hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Co/Alox/Co/NiFe/Au/nSiダイオード構造におけるスピン依存伝導

スピンエレクトロニクス(電子の電荷とスピンを制御するエレクトロニクス)に大きな注目が集まっている.本研究で対象としている素子は,Au/nSiショットキーダイオードとCo/AlOx/Co/NiFeトンネル磁気抵抗効果素子を組み合わせた,Co/AlOx/Co/NiFe/Au/nSi構造を持っ2端子素子である.予備実験では,1つの素子で,Au/nSiショットキーダイオードに対して逆方向に電圧を印加していくと,約0.8V付近で不連続な電流の増加が確認できた,また,別の素子では,電圧に対して,電流が振動的に変化するという結果が得られた.この結果の再現性を確認すべく,昨年度の結果をもとに,Si基板の表面処理法を確定して,Co/AlOx/Co/NiFe/Au/nSi2端子素子を作製した.液体窒素温度で,電流-電圧特性を測定したところ,電流が流れ始める順方向電圧は0.5V程度であり,逆バイアスで流れる電流はおおむね2nA以下であった.研究の目的は逆バイアス領域での不連続な電流変化を観察することであったら,この素子では観測できなかった.この理由として,予備実験で使用した素子の順方向電圧はほぼ0.8Vであったが,この素子では0.5Vと低い値であり,ショットキーバリアが低かったことが上げられる.また,現在使用している装置ではショットキー接合を作製した後,真空を破って,別の装置でオーミック接合を形成しているため,この待機暴露の工程が悪影響を与えていることも考えられる.逆バイアス領域では磁気電流効果が得られなかったが,順バイアス領域においては磁気電流効果がえら得られている.これはCo/AlOx/Co/NiFe磁気トンネル接合の特性を反映したものであると考えられる.Co/AlOx/Co/NiFe/Au/nSi2端子素子の逆バイアス領域における不連続な電流変化を観測するためには.ショットキーダイオードの特性を改善が必要である.真空を破ることなく,ショットキー接合,オーミック接合を作製するために,成膜装置を改造中であり,今後も研究を継続する予定である.電子の電荷とスピンを制御し,新しいデバイスを開発しようとする研究分野,スピンエレクトロニクスに大きな注目が集まっている.本研究は代表的半導体であるSiとスピンエレクトロニクスにおける代表的材料である磁気抵抗素子を組み合わせて素子を作製し,磁気電流効果を確認することを目的とするものである.本研究で対象としている素子は,Au/nSiショットキーダイオードとCo/AlOx/NiFeトンネル磁気抵抗効果素子を組み合わせた,Co/AlOx/NiFe/Au/nSi構造を持つ2端子素子である.この素子において,Au/nSiショットキーダイオードに対して逆方向に電圧を印加していくと,ある電圧で不連続な電流の増加が確認できる.通常のショットキーダイオードではこのような現象は確認できないため,この現象はAlOxトンネルバリアが存在するために生じていると考えることが出来る.また,この不連続な電流変化が起こる領域での磁気電流効果は非常に大きい.しかし,この現象は非常に再現性が乏しく,系統的な研究が行える状態ではない.そこで,この素子において特に重要でる考えられるAu/nSiショットキー接合の作製方法を変化させダイオード特性に与える影響を確認した.Si基板の表面処理に用いた溶液は以下の3種類である.表面処理したSi基板に素子をマグネトロンスパッタで成膜し,フォトリソグラフィにより微細加工を行った.ショットキー接合面積は100×200μm^2である.1から3のどの組み合わせで表面処理を行っても,ショットキー接合の作製は可能であったが,ダイオード特性の再現性が乏しかった(特にn値のばらつきが大きかった).比較的n値のばらつきの小さかった2の方法で作製した素子でも,逆方向バイアスにおける不連続な電流変化は観測できていない.順方向バイアスでは小さな磁気電流効果が観測されており,これはCo/AlOx/NiFeトンネル接合におけるトンネル磁気抵抗効果が原因であると考えている.スピンエレクトロニクス(電子の電荷とスピンを制御するエレクトロニクス)に大きな注目が集まっている.本研究で対象としている素子は,Au/nSiショットキーダイオードとCo/AlOx/Co/NiFeトンネル磁気抵抗効果素子を組み合わせた,Co/AlOx/Co/NiFe/Au/nSi構造を持っ2端子素子である.予備実験では,1つの素子で,Au/nSiショットキーダイオードに対して逆方向に電圧を印加していくと,約0.8V付近で不連続な電流の増加が確認できた,また,別の素子では,電圧に対して,電流が振動的に変化するという結果が得られた.この結果の再現性を確認すべく,昨年度の結果をもとに,Si基板の表面処理法を確定して,Co/AlOx/Co/NiFe/Au/nSi2端子素子を作製した.液体窒素温度で,電流-電圧特性を測定したところ,電流が流れ始める順方向電圧は0.5V程度であり,逆バイアスで流れる電流はおおむね2nA以下であった.研究の目的は逆バイアス領域での不連続な電流変化を観察することであったら,この素子では観測できなかった.

この理由として,予備実験で使用した素子の順方向電圧はほぼ0.8Vであったが,この素子では0.5Vと低い値であり,ショットキーバリアが低かったことが上げられる.また,現在使用している装置ではショットキー接合を作製した後,真空を破って,別の装置でオーミック接合を形成しているため,この待機暴露の工程が悪影響を与えていることも考えられる.逆バイアス領域では磁気電流効果が得られなかったが,順バイアス領域においては磁気電流効果がえら得られている.これはCo/AlOx/Co/NiFe磁気トンネル接合の特性を反映したものであると考えられる.Co/AlOx/Co/NiFe/Au/nSi2端子素子の逆バイアス領域における不連続な電流変化を観測するためには.ショットキーダイオードの特性を改善が必要である.真空を破ることなく,ショットキー接合,オーミック接合を作製するために,成膜装置を改造中であり,今後も研究を継続する予定である.
健常児との比較による発達障害児の語連鎖形成能力に関する研究

本研究では、健常児および言語発達遅滞児の自発話および課題場面おける発話を収集・分析し、語連鎖形成能力について検討した。主な成果は以下の通りである。1.1名の表出性言語発達遅滞児(3;8-5;2まで追跡)と3名の健常児(1;9-2;4まで追跡)における音形的および統語的特徴を検討した。その結果、遅滞児では、表出語彙数、1語を構成する音節数、1発話に含まれる文節数において、同時期に一様に急速な改善を示した。さらに、遅滞児と健常児の両者において、音形面と統語面が並行して発達する過程が確認された。2.言語的概念の連合能力を検討するため、「言葉の類推」課題を用い、事物の呼称や単純な指示理解は可能だが文脈理解が困難である5歳児3名と2;11-3;6の健常児6名における言語的応答を比較検討した。言語発達年齢で統制されているにもかかわらず、遅滞群では誤答率が高く、文脈に合わない不適切な語で応答する頻度が高く、刺激語間の関係性を正しく理解することに困難があると推測された。3.4名の言語発達遅滞児と15名の健常児を対象とした連続絵を用いた配列・説明課題では、配列正答率と発話の言語的内容の豊富さ、また、配列正答率と統語的複雑さの指標であるMLUとの間に相関が認められた。しかし、遅滞児群ではCAに比して内容語が乏しく、3-4歳代の健常児群に近いことが示された。また、接続表現の使用頻度も低く、1)名詞、動詞、形容詞等の誤用、2)助詞、助動詞の誤用、3)因果関係・連続性の不適切な説明の3種のうち、いずれかまたは複数の不適切さを示しており、本課題は、発達障害児の統語的側面を評価するのに有効な方法であることが示された。4.また、健常児および発達障害児の母子間の言語的やり取りについて分析し、親による子どもの発話の「繰り返し」、「拡張模倣」等、語連鎖形成を促すと思われる働きかけのあり方の示を得た。日本語習得児における初期の語連鎖を意味的・統語的観点から分析する試みはあるが、語連鎖発達を音形的発達と合わせて理論的枠組みに入れた研究は見当たらない。本年度は、対象としている言語発達遅滞児の中でも、特に1名の表出性言語発達遅滞児(3歳8ヶ月から5歳2ヶ月まで追跡)と3名の健常児(1歳9ヶ月から2歳4ヶ月まで追跡)に焦点を当て、これらの児における言語発達過程を音形面と統語面双方から検討した。その結果、言語発達遅滞児では、表出語彙数、1語を構成する音節数、1発話に含まれる文節数のすべての側面において、同時期に一様に急速な改善を示したことが明らかになった。さらに、表出性言語発達遅滞児および健常児の両者において、音形面と統語面が並行して発達する過程が確認された。特に興味深いのは、健常児において音形面で変化の著しく、単語が3音節以上で構成され始めた20-21カ月と24-25カ月の時期の間は、統語的にみても2語文が出現しその比率を増す時期と一致していたことである。

3音節以上の音形を獲得するということと、語連鎖を形成するということには、何らかの共通する言語固有の、もしくは認知的な基盤が存在している可能性がある。一般的には発語音形の巧緻化とより複雑な語連鎖形成は各々独立した領域の事象として捉えられているが、本研究の結果は、これらは相互に関連したものであるか、あるいは何らかの能力基盤を介して相互に影響を与え合う可能性を示唆している。言語発達のメカニズムを検討するにあたり、構音発達と統語発達の両側面を包括的に捉えて検討する必要性が示唆された。本年度は、語連鎖形成と関連して、言語的概念の連合能力を検討することを中心的課題の一つとした。事物の呼称や単純な指示理解は可能であるが文脈理解が困難である就学前児を対象に「ことばの類推」を通してその応答特徴と指導経過について検討した。5歳時に「会話や相手の話を理解することが困難」との主訴で指導を受けていた男児3名を対象とした。5歳時でのITPA言語学習能力診断検査からは「ことばの類推」が共通して低下しており、本下位検査の言語学習年齢は2:10から3:1であった。先行する文脈に沿って発話を展開することの困難が推定されたため、文脈の理解が求められる以下の課題を設定した。「AはB、Cは?」という問いにおいて、同一のCに対して複数の文脈(例「塩は辛い、リンゴは?(甘い)」「牛乳は飲む、リンゴは?(食べる)」)を用意し、先行刺激対であるAとBとの関係を把握してから応答することを求めた。不正解の場合には絵図版を提示し視覚的イメージから関係性の理解を促した。類推課題の1、2回目の応答を2;11-3;6の健常児6名と比較したところ、平均正答率は遅滞群31%、対照群53%であった。誤答分析によると、健常群では誤反応の半数以上が先行対に関わらず、刺激語から想起しやすい語で応答するパターンであったが、遅滞群では文脈に合わない不適切な語で応答する頻度が高く、刺激語間の関係性を正しく理解することに困難があると推測された。この他、本年度は、指導開始時に1語文は出現しているが、助詞を含んだ3文節以上からなる文の使用には至っていなかった言語発達障害児2名を対象とし、縦断的に指導を行う中で得た発話サンプルをデータベース化した。今後分析を加える予定である。最終年度である本年は、健常児および発達障害児の発話のデータベース資料の解析を行い、語彙種類数、平均発話長、助詞の使用等の分析を行った。また、昨年度の「ことばの類推」課題の発展として、健常児および発達障害児に連続する2枚の絵場面について説明を求めた際の発話データの解析を行った。この課題の対象は、生活年齢(CA)3;1から4;8までの15名(男児8名、女児7名)の健常児と、課題初回施行時年齢でCA5;2から6;1の言語発達遅滞児男児4名であった。絵画配列の正答率、発話についてはa)文法的複雑さ、b)言語的の内容の豊富さ、c)接続表現、d)発話の適切さの4つの観点から検討を行った。その結果、健常児群については、配列正答率と発話の言語的内容の豊富さ、また、配列正答率と発話の統語的指標であるMLUとの間に相関が認められた。その一方で、配列正答率に対してCA、VAのいずれも相関関係は認められず、年齢や単なる理解語彙数は順序性判断とは明らかな対応がないことが明らかになった。連続性表現については、「て・で」が3歳代、4歳代とも最も高頻度で出現していたが、5歳児で使用頻度の高かった接続詞「そして」は3歳代では使用されず、4歳代で接続助詞「て、と、たら」に次いで4番目の使用頻度であった。この接続詞・接続助詞等の使用頻度については内容語数との間に高い相関が認められた。一方遅滞児群ではCAに比して内容語が乏しく、3-4歳代の健常児群に近いことが示された。また、接続表現の使用頻度も低い傾向が明らかになった。
公共図書館計画における平等性と効率性評価に関する研究

初年度では、これまで一連の公共図書館システムに関する研究の事例としてきた千葉県柏市における、図書館利用状況調査の調査データをもとに、住民の図書館サービスの平等性の観点から、総合的な分析を行った。中では、住民特性(年齢・性・居住形態・家庭内の蔵書冊数など)、立地特性(図書館と自宅との位置関係・図書館までの距離や交通条件など)と個々人の図書館利用・非利用との因果関係の解明を目的とした、図書館非利用者を含む市民を対象とした「住民調査」の分析に最も力を注いだ。まず、定性的な側面から考察し、成人では女性の方が男性より、40歳代前半までの人がそれ以上の年齢の人よりも、短大以上の学歴の人がそれ以外の人よりも、市内居住歴の短い人がそして家庭内に蔵書を多く持つ人の方が図書館利用者となる比率が高いことを見出した。また図書館を利用できない・しない理由を全国調査結果などと比較検討した。次いで、近年交通工学分野において「交通手段選択モデル」として開発されたロジットモデルに着目し、上記調査データを図書館を利用するしないと、利用館が本館であるか分館かという二つの選択行動に適用したモデルの構築を行い、同モデルの有効性を証明した。第二には、全国の公共図書館に対するアンケート調査のデータ集である『日本の図書館』を用いて、施設の効率性を相互比較することが可能な指標の設定を目的とした分析を行った。第二年度においては、ロジットモデルの改良を行うなど、研究全般の精緻化を行った。最後に、これまでの分析結果をもとに、一つの市域の中に小規模分館を多数配置すべきという従来の計画指針に対し、館数を少なくしても個々の館の蔵書規模を大きくしそれぞれに特色を持たせることで、利用者の施設選択の幅を広げる方が効果的であるとの配置計画指針を得たが、今後はこの指針の実際への適用手法の開発が課題である。1.前年度までに実施した千葉県柏市住民に対する図書館利用状況調査の結果をもとに,住民特性(性・年齢・居住形態など),図書館特性(蔵書数・蔵書新鮮度・参考調査機能をもつか否かなど),立地特性(位置・図書館までの距離や交通条件など)と,個々人の図書館利用・非利用との因果関係を定性的視点から分析した.ついで,近年交通工学分野における「交通手段選択モデル」として開発されたロジットモデルに着目し,ロジットモデルをまず,図書館を「利用する」「利用しない」という選択問題に,第2に図書館を利用するとすれば「本館を利用するか」「近くの分館を利用するか」という選択問題に適応して,数理的分析を行った.分析では住民を(現在利用者)対(利用経験者+非利用者)などに分け5つのロジットモデルを作成した.結果としては, (利用者+利用経験者)対(非利用者)で最も顕著な相異がみられた.そして,利用者側に有意に作用している要因としては,自宅の蔵書冊数,市内での居住年数,教育年数及び最寄り館までの距離であった.第2の選択モデルでは,自宅の蔵書冊数の多い人程高度な蔵書水準の図書館を選択していることが確認された.今後は分析の過程で判明したロジットモデルの問題点の改善を計り,現状の分析だけでなく,利用者数の予測など計画段階においても応用できるようなものにしていく予定である.

2.公共図書館の活動に関し「住民間の平等性」「図書館需要の充足度」「図書館経営の効率性」の各視点から,相互比較が可能な指標項目の抽出を行い,全国の公共図書館の活動状況を一覧できるデータ集である『日本の図書館』をもとに,全国の地域内に複数の図書館施設をもつ354の市立図書館について,複数化の実質と人口規模別に各指標間の比較検討を行った.なかでは,「効率性」の指標として年間貸出冊数で図書館経費を除した「貸出コスト」に可能性が認められた.1.前年度に引き続き、非連続型選択モデルであるロジットモデルを、千葉県柏市の住民を対象に行った調査データに用いて分析を行った。ロジットモデルの理論そのものとその応用手法は、未だ完成の域には達しておらず、分析では諸々の改良を試みた。このモデルの利用方法として、新設される図書館の吸引力を代表する蔵書冊数を段階的に変化させた時に、それまでその図書館周辺に在住している利用者が、その新設図書館を利用するか、既存の図書館を利用し続けるかという選択行動に、モデルを適用し、新設図書館の利用者数の予測に利用可能であることを見出した。しかし、新設館の周辺に居住していながらそれまでは図書館の利用者でなかった者が、利用者に転換することをどう組み込むかが課題として残された。また、住民調査は広い地域の住民全体を対象にしないと充分な分析が行えないが、調査実施の限界から一部住民に限定しているため、特定の年齢層(10歳代後半から20歳代)が抜けており、モデルの構築のみにとどまった点を反省点としている。2.日本図書館協会が毎年3月末時点で全国の公共図書館を対象に実施しているアンケート調査のデータ集である『日本の図書館』から、施設の効率性に関わる指標の設定を試みた。館の規模等研究の目的から市立図書館だけに限定し、実績の因子として「年間貸出冊数」を置き、職員数、年間図書購入冊数、図書購入費、図書館経費を投入資源因子とした。この結果、年間貸出冊数は年間購入冊数と職員数とに強い相関関係をもつことが認められた。また、貸出コスト(二年間貸出冊数÷図書館経費)が、施設運営効率の指標として適当であろうことがわかった。図書館の運営効率ということはこれまでややないがしろにされてきた感があるが、今後は重要な評価項目となろう。
プライマー切り出し反応をターゲットとした抗インフルエンザ薬の探索

ノイラミニダーゼ阻害薬の耐性株がすでに多数見つかっており、その割合は増えている。2014年RNAポリメラーゼ転写阻害薬ファビピラビルが上梓されたが、その催奇性と新型インフルエンザへの対応という観点から一般には流通していない。また、2018年3月にPA阻害剤としてゾフルーザ上梓され、感染後期でも使用できると期待されているが、いずれは耐性株の出現が懸念されている。当研究室では、インフルエンザウイルスに固有な反応であるCap-snatching反応に着目し効率の良い反応定量法を確立し、北里大学薬学部微生物薬品製造学教室との共同研究により、新たな抗インフルエンザ薬のシード化合物の探索を行っている。平成27年度は新規創薬候補化合物のスクリーニングと候補化合物の精製について研究を遂行し、以下の成果を得た。1.新規創薬候補化合物の探索連携研究者の供田らが管理・運用している微生物ライブラリー培養上清中のCap-snatching阻害活性を我々が開発したプルダウン法によりスクリーニングを行った。これまでに、およそ1600検体について阻害活性をの効率を測定し、16検体に強い阻害活性がみられた。この16検体を再培養し、阻害活性が再現できた10検体については、阻害活性物質の精製を行うために様々な精製法を試みている。また、微生物ライブラリーについては、スクリーニングを継続して遂行している。最終的には、5000検体程度までスクリーニングを進めたいと考えている。2.候補化合物の構造決定と作用機作の解析再培養を行い阻害活性が見られた10検体について、二層分配法による分離条件を検討し、様々なpHによる酢酸エチル相、水相への抽出効率と安定性を検討した。また低分子化合物の精製において分離能の良いC18逆相クロマトグラフィー担体への吸着の有無について検討した結果、1検体がC18担体に結合し、他の検体は通常のBuffer条件では、C18担体に吸着しなかった。結合しなかった検体については、イオン交換担体や吸着カラム担体など他の精製法を検討している。C18担体に吸着した検体について、回収率を調べた結果、少なくとも3種類以上の阻害活性化合物が検体中に含まれていることが明らかになった。しかし、阻害活性の多くが未吸着画分にも存在するため、精製法にはさらに工夫が必要と考えられる。まずは、結合した化合物の同定に力を注ぐとして、未吸着画分に存在する阻害活性物質についてもBuffer条件を変更するなどの方法によって化合物の同定につなげてゆきたい。新規創薬候補化合物の探索については、順調にスクリーニングが進行している。1次スクリーニングにより陽性と判断された検体で、再培養後に活性が検出できなかったものや、低温保存中に阻害活性が減弱したものがあり、天然物からの精製の難しさを改めて痛感している。しかし再培養後にも、阻害活性の検出されたサンプルの中でC18による精製の可能性のあるものが2サンプル見つかっている。また、パイロット実験によりC18以外のクロマト担体に吸着し、精製法に工夫はいるものの阻害活性の強い検体もいくつか見つかっている。今後はこれらのサンプルについても精製法を開発し、構造決定までつなげてゆきたい。1.新規創薬候補化合物の探索平成28年度も、天然物ライブラリーのスクリーニングを継続して行った。昨年度から新たに約300種類についてスクリーニングを行い5種類の候補サンプルを見つけた。さらにスクリーニングを継続中である。今回見つかった候補サンプルについては、再培養を行い、阻害活性が再現できるかどうかを確かめている。再培養によって阻害活性がみつかれば構造決定、ならびにインフルエンザの増殖阻害活性についても調べる。2.候補化合物の構造決定と作用機作の解析これまでに強い阻害活性を示した2種類のサンプル、BF60、BF85について、大量培養を行い、精製方法の検討を行った。BF60については、活性は非常に高かったが、イオン交換クロマトグラフィーは行えるのであるが、疎水クロマトが使えないために高度な精製が困難であった。ウイルスの増殖阻害がみられるものの、細胞毒性も強く芳しい結果が得られなかったため、BF85の精製を優先させることとした。BF85は、疎水クロマト担体への結合がみられたため、現在、精製条件の検討を進めている。予備実験段階ではあるがいくつか特異的な化合物のピークが得られている。今後は、Cap-snatching反応を阻害することを確認すると同時に、転写伸長反応に対する影響も調べる。また、MDCK細胞を用いたウイルス増殖阻害活性を測定し、阻害物質の細胞に対する毒性についても評価を行ってゆきたい。これまでのところ、おおむね実施計画に沿って研究が進行している。今年度最終年度であるため、さらに研究を推し進める所存である。研究の概要にも記載したが、1.新規創薬候補化合物の探索については、昨年度から新たに約300種類についてスクリーニングを行い5種類の候補サンプルを見つけた。2.候補化合物の構造決定と作用機作の解析については、複数ある候補化合物のうち、BF60については、高度な精製が困難であったこと、細胞毒性が高いことなどから一旦精製を中止し、BF85の精製を優先させることとした。BF85は、疎水クロマト担体への結合いくつか特異的な化合物のピークが得られている。1.新規創薬候補化合物の探索

平成29年度中に、構造決定のされた精製化合物ライブラリーより得られた7種類の化合物の精製とCap-snatching反応阻害活性の再評価、細胞毒性や阻害活性の特異性、in vivoにおけるウイルス増殖阻害活性などについておおむね結論が出た。精製化合物のうちの一つ、BN0024は、in vitroにおける活性は低いものの培養細胞におけるインフルエンザウイルス増殖阻害活性は、非常に高くcap-snatching以外の抗インフルエンザの作用機構が示唆された。細胞毒性については、精製化合物が少ないため高濃度アッセイはできていないが、有効濃度が低くなった分、安全性は大きくなったと考えられる。この化合物については、さらに解析を進める。2.候補化合物の同定と構造決定と作用機作の解析現在までにCap-snatching反応阻害活性が認められた試料について、阻害活性物質の精製を行い、阻害活性の特異性、in vivoにおけるウイルス増殖阻害活性を調べた。これまでに、約10種類の候補化合物が再培養によって阻害活性が得られており、精製の準備を進めている段階である。今年、2月に塩野義からcap-snatching反応をターゲットとした、抗インフルエンザ薬、ゾフルーザが上梓された。作用点は同じであるが、ゾフルーザとは異なる構造をBN0024は持っているため、新たな抗インフルエンザ薬になりうると考えている。今後、スクリーニングによって新たな候補化合物が同定されれば、ゾフルーザとは作用点の異なる抗インフルエンザ薬の開発につながるものと考えられる。ノイラミニダーゼ阻害薬の耐性株がすでに多数見つかっており、その割合は増えている。2014年RNAポリメラーゼ転写阻害薬ファビピラビルが上梓されたが、その催奇性と新型インフルエンザへの対応という観点から一般には流通していない。また、2018年3月にPA阻害剤としてゾフルーザ上梓され、感染後期でも使用できると期待されているが、いずれは耐性株の出現が懸念されている。当研究室では、インフルエンザウイルスに固有な反応であるCap-snatching反応に着目し効率の良い反応定量法を確立し、北里大学薬学部微生物薬品製造学教室との共同研究により、新たな抗インフルエンザ薬のシード化合物の探索を行っている。平成28年度は、研究実施計画通りに新規創薬候補化合物のスクリーニングを進める。今年度中に3500検体をスクリーニングすることを目標とする。阻害活性のあったものについては、再培養を行って阻害活性が、再現されるかどうか調べる。阻害活性が再現され、大量に試料が得られたものについて、阻害活性化合物の精製、構造決定、作用機作の解析を行う。さしあたって、現在精製を進めている2種類のサンプルについて精製を行い、同時に他の再培養検体についてもC18以外のクロマト担体を用いた精製法の確立を目指して、様々なクロマト担体への阻害物質の結合性を調べる。1.新規創薬候補化合物の探索については、本年度もさらにスクリーニングを継続し、さらに有望な候補化合物の探索を行ってゆく。
ネコ前肢運動の皮膚感覚神経による調節の研究

本研究は、覚醒ネコの前肢の運動を皮膚神経切断の前後で比較解析して、皮膚感覚信号が実際の肢の運動の調節に如何に寄与するかを評価することを目的とした。1.指筋の姿勢機能の調節ネコが台の上で起立しているときの前肢足底の荷重分布の調節の様式を、空間分解能1mm、時間分解能33msの圧分布計測システムを用いて解析した。台が静止しているときは、central padが荷重の大部分を支えていた。台傾斜を急速に変えたときはcentral padの荷重は減少しtoe padの荷重が増大した。すなわちネコは指で支える荷重を増加させることで対応した。皮膚神経切断後は、静止台上でも指の荷重が増大し、全荷重の半分を支えるようになった。急速な傾斜変化に対するcentral padから指への荷重移動は消失または減弱した。以上の結果から指による荷重支持の調節機構に皮膚入力が重要であることが示唆された。2.前肢随意運動の調節ネコが前肢を伸ばして筒(内径35mm)に手を差し入れ餌を取る運動を、皮膚神経切断の前後で比較解析した。除神経後の初期の試行では、手は約10mm上にずれる程度で筒を通ったが、餌を行き過ぎ、軽度のdysmetriaが見られた。ところが試行を重ねる内に上方へずれるdysmetriaは、徐々に増大して手が筒の上の壁に当たるようになり、30-40mmずれたところでPlateauに達した。筒への挿入に合わせた手、指の関節の伸展も遅延した。以上の結果から皮膚除神経によってネコの手が餌に接触する前の運動にも異常が生じることが示された。これら接触前の運動異常は皮膚受容器が自らの筋活動に対して反応し、proprioceptorの一種として運動調節に寄与する可能性を示唆する。
患者由来iPS細胞を用いたTGFシグナル異常骨系統疾患の治療法の開発

Transforminggrowthfactor-β1(TGF-β1)が変異により恒常的に活性化することでカムラチ-エンゲルマン病(以下CAEND)が発症する.CAENDの特徴として遺伝的背景により表現型が大きく異なることがある.ゲノム編集技術によりCAEND患者から樹立したiPS細胞の変異を除去を行ない、遺伝的背景が同一細胞の作製を行なった.変異解析により新規のCAEND患者2名に218番目のアルギニンがシステインに置換した患者を同定した.また次世代型シーケンサーを用いた変異解析により、TGFシグナル系遺伝子の変異で骨系統疾患が発症することを明らかにした.カムラチ・エンゲルマン病(Camurati-Engelmann disease、以下CAENDと略す.OMIM: #131300)は非常に稀な常染色体優性遺伝形式の骨系統疾患である.報告者らが行った疫学調査により、本邦における患者数は50-60名程度と推測されている.CAEND患者では、頭蓋骨や長管骨において過剰な膜内骨化が起きており、この過剰な膜内骨化により、骨皮質肥厚および長管骨骨幹部の紡錘形肥大を引き起こす.加えて四肢の骨痛、筋力低下、易疲労性がこの疾患の特徴である.またステロイドホルモンの投与による対症療法が唯一の治療法であり、治療法の開発が急がれている.報告者らは、CAENDはtransforming growthfactor-β1(TGF-β1)遺伝子が責任遺伝子であることを報告した.TGF-β1は、活性ドメイン、その機能を抑制するlatency associated peptide (LAP)ドメイン、シグナルドメインの3つのドメインから構成されている. TGF-β1は活性を持たない潜在型として骨基質に存在しているが、CAEND患者では変異により容易に活性化して、血中に遊離していくと考えられている.報告者はCAENDモデルとして、患者で同定された変異をノックインしたマウスの作製を試みたが、ジーンターゲティング法やCRISPR/Cas9法による変異のノックインは失敗した.本研究では、CAEND患者由来の血球細胞から作製したiPS細胞を用いて、治療法の開発を目指す.遺伝的バックグラウンドの違いが、CAEND患者間での表現系の差を引き起こすため、まず患者由来iPS細胞からCRISPR/Cas9法で変異だけを除き、遺伝的バックグラウンドが完全に一致したコントロール細胞を樹立する.報告者は、CAENDは「TGF-β1の変異が引き起こす過剰なTGFシグナルによる細胞の自己増殖能の亢進と分化抑制がその発症原因である」と考えており、まずこの仮説を証明した後に、治療法の開発を目指す.CAEND研究において問題になることは、CAEND患者間での表現系の差異が非常に大きいことである.同じCAEND家系内でも、重・軽症度は大きく異なる.これはTGF-β1変異以外の遺伝的背景の効果が大きいためと考えられる.本研究においても、この点を改善する必要がある.研究に利用可能な健常人由来iPS細胞(正常コントロール)に加えて、患者iPS細胞からTGF-β1変異だけを除いた遺伝的背景を全く同一にしたiPS細胞の作製を行う.以前は不可能であったが、新規ゲノム編集技術であるCRISPR/Cas9法を利用することで可能になった.変異だけを除去する目的のため、14種類のguide RNA (gRNA)をin vitro合成し、Cas9タンパク質存在下で、標的配列を最も効率的に切断可能なgRNAを選抜した.2細胞の選択に必要なピューロマイシン耐性遺伝子とgreen fluorescence protein (GFP)を含むPiggy-Bacベクターに組換えに必要なTGFB1遺伝子断片をクローニングしたノックインベクターを作製した.3予備試験として、HEK293T細胞にgRNA、Cas9タンパク質、ノックインベクターを同時にトランスフェクションし、組換え体を作製した.新規CAEND患者の変異解析を行ったが、TGF-β1には変異が同定されなかった.エキソーム解析で網羅的な変異解析を行う.カムラチ・エンゲルマン病(Camurati-Engelmann disease、以下CAENDと略す.OMIM: #13130)は非常に稀な常染色体優性遺伝形式の骨系統疾患である.報告者らによる疫学調査から、国内の罹患者数は50-60名程度と推定されている.CAEND患者は頭蓋骨や長管骨の過剰な膜性骨化を特徴とし、骨皮質の肥厚や長管骨骨幹部の紡錘形肥大が診断の基準になる.加えて四肢の骨痛、難聴、筋力の低下が起こるが、根本的な治療法は無くステロイド投与による対症療法が行われている.報告者らはCAENDのtransforming growth factor-β1(TGF-β1)の変異により、その活性を抑制し骨基質への結合の足場となるlatency associated peptide(LAP)ドメインが不安定化し、TGF-β1が正常型に比べて容易に活性型として遊離することを報告した(Nature Genetics, 2000およびJ.B.C, 2001).しかしCAENDの大きな特徴は、患者間で(例えば罹患兄弟間でも)疾患の重軽症度が大きく異なることである.TGF-β1変異以外の遺伝的バックグラウンドが重要だと考えられる.また患者からの骨組織の採取は困難であるため、治療法の開発に向けて、CAENDモデルマウスの作製を試みたが、キメラマウスが不妊になるなど全て失敗に終わった.その後TGF-β1の218番目のアルギニン残基がヒスチジンに変異したCAEND患者の血液からiPS細胞を樹立した.

このiPS細胞から骨細胞に分化させCAENDの発症機序を明らかにし、治療法の開発を目指す.先述の通り遺伝的バックグラウンドの違いが病態に大きく影響するため、ゲノム編集法で患者由来iPS細胞から変異を除き遺伝的バックグラウンドが完全に一致したコントロール細胞の作製を行うことが第一歩である.報告者は『TGF-β1の変異による過剰なTGFシグナルの亢進が引き起こす骨細胞の自己増殖能の亢進と分化抑制がCAENDの発症機序である』と考えているが、実際に患者由来iPS細胞を培養すると、培養開始後しばらくは増殖速度が遅く容易に分化する傾向があった.しかし、現在は良好に増殖し、未分化の状態を保っている.現在は分化を抑制しながらフィーダーフリー化のステップを行っている.概要欄に記した様に、iPS細胞間の遺伝的バックグラウンドが表現系、つまり解析結果に影響を与えることが予想される.この影響を無くすためにゲノム編集を行った.guide RNAと野生型Cas9を発現するベクター(pXシリーズ)とレスキューベクターを同時にトランスフェクションし、相同組換えを利用して変異を除去する予定だったが効率が非常に悪く失敗に終わった.ゲノム編集は日々進化しているが、まだ改良が必要な技術でもある.現在新しいアルゴリズムを利用したguide RNAの再設計とレスキューベクターの再構築を行っている.また高効率な遺伝子導入法の検討も必要としている.骨分化後の解析に必要な定量RT-PCRやウエスタンブロッティングの条件設定、骨分化の評価法(アルシアンブルー染色・アリザニンレッド染色など)の準備は完了している.加えて新規のCAEND患者の変異解析を行い、CAEND罹患者で最も高頻度に同定されるR218C変異(218番目のアルギニンがシステインに変異)を同定した.現在この患者からもiPS細胞を樹立できないか、主治医・患者とその家族とコンタクトをとっている.また28年度の夏に胃潰瘍・貧血により入院し、その後も体調と相談しながら研究を続けているが、予想以上に研究の進行が滞っている.カムラチ・エンゲルマン病(Camurati-Engelmann disease、以下CAENDと略す、OMIM: #13130)は非常に稀な常染色体優性遺伝形式の骨系統疾患である.この疾患は頭蓋骨や長管骨の過剰な膜性骨化による骨皮質の肥厚や長管骨骨幹部の紡錘形肥大がその特徴であり、四肢の骨痛、難聴、筋力の低下も併発する.報告者らは2000年にCAENDの責任遺伝子がtransforming growthfactor-β1(TGF-β1)遺伝子TGFB1であり、その変異によりTGF-β1の活性を抑制し骨基質への結合の足場となるlatency associated peptide(LAP)ドメインが不安定化し、TGF-β1が正常型に比べて容易に活性型として遊離することを報告した(Nature Genetics, 2000およびJ.B.C, 2001).しかし現在でも根本的な治療法は無くステロイド投与による対症療法が行われている.治療法の開発に必要なモデルとしてR218H変異(218番目のアルギニンがヒスチジンに変異)を持つ患者血液からCAEND iPS細胞を樹立した.しかし、CAENDは患者間での表現系の差が大きく遺伝的修飾因子の存在が示唆されている.そこでゲノム編集技術を用いて患者変異を正常に戻すことが必要である.
DNA損傷応答を制御する細胞機能ネットワークに着目した新規がん放射線治療の開発

本研究では、がんのDNA損傷応答に影響を及ぼす分子群の作用機序を明らかにすることにより、DNA損傷応答を制御する細胞機能ネットワークを解明することを目指している。前年度までに、がんにおいて多様なレベルで発現が亢進しているがん精巣抗原SYCE2の体細胞における機能解析を進め、SYCE2がATM依存性のDNA損傷応答を亢進させて、放射線抵抗性を誘導すること、また、SYCE2がヘテロクロマチン制御分子であるHP1と直接結合してHP1をヘテロクロマチンから引き離すことを見出していた。平成30年度は、HP1との結合能力を欠いたSYCE2の変異体を発現させた細胞を樹立した。その結果、HP1との結合能力を欠いた変異型SYCE2を発現した細胞では、野生型SYCE2を発現した細胞で見られるATM依存性のDNA損傷応答の活性化が見られないことが明らかになった。このことからSYCE2の発現レベルに応じた細胞核内のHP1の局在変化がDNA損傷応答と修復の制御に重要であることが示唆された。SYCE2以外のがん精巣抗原においても機能解析を進めてきた。SYCE1は、ATM依存性のDNA損傷応答を亢進させて放射線抵抗性を誘導するなど、DNA損傷応答への影響という点ではSYCE2と似た表現型を示すが、SYCE2と同様に核内微小環境を変化させるのかどうかについてはまだ明らかになっていない。一方、正常細胞やがん細胞における相同組み換え修復関連分子の発現抑制実験を行い、細胞周期制御における当該分子の新たな役割を解明すべく、基礎検討を進めている。年度の前半は、SYCE2による核内環境の変化を介したDNA損傷応答の制御機構に関する詳細な解析が進み、国際学術雑誌での発表にこぎつけることができた。SYCE2以外のがん精巣抗原やDNA修復関連分子についても、その作用機序を詳細に解析することによって、DNA損傷応答を制御し得る他の細胞機能との関係を解明していく。個々のがんのDNA損傷応答機能の特性は、放射線治療や抗がん剤治療などの治療反応性に大きな影響を与えることが想定される。そのため、がんにおいてDNA損傷応答異常が発生するメカニズムを明らかにすることは、より効果的ながん治療を行うための基盤研究としても重要である。我々は最近、生殖細胞とがんにおいて特異的に発現する「がん精巣抗原」と呼ばれる分子群がDNA損傷応答に多様な影響を及ぼすことを見出してきた。中でも、がん精巣抗原SYCE2の機能解析を先行して進め、SYCE2がDNA損傷応答を亢進させて、放射線抵抗性を誘導することを見出すとともに、その機序として、SYCE2が細胞核構造を司る分子HP1と複合体を形成してHP1の局在を変化させることが重要であることを見出してきた。平成29年度は、SYCE2がHP1の局在変化を介してDNA損傷応答を制御する詳細な作用機序の解析にかなりの時間を費やした。一方、生殖細胞でSYCE2とともにシナプトネマ複合体を形成する分子であるSYCE1、TEX12、SYCE3などについても、体細胞の核内に異所性に発現することにより、核内の微小環境を変化させる可能性が想定される。発現解析では、いずれの分子もがんにおいて異所性に発現することが明らかとなり、その強制発現や発現抑制によるDNA損傷応答への影響を含む機能解析について準備中である。SYCE2による核内環境の変化を介したDNA損傷応答の制御機構に関してかなりの時間を費やし、詳細な解析が進んだ。その分、他の分子群の機能解析についてはやや遅れている状況である。SYCE2以外のがん精巣抗原についても、核内微小環境やDNA損傷応答に及ぼす影響を明らかにしていく。

SYCE2以外のがん精巣抗原やDNA修復関連分子についても、その作用機序を詳細に解析することによって、DNA損傷応答を制御し得る他の細胞機能との関係を解明していく。(理由)実験が順調に進行し、特に、抗体購入やsiRNA購入費について、予定より少額で研究を遂行することができた。(使用計画)次年度の物品費と合わせ、まだ十分に進んでいないSYCE2以外の分子の詳細な機能解析のために充てる予定である。(理由)実験が順調に進行し、予定より少額で研究を遂行することができた。(使用計画)次年度の物品費と合わせ、DNA修復分子と細胞周期制御分子や細胞核内構造をつかさどる分子の機能連携の解析のために充てる予定である。
レトロウイルス外膜蛋白活性化プロテーゼの発見と、その活性化による感染機序の解明

癌ウイルス,エイズウイルスを始めとするレトロウイルスの外膜糠蛋白は、いずれもリボソームで前駆体として合成された後、宿主細胞のゴルジ膜で限定分解を受け小胞体-ゴルジ装置系を通って細胞膜へ選択的に運ばれることが知られている。この限定分解が阻止さめると、ウイルスは不完全ウイルスとなり感染性を失う。我々はCD4陽性人Tリンパ球の膜分画より、ゴルジ膜あるいはERに局在するHIV-1の外膜蛋白前駆体活性化プロテアーゼの精製に成功した。本酵素は、HIV-1外膜蛋白前駆体gp160をgp120gとgp41に変換する分子量26kDaのトリプシン型セリン性プロテアーゼで、活性基のセリンを持つ。本酵素はgp160を基質にすると、pH6.5-7.5に至適pHを示した。本酵素はgp160のシークエンスの中で、-Arg^<508>Leu1-Lys-Arg^<511>-を特異的認識してArg^<511>の後を選択的に切断した。この切断部位のシークエンス-Arg(Lys)-X-Arg(Lys)-Argは、殆ど全てのレトロウイルス外膜糠蛋白前駆体の切断部位に認められる共通構造である。本酵素の活性は、人やマウスのT細胞以外に、B細胞、単球、HeLa細胞、血管内皮細胞に認められ種々のレトロウイルスの感染に関与していると思われる。本酵素の欠損した人マクロファージ培養細胞U2ME7ではHIVの外膜蛋白gp1分解されずER,ゴルジに蓄積される。本酵素は、これまでに報告のあったDibasicの基質を特異的に分解するKEX2ファミリープロテアーゼと異なり、金属非要球性でEDTAは活性に影響を与えない。また本酵素の活性は、DFP,アプロチニンなどのトリプシンインヒビターとDTT,システインなどのSH試薬により抑制され、これらの中でも特に低分子インヒビターが培養細胞レベルでも有効であり抗HIV活性を示すことが明らかとなった。癌ウイルス,エイズウイルスを始めとするレトロウイルスの外膜糖蛋白は、いずれもリボソ-ムで前駆体として合成された後、宿主細胞のゴルジ膜で限定分解を受け小胞体ーゴルジ装置系を通って細胞膜へ選択的に運ばれることが知られている。この限定分解が阻止されると、ウイルスは不完全ウイルスとなり感染性を失う。我々はCD4陽性人Tリンパ球球膜分画より、ゴルジ膜あるいはERに局在するHIVー1の外膜蛋白前駆体活性化プロテア-ゼの精製に成功した。本酵素は、HIVー1外膜蛋白前駆体gp160をgp120gとgp41に変換する分子量25kDaのトリプシン型セリン性プロテア-ゼで、活性基のセリンを持つ。本酵素はgp160を基質にすると、pH6.5ー7.5に至適pHを示した。本酵素はgp160のシ-クエンスの中で、ーArg^<508>ーLeuーLysーArg^<511>ーを認識してArg^<511>の後を選択的に切断した。この切断部位のシ-クエンスーArg(Lys)ーXーArg(Lys)ーArgは、殆ど全てのレトロウイルス外膜糖蛋白前駆体の切断部位に認められる一次構造である。

本酵素の活性は、人やマウスの種々のT細胞以外に、B細胞、単球、HeLa細胞、血管内皮細胞に認められ広くレトロウイルスの感染に関与していると思われる。本酵素は、これまでに報告のあったDibasicの基質を特異的に分解するKex2ファミリ-のプロテア-ゼと異なり、金属非要求性でEDTAは活性に影響を与えない。またDFPに対する強い感受性を示すが、トリプシンに対する代表的な低分子インヒビタ-のロイペプチンやアンチパインで活性が全く阻害されない。以上の事から、本酵素は基質の一次構造だけでなく高次構造を認識し、高い基質特異性を示す酵素で、インヒビタ-についても高い選択性が示唆された。癌ウイルス,エイズウイルスを始めとするレトロウイルスの外膜糖蛋白は、いずれもリボソームで前駆体として合成された後、宿主細胞のゴルジ膜で限定分解を受け小胞体ーゴルジ装置系を通って細胞膜へ選択的に運ばれることが知られている。この限定分解が阻止されると、ウイルスは不完全ウイルスとなり感染性を失う。我々はCD4陽性人Tリンパ球の膜分画より、ゴルジ膜あるいはERに局在するHIV-1の外膜蛋白前駆体活性化プロテアーゼの精製に成功した。本酵素は、HIV-1外膜蛋白前駆体gp160をgp120gとgp41に変換する分子量26kDaのトリプシン型セリン性プロテアーゼで、活性基のセリンを持つ。本酵素はgp160を基質にすると、pH6.5-7.5に至適pHを示した。本酵素はgp160のシークエンスの中で、-Arg^<508>-Leu-Lys-Arg^<511>-を特異的認識してArg^<511>の後を選択的に切断した。この切断部位のシークエンス-Arg(Lys)-X-Arg(Lys)-Argは、殆ど全てのレトロウイルス外膜糖蛋白前駆体の切断部位に認められる共通構造である。本酵素の活性は、人やマウスのT細胞以外に、B細胞、単球、HeLa細胞、血管内皮細胞に認められ種々のレトロウイルスの感染に関与していると思われる。本酵素の欠損した人マクロファージ培養細胞U2ME7ではHIVの外膜蛋白gp160は分解されずER、ゴルジに蓄積される。本酵素は、これまでに報告のあったDibasicの基質を特異的に分解するKEX2ファミリーのプロテアーゼと異なり、金属非要求性でEDTAは活性に影響を与えない。また本酵素の活性は、DFP、アプロチニンなどのトリプシンインヒビターとDTT、システインなどのSH試薬により抑制され、これらの中でも特に低分子インヒビターが培養細胞レベルでも有効であり抗HIV活性を示すことが明らかとなった。
Smad3 タンパク質リン酸化を標的とした創傷治癒促進・瘢痕形成抑制術の開発

口唇裂・口蓋裂患者における裂隙閉鎖術後の瘢痕組織はその強い瘢痕鈎縮により、上顎骨劣成長や上顎歯列弓狭窄をもたらし、その結果患者は重篤な不正咬合を呈する。一方、TGF-・のシグナル伝達因子の1つであるSmad3のノックアウトマウスでは、創傷治癒促進・瘢痕形成抑制が認められる。本課題では、RNAi法によるSmad3遺伝子発現抑制の口蓋創傷治癒過程に及ぼす影響を調べた結果、炎症関連因子の発現低下を伴う有意な創傷閉鎖促進が認められた。本研究は、TGF-βのシグナル伝達因子であるSmad3ノックアウトマウスの所見を手掛かりに、Smad3リン酸化抑制剤(SIS3:Specific Inhibitor of Smad3)を用いることで、創傷治癒促進ならびに瘢痕形成抑制法を開発する薬剤試験である。新生野生型マウス由来の上皮細胞と線維芽細胞の初代培養をそれぞれ行い、SIS3存在下とSIS3非存在下における上皮細胞の遊走能抑制ならびに線維芽細胞における炎症関連因子であるTGF-β1、MCP-1、MIP1α発現をTGF-β1存在下で検討した。結果、上皮細胞の遊走能はSIS3存在下においてやや亢進し、このことよりSmad3リン酸化抑制による上皮細胞の創傷治癒促進能が示唆された。また、線維芽細胞におけるTGF-β1、MCP-1、MIP1α発現はSIS3存在下でともに有意に減少し、コラーゲンゲルを用いた線維芽細胞の3次元培養では、TGF-β1存在下でのゲル収縮率がSIS3添加群で有意に減少した上に、α-SMAの発現も減少していた。これよりSIS3によるSmad3リン酸化抑制における炎症性細胞浸潤の減少の要因がin vitroにおいて確認された。また線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化抑制と、それに続く瘢痕組織形成抑制効果が示唆された。一方、創傷治癒促進・瘢痕形成抑制のための薬剤として、野生型マウス口蓋創傷部への局所投与を行ったところ、非添加群と比較し速やかな創傷閉鎖を認め、さらに皮膚においても同様の結果が得られた。結果、上皮細胞の遊走能はSIS3存在下において著しく亢進し、このことよりSmad3リン酸化抑制による上皮細胞の創傷治癒促進能が示唆された。一方、創傷治癒促進・瘢痕形成抑制のための薬剤として、野生型マウス口蓋創傷部への局所投与を行ったところ、非添加群と比較し速やかな創傷閉鎖を認めた。現在、創傷治癒過程における瘢痕形成メカニズムに関わる分子の免疫組織化学的な解析を進めている。本研究は、Smad3リン酸化抑制剤(SIS3)の創傷治癒促進・瘢痕形成抑制効果をin vitroならびにin vivoで分子レベルで解明することが目的である。まず新生野生型由来の上皮細胞と線維芽細胞の初代培養を用いたin vitroの系でSIS3投与時に、Smad3ノックアウトマウス由来細胞と類似の所見が得られるかの確認を行い、以下のことが達成された。

すなわち、上皮細胞の遊走能はSIS3投与群で有意に亢進し、このことよりSmad3リン酸化抑制による上皮細胞の創傷治癒促進能が示唆された。一方、線維芽細胞におけるTGF-β1、MCP-1、MIP1α発現は、SIS3存在下で有意に減少し、またコラーゲンゲルを用いた線維芽細胞の3次元培養では、ゲル収縮率がSIS3添加群で有意に減少した。さらにα-SMAの発現も非添加群と比較し減少していた。これらのことからSIS3によるSmad3リン酸化抑制能ならびに炎症性細胞浸潤の減少がin vitroにおいて確認され、また線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化抑制能と、それに続く瘢痕組織形成抑制効果をもたらすことも示唆された。マウス口蓋創傷部におけるin vivoでの検討においても創傷閉鎖促進効果が認められており、当初の予定通りに進展しているといえる。本研究の目的は、口蓋粘膜創傷部位の治癒促進・瘢痕形成抑制を目的とした薬剤の試験で、臨床応用を見据えたものである。そのため、これまでの結果を踏まえマウス口蓋創傷での薬効、さらには皮膚など他組織への効果を確認する。具体的には、口蓋創傷部位へのSIS3添加・非添加マウス間における上顎歯列弓長径ならびに幅径の比較を行う。3週齢マウスの口蓋に創傷を作製後、SIS3を麻酔下にて1日1回、1週間塗布する。その後、8週齢にて上顎歯列弓長径・幅径を測定することで、口唇裂・口蓋裂患者に生じる上顎裂成長の抑制効果を確認・検討する。また、口蓋のみならず、皮膚創傷においてもSIS3を塗布することで、その効果を形態学的・免疫組織化学的手法により比較・検討する。方法としては、皮膚ならびに口蓋に創傷を作製したマウスの組織切片を作製し、その治癒過程について経時的にH&E染色を行うとともに、筋線維芽細胞の分化マーカーであるα-SMAの免疫染色、ならびにTGF-β1、MCP-1、MIP-1αなどノックアウトマウスで発現低下の見られる炎症関連因子などの免疫染色を行う。その後、実験データの解析・統合、ならびに研究成果発表のための学術論文への投稿準備を行う。本実験で計画しているα-SMA、TGF-β1、MCP-1、MIP-1αなどの発現量変化をreal-time PCR法にて定量するためには、TaKaRa社製SYBRgreenが必要不可欠である。また、同分子の免疫組織学的検出にそれぞれの抗体を必要とする。一方、SIS3はSmad3リン酸化抑制剤のため、リン酸化タンパクの検出が必要であるが、それには高感度なブロッティングシステムが有利である。Invitrogen社製(iBlotゲルトランスファーデバイス・IB1001)はセミドライ式以上の非常に感度の高い検出を可能としている。このため、本研究で観察の必要なウエスタンブロッティングに最適である。さらに転写時間も数時間かかるウェット式と比較しわずか7分のため、実験効率の上昇にも寄与する。当教室はドライ式システムを有する装置を所有していないため本装置を備品として購入することは必要不可欠かつ妥当である。その他、使用すべきマウスを購入する。