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エリスロポエチン受容体アゴニストの抗動脈硬化作用に関する研究

エリスロポエチン(EPO)は造血促進作用以外に細胞保護効果を有することが明らかとなり注目を集めているが、その血栓症惹起作用が臨床使用を困難にしている。本研究では動脈硬化・心筋梗塞を自然発症するWHHLMIウサギを用いて副作用を有しないEPO受容体アゴニスト(EPORA)の抗動脈硬化作用を検討した。EPORAはアポトーシス抑制・抗炎症作用を示し、WHHLMIウサギの冠動脈病変の進展を有意に抑制した。EPORAにはスタチンのような多面的効果が認められ、新しい動脈硬化治療薬として臨床応用が期待される。本研究の目的は、エリスロポエチン受容体アゴニスト(EPORA)のin vivoにおける抗動脈硬化作用を検討することである。動物実験室renewal後の換気設備不具合により当施設ではウサギの飼育が困難となったため、神戸大学医学部附属動物実験施設の塩見准教授およびスタッフの協力を得て、実験を開始している。高脂血症、動脈硬化、心筋梗塞を自然発症するモデル動物であるWHHLMIウサギを用いて、EPORA群には30μg/kgのEPORAを3回/週、32週間皮下投与し、コントロール群には同量のプラセボペプチドを投与した後、安楽死させて大動脈および心臓等を摘出し、動脈硬化病変の進行がEPORAによって抑制されるか否かを評価する。各群4匹で開始しているが、病理学的所見、血清脂質および炎症所見などの推移をみて、個体数をさらに増やす予定である。また、EPORAの抗動脈硬化作用に関するメカニズムを調べるため、既報(Atherosclerosis.2008 Jan; 196(1):129-35.)の実験系を用いて血管内皮細胞のアポトーシスに対するEPORAの効果を検討した。CRPは動脈硬化のriskfactorであると同時に内皮細胞のアポトーシス惹起物質であり、CRPによる内皮傷害に対するEPORAの効果をみることはEPORAの抗動脈硬化作用を評価する上で意義がある。アポトーシスの評価は蛍光標識したannexin Vを用いてFlow cytometryにより行った。CRP(10μg/ml)は培養ヒト臍帯静脈内皮細胞にアポトーシスを惹起したが、EPORA(2.5-25ng/ml)はこれを有意に抑制した。さらに、この抑制効果はエリスロポエチンのアポトーシス抑制効果より有意に強力であった。CRPはまた、内皮細胞のずり応力応答性一酸化窒素産生を減弱させ、さらに単球におけるmatrix metalloproteinase-9の産生を亢進させて動脈硬化病変の発症・進展に寄与すると考えられており、現在CRPのこれらの作用に対するEPORAの効果を検討中である。神戸大学医学部附属動物実験施設の塩見准教授の協力を得て、高脂血症、動脈硬化、心筋梗塞を自然発症するモデル動物であるWHHLMIウサギを用いて実験を開始した。各群8匹まで増やし、EPORA群には30・g/kgのEPORAを3回/週、32週間皮下投与し、コントロール群には同量のプラセボペプチドを投与した後、安楽死させて大動脈および心臓等を摘出し、動脈硬化病変の進行がEPORAによって抑制されるか否かを評価した。現在のところ各群4匹まで解析が進んでおり、大動脈の動脈硬化病変には両群間で明らかな差を認めていないが、冠動脈においてはEPORA群で動脈硬化病変の抑制傾向が見られている。血清脂質および炎症所見に関しては途中経過ではあるが、両群間で明らかな差を認めていない。今後、動脈硬化病変におけるCRP、接着分子およびプラーク不安定化因子であるmatrixmetalloproteinase-9(WP-9)などの発現の違いを検討する予定である。またin vitro実験では、EPORAは動脈硬化のrisk factorであるCRPによって惹起された内皮細胞のアポトーシスを有意に抑制し、この効果はエリスロポエチンのアポトーシス抑制効果より強力であった。さらにMMP-9の産生についてもEPORAによる抑制傾向が見られており、引き続き検討中である。EPORAの細胞内シグナル伝達に関しては、ラット心筋細胞を用いた研究でAktの活性化がアポトーシス抑制に重要な役割を担っていることを既に報告しており(投稿中)、内皮細胞に関しても同様の可能性が考えられる。現在、NOの産生に及ぼすEPORAの効果を検討しているが、これと並行してWestern blotとsiRNA法を用いて内皮細胞におけるEPORAのシグナル伝達系を解明していく予定である。神戸大学医学部附属動物実験施設の塩見准教授の協力を得て動脈硬化・心筋梗塞を自然発症するモデル動物であるWHHLMIウサギを用いて実験を行った。EPORA群(n=8)には30μg/kgのEPORAを3回/週、32週間皮下投与し、コントロール群(n=8)には同量のプラセボペプチドを投与した。

安楽死させて冠動脈および大動脈を摘出し、動脈硬化病変の進行がEPORAによって抑制されるか否かを評価したところ、EPORAが冠動脈の動脈硬化病変を有意に抑制することが明らかになった(冠動脈平均狭窄率(Mean±SEM):コントロール群38.0±2.7%、EPORA群21.3±2.2%)。さらに、75%以上の有意狭窄病変を有する割合に関しては、コントロール群17.9±6.3%に対してEPORA群では3.8±2.5%と顕著な抑制効果がみられた。しかしながら、大動脈の動脈硬化病変には両群間で明らかな差を認めず(動脈硬化病変面積:コントロール群79.6±3.5%、EPORA群81.4±2.4%)、この原因に関しては、EPORAの抗動脈硬化作用を伝達する共通β受容体の発現が冠動脈病変と大動脈病変で異なっている可能性があり現在比較検討中である。血中脂質レベルおよび血糖値には両群間で有意差を認めなかった。血清TNF-α、hsCRP、NOxレベルに関しても両群間で明らかな差はみられなかったが、in vitroにおける検討ではCRPによって惹起される血管内皮細胞のNO産生障害をEPORAが有意に改善させることが判明し、さらにCRPによる内皮細胞のアポトーシス誘導および単球のMMP-9産生亢進作用もEPORAが有意に抑制することが判明した。細胞内シグナル伝達系に関しては既報(Proc Natl Acad Sci USA. 2010; 107(32):14357-14362.)においてEPORAによるAktの活性化が心筋細胞のアポトーシス抑制に重要な役割を担っていることを報告しているが、内皮細胞のアポトーシス抑制においてもsiRNA法により同様の結果が得られた。EpoRAにはスタチンのような多面的効果が認められ、新しい動脈硬化治療薬として臨床応用が期待される(投稿準備中)。
Blow-up ringsの環構造の研究

この研究は,次の課題とこれに密接に関連する課題について,期間内に成果を挙げることを目標とした。(1)Rees代数と随伴次数環のGorenstein性を判定する簡便かつ実際的な方法を開発し,その判定法に基づく豊かな具体例を提供する。(2)随伴次数環のGorenstein性に関連して,Gorenstein局所環内の「優良イデアル」の理論を整備。充実させる。既に,Gorenstein局所環内の「優良イデアル」に関する予備的な研究が完成した。次元dのGorenstein局所環(A, m)内のm-準素イデアルIは,その随伴次数環G(I)がGorenstein環であってa-不変量について等式a(G(I)=1-dが成立つとき「優良である」と呼ぶ。優良イデアルは,Gorenstein局所環内でパラメーター系で生成されたイデアルに次いで特殊であり,優良イデアルの分布状況と構造解析からは,基礎環A自身の構造に関する豊かな情報が期待できるが,体系的な研究は他に類例を見ない。分担者の協力を得て,優良イデアルの理論を深め,関連する問題の解明にも力を注いだ。他に,関連する研究課題として,整閉イデアルとこれに付随する素イデアルの構造に関して,想定外の体系的な深い理論の可能性が見い出された。その応用として,Noether局所環内のパラメターイデアルとsocleに関する端麗な解析が可能となった。2003年6月にはイタリアとポルトガルで,計2回可換環論の国際会議が開催される。出席して成果の発表を行うと同時に,海外に於けるこの分野の研究の進捗状況を探った。国内研究集会でも計3回の講演を行い,成果の発表を行った。充実させる。本年度は実に多様な展開がありました。ホモロジー代数の手法による可換なNoether環Rの特徴付けは,様々なhomological dimensionの定義となって実現しています。homological dimension有限の整閉イデアルIの付随素イデアルPには強い制約があることが予想されていましたが,実際に解析を進めるとイデアルIの射影次元(或いは,入射次元)が有限なら局所環R_Pは正則である([4])など,驚くほど明瞭な結果が得られました。この研究を発展させると,正則局所環内のイデアルのfiltrationに随伴するRees代数のa-不変量の評価が得られます([5])。このような可換環論のホモロジー代数的手法は,必ずしも可換ではないNoetherian algebrasに付いても,殆ど何の変更もなく有効であることが次第に明らかとなりました。成果は論文[6],[7]に纏めてあります。優良イデアルの基礎理論は[1],[2]に集約されていますが,m-準素とは限らないイデアルにも,優良イデアルの理論が可能であることがわかり,論文[3]にその基礎を述べておきました。この研究は,次の二つの課題について,成果を挙げることを目標とします。(1)Rees代数と随伴次数環のGorenstein性を判定する簡便かつ実際的な方法を開発し,その判定法に基づく具体例を豊富に提供する。(2)随伴次数環のGorenstein性に関連して,Gorenstein局所環内の「優良イデアル」の理論を整備・充実させる。平成14年度は課題(2)に力を注ぎました。次元dのGorenstein局所環(A, m)内のm-準素イデアルIは,その随伴次数環G(I)がGorenstein環であってa-不変量に関する等式a(G(I))=1-dが成立つとき「優良である」と呼びます。

昨年度に実行された,Gorenstein局所環内の「優良イデアル」に関する予備的な研究を基盤に,優良イデアルの理論を一層整備・充実させ,関連する問題の解明に力を注ぎました。成果は4編の論文に纏めてあります。平成14年6月にはLevico(イタリア)で,9月にはSinaia(ルーマニア)で,可換環論の研究集会が開催されました。出席して成果の発表(招待講演)を行い,同時に,海外に於けるこの分野の研究の進捗状況を探りました。研究の進展に連れて,局所環内の整閉イデアルに随伴する素イデアルの構造研究に予期せざる発展があり,随伴次数環のBuchsbaum性に関連して思い掛けない理論が展開可能となる見込みが生じたため,この方向の予備的な研究を平行させ,得られた成果を4編の論文に纏めておきました。この研究は,次の課題とこれに密接に関連する課題について,期間内に成果を挙げることを目標とした。(1)Rees代数と随伴次数環のGorenstein性を判定する簡便かつ実際的な方法を開発し,その判定法に基づく豊かな具体例を提供する。(2)随伴次数環のGorenstein性に関連して,Gorenstein局所環内の「優良イデアル」の理論を整備。充実させる。既に,Gorenstein局所環内の「優良イデアル」に関する予備的な研究が完成した。次元dのGorenstein局所環(A,m)内のm-準素イデアルlは,その随伴次数環G(l)がGorenstein環であってa-不変量について等式a(G(l))=1-dが成立つとき「優良である」と呼ぶ。優良イデアルは,Gorenstein局所環内でパラメーター系で生成されたイデアルに次いで特殊であり,優良イデアルの分布状況と構造解析からは,基礎環A自身の構造に関する豊かな情報が期待できるが,体系的な研究は他に類例を見ない。分担者の協力を得て,優良イデアルの理論を深め,関連する問題の解明にも力を注いだ。他に,関連する研究課題として,整閉イデアルとこれに付随する素イデアルの構造に関して,想定外の体系的な深い理論の可能性が見い出された。その応用として,Noether局所環内のパラメターイデアルとsocleに関する端麗な解析が可能となった。2003年6月にはイタリアとポルトガルで,計2回可換環論の国際会議が開催される。出席して成果の発表を行うと同時に,海外に於けるこの分野の研究の進捗状況を探った。国内研究集会でも計3回の講演を行い,成果の発表を行った。
大気浮遊粒子状物質の内分泌撹乱作用とその本体

ヒトや動物の内分泌機能に障害を与える外因性の化学物質、いわゆる内分泌撹乱化学物質が大きな環境問題になっており、大気浮遊粒子状物質(SPM)の内分泌撹乱作用も注目されている。そこで本研究では、金沢市と札幌市において季節毎(4月、7月、10月、1月)にSPMを捕集し、その内分泌撹乱作用(エストロゲン系/アンドロゲン系に及ぼす影響)を培養細胞系を用いて評価するとともに、作用を担う成分について種々検討し、以下の成果を得た。1.何れの試料も抗エストロゲン作用および抗アンドロゲン作用を示した、2.金沢と札幌の何れの都市においても内分泌撹乱作用は、冬期試料が強く、夏期試料が弱いという季節変動を示し、これは冬期には暖房などでエネルギー消費が増大するためと考えられた、3.アリル炭化水素受容体アンタゴニストで共処理するとSPM試料の内分泌撹乱作用が減弱され、SPM試料の内分泌撹乱作用の一部はアリル炭化水素受容体(AhR)のアゴニストとして作用する成分に基づくことが明らかになった、4.環境中に存在する代表的なAhRアゴニストの一つは多環芳香族炭化水素であるので、SPM試料中の多環芳香族炭化水素濃度の分析とそれらの内分泌撹乱作用の評価した結果、SPM試料の内分泌撹乱作用の一部は多環芳香族炭化水素に基づくことが明らかになった、5.競争的ホルモン受容体結合試験および酵母two-hybridアッセイの結果から、SPM中にはエストロゲン受容体/アンドロゲン受容体に結合する成分が存在し、各受容体にアンタゴニストして結合することが明らかになった。【緒言】今日の主要な大気汚染物質の一つは大気浮遊粒子状物質であり、都市や幹線道路周辺では大気浮遊粒子状物質の大部分は自動車、特にディーゼル車排気粉じん(DEP)である。そこで本研究では、市販ディーゼル車から排気されるDEPを捕集し、その抽出物のエストロゲン様作用および抗エストロゲン作用を評価した。【実験】DEPの捕集:アイドリング状態で運転する市販ディーゼル車のマフラーの後方にローボリュームエアーサンプラーを設置し、石英繊維ろ紙上にDEPを捕集した。アッセイ試料の調整:捕修されたDEPからベンゼン-エタノール(3:1)で超音波抽出し、抽出物を最終的にエタノールに溶解してアッセイ試料とした。アッセイ:ヒト乳癌由来MCF-7細胞とエストロゲン応答ルシフェラーゼ発現プラスミドを用いたルシフェラーゼレポータージーンアッセイ法により行った。陽性コントロールには10pM17β-エストラジオール(E2)を用いた。【結果および考察】E2非存在下において細胞を抽出物試料で処理した場合はルシフェラーゼ活性の有意な上昇は見られず、10pME2存在下で細胞を処理した場合はE2によるルシフェラーゼ活性の上昇が抑制された。E2非存在下および存在下で有意な細胞毒性は認められなかったことから、DEP抽出物試料が抗エストロゲン作用を示すことが明らかになった。抽出物試料の処理により、細胞内のCYP1A1mRNAレベルが上昇し、アリル炭化水素水素受容体(AhR)のアンタゴニストであるα-ナフトフラボン(α-NF)の共処理によりCYP1A1mRNAレベルが低下し、抗エストロゲン作用の減弱化したことから、抽出物資料の抗エストロゲン作用に多環芳香族炭化水素類が寄与していると考えられた。大気浮遊粒子状物質(PM)の内分泌撹乱作用とその本体を明らかにする目的で、金沢市および札幌市において季節ごと(4月、7月、10月、1月)にPMを捕集し、そのベンゼン-エタノール抽出物についてエストロゲン様作用/抗エストロゲン作用、アンドロゲン様作用/抗アンドロゲン作用を培養細胞(ヒト乳癌由来MCF-7細胞、ヒト前立腺癌由来PC-3細胞)を用いたルシフェラーゼレポータージーンアッセイ法により評価した。

その結果、何れの抽出物試料も抗エストロゲン作用と抗アンドロゲン作用を示した。金沢市と札幌市の何れの都市においても、これら抗ホルモン作用は冬期に強く、夏期に弱いという季節変動を示し、これは冬期には暖房用にエネルギー消費が増大するためと考えられた。次に、抗ホルモン作用を示す成分について検討した。細胞を抽出物試料で処理するとcytochromeP450 1A1 mRNAレベルが上昇したこと、細胞を抽出物試料とともにアリル炭化水素受容体(AhR)アンタゴニストであるα-ナフトフラボン(α-NF)で共処理すると抗ホルモン作用が減弱されたことから、抽出物試料の抗ホルモン作用の一部はAhRアゴニストとして作用する成分に基づくことが明らかになった。代表的なAhRアゴニストの一つは多環芳香族炭化水素化合物(PAH)であるので、抽出物試料中のPAHを分析したところ、AhRアゴニストとして作用するPAHが10化合物検出された。これら化合物濃度は夏期試料に比べ冬期試料で高いこと、抽出物中に存在する濃度で有意な抗ホルモン作用を示したことから、抽出物の抗ホルモン作用の一部はPAHに基づくことが明らかになった。以上の本研究から、PM中には抗エストロゲン作用/抗アンドロケン作用を示す成分が含まれ、その成分の一部はAhRアゴニストとして作用するPAHであることが明らかになった。
成体脳で移動する新生ニューロンが特定の嗅球細胞層を選択するメカニズム

成体脳の脳室下帯では、生涯を通じて新生ニューロンが産生され、嗅球へと移動して神経回路へ組み込まれる。これまでに研究代表者は、二光子顕微鏡を用いた生体イメージング法を確立し、嗅球新生ニューロンの成熟場所を決定するメカニズムを明らかにした(Sawada et al., J. Neurosci., 2011)。この結果にもとづき現在は、新生ニューロンを嗅球内で適切に配置するメカニズムを研究しており、Sema3E-PlexinD1による制御の可能性を見いだしている。本研究では、Sema3E-PlexinD1シグナルの新生ニューロンにおける役割を解明し、新生ニューロンの嗅球内配置機構を明らかにすることを目的とした。新生ニューロンは分化・成熟過程でleading processから分岐したlateral processを形成する。Lateral processの役割を解析するため、スライス培養法および固定組織を用いて観察した結果、嗅球に到着した新生ニューロンがアクチンを豊富に含むlateral processを形成し、形態が複雑になるにつれて移動が遅くなることを明らかにした。また、二光子顕微鏡下で新生ニューロンの分化・成熟過程を観察するため、細胞移植およびエレクトロポレーションを用いた新生ニューロンの形態観察法を確立した。Lateral process形成の分子メカニズムについて、Sema3Eの効果とアクチン重合の関係を調べるため、EGFP-UtrCHを新生ニューロンに導入し経時観察を行った。その結果、Sema3Eは新生ニューロンのアクチン重合を抑制することが示唆された。また、lateral process形成に重要な分子を新生ニューロンのFRETイメージングで探索し、アクチン制御因子Rac1を同定した。このRac1の活性化はSema3E添加で抑制されることを明らかにした。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
ヒト基本転写因子ＴＦＩＩＥのＮＭＲ法による全長構造の解明

基本転写因子は、タンパク質をコードする遺伝子の転写を行うRNAポリメラーゼIIが反応を開始するために必須のタンパク質である。本研究では、基本転写因子の一員であるTFIIEの完全長複合体の構造を核磁気共鳴法(NMR)により解析した。ヒトTFIIEはαとβからなる異種二量体で約8万の高分子量、且つ凝集しやすい性質の為、NMR法による解析は困難であったが、様々な技術の導入や高磁場NMR装置の利用により、完全長複合体における三つの機能ドメインのうちの1つの立体構造を高分解能で決定した。基本転写因子は、RNAポリメラーゼIIを転写開始領域に正しく位置づかせ、最終的にメッセンジャーRNAを合成可能な状態に活性化するまでの一連の過程を担う大変重要なタンパク質である。現在、RNAポリメラーゼIIと基本転写因子から構成される生体超分子複合体(転写開始装置)の立体構造モデル化が世界中で進められている。基本転写因子の一員であるTFIIEは、天然変性領域を広く含む等の問題によりうまく結晶化できずX線結晶構造解析の見通しは全く立っていない。そこで本研究は、溶液中の立体構造を決定することができるNMR法を用いて全長構造の解明を目指す。TFIIEは(αβ)異種二量体で分子量が約8万4千のため解析が大変困難であるが、得られる成果は転写開始装置の構造モデル化を通し、立体構造に基づいた転写開始機構の解明に多大に貢献することが期待される。大腸菌の共発現系から調製した13C, 15N標識、および2H(100%), 13C, 15N標識全長TFIIEαβ複合体を用いて、種々の多次元NOESY実験を実施した。得られたスペクトルを解析し、水素原子間距離情報を収集した。また、重水素交換実験から水素結合情報を得た。さらに、帰属した化学シフトから主鎖二面角を見積もった。これらを制限情報とし、Xplor-NIHプログラムを用いてシミュレーティッド・アニーリング法により立体構造を計算を行し初期構造を得た。併行して、立体整列同位体標識(SAIL)法の導入を進め、大量調製法を確立した。基本転写因子は、RNAポリメラーゼIIを転写開始領域に正しく位置づかせ活性化しメッセンジャーRNAを合成開始可能な状態にするまでの一連の作業を担う重要なタンパク質である。現在、RNAポリメラーゼIIと基本転写因子から構成される超分子複合体(転写開始装置)の立体構造のモデル化が世界中で進められている。基本転写因子の一員のTFIIEは、天然変性領域を広く含む等の問題から結晶化が障害となりX線結晶構造解析の見通しは全く立っていない。そこで、本研究では溶液中の立体構造を原子レベルで決定できるNMR法を用いて全体構造の解明を目指す。TFIIEはαβ異種二量体で分子量が約8万4千のため分子量に上限をもつNMR法にとって挑戦的研究となるが、得られる成果は立体構造に基づいた転写開始機構の解明に多大に貢献することが期待される。大腸菌の共発現系から調製した13C,15N標識、及び2H,13C,15N標識全長TFIIEαβ複合体を用いて、種々の多次元NMR実験を行った。シグナルを帰属後、NOEシグナルから水素原子間距離情報を収集した。重水素交換実験から水素結合を、帰属した化学シフト値から主鎖二面角を見積もった。これらを制限情報としXPLOR-NIHプログラムを用いてシュミレーティッド・アニーリング法により立体構造を計算した。以上の常法に加え、立体整列同位体標識(SAIL)した試料を利用し更なる構造情報を得た。予想されたようにTFIIEは広く天然変性領域を有していたが、その正確な領域を特定した。TFIIEαのC末領域には、基本転写因子TFIIHを転写開始複合体に呼び込む際に重要な役割をもつドメインがあるが、全長TFIIEαβ複合体中のその構造を高分解能で決定した。また両者の相互作用をNMR法で解析し相互作用部位を同定した。構造を形成している他のドメインについては現在解析中である。現在、RNAポリメラーゼIIと基本転写因子から構成される生体超分子複合体(転写開始装置)の立体構造モデルの構築を目標に、構成因子の立体構造解析が世界中で進められている。基本転写因子の1つであるTFIIEは、天然変性領域を広く含む等の問題により結晶化できずX線結晶構造解析の見通しが全く立っていない。そこで本研究は、溶液中の立体構造を決定できるNMR法を用いて全長構造の解明を目指す。

TFIIEは(αβ)異種二量体で分子量が約8万4千で溶解度も低いため解析が大変困難であるが、得られる成果は転写開始装置の構造モデル化を通し立体構造に基づく転写開始機構の解明に多大に貢献すると期待される。大腸菌の共発現系から調製した13C, 15N標識、および2H(100%), 13C, 15N標識全長TFIIEαβ複合体を用いて多次元NMR測定を行い、主鎖、側鎖の両シグナルを可能な限り帰属した。続いて、多次元NOESYを測定した。現在、NOEシグナルを帰属し水素原子核間距離情報を収集している。また、立体整列同位体標識(SAIL)法の導入を見据えて、大腸菌の無細胞発現系を検討した。研究計画では、平成24年度において、1.二面角、水素結合の解析2.立体構造計算、初期構造の算出3.構造の精密化、及び最終構造決定4.構造未決定領域の構造解析としていた。13については、ほぼ計画通りに研究を進めることができた。4は、着手はしたが、やや遅れている。研究計画では平成23年度において(1)主鎖シグナルの帰属、(2)側鎖シグナルの帰属、(3)NOEシグナルの帰属、としていたので、概ね順調に進展しているといえる。高分子量であるTFIIE複合体に対しても、領域によっては従来の方法で立体構造決定が可能であることが分かった。従って、そのような領域については、立体構造計算、精密化を進め最終構造を決定する。一方、従来の方法では立体構造決定不可能な領域に関しては、3つの新技術、(1)非線形サンプリング法、(2)立体整列同位体標識(SAIL)法、(3)メチル基ーTROSY法、を試みる。従来の方法でどの程度立体構造を決定できるかを見分ける。これを出来る限り早期(平成24年度の前半を目標)に実施する。従来の方法では立体構造解析が困難な領域については、新技術を試みる予定なので、それらを効率よく実施するための準備(文献調査、試薬の購入等)を進める。該当なし50%研究試薬の購入(安定同位体標識試薬、安定同位体標識アミノ酸、等)20%NMRスペクトル解析、立体構造計算、および発表資料作成用のパソコンの購入10%消耗品の購入(NMRチューブ、データ記録媒体等)10%学会参加(旅費)
敗血症性ショックに対する新規治療薬の開発

敗血症性ショックは、過度の血管拡張がもたらす持続的な低血圧状態であり、血圧の維持に難渋する場合が多い。血管拡張の原因物質は過剰な一酸化窒素であり、これは高度な炎症の結果発現した誘導型一酸化窒素合成酵素によって作り出される。過剰な一酸化窒素存在下ではカテコラミン類の感受性が低下し、有効な昇圧作用を得るためには多量に投与する必要がある。血管平滑筋の収縮と弛緩は、平滑筋構成タンパク質であるミオシン軽鎖のリン酸化および脱リン酸化によって引き起こされる。本研究では、ラットから摘出した大動脈を用いて、ミオシン軽鎖脱リン酸化酵素阻害薬の血管収縮作用について調べた。ミオシン軽鎖脱リン酸化酵素阻害薬は濃度依存性に血管収縮作用を示し、一酸化窒素供与体であり血管拡張物質であるニトロプルシドナトリウム存在下でも血管収縮作用は変化しなかった。また、血行動態への影響を調べるため、ミオシン軽鎖脱リン酸化酵素阻害薬をラット生体モデルに経静脈的に投与したが、血圧と心拍数に変化は生じなかった。背景:敗血症性ショックは、過度の血管拡張がもたらす持続的な低血圧状態であり、血圧の維持に難渋する場合が多い。血管拡張の原因物質は、高度な炎症の結果発現した誘導型一酸化窒素合成酵素によって作り出される過剰な一酸化窒素である。しかし、カテコラミン類の多量投与は副作用を引き起こす可能性が高くなるため、より効果的な昇圧薬の開発が期待されてきた。本研究では、敗血症性ショック状態からいち早く離脱するための薬剤として、ミオシン軽鎖脱リン酸化酵素阻害薬の利用に着目した。ミオシン軽鎖脱リン酸化酵素阻害薬は、ミオシン軽鎖のカルシウムイオン感受性を上昇させ、平滑筋に対し直接的な収縮作用を示すことが知られている。目的:トートマイシンおよびカリクリンAを用いて血管収縮性への影響を検討した。また全身性に投与した場合の血行動態への影響を観察した。方法と結果:具体的には、ラットから摘出した大動脈を利用した血管リングを用いて、血管収縮作用を調べた。特にカリクリンAは、濃度依存性に強い血管収縮作用を示した。一酸化窒素の供与体であるニトロプルシドナトリウム存在下でも血管収縮作用を認めた。ラット生体モデルにおける血行動態への影響を調べるため、ミオシン軽鎖脱リン酸化酵素阻害薬を経静脈的に投与したが、いずれも血圧の変動は認めなかった。リポ多糖類によって誘発したラット敗血症性ショックモデルにおいても、ミオシン軽鎖脱リン酸化酵素阻害薬投与による血行動態変動は認めなかった。考察:これらの結果より、一酸化窒素過剰状態である敗血症性ショック時において、ミオシン軽鎖脱リン酸化酵素阻害薬が有効な昇圧薬として機能する可能性が示唆された。しかし、生体レベルでの影響は観察されておらず、さらなる検証が必要であると考えられた。過剰な一酸化窒素存在下ではカテコラミン類の感受性が低下し、有効な昇圧作用を得るためには多量投与する必要がある。トートマイシンおよびカリクリンAはいずれもミオシン軽鎖脱リン酸化酵素阻害薬であり、血管収縮作用が報告されている。方法:具体的には、ラットから摘出した腸間膜動脈を用いて、血管収縮作用を調べた。いずれのミオシン軽鎖脱リン酸化酵素阻害薬も濃度依存性に血管を収縮させた。

機器のセットアップや薬剤の調達に予想以上の時間が必要であった。今後は、ミオシン軽鎖脱リン酸化酵素阻害薬における血管収縮のメカニズムについて調査するとともに、ラット敗血症モデルにおける血行動態への影響を検討する。試薬類、血行動態測定機器、研究動物購入および飼育費用などに使用し、また学会へ参加するための旅費としても使用する予定である。
モルヒネ活性代謝物生成に関わるグルクロン酸転移酵素の臓器分布について

当教室でクローニングしているモルヒネの活性代謝物生成に関するモルモット肝UGT55KのcDNAにおいて基質特異性の決定に重要な領域を、二価金属に特異的に結合するpoly-Histidineとのfusion proteinとして大腸菌に発現させるため、読み枠を合わせてpTrcHis vectorにサブクローニングした。このようにして構築した組換えプラスミド(pGUGT-M6N)でE.coli Yop10を形質転換させた。これを、大量培養して可溶化し、fusion proteinをNi^<2+>を固定化させたアフィニティーカラムを用いて精製した。精製fusionproteinを、フロイト完全アジュバンドとのemulsionとしてウサギに感作し、数回の追加免疫の後、採血し抗血清を調製した。この抗体は、部分精製のHartley系雄性モルモットのUGT55Kを認識したが、その特異性は必ずしも高くはなかった。これは抗原とした組換えペプチドが変性状態のものであったためであると思われる。Immunoblottingによる解析については更なる検討を行っているところである。また、肝臓と脳のmRNAを調製し、このUGT55Kは特異的なRT-PCRを行ったところ、肝臓だけでなく脳においても特異的な産物が得られ、その塩基配列から、脳内にUGT55Kの存在が示唆された。このことは、脳におけるM6Gの生成の可能性と脳機能へのUGTの関与を考える上で非常に興味深いものである。
転移を予防する新しいタイプの癌転移抑制薬の開発

我々はマウス・メラノーマBL6に高い自然転移能をもたらす原因遺伝子はコネキシン26であることを発見した。この成果を利用して、ギャップ結合形成の有無を評価できるダイ・トランスファー法を新たに開発して、独自に化学合成したコネキシン26阻害薬をスクリーニングできるようなシステムを設定した。これは新鮮なマウスの下大静脈片を取り出し、内腔側を上にして培養シャーレの底に沈め、その上に蛍光色素(BCECF)を取り込ませたメラノーマ細胞を播いてギャップ結合能を調べるという新たな技術である。そして、その過程でオレアミドがコネキシン26を阻害してダイ・トランスファー法によって測定したギャップ結合能のみならず、in vivoにおける自然転移を顕著に抑制することを見出した。そこで、阪大薬学部の北教授のグループとの共同研究としてオレアミドの派生物質を系統的に多数化学合成してダイ・トランスファー法により強いコネキシン26阻害活性を持つ薬物をスクリーニングした結果、MI-18,MI-22という2つの強力なコネキシン26を阻害薬を発見することができた。このうち、とくにMI-18はコネキシン26は強く阻害するがコネキシン43はほとんど阻害しないという選択的な阻害活性を示したという点で特筆に価する。なぜなら、コネキシン43を阻害すると心臓のパルスに影響を与える可能性があるので臨床的に使うのが困難となるが、コネキシン26の阻害だけならば副作用は少ないと期待できるからである。オレアミドおよびMI-18,MI-22のをin vivoでアッセイした結果、それぞれ対照の34%、15%、22%という癌自然転移能抑制能を示した。従来このような高い効果を閉め空いた薬物は無いので、この実験成果は画期的である。現在、さらに効果の大きい薬物を合成すべく系統的なスクリーニングを行っている。
トウモロコシにおける茎への木部液の注入が葉の老化におよぼす影響

葉の老化を抑制し、葉が長い間高い光合成速度を維持することは、作物生産の向上にとってきわめて重要である。土壌水分が減少し、水ストレス状態におかれると作物の葉の老化は急激に進む。本研究はトウモロコシを用いて土壌水分低下によって促進される葉の老化を根の機能に着目して検討し、以下の成果を得た。1.低土壌水分条件に生育するトウモロコシの葉の老化は湿潤土壌に生育するトウモロコシに比較してはやく進み、この傾向は下位の葉で顕著であった。2.低土壌水分条件に生育するトウモロコシは、湿潤土壌に生育するトウモロコシに比較して茎基部からの出液速度が著しく小さかった。3.トウモロコシ茎基部から採取した木部液に浮かべたトウモロコシ葉片のクロロフィル含量の低下は水に浮かべた葉片に比較して小さかったことから、根から地上部に送られる木部液には葉の老化を抑制する作用があることが推察された。4.湿潤土壌に生育しているトウモロコシの茎基部から採取した木部液を低土壌水分条件に生育し、老化の進行しているトウモロコシの茎基部に注入した結果、水のみを注入したトウモロコシに比較して生葉数、葉のクロロフィル含量、光合成速度の減少程度が小さく、葉の老化が抑制されることがわかった。5.根の木部液中にはサイトカイニンや窒素など葉の老化を抑制すると考えられる物質が含まれている。土壌水分が低下すると地上部に送られるこれらの物質の量が減少することが葉の老化の促進と関係していることが推察された。
超音波による骨密度計測値を用いた10歳代から80歳代までの骨年齢表示

本研究期間中に再生医療がクローズアップされ骨評価は重要度が増している。1.超音波による骨量計測は他の骨密度測定法と異なり被爆がなく、安全に繰り返し使用可能であるので広く普及してきている。超音波骨密度計測装置(Cuba Clinical,英国McCue社)は踵骨の骨密度を超音波減衰速度Broadband Ultrasonic Attenuation、BUA (dB/MHz)により表示するものであるが、我々は5歳から90歳代まで合わせて2000人を超えた。既に、計測結果は本装置に組み込まれている標準値と比較してやや低い傾向が見られたこと、20歳以下、80歳以上の計測値は組み込まれていなかったことから5歳から95歳までのすべての計測結果を年齢順にまとめ、"東京歯科大バージョン"として、表示画面を書きかえ、現在は新画面を用いている。またBUAによる骨年齢表示としてライフステージ全体にわたる特徴を加え現在論文化している。2.X線、超音波、両方とも顎骨用計測装置は現在まで開発されておらず、その理由はBUAは円筒形の骨である必要があるからである。口腔内挿入型、反射型、など考案されながら実現化されていない。小型化と超音波トランスデューサーの精度が課題で開発を継続している。3.平成16年から8020達成者が骨密度が高かったこと、QOLが高かったことから、骨量のの高さはアンチエイジングに直接関わっている。8020対照群として千葉市在住高齢者の骨密度調査、平成17年には文京区8020達成者の2回目骨密度縦断調査、千葉県特養芝山苑の2回目骨密度縦断調査、千葉県8020達成者3回目の横断調査を行ってそれぞれデータベースに組み込みこんでEBMとするため研究は今後も継続する。1.超音波骨密度計測装置(Cuba Clinical,英国McCue社)は踵骨の骨密度を超音波減衰速度Braodband Ultrasonic AttinuationBUA(dB/MHz)により表示するものであるが、茂木、山中らの日本人の骨密度計測は5歳から90歳代まで合わせて2000人近くとなり、計測結果を検討したところ、本装置に組み込まれている標準値と比較してやや低い傾向が見られた。また本装置は20歳以下、80歳以上の計測値はもともと組み込まれていなかった。そこで、すべての計測結果を年齢順にまとめ、"東京歯科大バージョン"として、表示画面を書きかえた。この画面はよりわかりやすくするため画面表示を検討している。2.下顎骨骨密度計測装置の開発は、口腔内挿入部考案、制作の段階になっている。試作品ができ次第、精度調査にはいる。3."歯科における骨密度の有用性について"と題した講演を行った。(バイオプログレッシブスタディークラブ総会、平成15年11月、大阪)1.超音波による骨量計測は他の骨密度測定法と異なり被爆がなく、安全に繰り返し使用可能であるので、近年広く普及してきている。超音波骨密度計測装置(Cuba Clinical,英国McCue社)は踵骨の骨密度を超音波減衰速度Braodband Ultrasonic AttinuationBUA(dB/MHz)により表示するものであるが、茂木、山中らの日本人の骨密度計測は5歳から90歳代まで合わせて2000人近くとなり、計測結果を検討したところ、本装置に組み込まれている標準値と比較してやや低い傾向が見られた。この画面はよりわかりやすくするための画面表示した。2.X線、超音波、両方とも顎骨用計測装置は現在まで開発されていない。

顎骨骨密度計測装置の開発は、口腔内挿入部考案、制作の段階になっている。上顎骨、下顎骨のそれぞれの特徴を考慮した計測が出来る超音波トランスデューサーとし、試作品ができ次第、精度調査にはいる。3."歯科における骨密度の有用性について"と題した講演を行った。(バイオプログレッシブスタディークラブ総会、平成15年11月、大阪)4.平成16年には8020対象群として千葉市在住高齢者の骨密度を計測し横断調査、平成17年には文京区8020達成者の二回目の骨密度計測を行って縦断調査とし、それぞれ発表予定である。1.超音波による骨量計測は他の骨密度測定法と異なり被爆がなく、安全に繰り返し使用可能であるので広く普及してきている。超音波骨密度計測装置(Cuba Clinical,英国McCue社)は踵骨の骨密度を超音波減衰速度Braodband Ultrasonic AttinuationBUA(dB/MHz)により表示するものであるが、茂木、山中らの日本人の骨密度計測は5歳から90歳代まで合わせて2000人近くとなり、計測結果を検討したところ、本装置に組み込まれている標準値と比較してやや低い傾向が見られた。また本装置は20歳以下、80歳以上の計測値はもともと組み込まれていなかった。そこで、すべての計測結果を年齢順にまとめ、"東京歯科大バージョン"として、表示画面を書きかえた。この画面はよりわかりやすくするための画面表示した。近々論文投稿予定。2.X線、超音波、両方とも顎骨用計測装置は現在まで開発されていない。顎骨骨密度計測装置の開発は、口腔内挿入部考案、試作の段階になっている(センサ:石川県)。上顎骨、下顎骨のそれぞれの特徴を考慮した計測が出来る超音波トランスデューサーについて試作中である。試作品ができ次第、精度調査にはいる。(バイオプログレッシブスタディークラブ総会、平成15年11月、大阪)4.平成16年に8020対照群として千葉市在住高齢者の骨密度調査、平成17年には文京区8020達成者の2回目骨密度縦断調査、千葉県特養芝山苑の2回目骨密度縦断調査、千葉県8020達成者3回目の横断調査を行ってそれぞれデータベースに組み込む予定である。本研究期間中に再生医療がクローズアップされ骨評価は重要度が増している。超音波骨密度計測装置(Cuba Clinical,英国McCue社)は踵骨の骨密度を超音波減衰速度Broadband Ultrasonic Attenuation、BUA(dB/MHz)により表示するものであるが、我々は5歳から90歳代まで合わせて2000人を超えた。既に、計測結果は本装置に組み込まれている標準値と比較してやや低い傾向が見られたこと、20歳以下、80歳以上の計測値は組み込まれていなかったことから5歳から95歳までのすべての計測結果を年齢順にまとめ、"東京歯科大バージョン"として、表示画面を書きかえ、現在は新画面を用いている。またBUAによる骨年齢表示としてライフステージ全体にわたる特徴を加え現在論文化している。
強力な神経興奮作用を示すカンファ-トリアジン類の合成と生理活性

研究代表者が天然産のカンファ-から合成した中枢興ふん薬カンファ-トリアジン1,2,3ートリアジンをリ-ド化合物とする開発研究の一環として、異性体である3ーヒドラジノあるいは3ーアミノカンフィ-1,2,4ートリアジンに数々の親電子剤を縮合させてトリアジン環上に5または6員環ヘテロ骨格であるイミダゾ-ル、1,2,4ートリアゾ-ル、チオジアゾ-ル、テトラジ-ル、ピリミジン等を構築した。2年間に合成したこれらトリアジミ環内窒素を構成原子とする多環状ヘテロ環の中枢作用を丸ごとのマウスを用いて測定した結果、出発物質の一つである3ーヒドラジノカンファ-1,2,4ートリアジンにリ-ド化合物に匹敵する強い作用が認められ、1,2,4ートリアジンとテトラゾ-ルが縮合した化合物にもペンテトラゾ-ルの50%程の作用が認められた。これに反し、興味あることに3ーアミノ体から構築した1,2,4ートリアジン誘導体には全く作用が観測されなかった。以上の結果から、カンファ-1,2,4ートリアジンの3位側鎖には二個の窒素原子が連続して存在することが作用発現に必須であることが示唆され、二個目の窒素原子が炭素で置換された縮合ヘテロ環には全く作用が認められないという極めて興味ある実験結果を得ることができた。またリ-ド化合物の骨格とその異性体であるカンファ-1,2,4ートリアジン環でも作用が持続する点も興味深い。今後さらに原子配列の異なるヘテロ環を構築し、より精度の高い構造活性相関を確立し中枢作用発現の主作用因を解明したい。研究代表者がカンファーから合成したカンファー1,2,3ートリアジンは極めて強力な中枢興奮作用を有し、中枢の薬理試験に繁用されるペンテトラゾ-ルの10倍の強さを示すとともに両化合物にはC_6ーN_3からなる共通の基本構造が存在し、しかもこれらのコンフォメ-ションがほとんど同じであることを見出した。そこでこのコンフォメ-ションが作用発現の活性コンフォメ-ションではないかと考え、C_6ーN_3の基本構造を持つ異性体カンファー1,2,4ートリアジンを合成し、これに含室素複素環を縮合することでC_6ーN_3構造をさらにヘテロ原子で延長したヘテロ化合物を作り、それらの中枢作用と構造との相関について研究した。まずカンファキノンとチオセミカルバチドとの縮合でカンファー1,2,4ートリアジンを合成した後3位メルカプト基をヒトラジノ基に変換した。ヒドラジノ基は含窒素ヘテロ環構築の重要なビルデイングブロックであり、各種の親電子剤と縮合させて新規縮合ヘテロ環を構築した。すなわち亜硝酸ソ-ダとの反応でテトラゾ-ル環とまたシクロヘキサンジオンとの反応で1,2,4ートリアジン環を構築した。一方その他の試薬との縮合で3位に置換基を有する1,2,4ートリアゾロカンファー1,2,4ートリアジン類も合成した。これらの化合物の中枢作用をマウスを使って測定したところ、3ーヒドラジノカンファー1,2,4ートリアジンにペンテトラゾ-ルを上回る強い作用が観察された。またテトラゾ-ルや1,2,4ートリアゾ-ルが縮合したカンファー1,2,4ートリアジンにも強い作用が認められたが、1,2,4ートリアジンの3位に置換基を導入すると作用が全く消失することが分った。これらの結果から、基本構造をC_6ーN_3ーN_2まで延長しても中枢作用が持続されることが判明し、今後の構造活性相関解明の重要な手がかりを得たことになる。

代表者が合成した中枢興ふん薬カンファ-1.2,3ートリアジンをリ-ド化合物とする中枢作用薬開発研究の一環として、前年度は3ーヒドラジノカンファ1,2,4ートリアジンに種々の求電子剤を縮合させ、1,2,4ートリアジン環にテトラゾ-ル、トリアゾ-ルあるいはトリアジン等のヘラロ環を縮合構築した。今年度は3ーアミノカンファ-1,2,4ートリアジンを出発原料とし、アミノ基とアジン環内窒素を構成原子とするイミダゾ-ル、1,2,4ートリアゾ-ル、チオジアゾ-ルおよびピリミジンの骨格を構築した。2年間に合成したヘテロ環縮合カンファ-1,2,4ートリアジン類の中枢作用を丸ごとのマウスを用いて測定した結果、出発原料に用いた3ーヒドラジノ体にリ-ド化合物に匹敵する強い作用が認められ、1,2,4ートリアジンとテトラゾ-ルが縮合した化合物にもペンチレンテトラゾ-ルの50%弱の作用が認められた。一方、3ーアミノカンファ-トリアジンにヘテロ環と構築した化合物には全く中枢興ふん作用が観測されなかった。以上の結果から、カンファ-1,2,4ートリアジンの3位測鎖には二個の窒素原子が連続して存在することが作用発現にとって必須であることが示唆され、二個目の窒素原子を炭素で置換すると作用が完全に消失するという極めて興味深い実験結果を得ることができた。今後さらに原子配列の異なる縮合ヘテロ環の構築を行ない、より精度の高い構造活性相関を確立し、中枢作用発現の主作用団を解明したい。
殻なし孵化装置を用いた経時的連続観察による新規鳥類胚発生毒性評価法の開発

本研究の目的は、殻なし孵化装置を用いた表現型影響の経時的連続観察によって、生態毒性試験の盲点となっている環境汚染物質曝露による鳥類胚の発生毒性評価法を開発することである。有機リン酸エステル系難燃剤(PFRs)は、ヒトや野生生物の健康へ悪影響の可能性があるために生産・使用禁止が決められた有機臭素系難燃剤の代替物質として生産・使用されている。PFRsは国内外に生息する野鳥の組織や卵からも検出される。一方、これらPFRsの毒性に関する報告は非常に少ない。そこで本研究では、殻なし胚孵化装置を用いて、PFRsを曝露したニワトリ胚の多様な表現型影響を経時的に観察・測定し、発生毒性影響を評価する。
脊髄再生に対する細胞移植の効果とそのメカニズム-形態学的解明と有効因子の解析-

(1)骨髄間質細胞の移植a.脊髄損傷部内への直接移植:細胞移植ラットは、BBB10ポイント前後まで回復した。再生軸索がコラーゲン線維を含むマトリクス内を伸び、損傷部を架橋した。移植細胞は2週前後で消失した。b.髄液経由による間接移植:細胞を第四脳室より注入した。BBBは1013で、所見は上記と同様であった。骨髄間質細胞は髄液経由投与で、亜急性?慢性期のいずれも有効である。移植効果は骨髄間質細胞が分泌する液性因子による。(2)培養上清に含まれる有効因子培養上清には、IGF-1,HGF,VEGF,TGF-β1が含まれている。また培養上清には未知の成長因子が含まれることを示した。本年度は、損傷後一定期間を経た脊髄損傷ラットに対する骨髄間質細胞の移植効果を調べた。ラットの脊髄に挫滅損傷を加え、2週間後に損傷部に培養骨髄間質細胞を注入した。細胞移植後8週迄観察して、歩行運動の回復を調べ、脊髄損傷部の組織学的な変化を対照群と比較した。その結果、細胞移植群では歩行評価指数(BBB)が、48週後で9.69.8ポイントであるが、対照群では細胞移植時とほとんど変化なく、45ポイント止まりであった。組織学的には、空洞の形成が対照群に比して1/3に抑制されていた。最も著明な所見は移植骨髄間質細胞の周りに無数の再生軸索が伸長することである。これらの再生軸軸索はシュワン細胞によって囲まれていた。これらの結果は、損傷2週後のラット脊髄損傷において、骨髄間質細胞の移植が軸索の再生を惹起し、歩行運動の回復をもたらすことが明らかとなった。次に、骨髄間質細胞の培養上清に含まれる有効因子の同定を行なった。培養上清をヘパリンカラムに流して、カラムに吸着する物質を塩濃度勾配で溶出し、有効因子の含まれる分画を同定した。効果の判定は、培養1日目のラット海馬ニューロンに対して、生存維持および突起伸長の作用がどの程度あるかによった。またこれとは別に、50KDa, 30KDa, 10KDa, 5KDa,およびそれ以下の分画として有効因子の含まれる分画を決めた。これによって、有効因子の含まれる分画をかなり絞ることが出来た。今後はこれに基づいて、個々の分子を同定して、上記のアッセイ系にかけて、その効果を判定する。1.細胞移植亜急性脊髄損傷の治療法の開発のために、ラットで損傷2週後に直接脊髄損傷部に骨髄間質細胞を注入した。ラットの行動は対照に比してBBBスケールで45ポイント上がった。免疫組織化学によって、損傷部にはアストロサイトの侵入がなく、代わりに細胞外基質の形成が見られた。注目すべきは、その中を無数の再生軸索が伸びてきたことである。骨髄間質細胞は細胞外基質の増生を促し、同時に再生軸索の伸張を促進させる働きがあると考えられる。移植1週後では、再生軸索は幼若な線維で、やはり幼若なシュワン細胞に囲まれていた。移植後2週以降ではシュワン細胞によって再生軸索に髄鞘が形成された。再生軸索には上行性および下行性線維が含まれていた。一方、骨髄間質細胞は移植12週後に消失した。骨髄間質細胞の効果は、細胞が宿主に組込まれることによるのではなく、細胞が何等かの有効因子を分泌することによるものと考えられる。この結果は論文として発表された。これと並行して、同じく亜急性脊髄損傷に対する骨髄間質細胞の髄液経由移植の効果を調べた。髄液経由でも上記と同じ効果が得られた。この事実も、骨髄間質細胞から分泌される有効因子の働きを示唆している。2.有効因子の解析骨髄間質細胞から分泌される因子の検索のために、骨髄間質細胞の培養上清を分析した。新生仔ラットの海馬から培養したニューロンをアッセイ系として用いた。骨髄間質細胞の培養上清の中に、海馬ニューロンの生存維持と突起伸長を促進させる因子が含まれていることが明らかとなった。具体的な解析では、プロテインアレイ解析では、NGFβ,VEGF,LIX,MCP-1,TIMP-1が検出された。ELISAでは、IGF-1,HGF,VEGF,TGF-β1が高濃度に含まれていた。しかし、これらの分子の組み合わせによるアッセイでは、どの組み合わせも培養上清と同じ効果を発揮するものはなかった。1.亜急性期および慢性期の脊髄損傷に対する骨髄間質細胞の移植効果を調べた。

生後6週のラットの脊髄に挫滅損傷を与え、損傷後1週から4週のラットに対して細胞移植を行った。移植細胞は培養骨髄間質細胞で、移植は脊髄損傷部内ではなく、第4脳室からの注入(髄液内移植)である。損傷1週後のラットは亜急性期、2週後は亜急性慢性期、そして4週後は慢性期と看做した。注入は、10^510^6個の細胞を1回/日で3回行った。細胞注入後から毎週ラットの歩行の観察を行い、BBBによって行動の回復を調べた。最終回の細胞移後4週で灌流固定をして組織を調べた。1週後から細胞移植を始めた群(亜急性)のBBBは、対象が01、移植群が10、2週後から始めた群(亜急性慢性)では対象が2、移植群が11、4週後から始めた群(慢性期)では、対照が4,移植群が11であった。これは明らかな回復である。組織学的には、再生軸索が損傷部内を頭尾方向に伸びており、これらの再生軸索内にはCGRPおよびserotonin作動性線維が多数みられた。これは先の急性期での細胞移植実験の結果と同じである。このことは、亜急性慢性期でも骨髄間質細胞の髄液経由移植が有効であることを示している。同じ様に骨髄から採取した単核球の移植効果を調べ、同様の効果が認められた。これは、骨髄から分離した細胞を、培養を経ないで移植する効果を示したもので、臨床応用への道が拓けたことになる。2.培養上清に含まれると考えられる有効成分が漸く掴めつつある。培養上清の特定の分画に海馬ニューロンの生存維持と突起伸長を促す分子があることが分かってきた。この効果を持つ分子は、恐らく未知の分子と考えられ、現在特許申請中である。この分子を髄液あるいは静脈内に注入する方法で、臨床的な応用を探索する。
精子セリンプロテアーゼによる選択的蛋白分解と精子生理機能調節に関する研究

受精での精子アクロソームタンパク質の選択的分解機構と生理機能獲得・欠失を明らかにすることを目的として研究を行い,以下の研究成果が得られた。1)アクロシン欠損マウス精子では媒精後初期の段階で透明帯通過に著しい遅れを生じているが,その遅延はアクロソーム反応時でのアクロソーム内容物の放出の遅れに起因していることが明らかとなった。アクロシンは,そのタンパク質分解活性によってアクロソームからの各種タンパク質の放出を促進していると結論した。2)パラアミノベンザミジン存在下では,アクロシン欠損マウスでも精子の卵透明帯通過がほぼ完全に阻害されることから,アクロシン以外のトリプシン様プロテアーゼが透明帯通過に機能していることも明確にした。その候補として,42と41キロダルトンのふたつの新規精子プロテアーゼを同定した。3) 42と41キロダルトンプロテアーゼは,トリプシン様のプロテアーゼによって活性化されることが明らかになった。これらのプロテアーゼの精製を現在行っている。4)すでに得られている4個のセリンプロテアーゼ(TESPl4)が,精子アクロソームに局在しアクロソーム反応によって放出されることを明確にした。おのおのについて,ノックアウトマウスを作製中である。
加齢とともに生じる個体差を識別するためのシステムの開発

近年、筋肉量が老化に深く関与していることが示唆されている。しかしながら、老化には遺伝子と環境が複雑に関与しているため、その原因を特定することは難しい。そこで、遺伝的に均一な実験動物である線虫の一種Caenorhabditis elegansを用いて筋肉量をモニタリングするシステムの構築をおこなった。筋肉構造に関わる遺伝子に蛍光遺伝子(GFP)を結合させ、その遺伝子を導入した線虫(TG)の筋肉量を蛍光強度で測定・選別し、その後の寿命を調べることで寿命と筋肉量の関係を明らかにできるのではないかと考えた。虫の選別には線虫用ソーター(COPAS)を用いた。最初にCOPASによる蛍光分布および選別の条件検討をおこなった。その結果、最適な条件でも全体の10%以下の線虫しか選別できないことが分かり、およそ4000匹の線虫を用いることで、2群の寿命比較実験が可能になることを明らかにした。次に、ソーターによる虫の寿命への影響を調べたが、COPASを通すことにより、15%程度寿命が短くなることが判明した。雑菌の混入による可能性が示唆されたため、抗生物質を添加して測定を行ったが、雑菌の混入は少ないにも関わらず寿命が短くなることから、ソーターのレーザー等が関与しているのではないかと思われた。しかしながら、同一条件(ソート)内であれば比較可能と判断し、まずは蛍光強度の強い抗酸化遺伝子SOD::GFPを導入した虫を用いて強度別に選別し、寿命を測定した。結果としては両者に有意差が見られないが(P<0.5)、同一条件内の測定が可能であることが示唆された。さらに、SODより蛍光強度が弱い筋肉特異的な遺伝子(myo-3)のTG線虫を用いても選別が可能であった。今後、このシステムを用い、若齢時のみならず高齢時の蛍光強度の測定、脂肪の蓄積に関わる遺伝子を導入することで、寿命と筋肉量や脂肪量の関係が明らかになるものと期待される。