hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
人工タンパク質のデノボ設計と実験室進化

天然様の性質をもつ人工タンパク質の設計法に関して以下のような研究を行った。1.分子設計用構造特異性関数の作製多数の天然タンパク質の立体構造における疎水性アミノ酸残基間の接触と側鎖コンフォメーション自由度の関係を調べ、構造特異性を評価する関数を作製した。その結果、各二次構造中で各疎水性アミノ酸残基の構造特異性に果たす役割を定量的に表すことが出来た。また、天然タンパク質における疎水性残基置換の効果も予測できるようになった。2.人工DNA結合タンパク質の分子設計各アミノ酸の側鎖コンフォメーションの違いを評価することが出来る精密化された分子設計用ポテンシャル関数を作製した。この関数を用いて、DNA結合タンパク質λCroの立体構造を安定化するアミノ酸配列を設計した。合成されたS4は、低濃度で、ほぼターゲットとした2次構造をもつダイマー蛋白質にフォールドした。さらにダイマーの構造モデル中でモノマー間の境界領域を形成するβリボンをβヘアピンに置換することによってモノマーとなるような変異体(S4m)を設計した。合成されたS4mは広い濃度領域でモノマーの状態をとり、良好なNMRスペクトルを示した。3.実験室進化系の作製本研究では、人工ヘムタンパク質の実験室進化に向けて、プロトヘムにスペーサーを介してビオチンを結合した新規分子(ビオチンヘム)の設計と合成を行った。合成されたビオチンヘムは単独で天然ヘム蛋白質のアポ体と結合し、その機能を再構成することができた。また、ストレプトアビジンとビオチンの強く特異的な相互作用を利用して、ビオチンヘムに結合した蛋白質を迅速に回収できることを確認した。ビオチンヘムは、人工ヘムタンパク質の実験室進化ばかりでなく、生体中の微量ヘムタンパク質の精製と標識、ヘムタンパク質関連疾患の診断薬、さらには光力学療法用治療薬等としても応用可能である。非蛋白質化合物では実現できない高機能分子の創出に向けて、天然蛋白質のアミノ酸配列に依存しない人工蛋白質設計と実験室進化の研究を行った。本年度は、人工ヘム蛋白質のin vitroselectionsystemとして、ファージを用いた人工蛋白質遺伝子のパッケージングとファージの外被表面上への発現蚕白質の提示を試みるとともに化学修飾ヘムを用いた活性クローンの選択系を作製した。具体的には、前年度までに設計されている人工グロビンをM13ファージの外殻蛋白質との融合蛋白質としてコードしているDNAを合成し、外被上に人工グロビンを発現しているファージを作製した。さらに、ヘム(プロトポルフィリンIX)に対する親和性を指標としてランダム変異を導入した人工蛋白質を選択するために、ヘムのプロピオン酸基をビオチン化し、ビオチンとストレプトアビジンの高い親和性を利用して、ビオチン化ヘムをストレプトアビジンでコートされた固相表面上に固定した。また、人工蛋白質に天然様の構造特性を与えるための理論的アプローチとして、蛋白質立体構造中のアミノ酸側鎖コンフォメーションと残基間接触の統計的解析を行い、構造特異性の指標となる新しい関数(ΔS^<contact>)を作製した。この関数は、これまでに報告されている天然および人工蛋白質の変性実験から得られたフォールディングの共同性(m値)と高い相関を示した。これを用いて人工グロビンの再設計・再合成を行ったところ、NMRによって検出される構造特異性が改善された。アミノ酸ロタマーごとに分子内環境への適合性を評価できるロタマーポテンシャルを用いて、DNA結合タンパク質λCroの立体構造(pdb code:5cro)を安定化するアミノ酸配列を設計した。λCroは、全長67残基のサブユニットからなるダイマーで、2次構造としてαヘリックスとβシートをもつ。

今回、最適化計算にはモンテカルロ法を用い、DNAとの相互作用に必須なQ16とQ27を固定し、蛋白質全体として塩華性の等電点を持つように組成を制限した。得られた配列は、等電点9.4(天然9.4)、モノマー分子量6961Da(同6719Da)、天然配列と26%の一致度を示した。この配列をコードする人工遺伝子を作製し、大腸菌に導入することによって人工蛋白質(S4)を合成した。S4は、低濃度で、ほぼターゲットとした2次構造をもつダイマー蛋白質にフォールドした。一方、蛋白質-DNA複合体の立体構造データベースから作製したアミノ酸-塩基間の経験ポテンシャルとS4の構造モデルから設計した人工オペレーターを用いたin vivo実験において、S4は非特異的で弱いDNA結合活性を示した。さらにダイマーの構造モデル中でモノマー間の境界領域を形成するβリボンをβヘアピンに置換することによってモノマーとなるような変異体(S4m)を設計した。合成されたS4mは広い濃度領域でモノマーの状態をとり、良好なNMR、スペクトルを示した。したがって、使用したロタマーポテンシャルは分子設計に有効であり、生物学的機能を付加するために予定している実験室進化実験における出発分子のデザインを可能とする。λファージCroタンパク質の立体構造へ折り畳まれるようにデザインした人工DNA結合タンパク質を合成し、NMRによる立体構造解析を行った。ターゲットとしたλCroは、66アミノ酸残基からなり、2次構造として3本のαヘリックスと4本のβストランドをもつ。計算によって得られたアミノ酸配列をコードする人工遺伝子を用いて大腸菌を形質転換し、^<15>NH_4Cl,^<13>C_6H_<12>O_6を添加したM9最小培地中で培養することにより、人工タンパク質を同位体ラベルした。この試料について、多次元NMRの測走を行い、主鎖由来シグナルを各構成アミノ酸残基に帰属することが出来た。Chemical shift indexの解析から、この人工タンパク質は、アミノ酸配列上、ターゲットとした立体構造と同様の2次構造分布をもつことが分かった。これらの結果は、我々の方法が、球状蛋白質構造の設計に適用できることを示す。一方、これまでに我々がデザイン・合成した人工ヘムタンパク質の機能をネイティブライクなものへと実験室進化させるツールとして、卵白に含まれるアビジンタンパク質と特異的に結合する補酵素であるビオチンと鉄-ポルフィリンをリンカーを介して共有結合させたビオチン化ヘムを合成した。この化合物を、大腸菌で発現させたアポミオグロビンや人工ヘムタンパク質を含む細胞抽出液に加え、市販されているアビジン-磁気ビーズやアビジン-アガロースを用いて回収したところ、それらのヘム蛋白質が効率良く精製できた。また分光学的測定からビオチンヘムと結合したミオグロビンが分子状酸素と安定に結合し、生物学的な活性を保持していることが分かった。したがって、この化合物は、人工ヘムタンパク質の実験室進化ばかりでなく、生体中の微量ヘムタンパク質の精製と標識、ヘムタンパク質関連疾患の診断薬、さらには光力学療法用治療薬等としても応用可能である。
染色体レベルの高度なゲノム編集を可能にするCRISPR/Casシステムの開発

複数遺伝子の同時破壊や染色体の広域欠失といった高度なゲノム編集を実行可能なベクターシステムを開発し、培養細胞およびマウス個体での実用性を検証した。培養細胞では、最大で7遺伝子までの同時破壊と染色体の広域欠失が可能であることが示された。また、特異性の高いCas9バリアントであるFokI-dCas9を用いたオールインワンベクターによって、単一プラスミドの顕微注入で複数の遺伝子座への変異導入がマウス胚内で実現できることを示した。ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)やTALEヌクレアーゼ(TALEN)などの人工ヌクレアーゼ、またはCRISPR/Casシステムを利用したRNA誘導型ヌクレアーゼを用いたゲノム編集法は、次世代型の遺伝子改変技術として脚光を浴びている。しかしながら、現状では単純な遺伝子ノックアウトやノックイン、および小さな染色体領域欠失の報告が主であり、同時多重遺伝子破壊や染色体の転座、逆位、重複、広域な領域欠失など、染色体レベルでの高度なゲノム改変を効率的に行うには更なる工夫が必要である。本年度は、標的ゲノム領域へのガイダンス分子であるガイドRNA(gRNA)を同時に複数発現し、かつヌクレアーゼ活性を有するCas9タンパク質の発現も同時に誘導できるベクターの構築システムを確立し、高度ゲノム編集の技術的基盤を築くことを目的として研究を遂行した。この目的を達成するために、Golden Gateアセンブリー法を利用したgRNA発現カセットの連結システムを確立し、単一のベクターで7つまでのgRNAとCas9ヌクレアーゼあるいはニッカーゼを発現させるシステム(以下マルチgRNAシステム)を構築した。更に、マルチgRNAシステムを導入したヒト培養細胞で、7か所のゲノム改変と数千塩基までの広域欠失が認められることも確認した。次年度は、本システムを更に発展させ、外来DNA配列の挿入も含めたより高度なゲノム改変技術の構築や、より広範な細胞種・生物種への応用を視野に入れて研究を実施する予定である。本年度は、前年度に確立したCRISPR/Cas9のオールインワンベクターシステムを用いて、効率的な遺伝子ノックインのシステム(PITCh法)を確立し、Nature Communications誌に論文を発表した。PITCh法は、マイクロホモロジー媒介性末端結合(MMEJ)と呼ばれる修復機構を利用した新規遺伝子ノックイン法であり、CRISPR/Cas9システムを用いてPITCh法を実行するためには、Cas9ヌクレアーゼと複数のガイドRNAを効率的に発現させることが必要不可欠である。本研究により、相同組換えの効率が低い細胞であっても高効率な遺伝子ノックインが実現可能となり、更にはこれまで遺伝子ノックインが極めて困難であった生物種(カイコやアフリカツメガエルなど)においてもノックインが適用できることが証明された。また、本年度はこれまでのオールインワンベクターシステムを拡張し、ヌクレアーゼ活性を不活化させたCas9タンパク質(dCas9)や、dCas9に制限酵素FokIのヌクレアーゼドメインを付加したFokI-dCas9にも対応可能なアドオンを開発した。これらの拡張パックと従来のシステムを併用し、マウス受精卵での変異導入および複数遺伝子の同時破壊が可能であることを示した。これにより、本研究によって確立されたオールインワンCRISPR/Cas9ベクターシステムは、培養細胞のみならず、動物個体においても機能的であることが証明された。26年度が最終年度であるため、記入しない。ゲノム生物工学26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究と密接に関連するTALENを用いた遺伝子破壊・染色体欠失細胞の濃縮法についての論文を、Genes to Cells誌に論文発表した。更にCRISPR/Cas9のマルチgRNAシステムの構築と、HEK293T細胞での多重遺伝子破壊・染色体領域欠失実験にも既に成功しており、本成果についても現在論文を投稿中である。次年度は、マルチgRNAシステムの更なる有用性を実証するため、様々な培養細胞において、染色体改変や長鎖外来DNAの挿入等を含めた高度ゲノム編集を試みる。その際には既存技術であるTALENも併用し、両者による改変効率や改変の正確性を比較することで、マルチgRNAシステムの実用性を検証する。また、CRISPR/Casの発現ベクターをマウスの受精卵へ直接顕微注入する、あるいは成体マウスの尾静脈に注入することで、個体レベルでのゲノム編集が可能であることが最近報告されてきた。そこで、マルチgRNAシステムによって構築したCRISPR/Casベクターを用いて、マウス個体内での高度ゲノム編集の実行を試みる。
果実におけるフラボノイド蓄積機構の解明

これまでにプロアントシアニジン(PA)生合成と関与が示されていない遺伝子群、すなわち、2種類のserine carboxypeptidase-like protein (DkSCPL1, DkSCPL2)、1-cys peroxiredoxin (DkPrx1)、3-dehydroquinate dehydratase-shikimate : NADP oxidoreductase (DkDHD/SDH)、glutathione S-transferase (DkGST1)、flavonol 3-O-galactosyltranseferase (DkF3GalTase)について作製した35Sプロモーターに連結したセンス、アンチセンスの両コンストラクトを、カルスにプロアントシアニジンを多く蓄積するカキ、蓄積しないキウイフルーツを材料に形質導入をし、表現型を観察するともにプロアントシアニジンの構成単位の分析など行いPAの蓄積との関連性やこれらの酵素の機能を調査している。このほかにPAの構成ユニットの分析や転写因子の解析等を行い、その成果を論文としてとりまとめた。また、ベレゾーン期にABAあるいはオーキシン処理し、ブドウ果皮の色相変化や蓄積したアントシアニンの成分分析とともに、これらの処理がアントシアニン生合成関連酵素遺伝子と制御因子の発現に与える影響を、フラボノイド生合成経路の構造遺伝子と下流の液胞への輸送に関わるもの、メチル化酵素、アシル化酵素やDkSCPLのホモログ、転写因子について量的real-time-PCRにより調査している。二次代謝産物の一つであるフラボノイドの果実特異的な蓄積機構の解明のために、果実発達の初期に高分子のプロアントシアニジン(PA)を多量に果肉に蓄積するカキ、成熟期に主に果皮にアントシアニンを多量に蓄積するブドウを用いてこれらの成分分析、生合成経路の遺伝子発現やそれらがコードするタンパク質の機能解析を行っている。これまでにカキ果実におけるPA蓄積と関与が想定される遺伝子群について35Sプロモーターに連結したセンス、アンチセンスの両コンストラクトを作製し、カルスにPAを多く蓄積するカキ、蓄積しないキウイフルーツを材料に形質導入をし、その表現型を観察するともにPAの構成単位の分析など行ってPA蓄積との関連性やこれらのタンパク質の機能を調査している。21年度は、特に2種類のDkSCPL1, DkSCPL2、DkPrx1、DkDHD/SDH、DkGST1、DkF3GalTaseについて実験を行った。赤色系のブドウについて、処理により着色が過剰になる早期、適当な時期、処理の効果の薄い時期の3つの処理時期に、中濃度、高濃度のABA処理を行うとともに、高濃度処理区には着色を遅延させる効果のあるオーキシン処理を行い、着色が良好となる処理区の特定とともに果実横径、糖度、酸度、全アントシアニン含量とアントシアニンの組成を調査した。次に、フラボノイド生合成経路について主な構造遺伝子(PAL, CHS, DFR, F3'H, F3'5'H, ANS, UFGT, ANR、FLS)と下流の輸送に関わるもの(GST, MATE)、メチル化酵素(OMT)とアシル化酵素(CaOMT)とDkSCPLのホモログ、転写因子(MybA, MybPA1, MybPA2, Myb5a, Myb5b)についてqRT-PCRによる発現解析を行うためのアレルの解析、プライマー作製を行っている。
マウス腫瘍同所移植モデルを用いた炎症性癌微小環境の研究

bulb/cマウスの盲腸に同系マウス由来の大腸癌細胞株であるCT26細胞の同所移植を行い、DSS腸炎群とコントロール群の比較を行った。DSS群では大腸長の短縮と組織学的な炎症が確認され、目的である炎症による腫瘍微小環境による腫瘍の変化の評価を行うことができた。腫瘍重量、腫瘍体積および転移率は現段階では両群間で差は認められていないが、HE染色においてDSS群でのみ筋層への浸潤が認められた。Ki-67免疫染色にてDSS群において有意に陽性細胞が増加しており、腫瘍増殖能の亢進が認められた。DSS群の腫瘍ではコントロール群では認められない、腫瘍細胞の紡錘形細胞への変化が認められた。間葉系マーカーであるα-SMAおよびフィブロネクチン陽性細胞の増生が免疫染色にて確認され、Western blotttingによりDSS腸炎群の腫瘍においてα-SMAとvimentinの発現量が多く確認され、腫瘍増殖能の増加に腫瘍細胞の上皮間葉移行(EMT)が関与している可能性が示唆された。CD31免疫染色による血管数を評価したところ、DSS群で有意に腫瘍内血管が増生している結果となった。以上の結果から、現段階では炎症による腫瘍微小環境により血管増生能の亢進、および腫瘍細胞のEMTにより細胞増殖能と浸潤能が亢進している可能性を考えている。マウス大腸腫瘍同所移植モデル作成については、bulb/cマウスへのCT26細胞株の移植は問題なく樹立できたが、B6マウスへの各種オルガノイドの同所移植は複数回試みたが成立しなかった。方針転換し、ヌードマウスへの移植も試みたがこちらも成立しなかった。実験系が確立できているbulb/cマウスへのCT26細胞株の移植モデルを中心に研究を継続していく。腫瘍重量、転移率はnを増やして再検討する。当初の予定通り、腫瘍微小環境内における免疫細胞のDSS群とコントロール群の差異を免疫染色やFACSで解析する。また、既に行っているマイクロアレイの結果を解析し、これまで明らかにしたEMT様変化や血管増生能の亢進に寄与するサイトカインネットワークなどのpathway解析や、今後行う予定の腫瘍内免疫細胞の差異を生じるpathwayの解析を行う。
骨格筋代謝能におよぼすトレーニング効果と機序の解明

はじめに近赤外線分光法が筋酸素消費量測定において高い有用性を示し,超最大運動時骨格筋の酸素利用は30秒間で安静時値の52.3倍になることを実証した。その酸素を利用した有酸素系のエネルギー供給は安静時の0.01mM ATP/secから30秒間で0.53mM ATP/secまで増加し,酸化的代謝の貢献度は48.3%であることを立証した。高強度持久性トレーニング(水泳)の影響を検討するとVO_2maxは増大を示し,筋酸素化レベルは10.5%の減少,ATが出現した時の筋酸素化レベルは13.1%低下した。血液量は運動時のどの時点でも低下した。筋生検の結果,明らかな筋肥大,毛細血管数増大,筋酸素拡散率の増大,タイプIIa線維の増加が生じた。ミオグロビン含有量は著明な増大,CS活性の増大,熱ショックタンパク質70,Cu, Zn-SOD, Mn-SODが有意に減少し,UCP2が増大した。VEGFmRNAは増加の傾向を示した。HIF1αmRNAとVEGFmRNAはトレーニング後有意な相関を示し,適応が示唆される。次に,カルシニューリンシグナル伝達系路に関わる遺伝子の発現について検討すると,c-fos mRNAの増加に伴って,NFATの発現レベルが変動することを示唆した。また,EDTAが筋組織のダメージを減らすことで,遺伝子導入の効率について検討すると,プラスミド溶液に3-10mM EDTAを入れることにより,導入した遺伝子の発現は10倍を示し,キレート剤やEGTAも遺伝子導入効率を高める。さらに,トレーニングは好中球O^.2^-産生を軽減し,特に脂質過酸化の増大を抑制することを示唆した。細胞内情報伝達機構について検討すると,チロシン残基フェニルアラニンに置き換えた変異型trkBを用いた探索により,hSH2-BはtrkBのactivation loop内の燐酸化チロシン残基にSH2ドメインを介して結合することを明らかにした。基盤研究(A) (1)、課題番号10308001「骨格筋代謝能におよぼすトレーニング効果と機序の解明」は平成10年6月19日付で決定通告がなされ、筑波大学体芸事務区からの科研費受付通知を平成10年7月24日付で受理、その後、直ちに共同研究者が一同に会し、研究の企画検討に入った。本研究の目的はその一部として、持久性トレーニングによる末梢骨格筋代謝能のメカニズムについて、末梢循環レベルにおける酸化ヘモグロビン・ミオグロビン等の酸素化レベルや血液量変動、また、動脈内血流量、末梢毛細血管変化をみる筋組織学的分析、筋の生化学的分析などの点から、総合的に検討しようとするものである。本研究では、特に、ヒトを対象としてin vivoで検討するもので、今日、世界でもまだおこなわれていない。従って、本年度は下記に示す研究計画で実施した。1.研究企画の綜合検討-平成10年78月中旬。Μ仮題:高強度・持久性トレーニングが骨格筋代謝能におよぼす影響。測定項目:最大酸素摂取量(V^^・O_2max)およびその他の呼吸循環機能、動脈内血流量、筋末梢部酸素血行動態、筋力、筋パワー、筋生検による組織学的分析、筋生化学的分析等。被検者:健常な一般成年男子13名。トレーニング条件:強度-V^^・O_2maxの8090%、期間-4カ月、頻度-5回/週、1回-75分、運動様式-水泳。

2.トレーニング前の測定-平成10年8月1825日。3.トレーニング実施-平成10年9月初旬12月初旬。4.トレーニング後の測定-平成10年12月15日23日5.平成10年1月以降3月現在、データーの分析中、論文執筆準備、一部論文執筆に入る。以上。本研究は自転車エルゴメーターを用いた一過性の筋運動、強い筋収縮をおこなう筋抵抗運動、および持久性トレーニングによる末梢骨格筋代謝能のメカニズムについて、抹消循環における酸素化レベルや血液量変動、また動脈内血流量、筋組織学的分析、さらに血管新生、筋生化学的分析などの点から総合的に検討するものである。それらの結果は、最大ペダリング運動と間欠性ペダリング運動中における活動筋内の酸素消費について近赤外分光装置を用いて検討した。ヒト血漿中のEC-SODに対する持久性トレーニングの効果について検討した。最大運動後のヒト好中球活性酸素産性能に対する持久性トレーニングの効果について検討した。超最大運動中における有酸素性エネルギー代謝の貢献度について、^<31>P-MRSと近赤外分光装置を用いて検討した。最大下運動後における再酸素化率の変化と骨格筋有酸素能力との関係について検討した。6.ヒトの骨格筋代謝能におよぼす全身的有酸素性高強度トレーニングの影響(1)運動時の筋内酸素動態と毛細血管密度との関連.7.超最大運動中における有酸素性エネルギー供給能の貢献度.8.最大下短時間静的運動後の再酸素化率と骨格筋有酸素能力との関係.9.好中球活性化に及ぼす運動誘発性筋損傷の影響.10.超最大全力ペダリング運動時における無酸素性,および有酸素性エネルギー代謝機構の貢献度.11.動脈血流遮断による最大運動負荷時の筋内酸素化レベルと有酸素的作業能力.平成12年度における研究成果は学術論文4本(欧文誌),平成12年学会発表5本(国際学会4本,国内学会1本)であった。また,平成13年度発表予定(平成13年2月現在)は国際学会3本,国内発表1本の予定である。本年度における研究成果の概略は主に2つの内容から構成されている。その主なものを示すと,I.骨格筋代謝能に対するトレーニングの影響6)ヒト骨格筋代謝能におよぼす全身的有酸素性高強度トレーニングの影響(2)筋組成および筋酸素化レベルにおよぼす筋レジスタンストレーニングの影響.第55回日本体力医学会,富山,2000.9.II.骨格筋代謝能および活性酸素発生等に対する一過性運動の影響8)連動負荷によるヒト骨格筋にみられる遺伝子発現の変化の検索.日本衛生学会,2001.平成13年度における研究実績の概要は以下の通りである。1.本研究の一部は持久性トレーニングが骨格筋のタイプII線維(速筋)からタイプI(遅筋)へ移行するかどうか、すなわち、遅筋化への影響についてカルシニューリン伝達経路およびそれに関連する転写因子(NFAT)について検討を加えた。その結果、NFAT mRNAは増加を示し、カルシニューリンmRNAも同様の傾向にあった。また、トレーニングの期間が大きく影響することが示唆された。3.本研究の一部は高強度持久性トレーニングによる影響を好中球0_2^-産生赤血球膜への酸化障害、および赤血球中の抗酸化酵素活性の点から検討した。その結果、持久性トレーニングは上昇する好中球を軽減し、同時に脂質過酸化の増大を抑制する。
ジアゾ酢酸エステルの精密重合を可能とする新規開始剤系の開発

遷移金属錯体を用いたジアゾ酢酸エステルの重合によって、炭素ー炭素単結合からなる主鎖骨格のすべての炭素上にエステルが結合したポリマー[ポリ(アルコキシカルボニルメチレン)]を得ることができる。このポリマーは、同じ側鎖を有するポリ(メタ)アクリル酸エステルに比べて高い側鎖官能基密度を有していることから、官能基集積ポリマーとして特異的な物性の発現が期待できる。本研究は、この重合法において、制御/リビング重合および立体特異性重合が可能な開始剤系の開発を目指すものである。加えて、現状ではこの新規ポリマーにおいて立体構造のNMRによる解析手法が確立されていないため、低分子モデル化合物を用いた明確な帰属の達成を目標としている。種々のPd錯体を用いたジアゾ酢酸エステルの重合の検討の結果、新たにPd(nq)2/NaBPh4開始剤系(nq = 1,4-naphthoquinone)を用いることで、比較的高分子量体のポリマーが収率よく得られることを見出した。生成したポリマーの末端構造をMALDI-TOF-MSにより解析し、本開始剤系によるジアゾ酢酸エステルの重合メカニズムの提案に成功した。さらに、新規Pd(II)錯体[Pd(cod)(Cl-nq)Cl](cod = 1,5-cyclooctadiene)にボラートとしてNaBPh4を組み合わせた開始剤系を用いることで、立体構造のかなり制御されたポリマーが得られることを見出した。興味深いことに、この新規Pd(II)錯体は、アニオン性NQ配位子を有するPd(II)錯体合成の初めての例で、さらに、Pd開始剤系を用いたジアゾ酢酸エステルの重合において最も立体制御能の高いポリマーを与える錯体であった。これらの成果はジアゾ酢酸エステルの重合において望まれている優れた開始剤系の開発に大きく寄与するものであり、今後ますますの発展が見込まれる。遷移金属錯体を用いたジアゾ酢酸エステル(N2=CHCO2R)の重合によって、炭素ー炭素結合からなる主鎖骨格のすべての炭素上にエステルが結合したポリマーを得ることができる。本研究は、この我々の独自の重合法において、いまだ達成されていないリビング重合および立体特異性重合が可能な開始剤系の開発を目指すものである。(I)リビング重合および立体制御可能な開始剤系の開発市販のπ-アリルパラジウムクロリドを用いたジアゾ酢酸エステルの重合において、π-アリル上の置換基や重合系への添加物ないし溶媒を変えることで、重合挙動(分子量・分子量分布、タクチシチー)が変化することを見出した。また、N-ヘテロ環状カルベン(NHC)を有するパラジウム錯体を用いた重合において、用いるPd前駆体やNHC上の置換基による重合挙動の変化が同様に観測された。(II)立体規則性のNMRによる解析手法の確立種々のアルコール(連鎖移動剤)存在下、ジアゾ酢酸エステルの重合を行うことで、ポリ(アルコキシカルボニルメチレン)オリゴマーを合成し、その3量体および4量体を分離した。その後、順相HPLCによるジアステレオマーの分離により、各ジアステレオマーへの分離に成功し、NMRによる構造の同定を行った。本研究において達成目標としている2つのテーマにおいて、初年次の計画事項をおおむね達成できていることから、本研究が順調に進展していると考える。パラジウムなどの遷移金属錯体を用いたジアゾ酢酸エステルの重合によって、炭素ー炭素単結合からなる主鎖骨格のすべての炭素上にアルコキシカルボニル基(エステル)が結合したポリマーを得ることができる。このようなポリマーは、同じ側鎖を有するポリ(メタ)アクリル酸エステルに比べて側鎖官能基密度が高く、官能基集積ポリマーとして特異的な物性の発現が期待できる。本研究は、この重合法において、いまだ達成されていないリビング重合および立体特異性重合が可能な開始剤系の開発を目指すものである。(I)リビング重合および立体制御可能な開始剤系の開発前年度に引き続き、N-ヘテロ環状カルベン(NHC)を有するパラジウム錯体を用いた重合を検討した。その結果、ある種のキノン系配位子を用いた場合に、タクチシチーがかなり制御されたポリマーが得られることを見出した。これは、これまで知られているPd系開始剤の中で最も立体規則性の高いポリマーを与えるものであり、高度にシンジオタクチックに制御可能なRh系開始剤に匹敵する結果である。(II)立体規則性のNMRによる解析手法の確立構造決定のためのモデルオリゴマーとして、3量体および4量体のオリゴ(メトキシカルボニルメチレン)を合成し、各ジアステレオマーへの分離に成功した。このうち4量体のオリゴマーにおいて、NMRのカップリング定数の観察と計算化学による考察の結果、4種のジアステレオマーの構造の推定に至った。

遷移金属錯体を用いたジアゾ酢酸エステルの重合によって、炭素ー炭素単結合からなる主鎖骨格のすべての炭素上にエステルが結合したポリマー[ポリ(アルコキシカルボニルメチレン)]を得ることができる。このポリマーは、同じ側鎖を有するポリ(メタ)アクリル酸エステルに比べて高い側鎖官能基密度を有していることから、官能基集積ポリマーとして特異的な物性の発現が期待できる。本研究は、この重合法において、制御/リビング重合および立体特異性重合が可能な開始剤系の開発を目指すものである。加えて、現状ではこの新規ポリマーにおいて立体構造のNMRによる解析手法が確立されていないため、低分子モデル化合物を用いた明確な帰属の達成を目標としている。種々のPd錯体を用いたジアゾ酢酸エステルの重合の検討の結果、新たにPd(nq)2/NaBPh4開始剤系(nq = 1,4-naphthoquinone)を用いることで、比較的高分子量体のポリマーが収率よく得られることを見出した。生成したポリマーの末端構造をMALDI-TOF-MSにより解析し、本開始剤系によるジアゾ酢酸エステルの重合メカニズムの提案に成功した。さらに、新規Pd(II)錯体[Pd(cod)(Cl-nq)Cl](cod = 1,5-cyclooctadiene)にボラートとしてNaBPh4を組み合わせた開始剤系を用いることで、立体構造のかなり制御されたポリマーが得られることを見出した。興味深いことに、この新規Pd(II)錯体は、アニオン性NQ配位子を有するPd(II)錯体合成の初めての例で、さらに、Pd開始剤系を用いたジアゾ酢酸エステルの重合において最も立体制御能の高いポリマーを与える錯体であった。これらの成果はジアゾ酢酸エステルの重合において望まれている優れた開始剤系の開発に大きく寄与するものであり、今後ますますの発展が見込まれる。(I)においては、触媒としてπ-アリルパラジウムクロリドを用いたジアゾ酢酸エステルの重合で、当初の予定よりも若干早く研究が進行しており、今後はその成果を論文投稿するための準備を行う予定でいる。また、N-ヘテロ環状カルベン(NHC)を有するパラジウム錯体を用いた重合では、重合に有効な市販のNHC含有Pd錯体が限られているため、in situで簡便に調整できる重合系の設計を予定している。(II)では、各ジアステレオマーの単結晶X線構造解析を予定している。また、5量体オリゴマーの合成・分離、構造決定を予定している。(I)においては、当初、種々のNHCを用いた重合を行い、NHCの構造が重合制御能や生成ポリマーのタクチシチーに及ぼす効果を調査する予定であったが、予想外なことに、NHCの構造による違いよりも他の要因が大きく影響していることを見出したため、計画を変更して検討を行う予定である。具体的には、電子的ないし立体的に異なる種々のキノン系配位子を合成し、市販のPd錯体と組み合わせて重合を行う。また、生成ポリマーの末端構造解析による重合メカニズムおよび立体構造制御機構の解明を目指す。(II)では、前年度に引き続き各ジアステレオマーの単結晶X線構造解析を予定している。一部消耗品の消耗が当初の予定に比べて抑えられたことから購入を先送りにした。
神経堤細胞の移動と分化を再現する培養系を応用した歯髄細胞にする機能歯再生法の開発

本研究の目的1.と2.は、『頭部神経堤細胞における歯胚発生関連遺伝子の変化の解明』、及び、『それを指標として、歯髄細胞から未分化歯髄細胞を作製する方法を開発』であったが、摘出した神経堤細胞のRNAの量が微量すぎた為、上記の指標ができず中断している。しかしながら、これらの研究過程で、歯と伴に原始口腔で発生する下垂体が、歯と酷似した遺伝子を発現しながら異なる分化過程を辿ることに着目し、その相違点を解明することは、必ずや歯牙再生の為の重要な基盤研究になるはずであろうと考え、以下の研究を行った。すなわち、(1)ラットの全歯牙において口腔外胚葉と前腸内胚葉の境界と中脳後脳の神経堤細胞の歯胚形成への寄与している明らかにし、(2)口腔外胚葉と前腸内胚葉の境界の非神経性の正中ANRが下垂体への寄与していること、及び、(3)脊索前板が非神経性の正中ANRやラトケ嚢に侵入し、最終的にホルモン産生細胞に分化することを明らかにした。更に、(4)脊索前板の原始口腔内への領域特異的な侵入パターンが、歯胚・下垂体・視床下部の誘導に寄与することを明らかにし、(5)脊索前板の除去は、ShhのK.O.マウスの形態や遺伝子発現と酷似していることを示した。また、再生にはニッチエが幹細胞と同様に重要であるため、目的3.『ラット胚の誘導能をそのまま利用して歯と歯周組織の再生を可能にする方法を確立』を中心に研究を行った。まず、上記15では、間脳腹側をラトケ嚢と伴に培養する上顔面長期培養法よりαMsh,TSHβ,LHβまでのホルモン産生細胞を再生できるニッチェが確立された。さらに、歯と歯周組織の発生のニッチェとしては、(6)鳥類の顎の発生過程を用いた神経堤細胞と歯・顎の再生に重要な領域、及び、(7)120時間の長期全胚培養系の確立を行なっている。これは歯と歯周組織の確立のみならず、視床下部(摂食関連神経核)の再生をも視野に入れている。当該研究では、(1)『頭部神経堤細胞歯乳頭までの間葉細胞における発生関連遺伝子の変化を解明』し、(2)『それを指標としてマウスの歯髄細胞から頭部神経堤細胞と相同な潜在的な分化脳(competent)をもつ幹細胞(未分化歯髄細胞)を作製する方法を開発』し、さらに、(3)『顎と歯胚の誘導能をもつラット胚の上皮組織をそのまま利用して作製した歯髄の幹細胞から歯と歯周組織の再生を可能にする方法を確立』することを目的とする。(1)現在、歯の初期発生に関わる遺伝子として、最も初期に発現する遺伝子として、Pitx2が知られているが、これはラトケ嚢にも発現している。したがって、未知遺伝子ものっているDNAチップを作製するための方法として、ある程度遺伝子を絞り込む実験を行っている。すなわち、そこで、本年度は上顎の歯を形成する領域とラトケ嚢を形成する領域間でDiferentiation Displayを行い、歯を形成する領域に特異的に発現する遺伝子のライブラリーを作製しており、どちらかに特異的に未知および既知の遺伝子が600クローンまで絞り込んだ。(2)上顔面の長期培養系でPitx2が予定歯領域とラトケ嚢の両方で発現することを確かめた。

(3)Fgf-8やShhは、中脳と後脳の神経堤細胞に対して、少なくとも、そのsurvivngとproliferatiorの維持に機能しており、歯髄細胞中の未分化間葉細胞に対して増殖や維持に関わる可能性がある。したがって、歯髄細胞の中に存在する神経堤細由来の細胞を選択的に増殖させるために、成獣マウスから摘出した歯髄細胞をMicromass cultureにより培養し、Fgf-8とShhを作用させ、外胚葉性間葉(あるいは、頭部神経堤細胞)未分化な間葉細胞をの形態を有する細胞を作製している。(4)その他の実験のセットアップも、並行している。(1)『頭部神経堤細胞歯乳頭までの間葉細胞における発生関連遺伝子の変化を解明』を行っているが、昨年までに上顎の歯を形成する領域とラトケ嚢を形成する領域間でDiferentiation Displayを行い、歯を形成する領域に特異的に発現する遺伝子のライブラリーを作製しており、どちらかに特異的に未知および既知の遺伝子が600クローンまで絞り込み、現在は、神経堤防細胞をmicrodissection装置で摘出する際のRNAの量が微量であり、その解決策を模索している。(2)『それを指標としてマウスの歯髄細胞から頭部神経堤細胞と相同な潜在的な分化能(competent)をもつ幹細胞(未分化歯髄細胞)を作製する方法を開発』では、Fgf-8やShhは、歯髄細胞の中に存在する神経堤細由来の細胞を選択的に増殖させることを証明するために、Fgf-8とShhの抗体を全胚芽培養下で作用させ、移動中の神経堤細胞への影響を観察し、どのような分子が変化してくるかを検索し、未分化歯髄細胞の作成への可能性を模索している。(3)『顎と歯胚の誘導能をもつラット胚の上皮組織をそのまま利用して作製した歯髄の幹細胞から歯と歯周組織の再生を可能にする方法を確立』では、まだ、下垂体の前葉も歯の再生方法は確立されていないが、歯と同様に下垂体の前葉を培養させることに成功し、内胚葉と外胚葉の境界で産生されること、および、ホルモン分泌細胞も産生することがあきらかになった。この方法を用いれば、誘導能をもつラット胚の内胚葉と外胚葉の境界領域の誘導能をそのまま利用して、下垂体の未分化細胞や未分化な上皮からホルモン分泌細胞を産生させることも可能になるため、下垂体の未分化細胞や未分化な上皮からホルモン分泌細胞が再生される可能性が高くなってきた。(1)『頭部神経堤細胞歯乳頭までの間葉細胞における発生関連遺伝子の変化を解明』を行っているが、昨年までに上顎の歯を形成する領域とラトケ嚢を形成する領域間でDifferentiation Displayを行い、歯についてはすでに解析が進められている分子ばかりだったので、ラトケ嚢についての解析を行っている。(2)『それを指標としてマウスの歯髄細胞から頭部神経堤細胞と相同な潜在的な分化能(competent)をもつ幹細胞(未分化歯髄細胞)を作製する方法を開発』では、歯髄細胞の中に存在する神経堤細由来の細胞を選択的に増殖させるために、Fgf-8とShhを全胚芽培養下で作用させ、移動中の神経堤細胞への影響を観察したが、未分化な細胞が神経堤細胞のマーカーを示す細胞は今のところできてきていない。しかしながら、Shhの抗体をHead hold期のラット胚に作用させたところ、全胚培養下で作用させたところ、下垂体と歯の分化を示すマーカーが出てこなかった。また、頭部中内胚葉の移動と分化にかかわっているらしいことが分かってきた。(3)『顎と歯胚の誘導能をもつラット胚の上皮組織をそのまま利用して作製した歯髄の幹細胞から歯と歯周組織の再生を可能にする方法を確立』では、まだ、下垂体の前葉も歯の再生方法は確立されていないが、歯と同様に下垂体の前葉を培養させることに成功し、中内胚葉層と外胚葉層の境界で産生されること、および、ホルモン分泌細胞も産生することがあきらかになった。
左右非対称性決定機構の解明

inv遺伝子は左右非対称性に関与する遺伝子がいくつか知られている中でも初期過程の決定に関与すると考えられる。inv遺伝子は1062個のアミノ酸を持ちN末に15回の繰り返しのあるアンキリン・モティフを持つ蛋白であるが、その左右決定に関する機能は不明である。inv遺伝子の機能解明のため、まず、その細胞内の局在をGFP(green fluorescent protein)との融合蛋白を作成しcos-7細胞にトランスフェクッションして調べた。fluorescent signalは細胞質内、特に核周囲に局在し、顆粒状又は線維状の2種のシグナルが認められた。inv遺伝子はC-末に2つのbipartite nuclear localization signalを持っているため、核移行性を調べるため、さらにいくつかのinv遺伝子の部分的コンストラクトを作成した。アンキリン・リピートを含むコンストラクトでは細胞質にsignalが存在したのに対して、アンキリン・リピートをもたず核移行シグナルのみのコンストラクトでは核にsignalの存在があった。次に、他の種類の細胞でも同様の局在を示すかどうかを調べるため、MDCK細胞に各コンストラクトをトランスフェクッションした。MDCK細胞では、cos-7細胞とは異なり、核移行signalを持つコンストラクトではsignalは核に認められた。さらに、Hela細胞、にトランスフェクッションすると、やはり核にsignalの存在が認められた。このことは、inv蛋白は上皮系細胞では核で、間葉系細胞では細胞質に存在している可能性を示している。
量子ドット間の静電相互作用制御による量子ドット結晶の作製と新規光池性

本研究の目的は、サイズの揃った半導体量子ドットが規則的に配列した"量子ドット結晶"を構築し、量子ドットが「分散」した状態とは異なる「組織体」としての新しい光物性を明らかにすることである。本年度の研究成果について報告する。正負に帯電したCdS量子ドット間の静電相互作用を利用したCdS量子ドット結晶の作製に取り組んだ。まず7%という狭い粒径分布幅をもつ正及び負に帯電した量子ドットを作製することができた。正及び負に帯電した量子ドットの混合溶液における吸収エネルギーが個々の量子ドットの吸収エネルギーよりも60meV低エネルギー側にシフトし、量子ドット間の静電相互作用が量子ドット結晶を作製する駆動力になり得ることを明らかにした。さらに試料溶液中に析出した量子ドット結晶のX線構造解析において2θ角が4°付近に回折ピークを明確に観測し、量子ドットが数nmの間隔で周期的に配列し手いることを確認した。すなわち、正負に帯電した量子ドット間の静電相互作用により、量子ドットが周期的に配列した量子ドット結晶を作製することに成功したことを示している。さらに、量子ドット結晶の構造を制御するため、光エッチングを利用し量子ドットサイズを制御することに取り組んだ。窒素レーザー励起色素レーザーを用いて、4%まで粒径分布幅を狭めることに成功し、さらにその後有機分子を用いた表面修飾により、帯電状態を制御したCdS量子ドットの作製に成功した。
中脳腹側被蓋ドーパミン細胞の投射部位と発火パターンに関する研究

中枢神経系ドーパミン(DA)ニューロンには単発と群発の2種類の発火パターンがあることが知られており、単発に比べ群発の発火でより強力なDAの放出が生じると考えられている。精神分裂病と強い関わりがあると考えられている中脳腹側被蓋のDA起始細胞の発火パターンを指標にして向精神薬のDA放出に対する作用がこれらの投射部位の違う細胞によって異なるのかどうか、また、近年、提唱されている精神分裂病のグルタミン酸低活動仮説との関連を検討することを目的とした。基礎実験としてグルタミン酸の作用点であるNMDA受容体を分子生物学的手法を用いて選択的に減少させ、DA系機能への影響を検討した。NMDA受容体チャンネルのサブユニットであるNMDAR1のmRNAの発現やレセプター蛋白への翻訳を抑制する短鎖のDNA(アンチセンス・オリゴヌクレオチド)を合成し、ラット脳室内へ浸透圧ポンプを用い1週間微量持続注入し(ノックダウン)、その後、細胞外シングルユニット記録法を用いて、バースト発火の率や性質の変化などをコンピュータで解析した。これまで、溶媒投与群との比較においてアンチセンス投与群に発火頻度には影響を与えず、選択的に有意なバースト発火率の低下を認めた。これらの所見はNMDA受容体ノックダウンが、DAニューロンの基礎活動には影響を与えず、その放出を抑制する可能性を示すものと考えられる。なお、これらの結果は第28回米国神経科学会で発表した。現在、コントロールオリゴヌクレオチド投与群との比較検討中である。また、このDA放出に対する検討としては、マイクロダイアリシス法を用い、メタンフェタミン負荷への反応性の変化などを調べ、同様に行動の変化については移所運動量などを測定して定量化する予定である。組織化学的には、アンチセンス投与の効果の検証や、DA受容体に与える影響を調べるため、ノーザンブロッティング法、in situ hybridization、受容体オートラジオグラフィーを用い、NMDAおよびDA受容体のmRNAやタンパクの発現、分布の変化などについても検討中である。中枢神経ドーパミンニューロンには単発と群発の2種類の発火パターンがあることが知られている。単発に比べ群発の発火でより強力なドーパミンの放出が生じると考えられており、実際、電気刺激や薬物による群発発火増加によって放出が著しく促進されることが証明されている。精神分裂病と強い関わりがあると考えられている中脳腹側被蓋のドーパミン起始細胞の発火パターンを指標にして向精神薬のドーパミン放出に対する作用がこれらの投射部位の違う細胞によって異なるのかどうか、また、近年、提唱されている精神分裂病のグルタミン酸低活動仮説との関連を検討するすることを目的とした。今年度は、基礎実験としてグルタミン酸の作用点であるNMDA受容体を分子生物学的手法を用いて選択的に減少させ、ドーパミン系機能への影響を検討した。NMDA受容体チャンネルのサブユニットであるNMDAR1のmRNAの発現やレセプター蛋白への翻訳を抑制する短鎖のDNA(アンチセンス・オリゴヌクレオチド)を合成し、ラット脳室内へ浸透圧ポンプを用い1週間微量持続注入した(ノックダウン)。その後、脳定位的に麻酔下in vivo細胞外シングルユニット記録法を用いて、中脳の発火ドパミン細胞の数の変化、発火頻度の変化、ドパミン放出を反映するバースト発火の割合や性質の変化などをコンピュータで解析した。溶媒投与群との比較においてアンチセンス投与群に有意なバースト発火率の低下を認めた。一方、発火頻度に有意な変化は認められなった。これらの所見は、グルタミン酸系ニューロンの低活動がドーパミン系ニューロンの基礎活動に変化を与えず、選択的にドーパミン放出を減少させる可能性を示唆するものかもしれない。ただし、今後、センス(アンチセンスに相補的なオリゴヌクレオチド)やランダム(アンチセンスと同じ塩基をランダムに配列してゲノムに相同性がないもの)などのコントロール投与群との比較が必要である。なお、この研究内容は第20回生物学的精神医学会にて発表予定である。

また、このDA放出に対する検討としては、マイクロダイアリシス法を用い、メタンフェタミン負荷への反応性の変化などを調べ、同様に行動の変化については移所運動量などを測定して定量化する予定である。組織化学的には、アンチセンス投与の効果の検証や、DA受容体に与える影響を調べるため、ノーザンブロッティング法、in situ hybridization、受容体オートラジオグラフィーを用い、NMDAおよびDA受容体のmRNAやタンパクの発現、分布の変化などについても検討中である。
高品質チーズ製造に向けた放牧牛乳中糖鎖の構造及び機能解析

放牧利用率の極めて高い日本の生乳生産の約5割を占める北海道において、放牧牛乳の特徴を明らかにすることは、牛乳および乳製品の付加価値を高める上で重要である。本研究では、とくに牛乳中の糖質に着目し検討を行った。放牧草を摂食することで、牛乳中のグルコースやガラクトースを主とした中性糖、すなわちヘキソース含量は変化しない。一方、唯一の糖鎖構成酸性糖であるシアル酸は増加した。放牧牛乳のこれらの変化は、乳製品に様々な影響を及ぼす可能性があり、更なる研究が必要である。昨今の飼料価格高騰に対処するため、低コストで省力管理が可能な放牧飼養の導入が進んでいる。以前の研究において、放牧飼養により乳中糖質濃度が変化する可能性を明らかにした。そこで、放牧飼養による乳中糖鎖の濃度変化及び特徴的構造の解明を目的とし、その特徴を明らかにするとともに、乳製品とくにチーズ製造への影響を明らかにする。本年度の研究結果から、次の三点が明らかになった。乳牛14頭を用い、放牧飼養時間を増加させる(4,8,20時間区,ラテン方格法,対照区は放牧前乳)と乳中ヘキソース濃度は変化しないが、乳中シアル酸濃度は放牧時間依存的に有意な増加がみられた。次に、6頭の乳牛を2週間舎飼い飼養に馴致した後放牧飼養に切り換えると、乳中シアル酸濃度は、放牧飼養期間が進むにつれて有意に増加し、同試験期間中に放牧飼養から舎飼い飼養に移行した区では、有意な減少が確認された。乳中シアル酸は、単独で存在することが極めて低いことからシアル酸により修飾されたミルクオリゴ糖または糖タンパク質、糖脂質などの複合糖質のいずれかが増加している可能性が考えられた。そこで、放牧飼養時間による乳中酸性オリゴ糖(シアル酸修飾を受けているオリゴ糖)濃度の変化を検討したところ、主要な乳中オリゴ糖である3 ́シアリルラクトースならびに6 ́シアリルラクトースは放牧時間が増加するにつれ有意に減少した。このことから、シアル酸修飾を受けているとされるκカゼインなどの糖タンパク質、またはガングリオシドなどの糖脂質が増加しているか、修飾するシアル酸含有糖鎖の構造が変化している可能性が考えられる。来年度以降、放牧飼養による複合糖質の濃度及び構成糖鎖構造への影響を検討し、さらにこれらシアル酸含有複合糖質を抽出精製してチーズ製造工程における影響を明らかにする。平成20年度の研究結果において、放牧飼養により乳中シアル酸が増加する可能性について示唆した。本年度は、この乳中シアル酸の増加要因として考えられる複合糖質の濃度について検討した。シアル酸含有糖蛋白質の一つであるラクトフェリン濃度について、放牧舎飼い切り換え試験(2週間反転試験)のサンプルを希釈法及び希釈倍率を決定し、ELISA法により検討したが、現在までのところ明確な結果が得られていない。また、乳中免疫グロブリン(IgA, IgG, IgM)についても、乳サンプルの希釈法ならびに希釈倍率を決定し、現在測定中である。次年度は、複合糖質の中でもシアル酸含有率の高い糖蛋白質(κカゼイン)及び糖脂質(ガングリオシド)について検討する予定である。チーズ製造に関しては2種類の乳酸菌スターター(ST-M5 : Streptococcus thermophilus, ABT-3 : Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacteriunm lactis S、ともにクリスチャンハンセン社)と放牧飼養及び舎飼い飼養乳を用いたモッツァレラ型チーズ製造法を確立した。これらのサンプルを分析したところ、放牧飼養乳を原料にすることで、機能性脂質である共役リノール酸のチーズへの高蓄積化が確認され、放牧飼養乳から乳製品を製造することが高付加価値化につながる可能性を示した。次年度はモッツァレラ型チーズ製造工程よりサンプリングした原料乳、チーズホエー及びカードにおけるシアル酸ならびに上述の研究により明らかになった放牧飼養乳に特徴的なシアル酸含有複合糖質の濃度変化を検討し、放牧飼養乳に特徴的な糖鎖構造と高付加価値化の関係について解明を目指す。H21年度につづき、放牧飼養(放牧草摂食区)及び舎飼い飼養(グラスサイレージ摂食区)による2週間で反転する切り換え試験より得られた牛乳サンプルを分析に用い、解析した。研究結果から、乳中総シアル酸は放牧飼養により増加する可能性が再び示唆され、放牧11日目以降有意な増加がみられた。さらにこれまで乳中シアル酸濃度の解析に使用してきたレゾルシノール法がメイラード反応により濃度を課題評価する可能性が考えられたため、緩和的加水分解法によるシアル酸の脱離及びDMBを用いた蛍光標識法及び高速液体クロマトグラフィーにより分子種毎(N-アセチルノイラミン酸及びN-グリコリルノイラミン酸)の定量法を検討し、濃度測定に用いた。

その結果、主要な乳中シアル酸であるNアセチルノイラミン酸(NA)は、舎飼いから放牧による有意な増加は認められず、総シアル酸の測定結果を反映するものにはならなかった。一方で、放牧から舎飼いに切り換えると有意な減少がみられ、総シアル酸濃度の変化と一致した。NA測定には検討の余地を残しており、今後、さらなる高精度の乳中シアル酸抽出・分析方法の検討が必要になる。また、乳中複合糖質の類似構造を有する酸性ミルクオリゴ糖(3'-シアリルラクトース及び6'-シアリルラクトース)はいずれも腸管細胞株HT-29において、高いToll-likeレセプター遺伝子の発現量を増加させることが明らかになった。このことから、様々な保健機能への効果が期待される。放牧乳製品における検討では、カマンベールチーズのシアル酸濃度を測定した。舍飼い、放牧両区間に有意な差は見られなかったが、熟成日数により両区とも有意な減少が見られた。このことから牛乳中のシアル酸はチーズの熟成期間において何らかの役割を有していることが考えられた。今後、より早い熟成期間(例えば10日や20日)でのシアル酸濃度の検討を行う必要がある。
疾患特異的細胞ｉＰＳ細胞を用いたニューロマスキュラーパソロジーの解析

球脊髄製筋萎縮症(SBMA)患者の線維芽細胞から樹立したiPS細胞を用いて病態解析を行った。まず、線維芽細胞と樹立したiPS細胞において、ARのCAGリピート数を解析したところ、リプログラミングによるCAGリピート数の変化はみられなかった。次に、患者iPS細胞と健常者iPS細胞を運動ニューロンへと分化誘導したところ、運動ニューロンの分化誘導効率や、SBMAの原因遺伝子であるARの発現量に差はみられなかった。また、ARのリガンドであるジヒドロテストステロン(DHT)存在下で培養したところ、分化成熟に伴ってARの発現が上昇し、TGFbシグナル関連分子やVEGFなどのDHT依存的発現変化を認めた。軸索輸送に関与するDynactin1の発現変化は観察されなかった。一方、骨格筋への分化誘導をも合わせて行っている。PiggyBac vectorを用いてMyoD1を強制発現する培養法に改良を加え、MyoD1導入細胞をクローニングすることなく、2週間以内に、約80%以上の高効率で、骨格筋を誘導する培養法を確立した。現在、これらの技術を組み合わせて、運動ニューロンと骨格筋の共培養による病態解析を進めている。26年度が最終年度であるため、記入しない。4名の球脊髄製筋萎縮症(SBMA)患者から線維芽細胞を採取し、エピゾーマルベクターを用いて、疾患特異的iPS細胞を樹立した。未分化マーカーの発現や神経分化能等の解析により、各患者について良質なクローンを各3クローンずつ選別した。また、同様の手法を用いて、性別、年齢をあわせた2名の健常者線維芽細胞から、コントロールiPS細胞を樹立し、良質なクローンを各3クローンずつ選別した。次に、これまでに開発してきたヒトES細胞から神経幹細胞を誘導する培養法を改変することで、ヒトES細胞、iPS細胞から、遺伝子導入せずに、短期間で高効率に運動ニューロンを誘導する方法を開発した。この方法で誘導した運動ニューロンは、成熟分化培養を行うことで、Choline acethyltransferase(ChAT)陽性のニューロンへと分化した。また、レンチウイルスレポーターを用いて運動ニューロンを可視化する方法を開発した。そこで、これらの手法を用いて、患者iPS細胞および健常者iPS細胞から運動ニューロンを誘導し、分化誘導効率、細胞死、変異ARによる凝集体形成、病態関連遺伝子の発現、細胞内シグナルなどについて解析を行っている。また、ヒトES細胞、iPS細胞から骨格筋の誘導法の開発、運動ニューロンと骨格筋の共培養系の開発も併せて行っている。当初予定していた患者由来iPS細胞の樹立、短期間で高効率に運動ニューロンを誘導する培養法の構築、運動ニューロンを用いた病態解析を進めることができた。また、骨格筋の分化誘導法や、運動ニューロンと骨格筋の共培養系の構築も開始しており、次年度も継続して研究を進めたい。樹立した患者由来iPS細胞を用いて運動ニューロンを誘導し、分化誘導効率、細胞死、変異ARによる凝集体形成、病態関連遺伝子の発現、細胞内シグナルなどについて、健常者由来運動ニューロンと比較解析することで、患者由来運動ニューロンにおける病態メカニズムを明らかにしていく。また、純化した運動ニューロンを用いてトランスクリプトーム解析を行うことで、治療の標的となり得る、あらたな分子病態の解明を目指す。また、運動ニューロンと骨格筋の共培養系を用いて、細胞間相互作用による病態の解明を行う。