hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
微小地域の微小貝における種分化プロセスの解明

本研究の目的は、小笠原諸島の石門地域内で多様な殻形態を示す微小陸貝を対象として、その形態分化のメカニズムの解明を試みることである。その解決手法として、対象種群の生息環境などの生態的な基礎データの蓄積をはじめ、遺伝的集団構造解析や交配実験など幅広く取り組んできた。しかし記録的な干ばつなどの不測の事態に見舞われ、十分なサンプルが得ることが出来ず、残念ながら交配実験については十分な成果が得られなかった。基礎データについては1年目に引き続き2年目となる今年度も調査をおこない収集した。また、1年目に手法を確立した主成分分析による殻の形態的特徴の定量化およびミトコンドリアDNAと核DNAを用いた分子系統推定をおこなうことで、小笠原諸島に生息する対象陸貝を含むキビオカチグサ近縁種群がおおよそ300万年におよんで殻形態の保守性を示してきた一方で、石門地域内でのみ最近になって急速な変化を遂げていることが明らかとなった。このような対照的な進化過程が同系統・小範囲内で観察できる例は非常に稀であり、適応放散などにみられる多様化メカニズム解明のための優れたモデル系となりうることが改めて示された。この成果は論文としてまとめられ、2013年発行のMolecular Ecology誌にて公表された。現在石門地域内の集団について、1年目に開発したマイクロサテライトマーカーを用いた遺伝的集団構造の解析を進めている最中である。以上のように、当初の予定からすると若干の遅れはあったものの本研究は着実に成果を挙げており、今後もさらなる発展を遂げることが期待できる。(抄録なし)野外調査を行い、対象地の陸貝種構成・密度、および植生・pH・落葉層の深さなど生息環境について記録した。これらのデータは本研究における仮説を検証していく上で重要な基礎データとなる。マイクロサテライトマーカーの開発についてはLian et al.(2006)による手法を採用した。マーカー候補となる配列は問題なく得られ、実用は目前である。本研究の対象陸貝集団はミトコンドリアDNAによる遺伝的分化がほとんど認められず、これまでは詳細な遺伝的構造や交雑の程度を調べることができていなかった。本研究において小範囲の交雑帯の詳細な遺伝解析は主要課題のひとつであり、マイクロサテライトマーカーの導入によってさらなる研究の進展が期待できる。殻の形態解析をおこなうため、野外調査の際に対象陸貝の死殻を集めた。集めた死殻は実体顕微鏡下でデジタル写真撮影をおこない、画像から殻の形態解析をおこなった。殻の高さ・幅や巻きの凹凸といった複数のパラメーターを用いた主成分分析により、殻の形態的特徴の定量化方法を確立した。一方、対象陸貝の系統的な位置づけや起源は明らかになっていない。そこで近縁種であるキビオカチグサを採取し、小笠原諸島外の近縁種を扱っている亀田勇一氏(東北大・学振特別研究員PD)と共同で系統解析をおこなった。その結果、小笠原諸島に生息する対象陸貝を含むキビオカチグサ近縁種群は単系統であり、南西諸島のホラアナゴマオカチグサに近縁であることが判明した。加えて小笠原諸島のグループは、殻形態における保守性と急速な変化という対照的な進化過程を含むことがわかった。同系統・小範囲内で異なる進化パターンが観察できるは非常に稀であり、海洋島における多様化について新たな洞察をもたらすと考えられる。この結果についてはすでに論文としてまとめ、現在海外学術誌に投稿中である。おおむね研究計画どおりに研究を進められ、関連データが集まりつつある。交配実験に関してやや遅れがあるが、一方で成果の一部は既に論文としてまとめ海外誌に投稿中であることから、全体的にはおおむね順調に進展していると判断できる。今後も、基本的には計画どおりに進めていく。

前年度の悪天候により交配実験に関してやや遅れがあるが、H25年度初めに予定している調査で対象陸貝の野外集団の状況をみて、交配実験をどこまで進めるかを適宜判断する。場合によっては遺伝解析および形態解析を中軸として研究を進めることを考慮しておく。(抄録なし)
マイナス鎖ＲＮＡウイルスの複製におけるウイルスと宿主の攻防

本研究の目的は、インフルエンザウイルスゲノムの機能制御に関わる宿主因子を同定し、それらの機能と分子構造を明らかにし、ウイルスの増殖と宿主生理機能の間で起こる宿主因子の奪い合いのメカニズムを明らかにすることである。インフルエンザウイルスゲノム複製に関与する新規宿主因子として、pp32/APRIL、Prp18を同定した。また、複製後のウイルスゲノムはYB-1によって中心体へとリクルートされ、コレステロールに富んだRab11a陽性リサイクリングエンドソームを利用して細胞膜に輸送されることを明らかにした。これにより、ウイルスゲノムの輸送と細胞膜での粒子形成が協調的に制御されることを見出した。本研究の目的は、インフルエンザウイルスゲノムの機能制御に関わる宿主因子を同定し、それらの機能と分子構造を明らかにする。その上で、ウイルスの増殖と宿主生理機能の間で起こる宿主因子の奪い合いのメカニズムを明らかにすることである。新規に複製されたウイルスゲノムは、ウイルスタンパク質NPと結合してribonucleoprotein (RNP)複合体を形成する。これまで我々は、試験管内ゲノム複製系の再構成と解体により、この過程を促進する宿主因子として、スプライシングに関わる因子であるUAP56を同定した。UAP56はNPのN末端部位(20 a.a.)と結合し、ウイルスゲノム複製と協調してNPを新規合成鎖上に配置することを明らかにした。この部位は、Importin alphaの結合部位とオーバーラップしており、核移行したNPの核内でのレセプターとしてUAP56が機能することが推測され、UAP56ーNP複合体およびImportin alphaーNP複合体の構造解析を進めているところである。これまで、ウイルスRNP複合体に結合する宿主因子としてYB-1を同定した。YB-1は、DNA/RNA結合タンパク質であり、転写因子として機能すること、および宿主mRNP複合体の主要構成因子とであることが報告されている。感染に応答して、核内でウイルスRNP複合体と結合したYB-1は、感染後期に移行すると複製されたウイルスRNP複合体と共に核外輸送され、細胞質で微小管合成中心(Microtubule organizing center; MTOC)に集積することが明らかになった。また、超解像顕微鏡で観察したところ、YB-1は中心体の構成因子として、中心小体の周囲でプロペラ様の局在を示すことも明らかにした。現在、中心体上でのYB-1の機能について解析中である。これまで我々は、試験管内ゲノム複製系の再構成と解体により、この過程を促進する宿主因子としてIREF-2を同定した。IREF-2は複製中間体からのウイルスゲノム複製を促進する因子であり、ウイルスポリメラーゼを活性化する因子であることを明らかにした。感染に応答して、核内でウイルスRNP複合体と結合したYB-1は、感染後期に移行すると複製されたウイルスRNP複合体と共に核外輸送され、細胞質で微小管合成中心(Microtubule organizing center; MTOC)に集積することを明らかにした。YB-1は中心体からの微小管合成を促進する活性をもち、それによって、ウイルスゲノムは効率よく輸送されることを明らかにした。ウイルスゲノム複製は、ウイルスゲノムの完全相補鎖であるcRNAを中間体として複製される。これまで、cRNAからのウイルスゲノム複製に関与する因子は不明であった。我々は、試験管内ウイルスゲノム複製系の再構成と解体により、この過程を促進する宿主因子としてIREF-2/pp32を同定し、その詳細な分子機構を明らかにした(eLife, 2015)。これまでに、複製されたウイルスゲノムの細胞内動態を決定する宿主因子として、YB-1を同定した。ウイルス感染によって、YB-1は中心体に集積し、微小管重合を促進することを明らかにした。また、これにともなって、エンドソームの中心体での集積が促進され、ウイルス粒子形成に必須なコレステロールの細胞内動態が制御されることを明らかにした(PLoS Pathogens. 2015)。我々が独自に同定した宿主因子とウイルス因子の相互作用機構の解析を進め、順調な結果が得られている。また、ウイルス感染に応答した中心体の活性化を介して、コレステロールの細胞内動態が制御されていることを明らかにできた。平成28年度では、酵母遺伝子欠損ライブラリーを用いた酵母内ウイルスRNA合成系により、NPタンパク質の新たなシャペロン分子として、スプライシング因子であるPrp18を同定した。Prp18により、ウイルスRNA合成反応時の鋳型鎖の構造が安定化され、RNA合成活性が促進されることを明らかにした。ウイルスポリメラーゼの伸長により、鋳型鎖から遊離したNPを再配置する機能をPrp18はもつと考えられる(Minakuchi M et al.)。

一方、これまでに同定したNPシャペロンであるRAF-2p48/UAP56の分子機構についても解析を進め、RAF-2p48/UAP56がNPの三量体化を促進することで、ウイルスゲノムとNPの結合を促進することを明らかにした。さらに、三量体のNPをウイルスゲノムにリクルートすることで、ウイルスゲノム上でのNPの非特異的凝集を抑制し、鋳型活性の高いウイルスゲノムを構築することが示唆された。また、核内で複製されたインフルエンザウイルスゲノムの細胞質への輸送を制御する分子として、メチル基転移酵素であるPRC2(polycomb repressive complex 2)複合体を同定した。PRC2は条件的ヘテロクロマチンの形成に必須な酵素である。PRC2は、メチル化活性非依存的にM1タンパク質と結合し、核外輸送複合体の形成を促進することを生化学的および細胞生物学的に明らかにした(Asaka MN et al.)。本研究の目的は、インフルエンザウイルスゲノムの機能制御に関わる宿主因子を同定し、それらの機能と分子構造を明らかにする。その上で、ウイルスの増殖と宿主生理機能の間で起こる宿主因子の奪い合いのメカニズムを明らかにすることである。新規に複製されたウイルスゲノムは、ウイルスタンパク質NPと結合してribonucleoprotein (RNP)複合体を形成する。しかし、試験管内ゲノム複製反応に必須な宿主因子であるMCM複合体とNPを添加したのみでは、子孫RNP複合体は形成されない。これまで我々は、試験管内ゲノム複製系の再構成と解体により、この過程を促進する宿主因子として、スプライシングに関わる因子であるUAP56を同定し、ウイルスゲノム複製と協調してUAP56によってNPがウイルスゲノム上に配置されることを明らかにしている。そこで本年度では、UAP56とNPの複合体形成機構を解析した。まず、各種欠損変異体を用いた解析より、NPのN末端から20アミノ酸の領域がUAP56のC末端部分と結合することが明らかになった。一方、細胞内でのUAP56の標的因子であるU2AF65とNPのUAP56結合部位のalpha-ヘリックスのアミノ酸配置を比較したところ、共通して同じ表面上に疎水性アミノ酸残基が露出していることが明らかになった。さらに、保存された疎水性アミノ酸の点変異株を作出したところ、どの変異体でも顕著にUAP56との結合が低下し、ウイルス増殖が低下した。以上の結果より、NPはU2AF65とUAP56の結合を模倣することで、宿主生理機能系からUAP56をウイルスの増殖過程へとリクルートすると考えられた。また、インフルエンザウイルス感染により、スプライソソームが崩壊することも観察されており、UAP56のウイルス複製系へのリクルートにより、スプライシングが破綻していることが示唆される。
1960年代日本の防衛・安全保障政策に関する実証的研究

本研究の実績として第一に、1960年代日本の防衛・安全保障政策に関する基礎的文献を収集し、整理したことが挙げられる。防衛政策の策定過程を明らかにする直接的な政府資料の公開は進んでいないが、アメリカの外交史料の公開によってある程度信頼できる一次史料が公開されると共に、60年安保改定や69年沖縄施政権返還を中心に日本の研究者によってその史料が分析され、公表されている。それらの史料、公表論文等を収集し、データを整理した。また、日本の外務省史料も60年代前半について公開が進んでおり、特にアジア太平洋関係に関してその一部を参照することが可能となった。同時に、三矢研究関係の公表文献を収集した。また、この時期の防衛政策の立案、実行に深く関わった加藤陽三氏等の著作を中心に当時の関係者の著述を収集した。さらに1960年代の防衛政策を見る上で重要な雑誌『国防』に寄稿された論文を中心に、防衛力整備、アジアの軍事情勢、日本の核保有問題、沖縄米軍基地問題等の問題別に整理した。第二に、本研究で集めたデータ、文献等を利用して、分析を進め、1960年代が日本の防衛・安全保障政策にとって重要な意義をもっていたことがほぼ明らかとなってきた。現段階の分析の結果として、第一に、この時期に進んだ日本のアジア諸国との関係の強化、特に韓国との国交樹立、東南アジア諸国との経済協力を軸とした協力関係の強化が、日本の安全保障政策と深く関わっていたことが明らかとなった。第二に、1960年代において日本の防衛政策の基礎が作られ、特に核をもたずアメリカの核の傘の下に入ること、日本本土に対する通常兵力による侵攻を想定して兵力整備を進めることが確定した時期であったことが分かってきた。これらの成果は、近刊予定の論文の中ですでに一部を公表した。具体的な予定としては決まっていないが、今後個別の論文として公表していく。本年度は、1960年代の日本の防衛政策に関連する基礎データの収集・整理を中心に研究を行った。特に、1960年代防衛問題の関係者による回想、同時代の著書の収集、雑誌『国防』、『外交時報』、『国際問題』を中心とした同時代論文の複写および整理、日本の防衛・安全保障政策に関連した文献の収集・整理を中心とした。また、アメリカの外交文書も次第に1960年代について刊行が進んでおり、それらを基礎に、アメリカの対日政策およびアジア政策、国防・安全保障政策について整理を開始した。未公刊資料については、外務省の公開資料に関して調査を開始したが、未だ近年の公開資料をカバーするには至っていない。これらの調査の結果、1960年代の日本の防衛・安全保障政策については、(1)三矢研究からベトナム戦争問題、沖縄返還に至る、地域的安全保障の問題のラインと、(2)中国の核実験から非核三原則の公表に至る核拡散問題のラインという二つのラインが存在することを改めて確認した。それぞれについて、当時かなり真剣な議論が行われており、その水準は当時の国際水準から見てもかなり高い内容をもつものであったと言える。次年度にかけて、外務省公開資料を含めて資料を整理し、研究としてまとめていく予定である。
半導体量子井戸構造中のサブバンド間結合によるバンド間遷移電気感受率の制御

本年度は理論的モデルの構築を行ないサブバンド間結合により電気感受率がどのように制御されうるかを様々な量子井戸構造および材料系に想定して数値計算を行なった。計算は様々なド-ピング濃度およびバンド間エネルギー、サブバンド間エネルギーに対して行なわれた。電気感受率はこれらのパラメータに対して強く依存し実際の測定に際してはサンプル構造を注意深く選択することが重要であることが判明した。また非対称構造の量子井戸系では3次のみならず2次の非線形光学効果の寄与も重要であることが示され、和周波発生のような現象も起きることが示唆された。非線形電気感受率はキャリアーの緩和時間に対しても依存することがわかったが、現在のモデルではこの緩和時間は現象論的の導入されたものであるためその物理的意味を理解するためにはより現実的なモデルが必要とされるようである。また現在のモデルはすべて定常励起を仮定しているが、この系が短パルス励起に対してどのような過渡応答現象を示すかは物理的に興味深いと共に、測定がパルス光源を用いて行なわれるという点からも重要である。今後の理論的研究は過渡応答現象と、より詳細な半導体量子井戸系のモデル化に重点を置く予定である。これら理論的研究と平行して測定装置の準備とサンプルの評価を始めた。基礎的な光学測定が出来る状態に持って来ており、これを使って材料の評価を行なっている。材料系としてはInGaAs/AlAs系が井戸と障壁のバンドギャップの差が大きくサブバンド間のエネルギー差を大きく取れて実験上好都合である歪み系であるため成長が難しいようである。今後の実験にとって設計通りのサンプル構造に成長できているかは極めて重要であるので現在発光、バンド間・サブバンド間吸収の測定を行ない井戸構造の評価を進めている。
組織破壊性蛋白分解酵素が結合組織性付着に及ぼす影響について

歯周疾患における組織破壊に関与すると考えられる蛋白分解酵素の存在を検討するため、歯周炎患者18名(男性10名、女性8名、年齢25-64歳)の歯肉溝滲出液中の中性蛋白分解酵素の濃度をELISA法にて測定した。その結果、エラスターゼ量、カテプシンG量共にポケットが浅い(1-2mm)ときは最小で、ポケットが中等度(3-5mm)から高度に(6mm以上)になるにつれ増加し、これらの酵素が歯周疾患における組織破壊に関与する可能性が示唆された。続いて、歯周組織における結合組織性付着に影響する因子およびその程度を検討するため、歯根膜由来線維芽細胞培養系を用いてin vitroにおける歯周疾患非罹患及び罹患根面への線維芽細胞の付着に関する実験を行い、併せて、根面に付着した細胞のDNA合成量およびアルカリホスファターゼ活性を測定した。その結果、根面が組織為害性物質で汚染されていない試料では細胞の付着及び増殖状態が良好であった。さらに根面に付着した細胞のDNA合成量は非罹患根面及び罹患根面共に、培養初期7日間、対数増殖を示したが、罹患根面では非罹患根面に比べ有意に低く、50%の合成量であった。アルカリホスファターゼ活性は非罹患根面は罹患根面より有意に高かった。この実験系で、中性蛋白分解酵素の結合組織性付着に及ぼす影響を十分に検討できると思われた。また試料の根面中から培養液中に溶出したエンドトキシン量は罹患根面では非罹患根面より有意に高かったが、罹患根面のエンドトキシン量は浸漬1日で総量の71%が溶出し、浸漬4日で非罹患根面のエンドトキシンと同レベルにまで減少した。さらに、ブラキシズムに関する研究を行い、歯周組織破壊に関わる外傷性因子について検討した。今後、外傷性因子が線維性付着にどのような影響を及ぼすか検討を継続する。歯周疾患における組織破壊に関与すると考えられる蛋白分解酵素の存在を検討するため、歯周炎患者18名(男性10名、女性8名、年齢25ー64歳)の歯肉溝滲出液をろ紙法にて採取した。蛋白分解酵素として、多形核白血球顆粒中に存在する中性蛋白分解酵素のエラスタ-ゼとカテプシンGを選択し、両酵素の歯肉溝滲出液中の濃度をELISA法にて測定した。その結果、エラスタ-ゼ量(平均値±SD)は1ー2mmのポケット22部位で1520±1425ng/μl,3ー5mmのポケット57部位では2405±1105ng/μl,6mm以上のポケット7部位では1925±1054ng/μlで、カテプシンG量は、同様に、1ー2mmのポケットで585±582ng/μlであった。続いてこれらの中性蛋白分解酵素が結合組織性付着にどのように影響するかを検討するため、歯根膜由来線維芽細胞培養系を用いてIn vltroにおける歯周疾患罹患根面への線維芽細胞の付着に関する基礎的な実験を行なった。歯周疾患罹患あるいは非罹患のヒト抜去歯にスケ-リングまたはル-トプレ-ニングを施した後に、歯科用タ-ビンで根面の含まれる小片に分割し、約5mm×7mm×1mmの試料片を作成した。各試料片は24穴アルチウェルに移し、PBS中で超音波処理後、5000個/mlの線維芽細胞浮遊αーMEM液を各ウェルに1ml分注し、7日間培養した。

培養後試料を固定し、付着細胞数の測定と走査型電子顕微鏡による線維芽細胞の形態観察と付着状態の観察とを行なった。その結果、根面が組織為害性物質で汚染されていない試料では、細胞の付着及び増殖状態が良好であり、この実験系で、中性蛋白分解酵素の結合組織性付着に及ぼす影響を十分に検討できると思われ、今後実験を継続していく予定である。本研究は第5回国際歯周病学会(平成4年5月、ブダペスト)で発表予定である。歯周組織における結合組織性付着に影響する因子およびその程度を検討するため、歯根膜由来線維芽細胞培養系を用いてIn vitroにおける歯周疾患非罹患及び罹患根面への線維芽細胞の付着に関する実験を行い、併せて、根面に付着した細胞のDNA合成量およびアルカリホスファターゼ活性を測定した。歯周疾患罹患あるいは非罹患のヒト抜去歯にスケーリング・ルートプレーニングを施した後に、根面の含まれた約5mm×7mm×1mmの試料片(以下、非罹患あるいは罹患根面)を作成した。各根面は24ウェルマイクロプレートに移し、PBS中で超音波処理後、1×10^4個/mlの線維芽細胞浮遊α-MEM液を各ウェルに1ml分注し、56日間培養した。その結果、根面が組織為害性物質で汚染されていない試料では、細胞の付着及び増殖状態が良好であった。さらに根面に付着した細胞のDNA合成量は非罹患根面及び罹患根面共に、培養初期7日間、対数増殖を示したが、罹患根面では非罹患根面に比べ有意に低く、50%の合成量であった。アルカリホスファターゼ活性は非罹患根面は罹患根面より有意に高かった。この実験系で、中性蛋白分解酵素の結合組織性付着に及ぼす影響を十分に検討できると思われた。また試料の根面中から培養液中に溶出したエンドトキシン量は罹患根面では非罹患根面より有意に高かったが、罹患根面のエンドトキシン量は浸漬1日で総量の71%が溶出し、浸漬4日で非罹患根面のエンドトキシンと同レベルにまで減少した。さらに、ブラキシズムに関する研究を行い、歯周組織破壊に関わる外傷性因子について検討した。今後、外傷性因子が線維性付着にどのような影響を及ぼすか検討を継続する。
乱流中での球形および非球形大粒子の衝突機構に対する数値研究

開発した埋め込み境界法に基づく粒子解像直接数値計算(DNS)法を用いて、粒子レイノルズ数Repが1よりも大きい大粒子間の衝突統計量の取得を継続した。具体的には、始めに、層流の中の多数粒子系を対象として、衝突頻度、クラスタリング効果を定量的に明らかにした。さらに、乱流の中の多数粒子系を対象として同様の解析を行った。最大規模の計算として2000^3格子程度の超大規模計算にも成功した。そして、乱流クラスタリング統計量を得ることができた。粒子慣性、粒子サイズを様々に変化させて得られた統計量を解析することにより、粒子間衝突や粒子クラスタリング機構に及ぼす有限サイズ効果や粒子周り流れを介した粒子間反発力の影響も明らかにした。以上により、これまでに得られたことのない乱流衝突統計量を取得することができ、球形・大粒子間の乱流衝突機構を解明することができた。また、複数の非球形粒子が接近する際に作用する潤滑を考慮する手法を開発した。開発した手法は、従来のReynolds潤滑方程式が仮定する極めて狭い隙間の流れに限定されず、非Poiseuille流れに基づく潤滑モデルであるという特長を有する。これにより任意形状物体間の潤滑問題へと一般化が可能になる。さらに、解析解および直接数値計算解との比較を通して、その有効性を確認した。今後、平成29年度に実施した潤滑解の埋め込み手法と併用することでより効率のよい数値解法への展開が期待できる。以上の成果を7件の査読付き論文誌として発表した。これまでに、計算モデルおよび計算コードの開発が順調に進み、物理の解析を開始することができた。大規模計算の実施も可能となり、今後、研究進捗が加速されると期待できる。また、開発したコードや得られた解析結果に関して査読付き論文誌という形で多数の成果発表も行っており、順調な進捗を継続できている。本課題は海洋研究開発機構と大阪大学との共同課題である。両者の知見を積極的に共有するために、お互いが定期的に訪問し合い、研究会のような形で議論を交えていく。このような交流を通じ、乱流中での大粒子の衝突機構の解明を推進するだけでなく、最終年度である令和元年度には、得られた成果を対外的に発表する場として、オープンな共同ワークショップを開催することで、成果の積極的な発信にも努める。研究代表者の所属する海洋研究開発機構のグループの有する大規模混相乱流に対する直接数値計算法(DNS法)に関する知見・経験と、研究分担者の所属する大阪大学のグループの有するImmersed Bundary法(IB法)に関する知見と経験を元に、将来の超並列計算を見据えた大規模並列粒子解像DNSコードを新規開発した。具体的には、有限差分法に基づきナビエーストークス方程式を解く流体計算コードと、粒子運動をラグラジアン追跡法に基づき計算するコードを開発した。その中では、粒子を質点として扱うのではなく、IB法を用いることによって粒子を解像した上で、流体と粒子間の相互作用を直接計算する。3次元領域分割による分散並列計算に対応できるようにしたことで大規模並列計算が可能である。開発したコードを用いて球形大粒子シミュレーションに適用し、既往研究と比較して、正確な抵抗係数を得られることを確認した。また、最大で1000プロセスを用いた大規模並列計算を実施し、並列計算の検証を行った。これにより、大粒子の乱流衝突機構の解明のための重要なツールを得ることができた。一方で、開発した混相乱流計算コードは、2粒子の間隙が計算格子と同等程度以下になった場合に、その間隙内の流体現象を正しく表現できなくなり、潤滑層反発力を過小評価してしまう。それを回避するために、解像できない潤滑層反発力を補うためのモデルの開発を行った。開発した潤滑層モデルは、レイノルズ方程式に基づき間隙内の流体運動を推定する。2軸潤滑シャフトに対してその信頼性を確認した。初年度の中心課題であった大規模並列・粒子解像DNSコードを新規開発を予定通り行った。また、潤滑層モデルの開発も行った。当初予定していたIB法に特化した簡易衝突検出法の開発は次年度以降に先送りしたものの、開発したDNSコードを用いた計算に関しては想定以上の進捗があった。具体的には、球形大粒子の抵抗係数に関する検証だけでなく、大規模並列計算試験も行うことができた。以上、総合的に考えて、順調に進展していると考える。平成28年度に開発した埋め込み境界法に基づく粒子解像直接数値計算(DNS)法を用いて、粒子レイノルズ数Repが1よりも大きい大粒子間の衝突統計量の取得を開始した。そして、層流での結果と乱流での結果を比較することにより、乱流の効果を明らかにした。参照のために、従来の質点近似を用いた場合の結果との比較も行った。以上により、これまでに得られたことのない乱流衝突統計量を元に、球形・大粒子間の乱流衝突機構の一端を解明することができた。大型スーパコンピュータを用いた大規模計算を実施する中で、随時、コードの高速化も行った。また、平成28年度に開発した潤滑層反発力モデルをDNS法に実装した上で、そのモデルの検証を行った。

開発したモデルは、二つの物体が接近する際に物体間の狭隘部を支配する潤滑方程式を解き、その解を狭隘路外部の流れ場に埋め込む数値的手法である。実際に、その手法を軸受と軸の隙間流れおよび接近する二粒子の間の流れに適用したところ、圧力分布や粒子の運動が理論解や独立に行われた数値解と良い一致をすることを確認できた。さらに、狭隘部で不足する解像度を補うことによって、数値解の精度を上げる可能性を示すことができた。以上の成果を5件の査読付き論文誌として発表した。これまでに、計算モデルおよび計算コードの開発が順調に進み、物理の解析を開始することができた。大規模計算の実施も可能となり、今後、研究進捗が加速されると期待できる。また、査読付き論文誌という形での成果も出てきており、順調な進捗を継続できている。開発した埋め込み境界法に基づく粒子解像直接数値計算(DNS)法を用いて、粒子レイノルズ数Repが1よりも大きい大粒子間の衝突統計量の取得を継続した。具体的には、始めに、層流の中の多数粒子系を対象として、衝突頻度、クラスタリング効果を定量的に明らかにした。さらに、乱流の中の多数粒子系を対象として同様の解析を行った。最大規模の計算として2000^3格子程度の超大規模計算にも成功した。そして、乱流クラスタリング統計量を得ることができた。粒子慣性、粒子サイズを様々に変化させて得られた統計量を解析することにより、粒子間衝突や粒子クラスタリング機構に及ぼす有限サイズ効果や粒子周り流れを介した粒子間反発力の影響も明らかにした。以上により、これまでに得られたことのない乱流衝突統計量を取得することができ、球形・大粒子間の乱流衝突機構を解明することができた。また、複数の非球形粒子が接近する際に作用する潤滑を考慮する手法を開発した。開発した手法は、従来のReynolds潤滑方程式が仮定する極めて狭い隙間の流れに限定されず、非Poiseuille流れに基づく潤滑モデルであるという特長を有する。これにより任意形状物体間の潤滑問題へと一般化が可能になる。さらに、解析解および直接数値計算解との比較を通して、その有効性を確認した。今後、平成29年度に実施した潤滑解の埋め込み手法と併用することでより効率のよい数値解法への展開が期待できる。以上の成果を7件の査読付き論文誌として発表した。また、開発したコードや得られた解析結果に関して査読付き論文誌という形で多数の成果発表も行っており、順調な進捗を継続できている。本研究課題は海洋研究開発機構と大阪大学の共同課題である。両者の知見と経験を積極的に共有するために、お互いが定期的に訪問し合い、研究会のような形で議論を展開していく。平成29年度には、大規模並列・粒子解像DNSコードと潤滑層反発モデルの開発と検証を継続するだけでなく、IB法に特化した簡易衝突検出法の開発を開始する。粒子レイノルズ数が1程度よりも小さい球形粒子だけでなく、球形大粒子のシミュレーションや非球形粒子のシミュレーションも開始する。本課題は海洋研究開発機構と大阪大学との共同課題である。両者ともに、開発フェーズから研究フェーズに移る。
青果物の成熟老化の生理学及び分子生物学的研究とれに基づく鮮度保持技術の再評価

青果物は収穫後代謝の変動が急速に進行し、成熟、老化が進み、品質が低下する。各研究者はこの現象の解明に生理学的、生化学的、分子生物学的手法と考えのもとに研究を行った。山木は果実の糖合成と蓄積の機構の中で、ソルビトール脱水素酵素、スクロース合成酵素の反応機構の研究を行った。茶珍は成熟に伴う肉質の変化の機構について、ペクチンとヘミセルロースの変動を分析した。土田は果実の軟化機構とその制御についてβ-ガラクトシダーゼ、α-アラビノフラノシダーゼの研究を行った。中村は果実、野菜の鮮度保持効果の分子生物学的解析の中で高濃度炭酸ガスによるエチレン生合成系酵素の活性誘導、水分ストレスによるポリガラクツロナーゼの活性誘導について遺伝子の発現を解析した。稲葉は果実のエチレン生成と成熟の機構において、ACC合成酵素とACC酸化酵素の発現と調節の研究を行った。兵藤はエチレン生成と老化の機構の中で、ブロッコリー花蕾の老化の機構と関連してエチレン生合成とその酵素について研究を行った。上田はガス環境と呼吸生理の解析の中で、低酸素条件が呼吸系の酵素に及ぼす影響と効果について研究を行った。秋元は成熟過程のシミュレーション解析の中でフィルム包装された青果物の呼吸速度をコンピュータによる数値解析を用いて推定する方式を考案した。寺井は老化とクロロプラストの微細構造の研究の中で、ブロッコリー花蕾の老化に伴うクロロプラストの構造変化を解析した。山内はクロロフィル分解の反応の機構の研究でブロッコリー花蕾のクロロフィル分解の一連の反応を解析した。松尾は低温感受性の分子生物学的解析で、植物の低温、高温耐性の特性を示すための遺伝子の発現について調査した。山脇は低温障害と感受性の機構の中で、各種青果物の高温、低温に対する感受性の違いと熱ショックタンパク質の解析を行った。これらの研究結果は多くのすぐれた成果をもたらし、研究の発展に大きく貢献した。これらの研究結果は青果物の鮮度保持技術を考察する上で多くの示唆を与えるものと思われる。青果物の成熟、老化に伴う代謝の変動、生理変化を生理学、分子生物学のレベルで解明し、その調節機構を明らかにし、それを鮮度保持技術に応用するための制御の方法を検討することを目的としている。成熟過程における果実の糖合成と蓄積の機構を明らかにするために、ショ糖合成酵素の性質と機能、及びソルビトール脱水素酵素の性質と機能を明らかにした。果実の成熟における軟化の機構を明らかにするために、ペクチン物質の変化、果実の軟化に関与すると思われる酵素類の活性変化、それら酵素類の阻害物質の影響、及び細胞壁多糖の組成と構造変化について調査した。青果物の成熟、老化の過程でエチレンが生成され、そのエチレンにより成熟、老化が誘導される。エチレン生合成において生理的に重要な役割を果たす酵素はACC合成酵素とACC酸素酵素である。トマト果実の成熟過程において、またブロッコリー小花の老化の過程でこれらの酵素の活性変動、遺伝子発現について明らかにした。高濃度二酸化炭素、低濃度酸素(CA,MA)の条件は成熟、老化を抑制し、鮮度保持に有効である。これらの条件下におけるエチレン生合成に関与する酵素の遺伝子発現、呼吸代謝を調査した。一方シミュレーション解析により、MA環境下における青果物の呼吸速度を動的に解析した。青果物は成熟、老化の過程でクロロフィルが分解し、脱緑が進行する。クロロフィル分解の機構を調べ、分解産物の同定を行った。ある種の青果物は低温貯蔵中に低温障害が発生する。

低温に弱い青果物、すなわち低温感受性を有する青果物の生理学的、分子生物学的機構を明らかにするために、アスコルビン酸代謝に関与する酵素の活性変動、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を明らかにしようと試みた。青果物は収穫後代謝の変動が急速に進行し、成熟、老化が進み、品質が低下する。各研究者はこの現象の解明に生理学的、生化学的、分子生物学的手法と考えのもとに研究を行った。山木は果実の糖合成と蓄積の機構の中で、ソルビトール脱水素酵素、スクロース合成酵素の反応機構の研究を行った。茶珍は成熟に伴う肉質の変化の機構について、ペクチンとヘミセルロースの変動を分析した。土田は果実の軟化機構とその制御についてβ-ガラクトシダーゼ、α-アラビノフラノシダーゼの研究を行った。中村は果実、野菜の鮮度保持効果の分子生物学的解析の中で高濃度炭酸ガスによるエチレン生合成系酵素の活性誘導、水分ストレスによるポリガラクツロナーゼの活性誘導について遺伝子の発現を解析した。稲葉は果実のエチレン生成と成熟の機構において、ACC合成酵素とACC酸化酵素の発言と調節の研究を行った。兵藤はエチレン生成と老化の機構の中で、ブロッコリー花蕾の老化の機構と関連してエチレン生合成とその酵素について研究を行った。上田はガス環境と呼吸生理の解析の中で、低酸素条件が呼吸系の酵素に及ぼす影響と効果について研究を行った。秋元は成熟過程のシミュレーション解析の中でフィルム包装された青果物の呼吸速度をコンピュータによる数値解析を用いて推定する方式を考案した。寺井は老化とクロロプラストの微細構造の研究の中で、ブロッコリー花蕾の老化に伴うクロロプラストの構造変化を解析した。山内はクロロフィル分解の反応の機構の研究でブロッコリー花蕾のクロロフィル分解の一連の反応を解析した。松尾は低温感受性の分子生物学的解析で、植物の低温、高湿耐性の特性を示すための遺伝子の発現について調査した。山脇は低温障害と感受性の機構の中で、各種青果物の高温、低温に対する感受性の違いと熱ショックタンパク質の解析を行った。これらの研究結果は多くのすぐれた成果をもたらし、研究の発展に大きく貢献した。これらの研究結果は青果物の鮮度保持技術を考察する上で多くの示唆を与えるものと思われる。
自己集合性光機能分子による電極修飾とその光電変換特性

光合成型の太陽電池を開発するにあたり、分子をナノメートルサイズで電極上に規則的に並べることが重要である。その基礎的知見を得るために光機能性分子を自己組織化法により単分子膜化することを試みた。まず、ポルフィリン-C_<60>連結分子にメチルチオ基を導入し金電極上に単分子膜を作製した。この修飾電極を用いた湿式2極系光電気化学セルの評価を行ったところ、その量子収率は約1%であった。また、ポルフィリンのみからなる参照系と比較するとその光電流値が約5倍増加していることからC_<60>が良好な電子伝達体として機能していることが明らかになった。しかしながら、スルフィドを用いたこと、およびアルキル鎖をスペーサーとして導入しなかったことから、その膜構造は疎に分子が集合したものであることが判明した。そこでアルキル鎖長の効果を調べるために種々のメチレン鎖長を持つポルフィリンジスルフィドダイマーを合成した。メチレン鎖が長くなるにつれ、ポルフィリン自己組織化単分子膜は高密度にパッキングした構造となることが紫外可視吸収分光法、サイクリックボルタンメトリー法、原子間力顕微鏡法によりわかった。またその光電気化学特性を評価したところ、メチレン鎖が短くなるにつれ、光電流値は減少した。これは励起ポルフィリンの失活過程として電子担体に電子を渡す過程と金電極によりエネルギー移動により失活する過程が競争していることを示唆している。そこで次に十分な長さのアルカンチオールを持つC_<60>誘導体を合成し、その膜構造と光電気化学特性を評価した。電気化学測定からC_<60>自己組織化単分子膜はポルフィリン同様に高密度・高配向の構造をとっていることがわかった。またその量子収率は7.5%となり、今までに報告された同形式の有機太陽電池の最高値に匹敵する性能を示すことが明らかになった。
シェーグレン症候群治療薬の標的探索

本研究ではシェーグレン症候群(SS)の病態に深く関与している患者末梢血単球でのBAFFシグナル伝達経路の解析と、既承認薬のリポジショニングによるBAFFシグナル伝達阻害物質の探索を試みた。その結果、SS患者末梢血単球ではIKKaやIKKbのリン酸化が亢進していること、単球からのBAFFによるIL-6産生がNF-kB阻害剤で強く抑制されることを見出した。また複数の既承認薬がBAFFにより刺激されたSS患者末梢血単球からのIL-6産生を抑制することも見出した。今後これらの薬剤のBAFFシグナル経路への影響と治療薬への展開の可能性を検討する。本研究ではシェーグレン症候群(SS)患者末梢血単球におけるB細胞活性化因子(BAFF)シグナルを特異的に阻害する化合物を細胞レベルで探索し、その作用点を明らかにすることを目的としている。我々はこれまでSS患者単球ではBAFF受容体(BR3)発現とBAFFにより誘導されるIL-6の産生が顕著に亢進しており、SS患者末梢単球におけるBR3発現率と単球からのBAFF誘導型IL-6産生量および患者血中IgG量に正の相関があることを明らかにした。これらの結果とSSは高IgG血症を伴う疾患として知られている背景と合わせて、SS患者末梢単球においてBR3の発現が亢進し、それにBAFFが結合することによりBAFFシグナル経路を介してIL-6産生を誘導し、B細胞からのIgG産生に影響を与えている可能性が示唆された。そこで今年度は単球からのBAFFシグナルを介したIL-6産生とB細胞からのIgG産生の関与について詳細な検討を開始した。さらにヒト単球系細胞株(THP-1)を用いて、既存医薬品ライブラリーからのBAFFによるIL-6産生誘導を阻害する薬剤スクリーニングを開始した。その結果、SS患者末梢血B細胞を単球と共培養することにより、B細胞からのIgG産生亢進が認められ、この培養系にBAFFを添加することによりIgG産生量が顕著に上昇することが明らかになった。この結果より、BAFFにより刺激された単球がB細胞からのIgG産生機構に重要な役割を果たしていると考えられる。また医薬品リポジショニング検討として、ヒト単球系細胞株THP-1を用いたBAFF誘導IL-6産生系を用いて慶應義塾大学薬学部より供与された既存医薬品のうち144化合物のスクリーニングを実施した。その結果細胞からのIL-6産生を50%以上阻害する化合物を複数見出すことに成功した。今後、B細胞のIgG産生機構に単球が関与する詳細な機構や、医薬品リポジショニングにより得られた化合物の作用点など詳細な検討を進める予定である。本研究は未だ治療薬の無いシェーグレン症候群(SS)の治療薬開発に向け標的候補分子を見出し創薬へと橋渡しをすることを目的としている。具体的にはSS患者末梢血単球におけるB細胞活性化因子(BAFF)シグナルを特異的に阻害する化合物を細胞を用いた評価系で探索し、その作用点を明らかにする。我々はこれまでSS患者末梢血単球ではBAFF受容体(BR3)の発現が異常に亢進し、このことが起因となり末梢単球からのBAFFによるIL-6産生が亢進していることを見出した。さらにSS患者末梢血単球におけるBR3発現量と患者血清IgG量に正相関があることから、末梢血単球におけるBR3発現は高IgG血症を伴う疾患であるSSの病態に関与することが示唆された。そこで昨年度から既承認薬ライブラリーを用いて単球からのBAFFによるIL-6産生を抑制する薬剤を探索する医薬品リポジショニングの検討を開始した。具体的にはヒト単球系細胞株(THP-1)を用いた刺激培養系を一次スクリーニング系として利用しスクリーニングを行う。昨年度に引き続き、今年度も医薬品リポジショニングによるスクリーニングを続行し、計222医薬品のスクリーニングを行った。その結果、約20種の医薬品がTHP-1からのBAFFによるIL-6産生抑制作用を有することが判明した。さらにこれらの医薬品についてヒト末梢血単球をBAFF存在下で培養し得られるIL-6産生に対する影響を二次スクリーニングとして検討した。その結果、数種類の医薬品が末梢血単球からのBAFFによるIL-6産生抑制作用を有することが明らかとなった。これらの医薬品はBAFFシグナルを阻害しIL-6産生抑制機能を発揮していることが推測される。本研究は厚生労働省の定める指定難病であるシェーグレン症候群(SS)の治療薬の開発を目指し、治療標的分子を見出し創薬へと橋渡しをすることを目的としている。我々はこれまでの研究においてSS患者末梢血単球上にBAFF受容体(BR3)が健常人と比較して有意に高発現しており、BR3発現亢進が単球からのIL-6産生や血中IgG値と有意に相関することを見出した。これらの知見を基に、BR3が本疾患の治療標的となり得ると考え、BAFFがBR3と結合し惹起されるシグナルを阻害する作用を有する化合物の探索を既承認薬ライブラリーを用いた医薬品リポジショニングを軸として進めてきた。具体的にはヒト単球系細胞株(THP-1)を用いてBAFFにより誘導されるIL-

6産生を抑制する作用を有する化合物を抽出する過程を1次スクリーニングとし、候補となる化合物を患者末梢血単球を用いBAFFにより誘導されるIL-6産生に対する抑制効果を検討する2次スクリーニング法を用いてより強くBAFFの作用を抑制する候補化合物を選択する方法を用いた。この結果今年度までに250種類の化合物の検定を終え、2次スクリーニング終了時に4種類の候補化合物を得ることができた。さらにこれらの化合物と共に培養したTHP-1および末梢血単球におけるBAFFシグナルへの影響を検討したところ、既知のBAFFシグナル経路の一つであるNF-kB経路の阻害作用を有することが明らかとなり、BAFFがBR3に結合することにより惹起されたBAFFシグナルを阻害していることが推察された。興味深いことに既承認薬のスクリーニングにより得られた候補化合物は、共通の分子を標的にした化合物であることが判明し(分子に関する特許出願準備中)、この分子のBAFFシグナル経路への関与が示唆され、世界で初めての知見となり得る。本研究ではシェーグレン症候群(SS)の病態に深く関与している患者末梢血単球でのBAFFシグナル伝達経路の解析と、既承認薬のリポジショニングによるBAFFシグナル伝達阻害物質の探索を試みた。その結果、SS患者末梢血単球ではIKKaやIKKbのリン酸化が亢進していること、単球からのBAFFによるIL-6産生がNF-kB阻害剤で強く抑制されることを見出した。また複数の既承認薬がBAFFにより刺激されたSS患者末梢血単球からのIL-6産生を抑制することも見出した。今後これらの薬剤のBAFFシグナル経路への影響と治療薬への展開の可能性を検討する。我々がこれまで得た知見より、SS患者末梢血単球においてBAFF受容体発現が亢進しており、これが高IgG血症を伴うSSの病態に関与していることが明らかとなった。この結果より今年度はBAFFによりIL-6産生が誘導されるヒト単球系の細胞株(THP-1)を用いて既承認薬を用いたリポジションニングのためのスクリーニングを行った。222種類の既承認薬のBAFFによるIL-6産生に対する効果の評価を遂行し、IL-6産生抑制効果を認める医薬品を見出した。さらに今年度は二次スクリーニングとしてこれらの医薬品について末梢血単球を用いた培養系での評価に進むことができた。これらの医薬品の一部は共通の作用機作を有していることが明らかになり、今後のBAFFシグナル関連標的分子を示唆するものでもあると考えられる。さらに今後B細胞機能への影響検討や動物モデルへの投与の方向性が明確になった経緯からも研究は順調に進捗していると考えている。臨床免疫学これまでの結果を受け、医薬品リポジショニングを目的としたスクリーニングから得られた候補医薬品についてB細胞からのIgG産生を検討するin vitroの三次スクリーニング系にて評価を進めていく予定である。具体的にはSS患者末梢血よりB細胞を単離し、同じく末梢血から分離した単球とBAFFと共に培養する。この培養系ではB細胞からのIgG産生が亢進するが、これに対する候補医薬品の効果を評価する。三次スクリーニングでIgG産生抑制効果が認められた医薬品について、炎症モデルマウスなど病態モデルマウスに投与し、病態で効果を検討する。一方で、これらの医薬品の作用点を明らかにするため、BAFFシグナルに関与する蛋白質の同定を、抗リン酸化抗体等を用いたハイコンテントスクリーニング法等で解析する。
高安定リンおよび関連イリドの一電子移動特性を利用した新規カップリング反応の開発

従来、イリドの関与する一電子移動過程は、わずかに反応機構の側面から述べられているに過ぎない。著者らのこれまでの研究から、例えば典型的な高安定リンイリドであるフルオレニリデントリフェニルホスホランは半波酸化電位が、0.29V(vs.SCE)と優れた一電子移動性を示した。本研究課題では安定リンおよび関連イリドの一電子移動を鍵とする新規反応および関連した反応の開発について検討した。主な結果を以下にまとめる。1.フルオレニリデントリアリールホスホラン誘導体(FL)を合成し、見積もられた半波酸化電位は0.060.34V(vs.SCE)と良好な一電子供与性を示した。特に3,6-ジメトキシフルオレニリデントリフェニル体(DMFL)は、最も高い一電子供与性を示した。2.イリドFLと種々のジアゾニウム塩(置換ベンゼンジアゾニウム、o-アルケニルおよびアルキニルオキシベンゼンジアゾニウム)との冷時反応を調べたところ、DMFLのみ脱窒素を伴うホスホニウム塩の生成、一分子のジアゾニウム塩の分子内Meerwein反応を伴うジアゾニウムの二量化生成物、または分子内Meerwein反応につづくイリドの付加-脱メチルによるキノイド化合物が生成した。他のイルドではジアゾカップリングが起こったのみであった。3.イリドDMFL-置換ベンゼンジアゾニウム系は、ラジカル重合開始剤として作用し、容易にポリメタクリル酸メチルを温和な条件下与えた。4.イリドDMFLと過酸化ベンゾイルとの反応ではペルオキシドO-O結合の切断を伴う、フルオレノンのアセタール化生成物を良好な収率で与えた。
ES細胞由来の心筋前駆細胞の虚血心への移植の有効性に関する研究

本研究ではマウスFlk1陽性ES細胞から心筋前駆細胞へ分化誘導した細胞を虚血心に移植し、心筋再生の可能性を探り、心機能改善効果を評価することを目的とした。マウスES細胞を分化誘導し、心筋細胞・心筋前駆細胞を得る方法。1)マウスのFlk1陽性ES細胞を分化誘導し3x10^6個という大量の心筋細胞を得る方法を確立した。マウスES細胞由来の心筋細胞・心筋前駆細胞を用いた細胞移植の検討1)マウスの拡張型心筋症モデルに対して、Flk1陽性ES細胞由来の心筋前駆細胞を用いた細胞移植を行い、心機能の改善を認めた。2)マウスの急性心筋梗塞モデルに対するFlk1陽性ES細胞由来の心筋細胞を用いた細胞雛を行い、移植細胞の生着、心筋に分化すること、梗塞後の心拡大の抑制、FS増加を認めた。3)ヌードマウス(免疫不全モデル)の慢性心筋梗塞モデルを作成して、細胞移植をみたが、細胞移植を行うことは困難であった。4)ヌードラット(免疫不全モデル)の慢性心筋梗塞モデルを作成して、心筋梗塞作成4週間後に、1x10^6個のマウスFlk3陽性ES細胞由来の心筋前駆細胞の移植を行った。移植後のドナー細胞の生着と分化に関する検討を行った。ラットをsacrificeして標本を作製し、GFP染色を行い、移植細胞のmassとしての生着、移植細胞の心筋への分化を確認した。細胞移植による心機能改善効果の検討を行った。細胞移植から2週間後と4週間後に心エコー検査を行い、4週間後にカテーテル検査を行い左室の収縮能および拡張能を評価した。が、現時点では心機能改善効果を認めていない。現在さらに検体数を増やし、心機能改善効果を検討している。再生医療として期待されている細胞移植療法であるが、心臓移植に代わるほどの心筋再生効果を持つ実用的なドナー細胞は今だに報告されてはいない。ES細胞はその多分化能から心筋や血管への分化に関しても多くの報告がなされているがほとんどがin vitoroでの研究であって、意外な事に虚血心への移植報告はまだ少ない.VEGF receptorの一つであるFlk1は、ES細胞の中胚葉系前駆細胞のマーカーとして注目されており、その陽性細胞は血管新生においても心筋再生においても有望であると考えられる。本研究はこのFlk1陽性ES細胞を急性及び慢性虚血心に移植することにより、ドナー細胞としての可能性を探るものである。1)Flk1陽性細胞の抽出GFPマウス由来の未分化なES細胞をLIF無添加培地で培養し分化を誘導した。これらの細胞からFACSを用いたソーティングによりFlk1を発現した細胞を抽出した。2)急性心筋梗塞モデルの作成マウスを挿管、人工呼吸による開胸下の冠動脈結紮により一定の大きさの心筋梗塞を作成する手技を確立した。3)上記1)で得られたFlk1陽性細胞を、2)で作成した同種同型のマウスの急性心筋梗塞モデルに移植した。心エコーによる評価ではFlk1陽性細胞移植群は、非移植群に対して左室の拡大は抑制され、収縮力は増大していた。また組織学的検討ではES細胞由来のGFP陽性細胞は主に心筋梗塞周辺部に生着し、トロポニンIをはじめとする心筋特異タンパクを発現していることが示された。4)さらに慢性虚血心モデルでも同様にFlk1陽性細胞が生着し、心機能を改善させる可能性を探るために心筋梗塞作成4週後の移植モデルを確立した。マウスは2回の挿管、人工呼吸下の開胸手術に耐えなければならず、手技の確立にはさらに熟練を要した。

結果については現在検討中である。重症心不全に対する再生医療として期待されている細胞移植療法であるが、これまで報告されてきた骨格筋芽細胞移植や骨髄細胞移植ではその治療効果の主体が血管新生であり、心筋の再生という目的では未だに有望な報告は見られていない。胚性幹細胞(ES細胞)はその多分化能のためにさまざまな分野で研究がなされ、in vitroでは心筋への分化誘導法が確立されつつあることから心筋再生のための有望なドナー細胞になりうると考えられる。本研究ではマウスのFlk1陽性ES細胞から心筋細胞へ分化誘導したものを虚血心に移植し心筋再生の可能性を探るとともに心機能の改善効果を評価することを目的としているが、昨年度までにマウスの急性心筋梗塞モデルに対する移植を行い移植細胞の生着と心機能低下に対する抑制効果を確認した。続いて慢性心筋梗塞モデルで移植を行い評価することを次の課題とし、ヌードマウス(免疫不全モデル)の慢性心筋梗塞モデルを作成して移植を試みるところで本年度を迎えたが、マウスの慢性期の梗塞心においては梗塞部の非薄化が著しく、梗塞巣の中心部はもちろん周辺部にさえ細胞移植を行うことは極めて困難であった。このため慢性心筋梗塞モデルとしてヌードラット(免疫不全モデル)を使用することにした。現時点までの成果として1)ヌードラットを用いて心筋梗塞作成4週後の慢性心筋梗塞モデルを確立し、感染等の問題を生じること無くその梗塞巣に細胞移植を行う手技を確立した。2)マウスのFlk1陽性ES細胞を分化誘導し3x10^6個という大量の心筋細胞を得る方法を確立した。3)1)で作成したヌードラット慢性心筋梗塞モデルに2)で得られたマウスES細胞由来の心筋細胞を移植し、移植後1週間目と4週間目で組織学的検討により移植細胞の生着を確認した。現在さらに実験を重ねて検体数を増やしており、今後心機能改善効果や腫瘍形成等の副作用の有無について検討を行っていく予定である。ES細胞はin vitroで心筋への分化誘導法が確立されつつある。本研究ではマウスFlk1陽性ES細胞から心筋前駆細胞へ分化誘導した細胞を虚血心に移植し、心筋再生の可能性を探り、心機能改善効果を評価することを目的とする。1)マウスFlk1陽性ES細胞由来の心筋前駆細胞の分離2)ラット慢性心筋梗塞モデルの作成免疫不全モデルであるヌードラット(F344/N-rnu:♂)の冠動脈左前下行枝を結紮し、適切な大きさの心筋梗塞を安定して作成する手技を確立した。3)マウスFlk1陽性ES細胞由来の心筋前駆細胞の移植心筋梗塞作成4週間後に、1)で得られた1x10^6個の細胞を梗塞部に直接注入した。4)移植後のドナー細胞の生着と分化に関する検討ラットをsacrificeして標本を作製し、GFP染色を行い、移植細胞のmassとしての生着、移植細胞の心筋への分化を確認した。5)心機能改善効果の検討以上より、心筋前駆細胞移植で心機能を改善する可能性を十分に確認し、引き続いて心機能改善効果を検討した。細胞移植から2週間後と4週間後に心エコー検査を行い、4週間後にカテーテル検査を行い左室の収縮能および拡張能を評価した。が、現時点では心機能改善効果を認めていない。現時点での成果は、上記のとおりである。