hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
初期原生代生命圏の高解像度復元を目指した酵素金属微小領域分析の地質試料への応用

約24億年前に起こった大気大酸化事変直後の時代に当たる初期原生代(約19億年前)は,嫌気的生命から好気的生命への進化の過渡期にあり,この時代における海洋環境に対応した微生物活動の解明は,生命進化研究の観点から重要度が高い.カナダ,ガンフリント層には堆積岩中に保存の良い有機物および微生物の化石(微化石)が報告されており,環境-生命が対応した生命圏の復元に適している.環境と生命活動をつなぐ代表的な生体作用が代謝であり,本研究課題では代謝に用いられる酵素を,生物種が特定可能なバイオマーカーとして利用可能なであることを実証することを目標とする.地質調査,鉱物記載,炭素同位体比分析等,いわゆる従来的な地球化学的分析結果と,走査型電子顕微鏡(SEM),透過型電子顕微鏡(TEM),二次イオン質量分析計(SIMS)など最先端微小領域分析装置による分析を組み合わせることで実証的かつ新規性の高い手法を確立することを目指す.平成30年度において,地質調査の結果採取した試料から約19億年前の環境と生態系の対応関係が明らかになり,酵素を用いたバイオマーカーの分析に必要な保存の良いバリエーションに富んだ微化石試料を入手することに成功した.さらにこれらの試料で高空間分解能二次イオン質量分析計(NanoSIMS)による初期分析を行い,微化石の軽元素分布を明らかにした.これにより,酵素金属バイオマーカーの分析に備えた試料準備や分析条件の確立,標準試料の選定を遂行した.TEMを用いた実験では堆積岩から抽出した有機物の観察を行い,グラファイト化が進行した有機物中に硫化鉱物など微小な鉱物が残存することを発見した.こうした鉱物が真に生命活動を示唆するものか,今後更なる検証を要する.採用前に行っていた予備的調査に加えて平成30年度に行った地質調査の結果,約19億年前のガンフリント層において浅海部,深海部の地域に応じた堆積環境の差が明らかになり,これに対応した微化石の産状の記載を行うことができた.有機物に富む黒色のストロマトライトが多く産出する地域では保存の良い様々な形状の微化石が見つかった.その中で,現生のシアノバクテリアの休眠細胞に似た構造やコロニー型構造など,これまでにガンフリント層で報告されていない新しい種類の微化石を含む10種類以上の微化石を発見した.これに対し,鉄を含む赤色のストロマトライトが産出する地域では微化石の種類が2種類と極端に減少し,さらに微化石自体が鉱物化し,有機物がほとんど残されないことが明らかとなった.発見したガンフリント微化石についてNanoSIMSによる元素マッピングを行なった.その結果,微化石試料に置いて炭素,窒素,硫黄の分布の可視化に成功し,微化石構造の外殻と内部で元素比が異なるなど新たな特徴を見出した.さらに鉱物化した微化石でも,通常の電子顕微鏡分析では検出できないほど微量の(ppmオーダー)有機物が残っていることが初めてわかった.これらは全て新規の発見であり,国際誌投稿に向けて成果をまとめている.こうしたNanoSIMSによる基礎分析と合わせて,酵素金属検出に向けての標準試料のテストも行い,平成31年度の分析に向けて条件を確定した.約27億年前の有機物を対象としたTEM観察ではグラフェン構造のなかにナノスケールの硫化鉱物が観察された.本研究課題で検出を目標とする酵素には,鉄-硫黄クラスターなど特徴的な金属-硫黄化合物が含まれる.今回発見した硫化鉱物が真に生物由来か,あるいは無機的な成因を考えるべきか,普遍性や共存する他の無機的鉱物との産状の違い,結晶構造の解析など今後のより詳細な鉱物学的観察が必要である.平成30年度において試料準備や,微小領域分析の条件の開発,基礎分析等を推進することができた.平成31年度はこれをもとに微化石を対象として酵素で用いられる金属元素の検出に取り組む.申請者は平成30年度,31年度共に東京大学大気海洋研究所の共同利用外来研究者として採択されており,研究の進行に問題はない.TEMによる観察でも収束イオンビームにより特定の微化石のみを切り出す手法に取り組んでおり,構造に対応した特定の元素の濃集を検出するなど新たな生物バイオマーカーの検証に取り組む.年次計画通り,得られた成果は適宜,不定形の有機物(ケロジェン)分析にも適用し,従来型の地球化学分析結果との整合性を確認する.また,これまでに微化石の分析を進める中でより新しい時代の保存の良い微化石や,同じ初期原生代の堆積岩でも別の地域に産出する試料と結果を比較する必要性を感じた.

平成31年度においては,こうした試料を対象とした地質調査や試料の採取を計画している.試料を採取出来れば本来の計画を遂行するためにより確実な証拠が増え,また分析手法自体はすでに確立しているため,本計画の達成がより確実なものになると期待している.約24億年前に起こった大気大酸化事変直後の時代に当たる初期原生代(約19億年前)は,嫌気的生命から好気的生命への進化の過渡期にあり,この時代における海洋環境に対応した微生物活動の解明は,生命進化研究の観点から重要度が高い.カナダ,ガンフリント層には堆積岩中に保存の良い有機物および微生物の化石(微化石)が報告されており,環境-生命が対応した生命圏の復元に適している.環境と生命活動をつなぐ代表的な生体作用が代謝であり,本研究課題では代謝に用いられる酵素を,生物種が特定可能なバイオマーカーとして利用可能なであることを実証することを目標とする.地質調査,鉱物記載,炭素同位体比分析等,いわゆる従来的な地球化学的分析結果と,走査型電子顕微鏡(SEM),透過型電子顕微鏡(TEM),二次イオン質量分析計(SIMS)など最先端微小領域分析装置による分析を組み合わせることで実証的かつ新規性の高い手法を確立することを目指す.平成30年度において,地質調査の結果採取した試料から約19億年前の環境と生態系の対応関係が明らかになり,酵素を用いたバイオマーカーの分析に必要な保存の良いバリエーションに富んだ微化石試料を入手することに成功した.さらにこれらの試料で高空間分解能二次イオン質量分析計(NanoSIMS)による初期分析を行い,微化石の軽元素分布を明らかにした.これにより,酵素金属バイオマーカーの分析に備えた試料準備や分析条件の確立,標準試料の選定を遂行した.TEMを用いた実験では堆積岩から抽出した有機物の観察を行い,グラファイト化が進行した有機物中に硫化鉱物など微小な鉱物が残存することを発見した.こうした鉱物が真に生命活動を示唆するものか,今後更なる検証を要する.採用前に行っていた予備的調査に加えて平成30年度に行った地質調査の結果,約19億年前のガンフリント層において浅海部,深海部の地域に応じた堆積環境の差が明らかになり,これに対応した微化石の産状の記載を行うことができた.有機物に富む黒色のストロマトライトが多く産出する地域では保存の良い様々な形状の微化石が見つかった.その中で,現生のシアノバクテリアの休眠細胞に似た構造やコロニー型構造など,これまでにガンフリント層で報告されていない新しい種類の微化石を含む10種類以上の微化石を発見した.これに対し,鉄を含む赤色のストロマトライトが産出する地域では微化石の種類が2種類と極端に減少し,さらに微化石自体が鉱物化し,有機物がほとんど残されないことが明らかとなった.発見したガンフリント微化石についてNanoSIMSによる元素マッピングを行なった.その結果,微化石試料に置いて炭素,窒素,硫黄の分布の可視化に成功し,微化石構造の外殻と内部で元素比が異なるなど新たな特徴を見出した.さらに鉱物化した微化石でも,通常の電子顕微鏡分析では検出できないほど微量の(ppmオーダー)有機物が残っていることが初めてわかった.これらは全て新規の発見であり,国際誌投稿に向けて成果をまとめている.こうしたNanoSIMSによる基礎分析と合わせて,酵素金属検出に向けての標準試料のテストも行い,平成31年度の分析に向けて条件を確定した.約27億年前の有機物を対象としたTEM観察ではグラフェン構造のなかにナノスケールの硫化鉱物が観察された.本研究課題で検出を目標とする酵素には,鉄-硫黄クラスターなど特徴的な金属-硫黄化合物が含まれる.今回発見した硫化鉱物が真に生物由来か,あるいは無機的な成因を考えるべきか,普遍性や共存する他の無機的鉱物との産状の違い,結晶構造の解析など今後のより詳細な鉱物学的観察が必要である.平成30年度において試料準備や,微小領域分析の条件の開発,基礎分析等を推進することができた.平成31年度はこれをもとに微化石を対象として酵素で用いられる金属元素の検出に取り組む.申請者は平成30年度,31年度共に東京大学大気海洋研究所の共同利用外来研究者として採択されており,研究の進行に問題はない.
筋分化をモデルとしたde novo DNAメチル化の誘導分子機構の解明

筋分化の研究領域は、転写因子MyoDという世界初のマスター因子の発見以来、発生・再生研究をリードしてきた。さらに、筋分化をモデルに、細胞運命決定のメカニズムを明らかにするため、我々はホールマウントインサイチューハイブリダイゼーションをほぼすべての転写因子・転写コファクターに行い胎児発生期の遺伝子発現データベースを作成した。その結果として、抑制性転写因子Rp58が、筋分化の遺伝子ネットワークの要となることを世界に先駆けて発表した。さらに、我々は、DNMT3AとDNMT3Bの筋および筋サテライト細胞特異的ノックアウトマウスを作成することで、de novo DNAメチル化が筋の発生と再生に必須であることを報告している。また、ヒト筋芽細胞の分化系においてゲノムワイドなメチル化の解析を行ったところ、DNAメチル化の亢進がRp58の認識部位に、特異的かつダイナミックにおこっていることを発見した。de novoDNAメチル化は、多くが初期発生期におこり、組織特異的なde novo DNAメチル化領域は比較的限局されていると考えられている。我々は筋特異的なDNMT3Aのノックアウトマウスの筋組織のde novo DNAメチル化部位をゲノムワイドに探索した。さらに、Rp58が筋分化において、de novo DNAメチル化を介して必須の機能を果たす仮説を検証するため、Rp58のコンディショナルノックアウトマウスを作成し、筋細胞特異的なCreマウスと交配させたところ、この遺伝子改変マウスでは、筋組織の分化が著しく阻害されていることが確認された。Rp58の欠損によるHoxの異常発現を介した筋分化阻害の検討:筋分化において、DNMT3AおよびRp58の筋特異的ノックアウトマウスにおいて、組織染色、遺伝子発現解析などの筋のフェノタイプ解析を行った。Rp58によるde novoDNAメチル化機構の解明:de novoDNAメチル化は、多くが初期発生期におこり、組織特異的なde novo DNAメチル化領域は比較的限局されていると考えられている。我々は筋特異的なDNMT3Aのノックアウトマウスの筋組織におけるde novo DNAメチル化部位をゲノムワイドに探索したところ、筋分化にともなうde novoDNAメチル化領域を同定し、この領域内にRp58結合サイトが存在することを見出した。さらに、Rp58が筋分化において、de novo DNAメチル化を介して必須の機能を果たす仮説を検証するため、Rp58のコンディショナルノックアウトマウス(Rp58CKO;Rp58fl/fl)を作成し、筋細胞特異的なCreマウスと交配させたところ、この遺伝子改変マウス(Myogeni-Cre;Rp58fl/fl)では、筋組織の分化が著しく阻害されていることが確認され、このCKOマウスの異常筋組織においては、上述の領域が低メチル化状態のままであること、これらの近傍の遺伝子の発現が高い状態にあることが確認された。i)Rp58とDNMT3Aの筋分化におけるゲノムワイドな局在解析:DNMT3AおよびRp58の5'にHAタグをCRISPR/Cas9を用いて挿入したノックインマウスを作成し、それぞれのE12.5, E13.5, E14.5の筋組織を用いてChIP-Seqを行い、DNMT3AとRp58の結合サイトのde novo DNAメチル化領域にオーバーラップがあるかどうか解析する。ii)マウスES細胞を用いたHox遺伝子座におけるRp58結合領域のDNAメチル化への影響:マウスES細胞からの筋分化の系において、Rp58のリクルートとde novo DNAメチル化のタイミングを時系列で解析、更に、Rp58結合サイトに、dCas9をリクルートすることでRp58の結合を阻害させた時のDNAメチル化および遺伝子の発現、更に筋分化への影響を検討する。この時、ヒストンの修飾マーカーもChIP-seqによって解析し、ヒストン修飾とDNAメチル化の関係についても検証する。iii)マウス個体レベルでのDNAメチル化誘導領域の解析:上記データを基に、Rp58結合領域をCRISPR/Cas9を用いて削除したマウスを作成、そのホモノックアウトマウスのフェノタイプおよび当該領域のDNAメチル化状態を解析する。

さらに、Rp58が筋分化において、de novo DNAメチル化を介して必須の機能を果たす仮説を検証するため、Rp58のコンディショナルノックアウトマウスを作成し、筋細胞特異的なCreマウスと交配させたところ、この遺伝子改変マウスでは、筋組織の分化が著しく阻害されていることが確認された。Rp58の欠損によるHoxの異常発現を介した筋分化阻害の検討:筋分化において、DNMT3AおよびRp58の筋特異的ノックアウトマウスにおいて、組織染色、遺伝子発現解析などの筋のフェノタイプ解析を行った。Rp58によるde novoDNAメチル化機構の解明:de novoDNAメチル化は、多くが初期発生期におこり、組織特異的なde novo DNAメチル化領域は比較的限局されていると考えられている。我々は筋特異的なDNMT3Aのノックアウトマウスの筋組織におけるde novo DNAメチル化部位をゲノムワイドに探索したところ、筋分化にともなうde novoDNAメチル化領域を同定し、この領域内にRp58結合サイトが存在することを見出した。さらに、Rp58が筋分化において、de novo DNAメチル化を介して必須の機能を果たす仮説を検証するため、Rp58のコンディショナルノックアウトマウス(Rp58CKO;Rp58fl/fl)を作成し、筋細胞特異的なCreマウスと交配させたところ、この遺伝子改変マウス(Myogeni-Cre;Rp58fl/fl)では、筋組織の分化が著しく阻害されていることが確認され、このCKOマウスの異常筋組織においては、上述の領域が低メチル化状態のままであること、これらの近傍の遺伝子の発現が高い状態にあることが確認された。i)Rp58とDNMT3Aの筋分化におけるゲノムワイドな局在解析:DNMT3AおよびRp58の5'にHAタグをCRISPR/Cas9を用いて挿入したノックインマウスを作成し、それぞれのE12.5, E13.5, E14.5の筋組織を用いてChIP-Seqを行い、DNMT3AとRp58の結合サイトのde novo DNAメチル化領域にオーバーラップがあるかどうか解析する。ii)マウスES細胞を用いたHox遺伝子座におけるRp58結合領域のDNAメチル化への影響:マウスES細胞からの筋分化の系において、Rp58のリクルートとde novo DNAメチル化のタイミングを時系列で解析、更に、Rp58結合サイトに、dCas9をリクルートすることでRp58の結合を阻害させた時のDNAメチル化および遺伝子の発現、更に筋分化への影響を検討する。この時、ヒストンの修飾マーカーもChIP-seqによって解析し、ヒストン修飾とDNAメチル化の関係についても検証する。iii)マウス個体レベルでのDNAメチル化誘導領域の解析:上記データを基に、Rp58結合領域をCRISPR/Cas9を用いて削除したマウスを作成、そのホモノックアウトマウスのフェノタイプおよび当該領域のDNAメチル化状態を解析する。(理由)遺伝子改変マウスの作成の一部が当初計画よりも遅れ、実験に使用可能なマウスを得ることができなかった。結果として本年度実験可能であったマウス数は予定より少なくなり、また同マウスを用いて行う予定であった実験が行えなかったことにより、予定通りの予算執行ができなかった。(使用計画)
トリインフルエンザ制圧に向けたインフルエンザM2特異的ヒト抗体の単離と機能解析

我々はISAAC法を用い、インフルエンザワクチン接種ボランティアよりインフルエンザM2eと結合する抗体のスクリーニングを行った。その結果、M2eと結合するAb1-10を得た。その機能解析を行った結果、季節性ウイルスのみならず、トリ型や2009年のパンデミック型にも結合することが示された。さらにin vitroにおいて抗ウイルス能が示された。これらの結果はAb1-10が有用な抗体医薬候補であることを示唆している。本研究は、我々が開発した「リンパ球チップ」という新しい抗体医薬戦略を用いて、トリインフルエンザウイルス(InV)を制圧する画期的な抗体医薬開発の基礎研究を目的とする。即ち、(1)トリInVを含むA型InVに共通して発現し、かつ抗原性変異が少ないマトリックスタンパク2(M2)に対するヒト抗体を作製する。(2)さらにそれら抗M2ヒト抗体の機能解析を通して、in vitroにおける中和能の検討を行う。平成21年度の研究実績は以下の通りである。1. Bリンパ球由来単一細胞5'-RACE法の向上:単一の抗体産生細胞より効率よく抗体遺伝子の増幅をおこなうため、定常領域に設計しているオリゴDNAの見直し、アニーリング温度などの反応条件検討を行った。その結果、6080%の効率で抗体遺伝子を取得する事が可能となった。2.迅速抗体構築法の向上:特異的Bリンパ球の検出からELISAの解析までの全行程をハイスループット化するため、各行程の至適条件の検討、簡素化を行った。その結果、全行程をおおよそ7日で完了するスクリーニング系を確立した。3.抗M2抗体アッセイ法の確立:M2リコンビナントタンパクを作製するため、M2発現プラスミドの構築を行い、哺乳類細胞にM2リコンビナントタンパクが発現していることを、免疫染色により確認した。4.インフルエンザワクチン接種者からの抗M2抗体の単離:ワクチン接種ボランティアより末梢血リンパ球を分離し、抗M2抗体を産生しているB細胞を我々が開発したISAAC法を用いてスクリーニングを行った。その結果、現在までに抗体Ab1-10がM2と特異的に結合することが明らかとなった。本研究は、我々が開発した「リンパ球チップ」という新しい抗体医薬戦略を用いて、トリインフルエンザウイルスを制圧する画期的な抗体医薬開発の基礎研究を目的とする。即ち、(1)トリインフルエンザウイルスを含むA型インフルエンザウイルスに共通して発現し、かつ抗原性変異が少ないマトリックスタンパク2(M2)に対するヒト抗体を作製する。平成22年度は平成21年度に得たAb1-10の機能解析を主に行った。研究実績は以下の通りである。1.Ab1-10が様々なA型インフルエンザと結合する事を調べるため、季節性のH1N1 (A/NewCaledonia/20/99)、同じく季節性のH3N2(A/Panama/2007/99)、トリ型であるH5N1(A/Vietnam/1194/04)、2009年に流行したHIN1(A/California/7/2009)の4種類の不活化ウイルス抗原と結合するかをウエスタン法により検討を行った。その結果、いずれのウイルス抗原と結合することが明らかになった。2.Ab1-10がどのアミノ酸を認識するかを調べるため、1アミノ酸ずつアラニンに置換したM2変異体発現プラスミドを作製し、哺乳類細胞に発現させ、その結合性をフローサイトメーターを用いて解析した。その結果、セリン2、ロイシン3、スレオニン5が結合に必須であることが示された。3.Ab1-10が抗ウイルス能を持っているかを調べるためin vitroにおいてプラークアッセイを行った。その結果H1N1(A/PuertoRico/8/1934)及び2009年型のHIN1(A/Osaka/132/2009(HIN1))ウイルスのプラークが大きくなることを阻害することが示された。
根の生理指標を用いた土壌酸性化に対する樹木への影響評価

土壌酸性化の樹木への影響を、根の生理指標を用いて評価する方法を確立するために、樹木への影響要因であるアルミニウムが、根の生理指標の一つカロース(多糖類の一種)蓄積量に与える影響を調べた。スギでは、他の樹種と異なった根端のアルミニウム蓄積特性により、過剰アルミニウム環境下で根端にカロースが蓄積されにくいことが明らかとなった。スギ根のカロース蓄積量は土壌酸性化に対する根の指標として有効でない可能性が示唆された。様々な濃度(0.005-10mM)のアルミニウム(Al)を1日添加する実験を行い、ヨーロッパグリ、ポプラ、ヨーロッパブナ、スギ苗の根のカロース量を測定した。前3種ではアルミニウム1日添加により根端にカロース形成が有意に蓄積された。ヨーロッパグリ苗では、酸性化の進んでいる森林土壌でもカロース蓄積が認められた。さらにポプラ苗では、CuやZn添加ではカロース蓄積が認められず、根端におけるカロース蓄積がAlに特異的な反応である可能性が示唆された。しかしながらスギ苗ではいずれの処理区でも対照区(0mM)と有意差は認められなかった。5mMのアルミニウムを一週間、スギ苗に添加しても同様であった。カロース合成促進剤であるジキトニンをスギ苗の根に1日添加したところ、対照区に比較してカロース形成量は有意に増加した。根呼吸量の指標として、スギ苗の根における酸素消費量を測定したものの、1日のアルミニウム処理、ジキトニン処理では、対照区に比べて有意な差は認められなかった。ヨーロッパブナ苗における根呼吸量の指標としてTTC還元量を、1日アルミニウム処理後に測定したところ、アルミニウム濃度が増加するにすれ減少する傾向にあったもののその差は有意ではなかった。この結果は、アルミニウムストレスの指標として、根呼吸量よりも根端カロース形成が有効である可能性を示唆するものである。これらの結果から、土壌酸性化の樹木指標として根のカロース蓄積量は、樹種により大きく異なり、ヨーロッパグリやポプラなどでは有効なものの、スギでは有効でない可能性が示唆された。わが国や欧州における酸性化の樹木指標に関連するこれまでの研究についてレビューを行い、根のCa/Alモル比が確立された有効な指標であること、早期に影響診断できるという観点から樹木生理指標確立の重要性を指摘した。ヒノキ、アカマツ、クロマツ苗について、アルミニウム(Al)に対する根端カロース特性を明らかにするために、アルミニウム1日添加実験をおこなった。ヒノキではスギと同様に、1mMのAl濃度処理でもカロース形成が認められなかった。しかしながらアカマツ、クロマツでは1mMのAl濃度処理でカロース形成が認められた。このことからスギやヒノキでは根端カロース量は酸性化指標として有効でない可能性が示唆された。一方でアカマツやクロマツでは、根端カロース量が酸性化の指標なりうることが示唆された。カロース形成特性の異なるスギとクロマツについて、1mMのAl 1日処理後の根端Al分布様式をSEM-EDXを用いて調べた。その結果、両樹種ともに皮層細胞壁よりも表皮細胞壁にAlが蓄積しやすい傾向にあった。すなわち根へのAl蓄積とカロース蓄積特性とは必ずしも一致しないことが明らかとなった。酸性土壌を用いて栽培されたヨーロッパブナの根端カロース形成量を測定したところ、土壌中のA1量とは相関が認められたが、土壌溶液中のAl濃度や根のCa/Alモル比との相関は認められなかった。この結果から、ヨーロッパブナのカロース形成量をAlストレスの指標として実際の森林で用いることには注意する必要があることが明らかとなった。根端のアルミニウム分布特性は、クロマツ苗とスギ苗ともに、根の中心柱など内側よりも外側の外皮細胞などに蓄積しやすい傾向にあった。カロース分布特性は、クロマツ苗では皮層細胞壁に蓄積するものの、スギ苗では皮層および外皮付近に蓄積することが明らかになった。さらにスギ苗では内皮細胞に強い自家蛍光があるため、カロースが検出されにくいものと示唆された。本結果から、スギ根端の内皮細胞などの根の細胞構造の違いがそのカロース特性に影響を与えており、これらのことが、スギにおける酸性化の生理指標として根のカロース特性が有効でない原因であることが示唆された。さらにこれまで報告されている樹木根のカロース特性からも、スギではとくにその形成量が少ないことが明らかとなった。また、関西地域における酸緩衝能の異なる森林土壌を用いたスギ苗植栽実験では、酸緩衝能の低い土壌で育成されたスギ苗の苗高および根成長は、酸緩衝能の高いものよりも有意に低かった。しかしながら根の呼吸速度および根直径など根形態については、苗高および根成長に比べてその差は小さかった。
ストレス性痛覚過敏動物を用いた鎮痛効力検定法の確立

1,麻黄附子細辛湯は100,300mg/kgの経口投与において、ラット及びマウスの反復低温ストレス性痛覚過敏を抑制したが、正常動物に対しては用量においても抗侵害受容作用に影響を及ぼさなかった。反復低温ストレス性痛覚過敏マウスにおいて、モルヒネの皮下投与やジクロフェナックの経口投与も有意に痛覚過敏を減弱した。2,反復低温ストレス負荷前にセロトニン神経毒5,7-DHTをラット脊髄くも膜下腔内注射し予め脊髄のセロトニンを減少させておくと、麻黄附子細辛湯による痛覚過敏の抑制効果が有意に減弱した。一方、カテコラミン神経毒6-OHDAの脊髄くも膜下腔内注射で脊髄のノルアドレナリンを枯渇させておいても、麻黄附子細辛湯の痛覚過敏抑制効果は減弱されなかった。3,セロトニン受容体遮断薬のシプロヘプタジン、メチオテピン、メチルセルジドをそれぞれラット脊髄くも膜下腔内に注射後、麻黄附子細辛湯を投与すると反復低温ストレス性痛覚過敏が有意に抑制された。一方、アドレナリン受容体遮断薬のフェントラミンの脊髄くも膜下腔内注射は無効だった。4,桂枝湯は100,300mg/kgの経口投与において、ラットの反復低温ストレス性痛覚過敏を抑制したが、正常ラットに対してはいずれの用量においても抗侵害受容作用に影響を及ぼさなかった。5,脊髄くも膜下腔内への6-OHDA注射は、桂枝湯の痛覚過敏抑制効果を減弱する傾向を示したが、5,7-DHT注射は無効であった。6,以上、反復低温ストレス性痛覚過敏モデルを用いて、麻黄附子細辛湯および桂枝湯の鎮痛作用を検出した。またその機序として、麻黄附子細辛湯では下行性セロトニン作動性神経系が、桂枝湯では下行性ノルアドレナリン作動性神経系が関与していることが明らかにした。1.桂姜棗草黄辛附湯,桂枝加朮附湯,芍薬甘草湯も反復低温ストレス性痛覚過敏に対しては抑制作用を示し,当帰加四逆呉茱萸生姜湯と防已黄耆湯は無効であった。桂姜棗草黄辛附湯は,少なくとも5日間の反復投与では抑制作用に耐性の生じないことが明らかとなった。2.反復低温ストレス負荷ラットの痛覚過敏に対する桂姜棗草黄辛附湯の抑制作用が,セロトニン神経毒5,7-DHTの脊髄クモ膜下腔内注射により予め脊髄のセロトニンを減少させておくと減弱し,カテコラミン神経毒6-OHDAの脊髄クモ膜下腔内注射で脊髄のノルアドレナリンをほぼ涸渇させておいても減弱しなかった。桂枝加充附湯の痛覚過敏抑制作用も5,7-DHTの脊髄クモ膜下腔内注射により抑制された。モルヒネの作用は,6-OHDAで抑制され,5,7-DHTでは有意な抑制が見られなかった。反復低温ストレス性痛覚過敏に対する桂姜棗草黄辛附湯の抑制作用は,セロトニン受容体遮断薬の脊髄クモ膜下腔内注射でも抑制され,セロトニン前駆体5-HTPの脊髄クモ膜下腔内注射で増大した。3.ラットにおける反復低温ストレス性痛覚過敏が,NKlサブスタンスP受容体遮断薬,グルタミン酸のNMDA受容体遮断薬,非NMDA受容体遮断薬の脊髄クモ膜下腔内投与で抑制された。また,NMDAの脊髄クモ膜下腔内注射で誘発される嫌悪反応が反復低温ストレス負荷で増大した。4.ラット脊髄後角におけるNMDA受容体サブタイプNMDAR_<2A>及びNMDAR_<2B>,NMDA_<2C>,NMDAR_<2D>のmRNAの発現をin situ hybridization法で調べたところ,第1,II層でNMDAR_<2C> mRNAの発現が反復低温ストレス負荷により増加していた。4,桂枝湯は100,300mg/kgの経口投与において、ラットの反復

低温ストレス性痛覚過敏を抑制したが、正常ラットに対してはいずれの用量においても抗侵害受容作用に影響を及ぼさなかった。5,脊髄くも膜下腔内への6-OHDA注射は、桂枝湯の痛覚過敏抑制効果を減弱する傾向を示したが、5,7-DHT注射は無効であった。6,以上、反復低温ストレス性痛覚過敏モデルを用いて、麻黄附子細辛湯および桂枝湯の鎮痛作用を検出した。またその機序として、麻黄附子細辛湯では下行性セロトニン作動性神経系が、桂枝湯では下行性ノルアドレナリン作動性神経系が関与していることが明らかにした。1,麻黄附子細辛湯は100,300mg/kgの経口投与において、ラット及びマウスの反復低温ストレス性痛覚過敏を抑制したが、正常動物に対してはいずれの用量においても抗侵害受容作用に影響を及ぼさなかった。反復低温ストレス性痛覚過敏マウスにおいて、モルヒネの皮下投与やジクロフェナックの経口投与も有意に痛覚過敏を減弱した。2,反復低温ストレス負荷前にセロトニン神経毒5,7-DHTをラット脊髄くも膜下腔内注射し予め脊髄のセロトニンを減少させておくと、麻黄附子細辛湯による痛覚過敏の抑制効果が有意に減弱した。一方、カテコラミン神経毒6-0HDAの脊髄くも膜下腔内注射で脊髄のノルアドレナリンを枯渇させておいても、麻黄附子細辛湯の痛覚過敏抑制効果は減弱されなかった。3,セロトニン受容体遮断薬のシプロヘプタジン、メチオテピン、メチセルジドをそれぞれラット脊髄くも膜下腔内に注射後、麻黄附子細辛湯を投与すると反復低温ストレス性痛覚過敏が有意に抑制された。一方、アドレナリン受容体遮断薬のフェントラミンの脊髄くも膜下腔内注射は無効だった。4,桂枝湯は100,300mg/kgの経口投与において、ラットの反復低温ストレス性痛覚過敏を抑制したが、正常ラットに対してはいずれの用量においても抗侵害受容作用に影響を及ぼさなかった。またその機序として、麻黄附子細辛湯では下行性セロトニン作動性神経系が、桂枝湯では下行性ノルアドレナリン作動性神経系が関与していることを明らかにした。
大学組織の意思決定・行動における横並び・相互参照・模倣行動に関する研究

本研究は、高等教育政策および大学組織の意思決定プロセスにおける横並び・相互参照・模倣行動の効果を解明することを目的とした。数量データを整備して分析した結果、国際レベルの高等教育制度(欧州のボローニャ・プロセス)の各国への浸透過程および日本国内の機関レベルの存続と設置改廃のサバイバル分析を通じて、仮説通り横並び・相互参照・模倣行動が確認・実証された本研究は、高等教育政策および大学組織の意思決定プロセスにおける横並び・相互参照・模倣行動の効果を解明することを目的とした。数量データを整備して分析した結果、国際レベルの高等教育制度(欧州のボローニャ・プロセス)の各国への浸透過程および日本国内の機関レベルの存続と設置改廃のサバイバル分析を通じて、仮説通り横並び・相互参照・模倣行動が確認・実証された本研究は、大学組織の複雑性と意思決定プロセスを解明することを目的としている。研究計画は大きく(A)基礎的作業フェーズ、(B)実査フェーズ、(C)分析・成果報告フェーズに別れており、21年度は(A)基礎的作業フェーズを進めた。基礎的作業フェーズは文献調査、定量的分析、定性的分析の基礎作業を進めた。文献調査は、組織論や政治学を中心に収集を進め、定量的分析を勧める上でのモデル構築の参考にすることができた。定量的分析では、大学・学部・学科レベルのプロフィール(設置改廃年、定員、実員など)に関する既存のデータベースを統計分析可能な形で整備し、大学組織の存続に関する分析を可能にした。実際にそのデータを活用し、その成果は『大学論集』の第41集に掲載された。さらに、大学院について研究科レベルでのデータを整備し、大学の学部レベルと同様に、来年度以降大学院の存続に関する分析を行うための整備を進めた。定性的分析については、来年度以降の本格的調査の基礎固めをするべく、大学関係者を招いての小規模ワークショップを開催し、研究フレームワークの検討や個別大学の組織特性に関する情報収集を行った。本研究は、大学組織の複雑性と意思決定プロセスを解明することを目的としている。研究計画は大きく(A)基礎的作業フェーズ、(B)実査フェーズ、(C)分析・成果報告フェーズに別れており、22年度は引き続き(A)基礎的作業フェーズを進めると同時に、(B)実査フェーズへと移行した。(A)の基礎的作業フェーズは文献調査、定量的分析、定性的分析の基礎作業を進めた。文献調査の成果を『大学と国家』に一部収録することができた。定量的分析では、新しい分析方法に着手し、その成果は『九州大学教育社会学研究室紀要』の第12号に掲載された。定性的分析については、高等教育研究者や大学関係者を招いての小規模ワークショップを開催し、研究フレームワークの検討や個別大学の組織特性に関する情報収集を行うと同時に、組織論・行政学の専門家への訪問調査を行った。(B)の実査フェーズについては、昨年度(A)基礎的作業フェーズで整備しつつある大学院について研究科レベルでのデータ整備を進め、大学の学部レベルと同様に、来年度以降大学院の存続に関する分析を行うための整備を進めると同時に、大学国際化に関する機関調査や教員活動調査などの既存のデータを再整備することを通じての組織分析を展開した。研究計画は大きく(A)基礎的作業フェーズ、(B)実査フェーズ、(C)分析・成果報告フェーズに別れており、23年度は引き続き(A)基礎的作業フェーズを進めると同時に、(B)実査フェーズにおいて各種調査や公開データの再整備を行い、(C)分析・成果報告フェーズへと移行した。(A)の基礎的作業フェーズは文献調査、定量的分析、定性的分析の基礎作業を継続し、一定の成果を得た。その成果は来年度以降『大学論集』や研究科紀要に随時掲載予定である。(B)の実査フェーズについては、昨年度(A)基礎的作業フェーズで整備しつつある大学院について研究科レベルでのデータ整備を進めると同時に、機関レベルの外形的データの収集と整備を行った。さらに、同時進行していた委託研究や所属の戦略研究と相乗りする形でマクロデータやアンケート調査を収集・整備し、欧州国家レベルの高等教育戦略に関する意思決定プロセスのデータ整備および日本の研究室レベルの活動と意思決定に関するデータを整備することができた。(C)分析・成果報告については、広島大学高等教育研究開発センターの特別教育研究経費報告書に、大場淳との共著「高等教育政策の新党・波及に関する分析-ボローニャ・プロセスを事例として-」および村澤の単著「公立大学設置改廃の定量的分析-試行的分析」が掲載された。さらに、2011年度の日本教育社会学会において、李敏との共同発表「大学組織の適正規模に関する探索的研究-ゼミ・研究室の組織体制とその規模を中心に-」を行った。
貧酸素による内湾の酸性化：微生物呼吸によるCO2生成の実態と水産生物への影響

昨年度に続いて大村湾内の貧酸素と酸性化状況の定量的把握を軸に観測したところ、湾中央部の海底直上水において夏季に顕著な酸性化が進行しており、通常のpH範囲(7.8-8.2)を大きく下回る7.59を示した。このとき炭酸カルシウム飽和度(Ω)は1を下回り、炭酸カルシウム骨格を形成する生物を強く阻害することが示唆された。昨年度と今年度の2年分の観測データに基づいてpH変化に関わる環境因子を調べたところ、溶存酸素(DO)、水温およびクロロフィル蛍光値(Chl.a)が選ばれ、このうちDOの寄与率が最も高く(66.58%)、DOとpHは強い正の相関を示した(r=0.794, n=162)。一方、貧酸素後期には、湾南部において顕著なDO低下にもかかわらずpHが下がらない水塊も発生していた。このようなDO低下と酸性化が同調しない水塊の生成には酸素と二酸化炭素を同時に消費する化学合成独立栄養細菌が関わっている可能性が考えられたことから、その検証に取り組んだ。pHと他の環境因子の関係式に基づいてpHの予測値を求め、実測値との残差(ΔpH)を酸性化抑制の指標としたところ、中央部と南部で見られた高ΔpHの水塊(最大0.161)では、化学合成独立栄養性細菌の一種であるアンモニア酸化古細菌(Thaumarcheaeota)の存在割合が増加していた。また、2018年8月後半と10月に中央部の底層水を培養すると、溶存態無機炭酸イオン(DIC)が減少し、特にアンモニア添加区でDICの減少が顕著だった。これらのことから、Thaumarcheaeotaによる酸素の消費と二酸化炭素の固定が貧酸素水塊における酸性化の緩和に寄与することが示唆された。大村湾の底層水において夏季に貧酸素化と酸性化が同時進行することは2年間の定量観測によって確実となった。その原因として微生物呼吸の寄与が最も大きいことも強く示唆され、炭酸カルシウム骨格を持つ水産資源生物に対する複合影響について初めて定量的な結果を示すことができた。一方、貧酸素および酸性化の多重ストレスの影響評価のため、炭酸カルシウム飽和度を推定し、炭酸カルシウム骨格をもつ水産生物がストレスを受けている可能性が高いことを示した。微小なプランクトン群集の定量解析のために画像解析装置を活用する予定だったが、装置の不具合により実施できなかったので、今後は環境DNAなどの手法なども取り入れて、貧酸素期の水産植物、動物の行動・分布状況を推定し、多重ストレスに関する調査・検討を加速する。<湾内における貧酸素化と酸性化の状況>湾内の底層DOは6月から夏場に向けて減少し、8月下旬には最低値となる0.203mg/lを湾南部の海底直上水で示した。DO低下と酸性化は8月の中央部付近の海底直上水で最も顕著であり、pHは7.634、二酸化炭素分圧は1233μatmに達した。海底直上水のpHは半年間で0.431単位変化した。pHを目的変数としてDO、クロロフィルa蛍光、深度、水温、全細菌数、濁度を独立変数とした重回帰分析の結果、pHの値にもっとも影響を及ぼすのはDOであり、pHとDOの間には強い正の相関(r=0.78,p<0.01)が見られた。<貧酸素水塊に出現する動植物プランクトンの状況>球換算直径(ESD)が4μm以上のプランクトンの個体密度は1リットル当たり10の3乗から7乗の範囲にあり、貧酸素環境下でも大きく減少することは無かった。珪藻や渦鞭毛藻類が優占したが、目レベルの分類群では組成変化が著しく、貧酸素下では移動能力を持つ種類の出現が顕著だった。<湾内における魚群の出現状況>魚群探知機の魚種判別機能によりカタクチイワシとマアジが推定され、貧酸素水塊発生前には湾全体に一様に分布したが、発生後は貧酸素水塊の周囲に近接して多く分布する傾向が認められた。魚群の多くは貧酸素水塊が発達する前と比べて、貧酸素期には出現水深が浅くなる傾向が認められた。当初の計画どおり大学附属練習船をもちいた大村湾内の観測により、貧酸素化と酸性化の状況を明らかにすることができた。その際、水柱の細菌群集、真核性の微小動植物プランクトンおよび魚類などの多様な海洋生物の分布や活動状況も把握することができた。関連する成果を国内および国際学会において発表するとともに、複数の学術論文として投稿し、受理された。以上のことから、本研究課題の進捗は概ね順調に進展していると考える。

一方、貧酸素後期には、湾南部において顕著なDO低下にもかかわらずpHが下がらない水塊も発生していた。このようなDO低下と酸性化が同調しない水塊の生成には酸素と二酸化炭素を同時に消費する化学合成独立栄養細菌が関わっている可能性が考えられたことから、その検証に取り組んだ。pHと他の環境因子の関係式に基づいてpHの予測値を求め、実測値との残差(ΔpH)を酸性化抑制の指標としたところ、中央部と南部で見られた高ΔpHの水塊(最大0.161)では、化学合成独立栄養性細菌の一種であるアンモニア酸化古細菌(Thaumarcheaeota)の存在割合が増加していた。また、2018年8月後半と10月に中央部の底層水を培養すると、溶存態無機炭酸イオン(DIC)が減少し、特にアンモニア添加区でDICの減少が顕著だった。これらのことから、Thaumarcheaeotaによる酸素の消費と二酸化炭素の固定が貧酸素水塊における酸性化の緩和に寄与することが示唆された。大村湾の底層水において夏季に貧酸素化と酸性化が同時進行することは2年間の定量観測によって確実となった。その原因として微生物呼吸の寄与が最も大きいことも強く示唆され、炭酸カルシウム骨格を持つ水産資源生物に対する複合影響について初めて定量的な結果を示すことができた。一方、貧酸素および酸性化の多重ストレスの影響評価のため、炭酸カルシウム飽和度を推定し、炭酸カルシウム骨格をもつ水産生物がストレスを受けている可能性が高いことを示した。初年度におこなった海洋観測を継続して、湾内の貧酸素および酸性化についてデータを蓄積する。高速画像解析手法の導入によって、微小プランクトン群集解析の効率化をすすめ、特に二枚貝幼生に対する貧酸素および酸性化の多重ストレスの影響評価を加速する。また、溶存態無機栄養塩類の精密測定を本格化し、特に窒素の循環過程に対する貧酸素と酸性化の影響評価を進める。さらに、微生物呼吸がもたらす酸素消費とCO2生成の定量関係について、マイクロコズム実験をとおして解析をすすめる。微小なプランクトン群集の定量解析のために画像解析装置を活用する予定だったが、装置の不具合により実施できなかったので、今後は環境DNAなどの手法なども取り入れて、貧酸素期の水産植物、動物の行動・分布状況を推定し、多重ストレスに関する調査・検討を加速する。
異所性遊離骨膜移植によって形成される骨の由来に関する研究

1.筋肉中に遊離骨膜を移植し、骨膜移植部におけるBMP-2の局在を免疫組織化学染色を用いて検討し下記の結果を得た。(1)移植後5日目には骨の形成を認め、新生骨周囲の未分化間葉系細胞、骨芽細胞、骨細胞にBMP-2の局在を認めたが、筋肉および筋肉周囲の未分化間葉系細胞にはBMP-2の局在を認めなかった。(2)骨基質、軟骨基質にはBMP-2抗体による特異的な染色像は認められなかった。(3)移植後14日目には破骨細胞が出現し、大部分の破骨細胞の細胞質にBMP-2抗体による特異的な染色像が認められた。3.筋肉中に遊離骨膜移植したときに形成される骨が骨膜細胞自身に由来するのか否かをautoradiographyを用いて検討し下記の結果を得た。(1)骨膜へのtritiated thymidine(^3HTdr)の取り込み率は5.2%であった。(2)新しく形成された骨組織の骨細胞の一部に^3HTdrの取り込みを認めた。また新生骨周囲の間葉系細胞の一部に^3HTdrの取り込みを認めた。以上の結果から、第一に遊離骨膜移植時に骨膜細胞がBMP-2を産生していること、第二に骨膜には骨誘導能がないかあっても極めて弱いことが確認された。したがって筋肉中に遊離骨膜を移植したときに形成される骨は骨膜細胞自身の増殖、分化によって形成される可能性が示唆された。1)移植後5日目には骨の形成を認め、新生骨周囲の未分化間葉系細胞、骨芽細胞、骨細胞にBMP-2の局在を認めたが、筋肉および筋肉周囲の未分化間葉系細胞にはBMP-2を局在が認めなかった。2)骨基質、軟骨基質にはBMP-2抗体による特異的な染色像は認められなかった。3)移植後14日目には破骨細胞が出現し、大部分の破骨細胞の細胞質にBMP-2抗体による特異的な染色像が認められた。さらに本研究において興味ある結果が2つ得られた。ひとつはBMP-2が豊富に存在している骨基質にBMP-2抗体による特異的な染色像が認められなかったこと。もうひとつは破骨細胞の細胞質にBMP-2抗体による特異的な染色像が認められたことである。これらの理由は明らかでなく、今後の解明が期待される。1.家兎に0.51.0mCi/gのtritiated thymidine(^3HTdr)を12時間おきに5回皮下注射し、最終注射の2時間後に屠殺して前肢部より骨膜を採取し、一部は10%中性ホルマリンで固定し、骨膜へのtritiated thymidine(^3HTdr)の取り込み率を調べ、残りの骨膜はヌードマウスの背部筋肉中へ移植し形成される骨が骨膜細胞自身に由来するのか否かをautoradiographyを用いて検討し下記の結果を得た。また新生骨周囲の間葉系細胞の一部にも^3HTdrの取り込みを認めた。以上の結果から新生骨の一部は移植した骨膜細胞に由来していることが確認された。

しかし本実験からは^3HTdrの取り込みが認められなかった骨細胞の由来は明らかにできなかったため新生骨の全てが移植した骨膜細胞に由来しているとは断定できなかった。このことに関しては別の何らかの方法で解明する必要があるが前年度の研究結果と本年度の研究結果を総合して考えると異所性に遊離骨膜移植したときに形成される新生骨の大部分は骨膜細胞自身の増殖、分化によって形成されることが示唆された。
日本手話の文法関係表示について

手話言語の主語/目的語標示を行う助動詞(AUX1やAUX2)は, Smith(1990)が,台湾手話でその存在を指摘し, Fischer(1996)が日本手話東日本方言にもAUX1のみ存在する事を認めた。AUX2が動詞「見る」から派生した事は, Smithが示したが, AUX1の生成過程は不明であった。Sapountzaki(2012)らの「代名詞連続からの派生」仮定も証拠が不十分である。本論では,日本手話西日本方言にはAUX1とAUX2が存在し, AUX1は「見る」→AUX2 →AUX1の順に文法化により生成された」という仮説を提案し,その妥当性を検証した。日本手話(JSL)の西日本方言において、主語/目的語の文法関係を標示する助動詞AUX1とAUX2が存在するが、まずこれらと(1)共起可能な動詞群の特徴を特定した。共起する動詞は必ず、1非一致動詞であり、かつ、2人間である目的語をとる他動詞である必要がある。さらに3多くの動詞が、目的語である対象を見た結果、好悪や未・既知等の判断をする意味を持つ傾向があるという特徴を明らかにした。またAUX1とAUX2では共起する動詞の種類には大きな差は見られないことも観察した。さらに(2)動詞「見る」が文法化のプロセスを経て、AUX2、さらにAUX1が成立したという仮説を提案し、音韻及び意味の変化の分析からその妥当性を検証した。そして同じ語族に属するJSL(西日本方言、東日本方言)のみならず、台湾手話におけるAUXも同様の説明が可能である可能性を示唆した。一方JSL等と語族が異なるオランダ手話(Bos, 1994)などにも、このAUX1, AUX2は存在していることが知られており、そのAUXが移動表現と関連しているという指摘がある。またJSLの東日本方言のAUX1についての研究でも、AUX1は「移動の経路」に関係しているという指摘(Fischer,1996)がなされている。今後はAUXが動詞「見る」から文法化のプロセスにより成立した事をふまえ、移動構文との関係に着目し、既に収集してある移動構文のデータの中から「見る」を含むデータを中心に分析し、この文法標示成立の認知的背景について明らかにしていく必要がある。日本手話(JSL)において,主語/目的語の文法関係を表す方法として,非常に一般的な「一致動詞(始点/終点)の使用」,「体の位置/向き」,「文末指差し(PTx)」,の3つに加えて,特定のいくつかの手話言語で存在が報告されている「助動詞(AUXの始点/終点)の使用」,計4つのパタンの存在を改めて確認した.その上で次のような分析結果を得た.1.「文末指差し」の方法は,一致動詞とは共起しにくい傾向があり,「助動詞」の方法はさらにその傾向が高い.2.「助動詞」は共起する動詞の意味に制限がある.「知る」「恐れる」「好む」など,対象に対する好悪の感情を表現する動詞が多く,「知る」の例で顕著に見られるように,それらの例の多くでは,助動詞が動詞「見る」と交替可能であることが観察された.Fischer(1996)をはじめとするJSLを対象とした先行研究では,「助動詞」の使用例が数例しか分析されていなかったこともあり,特に2.の指摘は十分に議論されていなかった.またFischerは「助動詞」のような文法の発生について,経路を表す一致動詞との関連を示唆していたが,実証には至っていない.豊富なデータに基づき,文法関係を表す「助動詞」と,視覚動詞(および「文末指差し」)との関連において,この問題の解決に近づく事が出来る可能性を見いだした.3.「一致動詞の使用」,「体の位置/向き」,「文末指差し」は一般的に広く使用されるが,「助動詞」は手話の習熟度等により使用の割合がことなる可能性が観察された.手話言語において,いわゆる一致動詞は、手形を主語の名詞のある位置から目的語のある位置まで動かす事で,主語/目的語を区別することができる。一方このような手形の移動を含まない非一致動詞が述部である場合,主語/目的語標示を行う助動詞(AUX1やAUX2)が共起する場合がある。Smith(1990)は,日本手話(JSL)と源を同じくする台湾手話(TSL)を観察分析する事によって、はじめてこのようなAUXの存在を指摘した。後にFischer(1996)が日本手話東日本方言(JSL-e)にもAUX1のみ存在する事を認めた。AUX2が動詞「見る」から派生した事は,2つの語の形状の類似性からSmithが示したが,どちらの研究者もAUX1の生成過程は明らかにしていなかった。

Sapountzaki (2012)らは,AUX1が指差し手形の「代名詞の連続」から派生したと仮定するが,十分な証拠が示されなかった。本論では,JSLの西日本方言(JSL-w)を新たに分析対象とし,JSL-wにはAUX1とAUX2の両方が存在することを明らかにした。その上でデータ分析の結果,JSL-wのAUX1は「「見る」→AUX2→AUX1の順に文法化により生成された」という仮説を提案した。JSL-wでは動詞「見る」,AUX2,AUX1は,この順に,手形の形態の簡素化,及び手形の動きの小型化,非手指サインの脱落等のように,音韻・形態が簡素化し,同時に「見る」という意味が次第に漂白されている。一方でAUX1が共起する述部であっても,手形の移動のみ簡素化する前の動きに変えると,AUX1にはないはずの「見る」という意味が現れる特別用法がある事を指摘し,これらの証拠により仮説の妥当性を議論した。言語学当初の予定通り、助動詞と共起する動詞の統語的意味的特徴を特定し、さらに助動詞の成立に関わる仮説の提案と検証も行なえた。日本手話のデータを記述し,分析を進めることができた.このことにより日本手話のデータベースの充実に貢献している。これらのデータから初年度に予定していた,JSLに見られる4つの文法関係表示の例を確認できた。さらに,本来は翌年(平成25年度)に実行の予定であった,「助動詞」についてデータ採集と分析を開始できた事から,設定した目的の3つのステップのうちの1つ目,つまり「助動詞」と共起可能な動詞群の特定を行った.これにより,1.共起する動詞群は従来指摘されていたよりも数多く観察できる事,2.共起する動詞は必ず非一致動詞であり,他者に対する好悪の感情を表すという意味制限がある事,多くの例で助動詞自身が視覚動詞「見る」と交替して類似の意味を表現する事ができる事も明らかに出来た.これらの結果についてはさらにデータを増やす必要はある。分析結果の一部は,論文として準備中である.よって予定よりも少し進んでいると言える.JSL以外で同様の助動詞表現をもつ世界の手話表現との比較から、仮説の妥当性の検証を継続する。先行研究で指摘されている、AUXと移動構文の関係については更なる探求が必要である。AUX1, AUX2がJSLの動詞「見る」から成立したことから、この動詞についても詳細な記述と分析を行った上で、が移動表現とどのように関連するのかを明らかにして行く必要がある。すでに収集したデータに加えて、新しくサイナーからのデータを集めて分析を行う。平成25年度に実施予定であった,文法関係を表示する「助動詞」について,手話話者の協力を得てより多くのデータ採集,及び分析をさらに進め、得られた分析結果の検証を行う必要がある.「助動詞」について,特に手話の習熟度と使用頻度の関係については,データ数も分析も不足しているので,これから本格的な作業が必要である.これに加えて,現在までに分析した移動構文のデータとの比較,「助動詞」と共起する動詞の詳細な分析をすすめ,Fischerらの先行研究で主張されていた当該文法の成立,および移動構文との関係について明らかにする事を目指す.また「文末指差し」など他の用法との関係についても考察していく必要がある.初年度の未使用額が当該年度の予算として計算されていなかった為残額が発生している。この学徒翌年度分として請求する助成金とをあわせた額で次年度は使用する。現在までのデータを整理しまとめるためパソコンと必要なソフトなど周辺の一式を揃える。