hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
河川水・地下水を介した陸海相互作用の包括評価：モンスーンアジアと乾燥地域の比較

海底湧水は河川水など他の陸水に比べてリンや窒素などの栄養を豊富に含むことから,沿岸海域の生物生産に高く寄与することが近年の研究で明らかにされつつある.しかし,これまでの研究は海底湧水と低次生産の関連を対象にしたものがほとんどであり,高次生物への影響を扱った研究例は世界的に見ても乏しい.今年度は、世界の沿岸海域における水産資源として重要な二枚貝の成長に海底湧水が与える影響を評価するための野外実験プロトコルを確立し,各地の調査サイトへ応用することを目的とした.海底湧水の存在が確認されている瀬戸内海の海岸域(湧水区)と対岸の無人島(対照区)において,海水中のラドン濃度(地下水湧出の指標)を測定した.2018年6月13日にアサリ(平均殻長27.3mm:湧水区,27.4mm:対照区)を6個体ずつ収容したプラスチック製の網を各調査区内の海底に6セットずつ設置し4週間後に回収した.期間中の殻長の増加量と実験区間で比較した.海底付近における水温,塩分を1時間ごとにデータロガーにより測定した.生息環境中におけるアサリの餌料生物量の指標として,クロロフィルa濃度,底生微細藻類の生産速度を実験区間で比較した.湧水区の平均ラドン濃度は対照区に比べて高く,海底湧水の影響が強いことを再確認できた.湧水区におけるアサリの平均日間成長速度は対照区に比べて有意に高かった(p<0.05).以上のことから,海底湧水起源の栄養がアサリの成長を促進している可能性が示唆された.また,二枚貝の成長に海底湧水が与える影響を評価するための野外実験プロトコルの一つとして有効な手法を確立することができた.過去の研究は,海底湧水と基礎生産の関連が解析対象とされてきた.本年度は,海底湧水による1次消費者(アサリ)への影響を評価するための野外実験プロトコルを確立できたため.水産資源を構成する多様な生物種を用いた実験プロトコルの確立と,海洋環境が異なる地域での野外実験への応用を可能とする技術が不可欠である.海底湧水は河川水など他の陸水に比べてリンや窒素などの栄養を豊富に含むことから、沿岸海域の生物生産に高く寄与することが近年の研究で明らかにされつつある。しかし、これまでの研究は海底湧水と低次生産の関連を対象にしたものがほとんどであり、高次生物への影響を扱った研究例は世界的に見ても乏しい。今年度は、魚類の摂餌・成長に海底湧水が与える影響を評価するための野外実験プロトコルを確立し,各地の調査サイトへ応用することを目的とした.海底湧水の存在が確認されている瀬戸内海の海岸域(湧水区)と対岸の無人島(非湧水区)において、海水中のラドン濃度(地下水湧出の指標)を測定した。2017年6月12日にマコガレイ稚魚(人工種苗、平均全長63.5mm)を1尾ずつ収容したケージ(45×45×30 cm、網目10mm)を各調査区内の海底に計16個ずつ設置し、2週間後に回収した。期間中の体長の増加量と回収時の胃内容物を調査した。ソリネット(40×30 cm,網目0.3 mm)による環境中の餌料生物採集、粒径組成およびデータロガーによる経験水温・塩分の解析を行った。湧水区の平均ラドン濃度は非湧水区に比べて高く、海底湧水の影響が強いことを再確認できた。湧水噴出域における平均日間成長速度(0.27mm/d)は対象区(0.17 mm/d)に比べて速かった。マコガレイ稚魚の胃内容物の多くはヨコエビ類,貝虫類・二枚貝類などで占められた。このうち、当海域における天然マコガレイ稚魚の主要餌料であるヨコエビ類の分布密度は湧水区において高かった。底生微細藻類の生産速度(炭素重量)および胃内容物の乾燥重量も湧水区において多かった。以上のことから、海底湧水起源の栄養がマコガレイ稚魚の摂餌と成長を促進している可能性が示唆された。

過去の研究は,海底湧水と低次生産の関連が解析対象とされてきた.本年度は,海底湧水による高次生物への影響を評価するための野外実験プロトコルを確立できたため.海底湧水は河川水など他の陸水に比べてリンや窒素などの栄養を豊富に含むことから,沿岸海域の生物生産に高く寄与することが近年の研究で明らかにされつつある.しかし,これまでの研究は海底湧水と低次生産の関連を対象にしたものがほとんどであり,高次生物への影響を扱った研究例は世界的に見ても乏しい.今年度は、世界の沿岸海域における水産資源として重要な二枚貝の成長に海底湧水が与える影響を評価するための野外実験プロトコルを確立し,各地の調査サイトへ応用することを目的とした.海底湧水の存在が確認されている瀬戸内海の海岸域(湧水区)と対岸の無人島(対照区)において,海水中のラドン濃度(地下水湧出の指標)を測定した.2018年6月13日にアサリ(平均殻長27.3mm:湧水区,27.4mm:対照区)を6個体ずつ収容したプラスチック製の網を各調査区内の海底に6セットずつ設置し4週間後に回収した.期間中の殻長の増加量と実験区間で比較した.海底付近における水温,塩分を1時間ごとにデータロガーにより測定した.生息環境中におけるアサリの餌料生物量の指標として,クロロフィルa濃度,底生微細藻類の生産速度を実験区間で比較した.湧水区の平均ラドン濃度は対照区に比べて高く,海底湧水の影響が強いことを再確認できた.湧水区におけるアサリの平均日間成長速度は対照区に比べて有意に高かった(p<0.05).以上のことから,海底湧水起源の栄養がアサリの成長を促進している可能性が示唆された.また,二枚貝の成長に海底湧水が与える影響を評価するための野外実験プロトコルの一つとして有効な手法を確立することができた.過去の研究は,海底湧水と基礎生産の関連が解析対象とされてきた.本年度は,海底湧水による1次消費者(アサリ)への影響を評価するための野外実験プロトコルを確立できたため.今年度に確立した野外実験プロトコルを各地のサイトへと応用する.水産資源を構成する多様な生物種を用いた実験プロトコルの確立と,海洋環境が異なる地域での野外実験への応用を可能とする技術が不可欠である.
マイクロデータロガーによる水生動物の代謝量測定の研究

2電極の超小型心電波形記録計を用いて、潜水中、潜水の間に水上にいる時、陸上で安静にしている時の海鳥の心拍数を計測し、それぞれの状態の海鳥の酸素代謝量を推定した。自然条件下で行動する2羽のアデリーペンギンから合計28時間分の心電波形の計測を行い、それぞれの状態での心拍を計数した。陸上で安静にしている際のアデリーペンギンの心拍数は70-90bpmであった。潜水と潜水の間に水上にいる時の心拍数は約300bpmであり、潜水をはじめると同時に心拍は、約半分(約150bpm)に減少し、潜水を続けると心拍数は更に減少した(最低30bpm)。アデリーペンギンの安静時の心拍数と酸素消費速度には正の相関関係があることが知られており(Culik 1995)、この関係を用いて心拍数から酸素消費速度を推定したところ、潜水中の酸素消費速度は休止時で60-70ml/min、潜水時で100-130ml/min、潜水間の水面に滞在している時で290-320ml/minであった。体重5.15kgのアデリーペンギンの酸素保有量は、302mlと推定されるため、酸素を用いて潜水可能な時間は、2-3minほどと推定される。小型深度計で計測された結果から、自然条件下のアデリーペンギンは1.5-2minほどの潜水を多く行っていることが知られている。これらの結果から、アデリーペンギンは潜水中に代謝速度を下げて潜水時間の延長を可能にしていると考えられる。飼育下のカワウにおいても心電波形の計測を行った。安静時、羽ばたき時、水面で浮かんでいるとき、潜っているときについて、心拍数及び波形の比較を行う。データについては現在解析中である。潜水中の心電図の変化を調べるために、心電計測データロガー(UWE-200ECG、リトルレオナルド)を開発し、電極の選定、装着方法の開発、改良等を行った。まず5msごとに心電位を記録するように設定した心電計測ロガー(UWE-200ECG)を海鳥の背中に装着し、針電極を脇の下と足の骨の上あたりにさして、安静時の心電図を計測した。ロガーは約3.6時間稼動し、大部分はきれいに心電図が得られたが、一部ノイズが入っていた。鳥が羽ばたき、羽づくろいなどを行ったときに相当する。運動中の心電図を計測するためには筋電の影響を受けず、電極と体の接触面が動かないような電極の装着方法をとる必要があったため、電極およびその装着方法について改良した。電極は細いしなやかな金属のまわりをビニールコーティングされているもので、ビニールの一部を2ヶ所削って通電するようにしてある。心電ロガーの電極ケーブルは麻酔下で鎖骨近くから挿入し胸骨の下を通し、腹部から引き抜く。またロガーまでのケーブルは皮下を通し、背中に固定したロガーに接続した。またメモリーサイズとサンプリングインターバルの関係で稼働時間が短いのも問題であったが、今回得られた波形から10msでのサンプリングでもきれいな波形が得られることがわかった。またロガーのメモリーサイズは倍の4Mbyteに、また限られた時間中に水中での心電図を確実に記録するためにロガーに水切りセンサー(SW)をつけた。ニワトリ、ガチョウ、カワウ等を用いた実験を行った。術後の回復は早く、野外で応用が可能だと思われる。しかしながら静止時の心電図はきれいに記録されたが、羽ばたいたときにはやはり波形が乱れた。野外でも潜水中の心電データの計測に成功し、現在解析中である。
孤発性筋萎縮性側索硬化症の剖検脳脊髄組織におけるRNA編集酵素活性異常の解析

RNA編集酵素ADAR2(adenosine deaminase acting on RNA2)活性欠失がAMPA受容体サブユニット未編集型GluA2の発現を通じて運動ニューロン死を引き起こすことを動物実験により示し、この分子異常が運動ニューロン死と直結する分子異常であることを明らかにした.さらに約30例の孤発性ALS患者剖検脊髄における脊髄運動ニューロンでは,ADAR2活性が低下することにより,正常では認められない未編集型GluA2が発現し,Ca透過型AMPA受容体が神経細胞死を引き起こす可能性を2011年度に報告した.また,孤発性ALS運動ニューロンでは,TDP-43タンパクの局在異常が,例外なくADAR2発現の低下した運動ニューロンに出現することを報告している.ALSの主な危険因子が加齢であることはよく知られている.加齢と発症のメカニズムの間には何らかの関連があると推測されるが、どのような関連かは不明であった.そのため,ADAR2活性低下と加齢に関連があるという仮説を立て,検討することにした.方法として各年齢(幼若,成獣,高齢)の野生型マウス(C57BL/6J)を用いてADAR2の活性をreal time PCR(各グループn=3)及び免疫組織化学(各グループn=2)で検討し,さらにTDP-43タンパクの局在異常を合わせて検討した.その結果,ADAR2活性は12週齢で最大になり,その後は変化無く,74週齢から減少に転じた.免疫組織化学的検討により,12ヶ月齢までの成獣マウスでは,核のADAR2染色性は明瞭でTDP-43も核に共染するが,12ヶ月齢を越えると少数であるが,lateral areaの大径運動ニューロンからADAR2の染色性の低下,TDP-43の局在異常がみられ始めた.100週齢前後になると例外なくこのような大径運動ニューロンが観察され,加齢に伴うものと考えられた.以上から,ALSの加齢による増加,発症後の進行速度が速いことも合わせるとALSの危険因子である加齢の本質がADAR2活性低下である可能性が強く示唆された.孤発性筋萎縮性側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,以下ALS)では,グルタミン酸受容体サブユニットであるGluA2 (GluR2)のRNA編集異常が,少数例の孤発性ALS例と疾患対照,正常対照例の剖検組織の検討から疾患特異的に生じていることが,先行研究で明らかにされていた.この結果をふまえ,GluA2 Q/R部位の編集異常はRNA編集酵素であるADAR2活性低下によるものかどうか,を検討した.方法は,単一運動ニューロン組織でGluA2 Q/R部位のRNA編集に特異的に関わるADAR2活性低下の有無を検討するために,ADAR2 mRNA発現量,GluA2 Q/R部位以外のADAR2基質の編集率を正常対照,孤発性ALS,疾患対照(多系統萎縮症)で測定した.約30人の様々な症状を示した,年齢も経過も様々の孤発性ALS剖検凍結組織由来の脊髄運動ニューロンを調べた.その結果,正常及び疾患対照群において,検索した全ての運動ニューロンにおいてGluA2 Q/R部位のRNA編集率は例外なく100%であり,その一方でALS群の全例で,未編集型GluA2を発現する運動ニューロンが検出された.ALSの運動ニューロンでは,ADAR2の活性が落ちており, ADAR2 mRNAの発現も低下していた.興味深いことに,孤発性ALSの編集型GluA2のみを発現する一見正常な運動ニューロンにおいても有意な発現低下がみられ,さらに未編集型を発現する運動ニューロンでは,著減していることが分かった.以上から,ALSの細胞死の原因が,運動ニューロンにおけるGluA2 Q/R部位を触媒するADAR2活性低下によることがADAR2の特異基質におけるRNA編集率の低下とADAR2 mRNA発現量の低下から明らかにすることが出来た.RNA編集酵素ADAR2(adenosine deaminase acting on RNA2)活性欠失がAMPA受容体サブユニット未編集型GluA2の発現を通じて運動ニューロン死を引き起こすことを動物実験により示し、この分子異常が運動ニューロン死と直結する分子異常であることを明らかにした.さらに約30例の孤発性ALS患者剖検脊髄における脊髄運動ニューロンでは,ADAR2活性が低下することにより,正常では認められない未編集型GluA2が発現し,Ca透過型AMPA受容体が神経細胞死を引き起こす可能性を2011年度に報告した.また,孤発性ALS運動ニューロンでは,TDP-43タンパクの局在異常が,例外なくADAR2発現の低下した運動ニューロンに出現することを報告している.ALSの主な危険因子が加齢であることはよく知られている.加齢と発症のメカニズムの間には何らかの関連があると推測されるが、どのような関連かは不明であった.そのため,ADAR2活性低下と加齢に関連があるという仮説を立て,検討することにした.方法として各年齢(幼若,成獣,高齢)の野生型マウス(C57BL/6J)を用いてADAR2の活性をreal time PCR(各グループn=3)及び免疫組織化学(各グループn=2)で検討し,さらにTDP-43タンパクの局在異常を合わせて検討した.

その結果,ADAR2活性は12週齢で最大になり,その後は変化無く,74週齢から減少に転じた.免疫組織化学的検討により,12ヶ月齢までの成獣マウスでは,核のADAR2染色性は明瞭でTDP-43も核に共染するが,12ヶ月齢を越えると少数であるが,lateral areaの大径運動ニューロンからADAR2の染色性の低下,TDP-43の局在異常がみられ始めた.100週齢前後になると例外なくこのような大径運動ニューロンが観察され,加齢に伴うものと考えられた.以上から,ALSの加齢による増加,発症後の進行速度が速いことも合わせるとALSの危険因子である加齢の本質がADAR2活性低下である可能性が強く示唆された.少数例のALS脊髄前角組織,単一脊髄運動ニューロンでの検討でAMPA受容体サブユニットGluR2 Q/R部位のRNA編集率が低下していることをふまえて,昨年度は,GluR2 Q/R部位の編集異常はRNA編集酵素であるADAR2活性低下によるものか,を知るために,生化学に検討を進めた.さらに,今後は,生化学的検討に加えて,免疫組織化学的に検討する研究計画を立てている.ADAR2の活性低下を免疫組織化学的に検討するため,ヒト脊髄,脳剖検組織において,抗ADAR2抗体による免疫組織化学にて,正常対照と孤発性ALSの運動ニューロン間の変化,について実験を行いたい.まず,条件検討と脊髄前角運動ニューロンの活性低下の検討を進める.ヒト脊髄剖検組織において,抗ADAR2抗体による免疫組織化学にて正常対照と孤発性ALSの運動ニューロン間の検討,孤発性ALSにおいて神経細胞死を起こしているもの,封入体の見られるもの,所見のないニューロン間での違いがあるか検討する.抗体については,抗ADAR2抗体により,ADAR2コンディショナルノックアウトマウスではノックアウトした運動ニューロンでは免疫組織化学的に抗ADAR2抗体の染色性が無いこと,からADAR2活性の変化の検出が可能であることが分かった.先行研究のマウスについては,灌流固定後,スクロース置換法により,凍結切片を作製後,ABC法を用いた免疫組織化学で抗ADAR2抗体による適切な染色条件が検討されており,少数例であるが,ヒト剖検組織においても凍結切片及びパラフィンについて,先行研究で検討している.マウスを用いて加齢の変化などADAR2の特性も併せて検討する.凍結状態,パラフィン切片における保存状態の程度に染色性が症例毎に異なる可能性があり,DAB法以外にも蛍光抗体染色などより定量性,再現性が得られる条件検討を行う.前年度の実験計画の生化学的検討の継続及び免疫染色を中心に実験し,画像及び統計学的解析,定量的なデータ処理を多角的に進める.蛍光染色による多重染色を検討しており,画像処理に必要なPC,PC関連の入出力デバイスを整備し,十分な解析が可能な状態を維持する.また,昨年度の成果を,国内学会及び国際学会で報告し成果を発信するようにする.また,研究成果を論文にまとめる.
両漢儒教の新研究

本研究は、両漢儒教に対して新たなる方法論による総合的な研究を行った。第一に、従来、中国哲学・東洋史・中国文学のように分かれて研究されてきた両漢文化を複合的に学際的に研究する方法論を取り、第二に、出土資料の研究成果を積極的に取り入れた。その結果、研究代表者は一冊の研究書を、共同研究の成果としては毎年一冊ずつ計四冊の研究書を出版し、両漢儒教の研究を大きく進展させた。「両漢儒教の新研究」は、以下の二つの観点により、両漢における儒教と政治権力との関わりに見直しを行うものである。第一に、中国哲学・東洋史・中国文学などの垣根を取り払い学際的な総合研究を行う。第二に、出土資料を利用すると共に、先秦儒教の研究成果を両漢儒教の研究に反映させる。以上である。平成17年度は、以上のような問題関心と方法論に基づき、三人の外国人研究者と招聘し、二つの国際シンポジウムを開催、その成果の一部を『両漢の儒教と政治権力』(汲古書院、平成17年9月、326頁)として公刊した。一つ目のシンポジウムは、東方学会と共催で開催したものであり、その成果は『両漢の儒教と政治権力』に収録されている。二つ目のシンポジウムは、東京大学を会場に、「易と術数研究の現段階」と題して行われ、その成果は、平成18年度の刊行を予定している『両漢における易と三禮』に収録される。渡邉義浩(編)『両漢の儒教と政治権力』は、二部から構成され、一部は国際シンポジウムの内容を収録し、二部は両漢の儒教と政治権力との関係に係わる研究動向の整理を行った。以下、目次の概略を示しておく。第一部量からの儒教と政治権力一、王啓発近十年来中国大陸「漢儒学与政治権力」相〓研究成果簡介和評〓二、李承律郭店楚簡『性自命出』の性情説と「礼楽」-礼楽の根源の思想史的展開三、池澤優「孝」の文化的意義-漢代における生者-死者関係を中心に四、堀池信夫前漢における孝の転回と国家五、渡邉義浩後漢儒教の固有性-『白虎通』を中心として第二部「両漢の儒教と政治権力」をめぐる研究の現在合評会福井重雅著『漢代儒教の史的研究』一、王啓発近十年来中国大陸漢儒学研究的基本走向和最新〓展二、渡邉義浩日本における「儒教の国教化」をめぐる研究について三、辛賢韓国における近十年間の両漢研究四、渡邉義浩ヨーロッパの哲学者から見た儒教-ヘーゲル・ウェーバーを中心に「両漢儒教の新研究」は、以下の二つの観点により、両漢における儒教と政治権力との関わりに見直しを行うものである。以上である。平成18年度は、以上のような問題関心と方法論に基づき、三人の外国人研究者を招聘し、二つの国際シンポジウムを開催、その成果の一部を『両漢における易と三礼』(汲古書院、平成18年9月、487頁)として公刊した。渡邉義浩(編)『両漢における易と三礼』は、三部から構成され、一部・二部は国際シンポジウムの内容を収録し、三部は両漢における易と三礼に関連する論文を掲載した。第一部易と術数研究の現段階一、薫漢明漢代易学の基本的な特徴について二、川原秀城術数学--中国の数術三、近藤浩之・大野裕司『日書』より見た『周易』卦爻交辞の用語・語法に関する考察四、辛賢易緯における世軌と『京氏易伝』五、劉楽賢一種の注目に値する古代天文文献--緯書『河図帝覧嬉』新考第二部両漢における三礼の展開一、渡邉義浩後漢における礼と故事二、堀池信夫漢代の「権」について三、王啓発『礼記』王制篇と古代国家法思想四、蜂屋邦夫『儀礼』鄭玄注と服部宇之吉の『儀礼鄭注補正』五、池田秀三鄭学の特質第三部両漢における易と三礼一、池田知久『周易』研究の課題と方法二、劉楽賢出土文献から見た楚と秦の選択術の異同と影響--楚系選択術中の「危」字の解釈を兼ねて三、堀池信夫夫人の出国--董仲舒の「変礼」についての補遺四、王啓発鄭玄『三礼注』とその思想史的意義「両漢儒教の新研究」は、以下の二つの観点により、両漢における儒教と政治権力との関わりに見直しを行うものである。

第一に、中国哲学・東洋史・中国文学などの垣根を取り払い学際的な総合研究を行う。第二に、出土資料を利用すると共に、先秦儒教の研究成果を両漢儒教の研究に反映させる。以上である。平成18年度は、以上のような問題関心と方法論に基づき、二人の外国人研究者を招聘し、二つの国際シンポジウムを開催、その成果の一部を『両漢における詩と三伝』(汲古書院、平成19年12月、463頁)として公刊した。以下、目次の概略を示すことにより、実績の概要にかえたい。第一部両漢における『春秋』三伝の相剋一、野間文史『春秋事語』と『左伝』二、岩本憲司義から事へ-『左氏伝』の出現三、ヨアヒム・ゲンツ『春秋』の微言大義-『公羊伝』における意味生成の戦略四、田中麻紗巳漢代の穀梁伝五、渡邉義浩両漢における『春秋』三伝と国政第二部詩経研究の現段階一、濮茅左『孔子詩論』の整理と研究二、石川三佐男両漢における四家詩の興亡について三、牧角悦子詩経の文学性四、池田秀三鄭学における「毛詩箋」の意義「両漢儒教の新研究」は、以下の二つの観点により、両漢における儒教と政治権力との関わりに見直しを行うものである。平成20年度は、以上のような問題関心と方法論に基づき、外国人研究者としてサラ・アラン氏を招聘し、国際シンポジウムを開催、そして四年間の共同研究の成果の一部を『両漢儒教の新研究』(汲古書院、平成20年12月、488頁)として公刊した。以下、目次の概略を掲げておく。第一部両漢における「天」の文化-思想史と歴史学の連携による(一、サラ・アラン漢代以前の「天」と「上帝」、二、池田知久天人相関と「自然」、三、渡邉義浩両漢における天の祭祀と六天説、四、池田秀三鄭玄の六天説と両漢の礼学、五、三浦國雄道教の天-「初期天師道」における「天帝」を中心に)第二部両漢における儒教の展開(一、渡辺信一郎前漢時代の宗廟と楽制、二、池澤優後漢時代の鎮墓文と道教の上章文の文書構成、三、渡邉義浩両漢における華夷思想の展開四、辛賢王弼忘象論再考)このほか、四年間における渡邉義浩個人の研究成果として、渡邉義浩『後漢における「儒教国家」の成立』(汲古書院、平成21年3月、302頁)を公刊した。同じく、目次の概略を掲げて、研究実績の概要の報告に代えたい。序論、第一篇国政の運用と儒教経典(一、両漢における春秋三伝と国政、二、『白虎通』に現れた後漢儒教の固有性、三、後漢における礼と故事、四、両漢における華夷思想の展開)、第二篇君主権の正統化と祭祀(五、鄭箋の感生帝説と六天説、六、中国古代国家における天の祭祀、七漢魏における皇帝即位と天子即位、八、「魏公卿上尊号奏」にみる漢魏革命の正統性、九、「受禅表」における『尚書』の重視)、結論。以上である。
台風の温帯低気圧化過程とこれに伴うメソ擾乱発達による気象災害の研究

西太平洋上で発生し日本付近まで北上してきた台風は、中緯度の大気の傾圧性の影響を受け、その構造が徐々に変化する。この過程で、さまざまなメソ擾乱が発生し、災害発生の原因となることが多い。本研究では、数値シミュレーションにより台風を再現し、その構造変化、メソ擾乱の発生、気象災害との関連を調べた。不知火海の高潮災害や豊橋の竜巻等の災害をもたらした1999年の台風18号は、日本海で一旦弱まった後再発達をとげたが、この様子を数値モデルで再現することに成功した。そして、再現結果を解析することにより、最盛期の台風の上層に形成される負渦位偏差が台風衰弱に重要であること、再発達期には対流圏上層のトラフにともなう正の渦位とのカップリングが生じ、これが再発達の要因となっていることを解明した。さらに、豊橋市付近で発生した竜巻に着目した数値計算を行い、竜巻発生場所の周辺で、対流潜在位置エネルギー(CAPE)とストーム相対ヘリシティ(SREH)との積であるエネルギーヘリシティ示数(EHI)が大きな値を持つことが示された。これは、将来、台風に伴う竜巻発生を予報できる可能性を示唆した者である。近畿地方、特に奈良盆地に大きな強風害をもたらした1998年の台風7号に関しては、消防署等も含むさまざまな期間から集めた気象観測データを解析し、台風に伴う地上風を詳細に調べた。これらの強風は、台風の背面で発生していること、強風域はバンド状のメソ降水系に対応していることを明らかにした。さらに、この強風域は台風の循環と中緯度の西風との号流域にから発生していることが数値実験で示された。秋に襲来する台風にともないしばしば観測される時間スケールの短い急激な気圧低下(pressure dip)に関しても、その発生頻度や性状を観測データからあきらかにするとともに、その発生メカニズムを数値シミュレーションで明らかにした。(1)並列計算機を購入整備し、局地気象モデルPSU/NCAR MM5を実行できるようにした。(2)(1)を用いて、T9807号のシミュレーションを実施した。気象庁の領域客観解析データを用いて、台風が四国沖に達した状態から予報実験を行った。台風の進路は実際の台風とほぼ同じであり、また実際の台風で観測された台風後面での強風域が再現された。数値計算結果を解析することにより、この強風域が中緯度の西風と台風の循環風との相互作用で発生することを示唆する解析結果が得られた。しかし、同台風によりもたらされた奈良盆地の強風は、必ずしも現実どおりには再現されず、次年度への課題となっている。(3)不知火海の高潮災害、豊橋市の竜巻などの災害をもたらしたT9918のシミュレーションを行った。計算結果を解析し、竜巻発生の指標として提案されている指標の空間分布を調べた。シミュレーション結果では、竜巻の発生した豊橋市周辺で、この指標が高い値を示すことが示された。これは、竜巻の発生可能性をある程度予報できることを示唆するといえる。(4)8月下旬から9月にかけて朝鮮半島に水害をもたらしたT0215号に関して、気象庁の領域客観解析データを用いた解析をすすめた。韓国の水害は、台風と停滞前線との相互作用であると考えられ、次年度に、数値モデルを用いた解析を進める予定である。(5)日本に接近する台風の中で特に強いものは、眼の構造が楕円あるいは多角形を示す場合があることが知られている。この現象を軸対称渦の不安定性として説明する理論的研究を進め、成果を米国気象学会誌に発表した。

西太平洋上で発生し日本付近まで北上してきた台風は、中緯度の大気の傾圧性の影響を受け、その構造が徐々に変化する。この過程で、さまざまなメソ擾乱が発生し、災害発生の原因となることが多い。本研究では、数値シミュレーションにより台風を再現し、その構造変化、メソ擾乱の発生、気象災害との関連を調べた。不知火海の高潮災害や豊橋の竜巻等の災害をもたらした1999年の台風18号は、日本海で一旦弱まった後再発達をとげたが、この様子を数値モデルで再現することに成功した。そして、再現結果を解析することにより、最盛期の台風の上層に形成される負渦位偏差が台風衰弱に重要であること、再発達期には対流圏上層のトラフにともなう正の渦位とのカップリングが生じ、これが再発達の要因となっていることを解明した。さらに、豊橋市付近で発生した竜巻に着目した数値計算を行い、竜巻発生場所の周辺で、対流潜在位置エネルギー(CAPE)とストーム相対ヘリシティ(SREH)との積であるエネルギーヘリシティ示数(EHI)が大きな値を持つことが示された。これは、将来、台風に伴う竜巻発生を予報できる可能性を示唆した者である。近畿地方、特に奈良盆地に大きな強風害をもたらした1998年の台風7号に関しては、消防署等も含むさまざまな期間から集めた気象観測データを解析し、台風に伴う地上風を詳細に調べた。これらの強風は、台風の背面で発生していること、強風域はバンド状のメソ降水系に対応していることを明らかにした。さらに、この強風域は台風の循環と中緯度の西風との号流域にから発生していることが数値実験で示された。秋に襲来する台風にともないしばしば観測される時間スケールの短い急激な気圧低下(pressure dip)に関しても、その発生頻度や性状を観測データからあきらかにするとともに、その発生メカニズムを数値シミュレーションで明らかにした。
高齢化社会における家庭内自動ドア用リニアモータの研究開発

これからの高齢化社会において普及すると思われるバリヤフリー住宅内では,自動ドアも必要になってくると考えられ,その際に単相電源でダイレクトドライブができるリニアモータが有用になってくると思われる.家庭内自動ドア用リニアモータとして,単相電源で駆動でき,構造が簡単で保守が容易である特長を持つリニアパラメトリックモータを用いて実用化に必要な条件を検討した.実験は,モータ磁心幅34mm一定,巻線を巻く窓面積を一定にして形状の異なる数種類のリニアパラメトリックモータを試作して行った.ポールピッチが40mmから80mmまでのモータを用いて検討した結果,ポールピッチが小さくなると漏れ磁束が小さくなり,静推力が大きくなることがわかった.特に,ポールピッチ50mmのモータにおいて静推力,推力質量比及び推力入力比の特性値が良好であり,家庭内ドアを駆動するのに充分な推力が得られることがわかったので,次にポールピッチ50mmのモータを自動ドアモデルに設置して動作特性に関する検討を行った.実験はモータとドアとのギャップ及び一次電圧に対する静推力及び速度特性について検討した.その結果,ギャップ5mm,一次電圧100Vにおいて,約0.3m/sの平均速度で動作することがわかった.これらの検討結果より,家庭内自動ドア用モータとしてリニアパラメトリックモータが充分応用できることがわかった.これからの高齢化社会において普及すると思われるバリヤフリー住宅内では,自動ドアも必要になってくると考えられ,その際に単相電源でダイレクトドライブができるリニアモータが有用になってくると思われる.家庭内自動ドア用リニアモータとして,単相電源で駆動でき,構造が簡単で保守が容易である特長を持つリニアパラメトリックモータを用いて実用化に必要な条件を検討した.実験は,モータ磁心幅34mm一定,巻線を巻く窓面積を一定にして形状の異なる数種類のリニアパラメトリックモータを試作して行った.ポールピッチが40mmから80mmまでのモータを用いて検討した結果,ポールピッチが小さくなると漏れ磁束が小さくなり,静推力が大きくなることがわかった.特に,ポールピッチ50mmのモータにおいて静推力,推力質量比及び推力入力比の特性値が良好であり,家庭内ドアを駆動するのに充分な推力が得られることがわかったので,次にポールピッチ50mmのモータを自動ドアモデルに設置して動作特性に関する検討を行った.実験はモータとドアとのギャップ及び一次電圧に対する静推力及び速度特性について検討した.その結果,ギャップ5mm,一次電圧100Vにおいて,約0.3m/sの平均速度で動作することがわかった.これらの検討結果より,家庭内自動ドア用モータとしてリニアパラメトリックモータが充分応用できることがわかった.家庭内自動ドア用リニアモータとして,単相電源で駆動できるリニアパラメトリックモータを用いて検討を行い,自動ドアとして充分な推力が得られること及び,ドアの形状や重量などが異なる場合でも対応できるように,形状の異なる数種類のモータを試作して,実験的に検討を行った.併せて電磁場解析ソフトを用いて実験値と比較検討した.これらの検討結果は,日本応用磁気学会,電気学会,IEEE及びEPE-PEMCなどで発表している.今回検討を行った条件は,バリヤフリー住宅のような床が平坦で,ドアが吊り戸式の場合を想定して,床下にモータを設置することを考慮し,開磁路形リニアパラメトリックモータを用いて検討を行った.一般家庭で用いられている吊り戸式ドアは,ドアの大きさや重量などによっても異なるが,約35N程度の推力が必要と思われる.そのため,モータ幅の検討及びモータ高さと長さの関係について検討を行った.その結果,モータ磁心幅W=34mm,ポールピッチτ=44mmの時に,良好な特性値が得られた.その時のモータ磁心の寸法は,磁心幅W,長さL及び高さHの比は,0.3:1:1.45であった.許容電流値以内で,最適な同調用コンデンサを接続した時の静推力は約15Nが得られ,家庭内自動ドアを充分駆動できることがわかった.これからの高齢化社会において普及すると思われるバリヤフリー住宅内では,自動ドアも必要になってくると考えられ,その際に単相電源でダイレクトドライブができるリニアモータが有用になってくると思われる.家庭内自動ドア用リニアモータとして,単相電源で駆動でき,構造が簡単で保守が容易である特長を持つリニアパラメトリックモータを用いて実用化に必要な条件を検討した.実験は,モータ磁心幅34mm一定,巻線を巻く窓面積を一定にして形状の異なる数種類のリニアパラメトリックモータを試作して行った.ポールピッチが40mmから80mmまでのモータを用いて検討した結果,ポールピッチが小さくなると漏れ磁束が小さくなり,静推力が大きくなることがわかった.特に,ポールピッチ50mmのモータにおいて静推力,推力質量比及び推力入力比の特性値が良好であり,家庭内ドアを駆動するのに充分な推力が得られることがわかったので,次にポールピッチ50mmのモータを自動ドアモデルに設置して動作特性に関する検討を行った.実験はモータとドアとのギャップ及び一次電圧に対する静推力及び速度特性について検討した.その結果,ギャップ5mm,一次電圧100Vにおいて,約0.3m/sの平均速度で動作することがわかった.これらの検討結果より,家庭内自動ドア用モータとしてリニアパラメトリックモータが充分応用できることがわかった.今後,実用化に際しては設置場所の条件によりセンサ,スイッチなどを用い,シーケンス制御による安全で快適な家庭内自動ドアの研究開発を行っていく予定です.
高温高圧変形実験で探る内核のレオロジー

地震波速度異方性の存在から、固体金属でできた地球の内核で大規模な流動変形が起こっていることが示唆されているが、内核での流動変形の実態は内核物質の物性の理解が不十分なためよくわかっていない。本研究では、変形実験によって内核構成物質であるhcp鉄のレオロジーを明らかにし、変形実験と並行してhcp鉄中の元素拡散のカイネティクスをアニール実験によって明らかにする。これらを組み合わせて、hcp鉄のレオロジーをそのミクロな素過程から総合的に解明し、内核での物質流動の正確な評価を確立する。hcp鉄のレオロジーから見積もられる内核の粘性率から、内核の異方的構造を生み出しているメカニズムの特定を目指す。高温高圧変形実験により、地球内核の構成物質である六方最密構造(hcp)鉄の流動変形におけるレオロジーを、また高温高圧実験により、hcp鉄中の元素拡散を解明し、hcp鉄のレオロジーをミクロな素過程から総合的に解明し、内核での物質流動の正確な評価を確立すると共に、内核の異方的構造を生み出すメカニズムの特定を目指す。研究代表者らが独自に開発してきた装置を用いての高温高圧実験・元素拡散実験によって、地球内核を構成するhcp鉄の流動変形のレオロジーを定量的に決定し、内核の異方性形成メカニズムの解明と内核での物質流動の正確な評価法の確立を目指す研究で、地球内核の物性及び流動変形の解明に向けた成果が期待される。
超高速切削過程の高表面活性と塑性衝撃波による高静水圧を用いた先駆的機能面創成

切削速度が被削材の塑性波伝播速度を超える超高速切削過程の切削機構の解明と,超高速切削により新しい切削加工仕上げ面を創成できる可能性について検討した.アルミニウム合金の高速切削過程では,切削速度を高速にすればするほど良好な仕上げ面を創成できること,鉛を用いた超高速切削実験では,切削力は高くなるが,せん断面せん断応力がほぼ0になるという常用の切削理論では説明できない新しい現象が発現することが分かった.切削速度が被削材の塑性波伝播速度を超える超高速切削過程の切削機構の解明と,超高速切削により新しい切削加工仕上げ面を創成できる可能性について検討した.アルミニウム合金の高速切削過程では,切削速度を高速にすればするほど良好な仕上げ面を創成できること,鉛を用いた超高速切削実験では,切削力は高くなるが,せん断面せん断応力がほぼ0になるという常用の切削理論では説明できない新しい現象が発現することが分かった.切削速度が被削材の塑性波伝播速度を越える超高速切削過程の切削現象を実験的に検討するため,環境制御型高速衝撃試験機を開発した.本試験機は,微小の切削工具を内蔵した全質量18gの飛翔容器を,圧縮ガスで発射し高速に加速させ,加工チャンバ内に設置した被削材の一部を削ることで高速切削過程を実現するものである.切削機構を分析する上で重要な切りくずは,飛翔容器内に捕獲する機構である.切削終了後,高速で飛翔する飛翔容器を損傷無しに停止させるため,圧縮ガスを対抗側から噴射する.本試験機は切削雰囲気の影響も考慮できるようにするため,大気から40Paまで環境を制御可能である.今年度は切削速度154m/sを達成した.開発した試験機を用いて,アルミニウム合金A2017と純鉛を被削材とし切削実験を行った結果,以下の知見を得た.塑性波伝播速度が154m/s以上であると推定されるA2017の場合は,切削速度154m/sで,せん断角は40^0に至る程高くなり,薄く,カールしない切りくずが生成する.仕上げ面は切削速度が高速化すればするほど平坦となる.一方,塑性波伝播速度が20m/sから80m/sと推測される純鉛の場合は,極低速切削では良好な仕上げ面が得られるが,切削速度50m/s付近では縮緬状の仕上げ面となり,切削速度が100m/sを超えると仕上げ面表面が溶融しているような性状となった.切りくずは切削速度100m/s付近までは薄く長い切りくずとなるが,これを越えると,切りくずは長くならなくなり,代わりに切りくず幅が顕著に広がるようになる.切りくず厚さは切削速度が増加するほど薄くなるので,せん断角は切削速度138m/sで45^0に至った.これより超高速切削過程では,せん断域の塑性衝撃波により非常に高い静水圧が発生するが,二次元切削の場合は,この高い静水圧を除荷するため切りくずの幅が拡大したと考えられる.切削速度が被削材の塑性波伝播速度を超える超高速切削過程では,せん断域に塑性衝撃波が伝播する.塑性衝撃波が伝播する領域は非常に高い静水圧下で,非常に高いひずみ速度で塑性変形していると考えられる.このため塑性衝撃波を伴う超高速切削による仕上げ面特性は,塑性衝撃波を伴わない場合と大きく異なる特性を有すると推測できる.昨年までは,開発した高速切削試験機(特許取得済み)を用いて,塑性波伝播速度が60m/sから80m/sの純鉛を用いて切削実験を行った結果,切削速度が100m/sを超えると切りくず生成機構が大きく変化することより,超高速切削で塑性衝撃波が実際に発生する証拠の一端を掴んだ.しかしながら,切削力(比切削抵抗)を高精度に計測できなかったため,今年度は計測システムの高精度化を計った.ここでは,切削前後の被削材の形状を計測し,両者の形状の差より真実切取厚さを自動計測する形状測定システムを開発し,また切削力と切削速度の波形を高サンプリングで計測できるように計測システムの改良を加えた.その結果,純鉛を被削材とした場合,切削速度が100m/sを超えると,比主分力が低下し,比背分力は僅かに増加する傾向が分かった.塑性波伝播速度が200m/s程度のアルミニウム合金でも同様の傾向が見られた.高速切削速度域での比主分力の低下は,切削熱による材料の熱軟化が主原因と言える.しかしながら,比背分力の増加,すなわち,超高速切削過程では摩擦角が極端に増加する原因の詳細な解明までは至らなかった.なお,動力計の周波数応答特性は上記切削条件を計測するに十分であることは確認している.さらに高速切削速度域の切削温度を実際に計測するため,工具表面に微細な熱電対を埋め込むセンサ内蔵工具の適応を試みた.ここでは工具表面にセンサ回路パターンとなる微細な溝を超音波加工で高能率に創成する手法として,薄硬質材-薄軟質材積層サンドウィッチ工具を開発し,特許出願した.比切削抵抗の時間変化をより詳細に解析できるよう装置を改良した.A2017-0の高速切削実験では,切削速度60150m/sでは,せん断角は上昇し,比切削抵抗と摩擦角はともに減少し,また切削速度が70m/s

程度までは表層の塑性流動層は確認できたが,切削速度が130m/s程度ではこれは確認できず,また表面粗さも小さくなることが分かった.純鉛を被削材とした超高速切削実験では,切削速度が120m/s程度(塑性波伝播速度の1.5倍程度)を超えると,比主分力も比背分力も急激に増加し,摩擦角は急激に増加し45°に達する現象が分かった.非主分力が急激に増加するのは塑性衝撃波に起因していると推測でき,この高い静水圧により,工具-切りくずの真実接触面積は理論接触面積に漸近するため,工具すくい面上の平均の摩擦応力は純鉛のせん断降伏応力に達する.ところが単純せん断モデルを想定すると,せん断面せん断応力は0になる.これは常用の切削理論では説明できない現象であり,超高速切削過程特有の新たな現象が発現したものと考える.この現象を詳細に検討するためには,切削温度の把握が極めて重要であることが分かり,これを計測するためのセンサの作成手法を検討した.さらに空孔率が20%程度のFe焼結体を切削速度70130m/sで切削実験を行った結果,切削速度が100m/sを超えると比切削抵抗が急激に上昇することが分かった.これはせん断域の空孔が急激に圧縮され,せん断域の材料がバルク材に近づくためと理解できる.また切削速度70m/s程度では塑性流動により表面の空孔は見えないが,切削速度130m/sでは,塑性流動がほとんど起きないため表面に多数の空孔が露出していることも分かった.この現象をシミュレートするため,ポーラス体を含む不均質材のFEM切削シミュレータを開発し,これは材料素材設計にも有効に利用できることを示した.
菌類の種間競争と有機物分解の関係を炭素配分戦略からモデル化する

種間競争は生物群集を形作る上で重要なメカニズムの一つだが、菌類では種間競争を説明する有効なモデルが未だ提案されていない。動物や植物と異なり、生息基質が食物資源でもある菌類の種間競争の理解には、空間獲得競争と資源利用を基軸とした新たなモデルが必要とされている。菌糸体同士が遭遇すると、菌糸体の高密度化や二次代謝物質・酵素の生産、CO2放出が活発になることから、種間競争は菌糸体にとって炭素コストになると考えられている。本研究では、競争時の菌類の炭素配分と資源利用を測定することで競争コストを推定し、有機物分解との関係を含んだ新しい競争モデルを提案する足がかりとする。
放線菌の線状ゲノムの末端タンパクの解析

放線菌は線状ゲノムをもち、そのDNA5'末端にタンパクが結合している。この末端タンパクは線状ゲノムの維持や末端DNAの複製・修復に重要であると考えられている。そこで本研究では、放線菌の末端タンパクを同定及び解析し、線状ゲノムの維持や末端DNAの複製・修復機構などの理解を目指した。放線菌において末端タンパクは単離・精製が非常に困難である。現在までにdenovoprotein sequencingによって解析された例は、唯一、最近になってStreptomyces rocheiのもつプラスミドpSLA2-Sのみである。S.coelicolor A3(2)のもつプラスミドSCP1は356kbあるが、その大きさ故大量回収が困難である。そこで、両末端にSCP1DNA末端断片をもつ7.9kbの線状プラスミドを人為的に作成した。このプラスミドはS.coelicolor A3(2)内で線状で存在するが、中央に位置する複製開始点が環状プラスミド由来だったため非常に不安定であり、細胞内で多コピーで存在しにくかったり、すぐに環状化してしまった。そのため、この人為的なプラスミドから末端タンパクを回収することはできなかった。そこでパルスフィールド電気泳動によってインタクトのSCP1を末端DNAと末端タンパクが結合したままの状態で大量に回収した。このDNA-protein complexからBenzonasesによってDNAを除き、SDS-PAGEによって末端タンパクと予想されるタンパクを回収し、TOF-Massで解析を試みたが、サンプル量の問題から同定には至らなかった。放線菌の線状染色体・線状プラスミドの5'末端には末端タンパク(Terminal protein)が結合している。この結合には末端タンパクと末端配列の相互作用が関与していて、これが末端複製に重要な働きをしていると考えられている。Streptomyces coelicolor A3(2)の線状プラスミドSCP1の全塩基配列356kbがつい最近決定されたが、その最末端配列は他の線状ゲノムと異なるので、相同性から末端タンパク遺伝子を同定することはできない。また、放線菌の末端タンパクは回収が極めて困難であり、解析例も少ない。そこでSDS-PFGEを用いて末端タンパクを単離して、TOF-MS等によるアミノ酸配列の解析を試みた。大量の末端タンパクが結合したままのSCP1 DNAをSDS-PFGEで単離・精製し、nuclease (Benzonase)でDNAのみを分解後、protein sequencerにかけたが、N-末端がブロックされているためか配列を決定できなかった。そこで現在、TOF-MSによる解析を試みている。また、中央に複製開始点を持ち、その両側にSCP1の最末端をもつ小さな線状プラスミドを人為的に作製し、S. coelicolor A3(2)に導入したところ、このプラスミドが線状で複製していることを確認した。このプラスミドはサイズが小さく扱いが容易であるので、このプラスミドの末端に結合している末端タンパクを密度勾配遠心法等によって回収することも試みている。
ペンドレッド症候群の原因となるSLC26A4の高頻出変異による構造障害機序の解明

ペンドレッド症候群は、高度両側性感音性難聴および甲状腺水腫を伴う常染色体劣勢遺伝形式を取る遺伝性疾患であり、その原因遺伝子は主に陰イオントランスポーターであるペンドリンをコードするSLC26A4である。その変異は、先天性難聴の10%を占め、特に高頻度変異であるp.H723Rは、SLC26A4変異を原因とする患者の約50%の頻度占める。本研究では、このp.H723R変異が見られるペンドリンの機能領域であるSTASドメインのX線結晶解析を行い、このp.H723R変異による構造障害メカニズムの解析を目的とした。結晶化には1mg単位の大量の精製蛋白質が必要であるため、SLC26A4のSTASドメイン領域の遺伝子配列を大腸菌大量発現系ベクターに導入し、大腸菌大量発現系の構築を行った。その中で蛍光蛋白質EGFPがSTASドメインのN末端に修飾されたpET28aベクターによる発現を試みたが、発現量が少ないことに加え、STASドメイン領域の顕著な変性が確認された。また、本大腸発現系では大腸菌の発育が悪いため、細胞毒性の可能性を考慮し、コムギ胚芽無細胞発現を試みたが、発現を確認できなかった。さらにN末端にSUMO-Tagを修飾した発現およびT4リゾチームとの融合タイプの発現を試みたが十分な量の発現蛋白質を得ることができなかった。本STASドメインの結晶構造解析はペンドレッド症候群の分子病態を知る重要な研究であるが、世界でまだ成功していない。本研究では主に大腸菌による大量発現系を用いてSLC26A4のSTASドメインの発現実験を一通り試たが、その方法では好ましくないという結論に至った。今後は、培養細胞系などを用いた発現系で発現を試み、結晶構造解析を進めるのが現実的と結論した。ペンドレッド症候群の原因遺伝子の一つであるSLC26A4の遺伝子変異は、先天性難聴の中で10%と高い発生率を占めている。特に人種を問わず高頻度に出現する病的変異p.H723Rは、トランスポーターの内膜側の機能ドメインであるSTASドメイン上に存在し、SLC26A4変異を原因とする患者の約50%の頻度占めている。本研究では、このp.H723R変異が見られるSTASドメインのX線結晶解析を行い、このp.H723R変異による構造障害メカニズムを明らかにすることを目的とし、将来的に高頻度のペンドレッド症候群の患者に有効な分子治療薬の開発に結びつけるものとする。そこで平成26年度では、このSTASドメインの結晶化を最初の目的とし、大腸菌大量発現系ベクターpET15bにSTASドメイン(535-729.aa)のシーケンスを挿入することによる発現系(STAS/pET15b)の構築を行った。また、STASドメインには不安定なループ領域(574-645.aa)が存在するため、結晶化を妨げる可能性を考慮しこれを除いた同STASドメイン領域の発現系(STAS-trunc /pET15b)の構築を行った。それぞれのベクターを大腸菌に形質転換し、目的蛋白質の発現量の確認を行った。STAS/pET15bでは25°Cと37°Cの大腸菌の培養条件下で目的蛋白質の発現を行い、電気泳動による確認を行ったところ、可溶性分画に約90%程度の正常な発現を確認した。しかし、STAS-trunc/pET15bでは、発現蛋白質はほぼ100%が不溶性分画であった。そこでGST融合蛋白質による安定性を高めることを考慮しpGEX-6P-1ベクターに組み換え同発現確認を行ったところ、可溶性分画の発現に成功した。蛋白質の構造解析では良質の結晶を得ることが重要であり、そのためには発現効率の優れた発現系ベクターの構築を慎重に検討しておく必要がある。この視点から本研究では、発現効率のよいベクターを着実に作成していると考えられる。当初の予定では、27年度中に大量精製、結晶化に繋がる発現系ベクターを完成させ、次のステップの大量精製、結晶化実験を開始することであったが、発現した蛋白質が不溶性の結果になったため、ベクターを再度組み換える必要が生じた。そのため本研究は、やや遅れていると評価した。ペンドレッド症候群は、高度両側性感音性難聴および甲状腺水腫を伴う常染色体劣勢遺伝形式を取る遺伝性疾患である。前庭水管拡大および蝸牛低形成を呈し、臨床的に診断される。原因遺伝子は主に陰イオントランスポーターであるペンドリンをコードするSLC26A4が知られており、発症の原因となるその病的変異は、先天性難聴の中で10%と高い発生率を占めている。特に高頻度に出現するSLC26A4遺伝子の病的変異p.H723Rは、本遺伝子変異を原因とする患者の約50%もの頻度を占める著名な病的変異である。本研究では、このp.H723R変異を持つ高頻度のペンドレッド症候群の患者に有効な分子治療薬の開発を視野において、このp.H723R変異による構造障害メカニズムを明らかにすることを目的とし、本研究のp.H723R変異を含むSLC26A4のSTASドメインのX線結晶解析を開始した。X線結晶解析では、結晶化のために大量の精製蛋白質が必要であるため、SLC26A4のSTASドメインの大腸菌の6種類の大量発現系ベクターの構築を行った。

それぞれの大腸菌ベクターを大腸菌Top10に形質転換を行い、IPTG誘導により蛋白質の発現を行い、SDS-PAGEによる発現確認を行った。その結果、蛍光蛋白質EGFPが正常型STASドメインのN末端に修飾されたpET28aベクター(yEGFP-STAS/pET28a)のみ良好なSTASドメインの発現に成功した。本ベクターは、正常に発現すると蛍光シグナルを呈するが、ネガティブコントロールによる変性状態で発現した場合は蛍光シグナルが観られなかった。つまり、蛍光シグナルにより精製のトレースが行いやすく、また安定すると考えらえるため、本研究成果は、EGFP融合型のSLC26A4-STASドメインの大量発現および精製が結晶化が期待できる。蛋白質のX線結晶解析では、良質の結晶を得ることが重要であり、そのために発現効率の優れた発現ベクターの構築が不可欠である。対象とするSLC26A4のSTASドメインは不安定であり、安定した発現が得られるまで、GST融合などベクターの種類を変えて構築を試みる必要があった。yEGFP-STAS/pET28aで発現が成功するまで、全部で6種類のベクター構築を試みたため、当初の予定より時間が掛かった。そのため本研究は、遅れていると評価した。本研究では、SLC26A4の頻出変異であるp.H723R変異が見られるSTASドメインのX線結晶解析を行い、このp.H723R変異による分子病態の機序を構造の切り口から明らかにすることを目的とし、将来的に本変異を持つ患者に有効な分子治療薬の開発に結びつけることを目的とする。現在に至るまで、大腸菌大量発現系ベクターpET15bにSTASドメイン(535-729.aa)の配列を挿入した発現系(STAS/pET15b)の構築、また、STASドメインには不安定なループ領域(574-645.aa)を除いた同STASドメイン領域の発現系(STAS-trunc /pET15b)、GST融合蛋白質による安定性を高めることを考慮しpGEX-6P-1ベクターに組み換え同発現確認を行った。また、無細胞系発現系の構築および発現実験と、N末端領域にEGFPを結合させたベクターの構築とその発現検討実験を行った。しかし、殆どが変性による不溶化および発現不全であった。EGFP融合蛋白質による安定性を高めることを考慮しpET28a-yEGFP融合ベクターに組み換え同発現確認を行ったところ、多少の可溶性分画の発現に成功した。EGFP融合蛋白質による構造の安定寄与が考えられた。しかし、大量発現には達しておらず、依然大量発現のための大きなブレークスルーを必要とする状況である。25度による低温培養化で発現条件の検討を行ったが、大きな改善は観られなかった。以上の経緯より、大腸菌発現系によるSLC26A4のSTASドメインの大量発現は困難であると結論付けた。ヒト由来の蛋白質発現は、HEK293細胞やバキュロウイルス昆虫細胞による発現系が有効であることから、現在、これらの系を構築中である。SLC26A4のSTASドメインおよびそのp.H723R変異配列を組み込んだ大量発現系の構築および発現確認実験は、無細胞系発現ベクターも含めて一通り行ったが、全てが不溶性分画つまり、変性するか、目的蛋白質の発現がほぼ観られないという結果であった。また、本遺伝子のSTASドメイン(p.H723R変異含む)を組み込んだ大腸菌は、何らかの理由により大腸菌培養において正常な増殖が観られず、早い段階で大腸菌が死滅してしまうため、ヒトSTASドメインは大腸菌にとって予期できない増殖阻害が生じた可能性が考えられた。