hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ErbB受容体を介した成熟心筋細胞の増殖誘導

作製した遺伝子改変ES細胞の株を8細胞期のマウス胚にインジェクションし、キメラマウスの作製を行った。germ-line transmissionの効率が非常にわるかったため、別のES細胞株を用いて、再度遺伝子改変を行った。これにより、目的のほとんどのES細胞株でようやくgerm-line transmissionを得ることに成功した。上記で作製したマウスを用いて、心筋細胞特異的に目的の遺伝子を発現させるため、トロポニンT Creマウスと掛け合わせて、表現型の解析を始めている。当初、近交系のB6Jマウスラインで表現型を解析しようとしたが、仔の生存率が非常に悪かったため、非近交系のICRにバッククロスした。バッククロスにより効率よく、変異マウスを得ることに成功した。トロポニンT-Creマウスとの掛け合わせにより、心筋細胞特異的に目的の遺伝子を発現させると、8週目には変異マウスで体重が減少し、著明な心不全により死亡することが判明した。心エコー上、EFの著明な低下、心室腔の著明な拡大、心室壁の菲薄化が認められ、拡張型心筋症と考えられた。以上のデータは、胎仔期から発現するトロポニンT-Creマウスとの掛け合わせにより得た結果で、8週目まで生存はするが、発生期の異常の可能性がある。そのため、現在トロポニンT-Cre-ERT2と掛け合わせを始めており、成仔で同様な変化がおこるかどうかを検討中である。また、共焦点顕微鏡を用いて生体マウスの拍動する心臓のなかで、心筋細胞を細胞内小器官レベルでライブイメージングを行うシステムを構築することに成功した。上記マウスを用いて、遺伝子変異により心筋細胞の挙動の変化を直接観察する。germ-line transmissionに至るまで、非常に時間がかかったが、ようやく解析すべきマウスを得た。また、マウスラインを非近交系のICRに変更したことにより、現在大量のマウスを得ることに成功し、表現型の解析が順調に進んでいる。今後は、トロポニンT-Cre-ERT2との掛け合わせで得たマウスに、タモキシフェンを投与することにより、細胞周期がほぼ完全に停止したと考えられる生後6週目で、心筋細胞の増殖を誘導してみる。まず、EdUを投与することにより、細胞周期活性の活性化の検討を行う。もし、細胞周期活性の活性化がみられれば、ライブイメージングを試す。また、トロポニンT-Creマウスとの掛け合わせにより得たマウスの心臓から得たRNAやタンパクを用いて、どのシグナルが活性化し、どの遺伝子の発現が更新しているかを検討し、遺伝子の変異により拡張型心筋症に至った原因を解析する。現在、ツールマウスの作成途中で、遺伝子改変ES細胞の株を、8細胞期のマウス胚にインジェクションして、順次キメラマウスを作製している。当初、ターゲティングマウスを作製後に改めて薬剤耐性遺伝子を除去する必要がないように、遺伝子改変ES細胞の作製に、薬剤耐性遺伝子を含まないターゲティングベクターを用いた。ゲノム編集技術を用いて、適切にターゲティングされたES細胞を、効率よく作製することに成功したが、適切にターゲティングされていないES細胞の混入があったため、目的のほとんどのマウスを得ることができなかった。そのため、改めて薬剤耐性遺伝子を含むターゲティングベクターを作製し、薬剤を用いたセレクションを行って遺伝子改変ES細胞を作製し直し、キメラマウスを作成している最中である。作製予定のコンディショナルノックインマウスの一つは、すでにgerm-line transmissionを得ており、心筋細胞特異的に目的の遺伝子を発現させるためにトロポニンT Creマウスと掛け合わせている。心筋細胞の増殖の可視化に関しては、申請時には採取した心臓の厚組織切片を作成し、それを培養することでライブイメージングを行う予定であった。当該年度はさらに発展させた形で、成体マウスの中で拍動する心臓を1細胞レベルで可視化するシステムを開発し、ほぼ完成に近づいている。目的のマウスを得たら、多光子顕微鏡を用いたライブイメージングをいよいよ始めるところである。薬剤によるセレクションが甘かったためか、目的の遺伝子がターゲティングされていたES細胞に、ターゲティングされていないES細胞がコンタミしていたたため、germ-line transmissionを得たにもかかわらず、目的のマウスをほとんど得られなかった。そのため薬剤耐性遺伝子を含んだターゲティングベクターを作製し直し、再度、ES細胞にターゲティングした。現在8細胞期のマウス胚に順次インジェクションして、キメラマウスを作成中である。

心エコー上、EFの著明な低下、心室腔の著明な拡大、心室壁の菲薄化が認められ、拡張型心筋症と考えられた。以上のデータは、胎仔期から発現するトロポニンT-Creマウスとの掛け合わせにより得た結果で、8週目まで生存はするが、発生期の異常の可能性がある。そのため、現在トロポニンT-Cre-ERT2と掛け合わせを始めており、成仔で同様な変化がおこるかどうかを検討中である。また、共焦点顕微鏡を用いて生体マウスの拍動する心臓のなかで、心筋細胞を細胞内小器官レベルでライブイメージングを行うシステムを構築することに成功した。上記マウスを用いて、遺伝子変異により心筋細胞の挙動の変化を直接観察する。germ-line transmissionに至るまで、非常に時間がかかったが、ようやく解析すべきマウスを得た。また、マウスラインを非近交系のICRに変更したことにより、現在大量のマウスを得ることに成功し、表現型の解析が順調に進んでいる。作製したターゲティングマウスを用いて、拍動心臓のライブイメージングの系を確立すると同時に、EdUの取り込み、および心筋細胞の数を評価することにより、目的遺伝子の強制発現による心筋細胞の増殖能の変化を検討する。また作製できていないターゲティングマウスについては、遺伝子改変ES細胞を順次、8細胞期マウス胚にインジェクションし、完成を急ぐ。今後は、トロポニンT-Cre-ERT2との掛け合わせで得たマウスに、タモキシフェンを投与することにより、細胞周期がほぼ完全に停止したと考えられる生後6週目で、心筋細胞の増殖を誘導してみる。まず、EdUを投与することにより、細胞周期活性の活性化の検討を行う。もし、細胞周期活性の活性化がみられれば、ライブイメージングを試す。また、トロポニンT-Creマウスとの掛け合わせにより得たマウスの心臓から得たRNAやタンパクを用いて、どのシグナルが活性化し、どの遺伝子の発現が更新しているかを検討し、遺伝子の変異により拡張型心筋症に至った原因を解析する。遂行を計画していたライブイメージングの備品の購入を予定していたが、その前段階で顕微鏡のセットアップが間に合わなかったため、購入を延期せざるを得なかった。本年度にその備品を購入する予定である。なおこの延期による、研究計画の遂行の支障はない。
初代培養肝細胞で発現が誘導されるグルクロン酸転移酵素

1. UDP-グルクロン酸転移酵素のメチルコラントレンによる転写活性化機構ラット肝初代培養細胞にレポーター遺伝子を導入することによりメチルコラントレンで誘導されるUDP-グルクロン酸転移酵素(UGT1A6)の転写活性化機構を解析した結果、UGT1A6遺伝子の転写開始点から上流135塩基前後に薬物応答配列(GCGTG)が同定された。さらに、ゲルシフトアッセイおよびフットプリントアッセイの結果、ここにAhレセプター/Arnt複合体が結合することが判明した。2.初代培養肝細胞で誘導されるUDP-グルクロン酸転移酵素(1)各UGT1分子種に特異的なプライマーを用いてRT-PCRを行った結果、ラット肝ではほとんど発現しないUGT1A3が肝初代培養細胞で大幅に(約100倍)誘導されていることが分った。(2)UGT1A3遺伝子のプロモーター領域をpBluescript IIにサブクローニングしてexonuclease IIIにより段階的に欠失させた鋳型を調製し、およそ4.8kbの塩基配列を解析した。(3)得られた塩基配列からTFSEARCHプログラムにより転写調節因子の認識部位候補を検索した結果、GATA配列、HNF、USF、およびTATAボックスなどが同定された。今後はシークエンス反応の鋳型に用いた欠失体を元にCATレポーター遺伝子を作製し、UGT1A6のときと同様な手段により転写活性化に必要な領域を決定する方針である。(4)ビリルビン代謝型分子種であるUGT1A1、UGT1A2、UGT1A3、およびUGT1A5、さらにフェノール代謝型分子種であるUGT1A6のcDNAを発現ベクターpUCDSRαに連結し、これらをCOS細胞に導入して各分子種を一過的に発現させた。その結果、UGT1A1およびUGT1A6はそれぞれビリルビンおよび4-ニトロフェノールを基質としたグルクロン酸抱合活性を示したが、UGT1A3はどちらに対しても活性を持たなかった。またUGT1A3は、4-メチルウンベリフェロンおよびジギトキシンモノジギトキシドに対してもグルクロン酸抱合活性を示さなかった。
強皮症の線維化におけるmicroRNAの役割の検討

全身性強皮症は皮膚だけでなく内蔵諸臓器の組織の線維化を特徴とする慢性疾患である。間質性肺炎、強皮症腎などは予後を左右するが、線維化に対する確立された治療法はない。一方、microRNAは標的mRNAの安定性や蛋白への翻訳を阻害する事で遺伝子発現調節を行なっており様々な疾患の発症に関与していることが明らかになっている。しかし、強皮症におけるmicroRNAの役割についてはほとんど解明されていない。近年exosome中にmicroRNAが存在することが明らかになっている。強皮症における線維化に対するmicroRNAの役割をあきらかにすることで、新規治療法を確立に寄与することができると考える。
重症患者の予後予測マーカーとしての末梢血アデノシン三リン酸の有用性の評価

重症患者の予後予測マーカーとしての末梢血アデノシン三リン酸(ATP)の有用性について、集中治療室に入室した患者において検討した。集中治療室入室患者は、健常人よりも末梢血ATP濃度が低下していた。また入室時の値は同時に測定した乳酸値よりも予後を予測する可能性が高く、特にAPACHE IIスコアが高い症例において組み合わせて使用することによりその精度が高まる可能性が示唆された。集中治療を必要とする重症患者を評価する指標としては、死亡リスクを評価項目としたものとしてAPACHEスコアやSAPSスコアが、臓器不全を評価項目としたものとしてMODSスコアやSOFAスコアが用いられている。これらの重症度評価システムの多くは生理学的パラメータを中心とした因子を用い、数学的手法により構築したモデルであるが、モデルと実際の患者群との間の差異が避けられない。またIL-6やTNF-αなどの炎症性・抗炎症性サイトカインは重症患者においてしばしば使用されるバイオマーカーであるが、侵襲による生体反応の大きさは反映するものの、臓器障害の程度とは必ずしも一致しない。ATP(アデノシン三リン酸)は生体内におけるエネルギー代謝の最終産物であり、エネルギー代謝を反映したバイオマーカーとなり得る。類似のバイオマーカーとして使用される乳酸が嫌気性代謝に関連した間接的なバイオマーカーであるのに対し、ATPは生体内で利用されるエネルギーそのものであり、より精度の高いバイオマーカーとして有望である。本研究は重症患者における重症度評価・予後予測のバイオマーカーとしての末梢血ATP濃度の有用性を検証することを目的とし、敗血症患者を中心として経時的なATP濃度の変化と患者属性、転帰(予後および在院日数、ICU在室日数、不全臓器数)に関するデータを収集し、それらの関連を解析するとともに、他の指標(APACHE IIスコア、乳酸など)と比較して精度を検討する。本年度は3か年のうちの2年目であり、1年目に引き続いて検体採取およびデータの収集、整理を行い症例を蓄積した。集中治療を必要とする重症患者の治療成績の向上のためには、前提として重症度評価・予後予測の指標が必要である。従来から用いられているAPACHE IIスコアやSOFAスコアは、生理学的パラメータや検査データなどから数学的モデルに基づいて重症度を評価する指標であるが、モデルと実際の患者群との差異による限界がある。IL-6やTNF-αなどの炎症性サイトカインは侵襲による生体反応の大きさを反映するものの、必ずしも臓器障害の程度とは一致しない。ATP(アデノシン三リン酸)は生体内におけるエネルギー代謝の最終産物であり、エネルギー代謝を反映したバイオマーカーとなる可能性がある。類似のバイオマーカーとしては乳酸があるが、乳酸が嫌気性代謝に関与した間接的な指標であるに対して、ATPは生体内において利用されるエネルギーそのものであり、より精度の高い重症度評価や予後予測のバイオマーカーとして有望と期待される。本研究は集中治療を必要とする重症患者において、重症度評価・予後予測のバイオマーカーとしての末梢血ATP濃度の有用性を検証することを目的とした。本研究は集中治療を必要とする重症患者の末梢血ATP濃度を経時的に測定すると共に、患者の属性、基礎疾患、転帰、在院日数およびICU在室日数、不全臓器数、他の重症度評価・予後予測指標(APACHE IIスコア、乳酸値など)に関するデータを3か年かけて収集し、ATPと予後との関係、および他の指標と比較した精度の優劣を解析する。本年度は3か年のうちの1年目であり、重症患者の中でも敗血症の患者を対象として15例の検体採取、データ収集を行いながら、同時に施行上の問題点を検討した。検体採取・処理およびデータ収集作業は問題なく施行可能であった。集中治療を必要とする重症患者を評価には、APACHEスコアやSAPSスコア、SOFAスコアなどが用いられている。これらの重症度評価システムは主に生理学的なパラメータを用いてモデルが構築されているが、モデル構築時の患者群と実際の患者群との間の差異が避けられない。また炎症性サイトカインや抗炎症性サイトカインの血中濃度は重症患者においてしばしば用いられるバイオマーカーであり、信州による生体反応の大きさを反映していると考えられるが、臓器障害の程度と必ずしも一致しない。ATP(アデノシン三リン酸)は生体内におけるエネルギー代謝の最終産物であるため、エネルギー代謝を反映したバイオマーカーとなり得る。類似のバイオマーカーとしては乳酸が用いられているが、ATPはより直接的で精度の高いバイオマーカーとなり得る可能性がある。本研究は重症患者における重症度評価・予後予測のバイオマーカーとしての末梢血ATP濃度の有用性を検証することを目的とし、敗血症患者を中心とした重症患者において、末梢血ATP濃度の経時的変化と患者属性および転帰に関するデータを収集し、その関連を解析した。その結果、ICU退室時および28日後の時点で予後不良であった群は、予後良好であった群と比較して末梢血ATP濃度が低値であり、また乳酸値とATP濃度との比が高い傾向にあった。これは敗血症患者、敗血症以外の重症患者とも同様の傾向であった。

末梢血ATP濃度は単独、もしくは乳酸値との組み合わせにより予後予測のバイオマーカーとなる可能性が示唆された。集中治療医学検体の採取やデータの収集、整理の作業に関しては大きな問題なく、おおむね順調に行っている。検体採取や処理、データ収集の作業は当初の計画通り行うことができた。対象症例数は年間50症例程度を見込んだが、本年度は初年度であり敗血症患者に対象患者を限定したこと、また当初の見込みよりも対象となる症例が少なかったため目標を下回った。症例数が見込みより少なかったため、本年度はデータの解析を行わず、次年度以降のデータと併せて行うこととした。引き続きデータを収集して症例を集積する。対象は敗血症を中心とした重症患者であるが、敗血症以外の患者についても範囲を広げる。また最終年度となるので集積したデータの解析を行い、関連学会等での発表を行う予定である。次年度以降も引き続きデータ収集作業を行う。本年度は集中治療を必要とする患者の中でも敗血症患者に限定したため当初見込みの目標症例数を下回ったが、データ収集作業自体には支障はなかった。次年度以降は当初計画通り対象患者を敗血症患者以外にも拡大して症例数の蓄積をはかる。症例がある程度蓄積した時点で末梢血ATP濃度と患者予後との相関、末梢血ATP濃度の経時的変化と患者予後との関係および末梢血ATP濃度の経時的変化と患者予後との関係についての解析を加える。前年度の症例数が見込みよりも少なかったため、検体採取等に使用する消耗品等に残が生じ、追加購入が計画よりも少なくなった。次年度も症例の集積を予定しており、次年度への繰越額は検体採取に使用する消耗品等への使用を予定している。またデータの整理保存、解析のための記憶媒体、ファイル等の購入と、情報収集・成果発表のために学会参加や論文投稿料への使用を予定している。次年度以降も検体採取・処理を行うため、シリンジ、スピッツ、マイクロピペット用チップ、センサー等の消耗品への使用を予定している。また収集したデータの保存・整理のための記憶媒体、ファイル等の購入を予定している。情報収集、成果発表のため関連学会への参加を予定している。次年度への繰越額は、同様に検体採取・処理用消耗品、記憶媒体に使用予定である。
EGFRリガンドの性質を決定するO-GlcNAc glycanの機能解析

本研究は、O-GlcNAc glycanがNotchシグナルだけではなく、EGFRシグナルも制御する糖鎖であることを実証することを目的とする。O-GlcNAc glycanは、Notch1などのEGFドメインに生じる非典型的な糖鎖修飾である。O-GlcNAc glycanの異常はNotchシグナルの破綻を引き起こし、その結果、先天性疾患や異常な血管新生の原因となる。本研究でO-GlcNAc glycanの多様性がEGFRシグナルを制御することが実証できれば、糖鎖多様性の基本原理を初めて明確に証明することになる。
漢字の書体の再分類・様式化に関する研究

本研究は、漢字というものに視点を当て、従来からの書体分類の方法である「篆書・隷書・楷書・行書・草書」の五体の分類が細分化できないかを検討してきた。中国書道史の研究では、中華人民共和国が建国されてからの約50年間に資料を「新出土資料」と総称している。これは、科学的な発掘技術の方法が確立され、文字資料を取り巻く環境、つまりどこにどのようにして収められていたか、墳墓の状況はどうであり他に副葬品は何があったかなどであるが、この周辺情報が得られることによって、文字資料の性格的な位置付けをすることに非常に有益となっている。書体研究と関連がないように思われるが、文字は書かれる場所や材質によって変化してくる。しかし、新出土資料は、中国全土から出土し報告書もばらばらであることから、全ての資料を網羅して知ることは難しく、研究の妨げになってきた。そこで、全ての文字資料と発掘状況を網羅したデータベースを作成し、簡易に検索でき必要な情報を取り出すことのできるシステム構築に取り組んできた。今年は、昨年収集できなかった資料の収集とデータ入力を中心に行ったが、入力・検索する上で問題となったのが、文字コードの問題である。現在の日本・中華人民共和国・台湾という漢字文化圏のコンピュータ上の文字コードはまったく異なり、検索の際にヒットしないことが生じる結果となった。そこで、ユニコードという世界的に統一しているコードに文字を置き換え、整備をした。書体分類上のキーとなる時代は後漢時代である。この時代は、先の五体が全て出揃い存在している時代であり、他に例を見ない時期である。データ化した資料の中から、特に刻石・肉筆書に視点を当てて検討を加え、新たな視点を探り出すことができた。その分類とは、書かれた地域による分類方法で、仮称「地域様式」と述べている。この地域様式は、現在の省別の分類ではなく、後漢時代の郡県による分類である。「熹平石経」後漢時代に作られた石碑の文字を基準にして新出土資料を見ると、「青州・徐州様式」「〓州様式」「予州西部・司隷校尉東部様式」等の細分化が可能であり、この地域様式を各資料に当てはめていくと、例えば隷書か楷書か区別できない資料でも分類できると考えることが可能であるという結論を得ることができた。平成11年度は主に、1950年以降科学的に発掘された墳墓などの報告書の中から文字資料を抜き出し、整理するという作業を中心に研究を進めている。これは、漢字の書体を分類しようとするときに、従来の資料だけでは再分類ができないが、科学的な発掘資料に見られる文字も十分に整理されていないからである。近年出土の資料にこだわるのは、それらが紛れもない第一次資料であるため偽物が混じることはなく、かつ出土状況や墳墓全体の状況が細かくわかり、文字を取り巻く環境を捉えることができるからである。文字変遷の内、注目すべき時代は秦・漢時代であり、特に後漢時代の文字資料は、隷書から草書・楷書・行書などの現在の書体分類がほぼ出そろう時期のものとして特に重点的に収集を進めている。整理途中であるが、書体の変化は肉筆書が先んじて変化していくものであり、肉筆の字形を刻石類がいかにまたいつ受容していくかを探っていけば様式分類の変化につながっていくのではないかという仮説を立てることができた。様式化を進める上で、注意すべきは比較の基準をどうするべきかであり、やはりその時代の実物資料に頼らざるを得ないのが現状である。文字は元々すべて手で書かれたものであるため、その書きぶりや字形は千差万別である。特に肉筆書と総称される文字は相当に細かい分類が必要になってくる。近年出土の文字の収集により、篆・隷・楷・行・草という簡単な枠組みでは分類しきれないことは確認できたが、これをいかに再分類するかが次年度の課題となる。

書体分類上のキーとなる時代は後漢時代である。この時代は、先の五体が全て出揃い存在している時代であり、他に例を見ない時期である。データ化した資料の中から、特に刻石・肉筆書に視点を当てて検討を加え、新たな視点を探り出すことができた。その分類とは、書かれた地域による分類方法で、仮称「地域様式」と述べている。この地域様式は、現在の省別の分類ではなく、後漢時代の郡県による分類である。「熹平石経」後漢時代に作られた石碑の文字を基準にして新出土資料を見ると、「青州・徐州様式」「〓州様式」「予州西部・司隷校尉東部様式」等の細分化が可能であり、この地域様式を各資料に当てはめていくと、例えば隷書か楷書か区別できない資料でも分類できると考えることが可能であるという結論を得ることができた。
ビデオ映像による下部尿路の臨床解剖学的研究:尿路禁へのアプローチ

排尿機能に関係の深い骨盤底部の構造部ならびに周囲の自律神経,リンパ系,筋膜等について,成人男性5体,女性3体の解剖を精細に行い,その映像化につとめた.(1)肛門挙筋の前端部は他の部よりも厚く,また男性では前立腺に密着し,結果として膀胱頸部の位地を上昇させて後部尿道を細長くし,失禁の防止に役立っていると思われる.このことは女性においても基本的に同じである.肛門挙筋の前端部には骨盤神経叢(自律神経叢)の最も低い枝が陰茎(核)背部に行く手前で数本の枝を与えているので,癌手術時にこの神経をできるだけ保存することが望まれる.(2)女性体の前会陰筋の剖出では,従来,尿道の括約筋装置と考えられてきた深会陰横筋は定型的には認められなかった.それにかわってその深部で両側の坐骨枝から起こり尿道の前で合する筋束が認められた.この筋は尿道の直前にアーチを作っており,収縮すれば尿道を後方に屈曲させるので,尿道の禁制機構として役立つことが期待される.今後,多数例における調査が必要と思われる.(3)骨盤神経叢の構成に関しては,主交感要素の上下腹神経叢・下腹神経の筋膜について検討した.腹部の上半では,腎筋膜は,大動脈,大静脈,尿管,精巣動静脈包含しているが,ほぼ下腸間膜動脈起始部のレベルで,(a)前方の精巣動静脈に続く筋膜,(b)中間の上下腹神経叢・下腹神経・尿管を含む筋膜,および(c)後方の腸骨血管鞘に続き膀胱下腹筋膜に連絡する筋膜の3層に分離する.(b)をとくに尿路下腹神経筋膜ureterohypogastric fasciaと名づけ,骨盤外科手術時における副損傷を避ける要素として強調したい.(4)以上の剖出結果をもとにビデオソフトを製作した.骨盤外科の臨床家の参考に提供される.排尿機能に関係の深い骨盤底部の構造部ならびに周囲の自律神経,リンパ系,筋膜等について,成人男性5体,女性3体の解剖を精細に行い,その映像化につとめた.(1)肛門挙筋の前端部は他の部よりも厚く,また男性では前立腺に密着し,結果として膀胱頸部の位地を上昇させて後部尿道を細長くし,失禁の防止に役立っていると思われる.このことは女性においても基本的に同じである.肛門挙筋の前端部には骨盤神経叢(自律神経叢)の最も低い枝が陰茎(核)背部に行く手前で数本の枝を与えているので,癌手術時にこの神経をできるだけ保存することが望まれる.(2)女性体の前会陰筋の剖出では,従来,尿道の括約筋装置と考えられてきた深会陰横筋は定型的には認められなかった.それにかわってその深部で両側の坐骨枝から起こり尿道の前で合する筋束が認められた.この筋は尿道の直前にアーチを作っており,収縮すれば尿道を後方に屈曲させるので,尿道の禁制機構として役立つことが期待される.今後,多数例における調査が必要と思われる.(3)骨盤神経叢の構成に関しては,主交感要素の上下腹神経叢・下腹神経の筋膜について検討した.腹部の上半では,腎筋膜は,大動脈,大静脈,尿管,精巣動静脈包含しているが,ほぼ下腸間膜動脈起始部のレベルで,(a)前方の精巣動静脈に続く筋膜,(b)中間の上下腹神経叢・下腹神経・尿管を含む筋膜,および(c)後方の腸骨血管鞘に続き膀胱下腹筋膜に連絡する筋膜の3層に分離する.(b)をとくに尿路下腹神経筋膜ureterohypogastric fasciaと名づけ,骨盤外科手術時における副損傷を避ける要素として強調したい.(4)以上の剖出結果をもとにビデオソフトを製作した.骨盤外科の臨床家の参考に提供される.
低温における超伝導渦糸の構造

1.従来、超伝導臨界温度(Tc)付近においてGinzburg-Landau理論は非常に重要な役割をはたしてきた。本研究では、自由エネルギーを電子場に関する汎関数行列式の形に書き、そこでSchwingerパラメタを導入し、さらにこのパラメタによる展開を行なった。その結果、Ginzburg-Landau領域をこえる低温において、自由エネルギーのオーダー・パラメタによる展開を得た。これは、Ginzburg-Landau自由エネルギーの一般化になっており、実際、最低次の展開では、Ginzburg-Landau自由エネルギーを正確に再現する。またこの自由エネルギーは、Tc付近では無視される束縛状態の寄与をも正しく考慮している。この自由エネルギーを用いて、我々は低温における渦糸の構造を決定した。その結果従来のGinzburg-Landau理論の予測とことなり、低温でコアー・サイズは減少するという結果を得た。2.Waxman,Williamsはポリアセチレンのソリトンにおいて、ソリトンの幅λがコヒーレンス長に比べ小さいとき、λlnλに比例する項がソリトンのエネルギーに現れることを示したが、本研究ではこの結果から、フェルミ場に対するポテンシャルを調和近似し、その結果えられた自由エネルギーの展開が厳密解を非常によく再現することを見出した。現在このポリアセチレンの結果を、超伝導渦糸に応用している。3.汎関数行列式を求める上で、Fredholm行列式の手法は大変有効である。我々は、1+1次元系におけるFredholm行列式の一般論を研究する過程で、1次元量子力学の境界値問題にかんし、全く新しい解法を発見した。これは、そもそもDirac場のFredholm行列式に関するものであったが、Schrodinger波動関数と、その微分のダブレットを定義することによって、Schrodinger場にも用いるようにした。その結果、本来無限次元の行列式であるFredholm行列式が2×2の行列式で表されるという予想をたてた。現在その証明を試みているが、環状分子の電子スペクトルへの応用などはすでに行なっている(Nakahara,Waxman準備中)。
衝撃波瞬時加熱法を用いた微粒子表面の非等方的修飾法の開発

本研究では衝撃波による瞬時加熱とそれらによる表面状態変化を利用することで簡便な微粒子表面の部分的表面修飾法の開発とその応用について検討を行った。衝撃波源としてはレーザ加熱を用い、超臨界二酸化炭素加圧した銀ナノ微粒子を含む水溶液にレーザ集光を非等方的に照射することで銀ナノ微粒子に異方性を持った表面修飾が可能かどうかを調べた。まずはレーザ照射前の銀ナノ微粒子の紫外可視吸収スペクトルを測定した。その結果、400nmにプラズモン吸収が明確に表れ、ナノ微粒子表面において銀が露出していることが確認できた。そこで、溶媒をトルエンにして銀ナノ微粒子にレーザを集光照射し、銀のプラズモン吸収がどのように変化したかを調べた。その結果、銀のプラズモン吸収は消滅し、銀に炭素由来の被膜ができていることが確認できた。しかし、透過型電子顕微鏡による銀ナノ微粒子の表面状態の異方性は確認できなかった。これはレーザ照射した微粒子が気液界面に存在しないで液内部に大部分が存在していることでないかと考えている。本研究では微粒子存在下に衝撃波を発生させ、異方性のある表面修飾された微粒子を生成させることを目的としている。従来、衝撃波は高圧ガスと低圧ガスに仕切りを設け、その仕切りをはずすことで衝撃波を発生させ、高温高圧場を実現しているが、背圧に通常用いられている高圧空気の代わりに、高圧水を用いることでより高速で、高温高圧場を生成することが期待できる。そこで、500気圧程度まで加圧できる高圧水の装置を製作依頼し、それを背圧とする衝撃波発生装置を製作した。今後、この衝撃波発生装置に微粒子または微粒子前駆体物質を封入し、微粒子表面を瞬時加熱し表面修飾に異方性を持つ分子を作成する予定である。その予備実験として、硝酸銀水溶液、硝酸銀をエチレングリコールを溶かした溶液を作成し、衝撃波加熱の変わりに、レーザ加熱を用いて微粒子を作成する実験を行った。レーザ光にはYAGレーザの基本波(1064 nm)を用い、各溶液にレーザ照射を行うことで銀微粒子生成を行った。その結果、銀微粒子の生成が確認され、レーザ加熱による硝酸銀溶液からの微粒子生成が確認された。また、今回の実験で用いた加熱光源であるYAGレーザは水に吸収されるため、レーザ加熱は溶液の表面近傍のみに進行し、生成する微粒子もこのような加熱の異方性があると予想し、走査型電子顕微鏡(SEM)による観察を行ったが、特に形状に大きな特徴をもつ銀微粒子の生成は確認できなかった。加熱方式の確認、励起波長を水をより吸収する波長に変換するなどして、微粒子表面の異方性の発現に向けて研究を進めていく予定。衝撃波加熱による微粒子の非等方的修飾をするため、気液界面に微粒子を配置し、微粒子にレーザを照射することで微粒子の液面側のみの片面修飾を目標とした。その予備実験として、微粒子を液面全体に含浸させてレーザを照射、レーザによる瞬時加熱により微粒子表面の改質の可否について検討した。微粒子としては様々な結晶相および微粒子径の種類が入手可能な酸化チタン微粒子を用い、チオ尿素を溶解させた溶液にこれら酸化チタン微粒子を懸濁させ、上部からレーザを30分、1時間等と異なる時間を照射し、表面の改質を微粒子の拡散反射スペクトル測定から確認した。その結果、レーザ照射と共に、微粒子の吸収がバンドギャップの380nmから可視光領域へとシフトし、レーザ照射により、チオ尿素中の硫黄分が酸化チタンに進入し、硫黄ドープ型の酸化チタンが形成されていることがわかった。次に、酸化チタンの片面のみの修飾を目指し、微粒子を気液界面に配置させようとしたが、酸化チタン自身が表面に親水基を持つことにより、界面に配置することが難しく、目的を達成できなかった。そこで、硝酸銀水溶液にレーザを照射し、レーザ加熱により銀ナノ微粒子を作る方法を応用し、酸化チタン微粒子を水中に懸濁させ、上部からレーザを照射することで酸化チタン微粒子に銀を表面修飾する方法を検討した。しかし、水中の酸化チタン微粒子が修飾される前に、レーザ加熱により硝酸銀水溶液自身から銀ナノ微粒子が生成し、酸化チタン表面に選択的に銀を析出させることができなかった。

このように、現在様々な手法を試みているが、酸化チタン表面の片面修飾には成功していない。今後、微粒子同士の凝集や界面活性剤の活用など微粒子表面の非等方的修飾を目標とし、研究を進めていく予定ある。微粒子の表面を修飾、改質して様々な新規の物性を発現させる研究が盛んに行われている。そこで、本研究では衝撃波による瞬時加熱とそれらによる表面状態変化を利用することで簡便な微粒子表面の部分的表面修飾法の開発とその応用について検討を行った。衝撃波源としてはレーザ加熱を用い、不均一場として超臨界二酸化炭素加圧した銀ナノ微粒子を含む水溶液にレーザ集光照射することで銀ナノ微粒子に異方性を持った表面修飾が可能かどうかを調べた。銀ナノ微粒子は400nm近傍にプラズモン吸収を持つため、紫外可視吸収スペクトルを測定するだけで簡単に銀ナノ微粒子の表面構造が確認できる。まずはレーザ照射前の銀ナノ微粒子の紫外可視吸収スペクトルを測定した。その結果、400nmにプラズモン吸収が明確に表れ、ナノ微粒子表面において銀が露出していることが確認できた。そこで、超臨界二酸化炭素加圧下で銀ナノ微粒子を水中に浮遊させ、レーザを集光照射した。その結果、銀ナノ微粒子のプラズモン吸収は長波長側にシフトし、表面状態が変化することが分かった。銀ナノ微粒子の表面状態の異方性を吸収スペクトルで確認しようとしたが、特に確認できなかった。また、透過型電子顕微鏡による観察も行ったが、そのような異方性は見ることができなかった。これはレーザ照射した微粒子が気液界面に存在しないで液内部に大部分が存在していることでないかと考えている。しかし、レーザ照射による銀表面の変化がプラズモン吸収により確認できた。そこで、溶媒を水からトルエンにかえて、銀ナノ微粒子にレーザを集光照射し、銀のプラズモン吸収がどのように変化したかを調べた。その結果、銀のプラズモン吸収は消滅し、銀に炭素由来の被膜ができていることが確認できた。そのことをさらに確認するためにトルエン溶液中に銀のナノ微粒子を含浸させ、レーザを集光照射し、同様の効果が見えるかどうか調べた。トルエン溶液においても銀のプラズモン吸収は消滅し、レーザによる銀ナノ微粒子表面修飾が可能であることが実証された。
PCNAのマルチユビキチン化による複製阻害回避機構の解明

DNA損傷によって起こるDNA複製阻害を回避するメカニズムはDNA損傷トレランスと呼ばれている。DNA損傷トレランスの制御には細胞増殖核抗原(PCNA)の164番目のリジン(K164)の翻訳後修飾が重要であると考えられている。本研究では、1つのPCNAリング上にK164が3つあることに着目し、その3ヶ所のK164が同時にユビキチン化を受けることで制御されるDNA損傷トレランス機構の解析を行った。K164に変異を導入したPCNAを発現した細胞株のDNA損傷剤に対する応答を解析した。DNA損傷は複製の進行を阻害し、突然変異や細胞死の原因になりうる。そのため、DNA損傷による複製阻害を回避するメカニズムは非常に重要であり、DNA損傷トレランス(DDT)と呼ばれる。真核細胞においてはDDTの制御にPCNAの164番目のリジン(K164)の翻訳後修飾が重要であることが明らかになってきているが、その詳細なメカニズムは不明な点が多い。本研究ではPCNAがホモ三量体であることに着目し、三量体の複数のモノマーがモノユビキチン化を受ける「マルチユビキチン化」のDDTにおける役割をヒト細胞を用いて解析している。DNA損傷剤としてIrofulvenを用いて解析を行っているが、Irofulven損傷はTC-NERによって修復されることが示唆されるため、当該年度はPCNAのマルチユビキチン化とTC-NERの関連性の解析を行った。TC-NER欠損細胞を用いた解析、及びマルチユビキチン化を減少させた変異体PCNA発現細胞を用いたTC-NERの検出を行った。その結果、マルチユビキチン化PCNAのTC-NERへの関与の可能性は低いと判断し、マルチユビキチン化PCNAが制御する経路に関与する因子の探索に着手した。当該年度の結果から、Irofulvenがマルチユビキチン化が関与するDDTメカニズムの解析に有用であることが強く示唆され、本研究計画の遂行が哺乳類細胞における複製阻害回避機構の理解に貢献することが期待される。DNA損傷による複製阻害は突然変異の蓄積をもたらしたり、細胞の癌化や老化につながる可能性がある。そのため、複製阻害を回避する機構は細胞内のゲノム安定性に重要な役割を果たす。真核細胞では複製阻害回避機構の制御にPCNA(細胞増殖核抗原)の164番目のリジン(K164)の翻訳後修飾が重要であることが明らかになってきている。しかし、詳細なメカニズムは不明な点が多く、特にPCNAがホモ三量体であり、一つのPCNA分子に三箇所の被翻訳部位があることに着目をした解析はほとんど報告されていない。本研究では、三量体の複数のモノマーがモノユビキチン化を受けた、マルチユビキチン化の複製阻害回避機構における役割をヒト細胞を用いて解析している。前年度の解析結果から、複製阻害を引き起こす薬剤であるIrofulvenを用いた場合、マルチユビキチン化PCNAが関与する複製阻害回避機構が働くと考えられたため、当該年度ではこの経路に関わる因子の探索を行い、既知のDNA損傷トレランス因子を含む複数の候補分子を得ている。これらの候補分子とマルチユビキチン化PCNAとの関連を精査し、研究計画をさらに進めていく。当該年度ではIrofulven損傷の複製阻害回避機構に関与すると考えられる複数の因子を見出しており、それらの因子とマルチユビキチン化PCNAとの関連を解析する実験準備に着手している。DNA上に損傷が生じると複製阻害を引き起こすおそれがある。DNA損傷による複製阻害は突然変異の蓄積などゲノム不安定性をもたらし、細胞の癌化や老化、細胞死につながる。そのため、細胞にはDNA損傷による複製阻害を回避する機構が備わっている。真核生物では、複製阻害回避機構にはPCNA(細胞増殖核抗原)の164番目のリジン(K164)の翻訳後修飾が重要な役割を果たすことが明らかになってきている。しかし、哺乳類細胞におけるPCNAのK164の翻訳後修飾の役割は不明な点も多い。PCNAはホモ3量体から成るリング上の構造をとり機能する、すなわち一つのリング上に3ヶ所のK164がある。これまでの研究では1つのリング上の複数個所の翻訳後修飾に着目した解析はほとんどなされていない。本研究では、1つのPCNAリング上の複数のK164がモノユビキチン化される「マルチユビキチン化」に着目し、そのヒト細胞における役割を解析した。前年度の解析から、未同定の複製阻害回避機構への関与が示唆される候補因子を見出した。そのため、当該年度はその候補因子をノックダウンした細胞の解析を中心に行った。マルチユビキチン化されるPCNAを減少させた細胞が高感受性を示すDNA損傷剤に対して、候補因子をノックダウンした細胞でも感受性が上昇した。さらにこのDNA損傷剤を用いた場合、マルチユビキチン化されるPCNAを減少させた細胞と候補因子をノックダウンした細胞が共に著しい複製阻害を引き起こした。これにより、本研究で新たに見出した因子が複製阻害回避機構へ関与する可能性が示唆された。

K164に変異を導入したPCNAを発現した細胞株のDNA損傷剤に対する応答を解析した。マルチユビキチン化PCNAとTC-NERの関係の解析を行い、既知のDDT関連因子との関係の解析にも着手している。またマルチユビキチン化PCNAと相互作用する因子を同定するための実験材料の準備を行っており、次年度以降速やかに解析を行うことができる。Irofulven損傷の複製阻害回避機構に関与すると考えられる因子をヒト細胞内でノックダウン、もしくはノックアウトし、Irofulven損傷に対する応答、及びマルチユビキチン化PCNAとの関連を解析する。ユビキチン化PCNAと相互作用する因子の精製を行い、質量分析による同定を試みる。また、変異体PCNA発現細胞を用いたIrofulven処理前後の遺伝子発現解析を行う。これらの解析と、前年度から引き続き行う既知のDDT関連因子とマルチユビキチン化PCNAの関連の解析から、マルチユビキチン化PCNAが関与するDDT経路の分子機構を明らかにしていく。Irofulven損傷による複製阻害回避機構に関与すると考えられる候補の因子を当該年度に見出し、27年度以降に行う計画であったノックアウト細胞の作成を28年度に行うため、次年度使用額が生じた。計画ではユビキチン化PCNAと相互作用する因子の同定及びIrofulven処理による遺伝子発現解析は26年度、または27年度に行う予定で、26年度に予算を計上していたが、既知のDDT関連因子とマルチユビキチン化PCNAの関係で、更なる解析により興味深い知見を得られる可能性があり、本年度はその解析を進行していたため、質量分析及び遺伝子発現解析を27年度に行うこととした。そのため次年度使用額が生じている。Irofulven損傷による複製阻害回避機構に関与すると考えられる候補の因子の、ノックアウト細胞を作成し、この細胞のIrofulven損傷に対する応答及び候補因子のマルチユビキチン化PCNAとの関連を調べる。マルチユビキチン化PCNAと相互作用する因子の同定及びIrofulven処理による遺伝子発現変化を解析し、マルチユビキチン化PCNAが制御するDDT経路の分子メカニズムの解析を行う。
内耳静脈系の循環障害に関する実験的研究

モルモットを使って,内耳の流出静脈である蝸牛小管静脈を閉塞し,蝸牛血流,蝸牛内直流電位,内外リンパ圧に及ぼす影響につき検討した.蝸牛小管静脈閉塞により蝸牛血流は2050%程度減少したが,蝸牛出血をおこす例では蝸牛血流は50%以下に減少した.蝸牛内直流電位は変化しなかった例も多かったが,一過性あるいは持続的に低下する例もみられた.内外リンパ圧はすべての例で一過性に上昇した.このようにモルモットでは蝸牛小管静脈は,内耳の最も大きな流出静脈ではあるが,他に内耳から流出する静脈があることを生理学的に示唆する所見が得られた.蝸牛窓膜破裂が蝸牛血流にどのように影響するかについてもマイクロスクウェアー法にて検討した.モルモットの蝸牛窓膜を単に針にて破っただけでは,蝸牛血流は有意な変化を示さなかった. (しかしながら,内耳にガラス毛細管を挿入することにより人為的に内耳圧を上昇させその上昇した内耳圧に抗しきれなくなり蝸牛血流が著明に障害されている時,蝸牛窓膜破裂がおこると内耳圧が減少し,蝸牛血流はむしろ回復することがわかった.すなわち,普通の状態では蝸牛窓膜破裂自体は,蝸牛血流に直接影響を与えないが,内耳圧が上昇している時,蝸牛窓膜は内耳圧低下のための完全弁として破裂する場合を認めた.また,モルモトに内耳気圧外傷をおこし,マイクロスフェアー法にて蝸牛血流がどのように変化するかについても検討した.内耳気圧外傷2日後の測定では,蝸牛血流は全体としては有意には変化しなかった.しかし,コルチ器を含むラセン板部には蝸牛全体の血流量の約1割程度が流れているが,ラセン板部の血流は減少する傾向を認めた.モルモットを使って,内耳の流出静脈である蝸牛小管静脈を閉塞し,蝸牛血流,蝸牛内直流電位,内外リンパ圧に及ぼす影響につき検討した.蝸牛小管静脈閉塞により蝸牛血流は2050%程度減少したが,蝸牛出血をおこす例では蝸牛血流は50%以下に減少した.蝸牛内直流電位は変化しなかった例も多かったが,一過性あるいは持続的に低下する例もみられた.内外リンパ圧はすべての例で一過性に上昇した.このようにモルモットでは蝸牛小管静脈は,内耳の最も大きな流出静脈ではあるが,他に内耳から流出する静脈があることを生理学的に示唆する所見が得られた.蝸牛窓膜破裂が蝸牛血流にどのように影響するかについてもマイクロスクウェアー法にて検討した.モルモットの蝸牛窓膜を単に針にて破っただけでは,蝸牛血流は有意な変化を示さなかった. (しかしながら,内耳にガラス毛細管を挿入することにより人為的に内耳圧を上昇させその上昇した内耳圧に抗しきれなくなり蝸牛血流が著明に障害されている時,蝸牛窓膜破裂がおこると内耳圧が減少し,蝸牛血流はむしろ回復することがわかった.すなわち,普通の状態では蝸牛窓膜破裂自体は,蝸牛血流に直接影響を与えないが,内耳圧が上昇している時,蝸牛窓膜は内耳圧低下のための完全弁として破裂する場合を認めた.また,モルモトに内耳気圧外傷をおこし,マイクロスフェアー法にて蝸牛血流がどのように変化するかについても検討した.内耳気圧外傷2日後の測定では,蝸牛血流は全体としては有意には変化しなかった.しかし,コルチ器を含むラセン板部には蝸牛全体の血流量の約1割程度が流れているが,ラセン板部の血流は減少する傾向を認めた.モルモットの主たるDraining Veinである蝸牛小管静脈を閉塞し、その蝸牛血流量に及ぼす影響について検討した。Microsphereを注入し、蝸牛を摘出脱灰後Microsphereの数を蝸牛小管静脈を閉塞した方の耳と反対耳とを比較検討した。Microsphereのcountingにおいては、蝸牛の各回転別にlateral portion,spiralportion,central portionの3部分別に行った。lateral partionは蝸牛の外側壁で前庭階、ラセン靱帯、血管条、spiral portionは骨ラセン板、コルチ器領域、central portionは蝸牛軸がはいる。測定をおこなった結果、蝸牛小管静脈閉塞例は、全例反対耳よりMicrosphereの数が少なく蝸牛小管静脈閉塞は蝸牛血流を明らかに減少させることがわかった。なかでも蝸牛小管静脈閉塞により蝸牛肉直流電位(EP)が低下した例では、蝸牛血流量の低下はさらに著明で4分の1以下にまで低下していた。蝸牛小管静脈閉塞によって主に蝸牛の基庭回転の外側壁の血流がもっとも障害をうけるという報告もあるが、今回の私達の実験では蝸牛の各回転とも血流量の減少を示し、またlateral spiralの3部分ともその血流量の低下の程度に有意差はなかった。

蝸牛小管静脈は蝸牛の主たるDraining Veinであるが、この静脈のみでは蝸牛血流は消失しないことが判明したが、これは他に蝸牛のDraining Veinが存在することを示している。その可能性は前庭小管静脈であると思われるが今後は前庭小管静脈の働きについても検討してみる予定である。
マツノマダラカミキリ産卵刺激物質の検索

マツノマダラカミキリの産卵反応は産卵基質に1821%以上の水分を含む時のみ,寄生植物樹皮中に存在する不揮発性の産卵刺激物質によって誘導される.寄生植物からの揮発性物質(誘引物質も含む)はカミキリの産卵行動に直接関与しない.寄生植物の形成層や材部もカミキリの産卵行動に関与しないと推定された.産卵管を挿入する前段階に見られる一点反復咬みつき行動は,外樹皮の含水率や寄生植物からの揮発性物質に依存せず,外樹皮中の不揮発性物質によって誘導される.外樹皮のこの物質の作用で,カミキリは外樹皮の一点を反復して咬み続け,内樹皮に達っした時点で含水率が1821%以上の時のみ,内樹皮中の活性物質に感応して産卵管を挿入するものと推定された.産卵管挿入行動には内樹皮中の産卵そのものの行動を支配する物質の他に,もっと多様な揮発性物質が関与しているものと推定された.産卵刺激物質は,熱水,温水,一部冷水, 70%アセトン,メタノール,ジメキルホルルアミドに可溶な極性物質である.生物検定と分析効果から,産卵刺激物質は寄生植物内樹皮中の,分子量1000以下の低分子フェノール性抽抽成分並びに硫酸・アンスロン処理で583588nmに吸収極大を与える糖物質である可能性が高く,これらが1821%の水分の共存下で相動的にカミキリに作用しているものと推定された.マツノマダラカミキリの産卵反応は産卵基質に1821%以上の水分を含む時のみ,寄生植物樹皮中に存在する不揮発性の産卵刺激物質によって誘導される.寄生植物からの揮発性物質(誘引物質も含む)はカミキリの産卵行動に直接関与しない.寄生植物の形成層や材部もカミキリの産卵行動に関与しないと推定された.産卵管を挿入する前段階に見られる一点反復咬みつき行動は,外樹皮の含水率や寄生植物からの揮発性物質に依存せず,外樹皮中の不揮発性物質によって誘導される.外樹皮のこの物質の作用で,カミキリは外樹皮の一点を反復して咬み続け,内樹皮に達っした時点で含水率が1821%以上の時のみ,内樹皮中の活性物質に感応して産卵管を挿入するものと推定された.産卵管挿入行動には内樹皮中の産卵そのものの行動を支配する物質の他に,もっと多様な揮発性物質が関与しているものと推定された.産卵刺激物質は,熱水,温水,一部冷水, 70%アセトン,メタノール,ジメキルホルルアミドに可溶な極性物質である.生物検定と分析効果から,産卵刺激物質は寄生植物内樹皮中の,分子量1000以下の低分子フェノール性抽抽成分並びに硫酸・アンスロン処理で583588nmに吸収極大を与える糖物質である可能性が高く,これらが1821%の水分の共存下で相動的にカミキリに作用しているものと推定された.1.産卵刺激物質の室内検定法をほぼ確立した。(1)8個体を同時に観察できる金網製検定装置を作った。(2)産卵を行う場自体としてのろ紙、基盤としてのマツ・ステンレス薄板でもって、樹皮と遜色のない人工的産卵の場を作り得ること。(3)産卵には樹皮片や人工的産卵の場は30%以上の水分量が保障されること。(4)産卵反応を経時的に観察し、9月初旬まで生物検定が行えること。2.産卵刺激物質の検索(1)アカマツ外樹皮の活性は低く、その内樹皮の活性が著しく高いこと。(2)産卵刺激物質はメタノールよりも熱水によって抽出されること。(3)内樹皮の熱水抽出液を水冷した時生じる沈澱物のDMF可溶部が内樹皮に匹敵する活性を示すこと。これをエーテル中で加熱還流し、可溶部を除去しても活性は低下しないこと。活性油分無存在下で活性を示すこと。(4)これに反して、ヘキサン,エーテル,酢酸エチル,ブタノール及びアルコール/ベンゼン混合液可溶部は無活性もしくは微弱な活性を示すこと(5)その他の8樹種の樹皮のうちヒノキ樹皮が若干の活性を示すこと。3.活性DMF可溶部の化学的特徴(1)約70%がフェノール類であり、その約90%がフラバノール類であること。フラバノールのほとんどがプロシアニジンであろうと推定されたこと。(2)約30%は糖類であること。この糖類はフコースのようなデオキシ糖から成る多糖類であろうことが示唆されたこと。4.今後の研究の展開変質防止,抽出法の検討,含まれる成分の徹底的分析,これに基ずく精製法の検討,活性本体の解明
神経線維腫症Ⅱ型に対する蝸牛温存型低侵襲水中内視鏡下経迷路法の確立に関する研究

神経線維腫症II型は両側聴神経腫瘍によって両側高度感音難聴を来す指定難病であるが、手術治療や放射線治療を施行した際の聴力温存率は満足できるものではないため、有効な聴力の残存している間は経過観察することが多い。一方で、最近我々が施行している水中内視鏡下耳科手術は内耳より明瞭に観察できる手術法であり、これまでに半規管瘻孔や上半規管裂隙症候群に対する同手術を施行したが聴力温存が可能であった。本研究課題では経迷路法による聴神経腫瘍摘出術の際に水中内視鏡下に迷路削開を行い、蝸牛を保護し聴力を温存するための低侵襲な手術方法を開発することを目的としている。初年度(平成28年度)にモルモットによる水中内視鏡下前庭破壊実験にて、術前後の蝸牛機能温存を聴性脳幹反応を用いて検証し、さらに灌流液の種類による差異を調査した。平成29年度は生体ヒツジによる水中内視鏡下前庭破壊実験を施行した。前年と同様に予めヒツジ頭部標本でシミュレーションを施行し、行程を確認しておいた。次に生体ヒツジを全身麻酔下に耳後部より削開し部分的迷路摘出術を水中内視鏡下に施行した。前後で聴性脳幹反応を測定し、1耳で術直後は良好に蝸牛温存が可能であった。平成30年度はこれまでの実験、また臨床データを解析し、灌流液は外リンパ液に最も近い組成の人工髄液がよいことが示唆された。また、ヒト側頭骨模型などを用いた手術シミュレーションにて水中内視鏡を用いた部分迷路切除術による錐体部へのアプローチは施行可能と考えられた。今後の課題として、膜迷路への機械的な操作の影響の検討、水中でも確実にシールできる閉鎖素材の改善が望ましいと考えられた。一方で、最近我々が施行している水中内視鏡下耳科手術は内耳をより明瞭に観察できる手術法であり、これまでに半規管瘻孔や上半規管裂隙症候群に対する同手術を施行したが聴力温存が可能であった。初年度(平成28年度)にこれらの有蹄類頭部標本(ヒツジ)を用いた内耳削開を施行し、解剖学的な理解と経迷路法による前庭神経の切除術のシミュレーションを計画した。平成29年度に計画中の生体ヒツジを用いた水中内視鏡下経迷路法による内耳温存手術実験に向けて、平成28年度はヒツジの頭部標本を用いた手術シミュレーションを施行した。水中内視鏡による解剖により、蝸牛、前庭、三半規管などの内耳膜迷路、前庭神経、蝸牛神経、顔面神経などの内耳道の走行などを鮮明に観察することができた。また、水中内視鏡下耳科手術の際の灌流条件を設定する目的で、モルモットを用いた水中内視鏡下前庭破壊実験を行った。術直後の聴性脳幹反応測定から、灌流液の種類によって蝸牛機能の温存率が高くなる傾向があった。初年度に計画していた有蹄類頭部標本(ヒツジ)を用いた水中内視鏡下経迷路法による手術シミュレーションは予定通り施行し、水中内視鏡による解剖により、蝸牛、前庭、三半規管などの内耳膜迷路、前庭神経、蝸牛神経、顔面神経などの内耳道の走行などを鮮明に観察することができた。さらに、モルモットを用いた蝸牛温存を目的とした灌流液の条件を変えながらの水中内視鏡下前庭破壊実験によって、次年度の生体ヒツジを用いた実験の灌流条件を決定するための重要な成果を追加することができた。水中内視鏡下経迷路法による蝸牛温存の手術行程について、ヒツジの内耳構造を把握し適切な手技を行える準備が整ったこと、モルモットの水中内視鏡下前庭破壊による蝸牛温存が実現され、その灌流液の条件についての知見をえられたことで、次年度のヒツジ生体実験への第一段階目標を達成できた。これらを踏まえて、平成29年度は生体ヒツジによる水中内視鏡下前庭破壊実験を施行した。