hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
レーザー誘起蛍光偏光分光法による磁場閉込めプラズマ周辺電場計測法の開発

本研究の目的は、プラズマの閉じ込めに関与する径方向電場分布を原子のシュタルク効果により直接計測可能な計測システム開発のために、レーザー誘起蛍光(LIF)偏光分光法の適用限界を電子密度と磁場の影響に焦点を絞り、実験的に明らかにすることである。本年度は主として電子密度と励起原子のディスアラインメントとの相関の解明を目標とした。以下に結果をまとめる。1)プラズマ装置にヘリウムガスを導入し、ペニング放電により低ガス圧(10mTorr)下で電子密度が10^<10>cm^<-3>10^<11>cm^<-3>程度のヘリウムプラズマを生成した。これらのプラズマパラメータはプローブにより決定した。2)プラズマ中の準安定ヘリウム原子を、電気四極子遷移を通じてレーザー励起し、誘起される蛍光の直線偏光成分の時間発展を磁場に直交した方向より観測した。3)放電電流の増加(ガス圧は一定)とともに偏光度の減衰が大きくなることが観測された。この増大は、ガス圧が一定に保たれていることから、原子衝突ではなく電子衝突に起因するものであると考えられる。4)LIFの直線偏光成分から、ディスアラインメントレートの放電電流への依存性を求めた。このリニアープロットから10mTorrの場合の原子衝突によるディスアラインメントを決定し、電子衝突によるものを分離した。このようにして得られた電子衝突によるディスアラインメントレートは放電電流に比例することが確認された。5)レーザー誘起蛍光過程に関する時間依存CRモデル計算により、本LIF法を適用して電場を決定する上で、上限となるディスアラインメントレートの値は約1.0×10^8s^<-1>であることが示された。6)以上の結果から、本LIF法を適用できるプラズマの電子密度の上限は1.5×10^<12>cm^<-3>程度と推定された。本年度は主として円偏光法の基本原理であるシュタルク・電気四極子干渉への磁場の影響の解明を目標とした。1)弱磁場下での成果電場分布が既知の円筒型ホロー陰極放電プラズマのシース電場分布に円偏光法を適用した。その結果、5-300Gまではこの方法が適用できることが確認できた。また、本方法が電場強度だけでなくその極性をも決定できることを実証した。2)強磁場下での成果300G以上の実験にはホロー陰極放電は使えないため、マグネトロン放電を用いた。この放電で1500Gまでプラズマを生成できた。この様な磁場領域では、He原子の励起準位4^1Dがゼーマン効果により分裂する。この状態で、分裂幅よりも狭いスペクトル幅を持つレーザーでHe準安定原子を励起した場合にシュタルク・電気四極子干渉が起こりうるのかどうかを実験的に調べた。磁場に直交する電場が存在するマグネトロンプラズマシースにレーザーを打ち込み、レーザー波長を走査することによってLIFの励起スペクトルを測定した。印加した磁場は0.75kG、1.13kG、1.5kGである。得られたスペクトルを、各磁気副準位への吸収スペクトル線形をガウス分布と仮定し、デコンボリューションを行った結果、スペクトル中にシュタルク・電気四極子干渉項による吸収遷移が含まれていることが示された。以上の結果は、円偏光法が、核融合プラズマのように強磁場が存在するプラズマへの適用の可能性を示している。
多様なmodalityによる振戦の病態解明とFUSやDBSによる病態修飾

本年度は順調に症例数を増やし、MRガイド下集束超音波治療(MRgFUS)を昨年度に続き累計25例実施した。治療成績も治療後6ヶ月の時点で、振戦の改善率71.4%と、従来の報告に比べても遜色なく、重篤な合併症もなかった。振戦の症例に対し、術前評価を行い、安静時fMRIやMEGを24例実施した。fMRIのデータはFSLを使って独立成分分析(independent component analysis)を行い、Dual regression analysis等の解析方法を使って、脳とこころの研究センターの健常人データベースと比較し、本態性振戦患者群と群間比較を行っている。現在解析作業を進めている。また、治療後の再評価を随時実施しており、治療前後の比較を検討する予定である。MRgFUSによる治療が国内で進む中、各学会での情報交換に留まらず、本年度は日本経頭蓋MRガイド下集束超音波治療研究会を設立し、第一回の研究会を名古屋で開催することができた。安全に有効な治療を進めていくために様々な観点から議論を重ね、次回以降も継続していくこととなった。またこれまでの治療実績の中で、治療後一過性に下肢脱力が生じた症例全例において、治療効果が非常に高いことが判明し、小脳と視床のnetworkに関して、重要な示唆が得られた。凝固巣が上下方向に伸びることにより、視床腹側の領域である不確帯(Zona incerta)まで凝固が及び、sub-thalamotomy効果が得られていることが推察された。これは従来言われているPSA(post subthalamic area)より外側に位置し、この部位含めて治療することで、振戦に対してより高い効果が得られると考えられた。今年度は、当初の計画通りに症例数を集め、MRgFUSもしくは高周波凝固術(RFL)での治療数も概ね予定通りに進んでいる。しかし全例で研究協力が得られる訳ではないため、現在も症例のリクルートを行っている。今までの症例を順次解析し、現時点の15例の本態性振戦患者群と15例の健常者群との比較においては、Dual regression analysisでは有意な違いは見られなかった。次年度も症例数を増やし、20例ずつの群でDual regression analysisを行う予定である。小脳や大脳基底核のconnectivityをより的確に描出するための解析方法も試みており、更なる検討を進める予定である。治療介入後のfMRIやMEGの実施も随時進めていく。本態性振戦は小脳ー視床ー大脳皮質の回路が重要な役割を担うと考えられる。またパーキンソン病の振戦では、小脳系に加え、大脳基底核ー視床ー大脳皮質回路が重要視されている。この様に振戦症状の理解にはネットワークとしての理解が必要であり、また非運動症状の成立や、個体間の症状の多様性を解明する為にもこのアプローチが必要である。この様な各病態の背景にあるネットワーク異常を安静時fMRIやMEGによる解析で明らかにし、従来の視床凝固術(RFL)や脳深部刺激術(DBS)に加え、近年日本でも臨床導入されたMRガイド下集束超音波治療(MRgFUS)により、ネットワークがどのように修飾され、症状の改善に結びつくのか解明することが本研究の主題である。本研究の達成により、ネットワーク的な病態の解明と治療法の選択に有用なバイオマーカーの確立を目指す。平成29年度は、新指針に沿った研究計画書を生命倫理委員会に提出し、モニタリングも含めた研究体制を構築した。薬剤抵抗性の難治性振戦の24例(本態性振戦20例、パーキンソン病4例)を治療対象として検討し、治療としては、MRgFUS13例、RFL2例、DBS3例が平成29年度に実施された。実際に研究の準備が整い、十分なインフォームドコンセントの上、研究の同意の得られた7例(本態性振戦6例、パーキンソン病1例)が研究の対象となった。全例に対し治療前の安静時fMRI及びMEGを実施した。また、高次機能評価(ACE-Rなど)及び振戦評価(CRST scoreなど)を行った。治療効果については、治療後1ヶ月後、3ヶ月後、半年後でCRSTを実施した。fMRIやMEGなど、治療後の再検査は半年前後で実施するため、まだ2例に留まっている。現在解析の準備を進めている。臨床研究の新指針に沿って、研究計画を修正し、倫理委員会に提出した。その後症例のリクルートを開始したため、実際に研究がやや遅れが生じてしまった。また、介入となる治療に関しても、慎重に厳密に適応判断したため、当初の見込みより症例が少なくなってしまい、結果的に研究対象となった症例も少なくなってしまった。また、機器の購入が遅れていたため、解析が遅れているが、解析方法の見直しとともに、機器の選定も見直しを行っている。

fMRIのデータはFSLを使って独立成分分析(independent component analysis)を行い、Dual regression analysis等の解析方法を使って、脳とこころの研究センターの健常人データベースと比較し、本態性振戦患者群と群間比較を行っている。現在解析作業を進めている。また、治療後の再評価を随時実施しており、治療前後の比較を検討する予定である。MRgFUSによる治療が国内で進む中、各学会での情報交換に留まらず、本年度は日本経頭蓋MRガイド下集束超音波治療研究会を設立し、第一回の研究会を名古屋で開催することができた。安全に有効な治療を進めていくために様々な観点から議論を重ね、次回以降も継続していくこととなった。またこれまでの治療実績の中で、治療後一過性に下肢脱力が生じた症例全例において、治療効果が非常に高いことが判明し、小脳と視床のnetworkに関して、重要な示唆が得られた。凝固巣が上下方向に伸びることにより、視床腹側の領域である不確帯(Zona incerta)まで凝固が及び、sub-thalamotomy効果が得られていることが推察された。これは従来言われているPSA(post subthalamic area)より外側に位置し、この部位含めて治療することで、振戦に対してより高い効果が得られると考えられた。今年度は、当初の計画通りに症例数を集め、MRgFUSもしくは高周波凝固術(RFL)での治療数も概ね予定通りに進んでいる。しかし全例で研究協力が得られる訳ではないため、現在も症例のリクルートを行っている。今までの症例を順次解析し、現時点の15例の本態性振戦患者群と15例の健常者群との比較においては、Dual regression analysisでは有意な違いは見られなかった。現在研究も軌道に乗り、症例の確保、研究員の確保も行って、治療も症例数を積み重ねてきたため、研究計画に基づき、次年度からの研究の遂行は十分と考えている。データ収集を継続して行い、脳とこころの研究センターでの健常者コホートとの比較やパーキンソン病患者との比較により、病態解析を進めていく。次年度も症例数を増やし、20例ずつの群でDual regression analysisを行う予定である。小脳や大脳基底核のconnectivityをより的確に描出するための解析方法も試みており、更なる検討を進める予定である。治療介入後のfMRIやMEGの実施も随時進めていく。研究計画の修正により、平成29年度の実施症例がやや少なくなり、解析への着手が遅延しているため、解析機器の購入が遅れ、検査実施の費用にも未使用額が生じている。現在は研究が軌道に乗り、対象の症例の確保や研究員の確保も進んでいるため、解析用機器の選定も再検討し、次年度に購入予定である。また、検査実施の費用にも使用予定である。解析方法の修正に伴い、現存の機器を一時的に使用しているため、物品費の残額が生じている。新しい解析方法の実施に伴い、次年度機器を購入する予定。
脈絡叢を介した神経再生メカニズムの解明

本研究の目的は、種々の栄養因子を含む脳脊髄液を産生している脈絡叢上皮細胞に着目し、脊髄損傷時におこる脈絡叢上皮細胞の応答を調べることで、本来持っている神経の自己再生メカニズムの一端を明らかにすることである。前年度には、ラットの側脳室と第四脳室の脈絡叢を採取し、それぞれの脈絡叢上皮細胞の初代培養系を確立し、免疫細胞化学的な手法でタンパク質レベルでの発現の違いを比較検討したところ、側脳室由来の脈絡叢上皮細胞の多くは未分化マーカーとして知られるSox2を発現していたが、第四脳室由来の脈絡叢上皮細胞はSox2を全く発現していないことを明らかにした。これを受けて、今年度はまず、側脳室と第四脳室由来脈絡叢上皮細胞のin vivoでの生理的な違いを調べるために、正常ラットの脳の凍結切片について免疫組織化学的な解析を行った。その結果、正常ラットではいずれの脳室の脈絡叢上皮細胞もほとんど未分化マーカーを発現しておらず、近傍の上衣細胞が発現していた。例外的に、SSEA-3は両脳室の脈絡叢上皮細胞の一部で発現が認められた。次に、脊髄損傷による反応をみるため、圧挫損傷を与えたラットの脳の凍結切片について免疫組織化学的な解析を行った。その結果、Sox9は両脳室の脈絡叢上皮細胞に同程度発現が認められた。一方で、SSEA-3は第四脳室よりも側脳室の脈絡叢上皮細胞で発現が増加した。これらのことから、in vivoでも脊髄損傷後に側脳室の脈絡叢上皮細胞で未分化マーカーの発現が高いことがわかった。今回、脊髄損傷から6週後(慢性期)のラットの脳のみを解析したため、今後さらに、急性期の脊髄損傷ラットも解析することで経時的な脈絡叢上皮細胞の反応を脳室ごとに明らかにしていく予定である。今年度は、前年度in vitroで明らかにした側脳室と第四脳室由来の脈絡叢上皮細胞の違いをin vivoで解析した。申請時は、先に脊髄損傷ラットの脈絡叢組織としての反応を発現遺伝子のプロファイリング等で網羅的に解析することを予定していたが、先に培養系を確立したことで結果として側脳室由来脈絡叢上皮細胞は未分化性があること、第四脳室由来脈絡叢上皮細胞は増殖能が高いことがわかったので、未分化マーカーをターゲットとしてin vivoでの解析が行え、その結果、in vivoでも脊髄損傷に応答して特に側脳室の脈絡叢上皮細胞で未分化マーカーの発現が上がることがわかった。このことは本研究の最終到達点である脈絡叢の神経自己修復への寄与の解明に近付けたと言える。来年度以降の具体的なストラテジーも決まったことは有意義であった。(1)脊髄損傷モデルラットで側脳室と第四脳室の脈絡叢がそれぞれどのように反応するのかを損傷から経時的に、特に急性期を重点的に免疫組織化学やDNA microarray等で解析する。(2)培養細胞を用いて、側脳室由来脈絡叢上皮細胞が実際に各種細胞に分化するかを調べる。具体的には、側脳室由来脈絡叢上皮細胞を基本培地中で培養した後、神経細胞やグリア細胞への分化誘導培地に交換して培養を続け、最終的に免疫細胞化学染色でβ-tubulinやGFAP等の細胞マーカーを用いて分化を評価する。第四脳室由来脈絡叢上皮細胞との比較も行う。(3)側脳室および第四脳室由来脈絡叢上皮細胞の培養上清の神経突起伸長に対する効果の違いをラット海馬由来神経細胞初代培養系を用いて検討する。そのためにまず、ラットの側脳室と第四脳室の脈絡叢を採取し、それぞれの脈絡叢上皮細胞の初代培養の至適条件を検討し、培養系を確立した。次に、側脳室と第四脳室由来脈絡叢上皮細胞の性状の違いを調べるために、免疫細胞化学的な手法でタンパク質レベルでの発現の違いを比較検討した。その結果、驚くべきことに、側脳室由来の脈絡叢上皮細胞の多くは未分化マーカーとして知られるSox2を発現していたが、第四脳室由来の脈絡叢上皮細胞はSox2を全く発現していなかった。このことは、側脳室の脈絡叢上皮細胞は分化能を持った状態で待機し、脊髄損傷などの中枢神経系の障害時に目的部位に遊走し、必要な細胞に分化することで自己修復の一端を担っていることが示唆された。一方で、第四脳室由来の脈絡叢上皮細胞は、未分化性は示さなかったが増殖能は側脳室由来脈絡叢上皮細胞より高いことがわかった。第四脳室の脈絡叢はそれ自身が分化するのではなく、産生する液性因子を介して中枢神経系の再生に寄与していると予想される。このことは、今後培養上清の詳細な解析をして明らかにしていく必要がある。現在、側脳室と第四脳室由来脈絡叢上皮細胞のin vivoでの生理的な違いの解析を進めるとともに、脊髄損傷時の変化を解析中である。さらに、側脳室

由来脈絡叢上皮細胞が実際に他の細胞に分化するかを培養細胞レベルで検討する予定である。今年度は、側脳室と第四脳室由来の脈絡叢上皮細胞の初代培養系を確立したことで、それぞれの機能を細胞レベルで比較検討することが可能となった。当初は、先に脊髄損傷ラットの脈絡叢組織としての反応を発現遺伝子のプロファイリング等で網羅的に解析することを予定していたが、先に培養系を確立したことで結果として側脳室由来脈絡叢上皮細胞は未分化性があること、第四脳室由来脈絡叢上皮細胞は増殖能が高いことがわかったことは本研究の最終到達点である脈絡叢の神経自己修復への寄与の解明に近付けたと言える。来年度以降の具体的なストラテジーも決まったことは有意義であった。本研究の目的は、種々の栄養因子を含む脳脊髄液を産生している脈絡叢上皮細胞に着目し、脊髄損傷時におこる脈絡叢上皮細胞の応答を調べることで、本来持っている神経の自己再生メカニズムの一端を明らかにすることである。前年度には、ラットの側脳室と第四脳室の脈絡叢を採取し、それぞれの脈絡叢上皮細胞の初代培養系を確立し、免疫細胞化学的な手法でタンパク質レベルでの発現の違いを比較検討したところ、側脳室由来の脈絡叢上皮細胞の多くは未分化マーカーとして知られるSox2を発現していたが、第四脳室由来の脈絡叢上皮細胞はSox2を全く発現していないことを明らかにした。これを受けて、今年度はまず、側脳室と第四脳室由来脈絡叢上皮細胞のin vivoでの生理的な違いを調べるために、正常ラットの脳の凍結切片について免疫組織化学的な解析を行った。その結果、正常ラットではいずれの脳室の脈絡叢上皮細胞もほとんど未分化マーカーを発現しておらず、近傍の上衣細胞が発現していた。例外的に、SSEA-3は両脳室の脈絡叢上皮細胞の一部で発現が認められた。次に、脊髄損傷による反応をみるため、圧挫損傷を与えたラットの脳の凍結切片について免疫組織化学的な解析を行った。その結果、Sox9は両脳室の脈絡叢上皮細胞に同程度発現が認められた。一方で、SSEA-3は第四脳室よりも側脳室の脈絡叢上皮細胞で発現が増加した。これらのことから、in vivoでも脊髄損傷後に側脳室の脈絡叢上皮細胞で未分化マーカーの発現が高いことがわかった。今回、脊髄損傷から6週後(慢性期)のラットの脳のみを解析したため、今後さらに、急性期の脊髄損傷ラットも解析することで経時的な脈絡叢上皮細胞の反応を脳室ごとに明らかにしていく予定である。今年度は、前年度in vitroで明らかにした側脳室と第四脳室由来の脈絡叢上皮細胞の違いをin vivoで解析した。申請時は、先に脊髄損傷ラットの脈絡叢組織としての反応を発現遺伝子のプロファイリング等で網羅的に解析することを予定していたが、先に培養系を確立したことで結果として側脳室由来脈絡叢上皮細胞は未分化性があること、第四脳室由来脈絡叢上皮細胞は増殖能が高いことがわかったので、未分化マーカーをターゲットとしてin vivoでの解析が行え、その結果、in vivoでも脊髄損傷に応答して特に側脳室の脈絡叢上皮細胞で未分化マーカーの発現が上がることがわかった。このことは本研究の最終到達点である脈絡叢の神経自己修復への寄与の解明に近付けたと言える。(1)培養細胞を用いて、側脳室由来脈絡叢上皮細胞が実際に各種細胞に分化するかを調べる。具体的には、側脳室由来脈絡叢
Cas9人工転写オシレーターを用いたリズム発振原理の解明とその応用

本研究では、哺乳類細胞内にCRISPR/Cas9システムを応用した人工的な転写フィードバックループを作製し、人工転写オシレーター(振動体)を創出することによって、遺伝子発現リズムの発振原理を解明することを目的とする。今年度は前年度に引き続き、転写アクチベーターと転写リプレッサーの転写調節能を検討した。今年度までに人工遺伝子回路の作出には至らなかったが、今後引き続き検討すべき課題であると考えている。また、概日時計の転写フィードバックループについて、主要時計遺伝子の欠損細胞を作製し、欠損遺伝子を異所性に発現させるadd back実験から、シスエレメントの重要性についての新しい知見を得ることができた。さらに、概日転写フィードバックループに関与すると考えられている転写因子REV-ERBα/βについてCRISPR/Cas9システムによるノックアウト実験から、REV-ERBα/βが概日時計形成の必須因子ではないことを示す知見を得た。このことは、概日時計を構成する2つの転写ループのうちREV-ERBα/βの関与するサブループはPer2などの時計遺伝子の発現振動に必須ではない可能性を示しており、本研究で目指す単一の転写フィードバックループによる遺伝子発現振動の可能性をサポートする知見である。概日転写フィードバックループではE-boxやD-box、RREなどの転写制御シス配列に転写因子が結合するが、それらのリズム形成における重要性については不明な点も多く、本解析から遺伝子発現リズムの発振原理解明に繋がる知見が得られることが期待される。初年度は転写抑制因子のプロモーターに用いるsgRNAターゲット配列の選定を行った。また、作成済の転写アクチベーターと転写リプレッサーの転写調節能を検討した。sgRNA配列はホモロジー検索ツールであるbowtieやウェブで公開されているCRISPRターゲット配列の検索ツール(CRISPR direct (http://crispr.dbcls.jp/), CRISPR DESIGN (http://crispr.mit.edu:8079/))を用いてゲノム上に類似配列のないものを複数選定した。また、内在性遺伝子のプロモーターを標的とするsgRNAと人工転写因子を培養細胞に導入して、内在性遺伝子の発現を指標に転写調節能を検証した。その結果、転写リプレッサーによる転写抑制は見られたが、転写アクチベーターによる発現上昇は低いレベルにとどまっていた。この結果から、転写アクチベーターについてはさらなる検討が必要であると考えられた。人口転写オシレーターに使用するsgRNA配列の設計と転写因子活性の検証を行い、転写アクチベーターについてはさらなる最適化が必要であると考えられた。入手可能な種々のアクチベーターを含めたさらなる条件検討を行う作業によりやや進捗に遅れが出ているが、本研究は培養細胞を用いた実験系であるため、今後のキャッチアップは十分可能であると考えている。現在までに人工転写オシレーターに使用するsgRNA配列の設計と転写因子活性の検証を行っている。また、概日時計の転写フィードバックループモデルに関するデータから、遺伝子発現リズムの発振原理の理解に繋がる知見を得た。人工転写因子のさらなる条件検討を行う作業によりやや進捗に遅れが出ているが、今後のキャッチアップは十分可能であると考えている。設計したsgRNA

配列による転写制御が可能かどうか、細胞に導入して検証する。また、転写アクチベーターについては、使用する転写活性化ドメインなどに様々なタイプのものが開発されており、Addgene等で入手可能となっている。これらの転写アクチベーターについても入手して転写活性化能を検証する。少なくとも2倍以上の転写活性化を誘導できるシステムを用いて転写ネットワークの導入を行う。設計したsgRNA配列による転写制御が可能かどうか、ヒトU2OS細胞に導入して検証する。転写アクチベーター、転写リプレッサーとともに発光レポーターを細胞に導入し、転写制御能を検証する。少なくとも1細胞レベルで発光が検出可能となる発現制御を行えるよう、導入レポーターのプロモーターや転写アクチベーターの誘導レベルなどの条件検討を行う。人工転写因子の条件検討に時間を要し、細胞への導入実験等を次年度以降に行うこととなったため。(理由)人工転写因子の条件検討に時間を要し、大規模な細胞への導入実験は次年度に行うこととなったため。(使用計画)人口転写因子発現ベクターの作製と細胞への導入実験についての条件検討および転写活性測定実験に充当する。人口転写因子発現ベクターの作製と細胞への導入実験、転写活性測定実験に充当する。
死にゆくがん細胞が発信するがん制御ネットワーク機構の遺伝的基盤

多細胞生物において、死にゆく細胞はその死の代償として周辺細胞の増殖を促す「代償性増殖」によって組織の正常発生や恒常性維持を制御しており、その分子機構が近年わかってきた。最近、このような生体恒常性維持機構としての代償性増殖システムががんの発生・進展にも関与する可能性が示唆されている。しかしながら、代償性増殖によるがん進展制御の分子基盤はよくわかっていない。そこで本研究では、ショウジョウバエ上皮をモデルとして死にゆくがん細胞とその周辺細胞との相互作用によるがん進展機構を生体レベルで明らかにすることを目的とした。前年度に細胞死を起点とした腫瘍悪性化メカニズムに関わる普遍的な因子を明らかにするため、これまでの解析で死細胞を起点として悪性度が変化することが分かっているSrc活性化細胞クローンとRas活性化細胞クローンに関して、それらの細胞集団の周辺細胞にEMSベースのランダムな突然変異を導入し、細胞死を起点としてRasもしくはSrc活性化細胞クローンの悪性化を誘発する変異体を単離する遺伝学的スクリーニングを実施した。約2000系統をスクリーニングした結果、Ras活性化細胞クローンの腫瘍悪性化を誘発する変異体を5系統、Src活性化細胞クローンの腫瘍悪性化を引き起こす変異体を4系統単離している。当該年度は、Src活性化細胞クローンに関して腫瘍悪性化を引き起こす変異体として新たに3系統を単離することに成功した。これら一連の変異体に関して次世代シークエンサーを用いてその責任遺伝子を探索し同定するに至った。さらに興味深いことに、死細胞の周辺には血球細胞が浸潤しヘテロな細胞集団によってがん微小環境が構築されていることを見出した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。多細胞生物において、死にゆく細胞はその死の代償として周辺細胞の増殖を促す「代償性増殖」によって組織の正常発生や恒常性維持を制御しており、その分子機構が分かってきた。最近、このような生体恒常性維持機構としての代償性増殖システムががんの発生・進行にも関わっている可能性が示唆されている。しかしながら、代償性増殖によるがん進展制御の分子基盤はよく分かっていない。そこで本研究は、死にゆくがん細胞とその周辺の細胞との相互作用によるがん進展機構を生体レベルで明らかにすることを目的とした。当該年度では、まずショウジョウバエの遺伝的モザイク手法を用いることでショウジョウバエ上皮に2種類のがん原性細胞集団を誘導し腫瘍内不均一性を生体レベルで再現し、死にゆくがん原性細胞と共存した時に腫瘍悪性化能を獲得する腫瘍細胞を探索した。これまでに、がん遺伝子Srcを活性化した細胞集団(Src活性化細胞)は正常細胞(野生型細胞)と隣接すると細胞死を引き起こして組織中から消失していくことが分かっている。そこでSrc活性化細胞と隣接するように異なるがん原性細胞を誘導したところ、がん遺伝子であるRasが活性化した細胞集団(Ras活性化細胞)はSrc活性化細胞と隣接した時に隣接組織である中枢神経系へと浸潤・転移した。さらに興味深いことに、このときRas活性化細胞集団のみならずSrc活性化細胞も細胞死を回避して腫瘍悪性化能を獲得することが分かった。すなわち、Src活性化細胞がもつ細胞死誘導性のシグナルがRas活性化細胞に腫瘍悪性化能を付加させる一方で、Ras活性化細胞も何らかの機構を介してSrc活性化細胞に悪性化能を誘導することが示唆された。当初の研究計画通り生体レベルで腫瘍内不均一性を再現し、がん原性細胞の細胞死が起点となりが腫瘍悪性化能を獲得する2種類の異なるがん原性細胞を同定した。さらに、この腫瘍悪性化には互いの細胞同士の相互作用が重要であることを見出している。これらの理由から当初の予定通り順調に進展しているといえる。当該年度は、前年度で見出したRas活性化細胞クローンの腫瘍悪性化メカニズムを明らかにすることに成功した。具体的には、Src活性化細胞クローンがJNK依存的な細胞死を引き起こす一方で炎症性サイトカインであるIL-6を放出し、これがRas活性化細胞クローンの悪性化を引き起こすことを見出した。一方で、細胞死を起点とした腫瘍悪性化メカニズムを明らかにするため、Src活性化細胞クローンとRas活性化細胞クローンの周辺細胞にランダムに突然変異を導入し、RasもしくはSrc活性化細胞クローンの悪性化を誘発する変異体を単離する遺伝学的スクリーニングを実施した。約2000系統をスクリーニングした結果、Ras活性化細胞クローンの腫瘍悪性化を誘発する変異体を5系統、Src活性化細胞クローンの腫瘍悪性化を引き起こす変異体を4系統単離することに成功した。さらに、単離された9系統の中の7系統の変異細胞は細胞死を引き起こしつつ、周辺の腫瘍細胞に悪性化能を付加していることが示唆された。生体レベルで細胞死が起点となり生じる腫瘍悪性化の分子メカニズムを明らかにしつつあると共に、本現象に関わる因子を網羅的に探索する遺伝学的スクリーニングによって複数の変異体を単離することに成功した。

現在その変異体の責任遺伝子の同定と分子メカニズムの解析が順調に進んでいるため。多細胞生物において、死にゆく細胞はその死の代償として周辺細胞の増殖を促す「代償性増殖」によって組織の正常発生や恒常性維持を制御しており、その分子機構が近年わかってきた。最近、このような生体恒常性維持機構としての代償性増殖システムががんの発生・進展にも関与する可能性が示唆されている。しかしながら、代償性増殖によるがん進展制御の分子基盤はよくわかっていない。そこで本研究では、ショウジョウバエ上皮をモデルとして死にゆくがん細胞とその周辺細胞との相互作用によるがん進展機構を生体レベルで明らかにすることを目的とした。前年度に細胞死を起点とした腫瘍悪性化メカニズムに関わる普遍的な因子を明らかにするため、これまでの解析で死細胞を起点として悪性度が変化することが分かっているSrc活性化細胞クローンとRas活性化細胞クローンに関して、それらの細胞集団の周辺細胞にEMSベースのランダムな突然変異を導入し、細胞死を起点としてRasもしくはSrc活性化細胞クローンの悪性化を誘発する変異体を単離する遺伝学的スクリーニングを実施した。約2000系統をスクリーニングした結果、Ras活性化細胞クローンの腫瘍悪性化を誘発する変異体を5系統、Src活性化細胞クローンの腫瘍悪性化を引き起こす変異体を4系統単離している。当該年度は、Src活性化細胞クローンに関して腫瘍悪性化を引き起こす変異体として新たに3系統を単離することに成功した。これら一連の変異体に関して次世代シークエンサーを用いてその責任遺伝子を探索し同定するに至った。さらに興味深いことに、死細胞の周辺には血球細胞が浸潤しヘテロな細胞集団によってがん微小環境が構築されていることを見出した。今後は、Ras活性化細胞とSrc活性化細胞の相互作用を解析し、腫瘍悪性化メカニズムを明らかにする。具体的には、細胞間相互作用により活性化するシグナル伝達経路や代償性増殖に関連するシグナル伝達経路に着目し、腫瘍悪性化能に対するそれらの関与を解析していく。もしこれらのシグナル伝達経路に変化が認められない場合は、染色体欠失系統を用いた遺伝学的スクリーニングを展開していく。今後はSrc活性化細胞集団の腫瘍悪性化メカニズムを周辺細胞、さらにその微小環境との相互的なシグナルネットワークに着目し解析していくと共に、単離した変異体の責任遺伝子の同定とその分子メカニズムを遺伝学的解析により明らかにしていく。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
ポリマー保護鉄硫黄クラスターを用いた窒素分子の活性化

1、研究成果の具体的内容当該研究室においては、ニトロゲナーゼP-clusterと同様のクラスター骨格を持つ[8Fe-7S]型クラスターが既に合成されている。そこで当該研究の予備実験として、このクラスターを用いたポリマー保護化を検討した。クラスターをトルエンに溶液させた後、ポリスチレンのトルエン溶液を加え、70°Cで撹拌したところ、予定通り、ポリマー保護体が生成した。この保護体のTHF溶解に対して、ルチジン塩酸塩およびデカメチルコバルトセンを両者の化学量論比が1:1となるように加え、室温で30分間反応させた。反応系の気相部分をガスタイトシリンジで採取し、ガスクロマトグラフィーを行ったところ、本反応において、水素分子が発生していることが確認された。比較実験のため、ポリマー保護していないクラスターの存在下で同様の反応を行った場合には、水素分子の生成は確認されなかった。2、研究成果の意義と重要性当該研究において用いる鉄硫黄クラスターの無機骨格は、かさ高いチオラート配位子によって覆われている。このクラスターに対してプロトンを反応させると、チオラート配位子がチオールとして遊離してしまう。その結果、クラスターの無機骨格表面がさらされることになるため、クラスター骨格は不安定化され、速やかに崩壊する。当該研究において工夫したポリマー保護化は、この問題点を解決するための方策であり、チオラートに比べて高い塩基性を示すアミド配位子が鉄に配位した化合物を用いて、プロトン耐性を確認できたのは、その研究指針が正しかったことを裏付ける成果である。1、研究成果の具体的内容鉄ビスアミド錯体に対してベンゼンチオールの2,6位がメシチル基で置換されたDmpチオールおよび同じ部分をトリメチルシリル基に置換したBtpチオールをそれぞれ1当量ずつ反応させ、2種類のチオラート配位子を持つ鉄錯体を合成した。この錯体に対して無機硫黄をトルエン中で加えたところ、4つの鉄と3つの硫黄で構成される不完全キュバン型のユニット2つが、6配位の硫黄原子で連結され、さらに1つのスルフィド配位子、2つのDmpチオラート配位子がユニット間を架橋した鉄硫黄クラスターが得られた。また、2つのDmpチオラートを持つ鉄錯体からも同じクラスターが生成しやすいこともあわせて見出した。2、研究成果の意義と重要性本研究の目的は、鉄硫黄クラスターを用いて窒素分子をアンモニアへと触媒的に変換することであり、そのためには基質をクラスターに捕捉させることが必要である。これまではBtpチオールに比べてかさの低いチオール類(例えばメシチルチオール)をDmpチオールと共に用いており、これらを持つ鉄錯体と無機硫黄との反応では、2つの不完全キュバン型ユニットが3つのチオラートで架橋されたクラスターが得られていた。このクラスターの無機骨格はほぼ完全に有機配位子で覆われているため、このままでは基質の取り込みは困難なように思われる。一方、架橋配位子としてスルフィドを持つクラスターの無機骨格はその一部が表面にさらされており、基質が骨格へと近づきやすくなる分、より有利に働くと考えられる。その意味で当該年度の成果は意義のあるものであり、新たに得られた鉄硫黄クラスタ一はより効率的な窒素分子の活性化を達成する上で重要な化合物であると位置づけられる。
舌-乳首接触圧計測システムの開発を通じた哺乳時の乳児舌運動メカニズムの解明

乳児の吸啜時における舌の運動機能を解明するために、小型力センサを複数個内蔵した人工乳首を開発し、PCをベースとした舌-人工乳首の接触圧をリアルタイムで計測できるシステムを構築した。計測を行った結果、それぞれの力センサからは、舌の蠕動様運動を示す単振動に近い圧力波形が観測され、起因する吸啜周期は1秒間に約2回であった。また、低出生体重児においては、成長に伴って圧力の値に変化が見られた。乳児の成長過程において栄養管理は極めて重要であるが,とりわけ低出生体重児は、母乳や人工乳を哺乳する「哺乳行動」に課題を抱えている割合が多く、健やかな成長の妨げとなる.このような背景から「哺乳行動の理解」は必要不可欠といえるが、実際は解明されていない点が多い。従来の研究より,哺乳行動は舌運動が主体となることが判明しているが,その力学的詳細は不明である.本年度の研究においては、小型圧力センサを複数内蔵した人工乳首を開発し、乳児が哺乳時において乳首の「どの部位に」「どの程度の圧力をかけているか」を計測して、哺乳時における乳児の舌運動について、その力学的特徴の抽出を試みた。すなわち,舌-人工乳首の接触圧をリアルタイムに計測できるPCベースのポータブルなシステムを構築し,複数の乳児に実際の計測を行った.力センサは,ステンレス薄板を梁とした片持ち梁を使用しており,汎用箔ひずみゲージを梁の表面に貼付している.各力センサの信号は増幅され,USBを経由してPCに入力される.本システムを用いて,新生児および乳児に対して計測を行った結果,すべての被験児において出力信号の波形が観測され,一秒間に約2回の吸啜回数が示された.また,経口哺乳が確立した乳児においては,舌の蠕動様運動を不す圧力波形が観測された.なお,計測例すべてにおいて舌尖部より舌根部の接触圧が大きい結果となった.これらの成果を英文学術論文および和文学術論文それぞれ1件投稿して採録された.さらに,国内における学会発表を1件行った.乳児の成長過程において栄養管理は極めて重要であるが「とりわけ低出生体重児は,母乳や人工乳を哺乳する「哺乳行動」に課題を抱えている割合が多く,健やかな成長の妨げとなる.このような背景から「哺乳行動の理解」は必要不可欠といえ,中でも哺乳時において主体的に働く舌の運動計測は極めて重要である.本年度の研究では,舌運動の力学的計測システムの最終形態を開発するとともに,臨床でも利用可能な計測環境の構築を試みた.本研究における成果を以下に示す.1片持ち梁式力センサの小型化と特性評価哺乳時において,舌が人工乳首に与える力を計測するために,小型力センサの開発を行った.梁や人工乳首の材質を最検討した結果,センサの動特性は13msに向上し,より詳細な舌運動計測が可能となった.2計測システムの構築マルチセンサに対応した信号処理装置を構築し,ほぼリアルタイムで計測結果を表示可能となった.具体的には,センサから得られた信号を増幅し,A/D変換するための信号処理装置の開発および組み込みシステムを導入した小型化を図ることに成功した.この成果により,臨床現場でも用いることができる可能性を示した.3新しい力センサの試作人工乳首の表面に対して垂直な力成分を抽出するために,新しくベアリング球を用いたセンシングユニットを試作した.これによって片持ち梁形式のセンサよりも堅牢さを増すことも可能となった.さらに,データロガ,液晶表示器を含めた信号処理装置一体型の小型計測装置の開発目処がたった.昨年度までの研究において,舌が人工乳首下部から与える圧力分布の推定に成功し,経口哺乳が確立した乳児においては舌の蠕動様運動を示す信号波形が観測された.力センサが舌尖および舌根部に接するよう2つ縦列に並べた場合,計測例すべてにおいて,舌尖部より舌根部の接触圧が大きく,吸啜周期は1秒間に2回程度であることが示された.さらに,4つのセンサを左右対称の二次元マトリックス様に並べ,被験児それぞれについて,圧力の左右差に関する検討を加えることが可能となった.本年度では,舌が人工乳首の表面に接触する部位に多数の力センサを設けた人工乳首を開発し,舌が人工乳首に与える力をマルチポイントで時系列的に計測することを目的として,正六角柱の3つの側面に力センサを縦列に2個ずつ配置し,合計6個の力センサを内蔵したセンサユニットを試作して,乳首表面における舌の蠕動様運動での力分布を時系列計測を試みた.被験児は,すでに経口哺乳が確立している乳児である.なお,被験児の親に対し,研究の目的および方法を説明し,実験に関する同意書へ署名ののち,計測を行った.その結果,力波形から,乳首の根元部に配置したセンサに次いで先端部に配置したセンサの順で最大値に達していることが判明した.

これは,正六角柱の3つの側面すべてにおいて,舌の蠕動様運動を立体的に捉えた結果である.すなわち,舌が乳首を包み込み,その後,乳首下部に大きな力を加えることが明らかとなった.今後は被験児を増やして,傾向を分析することが主務となる.当初目的としていた,力センサの小型化,高性能化に成功し,より詳細な舌運動計測が可能となった.さらには臨床現場に持ち込んでも有用なリアルタイム計測システムの構築にも成功し,組み込みシステムへの応用も半ば達成した.作業自体は計画以上に進んでいる.ただし,研究成果の公表においては,さらなる積極的な方策が必要と考えている.24年度が最終年度であるため、記入しない。研究遂行について,システム構築の作業は現場のペースを維持しつつ,ベアリング球を用いた新しいセンサの実用化を図る.また,研究成果をわかりやすく国民に知らせるため,研究の目的,概要,結果をWebページに掲載する.その場合は,被験者の個人情報保護に務める.また,被験者について,研究協力者と十分に相談し,健常児とそのように分類できない児の相違点を体系化し,吸啜異常の診断支援システムの構築を試みる.24年度が最終年度であるため、記入しない。
高時間分解能データを用いたサブストームに伴う磁気圏尾部ダイナミクスの研究

1.サブストームにおける近尾部でのプラズマ過程を調べるために、1992-2000年のGEOTAILデータから、|X|が11Re以下,|Y|が5Re以下の位置で観測されたはっきりしたdipolarizationを21例選び、その詳細を調べた。その結果、(1)磁場のdipolarizationは、数分10分程度継続する速い磁場変動をしばしば伴っていること、(2)この磁場変動は数秒程度の磁場の急激な増大や減少で形成され、振幅はしばしば10nTに達すること、(3)磁場のelevationangleが増大(dipolarization)する直前に、数秒-10秒程度の短い時間であるが、elevation angleが大きく減少する例が複数ある(explosive growth phase)こと、(4)この磁場変動は、特に磁場の弱い領域で起きている場合、地球向きのconvective flowを伴っていること、などがわかった。2.特にこの中の1例に関して、64Hzサンプルの電場生データを詳しく解析した結果、周期が5Hz程度の特徴的な電場の振動が、1-5mV/mという大きな振幅をもって発生していることがわかった。この振動が、tail currentの流れを妨げて、観測されたような特徴的な磁場elevation angleの減少を引き起こした可能性があり、今後、粒子シミュレーションとの比較を行っていく予定である。3.上記のデータ解析ではいくつかの観測事実を明らかにしたが、同時に、GEOTAILを含めたこれまでの人工衛星データでは、10Reよりも内側でサブストームに伴って起きている現象の成因について、決定的な結論を出すことは難しいことがわかった。このため、新たに10Reよりも内側の内部磁気圏を集中的に探査する人工衛星計画を提案し、その具体化について検討を重ねた。サブストームにおけるX=-10Re付近の近尾部でのプラズマ過程を調べるために、1992-2000年のGEOTAILデータ(磁場、電場、プラズマモーメント)を宇宙科学研究所よりコピーし、約50GBの解析用データベースを作成した。このデータベースの中から、|X|が11Re以下,|Y|が5Re以下の位置で観測された、はっきりしたdipolarizationを21例選び、その詳細を調べた。この際GEOTAILの磁場データは、高時間分解能である16Hzサンプルのデータを用いた。また、地上の磁場チェーン(CANOPUS,WDC,GADC,MM210,IMAGE)やPOLAR UVI,GOES等のデータを用いて、サブストームとの関連をチェックした。これらのデータの解析から、以下のようなことが明らかになってきた。1.磁場のdipolarizationは、数分10分程度継続する速い磁場変動をしばしば伴っている。2.この磁場変動の振幅は、周囲の磁場強度が弱いほど(neutral sheetに近いほど)大きい。3.この磁場変動は、サインカーブではなく、急激な増大や減少といったスパイク状の変動で形成され、スパイクの時間は数秒程度、振幅はしばしば10nTに達する。スパイクの起こる周期は5-20秒程度であった。4.この磁場変動は、特に磁場の弱い領域で起きている場合、地球向きのconvective flowを伴っている。このflowの速度は300km/s以下であった。5.1995年7月5日と1997年7月30日のイベントでは、プラズマデータから粒子圧を決定することができた。この2例では、速い磁場変動の前までは全圧力(磁気圧+粒子圧)はゆっくりと減少し、この磁場変動の最中と後(dipolarizationの最中と後)には、全圧力は増大していた。・昨年に引き続き、サブストームにおけるX=-10Re付近の近尾部でのプラズマ過程を調べるために、宇宙科学研究所からコピーした1992-2000年のGEOTAILデータ(磁場、電場、プラズマモーメント)の解析を行った。

|X|が11Re以下,|X|が5Re以下の位置で観測された、はっきりしたdipolarizationの21例について、時系列解析を行うことにより、このdiporalizationに伴う数十秒一分程度の周期の振動現象の空間スケール(空間波長)が、数Re程度であることがわかった。また、大部分の例で、この振動現象がdiamagnetic(磁気圧と粒子圧の変動が逆相関)であることがわかった。・上記のデータ解析ではいくつかの観測事実を明らかにしたが、同時に、GEOTAILを含めたこれまでの人工衛星データでは、10Reよりも内側でサブストームに伴って起きている現象の成因について、決定的な結論を出すことは難しいことがわかった。このため、新たに10Reよりも内側の内部磁気圏を集中的に探査する人工衛星計画を提案し、その具体化について検討を重ねた。その結果、ピギーバック型の2機の衛星(重量約80kg)に粒子、磁場、電場、波動観測器を搭載し、内部磁気圏を探査する赤道軌道に投入する衛星計画案を立案した。1.X=-10Re付近,|Y|が5Re以下の位置で観測された、はっきりしたdipolarizationの21例について、時系列解析を行い、特に、磁場のelevation angleが増大(dipolarization)する直前に、数秒-10秒程度の短い時間であるが、elevation angleが大きく減少する例が複数あることを見いだした。このような現象は、以前、AMPTE/CCE衛星によって10Reよりも内側で報告されたexplosivegrowthphaseと呼ばれる現象とよく似ているが、今回は、それが1回ではなく、一連の変動の中で複数回起きていることもわかった。2.特にこの中の99年8月31日に観測されたイベントに関して、より高時間分解能である64Hzサンプルの電場生データと128Hzサンプルのサーチコイル磁場データを詳しく解析した。サーチコイル磁場データから、このexplosive growthphaseのさいに低周波波動の振幅が大きく増大していることがわかった。更に電場のデータから、この時に、周期が5Hz程度の特徴的な電場の振動が、1-5mV/mという大きな振幅をもって卓越していた。この振動が、磁気圏尾部を流れる電流tail currentの流れを妨げて、観測されたような特徴的な磁場elevation angleの減少を引き起こした可能性が示された。
大都市における地下鉄開発に伴う自転車問題に関する研究-放置自転車対策と自転車駐車場の有料化施策に対する利用者意識からの検討

地下鉄は都市機能への影響が最小の高速で輸送効率の高い公共交通機関として注目を浴び、全国的に開発が相次いでいるが、既にある都市空間の中に新たに駅を開設するため、同時に自転車の駐車空間を確保することは非常に困難な状況にある。加えて、駅への端末交通としての自転車利用の増加は社会的にも公共施設機能の低下、通行上の障害や都市景観の悪化などの原因となり、問題は深刻である。この問題に対し、自転車放置禁止区域の設定や巨転車駐車場の有料化が実施され、その効果が期待されているが、このような行政的な問題解決の取り組みには限界があり、最大限の効果を発揮するには、利用者の理解と協力が大前提である。本年度は、前年度調査した、名古屋市内の主要鉄道駅における自転車駐車場の設置状況や利用状況あるいは放置状況などから、駅への自転車利用の抑制効果の分析などを進め、有料化は利用抑制にはある程度の効果があるが放置抑制の効果は少ないことなどを明らかにするとともに、全国の81自治体の自転車問題施策と財政的負担状況について調査したデータの分析を進め、年間その自治体の世帯数の約1/10に相当する数の自転車を放置自転車として強制撤去していることや放置自転車の撤去に1台あたり数千円の費用を費やしていることなどの実態を明らかにした。また、一般住民の自転車問題に対する意識を把握することを目的にアンケート調査を実施した。本調査は駅に付随する自転車駐車場の形態が有料であるか無料であるか、放置自転車の量が多いか少ないかなどの点で異なる地下鉄駅周辺の住民を対象に行った。その結果として、一般住民の自転車問題に対する意識は、非常に深刻に考え駐輪場の有料化に肯定的である人から、全く問題視することなく有料化に否定的である人まで多様な意見が存在することが明らかとなり、自転車の放置抑制、あるいは適正利用において、一般住民に自転車問題の深刻さや重要さを如何に周知させるかが大きな課題であることなどを指摘した。地下鉄は都市機能への影響が最小の高速で輸送効率の高い公共交通機関として注目を浴び、全国的に開発が相次いでいるが、既にある都市空間の中に新たに駅を開設するため、同時に自転車の駐車空間を碓保することは非常に困難な状況にある。そのため、放置自転車は社会的にも公共施設機能の低下、通行上の障害や都市景観の悪化などの原因となり、問題は深刻である。自転車放置禁止区域の設定や自転車駐車場の有料が実施され、その効果が期待されているが、このような行政的な問題解決の取り組みには限界があり、最大限の効果を発揮するには、利用者の理解と協力が大前提である。本年度は、放置自転車の現状の実情を整理し把握するという第1段階の目的を達成するために、自転車利用者、自転車駐車場形態、鉄道駅形態の相互関係について、名古屋市内の主要鉄道駅において、ヒヤリングや写真撮影、自転車駐車場状況調査を行うとともに、関連する各種統計資料・文献の収集・整理を通して、自転車駐車場の設置状況や利用状況、放置自転車の現状を把握した。また、地下鉄開発が行われている主要都市(京都、福岡、札幌等)の実情についても現地調査を行うとともに、大都市・中都市を対象に、鉄道駅に周辺のおける自転車放置の現状、自転車駐車場の整備状況、有料自転車駐車の運営、さらに、自転車対策費等についての資料収集を行った。その結果、新規開通の地下鉄駅はもとより、既存の駅周辺においても、放置自転車問題が表面化し、年間l万台を越える放置自転車を撤去し、自転車駐車場の整備や運営のために年間数億円の経費を費やしている都市も少なくなく、ほとんどの都市で、深刻な問題となっていることが、明らかとなった。また、自転車問題の解決には、利用者の理解と協力が不可欠であるという立場から、次年度実施する予定である利用者意識調査の予備調査を実施し、次年度実施予定の意識調査の調査項目の検討を行った。

その結果として、一般住民の自転車問題に対する意識は、非常に深刻に考え駐輪場の有料化に肯定的である人から、全く問題視することなく有料化に否定的である人まで多様な意見が存在することが明らかとなり、自転車の放置抑制、あるいは適正利用において、一般住民に自転車問題の深刻さや重要さを如何に周知させるかが大きな課題であることなどを指摘した。
高感度CCDマイクロスコープによる心筋虚血発生メカニズムの解析

心筋内で虚血や血流分布に局在性が生じるメカニズムを検討するために、実験動物を用いて心筋内ことに心内膜側心筋において、虚血の直接原因である微小血管の挙動と血流をニードル型CCDマイクロスコープを用いて観測した。ニードル型レンズを血管に軽く接触させることによる機械的な血管傷害を防ぐための衝撃吸収バルーン付きシースと、観察部位の代謝環境を生理的に保ち、良好な視野を確保するための生理的緩衝液フラッシュシステムを開発・応用することによって、冠微小血管を長時間にわたって安定した状態で観察できた。血管を観測する際、1)グリーンフィルターの採用、2)FITCデキストランの冠動脈内投与、3)インドシアニングリーンの冠動脈内投与および左心房内投与によって血管コントラストが増強され、細動・静脈の識別と血管径変化の計測が容易になった。ニトログリセリンの冠微小血管に対する効果を検討したところ、ニトログリセリンは心外膜側だけでなく心内膜側の細動脈も著しく拡張させることが明かになった。また、ニトログリセリンは心内膜側細動脈の心拍動に伴う拍動振幅も増加させた。さらに、ニトログリセリンは細動脈だけでなく細静脈も拡張させる可能性が示された。ニトログリセリンの心筋内細静脈に対する効果についてはこれまでほとんど検討されていないことから、今後、詳細に解析する必要があると考えられた。心内膜側の血流動態については、コントラストの高いIndia inkを血流マーカーとして使用することにより、心筋内だけでなく、心筋内から心腔内へ向かうThebesian静脈血流を描出できる可能性が示された。平成4年度は、拍動心の冠血管を傷害することなく安定して観察することができる方法論の確立を目的として実験を行なった。すなわち、麻酔開胸犬あるいはブタを対象に、ニードル型CCDマイクロスコープ(日本光電、直径4.5mm、510x492画素、200-400倍)で心外膜側だけでなく心内膜側の細動・静脈を観察した。ニードル型CCDマイクロスコープを用いてin-vivoで血管を観察する時には、ニードル型レンズを血管に軽く接触させるが、これによる機械的な血管傷害を防ぐために、衝撃吸収のためのバルーンを先端に装着したシースを開発した。また、観察中の血管および血管周囲組織の代謝環境を生理的に保ち、良好な視野を確保する目的で、生理的緩衝液を任意の温度に調節してスコープの先端から観察部に流すフラッシュシステムを開発・応用した。以上の手段によって、心表面の血管を長時間にわたって安定した状態で観察できることが明らかになった。次いで心筋内の深い部位を走行する微小血管のコントラストの増強を計るために、1)グリーンフィルターの採用、2)FITCデキストランの冠動脈内投与、3)インドシアニングリーンの冠動脈内投与および左心房内投与を試みた。その結果、1)、2)、3)のいずれの方法でも血管のコントラストを増強する効果が認められ、血管辺縁の識別を容易にした。また、FITCデキストランとインドシアニングリーンは冠動脈内に投与すると、これらが血管内を通過する順序と方向とから細動脈と細静脈との識別に有用であることが示された。以上の成果をもとに、拍動心の微小冠血管を観測した結果、心外膜側では細動・静脈血管径は心周期を通じてあまり変化しないが、心内膜側では心筋収縮によって細動・静脈の血管径が約20%小さくなることが明かになった。心筋内で虚血や血流分布に局在性が生じるメカニズムを検討するために、心筋内ことに心内膜側心筋において、虚血の直接原因である微小血管の挙動と血流をCCDマイクロスコープを用いて観測した。

心腔側心筋内の血管・血流動態の観測の要点を記すと、麻酔開胸犬の左心房からニードル型CCDマイクロスコープを左心室内膜側へ導き、心内膜側の細動脈、細静脈を直接観察した。その際、1)グリーンフィルターの採用、2)FITCデキストランの冠動脈内投与、3)インドシアニングリーンの冠動脈内投与および左心房内投与によって血管のコントラストを増強し、これによって細動・静脈の識別と血管径変化の計測が容易になった。ニトログリセリンの冠微小血管に対する効果を検討したところ、ニトログリセリンは心外膜側だけでなく心内膜側の細動脈も著しく拡張させることが明かになった。また、ニトログリセリンの心内膜側細動脈に対する拡張作用は血管のサイズによって異なることが示された。すなわち、ニトログリセリンは比較的太い細動脈(内径100ミクロン以上)に対する拡張作用が強く、細い細動脈(内径100ミクロン以下)に対する作用は一過性で、しかも相対的に軽微であることが示された。また、ニトログリセリンは心内膜側細動脈の心拍動に伴う拍動振幅も増加させた。さらに、ニトログリセリンは細動脈だけでなく細静脈も拡張させる可能性が示された。ニトログリセリンの心筋内細静脈に対する効果についてはこれまでほとんど検討されていないことから、今後、詳細に解析する必要があると考えられた。心内膜側の血流動態については、コントラストの高いIndia inkを血流マーカーとして使用することにより、心筋内だけでなく、心筋内から心腔内へ向かうThebesian静脈血流を描出できる可能性が示された。