hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
バイオフィードバックによる心拍変動の増大が圧受容体反射に及ぼす影響

バイオフィードバックを通じて心拍変動を増大させると、自律神経障害やストレスに関わるさまざまな症状(特に抑うつや不安)が緩和することが報告されている。この臨床的効果の背景には、心拍変動の増大による圧受容体反射機能の活性化が仮定されているが、実際的な検討は少ない。本研究は、1)心拍変動の増大によって圧受容体反射の感度が増加するか(心拍変動の増大が自律系ホメオスタシス機能を向上させるか)、2)心拍変動の増大によって脳波の随伴性陰性変動が変化するか(心拍変動の増大によって引き起こされた自律神経機能の変化が中枢過程に影響するか)を検討することを目的とした。平成2829年度までに圧受容体反射感度および脳波の随伴性陰性変動の評価システムを構築して上記1)および2)について検討し、平成30年度においても継続して観察した結果、これらの指標に有意な変化が認められた。このことから、心拍変動増大が自律神経機能を刺激していること(論文投稿中)、さらに、この種の内的な刺激が脳波の陰性変動に反映される認知(注意)過程に影響を及ぼしていることが示唆された(発表準備中)。これらの知見は心拍変動の増大に関わる臨床的効果の妥当性を心理生理学的な側面から示している。平成30年度の検討においては、一方で、ネガティブな刺激に対する認知過程(3オドボール課題に対する脳波変化)を評価する手続きを確立し、脅威刺激に対する注意の捕捉(より無意識的な注意)を観察できるようにした(論文掲載)。今後、心拍変動の増大がこのような認知過程(臨床場面で扱うことの多いネガティブな認知やバイアス)を調整することができるかどうか検討する予定である。平成28年度の主な検討目的は心拍変動バイオフィードバック(heart rate variability: HRVBF)を実施した際、圧反射感度(baroreflex sensitivity: BRS)が実際に高まるかどうかを検討し、この際、皮質活動の指標となる脳波の随伴性陰性変動(contingent negative variation: CNV)が同時に低下するかどうか確認することである。そのため、はじめにBRSおよびCNVの測定システムの構築を行い、それぞれの生理的指標の分析に関わるシステムを構築した。BRSは連続血圧装置によって収縮期・拡張期(および平均)血圧を測定した後、併行して測定した心拍変動との関係から回帰係数およびスペクトル分析パワー比を用いてBRS感度を評価した。また、CNVは脳波測定を通して予告信号の後のボタン押し課題において生じる陰性の電位変化を評価するシステムを構築した。一方で、BRSを確実に増加させるためにHRVBFの効率的な手続きを確立しておく必要性が生じてきたため、当初計画を一部変更し、HRVBFにおける共鳴周波数の効率的な検索手続きを開発した。具体的には、安静時の心拍変動をスペクトル分析した際の低周波(0.040.15Hz, low frequency: LF)成分に着目し、当該成分のピーク周波数をもとにペース呼吸を行った際、HRVBFの従来法に比較して有意に大きなスペクトルパワーが得られることがわかった。この結果はHRVBFにおける緩徐なペース呼吸をLFピーク周波数に合わせることによって、従来法よりも心拍変動より増大させることができることを示唆している。本研究成果は論文として発表した(印刷中)。したがって、このようなHRVBFの手続きを採用することでBRSの増加を確実に起こさせることが可能になると考えられた。今後、BRSおよびCNVの測定・分析システムの最終調整を経て、平成28年度において開発した効率的なHRVBFの手続きを実施した際のBRSの増加(およびCNV振幅)の程度を検討する予定である。計画を一部変更することになったが、本年度開発された手続きはHRVBFに関わる基礎的検討において汎用的に適用可能であり、この手続きによるHRVBFがもたらす結果には頑健性があるため、今後の検討課題(すなわち、HRVBFの実施によるBRSの増加)を円滑かつ確実に進めることが可能になると考えている。平成29年度の主な検討目的は、バイオフィードバックを通して心拍変動を増大させた際に圧反射感度(baroreflex sensitivity)が高まり、それによって皮質活動が変化するかどうかを随伴性陰性変動(contingent negative variation: CNV)を用いて検討することであった。平成28年においては心拍変動の増大を効率的に引き起こす手続き(心拍変動LFピーク周波数を基準としてペース呼吸を行うことで効率的な心拍変動の増大が生じる)を開発したが、本年度は当該手法を採用した後にCNV課題を実施して14名の参加者からデータを収集した。対照条件(心拍変動の増大を見込めない安静状態)と比較したところ、脳波中心部(Cz)のCNV面積が増大する傾向にあり(ただし、前頭および頭頂では変化がみられなかった)、心拍変動増大が皮質活動に影響する可能性のあることが示唆された。この結果についてはさらに参加者数を増やして検討を継続する予定である。一方、このような実験結果の背景で、開発した効率的な心拍変動増大の手続きが確実に圧反射感度を増加させたかどうかという問題が残されていた。このため、今年度(平成29年度)においては併行的にその検討を進めてきた。具体的に、連続血圧データと心拍RR間隔の処理方法を確立し(血圧の上昇[下降]に伴うRRの延長[短縮]シーケンスの検索を効率的化し)、圧受容体反射感度評価システムを構築した後、心拍変動増大手続きが圧反射感度を高めるかどうかを12名の参加者において検討した。その結果、圧反射感度はベースラインに比べて有意に増加した。

しかしながら、対照条件(従来より用いられている心拍変動増大の手順)と比較すると有意な交互作用には至らず、これについてさらに参加者を増やして検討を継続することとした。平成29年度は、心拍変動の増大による圧反射感度の高まりとそれによって生じる随伴性陰性変動の変化の検討に対し14名の参加者を得た。また、開発した心拍変動増大の手続きが圧反射感度を増加させるかどうかの検討において12名の参加者に協力を得た。全体としては順調に推移していると判断している。ただし、このように2つの検討を同時に進めているために各々の検討において参加者数は未だ少ない状況であるが、これまでと同様のペースで実験を進めることで平成30年度は統計的な解析に耐え得るデータの取得が見込めると考えている。平成29年度に取得した初期的データとしては予測した結果に近いものとなり、本年度、論文化へ向けて進展させることができると考えている。バイオフィードバックを通じて心拍変動を増大させると、自律神経障害やストレスに関わるさまざまな症状(特に抑うつや不安)が緩和することが報告されている。この臨床的効果の背景には、心拍変動の増大による圧受容体反射機能の活性化が仮定されているが、実際的な検討は少ない。本研究は、1)心拍変動の増大によって圧受容体反射の感度が増加するか(心拍変動の増大が自律系ホメオスタシス機能を向上させるか)、2)心拍変動の増大によって脳波の随伴性陰性変動が変化するか(心拍変動の増大によって引き起こされた自律神経機能の変化が中枢過程に影響するか)を検討することを目的とした。平成2829年度までに圧受容体反射感度および脳波の随伴性陰性変動の評価システムを構築して上記1)および2)について検討し、平成30年度においても継続して観察した結果、これらの指標に有意な変化が認められた。このことから、心拍変動増大が自律神経機能を刺激していること(論文投稿中)、さらに、この種の内的な刺激が脳波の陰性変動に反映される認知(注意)過程に影響を及ぼしていることが示唆された(発表準備中)。これらの知見は心拍変動の増大に関わる臨床的効果の妥当性を心理生理学的な側面から示している。平成30年度の検討においては、一方で、ネガティブな刺激に対する認知過程(3オドボール課題に対する脳波変化)を評価する手続きを確立し、脅威刺激に対する注意の捕捉(より無意識的な注意)を観察できるようにした(論文掲載)。今後、心拍変動の増大がこのような認知過程(臨床場面で扱うことの多いネガティブな認知やバイアス)を調整することができるかどうか検討する予定である。具体的に、実験参加者を30名程度を募集し、HRVBF群およびControl群として設定する。HRVBFは平成28年度に開発した手続きを採用して効率的にBRSを引き起こすこととし、一方でControl群はBRSの増加が期待されない約0.5Hzのペース呼吸を実施する。これらにおいて、CNVを評価し、BRSを高めるようなHRVBFがCNVに反映される大脳皮質活動を効率よく低下させるように働くかどうかを確かめる。
脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の巨核球分化成熟過程に対する病態生理学的意義の解明

これまでのin vitroの検討から、BDNFはマウス正常巨核球の自己増殖(clonal expansion)を促進することが明らかになった。そこで平成27年度はin vivoにおけるBDNFの巨核球・血小板造血への関与を検討した。血小板減少症モデルマウスにおいてBDNFは血小板数の回復を促進すると考え、本検討では抗マウスGPIb抗体カクテル投与による一過性血小板減少症モデルマウスを用いたBDNF投与実験を実施した。しかしながら、今回のモデルではBDNF投与マウスの有意な血小板数回復は認められなかった。本課題の今後の方針は、骨髄抑制モデルなど他の血小板減少症モデルにおけるBDNFの血小板・巨核球増殖促進作用の検討が挙げられる。一方、申請者は本課題以外に血小板活性化受容体CLEC-2の血小板造血における役割に関する研究も手掛けた。CLEC-2の生体内リガンドである膜蛋白、ポドプラニンを発現した新規の間質細胞を同定し、同細胞のポドプラニンと巨核球のCLEC-2が結合して全く新しいニッシェが形成されることを見出した。このニッシェで、ポドプラニン刺激で巨核球の増殖が促進され、CLEC-2の刺激で間質細胞が産生するサイトカインが巨核球のproplatelet形成を促進するという、画期的な機序を解明した。27年度が最終年度であるため、記入しない。平成25はin vitroにおける造血細胞の巨核球分化誘導法の構築とマウス骨髄からのnative巨核球の採取方法の条件検討に取り組み、それぞれの方法の確立に至った。1.造血幹細胞からの居割球分化誘導法の構築巨核球の分化成熟過程に対するBDNFの機能および作用時期を解析するために、造血幹細胞から巨核球へのin vitro分化誘導法を構築した。巨核球の分化誘導に供する造血幹細胞および巨核球前駆細胞マウス骨髄および胎児肝臓から分離し、thrombopoietin存在下で分化誘導可能であることを確認した。2.マウス骨髄巨核球の分離方法の確立In vitroで分化誘導した巨核球はinviv.巨核球の性質を必ずしも全て反映していない可能性が考えられるため、本研究ではマウス骨髄内容物から分離した巨核球も解析対象とし、その分離方法を構築した。分離した巨核球からto。talRNAを抽出後、cDNAを作製し、TaqMan probe法によるqRT-PCR実施への一連の解析方法を構築した。また、細胞学的機能解析としてproplatelet formation assayの条件検討を実施した。3.巨核球の分化成熟段階の評価方法の構築巨核球の分化成熟段階は細胞表面のCD抗原と核の多倍体化(ploidy)で評価する。核の多倍体化はFACSによるpopidium iodide染色により評価が可能であり、CD41陽性細胞でゲーティングした巨核球系細胞のPl染色強度からmean ploidyを算出する方法を構築した。CD抗原による成熟の評価はFACSでCD41とCD42bの発現量を検討することにより実施した。マウス骨髄から巨核球前駆細胞を分離し、MegaCult-Cを用いたコラーゲンゲル3D培養法によって巨核球前駆細胞の自己増殖能(clonal expansion)を検討した。その結果、骨髄由来巨核球前駆細胞はBDNFの存在下にて有意な自己増殖の促進が認められた。次に、巨核球前駆細胞を液体培地にて巨核球へと分化させ、FACSでその分化成熟段階を評価した。この結果はヒト巨核球由来細胞株MEG-01で認められたBDNFの増殖促進作用と極めて近いものであり、BDNFはマウス正常巨核球においても自己増殖促進作用を有する新規巨核球分化関連因子であると考えられた。2.巨核球の成熟に対するBDNFの作用巨核球の成熟の指標はendomitosisによる多核化(多倍体化、polyploidy)と血小板産生時に認められるproplatelet formationの2つが代表的であり、これら2つの指標がBDNF存在下でどの様な影響を受けるかを検討した。巨核球の多核化はFACSにより実施した。検討の結果、巨核球の多核化に対するBDNFの有意な影響は認められなかった。次に、proplatelet formationに対するBDNFの作用を検討した。その結果、proplatelet formationに対するBDNFの有意な影響は認められなかった。以上の結果から、BDNFは巨核球の成熟に対しては促進的な作用を呈さないサイトカインであると考えられた。

CLEC-2の生体内リガンドである膜蛋白、ポドプラニンを発現した新規の間質細胞を同定し、同細胞のポドプラニンと巨核球のCLEC-2が結合して全く新しいニッシェが形成されることを見出した。このニッシェで、ポドプラニン刺激で巨核球の増殖が促進され、CLEC-2の刺激で間質細胞が産生するサイトカインが巨核球のproplatelet形成を促進するという、画期的な機序を解明した。平成26年度はこれまでに確立した巨核球に関する各種解析手法を駆使し、BDNFの巨核球に対する生理作用の解析を実施した。解析の結果、BDNFはマウス正常巨核球に対して自己増殖(clonal expansion)を促進する一方、多核化やproplatelet形成に代表される巨核球の成熟には関与しないことが明らかになった。これらの生理作用はmegakaryocyte-colony stimulatingfactor (MEG-CSF)と呼ばれる巨核球造血関連サイトカインの作用に極めて類似するものである。今後はマウスへのBDNF投与などによりin vivoにおけるBDNFの巨核球・血小板造血への関与を詳細に検討する。BDNFノックアウトマウスの導入・解析と、巨核球BDNF mRNAの解析については遅れが認められるものの、in vitroにおける巨核球造血の解析で一定の成果を得たことから、概ね期待通りの研究の進捗状況であると評価する。27年度が最終年度であるため、記入しない。1.骨髄におけるBDNFの産生細胞の探索In vitroの実験系にてマウス正常巨核球に対してBDNFは自己増殖促進作用を呈したことから、in vivoにおいてもBDNFは巨核球造血に積極的に関与していると考えられた。そこで我々は骨髄内でのBDNF産生細胞の探索を実施することで、個体内でのBDNFと巨核球との関連性をより詳細に検討する。骨髄内BDNF産生細胞は骨髄凍結組織標本を用いる免疫組織化学染色(immunohistochemistry, IHC)により実施する。2.巨核球分化成熟因子としてのBDNFの作用メカニズムの解明巨核球の分化成熟関連転写因子とBDNFの相互作用の解析に向けて、幼若巨核球のBDNF添加・非添加培養条件を検討し、cDNA合成などの解析試料の作製などを進める。BDNFの作用による巨核球分化成熟関連転写因子(特に自己増殖促進に関与する転写因子)の変動をqRT-PCRを用いて解析する。平成25年度はin vitroにおける造血幹細胞の巨核球分化誘導法の構築とマウスの骨髄からのnative巨核球の採取方法の条件検討に取り組み、それぞれの方法を確立するに至った。In vitro分化誘導もしくは骨髄から分離した巨核球の評価はフローサイトメトリー法により実施し、核の多倍体化と細胞表面CD抗原による成熟度の判定方法を確立した。FACSAriaによる造血幹細胞や巨核球のソーティング技備の導入が遅れたため、当初平成25年度内を予定していたBDNFノックアウトマウスの導入はまだ達成できていないが、全体的には概ね計画通りの進捗と判断し、期待通りの研究進展であると評価する。
投球障害肩に関わる肩甲骨位置の解明と予防プログラムの考案

本研究目的は、第一に、大学野球選手を対象として、「プレシーズンに定量評価した肩甲骨位置」が「シーズン中に生じた投球障害肩」と関係するのかどうかを調べることである。第二に、投球障害肩の予防プログラムを実施することによって、プレシーズンとシーズン終了後に肩甲骨位置が改善して、シーズン中における投球障害肩の発生率が減少するのかどうかを調べることである。1年目である2018年度は、投球動作中の肩甲骨位置および肩関節屈曲・伸展・水平内転・水平外転方向の等尺性収縮運動時の肩甲骨位置を計測する実験環境を整え、2019年度のプレシーズン計測に向けた予備実験を実施した。行った予備実験では、野球選手15名を対象に、投球動作中の肩甲骨位置と等尺性収縮運動時の肩甲骨位置との関係性を検討した。その結果、いくつかの運動方向で、投球動作中の肩甲骨位置と等尺性収縮運動時の肩甲骨位置との間に相関関係を認めた。この結果より、「定量評価した肩甲骨位置」が「投球動作中に発生する肩関節へのメカニカルストレス」に関連する可能性を推察できる。そのため、今後検討する「プレシーズンに定量評価した肩甲骨位置」と「シーズン中に生じた投球障害肩」との関係を解釈する際の参考となるデータを得られたと考えている。2018年度中に、実験環境を予定通り整えることができた。しかし、2018年度シーズン終了後に、研究協力をいただいている大学野球部の監督交代があり、2019年1-3月に実施する予定であった「プレシーズンにおける肩甲骨位置」の計測を見合わせることとなった。そのため、研究の進捗状況はやや遅れていると判断した。すでに新監督には、2020年度プレシーズンでの肩甲骨位置の計測実験に関する研究協力の承諾はいただいており、今後は予定通り研究を進められると考えている。2018年度に行うことができなかった、プレシーズンにおける肩甲骨位置の計測は、2020年1-3月に実施する予定である。研究協力をいただく大学野球部とは具体的な日程等も確認できている。さらに、2019年度中に肩甲骨位置を改善するための介入プログラムの開発を目的とした予備実験を進める。健常男性15名を対象に、6週間の介入プログラム実施前後の「肩関節屈曲・伸展・水平内転・水平外転方向の等尺性収縮運動時の肩甲骨位置」を計測し、実施したプログラムが肩甲骨位置に及ぼす影響を明らかにする。2019年度中にこの予備実験を進めることで、2020年度以降に実施する予防介入プログラムの効果を事前に検討することができると考えている。「現在までの進捗状況」に記載した理由により、2018年度中に実施する予定であった「プレシーズンにおける肩甲骨位置」の計測を実施できなかった。

そのため、被験者および研究協力者に支払う予定であった謝金を使用しなかった。2019年度に予備実験および2020年度プレシーズンにおける肩甲骨位置の計測を実施する。予備実験で15名の被験者、プレシーズンにおける肩甲骨位置の計測に約70名に対して謝金の支出を予定している。また、2018年度に実施した予備実験に関するデータを学会で発表する予定であり、旅費・参加費の支出を予定している。具体的には、国際学会2件で約40万円を見込んでいる。
幹細胞の多能性維持、大量培養に向けた新規培養法の検討

幹細胞を培養する上で継代を繰り返すと多能性が減弱することは大きな問題となっている。多能性とは幹細胞が様々な種類の細胞に分化できる能力のことであり、再生医療研究を行う上での重要な要素である。本研究課題では、新規培養法に着目し、多能性を持った細胞を大量に得ることを目的とした。本研究課題は基盤的な研究内容であり、実用化された際には幅広い研究分野での応用が期待される。本研究計画では幹細胞の多能性維持と大量培養に着目して研究を行っている。間葉系幹細胞、上皮系幹細胞を用い、新規培養法と既存の培養法で細胞増殖率、多能性の維持について比較を検討している。これまでに、それぞれの細胞の単離、および培養条件を確立することに成功した。現在は従来型の培養法から本研究課題である新規培養法の組み合わせを模索している最中である。今後はその中で、最も能率よく多能性の維持と細胞の増殖が図ることのできる培養法を検討することとする。当初の計画から想定の範囲内であると考えているため。その中で、最も能率よく多能性の維持と細胞の増殖が図ることのできる培養法を模索することとする。培養条件の確立を当初予想していたより少ない予算で達成できたため。
哺乳類における前後軸に沿った胎仔生殖腺の分化能の解析

哺乳類の性決定はY染色体上の精巣決定遺伝子Sryの有無により支配されている。しかし、Sryの機能やSry直下の遺伝子ネットワークについて、いまだ不明な点が多い。今回、Sryを解析ための新規の実験系として、通常飼育下で繁殖能があり(XX卵巣)、人為的に熱ショック(HS)により、卵巣からXX精巣へと性転換させることができるSry誘導モデルマウス(#44)を樹立した。#44のSry誘導ラインを用いた解析の結果、Sryによる雄化を誘導できる臨界期(精巣分化のcritical period)が11.011.25dpc(12-14ts)であること、また、1516tsにおいては、中央部領域においてのみ、一部の細胞がSOX9陽性のセルトリ細胞に分化誘導されることが明らかとなった。このラインを用いて、1)Sryによる雄化誘導の臨界期と液性因子FGF9/WNT4との関連性について検討した。その結果、FGF9とWNT inhibitorであるsFRP2の添加により、SryによるSOX9発現維持の臨界期の延長すること、また、Wnt4遺伝子欠損マウスとの掛け合わせにおいて、臨界期を越えた11.511.75dpc(18-20ts)においても精細管形成などの精巣への形態形成を誘導できた。以上の結果から、性分化初期の6時間において、SryがFGF9/WNT4シグナルのバランスを雌型から雄型へ変化させることが精巣の形態形成に必須であることを明らかにした。この結果は、生殖腺の卵巣化分子プログラムが精巣分化開始後6時間で開始することを示すものであり、また器官形成におけるマスター遺伝子の臨界期を哺乳類で初めて同定したものである。マウスでは胎仔の性分化期の生殖原基において、Sryが、一過性(10-12時間)で中央部から前後端に波状に発現することにより、未分化生殖原基を卵巣から精巣に分化誘導する。しかし、Sryの機能・標的遺伝子を含む精巣の分化メカニズムは未だ不明である。以前、Sryの発現が生殖原基の中央部に限局している時期に前後軸に沿って三分割して培養すると、中央部の高い精巣分化能に対し、前部後部では正常な精巣分化が誘導できないことを明らかにしたが、この精巣分化能の領域差がどのように制御されているかについて詳細な解析を行った。その結果、1)Sryがこの精巣分化の領域特異的パターンを制御しているわけではないこと、2)細胞の移動、細胞間相互作用によるものではなく、中央部から前後端へ液性因子が分泌されることにより、このパターンが制御されていること、3)FGF9添加培養により前後端の精巣分化能が回復する一方、FGF阻害剤添加培養により精巣分化が中央部に限局することが示された。これらの結果から、精巣分化能の生殖腺中央部から前後端への波状パターンは、FGF9により制御されていることが強く示唆された(Hiramatsu et al.投稿準備中)。また、通常飼育下ではXX精巣性転換を示し、Sryが恒常的に生殖腺全領域に発現していることが明らかとなっている、XX/Hsp-Sryを用いて、性分化初期から精巣特異的に発現しているPgds(Prostaglandin D2 synthase)の解析を行った。その結果、PgdsはSox9により発現が直接制御されており、さらに、発現したPgdsがSox9の発現上昇を誘導するポジティブループが存在することを明らかにした(Wilhelm et al. 2007)。哺乳類の性決定はY染色体上の精巣決定遺伝子Sryの有無により支配されており、セルトリ前駆細胞において転写因子Sry遺伝子が精巣特異的遺伝子を活性化(あるいは卵巣特異的遺伝子を抑制)することにより、精巣分化を誘導しているものと推測されている。しかし、SRYの機能、Sryの直下の遺伝子ネットワークについては現在まで明らかになっていない。このSryの機能解析の立ち遅れの大きな理由に、Sryによる精巣誘導可能なin vitroの実験系がないことが挙げられる。今回我々は、熱ショック蛋白Hsp70.3をプロモーターに用いた、Hsp70.3-Sryトランスジェニックマウスを作成し、XX生殖腺において、熱処理により様々なタイミングでSryの一過性発現を誘導し、XX精巣へ分化を誘導することができるin vitroの実験系を確立させた。この系を用いて解析を行なった結果、1)Sryが未分化生殖腺を精巣へ分化を誘導できる臨界期は性分化期初期の6時間のみであること、2.)臨界期を越えてSryを発現させた場合でも、セルトリ細胞分化に必須の遺伝子Sox9の発現は一過性に誘導できるが、その発現の維持がされず、卵巣へと分化すること、3)臨界期を越えてSryを発現させた場合、液性因子Fgf9とWnt4の発現バランスが雌型、(Wnt4が上昇しFgf9が下がる)のままであり、FGF9およびWNTシグナル拮抗薬を添加することにより、セルトリ細胞およびライディッヒ細胞の分化を誘導することができることが明らかとなった。これらは、哺乳類の精巣分化において、Sryによるセルトリ細胞自律的な経路(Sox9の発現誘導)と独立した非細胞自律的な経路(Fgf9/Wnt4シグナルなど)が存在すること、また、適切なタイミングで分化が制御されることが重要であることを強く示唆している。哺乳類の性決定はY染色体上の精巣決定

遺伝子Sryの有無により支配されている。しかし、Sryの機能やSry直下の遺伝子ネットワークについて、いまだ不明な点が多い。今回、Sryを解析ための新規の実験系として、通常飼育下で繁殖能があり(XX卵巣)、人為的に熱ショック(HS)により、卵巣からXX精巣へと性転換させることができるSry誘導モデルマウス(#44)を樹立した。#44のSry誘導ラインを用いた解析の結果、Sryによる雄化を誘導できる臨界期(精巣分化のcritical period)が11.011.25dpc(12-14ts)であること、また、1516tsにおいては、中央部領域においてのみ、一部の細胞がSOX9陽性のセルトリ細胞に分化誘導されることが明らかとなった。このラインを用いて、1)Sryによる雄化誘導の臨界期と液性因子FGF9/WNT4との関連性について検討した。その結果、FGF9とWNT inhibitorであるsFRP2の添加により、SryによるSOX9発現維持の臨界期の延長すること、また、Wnt4遺伝子欠損マウスとの掛け合わせにおいて、臨界期を越えた11.511.75dpc(18-20ts)においても精細管形成などの精巣への形態形成を誘導できた。以上の結果から、性分化初期の6時間において、SryがFGF9/WNT4シグナルのバランスを雌型から雄型へ変化させることが精巣の形態形成に必須であることを明らかにした。この結果は、生殖腺の卵巣化分子プログラムが精巣分化開始後6時間で開始することを示すものであり、また器官形成におけるマスター遺伝子の臨界期を哺乳類で初めて同定したものである。
キルヒホッフ-ヘルムホルツ積分公式に基づいた音場再現手法に関する研究

音場の空間的な再現を実現するための原理としてKirchhoffの積分方程式に基づく方法を提案した。本研究ではその原理の実現可能性を明らかにすることを目的としている。この原理を用いて音場再現を行なう場合、次のような手順で制御を行なう。まず、元の音場(原音場)におけるある閉空間内の音場を再現するために、その閉空間を囲む境界上の音圧と粒子速度を観測する。次に、別の場所(再生音場)において同じ形の閉空間を想定し、その境界上の音圧と粒子速度が原音場と同じようになるように、2次音源を調節する。また、境界上の全ての点の音圧と粒子速度を観測することは不可能であるため、離散的な点の音圧から近似的に境界上の音圧と粒子速度を観測することを想定する。すなわち、境界上に有限数の参照用マイクロホンを配置し、それらのマイクロホンの出力信号が原音場と再生音場でなるべく等しくなるように2次音源の出力信号を決めるわけである。このような、手順で音場再現を行なうことを想定し、数値計算を用いて基礎的な計算を行なった。その結果、原理的にはKirchhoffの積分方程式に基づく方法が可能であることがわかった。しかしながら、再現する周波数が高いほど精度が悪くなくなることがわかった。2次音源および参照マイクロホンの数を増やし、境界上のマイクロホン間隔が狭くなれば、より高い周波数まで制御が可能となることがわかった。また周波数が十分低い範囲でも参照マイクロホンを配列する境界の形によっては著しく再現精度が低下する可能性があることが明らかになった。この再現精度の低下は境界面上に参照マイクロホンを規則的に配置したときに生じる。これは境界の形が規則的な場合に、音波の固有モードが生じやすくなるためである。したがって、参照マイクロホンの配置を不規則的することにより、対象とする周波数範囲内にモード周波数が生じないようにすることが可能であることがわかった。
インペラに作用する力の釣り合いを利用した動圧浮上遠心血液ポンプの開発

本研究では、1ヶ月以上の長期耐久性と優れた血液適合性の実現を目的に、血液自身を潤滑液として浮上回転する動圧軸受を用いた体外循環用動圧浮上遠心血液ポンプを開発するため、インペラに作用する流体力と永久磁石による磁気力、動圧軸受による軸受発生力の釣り合いを利用する血液ポンプを開発した。インペラの浮上位置の計測試験を実施した結果、動圧軸受を単独で使用した場合では達成困難な広い軸受隙間を安定して実現することができた。また、血液適合性試験を実施した結果、市販の血液ポンプと同等の溶血特性を実現し、急性動物試験では優れた溶血特性と抗血栓性を確認することができた。本課題では、インペラに作用する流体力と永久磁石による磁気力、動圧軸受による軸受発生力の釣り合いを利用した血液ポンプを開発することで、動圧軸受を単独で使用した場合では達成困難な広い軸受隙間を安定して実現する。平成27年度は、インペラに作用する動圧軸受による流体力と永久磁石による磁気力の解析ソフトウェアを開発した。1.動圧軸受による流体力の解析ソフトウェアの開発動圧軸受の発生力を求めるため、軸受の深さ方向に圧力一定と仮定し、二次元レイノルズ方程式を用いた解析ソフトウェアを開発した。二次元レイノルズ方程式は中心差分で離散化し、繰返し演算で計算することで、軸受内の圧力分布が得られた。そして、圧力分布を積分することで軸受の発生力が得られた。解析対象とするモデルは、スパイラル溝を有するスラスト軸受と、3円弧を有するラジアル動圧軸受とした。数値流体解析を実施した結果、スラスト軸受では、スパイラル溝を溝が狭くなる形状とすることで、スパイラル溝末端で高い圧力が局所的に発生することがわかった。また、ラジアル軸受では、軸受隙間が狭くなる前後で、高圧と低圧が局所的に生じていることがわかった。ラジアル軸受では、計算された流体力をもとに、運動方程式より羽根車の軌跡を静的解析した。その結果、羽根車が任意の位置へ収束する様子を計算可能であることがわかった。2.永久磁石による磁気力の解析ソフトウェアの開発ポンプ内に配置する永久磁石の最適な設置位置を求めるため、磁気力を求める解析ソフトウェアを開発した。本ソフトウェアで解析を実施した結果、事前に計測した磁気力と磁石間の距離から羽根車に作用する磁気力を求めることができた。本ソフトウェアで求めた磁気力の妥当性を評価するため、永久磁石を用いて磁気力を実測した。実測の結果、本ソフトウェアの解析結果が妥当性であることを示すことができた。インペラに作用する力の解析ソフトウェアの開発を目的に研究を実施した。その結果、研究目的通り、インペラに作用する動圧軸受による流体力と永久磁石による磁気力の解析ソフトウェアを開発することができた。平成28年度は、インペラに作用するスラスト合力とラジアル合力を解析することで、ポンプの至適形状を求めた。1)インペラに作用するスラスト合力の評価:ポンプ内のインペラに作用するスラスト合力を評価するため、インペラ上下面の流体力と動圧発生力を軸受隙間毎に数値流体解析により算出し、インペラの磁気力、自重、浮力は試作モデルを用いて実測した。そして、軸受隙間毎にインペラの合力を求めることで、総軸受隙間の中央でインペラ上下の合力が釣り合うインペラの至適形状を求めることができた。また、スパイラル溝形状の動圧軸受の山部と溝部の比と螺旋角度を数値流体解析により至適化することで、軸受発生力を高め、より安定した浮上を実現できることがわかった。2)インペラに作用するラジアル合力の評価:インペラに作用するラジアル合力を評価するため、インペラ中心方向に作用する流体力、動圧発生力、磁気力、遠心力を求め、インペラ中心方向に作用する合力と外周方向に作用する遠心力が釣り合う軸受隙間を求めた。さらに、軸受剛性を設計パラメータとして、偏心や公転運動の少ない多円弧動圧軸受の至適円弧数と軸受深さを求めることが出来た。3)インペラに加わる合力を考慮したポンプ形状の最適化設計:ポンプ形状の最適化設計を行うため、インペラに作用するスラスト合力の評価結果をもとに、スラスト方向の釣り合い位置は、動圧軸受の軸受形状とインペラの上下面の面積を変えたモデルにより調整できることが明らかとなった。また、ラジアル合力の評価結果より、ラジアル方向の釣り合い位置は、動圧軸受の軸受形状で調整できることが明らかとなった。平成28年度に作成したインペラの作用力を解析するソフトウェアを利用し、スラスト方向の合力の釣り合い位置がケーシング中央部となる至適形状を明らかにすることができた。また、ラジアル軸受の多円弧動圧軸受の至適円弧数と軸受深さを明らかにすることができた。本課題では、インペラに作用する流体力と永久磁石による磁気力、動圧軸受による軸受発生力の釣り合いを利用した血液ポンプを開発することで、動圧軸受を単独で使用した場合では達成困難な広い軸受隙間を安定して実現する血液ポンプを目指している。

平成29年度はこれまで開発してきた動圧軸受を有する血液ポンプを試作し、インペラの浮上位置計測試験と血液適合性試験を実施した。1.インペラの浮上位置計測試験動圧ポンプのインペラの浮上位置を評価するため、レーザー距離計を利用した評価試験を実施した。スラスト隙間は、最低回転数である500rpmのインペラの位置をゼロ点とし、回転数を増加させたときのインペラのスラスト方向の変位から計測した。スラスト変位の計測試験を実施した結果、インペラ内の永久磁石とコイルの間の磁気力とインペラに作用するスラスト流体力を最適化したモデルで動圧軸受単独では達成困難な100μmを超える軸受隙間が実現できた。インペラのラジアル隙間は、2つのレーザー変位計を使用して、インペラのラジアル軌跡より計測した。最低回転数である500rpmのインペラ軌跡からケーシング中心を求め、ポンプの回転数を増加させたときのインペラの偏心量と振動片振幅を評価した。本試験の結果、ラジアル動圧軸受の発生力がインペラの遠心力を超える多円弧軸受形状のモデルでインペラは安定駆動することが確認された。2.血液適合性試験試作した動圧ポンプの血液適合性を評価するため、動物血を用いた溶血試験とin-vitro抗血栓試験、ブタを用いた動物実験を実施した。血液適合性の評価試験を実施した結果、開発ポンプの溶血特性は市販ポンプよりも優れており、in-vitro抗血栓性試験でも血栓形成は観察されなかった。ブタを用いた動物実験では、抗凝固療法無しの条件で溶血や血栓形成は観察されず、優れた血液適合性を確認することができた。本研究では、1ヶ月以上の長期耐久性と優れた血液適合性の実現を目的に、血液自身を潤滑液として浮上回転する動圧軸受を用いた体外循環用動圧浮上遠心血液ポンプを開発するため、インペラに作用する流体力と永久磁石による磁気力、動圧軸受による軸受発生力の釣り合いを利用する血液ポンプを開発した。インペラの浮上位置の計測試験を実施した結果、動圧軸受を単独で使用した場合では達成困難な広い軸受隙間を安定して実現することができた。また、血液適合性試験を実施した結果、市販の血液ポンプと同等の溶血特性を実現し、急性動物試験では優れた溶血特性と抗血栓性を確認することができた。平成28年度以降、インペラに作用する合力を釣り合わせたポンプ形状の検討及び動圧ポンプの浮上位置計測試験と血液適合性試験による総合評価を実施する。インペラに作用する合力を釣り合わせたポンプ形状の検討では、解析ソフトウェアの結果をもとに、スラスト軸受では、流体力・動圧・磁気力・自重の4つの力を至適軸受隙間で釣り合わせる。また、ラジアル軸受では、偏心や公転運動が少なくなる至適軸受隙間で流体力・動圧・遠心力・磁気力を釣り合わせる。そして、開発した動圧ポンプの浮上特性と血液適合性を、浮上位置計測試験と血液適合性試験で評価する。最後に、連携大学病院にて動物実験を行うための最終モデルを製作する。平成29年度は、インペラに作用する合力を釣り合わせた至適形状の血液ポンプを試作し、動圧ポンプ内のインペラの浮上位置計測試験を実施し、解析結果と比較評価する。また、in vitroの血液適合性試験を実施する。医用工学評価試験モデルを設計するための解析結果に、計画時には検討していなかった、ラジアル軸受による羽根車の軌跡の解析が加わったため、モデルの製作が次年度となった。過去に製作した試作モデルを一部改良することで基礎データは取得できたため、研究計画上の遅延は生じていない。
4歳児積み木場面における積み木の操作と物語生成に関する検討

本研究では,幼児が特には物語を用いて他者との関係を構築して協働し,集団を形成していく過程を検討する。教材としての歴史が長く広く普及している積み木に着目し,幼児の具体的操作と認識,他者を含む相互行為のあり方を示す。また本研究対象である4歳児は,葛藤と自己調整を繰り返す中で,集団におけるより良い在り方像を獲得し,社会的望ましさを意識する最初の過程である時期でもある。本研究において,4歳児における積み木場面での物の操作と,場の参加者間で生成されていく物語生成との関係を明らかにすることで,保育におけるプロセスの何に着目し,どのような環境の設定や相互行為の支援が,質の向上に必要であるのかを解明する。
現代の生活習慣が引き起こす血栓症を予防する新規食品機能成分の探索と応用

現代の生活習慣によって乱れた血液凝固系が原因となって生じる血栓傾向を改善する新規食品機能成分を見出し、食生活からの血栓症の予防に応用することが本研究の目的である。今年度は、肥満・糖尿病マウスや高齢マウスでの検討に加え、睡眠障害マウスでの検討を進めた。アシタバ黄汁を混餌で摂取させた肥満・糖尿病マウスや高齢マウスでは、肥満や加齢による血栓傾向を抑制することがわかった。これらの効果は黄汁中のカルコンの主成分であるキサントアンゲロールによる可能性が高い。アシタバ黄汁は本研究の目的である食生活からの血栓症の予防に応用できる可能性がある。黒酢濃縮液や黒酢もろみ末については、これらを混餌で摂取させても肥満・糖尿病マウスや高齢マウスの血栓形成傾向へは影響しなかったが、in vitroの検討で黒酢もろみエタノール抽出物に血小板凝集抑制作用や血管内皮細胞からのPAI-1産生抑制作用が見られたため、これらの作用を指標に黒酢もろみ末抽出物を分画し機能性成分の探索を進めた。また、黒酢濃縮物の分画物については血液凝固反応を抑制したため、黒酢濃縮物の分画物中の機能性成分の探索も行った。研究期間中に成分の特定には至らなかったが分画物にも活性があったため、食生活からの血栓症の予防に黒酢もろみ末や黒酢濃縮液が応用できる可能性はある。睡眠障害マウスについては、予備検討段階では血栓形成傾向が見られたが、その後の検討では明らかな血栓形成傾向が見られず、本研究のモデルマウスとして適切かどうか疑わしい結果となったため、このモデルを使った検討は断念した。また、加齢による血栓傾向を抑制する機能性成分の探索を短期間で進める目的で、加齢促進マウス(SAMマウス)での検討を進めたが、SAMマウスでは通常の高齢マウスで見られるような加齢による血栓傾向を示す血中因子の変化は見られなかった。深夜勤務やシフトワーク、睡眠障害による生活リズムの乱れ、肥満や糖尿病などの生活習慣病は血栓症の発症リスクを増加させる。また、我が国が直面している社会の超高齢化により、今後確実に血栓症が増加する。本研究は、これまでに申請者らが構築してきた肥満、加齢、睡眠障害、時差ぼけによって血栓傾向が見られる独創的なモデルマウスによる評価系を応用し、現代の生活習慣によって起こる血栓症を日常の食生活から予防する新しい食品やその成分を見出して、ヒトで応用することを目的とする。そして、これらを使って新たな保険機能食品の利用基盤を築き、食生活からの血栓症の予防を目指す。当該年度は、血液凝固反応、血小板凝集反応、血管内皮細胞などを使った独自の評価系を使って新規候補食品の探索を行うとともに、モデルマウスを使った動物実験での検討も開始した。黒酢10倍濃縮液および黒酢もろみ末には、炎症性の血栓傾向を抑制する効果が見られた。また、黒酢もろみ末のエタノール抽出物については、血小板の凝集を抑制する効果を見出した。そこで、黒酢10倍濃縮液および黒酢もろみ末については、血小板凝集抑制や血管内皮細胞からのPAI-1産生抑制、血液凝固時間延長などを指標に、クロマトグラフィーを用いた分画を開始した。マウスモデルを用いた検討では、肥満糖尿病マウスを用いた検討で、アシタバ黄汁による血栓形成傾向の抑制作用が確認できた。また、アシタバ黄汁や黒酢もろみを含んだ餌を摂取させて飼育すれば、加齢による血栓形成傾向が抑制される可能性も見えてきた。研究開始時に予定した候補食品からの探索研究については、予定数の評価が行えていないという点でやや遅れている。しかし、黒酢10倍濃縮液や黒酢もろみ末の成分の分画研究は開始しており、また、2年目以降に本格的に進める予定だった、マウスモデルを用いた検討は、肥満マウスでの検討を中心に予定より少し早目に進行しているため、全体としては、おおむね順調に進行していると判断した。本研究は、これまでに申請者らが構築してきた独創的なモデルマウスによる評価系を応用し、現代の生活習慣によって起こる血栓症を日常の食生活から予防する食品やその成分を見出して、新たな保険機能食品の利用基盤の構築と、食生活からの血栓症の予防を目指す。当該年度から、モデルマウスを使った動物実験での検討に重点を置いて進めている。種々のモデルマウスの準備を進めながら、食品を使ったマウスでの検討も開始し、黒酢10倍濃縮液および黒酢もろみ末を混餌投与したマウスで、炎症性に誘発した血栓傾向を抑制する効果を見出した。動物実験以外の部分では、黒酢もろみ末エタノール抽出物が血小板凝集を抑制することや、培養血管内皮細胞からのPAI-1産生を抑制することなどを示した。現在は、黒酢もろみ末エタノール抽出物を分画し、機能成分の特定が可能かどうか検討を進めているが、分画後の抑制作用は確認できていない。一方、肥満糖尿病マウスを用いた検討では、アシタバ黄汁凍結乾燥物を混餌投与したマウスで、血栓傾向の抑制を確認した。

また、アシタバ黄汁を含んだ餌を摂取させ高齢まで飼育したマウスは、加齢による血栓傾向が抑制される可能性も見えてきた。しかし、実験期間短縮のために検討した加齢促進マウス(SAMマウス)では、このような効果は確認できていない。成分の分画研究は、分画後の活性評価に時間がかかり、思うように進まなかったことが遅れの原因である。また、マウスモデルでの有効性評価の部分では、思うように病態モデルマウスの症状が発現せず、飼育環境の再検討の必要が生じたことも遅れの原因である。現代の生活習慣によって乱れた血液凝固系が原因となって生じる血栓傾向を改善する新規食品機能成分を見出し、食生活からの血栓症の予防に応用することが本研究の目的である。今年度は、肥満・糖尿病マウスや高齢マウスでの検討に加え、睡眠障害マウスでの検討を進めた。アシタバ黄汁を混餌で摂取させた肥満・糖尿病マウスや高齢マウスでは、肥満や加齢による血栓傾向を抑制することがわかった。これらの効果は黄汁中のカルコンの主成分であるキサントアンゲロールによる可能性が高い。アシタバ黄汁は本研究の目的である食生活からの血栓症の予防に応用できる可能性がある。黒酢濃縮液や黒酢もろみ末については、これらを混餌で摂取させても肥満・糖尿病マウスや高齢マウスの血栓形成傾向へは影響しなかったが、in vitroの検討で黒酢もろみエタノール抽出物に血小板凝集抑制作用や血管内皮細胞からのPAI-1産生抑制作用が見られたため、これらの作用を指標に黒酢もろみ末抽出物を分画し機能性成分の探索を進めた。また、黒酢濃縮物の分画物については血液凝固反応を抑制したため、黒酢濃縮物の分画物中の機能性成分の探索も行った。研究期間中に成分の特定には至らなかったが分画物にも活性があったため、食生活からの血栓症の予防に黒酢もろみ末や黒酢濃縮液が応用できる可能性はある。睡眠障害マウスについては、予備検討段階では血栓形成傾向が見られたが、その後の検討では明らかな血栓形成傾向が見られず、本研究のモデルマウスとして適切かどうか疑わしい結果となったため、このモデルを使った検討は断念した。また、加齢による血栓傾向を抑制する機能性成分の探索を短期間で進める目的で、加齢促進マウス(SAMマウス)での検討を進めたが、SAMマウスでは通常の高齢マウスで見られるような加齢による血栓傾向を示す血中因子の変化は見られなかった。現在進行中の黒酢10倍濃縮液や黒酢もろみ末およびアシタバ黄汁の効果の検討では、各種動物モデルでの検討に重点を置きながら分画研究と共に進行させる。新規候補食品に関する抗血栓性の調査と抗血栓性物質の探索の部分の遅れを取り戻すことにより、探索段階から動物実験に移行できる候補食品の数を増やす。そして、これらの中から、生活習慣が引き起こす血栓症を予防する機能を見出し、応用に向けて推進する。成分の分画研究は、複数の評価系で評価しながら進める予定であったが、評価対象の食品中に血液凝固反応を阻害する可能性があるものが見つかったことから、血液凝固反応の評価系を主軸に使用して分画を進める予定である。また、動物モデルについては、飼育条件を再検討した結果、病態発現は安定してきた。今後は安定したモデルを優先利用して進める。食品からの新規候補物質の探索研究の部分の遅れに伴い、分画研究の進行も遅れ、成分の分画に使うクロマトグラフィー関連の消耗品購入費が予定より少なかったため。また、肥満糖尿病モデルマウスや加齢促進モデルマウスなど高価なマウスの購入数が少なかったため。(理由)分画研究の遅れに伴いクロマトグラフィー関連の消耗品購入費が予定より少なかったため。また、動物実験の遅れによりマウスの購入数が少なかったため。
バイオマーカーを用いた病弱児におけるストレス評価に関する研究

今年度は,小児がん患児における骨髄穿刺等の侵襲的な医療処置の前後の唾液アミラーゼ活性値と行動観察スケールを用いて評価した患児のdistress,患児および保護者が評価した医療処置に対する患児の不安,医師が評価した医療処置中の患児の身体的苦痛の程度の関連性について検討を行った。その結果,担当医師が評価した医療処置中の患児の身体的苦痛の程度と医療処置直後の患児の唾液アミラーゼ活性値の間に,有意な正の相関関係が認められた。医療者は患児のdistressの程度を患児の様子や行動に基づいて客観的に評価する傾向があることが報告されており,唾液アミラーゼ活性値が侵襲的な医療処置に際する患児のdistressを反映する客観的指標として有用である可能性が示唆された。近年,わが国においても患児のストレス(distress)を予防・軽減するための心理学的介入の重要性についての認識が高まるとともに,医師や看護師,チャイルド・ライフ・スペシャリスト等による取り組みが増えており,介入効果を客観的エビデンスに基づき評価できる方法や指標が求められている。本研究で得られた成果は,携帯型測定機器を用いて簡便に測定できる唾液アミラーゼ活性値が,そうした指標の一つとなりうる可能性を示すものである。今後は,実際の介入場面における測定等を通して,その効果を判断する指標としての唾液アミラーゼ活性値の有用性を検討する必要があると思われた。
高脂肪食によるGLUT4(糖輸送体)発現低下機序の解明

近年の栄養摂取過剰の傾向により、肥満、糖尿病、高脂血症などのいわゆる成人病が増加してきている。糖尿病の大部分を占めるII型糖尿病は、遺伝性素因のある人に、過食や運動不足などの環境因子が加わり発症することが知られている。これらの環境因子の中で、食の欧米化による食事中の脂肪含量の高いことが、肥満やインスリン抵抗性の主要な原因と考えられている。筋肉、脂肪組織(WAT、BAT)に特異的に発現している糖輸送体(GLUT4)は、末梢組織での糖代謝の律速段階になっていて、高脂肪食は、脂肪組織におけるGLUT4の発現量を低下させ、個体でのインスリン抵抗性を生じる。この機序を明らかにするため、5'-領域の長さの異なるミニジーンGLUT4欠失ミュータントを多種類作成し、それぞれのコンストラクトからトランスジェニックマウスを作成した。これらのマウスを用いて、脂肪組織での組織特異的シス・エレメントが転写開始点から-551と-506の間に、高脂肪食に反応するシス・エレメントが-701から-551までにあることを明らかにした。又、-700前後に存在するNF-1結合部位をミューテートしたコンストラクトを導入したトランスジェニックマウスを作成し、各組織でのミニジーンGLUT4mRNAの発現パターンを調べたところ、GLUT4の脂肪組織特異的発現が消失することを見出した。このことはNF-1結合部位と-551と-442の間のシス・エレメントとの両方に結合する転写因子が存在することを示し、高脂肪食に反応する転写因子との相互作用が推定された。目的:高脂肪食を摂取すると生じるインスリン抵抗性は、糖輸送体(GLUT4)遺伝子の発現低下がその主要な原因であると考えられている。そこで、高脂肪食によるインスリン抵抗性の発症原因を明らかにすることを目的として、脂肪組織におけるGLUT4遺伝子の発現低下機序について検討した。これまでのトランスジェニックマウスを用いた実験結果から、高脂肪食に反応するGLUT4遺伝子のシスエレメントが-701-551の間にあることがわかった。本年度は、その領域をさらに狭めて解析するためにミューテーションを入れたトランスジェニックマウスを作成し、その検討を行っている。方法及び結果:5'領域の長さの異なるマウスGLUT4ミニジーンコンストラクトを-701、-582、の2種類作成し、これらの遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを作成した。次に-701と-582のミューテーションコンストラクトを作成し、同時にこの遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを作成した。現在、これらのマウスに約4ヶ月間、高炭水化物食(脂肪エネルギー比10%)及び高脂肪食(脂肪エネルギー比60%)を摂取させ、白色脂肪組織においてRNase Protection法により、内因性と外因性のGLUT4mRNA量を区別して解析中である。また、この領域に結合している蛋白質を詳細に検討するために、高炭水化物食及び高脂肪食を摂取させたC57BL/6Jマウスの白色脂肪組織から核蛋白を抽出し、フットプリント、ゲルシフトを行った。その結果、-586-547(WF5)と-621-582(WF4)にタンパク質の結合領域が認められた。次に、WF5とWF4のミューテーションフラグメントを作成してゲルシフトを行ない、結合特異的なシスエレメントを推定した。

筋肉、脂肪組織(WAT、BAT)に特異的に発現している糖輪送体(GLUT4)は、末梢組織での糖代謝の律速段階になっていて、高脂肋食は、脂肪組織におけるGLUT4の発現量を低下させ、個体でのインスリン抵抗性を生じる。この機序を明らかにするため、5'-領域の長さの異なるミニジーンGLUT4欠失ミュータントを多種類作成し、それぞれのコンストラクトからトランスジェニックマウスを作成した。これらのマウスを用いて、脂肪組織での組織特異的シス・エレメントが転写開始点から-551と-506の間に、高脂肪食に反応するシス・エレメントが-701から-551までにあることを明らかにした。又、-700前後に存在するNF-1結合部位をミューテートしたコンストラクトを導入したトランスジェニックマウスを作成し、各紅織でのミニジーンGLUT4mRNAの発現パターンを調べたところ、GLUT4の脂肪組織特異的発現が消失することを見出した。このことはNF-1結合部位と-551と-442の間のシス・エレメントとの両方に結合する転写因子が存在することを示し、高脂肪食に反応する転写因子との相互作用が推定された。