hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
衛星グローバル観測によるCO2炭素同位体比を指標とした炭素収支の定量的解明

近年の地球規模の温暖化の将来を予測する上で、陸域・海洋・人間活動等のCO2排出や吸収の収支を理解することは重要であり、CO2の炭素同位体比(delta13C)はその強力な指標である。本研究では、delta13Cのグローバルな振る舞いの理解のため、従来は不可能とされていた衛星リモセンによるdelta-13C導出を目的とする。本研究では、12CO2と13CO2のスペクトルを高感度に観測するGOSATリモセンデータを使用する。今年度は、炭素同位体比の議論に必要な精度1‰達成のため、リトリーバル最適化に着手した。リトリーバルとは、濃度や同位体比等の物理量を観測スペクトルから逆問題を解いて推定する解析を指し、本研究ではRemoteC [Butz et al., 2011]を使用する。まずは12CO2と13CO2の100倍の存在量比により生じ得るカラム濃度導出時の高度情報の不均一さによる影響を調べた。リトリーバルにおける高度情報が大きく異なる場合、delta13Cの値にバイアスが生じる。リトリーバルにおける高度情報を保持したアベレージング・カーネル行列(A)を計算し、互いに掛け合わせて計算したdelta13Cの値と、Aを使用せずに計算したdelta13Cの値を比較した。その結果、両者は相関係数0.9以上で一致し、リトリーバルにおける12CO2と13CO2の高度情報の違いは無視できるほど影響が少ないことを確認した。さらに、リトリーバルで用いる先験値を次のように最適化した。先験値は、先行研究から得られる知見を適切に導入することで、リトリーバルの収束効率を上げる役割があり、従来使われていた0‰から、先行研究から得られる代表値の-8‰に変更した。また、リトリーバルにおける観測スペクトルノイズと先験値誤差の比率を決定するパラメータgの最適化のため、異なるgの値(1010^7)を用いてリトリーバル解析を実施し、得られるdelta13Cのヒストグラムから標準偏差を比較した。標準偏差が最小となるgの値として10^5を採用した。初年度は、本研究で最も重要となるリトリーバルアルゴリズムの最適化に着手し、12CO2と13CO2のリトリーバルにおける高度情報の不均一さによる影響が無視できるほど小さいことを確認した。さらに、衛星リモセンにおける同位体比リトリーバルにおいて重要となる先験値の最適化も実施し、まずはリトリーバルアルゴリズム最適化の理論的要素について順調に進んでいる。また、GOSAT観測スペクトルの並列計算処理システムを確立し、次年度以降に向けて大規模なリトリーバル処理を実施できる環境を整えた。以上の理由より、区分を(1)とした。今年度は、初年度に最適化を実施したリトリーバルアルゴリズムを全GOSAT観測スペクトルに適用し、導出されたdelta-13Cの値と他の観測結果とを比較する。これにより、初年度に実施したリトリーバルの内的な要因以外の誤差要因をあぶり出し、GOSAT観測によるdelta-13Cリトリーバルを評価する。比較対象としては、まずは同じ衛星リモセンデータであるカナダのSciSAT衛星搭載ACE-FTS、さらに温室効果ガス世界資料センター(WDCGG)[http://ds.data.jma.go.jp/gmd/wdcgg/]が提供する地上観測によるdelta-13Cの観測結果を用いる。比較・検証においては、ACE-FTSとの比較では主に相対的な変動について、地上観測結果との比較ではdelta-13Cの絶対値について着目し、本研究により導出されるdelta-13Cの相対的、および絶対的なバイアスを求める。比較結果を基にリトリーバルアルゴリズムをさらに修正し、delta-13Cのバイアスを補正、これを数回繰り返すことで、リトリーバルアルゴリズムを最適化するとともに、delta-13Cの導出精度を向上させていく。さらに、GOSATから導出されたdelta-13Cを使用し、季節変動等の影響を考慮したグローバル分布を求める。本研究が提供するdelta-13Cのデータは、相対的に人為起源のCO2排出が多い地域とそうでない地域などを特定することが可能となり、世界規模で地球温暖化対策を推進するための科学的なエビデンスとなる。

リトリーバルにおける高度情報を保持したアベレージング・カーネル行列(A)を計算し、互いに掛け合わせて計算したdelta13Cの値と、Aを使用せずに計算したdelta13Cの値を比較した。その結果、両者は相関係数0.9以上で一致し、リトリーバルにおける12CO2と13CO2の高度情報の違いは無視できるほど影響が少ないことを確認した。さらに、リトリーバルで用いる先験値を次のように最適化した。先験値は、先行研究から得られる知見を適切に導入することで、リトリーバルの収束効率を上げる役割があり、従来使われていた0‰から、先行研究から得られる代表値の-8‰に変更した。また、リトリーバルにおける観測スペクトルノイズと先験値誤差の比率を決定するパラメータgの最適化のため、異なるgの値(1010^7)を用いてリトリーバル解析を実施し、得られるdelta13Cのヒストグラムから標準偏差を比較した。標準偏差が最小となるgの値として10^5を採用した。初年度は、本研究で最も重要となるリトリーバルアルゴリズムの最適化に着手し、12CO2と13CO2のリトリーバルにおける高度情報の不均一さによる影響が無視できるほど小さいことを確認した。さらに、衛星リモセンにおける同位体比リトリーバルにおいて重要となる先験値の最適化も実施し、まずはリトリーバルアルゴリズム最適化の理論的要素について順調に進んでいる。また、GOSAT観測スペクトルの並列計算処理システムを確立し、次年度以降に向けて大規模なリトリーバル処理を実施できる環境を整えた。以上の理由より、区分を(1)とした。今年度は、初年度に最適化を実施したリトリーバルアルゴリズムを全GOSAT観測スペクトルに適用し、導出されたdelta-13Cの値と他の観測結果とを比較する。これにより、初年度に実施したリトリーバルの内的な要因以外の誤差要因をあぶり出し、GOSAT観測によるdelta-13Cリトリーバルを評価する。比較対象としては、まずは同じ衛星リモセンデータであるカナダのSciSAT衛星搭載ACE-FTS、さらに温室効果ガス世界資料センター(WDCGG)[http://ds.data.jma.go.jp/gmd/wdcgg/]が提供する地上観測によるdelta-13Cの観測結果を用いる。比較・検証においては、ACE-FTSとの比較では主に相対的な変動について、地上観測結果との比較ではdelta-13Cの絶対値について着目し、本研究により導出されるdelta-13Cの相対的、および絶対的なバイアスを求める。比較結果を基にリトリーバルアルゴリズムをさらに修正し、delta-13Cのバイアスを補正、これを数回繰り返すことで、リトリーバルアルゴリズムを最適化するとともに、delta-13Cの導出精度を向上させていく。さらに、GOSATから導出されたdelta-13Cを使用し、季節変動等の影響を考慮したグローバル分布を求める。本研究が提供するdelta-13Cのデータは、相対的に人為起源のCO2排出が多い地域とそうでない地域などを特定することが可能となり、世界規模で地球温暖化対策を推進するための科学的なエビデンスとなる。当初予定していた計画ではリトリーバル解析コード改良の補助として人件費を想定していたが、補助作業内容を絞ることで作業請負として外注し、その分コストを削減した。今年度は、初年度のリトリーバル解析に関する研究成果を2つの国際会議で発表するとともに、リトリーバル解析において著名な海外の研究者とディスカッションを深め、今年度の研究の方針を早い段階で絞り、効率的な研究実施を図る。
末梢血幹細胞と生分解性材料を用いた組織工学的手法によるハイブリッド人工血管の作成

動物実験による至適末梢血幹細胞数,至適ポリマーの探究及び選定を行った.実験動物として子犬を用い、末梢血幹細胞の採取は連続式の血液成分分離装置を用いて行った.採血側として橈骨動脈を,返血側として大腿静脈を用いた.採取した血液を遠心分離し,遠心後の沈殿部分に末梢血幹細胞が含まれていた.末梢血幹細胞のマーカーとしてCD34^+細胞を用いた.採取血液中の白血球数と採取血液の重量の積を,血液比重の1.05で除して,総採取細胞数を求めた.この総採取細胞数にCD34^+細胞陽性率を乗したものが採取できたCD34^+細胞数である.体重1kg当たりのCD34^+細胞数が2X 10^6を超えていれば十分量の末梢血幹細胞が採取できたと考えられ、十分な細胞数が得られれば,生分解性ポリマーの導管(7X 10mm)に播種した.2-3時間後に細胞を採取した同一動物を全身麻酔下に左開胸し,肺門部から心膜飜転部までの末梢肺動脈をこのティッシュエンジニアリングで作成した導管で置換した.コントロール実験として組織断片を播種しないポリマーシートのみの移植も行った.移植3-12ヶ月後に作成された組織に対して生化学的,生力学的,免疫組織学的検討を行った.生化学検査として,組織中コラーゲン,エラスチン,カルシウム濃度の測定を行い,インストロン張力検査機を用いて作成された組織の最大張力を測定し自己の同じ部位の組織と比較検討した.組織学的には免疫染色の手法を用いて内皮細胞の指標である第8因子を染色すると共に細胞間隙の間質蛋白質を染色し自己組織と比較検討した.同種細胞(allogenic)は拒絶反応の因子を排除できないため,細胞は全て自己(autologous)細胞を用いた.末梢血幹細胞も骨髄細胞と同様に再生血管の播種細胞として適していることが示唆された。根治手術時,約200-400mLの末梢血(十分量の末梢血幹細胞を含む)を上記の血液成分分離装置により完全清潔下に採取した.直ちに生分解性ポリマーの導管(7X 10mm)に播種した後,組織培養液中に浸漬し,手術室内の細胞培養室にて細胞のviabilityを維持しつつ保存した.細胞培養液は10%胎仔牛血清(Sigma Chemicals, St. Louis, MO)及び1%GPS(29.2mg/mL L-glutamine, 10,000 units/mL penicillin G sodium, and 10,000 g/mL streptomycin, GIBCO BRL-Life Technologies, grand island, NY)を添加したDulbecco's Modified Eagle Medium (GIBCO BRL-Life Technologies, grand island, NY)を使用した.培養液に浸漬する目的は、末梢血幹細胞ができるだけ多くポリマー繊維に接着するように誘導することである.播種細胞数は10^6個/cm2とし,細胞播種後,約2-3時間で移植手術を行った.このティッシュエンジニアリングで作成した導管を移植する際には,助手は導管を培養液に浸漬させながら移植を行った.今後の評価としては、術後約1ヶ月後に、心臓カテーテル、造影検査、心臓超音波検査を行いフォローアップは6ヶ月毎にに心臓超音波検査を用いて形態学的検索及び組織過形成の有無等を経過観察する.

術後遠隔期にも心臓超音波検査を施行する.再手術時に肺動脈移植部の組織片を客観的に評価した後、小組織を採取し、人工肺動脈組織と自己心肺動脈織を生化学的、生力学的、免疫組織学的に比較検討する予定である.動物実験による至適末梢血幹細胞数,至適ポリマーの探究及び選定を行った.実験動物として子犬を用い、末梢血幹細胞の採取は連続式の血液成分分離装置を用いて行った.採血側として橈骨動脈を,返血側として大腿静脈を用いた.採取した血液を遠心分離し,遠心後の沈殿部分に末梢血幹細胞が含まれていた.末梢血幹細胞のマーカーとしてCD34^+細胞を用いた.採取血液中の白血球数と採取血液の重量の積を,血液比重の1.05で除して,総採取細胞数を求めた.この総採取細胞数にCD34^+細胞陽性率を乗したものが採取できたCD34^+細胞数である.体重1kg当たりのCD34^+細胞数が2×10^6を超えていれば十分量の末梢血幹細胞が採取できたと考えられ、十分な細胞数が得られれば,生分解性ポリマーの導管(7×10mm)に播種した.2-3時間後に細胞を採取した同一動物を全身麻酔下に左開胸し,肺門部から心膜飜転部までの末梢肺動脈をこのティッシュエンジニアリングで作成した導管で置換した.コントロール実験として組織断片を播種しないポリマーシートのみの移植も行った.移植3-12ケ月後に作成された組織に対して生化学的,生力学的,免疫組織学的検討を行った.生化学検査として,組織中コラーゲン,エラスチン,カルシウム濃度の測定を行い,インストロン張力検査機を用いて作成された組織の最大張力を測定し自己の同じ部位の組織と比較検討した.組織学的には免疫染色の手法を用いて内皮細胞の指標である第8因子を染色すると共に細胞間隙の間質蛋白質を染色し自己組織と比較検討した.同種細胞(allogenic)は拒絶反応の因子を排除できないため,細胞は全て自己(autologous)細胞を用いた.
運動器疾患に対するエピジェネティック治療標的の探索

健康長寿の獲得が、超高齢社会を迎えたわが国における社会的課題である。そのためには要支援や要介護の原因を取り除く必要があり、骨粗鬆症、変形性関節症、筋肉減少症と行った運動器の疾患を克服する必要がある。これら運動器疾患の治療は、他の疾患と比較して明らかに選択肢が乏しい。その理由は疾患の詳細なメカニズムが解明されていないからである。我々は、疾患が遺伝的因子のみならず環境因子の影響も受けて発症、進展することを想定し、環境因子の一つといえるエピジェネティクスに着目して研究を実施した。その結果、Uhrf1という制御因子によるDNA維持メチル化が軟骨の正常発生に必須であることがわかった。四肢間葉系細胞特異的にCreリコンビナーゼを発現する(Prx1-Cre)マウスとUhrf1 floxマウスを交配し、四肢間葉系細胞特異的Uhrf1KO(cKO)マウスを作出し、解析を行った。その結果、外観上、cKOでは四肢長が明らかに短く、関節部位での変形を呈していた。生後6週齢オスでは、cKO群の四肢長管骨長はControl群に比べ、約3140%の有意な短縮と骨密度の低下を認めた。さらに、組織学的解析ではcKO群では成長軟骨板細胞の柱状配列に乱れを認め、有意な増殖軟骨の面積の減少を認めた。マウス新生仔膝関節の軟骨細胞初代培養の結果から、アルシアンブルーで染色される軟骨基質の著明な低下を認めた。さらに軟骨分化マーカー遺伝子発現変動を解析したところ、cKO群で有意なCol11a1の減少、Runx2およびMmp-13の発現上昇がみられた。Uhrf1の最も重要な機能としてDNA維持メチル化が報告されているが、今回の結果から細胞増殖のみならず、細胞分化においても重要な役割を果たすことが示された。Uhrf1の分子機能からは、DNAメチル化に関連した作用が細胞分化に関与していることが推定されるため、今後MeDIP-seqとRNA-seqとの統合的解析により、軟骨細胞分化における役割や分子メカニズムを明らかにしていきたい。当初の予定と比較して、概ね順調に進展しており、次年度の研究展開に進めている。エピゲノム修飾状態は、細胞分裂を経てもなお一部継承される。近年、細胞分裂の際のDNAメチル化維持制御因子であるUhrf1が、癌細胞増殖などに機能を発揮することが報告されている。しかしながら、骨格組織においてはその役割は全く不明であるため、我々は四肢特異的遺伝子欠損マウスを用いて骨格組織におけるUhrf1の働きについて解析した。四肢間葉系細胞特異的にCreを発現する(Prx1-Cre)マウスとUhrf1 floxマウスを交配し、四肢間葉系細胞特異的Uhrf1KO(cKO)マウスを作出、解析した。軟X線ではcKO群の四肢長管骨長がControl群に比べ、約3割の著明な短縮を認めた。また、組織学的解析ではcKO群の成長軟骨板細胞の柱状配列に乱れを認め、有意な増殖軟骨の面積の減少および肥大軟骨の幅の増加を認めた。さらに、cKO由来初代培養軟骨細胞では、細胞増殖の低下、アルシアンブルーで染色される軟骨基質の著明な低下を認めた。そこで、軟骨分化マーカー遺伝子発現変動を解析した結果、cKO群では、早期分化マーカーCol2、Col11a1に発現低下傾向を認め、後期分化マーカーCol10、Runx2には発現上昇傾向、さらにMmp13の有意な発現上昇を認めた。このことから、Uhrf1遺伝子欠損により軟骨細胞分化が促進され、成長軟骨板における肥大化が進行した結果、長管骨長の短縮を認めたと考えられた。そこで、Uhrf1欠損により軟骨細胞分化促進に至る責任遺伝子群を同定するため、ゲノムワイドなDNAメチル化変動をMeDIP-seq、遺伝子発現変動をRNA-seqで解析し、二つのゲノムワイドデータの統合的解析を行うため、メチル化DNAの濃縮を行った結果、cKO細胞では濃縮されるメチル化DNA量が有意に減少していた。研究実施計画に沿って、研究成果が得られている。今年度は、最終的な統合的解析を実施する予定である。四肢間葉系細胞特異的Uhrf1KO(Uhrf1ΔLimb/ΔLimb)マウス(以下cKO)の外観は四肢長が明らかに短く、関節部位での変形を呈していた。軟X線ではcKO群の四肢長管骨長がControl群に比べ、約3140%の短縮を認めた。さらに、初代培養軟骨細胞を用いた解析においてcKO由来の軟骨細胞では、細胞増殖能の低下とともに分化誘導した際の軟骨基質産生の著明な低下を認めた。軟骨分化マーカーは、Sox9の発現に差を認めないものの、cKO群では、比較的早期の分化マーカーであるCol2a1、Col11a1には発現低下傾向を認めた。一方で、後期分化マーカーであるCol10、Runx2には発現上昇傾向、さらにMmp13には有意な発現上昇がみられた。このことから、Uhrf1遺伝子欠損により軟骨細胞分化が促進され、成長軟骨板における肥大化が進行し、その結果、長管骨長の短縮を認めたと考えられた。

さらにRNA-seqの結果からUhrf1KOの軟骨細胞とすでに報告がある造血幹細胞の遺伝子発現変動を比較すると、共通して発現上昇を示したのはわずかに13遺伝子のみであった。RNA-seqとMBD-seqを用いた統合解析を行ったところ、cKO群では発現上昇を認める28遺伝子のプロモーター領域におけるDNAメチル化の減少がみられた。中でもIL-1関連遺伝子であり、軟骨細胞分化に影響を与えることが知られているHspb1に着目し、cKOの軟骨細胞に対しHspb1ノックダウンを行なったところ、Mmp13などの軟骨細胞分化に関与する遺伝子発現異常が救済された。健康長寿の獲得が、超高齢社会を迎えたわが国における社会的課題である。そのためには要支援や要介護の原因を取り除く必要があり、骨粗鬆症、変形性関節症、筋肉減少症と行った運動器の疾患を克服する必要がある。これら運動器疾患の治療は、他の疾患と比較して明らかに選択肢が乏しい。その理由は疾患の詳細なメカニズムが解明されていないからである。我々は、疾患が遺伝的因子のみならず環境因子の影響も受けて発症、進展することを想定し、環境因子の一つといえるエピジェネティクスに着目して研究を実施した。その結果、Uhrf1という制御因子によるDNA維持メチル化が軟骨の正常発生に必須であることがわかった。平成27年度の研究成果から、四肢間葉系幹細胞特異的Uhrf1遺伝子欠損マウスが、全長管骨の短縮のみならず、四肢全体の低形成、骨密度の低下、骨格変形等を来すことを見出した。このことから、本研究を軟骨のみに限定せず、運動器における多くの組織で評価する意味の重要性を考慮し、開始する。また、樹立したUhrf1遺伝子ノックダウン細胞株での軟骨分化実験では、遺伝子発現低下を認めたものの、細胞株毎にノックダウン効率が大きく異なり、バラツキが非常に大きくなったため、四肢間葉系幹細胞特異的Uhrf1遺伝子欠損マウス由来の初代培養軟骨細胞を用いて、ゲノムワイド解析を行う。Uhrf1の主な分子機能は、その有する複数の機能ドメインからDNAメチル化による遺伝子発現制御に関与しているため、軟骨細胞におけるUhrf1標的遺伝子を探索する。そのために、2メチル化DNAシーケンス(MeDIP-seq)を、分化前後の細胞を用いて、当施設内の次世代シーケンサおよび共同研究により、ゲノムワイドデータの統合的解析を実施する。同定しえた複数の候補因子について、CRISPR/Cas9システムを用いた遺伝子発現抑制の後に、細胞増殖実験や軟骨分化実験を行い、軟骨基質産生能をアルシアンブルー染色により、軟骨分化マーカーの遺伝子発現変動を定量的RT-PCR法により、その機能評価を行う。平成27、28年度の研究成果から、四肢間葉系幹細胞特異的Uhrf1遺伝子欠損マウスが、全長管骨の短縮のみならず、四肢全体の低形成、骨密度の低下、骨格変形等を来すことを見出した。
骨髄由来間葉系幹細胞を用いた閉塞性腎症に対する新規治療方法の確立

閉塞性腎症に対する骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)の注入療法による治療効果をラット片側尿管結紮モデルを用いて検討した。治療後の腎組織を採取して、上皮・間葉系形質転換(EMT)、腎線維化、それに関与する増殖因子とサイトカインについて評価した。1)赤色蛍光標識したヒトおよびラットMSCは、閉塞性腎症モデルの腎間質と尿細管に4週間以上にわたり局在した。2)閉塞性腎症モデルにおいて、EMTと腎線維化は、MSCの注入により治療後3日4週間までそれぞれ有意に抑制された。3) MSC注入によるEMTと腎線維化の抑制には、多くの増殖因子やサイトカインのなかでTNF-αの関与が示された。1.閉塞性腎症に対する間葉系幹細胞の治療効果a)ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)を投与前にPaul Karl Horan dye-26を用いて赤色蛍光標識し、Sprague-Dawleyラット片側尿管結紮モデルに注入後経時的に腎組織を採取して、蛍光顕微鏡を用いてその局在を詳細に評価し、幹細胞の局在ついて検討した。MSCは数週間にわたり腎間質と尿細管に局在することが判明した。b)ラットを麻酔後開腹して、1)培養液のみをvehicleとして左腎動脈に注入し、その後左尿管を結紮した閉塞性腎症群、2) MSC(1x106/匹)を動注後に尿管結紮した幹細胞治療群、および3)尿管結紮を行わないSham群を作製する。3日4週間後に腎組織を採取して、western blotting法によりE-cadherin、α-SMA発現を評価すると伴に、組織切片のfibroblast specific protein-1染色により上皮・間葉系形質転換(EMT)について評価した。また、同組織を用いてELISA法による組織コラーゲン濃度測定、および組織切片のMasson's trichrome染色により腎間質線維化を評価し、各群間の比較検討を行った。MSCは閉塞性腎症に伴うEMTと腎線維化を防止することが示された。2.間葉系幹細胞による腎線維化抑制効果の作用機序の解明a)上記の実験で採取した腎組織をホモジナイズし、ELISA法により増殖因子、サイトカインの組織内タンパクレベルを評価した。また、腎組織から抽出したRNAを用いてリアルタイムPCR法により増殖因子およびサイトカインの組織内遺伝子発現を評価し、間葉系幹細胞による腎線維化抑制効果に関するEMTおよび液性因子の関与を検討した。MSCによる腎線維化防止にはTNF-αの関与が示された。1.閉塞性腎症に対する間葉系幹細胞の治療効果a)ヒト骨髄由来およびラット骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)を投与前にPaul Karl Horan dye-26を用いて赤色蛍光標識し、Sprague-Dawleyラット片側尿管結紮モデルに注入後経時的に腎組織を採取して、蛍光顕微鏡を用いてその局在を詳細に評価し、幹細胞の局在ついて検討した。b)ラットを麻酔後開腹して、1)培養液のみをvehicleとして左腎動脈に注入し、その後左尿管を結紮した閉塞性腎症群、2) MSC(1x1 06/匹)を動注後に尿管結紮した幹細胞治療群、および3)尿管結紮を行わないSham群を作製する。また、同組織を用いてELISA法による組織コラーゲン濃度測定、および組織切片のMasson' s trichrome染色により腎間質線維化を評価し、各群間の比較検討を行った。c)予め左尿管を部分結紮したモデルにおいても同様の実験を行い、幹細胞治療効果を検討した。同様に、MSCは閉塞性腎症に伴うEMTと腎線維化を改善することが示された。

1.閉塞性腎症に対する間葉系幹細胞の治療効果a)ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)を投与前にPaul Karl Horan dye-26を用いて赤色蛍光標識し、Sprague-Dawleyラット片側尿管結紮モデルに注入後経時的に腎組織を採取して、蛍光顕微鏡を用いてその局在を詳細に評価し、幹細胞の局在ついて検討した。MSCは数週間にわたり腎間質と尿細管に局在することが判明した。b)ラットを麻酔後開腹して、1)培養液のみをvehicleとして左腎動脈に注入し、その後左尿管を結紮した閉塞性腎症群、2) MSC(1x106/匹)を動注後に尿管結紮した幹細胞治療群、および3)尿管結紮を行わないSham群を作製する。3日4週間後に腎組織を採取して、western blotting法によりE-cadherin、α-SMA発現を評価すると伴に、組織切片のfibroblast specific protein-1染色により上皮・間葉系形質転換(EMT)について評価した。また、同組織を用いてELISA法による組織コラーゲン濃度測定、および組織切片のMasson's trichrome染色により腎間質線維化を評価し、各群間の比較検討を行った。MSCは閉塞性腎症に伴うEMTと腎線維化を防止することが示された。2.間葉系幹細胞による腎線維化抑制効果の作用機序の解明a)上記の実験で採取した腎組織をホモジナイズし、ELISA法により増殖因子、サイトカインの組織内タンパクレベルを評価した。また、腎組織から抽出したRNAを用いてリアルタイムPCR法により増殖因子およびサイトカインの組織内遺伝子発現を評価し、間葉系幹細胞による腎線維化抑制効果に関するEMTおよび液性因子の関与を検討した。MSCによる腎線維化防止にはTNF-αの関与が示された。以下の実験・研究が未施行であるため。1. 1週間前に予め左尿管結紮した腎間質線維化を確立したモデルについても同様の実験を行い、幹細胞治療効果を検討する。2.両側尿管を部分結紮した両側閉塞性腎症モデルにおいても同様の実験を行い、経時的に採血、採尿により腎機能を評価すると伴に対象動物の生存期間を評価し、幹細胞治療の有効性を検討する。3.上記治療後の動物モデルを6ヵ月以上の長期間にわたり経過観察することにより、腫瘍発生など長期合併症の有無を評価しその安全性を確認する。4.上記実験で得られた結果を元に、関与が疑われる液性因子の抗液性因子抗体を同時に投与し、幹細胞の腎線維化抑制効果を比較検討する。5.関与が疑われる液性因子のsmallinterfering-RNAによって特定液性因子発現をノックダウンした幹細胞を作製し、その治療効果を評価して作用機序を解明する。4.上記実験で得られた結果を元に、関与が疑われる液性因子の抗液性因子抗体を同時に投与し、幹細胞の腎線維化
ヒト疾患における遺伝要因のゲノム的解析と分子病態の解明

日本学術振興会未来開拓研究事業(平成16年度終了)、文部科学省特定領域研究「応用ゲノム」(平成16度-平成21年度)と合同で、国際シンポジウム「ゲノム科学による疾患の解明-ゲノム科学の明日の医学へのインパクト」及び市民講座「ゲノム科学と社会」を平成18年1月17日-1月21日に行なった。国際シンポジウムの発表者は未来開拓5人、本特定領域6人、応用ゲノム3人、海外招待講演者9人であった。市民講座は、科学者側6名に対し、国際基督教大学の村上陽一郎氏に一般講演をお願いし、最後にパネルディスカッションを行なった。参加者は延べ550人であった。また、文部科学省特定領域「ゲノム」4領域(統合、医科学、生物学、情報科学、平成16年度終了)合同の一般向け研究成果公開シンポジウム「ゲノムは何をどのように決めているのか?-生命システムの理解へ向けて-」を平成18年1月28,29日に行なった。本シンポジウムの構成は、セッション1:ゲノムから細胞システム(司会:高木利久)講演4題、セッション2:ゲノムから高次機能(司会:菅野純夫)講演6題、セッション3:ゲノムから人間、ヒトへの道(司会:小笠原直毅)講演7題を行い、さらに、小原雄治統合ゲノム代表の司会の下、門脇孝、小笠原直毅、漆原秀子、藤山秋佐夫、高木利久、加藤和人の各班員、各代表をパネリストとしてパネルディスカッションを行なった。参加者は延べ700人であった。また、本領域の最終的な報告書を作製した。「ゲノム医科学」は、ヒトゲノム計画によって得られた、様々な配列情報やクローンなどのゲノム資源を基盤とし、今まで解析をおこなうことが困難であった多因子疾患について、その遺伝要因を明らかにし、病態を分子レベルで解明することを目的に、12年度より発足した。本特定領域では、多因子疾患の中でも特に問題となっている、高血圧等の循環器疾患、糖尿病等の代謝性疾患、喘息・アレルギー等の免疫疾患を中心に、それらの疾患の発症に関連する遺伝子の発見に努める。さらに、それらの遺伝子により、病態がどのように引き起こされるのか解析するための方法論の開発を行う。研究組織は、13の計画研究、116の公募研究および総括班より成る。本年度は、初年度であり、多因子疾患の疾患関連遺伝子解明のための体制作りに力を入れた。運営は、総括班を中心に行い、年2回の計画研究代表者会議および1回の研究進捗状況報告会を行い連携を深めた。さらに、上記の3重点疾患につき疾患別研究推進委員会を総括班に設置し、年2-3回の委員会を開催し、領域内の研究協力体制の整備、領域外の研究組織との連携について意見交換を行った。研究支援事業としては、染色体転座細胞の不死化事業、cDNAライブラリーの配布、本特定領域専用ホームページの立ち上げ、海外研究者の招聘と、海外への研究者の派遣をおこなった。特に、海外研究者の招聘はアジアの中堅研究者を中心に1-3ヶ月の招聘を行い、様々な共同研究を行った。なお、研究に当たっては、倫理問題に対して特段の配慮を行った。各大学・研究機関において、遺伝子解析研究のための倫理指針への対応が、若干遅れたが、本倫理指針に準拠した各大学・研究機関の倫理委員会にて審査を受け、各研究を進めている。

研究組織は、25の計画研究、84の公募研究および総括班より成る。本年度は、多因子疾患の疾患関連遺伝子解明のための体制作りに力を入れた。運営は、総括班を中心に行い、年2回の計画研究代表者会議および1回の合同班会議を行い連携を深めた。さらに、上記の3重点疾患につき疾患別研究推進委員会を総括班に設置し、年2-3回の委員会を開催し、領域内の研究協力体制の整備、領域外の研究組織との連携について意見交換を行った。研究支援事業としては、染色体転座細胞の不死化事業、本特定領域専用ホームページの立ち上げ、国際シンポジウムの開催、海外研究者の招聘と、海外への研究者の派遣をおこなった。特に、海外研究者の招聘はアジアの中堅研究者を中心に1-3ヶ月の招聘を行い、様々な共同研究を行った。なお、研究に当たっては、倫理問題に対して特段の配慮を行った。各大学・研究機関において、遺伝子解析研究のための倫理指針への対応が、若干遅れたが、本倫理指針に準拠した各大学・研究機関の倫理委員会にて審査を受け、各研究を進めている。「ゲノム医科学」は、ヒトゲノム計画によって得られた、様々な配列情報やクローンなどのゲノム資源を基盤とし、今まで解析をおこなうことが困難であった多因子疾患について、その遺伝要因を明らかにし、病態を分子レベルで解明することを目的に、12年度より発足した。本特定領域では、多因子疾患の中でも特に問題となっている、高血圧等の循環器疾患、糖尿病等の代謝性疾患、喘息・アレルギー等の免疫疾患を中心に、それらの疾患の発症に関連する遺伝子の発見に努める。さらに、それらの遺伝子により、病態がどのように引き起こされるのか解析するための方法論の開発を行う。研究組織は、31の計画研究、57の公募研究および総括班より成る。本年度も、多因子疾患の疾患関連遺伝子解明のために、総括班を中心に、疾患別研究推進委員会を総括班に設置し、年2-3回の委員会を開催し、領域内の研究協力体制の整備、領域外の研究組織との連携について意見交換を行った。特に、ミレニウムプロジェクトの一環として、糖尿病・高血圧、喘息アレルギーについては、SNPを用いての全ゲノム解析、マイクロサテライトを用いての解析等にサンプルを供給し、弛緩関連遺伝子探査の基盤を固めた。各大学・研究機関において、遺伝子解析研究のための倫理指針に準拠した各大学・研究機関の倫理委員会にて審査を受け、各研究を進めている。
マイクロチャネル気液二相流の大流量化に関する基礎研究

マイクロチャネルに大流量の気液二相流を流した場合の液滴飛散限界を評価するために,三角断面および台形断面形状のマイクロチャネルを用い,液滴飛散限界の実験測定を行なった.水-空気系の実験に加え,フロリナート(FC-3283)-空気系の実験を用いて,溝形状,流路長さ,流量,乾き度をパラメータとした実験を行った.評価方法は,出口部での可視化を行うとともに,飛散した液滴を下流の気液分離器で捕獲し,その重量を測定することで液滴飛散限界を求めた.ここで,液滴飛散限界は,液相の1%以上が気相にエントレインされる最大流量と定義した.その結果,水およびフロリナートのいずれにおいても,片側の壁面が急拡大するバックステップ流れにおける液滴飛散限界は,液膜レイノルズ数,気相見かけ速度とチャネル幅で定義したウェーバー数,およびチャネル幅および流路長さで定義される修正ボンド数の関数となることがわかった.即ち,液膜レイノルズ数が小さい場合は,液滴飛散限界は比較的大きいウェーバー数で観察されるが,液膜レイノルズ数が増加するとともに,液滴飛散限界を与えるウェーバー数は減少した.また,滴適飛散限界を与えるウェーバー数の液膜レイノルズ数依存性は,ボンド数によって影響を受けることも明らかとなった.最終的に,溝幅と気相見かけ速度で定義されるウェーバー数と,縮流部液膜レイノルズ数および修正ボンド数を用いて,水-空気,フロリナートー空気系二相流における液滴飛散限界を無次元整理した.マイクロチャネルに大流量の気液二相流を流した場合の液滴飛散限界を評価するために,三角断面および台形断面形状のマイクロチャネルを用い,液滴飛散限界の実験測定を行なった.水-空気系の実験に加え,フロリナート(FC-3283)-空気系の実験を用いて,溝形状,流路長さ,流量,乾き度をパラメータとした実験を行った.評価方法は,出口部での可視化を行うとともに,飛散した液滴を下流の気液分離器で捕獲し,その重量を測定することで液滴飛散限界を求めた.ここで,液滴飛散限界は,液相の1%以上が気相にエントレインされる最大流量と定義した.その結果,水およびフロリナートのいずれにおいても,片側の壁面が急拡大するバックステップ流れにおける液滴飛散限界は,液膜レイノルズ数,気相見かけ速度とチャネル幅で定義したウェーバー数,およびチャネル幅および流路長さで定義される修正ボンド数の関数となることがわかった.即ち,液膜レイノルズ数が小さい場合は,液滴飛散限界は比較的大きいウェーバー数で観察されるが,液膜レイノルズ数が増加するとともに,液滴飛散限界を与えるウェーバー数は減少した.また,滴適飛散限界を与えるウェーバー数の液膜レイノルズ数依存性は,ボンド数によって影響を受けることも明らかとなった.最終的に,溝幅と気相見かけ速度で定義されるウェーバー数と,縮流部液膜レイノルズ数および修正ボンド数を用いて,水-空気,フロリナートー空気系二相流における液滴飛散限界を無次元整理した.マイクロチャネルに大流量の気液二相流を流した場合の液滴飛散限界を評価するために,三角断面および台形断面形状のマイクロチャネルを用い,水-空気系気液二相流の液滴飛散限界の実験測定を行なった.実験では,供給する液相および気相流量を独立に制御することで,入口流量と乾き度を変化させた.評価方法は,出口部での可視化を行うとともに,飛散した液滴を下流の気液分離器で捕獲し,その重量を測定することで液滴飛散限界を求めた.ここで,液滴飛散限界は,液相の1%以上が気相にエントレインされる最大流量と定義した.片側の壁面が急拡大するバックステップ流れにおいて,液滴飛散限界は液膜レイノルズ数,気相見かけ速度とチャネル幅で定義したウェーバー数,およびチャネル幅および流路長さで定義される修正ボンド数の関数となることがわかった.即ち,液膜レイノルズ数が小さい場合は,液滴飛散限界は比較的大きいウェーバー数で観察されるが,液膜レイノルズ数が増加するとともに,液滴飛散限界を与えるウェーバー数は減少した.また,滴適飛散限界を与えるウェーバー数の液膜レイノルズ数依存性は,ボンド数によって影響を受けることも明らかとなった.一方,同一の流量および乾き度においてチャネル幅を大きくした場合,液滴飛散限界は低流量側にシフトしたが,この傾向は従来から液滴飛散限界判定においてよく用いられる予測式であるIshii & Grolmes(1975)の式では十分に再現できないことを示した.以上の実験結果から,あらたな液滴飛散限界を予測可能な整理式を作成した.マイクロチャネルに大流量の気液二相流を流した場合の液滴飛散限界を評価するために,三角断面および台形断面形状のマイクロチャネルを用い,液滴飛散限界の実験測定を行なった.今年度は,前年度まで行ってきた水-空気系の実験に加え,フロリナート(FC-3283)-空気系の実験を用いて,溝形状,流路長さ,流量,乾き度をパラメータとした実験を行った.評価方法は,出口部での可視化を行うとともに,飛散した液滴を下流の気液分離器で捕獲し,その重量を測定することで液滴飛散限界を求めた.ここで,液滴飛散限界は,液相の1%以上が気相にエントレインされる最大流量と定義した.

その結果,フロリナートにおいても,片側の壁面が急拡大するバックステップ流れにおける液滴飛散限界は,液膜レイノルズ数,気相見かけ速度とチャネル幅で定義したウェーバー数,およびチャネル幅および流路長さで定義される修正ボンド数の関数となることがわかった.即ち,液膜レイノルズ数が小さい場合は,液滴飛散限界は比較的大きいウェーバー数で観察されるが,液膜レイノルズ数が増加するとともに,液滴飛散限界を与えるウェーバー数は減少した.また,滴適飛散限界を与えるウェーバー数の液膜レイノルズ数依存性は,ボンド数によって影響を受けることも明らかとなった.最終的に,溝幅と気相見かけ速度で定義されるウェーバー数と,縮流部液膜レイノルズ数および修正ボンド数を用いて,水-空気,フロリナート-空気系二相流における液滴飛散限界を無次元整理した.
脳・認知機能測定によるエビデンスに基づく認知行動療法の治療技法選択に関する研究

高社交不安者に対する認知行動療法による介入の影響が、初期情報処理過程の特性を反映するサッカード課題には現れず、後期過程の特性を反映するボタン押し課題や状態不安得点にあらわれることが明らかになった。また、介入前にみられたスピーチ課題直後における前頭前野の賦活が、介入後にみられなくなることが明らかになった。さらに、読み書き障害児と算数障害児で、読書時に異なった眼球運動特性がみられることが明らかになった。これらの成果から、脳認知科学的エビデンスに基づく認知行動療法の技法選択の妥当性がしめされた。平成21年度は、(a)社交不安水準による認知行動的差異および(b)脳機能的差異、さらに(c)学習障害を持つ児童・生徒と健常群との認知行動的および(d)脳機能的差異を明確にするための実験を行った。(a)については、6名の大学生を対象に情動サッカード課題を行い、社交不安特性との関係を検討した。社交不安水準が高い参加者で特異的なパタンが得られること、また認知行動療法的介入によって、そのような特異的パタンが消失する可能性を示した。平成22年度以降も、実験を続ける予定である。(b)については、10名の大学生を対象にスピーチ課題を課し、その前後における前頭の脳活動をNIRSによって測定した。社交不安水準の高かった3名(高社交不安群)と低かった3名(低社交不安群)を比較すると、高社交不安群は聴衆を前にしたスピーチ後において、前頭におけるOxy-Hbのより大きな増加を示した。これは社交不安水準による脳機能的差異を反映していると考えられる。平成22年度以降は対象者を増やすと共に、CBT適用が先の脳活動に与える影響を明らかにすることをめざす。(c)については、学習障害をもつ中学生を対象に「文字の大きさ、文字組み方向(縦組み/横組み)、図の有無」などの要素を操作した文章を作成し、これらの文章を読む際の眼球運動パタンを健常な成人と比較した。この結果、学習障害をもつ生徒では、文字が小さい文章では一つ一つの文章を追跡していない傾向が見られた。また図や挿絵に対して停留が見られ、文章を目で追わない要因になっていることが示唆された。平成22年度以降は、(d)を実施するとともに、文章についてのさらに詳細な分析を行う予定である。今年度は、昨年度に引き続き、社交不安、および、発達障害を有する実験参加者を対象に、感情認知パラダイムによる横断的研究と、認知行動療法による介入にともなう認知機能・脳機能の変化の計測を行った。NIRSを用いた脳機能計測では、前年度までの横断的研究に加え、約20名の実験参加者を対象に集団認知行動療法の介入前後でのNIRS応答のパタンの比較を目的とした実験を行った。介入前後で有意な社交不安、特性不安、抑うつの低下が見られ、また、プレゼンテーションに対する自己評価の有意な上昇が見られた。NIRSの応答については、今年度も引き続き同様の介入実験を実施し、昨年度観察されたスピーチ前後の高社交不安者の前頭の過活動が追試できるか、またそれが介入後に変化するかを検討する。また今年度は、これまで行ってきた質問紙、眼球運動測定、NIRSに加え、fMRIを用いて脅威表情認知の脳内基盤と不安傾向の関係を検討した。不安水準の違いによって脅威表情認知課題中の脳活動の強さが異なる領域が複数見られることが明らかとなった。認知行動療法による介入前後の脳活動の比較もケース数を増やし実施する予定である。発達障害を有する実験参加者を対象とした研究については、今年度は,発達障害のある児童・生徒の視覚・認知的特徴を先行研究の知見にもとづいて明らかにし,その特徴に適した教材の開発または指導方法を探った。大学生を対象とした実験により,眼球運動上の変化を検討することで,効果的な視覚的ガイドの提示方法を検討した。平成23年度は、平成22年度に引き続き、社交不安、および、発達障害を有する実験参加者を対象に、感情認知パラダイムによる横断的研究と、認知行動療法(以下、CBTとする)による介入にともなう認知機能・脳機能の変化の計測を行った。NIRSを用いた脳機能計測では、前年度までの横断的研究に加え、約15名の実験参加者を対象に集団認知行動療法の介入前後でのNIRS応答のパタンの比較を行った。平成22年度同様、介入前後で有意な不安、抑うつの低下、プレゼンに対する自己評価の上昇が見られた。さらに平成22、23年度の全実験参加者の介入前後でのNIRSの応答を比較したところ、介入前の時点では高社交不安者にスピーチ前後での前頭の過活動が見られたが、それが介入後には低社交不安者と同程度まで低下した。これはCBTが脳機能の変化をも生じさせている証拠であると考えられる。fMRIを用いた研究では、行動目標である脅威刺激の処理に関わる脳内部位の特定および、当該領域の活動量に実験参加者の社交不安の強さが与える影響を調べてきた。

その結果、社交不安の強さは情動処理を担う扁桃体の活動量とは正の相関を示すのに対し、情動処理を制御するための領域と考えられる前頭前皮質の活動量とは負の相関を示すことが分かった。これらの結果は、不安が高い実験参加者には脅威関連刺激の処理を回避する傾向があることを示すと考えられる。発達障害のある児童・生徒を対象とした研究については、平成23年度は、読み障害のある児童と、読み障害はないが算数障害のある児童の眼球運動の計測を行った。この結果、読み障害の児童は、大学生と比べて、平均視線停留時間や平均視線移動距離において長く、平均視線移動回数において多くなる傾向が見られた。また文章の種類によっても違いがあるため、この結果を支援・教材に活用することが考えられる。
多孔質建築材料の音響伝搬定数計測法の開発研究

多孔質建築材料は、吸音材料としてつとに有名で、快適な居住環境を形成するに欠かせない建築材料である。音響材料としての性能は吸音率や伝搬定数、さらにバネ定数があり、吸音率は音響管法や残響室法の吸音率測定法で求められ、動的バネ定数も共振法で容易く求めることができる。それに対し、伝搬定数に関しては最近こそ測定システムが販売されるに致っているが、伝搬定数を求めるのはかなり困難な測定法として認識されている。そこで、研究代表者は多孔質材料の伝搬定数の計測に関し、音響管を用いた誰もが容易に計測できる極めて簡単な方法を考案している。すなわち、従前の手法では、音響管奥部に試料を設置し、その背後空気層の条件を変えた音響計測が必要であるが、試料の状態を変えずに背後空気層の条件のみ変える困難さがあった。新しい計測方法は困難さの原因である背後空気層を全く不要とする計測法として確立しものである。本研究は、この計測方法を基本としてその実用化を目指した開発研究であり、手始めに、音響管を幾つかに分解可能とし、特に試料設置を容易とし、また同時に、音響計測時には十分気密性を保って再接続が可能とする様な計測機構を開発し、より実用性を高める工夫をした。具体的な計測は音響管端部に設置した試料前後の音圧間の伝達関数をディジタル信号処理により求め、音響伝搬モデルに従い伝搬定数を求めるが、その計測システムは音響インピーダンス計測にも容易に流用可能とした。実際の応用計測として通常の多孔質材料に加え砂や柔らかな紙など本手法以外に計測不可能な材料の伝搬定数を計測した。その結果、周波数の増加に従って単位長さあたりのdB減衰値が増加することや伝搬速度が空気中の音速より低く周波数が低いほどその傾向が強いことを確認した。また、試料の共振現象に起因する誤差を除く為、試料を力学的に拘束して共振を軽減する方法を確立し、より実用化が図られた。音響管を利用したグラスウ-ルやロックウ-ルなどの多孔質材料の音響伝搬定数の新しい計測方法に関連し、吸音メカニズムなどの理論的検討を行った。また、音響管の剛端壁に密着させた試料の前後2点間の伝達関数分析を行えば、柔らかな試料の形態を変えずに背後に空気層を設けたり剛壁に密着させる従来の方法で最も厄介な2回の試験を不要とする、新しい計測モデルの妥当性を確認した。実際に、簡便な音響管試験装置を構成し、グラスウ-ルやロックウ-ルを対象とした試験計測を数多く試みた。その結果、たやすく伝搬定数が計測され、求まることが分かった。これらの理論的考察と計測例を日本音響学会建築音響研究会で報告した。また、上記の実験過程で伝搬定数の計測結果に顕著なディップ、すなわち誤差が認められた。そのため、多孔質材料の伝搬定数の計測装置の構成法の研究と並行し、多孔質材料の種類や試験寸法を変えた共振現象解明のための実験を実施した。その結果、試験材料が音響管壁で拘束を受け、板振動的な共振現象が生じていることが原因であると判明した。このほか、通常の試験材料の寸法では、建築音響で大変重要とされる数百Hzの周波数帯域に共振現象が生じやすいことや共振現象を緩和するには、管壁と試料が力学的に強く接しないように試料を設置することが重要なことが判明した。これらの試験結果や試験材料の設置方法に関する提案などの成果を日本音響学会の研究発表会にて報告した。

さらに、本年度の研究成果をもとに、明年度の研究の重要な柱とすべくより実用化に向けた音響管試験装置を試作した。多孔質建築材料は、吸音材料としてつとに有名で、快適な居住環境を形成するに欠かせない建築材料である。音響材料としての性能は吸音率や伝搬定数、さらにバネ定数があり、吸音率は音響管法や残響室法の吸音率測定法で求められ、動的バネ定数も共振法で容易く求めることができる。それに対し、伝搬定数に関しては最近こそ測定システムが販売されるに致っているが、伝搬定数を求めるのはかなり困難な測定法として認識されている。そこで、研究代表者は多孔質材料の伝搬定数の計測に関し、音響管を用いた誰もが容易に計測できる極めて簡単な方法を考案している。すなわち、従前の手法では、音響管奥部に試料を設置し、その背後空気層の条件を変えた音響計測が必要であるが、試料の状態を変えずに背後空気層の条件のみ変える困難さがあった。新しい計測方法は困難さの原因である背後空気層を全く不要とする計測法として確立しものである。本研究は、この計測方法を基本としてその実用化を目指した開発研究であり、手始めに、音響管を幾つかに分解可能とし、特に試料設置を容易とし、また同時に、音響計測時には十分気密性を保って再接続が可能とする様な計測機構を開発し、より実用性を高める工夫をした。具体的な計測は音響管端部に設置した試料前後の音圧間の伝達関数をディジタル信号処理により求め、音響伝搬モデルに従い伝搬定数を求めるが、その計測システムは音響インピーダンス計測にも容易に流用可能とした。実際の応用計測として通常の多孔質材料に加え砂や柔らかな紙など本手法以外に計測不可能な材料の伝搬定数を計測した。その結果、周波数の増加に従って単位長さあたりのdB減衰値が増加することや伝搬速度が空気中の音速より低く周波数が低いほどその傾向が強いことを確認した。また、試料の共振現象に起因する誤差を除く為、試料を力学的に拘束して共振を軽減する方法を確立し、より実用化が図られた。
根粒菌ーマメ科植物共生系における共生生物間の鉄輸送システムの解明

ダイズ根粒内感染細胞において植物細胞側と根粒菌バクテロイド側はシンビオソーム膜により隔離される。シンビオソーム膜に局在し植物細胞側からバクテロイド側へ鉄を輸送するタンパク質を同定するため、鉄欠乏根粒で高発現となるシンビオソーム膜タンパク質を探索する。初年度は鉄欠乏根粒を着生する生育条件を検討した。まずプラントボックスに滅菌したバーミキュライトを詰め、2つの異なる鉄濃度(20 μM, 2 μM)のMMM培地を水耕液として与え根粒菌を接種しダイズを栽培した。回収した根粒の鉄濃度を測定したところ、2 μM区で9.06±2.67mmol/g DW、0.2 μM区で8.81 ±2.67mmol/g DW(mean±SD)と有意差は見られなかった。そこでバーミキュライトから水で抽出される鉄濃度を測定したところ、計算上プラントボックス内のバーミキュライトからは20 μM区の2倍の鉄が溶出することが明らかになった。そこで、バーミキュライトの代わりに、水で抽出される鉄がほとんどない豊浦砂を栽培に用いた。しかしながら両処理区間の根粒鉄濃度には差が見られなかった。現在、鉄を全く加えない水耕液(0 μM)の処理区を加えて栽培を行っている。また、プラントボックス以外に、資材の鉄濃度の影響を受けないと予想されるシードパックを用いた栽培も行っている。また、今後見出す候補輸送体の機能解析を本来のホストを用いたダイズ毛状根形質転換系で行う予定であるが、この系の構築のために、これまでにシンビオソーム膜局在鉄輸送体と報告されているGmDMT1の毛状根形質転換体の作製を試みた。GmDMT1の内部配列をCRISPR/Cas9ベクターpMgP237に導入し、Agrobacterium rhizogenes K599株の形質転換を行なった。K599株の形質転換体をダイズ子葉に感染させ毛状根を作製した。根粒を着生しない水耕条件ではMMM培地でダイズを鉄欠乏にすることがわかっていたが、根粒着生のため資材を入れたポット栽培では鉄欠乏にすることが容易ではなかった。鉄欠乏根粒着生条件の検討に予想外に時間がかかっているが、毛状根形質転換体作成の方は想定より進捗しているため、おおむね順調と評価した。まず今年度は前半期に鉄欠乏根粒を着生させる。上記の豊浦砂、シードパックいずれも鉄欠乏にできなかった場合、さらに不純物が少ないと考えられるウレタンスポンジを資材として用いる。得られた鉄欠乏根粒からシンビオソーム膜を回収し、プロテオーム解析により、鉄十分根粒に比べ発現が上昇するタンパク質をリストアップする。それらの中から鉄など微量元素輸送体ファミリーとして報告のあるものを有力な鉄候補輸送体とし、ダイズ毛状根形質転換体を作製、根粒を着生させて根粒の表現型や窒素固定能を調べ、窒素固定能が失われるなど本来のホストであるダイズで機能解析を行う。また、鉄の安定同位体を取り込ませ、バクテロイドへの鉄輸送機能が損なわれた変異体でノックアウトした遺伝子を目的の輸送体遺伝子と同定する。ダイズ毛状根形質転換体については、毛状根作製まではできたものの植え継ぎ後の増殖、継代および根粒着生はまだ出来ていない。植え継ぎ後に増やせていない原因としては培地の栄養塩濃度が高すぎることが考えられるので、ダイズにK599株形質転換体を感染後生育させる培地を現在のMS培地から1/2培地に変更する。また、根粒菌を毛状根に接種する方法としては根粒菌を懸濁した寒天培地を用いる予定である。これらはすでに報告されている手法であり実現可能性は高いので、条件検討して進めていく。現状大きな方向転換は必要ないと考えており、申請書の研究実施計画に沿って進めていく。