hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
巨核球の分化と血小板関連蛋白質:遺伝子のクロ-ニングと発現調節の解析

又これら種々の亜株を用い、モノクロ-ナル抗体を作製し、分化に伴い反応に変化を認めたものにつき、cDNAライブラリ-を用いて巨核球の分化に関与する物質の同定をすすめる予定である。巨核球系細胞株CMKは、フォルボ-ルエステル(TPA)処理により、表面マ-カ-上でも、形態上でも、より成熟した巨核球に分化する。そこで巨核球の分化に伴って発現される蛋白質を同定する目的で以下の実験を行った。CMK細胞及びTPAで分化させたCMK細胞のmRNAを材料とし、2種のプロ-ブ用M13ファ-ジcDNAライブラリ-を作成し、これらをプロ-ブとしてデイファレンシャルハイブリダイゼ-ションを実施し、先にλgtllを用いて分化CMK細胞より作成したcDNAライブラリ-より、CMK細胞プロ-ブとは反応せず分化CMK細胞プロ-ブとのみ特異的に反応するクロ-ンを選択した。5回の別々の実験より得られたこれらクロ-オを、さらにNothern blotting法にて特異性を確認し、延べ36のクロ-ンを得、ついで重複するクロ-ンを除き最終的に18のクロ-ンを得た。これらの内、すでに3種については、それぞれGlucose transporter like protein,Glutation peroxidase,Leukocyte common antigenと確認されたが、他については未知のクロ-ンではあり、同定作業に入っている。CD34抗体は、造血幹細胞を認識する抗体である。CMK細胞は、CD34抗体に反応し、造血幹細胞としての形質を有している。本抗体に対する反応をTPAで分化誘導したCMK細胞、及び巨核球により分化した亜株であるCMK11ー5細胞で検討すると、両者ともCMK細胞と比べ反応細胞の比率が低下した。この結果より、CMK細胞が分化に伴って消失してゆくmRNAを検討することにより、造血幹細胞に特異的な物質を新たに同定しうる可能性が得られた。これにより、造血幹細胞の濃縮・純化が促進される可能性がある。
光活性化法によるリポソームの融合・破壊の基礎研究

光励起によるリポソームの融合・破壊の基礎実験を、以下にまとめる経過で行った。1.リポソームの調製に、従来用いていた凍結・融解・超音波法に加えて、透析法を導入し、大量調製の方法を確立した。これまでに、西洋わさびのペルオキシダーゼ、チトクロム酸化酵素、バクテリオロドプシンで再構成したリポソームに加えて、pH指示薬、ポルフィリンリポソームを調製した。2.フラッシュ励起色素レーザーの組み立て、発振制御用のコンピューターインターフェースの製作を行い、コントロール、データ処理のプログラムを、C言語で作成した。3.リポソームの破壊を検出するために、分光光学的方法、電気化学的方法を確立した。4.チトクロム酸化酵素リポソームとバクテリオロドプシンリポソームをカルシュウムイオンの存在下で融合させた場合、光照射により呼吸活性が促進されることを観測し、融合を判定する一つの指標を確立した。5.プロトポルフィリンを埋没させたリポソームを光照射すると、極めて短時間にポルフィリンが分解するとともに、リポソームの破壊することが判明した。破壊の程度は酸素濃度に依存し、酸素のかわりに窒素気流中で光照射すると、その程度はかなり抑えられた。6.ポルフィリンリポソームにチトクロム酸化酵素を再構成させた標品を光照射すると、酸化酵素活性が100%近く失われた。7.ローダミン色素レーザーで光励起したポルフィリンリポソームの減衰過程をフラッシュフォトリシス法で解析し、吸収スペクトルと吸光度の時間変化から、2段階変化の動力学的過程、酸素濃度の影響を明らかにした。レーザー励起リポソーム融合・破壊装置については、フラッシュランプ励起色素レーザーの組立と発振制御用のコンピューターインターフェースの製作を完了し、ローダミンによる可視光の発振は可能になった。一方、リポソーム融合・破壊の観測系については、螢光、光散乱強度の変化を観測するためにはレーザー光とは別に、励起光を連続的に照射する必要があり、そのために特殊なセル部分を設計・製作した。さらに破壊によるリポソーム内液の漏出を検出するために電導度の変化を利用することを目指して電導度セルの製作を行いつつあるが、これはほぼ完成に近付いている。また螢光、光散乱強度、電導度変化の観測時間がマイクロ秒から分、時間の広領域に及ぶため、全領域に亘って制御可能なコンピューターインターフェイスとプログラムの開発を行った。リポソームの調製については、従来のfreeze-thaw-sonicate法に加えて透析法を導入した。透析槽内部の試料溶液を撹拌し、透析外液を連続的に供給する手段で大量調製の方法を確立した。これまでに西洋ワサビのペルオキシダーゼや、pH指示薬を封入したリポソーム標品、また呼吸酵素であるチトクロム酸化酵素や、バクテリオロドプシンで再構成したリポソームの調製に成功している。とくに酸化酵素リポソームとロドプシンリポソームをカルシュウムイオンの存在下で融合させた場合、光照射によって呼吸活性が促進されることを観測し、融合を判定する一つの指標を確立した。
スフィンゴ糖脂質による神経細胞の増殖・分化シグナルの制御

脳神経系におけるスフィンゴ糖脂質糖鎖の役割について、糖転移酵素遺伝子のクローニングとその人為的操作により解析を行った。神経系培養細胞における糖鎖リモデリングと、相同的遺伝子組み換えに基づく糖鎖変異マウスの作製およびその異常表現型の解析により、細胞および生体内における糖鎖機能の解明をめざした。初めに作成したGM2/GD2合成酵素遺伝子ノックアウトマウスでは、脳神経系の形態形成に異常を認めなかったが、当初より神経伝達速度の遅延やロータロッドなどにおける異常行動を認めた。加齢と共に、本遺伝子欠損マウスは知覚異常、運動異常を呈し、病理学的にも特徴的な神経変性像を認めるに至った。知覚鈍痲、坐骨神経の変性、歩行異常、後根神経節と脊髄後角におけるニューロンの変性などを認めた。これらは、複合型ガングリオシドが神経系組織の維持に必須なことを示すものと考えられた。一方GM2/GD2合成酵素遺伝子のトランスジェニックマウスの場合、ガングリオシドの組成が、b-系列からa-系例ヘシフトしただけであったが、いくつかの異常行動および舌下神経の再生能低下を認めた。これより、ガングリオシドの適切な構成比が保たれることが、神経系の正常な機能保持に大切なことが示された。さらにGD3合成酵素遺伝子のノックアウトマウスは、ほとんど正常に生まれ、成長した。しかし、40週齢を越えると、おもにオスにおいて、行動異常、筋力低下などが明らかに観察された。このマウスとGM2/GD2合成酵素遺伝子ノックアウトマウスとをかけ合わせて、ダブルノックアウトマウスを作成したところ、GM3のみを残してガングリオシドが消失したことを確認した。このマウスでは、幼児の時から神経変性や行動異常を認め、また生後12週を過ぎると突然死を起こしたことから、単独ノックアウトでは見られなかった新規の異常、即ち糖脂質糖鎖の新規機能の存在が示唆された。シアル酸を含むスフィンゴ糖脂質であるガングリオシドの、神経細胞における意義を解明するために、培養神経系細胞株およびマウスにおける遺伝子操作によってガングリオシドのリモデリングを行った。まずラット褐色細胞腫PC12に、クローニングしたGD3合成酵素遺伝子およびGM1/GDlb/GA1合成酵素遺伝子を導入したトランスフェクタントを用いて、その増殖・分化などの表現型の変化を検討した。GD3合成酵素遺伝子導入細胞では、著しい増殖の亢進と、神経成長因子(NGF)による分化誘導への不応性が認められた。また、無血清処置によるアポトーシス誘導に抵抗性を示した。これらの変化のメカニズムとして、TrkAのリン酸化とMAPキナーゼの活性化がNGF刺激と無関係に惹起されたことが判明した。即ち、糖脂質の変化がTrkAの2量体形成を促進することによってTrkA/Ras/MAPキナーゼ系の恒常的活性化が起きたものと推察された。一方、GM1/GD1b/GA1合成酵素遺伝子導入細胞の場合は、増殖度に著変はなかったが、NGFによる分化誘導に不応性となっていた。ところがNGF添加後、親株に比して大幅に遅延したTrkAのリン酸化、MAPキナーゼの活性化を認め、この反応パターンの差が、NGF刺激で分化を誘導しえない原因と考えられた。また無血清処置に対するアポトーシス誘導に対しては、抵抗性を示した。この時、親株と対照的に、JNKの活性化が抑えられていることが判明し、これがアポトーシス抵抗性の機構と思われた。今後、個々の糖脂質糖鎖と細胞膜受容体やシグナル分子との分子会合や相互反応につき検討を進める。

また、PC12細胞に加えて、GM2/GD2合成酵素遺伝子ノックアウトマウスおよびGD3合成酵素遺伝子ノックアウトマウスの脳由来初代培養細胞を用いて同様の検討を行い、生体内における糖鎖のシグナル制御機構を解明する予定である。酸性スフィンゴ糖脂質であるガングリオシドの神経細胞の増殖・分化の制御機構を明らかにするために、培養細胞株およびマウスにおける遺伝子操作を行い、糖鎖をリモデリングして解析を行った。ラット褐色細胞腫PC12にGD3合成酵素遺伝子を導入したトランスフェクタントにおいて観察された増殖亢進と神経成長因子(NGF)不応性のメカニズムの解析として、NGF受容体TrkAの恒常的リン酸化と二量体形成を更に検討し、全てのトランスフェクタントにおいてNGF刺激後120分以上の長時間にわたって、強いリン酸化が持続することを確認した。これらのトランスフェクタントではGD1b、GT1bの増加が見られたので、外来性に個々のガングリオシドをPC12培養液に加えたところ、ある濃度の範囲では増殖亢進に働くことが判明した。また無血清処理によるアポトーシスの誘導に対し、本トランスフェクタントは抵抗性を示したが、ワルトマニン処置で抵抗性が消失することにより、TrkAの自律的リン酸化がP13キナーゼの恒常的活性化を惹起していることが示唆された。複合型ガングリオシド、b系列ガングリオシド群によるニューロン死の抑制および切断神経の再生促進効果を検討するため、GM2/GD2合成酵素およびGD3合成酵素遺伝子のノックアウトマウスを用いて、舌下神経切断実験を行った。前者ではアポトーシス抑制および再生度において野生型の約3分の1以下に低下が見られ、後者ては共に約3分の2まで低下していた。これらの結果より、a系列ガングリオシド群の方が、舌下神経に対する神経栄養因子様活性物質としてより重要である可能性を示唆するものと思われた。現在、複合型ガングリオシド欠失マウスの脊髄後角で見られた変性のメカニズムにつき、遺伝子発現の変化を検討することにより解明中である。脳神経系におけるスフィンゴ糖脂質糖鎖の機能解明のため、糖転移酵素遺伝子のクローニングとその人為的操作により解析を行った。神経系培養細胞における糖鎖リモデリングと、糖鎖変異マウスの作製およびその異常表現型の解析により、細胞および生体内における糖鎖機能の解明をめざした。α-シリーズガングリオシドの合成に働く、GD1α合成酵素、ついでGD1α/GT1aα/GQ1b1α合成酵素遺伝子の単離に成功した。これらはコリン作動性ニューロンに特徴的だといわれ、マイナー成分であるが重要性が指摘されてきたガングリオシドである。さらに、グロボ系糖脂質の合成に働くGb3/CD77合成酵素、Gb4合成酵素の遺伝子クローニングにも成功し、その構造と発現分布を明らかにした。遺伝子ノックアウトによる解析では、GM2/GD2合成酵素遺伝子ノックアウトマウスで、加齢に伴って、知覚異常、運動異常、および様々な病理学的変化、即ち知覚鈍痲、坐骨神経の変性、歩行異常、後根神経節と脊髄後角におけるニューロンの変性などを認めるに至った。これらは、複合型ガングリオシドが神経系組織の維持に必須であることを示すものと考えられた。
明治20年代の建築及び室内装飾にみるナショナリズム

明治20年代の建築および室内装飾に関する調査研究を、明治の日本におけるナショナリズムの担い手たちが生みだしたシンボルとして興味深い、明治21年完成の新宮殿(通称:明治宮殿)を中心に実施した。1.宮内庁書陵部に保管されている明治宮殿に関する文献資料の存在を確認した。対象とした主な資料は次の通りである。1)『皇居造営誌本紀』全130巻(付:絵図5帖)2)『皇居造営誌下調図』2帖3)『皇居御造営諸建物其他明細図』34帖4)『皇居御造営内部諸装飾明細図』32帖2.上記の調査であきらかとなった事柄のうち、とくに室内装飾のデザインや実際に装飾を手がけた工芸家たちについての研究を進めるため、明治時代に結成された工芸技法別の団体に関する文献資料の収集を幅広く行った。対象とした団体は次の通りである。1)東京彫工会2)日本金工協会3)東京鋳金会4)大日本窯業協会5)大日本織物協会6)日本漆工会3.上記の工芸技法別の団体と深く関わっていたと考えられる美術団体に関する文献資料の収集もあわせて行った。1)日本美術協会2)京都美術協会今回は、以上3段階の資料収集を行うにとどまった。今後はこれらの基礎的データの分析を継続し、研究を進めて行きたいと考えている。
ポジショナルクローニングによる遺伝性神経疾患の病因の解明

本研究の目的は,ポジショナルクローニング(positional cloning)の手法を用いて遺伝子神経疾患の原因遺伝子を解明し神経細胞の変性の分子メカニズムを明らかにしようというものである.主な対象として,遺伝子性脊髄小脳変性症の中でも,(1)Machado-Josepん病,(2)歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症(dentatorubral-pallidoluysianatrophy),(3)低アルブミン血症を伴う脊髄小脳変性症を対象として,その原因遺伝子の探求を行った.Machado-Joseph病については,連鎖解析という手法により6家系のMachado-Joseph病家系の詳細な解析を行い,多点連鎖解析で,D14S55の位置で最大のロッド得点9.719が得られ,Machado-Joseph病の遺伝子座が第14染色体14q24.3-32.1に存在することを発見した.D14S53,D14S45の位置での組み換え例の観察から,その遺伝子座の存在する領域は,D14S53とD14S45の間の29センチモルガンの領域であることを確定した.歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症(DRPLA)は常染色体性優性遺伝子を示す脊髄小脳変性症の一つであるが,本疾患の病因遺伝子の探索に当たって,われわれは何らかの3塩基繰り返し配列を有する遺伝子であろうとの仮説を立て,既知の遺伝子で3塩基繰り返し配列を有する遺伝子を有している遺伝子に着目して検索を行い,その結果,第12染色体に存在する本症の病因遺伝子を発見することができた.特に,従来からよく知られていた本症における臨床的多様性が3塩基繰り返し数の増大の程度とよく相関することを発見し,3塩基繰り返し数の増大の程度が病態機序の上で密接に関連することを明らかにした.低アルブミン血症を伴う脊髄小脳変性症は常染色体劣性遺伝子を示す疾患であるが,連鎖解析の結果からその遺伝子座が第9染色体にあること,臨床的には本症がフリードライヒ失調症に類似するものの病因遺伝子を異にする可能性が高いことを明らかにした.本研究の目的は,ポジショナルクローニング(positional cloning)の手法を用いて遺伝子神経疾患の原因遺伝子を解明し神経細胞の変性の分子メカニズムを明らかにしようというものである.主な対象として,遺伝子性脊髄小脳変性症の中でも,(1)Machado-Josepん病,(2)歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症(dentatorubral-pallidoluysianatrophy),(3)低アルブミン血症を伴う脊髄小脳変性症を対象として,その原因遺伝子の探求を行った.Machado-Joseph病については,連鎖解析という手法により6家系のMachado-Joseph病家系の詳細な解析を行い,多点連鎖解析で,D14S55の位置で最大のロッド得点9.719が得られ,Machado-Joseph病の遺伝子座が第14染色体14q24.3-32.1に存在することを発見した.D14S53,D14S45の位置での組み換え例の観察から,その遺伝子座の存在する領域は,D14S53とD14S45の間の29センチモルガンの領域であることを確定した.歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症(DRPLA)は常染色体性優性遺伝子を示す脊髄小脳変性症の一つであるが,本疾患の病因遺伝子の探索に当たって,われわれは何らかの3塩基繰り返し配列を有する遺伝子であろうとの仮説を立て,既知の遺伝子で3塩基繰り返し配列を有する遺伝子を有している遺伝子に着目して検索を行い,その結果,第12染色体に存在する本症の病因遺伝子を発見することができた.特に,従来からよく知られていた本症における臨床的多様性が3塩基繰り返し数の増大の程度とよく相関することを発見し,3塩基繰り返し数の増大の程度が病態機序の上で密接に関連することを明らかにした.低アルブミン血症を伴う脊髄小脳変性症は常染色体劣性遺伝子を示す疾患であるが,連鎖解析の結果からその遺伝子座が第9染色体にあること,臨床的には本症がフリードライヒ失調症に類似するものの病因遺伝子を異にする可能性が高いことを明らかにした.ヒトXq28にマップされている神経筋疾患の原因遺伝子を単離することを目的として,1)ヒトXq28領域のゲノムDNAをクローン化して,詳細な物理地図の作製を行うこと,2)ヒトX染色体長腕における発現遺伝子を数多く単離し,発現遺伝子地図を作製すること,3)X連鎖疾患を含めてさまざまの遺伝性神経疾患の患者細胞バンクを樹立すること,の3点について重点的に研究を進めた.第1のゲノムDNAのクローン化については,ヒトX染色体長腕のみ(Xq24-qter)を有する雑種細胞(X3000-11.1)よりコスミドベクターを用いて,ヒトXq24-qter由来の1784個のコスミドクローンを得た.これらからDNAを調製しNotI制限酵素認識部位を有するコスミドクローンをリンキングクローンとして400クローンを同定した.これらについて相互の重なりなをチェックしながらX染色体長腕上の詳細なマッピングを行いXq24-25領域に11グループ,Xq26-27領域に6グループ,Xq28領域に19グループを同定した.第2の発現遺伝子の単離については,ヒトXq24-

qterのみを有する雑種細胞(X3000-11.1)を用いて,スプライシングを受ける前のheterogenous nuclear RNAの中にまだ含まれているイントロン中にヒト特異的な反復配列が含まれていることを利用して,それに対応するcDNA(正確には,hetergenous nuclear RNA,hncDNA)をクローン化する技術を開発し実用化した.実際にこの方法を用いて,ヒトXq24-qter領域から合計11個のhncDNAをクローン化し,塩基配列の解析からはすベて従来報告のない新たな遺伝子であることが判明した.さらに,Xq28領域においては,3個に新たな発現遺伝子を同定した.第3のヒト神経疾患の細飽バンクについては,Xp28領域にマップされている副腎白質ジストロフィーを含めて,現在までに388株の細飽株を樹立することができる.本研究の目的は,ポジショナルクローニング(positional cloning)の手法を用いて遺伝性神経疾患の原因遺伝子を解明し神経細胞の変性の分子メカニズムを明らかにしようというものである.主な対象として,遺伝性脊髄小脳変性症の中でも,(1)Machado-Joseph病,(2)歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症(dentatorubral-pallidoluysian atrophy),(3)低アルブミン血症を伴う脊髄小脳変性症を対象として,その原因遺伝子の探求を行った.Machado-Joseph病については,連鎖解析という手法により6家系のMachado-Joseph病家系の詳細な解析を行い,多点連鎖解析で,D14S55の位置で最大のロッド得点9.719が得られ,Machado-Joseph病の遺伝子座が第14染色体14q24.3-32.1に存在することを発見した.D14S53,D14S45の位置での組み換え例の観察から,その遺伝子座の存在する領域は,D14S53とD14S45の間の29センチモルガンの領域であることを確定した.歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症(DRPLA)は常染色体性優性遺伝性を示す脊髄小脳変性症の一つであるが,本疾患の病因遺伝子の探索に当たって,われわれは何らかの3塩基繰り返し配列を有する遺伝子が原因遺伝子であろうとの仮説を立て,既知の遺伝子で3塩基繰り返し配列を有する遺伝子を有している遺伝子に着目して検索を行い,その結果,第12染色体に存在する本症の病因遺伝子を発見することができた.特に,従来からよく知られていた本症における臨床的多様性が3塩基繰り返し数の増大の程度とよく相関することを発見し,3塩基繰り返し数の増大の程度が病態機序の上で密接に関連することを明らかにした.低アルブミン血症を伴う脊髄小脳変性症は常染色体劣性遺伝性を示す疾患であるが,連鎖解析の結果からその遺伝子座が第9染色体にあること,臨床的には本症がフリードライヒ失調症に類似するものの病因遺伝子を異にする可能性が高いことを明らかにした.
インドネシア人看護師・介護士に関する研究―インドネシア側の視点を中心に

本研究は、日本ーインドネシア経済連携協定に基づき、2008年度より日本に滞在しはじめた、インドネシア人看護師・介護福祉士候補者を主たる対象として、彼ら/彼女らの受け入れの現状および、制度上の課題をインタビューなどの方法を中心に、明らかにするものである。とくに、これまであまり明らかにされてこなかった、インドネシア人看護師・介護福祉士候補者や候補者の送り出し校など、インドネシア側の当事者・関係者の視点に焦点をあてている。当事者のライフヒストリーなどを掘り下げ、少数の事例を掘り下げている点に特徴がある。本研究は、EPA(経済連携協定)に基づき来日している、インドネシア人看護士/看護師候補者および、彼ら/彼女らに関わる人びとへの質的調査を通じて、候補者が抱える問題や制度上の課題を、インドネシア人候補者の見方を中心として明らかにしようとするものである。本年度はとくに、現在日本に滞在するEPA候補者/帰国者にアクセスし、彼らの現状および、帰国後にどのような生活をし、問題を抱えるのかについて調査を行った。具体的には、第一に先行研究の収集および整理を行った。適宜、文献の相互利用などを使ったが、新聞記事等を含めより集中的に文献を収集するため、東京の国立国会図書館でも1度、文献収集をした。第二に、EPA候補者に対して、直接接触し、ヒアリング調査をした。たとえば、むつ市で介護福祉士試験に合格しながらも西ジャワ州に帰国した女性、神戸市および高松市近辺で介護福祉士候補者として研修を受けながらも、試験に合格せず東ジャワ州に帰国した夫婦、三重県と千葉県でそれぞれ介護福祉士候補者として研修しながらやはり試験に合格せず西ジャワ州に帰国したきょうだい、青森県で介護福祉士試験に合格し、就労を続ける女性などに複数回接触し、質的なヒアリング調査およびフォローアップ調査を行った。第三に、送り出し調整機関であるインドネシア海外労働者派遣・保護局の担当者、ジャカルタのビナワン保健大学(インドネシアから医療労働者を海外に多数輩出)の看護学部長、インドネシア大学の移民研究社など、関係者にヒアリング調査を行った。その結果、従来の研究ではあまり明らかにされてこなかった結果を明らかにすることができた。すなわち、日本で希望をもって就労する合格者がいると同時に、少なからずの帰国者が困難な状況に直面し、日本での経験や看護師・介護福祉士としてのキャリアがほとんど生かされないような職業選択をせざるをえない現状を解明できた。本研究は、EPAに基づき来日している、インドネシア人看護師候補者および介護福祉士候補者を対象として、その渡航動機、ライフヒストリー、海外就労意識などを明らかにすることによって、外国人看護師・介護福祉士候補者養成の制度上の問題を提示しようとするものである。2013年度は、1先行研究のフォローをするとともに、2インドネシア人看護師・介護福祉士候補者の潜在的プールである、インドネシアの看護学校の学生の海外渡航意識を明らかにした。3さらに、日本に滞在するインドネシア人看護師・介護福祉士候補者にヒアリング調査を行うとともに、4これまでの研究成果を論文に集約した。第一に、前年度に引き続き、先行研究のフォローを目的として、文献資料の収集とその読み込みを行った。第二に、インドネシア、ジャカルタ特別州にあり、海外へ看護師を積極的に送り出している、ビナワン保健大学看護学科の学生にたいして、海外への就労にかんするアンケート調査を実施した。この目的のために、前年度からビナワン保健大学担当者と調整・準備をしてきた。今年度は、2013年8月ー9月にかけて、学校を訪問し、実際に調査票を配布し、データ収集とその分析を行った。さらに、結果報告を兼ねて2014年2月に再度ジャカルタの関係者を訪れ、研究結果を報告した。第三に、日本に滞在するインドネシア人看護師・介護福祉士(候補者)を訪ね、ヒアリング調査を行った。第四に、これまでの成果を集約し、東北都市学会年報に論文を掲載するとともに、インドネシア大学社会政治学部の雑誌(Global)に投稿した。制度上の問題として、日本の受入れ機関における不適切な待遇、日本での就労に伴うリスクの存在、日本での就労のメリットが中東や欧米に比べて少ないこと、看護学生の安易な海外就労選択と、海外就労に関する不十分な情報収集の存在が明らかになった。本研究は、EPA(経済連携協定)にもとづいて2008年から来日している、インドネシア人看護師および看護師候補者を対象として、彼らのライフヒストリー、受け入れまでの経緯と現状などを明らかにすることによって、制度上の課題をインドネシア人側の見方を中心として明らかにしようとするものである。この目的のもと、平成23年度には、第一に、インドネシア人看護師・介護福祉士候補者およびEPA制度に関する基礎的資料と、先行研究の収集と整理を、日本およびインドネシア(大学や研究機関の図書館や新聞社等)で行った。その中で、インドネシア人看護師・介護士候補者に関する研究は、看護師・介護福祉士候補者の基本的属性などの統計的な基礎資料や関連の情報については、看護学の領域を中心としてそれなりに蓄積されてきていること、自分の研究をとりわけ質的ヒヤリングを中心に特化していく必要性が明らかになった。

第二に、インドネシア大学社会学部国際関係学科や同大学看護学部などのスタッフ、また「じゃかるた新聞」で看護師関連の記事を書いた記者等に直接会い、研究動向および調査可能性についてのディスカッションを行った。このコミュニケーションは現在もメイルを通じて随時行っている。24年度以降も協力してもらうことで合意を得ている。また、研究に関連する周辺のスタッフを紹介してもらい、ネットワークを広げた。第三に、送り出し側でのヒヤリング(インドネシア、西ジャワ州チレボンの民間の看護学校STIKES)の学長およびフタッフに対するヒヤリングを、2011年9月に実施した。第四に、日本(三沢市・むつ市)にいる看護師・介護福祉士候補者、およびインドネシアに既に帰国している看護師・介護福祉士候補者数名(リアウ州プカンバル)に、ヒヤリングを行った。昨年度と同様、東北地方ではインドネシア人看護師・介護福祉士候補者の帰国や、他地域への転出等が多くみられ、依然として、候補者・元候補者へのアクセスは容易ではない。彼ら/彼女らは温暖な気候や受入機関の多さなどを理由として、関東地方や西日本により多く偏在しているからである。しかしながら、個人的なネットワークを広げることで、研究を深めることができた。すなわち、インドネシア人看護士・介護福祉士候補者の個人的なネットワーク等を利用して、より多くのインドネシア人候補者に複数回接触し、日本での生活とインドネシアでの生活とのギャップ、直面する問題などについて、事例数は多くないものの、比較的詳細に聞き取ることができた。その結果、マスコミ等で流布している帰国理由、すなわち家族の問題ゆえに、候補者がインドネシアへ帰国するだけでなく、第二、第三の帰国理由をもつ候補者もいるということが明らかになった。すなわち、制度や施設に対する不満を抱えているがゆえに帰国するのである。あまりにも低い合格率、苛酷な労働、施設での不適切な対応、場合によっては雇用契約に違反するような事例、すなわち、有給休暇の取得を認めないとか、試験の費用を自己負担候補者に強いるなどのケースである。EPA制度下では、候補者側を要請する費用を負担するのが受入施設になっており、受入施設で研修を受け、就労に対する報酬を受け取る。したがって、雇用され、研修を受けている候補者が受入施設に対して、不満を表現できないのが現状である。また、候補者の相談窓口となるJICWELS(国際厚生事業団)も十分な相談業務を行えていない。成果論文は既に査読結果が出ており、「東北都市学会年報」に掲載確定であるが、ページが確定していないため、今回の報告書には記載できなかった。次年度の成果報告書に掲載予定である。最大の理由は、インドネシア人看護師・介護福祉士候補者へのアクセスが研究当初の予想以上に難しいことが調査をつうじて明らかになったからである。アクセスが困難な理由は、主に2つある。
分子シャペロンを用いたがん治療の基礎的研究

【目的】変異型p53癌細胞に効率のよい癌治療効果を適用することを目指し、変性蛋白質構造を正常な蛋白質構造に戻す働きのあるとされる分子シャペロン(グリセロール)の変異型p53癌細胞の放射線/抗癌剤感受性に対する増感作用および放射線/抗癌剤による変異型p53腫瘍の増殖抑制の増強作用を検討した。【成果】グリセロールによりH1299/mp53、SAS/Trp248、8305cおよびCa9-22細胞のX線あるいはCDDP感受性が増感し、アポトーシスが増強された。シャペロン効果はp53遺伝子の変異部位に依存しないことや正常型p53蛋白質の機能亢進によるものではないことを確認した。さらに、ヌードマウス移植癌系では次の分子シャペロン効果を検討し、それぞれの知見を得た。1.p53の遺伝子型のみが異なる細胞をヌードマウスに移植し、効率良くグリセロールを細胞へとりこませる方法を樹立する。→腫瘍体積の2倍量の1.2Mグリセロールを3日間連続局所投与および2日目のグリセロール局所投与直後にCDDPを腹腔内投与あるいはX線を腫瘍部位に照射することにより、効率良くグリセロールを細胞へとりこませることが出来た。2.各種濃度のグリセロールを注入後、放射線・温熱処理を行い、腫瘍の増殖曲線を求める。→腫瘍の増殖曲線を求めた結果、X線あるいはCDDPによる腫瘍増殖抑制がグリセロール処理で増強されることが分かった。3.分子シャペロン効果の見られたものについての癌細胞の死の様子について、病理的・分子生物学的に検索する。→変異型p53腫瘍ではグリセロールとX線あるいはCDDP併用処理によりアポトーシスが増強されることを免疫組織学的に明らかにした。【結論】変異型p53を保有する癌患者に対しては分子シャペロン治療を併用した放射線あるいは抗癌剤治療が有効であることが培養細胞系およびヌードマウス移植系で強く示唆された。【目的】変異型p53癌細胞に効率のよい癌治療効果をもたらすため、変性蛋白質構造を正常な蛋白質構造に戻す働きのある分子シャペロン(グリセロール)を用い、変異型p53タンパク質に正常型p53タンパク質の正常機能を回復させることを目的とした。【方法】神経膠芽腫細胞A-172あるいは舌扁平上皮癌細胞SASに変異型p53遺伝子(codon248,Arg→Trp)を導入した細胞(A-172/Trp248,SAS/Trp248)および変異型p53を保有する甲状腺未分化癌細胞8305cを用いた。グリセロール処理は放射線、温熱あるいはCDDP処理の2日前に培地に添加し(最終濃度0.6M)、これらストレス処理はグリセロール存在下で行った。コロニー形成法で感受性を測定し、ヘキスト染色法及びDNA ladder検出法でアポトーシスの解析を行った。変異型p53蛋白質のDNA結合活性はGel mobility-shift assay法で検討した。【結果】グリセロールによりA-172/Trp248細胞あるいはSAS/Trp248細胞の温熱感受性あるX線感受性が増感し、アポトーシスが増強された。グリセロール処理をした8305c細胞は、X線あるいはCDDPによるアポトーシス誘導の増強が見られ、ヌードマウス移植系ではCDDPによる腫瘍増殖抑制がグリセロール処理で増強された。また、グリセロールおよび温熱処理したA-172/Trp248細胞から抽出した核内p53タンパク質はp53 consensussequenceに結合するようになった。【考察】グリセロールを介した変異型p53蛋白質の活性回復により、X線、温熱あるいはCDDP処理後にp53依存的アポトーシスが誘導され、感受性が増強されることが示唆された。【結論】変異型p53を保有する癌患者に対しては分子シャペロン治療を併用した放射線、温熱あるいは抗癌剤治療が有効であることを示唆している。

3.分子シャペロン効果の見られたものについての癌細胞の死の様子について、病理的・分子生物学的に検索する。→変異型p53腫瘍ではグリセロールとX線あるいはCDDP併用処理によりアポトーシスが増強されることを免疫組織学的に明らかにした。【結論】変異型p53を保有する癌患者に対しては分子シャペロン治療を併用した放射線あるいは抗癌剤治療が有効であることが培養細胞系およびヌードマウス移植系で強く示唆された。【目的】変異型p53癌細胞に効率のよい癌治療効果を適用することを目指し、変性蛋白質構造を正常な蛋白質構造に戻す働きのあるとされる分子シャペロン(グリセロール)の変異型p53癌細胞の放射線/抗癌剤感受性に対する増感作用および放射線/抗癌剤による変異型p53腫瘍の増殖抑制の増強作用を検討した。【方法】p53欠損ヒト肺癌細胞H1299に変異部位の異なる変異型p53遺伝子(codon175,Arg→His ; codon248,Arg→TrP ; codon273,. Arg→His)を導入した細胞(H1299/mp53)、P53の表現型が正常型の舌扁平上皮癌細胞SASに変異型P53遺伝子(codon248,Arg→Trp)を導入した細胞(SAS/Trp248)および変異型P53を保有する甲状腺未分化癌細胞8305c(codon273,Ar9→Trp)とヒト口腔扁平上皮癌細胞株Ca9-22(codon248,Arg→Trp)を用いた。グリセロール処理は放射線あるいはCDDP処理の2日前に培地に添加した(最終濃度0.6M)。コロニー形成法で感受性を測定し、ヘキスト染色法及びDNAladder検出法でアポトーシスの解析を行った。SAS/neo細胞、SAS/Trp248細胞または8305c細胞をヌードマウス(Balb/cAJcl-nlの大腿皮下に移植し、1.2Mグリセロールを3日間連続局所投与および2日目のグリセロール局所投与直後にCDDPを腹腔内投与あるいはX線を腫瘍部位に照射した。【結果】グリセロールによりH1299/mp53、SAS/Trp248、8305cおよびCa9-22細胞のX線感受性が増感し、アポトーシスが増強された。グリセロール処理をした8305cあるいはSAS/Trp248細胞では、CDDPによるアポトーシス誘導の増強が見られ、これら細胞のヌードマウス移植系においてはX線あるいはCDDPによる腫瘍増殖抑制がグリセロール処理で増強された。【考察】グリセロールを介した変異型p53蛋白質の活性回復により、X線あるいはCDDP処理後にP53依存的アポトーシスが誘導され、感受性あるいは増殖抑制が増強されることが示唆された。さらに、このシャペロン効果はp53遺伝子の変異部位に依存しないことや正常型p53蛋白質の機能亢進によるものではないことが今年度新たに確認された。【結論】変異型p53を保有する癌患者に対しては分子シヤペロン治療を併用した放射線あるいは抗癌剤治療が有効であることが培養細胞系およびヌードマウス移植系で強く示唆された。
強相関・多自由度系超伝導体の微視的電子状態に基づいた理論研究

本研究課題は、重い電子系に代表される強相関・多自由度系超伝導体を微視的な立場から理解することを目的としている。本年度は、前年度のUPt3化合物に対する研究で得られた知見から、多自由度系における超伝導対称性の分類学を推し進め、軌道や副格子の自由度が存在する系で現れる特殊な引力機構やギャップ構造の解析を行った。特に多軌道系のおける超伝導対称性の分類では、軌道自由度とスピン軌道相互作用を陽に考慮することで、従来の一軌道模型を用いた分類で見逃されてきた特殊なノード構造が可能であることを指摘した。また、多軌道系においては、波数依存性のない局所揺らぎを媒介とした異方的超伝導や、スピン揺らぎなどの競合する揺らぎを必要としない異方的s波超伝導などが実現しうる。本課題ではUPt3やBiS2系超伝導体などを対象に、これら多軌道系に特有な超伝導ギャップの実現可能性について議論した。副格子自由度は系の空間群が非共型となる場合において特に重要な役割を担う。本課題では非共型空間群におけるノード構造の分類を磁気秩序相へ適用することで、反強磁性超伝導体UPd2Al3および強磁性超伝導体UCoGeのギャップ構造を解析し、引力機構の詳細によらない厳密な結果を得た。特にUPd2Al3が属する空間群では、c軸方向のブリュアンゾーン境界にフェルミ面が存在する限り、s波フルギャップの超伝導が禁止されることを示した。またUCoGeにおいては、第一原理計算で得られるフェルミ面を仮定した場合、どの対称性の超伝導が実現してもラインノードが約束されることを示した。これらのノード構造は実験事実ともコンシステントであり、このような非共型空間群に属するギャップ対称性の分類の重要性を示した結果である。28年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は当初の年次計画にあるように第一原理計算に基づいてUPt3化合物の超伝導対称性・発現機構の解析を行った。UPt3はスピン3重項超伝導が示唆される重い電子系化合物であり、磁場-温度相図において多重超伝導相図を示す非常に珍しい物質である。本研究では第一原理計算に基づく微視的な電子状態を用いて、電子相関効果を2次摂動の範囲で取り扱い、UPt3の磁気・多極子ゆらぎの構造や超伝導対称性の計算を行った。その結果、中性子散乱実験で観測されている構造とコンシステントな磁気揺らぎが得られ、その揺らぎを用いて最も実現可能性の高い超伝導対称性を計算した結果、多くの実験を比較的よく説明できるE2u表現の超伝導ギャップを得た。この超伝導ギャップはE2u表現という対称性に属しながら、従来考えられていなかった特殊なギャップ構造をしており、バンドごとにノードの入り方が異なるという著しい特徴を持っている。特に計算で得られた、小さなフェルミ面を持つバンドに入るノードの構造は、従来の非従来型超伝導体の研究において考慮されていなかった新しいタイプのギャップ構造である。この結果を受けて我々は合成角運動量j=5/2を用いた超伝導ギャップ関数の分類を行い、軌道自由度とスピン軌道相互作用を考慮することで、このような特殊なギャップ構造が現れ得ることを示した。このギャップ構造は回転磁場下における熱伝導度と比熱の両方の実験をコンシステントに説明でき、UPt3で実際に実現している超伝導ギャップの有力な候補になると思われる。当初の目標であった局所相関効果を取り入れた解析を行うには至らなかったが、第一原理計算に基づく解析でE2u表現に属する超伝導ギャップ関数が得られ、現象論で有力とされていた2次元・奇パリティの超伝導対称性を微視的な立場からサポートすることができた。また、合成角運動量を用いたギャップ関数の分類により示した軌道・バンド依存したノード構造は、熱伝導度・比熱の両方の実験結果をコンシステントに説明でき、当初の計画にない成果を生んだ。

特にUPd2Al3が属する空間群では、c軸方向のブリュアンゾーン境界にフェルミ面が存在する限り、s波フルギャップの超伝導が禁止されることを示した。またUCoGeにおいては、第一原理計算で得られるフェルミ面を仮定した場合、どの対称性の超伝導が実現してもラインノードが約束されることを示した。これらのノード構造は実験事実ともコンシステントであり、このような非共型空間群に属するギャップ対称性の分類の重要性を示した結果である。当初の予定通り、局所相関効果がUPt3や他の重い電子系超伝導体の対称性・発現機構に与える影響を調べる一方、本研究において一部行った多軌道・多自由度系超伝導体の分類も並行して進めていく予定である。特に、本研究で得たUPt3のギャップ構造にも現れている非共型空間群によって守られたノードの分類を行い、また実験との関連として、微視的な電子構造に基づく磁場中超伝導状態の計算も行っていく予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。
羊水塞栓症診断のための新規マーカー探索と診療ガイドライン作成

羊水/血清比が高い羊水特有な物質を、プロテオミクス技術を用いて同定することにより、感度に優れた血清診断マーカーが確立する可能性が示唆された。登録された羊水塞栓症データを用い、χ2検定により解析した結果、経産婦、満期産、経膣分娩、血清STN値47U/ml、IL-8値100pg/ml以上、呼吸困難、心停止および意識消失が致死的因子として抽出された。各症例における致死的因子の存在割合が増加することにより、死亡率が上昇するため、予後スコアとなる可能性が示唆された。1.低分子STNを含めた胎便・羊水特異物質の測定法の確立:胎便中低分子STN測定法の確立とし、0.5%胎便溶解液に2.5%W/V濃度のtrypsinを添加し30分培養した。Trypsinにより胎便溶解液中のSTNを含むムチンは、低分子化したSTNに分解されることを予測し、2.5%および15%のpolyacrylamid gelを用いて電気泳動を施行した。低分子化されたSTNを、STNに対する5種類のモノクローナル抗体(TKH-2,CC49,B72.3,CA54.CA61)を用いてWestern-Blot法を施行した結果、60kD,25Kd,15kDの低分子STNに分解されることが確認された。さらに、これらの低分子化されたSTNが、既存のSTNを認識する5種類のモノクローナル抗体のうち、どの抗体に感度・特異度に関して良いか検討した結果、TKH-2抗体とMA61抗体の2種類が候補となった。従来のTKH-2抗体1種類を用いたRIA法より、簡易測定キットの作成を計画するにあたり、2種類の抗体によるサンドイッチ法を用いたほうが感度および簡便性に関しても優れている。2.基礎データづくり:羊水塞栓症における本邦の診断基準は、診断基準案(2004年に羊水塞栓症診断における血清検査事業時の登録基準)であり、正式には存在しない。本邦独自の診断基準を考慮しようと考えると、やはりUSAの診断基準を無視するわけにいかないため、この基準をベースとした日本独自の方式を考慮するのが良いと考えている。現在考慮中の診断基準は、USAの診断基準を少し改良したものである。対象症例は、1992年から2006年までに羊水塞栓症とし登録された135症例である。これら症例を解析ソフトSPSS15.0Jに入力し統計を実施した。診断に使えるデータ項目と、予後因子を調査中である。調査する項目は26項目に限定し、死亡した場合と生存した場合をx^2検定により予後因子を検討している。1.予後因子の検討羊水塞栓症は、致死的な周産期疾患であるが、どのような症例に高い死亡率を示すのかは未だ不明である。そのため今回、本症の死亡例と生存例の背景因子を統計学的に検討し、致死的因子を明らかにする。1992年から2006年までに登録された羊水塞栓症データ(IRB承認)135例(死亡例65例と生存例70例)を用い、患者背景因子、臨床所見や血液データ(血清Zn-CP1値、STN値、IL-8値、血清補体価)などの因子をSPSS15.0Jを用い統計学的に解析し、致死的リスクの高い因子を探索した。その結果、患者背景では経産婦、満期産、経膣分娩がp<0.05であり、血清マーカーでは血清STN値47U/mlとIL-8値100pg/ml以上が母体死亡の危険因子として抽出された。一方、臨床症状として、呼吸困難、心停止および意識消失が有意差を認めた。以上より、致死的羊水塞栓症の危険因子は、経産婦が満期で経膣分娩をする場合であり、肉眼的羊水混濁がなくても胎便中のムチンを多く含んでいる時に、致死率が高くなった。我々は本症候群をクラシック型、DIC型、アナフィラキシー型に分類して解析を進めている。今後は、これら予後因子から予後をみる予後スコアを作成する予定である。2.羊水特異的マーカー(特許申請中)の探索羊水や胎便成分が、母体血中に流入し、何らかの反応が起こることにより羊水塞栓症が惹起される。そのため、母体旨血清中に少なく羊水中に多く含まれる羊水特異的マーカーを特定できれば、その物質(蛋白質)を血清学的診断方法に用いることが可能である。この蛋白質を、プロテオミクスとタンパクアレイを用いて同定した。(特許申請中)この物質が、臨床応用に可能かを見極めるため、母体より採取した血清、羊水および膣分泌物中の濃度を測定し、現在検討中である。

既存の羊水塞栓症の血清マーカーとしてSialyl Tn (STN)が存在するが、感度が25.8%、特異度が97.3%であり、今後感度の良いマーカーの開発が必要である。現在検討中のマーカーに期待する。【予後スコアの作成】1992年から2006.年までに登録された羊水塞栓症データ135例(生存例70例、死亡例65例)を用いて、致死的因子(A【有意差P<0.001:経膣分娩、STN 47U/ml以上、心停止、呼吸困難】,B【有意差0.001≦P<0.01:意識消失、満期産、経産婦】,C【有意差0.01≦P<005:IL-8 100pg/ml以上】)の各症例における存在割合により、死亡率が変化するかを検討した。致死的因子を含む割合が0-29%、30-59%、60-79%、80-100%における症例の死亡率は、それぞれ、0%、28.5%、70%、91.4%であり、致死的因子を含む割合が60%以上の場合、その症例が死亡する確率は極端に上昇した。有意差が大きな因子をそれぞれ2倍(致死的因子B)および4倍(致死的因子A)に加点した場合、死亡率は3.4%、26.2%、72.2%、96.4%となり、その傾向は更に強くなった。羊水塞栓症発症例において、致死的因子を含む割合をみることが、救命の指標となり、またさらに、致死的因子を有意差別に加点した予後スコアの作成が、本症における訴訟という社会的な問題を解決する一つの方法になる可能性も示唆された。【症状別解析】われわれは、羊水塞栓症は、多種の原因が混在した症候群として捉えている。今後は、本症候群を臨床症状よりクラシック型(肺血管閉塞型)、DIC型、アナフィラキシー型の3型に分類して解析を進める。
樹木の冬芽の凍結適応機構の解明と凍結挙動を制御する物質の同定

平成24年度は、厳冬期の樹木冬芽の凍結適応機構を分子レベルで明らかにするために、氷点下温度に対して細胞内水分を過冷却状態に保つことによって適応する原基を持つカラマツ冬芽を用い、水の過冷却を保つための細胞内成分の探索を試みた。はじめに、カラマツ冬芽5g新鮮重から得られたメタノール粗抽出物を1mlの水に溶解した水溶液と市販の蒸留水の凍結温度の差を過冷却活性として調べたところ、メタノール粗抽出水溶液は4.6°Cの過冷却活性を示した。つぎに、メタノール粗抽出物を有機溶媒に対する溶解性の違いによって分画し、酢酸エチル画分、メタノール画分および残渣画分を得た後、過冷却活性を測定したところ、メタノール画分においてのみ6.4°Cの過冷却活性が検出された。さらに、セファデックスLH-20カラムを用いてメタノール画分を分子量の違いによって3画分に分画したところ、画分1では過冷却活性は検出されず、画分2では5.5°C、画分3では3.2°Cの過冷却活性が検出された。そして、最も高い活性が得られた画分2には、炭水化物であるピニトール、フルクトース、グルコース、スクロース、メリビオース、ラフィノースが主成分として含まれていることが明らかになった。しかし、得られた6種類の炭水化物の市販品を用いて画分2に含まれる濃度と同様になるように混合水溶液を調製したところ、2.4°Cの過冷却活性を示したが、セファデックス画分2の過冷却活性には至らなかった。また、3.2°Cの過冷却活性を示した画分3には6種類の炭水化物は含まれていなかった。これらの結果により、主成分である炭水化物のみならずその他の物質が過冷却活性に寄与することが示唆された。本研究では、寒冷地に生育する樹木の冬芽が厳しい冬の氷点下温度にどのように適応しているのかを明らかにするために、冬芽の組織細胞の凍結挙動を低温走査型電子顕微鏡等を用いて観察してきた。平成22年度では、なぜ冬芽のみが他の組織とは異なる器官外凍結と呼ばれる特殊な凍結適応機構を示すのかを明らかにするために、冬芽から冬芽内の組織を摘出して、各組織のみを凍結させた時の細胞の凍結挙動を観察した。すると、翌年に葉や花となる冬芽の中心組織である原基組織の細胞は、冬芽の中に存在する時とは異なり細胞にとって致死的となる細胞内での水の凍結(細胞内凍結)を起こしてしまうことが明らかとなった。さらに、細胞内凍結が起きる原因を細胞膜に着目してフリーズレプリカ法を用いて観察を行ったところ、細胞内凍結を起こす温度とほぼ一致して細胞膜上で相分離を起こす様子が観察され、相分離によって細胞外から細胞内へ氷が伝播し、細胞内凍結を起こしてしまうことが明らかとなった。これまでの研究により、冬芽は原基組織の細胞が組織のみで凍結すると細胞内凍結を起こしてしまうため、器官全体で氷点下温度に適応しているということが明らかとなってきた。さらには、器官外凍結という特殊な凍結適応機構が、冬芽の原基組織の細胞の細胞膜の状態から春先の開芽、開葉に密接に関係していることが強く示唆されている。これまでに知られている、師部、形成層、常緑葉の細胞外凍結、木部の深過冷却という凍結適応機構に加え、冬芽の凍結適応機構が明らかになることで、樹木全体での氷点下温度に対する適応機構解明に重要な知見となり、また樹木が草本植物に比べて遥かに高い凍結抵抗性を持つ原因解明につながる。平成23年度は、樹木の成長にとって最も重要な器官である冬芽の冬の氷点下温度に対する適応機構を調べるために、広葉樹からカツラおよびシラカンバ、針葉樹からストローブマツを選び、冬芽の凍結挙動を低温走査型電子顕微鏡によって細胞レベルで観察を行った。1日に5°Cの冷却速度で-30°Cまで凍結したカツラ冬芽は、多くの樹木冬芽に特徴的な凍結適応機構として知られている器官外凍結を示し、芽鱗の間に氷が析出した。この時、冬芽の中心組織である花・葉原基の細胞は、若干の脱水を伴いながらも細胞内に水を保持して過冷却を示したが、芽鱗の細胞は、細胞外凍結を示すことが明らかとなった。さらに、花原基を冬芽から摘出して組織が氷と触れさせて凍結すると、細胞は-10°Cまでの凍結によって細胞にとって致死的な細胞内凍結を示した。一方、シラカンバおよびストローブマツでは、凍結下においても器官外凍結を示さず、芽鱗および原基内の細胞外に氷の析出が観察された。そして、全ての組織において細胞は凍結による脱水を示して細胞外凍結した。これらの両樹種の冬芽の原基を摘出して凍結しても、冬芽全体での凍結時と同様に細胞外凍結を示した。以前に調べた器官外凍結するカラマツ冬芽の凍結挙動の観察結果と今年度に行った実験結果により、樹木の冬芽は樹種によって異なる凍結適応機構を示すことが明らかとなった。さらに、器官外凍結もしくは細胞外凍結という適応機構の違いが、原基細胞における細胞外氷晶に対する感受性の違いによるものであること示唆された。今後、冬芽の凍結適応機構をより詳しく理解するために、季節変化における冬芽とそれを構成する全ての細胞の凍結挙動の変化、物質レベルでの凍結挙動の制御機構などを詳細に調べる必要がある。

平成24年度は、厳冬期の樹木冬芽の凍結適応機構を分子レベルで明らかにするために、氷点下温度に対して細胞内水分を過冷却状態に保つことによって適応する原基を持つカラマツ冬芽を用い、水の過冷却を保つための細胞内成分の探索を試みた。はじめに、カラマツ冬芽5g新鮮重から得られたメタノール粗抽出物を1mlの水に溶解した水溶液と市販の蒸留水の凍結温度の差を過冷却活性として調べたところ、メタノール粗抽出水溶液は4.6°Cの過冷却活性を示した。つぎに、メタノール粗抽出物を有機溶媒に対する溶解性の違いによって分画し、酢酸エチル画分、メタノール画分および残渣画分を得た後、過冷却活性を測定したところ、メタノール画分においてのみ6.4°Cの過冷却活性が検出された。さらに、セファデックスLH-20カラムを用いてメタノール画分を分子量の違いによって3画分に分画したところ、画分1では過冷却活性は検出されず、画分2では5.5°C、画分3では3.2°Cの過冷却活性が検出された。そして、最も高い活性が得られた画分2には、炭水化物であるピニトール、フルクトース、グルコース、スクロース、メリビオース、ラフィノースが主成分として含まれていることが明らかになった。しかし、得られた6種類の炭水化物の市販品を用いて画分2に含まれる濃度と同様になるように混合水溶液を調製したところ、2.4°Cの過冷却活性を示したが、セファデックス画分2の過冷却活性には至らなかった。また、3.2°Cの過冷却活性を示した画分3には6種類の炭水化物は含まれていなかった。これらの結果により、主成分である炭水化物のみならずその他の物質が過冷却活性に寄与することが示唆された。供試材料(樹種)を増やして観察を行ったことにより、樹木冬芽の凍結適応機構が異なることが明らかとなった。これにより、適応機構の違いによる冬芽の共通点、相違点が見いだされ、他の組織にはない器官外凍結の特徴とそのメカニズムが明らかになりつつある。冬芽の凍結適応機構を総合的に理解するために、季節的な氷点下温度に対する応答の変化に着目して研究を行う。これまで実験に用い、詳細に凍結挙動を観察してきたカラマツ冬芽を材料とし、凍結抵抗性の変化や、低温走査型電子顕微鏡によって冬芽と冬芽の細胞の凍結挙動の変化を観察する。さらには、フリーズレプリカ法によって細胞内微細構造に着目して構造変化、凍結挙動変化を詳細に調べる。