hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
筋量・骨量減少，平衡機能障害に対する前庭刺激を応用した新たな治療法の開発

過重力負荷による平衡機能障害に対する前庭刺激の効果:過重力環境下でラット,マウスを飼育すると,1 g環境に戻した時に平衡機能障害が起こることが知られている。この平衡機能障害が微弱な電流を用いた前庭電気刺激(GVS: galvanic vestibular stimulation)により予防できるかどうかを検討した。小型埋込型電気刺激装置を用い,10 μA, 1 Hzの刺激を1分間,9分休んでまた1分間を3 g飼育期間中(2週間)繰り返した。3 g負荷前後でロータロッドテストを実施し,ロッド上での滞在時間を測定して平衡機能を評価した。GVSを行わないラットでは,滞在時間が3 g負荷前256 ±19 sから負荷後32 ±13 sへと有意に減少したが,GVSを行ったラットでは,268 ±12 sから213 ±28 sと有意な減少は見られなかった。この結果は,平衡機能障害対策としての微小電流GVSの有効性を示唆する。宇宙から帰還後の平衡機能障害に対する前庭刺激の効果:68か月の国際宇宙ステーション滞在前後で,球形嚢(cVEMP, cervical vestibular evoked potential)と卵形嚢(oVEMP, ocular vestibular evoked potential)の機能および平衡機能障害の指標としての重心動揺を調べた。帰還直後には球形嚢機能は低下したが,卵形嚢機能は比較的保たれていた。また,帰還直後にみられた重心動揺の増加が,感知閾値以下の微弱なノイズ波形を用いたnoisy-GVSにより抑制された。これらの結果は,微小重力により球形嚢と卵形嚢は異なった影響を受け,そのoutcomeとしての平衡機能障害は,noisy-GVSにより改善される可能性を示唆する。本研究では,「前庭刺激により筋・骨,平衡機能への運動効果が増強されるか?」という課題に取り組んでいる。そのうち,本年度の研究により微弱電流によるGVSあるいはnoisy-GVSを用いることにより,過重力および微小重力により引き起こされた平衡機能障害が改善されることを示唆する実験結果を得ることができた。この結果はGVSの臨床応用をサポートするものであり,今後の研究に繋がることが期待される。2019年度以降は,宇宙飛行士実験の症例数を増やすことと,GVSの筋・骨に対する影響および重力酔いに対する影響を調べる。ラット,マウスの重力酔いの指標として深部体温低下を用いることができることを確かめており,GVSにより過重力負荷時の深部体温低下が抑制できるかどうかを調べる。筋・骨への影響を調べる実験は,卵巣摘出マウス,ラットを用いて行う。前庭刺激と48週間のトレッドミル運動トレーニングを組み合わせた後,筋量,骨量,平衡機能の評価を行う。
都市大気中の光化学生成物であるアルデヒド、カルボン酸のモニタリング装置の開発

大気汚染物質の規制及び監視により、近年、大気汚染の問題は数十年前の時代と比較して格段に改善されてきている。しかしながら、大都市においては自動車の排気ガスにより大気中のNOx濃度は依然として改善されておらずむしろ増加傾向にある。NO_x、SO_2等の主要な大気汚染物質の測定については、早くから研究が進み、モニタリングを行う上で十分な自動連続測定装置が開発され使用されてきたが、発癌性の物質として知られているホルムアルデヒド等のアルデヒドの測定技術は、アルデヒドの環境基準の規制が検討されているにもかかわらず、ここ20年来余り進歩しているとは言えない。そこで、本研究では、多孔質テフロン(PPTFE)チューブを利用した拡散スクラバーによるアルデヒド、カルボン酸の選択的補集について検討を行い、更に、分析装置とを組合せ、従来法では困難であったアルデヒド、カルボン酸の自動連続測定測定装置を実用化し、都市大気中のアルデヒド、カルボン酸濃度をモニタリングする装置の開発を検討した。本装置は多孔質テフロン(PPTFE)チューブを用いた拡散スクラバーによる補集装置、大気を吸引するエアポンプと流量計等の大気サンプリング装置、拡散スクラバー内の吸収液を分析装置に注入させるペリスタリックポンプと自動バルブ、液体クロマトグラフ等の分析装置を組み合わせた構成となる。そして、モニタリング装置としてのシステム化を図る為に、これらの装置の一連の操作をノートパソコンにより制御することで本システムによる自動連続測定装置の実用化した。本装置のアルデヒド、カルボン酸の検出限界濃度は0.1ppbvと非常に低く、本装置の実用化により、都市大気ばかりではなくサブppbvレベルの大気中のアルデヒド、カルボン酸濃度の一時間毎の自動連続測定が可能となった。しかしながら、大都市においては自動車の排気ガスにより大気中のNO_X濃度は依然として改善されておらずむしろ増加傾向にある。NO_X、SO_2等の主要な大気汚染物質の測定については、早くから研究が進み、モニタリングを行う上で十分な自動連続測定装置が開発され使用されてきたが、発癌性の物質として知られているホルムアルデヒド等のアルデヒドの測定技術は、アルデヒドの環境基準の規制が検討されているにもかかわらず、ここ20年来余り進歩しているとは言えない。そこで、本研究では、多孔質テフロン(PPTFE)チューブを利用した拡散スクラバーによるアルデヒド、カルボン酸の選択的捕集について検討を行い、更に、分析装置とを組合せ、従来法では困難であったアルデヒド、カルボン酸の自動連続測定装置を実用化し、都市大気中のアルデヒド、カルボン酸濃度をモニタリングする装置の開発を検討した。本装置は多孔質テフロン(PPTFF)チューブを用いた拡散スクラバーによる捕集装置、大気を吸引するエアポンプと流量計等の大気サンプリング装置、拡散スクラバー内の吸収液を分析装置に注入させるペリスタリックポンプと自動バルブ、液体クロマトグラフ等の分析装置を組み合わせた構成となる。本装置のアルデヒド、カルボン酸の検出限界濃度は0.1ppbvと非常に低く、本装置の実用化により都市大気ばかりではなサブppbvレベルの大気中のアルデヒド、カルボン酸濃度の一時間毎の自動連続測定が可能となった。

NOx、SO_2等の主要な大気汚染物質の測定については、早くから研究が進み、モニタリングを行う上で十分な自動連続測定装置が開発され使用されてきたが、発癌性の物質として知られているホルムアルデヒド等のアルデヒドの測定技術は、アルデヒドの環境基準の規制が検討されているにもかかわらず、ここ20年来余り進歩しているとは言えない。そこで、本研究では、多孔質テフロン(PPTFE)チューブを利用した拡散スクラバーによるアルデヒド、カルボン酸の選択的捕集について検討を行い、更に、分析装置とを組合せ、従来法では困難であったアルデヒド、カルボン酸の自動連続測定装置を実用化し、都市大気中のアルデヒド、カルボン酸濃度をモニタリングする装置の開発を検討した。本研究は多孔質テフロン(PPTFE)チューブを用いた拡散スクラバーによる捕集装置、大気を吸引するエアポンプと流量計等の大気サンプリング装置、拡散スクラバー内の吸収液を分析装置に注入させるペリスタリックポンプと自動バルブ、液体クロマトグラフ等の分析装置を組み合わせた構成となる。そして、モニタリング装置としてのシステム化を図る為に、これらの装置の一連の操作をノートパソコンにより制御することで本システムによる自動連続測定装置の実用化した。本装置のアルデヒド、カルボン酸の検出限界濃度は0.1ppbvと非常に低く、本装置の実用化により、都市大気ばかりではなくサブppbvレベルの大気中のアルデヒド、カルボン酸濃度の一時間毎の自動連続測定が可能となった。
肺移植術後の気道過敏性亢進に関与する非翻訳RNAとその標的分子種の同定

本研究計画では令和2年度までに、肺虚血再潅流傷害モデルラットに認められる気管支平滑筋過敏性発現におけるRhoA-ROCK系の関与を証明するとともに、その発現制御についてmicroRNAあるいはlong non-coding RNA (lncRNA)レベルまで検討を行い、RhoA-ROCK系が亢進するメカニズムを明らかにすること、さらに気管支平滑筋過敏性発現に対するROCK阻害薬前処置の効果について検討を行い、肺移植術後の呼吸管理におけるROCK阻害薬の有用性について予測することを目標としている。初年度である平成30年度はラット肺虚血再潅流モデルの作成および各種サンプルの調製を行った。代表者・花崎がこれまで川崎医大で行っていたものと同じ研究環境、プロトコルのもと遂行し、再現性を確認することを目的とした。まずは手技確認のための実験を行い、その後に実際のプロトコル作成に移行した。Wistar雄性ラットをペントバルビタールで麻酔、気管切開、人工呼吸のもと開胸し左肺門部をクランプして30分間の虚血(I)状態とし、後にクランプ開放により再潅流(R)とした。再潅流時間は30分から3時間まで、条件を変化させながら肺および他臓器の状態をチェックした。採取した左肺よりタンパク質サンプルあるいはtotal RNAサンプル調製用として、最適条件にて保存した。順調だが、下記に述べる通り、若干の遅れを生じている。研究代表者である花崎が国際医療福祉大学に転出したため、研究の拠点も川崎医科大学から国際医療福祉大学に移し、新たな研究環境の構築を行いながらの研究開始となった。Wistarラットを全身麻酔、気管切開、人工呼吸下に開胸し、左肺門部をクランプおよび開放することによって肺虚血再潅流モデルを作製するが、新たな研究環境において川崎医科大学当時と同条件で行えるか、各種セッティングの調整に多少の時間を要した。なお肺虚血再潅流モデル作製の技術そのものは確立されているため、研究環境構築した後はスムーズに行われている。引き続き肺虚血再潅流モデルラットから肺のサンプルを採取し、凍結保存またはRNA later中で保存する。一定数のサンプルを確保した後にWestern blot法、リアルタイムPCR法などを行う。同時に再潅流時間を30分3時間と変化させていく中で、もっともサンプルの状態がよく、かつラットの全身状態(とくに循環動態、酸素化能)が保たれる時間を決定する。その後マイクロアレイ解析などにより肺虚血再潅流傷害による気道過敏性亢進に関与する遺伝子を同定する。さらに、より詳細なメカニズム解明を目的に、培養細胞を用いたin vitroモデルの構築についても順次進めていく予定である。概ね順調に進んだが、研究代表者である花崎が川崎医科大学より国際医療福祉大学に転出し、研究の拠点を移すこととなった。これに伴い、川崎医科大学でおこなっていた研究と同じ環境を得るための各種調整および実験手技の確認作業を優先した。

このため本年度に予定していた実験に必要な経費の使用開始時期が少し遅くなり、次年度使用額が生じた。(使用計画)肺虚血再潅流傷害モデルから得られた標本を用い、ウェスタンブロットやリアルタイムPCRなど生化学的解析を続けるため消耗品(試薬、抗体)に用いる。
麻薬性鎮痛薬の副作用回避を目指した血液脳関門の中枢作用制御機構の解明

複数の麻薬性鎮痛薬の脳移行性の同時解析するため、ラット脳微小透析法とカクテル投与法を組み合わせた新規解析法を確立した。オキシコドンが血液に比べ脳で高い濃度勾配を形成することが確認され、血液脳関門におけるオキシコドントランスポーターが脳移行を制御することにより中枢作用規定因子となることが示唆された。さらにこのオキシコドントランスポーターがメマンチンなどの中枢作用型カチオン性薬物の脳移行を担うことが示された。麻薬性鎮痛薬の脳各部位における作用の指標としてオピオイド受容体占有率を測定するために、蛍光顕微鏡および質量分析計を用いた新規測定系確立のための基礎的知見を得た。すなわち、オキシコドンを始めとするオキシコドントランスポーターの基質となる5薬物を同時投与し、脳微小透析法により脳/血液遊離型濃度比(Kpuu値)を一斉測定した。Kpuu値は血液脳関門を介した脳取り込みクリアランス(CLin)と脳からの排出クリアランス(CLout)の比(CLin/CLout)と等しく、脳移行性を示す優れた指標である。実験条件を適切化することにより、カクテル投与においても単剤投与と一致するKpuu値が得られた。オキシコドンのKpuu値は1を超え、CLin >CLoutであることが確認され、血液脳関門のオキシコドントランスポーターが血液に比べ脳で高い濃度勾配形成に重要な役割を担っていると考えられた。このオキシコドントランスポーターの分子同定に関して、ヒト血液脳関門モデル細胞を用いたゲノムワイドマイクロアレイ解析により、複数の候補分子を抽出することに成功した。複数の麻薬性鎮痛薬の脳移行性の同時解析法するための、ラット脳微小透析法とカクテル投与法を組み合わせた新規解析法を確立し、オキシコドントランスポーターの候補分子をゲノムワイドマイクロアレイ解析により抽出できたことから、本研究はおおむね順調に進展していると考えている。麻薬性鎮痛薬の脳内μオピオイド受容体占有率を測定法の開発のための基礎的検討を行った。まず免疫染色法により標的となるμオピオイド受容体の脳内発現分布を明らかにした。次に蛍光標識ナルトレキソンを用いて脳内μオピオイド受容体の蛍光イメージングを試みたが、市販のμオピオイド受容体の蛍光標識プローブを用いた場合、検出可能な投与量では、μオピオイド受容体に対する十分な特異性が得られなかった。すなわち入手可能な蛍光標識プローブを用いた蛍光顕微鏡観察では、蛍光標識プローブの特異性と現状の蛍光顕微鏡測定感度の問題から、μオピオイド受容体のインビボ蛍光イメージングは困難であることが分かった。そこで質量分析計を用いた高感度分析法によりオピオイド受容体測定を試みることとした。ナルトレキソンをμオピオイド受容体プローブとして用い、ナルトレキソンのLC-MS/MS法による高感度分析計を確立した。この測定系は、マウスにトレーサー量のナルトレキソン投与による脳内ナルトレキソン濃度を測定するのに十分な測定感度を持つことが示された。すなわち、ナルトレキソンをμオピオイド受容体プローブとして用いることで、質量分析計を用いた脳内オピオイド受容体占有率測定が可能となったと考えている。またオキシコドンを脳内に効率的に輸送するプロトン交換輸送系がオキシコドンに加えてバレニクリンの輸送にもかかわることが示され、その薬効発現に重要な役割を果たすことが分かった。麻薬性鎮痛薬の脳内オピオイド受容体占有を測定法として、当初計画した蛍光イメージング法による測定法開発が困難であったため、受容体占有率の麻薬性鎮痛薬間での比較までは至らなかった。本研究はやや遅れていると判断した。しかし、質量分析法を用いた脳内オピオイド受容体占有測定の基礎的検討ができたため、残りの研究機関で十分に遅れを取り戻せると考えている。オピオイド鎮痛薬の抗コリン性副作用回避を目的としてムスカリン受容体占有率測定系の確立を非標識リガンドによる質量分析と放射標識リガンドを用いて試みた。ムスカリン受容体の放射性標識リガンドである3H-quinuclidinylbenzilate(3H-QNB)を用いて小脳部位における結合を非特異的結合として見積もることにより、脳各部位におけるムスカリン受容体占有率の測定が可能であることが示唆された。次にこれまでに得られたラット血液脳関門におけるオピオイド鎮痛薬の脳移行性の指標を用いてモルヒネおよびオキシコドン製剤服用後の脳内受容体占有率の予測を試みた。ヒト血漿中遊離型薬物濃度とμオピオイド受容体親和性を用いた予測結果比べ、モルヒネとオキシコドンの脳移行性を組み込んで予測することで、両薬物の脳内受容体占有率の予測の妥当性が向上することが示された。このことはヒト血液脳関門においてもオキシコドントランスポーターが機能する可能性を示唆するとともに、ヒト脳内オピオイド受容体占有率予測に基づいた至適投与設計法の確立が可能であることを示唆する。本研究成果はオピオイド受容体だけでなく、副作用と関連するムスカリン受容体など複数の受容体を含めて解析可能である。さらに本研究により得られた手法が、オピオイド鎮痛薬に限らず受容体作用薬全般に適応可能であることから、多剤併用による有害事象回避など医療薬学における問題解決に向けて大いに役立つと考えられる。

オキシコドンが血液に比べ脳で高い濃度勾配を形成することが確認され、血液脳関門におけるオキシコドントランスポーターが脳移行を制御することにより中枢作用規定因子となることが示唆された。さらにこのオキシコドントランスポーターがメマンチンなどの中枢作用型カチオン性薬物の脳移行を担うことが示された。麻薬性鎮痛薬の脳各部位における作用の指標としてオピオイド受容体占有率を測定するために、蛍光顕微鏡および質量分析計を用いた新規測定系確立のための基礎的知見を得た。新たに開発したカクテル投与と脳微小透析法を組み合わせた脳移行性の一斉評価法により、麻薬性鎮痛薬の脳移行性を比較する。さらにオピオイド受容体占有率を測定する。その実測が困難な場合には、脳微小透析法によって測定する脳細胞間液中濃度を用いてオピオイド受容体占有率を算出する。オキシコドントランスポーターの分子同定に関して、siRNA法と強制発現実験系を用いてさらに検討を進める。哺乳類細胞における内在性オキシコドントランスポーターにより解析が困難な場合、アフリカツメガエル卵母細胞を用いて検討する。質量分析計を用いた脳内オピオイド受容体占有の測定により、麻薬性鎮痛薬であるオキシコドン、モルヒネ、フェンタニルの受容体占有率を脳部位ごとに測定し、薬物間で比較する。これら3つの麻薬性鎮痛薬がそれぞれ特徴的な脳移行特性を持つことを我々は示しており、脳移行性と受容体占有率の関連を検討する。薬物動態学、薬力学平成27年度購入予定であった消耗品費が当初予定よりも低予算で済んだため、次年度使用額が生じた。平成28年度購入予定であった消耗品費が当初予定よりも低予算で済んだため、次年度使用額が発生した。次年度使用額(796,452円)については消耗品費として使用する予定。次年度使用額(1,780,455円)については消耗品費として使用する予定。
電場を用いた液晶のビンガム特性の制御によるマイクロ機能性構造の創製とその流体応用

条件により固体的な性質を発現するスメクティック液晶を用いて,電場印加方法を制御することにより,その固体的特性の強さを変化させて,流動性の低いところだけを残してマイクロ構造を創製する手法を検討した.特に,その流動させて構造を残す手法を確立するのに必要な変形発生時の過渡流動におけるスメクティック液晶の流動性の変化を検討し,流動発生後は電場タイプではなく,電場の有無が流動性に影響を与えることを明らかにした.条件により固体的な性質を発現するスメクティック液晶を用いて,電場印加方法を制御することにより,その固体的特性の強さを変化させて,流動性の低いところだけを残してマイクロ構造を創製する手法を検討した.特に,その流動させて構造を残す手法を確立するのに必要な変形発生時の過渡流動におけるスメクティック液晶の流動性の変化を検討し,流動発生後は電場タイプではなく,電場の有無が流動性に影響を与えることを明らかにした.本研究では,温度制御と微細パターン電極による電場制御により,スメクティック液晶を場所により異なる状態変化を発生させ,液晶の部分的な固相化によるマイクロ構造を形成する.そして,その構造を利用して,液晶自身の流ればかりでなく,気体の流動制御を行うシステムを試作し,その有効性を明らかにする事を目的としている.具体的には,液相状態の液晶に局所的な電場を印加し,直流電場の影響部だけ,構造化させる.電場の影響が生じず,降伏値をほとんど持たない層を重力などで応力をかけて取り除き,残った部分だけを固相化して構造を形成する.本年度は,固相化部の構造とその強度などを明らかにし,形成,形状変更が可逆的に可能なマイクロ構造の試作を行った.まず,温度による基本的な構造強度の変化を確認するために,レオメータで,その降伏特性を検討した.その結果,スメクティック相が現れる温度範囲の中心近傍の温度では,安定した構造が形成され,その降伏値も安定する事がわかった.しかし,温度を下げて固相に近づけると降伏値は大きくばらつき,その構造も不均一性が生じていることが考えられた.また,平行平板による2次元流路での降伏特性も調べたが,こちらは温度低下により大きな降伏値を生じるようになり,レオメータのクエット的流れ場とは異なることが分かった.これは,流路入口近傍でのスメクティック相の成長によると考えられ,温度条件が本研究で扱う現象には大きく影響することがわかった.また,パターン電極を用い,電場印加と重力による脆弱部の除去による構造化を試み,50ミクロン幅のパターン電極でその電極に沿った構造が形成されることを,変位計を用いて測定,確認した.これにより,マイクロ構造形成が可能であることが証明された.現在,より精度良く構造形成するための条件を検討している。本研究では,温度制御と微細パターン電極による電場制御により,スメクティック液晶を場所により異なる状態変化を発生させ,液晶の部分的な固相化によるマイクロ構造を形成することを目的とした.本年度は櫛歯状電極を用い,一部に交流電場を,一部に直流電場を印加して,構造の異なる液晶相を発現させ,重力または遠心力により,降伏現象をほとんど呈さない交流印加部を流し,直流印加部の構造のみを残す実験を行った.その結果では,流れやすさの違いが現れる場合と現れない場合など再現性が十分でない結果が得られた.この原因を解明にするために,直流および交流のそれぞれの電場下で形成される構造を偏光顕微鏡下で,形成過程を含めて検討を加えた.まず,交流電場下では静的に構造が形成され,安定したスメクティック相が発現していることが確認された.一方,直流電場下ではネマティック相の状態で電気対流が発生しており,その状態で温度が降下するため,層構造を有するスメクティック相は発現せず,言わばネマティック相に近い状態で,グリース状に硬化していることが明らかになった.すなわち,当初の目的のためには,直流印加部で対流などによりスメクティック相と異なる構造を形成できる微細な電場印加方法を検討する必要があることが分かった.また,直流電場下で形成された層構造を有しない構造は弾性的な特性を有し,微小ひずみの範囲内では応力を除荷した場合に一部ひずみ回復が生じることも明らかになった.現在,このような構造を効果的に発現させるために,急冷による構造形成の可能性などについても,検討を続けている.冷却時の構造形成を十分に制御できるようになれば,当初の目的も達せられると考えられる.
保育絵本をめぐる社会関係の史的分析―1950年代～1960年代を中心に

本研究は、第二次世界大戦後、保育絵本がその普及過程においてどのように意味づけられ、活用されたのかを明らかにするものである。保育絵本は、幼稚園や保育所へ直販されることが多かったがゆえに、つくり手や売り手、保育者、母親などの多様な期待や思惑をうつし出し、またそれらを伝達する役目を担いながら、出版社から保育現場へ、そして家庭へと受容された。本研究では、こうした様々な立場の大人たちが保育絵本やその主たるよみ手である子どもにどのような眼差しを注ぎ、また保育絵本をめぐっていかなる相関関係を築いたのかを探る。このことにより、絵本が保育や教育の場で今日ほどに重要視されるようになる歴史的経緯を詳らかにする。
ショウジョウバエのヒストン遺伝子における協調進化のメカニズムの解明

さまざまなショウジョウバエ種のヒストン遺伝子に起こっている進化的変化を調べ、協調進化に働いている要因とその役割を明らかにし、メカニズムを解明するのがこの研究の目的であった。キイロショウジョウバエの近縁種のうち未解析であった6種(D.teissieri, D.sechellia, D.mauritiana, D.yakuba, D.orena, D.erecta)および少し離れている5種(D.americana, D.lutescens, D.pseudoobscura, D.takahashii, D.immigrans)について複製依存型ヒストン遺伝子繰り返しユニット領域のDNA塩基配列を決定し、数種については繰り返しユニットコピー間の遺伝的違いも推定した。遺伝子ユニットの種内異質性の程度は1%以下であり、最も近縁な種間におけるそれよりかなり少なく、H3遺伝子領域でみられた協調進化がヒストン遺伝子繰り返しユニット全体でも起こっていることが明らかとなった。コード領域、5'領域、3'領域、スペーサー領域における塩基の組成を種間で比較したところ、突然変異の効果がより大きいと考えられる3'領域や遺伝子間スペーサー領域では種間に大きな差はみられないのに対して、4つのヒストン遺伝子の3番目のコドンの塩基組成は種間に違いがみられ、以前に解析を行ったH3遺伝子とすべて同じ傾向を示していた。種間にみられる塩基組成の違いは突然変異のパターンが変化したためではなく、自然選択が大きな役割をしていると考えられる。GC含量が高いコドン3番目の塩基組成にはAとTに対する負の自然選択が強く働いていることが考えられ、この自然選択の効率は集団の大きさに依存し、過去にその影響を大きく受けた種とあまり受けなかった種があり、この差が現在観察される塩基組成の種間の差になっていることが示唆された。このタイプの自然選択が協調進化の一部を説明できることがわかった。全体のどのくらいの割合を説明できるかについては今後の研究がまだ必要である。この科学研究費の交付期間内に、ショウジョウバエの複製依存型ヒストン遺伝子クラスター領域のゲノム進化のメカニズム、特に協調進化のメカニズムをDNAレベルで明らかにするのがこの研究の目的である。今年度におこなった研究から次のような成果が得られた。キイロショウジョウバエの近縁8種(D.melanogaster, D.teissieri, D.sechellia, D.mauritiana, D.simulans, D.yakuba, D.orena, D.erecta)で未解析であった6種から複製依存型ヒストン遺伝子繰り返しユニット(各約5kb、ただしH3遺伝子領域はすでに解析済み)をPCR法で増幅し、クローニングを行った。全領域のDNA塩基配列を決定し、8種の全データを完成させた。DNA塩基配列を種間および同じ種内のファミリーメンバー間で比較し、種間での分岐度、ファミリーメンバー間の異質性、塩基の組成等を遺伝子の領域ごとに分けて調べた。ヒストン遺伝子繰り返しユニットの異質性の程度はD.yakubaで0.6%、D.sechelliaで0.7%であった。これはD.melanogasterで観察された量とほぼ同じ値であった。また、最も近縁な種間における分岐度は種内のファミリーメンバー間の異質性よりかなり大きく、このことはH3遺伝子領域でみられた協調進化がヒストン遺伝子繰り返しユニット全体でも起こっていることを示している。GC含量については、近縁種間の比較では、各遺伝子領域でも、遺伝子の3番目のコドンにおいてもほとんど差はみられなかった。

そのため突然変異やゲノム全体に共通に働いている進化的要因の効果を詳しく調べることができなかったが、次年度以降にGC含量の異なる遠縁の種について解析を進める計画で協調進化に果たしているこれらの役割を明らかにすることができ、協調進化のメカニズムをDNAレベルで解明することができると思われる。この科学研究費の交付期間内に、ショウジョウバエの複製依存型ヒストン遺伝子クラスター領域のゲノム進化のメカニズム、特に協調進化のメカニズムをDNAレベルで明らかにするのがこの研究の目的である。キイロショウジョウバエと遠く離れたショウジョウバエ種の中にはゲノムの塩基組成がかなり異なる種がみられ、これらの種からの遺伝子を解析することで塩基組成やコドン使用の進化に働いている要因について重要な情報が得られると考えられる。そこで今年度はD.americanaのヒストン遺伝子繰り返しユニット領域を解析し、次のような成果が得られた。D.americanaから複製依存型ヒストン遺伝子繰り返しユニットをPCR法で増幅し、クローニングして、全領域のDNA塩基配列を決定した。これらのクローンの解析により、D.americanaには繰り返しユニット内のヒストン遺伝子の構成が通常タイプのものと異なるタイプ(5つのヒストン遺伝子が単位ではなく4つのヒストン遺伝子が単位になっているもの)の両方が存在することが明らかになった。ヒストン遺伝子の構成が通常と異なる繰り返しユニットは通常タイプと較べて協調進化ではなく独立な進化をしていることもわかった。D.americanaのヒストン遺伝子のコドン3番目のGC含量はH3遺伝子と同様に他種と較べて低くなっていることがわかり、H3遺伝子でみられたGC含量の傾向は繰り返しユニット全体に当てはまることがわかった。D.americanaとD.melanogasterでは遺伝子の塩基組成がかなり異なるが、突然変異の効果が大きいと考えられる3領域や遺伝子間スペーサー領域の塩基組成を較べてみてもあまり差がみられず、種間の違いは突然変異のパターンが変化したためではないと考えられる。特に自然選択の役割が大きいと考えられる。次年度以降もGC含量の異なる遠縁の他種についてさらに解析を進める計画で、ヒストン遺伝子繰り返しユニット領域の協調進化のメカニズムをDNAレベルで解明することができると思われる。ショウジョウバエの複製依存型ヒストン遺伝子に起こっている進化的変化を調べ、協調進化に働いている要因とその役割を明らかにし、DNAレベルでの適応進化のメカニズムを解明することを目的としている。平成17年度の計画は、キイロショウジョウバエと進化的に離れた関係にあるショウジョウバエ種のヒストン遺伝子繰り返しユニット領域をさらに多くの種から解析してみることであった。D.americanaにおいてヒストン遺伝子の構成が異なる繰り返しユニットが存在することを論文に発表できた(Nagoda et al.2005)。D.lutescens, D.pseudoobscura, D.takahashiiからも繰り返しユニットをクローニングし、全領域のDNA塩基配列を決定した。
脳動脈瘤に対する局所的遺伝子治療法の開発-実験的検討-

脳動脈瘤の遺伝子治療という観点からウサギ脳動脈瘤発生モデルを用い、脳動脈瘤作製処置後6ヶ月後に脳動脈瘤の発生を確認できた動物に関し種々遺伝子の導入を行い動脈瘤の縮小化が得られるかを検討することが目的である.3ヶ月後の変化としては,mRNAレベルはBasic fibroblast growthfactor, plateletderived groth-factorともに有意な発現が見られ,免疫染色法による蛋白質レベルの検討でも両蛋白の血管壁における染色性の増強が主に中膜外層外膜に観察された.内膜内膜下には染色性は認められなかった.この時点での脳動脈瘤のサイズは対照群に比し,治療群では径として75%への縮小がみられ,かつ脳動脈瘤の壁が160%への増大が観察された.従って,これらの遺伝子の導入は脳動脈瘤の治療に応用出来る可能性があると考えられた.脳動脈瘤の遺伝子治療という観点から最終的にはウサギ脳動脈瘤発生モデルを用い、脳動脈瘤作製処置後6ヶ月後に脳動脈瘤の発生を確認できた動物に関し種々遺伝子の導入を行い動脈瘤の縮小化が得られるかを検討することが目的である.しかし,6ヶ月後の変化としては,mRNAレベルに関しては両遺伝子ともに導入による発現の増大はみられるものの有意なものではなかった.また,免疫染色法による蛋白質レベルの検討でも両因子の染色性は淡く遺伝子導入効率の低下していることが示唆された.この知見をもとに脳動脈瘤作製後遺伝子の導入を行い,主に3ヶ月後を指標に,動脈瘤の縮小化が得られるかを検討していく予定である.脳動脈瘤の遺伝子治療という観点から最終的にはウサギ脳動脈瘤発生モデルを用い、脳動脈瘤作製処置後6ヶ月後に脳動脈瘤の発生を確認できた動物に関し種々遺伝子の導入を行い動脈瘤の縮小化が得られるかを検討することが目的である.3ヶ月後の変化としては,mRNAレベルはBasic fibroblast growthfactor, plateletderived growthfactorともに有意な発現が見られ,免疫染色法による蛋白質レベルの検討でも両蛋白の血管壁における染色性の増強が主に中膜外層外膜に観察された.内膜内膜下には染色性は認められなかった.しかし,6ヶ月後の変化としては,mRNAレベルに関しては両遺伝子ともに導入による発現の増大はみられるものの有意なものではなかった.また,免疫染色法による蛋白質レベルの検討でも両因子の染色性は淡く遺伝子導入効率の低下していることが示唆された.この知見をもとに脳動脈瘤作製後遺伝子の導入を行い,主に3ヶ月後を指標に,動脈瘤の縮小化が得られるかを検討していく予定である.脳動脈瘤の遺伝子治療という観点からウサギ脳動脈瘤発生モデルを用い、脳動脈瘤作製処置後6ヶ月後に脳動脈瘤の発生を確認できた動物に関し種々遺伝子の導入を行い動脈瘤の縮小化が得られるかを検討することが目的である.3ヶ月後の変化としては,mRNAレベルはBasic fibroblast growthfactor, plateletderived groth-factorともに有意な発現が見られ,免疫染色法による蛋白質レベルの検討でも両蛋白の血管壁における染色性の増強が主に中膜外層外膜に観察された.内膜内膜下には染色性は認められなかった.この時点での脳動脈瘤のサイズは対照群に比し,治療群では径として75%への縮小がみられ,かつ脳動脈瘤の壁が160%への増大が観察された.従って,これらの遺伝子の導入は脳動脈瘤の治療に応用出来る可能性があると考えられた.
固有ジョセフソン接合を用いたテラヘルツ波発振素子の大規模アレーの開発

本研究の目的は、銅酸化物高温超伝導体に内在する固有ジョセフソン接合を用いたテラヘルツ波発振素子の出力特性を、アレー化により改善することである。当該年度では、前年度、実施に遅れが生じていた「放射指向性測定系の構築」の継続および当該年度の計画通り「単素子の特性評価」、「多素子アレーの設計と試作」を進めた。放射指向性測定系の構築・・・前年度の検討結果を基に、当初計画の発振素子固定・検出器回転から発振素子回転・検出器固定へ、回転機構を変更して測定系を構築した。とりわけ発振素子回転用に新たに導入した2つの極低温用自動ステージにより2軸回転を実現する機構を組み上げ、それぞれの最小ステップ角度を100分の1度以下にできるシステムを実現した。また、温度変動に影響を受けにくい室温ボロメータ材料(チタンがドープされた酸化バナジウム薄膜)を作製し、検出器に利用できる見通しが得られた。単素子の特性評価・・・垂直指向性を有する121キャビティモードによるテラヘルツ波発振を観測するために、アンダードープのビスマス系銅酸化物超伝導体を用いて発振素子を試作した。測定した放射電力のバイアス電圧依存性から121モード発振に有効な広いバイアスマージンを同素子が有することを確認した。多素子アレーの設計と試作・・・前年度に引き続き数値シミュレーションにより同素子のアレーの放射特性を調べた。本研究で着目している121モード発振では、アレー化による放射電力の増加や放射パターンの先鋭化に対するアレー間隔の影響が、他のモードに比べて非常に小さいことが確認された。そのため121モード発振を利用すると素子アレーの設計に自由度があることが分かった。研究実績の概要に挙げた「放射指向性測定系の構築」が漸く完了したものの、以前、製作した発振素子から観測されていた121モード発振が、本研究で年度当初に試作した素子から発生しないことが判明した。その原因として、発振素子材料の銅酸化物超伝導体のキャリアドープ量が過剰であったために、バイアス領域が減少し、121モードを励振できる電圧まで素子をバイアスできなかったことが挙げられる。現在、ドープ量が過剰でないアンダードープ試料を用いて発振特性の改善を行っている。以上の原因解明と特性改善に時間を要したため、素子アレーの試作にも遅れが生じている。まずは、これまで計画していた単素子における発振モードと放射パターンの関係を、本研究で構築した放射指向性測定系による実験を通して明らかにし、これまでの理論から得られた予想結果と比較検討する。次に25素子の小規模のアレーを構成し、その放射電力と放射指向性を評価する。その際、本研究のこれまでのシミュレーションから得られた、121モード発振ではアレー間隔が放射特性に与える影響が小さいことについて、アレー間隔を変化させた素子アレーの特性評価により検証する。小規模アレーの結果を基に、アレーの大規模化を行い、1 mW以上の出力を得ることを目指す。本研究は、銅酸化物高温超伝導体に内在する固有ジョセフソン接合を用いたテラヘルツ波発振素子のアレー化による出力特性の改善を目的として、mWオーダーの最高発振出力と高い垂直指向性を有する発振素子アレーの開発を目指している。当該年度では「放射指向性測定系の構築」と「多素子アレーの理論的検討」を進めた。放射指向性測定系の構築・・・本研究の提案当初、放射指向性測定系の回転機構として被測定発振素子を固定し、その周囲の半球面上に配置された非冷却型検出素子を回転させる機構を考えていた。その後、微弱な信号まで検出できるように高感度な冷却型検出素子に変更する必要性を考慮し、回転機構の変更を検討した。その結果、検出素子を固定し、中心に置かれた発振素子を2軸回転したほうが、冷凍機チャンバーの限られた空間内に両素子を有効に配置できることがわかった。多素子アレーの理論的検討・・・素子間の電磁的な結合により各発振素子に流れる超伝導電流が変調を受けると仮定したモデルを構築し、素子の発振モード毎に放射出力と放射パターンのアレー数依存性を計算した。これにより、基本モードでは、アレー数が4以上で放射出力が飽和傾向を示したのに対して、高次の121モードでは、従来の超放射理論と同様に、アレー数の自乗に比例して放射出力が増加した。また、放射パターンは、基本モードではアレー間隔とアレー数に応じて様々なサイドローブをもつブロードなパターンとなる傾向を示したが、121モードでは常に垂直指向性をもつビームとなり、アレー数の増加とともにパターンが先鋭化することが分かった。研究実績の概要に挙げた「多素子アレーの理論的検討」はおおむね順調に進展しているものの、「放射指向性測定系の構築」では、回転機構の変更を現在検討していることと測定系内の冷凍機チャンバーにリークが生じていたため、多少の遅れを生じている。なお、チャンバーのリークについては原因を特定し、既に修理が完了している。

放射指向性測定系の構築・・・前年度の検討結果を基に、当初計画の発振素子固定・検出器回転から発振素子回転・検出器固定へ、回転機構を変更して測定系を構築した。とりわけ発振素子回転用に新たに導入した2つの極低温用自動ステージにより2軸回転を実現する機構を組み上げ、それぞれの最小ステップ角度を100分の1度以下にできるシステムを実現した。また、温度変動に影響を受けにくい室温ボロメータ材料(チタンがドープされた酸化バナジウム薄膜)を作製し、検出器に利用できる見通しが得られた。単素子の特性評価・・・垂直指向性を有する121キャビティモードによるテラヘルツ波発振を観測するために、アンダードープのビスマス系銅酸化物超伝導体を用いて発振素子を試作した。測定した放射電力のバイアス電圧依存性から121モード発振に有効な広いバイアスマージンを同素子が有することを確認した。多素子アレーの設計と試作・・・前年度に引き続き数値シミュレーションにより同素子のアレーの放射特性を調べた。本研究で着目している121モード発振では、アレー化による放射電力の増加や放射パターンの先鋭化に対するアレー間隔の影響が、他のモードに比べて非常に小さいことが確認された。そのため121モード発振を利用すると素子アレーの設計に自由度があることが分かった。研究実績の概要に挙げた「放射指向性測定系の構築」が漸く完了したものの、以前、製作した発振素子から観測されていた121モード発振が、本研究で年度当初に試作した素子から発生しないことが判明した。その原因として、発振素子材料の銅酸化物超伝導体のキャリアドープ量が過剰であったために、バイアス領域が減少し、121モードを励振できる電圧まで素子をバイアスできなかったことが挙げられる。現在、ドープ量が過剰でないアンダードープ試料を用いて発振特性の改善を行っている。以上の原因解明と特性改善に時間を要したため、素子アレーの試作にも遅れが生じている。前年に引き続き、放射指向性測定系の構築を行う。とりわけ、どの様な回転機構を採用するかを早急に決める。回転機構以外の冷凍機や制御系は既存のものを流用できるため、回転機構を完成させ次第、測定系の動作確認を行う予定である。これまでの理論的検討によりアレー間隔と発振特性の関係についての知見が得られたため、それに基づいてアレーの設計を行う。また、アレー間の位相同期を行うための結合回路も設計し、プロトタイプの試作を行う。まずは、これまで計画していた単素子における発振モードと放射パターンの関係を、本研究で構築した放射指向性測定系による実験を通して明らかにし、これまでの理論から得られた予想結果と比較検討する。次に25素子の小規模のアレーを構成し、その放射電力と放射指向性を評価する。その際、本研究のこれまでのシミュレーションから得られた、121モード発振ではアレー間隔が放射特性に与える影響が小さいことについて、アレー間隔を変化させた素子アレーの特性評価により検証する。小規模アレーの結果を基に、アレーの大規模化を行い、1 mW以上の出力を得ることを目指す。放射指向性測定系の回転機構のための自動ステージの購入を次年度に先送りにしたこと、旅費を計上していた国際会議の出席を取りやめたこと、および想定していた修理が安価で済んだことにより、当該年度の支出額が予定を下回り、次年度使用額が生じた。これらの使用計画として、回転機構用の自動ステージおよび真空部品や成膜材料の購入、さらに国内で開催される研究会と国際会議の参加費と旅費に使用する予定である。
双方向物質・熱輸送パイプ

つい最近,本研究代表者らは,壁面上に複数のはく離誘起体(例えば環状リブ)が設置された円管の中の流体を管軸方向に振動させると,双方向の物質輸送が生ずるという興味ある現象を見いだした.物質が輸送されれば,それに応じて熱エネルギも輸送される.本研究は,上述の予備的な可視化実験により見いだされた興味ある新しい現象につき,物質・熱輸送の機構を解明し,さらにその性能に及す諸パラメタの影響を明らかにすることを目的とする.流れの可視化と物質輸送実験では,テストセクションにアクリル製円管(内直径32mm,長さ500mm)を用いた.環状リブ(正方形断面,高さ5mm,幅5mm)は,ピッチ50mmまたは100mmで円管内壁に設置した.作動流体(水)へのインク注入による流れの可視化を行うとともに,設定距離間のインク輸送時間を計測し,これを物質輸送促進の指標とした.ストローク体積を増加させていくと,インク輸送時間はあるストローク体積(ウォーマースリー数12の場合に,リブ間体積の1.5倍)を境に大きく減少した.このインク輸送時間が減少した時には,トレーサはより後方のリブに捕捉されており,リブ付き円管内振動流における物質輸送促進には,流体の剥離領域への捕捉・解放が関係していることが分かった.伝熱実験では,作動流体は水であり,テストセクションは加熱・冷却部間を耐熱塩化ビニル製円管(内直径16mm,長さ800mm)でつないだ構造をしている.環状リブ(矩形断面,高さ1.5mm,3.0mm,4.5mm,幅1.5mm)は,ピッチ16mmで円管内壁に設置した.リブによって形成される剥離領域の影響により実効熱伝導率は増大し,本実験条件内では,リブ付管の実効熱伝導率は平滑管の最大約36倍(銅の熱伝導率の60倍以上)となった.つい最近,本研究代表者らは,壁面上に複数のはく離誘起体(例えば環状リブ)が設置された円管の中の流体を管軸方向に振動させると,双方向の物質輸送が生ずるという興味ある現象を見いだした.物質が輸送されれば,それに応じて熱エネルギも輸送される.本研究は,上述の予備的な可視化実験により見いだされた興味ある新しい現象につき,物質・熱輸送の機構を解明し,さらにその性能に及す諸パラメタの影響を明らかにすることを目的とする.流れの可視化と物質輸送実験では,テストセクションにアクリル製円管(内直径32mm,長さ500mm)を用いた.環状リブ(正方形断面,高さ5mm,幅5mm)は,ピッチ50mmまたは100mmで円管内壁に設置した.作動流体(水)へのインク注入による流れの可視化を行うとともに,設定距離間のインク輸送時間を計測し,これを物質輸送促進の指標とした.ストローク体積を増加させていくと,インク輸送時間はあるストローク体積(ウォーマースリー数12の場合に,リブ間体積の1.5倍)を境に大きく減少した.このインク輸送時間が減少した時には,トレーサはより後方のリブに捕捉されており,リブ付き円管内振動流における物質輸送促進には,流体の剥離領域への捕捉・解放が関係していることが分かった.伝熱実験では,作動流体は水であり,テストセクションは加熱・冷却部間を耐熱塩化ビニル製円管(内直径16mm,長さ800mm)でつないだ構造をしている.環状リブ(矩形断面,高さ1.5mm,3.0mm,4.5mm,幅1.5mm)は,ピッチ16mmで円管内壁に設置した.リブによって形成される剥離領域の影響により実効熱伝導率は増大し,本実験条件内では,リブ付管の実効熱伝導率は平滑管の最大約36倍(銅の熱伝導率の60倍以上)となった.
組織細胞の分化の安定性を制御する細胞因子への分子的アプローチ

ニワトリ色素上皮細胞(PEC)は、脱分化、再分化、水晶体細胞への分化転換をすることができる。PECの細胞分化における細胞外基質の役割を明らかにするために、1、細胞外基質を分析し、2、細胞の微細環境を自由に制御できる無血清培養系を確立した。材料は9日目のニワトリ胚である。1、脈絡膜を付着したままの色素上皮組織を、両組織の分離に有効な0.1%EDTA溶液で保温し、遠心上清をSDS-PAGEで分析した。CBBで検出された数本のバンドのうち約300KDのタンパク質(P300)について検討を進めた。P300に対する抗体を作成し、蛍光抗体法で組織を観察すると、P300は眼の結合組織や上皮基底膜や眼以外の結合組織に広く分布していた。抗P300は既知の細胞外基質成分とは免疫学的に交差しなかった。ついで、抗P300を用いて、P300をコートするcDNAをニワトリ全胚のcDNAライブラリーから検索し塩基配列を決定した。P300のcDNAはヒトのアポリポプロティンB(アポB)と高いホモロジー(アミノ酸配列では45.2%)を示した。そこでP300とアポBを生化学的に比較したところ分子量、抗原性、超遠心における密度が同じであることが判明した。本研究で示されたP300すなわちアポBの組織分布は従来知られていない興味深いものである。2、PECの無血清培養はMEM倍地にインスリン、コンアルブミン、トリプシンインヒビター、そして培養皿をコラーゲンでコートすることで達成された。インスリンは増殖、コンアルブミンは細胞の維持、トリプシンヒビターは細胞の分解を防止、コラーゲンは長期間、細胞が接着しているために役だっていた。PECのクローナルな増殖はこの条件以外にPECの合成した細胞外基質を加えることで可能になり、コラーゲン以外の基質成分の重要性を示唆している。無血清培養はPECの分化転換系で使用されるヒアルロニダーゼ、フェニールチオウレア、アスコルビン酸の果たす役割を解明するのにきわめて有効であると考えられる。
定型・非定型の脳・認知発達から探る言語コミュニケーションの獲得

本研究は自閉スペクトラム症(ASD)を主とする発達障害のリスクを持つ乳児(リスク児)と定型発達児を対象として,月齢3ヶ月時期(あるいは新生児期)から3,4歳までの脳機能,知覚・認知機能,運動機能を縦断的に計測するコホート研究である。特に言語コミュニケーションに障害を持つASDのリスク児と定型児の発達過程を比較することで(1)言語やコミュニケーション能力の獲得に脳,認知,運動の機能発達がどのように関与しているのか,(2)発達障害を予測する生理学的,行動学的因子は何か,を明らかにする。発達障害のリスクをもつ乳児を対象として、定型発達児との比較において、月齢3ヶ月時期から34歳までの脳機能、知覚・認知機能、運動機能を縦断的に計測する研究である。発達障害の中でも特に自閉スペクトラム症(ASD)に着目し、言語やコミュニケーション能力の獲得に対して種々の機能発達がどう関与しているか、発達障害を予測する諸因子は何か、といった点を明らかにすることを目指している。リスク児コホート研究は国際的に見ても独創性が高い研究と考えられる。研究代表者が今まで蓄積した小規模コホートおよびリクルートメントのシステムを活用することで、研究を発展的に進めようとしている点で優れている。自閉スペクトラム症児の発達に関する基礎データを提供し、自閉スペクトラム症を主とする発達障害のリスクを持つ乳児を対象とした予防的介入に役立つものと期待される。
血液脳関門標的化バブルリポソームによる脳実質組織への超音波核酸デリバリーシステム

本研究では、バブルリポソーム(BL)と超音波照射併用による脳標的化する核酸・遺伝子デリバリーシステムの開発を目的とした。BLと高密度集束超音波(HIFU)を併用することで標的部位のみでのBBB透過性亢進が可能となる明らかとした。本法によりアンチセンス核酸・遺伝子の脳内デリバリーが可能となることも示された。さらにポリプレックス搭載型バブルリポソームを新規開発し、これを静脈内投与後に頭蓋外からのHIFU照射を行うことで更なる照射部位選択的な遺伝子発現が可能となることを明らかとした。以上の結果は、今後の脳神経疾患治療に有用な核酸・遺伝子医薬のための新規デリバリーシステムとなりうるものと期待される。本年度計画では、バブルリポソーム(BL)と集束超音波(HIFU)照射併用法を確立し、血液脳関門(BBB)の透過性の向上を目指し、種々の検討を行った。バブルリポソームの構成脂質として、DPPCおよびPEGを用いて調製した。はじめにBBBの透過性を調べるために、BLとHIFU照射処理に伴う色素であるエバンスブルー(EB:血液中でアルブミンと結合)の脳実質組織への漏出を肉眼的かつ定量的な解析を行った。マウスにEBを尾静脈内投与し、数分後にBLを投与し、その直後に頭蓋から、HIFU照射を行った。数時間ごとに導入処理を行った脳を回収し、冠状断面の観察ならびに組織より、EBを抽出定量した。その結果、冠状断面の照射部位(右脳)のみにおけるEBの顕著な蓄積が観察された。また、抽出定量したところ超音波照射強度に伴うEB透過量の増加が認められた。このBLとHIFU照射処理後13時間においてEB蓄積量の増加は、ほぼ最大に達していた。次にHIFU照射条件の特性評価を行うために、超音波照射条件を変動させたところ、Duty10%、60秒で、十分なEBの透過を示した。さらに導入後の組織ダメージをHE染色、NADH-TR染色にて調べたところ、10%Dutyでは、顕著なダメージは、認められなかった。また、本照射条件(10%Duty、60秒)を利用することで、どの程度までの高分子量化合物が、BBBを透過できるか否かについて調べるためにFITC-Dextranを用いて、同様の実験を行った。その結果、最大2000kDaまでの分子が透過する傾向が認められた。また、その透過量は分子量の大きさに依存することも示された。さらにFITC修飾された低分子核酸を用いた場合では、BLとHIFU照射処理によって、脳内移行している傾向が示された。以上のことから、BLとHIFU照射処理によって、BBBの透過性を亢進させることが可能であることが明らかとなり、有用な脳へのデリバリーシステムとなりうるものと期待された。本年度計画では、核酸搭載型バブルリポソーム(BL)の調製と脳内核酸導入を検討した。バブルリポソームの構成脂質として、DPPC(中性脂質)、DPPG(アニオン性脂質)およびPEGを用いて調製した。2種類の基本脂質を用いて調製したバブルリポソームをマウスに尾静脈内投与し、その後の生体内(脳内)での安定性を超音波診断装置にて調べた。頭蓋内への診断造影の結果、DPPCを用いた場合と比較し、DPPGを基本脂質としたバブルリポソーム(AnBL)は、数分間にわたり、造影効果を示したことから、AnBLは、脳内デリバリーにおいて有用な超音波造影剤であると考えられた。実際にAnBLと集束超音波(HIFU)照射併用法による脳内への遺伝子導入効果を有するか検討した。方法としてルシフェラーゼ遺伝子をコードした発現プラスミドDNAと共にマウス尾静脈内へと投与し、その後、脳内へとHIFU照射したところ、照射部位における顕著な遺伝子発現の増強が認められた。一方で、更なる遺伝子導入効率の向上を目指し、AnBLへのプラスミドDNAとPEIの複合体(ポリプレックス)の搭載を試みた。その結果、粒子径100 nm以下のポリプレックスがAnBLに搭載可能であることが、フローサイトメトリーの解析により示された。また、AnBLへのポリプレックス搭載の有無に関わらず、造影能を維持できることも判明した。次に遺伝子導入効果をin vitro実験系にて検討したところ、Naked pDNAとBLとの超音波併用時と比較して、ポリプレックス搭載AnBLでは、約5倍程度の遺伝子発現レベルの上昇が認められた。以上のことから、AnBLは、生体内で安定な脳内核酸デリバリーツールとなりうるものと期待された。昨年度までの検討において、バブルリポソームと頭蓋外からの集束超音波(HIFU)照射の併用により、BBBの透過性が亢進するとともに、脳内への遺伝子導入が可能となることを明らかとしてきた。さらに、BBB透過後の核酸・遺伝子に神経細胞への選択性を付与することは、極めて重要と考えられる。そこで、神経細胞のニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)への結合により、導入されることが知られているRVG29ペプチドにカチオン性ペプチドを連結させた融合ペプチドを利用して、polyplex搭載型バブルリポソームの作製を試みた。はじめにRVG29融合ペプチドとルシフェラーゼをコードしたプラスミドDNAとの複合体(ポリプレックス)を調製し、その物性をアガロースゲル電気泳動により、確認した。結果、N/P比=10以上では、ほぼ完全にポリプレックスを形成できていることが示された。