hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
トマトに単為結果性を付与する原因遺伝子の同定

野菜に単為結果性を持たせる目的のために、単為結果性トマトに単為結果性を付与する原因遺伝子pat-2の分子的実体の同定を試みた。単為結果性トマトの遺伝子の解析は行ったが、最終的に同定できなかった。単為結果は受精によらず、着果および果実の肥大が起こる現象である。単為結果性を品種に持たせることは、果実の品質向上と安定な栽培に重要である。単為結果性をトマト品種に付与できれば、オーキシンによるホルモン処理や花粉媒介昆虫を利用する必要もなく、大いに省力化と経費削減につながる。トマト品種には遺伝的に単為結果性を示す品種が古くから知られている。これまでに、栽培種との交配により、これらの遺伝形質(例えばpat-2遺伝子)を栽培品種に導入する試みが行われ、その結果、単為結果性トマト`ルネッサンス'のような品種が育種されてきた。本研究課題では、トマトに単為結果性を付与する原因遺伝子pat-2の分子的実体を明らかにすることで、単為結果性の分子機構の解明を目指した。非単為結果性トマト`moneymaker'とpat-2遺伝子を持つ単為結果性トマト`LS935'の未受粉子房で、それぞれ特異的に発現している遺伝子をマイクロアレイ法とともにゲノムDNAをPCR法により検索した結果、`LS935'や品種ルネッサンスに保存されている9種類の遺伝子を同定した。これらの遺伝子は目的遺伝子のPat-2の近傍に位置しているという仮定の下に、これらの遺伝子のcDNAを単離した。さらにゲノム遺伝子の単離を試み、スクリーニング中であった。これら遺伝子の子房での発現を確認すると共に、`LS935'に`moneymaker'をバッククロスし、これら遺伝子の遺伝と単為結果性の関連を確認した。これらの結果から、原因遺伝子Pat-2の単離が期待できる状況であったため、`LS935'と`moneymaker'をリシーケンスしたが、研究年度の最後に競争グループからPat-2遺伝子の単離が報告された。そこで今度はその遺伝子の解析をする段階になった。現在、単為結果性を付与する原因遺伝子は複数あると推測されているが、その機構を説明できる分子的実体が明らかにされたものはない。オーキシン処理がトマトやナスの単為結果を誘発することは農業の現場で行われていることである。また、様々な園芸作物に、子房で特異的に発現する遺伝子プロモーターの下流に、アグロバクテリウムのオーキシン合成酵素遺伝子iaaMを導入すると単為結果性になるという報告があるなど、単為結果性にはオーキシンによるシグナルが必要であることに疑問の余地はない。これまでに研究代表者は、非単為結果性トマト`moneymaker'とpat-2遺伝子を持つ単為結果性トマト`LS935'の未受粉子房で、それぞれ特異的に発現している遺伝子をサブトラクション法でいくつか同定してきたが、単為結果性の原因遺伝子であると推定できる遺伝子の同定には至っていない。本研究課題では、トマトに単為結果性を付与する原因遺伝子pat-2の分子的実体を明らかにすることで、単為結果性の分子機構の解明を目指す。その遺伝子を非単為結果性作物に導入することにより、単為結果性を付与し、種子なし果実や、着果の安定した作物を作出するための基盤的研究を最終的な目的としている。単為結果性の`LS935'で特異的に発現している遺伝子群を同定した。同定した遺伝子群の、非単為結果性の`moneymaker'の未受粉子房における発現とゲノムにおける存在を調査した。その結果、少なくとも10種類の遺伝子が、`moneymaker'では発現しないばかりではなく、ゲノムDNAを鋳型としたPCR解析によって、遺伝子自身がゲノム配列上に存在していない可能性が見出された。そこで、一般的な非単為結果性トマト品種のゲノムDNAを鋳型としたPCRによって、これら遺伝子を検出を試みた。その結果、どの品種からも増幅DNAが得られず、これら遺伝子が単為結果性`LS935'に特異的な遺伝子であることが示唆された。さらに、これら遺伝子群が`LS935'の特定の染色体領域に集積していること、すなわち`LS935'に特異的な染色体領域が存在することが示唆された。単為結果性トマトと非単為結果性トマトを交配して得た100以上のF2種子を育成したところ、非単為結果性と単為結果性がほぼ3:1に分離することが確認できた。さらに、

`LS935'の未受粉子房で特異的に発現している遺伝子群のF2個体における分布をPCRによって調べたところ、先に同定した`LS935'特異的な10種類の遺伝子が単為結果性の個体では検出されたが、非単為結果性個体からは検出できなかった。現在、単為結果・非単為結果トマトの交配実験によって、単為結果性トマトに特異的な遺伝子の絞込みをさらに進めている。これまでの研究によって、単為結果性トマトで特異的に発現している少なくとも10種類の遺伝子を同定した。さらに、ゲノムDNAを鋳型としたPCR解析によって、一般的な非単為結果性トマトではこれら10種類の遺伝子が検出されず、これら遺伝子が単為結果性`LS935'に特異的な遺伝子であることが示唆された。なお、`LS935'は`moneymaker'を戻し交配して固定したラインであるので、両者のゲノム上の違いは理論的には単為結果性遺伝子pat-2に関わる配列であると推定される。したがって、`LS935'特異的な遺伝子群が集積したゲノム領域に標的とするpat-2遺伝子が存在すると推定される。そこで、`LS935'のBACライブラリーを作成し、同定した`LS935'特異的な遺伝子群を指標にして、BACクローンを選抜し、それらの配列を決定する。一昨年から、トマトのゲノムドラフト配列がウエブ上で公開されている。決定したBACクローンの配列を公開されているトマトのゲノムドラフト配列と比較する。公開されている配列は非単為結果性品種由来であるため、Pat-2に対応する配列は存在しないと予想される。上記比較によって同定された`LS935'特異的な遺伝子群の発現を、`LS935'と`moneymaker'の花の子房で比較すると、pat-2自身は`LS935'でしか発現していないはずである。最終的には、その遺伝子を`moneymaker'に導入して、単為結果性となるかどうかを確認することによって、単為結果性を決定するpat-2の同定を目指す。申請研究を実施するための研究施設・設備はほぼ整っているため、設備備品の購入予定はない。研究情報を収集するために、関連学会、シンポジウムなどに参加するための旅費(約100千円)を支出する。BACクローンの塩基配列の決定を予定しているが、時間と労力を必要とする塩基配列の決定は、研究室で実施するよりも迅速で、むしろ安価な受託分析を利用する。そのための経費(約400千円)の支出を予定している。残りの経費は、植物育成、遺伝子解析などに使用する消耗品購入経費として使用する。
森林レクリエーション地域へのアクセス制御による自然環境保全

1)大雪山登山口における現地調査:層雲峡ロープウェイおよび旭岳ロープウェイの乗り場において利用者アンケート調査を夏季と秋期の2回おこなった。このデータを、前年度と比較することによって、利用者の動力依存特性が明らかになった。すなわち、利用者は相対的に短時間のルートを選ぶ傾向があり、旭岳ロープウェイ運休していた去年は少なかったコースの利用が今年度は増加している。すなわち、ロープウェイ運休による4時間程度の徒歩時間増加が利用者の動向に大きな影響を及ぼしていることが明らかになった。特に、4時間付加することによって日帰りが困難になる地域で影響が著しい。2)研究経過発表:マレーシアのクアラルンプールで開催された国際森林研究機関連合世界大会で、大雪山国立公園のアクセス改善と環境影響に関するこれまでの研究成果の発表をおこなった。また、同国キナバル国立公園におけるアクセス制御手法について調査し、山小屋の宿泊定員で利用者数が決定され、過剰利用が抑制されていることが明らかになった。平成11年度は基礎調査として北海道大雪山の2箇所の代表的登山口、黒岳に向かう層雲峡と旭岳に向かう旭岳温泉における登山者のアクセス選定に関する調査をおこなった。7月末の夏のシーズンと9月中旬の紅葉シーズンの2回に分けて、登山口でのアンケート調査およびインタビューをおこなった。その結果、増強工事のため運行が停止された旭岳ロープウェイの旭岳登山口と従来通り運行されている層雲峡登山口を比較することが可能になり、旭岳ロープウェイの運休が登山ルート選択に及ぼす影響を調べた。すなわち、予想されたように利用者はロープウェイの使える層雲峡に集中している。一方で、ロープウェイが運行されているときには余り利用されていなかった旭岳温泉からの歩道利用者数が増加した。また、ロープウェイがないから静かな山旅が楽しめることを期待している登山者もいることが判明した。平成12年度には旭岳温泉ロープウェイの運行が再開されるので、今年度のデータと比較するために同様な調査をおこない、動力アクセスの有無が登山者のルート選択に与える影響が一層明らかにできると期待している。また、その他の地域においても動的アクセスが登山者に与える影響を探り大雪山における結果が一般化できることを実証したい。
スポーツの継続とペアレンティング：青年移行期を対象とした縦断研究

青年移行期には,児童期に慣れ親しんだスポーツからのドロップアウトが危惧される。ドロップアウトには,新しい活動を選択する転機としての離脱もある一方,何もしない大人へ向かうネガティブな離脱もあり,後者では,親,仲間,指導者による不適切な関わりが原因である場合も少なくない。本研究の目的は,子どもがスポーツを継続し,スポーツ本来の恩恵を享受するため,これを支える3エージェントの関わりと個人内要因(パーソナリティなど)の相互作用について検討することである。媒介変数としてスポーツを継続/離脱する子どもの動機づけに目を向けて,縦断研究の手法を用いてスポーツの望ましい継続に関わるプロセスを明らかにする。
新たなウイルス認識機構を介した植物免疫システムの解明によるウイルス病防除基盤構築

植物ウイルス病は効果的な防除法が存在せず、その防除は植物が備える植物免疫システムの利用に大きく頼っている。ウイルスに対する植物免疫としては、ウイルスの二本鎖を認識するRNAサイレンシングが知られており、多くのウイルスはこれに対抗してサプレッサーを持つ。サプレッサーを植物で一過的に発現させると抵抗性が誘導される例が報告されているが、これまでにサプレッサーを認識する植物の抵抗性タンパク質は発見されていない。Potexvirus属ウイルスはRNAサイレンシングを抑制するサプレッサーTGBp1を有するにも関わらず、シロイヌナズナに感染できないことから、シロイヌナズナはTGBp1を認識して誘導される抵抗性を持つと推測された。本研究はPotexvirus属ウイルスとシロイヌナズナを用いて、Potexvirus属ウイルスのサプレッサーTGBp1に対して植物が持つと考えられるサプレッサー認識型抵抗性遺伝子の探索と、その抵抗性機構の解明を目的としている。昨年度までに、TGBp1と相互作用するシロイヌナズナのタンパク質について絞り込みを行っている。今年度は、絞り込まれたシロイヌナズナタンパク質が認識するウイルスの広域性について解析を行うため、Potexvirus属ウイルスであるAlternanthera mosaic virusおよびPotexvirus属に近縁なCherry virus Aについて、国内の植物からの検出および全長塩基配列の決定を行った。また、シロイヌナズナタンパク質がウイルス以外の病原体を認識するかという基礎的知見を得ることを目的とし、他種病原体についても国内の植物からの検出およびその性状に関する解析を行った。28年度が最終年度であるため、記入しない。ウイルスに対する植物免疫としては、ウイルスの二本鎖RNAを認識するRNAサイレンシングが知られており、多くのウイルスはこれに対抗してサプレッサーを持つ。サプレッサーを植物で一過的に発現させると抵抗性が誘導される例が報告されているが、サプレッサーを認識する抵抗性タンパク質は発見されていない。本研究はPotexvirus属ウイルスとシロイヌナズナを用いて、Potexvirus属ウイルスのサプレッサーTGBp1に対して植物が持つと考えられるサプレッサー認識型抵抗性遺伝子の探索とその抵抗性機構の解明を目的としている。今年度はTGBp1を形質転換したシロイヌナズナ変異体を作製し、TGBp1と結合してTGBp1を直接認識する抵抗性タンパク質候補、およびTGBp1を間接的に認識する抵抗性タンパク質候補の回収を行った。本研究により得られた抵抗性タンパク質候補について、今後その遺伝子を同定し機能解析を進めることで、TGBp1を認識する抵抗性遺伝子を探索できる。また、本研究を進める中でTGBp1はオリゴマーを形成することが明らかとなった。TGBp1のオリゴマー化はTGBp1のサイレンシング抑制能や、植物がTGBp1を認識して抵抗性を誘導する上で重要な役割を果たすと考えられる。TGBp1形質転換シロイヌナズナを作出し、免疫沈降法により抵抗性タンパク質候補を回収することができた。これは当初の研究実施計画の通りであり、研究課題はおおむね順調に進展していると考えられる。本研究はPotexvirus属ウイルスとシロイヌナズナを用いて、Potexvirus属のサプレッサーTGBp1に対して植物が持つと考えられるサプレッサー認識型抵抗性遺伝子の探索とその抵抗性機構の解明を目的としている。今年度は、サプレッサー認識型抵抗性遺伝子の同定を目的として研究を実施した。前年度までに得られたTGBp1認識型抵抗性タンパク質の候補について、その配列を決定しシロイヌナズナのゲノムデータベースを用いて遺伝子の同定を行った。これらの抵抗性遺伝子候補について、抵抗性遺伝子候補が破壊されたシロイヌナズナのタグラインを用いてPotexvirus属ウイルスの感染性を解析し、抵抗性遺伝子候補の絞り込みを行った。今年度は、前年度までに得られた抵抗性タンパク質候補から抵抗性遺伝子を絞り込むことを目的とした研究実施計画であり、概ねその目標を達成できている。

Potexvirus属ウイルスはRNAサイレンシングを抑制するサプレッサーTGBp1を有するにも関わらず、シロイヌナズナに感染できないことから、シロイヌナズナはTGBp1を認識して誘導される抵抗性を持つと推測された。本研究はPotexvirus属ウイルスとシロイヌナズナを用いて、Potexvirus属ウイルスのサプレッサーTGBp1に対して植物が持つと考えられるサプレッサー認識型抵抗性遺伝子の探索と、その抵抗性機構の解明を目的としている。昨年度までに、TGBp1と相互作用するシロイヌナズナのタンパク質について絞り込みを行っている。今年度は、絞り込まれたシロイヌナズナタンパク質が認識するウイルスの広域性について解析を行うため、Potexvirus属ウイルスであるAlternanthera mosaic virusおよびPotexvirus属に近縁なCherry virus Aについて、国内の植物からの検出および全長塩基配列の決定を行った。また、シロイヌナズナタンパク質がウイルス以外の病原体を認識するかという基礎的知見を得ることを目的とし、他種病原体についても国内の植物からの検出およびその性状に関する解析を行った。今年度の研究により得られた抵抗性タンパク質について、そのアミノ酸配列を解析し、シロイヌナズナのゲノムデータベースを用いることで遺伝子の同定を行う予定である。さらに、同定された各抵抗性遺伝子候補についてその機能解析を進めることで、抵抗性遺伝子の同定を行う予定である。今年度の研究により絞り込みを行った抵抗性遺伝子候補について、更なる機能解析を進める。また、他種ウイルスや他属ウイルスについても解析を行い、抵抗性の評価を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。
ドクターヘリにおける費用効果分析と導入予定地域における費用効果シミュレーション

本研究はドクターヘリにおいて費用効果分析および費用便益分析を行い、経済的視点からの評価を行った。費用効果分析では札幌地域のドクターヘリにおいて、先行研究と比較して費用効果的と評価できた。費用便益分析では医療資源へアクセスによって住民のドクターヘリに対する価値が変化していた。またドクターヘリの導入地域において経済的評価からの視点におけるシミュレーション分析を行うためのシステムを考案した。本研究はドクターヘリの費用効果を明らかにし、費用効果の観点から新規導入のシミュレーションを行うものである。本年度はドクターヘリの費用と効果の決定および分析モデルの構築、ドクターヘリの費用効果分析を行った。費用効果指標は先行研究を参考に「100搬送あたりの運用直接経費に期待される外傷生存者の病院精算金を加えた金額に対し、100搬送あたりの増分生存者数で割ったもの」とした。ただし、生存者に関する情報は搬送されたそれぞれの病院以外では入手が困難であるため、この増分生存者数を「救急車搬送された場合には死亡していた患者をドクターヘリで搬送することによって救命できた人数」とすることで、算出を可能とした。これは過去の運用実績から求めた「救急車搬送した場合の死亡者定数」を用いて概算することができる。またこの指標を用いた札幌市に導入されているドクターヘリの運航実績から費用効果を算出した。費用効果指標は3,993,075円と算出され、ドイツの先行研究での費用効果指標約600万円と比較して、札幌市に導入されたドクターヘリは費用効果的であった解釈される。ただし、外国の救急システムとの比較は医療システムなどの違いから意味をなさない可能性がある。今後、日本の他の施設と比較することにより、効率の良い施設運用が特定できると考えられる。これらの結果を基に新導入地域におけるシミュレーションを行うことで、費用効果の観点からの導入を検討することが可能である。さらに来年度に計画しているインターネット公開のためのシステム構成、ソフトウェア、GISデータの策定を行った。サーバは会員制Webページを構築し、仮想化技術を用いてシミュレーション環境を公開する仕様とした。GISソフトウェアにはESRI社制ArcGISを採用した。地理データは同社の詳細地図、および道路網を用いた。試験運用のため北海道地方版のみとした。来年度は費用効果指標を組み込んだシミュレーション分析のアルゴリズムの作成、実装を行う。本年度は費用効果分析用のシステム構築および同システムで用いるデータ収集および分析を行った。システムはインターネットから分析を可能にするため、主要システムにシンクライアントを用い、ユーザにGISを自由に利用できる構成とした。シンクライアントの利点はデスクトップ機能全体をユーザに提供できること、さらに操作画面やマウス・キーボードの情報のみを伝達するためセキュリティが強固である点である。ただし、ライセンスの問題があり一般公開ではなく、登録ユーザでのみ利用できる仕様とした。昨年度は費用効果分析を行ったが、本年度はこれに加え、効用の指標を「ドクターヘリ設置地域における住民が潜在的に持つ価値」として費用便益分析を行った。費用効果分析の評価において、例えば北海道は冬季の天候などで出動回数が減り、常時出動できる地域から見ると低い評価になる可能性がある。費用便益分析を加えることにより、ドクターヘリが存在することでその地域住民が抱く潜在的な期待感や安心感といった価値を含めて評価可能になる。対象は北海道札幌市、旭川市、千葉県印西市を中心とする半径70kmの地域として分析を行った。方法は仮想評価法を用いて支払意思額を算出した。インターネットを用いてアンケート調査を行った。支払意思額の結果では、それぞれ札幌1,576円、旭川2,430円、印西1,174円であった。さらに旭川地域では周辺部と中心部で差が認められた。周辺地域は医療資源が乏しくアクセシビリティが低いことから、価値が高かったと考えられる。印西市ではドクターヘリが初期から導入されていた地域であるが、近くの都市部では医療資源が集中しアクセシビリティが高いなどから、価値が低かったと予想される。本研究で得られ調査結果を踏まえ、今後の研究では導入シミュレーションが可能であると考えられる。
ヒト子宮内膜癌の多段階発癌の検討

子宮内膜病変の遺伝子変化に関与する検索として腫瘍抑制遺伝子、癌遺伝子の変化を検討した。腫瘍抑制遺伝子としてはp53がPCR-SSCP法によりexon5からexson8までの遺伝子変異の有無を検討すると29例中5例(17.9%)で変異を認めた。又遺伝子異変をよく反映するp53の免疫組織化学では単クローン抗体007を用いて33例中15例(45%)と比較的高い頻度で陽性所見を認めた。又組織学的分化度が低くなるほどp53の異変は高率で観察された。又このp53の陽性細胞ではmRNA発現亢進を伴っていない事をin situ hybridizationで証明した。p53の異変は内膜癌の前癌病変とも考えられている内膜増殖症では認められなかった。これに対して癌遺伝子であるK-rasの変異は、内膜癌272例中28例(10.3%)でcodon12又は13の点突然変異が観察され、異型増殖症で9例中1例に認められている。この事からp53の変異は、癌化過程の比較的後期で生じてくるのに対してK-rasの変化は異型増殖症を含む早期からおこっている事が示唆された。アンドロゲンをエストロゲンに転換させるaromataseは子宮内膜病変70例で、発現、および生化学的活性も含めて多角的に検討した。aromataseは正常、子宮内膜増殖症では発現、活性共にほとんど見られないが、癌症例では^3H-water法で検討した活性が認められてきた。免疫組織化学、in situ hybridization法でaromatase発現の局在生を観察してみると、腫瘍細胞ではなく腫瘍包巣周囲の間質細胞で蛋白、mRNA双方のレベルで発現していた。この事は、子宮内膜病変で血中のアンドロゲンからエストロゲンに転移させて局所のエストロゲン濃度を高めるaromataseの発現は癌化のプロセスと深く関係しており、腫瘍局所でin situに産生されたエストロゲンはparacrine的に内膜癌細胞の増殖に関与している事が考えられた。現在癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子の変異とaromatase発現の関係を検討中である。
透明文字盤の特長を生かした非接触入力スイッチの開発

本研究は、長期間意思伝達支援が可能な透明文字盤の特長を生かし、Amyotrophic Lateral Sclerosis (筋萎縮性側索硬化症;ALS)などの進行性神経筋疾患の患者に対し、顔面周囲のわずかな随意性運動を入力源とする入力スイッチを開発することを目的とした。スイッチの構成は500万画素CCDカメラと画像処理ソフトによる画像センサ、および接点信号出力装置とした。入力を検出する随意性運動は口角の挙上とし、口角の中立位から1.5mm挙上した状態を検出した。試作した入力スイッチで市販の意思伝達支援装置の入力が可能なことを確認した。24年度実施内容:24年度の実施内容は、入力スイッチの誤作動防止対策、接点信号の出力信号の検討、入力スイッチ試作品の仕様検討の3項目だった。入力スイッチの誤作動防止対策:誤作動防止対策に必要な、入力スイッチの基本性能を確認、決定するために、表情変化の検出限界を定量化した。表情筋のうち、一側の口角の挙上動作について検出限界を求めた。顔面の安静状態の静止画像と口角を挙上した静止画像を取得し、口角周辺範囲の画像明度で安静状態と口角挙上状態を判別分析で判別した。結果として一側の口角を安静状態から2mm挙上した画像が、安静状態と挙上状態を判別する限界だった。このことから、一側の口角挙上を入力源とする場合、安静状態から2mm以上の随意性運動が必要になることがわかった。そのうえで、誤作動の防止対策として、頭頸部の可動域変化、カメラ位置の変化を変動パラメータとして、それらが変化しても2mm以上の口角挙上を検出できるように、キャリブレーションの方法を検討した。スイッチの使用前に安静状態の静止画像を取得し、口角挙上以外の画像の明度変化を相殺し、安定して検出することを確認した。口角挙上による検出限界の定量評価については、2013年9月予定のアジア理学療法国際会議(台湾台中市)に投稿中である。接点信号の出力方法の検討:接点信号の出力は、表情変化を検出したのち、パーソナルコンピュータの仮想シリアル(RS-232Cを仮想化したUSBポート)から出力する場合、マウスのクリック信号を出力する場合の2系統を検討した。入力スイッチ試作品の仕様検討:入力スイッチは、現在実験で用いているCCDカメラと画像処理システムを中心とする構成とした。24年度実績の意義および重要性:本年度の実績により、表情変化による入力スイッチの基本的な性能、誤作動防止の方法を見出したことで、研究の進行に対して有効だった。顔面周囲の随意運動のうち、日常の動作と入力動作の分離が容易で、実用的な入力動作を検討した。眼球運動、眼瞼運動(まばたき)、口唇の挙上について検討し、口唇の挙上が誤動作が少ないことから、口唇の挙上を主に入力動作の手段とした。本研究で開発した随意性運動システム(オムロンFJ-SC5MG-S)には35万画素CCDカメラおよび500万画素CCDカメラを用いた。安静状態から一側の口唇を挙上し、安静状態と挙上した画像の明暗の違いで画像を判別し検出した。500万画素カメラでは、カメラと顔面からの距離500mmの条件で、口唇を安静状態から1.5mm挙上するのを検出した。同様に35万画素カメラでは、カメラと顔面からの距離200mmの条件で、口唇を安静状態から1.5mm挙上するのを検出した。スイッチの入出力システムを構築した。システムの構成は、随意性運動システムにて口唇の挙上運動を検出すると5VDC出力を発生させ、その出力を接点信号に変換し、意思伝達支援ソフトウェア用のスイッチコネクタに入力した。スイッチコネクタに接点信号が入力されると、意思伝達支援ソフトウェアに入力される構成とした。システムの応答は、500万画素カメラで250msec、35万画素カメラでは100msecだった。健常者により入出力システムを操作し、意思伝達支援ソフトウェアの表示する画面上の文字を決定し、入力することを確認した。試作したシステムでは、単純な意思伝達に使用するには応答の影響は少ないが、画面に動きがあるターゲットをクリックする作業は、500万画素カメラによる検出は入力遅れが起きた。このことから、現行のシステム構成では、撮影位置などを工夫して解像度の低いカメラを用いて応答を速くする制御系にするなど配慮を必要とした。今後より安価なシステムを検討した上で、対象者への評価を実施する予定である。研究の目的:本研究は、Amyotrophic Lateral Sclerosis (筋萎縮性側索硬化症;ALS)などの進行性神経筋疾患の患者(対象者)に対し、高解像度カメラを検出部とする画像センサを用いて、眼球、瞼、表情など顔面周囲のわずかな随意性運動を入力源とする入力スイッチを開発する。

長期間意思伝達支援が可能な透明文字盤の特長を生かして、随意性運動機能の低下、運動可能な箇所の減少に柔軟に対応し、使用にあたって対象者には身体的負担を少なく、介護者には設置時の負担を少なくすることを目標とする。装置の開発により、対象者と介護者との意思伝達を継続的に支援することを目的とする。平成23年度の実施内容:1.入力スイッチの仕様決定:入力スイッチの仕様は、CCDカメラを使用者の前方に設置して、撮影範囲に使用者の顔面が入るようにした。入力方法は顔面周囲の随意性往復運動を入力源とし、中立位をOFF、運動時の状態をONとした。2.随意性運動システムの構築:入力スイッチの仕様設定に基づいて、「随意性運動システム」を構成し、導入した。装置の構成は、使用者の顔面周囲を詳細に撮影する500万画素CCDカメラと、高速で低価格の30万画素CCDカメラで画像データを取り込み、随意運動を検出してON/OFFの接点信号を出力する専用ソフトウェアとパーソナルコンピュータとした。2台のCCDカメラは用途に応じて使い分けることにした。3.検出方法の検討:検出可能な随意性運動の部位として、眼球、瞼、眉、眉間、頬、口角、下顎とする。運動の検出は、顔面の中立位と、随意運動実施時の画像データを取得し、画像の明度から、運動に関与しない部位の座標と運動した部位の座標を求め、それらの距離から運動の検出を行う方法とした。500万画素カメラを用い、概ね1mmの変化を検出した。24年度の実施計画は、入力スイッチの誤作動防止対策、接点信号の出力信号の検討、入力スイッチの試作の3項目とした。対して24年度の実施内容は、入力スイッチの誤作動防止対策、接点信号の出力信号の検討、入力スイッチ試作品の仕様検討の3項目だった。3項目中、2項目については計画通り実施した。残り1項目の入力スイッチの試作については、試作のための仕様検討にとどまった。これは、入力スイッチの誤作動防止対策に時間がかかったこと、24年度後半に研究者が研究機関に異動することになり、研究を実施する時間がかけられなかったことによる。25年度に研究の実施を加速し、計画を当初の予定通り遂行する予定である。平成23年度の計画のうち検出方法の検討において、運動の検出は、1.顔面の中立位と、随意運動実施時の画像データを取得し、画像の明度や色度から、運動に関与しない部位の座標と運動した部位の座標を求め、それらの距離、角度から運動の検出を行う方法、2.随意運動周辺の一定範囲を分割し、分割したマトリクス内の明度や色度を変数として、それらの平均値の差を検定して運動の有無を判定する方法、3.研究者が発案した、多変量解析を用いるパターンマッチングをして、運動の有無を判定する方法の3つの方法を検討した。このうち1.は達成したが、2.3.は24年度も継続して実施中である。平成25年度の本研究の推進方策として、入力スイッチの試作、入力スイッチの評価をするために意思伝達支援装置を構築し、装置操作を試作した入力スイッチで実施することで、入力スイッチの効果判定をする予定である。効果判定の結果をもとに研究のまとめを実施し、論文に投稿する予定である。平成24年度の予定随意運動検出、接点信号出力アルゴリズムの検討として、主に以下の2項目について実施する。
虚血性内耳障害による感音性難聴の分子機構

1)内耳の蝸牛軸動脈からコイル状細動脈にはエンドセリンBレセプターが発現している。2)蝸牛内に直接エンドセリンを導入すると、蝸牛電位は急速に低下する。3)エンドセリンによる蝸牛電位の低下は、エンドセリンBレセプターの選択的アンタゴニストにより抑制される。4)虚血性内耳障害の一つの病態である突発性難聴症例では、その発症時に血清中エンドセリン値は高値を示す。5)虚血性内耳障害による感音性難聴の発症機構の一つの因子として、エンドセリンおよびそり受容体による内耳血流低下が考慮される。1)蝸牛血管条には、ATP-dependent potassium channelの一つであるKAB-2チャネルが発現しており、一過性内耳虚血による血管条でのATR量の変化は、同チャネルの生理機能に影響を与える。3)虚血性内耳障害による感音性難聴の発症機構の一つの因子として、虚血時の血管条におけるATP量の変化を原因とするATP-dependent potassium channelの機能異常が考慮される。1)内耳前庭系の有毛細胞と1次ニューロン間の神経伝達も、グルタミン酸受容体のAMPA型レセプターを介して行われる。2)前庭および蝸牛系において、虚血性変化として、AMPA型レセプターのGluR2サブユニットの変化が示唆される。蝸牛有毛細胞に発現するMAP-2は、一過性虚血に対して鋭敏な反応を示し、中枢神経系の発生初期段階に発現するMAP-2cの発現増加が認められる。4)これらの2つの分子は内耳の虚血性変化を示す良いマーカーと考えられる。1)虚血モデル動物の作製Korpatchev(1982)らの方法により成熟ラットを用いて虚血モデル動物を作製した。開胸後心臓より上行する血管を圧迫し2-3分間心臓停止の状態を負荷することで全脳虚血を作製した。完全な心臓停止5-6分後に心臓マッサージと人口呼吸器による強制換気により脳循環を再開させ、動物は自発呼吸を始めた動物はケージに戻された。2)虚血モデル動物の内耳よりのmRNA抽出およびcDNAの作製全脳虚血負荷後1-5日で動物を二酸化炭素ガスにて麻酔後断頭し中耳骨胞を摘出した。中耳骨胞より蝸牛を切り出して液体窒素中でホモゲナイズした後、GTC-CsTFA液中で超遠心分離にて内耳mRNAを抽出した。さらにmRNAから試験管内で逆転写酵素により相補的DNA(cDNA)を合成した。この際、虚血モデル動物の内耳と同様に正常動物の内耳よりもmRNAを抽出してcDNAを合成した。虚血モデル動物の内耳cDNAのPCRによる増幅脳でクローニングされたグルタミン酸受容体(AMPA型GIuR1-4;KA型GIuR5-7;NMDA型NMDAR1&2)およびマイクロチュブール関連蛋白(MAP2b&c)のcDNAの塩基配列よりそれぞれに特異的な合成オリゴプライマーを作製した。虚血モデル動物および正常動物それぞれの内耳cDNAをテンプレートにして、PCR(polymerase chain reaction)法によりこれらのcDNAを増幅し、得られたcDNAをアガロースゲルで分離回収した。cDNAをプラスミドベクターに挿入しダイ・プライマ法を用いてオートシークエンサーにて塩基配列を決定した。虚血モデル動物内耳に発現するグルタミン酸受容体(AMPA型GIuR1-4)では正常動物の内耳と同様に8種類のサブユニットの発現が確認された。GIuR2の発現量の変化について解析中である。マイクロチュブール関連蛋白(MAP2b&c)に関しては、虚血モデル動物内耳においてMAP2bと共にMAP2cの発現が強く認められた。すなわち、虚血モデル動物内耳においてこれらの蛋白質複合体に分子レベルでの構造的変化があると推察された。

1)虚血モデル動物の作製Korpatchev(1982)らの方法により成熟ラットを用いて虚血モデル動物を作製した。開胸後心臓より上行する血管を圧迫し2-3分間血流を遮断し、さらに3分間心臓停止の状態を負荷することで全脳虚血を作製した。完全な心臓停止5-6分後に心臓マッサージと人工呼吸器による強制換気により脳循環を再開させ、自発呼吸を始めた動物はケージは戻された。2)虚血モデル動物の内耳よりのmRNA抽出およびcDNAの作製全脳虚血負荷後1-5日で動物を二酸化炭素ガスにて麻酔後断頭し中耳骨胞を摘出した。中耳骨胞より蝸牛を切り出して液体窒素中でホモゲナイズした後、GTC-CsTFA液中で超遠心分離にて内耳mRNAを抽出し、さらにmRNAから試験管内で逆転写酵素により相補的DNA(cDNA)を作製した。この際、虚血モデル動物の内耳と同様に正常動物の内耳よりもmRNAを抽出してcDNAを作製する。3)虚血モデル動物の内耳cDNAのPCRによる増幅脳でクローニングされたグルタミン酸受容体(AMPA型GluR1-4;KA型GluR5-7;NMDA型NMDAR1&2)、マイクロチュブール関連蛋白(MAP2b&c)およびNa^+-K^+ATPase(α&β)のcDNA塩基配列よりそれぞれに特異的な合成オリゴプライマーを作製した。虚血モデル動物および正常動物それぞれの内耳cDNAをテンプレートにして、PCR法によりこれらcDNAを増幅し、得られたcDNAを回収しその塩基配列を決定した。虚血モデル動物内耳に発現するグルタミン酸受容体では、AMPA型受容体のGluR1-48種類のサブユニットが確認され、またGluR2の発現が増加していた。マイクロチュブール関連蛋白では虚血モデル動物内耳においてMAP2cの発現が増加していた。・Na^+-K^+ATPaseに関しては現在検討中である。すなわち虚血モデル動物内耳においてこれらの蛋白質複合体に分子レベルでの構造的変化が起こっている可能性が示唆された。
カドミウムと粘土鉱物表面との分子レベル相互作用に着目した収着構造解析

本年度は昨年度に引き続き,粘土鉱物へのCd収着におけるpH依存性に着目し,その収着形態および収着サイトさらには粘土鉱物表面とCdとの相互作用を明らかにするために,以下の実験を行った.1.Cd収着および脱離実験:昨年度は,モンモリロナイト,パイロフィライト,カオリナイトへのCd収着サイトおよび収着形態を各pH範囲にわけて,明らかにした。本年度は,日本土壌を考慮し,酸性土壌下で多く存在する,HyA(hydroxyaluminum)-またはHAS(hydroxyaluminosilicate)-モンモリロナイト複合体および鉄酸化物を収着媒として,Cdの収着および脱離実験を行った。その結果から,各pHでのCdと粘土表面との相互作用を検討した。粘土複合体へのCd収着においては,モンモリロナイト及びパイロフィライトと同程度の,鉄酸化物へのCd収着ではそれ以上の相互作用が生じているとした。2.TPD(昇温脱離)実験:本年度は,あらたに粘土複合体および鉄酸化物試料のTPD実験を行った。Cd,AlおよびH_2OのTPDスペクトルから,鉄酸化物に収着したCdは,粘土複合体や粘土鉱物よりも安定した構造で収着していることがわかった。今後,昇温速度を変化させ実験を繰り返し,Cd脱離エネルギーを把握する。3.EXAFS(広域X線吸収微細構造)実験および解析:上記の結果を基に,各粘土鉱物および鉄酸化物へのCd収着形態のモデルを求め,それらを分子レベルで明らかにするためにEXAFS実験を行う必要がある。そこで,放射光施設であるKEK-PFに共同利用実験の申請を提出した(2006年度前期分)。また,以前測定を行ったモンモリロナイト試料のEXAFS解析を進め,モンモリロナイトへのCd収着サイトおよび収着形態を分子レベルで明らかにした(Takamatsu(2006))。本研究では粘土鉱物へのCd収着におけるpH依存性に着目し,その収着形態さらには粘土鉱物表面とGdとの相互作用を明らかにするために,1、収着・脱離実験と2、TPD(熱脱離)実験を行った.その結果,以下のことがわかった.1、Cd収着および脱離実験:収着実験から,モンモリロナイト,パイロフィライト,カオリナイトへのCd収着におけるpH依存性を明らかにした.そして,各粘土鉱物への収着挙動から,各pHにおける収着サイト(層間,結晶端面)および収着形態(外圏型表面錯体,内圏型表面錯体および表面沈殿)について推察した.さらに各pHでCdを収着させた粘土試料に対して,脱離剤としてEDTAおよびHNO_3を用いて,脱離実験を行った.その結果,脱離剤,粘土鉱物および収着時のpHによって脱離挙動が異なった.HNO_3ではモンモリロナイトの層間に収着したCdの脱離は生じなかった.また両脱離剤による脱離時のpH変化によって,収着形態を把握できた.これら結果から,収着実験で推察した粘土鉱物へのCd収着サイトおよび収着形態を確認した.2、TPD(昇温脱離)実験:東邦・大学理学部物理学科所有のTPD装置を用いて,各pHでCdを収着させた粘土試料のTPD実験を行った。一定温度で試料を加熱し,各元素(質量数)に対して,温度に対する脱離変化(TPDスペクトル)を測定した.測定元素はCdと粘土鉱物の主要元素(Al,SiおよびH_2O)である.その結果,粘土鉱物およびpHによってTPDスペクトルが異なった.特にモンモリロナイト試料においては,層間に収着したCdは層間水の脱水により,層間に閉じこめられ,結晶端面に収着したCdはモンモリロナイトからのSi,Alの脱離を抑制させることがわかった.しかし,モンモリロナイト表面-Cdとの相互作用を表す脱離エネルギーを把握することはできなかった.本年度は昨年度に引き続き,粘土鉱物へのCd収着におけるpH依存性に着目し,その収着形態および収着サイトさらには粘土鉱物表面とCdとの相互作用を明らかにするために,以下の実験を行った.1.Cd収着および脱離実験:昨年度は,モンモリロナイト,パイロフィライト,カオリナイトへのCd収着サイトおよび収着形態を各pH範囲にわけて,明らかにした。

そこで,放射光施設であるKEK-PFに共同利用実験の申請を提出した(2006年度前期分)。また,以前測定を行ったモンモリロナイト試料のEXAFS解析を進め,モンモリロナイトへのCd収着サイトおよび収着形態を分子レベルで明らかにした(Takamatsu(2006))。
気管支喘息におけるインターロイキン10を中心としたサイトカインの役割

I.アトピー患者と健常者末梢血におけるIL-5遺伝子発現と産生に対するグルココルチコイドの作用1.健常人と、グルココルチコイド治療を受けていないアトピー患者の末梢血単核球をグルココルチコイド存在下にPHAとPMAにて刺激し、IL-5 mRNAと培養液中のIL-5を定量した。2.グルココルチコイドはヒト単核球からのIL-5産生を治療で用いられる低濃度を含め、濃度依存的に抑制した。3.グルココルチコイドはPHA/PMAによるIL-5遺伝子発現を著明に抑制し、IL-5遺伝子発現の抑制がIL-5産生抑制作用に於ける重要な機序であることを示した。4.グルココルチコイドによる抑制はアトピーと健常群間に有意差は認められなかった。5.グルココルチコイドは(1)PHA/PMAによる直接作用を抑制するとともに、更に、(2)IL-2などオートクライン/パラクラインシステムを介した増幅作用も抑制した。6.IL-5産生抑制はグルココルチコイドの治療薬としての作用機序の中で重要な位置を占めていると考えられた。II.ヒト末梢単球、リンパ球のIL-10遺伝子発現に対するデキサメサゾンの効果1.健常者末梢血から分離した単核細胞、単球、リンパ球を10^<-0>Mデキサメサゾン(Dex),PHA/PMA or LPS存在下に12時間培養した。Northern blot法によりIL-10遺伝子発現を解析した。2.IL-10発現は非刺激下の単核細胞、単球、リンパ球からも認められ、5ug/ml LPSまたはPHA/PMA刺激により増強した。3.IL-10遺伝子発現は、Dexにより抑制されたが、10^<-6>Mの高濃度でもそれぞれ40%しか抑制されなかった。4.非刺激状態における明かな遺伝子発現、とその発現がステロイドでわずかしか抑制されないという結果は、TH2で産生され、アトピーを促進させるIL-4 IL-5などと非常に異なっており、IL-10遺伝子発現は、多くのサイトカインとは異なった調節を受けていると考えられた。気管支喘息は好酸球、リンパ球、肥満細胞の浸潤を伴う気道炎症性疾患と考えられる。ステロイドは喘息における最も強力な治療薬であるがその作用機序は明らかにされていない。IL5は好酸球に対し強力かつ特異的な増殖・活性化因子として作用し喘息の病態において重要な役割を演じている。IL10はTH2細胞より分泌されTH1細胞よりのサイトカイン産生を制御する。我々はステロイドのIL5、10発現に及ぼす影響を検討した。〔方法〕健常人単核球をDexamethasone(DEX)、PHA/PMA存在下に12時間培養した。培養液中のIL5濃度をELISA法で測定した。IL5、10遺伝子発現は、RT PCR/Southern blot法により解析した。〔結果〕IL5は非刺激下で産生を認めず、PHA/PMA刺激により1例で産生が認められ、Dexで抑制された。他の4例では測定限界以下であった。IL5遺伝子発現はPHA/PMA刺激により、全例で著しく増加した。このIL5発現は10^<-8>

M Dexで有意に、10^<-6>Mで90%以上抑制された。一方PHA/PMA刺激によるIL10発現はDexにより著明な抑制効果は認められなかった。〔考案〕Dexは強力にIL5産生と遺伝子発現を抑制した。DexはIL5遺伝子発現のレベルで抑制することにより、その産生を抑制すると考えられた。喘息におけるステロイドの作用はIL5の産生抑制が重要な役割を果たしていると考えられる。ステロイドはIL1、2、3、4、6、8、IFNγ、GM CSFなどの産生を抑制すると報告されている。今回の検討ではIL10はステロイドにより抑制されず、よって他のサイトカインとは違った制御を受けている可能性があり、今後検討していきたいと考えている。I.アトピー患者と健常者末梢血におけるIL-5遺伝子発現と産生に対するグルココルチコイドの作用1.健常人と、グルココルチコイド治療を受けていないアトピー患者の末梢血単核球をグルココルチコイド存在下にPHAとPMAにて刺激し、IL-5 mRNAと培養液中のIL-5を定量した。2.グルココルチコイドはヒト単核球からのIL-5産生を治療で用いられる低濃度を含め、濃度依存的に抑制した。3.グルココルチコイドはPHA/PMAによるIL-5遺伝子発現を著明に抑制し、IL-5遺伝子発現の抑制がIL-5産生抑制作用に於ける重要な機序であることを示した。4.グルココルチコイドによる抑制はアトピーと健常群間に有意差は認められなかった。5.グルココルチコイドは(1)PHA/PMAによる直接作用を抑制するとともに、更に、(2)IL-2などオートクライン/パラクラインシステムを介した増幅作用も抑制した。6.IL-5産生抑制はグルココルチコイドの治療薬としての作用機序の中で重要な位置を占めていると考えられた。II.ヒト末梢単球、リンパ球のIL-10遺伝子発現に対するデキサメサゾンの効果1.健常者末梢血から分離した単核細胞、単球、リンパ球を10^<-6>Mデキサメサゾン(Dex),PHA/PMA or LPS存在下に12時間培養した。Northern blot法によりIL-10遺伝子発現を解析した。2.IL-10発現は非刺激下の単核細胞、単球、リンパ球からも認められ、5ug/ml LPSまたはPHA/PMA刺激により増強した。3.IL-10遺伝子発現は、Dexにより抑制されたが、10^<-6>Mの高濃度でもそれぞれ40%しか抑制されなかった。4.非刺激状態における明かな遺伝子発現、とその発現がステロイドでわずかしか抑制されないという結果は、TH2で産生され、アトピーを促進させるIL-4 IL-5などと非常に異なっており、IL-10遺伝子発現は、多くのサイトカインとは異なった調節を受けていると考えられた。
情報更新のベイズ決定理論に基づく最適種苗放流計画

最適な効果的な種苗放流効果法を検討し計画するために,一般的には放流実験が推進されてきた。正攻法の進め方であるが実験計画のむずかしさや,同一条件で実験できないため要因選択の困難さが伴う。最近では視点を変えたやり方として,シミユレーション法も適用されつつある。種苗放流は少ない情報や不正確なデータのもとで,より多くの収益(少ない損失)を得るように最適な行動(放流計画)を決定しなければならない。ここでは,不確実な対象(目的,目標)に情報を入れ,これを推定しながら,次の行動を決定するという考え方を明示する(条件付確率を基としたベイズ決定方式という)。情報と意思との調和のもとで,放流という意思決定がなされ,決定のタイムリミットや情報を得る調査の費用との関連も数量的に表示できる。具体的な例として,長崎県平戸島の志々伎湾のマダイと遊漁の価値も高い淡水魚のアユをとり挙げる。放流計画は種苗の数・大きさ,放流時期・場所などの検討課題があるが,ここでは環境収容力が存在するとの前提下で,天然魚の資源量と放流種苗の数(数量的対応問題)のみ検討対象とした。事前情報は前年秋初春の産卵親量,産卵数,流下仔魚,追加情報I(データ,過去の知見)は春の稚魚数や遡上期の数,追加情報IIは初夏の着底期や解禁日前の生息数とした。天然魚資源量の状態と放流種苗数という行動の関数である効用関数(効用とは金額の望ましさの程度を示す値,損失関数を使うこともある)の作成,最適放流計画に関した事前情報の効果(価値,影響),追加情報の価値,追加情報IからIIへの情報更新などについて具体例と対応しながら精査した。
タンパク質リン酸化を選択的に認識する化学プローブの創製

本研究課題においては、Tb(III)錯体を利用して、タンパク質におけるチロシンリン酸化の直接可視化を目指した研究を行ってきた。当該年度においては、1.阻害剤の機能可視化による創薬への貢献を目指した展開、2.基質へのコンジュゲーションによる検出系の応用拡大、3.認識メカニズムの解明、という3点について研究を進めた。1.阻害剤の機能可視化前年度の段階においてチロシンキナーゼSrcの活性に対する阻害剤staurosporineの影響を可視化することに成功していたが、本年度においては幅広い酵素、阻害剤の組み合わせについてそれらを可視化し定量的に比較することに成功した。さらに、キナーゼと相補的に働くフォスファターゼの働き、フォスファターゼに対する阻害剤の効果をも可視化、定量することができた。既存の手法と比較してもよいシグナル/ノイズ比が得られることから、新規の阻害剤の評価系として発展させるうえで非常に有望な手法の1つであるといえる。2.コンジュゲーションによる検出系の拡大Huisgen環化付加反応によって基質にコンジュゲーションすることのできるTb(III)錯体Tb_2-Lclyneを合成した。基質ペプチドとしては、より反応観察に適切であるAbltideを用い、Ablによる反応を可視化することとした。コンジュゲーション反応とコンジュゲートペプチド精製の最適化を行ったところ、リン酸化反応に従って大幅に発光強度が増大する系を構築することに成功した。従来のTb_2-L^1では可視化できなかったターゲットも可視化できたことから、検出系の拡大に寄与する結果となった。3.認識メカニズムの解析リン酸化TyrのモデルであるPhOPと比較的強く相互作用するTb(III)複核錯体Tb_2-L^1を用い、エネルギー伝達効率を求めることで、フェノール部位とTb(III)イオンとの距離が7.64Åと決定された。これは、リン酸部位が2つのTb(III)イオンと、それぞれ水1分子を介して相互作用するモデルとよく一致する。このことから、Tb2-L1の2つのTb(III)イオンが協同的に作用することが示唆された。本研究課題においては、Tb(III)錯体を利用したTyrリン酸化検出システムを利用して、(1)タンパク質Tyrリン酸化の直接イメージングのための、高選択性かつ高い応答を示すTb(III)錯体の探索、(2)Tb(III)錯体のコンジュゲーションによる抗体の機能化という2点の研究を行っている。本年度、(1)に関しては、多種のリン酸基認識メカニズムを有する複数のTb(III)錯体を合成、評価した。しかし、いずれにおいても高い応答は観測されなかった。(2)に関しては、Tb(III)錯体の<酵素反応の基質ペプチドへの導入>→<基質タンパクへの導入>→<抗体等認識分子への導入>という順で検討を行うこととした。まず、以前の報告において最も良好なTyrリン酸化への応答・選択性を示したTb(III)錯体に反応性官能基を導入することで、正電荷を有するTyr含有ペプチドのC末端へとTb(III)錯体をコンジュゲーションした。これを基質とし、酵素的リン酸化を行ったところ、Tyrリン酸化に伴って発光強度が増大する様子を観察することに成功した。本手法により、負電荷を有するペプチドに限定されていたTb(III)錯体によるTyrリン酸化検出系を、より広汎な検出系へと展開することができた。さらに、チロシンキナーゼ阻害剤のスクリーニングにTb(III)錯体による負電荷をもつペプチドのTyrリン酸化検出系(以前に報告のもの)を用いる評価を進めた。本系では、ペプチドの酵素的リン酸化に伴って発光応答の上昇が観測されるため、阻害剤の効果がリアルタイムに観察できる。既知の阻害剤を用いてモデル実験を行ったところ、発光応答の抑制を観測することに成功した。現在、これを実際に定量手法へと展開するシステムを構築している。これらの研究は、in vitroでのタンパク質リン酸化解析、阻害剤のスクリーニング等、生命科学・創薬で利用できる有効なツールへとつながることが期待される。

コンジュゲーション反応とコンジュゲートペプチド精製の最適化を行ったところ、リン酸化反応に従って大幅に発光強度が増大する系を構築することに成功した。従来のTb_2-L^1では可視化できなかったターゲットも可視化できたことから、検出系の拡大に寄与する結果となった。3.認識メカニズムの解析リン酸化TyrのモデルであるPhOPと比較的強く相互作用するTb(III)複核錯体Tb_2-L^1を用い、エネルギー伝達効率を求めることで、フェノール部位とTb(III)イオンとの距離が7.64Åと決定された。これは、リン酸部位が2つのTb(III)イオンと、それぞれ水1分子を介して相互作用するモデルとよく一致する。このことから、Tb2-L1の2つのTb(III)イオンが協同的に作用することが示唆された。本年度、研究内容(1)に関しては、複数の錯体を合成し、それを評価したものの、そこから得られる情報が非常に少なく、これ以上の展開が難しくなっている。しかしながら、研究内容(2)に関しては、当初方針とはコンジュゲートの作製手法を変更したものの、そのことにより、ペプチドのリン酸化をリアルタイムに検出することに成功している。また、当初方針にはなかった、チロシンキナーゼ阻害剤の阻害効果をモニターすることに成功しており、本手法を、生命科学研究・創薬において実際に利用できるものへと展開する基礎を築くことができたと考えている。以上により、半分は計画未達、半分は計画以上の進展であると評価した。今後は、研究内容(2)を中心に据え、コンジュゲートによるペプチドリン酸化検出を確実に定量的なものとし、さらに、これをタンパク質リン酸化検出手法へと展開する計画である。その際、実績の概要でも述べたように、まず基質タンパクへのTb(III)錯体の導入を行い、続いて認識分子への導入をする。それぞれのレベルでリン酸化を発光によって検出するとともに、それを定量的に解析する計画である。また、阻害剤のスクリーニングの系については、それが定量的なものであることを確認するとともに、新規阻害剤の探索へと進める手法について検討する計画である。