hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ピリドキサール酵素のプロトン移動過程の解明に基づくコンポジット触媒の開発

ピリドキサール酵素のプロトン移動過程を調べることにより,従来概念の域を出なかった「誘導適合が触媒能力を高める機構」や「多基質認識の機構」の分子論的実体を明らかにすることができた.アスパラギン酸アミノ基転移酵素(AAT)は基質結合に伴って大小ドメインが接近するとGly38主鎖のカルボニル基がシッフ塩基に接近するために,脱プロトン化状態にあるシッフ塩基と静電的な反発を起こすことが判明した.これについて三次元エネルギー準位解析を行った結果,従来から言われてきた「基質結合に伴うシッフ塩基のpK_aの上昇」には本質的な意義を持つものではなく,ミハエリス複合体の不安定化によるk_<cat>の増大が目的であることが示された.AATとグルタミン酸(C5)の遷移相速度論的解析やX線結晶構造解析の結果,ミハエリス複合体ではC5基質はC4基質と異なりAATは開いた構造になること,一方,反応が1段階進んだ外アルジミン複合体では閉じた構造になることが判明した.C4基質のミハエリス複合体では活性部位表面の疎水性残基群が閉じたコンフォメーションになる際に互いに強く相互作用しているが,C5基質のミハエリス複合体ではこの相互作用が消失しているのがそのエネルギー準位を高めている理由であることが判明した.このようにしてAATの疎水性残基群がAATのC5基質の結合(K_m値)を犠牲にして最大反応速度(k_<cat>値)を増大している機構を担っていることを明らかにし,触媒パーツの機能を基質認識パーツが高めているというコンポジット触媒としてのパーツ間の有機的な相互作用の形態を明らかにした.この他,セリンパルミトイル転移酵素において反応パーツの多彩な機能を基質認識パーツが制御している機構を明らかにした.これは電子軌道のオーバーラップを制御するという立体化学的な機構に基づていることを明らかにした.ピリドキサール酵素のプロトン移動過程を調べることにより,従来概念の域を出なかった「誘導適合が触媒能力を高める機構」や「多基質認識の機構」の分子論的実体を明らかにすることができた.アスパラギン酸アミノ基転移酵素(AAT)は基質結合に伴って大小ドメインが接近するとGly38主鎖のカルボニル基がシッフ塩基に接近するために,脱プロトン化状態にあるシッフ塩基と静電的な反発を起こすことが判明した.これについて三次元エネルギー準位解析を行った結果,従来から言われてきた「基質結合に伴うシッフ塩基のpK_aの上昇」には本質的な意義を持つものではなく,ミハエリス複合体の不安定化によるk_<cat>の増大が目的であることが示された.AATとグルタミン酸(C5)の遷移相速度論的解析やX線結晶構造解析の結果,ミハエリス複合体ではC5基質はC4基質と異なりAATは開いた構造になること,一方,反応が1段階進んだ外アルジミン複合体では閉じた構造になることが判明した.C4基質のミハエリス複合体では活性部位表面の疎水性残基群が閉じたコンフォメーションになる際に互いに強く相互作用しているが,C5基質のミハエリス複合体ではこの相互作用が消失しているのがそのエネルギー準位を高めている理由であることが判明した.このようにしてAATの疎水性残基群がAATのC5基質の結合(K_m値)を犠牲にして最大反応速度(k_<cat>値)を増大している機構を担っていることを明らかにし,触媒パーツの機能を基質認識パーツが高めているというコンポジット触媒としてのパーツ間の有機的な相互作用の形態を明らかにした.この他,セリンパルミトイル転移酵素において反応パーツの多彩な機能を基質認識パーツが制御している機構を明らかにした.これは電子軌道のオーバーラップを制御するという立体化学的な機構に基づていることを明らかにした.アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AspAT)の反応機構は基質アナログとの反応を中心に解析されてきた。そこで真の反応過程がどうなっているか知るために,正常基質との反応を時分割スペクトルの採取とグローバルアナリシスによって解析した。さらに重水素同位体効果の解析を組み合わせることにより,重要な中間体間の速度定数の大部分を決定することが出来た。その結果はおおむね基質アナログとの反応によって得られた反応機構を支持するものであったが,触媒過程に重要な意義を有していると考えられて来た「基質結合に伴う補酵素-Lys258シッフ塩基のpK_aの上昇」がより顕著に見られ,その反応機構における意義が改めて注目された。次にその塩基性上昇のメカニズムを探った。基質結合は酵素蛋白質のコンフォメーション変化を起こす。そこで酵素の大小ドメイン間に存在するVal39をよりかさ高いPheに置換した酵素を作製して解析したところ,基質結合に伴って大小ドメインが接近するとGly38主鎖のカルボニル基がシッフ塩基に接近するために,脱ブロトン化状態にあるシッフ塩基と静電的な反発を起こし,結果的にそのpK_a、を高めることが判明した。これについて三次元エネルギー準位解析を行った結果,従来から言われてきた「基質結合に伴うシッフ塩基のpK_aの上昇」には本質的な意義を持つものではなく,ミハエリス複合体の不安定化によるた。k_<cat>の増大が目的であることが示された。ヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ(HisPAT),分枝アミノ酸アミノトランスフェラーゼ(BCAT)について単独および基質(アナログ)複合体の結晶構造を得た。

またセリンパルミトイルトランスフェラーゼ(SerPAT)については解析に容易な可溶性酵素を産出する菌を発見し,精製・クローニングを行った。いずれも平成14年度の酵素触媒反応の解析のための土台となるものである。アスパラギン酸アミノ基転移酵素(AAT)はC4とC5という異なる長さの基質を結合する能力を有する。一般に鎖長の異なる基質を結合する酵素は数多く知られているが,それらは炭化水素鎖の鎖長が異なる基質を疎水ポケットによって認識するという非特異的認識であることが多く,AATのように末端に認識のための官能基を有するような異なる鎖長の基質を認識するものは例が少ない。そこで,AATがどのような機構でC4およびC5基質の二重認識を行うかということについて解析した。AATとグルタミン酸(C5)の遷移相速度論的解析,およびC5基質アナログを結合したものの分光学的解析により,AATとC5基質の反応はC4基質の場合と異なり,多くのプロトン化状態を許容することが明らかになった。さらにC5基質とAATの複合体のX線結晶解析の結果,C4基質と異なりAATは開いたコンフォメーションを取り,C5基質はAATの中で伸びたコンフォメーションを取っていることが判明した。この結果α-アミノ基がSchiff塩基とは反対を向き,これらの間の相互作用が減弱し,多数のプロトン化状態を取ることが構造的に説明された。このミハエリス複合体の構造では弱い水素結合でC5基質とAATの結合が起こっており,これはAATがC5基質については結合(K_m値)を犠牲にして最大反応速度(k_<cat>値)を増大している方策であると解釈された。セリンパルミトイルトランスフェラーゼ(SPT)はAATと構造的に似通っていながら全く異なる反応を触媒する酵素であり,AATの基質認識コンポジットに対して反応コンポジットの面で興味深い。SPTについて結晶解析が進行しており,構造論的基盤に基づいた反応解析を次年度に展開する予定である。アスパラギン酸アミノ基転移酵素(AAT)は炭素数4個の基質(C4基質)と5個の基質(C5基質)の両方を基質とする.この二重の基質認識機構を前年度に引き続き解析した.遷移相速度論的解析・分光学的解析により,C4基質とAATのミハエリス複合体が閉じたコンフォメーションを取っているのと異なり,C5基質とAATのミハエリス複合体は開いたコンフォメーションを取っていることが判明した.一方,ミハエリス複合体から1段階進んだ外アルジミン複合体(活性部位において基質アミノ酸と補酵素ピリドキサールリン酸がシッフ塩基を形成したもの)においてはC5基質とAATの複合体もC4基質とAATの複合体と同様に閉じたコンフォメーションを取っていることをX線結晶解析で明らかにした.そこで,C5基質との反応においては開いた構造であるミハエリス複合体を閉じた構造である外アルジミン複合体にエネルギー的に近づけるための方策が必要となる.C5基質のミハエリス複合体のモデルであるグルタル酸とピリドキサミンリン酸型AATの結晶構造を用いて構造を比較したところ,C4基質のミハエリス複合体では活性部位表面の疎水性残基群が閉じたコンフォメーションになる際に互いに強く相互作用しているが,C5基質のミハエリス複合体ではこの相互作用が消失しているのがそのエネルギー準位を高めている理由であることが判明した.事実,この疎水性残基群の1つであるTyr70のベンゼン環を消失させる変異ではC5基質に対するk_<cat
英語学習者の異文化に対する積極的な態度の育成-教育手法の開発とその教育効果の実証

本研究の目的は、英語教育と異文化教育を統合した教育の教育効果を明らかにすることであった。Ishii(2009)で開発したCAモデルに加えて、ソーシャル・スキル・トレーニングを応用したSSTモデルを開発した。実験調査の結果、「他国文化の理解」の低い学習者には、CAとSSTを組み合わせるよりも、CAモデルを単独で導入する方が、積極的な態度変容により大きな影響を与えるということが明らかになった。外国語教育では、単なる言語の学習だけで無く、異文化に対する積極的な態度を獲得することも重要な学習目標の一つである。しかし、このような態度の育成手法は明らかにされていない。本研究は、異なる文化背景を持った人々と、英語で積極的にコミュニケーション使用とする態度を育成することを目指した英語教育の手法を開発し、その教育効果を実証的に明らかにすることであった。具体的には、(1)比較的異文化コミュニケーション摩擦がおこりやすい場面(例:依頼行動)におけるコミュニケーション「行動」に教育手法(SSTモデル)を開発した。さらに(2)異文化に対する「認識」を高める教育手法(CAモデル)によって異文化に対する友好的な態度や興味・関心などを高めた後、「行動」の学習を促すSSTモデルを可算的に実施し、その教育的効果を実験的調査で明らかにすることであった。研究対象はこれまでの研究に継続し、異文化教育に適切な時期であるとされる青年期以降(井下、1997)である高校生英語学習者とした。実験では、CAモデルとSSTモデルの2つの手法の教育効果を検討するため、(1)CA→英会話群、(2)CA→SST群、(3)英会話→SST群、(4)英会話→英会話群の4群を設定し介入実験を行った。最終年度は、実験で得られた量的データの処理を行った。結果、先行研究(Ishii, 2009)で確認された、異文化教育タスク群が英会話タスク群に比べて学習者の異文化に対する態度を積極的にさせる効果は、今回の実験では同じ態度尺度では確認できなかった。実験効果測定には、先行研究同様、国際理解に関する学習者の態度を測定する態度尺度を用いたが、異文化教育の学習効果を測定するには最適ではないことがわかった。今後の課題として、異文化教育の学習効果を測定するための尺度を開発する必要性が明らかになった。初年度の平成23年度は、(1)実験実施校との打ち合わせ、(2)SSTモデルとその教授内容・教材開発、(3)実験計画の修正を行い、(4)本実験の導入を行い、(5)効果の検討を始め、(6)研究成果の発表を行った。まず、(1)実験実施校との打ち合わせでは、4月から7月にかけて、研究校との打ち合わせを数回にわたって行い、実験導入の日程、並びに、実験協力者を確保し、実験に使用する場所を決定した。次に、(2)SSTモデルとその教授内容・教材開発では、「異なる文化背景をもった人々と積極的にコミュニケーションしようとする態度」の育成を目指した態度の行動・感情面の学習を目的とする体験的手法(ソーシャル・スキル・トレーニング、SST)を段階的に導入する教育モデル(SSTモデル)の開発と、その教授内容ならびに教材を開発した。(3)実験計画の修正では、実際の実験導入を想定し、方法・手順を詳細に書きおこし、実験導入時に予想される問題点を検討した。また、できる限り実験協力校ならびに実験協力者の負担にならないように考慮し実験計画を立て、その都度、シミュレーションを行い、計画の修正を行った。そして、(4)本実験の導入は、8月の夏季休業中に宮崎県の実験協力校(公立高等学校)にて行った。(5)効果の検討は、SPSSを用いて統計的な結果分析を行った。現在も結果分析の途中である。(6)研究成果の発表では、(5)効果の検討でこれまでに得られた結果をまとめ、The 2012 TESOL International Convention(於米国フィラデルフィア)において、題目"Developing learners' intercultural competence in language classrooms"として発表した。本年度、本実験導入前に行う予定であった予備実験を行わず、代わりに実験計画のシミュレーションと修正を丁寧に繰り返した。

その理由は、実験協力校ならびに実験協力者の負担をできるだけ軽減するためである。予備実験を回避する代わりに、慎重に実験計画を組んだ。さらに、遅延テストを導入予定であったが、既に、以前の研究(Ishii, 2009)において遅延テストを使用し、学習効果の維持を検討している理由から、今回は遅延テストも回避し、実験直後の学習効果のみを検討することとした。この理由もまた、実験協力者の時間的負担を軽減するためである。現在、心理尺度で測定できるデータはすべて入力し、分析が完了した。今後は、ビデオで録画した被験者の行動学習のデータを詳細に検討する必要がある。また、この録画した行動学習のデータは、3名の評価者に評価を依頼する予定である。これらの評価者への評価方法の教示や、評価に使用するルーブリックの作成を今後行う予定である。また、すべてのデータの分析結果の処理が完了次第、研究結果をまとめ、論文として発表する予定である。データ分析のための統計ソフトウェアの購入、結果報告のため実験協力校への出張費、学会発表出張費、データ分析協力者への謝金、書籍・文献購入費、印刷用のトナー並びにコピー用紙
学習コミュニティにおけるオンラインピアレビューの研究

(1)紙ベースとオンラインベースのルーブリックによる評価差の検証学生同士のピアレビューにおいて、紙ベースルーブリックの運用は、作成、配布、回収、集計の負担が大きい。特にクラスサイズが増大に伴い負担が大きくなるため、システムによるオンラインベース・ルーブリックが相互評価には不可欠である。一方で、紙ベースとオンラインベースに評価差が生じる可能性も考えられる。そこでライティング課題について、両方のルーブリックを用いて自己評価を行い、差異を検討した。その結果、両者の間に有意差は認められなかった。また、教師から学生の評価差が大きい場合には、ルーブリックに記述語が多いため解釈に差が出ている可能性がある。(2)ポートフォリオシステムへのピアレビュー機能の追加実装より精度の高いピアレビューのためには、評価バイアスを低減するしくみが必要である。このため、ピアレビュー機能を追加するにあたっては、「お互い様効果」と「ハロ効果」を削減する評価手続を備えることとした。「お互い様効果」は、レビュアとレビュイを相互に入れ替える場合に甘い評価を行う傾向があることをいう。これを抑制するために、あるレビュイを評価したレビュアは、そのレビュイからは評価されないように評価ペアを構成することにした。「ハロ効果」は、複数観点を持つルーブリックで評価を行う際に、レビュイに関する最初の観点評価が後の観点評価に影響を与えることである。また、グループにおける価値観が共有された場合、そのグループメンバー複数が1人のレビュイを評価する際には偏った評価が蓄積される可能性がある。このため、観点毎に複数のレビュイを評価するようにするとともに、1人のレビュイに対して同一グループのレビュアを割り当てないようなユーザインタフェースを実装している。また、レビュアがレビューを行いやすいようにユーザビリティにも配慮している。今年度は、関西大学東京センターにおけるキックオフミーティングをはじめ、14回のSkypeミーティングを開催し、これまでの授業実践で採集したデータをもとに、1レビュアによるレビューへの影響、2指標によるレビューへの影響を分析した。また、ピアレビューのより詳細な分析を行い、既存のポートフォリオシステムにピアレビュー機能を追加した。教師や学生にとってユーザビリティに配慮したユーザインタフェースを備えたモックアップを2017年度以前に作成していたが、これにさらに研究チームでレビューしながらさらに改善を加え、協力企業に業務委託してポートフォリオシステム"TEC-folio"への追加実装を行った。そして、このシステムをクラウドサービスであるAWS上に導入し、どこからでも利用できるようにした。これによって、2年目以降に計画している「3システムのユーザインタフェースがレビューに与える影響」「4大学、授業クラスなどの学習コミュニティの違いによるレビュー」を実施できる準備が整った。また、実装したピアレビュー機能を用いて、研究分担者が担当している授業でデータを採集する具体的な計画も準備している。2019年度は、実装したピアレビュー機能を用いて、ライティングの授業でピアレビューのデータを採集する。その際には実装したピアレビュー機能によって、「1レビュアによるレビューへの影響(お互い様効果とハロ効果による評価の歪みが抑制されているか)」および「2指標によるレビューへの影響(ルーブリックの観点構成がどのようにレビューに影響を与えているか)」について対照実験を実施して検証を行う。2020年度は、ユーザビリティテストも実施してユーザインタフェースの改善を試みるとともに「3システムのユーザインタフェースがレビューに与える影響」についても検討する。さらに、ピアレビュー機能を複数の大学の授業で使用して「4大学、授業クラスなどの学習コミュニティの違いによるレビュー」についても研究を行う。

また、ピアレビューのより詳細な分析を行い、既存のポートフォリオシステムにピアレビュー機能を追加した。教師や学生にとってユーザビリティに配慮したユーザインタフェースを備えたモックアップを2017年度以前に作成していたが、これにさらに研究チームでレビューしながらさらに改善を加え、協力企業に業務委託してポートフォリオシステム"TEC-folio"への追加実装を行った。そして、このシステムをクラウドサービスであるAWS上に導入し、どこからでも利用できるようにした。これによって、2年目以降に計画している「3システムのユーザインタフェースがレビューに与える影響」「4大学、授業クラスなどの学習コミュニティの違いによるレビュー」を実施できる準備が整った。また、実装したピアレビュー機能を用いて、研究分担者が担当している授業でデータを採集する具体的な計画も準備している。2019年度は、実装したピアレビュー機能を用いて、ライティングの授業でピアレビューのデータを採集する。その際には実装したピアレビュー機能によって、「1レビュアによるレビューへの影響(お互い様効果とハロ効果による評価の歪みが抑制されているか)」および「2指標によるレビューへの影響(ルーブリックの観点構成がどのようにレビューに影響を与えているか)」について対照実験を実施して検証を行う。2020年度は、ユーザビリティテストも実施してユーザインタフェースの改善を試みるとともに「3システムのユーザインタフェースがレビューに与える影響」についても検討する。さらに、ピアレビュー機能を複数の大学の授業で使用して「4大学、授業クラスなどの学習コミュニティの違いによるレビュー」についても研究を行う。研究分担者に割り当てた旅費のうち、分担者の業務の都合により出張が中止となったため、次年度使用額が生じている。次年度は、ピアレビューシステムを導入したクラウドサービス運用管理費として360,000円(その他)、打ち合わせおよび成果発表出張費用として180,000円(旅費)の使用を計画している。
人工ムチンの機能設計に基づく変異克服型抗インフルエンザウイルス剤の開発

インフルエンザウイルスの感染、接着に関わる特定の受容体シアロオリゴ糖鎖を高い効率且つ単純な手法で高密度に天然素材ポリペプチドである納豆菌由来γ-ポリグルタミン酸ベースに配して抗原性の変異を克服しかつトリ型およびヒト型インフルエンザウイルスに対応した強力な抗インフルエンザウイルス剤を構築した。また、感染阻害試験の結果から両型の受容体糖鎖特異性は末端シアル酸の結合様式において異なるだけでなく、そのコアとなる内部糖鎖構造も活性に大きく関与していることを実証した。インフルエンザウイルスの感染,接着に関わる特定の受容体シアロオリゴ糖鎖を高い反応効率で,且つ単純な手法でポリペプチド上(納豆菌由来γ-ポリグルタミン酸)に多価に配した人工ムチン(糖鎖含有ポリペプチド)を機能設計し,感染阻害活性を飛躍的に高めた強力な変異克服型抗インフルエンザウイルス剤の開発を目的とした。ムチンは高度にグリコシル化された高糖含量(4060%)の多様な糖鎖構造を有する糖タンパク質の総称で,膜表面に存在し細胞表面の保護,細菌感染の防御などに役立っている。インフルエンザウイルスに対する強力なバリア材料の開発を念頭に人工ムチン(糖鎖ポリペプチド)の機能設計を行う。人工ムチンの大量生産を克服するためのブレークスルーとして,ムチン分子を単純化したモジュールとし各々をウイルス受容体糖鎖構造部(A),リンカー部(B),γ-ポリグルタミン酸をベースとしたポリペプチド部(C)に3分割し,これらA,B,Cの各モジュールを単純かつ簡便なプロセスで効率的に繋ぎ合わせる画期的結合手法(グライコモジュール法)を開発し,実践的合成法の目処を立てた。これら作製した人工ムチンライブラリーをインフルエンザウイルス感染阻害試験に供したところ,Neu5Acα2-6LacNAc側鎖を含むシアリル糖鎖ポリペプチドは,ヒト型インフルエンザウイルスAと強力に結合するのに対し,Neu5Aca2-3LacNAc/Lac側鎖のそれは,トリ型インフルエンザウイルスAに結合特性を示した。インフルエンザウイルスの感染、接着に関わる特定の受容体シアロオリゴ糖鎖を高い反応効率で、且つ単純な手法でポリペプチド上(納豆菌由来γ-ポリグルタミン酸)に多価に配した人工ムチン(糖鎖含有ポリペプチド)を機能設計し、感染阻害活性を飛躍的に高めた強力な変異克服型抗インフルエンザウイルス剤の開発を目的とした。インフルエンザウイルスに対する強力なバリア材料の開発を念頭に人工糖鎖ポリペプチド(人工ムチン)の機能設計を行った。人工糖鎖ポリペプチドの大量生産を克服するため、糖鎖ポリペプチドを単純化したモジュールとし各々をウイルス受容体糖鎖構造部、スペーサー部、ポリペプチド部に3分割し設計にあたり、単純かつ簡便なプロセスで効率的に繋ぎ合わせる画期的結合手法(グライコモジュール法)を開発した。始めに受容体糖鎖とスペーサーを繋ぎ合わせO-型及びN-型配糖体を合成した。これら配糖体を納豆菌由来γ-ポリグルタミン酸側鎖に導入し各種アシアロ型糖鎖ポリペプチドを作製した。これらアシアロ体にシアル酸を酵素付加したSiaα2,3/6LacNAcシアロ型糖鎖ポリペプチドの実践的合成法を確立した。これら作製した人工ムチンライブラリーをインフルエンザウイルス感染阻害試験に供したところ、Siaα2,6LacNAc側鎖を含むシアリル糖鎖ポリペプチドは、ヒト型インフルエンザウイルスAと強力に結合するのに対し、Siaα2,3LacNAc/Lac側鎖のそれは、トリ型インフルエンザウイルスAに結合特性を示した。インフルエンザウイルスの感染、接着に関わる特定の受容体シアロオリゴ糖鎖を高い効率且つ単純な手法で高密度に天然素材ポリペプチドである納豆菌由来γ-ポリグルタミン酸ベースのに配して抗原性の変異克服した強力な抗インフルエンザウイルス剤を構築することを目的とした。まず、作製したOおよびN結合型一連の糖鎖含有ポリペプチドの構造と活性との相関を検証した。その結果、トリ型およびヒト型インフルエンザウイルスに対する感染阻害試験の結果から両型の受容体糖鎖特異性は末端シアル酸の結合様式において異なるだけでなく、そのコアとなる内部糖鎖構造も活性に大きく関与していた。この内部糖鎖構造に対する活性の違いはヒトとトリで大きく異なっており、特にヒト型ウイルスにおいては内部糖鎖の延長は著しい活性の増大をもたらのとは対照的にトリ型では内部糖鎖の延長は活性の減少をもたらした。そこで本活性に関与する内部糖鎖をアルキル直鎖に置き換え、末端をシアリル三糖に限定した各種糖鎖ポリペプチドを新たに合成した。その結果、内部糖鎖の場合と同様に、アルキル鎖の延長は阻害活性の増大と対応し、アルキルスペーサーは糖鎖ミメティックとして充分に利用できることを見出した。この機能設計に基づく最終的成果は、インフルエンザウイルス吸着剤の実践的量産化に見通しを与えた。
公共部門と民間部門の相互浸透領域の研究

1970年代末以来、先進産業諸国では、構造的な財政難を背景に、政府活動の量的拡大を抑制し社会全体としての効率を高めるための努力がつづけられている。その一つの結果として、公共部門(第一セクター)と、民間営利部門(第二セクター)、民間非営利部門(第三セクター)の相互浸透領域の拡大がある。これらの3つのセクターの隣接領域に生じる4つの相互浸透領域は、行政の発祥と同時に形成されたといってよいほどの歴史をもち、制度化され確認できるものでは11世紀(イギリスの諸問委員会)に遡る。なお、以下で指す相互浸透領域の大小は、法人格をもつ組織の数を指標としており、非制度的な関係を含むものではない。しかし、この約20年間における相互浸透領域の増大は、行政国家の成熟と行政活動の非効率を前提としている点で、従来の相互浸透とはその目的において方向性が逆転している。行政が政策の執行から形成にいたる過程で実質的な影響力を高めると同時に、行政活動の細分化、個別化、サービス行政化が進行するなかで、行政活動の効率性を維持するための方策なのである。地方政府では、福祉衛生保健を中心に政府と、市民すなわち民間非営利部門(第三セクター)との融合部分が拡大している。また、まちづくりを中心に、地方政府、地元市民、開発事業者の3者すべてが融合するアドホックな組織も増大している。一方、中央政府レベルでは、公益法人のうち行政機能を補完している団体の数が以然微増しているものの、特殊法人や認可法人の数および規模が緩やかではあるが削減される方向にあり、全体としては縮小している。80年代以降、わが国の3つのセクターが重複する4つの相互浸透領域は、中央政府レベルと地方政府レベルでその変化が異なっている。中央政府レベルでは、大部分を占める第二セクターとの間の相互浸透領域が縮小傾向にあり、地方政府レベルでは、第二センターとの相互浸透領域・第三センターとの相互浸透領域ともに増大している。とりわけ後者での伸びが大きい。また、地方政府レベルでは、政策執行機能を担う組織が多く設立されている。
糖尿病予防素材としての利用の面からみた日本で保存される桑葉品種の遺伝資源活用

抗糖尿病活性の高いクワ品種を選抜し、その増産方法を確立した。Α-グルコシダーゼ阻害活性(α-GI)が強く、1-デオキシノジリマイシン(DNJ)の高い桑品種の選抜を試みた。親木のDNJは、7月9月は同程度、10月に低下、幼木のDNJは親木より低く、親株の葉位16位以下の葉の含量に相当した。幼木で最もDNJ含量が高いのは、品種513であった。品種513を育成し、育成3年目以降、7月に一旦90cmの高さで切り揃え、その後約1か月育成した枝の先端付近の葉を採取することで、糖尿病予防効果の高い桑葉の生産が可能と結論した。抗糖尿病活性の高いクワ品種を選抜し、その増産方法を確立することを目的とした。桑のαグルコシダーゼ阻害活性と1-deoxynojirimycin(DNJ)量を測定し、阻害活性と、DNJ含量の実態を調査した。さらに、保存品種の場所、株数、表示看板の整備、保存桑園の環境整備も同時に行い、遺伝子保存施設としての環境を整備した。調査した247品種の5月、7月、8月の葉のDNJ含量の平均±標準偏差は、0.052±0.029%(n=82),0.063±0.029(n=83),0.071±0.037(n=82)であった。8月の平均は、5月よりも、有意に増加した(p<0.05)。5月は、0.040.06%の頻度が高かったが、0.14%以上は見られなかった。7月は、0.020.04%の頻度が最も高く、3品種が0.14%以上であった。8月は0.060.08%の頻度が最も高く、0.14%以上が4品種に見られた。阻害活性は、5月(n=111)が65.8±8.3%、7月(n=82)が62.1±11.9%、8月が(n=83)57.2±13.0であった。7月と8月の活性は、5月より高く(p<0.01)、7月の活性は、8月より高かった(p<0.01)。7月採集のカラヤマグワ系は、葉のDNJ含量と阻害活性の相関が高かった(r=0.901,r2=0.811,n=15)。他の系統の、7月の相関係数は、他の系統の5月や8月のそれらと比較して高かった。529試料の阻害活性の平均は62.3%で、60%70%の品種の出現率が最も高かった。系統別では、ヤマグワ系、カラヤマグワ系、ログワ系の主要3系統の阻害率の差異はない。季節的消長では、8月初旬採取が高く、8月30日、10月1日と季節が進むにつれて、阻害活性が低下した。葉位別では、上葉位ほど阻害率が高く、下葉位にいくにつれ、阻害活性が低下した。抗糖尿病性の高い品種を選抜し,その増産方法を確立することを目的として研究を行った.276品種のαグルコシダーゼ阻害性(α-GI)と、230品種の1-デオキシノジリマイシン(DNJ)含量を調査した.7月と8月のα-GIは,5月より高く,8月のDNJは5月より有意に高かった.7月のカラヤマグワ系のDNJとα=GIは,高い相関があった.採取日と葉位を一定として,各品種のDNJとα-GIの相関を解析すると,さらに高い相関さ認めた.各品種の葉位610のα=GIを100%とすると,葉位1620は平均で82.2%、葉位2630は平均71.0%,葉位3640は平均で68.9%に低下した.α-GLとDNJが共に高い品種,中程度の品種,低い品種を選択し,23種の季節別の阻害活性の推移を検討した.このうち21品種について,季節的なα-GIの消長を検討したところ,全部の試料の平均は,54.9%で,各品種とも60.1%60.5%の出現率が高かった.ヤマグワ系,カラヤマグワ系,ログワ系の3系統による阻害活性の差は認めなかった.葉位15と610の阻害活性は,11より下の置の葉より高かった.一部品種の8月採取のα-GIは,葉位130の範囲では,葉位に関係なく一定していた。

8月採取のDNJ含量が最も多かったので,8月機能性の高い桑葉の生産が可能である.有用品種として選定した品種は,挿し木による増殖実験を行った.育成2年目に達した11品種の,葉位15のみ採取し,その季節的,品種毎の機能性の消長を解析した.11品種の成本のα-GIは,7月・8月・9月が高く,幼木では7月・9月・10月が高かった.多くの品種で,成木と幼木間に季節ごとの成長の関連性は認められなかった.抗糖尿病活性の高いクワ品種を選抜し、その増産方法を確立することを目的とした。α-グルコシダーゼ阻害活性(α-GI)が強く、1-デオキシノジリマイシン(DNJ)の高い桑品種は、産業的応用価値が高いので、270品種より有望と考えられた10品種に絞り、その食品機能性解析と挿し木増殖法による幼木の遺伝形質の解析を行った。7月10月に採取した親木の葉とその幼木の葉のα-GIとDNJ含量を比較した。2品種は、両者は同傾向、他は親木の機能性が高かった。親木のDNJは7月9月はほぼ同程度、10月に低下した。幼木のDNJは親木より低く、親株の葉位16位以下の葉の含量に相当した。食品機能性の高い葉の育成法を検討し、枝を春先から伸ばしたままにした葉より、7月に一旦90cmの高さで伐採しその後1か月間育成した葉の先端の機能性が最も高くなった。さらに、京都産桑葉の機能性を比較する意味で、沖永良部島と徳之島に自生するシマグワの葉の機能性を調査した。京都の栽培桑は、ポリフェノール含量と抗酸化性おおむね高かった。DNJやα-GIは、ほぼ同程度と考えられた。幼木の機能性を昨年までの結果と比較したところ、京都工芸繊維大保存品種72、95、152、477は2年間にわたり同様のα-GIが観察された。本年採取の幼木で最もDNJ含量が高かったのは品種513であった。したがって、食品機能性の高い桑葉の効果的生産法は、品種513について挿し木増殖法で育成し、育成3年目以降、7月に一旦90cmの高さで切り揃え、その後約1か月育成した枝の先端付近の葉を採取することで、糖尿病予防効果の高い桑葉が生産可能であると推察した。
単一細胞における遺伝子発現の多面解析を用いた疾患の発症・進展因子の同定

【研究の目的】(1)遺伝子発現プロフィール解析の際に、出発材料としてシングルセルからスタートし、その発現相対比を保ちながらRNAを増幅するT7-RNA増幅法を確立すること。(2)病理切片を含む種々のin vivo試料への応用を前提として最適化すること。【研究の進め方】(1)研究代表者はこれまでに、KOマウス解析により特定のプロスタノイド受容体が癌やアレルギー、疼痛など疾患の発症・進展に関与することを示したが、受容体の下流でどの様にその病態作用を発揮するかという分子メカニズムは不明であった。(2)本研究では、これらプロスタノイドの病態作用を題材として、T7-RNA増幅法によりシングルセルの網羅的発現解析を行い、受容体の下流で決定的に働く病態因子の同定を試みる。【2001年度の研究当初計画】(1)解析の場となる疾患とプロスタノイド受容体の関係を明らかにする。(2)シングルセルを初発材料としたT7-RNA増幅法を習得し、アレイ解析系を確立する。(3)発熱、疼痛、アレルギー性喘息、大腸癌の各疾患モデルの進展因子解析を開始する。【2001年度の成果】(1)プロスタノイドの特定の受容体が大腸癌と潰瘍性大腸炎の発症・進展に関与することを見出した。(2)米国ペンシルバニア大にてEberwine教授の指導により組織切片のシングルセルからのT7-RNA増幅法を習得し、国内にて増幅からアレイ解析に至る系を確立した。(3)発熱を題材として解析を開始し、発熱伝達の候補因子を検索中である。【達成できなかったこと、予想外の困難、今後の課題】(1)シングルセルの回収方法の改善に時間を要し、再現性を取るまでには至らなかった。(2)動物実験における個体差のように、細胞間のゆらぎが問題となったが、複数の個体から複数の細胞を解析に供することで、生物学的な差を捉えることが可能であった。(3)本法のハイスループット化が今後の課題である。
ポアソン構造に付随するコホモロジー群の研究

斜交またはポアソン構造から決まるハミルトンベクトル場またはハミルトンポテンシャルの空間はリー環を成し,自然にリー環の(co)homology理論を展開出来,計算可能性の観点から荷重(weight)なるアイデアが有効である。ポアソン構造を特徴付けるスカウテン括弧積を用いるとベクトル場の外積代数はZ-graded (or pre)Lie superalgebra (リー超代数)である。更に改訂版(K.Mikami and T.Mizutani, arXiv:1809.08028v2, 2018 Dec)では二重荷重が異なるなら,全てのベッチ数は0である事をオイラー・ベクトル場を利用して示した。以上の結果は投稿中です。2012年から改訂を加えている(H.Kodama, K.Mikami and Y.Nakae, arXiv:1210.1662v2)でのゲルファント・フックスcohomology群のコンピュータ計算を,荷重24で5台のWSを約5年走らせ続け, 7次ベッチ=3,他は全て0と特定出来た。7次鎖体に生き残る3個のコサイクルの性質の解明は今後に残された興味深い課題です。2n次元斜交線形空間(シンプレクティック・ベクトル空間)の形式的ハミルトンベクトル場の成す無限次元リー環の斜交群不変(相対)ゲルファント・フックスコホモロジー群をウエイトを指定する毎に有限次元の議論に帰着して研究を続けている。シンプレクティック空間の形式的ハミルトンベクトル場の成す無限次元リー環の相対ゲルファント・フックス(GF)コホモロジー群を重さを指定する毎に調べる方法をarXiv:1210.1662 on http://arXiv.orgに公開している。2次元で重さ24の場合,全てのベッチ数を知るには次数6と7の余鎖複体間の余境界作用素の行列表現とその階数を決定すればよいとの状況に2015年3月に立ち至った。以来2台のWSをフル稼働して各行を求めている。行列型が(2887, 4281)で, 2887行中決定済みは約13ヶ月かけて1045行である。従って全体を入手するには現有戦力では後1年半ほどかかりそうである。2次元斜交空間の重さ24の形式的ハミルトンベクトル場のゲルファント・フックスコホモロジー群の全てのベッチ数を知るには次数6と7の間の余境界作用素の行列表現とその階数を決定すればよいとの状態に2015年3月に立ち至った。以来2台のWSをフル稼働して行列を求めているが,行列型が(2887, 4281)で, 2887行中決定済みは1045行である。従って全体を入手するには現有戦力では後1年半ほど必要である。2015年秋頃から斜交空間の形式的ハミルトンベクトル場のGFコホモロジー理論を線形空間(奇数次元も許す)の同次ポアソン構造(homogeneous Poisson structure)の多項式環あるいは形式的ハミルトンベクトル場のなすリー環のコホモロジー群に自然に拡張するアイデアを得,水谷忠良氏(埼玉大学名誉教授)とともに研究を始め, Cohomology groups of homogeneous Poisson structures (arXiv:1511.00199)として公開した。更に2015年度中は3度招待講演の機会を得(内一度は中国での国際会議),参加者の反応も好意的で今後の研究の進展に期待が持てる。以上により,おおむね順調に進展していると判断した。ポアソン構造のコホモロジー群の研究の端緒になったシンプレクティック線形空間のシンプレクティック群に関し不変な形式的ハミルトンベクトル場のなすリー環のコホモロジー群の研究に関し2次元の場合,ウエイト22まで完全に調べが済んでいて,ウエイト24の場合,そのオイラー特性数がゼロでないが幾つになるか研究を継続中である。次数6と7の間の余境界作用素の階数が判明するとウエイト24の研究が完結する。計算開始が2015年3月4日で扱う個数は2887個である。これまで計算を済ませたものは1749個(全体の60.6%)であり, 2016年度の計算実績を参考に単純予測すると完了時は2018年10月頃である。シンプレクティック線形空間のシンプレクティック群について不変な形式的ハミルトンベクトル場のなすリー環のコホモロジー群の研究に関し2次元の場合,ウエイト22まで完全に調べが済んでいて,ウエイト24の場合,そのオイラー特性数がゼロでないがベッチ数の分布がどうなるか研究を継続中である。次数6と7の間の余境界作用素の階数が判明するとウエイト24のベッチ数の分布の研究が完結する。これまで計算を済ませたものは1749個(全体の60.6%)であり, 2016年度に済ませた個数は772個です。この値を参考に完了時を単純予測すると1年半後の2018年10月頃です。これまで一貫してシンプレクティック(斜交)多様体の形式的ハミルトンベクトル場のなすリー環の研究を続けている。(1)斜交空間の形式的ハミルトンベクトル場の成す無限次元リー環の相対ゲルファント・フックス(GF)コホモロジー群を重さを指定する毎に調べる方法をarXiv:1210.1662 on http://arXiv.orgに公開しています。

2次元斜交線形空間での重み24のゲルファント・フックスコホモロジー群を2014年8月から計算中です。9区間の内難所が3区間ありその一つ縦2897横4281の行列計算を2014年12月に開始し3年かけて2018年1月に終え,ベッチ数が0と分かりました。非零ベッチ数を求めるべく次は縦4281横3534の行列入手を3台の計算機で始めました。斜交空間の形式的ハミルトンベクトル場の成す無限次元リー環の相対ゲルファント・フックス(GF)コホモロジー群を重さを指定する毎に調べる方法をarXiv:1210.1662 on http://arXiv.orgに公開しています。9区間の内難所が3区間あり,残る二区間の一つ縦2897横4281の行列入手を2014年12月に開始し3年かけて2018年1月に終え,ベッチ数が0と分かりました。非零ベッチ数を求めるべく次は縦4281横3534の行列入手を3台の計算機で始めた所です。予想外に計算時間を要したがトラブルもなく次のステップに挑戦出来る状況であるのでおおむね順調に進展していると判断している。これまでの2n次元斜交線形空間あるいは同次ポアソン空間の研究の舞台はベクトル空間です。そこでは多項式を使う事が出来ます。それとは性質の大きく異なる空間での重み付きホモロジー群・コホモロジー群の研究に2017年春頃から着手しました。その空間は斜交トーラスです。この空間の関数は全て周期関数なので,多項式は考える事が出来ず,テーラー展開のアナロジーとしてフーリエ級数展開近似する事により,荷重付きリー環のコホモロジー群に拡張するアイデアを得, First Betti number of weightedhomology group of Hamiltonian vector fields on symplectic tori (arXiv:1705.10894 on http://arXiv.org)に公開しました。既存の概念に関しては計算を深化し,その一方で新規の概念を提案出来ることは,これまでの研究方針や方向に確かな手応えを覚え概ね順調に進展していると判断している。斜交またはポアソン構造から決まるハミルトンベクトル場またはハミルトンポテンシャルの空間はリー環を成し,自然にリー環の(co)homology理論を展開出来,計算可能性の観点から荷重(weight)なるアイデアが有効である。ポアソン構造を特徴付けるスカウテン括弧積を用いるとベクトル場の外積代数はZ-graded (or pre)Lie superalgebra (リー超代数)である。更に改訂版(K.Mikami and T.Mizutani, arXiv:1809.08028v2, 2018 Dec)では二重荷重が異なるなら,全てのベッチ数は0である事をオイラー・ベクトル場を利用して示した。以上の結果は投稿中です。2012年から改訂を加えている(H.Kodama, K.Mikami and Y.Nakae, arXiv:1210.1662v2)でのゲルファント・フックスcohomology群のコンピュータ計算を,荷重24で5台のWSを約5年走らせ続け, 7次ベッチ=3,他は全て0と特定出来た。7次鎖体に生き残る3個のコサイクルの性質の解明は今後に残された興味深い課題です。
食道癌の転移関連遺伝子のクローニング

1.Matrix metalloproteinase7(MMP7)について2)次に抗MMP7抗体を用いてin vasion assayの結果がどの様に変化するかを調べた。その結果MMP7遺伝子導入KY150のin vadingcell数に著しく減少することが示された。(56%→17%)。以上よりMMP7は食道癌の浸潤機構に大きく関与する遺伝子の1つである事が示された。2.Integrin α6についてIntegrin α6遺伝子は食道癌組織で著明に発現が増加している事が示された。また本遺伝子発現の強い症例は深達度が深く、予後が悪い事が示された。現在integrin α6とheterodimerを形成するβ1、β4について発現を検索中である。また本遺伝子により発現が誘導される遺伝子として上記のMMPが考えられているため、両者の相関を明らかにし、浸潤についてのintegrinを介したシグナル伝達機構の解明をすすめているところである。(56%→17%)。【1】c-DNA subtraction法を用いて胃癌については2種類のc-DNAのクローニングに成功した。1つは浸潤に関与するmatrix metalloproteinase 7(MMP-7)であり、他の1つは血管新たに関与するIntegrin α6であった。1)MMP-7の36例の食道癌組織における発現をRT-PCR法で検討したところ、72%で腫瘍組織(T)>正常対照粘膜組織(N)であり、T/N比の高いものは有意にリンパ管侵襲、脈管侵襲、リンパ節転移が高い傾向を示した。2)Integrin α6のプローブを用いて45例の食道癌組織においてNorthern brotを行ったところ、87%においてT>Nであり、有意差はないまでも浸潤傾向の強い例や、リンパ節転移の高度な例にT/N比の高値例が多く認められる傾向があった。以上よりMMP-7、Integrin α6はともに食道癌の発育・進展に密接に関与しているものと思われた。またこれらの遺伝子学的解析は客観的であるため、食道癌の生物学的悪性度の判定に今後用いられると期待している。【2】differential display法を用いて、食道癌の臨床症例6例について、正常組織のみに発現する遺伝子を同定した。この遺伝子の発現を約50例の食道癌症例の正常粘膜組織、及び腫瘍組織について、RT-PCR法で検索をおこなったところ、80%の症例において腫瘍組織よりも正常組織に著しく強く発現していた。1.Matrix metalloproteinase 7(MMP7)について1)前年までにMMP7の発現の強い食道癌症例はリンパ管侵襲、脈管侵襲、リンパ節転移の頻度が高く悪性度が高い事を報告した。このために食道癌株化細胞KY150を用いてMMP7のcDNAを遺伝子導入しin vitro invasion assayを拭みた。KY150のparent cellはMMP7の発現が極めて弱い。一方遺伝子導入した細胞はMMP7を強く発現している事をNorthern blotで確認した。Invasion assayではparent cellのinvading cell数に比し遺伝子導入後のcellのinvading cell数は有意に増加している事が示された(10%vs56%)。
次代の郷土を創る人材に求められるコンピテンシーベースの歴史教育カリキュラムの開発

本研究は、義務教育段階の歴史教育におけるカリキュラム及び授業を研究対象とし、地方創生の観点から、地域素材(郷土の先人の業績や優れた文化遺産等)を活用し、次代の郷土を創る人材に求められるコンピテンシー(competency:資質・能力)を明確にした歴史教育カリキュラムモデルの開発を目的としている。2018年度は、国立教育政策研究所における「教育課程の編成に関する基礎的研究」を基に、研究代表者と研究分担者(社会科教育研究者)が中心となって先行研究を収集し研究動向を把握した。それらを基に、連携研究者(地域史研究者)と研究協力者(社会科実践研究者)のそれぞれの立場の知見を加え、四者で協働しながらコンピテンシーに関する研究の整理・分析を行い、共通理解を図り共通認識を形成していく理論研究を行った。本研究の目的は、次代の郷土を創る人材に求められるコンピテンシー(competency:資質・能力)を明確にした歴史教育カリキュラムモデルを開発することである。研究初年度の2018年度は、研究全体の理論研究として、まず初めに、世界の教育動向としては、イギリスのキースキルやオーストラリアの汎用的能力、ニュージーランドのキー・コンピテンシー等、世界各国において21世紀に求められるコンピテンシー(competency:資質・能力)を定義し、それを基礎にしたナショナルカリキュラムを開発する取組等の先行研究を収集し研究動向を把握した。その上で、学習指導要領等の改善に関する中教審答申(平成28年12月21日)において示された、21世紀を担う子どもたちに求められる資質・能力の三つの柱に基づく教育課程の枠組みについての整理・分析を行った。これらの理論研究により、次年度以降の研究を進捗させるための基盤が築けていることから、研究はおおむね順調に進展してると自己評価した。2019年度は、研究代表者と研究分担者、研究協力者で、次代の郷土を創る人材に求められるコンピテンシーについて、学校関係者及び地域関係組織(自治会、商工会、JA、NPO、企業、行政等)にアンケート調査し、地域(社会)の多様な考えを収集・整理・分析する。また地方創生及び地域資源活用の視点からのカリキュラム開発及び人材育成に関する先進事例等の視察を行い、情報を収集し整理・分析する。これらの調査結果を基に四者で協働しながら、次代の郷土を創る人材に求められるコンピテンシーの要素について分析し、カリキュラムモデルの枠組みを整理・分析する調査研究を行う。ただし、勤務地が変わったことから、研究内容に関して微調整が必要になっているので、その点に留意しながら研究を推進していく。
表皮角化細胞の脱核メカニズム解明と不全角化性疾患における関連因子の動態解析

皮膚バリア形成において、表皮角化細胞の最終分化における脱核は非常に重要であるが、そのメカニズムは不明のままであった。本研究では、脱核のプロセスには表皮メソトリプシンによるプロフィラグリンN末端のプロセシングを介した経路とカスパーゼ-14によるICAD/CADを介した経路が関与していることを初めて明らかにした。アトピー性皮膚炎や乾癬などの炎症性皮膚疾患では、これらのプロテアーゼの発現が不全角化部位に一致して著しく減少しており、皮膚バリア破綻と密接な関係が示唆された。表皮角化細胞における脱核は皮膚バリア獲得に重要であり、そのメカニズム解明は、アトピー性皮膚炎をはじめとした、不全角化を示す炎症性皮膚疾患において、新たな治療法への手がかりに繋がるものと期待し、本研究を進めてきた。脱核のプロセスには複数の経路が関与するのではないかとの仮説のもと、前年度までに、1カスパーゼ-14のICAD/CADを介した経路、2プロフィラグリンN末端を介した経路の検討を行った。その結果、カスパーゼ-14がICADを限定分解し、遊離したCADが核内に移行しDNA分解に働くこと、また、プロフィラグリンN末端のプロセシングにメソトリプシンが作用することを明らかにした。さらに、1と2の両経路の相互作用についても皮膚モデルを用いて検討し、カスパーゼ-14およびメソトリプシンの各々の発現を抑制すると不全角化を認めること、さらに、ダブルノックダウンでは残存核が顕著になることを確認した。これらの結果を踏まえ、本年度は、アトピー性皮膚炎および乾癬などの不全角化を示す疾患におけるカスパーゼ-14、メソトリプシンの発現状況を免疫染色にて検証した。その結果、不全角化部位に一致して、カスパーゼ-14もメソトリプシンも顕著な発現低下を認めた。さらに、炎症性疾患では、表皮においてS100A8/A9の異常な発現亢進が認められる。S100A8/A9はTNFαなどの炎症性サイトカインの発現を誘導し、かつ、これらのサイトカインによりS100A8/A9の発現が亢進することが明らかになっている。また、TNFαはフィラグリンやカスパーゼ-14の発現を抑制することが報告されていることから、これらのS100蛋白は炎症の慢性化に寄与しているのではないかと考えた。そのため、in vivoにおける検証を目的とし、S100A8、S100A9が表皮特異的に過剰発現するトランスジェニックマウスを作製した。これらを用いて、さらに関連する因子の動態解析を進めている。皮膚バリア機能獲得のために働く脱核のメカニズム解明は、不全角化がもたらされる炎症性皮膚疾患において、新たな病因・治療の解明に結びつくと考えられ、このプロセスを明らかにする目的で以下の項目を検討した。1カスパーゼ-14のICAD/CADを介した経路の検討;これまでの結果を踏まえ、revC14発現によるケラチノサイト形態の継時的変化やCADの局在を観察し、またProximity ligation assay(PLA)によるヒト皮膚組織を用いたin vivoでのカスパーゼ-14とICADの相互作用の検証を行った。2プロフィラグリンのN末端を介した経路の検討;表皮の最終分化にはプロフィラグリンN末端の関与が言われてきたが、核内に移行する部位や実際にDNAの分解に寄与するかは明らかではない。これまでにプロフィラグリンN末端のリコンビナントを作製し、条件の異なる4種類の培養ケラチノサイト抽出液と作用させ、相互作用を示す可能性がある物質をLC/MS/MS分析で検証した結果、メソトリプシンが候補として挙がった。そこで、プロフィラグリンN末端のプロセッシング酵素を同定するために、メソトリプシンを初め、KLK5、KLK7などの発現ベクターを作製し、培養細胞を用いて検証した。さらに、プロフィラグリンN末端のDNA分解に作用する部位の同定も行った。3ICAD/CADを介する経路とプロフィラグリンN末端を介する経路の相互作用の検討;これまでのカスパーゼ-14、DNase1L2、DNase2ノックアウトマウスの報告から、単独では表皮の不全角化が認められないことは明らかであり、複数の経路が相互に機能しているものと推測される。そこで、カスパーゼ-14とメソトリプシンの発現をsiRNAで各々または両者を抑制した条件下で3次元皮膚モデルを作製し、角層の残存核の違いを検討した。実験計画の大幅な変更もなく、つつがなく進行しているため平成24年度に得られた結果を基にして、さらに以下のことを検討する。1不全角化を示す疾患でのカスパーゼ-14およびメソトリプシン、フィラグリンの発現を検討;実際に、乾癬、アトピー性皮膚炎などの不全角化を認める疾患におけるカスパーゼ-14、メソトリプシン、フィラグリンの発現状況を免疫染色にて検証する。これらの病変組織は、当科受診患者さんで書面によるインフォームドコンセントにて了解を得た方から4mmパンチ生検を行ったものを、アセトン固定して使用する。2炎症状態に起因する不全角化メカニズムのマウスモデルを用いた解析;

不全角化を伴う炎症性疾患では、表皮においてS100A8/A9の異常な発現亢進が認められる。S100A8/A9はTNFαなどの炎症性サイトカインの発現を誘導し、かつ、これらのサイトカインがさらにS100A8/A9の発現を亢進するというポジティブフィードバックメカニズムが明らかになっている。さらに、TNFαはフィラグリンやカスパーゼ-14の発現を抑制することが報告されている。そこで、これらのS100分子は炎症の慢性化に寄与しているのではないかと考え、S100A8、S100A9が表皮特異的に過剰発現するトランスジェニックマウスを作製し、ヘアレス化を行う。さらにこれら2種類のマウスを交配し、ダブルトランスジェニックマウスを作製する。系統の確立を行った上で、関連する因子の動態解析を行う。以上の検討から得られた結果をとりまとめ、成果の発表を行う。研究実験に必要な試薬等の物品費に使用予定