hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多機能性ペプチドのナノ構造制御による細胞剥離ファイバーの開発

細胞の回収技術として、蛍光抗体で細胞をラベルして分離するFACS(Fluorescence-activated cell sorting)や、抗体を結合させた磁気ビーズで分離するMACS(Magnetic cell sorting)などが広く用いられている。しかしながら、FACSは抗体による細胞の前処理が必要であり、MACSは細胞に磁気ビーズが残ることが課題となっている。また、これまで研究されてきた捕捉細胞の剥離方法は、UVやDNaseの利用など、細胞が有する核酸やタンパク質に影響を及ぼす手法が殆どであった。そこで本研究では、基質が細胞外マトリックスにしか存在しない酵素であるIV型コラゲナーゼを細胞回収剤として選択し、ダメージなく細胞を回収することを目的とした。細胞剥離を目的としたコラゲナーゼ認識ペプチドをマイクロファイバーに固定化し、細胞の捕捉を抗体を用いて行った。細胞捕捉に関しては、マイクロファイバーに固定化した抗体の密度に依存すること、また抗体が認識する細胞膜抗原密度に依存することがわかった。剥離に関しては、コラゲナーゼにより剥離が可能であったが、剥離率が50%以下と十分な値でなかったため、コラゲナーゼ認識ペプチドと抗体の間にポリエチレングリコール(PEG)をリンカーとして入れて検討をした。PEGの分子量依存性を検討したところ、分子量が高いと捕捉率が低下することから、最適なPEG鎖長が存在することがわかった。さらに、血中循環がん細胞(CTC)を捕捉・剥離することを第一目的として研究をしてきたが、血液がんである白血病においても白血病細胞の存在量を知ることが治療において重要であることから、白血病細胞をターゲットとして細胞捕捉を行なった。白血病細胞に発現する抗原をターゲットとし、本マイクロファイバーシステムで捕捉、剥離することが可能であることを確かめた。血中循環腫瘍細胞(Circulating Tumor Cell, CTC)は、転移時に血管に浸潤して血液中を流れる細胞であり、癌診断におけるバイオマーカーとして近年注目を集めている。更に、患者によって効果が異なる抗癌剤や分子標的薬の検討を薬剤耐性検査により行うなど、より精度の高い癌治療のためには、回収後の患者由来のCTCを用いた性能評価が必要とされており、特異的に捕捉したCTCを回収可能な手法が求められている。細胞の回収技術としては、FACS(Fluorescence-activated cell sorting)やMACS(Magnetic cell sorting)などが広く用いられているが、FACSは抗体による細胞の前処理が必要であり、MACSは細胞に磁気ビーズが残ることが課題となっている。抗体を用いた表面設計を利用する場合も、捕捉した細胞の剥離時に細胞にダメージが入ることが少なくない。そこで本研究では、細胞に無害な酵素を用いたCTCの回収手法の確立を目的とした。コラーゲン由来の配列を有するペプチドによって基板に抗体を固定化することで、細胞に影響のない酵素であるIV型コラゲナーゼによりペプチドを分解し、抗体で捕捉した細胞を回収することが可能である。24量体のPEGを含み、活性エステル及びマレイミド基を有する二官能性架橋剤と、抗EpCAM抗体を反応させた。その後、ポリスチレンに対して高い吸着能を持つポリスチレンタグとIV型コラゲナーゼで分解するコラーゲン由来の配列を含むペプチド(RIIIRRIRRGGGGPPGVVGEQGEQGPPC)を合成した。このペプチドに抗体を結合させることで、特異的な細胞の捕捉およびコラゲナーゼによって細胞が剥離できることが示された。コラーゲン由来の配列を有するペプチドによって基板に抗体を固定化することで、細胞に影響のない酵素であるIV型コラゲナーゼによりペプチドを分解し、抗体で捕捉した細胞を回収することが可能であることを示せた。昨年度までは、血中循環腫瘍細胞(CTC)をターゲットとして研究をしてきたが、さらなる応用展開のためには、血液中の白血病細胞など、抗体のアフィニテーを用いて、その他の細胞を捕捉の可能性を探る必要がある。そこで、対象のがん細胞を、白血病細胞とし、細胞分離システムの開発を行った。まず、抗体として、anti-CD45抗体を用いた。まず、目的としたEoL1細胞に、CD45の発現を、フローサートメトリーにより確かた。ポリスチレンマイクロファイバーにanti-CD45抗体を固定化することで、EoL1細胞捕捉が可能であった。捕捉されたEoL1細胞の剥離を次に試みた。ペプチドを結合させた抗CD45抗体を固定化した二次元基板による細胞捕捉を試みたが、ペプチドを結合させた抗CD45抗体に対してEoL1細胞の捕捉ができなかった。原因を確認するため、CTCモデルのMCF-7細胞とEoL1細胞のターゲット抗原の発現量を比較した。MCF-7のEpCAM発現量と比較し、CD45の発現量が少なかった。これらの結果より、発現量の少ないターゲット細胞に関しては、抗体の固定化量を増やす必要があると察した。これらの問題点を解決するため、抗体を低分子であるペプチドアプタマーに変更した。ペプチド配列RAL(Arg-Ala-Leu)は、ファージディスプレイによって白血病細胞に吸着する配列として発見されたものであり、我々の実験においてもヒト好酸球由来の白血病細胞であるEoL-1細胞に対してアフィニティがあることが分かっている。このRAL配列およびコラゲナーゼで分解するコラーゲン配列、そしてポリスチレン基板にアフィニティのあるポリスチレンタグをもつペプチドを合成した。現在細胞捕捉と剥離を検討中である。今までターゲットとしてきた血中循環腫瘍細胞(CTC)から他のターゲット細胞においても、同システムで捕捉ができることを示せた。

細胞の回収技術として、蛍光抗体で細胞をラベルして分離するFACS(Fluorescence-activated cell sorting)や、抗体を結合させた磁気ビーズで分離するMACS(Magnetic cell sorting)などが広く用いられている。しかしながら、FACSは抗体による細胞の前処理が必要であり、MACSは細胞に磁気ビーズが残ることが課題となっている。また、これまで研究されてきた捕捉細胞の剥離方法は、UVやDNaseの利用など、細胞が有する核酸やタンパク質に影響を及ぼす手法が殆どであった。そこで本研究では、基質が細胞外マトリックスにしか存在しない酵素であるIV型コラゲナーゼを細胞回収剤として選択し、ダメージなく細胞を回収することを目的とした。細胞剥離を目的としたコラゲナーゼ認識ペプチドをマイクロファイバーに固定化し、細胞の捕捉を抗体を用いて行った。細胞捕捉に関しては、マイクロファイバーに固定化した抗体の密度に依存すること、また抗体が認識する細胞膜抗原密度に依存することがわかった。剥離に関しては、コラゲナーゼにより剥離が可能であったが、剥離率が50%以下と十分な値でなかったため、コラゲナーゼ認識ペプチドと抗体の間にポリエチレングリコール(PEG)をリンカーとして入れて検討をした。PEGの分子量依存性を検討したところ、分子量が高いと捕捉率が低下することから、最適なPEG鎖長が存在することがわかった。さらに、血中循環がん細胞(CTC)を捕捉・剥離することを第一目的として研究をしてきたが、血液がんである白血病においても白血病細胞の存在量を知ることが治療において重要であることから、白血病細胞をターゲットとして細胞捕捉を行なった。白血病細胞に発現する抗原をターゲットとし、本マイクロファイバーシステムで捕捉、剥離することが可能であることを確かめた。細胞の捕捉率はマイクロファイバーへの固定化抗体の密度、およびファイバーの膜厚に依存する。そこで、より高効率の細胞捕捉率をもつファイバーシステムを検証する。また、分離後の剥離効率を、ペプチド配列を変化させることで行い、さらに剥離後の細胞へのダメージの評価、臨床検体を使った診断システム開発を今後の研究で実証していきたい。報告で記載したように、CTC以外のがん細胞や白血球を対象として、細胞を捕捉する可能性を探ったところ、捕捉する細胞により、膜に発現しているタンパク質の量が異なり、これが捕捉率に大きな影響を与えることがわかった。抗体の固定化密度を上げることで、捕捉率をあげることが可能であるため、抗体からペプチドアプタマーへ変更して選択性を見出す。今年度は主に細胞剥離の効率を上げるためのペプチド設計に注力した。PEGをスペーサに入れることで剥離効率が80%まで上げることが可能となった。これからは、血液中に存在するがん細胞の検出システムを検証する。システム作製と動物実験のため、次年度への繰越を行った。
子育て支援推進下における育児休業をめぐる紛争の構造と過程

2018年度は、結婚や出産をめぐって女性労働者と会社が争った三井造船事件、東洋鋼鈑事件、朝霞和光幼稚園事件の3つの裁判例の分析を行い、その結果を学会発表するとともに、学術論文として公刊した。今年度の研究では特に育児休業法や男女雇用機会均等法が成立する以前の事件を分析することで、どのような紛争の歴史の中で、それらの法が制定されていったのかを明らかにするという意義がある。分析結果の概要は、以下の通りである。まず、これらの事件は昭和40年代ごろに生起したものであるが、その当時、性別と並んで年齢も、女性を旗艦的な業務から外す言説として機能していたことが明らかとなった。すなわち、さまざまな属性が駆使されるなかで、性別役割分業が作動していた。こうした分業的な体制に異議を申し立てたのが上記のような事件であり、その際、メリトクラシー論を駆使して性別役割分業的な体制へ女性たちは異議を申し立てていた。つまり、能力に基づく処遇を求めたわけである。しかしながらこの能力論は、たとえば「若い=力強い」といった属性と接合されることによって、分業を維持する言説としても機能していた。最後に、母性を保護する規定も、女性を職業から遠ざけるための言説として機能していたことが明らかとなった。すなわち、母性保護規定を会社が利用することで、女性労働者が望まない処遇をする根拠となっていた。以上のように、今年度は、育児休業法が制定される前の時代に、結婚や育児をめぐって争われた紛争の構造を分析した。当初の計画では、2018年度は、三井造船事件、東洋鋼鈑事件、朝霞和光幼稚園事件の、男女雇用機会均等法や育児休業法制定以前の事件を分析するとしており、その通りに実行することができた。また、学会発表を1回行うとともに、その結果を学術論文として2018年度中に交換することもできたので、上記の通り、「おおむね順調に進展している」と判断した。2019年度は、男女雇用機会均等法や育児休業法が制定される前後の事件を分析する。具体的には、東朋学園事件や日本シェーリング事件などの分析を予定している。これらの事件は、出産休暇等を取得したことにより、賃金や賞与で女性労働者が不利益を被ったために起こされたものであり、紛争がどのような構造をとり、また女性や育児に関する言説がどのように機能したのかを明らかにする。2020年度は、育児休業法制定以後現代までに起こった事件を分析し、現代的な育児休業をめぐる紛争の構造と過程を明らかにするとともに、これまでの研究を総括し、学術論文として公刊する。今年度は本研究開始初年度のため、資料の収集のための旅費等を中心的に計上していたが、資料収集が1回で済んだこと、また、裁判記録など言説資料の保存用のファイルなどをリサイクルで使いまわすなどしたため、次年度使用額が生じた。
視力・視野障害者の日常生活動作における頚部負担の運動学的手法による研究

本研究の目的は、弱視者が文字を読んだり書いたりする動作時の頭頚部の角度や目と文字の距離などを測定し、視力や視野の障害と頭頚部肢位との関連や痛みとの関係を調べることである。今回の調査の結果、弱視者の60%以上の人に頚肩部の筋骨格系の痛みが見られていた。両目の視野が半分以上欠損している視野障害群では多くの机上動作で視力が低いほど有意に目と文字の距離が近づき、頭頚部が前傾姿勢となる傾向が見られたが、視野欠損の少ない人では有意な関係はあまり認められなかった。障害のタイプに合わせた対応や障害補償の必要性が示唆された。平成25年度は測定環境の整備を行い、また倫理委員会承認後に予備測定を開始した。本研究では視覚障害者の頚部に着目し、1.机上動作における頚椎の角度や筋電位を測定、2.障害物のある平地歩行の三次元動作解析を行い頚部とその他身体部位の動きを分析、3.身体情報の基礎データとして関節可動域の検査や頚のレントゲン撮影、アンケートによるQOL調査や筋骨格系の痛みの確認等を予定している。平成25年度には全ての測定開始を予定していたが、3で使用を予定していたレントゲンの撮影装置が平成26年23月に更新され、電子化されることが決まったため、頚のレントゲン撮影を平成26年4月以降から行うことに計画を変更した。また、研究開始当初は2の歩行動作解析を行うシステムとして、本学所有のTOMOCO(東総システム社製)の使用を予定していたが、平成26年度本学に建設される新棟に、グローバルスタンダードとされるVICON(VICON社製)が導入される可能性が高くなったため計画を変更し、平成25年度では歩行解析の測定は行わず、測定環境の整備のみ実施した。1の机上動作における頚部の各測定については、予備測定を開始し、測定環境の検討を繰り返しながら本測定の準備をしている。平成26年度は環境が整ったものから測定を開始する予定である。1.研究目的視覚障害者の日常生活動作(特に机上動作・歩行)と頸部の動きの関係性を、症状のタイプ別に調べ、頸部に負担のかかる動作を検討し、対策を考察する。具体的には、読む・書くなどの机上動作や歩行などの日常生活動作を選び、動作中に頸にかかる負担を調べるため、頸部の角度、角速度、筋電位、三次元動作解析、筋力などを測定する。視覚障害のタイプ別(盲・弱視・視野障害)に健常者(以下晴眼者)と比較し、頸部への負担の予測、痛みへの対策や適切な視覚補助具等を検討するための基礎資料を作ることを目的とする。2.研究の意義・重要性視覚障害と動作との関係についての報告は少なく、研究されている内容は姿勢制御能力の関係を分析したものや日常生活動作との関係を調べた物が中心である。本研究は、視覚障害者の頸部の負担に着目し、その軽減、対策を目的とした新たな視点の研究である。本研究により、視覚障害の症状別に日常生活動作の特徴や頸部負担の実状が明らかになり、その対処方法や各個人に合った視覚補助具の検討をするための基礎資料となることが予想される.3.平成24年度の実績平成24年度は機器類の操作確認や測定項目の検討といった測定環境整備を中心に行った。頸椎の角度・筋電位の予備測定として研究代表者が角度計・角速度計・筋電計を装着し、机上動作や歩行動作を行った。その結果、当初予定していた脊柱形状計測分析器Spinal mouseによる頸椎の角度測定は困難であるとの結論に達した。そのため、他の角度測定方法を再検討し、筋電計と同期可能な2軸角度計および小型モーションレコーダにより頸椎の角度を測定することに計画を変更した。三次元動作解析については、歩行動作解析の予備測定を行った。これについても、障害物のある床での歩行解析について、環境設定の検討を重ねている。次年度からは協力者を募り、上記計画の測定を開始する予定である。本研究では視覚障害者の頚部に着目し、1.机上動作における頚椎の角度や筋電位を測定、2.障害物のある平地歩行の三次元動作解析により頚部とその他身体部位の動きを分析、3.身体情報の基礎データとして関節可動域の検査や頚のレントゲン撮影、アンケートによるQOL調査や筋骨格系の痛みの確認等を行う。平成26年度は上記の研究1と3について調査・測定を開始し、目標被験者数の約4割の測定が終了した。中間結果として、研究1の机上動作については、視力障害者は視野障害者と比べ、書字・読字の際の眼と文字の距離が近く、頭頚部の前屈角度が大きいが、胸腰部の角度は両群ともあまり差がないこと、視覚保障機器の使用により、眼と文字の距離や頭頚部の前屈角度が大きく改善されること、ノート型パソコンよりもディスプレイを分離したPC操作の方が頭頚部の角度や姿勢のしづらさが改善されること、などの傾向がみられた。また研究3の身体基礎情報としては、視力障害者は視野障害者と比べ、頚椎部疾患検査の陽性率が高い、頚部痛のある人が多いなどの傾向がみられた。以上、研究1と3については次年度以降に更に被験者を増やし、視覚障害者の頚部の特徴をまとめ、学会・論文等で発表する予定である。

また研究2について、研究開始当初は歩行の三次元動作解析を行うシステムとして、本学所有のTOMOCO(東総システム社製)の使用を予定していたが、現在本学に建設中の医療新棟に、グローバルスタンダードとされるVICON(VICON社製)が導入される可能性が高くなったため、計画を変更し、平成26年度では歩行解析の測定は行わず、測定環境の整備のみを実施した。本研究の目的は、視覚障害者の日常生活動作(特に机上動作・歩行)と頸部の動きの関係を症状のタイプ別に調べ、頸部に負担のかかる動作を検討し、対策を考察することである。具体的には、読む・書くなどの机上動作時や歩行時に頸にかかる負担を調べるため、頸部の角度、角速度、傾斜角、筋電位、筋力、目と文字の距離などを測定した。机上動作については、1)視覚保障機器なし、2)拡大読書器使用、3)ノートPC操作、4)デスクトップPC操作、5)タブレット端末使用、6)携帯電話使用の6つの環境を設定し、書字・読字・マウス操作などの作業時の頚部の状態を測定した。また対象者の基礎情報(視覚障害の種類や程度、筋骨格系の痛みの有無など)を自記式質問紙にて調査した。これらの結果を視覚障害のタイプ別(視力・視野障害)に2群に分け比較した。その結果、視覚障害者の60%以上の人に筋骨格系の痛みが見られた。視野障害群では多くの作業で視力が低いほど有意に目と文字の距離が近づき、頭頚部が前傾姿勢となる傾向が見られたが、視力障害群では視力の程度と距離や傾斜角との間にあまり関連を認めなかった。その他、自覚的な姿勢のしづらさと視力との間の関係については、あまり関係はみられなかった。本研究の課題と限界について、今回は弱視者を視野50%欠損の有無で2群に分けて比較を行ったが、様々な病態を呈する視覚障害者を2群に分けることは困難であったため、今後は群分けをせず、痛みや視覚障害の程度、肢位との関係についての要因を分析する必要がある。また本研究はサンプルサイズが小さい横断研究である。今後の展望として、本研究により視覚障害者の頚部負担の予測、痛みへの対策や適切な視覚補助具等を検討するための基礎資料を得ることができる。本研究の一部を第16回日本ロービジョン学会学術総会にて報告した。今後論文投稿を予定している。本研究の目的は、弱視者が文字を読んだり書いたりする動作時の頭頚部の角度や目と文字の距離などを測定し、視力や視野の障害と頭頚部肢位との関連や痛みとの関係を調べることである。今回の調査の結果、弱視者の60%以上の人に頚肩部の筋骨格系の痛みが見られていた。両目の視野が半分以上欠損している視野障害群では多くの机上動作で視力が低いほど有意に目と文字の距離が近づき、頭頚部が前傾姿勢となる傾向が見られたが、視野欠損の少ない人では有意な関係はあまり認められなかった。障害のタイプに合わせた対応や障害補償の必要性が示唆された。当初計画では、平成26年度中に測定を全て終了する予定であった。しかし、研究の一部である、歩行動作解析については、当初本学所有のTOMOCO(東総システム社製)を解析に使用する予定であったが、平成27年度に三次元動作解析のグローバルスタンダードとされるVICON(VICON社製)が本学に導入される可能性が高くなったため、計画を変更し、平成26年度は歩行解析の測定は行わず、その他、机上動作の解析(頚の筋電位・角度測定)やQOL調査のみを実施した。以上を考慮して、上記のとおり達成度を評価した。総合領域平成27年度は、VICON導入後に視覚障害者の歩行動作の測定・解析を行う。また平成26年度までに実施した机上動作の測定・解析やQOL調査についても被験者を更に追加し、測定・解析を進める。
無限海遊錯覚と心理状態のリアルタイムフィードバックを用いたVR潜水訓練システム

島国である我が国の周辺海域では,海運,漁業,マリンレジャーなど幅広い分野に渡る活動が行われている.中でも,海難救助活動やサルベージ作業,潜函工事など,海の安全や産業にとって潜水作業は欠かせず,潜水技術を持つ人材の早期育成が求められている.潜水作業にとって,海中の様々な状況を十分に体験し,いかなる状況にも対処できる対応力を身に着けることは必須であるが,プール訓練では状況の再現が難しい.そのため,実地訓練に頼らざるを得ないが,天候や波など,意図した海中状況になるとは限らない.また,訓練中における心理状態の把握が困難で,訓練プログラムや訓練中の指示内容が最適化されていない.以上から,十分な練度に到達するには多大な費用と時間を要する.そこで本研究では,スクーバ潜水訓練を一般プールで低コストかつ高いリアリティで実現可能なバーチャル海中体験環境を構築することを目的とし,本年度は以下の3点を研究課題に設定した.1.運動・生体情報リアルタイム計測システムの開発2.視覚刺激と引き戻し機構による水中無限海遊環境の構築3.提案システムの実装および有効性の検証初年度は,潜水用頭部搭載型ディスプレイの実装と水中で利用可能なモーションキャプチャシステムの導入を行い,潜水状態のユーザの位置・姿勢をリアルタイムに計測し,映像に反映させることに成功した.現在,上記システムの評価・改良を行うと共に,生体情報を計測するセンサの組み込みを進めている.初年度は,潜水用頭部搭載型ディスプレイの設計・実装を行い,水深約4.0mでの動作を確認することができた.また,有線接続部分の接続を改良し,水中における安定した映像出力を実現した.また,水中で利用可能なモーションキャプチャシステムを組み込んだ.低コストで実現するため,通常のモーションキャプチャカメラに収まる水中ハウジングを導入し,映像出力用PCで処理することで,潜水状態のユーザの位置・姿勢をリアルタイムに計測し,映像に反映させることに成功した.これらの装置を用いた動作検証を行い,安定した潜水バーチャルリアリティ体験が可能であることを確認した.運動・生体情報リアルタイム計測システムの開発では,初年度実装したシステムの評価・改良を行うと共に,生体情報計測機能をするセンサを潜水用頭部搭載型ディスプレイに組み込む.具体的には,視線計測ユニット,脈拍・皮膚温度センサをディスプレイに組み込めるサイズとなるよう新たに設計・実装する.また,ディスプレイ筐体もセンサに対応した設計を行い,両社を組み合わせる.モーションキャプチャシステムについては,システムの低コスト化・小型軽量化を進めるため,カメラ台数を最適化すると共に,インサイドアウト方式の導入を検討する.視覚刺激と引き戻し機構による水中無限海遊環境の構築では,水中における空間移動錯覚生成手法に取り組む.まず,視覚誘導性自己運動錯覚および移動方向錯覚それぞれについて,その効果を地上環境と水中環境で比較する.その後,両社を組み合わせることによる空間移動錯覚について,実現可能性および有効性を検証する.さらには,身体引き戻し機構を設計し,模型を用いた検証実験によって機構の有効性,安全性を検証する.提案システムの実装および有効性の検証では,スクーバ訓練の初歩的な技能である「各水深における中性浮力習得」に焦点を当てたバーチャル訓練計画を,専門家の意見を聞きながら設計する.島国である我が国の周辺海域では,海運,漁業,マリンレジャーなど幅広い分野に渡る活動が行われている.中でも,海難救助活動やサルベージ作業,潜函工事など,海の安全や産業にとって潜水作業は欠かせず,潜水技術を持つ人材の早期育成が求められている.潜水作業にとって,海中の様々な状況を十分に体験し,いかなる状況にも対処できる対応力を身に着けることは必須であるが,プール訓練では状況の再現が難しい.そのため,実地訓練に頼らざるを得ないが,天候や波など,意図した海中状況になるとは限らない.また,訓練中における心理状態の把握が困難で,訓練プログラムや訓練中の指示内容が最適化されていない.以上から,十分な練度に到達するには多大な費用と時間を要する.そこで本研究では,スクーバ潜水訓練を一般プールで低コストかつ高いリアリティで実現可能なバーチャル海中体験環境を構築することを目的とし,本年度は以下の3点を研究課題に設定した.1.運動・生体情報リアルタイム計測システムの開発2.視覚刺激と引き戻し機構による水中無限海遊環境の構築3.提案システムの実装および有効性の検証初年度は,潜水用頭部搭載型ディスプレイの実装と水中で利用可能なモーションキャプチャシステムの導入を行い,潜水状態のユーザの位置・姿勢をリアルタイムに計測し,映像に反映させることに成功した.現在,上記システムの評価・改良を行うと共に,生体情報を計測するセンサの組み込みを進めている.初年度は,潜水用頭部搭載型ディスプレイの設計・実装を行い,水深約4.0mでの動作を確認することができた.また,有線接続部分の接続を改良し,水中における安定した映像出力を実現した.また,水中で利用可能なモーションキャプチャシステムを組み込んだ.低コストで実現するため,通常のモーションキャプチャカメラに収まる水中ハウジングを導入し,映像出力用PCで処理することで,潜水状態のユーザの位置・姿勢をリアルタイムに計測し,映像に反映させることに成功した.これらの装置を用いた動作検証を行い,安定した潜水バーチャルリアリティ体験が可能であることを確認した.運動・生体情報リアルタイム計測システムの開発では,初年度実装したシステムの評価・改良を行うと共に,生体情報計測機能をするセンサを潜水用頭部搭載型ディスプレイに組み込む.具体的には,視線計測ユニット,脈拍・皮膚温度センサをディスプレイに組み込めるサイズとなるよう新たに設計・実装する.また,ディスプレイ筐体もセンサに対応した設計を行い,両社を組み合わせる.モーションキャプチャシステムについては,システムの低コスト化・小型軽量化を進めるため,カメラ台数を最適化すると共に,インサイドアウト方式の導入を検討する.

視覚刺激と引き戻し機構による水中無限海遊環境の構築では,水中における空間移動錯覚生成手法に取り組む.まず,視覚誘導性自己運動錯覚および移動方向錯覚それぞれについて,その効果を地上環境と水中環境で比較する.その後,両社を組み合わせることによる空間移動錯覚について,実現可能性および有効性を検証する.さらには,身体引き戻し機構を設計し,模型を用いた検証実験によって機構の有効性,安全性を検証する.提案システムの実装および有効性の検証では,スクーバ訓練の初歩的な技能である「各水深における中性浮力習得」に焦点を当てたバーチャル訓練計画を,専門家の意見を聞きながら設計する.購入物品の価格が予定よりわずかに下がったため,金額に差分が生じることとなり,次年度使用額として残った.次年度の実験に用いる筆記用具代として使用する予定である.
揮発性有機ハロゲン化合物分解・回収による環境破壊防止に関する研究

本研究の目的は,揮発性有機ハロゲン化合物の回収ならびに分解について知見を得ることである。揮発性有機ハロゲン化合物は,先端技術産業において汎用されており,イオウ酸化物,窒素酸化物などの従来型の大気汚染物質に加えて,新たな有害物質として注目されている。なかでも,1,1,1-トリクロロエタンは,オゾン層破壊作用を有するため,モントリオール議定書により西暦2005年までに全廃することが定められている。トリクロロエチレン,テトラクロロエチレンに代表される揮発性有機ハロゲン化合物は、地球環境に大きなインパクトを与えるのみならず,突然変異原性といった生体への影響も無視できない。したがって,環境破壊防止および健康障害予防を指向した揮発性有機ハロゲン化合物の高効率除去・回収技術についての検討が必要である。本年度においては,製造条件の異なる木質炭素材料を創製し,それらへの数種揮発性有機ハロゲン化合物の回収および分解性について検討した。吸着等温線より求めた揮発性有機ハロゲン化合物の吸着量は,焼成時間の長い炭素材料ほど高値であった。すなわち,炭素材料の比表面積ならびに細孔容積といった物理的構造因子が,揮発性有機ハロゲン化合物の吸着量を支配していることが示唆された。また揮発性有機ハロゲン化合物の分解性については,トリクロロエチレン,テトラクロロエチレンではほとんど分解しないのに対し,1,1,1-トリクロロエタンの場合には,分解生成物である塩素イオン量が高値であった。また1,1,1-トリクロロエタンの分解による塩素イオン生成量は,長時間焼成した炭素材料ほど少なく,炭素材料表面の酸性官能基が分解抑制に関与していることが推察された。
次世代医療技術に貢献するスターラーレス電界撹拌技術の開発

本年度は、前年度に引き続き3次元撹拌と2次元回転を融合させた撹拌を実現するための最適容器設計及び電極形状、電界印加方法の検討を行った。昨年度は電界撹拌が可能となる容器を独自に設計し、プラスチック成型によって製作し、閉鎖系で撹拌が行えるようにするため銅プレート電極をインサートした容器の蓋も製作していた。さらに、スイッチング回路によって、任意の電極部に電圧を印加できるPCで制御可能な高電圧スイッチング装置を開発した。このシステムによって電圧を印加する部位が右回り又は左回りに回転するように切り替えを行うことが可能となった。しかし、今後の再現性、簡便性、汎用性を考慮しすると、市販のシャーレ、さらにはスイッチング回路を用いない方法で、3次元撹拌と2次元回転を融合させた撹拌を可能にさせるセットアップ、条件を今年度は検討した。まず、細胞培養はシャーレを恒温、恒CO2濃度のインキュベーションチャンバー内で行うため、比較的コンパクトな電界撹拌セットアップを構築した。その後、数社で市販されているシャーレを用いて電界撹拌が行える条件検討を行なった。今年度からヒト女性由来の培養細胞であるHeLa細胞の培養系を構築し、電界撹拌技術を生きた細胞に導入する実験を行った。生きたヒト培養細胞に対して、48時間以上電界撹拌を行い、その後の細胞の様子を観察し、さらに死細胞の割合の増減を調べた。この実験の結果から、電界撹拌によって、培養細胞が大きな影響を受ける可能性が低いということが見出された。また、細胞培養工程へ導入する前に、まず電界撹拌技術をヒト培養細胞の免疫染色系に導入した。結果として、ヒト培養細胞の染色においても、電界撹拌技術を用いることによって染色時間を短縮することが可能であることを確認した。インキュベーションチャンバー内で行うため、比較的コンパクトな電界撹拌セットアップを構築した。その後、数社で市販されているシャーレを用いて電界撹拌が行える条件検討を行ないことができた。さらに、細胞培養環境を構築させ、来年度から本格的に、細胞培養工程に電界撹拌の導入実験を行える体制を整えることができたため。来年度は、本年度再開発した電界撹拌セットアップ、市販のシャーレを用いて、液滴に上下の振動だけでなく、回転運動を生じさせ、効率よい撹拌を可能とした淀みの無い撹拌を実現するため、電場条件における液滴挙動をマクロ的・ミクロ的視点から解析し、電場条件による挙動のメカニズムを究明し、最適電界条件の検討を行う。さらに、細胞培養工程へ電界撹拌を導入し、静置培養状態と比較する。本年度は、3次元撹拌と2次元回転を融合させた撹拌を実現するための最適容器設計及び電極形状、電界印加方法の検討を行った。まず、電界撹拌を可能にさせる容器の開発を行った。容器底面と側壁との内側境界部分に台座を設けで液がドーム形状となり、電界撹拌が可能となる容器を設計し、プラスチック成型によって製作した。次に、閉鎖系での電界撹拌が可能となるような銅プレート電極をインサートした容器の蓋を設計・製作した。蓋に関しては、平板電極、リング電極、三極分割電極の3種類製作した。そして、製作した3種類の容器を用いて、電界撹拌の条件検討を行った。今回成型した容器のサイズでは液量は1.5mLから2mL程度までが適量であり、平板電極とリング電極容器に関して1.5mLでは矩形波の方が液の動きは大きかったが、2mLではSin波の方が液の動きが大きいことが明らかになった。平板電極とリング電極を比較すると、溶液に吸引力が働く場所の距離が近い平板において、液の動きは若干大きかった。さらに激しく撹拌させるためには、電極間距離を小さくする必要があるということもわかった。高電圧アンプの後に本スイッチング装置を配置し、前述した三極分割電極に対してそれぞれの3極別々に電圧を印加した。この計に対しても電界撹拌条件の検討を行い、電圧±4Kv周波数5hz 1sec切り替え、±電圧4Kv周波数5hz 2sec切り替え、電圧±4Kv周波数6hz 3sec切り替え、電圧±4Kv周波数12hz 0.5sec切り替え等の条件を検討した。各条件においても、液表面が回転するような動きが観察することが出来た。本年度、来年度の計画では3次元撹拌+2次元回転ハイブリッド撹拌における最適容器設計及び電極形状、電界印加方法等の基本セットアップの開発及び挙動のメカニズムを究明となっている。その中で、今年度はまず容器の設計と制作、電極形状の検討・設計・製作、電界印加方法の基本セットアップ(高電圧スイッチング装置も含まれる)の開発を行い、シャーレ型の閉鎖系で、電界撹拌が行えるシステムを開発出来たため。

昨年度は電界撹拌が可能となる容器を独自に設計し、プラスチック成型によって製作し、閉鎖系で撹拌が行えるようにするため銅プレート電極をインサートした容器の蓋も製作していた。さらに、スイッチング回路によって、任意の電極部に電圧を印加できるPCで制御可能な高電圧スイッチング装置を開発した。このシステムによって電圧を印加する部位が右回り又は左回りに回転するように切り替えを行うことが可能となった。しかし、今後の再現性、簡便性、汎用性を考慮しすると、市販のシャーレ、さらにはスイッチング回路を用いない方法で、3次元撹拌と2次元回転を融合させた撹拌を可能にさせるセットアップ、条件を今年度は検討した。まず、細胞培養はシャーレを恒温、恒CO2濃度のインキュベーションチャンバー内で行うため、比較的コンパクトな電界撹拌セットアップを構築した。その後、数社で市販されているシャーレを用いて電界撹拌が行える条件検討を行なった。今年度からヒト女性由来の培養細胞であるHeLa細胞の培養系を構築し、電界撹拌技術を生きた細胞に導入する実験を行った。生きたヒト培養細胞に対して、48時間以上電界撹拌を行い、その後の細胞の様子を観察し、さらに死細胞の割合の増減を調べた。この実験の結果から、電界撹拌によって、培養細胞が大きな影響を受ける可能性が低いということが見出された。また、細胞培養工程へ導入する前に、まず電界撹拌技術をヒト培養細胞の免疫染色系に導入した。結果として、ヒト培養細胞の染色においても、電界撹拌技術を用いることによって染色時間を短縮することが可能であることを確認した。インキュベーションチャンバー内で行うため、比較的コンパクトな電界撹拌セットアップを構築した。その後、数社で市販されているシャーレを用いて電界撹拌が行える条件検討を行ないことができた。さらに、細胞培養環境を構築させ、来年度から本格的に、細胞培養工程に電界撹拌の導入実験を行える体制を整えることができたため。来年度は、本年度開発したシステムを用いて、液滴に上下の振動だけでなく、回転運動を生じさせ、効率よい撹拌を可能とした淀みの無い撹拌を実現するため、電場条件における液滴挙動をマクロ的・ミクロ的視点から解析し、電場条件による挙動のメカニズムを究明し、最適電界条件の検討を行う。また、容器の最適な形状の検討を行っていきたいと考えている。来年度は、本年度再開発した電界撹拌セットアップ、市販のシャーレを用いて、液滴に上下の振動だけでなく、回転運動を生じさせ、効率よい撹拌を可能とした淀みの無い撹拌を実現するため、電場条件における液滴挙動をマクロ的・ミクロ的視点から解析し、電場条件による挙動のメカニズムを究明し、最適電界条件の検討を行う。さらに、細胞培養工程へ電界撹拌を導入し、静置培養状態と比較する。今年度は予算のうち旅費をあまり使用しなかったためである。来年度は対外発表や技術調査のために有意義に使用していきたい。
食習慣を反映するエピゲノムバイオマーカーの開発

食後の高血糖をもたらす食習慣の履歴が、白血球や肝臓などの組織において、炎症関連遺伝子やインスリン抵抗性関連遺伝子の発現応答性の変化として反映されることを、2型糖尿病や肥満モデル動物を用いて明らかにした。高血糖に24時間曝露した単球では、炎症やインスリン抵抗性に関与するTNFα遺伝子のmRNAレベルと、それに伴うヒストンのアセチル化修飾(エピゲノムの変化)が持続的に増大することが明らかになった。ヒトにおける血糖上昇の履歴を示すマーカーとして、耐糖能の低下に関与する肝臓由来マイクロRNAや血漿中の可溶性細胞接着分子が利用できる可能性が示唆された。1.末梢血白血球における炎症関連遺伝子のエピゲノム調節機構の解析:2型糖尿病自然発症モデルラット(OLETF)では、毎日1回の糖経口負荷により糖負荷に対する応答性は徐々に強くなり、8日目では、糖負荷により、末梢血白血球における炎症関連遺伝子IL-1β、TNF-α、S100a8、IL-18の発現が著しく増大することが明らかになった。2.単球様培養細胞における高グルコース刺激による炎症関連遺伝子の発現制御:単球様THP-1細胞を高グルコース条件で24時間培養すると、その後、ヒストンH3のアセチル化修飾が増大するとともに、TNF-αおよびS100a8の発現が増大したが、この発現増大はアセチル化ヒストン結合タンパク質Brd4阻害剤の存在下では完全に抑制された。それゆえ、高グルコース刺激による炎症関連遺伝子の発現制御には、ヒストンコードの変化が関与することが示唆された。3.肝臓におけるALTおよびγ-GTP遺伝子サブタイプのエピゲノム調節機構の解析:C57BL/6J雄性マウスに高脂肪食を80日間投与したところ、肝臓におけるALT-1、ALT-2およびγ-GTP-1遺伝子の発現が増大したが、これらの発現増大は、Brd4ヘテロ欠損マウスでは抑制された。それゆえ、インスリン抵抗性惹起に伴う肝臓ALTおよびγ-GTP遺伝子の発現増大には、ヒストンコードの変化が関与している可能性が示唆された。4.健康診査受診者の末梢血白血球における炎症関連遺伝子の発現を反映するエピゲノムバイオマーカーの開発:健診受診男性1,165名の血球からDNAを抽出し、糖尿病関連遺伝子における潜在的miRNA結合部位における一塩基多型と空腹時血糖値との関連を検討したところ、HNF1B遺伝子のrs2229295およびrs1800929の一塩基多型の組合せが、空腹時血糖値の高値と強く関連することが明らかになった。1.肝臓由来培養細胞における高グルコース刺激による血糖調節関連遺伝子のエピゲノム制御: HepG2細胞を高グルコース環境で培養したところ、hsa-miR-24-3pの発現が低下するとともに、このmiRNAにより3'UTRを介して発現抑制が示されているHNF1B遺伝子のmRNA量が増大し、HNF1Bの標的遺伝子である糖新生律速酵素の遺伝子発現が増大した。それゆえ、肝細胞への高グルコース刺激は、インスリンによる糖新生抑制作用を、エピゲノム調節機構によって減弱させる可能性が示唆された。2.肝臓におけるインスリン抵抗性関連遺伝子のエピゲノム調節機構:C57BL/6Jマウスに高脂肪食を投与して作成したインスリン抵抗性モデル動物では、スクロースの投与によって、HNF1B遺伝子の発現の正の調節因子であるHNF4Aや、ヒストンのアセチル化を促すCBPとp300の遺伝子発現が増大し、インスリン抵抗性の候補遺伝子であるALT-2遺伝子の発現が有意に増大した。一方、アセチル化ヒストン結合タンパク質Brd4のヘテロノックアウトマウスでは、スクロース投与によるこれら遺伝子の発現促進作用が消失した。3.血糖上昇による末梢血白血球における炎症関連遺伝子のエピゲノム制御:2型糖尿病患者14名にα-グルコシダーゼ阻害剤を投与し、食事負荷による血糖上昇を抑制したところ、食事負荷後の末梢血白血球におけるIL-1βとTNF-αの遺伝子発現の増大が抑制された。ヒト単球様THP-1細胞における高グルコース刺激は、TNF-α遺伝子近傍におけるヒストンH3のアセチル化や、Brd4とRNAポリメラーゼIIの当該遺伝子への結合を増大させたが、Brd4阻害剤の存在下では、これらの変化は消失した。それゆえ、末梢血白血球における高グルコース刺激は、エピゲノム制御機構を介してTNF-α遺伝子の発現量を調節することが示唆された。予定していた細胞実験、動物実験ならびに臨床試験が、平行してほぼ順調に進展した。1.末梢血白血球における高グルコース刺激の履歴が炎症関連遺伝子上に維持されるエピゲノム機構の検討: 24時間の高グルコース刺激を受けたヒト単球様THP-1細胞では、その後、低グルコース環境に置かれて4日後でも、TNFα、IL-1β、S100a9ならびにS100a8の遺伝子発現が高いレベルを維持することが明らかになった。高グルコース刺激を短期間受けた細胞では、TNFα遺伝子のプロモータ領域(-400bp)だけでなく、転写領域(+1000bpおよび+2000bp)においても、ヒストンH3のアセチル化の増大が、低グルコース環境に置かれて4日後でも高いレベルに維持されていた。これらの領域では、ヒストンH3のアセチル化との増大と平行してブロモドメインタンパク質Brd4の結合の増大が見られた。それゆえ、末梢血白血球における高グルコース刺激の履歴は、ヒストンH3のアセチル化とそれに伴う転写伸長因子複合体の形成持続機構を介して、TNF-α遺伝子の発現増大を持続させることが示唆された。

2.食後高血糖抑制を目的とした介入試験による炎症関連バイオマーカーの変動:2型糖尿病患者にα-グルコシダーゼ阻害剤を追加投与することによって食事に伴う血糖の振幅を減少させたところ、末梢血白血球におけるTNFα、IL-1βおよびIL-8の遺伝子発現の増大が抑制されるとともに、可溶性細胞接着分子タンパク質であるsE-セレクチンならびにsVCAM-1の有意な低下が見られた。それゆえ、食後高血糖の抑制は、2型糖尿病の発症進展および合併症のリスクを低減させるものと考えられた。食後の高血糖をもたらす食習慣の履歴が、白血球や肝臓などの組織において、炎症関連遺伝子やインスリン抵抗性関連遺伝子の発現応答性の変化として反映されることを、2型糖尿病や肥満モデル動物を用いて明らかにした。高血糖に24時間曝露した単球では、炎症やインスリン抵抗性に関与するTNFα遺伝子のmRNAレベルと、それに伴うヒストンのアセチル化修飾(エピゲノムの変化)が持続的に増大することが明らかになった。ヒトにおける血糖上昇の履歴を示すマーカーとして、耐糖能の低下に関与する肝臓由来マイクロRNAや血漿中の可溶性細胞接着分子が利用できる可能性が示唆された。予定していた動物実験、細胞実験ならびにヒトゲノム疫学研究が、平行してほぼ順調に進展した。所期の計画通りに研究を推進する。28年度が最終年度であるため、記入しない。保健栄養学所期の計画通りに研究を推進する。
Grb14のインスリンシグナル抑制を制御するリン酸化状態の解明と関連因子の探索

Growth factor receptor-binding protein 14(Grb14)はインスリンの刺激に応答し、BPSドメインと呼ばれる領域を介してインスリン受容体の細胞内ドメインと直接的に相互作用し、同受容体の活性を部分的に抑制することが知られている。研究代表者は過去、Grb14のBPSドメイン内部のセリン残基クラスター中の複数のセリン残基がグリコーゲンシンターゼキナーゼ3(GSK-3)によってリン酸化され、インスリン受容体との複合体形成を抑制することかを示唆する結果を得ている。本研究ではこれをさらに掘り下げ、平成28年度、BPSドメイン内部でGSK-3の基質モチーフとなる全てのセリン残基について、GSK-3によるリン酸化の検討と、当該リン酸化がインスリン受容体との複合体形成に与える影響に関するより詳細な検討を行った。平成29年度は、計画申請段階より予定していた「Grb14のインスリンシグナリング調節に関わる脱リン酸化因子の探索」をおこなった。この検討は平成30年度まで継続し、リン酸化ペプチド、およびホスファターゼ阻害剤等を用いた検討から、上記セリン残基クラスターの脱リン酸化へのプロテインホスファターゼ1の関与を示唆する結果を得た。当該年度は上記の検討に加え「Grb14に結合する新規タンパク質の酵母ツーハイブリッドによる探索」も行った。平成30年度はGrb14のインスリン受容体へのリクルートの薬理学的コントロールに関する検討を行った。同一機関内のin silicoでのタンパク質-化合物構造に基づく薬剤探索を専門とする研究者の協力のもと、Grb14とインスリン受容体の相互作用を阻害する新規薬剤を化合物ライブラリよりスクリーニングし、上位20化合物に関して実験的な評価を行った。現在、バリデーションの確認が未完了であるが1種類の化合物に期待された活性が認められた。本研究ではインスリン刺激に応答してインスリン受容体の細胞内ドメインと複合体を形成し、インスリンシグナルを負に制御するGrowth factor receptor binding protein 14 (Grb14)の機能解明に向けた研究を行っている。Grb14の構造はRA、PH、BPS、SH2ドメインの4つのドメインより構成され、うち、BPSドメインは受容体チロシンキナーゼの偽基質として機能することが明らかとなっているが、インスリン刺激に応じたインスリン受容体へのリクルート機構は明らかとなっていない。研究代表者はBPSドメイン内部の偽基質領域近傍に、カゼインキナーゼ2(CK2)およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ3(GSK-3)によりリン酸化を受ける可能性のあるセリン残基クラスターを見出し、本年度はCK2とGSK-3が共役して当該セリン残基クラスターをリン酸化し、インスリン受容体との親和性に影響を与えるかどうかという点を中心とした検討を行った。1)研究代表者は全長のGrb14およびインスリン受容体細胞内ドメインの組換えタンパク質を調製し、Grb14のインスリン受容体への親和性を表面プラズモン共鳴法により解析した。セリン残基クラスターをグルタミン酸で置換したGrb14変異体と野生型を比較したところ。変異体は有意にインスリン受容体に対する親和性が低下した。2)上記セリン残基クラスター由来の合成ペプチドに対してCK2およびGSK-3を作用させ、発光試薬及び質量分析を用いたin vitroキナーゼアッセイを行ったところ、GSK-3による複数のセリン残基のリン酸化が確認された。3)酵母ツーハイブリッドにより、インスリン受容体とGrb14の野生型および変異体の複合体形成を評価したところ、GSK-3の基質となりうるセリン残基上の負電荷が複合体形成に影響を与える可能性が示唆された。本年度、当初の予定通り、Grb14のBPSドメイン内のセリン残基クラスター中の複数のセリン残基が、GSK-3によってリン酸化されることを示唆する結果を得た。また、このリン酸化によって生じる当該セリン残基上の負電荷が、インスリン受容体との複合体形成を抑制することも併せて示唆された。その一方、一般的にGSK-3は、プライミングと呼ばれる予備的なリン酸化を必要とし、CK2はその候補と考えられたが、CK2はこの作業仮説に反し、当該セリン残基クラスター中のGSK-3プライミングサイトとなるセリン残基をリン酸化しないことが示唆された。現在までに、Grb14の機能調節に関わる因子と調節機構の全容を解明できたわけではないが、GSK-3によってGrb14の機能は調節されている可能性が高いことを示唆する複数のエビデンスが得られたため、これらについて論文を投稿し、アクセプトされた。本研究では、インスリンの刺激に応答してインスリン受容体の細胞内ドメインと直接的に相互作用し、受容体の活性化を抑制することが知られているgrowth factor receptor-binding protein 14(以下、Grb14)のリン酸化が、上記の複合体形成に与える影響を検討している。Grb14はBPSドメインと呼ばれる領域を介してインスリン受容体と結合することが知られており、平成28年度はBPSドメイン内部のセリン残基クラスター中の複数のセリン残基がGSK-3によってリン酸化され、インスリン受容体との複合体形成を抑制することが示唆された。平成29年度は、計画申請段階より予定していた1「Grb14のインスリンシグナリング調節に関わる脱リン酸化因子の探索」に加え、昨年度の実施状況報告書に記載した2「Grb14に結合する新規タンパク質の酵母ツーハイブリッドによる探索」を行った。1の検討について、Grb14は、インスリンシグナリング下でグリコーゲン合成に関わるグリコーゲン合成酵素の調節機構と同様のメカニズムにより調節を受けると考えられた。

すなわち、Grb14のGSK-3によるリン酸化はプロテインホスファターゼ1(PP1)により脱リン酸化を受けると考えられた。リン酸化ペプチド、および各種ホスファターゼの選択的阻害剤を用いた検討から、PP1がGSK-3によるGrb14のリン酸化をキャンセルすることが示唆された。2の検討について、Grb14結合性タンパク質を、ヒトnormalized cDNAライブラリおよびヒト肝臓cDNAライブラリ中より、酵母ツーハイブリッド法にて探索したところ、いずれにおいてもポジティブクローンが得られたが、その中にはGrb14の機能調節に関わると期待できる受容体やキナーゼ・ホスファターゼは含まれていなかった。研究実績の概要にて示したように、本年度は本研究計画の申請時、2年目の検討項目として予定していた「Grb14のインスリンシグナリング調節に関わる脱リン酸化因子の探索」を行った。GSK-3のインスリンシグナリングにおける最もよく知られた機能として、グリコーゲン合成酵素のリン酸化によるグリコーゲン合成の抑制が挙げられる。このリン酸化はPP1により脱リン酸化をうけ、グリコーゲン合成酵素は活性化する。インスリン受容体とGrb14の結合の主体であるGrb14のBPSドメインの内部には、グリコーゲン合成酵素の活性調節領域と配列が酷似したリン酸化モチーフが認められる。実際、これらの中のセリン残基はGSK-3によるリン酸化を受け、インスリン受容体との結合が抑制されることをこれまでに明らかとした。Grb14とグリコーゲン合成酵素が同様の活性調節機構を共有しているという仮説に基づけば、Grb14のBPSドメインのGSK-3によるリン酸化はPP1により脱リン酸化を受けると考えられた。そこで、リン酸化ペプチドおよび各種ホスファターゼの選択的阻害剤を用いたペプチドレベルでの検討を行ったところ、HepG2細胞内に上記のリン酸化部位の脱リン酸化を行う酵素が含まれており、その酵素はPP1であることが示唆された。本年度は上記に加え、「Grb14に結合する新規タンパク質の酵母ツーハイブリッドによる探索」を行った。ヒトnormalized cDNAライブラリおよびヒト肝臓cDNAライブラリを対象にGrb14結合タンパク質のスクリーニングを行ったところ、いずれにおいても数十から百数十個のポジティブクローンが得られたが、分析の結果、これらは酵母ツーハイブリッドの偽陽性として知られる遺伝子や転写因子等であり、Grb14の機能調節に関わると期待できる受容体やキナーゼ・ホスファターゼは含まれていなかった。Growth factor receptor-binding protein 14(Grb14)はインスリンの刺激に応答し、BPSドメインと呼ばれる領域を介してインスリン受容体の細胞内ドメインと直接的に相互作用し、同受容体の活性を部分的に抑制することが知られている。
細菌における天然変性蛋白質のヒストンコード機構による形質制御の証明

真核細胞では、分子の一部または全体が特定の高次構造を持たない変性領域となっている天然変性蛋白質が多数見出されており、ヒストンはその代表格である。天然変性領域は様々な分子と結合してその機能を発現すると共に、翻訳後修飾による調節を受ける。細菌では天然変性蛋白質は希である。しかしながら、結核菌のヒストン様蛋白質MDP1は分子内にヒストンと同様の天然変性領域を有するユニークな蛋白質で、結核菌内で翻訳後修飾を受ける。本研究は結核菌の天然変性蛋白質の翻訳後修飾による機能調節を立証することを目的とする。MDP1によるグローバルな細胞機能制御:抗酸菌の野生株およびMDP1欠損株を用いて、菌の発育・生存におけるMDP1の影響を調べた。さらに、質量分析等により、菌の長期生存に関連する細胞内機能に及ぼすMDP1の影響を検討した。その結果、MDP1は定常期に向けて発現量が上昇し、定常期以降の菌の生存率の低下を抑制していることを明らかにした。定常期のMDP1欠損株と野生株の蛋白質発現を質量分析で解析したところ、MDP1がDnaA、Ndh、Fas1等の蛋白質の発現をグローバルに抑制し、複製・エネルギー産生等の細胞機能を抑制すると共に、抗酸菌に抗酸化作用を付与することで、定常期での生存率の低下を防いでいる可能性が示唆された。MDP1機能における天然変性領域の役割:MDP1機能における天然変性領域の重要性を明らかにするため、欠損させた抗酸菌を用いて野生型MDP1または天然変性領域欠損変異体(NTD)の誘導発現系を構築し、菌の表現型を比較解析した。その結果、MDP1が天然変性領域依存的に抗酸菌の染色体を凝集させ、菌の増殖を抑制することを明らかにした。このMDP1の天然変性領域依存的な染色体凝集機序の詳細解析のため、染色体上のMDP1の結合モチーフの網羅的解析を実施すべく研究を進めている。MDP1が抗酸菌の蛋白質発現をグローバルに抑制し、複製・エネルギー産生等の細胞機能を抑制すると共に、菌に抗酸化作用を付与することで、定常期での抗酸菌の生存率の低下を防いでいることを示した。MDP1による天然変性領域依存的な染色体凝集と増殖抑制を明らかにし、MDP1機能における天然変性領域の重要性を示した。現在、野生株、変異MDP1発現株等を用いた抗酸菌染色体上のMDP1の結合モチーフを網羅的に解明するため、実験系の構築を開始している。この様に、研究は概ね順調に進行している。MDP1機能における天然変性領域の重要性をさらに解析する。特に、天然変性領域依存的な染色体凝集の発現機序の解明を目指し、染色体上のMDP1の結合モチーフの網羅的解析を進める。加えて、抗酸菌において、MDP1との関連が報告されているその他の表現型、また染色体の高次構造に影響を受ける可能性が高い表現型について野生株および変異MDP1発現株(新たに作製する変異株を含む)を比較解析する。これにより、MDP1天然変性領域の重要性を順次明らかにしていき、抗酸菌におけるMDP1機能とその中での天然変性領域の役割を網羅的に把握する。MDP1は結核菌内で翻訳後修飾を受けている。質量分析によりMDP1の翻訳後修飾の全容を明らかにする。また、MDP1に修飾を導入する抗酸菌由来の修飾酵素についても同定を試みる。