hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
パネルデータによる現代日本家族の動態研究

第4回研究会を3月に開催予定であったが、地震の余波で開催することができなかったのは残念であった。本研究は、日本家族社会学会有志が1998年以降継続して実施してきた「家族に関する全国調査(通称NFRJ:National Family Research of Japan)」の一環として、同一標本を追跡するパネル法により現代日本の家族に関する全国規模のデータを収集し、家族の動態を把握しようというものである。今年度は、第一に、追跡調査を継続実施した。6月と12月にニュースレター4・5号を作成して調査対象者に送付した。そして、1月に郵送で追跡調査(WAVE4)を実施した。基本的には前年度に実施したWAVE3の質問を繰り返したずねることを優先したが、単年度の質問として、東日本大震災の影響ならびに意識を問う項目も含めた。調査時には住所確認のハガキを同封して住所移転に対応した。さらに、上記調査でこの1年の結婚経験が判明した対象者に、配偶者の属性をたずねる追加調査を郵送で実施した。対象者の住所ならびに名簿管理は、パネル調査の実績のある専門調査会社に引き続き委託した。第二に、前年度に実施したWAVE3のデータのクリーニング作業を行った。2008年度からの3年間にわたる調査データを連結し、研究メンバーが開発した専用ソフトを用いて、20数名の研究会メンバー全員が参加して作業を行った。この作業は、研究会メンバーが自宅で行う作業と、研究メンバーが会議を開催して検討する作業を組み合わせて実施された。昨年度のクリーニング経験を活かして、今年度は効率化をさらにすすめることができた。第三に、9月に立命館大学において第4回研究会を、2月に東洋大学において第5回研究会を開催した。第4回研究会では2波のパネルデータを用いた分析の報告を中心に、パネル分析技法についての討論を行なった。第5回研究会では3波のパネルデータを用いた分析の報告が行なわれ、活発な質疑が交わされた。第一に、2008年度から2012年度まで継続して実施してきた5回にわたるパネル調査のデータクリーニングを行い、最終的なデータセットを作成した。この調査は、第2波から第4波までは郵送法により行ってきたが、最終回にあたる第5波の調査は、訪問留置法により、第1波以来となる詳細な情報を収集した。第4波までの調査で洗い出されていた疑問点も、第5波の訪問時に確認した。それらの多量の情報を得て、5回の調査を通じての最終的なデータクリーニングをおこなった。これまでのノウハウの蓄積を活かして、まずはプログラムを組んでデータ上の不足や矛盾を洗い出した。次に、30数名の研究会メンバーで分担し、電子化された個票データをケースごとに照合して、必要な修正作業を進めた。さらに、本プロジェクトのメンバー等で8月に合宿形式で、ケースごとの検討作業を行った。最後に、データの齟齬を指摘するプログラムを用いて点検を行った。この点検ならびに修正は、データの矛盾が解決するまで繰り返された。調査票原票の電子化も進め、点検に活用した。クリーニング終了後に、最終的なデータセットを、ロング形式とワイド形式の両方で作成した。第二に、上記のデータセットを用いて、報告書を作成した。4部構成からなり、第一部で調査概要や調査の特長、回収状況等の基礎的な説明を掲載した。
肝栄養エネルギー代謝を標的とする抗メタボリックシンドローム研究

DHAやEPAをコレステロールとエステル化することで、有効性が約10倍になることを、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)進展リスク軽減効果で実証し、これらの産業的活用性を明らかにした。過剰(偏倚)栄養と栄養代謝に不十分な酸素供給により、肝栄養エネルギー代謝の機能低下・酸化ストレスと慢性炎症が惹起・加速し、NASH病態を増悪化進展させることを再現する評価系で、両者の効果は、赤血球変形能低下や酸化ストレス-炎症遷延の改善によることが示された。◎コレステリル多価不飽和脂肪酸エステルの合成:コレステロール(Ch)およびn-3多価不飽和脂肪酸ドコサヘキサエン酸(DHA)やエイコサペンタエン酸(EPA)の弱点克服を意図し、エステル結合体Ch-DHAやCh-EPA誘導体とした,動物実験必要量として、Ch-DHAやCh-EPAを各300g合成した。なお、Ch-DHAやCh-EPA中においてトランス型不飽和脂肪酸への変換が惹起されていないことも、定性分析から確認できている。NASH病態モデル【国際特許出願中[INPADOC、国際出願番号:PCT/JP2007/52477]】に対する効果を検討した。「研究計画・方法」に記述していない赤血球膜の採取を初め試料量の確保や経過的変化追跡が可能なラットを、「研究計画・方法」に記述していないラットを、赤血球膜の採取を初め試料量の確保や経過的変化追跡が可能なラットを用いた。平成22年度においては、評価系の確立に向け、有効投与量の設定実験を行った。被験群対照群[齧歯類用飼料MF給餌]、脂肪肝群[コリン欠乏高脂肪(CDHF)給餌]、NASH群[4週間CDHF給餌による脂肪肝形成後6週間の間歇的低酸素負荷]、NASH+DHA群、NASH+EPA群、NASH+Ch-DHA群および、NASH+Ch-EPA群で実施した。6週間の間歇的低酸素負荷期間において、パルスオキシメータ・MouseOxによる動脈血中酸素分圧の計測および化学発光法による白血球による酸化ストレスを経過的に計測した。実験的飼育期間完了時にフローサイトメトリーによる白血球表面抗原CD29の発現変化も検討した。NASH進行リスク低減効果は、DHAおよびEPAに比べ、Ch-DHaやCh-EPAは低投与量30100mg/kgでの有効性がうかがえるデータが得られた。動脈血中酸素分圧の変化や白血球の接着性の指標となるCD29発現増大がNASHラットで惹起されることが示された。NASHでの変化をCh-EPAが軽減する影響を認めたが、さらなる検討が必要である。平成22年度の成果としては、NASH進行リスク低減機能を調べる実験系として、血液流動性および血行動態に密接に関係する検討項目を組込んだ評価系の確立ができた。H23年度実施内容:非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)病態動物【PCT/JP2007/52477】へ、コレステロール(Ch)およびn-3多価不飽和脂肪酸ドコサヘキサエン酸(DHA)やエイコサペンタエン酸(EPA)とのエステル結合体Ch-DHAやCh-EPA誘導体10mgまたは30mg(DHAやEPA換算投与量)/Kg/毎日の経口投与による動物実験を実施した。実験的飼育期間完了まで経週的にパルスオキシメータ・MouseOxによる動脈血中酸素分圧の計測および化学発光法による白血球(メタリボツックシンドロームや多くの生活習慣病の病態に炎症性サイトカインや免疫細胞が関与し,持続的な炎症反応(慢性炎症)が病態に密接に関与することを想定.活性化白血球からは活性酸素・フリーラジカル種が産生される.血液は経週的に採取が可能得られる試料として病勢の把握に有用)による酸化ストレスおよび赤血球膜試料(血球膜の可塑性・変形能はスムーズな血流の要因)を採取し飼育行った。動物実験終了時に臓器および血液試料を採取した。これらを試料として、肝障害ならびにCh-DHAやCh-EPA各投与の有効性の評価を、血液生化学的肝機能パラメータALT,ASTやγ-GTP活性の測定ならびに病理組織化学的評価法により行った。さらに有効性の機序解明のため、赤血球膜の流動性をESR法にて検討した。病態進展機序や作用機序の解明のため、酸化ストレス、炎症、蛋白や遺伝子発現の評価のため、実験動物から得た血液、肝ホモジネート、核、ミトコンドリア、ミクロソームは調製後-80°Cに保存している。H23年度成果:Ch-DHAとCh-EPA(DHAやEPAとしての投与量は文献値の1/301/10程度)は、NASH進展リスク低減機能を発揮した。

脂肪肝担持動物への一過性の低酸素ストレスを連日負荷することでNASH病態を惹起させるNASH群における動脈血中酸素分圧の低下を、Ch-DHAやCh-EPAは用量依存的に軽減し、さらに、白血球の接着に機能するCD29のNASHでの発現増大の軽減や赤血球膜の流動性の上昇がESR計測で実証されつつある。燃料である脂質を燃やすための酸素を組織に運搬するための血流維持により、病態進展機構として想定した[肝栄養代謝の効率低下-肝細胞内の脂肪滴形成-体内酸素濃度-肝ミトコンドリア機能破綻による活性酸素種の派生=酸化ストレス↑-炎症-血液流動性・血行動態]を抑止することが示されつつある。1NASH病態の栄養エネルギー代謝低下に対するCh-DHAとCh-EPAの効果:ミトコンドリア(Mt)の機能不全は本研究の非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)病態モデル動物【特許第5109134】で示されている。NASH病態モデルへのn-3脂肪酸コレステリルエステル誘導体(Ch-DHAやCh-EPA誘導体;コレステロール(Ch)とDHAやEPAとのエステル)投与による影響を検討した。肝MtのATP産生能などの機能評価に用いられる酸素電極法による測定法により、呼吸調節率(respiratory control ratio; RCR)およびADP/O比による酸化的リン酸化能(ATP産生能)を測定した。RCR値とATP産生能のNASHでの低下をCh-DHAやCh-EPAの投与は軽減し、Mtのエネルギー代謝機能不全の改善作用が示された。7赤血球膜の変形能:赤血球膜の可塑性・変形能はスムーズな血流に不可欠である。ヒト臨床NASHリスクとして認められる脂肪肝への反復性間歇的低酸素ストレスNASH病態では、肝組織の低酸素ストレスが問題視される。動物実験期間完了後、採取・ー80°C冷凍保存の赤血球膜標本を試料とし、スピンラベル剤を用いる電子スピン共鳴分光(ESR)法にて膜流動性を検討した。即ち赤血球膜にスピンラベル剤を取込ませて計測するESRスペクトルからもとめられるorder parameter (S)値の上昇で、膜流動性の低下を検出できる。無処置対照群に比べ、NASH群のS値は大きくなり、赤血球の変形能の低下が実証された。NASH群での赤血球の変形能の低下をCh-DHAやCh-EPAの投与は改善した。動物実験でのCh-DHAやCh-EPA投与量は、DHAやEPAへの換算量10mgおよび30mg/kg/日で、ラットによる研究文献の投与量の1/301/10程度である。研究目的とした2軸の一方である「NASH病態への、Ch-DHAおよびCh-EPAの栄養代謝・炎症性反応・生理機能の各々に関する制御性の解明、生活習慣病の予防、治療への利用の可能性を学術的に解明し、Ch-DHAとCh-EPAの産業的利用の可能性を裏付けるデータを取得する。」については、肝ミトコンドリアATP産生効率による栄養代謝への影響についての詳細検討以外は実施済かつポジティブデータが得られている。これにより、残る1軸「過剰栄養性肝代謝異常-相対的酸欠-脂肪貯留-酸化ストレス-炎症-組織リモデリング-血流停滞-メタボリック症候群(MS : Metabolic Syndrome)進行の解明」についても、動脈血中酸素飽和度の低下とNASH、NASHにおける肝ミトコンドリア障害,酸化ストレスや炎症などの関連の解析が進みつつある。これは当初想定の進展状況である。24年度が最終年度であるため、記入しない。(1)肝栄養代謝の効率低下-(2)肝細胞内の脂肪滴形成-(3)体内酸素濃度-(4)肝ミトコンドリア機能破綻による活性酸素種の派生=酸化ストレス↑-(6)炎症-
B細胞活性化サイトカイン産生細胞が発現するT細胞受容体に基づく歯周炎診断の確立

歯周炎罹患歯肉組織中のT細胞の特性を解明する一環としてT細胞受容体(TCR)のレパートリーならびにサイトカイン産生のプロフィールを免疫組織学的に検索した。歯周炎歯肉組織は歯周外科処置時に、対照としての歯肉炎組織は歯周疾患と関係のない要抜去歯周囲から抜歯時に採取し、通法により凍結切片を作製後、アルカリフォスファターゼ-抗アルカリフォスファターゼ法によりTCRに関してはVα2、Vβ5.2-3、Vβ5.3、Vβ5.1、Vβ6.7、Vβ8、Vβ12.1遺伝子産物、サイトカインについてはIL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6を染色、検出した。それぞれの受容体ならびにサイトカイン陽性細胞の全T細胞に対する割合を求め、各レパートリー、サイトカイン間および歯肉炎組織と歯周炎組織で比較、検討した。さらに歯周炎患者10名、歯肉炎患者2名からは末梢血も採取し、末梢血と歯肉組織でのTCRレパートリーの違いについても検討した。その結果、歯肉組織でのTCRレパートリーは個人差が大きかった。またVβ5サブファミリーとVβ6.7はいずれの症例においても他のものに比べて使用頻度が高かったが、Vα2とVβ8サブファミリー使用頻度が低い傾向が認められた。さらに歯肉組織では自己の末梢血と比較して1ないし2つのレパートリーにおいて著明に高い発現がみられ、それらはVβ5.2-3、Vβ6.7、Vβ8、Vβ12.1等であった。サイトカインに関しては歯周炎罹患組織においてIL-4、IL-6産生細胞の比率が歯肉炎に比べて有意に高かった。またそれらの部位ではB細胞:T細胞の比率とIL-4陽性細胞の割合との間に有意な相関性が見られた。これらの結果は歯肉に浸潤しているT細胞のレパートリーは末梢血からのランダムな移行により形成されるのではなく、歯肉での局所的要因によって動員される細胞や増殖に偏りが生じ、さらにそれらのT細胞はTh2タイプであることが明らかになった。歯周疾患の発症、進行におけるT細胞の役割を調べる為、炎症歯肉に浸潤しているT細胞が持つ抗原受容体(TCR)とサイトカイン産生能について免疫組織学的に検索した。歯肉炎および歯周炎患者より採取した歯肉バイオプシーから凍結切片を作製し、一次抗体として抗IL-4、抗IL-6をサイトカイン検出用に、抗TCR抗体Va2、Vb5(a)、Vb5(b)、Vb5(c)、Vb6、Vb8、Vb12をT細胞レセプター検出用に用い、アルカリフォスファターゼ-抗アルカリフォスファターゼ法により発色させた。また、サイトカイン産生細胞のT細胞サブセットを調べる為に抗CD45RO抗体との二重染色も行った。その結果、IL-4はCD45ROサブセットにより産生され、歯周炎組織では歯肉炎組織に較べて有意にIL-4産生細胞の割合が高いこと、IL-6産生細胞においても統計的に有意差はなかったものの同様の傾向が示された。IL-6に関しては線維芽細胞、上皮細胞にも陽性反応が見られた。また、その他の特徴としては、IL-4産生細胞の割合が高い症例ではIL-6産生細胞の割合が低く、IL-6産生細胞の割合が高い症例ではIL-4産生細胞の割合が低いという傾向が認められた。

一方T細胞レセプターの発現については個体間で多様性が見られたが全般的に、Vb5(a)、Vb5(b)、Vb5(c)、Vb6に反応するT細胞の割合が高く、歯肉炎と歯周炎を比較すると歯周炎組織においてVa2、Vb8、Vb12が有意に高いという結果がえられた。このことから、歯周炎では歯肉炎に比べてB細胞活性化サイトカインを産生するメモリーT細胞が増加しており、従って歯周炎と歯肉炎ではT細胞の認識する抗原が異なっている可能性のあることが示唆された。歯周炎罹患歯肉組織中に浸潤しているT細胞の特性を解明する一環としてT細胞受容体のレパートリーを免疫組織学的に検索した。歯周炎歯肉組織は歯周外科処置時に、対照としての歯肉炎組織は歯周疾患と関係のない要抜去歯周囲から抜歯時に採取し、通法により凍結切片を作製後、アルカリフォスファターゼ-抗アルカリフォスファターゼ法によりVα-2、Vβ5.2-3、Vβ5.3、Vβ5.1、Vβ6.7、Vβ8、Vβ12.1遺伝子産物を染色、検出した。それぞれの受容体陽性細胞の全T細胞に対する割合を求め、各レパートリー間および歯肉炎組織と歯周炎組織で比較、検討した。さらに歯周炎患者10名、歯肉炎患者2名からは末梢血も採取し、末梢血と歯肉組織でのレパートリーの違いについても検討した。その結果、歯肉組織でのレパートリーは個人差が大きかったが、Vβ5サブファミリーとVβ6.7はいずれの症例においても他のものに比べて使用頻度が高かったが、Vα2とVβ8サブファミリー使用頻度が低い傾向が認められた。さらに歯肉組織では自己の末梢血と比較して1ないし2つのレパートリーにおいて著明に高い発現がみられ、それらはVβ5.2-3、Vβ6.7、Vβ8、Vβ12.1等であった。これらの結果は歯肉に浸潤しているT細胞のレパートリーは末梢血からのランダムな移行により形成されるのではなく、歯肉での局所的要因によって動員される細胞や増殖に偏りが生じ、その結果がT細胞レパートリーに反映されていることが示唆された。
筋小胞体カルシウムポンプの活性に関与チロシン残基の修飾と同定

筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseの反応にチロシン残基が関与しているか否か検討するため、テトラニトロメタン(TNM)を用いてチロシン残基を修飾し、その影響を調べた。1)TNMによるSH基の修飾を抑さえるため、テトラチオネートによるSH基の保護を試みたところ、4mMテトラチオネート2時間処理によりCa-ATPase活性は完全に抑えられ、4mM DTT 3時間処理により最大40%の活性の回復が見られた。2)テトラチオネート処理してSH基を保護した筋小胞体膜(SRV)1mg/mlを、0.1M KCl.50mM Tris-HCl(pH8.0).1mMCaCl_2存在下100μM TNMで処理した後、DTT処理により保護基をはずしてCa^<2+>-ATPase活性を測定した。活性はTNM処理時間の増加とともに低下し、10分で50%、60分で20%以下となった、16mM MgATPはこの阻害に対して保護効果を示さなかった。TNMによる活性阻害はpHに依存した。pH7.0では、TNMはなお十分な阻害を示したが、pH6.0では阻害は著しく遅くなった。3)TNMはSH基も修復するが、テトラチオネート処理後に残存するSH基がTNMによって修飾される速度は、pH8.0と6.0でほとんど異ならなかった。以上の結果は、TNMによる阻害がチロシン残基の修飾によって起こることを示唆している。4)TNM処理したSRVよりCa^<2+>-ATPaseをゲルろ過HPLCにより精製し、TNMによってニトロ化されたチロシンを分光学的に定量した。ニトロ化は60分までは速やかに進み12nmol/mgのニトロチロシンを生じた。その後ニトロ化の速度は著しく遅くなった。この結果は、Ca^<2+>-ATPase1モル当たり1から2モルのチロシン残基のニトロ化が強い活性阻害を起こすことを示唆している。
アセチレンおよびオレフィンのチタン錯体を経由する環状カルボニル化合物の新合成法

本研究では,XTi(O-i-Pr)_3(X=O-i-Pr,Cl)と2当量のi-PrMgClより発生する二価チタン等価体(η^2-propene)Ti(O-i-Pr)_2を利用する合成反応の開発の一つとして,不飽和結合を有するエステル類との反応がTi-不飽和錯体を経由する分子内求核アシル置換反応として進行し環状カルボルニル化合物を与えることを見出し,この反応を利用する各種環状カルボニル化合物を合成するものである。即ち,3-および4-アルキニルカーボナ-トよりα-アルキリデン環状ラクトンが,3-および4-アルケルニルカーボナ-トよりα-アルキル環状ラクトンが,また4-および5-アルキニルカルボン酸エステルよりα-アルキリデン環状ケトンがそれぞれ収率良く得られた。さらに,置換基を有する基質,特に多環性の生成物を与えるものへの適用を行った結果,クマロン類などの6-6および6-5ビシクロ環の構築に適用でき,また酸素などのヘテロ原子を有する環構築にも適用でき,種々の環状カルボニル化合物の合成に有用であることがわかった。(2)については時間の都合もありよい結果は無くさらに現在検討中である。本反応は,(1)従来ほとんど例の無い分子内求核アシル置換反応を効率よく達成している点,(2)合成上有用な環状カルボニル化合物の全く新規な合成法を提供した点,(3)生成物は加水分解前には有機チタン化合物でありこの反応性を利用するさらなる展開を行える点で学術的に意義が深いと思われ,また(4)安価で毒性の無い試薬を用い,(5)操作も簡便であることから高い実用的も持っている。新しい有機金属反応種の合成法を開発することは,新しい合成手法を提供することであり意義深い。最近,当研究室においてTi(OR)_4などの安価なTi(IV)化合物とGrignard反応剤との反応により系中でTi(II)化合物が生成し,これと不飽和炭化水素化合物とが反応し直接有機チタン化合物を与えることを見出している。本研究では,分子内にカーボナ-トやエステルなどのカルボニル基を有する不飽和炭化水素化合物が上述のTi(II)反応剤と反応し容易に分子内求核アシル置換反応が進行し生成物として官能基を有する有機チタン化合物を高収率で与えることを見出し,この反応の一般性・適応性を明らかにすることを目的としている。平成7年度の研究の成果として,(1)反応は一般性高く進行し,アルキルアルキニルカーボナ-トからα-アルキリデンラクトンあるいはα,β-不飽和エステルが,アルキルアルケニルカーボナ-トからラクトンが,アルキルアセチレニック酸エステルからα-アルキリデン環状ケトンが,カルボン酸のアルキニルエステルからα,β-不飽和ケトンがいずれも高収率で得られること,(2)生成物はいずれの場合も有機チタン化合物であり,この反応性を利用して更なる合成反応が可能であること,例えばヨウ素化やカルボニル化合物との付加反応などが高収率で進行した,(3)いずれの場合も反応は温和で反応操作も極めて容易であり,平成8年度の研究計画で予定しているより複雑な化合物を合成する応用反応にも充分適応可能なことを明らかにすることができた。なお,以上の成果は報文(裏面の研究発表の項を参照)として報告した。本反応は分子内環化反応を経て有機金属反応剤が直接生成する例の無い反応である点で学術的に興味深く,また安価な反応剤を用い,様々な応用が可能な新規環化反応手法として応用性・実用性のある有機合成上有用な反応と思われる。

本研究では,XTi(O-i-Pr)_3(X=O-i-Pr,Cl)と2当量のi-PrMgClより発生する二価チタン等価体(η2-propene)Ti(O-i-Pr)2を利用する合成反応の開発の一つとして,不飽和結合を有するエステル類との反応がTi-不飽和錯体を経由する分子内求核アシル置換反応として進行し環状カルボニル化合物を与えることを見出し,この反応を利用する各種環状カルボニル化合物を合成するものである。平成8年度は,前年度に明らかにした3-および4-アルキニルカーボナ-トよりα-アルキリデン環状ラクトンが,3-および4-アルケニルカーボナ-トよりα-アルキル環状ラクトンが,また4-および5-アルキニルカルボン酸エステルよりα-アルキリデン環状ケトンがそれぞれ収率良く得られたことを基にして,(1)置換基を有する基質,特に多環性の生成物を与えるものへの適用と,(2)キラルなチタン化合物を用いた不斉合成への展開をはかった。その結果,(1)ではクマロン類などの6-6および6-5ビシクロ環の構築に適用でき,また酸素などのヘテロ原子を有する環構築にも有用であることがわかった。(2)については時間の都合もありよい結果は無くさらに現在検討中である。
癌原遺伝子産物ｃ－Ｍｙｃによる新たな発癌分子機構の解明

これまでの解析から、c-Mycの下流因子として働く新規の癌化関連長鎖非コードRNAであるAS-GEF-XはProtein Xと複合体を形成することでCDK6の発現を調節している可能性が考えられた。そこでAS-GEF-XによるCDK6の発現制御機構の解明を行った。AS-GEF-XとProtein Xが共に細胞質に局在することから、転写後の遺伝子発現制御プロセスに関わっていると推察された。そこで、Protein XおよびAS-GEF-XがCDK6のmRNAと直接結合するか検証した。その結果、AS-GEF-XとProtein X、CDK6 mRNAは3者複合体を形成していることを見いだした。次に、この複合体におけるAS-GEF-Xの機能を明らかにするため、AS-GEF-Xを抑制し、AS-GEF-XのAS-GEF-XはProtein XのCDK6 mRNAへのリクルートを促進していることを見いだした。Protein XはCDK6 mRNAの3'UTRに結合することでmiRNAのアクセスを遮断し、結果としてCDK6のmRNAを安定化していることを明らかにした。さらに、c-Mycを発現抑制した細胞にAS-GEF-XおよびCDK6を強制発現することで、c-Mycの発現抑制に伴う細胞周期の停止がレスキューされた。以上、本研究では大腸がんにおけるc-Myc、AS-GEF-X、CDK6という新規の発癌機構および、新規長鎖非コードRNAであるAS-GEF-Xの作用メカニズムを明らかにした。27年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの解析から、長鎖ncRNA : As-GEF-XはGタンパク活性化ドメインを持つ機能未知分子GEF-Xの内在性アンチセンスRNAとして機能している可能性が考えられた。そこで、As-GEF-Xを過剰発現、または発現抑制し、GEF-Xの発現量に与える影響をウエスタンブロッティングにより検討した。HT29細胞、LS180細胞においてsiRNAを用いてc-Myc、β-CateninおよびAs-GEF-Xを発現抑制しGEF-Xのタンパク質量を定量した。その結果、c-Myc、β-cateninおよびAs-GEF-Xを発現抑制した際、GEF-Xのタンパク質量が上昇していた。次に、As-GEF-XとGEF-XのmRNAが直接結合しているかを明らかにするために、RNA immunoprecipitiation (RIP) assayを行った。PP7タグを付加したAs-GEF-XとFLAGタグを融合したPP7コートタンパク質を細胞に共発現させ、PP7-PP7コートタンパクの結合力を利用してFLAG抗体による免疫沈降を行った。その沈降産物にGEF-Xが含まれるかqRT-PCRで検証したところ、3EF-XがAs-GEF-Xと共に免疫沈降されることを確認し、As-GEF-XとGEF-Xが結合していることを明らかにした。GEF-Xはc-Mycの下流で発現抑制を受けることから、癌抑制遺伝子である可能性が考えられた。そこで、マウスの皮下異種移植モデルを使って、GEF-Xの機能解析を行った。GEF-Xを強制発現させたHT29細胞をヌードマウスの皮下に移植し、造腫瘍性に与える影響を調べた。その結果、GEF-Xの強制発現によりHT29細胞の造腫瘍性は低下し、GEF-Xが癌抑制遺伝子であることが明らかとなった。さらに、c-Myc/As-GEF-X/GEF-Xカスケードの重要性を明らかにするために、c-MycとGEF-Xのダブルノックダウンが細胞増殖に与える影響を調べた。HT29細胞においてc-Mycの発現抑制は細胞の増殖抑制を引き起こした。一方でc-MycとGEF-Xを共に発現抑制するとc-Myc単独を発現掬制した場合の比べ、細胞の増殖速度の回復が見られた。これらの結果から、c-Myc/As-GEF-X/GEF-Xカスケードが生体内で機能している可能性が考えられた。これまでの解析から、長鎖ncRNA:As-GEF-XはGタンパク活性化ドメインを持つ機能未知分子GEF-Xの内在性アンチセンスRNAとして機能している可能性が考えられた。さらに、GEF-Xはc-Mycの下流で発現抑制を受けることから、癌抑制遺伝子である可能性が考えられていた。しかし、GEF-Xを強制発現させたHT29細胞をヌードマウスの皮下に移植し、造腫瘍性に与える影響を調べたところ、GEF-Xによる造腫瘍性の低下の程度がAs-GEF-Xのノックダウンに及ばないことから、As-GEF-XはGEF-Xを介さない経路でも造腫瘍性に寄与している可能性が考えられた。As-GEF-XのGEF-Xを介さない機能を解明するために、As-GEF-Xの結合タンパク質取得を行った。ビオチン標識したAs-GEF-Xと細胞抽出液を混ぜ、ビオチン、アビジンの結合力を利用してAs-GEF-Xごと結合タンパク質をプルダウンした。さらに、精製したタンパク質が質量分析器により同定した。その結果As-GEF-X結合タンパク質としてProtein Xを同定することが出来た。As-GEF-Xの細胞における機能を明らかにするために、As-GEF-Xを発現抑制したHT29細胞からRNAを抽出し、RNA-seqを行った。As-GEF-Xの減少に伴って発現低下する遺伝子群を抽出し、パスウェイ解析を行った結果、細胞周期の進行に関わる遺伝子群を見いだした。

特にG1期の進行に関わる癌遺伝子の一つ、CDK6に関して顕著は発現の減少がみられた。さらに、ProteinXの発現抑制によってもCDK6の発現が減少することを見いだし、As-GEF-X、ProteinX、CDK6というカスケードがGEF-Xを介する経路とは独立に存在する可能性が示唆された。これまでの解析から、c-Mycの下流因子として働く新規の癌化関連長鎖非コードRNAであるAS-GEF-XはProtein Xと複合体を形成することでCDK6の発現を調節している可能性が考えられた。そこでAS-GEF-XによるCDK6の発現制御機構の解明を行った。AS-GEF-XとProtein Xが共に細胞質に局在することから、転写後の遺伝子発現制御プロセスに関わっていると推察された。そこで、Protein XおよびAS-GEF-XがCDK6のmRNAと直接結合するか検証した。その結果、AS-GEF-XとProtein X、CDK6 mRNAは3者複合体を形成していることを見いだした。次に、この複合体におけるAS-GEF-Xの機能を明らかにするため、AS-GEF-Xを抑制し、AS-GEF-XのAS-GEF-XはProtein XのCDK6 mRNAへのリクルートを促進していることを見いだした。Protein XはCDK6 mRNAの3'UTRに結合することでmiRNAのアクセスを遮断し、結果としてCDK6のmRNAを安定化していることを明らかにした。さらに、c-Mycを発現抑制した細胞にAS-GEF-XおよびCDK6を強制発現することで、c-Mycの発現抑制に伴う細胞周期の停止がレスキューされた。以上、本研究では大腸がんにおけるc-Myc、AS-GEF-X、CDK6という新規の発癌機構および、新規長鎖非コードRNAであるAS-GEF-Xの作用メカニズムを明らかにした。27年度が最終年度であるため、記入しない。As-GEF-XがCDK6の発現を制御している分子メカニズムを明らかにしていく予定である。当初の実験計画を達成できたため。
犯罪者を親にもつ子どもへの支援に関する総合的研究

例え親が犯罪をしていても、子どもにはその責任はない。しかし現実には、親が犯罪をした子どもは、家庭、学校、社会等において、精神的、物理的、経済的に様々な不利益にさらされている。そこで本研究では、親の犯罪を子ども自身(家族も含む)が被害者である虐待ケース(事件化しているかどうかを問わない)と、被害者が家族以外である場合に分けた上で、子どもの権利条約を中心とした国際基準、先進国の取組を含め、様々な分野からどのような法的支援ができるかを検討した。虐待については防止策、事件化のための法制度も検討した。親が受刑しているケースでは、刑務所内での子の養育、面会等について国際基準を踏まえて日本への提言を行った。本年は研究の初年度であり、本研究が扱うテーマは犯罪を「犯罪者を親にもつ子ども」という視点から捉え直すという、これまでほとんど扱われてこなかったテーマであるため、参加者全員での会議を重ね、各分野からの問題点の洗い出しを行った。全体会議では研究分担者の小西聖子氏より「被害者(子)と加害者(親)にかかわる認知行動療法」に関する報告、研究協力者の立石直子氏より家族法分野における「拘禁者を親にもつ子ども」の扱いに関して報告があり、メンバー全体で知識を共有した。又、各自が担当の国で調査を行った。特に、子どもの権利条約と関連して、「親が拘禁中の子ども」に焦点を絞り、研究代表者、分担者、協力者が現地調査を実施した。矢野はスウェーデン、ノルウェーの状況、小名木明宏はドイツの状況、齋藤実はフィンランドの状況について現地調査を実施したが、本問題は男女共同参画、国の福祉政策と関連していることが明らかとなった。どの国でも「子の最善の利益」を基準として、福祉関係者が子どもの状況を個別に判断していた。又、スウェーデン、ドイツ、フィンランドはいずれも男女共同参画が進んでおり、受刑者と子どもが一緒に暮らすことについて女性受刑者に限定はしていなかった。本年度の時点で明らかになった内容について、2014年の犯罪社会学会第41回大会において、「犯罪者を親にもつ子どもへの法的支援の必要性ー親が受刑中の場合」というテーマセッションを立ち上げ、矢野から企画趣旨を説明した後、法務省矯正局の小島まな美氏に日本の状況について述べて頂いた後、立石が家族法の観点からの問題提起を行い、小名木がドイツ、齋藤がフィンランド、矢野がスウェーデンの状況を述べ、フロアとディスカッションを行った。ディスカッションを通じて、児童相談所の関わりの可能性、矯正施設における被虐待児の扱いについても今後の課題とすることとした。本研究が扱うテーマは犯罪を「犯罪者を親にもつ子ども」という視点から捉え直すという、これまでほとんど扱われてこなかったテーマであるため、参加者全員での会議を重ね、各分野からの問題点の洗い出しを行った。「犯罪者を親にもつ子ども」については、大きく分けて、1自身が親の犯罪の被害者ではない場合、2自身が親の犯罪の被害者である場合の2つのカテゴリーがあり、又、a親が受刑中の場合、b親が社会にいる場合の2つのカテゴリーもあるが、2については被虐待児の研究と大きく重なることから1を中心とし、aについて日本ではこれまでほとんど扱われてこなかったのに対し、世界的には対応が進んでいることから、まずは1aのカテゴリーの子ども達について研究を開始し、海外調査も始め、学会報告も実施したため。昨年度に引き続き、全体会議を開催し、各自の進捗状況を報告し、問題共有に努めた。全体会議では、矢野恵美よりスウェーデンでの調査状況、分担者の小名木明宏氏よりドイツでの調査状況、分担者の齋藤実氏よりフィンランドでの調査状況等について、昨年度の犯罪社会学会での報告よりも詳細な内容が報告され、メンバーで情報を共有した。さらに代表者、分担者、協力者で各人の分担内容、分担国について調査を実施した。分担国については、矢野、齋藤の他、複数の研究協力者によって、英国の状況の調査、スウェーデン、フィンランド、ノルウェーの状況の追調査が実施された。さらに小名木によってドイツの状況の追調査が実施された。2015年5月の刑法学会第93回大会では、女性犯罪者へ刑事政策についてのワークショップを代表者(矢野)が開催し、矢野及び齋藤が女性受刑者と子どもの問題について言及した。2015年11月の犯罪社会学会第42回大会では性犯罪規定に関するテーマセッションを代表者(矢野)が開催し、矢野(スウェーデン)、齋藤(フィンランド)、研究協力者のソ・ウニョンが韓国の性犯罪規定について報告し、子どもが性虐待の被害者の場合の取扱について言及した。2015年11月の法哲学会学術大会において、信州大学関良徳氏主催のワークショップ「性暴力犯罪の法改革に向けて」において、矢野が報告し、日本の性犯罪規定における性的虐待を受けた子どもの扱いの問題点について言及した。2015年12月のジェンダー法学会第13回学術大会において、受刑者を親にもつ子どもへの法的支援に関するワークショップを代表者(矢野)が開催し、矢野、小名木、齋藤、立石直子、松村歌子が2年間の研究の内容を報告した。矢野からは日本における犯罪者を親にもつ子どもが抱える法的問題を整理した報告がなされた。「犯罪者を親にもつ子ども」については、1自身が親の犯罪の被害者ではない場合、2自身が親の犯罪の被害者である場合の2つのカテゴリーがあり、又、a親が受刑中の場合、b親が社会にいる場合のカテゴリーがあり、初年度は1aのカテゴリーの子ども達に関して研究を行った。

研究を進めると、さらに1aについても、i子ども自身が刑務所に居住している場合、ii子ども自身は社会にいる場合、i)受刑中の親が母親の場合、ii)受刑中の親が父親の場合等、様々なカテゴリー分けが必要であることが判明したので、今年度は、細分化の部分も含め分析を行い、家族法、行政の対応についても力点を置きつつ、刑事司法全体における子どもの保護の必要性について研究を進めた。また、研究成果については4つの学会で報告を行っており、大きな成果をあげていると考える。しかし、どの部分も、海外の調査対象国では福祉と連携して対策を進めているが、日本は受刑者の問題は法務省の管轄であり、受刑者ではない子どもの権利に着目した処遇の部分について種々の困難があり、現実的な提案を行うための調査がかなりの量必要であることがわかった。現在、日本の状況も精査しながら慎重に研究を進めているため、進捗状況がやや遅れているが、性急に研究を進め、現実味のない提案を行うことはできないと考えている。最終年度であるので海外調査を行う者はこれまでの調査を踏まえ最終的なインタビュー調査を行った(ドイツ、北欧、ハワイ)。成果報告では、司法福祉学会において、「受刑者を親にもつ子どもへの法的支援」のセッションを立ち上げ、3年間の総括にあたる報告を行った。矢野恵美、松村歌子、立石直子、齋藤実、阿部恭子(ワールド・オープンハート代表)が報告を行った。犯罪社会学会では、「犯罪者を親にもつ子どもの視点から見た被虐待児への対応と虐待者である親との関係について」のセッションを立ち上げた。企画趣旨では、矢野から、犯罪者を親にもつ子どものうち、子ども自身が被害者である児童虐待については、事件化されていないケースが非常に多いことを具体例を挙げて示し、事件化するシステム作り、予防策を講じる必要性を述べた。松村「犯罪者を親にもつ子どもと社会的養護児童福祉施設における現状と課題」、立石「親子の分離と子どもの福祉家族法の視点から」、齋藤「フィンランドにおける児童虐待対策」、矢野「スウェーデンにおける児童虐待の予防と事件化への体制作り」、小名木明宏「ドイツにおける被虐待児への対応と虐待者である親との関係について」を報告した。2017年3月4日には最終総括として、国際セミナー「刑務所内での子どもの養育フィンランドの女性刑務所長と少年社会福祉担当者に聞く」を開催し、ヴァナヤ刑務所長カイサ・モイラネン氏から「フィンランドにおける刑務所内での子どもの養育矯正の観点から」、国立健康・福祉研究所少年部局長マッティ・サルミネン氏から「フィンランドにおける刑務所内での子どもの養育福祉の観点から」の報告があり、多くの研究者、矯正実務家が参加した。この他、以前の科研費で行った受刑者調査のデータを、受刑者と子どもの観点から分析する研究にも着手した。最終成果の一部は『法律時報(2017年1112号)』に掲載された。例え親が犯罪をしていても、子どもにはその責任はない。しかし現実には、親が犯罪をした子どもは、家庭、学校、社会等において、精神的、物理的、経済的に様々な不利益にさらされている。そこで本研究では、親の犯罪を子ども自身(家族も含む)が被害者である虐待ケース(事件化しているかどうかを問わない)と、被害者が家族以外である場合に分けた上で、子どもの権利条約を中心とした国際基準、先進国の取組を含め、様々な分野からどのような法的支援ができるかを検討した。
擬似心拍ストレス環境下でのインビトロ心筋形成技術の構築とバイオ人工心臓への展望

本研究では、細胞に圧縮力学刺激を与え心筋細胞に分化誘導することを目指し、主としてフォトリソグラフィとシリコーン樹脂のモールディングによるマイクロマシニング技術を駆使して分化誘導用のマイクロデバイスを構築した。デバイスの培養面に細胞接着・非接着性を形成するために、一般的なマイクロマシニング技術を応用したゲルマイクロマシニング技術を開発した。開発したマイクロデバイス上に細胞を培養し、細胞に対して定期的に圧縮刺激を与え、分化誘導の様子を観察した。また、その際の分化誘導率を通常の培地内で培養した細胞を比較した。その結果、定期的な圧縮刺激は分化誘導を効率化するための因子であることが示唆された。心筋細胞分化誘導用マイクロデバイスについて、培養面への細胞の接着を阻害するアルギン酸薄膜のパターニング方法について検討した。本研究においては、今後、マイクロデバイスの製作プロセスの中に組み込むことを考慮し、一般的なフォトリソグラフィの技術と同様の工程で細胞接着阻害性を持つアルギン酸薄膜をパターニングする手法を開発した。本手法を用いることによって、様々な形状のマイクロパターンを形成できることを実証した。ただし、現時点では心筋細胞分化誘導デバイスに細胞接着阻害性を持つ細胞培養面を形成するには至っておらず、次年度に検討する予定である。一方、フォトリソグラフィとモールディングによって製作した自己接着性を持つPDMS構造体の積層により、心筋細胞分化誘導用マイクロデバイスを実現した。本デバイスは、細胞外部からの圧縮刺激の制御により、心筋細胞へと分化誘導することを目指したものである。構築したデバイスは、マイクロ流路、圧力印加ポート、細胞導入ポート、細胞培養チャンバ、圧縮刺激用ダイアフラムから構成されており、全て透明材料で構築されているため、刺激に対する細胞の応答・挙動をリアルタイムで評価することが可能である。また、圧力印加ポートからの空気圧の調整により、圧縮刺激用ダイアフラムの変形量をコントロールすることができるため、細胞に対して動的な刺激を与えることが可能である。さらに、細胞の分化誘導に対する予備検討として、当初の計画を繰り上げて、構築した本デバイスを用いて単一細胞に対する動的な圧縮刺激実験を行った。デバイスから圧縮刺激を受ける細胞の様子を光学顕微鏡を用いてリアルタイムで評価した結果、細胞の変形挙動や細胞内カルシウム応答を評価することに成功した。フォトリソグラフィとモールディングによって製作した心筋細胞分化誘導用マイクロデバイスを用いて、細胞への拍動刺激実験を行うための基礎実験を行った。具体的には、マイクロデバイスに導入する圧力と細胞刺激用ダイアフラムの変位量の基本特性を求めた。これにより、細胞刺激用ダイアフラムは印加する圧力に対して線形的に変形することを明らかにした。この結果を基にして、単一細胞への刺激実験を行い、圧縮刺激を受ける細胞の変形挙動をリアルタイムで観察することに成功した。本研究目的の本筋とは少し異なる派生的な内容であるが、刺激量と細胞の変形量・ひずみ量の関係から細胞の力学特性を評価できる事がわかり、今後の研究の新たな展開につながった。一方、細胞への長期的(断続的)な刺激実験を試みたが、細胞の基板への接着不良や培養途中での死滅により、刺激に対する細胞分化挙動を評価することができなかった。この原因は、細胞に充分な栄養と酸素を供給できていないことが考えられる。つまり、本実験において、細胞は培養チャンバ内で培養されているが、チャンバの容量が小さいため細胞周囲に充分な量の培地を供給できていない点、細胞の周囲の培地は拡散によってのみしか移動しか生じないため、細胞周囲の培地の入れ替わりが少ない点が原因として挙げられる。したがって、今後は細胞周囲の環境を改善するために培地の循環システムを設計・製作し、デバイスに組込む。この際、循環する培地の流量によっては細胞に大きな流体力が加わる可能性があるため、この点を充分に考慮した設計を行う。フォトリソグラフィを主とするマイクロマシニング技術とシリコーン樹脂のモールディングによって製作した心筋細胞分化誘導用マイクロデバイスを用いて、細胞への拍動刺激実験を行うために、前年度に課題となっていた長期培養が可能な培地の循環システムを設計・製作した。このシステムは静水圧を用いてデバイス中に培地を供給するものであるため、流体により細胞に大きな流体力が加わることがなく、また、脈動することなく培地を循環できるものである。本システムの構築により、細胞周囲の培地を循環させ、細胞に充分な栄養と酸素を供給できるようになったため、基板への接着不良や培養途中の死滅を防ぐことができた。その結果、1週間以上の期間、細胞を継続して培養することに成功した。本成果により、前年度までの課題であった長期的(断続的)な刺激実験を行うことができるようになった。構築した培地循環システムと心筋細胞分化誘導用マイクロデバイスを接続し、筋芽細胞に定期的な圧縮刺激を行うことによって、筋芽細胞分化誘導実験を行った。細胞が受ける圧縮刺激は2 kPaであり、12時間に1回の周期で各10分間の刺激を与え、8日後の分化の状態を評価した。比較対象として、培養ディッシュ内で通常培養した筋芽細胞を用いた。その結果、定期的に圧縮刺激を与えた場合の方が、通常の培養方法で培養した場合よりも効果的に分化し機能を発現することがわかった。一方、本研究の目的の一つであった、筋芽細胞から心筋細胞への分化誘導については、実現することができなかった。これは、マイクロデバイスの駆動源として使用しているプランジャポンプの能力では、当初目的としていた周期での圧縮刺激を与えることができなかったためであると考えられる。

今後、装置の見直しと再設計、再構築を行い、当初の目的の達成を目指す。本研究では、細胞に圧縮力学刺激を与え心筋細胞に分化誘導することを目指し、主としてフォトリソグラフィとシリコーン樹脂のモールディングによるマイクロマシニング技術を駆使して分化誘導用のマイクロデバイスを構築した。デバイスの培養面に細胞接着・非接着性を形成するために、一般的なマイクロマシニング技術を応用したゲルマイクロマシニング技術を開発した。開発したマイクロデバイス上に細胞を培養し、細胞に対して定期的に圧縮刺激を与え、分化誘導の様子を観察した。また、その際の分化誘導率を通常の培地内で培養した細胞を比較した。その結果、定期的な圧縮刺激は分化誘導を効率化するための因子であることが示唆された。心筋細胞分化誘導マイクロデバイスの設計・試作・動作実験が概ね完了し、細胞の刺激実験とその応答評価を行った。この成果により、計画当初は想定していなかった、細胞の力学特性を評価することに成功し、本デバイスの新たな可能性を見出した。一方、当初予定していた細胞への連続的・断続的な刺激とその際の細胞の分化挙動の評価に至っていない点で課題が存在するが、既に対応策の検討を開始しているため、達成度はおおむね順調であると言える。生物機能・バイオプロセス細胞の刺激により心筋細胞へと分化誘導するために、培養チャンバ内での細胞の接着不良や死滅を改善する。このため、デバイス内の培地を循環するシステムを設計・製作する。このシステムを用いて、本デバイス内でも長期間の培養実験が可能であることを確認する。これに続き、当初の計画通り、細胞に連続的・周期的な刺激を与えることによって心筋細胞への分化誘導実験を行う。前年度までにデバイス内での細胞の培養と刺激、刺激を受ける細胞のリアルタイム観察に成功しているため、これらの成果を基盤として具体的な条件を設定し、刺激を受けた細胞が分化した細胞種を特定すると共に誘導された細胞種と刺激の与え方との相関を取り、心筋細胞への分化誘導条件を導出する。本年度の目標であった心筋細胞分化誘導マイクロデバイスの設計・試作・動作実験が概ね完了した。また、当初の予定を繰り上げてデバイス上での細胞の刺激実験とリアルタイム評価を実施しており、当初の予定より進展がある。一方で、デバイスの培養面に細胞接着阻害性を組込むことができていない点で課題も存在するため、達成度はおおむね順調であると言える。培養チャンバ内への細胞の接着不良や細胞の死滅などの不具合が生じ、マイクロデバイス内の培地の循環が必要だと判断したため、できるだけ予算を確保し、次年度の予算とあわせて培地循環システムを構築することを計画し、次年度への繰越が生じた。まずは、心筋細胞分化誘導用マイクロデバイスの培養面に細胞接着阻害性を組込むことを検討する。細胞接着阻害性材料のパターニング技術は既に開発済みであるため、この技術を使うことによってデバイスへの組込みが可能であると考えている。
MAPキナーゼフォスファターゼによる生体内ヘルパーT細胞分化調節の分子機構

Th1/Th2分化機構の解明は、感染症、発癌、自己免疫疾患やアレルギー疾患の薬物療法の標的分子の特定にとって極めて重要であり、本研究では、Th1/Th2分化を決定する調節機構のうちの2つ:1)ヘルパーT細胞におけるJNK活性、2)抗原提示細胞へのTLRからのシグナル、について解析を進めた。JNK特異的なMAPキナーゼフォスファターゼであるMKP-Mは、ナイーヴヘルパーT細胞に少量発現され、Th2分化でその発現量が上昇する。T細胞特異的MKP-Mトランスジェニック(Tg)マウスの解析と、アデノウィルス発現系などを用いたin vitroの解析によって、ヘルパーT細胞におけるMKP-Mの発現が、生体内の抗原特異的免疫反応のTh2方向への偏位に重要な働きを果たしていることを示した。また、T細胞特異的なDN型MKP-MのTgマウスはTh1優位な抗原特異的免疫反応を示し、自己免疫性肝疾患であるPBCのモデルマウスとして有用な可能性を示した。主な研究実績1)Lckプロモーターを用いたT細胞特異的なMKP-M(野生型およびDN変異体)のTgマウスの系統を確立した。DN変異体Tgマウスの一部では胸腺内T細胞分化異常を認めた。野生型およびDN変異体TgマウスのOVAによる抗原感作を行ったところ、コントロールマウスと比べて、野生型Tgマウスにおいては、血中のOVA特異的IgG1、IgEサブタイプ抗体の増加、およびIL-4産生量の増加を認め、逆にDN変異体Tgマウスにおいては、IgG2aサブタイプの増加、IFNγ産生量の増加を認めた。これらの結果から、MKP-Mの生体内Th1/Th2分化における重要な役割が示唆された。2)自己免疫疾患である原発性胆汁性肝硬変(PBC)のマウスモデルを確立する目的で、Th1優位なDN変異体Tgマウスをピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDC)抗原で感作したところ、野生型マウスでは認められなかった腹水貯留を伴う著明な肝障害を認め、細胆管周囲組織への炎症性細胞の浸潤を認めた。また、DN変異体Tgマウスは、PDC抗原未感作でも血中抗ミトコンドリア抗体の陽性を認め、PBCマウスモデルとして有用な系統であることが示唆された。3)カリニ肺炎感染マウスモデルにおけるTLR4シグナルの役割を明らかにした。4)MKP-Mは骨芽細胞でも強く発現し、その分化に伴って発現パターンが変化することを見いだした。骨代謝におけるMKP-Mの生理的機能について現在解析中である。

Th1/Th2分化機構の解明は、感染症、発癌、自己免疫疾患やアレルギー疾患の薬物療法の標的分子の特定にとって極めて重要であり、本研究では、Th1/Th2分化を決定する調節機構のうちの2つ:1)抗原提示細胞へのTLRからのシグナル、2)ヘルパーT細胞におけるMAPキナーゼ活性、について解析を進めた。MAPキナーゼフォスファターゼの一つであるMKP-Mは、ナイーヴヘルパーT細胞に少量発現され、そのTh1/Th2分化細胞における発現パターンの変化から、Th1/Th2分化調節に特に重要な役割を果たす可能性がある。本年度の研究実績1)Lckプロモーターを用いたT細胞特異的なMKP-M(野生型およびDN変異体)のトランスジェニック(Tg)マウスの系統を確立した。DN変異体Tgマウスの一部では胸腺内T細胞分化異常を認めた。野生型およびDN変異体Tgマウスの卵白アルブミン(OVA)抗原感作を行い、抗原特異的免疫反応を血中免疫グロブリンサブタイプ濃度、各種サイトカイン濃度により解析し、コントロールマウスと比較した。野生型Tgマウスにおいては、血中のOVA特異的IgG1、IgEサブタイプ抗体の増加、およびIL-4産生量の増加を認め、逆にDN変異体Tgマウスにおいては、IgG2aサブタイプの増加、IFNγ産生量の増加を認めた。これらの結果から、MKP-Mの生体内Th1/Th2分化における重要な役割が示唆された。2)Th1優位なDN変異体Tgマウスをピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDC)抗原で感作し、典型的な自己免疫疾患である原発性胆汁性肝硬変(PBC)マウスモデルを作成した。4)カリニ肺炎感染マウスモデルにおいて、TLR4シグナルが感染抵抗性に重要な役割を果たしていることを明らかにした。Th1/Th2分化機構の解明は、感染症、発癌、自己免疫疾患やアレルギー疾患などの病態解明に極めて重要である。TLR下流シグナルに関わるMAPキナーゼフォスファターゼの一つであるMKP-Mは、ナイーヴヘルパーT細胞にも少量発現され、Th2分化でその発現量が上昇する。昨年度のT細胞特異的トランスジェニック(Tg)マウスの解析において、CD4(+)T細胞におけるMKP-Mの発現が、生体内の抗原特異的免疫反応のTh2方向への偏位に重要な働きを果たしていることを示した。本年度の研究実績1)昨年度に引き続き、T細胞特異的なMKP-M(野生型およびDN変異体)のTgマウスの系統の詳細な解析を進めた。DN変異体Tgマウスの1系列(DN変異体の強発現系統)で胸腺内T細胞分化異常を認め、CD4(+)CD8(+)double positive細胞からsingle positive細胞への分化過程の障害を確認した。よってMKP-MがT細胞の胸腺内分化にも関わることが示唆され、現在その分子機構の解明を進めている。2)典型的な自己免疫疾患である原発性胆汁性肝硬変(PBC)のマウスモデルを確立する目的で、Th1優位なDN変異体Tgマウスをピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDC)抗原で感作したところ、野生型マウスでは認められなかった腹水貯留を伴う著明な肝障害を認め、細胆管周囲組織への炎症性細胞の浸潤を認めた。また、DN変異体Tgマウスは、PDC抗原未感作でも血中抗ミトコンドリア抗体の陽性を認め、PBCマウスモデルとして有用な系統であることが示唆された。この結果を現在投稿準備中である。3)骨と免疫の関係が最近注目されているが、今年度の解析で、MKP-Mは骨芽細胞でも強く発現し、その分化に伴って発現パターンが変化することを見いだした。骨芽細胞におけるMKP-Mの生理的機能について現在解析中である。