hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自然免疫型アトピー性皮膚炎の機能ゲノム学的解析

本年度は昨年度行った自然免疫型アトピー性皮膚炎モデルマウスである特異的カスパーゼ1トランスジェニックマウス(KCASP1Tg)表皮で発現する遺伝子の網羅的解析にくわえて、同じく我々が開発した自然免疫型アトピー性皮膚炎モデルマウスIL-18トランスジェニックマウス(KIL-18Tg)についても同腹の対照マウスより得た表皮で発現する遺伝子の解析を試みた。正常対照およびKCASP1Tg, KIL-18Tg皮疹部皮膚から行いアトピー性皮膚炎発症条件における遺伝子の発現プロフィールをスクリーニングした発現強度4倍以上10倍以下のもの10数個には皮膚炎症に関連する可能性のある遺伝子が数個含まれていた。これらをアトピー性皮膚炎病因候補遺伝子とし、とくに両マウスに共通し強度10倍程度で機能的に重要と思われる1遺伝子を選んだ、その配列情報に基づいてプライマー、プローブをデザインし全配列を確認した。ついで、そのファミリー遺伝子数個を選んで、同様に発現があることを確認した。今回同定した遺伝子のmRNA発現をPCRにて半定量的に検出するとともに、特異的抗体を用いてKCASP1Tg皮疹部での発現増加を免疫組織学的に確認した。ELISAによる定量的解析、培養皮膚における発現量などを定量的に解析し、同物質が自然免疫型アトピー性皮膚炎病巣部で高発現していることを確認した。さらに、本物質により誘導されると予測される皮膚の病理学的変化について、免疫組織学的に検索し、アトピー性皮膚炎発症に強く関連することを確認した。今後、同遺伝子の高発現モデル作成による同物質のin vivoでの解析ならびにヒトのアトピー性皮膚炎皮膚での発現の検討を予定している。本年度はアトピー性皮膚炎モデルマウスのトランスクリプトーム解析を行った。表皮特異的カスパーゼ1トランスジェニックマウス(KCASP1Tg)と、同腹の対照マウスより得た表皮で発現する遺伝子の網羅的解析を試みた。それぞれの組織よりpoly(A)+RNAを抽出し、蛍光ラベルcDNAを作製したのち、DNAをプロットしたマイクロアレイにハイブリダイズし、レーザー光により蛍光シグナルを検出した。マイクロアレイには、FANTOMデータベースのマウスcDNAから4500の遺伝子をプロットしたアレイを用いた。シグナル強度の変化のある遺伝子についてクラスター分析を実施した。Caspase-1が他の遺伝子発現に及ぼす影響を遺伝子の機能別に検討するため正常対照およびKCASP1Tg皮疹部皮膚から行いアトピー性皮膚炎発症条件における遺伝子の発現プロフィールをスクリーニングした。スクリーニングにより、ADモデル皮膚での発現強度が対照皮膚の4倍以上の遺伝子が39個得られた。さらに、10倍以上の発現強度のものおよび4倍以上10倍以下のもの10数個がえられた。発現強度10倍以上の遺伝子は1つを除いてほとんどがhousekeeping geneであり除外した。発現強度4倍以上10倍以下のもの10数個には皮膚炎症に関連する可能性のある遺伝子が数個含まれており、これらをアトピー性皮膚炎病因候補遺伝子とした。とくに強度10倍で機能的に重要と思われる1遺伝子を選んで、その配列情報に基づいてプライマー、プローブをデザインし全配列を確認した。現在、同物質の抗体を制作しKCASP1Tg皮疹部での発現を確認ならびにKCASP1Tgの皮疹発症過程における各遺伝子の発現を時系列に解析することを行っている。ならびに抗ヒトアナログ抗体の作製を行い、アトピー性皮膚炎皮膚での発現の検討を予定している。
中期蒙古語における外来的要素が言語構造に及ぼした影響の研究

モンゴル語仏典には、翻訳当時の元朝時代の、複雑な多重言語状況を反映して、原典の言語であるサンスクリットやチベット語のみならず、漢語やウイグル語に由来する外来形式が多数保存されている。ちょうど、漢語が固有の日本語の中に取り入れられ、やがて、その言語構造に一定の影響を及ぼしたと同じく、それらの外来的要素は、固有のモンゴル語の言語構造にも少なからぬ影響を及ぼしている。研究期間のこの3年間は、その実相を、いくつかの仏典を対象としてとりあげその行文を子細に検討し明らかにする作業に従事した。その成果の一部は、既に公刊され、また一部は現在学術誌等に投稿中である。現時点における研究成果は、次の3点である。第1点は、『國文学解釈と教材の研究』(學燈社)の求めに応じて、執筆したものに加筆し修正したものである。同誌2003年3月号に掲載されている。一般読者を念頭に置いたものであるから、その限りにおいては、学術論文と称することは憚られるが、モンゴル訳経史の一端に触れつつ、モンゴル仏典研究の意義が那辺にあり研究代表者の目指す方向がいかなるものか、を概観したものであるため、本研究の概要紹介には適切と判断した。第2点は、2002年11月に大谷大学で開催された国際シンポジウム「モンゴルの出版文化」において発表したものに基づいている。研究代表者の従前の蓄積を概観するとともに、本研究によって得られた知見を紹介する試みである。同シンポにおいて、同学の士の批判を仰ぎ、討議を経て、得られた新たな知見を加味し、加筆修正し掲載している。第3点は、研究代表者が以前とりあげた『牛首山授記経』から引例しつつ、行文中の外来形式について、一層詳細な知見を得るべく努力を重ねた成果で、2002年5月にロシア連邦共和国カルムック自治共和国で開催された「アユカ・ハーン生誕360周年記念国際学術集会」において発表し、そこでの討論等に基づく知見を加味して加筆修正した。中期蒙古語の文献資料からうかがえるモンゴル帝国当時の言語状況と言語生活、それらが言語構造そのものに及ぼした影響の全容は未解明である。申請者は、既に、ウイグル語あるいはチベット語に範をとったと解し得る翻訳借用が、蒙古語に定着し、さらにそれが範型とな.つた形式が優勢になるにともない蒙古語の言語構造に影響を及ぼした事例を発見している。文献資料の資料的価値を確定しテキストを精査するとともに、そこで得られた知見を社会言語学的発想をもふまえた斬新な枠組みから見直すことによって、新たな展開を得ることは可能であると考えられる。この想定のもとに、その基礎的作業として本年度は内外のモンゴル語文献の収集状況を、確認するとともに資料収集に努めた。作製した資料と、申請者の現在に到るまでの研究蓄積を活用して、借用形式の来源を解明し真正の借用形式と疑似借用形式を峻別し、各々の正体を明らかにしたい。その成果に基づき、13-4世紀のモンゴル帝国の言語状況を考察するとともに、その状況下におけるモンゴル人の言語生活を可能な限り具体的に明らかにする作業に従事している。その成果は、次年度以降、逐次交換される公刊される予定である。

また、平成11・12年度の科研費交付によって得られた借用形式に関わる知見を加味して、電算機処理を活用した総合的な整理し体系化を試みるとともに、申請者が構想している「中期蒙古語における借用形式のデータベース」の実現の可能性を模索している。蒙古語仏典には、翻訳当時の複雑な言語事情を反映して、原典の言語であるサンスクリットやチベット語のみならず、漢語やウイグル語に由来する外来形式が多数保存されていることは、夙に指摘されている事実であるが、その実相を、いくつかの仏典を対象としてとりあげその行文を子細に検討し、それらの言語が中期蒙古語の構造にいかなる影響を与えたかを明らかにする作業に従事した。具体的には、研究代表者がかつてとりあげた『仏説宝網経』を、その後得られた様々な知見を活用しつつ再読した。その上で、その行文中の外来形式について、一層詳細な知見を得るべく努力を重ね、その成果の一端を、昨年5月にロシア連邦共和国内のカルムック共和国で開催された「アユカ・ハーン生誕360周年記念国際学術集会」において発表するとともに、それに基づいた討論を行い、新たな知見を得た。また、『文殊師利最勝名経』はトルファン出土文書中にも断片があり、原翻訳の成立は14世紀にさかのぼり得ることが確実な仏典の一つであるが、現在入手可能な全テキストを校訂し、定本を編纂した上で、その行文中に見いだされる外来形式の実相を解明し、蒙古語への影響を考察する作業にも着手した。その成果の一端は、他の仏典から得られた知見を加味して、昨年11月に開催された国際シンポジウム「モンゴルの出版文化」において発表し、同学の士の批判を仰ぎ、討議を経て、新たな知見を得た。いずれも現在投稿中である。モンゴル語仏典には、翻訳当時の複雑な言語事情を反映して、原典の言語であるサンスクリットやチベット語のみならず、漢語やウイグル語に由来する外来形式が多数保存されていることは、夙に指摘されている事実である。本研究は、いくつかの仏典を対象としてとりあげその行文を子細に検討することを通じて、その実相を解明し、外来形式がモンゴル語自体の言語構造に及ぼした影響を明らかにして、モンゴル語学、とりわけ中期モンゴル語における言語変化の実態解明に迫るとともに、ひろく言語接触と言語変容に関わる一般則の確立を目的とするものであった。具体的にとりあげた仏典は『文殊師利最勝名経』と『法華経』である。前者はトルファン出土文書中にも断片があり、原翻訳の成立は14世紀にさかのぼり得ることが確実な仏典の一つであり、また、後者は著名ではあるが、その行文の詳細は未研究である。これらについて、現在入手可能な全テキストを校訂し、定本を編纂した上で、その行文中に見いだされる外来形式の実相を解明する作業を遂行した。成果の一端は、一昨年5月にロシア連邦共和国カルムック自治共和国で開催された「アユカ・ハーン生誕360周年記念国際学術集会」において発表するとともに、それに基づいた討論を行い、新たな知見を得た。さらに、他の仏典から得られた知見を加味して、同じく11月に開催された国際シンポジウム「モンゴルの出版文化」において発表し、同学の士の批判を仰ぎ、討議を経て、新たな知見を得た。
植物ウイルスベクターを用いたエディブルVLPワクチンの開発

ウイルス様中空粒子(VLP)は感染性を持たないウイルス粒子であり、強力な免疫誘導能を持つことからワクチンとしての利用が期待されている。本研究では植物ウイルスであるジェミニウイルスをベクターとして用い、E型肝炎ウイルス(HEV)のカプシドタンパク質にインフルエンザウイルスのM2ペプチドを結合させた融合タンパク質、牛パピローマウイルス6型のカプシドタンパク質をレタスで一過性に発現させることに成功した。さらに、研究分担者の小野道之により、上記改変HEVカプシドタンパク質遺伝子をトマトとニンジンに導入した。VLPの形成が確認出来れば、マウスに腹腔内投与あるいは経口投与し抗体産生能を調べる予定である。本研究の目的は、強力なタンパク質発現能力を持つ植物ウイルスベクターを用い、E型肝炎ウイルスのVLPをレタスやトマトなどの植物で「g」あるいは「kg」の単位で大量に生産する方法を開発することである。さらに、E型肝炎ウイルスのVLPにインフルエンザウイルスのペプチドを付加し、E型肝炎だけでなくインフルエンザを予防する「食べる(edible)ワクチン」の開発を試みることである。本年は、E型肝炎ウイルスのコートタンパク質を植物ウイルスの一種であるジェミニウイルスをベクターにしてレタスで発現させた。しかし、コートタンパク質の発現は認められたものの、密度勾配遠心でVLPを形成している確証が得られなかった。一方、コントロールとしてノロウイルスのコートタンパク質を発現させた場合はVLPの形成が認められた。したがって、方法論的に問題があるとは考えられない。そこで、当初の計画通り、先に、ウシパピローマウイルスなど獣医学領域で重要なウイルスについても植物を用いてVLPを作製し、「動物用経口ワクチン」の開発を目指すことにした。ターゲットとして、最近、問題になっている牛パピローマウイルス6型(BPV-6)のL1遺伝子、牛パピローマウイルス9型(BPV-9)のL1遺伝子、豚サーコウイルス1型(PCV-1)のcapsid遺伝子を化学合成した。その際、植物(レタス)のコドン使用頻度に合わせて遺伝子を設計、合成した。また、潜在的なスプライシングドナーとアクセプター配列、poly A付加配列、リピート配列も除去した。牛パピローマウイルス6型(BPV-6)、牛パピローマウイルス9型(BPV-9)、豚サーコウイルス1型(PCV-1)のウイルス様中空粒子(VLP)を植物で発現する目的で、これらのウイルスのカプシドタンパク質をコードする遺伝子を植物のコドンの使用頻度に合わせて化学合成した。さらに、これらのタンパク質の検出を容易にするためカルボキシ末端にFLAGタグをコードする遺伝子配列を付加した。これらの遺伝子をまず、GatewayエントリーベクターのpCRGWTOPOに挿入し、次にクロナーゼ反応を用いてデスティネーションベクターであるGeminivirus vector pBYR2fpに移した。これらのGeminivirus vectorプラスミドを用いてアグロバクテリウムLBA4400.VirG株を形質転換して大量培養し、組換えアグロバクテリウムをレタスの葉に減圧下で感染させた。4日間の培養後、レタスの葉を液体窒素で凍結後、乳鉢で粉砕して粉末状にサンプルとした。FLAGタグに対する抗体を用いてWestern blottingで調べたところ、レタスの葉のサンプル中にBPV-6のカプシドタンパク質が含まれていることが判明した。BPV-9、PCV-1についてはバンドが検出出来なかった。BPV-6について、VLPを形成しているか否かを調べるため、レタスの葉の抽出液をショ糖密度勾配遠心にかけたがVLPの量が少なく判定することが出来なかった。ウイルス様中空粒子(VLP)はコートタンパク質のみからなるウイルス様の粒子である。VLPはゲノムを持たないので感染力は無いが強力な免疫誘導能を持つことからワクチンとしての利用が期待されている。本研究では、植物を用いてVLPの大量生産を試みた。まず、植物ウイルスであるジェミニウイルスをベクターとして用い、E型肝炎ウイルス(HEV)、牛パピローマウイルス(BPV)のコートタンパク質を組込みアグロバクテリウムを用いてレタスに導入し、それぞれのウイルスのコートタンパク質一過性に発現させた。さらに、研究分担者の小野道之により、HEVのコートタンパク質にインフルエンザウイルスの膜タンパク質であるM2タンパク質の細胞外ドメインのペプチドを結合させた融合タンパク質の遺伝子をトマトとニンジンのゲノムに導入した。トマトに関しては、アグロバクテリウム法で融合タンパク質遺伝子をトマトの葉片に導入し、カナマイシンによる選択後、組換えトマトの個体を得た。一方、ニンジンに関しては、上記融合タンパク質遺伝子とGFPタンパク質遺伝子をニンジンの胚性カルス細胞に遺伝子導入し、スペクチノマイシンに対する薬剤耐性とGFPによる蛍光により選択を行っているところである。今後、Western blottingにより組換えタンパク質の発現を確認し、VLPの形成について検討する予定である。VLPの形成が確認出来れば、マウスに腹腔内投与あるいは経口投与しHEVとインフルエンザウイルスに対する抗体産生能を調べる予定である。

VLPの形成が確認出来れば、マウスに腹腔内投与あるいは経口投与し抗体産生能を調べる予定である。BPV-6についてはレタスでの発現に成功した。しかしながら、発現量が少なくVLP形成の有無を判定することが出来なかった。BPV-9、PCV-1についてはカプシドタンパク質の発現が確認出来なかった。カプシドタンパク質の発現効率を上げる必要があると思われる。ウイルス学プラスミドのインサートが設計通りの塩基配列を有している事は確認してあるので、組換えアグロバクテリウムのレタス葉への導入効率を上げる。あるいは、別の種類の植物用発現プラスミドを使う等の工夫が必要と思われる。共同研究者の小野がE型肝炎ウイルス(HEV)のカプシドをタバコの葉緑体で発現させることに成功しているので、BPV-6、BPV-9、PCV-1のカプシドタンパク質を葉緑体で発現するのが早道かもしれない。そもそも、E型肝炎ウイルスのコートタンパク質は植物内ではVLPを形成しにくいことが原因と思われた。今年度は、牛パピローマウイルス6型(BPV-6)のL1遺伝子、牛パピローマウイルス9型(BPV-9)のL1遺伝子、豚サーコウイルス1型(PCV-1)のcapsid遺伝子について、ジェミニウイルスベクターを用いてレタスで一過性に発現させる予定である。この中で、植物体内でVLPを効率よく形成するものがあれば、大量に発現させて精製する方法を確立する予定である。さらに、VLPに異種抗原を付加する等の改変を加えて、VLP形成が可能か否かを調べる予定である。
質感を考慮した白色度評価手法の確立

白紙や白布などの白色物体の価値は,知覚的な白さによって左右されるが,例えば,印刷用紙では同じ白色度であっても,アート紙やコート紙といった塗工紙と上質紙に代表される非塗工紙とでは,表面の平滑度の違いによって質感が大きく異なり,印刷物の品質に決定的な違いが生じる.また,白布では経糸緯糸の織り方や糸の断面形状によって,鏡面反射光に起因するさまざまな光沢が生じ,その結果,白色度では評価できない品質の差異が生じる.しかし,従来の白色度指数は,表面性状が完全に均一な物体を想定しており,光沢や織の種類といった表面性状に起因する質感の影響を一切考慮していない.本研究は,さまざまな質感情報が白色度評価に与える影響を定量化し,質感に応じて白色度指数の補正方法を導出することを目的としている.研究初年度となる平成30年度は,表面性状に起因する質感情報が白色度評価に及ぼす影響を明らかにするため,視感評価実験を行った.キャリブレーション機能付きの液晶カラーモニター画面に画布を模したテクスチャを付加した高明度の無彩色刺激を呈示し,テクスチャの無い無彩色刺激との一対比較によって白色感を評価した.また,ハイパースペクトルカメラを用いて,テクスチャを有する刺激の2次元の明度分布を取得し,明度の頻度分布を算出した.視感評価実験の結果,白色度の平均値が同一の画像であっても,テクスチャの有無によって白色感が変化することが明らかとなった.視感評価およびハイパースペクトルカメラによる計測には,とくに技術的な問題がなく,計画通りに進んでいる.次年度は,明度の頻度分布が同一でテクスチャが異なる画像を生成し,視感評価によって,白色感に与えるテクスチャの影響を検討する.白紙や白布などの白色物体の価値は,知覚的な白さによって左右されるが,例えば,印刷用紙では同じ白色度であっても,アート紙やコート紙といった塗工紙と上質紙に代表される非塗工紙とでは,表面の平滑度の違いによって質感が大きく異なり,印刷物の品質に決定的な違いが生じる.また,白布では経糸緯糸の織り方や糸の断面形状によって,鏡面反射光に起因するさまざまな光沢が生じ,その結果,白色度では評価できない品質の差異が生じる.しかし,従来の白色度指数は,表面性状が完全に均一な物体を想定しており,光沢や織の種類といった表面性状に起因する質感の影響を一切考慮していない.本研究は,さまざまな質感情報が白色度評価に与える影響を定量化し,質感に応じて白色度指数の補正方法を導出することを目的としている.研究初年度となる平成30年度は,表面性状に起因する質感情報が白色度評価に及ぼす影響を明らかにするため,視感評価実験を行った.キャリブレーション機能付きの液晶カラーモニター画面に画布を模したテクスチャを付加した高明度の無彩色刺激を呈示し,テクスチャの無い無彩色刺激との一対比較によって白色感を評価した.また,ハイパースペクトルカメラを用いて,テクスチャを有する刺激の2次元の明度分布を取得し,明度の頻度分布を算出した.視感評価実験の結果,白色度の平均値が同一の画像であっても,テクスチャの有無によって白色感が変化することが明らかとなった.視感評価およびハイパースペクトルカメラによる計測には,とくに技術的な問題がなく,計画通りに進んでいる.次年度は,明度の頻度分布が同一でテクスチャが異なる画像を生成し,視感評価によって,白色感に与えるテクスチャの影響を検討する.
ビオチンライゲースを用いた新規インタラクトーム解析

インタラクトーム解析とは分子間相互作用の網羅的な同定手法である.本研究課題では,植物の核膜インタラクトーム解析のための新しいツール作りを目的とした.改変型ビオチンライゲース(BirA)は近接タンパク質をビオチン化する.このBirAと核膜タンパク質との融合タンパク質を発現する形質転換シロイヌナズナを作出した.この形質転換体においてBirA融合タンパク質および,ビオチン化タンパク質の蓄積を確認することが出来た.しかしながら,これらビオチン化タンパク質は蓄積量が少なく,精製および質量分析による同定を行うことが出来なかった.今後は,より高効率なビオチン化の系の開発と精製法の確立が必要と考えられる.インタラクトーム解析とは分子間相互作用の網羅的な同定手法である.本研究課題では,植物の核膜インタラクトーム解析のための新しいツール作りを目的とした.改変型ビオチンライゲース(BirA)は近接タンパク質をビオチン化する.このBirAと核膜タンパク質との融合タンパク質を発現する形質転換シロイヌナズナを作出した.この形質転換体においてBirA融合タンパク質および,ビオチン化タンパク質の蓄積を確認することが出来た.しかしながら,これらビオチン化タンパク質は蓄積量が少なく,精製および質量分析による同定を行うことが出来なかった.今後は,より高効率なビオチン化の系の開発と精製法の確立が必要と考えられる.タンパク質間相互作用ネットワークを解明するインタラクトーム解析は今や機能ゲノム科学の最重要の分野の1つとして認識されているが,植物細胞における確固たる手法の確立はまだされていない.網羅的なタンパク質間相互作用の情報の効率的な取得のために,本研究課題では改変型ビオチンライゲース(BirA)を用いた新規インタラクトーム解析の手法の確立を目指している.特に,未だ共通理解の得られていない植物の核膜に注目した解析を行った.まず最初に,申請者らが最近同定した核膜孔タンパク質Nup136および核内膜タンパク質KAKU4それぞれをBirAと融合させたタンパク質を発現する形質転換シロイヌナズナを作成した.融合タンパク質を高発現する形質転換体ラインを選抜後,蛍光抗体染色法により,これら融合タンパク質が核膜に局在することを確認した.次に,これら形質転換体を培養している培地にビオチンを加え,一定時間後タンパク質を抽出してウエスタンブロットに供した.アビジンーhorseradish peroxidaseを用いてビオチン化タンパク質を特異的に検出したところ,野生型では見られないタンパク質のバンドが形質転換体で複数検出された.これらの結果から,BirA融合タンパク質が植物細胞内でもビオチンライゲース活性を有することを示している.現在,アビジンビーズカラムを用いて形質転換体で特異的にビオチン化されたタンパク質の精製を試みている.タンパク質間相互作用ネットワークの解明は機能ゲノム科学分野の最重要分野の一つである.そこで,本研究課題の目的は「植物における,ビオチンライゲースを利用したハイスループットな新しいインタラクトーム解析の手法の確立」とした.BirAは近接するタンパク質をビオチン化する組換えタンパク質である.このBirAと植物核膜タンパク質との融合タンパク質を発現する形質転換植物を用いて,相互作用タンパク質の網羅的同定を目指す.前年度までに,ウエスタンブロットによって検出されたビオチン化タンパク質の精製と同定を試みた.BirAとの融合タンパク質には核膜孔複合体因子および核膜構造タンパク質の2種類を用意した.まず最初に,より高発現ができた核膜構造タンパク質との融合タンパク質を発現する形質転換植物を用いた.培地にビオチンを加えることで,特異的なビオチン化タンパク質の蓄積が確認できた.そこで,これらビオチン化タンパク質を質量分析計で同定するために,これらタンパク質の精製をストレプトアビジンビーズによって試みた.精製後のタンパク質を電気泳動して解析したが,1)大量の内在性ビオチン化タンパク質(非特異的)および2)特異的なビオチン化タンパク質の量が非常に少ないことにより,質量分析を行うための充分量のタンパク質を得ることが出来なかった.今後の改善点としては,内在性ビオチン量が少ない組織や培養細胞の探索や選択,植物体へのビオチンの効率的な取り込み法を検討する必要があると考えられた.植物細胞生物植物細胞でBirA(改変型ビオチンライゲース)を発現させた例はこれまでに報告がなかったが,本研究ではBirA融合タンパク質を高発現する形質転換シロイヌナズナのラインを複数単離することが出来た.同時に,培地にビオチンを加えることにより,形質転換体で特異的なビオチン化タンパク質も検出できたことから,BirAによるインタラクトーム解析が行える可能性が強く示せた.現在,アビジンカラムによるビオチン化タンパク質の精製を試みている.当初,培地中の過剰なビオチンが精製を阻害してしまっていたが,アセトン沈殿によるタンパク質溶液の交換を行うことで,この問題を克服しつつある.動物細胞の報告と比較して,形質転換シロイヌナズナではビオチン化タンパク質の総量が少ないようで,いかにしてビオチンを効率良く植物細胞に取り込ませるかが今後の課題である.今後はビオチン化タンパク質を効率良く精製し,質量分析計によってタンパク質の同定を行う.克服すべき課題として,より大量により特異的にビオチン化タンパク質を形質転換体から抽出・精製を行うことが必要と考えている.特に,葉緑体由来と思われる内在性のビオチン化タンパク質の混入を出来るだけ抑えるために,今後は形質転換体植物体の根または培養細胞をからタンパク質を抽出して精製を試みる.
ほ乳類の胚発生に不可欠な母性エピジェネティック制御機構の解明

本研究課題を達成するにあたり、2018年度は、卵母細胞特異的遺伝子ノックダウン法を確立した。まず、人工マイクロRNA(amiRNA)を卵母細胞特異的に発現させるホスト遺伝子としてZp3を選別した。Zp3が非成長期卵母細胞からフルサイズの卵母細胞まで高発現していることも確認した。次いで、Zp3遺伝子のイントロン内にamiRNAを挿入するためのガイドRNAを3種類設計し、受精卵におけるゲノム編集効率を解析した。いずれのガイドRNAも高い編集効率を示した。そこで、GFPに対するamiRNA(既報の配列)の両端に、Zp3のゲノム編集部位の上流および下流相同配列をそれぞれ付加した。GFPを恒常的に発現するトランスジェニックマウス(GFPマウス)より受精卵を採取し、この受精卵に、ガイドRNA、amiRNAおよびCas9タンパクを導入しノックインマウスを得た。GFP陽性かつamiRNAがノックインされたマウスの卵母細胞で緑色蛍光シグナルを測定したところ、GFPマウスのコントロール卵母細胞と比較してシグナル強度は大幅に減衰し、野生型マウスの卵母細胞と同程度となった。これに対し、卵母細胞を覆う卵丘細胞や顆粒膜細胞では、ノックインマウスとGFPマウスで緑色蛍光シグナルの強度に差はなく、強いGFPが観察された。以上より、Zp3のイントロン領域にamiRNAを導入することで、卵母細胞特異的な遺伝子ノックダウンシステムを構築することができた。続いて、ノックダウンの標的遺伝子として内在性のDnmt3lやKdm1bに対するamiRNAを2種のアルゴリズムで設計した。設計したamiRNAを発現ベクターのイントロンに導入し、ES細胞にトランスフェクションした。その結果、一方のアルゴリズムで設計したもののみノックダウン効果が認められた。今後、これらのamiRNAを導入したマウス系統を樹立し、解析を行う予定である。卵母細胞特異的遺伝子ノックダウン法を確立するために、今回、GFPマウスを使用した。このGFPマウスでは、ニワトリアクチン遺伝子(CAG)プロモーターでGFP遺伝子が転写されるため、発現量が非常に高い。従って、高発現しているGFPを卵母細胞特異的に消失させることに成功した点、また、成長初期の卵母細胞でも成長が完了した卵母細胞でも同様に高いノックダウン効果が観察できた点などは、予想以上の結果が得られたと考えている。一方、内在性遺伝子を標的としてamiRNAを設計する際には、予期せぬオフターゲット効果も考えられ、これについては、今後検証して行く必要が残された。DNMT3LはDNAのメチル化を触媒する直接的な活性を持たないが、新規DNAメチル基転移酵素DNMT3Aの補酵素として働き、生殖細胞のDNAメチル化に不可欠である。これらの知見は、既に、ノックアウトマウスの解析から得られている。今後は、Dnmt3lに対するamiRNAのオフターゲット解析を行う。まずは、ES細胞でオフターゲット解析を行った後、amiRNAノックインマウスを作製し、その卵母細胞のDNAメチル化型およびトランスクリプトームを解析する。得られた結果をDnmt3lノックアウトマウスのそれらと比較する他、オフターゲットスコアが高く、卵母細胞で発現するコード遺伝子の発現をwestern blotingで解析し、オフターゲットの影響を評価する。

一方、内在性遺伝子を標的としてamiRNAを設計する際には、予期せぬオフターゲット効果も考えられ、これについては、今後検証して行く必要が残された。DNMT3LはDNAのメチル化を触媒する直接的な活性を持たないが、新規DNAメチル基転移酵素DNMT3Aの補酵素として働き、生殖細胞のDNAメチル化に不可欠である。これらの知見は、既に、ノックアウトマウスの解析から得られている。今後は、Dnmt3lに対するamiRNAのオフターゲット解析を行う。まずは、ES細胞でオフターゲット解析を行った後、amiRNAノックインマウスを作製し、その卵母細胞のDNAメチル化型およびトランスクリプトームを解析する。得られた結果をDnmt3lノックアウトマウスのそれらと比較する他、オフターゲットスコアが高く、卵母細胞で発現するコード遺伝子の発現をwestern blotingで解析し、オフターゲットの影響を評価する。
G蛋白質共役型グルタミン酸受容体を阻害する生物毒素の探索

グルタミン酸受容体にはいくつかのタイプが知られているが、本研究計画ではこれらのタイプのうちGタンパク質共役型グルタミン酸受容体(mGluR)について、これを阻害する作用のある薬物を探索することを目的として、主に生物由来の材料を対象として検討し、以下のような結果を得た。1.アッセイ法の改良:mGluRを発現したアフリカツメガエル卵母細胞を用いてアッセイを行ったが、生物由来の抽出物試料などの場合、試料自身の中にグルタミン酸がしばしば高濃度で含まれており、アッセイが著しく困難となることが分かった。そこでグルタミン酸だけを特異的にサンプルから除去し、それ以外の検定すべき試料成分を何ら失うことなくアッセイが行えるような方法を検討し、開発することが出来た。グルタミン酸オキシダーゼを用いた酵素連鎖反応を利用した方法である。2.mGluRに対する選択的薬物:動物由来の毒素成分約20種類と植物由来の抽出試料約30種類を検討した。現在の段階では、mGluRを特異的に阻害すると考えられるアンタゴニスト成分を同定するには至っていない。しかし、アゴニストについて特異的な薬物を見いだすことが出来た。すなわち、トウダイグサと呼ばれる植物に含まれる天然のアミノ酸誘導体である3,5-ジヒドロキシフェニルグリシンが、mGluRに対して特異的に作用するアゴニストであることを見い出した。3.その他:副産物的な知見として、植物成長ホルモンであるサイトキニンの一種、6-ベンジルアミノプリンが、セロトニン(5HT_<2C>)受容体の強い阻害剤であることを見いだした。この物質はmGluRに対しても高濃度(100μMオーダー)ではある程度の阻害作用を示し、本研究計画の直接の目標をある程度充たすもののようでもあるが、セロトニン受容体に対する作用の方がはるかに強く、μMオーダーの濃度で有効であった。グルタミン酸は高等動物の中枢神経系における最も主要な興奮性神経伝達物質であり、その受容体は脳の高次機能において重要な役割を担っていると考えられている。グルタミン酸受容体にはいくつかのサブタイプが知られているが、本研究計画においてはこれらのサブタイプのうち、我々が見いだしたG蛋白質共役型グルタミン酸受容体について、特異的アンタゴニストを見い出すことを目指し、その一つのアプロ-チとして生物由来の毒成分の中にそのような阻害作用を持つものを探索することを目的として探索を行ってきたが、現在までの経過を要約すると以下のようである。この受容体はラット脳mRNAを注入したアフリカツメガエルの卵母細胞において初めてその存在が確定的に証明されたものであり、本研究計画においてもまずこの卵母細胞の系を用い、主として電気生理学的な方法によって試料検体のスクリ-ニングを行った。初年度には試料の入手が比較的容易なものから検討を行い、これまでのところ主として動物性の毒成分試料について、以下のようなものをスクリ-ニングした。ハチ毒3種類、海産生物の毒2種類、サソリ毒2種類、蛇毒8種類、クモ毒2種類、カエル毒1種類。現在の段階では、これらの試料の中に有効な成分を同定するには至っていない。これと同時に検定法の改良も試みてきた。最近この受容体の遺伝子単離が報告されたので、それに基づき、この受容体を恒常的に発現する培養細胞を作製することに成功した。この細胞を用いて、より効率の良い検定法を開発することを現在試みている段階である。

グルタミン酸受容体にはいくつかのサブタイプが知られているが、本研究計画ではこれらのサブタイプのうち我々が見いだしたG蛋白質共役型グルタミン酸受容体(mGluR)について、特異的阻害剤を見し出すことを目的とする。本年度は次のような成果を得た。1.トウダイグサと呼ばれる植物に含まれる天然のアミノ酸誘導体で3,5-ジヒドロキシフェニルグリシンがmGluRにたいして特異的に作用するアゴニストであることを見い出した。遺伝子クローンから卵母細胞に発現した受容体だけでなく、ラット脳神経細胞にもともとある受容体についても特異作用を確認した。2.ある種のプリン誘導体が、セロトニン受容体の強い阻害剤であることを見いだした。mGluRに対しても高濃度ではある程度の阻害作用を示すようであるが、セロトニン受容体に対する作用のほうがはるかに強く、μMオーダーの濃度で有効であった(未発表データ)。3.天然物抽出液などを検定する際、試料自身の中にグルタミン酸がしばしば高濃度で含まれており、アッセイを著しく困難なものにしていたが、この問題を克服する方法を検討し開発した。すなわち、ある種の酵素連鎖反応を利用する方法で、この方法によってグルタミン酸だけを特異的にサンプルから除去することができ、それ以外の検定すべき試料成分を何ら失うことなくアッセイが行えるようになった(未発表データ)。これによって特に天然物抽出試料の解析が促進されることが期待できる。グルタミン酸受容体にはいくつかのサブタイプが知られているが、本研究計画ではこれらのサブタイプのうちG蛋白質共役型グルタミン酸受容体(mGluR)について、天然の毒素や生物関連成分を中心として検索し、特異的阻害剤を見い出すことを目的とする。本年度は次のような結果を得た。1.前年度までに主として動物由来の毒素成分約20種類ほど検索したが、有効な成分を同定するには至っていなかった。本年度は主として植物由来の成分について、約30種類ほどを検討した。粗抽出液がアフリカツメガエル卵母細胞の系においてmGluR反応を見かけ上阻害する場合が数種類見いだされたが、現在の段階ではまだその阻害のメカニズムまでは明らかになっておらず、したがってそれらの成分がmGluRの受容体部位に対する阻害剤であるのか否かはっきりしておらず、さらに解析する必要がある。2.このサブタイプの受容体のうち最も代表的なものであるmGluRlについて、抗体を作成し、ポリクローナル抗体約10種類とモノクローナル抗体11種類を得た。これらについて特異性の検定を行っている段階であるが、少なくとも一つは特異性の高いモノクローナル抗体が得られている。これを含め、得られた抗体について受容体部位に対する阻害効果を検討する予定である。
臓器移植を目指したin vivoにおける臓器内の血管内皮再構築法の開発

1、「血管内皮欠損動物の作成」については、CRISPER/Cas9を用い当初の計画通り、Flk-1ヘテロノックアウトTgマウスを作製することに成功した。さらに、2、「胚盤胞補完法による血管の構築」については、血液細胞および血管内皮細胞の欠損により発生初期に胎生致死となる既報のFlk-1欠損(ホモノックアウト)マウス胚、とH29年度に作製したマウスES細胞あるいはiPS細胞を用いて、胚盤胞補完法により同種間Flk-1ホモノックアウトキメラマウスの作製に成功した。このレスキューされたFlk-1ホモノックアウトキメラマウスは、特別な異常もなく成体まで成長し、すべての血管内皮および血液細胞はESあるいはiPS細胞由来であることを確認した。以上のことから、ES/iPS細胞を用いた胚盤胞補完法により、Flk-1欠損マウスはすべての血管内皮細胞および血液細胞がES/iPS細胞で構築され、発生初期の胎生致死をレスキューすることに成功し、同種間における「臓器移植を目指したin vivoにおける臓器内の血管内皮再構築法の開発」について達成できた。H30年度以降に実施する計画であった「胚盤胞補完法による血管の構築」については、既報の血管内皮欠損マウス胚とマウスES/iPS細胞を用いた同種間キメラ動物の作製により、発生初期に胎生致死となる血管内皮欠損マウスをレスキューすることに成功した。これらキメラマウスは、成体まで異常なく成長し、すべての血管内皮細胞および血液細胞がES/iPS細胞由来であったことから、同種間における「臓器移植を目指したin vivoにおける臓器内の血管内皮再構築法の開発」について達成できた。今後は、さらに詳細な解析、さらに異種のES/iPS細胞を用いた検討を行う予定である。H29年度は、キメラ動物に寄与する多能性幹細胞の樹立ならびに血管内皮欠損動物の作成を目標に行った。さらに、H30年度以降の実施計画であった「胚盤胞補完法による血管の構築」についても着手することができた。1、「キメラ動物に寄与する多能性幹細胞の樹立」においては、マウス・ラットのES/iPS細胞を樹立し、キメラ動物における血管組織細胞への寄与を確認し、キメリズム解析を行った。キメラ動物における血管組織細胞への寄与はキメリズムの差はあるが、血管内皮に寄与することが可能なES/iPS細胞を確認した。2、「血管内皮欠損動物の作成」については、CRISPER/Cas9を用いた血管内皮欠損Tg動物を作成するためのgRNAを作製し、当初の計画通り、現在Tg動物を作製中である。3、「胚盤胞補完法による血管の構築」については、30年度以降に実施する計画であったが、既報の血管内皮欠損マウス胚を入手し、胚盤胞補完法とマウスiPS細胞を用いた同種間キメラ動物を作製した。その結果、従来血管内皮欠損マウスは発生初期に胎生致死となるが、胚盤胞補完を行った血管内皮欠損・iPS細胞キメラマウスは、発生初期の胎生致死をレスキューすることに成功した。このレスキューしたキメラマウスの血管内皮は、iPS細胞由来であることを確認した。以上のことから、iPS細胞を用いた胚盤胞補完法により、血管内皮欠損マウスはiPS細胞由来の血管内皮が構築され、発生初期の胎生致死をレスキューすることに成功した。今後は、さらに詳細な解析、さらに異なる細胞を用いた検討を行う予定である。30年度以降に実施する計画であった「胚盤胞補完法による血管の構築」については、既報の血管内皮欠損マウス胚を入手することが出来たため、胚盤胞補完法とマウスiPS細胞を用いた同種間キメラ動物を作製し、発生初期に胎生致死となる血管内皮欠損マウスをレスキューすることに成功した。

計画通り、「血管内皮欠損動物の作成」並びに「胚盤胞補完法による血管の構築」を行い、キメラ動物を増やし詳細な解析を行う。今後は、さらに詳細な解析、さらに異種のES/iPS細胞を用いた検討を行う予定である。H29年度は、使用する動物数が少なくすんだため、飼育費用が予定より少なくなった。次年度は、飼育動物を増やし、さらに外注検査を行う予定である。H30年度は、予定より使用する動物数が少なくすんだため、飼育費用が予定より少なくなった。
ナノスケールでの岩石の力学的不均質性の定量化

石英単結晶の表面に形成された微小圧痕の周辺がどのように変形しているのかを,ラマン分光やSEM-EBSD,レーザー顕微鏡を駆使して検討した。その結果,圧痕周辺には数ギガパスカルの応力が生じ、またドフィネ式双晶が生じていることがわかった。石英表面に圧痕を作るのに,超微小硬度計と高温微小硬度計を利用した。使用した圧子は,バーコビッチ三角錐圧子と三角錐68°圧子で,加えた荷重は最大で1N,温度は最高で約290°Cである。ラマン分光学的研究では,圧痕内部で通常の石英が呈するラマンピークの波数とは異なるものや,ピークが二つに分裂しているものを発見した。このことは,圧痕周辺に残留歪があることを示しており,ピークシフトの量から,その歪を生じさせた残留応力が最大で2。5GPa以上であることを見いだした。また,残留応力は圧痕から離れると急激に減少することも解った。SEM-EBSD法による観察では,圧痕周辺に特徴的なドフィーネ式双晶が存在することを見いだした。双晶の分布が圧痕と非常に密接に関係していることから,これが変形双晶であることを示した。ドフィーネ式双晶は規則的ではなく,特に試料中に既にこの双晶が存在する場合には,圧痕形成時に双晶が形成されないことも観察している。石英多結晶体(メタチャート)を試料として、石英粒子の結晶粒界を横切って、マイヤー硬度の測定を行った.その結果,結晶の粒界でマイヤー硬度が著しく下がっている場合があることを確認した。なぜそうなるのかについて目下検討中である.石英単結晶の表面に形成された微小圧痕の周辺がどのように変形しているのかを,ラマン分光やSEM-EBSD,レーザー顕微鏡を駆使して検討した。なぜそうなるのかについて目下検討中である.本年度は超微小硬度計を利用して鉱物の塑性変形に関わる硬さを、どのように定量化すればよいのかについて検討した。試料は石英で、単結晶石英、イスアのれき岩中の石英、ビグディンの変形岩中の石英について調べた。バーコビッチ圧子(三角錐形)を使用し、荷重100mN(約10グラム重)で10秒間保持し、その間に圧痕がどのくらい深く沈むのか、すなわち定荷重変位について調べた。石英単結晶では6nm±2nm程度、ビグディンの歪量の少ない変形岩中の石英では、9nm±3nm、歪量の大きい変形岩では14nm±5nm程度となった。また、荷重-変位曲線のループエネルギーを測定した。石英単結晶では6nJ程度、ビグディンの歪量の少ない変形岩中の石英ではxxの値を示した。これらの石英についての計測に先立って、超微小硬度計データに伴っているノイズレベルについての検討を行った。超鋼合金(タングステンカーバイド)をフラット圧子を用いて、100mN荷重下で10秒間保持し、その定荷重変位を測定した。その結果、3±2nmというデータを得た。超鋼合金は非常に硬い物質で、実質上硬さ無限大の剛体として扱い、定荷重変位は超微小硬度計が持っている誤差と考える。これらのデータを解析し、(1)常温常圧で、バーコビッチ圧子により圧痕が安定的に形成されること、(2)同じ石英試料でも産地が違ったり、結晶の方位によって圧痕の大きさが変わることが分かった。また、(3)超微小硬度計自体も振幅が1nm程度で振動していることが分かった。本年度は、高温下で硬度を測定できるように装置の組み立てを行った。従来の超微小硬度計(RIDER)では高温(400°C程度)にすると、計測システムが破損するおそれがあることが解った。そのためRIDERをそのまま高温用には使えない。

そこで、若干測定精度は劣るが、温度に対して鈍感な硬度計を新たに購入し、それに発熱体、温度計測熱伝対、装置冷却用のパイプを取り付けた。ただし、試料を装置に装着する方法に問題があり、高温での硬度の測定はまだ行っていない。高温にも耐えられる試料装着法を考案する必要がある。常温での硬度についての研究は、RIDERを用いて順調に進行中である。これまでは主として石英を試料として塑性流動の仕方について調べてきたが、本年度は新たに方解石、トパーズについても常温で塑性流動を確認した。塑性流動の程度を表示する方法についても検討した。これまでの変位の計測では装置そのもの(RIDER)の変位をきちんと評価していないことがわかった。装置の変位を正しく評価するのは、予想していたよりも容易でないことが解った。そこで、塑性変形の評価には、装置の変位を含まない量で行うことにした。その候補としてループエネルギー、定荷重変位、圧痕の深さを挙げ、詳細に検討した。この3つの量はそれぞれ別の物理的意味がある量である。検討の結果、ループエネルギーと圧痕の深さについては、石英、トパーズ、方解石すべてについて両対数グラフにプロットすると直線になることが解った。しかも3つの直線はほぼ同じ傾きになった。このグラフに鉄のデータをプロットしても同様の傾きになることが解った。石英単結晶の表面に形成された微小圧痕の周辺がどのように変形しているのかを,ラマン分光やSEM-EBSD,レーザー顕微鏡を駆使して検討した。その結果,これまでほとんど解っていなかった興味深い現象を発見した。石英表面に圧痕を作るのに,超微小硬度計と高温微小硬度計を利用した。使用した圧子は,バーコビッチ三角錐圧子と三角錐68°圧子で,加えた荷重は最大で1N,温度は最高で約290°Cである。ラマン分光学的研究では,圧痕内部で通常の石英が呈するラマンピークの波数とは異なるものや,ピークが二つに分裂しているものを発見した。このことは,圧痕周辺に残留歪があることを示しており,ピークシフトの量から,その歪を生じさせた残留応力が最大で2。5GPa以上であることを見いだした。また,残留応力は圧痕から離れると急激に減少することも解った。SEM-EBSD法による観察では,圧痕周辺に特徴的なドフィーネ式双晶が存在することを見いだした。双晶の分布が圧痕と非常に密接に関係していることから,これが変形双晶であることを示した。ドフィーネ式双晶は規則的ではなく,特に試料中に既にこの双晶が存在する場合には,圧痕形成時に双晶が形成されないことも観察している。石英多結晶体(メタチャート)を試料として、石英粒子の結晶粒界を横切って、マイヤー硬度の測定を行った.その結果,結晶の粒界でマイヤー硬度が著しく下がっている場合があることを確認した。なぜそうなるのかについて目下検討中である.
ロボットの社会的受容を規定する要因の認知科学的研究

ロボットはもはやSFの世界だけにとどまらず,学校,自宅,職場,博物館,病院といった我々の身の周りにおいて重要な存在となりつつある.申請者が以前に行った研究では,ヒューマノイド,ペット,サービス,アンドロイドロボットの4種類のロボットに対する知覚を検討したところ,ロボットの外見によってロボットに対する知覚が異なることを明らかにした.さらに昨年度は,オーストラリアと日本におけるロボットに対する知覚の違いについて検討したところ,日本人の参加者は,アンドロイドとの交流後に,アンドロイドに対してあまり擬人化されていないと感じ,知的であると感じなくなった一方で,より安全であると感じることが分かった.オーストラリア人の参加者は,安全性の印象は低いままでも,信頼ゲームを通じて,アンドロイドをより信用できると感じるようになった.本年度の研究も,オーストラリアと日本の参加者を対象に,同じ大きさで外見だけが異なる2つのロボットを使用し,実験参加者に各ロボットとの接触等の交流をさせたところ,ロボットの外見や交流時間によってロボットに対する知覚が変化することが分かった.また別の研究では,短い交流をした場合と外見だけを見た場合では,ロボットに対する知覚が異なることが分かった.これらは,ロボットとの交流やその外見によって人のロボットに対して感じる不気味さを緩和させることを示唆している.これらの研究成果は,複数の国際学会で発表された.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。ロボットはもはやSFの世界だけにとどまらず,学校,自宅,職場,博物館,病院といった我々の身の回りにおいて重要な存在となりつつある.申請者が以前に行った研究では,ヒューマノイド,ペット,サービス,アンドロイドロボットの4種類のロボットに対する知覚を検討したところ,ロボットの外見によってロボットに対する知覚が異なることを明らかにした.このように,ロボットの種類によって印象が異なることは示唆されたが,それに加えて文化的背景の違いもロボットの知覚に影響を与えると考え,平成26年度は,異文化間でのアンドロイドロボットに対する知覚を計測し,直接比較することを目的に研究を遂行した.実験は,オーストラリアのNew South Wales大学と東京大学で行われた.本研究において用いられたアンドロイドは,若い日本人女性の外見をしており,眉毛,まぶた,眼球および口を動かすことで,笑顔,驚きや怒りなど様々な顔の表情を示すことができ,また,お辞儀といった身体を使ったジェスチャーもすることができた.本実験は3段階で構成されており,参加者にアンドロイドに対する第一印象を評価させ,アンドロイドとの交流,信頼ゲームを行わせた後に,アンドロイドに対する印象を再度評価させた.その結果,日本人の参加者は,アンドロイドとの交流後にアンドロイドに対して,より擬人化されていないと感じ,知的であると感じなくなった一方で,より安全であると感じることが分かった.またオーストラリア人の参加者は,安全性の印象は低いままでも,信頼ゲームを通じて,アンドロイドをより信用できると感じるようになった.まとめると,オーストラリア人の参加者は日本の参加者に比べてより肯定的な印象をロボットに対して抱いていることが示唆される結果となり,次年度の研究計画に対する重要な知見となった.ロボットはもはやSFの世界だけにとどまらず,学校,自宅,職場,博物館,病院といった我々の身の周りにおいて重要な存在となりつつある.申請者が以前に行った研究では,ヒューマノイド,ペット,サービス,アンドロイドロボットの4種類のロボットに対する知覚を検討したところ,ロボットの外見によってロボットに対する知覚が異なることを明らかにした.さらに昨年度は,オーストラリアと日本におけるロボットに対する知覚の違いについて検討したところ,日本人の参加者は,アンドロイドとの交流後に,アンドロイドに対してあまり擬人化されていないと感じ,知的であると感じなくなった一方で,より安全であると感じることが分かった.オーストラリア人の参加者は,安全性の印象は低いままでも,信頼ゲームを通じて,アンドロイドをより信用できると感じるようになった.本年度の研究も,オーストラリアと日本の参加者を対象に,同じ大きさで外見だけが異なる2つのロボットを使用し,実験参加者に各ロボットとの接触等の交流をさせたところ,ロボットの外見や交流時間によってロボットに対する知覚が変化することが分かった.また別の研究では,短い交流をした場合と外見だけを見た場合では,ロボットに対する知覚が異なることが分かった.これらは,ロボットとの交流やその外見によって人のロボットに対して感じる不気味さを緩和させることを示唆している.これらの研究成果は,複数の国際学会で発表された.本研究に関する成果が,査読付き国際誌に論文として掲載された.また,学会発表等を通じて多くのフィードバックを得ることができ,それらを元に,現在も新たな研究成果を査読付き国際誌に投稿する準備をしている.これらのことから,現在までの達成度は,おおむね順調であると思われる.27年度が最終年度であるため、記入しない。今後も,昨年度と同様に,実験成果の発表および論文執筆を行い,実験も滞りなく進めていくことで,ロボットの社会的受容を規定する要因の解明を目指す.27年度が最終年度であるため、記入しない。
多形性膠芽腫細胞におけるMMAC1/PTENの細胞内シグナル伝達経路の解明

癌抑制遺伝子MMAC1/PTENとprotein tyrosine kinaseに関与すると考えられる各種細胞内シグナル伝達因子との関係を明らかにするため、ウエスタンブロッティングを中心とした細胞内シグナル伝達経路の推定を行なうことを目標としていた。しかし平成12年度の実績報告書で報告させて頂いたように、当初譲渡を受ける予定であったヒト多形性膠芽腫細胞株U-251にMMAC1/PTENを導入したU-251-MMACが入手困難となったため、課題研究の進行が大幅に遅延していた。そこで新たにヒト多形性膠芽腫細胞株U-251を入手し、独自にU-251-MMACを作成した。MMAC1/PTEN全長を含むplasmid vectorをリポフェクチン法によってU-251へ導入したU-251-MMACを6クローン得ることが出来た。これをSanta-Cruz社製PTEN(N-19)抗体を用いてウエスタンブロッティング法とchamber slideによる免疫染色法でcharacterizationを行った。しかしウエスタンブロッティング法ではバックグランドが高く、U251-MMACとU251-Mockとの差異が明瞭でなかった。免疫染色ではいずれのクローンでも細胞膜近傍が染色されるが、核は染色されなかった。これは、おもに核が染色されるという以前我々が報告した(Cancer Research,59(8),1820-1824,1999)結果と異なるものであった。そこでNovocastra社製PTEN(NCL-PTEN)抗体およびCASCADEBioScience社製PTEN(ABP-2001)抗体を用い、ウエスタンブロッティング法を行ったが、同様にバックグランドが高くU251-Mockとの差異が明瞭でなかった。今後更なる検討によりMMAC1/PTENと各種細胞内シグナル伝達因子との関係を明らかにしてゆきたい。癌抑制遺伝子MMAC1/PTENとprotein tyrosine kinaseに関与すると考えられる各種細胞内シグナル伝達因子との関係を明らかにするため、初年度の平成12年度はおもにウエスタンブロッティングを中心とした細胞内シグナル伝達経路の推定を行なうことを目標としていた。しかし米国M.D.Anderson Cancer Center神経腫瘍学のPeter A.Steck教授の急逝に伴い研究室が閉鎖されたため、当初譲渡を受ける予定であったヒト多形性膠芽腫細胞株U-251にMMAC1/PTENを導入したU-251-MMACが入手困難となったため、課題研究の進行が大幅に遅延している。そこでATCCより新たにヒト多形性膠芽腫細胞株U-251を入手し、独自にP.A.Steckらと同様の方法にてU-251-MMACを作成した。現在、これをSanta-Cruz社製PTEN(N-19)抗体を用いてウエスタンブロッティング法とchamber slideによる免疫染色法でcharacterization中である。ウエスタンブロッティング法ではややバックグランドが高く、免疫染色ではいずれのクローンでも細胞膜近傍が染色されるが、核は染色されない。これは、おもに核が染色されるという以前我々が報告した(Cancer Research,59(8),1820-1824,1999)結果と異なるものであり、この点についても今後検討したい。