hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
パルスレーザーを用いた光ピンセットによる細胞手術に関する研究

そこで,細胞内での自由な光ピンセット操作を実現することを目的として,パルスレーザー光を光ピンセットのアシストに用いて操作する手法であるPLAT (Pulse-Laser-Assisted optical Tweezers)を開発した.本研究では,このPLATを改良して細胞内での光ピンセット操作を実現させ,細胞手術に応用できるような光ピンセット技術の開発し,さらに,PLATに使用するパルスレーザーのパルス幅毎にその効果と適した操作を明らかにすることを目的とする.【進捗状況】これまでに,PLATで細胞操作を行う際に必要なパルス幅は150μs程度であれば十分であることが分かっている.更に,エネルギー照射時間が短く,且つPLAT効果を十分発揮できるパルス幅△は100nsから200nsが適切であることが分かったため,このパルス光を発振するロングパルスNd:YAGレーザーを開発し,このロングパルスレーザーのパルス光(△=160ns)で粒子の取り外し実験を行ったところ,格段に少ないエネルギーで効率的にPLATの効果が得られることを示すことができ,誘電破壊現象を抑えながら粒子取り外しを行えることを確認した.PLATを利用した細胞操作では,パルス幅150μsのパルスを用い,細胞表面に吸着した粒子を取り外したり,細胞内部から粒子を抽出したりすることに成功しており,細胞に対する操作にどの程度の力が必要かという指針を示すことに成功した.本年度は,細胞手術の実現に向けて生体細胞へ適用実験を行い,細胞中の物体を外に取り出すことに初めて成功した.光によるメカニカルな効果で細胞の内容物を外部に取り出した例はこれまでになく,画期的な成果だと考えられる.前年度にも細胞実験を行っているが,この際は細胞の表面に付着した粒子を取り外す実験であり,本年度に細胞内部の実験に成功したのは大変おおきなインパクトであり,評価できると考えている.本研究ではパルスレーザーのパルス幅を伸長させることでPLATの改良を行っているが,パルスレーザーのパルス幅がレーザーにより固定であるため,様々な長さのパルス幅のパルスを取得することが困難な状態にある.現時点で,6ns,20ns,160ns,150μsのパルス幅をもつパルスでの実験を行ってきたが,細胞操作への応用には150μsでは長すぎ,160psでは短いことが分かってきている.そのため,1μsオーダーから10μsオーダーのパルスによる実験を行うべき段階にあるが,そのパルス幅をもったパルスレーザーは市販されておらず,現状入手不可能である.この解決策としては,150μsのパルスを音響光学素子(AOM)によりチョッピングすることで,適切な長さのパルスを取得する方法を考えている.現在の光学系にAOMを組み込み,タイミングよくQスイッチをON/OFFすることでこれを実現する.今後は1μs,10μsのパルス幅をもつパルスを作成し,これらのパルスを用いて細胞に対する操作の実験を行っていく予定である.
証拠の蓄積によって形成される信念論理の知識獲得への応用

本研究の目的は,信念を扱う二つの方法,すなわち,様相論理に基づく形式的方法と測度に基づく数値的方法(Dempster-Shafer理論など)の理論的関係を探究することであった.具体的には,次の3ステップから構成された:(1)証拠の蓄積による信念形成を論理的枠組の中に定式化する,(2)信念から知識を獲得するための銃剣の探究,(3)文献検索を題材とするプロトタイプシステムを計算機上で実現する.以下,順に各点の成果を報告する.第1の点については,証拠の型を矛盾性および不確定性という二つの観点から5つの型に分類し,各型に対応する信念状態の性質を導いた.その結果,2値的な文およびあいまいな文が未知の状態から既知の状態へ確定する過程を証拠の観点か定式化できた.第2の点については,信念が知識としての整合性を持つためにふさわしい条件を様相論理の観点から導き,そのために必要かつ十分な証拠の性質を求めた.その結果,知識になるためにはどのような証拠を獲得すればよいか逆算できることが分かり,一種のプランニング能力を獲得した.理論面では更に,以前の理論では扱っていなかった証拠から導かれる測度の中間の値に対応する信念演算子を定義し,健全かつ完全な論理体系を同定した.第3の点については,文献検索モデルを可能世界意味論によって再構成し,前述の信念形成モデルを適用した結果,信念検索モデルの枠組を得た.これは通常のブール検索やファジィ検索のモデルを特別な場合として包含する.更に,ベクトル検索モデルを論理的に解釈することも可能となった.このモデルに基づくプロトタイプシステムをパソコン上に構築した.本研究の目的は,信念を扱う二つの方法,すなわち,様相論理に基づく形式的方法と測度に基づく数値的方法(Dempster-Shafer理論など)の理論的関係を探究することであった.具体的には,次の3ステップから構成された:(1)証拠の蓄積による信念形成を論理的枠組の中に定式化する,(2)信念から知識を獲得するための銃剣の探究,(3)文献検索を題材とするプロトタイプシステムを計算機上で実現する.以下,順に各点の成果を報告する.第1の点については,証拠の型を矛盾性および不確定性という二つの観点から5つの型に分類し,各型に対応する信念状態の性質を導いた.その結果,2値的な文およびあいまいな文が未知の状態から既知の状態へ確定する過程を証拠の観点か定式化できた.第2の点については,信念が知識としての整合性を持つためにふさわしい条件を様相論理の観点から導き,そのために必要かつ十分な証拠の性質を求めた.その結果,知識になるためにはどのような証拠を獲得すればよいか逆算できることが分かり,一種のプランニング能力を獲得した.理論面では更に,以前の理論では扱っていなかった証拠から導かれる測度の中間の値に対応する信念演算子を定義し,健全かつ完全な論理体系を同定した.第3の点については,文献検索モデルを可能世界意味論によって再構成し,前述の信念形成モデルを適用した結果,信念検索モデルの枠組を得た.これは通常のブール検索やファジィ検索のモデルを特別な場合として包含する.更に,ベクトル検索モデルを論理的に解釈することも可能となった.このモデルに基づくプロトタイプシステムをパソコン上に構築した.
PTH及びPTHrPは心血管系にどのような作用を及ぼすか?-心血行動態に対する生化学的機序及び心筋におけるc-fos発現との相互作用の解明-

研究目的は副甲状腺ホルモン(PTH)の心血管作用の機序およびフラグメントの違いによる作用の違いをラット摘出灌流心を用いて検討することである。1.PTHの陽性変時作用と各種受容体とのクロストークの検討。α1-受容体遮断剤、β-受容体遮断剤、アンジオテンシンIIタイプ1受容体拮抗薬、エンドセリン受容体拮抗薬はPTHの陽性変時作用に影響を及ぼさなかった。2 PTHの陽性変時作用と細胞内シグナル、カルシウム電流、ペースメーカー電流(If)の関与の検討。フォスフォリパーゼC阻害薬およびカルシウムチャネル遮断薬の前投与ではPTHの陽性変時作用は抑制されなかったが、アデニルシクラーゼ阻害薬およびペースメーカー電流(If)の阻害薬(CsCl)でほぼ完全に抑制された。3.PTHによる心室筋および心房筋のcAMP濃度の変化の検討。PTH投与によって心房筋においてcAMP濃度は有意に増加したが、心室筋においては変化を認めなかった。4.PTHの陽性変時作用とフラグメント。5.PTHの血管拡張作用とフラグメント。6.PTHの情報伝達系プロテインキナーゼA阻害薬はPTHの心血管作用を抑制したが、プロテインキナーゼC阻害薬は抑制しなかった.以上の結果より、PTHは他の受容体とのクロストークを介さず、心房PTH受容体を介しG蛋白-アデニルシクラーゼ系を活性化しcAMP濃度を増加させ、Ifを刺激することによって陽性変時作用を示すと考えられた。また、PTHの陽性変時作用にはN末端の1個のアミノ酸が、血管拡張作用にはN末端の3個のアミノ酸が必須であると考えられた。研究目的は副甲状腺ホルモン(PTH)の陽性変時作用の機序を明らかにする事である。1. PTHの陽性変時作用と各種受容体とのクロストークの検討。ラット摘出灌流心を用いて、α_1-受容体遮断剤(prazosine)、β-受容体遮断剤(propranolol)、アンジオテンシンIIタイプ1受容体拮抗薬(CV-11974)、エンドセリン受容体拮抗薬(TAK-044)の陽性変時作用に対する効果を検討した。PTHの陽性変時作用はこれらの薬剤の前投与によっては抑制されなかった。2 PTHの陽性変時作用とセカンドメッセンジャーの関与の検討。フォスフォリパーゼC阻害薬(U-73122)の前投与ではPTHの陽性変時作用は抑制されなかったが、アデニルシクラーゼ阻害薬(miconazole)でほぼ完全に抑制された(90%抑制、p<0.05)。3. PTHの陽性変時作用に対するカルシウム電流とペースメーカー電流(I_t)の関与の検討。PTHの陽性交時作用はカルシウムチャネル遮断薬(verapamil)の前投与では抑制されなかったが、ペースメーカー電流(I_t)の阻害薬(CsCl)の前投与で抑制された(80%抑制、p<0.05)。4. PTHによる心室筋および心房筋のcAMPの濃度の変化の検討。以上の結果より、PTHは他の受容体とのクロストークを介さず、直接PTH受容体に作用すると考えられた。さらに、心房筋においてG蛋白-アデニルシクラーゼ系を活性化しcAMP濃度を増加させ、L_tを刺激することによって陽性変時作用を示すと考えられた。研究目的は副甲状腺ホルモン(PTH)のfragmentの心血管作用の違いを検討することである。ラット摘出灌流心を用いて以下の検討を行った。Full length PTH(1-84)は濃度依存性に陽性変時作用と血管拡張作用を示した(p<0.05)。

PTHの84個のアミノ酸のどの部位が生理活性を有するか検討するために、PTH(1-34)、PTH(2-34)、PTH(3-34)、PTH(4-34)、PTH(7-34)、PTH(13-34)の計6種類のPTH fragmentを用いてさらに検討した。1.PTHの血管拡張作用にはN末端(1-3)が重要である。2.PTHの陽性変時作用にはN末端(1)が重要である。以上の結果より、PTHの血管拡張作用にはPTHのN末端の3個のアミノ酸が重要であり、陽性変時作用にはN末端の1個のアミノ酸が重要であると考えられた。今後、PTHの陽性変時作用および血管拡張作用の機序について検討していく予定である。研究目的は副甲状腺ホルモン(PTH)の心血管作用の機序およびフラグメントの違いによる作用の違いをラット摘出灌流心を用いて検討することである。1.PTHの陽性変時作用と各種受容体とのクロストークの検討。α1-受容体遮断剤、β-受容体遮断剤、アンジオテンシンIIタイプl受容体拮抗薬、エンドセリン受容体拮抗薬はPTHの陽性変時作用に影響を及ぼさなかった。2 PTHの陽性変時作用と細胞内シグナル、カルシウム電流、ペースメーカー電流(If)の関与の検討。フオスフォリパーゼC阻害薬およびカルシウムチャネル遮断薬の前投与ではPTHの陽性変時作用は抑制されなかったが、アデニルシクラーゼ阻害薬およびペースメーカー電流(If)の阻害薬(CsCl)でほぼ完全に抑制された。3.PTHによる心室筋および心房筋のcAMP濃度の変化の検討。PTH投与によって心房筋においてcAMP濃度は有意に増加したが、心室筋においては変化を認めなかった。4.PTHの陽性変時作用とフラグメント。5.PTHの血管拡張作用とフラグメント。以上の結果より、PTHは他の受容体とのクロストークを介さず、心房PTH受容体を介しG蛋白-アデニルシクラーゼ系を活性化しcAMP濃度を増加させ、Ifを刺激することによって陽性変時作用を示すと考えられた。また、PTHの陽性変時作用にはN末端の1個のアミノ酸が、血管拡張作用にはN末端の3個のアミノ酸が必須であると考えられた。
癌促進Ｃ５ａ－Ｃ５ａ受容体系の臨床を含めた総合的解析および癌標的治療法への応用

C5a受容体を発現する乳癌細胞や腎癌細胞は、C5a共存により運動性が活発化し、浸潤・増殖能が亢進すること、さらに転移も促進することを株化癌細胞実験で明らかにし、C5aの受容体を介した直接的癌促進作用を示した。さらに、患者癌組織と臨床データを解析して、患者癌細胞のC5a受容体発現が癌病期の進行、リンパ節転移増加、患者生存率低下と有意に相関することを、乳癌、尿上皮癌で突き止めた。癌病巣では補体系活性化や癌プロテアーゼによってC5aが産生されることが報告されている。そこで、内因性C5aによる癌細胞への作用を調べるために、マウス腎癌細胞Rencaを同系統マウスに接種し、接種部に免疫複合体による補体系活性化を介したC5a産生を誘導した。コントロール細胞に比較してC5a受容体発現Renca細胞の方が腫瘤径で7日目は1.4倍、14日目では1.6倍大きくなった。また、癌接種部皮膚組織標本を抗CD11b抗体と抗Ly6g抗体が共に陽性の骨髄由来抑制細胞(MDSC)の浸潤も有意に数が増加していた。以上より、C5aは数日の培養での癌増殖促進作用は観察されていないが、C5a-C5aR系が潜在的に癌増殖亢進作用をもち、C5aがCD8+ T細胞の抗腫瘍反応を抑制するMDSC細胞を動員し間接的に癌を促進することが解った。次の段階として、マウスC5a受容体発現Renca細胞とmock細胞をマウス腎臓被膜下に接種し、腫瘍成長、転移を比較して癌病巣で産生されるC5aの効果を調べ、C5a-C5a受容体系がマウスでも癌促進作用があることを確認する。さらに、このモデルを使って、C5a受容体拮抗剤や特異抗体の癌抑制効果を検討する計画である。これらの研究成果を通して、C5a-C5a受容体系が癌治療の標的として有用であることを提示する。C5a受容体を発現しないRenca細胞にマウスC5a受容体遺伝子を導入したRenca/C5aRにマイコプラズマ感染がわかり、除菌に時間を要した。しかも、Renca/C5aRの培養液中にはC5aR非発現細胞が出現しており、細胞分離装置を使ってC5a受容体発現細胞のみを分離し、実験に必要な数を確保するにも時間がかかった。Renca細胞は腎癌由来なので腎被膜下に除菌したRence/C5aRを接種して転移を調べたが、実験技術的に困難で一定の結果を得られなかった。そこで、皮膚に接種し同時に内因性C5a産生を誘導して影響を解析したところ、上記のようにC5a受容体依存性に浸潤と腫瘍形成亢進作用が引き起こされた。さらに、抗腫瘍反応を抑制するMDSCの浸潤を調べて癌微小環境も癌促進性に形成されていることが明らかになった。しかし、これらは2年度までの計画なので、最終年度計画の研究には至っておらず、研究達成にはやや遅れている段階にある。最終年度に計画していたRence/C5aRとRenca/mock細胞をマウスに接種し、C5a受容体発現癌細胞が非発現のコントロール細胞より進展することをマウスの系で示し、癌病巣で産生されるC5aの癌促進作用を明らかにする。Renca細胞をマウス腎被膜に移植する系が実施困難であれば、皮内接種の系に変更する。この系にC5a受容体拮抗剤や抗C5a受容体抗体投与の腫瘤形成、浸潤、MDSC細胞集積、腫瘍血管増生、リンパ節転移等を調べて両細胞間で比較し、癌促進抑制効果を解析する。これにより、C5a-C5a受容体系が癌治療のターゲットとして有用であることを示す。I. C5a受容体発現マウス癌細胞の高浸潤・転移能の検討マウス腎癌細胞RenCaにマウスC5a受容体遺伝子を挿入してC5a受容体を発現させたRenCa/C5aRと、コントロールRenCa/mockを作製した。両細胞を異なる近赤外線probe(Qtraker800とQtraker655)で標識して混合し、抗卵白アルブミンIgGと共に同系のBalb/cマウス皮膚内に注射し、直後に尾静脈から卵白アルブミンを投与して接種部にアルザス反応を誘導し、癌微小環境にC5aを供給した。近赤外線800nmと655nmを蛍光測定装置IVISで測定して、癌細胞浸潤の広がりを調べると、2日後にRenCa/C5aRはRenCa/mockに比較してアルサス反応誘導によって1.6倍広く浸潤した。熊本地震によるCO2インキュベータやその他の機器破損等で癌細胞が全滅し、そのため研究遂行が遅れたので、転移実験に関しては次年度以降に検討する。II.癌細胞C5a受容体発現と患者癌促進、予後との関係解析腎癌の転移がある患者では、C5a受容体陽性の腎癌が多かった。根治手術後の浸潤性尿上皮癌患者は、癌細胞がC5a受容体陽性であると生存率が低かった。乳癌においても、癌細胞のC5a受容体発現は癌の悪性度が高く、病期進行例に多く、リンパ節転移頻度も高かった。さらに、生存率も低かった。これらの結果は、C5a受容体発現が癌の進展を促進し、予後不良と関係が深いことを示している。今後、胃癌やその他の癌にも解析範囲を広げ検討する予定である。

マウス腎癌細胞RenCaにマウスC5a受容体遺伝子を挿入し、C5a受容体を発現させたRenCa/C5aR細胞のストックが融解し、実験用に再度培養するとC5a受容体を発現する細胞の割合が数パーセントに減少していた。それで、cell sorterによる陽性細胞を分別し、調整していた。ところが、熊本地震によるCO2インキュベータやその他の機器破損等で癌細胞が全滅し、その後、新規機種の納入、及び、施設の改修等に時間が掛かったため、実験用癌細胞が作製できず実験が遅れた。アルザス反応によるC5a産生の癌増殖促進効果の総合的解析内因性C5aによる癌細胞への作用を調べるために、自己免疫病のモデル炎症であり免疫複合体による補体系活性化引き起こされるアルザス反応の効果を解析した。Balb/cマウスの皮内に同種同系統のマウス腎臓癌細胞のRenca細胞を抗BSA抗体と一緒に注射し、抗原であるBSAの尾静脈注射で癌接種部にアルザス反応を誘導した。コントロール細胞に比較してC5a受容体(C5aR)発現細胞の方がアルザス反応によって腫瘤径が7日目で1.4倍、14日目で1.6倍大きくなった。アルザス反応を誘導しない場合は両細胞の腫瘤の大きさに有意な差はみられなかった。癌接種部皮膚組織標本を抗CD11b抗体と抗Ly6g抗体で蛍光免疫染色し、両抗体に共に陽性の骨髄由来抑制細胞(MDSC)の浸潤を調べると、アルザス反応でC5aR陽性癌細胞および陰性癌細胞接種皮膚で有意に数が増加していたが両癌細胞部での差はみられなかった。ヒト胆管癌細胞HuCCT1細胞をヌードマウスに尾静脈から注射し肺での結節形成を調べると、6週間後にC5aで刺激されたC5a受容体陽性細胞は非刺激C5a受容体陽性細胞やC5a刺激C5a受容体陰性細胞に比較して大きくかつ数倍の数の肺結節を形成した。以上より、C5aは数日の培養での癌増殖促進作用は観察されていないが、C5a-C5aR系が潜在的に癌増殖亢進作用をもち、アルザス反応部ではC5aによるCD8+ T細胞の抗腫瘍反応を抑制するMDSC細胞の動員も関与して腫瘤形成亢進が認められたと考えられた。この作用は自己免疫病をもつ癌患者の悪い予後に関連する機序の一つとして提唱される。Renca細胞は腎臓癌由来なので腎被膜下に接種して転移を調べたが、実験技術的に困難で一定の結果を得られなかった。そこで、皮膚に接種し同時にアルザス反応を誘導して影響を解析したところ、上記のようにC5a受容体依存性に浸潤と腫瘍形成亢進作用がアルザス反応でみられた。さらに、抗腫瘍反応を抑制するMDSCの浸潤を調べて癌微小環境も癌促進性に形成されていることが明らかになった。近赤外線標識細胞を使った転移の実験は長期の観察が必要であるので癌細胞を標識する赤外線probeの寿命の関係で不能であることがわかった。しかし、アルザス反応による癌促進作用は内因性C5aによる癌促進を確認するだけではなく、アルザス反応は自己免疫病のモデル炎症であることから全身性エリテマトーデスや、慢性関節リウマチなどの自己免疫患者が癌を発症した場合に生存率が低い理由の一つを解明することができたので、この実験の目的はほぼ達成されたと考えている。C5a受容体を発現する乳癌細胞や腎癌細胞は、C5a共存により運動性が活発化し、浸潤・増殖能が亢進すること、さらに転移も促進することを株化癌細胞実験で明らかにし、C5aの受容体を介した直接的癌促進作用を示した。さらに、患者癌組織と臨床データを解析して、患者癌細胞のC5a受容体発現が癌病期の進行、リンパ節転移増加、患者生存率低下と有意に相関することを、乳癌、尿上皮癌で突き止めた。癌病巣では補体系活性化や癌プロテアーゼによってC5aが産生されることが報告されている。
プラズマプロセッシングにおける非平衡希薄気体流れ

気体-固体界面における分子・原子の挙動を分子線散乱実験及び量子分子動力学数値計算により解析することを目的として研究を行った.まず,超高真空下で行われる分子線散乱実験において,時間測定精度の向上のため,分子線源周りの時間測定部の改良を行った.これにより,時間測定による誤差が定量的に評価できるようになった.また,二原子分子気体である窒素の散乱分布の計測を,入射分子の速度ベクトルと表面の法線ベクトルが作る平面内のIn-planeのみならずそれ以外の面内であるOut-of-planeに対しても行った.そして,ヘリウムでシードすることにより流速が上がることの効果や表面温度の影響,入射角による影響を解析した.その結果,理論から予測される流速がほぼ得られており,測定の信頼性の向上が確認できた.数値計算に関しては,まず,量子分子動力学法による解析結果をマクロスケールの流動解析に用いることを考え,気体分子間の振動緩和/励起衝突断面積に対するモデル化を行った.その結果モデルが非常に良く量子分子動力学法による解析結果を再現することが確認でき,マクロスケールの解析において,計算負荷をかけることなく,詳細な物理に基づいた解析をできるようになった.更に,気体-固体界面における分子・原子の挙動を解析するために,固体分子を古典的に取り扱い,気体分子の振動運動のみを量子力学により解析する二原子分子の量子分子動力学法の手法を確立した.そして,その手法の検証及び計算条件などの検討を行い,マクロスケールの流動解析に適用可能なモデルの構築に対する準備を行った.気体-固体界面における分子・原子の挙動を分子線散乱実験及び量子分子動力学数値計算により解析することを目的として研究を行った.まず,超高真空下で行われる分子線散乱実験において,計測データの解析プログラムを改良し,直接散乱過程及び吸着脱離過程の二成分で分離できると仮定し,それぞれの強度及びエネルギを求めることが可能となった.また,ヘリウムの空間的散乱分布測定を行い,直接散乱過程による鏡面反射であることが確認され,装置の検証及び表面正常性の確認が行えた.表面試料に対してはX線光電子分光法により表面の吸着分子を測定し,清浄表面が得られていることを確認した.また,二原子分子気体である窒素の散乱分布の計測も行い,ヘリウムでシードすることにより流速が上がることの効果や表面温度の影響,入射角による影響を解析した.シードすることにより常温でも大きなエネルギの分子線を得ることができることを確認した.数値計算に関しては,まず,量子分子動力学法の手法を確立するために,古典的分子動力学法やその結果を量子化する手法などと比較検討を行った.その結果,統計量に対しては既存の実験結果及び計算結果と定量的,定性的に良い一致を示し,計算負荷とあわせて考えると,他の手法に対し非常に有効であることが分かった.更に,気体-固体界面における分子・原子の挙動を解析するために,固体分子を古典的に取り扱う二原子分子の量子分子動力学法の手法を確立した.気体-固体界面における分子・原子の挙動を分子線散乱実験及び量子分子動力学数値計算により解析することを目的として研究を行った.まず,超高真空下で行われる分子線散乱実験において,時間測定精度の向上のため,分子線源周りの時間測定部の改良を行った.これにより,時間測定による誤差が定量的に評価できるようになった.また,二原子分子気体である窒素の散乱分布の計測を,入射分子の速度ベクトルと表面の法線ベクトルが作る平面内のIn-planeのみならずそれ以外の面内であるOut-of-planeに対しても行った.そして,ヘリウムでシードすることにより流速が上がることの効果や表面温度の影響,入射角による影響を解析した.その結果,理論から予測される流速がほぼ得られており,測定の信頼性の向上が確認できた.数値計算に関しては,まず,量子分子動力学法による解析結果をマクロスケールの流動解析に用いることを考え,気体分子間の振動緩和/励起衝突断面積に対するモデル化を行った.その結果モデルが非常に良く量子分子動力学法による解析結果を再現することが確認でき,マクロスケールの解析において,計算負荷をかけることなく,詳細な物理に基づいた解析をできるようになった.更に,気体-固体界面における分子・原子の挙動を解析するために,固体分子を古典的に取り扱い,気体分子の振動運動のみを量子力学により解析する二原子分子の量子分子動力学法の手法を確立した.そして,その手法の検証及び計算条件などの検討を行い,マクロスケールの流動解析に適用可能なモデルの構築に対する準備を行った.
神経膠腫細胞浸潤におけるArf6依存性および非依存性の意義

本研究おいては、まず神経膠腫浸潤におけるArf6の関与、および異なる神経膠腫細胞間におけるその普遍性について査定することを第一義としていた。調べた限りにおいてArf6を高発現する神経膠腫細胞はC6細胞のみであったが、本細胞におけるArf6ノックダウン下にて浸潤性が減少したことより、たしかにArf6の寄与は認められた。しかしながらその効果は50%程度であり、Arf6が浸潤性に関する主たる責任因子と考えることに疑義を生む結果となった。一方Arf6発現が低いSF268細胞中のArf6 mRNAよりcDNAをクローニングして活性に影響する変異がないか検討したが、そのような変異は観察されなかった。こうしたことから神経膠腫細胞浸潤においては、Arf6高発現細胞においてもArf6の寄与は限定的であり、一方Arf6低発現細胞においてはArf6の寄与はさらに小さいと考えられた。そこで、浸潤様式の異なる複数の神経膠腫細胞において共通に浸潤性に寄与する因子の検索へと移り、検索の結果、ナトリウムイオン/プロトン交換輸送体1(NHE1)を有力な当該因子として見出した。これまでに以下の知見を得ている。1.NHE1は浸潤様式の異なる神経膠腫細胞群において共通に発現亢進している(mRNA,タンパク質いずれのレベルにおいても)2.NHE1ノックダウンによって、浸潤性は90%以上の効率で抑制される3.NHE1阻害剤により浸潤様式の異なるいずれの神経膠腫細胞の浸潤も抑制される4.NHE1阻害剤はNHE1の細胞内局在を変動させ、かつアクチン細胞骨格の再構成を阻害しており、このことが細胞運動性を減弱させたことが浸潤性の抑制に作用したと考えられた。これらの結果は、NHE1阻害剤が、浸潤様式の異なる様々の神経膠腫に対して普遍的な浸潤抑制剤たる可能性を示唆しており、当該領域において大変重要な知見であると考えられる。これらのin vitroの成績はすでに特許申請を完了しており、現在論文として発表する準備を行なっている。またin vivoでの有効性についての検討に入っている。本年度の計画においては、神経膠腫細胞浸潤におけるArf6の関与の普遍性について確定することを第一としていた。その点において、1. Arf6ノックダウンおよびArf6下流因子AMAP1発現の検討より、C6細胞においてはArf6シグナル系が浸潤性に寄与していることが明らかとなった。しかしながらその活性への寄与は部分的であると考えられた。2.一方SF268細胞など、Arf6低発現下でかつ高浸潤性をしめす細胞において、発現しているArf6には活性化型変異は観察されず、またAMAP1発現も低かったことから、これらの細胞においてArf6は高浸潤性の要因たり得ないと考えられた。このことはすなわち、神経膠腫細胞の浸潤様式には、少なくともArf6依存的および非依存的などの多様性が存在することを明示しており、そのことは神経膠腫浸潤抑制の困難さの一因足りうると考えられた。そこで、「神経膠腫細胞浸潤の多様な様式間において共通して機能している分子機構」を知ることが神経膠腫浸潤抑制を実現するうえで必須と考え、そうした因子の検索を行った。星状細胞は神経膠腫の発生源と理解されているので、本細胞の初代培養細胞を比較対象とした。3.その結果、神経膠腫細胞において発現亢進を示す候補分子を見出した。4.さらに、その分子のノックダウンおよび阻害剤により神経膠腫細胞浸潤活性が抑制出来ることを観察したことから、本因子の阻害による神経膠腫浸潤抑制治療が構築できる可能性が拓けたと考えられる。現在論文化に先立つ特許申請を準備中である。また本因子機能のさらなる解析のため、計画を変更して機器の導入を行った。

これらの結果は、NHE1阻害剤が、浸潤様式の異なる様々の神経膠腫に対して普遍的な浸潤抑制剤たる可能性を示唆しており、当該領域において大変重要な知見であると考えられる。これらのin vitroの成績はすでに特許申請を完了しており、現在論文として発表する準備を行なっている。またin vivoでの有効性についての検討に入っている。
スゲ属ホンモンジスゲ類における異数性と遺伝的分化の解析

カヤツリグサ科スゲ属のホンモンジスゲ類は外部形態が種間でよく似ており、スゲ属の中でも特に分類が困難なグループである。本研究では、タイプ標本を参考にして日本産のホンモンジスゲ類の分類学的再検討を行なった。さらに、10分類群に関して染色体と酵素多型の分析を行ない近縁種の類縁関係を考察した。1.ホンモンジスゲ類の分類学的再検討小山(1964)と大井(1983)よりオオイトスゲとしてまとめられていた北海道産の個体は、植物体が小型で、基部葉鞘が淡褐色である点で異なり、本州に分布するものと異なる分類群であることが明らかになった。また、これまでイトスゲとされていた西日本に分布する個体は、葉幅が0.5mm以下で葉はすべて内巻きしており、イトスゲおよびハコネイトスゲとは異なる新分類群であることが明らかになった。今回の分類学的再検討により、ホンモンジスゲ類は15種11変種に分けられた。2.染色体の分析集団内で連続した染色体数を持つ種内異数体が5分類群で観察された。減数分裂での対合分析により、異型対合をしたIII価染色体が高頻度で出現し、その他の多価染色体は見られなかったことから、III価が各集団で維持されることにより連続した種内異数体が生じたことが明らかになった。3.酵素多型分析ベニイトスゲ、チャイトスゲ、イトスゲ、ケスゲの4分類群において、6-Pgdで遺伝子重複が観察された。これらは、NJ法による系統樹からも、よいまとまりを示し、この4分類群が分化する過程で、遺伝子の重複が生じたことが明らかになった。また系統樹より、染色体数2n=5661を持つ分類群から2n=6884の高次の染色体数を持つものに分化したことが推定された。日本各地より採集した、ホンモンジスゲ類のニシノホンモンジスゲ、コシノホンモンジスゲ、ミチノクホンモンジスゲ、ノズゲ、ベニイトスゲ、シロイトスゲ、アリマイトスゲ、チャイトスゲ、イトスゲ、ケスゲ、総計10taxa,40集団,684個体について染色体の観察と酵素多型の分析を行った。また、酵素多型分析には、外群としてオクノカンスゲ1集団11個体を用いた。染色体に関しては、ケスゲで2n=7480,ベニイトスゲ2n=6671,ニシノホンモンジスゲで2n=5861,イトスゲで2n=7074,ノスゲで2n=66,67の連続した種内異数体が集団内で見られた。減数分裂での対合分析により、III価染色体が高頻度で出現し、その他の多価染色体は見られなかったことから、III価が染色体の消失を伴わず両極に分配されて、各集団で維持されることにより連続した種内異数性が生じたことが明らかになった。また、III価は、全て異型対合をしていたことから、染色体の構造変異によって種内異数体が出現したと考えられる。酵素多型に関しては、ニシノホンモンジスゲ、コシノホンモンジスゲ、ミチノクホンモンジスゲ、ケスゲの4taxa間の遺伝的距離は0.1280.182という最も小さい値が得られ、これら4taxaは、遺伝的分化の程度が低い分類群であることがわかった。チャイトスゲは、他の9taxaとの遺伝的距離の平均が0.315と大きく、遺伝的に離れたtaxaである。

また、ベニイトスゲ、チャイトスゲ、イトスゲ、ケスゲの4taxaにおいて、6-Pgdで遺伝子重複が観察された。これらは、NJ法による系統樹からも、よいまとまりを示し、この4taxaが分化する過程で、遺伝子の重複が生じたことが明らかになった。また、系統樹から、北方に分布していたミチノクホンモンジスゲまたはコシノホンモンジスゲが、西南に分布域を拡大するに伴い、ニシノホンモンジスゲが分化したものと推定された。本年度はOhwi、AkiyamaおよびLeveille and Vaniotにより記載されたタイプ標本を参考にして、日本各地のホンモンジスゲ類の分類学的再検討を行なった。その結果、イトスゲ、アリマイトスゲ、オオイトスゲの3種に関して次のような新知見が得られた。イトスゲは、Leveilleand Vaniot(1901)により茨城県をタイプロカリティとして記載されており、タイプ標本(Faurie 4431,P)の葉幅は1.01.5mmである。中部地方以東に生育する個体で葉幅が1.01.5mmのものはタイプと同じ形態を持つものである。しかし、近畿地方以西に分布する葉幅が0.5mm以下の個体は、葉はすべて内巻きしている。葉幅が0.5mm以下で葉は内巻きしないハコネイトスゲとも明確に区別でき、これまでイトスゲと同定されてきた近畿地方以西に分布する植物は新分類群であることが明らかになった。岡山県後月郡芳井町産の個体は、匍葡枝、小穂、葉鞘などの形態がアリマイトスゲと同一であったが、果嚢に毛が多いことや嘴が長いことで異なり新分類群であると考えられる。また、小山(1964)と大井(1983)が記載したオオイトスゲは、植物体の大きさと基部葉鞘の色の違いで北海道に分布するオオイトスゲと本州に分布するシロイトスゲの2分類群に区別でき、秋山(1955)の見解を支持する結果が得られた。以上の結果をもとにホンモンジスゲ類の検索表の作成を試みたところ新たに作成した検索表は、大井(1983)に近いものとなった。秋山、小山、大井は色の形質に重点をおいて分類しているが、各分類群で色の変異が大きく、果胞の毛の有無を重視することで検索しやすいことがわかった。カヤツリグサ科スゲ属のホンモジスゲ類は外部形態が種間でよく似ており、スゲ属の中でも特に分類が困難なグループである。本研究では、タイプ標本を参考にして日本産のホンモンジスゲ類の分類学的再検討を行った。さらに、10分類群に関して染色体と酸素多型の分析を行ない近縁種の類縁関係を考察した。1.ホンモンジスゲ類の分類学的再検討小山(1964)と大井(1983)によりオオイトスゲとしてまとめられていた北海道産の個体は、植物体が小型で、基部葉鞘が淡褐色である点で異なり、本州に分布するものと異なる分類群であることが明らかになった。また、これまでイトスゲとされていた西日本に分布する個体は、葉幅が0.5mm以下で葉はすべて内巻きしており、イトスゲおよびハコネイトスゲとは異なる新分類群であることが明らかになった。今回の分類学的再検討により、ホンモンジスゲ類は15種11変種に分けられた。2.染色体の分析集団内で連続した染色体数を持つ種内異数体が5分類群で観察された。減数分裂での対合分析により、異型対合をしたIII価染色体が高頻度で出現し、その他の多価染色体は見られなかったことから、III価が各集団で維持されることにより連続した種内異数体が生じたことが明らかになった。3.酵素多型分析ベニイトスゲ、チャイトスケ、イトスゲ、ケスゲの4分類群において、6-Pgdで遺伝子重複が観察された。これらは、NJ法による系統樹からも、よいまとまりを示し、この4分類群が分化する過程で、遺伝子の重複が生じたことが明らかになった。また系統樹より、染色体数2n=5661を持つ分類群から2n=6884の高次の染色体数を持つものに分化したことが推定された。
放射線誘導DSB認識タンパク質の挙動解明

本研究は培養細胞およびマウス個体に高エネルギー・高LETの重粒子線を照射し、飛跡に沿ってDNA二本鎖切断(DSB)を生成させる。この直接的な放射線によるDSBとバイスタンダー効果によって近傍の細胞に生成するDSBに集まるDSB損傷認識タンパク質の照射後の経過時間毎の挙動を明らかにすることを目的としている。高エネルギー重粒子線の飛跡に集まるDSB損傷認識タンパク質の挙動を明らかにするため、昨年度に引き続き、我々は重粒子線(Fe,500MeV/u,200keV/μm)照射後のこれらのタンパク質のフォーカス形成とリン酸化を免疫化学染色法とフローサイトメトリー法を用いて解析した。リン酸化ヒストンH2AXのフォーカス形成は放射線によるDSB損傷部位で起こることがよく知られているので、我々は線量依存的な飛跡の検出に用いた。その結果、理論値とよく一致して線量と飛跡の数が一致していた。また、X線と同様に重粒子線の線量が増えるのに従ってヒストンH2AXのリン酸化量は増加したが、X線に比べて重粒子線照射後のヒストンH2AXのリン酸化残存量が多いことを明らかにした。このことは重粒子線による損傷が修復しにくいことを示しているのかも知れない。さらに、我々はDSB損傷認識タンパク質(特に放射線照射後にリン酸化したATMセリン1981、ヒストンH2AXセリン139、Nbs1セリン343、Chk2スレオニン68、DNA-PKcsスレオニン2609)の重粒子線照射後の挙動を調べ、リン酸化ヒストンH2AXのフォーカス形成部位とよく一致していることを明らかにした。高エネルギー・高LETの重粒子線はX線やγ線などの低LET放射線やその他の化学物質などと異なり、その飛跡に沿ってDSBを生成することから、DSB認識機構の解明にとって、有用なツールと考える。今年度は高エネルギー重粒子線の飛跡に集まるDSB損傷認識タンパク質の挙動を明らかにするため、我々は重粒子線(Fe,500MeV/u,200keV/μm)照射後のこれらのタンパク質のフォーカス形成とリン酸化を免疫化学染色法とフローサイトメトリー法を用いて解析した。さらに、我々はDSB損傷認識タンパク質(特に放射線照射後にリン酸化したATMセリン1981、ヒストンH2AXセリン139、Nbs1セリン343、Chk2スレオニン68、DNA-PKcsスレオニン2609)の重粒子線照射後の挙動を調べ、リン酸化ピストンH2AXのフォーカス形成部位とよく一致していることを明らかにした。高エネルギー・高LETの重粒子線はX線やγ線などの低LET放射線やその他の化学物質などと異なり、その飛跡に沿ってDSBを生成することから、DSB認識機構の解明にとって、有用なツールと考える、本研究は培養細胞およびマウス個体に高エネルギー・高LETの重粒子線を照射し、飛跡に沿ってDNA二本鎖切断(DSB)を生成させる。
土壌中の疎水性有機化学物質の存在形態解析に対する新たなアプローチ

疎水的有機化学物質の土壌中の存在形態の解明に対する基礎的知見を得、今後の研究の発展に繋げることを目的として研究を行った。腐植物質の種類によりディルドリンの吸着性が異なり、フルボ酸が吸着を阻害する可能性を示した。今後、農薬などの有機化学物質の土壌吸着を調べる際には、腐植の官能基特性などと関連付けて調べていく必要があることを示唆した。現在、得られた結果の裏付けを得るべく、さらに研究を進めている。ディルドリンの土壌への吸着は、24時間で平衡に達し、96時間目まで吸着量に変化は見られなかった。無処理土壌へのKd値は、50,000 (Kg L-1)で、極めて吸着性が高いことが示された。疎水性有機化学物質のディルドリンの各腐植(フミン酸、フルボ酸、ヒューミン)への吸着の親和性は、それぞれの腐植によて異なるのではないかと考え実験を行った。各腐植物質へのディルドリンの吸着強度は、ヒューミン>フミン酸>無処理土壌>フルボ酸の順となった。従来、農薬などの有機化学物質の土壌吸着は、土壌中に存在する腐植などの有機物質を一様の性質をもつものと捉えて解析される。しかし、本研究の結果は、腐植物質の種類によりディルドリンの吸着性が異なることを示し、中でも最も水溶性の高いフルボ酸が低い吸着性持つことを示した。今後、農薬などの有機化学物質の土壌吸着を調べる際には、腐植の官能基特性などと関連付けて調べていく必要があると考えられる。また、ヒューミン+フルボ酸+無機成分試料への吸着は、ヒューミン+無機成分にディルドリンを吸着させた後にフルボ酸を添加した実験の方が、ディルドリンとフルボ酸を同時添加した実験よりも吸着性が高くなった。さらに、時間差で添加した試料とヒューミン+無機成分の吸着傾向が似ていた。これは、無機成分とヒューミンを混合したものにフルボ酸とディルドリンを同時添加すると、フルボ酸の疎水的な部分がヒューミンの疎水的な部分に吸着し、親水的な部分が溶液側を向くことによりディルドリンの吸着が阻害されている可能性を示唆していた。同時に、一旦ヒューミンに吸着したディルドリンはフルボ酸によって容易に脱着しない可能性が示唆された。現在、上記の結果の裏付けを得るべく、さらに研究を進めている。疎水性有機化学物質は、土壌に強固に吸着される。また、土壌中における存在時間が長いほど、土壌により強固に吸着されるようになり、生物が利用しにくくなる。しかし、土壌中で30年を超えて残留するこれらの物質が、作物中から残留基準値を超えて検出され問題となっているが、30年を経過し、土壌に強固に吸着されboundresidueになっていると考えられる疎水性有機化学物質がなぜ植物に吸収されるのかは未解決のままである。本研究では疎水的有機化学物質の代表としてディルドリンを用いて、これらの疎水性有機化学物質の土壌吸着と土壌溶液への溶解に注目してこの問題の解決に取り組んだ。はじめに、バッチ法によりディルドリンの土壌への吸着を概観することとした。物質の土壌吸着実験は通常、固:液比=5:1で行う。しかし、ディルドリンの土壌吸着力は非常に強いため、この比率では、ほとんどのディルドリンが土壌に吸着されてしまった。そこで、固:液比を検討し、200:1以上の比率が適当であることがわかった。さらに、疎水性の高い有機化学物質の固体への吸着平衡は、固体成分によっては、数週間から数か月におよぶことがわかっている。そこで、吸着平衡に達する時間を検討したところ、本研究の目的を達成するためには、24時間で適当であることが明らかとなった。ディルドリンの主な土壌中の吸着成分は、腐植だと考えられるため、土壌からフミン酸、フルボ酸およびヒューミンを抽出し、未処理土壌へのディルドリンの吸着とこれらの腐植へのディルドリンの吸着を比べることとした。その結果、未処理土壌への土壌吸着はヒューミンへの土壌吸着よりも強く、フミン酸やフルボ酸がディルドリンの吸着にヒューミンよりも大きな役割をはたしている可能性が示唆された。今後、これらの腐植のディルドリンの吸着に対する寄与率を調べ、土壌中における疎水性有機化学物質の動態を明らかにしていく。当初は、初年度には各腐植物質(フミン酸、フルボ酸、ヒューミン)のディルドリンの土壌吸着に対する寄与率を調べ終える予定であった。しかし、未処理土壌とヒューミンへのディルドリンの吸着の違いを比べるに留まった。その原因は、腐植物質の抽出および吸着実験系の確立に時間を要したことにある。本研究では、腐植物質の違いがディルドリンの吸着機構に果たす役割を調べる。

そこで、通常よりも多量の腐植を土壌から抽出する必要があり、計画していたよりも多くの時間を要した。また、疎水性有機化学物質の研究は、その環境中や作物への残留を取り扱うため、もっぱら各媒体からの抽出操作によって行われる。しかし、本研究では、土壌中での動態を明らかにすることを目的とするため、添加実験によって行うため、その実験系を確立するために試行錯誤を必要とし、系の確立ために時間を要した。そのため、計画していた各腐植のディルドリンの土壌吸着への寄与を明らかにすることからやや遅れ、初年度は、無処理土壌とヒューミンへのディルドリンの吸着の違いを比べるところまでとなった。研究協力者である研究室に所属する大学院・学部生とより緊密に研究の進捗状況、情報の共有、意見交換を行い、研究を推進し、得られた成果を学術雑誌への公表のほかに、学会、シンポジウムの発表を中心に発信するよう努める。はじめに、初年度に引き続き、バッチ法により、フミン酸、フルボ酸およびヒューミンのディルドリンの吸着に対する寄与率を調べ、どの画分がディルドリンの吸着や溶解に寄与しているかを明らかとする。その後、カラムリーチングおよび分子ふるいによって、植物が吸収しやすい土壌溶液中のディルドリンの存在形態を精査する。カラムリーチングでは、ディルドリンを添加した担体をカラムに詰め、水溶液、各種腐植物質を溶解させた溶液をこのカラムに通すことによって、それぞれの溶液のディルドリンの溶解力を判定する。また、ディルドリンと水溶液および各種腐植物質を溶解させた溶液を分子ふるいに通すことで、腐植物質のディルドリン溶解に与える影響を知る。これらの研究を進めることによって、これまでの考え方では説明できない、30年を超えて土壌中に残留する疎水性の有機化学物質の土壌中での動態を明らかにし、現在、問題となっている残留性有機汚染物質の作物残留の問題などに貢献していきたい。初年度の研究費の執行に当たっては、1,428円の残額が出た。わずかな差ではあるが、申請した研究費と差が出た。最終年度の平成24年度にあっては、研究推進のため、より適正かつ適切な使用に留意する。
上皮間葉間の移行阻害による癌の悪性放棄の機序解明

AMF単量体を過剰分泌させると癌細胞と線維芽細胞の遊走を誘導する。AMF単量体を過剰分泌させると一部は二量体を形成する。分子量は非還元で55キロダルトンと110キロダルトンの二種類のバンドが確認され、還元では65キロダルトンの単一バンドとなる。N末端側の一カ所に点変異を加えるとアミノ酸の置換が生じ、二量体形成しなくなる。二量体形成をしないAMFを過剰分泌させると細胞遊走は誘導するが、上皮間葉移行を誘導しなくなる。AMFは高親和性受容体を介して細胞遊走を誘導することから、低親和性受容体は上皮間葉移行に関わっていることが強く示唆された。自己分泌型遊走因子強制発現のための全長cDNAならびにサイレンシングのためのライボザイムカセットcDNAを低転移型ヒト扁平上皮癌細胞株細胞HSC-3より抽出したトータルRNAより合成し、発現ベクターであるpBK-CMVならびにpCDNA3にライゲーションさせることでカセッティングした。これらのベクターは大腸菌JM109にトランスフォーメーションして少量調整した。さらにこれらのベクターは大腸菌JM109に単独もしくは共に導入させた。発現量は、大腸菌にフュージョン蛋白として発現させた後、ウエスタンブロットにて抗自己分泌型遊走因子抗体にて検出した。抗自己分泌型遊走因子抗体は、ウサギに免疫したポリクローナル抗体を用いた。これらの有効株から少量調整によりDNAを調整し、リポフェクタミンを用いてHSC-3細胞に単独もしくは共に導入し、現在G418セレクションを行い、ステーブル株樹立中である。ヒト口腔扁平上皮癌細胞totalRNAより2本鎖DNAを作製し、ヒト自己分泌型遊走因子相補遺伝子(SCC drived hAMF cDNA)をPCRにて増幅、単離し、これを発現ベクターであるPBKCMVおよびPCDNA3.1に組み込んだ。これと並行してhANFをsilencingさせるためのanti-hAMF ribozyme DNAを作製し、これも同様に発現ベクターであるPBKCMVおよびPCDNA3.1に組み込んだ。これらの発現ベクターを大腸菌内で少量調整し発現効率を比較した結果から効率の高いPBKCMVを採用した。次にPBKCMVをヒト扁平上皮癌細胞HSC-3にripofectamineを用いて遺伝子導入し、G418を用いて選択を行い、3ヶ月後に安定株を得た。ベクターのみの株、ribozymeを結合したベクターの株を比較すると、AMFの発現は抑制されていることが認められたが、hAMF cDNAをベクターに結合した株ではベクターの増殖およびAMFの発現増強を認めるものの、明らかなAMF発現増強による影響を認めなかった。そこでAMF cDNAの塩基配列を確認すると1塩基に置換が生じていることが明らかとなった。そのためアミノ酸に置換を帰結し故に立体構造に変化を引き起してAMFとしての機能を失ったものと考えられた。恐らくPCRによるものと考えられるため、現在正規の配列を持つhAMF cDNAの作製に取りかかっている。まず、山梨大学より東京医科歯科大学に移動となったために、これまで構築してきた実験系を、また新たに構築しなければならなくなったことから、主に少額備品の購入に使用した。冷蔵庫、ピペット、サーマルサイクラーなどのコンタミネーションを避けなければならないスペースの確保と器具の確保を行った。自己分泌型遊走遺伝子の導入により強制的に発現亢進させて、上皮間葉移行を誘導する実験は、扁平上皮癌細胞を用いても、比較的再現性のある実験系であった。しかし、上皮間葉移行の程度、扁平上皮癌細胞ではかなりばらつきがあった。そのため、自己分泌型遊走因子のサイレンシングによる間葉上皮移行も扁平上皮癌細胞ではその反応にばらつきを認めた。自己分泌型遊走因子AMFは種を超えてホモロジーが高く、ヒト、マウス、ウサギでも70%以上が保存されている。特にN末端側にはよく保存されている領域があり、種を超えて90%一致しており、蛋白レベレでも93%以上保存されている領域がある。またAMFは細胞内ではホモダイマー二量体として存在し、解糖系に影響を与えるブドウ糖ー果糖の転換酵素フォスフォへキソースイソメラーゼとしても機能しているが、細胞外へ分泌される時はモノマー単量体として分泌されて細胞遊走を誘導するAMFとして機能する。しかし現実には細胞外であっても、一部は二量体形成することが知られていたが、その機能については十分な答えが得られるまでには至っていなかった。またAMFには項親和性受容体と低親和性受容体の少なくとも二種類の受容体が存在するこも明らかにしたが、これがどのような受容体なのかについても十分な答えは得られていなかった。単量体のAMFを過剰分泌させると細胞遊走を癌細胞にも線維芽細胞にも誘導する。

また単量体AMFを過剰分泌させると一部は二量体形成をする。分子量は非還元では単量体55キロダルトンと二量体110キロダルトンの二種類のバンドが確認され、還元されると単量体65キロダルトンの単一バンドとなる。N末端側の一カ所にポイントミューテーションを加えるとアミノ酸の変化により二量体形成をしなくなる。二量体形成をしなくなったAMFを過剰分泌させると細胞遊走は誘導するが、上皮間葉移行を誘導できなくなる。AMFは高親和性の受容体を介して細胞遊走を誘導することから、低親和性の受容体は上皮間葉移行に関わっていることが強くしさされた。外科系歯学申請時は山梨大学であり、山梨大学医学部歯科口腔外科にてようやく研究環境が整いつつある時であった。しかし、東京医科歯科大学顎顔面外科に異動となり、研究環境は大きく変化した。そのため設備、備品等を改めて購入しなければならなくなったことが、大きな理由であると考えられる。DNA配列決定には技術的な進歩があり片側で約500bp程の塩基を読み取ることができる。hAMF cDNAは1.8 kbと長いため、DNA配列決定には1kbと0.8kbの2つの断片に分けて行った。そのため0.8kbの断片は双方向で重複して確実に読み取ることができたが、1kbの断片の中央部分はやや曖昧であった。一方では正確に一致していたため問題ないとして先に進んだが、結果として不一致であった。期限が迫っていたためそのままG418選択による安定株の作製へと進んだが、機能解析の実験では期待を裏切る結果となった。従ってAMFの発現抑制に起因する機能抑制に関しては満足する結果は得られたものの、比較すべきAMFの発現増強に起因する機能促進の結果は得られていない。遅れている最大の理由は山梨大学より東京医科歯科大学に移動となったために、これまで構築してきた実験系を、また新たに構築しなければならなくなったことである。しかし、一度実験系が確立してからは、上記のごとく、上皮間葉移行の誘導については概ね良好な再現性を認めた。第二の理由は扁平上皮癌細胞自体が上皮間葉移行の程度にばらつきがあり、しくしゅ細胞のように完全に間葉化しているわけではないので、間葉上皮移行の実験での反応性にもばらつきがあることである。本年中にステーブル株の樹立を完遂し、発現レベルを評価し、in vitroレベルでのEMTならびにMETを関連遺伝子ならびにタンパク質レベルでの発現を比較する。その上で、EMTならびにMETによる悪性獲得と悪性放棄の機序をこれらの樹立株細胞を用いて、mRNAおよびタンパク質レベルでの発現動態の変化を検討する他、ボイデンチャンバー、ウンドヒーリングアッセーなどの遊走実験やマトリゲルを用いた浸潤実験を行い動的な動態の機序解明を行う。また瞬時瞬時の細胞動態と発現のダイナミックな遺伝子ならびにタンパク質の変化を抗体を用いた免疫染色等で検討する。PCRに関しては最も信頼性の高い酵素はTAKARA Taqであり、現在はこれを用いてPCRを行っている。またDNA配列決定に関しては制限酵素を用いて300500bpくらいの小さな断片にして正確性を期した配列決定とする。