hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
癌・幹細胞増殖性維持に関わる翻訳抑制複合体の形成原理と創薬に向けた分子基盤の構築

癌・幹細胞増殖性維持に関わるRNA結合タンパク質Musashi1 (Msi1)はN端領域に2つのRNA結合ドメイン(RBD)、RBD1及びRBD2を有する。今年度は、これらのドメインが連結したRBD1-RBD2に対して種々のRNAの結合解析を行い、NMR及び高速AFMを用いた解析に適したRBD1-RBD2と、複数のRNAの候補を得た。これまでに、RBD1とRBD2がそれぞれ標的RNA、GUAG及びUAGを認識することを見出し、RBD1:(GUAG)U複合体及びRBD2:G(UAG)U複合体の立体構造を決定することで相互作用様式を明らかにして来た。これまでにもRBD1-RBD2のコンストラクトを作製していたが、今年度は最新の知見に基づいて、N及びC末端を確定しより有効だと考えられるコンストラクトを作製した。RNAに関しては前回UAGXnGUAG (X=U/A/C/G, n=0-50)を分子モデリングにより見出した(Molecules, 2017)。NMR解析用のRNAを得るため、低いn値、n=1のUAGXGUAGを少なくとも1つ含むnumb-15、WUAP、CCNG2等遺伝子由来のRNA及びn=0のRNAを調製し、RBD1-RBD2との結合をゲルシフトアッセイ及び蛍光偏光解消法を用いて解析した。これらのRNAはRBD1-RBD2との結合の解離定数が28-725 nM範囲にあった。さらに、n=2, 3のRNAを用いて同様の解析を行った結果、解離定数が0.3-30 nM範囲となり、RBD1-RBD2との結合に、より適したRNAの候補を得ることに成功した。現在、得られたRBD1-RBD2とRNAの複合体を作製し、NMR立体構造解析を行うところである。他方、高速AFMによるMsi1の探索及び標的配列の認識の観察にもこれらのRNAをはじめn値が大きなものも使って解析する予定である。昨年度の成果に基づいて、結合解析に適したMsi1のRBD1-RBD2コンストラクトを作製し、標的配列を含むRNAを複数個得た。標的RNA配列UAGXnGUAG (X=U/A/C/G)のうち、n=2,3のものがRBD1-RBD2との結合の解離定数が0.3-30 nM範囲となり、しかも1:1の複合体を形成することがわかった。これらのRNAはRBD1-RBD2との複合体のNMR立体構造解析に適している可能性が高いため、各種NMRスペクトルの品質を確認し、最も解析に適しているRNAを決定する。高速AFMの測定に関しては、一本鎖DNAを固定化したフレームの調製に昨年度成功していた。さらに今年度は、一本鎖DNAに結合し、その上を移動することが出来るコントロールタンパク質を用いて、実際にそのタンパク質が移動するのを観察することに成功した。また、Msi1とは異なるRNA結合タンパク質について、RNAの結合に際して誘導される構造変化を高速AFMで観察することに成功した。このように、高速AFMの測定におけるノウハウは蓄積してきた。現在、RBD1-RBD2の標的配列を含み、上記フレームに固定できる長鎖のRNAの調製を行っているところであり、調製の目処は立っている。NMR立体構造解析については、RBD1-RBD2の安定同位体標識を行う。高速AFM観察については、フレームに固定化するRNAの調製を行う。標的RNA配列UAGXnGUAG (X=U/A/C/G)のうちn=2-50のものを、また癌等に関わる遺伝子のmRNAに由来するものを想定している。癌・幹細胞増殖性維持に関わるRNA結合タンパク質Musashi1 (Msi1)が標的RNA配列を認識する機構について研究を行い、3つの論文として報告した。Msi1は2つのRNA結合ドメイン(RBD)を有する。N端側RBD(RBD1)については、以前、標的RNA配列(GUAGU)との複合体の溶液構造をNMRにより解明し、RBD1はGUAG部分を特異的に認識することを明らかにしていた。今年度は更に、分子動力学計算法及び、水和の統計熱力学理論を用いた解析を行い、結合に関する種々の熱力学パラメータを得た。そして、RBD1が標的RNA配列を高い特異性で認識するための原動力に関する新たな知見を得た(Phys Chem Chem Phys, 2018)。原動力は、基本的には、RBD1とRNAの形がピッタリ合うことにより水の並進エントロピーが得をするということ、それからRBD1の正電荷と核酸の負電荷が相補することにより、脱水和エネルギーの損失が保障されるということである。また今回、C端側RBD(RBD2)についても、単独及びRNAとの複合体のNMR構造を決定した。これにより、RBD2がUAGを特異的に認識することが明らかとなった(Molecules, 2017)。更に、Msi1 RBD1-RBD2と最短標的RNA配列(UAGGUAG)との結合様式について複合体モデリングによる解析を行った。その結果、Msi1は翻訳制御するべき遺伝子のmRNA中に含まれる(UAGnGUAG), n=0-50に立体障害なく結合出来ることが強く示唆された(Molecules, 2017)。他方、RBD2について、単独及び複合体における化学シフト値を報告した(Biomol NMR Assign, 2017)。

以上の化学シフト及び構造の情報は、Msi1を標的とする抗癌剤開発に利用することが出来る。以上の様に、今年度は主に原子レベル分解能のミクロな視点の知見を得た。これらの情報は、RNAと複数のタンパク質の結合を見るという、次年度以降のマクロな視点の解析にそのまま活用することが出来るまず、研究実績の概要に述べたとおり、これまでの研究を発展させ、Msi1のRBD1が標的RNA配列(GUAGU)を高い特異性で認識するための原動力に関する新たな知見を得た。また、Msi1 RBD2についても標的RNA配列との複合体構造を決定するとともに、Msi1 RBD1-RBD2:最短標的RNA配列(UAGGUAG)複合体の結合様式を分子モデリングにより示すことに成功した。これにより、Msi1 RBD1-RBD2がmRNAの3'非翻訳領域に含まれる(UAGnGUAG), n=0-50を立体障害なく認識出来ることが示された。以上の成果を論文として報告した。今年度得られた原子レベルのミクロな視点からの情報は、次年度行うマクロな視点の解析にそのまま活用することが出来る。マクロな視点の解析の準備としては、今年度は長いRNAを固定化するためのフレームの調製を行った。種々の条件検討を行い、安定的にフレームを供給することが出来るようになった。また、準備実験として、このフレームに長い一本鎖DNAを固定化した。これらの生成効率が高いことを、AFM観察により確認した。癌・幹細胞増殖性維持に関わるRNA結合タンパク質Musashi1 (Msi1)はN端領域に2つのRNA結合ドメイン(RBD)、RBD1及びRBD2を有する。今年度は、これらのドメインが連結したRBD1-RBD2に対して種々のRNAの結合解析を行い、NMR及び高速AFMを用いた解析に適したRBD1-RBD2と、複数のRNAの候補を得た。これまでに、RBD1とRBD2がそれぞれ標的RNA、GUAG及びUAGを認識することを見出し、RBD1:(GUAG)U複合体及びRBD2:G(UAG)U複合体の立体構造を決定することで相互作用様式を明らかにして来た。これまでにもRBD1-RBD2のコンストラクトを作製していたが、今年度は最新の知見に基づいて、N及びC末端を確定しより有効だと考えられるコンストラクトを作製した。RNAに関しては前回UAGXnGUAG (X=U/A/C/G, n=0-50)を分子モデリングにより見出した(Molecules, 2017)。NMR解析用のRNAを得るため、低いn値、n=1のUAGXGUAGを少なくとも1つ含むnumb-15、WUAP、CCNG2等遺伝子由来のRNA及びn=0のRNAを調製し、RBD1-RBD2との結合をゲルシフトアッセイ及び蛍光偏光解消法を用いて解析した。これらのRNAはRBD1-RBD2との結合の解離定数が28-725 nM範囲にあった。さらに、n=2, 3のRNAを用いて同様の解析を行った結果、解離定数が0.3-30 nM範囲となり、RBD1-RBD2との結合に、より適したRNAの候補を得ることに成功した。現在、得られたRBD1-RBD2とRNAの複合体を作製し、NMR立体構造解析を行うところである。他方、高速AFMによるMsi1の探索及び標的配列の認識の観察にもこれらのRNAをはじめn値が大きなものも使って解析する予定である。
民法学における歴史と比較・継受

19世紀の民法学の諸相を明らかにすべく、一方で、総論レベルで近代法という「歴史的形象」を明らかにすることに努め、他方で、具体的なテーマに即して、「比較と継受」の現象を辿った。まず、前者についていうと、フランス革命期ならびに明治日本において働いていた力とその意味を考えてみた。具体的には、梅やボワソナードの法観それ自体を問いなおし、ひいては法典に現れた近代とは何か、その意義と限界を明らかにした。後者については、具体なテーマとしては、日仏両国における「給付」の概念と「既判力」の概念の歴史的生成と展開を辿り、現代における両概念のあるべき姿を探究した。後者の研究は、直接、解釈論と直結したものである。しずれの研究においても、この分野における第一人者たる、アルペラン、レミー、ジャマン、シムレールの各教授と直接コンタクトを取るとともに、研究成果は日仏両国語で公表した。また、雑誌の特集は日仏両国での学会報告も幾つか行い、問題が問題として共有されるように心がけた。ただ、その成果については、疑問も残っている。ただ、「歴史・比較・継受」という現象を総体としてどう位置付けるのか、それらが法にとってどのような意味をもっているのか、そうした根本問題については未だ明確な答えを見い出すには至らなかった。テーマの性質上、個人でできることには限界があるのかもしれない。法の歴史性をめぐる研究については、その手法も含めて、改めて練り直して、本格的な共同研究をする必要性を痛感した。19世紀フランス法学と日本民法学の接点を求めて、科研費の援助も受けつつ研究を開始したが、今年度は、(1)「債務の分類」に着眼して、物権変動につき意志主義の法制(フランス民法典→19世紀学説→ボワソナード・梅・富井を通じでのわが国への伝播がある)の下で所有権移転義務(与える債務の一要素たりうる)の存在不可能性を論証し、(2)於保不二雄の提示した「担保する給付」概念の再評価を試みた。(1)については、民法施行100周年記念シンポジウム「物件変動理論と公示制度の現実」(日本司法書士会連合会主催、1998年3月6日)にて、パネラ-として「契約と物件変動の結び付き」というタイトルで報告し、その記録が近々に公刊されることとなっている。そのほか、本学所蔵の梅文書の仏文ノートにつき、北大助手のロベール氏の協力を得て、調査を行った。これは、司法省法学校でのアペ-ルの講義の内容を知る上で、また19世紀のフランスの(リオン)大学での授業内容を知る上でも、さらに、梅の法学形成の過程を知る上でも、貴重な作業となるべきものであるが、梅自身の筆記解読がフランス人にとっても困難であることから、今後はより本格的は調査・研究体制を整えないことには歯が立たないことも明らかになった。今後の課題として残された点である。民法学における歴史と比較・継受の問題を考究するに際しては、足元を固めておく必要があることから、今年度は、19把紀フランス法学とわが国との接点を解き明かす作業に没頭した。そのため、(1)民法典起草者の中心人物たる梅謙次郎の法典観と法学につきできるだけ時代背景に即しつつ論じ(「装置としての法典と法学ー梅謙次郎という神話ー」)、(2)ボワソナードのもたらしたものとそれに対する反応としての明治民法典の特質を明らかにするとともに(「法典の〈形式〉をめぐる諸問題ー旧民法と明治民法ー」)、(3)ボワソナード個人の思い入れと日本の側での受け入れ態度との落差を明らかにすることを試みた(「『プロジェ新版』につい」])。それぞれにつき、論文形式での公表を終えるとともに、(2)については北海道大学での学会(「ナポレオン法典と日本の近代化ーボワソナードを中心として」)でも報告した。今後は、19世紀を通じて展開する「近代法」の系譜と痕跡を辿る方向に研究の焦点を絞って行きたい。

そして、昨年の研究実績で報告した、担保給付についての論文が公表された。また、それと所有権移転義務の日仏比較も含めて、九州大学で開催された国際シンポジウムにて報告・討論した。近々に成果が刊行される予定である。なお、この九州大学での学会のために来日したジャマン教授とアルペラン教授は、いずれもフランスの若手研究者を代表する法学史の専門家であり、その機会に多くの議論をすることができ、今後の研究のうえで大変有益であった。昨年度の報告において、「今後は、19世紀を通じて展開する近代法の系譜と痕跡を辿る方向に研究の焦点を絞って行きたい」と述べたが、今年度はできるだけその方向での研究を深化させるよう務めた。まず、総論的には、19世紀の法現象の特徴たる、法典という近代的装置の歴史的意味と構造を解明することに意を注いだ(「法典という近代-権力・構造・言語」)。また、その延長線上で、法制史学会創立50周年記念シンポジウム「近代法の再定位-比較法史学的試み-」にて、「フランス革命・民法典と近代法-歴史・資本主義・市民社会-」というタイトルで報告した。いずれも、民法学の立場からは自明視されがちな法の存在形態につき、メスを入れようとしたものである。次に、各論的には、以前から検討を進めている債務法の基礎概念たる「給付」の分類概念につき、論文を公表した。一つは、司法書士会主催のシンポジウムの報告におけるものであり、所有権移転義務を「与える給付」として分類する19世紀フランス法の立場を対照的なドイツ法ならびにわが国の通説の立場を分析した。もう一つは、昨年度、九州大学で開催された国際シンポジウムにて報告・討論したものに大幅に手を加えて公表したものである(「与える給付と担保する給付-それから一〇〇年、もう一つの歴史-」)。さらに新たな各論的テーマとして、ポティエに始まり、フランス民法典・ボワソナードを経由した「既判力概念」の系譜につき、オルレアンで開催されたポティエ生誕300年記念の学会にて報告した。ここでもドイツ法の影響が顕著に認められるが、それはフランスでも同様であった点が興味深い。現地ではアルペラン教授を始め、多くの研究者と議論をすることができ、大変有益であった。以上、研究は、各論的側面では一定の進展をみているが、総論の核心たる「法の歴史性」に関しては、来年度を期するほかない。本年度は、研究の最終年度に該当し、これまでの研究成果が多く活字となって現れた。このように、個々具体的なテーマに即した研究は一定の成果を上げたが、「歴史・比較・継受」という現象を総体としてどう位置づけるのかという根本問題については、未だ明確な像を描くには至らなかった。テーマの性質上、個人でできることには限界があるのかもしれない。もっとも、法政大学現代法研究所では、報告者が中心となって「歴史と解釈」なる研究チームを組んで活動を行っており、2002年度にはその成果が公表されることになっている。本科研費研究もそれと有機的関連の下に行われていたことから、そこでの研究成果も参照して頂ければ幸いである。とはいうものの、「法の歴史性」をめぐる研究については、その手法も含めて、改めて練り直して、本格的な共同研究をする必要性を痛感した。
電解液ジェットターニング加工の研究

電解液のジェットを通して電流を流し、ジェットが衝突した部分だけを局所的に加工できる。この電解液ジェット加工をターニング加工に応用するための研究を行った。効率よく複雑形状を加工するために、曲面状のフラットジェットを開発した。また、超硬合金軸の加工に応用するために、交流電流を用い、人体に有害な水酸化ナトリウムを用いることなく、硝酸ナトリウム水溶液を用いた加工を可能にした。その際、絶縁性ノズルを用いることにより、ノズルの消耗を防止することができた。電解液ジェットを工作物(陽極)に当て、ノズルを陰極として電流を流し、電解作用により微細加工を行った。工作物の硬さによらず加工でき、残留応力の発生がなく、ジェット直下のみを選択的に加工できる。この特長を生かして前年度に引き続き、超硬合金の微細加工を行った。劇薬であるNaOH水溶液を用いる代わりに、弱毒性の硝酸ナトリウム水溶液を用い、交流パルスを用いることにより、工作物がマイナスの極性のときにジェット直下で生成されるNaOHが、プラスのときに生成される酸化タングステンを溶解することによって、ジェット直下で選択的な加工が行える。このとき、WC粒子とCoバインダの両方が均一に溶出し、表面粗さがよい加工が行え、しかもジェット直下に溶出が集中するために必要な電流値、パルス幅、デューティ比の最適値を実験より求めた。また、ノズルがプラスの極性で電解溶出しないように、半導体シリコンを用いたスリット状のノズルを開発し、交流パルスを用いてもノズルが消耗しない電解液ジェット加工を実現した。さらに、円筒ノズルの場合は大面積を加工するにはノズルの走査が必要であるが、スリット状ノズルから噴出するフィルム状ジェットを用いて、円筒ノズルよりも少ない走査回数で、大面積を効率よく加工できることを示した。次に、上記のスリット状のノズルを、直線状から曲線状に変え、曲面状のフィルムジェットを噴出可能なノズルを開発した。その製作方向としては、ワイヤ放電加工により曲面状に切断したオス・メス形状のブロック材のペアーで、スリットを設けた薄板を挟み込む方法を採用した。これによって、円筒状のジェットを2次元的に走査することなく、曲線状の溝を加工できることが分かった。よって本研究により、金型の超硬パンチや超硬ピンの微細複雑形状の電解加工が可能となった。バイトの代わりに電解液ジェットを回転中の工作物(陽極)に当て、ノズルを陰極として電流を流し、電解作用により微細なターニング加工を行った。工作物の硬さによらず加工でき、残留応力の発生がなく、加工反力が小さく、工具消耗がなく、電流で微小な切り込み量を制御できる。これらの特長を生かして超硬合金の微細加工を行った。一般に、超硬合金の電解加工においては、工作物(陽極)面上に酸化タングステンの被膜が生成され、それ以降の溶出を妨げる。従って、電解液にNaOHなどを混入して酸化タングステンを溶解しなければ加工が進行しない。しかし、電解液ジェット加工でNaOH水溶液を用いることは環境安全上好ましくない。そこで、中性で弱毒性の硝酸ナトリウム水溶液の使用を試みた。直流電流を用いた場合、金属製ノズル内面で生成されたNaOHがジェット噴流とともに工作物上に運ばれ、酸化タングステンを溶解するので、あらかじめ多量のNaOHを混入しなくても安全に加工が行える。しかし、NaOHがジェットの最外周に分布したまま工作物に衝突するため、ジェット中心部が加工されないことが分かった。そこで、ノズルを絶縁体(セラミックス)に交換したところ、金属製のノズルホルダ内面で生成されたNaOHがセラミックスノズルに導入される前に硝酸ナトリウム水溶液と混ざり合うため、ジェット直下で選択的な加工が行えることが分かった。また、交流電流を用いた加工の場合は、工作物が陽極の間に酸化タングステンが生成されるが、陰極の間に生成されたNaOHによって溶解される。このメカニズムによって、鋼の電解液ジェット加工と同様にジェット直下で精度のよい加工が効率よく行えることが分かった。しかし、金属製のノズルが消耗する問題が生じた。そこで、直流加工と同様にノズルをセラミックス製に替えることによって、ノズル消耗の問題を解決できた。加工反力が小さく、硬さによらず加工ができる放電加工や電解加工は、機械加工よりも超硬合金の加工に適している。特に、加工変質層の形成がなく、工具電極消耗がない点では、電解加工の方が放電加工よりも優れており、加工領域をジェットの衝突噴流域に限定できる点で、電解液ジェット加工は微細加工に適した加工法である。平成23年度は、陰極上で生成されるNaOHを利用して、安全な硝酸ナトリウム水溶液を用いた超硬合金の加工を可能にした点は達成度が高い。直流電流であっても、交流電流であっても、絶縁体ノズルを使用することによって、より精度のよい加工が行えることが分かった点は、当初の計画にはない大きな成果である。

さらに、電解液のジェットが工作物に衝突後、工作物面上に滞留すると、ジェットを中心にした放射状の層流が得られず、局所的な加工を困難にする。そこで、電解液ノズルと同軸上に、円環状のエアー噴射ノズルを設置し、アシストエアーの噴射により電解液の滞留を防止した。これによって安定した加工が行えるようになった。この発明も当初の計画にはない成果であり、特許出願をすることができた。ただし、超硬合金の加工は24年度に計画していた研究内容であり、当初23年度に計画していた電解液ターニング加工装置の製作やノズル形状の最適化の研究が行えなかった。23年度に行った超硬合金の加工の基礎実験は、研究室で過去に製作したフライス盤型の直交3軸の電解液ジェット加工装置を用いて行った。従って、ターニング加工装置の製作に必要な費用は使用しなかった。そこで、23年度の研究成果を踏まえて、24年度には超硬合金のターニング加工ができる装置を製作する。そして、任意形状の加工を試みるとともに、加工可能な軸径の微細化限界を調べる。また、微細加工のためのノズル形状の最適化を行う。さらに、アシストガスの効果についても詳細に調べ、アシストガス用のノズルの最適化を行う。次年度使用額と、24年度の研究費の一部とを合わせて、電解液ターニング加工装置を製作する。パソコン制御可能なバイポーラ電源、卓上型ドラフト装置、工作物回転用スピンドルの購入と、装置製作費が主な使途である。また、絶縁材料を用いて円筒状、スリット状、拡張型、集束型などのノズルを購入、あるいは製作する。さらに、内径が数十ミクロン以下のノズルを購入、または製作し、微細加工を行う。
グルコース6リン酸脱水素酵素(G6PD)遺伝子と薬剤耐性に関する研究

薬剤耐性細胞株でグルコース6リン酸脱水素酵素(G6PD)の発現が高まっていることをふまえ、G6PD遺伝子が薬剤耐性に関与するかを直接証明するために、以下の実験を行った。ネオマイシンで選択可能なEukaryocyte系expression vectorPCDNA 3.1(-)に1.6kbのcodingregionのみに短縮したG6PD遺伝子cDNAを組み込んだPCDNA3/G6PDと、それを反対方向に組み込んだPCDNA3/G6PD-Rを作成した。これらvectorおよびPCDNA3.1(-)を培養細胞cos7,K562にElectroporatorないしはTransferrifectionを用い、Transfectionを行った。G418で選択後23週間後にstable transfectantを得た。PCDNA3.1(-),PCDNA3/G6PD-Rを導入した細胞ではmRNA,タンパクの発現に差はなかった。一方PCDNA3/G6PDを導入した細胞ではmRNAの発現は1.52倍増強した。G6PDタンパクの活性は0.18μmole/mg protein,還元型グルタチオン6.4U/10^6cellsで、対照0.13μmole/mg,4.5U/10^6cellsと比し、やや高値であったが有意ではなく、LC90も10μM vs 5.5μMであった。臨床検体を用いたG6PDの検討では慢性リンパ性白血病(CLL)10例、既治療例6例でmRNA,タンパク発現の差はなく、また前リンパ球性白血病PL2例、悪性リンパ腫初発例3例、治療抵抗性の白血化症例3例でも差はなかった。以上より、G6PD遺伝子が薬剤耐性獲得に関与する直接的なdataは得られなかった。グルタチオン合成酵素が薬剤耐性に関与することはすでに報告されている。同遺伝子単独でtransfectした場合とG6PD遺伝子をco-transfectした場合とで薬剤耐性獲得の程度に違いがあるかどうかについては、興味がもたれるところである。また、G6PDの活性には個人差があることから、同一症例での治療前後のG6PD activityを検討する必要はあろう。グルコース6リン酸脱水素酵素(G6PD)が薬剤耐性に関与するかをみるためにネオマイシンで選択可能なEukaryocyte系expression vector pCDNA3.1(-)に、1.6kbのcodingregionのみに短縮したG6PD遺伝子cDNAを組み込んだpCDNA3/G6PDと、それを反対方向に組み込んだpCDNA3/G6PD-Rを作成した。これらvectorおよびpcDNA3.1(-)を培養細胞K562にTransFastを用いtransfectionを行った。Northern BlotおよびRT-PCR法でpCDNA3/G6PDのみにmRNAの発現の増強がみられた。また蛋白レベルでも同様の所見を得た。今後、さらにtransfectionの効率を高めつつ、cyclophosphamide(CPA)等の抗腫瘍剤に対して耐性となっているか否かを、細胞内還元型グルタチオン量、MDR1遺伝子の発現等を含めて多角的に検討する。さらに、アルデヒド脱水素酵素I型を組み込んだvectorも作成、両者co-transfectionした細胞の薬剤耐性獲得の程度を筆者らが作成したCPA耐性K562細胞と比較検討することにより、薬剤耐性におけるG6PD遺伝子の役割を明らかにする予定である。

一方、未治療の慢性リンパ性白血病(CLL)6例および既治療CLL2例の臨床検体を用いた検討では、G6PD遺伝子の発現には際立った違いはなかった。今後、症例数を増やすとともに、対象疾患を急性白血病等まで広げ、臨床検体でG6PD遺伝子が薬剤耐性と関連しているか否かを検討する予定である。グルコース6リン酸脱水素酵素(G6PD)が薬剤耐性に関与するかをみるために、ネオマイシンで選択可能なEukaryocyte系expresion vector PCDNA 3.1(-)に1.6kbのcoding regionのみに短縮したG6PD遺伝子cDNAを組み込んだPCDNA3/G6PDと、それを反対方向に組み込んだPCDNA3/G6PD-Rを作成した。これらvectorおよびPCDNA3.1(-)を培養細胞cos 7, k562にTransFastないしはTransferrifectionを用い、Transfedtionを行った。G418で選択後23週間後にstable transfetantを得た。PCDNA3.1(-),PCDNA3/G6PD-Rを導入した細胞ではmRNA,タンパクの発現に差はなかった。一方PCDNA3/G6PDを導入した細胞ではmRNAの発現が増強する傾向があったが、その強度は1.5倍以内にとどまった。G6PDタンパクの活性は0.18μmole/mg protein,還元型グルタチオン6.4U/10^6cellsで、対照0.13, 4.5Uと比し、やや高値であったが顕著な差ではなく、LC90も10μM vs 5.5μMであった。臨床検査を用いた検討では慢性リンパ性白血病(CLL)10例、既治療例6例で差はなく、また前リンパ球性白血病PL2例、治療抵抗性の白血化症例3例でもmRNAタンパクの発現はなかった。以上より、G6PD遺伝子が薬剤耐性獲得に関与する直接的なdataは今のところ得られていない。しかし、G6PDのmRNA、タンパクが遺伝し導入した細胞で十分発現しているとはいい難くG6PD遺伝子を組み込んだレトロウイルスベクターを作成中である。
ユビキチンプロテアソーム系の応用による細胞内寄生原虫に対するDNAワクチンの開発

原虫の感染系で「宿主寄生体相互関係」の解析およびそれらの病原体に対する遺伝子ワクチンの解析に携わってきた。その結果それらの病原体に対する防御免疫にはCD8^+T細胞を中心とした細胞性免疫が必須の関わりを持つこと、その免疫誘導には原虫抗原遺伝子とユビキチン遺伝子の融合遺伝子を用いた遺伝子免疫が最も効果的であることを報告してきた。更に我々は赤血球内寄生原虫であるマラリア原虫感染においても上記の細胞内寄生原虫と類似した「宿主寄生体相互関係」が存在し、それに対する宿主防御免疫がCD8^+T細胞を中心とした細胞性免疫が必須であることを解明した。現在は申請者がマラリア原虫の肝臓内型抗原遺伝子(CSP)と赤血球内型抗原遺伝子(MSP1)を各々ユビキチン遺伝子と融合させた後、両遺伝子の結合(キメラ)遺伝子を作成し、そのキメラ遺伝子を用いたDNAワクチンの開発研究を既に開始している。近年、田中らによりペプチド抗原をユビキチン化することによりその抗原がプロテアソームでプロセッシングを受け、必然的にMHCクラスI分子に提示され、抗原特異的CD8^+T細胞が誘導されることが証明された(Immunol.Rev. 163:1676,1998)。---この経路はユビキチンプロテアソーム経路と呼称されている。当研究室では上記知見を基盤とし、細胞内寄生病原体であるトキソプラズマ,クルーズトリパノソーマ、ネズミマラリア・結核菌等の遺伝子とユビキチン遺伝子の融合遺伝子を構築し、各々の原虫に特異的なCD8^+T細胞を強力に誘導するフユージョンDNAワクチンを開発してきた。本年度は主としてトキソプラズマ強毒株(RH株)感染に対するフュージョンDNAワクチン法を確立した。1)まずトキソプラズマ抗原遺伝子であるSAG-1遺伝子とユビキチン遺伝子の融合を行った後にCOS-7細胞にそのフュージョンDNAを定常発現させ、抗SAG-1抗体で免疫沈降させた後に抗ユビキチン抗体を用いWestern blottingで確認した。2)ついで、ユビキチン遺伝子とSAG-1遺伝子を融合させることにより、SAG-1遺伝子産物がプロテアソームでprocessingを受けることを1)で用いたCOS-7細胞とプロテアソーム阻害剤であるMG-132を用いて間接的に証明した。3)本融合遺伝子でBALB/cマウスに2週間毎に4回、遺伝子銃を用いてDNAワクチンを行い、最終ワクチンの2週間後にトキソプラズマRH株を感染させた。図AのごとくSAG-1遺伝子によるDNAワクチンでは全く効果がなかったが、ユビキチン-SAG-1融合遺伝子によるDNAワクチンでは90%以上のマウスが生存し、強いワクチン効果が証明された。さらにユビキチン-SAG-1遺伝子ワクチン群ではSAG-1を標的とした強いCD8^+T細胞によるキラー活性が認められた。4)本法のごとくユビキチンプロテアソーム系の応用によるDNAワクチン法は細胞内寄生病原体に対する全く新規の、そして強力なDNAワクチン法であり、結核菌に対しても有効なワクチン法であることが示唆された。5)なお、本DNAワクチン法は前述のごとくユビキチンプロテアソーム系の応用によるものであるので免疫プロテアソーム調節ユニットであるPA28α/βに依存しない経路を使用していることが明らかとなった。1)ワクチンベクター及びサイトカイン発現ベクター構築ワクチン抗原(トキソプラズマ原虫SAGl)をコードする遺伝子をユビキチン遺伝子とフュージョンした遺伝子(pcDNAUB-SAGl)でMHC class I依存性の免疫を誘導した。2)マウスモデルにおけるワクチンベクター導入効果の検討マウスに対して、「フュージョンベクター」DNAワクチンを行った。ワクチンには生体への遺伝子導入効率に優れた遺伝子銃を用いた。ワクチン後、同蛋白に対する特異抗体価、リンパ球の抗原特異的増殖反応・

サイトカイン産生及び細胞傷害活性について解析を行い、「フュージョンベクターによるDNAワクチン」の免疫誘導能並びにその特徴を明らかにした。3)マウスモデルにおけるワクチンベクターのユビキチンプロテアソーム経路への関与の検討マウスに対して、遺伝子銃を用いて「フュージョンベクター」DNAワクチンを行った。抗原提示細胞としてマクロファージ由来PMJ2-PC細胞等へワクチンベクターの遺伝子導入を行い、ワクチン後マウス脾細胞と共培養し、サイトカイン産生及び細胞傷害活性について解析を行った。その際、プロテアソーム阻害剤であるMG-132,エポキソマイシン等を用いることで、抗原提示におけるユビキチン-プロテアソーム経路の重要性について詳細に確認した。4)PA28α-/-β-/-及び免疫プロテアソームノックアウト(LMP7ko)マウスにおけるワクチンベクター導入効果の検討プロテアソームアクティベーターPA28あるいは免疫プロテアソームLMP7欠損マウスを用いてユビキチンプロテアソーム経路の影響についてin vivoでの詳細な解析を行った。その結果、SAGlに対するCD8^+CTLの誘導には、PA28は関与してないが、LMP7が必須の関わりを持つことが明らかとなった。1)ワクチン抗原(トキソプラズマ原虫SAG1)をコードする遺伝子をユビキチン遺伝子とフュージョンした遺伝子(pcDNAUB-SAG1)でMHC class I依存性の免疫を誘導した。2)作製したワクチンベクターは様々な細胞株に遺伝子導入を行い発現の確認を行い、抗原蛋白のプロセッシング及び抗原提示機構を解析した。作製したワクチンベクターを細胞株に遺伝子導入を行い、プロテアソーム阻害剤であるMG-132,エポキソマイシン等を用い、抗原蛋白質のプロセッシングとプロテアソーム阻害剤の影響についてウエスタンブロッティング法により解析を行った。3)マウスに対して、「フュージョンベクター」DNAワクチンを行った。ワクチンには生体への遺伝子導入効率に優れた遺伝子銃を用いた。ワクチン後、同蛋白に対する特異抗体価、リンパ球の抗原特異的増殖反応・サイトカイン産生及び細胞傷害活性について解析を行い、「フュージョンベクターによるDNAワクチン」の免疫誘導能並びにその特徴を明らかにした。4)マウスに対して、遺伝子銃を用いて「フュージョンベクター」DNAワクチンを行った。5)免疫プロテアソームのアクティベーターPA28及び免疫プロテアソームのメインコンポーネントであるLMP7のノックアウトマウスを用いて、ワクチンに対するユビキチンプロテアソーム経路の影響についてin vivoでの詳細な解析を行った。その結果、SAG1に対するCD8^+CTLの誘導には、PA28は関与してないが、LMP7が必須の関わりを持つことが明らかとなった。
ATP-活性化K^+チャネルを介した新規インスリン分泌制御機構についての研究

β細胞には各種のイオンチャネルの存在が知られているが、中でもインスリン分泌に影響をおよぼす重要なチャネルはATP感受性K^+チャネル、電位依存生K^+チャネル、電位依存性Ca^<2+>チャネルである。本研究ではパッチクランプ法並びに細胞内Ca^<2+>濃度の顕微測光法による測定を用いて、イオンチャネルレベルでインスリンとともに分泌されるATPの作用を研究し、さらに細胞内Ca^<2+>動態に対するATPの影響を検討した。単一β細胞に細胞接着型パッチを形成し、ATP感受性K^+チャネル電流を記録し、細胞外からATPを作用させK^+チャネル活動の変化を検討した。チャネルはATPにより活性化される場合と活性化されずに活動電位が抑制される現象が観察された。次に全細胞膜電位固定実験にて、電位依存性Ca^<2+>チャネルに対するATPの作用を観察すると、チャネルはATPにより可逆的に抑制された。この作用は細胞内Ca上昇によるチャネル抑制によってもたらされたものではなく直接チャネルを抑制する機序が考えられた。また、チャネル抑制の機序には細胞内に前投与したGDPベータSの存在下でも観察されたことからGTP結合蛋白の関与はないものと思われた。ATPの作用は10μM以上の濃度でみられた。また、細胞内Ca^<2+>濃度の測定では細胞外から適用したATPは細胞内Ca^<2+>濃度を一過性に上昇させた。この反応はレセプター刺激Pholpholipase C,PI turn over促進,IP3産生ERよりのCa^<2+>releaseが考えられている。以上より膵β細胞においてインスリンとともに開口放出されるATPはβ細胞膜上の固有のレセプターに結合し膜の過分極または、Ca^<2+>チャネルの抑制をもたらすが、細胞内Ca^<2+>濃度については一過性の増加を示す。Ca^<2+>チャネル抑制はこの細胞内Ca^<2+>上昇に対してチャネルを抑制しca^<2+>流入を減少させることにより細胞内Ca^<2+>濃度の上昇をすばやく抑制しインスリン分泌に対してはnegative feedback機構として働いていることが考えられた。
動的環境におけるロバストなチーム編成に関する研究

本年度の研究実施計画に記載した研究課題(1)動的環境における提携ゲームの定式化とアルゴリズムの開発,(2)確率的な提携構造形成問題及び,(3)応用研究としてナース・スケジューリング問題をそれぞれ実施した.まず,チーム編成問題を含む協力ゲーム理論における代表的な枠組みである提携構造形成問題の研究に従事した.チーム編成問題は集合被覆問題と等価であり,提携構造形成問題は完全集合分割問題と等価な問題である.研究課題(1)及び(2)では,確率的な提携構造形成問題のフレームワーク及び,解精度を保証する近似解法を開発した.また,ロバスト性を考慮したロバストな提携構造形成問題のフレームワークを提案し,ロバスト性と最適性を同時に考慮した多目的最適化アルゴリズムを開発した.さらに,提携構造形成問題における特性関数の簡略表記法に基づく確率的提携構造形成問題のフレームワークを提案し,この問題を解く効率的なアルゴリズムを開発した.本研究成果はエージェントの応用分野に関する国際会議International Conference on Principles and Practice of Multi-Agent Systems (PRIMA 2018)に2本の論文が採録され,その内の1本は最優秀論文賞に選ばれた.また知識表現に関する最難関国際会議International Conference on Principles of Knowledge Representation and Reasoning (KR 2018)にも論文が採録された.さらに,特性関数の簡略表記法に基づく確率的提携構造形成問題に関する研究では,情報系では国内で最も権威のある船井ベストペーパー賞を受賞している.研究課題(3)では,スポーツ・スケジューリングやナース・スケジューリングに着手し,現在いくつかの論文を投稿している.*申請者は既に本研究課題のベースとなるロバストな提携構造形成問題や,確率的な提携構造形成問題に関する研究に早い段階から着手しており,研究計画通りに取り組むことが出来た.*共同研究者らと研究打合せ・議論を行う機会を沢山もてたことが成果につながったと考える.*応用研究(C)に関しては従来の計画以上の成果を挙げることが出来た.H31年度の研究実施計画に記載した以下の研究課題に取り組む.基礎研究1:動的環境におけるチーム編成の解概念として,ヘテロジニアス(多様)及び,ホモジニアス(ロバスト)なチームをそれぞれ定義し,これらの解概念に基づく問題の定式化及び,この問題を解くアルゴリズムを開発する.基礎研究2:従来の特性関数の簡略表記法に基づく提携形ゲームに対して,確率を導入した問題の定式化及び,この問題を解く効率的なアルゴリズムを開発する.また,特性関数の簡略表記法に基づく制限付き提携構造形成の研究にも着手する.応用研究1:ロバスト性と関連するレジリエンスに着目し,レジリエンスに関する解概念を導入したナース・スケジューリング問題の定式化及び,この問題を解くアルゴリズムを開発する.応用研究2:特性関数の簡略表記法に基づく制限付き提携構造形成(基礎研究2)に基づくナース・スケジューリング問題の定式化及び,この問題を解くアルゴリズムを開発する.本年度は申請書に提案した研究課題(A)ロバストなチーム編成アルゴリズムの開発,(B)動的環境におけるロバストなチーム編成の定式化とアルゴリズムの開発及び,(C)災害派遣医療チーム編成問題の研究をそれぞれ研究計画に沿って実施した.研究課題(A)に関しては,多目的(分散)制約最適化アルゴリズムに基づくアプローチとして,単一目的の分散制約最適化問題の代表的なアルゴリズムである動的計画法に基づくDPOPを多目的へと拡張したアルゴリズムを開発した.チーム編成問題を含む提携ゲームは分散制約最適化問題として表現可能であり,本年度はチーム編成問題へ適用可能な多目的分散制約最適化アルゴリズムを開発した(研究計画A-1).本研究成果はエージェント分野の最難関国際会議であるInternational Conference on Autonomous Agents and Multiagent Systems (AAMAS-2018)に論文が採録されている.研究課題(B)に関しては,動的環境におけるチーム編成問題として,recoverable team formationの定式化及び,この問題を解くアルゴリズムを開発した(研究計画B-1,2,3).従来のロバストなチーム編成は動的環境におけるプロアクティブなアプローチであるのに対し,recoverable team formationはリアクティブなアプローチとなる.本研究成果もAAMAS-2018に論文が採録されている.研究課題(C)に関しては, DMATに関する情報収集及び,南海トラフを想定したDMAT編成シミュレーションを実施した(研究課題C-1,2).*申請者はこれまでに本研究課題のベースとなるロバストなチーム編成問題及び多目的(分散)制約最適化問題に関する研究成果を挙げており,これらを拡張した研究課題A及びBに関しては研究計画通りに取り組むことができた.*共同研究者らと研究打合せ・議論を行う機会を沢山もてたことが成果につながった.*平成30年度実施予定の研究にも着手することができ,特に応用研究(C)に関しては従来の計画以上の成果を挙げることが出来た.本年度の研究実施計画に記載した研究課題(1)動的環境における提携ゲームの定式化とアルゴリズムの開発,(2)確率的な提携構造形成問題及び,(3)応用研究としてナース・スケジューリング問題をそれぞれ実施した.まず,チーム編成問題を含む協力ゲーム理論における代表的な枠組みである提携構造形成問題の研究に従事した.チーム編成問題は集合被覆問題と等価であり,提携構造形成問題は完全集合分割問題と等価な問題である.研究課題(1)及び(2)では,確率的な提携構造形成問題のフレームワーク及び,解精度を保証する近似解法を開発した.

また,ロバスト性を考慮したロバストな提携構造形成問題のフレームワークを提案し,ロバスト性と最適性を同時に考慮した多目的最適化アルゴリズムを開発した.さらに,提携構造形成問題における特性関数の簡略表記法に基づく確率的提携構造形成問題のフレームワークを提案し,この問題を解く効率的なアルゴリズムを開発した.本研究成果はエージェントの応用分野に関する国際会議International Conference on Principles and Practice of Multi-Agent Systems (PRIMA 2018)に2本の論文が採録され,その内の1本は最優秀論文賞に選ばれた.また知識表現に関する最難関国際会議International Conference on Principles of Knowledge Representation and Reasoning (KR 2018)にも論文が採録された.さらに,特性関数の簡略表記法に基づく確率的提携構造形成問題に関する研究では,情報系では国内で最も権威のある船井ベストペーパー賞を受賞している.研究課題(3)では,スポーツ・スケジューリングやナース・スケジューリングに着手し,現在いくつかの論文を投稿している.*申請者は既に本研究課題のベースとなるロバストな提携構造形成問題や,確率的な提携構造形成問題に関する研究に早い段階から着手しており,研究計画通りに取り組むことが出来た.*共同研究者らと研究打合せ・議論を行う機会を沢山もてたことが成果につながったと考える.*応用研究(C)に関しては従来の計画以上の成果を挙げることが出来た.チーム編成を包括する提携ゲームにおいて,ロバスト性,不確実性,ダイナミクスを考慮した研究を実施する.具体的には,*提携ゲームの代表的なフレームワークである提携構造形成問題において,ロバスト性を考慮したロバストな提携構造形成問題の定式化及びアルゴリズムの開発を実施する.*確率的な提携ゲームの定式化及び,この問題を解くアルゴリズムの開発を実施する.*応用研究として,ロバスト性を考慮したスケジューリング問題に関する研究を実施する.H31年度の研究実施計画に記載した以下の研究課題に取り組む.基礎研究1:動的環境におけるチーム編成の解概念として,ヘテロジニアス(多様)及び,ホモジニアス(ロバスト)なチームをそれぞれ定義し,これらの解概念に基づく問題の定式化及び,この問題を解くアルゴリズムを開発する.基礎研究2:従来の特性関数の簡略表記法に基づく提携形
参加型現代美術作品を用いた体験的鑑賞教育の可能性についての調査研究

現代美術を対象とする鑑賞とは、様々なコンテクストへの接続が自らの判断に拠ることを自覚し、これを言語化して他者へ発信することを通して承認を得る過程だと借定し得る。参加型作品とは作品特性に従った鑑賞の一様態であり、「参加」が体験的鑑賞を助長または強化するとは断言出来ない。体験的鑑賞教育とは、一連の活動が個別的体験だと自覚される上で成立することが判明した。自覚化としての体験を鑑賞教育で獲得するには、批評性を獲得する必要がある。そして、批評の視点を持つことが「体験的鑑賞教育」の意義に成り得る。本研究は、参加型現代美術作品を用いた体験的鑑賞教育の可能性と「その意義を明らかにするための調査及び研究を行うことにある。現代美術といった場合、一般にその表現領域や時代区分が明確ではないため、これを借定する必要があった。調査の結果、2004年に開館した金沢21世紀美術館の作品収集方針に示された「1980年以降に制作された新しい価値を提案する作品」が現状に最も則していた。これを採用し本研究が対象とする現代美術作品とした。次に全国の美術館から現代美術作品を収蔵する美術館のリストを作成することを行った。上記した借定と照合した場合、近代美術館でも現代美術作品を収蔵していることが判明した一方、現代美術館はその性質上、作品収集を行っていない館が多いことが判明した。参加・体験型作品に限定した場合、収蔵点数は著しく低くなった。収蔵する全ての作品データが公開されていないことも多く、完全なデータベースを作成することは困難であるが継続中である。これが本年度の成果の1点目である。2点目として。参加型現代美術作品が展示に含まれていた展覧会を踏査した。金沢21世紀美術館でさた「金沢アートプラットホーム2008」と水戸芸術館で開催された「カフェ・イン・水戸2008」、宮城県美術館で開催された「OCCUR2009交差The momenta vector crosses.」である。その結果、次の三つの特性が判明した。第一に地域性の問題、第二に教育現場との連携に係る諸問題、第三に美術館の教育普及担当者又は鑑賞プログラムの構築に係る問題である。上記した美術館及び他館の鑑賞プラグラム及びツールの調査を始めたところであり、09年度も継続して行う予定である。以上の調査がら、参加型作品の体験によってのみ鑑賞教育の体験性が特化されるのではないことが判明した。鑑賞行為自体が体験的学習であるという前提のもと、作品との出会いをどのように構想するかが最も重要であることが明らかとなった。本研究は、参加型現代美術作品を用いた体験的鑑賞教育の可能性とその意義を明らかにするための調査及び研究を行うことにある。昨年度から継続して、主に次の2点を調査した。1参加・体験型作品の収蔵状況の調査。2参加型現代美術作品が展示に含まれている展覧会の踏査。1の結果、(1)DB検索において、館又は作品によっては画像が未掲載である。(2)表示されても参加・体験型であるかを判断できない。(3)検索条件によって表示内容に差が生じるなどの問題があることが分かった。これらは収蔵作品のDB化の遅れとともに、デジタルミュージアムのアーキテクチャが未構築に因るものである。従って、各館が発行する収蔵品カタログを参照する必要があることが判明した。今年度は2の調査対象に参加・体験性を有するアートプロジェクトを加え踏査したが、特に、アーティストユニット「KOSUGE1-16」の追跡調査を行った。対象となった展覧会は、「こども+大人+夏の美術館まいにち、アート!!」(群馬県立近代美術館)での活動『AC-GM5』である。『AC-GM5』を含む参加作家を対象とした教育普及活動、(1)子ども向け鑑賞教育、(2)トーナメント・イベント「AC-GM5杯」、(3)KOSUGEのアーティスト・トークを各々見学、視察、聴講した。(1)では、『AC-GM5』での子どもの様子を、(2)では他館との活動の比較を、(3)では、彼らが企図するアートを通したコミュニケーションの在り方を知ることが出来た。その結果、事前活動や(2)への参加など体験を重視することがKOSUGEの活動を理解する障害となりうるが理解された。このことは、(3)を理解するにはメタ的な視野を持つことの必要性を示唆している。これは本年度の大きな成果であり、今後、考察を深める必要がある。以上の調査の結果を踏まえて、研究代表者の個展とトークイベントを開催した。トークインベントでは、制作者として鑑賞に対する考えと鑑賞の現場における諸問題を提起することができた。

初年度から継続して、1参加型現代美術作品が含まれている展覧会の踏査。2美術館及び小中学校で行われている鑑賞教育。3参加型作品の制作および展示発表を行った。1では、KOSUGE 1-16の『AC-MOT』(こどもの庭・東京都現代美術館)及び『長者町山車プロジェクト』(あいちトリエンナーレ2010・愛知県名古屋市)を追跡調査した。これまでの考察を基に踏査した結果、次の変化が確認された。(1)鑑賞者がメタ的視点を持たなければ把握できない活動をより実感することが出来る仕組みを提示していること。(2)反面、外部の鑑賞者には半ば閉ざされたものへと変容したことである。2では、教職員向け鑑賞授業研修会(群馬県立近代美術館)、鑑賞の授業(小学校)、中学校と美術館の連携による鑑賞授業をそれぞれ視察した。結果、組織の違いから活動目的に差が生じることが明らかとなった。3では、制作に参加した鑑賞者とその友人、一般の鑑賞者など個別的なコンテクストが鑑賞に差異を与える結果が得られた。作者自身が参加者と鑑賞者の変化について考察した事例が限られている現状から、本考察の意義は少なくはない。本研究を踏まえ、次のように言うことが出来る。歴史的に価値付けられた解釈に至るという意味においては、作品に対する正しい理解は成立するが、現代美術のように価値が未確定な対象には合致し難い。ならば、現代美術を対象とする鑑賞とは、様々なコンテクストへの接続が自らの判断に拠ることを自覚し、これを言語化して他者へ発信することを通して承認を得る過程だと借定し得る。ならば、参加型作品とは作品特性に従った鑑賞の一様態であり、「参加」が体験的鑑賞を助長または強化するとは断言出来ない。体験的鑑賞教育とは一連の活動が個別的体験的だと自覚される上で成立することが判明した。
遺伝子発現に関与する核酸の特異構造と金属イオンの役割

最近の核酸合成法や遺伝子工学の発展によって、核酸分子の相互作用を利用して遺伝子の発現を制御する試みが可能になってきた。いろいろな機能をあわせもつ機能性核酸分子の開発もいよいよ現実化してきたと言えよう。この機能性核酸分子として最も有望なのが、リボザイムである。リボザイムは、エイズや癌などの遺伝子を切断する新しいタイプの"核酸薬剤"として期待されている。また、遺伝子の発現を制御するアンチセンス法やアンチジーン法においても有効であることが報告され始めている。しかしながら、このような機能性核酸分子の開発にあたっては、解決しなければならない問題も少なくない。その主な問題点は、1)リボザイムがヌクレアーゼなどに対して非常に不安定であること、2)リボザイムのダウンサイジング、3)リボザイムの反応効率がよくない(反応速度が遅い)ことの三点にあると考えられる。そこで、本研究では、特に2、3)のリボザイムのダウンサイジングと反応効率の改善に関して、リボザイムと金属イオンの関係を検討した。リボザイムの切断反応は、加水分解反応であるのが特徴であり、その切断機構には金属イオンが関与する部位が複数存在していると考えられる。したがって、異種の金属イオンが存在する場合、そのイオンの結合部位はその機能により異なると推測される。つまり、異種の金属イオンの組み合わせによっては、それらのイオンの役割分担が起こり、それぞれが単独で存在する場合によりも、高い切断活性が得られる可能性が期待できる。このような観点から、Pb^<2+>イオンによってRNAの非塩基対部位を特異的に切断する小型リボザイムであるレッドザイム(鉛リボザイム)を対象として、RNA分子の配列特異的な切断反応と希土類イオンとの関係を検討し、反応効率が格段に高くかつ非常に小さい(10量体)リボザイムの開発に成功した。
HBs抗原粒子をベクターとしたヒト肝細胞に対する遺伝子治療の開発

ヒト肝細胞癌に対して特異的に抗腫瘍効果を持つことのin vitroでの確認HGFの抗腫瘍効果-肝再生の判定はMTT assayで行う.HepC3Aでは抗腫瘍効果を認めたが対照の大腸癌株(WiDr)では抗腫瘍効果を認めなかった.ヒト肝細胞癌に対して特異的に抗腫瘍効果を持つことのin vivoでの確認肝細胞癌株(HepG2,HepC3A,NuE),大腸癌株(WiDr,HT29)をそれぞれマウスの皮下に移植し担癌マウスを作製.対照として正常ヒト肝組織移植ヌードマウスを作製.HGFを封入したL粒子をマウスの尾静脈から静注し,経時的に腫瘍径を測定やHE染色で細胞形態やApoptotic Indexを検討し抗腫瘍効果を判定する.ヒト肝細胞癌に対して特異的に抗腫瘍効果を持つことのin vitroでの確認HGFの抗腫瘍効果・肝再生の判定はMTT assayで行う.HepC3Aでは抗腫瘍効果を認めたが対照の大腸癌株(WiDr)では抗腫瘍効果を認めなかった.ヒト肝細胞癌に対して特異的に抗腫瘍効果を持つことのin vivoでの確認肝細胞癌株(HepG2,HepC3A,NuE),大腸癌株(WiDr,HT29)をそれぞれマウスの皮下に移植し担癌マウスを作製.対照として正常ヒト肝組織移植ヌードマウスを作製.HGFを封入したL粒子をマウスの尾静脈から静注し,経時的に腫瘍径を測定やHE染色で細胞形態やApoptotic Indexを検討し抗腫瘍効果を判定する.HGF封入L粒子は肝細胞癌株(HepG2)で腫瘍径の縮小を認めたが,対照の大腸癌株(WiDr)では抗腫瘍効果を認めなかった.ヒト肝細胞癌に対して特異的に抗腫瘍効果を持つことのin vitroでの確認HGFの抗腫瘍効果-肝再生の判定はMTT assayで行う.HepC3Aでは抗腫瘍効果を認めたが対照の大腸癌株(WiDr)では抗腫瘍効果を認めなかった.ヒト肝細胞癌に対して特異的に抗腫瘍効果を持つことのin vivoでの確認肝細胞癌株(HepG2,HepC3A,NuE),大腸癌株(WiDr,HT29)をそれぞれマウスの皮下に移植し担癌マウスを作製.対照として正常ヒト肝組織移植ヌードマウスを作製.HGFを封入したL粒子をマウスの尾静脈から静注し,経時的に腫瘍径を測定やHE染色で細胞形態やApoptotic Indexを検討し抗腫瘍効果を判定する.