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高効率スピン源の理論設計

高スピン偏極材料(ハーフメタル)や垂直磁気材料を用いた磁気抵抗素子の出力向上ならびに半導体へのスピン注入効率の改善を目的とし、第一原理計算に基づいて高効率スピン源を理論設計した。界面に至るまで高スピン偏極が保持されるハーフメタルと非磁性材料のヘテロ接合を提案することに成功し、界面での原子配列不規則化やスピン配列の熱揺らぎが、スピン依存伝導特性に及ぼす影響を解明した。外部電界による磁気異方性変調についても理論検討した。スピン流を利用した次世代エレクトロニクス素子を実現するためには、非磁性半導体もしくは非磁性金属にスピン偏極した電子を高効率に注入することが不可欠である。本研究課題は、電子状態の第一原理計算に基づいて高効率なスピン源を理論設計することを目的として、高スピン偏極強磁性体(ハーフメタル)を利用したヘテロ構造やスピンフィルタ機能を発現する量子ナノ構造におけるスピン依存電気伝導を第一原理計算する。ヘテロ接合界面や量子ナノ構造における原子配列と電子状態およびスピン依存電気伝導との関連を明らかにして、スピン源として有効な材料・構造を理論的に設計する。また、スピン軌道相互作用やスピン配列の熱ゆらぎがスピン源としての機能に及ぼす影響を理論的に検討すると共に、磁気異方性の電界制御を利用したスピン注入磁化反転の臨界電流密度の低減策を提案する。非磁性半導体または非磁性金属にスピン偏極した電子を高効率に注入するためのスピン源を、電子状態の第一原理計算に基づいて理論設計することを目的とした研究を実施し、以下の成果を得た。1.IV族半導体への高効率スピン源を探索するために、高スピン偏極ホイスラー合金とSiのヘテロ接合の電子状態を第一原理計算し、接合界面の原子配列と電子状態との相関を明らかにした。特に、ホイスラー合金とSiの(110)界面において高スピン偏極率が保持されることを初めて見出した。この成果は、Siへの高効率スピン注入を実現するための重要な知見を与えるものである。2.垂直磁気材料として知られる規則合金FePtと単結晶MgO障壁を用いたトンネル接合のスピン源としての有用性を検討するために、FePt/MgO/FePt(001)接合を透過するスピン依存伝導特性を第一原理計算し、接合界面の原子配列とトンネル電子のスピン偏極率との相関を明らかにした。特に、Fe終端界面を有するトンネル接合に対して、400%を越える巨大なトンネル磁気抵抗効比が得られる可能性を初めて指摘した。この成果は、FePt/MgO(001)接合が非磁性半導体または非磁性金属へのスピン源として利用する際に、スピン注入の高効率化を実現するための指針を与えるものである。3.非磁性金属表面における磁性金属ナノ構造を利用した高効率スピン源を探索するために、Pt(111)ならびに(001)表面上に積層したFe単原子層やFe単原子鎖の磁気異方性を第一原理計算し、これらのナノ構造におけるFe原子は面内磁化容易軸をもつが、Fe単原子層の上に更にPt原子層を積層することにより顕著な垂直磁気異方性が得られることを理論的に確認した。この成果は、表面ナノ構造において垂直磁化を実現するための指針を与えるものである。非磁性金属または半導体ヘスピン偏極電流を注入するための高効率スピン源を理論設計することを目標として、(1)ホイスラー合金/MgO接合における高スピン偏極界面の探索、(2)垂直磁気FePt/MgO/FePt(001)接合のトンネル磁気抵抗(TMR)比向上の検討、(3)一次元Fe鎖の磁気異方性に及ぼす電界効果の評価を行った。ハーフメタルと酸化物の接合界面に形成される電子状態を介したスピン反転トンネル過程が、温度上昇に伴うTMR特性劣化の要因と考えられる。そこでホイスラー合金/MgO接合界面の電子状態を計算した結果、CrAl終端Co_2CrAl/MgO(100)接合では界面電子状態が形成されないことを見出した。界面のCr磁気モーメントがCo_2CrAlバルクより約70%も増大していることが、界面における高スピン偏極率の保持と関係している。垂直磁気異方性を有するFePt/MgO/FePt(001)接合界面にFe原子層を挿入することにより、TMR比向上の可能性を検討した。膜厚の異なるFe原子層をMgO障壁の両側界面に挿入した場合のスピン依存伝導を計算したところ, 34原子層のFe原子層挿入によりFe/MgOIFe(001)接合と同程度の1000%を超える巨大なTMR比が得られた。電界による磁気異方性制御の可能性を理論的に検証するために、有効遮蔽媒質(完全導体極板)と一次元Fe鎖からなる系における磁気異方性の電界効果を評価した結果、磁気異方性エネルギーは電界に比例して変化することを見出した。電界によるs軌道電子の分布の変化と、s軌道とよく混成する3z^2-r^2軌道準位の変化が、磁気異方性に大きな影響を及ぼすことを明らかにした。

高効率スピン源を理論設計することを目標として、本年度は以下の研究成果を得た。1.ホイスラー合金を用いたCo_2MnSi/非磁性金属/Co_2MnSi三層構造の電子構造と電気伝導を第一原理計算した結果、多数スピン状態のコンダクタンスはCrスペーサに比べてAgスペーサの方が大きくなり、実験報告とよい対応が得られた。ホイスラー合金と非磁性金属のフェルミ面形状の整合性が、両者の伝導特性の違いをもたらしていることを明らかにした。2.ホイスラー合金Co_2MnSi/MgO接合界面における終端面構造を、X線吸収磁気円二色性(XMCD)測定と第一原理計算により決定した。Fe基板上に作製したCo_2MnSi/MgO薄膜のXMCDスペクトルから磁気総和則を用いてCoおよびMn原子のスピン磁気モーメントのCo_2MnSi膜厚依存性を求めた結果、膜厚が薄くなるにつれてスピン磁気モーメントが増大した。この実験結果はMnSi終端界面に対する計算結果とよい一致を示した。3.強磁性形状記憶合金Ni_2Mn_<1+x>Sn_<1-x>におけるマルテンサイト変態の発現機構を微視的に解明するため、硬X線光電子分光と第一原理計算を用いて、電子構造の組成・温度依存性を調べた。その結果、フェルミ準位直下にNi 3d(e_g)軌道からなる状態密度のピーク構造が存在しており、この状態に起因するJahn-Teller機構がこの系のマルテンサイト変態を引き起こしていることを明らかにした。4.垂直磁気異方性を示すPt/Fe/Pt(001)およびMgO/Pt/Fe/Pt(001)薄膜における磁気異方性エネルギーの電界依存性を第一原理計算した。両薄膜ともに磁気異方性エネルギーは電界に対して線形に変化し、金属表面から内向きの電界により減少する結果が得られた。MgOを接合することにより、磁気異方性の電界依存性は、MgOの比誘電率に比例して増大することを理論的に初めて明らかにした。1.ホイスラー合金を用いたトンネル磁気抵抗(TMR)素子は、TMR比の温度依存性が大きいために、室温でのTMR比の向上が課題とされている。そこで、ホイスラー合金/MgO接合界面における磁気モーメントの熱ゆらぎが、TMR特性に及ぼす影響を、第一原理電気伝導計算に基づいて理論的に検討した。その結果、界面付近のCo原子の磁気モーメントの熱ゆらぎが、この系のTMR比の著しい温度依存性の要因であることを明らかにした。ホイスラー合金を用いたTMR素子の室温での出力向上のためには、磁気異方性の大きな材料との積層構造を利用するなどの工夫が必要である。2.TMR素子の微細化に伴う磁化の熱ゆらぎ耐性を向上させる方策として、大きな一軸磁気異方性を示す規則合金を電極に用いる必要がある。そこで、高価なPtを含まない新たな垂直磁気材料の候補として、規則合金FeNiの電極材料としての適用性を第一原理計算に基づいて理論的に検討した。その結果、FeNiは最大で約7×106erglcm3の垂直磁気異方性を示すことを明らかにした。一方、FeNi/MgO/FeNi(001)接合のTMR比の理論値は、最大で50%程度であることが判明した。高出力TMR素子を実現するためには、FeNi/MgO界面にFe原子層を挿入することが有益である。
量子対話型証明とハミルトニアンに基づく検証つきセキュアクラウド量子計算

量子対話型証明とハミルトニアンに基づく検証つきセキュアクラウド量子計算について研究を行った。特に、セキュアクラウド量子計算について、完全古典の検証者では1ラウンドのプロトコルの場合、BQPがNPに入らない限り不可能であることが証明できた。今後は、ラウンド数を増やすことと、証明者からのメッセージが多項式長であるような場合に拡張することを検討する予定である。また、フーリエ階層の第二レベルという量子計算における重要なクラスについて、その量子スプレマシーと古典検証可能性についても証明することができた。第3レベル以降についても古典検証可能であるかどうかについて検討したい。さらに、証明者が利益を最大化するようなRationalな状況における量子計算の検証も考え、古典検証者でも検証可能なプロトコルを提案した。当初の計画とその発展についてすでに数本の論文を出版することができたため。今後の推進方法としては、最近米国中心に出ている新しい結果である、LWE暗号を利用した、計算量的安全性に基づくプロトコルの開発について推進したいと考えている。本研究では、ほぼ古典の能力のみからなる利用者がクラウド量子計算の正しさを確認できるか、という問題を検討した。利用者の能力としては、究極的には完全に古典の能力のみでできるようにしたいが、ひとまずは、1量子ビットの測定が可能であるとする。このような仮定は現在の技術的に、適切なものである。本研究では、局所ハミルトニアンを用いた新しい、量子計算の事後的確認プロトコルの開発を行った。サーバーが送る結果を信頼する場合はそのままでよいが、後になって信頼性が揺らいだ場合に、サーバーから、量子計算の正しさを証明する量子状態を送ってもらうことができる。その状態は量子計算の各ステップをエンコードしたようなものになっており、対応する局所ハミルトニアンの基底状態になっているので、エネルギーを測定することにより計算の正しさを確認できる。エネルギーの測定には一般にはエンタングルメント操作が必要であるが、1量子ビットの測定のみでエネルギーを測定する方法を提案した。また、この方法は、従来のセキュアクラウド量子計算プロトコルに組み込むことにより、任意のセキュアプロトコルを自動的に検証可能なものにすることができる。さらに、最近、この結果は、Learning with errors問題が量子計算では解くことが難しいという仮定の下で、古典の検証者のみで量子サーバーの計算の正しさを確認する新しいプロトコルにおいて、ベースとなるプロトコルとしても用いられている。いくつかの国際的な有名雑誌に結果を出版することができたため。今後も、現状の路線で進める予定である。特に、Learning with errors問題が量子計算では難しいことを仮定することにより作られるプロトコルは非常に有望なものであるので、それについて詳細な検討を進めたい。周辺機器、書籍等についての使用予定が多少変更になった。予定していた物品、旅費、招聘旅費について変更が生じたため。
がん幹細胞に対する宿主免疫応答の解明

最新のフローサイトメーター技術を用いてヒトがんの根幹細胞で、再発や転移の原因と考えられるがん幹細胞を分離し、その免疫病理学的特徴を明らかにした。3種類のがん幹細胞抗原を見出し、がん患者の血液からがん幹細胞特異的細胞傷害性T細胞を誘導することに成功した。動物モデルを用いて、がん幹細胞標的T細胞が通常型T細胞よりも高い抗腫瘍効果を発揮することを示し、がん幹細胞を標的とする新規免疫療法の有効性を示した。1.がん幹細胞の分離:肺がん細胞株LHK2,乳がん細胞株MCF7,大腸がん細胞株SW480をそれぞれ蛍光色素Hoechst33342で染色し、side population(SP)とmain population(MP)とをそれぞれソーティングした。SP細胞、MP細胞、それぞれをNOD/SCIDマウスに移植し、SP細胞がMP細胞よりも有意に高い造腫瘍性を持っていることを確認した。こうして、さまざまながん細胞株からがん幹細胞を分離することに成功した。2.がん幹細胞の細胞学的特性の解析:A:細胞死耐性試験:SP細胞、MP細胞それぞれをVP-16やStaurosporin存在下で培養し、細胞死感受性・耐性について各種death assayを用いて解析した。その結果、SP細胞はMP細胞よりも高い細胞死抵抗性を持っていることが明らかとなった。B:免疫感受性試験:CEP55抗原特異的CTLクローンを用いて、SP細胞、MP細胞それぞれを標的とした細胞障害試験を実施した。その結果、SP細胞もMP細胞と同様にCTLによって細胞障害を受けることを明らかにした。3. DNAマイクロアレイを用いたがん幹細胞選択的発現遺伝子の網羅的解析:SP細胞、MP細胞、それぞれからmRNAを抽出し、DNA microarrayを用いて網羅的な遺伝子発現解析を実施した。SP細胞で2倍以上発現が高い遺伝子群をスクリーニングした結果、約200種類の遺伝子候補を得ることができた。RT-PCRで発現解析を実施し、さらに約20種類の候補遺伝子を絞り込んだ。4. RT-PCRによる腫瘍細胞・正常組織の遺伝子発現プロファイリング:様々な腫瘍細胞株および正常組織遺伝子パネルを用いて、(3)で選択された遺伝子に関して、RT-PCRによって発現プロファイリング解析を実施した。その結果、がん幹細胞(SP細胞)選択的に高レベルに発現し、正常組織における発現は限定的な遺伝子を約5種類同定することに成功した。1.がん幹細胞抗原のCTLエピトープ同定(1)平成21年度までの研究で発見されたがん幹細胞抗原遺伝子候補の蛋白アミノ酸配列から、HLA-A2またはHLA-A24との結合モチーフを有するペプチドを検索し、合成ペプチドを作製。HLA結合アッセイを実施して、スクリーニングを完了した。(2)がん患者末梢血リンパ球と上記抗原ペプチドとを共培養し、IFN-gELISPOTアッセイによって、特異的CD8陽性T細胞の誘導に適したペプチドをスクリーニングした。(3)ペプチド特異的CTLが抗原陽性がん幹細胞株を障害することを確認した。(4)OR7C1がん幹細胞抗原特異的CTLクローンの樹立に成功した。2.マウス移植腫瘍モデルを用いたがん幹細胞抗原ワクチン試験(1)がん幹細胞抗原遺伝子DNAJB8遺伝子ワクチンをマウスに免疫し、RENCA細胞をチャレンジ。腫瘍の抑制効果を比較解析した。(2)NOD/SCIDマウスにヒトがん幹細胞を移植。OR7C1がん幹細胞抗原特異的CTLクローンを移入して、抗腫瘍効果を観察した。以上の研究によって、以下のことが明らかとなった。1.がん幹細胞特異抗原を複数個同定することに成功し、がん幹細胞障害性T細胞クローンを樹立した。がん幹細胞はCTLによって細胞障害を受けることを証明した。2.従来型のがん抗原に対する免疫応答よりも、がん幹細胞特異的免疫応答を誘導する方が、より効果的な抗腫瘍免疫を惹起できることが明らかとなった。がん幹細胞を標的とした免疫療法の有効性と優位性を証明することができた。(1)患者検体からのがん幹細胞抗原特異的CTLの誘導がん幹細胞抗原OR7C1のCTLエピトープペプチドを用いて、大腸がん患者末梢血リンパ球を刺激し、OR7C1抗原特異的CTLを誘導した。さらにCTLクローンを樹立することに成功し、抗原特異性を細胞障害性試験によって解析した。がん幹細胞と非幹細胞とに共通して発現しているがん抗原(Universal抗原)CEP55に対する特異的CTLクローンを対照群として細胞障害活性を比較した結果、OR7C1特異的CTLクローンががん幹細胞をより効果的に障害することが確認された。(2)マウス移植腫瘍モデルを用いたがん幹細胞抗原特異的CTLの腫瘍抑制効果免疫不全マウスに大腸がん細胞株SW480由来のがん幹細胞を移植し、腫瘍の増殖速度を解析した。腫瘍サイズが約3mm径になってから、がん幹細胞抗原OR7C1特異的CTLクローンまたは対照群のUniversal抗原CEP55

特異的CTLクローンをマウスに移植し、腫瘍増殖速度の違いについて解析を行った。その結果、CEP55特異的CTLよりも、OR7C1特異的CTLの方が有意に高い腫瘍抑制作用を示した。(3)マウス移植腫瘍モデルを用いたがん幹細胞抗原ワクチンの腫瘍予防効果Balb/cマウスにがん幹細胞抗原DNAJB8をコードするDNAを免疫。対照群はUniversal抗原SurvivinをコードするDNAを免疫した。4回免疫後、マウス腎がん細胞株RENCAを移植し、腫瘍径を計測した。その結果、SurvivinワクチンよりもDNAJB8ワクチンの方が有意に高い腫瘍抑制効果を示した。以上の結果から、がん幹細胞はCTLに対して感受性をもつこと、治療モデルと予防モデルの双方でがん幹細胞特異抗原に対する免疫応答は、Universal抗原に対する応答よりも高い腫瘍抑制作用を持つことが示された。
キラル有機分子触媒組込型高分子の開発と不斉触媒への応用

アミン塩を有するキラルイミダゾリジノン型有機分子触媒二量体とジスルホン酸誘導体による分子間アミンスルホネート生成重合により、高分子主鎖にイオン結合を有するキラル有機分子触媒組込型高分子を高収率で合成することに成功した。得られたキラル有機分子触媒組込型高分子は不斉Diels-Alder反応において、モデル触媒と同等以上の触媒性能を示すとともに、再利用できることが明らかとなった。本研究ではアミン塩を有する有機分子触媒二量体とジスルホン酸誘導体によるアミンスルホネート生成反応を分子間で連続的に行うことにより、高分子主鎖にイオン結合を有するキラル有機分子触媒組込型高分子合成の一般性を確立し、異なる二量化反応により得られたアミン塩を有する有機分子触媒二量体や種々のジスルホン酸誘導体により得られたキラル有機分子触媒組込型高分子の安定性ならびにその特徴に関する知見を得ることを目的とした。まず、代表的なデザイン型有機分子触媒であるキラルイミダゾリジノン触媒二量体とジスルホン酸誘導体の分子間反応により、キラル有機分子触媒組込型高分子の合成を行った。チロシンから誘導したフェノール性水酸基を有するキラルイミダゾリジノン触媒とキラルイミダゾリジノンのアミド部位にフェノール性水酸基を導入した触媒を合成し、ジハライドとのWilliamson反応により、構造の異なるキラルイミダゾリジノン触媒二量体の合成に成功した。またそれらの触媒性能は対応する低分子触媒と同等であることを確認した。次に、これらとジスルホン酸誘導体の重合反応により、キラル有機分子触媒組込型高分子の合成を試みた。重合反応はアミンとスルホン酸の中和反応であり、それぞれの溶液を室温で混合するだけで円滑に進行し、目的とするキラル有機分子触媒組込型高分子が高収率で得られた。特にスルホン酸部位のかさ高さは重合速度に大きく影響を与えることが分かった。得られたキラル有機分子触媒組込型高分子による不斉反応を行った。シクロペンタジエンとシンナムアルデヒドのDiels-Alder反応において、高い触媒活性を示し、特にendo生成物で低分子触媒を上回るエナンチオ過剰率を示した。高分子触媒は濾過等の簡単な操作で回収でき、数回の再使用が可能であった。本研究は、キラル有機分子触媒二量体とジスルホン酸誘導体の連続的な分子間反応により、キラル有機分子触媒部位をイオン結合を介して高分子主鎖中に適切に組み込んだ新規主鎖イオン結合型高分子である"キラル有機分子触媒組込型高分子"の開発を行い、その触媒性能を評価すると共に、低分子触媒を上回る高度な立体選択性を発現する高性能高分子キラル触媒の開発を目指した。本年度はアミン塩を含むキラル有機分子触媒二量体とジスルホン酸誘導体の分子間反応による、キラル有機分子触媒組込型高分子の分子設計ならびに触媒性能評価を行った。代表的なデザイン型有機分子触媒であるキラルイミダゾリジノン触媒二量体はチロシンから誘導したキラルイミダゾリジノン触媒とジブロモキシレンやジブロモブテン等のジブロミドのWillamson反応により合成した。得られたキラルイミダゾリジノン触媒二量体とジスルホン酸誘導体の分子間反応は連続的な中和反応であり、それぞれの溶液を室温で混合するだけでアミンスルホネート生成反応が速やかに進行し、目的とするキラル有機分子触媒組込型高分子が得られることが明らかとなった。この高分子は高分子主鎖にイオン結合とキラル有機分子触媒部位を含む新しいキラル高分子である。次にキラル有機分子触媒組込型高分子の触媒性能を調査するために、シクロペンタジエンとシンナムアルデヒドのDiels-Alder反応の触媒として用いた。キラル有機分子触媒二量体は対応するモデル触媒と同等の触媒性能を示すのに対し、適切なキラルイミダゾリジノン触媒二量体部位のスペーサーとジスルホン酸を組み込んだキラル有機分子触媒組込型高分子はより高いエナンチオ選択性を示すことが分かった。平成24年度計画はキラル有機分子触媒組込型高分子の分子設計、イオン結合安定性評価と自己重縮合型キラル有機分子触媒組込型高分子の合成を計画しており、キラル有機分子触媒組込型高分子の分子設計、イオン結合安定性評価はおおむね遂行済みである。また平成25年度に実施予定のIPCを用いた触媒的不斉反応にも既に着手していることから、研究はおおむね順調に進展している。平成25年度は自己重縮合型キラル有機分子触媒組込型高分子とハイパーブランチ型キラル有機分子触媒組込型高分子の合成と合成したキラル有機分子触媒組込型高分子を用いた触媒的不斉反応を実施する。自己重縮合型キラル有機分子触媒組込型高分子は一分子内にアミン塩およびスルホネートを有する有機分子触媒は連続的なアミンスルホネート生成反応により合成する。アミン塩およびスルホネートは共存できないため、片方の官能基の保護または前駆体を使用する必要があり、保護したスルホネートとアミン塩を有するキラル有機分子触媒の脱保護、スルホネートおよびアミンを有するキラル有機分子触媒のアミン塩への変換の2つの方法により、自己重縮合型キラル有機分子触媒組込型高分子の合成を検討する。2官能性アミン塩と2

官能性スルホネートの代わりに3官能以上のアミン塩またはスルホネートを用いると、多分岐高分子の合成が可能となる。そこでトリスルホン酸誘導体またはキラル有機分子触媒三量体等の用いたハイパーブランチ型キラル有機分子触媒組込型高分子の合成を試みる。これまでに合成したキラル有機分子触媒組込型高分子の有機分子触媒部位に対応した不斉反応を行い、キラル有機分子触媒組込型高分子の触媒性能の評価を行う。不斉反応における転化率、生成物の収率、立体選択性、触媒の再使用性に関して、従来の高分子固定化型有機分子触媒との比較・検討を行い、キラル有機分子触媒組込型高分子の特徴を明らかにする。得られた知見を元にキラル有機分子触媒組込型高分子の分子設計を行い、触媒性能の更なる向上を目指す。さらに、キラル有機分子触媒組込型高分子の親水性ー疎水性バランスを調節することで、水系での触媒的不斉反応に適用し、環境調和型の有機反応プロセスを確立させる。消耗品として不斉反応用試薬、ガラス器具、光学活性体分離用キラルカラム等、旅費として研究成果発表のための国内外旅費、人件費・謝金として研究補助、投稿論文校閲、その他として学会参加登録費を計画している。
フゾバクテリウム由来活性酸素誘導因子と好中球応答の研究

Fu菌体のn^-ヘプチルチオグルコシド可溶性画分から、種々のカラムクロマトグラフィー、プロティナーゼKおよびポリミキシンB処理によりマウス好中球に対して活性酸素を誘導する刺激画分を得た。刺激画分はペプチドと糖を含むが、刺激活性が耐熱性であること、過ヨウ素酸により失活すること、レクチン結合性があることから活性本体は糖物質であると考えられた。この画分にはリポ多糖が残存したが、対照実験からリポ多糖は活性酸素産生には影響を与えなかった。刺激画分を加水分解し薄層クロマトグラフィーおよびHPLC糖分析を行なったところ、グルコース、ガラクトース、マンノース、リボース、フコースが検出された。2.刺激因子受容体の検索メンブラン固定法によって刺激画分に結合するマウス好中球の細胞膜成分を分離した。電気泳動から、75、90、100、160、200kDaにバンドを認めたが、受容体との関連は不明であり、今後これらの成分の機能的な解析を要する。3.刺激因子による蛋白リン酸化好中球に対する刺激活性は、プロテインキナーゼ阻害剤スタウロスポリンおよびチロシンキナーゼ阻害剤ゲニステインのいずれによっても抑制されなかった。また抗ホスホチロシン抗体および抗ホスホセリン抗体を用いて、好中球のリン酸化蛋白の検出を行なったが、刺激によって新たに出現したり増加するリン酸化蛋白はいずれの抗体でも認められなかったので、他のキナーゼや情報伝達物質の変化について検討する必要がある。
遺伝子構成が異なる光入力系と体内時計中枢の再編成による光同調システムの解明

網膜-視交叉上核系を介した、明暗交代環境への哺乳類の概日リズムの同調機構を解析するため、時計遺伝子の一つであるクリプトクローム1,2をノックアウトしたマウスと正常マウスの網膜への光照射に対する視交叉上核ニューロンと網膜視神経の活動を記録し、その反応および視交叉上核ニューロンの分布を明期と暗期で比較した。まず、12時間/12時間の明暗環境で飼育したC57/BL6マウスを暗期あるいは明期に麻酔し、脳定位固定装置に補定し、明期開始後4時間から8時間(ZT4-8)および暗期開始後2時間から4時間(ZT14-16)の視交叉上核ニューロンおよび視交叉線維群の細胞外スパイク記録を行った。明期記録群は直前の暗期から引き続き実験開始まで暗室において網膜の明順応をさけた。光照射はマウスの光同調行動の最適光波長である500nm(青緑色)の超高輝度発光ダイオードを使い、入力電流によって光強度を10^9photons/cm^2/secから10^<16>photons/cm^2/secまで制御した。マウスの網膜に20秒から60秒の光照射を行い、その前後を含んだスパイク発火頻度の変化を記録した。その結果、光に対して発火頻度を上昇させる視交叉上核ニューロンは、暗期には平均して10^<11>photons/cm^2/sec付近に閾値があり、10^<15>photons/cm^2/secで最大応答に達する光強度応答曲線を描いた。一方、視神経は10^9photons/cm^2/sec以下に閾値があり、10^<13>photons/cm^2/secで最大応答に達する応答曲線を描き、視交叉上核ニューロンと視神経、それぞれの半値応答で比較すると、3050倍の感度の開きが認められた。視交叉上核ニューロンの最大応答刺激にあたる10^<15>photons/cm^2/sec以下の強度で光刺激した場合、暗期には視交叉上核でスパイク記録されたニューロンの70%で光に対する発火頻度の上昇が認められ、20%で抑制性の応答が観察され、視交叉上核ニューロンの大半が光応答性を示した。一方、明期に光応答を示したニューロンはわずか8%で、ほとんどのニューロンは光照射に対して無反応だった。この明期・暗期の応答分布の変化はこれまで報告されているラットとほぼ同じ傾向を示した。視神経応答は、暗期には半分が興奮性、残り半分弱が抑制性を示した。明期には7割弱が興奮性、2割強が抑制性を示したが、その明暗期における比率の違いには統計的有意差はなかった。同様の実験手順にてクリプトクロームノックアウトマウスで記録を行ったところ、視交叉上核ニューロンの興奮性の光応答には光強度応答曲線で10倍近い感度の差が認められた。視神経の応答特性には正常マウスとほとんど差が認められなかった。これらのことより、視交叉上核ニューロンの応答を含む光同調機構にはクリプトクロームが何らかの形で関わっているが、通常の視覚情報を伝える視神経応答は視交叉上核ニューロンの光応答には比較的関与が薄い可能性が示唆される。生物の体内時計は環境の明暗情報にもとづいて微調整されているが、ヒトを含めた哺乳動物の体内時計が明暗サイクルに同調する仕組みについては、断片的な現象しか報告されていない。それは哺乳類の光同調が、網膜と概日時計中枢である視床下部・視交叉上核(SCN)のふたつの組織によってもたらされているからである。体内時計は基本的に細胞内で起きる時計関係遺伝子発現のフィードバックループで形成されている。今回、時計遺伝子として代表的なものであるクリプトクローム遺伝子(Cry1,Cry2)をノックアウトしたマウス(Cry1/Cry2ダブルノックアウト;WKO)マウスについて、行動実験により行動リズムの解析と恒暗条件下での波長500nmの単波長光刺激に対する同調応答を解析した。さらに、ウレタン麻酔したWKOマウスの網膜への同光刺激に対する、体内時計中枢であるSCNニューロンの細胞外スパイク発火頻度の変化を記録した。この結果、まず野生型マウスのSCNニューロンは、昼間には光にほとんど反応せず、夜間の前半期に与えた光に対して、9割以上が反応を示した。つまり時間帯によって反応性を大きく変化させることが明らかになった。SCNニューロンの光反応は、光照射に対して発火頻度を増加させる亢進型、頻度を減少させる抑制型、光に対して無反応の3型に分類され、夜間の光反応はほとんどが亢進型だった。亢進型SCNニューロンに対して光強度応答関係の解析を行うと、網膜の通常の光感度より閾値を持ち、およそ3対数単位の作動範囲を持ち、高い光強度では反応が飽和することが明らかになった。これらの特性は行動実験から得られた光同調の特性とよくあう。Cryダブルノックアウトマウスでは、夜間のSCNニューロンの光反応性が優位に低下しており、昼夜の反応性の違いが小さいかほとんどなくなっていることが判明した。したがって、SCNの光反応にとって、Cry遺伝子が重要な働きをしていることが示唆された。網膜-視交叉上核系を介した、明暗交代環境への哺乳類の概日リズムの同調機構を解析するため、時計遺伝子の一つであるクリプトクローム1,2をノックアウトしたマウスと正常マウスの網膜への光照射に対する視交叉

上核ニューロンと網膜視神経の活動を記録し、その反応および視交叉上核ニューロンの分布を明期と暗期で比較した。まず、12時間/12時間の明暗環境で飼育したC57/BL6マウスを暗期あるいは明期に麻酔し、脳定位固定装置に補定し、明期開始後4時間から8時間(ZT4-8)および暗期開始後2時間から4時間(ZT14-16)の視交叉上核ニューロンおよび視交叉線維群の細胞外スパイク記録を行った。明期記録群は直前の暗期から引き続き実験開始まで暗室において網膜の明順応をさけた。光照射はマウスの光同調行動の最適光波長である500nm(青緑色)の超高輝度発光ダイオードを使い、入力電流によって光強度を10^9photons/cm^2/secから10^<16>photons/cm^2/secまで制御した。マウスの網膜に20秒から60秒の光照射を行い、その前後を含んだスパイク発火頻度の変化を記録した。その結果、光に対して発火頻度を上昇させる視交叉上核ニューロンは、暗期には平均して10^<11>photons/cm^2/sec付近に閾値があり、10^<15>photons/cm^2/secで最大応答に達する光強度応答曲線を描いた。一方、視神経は10^9photons/cm^2/sec以下に閾値があり、10^<13>photons/cm^2/secで最大応答に達する応答曲線を描き、視交叉上核ニューロンと視神経、それぞれの半値応答で比較すると、3050倍の感度の開きが認められた。視交叉上核ニューロンの最大応答刺激にあたる10^<15>photons/cm^2/sec以下の強度で光刺激した場合、暗期には視交叉上核でスパイク記録されたニューロンの70%で光に対する発火頻度の上昇が認められ、20%で抑制性の応答が観察され、視交叉上核ニューロンの大半が光応答性を示した。一方、明期に光応答を示したニューロンはわずか8%で、ほとんどのニューロンは光照射に対して無反応だった。この明期・暗期の応答分布の変化はこれまで報告されているラットとほぼ同じ傾向を示した。視神経応答は、暗期には半分が興奮性、残り半分弱が抑制性を示した。明期には7割弱が興奮性、2割強が抑制性を示したが、その明暗期における比率の違いには統計的有意差はなかった。同様の実験手順にてクリプトクロームノックアウトマウスで記録を行ったところ、視交叉上核ニューロンの興奮性の光応答には光強度応答曲線で10倍近い感度の差が認められた。視神経の応答特性には正常マウスとほとんど差が認められなかった。これらのことより、視交叉上核ニューロンの応答を含む光同調機構にはクリプトクロームが何らかの形で関わっているが、通常の視覚情報を伝える視神経応答は視交叉上核ニューロンの光応答には比較的関与が薄い可能性が示唆される。
痒みの発現機構―特に知覚神経線維の表皮内進入機序とオピオイド受容器の分布の解明

痒みには表皮真皮境界部に存在するC線維がヒスタミンなどの化学的刺激や温度、機械的刺激などにより活性化されて生じる末梢性の痒みとオピオイドペプチド-オピオイドリセプター系が活性化して生じる中枢性の痒みがある。臨床的には抗ヒスタミン薬が奏功する痒みと抗ヒスタミン薬に抵抗を示す痒みに分けられる。本研究では抗ヒスタミン薬が奏功しない難治性の痒みを呈する乾皮症、アトピー性皮膚炎、血液透析患者の痒みの発痒メカニズムについて研究した。その結果、1)ドライスキン(乾皮症、アトピー性皮膚炎)ではC線維が表皮真皮境界部に終わることなく角層直下まで侵入しているために、神経線維がヒスタミンなどのケミカルメディエイターを介さずに直接外部からの機械的、化学的、物理的刺激により活性化され、痒みが生じていることが示唆された。2)血液透析の患者では痒みを誘発するμオピオイド系(βエンドルフィン)が痒みを抑制するκリセプター系(ダイノルフィン)より優位になっているために痒みが生じていることを明らかにした。この結果に基づいてκリセプターのアゴニストを合成し、透析患者に投与した結果、全症例において痒みが抑制された。このことは抗ヒスタミン薬抵抗性の痒み対策としてκリセプターアゴニストが有効であることを示唆している。本年度はドライスキンを呈する老人性皮膚掻痒症のかゆみメカニズムを、表皮内神経線維との相関において検討した。1.老人性皮膚掻痒症の表皮内神経線維の密度と分布患者皮膚を採取(生検)し、Bodian染色して表皮内神経線維の数と長さを測定した。コントロールには手術時に得られた正常皮膚を用いた。その結果、老人性皮膚掻痒症の皮膚では正常皮膚コントロールと比較して単位当たりの神経線維の長さ、数ともに明らかに表皮内神経線維の増加が認められた(長さで約2.5倍、長さで約4.5倍の増加)。神経線維の分布では、多くは基底層から有棘層に分布して認められたが、一部の線維は表皮内深く進入し角層直下にまで認められた。以上の結果は老人性皮膚掻痒症の患者では、皮脂膜、角層問脂質、天然保湿因子の減少により易刺激性となった皮膚を介して外的機械的、化学的刺激が角層直下にまで進入している神経線維を刺激し、生じた活動電位が直接大脳皮質に達しかゆみが認識されることを示唆しているものと思われる。この場合にはヒスタミンなどのchemical mediatorを介しておらず、いわゆる抗ヒスタミン剤は奏功し難いものと思われる。2.今後の検討課題C線維に特異的に存在することが知られているSubstance Pに対する抗体を用いて染色したが、染色法に問題があり染色されなかった。現在さらに検討中である。昨年までの研究により、ドライスキンを呈する老人性皮膚掻痒症では神経線維が表皮内に深く侵入していることを明らかにした。そこで本年度は神経線維の表皮内侵入メカニズムについて動物モデルを作成し検討した。1.動物モデルの作成:hairless ratの背部皮膚を50%アセトン/エーテル(A/E)で30分処理すると、30分後にはtransepidermal water loss(TEWL)は13倍亢進、コンダクタンスは1/4に減少、角層内sphingolipid量は1/3に減少し、ドライスキンの動物モデルとなり得ることが示された。2.表皮内神経線維の分布と密度:A/E処理48時間後には表皮内に抗substance P抗体、抗CGRP抗体陽性神経線維が認められ、角層直下までその侵入が認められた。コントロールの無処理皮膚では陽性所見は認められなかった。表皮内神経線維の密度はA/E処理後の時間に依存して増加した。このことは、A/E処理により皮膚をドライスキンにすると神経線維(C線維)が表皮内に侵入し始めることを示している。3.Neurotrophicfactorの分布と発現:表皮内NGFの分布を、抗NGF抗体を用いた免疫染色により検討した。無処理

皮膚でも表皮全層に均一に弱い陽性所見が認められたが、A/E処理により陽性所見は増強し、特に基底層に強い陽性所見が認められた。以上の結果より、ドライスキンは神経線維の表皮内侵入を誘導すること、神経線維の表皮内侵入にはneurotrophic factor(NGF)の関与が推定された。抗ヒスタミン薬の奏功しない疾患には、腎不全、腎透析患者、胆汁うっ滞性肝疾患、アトピー性皮膚炎などがあり、これら疾患は全て難治性の痒みと皮膚の乾燥(ドライスキン)を呈することが特徴である。我々は、ドライスキンを呈する疾患では表皮内に神経線維が多数侵入していることを明らかにし、ドライスキンの呈する難治性痒みの本態は表皮内に侵入している神経線維の外部からの直接刺激であると考えている。そこで、本年度は表皮内に侵入している神経線維の消退メカニズムをヘアレスラットを用いて治療との相関において検討した。1.ドライスキン誘発表皮内神経線維の再現ラット背部皮膚を50%アセトン/エーテルで30分間処理すると48時間後には表皮内に多数の神経線維の侵入が認められた。このことは、ドライスキンになるとサブスタンスP含有神経線維が表皮内に侵入することが再現された。2.治療前後における表皮内神経線維の動向ラット皮膚に作成したアセトン/エーテル誘発表皮内神経線維が外用PUVAにより消退するか否かを照射前後で検討したが、一定した結果は示されなかった。今後、ステロイド軟膏の外用、外用免疫抑制剤であるタクロリムス軟膏などの効果を検討してゆきたい。3.セマフォリン発現誘発の検討PUVA療法のセマフォリン発現の効果を検討したが、期待したほどセマフォリンの発現増強は認められず、染色法などの検討が必要であった。今後更に検討してゆきたい。
主要抗原領域欠失型HBsAg蛋白質で形成される中空ナノ粒子の表面構造解析

ヒトB型肝炎ウィルス(HBV)のエンベロープ蛋白質(HBsAg)が形成する中空ナノ粒子は、ヒト肝細胞特異的な薬物送達キャリヤとして開発が進められている。我々はHBsAg蛋白質による粒子構造形成機構の解明のために、まず粒子を形成しうる必要最小限の配列を明らかにした。その最小配列HBsAg粒子の表面構造を調べるために粒子の精製を行い、野生型粒子同様の大きさと形状を持つ事を示した。ヒトB型肝炎ウィルス(HBV)のエンベロープ蛋白質(HBsAg)により形成される中空ナノ粒子は、ヒト肝細胞特異的薬物送達キャリヤとして開発が進められている。申請者らはこれまで、HBsAg蛋白質により中空ナノ粒子構造が形成される分子メカニズムを解明する為に配列欠失実験を行ってきた。HBsAg蛋白質は3カ所の疎水性領域[膜貫通領域(TM1、TM2)とC末端疎水性領域]および2ケ所の親水性領域(粒子外部と粒子内部)から構成されるが、そのうちのC末端領域、粒子外部領域、および粒子内部領域の各領域について粒子形成に必要な配列/不必要な配列を明らかにしてきた。本研究はこの不必要配列を欠失したHBsAg粒子の表面構造解析を通じて、粒子構造形成の分子メカニズム解明にアプローチすると同時に、欠失体粒子の有用性を示す事を目的とする。そのために本年度は不必要配列を欠失したHBsAg粒子の調製法を検討した。すなわち、1)粒子外部不必要領域を欠失させた変異体については、酵母発現系により安定発現株を作製した。その発現量は数mg/mlであった。発現酵母菌体内より変異体粒子を精製したところ、純度50%程度の精製品が1L培養あたり0.1mg取得された。発現培養条件および精製条件を精査することにより、純度および収量を向上する必要がある。2)上記3領域の不必要配列を全て欠失させたHBsAg変異体をCos7細胞で一過的発現させ、変異体粒子の分泌を確認した。さらに、TM1領域をも欠失させた「最小構造」変異体を作成して同様に発現させたところ、完全長の野生型変異体よりもむしろ良い分泌効率を示す事が示唆された。早急にこの「最小構造」変異体の大量調製系を検討し、粒子表面解析の材料としたい。3)粒子表面に位置すると推定されるC末端疎水領域の必要配列をコードするペプチドを合成した。リン脂質二重膜上での構造形成に用いる予定。ヒトB型肝炎ウィルス(HBV)のエンベロープ蛋白質(HBsAg)により形成される中空ナノ粒子は、細胞特異的薬物送達キャリヤとして開発が進められている。HBsAg蛋白質は3カ所の疎水性領域[膜貫通領域(TM1、TM2)とC末端疎水性領域]および2ヶ所の親水性領域(粒子外部と粒子内部)から構成される。これまでに申請者らはHBsAgの配列欠失実験により、粒子形成に不必要な配列を明らかにしてきた。本研究はこの不必要配列を欠失したHBsAg粒子の表面構造解析を通じた、粒子構造形成メカニズムの解明を目的とする。昨年度は粒子外部とC末端疎水性領域を欠失させたHBsAg変異体粒子の調製を試みたが、発現量が低く精製が困難だった。本年度は、発現量の高い欠失変異体を選別しなおし、その粒子性状を解析した結果、(1)C末端疎水性領域と、N末端側のTM1と内部親水性領域とを欠失させた変異体が、野生型の約100倍の粒子分泌を示した。TM1と内部親水性領域のみの欠失変異体では全く粒子を分泌しなかった事から、このN末端領域は粒子形成に必須ではないが、C末端疎水性領域と相互作用してその構造を支えたと考えられる。(2)C末端疎水性領域とTM1と内部親水性領域と粒子外部領域を欠失させた変異体も、野生型の数十倍の分泌を示した。しかしショ糖密度勾配遠心の結果、「HBsAg様粒子」を形成していない事が示された。この欠失体配列中には分泌促進構造が含まれているが、粒子形成には不十分と考えられる。(3)(1)の欠失変異体粒子をアフィニティー精製したところ、SDS-PAGE上で単一バンドを示したので、この蛋白質のみで粒子形成された事が示された。また、精製粒子の透過型電子顕微鏡観察の結果、野生型粒子と同等のサイズと表面形状を示す事を確認した。粒子形成に必要な構造を解明した上記知見は、新たなキャリヤ粒子デザインに役立つ。
抗neurofascin155抗体関連脱髄疾患のフラグメント抗体による病態モデル

近年、ランビエ傍絞輪部に局在する細胞結合膜蛋白neurofascin (NF)155に対するIgG4クラスの自己抗体が慢性炎症性脱髄性多発根ニューロパチー(CIDP)の一部で陽性になることが明らかとなってきた。本疾患は高度な神経肥厚を呈するため、しばしば難治性である。IgG4はin vivoでhalf molecular exchangeを起こすため、生体では1価の抗体として存在している。また補体結合活性がないため、認識する蛋白間相互作用を阻害することで病原性を発揮すると考えられている。本研究では抗NF155抗体陽性CIDP患者のリンパ球を採取し、全RNAからcDNAを調製後、免疫ファージ抗体ライブラリーを作成する。その後、ファージディスプレイ法を用いてヒトNF155特異的な一本鎖フラグメント(single chain variable fragment, scFv)を作製する。NF155特異的scFvを動物モデルへ移入することで病態を再現し、発症機序を解明し、画期的治療法を開発する。当該年度は抗NF155抗体陽性CIDP患者より末梢血中のリンパ球を採取し、RNAを抽出した後に逆転写PCRによりcDNAを調整した。続いてリンパ球由来のcDNA(さまざまな配列をもつ抗体遺伝子プールを含む)から数十個存在するV領域の遺伝子を、配列が類似した遺伝子ごとに特異的なプライマー設定した後に、cDNAを鋳型としてVH遺伝子とVL遺伝子を個別にPCR増幅した。その後リンカーペプチド配列をコードしたリンカーDNAを用いてアセンブリPCRを行うことでランダムに連結させ、それをファージのコートタンパク質g3pのN末端側に融合タンパク質として発現するようにファージミドベクター内に組み換えた。それを大腸菌に形質転換後ヘルパーファージを用いてファージを回収することで、抗体ファージライブラリーを作製した。当初の予定より若干のおくれはあるものの、免疫ライブラリーは構築されているため今後は同ライブラリーを用いてヒトNF155特異的なscFvを選別・増幅(バイオパニング)する。平成29年年度は昨年度に構築した、抗NF155抗体CIDP症例の末梢血リンパ球由来の抗体ファージライブラリーを用いて、ヒトNF155に対するファージを選別するためパニングを行った。パニングに際しては、抗NF155抗体のエピトープと推察される部位を強制発現させたHEK細胞を用いて抗体ファージライブラリを直接反応させる細胞パニング法を用いた。合計3回パニングを行った結果、ヒトNF155に結合するScFvを有するクローンが十分濃縮されていることを確認した。15クローンを採取し、そのうち13クローンがヒトNF155に結合することを確認した。また、各クローンのScFvの塩基配列を確認したところ、その多くが類似する組み合わせであることを確認した。ヒトNF155に高親和性のScFvが単離されている可能性が高い。今後は今回得られたファージクローンより、ScFvを単利して動物に投与することで、抗NF155抗体陽性CIDP症例でみられる脱髄所見を呈するのか確認していく。作製したscFvをマウス・ラットに局所注射(坐骨神経、足底)または腹腔内投与し、抗NF155抗体陽性CIDP症例でみられる症状や各種検査異常が再現できるか臨床病理学的に検討する。ロータロッドやグリップテストによる運動機能評価、末梢神経伝導速度検査、坐骨神経や足底の皮膚神経の免疫染色による傍絞輪部の構造変化、浮腫、神経肥厚の有無を観察する。抗体の投与量と重症度が相関するかどうかも検証する。29年度が最終年度であるため、記入しない。神経内科29年度が最終年度であるため、記入しない。
新規モノマー導入型ポリマーの微生物合成を実現するモノマー供給酵素の進化工学的創成

本プロジェクトでは、PHA微生物ポリマーの重合酵素に焦点を当て、その基質特異性を改変することで新規ポリマーを合成することを基盤としている。これまでは、重合酵素改変の最大の成果として従来重合が不可能であった乳酸の取り込みが挙げられる。この際、乳酸CoA体の合成に関与するCoA転移酵素の反応性が鍵となっていた。そこで、2位に水酸基を有する乳酸類似体であるグリコール酸の取り込み能力およびCoA活性化の検証とポリマー合成向上に有効な因子の探索に移行した。グリコール酸を外部添加し微生物培養したところ、確かにグリコール酸ユニットが取り込まれ、その分率も添加したグリコール酸濃度に依存していた。石油依存型のモノ作りからの脱却が求められている現代、再生可能資源であるバイオマスの高度利用は世界的な研究課題である。最近、当研究室では多くの微生物が合成するポリエステルであるポリヒドロキシアルカン酸(PHA)に注目し、化学合成ポリマーにない物性の発現や環境低負荷型の合成プロセスの開発に取り組んでいる。本プロジェクトでは、ポリマー合成の最終段階で触媒する重合酵素に焦点を当て、その基質特異性を改変することで新規モノマーの取り込みを実現することで新規ポリマーを合成することを基盤としている。しかし、この前提としてモノマー前駆体としての乳酸のCoA体の合成に関与するCoA転移酵素の反応性が鍵となっていた。前年度は、この乳酸CoAの供給を最終的な乳酸取り込みポリマーの合成を通してその成否を評価しており、一定の成果を上げた。今年度は、同じく2位に水酸基を有する乳酸類似体であるグリコール酸の取り込み能力およびCoA活性化の再検証とポリマー合成向上に有効な因子の探索に移行した。グリコール酸を外部添加し微生物培養後最終的に得られたポリマーサンプルをNMR解析に供したところ、確かにグリコール酸ユニットが取り込まれたことが分かり、その分率も添加したグリコール酸濃度に依存していた。しかし、ある濃度以上になると菌体自身の増殖に影響が生じた。また、重合に基底レベルで必須の3HB-CoAの供給に直接関与する還元酵素の低活性体の利用は顕著な効果がなかった。今後、グリコール酸の細胞内取り込み能力を強化すると同時に、高濃度グリコール酸に対する耐性の付与が課題となることもわかった。また、細胞内のモノマー中間体(乳酸-CoA)の追跡をLC-MSによって行う系の立ち上げに着手した。近年の石油資源の枯渇や環境保全の観点から、代替エネルギー資源やバイオベースの高分子材料の探索・合成に対する関心が世界的規模で高まっている。環境・生体調和型のバイオポリマーとして期待されている脂肪酸ポリまであるポリヒドロキシアルカン酸(PHA)の微生物合成システムに関する研究の歴史は長いが、この種のポリマーの産業化にはいくつかの解決しなければならない課題があった。本プロジェクトでは、新規モノマー導入型ポリマーの創製を目的に、微生物ポリマー合成システムのリモデリングから出発した。これまでに、天然型のPHA重合酵素は約70種以上が遺伝子クローニングされその酵素学的性質もいくつか調べられている。その共通の性質として、3位に水酸基を有するアルカン酸を基質認識することで知られていたが、我々の長年の人工進化実験を通じてついに2位に水酸基を有する乳酸のCoA体(LA-CoA)を認識し、ポリマー鎖内に乳酸ユニットを取り込む重合を酵素を取得できた。この乳酸重合酵素の発見を契機に、さらに乳酸類似の化合物をモノマー基質としてポリマー鎖内に取り込める重合酵素あるいはモノマー供給可能なCoA転移酵素の取得がプロジェクトの主要な課題となった。今回は、乳酸分率が向上する培養条件検討から着手して充分量にターゲットモノマーが細胞内に供給できる条件を最適化することに専念した。その結果、通気度制御と代謝改変株の組み合わせにより、乳酸分率の向上が実現した。また、全く新しい試みとして、同じく2位に水酸基を有する乳酸類似化合物としてグリコール酸を選定し、グリコール酸のポリマー鎖内取り込み実験を開始した。グリコール酸は、乳酸と異なり光学活性炭素を持たない点で乳酸と区別化され、反応に関与する2種の酵素であるCoA転移酵素および乳酸重合酵素の基質特異性に適合するか関心が持たれたが、グリコール酸含有ポリマーの合成が確認された。環境・生体調和型のバイオポリマーとして期待されているポリヒドロキシアルカン酸(PHA)の微生物合成システムを基盤として、新規モノマー導入型ポリマーの創製を目的に本プロジェクトはスタートした。これまでの研究から、天然型PHA重合酵素は3位に水酸基を有するアルカン酸を基質認識することで知られていたが、人工進化実験を組み込むことで2位に水酸基を有する乳酸のCoA体(LA-CoA)を認識し、ポリマー鎖内に乳酸ユニットを取り込む重合を酵素を取得できた。

この乳酸重合酵素の発見を契機に、さらに乳酸類似の化合物をモノマー基質としてポリマー鎖内に取り込める重合酵素あるいはモノマー供給可能なCoA転移酵素の取得がプロジェクトの主要な課題となった。さらに、共同研究において、5位に水酸基を有するアルカン酸にも反応性を示す重合酵素変異体が見つかり、重合酵素の基質特異性変換のキャパシティーの広さが示されている。まずは、新規モノマーとして認識可能となった乳酸自体のポリマー鎖内への取り込みキャパシティーを調べることから着手し、通気度を制御する培養工学的検討により、数モル%から50モル%近くまで分率を向上できることがわかった。次の段階として、乳酸に類似の化学構造を有する新規物質グリコール酸に注目し、培地中に濃度を変えながら添加した。膜透過→CoA転移酵素によるCoA化→重合酵素の認識によるグリコール酸ユニットのポリマー鎖内への取り込みの複数ステップからなる一連のプロセスデザインが想定通り機能するかを調べた。結果、少量ながらグリコール酸ユニットをGC/MSおよびNMR解析により確認することができ、構築したパスウエーが設計通りに作動することが予定の時期よりも早目に明らかとなった。上記のように、膜透過→CoA転移酵素によるCoA化→重合酵素の認識によるグリコール酸ユニットのポリマー鎖内への取り込みの複数ステップからなる一連のプロセスデザインが良好に作動するかどうかを、大腸菌細胞を使用したインビボ実験により最終プロダクトであるグリコール酸含有ポリマーの合成確認により実証できた。しかし、各ステップでの酵素の反応性や一連のポリマー合成パスウエーの律速段階のアドレスは、今後のグリコール酸含有ポリマーの効率的生産を実現する上での重要課題である。グリコール酸の細胞内導入を定量化するのは困難なので、CoA転移酵素によってCoA化されたグリコール酸-CoAを標準品を使用してメタボローム解析にて定量する。乳酸重合酵素のグリコール酸に対する反応性は、インビトロで活性試験を行い、乳酸重合酵素のさらなる改変が必要かを見極める。また、乳酸重合酵素の側鎖構造における基質特異性という観点から、乳酸モノマーとグリコール酸モノマーに対する反応性を取得する変異体毎に調査する。これら基礎的なデータを充実させたところで、本格的に対象ポリマーの微生物培養条件の最適化を試みる。(1)ポリマー鎖内の乳酸分率の向上微生物培養時の通気度制御とカウンターパートモノマーとなる3HB-CoAの生成量の軽減の両再度からアプローチする。前者は、ジャーファーメンタを使用して溶存酸素量をモニタリングし、後者はPhaB還元酵素の低活性体を意図的に使用する。(本実験では、微生物培養用の培地と集菌に必要な試薬類を購入する計画である。)(2)膜透過→CoA転移酵素によるグリコール酸のCoA化→重合酵素の認識によるグリコール酸ユニットのポリマー鎖内への取り込み実験上記の複数ステップが良好に作動するかどうかを、大腸菌細胞を使用したインビボ実験により最終プロダクトであるグリコール酸含有ポリマーの合成の再現性確認を行う。