hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
両大戦間期日本における「株主の法人化」の再検討

本研究課題は、両大戦間期に見られた「株主の法人化」現象について、その時期・経路・背景を詳細に分析する作業を通じて、戦前・戦時・戦後における企業システムの変容プロセスに関する通説に対して、一定の修正を加え、新たな歴史観を提示することを課題としている。研究期間4年間のうち最終年度にあたる平成30年度は、基礎作業(株主構成と株式市場に関する資料の収集とデータ整理作業、など)をある程度重視する段階を終え、具体的な分析を進め、成果をまとめて公表することを重視した。研究成果のうち、株式所有構造の変化に影響を与える資金調達方法に関する分析として、本研究課題の初年度以降取り組んできた「変態増資」に関する研究を発展させ、株式分割払込制度を前提とした「変態増資」と株式時価発行の関係について検討した論文を公表した。一方、同じく株式所有構造の変化との関係で重要になる、株式分割払込制度と株価の関係を検証する研究については、暫定的な成果を英語論文にまとめ、2018年9月にフランクフルト(ドイツ)で開催されたGUG/BHSJ Joint Conferenceにおいて報告した(報告論文については、同コンファレンスで寄せられたコメントを踏まえて改稿作業中)。この報告を行った際、フロアからの関心は予想以上に高く、イギリス、ドイツにも日本の株式分割払込制度と同様の制度が存在したが、やはり株価との関係については十分に解明されていないとのコメントを得た。現段階では国際比較を行うだけの準備は整っていないが、本研究課題終了後の方向性として、国際比較の準備を整えることを目指したい。また、戦間期における特定の産業に着目してその企業金融を検討する作業の一環として、当時の代表的な産業の1つであった製糖業の企業金融を具体的に検証する複数の論文を公表した。本研究課題は、両大戦間期の「株主の法人化」現象について再検討することを目的とし、(1)上位12株主のみを対象とした志村[1969]の分析を13位以下の少数株主を加えて再検証、(2)志村[1969]が取り上げた1919年、36年だけでなく中間の数時点を加えた詳細な分析を行い、「株主の法人化」が発生した時期・経路を特定、(3)「株主の法人化」で後退した個人株主の投資行動の背景となっていた株式担保金融の変化の検証、(4)企業経営への影響の分析、の4点を具体的な課題としている。そして、第1年度にあたる平成27年度は、(1)基礎作業の面で、1株主名簿と銀行帳簿の収集に着手し、2データの整理作業については、株主名簿に関する作業を先行して進めるとともに、(2)分析面では、11936年における大企業の株主構成を、少数株主も含めて再検証する作業を先行して進め、同時に、2データ整備作業の進捗を見ながら、「株主の法人化」の時期・経路に関する予備的考察を行うことを課題とした。このうち、(1)基礎作業の面においては、銀行帳簿を対象とする資料調査について若干の遅れがあるが、全体としては概ね計画通りに作業を進めた。一方、(2)分析面では、株式分割払込制度について先行研究を整理したうえで、それらの問題点を指摘するとともに、新たな分析視角を提示する論稿を発表した(同論文で提示した視角に基づいて実際の分析を行うことは、平成28年度の課題となる)。また、株式所有構造に関する分析のうち、M&Aにともなう変化という経路に関する分析を先行的に進め、明治製糖による変態増資(別会社を設立し直後に合併する形式の増資)の事例を分析した論文が学会誌に採択された(近刊)。また、変態増資については、明治製糖の事例のみにとどまらず、他の代表的な事例を含めた比較分析をも進め、経営史学会関西部会12月例会(大阪大学)で報告を行った。平成27年度の具体的な計画は、(1)基礎作業の面で、1株主名簿と銀行帳簿の収集に着手し、2データの整理作業については、申請者(齊藤)に経験の蓄積がある株主名簿に関する作業を先行して進めること、および、(2)分析面で、1先行研究の整理を進めるとともに、21936年における大企業の株主構成を、少数株主も含めて再検証する作業を先行して進め、同時に、3データ整備作業の進捗を見ながら、「株主の法人化」の時期・経路に関する予備的考察を行うことであった。このうち、(1)基礎作業の面で、1のうちの銀行帳簿を対象とする資料調査について若干の遅れがある。逆に、(2)分析面では、研究課題の第1年度の段階で、既述(「研究実績の概要」欄)のように、学会誌への採択決定1本(近刊)、その他の論文1本、学会報告1本という成果を残すことができ、予定よりも順調に進展しているといえる。以上を総合して、全体としては「おおむね順調に進展している」と判断した。

研究期間4年間のうち第2年度にあたる平成28年度は、(1)基礎作業の面で、1株主構成と株式市場に関する資料の収集とデータ整理作業、2株式担保金融に関する資料(各地の公文書館等に所蔵された銀行帳簿から得られる貸出先に関する情報)の収集とデータ整理作業を進めること、および、(2)分析面で、「株主の法人化」の時期・経路・背景に関する分析のうち、株式分割払込制度やM&A(その特殊な形態の1つが後出の「変態増資」)などの着手可能なテーマに関する分析を進め、研究成果の少なくとも一部を公表することを課題として研究を進めた。このうち、(1)基礎作業の面については、株式担保金融に関する資料の収集とデータ整理作業の進捗はやや遅れたものの、株主構成と株式市場に関する作業を中心に、全体としては概ね計画通りに作業を進めた。一方、(2)分析面については、「株主の法人化」と関係のある具体的なテーマのうち、「変態増資」(M&Aの一形態)について、明治製糖の事例を分析した論文を学会誌『経営史学』に公刊するとともに、東京モスリン紡織の事例を分析し、明治製糖の事例との比較を行った論文を大学紀要に公表した。また、複数の「変態増資」の事例を比較分析した成果を、日本金融学会春季大会(武蔵大学)で報告するとともに、戦前日本における企業金融を規定した重要な制度である株式分割払込制度について、先行研究が十分に分析していなかった株価との関係から検証した成果を、経営史学会関西部会大会(阪南大学)で発表した。研究期間(4年間)のうち第2年度にあたる平成28年度は、(1)基礎作業の面では、1株主構成と株式市場に関する資料の収集とデータ整理作業、2株式担保金融に関する資料の収集とデータ整理作業を進めること、および、(2)分析面で、「株主の法人化」の時期・経路・背景に関する分析のうち、着手可能なテーマに関する分析を進め、研究成果の少なくとも一部を公表することを課題とした。このうち、(1)基礎作業の面では、資料調査に時間・手間を要する株式担保金融に関する部分にやや遅れが生じているが、株主構成と株式市場に関する資料収集とデータ整理作業は順調に進展している。一方、(2)分析面では、戦前日本の企業金融を大きく規定した制度的な特徴の1つである株式分割払込制度や、戦間期における特徴的な資金調達形態である「変態増資」などのテーマを中心に、学会誌への公刊論文(査読付)1本、その他論文1本、学会発表3回という成果を残すことができた。この面においては、研究期間の半分が経過した時点としては、順調な進捗状況にあるといえる。以上を総合的に評価して、「おおむね順調に進展している」と評価した。本研究課題は、両大戦間期に見られた「株主の法人化」現象について、その時期・経路・背景を詳細に分析する作業を通じて、戦前・戦時・戦後における企業システムの変容プロセスに関する通説に対して、一定の修正を加え、新たな歴史観を提示することを課題としている。研究期間4年間のうち第3年度にあたる平成29年度は、基礎作業(株主構成と株式市場に関する資料の収集とデータ整理作業、など)をある程度重視する段階から、具体的な分析を進め、成果をまとめて公表することをより重視する段階へと移行し、(1)論文の公刊、および、(2)その前提となる研究報告を行うことを主な目標とした。このうち、(1)論文の公刊については、本研究課題の初年度以降取り組んできた「変態増資」に関する研究の成果として、日本鋼管による変態増資の事例を取り上げ、その背景を検証する論文を公刊するとともに、戦前から近年までを視野に入れ、資本市場と企業経営の関係を歴史的に位置づける論稿を公表した。なお、変態増資については、事例分析の成果が蓄積されてきたことから、比較検討を行ったうえで、その成果をまとめ、学術誌に投稿した。
インドネシアのデングウィルスの分離と新分離株の分子遺伝学的解析及び成果のまとめ

昭和62年度に本研究補助金を得て、別記の構成による研究班をもって、インドネシア国、主としてジャカルタ市及びその周辺地域、並びに日本国内の夫々の研究室において標記の共同研究を開始した。昭和63年度では、さらに若干の補遺的研究を続行した(但し、インドネシア国へ出向の旅費は別途財源より支出された)。得られた成績(現在続行中の研究を含む)は次のごとく要約される。1.ウイルスの分離とその同定並びに型別:偶々、ジャカルタ市及びその周辺地域において昭和62年秋より今63年春にかけてデング熱の大流行が起こった。臨床的にデング出血熱(DHF)と診断された患者(グレイドI-IVを含む)の末梢血より細胞培養(ヒトスジシマカ及びハムスター賢由来)を用いてウイルスの分離を実施した。接種培養についてポリクローナル抗血清による蛍光抗体染色(FA)により一次的な検索を行い、その陽性例からlimiting dilution法によってウイルス・クローンを獲得した。それらについて血球凝集抑制試験(HI)及び中和試験(NT)、並びに二、三の生物学的試験を行ってデングウイルス(DV)と同定されたもの17株を得た。これに関して型特異的モノクローン抗体(別途にハイブリドーマ細胞培養より作製したもの)を用いて型別を行った。その結果、17株中、1型が3株、3型が14株と判定された。従って、昭和62ー63年度のジャカルタのデング熱流行では3型ウイルスが主役を演じたことが確定された。これらのウイルス株は凍結保存し、以後の研究に供試する予定である。また、他研究者より要請があれば随時分与供給する用意がある。2.臨床病態血液学的研究:DHF患者について各種の血液学的検査を遂行した。特に、フイブリン形成能及び血小板の動態について観察した。得られた成績を概括すると:(1)フイブリン形成能に著明な変化が認められた。しかし、詳しく調べてみると、ある症例ないし病期ではフイブリン形成が阻害されて強い出血を来しているものがある反面、他の症例ないし病期ではフイブリン形成阻止の機能が低下する結果、却ってフイブリン形成が過度に進み、従って著明な血栓形成の起こっているものもあった。また、一旦形成されたフイブリンの溶解性が過度に高まることがあり、要するに、DHFにおいてはフイブリン形成の過程が極度に変動していることが証明された。(2)血小板はDHFのいずれの症例においても強く減少した。別途に行ったin vitroの実験的研究において、ヒト血小板とDVとが特異的反応を起こすことを明らかにしたが、おそらく同様なことがin vivoでも生起するのであろうことが推定された。これらの現象が相互に関連して強い出血を来すと考えられた。3.新分離ウイルスの分子遺伝学的解析:上記17株の新分離ウイルス株より、特定のもの(グレードIIIまたはIVの患者よりの分離株の内、1型2株、3型2株)について分子生物学的・分子遺伝学的解析を行っている。すなわち、ウイルスを精製し、それよりgenomic RNAを抽出し、その3'末端における複製開始の機序を究明すると共に、その遺伝子を大腸菌において発現させる実験を実施している。それに併せて、精製ウイルス及び感染細胞からウイルスのE蛋白及び非構成蛋白(NS1、NS3、NS5等)を抽出して、その生物学的・免疫学的性状を追求している。なお、DVの知見を確実ならしめるため、同様の研究を日本脳炎ウイルスについて遂行し、両者を比較してフラビウイルス全般の特性を究明することを目標とし、さらにそれらの知見とこれら感染症の疫学との関連を考究する計画である。4.新分離ウイルスのオオカへの接種実験並びに蚊組織内のウイルス増殖機構の研究:オオカ(Toxorhynchites)を実験室内にて系統飼育し、性、日令、生活条件等を厳密に一定したものを用い、これにウイルスを胸腔内注射により感染せしめ、時を追うて蚊体内のウイルスの動きを調べている。すなわち、蚊各種組織内のウイルスを定量すると共に、当該組織材料を免疫電顕法により観察してウイルス粒子の所在及び形態を観察している。なお、上記3の項目と同じく、DVの知見を確実ならしめるため、同様の研究をチクングニアウイルスについて遂行し、両者の特徴を比較検討することにしている。

これに関して型特異的モノクローン抗体(別途にハイブリドーマ細胞培養より作製したもの)を用いて型別を行った。その結果、17株中、1型が3株、3型が14株と判定された。従って、昭和62ー63年度のジャカルタのデング熱流行では3型ウイルスが主役を演じたことが確定された。これらのウイルス株は凍結保存し、以後の研究に供試する予定である。また、他研究者より要請があれば随時分与供給する用意がある。2.臨床病態血液学的研究:DHF患者について各種の血液学的検査を遂行した。特に、フイブリン形成能及び血小板の動態について観察した。得られた成績を概括すると:(1)フイブリン形成能に著明な変化が認められた。しかし、詳しく調べてみると、ある症例ないし病期ではフイブリン形成が阻害されて強い出血を来しているものがある反面、他の症例ないし病期ではフイブリン形成阻止の機能が低下する結果、却ってフイブリン形成が過度に進み、従って著明な血栓形成の起こっているものもあった。また、一旦形成されたフイブリンの溶解性が過度に高まることがあり、要するに、DHFにおいてはフイブリン形成の過程が極度に変動していることが証明された。(2)血小板はDHFのいずれの症例においても強く減少した。別途に行ったin vitroの実験的研究において、ヒト血小板とDVとが特異的反応を起こすことを明らかにしたが、おそらく同様なことがin vivoでも生起するのであろうことが推定された。これらの現象が相互に関連して強い出血を来すと考えられた。3.新分離ウイルスの分子遺伝学的解析:上記17株の新分離ウイルス株より、特定のもの(グレードIIIまたはIVの患者よりの分離株の内、1型2株、3型2株)について分子生物学的・分子遺伝学的解析を行っている。すなわち、ウイルスを精製し、それよりgenomic RNAを抽出し、その3'末端における複製開始の機序を究明すると共に、その遺伝子を大腸菌において発現させる実験を実施している。それに併せて、精製ウイルス及び感染細胞からウイルスのE蛋白及び非構成蛋白(NS1、NS3、NS5等)を抽出して、その生物学的・免疫学的性状を追求している。なお、DVの知見を確実ならしめるため、同様の研究を日本脳炎ウイルスについて遂行し、両者を比較してフラビウイルス全般の特性を究明することを目標とし、さらにそれらの知見とこれら感染症の疫学との関連を考究する計画である。4.新分離ウイルスのオオカへの接種実験並びに蚊組織内のウイルス増殖機構の研究:オオカ(Toxorhynchites)を実験室内にて系統飼育し、性、日令、生活条件等を厳密に一定したものを用い、これにウイルスを胸腔内注射により感染せしめ、時を追うて蚊体内のウイルスの動きを調べている。すなわち、蚊各種組織内のウイルスを定量すると共に、当該組織材料を免疫電顕法により観察してウイルス粒子の所在及び形態を観察している。なお、上記3の項目と同じく、DVの知見を確実ならしめるため、同様の研究をチクングニアウイルスについて遂行し、両者の特徴を比較検討することにしている。
DNA含有免疫複合体が自然免疫を介してループス腎炎の病態に及ぼす影響について

小児期発症SLE患者の腎組織のTLR9の免疫染色を行ったところ、糸球体におけるTLR9の発現は、正常の糸球体やループス腎炎寛解期の糸球体では認められず、腎炎の増悪期にのみ認められた。さらに、TLR9とSynaptopodinの二重染色により、TLR9は糸球体上皮細胞に一致して発現していることが判明した。また、TLR9が強発現する時期は、血清学的に抗二重鎖DNA抗体価の上昇と低補体血症を認める時期であり、血中にDNA含有免疫複合体が多い時期に一致することが推測された。また、ループス腎炎の急性期や増悪期には、synaptopodin、nephrin、podocin等の糸球体上皮細胞スリット膜関連蛋白の発現が低下する事実から、TLR9が糸球体上皮細胞傷害に関与している可能性が推測された。これらの結果より糸球体上皮細胞は、TLR9を介してループス腎炎における炎症病態や糸球体上皮細胞傷害に関与する可能性が推測された。本研究は、ヒトのループス腎炎とTLR9の関わりを明らかにした初めての報告である。今回の知見は、ループス腎炎の活動性の新たな指標や自然免疫系をターゲットとした新たな治療法の開発などにつながる可能性を秘めている。全身性エリテマトーデス(SLE)の自己免疫異常の代表として、DNAに対する自己抗体産生が挙げられる。また、末梢血液中にはDNA含有免疫複合体が発見される。一方、Toll-like receptor9(TLR9)は、細菌由来のDNAを認識し免疫を活性化する自然免疫受容体である。主症状であるループス腎炎において、TLR9と病態との関与について検討した。SLE患者の腎組織の免疫染色を行い、TLR9が糸球体上皮細胞領域に発現していることを発見した。TLR9の発現は治療により減少し、腎炎の重症度と相関する傾向にあった。一方、健常人の腎組織ではTLR9の発現は殆ど見られなかった。また、ループス腎炎の急性期や増悪期には、synaptopodin、nephrin、podocin等の糸球体上皮細胞スリット膜関連蛋白の発現が減少傾向にあることを発見した。これらの事実をin vitroにて確認するために、培養糸球体上皮細胞をDNA含有免疫複合体で刺激した。その結果、無刺激では発現のない、TLR9mRNAの発現が誘導された。さらに、CpGオリゴヌクレオチドの刺激に対してもTLR9発現が誘導された。昨年に引き続き、SLE患者の腎組織の免疫染色を継続した。糸球体におけるTLR9の発現は、正常の糸球体やループス腎炎寛解期の糸球体では認められず、腎炎の増悪期のみに認められた。また、TLR9が強発現する時期は、血清学的に抗二重鎖DNA抗体の上昇と低補体血症を認める時期であり、血中にDNA含有免疫複合体が多い時期に一致することが推測された。前年度に明らかにした、ループス腎炎の急性期や増悪期には、synaptopodin、nephrin、podocin等の糸球体上皮細胞スリット膜関連蛋白の発現が減少傾向にある事実から、TLR9が糸球体上皮細胞傷害に関与する可能性が推測された。この結果を基にマウス由来糸球体上皮細胞(MPC)をcytokineやDNA含有免疫複合体で刺激し、real time PCRでTLR9の発現を評価した。この結果、正常では認められなかったTLR9の発現が認められたものの、統計学的な有意差を認める程度ではなく、MPC自体の特性も問題であると考えられた。そこで、MPCにTLR9遺伝子の導入を行い、同様の刺激を行ったところ、MIP1αやINF-βの発現増強を認めた。このことよりTLR9を発現した糸球体上皮細胞は、DNA含有免疫複合体によりループス腎炎における炎症病態に関与することが推測された。
ホイスラー型結晶構造を持つ新規トポロジカル絶縁体薄膜の創製

トポロジカル絶縁体と予測されているホイスラー型結晶構造を持つLaPtBi薄膜のエピタキシャル成長方法の確立と、光電子分光法や電気伝導測定などによる物性解明を目的として研究を行った。高規則度LaPtBiエピタキシャル薄膜の成長方法を確立することが出来た。紫外光電子分光により第一原理計算結果とおおむね一致する価電子帯スペクトルが得られた。磁気抵抗効果などの電気伝導測定から、線形なバンド分散および高移動度キャリアの存在が示唆された。これらの成果は、ホイスラー合金LaPtBiがトポロジカル絶縁体の有力な候補であることをはじめて実験的に示したものである。平成25年度は、トポロジカル絶縁体と予測されているハーフホイスラー合金LaPtBi薄膜の結晶構造と電子状態の関連について研究を行った。La、Pt、Biの各元素は、単位胞内でそれぞれ特定のサイトを占める(=規則化する)ことがトポロジカル物性の発現に不可欠である。そこで、高い規則度を有するエピタキシャル薄膜を得るために詳細な成長条件探索を行った。成長温度や各元素の堆積レートなどを厳密に制御することで、平成24年度では0.6程度であったC1規則度が0.9以上まで向上する条件を見出した。そのようなLaPtBi薄膜の価電子帯の電子構造を紫外光電子分光(UPS)により測定したところ、C1規則度によってPtに由来する価電子帯スペクトルが変化し、C1規則度が高い方がシャープな形状を示した。また、C1規則度0.72程度の(001)LaPtBiではフェルミエネルギーにおいて価電子帯スペクトルの立ち上がりが存在しており、C1規則度0.94程度の(111)LaPtBiではフェルミエネルギーでの立ち上がりは小さくなった。規則度の向上にともないフェルミエネルギーにおける状態密度が減少し、ギャップが開く兆候をとらえた結果であるといえる。電気伝導測定から、C1規則度とキャリア濃度の対応関係について、規則度が高い方がキャリア濃度は低く、移動度は高くなる傾向を示した。これはUPSで見られた傾向と一致している。また、一般にローレンツ力により2次曲線の挙動を示す磁気抵抗効果が、本研究のLaPtBi薄膜では線形成分を含むことが分かった。これは線形なバンド分散に由来する可能性があり、以上の結果から本研究で作製したLaPtBi薄膜がトポロジカル絶縁体としての有力な候補であることを示すことが出来た。さらにトポロジカル物性を発現させるためには、格子歪の導入が不可欠であり、今後の研究課題である。平成24年度は、トポロジカル絶縁体と予測されているホイスラー型結晶構造を持つLaPtBi薄膜のエピタキシャル成長方法の確立と、光電子分光法や電気伝導測定などによる物性解明を目的として研究を行った。薄膜成長には多元スパッタリング装置を用いた。各元素の堆積速度を独立に制御することで薄膜の組成を調整するとともに、基板温度などのパラメータを精密に制御することにより、LaPtBiのエピタキシャル薄膜の成長方法を確立することが出来た。具体的には、YAlO3(001)基板上には面直方向に(001)面が成長したエピタキシャル薄膜が、Al2O3(0001)基板上には面直方向に(111)面が成長したエピタキシャル薄膜が、それぞれ275°Cという低温で得られることが分かった。このように、適切な基板を選ぶことで、LaPtBi薄膜の成長方位を制御することが可能になった。また、紫外光電子分光によりこれらの薄膜の荷電子帯のスペクトルを測定したところ、他グループにより報告されているLaPtBiの状態密度の第一原理計算結果とおおむね一致するスペクトルが得られた。角度分解光電子分光からも、作製したLaPtBi薄膜が計算によるバンド構造と類似する特徴を持っていることが示された。これらの成果は、ホイスラー合金LaPtBiがトポロジカル絶縁体の有力な候補であることをはじめて実験的に示したものであり、さらに研究を続けることでホイスラー型トポロジカル絶縁体の実現が期待される。また、ドイツなどで他に数グループが、異なる元素を用いたホイスラー型トポロジカル絶縁体薄膜の研究を行っているが、すべて成長温度が600°C程度以上の高温である。本研究における275°Cという低温成長は、薄膜の組成制御という点で有利であるとともに、今後、超伝導体や磁性体との積層による量子デバイスへの応用に向けて、積層界面の制御という面でも大きな利点となる。平成24年度は、LaPtBi薄膜のエピタキシャル成長方法を確立した。

275°Cという低温で薄膜成長させることで、組成制御を精密に行うことが出来るようになるとともに、適切な基板を選ぶことで成長方位の制御が可能となり、面直方向に(001)または(111)面が成長するエピタキシャルLaPtBi薄膜が得られた。これらの薄膜の電気伝導特性としては、これまでバルク試料で報告されているのと同じp型キャリアであったが、本研究で作製した薄膜はキャリア濃度がバルク試料や第一原理計算より1桁2桁ほど高い値を示した。紫外光電子分光を行ったところ、価電子帯のスペクトルはおおむね第一原理計算結果と一致していたが、フェルミエネルギー付近のスペクトル形状に計算との相違が見られ、予想より高いp型キャリア濃度を示しているのと一致する結果となった。低温での薄膜成長は組成制御には有利であるが、結晶構造を決めるもうひとつの重要なパラメータであるC1b規則度が低下し、その結果、キャリア濃度が増加していることが考えられる。今後は、規則度と組成を同時に最適条件にするように後処理方法などの検討を行い、キャリア濃度を出来る限り減少させることが必要である。一方で、成長方位の異なる薄膜の作りわけが可能になったことで、光電子分光や電気伝導測定による物性解明が進みつつあり、研究はおおむね順調に進展しているといえる。LaPtBiをはじめとするホイスラー合金は、格子歪を導入することでトポロジカル絶縁体になると考えられているが、今後、格子歪を系統的に制御できればトポロジカル絶縁体としての特性が現れてくると期待される。平成24年度から引き続き、当面の課題であるエピタキシャルLaPtBi薄膜の規則度と組成を同時に最適条件にするような作製条件の検討を行うと同時に、結晶構造と伝導特性などの物性の相関を明らかにしていく。シュブニコフ・ドハース振動の観測などを用いた表面状態の電気伝導特性の解明を行う。構成元素、格子歪、格子欠陥などとARPES観測結果、電気伝導測定結果、理論予測を比較し、ホイスラー型トポロジカル絶縁体を実現するために重要な要素を明らかにする。トポロジカル絶縁体と実証されたものについては、様々な基板上に薄膜成長し、表面伝導層におよぼす格子歪の効果を明らかにする。解析手法は低温におけるシュブニコフ・ドハース振動測定および抵抗率やホール効果の温度依存性により行う。その後、トポロジカル絶縁体/強磁性体接合の作製と電気磁気効果の発現を狙う。トポロジカル絶縁体と実証されたものについて、強磁性ホイスラー合金との積層構造を作製し、トポロジカル絶縁体で予測されている電気磁気効果の発現を目指す。成長温度、アニール温度、堆積速度などの最適化により急峻なトポロジカル/強磁性界面を実現する。界面構造の評価は透過型電子顕微鏡や原子間力顕微鏡などを用いて行う。電界を印加しながら磁気光学カー効果または異常ホール効果によって強磁性層の磁気状態の変化を観測する。最終的に、ホイスラー型トポロジカル絶縁体を実現するために重要な要素を明らかにすること、また、ホイスラー型トポロジカル絶縁体の表面状態の物性を解明すること、トポロジカル絶縁体/強磁性体接合における電気磁気効果を発現すること、の3点を達成する。薄膜成長に用いるターゲットや単結晶基板が必要である。特に、上で挙げた薄膜成長における問題点の解決には新しいターゲット形状の検討が必要と考えている。電気伝導測定において、適切なキャップ層を検討し、ターゲットを購入する。低温での角度分解光電子分光や電気的測定を行うため液体ヘリウムが必要となる。
酸化還元エネルギー

ミトコンドリア電子伝達系における電子伝達とエネルギー転換の機構を解明するために,その生理機構を支える構造の解明と同時に病態における構造異常と機能異常との関連を追究し,下記の諸点につき新知見を得た.小澤らはヒトのチトクロムc1のcDNAを単離し,その前駆体の全構造を明らかにしたさらに,その遺伝子が第8染色体の上にあることを確定し,その遺伝子の上流域の解析をすすめている.一方,種々の脳筋症の病型における電子伝達系酵素サブユニットの欠損の検索を行い,ミトコンドリアDNA自身の変異によってサブユニット欠損が生じている可能性を示唆した.多口らは,電子伝達系酵素欠損症の病態を明らかにするために,少量の培養線維芽細胞を用いて乳酸/ピリビン酸比および電子伝達系酵素活性を測定する方法開発した,これを用いて110例の患者の中から複合体I欠損症7例複合体IV欠損症3例を見出し,本法が酵素欠損症のスクリーニング法として有用であることを示した.松原らは遺伝子操作技術を駆使して酵母抗のチトクコムCの構造と機能の解析を行った.すなわち, DNA導入により作製した2種のC1遺伝子欠損株を分析した結果,チトクロムC1のC末端側の疏水性領域は内膜への局在化には必要ないが,複合体IIIのアッセンブリーに必須であることを明らかにした.折井らは酸化還元駆動性プロトンポンプの作用機構を明らかにするために,チトクロム酸化酵素と酵素の反応をflow-flash法によってまたプロドンの動きをPH指示薬によって同時測定を行った.解析の結果,酵素の分子内電子移動の過程においてプロトンが局折的に移動することを示唆する知見が見られた.佐藤らはミトコンドリア脳筋症における電子伝達系酵素異常をプロテインA-コロイドゴールド法により免疫電子顕微鏡的検討し,異常ミトコンドリア内の結晶様封入体では電子伝達系酵素が存在しないことをはじめて明らかにした.ミトコンドリア電子伝達系における電子伝達とエネルギー転換の機構を解明するために,その生理機構を支える構造の解明と同時に病態における構造異常と機能異常との関連を追究し,下記の諸点につき新知見を得た.小澤らはヒトのチトクロムc1のcDNAを単離し,その前駆体の全構造を明らかにしたさらに,その遺伝子が第8染色体の上にあることを確定し,その遺伝子の上流域の解析をすすめている.一方,種々の脳筋症の病型における電子伝達系酵素サブユニットの欠損の検索を行い,ミトコンドリアDNA自身の変異によってサブユニット欠損が生じている可能性を示唆した.多口らは,電子伝達系酵素欠損症の病態を明らかにするために,少量の培養線維芽細胞を用いて乳酸/ピリビン酸比および電子伝達系酵素活性を測定する方法開発した,これを用いて110例の患者の中から複合体I欠損症7例複合体IV欠損症3例を見出し,本法が酵素欠損症のスクリーニング法として有用であることを示した.松原らは遺伝子操作技術を駆使して酵母抗のチトクコムCの構造と機能の解析を行った.すなわち, DNA導入により作製した2種のC1遺伝子欠損株を分析した結果,チトクロムC1のC末端側の疏水性領域は内膜への局在化には必要ないが,複合体IIIのアッセンブリーに必須であることを明らかにした.折井らは酸化還元駆動性プロトンポンプの作用機構を明らかにするために,チトクロム酸化酵素と酵素の反応をflow-flash法によってまたプロドンの動きをPH指示薬によって同時測定を行った.解析の結果,酵素の分子内電子移動の過程においてプロトンが局折的に移動することを示唆する知見が見られた.佐藤らはミトコンドリア脳筋症における電子伝達系酵素異常をプロテインA-コロイドゴールド法により免疫電子顕微鏡的検討し,異常ミトコンドリア内の結晶様封入体では電子伝達系酵素が存在しないことをはじめて明らかにした.
マガキの健康に有用な血リンパマイクロバイオーム：環境ストレスの影響とその回復

本年度は、低溶存酸素ストレス区、すなわち16°C・DO 8.2 mg/L、16°C・DO 1.9 mg/L、25°C・DO 7.1 mg/L、25°C・DO 2.1 mg/L区に加えて、低塩分ストレス区、すなわち25 psuおよび20 psu区を設けた。メタゲノム解析はマガキ血リンパ試料について行い、結果を操作的分類単位(OTU)解析に供した。メタゲノム解析の結果から、低DOの区では細菌種の多様性が大きく減少していることが示された。これらのことから、マガキ血リンパの細菌叢に対する影響は、水温のみでは定常状態を損なうほどではないが、低DOが加わることにより著しい変化を示すことが明らかとなった。また、低塩分ストレス区では細菌叢が著しく変化した。OTUは有意に減少したことから、ストレスによって特定の細菌群が優占したと考えられた。低溶存酸素ストレス区で認められた試験期間中の死亡などは、低塩分ストレス区では見られなかった。そのため、現時点ではこれらの細菌群がどこまでマガキに悪影響を与えるかは明らかではない。しかし、一般に細菌叢の多様性が損なわれると、健康被害が高まることが知られているので、長期間の低塩分曝露は注意を要することが示唆された。昨年度までの結果で示唆されたこと、すなわち複数のストレス負荷により、細菌叢は深刻な損傷を受け、元の通常範囲内の細菌叢へ戻ることが不可能になったことで、細菌叢および宿主であるマガキに悪影響を与え、結果的に多くの死亡個体が現れたことに対して、上で示した本年度に実施した単一ストレス区の結果を考え合わせると、単一の環境ストレスのみでも、ストレスの負荷により細菌叢に変化が生じ、その条件に適応した細菌グループが独占するようになり、細菌叢は平常とは異なるものとなる。しかし、ストレスの程度に依存するが、本試験で行ったレベルでは、元の通常範囲内の細菌叢へ戻ろうとする傾向が示され、結果的にマガキの健康を損なうまでには至らなかったと考えられる。マイクロバイオームは一種の微生物生態系として、免疫応答など宿主の基本的な生理機能を助ける重要なものとして知られる。本研究は、これまでほとんど明らかにされていない、海産二枚貝マガキの血リンパに形成されるマイクロバイオームについて、以下のことを目的とする。1)健常個体のマイクロバイオームについて、組成や菌数を季節ごとに明らかにする。2)マイクロバイオームと宿主の相互制御のしくみとして、生体防御能との関連を明らかにする。3)環境ストレスや病原菌の感染が、マイクロバイオームの組成や菌数に与える影響を知る。4)3)でのマイクロバイオームの変化が、宿主の生理機能に与える影響を評価する。本年度は、特に1)の健常個体の持つマイクロバイオームを知ることと、3)の環境ストレスを人為的に与えて、マイクロバイオームの組成や数が変化することを調べた。その結果として、最初に、垂下養殖下で成育中のマガキ細菌叢を把握することができた。また、Marine agar 2216E培地上で観察されたコロニーについては、16S rRNA配列に基づく属レベルでの同定を行った。環境ストレス負荷実験では、マガキ細菌叢の変動を捉えることができた。水温25°Cで保持された場合、両試料ともMarine agar 2216Eで培養可能な生菌数は開始24時間後に大きく増加し、72時間後には保持開始前の水準にまで減少するという傾向を示した。しかし、水温25°Cで溶存酸素量を2.1 mg/Lと低下させた区では、72時間後の生菌数は24時間後よりもさらに増加した。さらに、メタゲノム解析の結果から、低溶存酸素量区では細菌種の多様性が大きく減少していることが示された。これらのことから、マガキ血リンパの細菌叢に対する影響は、水温のみでは定常状態を損なうほどではないが、低溶存酸素量が加わることにより著しい変化を示すことが明らかとなった。これまで研究例が少ない海産二枚貝のマイクロバイオームについて、新しい知見を得ることができたからである。重要なものとしては、本研究の実施により、マガキを人為的な環境ストレスに晒した際の細菌叢の変化を見る、という面で先進的なな結果が得られた。さらに、ストレスの負荷がかかり衰弱した個体では、メタゲノム解析により多様性の減少が示され、また、培養法により生菌数の増加が示された一方で、培養可能な菌に限定すると多様性の減少は認められないということを明らかにした。加えて、環境ストレスを2種類用いたことから判断すると、単一の環境ストレスのみでは、ストレスの負荷により細菌叢に変化が生じ、その条件下に適応した細菌グループが独占するようになるものの、変化した細菌叢は、元の通常範囲内の細菌叢へ戻ろうとする傾向が示され、結果的にマガキの健康へは大きな影響はなかったと考えられること、しかし複数のストレス負荷により、細菌叢は深刻な損傷を受け、元の通常範囲内の細菌叢へ戻ることが不可能になったことで、細菌叢および宿主であるマガキに悪影響を与え、結果的に多くの死亡個体が現れることを、水槽実験ながら明らかにしたことである。本研究は、これまでほとんど明らかにされていない、海産二枚貝マガキの血リンパに形成されるマイクロバイオームについて、本年度は以下の2項目を知ることを目的とする。

1)マイクロバイオームと宿主の相互制御のしくみとして、生体防御能との関連を明らかにする。すなわち、宿主の生体防御機構で中心的な役割を担い、血リンパに存在する血球の細菌に対する殺菌能や貪食能を調べ、マイクロバイオームの制御要因になり得るかを明らかにする。2)マイクロバイオームと宿主の相互制御のしくみとして、血リンパに存在するタンパク性の殺菌因子や凝集因子がマイクロバイオームの組成や菌数に与える影響を評価する。本研究では、マガキ血球に無顆粒球と顆粒球の2つの細胞亜集団を認めた。無顆粒球と顆粒球とに分けて貪食能を測定した結果、無顆粒球の貪食率は15.3%と低かったのに対し、顆粒球では70%の血球が酵母に対して貪食能を有していた。顆粒球には2つのタイプの細胞が観察されたが、どちらのタイプの細胞も異物をよく貪食し、貪食像に大きな違いは認められなかった。また、貪食指数も無顆粒球の値を大きく上回っていた。これらのことから、顆粒球は主として異物排除に働く細胞で構成されていることが示唆された。マガキ血リンパに存在する凝集タンパクのレクチンのうち、カルシウム依存的にウマ赤血球を凝集する成分(Gigalin-E)が補体成分に類似したC1q-like protein 4 isoform X1であることを特定した。gigalin-EがE.coliを凝集したことから、gigalin-Eは、細菌を凝集するレクチンとして生体防御に関与している可能性が考えられた。本課題に関連して2つの大きな知見を得ることができたからである。血リンパの中には血球という防御担当細胞とレクチンのような細菌に対してその増殖を抑制するタンパク質が存在し、マガキが健全な状態であれば、これらが機能して血リンパ中の細菌叢の種類や生菌数を一定のレベルに制御していることが明らかとなってきた。すなわち、裏を返せば、強い環境ストレスなどによってマガキの体調が悪くなった場合、防御機能も低下して細菌叢のバランスが崩れることが予想される。正常値と大きく異なる種類や生菌数を検出すれば、そのカキは何らかに変調をきたしていることが把握できるようになった。本年度は、低溶存酸素ストレス区、すなわち16°C・DO 8.2 mg/L、16°C・DO 1.9 mg/L、25°C・DO 7.1 mg/L、25°C・DO 2.1 mg/L区に加えて、低塩分ストレス区、すなわち25 psuおよび20 psu区を設けた。メタゲノム解析はマガキ血リンパ試料について行い、結果を操作的分類単位(OTU)解析に供した。メタゲノム解析の結果から、低DOの区では細菌種の多様性が大きく減少していることが示された。これらのことから、マガキ血リンパの細菌叢に対する影響は、水温のみでは定常状態を損なうほどではないが、低DOが加わることにより著しい変化を示すことが明らかとなった。また、低塩分ストレス区では細菌叢が著しく変化した。OTUは有意に減少したことから、ストレスによって特定の細菌群が優占したと考えられた。低溶存酸素ストレス区で認められた試験期間中の死亡などは、低塩分ストレス区では見られなかった。そのため、現時点ではこれらの細菌群がどこまでマガキに悪影響を与えるかは明らかではない。しかし、一般に細菌叢の多様性が損なわれると、健康被害が高まることが知られているので、長期間の低塩分曝露は注意を要することが示唆された。
熱帯モンス-ン地帯河川流域の水文特性と水管理ータイ国チヤオプラヤ川の事例研究

歴史的にチャオプラヤ川タイ王国の発展と密接に関係してきた。このチャオプラヤ川を中心として、典型的なアジアモンス-ン地帯であるタイ王国内の水文、利文、それに最近問題になってきた治水状況を2年に渡って調査した。チャオプラヤ川流域は、流域特性の変化に伴い、従来の自然氾濫方式から、治水方式に変化しつつある過程にある。そして、灌漑用水のみならず、電力として重要な意味を持つタイの水需要形態は、灌漑用の水を確保しつつ、非灌漑期にも水力発電のために一定量の水を放流することを考えると、かなり複雑な性質を持っている。これらの調査から、その大きな降水量にもかかわらず、タイ王国の水資源の量は、決して十分とは言えない状況にあることが分かった。しかし、一方ではこのような水資源の利用形態は、石油危機に強く、環境の保持に対しても強いという、優れた特質を備えている。チャオプラヤ流域においては、従来洪水に強い浮き稲(FLOATING RICE)を栽培してきたことは良く知られている。浮き稲は洪水に強い利点はあるものの、収量が少ないため、農民の収入源としては問題があった。ところが、現在、チャオプラヤ川の両岸に洪水堤防が建設されつつあり、これとともに小規模の洪水頻度は減少しつつある。これに伴い、農家も収量の多い通常の稲を栽培するようになった。これは、チャオプラヤ川の洪水防御より必要ひなったことを意味する。さらに、堤防の進展に連れて、農地への工場の進出も盛んになり、洪水被害の軽減のためにはさらに洪水防御を進なくてはならなくなっている。この傾向は、チャオプラヤ中流部から下流部にかけては、首都圏の需要を満たすための果樹園の増加となって現われており、これはバンコク周辺の土地利用状況の変化をもたらし、流出特性の大きな変化の原因となっていることが分かった。東北タイからメコン流域にかけては、依然として水資源が大幅に不足し、地下水使用量の増大に伴い、貯水池塩水化の問題が生じている。すなわち、表面灌漑のため、地表から浸透した水が地中の岩塩層に達し、地下水の大規模な塩水化を生じ、塩水が次第に貯水池に浸透するものである。この現象は10年ほど前から、日本の技術援助の専門家によって指摘されていたが、灌漑の普及によって顕在化したのである。タイ南部(マレ-半島)においては、世界的な天然ゴム需要の増大に伴い、ゴム林の植かえが促進されたが、斜面保護が不適切であるため、集中豪雨による大規模な土石流が発生している。これは結局は水源林の荒廃を招き、水資源上から見ても、防災上から見ても、大きな問題である。これら諸問題について、従来の水文デ-タの解析のほかに、リモ-トセンシングによる、解析、分析が大きな威力を発揮することが分かった。タイにおいても、これら諸問題研究の重要性が認識され、そのため、リモ-トセンシングデ-タを中心とする各種デ-タの提供も予想以上に急速、かつ適切に行なわれた。さらに、タイの研究分担者等を日本に招き、利根川、淀川の水利用状況、河川情報センタ-による情報の提供状況の実情を紹介することにより、タイと日本の類似性についてもより深い理解が得られた。特にわが国で最初に行なった、河川情報センタ-による、河川・湖沼に関する情報の、実時間による提供はタイ研究者の大きな関心を呼び、現在2国間の技術協力に発展しつつあることは喜ばしい。更に本協同研究がきっかけとなり、アジアの研究者間に河川水文学に間する関心が高まり、アジア水文学会結成の機運も生じた。これと並行して、タイ、マレ-シアにおいてIHPに対応する国内委員会も発足し、これはユネスコにおいて日本のIHP活動のひとつとして評価された。明年度より本研究を発展させた、タイ・マレ-シア領域の水文現象の学術調査が認められており、他の研究者の調査を総合すると、アジアの主たる国・地域については概略の調査がIHPの趣旨に沿って行なわれることになる。

さらに、堤防の進展に連れて、農地への工場の進出も盛んになり、洪水被害の軽減のためにはさらに洪水防御を進なくてはならなくなっている。この傾向は、チャオプラヤ中流部から下流部にかけては、首都圏の需要を満たすための果樹園の増加となって現われており、これはバンコク周辺の土地利用状況の変化をもたらし、流出特性の大きな変化の原因となっていることが分かった。東北タイからメコン流域にかけては、依然として水資源が大幅に不足し、地下水使用量の増大に伴い、貯水池塩水化の問題が生じている。すなわち、表面灌漑のため、地表から浸透した水が地中の岩塩層に達し、地下水の大規模な塩水化を生じ、塩水が次第に貯水池に浸透するものである。この現象は10年ほど前から、日本の技術援助の専門家によって指摘されていたが、灌漑の普及によって顕在化したのである。タイ南部(マレ-半島)においては、世界的な天然ゴム需要の増大に伴い、ゴム林の植かえが促進されたが、斜面保護が不適切であるため、集中豪雨による大規模な土石流が発生している。これは結局は水源林の荒廃を招き、水資源上から見ても、防災上から見ても、大きな問題である。これら諸問題について、従来の水文デ-タの解析のほかに、リモ-トセンシングによる、解析、分析が大きな威力を発揮することが分かった。タイにおいても、これら諸問題研究の重要性が認識され、そのため、リモ-トセンシングデ-タを中心とする各種デ-タの提供も予想以上に急速、かつ適切に行なわれた。さらに、タイの研究分担者等を日本に招き、利根川、淀川の水利用状況、河川情報センタ-による情報の提供状況の実情を紹介することにより、タイと日本の類似性についてもより深い理解が得られた。特にわが国で最初に行なった、河川情報センタ-による、河川・湖沼に関する情報の、実時間による提供はタイ研究者の大きな関心を呼び、現在2国間の技術協力に発展しつつあることは喜ばしい。更に本協同研究がきっかけとなり、アジアの研究者間に河川水文学に間する関心が高まり、アジア水文学会結成の機運も生じた。これと並行して、タイ、マレ-シアにおいてIHPに対応する国内委員会も発足し、これはユネスコにおいて日本のIHP活動のひとつとして評価された。明年度より本研究を発展させた、タイ・マレ-シア領域の水文現象の学術調査が認められており、他の研究者の調査を総合すると、アジアの主たる国・地域については概略の調査がIHPの趣旨に沿って行なわれることになる。
NAFLDの病態増悪に寄与するセラミド分子種の同定とその作用の解明

非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)は、脂肪の蓄積により慢性的な炎症を呈する代謝性疾患であり、このうち1020%は肝硬変や肝細胞癌の発症母地にもなる非アルコール性脂肪肝炎(NASH)へと進行する。この増悪を簡便かつ正確に診断する方法が求められているが、現時点では肝生検以外の確定診断ができないことが大きな問題となっている。生理活性脂質セラミドは、炎症などの刺激を受けて増加することが知られているほか、申請者の過去の研究では、特異的なセラミド分子種の増加が動脈硬化の病変部位で増加することを見出していることから、セラミドの分子種の違いがNAFLDの病態増悪に寄与すると考えている。前年度に引き続き、NAFLDモデルラットの作製方法を再度検討した。5週齢のラットを群分けし、コントロール群にはCE-2食を自由摂食させ、高脂肪・高コレステロール+コール酸食(ラード20%,コレステロール2.5 %,コール酸0.1%)を自由摂食させる群をHFCC群とした。これらをさらに1摂食開始と同時に低濃度LPSを週2回投与する系と、2脂肪肝形成後に低濃度LPSを投与する系に分けて評価を行った。前者1はLPS投与開始14週で解剖し評価を行ったが、HFCC群において高度な線維化形成は見られなかった。2においては20週目で充分な脂肪肝形成が見られたため、低濃度LPSにより炎症を惹起させ線維化形成の促進を試みたが、LPS濃度の検討が充分でなかったため、1回目の投与でHFCC群の3分の2を喪失してしまった。残ったHFCC群の肝臓組織切片のSirius Red染色結果から、LPSの単回投与により、肝臓の線維化が惹起されることが示された。また、肝臓におけるセラミド量を定量したところ、総量に差は無いが、HFCC群はコントロール群に比して特定のセラミド分子種の割合が大きく変化することが示唆された。当初の計画では前年度までにNAFLDモデル動物の肝臓中および血中のセラミド動態の網羅的解析を予定していたが、サンプル数が足りないことから、解析は全て終了していない。しかし、脂肪肝形成後にLPSを腹腔内投与することで、線維化が惹起されること、さらに線維化モデルでは肝臓中のセラミド総量に変化は無いが、特定のセラミド分子種の割合が変化することが示唆されたため、NAFLDの病態増悪の過程でセラミド分子種の代謝変化が起こることが予想された。次年度は線維化形成に有効なLPS濃度を検討しなおし、NAFLDの病態増悪に関わるセラミド分子種について、総合的な評価を行う予定である。平成30年度までの結果から、NAFLDの線維化形成には、脂肪肝形成後に低濃度のLPSを投与することが有効であることが示唆された。今年度は線維化形成に有効なLPS濃度及びLPS投与開始時期の検討を行う。また、線維化を形成したラット肝では特定のセラミド分子種が大きく増加することが示されたため、NAFLDの病態増悪に関わるセラミドの各分子種の代謝変化について追及する予定である。非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)は、脂肪の蓄積により慢性的な炎症を呈する代謝性疾患である。病態が進行すると肝癌や肝硬変となるため、NAFLDの増悪を簡便かつ正確に診断する方法が求められているが、現時点では肝生検以外の確定診断ができないことが大きな問題となっている。生理活性脂質セラミドは、炎症などの刺激を受けて増加することが知られており、結合する脂肪酸によって様々な分子種が存在する。申請者の過去の研究では、動脈硬化の進行に伴って特異的なセラミド分子種が病変部位で増加することを見出しており、セラミドの分子種の違いが病態の増悪に関わる可能性が考えられた。そこで、NAFLDの病態増悪に寄与するセラミド分子種を同定することを目的とし、今年度はNAFLDモデルラットの作製を行った。5週齢のラットを群分けし、コントロール群にはMF食を自由摂食させ、HFC群には高脂肪・高コレステロール食(ラード20%,コレステロール2.5 %)を自由摂食させた。それぞれ11週目および21週目で解剖を行った。肝臓のCT値結果および肝臓組織切片のHE染色結果から、HFC群は11週目および21週目のどちらも脂肪肝となったが、当初の予想に反し、肝線維化に至るまで病態は増悪しなかった。なお、AST、ALT値の結果からも炎症はほぼ起こっていないことが示された。肝臓のセラミドを定量したところ、それぞれの群の総量は同程度であったが、HFC群はコントロール群に比べて、特定の分子種のセラミドが増加する傾向が認められた。当初の計画では平成30度中にNAFLDモデル動物の肝臓中および血中のセラミド動態の網羅的解析を予定していたが、肝線維化が予想通りに発症せず、解析は全て終了していない。しかしながら、線維化には至らずとも単純性脂肪肝の状態でも一部セラミドの組成の変化が見られたことから、脂肪肝の進行によりセラミド分子種の変化が起こることが期待される。次年度はNAFLDモデル動物の作成法を検討しなおし、再度モデル作成を行う予定である。

生理活性脂質セラミドは、炎症などの刺激を受けて増加することが知られているほか、申請者の過去の研究では、特異的なセラミド分子種の増加が動脈硬化の病変部位で増加することを見出していることから、セラミドの分子種の違いがNAFLDの病態増悪に寄与すると考えている。前年度に引き続き、NAFLDモデルラットの作製方法を再度検討した。5週齢のラットを群分けし、コントロール群にはCE-2食を自由摂食させ、高脂肪・高コレステロール+コール酸食(ラード20%,コレステロール2.5 %,コール酸0.1%)を自由摂食させる群をHFCC群とした。これらをさらに1摂食開始と同時に低濃度LPSを週2回投与する系と、2脂肪肝形成後に低濃度LPSを投与する系に分けて評価を行った。前者1はLPS投与開始14週で解剖し評価を行ったが、HFCC群において高度な線維化形成は見られなかった。2においては20週目で充分な脂肪肝形成が見られたため、低濃度LPSにより炎症を惹起させ線維化形成の促進を試みたが、LPS濃度の検討が充分でなかったため、1回目の投与でHFCC群の3分の2を喪失してしまった。残ったHFCC群の肝臓組織切片のSirius Red染色結果から、LPSの単回投与により、肝臓の線維化が惹起されることが示された。また、肝臓におけるセラミド量を定量したところ、総量に差は無いが、HFCC群はコントロール群に比して特定のセラミド分子種の割合が大きく変化することが示唆された。当初の計画では前年度までにNAFLDモデル動物の肝臓中および血中のセラミド動態の網羅的解析を予定していたが、サンプル数が足りないことから、解析は全て終了していない。しかし、脂肪肝形成後にLPSを腹腔内投与することで、線維化が惹起されること、さらに線維化モデルでは肝臓中のセラミド総量に変化は無いが、特定のセラミド分子種の割合が変化することが示唆されたため、NAFLDの病態増悪の過程でセラミド分子種の代謝変化が起こることが予想された。次年度は線維化形成に有効なLPS濃度を検討しなおし、NAFLDの病態増悪に関わるセラミド分子種について、総合的な評価を行う予定である。脂肪肝から線維化が進行すると炎症が起こることから、NAFLDモデル動物の作成を、高脂肪・高コレステロールによる食餌誘導以外の方法を検討する予定である。また、当初の目的から対象を広げて、セラミドによる肝細胞の鉄代謝への影響も検討する。NAFLDの病態増悪には肝臓へ浸潤するマクロファージによる鉄の取り込みの関与が示唆されていることから、鉄調節タンパク質の発現とセラミド代謝との関連も検討する予定である。平成30年度までの結果から、NAFLDの線維化形成には、脂肪肝形成後に低濃度のLPSを投与することが有効であることが示唆された。今年度は線維化形成に有効なLPS濃度及びLPS投与開始時期の検討を行う。また、線維化を形成したラット肝では特定のセラミド分子種が大きく増加することが示されたため、NAFLDの病態増悪に関わるセラミドの各分子種の代謝変化について追及する予定である。期間中に購入する予定の物品の納期が遅れたため。次年度は物品の購入に充てる予定である。