C型肝炎ウイルスの表面抗原超可変領域内のTHVTGGRVASSTQSLに対してH-2b由来のT細胞、GRVASSTQSLVSWLSに対してH-2b由来のT細胞、WLSQGPSQKIQLVNTに対してHLA-DR4陽性慢性C型肝炎患者より採取した末梢血のT細胞が特異的増殖反応を起し、interleukin-2を産生していることが解明できた。このようにC型肝炎ウイルスの表面抗原超可変領域内には、異なるハプロタイプ、HLAにより制御されているT細胞が認識するエピトープが密在していることが判明した。次年度では、エピトープ相当部位のアミノ酸配列の構造解析、側鎖の性質(aliphatic,aromatic、charge,polarityなど)、高次構造、MHC(HLA)のペプチド結合floorにおける各ポケットとの結合様式(必要エネルギー等も)の解析などを行うとともに、T細胞レセプターやMHCへの結合強度を検討して、構造解析の理論の実験的裏付けを行う。

また、株間で保存された部位は残して、株間で高頻度に異なる部位のアミノ酸の共通の性質(側鎖の性質等上記の検討項目)を見い出し、広く交差反応(MHCまたはT細胞レセプター[TCR]認識のdegeneracy)を起こし得るアミノ酸によってエピトープのアミノ酸配列の1から数残基を置換し検討する。誘導されたT細胞のCD4、CD8の陽性の如何、抗原提示しているHLA分子の決定、Precursorの頻度、ペプチドの量依存性、等の詳細を検討を行う。患者血清を用いたELISAテストによりそれら合成したペプチドへの抗体反応(Titer,サブクラス等)を解析する。C型肝炎ウイルスの表面抗原超可変領域HVR1は中和抗体の標的とかんがえられている。ヘルパーT細胞のHVR1の認識とその抗体反応性の役割を検討するため、MHC遺伝子のことなるH-2d,H-2b,H-2kの3種類のMHCタイプのマウスにおいて、また種々のHLA遺伝子型の慢性C型肝炎患者由来の末梢血リンパ球をもちいて、私どもはHVR1に特異的なヘルパーT細胞を作製することを試みた。マウスとヒトの両者においてHVR1は複数のクラスIIMHC分子によってHVR1特異的CD4+ヘルパーT細胞抗原提示されていた、また、おどろくことに株間の交差反応を示した。HVR1特異的CD4+ヘルパーT細胞はほとんどの患者で、抗原であるHVR1のエピトープ特異的のにインターロイキン2を産生していた。HLA DR4陽性の2人の患者の同エピトープはDR4結合モチーフを含むより保存されたC末端の配列にマップされ、おそらくこのことが株間の交差反応性を説明している。顕著なこととして、全ての患者が表面抗原に対する抗体を保有しているにしても、患者自身のHVR1のアミノ酸配列にたいする抗体の反応は、HVR1のT細胞の応答をみた患者にのみみられた。従って、HVR1に特異的なT細胞は機能的にHCVに対する中和抗体を誘導することにおいて重要であるかもしれない。これらの結果は、ヘルパーT細胞エピトープがヒトの疾患の発症における抗体のエピトープの特異性を決定しているT細胞-B細胞の相互関係状態のはじめての例であるかもしれない。
肝癌発症予防を目的とした肝癌関連分子MICAの小分子核酸による発現制御法の開発

当研究者らは、ゲノムワイドアソシエーションスタディ(GWAS)解析で、1394例のC型肝炎罹患者と5486例の非感染者のサンプルを用いてC型肝炎感染から肝臓癌を発生しやすい宿主因子としてMICA遺伝子の上流に位置するSNPを同定し報告した(Nat Genet. 2011)。本研究ではmicroRNA25-106クラスターに由来するmicroRNAがMICA遺伝子の発現量を負に制御しうることを同定した。また、CRISPR-Cas9系を用いてCas9にVP16の転写活性化ドメインを融合した蛋白を用いた遺伝子編集手法の応用によってMICA遺伝子座からの転写を10倍以上高めることに成功した。以前に、肝癌発症のしやすさを規定する遺伝因子を同定するためのゲノムワイドアソシエーションスタディ(GWAS)解析で、1394例のC型肝炎罹患者と5486例の非感染者のサンプルを用いてC型肝炎感染から肝臓癌を発生しやすい宿主因子としてMICA遺伝子の上流に位置するSNPを同定した(Nat Genet. 2011)。この研究では、肝癌発症規定遺伝子MICAのSNPのrisk alleleを持つC型肝炎感染者は血清で測定したMICA蛋白の発現量が少ないことを報告している。すなわち、MICAは本来、C型肝炎ウイルス感染細胞あるいは肝癌のfociに高度に発現し、natural killer細胞やCD8+T細胞のレセプター(NKG2D)を活性化して感染細胞あるいは癌細胞の排除に向かわせる役割を担っていると考えられているリガンドであるものの、risk alleleを持つ人はこの発現が低くなることで感染細胞あるいは肝癌fociの排除が不全となり、結果的に肝臓癌を発症しやすくなっていると考えられた。従って、MICA蛋白の発現量を感染肝細胞で制御することは、ウイルス排除ひいては肝癌発症の抑制にもつながると思われた。MICA蛋白発現量の調節は、プロモーター活性に依存するだけでなく、転写後調節も大きく関与していることが知られていたので、今回は、肝癌発症感受性遺伝子MICAを機能的に標的としうるmicroRNAをスクリーニングし、MICA蛋白の発現を制御しているmicroRNAとしてmiR93-106bを同定した。それに対応するantisense分子の導入などにより、MICAタンパクの発現量が直接制御可能であることを示した。臨床的に肝癌は発症の高危険群が設定しやすい癌であるが、本申請では、これまで申請者らがゲノムワイドアソシエーションスタディ(GWAS)で同定した肝癌発症感受性遺伝子MICAの発現を制御することにより高危険群からの肝癌発症を予防する方法を開発する。MICA遺伝子の一塩基多型に対応する血清MICAタンパクの多寡が、慢性C型肝炎からの肝癌発症に関与することを我々は報告したが、その後の解析によってMICAタンパクの発現量は、転写後調節に大きく依存していることを確認している。小分子RNAによる治療が臨床試験に成功しつつある現在、本研究ではMICAタンパクの発現を制御しうるmiRNAをスクリーニングによって同定し、それに対応する小分子核酸を発現する遺伝子改変動物を駆使して小分子核酸の導入による肝癌発症の予防効果を検討する。今年度はMICAの翻訳後修飾を司る因子の同定と制御を目的に、特にMICAの切断と分泌を阻害する化合物をスクリーニングするべく、N端にnano-luciferaseを付けた癒合タンパクを発現する系を確立し、細胞外分泌機構を阻害する化合物をスクリーニングできる簡便な系を開発した。その系を用いて1000種類を超える化合物をスクリーニングしたところ、数個の化合物がMICAの切断を阻害することを同定した。このように、MICA蛋白の発現量の増大とともに細胞表面表出MICA量の増大を達成することがここまででできるようになったので、今後は1)癌細胞にMICA蛋白を発現増加させる核酸とMICAの切断阻害薬を共に添加することによるMICA蛋白の癌細胞表面の発現量の増大と、そこにヒトMK細胞を添加することによるNK細胞による癌細胞障害活性の増加の検証をしていきたいと考えている。MICAの発現調節に加えて、今年度は蛋白発現後の修飾・切断について介入する方法をスクリーニングできる系を確立し、実際にいくつかの化合物を同定できた。そこで今年度はゲノム編集の手法を用いてMICApromoter領域にCas9と融合した転写活性化因子を近づけることでMICAの転写を増やすことができないかを検討し、至適条件を決定し実際に蛋白量の増加をさせることに成功した。これにより、コンストラクトの導入という難点はあるが、自在にMICAの転写量は制御できる可能性が開かれ、自然面系系を介した発癌予防・治療のひとつの方策になる可能性が示された。

本研究ではmicroRNA25-106クラスターに由来するmicroRNAがMICA遺伝子の発現量を負に制御しうることを同定した。また、CRISPR-Cas9系を用いてCas9にVP16の転写活性化ドメインを融合した蛋白を用いた遺伝子編集手法の応用によってMICA遺伝子座からの転写を10倍以上高めることに成功した。当初の計画では同定したmicroRNAのトランスジェニックマウスの作製まで踏み込む計画だったが、実際にはmicroRNAの同定までにとどまった。MICA蛋白量の調整は同定したmicroRNAで可能であるが、動物モデルを作製する前に、その生物学的意義をもう少し検討する必要がある。癌細胞にMICA蛋白を発現増加させる核酸とMICAの切断阻害薬を共に添加することによるMICA蛋白の癌細胞表面の発現量の増大と、そこにヒトMK細胞を添加することによるNK細胞による癌細胞障害活性の増加の検証肝疾患の研究同定したmicroRNAあるいはそのアンチセンス核酸の作用をin vitroで検証し、実際にNK活性を上げるかどうか検討したうえで、肝癌発症予防のためのin vivo解析を目指した遺伝子改変マウスの作製にまで進むことを検討する。
光照射による蛋白質の選択的・特異的切断

1)強光照射に伴う光化学系IIの機能的、構造的変化FTIRで見たQ_Aセミキノンアニオン生成の阻害のタイムコースは酸素発生能の失活と良く一致しており、Q_Aの機能壊失が酸素発生能阻害の直接の原因であることが示された。D1蛋白質は光照射によりが選択的に損傷を受けた。2)Q_B部位への光化学系II阻害剤結合が光損傷に与える影響光合成阻害剤であるウレア・トリアジンとフェノール系阻害剤10数種について酸素発生能の失活、D1蛋白質の切断にあたえる影響を検討した。ウレア・トリアジン系阻害剤は酸素発生能の失活D1蛋白質の切断断片の生成を抑制した。一方、フェノール系阻害剤は失活を促進したが、D1蛋白質の切断断片の生成には影響を与えなかった。3)光化学系II阻害剤結合により誘導されるD1蛋白質の選択的切断フルオルグルシノール骨格を持つ1群の阻害剤によりD1蛋白質の切断が起こった。その中でPNO8(N-octyl-3-nitro-2,4,6-trihydroxy benzamide)について詳細な検討を行った。切断はQ_B部位に結合したPNO8により、D1蛋白質のdeループ中のロイシン258近傍1カ所で起こり、23、9kDa断片が生じる。切断は酸素の有無には影響されなかったが、低温条件やセリンタイプのプロテアーゼの阻害剤であるPMSFにより抑制された。以上の結果はPNO8の結合により引き起こされるQ_B部位近傍の構造変化が引き金となりD1蛋白質の切断が引き起こされることを強く示唆している。切断は完全暗黒下で進行するが、PNO8添加前に試料を短時間光照射すると著しい促進を受けた。前照射によりD1蛋白質に何らかの可逆的な標識付けが行われ、PNO8の結合は標識されたD1蛋白質のみに切断を誘導すると考えられた。PNO8による切断部位を明らかとするために、D1蛋白質の各部位の各部位に特異的に反応する抗体の作成を試みた。特に、Q_B-結合部位の各領域に特異性をもつ抗体の作成に重点をおいた。その結果、現在までの所、以下の領域に特異的に反応する、V58-E65、L326-E333、V58-P66、T227-E235、F239-N247、E333-A344、R225-E235の7種類の部位特異抗体を得ることに成功した。これらの抗体とPNO8処理により生じる切断断片との反応性、更に、小麦の系II膜断片をPNO8処理した場合、生じる切断断片がリジン残基特異的プロテアーゼ処理により受ける影響より、切断はLeu258近傍1箇所で起こり、その結果、23kDaN末端断片と9kDaC末端断片が生成すると結論した。2__-)様々のPNO8類縁化合物を合成し、構造/活性相関を調べた。フェノール環上の3つの水酸基がD1蛋白質分解に必須であること、またニトロ基の存在は活性を著しく増加させることなどが明らかとなった。3__-)PNO8によるD1蛋白質の特異的切断はi)低温では起こらない、ii)無酸素下でも起こる、iii)PNO8を加える前に試料を前照射することにより著しく促進される、iv)電子伝達の阻害活性とは異なるpH依存性をしめし、pKaは約6。3程度にある、等を明らかにした。

ウレア・トリアジンとフェノール系阻害剤10数種について酸素発生能の失活、D1蛋白質の切断に与える影響を検討した。ウレア・トリアジン系阻害剤は酸素発生能の失活D1蛋白質の切断断片の生成を抑制した。一方、フェノール系阻害剤は失活を促進したが、D1蛋白質の切断断片の生成には影響を与えなかった。2)光化学系II阻害剤結合により誘導されるD1蛋白質の選択的切断フェノール系阻害剤に属し、フルオルグルシノール骨格を持つ阻害剤PNO8(N-octyl-3-nitro-2,4,6-trihydroxybenzamide)によりD1蛋白質の切断が起こる事を見出した。D1蛋白質はdeループ中のロイシン258付近の1カ所で切断を受け、その結果光損傷によるD1蛋白質分解によって生じる断片と同じ分子量を持つ23、9kDa断片が生じた。分解反応は酸素の有無には影響されなかったが、低温条件やセリンタイプのプロテアーゼの阻害剤であるPMSFにより抑制された。PNO8によるD1蛋白質の切断は完全暗黒下で進行するが、PNO8添加前に試料を短時間光照射すると切断反応が著しい促進を受けた。以上の結果は前照射により、D1蛋白質に標識付けが行われ、PNO8によるQ_B部位近傍の構造変化が引き金となりD1蛋白質の切断が引き起こされることを強く示唆している。3)D1蛋白質切断活性の構造要求性フロログルシノール骨格を持ち、フェノール環に様々な置換基を導入した一連の化合物を合成し、電子伝達活性とD1蛋白質切断活性について構造活性相関を調べた。分割活性には、ベンゼン環上の2、4、6位の水酸基が必須であった。又、3位のニトロ基及び1位の疎水性側鎖は分割活性の上昇に寄与していることが明らかとなった。
固体NMR法によるタンパク質の活性中心の電子構造に関する研究

タンパク質の機能はその立体構造と深く関わっているため、立体構造に関する情報をどのように得るかが重要になる。生体中においてタンパク質は結晶状態にはないため、従来のX線回折法を用いて分子構造解析を行うことが困難であった。生体内において、タンパク質は細胞膜に埋め込まれた状態や結合した状態で存在する場合が少なくなく、様々な生体機能の一部を担っている。このようなタンパク質は一般に擬固体状態と考えられ、溶液状態に比べ分子運動が著しく抑制されている。本研究では、固体核磁気共鳴(NMR)法を用いてこのような擬固体状態の分子構造や電子構造に関する情報を引き出す方法を開発することを目的として、安定同位体^<13>Cラベルした数種のペプチドを合成し、L-アラニン残基中のカルボニル・α・β炭素の化学シフトテンソル主値と水素結合構造や主鎖骨格構造との相関を調べた。試料のマジックアングルスピニング(MAS)によるサイドバンド強度からα・β炭素の化学シフトテンソル主値を決定するには、数百Hz程度の安定した低速MAS回転が必要となる。しかし、この低速回転は非常に実現するのが困難であり、しかも、低速回転のため^<13>C-^<14>Nの異種核双極子カップリングによる線幅の広がりの影響が無視できないため、他の方法の開発が必務となっていた。そこで本研究では、実際のMASの回転数の1/nの回転数であたかも試料回転を行っているかのようなスピニングサイドバンドパターンを再現することができるパルスシーケンスであるeXtended Chemical Shift modulation(XCS)法を開発した。この方法により、高分解能スペクトルを保持しつつ化学シフト異方性の小さな核の化学シフトテンソル主値の決定が可能となった。このXCS法により、立体構造が既知のL-アラニン残基を含むペプチドのα炭素の化学シフトテンソル主値を決定した。その実験結果とab initio分子軌道法による磁気遮蔽定数の計算結果から、α炭素の化学シフトは主鎖の骨格構造(φ,ψ)の違いのみならず、カルボニル基やアミド基が形成する水素結合の影響を受けることがわかった。特に、水素結合の影響は、C′-C_α結合の方向から30°それた方向に主軸をもつδ_<33>に現れることがわかった。これは、各ペプチドの水素結合構造の違いがC′-C_α結合長の違いをもたらし、そのために磁気遮蔽の反磁性寄与に差が生じたためであると考えられる。
ジャミング・ガラス転移の統一理論の研究

本年度は、昨年度に完成した仕事のうち粉体系等の局所平衡も時間反転対称性が成り立たない系のゆらぎの定理に関する論文、量子系の一般化久保公式に関する論文、せん断粉体系での粘性率の発散に関する論文、非平衡定常状態でのキュムラント公式に関する論文が出版された他、今年度に入ってから投稿した負の反発係数に関する論文が出版された。また摩擦のある粒子のジャミングに関する論文の出版が決まった段階で、他に投稿中の論文が3つある。尚、残念乍、ガラス転移について進めた研究については細部を詰め切れず論文にするに至らなかった。摩擦のある系のジャミング転移に関する論文は、転移が摩擦係数によって連続転移から不連続転移に変化し、履歴依存性が現れることを明らかにした。その一方、外挿で決めた(仮の)臨界点周りのスケーリングは摩擦がない時と変わらず平均場近似で決めた臨界指数が依然有効であることを確認した。また、摩擦のない系のジャミング転移と粘性率の発散に関して詳細に調べ、従来知られていたスケーリングから研究代表者等が提唱したスケーリングへのクロスオーバーがあることを発見した。またジャミング転移が生じる粉体せん断系の非平衡キュムラント法による定常分布の表現を発展させ、同時に粉体系でのゆらぎの定理や一般化久保公式の成立を示した論文を著した。その他関連する研究として粉体素子の衝突で見かけ上負の反発係数が出ることを発見し、そのメカニズムを明らかにした論文や、一般化久保公式を量子系に適用した論文等が成果となっている。当該年度に出版された論文を分類するとジャミング転移、せん断粉体系の液体論、ナノクラスターと基盤の衝突、外場中のナノ粒子の輸送、微小重力下での粉体ガスの実験等になる。このうちせん断粉体系の液体論の論文は4つを数えており、せん断流体の時間相関関数のロングタイムテールのベキ指数がせん断によって小さくなることや同時刻速度相関等に現れる長距離相関、揺らぎの定理や一般化Green-Kubo公式の証明等の論文がある。これらの研究を通して第一原理的なせん断粉体液体の理解が可能になったと言ってよい。またナノクラスターの衝突に関する論文では基盤への吸着の相転移現象と、アルゴンとグラフェンの衝突に伴うグラフェンの変形と発熱を議論した。これらの論文では分子動力学シミュレーションをベースにして弾性論等を用いた理論解析による数値解析の結果の説明を行っている。またジャミング転移に関しては、摩擦のない粉体粒子系のジャミング転移では数多くの現象に対して平均場理論が非常に良く成り立っていることを明らかにした。また外場駆動のナノ粒子では壁との相互作用によってスケーリング領域が2つに分かれることを明らかにした論文と、航空機を用いた微小重力実験によって粉体ガスが満たすべき性質を明らかにした実験の論文等が成果として挙げられる。その他、論文リストには挙げていない印刷中の論文として粉体等の駆動散逸粒子系の定常状態での一般化Green-Kubo公式の成立や揺らぎの定理の成立をきっちりと示した論文や、粉体の弱散逸極限やハードコア極限での粘性率や圧力の発散の性質を明らかにした論文、量子系での一般化Green-Kubo公式を導いた論文等がある。これら数多くの論文から分かる通り順調に成果が出て、論文出版に邁進した一年だったと言える。しかしガラス転移に関する研究は論文発表に至らなかったのは残念だった。