hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
家族関係の再構築に向けた支援プログラムの開発と効果研究

心理教育の実践自体は順調に進展しているが、研修を行う行政の制度の変更などにより、効果研究のデータ数は伸び悩んでいる状況にある。そのため、他の行政との連携なども視野に入れつつ、支援のためのシステム作りを行っている。また、HPなどを用いた実践の支援の確立は、ほぼできつつあり、FAITプログラムの実践自体は、一定数の参加者が着たい状況になりつつある。調査研究するのに十分なデータを得られるよう、研究期間を延長の上、今後も継続的に努力をしていきたい。本研究は、家族関係の危機に伴い新たな関係を構築することが求められる、離婚を経験する家族と里親家庭に向けて、予防的視点も包含した有効な支援プログラムをそれぞれ作成し、その効果を検討することを目的としている。具体的には、米国で開発された離婚家庭に対する心理教育プログラムのFAIT(Families In Transition)および、子どもとの関係構築の改善を図るためのペアレンティングプログラムのCARE(Child-Adult Relationship Enhancement)を実施し、実施前後の効果を質問紙調査によって測定した。まず、離婚家庭に向けて、昨年度に引き続き、親子に向けたFAITの実践と効果測定を行った。HP上での募集を主とする方法による限界も関係して参加者の確保に困難を伴い、予定のデータ数には至らなかったが、参加者への調査結果からは、こうした心理教育プログラムの実施が親にとって意義があること、特に子どもへの理解や子育てにおける具体的場面の対応などにおいて、ある程度の効果がみられることが確認された。また、親向け子ども向け双方のテキストの完成とともに、マニュアルの改訂も行い、これらの資料をもとに専門家向けの研修などを積極的に行った。こうしたプログラムの普及に力を入れることで、今後の家族支援における新たな道筋を見いだすことができた。里親家庭に向けた支援については、CARE研修の実施前後の効果測定を行い、里親のストレス軽減や里子との関係性改善にある程度の効果があることを検証し、学会および論文にてその結果を公表した。また、里親に向けた3回の実践と平行して、専門家を対象としたトレーナー養成や研究会を開催し、プログラムの質の維持向上を図りながら専門的知識および、実践スキルの普及にも努めた。家族関係の再構築が求められる里親家庭と離婚家庭を対象に、家族支援に向けた心理教育プログラムの開発とその有効性の検証を行った。里親家庭には大人と子どもの絆を深めるためのCARE(Child-Adult Relationship Enhancement)プログラムを、離婚家庭には米国で開発された移行期の家族に向けたFAIT(families In Transition)プログラムをそれぞれに実践し、その前後における親の意識や親子関係の変化を検討した結果、社会文化的差異を踏まえた各プログラムが関係の再構築が必要な家族に対して、一定の効果があることが示された。実践と研究における今後の課題も検討した。
細胞性粘菌を用いた細胞質分裂シグナルの解明

細胞質分裂は、細胞分裂の最後に細胞質が二分される段階であるが、等価な娘細胞を複製するために、時間的・空間的に厳密に制御されている。本研究は、細胞質分裂の分子細胞生物学的碩究に有利な細胞性粘菌を用い、細胞質分裂の制御に関わるタンパク質の同定と機能解析を目的としている。これまで、細胞質分裂変異株を利用して,IQGAP様タンパク質GAPAと新規タンパク質CykAを同定した。平成10年度は,CykAタンパク質の機能解析を中心に研究を展開した。まず,細胞質分裂における形態変化をtimelapse videoを用いて観察したところ,CykA欠損細胞では、分裂溝の形成は正常に起こるが、GAPA欠損細胞と同様、中央体の分離にある頻度で失敗するため細胞が多核化することがわかった。また,ヘマグルチニン(HA)エビトーブとの融合タンパク質を作成し,CYkA欠損株で発現させたところ,HA-CykAはCykA欠損株の細胞質分裂の欠陥を相補した。この細胞を用いて間接蛍光抗体法によりHA-CykAの局在を検討したところ、CykAは細胞の表層に局在し,細胞質分裂中は,娘細胞のleadingedgeに強く濃縮するパターンを示した。さらに,CykA欠損細胞においても、ミオシンの分裂溝への局在は正常に見られた。これらのことから、CykAは,分裂溝の形成や収縮よりむしろ,娘細胞の分離のための細胞運動に関わっている可能性が示唆された。さらに,CykAの,普遍的な機能を明らかにするため,ESTの配列データベースに対するホモロジー検索で得られた部分配列をもとに、ヒト(2種)とラット(1種)由来のCykA類似タンパク質のcDNAをクローニングし,その全塩基配列を決定した。現在、これらCykA類似タンパク質の機能を解析するため、動物培養細胞系による検討を開始した。本研究は、細胞質分裂を制御するシグナル伝達を分子レベルで解明することを目指している。細胞性粘菌では、このシグナルにGAPAと名付けたIQGAP類似タンパク質が関与することを既に明らかにしたので、今年度はGAPAが働くシグナリングに関与する細胞性粘菌のタンパク質の同定を目指して多角的に研究を展開した。1.GAPAの欠損株と同様に、巨大多核細胞として増殖可能な細胞質分裂変異株の原因遺伝子を1つ同定した。この遺伝子は、4つのイントロンを持ち、328アミノ酸、分子量37kDの新奇タンパク質をコードしていた。今後このタンパク質の分子レベルでの機能解析を行う。2.GAPAタンパク質のRasGAP触媒ドメイン(GRD)様配列中にある低分子量GTPase結合部位のアミノ酸残基を置換した変異型GAPAは、GAPA欠損株を相補しなかった。このことから、GAPAのGRDと何らかの低分子量GTPaseとの相互作用が細胞質分裂に必須であることが明らかとなった。3.GST-GARAアフィニティービーズを用いてGAPAと複合体を形成するタンパク質を検索したところ、その複合体には52kD、23kdの未知タンパク質とアクチン、ミオシンが含まれることが明らかとなった。今後2種の未知タンパク質の部分アミノ酸配列を決定してタンパク質を同定する。4.GAPAと全長にわたり相同性を示す細胞性粘菌のDdRasGAP1とGAPAの2重欠損株は、それぞれの単独欠損株より重篤な細胞質分裂の欠陥を示した。このことから、これら2つのタンパク質は、細胞質分裂に必須な何らかの機能において共通の役割を果たすことが明らかとなっった。
極低温走査トンネル分光法による超伝導磁束格子のダイナミックスの研究

本研究は、いくつかの超伝導体において磁束格子を観察するのみでなく、磁場変化などを加えたときの磁束格子の変化を、走査トンネル分光法を用いて実空間・実時間で観察し、磁束格子のダイナミックスを調べることを目的とした。主な研究対象としては、我々が初めて磁束格子の観察に成功しているボロカーバイトYNi_2B_2Cを選んだ。この物質において、温度変化により磁束格子が三角格子から正方格子へ相転移することを実空間で観察した。また、1T程度の強い外部磁場を1.5Tまで変化させたときに、結晶中の析出物境界に磁束量子がピン止めされる様子を実空間で観測することに成功した。1T程度の強い外部磁場のもとで、このような磁束量子のピン止めの様子を実空間で観察したのは、われわれの知る限りではこれが初めてである。析出物境界の近くでは、境界の存在の影響により、磁束格子が安定な三角または正方格子から大きくひずんだ格子を形作っていることも見出した。また、試料表面に現れる結晶面のステップエッジに磁束量子が近づくと、ステップ構造により磁束量子の周りの超電流分布が乱され、ステップエッジ上で準粒子の状態密度が増加するという現象を見出し、このような構造の磁束量子の運動への影響を考えた。また、重い電子系の超伝導体CeRu_2においても磁束格子の観察に成功し、また同時に結晶表面に現れた超伝導にならない領域を観察し、このような領域がピンとして働く可能性を指摘した。極低温、ヘリウムガス中において単結晶試料を割る機能を有する走査トンネル顕微鏡(STM)を製作した。この機能を用いてSTM測定にたえうるきれいな単結晶表面を準備することに成功し、ボロカーバイドと呼ばれる物質群の一つであるYNi_2B_2C及び重い電子系超伝導体のCeRu_2において初めてSTMを用いて磁束格子の観察に成功した。これまでは、試料表面準備の難しさから、4種類の単結晶でしかSTMを用いて磁束格子が観察されていなかったことを考えると、この方法は表面準備のしにくい試料についてもSTMによる観察の道を開いたと言える。YNi_2B_2Cにおいては、c面及びa面の両方の面において磁束格子の観察し、磁場誘起の磁束格子の相転移を実空間で観察した。この結果相転移が起こる磁場は、磁場印加方向によって約1桁異なることを見出した。また磁束コアの外における準粒子状態密度の異常な磁場依存性も見出した。数T以上の高磁場中においては、磁束格子の乱れが増加するのが観察された。これはこの物質が高磁場において、磁束のピン止めの関係したいわゆるピーク効果を示すことことから、その関係に興味が持たれる。また低温・ヘリウムガス中でへき開性のない試料を割ると、表面に数nm程度の大きさの粒状の構造が現れることが分かった。これはYNi_2B_2CのみでなくCeRu_2や他の物質でも観察され、へき開性のない試料を低温・ヘリウムガス中で割る時の一般的な性質と考えられる。このようにきれいな表面の準備が難しかった試料においても、再現性良く磁束格子を観察することができるようになった。そこで次年度からは、磁場を変化させた時のこれら磁束の挙動などのダイナミックスを調べていく。

1T程度の強い外部磁場のもとで、このような磁束量子のピン止めの様子を実空間で観察したのは、われわれの知る限りではこれが初めてである。析出物境界の近くでは、境界の存在の影響により、磁束格子が安定な三角または正方格子から大きくひずんだ格子を形作っていることも見出した。また、試料表面に現れる結晶面のステップエッジに磁束量子が近づくと、ステップ構造により磁束量子の周りの超電流分布が乱され、ステップエッジ上で準粒子の状態密度が増加するという現象を見出し、このような構造の磁束量子の運動への影響を考えた。また、重い電子系の超伝導体CeRu_2においても磁束格子の観察に成功し、また同時に結晶表面に現れた超伝導にならない領域を観察し、このような領域がピンとして働く可能性を指摘した。
大環状ポリアミン錯体による二酸化炭素の活性化と化学的固定・変換

循環炭素資源としての二酸化炭素を化学的に有効に利用することは、環境や資源上の問題を解決する上に非常に重要である。我々は、大環状ポリアミン金属錯体を用いて、二酸化炭素の活性化、有用物質への変換を行い、その詳細な機構を明らかにすることを目的として本研究を行った。本年度は、光増感錯体(トリスビピリジンルテニウム錯体)、電子受容部位(ピリジニウム基)、二酸化炭素還元触媒(大環状テトラアミンニッケル錯体)を同一分子内にもつ複核錯体を合成し、効率の高い光化学的二酸化炭素固定システムの開発に成功した。以下に本年度の研究について要約する。(1)光増感錯体、電子受容体をもつ大環状テトラアミンニッケル錯体数種の合成。(2)電気化学的および分光学的測定による、各コンポーネントの酸化還元電位の評価。(3)上記の錯体を用いた水溶液中での光化学的二酸化炭素還元反応。以上の実験より、光増感錯体や電子受容体を二酸化炭素還元触媒の分子内に導入することにより、触媒能が顕著に向上することがわかった。また、電子受容体の酸化還元電位と還元触媒能の相関関係が明らかになり、電子受容体の役割を含めた反応機構が解明された。本研究の成果は、二酸化炭素固定システムを開発する上で重要な指針となると考えられる。
走化性方程式の爆発解の構造に関する研究

本補助金の交付中において、走化性方程式の解の性質についての研究を行ってきた。特に、典型的な爆発解の安定性と定常解の安定性について考察を行った。最初、後方自己相似解の性質について研究を行った。後方自己相似解は典型的な爆発解の一つである。我々は、その解がある種の安定性を持つことを明らかにした。後方自己相似解は豊富に存在するものではないが、我々の研究によって同様の性質を持つ爆発解が豊富にあることが明らかになった。次に、定常解の安定性について考察を行った。2次元領域における安定性はすでに知られていたが、我々は高次元領域の場合に安定性を示した。これを用いて振動解や無限次元爆発解を構成した。当該年度の主な研究成果は以下の2件である。1.走化性方程式の後方自己相似解に関する研究成果。Type I爆発解の中で重要となる球対称な後方自己相似解に関してその安定性を示した。球対称な後方自己相似解は有限時刻で爆発する典型的なTypeI爆発解であり、無限種類存在する事が知られている。この研究では、空間の次元が3から9のとき、球対称なType I爆発解が同じ時刻で爆発する球対称な後方自己相似解の一つに収束する事を示した。この研究は、Type I爆発解の性質に関する研究が後方自己相似解の研究に帰着できる可能性を示唆していると言う意味で重要であると考える。2.走化性方程式の振動解に関する研究成果。空間次元が2の場合に無限個の球対称な正の定常解が存在し、それらの定常解の積分量が8πである事が知られている。本研究では、それら定常解の間を振動する球対称な解の存在を示した。またディラックのデルタ関数の8π倍が当該方程式の特異定常解と理解でき、前述した定常解で近似できる事が知られている。これらの事実から、定常解と特異定常解の間を振動する解の存在も示す事ができ、それは無限時刻で爆発する解となる。現在までの爆発解の構造に関する研究は、爆発する速さやその時の解の形状に主眼を置く研究であった。しかし、ここで示した解は振動しながら爆発する解であり、この研究成果は爆発に至る過程も研究対象になりうる事を主張している。その意味で、本研究成果は重要であると考える。本年度の研究実績は以下の通りである。1)研究資料の収集と研究成果・手法の再検討による新しい知見本研究の2年目である23年度も、引き続き最新の関係資料の収集を行い、本研究目的に沿った資料の検討を行った。そのために、論文複写、学会ならびに研究集会への参加、関係する研究を行っている研究者の所属大学への出張、学会の開催等を行った。それら情報収集・資料討論の中で、藤細型非線形熱方程式の無限時刻爆発解に関する文献を発見した。その文献を検討する中で、そこで用いられている構成方法を適切に変更する事により走化性方程式系の解の解析に使える事が明らかになりその方向での研究に着手した。また資料収集や他の研究者との討論の中で、爆発解の研究とは逆の観点である時間大域解の研究により爆発解に関する新しい知見を得ると言う研究の方向も有効である事を理解した。Type I爆発解については、その特別な解である後方自己相似解の安定性に関して前年度までの研究を継続した。この研究により解の解析性を用いて後方自己相似解の安定性に関する新たな知見を得た。また、1)で述べた無限時刻爆発解の構成の研究については、中間的な成果を得る事ができた。その成果に関しては学会発表を行った。当該発表については本書類13の学会発表の欄に記載した。3)時間大域的な解に関する新しい知見1)で述べた時間大域解の研究については、解が爆発しない条件として、拡散項、走化性を表す項、外力項の強さを表す媒介変数の関係式を得た。この成果を論文雑誌に掲載した。当該論文に関しては本書類13の雑誌論文の欄に記載した。当該研究で考察した系は、非線形拡散項と生物の増殖・死滅による個体数変化を表す非線形項を持つ放物型走化性方程式系である。その解は、拡散項、走化性を表す項、そして個体数変化を表す項の性質によってその形状や挙動が決まる。これら3つの項の満たす条件を以下では方程式系の条件と呼ぶ。方程式系の条件によっては、有限時刻、または無限時刻で爆発する解をもつ場合がある。本研究では、全ての初期値に対して一意的に時間大域的な解が存在し有界であるための方程式系の十分条件を明らかにした。

一般的に非線形拡散項を持つ系に対して、解の一意性を示すことは簡単ではない。その意味で、この成果は重要であると考える。そして、ここで得られた解の時間大域的な有界性を用いる事により、解の大きさと初期条件の関係を明らかにした。具体的には、解の大きさの時間に関する最大値と初期値の大きさとの関係を明らかにした。この関係を用いる事により、我々は弱い意味でのアトラクターの存在を示す事が出来た。ここで、一般的に解がとりうる関数の集合よりも小さな集合であり、時間がたつに従って解がその小さな集合に近づくとき、その小さな集合をアトラクターと呼ぶ。つまり、アトラクターは時間が十分に経った時の解の挙動を表している。本研究全体の目的は、爆発する解をもつ方程式系の条件や爆発解の挙動を考察することであるが、本年度の研究では考察する系が爆発解を持たない十分条件を示した。この研究は、爆発解を持つ方程式系の条件を確定すると言う意味もあり、本研究全体の目的である爆発解の研究に対して有意義な研究であると考える。当該年度の主な研究成果は以下の2件である。1.走化性方程式の振動解に関する研究成果。空間次元が11以上の場合に無限個の球対称な正の原点対称な定常解が存在し、それらが大小関係を持ちながら連続的存在している事が知られている。本研究では、それら定常解が原点対称な摂動に対して安定である事を示し、その事の応用としてそれら定常解の間を振動する原点対称な解の存在を示した。またこれらの定常解の極限として特異定常解が存在し、定常解と特異定常解の間を振動する解の存在も示した。この解は無限時刻で爆発する解となる。これら定常解は、藤田型非線形熱方程式の定常解でもあり、その方程式でも同様にして定常解の安定性や振動解の存在が既に示されている。しかしながら、考察している方程式が異なるため藤田型非線形熱方程式の結果が直接走化性方程式の結果となるわけではない。その意味で本研究は、非線形藤田型熱方程式と走化性方程式の解構造の関連を示した新たな知見であると考える。2.2次元領域上走化性方程式の爆発解の漸近的な形状に関する研究成果。2次元領域上走化性方程式の爆発解は、爆発時刻における爆発点において本質的にデルタ関数の8π倍の特異性のみが現れる事が知られている。これは2次元全領域における全ての定常解が8πの総量を持つ事から、その定常解の総量が爆発点に凝縮する事によって生じる特異性である事が予測される。本年度は、2次元全領域におけるある種の相似変換に不変な走化性方程式に対して全ての原点対称な爆発解に対して前述した予想を示し、爆発の速度も解や爆発時刻・爆発点によらずに本質的に一種類である事を示した。関数方程式論本研究の目的は、走化性方程式系の典型的な爆発解の構成と一般的な解が漸近的に典型的な解と同じ振る舞いをする条件を明らかにすることである。本研究では、爆発解をType I、Type IIと二つの種類に分けてそれぞれについて前述の研究を行う事を考えている。現在まで、Type I爆発解については、典型的な解の構成とその解と漸近的に同じ振る舞いをする解の条件をほぼ満足のいく形で与えるとが出来ている。以上の事と平成23年度は5年計画の2年目に当たる事を踏まえると本研究はおおむね順調に進展していると判断できる。25年度が最終年度であるため、記入しない。
蛋白核外移行阻害天然物をシーズとする新規医薬リード化合物の創製

NESアンタゴニスト作用蛋白核外移行阻害天然物である1' -acetoxychavicol acetateおよびvaltrateについて、活性発現部位ならびに作用メカニズムを考慮することにより、活性の増強されたアナログの創成に成功した。また、これらのアナログはMEK活性化腫瘍細胞に対する選択的な細胞毒性を示すことを明らかにした。さらに、NES非アンタゴニスト作用蛋白核外移行阻害天然物peumusolide Aを見出し、その絶対構造を明らかにするとともに、アナログの効率的な合成法を確立したNESアンタゴニスト作用蛋白核外移行阻害天然物である1' -acetoxychavicol acetateおよびvaltrateについて、活性発現部位ならびに作用メカニズムを考慮することにより、活性の増強されたアナログの創成に成功した。さらに、NES非アンタゴニスト作用蛋白核外移行阻害天然物peumusolide Aを見出し、その絶対構造を明らかにするとともに、アナログの効率的な合成法を確立したNESアンタゴニスト作用蛋白核外移行阻害天然物である1'-acetoxychavicol acetate(ACA)の作用メカニズムに基づき、分子軌道計算によって活性向上が期待される3位にフッ素、塩素、臭素原子を導入したアナログについて合成し、それらがACAより強力なNES含有蛋白の核外移行阻害活性を示すことを明らかにした。また、標的蛋白であるCRM1とのドッキングスタディによりACAより低い相互作用エネルギーが算出された1'位にn-pentanoy1基、isohexanoy1基、n-propylcarbamoy1基を有するアナログを合成し、いずれもACAより強力な活性を示すことを明らかにした。また、同様にNESアンタゴニスト作用蛋白核外移行阻害天然物であるvaltrateについては、分子内に存在する3種のアシル基の嵩高さを改変した5,6-dihydrovaltrate類を合成することにより、1位水酸基上のアシル基についてisovalery1基よりacety1基の方が活性が向上することを見出した。一方、NES非アンタゴニスト作用蛋白核外移行阻害天然物であるpeumusolideAについては、NES含有蛋白であるMEKが高度に亢進している培養腫瘍細胞に対して選択的な細胞毒性を示すことを明らかにした。さらに、peumusolideAの側鎖を簡略化したアナログについて両エナンチオマーを合成し、そのCDを測定することで天然物が主としてS配置であることを見出すとともに、キラルHPLCによるさらなる検討によってS:R=82:18の混合物であることを明らかにした。また、これらアナログのうちS体には、天然物とほぼ同等の、R体には若干減弱した活性が認められるとともに、S体がMEK亢進腫瘍細胞に対して選択的な細胞毒性も有することも明らかにした。NESアンタゴニスト作用蛋白核外移行阻害天然物である1'-acetoxychavicol acetate(ACA)の4位および1'位エステル結合をカーボネートあるいはカーバメートへと変換したアナログを合成しだが、いずれも大幅な活性減弱が認められた。推察した作用メカニズムに基づき、1'位のみをカーバメートへと変換したアナログについても合成したところACAより強力な活性を示すアナログを見出せたことから、4位水酸基の加水分解が活性発現の鍵となっていることが明らかとなった。同様にNESアンタゴニスト作用蛋白核外移行阻害天然物であるvaltrateについては、前年度に見出した活性を向上させるアシル基の炭素鎖長の組み合わせを用いて、これをカーボネートおよびカーバメートへと変換した5,6-ジヒドロ体の合成を達成した。これらは、5,6-ジヒドロ体より活性は若干減弱したものの、ヒト血清中での安定性は大幅に改善された。さらに、3-fluoro-ACAと1-Ac-5,6-dihydrovaltrateについてMEK活性化腫瘍細胞に対する選択的な細胞毒性が確認できた。一方、NES非アンタゴニスト作用MEK核外移行阻害天然物であるpeumusolidec Aについては、我々が確立した三重結合への立体選択的なヨウ素原子導入を鍵反応として二重結合立体配置を制御して構築する合成法にしたがって、天然物と同一の立体配置を有し側鎖アルキル鎖長の異なる(C1, C4, C7)アナログを合成した。その結果、これらのアナログは、いずれも活性がほぼ同等であったことから、側鎖のアルキル鎖長は活性発現にほとんど影響しないことが明らかとなった。また、C7アナログを用いて、MEK活性化腫瘍細胞に対する選択的な細胞毒性が確認された。
シアノバクテリアの概日振動発生における転写翻訳制御機能の解析

シアノバクテリアの時計蛋白質KaiA, KaiB, KaiCを適当な濃度比でin vitroで混合することで,24時間周期のKaiCリン酸化の概日リズムを再溝成することができる。しかし,実際の細胞は,細胞分裂・増殖に伴う細胞内外のノイズ外乱のために,in vitroのようなstaticな場ではない。シアノバクテリアでは,増殖条件でのみ,kai遺伝子を含む大多数の遺伝子の転写翻訳リズムが観察されるが,kai遺伝子の転写振動は,コアの蛋白質振動ループの安定化に寄与している可能性が考えられる。この検証には転写翻訳ループ(すなわち時計遺伝子自体の転写リズム)のある条件と無い条件を再構成して,そのリン酸化振動の安定性解析をすればよい。そこで,概日リズムを示さない細胞として大腸菌に対し,kaiAもしくはkaiBCを,trcプロモーターもしくはbadプロモーターに連結した形質転換体を複数ヴァージョン作製し,KaiC蛋白質の量的変動・リン酸化の経時変化を検討した。その結果,さまざまな条件下でリン酸化プロファイルの変動に相違が見られた(Tozakiら,論文印刷中)。ただし,当面の目標は,大腸菌内でリン酸化振動を再構成することであるが,いまだ成功していない。理由としては,Kai蛋白質群の大腸菌内での発現量が,振動可能な範囲を逸脱していること,大腸菌内の細胞環境がシアノバクテリアのそれとは異なる可能性などが考えられる。さらに,マイクロアレイを用いた概日発現および明暗応答プロファイルの解析を続け,連続明条件下における発現位相が,明暗サイクル下でのそれと多くの場合乖離すること,比較的少数にとどまる暗誘導遺伝子群が,実際に蛋白質レベルでも誘導を受けること,例外的ではあったが,連続明条件下,高振幅で周期的に発現するnon-coding RNAが存在することなどを明らかにした。シアノバクテリアでは概日リズム発生の主要因が転写翻訳フィードバックではないことを最近明らかにした(Tomita et al. 2005;Nakajima et al.2005)。いっぽう,以前の研究から,殆どすべての遺伝子プロモーターが時計の支配下にあることもわかっていた。そこで,転写翻訳フィードバックに依存しない時計機構が,どのようにゲノムワイドな発現調節を行いうるのかを解析することがこの研究の主目的である。このために,私たちは主としてゲノムワイドな発現プロファイルのマイクロアレイを用いた解析と,時計蛋白質Ka, iABCと遺伝子発現を仲介する因子の探索の二項目に関して研究を行ってきた。前者については,SynechococcusのマイクロアレイをAffymetrix GeneChipを用いて調査し,従来のプロモーター活性ではなくmRNA蓄積レベルで少なくとも全ゲノムの30%以上の遺伝子産物が概日振動していることが明らかになり,kai遺伝手欠失によってこれらが消失することも確認出来た。後者については,KaiC結合ヒスチジンキナーゼSasAのパートナーとなる応答因子の探索を行い,有力な候補SyelRR16を得た。sasA同様,syelRR16欠失株においても転写リズムは著しく減衰した。興味深いことに,SasAの自己リン酸化ならびにSyelRR16へのリン酸基転移反応は,KaiCのリン酸化リズムの程度に応じて顕著に変化することが明らかになった。SyelRR16は典型的なOmpR型DNA結合蛋白質であることから,KaiABC蛋白質による翻訳後修飾レベルの基本振動が,SasA->SyelRR16のリン酸化リレーと介して転写調節に変換されることが強く示唆された。シアノバクテリアは最も単純な概日リズムのモデル生物である。KaiA, KaiB, KaiC蛋白質の蛋白質問相互作用を介して発生する基本振動は,全ゲノムにおよぶ転写制御に影響をもたらす。本年度は,KaiA, KaiB, KaiC蛋白質によるゲノムワイドな転写制御に関して大きな進展が得られた。まず,KaiC結合性ヒスチジンキナーゼSasAのパートナーとなるレスポンスレギュレーターRpaAを同定した。rpaA遺伝子破壊株では転写レベルの概日リズムが停止した。さらに,in vitroでSasAからRpaAへのリン酸基転移反応が起こること,さらにKaiABCによるinvitro振動システムとの組み合わせにより,KaiC蛋白質の時刻情報が,位相依存的にRpaA蛋白質のリン酸化促進されることによりリレーされることを示した。RpaAはDNA結合ドメインらしきモチーフ配列を持っているため,現在ターゲット遺伝子の探索を行っている。また,Kaiシステムの従来の表現型をできるだけ広範に説明するシミュレーションモデルを,慶応大学三由氏と共同で構築し,論文発表した。この数理モデルは,従来の分子遺伝学的データの多くにフィットしているが,最近明らかになったリン酸化回転の遅さといったKaiの際立った特性からは乖離していた。したがって,Kai蛋白質の生化学反応には,未知の新たな特性があると考えられ,実験的にKai蛋白質の性質を精査することが必要と考えられる。

そこで,概日リズムを示さない細胞として大腸菌に対し,kaiAもしくはkaiBCを,trcプロモーターもしくはbadプロモーターに連結した形質転換体を複数ヴァージョン作製し,KaiC蛋白質の量的変動・リン酸化の経時変化を検討した。その結果,さまざまな条件下でリン酸化プロファイルの変動に相違が見られた(Tozakiら,論文印刷中)。ただし,当面の目標は,大腸菌内でリン酸化振動を再構成することであるが,いまだ成功していない。理由としては,Kai蛋白質群の大腸菌内での発現量が,振動可能な範囲を逸脱していること,大腸菌内の細胞環境がシアノバクテリアのそれとは異なる可能性などが考えられる。さらに,マイクロアレイを用いた概日発現および明暗応答プロファイルの解析を続け,連続明条件下における発現位相が,明暗サイクル下でのそれと多くの場合乖離すること,比較的少数にとどまる暗誘導遺伝子群が,実際に蛋白質レベルでも誘導を受けること,例外的ではあったが,連続明条件下,高振幅で周期的に発現するnon-coding RNAが存在することなどを明らかにした。
わが国におけるセリアック病の頻度と合併症に関する検索

本研究の目的は,本邦でのセリアック病の頻度および合併症について明らかにすることである。グルテン摂取により誘発される本疾患は,海外では健常者の300人程度に1人の割合で潜在的な患者が存在し,抗トランスグルタミナーゼIgA抗体(TTGIgA)検査は感度99%,特異度96-99%である。本邦では,一般臨床の場においてまれな疾患と考えられているが,セリアック病が原因の庖疹状皮膚炎や小脳失調症が本邦でも報告されている。われわれは,本邦で始めてのセリアック病に関連した悪性リンパ腫症例を治療し,英文誌に報告したのち,本疾患に関する研究を開始した。当科受診患者700人においてレトロスペクティブに血清TTGIgA値を測定した。陽性症例は20例で,典型的なグルテン過敏症を5例に認めた。平均年齢は53歳,受診からの生存期間は52ヶ月で,2例は内視鏡的に本症と病理学的に診断された。生存者は1例のみであった。TTGIgA陰性例にはグルテン過敏症例を認めなかった。合併症としてセリアック関連の非ホジキンリンパ腫が2例認められた。以上から,TTGIgAはわが国でも本症のスクリーニングに有用であると考えられ,非ホジキンリンパ腫は本邦でも特記すべき合併症であった。現在,多施設共同で,プロスペクティブにTTGIgAの測定を開始し,全国10数施設の参加がある。また,当施設で新たに診断されたセリアック病の患者に対し,当院栄養科と共同でグルテン制限の介入を行っている。以上の趣旨を,日本内科学会,日本血液学会にて報告し,ホームページにて情報提供中である。セリアック関連悪性リンパ腫症例の二例目の症例報告が英文誌に受理され,TTGIgA検査の結果を現在投稿中である。海外からのセリアック病患者の本邦渡航にあたり,問い合わせが複数回有り,日本語の独自のマニュアルを作成,安全な旅行過程に貢献した。本研究の目的は、本邦でのセリアック病の頻度および合併症について明らかにすることである。グルテンの腸管アレルギーである本疾患は、海外では健常者の300人程度に1人の割合で潜在的な患者が存在し、TTGIgA検査は感度99%、特異度96-99%である。一般臨床の場において本疾患はまれな疾患と考えられているが、セリアック病が原因の疱疹状皮膚炎や小脳失調症が本邦でも報告されている。われわれは、本邦で始めてのセリアック病に関連した悪性リンパ腫症例を英文誌に報告したのち本疾患に関する研究を開始した。まず、当科受診患者においてレトロスペクティブに血清TTGIgA値を測定した。700人あまりのスクリーニングを行い陽性症例は20例であった。このうち、典型的なグルテン過敏症を5例に認めた。平均年齢は53歳、受診からの生存期間は52ヶ月で、2例は内視鏡的に本症と病理学的に診断された。合併症としてセリアック関連の悪性リンパ腫が2例認められた。以上から、TTGIgAはわが国でも本症のスクリーニングに有用であると考えられた。一方、海外の報告に比較し予後が悪いことが判明した。今後グルテン制限の介入が予後を改善するか、また健常者における本症の頻度を検討すべきと考えられた。以上の趣旨を、日本アレルギー学会、日本内科学会にて報告した。ホームページを開設し(http://www.geocities.jp/ldgl_shinshu/celiac.html)情報提供した。セリアック関連悪性リンパ腫症例の二例目とTTGIgA検査の結果をそれぞれ英語論文として投稿準備中である。マスコミおよび機器製造会社より本症に関する照会があるほか、日本全国の施設より、検査・診断の問い合わせがある。今後、多施設共同での研究を予定している。

現在,多施設共同で,プロスペクティブにTTGIgAの測定を開始し,全国10数施設の参加がある。また,当施設で新たに診断されたセリアック病の患者に対し,当院栄養科と共同でグルテン制限の介入を行っている。以上の趣旨を,日本内科学会,日本血液学会にて報告し,ホームページにて情報提供中である。セリアック関連悪性リンパ腫症例の二例目の症例報告が英文誌に受理され,TTGIgA検査の結果を現在投稿中である。海外からのセリアック病患者の本邦渡航にあたり,問い合わせが複数回有り,日本語の独自のマニュアルを作成,安全な旅行過程に貢献した。
運動想起型相互適応BCIにおけるフィードバック訓練のための信号取得法

ユーザが身体動作を想起した際の脳波を検出する運動想起型BCIの正答率向上のため,脳活動信号をユーザにリアルタイムで提示しながら課題の遂行を求めるニューロフィードバック(NF)訓練を行う際,被験者に提示するフィードバック情報を統計的手法により取得する方法を検討した.本研究の結果,多チャネル脳波に適用する空間フィルタによってNF訓練の効果が向上することがわかった,また,脳波から脳内信号源の電気活動を推定してNFに供することでNFの効果が向上する可能性が示された.ユーザが身体動作を想起(イメージ)した際の脳波を検出する運動想起型BCI(brain-computer interface)の正答率向上のため,脳活動信号をユーザにリアルタイムで提示しながら課題の遂行を求めるニューロフィードバック(NF)訓練を行う際,被験者に提示するフィードバック情報を統計的手法により取得する方法を検討した.本年度は,多次元データの統計解析手法のひとつである独立成分分析(ICA)および主成分分析(PCA)を用いて,運動想起時に感覚運動野から生じる脳波を解析し,脳機能の観点から意味のある信号分割を行う方法について検討を行った.ICAとPCAを併用し,運動想起に伴う感覚運動野由来の脳活動を,手動で試行錯誤的に行うことなく分離・検出する方法について検討を行った.またICAとPCAにより,データ解析の前段で雑音・アーチファクトを分離・除去する方法を検討した.その結果,運動想起に関連して生じる脳波の周期律動成分であるμ波,β波,γ波を選択的に抽出するための空間フィルタをICAを用いて設計することが可能であることが示され,研究代表者による過去の結果とも矛盾しない結果が得られた.本手法で得られた空間フィルタは対応する脳活動成分の信号源近傍に局在的に分布した.そのため,脳機能のマッピングに関する先験情報との対応付けが容易であり,またこの結果から検出に必要な電極数の削減も可能かもしれない.現在は,研究代表者が過去に提案した解析手法に加え,PCAを併用してより詳細に情報分離を行うための検討を行っている.また,脳波解析の際に必要な眼球運動に伴うアーチファクトを除去するために行う眼電図計測において,従来の4電極を用いる方法に代わり,鼻の上部と左右の3箇所に電極を設置する方法を提案し,その有効性を示すことができた.この方法により前頭部への脳波電極が容易になることが期待できる.信号源推定手法を用いてニューロフィードバック信号を取得するための検討が遅れている.階層的変分ベイズ法(variational Bayesian multimodal encephalography: VBMEG)を用いた方法などの数種類の方法の比較検討を行ったが,それらの実使用がまだ行えていない.また,MRI計測実験の準備を行ったが,fMRI計測実験のプロトコル策定がまだ完了していない段階である.ユーザが身体動作を想起(イメージ)した際の脳波を検出する運動想起型BCI(brain-computer interface)の正答率向上のため,脳活動信号をユーザにリアルタイムで提示しながら課題の遂行を求めるニューロフィードバック(NF)訓練を行う際,被験者に提示するフィードバック情報を統計的手法により取得する方法を検討した.本年度は,健常ヒト被験者に対して運動想起時のニューロフィードバック実験を行い,その短期間での効果を詳細に検討した.ニューロフィードバックの信号は,大脳運動野から生じるμ帯域脳波とした.運動想起に伴い,μ帯域脳波の強度は減少(event-related desynchronization: ERD)することが知られている.後頭部由来のα波は,μ波と類似した周波数帯域であり,課題遂行時に同じくERDが観測される.そのため,空間フィルタを適用して,μ波選択的に抽出してニューロフィードバックに用いた.本実験の結果,手掌の把持動作の想起に伴い生じるERDが,ニューロフィードバックを重ねるとともに増大し,またその頭皮上の空間分布が局在的になるケースが認められた.この結果は,ニューロフィードバックが,これまでの研究代表者の研究で示された結果よりも短い期間で顕著な効果をもたらす可能性を示すものである.さらに,脳波の信号源推定に基づいて脳内の責任部位から生じる脳活動を脳波から抽出するために,ソフトウェアBrainStormとそれに実装されている信号解析アルゴリズムを検証しながら準備を行った.今後は,階層的変分ベイズ法(VBMEG)と比較検討することにより,実験における解析に使用する準備を進める予定である.また,昨年度に引き続き,ICA,PCAを用いて,運動想起時に感覚運動野から生じる脳波を解析し,脳機能の観点から意味のある信号分割を行う方法について検討を継続している.脳波計測装置の故障により,脳波の64チャネル計測が一時不可能となった.そのため,その間の計測信号の空間分解能が不十分である.2016年度と2017年度に代替装置を購入することで,以降の実験には支障はないことが見込まれる.信号源推定手法を用いてニューロフィードバック信号を取得するための検討が遅れている.ユーザが身体動作を想起した際の脳波を検出する運動想起型BCI(brain-computer interface)の正答率向上のため,脳活動信号をユーザにリアルタイムで提示しながら課題の遂行を求めるニューロフィードバック(NF)訓練を行う際,被験者に提示するフィードバック情報を統計的手法により取得する方法を検討した.以下に得られた結果の概要を示す.1.運動想起時のNF実験の効果の検討:健常ヒト被験者に対して運動想起時のNF実験を行い,その効果を詳細に検討した.NFの信号は,大脳運動野から生じるμ帯域脳波とし,Laplacian型空間フィルタ,ICAによって設計した空間フィルタを用いてNF信号を抽出した.

本実験の結果,手掌の把持動作の想起に伴い生じるERDが,NFにより増大し,その頭皮上の空間分布が局在的になるケースが認められた.2.皮質電流の推定手法による運動想起関連応答の抽出手法の検討:運動想起に関連する脳活動を,脳波の信号源推定に基づいて脳波から抽出するために,階層的変分ベイズ法による皮質電流の推定アルゴリズムVBMEGを用いた運動想起時の脳活動の解析を行った.その結果,脳の構造に基づいて皮質電流を推定するVBMEGによって分離された運動想起関連の応答信号は,上述の空間フィルタを用いて抽出した信号に比べ,S/Nや空間分解能の点で信頼性が高いことを示唆する結果が得られた.今後は, VBMEGによって得られる皮質電流信号を信号源としたNF実験を実施し,その有効性を示す必要がある.ユーザが身体動作を想起した際の脳波を検出する運動想起型BCIの正答率向上のため,脳活動信号をユーザにリアルタイムで提示しながら課題の遂行を求めるニューロフィードバック(NF)訓練を行う際,被験者に提示するフィードバック情報を統計的手法により取得する方法を検討した.本研究の結果,多チャネル脳波に適用する空間フィルタによってNF訓練の効果が向上することがわかった,また,脳波から脳内信号源の電気活動を推定してNFに供することでNFの効果が向上する可能性が示された.今後は,ICA/PCAを用いた情報分離および雑音除去に加え,信号源推定手法を確立させて,NF実験に向けて準備を進めたい.今後,信号源推定を用いたニューロフィードバック実験を実現するために,信号限推定の手法やそのオンライン実装,MRIデータの併用による精度向上などに取り組む予定である.神経工学購入を予定していたアクティブ電極システムの機種候補を再検討した結果,平成28年度に機種改定が行われる可能性があることがわかった.機種改定により大幅に機能が向上する可能性があることがわかり,購入を平成28年度に延期することとしたため.購入予定物品の変更などの理由により,次年度使用額が生じた.本研究の遂行には支障はない.当該備品を平成28年度に購入すれば,計画遂行に大きな影響はない.実験遂行中に故障した装置の代替品を,2016年度と2017年度に本予算を用いて購入する予定である.
昆虫クチクラ蛋白質遺伝子の発現制御システムの解析

クチクラ蛋白質遺伝子(CPG)の存在するBACクローンのシークエンスを行い、BMWCP2,3,4,5が位置していることが確認できた。また、新たなCPGを見いだし、既存のものとの発現時期、ホルモン応答性を調べ、カイコの翅原基で5齢期に発現するCPGには5つのグループが存在することを明らかにした。カイコのCPGの発現制御領域を調べるために、BMWCP2,4の上流域約2キロをレポーター検定用のプラスミドにクローニングした。初めに培養細胞を用いてホルモン応答能のある細胞株を同定し、培養細胞にレポーター遺伝子を有するプラスミドが導入されることを確認した。次に、時期特異性を有する翅原基組織で遺伝子銃を用いて検定を行い、培養翅原基でレポーターアッセイのシステムを確立した。エクダイソンパルスで誘導される遺伝子の上流域をクローニングし、翅原基の培養系を用いてプロモーターアッセイの系を確立し、エクダイソンパルスに応答する配列を追跡した。遣伝子銃によるカイコの翅原基、翅組織への遺伝子の導入法を、器官の時期、培養条件について検討した。導入の確認にはGFPを用いた。さらに、遺伝子の上流部に突然変異を起こさせ、ゲルシフト法により応答配列の確認を行った。培養翅原基への遺伝子導入を確認後、翅組織にCPG(BMWCP2)の上流領域を含むプラスミド、あるいはその一部を削除したプラスミドを打ち込み、ルシフェラーゼアッセイを行った。この方法で翅組織での短時間の造伝子導入に成功し,ホルモンに反応しCPGの発現を制御する領域を調べる事が可能となった。BMWCP2の上流域の切除、FTZ-F1結合部位への突然変異、ゲルシフトの結果からBMWCP2の遺伝子発現はエクダイソンパルスに応答するFTZ-F1に誘導される事が確かめられた。本研究で得られた結果により,CPGの発現誘導に関わる転写因子とその結合部位を明らかにできた。カイコのクチクラタンパク質遺伝子の発現制御領域を調べるために、当研究室でクローニングした9種のクチクラタンパク質遺伝子、BmWCP1-9クローンをプローブ二用いてカイコのBACクローンのスクリーニングを行った。BmWCP1-8は同一のBACクローンに存在することがわかった。2種類の発現時期の異なるクローンの遺伝子の上流域をクローニングするために、BACクローンを用いてスクリーニングを行った。その結果、BmWCP2,4の上流域のシークエンスを決定することができた。さらにカイコのゲノムシークエンスが公開されたため、アクセスして、BLASTサーチを行いそれぞれの上流域2kbをレポーター遺伝子を有するプラスミドにクローニングを行った。現在、当プラスミドが培養細胞に導入できるかどうかを試験しているところである。一方、レポーターアッセイの系を構築するために、生物資源研から14種類のカイコの培養細胞を譲り受け、ホルモン処理を行った後クチクラタンパク質遺伝子の発現する培養細胞のスクリーニングを行った。その結果、4種の培養細胞で、ホルモン処理によりクチクラタンパク質遺伝子が発現することがわかった。これら培養細胞株のエクダイソン応答性を調べたところ、E75,BHR3などのエクダイソン初期応答遺伝子は4種の培養細胞でエクダイソンにより誘導されることが確かめられた。今後、これらの結果を利用して、培養細胞で2種クチクラタンパク質遣伝子の上流域のレポーターアッセイを行い、2種の遺伝子の上流域の調節領域を調べていく予定である。クチクラタンパク質遺伝子の存在するBACクローンのシークエンスを行い、当該クローンに9種の遺伝子のうち4種(BMWCP2,3,4,5)と、1種の断片が位置していることが確認でき、クチクラタンパク質遺伝子の進化について検討を行った。

また、この過程で、さらに新たなクチクラタンパク質遺伝子を見いだし、既存のものとの発現時期、ホルモン応答性を調べ、カイコの翅原基で5齢期に発現するクチクラタンパク質遺伝子には5つのグループが存在することを明らかにした。BMWCP2及びBMWCP3は3つのエキソンに2つのイントロンが存在し、BMWCP4及びBMWCP5は4つのエキソンに3つのイントロンが存在することが明らかとなった。カイロの発現時期の異なるクチクラタンパク質遺伝子の発現調節領域を調べるために、それぞれのグループから遺伝子を1種ずつ(BMWCP2,4)選択し、遺伝子の上流域約2キロbpをレポーター検定用のプラスミドにクローニングした。初めに培養細胞を用いてホルモン応答能のある細胞株を同定し、培養細胞のレポーター遺伝子を有するプラスミドが導入されることを確認した。次に、時期特異性を有する翅原基組織でレポーターアッセイが行えるかどうかを、遺伝子銃を用いて検定を行った。翅原基の培養条件、銃の圧力、打ち込む距離、金粒子の量、プラスミド濃度などを調べ、培養翅原基でレポーターアッセイのシステムを確立した。エクダイソンパルスでルシフェラーゼ活性が上昇することを確認できた。今後、このシステムを用いて遺伝子発現に影響する領域を調べていく予定である。エクダイソンパルスで誘導される遺伝子の上流域をクローニングし、翅原基の培養系を用いてプロモーターアッセイの系を確立し、エクダイソンパルスに応答する配列を追跡した。遺伝子銃によるカイコの翅原基、翅組織への遺伝子の導入法を、器官の時期、培養条件について検討した。導入の確認にはGFPを用いた。さらに、遺伝子の上流部に突然変異を起こさせ、ゲルシフト法により応答配列の確認を行った。培養翅原基への遺伝子導入を確認後、翅組織にクチクラ蛋白質遺伝子(BMWCP2)の上流領域を含むプラスミド、あるいはその一部を削除したプラスミドを打ち込み、ルシフェラーゼアッセイを行った。この方法で翅組織での短時間の遺伝子導入に成功し,ホルモンに反応しクチクラ蛋白質遺伝子の発現を制御する領域を調べる事が可能となった。BMWCP2の上流域を削る事により,プロモーター活性が低下し、FTZ-F1結合部位が1つ無くなるとホルモン反応性も著しい低下を示した。またFTZ-F1結合部位に突然変異を起こさせるとプロモーター活性の低下がみられ、ゲルシフトの結果からも結合部位に転写因子FTZ-F1が結合している事が推定された。これらの結果からBMWCP2の遺伝子発現はエクダイソンパルスに応答するFTZ-F1に誘導される事が確かめられた。本研究で得られた結果により,クチクラ蛋白質遺伝子の発現誘導に関わる転写因子とその結合部位を明らかにできた。今年度の結果については、現在投稿中の論文と、投稿準備を行っている論文が1つずつある。
市町村合併後における地域生活交通確保に関するワークショップ開催のための企画調査

本企画調査を行うことにより、日本国内の土木学会や交通工学研究会等に所属する交通計画・地域計画・交通政策論などを専門とする研究者が一堂に会して、「市町村合併後における地域生活交通確保のための交通施策のあり方に関して議論するワークショップ」を開催することができた。特に、今回は昨年立ち上げた土木学会の中の土木計画学研究小委員会(規制緩和後におけるバスサービスに関する研究小委員会:代表者喜多秀行神戸大学教授)とも連帯しながら、全国シンポジウム(生活交通シンポジウム)の開催とその開催準備のための個別ワークショップを2回開催した。また、研究課題を整理するための研究会(研究分科会)も開催することができた。具体的には、全国シンポジウムの開催準備のためのワークショップを平成18年5月と平成18年8月の2回開催し、シンポジウム企画の内容を検討した。また、ワークショップでは全国各地域における市町村合併後の地域生活交通のあり方について、具体的な対策法として、どのようなことが行われているのか現状報告を行うとともに、これからの合併市町村の課題についての議論を行った。全国シンポジウムの開催場所については、いろいろ議論した中で、市町村合併を行った後に、公共交通を中心としたまちづくりを進めている富山市において開催することを決定し、平成18年10月末に全国シンポジウム(生活交通シンポジウム市町村合併後のくらしと交通)を開催した。シンポジウムでは富山市と白山市で取り組んでいる公共交通活性化策の実例を紹介していただくとともに、その後のパネルディスカッションにおいて、「市町村合併後における地域生活交通の抱える課題」、「規制緩和後における地方公共交通のあり方」、「地域生活交通確保のための補助制度基準の決め方」など、さまざまな話題についての議論を行った。シンポジウムには、北陸の合併市町村の担当者を中心に、全国から約130名以上の参加者があり、シンポジウムでの議論が、今後の地域生活交通のあり方を検討する上で、非常に有益な内容であったと考えている。
エピジェネティック制御からみた食塩感受性高血圧のメカニズムと診断法の開発

塩分過剰摂取により高血圧を発症する食塩感受性高血圧とそれに関連する臓器障害について遺伝子修飾因子の関連を検討した。ヒストンのアセチル化によるWNK4を介したナトリウムチャネルの活性化を報告したまた、マイクロRNAにより酸化ストレス誘導因子が誘導され臓器障害を発症すること、そしてマイクロRNAが治療の対象となりうることを明らかにした。また、ヒト尿中にある細胞を分析することで、腎臓尿細管機能を推察できる可能性について基礎的な知見を得ることができた。microRNAによる治療応用腎臓に高発現している既報の73個のmicroRNAと酸化ストレスにより制御されうるmicroRNAをin silicoでサーチし、腎臓細胞での発現を確認した。miR29aは酸化ストレスにより著明に発現が抑制されるものであった。一方miR124a, 135,195は発現が亢進した。またmiR29aはrac1の活性化酵素であるTiam1の発現を抑制することを確認した。miR29aを介しTiam1が抑制されることでrac1の活性化が抑制された。Rac1はmineralocorticoid受容体を活性化するが、実際片腎摘出食塩負荷動物モデルでは酸化ストレスの増大とmiR29aの低下およびRac1の活性化をみとめ、腎臓の線維化が増悪した。このモデルでmineralocorticoid受容体拮抗薬あるいはmiR29aの補充は腎障害を抑制することが明らかになった。昨年までの検討でmiR29aの低下がmineralocorticoid受容体活性化を介して腎障害を引き起こす可能性を明らかにした。本年はさらにmiR29aの局在の検討とmiR29aの補充による腎障害軽減およびmineralocorticoid受容体を介した食塩感受性高血圧の発症に与える影響を検討した。内在性miR29aの存在はreal timePCRにて確認されていたが、腎臓内での局在を検討するためにin situ hybridizationを試みた。しかし、培養細胞では結果を得ることができるものの組織ではクロスリンクが不安定で一定した結果を得ることができなかった。一方、マトリゲルを用いたmir29aの導入を行い、GFPを結合させたmiR29aにより導入したmiR29aが尿細管に存在することが確認できた。またmir29aの導入により腎臓障害が抑制されることを病理標本で確認した。さらにmiR29aの導入により食塩負荷時の血圧上昇が抑制されることが確認できたが、ミネラロコルチコイド受容体を介した作用であるか、腎障害が改善された結果であるかの確証を得るに至らなかった。【1.カテコラミンによるHDAC活性の制御の解明】我々はすでにカテコラミンがHDAC8をリン酸化し、その活性を抑制することを報告しているが、今回リン酸化抗体入手可能であったHDAC15のリン酸化を検討したが、明らかにリン酸化されるものは認めなかった。【2.酸化ストレスによるヒストンアセチル化メカニズムの解明】mDCT細胞を用いてH2O2、アンジオテンシンIIあるいは糖負荷により酸化ストレスを増大させる系を用いて検討した。酸化ストレスの定量は我々が確立している方法を用いてNADPHoxidase活性、4HNE, 3-Nitrotyrosineを指標に確認した。活性化測定の可能なHDACのうちHDAC2の活性が阻害された。しかしHDAC2のリン酸化には変化が無くチロシン残基のニトロ化が生じていた。HDAC2のチロシンの変異体を作成中である。【3.microRNAによるヒストン調節とmicroRNAの診断応用】腎臓に高発現している既報の73個のmicroRNAから実験2で酸化ストレスと密接に関連するHDAC2並びにp300/CBPをターゲットとしうるものをサーチした。miR144/337、miR335/212/326/669eを候補として現在強制発現させたmDCT細胞を用いてヒストンのアセチル化ならびにmicroRNAとヒストンの直接の関連をRNA免疫沈降(RIP)assayにて確認している。昨年までの各種microRNAと転写調節についての研究から、本年は当初予想していない結果を産むことができた。すなわちin silicoでサーチしたmiR29aが各種遺伝子の発現を制御することが明らかになり、酸化ストレスによる臓器障害の進展を抑制する可能性が示唆された。現在論文を投稿中である。実験1ではリン酸化抗体のうち十分に評価に耐えうるものがそろわず、すべてのHDACについての評価ができなかった。今後腎臓に高発現するHDAC11などリン酸化抗体が手に入らないものについては活性を直接評価する必要がある。実験2では予想に反してリン酸化とは関係のなく活性が阻害されるHDAC2が見いだされ、実験計画の変更が必要となり、期間内に計画を進めることができなかった。実験3においてもHDAC2の重要性が明らかになったため当初候補として挙げたmicroRNAの検討を中止し、候補microRNAを変えたため、RIPアッセイが終了していない。