hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
iPS細胞の最小限の分化誘導による再生骨の作製とブタ顎骨欠損モデルへの応用

本研究の目標は必要最小限の分化培養によってミニブタiPS細胞(piPSC)を中胚葉系細胞へ分化誘導し、この細胞を細胞源として用いることで腫瘍化などの恐れがない安全・確実なiPS細胞を応用した顎骨再生医療を提供することである。本研究では同種移植が可能な近交系実験動物であるクラウン系ミニブタの胎性線維芽細胞に山中4因子をウイルスベクターで導入してiPS-like細胞を樹立した。そしてアクチビンA、BMP-4を含む無血清培地で中胚葉系細胞に分化誘導した。さらにこの分化誘導細胞から未分化細胞を除去して中胚葉系細胞を純化する方法を検討した。近交系ミニブタの新生児耳介片より単離した線維芽細胞にレトロウイルスベクターを用いて山中4因子を導入し、ES細胞様のコロニー形成能を有すミニブタiPS細胞株を樹立した。テロメラーゼ活性は線維芽細胞に比べて約1000倍の活性を有し、Nanog遺伝子の発現も増加した。細胞をSCIDマウスの皮下に移植すると腫瘍形成能を示した。染色体検査をおこなうと染色体数は38対であり、これはミニブタの染色体数と一致した。また検査を実施した50細胞中に染色体の異常はみられなかった。いっぽう導入遺伝子である山中4因子は40継代後も発現しており、ヒトiPS細胞で報告されている導入遺伝子のサイレンシングは確認できなかった。次にこの細胞株を用いて再生骨の原料となる中胚葉への分化誘導培養法を検討した。ES細胞を胚様体形成させて分化誘導するとき胚様体のサイズやジオメトリーが分化効率に影響するという報告がある。そこで96穴低接着性培養皿に細胞数を何段階に条件をふって播種しサイズの異なる胚様体を形成させ、VEGF/BMP4/SCF/Activin A含有培地で中胚葉系細胞に分化誘導をおこなった。分化誘導後の胚様体からRNAを回収し、初期中胚葉系細胞マーカーであるBrachyuryの遺伝子発現を測定すると検討した全ての群で発現増加が確認できたが、群間に有意差はみられなかった。また中胚葉細胞表面マーカーであるCD326(-)/CD56(+)細胞の割合をフローサイトメーターで測定すると全ての群でCD326(-)/CD56(+)細胞は増加したが、群間に有意差はみられなかった。分化誘導後も未分化マーカーであるNanog遺伝子発現が高発現を維持しており導入遺伝子のサイレンシングがみられないことが分化誘導を阻害しているのではないかと推察された。より良質な近交系ミニブタiPS細胞株の樹立する方法を検討している。我々が目指している再生骨を作製するためには、腫瘍の原因となる未分化細胞を含まない、中胚葉系細胞が必要である。また、iPS細胞は細胞株により細胞特性が異なることが知られているため本検討に用いるiPS細胞は中胚葉に向かう分化特性が高いことが望ましい。H25年度に我々が樹立したミニブタiPS細胞は、マウスiPS細胞に比べ中胚葉系への分化効率が低い細胞だった。このiPS細胞は、樹立時に用いた山中因子がサイレンシングされていなかったことから、リプログラミングが不完全な状態である可能性が推察された。そこでリプログラミング阻害因子として知られているMbd3遺伝子をsiRNAで抑制した条件でミニブタiPS細胞の樹立をおこなった。Mbd3遺伝子抑制下では作製効率が30倍以上増加した。さらにiPS細胞の分化特性も向上した。次にミニブタiPS細胞の培養法の検討をおこなった。先行報告ではヒトES/iPS細胞の培養で用いられるFGF添加培地あるいはマウスES/iPS細胞の培養で用いられるLIF添加培地のどちらか又は混和してブタiPS細胞は培養されている。そこで培養液による影響を検討した。FGF添加培地はミニブタiPS細胞の未分化性の維持に適しており、LIF添加培地は反対に分化特性を向上させる傾向があることを確認した。次にiPS細胞を中胚葉系細胞へ高効率に分化誘導可能な培養法の検討をおこなった。ヒトiPS細胞を間葉系細胞に99%以上の高効率で分化誘導可能な培養法として報告されている小分子化合物SB431542を用いた分化誘導法を用いるとミニブタiPS細胞を中胚葉系に効率よく分化誘導することが可能なことを確認した。ミニブタiPS細胞(piPSC)とヒトiPS細胞(hiPSC)のin vitroにおける中胚葉系細胞への分化特性を比較するとpiPS細胞の方が劣っていた。これは両者のリプログラミング因子導入により初期化される遺伝子に違いがあることが原因と考えた。そこでマイクロアレイを用いてヒトおよびミニブタのリプログラミング前後の細胞(線維芽細胞とiPS細胞)の遺伝子発現を網羅的に解析した。その結果hiPSCでは変動が確認されないがpiPSCでは発現増加/減少する遺伝子が1290/1145遺伝子、pIPSCでは変動が確認されないがhIPSCでは発現増加/減少する遺伝子が895/783遺伝子確認された。変動遺伝子にはKLF4、IHH、SOX17など多能性および骨分化関連遺伝子が多数含まれており、これらの遺伝子を増強あるいは抑制することでpiPSCの分化特性を改善する可能性があり、詳細な検討を継続しておこなっている。プライム型であるpiPS細胞をナイーブ型に誘導することで中胚葉系細胞への分化効率が向上するか検討をおこなった。

Hannaらが報告した培養法[Nature 504(7479):282-6, 2013]でpiPSCをナイーブに誘導するとコロニー形状がナイーブ型として特徴的なマウスES細胞様のものに変化した。またこの細胞をYuらが報告した分化誘導法[Cell Stem Cell. 8(3):326-34, 2011]を一部改変した方法で中胚葉系に分化誘導すると分化誘導4日の時点で初期中胚葉マーカーであるbrachyury発現が25倍増加し、FCM解析でも中胚葉系分化細胞数の増加が確認された。本研究の目標は必要最小限の分化培養によってミニブタiPS細胞(piPSC)を中胚葉系細胞へ分化誘導し、この細胞を細胞源として用いることで腫瘍化などの恐れがない安全・確実なiPS細胞を応用した顎骨再生医療を提供することである。本研究では同種移植が可能な近交系実験動物であるクラウン系ミニブタの胎性線維芽細胞に山中4因子をウイルスベクターで導入してiPS-like細胞を樹立した。そしてアクチビンA、BMP-4を含む無血清培地で中胚葉系細胞に分化誘導した。さらにこの分化誘導細胞から未分化細胞を除去して中胚葉系細胞を純化する方法を検討した。大動物(ミニブタ)を使ったiPS細胞による顎骨再建の検討に必要なミニブタiPS細胞が樹立できた。そして高効率な中胚葉系細胞への分化誘導方法の検討もおおむね順調に進行している。再生医学平成27年度はこれまでの検討で確立した分化誘導法を用いてミニブタiPS細胞を中胚葉系細胞に分化誘導し、細胞濃度(1x108、1x107、1x106 cells/mL)で、φ10 mm x2 mmの多孔質beta-TCPに投与し、投与細胞濃度の異なる3種の培養骨を作製する。beta-TCPのみを移植した群、および無処置群をコントロールとする。クラウン系ミニブタ(6ヶ月齢雄、n=8)の頭蓋骨にφ10 mmの全層骨欠損を1匹につき2ヶ所作製し、3種の再生骨を欠損部に移植する。術後2カ月間奇形腫形成を観察し、安楽死後、マイクロCT撮影および組織学的評価を行う。組織染色はHE染色、ALP染色などを行い、マイクロCT所見とあわて骨再生を評価し、再生骨の作製に用いる細胞濃度を設定する。樹立したミニブタiPS細胞にヒトiPS細胞で報告されている中胚葉系細胞への分化誘導培養を実施したが初期中胚葉細胞マーカーであるBrachyuryの発現増加はみられたものの、Nanog遺伝子は高いレベルで発現を維持していた。また中胚葉細胞表面マーカーであるCD326(-)/CD56(+)細胞の割合も10%未満であった。樹立した細胞株はヒトiPS細胞で報告されている導入遺伝子(c-Myc, Klf4, Oct3/4, Sox2)のサイレンシングが生じておらず、導入遺伝子が高いレベルで発現を維持しており、初期化状態へ移行するバイアスが恒常的にかかっていることが原因でないかと推察している。当初の計画では、平成25年度にミニブタiPS細胞由来の中胚葉系細胞分化誘導を確立し、平成26年度に頭蓋骨欠損ヌードラットに移植予定であった。しかしミニブタiPS細胞の分化能がヒトおよびマウスiPS細胞に比べて低いことが確認され、分化誘導法の最適化に時間を要したため平成26年度に購入予定だったヌードラットの購入数が減少した。2013年にMBD3遺伝子がiPS細胞への初期化を阻害する主要な因子であり、MBD3遺伝子を抑制することでiPS細胞の樹立効率をほぼ100%に向上できることが報告された。
大学での情報教育におけるリテラシー評価の標準化

本研究では,情報リテラシーを信頼性や妥当性をもって評価できる方法を求めるために,「主観調査」,「客観テスト」,「実技テスト」という3つの評価方法の関係や特徴を明らかにする中で,評価方法の標準化を検討した.その結果,「主観調査」とマッチングが良く適切な「客観テスト」,「実技テスト」とはある程度の有意な相関があることが分かった.したがって,簡便性・即時性が必要とされる場面では,「主観調査」が有効であることを示した.本研究では,情報リテラシーを信頼性や妥当性をもって評価できる方法を求めるために,「主観調査」,「客観テスト」,「実技テスト」という3つの評価方法の関係や特徴を明らかにする中で,評価方法の標準化を検討した.その結果,「主観調査」とマッチングが良く適切な「客観テスト」,「実技テスト」とはある程度の有意な相関があることが分かった.したがって,簡便性・即時性が必要とされる場面では,「主観調査」が有効であることを示した.本研究では,情報リテラシーやコンピュータリテラシーを信頼性や妥当性をもって評価できる方法を求めるために,「主観調査」,「客観テスト」,「実技テスト」という3つの評価方法の関係を明らかにすると共に,それぞれの特微を分析する.上記で,「主観調査」とは,情報リテラシーやコンピュータリテラシーの到達度の程度を,学生の主観で回答する意識調査アンケートを指す.次に,「客観テスト」は,それらリテラシーを正答が一義的に決まる客観的な問題で評価するテストを指す.最後に,「実技テスト」は,実際にコンピュータを操作させ,データを処理させる中で情報に関わる問題解決を行い,リテラシーを測るテストである.これら評価方法を用いて,学生の能力を測定し,3つの評価方法の関係を明らかにすると共に,それぞれどのような特徴があるのか議論する.そして,3つの評価手法とレディネス調査や,教員が学期末に行う成績評価の関連を明確にする中で,学生の実態把握や単位を与える際の評価法の標準化に資する.平成20年度は,学生の情報リテラシーやコンピュータリテラシーを測定するための「主観調査」,「客観テスト」をレディネス調査の中で実施し,分析を行った.その結果,主観調査と客観テストには弱い相関があることが分かると共に,学生のリテラシーを良く識別できる問題では,その相関が高くなることが推察された.したがって,主観調査がリテラシー評価に全く,用を成さないことはないこと,また,学習者の声を聞くことは教育を実践する上で基本であることから,客観テストだけではなく主観調査も重要であることを主張した.本研究では,情報リテラシーやコンピュータリテラシーを信頼性や妥当性をもって評価できる方法を求めるために,「主観調査」,「客観テスト」,「実技テスト」という3つの評価方法の関係を明らかにすると共に,それぞれの特徴を分析する.上記で,「主観調査」とは,情報リテラシーやコンピュータリテラシーの到達度の程度を,学生の主観で回答する意識調査アンケートを指す.次に,「客観テスト」は,それらリテラシーを正答が一義的に決まる客観的な問題で評価するテストを指す.最後に,「実技テスト」は,実際にコンピュータを操作させ,データを処理させる中で情報に関わる問題解決を行い,リテラシーを測るテストである.これら評価方法を用いて,学生の能力を測定し,3つの評価方法の関係を明らかにすると共に,それぞれどのような特徴があるのか議論する.そして,3つの評価手法とレディネス調査や,教員が学期末に行う成績評価の関連を明確にする中で,学生の実態把握や単位を与える際の評価法の標準化に資する.平成21年度は,授業評価アンケート中の項目「問10」,「問11」の「文書編集」と「表計算」に関して,それぞれ61.6%,60.8%の学生が身に付いた(5.強くそう思う+4.そう思う)と答えており,レディス調査では,関連項目の多くで5割を超えていなかったことを考えると,主観評価としては向上が見られるが,これは,実際の学生の実技を伴う課題の結果と符合していた.また,TEの項目別平均値とSEのそれとを比較すると,「問9」「難易度」を除く11項目中9項目で,TEの方が高く,教員の方が授業に関して肯定的に捉えていることが分かった.以前の本研究による調査結果から,教員の主観評価と成績評価には連関があることが分かっているから,今後は,教員の主観評価と学生の主観評価の間の相関を調べたい.本研究では,情報リテラシーを信頼性や妥当性をもって評価できる方法を求めるために,「主観調査」,「客観テスト」,「実技テスト」という3つの評価方法の関係とその特徴を明らかにする.上記で,「主観調査」とは,情報リテラシーの到達度の程度を,学生の主観で回答する意識調査アンケートを指す.次に,「客観テスト」は,それらリテラシーを正答が一義的に決まる客観的な問題で評価するテストを指す.最後に,「実技テスト」は,実際にコンピュータを操作させ,データを処理させる中で情報に関わる問題解決を行い,リテラシーを測るテストである.これら評価方法を用いて,学生の能力を測定し,3つの評価方法の関係を明らかにすると共に,それぞれどのような特徴があるのか議論する中で,評価方法の標準化に資する.平成22年度は,情報リテラシーに関わる「主観調査」と「客観テスト」,「実技テスト」の間の相関関係を調べた.

その結果,情報リテラシー全般に関わる「主観調査」と「実技テスト」の間には,有意な相関が見られなかったが(r=.337,n.s.),コンピュータリテラシーを測る「主観調査」の項目に焦点化して再分析を行ったところ有意な相関が見られた(r=.385,p<.05).これは「実技テスト」がコンピュータリテラシーを必要とする内容であったことを勘案すると,学習者の持っている操作活動を含んだコンピュータリテラシーを予測する指標として,「主観調査」は調査項目の内容を吟味すればある程度有効であることを示唆している.更に,永井(2007)によれば,「客観テスト」の項目を吟味すれば,「主観調査」と「客観テスト」の間にも弱い相関があることが分かっている.したがって,以上まとめると,「主観調査」を行えば,ある程度の情報リテラシーに関わる学生の知識・技能を把握することができるので,例えば「主観調査」のよさである簡便性や即時性が求められる場面では,その利用価値が高いと考えられる.
薬剤を服用している地域自立高齢者の口腔の健康と主観的幸福感に関する研究

調剤薬局と地域の自立高齢者の調査を行った.安静時唾液分泌能低下者は,32.5%(調剤薬局),52.3%(地域)で,唾液分泌能低下に関連する因子は,女性(調剤薬局と地域),抗うつ薬服用(調剤薬局),9剤以上の多剤服用(地域)であった.唾液分泌能と客観的指標であるEILERSの口腔アセスメント(OAG)(合計24点)とには関連があった.薬剤服用と唾液分泌能低下,唾液分泌能低下と口腔の健康状態低下の関連性が示された.調剤薬局と地域の自立高齢者の調査を行った.安静時唾液分泌能低下者は,32.5%(調剤薬局),52.3%(地域)で,唾液分泌能低下に関連する因子は,女性(調剤薬局と地域),抗うつ薬服用(調剤薬局),9剤以上の多剤服用(地域)であった.唾液分泌能と客観的指標であるEILERSの口腔アセスメント(OAG)(合計24点)とには関連があった.薬剤服用と唾液分泌能低下,唾液分泌能低下と口腔の健康状態低下の関連性が示された.本研究の目的は、地域高齢者の口腔の健康(特に口腔乾燥・唾液分泌)と主観的幸福感との関連、及び薬の使用状況(薬の数や種類)と唾液分泌能との関係を明らかにし、唾液分泌能の低下している者を簡便な問診によりスクリーニングする方法を確立することにある。研究方法:本調査は、平成20年12月-平成21年3月に実施した。対象者は、札幌市内および近隣市の調剤薬局で処方薬を受け取りに来た6574歳の要介護認定を受けていない高齢者200名を予定としたが、調査地域を商業地にある調剤薬局としたため、対象者はいるが、説明の段階で地域に歯科医院が多いので歯科治療中や歯科に定期的に受診している、口腔内を見せるのは恥ずかしいという理由のため協力者が42名であった。実績:対象患者は調剤薬局から処方を受けている健康な前期高齢者42名。調査項目としては、問診により基本属性、薬剤情報(過去3か月分の使用薬剤名、使用量、使用方法)を調べた後、安静時唾液(吐唾法15分)を測定し、唾液分泌量と薬剤の服用状況との関係を横断的に分析した。結果:平均年齢:71.14±4.41歳(男12名、女30名)。(1)唾液分泌量と薬の合計には有意な関連はなかった。(2)唾液分泌の低下には抗うつ薬・四環系が関連し、唾液分泌の増加には高血圧薬・Ca拮抗剤が有意に関連していることが示唆された。今後(平成21年度)は、さらにデータを加えて、別の地域を対象として同様の方法により、継続して研究をする予定である。【研究の目的】地域高齢者の口腔の健康(特に口腔乾燥・唾液分泌)と主観的幸福感との関連、及び薬の使用状況(薬の数や種類)と唾液分泌能との関係を明らかにし、唾液分泌能の低下している者を簡便な問診によりスクリーニングする方法を確立することである。【研究方法】本調査は、北海道の苫前町において,役場および苫前町立歯科診療所の協力のもとに行われた.65歳以上の介護認定を受けてない高齢者1185名に,事前に調査の主旨の説明,歯科検診の日時,場所の案内およびアンケートを郵送し,調査への協力を依頼したところ,140名(11.8%)が参加した.平成21年7月21日7月30日,町内の15ヵ所の集会所や公民館において8日間かけて実施された.このうち,欠測データ及び85歳以上のものを除外した128名(平均年齢:75.06±5.50歳,性別:男性73名,女性55名)を分析対象とした.【結果】唾液分泌量平均値は,2.27±2.25(0.00-13.50)ml/15分であった.唾液分泌低下群は67名(52.3%)にみられ,男性43.8%,女性63.6%(P<0.05)と性差を認めた.使用薬剤数と唾液分泌量には有意な相関関係があった.唾液分泌低下群は,薬剤数12剤で50.0%,35剤41.7%,68剤50.1%,9剤以上75.0%で,9剤未満と9剤以上との比較で,唾液分泌能低下群の割合に有意な関連がみられた(P<0.05,χ^2検定).唾液分泌の低下の有無を従属変数,年齢,性別,飲酒,喫煙の有無,現病歴の有無,薬剤数(9剤未満,9剤以上)を独立変数とし,多重ロジスティック解析を行ったところ,性別(オッズ比2.63,P<0.05)と薬剤数(オッズ比3.10,P<0.05)が有意に関連していた.【まとめ】安静時唾液分泌能低下群は約半数にみられ,女性でその割合が高かった.使用薬剤数と安静時唾液分泌量との間には負の相関があったが,安静時唾液分泌能低下群の頻度は,9剤以上で有意に高くなることが,明らかになった.唾液分泌能低下が口腔の健康状態にどのような影響を及ぼすかを今後検討する必要がある.
無臭チオール・スルフィドの開発とその有機反応への応用

グリーンケミストリーに分類できる「無臭チオール・スルフィドの開発とその有機反応への応用」と題した研究を行い、以下の成果を得た。1)新規無臭ボラン錯体の開発:汎用されているボランジメチルスルフィド錯体の問題点は反応処理後に発生するジメチルスルフィドが悪臭を発することであった。開発したDod-S-Me及びMMS(メチルモルフォリノヘキシルスルフィド)をボラン担体として活用することにより、この問題点を解決した。すなわち、ヒドロホウ素化反応やカルボニル化合物の還元反応の処理後に悪臭を発することが無くなり、従来のボラン錯体に替わる扱いやすい無臭反応剤として、その有用性を高めることができた。2)新規無臭有機セレン反応剤・ビス(4-トリメチルシリルフェニル)ジセレニドの開発:カルボニル基のα位への二重結合導入反応など多彩な反応に利用されているジフェニルジセレニドはセレン特有の悪臭を有することが欠点となっていた。その為、これに替わりうる新規無臭有機セレン反応剤ビス(4-トリメチルシリルフェニル)ジセレニドを開発した。この新規反応剤は、従来の悪臭のあるジフェニルジセレニドと同等以上の反応性・汎用性があり、且つ無臭という長所を有している。すなわち、無臭有機セレン反応剤を世界に先駆けて創製することに成功した。3)新規無臭フェニルメタンチオール及びベンゼンチオール誘導体の開発とチオ糖類の合成:パラ位にオクチルオキシ基を導入することによりこれらチオール類を無臭化できることを明らかにした。また、これを悪臭のあるフェニルメタンチオールの無臭代替反応剤として活用し、チオ糖類の合成を行った。4)新規無臭1,3-プロパンジチオール誘導体の開発:1,3-プロパンジチオールの2位にドデシル基を導入することによりジチオールが無臭になることを見出し、無臭ジチオール反応剤の開発に初めて成功した。1)無臭1-ドデカンチオールの開発脂肪族直鎖1-チオールを入手或いは合成しそれらの臭いを系統的に初めて比較した(6段階臭気強度表示法)結果、汎用されているエタンチオール(EtSH、炭素数2)は悪臭を有しているが、1-ドデカンチオール(Dod-SH、炭素数12)が無臭であることを見出した。これを我々が以前開発したAlX_3-EtSHによるエーテル、エステル類などの脱アルキル化反応において、Dod-SHをEtSHの無臭代替品として応用した。AlX_3-Dod-SHによる反応は従来の反応と同等に高収率で進行することが分かった。この無臭新反応剤は、従来の悪臭を有していた反応剤に比べて大変使いやすく、実験者の作業環境を大きく改善することに貢献した。また無臭ベンジルメルカプタン(P-Heptylphenylmethanethiol)の開発にも成功した。2)トリメチルシリル基の無臭化効果の発見(TMSBM、TMSBTの開発)ベンジルメルカプタンとベンゼンチオールの新しい無臭代替品として、4-トリメチルシリルフェニルメタンチオール(TMSBM)と4-トリメチルシリルベンゼンチオール(TMSBT)を開発した。ベンゼン環上にトリメチルシリル基を導入することによる無臭化効果は顕著であることを見出した。これらの無臭チオール類の開発は、基質に付加或いは置換反応によって導入後トリフルオロ酢酸で処理(protodesilylation)することにより、フェニルメチルチオ基或いはフェニルチオ基を悪臭のしない反応条件で基質に導入することを可能にした。3)本年度の研究計画に先行する研究成果として、悪臭のジメチルスルフィドの無臭代替品ドデシルメチルスルフィド(Dod-S-Me)、メチル6-モルホリノヘキシルスルフィド(MMS)等を開発することができた。詳細については次年度報告する。前年度の研究において見出した無臭チオール(1-dodecanethiol)にヒントを得て、各種アルキルメチルスルフィドを合成し、その臭気強度を調べた結果、ドデシルメチルスルフィド(Dod-S-Me)が無臭であることを見出した。これを悪臭のあるジメチルスルフィド(DMS)の無臭代替品として使用し、無臭Corey-Kim酸化法を開発した。また、フェノールのメチルエーテル、メチルエステルの脱メチル化反応およびオゾン分解反応の還元的後処理法に適用した。次に、Dod-S-Meに対応するスルホキシド(Dod-S(O)-Me)を合成し、無臭Swern酸化法を開発した。いずれに於いても、従来法が有する欠点(悪臭)を克服した環境調和型の新しい方法を提供することができた。上記の無臭硫黄反応剤Dod-S-Me、Dod-S(O)-Meは長鎖アルキル基を持っている為、比較的沸点が高く、反応処理後の生成物の精製にクロマトグラフィーが必要であった。これは実験室レベルの反応には適しているが大量スケールの工業的反応には不向きであった。この欠点を克服するためにモルホリンを導入した新無臭硫黄反応剤(メチルモルホリノヘキシルスルフィド(MMS)及びメチルモルホリノヘキシルスルホキシド(MMSO)を設計した。これらを活用して第二世代の無臭Corey-Kim and Swern酸化法を開発した。この新方法では生成物が分液操作のみで高収率で得られ同時に反応剤のMMSも高収率で回収でき且つ再利用ができる。

グリーンケミストリーに分類できる「無臭チオール・スルフィドの開発とその有機反応への応用」と題した研究を行い、以下の成果を得た。1)新規無臭ボラン錯体の開発:汎用されているボランジメチルスルフィド錯体の問題点は反応処理後に発生するジメチルスルフィドが悪臭を発することであった。開発したDod-S-Me及びMMS(メチルモルフォリノヘキシルスルフィド)をボラン担体として活用することにより、この問題点を解決した。すなわち、ヒドロホウ素化反応やカルボニル化合物の還元反応の処理後に悪臭を発することが無くなり、従来のボラン錯体に替わる扱いやすい無臭反応剤として、その有用性を高めることができた。2)新規無臭有機セレン反応剤・ビス(4-トリメチルシリルフェニル)ジセレニドの開発:カルボニル基のα位への二重結合導入反応など多彩な反応に利用されているジフェニルジセレニドはセレン特有の悪臭を有することが欠点となっていた。その為、これに替わりうる新規無臭有機セレン反応剤ビス(4-トリメチルシリルフェニル)ジセレニドを開発した。この新規反応剤は、従来の悪臭のあるジフェニルジセレニドと同等以上の反応性・汎用性があり、且つ無臭という長所を有している。すなわち、無臭有機セレン反応剤を世界に先駆けて創製することに成功した。3)新規無臭フェニルメタンチオール及びベンゼンチオール誘導体の開発とチオ糖類の合成:パラ位にオクチルオキシ基を導入することによりこれらチオール類を無臭化できることを明らかにした。また、これを悪臭のあるフェニルメタンチオールの無臭代替反応剤として活用し、チオ糖類の合成を行った。4)新規無臭1,3-プロパンジチオール誘導体の開発:1,3-プロパンジチオールの2位にドデシル基を導入することによりジチオールが無臭になることを見出し、無臭ジチオール反応剤の開発に初めて成功した。
キャピラリー/マイクロチップ電気泳動の特性解明および応用

本研究の目的は、キャピラリーやマイクロチップ中で行う電気泳動の特性を明らかにし、種々の物質の分析へ応用することにあった。平成11年度平成13年度の3年間にわたる研究により、これらの目的のうちキャピラリー電気泳動(CE)の特性解明と応用の部分については,期待以上の成果を上げることができた。一方、マイクロチップ電気泳動(ME)は本研究開始当初、ゲノム解析の領域を除き、未だ発展途上にあったが、本研究により糖質分析への展開を中心に新技術の導入をはかった結果、大幅な進展をみることができた。これらの成果の概要をまとめると、下記のとおりである。1,種々の分離モードを開発した。2,キャピラリー内での誘導体化法を開発し、体系化した。3,物質間相互作用解析法を開発し、微量試料による結合定数測定を可能にした。4.特異的認識能をもつ生体内物質を探索し、生理活性が期待できる種々の物質を見出すことができた1,ガラス、石英、有機ポリマー等のマイクロチップとシングルスポットレーザー励起蛍光検出により秒単位の超微量高速分析を実現した。2,汎用性のある全チャンネル一斉紫外部吸収法の可能性を探った。3.生体成分分析に有効に利用できることを明らかにした。本研究の目的はキャピラリーやマイクロチップ中で行う無担体電気泳動の特性を明らかにし、種々の物質の分析へ応用することにあるが、本年度は無担体キャピラリー電気泳動における特性研究を中心に進め、次の成果を得ることができた。1.分離モードの研究:本研究期間以前から行っていた研究をさらに進め、主に糖質を対象として種々の分離モード(バイオアフィニティー電気泳動、水素イオン結合電気泳動、錯体形成ゾーン泳動/イオン相互作用複合モードなど)を開発した。2.インキャピラリー誘導体化:キャピラリー内腔を反応の場として用い、生成物を直ちに分析するキャピラリー電気泳動特有の分析法を開発した。3.物質間相互作用解析法の開発:泳動液に種々の物質を添加し、これと相互作用する物質を試料として導入し、試料の移動度の添加物濃度に対する濃度依存性を観測することにより相互作用を解析する新しい方法を確立し、さらに多成分解析へと発展させた。また、マイクロチップ電気泳動に関しては、顕微鏡下でレーザーを光源として高感度検出する方式について、装置のセットアップを行い試験的に運転を開始できる程度まで進展させたが、マイクロチップの作成に関しては今後乗り越えなければならない問題も多いので、来年度の研究の展開に期待したい。研本研究の目的はキャピラリーやマイクロチップ中で行う無担体電気泳動の特性を明らかにし、種々の物質の分析へ応用することにあるが、本年度は昨年度実施した無担体キャピラリー電気泳動の特性研究の結果を基にして、キャピラリー電気泳動の応用研究を進めた。また、超高速分析を目指してマイクロチップ泳動の研究を行い、基礎技術を確立することができた。これらの研究の主な内容は下記のとうりである。1生体成分の微量超微量一斉分析:糖質を高感度検出可能な誘導体へ変換する簡便で定量的な方法として、1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone法やN-methylglycamine-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole法を確立し、これらを用いて糖タンパク質糖鎖の微量超微量一斉分析を行った。2化学反応を伴う分離分析:キャピラリー電気泳動の単相性を生かしてキャピラリー内で化学反応や酵素反応を行うと同時に生成物を分析するという、特徴のある分析法を確立した。3物質間相互作用の研究:昨年の研究を進展させ、さらに基礎理論を展開するともに、糖鎖-タンパク質相互作用に焦点を当てゝ解析を行った。また、生体試料中に存在し相互し合う物質をキャピラリー電気泳動により特異的に取り出す方法を開発し、血清中の糖鎖結合性タンパク質の探索等を行った。4単一細胞分析:単一細胞レベルでの赤血球の分析に成功し、さらに分離パターンを細胞表層の糖鎖の存在と関連づけて考察した。5マイクロチップ電気泳動装置の試作と応用:マイクロチップを構築し顕微鏡下でレーザーを光源として高速分離/高感度検出する方式について装置を試作し、糖分析等へ適用することができた。

一方、石英チップを用い紫外部検出による高速ルーティン分析する方式についても、島津基盤研究所の協力を得てほぼ満足できる分析を行うことができるまでに到達することができた。本研究の目的は、キャピラリーやマイクロチップ中で行う無担体電気泳動の特性を明らかにし、種々の物質の分析へ応用することにある。過去2年間の研究により、これらの目的のうちキャピラリー/マイクロチップ電気泳動の特性解明の部分については、期待以上の成果を上げることができたが、それらの成果の中で分子間相互作用解析への応用については特に目立つ進展があったので、本年度はこの応用研究の超微量化を進め、生体内分子間認識の研究へと発展させることができた。一方、装置や技術面においてキャピラリー電気泳動に関する部分はすでに完成の域にあるが、マイクロチップ電気泳動はゲノム解析の領域を除き未だ発展途上にある。そこで本年度はマイクロチップ電気泳動の高度な装置化と、新しい領域、特に糖質分析への展開を中心に研究を続行した。これらの成果をまとめると、下記のとおりである。1レーザー励起蛍光検出キャピラリー電気泳動による分子間相互作用解析の超微量化:nMレベルの低濃度で糖タンパク質糖鎖と機能性タンパク質の間の相互作用を解析することができた。2シングルポイントレーザー励起検出方式マイクロチップ電気泳動による糖分析法の開発:迅速簡便な方法により糖質試料を蛍光標識してマイクロチップ電気泳動分離し、レーザー励起蛍光検出することにより、femtomolで秒単位の超微量高速糖質分析を達成することができた。3全流露同時紫外部吸収検出方式によるマイクロチップ電気泳動の可能性についての検討:レーザー励起蛍光検出においては検出波長が特定されるため適用範囲が限定されるので、これを克服できる汎用検出法として全チャンネル紫外部吸収を同時検出する方式についても検討し、1-フェニル-3-メチル-5-ピラゾロンにより誘導体化すれば高速で糖質の簡易分析を行うことができることを明らかにした。
パルマ藻と原始型中心珪藻との比較による珪藻の進化機構の探究

珪藻は、全地球の炭酸固定の20%以上を担う海洋で最も重要な微細藻類であるが、その起源・繁栄機構は依然不明である。我々は培養の成功により、珪藻同様シリカの殻を持つパルマ藻が非常に限られた海域で生存しながらも珪藻と極近縁で共通祖先を持つことを明らかにした。本研究では、珪藻の起源・繁栄機構の解明にとって格好の対照生物であるパルマ藻の生態学・生理学・藻類学・ゲノミクス・生物地球化学による多面的な解明を目的とし、パルマ藻・珪藻間の系統関係、葉緑体・ミトコンドリアゲノム、亜寒帯域における個体群維持機構、パルマ藻のシリカの殻形成機構、パルマ藻の生活史、特異的なバイオマーカー(分子化石)の解析を行った。珪藻は微細藻類ながら熱帯雨林と同等の炭酸固定を行い、海洋で最も多様で重要な一次生産者であるが、その起源・繁栄機構は依然不朋である。我々は2年前に、珪藻同様シリカの殻を持つ微細藻類で培養不能なためその生物学的特性が全く未知であったパルマ藻の培養に発見以来30年後に世界で初めて成功し、この藻類が非常に限られた海域で生存しながらも珪藻と極近縁で共通の祖先を持つことを明らかにした。本研究は、珪藻の進化の鍵を握るパルマ藻と原始型かつ全球的に卓越する中心珪藻を対象に1.ゲノム解析、2.生理生態学的解析、3.生物地球化学的解析を統合して全貌を明らかにし、両者の相互比較により珪藻の出現から現在の繁栄にいたる進化過程の解明を目的とする。本年度は、1.ゲノム解析については、DAPI染色法によりパルマ藻T.laevisのDNA含量を約80Mbpと推定し、大量培養により得た試料からゲノム解析用DNAを超遠心法により調製した試料を,次世代シーケンサRoche454によりシーケンシングを開始した。また,比較ゲノムを利用したタンパク質のN末端同定の評価を行う方法を考案した。2.生理生態学的解析については、人工海水培地を用いた培養系を用いてリン、硝酸塩、ケイ酸塩濃度とパルマ藻T.laevisの増殖との関係を解析し、パルマ藻の増殖における栄養塩要求性を明らかにした。パルマ藻の生育環境については、親潮域および親潮黒潮混合域におけるパルマ藻群集の種組成および現存量の季節変化を解析し、本海域におけるパルマ藻優占種を特定し、パルマ藻群集の季節的動態を明らかにした。3.生物地球化学的解析については、パルマ藻固有のバイオマーカーの探索のため、パルマ藻T.laevisの培養株を対象とした脂質分析を実施し、多不飽和炭化水素、多不飽和脂肪酸、ステロイドを同定し、固有で未知の高分子量の極性脂質を複数検出した。シリカの殻を持ち珪藻に極近縁のパルマ藻は、珪藻の繁栄機構と進化過程を解明する上で格好の対照生物である。本研究では、生態学・生理学・藻類学・ゲノミクス・生物地球化学からパルマ藻の多面的な解明を目的とし、本年度は以下の点を明かにした。パルマ藻・ボリド藻・珪藻間の系統関係:パルマ藻と珪藻の姉妹群のボリド藻との複数株間での分子系統解析により、パルマ藻とボリド藻は同じクレードを形成し珪藻の姉妹群であること。さらにパルマ藻の葉緑体とミトコンドリアのゲノムの解読により、各ゲノムの遺伝子が珪藻の遺伝子と非常に相同性が高く、各ゲノム構造も珪藻と酷似することを明らかにした。個体群動態:亜寒帯でパルマ藻は、主に冬から春の低水温期に有光層中で増殖し個体群を拡大すること。夏から秋にかけ成層化により表層水温が増殖不可能な15°Cを越えると、表層から消失し水温15°C以下の水温躍層下の亜表層で生残すること。秋から冬にかけ水が混合し低水温期に入ると再び増殖を開始することをフィールド調査により明らかにした。シリカの殻形成機構:パルマ藻は珪藻と異なり、シリカ欠乏下でも無殻の細胞のまま増殖でき、珪酸塩存在下でシリカの殻を形成すること。細胞内部で形成されたシリカのプレートが細胞外に送り出され、細胞表面で規則正しく配置され特徴的なシリカの殻が形成されることを培養実験により明らかにした。生活史:パルマ藻は、シリカの殻を持つ通常のステージとボリド藻に類似した鞭毛細胞ステージを生活史に持つことを培養実験により明らかにした。この生活史はシリカの殻のステージと鞭毛ステージ両者を持つ点で、原始的珪藻である中心珪藻の生活史と類似性を持つ。バイオマーカー:パルマ藻は原始的な中心珪藻と共通の脂質バイオマーカーを持つ一方、比較的高分子量のパルマ藻固有の脂質バイオマーカーを持つことを生物地球化学的解析により明らかにした。

珪藻は微細藻類ながら熱帯雨林と同等の炭酸固定を行い、海洋で最も多様で重要な一次生産者であるが、その起源・繁栄機構は依然不明である。我々は近年、珪藻同様シリカの殻を持つ微細藻類で培養不能なためその生物学的特性が全く未知であったパルマ藻の培養に発見以来30年後に世界で初めて成功し、この藻類が非常に限られた海域で生存しながらも珪藻と極近縁で共通の祖先を持つことを明らかにした。本研究は、珪藻の進化の鍵を握るパルマ藻と原始型かつ全球的に卓越する中心珪藻を対象に1.ゲノム解析、2.生理生態学的解析、3.生物地球化学的解析を統合して全貌を明らかにし、両者の相互比較により珪藻の出現から現在の繁栄にいたる進化過程の解明を目的とする。本年度は、1.ゲノム解析については、パルマ藻Triparma laevisのゲノムアセンブリから,葉緑体ゲノムを含むscaffoldを取り出し,PCRを使って互いの結合部の配列と,内部の未解読部分の配列をそれぞれ増幅したうえで,Sanger法により配列を決めた。これにより,葉緑体ゲノムの配列の全体をきめた。2.生理生態学的解析については、パルマ藻の珪酸質外被形成機構について、培地中のケイ酸塩濃度の調節により外被形成を制御しながら、走査型顕微鏡と透過型顕微鏡を用いた形態学的解析を行った。3.生物地球化学的解析については、パルマ藻固有のバイオマーカーの探索のため、パルマ藻(T. laevis)の培養株を用いて固有の脂質バイオマーカー成分の検出を行った。その結果、パルマ藻バイオマーカーとして,C21:6 n-アルケンや、C20:5、C22:6脂肪酸、C27-C29ステロイドを同定した。これらは珪藻の培養株の研究においても検出例のある化合物であり、とくにステロールにおいてはC29 β-シトステロールが圧倒的に卓越することが明らかとなった。ゲノム解析、生理生態学解析、生物地球化学的解析全てにおいて順調に進展しており、着実に成果が得られている。さらには予想以上の新たな知見を得ることができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。ゲノム解析についてはパルマ藻の葉緑体ゲノムの解読が終了し、生理生態学解析については、パルマ藻の殻形成過程の詳細が電子顕微鏡観察により明らかになり、生物地球化学的解析については、パルマ藻特有のバイオマーカーの候補として高分子両極性分子の脂質マーカーが検出できた。以上から、ゲノム解析、生理生態学的解析、生物地球化学的解析ともに順調に進展しており、着実に成果が得られていると判断する。ゲノム解析については、引ぎ続き次世代シーケンサによるパルマ藻のゲノムDNA、cDNAのシーケンシングを行い、葉緑体、ミトコンドリアゲノムの解析を進める。生理生態学的解析については、新に培養株を確立したT.laevis以外のパルマ藻3種を対象に栄養要求性、増殖特性の解析を進める。生物地球化学的解析については、検出された複数の未同定の高分子脂質の構造決定を中心に進める。ゲノム解析については、これまでに次世代シークエンサーにより決定されたパルマ藻ゲノムの全塩基配列データを用いて、引き続きのミトコンドリアゲノムの解析を進め,さらに核ゲノムの解析を進める。得られた知見とこれまでのゲノム解読で得られている珪藻の知見との比較検討を行う。生理生態学的解析については、さらにパルマ藻の珪酸質外被形成機構を進め、パルマ藻の外被形成を伴う分裂過程を明らかにし、珪藻の被殻形成過程と比較する。
Extracellular matrixの酵素活性制御機序

ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の培養系を用い、細胞をfibrin,PMATNF,ILー1で刺激した場合の細胞上清液(CM),細胞溶解液(CL),およびECMの3画分のtーPA,PAIー1,およびtーPA・PAIー1抗原量、tーPAによPA活性を測定し、ECMでの酵素学的機能の特微を明らかにした。PMA刺激(500nM)でCMにはcontrolに比べ約15倍量のtーPA抗原が放出されたが、fibrin,TNF(50U/ml),ILー1(5U/ml)では有意な変動はなかったこの時CL,ECMのtーPA抗原量にも変動はなく、CMの約1/3のレベルであった。一方、fibrin刺激でCMのPAIー1原量はcontrolに比べ、約1/4に減少したが、PMA,TNF,ILー1でいずれも顕著な増加(1.8ー2.5倍)がみられた。この時CLでもCMと類似の刺激物質によるPAIー1の増減がみられたが、ECMではほどんど変動はなくCMの抗原量の約1/5のPAIー1蓄積量を示した。Enzymography法および合成基質法によりtーPA活性を測定したところ、CMとCLではPAIー1に対するtーPAの比率とtーPA活性とはいずれの刺激物質においても正相関を示した。すなわちtーPA/PAIー1比率が増加するに伴いtーPA活性も増加した。一方、ECMでは必ずしも相関はせず、ECMにおけるtーPAあるいはPAIー1の活性を制御する機構の存在が示唆された。各画分でのtーPA比活性(活性/抗原量)を算出するといずれの群でもECMではCMより高い値を示した。さらにtーPAの総活性(CM,CL,ECMの和)に占めるECMのtーPA活性はcontrol,fibーrin,PMA,TNF,ILー1で26,36,13,31,41%であり、CMの占める活性は同順に49,46,21,20,48%であった。このようにECMではtーPA,PAIー1抗原量がCMに比べて少ないにもかかわらず細胞周辺の総PA活性に占める割合は大きく、また生理活性物質刺激による総tーPA活性の変動にECMでのtーPA比活性が関与することから、ECMが細胞の酵素活性発現の場として重要な制御機能を有していると考えられる。
悪性骨腫瘍切除後処理骨ラットモデルを用いた付加処置による処理骨単独再建の確立

骨肉腫は若年者に好発する高悪性度骨腫瘍であり、罹患骨切除後殺細胞処理し再利用する再建法が使用される。処理骨再建は臨床使用されているにも関わらず、処理骨の吸収が問題となるが、効果改善を目的とする研究はされていない。本研究において処理骨骨髄内への付加処置を可能となるラット骨外固定モデルを作成する。骨新生促と骨吸収抑制のため、ゼラチンゲル溶解FGF-2骨骨髄内留置、処理骨骨髄内有茎血管移植、処理骨周囲人工的膜様構造物(unsintered hydroxyapatite and poly-L-lactide composites: u-HA/PLLA)被包、の3処置をラット処理骨モデルにて検討する。
画像処理による出羽国絵図の研究

1.出羽国絵図の年代推定と作成目的に関する研究出羽国絵図の所在を確認し,1点ずつ年代推定を行った結果,158点の出羽国絵図を確認することができた。この点数は国別現存点数として出羽国が最も多いことを示しており,また享保国絵図は作成していないとする従来の見解に対して,秋田藩と米沢藩では享保期にも国絵図を作成していたことなどを明らかにした。加えて,関連文書の所在確認を行い,小野寺淳は秋田藩・鶴岡藩・米沢藩における出羽国絵図の作成過程を解明した。2.出羽国絵図に描かれた空間表現の研究出羽国絵図を中心に,各地に残る国絵図との異同も視野に入れて,江戸幕府撰国絵図から信仰に関する表現や水上交通に関する表現の研究を行った。分担者の一人岩鼻通明は「国絵図にみる霊山の表現」を考察した。渡辺英夫は秋田藩の文書を収集し,「出羽国絵図にみる交通情報」について考察した。3.画像処理による出羽国絵図の研究国絵図は,現地調査の野図,下図,幕府伺いの内見図,幕府に納められた清絵図の控図,さらに様々な写本が現存している。これらの現存する絵図が,内見図か控図か,下図を踏襲しつつどの点を修正したかなどを明らかにするために画像処理を導入した。この結果,国境が微妙に異なる点などを明らかにし,作成過程を正確に把握することができた。今回の調査によって,はじめて出羽国絵図の全容が明らかになったが,いまだ写真版が少なく,主要な絵図の分析に止まった。この点を今後の課題としたい。日本国際地図学会第33回地方大会(仙台)平成10年10月24日に本研究の成果の一部として,小野寺淳は「出羽国絵図の作成過程ー鶴岡藩を中心にー」を発表した。出羽国絵図の撮影画像処理を行うための絵図を選定し,所蔵機関の撮影許可が得られた絵図のうち,以下の5点の絵図を撮影することができた。秋田県公文書館(秋田市)(1)秋田・仙北御絵図野書正保2年480×660cm(2)秋田領絵図享保14年280×440cm(3)御国絵図本図享保18年292×419cm致道博物館(山形県鶴岡市)(1)出羽-国之絵図(正保) 501×1108cm米沢図書館(1)羽後-円大絵図(正保) 621×547cm2.画像処理分析の経過絵図の輪郭の分析では,従来の研究では国境の異動が問題にされてきたが,本研究では海岸線にも異動がみられ,とりわけ船番所などの藩の施設が置かれた場所の海岸線に異動がみられることが明らかとなった。正保国絵図の幕府献上本の写本を比較すると,致道博物館本と米沢図書館本の正保国絵図は異なる点が多く,従来の年代推定を再検討する必要があることがわかった。このほか,文書や絵図の記載内容の分析のみでは知り得なかった問題点が明確になっており,次年度では絵図の作成過程に関するを考察を深めていく予定である。1.出羽国絵図に関する関連文書の収集など所在を確認し1点ずつ年代推定を行ってきた結果,昨年度よりさらに増加し,計158点の出羽国絵図を確認することができた。今年度は予算の関係で国絵図の撮影をすることができなかったが,山形大学附属博物館・山形県立博物館・秋田県立博物館などの厚意により,撮影済である小型の絵図のスライドを借用することができた。また,国絵図作成に関する関連文書の収集を行い,小野寺淳は鶴岡藩・米沢藩,渡辺英夫は秋田藩の文書を収集した。

予想以上に関連文書が現存しており,すべてを読み終えるまでには至らなかったが,貴重な成果を得ることができた。さらに,出羽国絵図との比較を行うために,阿波国絵図などの具体的研究成果を調査し,出羽国絵図の特色を把握するように留意した。2.画像処理による出羽国絵図研究のまとめ上記の調査を踏まえて,各地に残る国絵図との異同も視野に入れて,研究成果のとりまとめを協議した。これにより,小野寺淳は画像処理による出羽国絵図の作成過程を明らかにするとともに,鶴岡藩と米沢藩の関連文書の分析を行った。画像処理により,国絵図相互の異動が明瞭となり,作成の前後関係の推定や国境の研究に効果があった。また鶴岡藩旧蔵の関連文書の翻刻を終了した。岩鼻通明は国絵図に表現された霊山を中心に分析した。渡辺英夫は秋田藩の文書を収集し,出羽国絵図に描かれた交通情報を分析した。なお,秋田県立図書館の協力により,撮影した秋田県公文書館所蔵の絵図のCD-ROMを作成した。以上,役割分担に従い各自が研究を進め,研究成果報告書をまとめることができた。
ヒトＴＮＲＣ６ＡとＣＮＯＴ１による核内転写制御機構の解明と細胞癌化との関連

microRNA(miRNA)は、20塩基程度の短いRNAであり、細胞質において相補的な塩基配列をもつmRNAの分解や翻訳抑制を引き起こす。近年、miRNAは核内にも存在することが明らかとなったが、その機能は未解明な点が多い。miRNAは細胞質において、Argonaute(AGO)タンパク質に取り込まれ、さらに、GW182ファミリータンパク質を介してCCR4-NOT脱アデニル化複合体と相互作用する。当研究室では、ヒトGW182ファミリータンパク質のTrinucleotide repeat-containing gene 6A (TNRC6A)が、核-細胞質間シャトリングタンパク質であり、miRNA-AGO複合体を核内輸送することを明らかにした。本研究ではこれまで、質量分析法を用いて核内および細胞質TNRC6Aの相互作用因子を解析し、TNRC6Aが核内でCCR4-NOT複合体の一部と相互作用することを明らかにした。これにより、miRNAは核内でもCCR4-NOT複合体と協働した遺伝子発現制御を行う可能性が示唆された。本年度は、まず核内TNRC6A-CCR4-NOT複合体の標的遺伝子の解析を試みた。CCR4-NOT複合体は核内において、c-Myc等のプロモーター領域に結合し転写調節に働くことが報告されているが、miRNAやTNRC6Aの関与は不明である。そこで、TNRC6Aをノックダウンした際の標的遺伝子発現に与える影響を定量RCPで解析することで、既知の転写調節機構への関与を検証した。さらに、質量分析によりTNRC6Aのリン酸化残基が明らかとなった。細胞質と核でリン酸化パターンが異なることから、リン酸化がTNRC6Aの細胞質と核内における相互作用因子および機能を制御する可能性が考えられた。そこでAGOとの相互作用に与える影響に着目し、上記の仮説について検証した。AGOとの相互作用領域(GW-I、GW-II、GW-IIIドメイン)に着目し、質量分析で見出された各ドメイン内のリン酸化残基をそれぞれアラニン置換した変異体を作成した。細胞内おけるリン酸化状態を、SDS-PAGEを用いてタンパク質の泳動度の差異で確認した結果、GW-I、GW-IIドメインにそれぞれ1箇所、GW-IIIに2箇所のリン酸化残基を同定した。リン酸化がAGOとの相互作用に与える影響を免疫沈降実験により検証した結果、GW-IIドメインにおいて、リン酸化残基をアラニンに置換した変異体はAGOとの相互作用が減弱し、擬似リン酸化変異としてアスパラギン酸置換することで相互作用が回復した。さらに、RNAサイレンシング活性に与える影響についてルシフェラーゼレポーターアッセイにより検証した結果、GW-IIドメインのアラニン変異体はRNAサイレンシング活性が減弱し、アスパラギン酸変異により活性が回復した。また、GW-II断片を発現させた細胞を細胞質と核に分画し、SDS-PAGEで泳動度を調べた結果、GW-IIは主に細胞質側でリン酸化を受けていることが分かった。以上の結果より、GW-IIのリン酸化は、細胞質においてAGOとの相互作用およびRNAサイレンシングの増強に働くことが示唆された。核内TNRC6Aにより制御される遺伝子を同定するため、CRISPRシステムによるTNRC6ノックアウト細胞株の樹立、およびとそれらを用いたトランスクリプトーム解析の準備を進めている。ヒトGW182ファミリータンパク質は、TNRC6A、TNRC6B、TNRC6Cの3種のパラログが存在しており、これらは機能が重複していると考えられている。そのため、まずはTNRC6A、TNRC6B、TNRC6Cそれぞれのノックアウト細胞株を樹立しトランスクリプトームを比較することで、パラログ間における標的遺伝子の差異を明らかにする。さらに、核特異的に局在する変異型TNRC6Aまたは細胞質局在型のTNRC6A変異体をTNRC6Aノックアウト細胞に発現させることで、核内機能または細胞質機能のみを回復させる。これらのトランスクリプトームへの影響を比較することで、核内TNRC6Aによって制御される遺伝子の解析を行う。さらに、核内特異的な遺伝子については、CCR4-NOT複合体構成因子をノックダウンした際の遺伝子発現への影響等をしらべることで、CCR4-NOT複合体の関与を検証する。細胞質および核におけるTNRC6Aのリン酸化パターンの変化、およびそれに伴うRNAサイレンシング活性の変化が、どのような遺伝子発現の制御に関わっているのかを検討していく。

CCR4-NOT複合体は核内において、c-Myc等のプロモーター領域に結合し転写調節に働くことが報告されているが、miRNAやTNRC6Aの関与は不明である。そこで、TNRC6Aをノックダウンした際の標的遺伝子発現に与える影響を定量RCPで解析することで、既知の転写調節機構への関与を検証した。さらに、質量分析によりTNRC6Aのリン酸化残基が明らかとなった。細胞質と核でリン酸化パターンが異なることから、リン酸化がTNRC6Aの細胞質と核内における相互作用因子および機能を制御する可能性が考えられた。そこでAGOとの相互作用に与える影響に着目し、上記の仮説について検証した。AGOとの相互作用領域(GW-I、GW-II、GW-IIIドメイン)に着目し、質量分析で見出された各ドメイン内のリン酸化残基をそれぞれアラニン置換した変異体を作成した。細胞内おけるリン酸化状態を、SDS-PAGEを用いてタンパク質の泳動度の差異で確認した結果、GW-I、GW-IIドメインにそれぞれ1箇所、GW-IIIに2箇所のリン酸化残基を同定した。リン酸化がAGOとの相互作用に与える影響を免疫沈降実験により検証した結果、GW-IIドメインにおいて、リン酸化残基をアラニンに置換した変異体はAGOとの相互作用が減弱し、擬似リン酸化変異としてアスパラギン酸置換することで相互作用が回復した。さらに、RNAサイレンシング活性に与える影響についてルシフェラーゼレポーターアッセイにより検証した結果、GW-IIドメインのアラニン変異体はRNAサイレンシング活性が減弱し、アスパラギン酸変異により活性が回復した。また、GW-II断片を発現させた細胞を細胞質と核に分画し、SDS-PAGEで泳動度を調べた結果、GW-IIは主に細胞質側でリン酸化を受けていることが分かった。以上の結果より、GW-IIのリン酸化は、細胞質においてAGOとの相互作用およびRNAサイレンシングの増強に働くことが示唆された。核内TNRC6Aにより制御される遺伝子を同定するため、CRISPRシステムによるTNRC6ノックアウト細胞株の樹立、およびとそれらを用いたトランスクリプトーム解析の準備を進めている。ヒトGW182ファミリータンパク質は、TNRC6A、TNRC6B、TNRC6Cの3種のパラログが存在しており、これらは機能が重複していると考えられている。そのため、まずはTNRC6A、TNRC6B、TNRC6Cそれぞれのノックアウト細胞株を樹立しトランスクリプトームを比較することで、パラログ間における標的遺伝子の差異を明らかにする。さらに、核特異的に局在する変異型TNRC6Aまたは細胞質局在型のTNRC6A変異体をTNRC6Aノックアウト細胞に発現させることで、核内機能または細胞質機能のみを回復させる。これらのトランスクリプトームへの影響を比較することで、核内TNRC6Aによって制御される遺伝子の解析を行う。さらに、核内特異的な遺伝子については、CCR4-NOT複合体構成因子をノックダウンした際の遺伝子発現への影響等をしらべることで、CCR4-NOT複合体の関与を検証する。