hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
沈み込み帯深部の超微小鉱物から読む高圧変成岩の詳細変成履歴

古生代日本の形成・発達プロセスを明らかにするため、西南日本外帯に分布する黒瀬川帯中にレンズ状に産するシルル紀花崗岩類(三滝花崗岩類)からジルコンを分離し、LA-ICPMSを用いてU-Pb年代測定を行った。研究試料には、愛媛県西部の三滝花崗岩類模式地の三滝山地域の花崗閃緑岩、九州中央部祇園山地域の花崗閃緑岩、および紀伊半島西部名南風鼻地域の石英閃緑岩とトーナル岩を用いた。1.三滝花崗岩類は成因の異なる少なくとも2種類の花崗岩類から成る。2.三滝花崗岩類のうち、閃緑岩類はどの地域においても約445-435Maの明瞭なピークを持ち、古い粒子は含まないことから、オルドビス紀最末期-シルル紀に形成した新規弧地殻であったと考えられる。本研究で得られた結果とこれまで報告されている研究結果を踏まえると以下のことが考察される。3.トーナル岩に含まれる500Ma以前のジルコンは、約445-435Ma花崗閃緑岩類の元となった弧マグマが貫入・定置することにより融解した既存の大陸/弧地殻岩もしくはその砕屑物に由来すると考えられる。4.トーナル岩中に含まれる900-700Maを示すジルコンは、東アジアで唯一同時期の基盤を持つ南中国地塊の基盤岩から由来したと判断されるので、古生代日本は南中国地塊東縁の弧-海溝系であったと考えられる。5.本研究により、オルドビス紀-シルル紀の南中国地塊東縁の弧-海溝系では当時の弧地殻や堆積体が広く分布していたことが示された。現在の日本列島においてそれら地質体の分布は非常に限られている。恐らくそれらの大部分はシルル紀後の構造浸食によって日本列島の基盤から消滅したと考えられる。(抄録なし)白亜紀に起きた構造浸食プロセスについて読み取ることを目的として、当時の造山運動の各種構成地質体の配列関係が残っている三波川造山帯と四万十造山帯の構成地質体から分離した砕屑性ジルコンの年代頻度分布を比較・検討した。その結果、三波川変成岩および四万十変成岩のみに、ca.1000-2000Maという特徴的な年代のピークが観察されることが分かった。この1000-2000Maに卓越したピークは、南・北中国地塊間の衝突帯からの大量の削剥物質が海溝にもたらされた結果と考えられてきたが、一方で白亜紀前期の造山運動時に前弧域で堆積した砂岩のジルコン年代頻度分布は、(1)南北中国地塊由来の削剥物質がほとんど供給されていなかったこと、(2)後背地には、ca.80-300Maの形成年代を持つ花崗岩バソリス帯が卓越していたことを示している。従って、三波川変成岩および四万十変成岩がもつ1000-2000Maの卓越したピークについては、従来とは異なる地質学的説明が必要であることが分かった。本研究結果とこれまでの研究報告を組み合わせると、おそらく三波川造山運動時に上盤側にあったジュラ紀付加体が下底から構造浸食を被り、その物質が沈み込み帯深部で高圧変成作用を受けて1000-2000Maの卓越したピークをもつ三波川変成岩となったと考えられる。一方、四万十変成岩についても同様に説明され、四万十造山運動初期に大規模な構造浸食が起き、もともと三波川変成岩あるいは三宝山付加体であった物質が沈み込み帯深部で変成作用を受け1000-2000Maのピークをもつ四万十変成岩ができたと考えられる。ただし80Ma以降の原岩については、1000-2000Maのピークが不明瞭になる。おそらくイザナギ-クラ海嶺沈み込みと関係して、古い付加体の大規模構造浸食が進み、リサイクルする物質がきた結果と考えられる。白亜紀の東アジア大陸縁辺部で発達した西南日本の弧-海溝系における陸源性砕屑物の供給パタンの変化を解読することを目的として、三波川造山帯と四万十造山帯の各要素に含まれる砂質岩から分離した砕屑性ジルコンのU-Pb年代頻度分布を比較・検討した。白亜紀前期三波川造山帯:当時の弧内堆積体(豊西層群)、付加体(三宝山帯)および前孤海盆堆積体(領石-物部川層群)のジルコン年代頻度分布を比較すると、どの地質体にも、ca.90-350Maの間の共通のピークが認められるが、弧内堆積体にのみ、約1500-2500Maの特徴的な年代が卓越したスペクトルが観察されることが分かった。この観測事実は、(1)原生代の地質体由来の削剥物質が背弧側には供給されていたが、前弧域にほとんど供給されていなかったこと(2)前弧域には、ca.90-350Maの間に出来た比較的若い弧地殻物質がもたらされていたことを示す。これまでに明らかにされている日本列島周辺の地質構造史を参照すると、約1500-2500Maジルコンはトリアス紀に接合した南・北中国地塊の先カンブリア基盤岩およびジュラ紀付加体から由来したと考えられる。

以上の結果を踏まえると、白亜紀日本の前弧域では、ほぼ直前の時期に出来た弧バソリス域からの砕屑物が主に供給され、原生代の大陸由来の砕屑物がほとんど供給されていなかったことを示す。一方で、背弧側には、原生代の大陸由来の砕屑物が確実に届いていたことから、白亜紀の造山運動により形成された花崗岩バソリス帯(領家-山陽帯や山陰帯)は巨大なバリアとして、原生代の大陸由来の砕屑物質の前弧域への流入を遮断していたと考えられる。このことから同時代の造山帯砂岩であっても、砕屑性ジルコン年代分布が、弧を境に背弧側と前弧側で大きく異なるという例が示された。古生代日本の形成・発達プロセスを明らかにするため、西南日本外帯に分布する黒瀬川帯中にレンズ状に産するシルル紀花崗岩類(三滝花崗岩類)からジルコンを分離し、LA-ICPMSを用いてU-Pb年代測定を行った。研究試料には、愛媛県西部の三滝花崗岩類模式地の三滝山地域の花崗閃緑岩、九州中央部祇園山地域の花崗閃緑岩、および紀伊半島西部名南風鼻地域の石英閃緑岩とトーナル岩を用いた。1.三滝花崗岩類は成因の異なる少なくとも2種類の花崗岩類から成る。2.三滝花崗岩類のうち、閃緑岩類はどの地域においても約445-435Maの明瞭なピークを持ち、古い粒子は含まないことから、オルドビス紀最末期-シルル紀に形成した新規弧地殻であったと考えられる。本研究で得られた結果とこれまで報告されている研究結果を踏まえると以下のことが考察される。3.トーナル岩に含まれる500Ma以前のジルコンは、約445-435Ma花崗閃緑岩類の元となった弧マグマが貫入・定置することにより融解した既存の大陸/弧地殻岩もしくはその砕屑物に由来すると考えられる。4.トーナル岩中に含まれる900-700Maを示すジルコンは、東アジアで唯一同時期の基盤を持つ南中国地塊の基盤岩から由来したと判断されるので、古生代日本は南中国地塊東縁の弧-海溝系であったと考えられる。5.本研究により、オルドビス紀-シルル紀の南中国地塊東縁の弧-海溝系では当時の弧地殻や堆積体が広く分布していたことが示された。現在の日本列島においてそれら地質体の分布は非常に限られている。恐らくそれらの大部分はシルル紀後の構造浸食によって日本列島の基盤から消滅したと考えられる。分析装置の故障やマシンタイムの制約により、研究試料の分析結果を得る時期が、当初の予定よりもやや遅れたため。分析に必要なマシンタイムを確保することができ、研究に必要なデータが順調に得られた。他研究機関所有の装置で分析する場合、装置のトラブルなどで、十分なデータが予定通り得られない場合がある。他機関で分析する場合は、分析装置の状態を確認した上で、分析の予定を組み、装置の状態が悪い、もしくはマシンタイムが混んでいる場合は、他機関に頼らずに分析・解析することができる手法を適宜遂行し、研究に遅れが生じないよう努める。そのような事態になった場合を想定し、装置が復旧する間、装置に依存せず行える研究を即座に遂行出来るよう準備をしておくように努める。(抄録なし)
膀胱直腸障害に関する神経解剖学的研究

膀胱直腸障害に関する基礎研究として,膀胱および直腸の感覚神経の起始細胞の分布と臓器内における感覚神経の走行について,さらに膀胱を支配する自律神経の起始細胞の分布についてWGA-HRPを用いて検索した.実験動物としてはサル,ネコおよびイヌを用いたが,実験結果に明瞭な種差は認められなかった.膀胱にWGA-HRPを注入すると,標識細胞は第12胸髄(Th12)から第4腰髄(L4)および第1仙髄(S1)から第1尾髄の脊膸神経節にみられたが,特にL3とS2の脊膸神経節に多数みられた.次にこれらの脊膸神経節のうちの23分節の脊膸神経節にWGA-HRPを注入すると,標識線維は膀胱の平滑筋層に多くみられ,それらの多くは血管とともに走行していた.標識線維は粘膜固有層にも認められたが,粘膜上皮に達しているものは少数であった.これらの標識線維は仙髄の脊膸神経節にWGA-HRPを注入した例で最も多く観察された.上部直腸にWGA-HRPを注入するとTh12からL4およびS1とS2の,下部直腸にWGA-HRPを注入するとS1からS3の脊膸神経節に標識細胞がみられ,両注入例共にS2を脊膸神経節に最も多数の標識細胞が観察された.次にS1からS3の脊膸神経節にWGA-HRPを注入し,直腸の伸展標本を作成した.粘膜固有層で二分し,漿膜側と粘膜側で観察した.標識線維は粘膜側には少なく,漿膜側で豊富に観察された.直腸全長に多数の標識線維がみられ,そられは神経束を形成したり,あるいは一本から数本の神経として走行し,自由神経終末様構造物も観察された.膀胱の自律神経では,膀胱のWGA-HRP注入例で,下腸間膜動脈神経節に多数の標識細胞がみられ,さらに腰髄部の交感神経幹の神経節にも多数の標識細胞がみられた.副交感神経系としては仙髄の中間外側核に多数の標識細胞が認められ,特にS2の中間外側核に多かった.膀胱直腸障害に関する基礎研究として,膀胱および直腸の感覚神経の起始細胞の分布と臓器内における感覚神経の走行について,さらに膀胱を支配する自律神経の起始細胞の分布についてWGA-HRPを用いて検索した.実験動物としてはサル,ネコおよびイヌを用いたが,実験結果に明瞭な種差は認められなかった.膀胱にWGA-HRPを注入すると,標識細胞は第12胸髄(Th12)から第4腰髄(L4)および第1仙髄(S1)から第1尾髄の脊膸神経節にみられたが,特にL3とS2の脊膸神経節に多数みられた.次にこれらの脊膸神経節のうちの23分節の脊膸神経節にWGA-HRPを注入すると,標識線維は膀胱の平滑筋層に多くみられ,それらの多くは血管とともに走行していた.標識線維は粘膜固有層にも認められたが,粘膜上皮に達しているものは少数であった.これらの標識線維は仙髄の脊膸神経節にWGA-HRPを注入した例で最も多く観察された.上部直腸にWGA-HRPを注入するとTh12からL4およびS1とS2の,下部直腸にWGA-HRPを注入するとS1からS3の脊膸神経節に標識細胞がみられ,両注入例共にS2を脊膸神経節に最も多数の標識細胞が観察された.次にS1からS3の脊膸神経節にWGA-HRPを注入し,直腸の伸展標本を作成した.粘膜固有層で二分し,漿膜側と粘膜側で観察した.標識線維は粘膜側には少なく,漿膜側で豊富に観察された.直腸全長に多数の標識線維がみられ,そられは神経束を形成したり,あるいは一本から数本の神経として走行し,自由神経終末様構造物も観察された.膀胱の自律神経では,膀胱のWGA-HRP注入例で,下腸間膜動脈神経節に多数の標識細胞がみられ,さらに腰髄部の交感神経幹の神経節にも多数の標識細胞がみられた.副交感神経系としては仙髄の中間外側核に多数の標識細胞が認められ,特にS2の中間外側核に多かった.
ケロイドに対する新規分子標的併用療法の開発

ケロイドは、傷を修復する線維芽細胞がコラーゲンを異常産生し、細胞自身が異常増殖することが病因と考えられている。ケロイドにおけるTGF-β、IL-6などの過剰発現が注目されており、それらの経路に対して抑制効果が期待できる分子標的治療薬として、HDAC阻害剤とMEK阻害剤の組み合わせによる影響を検討した。ケロイド線維芽細胞株に対して、まずHDAC阻害剤単剤による濃度依存性の増殖抑制効果とコラーゲン産生抑制効果が認められた。一方、MEK阻害剤の単剤の影響は有意には認められなかった。HDAC阻害剤とMEK阻害剤の併用による影響を検討したが、HDAC阻害剤単剤の効果を上回る結果は得られなかった。申請者らは、このケロイド発症経路に着目した研究を進めてきた。今回、ケロイド抑制に重要な分子として、IL-6、TGF-βに着目し、その経路に対し、私たちが新たに見出した有望な分子標的治療薬(HDAC阻害剤、MEK阻害剤)の組み合わせの検討を行った。まず、ケロイド線維芽細胞に対するHDAC阻害剤(OBP-801/YM753)およびMEK阻害剤(trametinib)のそれぞれ単剤の影響を調べ、さらに、この二剤の組み合わせの条件を検討し、最も細胞増殖抑制効果が高く、コラーゲン合成抑制効果の高い併用条件を見出すことを目標とした。評価項目は、細胞増殖<WST-8アッセイ>、細胞周期<フローサイトメトリー>、コラーゲン産生能<Western blotting>を用いた。細胞はCell Research Corporationからのケロイド由来の線維芽細胞株2種を用いて行った。その結果、HDAC阻害剤(OBP-801/YM753)による細胞増殖抑制効果、コラーゲン合成抑制効果を認めた。MEK阻害剤(trametinib)については、細胞株により増殖抑制効果が認める場合と認めない場合があることがわかった。そして、両者の併用効果については現在検討中である。また、サイトカイン(IL-6、IL-18など)産生能<Western blotting、ELISA、リアルタイムRT-PCR>についても、計画中である。ケロイドは傷を修復する線維芽細胞がコラーゲンを異常産生し、細胞自身が異常増殖することが病因と考えられている。そのケロイド発症経路で重要とされているTGF-β、IL-6経路に着目し、その経路に対し、当施設で見出された有望な分子標的治療薬であるHDAC阻害剤(OBP-801/YM753)とMEK阻害剤(trametinib)の組み合わせによる効果の検討を行った。平成25年度はそれぞれ単剤によるケロイド線維芽細胞に対する効果を検討し、平成26年度にその二剤の組み合わせの条件検討を行った。HDAC阻害剤(OBP-801/YM753)単剤により、TSAと同様に、細胞増殖抑制、コラーゲン合成抑制効果がみられたものの、MEK阻害剤単剤では、細胞増殖並びにコラーゲン合成の抑制効果は弱い印象であった。そして、併用による効果はWST-8による細胞増殖変化、Western Blottingによるコラーゲン蛋白の一つであるCOL1A2で評価した結果、併用により、HDAC阻害剤単剤の効果を上回る併用効果はみられなかった。また、Western Blottingにて薬剤投与によるシグナル変化をみたところ、HDAC阻害剤、MEK阻害剤ともに、ERK阻害剤効果をもつことが確認された。このことから、HDAC阻害剤によるコラーゲンの抑制効果はERK経路とは別の経路阻害による可能性が示唆された。HDAC阻害剤の単剤でのケロイド線維芽細胞に対する効果が確認され、さらに副作用の少ないphytochemicalな薬剤による予防も含めた視野を検討に加えた。そして、HDAC阻害効果をもつphytochemicalな化合物の候補について、ケロイド線維芽細胞に対する増殖抑制効果が確認され、さらに詳細な検討に移っている段階である。ケロイド抑制に重要な分子として、TGF-β, IL-6に着目し、その経路に対して、有望な分子標的治療薬であるHDAC阻害剤(OBP-801/YM753)とMEK阻害剤(trametinib)の組み合わせによる効果の検討を行うことを目的とした。HDAC阻害剤(OBP-801/YM753)単剤により、これまで報告されているTSAを用いた場合と同様に、細胞増殖抑制、コラーゲン合成抑制効果がみられたものの、MEK阻害剤併用併用でHDAC阻害剤単剤の効果を上回る併用効果はみられなかった。一方で、HDAC阻害剤によるIL-6の抑制効果は認められなかったことから、平成27年度はケロイド発症経路とされるIL-6についても阻害効果を発揮し、かつより副作用が少ないことが期待されるphytochemical化合物がケロイド治療薬候補になりうるかについて探索した。その結果、phytochemical化合物XがIL-6経路およびSmad3を抑制し、ケロイド線維芽細胞の増殖およびコラーゲン合成を抑制することが判明した。さらに、ケロイド線維芽細胞とPBMCとの共

培養系においても、ケロイド線維芽細胞の細胞増殖およびコラーゲン合成抑制効果をもつことも確認した。この化合物Xは他の癌治療に対する使用において、副作用が少ないことが示されてきており、今後、ケロイド治療薬として期待される可能性が示唆された。ケロイドは、傷を修復する線維芽細胞がコラーゲンを異常産生し、細胞自身が異常増殖することが病因と考えられている。ケロイドにおけるTGF-β、IL-6などの過剰発現が注目されており、それらの経路に対して抑制効果が期待できる分子標的治療薬として、HDAC阻害剤とMEK阻害剤の組み合わせによる影響を検討した。ケロイド線維芽細胞株に対して、まずHDAC阻害剤単剤による濃度依存性の増殖抑制効果とコラーゲン産生抑制効果が認められた。一方、MEK阻害剤の単剤の影響は有意には認められなかった。HDAC阻害剤とMEK阻害剤の併用による影響を検討したが、HDAC阻害剤単剤の効果を上回る結果は得られなかった。HDAC阻害剤の細胞増殖抑制、コラーゲン合成抑制効果はみられたものの、MEK阻害剤との併用効果が明らかには認めなかった。併用効果については予定どおり検討を行った。併用効果がみられなかったため、HDAC阻害効果が期待される化合物による、予防も含めた新たな展開を行っており、現在、その効果を確認しているところである。ケロイド現在、HDAC阻害効果が期待される化合物による、ケロイド線維芽細胞に対する増殖抑制効果が確認されており、さらに、コラーゲン合成に対する評価も含めて検討している。さらに、リンパ球との共培養での化合物の効果も検討中である。それらの結果により、ケロイドに対する予防を含めた治療法を考察する予定である。平成25年度はHDAC阻害剤(OBP-801/YM753)およびMEK阻害剤(trametinib)のそれぞれ単剤の影響を計画しており、単剤による影響についての実験を実施し、さらに再現をとる段階になっている。本研究ではCell Research Corporationからの細胞株を購入したが、ケロイド細胞は早期の継代を用いなければならないというケロイド実験本来の制約があり、細胞培養に注意が必要であり、実施する実験の選択を厳選しなければならないということから、当初の計画からやや遅れているようにも考えられる。しかし、おおむね順調に進展していると考えている。HDAC阻害剤(OBP-801/YM753)およびMEK阻害剤(trametinib)二剤の影響を検討する予定となっている。評価項目は、細胞増殖<WST-8アッセイ>、細胞周期<フローサイトメトリー>、コラーゲン産生能<Western blotting>の予定であるが、上記理由から、使用できる細胞に限界があるため、可能な範囲で実験を選別していく方針である。得られた結果をもとに、臨床的な応用への可能性を検討していくことを目標としている。
DNA脱メチル化動的制御による心筋細胞特異的核内構造の構築と病態発生機構の解明

心臓は心筋細胞で構成される。心筋細胞は心臓の収縮機能を担い、心筋細胞特異的遺伝子の変異は先天的心筋症の原因となる。心筋細胞の病理を調べる目的において幹細胞から分化させた幹細胞由来心筋細胞は有用であるが、生体内の心筋細胞に比べて未成熟であり、長期培養しても成熟心筋細胞の特徴を獲得しないことが知られている。このことは、主に成体の心筋細胞を対象とする病態モデル作成などにおける障壁となっている。以前の研究より、大規模トランスクリプトーム分析から、幹細胞由来心筋細胞は長期培養後でさえも心筋細胞で成熟に伴って発現する主要な遺伝子群の発現が不十分であることがわかっている(魚崎ら、Cell Rep. 2015)。このことから、成熟過程には体系的な遺伝子発現変化が必要であることがわかる。我々の先行研究により心筋細胞はその特異的遺伝子群が「長い」という特徴をもち、さらにgene body(GB)領域のスーパーエンハンサー的(C-SE)構造を有することから、心筋細胞におけるGB領域が心筋細胞の体系的な遺伝子発現制御に役割を持つ可能性に注目している。2018年度は、まず幹細胞由来心筋細胞(mESC-CM)におけるGB領域エピジェネティック状態の構築を調べるため、脱メチル化中間産物である5-ハイドロキシメチルシトシン(5hmC)の分布を調べた。幹細胞からの心筋細胞分化誘導において心筋細胞は幼弱であり、その成熟のために三次元培養や特殊な細胞外環境を必要とする。幹細胞由来心筋細胞が培養条件下で成熟心筋細胞としての特徴を持つため、さらに病態にある心筋細胞の異常にC-ES構造が関与している可能性について検証する。2018年度はマウスES細胞からの心筋細胞の分化誘導と5hmC分布の解析を行った。CM特異的Ncx1プロモーター駆動ピューロマイシン耐性遺伝子を有するマウスES細胞からの心筋細胞分化誘導は、2i培地中で維持後、無血清分化培地中で2日間培養、アクチビンA、BMP4添加およびVEGFの存在下で2日後、bFGF、FGF10およびVEGFをふくむ培地に再播種し3日間培養することでおこなった。さらに、非CM細胞を除くためにピューロマイシンを23日間添加した。10日後、心筋トロポニンT染色により心筋細胞が90%以上であることを確認したものを幹細胞由来心筋細胞(mESC-CM)とし、必要に応じて再播種し分化後30日目まで無血清培地で培養した。mESC-CMサンプルを用いて、fMe-Seal-seq法によるゲノムワイドな5hmCマッピングを行った。5hmC分布を解析した結果から、培養10日目に心筋細胞特異的遺伝子のTSS下流2.0ー2.5kbに5hmCの蓄積が見られることがわかった。この一過性の蓄積について、in vivoとin vitroの心筋細胞を直接比較したところ、ES細胞由来心筋細胞と新生仔心筋細胞の遺伝子発現類似性とは異なり、新生仔心筋細胞では特異的遺伝子のGB領域全体に5hmCが分布するのに対し、ES細胞由来心筋細胞ではTSS下流2kbp付近に一過性の5hmC蓄積が観察されるのみだった。この分布は心筋細胞以外でも細胞腫特異的に観察されたが、肝細胞では成熟に伴って5hmC分布が定着したのに対し、心筋細胞では定着することなく失われた。このように、心筋細胞と肝細胞のあいだには成熟に伴う5hmCのGB領域への定着に伴う5hmC分布の変化と細胞特異的な違いが観察されたため、今後この機能について解析を行う。2018年度の研究成果により、生体内心筋細胞とES細胞由来心筋細胞のエピゲノムの違いはGB領域5hmCの維持にあることが明らかになった。心筋細胞特異的なGB領域エピジェネティック状態の構築にGB領域全体への持続的な5hmC分布が必要であり、それが形成されなかった幹細胞由来心筋細胞は成熟心筋細胞がもつC-SE構造を獲得できず、成熟細胞の遺伝子発現パターンを獲得できないという仮説を立てた。これに従い、2019年度以降の研究方針として以下の2点を中心に研究を進める。第一に新生仔心筋細胞とmESC-CMの違いを明らかにする成熟準備に必要な遺伝子を特定する。生体内の新生仔・成熟心筋細胞と幹細胞由来心筋細胞との発現の違いから成熟のボトルネック候補因子を抽出する。また、心筋細胞における成熟・未成熟の制御は新生仔心臓内で不均一であるため、成熟と未成熟の決定が新生仔心臓でどのように行われているかを上述の成熟因子の発現を、一細胞遺伝子発現解析を用いて明らかにし、いずれが成熟のボトルネック因子かを調べる。次に、ボトルネック因子の発現を基準に新生仔心臓および病態心臓を用いて成熟転換期の心筋細胞を精製し、5hmC分布とC-SE領域の形成、その影響範囲の変化を調べる。影響範囲の解析にはMed1/Smc1を用いたChIA-PETを用いて高次構造解析を行い、5hmCターンオーバーと高次構造形成の関係性について明らかにする。

このことは、主に成体の心筋細胞を対象とする病態モデル作成などにおける障壁となっている。以前の研究より、大規模トランスクリプトーム分析から、幹細胞由来心筋細胞は長期培養後でさえも心筋細胞で成熟に伴って発現する主要な遺伝子群の発現が不十分であることがわかっている(魚崎ら、Cell Rep. 2015)。このことから、成熟過程には体系的な遺伝子発現変化が必要であることがわかる。我々の先行研究により心筋細胞はその特異的遺伝子群が「長い」という特徴をもち、さらにgene body(GB)領域のスーパーエンハンサー的(C-SE)構造を有することから、心筋細胞におけるGB領域が心筋細胞の体系的な遺伝子発現制御に役割を持つ可能性に注目している。2018年度は、まず幹細胞由来心筋細胞(mESC-CM)におけるGB領域エピジェネティック状態の構築を調べるため、脱メチル化中間産物である5-ハイドロキシメチルシトシン(5hmC)の分布を調べた。幹細胞からの心筋細胞分化誘導において心筋細胞は幼弱であり、その成熟のために三次元培養や特殊な細胞外環境を必要とする。幹細胞由来心筋細胞が培養条件下で成熟心筋細胞としての特徴を持つため、さらに病態にある心筋細胞の異常にC-ES構造が関与している可能性について検証する。2018年度はマウスES細胞からの心筋細胞の分化誘導と5hmC分布の解析を行った。CM特異的Ncx1プロモーター駆動ピューロマイシン耐性遺伝子を有するマウスES細胞からの心筋細胞分化誘導は、2i培地中で維持後、無血清分化培地中で2日間培養、アクチビンA、BMP4添加およびVEGFの存在下で2日後、bFGF、FGF10およびVEGFをふくむ培地に再播種し3日間培養することでおこなった。さらに、非CM細胞を除くためにピューロマイシンを23日間添加した。10日後、心筋トロポニンT染色により心筋細胞が90%以上であることを確認したものを幹細胞由来心筋細胞(mESC-CM)とし、必要に応じて再播種し分化後30日目まで無血清培地で培養した。mESC-CMサンプルを用いて、fMe-Seal-seq法によるゲノムワイドな5hmCマッピングを行った。5hmC分布を解析した結果から、培養10日目に心筋細胞特異的遺伝子のTSS下流2.0ー2.5kbに5hmCの蓄積が見られることがわかった。この一過性の蓄積について、in vivoとin vitroの心筋細胞を直接比較したところ、ES細胞由来心筋細胞と新生仔心筋細胞の遺伝子発現類似性とは異なり、新生仔心筋細胞では特異的遺伝子のGB領域全体に5hmCが分布するのに対し、ES細胞由来心筋細胞ではTSS下流2kbp付近に一過性の5hmC蓄積が観察されるのみだった。この分布は心筋細胞以外でも細胞腫特異的に観察されたが、肝細胞では成熟に伴って5hmC分布が定着したのに対し、心筋細胞では定着することなく失われた。このように、心筋細胞と肝細胞のあいだには成熟に伴う5hmCのGB領域への定着に伴う5hmC分布の変化と細胞特異的な違いが観察されたため、今後この機能について解析を行う。2018年度の研究成果により、生体内心筋細胞とES細胞由来心筋細胞のエピゲノムの違いはGB領域5hmCの維持にあることが明らかになった。心筋細胞特異的なGB領域エピジェネティック状態の構築にGB領域全体への持続的な5hmC分布が必要であり、それが形成されなかった幹細胞由来心筋細胞は成熟心筋細胞がもつC-SE構造を獲得できず、成熟細胞の遺伝子発現パターンを獲得できないという仮説を立てた。
可視化技術を併用したデータマイニング手法によるmultimorbidityの解析

同一個人が複数の慢性疾患や健康障害を有する状態であるmultimorbidityに関して、企業の健康保険組合、自治体国民健康保険組合、疫学コホートデータなどのデータセットを対象にした解析を実施する。手法としassociation rule mining、階層クラスターや検証的因子分析に加えて、オープンソースツールを用いたnetwork analysisによるmultimorbidityの構造解析や可視化を行ない、傷病の共存に関する様々な推論を探索する。
ＮＰＨＰ嚢胞腎の発生機序の解析－尿細管上皮細胞の細胞分裂方向の決定機構の解析

我々は嚢胞腎において細胞分裂方向の乱れが生じている事から、その原因は上皮細胞の細胞極性の乱れであると予想した。そこで我々は嚢胞腎の尿細管上皮細胞の細胞極性因子の局在を解析した。解析の結果、嚢胞腎組織、二次元培養および三次元培養のどの方法においても、多くの既知の極性因子の細胞内局在はNPHP2嚢胞腎と正常腎の尿細管上皮細胞では差異は認められなかった。この事は嚢胞腎の原因は細胞極性の乱れではない事を示唆した。次に、増殖期の尿細管上皮細胞での繊毛の機能解析のために、虚血再還流による急性腎障害後の尿細管上皮細胞の再生および細胞死を起こす実験系の構築を行い、尿細管の再生と細胞死の機序を解明した。本研究目的は嚢胞腎の発生機序解明のために、尿細管上皮細胞の一次繊毛が管構造に与える影響、実際には嚢胞腎で乱れが生じることが報告されている尿細管上皮細胞の細胞分裂方向の決定機構の解明であった。しかしながら、昨年度までにWnt/PCP経路の活性化は認められず、またDvl2の局在に変化は認められなかった。そこで、本年度は継続してDvl3の局在変化の検討に加え、他の極性因子の局在変化について検討を行うために、尿細管上皮細胞の3次元培養系の構築を行った。現在までのところ、Dvl3の局在は嚢胞腎と正常腎において違いは認められていない。しかしながら、腎臓の組織切片では拡張時期の変動をリアルタイムで観察することはできない。そこで、拡張期を観察するために嚢胞腎および正常腎の尿細管上皮細胞株を用いた3次元培養系の確率を検討した。さらに、嚢胞腎尿細管上皮細胞株のみ明瞭に拡大した嚢胞を効率良く作り出すことに成功し、この嚢胞は内腔に向けて一次繊毛が生えていること、tight junctionが形成されているなどin vivoの上皮形態を持つことを証明した。現在、この実験系を用いていくつかの細胞極性因子の局在を観察しており、当初の目的であった尿細管上皮細胞の細胞分裂方向決定に関わる因子が同定されることが期待される。また、尿細管拡張の分子機序の解明のために繊毛局在蛋白であり、嚢胞腎形成責任遺伝子の一つであるinvに結合する因子の探索を行っている。現在はまだ途中段階であるが、新たな因子が同定されることが期待される。以上の2点を介して、嚢胞腎における細胞極性因子の動態および新たなinv結合因子の同定が解明されることにより、嚢胞腎発生機序が明らかになるだけでなく、新規治療表的因子の同定につながる可能性が高い。本研究の目的は嚢胞腎の発生機序解明のために、尿細管上皮細胞の一次繊毛が管構造に与える影響の解析であった.しかしながら、昨年までは嚢胞腎尿細管上皮細胞に平面極性因子などの細胞の方向を決める極性因子に変化は認められなかった.そこで、三次元培養系を用いて極性因子の局在を経時的に観察した.しかしながら、正常尿細管上皮細胞と嚢胞腎尿細管上皮細胞において差異は認められず、嚢胞化の原因および繊毛異常の原因は平面極性因子の局在異常ではない可能性が挙げられた.また、一次繊毛が尿細管上皮細胞に与える影響を解析するために、虚血再還流による急性腎障害後の尿細管上皮細胞の再生あるいは脱落における一次繊毛の機能解析を新たに行った.まずは、虚血再還流時間に応じて、急性腎障害後に尿細管が再生する/脱落することを確認して、再生腎モデルと萎縮腎モデルを作製した.そこで、まず再生腎と萎縮腎の違いを探索した.その結果、萎縮腎でのみ傷害2週後に尿細管上皮細胞の過剰なアポトーシスが起きていることを確認した.このアポトーシスは尿細管上皮細胞自身が分泌するTNF superfamilyの因子によって誘導されていることを明らかにした.実際にTNF alphaの阻害抗体を障害2週後直前の投与により、尿細管の脱落を抑えることに成功した.一次繊毛は傷害7日後に最も伸長しており、再生腎と萎縮腎において差はなかった.しかし、萎縮腎には繊毛が長い尿細管と短い尿細管があり、この繊毛の長さの違いが尿細管の脱落と関与する可能性が考えられた.以上の結果より、嚢胞腎における一次繊毛の機能解析には新たな方面からの探索が必要となったが、急性腎障害後の尿細管の脱落に一次繊毛が深く関与していることを示唆することに成功した.今後、嚢胞腎と急性腎障害のどちらに解析において、新たな一次繊毛の機能を見出すことが期待できる.我々は嚢胞腎において細胞分裂方向の乱れが生じている事から、その原因は上皮細胞の細胞極性の乱れであると予想した。

本研究目的は嚢胞腎の発生機序解明のために、尿細管上皮細胞の一次繊毛が管構造に与える影響、実際には嚢胞腎で乱れが生じることが報告されている尿細管上皮細胞の細胞分裂方向の決定機構の解明を目的とした。そこで、次に掲げる2点の計画研究を行った。(1)inv変異マウスにおけるWnt/PCP経路の解析において、inv変異マウスおよびpkd2ノックアウトマウスの嚢胞腎初期および後期の2ステージでの解析を行った。予想に反して、Wnt/PCP経路因子であるRho/Racの活性化は全く認められなかった。これにより、嚢胞腎で起こる細胞分裂方向の決定にはWnt/PCP経路は関与しない可能性が高くなった。(2)平面極性関連因子であるDisheveled(Dvl)2とDvl3の蛍光ラベルトランスジェニックマウスをinv変異マウスと交配し、Inv欠失下でのDvl2とDvl3の局在を解析した。現在までに、正常腎でのDvl2とDvl3の局在の解析を行っており、Dvl2は繊毛基部の基底小体に局在している事が観察されている。しかしながら、Dvl3の局在は不明であり、現在免疫組織化学染色法により確認している最中である。inv変異マウスの嚢胞腎でのDvl2の局在は、まだ途中段階であるが、正常腎と同じであり、この解析においてもWnt/PCP経路の関与は否定的である。そこで、着眼点を変えて、他のシグナル伝達系に注目した。p38 MAPKがinv嚢胞腎の発生と共に異常活性化していることは以前の科研費研究(若手B)の解析より明らかであった。そこで、p38 MAPK阻害剤を用いて阻害実験を行ったところ、嚢胞腎の繊維化を惹起するシグナルである事が明らかとなった。invは若年性ネフロン癆の責任遺伝子であり、ネフロン癆において繊維化は最も特徴的な症状であることからも、この結果は治療にもつながる重要性を持っている。実験計画においてはin vivoでの平面極性因子の動態を解明することになっていたが、顕微鏡の解像度、抗体の特異性などの問題により尿細管上皮細胞内での極性因子の局在を正確に示すことが困難であった。そのため、in vivoでの尿細管上皮細胞での平面極性因子の局在解析の研究は遅延している。残念なことに、高解像度の顕微鏡の構築や抗体の作製は当予算内で行うことができず、この計画の変更を行った。そこで、来年度行う予定になっていた培養系を先んじて構築して解析を行っており、嚢胞腎を極性因子の動態で解析し、その発生機序を明らかにする本研究目的達成のためには順調に進行している。計画していた本年度の計画に対して、嚢胞腎におけるwnt/PCP経路の解析およびDvl2/3トランスジェニックマウスを用いた尿細管上皮細胞での平面極性因子Dvl2/3の局在解析も、Dvl2については正常腎での局在解析はほぼ終了した。さらに、inv嚢胞腎においてのDvl2の局在解析も終了間近であり、Dvl2に関しては計画よりも先んじて進んでいる。Dvl3の局在解析についてはまだ確定できておらず、今後も解析を継続する必要がある。以上のように、計画の前後はあれど、おおむね順調に進展している。しかしながら、予想していたwnt/PCP経路が活性化していなかった。そこで、新規な平面極性関連因子のピックアップと嚢胞腎で活性化している他の細胞内シグナル伝達系の解析を並行して行った。その結果、嚢胞腎におけるp38 MAPKの機能を明らかにすることができ、科学雑誌に掲載された。以上の点を加味しても、本研究は順調に進展している。まずは3次元培養系を用いて、嚢胞における平面極性の局在を免疫組織化学染色法により解析し、正常腎と嚢胞腎で変動がある因子の探索を最重要課題として押し進める。
外来性線維芽細胞における遺伝子発現が腱基質の力学的再構築現象に与える意義の解明

1.目的壊死後膝蓋腱に浸潤する外来性細胞のマトリクス再構築過程を検討するため,rat in situ凍結解凍処理を用い壊死後膝蓋腱におけるIII型collagenの発現を検討し、さらに同膝蓋腱におけるcytokine発現およびcytokineの外来性浸潤細胞におけるMMPおよびcollagen発現に対する効果を検討した2.方法Wistar系rat膝蓋腱に凍結解凍処理を行ない、III型collagenの発現を定量的RT-PCRおよび免疫染色にて検討し、浸潤細胞におけるcytokine発現を免疫染色にて検討した.さらに凍結解凍処理後6週の膝蓋腱より単離した浸潤線維芽細胞にIL-1beta、PDGF-B,TGF-betaを投与し、MMPおよびcollagenのmRNA発現をNorthern blotにて検討した.3.結果術後6,12週の凍結処理腱のIII型collagen mRNAの発現量はそれぞれ内部対照の4.9±3.7%および4.5±2.6%と,sham手術に比し有意に高値を示した.また、免疫染色では浸潤細胞周囲にIII型collagenの発現を認めた.凍結解凍処理後膝蓋腱の浸潤線維芽細胞にIL-1betaの発現亢進が認めたものの、PDGF-B,TGF-betaの発現亢進は認められなかった.IL-1beta投与による浸潤線維芽細胞のMMP-13mRNA発現の亢進作用は正常線維芽細胞より弱かった.4.結論靭帯再建術において移植腱のcollagen fibril径は術後早期に減少する機序はいまだ不明であった.本研究で認められた浸潤線維芽細胞のIII型collagenの発現増加は,移植腱に認められるfibril径減少の一因であること、さらにIL-1betaによるMMP産生亢進が移植腱劣化に深くかかわっている可能性が示唆された.1.目的壊死後膝蓋腱に浸潤する外来性細胞のマトリクス再構築過程を検討するため,rat in situ凍結解凍処理を用い壊死後膝蓋腱におけるIII型collagenの発現を検討し、さらに同膝蓋腱におけるcytokine発現およびcytokineの外来性浸潤細胞におけるMMPおよびcollagen発現に対する効果を検討した2.方法Wistar系rat膝蓋腱に凍結解凍処理を行ない、III型collagenの発現を定量的RT-PCRおよび免疫染色にて検討し、浸潤細胞におけるcytokine発現を免疫染色にて検討した.さらに凍結解凍処理後6週の膝蓋腱より単離した浸潤線維芽細胞にIL-1beta、PDGF-B,TGF-betaを投与し、MMPおよびcollagenのmRNA発現をNorthern blotにて検討した.3.結果術後6,12週の凍結処理腱のIII型collagen mRNAの発現量はそれぞれ内部対照の4.9±3.7%および4.5±2.6%と,sham手術に比し有意に高値を示した.また、免疫染色では浸潤細胞周囲にIII型collagenの発現を認めた.凍結解凍処理後膝蓋腱の浸潤線維芽細胞にIL-1betaの発現亢進が認めたものの、PDGF-B,TGF-betaの発現亢進は認められなかった.IL-1beta投与による浸潤線維芽細胞のMMP-13mRNA発現の亢進作用は正常線維芽細胞より弱かった.4.結論靭帯再建術において移植腱のcollagen fibril径は術後早期に減少する機序はいまだ不明であった.本研究で認められた浸潤線維芽細胞のIII型collagenの発現増加は,移植腱に認められるfibril径減少の一因であること、さらにIL-1betaによるMMP産生亢進が移植腱劣化に深くかかわっている可能性が示唆された.1.目的壊死後の膝蓋腱に浸潤する外来性線維芽細胞のマトリックス代謝における再構築過程を検討するため,rat in situ凍結解凍処理を用い壊死後膝蓋腱におけるIII型collagenの発現を検討した.2.方法(1)Wistar系rat31匹を用い,右膝蓋腱には凍結解凍処理を左膝蓋腱にはsham手術を行なった.(2)術後3,6,12週のIII型procollagen mRNA発現および2,3,6,12週のIII型collagen自体の発現をそれぞれ定量的RT-PCRおよび免疫染色にて検討した.3.結果(1)定量的RT-PCRに関しては,術後6および12週の凍結処理腱のIII型procollagen mRNAの発現量はそれぞれ内部対照GAPDHの4.9±3.7%および4.5±2.6%と,sham手術の0.1±0.2%および0.0±0.0%に比し有意に高値を示した.(2)免疫染色では浸潤線維芽細胞周囲の膝蓋腱にIII型collagenの発現を認めた.4.考察および結論靭帯再建術において壊死後膝蓋腱のcollagen fibril径は術後早期に減少することが明らかとなっているが,その機序はいまだ不明である.一方,III型collagenのfibril径はI型に比し小さいことが報告されている.したがって,本研究で認められた浸潤線維芽細胞のIII型collagenの発現増加は,移植後膝蓋腱に認められるfibril径減少の一因であることが示唆された.1.目的壊死後の膝蓋腱に浸潤する外来性線維芽細胞のマトリックス代謝における再構築過程を検討するため,rat in situ凍結解凍処理を用い壊死後膝蓋腱におけるcytokineの発現およびcytokineの外来性線維芽細胞におけるcollagen発現に対する効果を検討した.2.方法

(1)壊死後膝蓋腱におけるcytokineの発現・Wistar系ratを用い,右膝蓋腱には凍結解凍処理を左膝蓋腱にはsham手術を行なった.(2)cytokineの外来性線維芽細胞のcollagenの遺伝子発現に対する効果・Wistar系ratを用い,凍結解凍処理後6週の膝蓋腱より外来性線維芽細胞を単離・培養した.3.結果(1)凍結解凍処理後膝蓋腱における外来性線維芽細胞にIL-1betaの発現亢進が認め、PDGF-B,TGF-betaの発現亢進は認められなかった.(2)TGF-beta投与はI型およびIII型collagen mRNAの発現を亢進させていた。また、TGF-beta投与による発現亢進はI型collagenにおいて顕著であった.4.考察および結論靭帯再建術において壊死後膝蓋腱のcollagen fibril径は術後に減少することが明らかとなっている.一方,III型collagenのfibril径はI型に比し小さいことが報告されている.したがって,本研究で認められたTGF-beta投与によるI型collagen優位の発現促進作用は壊死後膝蓋腱の力学劣化の人為的抑止への応用の可能性が示唆された.
心筋細胞の最終分化に関わる転写調節機構の解明

昨年までの研究において、ANP、BNP、α-skeletalactinといった複数の心筋胎児型遺伝子の発現を転写抑制因子NRSFがヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)との複合体形成を介して制御していることを報告した。さらにNRSFの心筋細胞形質維持における役割を生体内において検討するため、優勢抑制変異型NRSFを心筋細胞特異的に発現するトランスジェニックマウスを作製し、NRSFが生体でも胎児型遺伝子の発現調節に関与することを確認した。このマウスは人の拡張型心筋症類似の病態を示し、突然死することから、本年度はさらにその死亡原因の詳細な解析を引き続きおこなった結果、このマウスでは不整脈が起こりやすく、心室性頻拍にて死亡することを明らかにした。またgene chipにて網羅的に遺伝子発現変化を検討し、このマウスでは胎児期の心室筋に発現するHCNおよびT型カルシウムチャンネルが発現亢進していることを突き止めた。これらチャンネルは胎児期心室筋に発現するが生後はその発現が低下し、心不全などの病的状態で再発現し不整脈の発生に関与することが知られていることから、NRSFはこれら胎児型イオンチャンネルの発現調節を介して、分化した心室筋の電気生理学的形質の維持に関与していることが示唆された(現在投稿準備中)。さらに、NRSFの心筋機能調節機構に関しても検討し、NRSFがクラスIHDACのみならずクラスIIHDACとも会合しており肥大シグナルによるクラスIIHDACの核外移行がNRSFの転写抑制機能の低下につながっている可能性も見串した(現在投稿準備中)。以上よりNRSFが複数の胎児型心筋遺伝子の発現調節を介して、心筋細胞の形質維持に重要な役割を果たしていることが示され、また肥大シグナルによるクラスIIHDACとの解離によるその機能低下が心不全・突然死発症に関与している可能性が示唆された。
古典期スパルタ社会の変質過程の研究

本研究は古典期スパルタ史研究の欠を埋めることを目的とした。即ち、いわゆるスパルタ帝国と呼ばれるスパルタの政治的影響力の最盛期が、逆説的にもスパルタの「リュクルゴス体制」解体が多面的に進行した時代であることを闡明することを目的とした。まず1989年9月に『歴史学研究』に公表した論文に推敲を加えて英文化し欧米の学会に成果を問うこととした。その骨子はこうである。モタケス制度は父親の政治的、社会的、経済的失敗のためにアゴ-ゲ-をその半ばで中断せざるを得ず市民権を失うことになるスパルタ市民の子弟を救済する制度であった。しかしスパルタ当局はこの制度の活用が最も要請されるときにこれを怠り、政治・社会改革の必要性も理解しなかった。当局はモタケス制度に範を取ったトロフィモイ制度を新設して庶出子と外国人を兵士として起用して、ヘイロ-タイを活用するネオダ-モ-デイス制度の併用で深刻な兵力の不足を乗り切ったが、それはスパルタの抱えた病弊を解決するものではなく、スパルタの急激な没落の一因であった。市民人工の減少に関しては、スパルタ大地震の影響を軽く見積もるCartledgeの見解に対して最近FigueiraやHodokinsonはそれを重視する見解を提示した。後二者の論証を子細に検討する作業をさらに進めたい。いずれにしても土地所有制度と女子の相続権の問題が決定的に重要である。スパルタの土地の五分の二が女子の手にあったというアリストテレスの記事やこの度の研究で見い出したデルフォイの神殿修復資金を提供したスパルタ女性の存在を示す碑文から前360年代に女子が相続権を有したことは確実である。問題はCartledgeやHodokinsonの主張するように初めからそうであったのかFugueiraの主張するように古典期に生じたものなのかであるが、これは今後の課題である。さらにスパルタの「平等者体制」が実質をもったのか、二王家を頂点とした庇護関係が無視できないものであったのかも今後の研究課題である。
シナプス機能及び記憶、学習過程におけるARF6の役割

記憶、学習を支える分子メカニズムを解明するため、小脳におけるシナプス可塑性及びシナプス形態形成においてARF6が果たす役割を明らかにすることを目的とした。また、ARF6を介する分子経路の解明をおこなった。その結果、ARF6が小脳シナプス可塑性に関与していること、さらにプルキンエ細胞の形態形成を制御していることが明らかになった。さらに、ARF6には想定された下流分子候補であるPIP5Kを介さない分子経路が存在していることが分かった。また、候補分子の作用を検証するための小脳の培養系を確立することも出来た。記憶、学習の基礎過程は、シナプス後膜におけるグルタミン酸受容体を含む小胞輸送とそれに引き続くシナプス形態変化であるが、その分子機構はよく分かっていない。低分子量GTP結合タンパク質であるARF6は、興奮性シナプス後膜に豊富に存在し、トラフィッキングと膜形態を制御する。そこで、本研究ではARF6に着目し、生化学、電気生理学、行動学的方法を多角的に用いることにより、小脳におけるシナプス可塑性およびシナプス形態形成におけるARF6の機能を解明することを目指した。今回、条件付きノックアウトマウス(ARF6-flox)を用いて、小脳シナプス可塑性のひとつであるLTP(長期増強)、LTD(長期抑圧)に異常が見られることを見いだした。また、ARF6が小脳プルキンエ細胞の形態形成を制御していることがわかった。今後、ARF6の上流、下流候補分子の関与を検証し、総合的な分子実態の解明を進める。低分子量GTP結合タンパク質であるARF6は、興奮性シナプス後膜に豊富に存在し、トラフィッキングと膜形態を制御している。記憶、学習を支えるメカニズムとしてシナプス後膜におけるグルタミン酸受容体を含む小胞輸送とそれに引き続くシナプス形態変化があるが、その分子実体は未だ不明な点が多い。本研究では、ARF6に着目し、小脳におけるシナプス可塑性及びシナプス形態形成においてARF6が果たす役割を明らかにすることを目指した。ARF6の関与を示す結果を得た昨年度に引き続き、本年度は、ARF6のシグナルカスケードを明らかにすることを第一の目的とした。ARF6の下流分子の候補としてホスファチジルイノシトール4-リン酸5-キナーゼ(PIP5K)は、ARFにより直接活性化されることが示唆されている。小脳LTDの際のPIP5Kの関与を明らかにするために、PIP5Kγリン酸化ペプチドを用いて、LTDの障害有無を検討したところ、リン酸化ペプチドによる障害はほとんど認められず、これはPIP5Kを介さない分子経路の存在を示唆している。また、他の候補分子の作用を検証するための小脳の培養系を確立することもできた。神経生理学プルキンエ細胞の形態形成と平行線維ープルキンエ細胞シナプス形成におけるARF6の役割を明らかにするために、ARF6機能欠損マウスと電気生理学的手法を用いて研究を進めてきた。その結果、ARF6の関与を示すことができた。しかし、一連のシグナルカスケードを解明するためのARF6下流候補分子の関与に関しては、本年度も引き続き研究を行い、総合的な分子実態の解明を行う。研究計画当初の予定通り、ARF6の上流候補分子のノックダウンによるARF6の活性状態の変化と下流候補分子操作によるLTD障害の有無を生化学的、電気生理学的手法を用いて検討する。さらにARF6遺伝子欠損マウスを用いた小脳運動学習課題に取り組み、一連のシグナルカスケードの解明と最終的な表現型解析を行う。平成25年度に始めたARF6の分子メカニズムの同定をひき続き行なうため、平成26年度にも予算を配分した。また、平成25年度は研究打ち合わせに共同研究先研究室を訪問しなかったが、平成26年度は行動解析実験をおこなうため、何度か訪問予定である。生化学的実験を引き続き行なうためのペプチド合成と、主として共同研究先訪問のための旅費として使用を予定している。
高活性鉄触媒によるエステル交換反応の開発

平成28年度、平成29年度の研究では、学会誌に発表した無置換の鉄サレン錯体を触媒として用いた二つの反応のうち(Chem. Eur. J. 2016, 22, 12278-12281)、合成化学上有用なtert-ブチルエステルを合成可能な反応であるメチルエステルと三級アルコールを用いた触媒的なエステル交換反応の反応性の向上のため、高活性な触媒の開発を目指した。種々の検討の結果、無置換の鉄サレン錯体よりも高い触媒活性を有するいくつかの錯体を見出すことに成功した(詳細な構造については省略する)。しかしながら、本研究の最終的な目標と比較すると触媒活性は未だ不十分であった。そこで、平成30年度は置換基以外の部分、特に錯体に含まれるリンカーやカウンターアニオンに注目し、検討をおこなうこととした。本年度は、リンカーで連結された錯体に注目し、近接効果による触媒活性の向上を目指し、錯体の検討を行った。しかし、検討する予定であった錯体は、複雑な構造を有する新規錯体が多く、錯体の合成が困難であり十分に触媒活性の検討を行うことはできなかった(詳細な構造は省略する)。一方、錯体の合成や精製・分析に関する知見は得ることができたため、今後の研究に生かしたいと考えている。また、研究計画に記載したヒドロキシ基とアミノ基の共存下における化学選択的かつ位置選択的アシル化反応についても、錯体の合成が不十分であったため、十分に検討を行うことができなかった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成29年度において実施した研究のうち、データコレクション以外の内容を以下にまとめる。平成28年度の報告では、学会誌に発表した無置換の鉄(III)サレン錯体を触媒として用いた二つの反応のうち(Chem. Eur. J. 2016, 22, 12278-12281)、合成化学上有用なtert-ブチルエステルを合成可能な反応であるメチルエステルと三級アルコールを用いた触媒的なエステル交換反応の反応性の向上のため、高活性な触媒の開発を目指した。種々の検討の結果、無置換の鉄サレン錯体よりも高い触媒活性を有するいくつかの錯体を見出すことに成功した(知財の関係上、詳細な検討については省略する)。しかしながら、より穏和な条件下において反応を行うには、未だ触媒活性が不十分であったため、平成29年度も引き続き触媒活性の向上を目指し検討を行った。平成29年度は、平成28年度に得られた知見を基にさらなる錯体の検討を行った。検討の結果、より高活性な錯体を見出すことに成功した(知財の関係上、詳細な検討については省略する)。しかし、穏和な条件下において反応を行うには、未だ触媒活性は不十分と考えられる。また、求核剤と求電子剤の近接効果による触媒活性の向上を目指した協奏機能型二核錯体は、現在合成の途中段階である。平成30年度は、協奏機能型二核錯体の配位子とリンカーの検討を行い、触媒活性の向上を目指す。さらに本検討の後、研究計画に記載したヒドロキシ基とアミノ機の共存下における化学選択的かつ位置選択的アシル化反応についても検討を行い、認識部位を持つ鉄サレン錯体の開発を行う予定である。平成29年度は研究計画に記載した一つ目のテーマの「協奏機能型二核錯体」について平成28年度に見出した高活性な触媒よりも高い触媒活性を有する錯体の開発を目指して研究を行った。検討のために種々の新規錯体の合成を行ったが、複雑な構造を有する錯体も多く、合成や精製に予定よりも多くの時間を費やしてしまい、研究計画に記載した当初の予定よりもやや遅れる結果となってしまった。しかしながら、いくつかの錯体において、高い触媒活性を有することを見出しており、少しずつではあるが進展している状況である。