hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
視覚系における輝度・色情報統合の時空間的制約〜短時間情報提示のために〜

デイスプレイを介して人間に情報を与える際に,画像情報の状態や目的によっては画像が短時間呈示になる場合が生じる。そこで本研究では,映像情報の視覚処理で主要な役割を果たしている輝度と色の刺激の処理系とその情報統合に着目して人間の時間特性を明らかにした。前年度は,輝度のみの刺激について時間的な応答変化を示す刺激応答関数(輝度インパルス応答関数)を知覚閾値測定データよりモデルを用いて導出し,輝度単独の情報処理における時間特性を明らかにした。本年度は,同様の手法をもちいて,色変化のみの刺激についての刺激応答関数(色インパルス応答)を測定し,特に空間周波数の影響について検討した。各実験データは,輝度の場合と同様に,色インパルス応答導出の場合でも,手法,実験装置およびモデル解析が有効であることを示した。実験結果は,興奮相のピークまでの時間で定義される応答速度は,単純Gabor関数3.12cpdの領域でほぼ一定(120msec)であるが,3cpd4cpdを境にしてそれ以上の空間周波数領域(実験した4.015.79cpdの領域)では,ほぼ一定の50msecに上昇することが明らかとなった。このことは輝度インパルス応答の場合と同様に,高空間周波数の方が応答速度は速いことを示している。ただし,輝度インパルス応答の場合とは異なり,応答速度が最速ピークとなる空間周波数は見られなかった。以上より短時間での色刺激呈示においては,4cpdよりも高い空間周波数(但しコントラスト知覚閾値限界よりも低い空間周波数)で主として構成される刺激を用いた方が,高速な視覚系の処理が期待できることが明らかになった。サインや警告表示などでの応用が期待される。ディスプレイを介して人間に情報を与える場合に,画像情報の状態や使用目的によっては画像が短時間呈示になってしまう場合や,作業効率上短時間呈示が求められる場合が生じる。そこで本研究では,映像情報の中でも特に情報伝達で主要な役割を果たしている輝度と色の刺激の処理系とその情報統合に着目して人間の時間特性を明らかにしようとする。本年度は,輝度のみの刺激について時間的な応答変化を示す刺激応答関数(輝度インパルス応答関数)を知覚閾値測定データよりモデルを用いて導出し,輝度単独の情報処理における時間特性を明らかにした。手法として2刺激光法を用い,刺激は空間的横グレーティングにGabor関数の包絡線をかけたものとし,特に空間周波数の影響についても検討した。各実験データは,この手法,実験装置およびモデル解析が有効であり,輝度インパルス応答関数が導出できることを示した。実験結果は,興奮相と抑制相の交代で定義される応答速度は,単純Gabor関数0.5cpdの領域と514cpdの領域でほぼ一定であり,24cpdではほぼ3cpdをピークとしてそれらより高速な応答が得られることを明らかにした。また高空間周波数を用いた場合には,P(Parvocellular)経路の特性から考えて,抑制相が弱まり時間的足し会わせ時間が増大することが予測されたにもかかわらず,514cpdの領域では,逆に単純Gabor関数0.5cpdの領域の場合と比べて,より早い応答が得られた。以上より短時間輝度刺激呈示においては,24cpdで構成される刺激を用いると,高速な視覚系の処理が期待できることが明らかになった。
造血幹細胞移植による肝不全の治療

マウス造血幹細胞は骨髄中ではCD34^-であり、G-CSFにより末梢血に動員された造血幹細胞はCD34^+であることを見出した。また、骨髄中の造血幹細胞は接着因子の阻害により機械的に末梢血に動員される可能性があることを、c-kit-SCF結合を阻害する可溶性c-kit投与が末梢血に造血幹細胞を動員することにより明らかにした。これらの基礎的検討をもとに、急性肝不全において、造血幹細胞はG-CSFによって、肝細胞に分化する能力を失うことなく末梢血に動員され、壊死に陥った肝臓内に動員され肝細胞に分化することをクローナルなレベルで証明し、造血幹細胞移植またはG-CSF投与が急性肝不全の治療になる可能性を示唆した。はじめに、GFP発現マウス(C57BL/6Tg(act-EGFP)Osb1)の骨髄よりLin^-細胞をビーズ法によって分離し、さらに一個のc-kit^+Sca-1^+CD34^-細胞をフローサイトメトリー法にて分離し、致死量の放射線照射を行った正常マウス(GFP^-)に移植した。2ヵ月後、GFP^+の血液細胞を持つキメラマウスとなった。このマウスに四塩化炭素およびレトロルシン処理後、G-CSFを投与し、2ヵ月後に肝臓内にGFP陽性肝細胞が再生されているかを検討した。次にGFP発現マウスにG-CSFを投与し、一個のマウス末梢血Lin^- c-kit^+Sca-1^+CD34^+細胞を分離し、この細胞を四塩化炭素およびレトロルシン処理後急性肝不全マウス(GFP^-)に、経脾経門脈的に移植し、2ヶ月後にマウス肝臓にGFP陽性肝細胞を再生し得るか否かを検討した。結果は、これらの造血幹細胞分画に属する一個の細胞が、放射線照射マウスの造血を再構築するとともに、急性肝不全マウスの肝細胞を再生した。また、自己の骨髄細胞から障害された肝組織に造血幹細胞が動員され肝細胞を再構築した。サイトカインによって末梢血に動員された造血幹細胞が肝細胞に分化し得るかどうかを検討した。また、幹細胞を末梢血に動員する機序を解明し、動員に有効なサイトカインの組み合わせについて検討した。GFPトランスジェニックマウスにG-CSF投与を行った後に末梢血を心臓穿刺にて採取し、Lin^+細胞を磁器ビーズ法にて除去したマウス末梢血Lin-単核球をセルソーターにてLin-c-kit^+Sca-1^+CD34-分画とLin'c-kit^+Sca-1^+CD34^+分画に純化した。このテスト細胞をretrorsine及びCCl_4投与により作成した急性肝障害マウスに経門脈的に移植した。移植2ヵ月後にマウス肝臓内におけるGFP陽性細胞のclusterについて検討した。Ly5.1マウスにG-CSF、可溶性c-kit受容体.(s-kit)を単独または組み合わせて投与した後、末梢血を心臓穿刺にて採取し、マウス末梢Lin-単核球をLy5.2マゥスに移植した。移植6ヶ月後に、レシピ5ントマウスの末梢血を用い、キメリズム解析を行った。GFPマウスの末梢血を移植されたマウスでは、両群とも約30%のマウスに肝臓内にGFP陽性clusterを認めた。

s-kit投与後のLy5.1マウス末梢血単核球を移植されたマウスLy5.2の末梢血中にLy5.1陽性細胞が見られた。また、G-CSF単独より、G-CSF+s-kitを投与したLy5.1マウス末梢血単核球を移植した群が、レシピエントマウスの末梢血中ドナー由来のLy5.1陽性細胞のキメリズムが有意に高かった。造血幹細胞はサイトカイン投与により骨髄微小環境との接着を阻害され、末梢血中に出現する。その造血幹細胞分画に肝細胞に分化しうる細胞が存在し、末梢血幹細胞移植療法は、骨髄のみならず他の再生医療にも有効な手段である可能性が示唆された。サイトカインによって末梢血に動員された造血幹細胞が肝細胞に分化し得るかどうかを検討し、幹細胞を末梢血に動員する機序を解明し、動員に有効なサイトカインの組み合わせについて検討した。GFPトランスジェニックマウスにG-CSF投与を行った後に末梢血よりLin-c-kit^+Sca-1^+CD34^+分画の細胞を、retrorsine及びCCl_4投与により作成した急性肝障害マウスに経門脈的に移植した。移植2ヵ月後に30%のマウス肝臓内においてGFP陽性細胞のclusterを認めた。次に、GFPトランスジェニックマウスのLin-c-kit^+Sca-1^+CD34^-分画の細胞を1個、致死量の放射線照射を施行したマウスに移植した。移植2ヵ月後に造血細胞がGFP(+)に置換されたマウスにretrorsine及びCCl_4投与し急性肝障害を作成した後G-CSF投与を行った。その2ヵ月後にB6マウス肝臓内において中心静脈を中心に、GFP陽性細胞のclusterを認めた(Blood 102:336a、2003)。Ly5.1マウスにG-CSF、可溶性c-kit受容体(s-kit)を単独または組み合わせて投与した後、マウス末梢血Lin-単核球をLy5.2マウスに移植した。移植6ヶ月後に、レシピエントマウスLy5.2の末梢血中にLy5.1陽性細胞力が見られた。また、G-CSF単独より、G-CSF+s-kit投与Ly5.1マウス末梢血を単核球移植した群が、ドナー由来のLy5.1陽性細胞の%が有意に高かった(Exp.Hematol 32:390-396,2004)。また、その造血幹細胞分画には肝細胞に分化しうる細胞が存在し、造血幹細胞を末梢血に動員することができるサイトカイン投与は、再生医療にも有効な手段である可能性が示唆された。
船載型方向スペクトル波計測装置の開発

海洋波浪の正確な把握は船舶、海洋構造物の設計、運航ひいては海洋開発そのものにとって非常に重要である事は言うまでもない。従来からその計測解析方法として数多くの手法が提案されてきたが沿岸でなく大洋で船舶職員の目視観測に代わって自動的にかつ比較的手軽に実施出来る計測解析技術はまだ完成されていない。一方筆者は以前に船体動揺をもとにした方向スペクトル波計測法を提案し実船実験も実施したがまだ完全ではなく、船体応答の少ない短波長域で推定精度が落ちる欠点があった。そこで、今回その欠点を克服する船舶搭載型波浪計測器の改良開発を行う事をめざした。まず短波頂領域では本質的に船体応答は非常に小さくなる事により波浪スペクトルの推定精度は落ちるので推定に使用する運動モードはピッチ、ヒ-ブだけでなくロール、加速度、相対運動も考慮した。また追い波状態では出会いの周波数に対して対応する絶対周波数(即ち波長)が3価関数となり一対一対応が崩れてしまう問題については最尤法の再検討により解決した。またこれらの改良を実験水槽でのPCM無線使用自由航走模型試験および商船大学の実験船による実海域試験により確認しほぼ実用になる事を確認した。即ち従来の目視観測に代わって自動的に風浪およびウネリの有義波高、平均周期、主方向を特定出来る道が開けた。1.船体運動に基づく方向波スペクトルの推定法の改良を試みた.これは基本的には通常の船舶の船体運動の周波数応答関数はストリップ法でほぼ推定可能である故波浪中でピッチ、ヒーブ等の応答を計測し周波数応答関数を介して入射波たる方向波のスペクトルを最小2乗法的に逆推定するもので既に実績があるが短波長域及び追い波中で問題があった.即ち短波頂領域では本質的に船体応答は非常に小さくなる事により波浪スペクトルの推定精度は落ちる.また追い波状態では出会いの周波数に対して絶対周波数が3価関数となり一対一対応が崩れてしまう問題である.そこで推定法の本質的な改良点は短波長域での応答計測の精度向上と追い波中で絶対周波数と出会い周波数が3価関数となる点を一対一の対応とする改良であるが実用的な解決方法の糸口がつかめたものと考えている.この目的の為に若干数値シミュレーションを実施し問題解決の補助とした.その為にパソコンを並列した形の高速データ処理装置を、また実験準備としてデータ処理に必要なフィルター等を購入し使用した.2.方向スペクトル波中の模型実験も若干実施し推定法との関連を調べた.3.次年度には実海域での検証を考えている.そのため実船データ取得の予備実船試験を実施した.その結果船体運動、波浪画像等のデータ取得の見込みが得られた.(1)船体運動を加速度計、角速度計により又船体周りの波浪状態を相対波浪計を用いて計測し船体運動等による波浪推定の補強を行う方法を検討した.このために実船試験で使用する船の2.7メートルモデルを改造し水槽実験を実施した.モデルは実船との対応を考え、完全な自由航走とし、向かい波、追い波、斜め波中で実施した.なお舵の制御及び計測データの送受信はPCM方式の無線で行った。又方位角の制御には従来ジャイロを用いていたが今回は光学的な手法も新しく開発して使用た.今回の実験は主として長波頂不規則波中において相対波高計測に重点をおいて実施したが、その結果相対波高計に航走時応答特性の低下が見られると言った計測上の問題があったものの少なくとも一次元スペクトルは相当改善される事がわかった.また逆に、従来使用されているストリップ法による周波数応答関数の短波長域での問題点も明らかとなった(平山、上野担当).また方向スペクトルについても推定法を数値計算でも若干検討した(馬担当).これらの計測、計算には今年度購入した設備備品が役だったが検討に時間がかかり購入時期が若干遅くなった.(2)早めに進行すれば、開発した新しい手法の実用性を実海域で確認するために民間または公的機関の所有する船に便乗し実船試験を実施する予定であったが実験実施に若干手間取った為実施出来なかった.次年度には実海域での実船による方向スペクトルの推定検証が可能であると考えている.

沖合いの海洋波浪の正確な把握は船舶、海洋構造物の設計、運用ひいいては海洋開発そのものにとって非常に重要である事は言うまでもない。しかしながら目視観測に代わって定常的にかつ比較的手軽に実施出来る計測解析技術はまだ完成されていない。筆者は以前に船体動揺をもとにした方向スペクトル波計測法を提案し実船実験も実施したがまだ完全ではなく、船体応答の少ない短波長域で推定精度が落ちる欠点があった。そこで前述の現状に鑑み、その欠点を克服する船舶塔載型波浪計測器の改良開発を行なう事をめざした。前年度までに水槽実験も実施し、短波長域での改良方法を大略検討出来た。今年度は計画の最終年度であり、開発した新しい手法の実用性も実海域で確認するために公的機関の所有する船に便乗し実船試験を実施した。そのさい船舶用のレーダーも画像処理により利用した。相対波高はマイクロ波波高計及び超音波波高計を船に設置した。なお、前年度模型実験上で若干問題があった点に関しては水槽における模型実験も実施した。研究代表者は全体を統括し、分担者は実践試験の解析、(上野)及び水槽実験の解析(馬)を担当した。以上の結果、追い波状態での方向波スペクトル推定にやや問題があるものの、船体運動と相対波高を併用した絶対周波数ベースの方向波スペクトル推定がほぼ可能となり、従来目視に頼っていた風浪とウネリの区別も定量的に可能となった。
HIV感染に関連する口腔病変の病理学および分子病態学的研究

1今回の研究の研究試料の提供および共同研究者としてミャンマーのヤンゴー大学歯学口腔病理Swe Swe Win修士とベトナムのホーチミン大学歯学部口腔病理Nguyen Thi Hong修士の協力で真菌やウイルスについて以下のように検索した。2 HIV感染症の合併症のひとつとして口腔扁平上皮癌がある。今回ベトナムホーチミン大学の口腔癌について共同研究者、Nguyen Thi Hong修士とLan教授と共同研究を行った。158例の口腔癌を対象として正常口腔粘膜上皮についてp53、mdm-2、Ki-67、MMP9を免疫組織化学的に調べた。染色性の有意な相関が組織分化度(p53、mdm-2、Ki-67、MMP9)、再発(p53、MMP9)、リンパ節転移(Ki-67、MMP9)との間でみられた。3共同研究者のSwe Swe Win修士との共同研究ではCandida albicans感染とHPV感染とp53発現についてミャンマーのヤンゴンおよびその周辺在住のビータルタバコ関連の白板症と粘膜膜下線維症を対象として検索して,対象は19例の白板症、8例の粘膜下線維症、11例の扁平苔癬です。本研究によればビータルタバコ関連の白板症と粘膜か線維症ではp53の発現があったがCandida albicansとHPVの感染はみられなかった。5本研究はアジアのHIV感染症という視点から口腔病変を分子病理的に研究しようとする点で意義を認めた。今回の研究は研究資料の提供および共同研究者としてミャンマーのヤンゴン大学歯学部口腔病理のSwe Swewin修士とベトナムのホーチミン大学歯学部口腔病理のNguyen Thi Hong修士の協力で以下のように検索した。(1)Human papilomavirusについては、ミャンマー人の口腔癌からの抽出したDNAを用いて、検出頻度の検索と型分類を行った。(2)ミャンマー人の口腔癌についてp53、p21について免疫組織化学的研究を行った。(3)ベトナム人の流質癌についてHPV、カンジダ、p53、Ki-67などの免疫組織化学的研究を行った。(4)HIV感染では口腔の多発癌が知られているので、日本人の口腔癌の多発癌について病理学的に研究した。
遺伝子欠損マウスを用いた光障害による網膜視細胞死の分子解析

1.caspase-1ノックアウトマウスとその野生型マウス(C57BL/6)の右眼を散瞳した後に、白色蛍光灯を20000ルクス、2時間照射した。2.光照射後12,24,48,168時間のそれぞれでマウス眼球摘出・固定し、その網膜のパラフィン切片、凍結切片を作成した。3.作成した標本において、TUNEL法(Gavrieli et al.J.C.B.1992)による染色を加え、網膜視細胞層でアポトーシスを起こしている細胞を検出した。野生型マウスでは24時間後をピークとして網膜視細胞層にTUNEL陽性細胞が見られた。168時間後にはほとんどTUNEL陽性細胞は認められなかった。各時間経過において、caspase-1ノックアウトマウスではTUNEL陽性細胞数は野生型と比較して有意に減少していた。4.網膜凍結切片を用いて免疫組織化学的検討を行った。野生型マウスの網膜視細胞層においてcaspase-1抗体、caspase-3陽性細胞数は光照射24時間後に照射前よりも増加していた。5.経時的に摘出した網膜からタンパクを抽出し、網膜光障害におけるcaspaseファミリーの酵素活性を合成ペプチド基質を用いて測定した(Thomberry et al.J.Biol.Chem.1997)。光照射24時間後の野生型マウス網膜のcaspase-1様酵素活性は照射前より上昇していた。48時間後には照射前と同程度に低下した。以上の結果からマウス網膜光障害による網膜視細胞のアポトーシスにcaspase-1が大きく関与していることが示唆された。1.caspase-1ノックアウトマウス、caspase-3ノックアウトマウス(ヘテロ)と、その野生型マウス(C57BL/6)の右眼を散瞳した後に、白色蛍光灯を20000ルクス、2時間照射した。2.光照射後12、24、48、168時間後のそれぞれで網膜電図(ERG)検査を行い、電気生理学的に両者を比較した。a波、b波とも、光照射後48時間でcaspase-1ノックアウトマウスは野生型より有意に高値を示した。caspase-3ノックアウトマウス(ヘテロ)の各時間でのa波、b波は野生型マウスに対して有意差が見られなかった。3.光照射後12,24,48時間のそれぞれでマウス眼球摘出・固定し、その網膜のパラフィン切片、凍結切片を作成した。4.作成した標本において、TUNEL法(Gavrieli et al. J.C.B.1992)による染色を加え、網膜視細胞層でアポトーシスを起こしている細胞を検出した。caspase-3ノックアウトマウス(ヘテロ)ではTUNEL陽性細胞数は野生型マウスと比較して有意差が見られなかった。5.網膜凍結切片を用いて免疫組織化学的検討を行った。野生型マウスの網膜視細胞層においてcaspase-1抗体陽性細胞数は光照射24時間後に照射前よりも増加していた。更にcaspase-1の網膜光障害への関与について詳細に検討する予定である。
糖尿病患者に対する問題解決療法プログラムの作成と効果検証

糖尿病患者の心理的問題に関する最新の知見を得るために学会に参加するとともに、糖尿病患者の問題解決スキルを測定するための日本語版の尺度がないため、尺度開発のための情報収集を行った。また、研究協力をしてくださる医療機関の開拓など、調査研究のための準備を行った。問題解決スキル尺度の日本語版を作成予定であったが、内容を吟味したところ日本に即した尺度開発をした方がより良い介入効果測定の指標となると判断した。そのため、作成方法の再検討を行っていたため進捗が遅れている。問題解決スキル尺度の作成を行い、信頼性および妥当性の検討を行う予定である。また、介入プログラムの内容についても検討する。尺度開発のための印刷費、質問紙の購入に使用予定である。また、学会参加、研究協力施設への調査実施のための旅費、論文投稿費に使用予定である。
植民地教育令の制定過程に関する研究-台湾と朝鮮を比較して-

かつて日本の植民地であった台湾と朝鮮に公布・施行された教育令には、植民地教育の思想的な根幹が示されているはずである。しかし、日本政府が両植民地を視野に入れ、その教育方針を共通化したのは1922年のことだった。それ以前は両総督府の学務官僚により、それぞれの状況に応じた学校制度が整備されていたため、台湾では朝鮮と合わせるために制度が後退する事態にもなった。一方、第一次朝鮮教育令で示された綱領はその後、教育令の条文から姿を消すが、「忠良ナル国民ノ育成」は水面下で強化され続けた。本研究課題は、台湾教育令と朝鮮教育令の制定過程と内容の変遷について比較的に分析を行い、植民地教育の思想的根幹がどのように築かれたのかを明らかにすることを目的としている。19年度は研究初年度にあたっており、史料調査、収集とその整理に多くの時間を費やした。史料調査は概ね、研究実施計画どおり行われた。具体内容は以下のとおりである。【国内】アジア歴史資料センター:台湾教育令「台湾教育令ヲ定ム」ほか112件朝鮮教育令「朝鮮教育令ヲ定ム」ほか196件国立国会図書館憲政資料室:後藤新平文書【韓国】国家記録院政府記録保存所:「昭和二年度教育補助書類三ノ三学務課」ほか2件大韓民国国立中央図書館:『朝鮮教育令及学校規定綴』【台湾】国史館台湾文献館:「台湾教育令施行期日ヲ定ムル府令並同令施行に関スル告諭発布ノ件」ほか、台湾教育令関係文書5件国立中央図書館台湾分館:『台湾教育令関係法規輯覧』史料調査、収集段階としては、台湾国史館文献館にて台湾教育令に関する公文書を閲覧することができ、アジア歴史資料センターの史料と突合せを行うことで、新たな知見が得られることと期待している。尚、2007年12月16日に九州大学韓国研究センターで行われた国際研究集会(第2部ワークショップ「植民地朝鮮の教育」)にて、本研究課題の研究構想を報告した。【研究成果の具体的内容】(1)初年度に収集した資料の内容分析をおこなった。対象とした資料は、アジア歴史資料センター、国会図書館憲政資料室、大韓民国中央図書館、国家記録院、台湾文献館、中央図書館台湾分館の台湾教育令・朝鮮教育令関係文書である。(2)史料の追加収集は、中央図書館台湾分館、関西学院大学学院史編纂室などで行った。関西学院大学では1931年53年の文部省と学院との往復文書を閲覧することができた。両教育令の制定に関わった官僚の個人文書としては、阿部洋氏から資料(隈本繁吉日誌)の提供を受けると同時に、研究上の助言をいただいた。(3)教育史学会大会(9月:青山学院大学)、アジア教育学会大会(10月:早稲田大学)や日本植民地教育史研究会大会(3月:龍谷大学)に参加し、廣川淑子さんをはじめとする先行研究者と意見交換を行った。(4)内容分析の結果を年表型のシートに入力する作業を継続して行っている最中である。【意義・重要性】この作業が完結すれば、台湾教育令と朝鮮教育令の制定過程を時系列でみることができると同時に、横断的にも考察することができる。教育令の制定は朝鮮が先行しているが、制度や組織、教育内容の導入にあたっては両者が前後することもあった。また、両総督府の教育政策の違いや教育令の制定に関わった教育者・官僚たちの認識の相違などが垣間見られる。朝鮮の第3次教育令をも含めた植民地教育令の制定に関する全体像(時系列+横断)を描くことに意義と重要性を見出している。本研究の目的は、かつて日本の植民地であった台湾(1895-1945)と朝鮮(1910-1945)に公布・施行された各時期の教育令の制定過程と内容の変遷について比較的に分析を行い、植民地教育の思想的根幹がどのように築かれたのかを明らかにすることにある。3年目にあたる今年度の研究実施計画は光当初,第3次朝鮮教育令の制定過程の分析の可能性を検討すること、学会報告を行い、論文を執筆することにあった。しかしながら、第2次台湾教育令、第2次朝鮮教育令の比較分析に予想以上に時間がかかり、学会報告には至らなかった。現在、論文執筆の準備中である。現時点で得ている知見は、(1)統治の開始から全く異なる地理的条件、社会的背景を有する両地域が、日本政府の現地の出先機関である両総督府主体の統治から、日本政府の配下に置かれ、同じ植民地と位置づけられ,共通の教育政策が施行される過程が第2次の両教育令から明らかなこと。(2)その際に第1次朝鮮教育令の制定に関わった学務官僚や日本の教育家が一定の働きをしていること。

(3)一方で、両地域の教育事情の差から教育政策も完全に日本政府主導とはいかなかったこと(第3次教育令の公布・施行は朝鮮のみで台湾にはない。)といった諸点である。比較的、通史的な視点で分析することで、両総督府の総督をはじめとした首脳部、学務官僚と日本政府、枢密院の統治方針や教育政策の決定過程が明らかになることに意義がある。
中央アジアの大規模灌漑農業による地下水汚染と食物連鎖による環境影響評価

中央アジアでの大規模灌漑農業が地下水汚染と食物連鎖に与える影響について以下の調査を行った。1)飲料水である地下水の調査を行った。2)潅漑用水、潅漑排水、および河川水を採取し、灌漑農業による河川水への影響を調査した。3)農村で、水利用に関しての聞き取り調査を行った。その結果、リン肥料に含まれる副産物ウランが地下水を汚染している可能性があることが分かった。また、地下水に含まれるSrの濃度が高いことが分かったが、汚染源は明らかにできなかった。世界の多くの乾燥地域の灌漑農地で、毛細管現象による塩害を防ぐために表層より5mぐらい深く灌漑排水は掘られている。しかし、多くはコンクリートによる表面加工されていない水路である。そのために、イオン濃度の高い灌漑排水は、表層地下水と混合する。一方、これらの地域では、主に地下水、なかでも、表層地下水を飲料水としているところが多い。また、世界の援助団体も途上国の乾燥地で、飲料水をはじめとする生活用水確保のため表層地下水を水源とする井戸を掘っている。中央アジアの乾燥地での大規模灌漑農業による環境汚染を調査している中で、ウランなどの放射性核種や重金属の汚染が灌漑水によって拡散していることがわかった。特に、灌漑農地でより汚染がひどいことから、ひとつの原因としてリン肥料からの汚染を考えた。ウランは副産物としてリン鉱石に含まれやすい。先進国では、リン鉱石中のウランを取り除いた後リン肥料としているが、途上国の場合そうしたことがなされていないことが多い。飲料水の水質基準を満たしていない地域が多くあり、農作物によって生物濃縮し、人体に影響を及ぼす可能性もある。そこで、本研究では、放射性核種や重金属の汚染の実態解明を現地調査と衛星データから行い、人体への影響について考察し、汚染除去策の立案を行うことを目的としている。本年度は、ウズベキスタン共和国カラカルパキスタン自治州およびフェルガナ州にて水質・土壌調査および農家への水使用に関する聞き取り調査を行った。本年度は、ウズベキスタン共和国カラカルパキスタン自治州、ホレズム州およびフェルガナ州とキルギス共和国にて水質・土壌調査および農家への水使用に関する聞き取り調査を行った。中央アジア、ウズベキスタン共和国ウルゲンチ地方において水質調査を行った。また、現地の農村にて、聞き取り調査を行った。その中で、アラル海が縮小し、干ばつが起こった時に、農民がどのように収入を得ることができるのかについて考えていくことが重要であることがあきらかとなった。。また、地方女性の社会進出を進めていくことも貧困対策で重要だとわかった。今後どのような形で検討していくことが必要かを議論し、研究体制を確立することにしたこれまでの研究結果を、ウズベキスタンのサマルカンドで行われた国際会議、International Conference of Arid Land 2において、発表した。中央アジアでは、数カ国にまたがって流れているシルダリア、アムダリアの2つの国際河川の河川水を用いて乾燥地で大規模灌漑農業を行っている。その結果、2つの川から流入のなくなった世界第4番目の湖、アラル海は、急速に縮小し、50年間で10分の1になり、世界的な環境問題として知られるようになった。2015年度9月にアラル海研究の第一人者ロシア科学アカデミーAladin博士、日本で中央アジアを研究している総合地球環境学研究所窪田順平副所長、北海道大学スラブユーラシア研究センター地田地田徹朗助教、奈良女子大学共生科学研究センター渡辺三津子研究員、ウズベキスタン共和国地質省Aparin博士、ウズベキスタン共和国タシュケント農業大学Beridiyar教授とアラル海調査を行った。アラル海は10分の1以下になり、元湖底で天然ガスが採掘されており、アラル海の縮小は止められない。このような中、アラル海周辺のウズベキスタン共和国カラカルパキスタン自治州の環境影響を評価することは非常に重要であることが明らかになった。また、これまでの研究成果の一部を論文としてまとめ、カラカルパキスタン自治州での水質変化をまとめたものがChanges in Water Quality of Amu-Darya River and Ground Water in Karakalpakstan, UzbekistanとしてJournal of Arid Land StudiesVol. 25 (2015) No. 3 p. 125-128に掲載された。

現地調査を進めている。またこれまでの研究成果を公表しており、情報公開もすすめているため中央アジアでは,数カ国にまたがって流れているシルダリア、アムダリアの2つの国際河川の河川水を用いて乾燥地で大規模灌漑農業を行っている。その結果、2つの川から流入のなくなった世界第4番目の湖、アラル海は、急速に縮小し、50年間で10分の1になり、世界的な環境問題として知られるようになった。浅層地下水や潅漑水に、重金属類の濃度の高い地域があることが解った。しかし汚染源は、全く明らかとなっていない。けれども、潅漑水による中央アジア全域への汚染拡大により、農作物から、人体を始めとする生態系に悪影響を与える可能性が非常に高い。しかし、中央アジアの乾燥地域における、農地による放射性元素や、重金属の汚染拡大についての研究報告は、非常に少なく汚染経路を経てきたのか明らかとなっていない。そこで、放射性核種を含む重金属による地下水汚染について研究を行った。その結果、リン肥料に含まれるウランにより浅層地下水が汚染され、一部の飲料水としても使用されている地下水の汚染が進行していることが、明らかとなった。また、世界第4位の湖面積を誇ったアラル海が、中央アジアの大規模灌漑農業の影響により10分の1にまで縮小していることから、アラル海の水質がどのように変化したかを調査した。その結果、我々が1994年に行った調査と比較して、塩分濃度は上昇しているが、主要イオン濃度の割合に変化が出たことがわかった。特に、Na, Clの割合が上昇し、海水の比率に近くなったことが明らかとなった。これらの研究成果をまとめて、2017年3月6日から10日までインドで開催された11th Asia Pacific Conference on Sustainable Energy & Environmental Technologies (APCSEET 2017)で発表した。中央アジアでの大規模灌漑農業が地下水汚染と食物連鎖に与える影響について以下の調査を行った。1)飲料水である地下水の調査を行った。2)潅漑用水、潅漑排水、および河川水を採取し、灌漑農業による河川水への影響を調査した。3)農村で、水利用に関しての聞き取り調査を行った。その結果、リン肥料に含まれる副産物ウランが地下水を汚染している可能性があることが分かった。また、地下水に含まれるSrの濃度が高いことが分かったが、汚染源は明らかにできなかった。調査を毎年継続している。さらに、これまでの成果を国際学会で発表し、論文として投稿している。また、日本の雑誌にも執筆し、NPO法人ウズベキスタン協会が主催するシンポジュームでも講演を行い、広く一般の人にも研究成果を公表した。本年度夏にウズベキスタンで現地最終調査を行う。そして、これまでの研究成果をまとめて、論文を投稿する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
筋肉化学受容器による血圧調節に及ぼすトレーニングの影響 -縦断的トレーニング-

本研究の目的は、局所的な筋力・持久力トレーニングが、筋化学受容器による血圧調節に影響を及ぼすかどうかについて検討することである。トレーニング効果を検討する実験には、横断的研究と縦断的研究があり、個人差や環境による影響を少なくしてトレーニングの影響をより明らかにするためには縦断的研究が必要である。そこで本研究では、4名の健康な男子について6週間の前腕のトレーニングを行わせ、その前後で筋内化学受容器反射の特性を測定した。トレーニングの内容は、30%MVCの強度で30回/分の頻度で疲労困憊までハンドグリップを行うという、低強度の持久的トレーニングであった。得られた結果は、以下に示すとおりである。1)トレーニング前後で、前腕のハンドグリップ時の最大筋力には差がみられなかった。2)トレーニング前後で、30%MVC強度のハンドグリップ運動の疲労困憊までの継続時間は、すべての被験者で増加した。このことから6週間のトレーニングによって前腕の筋持久力は増加したものと考えられる。3)筋内化学受容器反射の特性を、筋内pHの低下と血圧上昇との関係より求めたところ、トレーニングによってその関係が変わる傾向がみられた。すなわち、少ない筋内pH変化でもって大きな血圧変化が生じるようになるようである。現段階では、被験者が申請時の数より少ない4名しか終了していない。今後継続して、合計10名のデータをまとめる予定である。筋内化学受容器反射にトレーニング効果のあることが示唆されているため、今後は筋内化学受容器を特別に刺激するようなトレーニング法を模索するとともに、どのような機序でトレーニング効果が発現するのか等に関して研究を進める予定である。
シリル基の特性を利用した位置選択的C-H官能基化反応の開発

本研究では、有効な位置選択性制御法の存在しない、配位性配向基を持たない基質の分子間C-H官能基化反応において、ケイ素の特性を利用した位置選択性制御法の創出を目的としている。本研究の遂行により、有機合成化学において合成戦略のパラダイムシフトの可能性のため、一大潮流となっているC-H結合官能基化研究において、独自の手法を構築することを目的とする。これまでのところ、ロジウム二核錯体を触媒として発生させたロジウムナイトレノイドを利用すると、有機ケイ素化合物のシリル基β位選択的にC-Hアミノ化反応が進行することを見出した。これは、遷移状態で生じる部分正電荷がシリル基の立体電子効果により安定化されるためと考えられる。この反応の一般性をさらに拡大することで、有機ケイ素化合物の新たな官能基化法を確立し、これまでビルディングブロックとして想定されなかった化合物の合成利用を可能にする合成手法を提示したい。また、不斉反応への展開も行い、キラル炭素に比べて不斉合成法の未熟なキラルケイ素分子構築法の発展も目指す。シリル基β位の他にも反応性の高いベンジル位や酸素原子α位のC-H結合を有するいくつかの基質においても、β位選択的にアミノ化が進行することを見出した。さらに環内にケイ素原子をするシラシクロアルカン類は非常に高い反応性を有し、基質小過剰でもほぼ定量的に反応が進行することがわかった。不斉反応への展開も既に検討を開始しており、キラルなロジウム二核錯体を触媒として用いると、70%程度のエナンチオ過剰率で光学活性なアミノ化体が得られることがわかった。また、メカニズム解析に関する実験として水素速度論的同位体効果を検証したところ、独立の反応系で測定したものと競合反応系で測定したものの値が異なる値となった。興味深い知見が得られたため、計算化学を含めたさらなるメカニズム解析を行い、律速段階等を見極めたい。当初の予定通り、前年度に見出したC-Hアミノ化反応が選択的に進行する基質に関して、他の官能基化(C-H酸化やC-C結合形成反応等)を検討していく。C-H結合開裂の際のメカニズムが異なる場合のケイ素の立体電子効果に関しても興味がもたれるため、様々な反応条件を精査する。開発した反応を基盤として、ケイ素含有複素環など合成法の未発達な有用分子の合成法へと展開する。さらに、前年度に見出した不斉反応を続けて検討し触媒的不斉C-Hアミノ化反応を開発する。不斉C-Hアミノ化反応を炭素中心だけでなく、ケイ素中心のキラリティの構築にも展開し、キラルケイ素化合物の触媒的構築法を開発したい。ケイ素は炭素と同じ4本の結合を形成するが、炭素より長い結合距離を有する等似て非なる性質を持つため、炭素では構築できない不斉環境を構築できると予想される。新たなキラルビルディングブロックとしての利用も検討したい。

不斉C-Hアミノ化反応を炭素中心だけでなく、ケイ素中心のキラリティの構築にも展開し、キラルケイ素化合物の触媒的構築法を開発したい。ケイ素は炭素と同じ4本の結合を形成するが、炭素より長い結合距離を有する等似て非なる性質を持つため、炭素では構築できない不斉環境を構築できると予想される。新たなキラルビルディングブロックとしての利用も検討したい。(理由)初年度購入予定と申請していたガスクロマトグラフ用のキャピラリーカラムを次年度購入することとした。前年度はC-H結合アミノ化反応のや不斉反応に関しての検討を主に検討し、ガスクロマトグラフ用のキャピラリーカラムによる分析を必要とするC-H酸化反応に関しては次年度に注力することとした。(使用計画)当初の予定通り、ガスクロマトグラフ用のキャピラリーカラムを購入する。前年度にほぼ確立したC-Hアミノ化反応の他に、C-H酸化反応やC-C結合形成反応の生成物の解析にこれを用いる。
Foxp3の発現制御に関わるレギュラトリーT細胞への分化決定因子の探索

1.レギュラトリーT細胞は胸腺で通常のCD4+T細胞とは異なった系列のT細胞として分化する。転写制御因子であるFoxp3の発現がレギュラトリーT細胞の分化決定因子であるが、未熟な胸腺細胞の集団から通常のT細胞に分化する細胞と、Foxp3が発現しレギュラトリーT細胞へ分化するものとの振り分けは何によってなされるのか不明な点が多い。T細胞レセプターによって適度なアフィニティーで認識される抗原とそのT細胞レセプターの両方を発現するトランスジェニックマウスの胸腺において、胸腺細胞のあるものは発現させた抗原を認識しネガティブセレクションによって除去されるが、かなりの割合の細胞がFoxp3を発現するCD4+CD25+レギュラトリーT細胞へと分化する。一方、T細胞レセプターのみのトランスジェニックマウスでは、その認識する抗原を持たないため胸腺細胞のネガティブセレクションもレギュラトリーT細胞への分化もおこらない。これらのマウスの胸腺細胞中、胸腺細胞の選択が行われるダブルポジティブ胸腺細胞からCD4+胸腺細胞を集め転写因子の発現を比較した。T細胞分化に必須であるGATA3,胸腺細胞の選択のレギュレーターであることが示唆されているTOXの発現は両者の胸腺細胞で発現レベルに差が認められなかった。CD4胸腺細胞分化に関わっているc-Kroxの発現は通常のポジティブセレクションを受ける細胞では高かったがレギュラトリーT細胞分化がおこる胸腺細胞では発現が殆ど認められなかった。Foxp3の発現はレギュラトリーT細胞へ分化がおこる胸腺細胞でのみ認められた。そこで、レギュラトリーT細胞への分化が誘導される胸腺細胞とレギュラトリー細胞への分化が起こらない胸腺細胞を用い、PCRを用いたcDNAサブトラクションを行いレギュラトリーT細胞分化がおきる胸腺細胞でのみ発現している遺伝子を単離した。これらの中からレギュラトリーT細胞分化に関わる遺伝子を現在探索している。2.TGF-β1はレギュラトリーT細胞がFoxp3の発現維持に必要である。レギュラトリーT細胞におけるTGF-β1の発現にNFATの活性化が重要であることがわかった。胸腺で未熟T細胞は、胸腺上皮細胞に発現しているMHC分子をT細胞レセプターを介して認識し、分化生存に必要なシグナルを受け取り成熟T細胞へと分化する。レギュラトリーT細胞は同様に胸腺でMHC分子とT細胞レセプターの相互作用により分化するが、通常のT細胞に分化誘導が行われるポジティブセレクションとは異なったシグナルによりFoxp3が発現して分化した、独立したT細胞集団であると考えられる。そこで、通常のT細胞分化が誘導されるポジティブセレクションとレギュラトリーT細胞への分化決定において、分化機構の違いを明らかにする目的でFoxp3の発現制御にかかわる遺伝子を探索することにした。抗原特異性を固定したTCRトランスジェニックマウスの胸腺でも、ごく一部の細胞が内在性のT細胞レセプターを利用してレギュラトリーT細胞分化が起きるため、RAG遺伝子を欠損させ全ての細胞がポジティブセレクションされるようにした胸腺細胞と、多くの細胞がレギュラトリーT細胞に分化する胸腺細胞における発現遺伝子の比較をした。レギュラトリー

T細胞が多く分化する胸腺として、TCRの認識するリガンドをそのTCRのトランスジェニックマウスに発現させたものを用いた。リガンドとTCRを発現させたマウスの胸腺細胞ではFoxp3の発現が認められたがRAG欠損TCRトランスジェニックマウスでは認められなかった。レギュラトリーT細胞への分化決定はCD4,CD8をともに発現するダブルポジティブ胸腺細胞からCD8の発現が低下し始めるCD4+CD8lowに移行する段階で、レギュラトリーT細胞が発現しているCD25の発現が上昇することから、この時期と推測できる。そこで、レギュラトリーT細胞が分化する胸腺と分化しない胸腺から、CD4+CD8+とCD4+細胞を単離し、これらからRNAを調整しcDNAを合成した。PCRを用いたサブトラクションを行いレギュラトリーT細胞が分化する胸腺細胞に発現している遺伝子のライブラリーを作製した。両者のRNAを用いてアイソトープラベルしたcDNAを合成し、再度ライブラリーをスクリーニングして、レギュラトリーT細胞が分化する胸腺細胞にのみ発現している遺伝子を現在までにいくつか得ることができた。今後これらの解析を行う予定である。レギュラトリーT細胞は胸腺で未熟T細胞が分化しT細胞レセプターの選択が行われるとき、異なった系列のT細胞として分化する。転写制御因子であるFoxp3の発現がレギュラトリーT細胞分化における決定因子であるが、未熟な胸腺細胞の集団から通常のT細胞に分化する細胞と、Foxp3の発現誘導が行われレギュラトリーT細胞へ分化するものとの振り分けは何によってなされるのか不明な点が多い。T細胞レセプターによって適度なアフィニティーで認識される抗原とそのT細胞レセプターの両方を発現するトランスジェニックマウスの胸腺において、胸腺細胞は発現させた抗原を認識し、あるものはネガティブセレクションによって除去されるが、かなりの割合の細胞がFoxp3を発現するCD4+CD25+レギュラトリーT細胞へと分化する。一方、T細胞レセプターのみのトランスジェニックマウスでは、その認識する抗原を持たないため胸腺細胞のネガティブセレクションもレギュラトリーT細胞への分化もおこらない。これらのマウスの胸腺細胞中、胸腺細胞の選択が行われるダブルポジティブ胸腺細胞からCD4+胸腺細胞を集め転写因子の発現を比較した。T細胞分化に必須であるGATA3,胸腺細胞の選択のレギュレーターであることが示唆されているTOXの発現は両者の胸腺細胞で発現レベルに差が認められなかった。CD4胸腺細胞分化に関わっているc-Kroxの発現は通常のポジティブセレクションを受ける細胞では高かったがレギュラトリーT細胞分化がおこる胸腺細胞では発現が殆ど認められなかった。Foxp3の発現はレギュラトリーT細胞へ分化がおこる胸腺細胞でのみ認められた。そこで、レギュラトリーT細胞への分化が誘導される胸腺細胞とレギュラトリー細胞への分化が起こらない胸腺細胞を用い、胸腺細胞の選択が行われるCD4+CD8+と選択を受けたCD4+CD8^<low>細胞をFACSによりソーティングしRNAを抽出した。
鯨偶蹄目動物、ネコ目動物のモルビリウイルスを用いた進化学的研究

ウイルス学的視点から哺乳動物の進化を検証し、その結果を従来の遺伝学的解析結果と比較評価することによって、新たにネオウイルス学的な進化論を展開し、「ネオウイルス学」の確立に貢献することを目的とする。ウイルス学的視点から、鯨偶蹄目動物の進化、その際のカバの重要性について解析を行い、ネオウイルス学に相応しい進化学研究を展開させていきたい。次に海棲哺乳動物とMoVの共進化について受容体利用能の観点から検討を行う。各種動物のSLAMとMoVのタンパク質との機能的相互作用を、実際に解析することによって、SLAM遺伝子変異の哺乳動物進化への関与を明らかにし、ネオウイルス学のさらなる発展に貢献する。
新規な遺伝子運搬体:融合活性ポリペプチドの導入による人工ウイルスの構築

ウイルスの融合タンパク質の活性部位と類似した構造である両親媒性αヘリックスを形成するポリペプチドpoly(Glu-Aib-Leu-Aib)を合成し、活性に及ぼすこのポリペプチドの分子量やコンホメーションの影響を調べることによって、膜融合活性ポリペプチド設計の最適化を行った。さらに、このポリペプチドのリポソームへの固定化について検討した。種々の分子量を有するオリペプチドpoly(L-Glu-Aib-L-Leu-Aib)をホスホロアジド酸ジフェニル法によって得た(平均分子量1700,3400,4400)。また、(Glu-Aib-Leu-Aib)(n=2,3)を液相法によって合成した。これらのポリペプチドは酸性条件下で卵黄ホスファチジルコリンリポソームの融合を誘起した。分子量1255以下のペプチドは弱い活性しか示さなかったが、1700以上の分子量をもつポリペプチドは強い活性を示した。またその活性は分子量の増大とともに大きくなることがわかった。さらに、poly(L-Glu-Aib-L-Leu-Aib)のリポソーム膜への固定化を行った。Glu残基側鎖のカルボキシル基の一部にアルキル鎖を導入したポリペプチドはリポソーム膜に安定に保持されることがわかった。また、このポリペプチドを固定化したリポソームは、融合性を示すことが示唆された。
高等植物におけるオルタナティブスプライシングによる情報発現制御

光によるオルタナティブスプライシングの制御機構の解明のため、近年、制御因子の一つとして考えられているSRタンパク質(Serine/arginine-richprotein)に着目し、暗所下で生育させたカボチャ子葉から作製したcDNAライブラリーから、そのcDNAのスクリーニングを行った。その結果、分子量の異なるセリンとアルギニンに富んだRNA結合タンパク質をコードする2種類のcDNAクローン(pnSRp35、puSRp40)を単離した。puSRp35タンパク質は、N末端に2つのRNA結合領域をもつのに対し、puSRp40タンパク質は1つしかもたず、それぞれ、Type I、Type II SRタンパク質であることが明らかとなった。それらの種子発芽時における挙動を調べたところ、1日目で、多量のRNA及びタンパク質が蓄積し、その後、急速に減少していくこと、また、光照射により急速にタンパク質が検出されなくなることから、これらのSRタンパク質は、種子発芽の非常に早い時期に発現し、その制御機構には光が関与している可能性が示唆された。これらSRタンパク質をシロイヌナズナで過剰発現させた結果、葉の形態異常や植物個体の成長抑制が観察され、過剰発現したSRタンパク質が正常なスプライシングを妨げていると考えられた。現在、スプライシング能を調べるため、形質転換体と野生型のスプライシングパターンを解析中である。近年、植物においてもオルタナティブ・スプライシングによる調節の重要性が指摘されつつある。我々は、カボチャにおいて、緑葉ベルオキシソーム酵素のヒドロキシピルビン酸レダクターゼ(HPR)と、葉緑体のアスコルビン酸ベルオキシダーゼ(APX)の生成にオルタナティブ・スプライシングが関与し、各々、細胞内局在性の異なる2種類のアイソザイムが生成すること(HPR1は緑葉ベルオキシソームに、HPR2はサイトソルに、sAPXはストロマに、tAPXはチラコイド膜に局在)を明らかにしてきた。今年度は、このオルタナティブ・スプライシングの調節機構の解明を目的として、形質転換植物体の解析ならびにカボチャ種子発芽時におけるスプライシングの挙動を検討した。暗所下のカボチャ幼植物体を明所に移すと、HPR2とtAPXの生成が誘導されること、また、器官特異性の解析から根のような光が当たっていない器官では、tAPXに比べてsAPXが多量に存在することが明らかとなった。これらの結果は、このオルタナティブ・スプライシングが光により制御を受け、各々の器官におけるオルガネラの機能獲得と密接にリンクしていることを示唆している。
脳卒中患者に対する短期集中型上肢機能訓練(CI療法)が脳機能に与える影響について

本研究の目的は、CI療法が脳卒中患者の脳機能に及ぼす影響を明らかにすることである。本研究においては上肢全体を使用する粗大な動きを含んだ運動を運動課題として用い、運動機能と、脳機能との関連について、健常者、脳卒中片麻痺患者を対象に検討した。なお先行研究のほとんどは脳機能解析にfMRIを用いているために、測定手法が制限され、対象課題は臥位での手指運動に限られているが、我々は脳機能解析に近赤外線分光法(Near infrared spectroscopy : NIRS)を用いることで、座位で上肢全体を使った粗大運動を対象課題とし、より実際的な運動機能と脳機能の関連について評価している点で発展的である。研究結果から、まず健常被験者では、運動課題難易度の違いによって、特に補足運動野の脳皮質血流に変化が起きることが明らかとなった。一方、麻痺患者ではCI療法施行前後、およびその後の測定を行った結果、運動機能改善と直接的な関連を示唆する脳血流変化、及び特定パターンの脳血流変化は観察されなかった。これより、従来報告されてきた手指運動時の脳機能変化は、手指運動課題に特有のものであり、上肢全体を使うような実際的な運動課題とは必ずしも結びつかない可能性が示唆された。手指運動とfMRIによる検討は、脳卒中患者の脳機能変化の一部を捉えているにすぎず、CI療法が脳機能に及ぼす影響をより客観的に評価するためには、本研究で用いたような粗大運動を対象とした脳機能計測を加える必要性が示唆された。
絨毛トロホブラストにおけるNECC1シグナル伝達系とその機能の解明

1.正常絨毛で高発現し、絨毛癌で発現消失するNECC1遺伝子を単離した。胎盤発生への関与を明らかにするためNECC1+/+及び-/-胎盤を用いて胎盤の組織構築への関与を解析した。NECC1+/+胎盤では8.510.5dpcにおいて一過性の発現を認めた。NECC1-/-胎盤では巨細胞層の過形成及び海綿状栄養膜細胞層の低形成が観察された。2.トロホブラスト分化へのNECC1蛋白の関与を解析する目的でトロホブラスト幹細胞(TS)及びその性格を有することが示唆されているラット絨毛癌細胞RCHO-1を用いてNECC1発現による分化プログラム構築への関与について解析した。Ad-NECC1感染により巨細胞のマーカーであるp11発現は抑制され、海綿層栄養膜細胞のマーカーであるTpbp発現は亢進した。形態学的にも巨細胞の出現は抑制されていることが判明したためNECC1はTSから巨細胞への分化を負に制御し、海綿状栄養膜細胞への分化を正に調節すると示唆された。3.NECC1発現調節機構を解析するため同遺伝子プロモータ領域の塩基配列を決定し、欠失変異体を作成した。その結果NKX3.1結合サイトが存在し、その欠失変異体ではプロモータ活性が抑制されることが明らかとなった。さらにヒト絨毛細胞におけるNKXファミリーメンバーの発現を解析したところNKX3.1発現を確認した。4.NECC1下流シグナルを同定する目的でSRFドミナント・ネガティブ(DN)変異体をRCHO細胞に形質導入し分化プログラム構築に与える影響について解析した。SRF/DN変異体発現はAd-NECC1感染時と同様に分化刺激存在下におけるRCHO-1細胞の分化を阻害したためSRF活性を負に制御することにより絨毛細胞に分化プログラムを構築すると示唆された。1.マウス胎盤組織構築へのNECC1遺伝子の関与NECC1+/+、+/-及び-/-マウス胎盤を収集し、胎盤の組織構築を解析した。NECC1遺伝子は+/+胎盤においてE8.5-E10.5巨細胞及び海綿層で発現していた。E11.5胎盤ではその発現は消失した。巨細胞層、海綿層及びトロホブラスト幹細胞にそれぞれ特異的に発現するpl1、Tpbp及びCea4、Cdx2発現をIn situ hybridizationで調べ、-/-及び+/-或いは+/-胎盤と比較した。その結果、-/-胎盤では巨細胞層の過形成及び海綿層の低形成が観察された。さらに-/-胎盤におけるトロホブラスト幹細胞の顕著な減少が観察された。E11.5-/-胎盤ではpl1及びTpbpの両方のマーカーを発現する巨細胞も出現し、NECC1は胎盤絨毛細胞の分化に関与することが示唆された。2.RCHO-1細胞におけるNECC1強制発現系の樹立ラットトロホブラスト幹細胞としての性格を有するRCHO-1細胞を用い、低血清刺激による分化誘導を行った。分化刺激後3日目にNECC1発現は有意に亢進し、4日目にはその亢進が抑制された。RCHO-1細胞は分化刺激により、トリプリン抵抗性やploidyの増大などの分化に関する表現型が出現した。同時に巨細胞のマーカーであるpl1発現も亢進した。しかしアデノウイルスに組み込んだNECC1(Ad-NECC)を感染すると分化刺激存在下での分化誘導が抑制された。分化誘導の抑制に伴いpl1遺伝子発現の抑制も観察された。3.NECC1シグナル伝達路の解析NECC1及びSRFに対する抗体を用いて免疫沈降を行った結果、NECC1はSRFと共沈することが判明した。SRF-lucリポーターコンストラクトを用いて、NECC1によるSRFへの蛋白相互作用がSRF転写能の変化に及ぼす影響について解析した。その結果、NECC1はSRFと結合する事によりその転写能を抑制する事が明らかとなった。ドミナント・ネガティブSRF強制発現RCHO-1細胞を作成した結果、Ad-NECC1感染時と同様の分化抑制が示された。形態学的にも巨細胞の出現は抑制されていることが判明したためNECC

1はTSから巨細胞への分化を負に制御し、海綿状栄養膜細胞への分化を正に調節すると示唆された。3.NECC1発現調節機構を解析するため同遺伝子プロモータ領域の塩基配列を決定し、欠失変異体を作成した。その結果NKX3.1結合サイトが存在し、その欠失変異体ではプロモータ活性が抑制されることが明らかとなった。さらにヒト絨毛細胞におけるNKXファミリーメンバーの発現を解析したところNKX3.1発現を確認した。4.NECC1下流シグナルを同定する目的でSRFドミナント・ネガティブ(DN)変異体をRCHO細胞に形質導入し分化プログラム構築に与える影響について解析した。SRF/DN変異体発現はAd-NECC1感染時と同様に分化刺激存在下におけるRCHO-1細胞の分化を阻害したためSRF活性を負に制御することにより絨毛細胞に分化プログラムを構築すると示唆された。