hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生理活性物質の多重免疫測定法の開発

即ち、大量に入手可能でしかも安価な第二抗体(ホルモン抗体を作製した動物のIgGに対する抗体)をビーズにコートしたものを基本的に使用し、以下の2方法を検討した。方法1:測定対象ホルモン(たとえば2種類)の標識体と標準品との混合物をウェルに入れ、最初のホルモンに対する抗体を加え、ビーズ1を加えて反応後ビーズ1を取り出してカウントし、第二のホルモンに対する抗体をウェルに加え、ビーズ2をくわえて再び反応させ、取り出してカウントする。方法2:第二抗体コートビーズを測定対象ホルモン1,2,..対する抗体の溶液に浸すことでホルモン抗体をビーズに固相化し、標識ホルモンとホルモン標準品の入ったウェルにシリアルに、或いは同時に加え、反応後取り出してカウントする。方法1に関してはラットLH、TSHを順序を入れ替えて試みた結果、ほぼ同じ標準曲線を描くことが出来、がやや手間が掛かる難点がある。方法2については、1/4インチのビーズを使用したシリアルな測定でLH,TSHについて良好な標準曲線が得られ、更に同時測定を行うために1/8インチビーズを用いて試みた結果、LH、FSH、TSH、LHについて一応標準曲線を描くことが出来、この方法をリファインしてmulti-riaのシステムを構築して行くつもりである。同一試料で多数の生理活性物質を同時に測定する多重免疫測定法の開発を目的として研究を行って来た。前年度における検討の結果、1)第一に、第二抗体固相化ビーズに第一抗体を反応させ、競合的結合原理に基づいて測定するRIAを主に検討した。測定対象ホルモンとしてはラットLHSラットTSHをシリアル、及びパラレルに測定し、それぞれに良好な標準曲線を描くことが出来た。シリアルアッセイでは、1/4インチビーズを使用できるため、ゼロ・スタンダードで標識ホルモンの高い結合率を得ることが出来たが、パラレルアッセイでは1/8インチビーズを使用せざるを得ないために、表面積は1/4となり、抗体及びホルモンの結合量は少なくなり、測定値の変動がやや大きくなるきらいがあった。また標準液の濃度の順をLHとTSHで逆にすると、TSH標準品の中に混在する少量のLHのためにLHの標準曲線に大きな影響が現れることが判明した。更にTSH-FSH、TSH-PRL、FSH-LH、LH-PRLの組み合わせについても検討し、このシリアル、及びパラレルのMulti-RIAのプロトコールを作製した。2)第二に今後主流となることが予想される非RI測定法の検討に移った。感度の改善をも狙ってEuを用いたサンドイッチ結合原理による測定法を様々なホルモンについて確立すべく自家製抗体の作製とともに、それを用いて実験を行い、その結果ラットPRL、ラットLH、ラットInsulinに対するウェル第一抗体固相化-Eu標識第一抗体測定系(IFMA,immunofluorometric assay)を確立した。LH測定系はヒツジ、ウシ、ブタLHにも応用可能であり、Insulin測定系についてもヒツジ、ウシ、ブタ、ヒト等のInsulinが高感度(0.1fmol)で測定可能である。
文法と形態論における複合語形成の位置づけ

文法体系における複合語形成の位置づけを明らかにすることを目的として,日本語とベンガル語の形態論を研究した。研究代表者は,日本語に関して,第20回Japanese/Korean Linguistics Conference(オックスフォード大学)において基調講演を行い,日本語には世界諸言語に見られないような特徴的な複合語形成として,「プロカメラマン撮影(のポートレート),一級建築士設計(のビル)」のように他動詞述語が主語と組み合わされる複合語が統語構造で生産的に作られることを述べ,それが主題名詞の特性を描写する「属性叙述機能」を有することを立証した。すなわち,従来論じられてきた名詞+動詞型の複合動詞や名詞抱合が事象叙述文において他動詞と目的語が結合するのに対して,他動詞と主語が結びついた複合語は主語ないし主題名詞の属性を表すという特殊な機能を有する。このことから,複合語形成に対する構造制約は一律ではなく,事象叙述か属性叙述かという叙述機能に応じて異なることが明らかになった。他方,日本語と同じタイプの統語的複合語がインドの言語にも実証できるかどうかを,研究分担者が詳細に調査した結果,ベンガル語およびサンスクリット語においてはそれに相当するものが存在しないことが判明した。その結果,統語的複合語形成(および名詞抱合)は日本語のような膠着型言語(および複総合型言語)に特徴的であり,インド諸言語のような屈折型言語には存在しないという暫定的結論が得られた。研究計画の目的は,モントリオール大学のRajendra Singh教授をリーダーとする研究グループが提唱するWhole Word Morphology(WWM;一体性形態論)という形態論理論(語というものは,内部構造を持たない一体のまとまりである)が普遍的な妥当性を持つかどうかを,系統の異なる日本語(特に複合語形成)について検証し,その結果に基づき,より精度の高い普遍的理論に向けて修正を提案することである。研究代表者(日本語)と研究分担者(ベンガル語)は,まず,相手方の言語の形態論に関する研究文献を検討し,その独自性を理解するよう務めた。同時に,各々の母語について複合語形成のプロセスを細部にわたって検証した。研究代表者は,The Oxford Handbook of Compoundingに所収の"Isolate:Japanese"において,日本語には語彙化されて生産性のないものから,レキシコンあるいは統語構造で自由に作られる生産性の高いものまで様々な複合語が存在することを述べたが,とりわけ,統語構造において名詞が述語に編入される複合語形成がWWM理論にとって反証となる可能性を指摘した。他方,研究分担者は,ベンガル語の複合語およびそれに付随する形態論・音韻論の研究をまとめ,その幾つかを海外で発表した。とりわげ"Bengali Compounds,Are They All Seamless?"(Indo-Aryan Linguistics)において,ベンガル語の複合語が内部構造を持たない一体のものであるかどうかを吟味し,内部構造を持つものがあることを示唆した。現在,日本語の統語的複合語形成と類似の現象がベンガル語にないかどうかを調査中である。当初目的は,すべての複合語がレキシコンで語彙的に作られ,その内部構造は統語的に不可視である(Ford et al.1997など)のか,それとも複合語の中には統語構造で作られるものがあり,それらは内部構造が統語的に見える(Shibatani and Kageyama 1988)のかという理論的問題を日本語およびベンガル語のデータで実証的に解決することであった。平成21年度は,日本語の複合語の特質を考慮しながらベンガル語を調査し,次のような2つの暫定的結論を得た。1つは,ベンガル語には2つの自由要素で構成される複合語が存在することが明らかになった。これらの複合語はレキシコンで作られると想定されるにも関わらず,語内部が分割可能である。これはFord et al.(1997)の主張に対する強い反証となる(Bhattacharja.2009. "Bengali compounds : Are they all seamless?' In Omkar N.Koul(ed.)Indo-Aryan Linguistics)。もう1つは,第二要素が一人前の語でも接尾辞でもない複合語がベンガル語に存在することを明らかにした。これは語彙的複合語にも統語的な複合語にも分類することが困難であり,そのため,従来の語彙的複合語と統語的複合語という分類が不十分である(Bhattacharja.in press. "On the origin of affixal polysemy/homonymy in Bengali" in Annual Review of South Asian Languages and Linguistics 2010)。

他方,日本語と同じタイプの統語的複合語がインドの言語にも実証できるかどうかを,研究分担者が詳細に調査した結果,ベンガル語およびサンスクリット語においてはそれに相当するものが存在しないことが判明した。その結果,統語的複合語形成(および名詞抱合)は日本語のような膠着型言語(および複総合型言語)に特徴的であり,インド諸言語のような屈折型言語には存在しないという暫定的結論が得られた。
クロスカップリングの新方法論:炭素-炭素結合の切断と生成

近年、様々な機能性分子材料や生理活性物質の合成と相まって、効率のよい新規な結合形成反応の開発が、ますます重要な研究課題となっている。本研究では、研究代表者らが最近見出した、炭素-炭素結合および炭素-水素結合の切断と炭素-炭素結合の生成を含む、芳香族化合物や不飽和化合物の新しいいくつかの触媒的カップリング反応を系統的に精査し、より高効率かつ選択的な合成手法へと展開を図るとともに、関連する新規反応の開拓を行うことを目的とする。まず一連の、カルボキシル基やヒドロキシル基を有する芳香族基質およびアルケン、アルキン類を用い、いくつかの後周期遷移金属錯体存在下での触媒反応を検討した。芳香族カルボン酸類と内部アルキンとの反応では、ロジウムあるいはイリジウム触媒を用いることで、炭素-水素結合の切断を伴う酸化的1:1および1:2カップリングが効率良く進行し、それぞれイソクマリンおよびナフタレン誘導体が選択的に生成することが明らかとなった。特に後者の反応において、カルボキシル基は配向基として機能し、位置選択的炭素-水素結合切断を誘発した後、脱炭酸段階で除去される。この特徴を利用した新反応開発を検討したところ、インドールやチオフェン等のヘテロ芳香族カルボン酸類の位置選択的ビニル化およびアリール化が、パラジウム触媒存在下、効果的に進行することを見出した。これら以外の関連するいくつかのカップリング反応についても検討し、幅広い展開に成功した。本研究で得られた成果は学術論文への掲載および学会発表により、国内外に広く公表した。交付申請書に記した様に、まず一連の、カルボキシル基やヒドロキシル基を有する芳香族基質およびアルケン、アルキン類を調製または購入し、いくつかの後周期遷移金属錯体(金属:パラジウム、ロジウム、イリジウム、ルテニウム)存在下での触媒反応を検討した。その結果、芳香族カルボン酸類と内部アルキンとの反応において、炭素-水素結合の切断を伴う1:1カップリングによるイソクマリン誘導体の生成と、炭素-炭素結合および炭素-水素結合の切断を伴う1:2カップリングによるナフタレン誘導体の生成が競合して起こることが明らかとなった。この反応は、用いる錯体触媒の中心金属、配位子、および添加剤の種類により、生成物比が大きく変化し、いずれの誘導体も選択的に得ることが可能となった。一方、ジフェニルチエニルメタノール誘導体の芳香族ハロゲン化物による炭素-炭素結合および炭素-水素結合の切断を伴うアリール化反応では、2-チエニル体と3-チエニル体で反応パターンが大きく変化し、チオフェンの異なる二種のジアリール化体が選択的に得られる系を見出した。さらに芳香環基が置換したプロパルギルアルコールの反応ではシリルアセチレンとの反応が炭素-炭素結合および炭素-ケイ素結合の切断を伴ってクロスカップリング反応が進行する新たな触媒反応系の開発に成功した。交付申請書に記した様に、昨年度に続きまず一連の、カルボキシル基やヒドロキシル基を有する芳香族基質およびアルケン、アルキン類を用い、いくつかの後周期遷移金属錯体存在下での触媒反応を検討した。

昨年度見出した、芳香族カルボン酸類と内部アルキンとの反応に加え、その展開としてのトリアリールメタノールを基質に用いる反応を行ったところ、ロジウム触媒および銅酸化剤存在下、炭素-炭素結合および炭素-水素結合の切断を伴う1:2カップリングによるナフタレン誘導体の生成が選択的に起こることが明らかとなった。この反応には、ロジウム触媒配位子として多置換シクロペンタジエンが有効であることがわかった。一方、インドール等のヘテロ芳香族カルボン酸を基質に用いたアルケンによるビニル化反応では、パラジウム触媒および銅酸化剤存在下、カルボキシル基の隣接炭素で選択的に反応が進行した。この反応では、炭素-炭素結合切断を伴う脱カルボキシル化を伴い、結果として通常の直接反応とは異なる置換パターンの生成物を与えた。これはカルボキシル基が配向基ならびに脱離基として機能することを示す結果であり、極めて興味深い。これら以外の関連するいくつかの芳香族カップリング反応についても検討し、成果を論文発表した。
高含有大豆イソフラボン代謝産物を用いた口腔乾燥症に対する効果とその作用機序の検討

本課題ではエストロゲン様作用を示し抗酸化物質である大豆イソフラボンであるエクオールが唾液分泌に与える影響を検討することを目的とした。対象は中高年の女性、無作為プラセボ対照のクロスオーバー比較試験にてエクオール含有イソフラボンサプリメントを摂取することによる唾液分泌量、唾液・尿中酸化ストレス値、主観的評価の変化を検討した結果は実測値を用いた解析において試験食品群では摂取後に唾液分泌量の増加傾向を認め、尿中のエクオール値は有意に増加した。酸化ストレスマーカーはエクオール摂取により減少する割合が増加した。主観的評価では口や歯の調子が悪いことが気になる、便秘、白髪で有意な改善が認められた。唾液分泌障害では著しい口腔の乾燥症状(ドライマウス)を呈するとともに、全身のQOL(Quality of Life)は顕著に低下する。本疾患の要因は様々であり、更年期だけでなく女性に多く発症することから女性ホルモンであるエストロゲンの関与も示唆されているが、その対処法は未だ確立されていない。一方、大豆イソフラボンは大豆胚芽に多く含まれるフラボノイドの一種であり、その化学構造がエストロゲンと類似していることから、エストロゲン受容体(ER)と特異的に結合することで、様々な生物活性を発揮することが報告されており、さらに最近では抗酸化作用も有し、活性酸素・フリーラジカルによる障害に対して抑制的に作用することも知られている。これらのことから、本研究では中高年女性のドライマウス患者を対象とした唾液分泌障害に対する大豆代謝産物による効果の検討を行っている。食品中のイソフラボンの多くは配糖体であり、腸内細菌によりβグリコシダーゼによりアグリコンであるゲニステイン、ダイゼインへ変化し、さらに腸内細菌の影響を受けることでエクオールへと変化する。エクオールに変換可能な腸内細菌の保有率は日本人で約50%と報告されている。ERの親和性はエクオール>ゲニステイン>ダイゼインであることが報告されているが、現在市販されている商品にはエクオールは含有されていない。今年度は、ダイゼイン高含有のイソフラボンをドライマウスを自覚する者(シェーグレン症候群:9名、ドライマウス5名)に1粒/日、連続2ヶ月間摂取することによる摂取前後における唾液分泌量(サクソンテスト)、酸化ストレス(8-OHdG、HEL、PRL)、主観的評価の変化を検討した。結果は、唾液分泌量の有意な差を認め、酸化ストレスは減少傾向を示し、唾液中にはイソフラボンの代謝産物であるダイゼインとゲニステインが明らかに増加した。主観的評価では口が渇く、食事の際に水分が必要に有意に改善を認めた。ドライマウスは唾液分泌量が減少する多因子性の疾患で、口腔乾燥感、飲水切望感、食物摂取困難だけでなく、味覚異常、齲蝕、歯周病や口腔内の疼痛などの誘因となりQOLを著しく低下させることが知られている。本症の病因は未だ明らかではないが、加齢と共に発症率は高くなり、特に50歳代の更年期前後の女性に多く発症する疾患であることが報告されていることや、動物実験においても卵巣摘出したマウスでは唾液分泌量の低下が生じ、これらのマウスにエストロゲンを補充することにより分泌量が改善することも示され、我々の動物実験においても加齢に伴い唾液分泌量が減少するマウスがエストロゲンと競合的に作用するイソフラボンの摂取により明らかに唾液分泌量が改善することを認めた。ヒトにおいては、過去の論文で、更年期障害の患者に行われているエストロゲンの補充療法により口渇感の改善も報告されている。これらのことより、本研究ではドライマウスを呈する閉経後の女性に高含有大豆イソフラボン摂取による唾液分泌量や唾液中の酸化ストレス、主観的評価の変化を確認したが、唾液分泌量や酸化ストレスなどに変化を認めなかった。しかしながら、対象者をイソフラボンの一種であるエクオール産生の有無で分けて解析した結果、主観的評価の項目に有意差を認めた。臨床研究において、対象者とするボランティアの参加者が当初の予定より不足しているため。唾液分泌機能には加齢や酸化ストレスなどの環境要因が関与すると報告されており、重度のドライマウスを呈するシェーグレン症候群(SS)や更年期以降の女性において唾液分泌能の低下が認められている。一方、大豆に多く含まれるイソフラボンはエストロゲンの化学構造と近似していることから、エストロゲンレセプター(ER)を介してエストロゲン様作用を示す物質として報告され、さらにはポリフェノールであるフラボノイドに分類される抗酸化物質としても周知されている。多くの大豆イソフラボン製品は配糖体が多く、腸内細菌や加水分解酵素により非配糖体のアグリコン型であるダイゼインやゲニステイン、エクオールへ分解されることにより更年期障害等の予防、症状軽減に寄与する可能性が期待されている。しかしながら、ERへの結合能が最も強いエクオールを含有している食品についての検討は少ないことやエクオール含有イソフラボンの唾液分泌に及ぼす効果についての介入試験による研究は行われていないことから、本課題では大豆イソフラボンであるエクオールの唾液分泌に与える影響について検討を行うことを目的に、対象を中高年の女性とし、無作為プラセボ対照のプラセボ対照クロスオーバー試験にてエクオール含有イソフラボンサプリメントを摂取することによる唾液分泌量、唾液中の酸化ストレス、主観的評価の変化を検討した。対象者は1日朝・夕食後の2回、1回2錠、食後に試験食品(1錠中にエクオールを2.5mg含)を4錠1ヶ月間継続摂取し、対照食品はエクオールを含有しないものとして同じ方法で1ヶ月間継続摂取した。

結果は実測値を用いた解析において、試験食品群では摂取後に唾液分泌量の増加傾向を示し、唾液中エクオール値は摂取により増加し、主観的評価では口や歯の調子の悪いことが気になる、便秘、白髪などに有意な改善を認め、ストレスマーカーが減少する人の割合いが増加した。本課題ではエストロゲン様作用を示し抗酸化物質である大豆イソフラボンであるエクオールが唾液分泌に与える影響を検討することを目的とした。対象は中高年の女性、無作為プラセボ対照のクロスオーバー比較試験にてエクオール含有イソフラボンサプリメントを摂取することによる唾液分泌量、唾液・尿中酸化ストレス値、主観的評価の変化を検討した結果は実測値を用いた解析において試験食品群では摂取後に唾液分泌量の増加傾向を認め、尿中のエクオール値は有意に増加した。酸化ストレスマーカーはエクオール摂取により減少する割合が増加した。主観的評価では口や歯の調子が悪いことが気になる、便秘、白髪で有意な改善が認められた。臨床研究ではボランティアを募り参加協力して頂き、おおむね計画通りに遂行できていると考えている。今年度はさらに対象者を選定(エクオール産生者を増やす)して、臨床研究の対象者の拡大を図る予定である。対象者人数を増やし、唾液分泌量、摂取後の酸化ストレス等、主観的評価の変動を確認する予定である。医歯薬学今年度も継続して臨床研究を推進する予定である。今年度はアグリコンであるゲニステイン高含有のイソフラボンを摂取することによる唾液分泌量の変化や酸化ストレス、主観的評価の変化を確認することを計画している。臨床研究において対象者の人数が少なかったため。臨床研究の対象者が当初予定していた人数より少なく、使用する物品の購入が少なかったため。現在まで研究に参加された対象者の人数が想定されていた人数に至らなかったこと、さらにデータ解析に時間を要し、動物実験の結果を踏まえて動物実験で得られた結果から対象者の条件や摂取期間を変更して、今後ボランティアを募る予定である。今年度は対象者を増加するため、物品購入額は増える予定である。
ケミカルプレストレスを複合したPRC部材の力学的特性

本研究では、まず膨張コンクリートの利用により鉄筋コンクリートにケミカルプレストレスを導入し、その後PC鋼材を緊張して機械的なプレストレスを導入した新しいタイプのプレストレスト鉄筋コンクリート(PRC)はりの力学的特性を実験的に検討した。実験はT形断面はりを主体とし、1部矩形断面も追加した。また、機械的なプレストレスが与えられた状態での膨張コンクリートの膨張特性およびクリープ特性を検討するため、断面が10×10cm,長さが40cmの角柱供試体による実験を行った。本研究より、次のことが明らかになった。1.膨張作用による圧縮強度の低下がほとんどない単位膨張材量を40kg/【m^3】用いたPRCはりでは、曲げひびわれ発生モーメント,引張鋼材のひずみ曲げひびわれ幅,およびたわみのいずれについても、ケミカルプレストレスの優れた効果が確認できた。2.膨張作用により圧縮強度が約10%低下した単位膨張材量を50kg/【m^3】用いたPRCはりでは、膨張材の使用量の増加に比較して、はりの力学的特性に及ぼすケミカルプレストレスの効果が小さかった。3.ケミカルプレストレスおよび機械的プレストレスが、はりの力学的特性に及ぼす効果は、本研究で開発した、はり断面を積層要素に分割する計算プログラムにより、評価することができた。4.材令1日に与えた機械的プレストレスが75kgf/【cm^2】までの範囲において、膨張コンクリートのクリープと弾性変形を考慮した仕事量は、拘束鋼材比が大きいほど、大きく算定された。このことは、普通コンクリートに比較して、若材令時における膨張コンクリートのクリープとヤング係数が優れていることを示すものと考えられる。
in vitro enChIP法の技術基盤の確立およびゲノム機能解析への応用

本申請課題では、生体内でのクロマチン構造を保存したまま、標的とするゲノム領域を単離する方法として、in vitro enChIP法の開発を進めた。まず、精製CRISPR分子を利用することで、in vitro enChIP法の技術基盤を確立した。次に、in vitro enChIP法と次世代シーケンス解析を組み合わせることで、標的ゲノム領域と相互作用しているゲノム領域を同定することに成功した。さらに、標的ゲノム領域内に存在する遺伝子の発現制御を担うエンハンサー領域を同定することにも成功した。本研究で開発した技術は、ゲノム機能の分子機構の解明に有用である。申請者は、これまでに、生体内でのクロマチン構造を保存したまま解析対象とするゲノム領域を単離する方法の一つとして、enChIP法(engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation)を開発してきた。enChIP法は、ゲノム編集技術で利用されているTALENテクノロジー(TAL蛋白質)やCRISPR系などの人工DNA結合分子のDNA認識領域を利用し、解析対象とするゲノム領域を細胞内でタグ付けした後、当該ゲノム領域を遺伝子座特異的に単離する方法論である。本申請課題では、人工DNA結合分子の細胞内発現を必要としない、in vitro enChIP法の技術基盤を確立する。具体的には、機能分子として精製した人工DNA結合分子と、細胞から抽出・断片化したゲノム複合体を、試験管内で混合後、アフィニティー精製することで、解析対象ゲノム領域を単離する技術を確立する。本年度は、精製したCRISPR複合体(不活性型Cas9蛋白質およびgRNA)を利用したin vitro enChIP法の技術基盤の確立を試みた。まず、不活性型Cas9蛋白質を組換蛋白質としてカイコ発現系で準備し、化学合成したgRNA(IRF-1遺伝子プロモーター領域内の塩基配列に相補的)と機能性複合体を形成させた。次にヒト細胞株から断片化ゲノムを用意し、上記複合体と試験管内で混合させた後、アフィニティー精製することで、CRISPR複合体が結合したIRF-1遺伝子プロモーター領域を単離した。単離効率を評価した結果、Inputの1%の効率で標的ゲノム領域が単離できることが判明した。さらに、バッファー組成の最適化を図ることで、非特異的ゲノム領域の混入を減少させることに成功した。現在、標的ゲノム領域に結合する蛋白質・RNAの網羅的同定を進めている。交付申請記載の研究計画に沿って、CRISPR系を利用したin vitro enChIP法を確立することができた。これまでに、精製したTAL蛋白質を利用したin vitro enChIP法の可能性について検討を行ってきた。本年度は、精製したTAL蛋白質を利用したin vitro enChIP法の技術基盤の確立について検討を行った。その結果、カイコ発現系で準備した組換TAL蛋白質は分解が激しく、現時点では、精製TAL蛋白質をin vitro enChIP法へ利用することは難しいことが考えられた。次に、技術基盤が確立できたCRISPR系を利用したin vitro enChIP法を利用して、細胞内で解析対象ゲノム領域に結合しているDNA・蛋白質・RNAの網羅的同定を進めた。現在、in vitro enChIP法と次世代シーケンス解析を組み合わせることで、解析対象ゲノム領域と相互作用しているゲノム領域(エンハンサー領域など)の同定を進めている。TAL蛋白質を利用したin vitro enChIP法の技術基盤の確立について検討を行った結果、TAL蛋白質は分解が激しく、CRISPR系と比較してin vitro enChIP法への利用が難しいことが考えられた。現在、技術基盤が確立できたCRISPR系を利用したin vitro enChIP法を利用して、細胞内で解析対象ゲノム領域に結合しているDNA・蛋白質・RNAの網羅的同定を進めている。

具体的には、機能分子として精製した人工DNA結合分子と、細胞から抽出・断片化したゲノム複合体を、試験管内で混合後、アフィニティー精製することで、解析対象ゲノム領域を単離する技術を確立する。これまでに、精製したTAL蛋白質やCRISPR系を利用したin vitro enChIP法の可能性について検証を行ってきた。その結果、精製CRISPR分子がin vitro enChIP法に適していることが判明した。次に、技術基盤が確立できたCRISPR系を利用したin vitro enChIP法を利用し、細胞内で解析対象ゲノム領域に結合しているDNA・蛋白質・RNAの網羅的同定を進めた。in vitro enChIP法と次世代シーケンス解析を組み合わせることで、標的ゲノム領域と相互作用しているゲノム領域を同定することができた。さらに、標的ゲノム領域に存在する遺伝子の発現制御を担うエンハンサー領域を同定することも成功した。本申請課題では、生体内でのクロマチン構造を保存したまま、標的とするゲノム領域を単離する方法として、in vitro enChIP法の開発を進めた。まず、精製CRISPR分子を利用することで、in vitro enChIP法の技術基盤を確立した。次に、in vitro enChIP法と次世代シーケンス解析を組み合わせることで、標的ゲノム領域と相互作用しているゲノム領域を同定することに成功した。さらに、標的ゲノム領域内に存在する遺伝子の発現制御を担うエンハンサー領域を同定することにも成功した。本研究で開発した技術は、ゲノム機能の分子機構の解明に有用である。次に、TAL-DNA認識ドメインを利用したin vitro enChIP法の技術基盤を確立する。CRISPR系を利用したin vitro enChIP法の開発経験を基に、技術基盤の確立を進める。これまでの予備実験から、カイコ発現系で準備したTAL蛋白質の精製組換蛋白質は分解が多いことがわかっている。何種類かのTAL-DNA認識ドメインを組換蛋白質として用意することで、TAL-DNA認識ドメイン構造の違いによる蛋白質分解への影響を評価するとともに、標的ゲノム領域の単離効率について検討していく。必要であれば、蛋白質発現系の検討も行う。これまでの実験から、CRISPR系を利用したin vitro enChIP法は、1%程度の効率で、解析対象ゲノム領域を単離できることが判明している。そこで、実験系(細胞数など)を最適化しつつ、細胞内で解析対象ゲノム領域に結合しているDNA・蛋白質・RNAを網羅的に同定する。
生体組織を構成する微細要素における力学的適応に関する研究

腱や靭帯は直径100μm程度のコラーゲン線維束,直径1μm程度の線維,直径50500nmの原線維の順に階層構造をとっている.また,線維束は多数の線維や原線維とそれらの間を満たしているプロテオグリカンなどの線維間物質で構成されており,外周はEndotenonと呼ばれる薄い膜状の組織に包まれている.このため,腱や靭帯の基本的な性質を把握するには,これら微細構成要素レベルでの構造と力学的性質の関係を明らかにすることが重要である.本研究では,マウス尾腱より摘出した線維束を撹搾装置にかけて,水流により線維間物質を除去した.この試料について,引張試験を行なうとともに,走査型電子顕微鏡や原子問力顕微鏡による微細構造観察を行い,線維や原線維と線維間物質の間の力学的相互作用について検討した.さらに,攪拌により分離した原線維の引張試験を行い,原線維と線維束の力学的関係について検討した.その結果,水流によって線維間物質が線維束より除去されると,線維束は原線維のレベルにまで分離されて,原線維同士の繋がりが無くなり,線維束の引張強度が低下することが明らかになった.このことから,線維間物質は,原線維の周りを取り囲むように存在して原線維同士を結合し,線維束の長軸方向の力学的性質に大きな影響を及ぼしていると考えられる.また,原線維の引張強度は86.3±8.2MPa(Mean±S.E.)で,線維束の引張強度の3.3倍と著しく大きくなった.以上の結果より,線維束の破断時には原線維が破断するのではなく,原線維同士を結合している線維間物質の部分で破断が起こると考えられる.腱や靭帯は直径100μm程度のコラーゲン線維束,直径1μm程度の線維,直径50500nmの原線維の順に階層構造をとっている.また,線維束は多数の線維や原線維とそれらの間を満たしているプロテオグリカンなどの線維間物質で構成されており,外周はEndotenonと呼ばれる薄い膜状の組織に包まれている.このため,腱や靭帯の基本的な性質を把握するには,これら微細構成要素レベルでの構造と力学的性質の関係を明らかにすることが重要である.本研究では,マウス尾腱より摘出した線維束を撹搾装置にかけて,水流により線維間物質を除去した.この試料について,引張試験を行なうとともに,走査型電子顕微鏡や原子問力顕微鏡による微細構造観察を行い,線維や原線維と線維間物質の間の力学的相互作用について検討した.さらに,攪拌により分離した原線維の引張試験を行い,原線維と線維束の力学的関係について検討した.その結果,水流によって線維間物質が線維束より除去されると,線維束は原線維のレベルにまで分離されて,原線維同士の繋がりが無くなり,線維束の引張強度が低下することが明らかになった.このことから,線維間物質は,原線維の周りを取り囲むように存在して原線維同士を結合し,線維束の長軸方向の力学的性質に大きな影響を及ぼしていると考えられる.また,原線維の引張強度は86.3±8.2MPa(Mean±S.E.)で,線維束の引張強度の3.3倍と著しく大きくなった.以上の結果より,線維束の破断時には原線維が破断するのではなく,原線維同士を結合している線維間物質の部分で破断が起こると考えられる.腱や靭帯などの生体組織は,階層構造をなしており,コラーゲン線維束,線維,原線維やそれらを包む膜状の腱鞘からできている.このため,腱や靭帯の力学的反応を把握するには,これら微細構成要素の構造と力学的性質の関係を明らかにすることが重要である.そこで,本研究では,ラットやマウスの腱・靭帯を微細構成要素に分解して,それら構成要素の力学的性質と構成要素同士の力学的相互作用について検討し,力学的環境の変化に対する生体組織の適応制御のメカニズムを解明することを目指している.本年度は,腱や靱帯の微細構成要素であるコラーゲン線維の微細構造と力学的性質の関係を解析するための手法を確立した.微分干渉顕微鏡,近赤外微分干渉顕微鏡,プローブ顕微鏡を用いて,ラットやマウスより摘出した尾腱,膝蓋腱の微細構造を観察し,構成する微細要素であるコラーゲン線維束,コラーゲン線維およびそれらを包む膜状の腱鞘などの関係を正確に把握するとともに,顕微鏡観察下で,これら微細構成要素を腱や靭帯から摘出することができた.また,我々が開発したマイクロ力学試験装置を用いて,得られた試料の微細構造を微分干渉顕微鏡で観察しながら引張試験を行うことができた.腱や靭帯は直径100μm程度のコラーゲン線維束,直径1μm程度の線維,直径50500nmの原線維の順に階層構造をとっている.また,線維束は多数の線維や原線維とそれらの間を満たしているプロテオグリカンなどの線維間物質で構成されており,外周はEndotenonと呼ばれる薄い膜状の組織に包まれている.このため,腱や靭帯の基本的な性質を把握するには,これら微細構成要素レベルでの構造と力学的性質の関係を明らかにすることが重要である.そこで本研究では,マウス尾腱より摘出した線維束を攪拌装置にかけて,水流により線維間物質を除去した.この試料について,引張試験を行なうとともに,走査型電子顕微鏡や原子間力顕微鏡による微細構造観察を行い,線維や原線維と線維間物質の間の力学的相互作用について検討した.

その結果,水流によって線維間物質が線維束より除去されると,線維束は原線維のレベルまで分離されて,原線維同士の繋がりが無くなり,線維束の引張強度が大きく低下することが明らかになった.このことから,線維間物質は,原線維の周りを取り囲むように存在して原線維同士を結合し,線維束の長軸方向の力学的性質に大きな影響を及ぼしていると考えられる.腱や靭帯は直径100μm程度のコラーゲン線維束,直径1μm程度の線維,直径50500nmの原線維の順に階層構造をとっている.また,線維束は多数の線維や原線維とそれらの間を満たしているプロテオグリカンなどの線維間物質で構成されており,外周はEndotenonと呼ばれる薄い膜状の組織に包まれている.このため,腱や靭帯の基本的な性質を把握するには,これら微細構成要素レベルでの構造と力学的性質の関係を明らかにすることが重要である.本研究では,マウス尾腱より摘出した線維束を攪拌装置にかけて,水流により線維間物質を除去した.この試料について,引張試験を行なうとともに,走査型電子顕微鏡や原子間力顕微鏡による微細構造観察を行い,線維や原線維と線維間物質の間の力学的相互作用について検討した.さらに,攪拌により分離した原線維の引張試験を行い,原線維と線維束の力学的関係について検討した.その結果,水流によって線維間物質が線維束より除去されると,線維束は原線維のレベルにまで分離されて,原線維同士の繋がりが無くなり,線維束の引張強度が低下することが明らかになった.このことから,線維間物質は,原線維の周りを取り囲むように存在して原線維同士を結合し,線維束の長軸方向の力学的性質に大きな影響を及ぼしていると考えられる.また,原線維の引張強度は86.3±8.2MPa(Mean±S.E.)で,線維束の引張強度の3.3倍と著しく大きくなった.以上の結果より,線維束の破断時には原線維が破断するのではなく,原線維同士を結合している線維間物質の部分で破断が起こると考えられる.
遺伝および環境要因を考慮した尿路上皮癌における新たな分子基盤の構築

TP53 codon72および喫煙と体細胞変異との関連:膀胱癌患者の体細胞変異とTP53 codon72に着目し、筋層非浸潤癌においてはArg/ArgおよびArg/Pro患者においてはFGFR3の頻度が有意に高かった。また、Arg/Arg患者ではPIK3CAの頻度が有意に高く、Pro/Proアレルを持つ患者ではRAS変異の頻度が有意に高いことを見出した。筋層浸潤癌においては筋層非浸潤癌と同様でArg/ArgおよびArg/Pro患者においてはFGFR3の変異頻度が高い傾向を認めた。一方RASやPIK3CAおよびTP53の変異頻度とTP53codo72との間には相関を認めなかった。喫煙と体細胞変異との相関を比較すると喫煙者においては筋層非浸潤癌患者および筋層浸潤癌患者双方においてRAS変異の頻度が高い傾向を示した。喫煙とTP53 codon72のアレル情報を統合して比較検討すると筋層非浸潤癌においてはTP53codon72のArg/ArgおよびArg/Proアレルを持つ患者ではFGFR3変異が多いが、非喫煙者ではRAS変異がほとんど見られなかった。Pro/Proアレルを持つ患者では喫煙歴にかかわらずRAS変異が多い結果であった。ジャポニカアレイによる網羅的SNP解析:ジャポニカアレイを用いて網羅的SNP解析を96例について解析を終了している。体細胞変異陽性患者および陰性患者を比較して、変異の頻度に関連するSNPの検索を進めている。TP53codon72および喫煙と体細胞変異との関連について:TP53 codon72と喫煙が筋層非浸潤癌においてRASおよびFGFR3の変異と相関があることを見出した。今後TP53codon72の遺伝子多型や喫煙、体細胞変異が腫瘍免疫環境と関連がないか比較検討する予定である。全ゲノム領域のSNP情報の取得と体細胞変異、免疫環境の関連性の検討について:全ゲノム領域の網羅的SNP解析については96例については解析が終了しており、体細胞変異との関係については比較検討中である。体細胞変異と腫瘍免疫環境における環境要因の影響について:環境要因として喫煙が筋層非浸潤癌においてRAS変異との間に相関があることを見出した。現在HPVなどのウイルス感染が変異や腫瘍免疫環境に関連するか検討中である。以上から概ね順調に進展していると考えている。全ゲノム領域のSNP情報の取得と体細胞変異、免疫環境の関連性について:全ゲノム領域の網羅的SNP解析の結果とターゲットシークエンスで得られた体細胞変異との相関について検討中である。現在候補となるSNPをピックアップしており既報との関連を検討する予定である。今後、腫瘍免疫環境についてはRNA-seq解析やFFPE検体を用いて検討する予定である。また膀胱癌におけるHPVなどのウイルス感染の頻度をRNA-seqデータを用いて評価し頻度を検討中である。ウイルス感染と体細胞変異との関連や腫瘍免疫環境との関連について比較検討する予定である。

現在候補となるSNPをピックアップしており既報との関連を検討する予定である。体細胞変異と腫瘍免疫環境における環境要因の影響について:環境要因として喫煙が筋層非浸潤癌においてRAS変異との間に相関があることを見出した。今後、腫瘍免疫環境についてはRNA-seq解析やFFPE検体を用いて検討する予定である。また膀胱癌におけるHPVなどのウイルス感染の頻度をRNA-seqデータを用いて評価し頻度を検討中である。ウイルス感染と体細胞変異との関連や腫瘍免疫環境との関連について比較検討する予定である。当初、予定していた消耗品等が年度末で品切れだったため購入ができなかったため。年度が変わり品物の手配が付き次第購入する。
In vitro眼疾患プラットフォームの構築

本年度は、主に網膜色素上皮細胞(RPE)層の評価、および摘出ブタ眼球を用いた人工まぶたの評価を検討した。RPE層の評価では、まず、ポーラス膜で上層と下層の流路が隔てられた2層式の流路チップの上層流路側にRPE層を形成させた。その後、上層流路に蛍光デキストラン(70kDa)を導入したところ、下層流路では蛍光デキストランはほとんど検出されず、RPE層のバリア機能形成が示唆された。また、24時間の疑似低酸素負荷を与えた後に同様の実験を行ったところ、下層流路において蛍光デキストランはほとんど検出されず、当該条件ではRPE層のバリア機能破壊がほとんど進行しないことが示唆された。一方で、当該条件で培養したRPE層からの血管内皮増殖因子(VEGF)の分泌を評価したところ、コントロールに対して有意な増加が確認され、24時間程度の疑似低酸素負荷はRPE層の構造的な変化までは誘発しないが、サイトカインの分泌に影響を及ぼすことが示唆された。次年度は、昨年度作製した人工脈絡膜へのRPE層の集積を検討する予定である。人工まぶたの評価では、まず昨年度作製した人工まぶたを摘出ブタ眼球上に設置し、40kPa以上の接触圧で作動させたところ、ウェット条件では角膜表面に変化は認められなかった。一方で、ドライ条件で同様の実験を行ったところ、角膜表面に傷の形成が確認された。Ex-vivoモデルで人工まぶたの動作することがわかったので、次年度は3次元角膜培養モデルへの人工まぶたの搭載を検討する予定である。当初の計画通り研究が進行しているため。大幅な研究計画の変更は考えておらず、当初の計画に沿って研究を遂行する。本年度は、主に人工脈絡膜の作製、および人工まぶた用のリニアアクチュエータの作製を検討した。人工脈絡膜の作製には、チャネル間にマイクロポストアレイを形成したポリジメチルシロキサン(PDMS)製の流路チップを用いた。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)、ヒト肺線維芽細胞(NHLF)を懸濁させたフィブリノーゲンとトロンビンの混合溶液を中央と両脇のチャンネルにそれぞれ注入し、ゲル化させた後、培養液で満たした。HUVECは単独培養においては、播種直後粒状であり時間の経過とともに細胞の伸長のみが観察された。一方でHUVECとNHLFの共培養においてはHUVECが単独培養のものよりも早く成長し、細胞同士が結合して毛細血管網を形成することが観察された。この作製した血管において蛍光粒子を導入したところ、血管内に粒子が流れる様子が観察されたことから管腔構造が形成されていることが示唆された。リニアアクチュエータの各パーツは3Dプリンタを用いて作製した。これらをPC制御されたDCモーターに接続することで、健常者およびドライアイ患者のまばたきを模した水平運動を可能にした。予備検討として、PDMSヘッドを取り付けたリニアアクチュエータを、線維芽細胞を培養した基板上で作動させたところ、細胞形態に大きな変化は観察されなかった。しかしながら、現状のシステム構成では細胞表面に作用する応力は不明であり、今後圧力センサの集積を検討する予定である。
ポリマー固定化キラルルイス酸による触媒的不斉アルドール反応

計画通り、式(1)で合成したポリマー同定化キラルルイス酸を用いて、式(2)の反応に適用し、THFを溶媒として、ca、90%eeのアルドール体合成に成功した。均一系での結果がポリマー系でも再現できることが判明した。しかしながら、反応は触媒的には進行せず、今後の問題も明らかになった。現在、さまざまな改善を試みている段階である。2.さらに同系列の不斉アルドール反応の研究の一環として、均一系キラルボランを開いて、不斉アルドール反応とそれに続く不斉還元が同一キラルボランで連続して起こる系を開発し、天然物(1S、3S、5R)-1,3-Dimethyl-2,9-dioxabicyclo[3、3、1]nonaneに適用し、きわめて短いルートでその全合成を達成させた。不斉収率は94%eeであった。
分娩麻酔による局所麻酔薬母体血中濃度が新生児神経行動に及ぼす影響

硬膜外麻酔や脊髄くも膜下麻酔による無痛分娩は年々増加の一途をたどり、近年わが国においても一般に知られるようになってきた。一方、麻酔薬を中心とする無痛分娩は、わが国ではほとんど知られておらず、その薬理的作用が胎児・胎盤循環および母体に与える影響がはっきりとしていないために敬遠されがちであるのも現状である。日本における無痛分娩を広く、より安全に行うためには麻酔薬が胎児・胎盤循環および母体に与える影響に関して詳細に研究を重ねる必要があると考えられる。臨床的な報告は欧米でも認められるが、これらに関して詳細に検討が行われた報告はなく、明らかになっていない。このためには、麻酔薬の母体、胎児・胎盤循環に与える影響を詳細に調べ、その有益性を妊婦に提示することで無痛分娩の理解を深めていくことが重要である。今回の研究では母体、臍帯血中の麻酔薬濃度を測定し、無痛分娩における至適麻酔薬投与量の決定を行う。同時に、無痛分娩によって得られる母体の満足度や、新生児アプガースコア、臍帯血ガス分析、新生児行動学的評価等によってその影響を評価した。妊婦における局所麻酔薬・麻薬の総投与量と新生児神経学的行動検査(NACS)、新生児アプガースコア、臍帯血ガス分析に関して、影響を与えることはなかった。さらに、無痛分娩による満足度調査からより選択的神経遮断を行うべきだと考え、より少ない局麻濃度を用いることによって、その危険性を減少させることが出来、かつ血中濃度も有意に減少させることが出来た。無痛分娩を受けた症例全例において、安全な麻酔管理が行われた。現在、論文作成中である。無痛分娩による分娩は年々増加の一途をたどり、近年わが国においても一般に知られるようになってきた一方、麻酔薬を中心とする無痛分娩は、わが国ではほとんど知られておらず、その薬理的作用が胎児・胎盤循環および母体に与える影響がはっきりとしていないために敬遠されがちであるのも現状である。一方、妊娠・分娩による合併症の頻度は依然として高率であり、妊娠中毒合併症例や心疾患合併例ではその死亡率も数%に上っているのが現状である。これらの症例に対して、麻酔薬による無痛分娩と分娩管理を行うことが出来れば、安定した循環動態を維持しながらスムーズに分娩を行うことが出来、母体および胎児の合併症・死亡率等を減少させえるものと考えられる。同時に、無痛分娩によって得られる母体の満足度や、新生児アプガースコア、臍帯血ガス分析、新生児行動学的評価等によってその影響を評価する。現在まで、血中濃度測定のため微量生体試料測定解析装置整備し、高速液体クロマトグラフィーによる薬剤濃度の適正について、試験段階的に機器の精密度を測定している。また、妊婦における局所麻酔薬の総投与量と新生児神経学的行動検査(NACS)に関して、影響を与えるような結果はでていない。今回の研究でに母体、臍帯血中の麻酔薬濃度を測定し、無痛分娩における至適麻酔薬投与量の決定を行う。現在まで、血中濃度測定のため微量生体試料測定解析装置整備し、高速液体クロマトグラフィーによる薬剤濃度の適正について、試験段階的に機器の精密度を測定し症例を重ねている。また、妊婦における局所麻酔薬の総投与量と新生児神経学的行動検査(NACS)、新生児アプガースコア、臍帯血ガス分析に関して、影響を与えることはなかった。

一方、麻酔薬を中心とする無痛分娩は、わが国ではほとんど知られておらず、その薬理的作用が胎児・胎盤循環および母体に与える影響がはっきりとしていないために敬遠されがちであるのも現状である。日本における無痛分娩を広く、より安全に行うためには麻酔薬が胎児・胎盤循環および母体に与える影響に関して詳細に研究を重ねる必要があると考えられる。臨床的な報告は欧米でも認められるが、これらに関して詳細に検討が行われた報告はなく、明らかになっていない。このためには、麻酔薬の母体、胎児・胎盤循環に与える影響を詳細に調べ、その有益性を妊婦に提示することで無痛分娩の理解を深めていくことが重要である。今回の研究では母体、臍帯血中の麻酔薬濃度を測定し、無痛分娩における至適麻酔薬投与量の決定を行う。同時に、無痛分娩によって得られる母体の満足度や、新生児アプガースコア、臍帯血ガス分析、新生児行動学的評価等によってその影響を評価した。妊婦における局所麻酔薬・麻薬の総投与量と新生児神経学的行動検査(NACS)、新生児アプガースコア、臍帯血ガス分析に関して、影響を与えることはなかった。さらに、無痛分娩による満足度調査からより選択的神経遮断を行うべきだと考え、より少ない局麻濃度を用いることによって、その危険性を減少させることが出来、かつ血中濃度も有意に減少させることが出来た。無痛分娩を受けた症例全例において、安全な麻酔管理が行われた。現在、論文作成中である。
魚類における新規光情報伝達系の同定とその機能解析

光は魚類の生殖腺発達や生物時計の同調に関与する最も重要な環境要因のひとつである.光情報は網膜と松果体により受容されると考えられてきたが,魚類の光周反応や遊泳活動リズムの明暗サイクルへの同調が,眼球や松果体を除去した後もみられることから,網膜・松果体以外の光受容器が存在することもまた明らかである.しかしながら,それらの局在と機能については未だ明らかではない.そこで本研究においては,魚類の脳内に存在すると考えられる光受容器の同定を試み,さらにその魚類の光周反応や生物時計の同調における機能について検討することを目的としている.本年度は以下の2項目について検討した.(1)新規光受容タンパク質のcDNAクローニング昨年度に引き続き,新規光受容タンパク質のDNAクローニングを試みた,その結果,アユ松果体より新規のロドプシン(エクソロドプシン),網膜と脳より赤錘体オプシンをコードすると思われるcDNAをクローニングし,それらの全長の塩基配列を決定した.(2)オプシン遺伝子群の発現部位の同定昨年度クローニングされたアユ網膜・脳に発現するロドプシンcDNAの塩基配列から演繹されるアミノ酸配列からデザインされた合成ペプチドを抗原として抗体を作成し,免疫組織化学により脳内にロドプシン免疫陽性細胞が存在することを明らかにした.また,アユ脳内にロドプシンと赤錘体オプシンが,松果体にエクソロドプシンが,網膜にロドプシンと赤錘体オプシンが発現することをRT-PCRにより明らかにした.光は魚類の生殖腺発達や生物時計の同調に関与する最も重要な環境要因のひとつである.光情報は網膜と松果体により受容されると考えられてきたが,魚類の光周反応や遊泳活動リズムの明暗サイクルへの同調が,眼球や松果体を除去した後もみられることから,網膜・松果体以外の光受容器が存在することもまた明らかである.しかしながら,それらの局在と機能については未だ明らかではない.そこで本研究においては,魚類の脳内に存在すると考えられる光受容器の同定を試み,さらにその魚類の光周反応や生物時計の同調における機能について検討する.本年度は以下の2項目について検討した.(1)オプシン遺伝子cDNAクローニング各種オプシンタンパク質の間で保存されたアミノ酸配列から設計された縮重プライマーを用い,脳のトータルRNAを鋳型としてRT-PCR法により脳内で発現しているオプシン遺伝子のcDNAクローニングを行った.その結果,アユにおいては網膜に発現しているロドプシン遺伝子と同一のロドプシン遺伝子が脳内にも発現していることが明らかになった.また,網膜と松果体からも複数のオプシンをコードすると思われるcDNA断片を得た.(2)クリプトクローム遺伝子のcDNAクローニング各種動植物の青色光受容体クリプトクロームタンパク質の間で保存されたアミノ酸配列から設計された縮重プライマーを用い,脳のトータルRNAを鋳型としてRT-PCR法により脳内で発現しているクリプトクローム(Cry)遺伝子のcDNAクローニングを試みた.その結果,Cry2をコードすると思われるcDNA断片を得た.光は魚類の生殖腺発達や生物時計の同調に関与する最も重要な環境要因のひとつである.光情報は網膜と松果体により受容されると考えられてきたが,魚類の光周反応や遊泳活動リズムの明暗サイクルへの同調が,眼球や松果体を除去した後もみられることから,網膜・松果体以外の光受容器が存在することもまた明らかである.しかしながら,それらの局在と機能については未だ明らかではない.そこで本研究においては,魚類の脳内に存在すると考えられる光受容器の同定を試み,さらにその魚類の光周反応や生物時計の同調における機能について検討することを目的としている.本年度は以下の2項目について検討した.(1)新規光受容タンパク質のcDNAクローニング昨年度に引き続き,新規光受容タンパク質のDNAクローニングを試みた,その結果,アユ松果体より新規のロドプシン(エクソロドプシン),網膜と脳より赤錘体オプシンをコードすると思われるcDNAをクローニングし,それらの全長の塩基配列を決定した.(2)オプシン遺伝子群の発現部位の同定昨年度クローニングされたアユ網膜・脳に発現するロドプシンcDNAの塩基配列から演繹されるアミノ酸配列からデザインされた合成ペプチドを抗原として抗体を作成し,免疫組織化学により脳内にロドプシン免疫陽性細胞が存在することを明らかにした.また,アユ脳内にロドプシンと赤錘体オプシンが,松果体にエクソロドプシンが,網膜にロドプシンと赤錘体オプシンが発現することをRT-PCRにより明らかにした.
ヒト線維柱組織の免疫組織化学的研究

正常人眼線維柱組織をロビクリルK4Mに包埋し超薄切片を作り,17種のレクチンを用いてその結合性コロイド金で標識しその局在を電子顕微鏡を用いて観察し次の結果を得た。PHA-E_4,WGA,PNA,RCA120,ConA,DSA,MAM,SSA,LPAは内壁直下の細線維と角強横網の膠原細線維に局在していたが,ConA,ABA,DSAは長周期線維,基底膜,弾力線維細線維とその周辺の細顆粒状物質に局在がみられた。原発開放隅角緑内障,先天並びに若年緑内障,水晶体のう緑内障の線維柱組織を手術により切除し同組織の上述と同様な方法で固定,包埋し超薄切片を作り,I,III,IV,VI型コラーゲン,ラミニン,フイブロネクチン,トロンボスポンジン,トロポエラスチン,エラスチン,ケラタン硫酸,ヘパラン硫酸,コンドロイチン硫酸等の抗体を用いてそれぞれの抗原の局在を電顕を用いて観察し次の結果を得た。原発開放隅角緑内障では正常眼とは異なり,エラスケンの局在は,弾力線維内ばかりではなく内壁直下の細線維内にも屡々認められた。先天,若年緑内障ではエラスチンの局在は正常眼と同程度であったが、原発開放隅角緑内障とは異なりリフイブロネクチンの内皮網内への局在が顕著であった。水晶体のう緑内障では水晶体のうばかりではなく隅角組織のPE物質内にもエラスチンの局在が顕著であった。内服したブタ膵臓エラスターゼの効果をみるため,線維柱組織切片をエラスターゼ並びに抗トリプシン-エラスターゼ複合物で処理した後,先述の方法でエラスチンを染色した所,両者ともかなり低濃度に至る迄線維柱組織のエラスチンを消化することが判明し,このエラスターゼが緑内障の治療剤になる可能性があることが判明した。