hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
各種抗癌剤におけるアポトーシスの誘導とその機序に関する研究

ヒト口腔由来扁平上皮癌培養細胞株(HSC-2,HSC-3,HSC-4,Ca9-22)に各種抗癌剤(5-FU,カルボプラチン,ネダプラチン)を作用させ、その細胞死に関する検討を行った。MTTassayでカルボプラチンは全てのcell linesに増殖抑制効果はなかった.一方,5-FUではCa9-22、HSC-4のみに増殖抑制効果があった.他方,ネダプラチンでは,全てのcell linesにおいて腫瘍抑制効果があった.ネダプラチン添加24時間後の50%増殖抑制濃度は、HSC-3が5.74μg/mlと最も低く,次いでHSC-4が8.37μg/ml,Ca9-22が10.96μg/ml、HSC-2が13.74μg/mlと最も高かった。また,ネダプラチンを10μg/ml添加し細胞数の経時的変化をみると,全てのcell linesで経時的に細胞数が減少した.そこで,この細胞死についてTUNNEL法による検討を加えた.ネダプラチン添加24時間後に全てのcell linesでapoptotic cellを見い出した.またApoptotic indexを計測したところ,HSC-3のapoptotic indexは約66%,HSC-4が約52%,Ca9-22が約10%,HSC-2が約7%とcontrolに比べ有意に上昇しており,特に増殖抑制効果の高かったHSC-3およびHSC-4では高値を示した.これらの結果より,ネダプラチンの増殖抑制作用には.apoptosisが関与していることが示唆された.今後ネダプラチンにより誘導されたapoptosisの誘導機序を解明するためapoptosis関運蛋白質をウエスタンブロット法を用いて検索する予定としている.ヒト口腔由来扁平上皮癌培養細胞株(HSC-2,HSC-3,HSC-4,Ca9-22)に各種抗癌剤(5-FU,カルボプラチン,ネダプラチン)を作用させ、その細胞死に関する検討を行った。また,ネダプラチンを10μg/ml添加し細胞数の経時的変化をみると,全てのcell linesで経時的に細胞数が減少した.そこで,この細胞死についてTUNNEL法による検討を加えた.ネダプラチン添加24時間後に全てのcell linesでapoptotic cellを見い出した.またApoptotic indexを計測したところ,HSC-3のapoptotic indexは約66%,HSC-4が約52%,Ca9-22が約10%,HSC-2が約7%とcontrolに比べ有意に上昇しており,特に増殖抑制効果の高かったHSC-3およびHSC-4では高値を示した.これらの結果より,ネダプラチンの増殖抑制作用には.apoptosisが関与していることが示唆された.今後ネダプラチンにより誘導されたapoptosisの誘導機序を解明するためapoptosis関運蛋白質をウエスタンブロット法を用いて検索する予定としている.
神経障害性疼痛の関わる脊髄ニューロン・グリアの分子形態学的基盤

神経障害性疼痛発症の分子メカニズム特に脊髄グリアとニューロン間の相関に関係する分子を解明するために、主にラットを用いたニューロパチックペインモデルを用いて、侵害受容系における種々の分子の関与をこの3年間調べてきた。その結果、後根神経節や脊髄後角ニューロン、さらに脊髄グリア細胞におけるATP受容体、脂質メディエーターに関して新しい所見を得て、国際一流雑誌に報告することが出来た。1.一次知覚ニューロンにおけるロイコトリエン合成酵素、受容体mRNA発現、その痔痛行動への関与の解明末梢炎症モデルを用いて、a. CysLT2がDRGニューロンで多く発現し、それとATP受容体P2X3が高頻度に共存することが明らかとなった。b. CysLT2のアゴニストであるLTC4を事前投与すると、単独では疼痛行動を惹起しない量のATPアゴニストでも痺痛行動が現れることが明らかとなった。c.一次知覚ニューロンにおいてもロイコトルエン受容体CysLT2が末梢炎症時の痛覚過敏に関与していることが明らかにとなり、以上のデータはMolecular Painに発表した。2.神経障害性痔痛モデルにおける脊髄でのP2Y6,13,14受容体の発現解析と、それぞれ特異的なantisense、阻害剤の投与後の疼痛行動の変化の解析をこの1年間行ってきた。以下の所見が得られて論文投稿直前である。a.半定量的RT-PCR法を用いてP2Y6,13,14mRNA発現量の変化を測定したところ、それぞれ特異的な時間的変化を示す発現増加が観察された。b.マイクログリアにおいてP2Y6,13,14mRNAシグナルが増加しており、細胞がマイクログリアであることは免疫二重染色法を用いて確認した。c.術側ではP2Y14 AS-ODN投与群とMM ODNの2群間は統計学的に有意差があり、手術後5-7日でantisense群で機械的刺激、温度刺激に対する過敏反応の抑制が観察された。1.末梢神経障害後の脊髄マイクログリアにおけるPAF(platelet-activating factor)合成酵素及びその受容体の増加末梢神経損傷モデルを用いて、PAF合成酵素であるLPCAT2が活性化マイクログリアにて産生増加することを、RT-PCR及び二重染色in situハイブリダイゼーション法にて発見した。さらにその受容体であるPAFrが同様にマイクログリアで増加し、PAFr阻害剤の投与で疼痛過敏が抑制されることが明らかとなった。末梢神経障害後に脊髄マイクログリアでPAF-PAFrシグナリングが神経障害性疼痛に関与していることをMolecular Painに発表した。2.神経障害性疼痛モデルにおける脊髄でのP2Y6,13,14受容体の発現解析と、それぞれ特異的なantisense、阻害剤の投与後の疼痛行動の変化の解析をこの2年間行ってきた。以下の所見が得られて論文を投稿して、現在revisionのための追加実験中である。1)半定量的RT-PCR法を用いてP2Y6,13,14mRNA発現量の変化を測定したところ、それぞれ特異的な時間的変化を示す発現増加が観察された。2)マイクログリアにおいてP2Y6,13,14mRNAシグナルが増加しており、細胞がマイクログリアであることは免疫二重染色法を用いて確認した。3)術側ではP2Y14 AS-ODN投与群とMM ODNの2群間は統計学的に有意差があり、手術後5-7日でantisense群で機械的刺激、温度刺激に対する過敏反応の抑制が観察された。4)p38阻害剤であるSB203580投与群ではP2Y14 mRNAの発現が抑制されていた。5)P2Y6,12,13の阻害剤を同時投与すると、単体投与よりも疼痛行動の抑制が長時間継続した。末梢神経損傷モデルを用いて、PAF合成酵素であるLPCAT2が活性化マイクログリアにて産生増加することを、RT-PCR及び二重染色in situハイブリダイゼーション法にて発見した。末梢神経障害後に脊髄マイクログリアでPAF-PAFrシグナリングが神経障害性疼痛に関与していることをMolecular Pain2012, 8:8に発表した。2.神経障害性疼痛モデルにおける脊髄でのP2Y6,13,14受容体の発現解析と、それぞれ特異的なantisense、阻害剤の投与後の疼痛行動の変化の解析を行い、GLIA 60:1529-1539 (2012)に発表した。以下にその内容をまとめる。a.半定量的RT-PCR法を用いてP2Y6,13,14 mRNA発現量の変化を測定したところ、それぞれ特異的な時間的変化を示す発現増加が観察された。b.マイクログリアにおいてP2Y6,13,14 mRNAシグナルが増加しており、細胞がマイクログリアであることは免疫二重染色法を用いて確認した。

c.術側ではP2Y14 AS-ODN投与群とMM ODNの2群間は統計学的に有意差があり、手術後5ー7日でantisense群で機械的刺激、温度刺激に対する過敏反応の抑制が観察された。d. p38阻害剤であるSB203580投与群ではP2Y14 mRNAの発現が抑制されていた。e. P2Y6,12,13の阻害剤を同時投与すると、単体投与よりも疼痛行動の抑制が長時間継続した。脊髄マイクログリアにおける脂質受容体として、ロイコトルエン系の合成酵素や受容体の発現変化等の発表以外に、PAFに関しても既に論文とすることが出来た。ATP受容体に関しては、レフリーから要求された追加実験がほぼ終わり、最終改訂版の作成途中である。24年度が最終年度であるため、記入しない。ATP受容体に関しては最終的な採択に向けて最大限の努力をする予定である。この1年間に関しては、グリアからのサイトカインの産生に関する新しい研究や、ロイコトルエンの脊髄ニューロンに対する調節メカニズムを電気生理学的手法によって解明する新しいプロジェクトに傾注する予定である。
コストと耐久性を考慮した中規模木橋の標準設計手法の開発とその評価

近年復活しつつある木橋ではあるが、主桁等の継ぎ手部の耐久性はやはり課題である。そこで、実大寸法の接合部モデルを風雨暴露下において設計荷重を常時載荷し、その挙動と劣化度の進行を調べた。また実在する木橋の劣化度の傾向について管理者へのヒアリングによりデータを蓄積した。これらを元に標準的な設計手法と留意点について提案するための資料を得た。(1)小試験片の断面について特殊な機器による穿孔抵抗値分布を測定する。それを破壊試験に供することで、部材強度を穿孔抵抗値の関数として表すことを試みる。このとき軸方向力と曲げでは断面内の健全度分布により評価が異なるはずであるので、その分布を考慮して正規化された指数を提案する。(2)実構造材の診断への適用性を検討するため、その穿孔抵抗値測定を行い、残存強度、耐力を推定する。これを実際の強度、耐力と比較することで適用性を検証する。(3)以上でとりまとめられた劣化度診断手法を用いて中規模木橋の劣化度の傾向を調査し、それらを踏まえた中規模木橋の標準的な設計手法を提案する。実大の木橋と同程度の寸法の試験体1体に対する試験よりも、環境条件を変化させた試験体を多数試験する方が汎用性の高い成果が得られるとのアドバイスに鑑み、全長2mの方持ちはり式試験体を8体製作した。試験体は以下のような考えのもとで設計・製作した。・小さい試験体でも接合部に設計荷重を作用させるために方持ちはり式の試験体とした。・接合は引張側にM16ボルト1本とし、圧縮側は固定台と試験体端面を面接触させてめりこみ変形が生じないようにした。このことにより、試験体の変位は引張側のボルト付近の劣化のみにより生じることになる。・異等級対称のスギ集成材とし、ボルト孔付近にはジョイントや節を有しないものとする。試験体は木橋の架設実績とともに大学等の研究機関にも試験体を納入している鹿児島県の集成材メーカに製作を依頼する。・早期の劣化を期待するため加圧注入はしないが、表面劣化を防止するために防腐塗料を塗布する。・治具およびボルトには亜鉛メッキを施し、さびの影響を排除する。・試験体の自重と先端のおもりによりボルトに設計耐力が作用するように試験体長とおもりの重さを決める。現在試験体と治具、固定台の製作が終わり、試験載荷も行って問題なく試験が実施できることを確認した。今後ただちに常時載荷試験を開始する。試験中は気温と湿度を常時測定するとともに、定期的に目視・打診・触診による簡易診断と、含水率、ピン打ち込み深さ、穿孔抵抗値測定の定量化診断を実施して劣化の進行状況を詳しく調べる予定である。全長2mの片持ちはり式試験体を8体製作し、うち4体を室内で、残りの4体を屋外で長期載荷試験を実施している。小さい試験体でも接合部に設計荷重を作用させるために方持ちはり式の試験体とし、固定部の引っ張り側にM16ボルト1本を配置して、この部位のめりこみ等による変化の状況を観察する。なお、圧縮側には鋼板を貼り付け、面接触させることでめり込み変異が生じないようにした。試験体は異等級対称のスギ集成材とし、ボルト孔付近にはジョイントや節を有しないものとする。試験体は木橋の架設実績とともに大学等の研究機関にも試験体を納入している鹿児島県の集成材メーカで製作した。早期の劣化を期待するため防腐薬剤の加圧注入はしないが、表面劣化を防止するために防腐塗料を塗布する。また治具およびボルトには亜鉛メッキを施し、さびの影響を排除する。固定部には試験体の自重によるモーメントが作用するが、引っ張り側ボルトに設計体力を作用させるため、不足分として先端におもりを作用させる。測定は気温と湿度を常時測定するとともに、12週間毎に接合部の変位を測定している。今後は目視・打診・触診による簡易診断や含水率、ピン打ち込み深さ、穿孔抵抗値測定の定量化診断も併用し、劣化の進行状況を詳しく調べる予定である。

固定部には試験体の自重によるモーメントが作用するが、引っ張り側ボルトに設計体力を作用させるため、不足分として先端におもりを作用させる。測定は気温と湿度を常時測定するとともに、24週間毎に目視診断と接合部の変位を測定している。一旦除荷してピン打ち込み深さ、穿孔抵抗値測定を行ったところ特に異常は見られなかった。またボアホールカメラによりボルト孔を観察したところ、カビが発生しており水分の侵入が認められたが、劣化は見られなかった。その後、さらに試験を継続している。全長2mの片持ちはり式試験体を8体製作し、うち4体を室内で、残りの4体を屋外で長期載荷試験を実施した。小さい試験体でも接合部に設計荷重を作用させるために方持ちはり式の試験体とし、固定部の引張側にM16ボルト1本を配置した。圧縮側には鋼板を貼り付け、面接触させることでめり込み変位が生じないようにした。試験体は異等級対称のスギ集成材とし、ボルト孔付近にはジョイントや節を有しないものとした。試験体は木橋の架設実績とともに大学等の研究機関にも試験体を納入している鹿児島県の集成材メーカーで製作した。早期の劣化はむしろ歓迎であることから防腐薬剤の加圧注入当の積極的な耐久性向上策は採らなかった。ただし、ボルトや接合材のサビによる影響を排除するため、これらには亜鉛メッキを施した。試験体の自重に加え、不足分として先端に調整したおもりを常時載荷することで、引張側ボルトに設計耐力を作用させた。測定では気温と湿度を常時測定するとともに、24週間毎に目視診断と接合部の変位を測定した。また、接合部の劣化状況の変化を詳細に把握するため、一旦除荷してピン打ち込み深さ、穿孔抵抗値測定等を行った。これまでの試験により、屋内の試験体では変位はほとんど生じないものの、屋外の試験体では接合部の変位がわずかではあるが徐々に大きくなることがわかった。屋外の試験体の詳細調査から接合部の異常は特には見られなかったが、ボアホールカメラによる観察より、ボルト内部にカビが発生しており、この水分の侵入が変位の原因となっていることが考えられる。また、これらの成果を実際の橋梁等の設計に生かすための方策について検討を行った。その結果、ボルト接合部の隙間部を樹脂により充填する方法が好ましいこと等が明らかになった。
磁性強誘電体におけるドメイン構造の可視化と外場制御

本研究では磁性と強誘電性を同時に有するマルチフェロイック物質を対象として、ドメイン構造の可視化と磁場や電場による制御を目指し研究を行った。マンガン酸化物を対象とした実験では、ドメイン壁の厚さによって誘電応答が変化することを見出した。ドメイン構造の可視化へ向けて新たに光学測定系を構築し、この測定系を利用して数種類のマルチフェロイック物質について光吸収スペクトルの測定を行った。強磁性や強誘電性といった複数の強的な秩序を同時に有するマルチフェロイック物質では、非対角応答を利用した新しい物性制御方法の開拓が期待される。特に「らせん磁性強誘電体」では電気分極の向きと磁気構造が一対一に対応しており、磁場による電気分極の回転などの巨大な外場応答が報告されている。このような外場応答の起源として、電気分極の向きが異なるドメイン間に存在するドメイン壁の運動が挙げられる。本研究では磁性強誘電体におけるドメイン構造を光学的手法によって可視化し、その外場応答について調べることで、磁性強誘電体の外場応答を理解することを目的とする。本年度は冷凍機および分光器を用いた光学系を構築し、紫外領域から近赤外領域までの波長で測定を行える環境を整えた。構築は本研究費により偏光子やレンズといった光学素子を購入することで行った。光学系の構築と並行して磁性強誘電体の単結晶育成を行った。このとき水平ブリッジマン法による単結晶育成を行うため、横型管状炉とACモーターを利用した簡易型のブリッジマン炉の作成を行った。また、関連する研究として希土類マンガン酸化物におけるドメイン壁の応答をメガヘルツ帯までの誘電率および電気分極の外場応答を詳細に測定することにより、ドメイン壁の厚さに依存した物性応答が現れることを明らかにした。次年度は構築した光学測定系を利用してドメイン壁の可視化を行い、ドメイン壁の外場応答を明らかにしていく。並行してブリッジマン炉を使用して単結晶育成を行い、新しい磁性強誘電体の探索を行う。複数の強的あるいは反強的な秩序を同時に有するマルチフェロイック物質では、非対角応答を利用した新しい物性制御方法の開拓が期待される。このような物性応答を理解するためには強的な秩序状態における双安定性によって生じる分域構造および分域壁の外場応答についての知見を得る必要がある。本研究では主に「らせん磁性」を有するCuCrO2、電気磁気効果を示すRFe3(BO3)4やCuB204などを対象としてドメイン構造の可視化と外場制御を目指し研究を行った。研究では単結晶試料を育成し、磁化および電気分極を測定した後、光吸収スペクトルの測定を行った。ここでは特にRFe3(BO3)4について調べた結果を述べる。RFe3(BO3)4は磁気構造の変化に伴い電気分極が変化する。この様子を可視から近赤外領域の吸収分光によって検出することを試みた。はじめに単結晶試料をフラックス法によって育成し、磁化率、誘電率、電気分極の測定を行い電気磁気効果が現れることを確かめた。次に磁気誘電性を示す物質であるHoFe3(BO3)4と磁気誘電性を示さないYFe3(BO3)4について光学測定を行った。これらの物質は三方晶に属するため一軸性の光学応答を示すことから光学主軸であるc軸方向およびc軸と垂直な[110]方向に電場成分を持つ直線偏光を入射し、光吸収スペクトルの温度変化を測定した。この結果からFe3+イオンのスピン禁止遷移による光吸収の大きさと磁化率および電気分極が同様の温度変化を示すことがわかった。今後は電磁石およびCCD検出器を用いて分域構造の可視化を行うことによって電気磁気効果の発現機構について明らかにして行く。
境界研究の分析法を用いた国境・境界地域における基礎教育に関する国際比較研究

本研究の目的は、国境・境界地域での現地調査を通じて、各事例における基礎教育の特徴的な実態およびそうした実態が生じることになった歴史的背景や社会・政治・経済などの要因を境界研究の分析法によって解明すること、および各事例の分析結果を比較することによって、現代の教育事象を捉えるための新たな視座を提示するとともに、新たな比較教育学方法論を構築することである。この研究目的を達成するため、本年度は研究代表者の他に研究分担者12名、研究協力者6名の参画を得て実施した。まず、調査対象国の基礎教育および境界研究に関する文献・資料を収集・整理・分析するとともに、準備が整った調査計画から順次現地調査を実施した。調査を実施した国・地域は、台湾<金門島>、カンボジア=ラオス国境、ラオス=中国国境、マレーシア=ブルネイ=インドネシア国境、ミャンマー=タイ国境、アメリカ=メキシコ国境であった。その他資料調査を中国、ベトナム等で実施した。また、研究計画・方法論の共有および個別情報の集約・統合を図るため、7月に第1回打ち合わせ会議を行った。3月には第2回打ち合わせ会議を行い、境界研究専門家2名(岩下明裕氏・川久保文紀氏)に依頼して境界研究の分析法・先行研究に関する講演を実施したとともに、本年度の調査研究の結果を各メンバーが報告して成果を共有した。さらに、本研究課題の基盤となったこれまでの研究成果および当年度の調査結果を日本比較教育学会およびアジア比較教育学会等で発表した。研究計画を推進するために、研究打ち合わせ会議を年度内に2回開催できた。いずれも、ほとんどのメンバーの参加が得られ、第1回会議では研究目的の確認、具体的な研究計画の立案などを行い、第2回会議では境界研究の専門家による講演によって、境界研究の分析法を教育学に用いることに関する理論的・方法論的な議論が深まるとともに、それぞれの文献資料調査・現地調査の結果について討議できた。多くの調査が実施されて、それぞれの初年度達成しようとした目標が達成できた。そのなかでも、アメリカ=メキシコ国境やカンボジア=タイ国境では、毎日越境通学する児童の存在が実証的に確認され、今後の本研究課題の重要な成果を生み出す契機として注目できる。なお、いくつかの予定された国境・境界地域における現地調査は、現地事情等により資料調査に振り替えるなどしたが、元来調査実施には相当の準備が必要な地域もあり、ある程度は想定されていたものである。研究成果の発信については、各メンバーによって論文や学会発表を通して積極的に行われた。特に、本研究課題の背景や経緯、意義や将来像に関する研究代表者による論文が、日本比較教育学会紀要に掲載されたことは当初予定を上回る成果と言える。なお、当初予定されていたホームページの開設は、予算上の制約や掲載内容の精査に時間がかかることから次年度に延期した。以上のことを総合的に判断して、おおむね順調に進展していると考えられる。研究課題の目的を達成するため、本年度に引き続き国境・境界地域における現地調査を柱とする研究計画を推進する。特に、現地事情等により本年度に調査が実施できなかった中国=モンゴル国境、中国=ミャンマー国境、ベトナム=カンボジア国境、フィンランド=ロシア国境については、実現に向けて精力的に取り組むこととする。また、本年度に大きな成果が得られたアメリカ=メキシコ国境については、米大統領の政策によって世界の注目を集めていることでもあり、重点的に推進する方針とする。同時に、各メンバーの調査研究の経験を集約・統合しながら、比較教育学としての境界研究の方法論を構築するため、研究打ち合わせ会議を行う。その過程について日本比較教育学会の課題研究や世界比較教育学会などを活用して国内外の学界に発信していく。あわせて、ホームページを開設することにより、広く社会に発信する体制を整える。

多くの調査が実施されて、それぞれの初年度達成しようとした目標が達成できた。そのなかでも、アメリカ=メキシコ国境やカンボジア=タイ国境では、毎日越境通学する児童の存在が実証的に確認され、今後の本研究課題の重要な成果を生み出す契機として注目できる。なお、いくつかの予定された国境・境界地域における現地調査は、現地事情等により資料調査に振り替えるなどしたが、元来調査実施には相当の準備が必要な地域もあり、ある程度は想定されていたものである。研究成果の発信については、各メンバーによって論文や学会発表を通して積極的に行われた。特に、本研究課題の背景や経緯、意義や将来像に関する研究代表者による論文が、日本比較教育学会紀要に掲載されたことは当初予定を上回る成果と言える。なお、当初予定されていたホームページの開設は、予算上の制約や掲載内容の精査に時間がかかることから次年度に延期した。以上のことを総合的に判断して、おおむね順調に進展していると考えられる。研究課題の目的を達成するため、本年度に引き続き国境・境界地域における現地調査を柱とする研究計画を推進する。特に、現地事情等により本年度に調査が実施できなかった中国=モンゴル国境、中国=ミャンマー国境、ベトナム=カンボジア国境、フィンランド=ロシア国境については、実現に向けて精力的に取り組むこととする。また、本年度に大きな成果が得られたアメリカ=メキシコ国境については、米大統領の政策によって世界の注目を集めていることでもあり、重点的に推進する方針とする。同時に、各メンバーの調査研究の経験を集約・統合しながら、比較教育学としての境界研究の方法論を構築するため、研究打ち合わせ会議を行う。その過程について日本比較教育学会の課題研究や世界比較教育学会などを活用して国内外の学界に発信していく。あわせて、ホームページを開設することにより、広く社会に発信する体制を整える。
食道内への胆汁逆流が睡眠時ブラキシズムに及ぼす影響を明らかにする研究

これまでの研究から、食道内への酸逆流と睡眠時ブラキシズムとの関連が示唆されているが、その因果関係は解明されていない。本研究の目的は、睡眠時の食道内への酸刺激が睡眠時ブラキシズムを発現させるという仮説を実験的に検証することである。健康な成人男性12名を対象に咬筋筋電図や食道内pH計測を含む睡眠ポリグラフ検査を行い、睡眠中に酸性溶液を食道内に注入する介入を行った。その結果、酸注入後では筋電図バーストや睡眠時ブラキシズムエピソード、歯ぎしり音の頻度が有意に増加することが示された。また、酸が咽喉頭へ逆流していない場合にも睡眠時ブラキシズムが認められた。以上から、睡眠時ブラキシズムは食道内への酸注入により引き起こされること、酸の暴露範囲ではなく酸性度が睡眠時ブラキシズムのトリガーとなっている可能性が示唆された。1)予備調査はじめに問診やブラキシズムの自覚・他覚症状に関する調査、咀嚼筋の終夜筋電図計測を行い、ブラキシズム患者の選抜を行った。十二指腸胃食道逆流では逆流物は咽頭・喉頭付近まで逆流物が到達する事例がしばしば認められる。このため、本研究でも予備調査として起床時にブラキシズム患者の咽頭部から試料を採取し採取資料中の胆汁酸やトリプシンを調査したところ、サンプル中からは胆汁酸やトリプシンは認められなかった。そこで、逆流した胆汁酸やトリプシンの濃度が低い可能性やpH変化の現れにくい微小な酸の影響も考えられることから、健常者を対象に介入的研究を行いその結果を検討することした。2)介入的研究対象は全身疾患のない健康な成人20名、消化器疾患の症状・既往のあるものや酸感受性試験で陽性を示すものは本研究の対象から除外した。pHセンサー付き液体注入用カテーテルを経鼻で食道内へ設置し、PSG検査を行った。PSG検査の計測項目はEEG(C3-A2,O2-A1)、EOG、ECG、EMG(咬筋、顎二腹筋)、呼吸、体位、脈波、SpO2、食道内pH、ビデオ撮影である。注入する液体は0.1NHC1と生理食塩水を選択した。睡眠時に食道内へHC1もしくは生理食塩水を注入し、それらに対する反応を観察した。本研究は現在進行中である。本研究の結果は集計し、平成21年度中に国際的な学術誌へ発表する予定である。本研究では、食道内への化学的刺激が睡眠障害や睡眠時ブラキシズム(SB)の発現に及ぼす影響を実験的に検討した。対象と方法:対象は健康な成人男性12名(平均24.2歳)を対象に、咬筋筋電図、食道内pH計測および睡眠ポリグラフ検査を4晩連続で行った。2晩目のデータをSBと睡眠障害の診断に使用し、3晩目と4晩目に酸性液(pH1.2HC1)と生理食塩水を経鼻カテーテル経由で食道内に各晩3回以上注入した。酸と生理食塩水の順序は被験者に伝えずランダムに決定し、non-REM睡眠段階2で、1回あたり5mlを1分間で注入した。2回目以降の注入は前回の注入から20分以上経過し、食道内pHの上昇後に行った。各液体注入後20分間の食道内pH、咬筋筋電図バースト、RMMAエピソードおよび歯ぎしり音の頻度を比較した。結果:2晩目のデータからSBや睡眠障害を呈する者はいなかった。酸性液と生理食塩水の注入で睡眠時間、睡眠効率、各睡眠段階の割合などの睡眠データに有意差を認めなかった。酸性液注入後の20分間で食道内のpHは有意に上昇し、生理食塩水に比べ微小覚醒、筋電図バースト、RMMAエピソードおよび歯ぎしり音の頻度が有意に高く、酸性液注入によるSBの発現頻度はSBの実験的診断基準を満たしていた。繰り返し刺激による影響については、1回目に比べ2回目と3回目の酸刺激後では筋電図バーストや歯ぎしり音の頻度が有意に高かった。考察:食道内への化学的刺激(酸刺激)がSBを引き起こす事が示された。また、食道内に対する化学的刺激の回数を重ねるに従い反応が亢進することが示された。以上から、SBは睡眠中の食道内のクリアランスに関係している可能性が示唆された。

対象と方法:対象は健康な成人男性12名(平均24.2歳)を対象に、咬筋筋電図、食道内pH計測および睡眠ポリグラフ検査を4晩連続で行った。2晩目のデータをSBと睡眠障害の診断に使用し、3晩目と4晩目に酸性液(pH1.2 HCl)と生理食塩水を経鼻カテーテル経由で食道内に各晩3回以上注入した。酸と生理食塩水の順序は被験者に伝えずランダムに決定し、non-REM睡眠段階2で、1回あたり5mlを1分間で注入した。2回目以降の注入は前回の注入から20分以上経過し、食道内pHの上昇後に行った。各液体注入後20分間の食道内pH、咬筋筋電図バースト、RMMAエピソードおよび歯ぎしり音の頻度を比較した。結果:2晩目のデータからSBや睡眠障害を呈する者はいなかった。酸性液と生理食塩水の注入で睡眠時間、睡眠効率、各睡眠段階の割合などの睡眠データに有意差を認めなかった。酸性液注入後の20分間で食道内のpHは有意に上昇し、生理食塩水に比べ微小覚醒、筋電図バースト、RMMAエピソードおよび歯ぎしり音の頻度が有意に高く、酸性液注入によるSBの発現頻度はSBの実験的診断基準を満たしていた。繰り返し刺激による影響については、1回目に比べ2回目と3回目の酸刺激後では筋電図バーストや歯ぎしり音の頻度が有意に高かった。本研究の意義と重要性:本研究の結果から、1)食道内への化学的刺激(酸刺激)がSBを引き起こすこと、そして2)化学的刺激の回数を重ねるに従い反応が亢進することが示された。この結果は、食道内に対する化学的刺激を遮断するアプローチを通してこれまで困難であったSBの根本療法が可能となる可能性を示唆している。
光受容及び生物時計を司る遺伝子システムの解明

クリプトクロームは、Flavin Adenine Dinucleotide(FAD)を補酵素として持つフラボタンパクであり、バクテリアから植物、ヒトまで生物界に幅広く存在している。クリプトクロームは光回復酵素と呼ばれる光を受容する事により機能するDNA修復酵素に由来しており、何らかの光受容過程を含む生理機能に関与している事が示唆されていたが、高等動物においては概日リズムの制御を行っている事が明らかとなった。概日リズムを作り出す生物時計は、PASドメインと呼ばれるタンパク間相互作用に関与するモチーフを持つ一群のタンパクから構成されている。クリプトクロームは、このPASドメインを持つ一群の転写因子に直接結合し、その活性を制御しており、生物時計の中心的役割を担っている。本研究は、クリプトクローム及びそれと相互作用するPASドメインタンパク群の機能を、シアノバクテリア、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ(メダカ)、マウスにおいて包括的に解析しようというものである。本年度は以下のことを明らかにした。1)CRYは光回復酵素・クリプトクロームタンパクファミリーの一員であるが、このファミリーの中でCRYと一次構造が最も似ている6-4光回復酵素の結晶構造を明らかにした。これまでに、CPD光回復酵素については米国のグループが、またシアノバクテリアのCRYに関しては昨年度の本申請研究で結晶構造を明らかにしていたが、このタンパクファミリーの構造と機能を理解する上で重要な知見を得ることが出来た。2)機能の異なるCRYタンパク間でキメラを作成することにより、CLOCK, BMAL1と相互作用するドメインを決定するとともに、核移行二十葉な働きをするドメインを同定した。3)ゼブラフィッシュ培養細胞において、光により特定のCry遺伝子の発現が誘導される事を報告していたが、これをリアルタイムで検出する系を開発した。その制御メカニズムを明らかにすることが可能になると期待できる。
神経因性疼痛発現維持機構の解明を目的としたプロテオミクス研究

慢性疼痛では、脊髄後角シナプスの反応様式の変化や構成が増大する可塑的変化が生じ、その一つとしてNR2Bの1472番目のTy残基(Y1472)のリン酸化必要であることを明らかにしてきた。本解析ではNR2BY1472をPheに置換したノックインマウスを比較対照とし、脊髄後角でのY1472リン酸化の下流経路の解明として、CaMKIIを介したリン酸化シグナルの解明と、後シナプス肥厚部(PSD)画分のプロテオミクス解析により関連分子の同定を行った。本研究は、慢性疼痛発現維持機構の解明を目的としたプロテオミクス解析である。侵害刺激は、脊髄後角でシナプスを形成し、二次ニューロンを介して脳へと伝達され、「痛み」として認識される。このシナプスでの反応様式の変化や構成が増大する可塑的変化により神経因性疼痛が発症することが知られていることから、神経因性疼痛モデルマウスの脊髄後シナプス肥厚部(PSD)画分を用いたプロテオミクス解析により機能性分子を探索、同定し、機能解析を通して慢性疼痛の機序を明らかにしようとするものである。申請者らのグループはNR2Bの1472番目のチロシン残基(NR2BY1472)のリン酸化が神経因性疼痛の発現に重要であることを明らかにしてきたことから、NR2BY1472をフェニルアラニンに置換したノックインマウス(NR2BY1472FKI)と野生型マウスの両方を用いた。神経因性モデル動物には、SNI(spared nerve injury)モデルを選択した。本研究内で、NR2BY1472FKIでSNIモデルでの疼痛閾値の低下が、野生型に比べ抑制されることを明らかにした。よって、神経因性疼痛におけるNR2BY1472のリン酸化の下流での新規機能性分子探索の試みとしてプロテオミクス解析を行った。比較群は、野生型無処置群とSNIモデル群、NR2BY1472FKI無処置群とSNIモデル群の4群とした。4群(各130-140匹)より脊髄後角を摘出しPSD画分精製した。プロテオミクス解析には、4群間比較と、受容体などの不溶性および高分子量タンパクが多く含まれるPSD画分での解析であることから、isobaric tag for relative and absolute quantitation (iTRAQ)を用いたプロテオミクス解析を行なった。今年度の成果として4群間の脊髄PSD画分での発現分子の同定、定量化および比較を行い、神経因性疼痛の機能性分子の候補分子を選択した。本年度で候補分子の機能解析を行う予定である。このシナプスでの反応様式の変化や構成が増大する可塑的変化により神経因性疼痛が発症することから、神経因性疼痛モデルマウスの脊髄後画の後シナプス肥厚部(PSD)画分を用いた解析を実施してきた。申請者らのグループはNR2Bの1472番目のTyr残基(NR2BY1472)のリン酸化が神経因性疼痛の発現に重要であることを明らかにしている。よって、NR2BY1472をPheに置換したノックインマウス(NR2BY1472FKI)と野生型マウスの両方を用い、そのリン酸化の下流における機能性分子を同定し、機能解析を通して慢性疼痛の発現機序を明らかにしようとするものである。これまでに、NR2BY1472FKIで神経因性疼痛モデル、Spared nerve injury(SNI)モデルを作製し、野生型との両方から腰部脊髄後角PSD画分を精製し、iTRAQ法を用いた解析でSNIにより発現の増加する分子(野生型30、KI型22)群を見いだし、NR2B Y1472のリン酸化に重要な分子として2分子に焦点を当てた。さらに、下流のリン酸化を介した疼痛発現経路を同モデルで見いだし、この経路が脳を介した機序であるか、あるいは腰部脊髄で選択的に生じているかを明らかにするために、リン酸化酵素の阻害剤を腰部髄腔内に注入し、腰部脊髄で局所的な活性阻害をおこなった。その結果、腰部脊髄の局所的なリン酸化阻害により、神経因性疼痛による機械的アロディニアが有意に抑制されることがわかった。また、機能が未解明である2分子を標的蛋白として、iTRAQ解析によって同定したことから、現在これらの蛋白のノックアウトマウスの作製を開始している。本研究は、慢性疼痛発現維持機構の解明を目的としたプロテオミクス解析と、細胞内での機能性分子の解析を行うものである。

侵害刺激は、脊髄後角でシナプスを形成し、二次ニューロンを介して脳へと伝達され、「痛み」として認識される。このシナプスでの反応様式の変化や構成が増大する可塑的変化により神経因性疼痛が発症することから、神経因性疼痛モデルマウスの脊髄後画の後シナプス肥厚部(PSD)画分を用いた解析を実施してきた。申請者らのグループはNR2Bの1472番目のTyr残基(NR2BY1472)のリン酸化が神経因性疼痛の発現に重要であることを明らかにしている。よって、NR2BY1472をPheに置換したノックインマウス(NR2BY1472FKI)と野生型マウスの両方を用い、そのリン酸化の下流における機能性分子を同定し、機能解析を通して慢性疼痛の発現機序を明らかにしようとするものである。これまでに、NR2BY1472FKIで神経因性疼痛モデル、Spared nerve injury(SNI)モデルを作製し、野生型との両方から腰部脊髄後角PSD画分を精製し、iTRAQ法を用いた解析でSNIにより発現の増加する分子(野生型30、KI型22)群を見いだし、NR2B Y1472のリン酸化に重要な分子として2分子に焦点を当てノックアウトマウスの作製を開始した。さらに、PSDに多く存在するリン酸化酵素であるCaMKIIの活性化をin vivoで評価し、その活性化が痛みの発現に必要であることをCaMKIIの選択的阻害剤を腰部髄腔内に投与し明らかにした。また、末梢神経損傷によって活性化したCaMKIIの標的分子がAMPA受容体のサブユニットの一つであるGluR1の831番目のSerであることを明らかにした。リン酸化を介したAMPA受容体の活性化が神経因性疼痛の発現維持に必要であることを示し、本成果を論文に発表した。
ナノ間隙冷陰極の作製と電子波干渉の観測

電界放射顕微鏡(Field Emission Microscope:FEM)によりビーム誘起堆積Pt冷陰極の電子放出パターンの評価を行った。これにより、ビーム誘起堆積Pt冷陰極の電子放出パターンは複数のスポットで構成されていることが分かった。また、陽極電圧を高くするとスポットの数も増加することが分かった。ビーム誘起堆積Ptはアモルファスカーボン内に直径3nm程度のPtナノクリスタルを内包した構造をしている。そのため、複数のスポットからなる電子放出パターンはPt冷陰極先端のPtナノクリスタルの分布を反映したものであると考えることができる。400°Cアニール処理を行ったPt冷陰極では、放出電流が低い時に縞状の電子放出パターンを観察した。アニール処理によりPtナノクリスタルが凝集し電気伝導特性が変化したことにより、隣接する電子放出サイトで電子波の干渉が起こっている可能性があることを示した。次にアニール処理を行うことによってPt冷陰極表面にナノ突起を作製することができ、先端に10nmの間隙をもつナノ突起を作製することが出来た。電界放射顕微鏡による評価を行ったところ、隣接2先端から放出した電子波の干渉縞と考えられる7本の縞状の電子放出パタニンを観測した。得られた干渉縞はフラウンホーファ回折モデルから得られた干渉パターンと良い一致を示すことを明らかにした。干渉縞の間隔から電子波の波長を求めると金属のフェルミ波長と同程度となることを明らかにした。陽極印加電圧一定時の電子放出パターン及びエミッション電流の時間依存性を計測すると、エミッション電流が激しく振動しており、その電流の上昇、下降に連動して電子放出パターン内に輝点が点灯していることが分かった。これは陰極表面上で真空中の残留ガスが吸着・脱離を起すことによって陰極表面上の局所仕事関数が変化したことに起因している。そのため、電子放出パターンを更に厳密に評価するためには測定前に真空中で陰極表面を加熱クリーニングする必要があると考えられる。400°Cアニール処理を行ったPt冷陰極の電子放出パターンも同様の手法で評価した。電子放出パターンはアニール処理をしていないPt冷陰極と同様に複数のスポットにより構成されていた。以上の結果により、ビーム堆積Pt冷陰極から放出される電子により電子波の干渉を観察するためには、Pt冷陰極上のPtナノクリスタルエミッションサイトを制御する必要があることがわかった。この成果を第66回応用物理学会学術講演会(2005年9月7日11日徳島大学)で発表した。
音韻論の知見に基づいた日本語の読みの獲得と障害の研究

読みの獲得や障害は音韻と密接に関連していると言われているが、日本語においては音韻論の知見をふまえた読みの研究は少ない。本研究の目的は音韻論の知見に基づいて、読みの障害と獲得について明らかにすることである。今年度の研究については、以下の通りである。読みの障害および獲得と非語の復唱能力との関係性が示唆されている。本研究では、定型発達における読みが未熟な幼児(逐字読み群)は読みが熟達している幼児(流暢読み群)よりも非語の復唱の成績が低いかどうか、誤用の特徴にも違いがみられるのか、を検討した。この結果をまとめたものを、特殊教育学研究にて発表した。さらに、非語の復唱の困難さについては、読み困難児における非語の復唱の特徴を明らかにするために、幼児期の逐字読み群および流暢読み群の成績(迫野・伊藤, 2015)と比較検討を行った。この結果について、第60回日本音声言語医学会総会・学術講演会にて報告した。また、読みの障害や読みの獲得段階における未熟さをもつ場合、語の音韻構造の影響を受けやすいと予測される。そこで採用1年目より、学齢期の読みに困難をもつ児童が、定型発達における読みが未熟な子どもと同様の特徴を示すのかどうかについての検討を行っている。今年度は、読み困難児の読みと音節・モーラとの関係について検討を行った。この結果について、第53回日本特殊教育学会大会で報告した。さらに読み困難児の読みに及ぼすアクセントの影響について、研究結果をまとめ、英語論文を投稿した。近年、読みの獲得及び障害と音韻との関係について分節的側面に加えて韻律的側面からの検討が行われている。本研究では、幼児の単語の読み誤りの変化の特徴を、分節的側面と韻律的側面に着目して縦断的に検討を行った。この結果について、第41回日本コミュニケーション障害学会学術講演会において報告した。27年度が最終年度であるため、記入しない。近年、発話の能力と読みの能力との関連が指摘されているが、日本においてはこの点について詳しく検討されていない。そこで今年度は、まず定型発達における読みが未熟な幼児(逐字読み群)は読みが熟達している幼児(流暢読み群)よりも非語の復唱の成績が低いかどうか、誤用の特徴にも違いがみられるのか、を検討した。この結果をまとめたものを、現在学会誌に投稿中である。次に、読みが未熟な幼児(逐字読み群)における非語の復唱課題でみられた音の誤りの特徴を、弁別素性に着目して検討を行った。この結果について、国内の学会で報告した。また、これまで定型発達を示す幼児を対象とした一連の研究において明らかになった、読みの困難さを早期に発見するための指標として示唆された音韻的側面の特徴が、実際に学齢期の読み困難児にみられるのかどうかの課題を開始した。データについて、現在分析中である。さらに、非語の復唱の困難さについては、読みの獲得段階における未熟さと、読み障害の違いはどこにあるのかを明らかにするため、音韻分析を用いた比較検討を行った。この結果について、5月に行われる国内の学会にて発表することが確定している。この結果をまとめたものを、特殊教育学研究に投稿し、採択が決定した。さらに、非語の復唱の困難さについては、読みの獲得段階における未熟さと、読み障害の違いはどこにあるのかを明らかにするために、定型発達を示す読みが未熟な幼児と学齢期の読み困難児を対象に、音韻分析を用いた比較検討を行った。この結果について、第40回日本コミュニケーション障害学会学術講演会にて報告した。また、これまで定型発達を示す幼児を対象とした一連の研究において明らかになった、定型発達における読みが未熟な子どもにみられた音韻構造の影響が、学齢期の読み困難児に同様にみられるのかどうかの課題を昨年度より開始した。今年度はフットおよび音節量について検討を行った。フットについては、読み困難児も幼児の逐字読み群と同様にフットの影響を受けるのかどうか、つまり3モーラ語の反応潜時がF+F構造をもつ4モーラ語よりも長いのかどうかを検討した。この結果について、第52回日本特殊教育学会大会で報告した。

音節量については、読み困難児も逐字読み群と同様に音節量の影響を受けるのかどうか、すなわちHLの反応潜時がLHよりも短いのかどうかを検討した。この結果について、第59回日本音声言語医学会総会・学術講演会において報告した。読みの獲得や障害は音韻と密接に関連していると言われているが、日本語においては音韻論の知見をふまえた読みの研究は少ない。本研究の目的は音韻論の知見に基づいて、読みの障害と獲得について明らかにすることである。今年度の研究については、以下の通りである。読みの障害および獲得と非語の復唱能力との関係性が示唆されている。本研究では、定型発達における読みが未熟な幼児(逐字読み群)は読みが熟達している幼児(流暢読み群)よりも非語の復唱の成績が低いかどうか、誤用の特徴にも違いがみられるのか、を検討した。この結果をまとめたものを、特殊教育学研究にて発表した。さらに、非語の復唱の困難さについては、読み困難児における非語の復唱の特徴を明らかにするために、幼児期の逐字読み群および流暢読み群の成績(迫野・伊藤, 2015)と比較検討を行った。この結果について、第60回日本音声言語医学会総会・学術講演会にて報告した。また、読みの障害や読みの獲得段階における未熟さをもつ場合、語の音韻構造の影響を受けやすいと予測される。そこで採用1年目より、学齢期の読みに困難をもつ児童が、定型発達における読みが未熟な子どもと同様の特徴を示すのかどうかについての検討を行っている。今年度は、読み困難児の読みと音節・モーラとの関係について検討を行った。この結果について、第53回日本特殊教育学会大会で報告した。さらに読み困難児の読みに及ぼすアクセントの影響について、研究結果をまとめ、英語論文を投稿した。近年、読みの獲得及び障害と音韻との関係について分節的側面に加えて韻律的側面からの検討が行われている。本研究では、幼児の単語の読み誤りの変化の特徴を、分節的側面と韻律的側面に着目して縦断的に検討を行った。この結果について、第41回日本コミュニケーション障害学会学術講演会において報告した。本研究の目的は、音韻論の知見に基づいて読みの障害と獲得について明らかにすることである。幼児を対象とした読みと発話に関する研究については論文掲載決定に至った。また、読み困難児を対象とした読みに及ぼす音韻構造の影響に関する研究についても、順調に進んでおり、明らかになった結果について順次国内学会にて報告することができている。さらに、発話に及ぼす音韻的側面の影響についてはこれまでとは違った視点からふみこんだ検討を行い、国内学会で報告を行った。27年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度である今年度は、幼児および学齢期の読み困難児の音韻に関する研究を継続することにより、読みの獲得および障害に関わる音韻の問題をさらに明らかにし、研究の仕上げとする。今後は、まず読み困難児に及ぼす音韻構造の影響について、まだ結果を報告していないものについて結果をまとめ、学会発表および論文投稿を行う。また、学齢期の読み困難児を対象に音韻の困難さがどのように変化していくのかを見るため、1年目に行った課題と同様のものを2年目も行ったので、その結果についてデータ分析を行う。さらに、3年目も同様に調査を依頼する予定である。これまであまり注目してこなかった読み誤りについても、前年度よりはじめた音韻分析等の新たな視点からの分析を行っているところである。データ分析後、これについても研究発表を行う準備をする。
単一ドメイン抗体無細胞ディスプレイと光を用いた創薬標的探索の効率化

フルオレセイン標識抗体と光照射によるリアルタイム蛋白質不活性化法(FALI)は、相互作用の場における時間分解能の高い手法である。これを効率化し、特定の細胞間相互作用に関与する細胞表面分子を同定して創薬標的探索法として確立することを目指している。cDNA display技術を単一ドメイン抗体ライブラリー(VHH)に応用してFALIを行い、細胞機能アッセイ系と一体化させるための基盤技術を確立する。昨年度、アミノ酸配列既知の単一ドメイン抗体(様)分子をモデルとして用いることにより、cDNA displayの収量増加に重要であるのは、還元条件の無細胞翻訳時の蛋白質フォールディングである可能性が示された。さらに安定した構造を持つ抗体様分子をスキャフォルドとして用いることで、高効率発現と細胞へ適用するために重要な界面活性剤フリー溶液への置換が可能となった。この条件を満たす抗体様スキャフォルドを利用して、新たにスモールスケールのライブラリーを作製し、ビオチン-アビジン結合を利用してビーズに固定化した組換えタンパク質に結合するクローン選択を行った。さらに高親和性のクローンを得るためのオフレート選択やPCRによる変異導入条件の検討を進めた。また、ペプチドタグを認識する単一ドメイン抗体をモデルとして、高効率発現のための検討を行った。FALIと組合せハイスループット創薬標的探索法として確立するため、高親和性抗体様分子のcDNA display取得を基盤として細胞への適用を進める。フルオレセイン標識抗体と光照射によるリアルタイム蛋白質不活性化法(FALI)は、相互作用の場における時間分解能の高いタンパク質機能解析法である。これを効率化して細胞機能アッセイに適用し、特定の細胞間相互作用に関与する細胞表面分子を同定して創薬標的探索法として確立することを目指している。本年度は、多様性を維持したライブラリーをなるべくスモールスケールで取り扱うため、化学合成VHHライブラリーcDNA displayの発現効率向上の検討を中心に行った。研究分担者が開発した光架橋によりmRNAと高効率に結合可能な改良型リンカー、最適な磁気ビーズの選択、反応条件、特に無細胞タンパク質合成系の至適化により、さらなる発現効率向上が可能であることが明らかとなった。また、クローン選択条件設定のために必要な、GFPやペプチドタグに高親和性に結合するVHHクローンcDNA displayを作製し、抗原への結合確認とともに反応条件の検討を行った。以上の検討結果にもとづき、膜タンパク質の細胞外ドメイン由来ペプチドを含む3種のペプチドを磁気ビーズに固定化し、VHHライブラリーのスクリーニングの試行を行った。これによりランダムな変異を導入してより高い親和性を持つクローンを得るための条件設定が可能となった。引き続きクローン選択の条件検討を進めるとともに、cDNA display発現効率の向上を図っている。本年度のVHHライブラリーcDNA displayの発現効率向上の検討により、十分な多様性を維持したライブラリーをスモールスケールで取り扱うことが可能となった。また、VHHライブラリーのスクリーニングの試行によりランダム変異導入による高親和性クローン選択のための条件設定が可能となった。昨年度に引き続き、VHHライブラリーのcDNA display発現効率の向上のための条件検討を進めるとともに、多様性を維持したライブラリーをスモールスケールで取り扱うため、抗体様スキャフォルドのcDNA display発現効率と比較検討した。その結果、cDNA displayの収量に大きな影響があるのは、還元条件の無細胞翻訳時の蛋白質フォールディングである可能性が示された。この結果をもとに、安定した構造を持つ抗体様分子を用いることで、高効率の発現と界面活性剤フリーの溶液への置換が可能となった。CHO細胞表面に発現させたerbBにより結合クローンを選択するモデル実験を行い、条件検討を行った。さらに、error-prone PCRによりランダム変異を導入し、高親和性クローンを選択するためoff-rate selectionの条件検討を行った。以上の成果をもとに新たなライブラリーを構築し、高効率に発現させる条件検討、固定化した標的に結合するクローン選択と高親和性のクローンを得るための変異導入条件の検討を行うモデル実験を進めてきた。今後、ハイスループット創薬標的探索法として確立するためのcDNA display高効率発現の基盤技術の確立を目指す。VHHのcDNA display発現効率を抗体様スキャフォルドと比較検討することにより、高効率発現を得るために重要なポイントが明らかとなり、ライブラリーの改変は必要になったものの、高効率発現の目処が立った。十分な多様性を維持したライブラリーをスモールスケールで維持することが可能となり、ランダム変異による高親和性クローン選択についても条件検討が進んだ。

さらに安定した構造を持つ抗体様分子をスキャフォルドとして用いることで、高効率発現と細胞へ適用するために重要な界面活性剤フリー溶液への置換が可能となった。この条件を満たす抗体様スキャフォルドを利用して、新たにスモールスケールのライブラリーを作製し、ビオチン-アビジン結合を利用してビーズに固定化した組換えタンパク質に結合するクローン選択を行った。さらに高親和性のクローンを得るためのオフレート選択やPCRによる変異導入条件の検討を進めた。また、ペプチドタグを認識する単一ドメイン抗体をモデルとして、高効率発現のための検討を行った。FALIと組合せハイスループット創薬標的探索法として確立するため、高親和性抗体様分子のcDNA display取得を基盤として細胞への適用を進める。今後、これまでに確立した実験条件をもとに、モデル系を用いて高親和性のVHHクローンを得るための変異導入実験を開始する。あわせて、研究分担者と協議しつつ、アッセイに十分な量のcDNA displayクローンを高効率で合成するための基盤技術開発を目指す。上記の成果をもとに新たなライブラリーを構築し、高効率に発現させるための条件検討、固定化した標的に結合するクローン選択と高親和性のクローンを得るための変異導入条件の検討を行うモデル実験を引き続き進めていく。あわせて、細胞表面におけるクローン選択について効率的に進める条件を検討していく。研究分担者と協議しつつ、ライブラリーの改良を進め、必要な基盤技術の確立を目指す。VHHライブラリーのcDNAディスプレイ発現効率向上が達成され、当初の予定よりも無細胞タンパク質合成系等の試薬・キット類の使用量が少なかったため。VHHのcDNA display発現効率を抗体様分子と比較検討することによりスキャフォルドや実験条件の修正・改善により予想以上に高効率の発現が得られることが明らかとなった。今後の研究を効率的に進める上で重要なことから、その結果を踏まえてライブラリーを構築し、追加の検討を進めてきた。ライブラリ構築に時間がかかったこともあり、次年度使用額が生じたが、今後、これまでの成果をもとに、高効率発現、変異導入による高親和性クローン選択などの基盤技術確立を進める。今後は、VHHライブラリーを用いた結合クローン選択、変異導入による高親和性クローン取得、VHHクローンの高効率合成のために試薬・キット類を多く使用する予定であり、そのために研究費を使用する。