hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イネを経由するメタンガス放出機構の解明：同位体分別効果を活用した新アプローチ

水田土壌中では温室効果ガスであるメタンが盛んに生成され、多くはイネの通気組織を介して大気へ放出される。しかその輸送メカニズムは殆ど分かっていない。本研究課題では実際のフィールド(農家水田)から放出されるタンの量とその炭素安定同位体比を生育期間全般に渡って調べた。その結果、生育中盤以降、放出されたメタンの量は2ー3倍に及ぶ日較差を示すこと、さらに放出量の多い日中には、13Cの割合が相対的に多い「重い」メタンが放出され、夕方早朝にかけての放出量が少ない時間帯では比較的「軽い」メタンが出てくることが分かった。この結果は昼夜でメタンの移動メカニズムが異なることを示唆していた。水田は約30億人に主食のコメを提供する食料生産基地である一方、強力な温室効果ガスであるメタンの最大人為発生源の一つでもある。水田からのメタン発生には、微生物による「生成」「酸化(分解)」および、土壌中の「貯留」と大気への「輸送」の4つのプロセスが関与する。このうち「輸送」については、イネを通る経路の重要性が強調されてきたが、そのメカニズムに踏み込んだ研究はないまま「放出量の変動に輸送過程は関与しない」という単純な仮定が置かれてきた。本研究ではガスの輸送に伴う「同位体分別効果」を活用することで、イネを通るメタンの拡散・移流メカニズムを明らかにすることを目的とした研究を行っている。平成25年度は本研究で必要となるメタン炭素安定同位体比分析装置の改良を精力的に行った。既存の分析ラインでは、大気中に微量存在するクリプトンがメタンの同位体比分析に大きな測定誤差をもたらすことが最近明らかにされた(Schmitt et al. 2013, Atmos. Meas. Tech.)。本研究では前処理ラインを改良することによってクリプトンの影響を取り除くことに成功した。また前処理ラインを自動化することによって高精度・ハイスループットの分析ラインを確立することができた。確立した分析装置を用いて実際の農家水田から放出されたメタンの同位体比を分析した結果、同位体比には大きな日変動や生育ステージ依存性があることを見出したた。これは、メタンの輸送に分子拡散と移流の両者が関与し、その割合が気象要因やイネの組織形成などによってダイナミックに変化することを強く示唆していた。水田は強力な温室効果ガスであるメタンの最大人為発生源の一つである。メタンは嫌気的な水田土壌中で生成されるが、多くはイネの通気組織を経由して大気へ放出されると考えられている。しかし、その物理的な輸送メカニズムは殆ど分かっていない。本研究課題では、「同位体分別効果」を活用することで、イネを通るメタンの拡散・移流メカニズムを調べ、メタン放出量の変動に輸送過程がどのように寄与するかを明らかにすることを目的とした。前年度に引き続き平成26年度も安定同位体比質量分析計の前処理ラインを改良し、メタンの炭素安定同位体比を高精度かつハイスループットで分析できるラインを作成した。これにより、これまで不可能だった多検体の分析が可能となり同位体を用いた研究を飛躍的に進める基盤が整った。実際の水田で自動開閉チャンバを用いて放出されたメタンを採取し分析したところ、メタンの同位体比は生育中期以降に大きな日変動を示していた。このことから、この時期の数倍に及ぶメタン放出量の日較差は、拡散による定常的な輸送に加えて移流による大きな放出が加わることが主な要因であることが示唆された。一方、生育前半は放出量の大きな日較差は見られず、安定同位体比にも日変化は見られなかったことから、シーズン前半の放出量が少ない時期は、拡散による輸送が卓越することが示唆された。このように生育途中で大きくメタンの放出メカニズムが変化する理由は今のところ不明であり、今後は土壌中のメタンの存在形態やイネの生育ステージや組織形成などとの関係を解明する必要がある。生物地球科学昨年度に確立したメタンの炭素安定同位体比分析ラインは、世界最高水準の精度をもち、なおかつ完全な自動分析化に成功したため、極めてスループットが大きい。この点は当初の計画以上に研究開発が進んだ。また実際の水田から放出されたメタンの同位体分析も行い、同位体比の時間変動に関して新しい知見が得られた点も大きな成果と考えている。当初計画していた室内モデル実験による精密な測定に関しては、同位体ラインの改良にリソースが割かれた関係で、一部に遅れが見られるが、そのための準備は順調に進んでいる。以上まとめると、研究計画全体として概ね順調に進展していると判断した。同位体比の分析ラインが確立されたことから、今後の研究は概ね順調に進展すると考えている。

ただし申請書にも記したように、同位体比は輸送過程(拡散・移流の相対的割合)だけではなく、その他の過程も影響を与える。これまでの予備的試験から、メタンの酸化による同位体比の変化が予想されたことから、今後はメタン酸化阻害剤を組み合わせた試験を行い、輸送過程による影響をよりよく抽出できる試験計画を策定する。物品の競争入札により当初見込みよりも若干ながら支出額を抑えられたため。次年度使用額は同位体分析に必要な液体窒素の値上がり分の一部にあてる予定である。
糖尿病網膜症における眼底イメージングを用いた新規病変の探索とその分子機構の解明

我々は光干渉断層計アンギオグラフィー(OCTA)や眼底自発蛍光撮像装置を用いて、新たな所見を探索している。OCTAによる網膜血管の形態的は評価では、黄斑と黄斑外では、網膜動脈の存在する位置が異なり、灌流セグメントを違いを生み出すという新規知見を見出した。糖尿病網膜症で臨床的に重要な所見である無灌流域形成は、灌流の重複性に依存することを示した(Yasukura S, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2018)。また、眼底自発蛍光は、新たな所見として、短波長および近赤外波長での顆粒状病変が生じることを見出した(Yoshitake S, et al. Eye. Epub ahead of print)。以前より網膜における神経細胞の障害、特に、黄斑部視細胞障害が視力低下に強く関連することが臨床的に知られていた。本研究において、我々は疾患に関連する新規自己抗体として、抗fumarase抗体と抗hexokinase 1抗体を同定し、糖尿病黄斑浮腫の患者血清で有意に上昇していることを報告した(Yoshitake S, et al. Diabetologia 2019; Yoshitake S, et al. Sci Rep. 2019)。また、患者血清からの自己抗体を精製し、培養細胞やモデル動物を用いて、自己抗体は補体と共働して、黄斑部視細胞障害を惹起することを見出し、本疾患の新規分子機構を明らかにした(Yoshitake S, et al. Diabetologia. 2019)。興味深いことに、抗VEGF療法において、抗fumarase抗体が視力改善の予測因子であることも新たに見出し、その臨床的な意義が非常に大きいことを確認した(Yoshitake T, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2019)。本研究の平成30年度の目標として、眼底イメージング装置を用いて見出された網膜病変の分子機構を明らかにするために、特に、自己抗体に着目して解析を進めている。実際に新規自己抗体を同定し、その臨床的な意義を確認しており、おおむね予定通りに進捗している。また、次の段階として、自己抗体による網膜障害の分子機構を解明するために、培養細胞やモデル動物を用いた実験系での評価を開始しており、一定の成果が得られている。また、その一部はすでに海外誌に掲載されている(Yoshitake S, et al. Diabetologia 2019)。これらのことから、本研究は滞りなく研究が推進されていると考える。我々はWestern blot法を用いた自己抗体のスクリーニングを行ったが、糖尿病網膜症患者の血清中には、多数の抗網膜抗体が存在することが示されていた。今までにその一部として、抗fumarase抗体と抗hexokinase 1抗体を同定しているが、今後も、新規自己抗体の同定を継続する予定である。また、抗fumarase抗体に関しては、網膜への病的な影響を評価しているが、細胞実験、および、動物実験の系はある程度確立できている。今後は、追加で同定された自己抗体に関しても、同様の評価を行う予定にしている。臨床的なサンプルも十分量確保されているが、今後も継続的に取得予定である。また、自己抗体の機能解析に必要な実験系はある程度確立されており、滞りなく推進できるものと考えている。しかし、自己抗体に未知の機能評価が必要となった場合、細胞および動物実験に習熟した鈴間医師と連携を取りながら、実験系をセットアップできると考えている。我々は、新たな眼底イメージング機器であるOCT angiographyを用いた研究で、糖尿病網膜症眼において、3層ある毛細血管叢の内層もしくは外層のみが脱落する所見が、神経グリア組織における変性病変や嚢胞様腔と対応していることを見出した。また、脈絡膜毛細血管板における血流障害に関しても報告し、視細胞障害や視力障害との関連が強いことを示した。これらの研究により糖尿病網膜症における視機能障害の原因となる未知の病態の一部が明らかになり、今後展開予定である分子機構の研究の対象となる。また、日常診療で使用される眼底診断機器である光干渉断層計(OCT)を用いた解析で、一般的な治療法である抗VEGF療法の治療回数や視力改善と関連する因子として、網膜厚、嚢胞様腔内のhyperreflective fociが重要であることを見出した。これらは、実臨床において複数の治療法が存在する糖尿病黄斑浮腫の治療を最適化するために有用な情報である。つまり、労働世代の視力障害の大きな原因となっている本疾患の治療の質を向上させることで、社会的貢献が可能であると考えられる。また、我々は血液サンプルを用いた研究で、糖尿病網膜症における新たな自己抗体を複数見出してきた。また、特定の自己抗体は、糖尿病黄斑浮腫の標準療法である抗VEGF療法の治療効果予測に有用であることを見出し、学会報告した。また、その視細胞への障害のメカニズムを明らかにし、現在論文準備中である。また、糖尿病黄斑浮腫で抗体価が上昇する自己抗体を他にも見出し、その診断的価値を見出した。その内容に関しても論文準備中である。本研究期間の初年度の目標は、眼底イメージング装置を用いて、新たな病変を見出すことであった。実際にOCT angiographyを用いて、新規の血管病変に対応する神経障害を示唆する所見を見出しており、おおむね予定通りに進捗している。また、次のステップである分子機構の解明に関しても、手掛かりとなる自己抗体の抗体を複数見出しており、滞りなく研究が推進されていると考える。

我々は光干渉断層計アンギオグラフィー(OCTA)や眼底自発蛍光撮像装置を用いて、新たな所見を探索している。OCTAによる網膜血管の形態的は評価では、黄斑と黄斑外では、網膜動脈の存在する位置が異なり、灌流セグメントを違いを生み出すという新規知見を見出した。糖尿病網膜症で臨床的に重要な所見である無灌流域形成は、灌流の重複性に依存することを示した(Yasukura S, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2018)。また、眼底自発蛍光は、新たな所見として、短波長および近赤外波長での顆粒状病変が生じることを見出した(Yoshitake S, et al. Eye. Epub ahead of print)。以前より網膜における神経細胞の障害、特に、黄斑部視細胞障害が視力低下に強く関連することが臨床的に知られていた。本研究において、我々は疾患に関連する新規自己抗体として、抗fumarase抗体と抗hexokinase 1抗体を同定し、糖尿病黄斑浮腫の患者血清で有意に上昇していることを報告した(Yoshitake S, et al. Diabetologia 2019; Yoshitake S, et al. Sci Rep. 2019)。また、患者血清からの自己抗体を精製し、培養細胞やモデル動物を用いて、自己抗体は補体と共働して、黄斑部視細胞障害を惹起することを見出し、本疾患の新規分子機構を明らかにした(Yoshitake S, et al. Diabetologia. 2019)。興味深いことに、抗VEGF療法において、抗fumarase抗体が視力改善の予測因子であることも新たに見出し、その臨床的な意義が非常に大きいことを確認した(Yoshitake T, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2019)。本研究の平成30年度の目標として、眼底イメージング装置を用いて見出された網膜病変の分子機構を明らかにするために、特に、自己抗体に着目して解析を進めている。実際に新規自己抗体を同定し、その臨床的な意義を確認しており、おおむね予定通りに進捗している。また、次の段階として、自己抗体による網膜障害の分子機構を解明するために、培養細胞やモデル動物を用いた実験系での評価を開始しており、一定の成果が得られている。また、その一部はすでに海外誌に掲載されている(Yoshitake S, et al. Diabetologia 2019)。これらのことから、本研究は滞りなく研究が推進されていると考える。現在、すでに取得しているOCT angiographyやstructure OCT、超広角眼底写真などには、いまだ解析されていない所見が多々含まれている。その系統的な評価を継続し、更なる臨床パラメータの発見とその臨床的意義の検討を予定している。我々は、Western blot法を用いた自己抗体のスクリーニングにより、糖尿病網膜症患者の血清中には、網膜抗原に対する自己抗体を多数認めることを確認した。生化学的手法と質量分析を組み合わた自己抗体の同定方法を用いて、その候補を複数同定している。今後も継続的に、新規自己抗原の同定を進めていく予定にしている。
均衡的現象としての貨幣・コミュニケーションの分析

貨幣理論方面では、貨幣のサーチ・モデルにおける定常均衡の非決定性という結果の頑健性や、非定常均衡の分析において一定の成果が得られた。コミュニケーション理論方面では、退出・発言アプローチの分析、聴き手の私的情報がコミュニケーションに与える影響の分析、複数人とのコミュニケーションの分析などで、おおよそ想定した研究成果を上げることができた。一方で、貨幣とコミュニケーションの統一的分析についてはあまり進展が見られなかった。貨幣理論方面では“Hysteresis in Dynamic General Equilibrium Models withCash-in-Advance Constraint"を改訂した。この論文では、ワルラス市場においても定常的サイクルをもつ均衡が無数に存在することを示した。また“Cheap Talk with an Informed Receiver"を改訂するとともに、“Asking Too Many?Why a Leader Needs to Be Decisive"を作成した。これらの論文ではともに情報の受け手が状態に関する私的情報を持つことがコミュニケーションに与える影響を分析した。特に、後者の論文は前者の論文をより動学的な状況に拡張し、意思決定者が専門家にあまり情報を求めないことにコミットした方が良くなる可能性を指摘している。コミュニケーション理論方面では"Which Is Better for the Receiver between Senders with Like Biases and Senders with Opposing Biases?"を作成した。この論文では、Austen-Smith流のチープ・トーク・モデルを用いることで、異なる方向のバイアスを持つ送信者を組み合わせるよりも、同じ方向のバイアスを持つ送信者を組み合わせる方が望ましい状況があることを示した。これは、同質的な組織が良いのか、異質的な組織が良いのか、という組織論の議論に、情報効率性の観点から一つの回答を与えた研究になっている。貨幣理論方面では"Dynamic Auction Markets with Fiat Money"と"Hysteresis in Dynamic General Equilibrium Models with Cash-in-Advance Constraint"の改訂を行い、貨幣モデルの定常均衡の決定要因についてより詳細な結果が得た。より具体的には、"Dynamic..."では、貨幣サーチ・モデルで見られる定常均衡の非決定性が集権的・分権的オークション市場においても発生しうることを示し、集権的取引が定常均衡の決定要因に必ずしもならないことを示した。また"Hysteresis..."では、ワルラス市場においても定常的サイクルをもつ均衡が無数に存在することを示した。コミュニケーション理論方面では" Cheap Talk with an Informed Receiver"の改訂を行うとともに"Can More Information Facilitate Communication?"を完成させた。これらでは情報の受け手が持つ私的情報がコミュニケーションに与える影響について分析を行い、それぞれマイナスの影響を持つケースとプラスの影響を持つケースとを提示した。また"Cheap Talk with an ExitOption: A Model of Exit and Voice"の改訂を行い、発言・退出メカニズムのより詳細な結果が得られた。より具体的にはチープ・トーク・モデルにおいて情報の送り手が退出のオプションを持つことによってより発言の効果が強くなることを示した。コミュニケーション理論方面では、一定の研究の進展が見られた。“Cheap Talk with an Exit Option: A Model of Exit and Voice"の改訂作業を進めることで、情報の送り手が退出のオプションを持つ状況がだいぶ明らかになってきた。また上述の作業や“Can More Information Facilitate Communication?"の改訂作業により、情報の受け手が状態に関する私的情報を持つ状況でのコミュニケーションの理解が進んだ。貨幣理論方面では、既存の論文の改訂を行ったことにより従来得られていた分析をさらに詳細にすることができた。一方で、新しい方向性についてはあまり進展がなかった。特に既存論文"Stationary Monetary Equilibria with Strictly Increasing Value Functions and Non-Discrete Money Holdings Distributions: An Indeterminacy Result"の拡張が遅れている。一方、コミュニケーション理論方面については一定の進展が見られた。特に情報の受け手が持つ私的情報がコミュニケーションに与える影響についての基礎的な分析に成功した。このことによりより一般的な状況への見通しが得られた。貨幣理論方面では、何より前述の拡張を優先的に進め、さらには均衡径路外の動学分析や政策的含意を得るように企図する。コミュニケーション理論方面では、上述の改訂作業を続けることで、情報の送り手が退出のオプションを持つ状況や、情報の受け手が状態に関する私的情報を持つ状況でのコミュニケーショについて分析を進める。その他にも、チープ・トーク・モデルをさまざまな組織の文脈に応用し、既存結果の頑強性を検証することを目指す。貨幣理論方面では、何より前述の拡張を優先的に進め、さらには均衡径路外の動学分析や政策的含意を得るよう企図する。コミュニケーション理論方面については、前述の報の受け手が持つ私的情報がコミュニケーションに与える影響についてより包括的な分析を行うことによって、効率的コミュニケーションの決定要因を明らかにする。またこれとともに、費用をかけることによりメッセージの立証可能性を高められるモデルを構築し、従来のチープ・トーク・モデルと説得モデルを統一的な視座から分析する。消耗品費:当研究に関係するゲーム理論関係書籍、貨幣理論関係書類の購入に充てる。

旅費:海外での成果報告や研究者との交流、国内の研究者との共同研究打ち合わせに充てる。謝金等:英文の校閲に充てる。なお次年度繰越金が生じた理由としては、学内の業務の都合により、当初の計画で予定していた海外への学会への出席ができなかったことが挙げられる。この次年度繰越金については、次年度の旅費に繰りこんで支出する予定である。消耗品費:当研究に関係するゲーム理論関係書籍、貨幣理論関係書籍の購入に充てる。なお次年度繰越金が生じた理由としては、学内での業務の都合により、当初の計画で予定していた海外での学会への出席ができなかったことが挙げられる。
バリ舞踊の伝承の歴史と舞踊家の社会的地位に関する研究

平成21年度に実施した研究の成果は以下の通りである。1.投稿論文の発表東京外国語大学大学院博士後期課程論叢『言語・地域文化研究』(査読有)に「インドネシアにおける国民文化の創成:中部ジャワとバリにおける舞踊劇スンドラタリ・ラマヤナを事例として」が掲載、刊行された。2.海外現地調査の実施平成21年1月中旬にインドネシア政府研究技術省から取得した研究許可に基づいて、平成21年4月から12月までバリ州にて引き続き海外現地調査を行った。平成21年度の現地調査では、踊り手の人的ネットワークによって規定される活動範囲のなかでも、踊り手自身が所属する地域組織であるバンジャルbanjarに焦点をあて、踊り手の社会的地位と、踊り手であることの社会的意義について検討した。現在、平成20年度および平成21年度の海外調査で得られたデータの分析を進めているが、現時点において提示できる成果は以下の通りである。(1)バンジャルにおける踊り手の社会的地位踊り手は、バンジャルの一構成員として他の構成員と等しく社会的責任を果たしている。(2)踊り手であることの社会的意義踊り手は、舞踊指導者として教育機関で専門職に就いたり、舞踊教室を主宰するなど舞踊指導自体をビジネス化することで収入を得ながら、一方で自身の人的ネットワークを通して、様々なコンテクストにおいて舞踊を実践している。したがって、舞踊の実践を通して経済活動と社会的な貢献を行うことができる点において、踊り手であること/なることの社会的意義があると考えられる。平成20年度に実施した研究の成果は以下の通りである。1.東京外国語大学大学院の投稿論文『言語・地域文化研究』(査読有)に、「インドネシアにおける国民文化の創成」の題目で論文を投稿した。平成21年中に刊行される予定である。2.海外現地調査のための事前準備および実施インドネシア政府研究技術省(RISTEK)から研究許可を取得し、平成21年1月から現地調査を行っている。これまで、特定のバリ舞踊家が関わる活動に積極的に随行し参与観察やインタビュー調査を行うことによって、舞踊家がおかれている社会的状況が徐々に見えてきた。現時点で報告できることは以下の二点である。(1)バリ舞踊家の活動領域についてバリ舞踊家の活動は、自身の舞踊教室における指導にとどまらず、所属する村落共同体や寺院の領域を越えて、他地域への出張指導や、さらには州政府による芸術祭への関与など広範囲にわたっている。(2)バリ舞踊家による「舞踊奉納」という行為バリ舞踊家は、自身が所属する村落共同体や寺院の儀礼において舞踊奉納を行うが、他の儀礼参加者ができない舞踊を奉納することができるという点において、社会のなかで特殊な資格を持つ存在であり、また儀礼に欠かせない舞踊を奉納することによって社会的貢献を果たしているといえる。また一方で、舞踊家自身は「踊る」ことによって、バリ・ヒンドゥー教に対する信仰心の篤さを身体表現によって具現化しているともいえる。以上のように、バリ舞踊家が広範囲にわたる活動領域のなかで「踊る」という行為には、社会的/個人的レベルにおいてそれぞれ意味があることをより具体的に明らかにするために、今後も継続して特定の舞踊家が関わる活動に積極的に随行し、舞踊家の生活の一部を織りなしている社会組織、宗教という側面から舞踊活動を分析していきたい。
種分化による多様性創出のメカニズムの解明

生殖隔離がどのようなメカニズムで進化したかという問題の解明は、地球上での多様性創出の原因を考える上でも重要なテーマの一つである。この問題を「種分化のメカニズムの解明」と「種分化と生物の多様性の関係」から探る研究を押し進めるために、2回の会合を東北大学(仙台)で開催した(11月と2月)。会合では、植物、動物、微生物の対象生物について、理論的研究、分子生物学的研究、生態学的研究、生物地理学的研究、古生物学的研究について討論が行われた。討論の結果、種分化メカニズムの解明のための研究には、(1)交配や資源利用にかかわる遺伝メカニズムを分子レベルで解明する必要性であること、(2)自然界での多様性のプロセスを解明するためには、グローバルな視点からの多様性のパターンの解析が必要であり、そのためには個体をベースとたデータベースが必要であるということ、(3)どのように生態的な要因が種分化の促進に関わっているかを実証研究すること、(4)実際の生物に応用できる理論的研究の発展がのぞましいこと、などが確認された。また、今後の新たな研究計画に利用できるように、種分化研究の文献データベースの作成や一部計測データのデータベースの作成を行った。今回の成果は、日本生態学会でのシンポジウム「生物多様性の進化機構の解明」などで公開されるほか、雑誌での特集記事として企画している。また、継続的に論議し、今後、大きなプロジェクト研究として計画予定である。
HB-EGF発現を制御する転写因子の同定と癌の診断及び治療への応用

本研究では、乳がんの標的分子であるHB-EGFの発現を制御する遺伝子として翻訳の際にHB-EGF mRNAのexon junctionに結合し、HB-EGFのタンパクへの翻訳を増進する遺伝子(X)を同定した。遺伝子(X)がin vivoモデルで造腫瘍能を亢進させ、乳がん患者の予後因子となることから、HB-EGFと同様にがんの診断と治療において有用であることが示唆された。本研究の目的は癌標的分子であるHB-EGFの発現に関与する転写因子を同定し、その転写因子がHB-EGFと同様に癌の診断と治療において有用であることを明確にすることである。そこで、本年度はHB-EGFの転写に関わる遺伝子群をHB-EGFの発現を抑制させることと、逆に発現を亢進させることの2種類の方法で網羅的にスクリーニングした。まず、HB-EGFの発現を抑制させる実験系として、HB-EGF特異的抑制剤であるCRM197を用いた。HB-EGF高発現細胞株にshRNA発現ライブラリーを導入し、培養上清中にCRM197(10μg/ml)を添加し、72時間後に生存細胞からRNAを回収した(A)。また、HB-EGFの発現を亢進させる実験系としてHB-EGF低発現乳癌細胞にHER2やKras遺伝子導入し、HB-EGFの発現を亢進させた(B)。AとBのRNAを用いた発現アレイ解析により、HB-EGFの発現に関与する候補遺伝子としてHB-EGFの受容体であるEGFRの下流に位置する遺伝子(MAPK及びAkt)や乳癌において癌増殖に関連する遺伝子、癌の血管新生に関連する遺伝子が同定された。また、核内転写因子としてPPARγや他の転写因子(特許のため遺伝子名は伏せさせていただく)も同定された。最終的にHB-EGF高発現細胞株に対して、上記で抽出された転写因子の発現を抑制し、CRM197に対して抵抗性を示すことができた遺伝子をHB-EGFの発現に関与する転写因子として同定した。来年度はスクリーニングした遺伝子群を用いてミニアレイを作成後、HB-EGFが高発現しているヒトの乳癌組織を用いて解析し、HB-EGFの発現させる核内遺伝子をさらに絞り込み、それらの遺伝子がHB-EGFの発現及び癌増殖機構に関与するかを検討する。本研究の目的は癌標的分子であるHB-EGFの発現に関与する遺伝子を同定し、その遺伝子がHB-EGFと同様に癌の診断と治療において有用であることを明確にすることである。そこで、本年度はH22年度にスクリーニングしたHB-EGFの発現に関与する115遺伝子のヒト乳癌組織での発現解析を行い、HB-EGFの発現に関わる遺伝子をさらに絞り込み、それらの遺伝子がHB-EGFの発現及び癌増殖機構に関与するかを検討した。HB-EGFの発現が高いヒト乳癌組織30例と低いヒト乳癌組織17例を用いて前述の115遺伝子の発現量を解析したところ、HB-EGFの発現量と相関する遺伝子として翻訳の際にHB-EGF mRNAのexon junctionに結合し、HB-EGFのタンパクへの翻訳を増進する遺伝子X(特許のため遺伝子名は伏せさせていただく)が同定された。HB-EGF高発現乳癌細胞株を用いてsiRNA法による遺伝子Xの発現量を抑制すると、HB-EGF mRNAの断片化を認め、細胞培養上清中に分泌されるHB-EGFタンパク量が抑制された。また、遺伝子Xの発現が恒常的に抑制された乳癌細胞を作製し、in vivoでの造腫瘍能抑制効果を検討したところ、コントロールの細胞と比較して遺伝子Xの発現が抑制された細胞では造腫瘍能は抑制された。さらに、ヒト乳癌組織における遺伝子Xの発現量は無病増悪期間と有意な相関を示した。以上より、本研究で同定された遺伝子XはHB-EGFの発現にタンパクへの翻訳を増進することで関与し、乳癌における新たな標的分子となることが示唆された。今後は遺伝子Xを特異的に抑制する低分子化合物を同定し、臨床応用への可能性を追求していく予定である。
アレルギー性結膜疾患発症における結膜抗原提示細胞の解析

実験的アレルギー性結膜疾患発症における抗原提示細胞の役割を解析した.結膜に存在する抗原提示細胞の表面に発現している共刺激分子が結膜炎誘導能を持つT細胞を活性化し,結膜炎発症に関与している可能性が示唆された.抗原提示細胞としての機能を持つマクロファージにはF4/80やCD11bが発現している.これらの分子はマクロファージのみならず好酸球にも発現しており,結膜好酸球浸潤に重要な働きを持つことが判った.実験的アレルギー性結膜疾患発症における抗原提示細胞の役割を解析した.結膜に存在する抗原提示細胞の表面に発現している共刺激分子が結膜炎誘導能を持つT細胞を活性化し,結膜炎発症に関与している可能性が示唆された.抗原提示細胞としての機能を持つマクロファージにはF4/80やCD11bが発現している.これらの分子はマクロファージのみならず好酸球にも発現しており,結膜好酸球浸潤に重要な働きを持つことが判った.本年度は結膜における抗原提示細胞の同定を試みた。結膜を採取し凍結切片を作成し免疫染色を行った。まず、F4/80陽性細胞、CD11b陽性細胞の存在を確認した。結膜炎の誘導により抗原提示細胞が増加することも分かった。抗原提示細胞が抗原を提示しT細胞を活性化する際には共刺激分子も関与する。さらに、我々の一連の研究結果からT細胞活性化に関与する共刺激分子に強制刺激を加える、あるいはそのリガンドとの結合を阻害することにより、結膜炎症の程度に変化がみられることが明らかとなった。たとえば、4-1BBに強制刺激を加えると結膜炎症が有意に抑制されるが、OX-40に強制刺激を加えると逆に結膜炎症が有意に悪化する。しかし、その報告では共刺激分子に対する抗体を全身投与し、その効果をみたものであり、結膜局所での抗原提示細胞/T細胞の反応をみたものではなかった。そこで、結膜における共刺激の発現を免疫染色法で確認した。その結果、4-1BBリガンド、OX40リガンド、PD-1リガンド、B7RP-1、B7-H3、CD80、CD86、ガレクチン9のいずれの分子もナイーブな状態でも発現していることが分かった。結膜炎を誘導することによりこれらのいずれの分子の発現も増強していた。これらの結果から、結膜に存在する抗原提示細胞の表面に発現している共刺激分子が結膜炎誘導能を持つT細胞を活性化し、結膜炎発症に関与している可能性が示唆された。アレルギー性結膜炎発症における抗原提示細胞の役割を検討することを目的とした.具体的にはマクロファージがアレルギー性結膜炎にどのように関与しているかを検討した.まず,マクロファージのマーカーとして汎用されているCD11bとF4/80を発現する細胞が,実験的アレルギー性結膜炎の誘導により結膜に浸潤することを確認した.アレルギー性結膜炎を誘導する際にCD11bならびにF4/80に対する抗体を全身に投与した.ブタクサを能動免疫してからこれらの抗体を腹腔内にブタクサ点眼まで(感作相),あるいはブタクサ点眼直前(惹起相)に投与した.その結果,誘導相にこれらの抗体を投与してもアレルギー性結膜炎の指標である結膜好酸球浸潤に影響はみられないが,惹起相に投与した場合,結膜好酸球浸潤が抑制されることが分かった.この結果は,マクロファージの表面マーカーとして汎用されているCD11bとF4/80が好酸球に発現している可能性を示唆するものである.そこで,IL-5の遺伝子を導入したマウスより回収した脾臓好酸球をフローサイトメトリー法で調べたところ,CD11bとF4/80の強い発現を認めた.さらに,エオタキシンの結膜下注射により誘導される結膜好酸球浸潤においても,これらの抗体を腹腔内投与すると好酸球浸潤が抑制された.以上の結果からマクロファージの表面マーカーとして汎用されているCD11bやF4/80は好酸球の表面マーカーでもあり,好酸球が炎症局所に浸潤する際にこれらの分子が関与することが明らかとなった.
UV-LEDを用いたNADH蛍光検出式バイオセンシングに関する研究

高輝度紫外線LEDを励起光源とした新規な光ファイバ式NADH蛍光検出システムを応用し、湿潤した酵素固定化膜をプローブに装着することで、アルコール計測用生化学式ガスセンサ(バイオスニファ)を作製した。アルコール脱水素酵素の反応生成物であるNADHの蛍光特性を利用することで、高い選択性にてエタノールガスの計測が可能である。本センサにエタールガスを負荷し、蛍光出力の変化を調べたところ、濃度に応じた著しい出力変化が観察された。溶存酸素に依存しないバイオセンサ構築のため、その計測原理となる蛍光検出と従来用いられる水銀ランプなどの大型光源を小型にすることを目的として、まず小型な高輝度紫外線LED(UV-LED)を用いた励起光システムおよび還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)蛍光検出システムの検討を行った。励起光システムではNADHの励起波長である340nmをピーク波長とするバンドパスフィルタを用い、蛍光検出の妨げとなる500nm付近の波長を遮断し作製した。また、効率的にNADH蛍光を検出するため、400nm以上の波長を透過するロングパスフィルタを用いて励起光波長成分を遮断することで倍波長成分を除去し、最適化を行った。これらの結果からNADH蛍光計測システムを構築し、特性評価を行ったところ、NADH溶液を1.0300.0μmol/lの濃度範囲で定量が可能であった。次に、溶存酸素に依存せず、連続測定が可能なNADH蛍光検出式エタノール用バイオセンサの構築を行った。バイオセンサの作製では、光ファイバプローブ先端に、アルコール脱水素酵素(ADH)固定化膜を取り付け、バイオセンサとした。ADH固定化膜は、ADHを生体膜表面と類似した高分子ポリマーPMEHを用い、冷所で乾燥させることでPTFE膜上に包括固定化した。ADH固定化バイオセンサのエタノール溶液に対する定量特性を調べたところ、リン酸緩衝液中のエタノール溶液の濃度の増加に伴っセンサ出力の増加が確認された。このようにして得られた、センサ出力の定常値をもとに定量特性を調べたところ、本センサにてエタノール溶液を0.01-100mmol/lの濃度範囲で定量が可能であった。本センサは、UV-LEDを用いることで小型な形状となり、従来の光源と比べ約1/10ほどのサイズになり、携帯性が高まった。本センサの技術をガス計測の適用することで、呼気診断に利用できるものと考えられる。エタノールガスを簡便かつ選択的に計測するため、アルコール脱水素酵素(ADH)の触媒反応により生成される還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)の蛍光を、高輝度紫外線LED(UV-LED)光源を利用した光学システムを用いて検出する、エタノールガス用バイオセンサを作製した。まず、親水性PTFE膜上に、ADHと、ポリマーの一種であるPMEHとの混合液を塗布・含浸させ、冷蔵室にて3時間乾燥させることにより酵素を包括固定化した。次に、光ファイバプローブをシリコンチューブ及びアクリルパイプからなるフローセルに組み込み、ADH固定化膜をファイバ先端に密着するように取り付け、エタノールガス計測用バイオセンサとした。ここで用いたフローセルは、液相セルと気相セルとから構成されており、リン酸緩衝液を循環させることが可能な構造であることから、連続的にエタノールガスの検出が可能となる。作製したセンサの特性を調べるため、バイオセンサの気相セルにエタノールガスを導入したところ、ガス濃度に応じたセンサ出力の増加が観察され、エタノールガスを0.32-300.0ppmの濃度範囲で定量が可能であった。また、エタノールガスと同様の手順にて、異なる種類のガスを導入したところ、エタノールを含まない試料についてはほとんど応答を示さなかったことから、酵素の基質特異性にもとづくガス選択性が確認された。以上の結果から、本センサは、アルコール代謝の評価や酒気帯び運転の判断ツールとして有効であると考えられる。本センサは既存の半導体式ガスセンサに比べ、高感度且つ選択的なエタノール検出が可能であるうえ、センサデバイスの小型化が可能であるため、汎用性が高まると同時に集積化することが可能である。したがって、パターン認識による匂いの識別や、携帯用簡易センサとして他の疾病の診断による医療分野や環境計測のモニタリングへ応用展開できるものと考えられる。
種苗工場のプロセス化に必要な植物培養細胞の生理的計測の自動化

種苗工場とは、次世代の農業生産体系を担う工業化された種苗生産システムをさす。生理学的計測とその自動化は種苗工場を具体化させるために必要なプロセスである。本研究では、植物体の生長に関する生理的研究、培養体の研究、植物体の環境ストレス反応に関する研究、種苗の水耕栽培における研究、制御及び計測の自動化に関する研究に区分して研究を段階的に遂行した。生長に関する生理学的研究:植物の生長は、細胞の90%以上が水で構成されているため、細胞に水が流入する速度によって生長が制限されることが明らかにされ、生長に伴った水ポテンシャル場の計測により、植物の生長速度の予想が可能となった。培養体の研究:植物培養における形態形成および細胞伸長における培地条件と細胞水分生理的特性を研究することにより、細胞の膨圧および生長に伴った水ポテンシャル場の存在が培養植物で明らかにされた。環境ストレスに関する研究:種苗における塩ストレス、温度ストレス、湿度ストレスでの植物体での細胞伸長、光合成、気孔反応の生理的メカニズムを明からにした。種苗の水耕栽培における研究:水耕栽培で植物を育てたときの生育と生理的特性、管理の自動化について明らかにし、特に、塩類ストレスにたいする種苗の耐性のメカニズムと塩類ストレスによる栽培植物果実における糖の集積による高品質化についても触れた。制御及び計測の自動化に関する研究:植物の生体計測と計測制御およびその自動化について、人工知能型コンピューター利用について明らかにした。本年度は細胞の水分状態計測の実施と培養植物を濃度の異なった培地で育成させることによる生長の差異を検討した。細胞の水分状態の計測のため、ムラサキツユクサを使用し、光合成と蒸散作用に関わる気孔開閉のための生理的特性について検討を行なった。このムラサキツユクサは培養の植物材料としても使われており、細胞の水分計測をプレッシャ-プロ-ブ、ナノリッタ-オスモメ-タ、サイクロメ-タを使用して計測しており、培養の植物材料の生理特性を解析することは培養に先立って無視することができない過程である。この研究でムラサキツユクサの細胞における容存物の濃度が決定できさらに環境条件の変化に伴う細胞の水ポテンシャル、膨圧の特性がわかった。この特性は、細胞培養を行なった場合にもある程度適応できると考えられ、ここで得られた浸透ポテンシャルをもとにして培養に適した培地の濃度を決定を行なっているところであり、最適培養濃度を決定した後、培養に適した温度を決定する予定である。さらに、本年度インゲンマメの種子から胚培養を行なった。胚培養は植物ホルモンを含まない培地を使用して行い、培養された胚は、カルス分化することなく細胞分裂と細胞伸長を繰り返し、正常な植物体を分化させた。細胞が拡大するためには細胞内に水が流入しなければならず、そのためには水源と伸長細胞間に生長に伴った水ポテンシャル勾配が存在すると思われる。本研究では、生長に伴った水ポテンシャル勾配を成熟部位と伸長部位の水ポテンシャルの差で推測した。その結果、培養植物体の伸長は生長に伴った水ポテンシャル勾配に依存していることがわかった。このことにより、種苗工場における種苗の培養および育苗のためには生長に伴った水ポテンシャル勾配を計測すれば、生長制御に役立つことがわかった。本研究においては、種苗工場の基礎となる植物細胞からの不定胚の分化さそれからの発芽生長過程および幼苗種苗での細胞レベルで物理化学的計測を行ないインタ-フェ-スを通じてコンピュ-タ入力を行なって種苗工場のプロセス化を行なうための生理的計測の自動化を研究目的としている。具体的には、無菌室に設定されたジャ-ファ-メンタ中または振盪培養器中で培養された不定胚または種子から発芽させた幼苗の細胞の生長率を計算し、同時にプレッシャ-プロ-ブを用いて細胞膨圧、細胞膜の透水率、細胞壁の弾性率を計測し、さらにナノリッタ-浸透圧計を使用してプレッシャ-プロ-プと組み合わせることにより細胞の浸透圧、水ポテンシャルの計測を行った。

その結果、不定胚形成に伴った組織分化には、細胞の膨圧の大きさと細胞壁の弾性が関わっていることが明かとなった。さらに、培養植物の細胞伸長は、細胞に流入する水の速度によって生理的に制御されていることが、塩類ストレスおよび温度ストレスの実験を行うことによって明かとなった。また、種苗を水耕栽培することにより、種苗の光合成量と生長の関係を調べ、環境ストレス下での生長の最適化について研究し、生長にともなった水ポテンシャル場が生長を制御する生理的要因になっていることがわかった。今後さらに、環境条件をステップ変化させ、どの生理的計測量が環境の変化量に対応して変化するか解明し、その生理的計測量をもとにしての計測の自動化のために役立つ生理的主要情報関数を抽出し、培養およびそれから得られた種苗が生理情報関数によりコンピュ-タを用いて制御できるかどうか試みる予定である。種苗工場とは、次世代の農業生産体系を担う工業化された種苗生産システムをさす。生理的計測とその自動化は種苗工場を具体化させるために必要なプロセスである。本年度の研究では、主に培養体における細胞水分生理的研究、種苗植物体の環境ストレス反応に関する研究、水耕栽培における応用研究、制御及び計測の自動化に関する研究に区分して研究を遂行した。培養体における細胞水分生理的研究:植物培養における形態形成および細胞伸長における培地条件と細胞水分生理的特性を研究することにより、細胞の膨圧および生長に伴った水ポテンシャル場の存在が培養植物で明らかにされた。環境ストレスに関する研究:種苗を水耕栽培することにより、種々の塩ストレスを種苗に課した。水耕養液の水ポテンシャルを同一にしてイオンの種類のみ変えて塩ストレスを課したところ、植物に与える水分生理的特性に大きな差があることが解明され、根におけるイオンの透過性に依存していることが明らかとなった。しかし、複数の塩を混合した水耕養液では、単一の塩による塩ストレスと異なった植物応答が見られ、単一塩により計測された膜透過性は、必ずしも水耕養液における複合のイオン環境では適応できないことがわかった。水耕栽培における応用研究:水耕栽培で植物を育てたときの生育と生理的特性、管理の自動化について明らかにし、特に、塩ストレスに対する種苗の耐性のメカニズムと塩ストレスによる栽培植物果実における糖の集積による高品質化についても触れた。制御及び計測の自動化に関する研究:植物の生体計測と計測制御およびその自動化について、人工知能型コンピューター利用について明らかにした。
スギ花粉症初期療法が鼻粘膜ヒスタミンH1受容体発現に及ぼす効果と機序に関する研究

初期療法を施行することで鼻粘膜擦過細胞中のヒスタミンH1受容体mRNAの発現量は有意に低下することが確認された。スギ花粉飛散開始前の鼻粘膜擦過細胞中のヒスタミンH1受容体mRNA発現量と、スギ花粉飛散時期の鼻症状に、正の相関関係があることを見出した。マウスにスギ花粉エキスを反復投与することで、くしゃみや鼻掻きの鼻症状を有意に誘導し、血清中スギ花粉特異的IgEが産生されることを確認した。ヒト鼻粘膜上皮培養細胞にヒスタミン受容体が発現していることを確認できた。スギ花粉症に対する治療方法の一つに初期療法がある。スギ花粉飛散開始前に治療を開始する初期療法が有用であることは周知の事実となっているが、そのメカニズムや治療開始時期については不明な点が多い。スギ花粉症を含めたアレルギー性鼻炎において、症状発現の中心的役割を担っているのは、主に肥満細胞から放出されるヒスタミンとその受容体であるヒスタミンH1受容体である。我々は、初期療法が有効である一因として鼻粘膜のヒスタミン受容体発現の変化に着目し研究を行っている。平成24年のスギ花粉飛散時期に初期療法を施行した対象者から鼻粘膜擦過細胞を採取し、鼻粘膜擦過細胞に発現しているヒスタミンH1受容体mRNAの発現量を測定し、比較検討を行った。その結果、初期療法を施行することで鼻粘膜擦過細胞中のヒスタミンH1受容体mRNAの発現量は有意に低下することが確認された。また、スギ花粉飛散開始前の鼻粘膜擦過細胞中のヒスタミンH1受容体mRNA発現量と、スギ花粉飛散時期の鼻症状に、正の相関関係があることを見出した。これらの結果から、スギ花粉症患者に対し、初期療法が有用であることの一因として、鼻粘膜に発現しているヒスタミンH1受容体の発現量変化が関与している可能性が示唆された。また、スギ花粉症モデルマウスの作成について、スギ花粉エキスを経腹腔投与もしくは経鼻投与を反復することで、くしゃみや鼻掻きの鼻症状を有意に誘導し、血清中スギ花粉特異的IgEが賛成されることを確認した。また、ヒト鼻粘膜上皮培養細胞にヒスタミン受容体が発現していることを確認できた。スギ花粉飛散開始前に治療を開始する初期療法が有効であることは周知の事実となっているが、そのメカニズムや治療開始時期については不明な点が多い。鹿児島県において、スギ花粉は1月下旬から3月下旬にかけて主に飛散する。そのため、平成24年1月から初期療法群の鼻粘膜擦過組織の採取を開始し、飛散開始後の2月上旬から飛散後治療群の鼻粘膜擦過組織の採取を開始した。スギ花粉症患者では、ヒノキ花粉症を同時に発症していることが多くみられる。そのため、ヒノキ花粉症発症の有無とヒノキ花粉症による症状増悪についても同時に検討する必要がある。鹿児島県において、ヒノキ花粉の例年の飛散時期は3月から5月上旬までである。スギ花粉症による症状発現とその増悪について、さらにヒノキ花粉症による症状増悪を加味して検討するため、経過中の鼻症状確認や鼻粘膜擦過組織採取は平成24年5月まで継続して行う予定である。採取した鼻粘膜擦過組織はすべて凍結保存しており、サンプル採取が終了した時点で、鼻粘膜擦過組織中のヒスタミンH1受容体の発現について測定する予定である。その結果を踏まえて、次年度の研究を進める計画である。研究計画に沿って研究を継続中である。スギ花粉非飛散期の検討については、次年度に実施予定である。おおむね研究実施計画にそって研究を進める予定である。スギ花粉飛散時期が年度を跨ぐため、サンプルの測定が次年度となる。そのために予算の一部を次年度へ繰り越す必要があった。スギ花粉の飛散時期は、例年2月から4月にかけてである。そのため、本研究におけるサンプルは年度をまたいで採取する必要があり、その後に測定や解析を行うために、前年度の研究費の一部を繰り越す必要があった。また、次年度においては研究実施計画に沿ってマウスを使用した実験などを遂行する予定である。
サイトカイニン情報伝達系の研究

本研究の目的は、サイトカイニンの受容・情報伝達系に関わると考えられる遺伝子を同定し、それら遺伝子の機能を解析し、サイトカイニン応答の分子機構をより良く理解することである。そのため、サイトカイニン応答が変化したシロイヌナズナの変異体を分離し、その原因遺伝子を分離するという手法をとった。突然変異源としては、転写エンハンサーと、化学的突然変異源を用いた。転写エンハンサーをシロイヌナズナのゲノムのランダムな位置に挿入することにより得られた優性の変異体で、恒常的にサイトカイニン応答を示すものとしてcki1とcki2を分離した。CKI1の原因遺伝子は以前に報告しているようにヒスチジンキナーゼをコードしている。ここでは、cki2変異体の表現型の原因を調べた。cki2では、外来エンハンサーが、ここでCKI2と名付けた遺伝子のコード領域に挿入され、CKI2の転写、翻訳が遺伝子の途中から始まっており、このことはN-末端が欠失したCKI2タンパク質が合成されていることが表現型の原因であることを示している。CKI2もヒスチジンキナーゼをコードする。シロイヌナズナの他のヒスチジンキナーゼがすべて膜貫通タンパク質と予想されるのに対して、CKI2は細胞質局在型であるという特徴を持っている。また、化学的突然変異源を用いて分離したサイトカイニン高感受性変異体ckh1の原因遺伝子も特定し、これが転写開始複合体の一員であるTAFの一つと部分的に相同性があることを示した。同じくEMSを用いて分離したサイトカイニン耐性変異体の原因遺伝子はヒスチジンキナーゼの一つをコードしていた。CKL1はサイトカイニン受容体であるかもしれない。本研究を通じてサイトカイニンの受容・情報伝達に関わるいくつかの遺伝子を単離、解析できた。これまでにシロイヌナズナのサイトカイニン高感受性突然変異体ckh1(cytokinin hypersensitive1)とckh2を分離している。CKH1遺伝子座に強く連鎖するCAPSマーカーm59周辺のTACのcontingクローンを分離した。相補性を調べるために、これらをcki1変異体に導入しているところである。ここで、購入した遺伝子増幅装置を用いて遺伝子操作をおこなった。CKI1は、アクティベーションタギングにより、遺伝子が過剰発現した時にサイトカイニン非存在下でもサイトカイニン応答を引き起こす遺伝子としてクローニングしたもので、その産物はヒスチジンキナーゼに相同性がある。CKI1遺伝子産物がヒスチジンキナーゼとしての活性があるのかどうか、また、シグナル伝達系での下流はどうなっているのかを知るために実験を行った。CKI1産物は少なくとも酵母の中ではヒスチジンキナーゼとして働き、YPD1にリン酸基を転移する活性があるらしいことを示した。また、保存されたヒスチジン、アスパラギン酸残基のアミノ酸置換の実験を行い、酵母中での活性にこれらの残基が必須であることがわかった。また、これらのアミノ酸は植物中でもCKI1が活性を示すためにも必須であることがわかった。これらの結果は、リン酸化型のCKl1がサイトカイニン応答を引き起こすらしいことを示唆している。cki2もアクティベーションタギングにより得られた突然変異体であり、cki1に似た表現型(サイトカイニン応答を常に示す)をもつ。原因遺伝子CKI2のcDNAのクローニングをおこなったところ、CKI1とは別のヒスチジンキナーゼ類似蛋白質をコードしているらしいことがわかった。植物ホルモンの一種、サイトカイニンは、植物の形態形成に重要な役割を果たしている。本課題は、サイトカイニン受容および情報伝達系についての研究である。本年度の研究を始めるまでに、サイトカイニンの情報伝達系に関わる遺伝子のCKI1遺伝子をクローニングしている。

また、サイトカイニン情報伝達系に関する突然変異体を分離し、それらをそれぞれ、cki2,msh,ckh1,ckh2となづけている。本年度は、昨年度より引き続き行っているcki2とmsh突然変異体の原因遺伝子のクローニングを終了し、それぞれCKI2、MSHと名づけた。CKI2遺伝子産物はハイブリッド型のヒスチジンキナーゼに属する。cki2変異体では、一部欠損したCKI2遺伝子産物が合成されることにより、恒常的サイトカイニン応答を示す表現系が引き起こされている可能性が高いことがわかった。MSH遺伝子産物は、ホメオボックスと相同性のある新規の遺伝子であった。クローニングしたMSH遺伝子をシロイヌナズナのカルス中で過剰発現させると、サイトカイニン非存在下でもカルスは多くのシュートを形成したことより、MSH遺伝子はシュート形成に関わる重要な遺伝子ではないかと考えている。CKI1遺伝子は、サイトカイニン受容体をコードしている可能性が高いと考えている。このことを証明するため、CKI1を大量発現させ、生化学的研究を行う系を開発中である。ここに述べた研究を継続することにより、サイトカイニン受容からシュート形成等のサイトカイニン応答に至る情報伝達経路が理解せきると考えている。本研究の目的は、サイトカイニン受容・情報伝達系に関わると考えられる遺伝子を同定し、それら遺伝子の機能を解析することである。私達が以前に同定した遺伝子で、ヒスチジンキナーゼをコードし、サイトカイニン情報伝達系の初期に働いていると考えられるCKI2に関しては、過剰発現させるとサイトカイニン応答を引き起こすこと、また、その産物のNー末端領域が抑制的に働いているらしいことを示した。また、CKI2遺伝子の破壊株の同定に成功し、現在は遺伝子破壊株の表現型を調べているところである。また、サイトカイニンに対する感受性の低下した半優性の突然変異体ckI1の原因遺伝子も同定し、これもまた、ヒスチジンキナーゼであることを示した。以前に発表したヒスチジンキナーゼCKI1を含め、本研究は、サイトカイニンの受容、情報伝達にはヒスチジンキナーゼが重要な役割を果たしていることを明らかにした。今後は、ヒスチジンキナーゼがサイトカイニンの受容体そのものであるのかどうか、また、各ヒスチジンキナーゼはどのように機能分担しているのか、を調べていく予定である。また、サイトカイニン受容性の上昇した変異体ckh1の原因遺伝子もクローニングした結果、その産物が、転写調節に関わるTAFに似ていることがわかった。CKH1の細胞内局在を調べるため、CKH1とGFPの融合蛋白質を植物細胞内で発現させたところ、融合蛋白質は核に存在することがわかった。Ckh1変異体は劣性であることより、CKH1はサイトカイカイニン情報伝達系の負の制御因子であると考えられる。これらのことより、CKH1は転写調節を介してサイトカイニンの情報伝達を負に調節している可能性が高いと考えている。