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中央アナトリアのヒッタイト象形文字の研究-カマン・カレホユック出土資料を中心に-

本研究は、カマン.カレホユック遺跡(トルコ共和国のほぼ中央部)から出土したヒッタイトの印章の研究の一環として行われた。円形遺構1出土の約700点の印影付粘土塊をはじめカマン・カレホユックの全てのヒッタイトの印章資料を対象として、必要に応じ新たな実測図の作成や写真撮影、基礎的データの入力などを行い、これをほぼ終えることが出来た。象形文字については、その意味や音価の同定のみならず、これ迄ほとんど研究されてこなかった象形文字の時代的・地域的な変化にも着目した。またマルカヤの岩碑文のような、カマン・カレホユック遺跡近郊の象形文字碑文の調査も実施した。本年度の現地カマン・カレホユックでの資料調査は、共同研究者のロンドン大学のM・ウィードンが行った(2008年9月)。これによりカマン・カレホユック北区'円形遺構1'出土の象形文字付印影資料の暫定的なカタログの作成はほぼ完了した。またM・ウィードンは、カマンの西、クルシェヒールの近郊に位置するマルカヤの象形文字碑文の調査成果をまとめ、Anatolian Archaeological Studies Vol.17(2009年7月刊行予定)にJ・D・ホーキンスとの共同執筆の論文として癸表する。マルカヤ碑文は、中央アナトリアに残るヒッタイト象形文字碑文の一つとしてすでに1940年代には知られていたが、今回はその再調査であり、地理的に近いカマン・カレホユック出土の象形文字資料との比較資料としても注目されている。一方吉田はこれ迄の資料整理、研究と国内での作業を進め、特にヒッタイト象形文字の字形の変化に着目した成果の一部をトルコ調査研究会で口頭発表した。象形文字の字形の時代的な変化については、資料上の制約もあり、同時期の楔形文字に比べて研究が遅れているが、今後の研究の進展により象形文字碑文の年代付けの有力な指標になるものと期待される。また、カマン・カレホユック出土の象形文字資料(印章資料)の出版にむけて、全体の構成等具体的な検討に入った。カマン・カレホユック出土の印章資料の現地での調査は、昨年度に引き続き、共同研究者のロンドン大学のM・ウィードンが実施した(2009年9月)。カマン・カレホユック北区の'円形遺構1'から大量に出土した印影付粘土塊(封印として用いられた)に加えて、これ迄に他の発掘区から出土したヒッタイト時代(前1712世紀)に年代付けられる全ての印章資料を調査対象とした。本研究の主眼である印面のヒッタイト象形文字、また装飾、形状、材質、色調、出土状況(出土地点、層位など)についても詳しく注記した。新たな出土物については、必要に応じて保存処理を施した上で写真撮影、注記を行った。一方吉田は国内で、これ迄に蓄積されたデータの整備、中央アナトリアの他遺跡出土の資料との比較研究にあたった。カマン・カレホユック出土の印章資料は、時代的偏りはあるもののヒッタイト王国の初期から末期までの全時期をカバーしており、同一遺跡でヒッタイトの印章、印面の象形文字の変遷を跡づけることの出来る数少ない遺跡である。本研究を通して、これまで知られていなかったヒッタイト象形文字の音価の同定、字形の時代的変化、また印章の使用法などについても新たな知見が得られつつある。カマン・カレホユック遺跡(トルコ共和国のほぼ中央部)出土資料を主に対象とする現地調査は、本年度も海外共同研究者のロンドン/オクスフォード大学のM・ウィードンを中心に行われた(2010年8月)。最終年度の本年は、カマン・カレホユック出土のヒッタイト時代の印章資料の総括的な研究の出版を視野に入れて、これ迄調査した資料、データの整理、整備に重点を置いた。同時にアナトリア各地の遺跡出土の資料との比較研究を進め、まとまったヒッタイト印章資料の出土地としては最も西に位置するカマン・カレホユックの資料が全体の中でどのように位置づけられるのか、西アナトリアの文化の影響の有無、あるいはヒッタイト象形文字の起源など、より全般的・基本的な問題にも焦点が当てられた。また、カマン・カレホユック遺跡の西へ30kmほどに位置するビュクリュカレの昨年の発掘調査で出土したヒッタイトの粘土板文書(書簡)の調査が行われた。

このヒッタイト語で書かれた書簡(発信者は恐らくヒッタイト王か王子)は楔形文字の字形の特徴から前14世紀に年代付けられるが、これはカマン・カレホユック遺跡北発掘区の「円形遺構1」から大量に出土したブッラ(印影付粘土塊、その印面に象形文字が記されている)とほぼ同時期にあたり、本研究にとっても極めて重要な意味を持つものと言える。今後の発掘調査の進展が注目される。
第一原理計算による3核子力効果の解明とその宇宙核反応への影響

我々の宇宙にある元素の合成過程において、恒星内での放射捕獲原子核反応や、超新星爆発におけるレプトン(電子、ニュートリノ等)原子核反応は決定的な役割を成すことが知られているが、反応率が極端に小さいため、実験による検出が難しく、系統的な反応率の評価は理論計算に頼らざるを得ない。本研究は原子核の外場による応答を第一原理的に求めることで、信頼のおける宇宙核反応率の評価を行う。核子(陽子・中性子)多体系である原子核の精度の良い記述には2核子力だけではなく3核子力の寄与が重要であるが、実験・理論研究の困難さから未だ大きな不定性が残されている。そこで模型を仮定しない一貫した枠組みにより、原子核構造・反応における3核子力の役割を明らかにし、信頼のおける宇宙核反応率を評価する枠組みを確立ことが目的である。本年度は3核子力及びレプトン原子核反応の核行列要素の定式の整理を行うとともに、宇宙核反応で重要となるリチウム6の光吸収反応、すなわち電場による応答に関する微視的計算を進めた。模型を仮定しない6体計算を実行することにより、原子核の電場による励起機構についてクラスター構造の重要性を示唆する新たな知見が得られ、現在論文としてまとめているところである。同時に陽子や中性子による原子核散乱、応答に関する手法の開発やその応用についての研究を進め、それらは5本の誌上論文としてまとめられた。これら一連の成果は9件の国内外学術会合において発表された。本年度はリチウム6の電場による応答について、模型を仮定しない完全微視的な6体計算を実行し、原子核の励起機構に関わる新たな知見を得ることができた。論文としての出版は次年度となるが、そのほかにも原子核の様々なプローブによる応答に関する研究が大きく進展し、査読付き誌上論文としてまとめることができた。3核子力の核行列要素の定式の検討は進めており、計算プログラムの実装について具体的に考えている段階である。次年度はまず現在まとめているリチウム6の電場応答についての論文の出版を目指す。3核子力を含む核行列要素の定式化を整理し、実際の計算コードの作成を行う。その後、様々な原子核応答への応用を考え、3核子力による核子相関やその宇宙核反応への影響を明らかにする。また、国際会議における研究成果及び中間成果発表も積極的に行う予定である。都合により予定していた国際学会に参加できなくなったため、次年度使用額が生じた。来年度は多数の国際学会が予定されているため、その旅費に充てる。
腫瘍の悪性度・転位能の評価を目的とした新規組織トラップ型核医学診断薬剤の開発

糖転移酵素であるN-Acetylglucosaminyl transferase-V(GnT-V)の発現は腫瘍の悪性度と関連するため、その活性を測定することにより、腫瘍の質的診断が期待される。本研究では腫瘍集積機序にGnT-Vによる水溶性の増大(糖付加)を利用した、代謝トラップ型診断薬剤の開発を試みた。すなわちGnT-Vの基質認識性を考慮し、3糖構造:GlcNAcβ1→2Manα1→6-Glcのグルコース部分に、直鎖状炭素を介して放射性ヨウ素標識Iodophenyl基を導入した化合物を合成し、その有効性を基礎的に評価した。まず、リンカーとなる直鎖状炭素鎖数が2の化合物について、対応するアルキルスズ前駆体からI-125標識化合物([^<125>I]IPGMG)を合成し、in vitroで評価した。その結果、[^<125>I]IPGMGはGnT-Vに基質として認識され、さらにHPLC分析により求めた反応速度をDouble reciprocal plot解析したところ、Km値は24μMであり、汎用されている蛍光標識試薬(Gn, Gn-bi-PA)と比較して約10倍以上のGnT-Vへの高親和性を有することが明らかとなった。また、本法の検出感度は蛍光法より約3倍高く、[^<125>I]IPGMGによるGnT-V活性のin vitro測定の可能性が示された。一方、GnT-Vを遺伝子導入したWidr(大腸癌)細胞を用い、[^<125>I]IPGMGの取込み実験を行ったところ、本化合物は細胞膜透過性が低いことが明らかとなった。これは、リンカー部の炭素鎖数が細胞膜を透過する上での脂溶性の獲得に不十分であったためと考えられたことから、引き続き炭素鎖を伸長あるいは脂溶性を高める適当な置換基を導入した化合物を合成し、動態制御を達成することでI-123標識in vivo SPECT用放射性診断薬剤へと展開する。腫瘍の悪性度に関与する糖転移酵素、GnT-Vの活性を定量化するインビボ画像診断用放射性薬剤の開発を目指し、当該年度は、設計した化合物の3糖構造部分と放射性ヨウ素を導入したヨードフェニル基とのリンカー部の炭素鎖数がn=2の化合物の合成と、インビトロでの基礎的評価を行った。フェニル基のヨウ素導入部位をトリブチルスズで置換した前駆体とNa[^<125>I]を反応させることにより、目的とする化合物([^<125>I]IPGMG)を、無担体、95%以上の放射化学的純度にて得た。GnT-Vを遺伝子導入したWidr細胞の溶解液について、糖鎖ドナーのUDP-GlcNAcと[^<125>I]IPGMGを37°Cで4時間反応させ、Double reciprocal plotにて求めたKm値は24mMであり、本化合物のGnT-Vとの親和性は、現在汎用されている蛍光標識基質のGn,Gn-bi-PA(Km:270mM)より10倍以上高いことが明らかとなった。また、種々の濃度のGnT-Vを含有する試料につき、[^<125>I]IPGMGを用いてGnT-V活性を測定したところ、蛍光法と比較してより高感度にGnT-V活性を測定できることが示された。一方、[^<125>I]IPGMGのインビボ画像診断薬としての可能性については、Widr細胞を用いた取込み実験にて検討したところ、本化合物は細胞膜透過性が悪いことが明らかとなった。これは、リンカー部の炭素鎖が少なく、脂溶性の獲得が十分でなかったためと考えられる。そこで、現在炭素鎖n=13の化合物を合成中であり、これについても同様の手法にてGnT-Vの基質としての活性を評価した上で、腫瘍細胞と担癌動物を用いた実験から、インビボ画像診断薬剤としての展開を試みる予定である。また、本法の検出感度は蛍光法より約3倍高く、[^<125>I]

IPGMGによるGnT-V活性のin vitro測定の可能性が示された。一方、GnT-Vを遺伝子導入したWidr(大腸癌)細胞を用い、[^<125>I]IPGMGの取込み実験を行ったところ、本化合物は細胞膜透過性が低いことが明らかとなった。これは、リンカー部の炭素鎖数が細胞膜を透過する上での脂溶性の獲得に不十分であったためと考えられたことから、引き続き炭素鎖を伸長あるいは脂溶性を高める適当な置換基を導入した化合物を合成し、動態制御を達成することでI-123標識in vivo SPECT用放射性診断薬剤へと展開する。
細胞間相互作用による制御

本年度は最終年度であるので、なるだけ結論的な成果を出すことと、今後の問題点を明らかにすることに留意して研究を進めた。1.酵母において、α型特異的に性的凝集能を支配する遺伝子が第10番染色体上に存在することを明らかにし、この遺伝子がα型凝集物質の構造遺伝子である可能性を示した。また、この遺伝子の活性を調節する遺伝子を発見した。2.細胞性粘菌において、細胞接触なしに細胞分化を誘導する因子を発見し、この因子の精製に成功した。3.ヒトデの濾胞層崩壊の誘起には核の存在が不要であることを発見し、卵成熟促進因子の作用部位は細胞質中にあることを示した。4.複合ホヤの血漿中の非癒合反応誘導因子の生化学的研究を続行したが、結論を出すことは出來なかった。5.高等植物の組織内細胞で微小管が軸と直角方向にずれているのは力学的な細胞間相互作用によることを発見した、ジベレリンはこの相互作用から細胞を解放する作用があることを示した。6.エンドウの茎生長において、ジベレリンが子葉から茎への糖の転流を促進し、浸透ポテンシャルを低くして、茎生長促進を行う。7.マウスやニワトリを用い、モノクローナル抗体法により、ア種の【Ca^(++)】依存性細胞間接着分子を同定した、これらの中には、発生初期から発現しているもの、原腸陥入期に現われはじめるものがある。8.アフリカツメガエルにおいて、視中枢と強く結合するモノクローナルな抗体(A5)を用い、次の成果を得た。この抗体の認識する分子は細胞表面蛋白値である。この分子は視神経線維が脳内の視中枢を選択的に識別して、これと結合する際に最も重要な役割を果たす。
3倍体ニワトリを用いた動物の大きさを決める因子の探索

動物には、種固有の大きさがあるが、それはどのような仕組みで決まっているのであろうか。例えば5倍体イモリにおいては、細胞の大きさは1倍体の5倍の大きさであり、全体の細胞数は5分の1になり結果的に体全体や組織の大きさは変わらない。このことから、体の大きさを制御するための細胞分裂調節機構があり、単に細胞数や分裂回数を数えているのではなく、何らかの方法で実際に大きさを調整する因子が存在すると考えられている。この体の大きさを調節していると考えられる因子の探索の糸口として本研究では、異数体ニワトリに注目した。異数体ニワトリは、コルセミドを投与することによって、卵子の減数分裂に異常を起こし、2倍体卵子が精子と受精することによって3倍体の個体が作出されるものである。この3倍体ニワトリ個体の外見上の大きさは、他の異数体動物と同様に2倍体個体と変わらない。雌ニワトリにコルセミドを投与し、3倍体ニワトリの作出を行った。一方、3倍体ニワトリは間性となることが多いので、その生殖巣についての研究が比較的よく行われているが、われわれはTGF-βシグナル伝達を中心としたゴールデンハムスター精巣の機能・大きさの変化の機構解明を中心に研究を行った。まず細胞増殖の制御、動物の体の大きさに対し重要な役割を持つと考えられるTGF-βスーパーファミリーのシグナル伝達因子であるSmad3のクローニングを行った。また飼育室の点灯条件を変化させて人工的に萎縮させたゴールデンハムスター精巣においてSmadフアミリー、特にSmad2ならびにSmad3の発現や局在の変化についての解析を行ったところ、点灯条件変化によって精母細胞や精祖細胞における発現や局在の変化がみられ、TGF-βやアクチビンを介した精巣の機能や大きさの調節にSmad2ならびにSmad3が大きく関与していることが示唆された。現在、ニワトリにコルセミドを投与し、3倍体ニワトリの作出を行っている。また、3倍体ニワトリは間性となることが多いので、その生殖巣についての研究が比較的よく行われている。われわれはその予備実験として、TGF-βシグナル伝達を中心としたゴールデンハムスター精巣の機能・大きさの変化の機構解明を中心に研究を行った。まず細胞増殖の制御、動物の体の大きさに対し重要な役割を持つと考えられるTGF-βスーパーファミリーの新規シグナル伝達因子であるSmadのクローニングを行った。特に、このSmadは線虫において、その体全体の大きさを決定する遺伝子の一つである。また、Smadファミリーは近年細胞増殖、がん、発生などの分野において非常に注目されている因子である。また、ゴールデンハムスター精巣において日照条件の変化に伴うこのSmadファミリーの発現変化についての解析を行った。

また飼育室の点灯条件を変化させて人工的に萎縮させたゴールデンハムスター精巣においてSmadフアミリー、特にSmad2ならびにSmad3の発現や局在の変化についての解析を行ったところ、点灯条件変化によって精母細胞や精祖細胞における発現や局在の変化がみられ、TGF-βやアクチビンを介した精巣の機能や大きさの調節にSmad2ならびにSmad3が大きく関与していることが示唆された。
自閉症スペクトラム障害は双極性障害と関連しているか

1529歳の自閉症スペクトラム障害39名、双極性障害41名、健常対照52名を対象としてRorschach ink blot反応を検討した結果、前2者ともに健常対照と有意差を認めた項目は、純粋形態反応(pure F%)と動物運動反応(FM)であった、この両者の反応はAutism-spectrum Quotientと有意な相関を示した。また予備的に行ったdiffusion tensorimagingにて脳梁膨大部のfractional anisotropy値が双極性障害において他の2群よりも有意に低く、双極性障害と自閉症スペクトラム障害とが併存していると、さらに有意に低値となった。臨床的な印象は、自閉症スペクトラム障害と双極性障害は関連しているように見えることである。その根拠は、自閉症スペクトラム障害が双極性障害を併存することが多いこと、自閉症スペクトラム障害の第1度親族に双極性障害の者が多いことである。一見、関連性の乏しいように思えるこの2つの精神障害は遺伝の関与のきわめて高い精神障害を代表している。症候学的にも、病態生理学的にも、遺伝学的にも、両者を対象として検討することは困難かもしれないがやりがいのある仕事である。平成21年度は、金沢大学医学倫理委員会の承認のもと、金沢大学附属病院神経科精神科に通院中の自閉症スペクトラム障害、双極性障害の患者およびその第1度親族を対象に、平成22年3月末日時点で144名から研究参加の同意を得、強迫症状の評価法であるDimensional Yale-Brown Obsessive Compulsive Scale(DY-BOCS)を90名に施行し、人格評価法であるRorschach testを32名に施行し、Voxel Based Morphometryによる脳の体積測定にためのMagnetic Resonance Imagingの撮像を39名に施行した。なお途中経過であるが、DY-BOCSにより、自閉症スペクトラム障害と双極性障害において、強迫症状は多くに存在し、かつ強迫の対象が両障害で類似していることが示唆された。自閉症スペクトラム障害と双極性障害は、一卵性双生児における一致率の高い精神障害の上位2つを占め、遺伝の関与の高いことがうかがえる。臨床的に興味深い印象は自閉症スペクトラム障害が双極性障害を高率に併存すること、自閉症スペクトラム障害の第1度親族に双極性障害の者が多いことである。両者の関連性の有無の検討は遺伝学的および症候学的な観点から意義があるかもしれないと考える。平成22年度は、第一に、拡散テンソル画像を、自閉症スペクトラム障害20名、双極性障害24名、双極性障害を併存した自閉症スペクトラム障害4名、健常者18名から得た。双極性障害を併存した自閉症スペクトラム障害では、脳梁膝部と膨大部および上縦束の異方性比率が他の3群に比べ有意に低かったが、対象数が少ないので今後、増やしていく。第二に、人格検査であるロールシャッハ・テストは意味のないインクのしみが何に見えるか尋ねるものだが、何らかの認知テストととらえられる可能性がある。自閉症スペクトラム障害患者16名、双極性障害患者28名、健常者68名に施行した。今後は結果の3群間の比較、および同時に撮像した核磁気共鳴画像による脳体積の解析結果を加えた比較を行う。第三に、強迫症状を評価するために、次元別の評価法を、自閉症スペクトラム障害12名、双極性障害23名、双極性障害を併存した自閉症スペクトラム障害3名、健常者66名に行ったが、今後は対象者数を増やし、4群間の比較を行う。自閉症スペクトラム障害の第1度親族における双極性障害の頻度の算出は、研究計画の準備中である。
乳酸菌によるペプチド腸管送達系の構築と炎症性腸疾患治療への応用

遺伝子組換え乳酸菌は、有用なタンパク質を腸管へ運ぶことができる。一方、コレラトキシンBサブユニット(CTB)は、GM1ガングリオシドに結合し、腸管細胞内へ侵入する機能を持つ。本研究では、炎症性腸疾患(IBD)の治療薬として期待されるペプチドYVADを腸管へ運ぶために、CTBとYVADの融合タンパク質CTB-YVADを分泌する乳酸菌を作製した。そして、CTB-YVADがGM1ガングリオシドに対する結合能力、細胞内侵入機能、抗炎症作用を持つことを明らかにした。以上の結果は、乳酸菌とCTBを用いたペプチド腸管送達系の有用性とCTB-YVAD分泌乳酸菌がIBD治療薬となりうる可能性を示した。1. CTB-YVADはCaco-2細胞内に侵入する。Vibrio choleraeが産生するCTBは、上皮細胞の細胞膜に存在するGM1-gangliosideを介して細胞内に侵入する。そこで、CTB-YVADを曝露したCaco-2細胞からタンパク質を抽出し、抗CT抗体を用いたウエスタンブロットを行った結果、CTB-YVADがCaco-2細胞内に検出された。LPSにより炎症を誘発したCaco-2細胞の細胞内タンパク質をにおいて、CTB-YVADはcaspase-1の活性化を阻害した。また、caspase-1の活性化は、炎症性サイトカインinterleukin (IL)-1βの遊離を促すことから、LPSとCTB-YVADを曝露したCaco-2細胞の培養上清中のIL-1β量を測定した結果、CTB-YVADはLPSによるIL-1βの遊離を阻害した。以上のことから、L. caseiに分泌させたCTB-YVADは、上皮細胞内に侵入後、caspase-1の活性化およびIL-1βの遊離を阻害することで、抗炎症作用を示すことが明らかと成った。よって、CTB-YVADを分泌するL. caseiは、新たなIBD治療薬と成り得る可能性があると考えられる。本研究の目的は、caspase-1の活性化を阻害するYVAD(チロシン-バリン-アラニン-アスパラギン酸)をCholera Toxin B subunit (CTB)との融合体として分泌する乳酸菌を作出し、炎症性腸疾患(IBD)の治療薬として応用することにある。平成24年度は、大腸菌と乳酸菌のシャトルベクターpHIL253を作製した後、CTBおよびCTB-YVAD融合タンパク質を分泌するLactobacillus caseiを作出した。L. caseiに分泌させたCTBおよびCTB-YVADは、Vibrio choleraeが産生するCTBと同様に、GM1-gangliosideに結合することを確認した。さらに、CTB-YVADの生理活性を検討するために、培養上清からのCTBおよびCTB-YVADの精製を行った。L. caseiに分泌させたCTB-YVADがGM1-gangliosideに結合したことから、申請者の予測どおり、CTB-YVADは容易にヒトおよびマウス細胞内に侵入し、caspase-1の活性化を阻害できる可能性が高い。したがって、平成24年度の研究により、新たなIBD治療薬となり得る遺伝子組換え乳酸菌を作出することができた。本研究では、CTB-YVADの抗炎症作用を評価するために、Caco-2細胞においてLPSにより誘発されるcaspase-1の活性化、IL-1bの遊離を指標とする。また、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)の自由飲水により誘発されるマウス大腸炎の効果も検討する。平成24年度は、その前段階として、LPSのCaco-2細胞への曝露によりcaspase-1が活性化されることをその酵素活性を測定することで、IL-1bの遊離が増大することをELISA法を用いて確認した。さらに、DSSの投与により大腸炎を発症するマウスの作製に成功した。本研究の目的を達成するためには、「CTB-YVAD融合タンパク質を分泌する遺伝子組換え乳酸菌を作出する」、「精製したCTB-YVAD融合体タンパク質の抗炎症作用をin vitroで確認する」、「CTB-YVAD融合タンパク質を分泌する乳酸菌のIBDモデルマウスに対する治療効果を検討する」の3項目を実施する必要がある。本年度の研究により、それぞれの項目について、以下の結果を得ることができたため、おおむね順調に進展していると判断した。「CTB-YVAD融合タンパク質を分泌する遺伝子組換え乳酸菌を作出する」:GM1-gangliosideに対する結合能を有するCTB-YVADおよびCTBを分泌する遺伝子組換えL. caseiを作出した。「精製したCTB-YVAD融合体タンパク質の抗炎症作用をin vitroで確認する」:CTB-YVADおよびCTBを分泌する遺伝子組換え

L. caseiの培養上清からのCTB-YVADおよびCTBの精製に成功した。また、精製したCTB-YVADの抗炎症作用をin vitroで評価する前段階として、ヒト腸管上皮細胞株Caco-2にLPSを曝露することで、caspase-1の活性およびIL-1bの遊離が増大することを確認した。「CTB-YVAD融合タンパク質を分泌する乳酸菌のIBDモデルマウスに対する治療効果を検討する」:CTB-YVADを分泌する乳酸菌の治療効果を検討する前段階として、IBDモデルマウスを作製することに成功した。具体的には、6週齢の雄性C57BL/6Nマウスに5%デキストラン硫酸ナトリウムを7日間自由飲水させることで、体重減少、下痢、血便、大腸の短縮、腸管におけるミエロペルオキシダーゼ活性の増大、炎症性サイトカインの発現誘導を観察することができた。今後は、「精製したCTB-YVAD融合体タンパク質の抗炎症作用をin vitroで確認する」、「CTB-YVAD融合タンパク質を分泌する乳酸菌のIBDモデルマウスに対する治療効果を検討する」の2項目を実施する。「CTB-YVAD融合タンパク質を分泌する乳酸菌のIBDモデルマウスに対する治療効果を検討する」:平成24年度の研究成果により作製したIBDモデルマウスに、CTB-YVADを分泌する遺伝子組換えL. caseiを経口投与し、大腸炎が改善されるか検討する。次年度の研究費として、消耗品1,950千円を使用する予定である。具体的には、電気泳動やイムノブロッティング等に必要な一般試薬に200千円を、遺伝子組換え等に必要な制限酵素等の酵素類に200千円を、細菌や細胞の培養に必要な培地成分、血清等の培地類に300千円を、イムノブロッティングやELISAに必要な抗体類に300千円を、実験用マウス購入費用に200千円を、実験に必要なマイクロチューブ、チップ、培養器具類などプラスチック器具類に300千円が必要である。その他、学会発表を行うための旅費として100千円を、実験補助のための人件費として150千円を外国語論文の校閲費や印刷費などに、200千円を試算している。
歯周疾患の免疫学的診断法に関する総合的研究

歯周疾患関連細菌と病態との関係について細菌学的,免疫学的,遺伝子工学的に研究を行なった.私共は,歯周疾患患者の末梢血中の歯周疾患関連細菌に対する血清IgG抗体価を酵素免疫測定法(ELISA法)を用いて測定し、病態との関連性について研究してきた.今回,従来の測定法の処理能力を高めるために,測定法の改良を試みた.Porphyromonas gingivalis(P.g.),Prevotella intermedia(P.i.),Actinobacillus actinomycetemcomitans(A.a.),Fusobacterium nucleatumの4菌種に対する血清IgG抗体価を測定した結果,単位当りの処理数は約6倍となった.また,この改良法は比較的高い抗体価を示す血清のスクリーニングに有効であると考えられた.初診時と治療終了時の測定値を比較したところ,P.g.とP.i.の血清抗体価が有意に減少した.P.g.に対する抗体価の減少量と歯周外科処置の回数,治療期間,まちP.i.に対する抗体価の減少と喪失歯数の間に有意の相関が見られた.これにより,P.g.,P.i.の抗体価の減少は歯周治療の有効性を評価する指標になり得ることが示唆された.1988年から1989年までの2年間に測定した60名の患者の測定値と臨床指数との関連性について調べたところ,P.g.に対する抗体価とprobing depthおよび歯槽骨吸収率,A.a.に対する抗体価と歯槽骨吸収率との間に相関が見られた.この結果から,P.g.とA.a.が歯周炎の進行において重要な鍵を握る細菌であることが免疫学的に明らかになった.次に非放射性DNAプローブを開発して,P.g.とP.i.について十分な特異性と感度が得られた.調査して歯周炎患者全てからP.g.が検出され,probing depthとbleeding on probngと相関し,細菌学的にもP.g.が歯周炎の進行の鍵を握る細菌であることが明らかになった.P.g.の線毛遺伝子についてRFLP分析を行ったところ,バンドパターンの多様性が認められ,同一菌種でも病原性の強弱の違いを持つことの一因が線毛によることが示唆された.歯周疾患関連細菌と病態との関係について細菌学的,免疫学的,遺伝子工学的に研究を行なった.私共は,歯周疾患患者の末梢血中の歯周疾患関連細菌に対する血清IgG抗体価を酵素免疫測定法(ELISA法)を用いて測定し、病態との関連性について研究してきた.今回,従来の測定法の処理能力を高めるために,測定法の改良を試みた.Porphyromonas gingivalis(P.g.),Prevotella intermedia(P.i.),Actinobacillus actinomycetemcomitans(A.a.),Fusobacterium nucleatumの4菌種に対する血清IgG抗体価を測定した結果,単位当りの処理数は約6倍となった.また,この改良法は比較的高い抗体価を示す血清のスクリーニングに有効であると考えられた.初診時と治療終了時の測定値を比較したところ,P.g.とP.i.の血清抗体価が有意に減少した.P.g.に対する抗体価の減少量と歯周外科処置の回数,治療期間,まちP.i.に対する抗体価の減少と喪失歯数の間に有意の相関が見られた.これにより,P.g.,P.i.の抗体価の減少は歯周治療の有効性を評価する指標になり得ることが示唆された.1988年から1989年までの2年間に測定した60名の患者の測定値と臨床指数との関連性について調べたところ,P.g.に対する抗体価とprobing depthおよび歯槽骨吸収率,A.a.に対する抗体価と歯槽骨吸収率との間に相関が見られた.この結果から,P.g.とA.a.が歯周炎の進行において重要な鍵を握る細菌であることが免疫学的に明らかになった.次に非放射性DNAプローブを開発して,P.g.とP.i.について十分な特異性と感度が得られた.調査して歯周炎患者全てからP.g.が検出され,probing depthとbleeding on probngと相関し,細菌学的にもP.g.が歯周炎の進行の鍵を握る細菌であることが明らかになった.P.g.の線毛遺伝子についてRFLP分析を行ったところ,バンドパターンの多様性が認められ,同一菌種でも病原性の強弱の違いを持つことの一因が線毛によることが示唆された.ヒト歯周炎は早期発症型と成人型に大別されるが、前者は若年期に発症し年齢の割には重篤な組織破壊を伴うことから、その病因の解明及び診断法の確立が望まれている。現在までの私達の研究からも、歯周ポケット内に存在する歯周疾患関連細菌が重要な病因であることが確認された。しかし、従来から用いられている細菌学的方法による検出では、かなりの時間を必要とするために、臨床において実際に利用し難いものであった。そこで、従来の細菌学的方法に代わり得る方法として、細菌のDNA自身を用いて特定の細菌を同定するプロ-ブが開発されてきた。私達は、この研究において非放射性で免疫化学的方法によるDNAプロ-ブを考察した。従来の方法の多くはDNAを放射性物質によりラベリングするもので、このことがDNAプロ-ブ法による細菌の同定法の使用を妨げてきた。今年度、私達は非放射性DNA

プロ-ブを用いたB.gingivalis(B.g.).B.intermedius(B.i.).A.actinomycetemcomitans(A.a)などの歯周疾患関連細菌の同定の可能性についての基礎的研究を行った。私達が考察したDNAプロ-ブは、DNAのシトシン基をスルホン化し、これに対する特異的な抗体を用いて、免疫化学的に標的細菌を検出するものである。その結果、B.gingivalisとB.intermediusについては十分な特異性と感度が得られ、臨床応用の可能性が示唆された。さらに、現在までの私達の研究により確立されてきた歯周疾患関連細菌に対する患者血清抗体価のELISA法による測定を、より精度の良い方法とし、生体応答性の違いを明かにするために、B.gingivalisの主要免疫抗原の性質についての検索を行った。その結果、B.gingivalisの主要免疫抗原は主に蛋白質と考えられたが、非蛋白質物質の関与も示唆された。これらの研究により、歯周疾患関連細菌の同定が簡易化され、生体側の抗体産生機構がより明らかにされると考えられた。歯周ポケット内の細菌は歯周疾患の発病と進行に深く関与していると考えられている.その中でもPorphyromonas gingivalis,Actinobacillus actinomycetemcomitansなど数種の細菌は種々のビルレンス(病原因子)を保有し,歯周病原細菌として,特に注目されている.私共の教室では7年前から,ELISA法によってこれら歯周病原細菌に対する患者血清IgG抗体価の測定を行なってきた.今回,従来の測定法を迅速かつ検体処理能力の高いものとすることを目的として測定法の改良を試みた.標準血清を連続希釈して標準血清曲線を描き,全ての被験血清はこの標準曲線上に乗るものとして,単一希釈した被験血清からその抗体価を算出した.24名の患者血清について,P.gingivalis,Prevotella intermedia,A.actinomycetemcomitansおよびFusobacterium nucleatum4菌種に対する抗体価を10回ずつ測定した結果,改良した測定法では測定時間は短縮できなかったが,単位時間当りの検体処理数が約6倍に改善された.しかし,比較的抗体価が低い場合は今までの抗体価より高く算出される為,改良型血清抗体価測定法は比較的高い抗体価を示す血清をスクリ-ニングする際には有効であると考えられた.次に,中等度から重度の歯周炎患者の初診時と,activeな治療が終了した時点での7種の歯周病原細菌に対する血清IgG抗体価をELISA法で測定し,治療による歯周炎の治癒が血清抗体価に及ぼす影響を検討した.
地域保健活動はどのように住民の健康に寄与したのか？―島根モデルの歴史的変遷を例に

本研究は,島根県独自の地域保健活動(疾病予防活動)の歴史的変遷を明らかにすることである。島根県の地域保健活動は大別すると,戦後以降、島根県の疾病予防活動の中核をなしてきた「脳血管疾患の死亡率の低下を目指す時期」,「健康づくりのためのまちづくりを目指す時期」,「互助組織が主体となり地域住民が主体となる時期」の3つの時期区分に分かれている。昨年度は、戦後から現在にわたる島根県内の地域保健活動に関する文献や報告書,保健統計資料を用いた文献調査を実施した。県独自の地域保健活動を行う経緯のひとつは,戦中に開校された社会保健婦養成校にあると指摘できる。島根県は全国と比較しても保健婦養成に力点を置いた教育を行っていた。学生の就学環境や養成期間,保健婦養成の中核となる科目だけでなく,充実したカリキュラムが実施されていた。卒業生らの半数は国保保健婦や保健所保健婦として県内に就職するか,教育者として養成校に勤務しており,当初の教育を引き継ぐ形で人材育成が行われていた。また,保健統計資料や当時の活動資料を考察するに,島根県民の脳血管疾患の死亡率の低下を主として疾病予防対策事業が実施されていたが,同時期に市町村ごとの疾病傾向調査を実施していた。戦後以降も,県独自に患者調査や健康意識調査が頻繁に実施されており,当時の地域住民の健康問題や疾病状況を調査していたことがわかる。当時、国家事業であった脳卒中特別対策事業を契機として,保健所と市町村自治体が連携し,地域独自の保健活動がより広範囲に実施されるようになったことが明らかになった。これらの研究成果は,申請者の所属する学会や研究会等で報告された。研究計画に基づき,初年度の課題は戦後から現在にわたる既存資料を用いた文献調査が主であり,昨年度はその研究課題に従事することができたと評価できる。また,関係者への予備的なインタビュー調査から戦中の保健婦養成が島根県の独自性として言及され,養成校における人材育成という新しい視点から検討することができた。ただし,これらの文献や資料は,当時の関係者が個人で所蔵しているものが大半であり,限られた期間で文献を収集することに限界があった。したがって,本年度も引き続き,文献の収集及び内容分析を実施する。加えて,初年度は地域住民が参加する研究会において,本研究の知見を一部報告し,直接的に意見交流の場を設けることができたことは評価に値する。本研究の特色として,島根県の地域保健活動に基づく知見を地域住民に還元することも重要であると考える。初年度は文献や報告書の収集と分析を実施することを主としていたが,地域での保健活動の実施に社会保健婦養成校における人材育成という背景要因がみられ,新しい観点を導入するに至った。来年度も引き続き,文献の収集と内容分析を行い,研究成果を報告する。また、来年度も継続して,当時の関係者へのインタビュー調査を実施する。当時の地域保健活動の詳細と人材育成の両側面から,地域保健活動における島根県の独自性がどのように構築されたのかを明らかにすることを目指す。本研究課題の中核をなす地域住民の健康指標を用いた分析は,本年度の実施を予定していたが,既存の文献資料を検討する中で,初年度のうちに一部を分析した。その結果,地域住民の脳血管疾患死亡率の低下は,健康なまちづくりを形成する時期にあたることを示した。本年度は,この時期に実施された活動の焦点を当て,詳細な分析を実施する予定である。死亡率の低下と地域で実施された疾病予防活動の関連性を議論する。さらに,本年度はカルガリー大学(カナダ)のTurin教授の研究室を訪問し,健康課題を解決するプロセスに関する研究の方法論的示唆をいただく予定である。

また,関係者への予備的なインタビュー調査から戦中の保健婦養成が島根県の独自性として言及され,養成校における人材育成という新しい視点から検討することができた。ただし,これらの文献や資料は,当時の関係者が個人で所蔵しているものが大半であり,限られた期間で文献を収集することに限界があった。したがって,本年度も引き続き,文献の収集及び内容分析を実施する。加えて,初年度は地域住民が参加する研究会において,本研究の知見を一部報告し,直接的に意見交流の場を設けることができたことは評価に値する。本研究の特色として,島根県の地域保健活動に基づく知見を地域住民に還元することも重要であると考える。初年度は文献や報告書の収集と分析を実施することを主としていたが,地域での保健活動の実施に社会保健婦養成校における人材育成という背景要因がみられ,新しい観点を導入するに至った。来年度も引き続き,文献の収集と内容分析を行い,研究成果を報告する。また、来年度も継続して,当時の関係者へのインタビュー調査を実施する。当時の地域保健活動の詳細と人材育成の両側面から,地域保健活動における島根県の独自性がどのように構築されたのかを明らかにすることを目指す。本研究課題の中核をなす地域住民の健康指標を用いた分析は,本年度の実施を予定していたが,既存の文献資料を検討する中で,初年度のうちに一部を分析した。その結果,地域住民の脳血管疾患死亡率の低下は,健康なまちづくりを形成する時期にあたることを示した。本年度は,この時期に実施された活動の焦点を当て,詳細な分析を実施する予定である。死亡率の低下と地域で実施された疾病予防活動の関連性を議論する。さらに,本年度はカルガリー大学(カナダ)のTurin教授の研究室を訪問し,健康課題を解決するプロセスに関する研究の方法論的示唆をいただく予定である。申請時の研究計画には当時の関係者へのインタビュー調査を初年度に実施すると記載していたが,初年度は文献調査と次年度に実施する予定であった保健統計を用いた分析に従事したため,研究計画を一部前後して実施した。初年度,インタビュー調査にかかる人件費や謝金,逐語録作成のための業者委託費,旅費等を繰り越している。該当箇所にあたる費用等は,本年度に実施する予定である。また本年度は,本研究課題の国際協働の一部として,申請者はカルガリー大学のTurin教授の研究室を訪問する予定である。Turin教授は,公衆衛生学分野において地域における健康課題の検討するための実践法を研究しており,本研究課題に関する新しい知見が提供されると考える。Turin教授の研究室を訪問し,研究に関する意見交換を行う。それにかかわる諸経費を計上する予定である。
モノクローナル抗体を利用した消化器癌の新しい診断と治療の研究

本研究によりヒト/マウスキメラ抗体の開発に成功し、そのFab分画とネオカルチノスタチンとの複合体を合成した。本複合体は臨床的に第一相試験を完了し、その安全性と、Human Anti-Mouse Antibodyの産生が抑制されることが証明された。また、微少転移巣に対する免疫複合体の効果を検討するために、ヌードマウス移植ヒト胃癌で腹膜播種モデルを作成した。再現性の良好な、ヒト腹膜播種に類似したモデルの開発に成功した。これを用いて、キメラ抗体と抗癌剤ネオカルチノスタチンとの複合体による治療実験を行ったところ、ネオカルチノスタチン水溶液より優れた効果が得られた。また、腹腔内投与によりネオカルチノスタチン水溶液では腹膜の癒着が強く起こったが、複合体では癒着は軽度であり、臨床応用する上で有利と考えられた。抗体に微少鉄を結合する事に成功した。その活性が完全に残されていることを実験的に証明した。微小鉄標識抗体によるImmuno-guided surgeryは、まだ臨床応用には至らなかったが、ヌードマウス移植癌におけるMRIを用いたイメージングに有用であることが明らかになった。以上、本研究により抗体の臨床応用への道が大きく開けたと考えている。今のところ臨床試験の実施が困難な状況にあるが、新しいGCPへの対応が確立した時点でさらに本研究の進展することが期待できる。1.計測装置を利用して、選択的に転移リンパ節を郭清することによる神経温存手術が可能か検討した。その結果、現在使用している機器では、リンパ節の微小転移まで検出することは困難であったが、腫大したリンパ節に関しては検出可能であり、神経温存に役立つものと考えられた。比較的小さなリンパ節の転移の検出にはさらに機器の改善が必要と考えられた。2.標識抗体の投与経路をリンパ節内投与や動注にすることで、静脈内投与例と比較してより感度が高くなった。特に、リンパ節内投与により抗体の到達性は大幅に改善された。また、術前に病巣の周囲に局注する事で、所属リンパ節にも効率よく標識抗体が移行することが明らかになった。3.標識の核種を^<125>Iから^<111>Inに変えることにより、その感度が改善された。微小磁性鉄標識抗体のMRI画像診断への応用(大辻) :以前使用した磁性鉄は粒子径が大きく(10nm)、精製の段階での回収率の低下、網内系への取り込みの増加などが見られたため、今年度はより粒子の小さい磁性鉄(100Å)を抗体に結合させ検討した。その結果、やや抗体の結合活性に低下がみられたものの、ほぼ臨床使用に耐えうる標識抗体が合成できた。キメラモノクローナル抗体結合抗癌剤(chA7-NCS)の腹膜転移治療への応用(山口、北村) :ヒト大腸癌株WiDrをヌードマウスに移植し、3日後に複合体を投与し、複合体の腹腔内より血液中への移行速度の計測、腹膜転移巣への複合体の集積率、移転病巣の数を計測した。その結果、複合体は腹腔内に投与しても12時間後にはほぼ血液中に吸収されること、腹膜転移巣への集積は血液内濃度の約10倍になること、また複合体投与により腹膜転移巣の形成が著明に抑制されることが明らかになった。消化器癌補助化学療法への応用(高橋、北村) :キメラモノクローナル抗体と抗癌剤NCSの複合体を再発大腸癌患者10例に投与し、第一相試験を行った。その結果、NCSにして40000単位までは安全に投与可能であることが明らかになった。なお一部に部分寛解が得られた。複合体投与による副作用の検討(北村) :ChA7-NCSの最も懸念される副作用は腎障害である。ラットを用いた毒性実験において、chA7-NCS投与例はNCS単独投与例に比し、高容量投与においても、腎障害は少なかった。

臨床例においても、chA7-NCS投与例では、NCS単独投与例に比し、NCSの尿中への移行が緩徐であり、腎障害が少なかった。複合体投与例におけるHuman Antimouse Antibody (HAMA)の産生を計測したところ、マウス抗体投与例に比し、HAMAの産生が少なかった。放射性同位元素標識抗体や抗体分画による癌の画像診断について臨床的に比較検討した結果、最も病巣の描出が良好であったのはwhole抗体とF(ab`)2であった。一方、正常組織への非特異的取り込みの最も少なかったのは、ヒト/マウスキメラ抗体であった。総合的にはF(ab')2が最もイメージングに適していると考えられた。微小鉄標識抗体によるImmuno-guided Surgeryは、まだ臨床応用には至らなかったが、ヌードマウス移植癌におけるMRIを用いたイメージングに有用であることが明らかになった。また、微小転移巣に対する免疫複合体の効果を検討するために、ヌードマウス移植ヒト胃癌で腹膜播種モデルを作成した。再現性の良好な、ヒト腹膜播種に類似したモデルの開発に成功した。これを用いて、キメラ抗体と抗癌剤ネオカルチノスタチンとの複合体による治療実験を行ったところ、ネオカルチノスタチン水溶液より優れた効果が得られた。また、腹腔内投与によりネオカルチノスタチン水溶液では腹膜の癒着が強く起こったが、複合体では癒着は軽度であり、臨床応用する上で有利と考えられた。
視覚的特徴の乏しい物体の検出を可能にする特徴量の探索と原虫類種同定への応用

本研究では寄生虫由来の疾患が発生した際に患者の資料に対する顕微鏡写真中に見い出される原虫類を検出してその種を識別し、寄生虫由来の疾患に対する事例に関する経験が十分でない医療関係者に対してその識別結果を提供することにより確定診断に必要な情報提供を支援する技術並びにシステムの確立を目指すものである。本研究では原虫類を対象として、顕微鏡写真画像より虫体領域を分割し、その種を識別するための画像特徴量の探索と検出、識別技術の確立、並びにこれら手法を検討、実装し検証する際に必要となる寄生虫情報データベースの拡充を実施した。まず、寄生虫情報データベースの拡充に関しては、各腸管寄生原虫の形態的評価のベースとなる分類を確立するため、分子疫学的調査・研究を実施した。その分類調査の過程で、インドネシアおよび日本の野鼠に分布するブラストシスチスを遺伝子レベルで評価し、その種内多型における位置づけを明らかにした。また、インドネシアに分布するレトルタモナスをヒトおよびヒトと密接に関係するイヌ、豚、牛などのほ乳類から検出し、脊椎動物由来のレトルタモナスに存在する遺伝子型から分類を明らかにし、さらには、非病原性と考えられてきたハルトマンアメーバが病原性を保持する可能性などが明らかとなった。顕微鏡画像を入力とした虫体領域の認識、種の識別に関しては、これまで構築した寄生虫情報データから虫体領域を教師データとして切り出し、それをResNetを改良したネットワークに学習させることにより、スケール、形状、染色法の違いによる影響を受けにくい領域分割を実現した。領域分割処理の後には局所特徴量をスケールごとにクラスタリングし、スケールごとに局所特徴を求めてそれに基づき種の識別を行うことにより従来法と比較してより高い種の識別精度を達成した。顕微鏡画像を対象とした虫体識別処理に関して、本課題実施前の調査段階では虫体領域を入力画像より主観判断により領域分割したものに対して局所特徴量表現に基づく識別処理の有効性を調査してきた。そのため本年度はまず、虫体の大域的特徴表現、すなわち外部形状をHOG特徴量の2次元マトリクスとして表現し、そのスケールとアスペクト比を変化させつつ画像上での探索領域をシフトさせながら評価関数により適合度を測り虫体領域を検出するアルゴリズムを実装した。虫体領域検出後、その内部領域に対しては、式操作に関する特徴量は虫体識別に対する有効性が高くないため、空間周波数の視点から特徴づけることを検討し、フーリエ変換、ハイパスフィルタ処理の後、主成分分析を適用することにより局所的特徴を表現するアルゴリズムを設計し、実装した。上記手法をシストイソスポーラ等8種の原虫類画像に対して適用したところ、ほとんどの事例に関して本課題実施前の予備調査段階を上回る検出精度を得ることができた。寄生虫データベースの構築、整備に関しては、臨床検査及びインドネシア、アフリカでのフィールドワークの際の寄生虫顕微鏡検査において、各種寄生虫の画像および遺伝子を収集した。具体的には、臨床検査では、シュードテラノバ(腸管外アニサキス症病理画像)、口腔トリコモナス、ジアルジア(ランブル鞭毛虫)、腟トリコモナス、戦争イソスポーラの新規画像とDNAデータをセットで収集した他、フィールドでは、大腸バランチジウム、エンテロモナスについて新たなデータセットの収集をおこなった。これらのサンプルのうち、シュードテラノバについては、英文と和文で、また、口腔トリコモナスについては和文で論文発表した。虫体分割処理に関しては、虫体以外の背景のコントラストが低い状況や、背景中の他物体が相対的にアウトフォーカスである場合には良好に虫体を分割で来ている。しかしながら、虫体が他の細胞等と重なっている場合、空間周波数の観点からの局所的特徴に大きな差が表れない事例もいくつか判明しており、その理由の分析と精度向上のための改善手法の検討を進めている。虫体領域分割処理後の種の識別処理に関しては、SVMを始め4種類の判別アルゴリズムによる識別精度の違いについて評価実験を進めており、本課題で対象とするような、視覚的特徴が相対的に乏しい対象物に対する識別精度の優劣を評価した。これらに加え、深層学習により種の識別に有用な特徴量の抽出と、その特徴量に基づいて種の識別処理を実行する手法の優劣についても調査を進めている。寄生虫情報データベースの構築整備に関して、臨床およびフィールドワークでの画像取得は順調に進行している。一方、これまで分子同定によって種鑑別を実施し、なおかつ培養株が成立している腸トリコモナスとレトルタモナスについては、共焦点レーザー顕微鏡を用いたZスタック画像取得のために、蛍光抗体染色の最適化を開始した。

顕微鏡画像を入力とした虫体領域の認識、種の識別に関しては、これまで構築した寄生虫情報データから虫体領域を教師データとして切り出し、それをResNetを改良したネットワークに学習させることにより、スケール、形状、染色法の違いによる影響を受けにくい領域分割を実現した。領域分割処理の後には局所特徴量をスケールごとにクラスタリングし、スケールごとに局所特徴を求めてそれに基づき種の識別を行うことにより従来法と比較してより高い種の識別精度を達成した。虫体検出処理に関しては、大域的特徴として虫体の外形をHOGのマトリクスとして表現しているが、部分的に微小な形状特徴の相違がある虫体間の識別を大域的特徴量表現のレベルで可能とするよう、特徴量表現法の改良を検討していく。また、虫体のスケールに関する一貫性を制約とすることにより、局所特徴量が類似している対象虫体以外の背景物の誤検出を抑制する処理についても検討する。虫体識別処理に関しては、現在は空間周波数に関する局所特徴量を画一的なハイパスフィルターを適用した後にクラスタリングして得ているが、空間フィルタの適用方法やそれに伴うクラスタリングのアルゴリズムを改善するとともに、深層学習による特徴量抽出と、それに基づく虫体分割、識別処理の有用性や、上記処理との統合についてさらに研究を進める。虫体情報データベース構築関連では、培養株や固定サンプルをZスタック画像としてZ軸方向の多数画像で撮影し、従来の画像取得では十分に考慮されてこなかった、フォーカス位置の違いによる虫体の視覚情報の変化を考慮した画像処理による認識精度の改善を図れるようにする。そのために、共焦点レーザー顕微鏡による蛍光画像の他、微分干渉像などについても画像取得を進め、様々なモードによる画像データの充実を図る。購入機器、消耗品の実購入額が当初予定よりも安価に購入可能であったことと、予想した数量よりもやや少なめであったことによる。次年度は画像データ等の取得が当初予定以上に順調に進むことが見込まれるため、次年度ではそれに対応するための消耗品等購入並びに国際共同研究相手方との打ち合わせのために使用予定である。