hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
免疫寛容の誘導・維持と破綻における樹状細胞の機能と作用メカニズムの解析

胸腺由来のCD25+CD4+制御性T細胞(Treg)は自己免疫疾患の発症を抑制していることが知られるが、活性化した樹状細胞(DC)はTregの増殖を誘導し、免疫応答を制御することもこれまでの研究で明らかである。また、DCによって増殖したTregはその抗原特異性を維持し免疫応答を抑制する。そこで、異系白血球混合培養応答(MLR)によって増殖するTregの特異性とその効率をin vitroならびにin vivoで検討した。その結果、異系DCはIL-2非添加に比べ添加時に非常に効率よくTregの増殖を誘導すること、IL-2およびCD80/86非依存的にFoxp3の発現を維持することが示された。また、増殖したTregは生体から調製された直後の細胞に比べ、遥かに強力にMLRを抑制すること、また、増殖誘導に用いられたDCの系統に対するMLRの抑制活性は別の系統に対するものに比べ3-10倍であった。そこで、この細胞を同系のCD25-CD4+ T細胞と共に亜致死線量を照射した異系マウスに輸注したところ、GvHの発症が有意に抑制されることも示された。このようなTregの増殖誘導に関しては、骨髄前駆細胞よりin vitroで誘導された活性化DCがとりわけ強力な作用をもつことから、生体から調製した脾DCによる抗原提示における作用を検討した。その結果、脾DCはナイーブな抗原特異的T細胞だけでなく、増殖誘導した抗原特異的Tregの増殖も誘導した。しかし、培養過程におけるDCのMHCクラスIIならびにCD80の発現上昇はTregと培養した場合には認められなかった。さらに、抗原特異性の異なるTregとナイーブT細胞を両方の抗原を提示する同時に提示するDCと共に培養すると、ナイーブT細胞の活性化が有意に抑制されることが明らかになった。強力な抗原提示細胞として知られる樹状細胞は、特異的免疫応答の誘導において必須の細胞である。その一方で、胸腺における自己MHC分子に特異的な細胞の除去という中枢免疫寛容の誘導に中心的役割を果たしていることが知られる。同様に、末梢組織・器官に発現される組織特異的抗原に対する特異的T細胞の除去・不活化においても作用していることが予想され、末梢免疫寛容の誘導はそれぞれの所属リンパ器官で誘導されることも示唆されている。この様な作用は、樹状細胞の末梢からリンパ器官への移動という特徴的な機能と密接に連関している。末梢リンパ器官のT細胞領域に分布する樹状細胞はCD205を発現することに注目し、特異抗体遺伝子に抗原ペプチド遺伝子を導入することにより調製した抗体を用いて、抗原を選択的にT細胞領域樹状細胞にターゲティングさせることにより、末梢リンパ系器官樹状細胞の免疫寛容誘導における役割を検討した。その結果、投与した抗体は短時間の内にリンパ組織に分布する樹状細胞にのみ選択的に取り込まれることが示された。また、抗原ペプチドを結合させた抗体を用いると、in vitroで特異的T細胞の活性化を誘導するだけでなく、リンパ器官でも特異的T細胞の速やかな増殖が検出された。ところが、抗原ペプチド結合抗体の投与後、1週間後にはリンパ節T細胞には抗原に対する応答能が検出されず、しかも一過性に増殖したT細胞が著明な減少が示された。しかし、抗原ペプチド結合抗体の投与時に抗CD40抗体を投与すると、樹状細胞の活性化が誘導され、それと同時に抗原特異的T細胞の減少も認められなくなった。しかも、抗CD40抗体を投与した場合にのみ、IFN-γの産生が検出された。以上の結果より、定常状態における樹状細胞は、免疫応答の誘導ではなく末梢における免疫寛容の誘導に働く抗原提示細胞として機能していると考えられる。免疫寛容の誘導と維持に対する作用ならびにその破綻における役割という両面から生体内における樹状細胞の性状と機能を検討する目的で実験を行い、以下の結果を得た。生体における自己免疫応答が臓器あるいは組織特異的であり、しかもその標的となる抗原は細胞に由来することを考慮し、標識した異系あるいは抗原を取り込ませた自己細胞、腫瘍細胞などを投与し、樹状細胞の捕捉能ならびにそれらに由来する抗原提示能をリンパ器官から調製した樹状細胞を用いて検討したところ、アポトーシス細胞を取り込んだのはCD8^+樹状細胞サブセットであった。また、生細胞を投与した場合には、ホストのNK細胞によって傷害され、その結果CD8^+樹状細胞に捕捉されることが示された。また、組織学的検討によりこれらの細胞はリンパ器官T領域だけでなく、赤脾髄にも分布していることも明らかになった。また、特異的T細胞を用いた抗原提示能を検討したところ、死細胞捕捉能が認められた樹状細胞サブセットにのみ、MHCクラスII及びクラスIを介するT細胞活性化能が検出された。ラテックス粒子や可溶性蛋白抗原に対してはどちらのサブセットもほぼ同じように取り込み、しかもCD4^+T細胞だけでなくCD8^+T細胞をも活性化した。これらの結果から、サブセット特異的な死細胞認識機構の存在が示唆されたと同時に樹状細胞は他の抗原提示細胞とは異なり外来性抗原を内因性抗原としてもプロセッシングできる機能を有することが明らかとなった。

そこで、蛋白抗原を負荷したTAPあるいはβ2m欠損細胞を用いて、それらの捕捉に伴う生体内での免疫応答を検討したところ、定常状態における樹状細胞に取り込まれた抗原は特異的T細胞に提示されそれらの一過性の細胞増殖を誘導するものの、エフェクター細胞の誘導には至らず、免疫寛容が成立することが示された。免疫寛容には特異的T細胞の除去や不活化に加えて、CD25^+CD4^+制御性T細胞が重要な役割を担うことが明らかになっている。また、活性化した樹状細胞が制御性T細胞の抑制作用を解除することも報告されている。そこで、樹状細胞の制御性T細胞に対する作用を検討した。先ず、in vitroで骨髄から誘導した活性化した樹状細胞を抗原提示細胞として用いると、通常の脾細胞を抗原提示細胞とした場合とは異なり、CD25^-CD4^+T細胞への抑制作用が認められないことが確認された。樹状細胞とCD25^+CD4^+制御性T細胞を培養してみたところ、抗原特異的あるいはanti-CD3の刺激を介してCD25^+CD4^+制御性T細胞を活性化することが示された。また、IL-2の存在下では抗原非特異的にCD25^+CD4^+T制御性細胞の増殖を誘導した。しかし、その増殖はIL-2の存否にかかわらず、初期においてはCD25^-CD^4+T細胞と同程度であったが、比較的早くその増殖を停止することが示された。このような活性化樹状細胞によるCD25^+CD4^+抑制性T細胞の増殖応答には、樹状細胞およびCDCD25^+CD4^+抑制性T細胞自身が産生する僅かのIL-2が関与している可能性が示唆されると共に、樹状細胞上に発現されるCD80/86が重要な役割を担うことも示された。また、in vitro培養によって増殖したCD25^+CD4^+制御性T細胞は増殖以前の表現型を保持しており、また抑制活性を保持していることも確認された。また、蛍光標識した抗原特異的CD25^+CD4^+制御性T細胞を生体に投与すると、活性化された樹状細胞だけでなく、生体内樹状細胞によっても抗原特異的な増殖応答が誘導されることも示された。以上の結果より、樹状細胞は生体内において炎症応答などを伴う強力な免役応答を誘導する必要がある場合にはCD25^+CD4^+制御性T細胞を活性化することによりその抑制作用を解除するが、同時に増殖応答を誘導してその後の制御を維持させる機能を持つと考えられるこれまでに、定常状態の脾CD8+樹状細胞に静脈より投与した死細胞を捕捉し、それに由来する抗原を提示することにより特異的CD8+ T細胞の一過的な増殖に続くそれらの除去によるトレランスを誘導することを明らかにしてきている。しかし、肝臓の血管内皮細胞も死細胞の捕捉と抗原提示に関与することが報告されているため、骨髄キメラ動物を用いて再検討した。その結果、血管内皮細胞では、特異的T細胞の活性化は誘導されないことが確認された。また、特異的T細胞の除去に必要な抗原提示期間を検討したところ、増殖後に抗原が提示され続けていなければならないことも明らかになった。クロストレランスならびにクロスプライミングの誘導における補助刺激分子の役割を検討した結果、クロストレランスの誘導には抗原提示細胞上のCD40やCD80/86は不要であること、T細胞のCTLA-4をブロックすることにより活性化されたT細胞の増殖は増強されたが、トレランスの誘導の回避は認められないことが示きれた。他方、クロスプライミングにおいては、CD80/86だけでなくCD40も必須であった。ヒトCD11c陰性plasamacytoid前駆樹状細胞は、IL-
多相高分子モデル表面の構築と環境応答特性の評価

多相高分子の表面及び界面における組成や構造が、外部環境と相互作用してどの様な応答挙動を示すかを明らかにすることは、表面機能性素材特に生体機能素材の分子設計にとって重要である。本研究では、化学的に異なった成分鎖ばかりでなく物理的性質(ゴム、ガラス、結晶状態)も異なる成分鎖を含む多相高分子において、空気中から水中へ環境を変化させたときの高分子表面の環境応答挙動をXPS及び接触角測定より明らかにした。結果は以下の通りである。(1)空気中において製膜された試料フィルムはすべて表面自由エネルギ-の小さい成分が表面に濃縮されている。その試料を水中に浸漬すると、片方の成分鎖がフレキシブルである場合は媒体と成分鎖の相互作用に応じて速やかに表面成分の交替が起こり、その変化は可逆的であった。(2)一方の成分鎖がガラス状態でありもう一方が結晶状態である鎖からなる共重合体においては、環境応答性はみられなかった。しかしその場合でも、融点以上の温度では速やかな環境応答を示した。(3)同じ成分からなる多相高分子でもグラフト共重体の方がブロック共重合体の方が速い環境応答を示した。特に、グラフト共重合体においては、共重合体組成が高々30%程度の成分であっても表面をほぼ覆い尽くすことが明らかになった。(4)このような表面成分の環境応答挙動は、片方の成分鎖の運動が凍結(ガラス状態)されていても起こること及びブロックよりもグラフト共重合体の方が環境応答に敏感であることを考えると、分子そのものの移動よりも成分鎖の広がりの伸縮が多分に寄与したものであることが示唆される。また、それはいずれも可能である。ー以上より、表面機能性多相高分子材料の分子設計において、機能的化学構造を有する成分の導入は当然であるが、その表(界)面自由エネルギ-と物理的状態を考慮することが非常に重要であることが明らかになった。
生体低分子の精密構造認識と機能発現

本研究班は生体低分子による複合系形成における精密構造認識を有機化学的手段により解析し、生物機能発現の機構を解明する。具体的には植物病原菌の生物機能の動的解析と化学的シミュレ-ション、花色素における精密構造認識と機能発現、ホルボ-ルエステルアンタゴニストをめざした分子設計と化学合成、海産物、微生物、植物由来の多様な生理活性物質と機能発現などを研究する。これらの分子認識における微視的構造上の特徴の解明を通じて、生物機能発現の人為的制御も可能となり、広範な応用研究に発展させることを目的としている。生理活性物質の生合成研究において、從来までは標識低分子化合物の取り込み実験を主とした研究手段では最終生成物の標識位置よりその生成経路を推定するにとどまり、中間段階でどのような中間体が関与しているかは不明のままであった。植物病原菌の一種、ビ-ト蛇眼病菌の培地にアンシミド-ル、ウニコナゾ-ルなどの水酸化酸素阻害剤を添加することにより、分子内DielsーAlder反応直後の、ベ-テノン類の前駆物質であるプロベ-テノンを単離することが出来た。ソラナピロンやケトグロボシンについても同様の研究を行い、分子内DielsーAlder反応の傍証を得ることが出来た。花色素の変異・安定化機構には從来までさまざまな説が提出されていたが、後藤らはツユクサの青色花弁色素コンメリニンをとりあげ、各種機器分析、交差再合成さらにはカドミウム・コンメリニンのX線結晶構造解析により構造を確定した。その構造は予備的結果から推定していた当重点領域研究シンボルマ-クとも見事一致しており、人類の長年の夢であった花色素の真の構造を解明したもので、当班の特筆に値する研究成果である。PMA(phorbol myristate acetate)は強力な発癌プロモ-タ-として知られているが、このレセプタ-であるCキナ-ゼに特異的なアゴニストおよびアンタゴニストの創製を目標とし、これらの共通中間体を合成した。さらにB環の合成も収率良く達成することが出来た。
図形推論の観点からのライプニッツ数理哲学の総合的解釈

ライプニッツが同時代の数学を学び、独自の数学を構築し、当時の未解決問題を解いたパリ時代の数学関連の遺稿や、ライプニッツ文書館に保管されている幾何学関連の遺稿を、現代の図形推論研究の知見を活用して読解することで、無限小解析の分野でライプニッツが問題解決のためにいかに図形を活用していたか、ライプニッツは図形についてどのような哲学的分析をおこなったか、そうした分析が数学研究にどう影響したか、を明らかにし、無限小解析と幾何学の関連をライプニッツ数理哲学に位置づけることにある。これにより、現代的観点を踏まえつつも歴史研究としても厳密なライプニッツ数理哲学の解釈を構築することを目指す。
アフリカの民主主義の実践をめぐる人類学的研究：ナイジェリアの政治慣習の事例研究

本研究では、民政移管後のナイジェリアを事例とし、アフリカにおける民主主義の実践について、政治人類学の視点から考察した。特に、民族・宗教・地域対立を乗り越え政治参加の平等性を保証する方策として、同国において重要視されている「輪番制」と「均等配分制」という2つの政治慣習について、フィールドワークに基づく分析を行った。連邦政治から地方政治に至るまで、2つの政治慣習の実際の運用を調査するとともに、それら運用に対する人々の解釈・言説を収集した。それによって、国民の融和を目的とした政治慣習の可能性と問題点を分析し、「輪番制」と「均等配分制」が政治的競合における秩序産出に果たす役割について論じた。本研究は、ナイジェリアにおいて、民族・宗教・地域対立を乗り越え政治参加の平等性を保証する方策として重要視されている「持ち回り制」と「均等配分制」という2つの政治慣行についてフィールドワークをもとに調査研究ことを目的とする。初年度にあたる平成26年度は、これまで調査を進めてきたイモ州ンビセ地方において、イモ州政府及びエジニヒテ=ンビセ地方行政区を対象とし、州政府/地方政府における「持ち回り制」「均等配分制」の実践について調査を行う予定であった。しかし、フィールド調査を予定していた時期に、ナイジェリアではエボラ出血熱の感染の報告があった。10月20日には収束宣言が出されるも、調査を予定していた8月から9月にかけては感染拡大を懸念する声が挙がっており、調査を断念せざるを得ない事態となった。代わって本年度は、平成27年3月28日に実施された大統領選挙について情報収集を行うとともに、日本に暮らすナイジェリア人を対象に聞き取り調査を行った。結果として、申請書にも記載した通り、人々が大統領選挙や、さらには近年話題となっている「ボコ・ハラム」(イスラム教過激派組織)の問題などを、「持ち回り制」や「均等配分制」と関連づけて解釈している点が具体的に明らかになった。ボコ・ハラムについて、日本では国際政治を争点に論じられることが多い。一方で、ナイジェリアでは、宗教対立・地域対立を背景とした政党政治が背景にあり、2つの政治慣行をめぐる解釈の衝突とする言説が広く普及している。これは、申請時に3つの目的の一つとして掲げた2「二つの政治慣習は如何にして守られ、また如何にして破られるのか」を考察する好例と考える。次年度以降、今年度調査できなかった分の保管も含め、ナイジェリアにおけるフィールド調査でより詳細なデータを集めていきたい。本研究は、民政移管からおよそ15年が経過したナイジェリアにおいて、国民の融和と政治参加の平等性を保証する方策として重要視されている2つの政治慣習(「持ち回り制」と「均等配分制」)についてフィールドワークをもとに調査研究を行うことを目的とする。初年度にあたる平成26年度は、渡航を予定していた時期にナイジェリアでエボラ出血熱感染者が確認され、結果として予定していた第一回調査を行うことができなかった。その点を踏まえ、2年目となる本年度は平成27年8月から9月にかけてフィールドワークを実施し、中止となった調査の遅れを取り戻すべく、研究活動を行った。本年度の調査では、特に平成27年3月に実施された総選挙の結果について、住民たちの解釈を収集した。調査を行ったのが、総選挙が終わって半年もたってない時期であったことから、貴重な言説を収集することができた。加えて、調査拠点としたイモ州ンビセ地方のコミュニティでは、現在、新しい伝統的権威者の候補者選びが行われており、これについても2つの政治慣習にカンする住民たちの解釈について多くの語りを収集することができた。今回の調査で、二つの政治慣習について多様な解釈が成り立つことが具体的な事例を通して明らかになった。今回の研究の申請にあたっては、3つの目的の一つとして2「二つの政治慣習は如何にして守られ、また如何にして破られるのか」を上げた。しかし、今回の調査と通じて政治的慣習の理解は「守る/破る」の二分法では語れない実態が判明し、議論を深めることができた。また、コミュニティ内の伝統的権威者の候補者選びと平成27年度3月の総選挙(州選挙)において、二つの政治慣習をめぐる住民の語りには相似が見られることも明らかとなり、国政をめぐる政治慣習と草の根レベルでの政治意識の間に結節点を見いだすことができた。平成27年度は、初年度にエボラ出血熱のため渡航を中止したことをふまえ、第一回調査を行った。調査では、イモ州ンビセ地方を拠点とし、同地方における「持ち回り制」「均等配分制」の実践と解釈について調査を行った。今回の調査では、特に以下の点について調査を行った。(1)平成27年3月に実施された総選挙の結果について住民たちの評価を聞くとともに、それら語りにみる二つの政治慣習に関する人々の解釈を分析した。(2)加えて、拠点としたコミュニティで進行中の伝統的権威者の候補者選びについて、自治組織の役員や首長たちを中心に、住民たちの語りを収集した。今回の調査では、二つの政治慣習に関する人々の理解の多様性が明らかとなった。二つの政治慣習を尊重する場合でも、持ち回りの順番や、均等にすべき対象をめぐって住民たちは異なる意見を持ち、結果として紛争が生じることを、具体的な事例を通して論じることが可能となった。そのため、研究計画時に想定した結果を超えて議論に深みを出す可能性を見いだすことができ、初年度の遅れをある程度取り戻すことができたと考える。

本研究は、民政移管からおよそ15年が経過したナイジェリアにおいて、国民の融和と政治参加の平等性を保証する方策として重要視されている2つの政治慣習(「持ち回り制」と「均等配分制」)についてフィールドワークをもとに調査研究を行うことを目的とする。前年27年度の調査では、政治慣習についての人びとの理解は「守る/破る」の二分法では語れない実態が明らかとなった。この点を考慮し、3年目にあたる本年度は平成28年8月から9月にかけてフィールドワークを実施し、前年の知見を深めるデータ収集に努めた。調査では、主に以下の2点についてデータを収集した。第一に、政治慣習をめぐる人びとの認識の変化を確認するため、過去の総選挙(主に州選挙と地方選挙)に関する人びとの語りを収集した。過去の選挙は、必ずしも二つの政治慣習に沿って行われたわけでもない。にもかかわらず、人びとは政治慣習が過去から行われてきたものとして解釈していることが明らかとなった。第二に、国政をめぐる政治慣習と草の根レベルの政治意識の結節点を探るために、地方コミュニティの指導者選びをめぐる人びとの解釈と実践について調査を行った。調査拠点とするコミュニティでは、前年度調査を行った伝統的権威者の候補者選びに加え、本年度には自治組織の選挙が行われていた。それらコミュニティレベルの指導者選びについて調査を行うことで、人びとが特定の候補者を支援・支持する際に、二つの政治慣習の語りをいかに用いているかが明らかとなった。平成27年度及び28年度の調査によって、二つの政治慣習に関する人びとの理解について、「守る/破る」を越えた多様な実践・解釈が明らかとなった。二つの政治慣習を尊重する場合でも、持ち回りの順番や、均等にすべき対象をめぐって住民たちは異なる意見を持ち、結果として紛争が生じることを、具体的な事例を通して論じることが可能となった。また、過去の州選挙や地方選挙についての調査を通して、これら政治慣習をコミュニティの「伝統」と論じる言説について、通時的に検証することができた。その一方で、初年度にエボラ出血熱のため渡航を中止した結果生じた遅れを、十分に取り戻せていない。特に、平成27年3月に行われた総選挙を前後して流布した言説の収集が不十分であり、平成29年度はその調査を課題の一つとしたい。本研究は、民政移管からおよそ15年が経過したナイジェリアにおいて、国民の融和と政治参加の平等性を保証する方策として重要視されている2つの政治慣習(「持ち回り制」と「均等配分制」)についてフィールドワークをもとに調査研究を行うことを目的とした。これまでの調査は主にイモ州ンビセ地方で実施し、2つの慣習がローカルな実践において持つ影響力について調査を行ってきた。特に、地方コミュニティの指導者選びを事例とした聞き取り調査を行った結果、一見すると単純に見える慣習について多様な解釈が生まれていること、それを人々が自らの政治的主張・実践を正当化する手段の一つとして活用している様が明らかになった。それをうけ、最終年度にあたる平成29年度調査では、ナイジェリア大学(エヌグ州)およびコンベナント大学(ラゴス州)においてアーカイブ調査を行を行うとともに、現地の社会学者・政治愚者と意見交換を行った。アーカイブ調査では、特に2011年及び2015年選挙に関する新聞・雑誌記事を閲覧し、2つの政治慣習に関する言説を収集した。
律動的皮質神経活動に関わるCaチャネル及び伝達物質の役割

意識レベル維持や高次統御機能にとって重要と考えられている皮質神経回路の律動的同期活動を調節するメカニズムを、チャネルから局所回路に至るレベルにおいて研究するため、マウスから視床-皮質神経結合を保つスライス標本を作成し、自発的あるいは電気刺激により誘発される皮質の律動的興奮現象を電気生理学的に記録した。まず、膜電位感受性蛍光色素を用いスライス全面より光学的2次元電位測定を行ったところ、視床と皮質(体性感覚バレル野)の神経結合が保たれていることが確認された。次にホールセルパッチクランプ記録を行い、皮質への入力線維を外包等でテタヌス刺激して強力な興奮性を与えた時、その後の12秒間に亙って10-40Hzの高頻度電位/電流振動が観察された。しかしこの高頻度律動的神経活動はT及びR型電位依存性CaチャネルのブロッカーとされるNi^<2+>やGABA_Aレセプターの拮抗薬であるbicucullineでは消失しなかった。そこでより安定した律動的神経活動が期待される海馬CA3領域での解析に研究方法を転換した。同領域を残したスライス標本でフィールド記録、またはパッチクランプ記録による錐体細胞層でのニューロン活動を指標として見た時、carbachol、tACPD、カイニン酸等の潅流適用によって神経系の興奮性を高めることにより、10Hz以上の周波数域での活動増加とそれ以下の低周波数域での活動減少がひき起こされることが観察された。この変化は潅流液の温度を体温近くまで高めることでより発生しやすくなった。また動物の発達に依存する可能性と、静脈麻酔薬であるプロポフォールにより抑制される傾向が観察された。まず、視床と皮質の神経結合が保たれていることを確認するため、膜電位感受性蛍光色素を用い、スライス全面より光学的2次元電位測定を行ったところ、視床または途中の線維束の電気刺激により皮質の一部(体性感覚バレル野)において興奮性の反応が観察された。また、その部位からは細胞外記録によるフィールド電位としてもシナプス反応が確認された。この標本で4-aminopyridine等の潅流により神経回路の興奮性を高めることで、高頻度の律動的神経活動が誘発されることが報告されているため、その確認も行ったが、今迄のところ確認出来なかった。また、光学的測定では時間分解能を高く保ち加算平均の出来ない場合にはS/N比が低く、色素の退色等の問題もあることから今回の目的には最適でないと判断し、より分解能に優れ解釈に信頼性のおけるwhole-cell patch-clamp記録を主にすることにした。その結果、皮質への入力線維を外包等でテタヌス刺激し、強力な興奮性を与えた時、その後の12秒間に亙って10-40Hzの高頻度電位(または電流)振幅が観察された。この高頻度律動的神経活動はT及びR型電位依存性CaチャネルのブロッカーとされるNi^<2+>やGABA_Aレセプターの拮抗薬であるbicucullineでは消失しなかった。今後、単に1ニューロンの律動性だけでなく、複数ニューロンの同期性にも注目し、揮発性麻酔薬も併せて回路網活動に影響を与える因子が何かを検討して行くつもりである。

意識レベル維持や高次統御機能にとって重要と考えられている皮質神経回路の律動的同期活動を調節するメカニズムを、チャネルから局所回路に至るレベルにおいて研究するため、マウスから視床-皮質神経結合を保つスライス標本を作成し、自発的あるいは電気刺激により誘発される皮質の律動的興奮現象を電気生理学的に解析することを当初の目的として研究を開始した。昨年度すでに報告した通り、視床-皮質の連絡を保つ標本は機能的連絡の確率が低く、またテタヌス刺激により誘発された高頻度律動活動はシナプス伝達に依存するものの、ネットワーク活動ではないことが確認された。そこで、本年度はより安定して律動的神経活動を発生する事が期待される海馬CA3領域での記録を中心に解析を進めることに研究方法を転換した。同領域を残したスライス標本でフィールド記録、またはホールセルパツチクランプ記録による錐体細胞層でのニューロン活動を指標として見た時、muscarmic受容体agonistのcarbachol、代謝型グルタミン酸受容体agonistであるtACPD、kainate型受容体agonistのカイニン酸等の潅流適用によって神経系の興奮性を高めることにより、10Hz以上の周波数域での活動増加とそれ以下の低周波数域での活動減少をひき起こすことが観察された。この変化は潅流液の温度を体温近くまで局めることでより発生しやすくなった。また動物の発達に依存する可能性と、静脈麻酔薬であるプロポフォールにより抑制される傾向が観察された。現在、残された期間内で、この2点についての確証を得る作業を行っている。
エチオピアにおける伝統的政治体系の再興を巡る言説と実践に関する社会人類学的研究

本研究は、ガダの再興を巡るアルシの人々の言説と実践に着目しながら、国家の成立とともに消滅した伝統的政治体系の再生の可能性とその意味を問うものである。従って、a)20世紀以前のアルシにおけるガダの解明、b)ガダ再興に関わる実践、に焦点を当て調査を行っていく。a)に対しては、ガダに関する知識、伝承、歴史記憶を有する古老からの聞き取りをもとに、20世紀以前のガダの実践について明らかにする。b)に対しては、ガダの再興やガダの役職者の選出を巡る会議や儀礼の中で展開される議論を分析し、人びとの多様な視点、言説と実践のズレや相関関係を明らかにしながら、ガダが再興されていく過程を明らかにしていく。
ホウ素中性子捕捉療法により誘導される新規宿主腫瘍免疫賦活効果の同定

ホウ素原子(10B)は生体内元素の数千倍の確率で中性子と反応し、大きなエネルギーを極めて狭い空間へ放出する核反応(ホウ素中性子捕獲反応)を起こす。ホウ素原子を薬剤の形で体内へ注射し、腫瘍細胞に集積させ、そこに中性子を照射することにより病巣内部に限局してホウ素中性子捕獲反応を起こすことが可能である(ホウ素中性子捕捉療法)。従来のX線照射には免疫システムを賦活し、腫瘍に対する免疫効果を高める効果があることが近年示された。この研究によりこれまで明らかとなっていないホウ素中性子捕獲反応が免疫システムへ及ぼす影響を調べ、将来的にホウ素中性子捕捉療法を免疫療法と併用する際の学術的な基盤を確立したい。
九州における対外交流文化財の保存と活用に向けた研究基盤の創設

外来文化の受容と展開における先進性や辺境性を示す文化財を対外交流文化財として位置づけた。私達は東西南北4つの方向から九州に流入した文化の中から代表的な事象を選び、北ルート(中国大陸との交流)および西ルート(東南アジアとヨーロッパとの交流)を中心に調査した。北ルートの対馬・壱岐・福岡・佐賀における朝鮮半島・中国大陸の文化財を調査した。また、西ルートの長崎・佐賀・福岡における東南アジア・西洋地域の文化財を調査した。さらに、文化財を九州国立博物館に移動して大型X線CT、精密三次元計測機、高精細大型スキャナなどのデジタル計測機器を使って科学調査を実施することによって新たなデジタルアーカイブを構築した。九州はその地政学的特質から日本列島の窓口としてアジアや西洋の文化や技術をいち早く受け入れてきた。そのため、九州には対外交流に関連する文化財が多く残されている。本研究では、九州およびその周辺諸国・地域に所在する対外交流に関係する文化財を対象とする。九州に東西南北4つの方向から流入した文化の中から代表的な事象を選んで調査を展開する。本研究期間内に、特に中国・朝鮮半島からの北ルートおよび西洋・東南アジアからの西ルートに重点をあてて調査する。調査は、各地の博物館・教育委員会等と協力して文化財の状態把握に主眼を置いた調査を行いながら調査対象を厳選する。本年度は北ルートの対馬、および、西ルートの長崎市、松浦市の対外交流文化財を九州国立博物館に移動して、大型X線CT、精密三次元計測機、高精細大型スキャナなどの最新鋭のデジタル計測機器を活用した科学調査を実施した。この科学調査の結果をふまえて、学際的な研究チームによる実物調査を実施することにより、これまでにない高精度のデジタル情報を網羅したアーカイブを新しい博物館情報の研究基盤として構築している。九州の特質とも言える外来文化の受容と展開における先進性や辺境性を示す文化財を対外交流文化財として位置づけ、東西南北4つの方向から流入した文化の中から代表的な事象を選んで調査を展開した。平成25年度は昨年度に引き続き北ルート(古代を中心とする大陸との交流)および西ルート(中世・近世を中心とするアジア・ヨーロッパとの交流)を中心に調査を展開した。特に、北ルートの起点となった福岡・対馬・壱岐および朝鮮半島・中国大陸の文化財、西ルートの中心となった長崎や佐賀・福岡と中国・東南アジア・西洋地域の文化財を中心に実物調査を実施した。さらに、現地調査した文化財を九州国立博物館に移動して、大型X線CT、精密三次元計測機、高精細大型スキャナなどの最新鋭のデジタル計測機器を活用した科学調査と文化財の健康診断調査を実施した。本研究では、九州およびその周辺諸国・地域に所在する対外交流に関係する文化財を対象として、九州に東西南北4つの方向から流入した文化の中から代表的な事象を選んで調査を展開している。本年度は、古代を中心として発達した大陸との交流(北ルート)および、中世・近世を中心として発達したアジア・ヨーロッパとの交流(西ルート)に重点をあてて調査を進めた。北ルートでは、九州と大陸を結ぶ海の道として五島列島と、対馬・壱岐に残された文化財の悉皆調査を行なった。特に、長崎県・対馬市と連携して、対外交流文化財を九州国立博物館に移動して、大型X線CT、精密三次元計測機、高精細大型スキャナなどの最新鋭のデジタル計測機器を活用した科学調査を実施した。西ルートでは、中近世社寺所蔵対外交流文化財の調査として、長崎市・興福寺の諸像について、X線透過撮影の実施した結果、像内に納入品が存在することを確認し、X線CT調査によって金属製五臓を検出した。また、松浦市鷹島海底遺跡から発見された元寇関連遺物について遺物を九州国立博物館に移動して、大型X線CT、精密三次元計測機等の科学調査を実施した。本研究では、北ルート(原始・古代を中心とする大陸との交流)および西ルート(中世・近世を中心とするアジア・ヨーロッパとの交流)を中心に調査を展開した。特に、北ルートの起点となった対馬・壱岐・福岡・佐賀および朝鮮半島・中国大陸の文化財、西ルートの中心となった長崎・佐賀・福岡と中国・東南アジア・西洋地域の文化財を中心に実物調査を実施した。また、各地で現地調査した文化財を九州国立博物館に移動して、大型X線CT、精密三次元計測機、高精細大型スキャナなどの最新鋭のデジタル計測機器を活用した科学調査と文化財の健康診断調査を実施した。26年度が最終年度であるため、記入しない。博物館学26年度が最終年度であるため、記入しない。北ルートの対外交流文化財調査として対馬の文化財について調査を開始した。西ルートの対外交流文化財調査として、黄檗宗などの中国仏教の中心地となる長崎の寺院所蔵文化財の調査を実施した。

その結果、聖福寺所蔵仏像の象内に心臓や肺に見立てた金属製の五臓をはじめとする内臓模型を納めた「生身仏」の作例であることを確認した。象内に金属製五臓を納入した仏像は国内外で4例が確認されているだけの貴重な発見であった。また、長崎県松浦市鷹島の海底遺跡から発見された元寇関連遺物に関するX線CT調査と中国内モンゴル自治区研究者による調査を実施した。これら成果は、新聞テレビ等で報道された。北ルートに関しては、唐津湾の加唐島を調査した。加唐島は武寧王生誕地として韓国内でも周知されている。そこで、島に伝わる伝承や文化財などを調査した。その成果を「加唐島に伝わる武寧王の生誕に関わる伝承」として、当館研究紀要に報告した。西ルートに関しては、九州各地の社寺には中近世におけるアジアとの交流で伝来した文化財が所蔵されている。このような寺社が所蔵している文化財を調査し、必要に応じて九州国立博物館に移動してX線CTスキャナによる構造調査を実施した。その成果を「博物館研究におけるX線CTスキャナ活用の可能性」として当館研究紀要に報告した。また、日本と東南アジアの交流を物語る文化財の調査として、19世紀以前に九州に運ばれた東南アジアの仏像、工芸品等を調査し、東南アジア世界との文化交流の実相を浮かび上がらせた。その成果として、「安南日越外交文書集成」として当館紀要に報告した。さらに、南蛮屏風や南蛮漆器をはじめ、近世初期における日本と海外との交流を物語る作品を調査した。1南蛮屏風が成立する前提となった唐船図、2初期の作品を中心とする南蛮屏風、3日本の屏風と関わりの深い西洋・中国の美術、4上記と関わりの深い南蛮漆器などを取り上げる。本研究を基に、日本の美術からの影響を受けた国内未公開の作品を紹介する計画である。北ルートの対外交流文化財調査として、昨年に引き続き対馬の文化財について調査を実施した。西ルートの対外交流文化財調査として、黄檗宗などの中国仏教の中心地となる長崎の寺院所蔵文化財の調査を実施した。その結果、昨年の聖福寺調査に引き続き、興福寺所蔵仏像の象内に心臓や肺に見立てた金属製の五臓をはじめとする内臓模型を納めた「生身仏」の作例であることを確認した。この調査結果は新聞テレビ等で報道された。また、長崎県松浦市鷹島の海底遺跡から発見された元寇関連遺物に関するX線CT調査を実施した。さらに佐賀県武雄の絵蘭について調査した。これらの科学調査の結果をふまえて、これまでにない高精度のデジタル情報を網羅したアーカイブを新しい博物館情報の研究基盤として構築している。今後は、北ルートでは壱岐・対馬における対外交流文化財を中心に科学的調査を進めたい。また、日本の中の百済文化調査を実施したい。西ルートでは、昨年に引き続き、長崎市を中心に黄檗宗などの中国仏教文化の調査、松浦市を中心に元寇関連文化財の調査を実施したい。
共生微生物を利用した泥炭地におけるCO2吸収促進、N2O排出抑制技術の開発

泥炭地でキーとなり、さらに宿主に環境ストレス耐性を付与する根部エンドファイトDSE種が宿主に高率で定着できる育苗法を検討したところ、泥炭地より頻繁に分離され、宿主植物に定着し生育促進効果を示すDSEとして,Phialocephala fortiniiを選抜した。同菌は貧栄養条件や低温条件などの環境ストレス条件下においても宿主植物の生育をサポートし、主に宿主根の表皮組織に定着していることが明らかとなった。また、菌類(DSE)-バクテリア相互作用の解明のため、西南地方から分離されたDSE Veronaeopsis simplexが菌類-バクテリアの相互作用解明に最適な材料であることを明らかにした。内生(菌糸表面付近に定着しているものを含む)する細菌のコントロールは抗生物質が有効であった。また、T-RFLPによって細菌の群集構造解析を行ったところ、これらの細菌が複数種存在することが明らかになった。1. DSEの泥炭地での生態把握非培養法としてT-RFLP解析による菌類群集構造解析を行った。亜熱帯地域の鹿児島県屋久島および亜寒帯地域のカナダアルバータ州エドモントンを調査地とした。培養法として釣餌法を用いて宿主植物根部を洗浄し菌株を分離した。さらに、選抜した菌株の病原性の有無、生育促進効果を確認するために接種試験を行った。T-RFLP解析の結果、亜熱帯地域と亜寒帯地域での菌類相が異なることが確認された。また、一般的には、温暖な地域が、寒冷な地域に比べ菌類の多様であるが、今回は両地域とも同程度であった。屋久島土壌から196菌株が得られ、そのうち5菌株をDSE様菌株として選抜し、1菌株をPhialocephala fortiniiと同定した。接種試験の結果、供試した4菌株は宿主に対して病原性を示さず、地下部において明らかな根量の増加の効果が認められた。2. N2O活性が高い土壌からの菌類-バクテリア共生体の分離近年真核生物である糸状菌が亜酸化窒素生成活性を示すことが報告された。環境中の糸状菌の亜酸化窒素生成活性を知るためには多くの種の亜酸化窒素生成活性を網羅的に調べる必要がある。本研究の結果、糸状菌種の違いによってN2O活性強度が大きく異なることが明らかとなった。特にHypocreales目に属するMetarhizium, Myrothecium, Clonostachys, Trichoderma,およびFusarium属菌に近縁な分離株に高いN2O生成活性がみられた。以上より、土壌における糸状菌の群集構造は植生などの環境要因の違いによって大きく変化することから、活性の高い糸状菌が優占しないような土壌管理が必要であると考えられた。1.泥炭地でのDSEキー種の選定泥炭地より頻繁に分離され、宿主植物に定着し生育促進効果を示すDSEとして,Phialocephala fortiniiを選抜した。同菌件や低温条件などの環境ストレス条件下においても宿主植物の生育をサポートし、主に宿主根の表皮組織に定着してい明らかとなった。2.宿主主植物とDSEの相互作用を利用した育苗技術の開発最適な栄養条件を検討するため、硝酸態窒素、バリン、およびNA:ネイチャーエイド(有機の液肥)の3種の異なる加した寒天培地を作成し、それぞれ窒素濃度を10mg/L、100mg/Lに調整した。Phialocephala fortiniiを寒天培地上で培養コロニー上に種子を直接播種し、3週間無菌的に植物の栽培を行った。栽培後、地上部の乾燥重量を求め、さらに葉緑た結果、DSE処理区の地上部バイオマス量は、窒素濃度がN100mg/Lの処理区および無窒素処理区で増加した。特に、は10mg/Lおよび100mg/L両濃度でバイオマス量が増加した。同様に葉緑素量もすべての処理区において増加した。3.菌類(DSE)-バクテリア相互作用の解明西南地方から分離されたDSE Veronaeopsis simplexが菌類-バクテリアの相互作用解明に最適な材料であることを明らかにした。1.宿主主植物とDSEの相互作用を利用した育苗技術の開発

泥炭地でキーとなり、さらに宿主に環境ストレス耐性を付与するDSE種が宿主に高率で定着できる育苗法を検討したところ、泥炭地より頻繁に分離され、宿主植物に定着し生育促進効果を示すエンドファイトDSEとして,Phialocephala fortiniiを選抜した。同菌は貧栄養条件や低温条件などの環境ストレス条件下においても宿主植物の生育をサポートし、主に宿主根の表皮組織に定着していることが明らかとなった。また、Phialocephala fortiniiを寒天培地上で培養した後、同コロニー上に種子を直接播種し、3週間無菌的に植物の栽培を行った。栽培後、地上部の乾燥重量を求め、さらに葉緑素を測定した結果、DSE処理区の地上部バイオマス量は、窒素濃度がN100mg/Lの処理区および無窒素処理区で増加した。特に、NA処理区は10mg/Lおよび100mg/L両濃度でバイオマス量が増加した。同様に葉緑素量もすべての処理区において増加することを明らかにした。2.N2O活性低下が確認された菌株(DSE)の泥炭地での利用法の検討菌類(DSE)-バクテリア相互作用の解明のため、西南地方から分離されたDSE Veronaeopsis simplexが菌類-バクテリアの相互作用解明に最適な材料であることを明らかにした。内生(菌糸表面付近に定着しているものを含む)する細菌のコントロールは抗生物質が有効であった。また、T-RFLPによって細菌の群集構造解析を行ったところ、これらの細菌が複数種存在することが明らかになった。
RNA酵素からRNA複合体酵素への人工的進化

RNAワールドから現在のDNA/タンパク質ワールドへの変遷にあたって、まずRNA/タンパク質ワールドを経たと考えられる。本研究では、この過程を実験的に再現する意味で、RNA酵素をRNA-タンパク質複合体酵素に人工的に改変することを目的として、以下の2つのアプローチを検討している:(1)RNA酵素のin vitroselection法による、RNA-アルギニン、およびRNA-ポリペプチド複合体酵素への進化実験。20ヌクレオチドからなるランダムなDNA配列の中からRNAのリン酸ジエステル結合を切断するDNA酵素のセレクション・サイクルを確立した。さらに、本選択系を用いて、アルギニンが存在する条件、および、存在しない条件でのRNA切断活性を持つ配列の選択を行った。5ラウンドのセレクション後、活性配列の濃縮が確認できたため、引き続きセレクションを行っている。今後、同定したDNA酵素によるRNA切断活性のアルギニン依存性について検討する。(2)生体内スクリーニング法を用いたRNA酵素のRNA-ポリペプチド複合体酵素への進化実験我々が開発したRNA結合ペプチドのコンビナトリアル・ライブラリーからのスクリーニング法(Harada and Frankel,1997)を用い、直接ハンマーヘッド(HH)、ヘアピン・ライボザイム等の活性の向上に結びつくポリペプチドのライブラリーからの同定を目的とする。RNA酵素活性は、Fujitaらによって開発された検出系を利用する(PNAS,94:391-396)。本研究期間は、レポーター遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子であるNPT IIを用い、活性なHHライボザイムと不活性なライボザイムとをはっきり識別できることを確認した。また、これらの実験に用いるランダム・ペプチド・ライブラリーをRNA結合能の観点から最適化を行った。生物進化初期には、RNAを主体とする生命体がまず存在したとするRNAワールド仮説が広く受け入れられている。RNAワールドの現在のDNA/タンパク質ワールドへの変遷にあたって、まずRNA/タンパク質ワールドを経たと考えられる。本研究では、この過程を実験的に再現する意味で、RNA酵素をRNA-タンパク質複合体酵素に人工的に改変することを目的としている。これは、RNA酵素に変異を導入し、特定のアミノ酸やポリペプチド存在下で、1)より高い活性、2)co-factorへの依存性、3)新規活性などを示すRNA-ポリペプチド複合体酵素を選択することによって行う。出発点となるRNA酵素は、ハンマーヘッド・ライボザイム、および、類似した反応を触媒するDNA酵素を用いる。RNAおよびDNA酵素に変異を導入するにあたって、活性部位を「ランダム化」する手法、および、「ドーピング」する方法があるが、まず、DNA酵素を「ランダム化」するアプローチをすることにした。実験系は、特定の位置にリボースをひとつもつDNA基質とこれに相補的に結合するランダム化したDNA酵素からなる。基質と酵素が相補的な塩基対によって形成する複合体は、基質の末端のビオチンを介して固定してある。唯一のRNA様リン酸ジエステルでの切断により、DNA酵素が固定相からはずれ、数少ない活性なDNA配列だけをPCRにより増幅できる。現在、人工的進化に用いるタンパ合ク質因子は、アミノ酸のひとつであるアルギニンをモデルとして選んで進化実験を行っている。
超高真空中における皮膜処理歯車の負荷性能及び歯面損傷の異常検出システムの構築

今年度では、すずめっき熱拡散処理を施したステンレス鋼SUS440C歯車の場合について、グリース潤滑及び乾燥摩擦の状態における歯車の摩擦・摩耗特性及び歯面摩擦損失率等について実験を行った。潤滑試験の場合では、グリース潤滑剤として、パ-フルオロ・ポリエーテルを使用し、二硫化モリブデンの添加濃度が0%及び30%になるように調合したグリースを歯面に塗布して実験を行った。歯車試験機としては、動力循環式歯車試験機を使用し、真空中における試験の場合では、真空度は10^<-4>Pa程度であった。なお、大気中における歯車試験も実施し、真空中の場合の摩擦・摩耗特性と比較・検討した.さらに、歯元すみ肉部の応力の減少に及ぼす拡散層の影響を検討するため、一定応力振幅曲げ疲労試験を行ってS-N曲線を求め、各歯車の曲げ疲労強度を明らかにした。(1)真空中の場合では、二硫化モリブデンの添加濃度が30%の場合の歯車の運転が歯面損傷により運転の継続が不能になるまでの時間強度は、二硫化モリブデンを添加しない場合のそれと比して30%程度向上しており、固体潤滑剤としての二硫化モリブデンの効果が僅かであるが認められる。(2)大気中の場合では、運転の継続が不能になるまでの時間強度は、真空中の場合のそれと比して約57%低下する。これは、大気中の酸素などが時間強度に影響を及ぼすものと考えられる。(3)歯面摩擦損失率に関しては、運転開始から小歯車の累積回転数が10^5までは各歯車とも、歯面摩擦損失率は徐々に減少する。その後、歯面摩擦損失率は0.010.015で変動するが、その変化は小さい。(4)すずめっき熱拡散処理歯車の場合の曲げ疲労強度は未処理歯車の場合のそれと比して若干異なり、拡散処理歯車の場合の曲げ疲労強度は約450MPaで、未処理歯車の場合より約50MPa大きい。潤滑試験の場合では、グリース潤滑剤として、パ-フロ・ポリエーテルを使用し、二硫化モリブデンの添加濃度が0%及び30%になるように調合したグリースを歯面に塗布して実験を行った。なお、歯車試験機としては、動力循環式歯車試験機を使用し、真空中における試験の場合では、真空度は10^<-4>Pa程度であった。(2)大気中における試験は現在継続中であるが、二硫化モリブデンの添加濃度が30%の場合の歯車の時間強度は、真空中における歯車の時間強度と比して、大きく現れる。これは、大気中の場合には、歯面上に発生する摩擦熱により、噛み合い歯面が酸化被膜で覆われるためと考えられる。なお、大気中における試験では、歯面の淡い茶褐色に変色しているのが観察されている。

その後、歯面摩擦損失率はほぼ一定値の0.015を示すが、小歯車の累積回転数が10^6から運転の経過に伴って歯面の損傷が進展するため、次第に上昇する。今年度では、すずめっき熱拡散処理を施したステンレス鋼SUS440C歯車の場合について、グリース潤滑及び乾燥摩擦の状態における歯車の摩擦・摩耗特性及び歯面摩擦損失率等について実験を行った。潤滑試験の場合では、グリース潤滑剤として、パ-フルオロ・ポリエーテルを使用し、二硫化モリブデンの添加濃度が0%及び30%になるように調合したグリースを歯面に塗布して実験を行った。歯車試験機としては、動力循環式歯車試験機を使用し、真空中における試験の場合では、真空度は10^<-4>Pa程度であった。なお、大気中における歯車試験も実施し、真空の場合の摩擦・摩耗特性と比較・検討した。さらに、歯元すみ肉部の応力の減少に及ぼす拡散層の影響を検討するため、一定応力振幅曲げ疲労試験を行ってS-N曲線を求め、各歯車の曲げ疲労強度を明らかにした。(1)真空中の場合では、二硫化モリブデンの添加濃度が30%の場合の歯車の運転が歯面損傷により運転の継続が不能になるまでの時間強度は、二硫化モリブデンを添加しない場合のそれと比して30%程度向上しており、固体潤滑剤としての二硫化モリブデンの効果が僅かであるが認められる。(2)大気中の場合では、運転の継続が不能になるまでの時間強度は、真空中の場合のそれと比して約57%低下する。これは、大気中の酸素などが時間強度に影響を及ぼすものと考えられる。(3)歯面摩擦損失率に関しては、運転開始から小歯車の累積回転数が10^5までは各歯車とも、歯面摩擦損失率は徐々に減少する。その後、歯面摩擦損失率は0.010.015で変動するが、その変化は小さい。(4)すずめっき熱拡散処理歯車の場合の曲げ疲労強度は未処理歯車の場合のそれと比して若干異なり、拡散処理歯車の場合の曲げ疲労強度は約450MPaで、未処理歯車の場合より約50MPa大きい。
形質膜結合性ホスファチジン酸ホスフォターゼの構造と機能の解析

ホスファチジン酸ホスファターゼ(PAP2)の生理的機能を明らかにするために、前年度から引き続いて酵素の活性ドメインに関する研究を行った。PAP2bをtransientに発現した293細胞を準備して、その培地に^<32>Pでラベルしたリゾホスファチジン酸を加えた。一定時間後培地中に遊離された無機リン酸量はPAP2過剰発現細胞の方がコントロール細胞より多かった(約2倍)。細胞内の無機リン酸量には有意の差が見られず、したがってPAP2bは細胞外に触媒部位を持つecto-PAPであることが示唆された。その一方、無細胞抽出液を用いてin vitro assayを行ったときのPAP活性は、過剰発現細胞の方が1020倍も高い。この差が生細胞に反映されない理由を明らかにするべく、PAP2b-GFP融合タンパク質を細胞に発現させて、この局在性を蛍光顕微鏡で観察した。その結果GFPの示すシグナルは細胞内に顆粒状に存在しているものの割合の多いことがわかった。本酵素は膜タンパク質であるので、酵素が局在する膜の成分を分析するためにショ糖密度勾配遠心法で細胞分画を行った。その結果、ある程度(1050%)のPAP2bがいわゆるTriton X-100 insoluble membraneに存在することが示された。これはすなわち、caveolaeやmembrane raftに本酵素が局在することを示している。現在、その局在の正確な分布を調べている。本研究は膜結合型ホスファチジン酸ホスファターゼ(PAP2)の構造解析によって生理的機能を明らかにすることを目的としている。1.ドメイン構造の解析-当初の予定では様々な欠損型ミュータントの酵素活性変化を調べてPAP2の構造を明らかにするはずであったが、Neuwald(1997,Protein Sci.6)によって説得力のあるモデルが提唱されたので実験方針を変更した(実際、彼のモデルにしたがってAsp227をAlaに変異させたPAP2は活性を失うことを確認済)。現在は次項に示すように平成10年度に予定していた計画を進めている。2.活性ドメインの位置-PAP2が基質のリン酸基を細胞表面膜の内外どちら側で加水分解するかを明かにすることは本酵素の生理的機能を明かにする上で必要不可欠である。活性ドメインの内外を調べるためにtransientにPAP2を発現した293細胞の培地にホスファチジン酸を加えてはみたが、コントロール293細胞と比べても無機リン酸とジアシルグリセロールの増加量には大きな差が見られなかった。PAP2の発現が細胞内でホスファチジン酸を分解するのならば、この変化量を観察するにはtransient発現系では限界がある。これを受けて平成9年度はPAP2を安定に発現する細胞株のスクリーニングを行ってきた。次年度は安定発現株を用いて引き続き研究を行う。