hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
星形成領域における炭素鎖分子の化学進化とメカニズム

当該年度では、2本の査読論文を出版した。太陽より8倍以上重い星である大質量星の誕生直後の暖かいガスの中の化学組成について、今まではあまり着目されていなかった、炭素原子が複数連なった炭素鎖分子の化学について調べてきた。アメリカのVery Large Array干渉計を用いて、大質量原始星周辺において、炭素鎖分子のシリーズの一つである、シアノポリインシリーズ(HC3N, HC5N, HC7N)の空間分布を調べる観測を行った。この観測結果から、シアノポリインは、JCMT望遠鏡のSCUBAで得られた450μmの暖かいダストの空間分布とよく一致することがわかった。また、Spitzerの赤外線のイメージと合わせ、このダストの中には、誕生直後で深く埋もれた、中小質量原始星あるいはその集団があるのではないかと推測した。以上の結果より、シアノポリイン分子が暖かいガスの中で、ダストから昇華してきたCH4やC2H2を元にして生成している可能性を示唆した。さらに、大質量原始星由来のアウトフローの部分にコンパクトなシアノポリインの分布も発見した。国立天文台野辺山宇宙電波観測所の45m望遠鏡とチリ観測所のASTE望遠鏡を用いて、3つの大質量原始星の観測を行った。3天体の化学組成の比較を行い、有機分子が豊富なコアを持つ天体はメタノールを多く含む暖かいエンベロープに、有機分子が少ないコアはHC5Nが豊富な暖かいエンベロープに囲まれているとわかった。これは大質量原始星周辺の化学的多様性の可能性を示唆するものである。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。国立天文台野辺山45m望遠鏡を用いて、大質量星形成領域の17個の星なしコアと28個の星ありコアの炭素鎖分子、HC3N, CCS, cyclic-C3H2、及びN2H+のサーベイ観測を実施した。大質量星形成領域での化学進化の指標の確立を目的としたものである。HC3N/N2H+の存在量比は増加することがわかった。これは、大質量星形成領域では、温度が高いため、ダストから昇華してくる分子であるCH4やC2H2がHC3Nを新たに生成しているためと考えられる。この結果について議論するため、アメリカのハーバード-スミソニアン天体物理学センターの共同研究者を2週間訪問し、投稿論文としてまとめる準備を行った。野辺山45m望遠鏡を用いて、2つの中小質量星形成領域の星なしコア、L1521B及びL134N、のHC3Nの13C同位体分別の観測を行い、それぞれの天体におけるHC3Nの主要な生成経路を調べる観測を行った。その結果、L1521BではC2H2とCNの反応、L134NではCCHとHNCの反応がそれぞれ優位であることがわかった。先行研究では、TMC-1の観測が行われており、C2H2+CNが優位であることが知られていた。これら3天体はいずれも物理環境が似ているにも関わらず、このような違いが見られた理由として、コアの年代が関わる可能性を化学反応ネットワークシミュレーションを用いて示した。アメリカのVery Large Array干渉計で得られたG28.28-0.36の大質量星周辺のHC3N, HC5N, HC7Nの観測結果の解析を行い、他望遠鏡のアーカイブデータと合わせることで、暖かい領域にこれらの炭素鎖分子が存在しているか調べた。本年度は、学位論文の執筆に加え、当初予定していた論文数より多く投稿することができ、4本を投稿論文として出版した。学位論文にまとめた内容で、まだ投稿論文として未出版の研究について、投稿論文としてまとめるのを優先して進めていく。アメリカのVery Large Arrayを用いた炭素鎖分子の高空間分解能観測の結果、野辺山45m望遠鏡を用いて行った大質量星形成領域のサーベイ観測の化学進化についてまとめる。

また、ALMAのアーカイブデータを使った大質量星形成領域の分子の空間分布の比較について、現時点では解析を行った段階であり、今後、議論の方向性を決め、論文としてまとめることを目標に進める。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
口腔癌治療における口腔内細菌叢の解析と周術期管理への応用

口腔がん患者に特徴的な口腔細菌叢の有無と、この細菌叢が口腔がん治療に伴ってどのように変化するかを周術期に採取した唾液検体について検討した。検体から得られた細菌数は治療開始前で最も多く、化学放射線治療中で最も少なかった。細菌叢の構成は、化学放射線治療によってNeisseria属、Rothia属の構成比率が高まっていることが示唆された(T-RFLP法)が、Ion PGMを用いて分析したところ、Neisseria属、Rothia属の構成比率の増加は統計的に有意ではなかった。化学放射線療法および手術が口腔細菌叢に及ぼす影響は治療の影響は有意ではなく、個人によって異なることが示唆された。口腔癌治療において放射線療法や化学療法が口腔内の細菌叢にもたらす影響の有無を明らかにするために、加療を行った口腔癌患者において術前治療ならびに周術期に採取した唾液を材料として口腔内細菌叢の細菌構成の変化について解析を行った。口腔癌患者よりそれぞれ治療開始前(A期)、放射線化学療法治療中(B期)、手術直前(C期)、術後の経口摂取開始後(D期)の4つの時期の唾液検体を採取し、含まれる細菌構成の解析法には16S rRNA遺伝子を用いたterminal restriction fragment length polymorphism(T-RFLP)法を用いた。比較的検体の採取条件が一定した5名の患者から得られたT-RFLPピークパターンから、口腔癌の周術期に口腔フローラの細菌構成の大きく変化する傾向が認められた。その変化の度合いはA期とB期の間で最も大きく、その後C期を経て手術後に経口で食事を開始するD期にかけてA期(治療開始前)のパターンに復元していく傾向が認められ、放射線化学療法が常在細菌叢の一時的な破綻をもたらしている可能性が示唆された。とくにNeisseria、Haemophilusに相当するピークの全体のピーク面積に対する比率は、どの被験者においてもA期からB期にかけて増加し、B期からC期にかけて減少しており、これらの菌種が放射線・化学療法ないしそれに伴う粘膜炎と関連している可能性が考えられる。次年度以降は被験者数を増やしデータの精度を高めていくと同時に、放射線化学療法治療中の粘膜炎の重篤度と菌叢変化との関連について検討を行っていく予定である。本年度は口腔癌患者7名より、周術期における4つの時期(治療開始前(A期)、放射線化学療法治療中(B期)、手術直前(C期)、術後経口摂取開始後(D期))において唾液検体の採取を行った。これに前年度採取した5例を加えた12名分の検体について細菌16S rRNA遺伝子を用いたTerminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP)法にて解析した。得られたT-RFLPピークパターンをもとに細菌叢構成の比較を行ったところ、治療開始前の細菌叢構成と原発腫瘍の存在部位(舌、歯肉、口底)とのあいだに関連は認められなかった.前年度の5検体から示唆された治療開始前(A期)から放射線化学療法治療中(B期)にかけての細菌叢構成の変化の度合いが最も大きく、経口摂取開始後(D期)にかけて治療開始前(A期)のパターンに復元していく傾向は検体数を増やした今年度においても保持されており、放射線・化学療法が口腔常在細菌叢の構成をもたらしている可能性が支持された。一方で重篤な粘膜炎症を引き起こす患者に特有の細菌構成ないし細菌叢変化の明確なパターンはいまのところ検出されていない。本年度は口腔癌患者より採取した口腔細菌叢検体についてIon PGM(Life Technologies社)を用いた16S rRNA遺伝子のの塩基配列解析により細菌構成の変動について検討を行った。口腔がん治療を行った13名の周術期4点(治療開始前(A期)、放射線化学療法治療中(B期)、手術直前(C期)、術後経口摂取開始後(D期))の検体についてIon318 chipを用いて解析を行ったところ、644,628リードの16S rRNA遺伝子塩基配列が得られた。各検体から検出されるOTU(菌種)数は治療開始前(A期)から手術直前(C期)について有意な変動は認められなかった。細菌構成類似度指標UniFracを用いた解析からは各検体から検出される細菌種の構成変動が被験者間の細菌構成の違いに比べ小さなものであることが示唆された。各菌属の構成比率はStreptococcusが24.7±14.4%と最も優勢であり、続いてNeisseria、Prevotella、Porphyromonas、Rothia、Veillonella、Gemellaといった菌属が高比率検出された。治療開始前(A期)から手術直前(C期)にかけてNeisseria属、Rothia属の構成比率に増加する傾向は認められたものの統計的に有意な変動をしめす菌属は認められなかった。

本研究期間内の結果からは、口腔がん周術期における細菌構成について特徴的な変動を示すことはできず、化学放射線治療および手術における口腔細菌叢に対する影響は患者個々によって異なることが示唆された。本年度は口腔癌患者12名より、周術期4点(治療開始前(A期)、放射線化学療法治療中(B期)、手術直前(C期)、術後経口摂取開始後(D期))に採取した唾液検体について定量PCR法を用いた総細菌数の変動について検討を行った。周術期4点のうち、治療開始前(A期)の細菌数は10を底とした対数値で7.7±0.3と最も高く、特に放射線・化学療法治療中(B期)の6.8±1.2と術後経口摂取開始後(D期)の7.2±0.6との間には有意な傾向(p<0.1)が認められた。一方で口腔内総細菌数の大小は腫瘍の部位(歯肉癌、舌癌、口底部癌)および放射線・化学療法後の粘膜炎症の重篤度との間に関連は認められなかった。加えて前年度行ったT-RFLP法を用いた細菌叢の変化について解析ソフトウェアTRFMAWを用いて系統学的な分析を行ったところ、多くの被験者で大きな変動が認められたA期からB期にかけて特に分子量64900及び73500に相当するピークの面積比率の増加が認められていることが明らかとなり、放射線・化学療法によってNeisseria属、Rothiaの構成比率の増加がおこっている可能性が示唆された。現在までの達成度としてはやや遅れているが、25年度は検体保存について細心の注意を払いながらさらなる収集を行うとともに、細菌構成の変動について従来行ってきたT-RFLP解析に加え近年開発された16S rRNA遺伝子バーコードパイロシーケンス法を用いて詳細な解析を行っていく。本手法で得られた解析結果については研究分担者がこれまでに開発したR,PHPによる解析環境とオープンソースソフトウェアを利用した解析系を用いる。これについてはさらなる改良と高速化も行っていく。平成23年度は、検体収集症例数が予想より少なかったために、細菌叢構成内容ならびに周術期における検体採取時期による細菌叢の傾向を十分に見いだすまでに至らなかった。25年度が最終年度であるため、記入しない。24年度は前年度に行った細菌構成についての検討に加えて細菌量についての分析を行い、口腔癌治療に伴う変動について明らかにすることができ、また研究分担者が開発した解析ソフトウェアを用いることで構成変化の系統学的情報を明らかにすることができた。さらに臨床症状に関するデータについてデータベース化を行った。一方で採取した検体の保存に関するトラブルがあったことから解析検体数を大きく増やすことができなかったことから達成度は「やや遅れている」と判断した。23年度末から検体採取態勢を改めており、24年度にかけて検体採取症例数は増加することが見込まれ、分析にたえるものと予想する。当科における年間の口腔癌患者数は分析に耐えるだけの症例数がある。また、24年度後半からは関連する学会などで結果発表を行ってゆくことも考えている。
配偶子の雌雄分化の分子基盤

テッポウユリの生殖核に特異的ならびに豊富な6種類のタンパク質の部分配列を決定したとともに、それらを抗原としてラットに免疫し、それぞれの抗血清を得た。これらの抗体を用いて、(1)雄性配偶子分化との相関、(2)雌性配偶子分化での発現、(3)種を越えた普遍性などを調査するとともに、(4)雄性配偶子特異的遺伝子の単離を試みている。まず、3種の生殖核特異的タンパク質は、正常な花粉発生をコルヒチンによって阻害されて生じた一細胞性花粉や均等な二核をもつ花粉、あるいは雌性配偶子形成過程においては出現しないことから、いずれも雄性配偶子分化に直結したものであると判断された。ただし、同様な核タンパク質はユリ以外では検出されていない。特異的抗体を用いた遺伝子の単離[研究協力者:上田健治(秋田農短大・生工研)]においては、すでにポジティブなクローンがいくつか得られており、その一部は生殖核特異的タンパク質をコードするcDNAであることが明らかとなっている。一方、3種の生殖核豊富タンパク質(ヒストンH1様)の花粉以外での存在を間接蛍光抗体法によって調査したところ、そのうちの一つは花粉発生時の核小体(仁)に、もう一つは減数分裂時の動原体に局在する核タンパク質であることが明らかとなった。これらの抗体は、いずれも高等植物の細胞核の貴重な分子プローブであるだけでなく、生殖過程中にある細胞を特異的に認識するため、これらの核タンパク質の構造、機能を現在調査中である。
非平衡系におけるパターンの時間発展に関する研究

非平衡系におけるパターンの時間発展に関する研究として、非一様反応拡散系における非線形活性波の屈折と、粘性指状体(viscous fingering)の分岐現象について解析を行った。反応拡散系は、生物学的興奮組織(神経系)や化学反応系における様々な不安定現象を解析するモデル方程式として重要である。特に現実の自然界におけるこれらの現象には、必ず何らかの非一様性が存在するが、これまで非一様反応拡散系における波の伝播はほとんど調べられてこなかった。本研究では、2次元2成分反応拡散方程式を基本方程式として採用し、濃度の極端に違う媒質中における非線形活性波の屈折について数値解析を行った。その結果、入射領域における波の速度が透過領域における波の速度よりも大きい時には、Snellの法則が成り立っていることが確かめられた。また、入射領域の速度の方が小さい時には、系が双安定状態から興奮状態へと遷移し、透過領域に入射波とは全く別の形状をもった新たな波が生じることがわかった。放射状Hele-Shaw cellにおいて、グリセリンや高分子溶液などの高粘性流体を空気で置換すると境界の分岐現象がおこる(viscous fingering)。非平衡系におけるパターンの時間発展に関するもうひとつの研究として、viscous fingeringにおける分岐現象の解析を行った。本研究では、境界における系のエネルギー変分を考察することによって、境界条件そのものの不安定性とそれによって生じるfingerの分岐のメカニズムを明らかにした。解析ではまず、境界面の無限小変位を考え、その変位に要する仕事を計算した。この仮想仕事における第一変分から、境界における流体の圧力は表面張力に比例する、というよく知られた境界の熱力学的平衡条件式が得られる。分岐後の境界のふるまいを見るために、第二変分まで計算し、その極値化を行った。その結果、第一変分から定まった境界の形状は不安定であり、初期に円から出発したとしても、放射状Hele-Shaw cellにおけるfingerは分岐を起こし、分岐後はfingerの進行方向が変わるという実験的事実が確かめられた。
グラム陽性球菌が保有する宿主接着機構の伝染性牛乳房炎発症への関与の解析

牛の乳房炎は、酪農経営においてもっとも大きな経済的損失を与える疾病の一つである。最近のゲノムシークエンス等の研究成果から、伝染性牛乳房炎の主要な原因菌であるStaphy lococcusaureusおよびStreptococcus agalactiaeは、他のレンサ球菌で宿主細胞への接着に関与することが明らかになっている接着因子の相同体(GspB相同体)を保有していることが明らかとなってきた。そこで本研究課題では、S. aureus及びS. agalactiaeが保有するGspB相同体の牛乳房炎発症への関与の可能性について検討した。平成19年度は、初年度に作製したS. aureusのGspB相同体遺伝子破壊株を用いて、マウス乳房炎モデルでの感染実験および培養ウシ乳腺上皮細胞への付着試験を行った。その結果、S. arueusのGspB相同体遺伝子を破壊しても泌乳中のマウスの乳腺組織内での定着性や培養ウシ乳腺上皮細胞への付着能に影響がないことが明らかとなった。また、日本で乳房炎の原因となるS. aureusの主要な莢膜血清型は5型と8型であるが、今回調べたバルク乳由来S. aureus株のうち、血清型8型の全ての株でGspB相同体が発現していなかった。これらの結果から、S. aureusのGspB相同体は菌の乳腺組織への定着には重要な因子ではないことが示唆された。最近のゲノムシークエンス等の研究成果から、伝染性牛乳房炎の主要な原因菌であるStaphylococcus aureus及びStreptococcus agalactiaeは、他のレンサ球菌で宿主細胞への接着に関与することが明らかになっている接着因子の相同体(GspB相同体)を保有していることが明らかとなってきた。本研究課題では、S.aureus及びS.agalactiaeが保有するGspB相同体の牛乳房炎発症への関与を明らかにするために、乳房炎由来株を収集し、GspB相同体の遺伝子の保有状況及び発現の有無について調べた。その結果、乳房炎由来株の多くの株がGspB相同体の遺伝子を保有しており、半数以上の株で細胞表層にGspB相同体が発現していることが明らかになった。また、今回調べた乳房炎由来株では、保有するGspB相同体に大きな配列上のバリエーションは認められなかった。そこでGspB相同体を発現しているS.aureus株及びS.agalactiae株を1株ずつ代表株として選択し、遺伝子破壊株を作製した。また、GspB相同体のレコンビナントタンパク質を大腸菌で発現させ、精製したタンパク質を用いて抗血清を作製した。今後はこれらの遺伝子破壊株やレコンビナントタンパク質を用いて、GspB相同体が牛の細胞・組織に対して結合能を有しているか否かについて調べる予定である。
セラミックスを内包するマイクロクローズドセル構造金属材料創製技術の開発

(1)放電プラズマ焼結法を用いたセラミックス内包クローズドセル構造金属材料作製法粉末試料に大電流をパルス状に引加しながら荷重を作用させ、放電あるいは通電による加熱によって粉末を焼結することのできる放電プラズマ焼結法を用いて、クローズドセル構造金属材料作製を試みた。セラミックス粒子に無電解メッキによりNi-P合金をコーティングし、放電プラズマ焼結法を用いて焼結した。セル構造は荷重方向に対して垂直な方向に楕円形に変形したが、セル構造を有することができた。またグリーン体作製が可能な場合は、放電プラズマ焼結時にグリーン体とダイとの間に硬いセラミックスの粒子を充填させて、疑似的に静水圧状態で焼結する手法も開発した。(2)金属コーティング多孔質セラミックス粒子を用いたクローズドセル構造金属材料作製法変形し易いセラミックスとしてアルミナやチタニアなどの多孔質のセラミックス粒子にNi-P合金をコーティングし、これを静水圧加圧後に真空中で加熱焼結する方法と放電プラズマ焼結法を用いて焼結することにより、セラミックス粒子を内包するクローズドセル構造金属材料を作製した。比較材として、変形し難いジルコニア粒子に金属をコーティングして同様な手法で焼結を試みた。変形し難いジルコニア粒子においては静水圧下でグリーン体を作製することができないため、静水圧負荷後の真空焼結法では本クローズドセル構造金属材料の作製することはできず、放電プラズマ焼結法のみ作製することができた。また、放電プラズマ焼結法を用いると10×20×1mmほどの小さな試料も作製できた。(3)作製したクローズドセル構造材料の評価3点曲げ試験においてはアルミナ等の多孔質粒子を用いたものが高い強度を示し、またセル構造の形態と強度との関係は、セル構造が複雑なほど高い強度を示した。(4)小型試料の作製矩形型のグラファイトダイおよびパンチを用い、放電プラズマ焼結法により幅:数mm、長さ:十数mm、厚さ:13mmの小型矩形型試料を作製し3点曲げ試験による強度を評価した。セラミックスを内包するクローズドセル構造金属材料作製法の開発従来開発したクローズドセル構造金属材料作製法は、内包させたい材料の比較的大きさのそろった粒子に金属をコーティングし、これをカプセルに充填して静水圧加圧により成形体(グリーン体)を作製し、これを高温に加熱しセル壁同士を接合させて作製した。セラミックスは非常に硬く、また、もろいためにこの手法では静水圧加圧によりグリーン体を作製することができず、クローズドセル構造金属材料を作製できなかった。そこで本提案では、放電プラズマ焼結法を用いて、グリーン体を作製せずクローズドセル構造金属材料を作製することを試みた。本年度は、直径100μmのジルコニア粒子にNi-P合金をコーティングし、静水圧加圧後の高温焼結法および放電プラズマ焼結法により焼結を試みた。ジルコニアは硬く、静水圧加圧により成形体を作ることができなかった。放電プラズマ焼結法では、Ni-P合金同士が焼結しセル壁をなすが、ジルコニア粒子は多面体には変形せず、不完全なマイクロクローズドセル構造材料であった。また本方法は、一方向から荷重をうけるために粒子が荷重方向に対して垂直方向に扁平になる。

そこで、放電プラズマ焼結法で短時間焼結し成形体を作製した後、放電プラズマ焼結装置を用いた静水圧加圧法(特許願2002-368987)により再度焼結する手法も試みた。(1)放電プラズマ焼結法を用いたセラミックス内包クローズドセル構造金属材料作製法粉末試料に大電流をパルス状に引加しながら荷重を作用させ、放電あるいは通電による加熱によって粉末を焼結することのできる放電プラズマ焼結法を用いて、クローズドセル構造金属材料作製を試みた。セラミックス粒子に無電解メッキによりNi-P合金をコーティングし、放電プラズマ焼結法を用いて焼結した。セル構造は荷重方向に対して垂直な方向に楕円形に変形したが、セル構造を有することができた。またグリーン体作製が可能な場合は、放電プラズマ焼結時にグリーン体とダイとの間に硬いセラミックスの粒子を充填させて、疑似的に静水圧状態で焼結する手法も開発した。(2)金属コーティング多孔質セラミックス粒子を用いたクローズドセル構造金属材料作製法変形し易いセラミックスとしてアルミナなどの多孔質のセラミックス粒子にNi-P合金をコーティングし、これを静水圧加圧後に真空中で加熱焼結する方法と放電プラズマ焼結法を用いて焼結することにより、セラミックス粒子を内包するクローズドセル構造金属材料を作製した。比較材として、変形し難いジルコニア粒子に金属をコーティングして同様な手法で焼結を試みた。変形しにくいジルコニア粒子においては静水圧下でグリーン体を作製することができず、静水圧負荷後の真空焼結法では本クローズドセル構造金属材料の作製することはできず、放電プラズマ焼結法のみ作製することができた。3点曲げ試験においてはアルミナ等の多孔質粒子を用いたものが高い強度を示し、またセル構造の形態と強度との関係は、セル構造が複雑なほど高い強度を示した。また、放電プラズマ焼結法を用いると10x20x1mmほどの小さな試料も作製できた。セラミックスを内包するクローズドセル構造金属材料作製法の開発としては、加熱焼結ではなく放電プラズマ焼結法を用いてグリーン体を作製せずクローズドセル構造金属材料を開発した。セラミックス粒子に電解メッキによりNi-P合金をコーティングし、これを放電プラズマ焼結法を用いて金属コーティング粒子のコーティングしてある金属同士を焼結させて作製する。この方法は、一方向から荷重をうけるために粒子が荷重方向に対して垂直方向に扁平になる。そこで静水圧加圧して成形体を作製した後に、放電プラズマ焼結装置を用いて擬似的に静水圧を付加する方法を用いて焼結し、扁平化せず比較的正多面体に近い形状のセル構造を有するクローズドセル構造金属材料を作製した。また、変形の容易なセラミックスとしてTiO_2などの多孔質のセラミックス粒子にNi-P合金をコーティングし、これを放電プラズマ焼結法を用いて加圧焼結すると、加圧中大きな変形を受け、セラミックス粒子とコーティング金属界面近傍が大きく変形し、大きな面積でコーティング金属同士が接触し、セラミックスを内包するクローズドセル構造金属材料を作製した。さらに、セラミックス粒子として凹凸があるアルミナの非真球粒子に金属をコーティングし、これを放電プラズマ焼結法を用いて焼結して、アルミナ内包クローズドセル構造金属材料を作製した。また、矩形型のグラファイトダイおよびパンチを用い、幅:数mm、長さ:十数mm、厚さ:13mmの小型矩形型試料を作製し三点曲げ試験による強度を評価した。
網羅的スキンブロッティング法による「褥瘡予測タンパク質」の探索と臨床応用

本研究の目的は、皮膚内部のタンパク質を網羅的に分析可能な「網羅的スキンブロッティング法」を用いて、褥瘡(いわゆる床ずれ)の発症を予測できるバイオマーカーを探索し、そのバイオマーカーを用いた褥瘡予測可能性を実証することである。対象として、褥瘡を起こすリスクの高い高齢者(たとえば療養型施設に入所している寝たきりの高齢者など)を選定した。同意を得た上で対象者から皮膚内部タンパク質を非侵襲的に回収し、その後縦断的に皮膚を観察することにより褥瘡の発症を追跡、発症群と非発症群のタンパク質プロファイルを比較することで、褥瘡発症に特有のタンパク質(褥瘡バイオマーカー)を見つけ出すことが計画である。初年度には臨床でのタンパク質サンプルを集め分析をする予定であったところ、臨床サンプルは徐々にではあるが集まりつつある。しかしその最中、本学に新たな分析方法(プロテオミクス分析装置)が導入・利用開始され、その装置が利用できれば本研究の効率が飛躍的に向上すると考えた。具体的には、分析可能なタンパク質の種類が文字通り「桁違い」になると考えられた。そこで、当初予定していた臨床サンプルの分析を一度停止させ、今一度分析手法の検討を実施することとし、その確立を論文化を目下の課題と設定した。そのため、臨床サンプルの分析を二年次以降にすることとし、新たな分析手法の確立を先んじて実施することを優先させ、現在その研究を遂行中である。臨床でのタンパク質サンプルの回収は予定通り進んでいるが、その分析手法を改良するための研究を開始し、その進捗がやや遅れている。全体として、当初予定よりやや遅れていると判断した。今後は、早急に新たな分析方法の確立(または、新たな分析装置が本研究の目的に適していないと判断された場合は旧来の方法に立ち戻る)を行い、臨床サンプルの分析を進める。
フォーカストアレイ分析による脂肪肝炎発症メカニズムの解析と食品の影響評価

脂肪肝は肝癌や肝硬変につながる肝炎の危険因子で、肥満に伴う非アルコール性脂肪肝の増加が問題となっている。本研究では多因子が影響する肝炎発症メカニズムの解析と食品成分による予防研究のため、これを可能にする動物モデルの構築と解析法について検討した。高脂肪食摂取で血漿肝障害マーカーの増大と脂肪肝が見られたラットの肝臓mRNAをフォーカストアレイ解析に供したところ、初期の炎症サイトカインの発現上昇と、抗酸化系経路への影響が観察された。これらの結果は多因子が影響し合う肝炎発症メカニズの研究への、フォーカストアレイ解析の応用の有用性を示しており、さらなる検討により肝炎発症機序解明が可能になると期待される本研究は食品成分による非アルコール性脂肪肝炎抑制をめざし、非アルコール性脂肪肝から脂肪肝炎への進展過程を再現した実験動物モデルの作出と、フォーカストアレイによる脂肪肝炎進展時の遺伝子発現群の変化の解析を目的とする。数百から数十程度の特定の遺伝子を、高精度に解析するフォーカストアレイは、再現性・信頼性が高い特定の目的に特化した解析が可能である。一方で、解析可能な遺伝子数が少ないため、研究目的に合致した遺伝子を搭載する必要があるが、脂肪肝および脂肪肝炎発症関連遺伝子に特化した市販チップは存在しない。H27年度は脂肪肝から肝炎へ進展する過程で関連する遺伝子群について精査し、190の関連遺伝子を搭載したラット専用のフォーカストアレイカスタムチップの作成を行った。すなわち、肝臓での中性脂肪の取り込み、運搬、生合成、分解系、分泌系に関わる蛋白および各調節因子の遺伝子に加え、解糖・糖新生、インスリンシグナル、酸化ストレス、炎症マーカー関わる遺伝子群のリストアップを行い、フォーカストアレイカスタムチップを作成した。さらに、近交系アルビノラットのF344ラットを脂肪肝モデルとして利用するための条件検討を行った。すなわち、F344ラットを高脂肪食または普通食、あるいは飼育開始週齢が異なる高脂肪食で一定期間飼育し、麻酔下の腹部大静脈採血により血漿を得るとともに、主な組織重量を測定後、肝臓、脂肪組織を採取し、試験に供した。その結果、飼育開始週齢が5ヶ月齢のラットで有意な肝臓脂質の上昇が観察された。本年度は当初目標としていた肝臓での中性脂肪の取り込み、運搬、脂質生合成・分解系、解糖・糖新生、インスリンシグナル、酸化ストレス、炎症マーカーに関連する遺伝子群のリストアップを行い、フォーカストアレイカスタムチップ作成した。さらに、予備的に動物試験を行い、飼育開始週齢が高い条件で肝臓の脂質蓄積かみられた。以上のとおり、おおむね計画通りに研究が進展していると言える。平成27年度はフォーカストアレイカスタムチップの作成と、本チップの評価に必要な高脂肪食摂取脂肪肝モデルラットの作成条件の検討を行った。その結果、高脂肪摂取群で内臓脂肪の蓄積がみられたものの、予想に反し、得られた血漿および肝臓の脂質関連データおよび肝障害マーカーに差はみられなかった。そこで、28年度は、飼料条件および飼育開始週齢の再検討を行ったところ、この飼育開始週齢の高いラット(成熟ラット:飼育開始時20週齢)に多価不飽和脂肪酸含量の高い飼料を与えた場合に、肝臓への脂質蓄積が観察された。さらに、肝臓でのリン脂質過酸化(酸化ストレスの上昇)も観察され(J. Oleo Sic., in press)、脂肪肝から肝炎への進展を再現した実験動物モデルとしての可能性が示唆された。また、成熟ラットは対照の若齢ラット(飼育開始時6週齢)より有意に高いALT値を示したので、これらのラットについてフォーカストアレイによる解析を行った。その結果、飼育時週齢の高いラットでは、対照に対してMCP-1, IL1-aといった炎症系サイトカイン等の炎症関連遺伝子量の増加と、Keap1、Nfe2l2、G1、GPX2といった抗酸化関連遺伝子量の低下が観察された。一方、IL10, Tgfb1, TNFなどの炎症系サイトカインやNOS2といった炎症時に発生する酵素の遺伝子量は群間で差はなく、低値であったことから、今回使用した高脂肪食成熟ラットの肝臓は脂肪肝炎の初期段階であることが示唆された。これらの成果はフォーカストアレイチップの有用性を示すものである。これらの結果は多因子が影響し合う肝炎発症メカニズの研究への、フォーカストアレイ解析の応用の有用性を示しており、さらなる検討により肝炎発症機序解明が可能になると期待される平成28年度は作成したモデル動物の詳細な生化学データに測定と解析を進め、選抜した試料について、DNAアレイによる肝障害関連遺伝子群の網羅的発現解析を行う。試験飼育開始時および普通食給与ラットとの発現比の比較から、高脂肪給与による脂肪肝モデルにおいて顕著に変化する遺伝子を抽出し、PCR法による遺伝子発現解析によるデータの再現性の検証を行う。また、主要な変化が観察された蛋白については、ウエスタンブロット法による定量も行う。

食品学研究が順調に推移していたため、次年度予定していたフォーカストアレイ解析の一部を年度末に前倒しで実施することを検討したが、得られたデータの解析の結果、解析に使用する実験群の再検討が必要になったため、実施しなかった。H27年度に実施しなかったフォーカストアレイ解析を予定通り実施する。
光異性化分子による有機ナノ結晶の配向制御と有機薄膜太陽電池への応用

レーザーアニール法は、アモルファスシリコンからポリシリコンへ変換する技術として既に実用化されているが、有機系薄膜材料への応用展開は未だ十分な検討がなされていない。本研究では、プリンテッドエレクトロニクスへの関心とともに注目されている有機熱変換材料に対してレーザーアニール法を適用し、ナノ構造を制御した有機薄膜の作製やパターニング技術について検討した。その結果、有機EL画素の微細パターニングや配向制御による有機薄膜太陽電池の高効率化に成功し、プリンテッドエレクトロニクスの共通基盤技術に成り得ることを実証した。コンタクトプリント法はシリコーンエラストマーをスタンプとして用いる印刷技術であるが、ぬれ難いスタンプ上へ成膜する際にはUVオゾン処理等の表面改質が必須である。しかし、従来の表面改質法ではスタンプからの膜剥離が困難となるため、成膜性と剥離性を両立した新たな表面改質法が望まれている。当該年度では、共有結合によるスピロピランのシリコーンエラストマーへの導入を試み、ぬれ性の制御やスタンプ特性に関して検討した。オレフィン末端基を導入したスピロピラン(SPh)を合成した。一方、ポリジメチルシロキサン(PDMS)上にポリメチルヒドロシロキサン(PMHS)をスピンコートし、熱硬化させてPDMS上にPMHS膜を作成した。その後、白金触媒を含有するSPhトルエン溶液にPMHS/ PDMS膜を浸漬して、PMHSとのヒドロシリル化反応によりPDMS上にSPh修飾PMHSを得た。作成したSPh-PMHSの透過FT-IRスペクトルにおいて、SPhの末端二重結合に基づくピークが消失したことから、PMHSにSPhが共有結合により導入されたことが示唆された。また、SPh-PMHSの静的接触角と前進接触角では光異性化前後における変化は認められなかったが、後退接触角ではSP体表面で75°、PMC体表面で49°と光異性化前後で大きな差異がみられた。異方構造をもつ分子材料の光・電子機能は、分子相互の空間的配置により著しく変化するため、有機分子の本来持っている物性を期待どおりに引き出すには分子配向を含めた高次構造を精緻に制御する必要がある。有機薄膜太陽電池の高効率化には、膜中における有機ナノ結晶の配向を厳密に制御することが必須である。真空蒸着法などのドライプロセスではエピタキシャル成長などを利用した有機ナノ結晶の配向制御が可能であるが、塗布形成における有機ナノ結晶の配向制御は容易ではない。当該年度は、局所的なレーザー加熱法による有機ナノ結晶の配列・配向化を検討した。熱変換前駆体をスピンコート法により成膜し、線状に集光した赤外レーザーを薄膜上部から一方向に走査することで薄膜全面を加熱した。レーザーの走査に伴い、センチメートルオーダーの範囲で方位の揃った大面積一軸配向膜を得ることができた。レーザー照射による急峻な熱勾配の方向と分子間のπ-π相互作用の方向が一致するように分子カラムを形成して高度に配向することが明らかになった。レーザー加熱法によって膜中のナノ結晶の配列・配向を制御することに成功した。有機薄膜太陽電池の高効率化には、膜中における有機ナノ結晶の配向を厳密に制御することが重要である。前年度までに、p型半導体特性を示す熱変換前駆体材料を対象とし、レーザー加熱法を用いて有機ナノ結晶の配列・配向化について検討した。その結果、センチメートルオーダーの広範囲で方位のそろった一軸配向膜を得ることに成功した。しかし、デバイス化には、透明電極上で一軸配向膜を形成する必要があり、通常透明電極として用いられるITO/ガラス基板では赤外線を強く反射するため、前駆体の熱変換、並びに、一軸配向膜の形成が困難である。そこで、当該年度は、ガラス側(裏面)から赤外線レーザーを照射することで、前駆体を熱転化する新たな方法を検討した。吸収スペクトル測定及び偏光顕微鏡観察によって、裏面照射した試料が熱変換し、大きなドメインを形成する様子が確認できた。また、電子線回折の結果、ガラス基板上と同様な一軸配向膜を形成していることが判明した。更に、pn接合型の有機薄膜太陽電池を作製するために、n型半導体、及び、上部電極を形成した。作製したデバイスの電流電圧特性を評価したところ、良好な太陽電池特性を示すことが分かった。変換効率(PCE)は1.10%と算出され、pn接合型の有機薄膜太陽電池としては高い値を示した。裏面照射することで透明基板上で一軸配向膜の形成が可能となり、有機薄膜太陽電池への実装にも成功した。レーザー加熱法を用いることで、当該年度に予定していた有機ナノ結晶の配列・配向制御における目標は達成できたが、スタンプを用いた親疎水のパターン形成による選択的な結晶核生成とエピタキシャル成長については更なる検討が必要なため。27年度が最終年度であるため、記入しない。

半導体工学当初の計画通り、高効率な有機薄膜太陽電池を目指して、配向制御した有機ナノ結晶の物性を評価し、デバイスの活性層として実装を行う。当該年度に予定していた共有結合によるスピロピランのシリコーンエラストマーへの導入及び光異性化前後の静的・動的接触角評価などを中心とした基本計画はおおむね達成できたが、スタンプ上での成膜や基板への転写などのスタンプ特性についてはさらなる検討が必要なため。27年度が最終年度であるため、記入しない。効率的な予算の執行により生じた。当初の計画通り、理想的な界面制御技術とナノレベルでの結晶成長制御技術の融合を目指して、表面エネルギーの制御による選択的な結晶核生成やエピタキシャル成長による有機ナノ結晶の配列・配向化に挑戦していく。次年度の研究を遂行する上で必要な消耗品の充実にあてる。
抗ミューラー管ホルモンを用いた新しい繁殖管理技術の開発

黒毛和種ウシにおける抗ミューラー管ホルモン(AMH)をバイオマーカーとした新しい繁殖管理技術の開発を行うべく、春機発動期および周産期における血液中のAMHの動態と、AMHと春機発動時期や分娩後の繁殖成績との関係性について検討した。その結果、黒毛和種雌ウシの血中AMH濃度は、出生後10週にかけて上昇しその後低下すること、分娩後より妊娠期が高くなることが分かった。また、血中AMH濃度は、春機発動が早期にみられる牛で高く推移すること、分娩後の発情回帰日数と相関性がみられたことから、繁殖機能のバイオマーカーとなる可能性が示唆された。本課題は、黒毛和種雌ウシにおいて、試験1では出生後から春機発動(初回排卵)、試験2では分娩前から分娩後の初回排卵について、同一個体における抗ミューラー管ホルモン(AMH)などの臨床バイオマーカー候補の動態を明らかにし、生時より備わっている繁殖能力や周産期における非生産時の繁殖機能を評価する新しい繁殖管理技術の開発を行う。平成25年度は、試験1において、30頭の黒毛和種育成ウシからサンプルの採取を開始できている。また試験2において、授乳中の黒毛和種雌ウシ12頭(413産、平均6.8産)を供し、分娩の-9週(-9w)、-4週(-4w)、-2週(-2w)、分娩後6日以内(0w)、分娩後2週(2w)、4週(4w)に採血、分娩後1週間間隔で超音波検査を行い、発情回帰(黄体の確認した週)、初回人工授精(AI)日数、初回AI受胎性、受胎までのAI回数、空胎日数を記録した。血中AMH濃度は、-9wの0.10ng/mlと-4wの0.07ng/mlが-2wから4w(0.050.06ng/ml)よりも、血中インスリン様成長因子(IGF)-1濃度は、-9wから0w(79.0115.4ng/ml)が2wと4w(それぞれ56.9、55.2ng/ml)よりも有意に高かった。血中AMH濃度は各週のすべての間で有意な相関(r=0.650.96)がみられ、血中IGF-1濃度は一部に有意な相関(r=0.660.86)がみられた。各週の血中AMHおよびIGF-1濃度と発情回帰、初回AI日数、受胎までのAI回数、空胎日数との相関は、0wの血中IGF-1濃度と空胎日数(r=-0.63)に有意な相関がみられた。よって、妊娠期間中であっても卵巣予備能の指標としてAMHは有用であり、分娩後6日以内のIGF-1はその後の繁殖性の指標として有用であることが分かった。平成26年度は、試験2で目標である50頭の採材を概ね終了し、試験1で40頭の黒毛和種育成ウシについて、出生後0週から60週の隔週にサンプルの採取とともに超音波検査を開始し、12頭について卵胞刺激ホルモン(FSH)およびAMHの解析を行った。0週から60週の間において、FSHは0.31から5.15ng/mlの間で推移し、0週に比べ10週、1830週、36週、38週、4252週で有意に高くなることが分かった。また、AMHは0.01から1.97ng/mlの間で推移し、0週に比べ816週で有意に高くなることが分かった。以上より、顆粒層細胞に作用する下垂体前葉由来のFSHと顆粒層細胞のみから分泌されるAMHでは出生後から春機発動までの動態を異にし、AMHがFSHに先行して分泌レベルのピークを迎えることが明らかとなった。このことは、AMHは、FSHによる制御を必要とせず、出生後早い時期に必要とされる生理的事象の存在が示唆された。この差異が将来的な繁殖性に及ぼす影響について、今後検討していく。本課題は、黒毛和種雌ウシにおいて、春機発動時期(試験1)、周産期(試験2)における抗ミューラー管ホルモン(AMH)の動態を明らかにし、繁殖成績との関係から、AMHによる生時より備わっている繁殖能力や周産期における非生産時の繁殖機能を評価する新しい繁殖管理技術の開発を行う。これまでに、試験1では出生後から春機発動(初回排卵)まで、試験2では分娩前60日から分娩後初回排卵まで、同一個体で継続的に追跡調査し、AMHを含む生理活性物質の動態を明らかにしてきた。本年度は実証試験として、試験1でこれまで得られた知見を基に春機発動時期(初回発情が確認できた週齢)を早期と晩期に分けAMHの動態を比較した。その結果、春機発動が早期にみられたウシは、晩期にみられたウシに比べ出生時から24週まで血中AMH濃度が高く推移することが分かった。一方、試験2でこれまで得られた知見を基に分娩後40日から80日のウシに対しショートシンク法を行い、血中AMH濃度とその後の受胎性を調査したが有意な関係性はみられなかった。

よって、血中AMH濃度は、出生後もっとも濃度が高くなる3カ月齢前後(0カ月から6カ月齢)の時期に測定することで春機発動時期を予測できることが示唆された。黒毛和種ウシにおける抗ミューラー管ホルモン(AMH)をバイオマーカーとした新しい繁殖管理技術の開発を行うべく、春機発動期および周産期における血液中のAMHの動態と、AMHと春機発動時期や分娩後の繁殖成績との関係性について検討した。その結果、黒毛和種雌ウシの血中AMH濃度は、出生後10週にかけて上昇しその後低下すること、分娩後より妊娠期が高くなることが分かった。また、血中AMH濃度は、春機発動が早期にみられる牛で高く推移すること、分娩後の発情回帰日数と相関性がみられたことから、繁殖機能のバイオマーカーとなる可能性が示唆された。試験1および試験2の両試験において、1農場において継続的な採材を行う環境を整えることができている。平成25年度の試験2における解析の開始に加え、平成26年度は試験1においても解析を開始することができた。当初計画では、両試験において目標とされるサンプル数を各50頭としていたことから、概ね順調に材料の採取が開始できており、計画が進展していると考える。獣医臨床繁殖学本研究の最終年度となる平成27年度は、引き続きサンプルの採取を継続して試験1および2の解析をより進めるとともに、新たな繁殖管理技術に相応しい臨床バイオマーカーとその評価時期について検討を行う。また、試験1および2で得られたAMHによる新たな繁殖管理技術を研究代表者らが定期的に繁殖検診を行っている民間農場(9戸)をモデルとした実証試験を行う。飼養環境や血統などの遺伝的要因によるバイオマーカーへの影響を明らかにする他、AMH単体をはじめ、他のバイオマーカー候補との複合による評価も考慮しながら、PDCAサイクルを回し、新たな繁殖管理技術の確立に向けた準備を進めていく。試験1では平成25年度において30頭の黒毛和種育成ウシよりサンプルの採取を開始できており、さらにその内の13頭では超音波検査による卵巣動態の追跡も開始できている。試験2では平成25年度において30頭の黒毛和種経産ウシよりサンプルの採取を開始できており、さらに12頭の解析を行うことができた。当初計画では、平成25年度から平成26年度にかけ両試験において目標とされるサンプル数を各50頭としていたことから、概ね順調に計画が進展していると考える。平成26年度に購入を予定していたプラスチック資材を購入するには不足額が生じたため、年度内での納品が困難となった。平成26年度以降も引き続きサンプルの採取を継続し、試験1および2の解析を進め、新たな繁殖管理技術に相応しい臨床バイオマーカーとその評価時期について検討を行う。また、平成27年度においては、試験1および2で得られたAMHによる新たな繁殖管理技術を研究代表者らが定期的に繁殖検診を行っている民間農場(10戸)をモデルとして、検証を行う。平成27年度での購入を計画し繰越とした。平成25年度に購入を予定していたプラスチック資材(サンプル保存容器)が平成25年度内での納品が困難となった。平成26年度に、改めて発注および購入を予定する。
哺乳類卵子及び受精卵の代謝調節機構と老化メカニズムの解明

代謝調節関連因子であるSirt3に注目し、本研究ではマウスの老化卵子やSirt3欠損卵子、Sirt3過剰発現卵子を解析に用いて代謝と遺伝子発現と卵子の質との関係を明らかにすること、さらにSirt3機能補助による老化卵子の質の改善の可能性を検討すること、Sirt3の活性化方法を探索することを目的とし、発生生物学的な手法及び分子生物学的な手法を用いて研究を行った。研究期間を通じて、Sirt3の発現制御の一端を明らかにするとともに、Sirt3が卵子の老化の抑制に機能し、Sirt3の補助により胚発生能を改善できる可能性を見いだした。この結果は生殖補助医療技術の改善に寄与するものと考えられる。本研究はマウスの老化卵子やSirt3欠損卵子、Sirt3過剰発現卵子などの遺伝子発現状態をRNA-seq法により明らかにして、代謝と遺伝子発現と卵子の質との関係を明らかにする。さらにSirt3機能補助による老化卵子の質の改善の可能性を検討するとともに薬剤などによる活性化方法を探索することを目的としている。26年度は以下の実験を行った。1.作成した生殖細胞特異的Sirt3過剰発現マウスの加齢による排卵数や卵巣内に保存されている卵胞数、受精後の発生率などを検討し、コントロール群に比較しての有意な差を認めた。2.卵巣、卵子内のミトコンドリアDNA(mtDNA)の定量化を行い、老化やSirt3の増減に伴うmtDNAの変動を調べた。一方、mtDNAの欠失に関しては、高頻度で欠失が生じると報告のある部位の検討のみ行っていたが、実際は様々なパターンで欠失が生じており別の方法をとる必要がある。また、欠失ではなく変異の場合もあることから、定量化だけでなくシークエンシングによる変異の検出も必要になる可能性が考えられた。3.加齢およびSirt3の発現量変化に伴う卵子内遺伝子発現変化を調べるためにRNA-seqencingに供試するRNAサンプルを調整した。少数の卵子から得られるRNA量ではmicroarrayに必要な収量が確保できないためRNA-sequencing法を選択した。4.ミトコンドリア呼吸鎖複合体の阻害剤処理による胚発生を検討し、ピルビニウムによる発生阻害は観察したが、より特異性の高いアトペニンによる阻害は見られなかったことから、複合体IIを利用した初期胚の代謝は寄与率が高くない可能性は考えられたが、薬剤の浸透性の違いによる可能性を検討する必要がある。卵子の老化は正常出産率の低下、染色体異常の増加と関連する。その背景に活性酸素種(ROS)やミトコンドリア機能異常などが指摘されているが、その分子メカニズムは未解明な点が多い。近年、我々は脱アセチル化酵素Sirt3がマウス受精卵においてミトコンドリアの機能調節を介した酸化ストレス防御機構に働くことを報告した。成体の老化にROSの関与が指摘されていることから、卵子においてもSirt3が酸化ストレス防御機能を介して品質管理に関与する可能性が考えられた。そこで本研究ではマウスの老化卵子やSirt3欠損卵子、Sirt3過剰発現卵子を解析に用いて代謝と遺伝子発現と卵子の質との関係を明らかにすること、Sirt3機能補助による老化卵子の質的改善の可能性を検討すること、Sirt3の活性化方法を探索することを目的とした。最終年度では、卵子の加齢変化をミトコンドリアの活性及び局在、動原体構造などの変化を指標に評価し、Sirt3を過剰に発現するマウスの老化卵子において、その加齢に伴う質的劣化が抑制され、若齢卵子様に維持されうることを見いだした。また、Sirt3の発現制御に関して、バイオインフォマティクス解析により抽出した候補転写因子群の一部が発現調節に関与する可能性を示す結果を得た。さらに、加齢およびSirt3の発現量変化に伴う卵子の遺伝子発現変化を調べることを目的として、RNA-seqに供試するRNAサンプル調整予備実験を行ったが、特に加齢卵子からのRNAサンプルにおいてRNA-seqに必要な量及びクオリティーを確保することが困難であり条件の改善を行った。研究期間を通じて、Sirt3の発現制御の一端を明らかにするとともに、Sirt3と卵子の加齢変化との関連を示し、Sirt3補助による老化卵子の質的改善の可能性を見いだした。この結果は生殖補助医療技術の更なる向上に貢献するものと考えられる。26年度中に産休、育休のため、研究活動を一時中断したことにより当初の計画に比較してやや遅れが生じた。RNA-sequencingのサンプル調整が完了したため、26年度に予定していた解析を実施し、卵子の老化に関係する遺伝子の抽出を行う。

これまでの研究からSirt3による老化卵子の発生補助の可能性が見いだしたことから、NAD+濃度の変化以外による内因性のSirt3の発現を制御するメカニズムに関しても検討を行い、Sirt3の発現誘導方法を見いだしたい。1) USD Genome Bioinformaticsのデータベースを用いてSirt3の上流領域で種間で保存されている標的配列を絞り込む。また、東京大学先端科学技術センターゲノムサイエンス分野(油谷研究室)の協力のもと、既存のChIP-Seqデータベースからも結合転写因子の候補を絞り込む。(Xiaohui etal.,PNAS.,2007)(Jolma et al., Cell, 2013)。BACライブラリーからクローニングした候補配列をLuciferaseベクターに組み込みLucアッセイを行い、転写の活性または抑制に重要な配列を特定する。2)データベースから絞り込んだ因子及びRNA-seqにて老化により発現変化した転写因子群のなかで、Sirt3と関連のありそうな因子を既存の研究を参考に絞り込み、Sirt3の転写に影響を与えるかどうかを検討するとともに、ChIP法により結合しているかを検討する。3)薬剤によるSirt3の発現誘導法の検討を行う。1),2)で絞り込んだ分子を標的にした薬剤が存在する場合、その処理によりSirt3の発現制御が起こせるのかを培養細胞で検討する。細胞傷害が観察されない場合には卵子は初期胚の倍層培地に添加し、発生や生後の生理状態への影響を検討する。薬剤、特にミトコンドリア代謝関連の薬剤に関しては東京大学北潔教授の助言のもと行う。以上の研究から得られた結果を取りまとめ、成果の発表を行う。26年度中に産休、育休のため、研究活動を一時中断したことにより当初の計画に比較して研究の進度に遅れが生じた。当初の計画では26年度にRNA-sequencingによる解析を行う予定で予算を組んでいたが、27年度にずれ込むことが決定し、充当する計画であった予算を繰り越すことにした。また、妊娠期間中の学会発表や研究会への参加を一部取りやめたため、予算に計上していた支出が生じなかったことも理由として挙げられる。RNA-sequencingのサンプル調整が完了したため、26年度に予定していた解析を実施する。比較したい実験群および実験条件が多岐に渡るため、繰り越した額相当には予算が必要だと考えられる。また、RNA-sequencing以外の実験データが充実してきたため、本年度は論文投稿に向けた準備を始めており、投稿費および掲載費等への予算の充当を計画している。