hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
慢性大動脈解離entry閉鎖を目的とした生体適合性形状記憶ポリマーの開発

この特性のため、アモルファス状態で形を変形した後に融点以下まで温度を下げることで、変形した形を一時的に記憶させることが可能である。また再び融点以上に加熱することで、一度記憶した形を再び元の形へ戻すことができる。PCLの融点が60°C付近であり、これまで生体分野への応用が困難であったが、共同研究先の独立行政法人・物質材料研究機構研究室荏原らの研究成果でもあるPCLの分子量、分岐数、D,L-乳酸との混合比などを精密に設計することで生体への応用も可能となった。デバイスの形状としては、entry閉鎖のため特殊な形態が必要となり、平成27年度の計画では、この特殊な形状を鋳型にいれ、作成することであった。平成28年度も同様にこのデバイスの作成が主たる研究課題であった。平成29年度もこのデバイスの作成に時間を要したが、現在まだ、動物実験に至るデバイスの開発には至っていない。昨年同様、材料の作成において予想以上の遅延が発生している。その理由としては、水酸基の数が異なる多価アルコールを開始剤として、開環重合を行うことで、分岐型ポリカプロノラクトン(PCL)を合成するが、entry閉鎖をする形状にすることが難しく、その形状に関して議論し、まだ鋳型の作成に至っていない。大動脈解離は、我が国では発症頻度高く、上行大動脈から解離が発症する急性大動脈解離Stanford A型は、手術をしないと1週間以内に約9割のかたが死亡する致死的な疾患である。左鎖骨下動脈直下に解離が発症するStanford B型においても、臓器の虚血症状がないときは、降圧療法による保存的治療が一般的であるが、慢性期に瘤の拡大を認める症例も多い。本症の病態は、大動脈中膜が解離し、動脈が真腔と偽腔にわかれ、両者はフラップと呼ばれる裂口(entry)で隔てられる。慢性期Stanford B型解離においては、entry閉鎖も含めた術式もあるが手術時の脳梗塞および下半身麻痺の合併もあり、手術侵襲は多大である。最近では、ステントグラフトを留置する術式もある。今回の研究目的は、entry閉鎖可能な生体適合性形状記憶ポリマーを開発して、実験的モデルを作成し、臨床応用に結びつけるものである。平成30年度は、昨年までと同様に作成したポリ(e-カプロラクトン)(PCL)誘導体を使用し、in-vitro、in-vivoの実験系の確立にあて、開発した担体の有用性を検討する予定であったが、理想とする生体適合性形状記憶ポリマーの開発に難渋し、完成にはいたらなかった。そのため、予定していた、大動物の大動脈モデルを設置し、in-vitroの実験系の作成や、大動物でのin-vivoの実験に到達することがかなわなまま終了した。今後は、平成27年度同様、entry閉鎖可能な形状の模索および試験モデルの作成評価にあてる。理想的な生体適合性形状記憶担体が作成できたら、37°Cの温生食内に拍動可能な大動物の大動脈モデルを設置し、in-vitroの実験系の作成を行う。担体の生体への適合性、穴への生着度評価などを行う。今後は、平成27年、28年度同様に、entry閉鎖可能な形状の模索および試験モデルの作成評価にあてる。鋳型の作成および、試験モデルの形状評価が主たる研究となる。
規整表面上に精密集積した金属錯体触媒の開発

本研究課題では、触媒調製の新しいアプローチとして、構造が規整された表面上に分子レベルで精密に金属錯体を集積することによって特異かつ有用な触媒反応場を構築する手法の開発を試みている。今年度は、金表面上における種々の高密度なジイソシアニド金属錯体単分子層の形成とその触媒機能、および、規則性メソポーラス有機シリカ表面上における金属錯体高密度固定化について検討を行った。有機化合物が表面上で高密度な自己組織化単分子層を形成する現象は種々の機能性材料の調製手法となる。この現象を触媒調製に利用した例は少ないが、特異的な触媒反応場の構築手法として展開できる可能性を秘めている。最も利用されている自己組織化単分子層は金表面上のチオール分子の系であるが、我々は新展開を図るべく、研究例の非常に限られたイソシアニド単分子層を触媒反応場の構築に利用することに着手した。今年度は、金表面上に新たに高密度なニッケルおよび鉄ージイソシアニド単分子層の形成を行い、その触媒機能を精査した。メソポーラスシリカは担持金属触媒の担体として広く用いられている。規則的なメソ細孔空間内に活性金属種を導入して特殊な触媒反応場として利用する試みが報告されているが、配位子分子を導入するために元来のメソ細孔の規則性が失われることが多い。そこで今年度の研究では、配位子分子が骨格内に組み込まれた規則性メソポーラス有機シリカを活用することとした。特に、特異な触媒機能の発現が期待される複核錯体構造としての高密度固定化を可能にする手法の確立を目指した。また、今年度の検討では、メソポーラスシリカおよびゼオライト鋳型炭素に担持した白金ナノ粒子がそれぞれ微量エチレンの低温酸化およびフェニルアセチレンの部分水素化において優れた触媒機能を有することを見出した。24年度が最終年度であるため、記入しない。触媒調製の新しいアプローチとして、構造が規整された表面上に分子レベルで精密に金属錯体を集積することによって特異かつ有用な触媒反応場を構築する手法の開発を試みた。今年度は、金表面上における高密度なジイソシアニドーロジウム錯体単分子層の形成とその触媒機能、および、メソポーラスシリカ表面上における表面選択的有機修飾手法について主に検討を行った。金表面を4,4-terphenylenediisocyanide(TPDI)および[Rh(CO)2Cl]2の溶液に段階的に浸漬することにより高密度なRh-ジイソシアニド単分子層を得た。触媒の構造解析および導入されたRhの定量は、XPS、IR-RAS、ICP-MSなどにより行った。このようにして得られた単分子層は、炭素-炭素不飽和結合の水素付加反応に高い触媒と回転数と繰り返し利用性を示した。特に、α,β-不飽和カルボニル化合物を基質とした際には、対応する均一系触媒条件よりも高い選択性で1,4-還元体を与えた界面活性剤を細孔内部に有するas-synthesized MCM-41をトリメチルシリルトリフラート(Me3SiOSO2CF3)で処理することにより、外表面選択的なシリル化を達成した。従来多用される他のシリル化試薬を用いた場合には、選択性や修飾効率に点で問題があることが明らかとなった。本研究では、固体29Si NMRなどの各種分析種法を用いて有機修飾に関する詳細かつ定量的な構造解析を行った。交付申請書記載の「研究の目的」に相当する研究の実施および成果の取得が行えたため。

研究計画通りに、表面上に隣接する金属錯体間での協奏的な触媒機能を鍵とする触媒反応の開発、および、メソ細孔空間内部に精密に形成した金属錯体の集積体を鍵とする触媒反応の開発を実施する。
モジュール連動に基づく対話システム基盤技術の構築

現在の対話システムの主な構成論は,複数のモジュールを疎結合させ,各モジュールを学習データにより改善するというものである.しかし,このような構成論で構築されたシステムは,疎結合であるがゆえに,全体最適化が困難である.また,可塑性に乏しく,一度学習されたモュールを動的に変更することは難しい.その結果,ユーザや状況に応じた対話ができず,人間がシステムを熟知しなくては対話が成立しない.本研究では,現在の対話システムの基本構成を見直し,ユーザや状況に応じてシステム全体の効用を最大化できるように複数のモジュールが連動することで理解・生成を行う対話システム基盤の構築を目指す.現在の対話システムの主な構成論は,複数のモジュールを疎結合させ,各モジュールを学習データにより改善するというものである.しかし,このような構成論で構築されたシステムは,疎結合であるがゆえに,全体最適化が困難である.また,可塑性に乏しく,一度学習されたモュールを動的に変更することは難しい.その結果,ユーザや状況に応じた対話ができず,人間がシステムを熟知しなくては対話が成立しない.本研究では,現在の対話システムの基本構成を見直し,ユーザや状況に応じてシステム全体の効用を最大化できるように複数のモジュールが連動することで理解・生成を行う対話システム基盤の構築を目指す.
High-Resolution Manometryによる高齢者嚥下咽頭圧の評価

高齢者における嚥下機能の加齢変化に関して、嚥下圧検査に関しては従来の査法では充分なデータが得られていなかった。本研究では最新型の圧トランスデューサを20チャンネル有するHigh-Resolution Manometryを使用して65才以上の高齢者ボランティアを対象として、嚥下時の咽頭圧測定を行った。対照として2039歳の若年成人の嚥下咽頭圧の測定も行った。また、今回の研究で嚥下機能を比較評価するために、新たなパラメーターとして嚥下咽頭運動量を考案した。高齢者群は若年成人群と比較して嚥下咽頭運動量に統計学的に有意な差は無かった。高齢者においては重大な疾患がなくても生理的に嚥下機能が低下することは一般的に知られている。具体的には、嚥下反射の惹起遅延、食塊駆動力の低下、嚥下運動のタイミング異常などである。嚥下機能の加齢変化に関しては、これまでの文献報告でも多角的な検討がなされているが、嚥下圧検査に関しては、従来式の圧トランスデューサー(4チャンネル)を用いた検査法では満足なデータが得られていなかった。今回本研究で使用するHigh-Resolution Manometry (HRM)は本来食道内圧を測定するために開発された新しい多チャンネル食道内圧計で、全周性の圧センサーが1cm間隔で20チャンネルあり、上咽頭から頸部食道までの圧測定を空間的にも時間的にもシームレスに行うことができる。また得られたデータは、深さ(距離)と時間を2軸とした平面上に、圧変化を色の変化で表現され、等高線地図の様な視覚的・直感的に理解しやすい形で表される。そのため、嚥下時の咽頭収縮による咽頭内圧の変化、食塊駆動力、収縮伝播速度などより詳細かつ正確に測定・解析できるようになった。本研究では高齢者(65歳以上)における嚥下内圧の時間的変化を測定し、圧変化のパターン分類や咽頭収縮の伝播速度の解析を行っている。また、対照として2030歳代の若年成人のデータも収集している。高齢者と若年者のデータを比較することで生理的な加齢性変化を分析し、状況に応じたリハビリ方法や食物剤形を工夫するなど、誤嚥防止に寄与できる方法を模索中している。本年度は新たに高解像度マノメトリーの最新システム一式を購入した。まずは新しいこのシステムの使用法を習熟することからはじめた。コンスタントに安定したデータを習得できることを確認できたため、本来の目的である、ボランティアによるデータ集取を行っている。嚥下機能の加齢変化に関しては、これまでの文献報告でも嚥下内視鏡検査や嚥下造影検査、嚥下圧検査、下咽頭収縮筋の組織学的変化の検討など多角的な検討がなされている。しかしながら嚥下圧検査に関しては、従来式の圧トランスデューサーを用いた検査法では満足なデータが得られていなかった。今回本研究において使用するHigh-Resolution Manometry(HRM)は本来食道内圧を測定するために開発された最新の多チャンネル食道内圧計で、全周性の圧センサーが1cm間隔で20チャンネルあり、上咽頭から頸部食道までの圧測定を空間的にも時間的にもシームレスに行うことができる。また得られたデータは深さ(距離)と時間を2軸とした平面上に、圧変化を色の変化で表現され、等高線地図の様な視覚的・直感的に理解しやすい形で表される。そのため、嚥下時の咽頭収縮による食塊駆動力、収縮伝播速度などをより詳細かつ正確に測定・解析できるようになった。本研究では高齢者(65歳以上)における嚥下圧を測定し、圧変化のパターン分類や咽頭収縮の伝播速度の解析を行っている。また今回の研究で、嚥下の咽頭圧の評価項目として、新たにサブトラクション法を用いた嚥下咽頭運動量を考案した。また対照として20ー30歳代の若年成人のデータも収集した。それぞれのデータは収集が完了しており、若年者と高齢者とのデータを比較することで、生理的な加齢性変化を分析し、状況に応じたリハビリ方法や食物剤形の工夫するなど、誤嚥防止に寄与できる方法を検討している。本年度は新規に購入した検査システムの習熟に重点を置き、確実に安定したデータを得られることを確認した上で、本来のボランティアのデータ収集を開始した。来年度中に、当初の計画通りのデータ収集を完了し、解析をおこなう。

摂食嚥下障害学当初の計画通りの人数のボランティアのデータ収集を行う予定である。データ収集後はすみやかにデータの解析をおこなう。高解像度食道内圧計(スターレット一式)を購入した金額の差額である。ボランティアの謝金として使用予定である。
オーストラリアにおける社会性昆虫類の分類学・生態学的研究

本研究は、ハチ、アリ、シロアリ等の真社会性昆虫の社会性の進化ルートおよびそのメカニズムを考察するため、これらの原始的な種類を多数かかえているオーストラリアにおいて生態学的・分類学的調査を行なったものである。昭和61年度に予備調査、62年度に本調査を行ない、引き続いて本年度はその総括作業を行なった。以下、一連の研究成果の概要を各昆虫群ごとに述べる。1.狩りバチ類に関しては、チビアシナガバチ属の5種の社会構造の研究を行なった。その中で、Ropalidia revolutionalisにおいては、創巣が複数のメスで行なわれ、それらのメス間に産卵上の優劣差が明瞭に認められることが分かった。また、巣が拡大し複巣になると攻撃行動が高いレベルに達することが観察された(Ito,1987)。特筆すべき発見はRopalidia plebeianaにおける創設直後の巣の分割によるコロニーの増殖法であるこのような増殖法は、従来、社会性昆虫ではまったく知られていなかったものであり国際的に注目されるであろう(Yamane,Ito & Spradbery,in prep.)。このハチは、橋の下などに巨大な巣集団を作る。それは極めて密な集団であるが、個々の巣は独立しており、それぞれを占有しているメスは、別巣に移ることはない(Ito & Higashi,1987)。このような営巣様式の適応的な意味を知るため一つの巣集団内の個々の巣の生存率と繁殖メス生産率を調査した。巣の生存率は極めて高く、古巣、新巣ともに90%近くに達していた。これはこれまで知られていた他のアシナガバチ亜科の値に比して最も高い値である。1コロニー・サイクルの間の繁殖メスの数は11倍にも増加していた。本種の巣集団形成はこのような高い増殖率を実現させる点で有利であると考えられる。おそらくヒメバチ等の寄生に対処する上で重要な方策であると思われる(Ito,Yamane & Spradbery,1988)。2.アリ類に関しては、系統学の観点から興味深いいくつかの原始的な種をとりあげた。各地のトビキバハリアリ類の染色体を調査した結果、特異的な染色体多型が発見された。このアリは従来は1種と考えられていたが、染色体、形態、生態の面からいくつかの新種に分けられるべきものであり、染色体進化と種分化の問題を明かにする上で大変重要なものであることが分かった(Imai,Taylor,Crosland & Crozier,1988)。キバハリアリの1種であるMyrmecia brevinodaの巣を掘り、その全コロニーを詳細に調べた。全数で2576匹のワーカーがおり、それらは大小の2型を示し、小ワーカーは巣の下部に、大ワーカーは上部に多かった。そして、小ワーカーは内部の巣作り、大ワーカーは狩猟、防衛、外部の巣作りを行なっていることが分かった(Higashi,in prep.)。シロアリの塚内に生息している8種のアリを調査し、それらとシロアリとの関係を考察した。これらのアリ類は、塚を作るシロアリに対する破壊的な捕食者であるIridomyrmex sunguineaにたち向かう。結果として、これらのアリとシロアリの間には共生(相互扶助)的関係が成立していると考えられた(Higashi,in prep.)。3.シロアリ類に関しては、山地熱帯多雨林におけるシロアリ群集の種組成、生活様式、個体群密度、現在量を調べた。6種のシロアリが発見されたが、内5種は下等なものであった。東南アジア、アフリカ、南米などの熱帯多雨林でのシロアリ群集と比較すると、オーストラリアは種類数が極端に少なく、下等な種の割合が高いことで、他の地域とは大きく異なっていることが分かった(Abe,in prep.)。4.シロアリの社会性の起源を考察する上で重要な、朽木中に生息する食材性のオオゴギブリ属の4種のコロニー組成についてのデータを詳しく取り、これらのゴキブリの亜社会性生活の意味を考察した(Matsumoto,1988)。また、従来ほとんど知られていなかったヨロイモグラゴキブリの調査を行ない、その生活様式を詳細に明らかにした。このゴキブリはオートラリア東北部のユーカリ疎林地帯に分布し、地中に営巣して家族を形成する。また、その生息密度の高さ、巨大な体のことを考えると、社会進化学上たいへん注目されるものである(Matsumoto,in prep.)。

特筆すべき発見はRopalidia plebeianaにおける創設直後の巣の分割によるコロニーの増殖法であるこのような増殖法は、従来、社会性昆虫ではまったく知られていなかったものであり国際的に注目されるであろう(Yamane,Ito & Spradbery,in prep.)。このハチは、橋の下などに巨大な巣集団を作る。それは極めて密な集団であるが、個々の巣は独立しており、それぞれを占有しているメスは、別巣に移ることはない(Ito & Higashi,1987)。このような営巣様式の適応的な意味を知るため一つの巣集団内の個々の巣の生存率と繁殖メス生産率を調査した。巣の生存率は極めて高く、古巣、新巣ともに90%近くに達していた。これはこれまで知られていた他のアシナガバチ亜科の値に比して最も高い値である。1コロニー・サイクルの間の繁殖メスの数は11倍にも増加していた。本種の巣集団形成はこのような高い増殖率を実現させる点で有利であると考えられる。おそらくヒメバチ等の寄生に対処する上で重要な方策であると思われる(Ito,Yamane & Spradbery,1988)。2.アリ類に関しては、系統学の観点から興味深いいくつかの原始的な種をとりあげた。各地のトビキバハリアリ類の染色体を調査した結果、特異的な染色体多型が発見された。このアリは従来は1種と考えられていたが、染色体、形態、生態の面からいくつかの新種に分けられるべきものであり、染色体進化と種分化の問題を明かにする上で大変重要なものであることが分かった(Imai,Taylor,Crosland & Crozier,1988)。キバハリアリの1種であるMyrmecia brevinodaの巣を掘り、その全コロニーを詳細に調べた。全数で2576匹のワーカーがおり、それらは大小の2型を示し、小ワーカーは巣の下部に、大ワーカーは上部に多かった。そして、小ワーカーは内部の巣作り、大ワーカーは狩猟、防衛、外部の巣作りを行なっていることが分かった(Higashi,in prep.)。シロアリの塚内に生息している8種のアリを調査し、それらとシロアリとの関係を考察した。これらのアリ類は、塚を作るシロアリに対する破壊的な捕食者であるIridomyrmex sunguineaにたち向かう。結果として、これらのアリとシロアリの間には共生(相互扶助)的関係が成立していると考えられた(Higashi,in prep.)。3.シロアリ類に関しては、山地熱帯多雨林におけるシロアリ群集の種組成、生活様式、個体群密度、現在量を調べた。6種のシロアリが発見されたが、内5種は下等なものであった。東南アジア、アフリカ、南米などの熱帯多雨林でのシロアリ群集と比較すると、オーストラリアは種類数が極端に少なく、下等な種の割合が高いことで、他の地域とは大きく異なっていることが分かった(Abe,in prep.)。4.シロアリの社会性の起源を考察する上で重要な、朽木中に生息する食材性のオオゴギブリ属の4種のコロニー組成についてのデータを詳しく取り、これらのゴキブリの亜社会性生活の意味を考察した(Matsumoto,1988)。また、従来ほとんど知られていなかったヨロイモグラゴキブリの調査を行ない、その生活様式を詳細に明らかにした。このゴキブリはオートラリア東北部のユーカリ疎林地帯に分布し、地中に営巣して家族を形成する。また、その生息密度の高さ、巨大な体のことを考えると、社会進化学上たいへん注目されるものである(Matsumoto,in prep.)。
HWY系ラットの毛包形成異常にかかわる遺伝子群の解明

1)本ラット原因遺伝子Hwyはラット第15番染色体上のD15Ish3-D15Got58間(約0.17cM)に存在する。この領域はマウス第14番染色体のD14Mit223-D14Mit193間およびヒト第8番染色体に相当し、各種ゲノムデータベースから約50の遺伝子が候補遺伝子として存在すると考えられる。それらの候補遺伝子全てについて、cDNA翻訳領域の塩基配列について解析を行ったところ、3つの遺伝子においてHWYおよびBNラット間での系統間多型が認められた。この3遺伝子が原因遺伝子である可能性が考えられた。本ラットでは原因候補領域内にセントロメアが存在することよりこれ以上の解析は困難であるため、本ラット原因遺伝子と同遺伝子の変異が考えられるHr^Nマウスの凍結卵を米国オークリッジ国立研究所より輸入し、このマウスを用いて連鎖解析を実施するべく育種中である。2)HWYラットに由来する原因遺伝子領域をBNラットの遺伝的背景に導入したコンジェニックラットの作製を計画し、現在、戻し交配第8世代(N8)を得ている。あと2世代の交配によりコンジェニック化が完了する。なお、本研究は本年度から米国コロンビア大学医学部Christiano博士との共同研究により研究を行っている。1)BN系ラットとの間のF_2個体(577検体)を用いた連鎖解析を行ったところ、本ラット原因遺伝子Hwyはラット第15番染色体上のD15Ish3-D15Got58間(約0.17cM)に存在することが明らかとなった。この領域はマウス第14番染色体のD14Mit223-D14Mit193間およびヒト第8番染色体に相当し、候補遺伝子として、無毛突然変異が報告されているhairless(hr)、およびヒトの遺伝的貧毛症"hypotrichosis of Marie Unna"の原因遺伝子(未知)が予想された。しかし、本ラットの毛包形成異常の組織像およびhr遺伝子に関する検索(mRNAの発現量、全長cDNAおよびゲノムDNAの塩基配列)からhrはHwyではないと考えられた。(投稿準備中)2)ヒトおよびマウスのゲノムデータベースから、上記の原因遺伝子候補領域には約50の遺伝子が存在していると推定される。それらの各組織での発現情報や、予想される蛋白の構造・機能、KOマウスの表現型などから18遺伝子に候補を絞った。現在、HWYおよびBNラットcDNAを用いて各因子翻訳領域の塩基配列の解析を行っている。3)HWYに由来する原因遺伝子領域をBNラットの遺伝的背景に導入したコンジェニックラットの作製を計画し、現在、戻し交配第2世代(N_2)を得ている。スピードコンジェニック法を用いてN_5ないしN_6でコンジェニックラットを完成させる予定である。遺伝的背景の統一の後に、変異および正常ラット皮膚mRNAを検体としてSubtractive Hybridization法を行い、両ラット皮膚で発現量の異なる(=Hwyにより制御を受ける)遺伝子群を明らかにする予定である。それらの候補遺伝子全てについて、HWYおよびBNラット皮膚cDNAを用いてRT-PCRによる発現量解析を行ったが、両系統ラット間で発現量に大きな差のある因子は認められなかった。2)続いて、各候補因子cDNA翻訳領域の塩基配列について解析を行ったところ、3つの遺伝子においてHWYおよびBNラット間での系統間多型が認められた。いずれの多型についてもHWYタイプの多型は他のラット6系統では認められなかった。このことから、この3遺伝子が原因遺伝子である可能性が考えられた。今後In situ hybridization法を用いてこの各因子の毛包での発現様式を検索する予定である。3)HWYラットに由来する原因遺伝子領域をBNラットの遺伝的背景に導入したコンジェニックラットの作製を計画し、現在、戻し交配第5世代(N5)を得ている。まだ完全なコンジェニック状態ではないが、N5世代におけるHWY由来染色体領域の割合はおよそ3%と推測される。そこでN5世代のヘテロ個体同士の交配により得られる、変異および正常ラット皮膚mRNAを検体としてSubtractive Hybridization法を行い、両ラット皮膚で発現量の異なる(=Hwyにより制御を受ける)遺伝子群を明らかにする予定である。

2)HWYラットに由来する原因遺伝子領域をBNラットの遺伝的背景に導入したコンジェニックラットの作製を計画し、現在、戻し交配第8世代(N8)を得ている。あと2世代の交配によりコンジェニック化が完了する。なお、本研究は本年度から米国コロンビア大学医学部Christiano博士との共同研究により研究を行っている。
伸長成長におけるオーキシン作用機構の分子生物学的・遺伝学的研究

研究代表者らは、ヤエナリ下胚軸切片でオーキシンによって発現が誘導されるmRNA、Arg1の塩基配列を明らかにした(Yamamoto et al.,1992)。Arg1はそのアミノ酸配列より、生体膜を2回貫通している膜タンパクをコードしていることが推測されたが、その実体は分からなかった。今回新たにタンパク・データベースを検索した結果、Brassica napusの△15位の脂肪酸不飽和化酵素(Fad3;Arondel et al.,1992)と69%、Syne-Chocystisの△12位の脂肪酸不飽和化酵素(DesA;Wada et al.,1990)と25%の同一性アミノ酸レベルで示すことが分かった。Arg1もFad3もN末端にシグナル・ペプチドを持たないが、C末端近くのリシン残基がERへの保持シグナルとなっていると考えられる。以上の結果から、Arg1はヤエナリのERでグリセロリピッドを基質として働く△15脂肪酸不飽和化酵素であると結論できる。ノーザン分析によって、Ara1mRNAは、胚軸と根の先端および幼葉の成長の盛んな器官に多く分布していること、オーキシン処理後20分後に蓄積が見られることが分かった。胚軸切片でオーキシンによって誘導される遺伝子はいくつか報告されているが、その実体が明らかになったのはArg1が最初である。脂質代謝とオーキシンとの関係は今までに研究されたことがなかったが本研究の結果はオーキシン作用機構に脂質代謝が関与している可能性を強く示唆している。実際、オーキシンによる伸長成長の際にはエキソサイトーシスが急速に促進されることが知られており(Hager et al.,1991)、今後はオーキシン作用における生体膜系の代謝回転と脂質代謝の関係を追及する必要があるように思われる。
多国籍アングロフォンコミュニティの言語変化と社会的ネットワークモデルの構築

本研究は日本の多国籍アングロフォンコミュニティで英語方言接触によって誘発される言語的アコモデーションに着目し、話者の社会的ネットワークの影響力を考察した。「義務」と「所有」を表す英語表現に焦点を当て統計分析を行った結果、話者の出身国やソーシャルネットワークにより、他の英語バラエティへのコンバージェンスとダイバージェンスの両方が見られた。本研究はコミュニティ内での言語変化のメカニズムを明らかにし、方言接触の影響と個々の話者に起こる言語アコモデーションを説明する上での話者のネットワークの重要性を提示した。平成26年度は多国籍アングロフォンコミュニティ内における言語変化を調査するため、まず「義務を表す動詞表現」の分析に着手した。言語コーパス(実時間調査によって得られた英語母語話者の自然談話録音データ)より、「義務を表す動詞表現」の分析対象使用例を抽出し、言語内的要因や被験者の社会的属性・社会的ネットワークをコード化したものとともに、統計ソフトのデータファイルに入力する作業を行った。統計用ソフトSPSSのペアサンプルのT検定、ピアソン相関係数、重回帰分析等の統計分析により、1各話者の英語の文法的なバリエーションと起こりつつある言語変化、2国籍別グループの「義務を表す動詞表現」のバリエーションと変化の傾向、3言語変化と社会的ネットワークの関係、4言語変化と言語内的要因との関係等を明らかにした。26年度に得られた研究成果は海外共同研究者とともにThe International Society for the Linguistics of English 2014 (2014年8月スイス・チューリッヒ)にて報告した。多国籍アングロフォンコミュニティ内における言語変化を調査するため、「義務を表す動詞表現」に続き平成27年度は「所有を表す動詞表現」の分析に着手した。言語コーパス(実時間調査によって得られた英語母語話者の自然談話録音データ)より、「所有を表す動詞表現」の分析対象使用例を抽出し、言語内的要因や被験者の社会的属性・社会的ネットワークをコード化したものとともに、統計ソフトのデータファイルに入力する作業を行った。統計用ソフトSPSSのペアサンプルのT検定、ピアソン相関係数、重回帰分析等の統計手法を用い、1各話者の英語の文法的なバリエーションと起こりつつある言語変化、2国籍別グループの「所有を表す動詞表現」のバリエーションと変化の傾向、3言語変化と社会的ネットワークの関係等を分析した。研究計画予定通り、モビリティ向上に伴い世界各地の英語圏から来日する英語母語話者の言語のバリエーションと変化を、「義務を表わす動詞表現」と「所有を表わす動詞表現」の観点から検証し、話者の複雑な人間関係が言語変化に与える影響を社会的ネットワーク観点から分析を行ってきた。またここまでの研究結果は国内外の学会で報告しており、おおむね順調に進展していると判断する。本研究は日本の多国籍アングロフォンコミュニティ内の英語方言接触によって誘発される文法上の言語的バリエーションと変化のメカニズムを解き明かし、モビリティ性の高いコミュニティの言語行動に応用できるソーシャルネットワークアプローチを用いて言語的アコモデーションを考察した。平成28年度は言語コーパス(実時間調査によって得られた英語母語話者の自然談話録音データ)より抽出した「所有を表す動詞表現」(have got, have, got)の分析を引き続き行い、1出身国グループ別の「所有を表す動詞表現」のバリエーションと変化の傾向、2言語変化と社会的ネットワークの関係等を統計分析により明らかにした。出身国別の分析では、他の英語バラエティへのコンバージェンスとダイバージェンスの両方が見られた。イングランド人被験者は来日一年後にイギリス英語をより特徴づけるダイバージェンスの変化を見せた一方、ニュージーランド人の英語にはアメリカ英語へのコンバージェンスが観察された。個々の話者の変化の方向や増減の幅は一様ではなく、出身国別の結果と必ずしも一致するものではない。ソーシャルネットワークの分析により、イングランド人の被験者の場合あらゆる英語圏出身の英語母語話者とのネットワーク強度がhaveやhave gotの使用率の変化に強い影響を与えることなどが判明した。「義務を表す動詞表現」(must, have got to, have to, got to)と「所有を表す動詞表現」の量的分析により、中期的方言接触の結果個々の話者に起こる言語変化を説明する上で、話者の社会的ネットワークは重要な役割を果たすこと、また文法的コンバージェンスは音韻的なものよりもかなり長い期間を必要とすることを本研究は示唆した。研究計画予定通り、26年度は「義務を表わす動詞表現」について社会的ネットワークと言語内的要因の観点からの分析を行い研究結果を報告した。平成28年度は「所有を表す動詞表現」の分析を引き続き行い、言語変化と社会的ネットワークの関係、言語変化と言語内的要因との関係等を統計分析により明らかにする。また日本の多国籍アングロフォンコミュニティ内で起きている文法上の言語的バリエーションと変化のメカニズムを解き明かし、より複雑でモビリティ性の高いコミュニティの言語行動に応用できる社会的ネットワークモデルを構築する予定である。社会言語学平成27年度は「所有を表す動詞表現」に焦点を当てデータ入力と分析を行う。

平成28年度までに日本の多国籍アングロフォンコミュニティ内で起きている文法上の言語的バリエーションと変化のメカニズムを解き明かし、より複雑でモビリティ性の高いコミュニティの言語行動に応用できる社会的ネットワークモデルを構築する予定である。データ入力は申請者本人が行い、英文校正は共同研究者が行ったため、予定していた謝金の予算が残金となった。旅費の申請手続きに一部不備のあることが年度末に判明し差額が残金となった。残金は2016年にスペイン・ムルシアで開催されるThe 21st SociolinguisticsSymposiumに参加するための旅費の一部に充てる。残金は次年度の旅費に充てる。
熱帯雨林は人類にとって魅力的環境か:カメルーン南部熱帯雨林住民の生態人類学的研究

本研究の目的は,カメルーン南部の熱帯雨林において,ピグミーとして知られるバカ人を協力者として,森の野生食物だけで一定期間生活するという実験的狩猟採集生活の観察調査を通して,1)熱帯雨林は農耕開始以前の人類の生息環境たりえたか,2)もし,そうならば,それはいつからか,そして,何がそれを可能にしたか,等について検討し,人類の生息環境としての熱帯雨林を進化史的観点から評価することである。2003年は8月の小乾季,2005年には10月の雨季においてそれぞれ上記の観察調査を実施した。また,2004年には,狩猟採集生活と現在の定住集落における日常生活を比較するために定住集落における日常活動観察調査を実施した。また,そのとき,実験協力者のエネルギー消費量を推定するためにバカ人一般の基礎代謝量,諸活動の標準的エネルギー消費量の計測調査も実施した。資料の整理中である現在の段階で言えることは以下の通りである。小乾季,雨季とも20日間の農作物を利用しない狩猟採集生活は十分可能であった。期間中の主要食物は野生ヤマノイモであった。これは全食物エネルギー量の過半を安定的に供給していた。その他に獣肉,魚類,ナッツ類が主要な補完的食物として,さらに,蜂蜜,シロアリなど多様な食物が森における食生活を支えていた。それらの食物を得るためのコスト,すなわち,エネルギー消費については現在分析中である。この分析が終われば,さまざまな環境下における狩猟採集生活との比較が数量的に可能になり,人類の生息環境としての熱帯雨林の客観的評価の道が開けるであろう。また,この分析のためにおこなったバカ人60名の基礎代謝量調査によってピグミー系狩猟採集民の基礎代謝量が世界で初めて明らかになるだろう。なお,成果の一部は年末にインドで開かれる国際狩猟採集社会会議において発表する予定である。熱帯雨林において人類は野生食物資源だけで生存可能かという問題を検証するためカメルーン南部の乾季の熱帯雨林において農作物に依存しない純粋な採捕生活実験を試みた。実験は8月17日から9月5日まで20日間,当地の狩猟採集民バカの6夫婦を被験者として実施した。調査項目は,体重,血圧,運動量など被験者の生理学的側面,採捕食物の同定と重量測定など栄養学的側面,加速時計や追跡観察による生計活動の行動学的側面であった。被験者およびその家族は健康面に異常もなく無事に実験期間を終えることができ,乾季の20日間と条件は限られるが,熱帯雨林における純粋な狩猟採集生活の可能性が否定されはしなかった。しかし,被験者に身体的,心理的な負荷はあったか,なかったか,もっと長期ならどうであったかなどについて,詳細な検討が必要であるが,現在,資料の整理中である。また,どれほどの時間・空間を活動したのか,という行動学的側面,どんな食物をどれほどの量を採捕したかなど栄養学的側面も早期にまとめたいと考えている。また,生理学的側面については次年度におこなうエネルギー消費に関する生理学的調査結果を待って,まとめるつもりである。2003年12月には,同地域において採捕生活キャンプ地の分布に関する広域調査,およびヤマノイモの高密度分布地域おけるキャンプ跡地の表面観察調査を実施した。この調査では土器片などの生活遺物も発見され,現在,資料の分析中である。本研究の目的は,カメルーン南部のピグミー系狩猟採集民バカの行動観察調査を通して人類の生息環境としての熱帯雨林を進化的観点から評価することである。本年度は,15年度に実施した熱帯雨林内における狩猟採集生活実験の被験者家族6家族を含む10家族を対象として,畑のある定住集落における日常生活についての観察調査をおこなった。

調査期間は,8.月15日から9月4日までの20日間。調査項目は,前年度同様,入手した食物の種類と量などの栄養学的項目,被験者の体重,血圧変動など健康・身体形質的項目,さらにライフコーダー(加速度計)による消費エネルギーの計測など行動学的項目であった。この調査では,定住集落ではエネルギー源食物としてリョウリバナナとキャッサバの2種類の作物がきわめて重要であること,一方,森の生活ではかなりの収穫量が期待されるタンパク源としての野生獣肉,魚介類が定住村では非常に乏しいこと,活動が全般に不活発でエネルギー消費が小さそうであることが観察された。しかし,詳細な結果は未整理である。本年度の結果は,前年度におこなった乾季,および次年度の雨季に予定している森林内のキャンプ生活におけるそれらと比較検討され,熱帯雨林におけるキャンプ生活と,定住村における生活とでは,食生活,活動の質と量においてどのような差異があるか,その差異の要因は何か,現在の狩猟採集民にとって森のキャンプ生活はどのような意味があるのか等を明らかにし,熱帯雨林の人類の生息環境としての可能性を検討する予定である。また,7月27日から8月13日の18日間,エネルギー消費量を推定するために不可欠な資料として基礎代謝量や各種活動の単位時間あたりのエネルギー消費量を延べ60名のバカ人を対象にダグラスバッグ等を使用して計測した。これも現在整理中である。また,12月から3月にかけて,乾季の森林内キャンプ生活における河川の重要性を鑑み,漁労活動,魚介類に注目した行動学的調査を実施した。本研究の目的は,カメルーン南部の熱帯雨林において,ピグミーとして知られるバカ人を協力者として,森の野生食物だけで一定期間生活するという実験的狩猟採集生活の観察調査を通して,1)熱帯雨林は農耕開始以前の人類の生息環境たりえたか,2)長期間,熱帯雨林が人類の生息環境でなかったのは何故か,そして,何がそれを可能にしたか,等について検討し,人類の生息環境としての熱帯雨林を進化史的観点から評価することである。本年度は,雨季における実験的狩猟採集生活を実施した。実験協力者はカメルーン南部のンドンゴ村に住むバカの8家族であった。うち4家族は2003年と重っている。実験に要した期間は9月末から10月末までの約4週間,場所は2003年の調査と同じ場所でンドンゴ村から徒歩2日を要するBek山麓であった。キャンプ地は実験協力者たちが自ら選んだ。調査は佐藤,山内,調査協力者の3名で行った。調査では,2003年の乾季と同様,採捕された食物の種類と量,エネルギー消費量(ライフコーダによる測定),活動域(GPSによる測定),適用技術,分業・協業などの行動学的資料,体重,血圧変動その他の協力者の健康・身体形質的資料などを収集した。現在,資料の整理中であるが,協力者たちが健康面に異常なく無事に実験期間を終えたこと,期間中,食物供給,および食物獲得のためのコストいずれも安定していたことは確認できた。20日間と期間は限られるが,乾季(2003年8月),雨季(10月)とも熱帯雨林における純粋な狩猟採集生活の可能性は否定されなかった。雨季においても,野生ヤマノイモがもっとも信頼できるエネルギー源としての役割を果たしていた。
高精度電鋳プロセスの開発と回転楕円軟Ｘ線集光ミラー作製への応用

前年度まで,室温電析を特徴とした電鋳法による高精度形状転写プロセスの開発に取り組んできた.一方で転写性能評価は転写形状と被転写形状の比較によりなされるが,小径円筒状のミラー内面の形状を高精度に計測することは困難であり,これまで転写性能評価は真円度測定器を用いた周方向プロファイルの計測・比較のみにとどまっていた.そこで複数のレーザープローブと参照平面を用いた同時比較計測を特徴とした,マンドレル外周のための三次元形状計測装置を改造し,ミラー内面形状計測システムを開発した.ここでは,ミラー内面上での走査が可能である接触式プローブも併用した装置構成とした.接触式プローブによる摩擦や測定力の影響を補正・最小化することで,10 nmの置き直し再現性の下,ミラーの長手方向プロファイルの計測が可能となった.複数の長手方向プロファイルと周方向プロファイルを組み合わせてミラー形状誤差の三次元的な分布を求め,マスター形状誤差と比較した結果,上下流端近傍を除いた中心付近においてRMS 15 nmの精度で形状転写がなされていることが確認された.数十ミリメートルスケールの範囲でこのような転写精度が達成された例は報告されていない.ミラー形状誤差に基づき,波動光学シミュレーションにより集光特性を求めたところ,波長4.13 nmの軟X線を光源に用いた場合,ビーム中心から半径250 nmの範囲内にエネルギーの50%以上が含まれることが示された.これは同ミラーを用いて大型放射光施設で実施された実際の集光実験結果とよく一致している.このように高精度ミラーの作製・形状評価により,高精度X線光学素子作製手法としての提案プロセスの有用性を示した.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。常温電鋳プロセスでは,不安定要素として,電析時に水素気泡が製品表面に付着しやすいことが挙げられる.気泡が付着したままプロセスが進行すると,製品の内部構造が不均一になり,製品の形状精度を著しく低下させる.これまで周辺雰囲気の減圧脱気により上記問題を解決してきたが,液条件次第では気泡が完全には除去されないことが明らかになった.そこで長周期・低デューティー比の逆電流を加え,電析層近傍のpHを一時的に変化させることで気泡の脱離を促し,気泡除去効果を向上させた.これにより本研究のターゲットである回転楕円ミラーの安定的生産を可能にした.また,現在開発中であるシャックハルトマン波面センサを用いた応力測定装置の測定性能の定量的評価として,測定の安定性評価,測定再現性の評価および測定精度の評価を実施し,いずれも優れた性能を有することを確認した.これらは電析時に生じる変形をインプロセスで高精度検出・早期検出が可能であることを示しており,応力制御システムへの応用が可能であることが確認された.応用研究としては,内部応力が回転楕円ミラーの形状精度に及ぼす影響を調査した.初めに様々な応力分布を仮定した回転楕円ミラーのシミュレーションモデルを構築し,有限要素法解析により,応力に起因する変形量を求めた.続けて異なる応力が生じるような電析条件下で複数の回転楕円ミラーを作製し,それぞれの転写面真円度を測定した.両者において,物理的に非常に安定的な電析環境が実現されている本電鋳プロセスでは,内部応力がミラー真円度に及ぼす影響は極めて限定的であることが示された.これらの成果は,形状転写性能向上のための指針を与えた点,常温・無撹拌・添加物フリーの電鋳を可能にした点で,次年度以降の研究遂行を容易にするのみならず,その汎用性から工業的有用性の観点からも意義があるといえる.27年度は当初の研究計画以外に,内部応力が回転楕円ミラーの形状精度に及ぼす影響を調査した.これにより,形状転写性能向上のためには電析環境の安定化がより重要であることが示された.今後,電析環境のさらなる安定化を図ることで,本研究で開発する装置による応力制御のみでは達成し得ない形状転写精度を実現できる可能性が高まった.これは,電鋳プロセスの高精度化という研究全体の目的に立ち返れば,期待以上の成果をもたらしたといえる.また現在開発している常温電鋳プロセスでは,まれに電析時に水素気泡が製品表面に付着することが問題であった.本研究でターゲットとしている回転楕円ミラーは,問題なくプロセスが進行した場合,作製に2週間程度を要するが,作製時に水素気泡の付着があった場合,全工程を一からやり直す必要があり,これが研究遂行の不安定要素となっていた.27年度分の研究成果により,ミラー作製プロセスが飛躍的に安定化され,ミラー1本当たりの作製に実際に要する時間が短縮した.ミラー作製の安定化は研究遂行を大いに促進するものであり,29年度分までを考慮した研究計画全体の観点から評価すれば,本研究は当初の計画以上に進展しているといえる.電鋳プロセスにおいては,電析条件により内部応力の大小や分布が決定される.これらは転写精度に影響を及ぼすため,精度向上を図る際には転写精度の評価結果に基づいて電析条件改善がなされる.電鋳法によるナノ精度形状転写の実現を目指した本研究においては,ナノ精度で転写面形状を評価することが不可欠である.

これまで回転体形状サンプルの周方向形状評価の際には真円度測定器を用いてきたが,転写面長手方向の形状評価手法は確立されていなかった.前年度の研究成果により,回転楕円ミラーのような軸対称中空形状サンプルの作製において,内部応力の大小が周方向における形状転写性能に及ぼす影響は限定的であることが示されたが,対称性を有さない長手方向においてはその影響が顕著であると予想される.長手方向形状転写精度と内部応力の関係を調査するため,電析膜厚分布の解析および回転体ミラーのための長手方向形状計測システムの開発に取り組んだ.前者では回転体ミラー電析時の電場分布を有限要素法により求めることで,電析膜厚分布を推定した.後者では,1 nmレベルの分解能を有する分光干渉レーザー変位計と1 nmレベルの平坦面を有する複数の参照平面を用いたマンドレル形状計測システムを,回転楕円ミラー内面形状計測に適用すべく装置改良を試み,ミラー長手プロファイルの長空間波長成分についてsub-100 nmレベルの精度で形状評価が可能であることを実験的に示した.当初は,金属電析プロセスにおける応力のin-situ制御による精密形状転写の実現を計画していたが,前年度の研究成果により,回転楕円ミラーのような軸対称中空形状サンプルの作製において,内部応力の大小が周方向における形状転写性能に及ぼす影響は限定的であることが示された.そのためプロセス改善に向けた形状転写性能評価のためにはin-situ応力制御システムの開発に先立ち,サンプル長手方向の形状評価システムを確立することがより重要となった.これまで転写面長手方向の形状評価は十分な精度で行われていなかった.本年度の研究成果により,5 mm以上の空間波長成分においてsub-100 nmレベルの精度でミラー形状評価が可能であることが実験的に示された.現時点で測定精度は満足いくものではないが,計測用プローブの詳細な特性調査等を通じて測定精度向上が十分に可能であると考えている.また本計測システムは真円度測定器に組み込まれたものであるため,サンプルの再アライメントを必要とせず同一機上で長手方向・周方向ともに高精度な形状計測が構造上可能である.今後,長手方向計測精度が改善されることで,回転体ミラーの3次元的な形状評価も可能となる.本年度の研究成果は電鋳プロセスにおける最終的な形状転写性能評価に不可欠な,3次元的な形状評価システム実現にただちにつながるという点で,研究がおおむね順調に進展したといえる.前年度まで,室温電析を特徴とした電鋳法による高精度形状転写プロセスの開発に取り組んできた.一方で転写性能評価は転写形状と被転写形状の比較によりなされるが,小径円筒状のミラー内面の形状を高精度に計測することは困難であり,これまで転写性能評価は真円度測定器を用いた周方向プロファイルの計測・比較のみにとどまっていた.そこで複数のレーザープローブと参照平面を用いた同時比較計測を特徴とした,マンドレル外周のための三次元形状計測装置を改造し,ミラー内面形状計測システムを開発した.ここでは,ミラー内面上での走査が可能である接触式プローブも併用した装置構成とした.接触式プローブによる摩擦や測定力の影響を補正・最小化することで,10 nmの置き直し再現性の下,ミラーの長手方向プロファイルの計測が可能となった.複数の長手方向プロファイルと周方向プロファイルを組み合わせてミラー形状誤差の三次元的な分布を求め,マスター形状誤差と比較した結果,上下流端近傍を除いた中心付近においてRMS 15 nmの精度で形状転写がなされていることが確認された.数十ミリメートルスケールの範囲でこのような転写精度が達成された例は報告されていない.
熱応答ゲル化ポリマーを利用した，中性子線構造解析のための大型結晶作製法の開発

本研究では,中性子線構造解析のために,タンパク質の良質な大型結晶の作製技術を確立することを目的とする.研究期間で,LCST型温度応答ポリマーを利用して,数種類のサンプルの大型結晶を成長させた.そのうち,分子量110kDaであるGatCABと基質の複合体の中性子構造も得られ,そのポリマーが結晶の成長に有効であることが確認できた.また,LCST型温度応答ポリマーが結晶成長に与える影響を検討したところ,結晶成長中に溶液のエントロピー変化量の変化が見られた.これは,結晶成長とともに生じていた温度変化によってポリマーの相転移が起こり,タンパク質結晶の周辺にある水分子に影響を与えたと考えられる.中性子線を利用した構造解析は,タンパク質等の生体高分子の生理機能に直接関与する水素原子や水分子の位置を精度よく決定できるため,潜在的な利用価値は高いが,非常に大型の結晶を必要とするために,現時点での利用は限定的である.本研究では,中性子線構造解析のための良質な大型結晶を作製する技術を,LCST型温度応答ポリマーを利用して確立することを目的とする.その目標を達成するために,H27年度には,タンパク質GatCAB複合体,セロビオース2-エピメラーゼCE,tRNA成熟化酵素Trilのligaseドメイン,毒素Vip3Aなど,合計4種類のサンプルを用いてLCST型温度応答ポリマーの汎用性,多様な結晶化条件に対する適応性を検討した.その結果,塩濃度の高い結晶化条件には適応できないことがわかった.その後,LCST型温度応答ポリマーを用いて,結晶化条件を最適化し,GatCAB複合体とCE結晶のサイズがそれぞれ,>3立方ミリメートル超,1立方ミリメートルまで成長することができた.また,ポリマーの濃度がタンパク質の結晶成長に与える影響を確認したところ,バッチ法を用いてポリマーの濃度1-2%程度のときが最も効果的であることが分かった.結晶の体積が3立方ミリメートルを超えるGatCABの結晶を得たので,中性子線回折データを測定するための重水置換の実験も進めた.重水置換はソーキング法と共結晶化法を試みたが,共結晶化法で得られた結果の分解能が若干高かった.さらに,得られた巨大GatCAB結晶を用いて,ドイツのガーヒンクMLZにて中性子線回折実験を行い,約3.2Å;の反射を確認することができた.以上の結果は,申請者が考えたようにLCST型温度応答ポリマーは中性子線回折用の巨大結晶の汎用的な結晶成長法にとって非常に有望であることを示している.水素の可視化にとって有効な方法である中性子線結晶構造解析は,巨大な結晶を必要とするために,解析の成功例は極めて少ない.それは,巨大な結晶の作製が極めて困難であるからである.本研究では,LCST型温度応答ポリマーを利用して,大型結晶の作製法を確立することを目指している.H27年度の研究は,所期の計画の通りに進み,その結果,LCST型温度応答ポリマーの利用が大型結晶の成長に有効であることが確認できた.以上より,本研究はおおむねに順調に進展しているといえる.中性子線を利用した構造解析は,タンパク質等の生理機能に直接関与する水素原子や水分子の位置を精度よく決定できるため,潜在的な利用価値は高いが,巨大結晶を必要とするために,現時点での利用は限定的である.本研究では,中性子線構造解析のための良質な大型結晶を作製する技術を確立することを目的とする.その目標を達成するために,平成28年度に,数種類のサンプルを用いてLCST型温度応答ポリマーの利用が大型結晶の成長に有効であることが確認できた.また,そのポリマーは,塩の高い結晶化条件に適用しないことが分かったので,平成29年度は,結晶条件に塩濃度の低い,もしくは塩のないGatCAB,セロビオース2-エピメラーゼCE,tRNA成熟化酵素Trl1のligaseドメインに縛って,大型結晶の作成法の改良を継続的に行った.また,GatCABと基質Glnとの複合体の共結晶も重水条件で行い,巨大結晶が得られた.その結晶を用いてX線構造解析法で確認したところ,基質GlnがGatAの活性部位に結合していることが確認できた.そこで,得られたGatCABとGatCAB-Glnの重水置換した結晶を用いて,ドイツの中性子施設MLZにて,それぞれ,3.2と2.8Å分解能のデータを収集し,中性子線の構造に成功した.現在X線回折と中性子線回折データを合わせて,joint-refinementを行っている.また,LCST型温度応答ポリマーが,結晶成長に対して,どのように影響するかを検討するため,結晶化溶液の温度変化と共に,タンパク質の溶解度を測定し,タンパク質結晶成長に伴う溶液のエントロピー変化の見積もりを試みた.その結果,LCST型温度応答ポリマーを加えることによって,結晶成長中に溶液のエントロピー変化量の変化が見られた.このことから,結晶成長とともに生じていた温度変化によってLCST型温度応答ポリマーの相転移が起こり,その相転移はタンパク質結晶の周辺にある水の状態を変化させると考えられる.本研究では,中性子線構造解析のために,タンパク質の良質な大型結晶の作製技術を確立することを目的とする.研究期間で,LCST型温度応答ポリマーを利用して,数種類のサンプルの大型結晶を成長させた.そのうち,分子量110kDaであるGatCABと基質の複合体の中性子構造も得られ,そのポリマーが結晶の成長に有効であることが確認できた.また,LCST型温度応答ポリマーが結晶成長に与える影響を検討したところ,結晶成長中に溶液のエントロピー変化量の変化が見られた.

これは,結晶成長とともに生じていた温度変化によってポリマーの相転移が起こり,タンパク質結晶の周辺にある水分子に影響を与えたと考えられる.H27年度に引き続き,計画通りに、下記のように研究を進める.(1) LCST型温度応答ポリマーの汎用性,多様な結晶化条件に対する適当性の検討:サンプルの調製の難易度と時間を考え,サンプルを3種類(GatCAB, CE, Tril1_ligase)に絞りテストを行う.(2) LCST型温度応答ポリマーの効果の原理の追求:大型結晶の成長に有効なLCST型温度応答ポリマーを見つけたので,結晶成長に対する効果の原理を追求する.温度変化に対するゲル化率を測定して,結晶成長に対する効果との間の相関を調べる.同時に,結晶成長に伴う溶液のエントロピー変化を見積もり,結晶成長に対する効果との相関を調べる.以上の実験から,LCST型温度応答ポリマーの結晶成長に対する効果のメカニズムの解明を目指す.(3) GatCABの中性子線構造解析:重水を用いた共結晶化によって,GatCABの中性子線構造解析用の大型結晶が得られたので,中性子線構造解析を行う.回折データの測定は中性子線施設(茨城県J-PARCとドイツガーヒンクMLZ)にて行い,それを利用して中性子結晶構造解析を試みる.本挑戦萌芽の研究はプレリミナリーな結果が得られ、論文、あるいは製品化する前に、研究成果をwebページに公開することができないが、研究室のホームページに研究活動を掲載している.構造生物学