hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ABO抗原合成酵素蛋白の三次元構造抽出に基づく抗体作製戦略

我々はこれまでにABO式血液型抗原の合成に関与する糖転移酵素について抗酵素抗体を作製し、酸素蛋白の免疫学的特徴を明らかにしてきた。一方、糖転移酵素の三次元構造の解析には、アミノ酸配列、基質構造と酵素反応の活性中心等の特定、糖転移酵素蛋白のX線解析像等が重要な情報になる。これまでに様々なABO式血液型抗原の対立遺伝子の酵素蛋白のアミノ酸配列と酵素活性の関係が調べられているが、X線解析像を得るために精製された酵素蛋白質を多量に作製することは出来ていない。しかし、我々はこの研究期間内にABO式血液型遺伝子の転写制御について以下のような重要な事項を明らかに出来た。即ち、(1)ABO遺伝子の転写はcap site-CpG islandのmethylationによって抑制され、脱methylationによって促進する(2)転写開始点の上流3.2kbから4.0kbの領域には43bpを単位とする繰り返し領域があり、これが転写活性を増強する(3)この繰り返し数が1回のものは、A遺伝子と連鎖し、4回のものはBあるいはO遺伝子と連鎖している。近年の分子生物学の進歩発展により、多数の蛋白分子のアミノ酸配列およびそれらのcDNAの塩基配列が決定され、またコンピュータソフトの開発により、それらの配列情報に基づいて三次元構造の推定像を描出することが可能になった。この研究は三次元構造の推定像に基づいて有効な抗原刺激を持つペプチドを選定する。ABO抗原合成酵素蛋白のアミノ酸配列は既に明らかにされているので、シリコングラフィックスのワークステイション上で三次元構造の構築に関する計算を行うが、現在その作業の準備が進行している。一方、有効な抗原刺激のために、適当なアミノ酸配列を選ぶ必要があると同時に、免疫動物を選定する必要がある。そこで、部分精製したヒトのA型抗原合成酵素蛋白をウサギに免疫して抗体を作製したところ、A型抗原を持つA'型のウサギ血清中には抗体価は低いがヒトのA型抗原合成酵素に対する特異性が高い抗体が産生され、A型抗原を持たないO'型のウサギ血清中には抗体価は高いがヒトのA型抗原合成酵素に対する特異性が低い抗体が産生されることが判明した。そこでウサギのDNAについてヒトA型抗原合成酵素cDNAを用いてsouthern hybridazationを行ったところ、明瞭なhybridazation spotsを見いだした。現在、それらについて塩基配列の解析を行い、ヒトとウサギの相違点を明らかにする作業を進め、この方面からも抗原刺激の有効アミノ酸配列を選定することを検討している。我々はこれまでにABO式血液型抗原の合成に関与する糖転移酵素について部分精製したヒトのA型抗原合成酵素蛋白をウサギに免疫して抗体を作製したところ、A型抗原を持つA′型のウサギ血清中には抗体価は低いがヒトのA型抗原合成酵素に対する特異性が高い抗体が産生され、A型抗原を持たないO′型のウサギ血清中には抗体価は高いがヒトのA型抗原合成酵素に対する特異性が低い抗体が産生されることが判明した。現在、それらについて塩基配列の解析を行い、ヒトとウサギの相違点を明らかにする作業を進めている。一方、ABO式血液型抗原の合成に関与する糖転移酵素の三次元構造の解析には、アミノ酸配列、基質構造と酵素反応の活性中心等の特定、糖転移酵素蛋白のX線解析像等が重要な情報になる。これまでに様々なABO式血液型抗原の対立遺伝子の酵素蛋白のアミノ酸配列と酵素活性の関係が調べられているが、X線解析像を得るために酵素蛋白質を多量に作製することを目的として、転写機構の研究を行っている。その結果、ABO遺伝子の転写はcap site-CpG islandのmethylationが関係することを明らかにした。現在、mRNAの最も有効な翻訳の条件を選ぶ研究を進めている。
ES細胞の生存を制御するmTORおよび関連因子の解析

免疫抑制剤標的タンパクmTORはこれまでラパマイシンを用いた機能抑制実験によりその機能の多くが解明されてきた。本研究は、薬理学的解析では見えてこなかったmTORの真の機能を解明することを目的におこなっている。これまでの本研究で、mTORは初期胚発生やES細胞の増殖に必須である事を明らかにした。ES細胞ではコンディショナルノックアウト細胞を樹立してリコンビナントのCREタンパクを用いて、ノックアウト細胞の樹立を試みたが細胞は殆ど増えてこず、十分に研究する事が出来なかった。そこで、私はDOX依存的にmTORの発現を誘導する事ができるKO細胞を試み、樹立する事ができた。現在はその細胞を使って、これまでのラパマイシンによる薬理学的な機能抑制では見えてこなかったmTORの真の機能を解析するために、実験をおこなっている。(1)初期胚発生時のオートファジーオートファジーが起こらないATG5ホモ変異マウスは外見上ほぼ正常に出生するものの、生後一日以内に死亡するという事が報告されている。出生直後に胎盤からの栄養供給が遮断されると飢餓状態に陥る事が明らかにされているが、エネルギー恒常的におこるオートファジーがおこらないために致死となるといわれている。本研究では、胚発生の最も初期段階である卵成熟から胞胚期までのオートファジーの意義を解明する事を目的に研究を進めている。本研究の結果、未受精卵ではまったくオートファジーは起こっていないのに関わらず受精卵、2細胞期以降の卵で積極的に起こっている可能性がでてきた。電子顕微鏡レベルでも解析を進めている。人工授精で回収してきた2細胞期の卵をリソソーム阻害剤入りの培地で体外培養を行った。コントロールでは殆どが胞胚期まで発生が進んだのに対して、阻害剤を添加するとすべての卵が2細胞期で発生を停止した。現在は、卵成熟時からのATG5の発現をノックアウトした母性因子の影響をうけないマウスを用いて詳細な解析を進めている。最近の研究の結果、脂肪細胞がインスリン類似作用を持ったVisfatinを産生している事が報告された。私たちはES細胞もまたVisfatinを高発現しており、分化とともに発現が低下することを見いだした。このタンパクは大腸菌からヒトまで高度に保存されている分子で、NAD(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸)の生合成に関わる酵素としても知られている。これまでの研究の結果、大腸ガンで高発現している事が判明しており、ガン細胞と同じく無限増殖能を維持する幹細胞においてVisfatinこそがES細胞の増殖を担う因子ではないのかという事を予測した。そこで、Visfatinの生体内での機能を解析するためにノックマウスを作製した。ヘテロ変異マウスは正常に発生し、生殖能力も有していたが、糖代謝能に異常が見られた。一方、ヘテロ変異マウス同士の交配からはホモ変異マウスは誕生しなかった。胎児解析の結果、ホモ変異マウスは着床直後に致死になる事が分かった。Visfatin欠損胚盤胞は一見正常であるがin vitroで培養しても増殖できなかった。以上のことから、初期胚発生においてVisfatinは非常に重要な因子であることが判明した。次にVisfatin KOマウスが早期胎生致死となる原因を解明するために以下の仮説を考えた。(1)初期胚発生においてインスリン様作用(2)NADの生合成酵素は初期胚発生に必須(3)インスリン様作用もNADの両方が重要(4)既知の作用以外の重要な作用を担う。これらの作用を胚盤胞のin vitro培養系を用いて確認している。そして初期胚発生のin vitroのモデルとなるES細胞においてもVisfatinの機能解析を行っている。レトロウィルスを用いてノックダウン細胞の樹立に成功しており、その解析を中心に研究を行っている。人工授精で回収してきた

2細胞期の卵をリソソーム阻害剤入りの培地で体外培養を行った。コントロールでは殆どが胞胚期まで発生が進んだのに対して、阻害剤を添加するとすべての卵が2細胞期で発生を停止した。現在は、卵成熟時からのATG5の発現をノックアウトした母性因子の影響をうけないマウスを用いて詳細な解析を進めている。
プロトン酸・遷移金属錯体複合触媒の開発と新規ヘテロ原子化合物の合成

遷移金属触媒とスルホン酸を組み合わせると炭素-炭素不飽和化合物へのヘテロ元素化合物の付加反応が著しく促進されることを見出した.このような複合触媒系は従来ほとんど検討が行われていない.本研究の目的はこの方法論の一般性を検討するとともに,新しいヘテロ原子化合物合成のための触媒反応を開発するものである.すでにこの触媒系を用いてアセチレンとアレンへのホスフィンの付加反応が位置および立体選択的に進行することを明らかにしている.今回共役ジエンへの付加反応を検討した結果,ホスフィンと水素がそれぞれ1,3-ジエンの1位と2位の炭素に選択的に付加したアルキルホスホニウム塩を高収率で与えることがわかった(anti-Markovnikov mode).通常遷移金属触媒によるジエンへの求核剤の付加は,多くの場合π-アリル中間体を経由して1,4-付加体を与えるのに対し,本法では、anti-Markovnikov配向の1,2-付加体が選択的に生成する点で反応機構的にも興味深い.現在,単純なオレフィンへの付加反応を検討中である.またこれまでに,複合触媒系を用いるとアセチレンにジスルフィドが開裂1,2-付加することも明らかにしている.同じ触媒系を用いてアレンとジスルフィドの反応を検討した結果,(E)-1,3-ジエニル-2-スルフィドと(E)-アルケニル-2-スルフィドを与えることがわかった.添加するホスフィンの種類を変えると,ジセレニド化合物の開裂付加反応にも適用できた.アセチレンとの反応ではジスルフィドが開裂1,2-付加するのに対し,アレンではジスルフィドまたはジセレニドが開裂してアレン二分子にアルキルチオ基が一つずつ移動するとともに,アレン間で水素移動が起こることは興味深い.今後は,不飽和化合物への種々のヘテロ元素化合物の付加反応に発展させたい.遷移金属触媒とスルホン酸を組み合わせると炭素一炭素不飽和化合物へのホスフィンの付加反応が著しく促進されることを見出した.このような複合触媒系は従来ほとんど検討が行われていない.本研究の目的はこの方法論の一般性を検討するとともに,新しいヘテロ原子化合物合成のための触媒反応を開発するものである.すでにこの触媒を用いてアセチレンとアレンへのホスフィンの付加反応が位置および立体選択的に進行することを明らかにしている.今回共役ジエンへの付加反応を検討した結果,ホスフィンと水素がそれぞれ1,3-ジエンの1位と2位の炭素に選択的に付加したアルキルホスホニウム塩を高収率で与えることがわかった(ami-Markovnikov modc).ここで,(E)-1,3-ジエンは0°Cでホスフィンが付加するのに対し,(Z)-1,3-ジエンではより高い温度が必要である.この反応性の差を利用して,1,3-ジエンの異性体混合物から純粋な(Z)-ジエンを分離することができた.(Z)-ジエンの立体選択的合成は一般に容易ではないので,本法は(E/Z)-ジエンから(Z)-ジエンを単離する有用な物質供給法であると言える.また,通常遷移金属触媒によるジエンへの求核剤の付加は,多くの場合π-アリル中間体を経由して1,4-付加体を与えるのに対し,本法ではanti-Markovnikov配向の1,2-付加体が選択的に生成する点で反応機構的にも興味深い.アルキルホスホニウム塩は従来ハロゲン化アルキルとホスフィンとの置換反応で合成されていた.これをアルケンへの付加反応で合成できれば,合成化学的な意義は大きいと考えられる.今後は,単純なオレフィンへの付加反応を検討するとともに、種々のヘテロ元素化合物の不可反応に発展させたい.遷移金属触媒とスルホン酸を組み合わせると炭素-炭素不飽和化合物へのヘテロ元素化合物の付加反応が著しく促進されることを見出した.このような複合触媒系は従来ほとんど検討が行われていない.本研究の目的はこの方法論の一般性を検討するとともに,新しいヘテロ原子化合物合成のための触媒反応を開発するものである.すでにこの触媒系を用いてアセチレンとアレンへのホスフィンの付加反応が位置および立体選択的に進行することを明らかにしている.今回共役ジエンへの付加反応を検討した結果,ホスフィンと水素がそれぞれ1,3-ジエンの1位と2位の炭素に選択的に付加したアルキルホスホニウム塩を高収率で与えることがわかった(anti-Markovnikov mode).通常遷移金属触媒によるジエンへの求核剤の付加は,多くの場合π-アリル中間体を経由して1,4-付加体を与えるのに対し,本法では、anti-Markovnikov配向の1,2-付加体が選択的に生成する点で反応機構的にも興味深い.現在,単純なオレフィンへの付加反応を検討中である.またこれまでに,複合触媒系を用いるとアセチレンにジスルフィドが開裂1,2-付加することも明らかにしている.同じ触媒系を用いてアレンとジスルフィドの反応を検討した結果,(E)-1,3-ジエニル-2-スルフィドと(E)-アルケニル-2-スルフィドを与えることがわかった.添加するホスフィンの種類を変えると,ジセレニド化合物の開裂付加反応にも適用できた.

アセチレンとの反応ではジスルフィドが開裂1,2-付加するのに対し,アレンではジスルフィドまたはジセレニドが開裂してアレン二分子にアルキルチオ基が一つずつ移動するとともに,アレン間で水素移動が起こることは興味深い.今後は,不飽和化合物への種々のヘテロ元素化合物の付加反応に発展させたい.
再生医療のための遺伝子導入の空間的・時間的コントロール

研究代表者らは近年、細胞接着因子およびDNAを担持させたアパタイト複合層による安全で高効率な遺伝子導入技術を開発した。本研究では、この遺伝子導入技術を再生医療に応用するための要素技術開発とfeasibility studyを行った。具体的には、複合層の組成と構造を精密に制御するすことによって、遺伝子導入の行われる場所とタイミングをコントロールする技術を確立した。さらに、ラット間葉系幹細胞を用いたin vitro評価、およびラット骨欠損モデルを用いたin vivo評価を行い、本遺伝子導入技術の骨組織再生医療における有用性を実証した。目的の場所の細胞内に意図したタイミングで遺伝子を導入する技術は、再生医療を行う上で重要である。本研究は、細胞接着因子およびDNAを担持させたアパタイト層(CD-Ap層)を利用して、遺伝子導入の空間的・時間的コントロールを行うための技術を確立することを目的とする。平成22年度は、遺伝子導入の空間的コントロール技術として、目的の遺伝子をCD-Ap層表面に接着した細胞に選択的に導入することを検討した。具体的には、Firefly Luciferase(FL)あるいはRenilla Luciferase(RL)の相補的遺伝子を含むプラスミドを担持させた2種類のCD-Ap層(前者をCD(FL)-Ap層、後者をCD(RL)-Ap層とする)を1つのウェル内で隣接させ、それぞれの層表面における2種類の遺伝子の導入効率(培養細胞のFL活性およびRL活性)を調べた。その結果、CD(FL)-Ap層表面に接着した細胞のFL活性はRL活性よりも470倍高く(RL活性はバックグランドと同レベル)、CD(RL)-Ap層表面に接着した細胞のRL活性はFL活性よりも1360倍高かった(FL活性はバックグランドと同レベル)。以上の結果は、CD-Ap層表面から溶出したDNAが同層表面に接着した細胞にのみ選択的に導入され、同じウェル内であっても同層外部の周辺細胞にはほとんど導入されないことを示している。すなわち、CD-Ap層表面における遺伝子導入システムにより、目的の遺伝子を目的の場所の細胞に選択的に導入できることを示した。上記を含む本研究の成果は、2報の総説として発表したほか、1報の査読付き論文、2報の査読無論文として発表予定である(ほか、国内学会発表3件、国際学会発表3件)。また、本研究実績を含む業績により、研究代表者が日本バイオマテリアル学会奨励賞を受賞した。研究代表者らは、細胞接着分子(Cell adhesion molecule)およびDNAを担持させたアパタイト層(CD-Ap層)を利用した、安全かつ高効率な遺伝子導入技術を提案してきた。本研究課題は、CD-Ap層の設計によって、遺伝子導入の空間的・時間的コントロールを行うための技術を確立することを目的とする。当該年度は、遺伝子導入の時間的コントロールを行うためのCD-Ap層の設計について検討した。具体的には、CD-Ap層にフッ化物イオンや炭酸イオンを添加することにより同層の溶解速度を変化させ、層表面に接着した細胞の遺伝子発現の程度を経時的に調べた。その結果、CD-Ap層に炭酸イオンを添加すると、同層の溶解速度が増大し、それにより同層表面における遺伝子導入の効率が向上することが分かった。一方、CD-Ap層にフッ化物イオンを添加すると、添加量に比例して同層の溶解速度が低減し、それにより同層表面における遺伝子導入の効率が低下するとともに、遺伝子発現の時期が遅延することが分かった。すなわち、CD-Ap層へのイオンの添加により、同層表面における遺伝子導入の効率と時期をコントロールできることを示した。また、preliminaryなラットin vivo実験を行い、CD-Ap層による本遺伝子導入技術の安全性と有効性を確認するための動物実験モデルを確立した。以上の研究により得られた成果を4報の査読付き原著論文(ほかに国際学会論文2報、)、および2報の査読付き総説論文として発表した。また、国内学会において2件、国際学会において3件の成果発表を行い、うち1件の発表においてABC Award(11th Asian BioCeramics Symposium)を受賞した。当該年度は、昨年度までに開発してきたアパタイト(Ap)複合層による遺伝子導入システムの安全性と有効性をin vitroおよびin vivo実験により確認するとともに、複合層形成手法の安全性向上を図った。まず、DNAのみを担持させたAp層(D-Ap層)に脂質あるいはフィブロネクチンを複合担持し、株化細胞およびラット間葉系幹細胞へのルシフェラーゼ遺伝子(レポーター遺伝子)の導入効率を評価した。複合層の組成を制御することによって導入効率を最大限向上させた複合層によれば、株化細胞だけでなくラット間葉系幹細胞に対しても遺伝子を導入できることを実証した。次に、レポーター遺伝子に替わって骨形成タンパク質-2(BMP-2)のcDNAを含むプラスミドを用いて上記の複合層を形成させた。同複合層の表面において、骨芽細胞系株化細胞であるMC3T3-E1細胞を培養し、in vitro骨分化誘導実験を行った。

その結果、同複合層の表面ではコントロール群(Ap層およびD-Ap層)に比べて、細胞の骨分化が促進されることを明らかにした。また、人工骨モデル材料である焼結Ap基板の表面に同複合層を形成させてラットの頭蓋骨欠損部に移植したところ、周辺組織における骨分化マーカーの遺伝子発現量および新生骨形成量が、コントロール群に比べて増大した。ラット皮下(骨組織のない部位)への移植においても、骨欠損部と同様の遺伝子発現の結果が得られた。以上の結果から、本遺伝子導入法によれば、in vitroだけでなくin vivoにおいても細胞の分化を誘導でき、周辺組織の再生を促進できることが示唆された。さらに、厚生労働省の認可を受けて臨床使用されている医療用輸液のみを用いてコーティング液を調製し、D-Ap層を形成できることを示した。これにより、従来法に比べて安全性の高い複合層の形成手法を確立した。当初計画の研究内容を実施し、目標を達成している。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初計画に従い、動物実験による安全性・生体内における性能評価を進めるとともに、より安全なアパタイト複合層の作製手法についても検討を行う。
ポリジメチルシロキサンの軟Ｘ線直接加工

レーザープラズマ軟X線によるポリジメチルシロキサン(PDMS)のアブレーション加工法について研究した。この方法で、1μmのスケールで精密にPDMSのアブレーション加工を可能にした。測定を行った範囲では、レーザープラズマ軟X線の波長に強く依存ことはなく、PDMS表面での軟X線のパワー密度により加工特性が決まっていることを明らかにした。軟X線照射面の化学的改質は観測できなかった。このように、マイクロメートルスケールでのPDMSの微細加工に有用な加工特性を実現した。本研究では,バイオテクノロジーへの応用のための実用的なシリコーンゴム(ポリジメチルシロキサン;PDMS)の光直接加工法の確立を目的とする.PDMSは生体適合性が高く,型に流し込んで固めることにより成形できる.この特性を利用し,バイオセンサーなどの細胞の操作や,より一般に微小化学分析器の流路の形成に有用であると期待できる.しかしながら,貫通孔のようなアスペクト比が高い構造をマイクロメートルのスケールでを作製することは困難で,作製できるデバイスの構造に大きな制限を与えている.そこで,ターゲット材料にレーザー光を集光照射することにより発生するプラズマ光(レーザープラズマ軟X線)による光直接加工法について研究した.そのために,PDMSを構成する結合を全ての化学結合を切るだけの光子エネルギーを有する軟X線源および高パワー密度で集光する光学系を開発した.これによりPDMS上での軟X線のパワー密度がある閾値以上のときには,軟X線照射により表面を削り取るアブレーション加工が可能であることを見出した.このとき,照射前と比較し組成や撥水性が変わらず加工に適した特性を有することを明らかとなった.また,アブレーションが起きるパワー密度では直径1マイクロメートルの貫通孔を8マイクロメートルのPDMSシートに作製できることを示した.より低いパワー密度では,これまでに紫外レーザーを用いた場合に報告されているように,照射箇所が盛り上がり組成がSiO2に変性することが分かった.このように,一定のパワー密度を確保することが重要であることを明かにした.以上の研究により,レーザープラズマ軟X線を用いたPDMSの微細加工法を確立できた.化学的構造および物理的構造の観点から,レーザープラズマ軟X線によるポリジメチルシロキサン(PDMS)の加工特性について研究を行った.化学的構造の観点から,軟X線照射面の化学的変性を起こさないでアブレーション加工するために,Si-O結合も切断できる波長のレーザープラズマ軟x線を用いた.とくに,Nd:YAGレーザー光をTaターゲットに照射して発生した100eV前後の領域の軟X線CO2レーザー光をXe,Snターゲットに照射して発生した113eVおよび92eVの軟X線をPDMSに照射した,照射後の表面化学構造をXPSにより測定した.これにより,十分波長が短い光をアブレーション閾値以上のパワー密度で照射すると,PDMSの化学的構造が保たれたまま加工が可能であることを明らかとした.また,物理的構造の観点から,軟X線照射後の加工形状を,共焦点レーザー顕微鏡を用いて観測した.これにより,最も長い波長成分が含まれるNd:YAGレーザー光をTaターゲットに照射して発生した軟X線の場合でも,10μmの厚さのPDMSシートに直径が1μmの貫通孔を作製できることを明らかにした.さらに,PDMSの主鎖を構成するSiの2p電子を励起できる113eVの軟X線と励起できない92eVの軟X線を比較した.これにより,113eVの軟X線が優れた加工特性を有することを明らかにした,以上の研究により,従来の金型を用いる方法およびレーザー加工と比較し,化学的構造を変えずにアスペクト比が高い微細加工法を確立できたと結論できる。ポリジメチルシロキサン(PDMS)は,生体適合性がありバイオテクノロジーおよび微小化学分析器に不可欠な構造材である。本研究では,レーザー生成プラズマを用いた狭帯域・高パワー密度軟X線源を開発した。これを用いてPDMSに軟X線を照射し,励起準位を制御した高密度励起を行った。この軟X線照射によるPDMSの加工について研究を行った。まず,真空紫外から軟X線の領域までの広い範囲で得られるプラズマ輻射光をPDMSに照射した.ある閾値以上のプラズマ光を照射したところ,直径が1μmの穴開けなど精密なアブレーション加工が可能であることを明かにした。また,閾値近傍では, PDMSのメーカーおよびロットにより隆起が起きる場合があり,加工には向かないことを示した。また, Si 2s内殻励起が可能な11 nmのプラズマ光と,比較のため13 nmにピークを持つプラズマ光を照射した。ここで用いた3種類の光源の範囲では,波長によるアブレーション特性の相異は認められず,照射パワー密度によってアブレーション深さが決まっていることを明かにした。さらに,光電子分光により分析したところ,照射前後で表面の化学的構造が変化することなくアブレーション加工を実現てきることが明らかとなった。

以上の研究により,従来法では困難であった1μmから1mmの長さの領域においてPDMSを加工する軟X線微細加工法を確立した。ボリジメチルシロキサン(PDMS)は,生体適合性がありパイオテクノロジーおよび微小化学分析器に不可欠な構造材である。本研究では,レーザー生成プラズマを用いた狭帯域・高パワー密度軟X線源を開発する。これを用いてPDMSに軟X線を照射し,励起準位を制御した高密度励起を行う。この軟X線照射によるPDMSの加工について研究を行う。これにより, 1μmから1mmの長さの領域においてPDMSを加工する軟X線加工法を確立することを目的とする.軟X線源として,金属Ta,金属Sn,固体Xeターゲット材料にNd:YAGもしくはCO2レーザー光を集光照射することにより発生するプラズマ光(レーザープラズマ軟X線)を用いた.また,発生した比較的広い波長範囲の軟X線を効率よく集光するための集光光学系を開発し採用した.これにより,結合を切断するのに十分な光子エネルギーを有する真空紫外光の他に, Si 2p電子の選択励起ができる光源を開発した.また同時に,高パワー密度が実現できる集光光学系を実現した.以上の光源および光学系を組み合わせてPDMSに軟X線を照射した.これにより,厚さ10μmのPDMSシートに直径1μmの貫通孔を作製する方法を確立した.さらに,照射する軟X線のPDMS表面でのパワー密度Pを変え,以下のアブレーション特性を見出した.ある閾値のパワー密度P0以上では,アブレーション加工ができる.閾値以上では,アブレーション深さDは, D=(1/a) ln(P/P0)の関係にある.この軟X線からアブレーションに至るエネルギー伝達効率aから,表面100nm以下の深さで効率的にエネルギー伝達が起き,ほぼ原子状に分解されると考えられる.目的としたことを達成できている。独創的な装置を開発し,それを用いた研究であり,装置開発に一定の時間がかかる。そのため,計画以上に進展させることは困難であった。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では,バイオテクノロジーおよび微小化学分析器への応用を前提とした実用的なPDMSの光直接加工法の確立を目指す.特に,従来法では実現できないマイクロメートルのスケールでの高いアスペクト比の加工法,および3次元加工法の確立を目指す.これまでにTa, Sn, XeターゲットにNd:YAGまたはCO2レーザー光を照射し, 10 nm前後の軟X線を発生し,とくにこの波長領域の光を効率よく集光する光学系を開発した.これにより, 10μmの厚さのPDMSシートに直径1μmの貫通孔を作製することを可能とした。加工特性を明らかとするため,軟X線のパワー密度を広い範囲で変化させ,軟X線照射後のアブレーション深さおよびPDMS表面の化学的構造を調べた。本研究で採用した高いパワー密度の軟X線を用いた場合,ある閾値のパワー密度があり,れより高いパワー密度ではアブレーションが起きることが明かとなった.
Cu-64イオンを用いた簡便ながんイメージング法の開発

ヒトの必須微量元素のひとつでもある銅の放射性同位体のうちCu-64は、半減期が12.7時間と比較的長く、医療用小型サイクロトロンでも製造可能なポジトロン放出核種であることから、PETイメージング薬剤への利用が大いに期待されている。本研究では、従来の標識反応を必要とせずフリーのCu-64イオンをそのまま薬剤として利用する簡便迅速ながんの診断法を提案し、担がんマウスにおけるPETイメージング画像からその有効性を検証した。本研究では、これまでほとんど検討されることのなかった錯体を形成せずにフリーのCu-64イオンをそのままイメージング薬剤として利用する新たながん診断用PETイメージングの手法を確立することを目的とする。具体的には、各種がん細胞を用いた細胞実験を行った上で、特異的な取り込みが認められたがん細胞を移植したマウスを作製し、Cu-64の体内動態解析からPETイメージング薬剤としてのCu-64イオンの有用性を明らかにする。今年度は、主にサイクロトロンにて製造したCu-64イオンを用いて、各種がん細胞へのCu-64の取り込みを評価した。1.Cu-64の製造、分離:(p,n)反応を利用してNi-64をターゲットとし、AVFサイクロトロンから生じる約10 MeVの入射エネルギーをもつプロトンビームを電流値5μAで一定時間照射した。照射後のターゲットを6 M塩酸水溶液に溶解した後、キレート交換樹脂を用いた分離精製法によって無担体かつ高純度のCu-64を単離することができた。2.Cu-64イオンの細胞内取り込みの評価:12種類のがん細胞を培養した後に、それぞれ一定量の細胞に対してCu-64イオンを加え、37°Cで培養液中一定時間インキュベートした。遠心分離後の上清を除去し、緩衝液等で十分に細胞を洗浄する操作を繰り返し行った後、細胞内に取り込まれたCu-64の放射能を測定した。その結果、細胞間で取り込み量に有意な差が認められ、フリーのCu-64イオンがある種のがん細胞に対して特異的に取り込まれることがわかった。ヒトの必須微量元素のひとつでもある銅の放射性同位体のうちCu-64は、半減期が比較的長く医療用小型サイクロトロンでも製造可能なポジトロン放出核種であることから、PETイメージング薬剤への利用が大いに期待されている。本研究では、従来の標識反応を必要とせずにフリーのCu-64イオンをそのままイメージング薬剤として利用する簡便ながん診断用PETイメージング法の開発を目的とする。今年度は、前年度に引き続き各種がん細胞を用いたCu-64イオンの細胞実験を実施した上で、特異的な集積が認められたがん細胞を移植したマウスを用いてCu-64の体内動態を解析した。緩衝液中およびウシ胎仔血清を含む培地中の両者で、各種がん細胞へのCu-64イオンの集積性を評価した結果、それぞれ異なる結果が得られた。生体成分により近い培地中でCu-64が高く集積した脳腫瘍および大腸がん由来のがん細胞をそれぞれマウスの皮下に移植し、担がんマウスを作製した。サイクロトロンで製造したCu-64イオンを尾静脈から投与し、一定時間経過した後の血液を採取するとともにマウスを解剖し、がん組織、心臓、肺、肝臓、脳、腎臓等の各臓器への集積を放射能測定により分析した。その結果、肝臓への高い集積が認められたものの、細胞実験での結果を反映して動物実験でもCu-64ががん組織に高く集積することが明らかとなり、がんのイメージング薬剤としての有用性を示唆できた。担がんマウスにおけるCu-64の体内動態解析の結果から、PETイメージング薬剤としてのCu-64イオンの有用性を示唆することができた。ヒトの必須微量元素のひとつでもある銅の放射性同位体のうちCu-64は、半減期が12.7時間と比較的長く、医療用小型サイクロトロンでも製造可能なポジトロン放出核種であることから、PETイメージング薬剤への利用が大いに期待され、これまでに数多くのCu-64標識薬剤の開発研究が進められてきた。本研究では、錯体を形成せずにフリーのCu-64イオン(64CuCl2)をそのまま薬剤として利用する新たながん診断用PETイメージングの手法を開発することを目的として、以下の実験を行った。12種類のがん細胞を用いてCu-64イオンの細胞内取り込みを評価した結果、脳腫瘍、大腸がん等に対してCu-64が特異的に取り込まれることがわかった。これらがん細胞の皮下移植により作製した担がんマウスに、Cu-64イオンを尾静脈から投与した後の経時変化を動物用PET装置によって撮像した。その結果、銅の主な代謝器官である肝臓への高い集積が認められたものの、腫瘍にもCu-64が高く集積することが明らかとなり、PETイメージングにおいてがんを明瞭に描出することに成功した。また、Cu-64の体内動態解析の結果からも、時間経過にともなって肝臓への集積は徐々に減少するのに対して、腫瘍への集積は増加する傾向にあることがわかった。以上の結果から、64CuCl2そのものががん診断用PETイメージング薬剤として有用であることを明らかとすることができた。今後は、引き続きCu-64ががん細胞内へ取り込まれるメカニズムを検証するための基礎実験を行うとともに、正常組織への生理的集積を低減させる薬剤との併用によりがん特異性の向上を目指す。ヒトの必須

微量元素のひとつでもある銅の放射性同位体のうちCu-64は、半減期が12.7時間と比較的長く、医療用小型サイクロトロンでも製造可能なポジトロン放出核種であることから、PETイメージング薬剤への利用が大いに期待されている。本研究では、従来の標識反応を必要とせずフリーのCu-64イオンをそのまま薬剤として利用する簡便迅速ながんの診断法を提案し、担がんマウスにおけるPETイメージング画像からその有効性を検証した。研究期間1年目にあたる今年度は、当初の計画通り各種がん細胞を用いたCu-64イオンの細胞内取り込みを評価することができた。今後は、生体内におけるCu-64の化学形の変化、および銅トランスポーターの関与等を検討することで、Cu-64のがん細胞への集積機序を明らかにする。また、体内動態の解析結果より、がん以外に高い集積が認められた肝臓から、選択的にCu-64を排出させることのできるキレート剤等の薬剤を探索し、がん特異性の向上を目指す。医歯薬学今後は、Cu-64のがん細胞への取り込みメカニズムを検討するとともに、特異的な取り込みが認められたがん細胞を移植したマウスを作製し、Cu-64の体内動態を解析する。前年度同様に価格が高騰した濃縮ターゲットの購入を見送らざるを得ず、動物実験用マウスや実験機材等消耗品の購入に充てたため。Cu-64の製造に必要な濃縮ターゲット(Ni-64)を米国メーカーより購入する予定であったが、為替相場の変動により予算を大幅に上回る金額にはね上がり購入を見送ったため。翌年度の研究経費については、RI取り扱いおよび動物実験に必要な機材の購入に充てるほか、Cu-64の製造に必要な濃縮ターゲットの購入に使用する計画である。次年度以降の研究経費については、主に動物実験用機材のほか薬品およびガラス器具等の消耗品の購入にあてる予定である。
少数多体系の化学

本研究班は、平成7年度-9年度の3年間に実施予定の重点領域研究「少数多体系の化学」に関し、その計画班員が、研究の現状、そして今後の計画について討論し、重点領域計画が円滑に進行するために実施されたものである。本研究計画は、クラスターという有限個の原子・分子の集団に特有な性質を、物理化学の実験家と、非線形動力学の物理の理論家とが共同して解明していこうとするものである。本申請で具体的に取り組むテーマとして「少数多体系としてのクラスターの動力学」、液相におけるクラスター構造、「表面とクラスターの特異的相互作用」の3つを取り上げた。本総合研究(B)において、研究代表者(茅)および、分担者の大部分(21名)が参加して研究会が本年1月熱海において開催され、その他、今後の共同研究の打ち合せが数度おこなわれた。特に、本年1月の研究会では、理論家と実験家が、相互の理解を得るために、徹底した議論が交され、実りあるものであった。保田(阪大)は、あるサイズまでの金属クラスターが、外側からの異種原子による合金化を異常に迅速に受ける「自発的合金化」を観測し、理論家の強い関心を引いた。池田(立命館大)は非線形理論とクラスターとの関連について説明し、実験家のこの方面への関心を強めた。西川(横国大)は、液体の超臨界点付近のx線小角散乱から、液体・気体相平衡線の臨界点を越えた延長線上にクラスター化しやすい領域がある事を見つけ、今後理論・実験の両面からの進展がのぞまれる事を示唆した。近藤(東大)は、分子クラスターイオンと固体表面との衝突反応で、衝突エネルギーによって反応過程に特異的がある事を報告し、動力学の理論・実験家の注目するところとなっている。このように、今後の本研究計画の推進によって、クラスターならではの新しい物理・化学の境界領域研究が進展するものと結論できる。
神経経済学的観点に基づく糖尿病患者の行動経済学的分析

2型糖尿病の基本的治療は食事制限と適切な運動である。しかし、それぞれの生活習慣の改善は簡単ではない。2型糖尿病治療に対する解決法を考案するため、血糖コントロールの悪い糖尿病患者に対して神経経済学的観点から行動経済学的アンケート調査を試みた。その結果、1型と2型糖尿病は基本的に異なった疾患であること、2型糖尿病の中年の患者では定量的リテラシー能力が低いこと、このことが糖尿病発症に関与している可能性があり、アンケートの回収率が低くなる要因でもあり、さらに、ここに先送り傾向が重なると合併症が進行することが示された。平成24年度に改変した新しいアンケート調査を行った。【方法】外来2型糖尿病患者100名に、外来にてアンケートを手渡し、記入後郵送で送ってもらうこととした。謝礼として500円の図書券を前渡しとした。アンケートは19問からなる。以下にその一部を示す。(問5)あなたは子供のころ、休みに出された宿題をいつ頃することが多かったですか。1休みの最初の頃が多い2休み期間中ほぼ均等に3休みの終わり頃が多い(問6)現在のあなたなら、休みに出された宿題をいつごろやりますか。1休みの最初の頃2休み期間中ほぼ均等に3休みの終わり頃(問14)あなたを含む100人のうち、10年以内に心筋梗塞や脳梗塞になる人が何人の確率だと自分も心筋梗塞や脳卒中になると思いますか?(問15)あなたを含む100人のうち、10年以内に心筋梗塞や脳卒中になる人が50人だとします。ある薬を飲むと、その50人が25人に減ります。あなたは、毎月いくらならその薬を飲み続けますか?【結果】アンケートの回答率は前回の謝礼図書券後渡しの49%に対し、前渡しでは61%に上昇した。微量アルブミン尿30mg/gCre以上の腎症を有する患者では、問6の現在でも宿題を休みの終わり頃にすると答えた患者が19名中7名で、腎症のない患者の35名中4名と有意差(p<0.05)を認めた。問5の子供のころについては差を認めなかった。また合併症を持っているか血糖コントロールの悪い患者では問14の質問で低い数値で脳血管障害の危険性を認識していながら、問15でその回避に支払う金額は少ない回答だった。【目的】行動経済学の理論を応用して、糖尿病患者の行動メカニズムの解明を試みている。【方法】1型患者66名、2型患者153名に行動経済学的アンケート調査を行った。分析の対象となったアンケート部分のみを示す。(問a)半々(50%)の確率で2,000円当たる宝くじがあります。あなたはこのくじを、いくらまでなら買いますか?(問b)百分の一の確率(1%)で10万円当たるくじがあります。あなたはこのくじを、いくらまでなら買いますか?(問c)あなたは子供のころ、休みに出された宿題をいつ頃することが多かったですか。(問d)現在のあなたなら、休みに出された宿題をいつごろやりますか。【結果】アンケートの回答率は1型87.9%に対し、2型71.9%と有意に2型の回答率が低かった(p<0.05)。1型では若年者が多く、2型では高齢者が多いため、年齢階層別の回答率分析を行ったが、この結果はマンテル・ヘンツェル法による統計解析で有意差を認めた(p<0.01)。問aおよび問bは不確実な収益に対する確実等価を尋ねている。数学的期待値はいずれも1000円である。質問の文章を正確に理解し、数学的に妥当な金額を真面目に答える意志と能力が問題となる。45歳以上65歳未満においては、1型と2型に有意差を認めた(p<0.05)。問c、問dは池田(自滅する選択,東洋経済新報社,2012)によって示された問題の先送りの傾向を測る質問で、2型において、3期以上まで進行した腎症の患者では、子供の頃も現在もともに宿題を休みの終わり頃にやると答えた患者が32%であったのに対し、2期以下の患者では14%と有意に少なかった(p<0.05)。【考案】今回の分析により2型には怠惰さとリテラシー能力の低さが認められた。1型は膵臓のインスリン分泌障害であるが、2型は脳の神経経済学的意味での適応障害である可能性がある。【目的】経済学的価値判断が糖尿病治療に影響するかを検証するため、患者の行動経済学的意識調査を行った。【方法】外来糖尿病患者100名、非糖尿病患者40名に行動経済学的アンケート調査を行った。

アンケートは同意書とともに郵送で答ええることとし、協力患者には500円の図書券を送付するというインセンティブを設けた。アンケートは12の質問からなる。以下に一部を示す。(問1)あなたが普段お出かけになる時に、傘を持って出かけるのは降水確率が何%以上の時ですか。(問2)電車の座席指定を予約しているとき、電車の出発時刻の何分前に駅に着くようにしていますか。(問4)100分の1の確率で10万円当たる宝くじをいくらなら買いますか?(問5)問4のくじをもらった(拾った)とします。いくらなら人に売りますか?(問9)あなたを含む100人のうち、10年以内に心筋梗塞や脳梗塞になる人が何人の確率だと自分も心筋梗塞や脳卒中になると思いますか?(問10)10年以内に心筋梗塞や脳卒中になる人が50人だとします。病院では扱わないある薬を飲むと、その50人が25人に減ります。あなたは、毎月いくらなら飲み続けますか?【結果】非糖尿病患者(非DM群)のアンケート回収率が69.4%に対し、糖尿病患者のアンケート回収率は49.0%に留まり有意に低く、特に血糖コントロールの悪いHbA1cが9.4 %以上の患者では11名中3名のみ(27%)に留まった。比較的コントロールの悪いHbA1c 7.4%以上の糖尿病患者群(不良群)の特徴としては、提示された仮想報酬に対して定量的に数値で評価することを回避しがちであり、危険回避度の指標が低い値を示した。危険回避に支払うコストが現在の支払い額に強く影響されるという特徴がみられた。これは糖尿病患者の行動経済学的分析が糖尿病の治療介入に重要な示唆を与え得ることを初めて示した研究である。従来の投資マインドを測定するために行動経済学で使われていたアンケートが、糖尿病患者の血糖コントロールの良悪を予想する手段として使えるかどうかを検証してきている。アンケートには500円の図書券というインセンティブを設けているが、コントロールの悪い患者ほど回答率が悪かった。また、質問項目によっては十分理解して答えているのかわからない部分もあった。そこで平成24年度は質問項目を改変し、さらに図書券を前渡し(科研費からの支出は回答者の分のみ)とした。これらの工夫によって2型糖尿病患者に関しては49%から69%と飛躍的な回答率の上昇を認めた。また、24年度のアンケートでは1型糖尿病患者53名からもデータを収集したほか、学生23名からもデータを集めることができ、比較対照することができた。これらの分析結果より、コントロールの悪い糖尿病患者では、純粋に経済学的な意味でも、また健康に関する問題においても、金銭的な価値に置き換えて定量的に判断することが苦手であることが判明した。これは数字の取り扱いリテラシーの問題と深くかかわっていることが考えられた。糖尿病患者100名非糖尿病患者40名、その他患者以外のボランティア21名にアンケートを実施し、回収されたアンケートは100名分であった。この人数においても、糖尿病患者において、血糖コントロール良好な群と不良な群に有意差を認めることができている。今後さらに人数を増やしてアンケートによるデータ収集を続ければ、さらなるコントロール不良患者の特徴を明らかにすることができると考えられる。3年間で糖尿病患者300名、非糖尿病患者150名のデータが得られる予定である。これまでのアンケートでコントロールの悪い2型糖尿病患者の特徴として、金銭や確率などの数字を扱った質問に対して無回答あるいは直接的な解答を回避する傾向があることが判明した。その心理的メカニズムとして次のようなものが考えられた。
認知症高齢者へのライフコースアプローチを基盤にした生きがい支援プログラムの開発

本研究は、スピリチュアルペインを抱えている認知症高齢者に対して、失われた本来の「生き方」に焦点をあてたライフコース的アプローチを基盤にした生きがい支援プログラムを開発することにある。昨年度までに文献レビュー等行い認知症高齢者への生きがい支援プログラム開発の土台となる哲学・概念等を明らかにした。さらに、現在の認知機能アセスメントや評価は「できない」ことに支援することにのみ視点がいきやすくケアと直結しにくいことを明らかにし、研究計画を以下のように追加修正した。1)生きがい支援プログラム開発の方向性およびライフコース的アプローチから得た情報を活かすための認知症高齢者の日常生活における強みを引き出す認知機能評価方法を検討:看護師や介護師の専門職だけでなく、家族も含む介護者が日常生活の中で認知症高齢者の「できること」を活かす認知機能アセスメント手法を検討、吟味し案を作成した。2)それに加え海外のライフコース的アプローチに関連するライフコースストーリーワークや生きがい支援の実際や手法を調査し、現在の動向を得た。また、研究協力施設に対して、生きがい支援プログラム開発に必要な現場における認知症ケアの困難さや理解といった調査を行い、課題を明らかにした。3)1)2)の成果を総合し、失われた本来の「生き方」に焦点をあてたライフコース的アプローチを基盤にした生きがい支援プログラム第一案を作成し、検証の準備を整えた。まず、H29年度に生きがい支援プログラム案作成にあたり、新たな日常生活での強みを引き出す認知機能アセスメント手法の必要性が明らかとなり、日常生活場面からのアセスメント手法案を作成するなどの計画修正を行い、下半期に遅れをを調整しようとしたが、研究代表者の予測不可能な大学業務のエフォート(100%)の増大が生じたため、H30年度時点で本来の研究計画が遅れていた。H30年度は、その遅れを調整に入れた計画を立てた。しかし、認知症高齢者に支援する人に適した「生きがい支援プログラム」開発を検討するに当たり、施設(老人保健施設や特別養護老人ホームなど)の研究協力は必須であるにもかかわらず、当初予定をしていた施設の問題(社会的問題の発生・人員不足)により、研究協力が困難な事態が生じた。そのため、新たな協力施設の開拓に時間を要した。さらに、新たに開拓した協力施設の人事や事情(人事異動・業務スケジュールなど)により作成したプログラム案の実施と検証が遅れている状態である。1.【日常生活での強みを引き出す認知機能アセスメント手法案の検証】研究協力施設にて、作成した日常生活場面での評価フォーマット案の検討をする。多職種研究者との意見交換および現場の看護師、介護師、家族への検証(分析手法および評価フォーマットの活用可能性・精度について)およびフォーカスグループインタビュー調査を行い、必要な修正を加え精度を高める。2.【ライフコース的アプローチを用いたプログラム案の検討と検証】ライフコース的アプローチに必要な知識と演習及びケア計画、ケア実践に至るまでのプログラム第一案を用いてプログラムを実施する。実施中の調査や実施後フォーカスグループインタビュー調査を行い、必要な修正を加え精度を高める。3.【文献レビュー結果の論文化】成果を学会発表および論文化する。昨年度の文献レビューにより、認知症高齢者への生きがい支援プログラム開発の土台となる概念枠組み・分析に必要な項目と各項目の関連性を明らかにしプログラム開発の方向性は、明らかになった。しかし、生きがい支援プログラム作成にあたり、ライフコース的アプローチから得た情報を活かすための新たな日常生活での強みを引き出す認知機能のアセスメント手法が必要となり、H29年度の研究計画を追加修正し、認知症の人の力を活かす日常生活場面アセスメント手法の文献レビューおよび手法の検討を行った。結果、文献レビューにおいては、既存の検査は次の3つの理由で十分ではないことが明らかとなった。第1に、認知機能を反映した生活機能を捉える質問項目が大きすぎ、「IADL等の諸活動が平均的に実施できる健常者」を基準として質問内容が決められているため、認知症の人の力を見落とす可能性が高いこと。第2に、質問項目という枠でしか、その人の力を見つけることができないこと。第3に、検査項目の目的が機能障害を見つけることのみを前提としていることである。この結果を元に、新たなアセスメント手法の検討が必要であることが明らかとなった。そこで、看護師や介護師の専門職だけでなく、家族も含む介護者が現在のその人を活かすアセスメント手法を検討、吟味し案を作成した。生きがい支援プログラム案作成にあたり、新たな日常生活での強みを引き出す認知機能アセスメント手法の必要性が明らかとなった。これは、ライフコース的アプローチから得た情報を日常生活に活かすための重要な検討である。そこで、H29年度の4月8月の上半期は、この点に焦点を当て研究計画を追加修正し、認知症の人の力を活かす日常生活場面のアセスメント手法の文献レビューおよび日常生活場面からのアセスメント手法案の検討を行った。しかし、下半期は、研究代表者の予測不可能な大学業務のエフォート(100%)の増大が生じた。研究エフォートも上げるべく大学に業務改善に向け交渉や調整を試みたが改善は困難であった。以上、2点の理由により、本来の研究計画が遅れた。

昨年度までに文献レビュー等行い認知症高齢者への生きがい支援プログラム開発の土台となる哲学・概念等を明らかにした。さらに、現在の認知機能アセスメントや評価は「できない」ことに支援することにのみ視点がいきやすくケアと直結しにくいことを明らかにし、研究計画を以下のように追加修正した。1)生きがい支援プログラム開発の方向性およびライフコース的アプローチから得た情報を活かすための認知症高齢者の日常生活における強みを引き出す認知機能評価方法を検討:看護師や介護師の専門職だけでなく、家族も含む介護者が日常生活の中で認知症高齢者の「できること」を活かす認知機能アセスメント手法を検討、吟味し案を作成した。2)それに加え海外のライフコース的アプローチに関連するライフコースストーリーワークや生きがい支援の実際や手法を調査し、現在の動向を得た。また、研究協力施設に対して、生きがい支援プログラム開発に必要な現場における認知症ケアの困難さや理解といった調査を行い、課題を明らかにした。3)1)2)の成果を総合し、失われた本来の「生き方」に焦点をあてたライフコース的アプローチを基盤にした生きがい支援プログラム第一案を作成し、検証の準備を整えた。まず、H29年度に生きがい支援プログラム案作成にあたり、新たな日常生活での強みを引き出す認知機能アセスメント手法の必要性が明らかとなり、日常生活場面からのアセスメント手法案を作成するなどの計画修正を行い、下半期に遅れをを調整しようとしたが、研究代表者の予測不可能な大学業務のエフォート(100%)の増大が生じたため、H30年度時点で本来の研究計画が遅れていた。H30年度は、その遅れを調整に入れた計画を立てた。しかし、認知症高齢者に支援する人に適した「生きがい支援プログラム」開発を検討するに当たり、施設(老人保健施設や特別養護老人ホームなど)の研究協力は必須であるにもかかわらず、当初予定をしていた施設の問題(社会的問題の発生・人員不足)により、研究協力が困難な事態が生じた。そのため、新たな協力施設の開拓に時間を要した。さらに、新たに開拓した協力施設の人事や事情(人事異動・業務スケジュールなど)により作成したプログラム案の実施と検証が遅れている状態である。1.【日常生活での強みを引き出す認知機能アセスメント手法案の検討と検証】H29年度に作成した日常生活場面での評価フォーマット案の検討をする。多職種研究者との意見交換および現場の看護師、介護師、家族への検証(分析手法および評価フォーマットの活用可能性・精度について)およびフォーカスグループインタビュー調査を行い、必要な修正を加え精度を高める。2.【ライフコース的アプローチを用いたプログラム案の作成と検討】H28年度に文献レビューで明らかになった分析手法を元にライフコース的アプローチに必要な知識と分析手法を明確にする。さらに、プログラム案および分析手法案を作成する。3.【文献レビュー結果の論文化】
巨核球の分化と血小板関連蛋白質:遺伝子のクロ-ニングと発現調節の解析

巨核球系細胞株CMKより数種の亜株をを得た。これらの内CMK6は形態上も表面マ-カ-上もより末熟な巨核芽球であり、CMK11ー5は共により成熟した巨核芽球であった。CMK細胞は、インタ-ロイキン6(ILー6)を産生し、かつILー6により増殖と分化の両方を誘導された。巨核球の分化に伴って発現される蛋白質を同定する目的で以下の実験を行った。フォルボ-ルエステル(TPA)で分化させたCMK細胞よりmRNAを抽出しcDNAを合成し、λgtllを用いライブラリ-(1.2×10^7クロ-ン)を作成した。同時に、CMK細胞及びTPAで分化させたCMK細胞のmRNAを材料とし、2種のプロ-ブ用M13ファ-ジcDNAライブラリ-を作成た。これらをプロ-ブとしてデイファレンシャルハイブリダイゼ-ションを実施し、分化CMK細胞より作成したcDNAライブラリ-より、CMK細胞プロ-ブとは反応せず分化CMK細胞プロ-ブとのみ特異的に反応するクロ-ンを選択した。5回の別々の実験より得られたこれらクロ-ンを、さらにNothern blotting法にて特異性を確認し、延べ36のクロ-ンを得、ついで重複するクロ-ンを除き最終的に18のクロ-ンを得た。これらの内、すでに3種については、それぞれGlucose transporter like protein,Glutation peroxidase,Leukocyte common antigenと確認されたが、他については未知のクロ-ンであり、同定作業に入っている。CD34抗体(造血幹細胞認識抗体)に対する反応をTPA処理CMS細胞、及びCMK11ー5細胞で検討すると、両者ともCMK細胞と比べ反応細胞の比率が低下した。この結果より、CMK細胞が分化に伴って消失してゆくmRNAを検討することにより、造血幹細胞に特異的な物質を新たに同定しうる可能性が得られた。CMK細胞はDown症候群に伴った急性巨核芽球性白血病患児より樹立された細胞株であり、巨核芽球としての形質を強く発現している。CMK細胞はフォルボ-ルエステル処理により、より成熟した巨核球へ分化する。この過程で発現の増強をうけるm-RNAについてクロ-ニングをすすめ、既知の物質(common leukocyte antigen等)の遺伝子数種を含む、複数の遺伝子のクロ-ニングした。これら遺伝子の産物につき、モノクロ-ナル抗体を用いて検討をすすめている。CMK細胞より分化度の異なる亜株を数種クロ-ニングした。このうちCMK11-5細胞は比較的大型で、細胞膜の血小板特異糖蛋白質の発現も強く、巨核球としての分化度の高い亜株であり、CMK6細胞は比較的小型で巨核球としての分化度の低い亜株である。これら亜株の特性化を進める中で、多剤耐性遺伝子(mdr-1)及びraf-1遺伝子の発現に差が認められ、共にCMK11-5細胞において発現が増強している事が判明した。現在更にクロ-ニングを進め、より未熟な幹細胞に近い株、より分化の進んだ株の樹立をすすめながら、その特性化を行っている。同時に種々の亜株よりm-RNAを抽出し精製をすすめており、これよりcDNAを合成しλgt10および11を用いてライブラリ-を作製し、亜株間において発現に差を認めた遺伝子を中心にクロ-ニングを進めている。