hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高いS/N比を有するSPRバイオセンシングを目指したセンサー表面修飾法の検討

表面プラズモン共鳴による生体分子同士の相互作用の検出は、相互作用する生体分子が結合したことによる屈折率変化を利用する。本課題では、温度応答性高分子ミセルを表面プラズモン測定に利用することで、生体分子の結合に伴う屈折率変化に加えて、生体分子が結合することによって誘起される温度応答性高分子の相転移変化を屈折率変化として新たに付加することで、シグナルが増幅された表面プラズモン共鳴バイオセンシングシステムの構築に成功した。本年度は、可逆的付加開裂連鎖移動(RAFT)重合法により、温度応答性高分子ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAAm)とポリスチレン(PSt)からなるブロック共重合体を合成し、表面プラズモン共鳴(SPR)測定基板表面上に固定化する高分子層として用いる、コアがPSt、シェルがPNPAAmの高分子ミセルを調製した。PNIPAAmおよびPSt分子量が異なる様々な組成を有する高分子ミセルを調製したが、いずれの高分子ミセルも単分散な粒径分布を示した。調製したミセル末端にラクトースを修飾し、ラクトースと特異的相互作用するレクチンを導入した際のミセルのLCSTシフトおよびミセルの相転移変化を、ミセルの分散-凝集変化を紫外可視吸光法を用いて観察することにより評価した。その結果、ミセル組成の違いにより、レクチンを導入した際のミセルのLCST変化量は大きく異なった。PStの分子量が大きいほど、PNIPAAmの分子量が小さいほど、LCST変化量は増加した。大きなLCST変化量を示した高分子ミセル(PNIPAAm;4KDa、PSt;1.6KDa)を用いて、ミセルにラクトースを修飾し、レクチンをミセル分散溶液に添加した際の吸光度変化を測定した。その結果、レクチンを添加することで吸光度は急激に変化し、添加後10分でほぼ平衡に達した。一方、BSAをレクチン濃度の10倍濃い濃度で添加しても、吸光度はまったく変化しなかった。また、レクチンによるミセル溶液の吸光度変化は測定温度により異なり、LCSTシフト領域の温度において、最も吸光度が変化した。これらの結果より、特異的相互作用を示す分子のみがミセル表面に結合した場合のみ、ミセルが相転移変化を生起しミセル同士が凝集すると示唆された。今後、このミセルをSPR基板上に固定化し、SPRシグナルの増幅効果に関して検討する予定である。本課題は、リガンド分子を修飾した温度応答性高分子ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAAm)をシェル、ポリスチレン(PSt)をコアとした高分子ミセルのターゲット分子結合に伴うPNIPAAmの下限臨界溶液温度のシフト、それによって誘起されるミセルの相転移変化を表面プラズモン共鳴(SPR)のシグナル増幅効果へ応用した高いS/N(シグナル/ノイズ)比を有するバイオセンシングシステムの構築が目的である。SPR金基板上にコンカナバリンA(Con A)を修飾し、この基板上にCon Aと特異的相互作用するマンノースを修飾した温度応答性ミセルを流した際のSPRシグナル変化を測定した結果、10°Cにおけるシグナル変化量は、マンノースを流した際の183倍、未修飾ミセルを流した際の58倍、30°Cでは、378倍および99倍であり、ミセルの相転移変化に伴うSPRシグナル増幅効果が顕著に現れ、高いS/N比を示す結果となった。一方、マンノース、マンノース未修飾ミセルを流した際のSPRシグナル変化量は、温度による影響はほとんどなかった。金基板上にアミノ基を導入し、カルボキシル基末端を有する温度応答性高分子ミセルをアミノカップリング法よりSPR基板上に固定化した。その結果、基板上にミセルを固定化でき、AFMでその固定化を観察した。ミセル固定化表面の温度変化させた際のSPRシグナル変化は未修飾金基板表面と比較して大幅に変化しており、ミセルの相転移による影響であると考えられた。また、固定化したミセルにマンノースを修飾した場合、さらにCon Aを修飾した場合の温度変化によるSPRシグナル変化を測定した結果、SPRシグナルが大幅に増幅する温度が両者で異なり、ターゲット分子結合に伴うミセルの相転移変化を確認できた。以上より、シグナル増幅機能を有する新規バイオセンシングシステムの構築に成功した。
食事由来のアクリルアミド摂取量推定とその健康影響評価への展開

食品が高温で調理されたときに生じるアクリルアミドは、動物において生殖・発達への障害が認められている。日本における食品中のアクリルアミド含有量の基礎データを基に小児428名、妊婦392名における食事記録からアクリルアミド摂取量を推定し、生殖・発達機能に係る内因性の性ホルモンとの関連を評価した。平均アクリルアミド摂取量は、小児において21.0μg/dであった。男児において摂取量が高いと尿中テストステロン値が有意に高かった。妊婦におけるアクリルアミド摂取量は、19.6μg/dであった。摂取量が高いと妊娠10週時のテストステロン、臍帯血のエストラジオールが女児を出産した妊婦において高かった。食品を高温で調理した時に生じるアクリルアミドは、動物実験により、発がん性および成長・生殖に対する毒性が示されているが、日本人の食品からのアクリルアミド摂取量はもとより、その健康影響に関する疫学研究は日本で行われていない。日本における食品中のアクリルアミド含有量の基礎データが最近蓄積されており、まず、それらのデータを基に日本の一般成人、小児を対象に、食事記録からアクリルアミド摂取量を推定し、また、今後、アクリルアミド摂取の健康影響評価を目指すため、その疫学研究に有用な食物頻度調査票による摂取推定方法を確立することを目的とした。本年度は、まずは日本の食品におけるアクリルアミド含有量データの収集にあたった。農林水産省、厚生労働省の公表データを主に、論文による報告、米国FDAデータも参照した。これらのデータを基に幼児428名における食事記録からの平均アクリルアミド摂取量は、21.0μg/d、最小値2.7μg/d最大値98.4μg/dであった。幼児においては横断研究のデザインで、アクリルアミド摂取量と、生殖・発達機能に係る内因性の性ホルモン(尿中エストラジオール、テストステロン、デハイドロエピアンドロステロン、アンドロステネジオール)との関連性を評価した。男児においてアクリルアミド摂取量が高いと尿中テストステロン値が統計的に有意に高かった。女児においてはどの尿中ホルモン値とも有意な関連性は認められなかった。アクリルアミド推定作業に重点を置いたため。但し、新たな食品含有量データの発表にあたり、推定をアプデートする必要がある。アクリルアミドは、食品に含まれる特定のアミノ酸と糖類が高温で調理した時に生じる物質で、動物実験により、発がん性および成長・生殖に対する毒性が示されている。人の健康影響に関する関心は世界的にも高いものの、日本における疫学研究は、申請者らによる報告以外ない。日本の食品中のアクリルアミド含有量の基礎データが最近蓄積されており、それらのデータを基に日本人のアクリルアミド摂取量を推定可能とし、生殖・発達機能に係る内因性の性ホルモンとの関連を評価した。本年度は、妊婦392名を対象に、妊娠後期(29週)に行った食事記録を基にアクリルアミド摂取量を推定し、妊娠10週、29週、出産時における母親の血中と出産時の臍帯血中におけるホルモン(エストラジオール、エストリオール、テストステロン)値との関連を評価した。また、胎児の成長の度合いとして、出生時体重、身長、頭囲との関連も評価した。年齢、出産数、喫煙状態、妊娠前の身長、体重、測定時の妊娠前からの体重増加、総エネルギーは補正変数として用いた。妊婦における平均アクリルアミド摂取量は一日あたり19.6μgであった。アクリルアミド摂取量が高いと妊娠10週時のテストステロン、臍帯血のエストラジオールが女児を出産した妊婦において高かった。男児を出産した妊婦では、アクリルアミド摂取量とホルモンとの関連は認められなかった。出産児の性別にかかわらず、アクリルアミド摂取量と出生体重は有意な関連がなかった。成人を対象とした食事記録からのアクリルアミド摂取量推定と、従来の食物摂取頻度調査票がアクリルアミド摂取量推定にも応用できるよう推定法を確立する。疫学、予防医学
感音性難聴者の語音弁別を促す音声の周期性知覚支援型信号処理の開発

研究の目的は、既存補聴器に自己相関解析という信号処理技術を新たに導入し、補聴後の感音性難聴者の語音明瞭度を健聴者に近いレベルまで改善させることである。従来の補聴用信号処理は、音声帯域の強調やフォルマント周波数の明確化など、周波数帯域での計算アルゴリズムが一般的であり、言葉の聞き取りを部分的に回復させるにとどまっていた。本研究が提案する自己相関解析は、周期性を検出する時間領域アルゴリズムで、これまでの不足部分を補うことが大いに期待できるものである。今回本申請では、この自己相関解析と異聴傾向から感音性難聴メカニズムを解明し、周期性を安定化させるジッター補正というDSPを加えて、感音性難聴者の明瞭度改善を目指す。本研究成果は、内耳に電極を埋め込む人工内耳以外の新たな選択肢を提案し、患者の身体的・精神的負担を大きく軽減することができる。これまでの研究では、「単音節の自己相関解析から計算される有効継続時間の中央値が短いほど、その単音節は聞きとりづらい」というマクロなモデルにとどまっている。よって初年度はまず、聞き間違いが生じるタイミングの特定を目標とし、各単音節の騒音暴露レベルを解析した。騒音暴露レベルとは音圧の時間積分値である。その結果、騒音暴露レベルが急峻に上昇する単音節ほど、感音性難聴者には聞きとりやすいという事実が明らかとなった。つまり、音の出だしがある閾値に速やかに到達する単音節ほど聞きとりやすい、ということである。よって本年度は、単音節の音圧の立ち上がりを信号処理で加工し、明瞭度の差にどのように影響するのか、より詳細な検証を行う。また自己相関解析から得られる有効継続時間との対応関係についても調査する。これまで我々が示すことが出来た、単音節の明瞭度(心理)と自己相関解析(物理)との対応は子音間という条件があったが、今回の騒音暴露レベル(物理)との対応は、VOT>0という条件はあるものの、前単音節に対して当てはまる、大変汎用性が高いものである。この新しい説明変数の発見は、今後の研究に新しい可能性をもたらすものと考える。【現在までの進捗状況】で説明したように、VOT<0という条件下では、単音節の明瞭度(心理)と騒音暴露レベル(物理)との関係が見いだせていない。今年度はこの問題に取り組み、より汎用性の高い説明変数を見いだす。またこれまでの自己相関解析、騒音暴露レベルを含めた、統合的な評価指標について提案する。
HER2陽性胃癌における遺伝子異常の包括的評価と臨床的意義の解明

HER2タンパク質過剰発現(HER2陽性)を呈する胃癌に対する抗HER2療法の効果は高い。しかし、HER2陽性であっても抵抗性を示す症例が存在し、ERBB2下流やその他の細胞増殖経路の遺伝子異常の関与が予想される。癌遺伝子解析パネルはERBB2増幅と同時に複数の遺伝子異常を包括的に評価できるため、抗HER2療法の最適化にとって有用な可能性がある。癌遺伝子解析パネルを用いてERBB2遺伝子異常に併存する遺伝子異常の詳細を明らかにし、その臨床的意義を抗HER2療法の治療効果を含む臨床データとの関連で明らかにして、抗HER2療法の最適化による胃癌薬物治療発展のための科学的基盤を確立する。
病原性結核菌強毒株H37Rvプロモーターのシステマティックな総合的検索

【研究目的】病原性結核菌強毒株M.tuberculosis H37Rvの全ゲノムの塩基配列が決定されたが、この株は転写開始因子(シグマ因子)が異なる13種のRNAポリメラーゼをもつなど複雑な転写様式をもつ。本研究の目的は、再興感染症の一つの原因菌であり、取り扱いが危険なこの結核菌強毒株のプロモーターを、生化学とバイオインフォーマティックスとを総合的に利用することにより、実用的で危険の無い固定化酵素を用いた新手法で探索することである。この研究で得られる結果は結核菌の転写機構の一般的な理解のみに止まらず、現在まだ不明である病原性にかかわる遺伝子の転写機構を明らかにして感染症の制御やワクチン開発の基盤をあたえる意義をもつと同時に、本研究の新手法は他の病原性バクテリアにそのまま利用できる一般性をもつものである。【研究実績】大腸菌多量発現系を用いてM.tuberculosisの異なるシグマ因子をもつ8種のリコンビナントホロ酵素をそれぞれ精製し、開発した固定化樹脂を用いて、結核菌の13種のうち8種の固定化ホロ酵素(sigA, sigB, SigC, sigD, sigE, SigG, SigH, sigI型)を調製した。ゲノムでの出現頻度から設計されたプライマーを用いたPCRによって構築したM. tuberculosisゲノムライブラリー(前年度構築済)から、それぞれの固定化ホロ酵素に高い親和性をもち、かつ1サイクルの転写に伴って解離されるDNA断片を選択した。次に、選択されたDNA断片の塩基配列を決定したのち、シグマ型ごとにプロモーター配列を整列し、各々の共通性を探った。その結果、sigA, sigE, sigH型のプロモーターDNA断片を収集した。その結果、sigA型(major RNA polymerase)プロモーターは大腸菌のシグマ70型プロモーター共通配列(TTGACA<16/17/bp>TATAAT)と類似したもの、-10配列のみが類似のもの及び類似していないものが得られた。また、sigH型(EcF RNA polymerase)のプロモーターは、ECF型プロモーター共通配列(CCGGAACTT<16/17/bp>TCTgA)の-35領域が保存されていた。一方、SigE型のプロモーターもECF型であるが、その共通配列と類似性はなく、共通配列はGG^<aa>_<gc>(C/A)<18bp>^c_gGTT^g_cと推定される。
家族集積性の強い脳血管疾患の遺伝分析

本課題においては、家族集積性の高い脳血管疾患である(1)もやもや病および(2)脳動脈瘤(3)脳動静脈奇形の3疾患についての検討を行う。本年度は、(1),(2)について検討を行った。もやもや病では、多くの動脈で、血管平滑筋細胞の増殖が認められるが、内頚動脈終末部を中心に最も高度に増殖が生じ、血管閉塞の原因となる。本疾患に係る(1)責任遺伝子、および(2)病理的検討によりPathwaysを同定し、脳動脈硬化の発生基盤を解明することを目的とする脳動脈瘤においては、家系内に3名以上の未破裂動脈瘤あるいはくも膜下出血を有する家系を対象とし、2001-2003年にかけて29家系に遺伝解析を行った。その結果、17cenに強い連鎖を認めた。今回これら家系を5年以上追跡し、新規の脳動脈瘤あるいはくも膜下出血を観察し、phenotypeをもとに再度連鎖解析を行い、感受性遺伝子の特定を目指す。もやもや病においては、国内、38家系205名、韓国では1家系5名の家系の参加を得た。また、我が国83名、韓国38名、中国24名、EU29名の参加を得た。合計で387名の参加を得た。これら家系で、候補遺伝子の検証を行う。また、現在、候補領域のBAC Libraryを作成した。現在遺伝研の協力を得てShotgun sequencingを行いつつある。機能解析について、現在候補遺伝子群についてZebra FishでのKnock outによる影響を観察している。生化学的な機能解析についても同時に進行させている。さらに、抗体を作成中であり、病理検索に用いる。脳動脈瘤においては、5年後の追跡を終了し解析を行いつつある。本課題においては、家族集積性の高い脳血管疾患である(1)もやもや病および(2)脳動脈瘤の検討を行う。脳動脈瘤については、5年後の追跡調査によりCh17のLOD Scoreは増加した.現在この領域の配列決定を行いつつある。
カサノリに存在するイオン能動輸送系に関する分子生物学的研究

1.カサノリCl^--ATPaseについてa(54 kDA)及びb(50 kDa)サブユニットの全長をコードするcDNAを得た。bサブユニットを大腸菌F_1-ATPase,β欠損株で発現させた結果,酸化的リン酸化能の回復はみられなかった。bサブユニットの96-161アミノ酸部分が決定的に機能回復を阻害する配列を持つことを,キメラ蛋白質の解析により明らかにした。2.カサノリV-PPaseについて3.カサノリV-ATPase,proteolipid subunitについて上記subunitをコードするcDNA6種をクローニングした(AACEVAPD 1-6)。これらのcDNAを酵母発現ベクターpESC-Leuに連結し,AACEVAPD 2,4及び5についてrecombinantを得た。これらを,酵母V-ATPase,proteolipid subunit欠損株(vma3-deficient strain)に導入し,transformantを得た。培養後,酸性小器官へのキナクリンの取り込みを蛍光顕微鏡で観察した。それぞれのtransformantで蛍光がみられ,カサノリV-PPase,proteo-lipid subunitの発現並びに機能のcomplementationが実証された。4.カサノリABC transporterについて生体膜を介する溶質の選択的な移動を媒介するATP-bindingcassette(ABC)superfamilyのcDNAクローニングの結果,sulfate permeaseのCysA subunitの全長をコードするcDNAを得た。357アミノ酸をコードし,分子量40,679の蛋白質であり,シアノバクテリアCysA proteinに48.7%のidentityを示すものであった。即ち,バクテリアタイプの構造を有することが明らかになった。細胞性粘菌Polysphodylium pallidumの子実体は、主軸上に輪生した分枝をだして、枝分かれした構造を形成する。我々は、この分枝構造に注目し、この構造が、どのような分子的基礎のもとに、どのような遺伝子産物が、どのような機構で形成されるかについて明らかにすることを目的とした。まず、この生物で挿入突然変異作製法を確立した。次に、この方法を用いて、多数の形態異常の変異体を単離した。その中の一つに、輪生状の枝分かれ構造を全く形成しない突然変異体があり、その原因遺伝子を特定するための実験を行ったが、現在のところその遺伝子をクローン化出来ていない。また、その中の1つに、分岐した枝の長さが長い変異株があり、この原因遺伝子をクローン化し塩基配列を決定して1個のORFを見つけた。また、cDNAを解析することにより、この遺伝子は2個のイントロンを含むことを明らかにした。相向性検索やアミノ酸配列の比較、また膜貫通ドメインの存在とその位置により、この遺伝子にコードされたタンパク質は、分泌タンパク質の小胞輸送に関与しているp24タンパク質ファミリーに属することが分かった。また、ノーザンブロット解析から、この遺伝子は発生開始後8時間目に発現量が最大に達して、その後減少していくことと、変異株ではこのmRNAは全<発現しないことが明らかになつた。また、細胞性粘菌Dicytostelium discoideumのEST中に、この遺伝子のホモログを3個見つけたので、それらの遺伝子のゲノムDNAの塩基配列とcDNAの塩基配列を決定した。その中の1つの遺伝子について遺伝子破壊株を作製し、現在その解析をおこないつつある。1.カサノリC1^-輸送性ATPaseについて(1)a(54kDa)及びb(50kDa)サブユニットの遺伝子クローニング:aサブユニットについては,全長2,763bp・ORF,61-1,569bp・502アミノ酸をコードするクローンを得た。ホーレンソウのクロロプラストF1-ATPase,αサブユニットに約77%の相同性を示した。bサブユニットについて,全長2,538bp・ORF,45-1,482bp・478アミノ酸をコードするクローンを得た。

N末端から約120アミノ酸は,クロロプラストF1-ATPase,βサブユニットに対し,約70%と相同性は低く,120アミノ酸以降の一次構造は約92%の相同性を示すものであった。(2)bサブユニットの大腸菌F1-ATPase,β欠損株への発現:bサブユニットを発現させた場合,suc(-)即ち酸化的リン酸化能の回復はみられなかった。大腸菌F1-ATPase,βサブユニットとのキメラ蛋白質の発現により,C1-ATPase,bサブユニットの96-161アミノ酸部分が決定的に機能回復を阻害する配列を持つことを明らかにした。この領域はいわゆるATP binding motifを持つ領域である。2.カサノリH^+-PPase及びV-ATPase,proteolipid subunitについて1.カサノリV-PPaseの酵母細胞への発現2.カサノリV-ATPase,proteolipid subunitの6種のisoformの細胞内での発現これまでに,上記subunitをコードするcDNA6種をクローニングした(AACEVAPDl-6)。カサノリからtotal RNAを調製し,Northern解析により各mRNAの発現量を定量した。その結果,mRNA量は,AACEVAPD4=6_<>>>AACEVAPD3_>AACEVAPD2=5_<>>>AACEVAPD1となり,発現量からは4グループに分類された。それぞれ,PCRにより連結したfull lengthのcDNAを作成しており,発現実験の準備が完了している。3.カサノリABC transporterのcDNAクローニング生体膜を介する溶質の選択的な移動を媒介するATP-bindingcassette(ABC)superfamilyのcDNAクローニングにより,カサノリに少なくとも3種類のABC transporterが存在することが明らかとなった。sulfate permease,putrescine/spermidine transporter及びmaltose permeaseである。Northern解析の結果から,いずれもバクテリアタイプの構造が示唆されるものであった。これまでに、上記subunitをコードするcDNA6種をクローニングした(AACEVAPD 1ー6)。これらのcDNAを酵母発現ベクターpESC-Leuに連結し、AACEVAPD2,4及び5についてrecombinantを得た。
センサーネットワークを用いた東シナ海南西部における外洋と沿岸の統合観測

1.遠距離海洋レーダによる海洋面観測遠距離海洋レーダによって東シナ海南西部における黒潮とその周辺の流動場を観測した。その結果、東シナ海南西部における黒潮とその周辺の流動場特性、外洋と沿岸域との相互作用、黒潮周辺で発達する渦の変動特性、黒潮と八重山諸島沿岸の潮位変動との関係等を明らかにした。また、遠距離海洋レーダによる台風下での波浪計測を実施し、台風下の東シナ海南西部の波浪場の特性を明らかにした。2.短波海洋レーダによる石西礁湖内の流動場観測短波海洋レーダによって石西礁湖とその周辺海域の流動場を観測した。観測の結果、石西礁湖とその周辺海域の流動場特性を明らかにするとともに、石西礁湖と太平洋(外洋)との海水交換の特性を明らかにした。また、石西礁湖でのサンゴの産卵期における流動場の特性も明らかにした。3.漂流ブイによるサンゴ幼生の追跡シミュレーション調査石西礁湖内のサンゴ幼生がどのような経路で浮遊し、定着するのかを明らかにするために、GPSと衛星通信を利用した漂流ブイによる追跡シミュレーション調査を実施した。調査の結果、石西礁湖内のサンゴ幼生の大部分は石垣島や西表島の沿岸域に供給されていることが明らかになった。また、サンゴ幼生の一部は黒潮本流に取り込まれ、下流の島々(宮古島など)にサンゴ幼生が供給される可能性があることも明らかにした。4.微細構造測定装置による乱流強度の解析東シナ海南西部から石西礁湖における混合層の特性を明らかにするために、鉛直微細構造計測器による表層の乱流強度計測を実施した。その結果、東シナ海南西部から石西礁湖における海上風による表層の混合層発達過程とエネルギー逸散率の特性を明らかにした。1.遠距離海洋レーダによる外洋の流動場観測遠距離海洋レーダの開発で試験的に取得した受信信号(2002年)から日平均の表層流ベクトルのデータセットと日平均の渦度のデータセットを作成し、東シナ海南西部における黒潮とその周辺の流動場の特性、外洋と沿岸域との相互作用、黒潮周辺で発達する渦の変動特性等を明らかにした。また、遠距離海洋レーダで計測した表層流データから黒潮の変動に伴う八重山諸島の潮位変動を推定する手法を開発し、黒潮が沿岸潮位の変動に及ぼす影響について明らかにした。2.短波海洋レーダによる石西礁湖の北側海域と外洋の流動場観測短波海洋レーダによって石西礁湖の北側海域と外洋の流動場の連続観測を2005年8月22日2005年10月1日まで実施し、その流動場と渦度場の特性を明らかにした。また、東シナ海南西部から石西礁湖への外洋水の流入パターンを明らかにした。3.Gpsと衛星通信を利用した漂流ブイによる石西礁湖内の流動場観測GPSと衛星通信を利用した漂流ブイによって、東シナ海南西部から石西礁湖への物質輸送の過程(移動速度と移動経路)と、石西礁湖から東シナ海南西部への物質輸送の過程(移動速度と移動経路)を明らかにした。また、東シナ海と太平洋における広域物質輸送についての計測を行い、そのパターンを明らかにした。4.微細構造測定装置による定地点計測鉛直微細構造計測器によって、東シナ海南西部から石西礁湖における水平流速の鉛直傾度、鉛直傾度の観測を実施し、東シナ海南西部と石西礁湖におけるこれらの物理量の特性を明らかにした。また、水平流速の鉛直傾度、高感度水温計の鉛直傾度との間の相関関係も明らかにした。

さらに、短波海洋レーダと漂流ブイによる流動場観測結果との比較により、流動場の変動とこれらの物理量の変動との関係を明らかにした。1.遠距離海洋レーダによる外洋の流動場観測東シナ海南西部における流動場の時空間特性を明らかにするために、遠距離海洋レーダによって計測された表層流データを用いて東シナ海南西部における黒潮とその周辺の流動場の時系列解析(2002年2005年)を行った。解析の結果、東シナ海南西部に流入する黒潮には2つの流路パターンが存在し、数十日数百日間隔で不規則に変動していることが明らかになった。また、黒潮と八重山諸島に挟まれるの海域では、与那国島の西と東から発生した時計回りの渦と反時計回りの渦によって海洋性乱流場が形成されることも明らかになった。さらに、台湾の北東から反時計向りの渦が生成され、下流方向に移動することが明らかになった。2.短波海洋レーダによる石西礁湖の北側海域と外洋の流動場観測短波海洋レーダによって石西礁湖の北側海域と外洋の流動場の長期連続観測(2006年6月12日2007年1月10日)を実施(実際には短波海洋レーダが落雷と台風(13号)によって壊滅的被害を受けたため、その表層流観測は2006年11月11日2007年1月10日の期間しか実施できなかった)し、その流動場と渦度場の特性について調査した。3.GPSと衛星通信を利用した漂流ブイによる石西礁湖内の流動場観測GPSと衛星通信を利用した漂流ブイによる流動場観測によって、石西礁湖から黒潮本流への物質輸送の過程(移動速度と移動経路)と黒潮本流上での物質輸送の特性(移動速度と到達距離)を明らかにした。4.微細構造測定装置による定地点計測昨年度と同様に、鉛直微細構造計測器によって、東シナ海南西部から石西礁湖における水平流速の鉛直傾度、鉛直傾度の観測を実施し、東シナ海南西部と石西礁湖におけるこれらの物理量の特性について調査し、昨年度の観測結果との比較を行った。1.遠距離海洋レーダによる海表面観測東シナ海南西部における流動場の時空間特性を明らかにするために、遠距離海洋レーダによって計測された表層流データと海面高度計によって計測されたデータを用いて東シナ海南西部における黒潮とその周辺の流動場の時系列解析(2002年2006年)を行った。解析の結果、東シナ海南西部に流入する黒潮は、台湾の東の海上で中規模渦を取り込むことでその流動場を大きく変化させることが明らかになった。また、遠距離海洋レーダによって台風下における流動場と波浪場の特性についての解析を行い、鉛直方向の混合の特性と沿岸域との海水交換の特徴を明らかにした。2.短波海洋レーダによる石西礁湖内の流動場観測短波海洋レーダによって石西礁湖とその南側海域の流動場の長期連続観測(2007年4月28曰2007年8月2日)を実施し、その流動場の特性について調査した。観測の結果、石西礁湖でのサンゴの産卵期における流動場の特性を明らかにした。また、石西礁湖と太平洋(外洋)との海水交換の特性を明らかにした。3.漂流ブイによるサンゴ幼生の追跡シミュレーション調査石西礁湖内のサンゴの幼生がどのような経路で浮遊し、定着するのかを明らかにするために、GPSと衛星通信を利用した漂流ブイによる追跡シミュレーション調査を実施した。調査の結果、石西礁湖内のサンゴ幼生の大部分は石垣島や西表島の沿岸域に供給されていることが明らかになった。また、サンゴ幼生の一部は黒潮本流に取り込まれ、下流の島々(宮古島など)にサンゴ幼生が供給される可能性があることも明らかになった。4.微細構造測定装置による乱流強度の解析
韓国の移住小説における都市空間研究

韓国の移住小説に現れている都市空間の分析により、(1)移住空間における領土と主権の不一致状態、即ち脱領土化が進んでいること、(2)これに対する上からの再領土化企画(強制追放等)と下からの再領土化企画(民主的な反復による法生産・柔軟な国境化)が共に進んでいること、(3)普遍的な人権に基づいた国家層位における再領土化と共に、まだ不完全ではあるが、トランスナショナルな層位における多国家市民権を通して領土と主権の矛盾を解決しようとする事情等が把握できた。今回の研究テーマの一つである「海外から韓国の都市空間への移住文化研究」は、研究目的において言及した通り、(1)植民地期の「都市空間」における文化研究、(2)韓国からの「海外(中・日)空間」への移住文学研究の延長線上に置かれている。そのため、まず韓国の都市空間に存在している植民地性-都市空間の二重性を、安夕影と岡本一平の作品に表れている植民地近代の「同一性と非同一性」を通じて探ってみた。続いて、2010年度の研究計画のメインテーマに基づいた研究発表「主権の脱領土化と東アジア市民」は、ネパールといった東南アジアからの韓国の首都圏都市への移住を描いたパク・ボムシンの長編小説『ナマステ』を研究・分析したものである。この研究は、韓国の小説『小人が打ち上げた小さいボール』の延長線上でネパールの移住労働と児童労働との関係を描いた著書『ガマライジャイ:ネパールの幼い労働者と移住』といくつかの側面で緊密につながっている。著書に見られる、ネパールの山村から都会へ・都会から海外都市への移住は、小説『ナマステ』の前史といえるからである。東アジアの移住は東アジアの南北問題によるものだといえる。研究発表はまず国家主権について論じているが、近年両極分解された国家主権は、下位国家的な市民権(都市市民権)と上位国家的な市民権(ヨーロッパ連合市民権)或いは二重国籍(中南米の一部)など、脱国家化が進み、多様な市民権が登場するようになった。そこで特に本研究は、小説『ナマステ』に表れているこのような「脱領土化」と国家主権の「再領土化」の拮抗過程に注目しながら、韓国の「雇用許可制」に焦点を合わせ、「上からの再領土化企画」(未登録移住労働者の強制追放)と「下からの再領土化企画」(民主的な反復による法生産的政治学・柔軟な国境化)を究明している。普遍的な人権に基づいた「国家単位の再領土化」と、トランス国家的な「下からの地域(東アジア)市民権」についても共に考察している。2010年度は、(1)先ず韓国の都市空間に存在している植民地性-都市空間の二重性を、安夕影と岡本一平の作品に表れている植民地近代の「同一性と非同一性」を通して探り、(2)ネパールから韓国への移住労働者をはじめとする未登録移住労働者問題を描いた小説『ナマステ』に現われていた「脱領土化」問題と、この問題を解決するために試みられていた国家主権の「再領土化」について考察し、グローバル空間化における新たな領土主権について探ってみた。今年度は、まず2010年度に行った研究発表内容を論文としてまとめることができた。また、ソウルのガリボン空間を描いた三つの小説と一つの映画を通して、ガリボン空間がどのようにして70年代の女工による「領土化」、87システム以後進んでいた「脱領土化」、そして2000年代前後からの中国朝鮮族による「再領土化」を遂げたのかを探ってみた。特に、87年以後における中国朝鮮族によるガリボンの再領土化過程は、三つの層位、即ち超国家・国家・ローカルの層位から考察する必要がある。従来はガリボンという都市空間を国家層位からのみ分析したケースが多いからである。87体制以後のガリボン空間を「超国家的(transnational)」層位から探ってみるとき問題になるのは、「超国家的家族ネットワーク」(特に女性ネットワーク)である。「国家」層位からの再領土化(国家単位の関連法律の制定等)は、朝鮮族の不法滞在環境と直結し、小説「ガリボンの羊串」に登場する暴力組織のようにゲットー化や朝鮮族だけの専有空間化に繋がっている。「ローカル」層位から探ってみると、ガリボン空間は臨時的・流動的少数民族集団居住地化することが分かった。中国への逆移住・ローカル単位の都市政策が臨時的・流動的という特徴を規定する。今回の研究によって、国家単位だけでなく超国家・ローカル単位の新たな「領土主権」の必要性と地域住民との疎通(親密性)の必要性を明らかにした。今年度は、(1)韓国の許文日の小説「自主村」の背景になっている共同耕作契を通した理想的な農村空間に関する論文「協働共同体とフォルケホイスコーレ」を通して、韓国の移住労働者と共に作っていく京畿道安山の理想的な都市空間「国境なき村」との比較を行った。

韓国の小説「自主村」の背景になっている協働論は、日本の賀川豊彦、杉山元治郎、西欧のロバートオーエン、フーリエの協働共同体論と繋がっており、近代以来の代案空間論としての意味を持っている。(2)研究の最終年度の実施計画であった、戦後の在日コリアンの空間と領土主権との比較を通した現代韓国のグローバル空間の性格と領土主権についての考察である。2012年8月の日韓共同研究ワークショップと2013年2月の国際学術シンポジウムを経て発表した論文「在日コリアンと多国家市民権」は、在日コリアン小説家である梁石日の小説を映画化した『血と骨』と『月はどっち出ている』、梁ヨンヒの映画『ディア・ピョンヤン』を素材として考察したものである。論文では、移住による主権と領土の不一致、即ち主権と領土の矛盾を解決するため、戦後在日コリアンがどのような努力を傾けてきたかを探った。主権と領土の矛盾を解決するための努力の一つは帰還・帰国することで、もう一つは失われていた権利と責務を永住の領土である日本で実現することである。矛盾の解決は、前者から後者への転換によって図れている。即ち「国民:単一国家単一民族論」から「市民:多国家市民論」への転換である。在日コリアンの一部は、最近韓国での投票権を行使したが、これは領土と主権の矛盾を解決しようとする国家の自救策であり、多国家市民を認める一現象ともいえる。韓国への移住と定着を描いた小説に現れている都市空間の深さ及び幅の拡張との関連性も探ってみられる。ネパールから韓国への移住労働者をはじめとする未登録移住労働者問題を描いた小説『ナマステ』に表れていた「脱領土化」問題と、この問題を解決するために試みられていた国家主権の「再領土化」、グローバル空間化における新たな領土主権について探ってみた。また、ソウルのガリボン空間を描いた三つの小説と一つの映画を通して、ガリボン空間がどのようにして70年代の女工による「領土化」、87システム以後進んでいた「脱領土化」、そして2000年代前後からの中国朝鮮族による「再領土化」を遂げたのかを、超国家・国家・ローカルという三つの層位から考察した。このように当初計画していた中国と東南アジアから韓国への移住小説における都市空間研究は概ね順調に進んでいる。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初計画していた中国と東南アジアから韓国への移住小説における都市空間研究はある程度分析が進んでいるが、問題は移住が発生する前のローカル空間についての分析であろう。この分析のため、先ず韓国の小説に表れているローカルコミュニティ空間についての通時的・共時的分析を行う予定である。なお、超国家・国家・ローカルレベルにおける移住空間についての分析、特に戦後の在日コリアンの空間を注目する必要がある。戦後の小説を通してこれらの空間分析を行いたい。
高精細CGキャラクタ表現のための実時間皮膚変形計算モデルの学習

例示データを用いて非線形皮膚変形計算モデルを学習する手法の開発にあたって、平成30年度は、1.回転・並進運動に加えてスケール成分を含めた補助骨姿勢最適化アルゴリズムの開発と、2.例示データ生成機構の効率化に取り組んだ。1.については、従来法の回転・並進運動最適化アルゴリズムを拡張し、スケール成分を含んだ非線形凸最適化問題に対しても頑健に解を得る反復型最小二乗推定アルゴリズムを開発した。2.については、一様サンプリングによって大量に生成した例示データの中から、特に皮膚変形計算モデルの推定に適した少数のデータを自動選択する技術を開発した。その際、線形ブレンドスキニングとの類似度および非類似度を表すような2つの定量的な指標を定式化した。こうした2つの提案法の有用性については、複数種類のデータに対する実験を通じて、実用に十分に足る性能を持つことを確認している。本来であれば次年度の計画であった例示データ生成機構の開発を繰り上げて実施し、それに合わせて当年度予定していた研究テーマの一部を繰り下げる等の変更を行ったが、計画全体としてみると順調に推移している。研究遂行の過程で表面化した技術的課題も当初想定の範囲内であり、すでに対策を施しているか、今後の研究遂行においても問題ないことを確認している。学会等での研究成果報告も順調に行っており、特に米国計算機学会誌への掲載という当初目標以上の成果が得られた。なお、実開発現場での検証を通じて多くの課題点も明らかになっているが、そのうちいくつかは新たな研究シーズに展開するものと捉えている。当年度に行った各種事前実験や連携先との議論を踏まえ、研究計画に大きな変更は必要ないことを確認している。したがって、当初計画にしたがって、補助骨の非線形運動を模倣する最適な数理モデルを明らかにするともに、さらに高精度な皮膚変形表現の実現を目指す。また、自動構築したキャラクターリグを利用したアニメーションの誇張表現などの課題にも取り組む。英文校閲や渡航費等が予算計上時より安価に収まったことによる残額は、次年度の図書・消耗品購入等にあてる。
肝硬変治療の為の多機能性有機－無機ハイブリッドナノ粒子の開発

二種類のシリコンアルコキシドを用いたゾルーゲル反応により、one-potで中空構造の有機ー無機ハイブリッドナノ粒子の合成法を確立した。この有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子は主にジスルフィドとシロキサンから構成され、ナノ粒子表面にはチオール基が存在していた。このチオール基を用いて表面修飾をし、さらに、ナノ粒子内部に蛍光色素を封入し、肝繊維化に関与するクッパー細胞および肝星細胞とともに培養することにより、これらの両方の細胞内に取り込まれることを共焦点レーザー顕微鏡観察により明らかにした。このナノ粒子の合成の際に、あらかじめ抗酸化物質を添加しておくことで、抗酸化物質を有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子内部に封入することができた。また、この有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子は刺激に応答して化学構造が一部分解し、内包する抗酸化物質を放出することが明らかになった。さらに、この有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子は抗酸化物質を担持していなくても、この有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子の化学構造に起因する活性酸素除去機能を有していた。これらの有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子の特徴(クッパー細胞および肝星細胞ターゲティング能および抗酸化作用)を活かして、クッパー細胞が生成するヒドロキシラジカルを除去することが可能であることを明らかにした。さらに、この有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子は細胞毒性を示さないことをWST-1アッセイにより評価した。平成30年度は、培養した星細胞を用いて、中空ナノ粒子が星細胞内に侵入するかの確認、細胞内で内包物を放出するかの確認、中空ナノ粒子の細胞毒性評価、を目的としていた。本研究で合成した有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子は表面修飾により、肝繊維化に関与するクッパー細胞および肝星細胞をともにターゲティングできた。この有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子は刺激に応答して化学構造が一部分解し、内包する抗酸化物質を放出した。この有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子は細胞毒性を示さなかった。以上より、当初目的としていた研究内容は全て達成された。これまでの研究は概ね順調に遂行している。2019年度は、当初計画していた通り、肝繊維症マウスを用いてin vivo評価を行う。評価内容は、有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子が、生体内においてもクッパー細胞および肝星細胞をともにターゲティングできるかを蛍光イメージングおよび免疫組織染色により確かめる。また、生化学検査と病理組織学的解析により、有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子を用いた治療法の有効性を評価する。また、治療効果が認められる投与スケジュールなどを検討する。本研究は有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子を用いた肝線維症治療に関する研究である。平成29年度は、肝線維症治療を可能にする多様な機能を有する有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子の作製およびこの有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子の表面修飾による特的の細胞に対するターゲティング能の付与に取り組んだ。中空構造を有する有機ー無機ハイブリッドナノ粒子をone-potで合成する方法を確立した。この有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子の粒径は約145 nmであり、その骨格の厚さは約35 nmであった。また、この骨格はジスルフィドとシロキサンから成ることを、FTIRおよびラマンスペクトルから明らかにした。有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子の表面には6.6 mol/gのチオールが存在していた。TG-DTAから、この有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子の無機相は42%、有機相は58%であることが分かった。さらに、上記有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子に抗線維化作用を示すシリビニンを封入する方法も確立した。有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子へのシリビニンの封入効率は100%であり、350 mMのシリビニンを封入することができた。肝臓のクッパー細胞および肝星細胞をターゲティングするために、有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子の表面に存在するチオールを活用し、レチノールを修飾した。有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子表面にチオールを残しておく必要があるため、全てのチオールを使用せず、3.1 mol/gのチオールを残し、3.5 mol/gのレチノールをナノ粒子表面に修飾した。有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子は活性酸素、特に肝臓の線維化を引き起こす主原因であるヒドロキシラジカルを捕捉することを確認した。さらに、有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子はグルタチオンに応答して分解し、シリビニンを放出することを確認した。平成29年度に行うことを計画していた内容を全て達成することができたため。

これらの有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子の特徴(クッパー細胞および肝星細胞ターゲティング能および抗酸化作用)を活かして、クッパー細胞が生成するヒドロキシラジカルを除去することが可能であることを明らかにした。さらに、この有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子は細胞毒性を示さないことをWST-1アッセイにより評価した。平成30年度は、培養した星細胞を用いて、中空ナノ粒子が星細胞内に侵入するかの確認、細胞内で内包物を放出するかの確認、中空ナノ粒子の細胞毒性評価、を目的としていた。本研究で合成した有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子は表面修飾により、肝繊維化に関与するクッパー細胞および肝星細胞をともにターゲティングできた。この有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子は刺激に応答して化学構造が一部分解し、内包する抗酸化物質を放出した。この有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子は細胞毒性を示さなかった。以上より、当初目的としていた研究内容は全て達成された。これまで滞りなく研究を遂行することができているため、平成30年度以降も申請書に記載した計画に従い研究を遂行する。これまでの研究は概ね順調に遂行している。2019年度は、当初計画していた通り、肝繊維症マウスを用いてin vivo評価を行う。評価内容は、有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子が、生体内においてもクッパー細胞および肝星細胞をともにターゲティングできるかを蛍光イメージングおよび免疫組織染色により確かめる。また、生化学検査と病理組織学的解析により、有機ー無機ハイブリッド中空ナノ粒子を用いた治療法の有効性を評価する。また、治療効果が認められる投与スケジュールなどを検討する。
大腸癌モデルマウスを用いた遺伝子治療の基礎実験

APC遺伝子のexon 1から14までの約2キロベースをmRNAからRT PCRで増幅する。正常マウスの腸管からIso-gen kitを用いてmRNAを抽出し、逆転写酵素でcDNAを作製する。exon 1から14に特異的な塩基配列にSubcloningしやすい様に制限酵素のsiteを付加したPCRプライマーを作成し、GeneAmp Kitを用いてPCRを行ない正常マウスAPC遺伝子exon 114を増幅する。pCMV-Flag Plasmidにレポーター遺伝子Flag蛋白とAPC遺伝子が接合するようにSubcloningする。同時にexon 15に特異的なPCRプライマーを作成し、exon 15を増幅し、上記のPlasmidに結合し、APC遺伝子8535ベース全長を構築する。Adeno Virus Expressionkitを用いて、Flag-APC遺伝子をコスミドベクターに導入する。Cre遺伝子を組み込んだコスミドベクターと制限酵素処理済みDNA-TPCとを293細胞にco-transfectにより導入し、相同組換えを起こし非増殖型の組換えアデノウイルスを得る。現在、再考を加えつつ導入遺伝子を作製中である。肝細胞成長促成因子(Hepatocyte growth factor以下HGF)は肝細胞の成熟に関与している。HGFを持続的に産生する細胞を肝切除後、薬剤性肝炎等の実験動物に投与することで、肝機能を改善させる結果が報告されている。しかしHGFは濃度や、期間により、その働きが変わり肝癌の発育促進、あるいは転移に関与するという報告もある。そこでHGF遺伝子を導入し、コントロールすることを試みる。Cre/loxP recombinationsystemは、導入遺伝子発現のコントロールを可能にし得る方法として注目されている。lox配列とは哺乳類の細胞には存在しない34個の塩基配列で、Cre recombinase(クレ組換え酵素)が働くと相同組み換えを起こすことが知られている。つまり、クレ組換え酵素存在下では2つのloxP配列に挟まれた遺伝子領域は切り離され転写、翻訳されることがなくなる。このシステムを利用して、導入遺伝子の発現をコントロールし、HGFの生理学的作用や周術期における役割を検討し、肝切除後の肝再生補助に適応したい。マウスHGF cDNAを含むplasmidを購入し、DNAを抽出、精製する。HGF exon 1とexon 2から15に特異的なPCRプライマーを作成し、exon 1、およびexon 2から15を増幅する。マウスGenomic libraryよりGenomic DNAを入手し、HGF exon 1のPCR産物をprobeとしてexon 1を含むファージを単離し、ファージDNAを精製する。loxP配列を含むファージDNAをCLONTECHより購入し、HGF exon 1を含むGenomicDNAを2つのloxP配列の間に挿入しloxP-HGF exon 1-loxPを得る。この下流にexon 2から15のcDNAを結合させ導入遺伝子を精製する。現在、この導入遺伝子を作製中である。
Ｆｅナノ粒子ＭＲＩ造影剤の開発

金属鉄の大きな飽和磁化を活かした新しい陰性造影剤の開発を目的として研究を行い以下の成果を得た:(a)金属水素化物還元法を基に、世界最高のMs(170 emu/g以上)と優れた耐酸化性(大気曝露1000時間でのMs低下が10%未満)を併せ持つ酸化鉄被覆金属鉄ナノ粒子を合成する事に成功した。(b)表面開始原子移動ラジカル重合法により、ポリエチレングリコール誘導体をナノ粒子表面にグラフト重合し、貪食細胞のレーダーをすり抜けるステルス性と分散安定性をナノ粒子に付与する事に成功した。本研究は、核磁気共鳴画像(MRI)法によるがん診断のキーマテリアルとなる造影剤の開発を行う事を目的とする。本研究では、1Feナノ粒子の磁気特性向上によるナノ粒子レベルの造影能改善技術、2がん部位へFeナノ粒子を効率よく到達させる体内動態制御技術、および3Feナノ粒子をがん細胞内に効率よく蓄積させる細胞内動態制御技術の開発を行う。H24年度は主に1Feナノ粒子の磁気特性向上によるナノ粒子レベルの造影能改善技術に関する研究を行った。具体的には、金属水素化物還元法を基に、世界最高の飽和磁化(Ms、170 emu/g以上)と優れた耐酸化性(大気曝露1000時間でのMs低下が10%未満)を併せ持つFe@Fe3O4ナノ粒子を合成する技術(高Ms化技術)を開発することである。まず始めに、15nm程度のFeナノ粒子をモデル系として実験を行い、目的とする耐酸化性の確保に必要とされるFe3O4シェル厚を評価した。具体的には、シリカで被覆された状態のFeナノ粒子に対して酸化反応を行い、Feナノ粒子の表面にFe3O4シェルを形成させた。続いて、シリカ被覆を溶解・除去して得られるFe@Fe3O4ナノ粒子試料のMsの大気暴露時間依存性を測定することにより、その耐酸化性を評価した。様々な酸化反応条件を検討した結果、シリカで被覆された状態のFeナノ粒子を大気中に短時間暴露した後に、不活性ガス雰囲気下で500°C12時間熱処理したサンプルが所定の耐酸化性(大気曝露1000時間でのMs低下が10%未満)を示すことを見いだした。酸化鉄シェル層の膜厚は約2 nm程度であった。シェルがFe3O4で構成されている場合、170 emu/g以上のMsを得るのに必要なFeコアサイズは17 nm (Fe@Fe3O4ナノ粒子として21 nm)程度であることが分かった。また実際に試料作製を行い、Fe@Fe3O4ナノ粒子分散液を得ることに成功した。H25年度は主に2がん部位へFeナノ粒子を効率よく到達させる体内動態制御技術に関する研究を行った。まずはじめに、表面開始原子移動ラジカル重合(ATRP)を行うために必要となるATRP開始部位でナノ粒子を修飾することを試みた。アミノプロピルトリメトキシシランと2-ブロモ-2-メチルプロピオン酸クロライドの反応により得られる化合物にてナノ粒子表面は修飾可能であったものの、修飾後のナノ粒子の各種溶媒への分散性は大きく低下した。本化合物の鎖長が短いため、充分な分散性を得ることが難しかったためと考えられる。種々の構造を有する化合物を検討した結果、細胞膜透過性に優れる化合物であるポリエチレンイミンをナノ粒子表面に固定化、その後2-ブロモ-2-メチルプロピオン酸クロライドあるは2-ブロモ-2-メチルプロピオン酸を反応・ATRP開始部を導入することにより、優れた分散安定性とATRP開始能を併せ持つナノ粒子を得ることに成功した。続いて、ステルス性に優れるポリエチレングリコール誘導体(PEGMA)の表面開始ATRPを行い、種々の分子量のp(PEGMA)鎖で修飾されたナノ粒子を合成する事に成功した。H26年度に作製された、細胞膜透過性に優れるポリエチレンイミンとステルス性に優れるポリエチレングリコール誘導体ポリマー(p(PEGMA))にて修飾されたナノ粒子の特性評価を行った。p(PEGMA)グラフト重合の開始点部位濃度の増加に伴い、得られる試料の有機物含量も大幅に増加しており、ナノ粒子表面がp(PEGMA)鎖で密に被覆された試料が得られたことが分かった。またいずれの試料のゼータ電位値は、重合前の状態(約40mV)と比較して小さくなって(10-20 mV程度)おり、ナノ粒子がp(PEGMA)鎖によって均一に被覆されていることが分かる。

また、いずれの試料も生理食塩水に対して優れた分散安定性を示した。つづいて、がん細胞への取り込み効率を上昇させる細胞内動態制御技術の開発を試みた。具体的には、通常組織部では膨潤したp(PEGMA)ブラシがPEIを遮蔽している(ステルス状態)が、エンドソーム内の低pH条件(4.5-6.5)でヒドラゾン結合が開裂し、p(PEGMA)鎖を脱離させる表面の構築を目指した。P(PEGMA)鎖が脱離して細胞膜透過性に優れるPEI部位が露出すれば、がん細胞内への侵入・蓄積の促進が期待できるためである。PEI上に導入されたATRP開始部位をpH = 5で開裂するヒドラゾン結合部位(-C=N-NH-)をもつATRP開始部位に置き換えることを試みたが、その合成は極めて困難であり、目的とする化合物を得る事ができなかった。ヒドラゾン結合部位をもつその他のATRP開始化合物についても合成を試みたが、残念ながら目的とする化合物を得る事はできなかった。26年度が最終年度であるため、記入しない。H24年度に予定していた研究計画がほぼ完全に遂行できたため当初想定していた固定化開始剤修飾ナノ粒子の溶媒への分散性が思わしくなく、その他の表面修飾分子を検討していたため26年度が最終年度であるため、記入しない。170emu/g以上Msを有するFe@Fe3O4ナノ粒子を合成する条件は確立されており、p(PEGMA)修飾を行う。更に、p(PEGMA)修飾された試料の特性を評価する。p(PEGMA)にて修飾されたナノ粒子を合成する技術は既に確立しており、今後は基礎特性の評価を行うとともに、pH = 5で開裂するヒドラゾン結合部位をATRP開始部位に導入させることを行う。エンドソーム内の低pH条件(4.5-6.5)でヒドラゾン結合を開裂・p(PEGMA)鎖を脱離させ、細胞膜透過性に優れるポリエチレンイミン部位が露出することにより、がん細胞内への侵入・蓄積が促進されるナノ粒子の実現をめざす。実験補助者を雇用し、研究を推進する予定であったが、適当な人材が確保できず、当初の研究計画通りに研究を遂行することができなくなったため。来年度の研究費と併せて実験補助者を雇用し、研究の遂行を促進させる。試料の作製が遅れ、予定していた実験をH25年度内に行うことができなかったため表面開始ATRP法により、ブラシ特性が明確なp(PEGMA)ブラシで4ナノ粒子を修飾する技術はすでに確立されている。細胞毒性を含む各種基礎特性評価、ステルス性評価により、ナノ粒子を安定分散させるのみならず、EPR効果による標的化に適したサイズ(100 nm以下)と最適なステルス性を実現するp(PEGMA)ブラシ修飾条件を見いだす。さらに引き続きpH = 5で開裂するヒドラゾン結合部位をATRP開始部位に導入させることを行う。