hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アルツハイマー型認知症治療を目指したインスリン経鼻投与後の新規脳内送達法の開発

近年、インスリンは軽度のアルツハイマー型認知症の治療に有効であるとの報告が見られるが、インスリンは高分子で分解されやすいペプチド性医薬品であるため、その脳移行性は大きく制限される。一方、薬物の経鼻投与においては、鼻腔から脳脊髄液への薬物の直接移行経路が存在することが知られており、血液ー脳関門を介さない薬物の新たな脳への移行経路として注目されている。そこで本研究ではまずインスリンをマウスに経鼻投与し、経鼻投与後の脳への移行性について検討した。その結果、インスリン単独でも一部が脳に移行することが確認でき、特に嗅球においてインスリンの濃度が高いことが認められた。一方、前脳においてもインスリンは検出されたが、後脳にはほとんど移行しないことが認められた。そこで、次にインスリンに吸収促進剤であるN-アシルタウリンを併用して、インスリンの経鼻投与後の脳移行性の改善を試みた。その結果、N-アシルタウリンであるsodium methyl lauroyltaurate (LMT)及びsodium methyl cocoyltaurate (CMT)を併用してインスリンの脳移行性を検討したところ、これら吸収促進剤により血漿中インスリン濃度は顕著に上昇したが、インスリンの脳移行性は逆に低下することが認められた。このことから、これら吸収促進剤は、経鼻投与後のインスリンの血液中への移行性は増大させるものの、脳(嗅球、前脳、後脳)への移行性にはあまり効果が見られないことが認められた。これは、おそらくこれら吸収促進剤がインスリンの血中への移行性改善に優先的に作用した結果であると考えられる。したがって、今後はインスリン経鼻投与後、インスリンを選択的に血中に移行させず、脳への移行性を選択的に増大できるタイプの吸収促進剤の探索が必要であると考えられる。当大学において、従来から動物の麻酔にはペントバルビタールを使用していたが、ペントバルビタールは鎮痛作用が弱く、最近、当大学の動物実験員会において動物愛護の観点からペントバルビタールの単独での麻酔としての使用が禁止された。そのため、インスリンの経鼻投与実験において、ペントバルビタールに代わり三種混合麻酔やイソフルランの麻酔を使用したが、これら麻酔下では血糖値が顕著に上昇することが明らかとなり、インスリンの吸収性や脳移行性を正確に測定することが出来なかった。そのため、しばらくの間、インスリン経鼻投与後の吸収性や脳移行性を正確に評価できない時期があり、予定のスケジュールよりも遅れたが、現在は、ペントバルビタールにリドカインを併用した麻酔が当大学の動物実験委員会で承認され、この方法による麻酔下で実験を検討しており、徐々にデータが出つつある。したがって、麻酔の問題は解決したので、今後は実験の遅れを取り戻して検討を進める予定である。本研究では、N-アシルタウリンであるsodium methyl lauroyltaurate (LMT)及びsodium methyl cocoyltaurate (CMT)を併用してインスリンの脳移行性を検討したところ、これら吸収促進剤により血漿中インスリン濃度は顕著に上昇したが、インスリンの脳移行性は逆に低下することが認められた。したがって、今後、これら促進剤の濃度や投与のタイミングなどを変更して、インスリンの脳内移行性を改善できる条件を検討していく予定である。さらに、これら促進剤で十分な効果が認められない場合には、インスリン経鼻投与後、インスリンを選択的に血中に移行させず、脳への移行性を選択的に増大できるタイプの新たな吸収促進剤を探索する予定である。

当大学において、従来から動物の麻酔にはペントバルビタールを使用していたが、ペントバルビタールは鎮痛作用が弱く、最近、当大学の動物実験員会において動物愛護の観点からペントバルビタールの単独での麻酔としての使用が禁止された。そのため、インスリンの経鼻投与実験において、ペントバルビタールに代わり三種混合麻酔やイソフルランの麻酔を使用したが、これら麻酔下では血糖値が顕著に上昇することが明らかとなり、インスリンの吸収性や脳移行性を正確に測定することが出来なかった。そのため、しばらくの間、インスリン経鼻投与後の吸収性や脳移行性を正確に評価できない時期があり、予定のスケジュールよりも遅れたが、現在は、ペントバルビタールにリドカインを併用した麻酔が当大学の動物実験委員会で承認され、この方法による麻酔下で実験を検討しており、徐々にデータが出つつある。したがって、麻酔の問題は解決したので、今後は実験の遅れを取り戻して検討を進める予定である。本研究では、N-アシルタウリンであるsodium methyl lauroyltaurate (LMT)及びsodium methyl cocoyltaurate (CMT)を併用してインスリンの脳移行性を検討したところ、これら吸収促進剤により血漿中インスリン濃度は顕著に上昇したが、インスリンの脳移行性は逆に低下することが認められた。このことから、これら吸収促進剤は、経鼻投与後のインスリンの血液中への移行性は増大させるものの、脳(嗅球、前脳、後脳)への移行性にはあまり効果が見られないことが認められた。これは、おそらくこれら吸収促進剤がインスリンの血中への移行性改善に優先的に作用した結果であると考えられる。したがって、今後、これら促進剤の濃度や投与のタイミングなどを変更して、インスリンの脳内移行性を改善できる条件を検討していく予定である。さらに、これら促進剤で十分な効果が認められない場合には、インスリン経鼻投与後、インスリンを選択的に血中に移行させず、脳への移行性を選択的に増大できるタイプの新たな吸収促進剤を探索する予定である。当該年度では、すべての交付額を物品費で支出したが、一部の物品が予想よりも安価で購入できたため、わずかながら残高が生じた。その分は、次年度使用額として計上した。
分子カプセルを利用した３次元規則性超分子構造体の作成と機能開発

両親媒性環状化合物を合成し、凝集状態に及ぼす分子構造の影響と環状化合物を用いた分子カプセルの形成および分子カプセルの3次元配列制御について検討した。両親媒性カリックスアレーンの場合、アルキル鎖長によって凝集状態が変化することおよび分子カプセルの形成には最適のアルキル鎖長があることを解明した。さらに、液晶性シクロデキストリン(LCCD)を合成し、液晶性を利用して分子カプセルを規則的に配列させる方法を検討した。βLCCDがスメクチック液晶構造をとり、環状骨格を層状に規則的に配列させることが可能となった。これは、分子カプセルの規則的な3次元配列を可能とする分子集積技術へと応用される。1)目的:フェノール系環状オリゴマーであるカリックスアレーンは、特異的な立体構造と官能基の導入が容易であることからホストーゲスト相互作用を基づく機能性材料の構成要素分子として注目されている。我々は、これを凝集させることによる新規機能の開発と応用を試みている。今回、環状分子内に水酸基と長鎖アルキル基を有する両親媒性レゾルシンアレーン(amp-CR)を構成要素として分子集合体の形成を行い、親水性と疎水性のバランスおよび外部環境を制御することによってカリックスアレーン骨格の凝集状態を変化させることを中心に検討を行った。2)実験:amp-CRは、溶媒に加熱・溶解させ、室温まで冷却することでゲルを形成する。この溶液の種類、濃度や温度によるゾルーゲル転移挙動を目視、偏光顕微鏡およびDSC測定により観察し,ゲルの形成機構と凝集構造について検討した。さらに、この凝集体を分子カプセルとして利用することで、反応を制御することを試みた。3)結果と考察:ジエチレングリコール(DEG)にamp-CRを加熱・溶解させたところ、ある温度域でゲル化が起きることがわかった。さらに、アルキル鎖を制御することでゾルーゲル転移挙動に変化が見られた。特に,アルキル鎖が偶数の時にゲル化が促進された。今回のゲル化は、amp-CRと溶媒分子との水素結合と、疎水性部位であるamp-CRの長鎖アルキル基同士の凝集によるネットワークの形成により引き起こされたと考えられる。amp-CRとDEGとの水素結合は、^1H NMRにおけるamp-CRの水酸基プロトンの化学シフトが変化することからも支持された。以上により、溶媒分子とamp-CRの水酸基間の水素結合が基本となって、ネットワーク中で特異な構造を形成していることが示唆された。さらに、カリックスアレーン骨格を凝集させることで分子カプセルとして、シリコンの生成反応について検討したところ、粒径を制御することが可能であることを確認した。1)レゾルシノールと脂肪族アルデヒドを塩酸触媒下で縮合反応させることで、両親媒性環状化合物カリックス[4]レゾルシンアレーン(amp-CR)が合成できる。amp-CRの特徴として空孔を持つためホスト-ゲスト相互作用を有することおよび両親媒性であるためミセルのように凝集しやすいことが挙げられる。本研究では、アルキル鎖の炭素数が異なるamp-CRを合成し、その凝集状態を解析した。さらに、amp-CRの凝集を利用したシリコーン微粒子の合成を試み、粒径を制御した微粒子を合成することが可能となった。分子カプセルのキラル配列を目指して、セルロース誘導体が濃厚な溶液中で形成するコレステリック液晶相を固定した界面を調製した。すなわち、低温でのセラミックス合成法であるsol-gel法によってセルロース/シリカハイブリッド複合体を合成し、液晶構造を固定化したキラリティーをもつ材料を調製した。これをもとに、キラルな状態をもつ分子カプセルの配列を検討した。2)シクロデキストリン(CD)はグルコース単位が環状に結合した分子であり、6量体のα-CD、7量体のβ-CD、8量体のγ-CDが存在し、空孔サイズに応じた分子を特異的に包接する。また、CDはチャンネル型、かご型、層状型の結晶形態をとる。ソフトマテリアルである液晶は、熱および濃度の変化により自発的にメソゲンが配向するため、CDが液晶を形成することでCDの空孔を維持して規則的に空孔を並べたソフトマテリアルを構築できる。このようなナノレベルの空間は、分子カプセルや反応場としての応用が期待される。そこで本研究では、α-CD、β-CD、γ-CDの6位に選択的にメソゲンを導入した液晶性CD誘導体を合成し、サーモトロピックおよびリオトロピック液晶特性とその集合体構造について調査したところ、環状骨格が層状に配列した特異な空間を作り出すことが可能となった。1)新規な環状分子の自己組織体の合成親水性部として水酸基を,疎水性部として長鎖のアルキル基を選択し,両親媒性カリックスアレーンampCRを合成した。これは,レゾルシノールと長鎖アルデヒドから合成する。

合成に関しては,これまでの検討により定量的に合成できることを確認している。これを組織化する方法として,メタノールなど水溶性の有機溶媒中にampCRを溶解させながら水を添加することにより,自己組織化させた。ampCRの構造確認にはNMR測定を行い,自己組織化は光散乱測定を用いて検討した。さらに,ampCRの会合状態を詳細に観察するため,電子顕微鏡(SEM)および走査型プローブ顕微鏡(SPM)を駆使し,ampCRの分子構造(アルキル鎖の長さ)と会合状態の関係を詳細に検討した。2)分子カプセルの集積化の検討上記に示したampCRの環状部分は芳香環に囲まれた空間と水酸基を多数有し,糖鎖およびハロゲン化合物などの電子受容性分子と相互作用すると考えられる。この相互作用を利用し,分子カプセルを集積化させる方法として,オリゴ糖をampCRと共存させることを試みた。すなわち,分子カプセルを規則的に並べるため,液晶性セルロース誘導体を土台とする基盤の合成を行った。この基盤上の規則的な相互作用点として液晶構造を構築し,その特徴的な構造に沿って,分子カプセルを並べることを狙いとした。セルロース複合体とガラスの複合体を用いることで,液晶構造を固定化した基盤を合成することができた。基盤の形成は,反射光を利用するFT-IR装置(設備備品),走査型プローブ顕微鏡(SPM)およびSEM・TEM電子顕微鏡観察によってモルホロジーの観察を詳細に行うことで確認した。さらに,基盤上にampCRの分子カプセルを集積化させることを検討した。分子カプセルの形成を確認することができ、本研究の第1段階が達成できたと考える。分子カプセルの応用として、シリコン微粒子の形成を確認できたことから、次の段階への準備が整ったと考えられる。25年度が最終年度であるため、記入しない。分子カプセル化の問題と新規な環状分子の合成親水性部として水酸基を,疎水性部として長鎖のアルキル基を選択し,両親媒性カリックスアレーンampCRを合成した。これをカプセル化する方法として,アルコールやアセトンなど水溶性の有機溶媒中にampCRを溶解させながら水を添加することにより相分離状態を作り出し,ミセルのような分子カプセルを形成させる予定であった。溶媒をアルコール/水系とすることで,ミセル状の分子カプセルの形成を確認した。しかしながら,他の有機溶媒ではampCRが凝集せずに分子カプセルとならなかったり,ジエチレンオキサイド系にするとファイバー状の組織体が形成する場合もあった。このように,現状では分子カプセルを再現よく効率的に構築するに至っていない。そこで,分子カプセル形成の再検討および新たな環状化合物の探索を行った。分子カプセル形成の再検討として無機物を中心に分子カプセルを形成させること,および,新たな環状化合物としてシクロデキストリン誘導体を利用することとした。1)分子カプセルの形成挙動を詳細に確認するとともに、分子カプセルを3次元的に配列させる手法を開発する。2)分子カプセルを反応場として利用することをさらに進める。3)分子カプセルを3次元的に配列させることで、反応場としての立体的な制御を行う。
世界モデルを用いたシミュレーションによる歴史テキスト理解

本研究プロジェクトの目的は、世界史や日本史といった歴史的事象に関するテキストを理解・解釈することのできる計算機システムを実現することである。それを実現する方法として我々は、様々な歴史イベントを表現可能であり、自律的に時間発展する世界モデルを用いるというアプローチを提案している。前年度は、歴史的人物の地点間の移動を、隠れマルコフモデルによってモデル化し、EMアルゴリズムの一種であるBaum-Welchアルゴリズムにより人物の移動経路をある程度推定できることが明らかになった。しかし同時に、テキストから抽出された人物の存在地点に関する情報の誤りや、データ量が小さいことに起因する過学習の問題も明らかになった。これらの問題に課題に対処するため、当該年度は、構文解析器と機械学習を利用することによる情報抽出の精度向上、およびベイズ推定の枠組みを利用することによる過学習の軽減に関する研究を行った。上記のアプローチの有効性を検証するため、前年度に引き続き日本語Wikipediaのテキストを利用して実験を行った。具体的には、日本の戦国時代の人物に関して、テキスト記述から人物の存在地点に関する断片的な情報を抽出し、それらを制約条件として、他の時点における存在確率を推定することとした。また、誤検出防止のための機械学習モデルとして、BERTと呼ばれる言語モデルを人手によるアノテーションデータで転移学習したモデルを利用した。実験の結果、機械学習と構文解析器の導入により、テキストから抽出される人物の位置情報の精度が向上することが明らかになった。本研究プロジェクトでは、計算機による本質的な自然言語理解を実現するための試みとして、世界モデルを用いた歴史テキスト理解の問題に取り組んでいる。初年度は、最初の実験用の世界モデルとしての「人物移動モデル」の構築、およびそれを利用した「テキストからのイベント抽出」と「テキストに即したシミュレーションの実現」を具体的な目標として研究を行った。人物移動モデルとしては、歴史上の人物の都市間の移動をモデル化の対象とし、Wikipediaから収集した各都市の緯度・経度情報から計算される都市間の距離に基づいて、各都市間の移動コストを設定した。次に、このモデルを利用した自然言語解釈タスクとして、テキストからのイベント抽出の問題に取り組んだ。具体的には、文章中から得られる(不確実な)イベント情報、すなわち、「誰が」「いつ」「どこに」存在した可能性があるかという情報から、人物移動モデルに基づいて正しい情報を選択するためのアルゴリズムを構築し、その効果を検証した。実験では、代表的な意味解析技術のひとつである意味役割付与に基づくアプローチと比較し、提案手法の精度が優れていることを確認した。また、人物移動モデルを利用した自然言語解釈の一例として、共参照解析の実験を行った。スタンフォード大学が開発した共参照解析システムをベースラインとし、その出力結果を人物移動モデルによる時間・空間制約を考慮することで、共参照解析の精度が向上することを確認した。初年度の目標としてた3つのタスク、すなわち、「人物移動モデルの構築」、およびそれを利用した「テキストからのイベント抽出」と「テキストに即したシミュレーションの実現」は、それらを実現するためのアルゴリズムの実装およびその効果の検証を行うことができた。昨年度は、歴史的人物の地点間の移動を、無向グラフによってモデル化し、シミュレーテッドアニーリング法により人物の移動経路をある程度推定できることが明らかになった。しかし同時に、テキストから情報を抽出する際の欠損値の扱いや、推定結果の不確実さを表現することの難しさも明らかになった。それらの課題に対処するため、当該年度は、人物の地点間の移動を確率的現象としてとらえ、隠れマルコフモデルによってモデル化するアプローチの研究を行った。隠れマルコフモデルを用いることで、人物が各地点間を移動する確率や、各地点における人物の存在確率は、それぞれ、状態間の遷移確率および状態の周辺確率として自然にモデル化することが可能になる。上記のアプローチの有効性を検証するため、日本語Wikipediaのテキストを利用して実験を行った。推定にはEMアルゴリズムの一種であるBaum-Welchアルゴリズムを用いた。実験の結果,データ不足に起因する偏りはあるものの、地点間の遷移確率および各時点における人物の存在確率をある程度推定できることが明らかになった。自然言語を理解するための世界モデルとして、どのようなモデルを用いるべきかということは本プロジェクトにおける非常に大きな問題であった。当該年度の研究により、隠れマルコフモデルのような確率的生成モデルを利用することの有効性がある程度明らかになったのは、本研究プロジェクトを進めるうえで重要なマイルストーンとなった。

これらの問題に課題に対処するため、当該年度は、構文解析器と機械学習を利用することによる情報抽出の精度向上、およびベイズ推定の枠組みを利用することによる過学習の軽減に関する研究を行った。上記のアプローチの有効性を検証するため、前年度に引き続き日本語Wikipediaのテキストを利用して実験を行った。具体的には、日本の戦国時代の人物に関して、テキスト記述から人物の存在地点に関する断片的な情報を抽出し、それらを制約条件として、他の時点における存在確率を推定することとした。また、誤検出防止のための機械学習モデルとして、BERTと呼ばれる言語モデルを人手によるアノテーションデータで転移学習したモデルを利用した。実験の結果、機械学習と構文解析器の導入により、テキストから抽出される人物の位置情報の精度が向上することが明らかになった。今後は、当初の計画通り、世界モデル及びシミュレーションの高度化と、世界モデルを利用した自然言語処理の曖昧性解消、それを利用した質問システムの開発を主な目標として研究を進める。当該年度は、人物の地点間の移動というイベントに着目して研究を行った。今後は、扱うイベントの種類を増やすことによって、テキストに記述されている様々な情報をモデル化することが目標である。研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため当初の見込み額と執行額は異なったが、研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め、当初予定通りの計画を進めていく。物品購入に必要な経費が想定を下回ったために次年度使用額が生じた。次年度に予定する物品費と合わせて使用する計画である。次年度の研究費は、自然言語解析および世界モデル構築のための計算機の購入、研究動向の調査および成果発表のための国内・国外旅費の使用を予定している。
脳老化を制御するプロテアーゼシステムの解明

アルツハイマー病アミロイドβペプチド(Aβ)の脳内代謝を検討し、以下の点を明らかにした。[1]ネプリライシンが主要なAβ分解酵素である。[2]ネプリライシン活性が低下すると脳内Aβレベルが上昇する。[3]ネプリライシンの発現は加齢に伴って低下する。[4]Aβアミロイドーシスマウスモデルにウィルスベクターを用いてネプリライシンを過剰発現させると、Aβ蓄積が抑制される。[5]Aβアミロイドーシスマウスモデルで観察される長期増強の抑制や行動異常は、ネプリライシン活性低下により増強する。[6]神経ペプチドソマトスタチンは、神経細胞のネプリライシンを活性化し、Aβ代謝を促進する。以上の結果は、ソマトスタチン受容体のアゴニストを用いることによって、脳内Aβの代謝を制御し、アルツハイマー病、ひいては、脳老化の予防や治療に応用することができる可能性を示している。一方、カルパインの神経変性における病理作用を検討するために、カルパスタチントランスジェニックマウスおよびノックアウトマウスを作成し、以下の点を明らかにした。[1]成熟脳の神経細胞死においては、カスパーゼではなくカルパインが主要な役割を担っている。[2]Aβアミロイドーシスマウスモデルにおけるカルパイン活性化は、神経変性を促進させる。これらの結果は、カルパインが神経細胞死に広く関与する可能性を示しており、活性化カルパイン特異的な合成阻害剤は、神経変性疾患の予防薬あるいは治療薬となることを期待させる。(1)βアミロイド分解システムの同定と制御動物脳内におけるβアミロイドペプチド(Aβ)の分解系路を明らかにするためにラジオアイソトープで多重標識したAβを投与する実験システムを用い、以下の点を明らかにした。[1]βアミロイドペプチドは脳実質内のプロテアーゼによって分解される。[2]分解における主要な中間体はAβ10-37であり、この中間体の生成が律速過程を担う。[3]この中間体を生成するプロテアーゼは、ネプリライシン様の中性メタロエンドペプチダーゼである。[4]動物脳において分解システムを抑制することによってβアミロイドの蓄積が促進される。さらに、分解酵素について分子生物学的・生化学的・発生工学的検討を行い、ネプリライシンが脳内における主要なAβ分解酵素であることを示した。(2)神経細胞質内プロテアーゼ群の病理作用の解析脳老化制御における主要な細胞内プロテアーゼ群であるカスパーゼ・カルパイン・プロテアソームの役割を解析するために、カスパーゼインヒビター(p35)・カルパインインヒビター(カルパスタチン)・プロテアソームユビキチンリセプターサブユニット(S5a)を神経細胞に発現するトランスジェニックマウスの作成を開始した。p35トランスジェニックマウスについてはライン化に成功し、現在解析を進めている。他のマウスについても複数のラインが得られつつある。(1)βアミロイド分解システムの同定と制御動物脳内におけるβアミロイドペプチド(Aβ)の分解系路について検討を行い、中性エンドペプチダーゼの中で特にネプリライシンが主要な役割を担うことを見いだした。最も大切なことは、ネプリライシンノックアウトマウスにおいて、脳内Aβレベルが、ネプリライシン遺伝子発現レベルに逆相関して増加しており、部分的なネプリライシン活性の低下がAβ蓄積の原因となりうることを示したことである。詳細な免疫組織科学的検討により、ネプリライシンは神経細胞のプレシナプス側に存在し、さらに、インターニューロンに強く発現することを見いだした。また、一方で、初代培養ニューロンにネプリライシンを強制発現することによって、細胞内外のAβが顕著に減少した。このことから、分解系の低下を抑制することや分解系を操作して増強することは、加齢に伴うAβ蓄積を抑制することによって、アルツハイマー病の予防や治療に役立つ可能性があると考えられる。

(2)神経細胞質内プロテアーゼ群の病理作用の解析神経毒(カイニン酸)による神経細胞死におけるカスパーゼの役割を解析するために、カスパーゼインヒビター(p35)を神経細胞に発現するトランスジェニックマウスを作成し、細胞死に対する効果を検討したところ、カスパーゼよりもカルパインの活性化が神経細胞死によく相関することが見いだされた。この点をさらに検討するために、カルパスタチントランスジェニックマウスを作成し、解析を始めた。さらに、カルパスタチンノックアウトマウスの作成も開始した。アミロイドAβ(Aβ)分解系については、ネプリライシンが脳内における主要なAβ分解酵素であることを明らかにしたのみならず、老化に伴ったネプリライシンの発現や活性の低下が、部分的であっても、Aβの蓄積、ひいては、アルツハイマー病発症の原因となりうること、および、ネプリライシンの発現や活性を正方向に制御することによって脳内におけるAβ蓄積を抑制できることを示してきた。実際に、ネプリライシンをプライマリカルチャーに強制発現することによって、細胞内外のAβを除去することができることを示した。また、詳細な免疫組織化学的解析によりネプリライシンは、軸索付近およびプレシナプスに存在すること、インターニューロンに強く発現すること、そして、加齢に伴って貫通線維および苔状線維の末端部位で選択的に低下することを観測した。インターニューロンは種々の神経ペプチドの産生部位であると同時に神経ペプチドによる支配を受けているので、神経ペプチドリセプターを介したネプリライシン発現制御機構の存在が示唆される。このことは、アルツハイマー病の脳である種の神経ペプチドのレベルが低下していることとも一致することから、神経細胞特異的にネプリライシンの遺伝子発現を制御する因子(GPCRリガンド)をスクリーニングするための新しい実験系を作成し、スクリーニングを開始し、有力な候補が得られつつある。また、細胞内蛋白分解システムの解析においては、カスパーゼ阻害蛋白質(p35)Tgマウスを用いた解析により、in vivoにおける興奮性アミノ酸による神経細胞死には、カスパーゼよりむしろカルパインが関与していることが示された。現在作成中のカルパスタチンTgマウスとあわせて、様々の様式の神経細胞死の機構の解析に応用できることが期待される。また、カルパスタチン遺伝子破壊マウスの作成についても順調に進行している。1.実質におけるβアミロイド分解システムの同定と制御Aβ分解酵素ネプリライシンの活性を利用して脳内Aβを除去する試みとして、初代培養神経細胞にネプリライシンを過剰発現させることにより細胞外のみならず細胞内のAβレベルが低下することを示した。さらに、動物組織にネプリライシンを発現するために長期間に渡って発現を維持しかつ病原性の低いウイルスベクターを開発し、これを用いてマウス脳内に持続的にネプリライシンを発現させたところ、Aβの定常量を低下させるとともに、病理学的蓄積を抑制することを確認した。神経細胞特異的なリガンド-レセプターシステムを利用してネプリライシンの発現制御を行う目的で、初代培養神経細胞に様々なペプチド性リガンドを添加してネプリライシン活性の増減を指標に網羅的な検索を行い、ソマトスタチンがネプリライシンの発現を誘導することを認めた。
翻訳制御への関与が期待される新規GTP結合タンパク質GSPT/eRF3の機能解析

私はこれまでに、出芽酵母においてGSPTとeRF1、GSPTとPABPが結合することをin vitro結合実験及び免疫共沈実験で示した。さらに私は、GSPTとeRF1の結合がGSPTのグアニンヌクレオチド型で制御されること(GTP型で結合し、GDP型で乖離する)、及びGSPTとPABPの結合はGSPTのグアニンヌクレオチド型非依存的であることを示した。本年度は、以上を踏まえて実験を行い、以下に記す知見を得た。1)出芽酵母におけるGSPTとUpflpの結合は、GSPTのグアニンヌクレオチド型非依存的であった。2)野生型及びGTP結合ドメイン変異型GSPTを形質転換した出芽酵母株を作製し、その株における翻訳終結反応を検討した結果、GTP結合ドメイン変異型GSPT発現株において翻訳終結反応の異常が見られた。3)上記の株を用いてmRNA分解を検討した結果、PABPとの結合を介して制御される通常のmRNA分解経路、Upflpとの結合を介して制御されるNMD経路共にGTP結合ドメイン変異型GSPT発現株において異常が見られた。以上の結果から、GSPTはそのグアニンヌクレオチド型の変換により翻訳終結反応と2つのmRNA分解経路を制御していることが明らかとなった。
感染防御系におけるIFN及びIFN調節因子活性化の役割とその分子基盤の解析

本年度,抗ウイルス免疫応答系においてIFNとp53との新しい関連性を報告した.癌抑制因子であるp53の遺伝子がIFN-α/βによって発現誘導されることを見出した.また,p53はウイルス感染によってリン酸化され,活性化されることも明らかにした.p53欠損細胞では水庖性口内炎ウイルス(VSV)感染によるアポトーシスが阻害され,結果的には上清中のウイルス産生のレベルが野生型細胞の場合と比較して著明に高くなる結果を得た.更にP53欠損マウスが野生型マウスに比べ,VSVに対して感受性であり,また,ウイルスが過剰に増殖し,死亡に至る割合が高いことが見出された.さらに,IFNAR1欠損細胞を用いた解析より,ウイルス感染により産生されるIFN-α/βによって誘導されたp53も同様の役割を担っていることが示された.即ち,ウイルスによって活性化されたp53は感染細胞を迅速かつ効率のよい細胞死をもたらすことによってウイルスの複製や周囲への拡散を抑制することに寄与していると考えられた.一方,IFN-α/βはウイルスのみならず様々な病原体関連分子により樹状細胞において発現が誘導され,樹状細胞の成熟・活性化に重要な役割を担っていることも明らかにした.即ち,マクロファージや樹状細胞においてLPSや二本鎖RNA刺激によりIFN-α/β遺伝子の発現誘導が認められ,その誘導にIRF-3やIRF-7が関与しているという結果を得た.また,ウイルス感染時における樹状細胞の活性化はIFN-α/β依存性であることも見出した.二本鎖RNAの認識受容体であるTLR3とPKRの発現誘導がIFN-α/βにより転写レベルで制御されていることも明らかにした.更に,IFN-α/βはTLR3,PKRのみならず,それ以外にもウイルス認識に関わる分子群の誘導に関わっているという結果をTLR3,PKR欠損マウスを用いた検討から明らかにした.本年度,抗ウイルス免疫応答系においてIFNとp53との新しい関連性を報告した.癌抑制因子であるp53の遺伝子がIFN-α/βによって発現誘導されることを見出した.また,p53はウイルス感染によってリン酸化され,活性化されることも明らかにした.p53欠損細胞では水庖性口内炎ウイルス(VSV)感染によるアポトーシスが阻害され,結果的には上清中のウイルス産生のレベルが野生型細胞の場合と比較して著明に高くなる結果を得た.更にP53欠損マウスが野生型マウスに比べ,VSVに対して感受性であり,また,ウイルスが過剰に増殖し,死亡に至る割合が高いことが見出された.さらに,IFNAR1欠損細胞を用いた解析より,ウイルス感染により産生されるIFN-α/βによって誘導されたp53も同様の役割を担っていることが示された.即ち,ウイルスによって活性化されたp53は感染細胞を迅速かつ効率のよい細胞死をもたらすことによってウイルスの複製や周囲への拡散を抑制することに寄与していると考えられた.一方,IFN-α/βはウイルスのみならず様々な病原体関連分子により樹状細胞において発現が誘導され,樹状細胞の成熟・活性化に重要な役割を担っていることも明らかにした.即ち,マクロファージや樹状細胞においてLPSや二本鎖RNA刺激によりIFN-α/β遺伝子の発現誘導が認められ,その誘導にIRF-3やIRF-7が関与しているという結果を得た.また,ウイルス感染時における樹状細胞の活性化はIFN-α/β依存性であることも見出した.二本鎖RNAの認識受容体であるTLR3とPKRの発現誘導がIFN-α/βにより転写レベルで制御されていることも明らかにした.更に,IFN-α/βはTLR3,PKRのみならず,それ以外にもウイルス認識に関わる分子群の誘導に関わっているという結果をTLR3,PKR欠損マウスを用いた検討から明らかにした.
植物利用型有用タンパク質生産における環境制御とその効果の機構解明に関する研究

本研究では,ワクチンなどの有用タンパク質の遺伝子を植物に後天的に導入して一過的に発現させる一過性遺伝子発現法を対象として,遺伝子導入前後の植物の栽培環境が有用タンパク質生産量に及ぼす影響を明らかにするとともに,環境制御の効果をもたらす生理的メカニズムを解明することを目的としている。本年度は,おもに(1)遺伝子導入前後のCO2濃度が有用タンパク質生産量に及ぼす影響の解明,および(2)遺伝子導入後の気温が有用タンパク質生産量に及ぼす影響のメカニズムの解析,に取り組んだ。供試植物にベンサミアナタバコを,有用タンパク質にインフルエンザワクチンであるヘマグルチニン(HA)を用いた。(1)では,予想に反して,遺伝子導入前のCO2施用による植物のバイオマスおよびバイオマスあたりのHA含量への影響が顕著でないことを明らかにした。その一因は,ベンサミアナタバコの光合成およびバイオマス生産能力が低く,人工光型植物工場における一般的な栽培条件でおおむね上限に近い生長速度となっていることにあると示唆された。また,CO2濃度以外の,遺伝子導入前の光合成有効光量子束密度(PPFD)および気温は,収穫時(遺伝子導入後6日目)のバイオマスあたり有用タンパク質含量および株あたり有用タンパク質集積量に影響を及ぼすことも明らかとなった。(2)では,遺伝子導入後の気温が25°Cの場合,20°Cと比較して,HA遺伝子および小胞体ストレスマーカー遺伝子の転写産物量が大となる傾向にあった。25°Cでは,HA遺伝子の転写レベルが植物にとって過剰となることで小胞体ストレスが生じ,その結果ネクロシスが生じて,HAタンパク質含量がむしろ早期に減少するものと推察された。研究計画調書,および本年度の交付申請書に記載した研究実施計画に,おおむねしたがって進展したため。次年度は,(1)遺伝子導入前の栽培環境が有用タンパク質生産量に及ぼす影響の解明,および(2)遺伝子導入後の気温が有用タンパク質生産量に及ぼす影響のメカニズムの解析,を中心に進める。(1)では,PPFDおよび気温をおおよそ一定に制御可能な人工光型植物工場と,それらの環境要素レベルが日・季節変化する温室とで,それぞれ遺伝子導入前栽培を行なった場合のHA生産量への影響を調べる。人工光型植物工場を想定したグロースチャンバと温室とでそれぞれ栽培実験を行い,栽培バッチごとの有用タンパク質生産量のばらつきを評価することで,実用生産における遺伝子導入前栽培に適したシステムについて考察する。(2)については,昨年度の研究により示唆された,HA遺伝子転写産物量と小胞体ストレスとの関係をより詳細に解析するため,各種遺伝子の転写産物量の経日変化を明らかにする実験を反復する。また,異なるベクターを用いた場合の応答についても検討を進める。本年度はまず,遺伝子導入後の二酸化炭素濃度が有用タンパク質生産量に及ぼす影響を調べた。供試植物にはベンサミアナタバコを,有用タンパク質にはインフルエンザワクチンとなる抗原タンパク質であるヘマグルチニン(HA)を用いた。導入後の高二酸化炭素濃度処理は,株あたり乾物重を増加させる傾向にあったものの,乾物重あたりのHA含量は逆に減少する傾向にあり,結果として株あたりHA含量は必ずしも増加しなかった。この傾向は,高二酸化炭素濃度に高光合成有効光量子束密度を組み合わせた条件でより顕著であった。バイオマスあたりのHA含量の減少は,HAの抽出・精製コストを増加させうることから,一過性遺伝子発現法を用いたベンサミアナタバコ体内でのHA生産では,二酸化炭素施用は必ずしも有用でない可能性がある。今後,追試を実施し,結果の再現性を確認する予定である。次に,環境制御の効果をもたらす生理的メカニズムを解明するための手法を確立するため,遺伝子導入によって植物体に引き起こされるストレスを定量化するための遺伝子発現の定量解析手法について検討した。小胞体ストレス応答に関わるいくつかのマーカー遺伝子の転写産物量を定量するのに適した実験条件(プライマー,PCR条件など)を確立した。交付申請書に記載した,本年度の研究実施計画どおりにおおむね進展したため。

(2)では,遺伝子導入後の気温が25°Cの場合,20°Cと比較して,HA遺伝子および小胞体ストレスマーカー遺伝子の転写産物量が大となる傾向にあった。25°Cでは,HA遺伝子の転写レベルが植物にとって過剰となることで小胞体ストレスが生じ,その結果ネクロシスが生じて,HAタンパク質含量がむしろ早期に減少するものと推察された。研究計画調書,および本年度の交付申請書に記載した研究実施計画に,おおむねしたがって進展したため。二酸化炭素濃度以外の環境要素の影響についての検討を進める。また,本年度に確立した遺伝子発現の定量解析手法を用いて,遺伝子導入後の気温およびHAの細胞内蓄積部位が小胞体ストレス応答に及ぼす影響を調べ,HA含量との関係について検討する。次年度は,(1)遺伝子導入前の栽培環境が有用タンパク質生産量に及ぼす影響の解明,および(2)遺伝子導入後の気温が有用タンパク質生産量に及ぼす影響のメカニズムの解析,を中心に進める。(1)では,PPFDおよび気温をおおよそ一定に制御可能な人工光型植物工場と,それらの環境要素レベルが日・季節変化する温室とで,それぞれ遺伝子導入前栽培を行なった場合のHA生産量への影響を調べる。人工光型植物工場を想定したグロースチャンバと温室とでそれぞれ栽培実験を行い,栽培バッチごとの有用タンパク質生産量のばらつきを評価することで,実用生産における遺伝子導入前栽培に適したシステムについて考察する。(2)については,昨年度の研究により示唆された,HA遺伝子転写産物量と小胞体ストレスとの関係をより詳細に解析するため,各種遺伝子の転写産物量の経日変化を明らかにする実験を反復する。また,異なるベクターを用いた場合の応答についても検討を進める。
英語と日本語を介した科学教育における言語の役割の解明

筑波大学(「確率論」,「光エレクトロニックス」,「細胞学概論」,「データベース概論I」,「数値計算」の6科目),京都大学(「振動・波動論」,「代数学II」,「有機分子たちを考えて日常生活を理解しよう」の3科目)および上智大学(「基礎物理学」の1科目)がオンラインで公開している日本語による116講義(158講義時間相当)をダウンロードし,映像ファイルを音声ファイルに変換して書き起こし作業を(理工系学生が担当した一部のデータを除き)外注した.ただし,外注先のNVivo Transcriptionsは,オンラインでアップロードした音声データを自動的に書き起こす方法を採用しているため,書き起こされた結果を確認する必要がある.自動的書き起こしはかなり早いが,人間による確認作業は必要となる.確認作業が完了しているのは111講義時間分であり,この分は日本語による講義のコーパス(OnCAL.jp)へアップロード済みである.全データの確認作業が終了した時点でOnCAL.jpを公開する予定である.本プロジェクトの内容・目的・進捗状況を国内外の学会等にて初年度から複数回にわたって報告した際,建設的な批判を受けた.以前には,コーパスに含まれていた複数の科目について「対面講義でないのでよくない」や「多数の教員が担当しているのでよくない」と批判された科目をコーパスから削除し,コーパス内容を調整しながら新しい科目を追加した結果,上記の158講義時間分のデータとなった.すでに開発が完了している英語による講義のコーパスとの比較を可能にするために,今後も日本語による講義をさらにコーパスに追加していく予定であるが,2017年度末時点のコーパスに比べて現時点のコーパスは,定量的にも,定性的にもバランスが取れていると言える.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。1開発作業.英語版OnCALの機能を強化し,新規サーバーへ移行させて,課題となっていた検索速度を改善した.また,日本語版OnCAL (OnCAL.jp)を開発し,日本語テキストを解析可能とした.さらに,日本語による講義として,公開されている21講義分(工学分野)の映像をダウンロードし,教員一名(情報科学分野)から44講義分の映像を提供受けた.これら65講義を書き起こしてOnCAL.jpにアップロードした.2文献調査.多文化共生における科学教育の課題が多数報告されている.文化的背景や地域によって科学の教授法と学習スタイルが異なるとの指摘.北米では白人による科学教授法は理論的な推理に基づいており,観察を重視する他人種の学習スタイルを軽視していると批判される.つまり、English-medium instructionが世界各国で採用される中,学習者の文化的背景や学習スタイルについて,教員側が意識を高める必要がある.このように科学教育を文化の枠組みの中で捉える試みにおいて,研究代表者と分担者が,日本科学教育学会と日本比較教育学会の会員となり,日本における科学教育の現状と動向を調査し,さらなる知見を得ることにした.3解析.日本語・英語による講義を比較し,次の結果を得た.まず,代名詞の使い方については,英語による講義では「you/your」が最も多かったのに対して,日本語による講義では第一人称が最も多かった.また,一講義当たりの学習者による質問の数についても,英語の場合は日本語の約10倍だった.これらの結果は,米国の方が日本よりも講義が対話型であることを示し,文化的背景の指標であるPower Distance Indexと合致すると解釈できる.さらに,米国の講義では科学的なtruthが中心であるのに対して,日本の講義ではtruthを導いた「人」が中心となる形跡を見つけた.1.解析ツールの開発はほぼ完成した.2.収集した日本語による講義の数はいまだ少なく,増やす必要がある.3.日本語版OnCALを公開するための許諾が得られない.筑波大学(「確率論」,「光エレクトロニックス」,「細胞学概論」,「データベース概論I」,「数値計算」の6科目),京都大学(「振動・波動論」,「代数学II」,「有機分子たちを考えて日常生活を理解しよう」の3科目)および上智大学(「基礎物理学」の1科目)がオンラインで公開している日本語による116講義(158講義時間相当)をダウンロードし,映像ファイルを音声ファイルに変換して書き起こし作業を(理工系学生が担当した一部のデータを除き)外注した.ただし,外注先のNVivo Transcriptionsは,オンラインでアップロードした音声データを自動的に書き起こす方法を採用しているため,書き起こされた結果を確認する必要がある.自動的書き起こしはかなり早いが,人間による確認作業は必要となる.確認作業が完了しているのは111講義時間分であり,この分は日本語による講義のコーパス(OnCAL.jp)へアップロード済みである.全データの確認作業が終了した時点でOnCAL.jpを公開する予定である.本プロジェクトの内容・目的・進捗状況を国内外の学会等にて初年度から複数回にわたって報告した際,建設的な批判を受けた.以前には,コーパスに含まれていた複数の科目について「対面講義でないのでよくない」や「多数の教員が担当しているのでよくない」と批判された科目をコーパスから削除し,コーパス内容を調整しながら新しい科目を追加した結果,上記の158講義時間分のデータとなった.

すでに開発が完了している英語による講義のコーパスとの比較を可能にするために,今後も日本語による講義をさらにコーパスに追加していく予定であるが,2017年度末時点のコーパスに比べて現時点のコーパスは,定量的にも,定性的にもバランスが取れていると言える.2017年度までに,本プロジェクトの内容・目的・進捗状況を国内外の学会等にて初年度から複数回にわたって報告した際,建設的な批判を受けた.コーパスに含まれていた複数の科目について「対面でない講義(オンデマンド講義)が含まれているのでよくない」や「多数の教員が担当している科目なのでよくない」と批判された.そこで,コーパスに追加することができる,質のよい科目(対面授業,教員一人が担当)を検索することにした.2017年度中にはその講義検索の作業,講義の質に関する詳細確認を始めたが完成できず,2018年度中に多くの質のよい講義について書き起こし作業まで完成できるように研究費の一部を繰り越した.2018年度には,批判された科目をコーパスから削除して,質のよいと判断した科目を追加した.講義の検索,質の確認作業を行った結果,筑波大学(「確率論」,「光エレクトロニックス」,「細胞学概論」,「データベース概論I」,「数値計算」の6科目),京都大学(「振動・波動論」,「代数学II」,「有機分子たちを考えて日常生活を理解しよう」の3科目)および上智大学(「基礎物理学」の1科目)から,オンラインで公開されている日本語による116講義(158講義時間相当)をダウンロードし,映像ファイルを音声ファイルに変換して書き起こし作業を(理工系学生が担当した一部のデータを除き)外注した.この一部の書き起こし作業は,繰り越した研究費によって実現した.2017年度までに完成できなかった計画のほぼすべてが2018年度に完成した.2017年度には日本語による講義の数を増やす必要があり,そして公開への許諾を得るように努める.ただし,公開への許諾が得られなくても,解析は可能であることを念頭において,インターネット上で公開されている講義映像をダウンロードして書き起こす作業を進める.日本語および英語による講義を詳細に比較することによって教授法や学習スタイルにおける具体的な相違を特定し,普及するEnglish-medium instructionの採用における課題の特定を目指す.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。日本語による講義のコーパスをさらに拡張するため,および英語による講義のコーパスと比較するために,日本語による講義をコーパスに追加していくことを目指す.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
皮膚内代謝を基盤としたシックハウス症候群発現リスク評価法の確立

本研究はシックハウス症候群(SHS)の原因物質の一つであるフタル酸エステルの経皮暴露に対するリスク評価法の確立を目的としている。SHS患者は神経障害標的エステラーゼ(NTE)の皮膚内活性が高いためにフタル酸エステルの経皮吸収性が高いが、NTEの総エステラーゼ活性に占める割合が低いことから、平成29年度は、フタル酸エステルの皮膚内代謝に寄与するNTE以外のエステラーゼの探索を試み、基質特異性やviableな表皮への局在ならびに皮膚内エステラーゼ活性に及ぼす種々酵素の寄与の結果からカルボキシエステラーゼ(CES)その中でもCES2の重要性を明らかにした。しかし、CESには代謝活性が著しく異なる多型の報告はなく、CES2の皮膚内エステラーゼ活性の寄与率も約70%であった。そこで平成30年度は、ヒト皮膚内の酵素分布量とその個体差を明らかにするとともに、さらなるエステラーゼの探索の一環としてエステラーゼBに属するCESとは有機リンに対する反応性が異なるエステラーゼDの代謝特性を評価し、以下の研究成果を得た。CES2はCES1と同様、皮膚特異的脂質代謝酵素に比べて10-100倍と高い分布量を示し、分布量の個体差も約10倍と大きかった。この大きな個体差がSHS患者の高いフタル酸エステル経皮吸収を引き起こす可能性が示唆された。一方、エステラーゼDの種々エステル化合物に対する代謝挙動は1次反応を示し、基質に対する親和性は低く、皮膚内の分布量も低かった。これらのことから、フタル酸エステルの皮膚内代謝に対する寄与は小さいものと推察された。本研究の目的はシックハウス症候群(SHS)原因物質の一つであるフタル酸エステルの経皮暴露に対するリスクファクター評価法を確立することにある。平成28年度はSHS患者の単核球中で健常人より活性が高いことが報告されている神経障害標的エステラーゼ(NTE)に焦点を当て、以下の研究成果を得た。ヒトNTE遺伝子PNPLA6導入マウスは野生型と比較して皮膚内のNTE活性が高く、フタル酸エステルの皮膚透過性も高かったが、皮膚内で代謝されない硝酸イソソルビドの透過性に差は認められなかった。この結果は、NTE遺伝子の導入はマウスの皮膚バリヤー能自体には影響しないが、皮膚内のエステラーゼ活性を高め、その結果フタル酸エステルの皮膚透過性が増大したことを示唆している。フタル酸エステルは高脂溶性のため、角質層へ容易に分配するが、水分に富む角質層以下の皮膚組織へは移行し難い。しかし、皮膚内で加水分解を受けて極性を得、より毒性の高い代謝物として経皮吸収されるという新たな暴露シナリオを描くことができる。次に、皮膚移植手術を受けるSHS以外の患者の皮膚内と単核球中のNTE活性の関係について検討した。皮膚内のNTE活性は定量限界に近い低値を示したが、ヒトの単核球やPNPLA6導入マウスの皮膚や脳を用いた代謝実験から、NTE活性はパラオキソン抵抗性エステラーゼ活性で近似できることを見出した。その皮膚内の活性と単核球中NTE活性との関係を検討したところ高い相関関係が得られ、SHS患者は皮膚内のNTE活性が高く、そのためフタル酸エステルの経皮吸収性も高いものと推察された。本被験者のPNPLA6遺伝子内のSNP出現頻度は健常人に近く、NTE活性と遺伝子多型の関係は明らかにできなかった。また、皮膚内の総エステラーゼ活性に占めるNTE活性の割合も10 %程度であった。次年度は他のエステラーゼの寄与を検討する。平成28年度の研究実施計画では、ヒト皮膚内NTE活性の予測法の確立を目標として掲げ、「ヒトNTE遺伝子導入マウスの皮膚透過性の評価」と「ヒト皮膚内NTE活性と単核球中NTE活性の関係の評価」の2つの研究課題に取り組むこととした。第一の課題では、ヒトNTE遺伝子PNPLA6導入マウスの皮膚バリヤー能を、皮膚内で加水分解を受けない硝酸イソソルビドの皮膚透過性から評価した。PNPLA6導入マウスの皮膚透過性は野生型マウスと同等であり、皮膚バリヤー能自体には遺伝子導入の影響はないことが確認できた。透過物質をさらに追加することも考えたが、硝酸イソソルビドと本研究で標的としているフタル酸エステルの物理化学的特性の類似性から本透過物質で十分であると判断した。第二の課題では、皮膚移植手術を受ける患者の皮膚内と単核球中のNTE活性の比較を試みた。本被験者はSHS患者ではなく、皮膚内のNTE活性が定量限界に近いほど低いという問題に突き当たった。しかし、被験者の単核球やPNPLA6導入マウスの皮膚や脳を用いた代謝実験により、NTE活性の代替としてパラオキソン抵抗性エステラーゼ活性が使用できることを見出し、皮膚内と単核球中のNTE活性は相関することを明らかにした。PNPLA6のSNP解析も行ったが、本被験者では健常人とほぼ同じ発現パターンが得られ、酵素活性との関係の解析までには至らなかった。以上のように、研究実施計画に示した全ての研究課題に取り組むことができ、想定外の結果が得られた場合も代替案で十分に対処できた。本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。

平成28年度はSHS患者において健常人より単核球中酵素活性が高いことが報告されている神経障害標的エステラーゼ(NTE)に着目し、ヒトNTE遺伝子PNPLA6導入マウスとSHS以外の皮膚移植患者の皮膚および単核球を用い、皮膚内のNTE活性は単核球中活性に相関し、皮膚内活性が高いほどフタル酸エステル経皮吸収性が増加することを明らかにした。しかし、皮膚内の総エステラーゼ活性に占めるNTE活性の割合は10%程度であったことから、平成29年度はフタル酸エステルの皮膚内代謝に寄与するNTE以外の酵素の探索を試み、以下の研究成果を得た。既存のDNAデータベースに基づき、ヒト正常皮膚に高発現している異物代謝酵素のカルボキシルエステラーゼ(CES1およびCES2)と角質細胞間脂質代謝酵素のスフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ1(SMPD1)、ステロイドスルファターゼ(STS)およびグルコセレブロシダーゼ(GBA)を取り上げ、その皮膚内分布と加水分解挙動の速度論的解析を行った。皮膚内のエステラーゼ活性は主に角層以下の表皮に局在し、CES2、SMPD1およびSTSはエステラーゼ活性と同じ部位に局在したが、CES1とGBAは皮膚全体に分布した。CES1とCES2はエステル化合物に対してMichaelis-Menten型の加水分解挙動を示したが、脂質代謝酵素の基質に対する親和性は著しく低かった。ヒト皮膚内のエステル加水分解挙動に及ぼす酵素の寄与を重回帰分析で評価し、約70%がCES2で説明できることが明らかとなった。次年度は各酵素の皮膚内分布量を評価するとともに、他の異物代謝酵素についても検討し、フタル酸エステルの経皮暴露に対するリスク評価法の確立を試みる。平成29年度の研究実施計画では、フタル酸エステルの皮膚内代謝に寄与するNTE以外の酵素の探索を目標に掲げ、「種々エステラーゼのヒト皮膚内分布の評価」と「種々エステラーゼによるエステル化合物の加水分解挙動の速度論的解析」の2つの研究課題に取り組んだ。第一の課題では、DNAマイクロアレイのデータベースから複数のデータで皮膚内に高発現していることが確認された異物代謝酵素CES1およびCES2と角質細胞間脂質代謝酵素SMPD1、STSおよびGBAを選択し、その皮膚内分布を皮膚切片の抗体染色により評価した。CES1とGBAは皮膚全層に分布が認められたが、CES2、SMPD1およびSTSは高いエステラーゼ活性が存在する角層以下の表皮に局在し、エステル化合物の皮膚代謝との関連が示唆された。第二の課題では、これらの酵素による種々エステル化合物の加水分解挙動をヒト皮膚の場合と比較した。CES1およびCES2による加水分解挙動はヒト皮膚と同様にMichaelis-Menten式で解析できたのに対し、脂質代謝酵素の場合は一次速度反応となり、基質親和性が低くいため、エステル化合物の皮膚内代謝への寄与は低いと考えられた。これらのことから、エステル化合物の皮膚内代謝に対する種々酵素の寄与をさらに明らかにするため、平成30年度に実施予定の重回帰分析を前倒しして行い、ヒト皮膚におけるエステル化合物の加水分解能の約70%がCES2で説明できることを明らかにした。以上のように、研究実施計画で目標とした二つの課題に取り組むことができ、また、一部の研究は前倒して行った。最終的には酵素分布量や他の異物代謝酵素についても評価する必要はあるが、本研究はおおむね順調に進展している。
ショウジョウバエ神経筋接合部をテデルとしたシナプス形成機構の遺伝学的解析

1.エンハンサートラップ法による神経筋接合部形成に異常を持つ突然変異体の探索(吉原担当)我々は、神経筋接合部形成に働いている分子を遺伝学的に同定する目的で、エンハンサートラップ系統のスクリーニングを行っている。この目的のために、(1)運動神経あるいは筋細胞での発現が見られる(2)孵化不能、即ち致死であるという二つの基準を満たすものを候補として選択している。神経軸索でもレポーター遺伝子の産物がみられるKZTRAPの挿入系統を樹立する作業を続けている。現在のところ、約1000系統を樹立し、その内、致死の240系統をX-gal染色によってスクリーニングしたところ、運動ニューロンで発現の見られる8系統と筋細胞で発現の見られる18系統を選び出した。今後、これらの系統を電気生理学的に解析し、シナプス形成異常の突然変異体を単離する予定である。正常な神経筋接合部形成過程の記述(1)形態学的記述(吉原担当)神経筋シナプス形成の過程を、抗HRP抗体と共焦点レーザー顕微鏡によって記述したところ、授精後16.5時間でbouton状のシナプスが形成され始めることがわかった。(2)電気生理学的記述(城所担当)昨年度に引き続いて、本年はさまざまなモードで胚期の筋細胞のpatch clampを行い、各stageでのchannelの性質を記述した。