hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳におけるカルシウム結合蛋白質の生理的動態に関する研究

平成2年度には,抗体を用いたWestern blotや電気泳動法により,牛脳PDEには分子量のわずかに異なる(60,000と63,000)2種のアイソザイムが存在することを明らかにした。さらに平成3年度にかけて,63,000の分子量のPDE(PDE_1)はカルモデュリン依存性リン酸化酵素により,分子量60,000のPDE(PDE_2)はcーAMP依存性リン酸化酵素により,それぞれStoichiometricにリン酸化を受けることを示し,両アイソザイムが異なったコントロ-ルを受けている可能性を示した。また,免疫組織学的解析では,脳にはPDE_1の方がPDE_2より多く存在し,かつ局在も比較的はっきりしていることが判明した。3.リポコルチン(アネキシン)平成元年度には,リポコルチンI(LPーI,分子量35,000)とリポコルチンII(LPーII,分子量36,000)に対するモノクロ-ン抗体の作製を試みた。また,LPーI,LPーIIともホスホリパ-ゼA_2活性を抑制すること,かつLPーI,LPーIIがCキナ-ゼによりリン酸化されるとその抑制活性が減少することが判明した。平成2年度には,LPーI,LPーIIのラット脳の発達に伴う変化につき研究し,LPーI,LPーIIとも生直後には多いが,成長するにつれて減少し,78週になるとほとんど消失することを示した。この結果はLPーI,LPーIIのcDNAプロ-ブを用いたNorthern blot法にても確認され,新生児よりも胎生期の脳においての方がmRNAレベルがさらに高かった。平成3年度においては,LPーI,LPーIIのモノクロ-ン抗体を用いた免疫組織化学的解析を行った。LPーI,LPーIIとも,胎生から新生児にかけての脳の,特にアストロサイトにおいて存在していることが明かとなった。現在は,LPーI,LPーIIがさまざまな病態時にどのように変動するかをラット脳における疾患モデル系において検討しているが,アストロサイトの増殖を伴う系において,両蛋白質の増加が認められることが示唆されている。カルシウムイオンは生体にとって必須であり,細胞の増殖・分化・分泌・収縮などに重要な役割を担っていることは広く知られている。特に脳においてはシナプスの伝達や神経細胞の活性化の維持に中心的な役割を果たしている。また,細胞内においてカルシウムイオンは主要なセカンドメッセンジャ-(細胞内二次情報伝達物質)である。そこで,このイオンの生理作用発現のための機構を分子レベルから臓器レベルに至るまで多面的に研究する。1.ラット脳におけるカルシニュウリンの役割についてカルシニュウリンの異なるサブユニットA,Bの局在が異なること(光顕レベル),サらに,Aサブユニットは電顕レベルで軸策に主に存在することを明らかにした。また,BサブユニットのDNAの一次配列を分子生物学的手技で明らかにした。2.リポコルチンの分化における機能についてリポコルチンI,IIに対する単クロ-ン抗体を得,白血球細胞の分化誘導時における局在,量的変化について解析した。分化にともない,リポコルチンは約2倍に増え,局在も細胞全体に広がることより増殖から分化への過程で重要な役割を果たすと考えられる。3.脳内微小透析法による解析インシュリン様成長因子は体幹では成長ホルモンに応答して,体の成長に密接に関係しているが,脳内においてもパラクラインの様式で作用しており,損傷時において修復因子として働くことを示した。
光電気化学表面力装置を用いた界面光電子移動へのイオン吸着効果の解明

電極表面間距離を制御しながら光照射が可能な電気化学表面力装置を構築した.有機光触媒として研究例のあるフタロシアニンと3,4,9,10-ペリレン四酢酸ビスベンズイミダゾールの積層膜について表面力測定可能な平滑表面の調製方法を検討し,二乗平均粗さ2 nm程度の表面の調製に成功した.調製した膜電極表面間の表面力測定を,構築した装置により測定し,水酸化カリウム水溶液中における相互作用力測定が可能であることを確認した.観測された相互作用力は距離の増加に伴って指数関数的に増加し,その減衰長は溶液塩濃度から算出されるデバイ長と一致することが分かった.表面力測定に使用した電極の光電流挙動についても確認した.本研究の目的は,電極界面における光電子移動反応に対するイオン吸着・濃縮の効果の解明を目的としている.光電子移動反応に用いる電極界面に表面力測定を適用し,表面電荷密度・イオン吸着について評価し,また同じ電極上で光電子移動反応を誘起して反応収率やダイナミクスを調べ,電極界面のイオン挙動との相関について明らかにすることを目指す.本年度は,電極表面間距離を制御しながら光照射が可能な電気化学表面力装置を構築した.また,有機光触媒として研究例のあるフタロシアニンと3,4,9,10-ペリレン四酢酸ビスベンズイミダゾールの積層膜について表面力測定可能な平滑表面の調製方法を検討し,二乗平均粗さ2 nm程度の表面の調製に成功した.さらに調製した膜電極表面間の表面力測定を,本年度構築した装置により測定し,水酸化カリウム水溶液中における相互作用力測定が可能であることを確認した.観測された相互作用力は距離の増加に伴って指数関数的に増加し,その減衰長は溶液塩濃度から算出されるデバイ長と一致することから,表面電位・電荷密度を見積もるのに必要な電気二重層斥力を観測できることが分かった.積層膜を構成する分子自体が電荷をもたないことから考えて,ここで観測された電気二重層斥力から得られる電荷密度はすべてイオン吸着に由来するものと考えられる.加えて,この電気二重層斥力の大きさを可視光照射の有無で評価したが,両者に差が観測されないことから,光反応による表面電位の変化はないことが分かった.本年度は,計画の通りに装置の構築と光電子移動反応を引き起こす有機半導体光触媒電極の調製を行い,また試測定を行って使用可能であることを確かめることができた.また電極表面間の表面力測定によって有機半導体光触媒電極における表面電位・イオン吸着の評価を計画通りに行うことができた.以上のように,当初の計画通りに研究を進められたことから,「(2)おおむね順調に進展している。」と評価した。本研究の目的は,電極界面における光電子移動反応に対するイオン吸着・濃縮の効果の解明である.光電子移動反応に用いる電極界面に表面力測定を適用し,表面電荷密度・イオン吸着について評価し,また同じ電極上で光電子移動反応を誘起して反応収率やダイナミクスを調べ,電極界面のイオン挙動との相関について明らかにすることを目指す.本年度は,昨年度調製方法を確立した有機光触媒として研究例のあるフタロシアニンと3,4,9,10-ペリレン四酢酸ビスベンズイミダゾールの積層膜について,表面力測定を行い,水酸化カリウム水溶液中における相互作用力測定が可能であることを確認した.観測された相互作用力は距離の増加に伴って指数関数的に増加し,その減衰長は溶液塩濃度から算出されるデバイ長と一致することが分かった.また接触部への光照射の有無でデバイ長や力の大きさに変化を生じないことを確かめた.さらに表面力測定に用いた積層膜について光電気化学反応が起こるかどうか確認するために,3極式の電気化学セルに積層膜を作用極として組み込み,水酸化カリウムおよび過塩素酸カリウム水溶液中でサイクリックボルタンメトリーを行い,光照射による電流値の変化を測定した.いずれの電解質水溶液の場合でも,光照射による電流の増幅を確認できたことから,調整した膜が光触媒膜としての機能を保持していることを確認できた.また犠牲試薬としてアルキルチオール系分子を添加することで光電流値が増幅されることも確かめることができた.電極表面間距離を制御しながら光照射が可能な電気化学表面力装置を構築した.有機光触媒として研究例のあるフタロシアニンと3,4,9,10-ペリレン四酢酸ビスベンズイミダゾールの積層膜について表面力測定可能な平滑表面の調製方法を検討し,二乗平均粗さ2 nm程度の表面の調製に成功した.調製した膜電極表面間の表面力測定を,構築した装置により測定し,水酸化カリウム水溶液中における相互作用力測定が可能であることを確認した.観測された相互作用力は距離の増加に伴って指数関数的に増加し,その減衰長は溶液塩濃度から算出されるデバイ長と一致することが分かった.表面力測定に使用した電極の光電流挙動についても確認した.本年度,調製と予備測定に成功した有機半導体光触媒電極について,次年度は電気化学的電位制御のもとで表面力測定を行い,光照射の有無で電気二重層斥力の変化を調べる.光電子移動反応による表面電位の変化やイオン吸着の変化を調べ,これらと反応挙動との相関について調べて,電極界面の電荷・イオン挙動の反応機構における役割を解明することを試みる.また電極間距離の変化が光電極反応に及ぼす影響についても調べ,イオン濃縮等の閉じ込めの影響が反応に与える影響についても調べる.界面化学,光化学購入予定であった電気化学アナライザーについて,既存のものを使用することで間に合わせることができ,またその他の消耗品等を節約することで,経費節約することができた.

これまでの研究計画で行っている有機半導体光触媒電極について電荷の正負を確認するための,測定に用いる試薬や基板の購入等に節約できた経費を有効に使用する予定である.
気象再解析と物理法則に基づく超長期河川流量の模擬作成と100年確率流量の内挿推定

本研究では,限られた年数しか存在しない気象データから,多数年におよぶ河川流量データを擬似的に作成する手法の開発に取り組むことを目的としている.これまでに,タイ国チャオプラヤ川上流のブミポンダム上流域を対象に多数年におよぶ河川流量データの擬似作成に取り組んできた.擬似作成した大気場から求めた河川流量に対して水文統計分析を行った結果,年最大日流量に着目すると,擬似作成された河川流量は,通常の手法で得られる河川流量と比較して,統計的に有意な差は確認できなかった.すなわち,擬似作成された河川流量は,概ね妥当なものであるとの結論が得られた.さらに,疑似作成する河川流量の元となるデータの年数を,現実として入手可能な年数である25年分に設定し,その25年分のデータがどのような組み合わせであっても本手法を適用して,確率流量を推定することができるかどうかを分析した.まず,手元に保有する全ての実時系列流量データ(54年分)を用いて,確率流量を求める.これを確率流量の真値とみなす.次に,54年の中から任意の25年を選択し,確率流量を得る.このデータを用いて擬似流量データを作成し,確率流量を求める.このようにして求めた疑似流量データによる確率流量が,25年分の実時系列流量データによる確率流量よりも真値とみなす確率流量により近しい値であるかどうかを分析した.その結果,選択した流量データに小さな流量が含まれる場合には,疑似流量データは真値とみなす確率流量を推定することが難しく,一方で,選択した流量データに大きな流量が含まれれば疑似流量データによる確率流量が真値と近くなる傾向が確認された.本研究では,限られた年数しか存在しない気象データから,多数年におよぶ河川流量データを擬似的に作成する手法の開発に取り組むことを目的としている.当該年度では,タイ国チャオプラヤ川上流のブミポンダム上流域を対象に多数年におよぶ河川流量データを擬似的に作成した.気象データとして,気象庁55年長期再解析JRA-55を用いた.河川流量の推定に大きな影響を与える降水量と気温について,2003年から2012年の月単位の値を対象に時間相関を分析し.その結果,降水量と気温の偏差の相関は8月と9月の間が最も小さかった.観測値も同様の結果を示したため,8月と9月の間で大気場を組み換え,多数年におよぶ大気場を擬似作成した.擬似作成した100年分の大気場と,連続した通常の10年分の大気場それぞれを入力条件として,分布型水循環モデルを用いて河川流量に変換した.擬似作成した100年分の大気場から得られた年最大日流量の非超過確率分布は,通常の10年分の大気場から得られた年最大日流量の非超過確率分布を補間するものとなっていた.また,擬似作成した年最大日流量には,通常の方法で得られる年最大流量よりも大きな値を計算していた.当該年度当初は,長期間におよぶ気象データを模擬作成する手法を確立することを計画していた.現状は,多数年におよぶ大気場の擬似作成を行ったばかりでなく,それらを入力条件として分布型水循環モデルを用いて河川流量を求めることができている.さらに,大気場を擬似作成することの妥当性や,擬似作成した大気場から求めた河川流量の解釈といった研究にも着手している.本研究では,限られた年数しか存在しない気象データから,多数年におよぶ河川流量データを擬似的に作成する手法の開発に取り組むことを目的としている.当該年度以前までに,タイ国チャオプラヤ川上流のブミポンダム上流域を対象に多数年におよぶ河川流量データを擬似的に作成してきた.これを受けて当該年度では,擬似作成した大気場から求めた河川流量がどのような意味を持つのか,を調べるために水文統計分析を行った.当該年度以前では,10年分のデータを元に擬似作成を行い,提案手法の妥当性を検討し,本手法の妥当性についてある程度の有効性が確認できた.そこで,当該年度では使用するデータを54年分に拡張し,計2916年分にもおよぶ河川流量データの擬似作成を行った.年最大日流量に着目すると,擬似作成された河川流量は,通常の手法で得られる河川流量と比較して,統計的に有意な差は確認できなかった.すなわち,擬似作成された河川流量は,概ね妥当なものであるとの結論が得られた.さらに,擬似作成された河川流量の年最大日流量について,洪水を生起させる降水量と洪水生起前の土壌水分が,それぞれどの程度の寄与があるかを分析した.その結果,年最大日流量の変動に対して,降水量に起因する変動は590 m3 sー1程度であり,土壌水分に起因する変動は160 m3 sー1程度であった.これは,土壌水分が年最大日流量の変動に与える影響が降水量のそれと比較して約27%であることを示しており,降水量だけで河川流量の大きさが決まるとは限らないことを示す結果である.本研究課題の目的である,多数年におよぶ河川流量の模擬作成は既に達成されている.それに加えて,当該年度において,本手法の妥当性を検討する手法を確立し,本手法の妥当性についても確認ができている.さらには,本手法によって作成された河川流量を分析し,河川流量に与える降水量と土壌水分量の寄与についての分析を行った.本研究では,限られた年数しか存在しない気象データから,多数年におよぶ河川流量データを擬似的に作成する手法の開発に取り組むことを目的としている.

これまでに,タイ国チャオプラヤ川上流のブミポンダム上流域を対象に多数年におよぶ河川流量データの擬似作成に取り組んできた.擬似作成した大気場から求めた河川流量に対して水文統計分析を行った結果,年最大日流量に着目すると,擬似作成された河川流量は,通常の手法で得られる河川流量と比較して,統計的に有意な差は確認できなかった.すなわち,擬似作成された河川流量は,概ね妥当なものであるとの結論が得られた.さらに,疑似作成する河川流量の元となるデータの年数を,現実として入手可能な年数である25年分に設定し,その25年分のデータがどのような組み合わせであっても本手法を適用して,確率流量を推定することができるかどうかを分析した.まず,手元に保有する全ての実時系列流量データ(54年分)を用いて,確率流量を求める.これを確率流量の真値とみなす.次に,54年の中から任意の25年を選択し,確率流量を得る.このデータを用いて擬似流量データを作成し,確率流量を求める.このようにして求めた疑似流量データによる確率流量が,25年分の実時系列流量データによる確率流量よりも真値とみなす確率流量により近しい値であるかどうかを分析した.その結果,選択した流量データに小さな流量が含まれる場合には,疑似流量データは真値とみなす確率流量を推定することが難しく,一方で,選択した流量データに大きな流量が含まれれば疑似流量データによる確率流量が真値と近くなる傾向が確認された.擬似作成した大気場から求めた河川流量に対して水文統計分析を行い,得られた値がどのような意味を持つのか,あるいは実務に活用しうる値となりえるのかを分析する.本研究課題では,少数年のデータから多数年のデータを擬似作成する手法を提案し,その妥当性を確認した.今後は,元となるデータの年数が実際に入手可能な年数,例えば20年分であった場合に,その20年分のデータがどのような組み合わせであっても本手法を適用して,確率流量を推定することができるかどうかを分析する.また,本研究手法の提案およびその妥当性に関する研究は,チャオプラヤ川上流のブミポンダム上流域で行ってきた.周辺流域や他の地域でも,同様に適用できる手法であるかどうか,すなわち,本手法の汎用性がどの程度であるかを分析する.本研究課題では,多数年におよぶ流量計算を実施する.そのためのデータサーバの購入を計画していたが,全ての計算結果を保存するのではなく,保存するデータを取捨選択したため,既存のデータサーバにデータを保存することができた.次年度以降は,流量計算の対象をさらに拡大する予定であるるが,既存のデータサーバでは容量が不足する.そこで,次年度にデータサーバを購入し,計算結果の保存先を確保する予定である.
先端生体材料を用いた転移性骨腫瘍の低侵襲かつ機能温存手術治療法の開発

リン酸化プルランを用いた転移性骨悪性腫瘍治療薬との併用時における有用性について検討した。転移性骨腫瘍の原発巣として頻度の高い乳癌細胞株(MDAーMB231)をヌードマウス大腿骨の遠位果部に24G針を用いて作成した骨孔に注入し、担癌腫瘍を作成した。これらを、無治療群、抗がん剤単独群、抗がん剤+リン酸化プルラン群、リン酸化プルラン群に分類し、腫瘍抑制効果を継時的に評価した。抗がん剤はドセタキセルを使用した。抗がん剤単独群と抗がん剤+リン酸化プルラン群で腫瘍抑制効果が認められた。以上より、リン酸化プルランは抗がん剤含有セメントとして有用であることが示唆された。本研究の目的は,抗腫瘍薬徐放能を有する骨置換型骨セメントの開発である。以前我々は、多糖誘導体リン酸化プルランから創製した骨セメントのメソトレキサート(MTX)の徐放能を測定し、PMMA骨セメントとの比較を行った。PMMAと比べリン酸化プルランでは大量かつ長期間に渡ってMTXの徐放を認めた。H25年度は、細胞毒性のないリン酸化プルランの濃度を検討した。その濃度のリン酸化プルランに各濃度のMTXを混和し、ヒト骨肉腫細胞株でのMTXの細胞増殖抑制効果を検討した。0.1%以下のリン酸化プルランにおいて細胞毒性を認めなかった。また、0.1%リン酸化プルランにMTXを混和することで、MTXのみと比べより低濃度で骨肉腫細胞の細胞増殖抑制効果を認めた。本研究では申請者らが開発したリン酸化プルランを用いて、転移性骨悪性腫瘍治療におけるそれらの材料の有用性を検討した。前年度に検討したin vitroにおいて、抗腫瘍薬の徐放特性を調べ、さらに徐放液の乳癌細胞株への作用を検討し、抗腫瘍効果を得た。今年度は,マウス転移性骨悪性腫瘍モデルを作製し、抗腫瘍薬含有リン酸化プルランでの抗腫瘍効果について検討した。ルシフェラーゼ発現細胞乳癌細胞株(MDA-MB-231-luc)を用いて、ヌードマウス大腿骨に担癌腫瘍を作成し、(1)無治療群、(2)抗がん剤単独群、(3)抗がん剤+リン酸化プルラン群、(4)リン酸化プルラン群で腫瘍抑制効果を経時的にIVISで評価した。(1)群と比較して(2),(3)群で腫瘍抑制効果を認めた。本研究において、リン酸化プルランは転移性骨腫瘍において、抗がん剤含有セメントとして有用である可能性が示された。脊椎外科学リン酸化プルランとMTXの混和物での細胞増殖抑制効果の検討に時間を要したため今後は、MTX以外の抗腫瘍薬の徐放効果と最適濃度を調べるとともに、様々な細胞株を用いてマウス悪性腫瘍モデルを作製し、治療効果について検討を行う予定である。
血管内皮前駆細胞の流血下捕捉による内皮化小口径人工血管:動物移植実験による検証

本研究では、1)拍動圧に感受して脈動し、生体血管と力学的適合する骨格基材とその成型加工技術をより高精密化し、2)流血下で内皮前駆細胞のみを選択的に捕捉し、経時的に内皮細胞への分化、増殖、単層形成化による新しい血管再建技術の設計概念、作動原理を提出し、3)そのプロトタイプ・デバイスを作製し、動物実験で検証することを目的とする。作業原理の妥当性とプロトタイプデバイスにおいて実証できた。本研究では、拍動圧に感受して脈動し、生体血管と力学的適合する骨格基材(Mechano-Active Scaffold)とその成型加工技術、これらの開発してきた要素材料と要素技術をより高精密化し、流血下で他の大量に存在する血液細胞(血小板、白血球)の接着は完全に阻止し、内皮前駆細胞のみを選択的に捕捉し、経時的に内皮細胞への分化、増殖、単層形成化による新しい血管再建技術の設計概念、作動原理を提出し、そのプロトタイプ・デバイスを作成・動物実験で検証し、全く困難とされていた小口径人工血管の臨床応用に、極めて高い可能性を与えるシステムを世界で初めて実証することにある。現在、動物実験に着手し始めているが、20年-21年度で精力的に動物(ミニブタ)〔短期(1週間)から長期(1年)〕の移植を行い、前駆細胞の接着の有無、内皮化および抗血栓を期間毎に調べ、内腔層設計の手直し改良を行う。特に、内腔層のコーティング操作、光硬化操作は自動装置を新しく考案し、手作業での製作を省いて再現性を高める。具体的には、(1)動物移植実験(金沢大・心肺外科:渡邊教授、大竹講師):19年度の充分なる予備的検討より、ミニブタの頸動脈(内径3-4mm)にVEGF固定化コンプライアント人工血管を移植し、経時的に摘出する。上記の移植期間は1週間、1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、12ヶ月とし、各n=5の移植実験を行った。(2)動物実験の評価(金沢大:渡邊教授、大竹講師、金沢工大:松田、柚木):Flk-1、Tie-2、CD34、AC133等により接着細胞を免疫染色し、蛍光顕微鏡により前駆細胞および分化した内皮細胞を検出する。走査電子顕微鏡にて血栓形成、血小板の付着等を検出する。前駆又は分化した内皮細胞と同定された場合は、Reat-time PCR法によって分化度の同定を行った。(3)人工細胞外マトリックスの最適化1ヘパリン徐放量、VEGF固定化量および固定化法の改良(金沢工大グループ)。(4)コーティング:光硬化の自動装置の製作。コーティング濃厚溶液を圧入する自動装置であり、可視光照射は高強度装置(市販)に外径1mmのガラス棒を先端に有する照射部を搭載した。21年度で精力的に動物(ミニブタ)〔短期(1週間)から長期(6ヶ月)〕の移植を行い、前駆細胞の接着の有無、内皮化および抗血栓を期間毎に調べ、内腔層設計の手直し改良を行った。特に、内腔層のコーティング操作、光硬化操作は自動装置を新しく考案し、手作業での製作を省いて再現性を高めた。具体的には、(1)動物移植実験(金沢大・心肺外科:渡邊教授、大竹講師):20年度の充分なる予備的検討より、ミニブタの頸動脈(内径3-4mm)にVEGF固定化コンプライアント人工血管を移植し、経時的に摘出した。上記の移植期間は1週間、各n=5の移植実験を行った。(2)動物実験の評価(金沢大:渡邊教授、大竹講師.金沢工大:松田):・Flk-1、Tie-2、CD34、AC133等により接着細胞を免疫染色し、蛍光顕微鏡により前駆細胞および分化した内皮細胞を検出した。(3)人工細胞外マトリックスの最適化(金沢工大):ヘパリン徐放量、VEGF固定化量および固定化法の改良した。(4)コーティング:光硬化の自動装置の製作については設計中である。コーティング濃厚溶液を圧入する自動装置であり、可視光照射は高強度装置(市販)に外径1mmのガラス棒を先端に有する照射部を搭載する。本研究では、1)拍動圧に感受して脈動し、生体血管と力学的適合する骨格基材(Mechano-Active Scaffold)とその成型加工技術をより高精密化し、2)流血下で他の大量に存在する血液細胞(血小板、白血球)の接着は完全に阻止し、内皮前駆細胞のみを選択的に捕捉し、経時的に内皮細胞への分化、増殖、単層形成化による新しい血管再建技術の設計概念、作動原理を提出し、3)そのプロトタイプ・デバイスを作製し、動物実験で検証し、4)全く困難とされていた小口径人工血管の臨床応用に、極めて高い可能性を与えるシステムを世界で初めて実証することにある。本年度では、動物(ミニブタ)

〔短期(1週間)から長期(6ヶ月)〕の移植を行い、前駆細胞の接着の有無、内皮化および抗血栓を移植期間毎に調べ、内腔層設計の手直し改良を行った。内腔層のコーティング操作、光硬化操作は自動装置を新しく考案した。ミニブタの頸動脈(内径3-4mm)にVEGF表面固定化したコンプライアント人工血管を移植し、経時的に摘細胞表層の膜蛋白質Flk-1、Tie-2、CD34、AC133の螢光免疫染色し、前駆細胞および分化した内皮細胞を検出した。走査電子顕微鏡にて血栓形成、血小板の付着等を検出した。VEGF固定した表面の内皮細胞のReat-time PCR法によって分化度の同定を行い、細胞内シグナル伝達機構の持続的活性化が観測された。
BAM 複合体による細胞膜タンパク質輸送機構の解明

多剤耐性菌の出現により、抗生剤が効かない病原菌で社会的に大きな問題となっている。特にグラム陰性の病原菌が世界に広かっており、大きな問題になっている。そこで本研究では多剤耐性グラム陰性菌に有効な新規薬剤標的分子としてBAM(β-barrel assembly machinery)複合体の構造生物学的な基盤構築を行い、新規薬剤の開発を研究目的である。BAM複合体はグラム陰性菌の外膜生合成で中心的な役割を担う装置であり、菌の生存に必須な機能を有する。しかし、新規薬剤開発のための構造基盤の情報は少なく、我々は、BamA-Dをターゲットとし、発現系構築に成功し結晶化を試みたが、良好な結晶を得る事は出来なかった。そこで、我々はBamCとBamDの複合体での機能解析や、結晶化に成功した。BamCとBamDのX線小角散乱(small angle X-ray scattering)法や分析超遠心(AUC)により、溶液中での相互作用を確認する事が出来た。また、複合体での微結晶ながらX線による反射点も確認する事が出来たが、構造決定までには結晶化の最適化が必要である。引き続き、結晶化条件の最適化と、Bam機構解析を行う。大腸菌の外膜に膜貫通タンパク質を挿入するタンパク質複合体BAMは細菌の成長に絶対必須である。病気を起こすオートトランスポーターという因子も、BAMに相互作用して、C末端の領域を外膜に挿入する。オートトランスポーターのN末端ドメインは外膜を通って分泌される。この二つの輸送メカニズムはまだ解明されていないので、我々はBAMの構造と基質の相互作用を研究している。Hbpというのオートトランスポーターと大腸菌のBAMを使って実験した。他の研究室の結果によると、BAMは五つの成分を含む:BamA、YfiO、YfgL、NlpB、SmpA。我々はこの遺伝子をクローン化して、タンパク質を発現させた。各成分タンパク質を精製して、複合体の結晶化を目指し、まず最初に成分同士の相互作用を物理的手法で調べた。BamAは大きい膜貫通タンパクだが、N末端領域のPOTRAドメインしかBAMのタンパク質に結合しないと報告された。それで、我々はPOTRA領域を発現し、他のBAM成分に結合するかどうかを調べた。結果、分析超遠心機でPOTRA、YfgLとSmpAは他のタンパク質に結合しない。Electrospray mass spectrometryでも同じ結果だった。一方、NlpBとYfiOはお互いに結合する。等温滴定熱量計を使って、相互作用の親和性を測った。親和性は高くないから、この複合体もかなり結晶化しにくいと考えられる。POTRAドメインは単独で結晶化し、X線データーを収集したが、この構造は最近出版された。BamAの膜貫通ドメインも精製したが、結晶は出てこない。Hbp膜ドメインの結晶構造も解析して、結果を発表した。この構造は新しいタンパク質分解メカニズムを示している。現在、我々のモデルを基盤として、分泌中間体を安定化するような変異体を設計し、分泌メカニズム解明を目指している。本研究は、大腸菌の外膜に存在するBAM(beta-Barrel Assembly Machine)複合体と呼ばれる装置が、どのようにして他のタンパク質を外膜に挿入したり、外膜の外側へと分泌させているかについての具体的なメカニズムを、構造生物学の手法を用いて理解することが目的である。この輸送メカニズムはまだ解明されていないので、我々はBAMの構造と基質の相互作用を研究している。BAM複合体の具体的なタンパク質輸送メカニズムが解明されれば、新しい薬剤開発ターゲットとなりうる。

一方、NlpBとYfiOはお互いに結合する。等温滴定熱量計を使って、相互作用の親和性を測った。親和性は高くないので、この複合体もかなり結晶化しにくいと考えられる。今後はこの複合体をいかに安定化させて、結晶化するかの具体的な検討に入る。抗生剤が効かない多剤耐性菌の出現が社会的に大きな問題となっている。特にグラム陰性菌の仲間である緑膿菌(P.aeruginosa)およびアシネトバクター(A. baumannii)が世界で蔓延しており、この状態が続けば医療崩壊につながるのではと危惧されている。この深刻な状況を打開するための最も有効な方法は新規薬剤の開発であるが、残念ながらその進展は見られていない。そこで本研究では多剤耐性グラム陰性菌に有効な新規薬剤標的分子としてBAM(β-barrel assembly machinery)複合体の構造生物学的な基盤構築を行い、新規薬剤の開発を研究目的とした。BAM複合体はグラム陰性菌の外膜生合成で中心的な役割を担う装置であり、菌の生存に必須な機能を有する。しかし、新規薬剤開発のための構造基盤の情報は少なく、我々は、BamA-Dをターゲットとし、発現系構築に成功し結晶化を試みたが、良好な結晶を得る事は出来なかった。一方、我々はBamCとBamDの複合体での機能解析や、結晶化に成功した。X線小角散乱(small angle X-ray scattering)法や分析超遠心(AUC)により、BamCとBamDの溶液中での相互作用を確認する事が出来た。また、微結晶ながらBamC-BamD複合体結晶のX線による反射点も確認する事が出来たが、構造決定までには結晶化の最適化が必要である。引き続き、結晶化条件の最適化と、Bam機構解析を行う難しいと考えられていたタンパク質の調製に成功し、物理化学的実験が進行中である。24年度が最終年度であるため、記入しない。タンパク質複合体の結晶構造解析を目指して、NlpBとYfiOの発現系の最適化を行う。具体的には発現タンパク質の長さを調節する、融合タンパク質として共発現する、等の工夫を施す。
リチウム―アンモニア,アミン系溶液からのリチウム膜の生成

本研究は,Li-NH_3,アミン溶液の薄層から溶媒を蒸発させて迅速に除去し,Liを析出させることにより金属Li膜を生成させるプロセスについての基礎研究である.本年度は,当初の計画に従い,Li膜を生成させるための多孔質材料の選定に重点を置いて,種々の有機,無機系素材とLi-NH_3溶液の反応性について検討するための実験をおこなった.実験では,213.15243.15Kにおいて,真空雰囲気のパイレツクスガラスおよび石英ガラス製のセル内に種々の組成のLi-NH_3溶液を調整し,溶液に試験素材を漬浸して撹拌(円柱状試料の回転などの方法による)を行い,試験素材と溶液の反応に伴う溶液の電気伝導度の変化を測定する方法などによって,溶液内のLi濃度の経時変化を調べた.使用した試験素材は,フッ化樹脂(Teflon),ポリエチレン,ポリプロピレン,ポリエチレンテレフタレートなどのプラスチック系素材と,グラファイト,リチウムナイトライドの無機系素材である.実験の結果,グラファイト,リチウムナイトライドでは,固体表面の触媒作用によりLiとNH_3間のアミド生成反応が速やかに進行することがわかった.フッ化樹脂の場合,溶液内のLiと樹脂の化合物生成反応が認められ,この反応は液側Liの物質移動と固体内のLiの拡散により律速されることが推定された.ポリエチレンテレフタレートの場合も同様な反応が進行するものと考えられる.これらの結果は,FやOなどがLiに対して官能基として作用することを意味すると考えられる.一方,ポリエチレン,ポリプロピレンでは,溶液と素材の反応は十分遅く,実際に,これらの素材表面にLi膜を生成させることができた.現在,生成したLi膜と素材界面のキャラクタリゼーションと,スプレー法による膜生成について検討を進めている.本研究では,Li-NH_3,アミン溶液中の薄層から溶媒のNH_3,アミンを蒸発させて迅速に除去し,Liを析出させることによって金属Li膜を生成させるプロセスについての基礎研究を行う.本年度は,予備実験の結果,-40°C以下の低温における操作の必要なLi-NH_3溶液より,常温における実験の可能な溶液を使用することが望ましいことがわかったので,NH_3より沸点の高い溶媒として沸点118°C(融点10°C)のエチレンジアミン(EDA)をとりあげ,Li-EDA溶液の応用が可能か判断するための基礎研究として,溶液の安定性についての実験をおこなった.実験では,所定濃度のLiを含有するLi-EDA溶液から,溶媒と溶質の反応により生成するH_2の量の経時変化を調べ,実験結果から反応(A)の速度を求めた.実験条件として,溶液の撹拌条件,温度,Li初濃度を変化させた.また,本研究の目的の上で特に重要な,Li-EDA溶液の保持方法とつながる,保持担体となる物質が反応(A)におよぼす影響を調べるために,ガラスや金属などの反応(A)への触媒効果について調べた.実験の結果,LiとEDAの反応は,実験温度範囲1525°Cにおいては,温度および溶液の撹拌条件の影響を強く受けることがわかった.また,反応セル内にガラスビーズを入れた実験の結果から,反応は25°Cでは溶液内の均一反応によって進行し,一方,15°Cでは主としてガラス容器およびビーズ表面における不均一反応によって進行することがわかった.また,金属Niなどの触媒は反応速度を大きく促進することが判明した.このことから,Li-EDA溶液を使用するプロセスは現実的でないと判断された.本研究は,Li-NH_3,アミン溶液の薄層から溶媒を蒸発させて迅速に除去し,Liを析出させることにより金属Li膜を生成させるプロセスについての基礎研究である.本年度は,当初の計画に従い,Li膜を生成させるための多孔質材料の選定に重点を置いて,種々の有機,無機系素材とLi-NH_3溶液の反応性について検討するための実験をおこなった.実験では,213.15243.15Kにおいて,真空雰囲気のパイレツクスガラスおよび石英ガラス製のセル内に種々の組成のLi-NH_3溶液を調整し,溶液に試験素材を漬浸して撹拌(円柱状試料の回転などの方法による)を行い,試験素材と溶液の反応に伴う溶液の電気伝導度の変化を測定する方法などによって,溶液内のLi濃度の経時変化を調べた.使用した試験素材は,フッ化樹脂(Teflon),ポリエチレン,ポリプロピレン,ポリエチレンテレフタレートなどのプラスチック系素材と,グラファイト,リチウムナイトライドの無機系素材である.実験の結果,グラファイト,リチウムナイトライドでは,固体表面の触媒作用によりLiとNH_3間のアミド生成反応が速やかに進行することがわかった.フッ化樹脂の場合,溶液内のLiと樹脂の化合物生成反応が認められ,この反応は液側Liの物質移動と固体内のLiの拡散により律速されることが推定された.ポリエチレンテレフタレートの場合も同様な反応が進行するものと考えられる.これらの結果は,FやOなどがLiに対して官能基として作用することを意味すると考えられる.一方,ポリエチレン,ポリプロピレンでは,溶液と素材の反応は十分遅く,実際に,これらの素材表面にLi膜を生成させることができた.現在,生成したLi膜と素材界面のキャラクタリゼーションと,スプレー法による膜生成について検討を進めている.
シュレディンガー方程式の準古典解析

(1)双曲型不動点の近傍での超局所解の構造を明らかにした。少し詳しく述べると、incomingな安定多様体からoutgoingな安定多様体への超局所解の伝播の一意性および存在定理を証明し、さらに解の伝搬の様子をフーリエ積分作用素を用いて表現した。(2)シュレディンガー作用素の、解析性を持たない島の中の井戸型ポテンシャルが生成するレゾナンスの準古典分布を計算し、解析性をもつポテンシャルの場合と同じ結果を得た。(3)偏微分方程式の国際研究集会、および若手育成のためのスクール「準古典解析入門講義」(A. Martinez教授による講義ほか)を、それぞれイーグレ姫路、先端技術支援センターで開催した。交付申請書に記載した研究目的のうち、次の二つの研究において成果を得た。1.ハミルトン力学系の非退化な不動点が生成するincomingおよびoutgoingな安定多様体について、対応する準古典シュレディンガー方程式の超局所解の特異性(超局所台)が一方から他方へ伝播するかどうか、またincomingな安定多様体上のインプットデータを与えてoutgoingな安定多様体上のアウトプットデータを計算する方法(J.-F.Bony,T.Ramond,M.Zerzeri氏との共同研究)およびその応用。2.滑らかだが解析的ではない島の中の井戸型ポテンシャルが生成するレゾナンスの虚部の準古典漸近展開を計算することである(L.A.Benbernou,A.Martinez氏との共同研究)。特に1については投稿した論文がJounal of Functional Analysisに掲載され、また国内のいくつかの研究集会等で発表した。されに2月にフランスに渡航した際、共同研究者と研究連絡をとり、磯崎-北田の散乱行列の表現公式とMaslovの大局的な漸近解の構成の理論をこの結果に援用して、ポテンシャルの非退化な最大点が生成するレゾナンス(散乱極)での散乱振幅、あるいはレゾルベントの留数を求める研究を開始した。2についてもフランス渡航中に共同研究者と研究連絡をとり、ポテンシャルが解析的でなくても滑らかであれば、レゾナンスの虚部について、解析的な場合と同じ漸近展開が得られることの証明を完結させることができた。平成20年度は、前年度に行った次の2つの研究の成果発表とそこから派生する新しい問題への着手を今年度の目的としていた。それぞれについて実績を述べる。1.双曲型不動点の近傍での超局所解の伝播についての前年度の研究に、本年度は、磯崎-北田の散乱行列の表現公式とMaslovの大局的な漸近解の構成の理論を援用して、ポテンシャルの非退化な最大点が生成するレゾナンス(散乱極)でのレゾルベントの留数について研究を開始した。8月末より3カ月ボルドー大学にフランスCNRSの客員研究員として滞在し、共同研究者のBony氏等と留数の漸近公式を求めることに成功した。この研究結果の一部については、すでに京都大学、東京大学、九州大学、山口大学における国際研究集会で発表した。2.解析的でない、島の中の井戸型ポテンシャルが生成するレゾナンスの虚部の準古典漸近展開の研究成果を、10月にパリの数理物理の研究集会Seminaire Tournantにおいて発表した。またこの問題をポテンシャル障壁に対するトンネル効果の問題として局所化して、京都大学数理解析研究所の共同研究集会で発表し、講究録別冊に投稿、受理された。その他、6月には播磨科学公園都市において若手研究者育成のための研究会「準古典解析入門講義」をイタリアからMartinez教授を迎えて開催し、2月には姫路において国際研究集会「偏微分方程式姫路研究集会」を開催した。
mRNA発現解析によるカロリー制限の腎不全に対する予防学的効果に関する研究

(目的)腎不全の予防に関しては、従来の蛋白制限に加えて、最近カロリー制限によるものが報告されているが、その機序についてはほとんど明らかになっていない、近年、我々はいくつかの腎血管性ホルモンの急性腎不全モデルにおける産生上昇が、カロリー制限の極端な形である絶食によって抑制されるという、短期絶食の腎不全に対する予防効果を明らかにした。本研究では、強力な血管収縮性ホルモン、エンドセリンのmRNA発現を指標に、カロリー制限の腎不全に対する予防医学的効果について、蛋白制限の効果と比較しながら検討を行った。(方法)高蛋白、標準蛋白、低蛋白の蛋白食、また蛋白の1日摂取量を一定に保つように、高度、軽度のカロリー制限食を作成し、それぞれを2週間、ラットに摂取させたのち、急性閉塞性腎症モデルを作成した。これらラットの腎糸球体細胞からRNAを抽出、エンドセリン-1に対するmRNAの発現をRT-PCR法を用いて分析し、定量を行った。(結果及び考察)それぞれの食餌群で、閉塞性腎症モデルから得られた腎糸球体細胞内のmRNAは、コントロール群に比しいずれも有意に高く、閉塞性腎症における腎機能低下におけるエンドセリンの関与があらためて確認された。エンドセリン-1に対するmRNAの発現は、摂取蛋白量の上下によって、コントロール群・腎症モデル群とも上下するのが認められたのに対し、摂取蛋白量を一定にした場合、摂取カロリー量は両群ともその発現に影響を与えないことが明らかとなった。蛋白による影響は、蛋白制限の腎不全に対する予防効果をあらためて示すとともに、その機序におけるエンドセリンの役割を強く示唆している。また、カロリー制限についての結果は、腎不全に対するカロリー制限の効果を決して否定するものではないが、少なくとも閉塞性腎症ではカロリー制限による変化にエンドセリンの関与はないものと考えられた。カロリー制限による予防効果については、この知見をもとにさらなる検討を必要とする。加えて、以上のことから、短期絶食が閉塞性腎症を予防する機序としては、カロリーよりも蛋白がより重要な役割を果たしていると考えられた。
天然・人工ハイブリッド遺伝子回路を用いた構成的制御によるｉＰＳ細胞の初期分化誘導

本研究ではiPS細胞からの分化制御の第一段階として、iPS細胞からの外肺葉と中胚葉への分化の比率を制御できるための人工遺伝子回路の設計原理の確立を目的とする。合成生物学的手法では数理モデルの構築、シミュレーション、機能既知の遺伝子からなる人工遺伝子回路の設計を行うことにより、細胞に所望の挙動を行うことができる。昨年度に研究実施者が見出した人工遺伝子回路の設計原理は、iPS細胞研究の枠を超え、様々な種類の細胞に対応する基礎原理になると考えられ、平成26年度に研究をとりまとめ査読付き国際会議InCoB2015[1]にて発表を行った。この発表は特に優れた発表としてBest paperawardを受賞した。なお設計原理が実際の生物において駆動することを確かめる必要がある。そのため平成25年度、私はarabinoseとIPTGという誘導剤濃度変化により挙動が変化する人工遺伝子回路の制御遺伝子群のオシレーターの挙動を観察するために下流に存在するプロモーターの様々な改変を行った。そして平成26年度にはオシレーターの振動する誘導剤領域が変化することを確認するための新規トラッキング手法を構築した。既存のトラッキング手法は100倍の対物レンズを用いているために1細胞を追跡することが容易であるが、40倍の対物レンズでは1細胞を追跡することは困難である。そのために平成26年度には大腸菌のマイクロコロニー内の一領域をトラッキングする方法を確立した。26年度が最終年度であるため、記入しない。・合成生物学的手法により、iPS細胞の分化の比率制御を目指した人工遺伝子回路の設計原理の確立本研究ではiPS細胞からの分化制御の第一段階として、iPS細胞からの外肺葉と中胚葉への分化の比率を制御できるための人工遺伝子回路の設計原理の確立を目的とする。ホニュウ細胞では既存の合成生物学的手法で用いられる大腸菌よりも生育が遅く、1細胞ごとのノイズが大きくなっている。そのため分化比率制御を行うためには、既存の人工遺伝子回路よりも正確な数理モデル構築が必要となる。平成24年度、平成25年度にはその効果として人工遺伝子回路設計に必須なレポーター遺伝子が数理モデル上に組み込まれていないという問題を発見し、レポーター遺伝子が人工遺伝子回路の制御遺伝子に与える影響として、(1)レポーター遺伝子のプロモーターがDNA結合サイトとして制御遺伝子のプロモーターとの間で制御遺伝子群を奪い合う効果、(2)レポーター遺伝子のタンパク質と制御遺伝子のタンパク質がタンパク質分解酵素を奪い合う効果、を見出した。そしてそれらの効果の数理モデル、シミュレーション結果から、生育が早く細胞ごとの個性が少ない大腸菌においてそれらの効果が出ていることを顕微鏡実験により確認している。そして数理モデル、シミュレーションの成果を取りまとめ、投稿準備中である。目的:合成生物学的手法により、iPS細胞の分化の比率制御を目指した人工遺伝子回路の設計原理の確立本研究ではiPS細胞からの分化制御の第一段階として、iPS細胞からの外肺葉と中胚葉への分化の比率を制御できるための人工遺伝子回路の設計原理の確立を目的とする。今年度に研究実施者が見出した人工遺伝子回路の設計原理は、iPS細胞研究の枠を超え、様々な種類の細胞に対応する基礎原理になると考えられ、とり急いで研究をまとめている最中である。平成25年度にはその効果として人工遺伝子回路設計に必須なレポーター遺伝子が数理モデル上に組み込まれていないという問題を発見した。シミュレーションにはMATLAB付属の決定論シミュレーションだけでなく、C言語による確率論シミュレーションの実験系を確立し、決定論・確率論の両シミュレーションにより計算機実験を行った。レポーター遺伝子が人工遺伝子回路の制御遺伝子に与える影響として、(1)レポーター遺伝子のプロモーターがDNA結合サイトとして制御遺伝子のプロモーターとの間で制御遺伝子群を奪い合う効果(2)レポーター遺伝子のタンパク質と制御遺伝子のタンパク質がタンパク質分解酵素を奪い合う効果を見出した。

既存のトラッキング手法は100倍の対物レンズを用いているために1細胞を追跡することが容易であるが、40倍の対物レンズでは1細胞を追跡することは困難である。そのために平成26年度には大腸菌のマイクロコロニー内の一領域をトラッキングする方法を確立した。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度に見出した新たな人工遺伝子回路の設計原理は科学的に重要な知見である。そのため、急いでまとめる必要がある。そして設計原理を立証するための、数理モデルの構築・シミュレーションは順当に進んでいると言える。また生物実験における実証によりその設計原理が実際の生物系で行われていることを示す必要がある。iPS細胞の分化の比率制御を目指し、人工遺伝子回路の設計原理を確立したものの、iPS細胞での人工遺伝子回路の導入・動作確認が遅れているため。ホニュウ細胞では既存の合成生物学的手法で用いられる大腸菌よりも生育が遅く、1細胞ごとのノイズが大きくなっている。そのため分化比率制御を行うためには、既存の人工遺伝子回路よりも正確な数理モデル構築が必要となる。そこで新たな人工遺伝子回路の設計指針を構築し、顕微鏡実験においてその設計指針の有用性を確かめる。
つまずき・すべりを考慮した転倒挙動の測定を可能とする加減速装置の開発と実験

本研究では、ヒトのつまずき・すべりなどによる転倒挙動を測定し、その結果から転倒予防のための評価値を得ることを目的として、人体に加減速の外乱を与え、その時の挙動を測定するための基礎的な装置を製作し各種測定を行った.まず、ヒトの外乱に対する基本的な挙動を把握するため、一方向の外乱を作用させることを目的に、一自由度のレール上に台車を設置しワイヤによる牽引により加減速する装置を製作した。さらに同装置の台車上に重心移動測定のためのフォースプレートを製作して設置した.また、同時に高速度カメラを用いてヒトの身体全体の挙動を測定可能とした。以上の装置を用いて、転倒に至らない程度の加減速による身体挙動の測定を行った.その結果、外乱の与え方によって、比較的安定した立ち直り反射と、不安定さを伴う踏切反射が生ずることを確認した.また、踏み直り反応時は重心速度の最大値が大きく、被験者の重心位置はつま先付近まで移動する一方、立ち直り反射時は、重心速度の最大値が小さく重心位置はつま先付近まで達しないことがわかった.得られた結果を考察すれば、つま先付近に重心位置が移動するほど、足指に大きな負荷が作用するが、発生可能な足指支持力には個人差がある.そのため、足指の発生力の限界に達すると踏み直り反応を起こすことになり、つま先付近に重心位置が達していない場合は、立ち直り反射になったと考えられる.以上の結果より、転倒回避行動において重要な要素は、重心速度と足指支持力であると考えられる.また、重心速度は外乱を感知してから転倒回避行動を始めるまでの反応時間、前方に移動した重心位置を戻す際に使用する筋力により決定されると予測される.本研究では、ヒトのつまずき・すべりなどによる転倒挙動を測定し、その結果から転倒予防のための評価値を得ることを目的として、人体に加減速の外乱を与え、その時の挙動を測定するための基礎的な装置を製作し各種測定を行った.まず、ヒトの外乱に対する基本的な挙動を把握するため、一方向の外乱を作用させることを目的に、一自由度のレール上に台車を設置しワイヤによる牽引により加減速する装置を製作した。以上の装置を用いて、転倒に至らない程度の加減速による身体挙動の測定を行った.その結果、外乱の与え方によって、比較的安定した立ち直り反射と、不安定さを伴う踏切反射が生ずることを確認した.また、踏み直り反応時は重心速度の最大値が大きく、被験者の重心位置はつま先付近まで移動する一方、立ち直り反射時は、重心速度の最大値が小さく重心位置はつま先付近まで達しないことがわかった.得られた結果を考察すれば、つま先付近に重心位置が移動するほど、足指に大きな負荷が作用するが、発生可能な足指支持力には個人差がある.そのため、足指の発生力の限界に達すると踏み直り反応を起こすことになり、つま先付近に重心位置が達していない場合は、立ち直り反射になったと考えられる.以上の結果より、転倒回避行動において重要な要素は、重心速度と足指支持力であると考えられる.また、重心速度は外乱を感知してから転倒回避行動を始めるまでの反応時間、前方に移動した重心位置を戻す際に使用する筋力により決定されると予測される.
軟骨形成における活性イオウ種の役割の解析

近年、イオウ原子が多数つながって生成された活性イオウ種(RSS)の存在が生体内で発見された。RSSは、優れた抗酸化作用を有しており、さらに内因性親電子物質の1つである8-ニトロ-cGMPを修飾することにより、様々な生理活性を引き起こすことが明らかとなった。本研究の結果、マウス脛骨の伸長にはRSSが必要であることが示唆された。また、マウス脛骨成長板軟骨における8-ニトロ-cGMPの局在も確認され、8-ニトロ-cGMPによる脛骨の伸長も認められた。これらの結果より、RSSは軟骨疾患に対する新規治療薬になり得ると示唆された。最近、シスタチオニンβ-シンターゼ(CBS)およびシスタチオニンγ-リアーゼ(CSE)がシスチンを基質としてイオウ原子が多数つながったpersulfideを生成することが明らかとなった(Proc Natl Acad Sci USA 11: 7606, 2014)。Persulfideは化学的反応性が極めて高いことから活性イオウ種(RSS)と呼ばれ、細胞内酸化還元環境の維持やシグナル伝達に重要な役割を果たす可能性が示唆されているが、硬組織における役割は全く分かっていない。そこで申請者は、RSSの軟骨内骨化における役割を解析したところ、RSSの前駆物質であるNaHSは軟骨細胞の増殖や骨格成長を著しく促進することを見出した。この発見は、全く新しい軟骨代謝調節システムとして位置付けることができる。そこで本研究は、軟骨代謝におけるRSSの役割を解明することで、軟骨疾患の新規治療方法の開発基盤を確立することを目的とする。本年度の研究において、活性酸素種シグナル伝達系に関与する内因性親電子物質の一つである、8-ニトロ-cGMPが軟骨細胞の増殖に有意に関与することを裏付けるデータを得ることができた。RSSは8-ニトロ-cGMPをスルフヒドリル化(-SH基の付加)することが知られており、軟骨細胞の代謝調節システムとRSSの相関関係を見いだすことができる第一歩であると言える。また、脛骨成長板軟骨における8-ニトロ-cGMPの免疫染色によって、増殖軟骨細胞層における8-ニトロ-cGMPの発現を確認することができた。このex vivoの実験系からも、軟骨細胞の代謝調節システムとRSSの新たな相関関係が示唆された。研究実績に関して、第1回骨免疫学会、第15回東京骨関節フォーラム、第33回日本骨代謝学会学術集会で学会発表を行うことができており、おおむね順調に進展していると言える。近年、イオウ原子が多数つながったpersulfideが生体内で生成されることが明らかとなった(Proc Natl Acad Sci USA 11: 7606, 2014)。Persulfideは化学的反応性が極めて高いことから活性イオウ種(RSS)と呼ばれ、細胞内酸化還元環境の維持やシグナル伝達に重要な役割を果たす可能性が示唆されているが、硬組織における役割は不明である。そこでRSSの軟骨内骨化における役割を解析したところ、RSSの前駆物質であるNaHSは軟骨細胞の増殖や骨格成長を著しく促進することを見出した。この発見より、軟骨代謝におけるRSSの役割を解明し、軟骨疾患の新規治療方法の開発基盤を確立することを目的とする研究を行った。昨年度の研究において、活性酸素種シグナル伝達系に関与する内因性親電子物質の一つである、8-ニトロ-cGMPが軟骨細胞の増殖能に関与することを裏付けるデータを得ることができた。また、脛骨成長板軟骨における8-ニトロ-cGMPの免疫染色によって、増殖軟骨細胞層における8-ニトロ-cGMPの発現を確認することができ、軟骨細胞の代謝調節システムとRSSの新たな相関関係が示唆された。これらの結果より、本年度はマウス初代培養軟骨細胞内での8-ニトロ-cGMPの生成量を定量化するため、LC-MS/MS法を用いて測定したところ、軟骨細胞内での8-ニトロ-cGMPの定量化に成功した。RSSは8-ニトロ-cGMPをスルフヒドリル化(-SH基の付加)することが知られており、軟骨細胞の代謝調節システムとRSSの相関関係を見いだすことができたと言える。1)マウス胎仔脛骨の器官培養の実験系にて骨・軟骨組織におけるRSSの生成を明らかにする。2)初代培養軟骨細胞の分化・増殖過程におけるRSSの生成を解明する。3) RSS前駆物質であるNaHSが軟骨細胞の増殖・分化・機能発現に及ぼす作用を明らかにする。4) RSSによってスルフヒドリル化する親電子物質を同定し、その親電子物質の機能変化を明らかにする。28年度が最終年度であるため、記入しない。生化学28年度が最終年度であるため、記入しない。