hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
癌移植腫瘍における温熱およびX線処理後に誘導される遺伝子・タンパク質群の解析

p53依存的温熱および放射線感受性の要因の1つとして,培養細胞系および移植腫瘍系の両者でBax依存的アポトーシスが関与していることは,これまでに頭頸部扁平上皮癌細胞(SAS細胞)に変異型p53遺伝子を導入した細胞(SAS/mp53細胞)とコントロールベクターを導入した細胞(SAS/neo細胞)を用いて報告した。さらに,このSAS/neo細胞とSAS/mp53細胞を用いて,温熱処理およびX線処理後の遺伝子発現の有無をDNAマイクロアレイで検討したところ,アポトーシスを促進させる遺伝子群の発現増加とアポトーシスを抑制させる遺伝子群の発現抑制が確認された。しかしながら,移植腫瘍系での検討は行われていないのが現状である。SAS/neo腫瘍およびSAS/mp53腫瘍を用いて,移植腫瘍系でのp53依存的温熱感受性およびX線感受性に関与する遺伝子群およびタンパク質群の発現の変動を明らかにすることを目的とする。1)頭頸部扁平上皮癌細胞(SAS細胞)に変異型p53遺伝子を導入した細胞(SAS/mp53細胞)とコントロールベクターを導入した細胞(SAS/neo細胞)をを約1×10^7個の細胞数を200-400μeのDMEMに縣濁し,ヌードマウス(Balb/cAJcl-nu,6週齢,雄)に皮下に移植した。2)移植された腫瘍が,径6-7mmとなった時点で,a)温熱処理,b)X線照射,c)X線照射後に温熱処理の併用のそれぞれの処理を行い,処理後6,12,24,48,72時間目と未処理群の腫瘍を取り出した。取り出した腫瘍での温熱感受性に関与するタンパク群の発現様式をプロテインチップで現在解析中である。p53依存的温熱および放射線感受性の要因の1つとして、培養細胞系および移植腫瘍系の両者でBax依存的アポトーシスが関与していることは、これまでに頭頸部扁平上皮癌細胞(SAS細胞)に変異型p53遺伝子を導入した細胞(SAS/mp53細胞)とコントロールベクターを導入した細胞(SAS/neo細胞)を用いて報告した。さらに、このSAS/neo細胞とSAS/mp53細胞を用いて、温熱処理およびX線処理後の遺伝子発現の有無をDNAマイクロアレイで検討したところ、アポトーシスを促進させる遺伝子群の発現増加とアポトーシスを抑制させる遺伝子群の発現抑制が確認された。しかしながら、移植腫瘍系での検討は行われていないのが現状である。SAS/neo腫瘍およびSAS/mp53腫瘍を用いて、移植腫瘍系でのp53依存的温熱感受性およびX線感受性に関与する遺伝子群およびタンパク質群の発現の変動を明らかにすることを目的とする。1)頭頸部扁平上皮癌細胞(SAS細胞)に変異型p53遺伝子を導入した細胞(SAS/mp53細胞)とコントロールベクターを導入した細胞(SAS/neo細胞)をを約1×107個の細胞数を200-400μlのDMEMに縣濁し、ヌードマウス(Balb/cAJcl-nu、6週齢、雄)に皮下に移植した。2)移植された腫瘍が、径6-7mmとなった時点で、a)温熱処理、b)X線照射、c)X線照射後に温熱処理の併用のそれぞれの処理を行い、処理後6,12,24,48,72時間目と未処理群の腫瘍を取り出した。取り出した腫瘍での温熱感受性に関与する遺伝子群の発現様式をDNAチップで現在解析中である。結果は次年度に報告予定である。
水素のミクロ・マクロ熱流動特性に対する量子効果発現メカニズムの解明

昨年度は、セントロイド分子動力学(CMD)法を用いて、水素分子の量子効果がその輸送物性に与える影響とその分子論的メカニズムを明らかにした。交付申請書に記載した通りに、Green-Kuboの方法より液体水素の拡散係数を計算し、古典MD法の結果と比較することで、水素分子の量子効果がその拡散性に与える影響とその温度依存性について議論を行った。さらに、非平衡分子動力学法を用いて熱伝導率の評価も行った。CMD法と古典MD法より得られた拡散係数を対応状態原理に基づいて比較した結果、CMD法の結果と古典MD法の結果はほとんど同じ温度依存性を示すことが明らかとなった。この要因を調べるために、水素分子間ポテンシャルを作成し比較したところ、斥力範囲が広くなり、さらにポテンシャル井戸の深さが浅くなることが分かった。つまり両MD法が同じ温度依存性を示したのは、量子効果による二つの分子間相互作用の変化がお互いの影響を打ち消しあうため、結果的に両MD法が同じ温度依存性を示すことが明らかとなった。さらに非平衡分子動力学法による熱伝導率の解析では、量子効果を考慮することで熱伝導率が低下すことが分かった。これは、量子効果によりポテンシャルエネルギ自体が小さくなり、さらに分子間相互作用が弱くなるため、分子運動によって輸送されるポテンシャルエネルギが低下し、分子間相互作用により輸送されるエネルギが低下することが原因であることが明らかとなった。これらの研究成果は、従来のMD法では水素の熱流動現象を正確に予測できないことを明確にしたものであり、工学的に重要な燃料である水素を安全かつ効率良く使用するためには、大変有意義な研究成果である。また、本研究では、液体における量子効果の分子論的メカニズムについても明らかにしており、これは学術的に大変大きな意義を持っている。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、経路積分法に基づいた分子動力学法を用いて、水素分子の量子効果がその熱・輸送物性に与える影響とその分子論的メカニズムを明らかにした。本年度は、交付申請書に記載した通りに、まずPIMD法を用いて幅広い温度-密度条件における系の圧力および内部エネルギを計算し、Kataokaの方法を用いて状態方程式(EOS)を構築し、古典MD法の結果と比較することでEOSに与える量子効果の影響を解析した。また、重心位置(セントロイド)に働く力からForce matching法より量子効果を考慮した水素分子間ポテンシャルを作成した。さらにセントロイドMD (CMD)法を用い、Green-Kuboの方法より液体水素の拡散係数を計算し、古典MD法の結果と比較することで、水素分子の量子効果がその拡散性に与える影響とその温度依存性について議論を行った。本研究により、水素分子の量子効果がその熱物性に与える影響は大きく、量子効果を考慮することで、ビリアル圧力が上昇することが明らかとなった。さらに、作成した水素分子間ポテンシャルと量子化学計算より導出した分子間ポテンシャルを比較した結果、水素分子の量子効果を考慮することで、斥力範囲だけではなく、ポテンシャルの井戸の深さが浅くなることを明らかにした。また、CMD法と古典MD法より得られた拡散係数の比較より、量子効果を考慮した場合、温度が低くなるにつれて、拡散に必要な活性化エネルギが低下し、30K以下では古典MD法の活性化エネルギより小さくなることが分かった。これは水素分子の拡散に対する支配因子が、斥力範囲の拡大からポテンシャル井戸の深さの変化に変わったためであると考えられる。

また、本研究では、液体における量子効果の分子論的メカニズムについても明らかにしており、これは学術的に大変大きな意義を持っている。26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の予定では、量子効果が液体水素の熱伝導率に与える影響の解析まで行う予定になっているが、現在プログラムの作成は終了し、結果の解析を行っている状況であること、また他の解析結果については、学会発表や論文執筆なども行っていることより、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。今後は、水素分子の量子効果がその熱伝導率に与える影響について解析を行う予定である。これまでは、水素の静的物性と拡散係数のみについて解析を行ってきたが、水素分子の量子効果がエネルギ輸送メカニズムに与える影響関する研究はこれまで行われておらず、学術的に非常に重要である。さらに、これまでは水素のマクロな熱流動特性のみの解析であったが、今後は水素のミクロな熱流動特性についても解析を行い、水素分子の量子的なゆらぎがミクロな領域の流動特性にどのような影響を与えるかについて調べる予定である。
固液界面における自己集合の高次階層制御

有機分子の自己集合により固体表面において形成される二次元分子配列は、数ナノメートルのピッチを有し、分子回路や極微反応場の構築、有機光電変換素子の効率化につながる基礎技術として、その制御法の開発に多大な関心が集まっている。しかし、固体表面における自己集合の制御に関する知見は少なく、特定の機能を示す創発的な分子集合体を作成するには、近接分子間の相互作用の制御にとどまらない階層的な相互作用を制御する方法の確立が望まれる。本課題では、これらの配列制御に関する理解を深めることを目的に、以下の課題について検討した。1.配列形成に与えるエントロピーの影響:固液界面における分子配列形成にはエントロピーが影響すると考えられるが、これまでに調査がなされていなかった。そこで、アルコキシ基により置換されたデヒドロベンゾ[12]アヌレン(DBA)の形成する配列の、温度に応じた非多孔性配列から多孔性配列への相転移を熱力学モデルにより解析し、相転移に伴う熱力学的パラメータの変化を実験的に見積もることに成功した。2.階層的分子認識による配列制御:アキラルなDBAはキラルな関係にあるハニカム型の配列を等面積で形成する。一方、キラルなアルキル基を持ったDBAは、ホモキラルな分子配列を形成することを明らかにした。また、キラルな分子をキラル源として、アキラルな分子配列のキラル誘起について検討したところ、階層的な分子認識により完全にキラリティーが誘起されることが分かった。3.二次元配列のエピタキシャル成長:二次元配列のエピタキシャルな構造成長を目的に、DBAの三つのアルキル鎖の先端に金属ポルフィリン部位を含む分子を合成した。この分子は金属ポルフィリン部位を空孔に配置させながらハニカム型に配列した。空孔の金属ポルフィリンへの電荷移動相互作用によるC60の、配位結合によるピリジン誘導体の配置に成功した。24年度が最終年度であるため、記入しない。溶液や結晶中の三次元系自己集合と比較して、固体表面での二次元自己集合の制御に関する知見は少なく、これらを階層性と機能を備えた創発的な分子集合体にまで発展させるには、多くの未知の制御因子を解明する必要がある。特に、近接分子間の相互作用の理解にとどまらない階層的な相互作用の制御とエントロピーの寄与の理解を主とした指導原理の確立が必須である。本課題では、未知の制御因子の解明を目的とした、二つの課題、(1)「エントロピーの与える配列形成への影響」の調査、(2)「分子配列を鋳型とした三次元構造の構築」に取り組んでいる。課題(1)は二つの課題(1)と(2)にさらに細分される。(1)では、有機溶媒/グラファイト界面において六本の長鎖アルコキシ基により置換されたデヒドロベンゾ[12]アヌレン誘導体(DBA)の形成する配列について、温度の与える影響について走査型トンネル顕微鏡(STM)を用いて調査した。その結果、温度に依存して構造とドメインサイズが大きく変化することが明らかになった。(2)では、デシル基を有するDBAと菱形bisDBAが混合した場合に形成される配列について、有機溶媒とグラファイトの界面で調査した。その結果、それら二つの分子が乱雑に混ざり合った空孔を持った構造が形成されることを見出した。また、温度に依存した構造変化についても調べ、配列形成に与えるエントロピー的な影響について検討した。課題(2)では、DBAのハニカム構造の空孔を鋳型として、有機配位子と金属カチオンとの配位結合を利用して三次元的に構造を拡張し、多孔性結晶やカゴ型作成を構築することを目的とする。そのため、アルキル鎖の末端に配位部位(亜鉛ポルフィリン部位)を有するDBAを新たに合成した。

この分子は金属ポルフィリン部位を空孔に配置させながらハニカム型に配列した。空孔の金属ポルフィリンへの電荷移動相互作用によるC60の、配位結合によるピリジン誘導体の配置に成功した。24年度が最終年度であるため、記入しない。課題(1)および(2)についてどちらも順調に進展しているため。課題(1)では温度の与える配列への影響について既に明らかにした。得られた結果をもとにして次年度は半定量的な熱力学モデルによって考察を進める。そのため、海外研究協力者であるSteven De Feyter教授と密に研究を進展させる。課題(2)では亜鉛ポルフィリン部位を持った分子の合成に成功した。次年度ではこの分子が形成する配列について調査を進める。
イネＲＴ９８型細胞質雄性不稔性における不稔及び稔性回復機構の分子遺伝学的解析

1. RF98の機能解析CMS系統RT98AにPPR762を遺伝子導入したところ,最大で一穂あたり15.9%の稔性回復が示された.この結果から, PPR762を稔性回復遺伝子Rf98として同定することができ,国際論文に発表した.PPR762は完全な稔性回復作用を示さなかったため,稔性回復能力を向上させる稔性回復補助遺伝子が存在することが予測された.Rf98のマッピングで得られた組換え個体R1R8の稔実率を調べたところ,稔性回復遺伝子Rf98の近傍がT65に置換される系統R3およびR4では,稔性の低下が起こることが明らかとなった.この結果から,稔性回復補助遺伝子は稔性回復遺伝子Rf98の近傍約316 kb (日本晴相当)に存在することが明らかとなった.稔性回復遺伝子Rf98はPタイプのPPRタンパク質であるPPR762をコードしていたため,機能は配列特異的なRNAのプロセッシング,スプライシング,分解,翻訳の制御であることが予測された.orf113はCMS系統RT98Aと稔性回復系統RT98Cの間でmRNAの蓄積パターンに違いが見られ, RT98CにおいてRT98Aよりも短い断片が検出されることから, RT98Cではorf113 mRNAのプロセッシングが起きていることが予測された.このプロセッシングを起こしている因子がPPR762であることを確かめるために, PPR762をRT98Aに導入して稔性が回復して得られた後代においてノーザンブロット分析を行った.その結果, PPR762はorf113 mRNAのプロセッシングには関与しないことが明らかとなった.このことから, Rf98の機能はorf113に対しては翻訳制御を行っている可能性, orf113以外のCMS原因遺伝子に作用している可能性が考えられた.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。1.A.稔性回復遺伝子Rf98の候補とした, pentatricopeptide repeat (PPR)モチーフを持つ遺伝子8個について,ゲノム断片のクローニングとシークエンスの確認,細胞質雄性不稔系統RT98Aへの遺伝子導入,形質転換体の稔性の評価を行った. 8個の遺伝子のうち, PPR762をコードする遺伝子を導入して得られた2個体中1個体で3粒の稔実が確認できた.弱いながらも確実な稔性回復作用を持つ遺伝子を見出したことに意義があり, RT98型CMSの稔性回復機構解明の起点となるため重要性がある.2.A.ORF113リコンビナントタンパク質を作製し,抗ORF113抗体を得ることができた.作製した抗体はリコンビナントORF113を検出可能であることをウェスタンブロットにより確認できたが,花粉でのORF113の蓄積は検出できていない.ORF113のタンパク質の蓄積が雄性不稔の原因でない可能性を示した点に意義がある.2.B.細胞質雄性不稔系統RT98Aと維持系統T65の3核期の葯から抽出したRNAを用いてRNA-seq解析を行った.両系統間で有意に発現が変動していた遺伝子を1,607個見出した.このうち, RT98Aで発現が増加していたものが1112個, T65で発現が増加していたものが494個であった.ホルモン解析を3核期の葯サンプルについて行った結果,細胞質雄性不稔系統RT98Aで不足している植物ホルモンは無かったことから,特定の植物ホルモンの不足はRT98型細胞質雄性不稔性の原因ではないことが示唆された.1.稔性回復遺伝子RF98の同定昨年度の結果からPPR762が稔性回復遺伝子Rf98の実体であると予想し,形質転換実験を継続して行い, PPR762のゲノム断片をCMS系統RT98Aに導入した形質転換体を合計で23個体得ることができた.それらの形質転換体について稔性の評価を行った結果,最大で1穂あたり15.9%の稔性回復が示された.この結果から,稔性回復遺伝子Rf98はPPR762であることがわかった.本研究の目的であるRT98型CMSの稔性回復機構の全貌の解明において,その一端を担う遺伝子を同定することができたことに意義がある.2. RF98の機能解析稔性回復遺伝子Rf98の発現解析を試みたが,稔性回復遺伝子の候補として選抜した他の7個のPPR遺伝子に比べて発現が極端に低いことがわかった. PPR762を含むゲノム断片を導入した形質転換体23個体のうち,稔実率の高かった2系統から得たT1種子をカルス化し,ミトコンドリアRNAを抽出してorf113プローブでorf113のmRNAが切断されているかどうかをノーザンブロット分析により調査したところ, orf113の切断は起きていないことがわかった.以上の結果から,稔性回復遺伝子の機能を補助する稔性回復補助遺伝子が存在する可能性,稔性回復遺伝子Rf98のターゲットはorf113ではない可能性, Rf98の発現量が低いためにRF98の作用が検出しにくく稔性回復能力も低い可能性が考察された.RF98の機能が低い理由を考察できたことに意義がある.

本研究の目的であるRT98型CMSの雄性不稔機構の解明のためにはorf113以外のCMS原因因子を探索する必要がある.Rf98を過剰発現させることで稔性回復能力を強化させることができれば, RF98の機能解析をより効果的に実施することができると考えられる.稔性回復遺伝子Rf98の同定を達成することができた.CMS原因因子を再度探索することが必要であるため, CMS原因遺伝子の機能解析が停滞している.1. RF98の機能解析CMS系統RT98AにPPR762を遺伝子導入したところ,最大で一穂あたり15.9%の稔性回復が示された.この結果から, PPR762を稔性回復遺伝子Rf98として同定することができ,国際論文に発表した.PPR762は完全な稔性回復作用を示さなかったため,稔性回復能力を向上させる稔性回復補助遺伝子が存在することが予測された.Rf98のマッピングで得られた組換え個体R1R8の稔実率を調べたところ,稔性回復遺伝子Rf98の近傍がT65に置換される系統R3およびR4では,稔性の低下が起こることが明らかとなった.この結果から,稔性回復補助遺伝子は稔性回復遺伝子Rf98の近傍約316 kb (日本晴相当)に存在することが明らかとなった.稔性回復遺伝子Rf98はPタイプのPPRタンパク質であるPPR762をコードしていたため,機能は配列特異的なRNAのプロセッシング,スプライシング,分解,翻訳の制御であることが予測された.orf113はCMS系統RT98Aと稔性回復系統RT98Cの間でmRNAの蓄積パターンに違いが見られ, RT98CにおいてRT98Aよりも短い断片が検出されることから, RT98Cではorf113 mRNAのプロセッシングが起きていることが予測された.このプロセッシングを起こしている因子がPPR762であることを確かめるために, PPR762をRT98Aに導入して稔性が回復して得られた後代においてノーザンブロット分析を行った.その結果, PPR762はorf113 mRNAのプロセッシングには関与しないことが明らかとなった.このことから, Rf98の機能はorf113に対しては翻訳制御を行っている可能性, orf113以外のCMS原因遺伝子に作用している可能性が考えられた.稔性回復遺伝子Rf98の同定について,候補遺伝子のゲノム断片のクローニングおよびRT98Aへの相補性試験を達成した.CMS原因因子の解明について,抗ORF113抗体の作製を達成できたが, ORF113タンパク質の蓄積の検出が未達成である.花粉のトランスクリプトーム解析を達成し,測定結果を解析中である.花粉のホルモン解析を達成し,測定結果を解析中である.今年度の結果から,稔性回復遺伝子の機能を補助する稔性回復補助遺伝子が存在する可能性,稔性回復遺伝子Rf98のターゲットはorf113ではない可能性, Rf98の発現量が低いためにRF98の作用が検出しにくく稔性回復能力も低い可能性が考察された.これらの可能性を考慮しつつ, CMS原因遺伝子の実体を明らかにするため,以下の実験を進行中である.1)稔性回復補助遺伝子の同定に向けたマッピングを行い,候補領域にある遺伝子の中からPPR782をクローニングした.PPR782はWA型CMSの稔性回復遺伝子Rf4の実体である(Kazama and Toriyama 2014; Tang et al., 2014).そのため,優先して形質転換実験を行っている.2)稔性回復遺伝子Rf98のターゲットを見出すべく, Rf98のターゲット予測を行った.予測されたターゲットに対して特異的なプローブを作成し,ノーザンブロット法によりRT98AとRT98Cで転写パターンに違いのあるターゲットを探索中であある. 3)
多官能基性分子のカルボン酸選択的有機触媒反応

当量のホウ素化合物を用いたカルボン酸の求核的活性化を既に見出している。本予備的知見を踏まえ、ホウ素化合物の触媒化と世界初のカルボン酸をドナーとする触媒的不斉アルドール反応の実現に注力した。まず当量反応条件を確立した。ホウ素上の置換基のチューニングにより、電子求引性のリガンドを用いたときに、芳香族、脂肪族双方のアルデヒドに対して有効に機能するカルボン酸アルドール反応を見出した。触媒の電子密度と立体障害、配位飽和度等を最適化し、生成物と触媒の解離を加速することで触媒再生を促進することを試みた。その結果、トリフルオロメチルケトンを基質として用いると、カルボン酸アルドール反応でホウ素触媒の回転が観測された。この基質依存性の原因を探るべく、トリフルオロメチル基を含む2級アルコールと3級アルコールをそれぞれ共存させて反応を行ったところ、3級アルコール存在下では触媒回転が達成できたのに対して、2級アルコール存在下では触媒回転が見られなかった。以上の結果は、アルドール生成物の立体項が触媒回転の有無に重要な役割を果たしていることを示している。この知見をもとに、今後、ホウ素上の置換基を立体的に嵩高くすることにより基質一般性のより高い触媒回転の実現を目指して行く予定である。この研究で開発した方法を用いると、カルボン酸類が化学選択性高く求核的に活性化することができる。カルボン酸は特に医薬等の生物活性化合物に数多く含まれる官能基であり、医薬のlate-stage構造変換に有用な反応が開発できたと考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。有機触媒との共有結合形成を介したカルボン酸の求核的活性化と触媒的不斉炭素骨格構築反応の開発を通じて、カルボキシ基を起点とする官能基選択的分子変換を実現する方法論の創製を目的とする。酸性官能基を認識し活性化する触媒の特性を利用した本方法論は、カルボン酸選択的α位官能基化反応へと一般的に拡張可能であり、保護・脱保護に依存した従来の医薬合成とは一線を画する革新的分子構造変換法へと将来的に展開できると期待している。触媒制御による官能基選択性や立体選択性を活用して、多官能基性医薬分子や生物活性天然物のカルボン酸部位選択的直接的誘導化法の確立、更には本触媒法を基盤とした次世代医薬機能最適化法の提案を狙う。本年度は、ホウ素化合物を用いた有機塩基によるカルボン酸のエノラート化、およびこれを求核剤とするアルドール反応やMannich反応の開発に成功した。特にMannich反応では、不斉触媒化も実現した。また、ペプチドや医薬分子と言った多官能基性分子に対しても、カルボン酸が選択的にエノレート化され、カルボン酸部位から炭素骨格を伸ばして行くことが可能であった。世界初のカルボン酸を出発部位とする触媒的不斉炭素骨格構築反応に成功しているため。あと一年で、多大なる進展が見込める。保護基の使用を最小限に抑えた医薬合成等の基盤技術へと発展させる。
環境感知応答システムによる異物排出蛋白質発現制御ネットワークの解明

異物排出蛋白質は多くの細菌に存在する主要な多剤耐性因子である。大腸菌においては20種類もの異物排出蛋白質がゲノム上に存在しているもののそのほとんどが構成的に発現しておらず、なんらかの刺激で発現が誘導され、結果的に多剤耐性化を引き起こすのではないかと考えられてきた。しかしながら、実際多くの異物排出蛋白質が通常はどのような機構で発現が抑制されどのような刺激で発現が誘導されるのかは明らかになっていない。1年目では、インドールという化合物が二成分情報伝達系に作用し、数種類の排出蛋白質の発現を誘導させることを発見した。さらに、本研究では排出蛋白質の発現誘導シグナルおよび、条件、発現抑制因子を広く同定することを目指した。最初に大腸内での排出蛋白質の発現レベルを評価するために、生育段階毎に排出蛋白質のプロモーター活性を測定した。この結果、MdtEFと呼ばれる排出蛋白質が培養時間とともにその発現量が劇的に増大し、定常期において最大になることを見出した。さらに、この定常期におけるMdtEFの誘導は大腸菌自身および、他の腸内細菌が分泌するインドールが原因であることを発見した。一方、イシドールは定常期での遺伝子発現調節シグナルとして腸管出血性大腸菌の病原性にも関わっていることも明らかにした。次に、排出蛋白質の発現誘導物質のGlobal Screeningおよび、発現抑制因子をトランスポゾンによるランダムノックアウト法により探索、同定を行った。この研究過程でCRP-cAMP(Catabolite Receptor Protein)がmdtEFの、Fur(Ferric Uptake Regulator)がacrDとmdtABCの発現を抑制し、PTS sugar高濃度存在下では、CRP-cAMPによるmdtEFの、そして鉄欠乏条件下では、FurによるacrDとmdtABCの発現抑制がそれぞれ解除されることで結果的に、これらの発現が増大することも明らかにした。以上の結果から、排出蛋白質の発現は細菌自身が分泌するインドールシグナル、鉄やPTS sugarの濃度変化といったある種の環境変化により増強されることが示された。異物排出蛋白質は多くの細菌に存在する多剤耐性の主要な因子であると知られている。しかしながら、実際多くの異物排出蛋白質が通常はどのように発現が抑制されどのような刺激で発現が誘導されるのかは明らかになっていない。これまで、我々は微生物に存在する環境感知応答システムである二成分情報伝達系が多くの排出蛋白質の発現を正に調節していること、また二成分情報伝達系によって制御される排出蛋白質のうち数種類がインドールによって発現が誘導されることを突き止めた。1年目は第一に「インドールによる排出蛋白質発現誘導に二成分情報伝達系が関わっているのかを検証し、インドールによる排出蛋白質の発現誘導ネットワークを解明する。」ことを目的とした。その成果としてMolecular Microbiology誌に発表を行うことができた。第二に「異物排出蛋白質の発現誘導物質と発現抑制因子探索の準備段階として、レポーター遺伝子を付加した排出蛋白質遺伝子プロモーターライブラリの構築を行い、排出蛋白質の未知の発現抑制因子とインドールに続く発現誘導物質の同定を行う」ことを目的にした。1年目は計画通り、発現誘導物質、発現抑制性因子探索のためのスクリーニング系を構築した。さらに、スクリーニングの結果、発現誘導物質に関しては細胞壁の分解産物であるN-アセチルグルコサミンが1つの異物排出蛋白質の発現を特異的顕著に増大させることを見出した。この成果については現在投稿準備中である。また、発現抑制性因子に関しては鉄応答性の転写制御因子がいくつかの異物排出蛋白質の発現を抑制していることを見出した。現在は大腸菌の鉄応答性に異物排出蛋白質がどのような形で寄与しているのか調査中である。

この研究過程でCRP-cAMP(Catabolite Receptor Protein)がmdtEFの、Fur(Ferric Uptake Regulator)がacrDとmdtABCの発現を抑制し、PTS sugar高濃度存在下では、CRP-cAMPによるmdtEFの、そして鉄欠乏条件下では、FurによるacrDとmdtABCの発現抑制がそれぞれ解除されることで結果的に、これらの発現が増大することも明らかにした。以上の結果から、排出蛋白質の発現は細菌自身が分泌するインドールシグナル、鉄やPTS sugarの濃度変化といったある種の環境変化により増強されることが示された。
薬剤耐性癌細胞の耐性獲得機序の解明と解除法の研究-細胞骨格系よりの解析-

癌の化学療法において癌細胞の薬剤耐性獲得は治療成績の向上を阻害する最大の問題であり,発癌機構の解明と表裏一体をなしている.薬剤耐性機序は多剤薬剤耐性遺伝子(MDR1)産物のP糖蛋白が薬剤排出ポンプとして作用することが主なものとされている.われわれはP糖蛋白以外にも耐性機構が存在すると考え,物質の輸送などに関連する細胞骨格系の微少管について検討した.その結果,1)各種多剤薬剤耐性細胞ではアクチン,ビメンチンの増加は認められないが,α-,βチュブリン共に蛍光抗体法による発現量,mRNA量は有意に増加しており,2)この増加はMDR1-mRNAの発現増加の見られない細胞においても明らかであった.3)さらにチュブリン発現量の誘導は薬剤の種類によって異なり,アドリアマイシンはMTXなど他の薬剤に比べ誘導作用の強いことが示唆された.4)微少管構築を阻害するコルセミド添加により,MDR発現の有無に係わらず耐性細胞においても細胞内,特に核内の薬剤濃度は上昇し,耐性は解除された.5)これらのことより微少管構築はP糖蛋白とともに薬剤耐性に深く関与しており,薬剤の組み合わせ,量の設定や使用期間に微少管構築を考慮するとともに微少管を標的にした新たな薬剤の開発や使用が耐性克服に必要なことが示唆される.耐性細胞ではチュブリン遺伝子の変異も報告されており,現在この点も検討している.癌の化学療法において癌細胞の薬剤耐性獲得は治療成績の向上を阻害する最大の問題であり,発癌機構の解明と表裏一体をなしている.薬剤耐性機序は多剤薬剤耐性遺伝子(MDR1)産物のP糖蛋白が薬剤排出ポンプとして作用することが主なものとされている.われわれはP糖蛋白以外にも耐性機構が存在すると考え,物質の輸送などに関連する細胞骨格系の微少管について検討した.その結果,1)各種多剤薬剤耐性細胞ではアクチン,ビメンチンの増加は認められないが,α-,βチュブリン共に蛍光抗体法による発現量,mRNA量は有意に増加しており,2)この増加はMDR1-mRNAの発現増加の見られない細胞においても明らかであった.3)さらにチュブリン発現量の誘導は薬剤の種類によって異なり,アドリアマイシンはMTXなど他の薬剤に比べ誘導作用の強いことが示唆された.4)微少管構築を阻害するコルセミド添加により,MDR発現の有無に係わらず耐性細胞においても細胞内,特に核内の薬剤濃度は上昇し,耐性は解除された.5)これらのことより微少管構築はP糖蛋白とともに薬剤耐性に深く関与しており,薬剤の組み合わせ,量の設定や使用期間に微少管構築を考慮するとともに微少管を標的にした新たな薬剤の開発や使用が耐性克服に必要なことが示唆される.耐性細胞ではチュブリン遺伝子の変異も報告されており,現在この点も検討している.
超伝導関連酸化物における不定比酸素の秩序化および凍結現象と低温相挙動の熱的解明

La_2NiO_<4+δ>およびLa_2CuO_<4+δ>結晶は高温でともにK_2NiF_4構造を持ち、過剰酸素を持つ後者結晶の低温相で超伝導性が見出されている。両結晶は酸素組成に不定比性を示すために、過剰酸素の平均組成、配置、さらに配置変化速度の詳細は低温における各結晶相の構造、性質、また超伝導性に重要な影響を及ぼすものと予想される。特に酸素組成が異なる2相への分離は過剰酸素の長距離的な拡散を伴うために、その過程は低温で次第に緩慢になり、ガラス転移を経て凍結する可能性がある。そこで本研究では、La_2NiO_<4+δ>とLa_2CuO_<4+δ>結晶の相挙動と過剰酸素の配置変化速度を統一的に明らかにすることを目的として、断熱型熱量計を用いた両結晶の熱容量測定を行った。La_2NiO_<4+δ>結晶では、δ=0.00結晶において81Kの構造相転移、335Kの反強磁性相転移を観測した。δ=0.14では292Kに一次の構造相転移、45K付近に他の熱異常を見出した。δ=0.11および0.14においてはガラス転移に特徴的な発熱、続いて吸熱のエンタルピー緩和を観測し、相分離の存在とともに過剰酸素配置の200K付近での凍結過程を明らかにした。La_2CuO_<4+δ>結晶では、相分離領域にあるδ=0.015および0.035において200300Kの温度域で3つの熱容量異常を観測した。δ=0.015で287K、δ=0.035で295Kの異常はイジング系の分子場理論の結果に相似した二次相転移、265Kの異常は無拡散過程として進行するマルテンサイト的な構造相転移であり、δ=0.015における222Kの異常は吸熱効果を伴う一次の相転移である。La_2CuO_<4+δ>結晶では相分離に基づくガラス転移は観測されず、低温で超伝導性を示す結晶相は300K以下で3つの構造相転移を通じて形成されることを明らかにした。酸素組成の異なる二相への分離は従って300K以上で進行し、λ型の熱容量異常として見出されるものと予想される。
医療過誤への刑法上の対応の在り方

医療過誤の処罰とその制限と題する博士論文を出版向け修正しますとともに、次の3点で博士論文の内容を発展させました。(1)日本、ドイツ、アメリカとイギリスの4か国の比較的考察を内容とする博士論文は、日本の法律と判例を基盤にし、日本の医療問題を解決するための研究ですが、その研究結果は、その基盤に違いがある中国にも適用する余地があるか、あればどのように適用するかを検討することが必要となっています。今年度、博士論文には、中国法上の対応の在り方を示すための学説・判例研究という部分を加え、その上、ほかの4か国とあわせて5か国の比較的研究を行いました。(2)医療の領域においては、問題となった治療行為が危険なものであって、そしてその危険が実現されていても、客観的に適切な医療行為と認められる場合もあるが、その場合には、予見可能性が問題となるまでもなく、犯罪は成立しません。つまり、医療上の誤りは当然に違法性に帯びるものではありません。このような医療の特徴性に着目して、医療過誤と自動車運転過失、過失失火などのほかの過失行為の比較的研究を行いました。(3)医療過誤の因果関係判断に関する研究を行い始めました。治療効果が、発症機序、薬剤に対する感受性、人の身体状態等と関連しますので、適切な治療を行っていても相当高い治癒率・救命率が確保できない場合が多いし、医療ミスによる致死の場合において、生命がどの程度まで短縮されたのかが確実に立証できない場合も多いですので、医療過誤の因果関係判断が困難なものです。新しい研究での議論はそれらの問題をめぐりされています。(抄録なし)研究成果:研究の核心的内容として「医療過誤の処罰とその制限」と題する博士論文を完成して、博士学位が授与され特別優秀博士論文賞が決定された。具体的内容:本研究は、医療過誤の処罰範囲を明確にしてその適切な制限を図ることを目指し、日本の判例・学説を、ドイツの判例・学説を、イギリスの判例を、アメリカの判例を、それぞれ紹介・検討し、これらの検討に基づき、日本における医療過誤の処罰のあり方を検討したものである。医療過誤の処罰範囲について、過失理論と刑事政策の両面から、裁判では注意義務の基準たる医療の一般水準が何を意味しているか、どのように判断されるかという問題を、医療の分野にどこまで刑事法が介入すべきであるかという問題をそれぞれ取り上げて、議論を展開して、比較法的研究を行った。研究の意義および重要性:過失理論の問題に関する検討は、専門外の治療、研修医による治療、特別有能者による治療、医療資源の分配によって注意基準が客観的に類型化される程度がどこまで進んでいるかを明らかにした点で、これまでの研究を飛躍的に発展させた。刑事政策の問題をめぐる議論の結論として、ヒューマン・エラーの処罰範囲を制限する条件を提出した。また、医学的判断の誤りに基づく医師の処罰を差し控える根拠を説明した。日本は、英米のように、医療過誤に基づく法人の刑事責任を問う方向へ立法を含め検討を進めることを提案した。外国法の研究は、予定通り順調に進展している。日本法の研究については、平成24年12月、刑事医療過誤判例集で公表された新たな判例は、最近の5年間に医療過誤への法的対応の動向について大きな動きがあったという実態を示したので、その新動向について検討精査する必要が生じた。これまでの研究の中核をなすのは、医療過誤に刑事司法がどこまで立ち入ることが適切であるかという問題である。この問題を解決した後、過失理論の問題として、医療領域の特色を考慮する上で、医療過誤事件の処理と自動車運転致死事件の処理の共通点と相違点をそれぞれ検討する必要がある。

また、刑事政策の問題として、医療過誤への対応手段として、処罰以外、損害賠償責任の追及、医師免許剥奪などの手段も考えられうるが、日本の医療事故に適用され得る規制手段の不完備の現状がよく指摘されており、ここで、ほかの規制手段の完備化は医療過誤の処罰範囲にどの程度で影響を与えるかをさらに検討する価値がある。これからの研究は、上記の2つの問題の解決を目指し、議論を行う。(抄録なし)
ビタミンD関連生理活性化合物の新規実用的合成法の開発に関する研究

本研究は,ビタミンD関連医薬品の開発を念頭に置いて,その構造活性相関の系統的な調査に必要な系統的誘導体の調製に要求される,変幻自在な合成法の確立を目的として行われた。研究開発の主眼は収束的合成を基本として,(1)C,D-環フラグメントの新規不斉合成法の開発,(2)A-環フラグメントの新規不斉合成法の開発,(3)C,D-環フラグメントとA-環フラグメントのカップリングに関する新手法の開発,の三つの観点から検討を行った。その結果,(1)については2-methylcycopentanc-1,3-dioneを出発として,フェニルメチル基をキラル補助基とする分子内不斉Horner-Emmons縮合によってC,D-環コア部分を98.3%deで構築することに成功した。(2)については,天然型リンゴ酸ジエステルを出発として,アリル基の導入とともに1,3-ジオールの構築,引き続く分子内ニトリルオキシド・オレフィン環化付加反応用をいる炭素6員環合成を採用して成功した。(3)については,モデル反応の段階ではあるが,α-シリルアリルアニオンとアルデヒドの縮合・ピーターソンオレフィン化反応によって,C,D-環とA-環のカップリングが可能であることを明らかにした。いずれの方法も大量合成が可能であり,様々な誘導体合成には極めて適した方法であると考えられる。しかし,C,D-環フラグメントの合成法については,合成ステップが多くその点の改善が必要である。現在,(1)に述べた方法の改良ではなくて,全く新しい,著しく短段階な合成設計を考案し実験的検討を行っている。従って,本課題に基づく研究を引き続き推進し,画期的な合成法の確立を目指す。1.C,D-環相当フラグメントの不斉合成法の一つを確立した。2-メチルシクロペンタン-1,3-ジオンの2位にキラルなホスホノエステル基を有するC-環合成等価単位を導入し、分子内Wadsworth-Emmons反応を行ったところ、98%deの高いジアステレオ選択性かつ高収率で望む縮合生成物が得られた。この縮合生成物より、パラジウムを用いたギ酸還元法と隣接ジオール開裂によって17-位(ステロイド位置番号)へアセチル基を導入した。科学研究費研究計画調書の段階ではアセチル基の導入前に、17-位カルボニル基を還元し、水酸基に嵩高い保護基を導入し、その後6員環部のエキソ型二重結合の還元を行う経路を採用していた。しかし、その方法より、17-位へのアセチル基導入後、6員環部のエキソ型二重結合を選択的にトランス還元する経路の方が様々な意味で合理的であることが判明し、目的のC,D-環相当光学活性合成単位の調整に成功した。まだ、改良の余地は残されているものと考えており、引き続き鋭意検討する。2.A-環相当グラグメントの不斉合成法については、科学研究費研究計画調書に示したリンゴ酸を用いる段階的2炭素伸長、分子内Sn2反応に依る6員環合成、の方法を重点的に検討したが、結局2炭素伸長のプロセスに不可避的な問題があることが明らかになり、その解決が短期間には困難であると判断した。そこでこの方法を取り敢えずあきらめ、キラルアセチレンカルボン酸をジエノフィルとする、ジエニルアリルチオエーテルとの不斉ディールス・アルダー反応を機軸とする新しい方法を採用することとし、現在検討中である。付加生成物(3-arylthio-1,4-cyclohexadiene誘導体)はスルホキシドに変換し、エバンス転移によって2-alkoxycarbony1-5-hydroxy-1,3-cyclohexadiene誘導体に導かれるものと考えている。1.A-環相当フラグメントの新しい不斉合成法を開発した。

本課題は前年度不成功に終わっていたので本年度重点的に検討した結果,Lーリンゴ酸由来のethyl 3,4-O-isopropylidenebutanoateを出発物質とし,そのエステル基の還元によるホルミル基への変換,アリル金属化合物の付加反応による増炭と1,3-アンチジオールの構築,末端ヒドロキシル基の酸化とそのニトリルオキシドへの変換の後,分子内[3+2]環化付加反応による基本骨格の構築を行うもので,A-環相当フラグメントの新しい短段階合成経路が確立された。ただし,1,3-アンチジオール部分の構築に関してそのジアステレオ選択性は今後改善すべき課題として残っている。2.Lーリンゴ酸エステルの選択的還元反応に関連した研究として,ベンジリデンアセタールやアセトニドの様なアセタールのC-O結合の還元的開裂反応における新しい反応剤のシステムを開発した。BH_3とBF_3の組み合わせで用いるもので,著しい還元反応速度の促進とアルミニウム反応剤を用いる従来の方法に較べて反応後処理の簡便さが目立った特徴であり有機合成上有用である。本還元法は,アセタール基の近くに水酸基が存在する場合その水酸基で指向した選択的アセタールC-O結合開裂にも応用できる。この手法を用いて異なった保護基を有するグリセルアルデヒドの合成が可能となった。この種の化合物は従来マンニトールから合成されていたが,今回L-酒石酸を出発物質とする合成経路を確立したことにより,両鏡像体の供給が保証された。1.A-環相当フラグメントの不斉合成法の大筋は前年度に確立した。本年度は,細部に渡る検討を行い,C,D-環相当フラグメントと直接カップリングさせるA-環フラグメント,即ち(3S,5R)-3,5-bis(tert-butyldimethylsiloxy)-2-methyl-1-cyclohexenecarbaldehydeの製取に成功し,詳細な合成プロトコールを作成した。本方法では,安価な天然型リンゴ酸を出発物質に用いているため,C(3)-位の絶対構造はS(100%ee)である。しかし,C(5)-位の絶対構造についてはR体とS体を分離しているので,(3S,5R)-体と(3S,5S)-体の2種類のシアステレオマ-を入手している。非天然型構造を有する異性体は構造活性相関を調査する際に必要となる。2.A-環フラグメントとC,D-環フラグメントをカップリングさせる時の基本反応としては,アリルシラン体から調製可能なα-シリルアリルアニオンとアルデヒドのカップリングと,引き続くピーターソンオレフィン化反応を採用する予定である。そのモデル反応を試みたところ,期待した結果が得られた。この結果,上記の(1)の結果及び初年度に開発したC,D-環フラグメント合成法の確立と併せて,本研究で目指していたビタミンD関連化合物の新しい収束型全合成法の大筋が明らかにされたものと考えている。現在,C,D-環フラグメントに関して更に効率的な合成法の検討を開始しており,補助金が支給される研究期間は本年度で終了するが,引き続き研究を継続する予定である。
"超高密度"ポリマーブラシの構造と物性

表面に適当な開始基を化学結合で導入した固体(シリコン基板、シリカ微粒子、金属微粒子など)に原子移動ラジカル重合(ATRP)や可逆的付加・開裂連鎖移動(RAFT)ラジカル重合などのリビングラジカル重合法(LRP)を適用し、固体表面に0.7chams/nm^2にも達する高密度で長さおよび化学構造の制御された各種のモノマーからなるグラフト鎖(ポリマーブラシ)を形成する技術を確立した。これら高密度グラフト膜の特性を膨潤状態および乾燥状態で調べた結果、キャスト法による(通常の)高分子薄膜とは著しく異なる性質を有する新規な分子集合組織であることが判明した。例えば、良溶媒中において高密度グラフト膜中の分子鎖は膜面に垂直な方向に高度に伸張し、伸び切り鎖長の8090%にも達する膜厚を与える。また、膨潤膜の圧縮弾性率はグラフト鎖長とともに増大する非スケーリング性を示す。溶融状態における乾燥膜の圧縮弾性率も等価なキャスト膜に比して約50%高い。また、乾燥膜のガラス転移温度T_gは等価なキャスト膜に比べて、低分子量領域(膜厚で約50nm以下)および高分子量領域で特徴的な差異を示した。特に、実験データは分子量が無限に大きい極限においてもポリメタクリル酸メチル(PMMA)高密度グラフト膜のT_gがバルクPMMAのそれに比して約8K高いことを示しており、表面グラフトという界面効果が膜のバルクな性質に及ぶことが判明した。リビングラジカル重合の一つである原子移動ラジカル重合(ATRP)法によりシリコン基板あるいはシリカ微粒子表面にポリメタクリル酸メチルあるいはポリスチレンをグラフト重合し、表面密度が0.7chains/nm^2にも及ぶ高密度ポリマーブラシを調製することに世界に先駆けて成功した。重合条件を変えることにより、鎖長および鎖長分布の異なるポリマーブラシを調製した。グラフト密度に関しては、表面固定された開始基の光分解あるいは不活性シランカップリング剤との混合吸着により開始剤の表面密度(高感度赤外分光法により定量する)を減少させ、グラフト密度の異なる試料を作成した。得られたグラフト鎖の鎖長および鎖長分布は、グラフト鎖を表面より加水分解処理により切り出した後GPC法により直接定量し、また、グラフト密度は、FT-IR法およびエリプソメトリー法によりグラフト量を定量し、鎖長との比より求めた。その結果、グラフト鎖はフリーポリマーとほぼ同じ分子特性を有し、鎖長および鎖長分布に関しよく制御されていることを明らかにした。原子間力顕微鏡(AFM)(申請備品)を用いて、溶媒(トルエン)中、膨潤ポリマーブラシ層とプローブとしてAFMカンチレバー先端に取り付けたシリカ粒子との間に働く力を表面間距離の関数(フォースカーブ)として測定することにより、ポリマーブラシの平衡膨潤層厚、圧縮弾性率、吸着力等を評価した。その結果、超高密度ブラシは良溶媒中で伸びきり鎖長に比肩しうる膨潤膜厚を与えることや、そのフォースカーブが既存の理論では説明できない特異な挙動を示すことを明らかにした。表面に適当な開始基を化学結合で導入した固体(シリコン基板、シリカ微粒子、金属微粒子など)に原子移動ラジカル重合(ATRP)や可逆的付加・開裂連鎖移動(RAFT)ラジカル重合などのリビングラジカル重合法(LRP)を適用し、固体表面に0.7 chains/nm^2にも達する高密度で長さおよび化学構造の制御された各種のモノマーからなるグラフト鎖(ポリマーブラシ)を形成する技術を確立した。

また、乾燥膜のガラス転移温度T_gは等価なキャスト膜に比べて、低分子量領域(膜厚で約50nm以下)および高分子量領域で特徴的な差異を示した。特に、実験データは分子量が無隈に大きい極限においてもポリメタクリル酸メチル(PMMA)高密度グラフト膜のT_gがバルクPMMAのそれに比して約8K高いことを示しており、表面グラフトという界面効果が膜のバルクな性質に及ぶことが判明した。
酸化ストレス応答による細胞極性の異常を起点とした病態発生の分子機構の解析

本研究では、「PS(フォスファチジルセリン)の過酸化物がaPKCの過剰活性化を引き起こし上皮管腔組織構造の破綻を誘導し炎症性腸疾患(IBD)の発生に至る事を明らかとする」を達成する為、以下の解析を行う。1.IBDモデルマウスの腸組織の形態変化(傷害)が誘導される初期の段階において、aPKCの活性変化およびaPKC-PAR複合体の形成阻害が誘導されているか明らかとする。2.IBDの病態発生の初期過程において酸化ストレスによるフォスファチジルセリン(PS)の過酸化物が産生されているか検討する。また、aPKC活性化作用について検討する。3.IBD患者において過酸化PSおよびaPKC活性変化が生じているか解明する。前年度の解析から、酸化ストレス障害モデルラット(四塩化炭素による肝傷害モデル)において、aPKCの過剰な活性化を認め、aPKC-Par複合体形成が抑制されていた。また、組織中の過酸化脂質量であるDAGの増加を認め、aPKCの活性化に作用するPS(フォスラチジルセリン)の過酸化物の増加が予想された。最終年度においては、PSの過酸化体の精製標品作成に成功した。aPKCに対する作用を検討したところ、過酸化PSを処理した細胞においては、aPKCの活性化に関与するリン酸化が上昇していることがわかった。さらに、培養上皮細胞の極性に対する作用を検討したところ、上皮細胞の接着構造の変化を確認した。今後はIBDモデルマウスの腸管組織および肝傷害モデルマウス肝組織において過酸化PSの上昇が観察されるか質量分析装置を用いて精査する予定である。本研究では、「PSの過酸化物がaPKCの過剰活性化を引き起こし上皮管腔組織構造の破綻を誘導し炎症性腸疾患(IBD)の発生に至る事を明らかとする」を達成する為、以下の解析を行う。以上の解析を通じ炎症性病態の共通分子基盤としてaPKCの関与を解明する。本年度の解析から、IBDモデルマウスの腸上皮細胞ではaPKC、Par-3のタイトジャンクションの局在異常が確認された。また、免疫組織化学的な解析から、aPKCの活性化を示すリン酸化が亢進していた。さらに、培養上皮細胞に酸化ストレスを与えたところin vtroリン酸化実験においてaPKCの活性が亢進していることが分かった。aPKC-Par複合体形成に対する酸化ストレスの作用を検討したところ、酸化ストレスにより、それら複合体の形成が阻害されていた。一方、過酸化されたPSの精製標品を合成・精製することができた。以上の結果から、酸化ストレスによる細胞障害時には、aPKCの異常活性化が誘導され極性異常が生じることが示唆された。今後、この標品を使い消化管上皮細胞に処理し細胞極性に与える作用を検討する。また、酸化ストレス障害モデル組織・細胞中に過酸化PS量の変化について検討を加える予定である。本年度の解析から以下の点が明らかとなった。1IBDモデルマウスの消化管上皮細胞においてaPKCおよびPar-3のタイトジャンクションの局在化が失われた。また、aPKC活性化の指標となるリン酸化が免疫組織化学的手法を用いた解析から明らかとなった。2酸化ストレスを培養上皮細胞に与えたところ細胞極性の異常が誘導されること、また、aPKCの異常活性化が誘導されることが分かった。3フォスファチジルセリン(PS)の過酸化物の精製標品を作成することができた。これらの結果より、酸化ストレスにより肝障害時に観察される細胞極性の異常が他の臓器(細胞)においても惹起されること事が明らかとなった。培養細胞を用いた解析結果ではあるが、極性異常が生じる際にはaPKCの異常活性化が極性変化を誘導する可能性が示唆された。本年度は、酸化ストレス障害モデルラット(四塩化炭素による肝傷害モデル)を作成しaPKCの活性変化およびaPKC-Par複合体形成に対する作用について検討を加えた。その結果、酸化ストレス障害モデルラット肝臓においてaPKCの過剰な活性化を認めた。この時、aPKC-Par複合体形成が抑制されていた。aPKCは、PSにより活性化されるが、肝組織では過酸化脂質を検出しておりグリセロール骨格に不飽和脂肪酸を有するPSの過酸化物によるaPKCの活性化が予想された。

そこで、PSの過酸化体の精製標品を作製に成功した。今後、aPKCに対する作用をin vitroにて検討すると共に、IBDモデルマウスの腸管組織および肝傷害モデルマウス肝組織中に過酸化PSが含まれるか質量分析装置を用いて精査する予定である。これまでの解析から以下の点が明らかとなった。1IBDモデルマウスの消化管上皮細胞においてaPKCおよびPar-3のタイトジャンクションの局在化が失われた。また、aPKC活性化の指標となるリン酸化が免疫組織化学的手法を用いた解析から明らかとなった。2酸化ストレス障害モデルラット(四塩化炭素による肝傷害モデル)を作成しaPKCの活性変化およびaPKC-Par複合体形成に対する作用について検討を加えた。その結果、酸化ストレス障害モデルラット肝臓においてもaPKCの過剰な活性化を認めた。さらに、aPKC-Par複合体の形成が抑制されていた。3酸化ストレスを培養上皮細胞に与えたところ細胞極性の異常が誘導されること、また、aPKCの異常活性化が誘導されることが分かった。この変化は、aPKCの活性阻害剤処理により抑制される傾向が確認された。3フォスファチジルセリン(PS)の過酸化物の精製標品を作成することができた。これらの結果より、酸化ストレスにより肝障害時に観察される細胞極性の異常が他の臓器(細胞)においても惹起されること事が明らかとなった。酸化ストレスによる細胞障害の新たなシグナル伝達経路として「酸化ストレス→aPKCの異常活性化→aPKC-Par複合体の減少→細胞極性の異常→細胞(組織)障害」というシグナル系の存在が示唆された。本研究では、「PS(フォスファチジルセリン)の過酸化物がaPKCの過剰活性化を引き起こし上皮管腔組織構造の破綻を誘導し炎症性腸疾患(IBD)の発生に至る事を明らかとする」を達成する為、以下の解析を行う。1.IBDモデルマウスの腸組織の形態変化(傷害)が誘導される初期の段階において、aPKCの活性変化およびaPKC-PAR複合体の形成阻害が誘導されているか明らかとする。2.IBDの病態発生の初期過程において酸化ストレスによるフォスファチジルセリン(PS)の過酸化物が産生されているか検討する。また、aPKC活性化作用について検討する。3.IBD患者において過酸化PSおよびaPKC活性変化が生じているか解明する。前年度の解析から、酸化ストレス障害モデルラット(四塩化炭素による肝傷害モデル)において、aPKCの過剰な活性化を認め、aPKC-Par複合体形成が抑制されていた。また、組織中の過酸化脂質量であるDAGの増加を認め、aPKCの活性化に作用するPS(フォスラチジルセリン)の過酸化物の増加が予想された。最終年度においては、PSの過酸化体の精製標品作成に成功した。aPKCに対する作用を検討したところ、過酸化PSを処理した細胞においては、aPKCの活性化に関与するリン酸化が上昇していることがわかった。さらに、培養上皮細胞の極性に対する作用を検討したところ、上皮細胞の接着構造の変化を確認した。今後はIBDモデルマウスの腸管組織および肝傷害モデルマウス肝組織において過酸化PSの上昇が観察されるか質量分析装置を用いて精査する予定である。