hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
口腔バイオフィルム内のクオラムセンシングの解明とその制御によるプラーク形成の抑制

デンタルプラークは歯面に成立したバイオフィルムで、環境変化、抗生剤、宿主免疫等の侵害刺激からプラーク細菌を防御する。このバイオフィルムは、ミティスグループレンサ球菌などの早期に定着するレンサ球菌が産生した菌体外多糖(グルカン)を足がかりに、さらに粘着性のグルカンを産生するミュータンスレンサ球菌が定着してう蝕の発生に大きく関与する。このバイオフィルム中で細菌はホルモン様伝達物質のオートインデューサーを放出し、菌種間でクロストークして細菌の密度を一定に保ったり、免疫に対抗する集団を形成したりするクオラムセンシングを行う。本研究ではこのプラーク中のクオラムセンシングを解明するために、口腔バイオフィルム中のメンバーを同定することにした。その手法として16S-23S rRNA intergenic spacer遺伝子を利用したPCR法による口腔レンサ球菌同定法を開発し、Pediatric Dental Journal誌に"Method for rapid identification of oral streptococci by PCR using 16S-23S ribosomal RNA intergenic spacer"として発表した。これによりプラーク細菌中の60%以上を占めるレンサ球菌の迅速な同定を可能とした。その一方で、乳児を対象として歯の萌出前からの長期的な口腔細菌叢の変遷と保育園児童を対象として横断的な口腔細菌叢の相違を観察した。この結果、ミティスグループレンサ球菌を含むα溶血性菌はミュータンスレンサ球菌の定着により口腔内での割合が減少することから、これら菌種間のクオラムセンシングの存在を示唆し、"Establishment of S.mutans Changes Salivary Bacterial Ratio"と題して英文誌に投稿中である。今後はこれらの細菌間のオートインデューサーの同定を行う予定である。デンタルプラーク細菌はホルモン様伝達物質であるオートインデューサー(AI)を放出し,菌種間で互いにコミュニケーションを取り,細菌の密度を一定に保ったり,免疫に対抗する集団を形成したりすることによって共生するクオラムセンシングを行っている.本研究で我々は,う蝕病原性プラークの細菌のクオラムセンシングの解明を行うために以下の調査を行った.1.経時的・横断的なデンタルプラーク細菌叢の変化の調査ミュータンスレンサ球菌の口腔内への定着に先立ち,ミティスグループなどのレンサ球菌が定着することは知られているが,ミュータンスレンサ球菌がこれらのレンサ球菌にどのような影響を与えるかは知られていない.そこで我々は経時的および横断的な細菌叢の変化の調査を行い,歯の萌出前は優位であったα溶血性菌がミュータンスレンサ球菌の定着により減少することを明らかとした.この結果,ミュータンスレンサ球菌はプラーク中のα溶血性菌数を減少させるAIを放出していることが示唆された.2.DNAデータベースによるクオラムセンシングに関わる因子の推測ミティスグループレンサ球菌は,宿主の免疫機構から逃れる為にIgA1プロテアーゼを産生し,同酵素を持たないミュータンスレンサ球菌は,クオラムセンシングによりミティスグループのIgA1プロテアーゼを利用することを予想した.しかし,DNAデータベースには,IgA1プロテアーゼの産生を直接的に制御する遺伝子の情報は現在のところ存在しなかった.その一方で,デンタルプラークの構造上の基盤となるグルカンを合成する酵素グルコシルトランスフェラーゼは,その産生を制御するrgg遺伝子を有し,これはレンサ球菌間で比較的相同性が高いことから,AIによってその産生が制御される可能性が示唆された.次年度は,これらの知見を基に細菌叢の成立に関して特異的なAIの同定とその機構を解明する予定である.う蝕の原因となるデンタルプラークは、歯面に成立したバイオフィルムであり、口腔内の環境の変化、抗生剤、宿主の免疫などの侵害刺激から逃れるための防御壁となっている。

このバイオフィルムは、ミティスグループレンサ球菌などの早期にヒト口腔内に定着するレンサ球菌が産生した菌体外多糖(グルカン)を足がかりとし、さらに粘着性の高い不溶性のグルカンを産生するミュータンスレンサ球菌が定着することによって形成され、う蝕や歯周病の発生に大きく関与する。このバイオフィルム中で、細菌はホルモン様伝達物質であるオートインデューサーを放出し、菌種間で互いにコミュニケーションを取ってバイオフィルム中の細菌の密度を一定に保ったり、免疫に対抗する集団を形成したりすることで共生しており、この現象はクオラムセンシングと呼ばれている。本研究ではプラークバイオフィルムにおけるクオラムセンシング機構を解明するために、まず口腔バイオフィルム内で互いにコミュニケーションを取り合っているメンバーを同定することにした。そのための手法として16S-23S ribosomalRNAintergenic spacer遺伝子を利用したPCR法によるレンサ球菌の菌種同定法を開発し、Pediatric Dental Journal誌に"Method for rapid identification of oral streptococci by PCR using 16S-23S ribosomal RNA intergenic spacer"と題して発表した。これにより、デンタルプラーク中の60%以上を占めることから口腔バイオフィルム内クオラムセンシングの中核をなすと考えられるレンサ球菌の迅速な同定が可能となった。その一方で、歯の生える前からの乳児を対象とした長期的な口腔細菌叢の変遷および保育園の児童を対象とした横断的な口腔細菌叢の相違を観察し、ミティスグループレンサ球菌などのα溶血性を示す菌群は、ミュータンスレンサ球菌が口腔内に定着するとその口腔内の総菌数に対する割合が減少することを明らかにし、ミュータンスレンサ球菌とα溶血性菌の間に何らかのクオラムセンシングの機構が働いていることを示唆した。このことは、"Establishment of S.mutans Changes Salivary Bacterial Ratio"と題して、現在英文誌に投稿中である。今後は、ミュータンスレンサ球菌とα溶血性レンサ球菌間のクオラムセンシングに関わる分子を同定する予定である。
ＣＭＯＳ技術による高密度フレキシブル脳計測・刺激デバイス

半導体集積回路技術(CMOS技術)を利用して、高密度に脳の活動電位計測・電気刺激を可能とするフレキシブル脳計測・刺激デバイスの実現を目指した。最大の特長は、マルチチップアーキテクチャを利用していることである。これは、CMOS集積回路による小型の神経刺激チップを、フレキシブル基板上に複数搭載して強調動作させるものである。これにより、通常は屈曲が不可能なCMOSチップを搭載しながら、屈曲した神経組織にフィットすることが可能となる。本研究では、機能実証用のCMOS単位チップを設計・試作し、これに対する機能検証、およびパッケージングを施してフレキシブル神経刺激・計測デバイスの試作・実証に成功した。分散型アーキテクチャによるフレキシブル脳計測・刺激デバイスの機能拡張と性能向上を行った。4つの共通入力端子によって多数の刺激・計測電極を駆動・制御する方式の動作を確認するとともに、電極としてこれまでより物理的、化学的な強靭さを実現できるバルク電極の搭載を行った。特に神経刺激を行う際には、生体組織内での電極の電気分解が生じて電極の劣化と生体に対するダメージを生じることが懸念されるが、Pt等の貴金属のバルク電極を基本構造とし、表面をIrOxやTiNなどの高性能生体刺激用材料でコーティングした電極の場合、表面電極のダメージがデバイス全体の破損や生体の損傷につながらないようにできる。また、現在の入力数をより少なくするための回路方式について検討を開始した。CMOS半導体集積回路技術をベースとしたフレキシブル脳計測・刺激デバイスを試作・機能実証した。本研究で実現したデバイスの最大の特長は、分散型アーキテクチャを採用した構造である。分散型アーキテクチャは、小型のCMOS神経刺激チップを、フレキシブル基板上に分散配置することで、集積回路のスイッチングによる少配線-多点刺激および、チップ内部での刺激信号生成やアンプによる計測性能の向上を狙うものである。平成25年度は、それまでに実現したCMOS単位チップと、高性能電極を組み合わせたデバイスの試作・機能実証を行った。実現したデバイスは、電極の中にCMOS単位チップを内蔵する"スマート電極"タイプの構造をとっており、既存技術との形状互換性を維持しながら、集積回路搭載による高機能性を実現した。パッケージングには、フリップチップ実装技術を用いており、CMOS集積回路による単位チップはフレキシブル基板および電極によりシールされ、防水性を実現する。デバイスの駆動テストの結果、目的とする刺激・計測機能が実現できた。現在のプロセスは高い技術を必要とし、歩留まりに限りがある。実装プロセスを最適化し、信頼性を向上することによって、脳科学・医療分野に利用できるデバイス技術になると期待される。マルチチップアーキテクチャに基づく単独動作可能な小型CMOS脳計測・刺激装置を設計試作し、フレキシブル基板上に配置して少数の共通配線(バス配線)で駆動する脳神経刺激デバイスの試作を行った。ひとつのCMOSチップ(単位チップ)に1つの脳刺激・計測電極が搭載された構成をとり、単位チップサイズは約400um角とした。電極として直径200umのPt円板型電極を採用している。単位チップは0.35um標準CMOSプロセス+5V高耐圧MOSトランジスタで設計し、神経刺激計測部においては最大5Vの電圧で駆動可能な構成とした。各チップはGND, VCCの2つの電源入力およびCONT1, CONT2の制御兼出力端子をあわせた4つの外部入出力によって制御・駆動される。これら4つの入出力はフレキシブル基板上にした複数の単位チップに対して共通であり、全単位チップを4配線で駆動可能である。各単位チップはCONT1, CONT2を経由して与えられるアドレスに基づいて命令を解釈することができるため、単位チップごとに異なる駆動条件を設定することができる。単位チップには双極性の神経刺激を行うための電流生成回路を搭載しており、チップごとにあらかじめ指定した電流を、デバイス全体で同期的に出力することが可能である。また計測面においては、全単位チップのうち1つを選択し、刺激ではなく計測に利用することが可能である。フレキシブル基板上に単位チップを1x4配置で搭載した脳神経刺激・計測デバイスの駆動試験を行ったところ、電流刺激・計測のいずれの機能も正常に動作することが確認できた。平成23年度に試作したチップをベースに、平成24年度の最大の目的であった回路面・実装技術面での性能向上に成功した。平成23年度に目指していた機能をほぼ完全に搭載した単位チップの設計試作と、これを搭載した最初の脳神経刺激デバイスの動作検証に成功しており、計画の遂行についてはほぼ予定通りである。平成25年度は、動物実験による機能実証を行う。またさらなる機能向上として、単位チップへの入力配線を2-3本とするための回路方式の検討と、試作・検証を進める。平成23年度に基礎機能を実現・実証した脳神経刺激・計測デバイスの(1)回路面での機能向上、(2)実装技術面での微細化と信頼性の向上、(3)動物実験での機能実証、を行う。

(1)については平成24, 25年を通して複数回の改善を、(2)については主として平成24年度、(3)については平成25年度に取り組む。次年度使用額は、デバイス実装、駆動システム開発のための材料費・薬品費の購入のタイミングに起因するものであり、実質的な研究進捗には影響がない。平成23年度からの繰越金は、主にデバイス実装のための材料・薬品費の購入タイミングに起因するものである。したがって実質的な研究の進捗には変更がない。
実用化を目指した有望なDNA合成画像診断薬4DSTの18F化とその臨床応用

本研究では18F標識4DSTの開発を目的とした。5-fluoromethyl体は不安定で単離できなかった。5-fluoroethyl体は標識可能で有ったが、体内分布試験の結果、腫瘍への集積性を示さなかった。5-fluoro体は銅ピリジン錯体を用いるスズ体のフッ素化反応により標識可能であったが、収率が低く標識条件の最適化が必要であった。最も有望な5-fluoro体についてスクリーニング毒性試験を行ったところ、静脈内単回投与毒性試験では臨床予定投与量の1000倍でも異常を認めなかったが、遺伝毒性試験(Ames)試験では大腸菌株についてのみ変異原性を認めた。がんの研究において、インビボでがん細胞の増殖を評価するために「DNA合成」を画像化することが望まれている。これは、細胞増殖(=DNA合成)が、がんの最も基本的な性質であり、病理学的診断のゴールドスタンダードだからである。これに対して申請者は世界で初めてDNA合成を直接的に画像化するPET薬剤11C-4DSTを開発し、臨床応用を達成することに成功した。11C-4DSTは多くの腫瘍で有用性が明らかになりつつあり、現在、その普及が国内外で望まれている。そこで本研究では、DNA合成画像診断の普及を目指し11C-4DSTをベースとして、デリバリー可能でかつ汎用性が高く、多施設での検査を可能にする18F標識4DST誘導体(以下、18F-4DST誘導体)の開発を試み、その臨床応用に達成することを目的とする。インビトロ試験にて可能性が示されている18F-4DST誘導体3化合物の標識前駆体および標準品の合成を実施した。候補化合物はそれぞれ、4DSTの5-fluoro体、5-fluoromethyl体ならびに5-fluoroethyl体である。5-fluoromethyl体は単離後比較的速やかに分解したが、5-fluoro体ならびに5-fluoroethyl体の標品を得ることに成功した。今年度は、さらに5-fluoroethyl体のF-18標識検討を行った。現在までに、F-18標識のためには3'-OH、5'-OHに加えてN-3の保護基を必用とすることが明らかとなっている。がんの研究において、インビボでがん細胞の増殖を評価するために「DNA合成」を画像化することが求められている。これに対して我々は正解で初めてDNA合成を直接的に画像化するPET薬剤11C-4DSTを開発し、臨床応用を達成することに成功した。11C-4DSTは様々ながん種での有用性が明らかになりつつあり、その普及が国内外で望まれている。本研究では、DNA合成画像診断の普及を目指し、11C-4DSTを基礎として、デリバリー可能でかつ汎用性が高く、多施設での検査を可能にする18F標識4DST誘導体(以下、18F-4DST誘導体)の開発を試み、その臨床応用に達することを目的としている。現在まで、インビトロ試験にて可能性が示されている18Fー4DST誘導体3化合物の標識前駆体および標準品の合成を試みた。5-fluoromethyl体は単離後速やかに分解したため候補化合物から除外した。5-fluoroethyl体については標識前駆体の保護基を様々に変更し、最終的に、脱離基がTso体でN-Boc-3',5'-di-O-tolyl体でF-18標識が可能であった。F-18標識体について腫瘍移植マウスでの体内分布を確認したところ、脱フッ素が認められ、腫瘍への集積性も低かった。以上の結果から、5-fluoroethyl体も脱落し、残る候補化合物は5-fluoro体に絞られた。平成26年度に選択した化合物5-Fluoro-4'-thio-2'-deoxyurdine(FDST)について、平成27年度は標識合成法の検討と臨床応用を想定したスクリーニング毒性試験を実施した。標識合成の検討においては、類似化合物で安価に合成可能な4'-oxoの誘導体を用いて、ウラシルへの二重結合の付加反応による合成及び精誠条件を検討した。標識前駆体(74μmol)を5%酢酸を含むジクロロメタン溶液(4ml)に溶解し、室温下で[18F]F2ガスを吹き込むことにより標識を行った。溶媒を除去したのち、1Mリン酸ナトリウム(pH11)を用いて130°C、5分間加熱することにより加水分館を行い、反応混合液を中和後に分取HPLCにて目的物を精誠した。その結果、減衰補正後収率24%、放射化学的純度100%、比放射能38MBq/nmolにて目的物を得ることに成功した。この知見に基づき、候補化合物である4'-thio誘導体での標識をスズ体を用いた置換反応で検討したものの、標識体を単離することができなかった。FDSTのスクリーニング毒性試験を、マウスを用いた静脈内淡海投与毒性試験ならびに遺伝子突然変異試験(Ames試験)を実施した。単回静脈内投与試験では、臨床推定投与量の約1000倍のFDST(原薬)を投与しても何ら毒性兆候は認められなかった。Ames試験では、高容量において細胞の増殖抑制が認められたため、低用量にて試験を実施したところ、E.Coliの1株においてのみ陽性を示した。化合物スクリーニングの結果、候補化合物が[18F]

Fアニオンで標識することが難しい化合物となり、[18F]F2での標識を検討することとなった。[18F]F2の製造を立ち上げるのに時間がかかり、スケジュールが遅れている。また、この標識合成には[18F]Fアニオンを用いる方法に比べて、多量の原料を用いるため、標識前駆体の合成にも時間を取られている。候補化合物5-Fluoro-4'-thio-2'-deoxyuridine(FDST)の標識合成法として、H27年度に実施した[18F]F2を用いる方法は、特許の関係からスズ体を標識前駆体を用いたが、高価な原料を大量に用いること、副生成物の除去やサンプルの溶解性などの問題によって、目的物を得ることが困難であった。また、スクリーニング毒性試験の結果から非標識のFDSTを大量に含む[18F]F2による標識合成方法では安全性のマージンが低いことも明らかであったことから、[18F]Fアニオンでの標識検討を実施する事とした。具体的には、テトラキス(ピリジン)銅(II)トリフラートを用いてスズ体の[18F]F化反応を実施した。その結果、トレース量ではあるが、[18F]F標識体をTLCにて確認することに成功した。今後、標識条件の最適を行うことによって臨床使用可能な品質・収量の[18F]FDSTが得られる可能性が示された。本研究では18F標識4DSTの開発を目的とした。5-fluoromethyl体は不安定で単離できなかった。5-fluoroethyl体は標識可能で有ったが、体内分布試験の結果、腫瘍への集積性を示さなかった。5-fluoro体は銅ピリジン錯体を用いるスズ体のフッ素化反応により標識可能であったが、収率が低く標識条件の最適化が必要であった。最も有望な5-fluoro体についてスクリーニング毒性試験を行ったところ、静脈内単回投与毒性試験では臨床予定投与量の1000倍でも異常を認めなかったが、遺伝毒性試験(Ames)試験では大腸菌株についてのみ変異原性を認めた。当初の予定では、H26年度中に安全性試験へ入る予定であったが、5-fluoroetyl体の標識合成が予想以上に困難であったため、最終的な化合物の選択が遅れた。一方、これまでの結果から5-fluoro体以外を候補化合物から除外することは明確となった。標識前駆体として、特許の関係からスズ体を用いる合成方法を採用したが、ウラシルを用いる方法も採用して検討を行う。スズ体を用いる標識方法が上手くいかない原因は、副生成物の除去やサンプルの溶解性の問題によって、自動合成装置での応用が困難であることに起因しているため、一部の合成プロセスを手動で実施する必要がある。現在所有している1ポット法では限界があるため、加水分解前に精誠する工程を入れる。28年度が最終年度であるため、記入しない。放射性医薬品科学候補化合物を5-fluoro体に絞り込んだ。標識合成・有用性の評価を継続するとともに、並行して安全性試験の実施を行う。H27年度中には非臨床試験データを取り揃え、臨床使用に向けた取り組みを加速する。目的とする3化合物の標識前駆体および標品の合成検討を行った。その結果、5-fluoromethyl体は標品を安定して単離困難であったが、それ以外の化合物については、標品を得、標識合成検討に入っている。
コーパス日本語研究の高度化と多面化のための総合的研究─語史研究への応用を中心に─

近年利用可能になった各種の歴史的資料アーカイブを用いていくつかの研究に取り組んだ。近代日中語彙交流の分野では、日中各語における中国語を表す名称の歴史を考察し、結果を「数位化時代下的漢語全球教育史国際学術研討会曁世界漢語教育史研究学会第十届年会」(関西大学,2018年10月21日)で「指称漢語的諸名称ー它們的歴史与用法差異」として披露し、論文「中国語を表す言語名の諸相ーその多様性、淘汰と変質、用法差ー」(『待兼山論叢』第52号文化動態論篇、大阪大学大学院文学研究科、2018年12月25日)として発表した。「漢字文化圏近代語研究会2019国際シンポジウム」(北京外国語大学、2019年3月23日)では発表「中国語における日本語の呼称の変遷」を行った。中国英語学習史の分野では、中国の初期英語学習書十数点における英語発音の漢字表記について分析し、「東アジア文化交渉学会第10回国際学術大会」(香港城市大学,2018年5月13日)で「中国初期英語学習書における英語発音の漢字表記ー英語の流音の知覚と表記」として発表し、論文「中国初期英語学習書における英語発音の漢字表記ー流音の知覚と表記ー」(『大阪大学大学院文学研究科紀要』第59巻、2019年3月31日)として発表した。「語言互動史研究ー近代東西語言接触研究学術会議2018」(北京外国語大学,2018年12月22日)では発表「《華英通語》道光本ー首部由中国人編写的正統英語学習書」を行った。「第4届中南地区日語教学学術研討会」(湖南大学、2019年3月17日)では「言語研究に対する電子資料の新たな衝撃ーコーパスの先にあるものー」と題して歴史的資料アーカイブの言語研究上の利用価値を紹介した。また、アーカイブを活用した周辺的な事例として、論文「ダッシュ、プライム」(『数学セミナー』第57巻第8号、2018年8月1日)を発表した。研究は計画に従って順調に進んでおり、特に記すべきことはない。今までの研究を発展させるとともに、新しい課題の可能性を模索するという方法によって研究を進める。
哺乳動物腎尿細管細胞表面の複合糖脂質

1.イヌ,サル,ブタおよびウシの尿細管由来培養細胞のGalCerI^3-sulfate(SM4_S)およびLacCerII^3-sulfateの発現量が,培養培地浸透圧の増減に正の相関関係を持って変化することを明らかにした。またイヌ腎尿細管由来培養細胞(MDCK)から高浸透圧適応した2種類のクローンを得,これらのクローンでは親細胞に比べ硫酸化糖脂質濃度の増加や代謝回転の亢進が見られることを明らかにした。2.サケ腎よりV^3αFuc,IV^3βGalNAc,II^3(αNeuAc)_2-Gg_4Cer,およびそのシアル酸に4-【0!_】-acetyl基が結合した構造アナログを単離精製し,組成分析,メチル化, ^1H-NMR分析等によりそれらの構造を決定した。魚類の腎は浸透圧調節のみならず造血機能をも持つことが知られているので,今後血球膜糖脂質成分とこれらの物質との間の関連性についての検討も必要と思われる。3.ラット腎の微量硫酸化糖脂質として,iGb_4CerIV^3-sulfate,iGb_5CerV^3-sulfateおよびGg_3CerIII^3-sulfateを単離し,組成分析,ソルボリシス,メチル化, ^1H-NMR,IR,質量分析等によりその構造を決定した。ラット腎にはガングリオ系に属するビス硫酸化糖脂質を含めてこれまで5種の硫糖脂質の存在が知られているが,他の動物も含めてイソグロボ系硫糖脂質の発見は初めてのものである。4.SM4_Sおよびセミノリピドの^1Hおよび^<13>C-NMR分析を行い,化学シフトや結合定数等のパラメーターを得た。また硫酸基をもたないGalCerとの比較も行った。炭素と水素と間の結合定数( ^1J_<C,H>)は,その炭素に結合した置換基の電気陰性度を反映するが,Galの3位の硫酸化はC-1,C-3C-5の^1J_<C,H>を増加させた。これは,かさ高い硫酸基が空間的に広範囲の-OHあるいは-H基に影響を与えいるか,または硫酸基の結合によってリングに歪が正じている可能性を示唆した。1.ラット腎の微量硫酸化糖脂質として,iGb_4Cer IV^3ーsulfateおよびGg_3Cer III^3sulfateを単離し,組成分析,ソルボリシス,メチル化, ^1HーNMR,IR分析によりその構造を決出した.ラット腎にはガングリオ系に属するビス硫酸化糖脂質を含めてこれまで5種の硫糖脂質の存在が知られているが,他の動物も含めてイソグロボ系硫糖脂質の発見は初めてのものである.2.サケ腎よりV^3αFuc,IV^3βGalNAc,II^3(αNeuAc)_2ーGg_4Cer,およびそのシアル酸に4ー0ーacetyl基が結合した構造アナログを単離精製し,組成分析,メチル化,^1HーNMR分析等によりそれらの構造を決定した。魚類の腎は浸透圧調節のみならず造血機能をも持つことが知られているので,今後血球膜糖脂質成分とこれらの物質との間の造連性についての検討も必要と思われる.3.イヌ,サル,ブタおよびウシの尿細管由来培養細胞のGalCer I^3ーsulfate

およびLacCer II^3ーsulfateの発現量が,培養培地浸透圧の増減に正の相関関係を持って変化することを明らかにした.培養培地の浸透圧をNaCl濃度を加減することにより±200mOsm増減させて尿細管細胞を培養すると,浸透圧に依存して硫糖脂質への^<35>Sの取込みおよび硫酸化糖脂質発現量に増減がみられた.この現象はおそらく細胞内陽イオン濃度の変化が硫酸基転移酵素活性を修飾した結果生じたものと推測された.4.GalCerの糖リングプロトンに5個の結合を介した遠隔結合(^5J_<1.4>〓0.2Hz)が存在することが, ^1HーNMR decouplingおよびspin simulationによって示唆された.リングプロトンの遠隔結合定数は通常分解能(1 Hz)以下のため無視されがちだが,実際はこれらの値がスペクトルの形状に微妙な影響を与えているものと考えられた.1.イヌ腎尿細管由来培養細胞(MDCK)を高浸透圧培地ですることにより,それぞれ700mosmol/および800mosmol/1の浸透圧環境に適応した2種類のクロ-ン,osmRーAおよびosmRーBを得た。これらのクロ-ンを等張培地(300 mosmol/1)で培養して親細胞と比較すると、そのスルファチド(SM4s)およびラクトシルスルファチド(SM3)濃度が3.45.9倍に増加していた.また,これらの細胞への〔^<35>S〕ー硫酸の取込みも親細胞に比べ1.96.7倍に増加していることが明らかとなった.一方,親細胞を高浸透圧培地で培養した際に見られる硫酸化糖脂質への〔^<35>S〕ーラベルの取込みの亢進は,サイクロヘキシミド添加により完全に阻害された.このことは高浸透圧環境への適応の際には,硫酸化糖脂質への〔^<35>S〕ーラベルの取込みに関与する何等かのタンパク質の合成が活性化していることを示唆するものと考えられた。2.ラット腎の微量硫酸化糖脂質として,あらたにGg_3Cer III^3ーsulfate(SM2b)を単離し,組成分析,ソルボリシス,メチル化,^1HーNMR,Iすおよび質量分析等によりその構造を決定した.ラット腎には以前からガングリオ系に属するGg_3Cer II^3ーsulfate(SM2a)の存在が知られているが,SM2bはこれとは硫酸化糖の種類のみ異なるアイソマ-と考えられた.3.SM4sおよびセミノリピド(SM4g)の^1Hおよび^<13>CーNMRを分析った.2Dーphase sensitive DQFーCOSYスペクトルより,両者のリングプロトンの化学シフトおよび結合定数はほぼ同一の値が得られ,またSM4gに関する以前の報告ともよく一致した.また脱硫酸化物と比較の結果,硫酸基の結合部位の3位のプロトンに,硫酸基の脱遮蔽効果に基づく低磁場シフト(△0.7ppm)が観察された.DEPTおよびCーHーCOSYスペクトルより得られた両者のリングカ-ボンの化学シフト値はよく似ており,lysoーSM4sにおいて報告されている値とよく一致した.また脱硫酸化物と比較した結果,プロトンの場合と同様に,電気陰性度の高い硫酸基が結合した3位のカ-ボンに約6ppmの低磁場シフトが見られた.
メタボリックシンドローム・動脈硬化における終末糖化産物・血管炎症の意義

RAGE切断の調節と機序は不明である。血管内皮RAGE過剰発現マウスでは、TNFαはRAGE切断を誘導した。RAGE過剰発現ヒト血管内皮細胞においてもTNFαはADAM10に依存的にRAGE切断を誘導した。TNFαは一過性にATF4の発現を誘導し、ATF4阻害によりRAGE切断とADAM10発現は抑制された。他の小胞体ストレス関連因子の阻害はRAGE切断に影響しなかった。小胞体ストレス誘導物質はATF4の持続的な発現を誘導したが、RAGE切断には影響しなかった。ATF4の阻害はTNFαによるMMP9発現に影響しなかった。以上より、TNFαは血管内皮のRAGE切断をATF4依存的に誘導する。終末糖化産物(AGE)受容体(RAGE)は、種々の炎症性リガンドの受容体として、炎症機転に深く関与する。昨年度、ヒト血管内皮細胞において炎症性サイトカインのTNF-αは、JNK- , p38-MAP kinaseと小胞体ストレスにかかわるATF-4を介してADAM10活性化、RAGE sheddingを誘導することを示した。本年度我々は、ヒトRAGEを血管内皮特異的に強制発現させた(endo-hRAGE-Tg)マウスを用いて、RAGE sheddingが実際in vivoで誘導されるか、炎症惹起との関係、さらにそのTNF-α依存性、小胞体ストレスの関与について検討した。endo-RAGE WT/WTまたはTg/TgマウスにLPS投与2時間後には血中TNF-αが著明に増加した。また、Tg/TgマウスではWT/WTマウスに比べてLPS投与後の血中TNFα値が有意に高く、血管内皮特異的RAGE過剰発現マウスは炎症反応の増幅現象が認められた。Tg/Tgマウスにおいては、LPS投与後1024時間後にかけてsRAGEが2-4倍に増加し、生体内でRAGE sheddingが誘導されることが確認できた。WT/Tgマウスにおいても、sRAGEの上昇はTg/Tgマウスの半分程度で観察された。TNFαの特異的な阻害薬であるEtanerceptの前投与によりLPS投与後のsRAGEは部分的にしか抑制されず、RAGE sheddingはTNF-αのみに依存した現象ではなかった。また、小胞体ストレスの阻害作用を有するtauroursodeoxycholic acidの前投与によっても、LPS投与後の血中sRAGE上昇は抑制出来なかった。これらの結果より、血管内皮特異的なRAGE過剰発現はLPSによる炎症反応を増大し、またLPSによる非特異的な炎症刺激によりRAGE sheddingが誘導されることが明らかになった。LPSによるRAGEsheddingは必ずしもTNF-α及び小胞体ストレスに依存した現象でないことも明らかになった。RAGEsheddingの細胞・分子機序を基にして、本年度は血管内皮特異的ヒトRAGE過剰発現マウスを用いることにより、血管内皮表面のRAGEが炎症惹起により直接sheddingが誘導されることが示された。LPSを用いた非特異的炎症によるRAGEsheddingは、必ずしもTNF-α、小胞体ストレスに依存的とは考えられなかったが、実際に血管内皮のRAGE過剰発現がTNF-α産生系に影響するという、予期せぬ成果も得られ、最終年度の研究計画への重要な知見が得られたと考えている。また、計画通り、endo-RAGE TgマウスをBl-6系の遺伝背景にBack-crossも8代まで進んでおり、肥満病態モデルへの応用も可能な状況になりつつある。RAGEは厳密に調節された細胞内情報伝達により切断(shedding)され、RAGEの炎症作用が修飾される可能性がある。我々はヒト血管内皮細胞を用いて、炎症シグナルとRAGE sheddingの関連を検討してきた。TNFαはRAGE sheddingを著明に誘導し、その作用はATF-4の発現及びADAM10の発現に依存していた。他の小胞体ストレスシグナルにかかわるXBP-1の関与は顕著でなかった。in vivoにおいて、内皮特異的ヒトRAGEトランスジェニックマウス(endo-RAGE Tg)においては、ヒトsoluble RAGE (sRAGE)を測定することによりRAGEsheddingを評価可能なモデルを確立した。endo-RAGE Tg/Tgマウスは血中sRAGEが測定可能であり、通常状態でRAGE shedding誘導されていた。Tg/TgマウスにTNFα阻害薬であるetanerceptを投与すると、血中sRAGEの軽度の低下が認められ、生体内においてもTNFαがRAGE sheddingに関与する可能性を示唆した。Tg/Tgマウスに低濃度のLPSを投与すると、血中TNFαは投与2時間後をピークに著明に誘導され、それに引き続いて投与10時間後をピークに血中sRAGEが約2.5倍に有意に上昇した。またTNFα自身の腹腔内投与10時間後においても、血中sRAGEは有意に約30%増加し、TNFαが直接in vivoにおいても血管内皮表面のRAGE sheddingを誘導することが明らかとなった。本研究課題の成果として、生体内においてTNFαがRAGE sheddingを誘導すること、その作用がATF4, ADAM10活性化を介することが明らかになり、糖尿病や代謝異常患者における血管炎症にRAGEがその基盤因子として働くことが明らかとなった。血管内皮RAGE

過剰発現マウスでは、TNFαはRAGE切断を誘導した。RAGE過剰発現ヒト血管内皮細胞においてもTNFαはADAM10に依存的にRAGE切断を誘導した。TNFαは一過性にATF4の発現を誘導し、ATF4阻害によりRAGE切断とADAM10発現は抑制された。他の小胞体ストレス関連因子の阻害はRAGE切断に影響しなかった。小胞体ストレス誘導物質はATF4の持続的な発現を誘導したが、RAGE切断には影響しなかった。ATF4の阻害はTNFαによるMMP9発現に影響しなかった。以上より、TNFαは血管内皮のRAGE切断をATF4依存的に誘導する。代謝内分泌
吸収上皮細胞における頂部細管系の構造分化に関する研究

1.さかんにエンドサイトーシスをおこなういくつかの吸収上皮細胞(腎臓近位尿細管上皮,卵黄嚢上皮,精巣輸出管上皮,回腸吸収上皮)の細胞頂部に複雑に入り組んだ膜性の細管構造(頂部細管系)を観察した.2.この頂部細管の内腔は,通常の電顕用固定液による観察では均一無構造にしか見えないが,新しく考案した固定液をつかって観察した結果,細管内にラセンを巻いて走る線維構造を発見した.3.さらに高分解能連続超薄切片法および急速凍結置換固定法による解析の結果,この構造は左巻きの四重ラセンであり,おのおののラセンは顆粒状のサブ・ユニットの線状配列から構成されていることを明らかにした.4.この構造を細胞化学的手法(過ヨー素酸・チオカルバジド・プロテイン銀染色法およびリンタングステン酸染色法)で解析した結果,その化学的構成成分として,タンパク質と多糖類を含むことを明らかにした.5.また,いろいろな電顕的トレーサー(西洋ワサビペルオキシダーゼ,フェリチン)をもちいた実験により,頂部細管系は吸収上皮細胞の物質取り込み(エンドサイトーシス)のさいに細胞膜の落ち込みによってできるのではなく,細胞表面直下に存在する吸収空胞(エンドゾーム)より発芽して形成されることをつきとめた.6.器官培養した回腸吸収上皮細胞に,エンドサイトーシスを阻害するコルヒチン,サイトカラシンBを投与し,各種物質(ルシファー・イエロー,ペルオキシダーゼ等)の取り込みと頂部細管系の形態的変化を解析した結果,物質吸収の減少にともなって,頂部細管系も減少することを明らかにした.しかしながら,細管内の構造分化には著明な形態的変化は見られなかった.1.さかんにエンドサイトーシスをおこなういくつかの吸収上皮細胞(腎臓近位尿細管上皮,卵黄嚢上皮,精巣輸出管上皮,回腸吸収上皮)の細胞頂部に複雑に入り組んだ膜性の細管構造(頂部細管系)を観察した.2.この頂部細管の内腔は,通常の電顕用固定液による観察では均一無構造にしか見えないが,新しく考案した固定液をつかって観察した結果,細管内にラセンを巻いて走る線維構造を発見した.3.さらに高分解能連続超薄切片法および急速凍結置換固定法による解析の結果,この構造は左巻きの四重ラセンであり,おのおののラセンは顆粒状のサブ・ユニットの線状配列から構成されていることを明らかにした.4.この構造を細胞化学的手法(過ヨー素酸・チオカルバジド・プロテイン銀染色法およびリンタングステン酸染色法)で解析した結果,その化学的構成成分として,タンパク質と多糖類を含むことを明らかにした.5.また,いろいろな電顕的トレーサー(西洋ワサビペルオキシダーゼ,フェリチン)をもちいた実験により,頂部細管系は吸収上皮細胞の物質取り込み(エンドサイトーシス)のさいに細胞膜の落ち込みによってできるのではなく,細胞表面直下に存在する吸収空胞(エンドゾーム)より発芽して形成されることをつきとめた.6.器官培養した回腸吸収上皮細胞に,エンドサイトーシスを阻害するコルヒチン,サイトカラシンBを投与し,各種物質(ルシファー・イエロー,ペルオキシダーゼ等)の取り込みと頂部細管系の形態的変化を解析した結果,物質吸収の減少にともなって,頂部細管系も減少することを明らかにした.しかしながら,細管内の構造分化には著明な形態的変化は見られなかった.
ポリアミンによる細胞増殖に必須な翻訳制御の解明

ポリアミン(プトレスシン、スペルミジン、スペルミン)は細胞増殖因子として細胞機能に大変重要である。特にRNAとの相互作用を通じて翻訳制御に関わることから、ポリアミンが標的とする生体分子の同定を目指して研究を行い、その候補となる分子を同定した。また、スペルミジンにより修飾を受ける蛋白質合成開始因子eIF5A及びその修飾酵素の欠損マウスの解析を行い、致死となることを明らかにした。1.ポリアミンにより翻訳促進を受ける遺伝子、ポリアミンモジュロンとなる転写因子の同定を目指すため、ポリアミン生合成阻害剤存在下でヒトHeLa細胞株を培養し、ポリアミン枯渇細胞を作製した。その細胞から核抽出液を調整し、プロテイン-DNAマイクロアレイを行った。正常細胞と比べてポリアミン枯渇時に核内の量が減少する転写因子のスクリーニングを行った。ポリアミンモジュロンとして、転写因子が同定されたならば、その下流にある遺伝子発現制御がポリアミンによる細胞増殖制御の一部を担う可能性がある。現在、いくつかの転写因子を候補をとして同定した。今後、これらがポリアミンモジュロンとなるかどうかの判定を行っていく予定である。2.ポリアミンが唯一翻訳後修飾するeIF5A蛋白質及びその翻訳後修飾を担う酵素であるデオキシハイプシン合成酵素(DHS)のジーントラップマウスの解析を行った結果、ともに胎生致死を示した。胎生致死の時期はポリアミン生合成酵素遺伝子ノックアウトマウスと同様、子宮への着床後すぐに胚の確認が出来なくなる初期胚のステージであり、これらが生命誕生に必須であることが明らかとなった。3.ポリアミン代謝により発生するアクロレインが、血中においてアルブミンのリジン残基に付加したポリアミン抱合蛋白質(PC-ACR)として質量分析法の解析により同定した。そして、PC-ACRの生成はアクロレインによる細胞増殖阻害を防ぐ役割を担っていることが示唆された。1.ポリアミン生合成阻害剤存在下でヒトHeLa細胞株の培養を行い、ポリアミンの枯渇した細胞を作製した。その細胞から核抽出液を調整し、プロテイン-DNAマイクロアレイを行い、ポリアミン枯渇時に核内の量が変化する転写因子のスクリーニングを行った。その結果、14種の転写因子を同定した。これらの転写因子の活性が本当に変化しているかどうかをEMSA法により、検討を行ったところ、PU.1という転写因子がポリアミン枯渇時の核内で活性化されていることを確認した。この転写因子は血球系の分化に重要な因子であり、ポリアミンによる細胞分化の制御機構において必要とされている可能性が示唆された。2.ポリアミンの分解によって産生されるアクロレインは細胞障害性疾患である脳梗塞時に検出される毒性成分である。脳梗塞時には活性酸素種(ROS)も産生されるが、アクロレインの方がより強い障害活性をもつことを明らかにした。また、細胞内でポリアミンが主に相互作用しているRNAに対して、ROSとアクロレインによって分解が引き起こされるかどうかを検討した結果、ROSによってのみ、分解されることがわかった。そこで細胞障害時のモデルとして、細胞内で産生したROSが、RNAの分解を促進して相互作用していたポリアミンを遊離させ、ポリアミン分解によるアクロレイン産生を導くモデルが提唱された。
実例・学習者両コーパスを利用した科学系英文論文の複数文間の連携に関する研究

科学系英文論文について、実際に国際誌に掲載された論文並びに大学院博士前期課程レベルのバイオサイエンス系学生の作成した論文の一部を大量に収集し、それを元にして複数文間の連携に関して研究を行なうと同時に、その教育面への応用を研究した。まず、論文レベルの学習者コーパスを成果の一環として、収集したデータのうち著作者本人の了解を得て公開可能な約30万語についてその電子データを公開した(研究代表者から直接入手可能)。また、学習者が論文等の執筆時に語句の用法について簡便に調査ができるようにするため、キーワード検索ツールとしてMyKwicをWindows上で動作するフリーソフトウェアとして開発・公開した。主たる研究テーマである複数文間の連携については計量的な調査に基づき、次の点について明らかにした。まず、複数文間の連携においていわゆる接続語が果たす機能はあくまでも副次的であって、接続語の適切な利用だけでは複数文間の連携は維持されない。連携を保証するのはトピックの働きであり、各文のトピックは適切に前文との連携を保証しなければならない。科学系英文論文においてはトピックは主節の主語またはそれが登場するより左に位置する名詞句である。このトピックが前文の(1)トピック、(2)焦点位置、(3)文全体と緊密な語彙的結束性を持つことで複数文間の連携が保証される。さらに焦点位置は原則として、修飾語を排したときの文末ならびに全体としての文末であり、いずれもそのうちの名詞句(ただし、名詞句の中の修飾的名詞句は数えない)である。このうち、学習者はとりわけ(2)について誤りが多く、また、(1)や(3)についても適切な語句選択に困難を感じている例が多数見られた。また、これら結果を元に、科学系英文論文作成の教育においてもトピックを中心とした複数文間の連携を中心的なテーマとすることでその教授内容を大幅に組み替え単純化したものを提示した。今年度は主に分析対象となるデータの収集・整理を中心とした作業を行なった。科学英文論文としては、バイオサイエンス系のもの並びに物性科学系のものを中心とし、データ量として6GB(テキストデータに変換して約2GB)の収集を終え、そのすべてをセクション別に分類している。学習者データベースとしては本研究者が関わっている奈良先端科学技術大学院大学の修士課程学生の答案を中心としたデータ構築をOCR等を利用しつつ整理した。こうしたデータの分析に当たって本研究では形態素解析プログラムを用いるため、その実装として奈良先端科学技術大学院大学で開発途上のechasenの辞書データベースの整備に併せて着手している。特に科学英文論文を扱うため大量の専門用語の登録が必要であり、上記で構築したデータの一部を入力として登録を進めている。この作業をある程度自動化することによって他分野の用語も簡便に登録が可能なようにする手法を検討中である。また、既に整備が完了したデータなどをもとに文間連携の単位の一つであるパラグラフの構造を分析し、いわゆるトピックセンテンスの設定自体に諚義のあることを論文として発表した。むしろ、パラグラフ冒頭付近の提題文を定義し、その上でパラグラフの他部分の各文がどのように働いているかを検討する必要性を示している。
抗腫瘍剤および放射線照射の細胞障害作用に関する基礎的研究・トポイソメラーゼ変異細胞におけるアポトーシス制御機構の解析

(1)アポトーシス細胞の定量方法の確立した.すなわち細胞を固定し,TdTによりBrDUを取り込ませた.ついでFITCをラベルした抗BrdU抗体と反応させ,酵素抗体法によりアポトーシスを起こした細胞を同定することができた.(2)ヒト白血病細胞の野生株とトポイソメラーゼIIαに変異を持つ薬剤耐性株を抗腫瘍剤で処理し,アポト-シスを起こした細胞を定量した.抗腫瘍剤に対する薬剤耐性の度合いとアポトーシス細胞の比率が逆相関することがわかった.(3)ヒト白血病細胞の野生株とトポソイメラーゼIIαの変異株に抗トポイソメラーゼ作用を持つ抗腫瘍剤(doxorubicin,VP-16)を作用させると,いずれもG2-M期の細胞の集積がみられた.従って,doxorubicin,VP-16はG2-M期の細胞に作用してアポトーシスを引き起こすことが推測された.(4)近年,アポトーシスに先立ってトポイソメラーゼIIαの発現量が低下することが明らかにされたため,細胞周期の進行とトポイソメラーゼ発現の調節機構の関連を検討した.トポイソメラーゼの発現量は正常だが蛋白構造に変異を持つ薬剤耐性細胞とトポイソメラーゼの蛋白構造は正常は発現量が低下している薬剤耐性細胞のいずれにおいても,doxorubicin,VP-16の処理によるトポイソメラーゼ発現量の低下は野生株に比較してごく軽度であり,トポイソメラーゼ活性の低下によって導かれるアポトーシスの経路が存在することが示唆された.(1)アポトーシス細胞の定量方法の確立した.すなわち細胞を固定し,TdTによりBrDUを取り込ませた.ついでFITCをラベルした抗BrdU抗体と反応させ,酵素抗体法によりアポトーシスを起こした細胞を同定することができた.(2)ヒト白血病細胞の野生株とトポイソメラーゼIIαに変異を持つ薬剤耐性株を抗腫瘍剤で処理し,アポト-シスを起こした細胞を定量した.抗腫瘍剤に対する薬剤耐性の度合いとアポトーシス細胞の比率が逆相関することがわかった.(3)ヒト白血病細胞の野生株とトポソイメラーゼIIαの変異株に抗トポイソメラーゼ作用を持つ抗腫瘍剤(doxorubicin,VP-16)を作用させると,いずれもG2-M期の細胞の集積がみられた.従って,doxorubicin,VP-16はG2-M期の細胞に作用してアポトーシスを引き起こすことが推測された.(4)近年,アポトーシスに先立ってトポイソメラーゼIIαの発現量が低下することが明らかにされたため,細胞周期の進行とトポイソメラーゼ発現の調節機構の関連を検討した.トポイソメラーゼの発現量は正常だが蛋白構造に変異を持つ薬剤耐性細胞とトポイソメラーゼの蛋白構造は正常は発現量が低下している薬剤耐性細胞のいずれにおいても,doxorubicin,VP-16の処理によるトポイソメラーゼ発現量の低下は野生株に比較してごく軽度であり,トポイソメラーゼ活性の低下によって導かれるアポトーシスの経路が存在することが示唆された.【細胞周期とアポトーシス】以下の方法によりアポトーシスの定量をおこなった。すなわち目的とする細胞を固定した後,TdTによりBrdUを取り込ませ,次いでFITCをラベルした抗BrdU抗体と反応させてFACSを用いて解析し,細胞に取り込まれたBrdU量をアポトーシスにより断片化したDNAの指標とした。また細胞をPI染色しFACSを用いてDNA量を定量し,Brdu値とPI値を二次元表示することによりアポトーシスが細胞周期のいかなる段階でおきているかを知ることができた.【薬剤耐性細胞におけるアポトーシス】ヒト白血病細胞の野生株とトポイソメラーゼIIαに変異を持つ薬剤耐性株を抗がん剤で処理したところ,両細胞ともアポトーシスは主としてG2/M期に誘導されることが明らかになった.【平成10年度の研究計画】最近アポトーシスに先だってトポイソメラーゼIIαの発現量が減少することが明らかにされた.トポイソメラーゼIIαの減少がアポトーシスの引き金になっている可能性もあることから,トポイソメラーゼIIαに変異を持つ薬剤耐性細胞を用いてサイクリン,P53などの細胞周期制御因子やFAS,Bc12などアポトーシス制御因子の発現を経時的に検討したい.【平成10年度までの研究の進行状況】(1)アポトーシス細胞の定量方法の確立した.すなわち細胞を固定し,TdTによりBrdUを取り込ませた.ついでFITCをラベルした抗BrdU抗体と反応させ,酵素抗体法によりアポトーシスを起こした細胞を同定することができた.(2)ヒト白血病細胞の野生株とトポイソメラーゼIIαに変異を持つ薬剤耐性株を抗腫瘍剤で処理し,アポトーシスを起こした細胞を定量した.抗腫瘍剤に対する薬剤耐性の度合いとアポトーシス細胞の比率が逆相関することがわかった.(3)ヒト白血病細胞の野生株とトポイソメラーゼIIαの変異株に抗トポイソメラーゼ作用を持つ抗腫瘍剤(doxorubicin,VP-16)を作用させると,いずれもG2-M期の細胞の集積がみられた.従って,doxorubicin,VP-16はG2-M期の細胞に作用してアポトーシスを引き起こすことが推測された.【平成12年度の研究計画】(1)近年,アポトーシスに先立ってトポイソメラーゼIIαの発現量が低下することが明らかにされた.

そこで細胞周期の進行とトポイソメラーゼ発現の調節機構の関連を明らかにするために,トポイソメラーゼの発現量は正常だが蛋白構造に変異を持つ薬剤耐性細胞とトポイソメラーゼの蛋白構造は正常だが発現量が低下している薬剤耐性細胞を用いて,doxorubicin,VP-16の処理によりトポイソメラーゼの発現量の変化が見られるか否かを検討する.(2)さらにトポイソメラーゼの発現量の変化がアポトーシスの引き金なのか,単に細胞死の過程を反映しているものなのかを検討するために,両細胞における各種サイクリンやP53などの細胞周期制御因子とFasやBc12などのアポトーシス制御因子の発現を検討する.(1)アポト-シス細胞の定量方法の確立した.すなわち細胞を固定し,TdTによりBrdUを取り込ませた.ついでFITCをラベルした抗BrdU抗体と反応させ,酵素抗体法によりアポトーシスを起した細胞を同定することができた.(2)ヒト白血病細胞の野生株とトポイソメラーゼIIαに変異を持つ薬剤耐性株を抗腫瘍剤で処理し,アポトーシスを起した細胞を定量した.抗腫瘍剤に対する薬剤耐性の度合いとアポトーシス細胞の比率が逆相関することがわかった.(3)ヒト白血病細胞の野生株とトポイソメラーゼIIαの変異株に抗トポイソメラーゼ作用を持つ抗腫瘍剤(doxorubicin,VP-16)を作用させると,いずれもG2-M期の細胞の集積がみられた.従って,doxorubicin,VP-16はG2-M期の細胞に作用してアポトーシスを引き起こすことが推測された.(4)近年,アポトーシスに先立ってトポイソメラーゼIIαの発現量が低下することが明らかにされたため,細胞周期の進行とトポイソメラーゼ発現の調節機構の関連を検討した.トポイソメラーゼの発現量は正常だが蛋白構造に変異を持つ薬剤耐性細胞とトポイソメラーゼの蛋白構造は正常だが発現量が低下している薬剤耐性細胞のいずれにおいても,doxorubicin,VP-16の処理によるトポイソメラーゼ発現量の低下は野生株に比較してごく軽度であり,トポイソメラーゼ活性の低下によって導かれるアポトーシスの経路が存在することが示唆された.
峡部オーガナイザー形成のメカニズム

Fgf8bをニワトリ胚後脳胞間脳胞に強制発現させると、Ras-ERKシグナル伝達系が活性化されて中脳胞の発生運命が変わり、小脳として分化する。この際導入したFgf8が直接オーガナイザーとして働いたのか、胚でオーガナイザーの再編が起こっているかを検証した。そのため、マウスFgf8をエレクトロポレーションによりニワトリ胚の後脳胞間脳胞に強制発現させ、ニワトリFgf8に特異的なプローブ、マウスFgf8に特異的なプローブを用いてin situハイブリダイゼイションを行い、導入したFgf8,胚のFgf8の発現を時間を追って調べた。その結果、胚の中でオーガナイザーの再編が起こり、最終的に胚の遺伝子によるFgf8がオーガナイザーとして働くことが明らかとなった。このオーガナイザーの再編にはOtx2,Gbx2,Limx1b, Wnt1,Fgf8の相互作用が大きく関与している。Fgf8がRas-ERKシグナル伝達系を活性化することにより小脳が誘導されるが、その際Ras-ERKシグナルの負の調節因子であるSprouty2が直ちに誘導され、シグナルの流れを適度に調節していることを示した。Sprouty2およびドミナントネガティブ型のSprouty2の強制発現により次のことが明らかとなった。すなわちRas-ERKシグナルが流れすぎると中脳後脳境界が頭側により、Sprouty2により抑制されると尾側によって本来小脳として分化する後脳胞背側は視蓋として分化するようになる。このような領域の運命を調節するシグナルの量は厳密に調節される必要があり、峡部でもSprouty2に加えて、sef, Mkpといった負の調節因子により、2重3重に調節されているようである。
情報モデルに基礎を置く製品や生産技術開発のための情報プラットフォーム

グローバル化や地球環境配慮、競争激化、技術の急変など様々な理由により、製品開発や生産システムには大きな変革が求められている。最も重要なことは変化に対する柔軟性であり、そのためには、製品や生産システムに関する知識を体系化し、過去の知見や物理的.知的資産を無駄なく活用・再利用して、適切な製品や対応する生産システムを迅速に開発・構築・再構築できることが望まれている。この課題解決の基礎として、製品の全ライフサイクルを対象として、製品自体や対応する生産システム、関連する環境なども含めて、包括的にモデル化できるような製品や生産システムに関するライフサイクルモデルは重要である。体系化なモデル構築のために、製品や生産システムに関する基礎知識をオントロジーとして整理し、生産システム構築のための情報モデルを形式的に記述することを考え、情報モデルに基づくシステム構築のための情報プラットフォームの研究を行なう。一般的な情報モデルを基礎として、わが国の製造業に固有な生産技術知識を具体的に体系化していくことは、今後のわが国の製造技術の進歩にとって極めて有効である。本年度は、研究期間が短期間であるので、対象とする製品や生産システムの分析と情報プラットフォーム構成について基本概念を研究した。自動車産業を主な対象分野として、製品や生産システム構築のための情報モデリングの研究現状をまとめ、具体的なモデリング手法を検討した。また、製品開発や対応する生産システム構築における創造的な開発プロセスの体系的な分析を行い、協調作業や意志決定などを支援する情報システムの構成を検討した。情報モデルに基づいて上記のような情報システムを具体的に構築するために、製品や生産システムに関する基礎知識をオントロジーとして整理することを考え、それにより情報プラットフォームの基本構成を研究した。