hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
コンピュータの活用による英語学習者に対する自律的動機付けの向上に関する縦断的研究

当研究を踏まえて明らかになったのは、コンピュータでストラテジーを与えることによって学習者にある程度の動機付けに繋がるが、与えられているストラテジーを十分に利用することができない。学習方法を改善方法がわからない限りは、自律性が生まれない。そこで、そのストラテジーについて話し合う場を与えることで、タスクにより積極的に取り組めるようにもなり、自分の学習プロセスについて考えられるようになる。そういうことによって、実際に使っているストラテジーを振り替え、自律性の発達に繋がると思われる。このプロジェクトの目的は、学習者各自で確認できるプロフィールの作成によって、の英語に関する自律的動機付けを保てるかどうかを調査することである。平成25年度は、計画に書かれた2つ目のステージであり、前年度に開発したデータベースを拡大し、それにリーディング・ライティングの機能を付け加えることになった。この計画に従い、まずはデータベースの拡大構造に挑んだ。前年度に使用されていた語彙のものを基に作成し、データベースの入れる語彙と文法と、英語の意味、和訳、音声など、それから学習者用のインターフェースのデザインに励んだ。その作成の過程について、5年に一度しか開催されない、イギリスにてWorldCALLの国際学会大会で発表をした。9月の秋学期から学習者との実際の使用を始めた。システム自体が安定していて、問題はなかったが、今年度も学習者は当初思ったほど使用としなかったため、アンケート・インタビューなどで、さらに理由を探った。前年度の調査の結果を踏まえて、スマートフォンを利用してもシステムが問題なく作動することができるようになった。学習者がスマートフォンを使用するにあたって、どのようにデザインしたらいいのかを、スタンフード大学のPhilip Hubbard教授と共同で論文を執筆した。まだ課題が残っていたため、モーバイル・ラーニングの専門家である、オーストラリアのMike Levy教授とMichael Harrington教授と打合せをし、改善に向けて打合せを行った。平成24年度は、計画に書かれた1つ目のステージであり、語彙・文法のテータベースを設計した上、小規模でデータベースを実験的に使用することであった。この計画に従い、まずはデータベースの構造に挑んだ。以前のプロジェクトで使用されていた語彙のものを基に作成する予定ではあったが、文法が入ることによって、多少の困難があったため、ベルギーにいらっしゃる、語学学習のデータベースの専門家であるJozef Colpaert教授と相談し、問題を解決することができた。データベースの入れる語彙と文法と、英語の意味、和訳、音声など、それから学習者用のインターフェースのデザインに励んだ。その作成の過程について、国内のJALTCALLの学会で中間発表を行った。9月の秋学期から1年生の45人の学習者との実際の使用を始めた。システム自体が安定していて、問題はなかったが、アクセス記録を確認したところ、学習者は当初思ったほど使用としなかったため、アンケートなどで、その理由を探った。システムに関しては不満や指摘するところはほとんどなかったが、自宅にパソコンを持っていない学習者が少なくなく、スマートフォンで教材を使用する学習者が多かったことが判明した。そこで、システムをスマートフォンを利用しても問題なく作動する必要があると判断し、モーバイル・ラーニングの専門家である、オーストラリアのMike Levy教授とMichael Harrington教授と打合せをし、今後のモーバイル・ラーニングの部分に関する論文の執筆について打合せを行った。このプロジェクトの目的は、学習者各自で確認できるプロフィールの作成によって、英語に関する自律的動機付けを保てるかどうかを調査することである。平成26年度は、計画に書かれた最終のステージであり、前年度の経験を踏まえてデータベースを改造し、それにリーディング・ライティングの機能をさらに工夫することになった。前年度中に語彙と文法と、英語の意味、和訳、音声などをデータベースに入力したのですが、インターフェースのデザインに工夫する必要があった。前年度に実際に使ってみたらわかったのは、学習者に具体的なトレーニングが必要だということだった。そのため、今年度中にソフトの使い方のみならず、学習方法についても具体的なトレーニングも提供した。このデータベースのデザインを経てわかったガイドラインを6月に名古屋で開催されたJALTCALL学会大会と、ベトナムで開催されたティーチャー・エデュケーション・セミナーで研究発表した。学習者のトレーニングについては、スタンフード大学のPhilip Hubbard教授とベルギーで開催されたインターナショナル・コール・カンファレンスで研究結果を発表した。引き続きデータを分析した結果、学習者にはテクニカル的な面のみならず、教育的な面と方略的な面を一緒に指導すると、学習者が継続的に学習に挑む確率が高いことがわかった。そのために、教員と学習者との間のダイアログを持つ機会を設ける必要がある。その結果に関しては、現在執筆中である。データ収集は平成26年度に完了したが、その分析及び報告は終えることができなかったため、平成27年度に完了した。研究を始めた際には、モーバイル・ラーニングは何らかの影響があると予想していたが、実際に研究を行ってみると、その影響は思った以上であった。特に、学習者は授業外にもタスクに取り組みたいという意思を示したが、それをどのように効果的にできるかが困難であった。そのため、スマートフォンを通しての取り組みについてのトレーニングを具体的に調査することにした。前年度中にデータベースの入れる語彙と文法と、英語の意味、和訳、音声など、それから学習者用のインターフェースのデザインを終えた。

その研究結果を7月にスペインで開催されたInternational CALL Research Conferenceという国際学会大会で発表をした。研究をしているうちに明らかになったのは、学習トレーニングは大きな影響を与える可能性があることであり、その結果をスタンフォード大学のPhilip Hubbard教授と共同で、9月にイタリアで開催されたEuroCALL国際学会大会で結果を発表した。その研究の結果を現在ケンブリッジ大学出版局の査読付きのReCALL Journalに提出する予定で、執筆中である。一部の結果は8月に査読付きのCALICO Journalにて出版済みである。当研究を踏まえて明らかになったのは、コンピュータでストラテジーを与えることによって学習者にある程度の動機付けに繋がるが、与えられているストラテジーを十分に利用することができない。学習方法を改善方法がわからない限りは、自律性が生まれない。そこで、そのストラテジーについて話し合う場を与えることで、タスクにより積極的に取り組めるようにもなり、自分の学習プロセスについて考えられるようになる。そういうことによって、実際に使っているストラテジーを振り替え、自律性の発達に繋がると思われる。研究はおおむね順調に進展している。平成26年度中に予定をしていたのは、データベースと学習者の改造とともに、1000語程度の語彙と、リーディングとライティングの機能を付け加えた学習システムを調査することだった。当初は、データ分析の多くが研究補助者によるものの予定だったが、データ自体が複雑であることと、実際に教室で指導をしている教員が分析する必要がでてきたため、ほとんどは研究者代表者によって行われた。そのため、当初の予算よりを下回りました。研究をしているうちにわかったのは、様々なトレーニングを提供することによって、より継続的に学習出来ることがわかり、これについて平成27年度中に開催される学会で発表することとなった。学習者の授業内外のモバイル・ラーニングによる語学学習の習慣についての中間発表となる論文の作成もできた。現在は、様々なトレーニングの影響も調査を行っている最中であるため、順調だと思われる。コンピュータ支援語学学習平成26年度の研究費の使い方はおおむね予算通りとなったがデータ分析は実際に教室で教えている教員によって行わなければならないことがわかったため、代表研究者がそのほとんどを行うことになった。そのため、前年度から予算が残ったので、それを使用し、国際学会で研究発表を行うことができる。
岡山県における近世以降の石造農業樋門について

岡山県は近世最大の干拓である沖新田を初めとして多くの干拓地が造られた。それにともない多くの樋門が造られたが、ほとんど研究の対象にされず、河川改修にともない次第に消えていっている。そこで筆者は悉皆調査を行い、約100箇所の樋門を写真に記録した。それらの樋門は県南で採れる花崗岩を使ったものである。岡山県の樋門の特徴を明らかにするためにも他県の石造樋門の調査は欠かせないことから、県外の樋門を中心に踏査を行った。全国的には広島県草深の唐樋門、山口県の田島新開作南蛮樋門・高泊開作浜五艇唐樋・土手町南蛮樋・堀川南蛮・尾津町南蛮樋、福岡県の寿命の唐戸・堀川の中間唐戸・猿喰新田塩抜きの穴、熊本県の大鞘樋門・石塘樋門・百太郎樋門、佐賀県の石井樋、愛媛県の禎瑞新田の南蛮樋、神奈川県の姫小島樋門がある。今回の調査では、田島新開作南蛮樋門・土手町南蛮樋・堀川南蛮樋・尾津町南蛮樋、大鞘樋門・石塘樋門、禎瑞新田南蛮樋、石井樋の調査を行うことができた。そのなかで、岡山県には近世以降の石造樋門が百箇所程度が残っているが、県外では先に示したように非常に限られた数しか残っていないことがわかった。樋門の構造には地域によって大きな違いがあり、大きく分けると、巻き上げ式、引き上げ式、招き戸式、観音開式の四つのスタイルがある。呼び方にも南蛮樋及び唐樋の二通りの呼び方が行われているが、岡山県ではすべて唐樋と呼ばれている。また、樋門の上部に覆屋があるものとないものがある。そのほか、石の使い方、ろくろ木、水切りなどのさまざまな違いがあり、それらを詳細の違いを明らかにしていく予定である。今後は残された金沢八景の樋門・百太郎樋門の調査を行うと共に、新たな樋門を見つけていきたい。
ダブルノックアウトマウスを用いた動脈硬化におけるサイトカインの役割に関する研究

動脈硬化病巣にはコレステロールの蓄積を中心として,マクロファージ,平滑筋細胞,Tリンパ球などが存在しており,これらの細胞群は種々のサイトカインを分泌している.従って,これらのサイトカイン,とりわけproinflammatory cytokineであるTNF-α(tumor necrosis factor-α)は動脈硬化の発症,進展に深く関与していると想定される.しかし,現在までのところ動脈硬化に対するTNF-αの関与を直接的に証明した成績は認められない.本研究では,TNF-αノックアウトマウス(TNF-αKO)とアポリポ蛋白E(ApoE)ノックアウトマウス(ApoE KO)を交配させることによって樹立したダブルノックアウトマウス(TNF-α/ApoE KO)を用い,動脈硬化発症におけるTNF-α.の役割を直接的に証明した.以上の成績より,TNF-αは接着因子やケモカインの発現を誘導してマクロファージの接着・遊走を促進し,動脈硬化病変の形成に促進的に働いていることが示された.動脈硬化病巣にはコレステロールの蓄積を中心として,マクロファージ,平滑筋細胞,Tリンパ球などが存在しており,これらの細胞群は種々のサイトカインを分泌している.従って,これらのサイトカイン,とりわけproinflammatory cytokineであるTNF-α(tumor necrosis factor-α)は動脈硬化の発症,進展に深く関与していると想定される.しかし,現在までのところ動脈硬化に対するTNF-αの関与を直接的に証明した成績は認められない.本研究では,TNF-αノックアウトマウス(TNF-αKO)とアポリポ蛋白E(ApoE)ノックアウトマウス(ApoE KO)を交配させることによって樹立したダブルノックアウトマウス(TNF-α/ApoE KO)を用い,動脈硬化発症におけるTNF-α.の役割を直接的に証明した.以上の成績より,TNF-αは接着因子やケモカインの発現を誘導してマクロファージの接着・遊走を促進し,動脈硬化病変の形成に促進的に働いていることが示された.【目的】TNFα遺伝子欠損マウス(TNFα0)と動脈硬化のモデル動物として利用されているアポ蛋白E遺伝子欠損マウス(apoE0)を交配させることによって樹立したダブルノックアウトマウス(TNFα0/apoE0)を用いて、動脈硬化におけるTNF-αの役割を直接的に検討した。【方法】C57BL/6J由来のApoE0とTNFα0の交配させ、出生したマウスのtail veinより採取した血液よりDNAを抽出し、それぞれの特異的primerを用いてスクリーニングを行い、TNFα0/apoE0を樹立した。次にTNFα0/apoE0およびApoE0に対して、普通投与の上、12週間後に血清中の総コレステロール(TC)、LDL-コレステロール、HDL-コレステロール、トリグリセライド(TG)を測定し両群を比較した。血清脂質測定は自動分析法、リポ蛋白プロフィールはファルマシア社製のカラムによるHPLC法により行った。さらに両群での動脈硬化病変を病理組織学的に比較検討した。【結果および考察】血清TCは、apoE0が467±20.6(S.E.M)mg/dl、TNFα0/apoE0は536.7±28.0mg/dl、血清TGはそれぞれ54.6±5.0mg/dl、47.9【plus-minus】4.4mg/dlであったが、いずれも有意差は認められなかった。リポ蛋白プロフィールは両群ともほぼ同様のパターンを示した。HE染色による動脈硬化病変の定量ではapoE0が7.0×10^5μm^2、TNFα0/apoE0は5.1×10^5μm^2は有意な差を認めた(p<0.001)。アポ蛋白E遺伝子欠損マウスにおける動脈硬化病変の進展においては、TNFαは動脈硬化促進的に働いている。動脈硬化病巣にはコレステロールの蓄積を中心として,マクロファージ,平滑筋細胞,Tリンパ球などが存在しており,これらの細胞群は種々のサイトカインを分泌している.従って,これらのサイトカイン,とりわけproinflammatory cytokineであるTNF-α(tumor necrosis factor-α)は動脈硬化の発症,進展に深く関与していると想定される.しかし,現在までのところ動脈硬化に対するTNF-αの関与を直接的に証明した成績は認められない.本研究では,TNF-αノックアウトマウス(TNF-αKO)とアポリポ蛋白E(ApoE)ノックアウトマウス(ApoE KO)を交配させることによって樹立したダブルノックアウトマウス(TNF-α/ApoE KO)を用い,動脈硬化発症におけるTNF-αの役割を直接的に証明した.以上の成績より,TNF-αは接着因子やケモカインの発現を誘導してマクロファージの接着・遊走を促進し,動脈硬化病変の形成に促進的に働いていることが示された.
数値的評価法に基づく高速・低速・混相流統合解析新手法の研究

まず本研究では,圧縮性流体の計算手法の一つであるSLAU2(Kitamura-Shima, 2013)について,高速流れ(極超音速流れ)において問題となる「衝撃波異常解」の抑制や,空力加熱の予測精度の向上を試みた.その結果,より強力な制限関数(つまり,衝撃波において空間精度をなるべく下げる)を併用する事でこれらの問題の改善が見られた.またSLAU2は,低速から高速の幅広い速度域を有する混相流においても,「二流体モデル」と呼ばれる手法により問題なく適用できる事が示された.高速・低速・混相流の統合解析新手法の提案を目指し,平成25年度は1)高速流れの衝撃波異常解と空力加熱,および2)混相流への拡張に焦点を当てた.1)では,従来の我々の論文(Kitamura et al., AIAA Journal, 2009)では調査が不十分であった空間精度の影響について,数値実験を行った.その結果,1次精度で安定な数値流束は2次精度でも概ね安定であるものの,制限関数やそのパラメタも数値流束とほぼ同程度に解へ影響を及ぼす事が明らかとなった.またそれら様々な組み合わせの中から,比較的良い性能を示すものを提案した.例えば,AUSM+-upもしくはSLAU2(数値流束)と,minmod制限関数を用いたMUSCL(k=-1,基本量の内挿)である.2)では,これらの数値流束(AUSM+-upおよびSLAU2)を2流体モデルによって混相流へ拡張した結果,有望な性質を示した.衝撃波の存在する場合や,現在でもモデル化が難しいとされるキャビテーションについても,計算を実行できる事を確認した.一方で,数値流束,空間精度やユーザ指定パラメタの選び方によっては計算が不安定となってしまうという課題も明らかとなり,これらの解決が今後の課題となる.なおこれらの研究の途中経過は平成25年度の国際会議で発表し,有識者らから有益なコメントを得た.また上記1),2)に共通して,本研究において導入したワークステーションを用いて効率的に数値計算を行った.3次元,非定常の問題についても今後の調査が必要であり,今後も同一のワークステーションで一貫して研究を進める.高速・低速・混相流の統合解析新手法の提案を目指し,平成26年度は低速流れにおける高解像度計算手法HR (High-Resolution)-SLAU,HR-SLAU2,およびHR-AUSM+-upの提案を行った.これらにより,マッハ数が10のマイナス4乗の低速流れを既存手法よりも精度良く捉える事に成功した.また,マッハ1以上の超音速流れでは従来手法に帰着する為,新手法は広いマッハ数範囲で問題なく利用可能である事を確認した.これらの成果を数値流体力学の国際会議(2014年7月,バルセロナ)で発表し,有識者から有益なコメントを得た後,国際学術誌への投稿を行った.圧縮性流体の数値流体力学(CFD)手法はほぼ確立していると言われているが,一方でそれぞれの速度域においては,特有の課題が未だに残っている.例えば高速流れでは,衝撃波を数値的に捉える際に不安定性が生じる事が知られている(例:カーバンクル現象).また低速流れでは,圧縮性流体の解析手法をそのまま適用すると,過度の散逸により解に誤差が生まれてしまう.こうした中,研究代表者らは高速・低速・混相流の統合解析新手法としてSLAU2を提案している.最終年度では,このSLAU2について,1)高速流れにおける更なる検討を行い,それぞれを国際学術誌に掲載した.1)では,SLAU2単体の性能評価に加え,制限関数との組み合わせ方,内挿変数の選び方によって解の振る舞いが変化し,マッハ5以上の極超音速空力加熱の予測精度に影響が出る事を明らかにした.そして,複雑な衝撃波干渉を伴う極超音速空力加熱計算に推奨される手法の組み合わせを提案した.2)では,マッハ数が10のマイナス4乗の低速流れからマッハ1以上の超音速流れまで幅広く解像度を向上できる事を示した.なお,SLAU2が混相流で使用できる事は,既に前々年度に示してある.またSLAU2は本研究の期間中にJAXAの標準コードにも実装され,ますます多くの方々に使っていただいている.以上より,今後は新しい統合的流体計算手法として,SLAU2を世界で広く使っていただけるものと期待している.まず本研究では,圧縮性流体の計算手法の一つであるSLAU2(Kitamura-Shima, 2013)について,高速流れ(極超音速流れ)において問題となる「衝撃波異常解」の抑制や,空力加熱の予測精度の向上を試みた.その結果,より強力な制限関数(つまり,衝撃波において空間精度をなるべく下げる)を併用する事でこれらの問題の改善が見られた.またSLAU2は,低速から高速の幅広い速度域を有する混相流においても,「二流体モデル」と呼ばれる手法により問題なく適用できる事が示された.これまでに高速・低速・混相流それぞれについて新たな知見や新手法を発表し,予定通り順調に前進している.ただし飛躍的な進展や革新的発見には至っていない為,「おおむね順調」とした.航空宇宙工学,流体力学,CFD(数値流体力学)低速流れについては3次元非定常問題を扱う.また,これまでに進展させてきた高速流れ・混相流についての知見と併せ,統合解析手法として検証,発表を行う.新規手法の提案に当たり,高速流れにおける数値流束以外の影響を調べ,衝撃波異常解への知見を拡げた点において,大きな前進が見られた.また混相流においても,一部の研究者のみに使用が限られていた

2流体モデルの有効性を示し,解の精度向上や効率化に成功した.ただし革新的に新しい手法の提案には至っていないため,全体的に見れば「概ね順調」と考えられる.情報収集の為に参加を計画している学術会議のスケジュールに偏りが生じ,本年度予算の一部を次年度使用分として繰り越す事が望ましいと判断した為.高速流れについては3次元,非定常問題を扱い,これまで得られた2次元,定常問題における知見と比較を行う.混相流については,これまで考慮していなかった表面張力等の影響を組み込み,解の更なる精度向上を目指す.次年度学会参加費および旅費に充てる.
「事実」の思想史：１８世紀フランス経験主義の再検討

本研究の目的は18世紀フランス啓蒙期における経験主義の再解釈である。この目的を果たすために、本研究では当時のフランスの言説における「事実fait」という語の意味内容・認識論的地位を解明することを目指す。言い換えれば、当時の人々が何をもってある事象を事実とみなしたのかを明らかにすることを目指す。この研究を通じて、今日的な経験的・科学的姿勢が歴史的にいかに形成されたのかを解明することが可能となる。
ショウジョウバエ発生過程の特定の期間を決める生物タイマーの分子機構とその調節

本研究でキイロショウジョウバエの蛹化のタイミングを決める生物タイマーの分子機構を明らかにした。つまり、分泌されたエクダイソンを20ヒドロキシエクダイソン(20E)に変換する酵素Shadeが蛹化のタイミングを決めること、次に、Shadeは、前蛹への変換を誘導する20Eによって誘導される転写抑制因子Blimp-1によって発現時期が決まる転写因子FTZ-F1によって誘導されることを示した。さらに、この同定したタイマーは栄養状態を感知する器官である脂肪体で働くことを明らかにし、栄養情報を脂肪体でタイマー機構に伝える可能性が示唆された。一方、FTZ-F1は3齢幼虫期の決定に重要な役割をすることを示した。囲蛹殻形成後8時間の前蛹期のftz-f1変異株にecdysoneあるいは20-hyroxyecdysoneを注射し、蛹化がおこるか調べたところ、いずれを注射しても蛹化が早まることは観察されなかった。このことから、FTZ-F1はecdysteroid pulseで蛹化するためのcompetenceを与える役割も果たすことが示唆された。FTZ-F1の標的遺伝子の候補のshade遺伝子領域を調べたところ、FTZ-F1の結合配列が複数みられ、実際にFTZ-F1が結合していることをChIPアッセイで確認した。Blimp-1およびFTZ-F1による抗体染色を行い、前蛹期の様々な時期に、前胸腺、トラキア。唾腺、脂肪体、中腸でほぼ同時に発現し、消失していることが明らかにした。しかし、器官によって発現時期に多少の違いが生じており、器官によってタイマーの進行速度が異なる可能性が生じた。脂肪体でのBlim-1およびFTZ-F1の発現の重要性を調べるため複数のGAL4系統を用いて脂肪体特異的にそれぞれの因子のノックダウンと強制発現を行った。その結果、脂肪体でのこれらの因子の発現が蛹化のタイミングを決める上で重要であることが判明した。さらに蛹期についても同様の解析を行ったところ、Blimp-1によって発現のタイミングが制御されるFTZ-F1の脂肪体での発現によって蛹後期の発生のタイミングおよび羽化タイミングが決定されることを明らかにした。3齢幼虫を貧栄養状態下で飼育し、前蛹期が長くなる条件にした場合の前蛹期におけるFTZ-F1の発現パターンをWesternブロッテイング法で調べたところ、FTZ-F1の発現時期が遅延することを示す結果が得られた。このことから貧栄養状態のシグナルが同定しているタイマー機構にはいり、そのことによって幼虫期が長くなること考えられた。前年度にすでにshade遺伝子領域にFTZ-F1の結合部位が存在することを示し、ChIPアッセイにより実際に結合することを示したが、今年度はChIPアッセイをさらに改良し、精度の高い結果が得られた。さらに、熱ショックでFTZ-F1を前蛹中期に強制発現させ、shade遺伝子の発現パターンを調べたところ、コントロール系統よりもshade遺伝子が早く発現することを示すとともにftz-f1変異株でshade遺伝子の発現のピークが大幅に遅延することを示した。これらのことから、shade遺伝子領域にFTZ-F1が直接結合して遺伝子の活性化にかかわる可能性が支持された。栄養素が3齢幼虫期間および前蛹期間に及ぼすか調べるため、通常のえさに含まれるグルコース、乾燥酵母、コーンミールの濃度を変えて飼育したところ、グルコース濃度が重要な役割をすることが明らかになった。前蛹期でのFTZ-F1の強制発現およびノックダウンを神経細胞、グリア細胞、上皮細胞、筋肉細部特異的に行ったが、脂肪体でのみられたような明らかな影響は見られなかった。このことから、脂肪体でのFTZ-F1を含めた同定した因子の発現のタイミングが前蛹期間を決めている可能性が高くなった。D. pseudoobscuraのBlimp-1の強制発現をD. melanogasterで行ったが、蛹化のタイミングへの影響はみられず、D. melanogasterの生体内では両者に分解速度の違いがないものと推定され、D. pseにおいて前蛹期間が長くなる理由は現時点では明らかにならなかった。トランスポゾン挿入により3齢幼虫期間に影響を与えるftz-f1遺伝子領域のスクリーニングを行い、複数の変異株を同定したが、そのトランスポゾン挿入位置は様々であり、また、影響が生じない変異株での挿入位置が近傍な場合もあり、挿入部位と3齢幼虫期間の間に関連があることを示す結果は得られず、その制御機構が複雑である可能性が生じた。同定した蛹化のタイミングを決めるタイマー因子のひとつであるShadeの器官特異的な強制発現とノックダウンをおこない、蛹化のタイミングに与える影響を調べた。その結果、筋肉、神経、グリア、表皮でのShadeのノックダウンの影響は観察されず、脂肪体でのノックダウンでのみ蛹化の遅延が観察された。一方、脂肪体だけでなく、筋肉、神経、表皮でのShadeを強制発現により、蛹化のタイミングの早期化が観察された。また、免疫組織染色によりShadeは前蛹期においても脂肪体で特異的に発現することを示した。これらの結果から、Shadeは脂肪体以外で発現してもEを20Eに変換して蛹化のタイミングを決定できるが、実際は脂肪体でのみFTZ-F1によって誘導されるしくみになっており、栄養を感知する重要な器官である脂肪体で同定したタイマーが働いていることが確認された。

栄養状態が3齢期間および前蛹期間に与える影響をさらに詳しく解析したところ、餌中のグルコース濃度が高くても低くても比較的大きな影響を与えることが明になり、グルコース濃度が発生速度の決定に大きな役割を占めることが明らかになった。また、異なる栄養条件で飼育した前蛹でのFTZ-F1の発現時期をwestern法で解析したところ、餌中のグルコース濃度により前蛹期中期のFTZ-F1発現時期に影響が生じることを示す結果が得られ、栄養のシグナルがFTZ-F1発現の上流に入ることが示唆された。3齢幼虫期のFTZ-F1発現制御機構を調べるために、FTZ-F1遺伝子の様々な領域へのトランスポゾン挿入が3齢期間に与える影響を継続して調べた結果、FTZ-F1遺伝子領域にある複数のプロモーターの特定のプロモーター近傍の挿入が少なくとも3齢期の延長を誘導する結果が得られ、このプロモーターからの転写物の重要性が示唆された。本研究でキイロショウジョウバエの蛹化のタイミングを決める生物タイマーの分子機構を明らかにした。つまり、分泌されたエクダイソンを20ヒドロキシエクダイソン(20E)に変換する酵素Shadeが蛹化のタイミングを決めること、次に、Shadeは、前蛹への変換を誘導する20Eによって誘導される転写抑制因子Blimp-1によって発現時期が決まる転写因子FTZ-F1によって誘導されることを示した。さらに、この同定したタイマーは栄養状態を感知する器官である脂肪体で働くことを明らかにし、栄養情報を脂肪体でタイマー機構に伝える可能性が示唆された。一方、FTZ-F1は3齢幼虫期の決定に重要な役割をすることを示した。hadeがFTZ-F1によって直接制御されることを示すことができたこと、同定したタイマー機構が脂肪体で主に作用していることを示す複数の結果が得られるなど脂肪体の重要性をほぼ確実にできたこと、種間での前蛹期の違いはBlimp-1タンパクの分解速度の違いによるものではないことを示唆する結果を得たこと、また、栄養素によって3齢幼虫期期間や前蛹期間に与える影響が異なっていることも示すことができた。ただし、ftz-f1の制御領域の解析は制御領域が単純ではない可能性もあり、まだ完了できていない状況にある。したがって、全般的にはほぼ計画通りに進んでいると判断される。発生生物学環境要因がどのような経路を通じてタイマー機構に情報が伝わるか、また、新たなタイマー因子のスクリーニングを継続することにより、タイマー機構の全容の解明を目指す。また、CWとTGP決定へのFTZ-F1の役割の解明も目指す。予算が減額になったため、マイクロアレイでの解析は断念し、代わりにChIPアッセイを行い、Shade遺伝子がFTZ-F1の標的遺伝子であることを示す有力な結果を得た。また、抗体組織染色での解析は、ほぼ予定通りにおこなうことができてはいるが、担当学生の体調不良で、1個体での解析の部分は進まなかった。ftz-f1変異株の影響がCWとTGのどちらに影響するかを調べる実験は、その前の準備段階として多数あるFTZ-F1遺伝子領域にトランスポゾンが挿入された系統での発生速度を調べ、解析する価値のある系統を選抜する段階に留まったが今後の解析にたり重要な材料を得ることができた。一方で、前蛹期と同様の機構が蛹期の発生のタイミングの決定にも用いられることを示す結果を得ることができ、変態期全般での発生のタイミング制御の分子レベルでの理解に道筋を開いた。
IgA腎症における腸管粘膜応答異常について

本研究では,IgA腎症におけるTLRsを介した粘膜免疫応答について検証することを目的としている。ヒトIgA腎症の自然発症モデルであるddYマウスを用いて,血中・消化管関連リンパ組織(GALT)におけるIgA,Gd-IgA,IgG-IgA免疫複合体を測定することで,腸管粘膜応答異常がIgA腎症の発症・増悪に寄与しているか検討を行った。腸管関連リンパ組織の中で,IgA産生に重要な役割を担う腸間膜リンパ節(MLN)を用いて評価した。続いて,IgA腎症発症ddYマウスに対してTLR9のリガンドであるCpG-ODNで脾臓,MLN, NALT細胞を培養・刺激し,上清中のIgA,糖鎖異常IgA,IgG-IgA免疫複合体を測定し,比較検討を行った。その結果、IgAに関しては,血清,脾臓,MLNのいずれにおいて腎炎発症・非発症ddYマウスで差はなかった。しかし,糖鎖異常IgA,IgG-IgA免疫複合体に関しては,IgA腎症発症ddYマウスの方がIgA腎症非発症ddYマウスに比較して,血清,脾臓において有意に高値であった一方,MLNにおいては両群に差がなかった(p= <0.01)。このことから,腸管関連リンパ組織由来のIgAは血清や脾臓とは糖鎖修飾パターンが異なることで免疫複合体を作らないと考えられた。さらに,NALT,脾臓,MLN細胞に対してCpG-ODN刺激を行い,培養したところ,いずれの組織もIgAの産生増加を認めた。しかし,糖鎖異常IgA,IgG-IgA免疫複合体に関しては, NALTと脾臓において有意に産生増加をした一方で,MLNにおいては産生増加を認めなかった。今後、無菌マウスを作成し、粘膜免疫応答とIgA腎症の関わりについて、検証していく予定である。これまでの結果によると、IgA腎症と腸管関連リンパ組織との関連はやや否定的と考えられる。しかし、欧州を中心に腸管とIgA腎症との関わりと疑う論文もあることから、今後慎重に検討する必要があるため。今後、IgA腎症発症マウスを無菌環境で飼育することにより、粘膜免疫応答異常との関わりの証明を行う。さらに、腸管関連リンパ組織か、鼻咽腔関連リンパ組織の可能性を含めてさらなる検証を行う予定である。IgA腎症は原発性糸球体腎炎のなかで最も頻度が高いが、有効な治療法が確立されておらず予後不良である。IgA腎症の病態には糖鎖異常IgA1と糖鎖異常IgA1免疫複合体が深く関与しており、その産生にはToll like receptor(TLR)などのPattern recognition receptors(PRRs)を起点とした粘膜免疫応答異常が考えられる。本邦においては扁摘パルス療法が一定の効果を示している一方で、北欧においては腸管選択的ステロイド薬の効果が示されており、その議論が分かれている。本研究では、腸管におけるPRRsを介した糖鎖異常IgA1免疫複合体形成機序を検証することを目標としている。ヒトIgA腎症の自然発症モデルであるddYマウスを用いて、血中・消化管関連リンパ組織におけるIgA、糖鎖異常IgA、IgG-IgA免疫複合体を測定したところ、IgA腎症発症マウスの方が未発症マウスに比較して、血中・脾臓の細胞培養液中のGd-IgA, IgG-IgA免疫複合体が有意に高かったが、腸間膜リンパ節においては両者に有意差はなかった。今後は、腸管におけるPRRsがIgA腎症発症・増悪に寄与しているか調べるため、IgA腎症発症/非発症ddYマウスを用いて、TLR4/9やその下流のサイトカインの発現を検証し、さらにはTLR4/9のリガンドを投与することで、IgA腎症を惹起できるか検証する。また、グルテンフリー食、腸管選択性ステロイド薬、中和抗体・siRNAを用いて、Gd-IgAおよびIgG-IgA免疫複合体産生の抑制効果を検証する。消化管関連リンパ組織におけるIgAの解析等については、順調に進んでいるが、腸管選択性ステロイド薬、中和抗体・siRNAなどの抑制薬の開発についてやや遅れている。

しかし,糖鎖異常IgA,IgG-IgA免疫複合体に関しては,IgA腎症発症ddYマウスの方がIgA腎症非発症ddYマウスに比較して,血清,脾臓において有意に高値であった一方,MLNにおいては両群に差がなかった(p= <0.01)。このことから,腸管関連リンパ組織由来のIgAは血清や脾臓とは糖鎖修飾パターンが異なることで免疫複合体を作らないと考えられた。さらに,NALT,脾臓,MLN細胞に対してCpG-ODN刺激を行い,培養したところ,いずれの組織もIgAの産生増加を認めた。しかし,糖鎖異常IgA,IgG-IgA免疫複合体に関しては, NALTと脾臓において有意に産生増加をした一方で,MLNにおいては産生増加を認めなかった。今後、無菌マウスを作成し、粘膜免疫応答とIgA腎症の関わりについて、検証していく予定である。これまでの結果によると、IgA腎症と腸管関連リンパ組織との関連はやや否定的と考えられる。しかし、欧州を中心に腸管とIgA腎症との関わりと疑う論文もあることから、今後慎重に検討する必要があるため。特に欧米においてグルテンに対する不耐性により腸炎を発症する自己免疫疾患であるセリアック病とIgA腎症との合併症例が多く報告されており、グルテンフリー食によりgliadinに対する特異的IgAやIgA免疫複合体の低下を認めたという報告や、ヒトIgA1-CD89表現型IgA腎症モデルマウスにおいて、グルテンフリー食により糸球体IgA沈着が抑制されたという報告がある。また、牛ガンマグロブリンを用い、マウスにおいてIgA腎症を誘導できたという報告もある。腸間膜リンパ節を使用した解析では、腎炎発症マウスにおいて申請者らが近年樹立したIgA腎症自然発症モデルであるddYマウスを用いて、グルテンフリー食、あるいは牛ガンマグロブリンを負荷することで腸管粘膜応答異常とIgA腎症発症のメカニズムを検討する。また、IgA腎症発症/非発症ddYマウスを用いて、腸管におけるToll like receporsとその下流にあるBAFF、APRILやIL-6,10,18の発現をReal Time PCRで比較検証する。さらには、TLR4/9を刺激することでBAFF、APRILを誘導した後、便中・血中・消化管関連リンパ組織のIgA、Gd-IgA、IgG-IgA免疫複合体を測定し、腸管・腎組織を解析することで、腸管における免疫応答異常とIgA腎症との関連を検証する。今後、IgA腎症発症マウスを無菌環境で飼育することにより、粘膜免疫応答異常との関わりの証明を行う。さらに、腸管関連リンパ組織か、鼻咽腔関連リンパ組織の可能性を含めてさらなる検証を行う予定である。今年度と来年度を合算させて、物品購入分があるため。人件費および旅費の分が削減できているが、次年度は発表などがあるため、今後使用予定である。また、無菌マウスの作製など、今年度分を来年度に繰り越す必要があるため。
大腸癌の浸潤,転移及び予後に関与するsyndecan-1の発現調節機構の解明

大腸癌細胞株(HT29,colo201,T84,SW480,SW620,colo26)について,メチル化阻害剤5-aza-2'-deoxycytidineを用いて,脱メチル化によるsyndecan-1 mRNAおよび蛋白発現の変化を検討した.light cyclerによる定量的PCRの結果,メチル化阻害により大腸癌細胞株におけるsyndecan-1 mRNA発現は有意に増加していた.また,同様にflow cytometeryにてsyndecan-1蛋白の発現も,脱メチル化により増加することを確認した.これらの事実から大腸症におけるsyndecan-1発現低下は,遺伝子プロモーター領域のメチル化により制御されていると考えられた.これらの研究成果は後記の論文にて報告した.現在,大腸癌細胞株および癌組織,患者血清からDNAを抽出し,methylation specific PCR法にてsyndecan-1遺伝子における異常メチル化の頻度やメチル化部位の同定を行っている.また,大腸癌細胞株から得たRNAを用いてRT-PCR法にて,syndecan-1遺伝子coding領域の全長cDNAを抽出した.このcDNAを,我々が樹立したsyndecan-1低発現のマウス大腸癌細胞株(colo26変異株)に導入した.このsyndecan-1高発現colo26変異株の,in vitroおよびin vivoの浸潤能について現在検討中である.大腸癌細胞株(HT29,colo201,T84,SW480,SW620,colo26)について,メチル化阻害剤5-aza-2'-deoxycytidineを用いて,脱メチル化によるsyndecan-1 mRNAおよび蛋白発現の変化を検討した.light cyclerによる定量的PCRの結果,メチル化阻害により大腸癌細胞株におけるsyndecan-1 mRNA発現は有意に増加していた.また,同様にflow cytometeryにてsyndecan-1蛋白の発現も,脱メチル化により増加することを確認した.これらの事実から大腸症におけるsyndecan-1発現低下は,遺伝子プロモーター領域のメチル化により制御されていると考えられた.これらの研究成果は後記の論文にて報告した.現在,大腸癌細胞株および癌組織,患者血清からDNAを抽出し,methylation specific PCR法にてsyndecan-1遺伝子における異常メチル化の頻度やメチル化部位の同定を行っている.また,大腸癌細胞株から得たRNAを用いてRT-PCR法にて,syndecan-1遺伝子coding領域の全長cDNAを抽出した.このcDNAを,我々が樹立したsyndecan-1低発現のマウス大腸癌細胞株(colo26変異株)に導入した.このsyndecan-1高発現colo26変異株の,in vitroおよびin vivoの浸潤能について現在検討中である.
低次元グラファイトの3次元的ナノ構造制御技術の開発と量子輸送現象の研究

本研究は,原子層一層からなる2次元グラファイト,またそれが円筒状に丸まったカーボンナノチューブ等の低次元グラファイト材料の構造を3次元的に制御した中で量子輸送現象を調べ,新機能の発現,量子効果ナノデバイス実現の可能性を探索した。まず,単層2次元グラファイトであるグラフェンに対してコンタクトを取り,ナノ微細加工プロセスを用いて試料の形状をトップダウン加工によってナノレベルで構造を制御する手法を確立した。そして作製した量子効果ナノデバイスである,グラフェン2重結合量子ドット素子の単一電子輸送特性を詳細に調べ,量子ドット中の電子を1個単位で制御する単一電子デバイス動作の実証と,ドット間の静電的,および量子力学的なトンネル結合の外部ゲート電極による制御等に成功した。本研究によって実現された,新カーボン材料による集積化ナノデバイス作製の基礎技術の開発と物理現象の解明は,ナノカーボン量子デバイスの分野において重要な基幹研究であり,今後の量子デバイス開発の進展につながると考えられる。本研究は,原子層一層からなる2次元グラファイト,またそれが円筒状に丸まったカーボンナノチューブ等の低次元グラファイト材料の構造を, 3次元的に制御した中で量子輸送現象を調べる。即ち,低次元グラファイト材料にナノレベルでの引っ張りや歪みを印加しシートの幾何学的構造を制御することによって,量子輸送現象における新機能の発現,量子効果ナノデバイス実現の可能性を探索する。今年度において単層2次元グラファイトであるグラフェンに対してコンタクトを取り,ナノ微細加工プロセスを用いて試料の形状をトップダウン加工によってナノレベルで構造を制御することに成功した。さらに,そこで2重結合量子ドット素子構造を作製し,その単一電子輸送特性の観測に世界で初めて成功した。2重結合量子ドットは,固体素子としての量子コンピューティングデバイスや,量子セルオートマトンの基本素子として,将来の量子デバイス実現の重要な基本デバイスである。2次元に拡がった構造を持つグラフェンで量子ドット間の量子力学的結合状態をコントロールすることができた本研究成果は,グラフェン材料を用いた集積化量子デバイス実現の可能性を示す重要な結果である。また,同じく低次元グラファイト材料であるカーボンナノチューブの量子ドット素子を作製し,その電子輸送特性も精密に評価した。さらに,極低温での量子輸送現象測定に向けた,構造制御素子を組み込んだ極低温・低ノイズな計測環境の確立を行った。具体的には1.5Kで測定を行う4He冷凍機に対して,この構造制御素子と電気伝導測定配線を組み込んだ試料ホルダを作製した。本研究は,原子層一層からなる2次元グラファイト,またそれが円筒状に丸まったカーボンナノチューブ等の低次元グラファイト材料の構造を,3次元的に制御した中で量子輸送現象を調べる。即ち,低次元グラファイト材料をナノレベルで加工し,シートの幾何学的構造を制御することによつて,量子輸送現象における新機能の発現,量子効果ナノデバイス実現の可能性を探索する。前年度において単層2次元グラファイトであるグラフェンに対してコンタクトを取り,ナノ微細加工プロセスを用いて試料の形状をトップダウン加工によってナノレベルで構造を制御することに成功した。今年度は,作製した量子効果ナノデバイスである,グラフェン2重結合量子ドット素子の単一電子輸送特性を詳細に調べ,量子ドット中の電子を1個単位で制御する単一電子デバイス動作の実証と,2重結合量子ドットの形成を示す電荷安定図を観測し,ドット間の静電的,および量子力学的なトンネル結合の外部ゲート電極による制御に成功した。また,同じく低次元グラファイト材料であり,1次元伝導素子であるカーボンナノチューブを用いて量子ドット素子を作製し,ドット内の電子スピンの状態を反映した電子輸送特性を解析し,ドット内の電子スピン状態の変化をプローブすることに成功した。本研究によつて実現された,新カーボン材料による集積化ナノデバイス作製の基礎技術の開発と物理現象の解明は,ナノカーボン量子デバイスの分野において重要な基幹研究であり,今後の量子デバイス開発の進展につながると考えられる。
臓器特異的自己免疫疾患の標的臓器における末梢性自己寛容誘導機序の異常に関する研究

自己免疫性甲状腺疾患の甲状腺浸潤リンパ球にアポトーシスが生じているかどうかを、甲状腺および末梢血から分離したリンパ球(またはリンパ球サブセット)のDNAの断片化を、TUNEL法で調べ、核クロマチンの凝集・断片化をbisbenzimide H 33258によるクロマチン染色で調べ、さらにリンパ球細胞膜の統合性の異常を7-amino-actinomycin Dを用いてフローサイトメトリーで調べ、甲状腺内でリンパ球のアポトーシスが生じていることを確認した。しかし、どのサブセットで強く起こっているかは細胞の収量が少なく明らかにはできなかった。またCytocentrifuged Cell Smearを用いて、甲状腺および末梢血から分離したリンパ球のFas抗原の発現を酵素抗体法で調べ、甲状腺浸潤リンパ球でFas抗原の発現が増強しているを明らかにした。一方、Th1とTh2のバランスおよびTc1とTc2のバランスについては、バセドウ病と橋本病患者の甲状腺および末梢血から分離したリンパ球の細胞質内サイトカイン(IFNγ,IL-2;IL-4,IL-5;IL-10)をプロ-サイトメトリーでCD4細胞およびCD8細胞に分けて調べた。しかし、検索した症例数が少ないこともあるが、現時点では個々の症例で大きく異なり、有意の結果が得られなかった。さらに、MHCクラスII抗原陽性甲状腺上皮細胞の影響については、甲状腺浸潤リンパ球の収量がもともと少なく、またリンパ球を、自己のMHCクラスII抗原陽性および陰性の甲状腺上皮細胞と混合培養して反応させた後の回収率が悪く、十分調べることができなかった。従って、今後新たな研究方法を考える必要が明らかになった。自己免疫性甲状腺疾患をモデルに、ヒトの臓器特異的自己免疫疾患の病因解明に関する研究を行い、病因に関して、自己免疫性甲状腺疾患の甲状腺上皮細胞に発現するMHCクラスII抗原が、甲状腺特異的自己免疫応答や非特異的免疫応答の結果Tリンパ球から産生されるIFN-γによって二次的に生じていること、さらに甲状腺上皮細胞がMHCクラスII抗原を発現することにより甲状腺特異的自己免疫応答を抑制すること(末梢トレランス)を最初に明らかにした。そして、この標的臓器細胞のMHCクラスII抗原発現による臓器特異的自己免疫応答抑制機序の不完全な欠陥が臓器特異的自己免疫疾患の病因であるという仮説を提唱した。さらに甲状腺内に通常胸腺内にしか認められないCD4^+CD8^+(Double Positive : DP)細胞の存在およびTCRαβ^+CD4^-CD8^-(Double Negative : DV)細胞を初めて見出し、標的臓器内で胸腺内と類似のT細胞の選択が行われている可能性を示してきた。そこで、現在甲状腺上皮細胞がMHCクラスII抗原を発現している自己免疫性甲状腺疾患の甲状腺浸潤リンパ球にアポトーシスが生じているかどうか、またどのリンパ球サブセットにより強くアポトーシスが生じているかを、CD4^+CD8^+(Double Positive : DP)細胞およびTCRαβ^+CD4^-CD8^-(Double Negative : DN)細胞を中心に調べており、さらに、甲状腺より分離したリンパ球サブセット(特にDP細胞)のIFNγ,IL2,IL4,IL5等のサイトカイン産生能をフローサイトメトリーで調べることにより、甲状腺内でTh1とTh2およびTc1とTc2のどちらが優勢か、また甲状腺MHCクラスII抗原と反応させることによりこれらのバランスがどのように変化するかを調べているところである。甲状腺上皮細胞がMHCクラスII抗原を発現している自己免疫性甲状腺疾患における甲状腺浸潤リンパ球の免疫異常を調べ、甲状腺MHCクラスII抗原発現の意義および自己免疫性甲状腺疾患の病因について検討することを研究目的とした。

今回、最近フローサイトメトリーを用いて細胞質内にIFNγ,IL2,IL4,IL5等のサイトカインを含有するリンパ球サブセットの測定が可能になったことより、自己免疫性甲状腺疾患の末梢血リンパ球および甲状腺に浸潤しているリンパ球において、IFNγ,IL2を産生するCD4細胞(Th1)およびCD8細胞(Tc1)、およびIL4、IL5、IL10を産生するCD4細胞(Th2)およびCD8細胞(Tc2)を調べた。そして、Th1およびTh2細胞のバランス、およびTc1およびTc2細胞のバランスを末梢血と甲状腺内で比較し、甲状腺内では主に細胞性免疫応答の増強に働くTh1と主に液性免疫応答の増強に働くTh2のどちらが優勢であるのか、またTc1とTc2細胞のどちらが優勢であるかを明らかにすることを試みた。しかし、検索した症例数がまだ少ないこともあるが、現時点では個々の症例で大きく異なり、有意の結果が得られなかった。さらに症例数を増やして検索する予定である。また、甲状腺上皮細胞に発現しているMHCクラスII抗原がリンパ球に与える影響については、甲状腺浸潤リンパ球の収量が少なく、また混合培養後のリンパ球の回収率が悪いため、新たな研究方法を考える必要が明らかになった。
植物性スーパークーラントを用いた過冷却による24時間超長時間心保存法の開発

背景:重症心不全に対する治療として心移植は標準的治療になってきている。現状のプロトコールではドナー心は臓器保存液内で+4°Cの冷保存下にレシピエントのもとに搬送される。その許容虚血時間は4時間から6時間と非常に短い。より安全な移植およびドナープールの拡大のためにドナー心の保存時間の延長は心移植において残された課題の一つである。保存時間延長のため過冷却下の臓器保存がこれまで検討されてきたが、現在のところ充分な効果が得られてはいない。そこで、われわれは、新たに過冷却促進効果が報告されたフラボノールの一種であるKaempferol 7-0-β-D-Glucopyranoside(KF7G)を臓器保存液に導入し、過冷却下心保存の効果を検討した。方法:ラット異所性心移植モデルを用いて、従来の+4°C心保存とKF7Gを用いた-2°C,-5°C過冷却保存の保存効果を比較した。ドナー心を(1)University of Wisconsin (UW)液、+4°C保存(2)UW液+0.01%KF7G.-2°C過冷却保存(3)UW液+0.01%KF7G、-5°C過冷却保存の3群に振り分け18,24,30時間保存した後、レシピエント腹部に移植した。移植15分後の拍動の強さを肉眼的に評価し、また2時間再灌流後の移植心を摘出し、組織学的にアポトーシスを評価した。また、電子顕微鏡での観察もおこなった。結果:過冷却保存群のドナー心はすべて凍結することなく保存された。移植心の拍動はすべての保存時間で有意に-2°C過冷却保存群が+4°C保存群より良好であった。一方、-5°C保存群では+4°C保存群を上回る効果は見られなかった。TUNEL染色でのアポトーシスの定量化においては有意に-2°C保存群のTUNEL陽性細胞が減少していた。電子顕微鏡による観察では、-2°C過冷却保存群で+4°C保存群に比較してミトコンドリアやサルコメアの形態的保存状態が良好であった。結語:KF7Gを臓器保存液に導入することで、過冷却下に心臓を保存することが可能であった。また-2°C過冷却保存が従来の+4°C保存より有意に優れた保存効果をもつことが示された。臓器移植における臓器保存時間の許容範囲は心臓移植では4時間とされている。虚血温度に関しては氷晶を作るまでは低い方がよいとされ、現実的には4°Cで保存されている。が、過冷却物質を使用すればより長時間の心保存が可能となる。我々は極寒のシベリアに何億年も前から生息している植物に注目し、そこから抽出された多糖類のケンフェロールに着目した。本物質は自然界に広く存在する植物由来物質であり、しかも食物添加物質として既に国内でも認可されている物質である。本研究ではこのケンフェロールを用いてラット心臓過冷却保存モデルで24時間超長時間心保存法を開発することを目的とする。初年度はケンフェロールの基本的性能を確認する。動物実験モデルとしては、ラットを用いた異所性心臓移植モデルで、移植免疫反応の影響を除外するため、同種同系移植とする(Lewis ratからLewis ratへ)。ドナーとなるLewis rat(Charles River Japan Inc, Yokohama, Japan ; Lew)に腹腔内投与による全身麻酔をかけヘパリン投与の後心臓を摘出する。この心臓をUW液でflushしケンフェロール1mg/ml含有UW液に浸漬する。初年度はこの保存温度をマイナス5°C、マイナス2°C、プラス4°Cの3群とする。一定時間の保存の後、レシピエントラット(Lewis rat)の腎動脈下腹部大動脈・下大静脈に9-0ナイロン糸(Bear, Chiba, Japan)を用いて端側吻合(連続縫合)を行い、異所性心移植を施行する。保存時間は、臨床での限界時間とされている4時間をはるかに超える12、18、24時間の3群を作成する。心臓の冷保存は、温度可変式ディープフリーザー(ツインバード社、SC-DF25、Yokohama, Japan)を用いて管理する。移植再灌流後は腹壁表面からの心拍動触知により心拍動時間を計測し、24時間以上拍動が持続したものを冷保存成功例とみなすこととする。各保存時間ごとにn=46の実験を行い、冷保存成功率を算出した。その結果、マイナス2°Cでの保存効果が最良であった。今後、心筋の病理検索を行う予定である。

そこで、われわれは、新たに過冷却促進効果が報告されたフラボノールの一種であるKaempferol 7-0-β-D-Glucopyranoside(KF7G)を臓器保存液に導入し、過冷却下心保存の効果を検討した。方法:ラット異所性心移植モデルを用いて、従来の+4°C心保存とKF7Gを用いた-2°C,-5°C過冷却保存の保存効果を比較した。ドナー心を(1)University of Wisconsin (UW)液、+4°C保存(2)UW液+0.01%KF7G.-2°C過冷却保存(3)UW液+0.01%KF7G、-5°C過冷却保存の3群に振り分け18,24,30時間保存した後、レシピエント腹部に移植した。移植15分後の拍動の強さを肉眼的に評価し、また2時間再灌流後の移植心を摘出し、組織学的にアポトーシスを評価した。また、電子顕微鏡での観察もおこなった。結果:過冷却保存群のドナー心はすべて凍結することなく保存された。移植心の拍動はすべての保存時間で有意に-2°C過冷却保存群が+4°C保存群より良好であった。一方、-5°C保存群では+4°C保存群を上回る効果は見られなかった。TUNEL染色でのアポトーシスの定量化においては有意に-2°C保存群のTUNEL陽性細胞が減少していた。電子顕微鏡による観察では、-2°C過冷却保存群で+4°C保存群に比較してミトコンドリアやサルコメアの形態的保存状態が良好であった。結語:KF7Gを臓器保存液に導入することで、過冷却下に心臓を保存することが可能であった。また-2°C過冷却保存が従来の+4°C保存より有意に優れた保存効果をもつことが示された。