hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
代数幾何学と構造学習理論に基づく周辺尤度と汎化誤差のモデル評価法の相違の解明

本研究課題は統計学および機械学習において自由エネルギーと汎化損失を基づいてモデルや事前分布を評価する方法の相違を解明することが目的である。2018年度には次の二つの研究成果が得られた。(1)自由エネルギーはベイズ法を用いた仮説検定の最強検定を与える統計量であるが、帰無仮説が対立仮説の特異点に相当するときの定数部の漸近挙動は解明されていなかったため統計的検定に応用することができなかった。本研究では混合正規分布において1個の正規分布を帰無仮説とし2個の正規分布の混合を対立仮説とする検定においてその定数オーダーの部分が従う確率分布を導出し、統計的検定の基礎を構成した。(2)一般にサンプルから汎化損失を推定するための方法としてクロスバリデーションと情報量規準があるが、事前分布のハイパーパラメータを変化させたときのそれらの量の挙動はデータの数をnとするとき高次のオーダーであり、nの二乗に反比例するため正則な場合においても理論的な解明がなされていなかった。本研究では、ハイパーパラメータを変化させたときの汎化損失・クロスバリデーション・情報量規準WAICの挙動を正則な場合に理論的に考察し、高次のオーダーを与える公式を導出した。その結果、平均値については高次のオーダーにおいても3つの量が等価であることが解明された。また確率変数としてクロスバリデーションと情報量規準WAICが等価であることも解明された。さらにクロスバリデーションと情報量規準WAICを最小化するハイパーパラメータは平均汎化損失を最小にするパラメータに収束するが、平均汎化損失を最小化するハイパーパラメータは確率変数としての汎化損失を最小化する値に収束するとは限らないことが解明された。数値実験によりハイパーパラメータを最適化する際には情報量規準WAICのほうがクロスバリデーションよりも分散が小さいことが多いことを確認した。混合正規分布の検定に使われる自由エネルギーの定数オーダーの確率変数の挙動が解明できた。また正則な場合に、また汎化損失、クロスバリデーション、情報量規準WAICがハイパーパラメータの関数としての挙動が解析でき、ハイパーパラメータを最適化することで生じる現象が解明できた。自由エネルギーの定数部が従う確率分布について、さらに詳しい解析をすすめる。汎化損失、クロスバリデーション、情報量規準WAICについてこれまでに解析されてこなかった統計モデルや機械学習のモデルへの応用を検討する。統計学および機械学習において用いられている確率モデルや事前分布の適切さを合理的に評価する量として汎化誤差と周辺尤度が知られている.汎化誤差は予測を行う時の誤差の大きさであり、周辺尤度は確率モデルと事前分布の尤度を表している.我々はこれまでの研究において、事後分布が正規分布で近似できない場合であっても汎化誤差と周辺尤度を求めることができる公式を代数幾何学的な理論を構築することにより導出してきた.汎化誤差と周辺尤度はどちらも大切な量であるが、事後分布が正規分布で近似できる場合であっても、その数学的な性質は大きく異なることが知られている.本研究では,事後分布が正規分布で近似できない場合における両者の違いを数学的に解明し,現実の確率モデルの評価に適用できるようにすることを目的としている.平成27年度には次の研究を行った.まず,クロスバリデーションとWAICとを用いて事前分布を最適化した場合に,最適化された事前分布は平均汎化誤差および汎化誤差を漸近的に最小化するかという問題を研究し,次の結論を得た.クロスバリデーションおよびWAICによる事前分布の最適化は漸近的に等価であり,平均汎化誤差を漸近的に最小化するが、確率変数としての汎化誤差を最小にはしない.次にレプリカモンテカルロ法を用いて対数周辺尤度を求めたとき,その値の真の値からのずれにはどのような性質があるかという問題を研究し,次の結論を得た.対数周辺尤度の数値の精度は代数幾何学的な方法で真の値を求めることで計算することができ,モンテカルロパラメータ数の平方根に逆比例し,レプリカ温度数の指数乗に比例する.研究実績の概要で述べたように,汎化誤差および周辺尤度の挙動について基本的な性質が解明できた.統計学および学習理論の実問題への応用においては、それに先立って、データを発生している真の分布、パラメータが与えられたときの統計モデル、およびパラメータの事前分布の三つ組が与えられたときの、自由エネルギーと汎化誤差の挙動をあらかじめ解明しておくことが必要になる。このうち自由エネルギーの漸近展開の主要項であるlog nの係数(nはデータの個数)は実対数閾値であり、汎化誤差の平均値の漸近展開の主要項である(1/n)の係数は特異揺らぎであるが、実対数閾値と特異揺らぎは、パラメータの空間を双有理変換しても変化しない双有理不変量であることが知られている。データが与えられたときに適切なモデルを選ぶ方法として自由エネルギーの最小化を行なう方法と汎化誤差の期待値を最小化する方法があるが、それらの方法は統計学的に異なる選択を与える規準であり、その選択法の相違を明らかにすることが本研究の目的である。平成28年度は、(1)統計モデルのパラメータ集合がユークリッド空間全体ではなく、個々のパラメータが非負であるという制限における実対数閾値がどのような挙動を持つかの解析を行なった。

観測の結果としてデータから得られる行列を成分が非負の行列の積で表すことは非負値行列分解と呼ばれている方法であるが、非負値行列分解においては、パラメータに制限がない場合の行列分解よりも一般には実対数閾値が大きくなることを明らかにしその上界を与えた。またマルコフ連鎖モンテカルロ法による事後分布の近似により上界の確認を行なった。(2)事前分布として多くのパラメータがゼロになりやすいものを用いて不要なパラメータを消去する方法はスパース推定と呼ばれているが、スパース推定の実対数閾値をハイパーパラメータの関数として導出した。(1)自由エネルギーと汎化誤差の挙動について従来はパラメータについて実質的な制限がない場合が研究されていたが、パラメータの制限が推測結果に影響を及ぼす場合における実対数閾値の挙動が解明された。行列の非負値分解は実問題への応用が多く研究報告されている一方でその理論的な精度については解明されていなかったが、本研究により精度解明がなされた。パラメータ集合に制限がない場合には統計モデルと真のモデルのランクのみに依存するが、制限がある場合にはランクだけでは定まらない値になることが分かった。(2)またスパース推定におけるハイパーパラメータが実対数閾値に及ぼす影響を明らかにした。スパース推定のようにハイパーパラメータの変化が自由エネルギーや汎化誤差の主要項に影響を及ぼすモデルでは、そうでなくモデルよりもハイパーパラメータ設計の方法はより重要な意味を持っていることが明らかになった。神経回路網や混合正規分布のように階層的な構造を持つ学習モデルは、パラメータと確率分布との対応が一対一ではないため統計的に正則なモデルではなく、学習誤差や汎化誤差の挙動が解明されていなかったが、近年、代数幾何学を基盤とした新しい理論の構築により正則でないモデルも含めて扱うための方法が確立された。本研究においては、統計的学習においてモデルの評価に用いられる自由エネルギーと汎化誤差およびその推定法の数学的な相違と実問題への適用における差を双有理幾何学の観点から解明することを目的とする。平成29年度の研究においては次のことを解明した。(1)汎化誤差の推定量である交差損失と情報量規準WAICの違いを解明した。入力Xから出力Yへの条件つき確率の推定において交差損失が汎化損失を推定できるためにはXとYの同時確率の独立性が必要になるが、一方、情報量規準はXが与えられたときのYの独立性の条件があれば適用することができる。これは情報量規準のほうが交差損失よりも広い問題に適用できることを意味している。同時確率が独立である場合には両者は漸近的に等価であるが、そうでない場合には情報量規準のほうが汎化誤差の推定に広く利用できることが明らかになった。また交差損失と情報量規準の値に大きな差がある場合には、データにおけるXの独立性が保証されないということもわかった。(2)これまで汎化誤差や自由エネルギーの挙動が解明されていなかった非負値行列分解の実対数閾値の上界を代数幾何学的な方法で解明し、数値実験により上界の精度を検証した。これにより非負値行列分解における自由エネルギーと汎化誤差の値を知ることが可能になり、モデル選択やモデルの検定を合理的な形式で行うことが可能になった。汎化誤差の漸近的に不偏な推定量である交差損失と情報量規準の理論的な相違について、それぞれを適用するための数学的な条件の違いが解明がされた。教師あり学習および回帰分析は機械学習と統計学において実務上しばしば利用される問題であるが、交差損失と情報量規準の数理的な違いを用いてモデルの診断
植物遺伝資源の経済的財産権に関する理論的・実証的研究

スイスの経済学者バーゼルは、財産権を国家が個人に与える法的財産権とある財産の価値を享受する能力としての経済的財産権とに分類した。本研究は、このバーゼルの財産権に対する考え方を手掛かりとして、遺伝子組換え(GM)作物をめぐる法的財産権と経済的財産権に着目した。GM作物に対し法的財産権である特許保護が認められたとしても、GM作物が植物である以上、その利用と管理には価格に反映されない公共領域が存在するという前提に立ち、米国とカナダで係争された判例分析に依拠し、GM作物に対する特許保護は、その範囲が植物としての機能にまで及ぶ場合は、種子再利用という経済的財産権に影響を及ぼすことを明らかにした。平成25年度においては、遺伝子組換え作物をめぐる特許保護と農民特権の問題について、米国およびカナダで係争された裁判の判例を分析し、生命特許を巡る知的財産権保護制度の史的展開とそれが開発者と使用者間の利益配分に与える経済的インパクトを考察した。その成果として、遺伝子組換え作物に対する知的財産権保護については製品としての手段的価値と植物としての固有価値との衝突が生じていることが明らかになった。当該年度に行った判例分析の結果では、米国で出された最新の判決結果をみても、遺伝子組換え作物については製品としての手段的価値が重視され、種子の保存、再播種、近隣農家との交換、非市場価格による販売といった植物としての固有価値に基づく使用が抑制されてきている。これは、遺伝子組換え作物が植物という生物でありながらも、製品に対する特許保護を植物にも拡大するというアプローチが主流になっている証左である。このような傾向にあって、本研究は「生物特許」という従来の特許保護制度では扱うことが困難な問題について結論を出すべく研究を進めている。今後の研究においては、「生物特許」というコンセプトについて、製品や製造工程を対象とした従来の特許保護制度を植物にまで拡大するという現在主流となりつつある考え方を批判的に検討し、遺伝子組換え作物が植物としての固有価値を有する点を考慮した「調和的な」生物特許制度の在り方を本研究の結論として示したい。上記の研究成果については、平成26年3月に、植物遺伝子に対する特許保護制度の多様性に関する論文をスイスのKyklos誌に投稿し、現在査読結果を待っているところである。また、遺伝子組換え作物をめぐる特許保護と農民特権をテーマとした論文を現在執筆中であり、平成26年度に本研究の集大成として海外のジャーナルに投稿予定である。本研究は、遺伝子組換え作物をめぐる特許保護と農民の権利の衝突に着目し、国家が開発者に与える法的財産権ではなく、資源や製品が有する価値を享受する能力と定義される「経済的財産権」という視点から遺伝子組換え作物の財産権制度を考察する理論的・実証的研究である。そして、本研究は、遺伝子組換え作物に対する特許保護が当該作物の有する経済的財産権ー農民による種子の貯蔵、次期における再播種、近隣農家との交換、市場価格より低い価格での販売等の「農民の権利」に関する諸行為ーに与えるインパクトを定量的かつ定性的に明らかにすることを到達目標としている。今年度の研究においては、当該テーマに関する研究の方向性を整理するために、文献サーヴェイにより理論的研究における論点整理を行った。その結果、次の3つの仮説を導出した。元来公共財としての性格を有する植物遺伝資源(種子)にまで特許保護の範囲が拡大されたことは、新薬や遺伝子組換え作物にみられるように当該資源の価値増加という「市場メカニズム」に由来するのか、あるいは国家と特許申請者の「権力」によるものなのかが当該研究においては中心的な論点となること。特にインドにおいては、2005年の特許法改正により、従来は生産工程に限定されていた植物遺伝資源に対する特許保護の範囲を遺伝子組換え作物のような製品にまで拡大したことにより、特許保護を有する遺伝子組換え作物(綿花)が急激に普及したこと。遺伝子組換え作物の世界規模での拡大は、特許権という法的財産権により遺伝子組換え作物の「製造物」としての性格を保護することに依拠しているが、その反動として「植物」としての遺伝子組換え作物が有する「経済的財産権」、即ち農民の権利に対する保護運動も同時に拡大すること。今年度(平成25年度)以降の研究においては、データ分析とケーススタディにより上記3つの仮説を検討する。本年度の研究成果としては、テーマである「遺伝子組換え作物をめぐる知的財産権と種子の再利用」について、これまでの判例研究に基づく法的責任に関する考察に加え、今日注目を集める社会的責任の視点へと研究の視野を拡大したことにある。これまでの判例研究から、遺伝子組換え作物に対する特許保護の所有企業は、その使用者ばかりでなく、当該種子が自生した農家に対しても遺伝子組み換え種子の再利用をめぐって裁判を繰り返してきた。種子の再利用は、特に小規模農家を中心として伝統的に行われてきたいわば慣行である。

また、遺伝子組換え作物に対する特許保護の適用範囲が、組換え遺伝子が有する特殊な機能に限定されるのか、あるいは植物全体に及ぶのかという論争がある。今年度行った判例研究では、遺伝子組換え作物に対する特許保護は、機械本体と部品の関係同様に、植物全体に及ぶという判決が主流であることを明らかにした。また、遺伝子組換え作物が自生した農家が逆に特許所有者の企業やそれを栽培する近隣農家を訴える判例が増加していることに着目した。特に、それが自生した農家が有機作物栽培農家であった場合、有機作物としての規格を失ったとして賠償請求が問われるのかが当該裁判の争点となっている。この遺伝子汚染をめぐる判決においても、企業側が勝訴し、遺伝子組換え作物栽培農家には責任が問われない判例が主流となっている。そこで今年度の本研究では、上記のような動向を踏まえ、遺伝子組換え作物の開発者や使用者がたとえ法的責任を免れたとしても、その社会的責任は残るという仮説を建て、研究を進めた。今年度の研究の成果として、遺伝子組換え作物に対して特許権を有する企業の中でも、特許保護をめぐって法律上の係争に終始する企業もあれば、小規模農家にも使用できる安価な種子の開発を小規模農家自身の参加により行う企業もみられるようになってきたことを明らかにした。環境経済論交付申請書の「研究目的」において記載した遺伝子組換え作物をめぐる法的財産権(特許保護および育成者権)と経済的財産権(植物としての固有価値を利用する権利を含めた広義の財産権)の衝突について、国際条約の条文や判例を分析し、その制度構造を明らかにできたことから、研究の目的についてはほぼ70%を達成できたと自己評価している。残るは、遺伝子組換え作物に対する特許保護制度の多様性と独自性に関する国際比較が本研究を完結するうえでの最終の重要課題となる。したがって、平成26年度においては、交付申請書にある通り、海外における遺伝子組換え作物に対する特許保護制度についてのヒアリング調査を実施し、遺伝子組換え作物をめぐる法的財産権と経済的財産権のせめぎあいが生物特許制度に与える影響を明らかにしたい。本研究の目的は、理論サーヴェイ、数量データ分析、ケーススタディといった研究方法を用い、植物遺伝資源をめぐる経済的財産権の公正かつ互恵的な配分を可能にする制度の在り方を提示することにある。そして、本研究では、遺伝子組換え作物に対する特許保護が当該作物の有する経済的財産権ー農民による種子の貯蔵、次期における再播種、近隣農家との交換、市場価格より低い価格での販売等の「農民の権利」に関する諸行為ーに与えるインパクトを定量的かつ定性的に明らかにしたい。この研究の目的に対し、今年度の研究では、理論的研究については、植物遺伝資源をめぐる特許保護という財産権制度の変化について、その推進力(driving force)についての仮説を整理するという当初の目標を概ね達成できたと評価している。特に、遺伝子組換え作物に対する特許保護の増加の要因については、バイオテクノロジーの商業的価値の増加だけでは説明が困難であり、国家と多国籍企業が有する権力に着目する必要があるという研究の方向性を導出できた。
木質系複合材料の力学特性の解明と新しい評価法の確立

合板,中密度繊維板(MDF)および紙などの木質系複合材料の弾性定数や強度の値は,実施する試験方法や試験体形状の影響が著しく,たとえば積層理論などの単純な理論では精度よく評価できないことが指摘されていた。本研究ではこうした力学特性評価に及ぼす試験方法や試験体形状の影響について精査し,評価法の問題点および問題点が発生する原因について検討した。また,さまざまな材料について適切な評価値を与えることができる試験方法や試験体形状を提案することができた。木質系複合材料の力学特性値については,たとえば合板や単板積層材料などではしばしば単純な複合則や積層理論によって予測され,積層構成や試験体形状の影響などについては十分な検討がなされていなかった。そこで本研究では,木質系複合材料の力学特性におよぼす積層構成や試験体形状の影響を検討し,その力学特性値を適切に評価できる試験法および試験条件の確立を目指すこととした。昨年度は木材素材,合板,中密度繊維板について検討したが,本年度はさらに代表的な木質系材料である紙についても検討し,十分な成果を得ることができた。代表的な成果を以下に示す。(1)片側にき裂を持つ中密度繊維板の非対称4点曲げ試験により,き裂進展開始時における面内せん断モードの破壊力学特性を屈曲き裂の発生を考慮して解析した。その結果,屈曲き裂が発生してもき裂先端における非線形挙動を考慮することで適切に破壊力学特性値が評価できることがわかった。(2)さまざまな積層構成および試験体形状を持つ合板をたわみ振動試験し,合板の厚さ方向に振動を与えたときのヤング率およびせん断弾性係数におよぼす積層構成および試験体形状の影響について検討した。その結果,試験体が短くなるほどヤング率の測定値は減少し,せん断弾性係数の測定値が増加することがわかった。(3)様々な繊維傾斜角および試験体の幅を持つ木材素材を振動試験して対数減衰率を測定した。その結果,いずれの繊維傾斜角においても試験体の幅が広いほど対数減衰率が大きくなることがわかった。(4)コピー用紙,袋紙およびろ紙を抄紙方向に対してさまざまな角度になるように試験体を切り出し,引張試験をすることによって提案されているいくつかの破壊条件式を検討した。また,試験結果に基づいて,引張試験から紙のせん断強さを予測する式を提案した。本年度は以下の5点について市販の木材素材,合板および中密度繊維板を使用して検討し,十分な成果を得ることができた。(1)木材素材の開口モードおよび面内せん断モードが混合する状態におけるき裂進展開始時および進展時の破壊じん性値の変化について検討した。その結果,き裂の進展によるモード比の変化を直接測定することができた。(2)さまざまな積層構成および試験体形状を持つ合板を使用し,合板の厚さ方向に振動を励起することで曲げヤング率および面外せん断弾性係数を測定した。その結果,これらの弾性定数を適切に測定するためには試験体の長さ/厚さ比を十分に大きくする必要があることがわかった。(3)さまざまな積層構成および試験体形状を持つ合板を使用し,合板の長さおよび幅方向に非対称4点曲げ負荷することで面内せん断弾性係数を測定した。その結果,面内せん断弾性定数を適切に測定するためには試験体のスパン/はりせい比を十分に小さくする必要があることがわかった。(4)中密度繊維板の3点曲げおよび非対称4点曲げショートビームシア試験を行い,層間せん断強さを測定した。その結果,非対称4点曲げ試験の方が適切に層間せん断強さを得ることができることがわかった。(5)木材素材,合板および中密度繊維板をさまざまなスパン/はりせい比で静的曲げ試験し,ヤング率を測定した。その結果,ISOやJISに規格化された方法では適切にヤング率を得ることができないことがわかった。合板,中密度繊維板および紙のような木質系材料の力学特性は,木材素材の力学特性評価法に基づいた方法で評価されることが多かった。しかし,これらの木質系材料はしばしば不均質であるため,均質な直交異方性材料を前提とした木材素材の評価法がそのまま適用できない。こうした考え方にしたがって,本年度も木質系材料の力学特性評価法の検討ならびに木材素材についても新たな評価法の提案を試み,十分な成果を得ることができた。具体的な成果を以下に示す。(1) 3点曲げおよび非対称4点曲げによる合板の層間せん断強さの評価法について検討し,適切な試験条件を提案した。

(2)中密度繊維板については片側切欠き曲げ試験法によって適切に破壊じん性値を求めることができることを示した。また,ねじり振動およびたわみ振動試験を混合させることにより,試験体形状に依存して精度よく測定できなかった面内せん断弾性係数の正確な測定法を提案した。(3)非対称4点曲げ試験による紙のせん断強さの測定法を提案した。また,紙の非線形領域における応力ーひずみ関係が数理塑性理論にしたがって記述できることを示した。(4)木材素材を圧縮試験した際の横方向のひずみ挙動を数理塑性理論に基づいて解析した。また,振動試験でヤング率およびせん断弾性係数を測定する際,太った試験体を使用すると振動理論から逸脱し,精度よく測定できないことを示した。さらにき裂進展抵抗曲線(R曲線)の測定範囲を広くするために,端部切欠きばりの偏心3点曲げ試験(3EENF試験)を新たに提案した。木質科学平成25年度は木材素材,合板,中密度繊維板および紙を使用し,試験体形状や試験方法を様々に変えて振動試験,静的負荷試験および破壊じん性試験などの力学試験を行うことでこれらの材料の力学特性評価を実施することを予定していた。また,理論解析や数値解析を併用して上記の木質系複合材料の力学特性を予測し,得られた予測と実際の試験から得られた結果を比較・検討から適切に力学特性値が評価できる試験法および試験条件を決定することを目指した。その結果,概要に述べたことのみならず以下の成果を得ることができたため,当初の計画以上に進展していると思われる。(1)木材素材の繊維方向に圧縮力を負荷し,繊維に直交方向の材料非線形領域におけるひずみの変化について数理塑性力学の理論に基づいて解析した。その結果,数理塑性力学の理論の有効性が示唆された。(2)ラワンの5プライ合板を用いて3点曲げおよび非対称4点曲げを実施し,適切な層内せん断強さを評価できる試験体形状について検討した。その結果,逆対称4点曲げ試験によって広いスパン/はりせい比の範囲で安定した層内せん断強さを評価できることを示すことができた。(3)コピー用紙の抄紙方向および垂直方向の引張特性を試験体の長さを変えて測定し,その影響について調べた。その結果,引張特性を適切に求めるには十分な長さをもつ試験体を使用することおよびつかみ具の応力集中を十分に排除する必要があることを示すことができた。(4)非対称4点曲げ試験で測定したコピー用紙,袋紙およびろ紙の面内せん断強さの妥当性を,繊維傾斜を持つ試験体の引張試験から得られたせん断強さの値と比較することで検討した。その結果,薄い紙の非対称4点曲げ試験で得られるせん断強さは引張せん断強さよりも小さく,試験方法に対応するせん断強さの評価方法を整備する必要性を示すことができた。平成24年度は市販の合板,パーティクルボード,中密度繊維板および単板積層材を使用し,試験体形状や試験方法を様々に変えて振動試験,静的負荷試験および破壊じん性試験などの力学試験を行うことでこれらの材料の力学特性評価を実施することを予定していた。
変形性関節症膝における潤滑性能劣化のメカニズム-原子間力顕微鏡による生体計測-

関節軟骨の力学性能計測を生理食塩水中で行うことの可能なシステムを,現有の原子間力顕微鏡に改良を施すことにより完成させた.変形性関節症モデル膝を作成するために,前十字靭帯切離法を家兎の右膝に適応し,ケージ内で12または24週飼育して膝関節を採取した.関節の周囲軟組織を切除して振り子試験を行い,摩擦係数を測定して潤滑性能の指標とした.その後,軟骨の摩擦部分をメスで摘出し,原子間力顕微鏡にて形状を観察した後に表面粗さを求めた.さらに,原子間力顕微鏡で軟骨の押し込み試験を行い,剛性を求めた.健常膝に比較して変形性関節症膝の摩擦係数は有意に増大し,変形性関節症発症に伴って潤滑機能が低下することが確認された.表向観察の結果,健常軟骨では高さ2μm程度の突起を有するゲル状物質が多く見られたのに対し,変形性関節症膝ではゲル状物質が減少していたことが分かった.また,変形性関節症膝では健常膝に比べて表面粗さが有意に低下し,剛性は有意に増大していた.健常関節の軟骨表面に多く存在するゲル状物質は,関節液の見かけの粘度を増大させ,関節の潤滑機能を高めていると考えられる.逆に,変形性関節症ではゲル状物質が減少・消失して下層に位置する軟骨表面が部分的に露呈したため,剛性が高まるとともにスクイズ膜による弾性流体潤滑が実現されず,摩擦係数が増大したと考えられる.以上から,変形性関節症における潤滑能の劣化には,軟骨表面のゲル状物質の減少・消失が関与していることが分かった。現有の原子間力顕微鏡に改良を施し,関節軟骨の力学性能計測を生理食塩水中で行うことが可能なシステムを完成させた.変形性関節症モデル膝を作成するために,前十字靭帯切離法を家兎の右膝に適応した.処理後は飼育ケージ内で飼育し,12または24週後に膝関節を採取して試料とした.試料の周囲軟組織を切除して振り子試験を行い,摩擦係数を測定して潤滑性能の指標とした.その後,軟骨の摩擦部分をメスで摘出し,原子間力顕微鏡にて形状を観察した後に表面粗さを求めた.さらに,原子間力顕微鏡で軟骨の押し込み試験を行い,剛性を求めた.健常膝に比較して変形性関節症膝の摩擦係数は有意に増大し,変形性関節症発症に伴って潤滑機能が低下することが確認された.表面観察の結果,健常軟骨では高さ2μm程度の突起を有するゲル状物質が多く観られた.一方,変形性関節症膝ではゲル状物質が減少していた.また、変形性関節症膝では健常膝に比べて表面粗さが有意に低下し,剛性は有意に増大していた.健常関節で多く見られた軟骨表面のゲル状物質は,関節液の見かけの粘度を増大させ,関節の潤滑機能を高めていると考えられる.逆に,変形性関節症ではゲル状物質が減少・消失して下層に位置する軟骨表面が部分的に露呈したため,剛性が高まるとともにスクイズ膜による弾性流体潤滑性能が低下して,摩擦係数が増大したと考えられる.以上から,変形性関節症における潤滑性の劣化には,軟骨表面のゲル状物質の減少・消失が関与していることが示唆された.関節軟骨の力学性能計測を生理食塩水中で行うことの可能なシステムを,現有の原子間力顕微鏡に改良を施すことにより完成させた.変形性関節症モデル膝を作成するために,前十字靭帯切離法を家兎の右膝に適応し,ケージ内で12または24週飼育して膝関節を採取した.関節の周囲軟組織を切除して振り子試験を行い,摩擦係数を測定して潤滑性能の指標とした.その後,軟骨の摩擦部分をメスで摘出し,原子間力顕微鏡にて形状を観察した後に表面粗さを求めた.さらに,原子間力顕微鏡で軟骨の押し込み試験を行い,剛性を求めた.健常膝に比較して変形性関節症膝の摩擦係数は有意に増大し,変形性関節症発症に伴って潤滑機能が低下することが確認された.表向観察の結果,健常軟骨では高さ2μm程度の突起を有するゲル状物質が多く見られたのに対し,変形性関節症膝ではゲル状物質が減少していたことが分かった.また,変形性関節症膝では健常膝に比べて表面粗さが有意に低下し,剛性は有意に増大していた.健常関節の軟骨表面に多く存在するゲル状物質は,関節液の見かけの粘度を増大させ,関節の潤滑機能を高めていると考えられる.逆に,変形性関節症ではゲル状物質が減少・消失して下層に位置する軟骨表面が部分的に露呈したため,剛性が高まるとともにスクイズ膜による弾性流体潤滑が実現されず,摩擦係数が増大したと考えられる.以上から,変形性関節症における潤滑能の劣化には,軟骨表面のゲル状物質の減少・消失が関与していることが分かった。
樹状細胞による造血幹細胞の制御機構の解析

申請者は、ウィルス感染時に生産されるI型およびII型IFN依存的にHSCが活性化し、細胞周期の進展および静止が観察されること、この活性化には、樹状細胞やNK細胞以外のIFN生産細胞も関与する可能性を明らかとした。また、IFNは、HSCの末梢への動員阻止やウィルス感染防御に重要な役割を果たしていることも明らかとした。本年度は、樹状細胞(Dendritic cells:DC)が、ウイルス感染時にInterferon(IFN)を介して造血幹細胞(hematopoietic stem cell:HSC)を起点とした造血システムの司令塔として働いているか検討した。DNAおよびRNAウイルスをマウスに感染させることによりIおよびII型IFN依存的にHSC(LSK CD150+CD48-細胞)が細胞周期(G0期からG1期)に入り、活性化することが明らかとなった。このHSCの活性化には、直接的にIFNがHSCに作用する経路と、IFN依存的に誘導されたIL-27やTNF-αがHSCに間接的に作用する2経路が存在する可能性が示唆された(投稿準備中)。IFN依存的HSCの活性化にType IIFNの主な生産細胞の一つである従来型DC(conventional DC、cDC)と形質細胞様DC(plasmacytoid DC、pDC)が関与するかについて、CD11c-DTR-GFPマウスにジフテリアトキシンおよび抗mPDCA-1抗体を投与し、それぞれcDCおよびpDCをin vivoで選択的に除去し検討したところ、予想に反して、DC除去後もHSCの活性化は観察された。そこで、抗AsialoGM1抗体も加えDCおよびType II IFNの主な生産細胞であるNK細胞を除去したが、まだ、HSCの活性化は観察された。以上の結果から、ウイルス感染時にHSCがIおよびII型IFN依存的に活性化すること、この活性化に、DCやNK細胞だけではなく、他のIFN生産細胞も関与する可能性が考えられた。今後は、IおよびII型IFN依存的マウスHSCの活性化が、ヒトHSCでも観察されるか、またDCを含めたどのようなIFN生産細胞がこの活性化に関与しているかヒト化マウスを用いて検討していく予定である。このことから、ウィルス感染時、DCがIFNを生産しHSCに作用することによってHSCの細胞周期を進展および静止している以外に、他の免疫細胞や非造血系細胞がHSCの細胞周期の制御に関与している可能性が考えられた。そこで、本年度は、多様な細胞から生産されるIFNがHSCに作用する生物学的意義に着目し以下の結果を得た。1)HSCのmobilization:IFNAR1-/-IFNGR1-/-HSC(LSK CD150+CD48-細胞)は、野生型HSCと比較し、脾臓へのmobilizationが亢進している事が明らかとなった。このmobilizationは、ウィルス感染よってさらに顕著に誘導された。2)HSCの維持:ウィルス感染時、細胞周期が静止しているHSCが存在していることを明らかとした。この結果から、IFNが作用しても、静止期状態のHSCが一定数必ず残る可能性が考えられた。そこで、この静止期維持機構を明らかとする目的で、IFNのネガティブフィードバック因子であるSuppressor of cytokine signaling 1/3(SOCS1/3)の関与に着目し検討したところ、IFNが直接HSCに作用しSOCS1/3mRNA発現を誘導することが明らかとなった。
好中球の活性酸素産生および遊走におけるARFの機能

好中球は、感染の際、最初に応答する、極めて重要な自然免疫細胞である。好中球は、病原体を認識すると、すばやく病原体の方へ遊走を開始し、病原体に到着すると活性酸素を産生して、病原体を不活化する。これまでに、細胞内輸送に関わるARFの制御因子が、好中球の活性酸素の産生及び遊走に関わっていることが明らかになっている。そこで、本研究では、ARFと活性酸素産生および遊走の関係に注目し、研究を行った。その結果、ARF1が、細胞骨格の制御タンパク質の一つであるRac1の細胞内局在に深く関与していることが明らかになった。好中球は、ヒトの白血球の半数以上を占める重要な免疫細胞であり、その主な役割は、体内に侵入してきた病原体へ向かい、病原体を貪食し、活性酸素によって殺菌し、体内から病原体を排除することである。これらは、いずれも巧みに制御されているが、なかでも活性酸素は、生体に大きなダメージを与えることから、その産生は厳密に制御されている。この活性酸素産生のメカニズムが明らかになれば、その産生を制御し、炎症をコントロールすることも可能になることから、その解明が待ち望まれる。これまでに、申請者らは、ADP-ribosylation factor (ARF)のGuanine nucleotide exchange factor (GEF)とGTPase-activating protein (GAP)が、好中球の活性酸素の産生と遊走のいずれにも深く関わっていることを明らかにしている。そこで、好中球の活性酸素産生のメカニズムを解明し、活性酸素の産生をコントロールする手掛かりを得るために、本研究では、特にARFに注目し、好中球の活性酸素産生と遊走におけるARFの機能を明らかにする。今年度は、まずfMLPの刺激によって、どのARFアイソフォームが活性化されるのか決定した。さらに、N-formyl-Met-Leu-Phe(fMLP)の刺激による、ARFアイソフォームの局在の変化を調べた。また、fMLPの刺激によって活性化されるARFアイソフォームの発現を抑えるテトラサイクリン誘導shRNA発現プラスミドを作成し、HL-60細胞に導入して安定株を得た。これらは、いずれも巧みに制御されているが、なかでも活性酸素は、生体組織に傷害を与え、炎症を引き起こし、生体に大きなダメージを与えることから、その産生は必要な場所のみで行われるように厳密に制御されている。この活性酸素産生のメカニズムが解明されれば、その産生を制御し、炎症をコントロールすることも可能になることから、その解明が待ち望まれる。しかし、そのメカニズムについては、未だ多くの謎が残されている。これまでに、申請者らは、膜輸送に関わる低分子量Gタンパク質ADP-ribosylation factor (ARF)のGuanine nucleotide exchange factor (GEF)とGTPase-activating protein (GAP)が、好中球の活性酸素の産生と遊走のいずれにも深く関わっていることを明らかにしている。今年度は、好中球の遊走とARFとの関係を明らかにするために、AFRのGEFの一つであるGBF1に注目し解析した。その結果、特定のARFのアイソフォームによって、細胞骨格の制御に関与するタンパク質が、細胞前端部へ運ばれていることが示唆された。今年度は、これまでの解析の結果に基づき、詳細に解析した。その結果、N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)刺激によって、複数のARFのアイソフォームが活性化すること。そのうちの1つのアイソフォームが、細胞骨格の制御に関与するタンパク質が共局在すること。さらに、そのアイソフォームが、その細胞骨格の制御に関与するタンパク質の局在に関与していることが明らかになった。

好中球は、感染の際、最初に応答する、極めて重要な自然免疫細胞である。好中球は、病原体を認識すると、すばやく病原体の方へ遊走を開始し、病原体に到着すると活性酸素を産生して、病原体を不活化する。これまでに、細胞内輸送に関わるARFの制御因子が、好中球の活性酸素の産生及び遊走に関わっていることが明らかになっている。そこで、本研究では、ARFと活性酸素産生および遊走の関係に注目し、研究を行った。その結果、ARF1が、細胞骨格の制御タンパク質の一つであるRac1の細胞内局在に深く関与していることが明らかになった。所属機関の移動によって実験環境が変化したため。細胞生物学本年度の研究から、fMLP刺激によって、特定のARFのアイソフォームが活性化し、細胞骨格の制御に関与するタンパク質が細胞前端部へ運ばれることが示唆された。今後は、このARFのアイソフォームによって細胞前端部へ運ばれるタンパク質群を解析し、好中球の活性酸素産生及び遊走とARFとの関係を明らかにしていく予定である。ARFアイソフォームの発現を抑える安定株が得られたので、これを使用することで、fMLP刺激による活性酸素の産生や遊走能の解析を進める。また、fMLPの刺激によって、どのARFアイソフォームが活性化されるのか決定したので、活性酸素産生や遊走で影響が見られたARFのアイソフォームに直接結合しているタンパク質を同定を進める。
顎顔面および手足の先天性形態異常疾患における発症機序の解明

目的:ホメオボックス(HOX)遺伝子は,形態形成において時期および部位特異的に発現をすることから,形態形成を制御する転写制御因子群をコードする遺伝子群であると考えられている。なかでもHOXA913およびHOXD913遺伝子は四肢の形態形成に重要な役割を担う。またMSX1、DLX1、DLX2は胎生期に口唇、口蓋領域の原基となる上顎突起において細胞増殖・分化をコントロールする転写調節因子として作用する。本研究では先天性形態異常疾患におけるHOX遺伝子の解析を行い、疾患発症との関連性について検討した。対象:患者-対照研究法を用いた。手足疾患群は重複母指症41例,多合趾症33例、合趾症12例、合指症6例,Apert症候群6例,多趾症3例、多合指症2例,裂手症1例,裂手裂足症1例,その他4例の計109症例であった。また口唇口蓋裂疾患群は口唇裂55例、口唇口蓋裂59例、口蓋裂28例であった。対照群は健常者53109例である。結果:手指疾患群では重複母指症例でアラニン連続領域に繰り返し配列の短縮が2例、エクソン1のミスセンス変異が3例で、また5'-UTR部1塩基置換を認めた。足趾疾患群では多合趾症でエクソン1のミスセンス変異が1例、ポリアラニン領域の12塩基欠失が1例、4塩基挿入が1例、1塩基欠失が1例および5'-UTR部で10塩基欠失が1例認められた。多合趾症でミスセンス変異が1例に認められた。また、MSX1では3'UTR*71C>Tにおいて左側口唇口蓋裂との関連が示唆された(P=0.035)。また同SNPは他のMSX1遺伝子上の多型と強い連鎖不平衡を示していた。DLX1ではアミノ酸翻訳領域に多型は認められなかった。DLX2ではexon1に存在するAGC triplet repeatにおいてrepeat7 alleleと完全口唇口蓋裂との関連が示唆された(P=0.0093)。また同triplet repeatにおいてもDLX2上の他の多型と強い連鎖不平衡を示していた。本研究で、手足疾患群の発症にHOXD13の遺伝子異常が関連している可能性が示唆された。口唇口蓋裂群でもMSX1およびDLX2遺伝子またはその近傍の遺伝子が疾患発症の感受性遺伝子である可能性が示唆された。脊椎動物のホメオボックス(HOX)遺伝子は,形態形成において時期および部位特異的に発現をすることから,形態形成を制御する転写制御因子群をコードする遺伝子群であると考えられている。なかでもHOXA913およびHOXD913遺伝子は四肢の形態形成に重要な役割を担うとされる。近年,多合指症の家系例においてHOXDの13の遺伝子異常が,またhand-foot-genital症候群ではHOXA13の遺伝子異常が報告され注目されている。今回の研究(中間報告)では手指先天性形態異常疾患患者におけるHOXDの13遺伝子の解析を行い疾患発症に関連性を有する可能性を見いだした。方法:対象は手指の形態異常を有する症例で,重複母指症41例,合指症6例,Apert症候群6例,多合指症2例,裂手症1例,裂手裂足症1例の計57例である。対照として健常者53例についても同様の解析を行った。インフォームドコンセントを得た後に静脈血中の白血球よりDNAを抽出した。HOXD13の解析は,翻訳領域の全長を含んで5'-UTR側3bp,イントロン部および3'-UTR側352bpについても解析した。PCR法により目的とする遺伝子部分を増幅した後,ダイ・ターミネーター法を用いたダイレクトシークエンスによって塩基配列を解析した。結果:疾患群および健常者群にエクソン1のアラニン連続領域とイントロン部のCA繰り返しDNA塩基配列部位に遺伝子多型を検出したが両群の頻度に差は認めなかった。重複母指症例ではアラニン連続領域に繰り返し配列の短縮が2例、エクソン1のミスセンス変異が3例で、また5'-UTR部に1塩基置換を認めた。ホメオボックス遺伝子のうち特にHOXD13とHOXA13とは相互作用をしながら手指の形態形成に強く関与するとされている。今回の研究で遺伝子異常を認めた重複母指症例では,その発症にHOXD13遺伝子の遺伝子異常が強く関連している可能性が示唆された。

また口唇口蓋裂疾患群は口唇裂55例、口唇口蓋裂59例、口蓋裂28例であった。対照群は健常者53109例である。結果:手指疾患群では重複母指症例でアラニン連続領域に繰り返し配列の短縮が2例、エクソン1のミスセンス変異が3例で、また5'-UTR部1塩基置換を認めた。足趾疾患群では多合趾症でエクソン1のミスセンス変異が1例、ポリアラニン領域の12塩基欠失が1例、4塩基挿入が1例、1塩基欠失が1例および5'-UTR部で10塩基欠失が1例認められた。多合趾症でミスセンス変異が1例に認められた。また、MSX1では3'UTR*71C>Tにおいて左側口唇口蓋裂との関連が示唆された(P=0.035)。また同SNPは他のMSX1遺伝子上の多型と強い連鎖不平衡を示していた。DLX1ではアミノ酸翻訳領域に多型は認められなかった。DLX2ではexon1に存在するAGC triplet repeatにおいてrepeat7 alleleと完全口唇口蓋裂との関連が示唆された(P=0.0093)。また同triplet repeatにおいてもDLX2上の他の多型と強い連鎖不平衡を示していた。本研究で、手足疾患群の発症にHOXD13の遺伝子異常が関連している可能性が示唆された。口唇口蓋裂群でもMSX1およびDLX2遺伝子またはその近傍の遺伝子が疾患発症の感受性遺伝子である可能性が示唆された。
ヒト排尿筋における神経-筋伝達機構と受動的膜特性の検討

ヒト排尿筋単離細胞を用いてパッチクランプ法による検討を行った。保持電位-60mVでコンベンショナルホールセル状態を作成すると、時間と共にゆっくりとノイズのある内向き電流が記録され、この内向き電流は、選択的スルフォニルウレア受容体阻害薬であるグリベンクラミドの投与により抑制された。グリベンクラミド感受性電流成分は内向き整流性を示した(逆転電位はカリウムイオンの平衡電位とほぼ一致し0mV)。次に、ピペット内液にATPを500μM添加した状態でコンベンショナルホールセルを作成すると、この内向き電流は記録されなかった。以上より、この内向き電流は細胞内ATP及びグリベンクラミド感受性カリウム電流である可能性が強く示唆された。またK_<ATP>チャネル開口薬であるピナシジル100μMを投与すると直ちに内向き電流が惹起され、この電流はグリベンクラミド5μM追加投与によりほぼ完全に抑制された。シングルチャネル記録法であるセルアタッチ法による検討では(保持電位-60mV、細胞内液および細胞外灌流溶液のK^+濃度140mM)、ピナシジル100μM投与後、約4.8pAの単一電流振幅のK^+チャネル活性が惹起された。このチャネル活性はグリベンクラミド1μMおよび10μMの追加投与により濃度依存的に抑制され、その除去により投与前の状態まで回復した。セルアタッチ状態からインサイドアウトを形成するとただちにチャネルの活性化が観察され、このチャネル活性はATP100μM投与によりほぼ完全に抑制された。また、インサイドアウト状態でATP100μM存在下においてUDP1mM追加投与してもチャネルの活性化は観察されなかったが、ピナシジル100μMを追加投与すると約4.8pAのチャネル活性が観察された。シングルチャネル記録法下の電流電圧関係より、チャネルコンダクタンスはセルアタッチ法で約79pS、インサイドアウト法では約82pSであった。以上より、チャネルコンダクタンスがKir6.2のチャネル発現系実験の結果とほぼ一致し、しかも細胞内ATP感受性が他の平滑筋に比較して高い点から考えて、ヒト膀胱平滑筋型K_<ATP>チャネルのKir蛋白タイプは、主にKir6.2である可能性が強く示唆された。前立腺全摘出術あるいは膀胱全摘出術の際に得られたヒト膀胱排尿筋標本に対して1)等尺性収縮法2)ホールセル電位固定法3)細胞内微小電極法を応用してその神経-筋伝達機構ならびに細胞膜カリウムチャネルの特性を検討している。膀胱の支配神経である副交感神経の神経-筋伝達物質として、アセチルコリンとともに重要とされるATPの収縮機構に関しては、シナプス後膜のP2x受容体が関与するとされているが、ウサギならびにヒト排尿筋の収縮実験では二相性の収縮反応が得られており、このうち後半の収縮はP2x受容体脱感作後も残存することからP2y受容体が関与することがほぼ判明しており、またその機序としてイノシトール3リン酸(IP_3)による細胞内ストアサイトからのCaイオンの放出が考えられるため、P2y受容体阻害薬ならびにIP_3受容体ブロッカーを用いて解析を実施中である。

また細胞内微小電極法によるヒト排尿筋細胞の膜電位測定を行っており、アセチルコリンならびにカルバコールによる膜脱分極の閾値を詳細に測定中である。この結果から、神経の興奮に伴う排尿筋収縮が主に膜の脱分極を伴う反応(電位依存性Caチャネルを介する)か、脱分極を伴わないCa濃度の増加によるものであるかが推測できると考えている。実験回数を重ねて検討中である。ホールセル電位固定法を用いて、排尿筋細胞膜のATP依存性のKチャネル(KATPチャネル)の解析も行っている。既に、ヒト排尿筋単離細胞では細胞内ATP感受性が非常に高い特性を有するK電流の解析がほぼ完了しており、現在は単一チャネルのkineticsを詳細に解析中であるが、細胞内液をATP freeとした条件下では79psのコンダクタンスを有するシングルチャネル活性が観察されている。この特性は心筋や膵臓ベータ細胞に近く、他の平滑筋とはチャネル蛋白の組み合わせの相違があるものと考え、詳細に検討中である。ヒト膀胱排尿筋標本に対して等尺性収縮法ならびにホールセル電位固定法を応用して、神経-筋伝達機構ならびに細胞膜イオンチャネルの特性を引き続き検討中である。膀胱の支配神経である副交感神経の神経-筋伝達物質として、アセチルコリンとともに神経末端より放出されるATPの収縮機構に関しては、主にシナプス後膜のP2x受容体が関与するとされているが、ウサギならびにヒト排尿筋の収縮実験ではATPにより二相性の収縮反応が確認されている。このうち後半の緩やかな収縮はP2x受容体脱感作後も残存することからP2y受容体が関与する可能性が高く、その発生機序としてイノシトール3リン酸(IP_3)による細胞内ストアサイトからのCaイオンの放出が考えられるため、P2y受容体阻害薬ならびにIP_3受容体ブロッカーを用いた解析を詳細に行った。その結果は現在論文に作成中である。ヒト排尿筋単離細胞に対してホールセル電位固定法を用いて、排尿筋細胞膜のATP依存性のKチャネル(KATPチャネル)の解析を引き続き検討している。ヒト排尿筋における、細胞内ATP濃度に対して高い感受性を有するK電流の解析が完了した。単一チャネルの動態解析では、心筋や膵臓ベータ細胞に近い特性を有するチャネル活性(細胞内液をATP freeとした条件下では79psのコンダクタンスを有する)が確認されているがこの特性は他の平滑筋とはチャネル蛋白の組み合わせの相違があるものと考え、生化学的なアプローチを加えて現在論文に作成中である。等尺性収縮記録法によるヒトおよびウサギ膀胱排尿筋標本におけるATPの収縮反応の検討では、ATP投与により二相性の収縮反応が観察され、このうち後半の緩やかな収縮はP2x受容体脱感作後も残存することから、シナプス後膜のP2x受容体に加えてP2y受容体もその収縮に関与している可能性が確認された。このP2y受容体を介した収縮反応は、P2y受容体阻害薬ならびにIP_3受容体阻害薬を用いた詳細な検討結果から、イノシトール3リン酸(IP_3)による細胞内ストアサイトからのCaイオンの放出がその発生機序と考えられた。ヒト排尿筋単離細胞に対してパッチクランプ法(ホールセル電位固定法)を用いて、排尿筋細胞膜のATP依存性Kチャネル(K_<ATP>チャネル)の解析を行った結果、その特性は細胞内ATP感受性や単一チャネルコンダクタンスが血管平滑筋K_<ATP>チャネルで報告されているものとは明らかに異なっていた。
ケモカイン結合ペプチドを用いた制御性T細胞の遊走阻害による免疫抑制解除の基盤研究

本年度は、マウスCXCR1ペプチドによる腫瘍局所のTreg集積阻害を目的として以下の3項目について研究を行った。1)ペプチドの投与量、投与時期の決定2)決定した投与条件で複数のマウス腫瘍細胞株を用いた腫瘍縮小効果の検討3)決定した投与条件下でTIL中のTregの割合が減少するかを検討する1)について、マウス白血病細胞株RL male 1を用いたマウス腫瘍モデルにおいて、ペプチドの投与回数、時期、経路を決定した。投与時期は腫瘍接種後7日目、投与回数は3回、投与経路は静脈内投与で腫瘍縮小効果が観察された。また投与量は、0.0252.5 mg/kgで効果が認められ、0.125 mg/kgの条件で最も腫瘍拒絶が観察された。2)について、RL male 1の他、線維肉腫細胞株MethA、CMS17、大腸がん細胞株colon26、乳がん細胞株4T1において同条件で実験を行ったところ、すべての細胞株で腫瘍縮小効果が認められた。3)について、RL male 1腫瘍組織を各マウスにおいて経時的に切除し、フローサイトメーター前処理装置により腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を回収後、FACSCantoIIによりTregの割合を測定した。1)の条件で、TILにおいて、ペプチド投与ごとに劇的にTregの減少が観察された。これらの結果より、Tregの遊走を阻害するCXCR1ペプチドは複数種の腫瘍細胞に対して効果があり、腫瘍が生着してからでも効果があることから、ヒトへの応用も可能であると考えられる。また、CXCR1ペプチド投与により、がん抗原特異的な免疫応答の誘導が検出されれば、がんワクチンをはじめ、各種免疫療法との併用で既存の治療効果を進展させることができる可能性もある。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
発作性夜間血色素尿症における赤血球補体活性化制御因子に関する研究

発作性夜間血色素尿症(PNH)は、後天的に出現した補体感受性の高い赤血球がdecay-accelerating factor(DAF:C3分解酵素を失活する)およびhomologous restriction factor(HRF:C8b-9膜障害複合体を失活する)の欠損により補体感受性が亢進し、溶血するものと考えられている。われわれはこれまでの研究でELISA法および組織化学染色・測光法による血球DAFの測定法を開発し、本症における意義を明らかにした。しかしながら本症の血球におけるHRFの欠損の程度およびその意義はほとんど明らかにされていない。本研究ではHRFのELISA法による測定法を開発し、本症の血球におけるHRF欠損の意義を検討した。方法および結果(1)プールしたヒト赤血球膜のghostからZalmanの方法により抽出、分画しHRF活性を有する分画を用いてモノクロナル抗体を作成した。(2)このモノクロナル抗体とghostを用いてSDS Pageでwestern blottingを行なった。その結果、PNH赤血球膜のghostにはHRFは存在しないことが証明された。(3)われわれが開発したELISAによるDAFの測定法(二宮法)に準じてHRFの測定法を開発した。HRFは4例のPNH症例全例において欠損が認められ、その程度はDAFの欠損の程度とほぼ平行することが明らかとなった。(4)赤血球DAFの染色法(二宮)に準じて免疫細胞化学法によりHRFを測定した。PNH4例においてHRFの欠損赤血球の割合はDAF欠損率とほぼ平行して認められた。またPNHの重症度に応じて欠損率の高値が認められた。(5)FACSを用いて赤血球のHRF欠損populationを検討すると、PNHに重症度に応じて欠損populationが大きいこと、およびDAF欠損populationにHRFの欠損が認められることが明らかとなった。結論以上の成績からPNH赤血球のHRFは重症度およびDAF欠損の程度と平行して欠損している。