hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
認知症介護にかかわる家族の日常生活における回想行為と精神的健康の関連に関する研究

回答について介護者が65歳以上の高齢群と65歳未満の若年群で比較したところ、高齢群では、介護者が「私は私である」と認識している場合に同一性得点が高かったことから、認知症介護における高齢介護者には自己同一性の維持をめざした支援が必要であると考えられた。さらなる分析では、「自分らしく過ごせている」と回答した介護者では精神的健康度が高く、介護負担感が低かった。その内訳をみると、65歳未満の女性に多く、認知症のタイプや要介護度、家族構成、介護経験、介護者との続柄、仕事の有無そのものでは差はないが、仕事をしている場合にはフルタイムで働いている場合が多かった。また、介護を助けてくれる人がおり、日々の介護には自分の思うように取り組めていると認識し、今後の介護を継続する意思を持っている場合が多く、さらに、自分自身については、「自分は介護者」ではなく「自分は自分」と認識している場合が多かった。これらの結果から、介護者には、介護者の年齢や性別を考慮するとともに、介護者自身が自分らしく過ごせているという認識を維持、向上できるような介護環境の確保、および自己認識を形成できるような支援をすることが、介護者自身の精神的健康を促進し、穏やかに介護を継続できる可能性を高めると考えられた。あわせて、平成28年度調査分の回答の整理と分析を行っている。当初の研究計画においては、調査対象者として認知症介護にかかわる家族会、デイサービスやデイケア等を利用する認知症者の家族介護者(以下、介護者)約200名を想定していたが、調査対象者の条件をできるだけ揃えるために、地域で認知症診療を行っているクリニックに協力を求めたところ、調査対象としてそこに通院する認知症患者の介護者約1500名に協力を得られることとなった。協力医療機関には、受診状況を考慮して平成28年度にも調査票を追加送付した。調査対象数が多く見込めることにはなったが、協力医療機関ではそれぞれの認知症患者への診療に時間をかけておられ、予約制のため受診までに時間を要する場合もあることから、質問紙調査にかける期間を延長する必要があった。そのために、質問紙調査後に予定していた回想法による面接調査の開始を遅らせることとなった。平成29年度は、地域のクリニックに通院する認知症患者の家族介護者(以下、家族)への調査を継続し、合計680名による回答を得た。このうち、主に、認知症の人を自宅で介護する家族を対象として、基本属性、介護状況、介護への認識のほか、精神的健康度(日本語版WHO-5(WHO-5-J)、エリクソン心理社会的段階目録検査(EPSI))、介護者の自己認識、日常経験することの回想などの関連を検討した。家族を65歳以上(高齢群)と65歳未満(若年群)の2群により比較したところ、精神的健康度の指標であるWHO-5-Jの合計得点は、若年群の方が高齢群より高かった。高齢群に限っては、自分自身のことを「自分は介護者」ではなく「私は私である」と認識している場合にWHO-5-J合計得点とEPSIの同一性得点が高かった。精神的健康度や自己認識について介護環境による差は認められなかった。これらの結果から、在宅介護という同様の介護形態であっても、家族自身の年齢により負担のあらわれ方が異なり、とくに高齢の家族には、若い家族よりも精神的負担を軽減するための支援がより多く必要であることや、アイデンティティの維持、促進のための心理的支援を明らかにする必要があると考えられた。また、ADおよびVaDの人の家族の精神的健康度については介護を助けてくれる人がいる場合に高く、さらに、話を聴いてくれる人がいることとも関連する可能性が示された。
電気生理学的手法による他覚的静脈性嗅覚検査法の開発

アリナミンを用いた静脈性嗅覚検査を他覚的検査に発展させるための、脳波と呼吸曲線を測定し以下の結果を得た。尚、対象とした被験者はすべて、インフォームドコンセントを得た人々である。1)アリナミンを嗅覚正常な被験者に20秒間で2ml静脈注射すると、注射後1020秒程度で、前頭部に30200Hzを主成分とする脳波のバーストが現れた。このバーストは、生理食塩水の静脈注射では、出現しなかった。2)各種の嗅覚障害の患者で、1)と同様の実験をすると、呼吸性嗅覚障害では、本人の自覚と一致してバースト脳波が記録されることもあったが、嗅上皮性嗅覚障害では記録されなかった。中枢性嗅覚障害では、バースト脳波が記録される例と、されない例があった。バースト脳波は嗅球由来と推測されるので、この場合、記録される例は、障害部位が、嗅球より高位と理解した。3)被験者の自覚と脳波バーストを比較したところ、注射をしてから反応がある、潜伏時間は有意な相関が有ったが、持続時間は、相関がなかった。4)呼吸曲線と静脈性嗅覚の自覚を比較すると、ニオイの自覚時に呼吸曲線が変動することが多く、呼吸の観察によっても他覚的静脈性嗅覚検査が可能と思われた。5)以上より、脳波や呼吸を調べることによって、他覚的静脈性嗅覚検査が可能と思われた。6)開発した脳波を用いた静脈性嗅覚検査を行う装置を、金沢大学学長名義で国有特許出願を行った。(特願2000-293543)健康な被験者の前頭部に電極を設置し、11000Hzを増幅するアンプにつなぎ、静脈性嗅覚検査時の脳波を記録した。このとき、被験者は静脈性嗅覚が発現している間、応答スイッチを押すように指示し、ニオイ応答も電気信号として脳波と同時に、データレコーダーに記録した。この結果、被験者の静脈性嗅覚発現に相前後して、バースト状の自発脳波の増強が見られた。この増強は周波数を分析すると、30200Hzの範囲であった。この静脈性嗅覚による脳波の増強は、静脈性嗅素(アリナミン)の静注によって起こり、生理食塩水の静注によっては起こらなかった。また、顔面筋の収縮による筋電図では、脳波の10倍以上の高電位が発生し、筋電図の混入によるアーチファクトは否定された。ニオイによりヒト嗅球が、40Hz程度の律動脳波を出すことが、以前より知られており、また、ラットに於いて、ニオイ刺激時に頭皮上から3080Hzの脳波が出るという報告が1999年あった。故に、この静脈性嗅覚における脳波の変化は、ニオイによる嗅球の律動脳波を捕らえている可能性が高いと思われ、これを証明する実験を計画中である。本年度の研究において、静脈性嗅覚検査時の脳波を測定することが、他覚的静脈性嗅覚検査への有望な候補であることがわかった。(特願2000-293543)
肺高血圧症の閉塞性血管病変形成と維持における血行動態ストレスの役割解明

肺高血圧症では、新生内膜やplexiform lesionといった閉塞性増殖病変が進行する。本研究では、病変進展・維持における血行動態ストレスの役割を検討した。われわれは、ヒト肺高血圧に特徴的な閉塞性増殖病変と重症の肺高血圧症を経時的に再現する疾患モデル(Su/Hx/Nxモデル)に対し、左肺動脈縮窄による血行動態ストレスを軽減することで、閉塞性病変の進展・維持における血行動態ストレスの役割を検証した。結果としては、血行動態ストレスを軽減した左肺では、完成していた炎症と閉塞性血管病変の退縮を認めた。血行動態ストレスが肺高血圧に特徴的な閉塞性病変の根源的な機序であることが明らかになった。体血管系において、血行動態ストレスが増加すると、炎症や細胞増殖に関わる多くの因子が活性化し、血管病変が進行することが報告されている。一方、肺循環系の疾患である肺動脈性肺高血圧症の閉塞性血管病変の進展・維持には、腫瘍様異常細胞の増殖が主で、血行動態ストレスの病態的役割は非常に少ないと考えられている。本研究では、申請者が報告した新生内膜・叢状病変(plexiform lesion)などの閉塞性病変を示す疾患モデルに対し、片肺動脈縮窄や片肺移植により血行動態ストレスを軽減することで、閉塞性病変の進展・維持における血行動態ストレスの積極的関与を明らかにする。本研究により、閉塞性病変進展・維持は「腫瘍性異常細胞の増殖による」とされてきた従来の病態生理の理解から、「血行動態ストレスが主である」という理解へとパラダイムシフトが期待される。初年度である平成26年度は、肺高血圧モデル動物(Su/Hx/Nxモデル)を作製した。このモデルに対して片肺動脈縮搾を行い、閉塞性血管病変の進展における血行動態ストレスの役割を検討した。すでに、閉塞性病変を多く認める5週目に片肺動脈縮搾を行ったところ、血行動態ストレスを軽減した左肺において病変の退縮を認めた。本研究の研究成果は、米国呼吸器学会総会、日本肺高血圧・肺循環合同学術集会など多くの学会で採択され、日本循環器学会学術集会においてはシンポジウムで発表する機会を得た。また、サイトカイン、特にIL-6の発現抑制とマクロファージの浸潤抑制も認めた。血行動態ストレス軽減により、炎症シグナルが抑制されたことが明らかとなった。本研究の研究成果は、米国呼吸器学会総会での発表、日本肺高血圧・肺循環合同学術集会、日本心臓病学会、日本呼吸器学会総会のシンポジウム、ならびに日本循環器学会学術集会のプレナリーセッションなど国内外の主要な学会にて発表する機会を得た。当初の予定通り、肺高血圧モデル動物(Su/Hx/Nxモデル)の作製と、このモデルに対して片肺動脈縮搾を行い、閉塞性血管病変の進展における血行動態ストレスの役割を検討できた。また、国内外の主要学会のシンポジウム等で口述発表に採択され、Cardiovascular Researchに第1報が採択された。本研究では、申請者が報告した新生内膜・叢状病変(plexiform lesion)などの閉塞性病変を示す疾患モデルに対し、片肺動脈縮窄により血行動態ストレスを軽減することで、閉塞性病変の進展・維持における血行動態ストレスの積極的関与を明らかにする。平成28年度は、肺高血圧モデル動物(Su/Hx/Nxモデル)を作製した。すでに、閉塞性病変を多く認める5週目に片肺動脈縮搾を行ったところ、血行動態ストレスを軽減した左肺において病変の退縮とサイトカインの減少を認めた。本研究の研究成果は、日本肺高血圧・肺循環合同学術集会では学会賞を受賞し、米国呼吸器学会総会など多くの学会で採択され、日本循環器学会学術集会においてはシンポジウムで発表する機会を得た。また、本研究の最終的な成果は、Cardiovasc Res誌に掲載された。

肺高血圧症では、新生内膜やplexiform lesionといった閉塞性増殖病変が進行する。本研究では、病変進展・維持における血行動態ストレスの役割を検討した。われわれは、ヒト肺高血圧に特徴的な閉塞性増殖病変と重症の肺高血圧症を経時的に再現する疾患モデル(Su/Hx/Nxモデル)に対し、左肺動脈縮窄による血行動態ストレスを軽減することで、閉塞性病変の進展・維持における血行動態ストレスの役割を検証した。結果としては、血行動態ストレスを軽減した左肺では、完成していた炎症と閉塞性血管病変の退縮を認めた。血行動態ストレスが肺高血圧に特徴的な閉塞性病変の根源的な機序であることが明らかになった。当初の予定通り、肺高血圧モデル動物(Su/Hx/Nxモデル)の作製と、このモデルに対して片肺動脈縮搾を行い、閉塞性血管病変の進展における血行動態ストレスの役割を検討できた。したがって、順調に研究が進展しているといえる。今後の研究は予定通り、肺高血圧モデル動物(Su/Hx/Nxモデル)に対して血行動態ストレスを軽減するほかの方法として片肺移植を行い、血行動態ストレスを軽減した左肺において病変の退縮を認めるかどうかの確認をする。次に、閉塞性病変の進展と維持に関わる分子機序(遺伝子やタンパク発現)を明らかにする。すでに第1報は採択され、本研究における閉塞性病変の進展と維持に血行動態ストレスが重要な位置づけであることは報告済みである。今後は、肺高血圧症の病態に近いシーズ発見に向けた機序の研究を行う。現時点で研究計画遂行における問題点は特にない。肺高血圧症今後の研究は予定通り、肺高血圧モデル動物(Su/Hx/Nxモデル)に対して血行動態ストレスを軽減するほかの方法として片肺移植を行い、血行動態ストレスを軽減した左肺において病変の退縮を認めるかどうかの確認をする。すでに1本目の論文を投稿中であり、閉塞性病変の進展と維持に関わる分子機序が解明されれば、肺高血圧症の病態に近いシーズ発見になる可能性が高い。肺移植に対する手術道具、および機序解析キットの購入のため、前年度から繰り越しを行った。予定通り、手術器具およびPCRとELISAの解析キットを購入し、血行動態ストレス軽減から病変退縮に至る分子標的を探索する。
ケミカルバイオロジーによるコーヒー成分の大腸癌予防メカニズムの解明

本邦における大腸癌罹患率・死亡率の漸増を受け、効果的な大腸癌の化学予防法の確立が喫緊の課題と叫ばれるなか、近年「コーヒーの常飲が大腸癌のリスク低下に寄与する」という疫学研究が国内外で報告され、注目されている。一方、その分子メカニズムについては十分解明されておらず、基礎的研究による裏付けが遅れを取っている状況である。本研究は、ケミカルバイオロジーの技術を用いて、コーヒーに含まれる生理活性成分の結合タンパク質を同定し、「コーヒーによる大腸癌予防メカニズム」の詳細を明らかにすることを目標としている。まず初年度の成果として、コーヒーに含有される代表的な3つの生理活性物質クロロゲン酸、キナ酸、コーヒー酸のうち、マウスの小腸ポリープ細胞および複数のヒト大腸癌細胞に対し、クロロゲン酸とコーヒー酸が顕著なコロニー形成抑制効果を示すことを明らかにした。一方、キナ酸はいずれの細胞においても、有意な細胞増殖抑制は示さなかった。またクロロゲン酸は生体内において分解されてコーヒー酸となることから、以後の主たる解析はコーヒー酸を用いることとした。次にケミカルバイオロジーの技術を用いて、コーヒー酸をナノ磁性ビーズに固定化することに成功した。コーヒー酸固定化ビーズと大腸癌細胞の抽出液を反応させ、コーヒー酸の結合タンパク質を精製し、これを質量分析計にて解析した結果、コーヒー酸の新規標的分子として、2種のタンパク質XとYが同定された(現時点ではXおよびYの詳細については未公表)。さらに、siRNAの技術を用いて、大腸癌細胞内において、XとYそれぞれ発現枯渇させたところ、いずれも著名なコロニー形成抑制効果を認め、いずれのタンパク質もコーヒー酸が示す抗腫瘍効果に関わっている可能性が示唆された。現在、引き続き、これらXおよびYが大腸癌内のどのような細胞増殖シグナルに影響を与えているかについて解析中である。おおむね初年度において計画していたin vitro実験を完了し、下記の通りの興味深い結果が得られた。(1)マウス小腸ポリープ細胞および複数のヒト大腸癌細胞に対し、抗腫瘍効果を有する有力なコーヒー含有生理活性成分として、コーヒー酸を絞り込んだ。(2)コーヒー酸のナノ磁性ビーズの固定化に成功した。(3)上記のコーヒー酸固定化ビーズを用いて、大腸癌細胞内におけるコーヒー酸の新規結合タンパク質について質量分析計にて解析した結果、XとYを同定した(XとYの詳細については現時点では非公開とする)。(4)大腸癌細胞内において、siRNAの手法を用いて、XおよびYを各々ノックダウンしたところ、いずれも著名なコロニー形成抑制作用を認めた。この結果から、コーヒー酸の抗腫瘍効果に、XおよびYのいずれか、あるいは双方が関与していることが示唆される。現在、新規に同定しえたコーヒー酸結合タンパク質XとYが、大腸癌細胞内のどのようなシグナル伝達に関与しているのかについて解析が進行中である。並行して次年度は、コーヒー酸の大腸癌予防効果の前臨床試験として、大腸ポリープモデルマウス(Apcminマウス)を用いた概念実証実験に移行していきたいと考えている。

この結果から、コーヒー酸の抗腫瘍効果に、XおよびYのいずれか、あるいは双方が関与していることが示唆される。現在、新規に同定しえたコーヒー酸結合タンパク質XとYが、大腸癌細胞内のどのようなシグナル伝達に関与しているのかについて解析が進行中である。並行して次年度は、コーヒー酸の大腸癌予防効果の前臨床試験として、大腸ポリープモデルマウス(Apcminマウス)を用いた概念実証実験に移行していきたいと考えている。
細菌下痢毒素の粘膜アジュバント作用におけるcAMP依存性シグナル伝達経路の関与

コレラ毒素(CT)の示す粘膜アジュバント活性におけるcAMPの関与を分子生物学的に解析するため、CTとその変異CT(E112Q)及びBサブユニット(CTB)を用いて実験を行った。CTはCTBとGM1の結合を介して脾細胞に結合し、Aサブユニットの酵素活性依存的にcAMP下流シグナルのPKA-CREB経路の他p38-CREB経路も活性化した。またCTを経鼻投与したマウスから調製した脾細胞は、CT及びE112Q刺激に対してサイトカインを産生した。これらの活性はE112QやCTB処置した脾細胞やマウスでは認められなかったことより、CTの活性によるcAMPシグナルはアジュバント活性に何らかの関与をしていると考えられた。本年度は下痢を引き起こすコレラ毒素(CT)及び毒素原性大腸菌易熱性毒素(LT)が示す粘膜アジュバント活性メカニズムを、宿主細胞に引き起こすcAMPの増加の関与に焦点を当てて解析を行った結果、以下のことが明らかとなった。1.精製CT、Aサブユニットの無毒変異毒素(mCT)及びBサブユニット(CTB)を、卵白アルブミン(OVA)とともにマウスに経鼻投与し、血中の抗OVA抗体の誘導能を比較したところ、CTとの免疫群で最も高い抗OVA抗体を誘導した。2.1.の結果を踏まえ、マウスの脾臓細胞に対して各CTを添加し、cAMPシグナルの下流に存在するCREBのリン酸化を調べたところ、CTで最も高いリン酸化が認められたが、mCTやCTBでは認められなかった。その上流に存在するキナーゼの関与を調べるため、各キナーゼの阻害剤で前処理した脾臓細胞に対してCTを添加した結果、CTによるCREBのリン酸化はプロテインキナーゼA阻害剤で完全に阻害され、部分的にp38 MPAキナーゼ阻害剤でも阻害されたことより、これらのキナーゼの関与が示唆された。3.この経路に関与する細胞を同定するため、脾臓細胞からB細胞とT細胞をそれぞれ分離して各CTを添加したところ、いずれの細胞でもCREBの高いリン酸化が認められた。さらに詳細な解析を行うため、レセプターであるGM1付近に存在すると考えられるキナーゼの関与の解析を行うとともに、CREBのリン酸化がサイトカインの産生にどのように影響するかを検討している。以上のことより、CTはPKAまたは部分的にp38 MAPキナーゼの経路を介してCREBをリン酸化しており、抗体価がパラレルであることより、アジュバント活性とも関与している可能性が考えられる。この結果は経鼻投与という侵襲性の少ない投与経路で、より効果的に高い抗体産生を誘導できるワクチンの開発に貢献するものであると考えられる。本研究は、コレラ毒素(CT)を粘膜アジュバントとして利用する基礎データを得るため、そのメカニズムを分子レベルで解明するために行った。22年度は、21年度に得られたCTによるCREBリン酸化がアジュバント活性に関わるか否かを調べるために以下の実験を行い、結果を得た。1.CTによる脾臓T細胞とB細胞におけるCREBのリン酸化が、CTの直接相互作用によるものかを調べるために、ビオチン標識CTとCTBを作用させたところ、いずれも強く結合したが、GM1非結合変異CT(G33D)はCREBのリン酸化を起こさなかったことより、CTによるCREB活性化シグナルにはCTBとGM1の結合は必須ではあるが、この結合刺激がシグナルを誘導しているのではないことが明らかとなった。2.各CTをマウスに経鼻投与した後、採取した脾臓細胞を各CTやCTBで2次刺激した時のサイトカインの産生を調べたところ、CTを基礎免疫したマウスでの脾細胞の2次刺激応答はCTまたはE112Qでのみ高く産生されたが、E112Qで基礎免疫したマウスではCT、E112Qのいずれの2次刺激においてもあまり誘導されないことより、CTの活性は免疫初期の免疫記憶の形成に関わることが考えられた。3.CTによるCREBリン酸化の影響を直接評価できる株化細胞モデルを検討したところ、ヒトT細胞株であるJurkat E6.1がマウス脾細胞と同様のリン酸化の挙動を示した。本細胞はIL-2産生株であることより、CREB遺伝子のノックダウンまたはドミナントネガティブ変異CREB遺伝子を導入することにより、CTによるCREBリン酸化とアジュバント活性の関連を解析できる可能性があり、現在その細胞株の作製を行っている。現在、CTや毒素原性大腸菌易熱性毒素(LT)はその毒性による懸念から無毒変異体が検討される傾向にあるが、野生型毒素の酵素活性がアジュバント活性に重要であることは明白であり、量をコントロールまたは経鼻以外の投与方法を用いることにより応用可能であると考えられる。
位相積空間の多面的考察

研究代表者である矢島幸信は、積空間の位相的性質として主に被覆性に関して研究結果を得た。無限積空間に対しては、そのオーソコンパクト性とメタコンパクト性という2つの被覆性についての関連を考察した。また、その中で1つの問題を提起したが、それはごく最近とアメリカとポーランドの著名な数学者によって独立に解決された。有限積空間に対しては、同一の空間からなる積空間から対角線部分を取り除いた残りの部分空間を考えて、そのある種の被覆性によってもとの空間のより強い被覆性構造を特徴づけるという研究を、より一般的なものへと拡張し発展させた。さらには、積空間から提起された被覆に関する問題が、より一般的な空間において肯定的な面と否定的な面とで予想外の面白い形で解決できた。酒井政美は、無限積空間によっても保存されるという顕著な位相的性質をもつカッパー距離空間に関する玉野の問題を解決した。また、積空間の特殊な場合である関数空間にカッパー距離空間を埋め込むことができるための条件を考察した。酒井一博は、閉多様体上の微分同相写像の軌道性と横断性を主体とした研究を初めとして、特殊な写像の横断性、拡大写像の研究など論文を4編以上書き大いに活躍をした。積空間に関するアイデアは間接的に大変役に立っている。阿部吉弘は、基本イディアルの飽和に関する研究と無限積空間との関連を模索している。基本イディアルの飽和に関する論文は、近いうちに掲載が決定する予定である。
野鳥由来弱毒インフルエンザウイルスの高度病原性獲得機序に関する研究

鶏の強毒インフルエンザ、いわゆる家禽ペストは急性で致死的な伝染病であり、一度流行するとその国の養鶏産業は壊滅的な打撃を被る。しかし、野鳥が保有する弱毒のトリインフルエンザウイルスがどのようなメカニズムで鶏に対する病原性を獲得するのかは詳らかではない。そこで本研究では弱毒トリインフルエンザウイルス病原性獲得機構の分子レベルでの解明を試みた。我々はまず、国内に飛来する渡り烏から分離された弱毒トリインフルエンザウイルスを鶏ヒナの気嚢で24代、さらに脳で5代継代した。最終的に得られた24a5b株は鶏に対する致死率が100%の強毒株に変異していた。そこでこの弱毒ウイルス親株と一連の継代株のHA開裂部位のアミノ酸配列を調べた。その結果、親株の開裂部位には、塩基性アミノ酸R(アルギニン)が-1位と-5位にそれぞれ離れて単独で存在する典型的な弱毒型HAのアミノ酸配列であったが、継代を繰り返す間に2度の点変異と3塩基の挿入が起こり塩基性のアミノ酸(Rまたはリジン(K))への置換あるいは挿入が起こり、結果としてR-R-K-K-Rという合計5個の塩基性アミノ酸が連続した強毒ウイルスに変異していたことが明らかとなった。一方、継代株のニワトリ体内での増殖試験では継代を重ねるごとに、最初は鶏でほとんど増殖できなかった親株が徐々に他臓器増殖性を獲得し、最終的に脳を含む全身で増殖可能な強毒ウイルスに変異していたことが明かとなった。即ち、自然界においても渡り鳥が保有する弱毒トリインフルエンザウイルスが鶏に伝播し、鶏から鶏へと次々に新たな感染が操り返される間に、HAの開裂部位のアミノ酸が段階的に置換し、徐々に多臓器増殖性を獲得して強毒ウイルスに変異するものと考えられた。野鳥が保有する弱毒のトリインフルエンザウイルスがその起源と考えられるが、その弱毒ウイルスがどのようなメカニズムで鶏に対する病原性を獲得するのかは未だ理解されていない。そこで本研究ではまず、渡り鳥の糞便から分離された弱毒ウイルスA/swan/Shinmane/499/83(H5N3)を鶏の気嚢で24代、脳で5代継代することにより、鶏に対して致死率100%の強毒変異株(24a5b株)を得た。その病原性獲得機序の解明を目的として、継代途中の各々のウイルス(11a,18,24a,24alb,24a2b,24a3b及び24a4b)を比較解析した。その結果、鶏に対する致死率および各臓器でのウイルス回収量は継代数に伴って上昇し、24a3b以降は致死率100%に達した。これらのウイルスはトリプシン非存在下でプラークを形成する易開裂型の性質を獲得していた。即ち、親株がトリプシン様酵素の存在する局所でのみ増殖可能であるのに対し、変異株は全身の臓器で増殖できる家禽ぺストウイルスの性質を獲得したと考えられた。また、親株の開裂部位は塩基性アミノ酸が-1位と-4位にそれぞれ単独で存在する典型的な弱毒型(R-E-T-R)であったが、24aでは開裂部位から-2位のアミノ酸がTからKに(R-E-K-R)、24a2bはさらに-3位がEからKに(R-K-K-R)置換していた。加えて24a3b以降のウイルスは-4位にRが挿入されることにより、最終的に合計5個の塩基性アミノ酸が連続していた(R-R-K-K-R)。

以上の成績から本ウイルスは鶏継代によりHAの開裂部位のアミノ酸が段階的に置換し、その開裂性が高まることによって病原性を獲得したものと考えられた。次年度では同じく野鳥由来のH7亜型の弱毒ウイルスについても、鶏継代を実施し、同様のメカニズムで病原性獲得が起こり得るか否かを検証する。鶏の強毒インフルエンザ、いわゆる家禽ペストは急性で致死的な伝染病であり、一度流行するとその国の養鶏産業は壊滅的な打撃を被る。しかし、野鳥が保有する毒弱のトリインフルエンザウイルスがどのようなメカニズムで鶏に対する病原性を獲得するのは群らかではない。そこで本研究では弱毒トリインフルエンザウイルス病原性獲得機構の分子レベルでの解明を試みた。我々はまず、国内に飛来する渡り鳥から分離された弱毒トリインフルンザウイルスを鶏ヒナの気嚢で24代、さらに脳で5代継代した。最終的に得られた24a5b株は鶏に対する致死率が100%の強毒株に変異していた。そこでこの弱毒ウイルス親株と一連の継代株のHA開裂部位のアミノ酸配列を調べた。その結果、親株の開裂部位には、塩基性アミノ酸R(アルギニン)が-1位と-5位にそれぞれ離れて単独で存在する典型的な弱毒型HAのアミノ酸配列であったが、継代を繰り返す間に2度の点変異と3塩基の挿入が起こり、塩基性のアミノ酸(Rまたはリジン(K))への置換あるいは挿入が起こり、結果としてR-R-K-K-Rという合計5個の塩基性アミノ酸が連続した強毒ウイルスに変異していたことが明らかとなった。一方、継代株のニワトリ体内での増殖試試験では継代を重ねるごとに、最初は鶏でほとんど増殖できなかった親株が徐々に他臓器増殖性を獲得し、最終的に脳を含む全身で増殖可能な強毒ウイルスに変異していたことが明かとなった。即ち、自然界においても渡り鳥が保有する弱毒トリインフルエンザウイルスが鶏に伝播し、鶏から鶏へと次々に新たな感染が繰り返される間に、HAの開裂部位のアミノ酸が段階的に置換し、徐々に多臓器増殖性を獲得して強毒ウイルスに変異するものと考えられた。
発展途上国における作物生産阻害要因を検出するための開花撮影法開発

この研究では作物の発育において重要な段階であり,収量の決定にも大きな影響を及ぼす開花とそれに関連した現象を近年,急速に発展してきた自動制御可能な光学機器(デジタルカメラとファイバースコープ)と種々の補助となる器具(レンズ,ルーペ,光学フィルター)を組み合わせることによって,自動連続観察する装置を作成することを目的としてきた.深度合成によって,汎用デジカメ,ルーペなどを組み合わせることによってイネ,アズキなどの作物の開花の撮影ができるシステムを作り上げた.深度合成撮影のうち,デジカメをマイクロポジショニングプレートに設置して,微動しながら撮影する方法がもっとも精細な写真を撮ることができた.より簡便な撮影方法として,カメラ内蔵のプログラムにより,フォーカスの少しずつ異なる写真を自動的に撮影して,深度合成する撮影ではそこまでの精細な写真を得ることはできなかった.より開花中の花に接近あるいは花の内部に入って撮影できる方法であるボアスコープあるいはファイバースコープによる方法は接近すると,急速に被写体との関係が変わるためにプログラムによる深度合成は困難だった.マイクロポジショニングプレートによる方法では柱頭に付着した花粉粒,葯内部に残存した花粉粒の観察が可能だった.花粉の発芽をみるために紫外線照射下での撮影を試みたが,花粉管までは見えなかった.カメラにルーペを取り付けることでより大きな画像を撮影できたが,この場合,10倍程度のルーペがもっとも適当であった.当初は追尾システムによる撮影を試みたが,あまりうまくいかなかったが,その後,深度合成撮影法が目的にかないそうであるということで,方向を転換した.その結果,現在のところ,風による撮影への影響がほとんど無視できる人工気象室での撮影,しかもピンポイントの撮影では深度合成撮影によって開花過程をとらえることが可能になった.しかし,最終目標は圃場におけるインターバル撮影であるので,1年延長して,検証することにした.深度合成撮影法によって圃場で撮影できるシステムを確立することが最終目標であったが,現在のところ,風による撮影への影響がほとんど無視できる人工気象室での撮影,しかもピンポイントの撮影までにとどまっている.今後,人工気象室でインターバル撮影あるいは手動による連続撮影を行い,しかし,人工気象室などの環境条件の下での撮影なので,実際の野外圃場条件下での撮影を2019年夏季に行い,開発した方法の実用性を検証する.順序としては1)ストレスのない条件での人工気象室における撮影,2)高温などの開花期のストレスを与えた条件で撮影し,対照となるストレスのない植物と開花過程が異なるようすを撮影する,3)ストレスのない条件での圃場での撮影を行い,4)圃場においてストレスを与えた条件での開花撮影を行う.発展途上国において頻発する気象災害による作物の花への障害を常時観察可能であり,しかも現地農家でも利用できる安価な撮影システムの開発を目指した.今年度は,花の移動を追跡する追尾装置システム,紫外線照射による花の観察,工業用(汎用)のファイバースコープによる花器内部の観察,汎用のハイスピードカメラによるイネの花粉散布の観察などを行った.開花前後の花の移動を追跡しながら撮影するシステムとして,当初はカメラ自体を追尾させる装置を念頭に置いていたが,複数のカメラを設置して三次元として,移動する花を撮影する方がうまくいきそうであると判断し,三次元の画像構築によって開花を汎用のデジカメ数台で追跡するシステムを構築することにした.今のところ,三次元の画像を構築することはできるが,花器内の葯,柱頭まで観察するには不十分で,今後,設置するカメラの方向,台数を改良する必要がある.紫外線を照射できる汎用のブラックライトおよび紫外線のみを透過するガラスフィルターを利用して,開花したコスモス(イネなどの作物に比べて,花器内の観察が簡単なため,モデル植物として採用した)などの葯や花弁の撮影を行った.花弁は紫外線撮影で特徴的な画像を得られたものの,葯,花粉が紫外線で観察できるには至らなかった.照射紫外線強度と使用したデジカメの紫外線感度を改善する必要がある.工業用(汎用)のファイバースコープによる花器内部の観察では,安価なファイバースコープの太さではそのままファイバースコープを近づけても,イネのような小さい花の観察はまだ困難であることがわかった.ファイバースコープにスマホ用のマクロレンズなどをかぶせることによって撮影できるかどうかも試した.さらなる工夫次第で鮮明な画像を得ることができる可能性もみられた.汎用のハイスピードでのイネの花粉散布の撮影も行った.移動する花を追跡するシステムとして,当初予定した追尾装置から三次元画像によるものに変えたことで,当初よりも実験システムの完成が遅れることになったことからである.

花器内の葯,柱頭まで観察するには不十分で,今後,設置するカメラの方向,台数を改良する必要があるので,完成に至っていないことからやや遅れていると判断した.発展途上国において頻発する気象災害による作物の花への障害を常時観察可能であり,しかも現地農家でも利用できる安価な撮影システムの開発を目指した.今年度は,安価なデジカメあるいはUSBマイクロスコープなどを使う深度合成撮影によって,花をより接近して,葯や花粉をできるだけ精密に撮影する方法を主に試み,3D合成による連続撮影も併用した.深度合成の方法は2種類用いた.1つめは,深度合成機能が組み込まれたカメラ(オリンパスSTYLUS TG-4 Tough)およびそのカメラのレンズの前に530倍のルーペを接続して開花したソバとイネの花を撮影し,深度合成画像をカメラ内に作成した.2つめは焦点を少しずつずらした写真をカメラあるいはUSBマイクロスコープによって複数撮影して,Helicon Focusによって深度合成画像を作成した.ルーペをつけない状態でソバやイネの花を撮影した場合,葯や柱頭を拡大撮影するくらいにカメラを接近するとオートフォーカスが利かなくなり,ピントが合った写真が得られなかった.一方,ルーペをカメラの前につけた場合,ピントの合う範囲は狭くなるが,カメラの自動深度合成機能によって花器内にピントの合った拡大画像を得ることができた.さらに,ブラケット撮影した複数枚の画像をHelicon Focusによって深度合成を行うことによって被写体全体にピントの合った写真も得られた.22倍のルーペをつけたときにもっとも葯や柱頭の精細な画像が得られた.今回の知見をもとに今後は,穎花内にファイバースコープを入れ,深度合成撮影を行うことで葯の裂開の経時的観察,それにともなう花粉の散布など非生物的ストレス下で重要な現象を撮影する技術を確立したい.三次元画像合成よりも深度合成撮影の方が,目的にかなうと考えて,本年は深度合成撮影を中心に実行した.深度合成撮影によるイネ,ソバの撮影はかなり見込みがあることがわかったものの,目標とする葯の裂開を経時的に観察するシステムを2年目までに開発し,3年目に実際にストレス環境下で撮影するところまではいかなかった.そのことからやや遅れていると判断した.この研究では作物の発育において重要な段階であり,収量の決定にも大きな影響を及ぼす開花とそれに関連した現象を近年,急速に発展してきた自動制御可能な光学機器(デジタルカメラとファイバースコープ)と種々の補助となる器具(レンズ,ルーペ,光学フィルター)を組み合わせることによって,自動連続観察する装置を作成することを目的としてきた.深度合成によって,汎用デジカメ,ルーペなどを組み合わせることによってイネ,アズキなどの作物の開花の撮影ができるシステムを作り上げた.深度合成撮影のうち,デジカメをマイクロポジショニングプレートに設置して,微動しながら撮影する方法がもっとも精細な写真を撮ることができた.より簡便な撮影方法として,カメラ内蔵のプログラムにより,フォーカスの少しずつ異なる写真を自動的に撮影して,深度合成する撮影ではそこまでの精細な写真を得ることはできなかった.より開花中の花に接近あるいは花の内部に入って撮影できる方法であるボアスコープあるいはファイバースコープによる方法は接近すると,急速に被写体との関係が変わるためにプログラムによる深度合成は困難だった.マイクロポジショニングプレートによる方法では柱頭に付着した花粉粒,葯内部に残存した花粉粒の観察が可能だった.花粉の発芽をみるために紫外線照射下での撮影を試みたが,花粉管までは見えなかった.カメラにルーペを取り付けることでより大きな画像を撮影できたが,この場合,10倍程度のルーペがもっとも適当であった.当初は追尾システムによる撮影を試みたが,あまりうまくいかなかったが,その後,深度合成撮影法が目的にかないそうであるということで,方向を転換した.その結果,現在のところ,風による撮影への影響がほとんど無視できる人工気象室での撮影,しかもピンポイントの撮影では深度合成撮影によって開花過程をとらえることが可能になった.しかし,最終目標は圃場におけるインターバル撮影であるので,1年延長して,検証することにした.
絶対位相制御光周波数コムによるマルチ光周波数基準の発生と光周波数同期網への展開

2030年に3桁増加が予想される通信トラヒック需要を支えることのできる新しい光ファイバ通信ネットワーク技術として光周波数同期網の概念提案を行い、基礎をなす高周波数確度光周波数コム基準生成に取り組んだ。光周波数がHz程度で確からしい10-14を目標として掲げ、それを可能とするCarrier-envelope offsetphase制御光発生を目指し、半導体レーザ光源による最もハードルの高いオクターブ光発生を達成した。(1)短パルス種光源の生成:短パルス種光生成へ向けて位相変調光に対するパルス圧縮法に基づくシミュレータを開発し、200-800fs短パルス光発生条件パラメータを明らかにした。25GHz繰返しパルスに対するパルス圧縮により700fs短パルスの生成に成功し、シミュレーション通りの結果が得られることが確認できた。400fs短パルス発生を目標に実験系の準備を進めているところである。(2)オクターブ光の発生:5Wクラス高出力光増幅器内での非線形現象発現を線形パラメータへ組込んだオクターブ光発生用高非線形ファイバへの結合条件設計を行なった。発表論文の如くErファイバレーザ光に対して成功しており、半導体レーザ短パルス光向けに20%以上の効率向上を目指しているところである。40dB以内の強度偏差に収まるオクターブ光の発生までは到達できた。半導体レーザ(LD)を種光源とする25GHz高繰返し周期Carrier-Envelope Offset Phase Lock光発生とその光周波数同期網への展開へ向けて、ハードルが最も高いSCオクターブ光の発生に成功するとともに、位相感応型光増幅器による伝送距離拡大の可能性をシミュレーションにより明らかにした。(1) LD光による300fsec短パルス列の発生:LDによる短パルス列の生成は、これまでゲインスイッチ法が有力な手法であったが、それぞれのモードでの位相は同期しているとは言い難かった。位相変調によるチャープ光を分散圧縮する手法によって、250fsecの短パルス列の発生に成功した。位相雑音(rms timing jitter)は、マイクロ波信号減にのみ依存し、使用したシンセサイザの性能から100fsecと推定できる。(2)オクターブ光の発生:25GHz高繰返し周期250fsecの短パルス光列を発生させ、その後短パルスピーク強度を高めるために100MHz光ゲートによって分周し、非線形媒質へ入力した結果、30dB低下オクターブ光発生に成功した。提案構成の特徴である高繰返し周期とオクターブ光発生のための高エネルギー化周期の独立設計が可能とした成果である。(3)位相感応型光増幅中継シミュレーション:光周波数同期網にて想定している位相感応型光増幅中継の効果と増幅器励起光と信号光の位相同期条件を把握するため、今年度は位相感応型光増幅中継系における再生中継間隔を数値シミュレーションした。その結果、10Gbit/s-BPSK変復調方式では、伝送路分散±10ps/nm/km以下で再生中継間隔1600km以上を得た。LDを種光として生成した25GHz繰返しパルスに対して(1/100)光ゲート分周し、EDFAによりピークエネルギーを高めてオクターブ光を発生させる本方式について、英国電気学会ElectronicsLettersへ投稿し採録された。本方式の新規性が認められた結果である。その後、各スペクトル成分におけるCNRを十分に確保するために、シミュレーションによるマイクロ波信号源位相雑音の評価、その後実験系の再構築を行いCNRの向上を果たした。詳細を以下に記す。(1)シミュレーション:位相雑音によるスペクトル成分の広がりの程度とピーク強度の低下の程度を定量的に明らかにした。オクターブ光端では25GHz繰返しパルス用マイクロ波信号の位相雑音は約4000倍になる。位相雑音は、CNRを劣化させf-2f干渉信号の観測を困難にする要因となる。25GHzではSSB位相雑音としては-110dBc/Hz@10kHz以下が必要である。(2)CNRの向上:より帯域を拡大することによりパルス幅を100fsecまで細くし、かつ光ゲートを2段とし不要な成分の抑圧度を高めた結果、SC光のオクターブ拡がり時のレベルが昨年の-30dBから-20dBへ向上した。効率も高まり、1W平均出力で得られた結果である(上記学会発表時では2.5W)。その結果を踏まえて、1300nm光源とのビート信号を観測したところ、-70dBmRFビート信号が観測できた。続いて、PSAへの展開である。光周波数同期網のもとで容易となる光PLLの実証例題として、位相感応型光増幅機能を確認したところ、励起光が信号光に位相同期し増幅特性が確認できた。また、PSAを中継増幅器として用いる多増幅中継光ファイバ伝送系において、100段のPSK変調多中継伝送系では符号誤り率が10^(-5)におけるパワーペナルティを0.1dB以下に抑えるには、各PSA励起光と信号光の位相差の分散が30 mrad以下である事を示した。
生分解性スキャホールド表面での細胞内直接遺伝子導入を利用した組織再生

カチオンキャリヤーとプラスミドDNAとの複合体を利用した細胞への遺伝子導入法を、組織再生工学に応用するためには、(1)高い導入効率、および(2)ポリ乳酸系スキャホールドからのDNAの徐放化が重要である。従来型の水溶性カチオンベクターに少量のステアリル基を導入した新規ベクターが、上記の両条件、特に条件(1)に大きな効果をもたらす機構が解明できた。これらのキャリヤー分子がのミセル様構造がAFM測定により確認され、さらに、DNAとの複合体はこのミセルが多く集合したブドウ状複合体であった。直鎖状ポリカチオンと異なり、ナノミセル状キャリヤーはDNA分子との複合体における絡み合いの度合いが小さく、容易に解離する(DNA分子を放出する)ポリアニオン交換反応試験により明かとなった。また、この現象が、細胞内でも起こっていることを視覚化することが重要と考え、FITCでラベルしたDNA分子とCy3でラベルしたキャリヤー分子とからなる複合体内で起こる、蛍光エネルギー移動現象(FRET)を利用したトレーシング実験を行った。その結果、偽ミセル状態(完全なフローズンミセルまでは至らない状態のミセル様構造)のキャリヤーが、DNA分子を細胞内に効率よく送達できる上に、細胞内で、速やかにDNA分子と解離することで、高い発現効率を誘導することが明かとなった。一方、従来の複合体では、いわゆるバースト効果により数時間のうちにポリ乳酸スキャホールドからの放出が終了するのに対して、子のナノミセル型キャリヤーにより、約2週間にわたる徐放化に成功した。CMVプロモーターの下流にVEGFを挿入したプラスミドの作製が完了し、予備的ながらin vivoでの血管床誘導実験の着手にも漕ぎつけた。カチオン性高分子(カチオンベクター)とプラスミドDNAとの複合体を利用した細胞への遺伝子導入法を、組織再生工学に応用するためには、(1)高効率で遺伝子を導入できるカチオンベクターの開発、および(2)ポリ乳酸系スキャホールドからの複合体の徐放化が有用である。本年度では、我々が開発したカチオンベクター(40モル%カチオン基と60モル%の非電荷親水基を有する高効率ベクター)に、1モル%の割合でステアリル基を導入した新たなカチオンベクターを開発した。この、ベクターは、上記必須条件(1)および(2)に大きな効果をもたらすことが明らかとなった。従来の複合体のポリ乳酸スキャホールドからの放出挙動は、数時間で完了する、いわゆるバースト効果を示すのに対して、新たに作製したベクターの場合、複合体と基質との疎水性相互作用に基づく1週間にわたる徐放化が確認された。さらに、徐放化された複合体による、培養細胞への遺伝子導入効率を検討した結果、従来のベクターの約4倍の発現効率が得られた。この活性上昇のメカニズムを解明するために、複合体の形状と物理化学的特性について検討した。ステァリル基を導入することによって、ポリカチオンがミセル様の構造を呈していること、さらに、細胞内に存在するポリアニオン等とのインターエクスチェンジ反応が容易となり、細胞内でフリーのプラスミドDNAが効率よく放出されることが明らかとなった。これらの、共同効果により、新たに合成した疎水かベクターの高効率が発現したものと思われる。カチオンベクター(40モル%カチオン基と60モル%の非電荷親水基を有する高効率ベクター)に、1モル%の割合でステアリル基を導入した新たなカチオンベクターは、上記必須条件(1)および(2)に大きな効果をもたらすことが明らかとなった。

従来の複合体では、いわゆるバースト効果により数時間のうちにポリ乳酸スキャホールドからの放出が終了するのに対して、疎水貴導入ベクターを利用したところ1週間にわたる徐放化が確認された。さらに、このベクターは、DNA分子と形成する複合体の形状と物理化学的特性が特徴的であることが明らかになった。すなわち、導入したステアリル基が凝集性疎水場を形成することで、ミセル様の構造を呈し、その結果、ベクター分子とDNA分子間のエンタングルメントが緩和されることで、細胞内でのDNA分子リリースを促進する。その結果、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いた導入実験では、従来ベクターに比較して顕著な効率上昇が見られた。また、従来より、原因が解明されていなかった過剰量のベクター添加による遺伝子発現効率の低下も効率よくよく改善出来るベクターであることが明らかとなった。さらに、in vivoでの組織再生をめざし、ユビキタスなプロモーターの穎粒にVEGF遺伝子を挿入した発現系を構築し、このプラスミドを導入することによる細胞の定性的変化が確認された。カチオンキャリヤーとプラスミドDNAとの複合体を利用した細胞への遺伝子導入法を、組織再生工学に応用するためには、(1)高い導入効率、および(2)ポリ乳酸系スキャホールドからのDNAの徐放化が重要である。従来型の水溶性カチオンベクターに少量のステアリル基を導入した新規ベクターが、上記の両条件、特に条件(1)に大きな効果をもたらす機構が解明できた。これらのキャリヤー分子がのミセル様構造がAFM測定により確認され、さらに、DNAとの複合体はこのミセルが多く集合したブドウ状複合体であった。直鎖状ポリカチオンと異なり、ナノミセル状キャリヤーはDNA分子との複合体における絡み合いの度合いが小さく、容易に解離する(DNA分子を放出する)ポリアニオン交換反応試験により明かとなった。また、この現象が、細胞内でも起こっていることを視覚化することが重要と考え、FITCでラベルしたDNA分子とCy3でラベルしたキャリヤー分子とからなる複合体内で起こる、蛍光エネルギー移動現象(FRET)を利用したトレーシング実験を行った。その結果、偽ミセル状態(完全なフローズンミセルまでは至らない状態のミセル様構造)のキャリヤーが、DNA分子を細胞内に効率よく送達できる上に、細胞内で、速やかにDNA分子と解離することで、高い発現効率を誘導することが明かとなった。一方、従来の複合体では、いわゆるバースト効果により数時間のうちにポリ乳酸スキャホールドからの放出が終了するのに対して、子のナノミセル型キャリヤーにより、約2週間にわたる徐放化に成功した。CMVプロモーターの下流にVEGFを挿入したプラスミドの作製が完了し、予備的ながらin vivoでの血管床誘導実験の着手にも漕ぎつけた。
各種緑内障治療薬成分における網膜神経節細胞カルシウムチャネルへの効果

1.電位依存性Ca電流に対するプロスタグランディン製剤(プロスタグランディンF2α)の抑制効果の濃度依存性と電圧依存性の検討上丘へ注入したLucifer yellowの逆行性標識により同定したラット単離網膜神経節細胞の電位依存性Ca電流に対するプロスタグランディンF2αによる阻害効果の濃度依存性を「薬剤投与システム」により解析した。0.2μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM濃度でのプロスタグランディンF2αによるCa電流阻害率を定量的に解析した結果、この50%抑制効果濃度は0.69μMであった。またこの抑制効果には電位依存性が無い事を明らかにした。2.遅延整流性K電流に対するプロスタグランディンF2αの抑制効果電気生理学的並びに薬理学的に同定した遅延整流性K電流を0.5μMから2μMプロスタグランディンF2αは24%から31%と濃度依存的に抑制した。またこれに伴って遅延整流性Kチャネルのコンダクタンスは12.2nSから8.0nSに低下した。これらの抑制効果には電位依存性は認められなかった。3.低酸素により誘発される内向き流のプロスタグランディンF2αによる抑制効果細胞外液を100%酸素で飽和した溶液から99%窒素で飽和した溶液に置換すると、単離した網膜神経節細胞で内向き流が誘発された。細胞外液に予めプロスタグランディンF2α(2μM)を投与しておくと窒素で飽和した細胞外液に置換しても内向き流は誘発されなかった。1.急性単離ラット網膜神経節細胞のCa電流の同定・観察実験数日前に幼若ラットで逆行性染色により網膜神経節細胞を蛍光色素で標識した。摘出した眼球から網膜を取り出し、細片とした後、酵素処理及び機械的に網膜神経節細胞を単離した。この時得られた網膜神経節細胞を含む浮遊液をチャンバーに移し、Naチャネル阻害剤とKチャネル阻害剤を含み95%酸素・5%二酸化炭素で飽和した細胞外液で潅流した。紫外線の短期間励起により蛍光色素で標識された網膜神経節細胞を水侵レンズで観察・同定した。同定された網膜神経節細胞で、内液にKチャネル阻害剤を含む微小ガラス管電極をwhole-cell patch clampを行った。-90mVに電圧固定して15mVステップで45mVまでのコマンド電圧により電位依存性Ca電流を(静止電流を電圧固定法で)測定した。(電位負荷により網膜神経節細胞の電位依存性Ca電流を測定した。)2.電位依存性Ca電流に対するプロスタグランジン製剤(プロスタグランジンF2α)の効果観察細胞外液にプロスタグランジンF2αを「薬剤投与システム」により投与して、Ca電流の変化を観察した。2μMプロスタグランジンF2αはCa電流を17%可逆的に抑制した。また投与した0.3-5μMの間で濃度依存的にCa電流抑制効果を示すことを確認した。
木材腐朽菌によるリグナン類の代謝に基づくグメリナ材の耐腐朽性発現機構の解明

グメリナ心材のカワラタケに対する主要な抗菌成分である(+)-gmelinol及び(+)-paulowninをカワラタケによって代謝させ(+)-7'-methoxygmelinol, (+)-7'-methoxypaulownin等の代謝産物を単離構造決定した。大部分の代謝産物のカワラタケに対する抗菌活性は基質よりも低下したが、(+)-7'-methoxygmelinolの抗菌活性は基質よりも増大し、また、本代謝産物の収率は非常に高かった。グメリナ心材中に共存する複数の基質の7'-位がメトキシル化され、最も収率の高い代謝産物の抗菌活性が増大した結果耐腐朽性が発現する機構を推定した。昨年度は、スモールスケールでグメリナ(Gmelina arborea)心材の主要な抗菌活性リグナンであるグメリノールのカワラタケ(Trametes versicolor)による代謝の条件を確立した。当年度は、代謝生成物の収率が高くなる条件を用いて液体培養のスケールアップを行い、代謝生成物を大量に生成し、機器分析並びに抗菌アッセイに必要な量の確保を試みた。培養後の液体培地から含有成分を回収、濃縮乾固し、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で分析したところ、3種の代謝物が大量に生成していた。これらの代謝生成物を分取HPLCを用いて単離し、機器分析によって構造決定した。その結果、代謝生成物はグメリノールのベンジル位に12個のメトキシル基が導入された化合物であり、これらは新規リグナン類であることが判明した。木材腐朽菌によるリグナン類のベンジル位メトキシル化という変換反応についてはこれまで報告例がないことから木材腐朽菌における新しい知見となった。単離された3種の代謝生成物の基質に対する収率は39.3%, 14.5%, 5.2%であった。ハロー法を一部改変した手法によって代謝生成物のカワラタケを用いた抗菌アッセイを行ったところ、最も高収率で得られた代謝生成物は基質(グメリノール)よりも高い抗菌活性を示した。一方、その他の2種の代謝生成物の活性は、基質よりも低くなり、特に2カ所にメトキシル基が導入された生成物では、抗菌活性は著しく低下していた。このことから一般的な菌体は基質の弱毒化を図ると考えられるが、カワラタケによるグメリノールの代謝では、通常とは異なる代謝系が働き、抗菌活性の高い代謝物の生成による耐腐朽性発現を示唆する結果となった。グメリノールはグメリナ心材に大量に存在するため、抗菌活性の高い代謝生成物が効率よく生成することによって抗菌活性発現に大きく寄与するものと推察した。グメリナ材の耐腐朽性発現機構を明らかにすることにより抗菌剤開発のための知見を得ることを目的とした。グメリナ心材のメタノール抽出物の酢酸エチル可溶部からカラムクロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィーによって代謝実験の基質として使用するためのgmelinolを約300 mg単離した。gmelinolの同定は、NMRスペクトルと旋光度の標品との比較によって行った。液体培地中でgmelinolをカワラタケによって代謝させた後、培地並びに菌体から代謝生成物を回収する方法を検討した結果、菌体内に取り込まれるか吸着する代謝生成物の量は非常に少なく、また培地中に存在する代謝生成物と組成がほぼ等しかったため、今後の代謝反応の実験では菌体のホモジナイズの操作を省略できることがわかった。代謝(培養)日数を変えて実験したところ、基質は8日間で大部分代謝されることが明らかになった。代謝生成物は8日以降に大量に生成した。16日目における代謝物の生成量は8日目とほぼ等しかったので、代謝生成物の単離は8日間の培養後に行うべきであることがわかった。代謝日数4日目の代謝生成物は量が少なかったが、逆相HPLCにおいて保持時間の短いピークが相対的に大きかったため、基質が水酸化された代謝生成物の存在が予想された。培地及び基質に対する菌体の量を変えて実験したところ、代謝生成物の組成が大きく異なる結果が得られ、今後菌体量をコントロールすることによって多様な生成物を単離できる可能性が示唆された。前年度までにグメリナ心材中での含有率が最も高い(+)-gmelinolをカワラタケによって代謝させ、ベンジル位(7'-位)にメトキシル基が導入された(+)-7'-methoxygmelinol及び2種のリグナン類を代謝産物として単離、構造決定した。当年度は、(+)-gmelinolに構造が類似した(+)-paulowninを基質として用いて同様に代謝実験を行い、結果を比較した。