hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
カンピロバクター腸炎の実態解明（臨床情報・菌株情報の連結による調査研究）

カンピロバクター腸炎の実態解明のため,福岡地域の分離菌株とそれに附帯する臨床情報を収集し,鞭毛遺伝子(fla A)によるPCR-RFLP解析,Multi Locus Sequence Typing(MLST)などを実施して,臨床情報と分離菌株情報とを連結した解析を行った.市内の飲食店で発生した事例では,分離されたC. jejuni10菌株はfla A PCR-RFLP,RAPD法および細胞致死性伸張化毒素の遺伝子解析において2群に分かれ,MLST解析で異なる2種類のSTタイプが検出された.互いに類縁関係がないことから,原因食材が由来の異なる2種類以上の菌株に汚染されていたことが明らかとなった.近年増加して問題になっているカンピロバクター腸炎の日本での実態解明を目的に,臨床情報と分離菌株情報とを連結した解析を進めている.本感染症の大部分を占める散発性腸炎について,福岡地域の183検体の検体情報を解析した.鞭毛遺伝子(fla A)によるPCR-RFLP法では,多くの菌株ではパターンが異なっていたが,同一パターンを示す菌株グループも見られた.散発性腸炎患者からの分離株のMulti Locus Sequence Typing (MLST)解析では,これまでの諸外国での報告と同様の傾向が見られたが,世界的に流行しているSTタイプ群に混じってデーターベースに未登録のSTタイプが見られ,わが国独自のものである可能性が示唆された.本菌による集団食中毒事例(集団発生例)について,福岡市内の飲食店で発生した事例(11名グループ中8名が症状を訴え,便培養で8名全員からカンピロバクターが検出)について,臨床情報および分離菌株の分子生物学的解析を行った.症状では,下痢が有症者全員にみられ,期間は310日間であった.発熱は一部に見られた.分離された10菌株は,生化学的性状検査および分子生物学的検査で全てC. jejuniと同定された.これらの菌株は鞭毛遺伝子の解析(fla A PCR-RFLP)で2群に分けられ,RAPD法および細胞致死性伸張化毒素cytolethal distending toxinの遺伝子解析においても異なる2菌株であることがわかり,原因食品が複数の菌により汚染されていたと推察された.これらの菌種のMLST解析では,異なる2種類のSTタイプが検出され,互いに類縁関係がないことから,原因食材が由来の異なる2種類以上のC. jejuniに汚染されていたことが明らかとなった.本感染症の大部分を占める散発性腸炎では,患者年齢分布は30歳未満の割合が全体の約9割を占め,特に59歳での発生数が最も多く,次いで1019歳であった.1歳未満の発生率が非常に少なく,欧米と大きく異なっていた.男女比は欧米の報告とほぼ同様であった.分離菌株の分子生物学的菌種同定では,C. jejuniが最も多く,次いでC. coliだった.fla A PCR-RFLP法では,多くの菌株ではパターンが異なっていたが,同一パターンを示す菌株グループも見られた.MLST解析では,世界的流行のSTタイプ群に混じって,日本独自のものと考えられるSTタイプが見られた.福岡市内の飲食店で発生した集団食中毒事例(11名グループ中8名が症状を訴え,便培養で8名全員からカンピロバクターが検出)では,症状で下痢が有症者全員にみられ,期間は310日間であった.発熱は一部に見られた.分離された10菌株は,生化学的性状検査および分子生物学的検査で全てC. jejuniと同定された.これらの菌株は鞭毛遺伝子の解析(fla A PCR-RFLP),,RAPD法および細胞致死性伸張化毒素cytolethal distending toxinの遺伝子解析においても2群に分けられた.MLST解析で異なる2種類のSTタイプが検出され,互いに類縁関係がないことから,原因食材が由来の異なる2種類以上のC. jejuniに汚染されていたことが明らかになった.カンピロバクター腸炎の実態解明のため,福岡地域の分離菌株とそれに附帯する臨床情報を収集し,鞭毛遺伝子(fla A)によるPCR-RFLP解析,Multi Locus Sequence Typing(MLST)などを実施して,臨床情報と分離菌株情報とを連結した解析を行った.市内の飲食店で発生した事例では,分離されたC. jejuni10菌株はfla A PCR-RFLP,RAPD法および細胞致死性伸張化毒素の遺伝子解析において2群に分かれ,MLST解析で異なる2種類のSTタイプが検出された.互いに類縁関係がないことから,原因食材が由来の異なる2種類以上の菌株に汚染されていたことが明らかとなった.近年増加して問題になっているカンピロバクター腸炎の日本での実態解明を目的に,臨床情報と分離菌株情報とを連結した解析を進めている.本感染症の大部分を占める散発性腸炎について,福岡地域の183検体の臨床情報を解析した.患者年齢分布は,30歳未満の割合が全体の約9割を占め,特に59歳での発生数が最も多く,次いで1019歳であった.1歳未満の発生率が非常に少なく,欧米と大きく異なっていた.一方,男女比は欧米の報告とほぼ同様であった.

分離菌株の分子生物学的菌種同定では,C. jejuniが最も多く,次いでC. coliであった.鞭毛遺伝子(fla A)によるPCR-RFLP法では,多くの菌株ではパターンが異なっていたが,同一パターンを示す菌株グループも見られた.本菌による集団食中毒事例(集団発生例)について,福岡市内の飲食店で発生した事例(11名グループ中8名が症状を訴え,便培養で8名全員からカンピロバクターが検出)について,臨床情報および分離菌株の分子生物学的解析を行った.症状では,下痢が有症者全員にみられ,期間は310日間であった.発熱は一部に見られた.分離された10菌株は,生化学的性状検査および分子生物学的検査で全てC. jejuniと同定された.これらの菌株は鞭毛遺伝子の解析(fla A PCR-RFLP)で2群に分けられ,RAPD法および細胞致死性伸張化毒素cytolethal distending toxinの遺伝子解析においても異なる2菌株であることがわかり,原因食品が複数の菌により汚染されていたと推察された.本研究計画は,1医療機関からのカンピロバクター腸炎検体より臨床情報およびカンピロバクター分離株を収集し保存,2菌株情報の解析:菌種同定(生化学的・分子生物学的方法),血清型別,分子生物学的型別(flaA PCR-RFLP,MLST),薬剤耐性(特にキノロン系薬剤),3臨床情報および菌株情報をデータベース化,4上記データの分析およびデータ間比較解析によるカンピロバクター腸炎の実態解明である.現在までに,1福岡地区のカンピロバクター腸炎検体より菌株とそれに附帯する臨床情報を収集した.そして2収集菌株の菌種同定とflaA PCR-RFLPを実施し,3臨床情報の全てと菌種・flaA PCR-RFLPの一部をデータベース化した.菌株からのゲノム抽出を完了してMLST解析を進めており,4データの揃った菌株について,これまでに得られた各データを解析し,その分析結果を国内学会および国際学会において発表した(研究業績参照).本研究計画は,(1)医療機関からのカンピロバクター腸炎検体より臨床情報およびカンピロバクター分離株を収集し保存,(2)菌株情報の解析:菌種同定(生化学的・分子生物学的方法),血清型別,分子生物学的型別(flaA PCR-RFLP,MLST),薬剤耐性(特にキノロン系薬剤),(3)臨床情報および菌株情報をデータベース化,(4)上記データの分析およびデータ間比較解析によるカンピロバクター腸炎の実態解明である.現在までに,(1)福岡地区のカンピロバクター腸炎検体より菌株とそれに附帯する臨床情報を収集した.そして(2)収集菌株の菌種同定とflaA PCR-RFLPを実施し,(3)臨床情報の全てと菌種・flaA PCR-RFLPの一部をデータベース化した.さらに(4)これまでに得られた各データを解析し,その分析結果を国内学会および国際学会において発表した(研究業績参照).得られた情報(臨床・菌株)のデータベース化をさらに進めて完成させる.さらにMLST解析結果を総合解析ソフトBioNumericsによって菌株毎にデータベース化する.BioNumericsは電気泳動画像や塩基配列など多様な生物学実験データをデータベース化して系統分類・解析・同定を行う実験データ統合環境ツールであり,これまでに得られた研究データおよびMLSTデータとの相互解析を進めて,カンピロバクター腸炎菌株の系統分析と分子疫学および母集団構造の調査によって本菌感染症の実態解明を目指する.
豆乳クリームの生成とその安定性

健康に必須である油をより美味に安定に食品へ導入するかを研究するために、大豆中の油が如何にして水中で安定な乳濁質を作り、豆腐ゲル中で強固に固定されているかをタンパク質と脂質の関係から研究した。1.大豆より未加熱の豆乳とそれを加熱した豆乳を調製し、超遠心分離によりクリーム,可溶性,粒子の3画分を得、タンパク質・脂質含量を測定した。未加熱では中性脂質の70%が粒子中に存在し、加熱によりそのほとんどがクリーム画分に移行することが判った。リン脂質は未加熱・加熱に関わらずその半量はタンパク質に結合していた。2.未加熱豆乳を室温から100°C近くまで5°Cづつ順次温度を上昇させたものについて、1.同様に分画後、分析を行った。粒子中に含まれるタンパク質,脂質は65-70°Cで粒子より遊離し、80-90°Cで脂質はクリーム画分に、タンパク質は新たに11SのBと7Sのβサブユニットで粒子を形成することが判った。クリーム画分中タンパク質は中性域に等電点を持つオレオシン様タンパク質であることが分かった。3.豆乳に塩化カルシウムを順次加えると、先ずクリーム画分と粒子が結合し、その後に可溶性タンパク質がさらに結合して行くことが分かった。そのため、脂質はタンパク質に取り囲まれて豆腐カードを作ると推定された。以上のことから、豆乳脂質の安定化はオイルボディ類似のクリーム生成とそれが豆腐カード形成における核として機能することによると考えられる。2.各画分のタンパク質組成をSDS電気泳動により検討したところ、未加熱の粒子画分には11Sグロブリンが多く、加熱によりその粒子は崩壊し新たに7Sのβと11SのAサブユニットを主体にした粒子を生成することが判った。一方、クリーム画分には大量に2種のタンパク質が含まれ、それは大豆中ではマイナ-なタンパク質であり、リピッドボディタンパク質ではないかと考えられた。3.未加熱豆乳を室温から100°C近くまで5°Cづつ順次温度を上昇させたものについて、1.同様に分画後、分析を行った。以上のことから、豆乳の調製におけるクリーム画分とタンパク質粒子画分の生成についての基本的なデータが得られた。今後さらに、豆腐ゲル生成におけるクリームおよびタンパク質粒子の挙動を追跡し、脂質の安定化機構を解明する予定である。健康に必須である油をより美味に安定に食品へ導入するかを研究するために、大豆中の油が如何にして水中で安定な乳濁質を作り、豆腐中で強固に固定されているかをタンパク質と脂質の関係から研究した。昨年度までに、豆乳調製時の加熱でクリーム画分が7Sと11Sグロブリンの変性温度と関係し出来て行くことが明らかになった。また、クリーム画分中タンパク質が中性域に等電点を持つオレオシン様タンパク質であることを明らかにした。そこで本年度は、脂質の安定化機構を解明のため豆腐カード形成におけるクリームとタンパク質の結合について研究し次の結果を得た。1.豆乳に塩化カルシウムを順次加えると、先ずクリーム画分と粒子が結合し、その後に可溶性タンパク質がさらに結合して行くことが分かった。

2.上記の現象はpH低下による凝集でも同様の結果が得られた。3.クリーム画分は上記1,2のカルシウム濃度およびpHで自己会合し浮上する。以上のことから、脂質顆粒(クリーム)ともっとも結合しやすいのはタンパク質粒子であり、その後に自己会合することによりカードネットワークが形成され、さらに可溶性タンパク質が結合し豆腐カードが形成される。そのため、脂質はネットワークの核となり、極めて厚いタンパク質に覆われることになる。この機構が、脂質を安定化しているものと考えられる。
CTL誘導抑制による長期発現持続型アデノウイルスベクターの開発

非増殖アデノウイルスベクターは米国において遺伝子治療に用いられているが、CTL誘導による炎症等の副作用や発現細胞が免疫的に除去されるため発現持続が短縮するなどの問題が指摘されている。この原因としてアデノウイルスベクターのもつE2A遺伝子の微量発現が考えられているが、この遺伝子はベクターを293細胞で増殖させる場合に必須の遺伝子である。もしウイルスの増殖に必須の遺伝子を除去したウイルスを調製できれば問題の解決となり得る。この観点から、ウイルスゲノム上のE2A/L3領域を特異的に欠失した組換えウイルスを調製する方法の開発を試みた。本法には部位特異的組換え酵素Creを利用した。この酵素は34塩基の特異的標的配列loxPを認識し、2つのloxP配列間のDNAを環状に切り出して除去する作用を持つ。まずE2A/L3領域の両側にそれぞれloxP配列を組み込んだ標的ウイルスを作製した。この挿入部位のうちE2A遺伝子側はこれまで記載のない新しい挿入部位である。この標的ウイルスをCre発現ウイルスとともに293細胞に同時感染させることにより、発現したCre酵素が標的ウイルスのE2A/L3領域を特異的に切り出し、E2A/L3領域欠失ウイルスを生成させることに成功した。この欠失ウイルスはサイズが小さくなるため、Cre発現ウイルスや除去前の標的ウイルスとは塩化セシウムの密度勾配遠心により分離することが可能である。本法の開発により、CTLの原因となり得るE2A遺伝子を欠失したアデノウイルスベクターを開発する新たな方法が確立された。またこの方法は、あらゆるDNAウイルスの任意の必須遺伝子を除去したウイルスを作製できる一般的方法としても有用であると考えられる。この酵素は34塩基の特異的標的配列1oxPを認識し、2つの1oxP配列間のDNAを環状に切り出して除去する作用を持つ。まずE2A/L3領域の両側にそれぞれ1oxP配列を組み込んだ標的ウイルスを作製した。
脳内温度と神経活動の機能相関

これまで報告されてきたTRPV4の機能(皮膚における外界の温度受容体としての機能)とは全く異なり、海馬TRPV4は脳内温度エネルギーを電気信号に変換することで神経活動調節因子として機能している可能性が高いと考えられた。この可能性を検証するために、野生型(WT)とTRPV4欠損マウス(TRPV4KO)の海馬よりスライス標本を調整し、静止膜電位および興奮性を調べた。その結果、TRPV4KOは脳内温度エネルギーを電気信号に変換する分子機構の欠如により、WTと比較し、神経興奮性が低下していることが示された。WTとTRPV4KOの海馬に脳波電極を挿入し、個体での異常を調べたところ、スライスパッチクランプのデータと一致して、TRPV4KOは神経興奮性が低下していることが示された。さらに行動テストを行ったところ、TRPV4が行動異常を示すことも明らかとなった。これらの結果より、脳内温度によりTRPV4は恒常的に活性化されており、神経細胞が興奮しやすい土台環境を産み出していることが示唆された。本申請では、局所の脳内温度が神経活動に依存しダイナミックに変動することを解き明かし、脳内温度が神経興奮を制御する主要因子であることを明らかとすることを目的としている。この目的を達成するために民間企業と共同で世界初の局所脳内温度測定装置を開発することを目指している。さらには、脳内温度変動がもたらす生理学的意義と温度センサー・TRPV4の関わりを明らかとし、TRPV4やこの分子の下流シグナルの遮断により、神経興奮が抑制できることを見いだし、てんかん発作に代表される疾患の新規治療器具、あるいは治療薬の開発を行うことを目標としている。本年度は、この目標を達成するために自由行動下マウスの脳内温度をリアルタイムに測定することを可能とする局所脳内温度測定装置の開発に成功した(特許出願中)。この開発した装置を用いた測定により、睡眠-覚醒期の移行に伴い脳内温度は約1.5°Cの変動をすることを突き止めた。現在、この脳内変化に伴い、神経活動がどのように変化するのかを脳波測定を併用することで調べている。さらには、任意に脳内の温度を変化させることが出来る脳内温度可変装置の開発中であり、本年度はその試作機の作製に成功している。次年度にこの装置を開発させ、脳内温度と神経活動の機能連関を生体実験で明らかにしていく予定である。本年度は脳内温度センサー・TRPV4の類縁ファミリー分子であるTRPV2(52°C以上で活性化)が胎児の神経において膜伸展刺激センサーとして使われ、神経回路形成を促していることも明らかとした。本申請では、局所の脳内温度が神経活動に依存しダイナミックに変動することを解き明かし、脳内温度が神経興奮を制御する主要因子であることを明らかにすることを目的としている。昨年度は、任意に局所脳内の温度を変化させることが出来る脳内温度可変装置の開発に成功した(特許出願中)。現在、脳内温度の加温あるいは冷却に伴い、神経活動がどのように変化するのかを脳波測定を併用することで調べている。本年度は脳内温度と神経活動の機能連関を分子レベルで明らかにしていく予定である。また、生体では侵害熱センサーとして機能しているTRPV2(52°C以上で活性化)が胎児の神経においてメカノセンサーとして使われ、神経回路形成を促していることも明らかとした(毎日、読売、日経新聞などやYahooトップニュース、NHKニュースなどで報道された)。この研究を発展させ、消化管の神経に発現するTRPV2もメカノセンサーとして機能しており、消化管の蠕動運動を調節していることを見いだした(毎日、日経新聞などで報道された)。さらに、TRPV1が糖尿病初期の糖尿病性神経変性症に伴う痛み感覚の増大に関与していることを見いだし(PAIN誌の表紙として紹介された研究成果)、糖尿病性神経変性症の治療法開発に道を開いた。実際に、TRPV4KOマウスの行動実験をした場合に、解剖形態学的な脳の異常は全く認められないものの、神経活動に異常をきたし、行動異常が観察された。TRPV4KOマウスの行動異常に関わる脳内領域として海馬歯状回を同定した。また、その海馬歯状回において、25°C、30°C、35°Cと3段階に厳密に温度制御した条件におけるスライスパッチクランプ実験を行い、野生型と異なりTRPV4KOでは35°C温度条件で神経興奮性が異常を示すことを見いだした。

しかしながら、上記の実験だけでは、脳内においてTRPV4が脳内温度エネルギーにより活性化しているのか、あるいはその他の内在性リガンドにより活性化しているのかが不明である。TRPV4が脳内温度エネルギーにより活性化していることを示すには、in vivoで脳を冷却し、TRPV4の活性化温度閾値(34°C)以下の環境を作り出した場合に神経興奮性がどのように変化するのかを調べる他はない。そこで、野生型とTRPV4KOマウスの脳内にカニューレを埋め込み、脳内温度を37°Cから30°C程度へと冷却したところ、野生型マウスの神経活動は著しい低下を示した。一方、TRPV4KOではそのような著しい低下を示さないことが分かった。つまり、正常時にはTRPV4が脳内温度エネルギーを電気信号に変換し、これにより神経活動がポジティブな制御を受けていることがクリアーに証明された。これらの結果は、我々の脳内温度工ネルギーをTRPV4が恒常的に電気信号に変換することで神経興奮性を正常に保っていることを意味している。
オキシ酸による遷移金属(IV〜VI族)イオンの高感度イオンクロマトグラフィ-

従来の研究成果(オキシ酸を用いた抽出比色定量法)をイオンクロマトグラフィ-に応用するため、今年度はその基礎的デ-タの収集に努め、数種金属元素の同時定量の可能性について検討を行った。今回検討した3種類のα-オキシ酸(錯化剤)及び7種類の分析元素を下記に示す。その結果、V(50ppm)とGe(100ppm)に関しては、どの錯化剤を用いても新たな錯陰イオンのピ-クは得られなかった。新しく観測されたピ-クの出現時間と波形について下記に示す。このように、用いる金属イオン及び錯化剤の種類によって、生じる錯陰イオンのイオンクロマトの出現ピ-クが異なってくることより、本研究を遂行することにより数種金属イオンの同時定量が可能であると思われる。現在、より詳細な実験条件の検討(流速、反応pH域、波形、定量範囲等)を行い、高感度な同時定量法の確立をめざしている。
画像理解の手法による3次元動的心臓モデルの構築に関する研究

心臓のような3次元空間において、剛粘性を持つ物体の表面の動きを分類する手法を画像理解の手法、非線形偏微分方程式理論、最適化問題による手法を融合して開発した。すなわち、N次元ユークリッド空間で定義された濃度分布の微小運動としてのオプティカルフローを定義した。さらに、ナーゲル=エンケルマンの拘束式の一般の次元への拡張を導くと共に、この制約式と対をなす新たな拘束を定義した。また、ホーン=シャンクの拘束式、ナーゲル=エンケルマンの拘束式、新しい拘束式、すべての場合に収束する差分スキームを導出した。そして、3つの手法による解を比較し、新しい制約条件に基づく手法は3次元物体の運動境界での接平面にそった運動を抽出できることを示した。球面画像処理は,脳画像,顔画像の認識など,静止形状の3次元認識には利用されている。しかし,本研究で取り扱う,変動する球面分布の認識分類はまったく例をみないものである。そこで,球面上において定義された関数のハターン認識理論を構築するために,球面上の関数の境界,骨格などの不変特徴量の抽出,球面上に描かれた形状パターンの整合など,通常の画像や平面状の形状処理に対して開発された特徴量抽出理論を球面画像に適用するために,形状のトポロジーを保存する情報圧縮表現として骨格化を検討した。平面上の骨格抽出方として,(1)非線形拡散方程式に基づくもの,(2)計算幾何学に基づくものの2種類がある。これらの手法を球面上の形状に対して適用する場合,それぞれ,(1)曲がった空間における波面伝播,(2)曲がった空間における組合せ幾何学が必要となる。(1)波伝播,(2)計算幾何学の分野においてその一般論が研究されている。これらの手法を,曲率が正の一定値である曲面,すなわち球面に制限することで,高速高精度な,特徴量抽出手法を開発した。臓器のような非剛体3次元形状は、個人により異なっている。また、個人においても経年変化がある。そこで、標準的な形状に変換して、個人差や経年変化を記録する必要がある。さらに、断層像再構成などの手法を利用して映像化され臓器映像の解像度は、現状でも0.5mm立方程度であり、細胞レベルでの臓器の動きを記述するには不十分である。そこで、すでに利用されている物体運動追跡算法の理論を再構築すると共に、計測限界を以下の解像によって臓器の動きを追跡する動画超解像技術を開発した。現状の物体運動追跡理論は、2次元画像の運動追跡理論と独立に提案された手法と、2次元の手法を形式的に3次元に拡張したものがある。本研究では、3次元弾性体変形理論の基づく数理解析を活用して、二つの理論をヘルムホルツによる運動分解理論を利用した統合した。そして、古くから知られているホーンシャンクの運動追跡理論において解かれる反復方程式が必ず正しい解に収束する条件を導くとともに、離散幾何学を利用して、離散化反復方程式の幾何学的性質を解明した。
PET画像再構成アルゴリズムがフラクタル次元へ与える影響についての研究

本研究では脳PET検査において、画像再構成アルゴリズムがフラクタル次元に与える影響を明らかにすることである。平成30年度は腫瘍を模擬したファントムを使用した結果を報告した。また、脳メチオニンPET検査における悪性度分類がフラクタル解析により可能かどうか、臨床データを用いて評価を行い、評価の一部を学会等で報告した。腫瘍を模擬したファントムを用いて、4つの画像再構成アルゴリズムordered subsets expectation maximization (OSEM)法、OSEM法にpoint spread function (PSF)分解能補正のみを組み込んだ方法(OSEM+PSF法)、OSEM法にtime of flight (TOF)のみを組み込んだ方法(OSEM+TOF法)、OSEM法にPSF分解能補正とTOFを組み込んだ方法(OSEM+PSF+TOF法)について、繰り返し数とサブセットの関係、平滑化処理フィルターの強度がフラクタル次元に与える影響を調査し、臨床データにおける各再構成アルゴリズムにおける再構成条件の適正化を行った。本データより得た再構成条件を用いて、臨床データを解析した。臨床データにおいては、どの再構成アルゴリズムにおいても脳腫瘍の悪性度が高くなるほどフラクタル次元は小さくなり、脳メチオニンPET検査において腫瘍の悪性度分類にフラクタル次元が使用できる可能性が示唆された。次年度は、再構成アルゴリズムにより、悪性度分類に差が生じるかどうか検証し報告する予定である。脳腫瘍の悪性度がグレード2の症例が予定よりも少なく、解析が進まなかったことが理由の一つとして挙げられる。また、データの集計、解析にも予定より時間がかかってしまったことも理由の一つであると考えている。臨床データの集計はできているので、統計解析等を進める予定である。平成29年度は腫瘍を模擬したファントムを使用し、基礎的な検討を行った。C-11メチオニンPETを想定し、腫瘍を模擬したファントム(腫瘍ファントム)を用いて、4つの画像再構成アルゴリズムordered subsets expectation maximization (OSEM)法、OSEM法にpoint spread function (PSF)分解能補正のみを組み込んだ方法(OSEM+PSF法)、OSEM法にtime of flight (TOF)のみを組み込んだ方法(OSEM+TOF法)、OSEM法にPSF分解能補正とTOFを組み込んだ方法(OSEM+PSF+TOF法)について、繰り返し数とサブセットの関係、平滑化処理フィルターの強度がフラクタル次元に与える影響を調査した。実験は、1腫瘍ファントムの腫瘍模擬インサートにF-18 FDG溶液を満たしバックグラウンド部には水を満たした場合と2腫瘍模擬インサート部とバックグラウンド部の放射能濃度比が3:1となるように腫瘍ファントムを調整した場合の2種類について行った。再構成アルゴリズム、繰り返し数とサブセットの積、平滑化フィルターの強度によりフラクタル次元の値は変化した。また腫瘍模擬インサート周辺のバックグラウンドの放射能の有無によって、フラクタル次元の変化の傾向は異なった。本ファントム実験の結果から、再構成アルゴリズムおよび再構成条件によって、フラクタル次元は変化することが予想された。本結果は臨床データを解析するにあたって、重要な知見となると考えられた。平成29年度は人体模擬ファントムを用いて,再構成アルゴリズムおよび画像再構成条件がフラクタル次元に与える影響を調査することを目的とした.具体的には,6つの再構成アルゴリズムと再構成条件,関心領域の設定について調査する予定であったが,4つの再構成アルゴリズム(OSEM法,OSEM+PSF法,OSEM+TOF法,OSEM+PSF+TOF法)および再構成条件(画像の更新回数,ガウシャンフィルターの強度)の変化がフラクタル次元に与える影響を調査するにとどまった.フラクタル解析においては関心領域の設定がフラクタル次元に大きく影響することが考えられるため,関心領域の設定がフラクタル次元に与える影響を調査する必要があったが解析を行うことができなかった.解析ができなかった理由は,本解析において使用したソフトウエアの取り扱いに苦慮したため,解析に使用する時間が足りなかったことが大きな要因であると考えている.しかしながら,関心領域設定についてのデータはすでに取得しており,データ解析を行い結果を整理することができれば報告可能であると考えている.本研究では脳PET検査において、画像再構成アルゴリズムがフラクタル次元に与える影響を明らかにすることである。

脳腫瘍の悪性度がグレード2の症例が予定よりも少なく、解析が進まなかったことが理由の一つとして挙げられる。また、データの集計、解析にも予定より時間がかかってしまったことも理由の一つであると考えている。平成29年度のデータ解析結果は,Society of Nuclear Medicine and Molecular Imaging(SNMMI)2018(米国)で報告予定となっている.平成30年度の予定はファントム解析とともに臨床データの解析を行う.すでに臨床データを解析可能な状態に整理することをはじめており,研究計画どおりに進めることが可能と考えている.臨床データの集計はできているので、統計解析等を進める予定である。旅費及び物品費が予定よりも低価格であったため,次年度使用額としました.使用計画としては,物品費やその他の経費として使用する予定です.結果の報告に関する費用、旅費及び物品費が予定よりも低価格であったため,次年度使用額としました。使用計画としては,研究発表の報告の旅費、結果報告に対する英文校正費、その他統計解析ソフトウエアの購入およびその他の経費として使用する予定です.
広食性昆虫（ハスモンヨトウ）の味覚受容システムの解明

広食性農業害虫ハスモンヨトウの味覚受容解析のため、摂食行動実験により昆虫の基本味とされる糖、塩、苦味物質への応答を調べた。その結果、動物(昆虫)が嗜好する5から100 mMの低濃度塩(NaCl)に対してハスモンヨトウ幼虫が忌避行動を示し、その摂食行動は強く抑制された。Na+イオンによる摂食阻害効果を確認するため、KCl, CaCl2, CaCO3,グルコン酸ナトリウム(GluNa)を用いて摂食実験を行った結果、KClは高濃度でも阻害効果を示さず、CaCl2, CaCO3, GluNaでは低濃度でも阻害効果を示した。よって、摂食阻害効果はNa+イオンやCa2+といった陽イオンに起因すると予想された。さらに、本種幼虫の塩忌避における高感受性が本種の普遍的な表現型であるかを検証するため、佐賀県、沖縄県、鹿児島県で採集した個体における摂食行動実験を実施し、これまで使用してきた累代飼育系統と比較した。その結果、採集地域により塩忌避性は異なり、一部の個体群は低濃度塩に対する忌避行動を示さなかった。よって、本種幼虫は地理的変異による味覚受容の差異が存在する可能性がある。さらに、電気生理学的解析により、本種幼虫の塩受容は、他種昆虫と同様に2種類の味受容細胞によって制御されていることが予想された。塩の摂食は動物にとって必須であり、低濃度塩は美味しく感じるが、高濃度塩に対しては忌避行動を示す。塩濃度による嗜好性の変化はマウスでは約250 mM、キイロショウジョウバエでは約100 mMを境界とし、低濃度塩受容細胞と高濃度塩受容細胞によって制御されるが、電気生理実験の結果より、本種幼虫は塩濃度による嗜好性変化の境界濃度が極めて低いことが示唆された。A電気生理実験本研究課題である塩受容細胞数の特定に注力して実験を行ったため、糖・苦味物質・水に対する電気生理学的応答についてデータ量が不十分である。B塩を添加した人工飼料・植物は粉末を用いた摂食実験これまでの研究成果により、苦味物質と塩が本種幼虫の摂食行動を抑制することが明らかとなった。しかし、塩および苦味物質ともに過剰摂取は人体にも悪影響を及ぼすため、本種の味覚受容システムをターゲットとした防除系確立にはより低濃度でも十分な抑制効果を示す至適濃度を検証する必要がある。そこで、苦味物質(カフェイン・キニーネ・ベルベリン・ストリキニーネ)および塩(NaCl)を用いて摂食実験を行った結果、その抑制効果の下限濃度はそれぞれ0.1 mMおよび5 mM程度であった。さらに、苦味物質と塩を混合させた場合、摂食抑制に対して相乗効果を示し、各化合物とも単体での抑制効果の下限濃度以下の濃度で有意に摂食量が減少した。C本種の遺伝的多様性と味覚多様性の相関の検証九州・沖縄で本種の採集を行い、塩受容に注力して行った。概要に記載した通り、野外個体群では塩受容の嗜好性変化の境界濃度が他種昆虫と同様である可能性が示されたため、味覚受容システムにおける地理的変異が存在すると予想された。RAD-Seq解析については未実施であるが、採集地ごとにDNAサンプルを虫体から抽出・調整済みである。1電気生理実験の進捗がやや遅れているため、注力する。本種幼虫の味細胞レパートリーの特定を急ぐ。2塩と苦味物質の相乗効果の検討において3種類以上の混合餌における摂食抑制効果を検証する。新規苦味物質の探索およびアミノ酸の摂食への影響を摂食行動実験および電気生理実験にて検証することを計画している。3本年度も引き続き九州地方を中心に本種のサンプリングを行い、摂食行動実験を行う。同一採集地域での塩嗜好性の境界濃度における年次変動を確認する。さらに、各地域で採集した個体群のDNAの抽出・精製を行い、2年分のサンプルをRAD-Seq解析を実施することにより遺伝的多様性と味覚(塩受容)多様性の相関を検証する。また、海外サンプルの入手を実施し、国内および海外系統間の差異を確認する。4これまでの本種幼虫の摂食実験は3齢幼虫を中心に実施してきた。本種幼虫の最終齢は6齢であり、齢期による味覚応用の差異は検証していない。よって、本年度は終齢幼虫を中心に摂食行動実験を実施するである。また、すでに成虫期の摂食行動実験を実施しており、幼虫ー成虫間の塩応答の差異を検証済みであるため、発育ステージ間の味覚応答差の有無について本年度も検証予定である。

その結果、採集地域により塩忌避性は異なり、一部の個体群は低濃度塩に対する忌避行動を示さなかった。よって、本種幼虫は地理的変異による味覚受容の差異が存在する可能性がある。さらに、電気生理学的解析により、本種幼虫の塩受容は、他種昆虫と同様に2種類の味受容細胞によって制御されていることが予想された。塩の摂食は動物にとって必須であり、低濃度塩は美味しく感じるが、高濃度塩に対しては忌避行動を示す。塩濃度による嗜好性の変化はマウスでは約250 mM、キイロショウジョウバエでは約100 mMを境界とし、低濃度塩受容細胞と高濃度塩受容細胞によって制御されるが、電気生理実験の結果より、本種幼虫は塩濃度による嗜好性変化の境界濃度が極めて低いことが示唆された。A電気生理実験本研究課題である塩受容細胞数の特定に注力して実験を行ったため、糖・苦味物質・水に対する電気生理学的応答についてデータ量が不十分である。B塩を添加した人工飼料・植物は粉末を用いた摂食実験これまでの研究成果により、苦味物質と塩が本種幼虫の摂食行動を抑制することが明らかとなった。しかし、塩および苦味物質ともに過剰摂取は人体にも悪影響を及ぼすため、本種の味覚受容システムをターゲットとした防除系確立にはより低濃度でも十分な抑制効果を示す至適濃度を検証する必要がある。そこで、苦味物質(カフェイン・キニーネ・ベルベリン・ストリキニーネ)および塩(NaCl)を用いて摂食実験を行った結果、その抑制効果の下限濃度はそれぞれ0.1 mMおよび5 mM程度であった。さらに、苦味物質と塩を混合させた場合、摂食抑制に対して相乗効果を示し、各化合物とも単体での抑制効果の下限濃度以下の濃度で有意に摂食量が減少した。C本種の遺伝的多様性と味覚多様性の相関の検証九州・沖縄で本種の採集を行い、塩受容に注力して行った。概要に記載した通り、野外個体群では塩受容の嗜好性変化の境界濃度が他種昆虫と同様である可能性が示されたため、味覚受容システムにおける地理的変異が存在すると予想された。RAD-Seq解析については未実施であるが、採集地ごとにDNAサンプルを虫体から抽出・調整済みである。1電気生理実験の進捗がやや遅れているため、注力する。本種幼虫の味細胞レパートリーの特定を急ぐ。2塩と苦味物質の相乗効果の検討において3種類以上の混合餌における摂食抑制効果を検証する。新規苦味物質の探索およびアミノ酸の摂食への影響を摂食行動実験および電気生理実験にて検証することを計画している。3本年度も引き続き九州地方を中心に本種のサンプリングを行い、摂食行動実験を行う。同一採集地域での塩嗜好性の境界濃度における年次変動を確認する。さらに、各地域で採集した個体群のDNAの抽出・精製を行い、2年分のサンプルをRAD-Seq解析を実施することにより遺伝的多様性と味覚(塩受容)多様性の相関を検証する。また、海外サンプルの入手を実施し、国内および海外系統間の差異を確認する。4これまでの本種幼虫の摂食実験は3齢幼虫を中心に実施してきた。本種幼虫の最終齢は6齢であり、齢期による味覚応用の差異は検証していない。よって、本年度は終齢幼虫を中心に摂食行動実験を実施するである。また、すでに成虫期の摂食行動実験を実施しており、幼虫ー成虫間の塩応答の差異を検証済みであるため、発育ステージ間の味覚応答差の有無について本年度も検証予定である。
血管内皮細胞におけるTNFα関連アポトーシス誘導因子TRALの機能の解明

われわれは前年度までに、TRAIL(TNFα-Related Apoptosis-Inducing Ligand)が血管内皮細胞や気管支上皮、腎尿細管に発現すること、TRAILはBAECの培養上清中に分泌されること、TRAILを血管内皮細胞に添加すると、PI-3キナーゼが活性化し、Aktがリン酸化されること、およびTRAILは、炎症性サイトカインIL-1βによる内皮細胞活性化を抑制する効果があることを明らかにした。われわれは、さらに、IL-1βによる血管内皮細胞の活性化の分子機構を解析した。IL-1b添加によって血管内皮細胞における遺伝子発現は多様に変化するが、転写因子ATF2のリン酸化が誘導されることを見いだした。リン酸化ATF2は種々の炎症性サイトカイン遺伝子のプロモーターに結合し、転写を促進する。そこで、ATF2のリン酸化を抑制する生理活性物質を検討した。その結果、内皮細胞が産生するプロスタサイクリン(PGI2)やeNOS由来のNitric oxide(NO)が、IL-1βによるATF2のリン酸化を強力に抑制することが判明した。PGI2 analogue製剤であるベラプロストナトリウム(BPS)はPGI2と同様にATF2のリン酸化を抑制した。また、BPSは培養血管内皮細胞およびマウス大動脈において、NO産生を増加させた。その機序として、BPSが細胞内cAMP濃度を増加させ、cAMP dependent protein kinase A(PKA)を介したCREBのリン酸化を引き起こし、eNOSプロモーターの活性を増加させることが明らかとなった。プロスタサイクリンアナログのベラプロスト(BPS)は血管内皮細胞におけるeNOS発現を増加させ、このメカニズムとして、cAMP-Response Element(CRE)を介する転写レベルの調節が重要であった。CREにはCREBが結合することが知られており、BPSはCREBのリン酸化を惹起することによって転写活性を増強させることが明らかになった。以上より、血管内皮細胞がもつ動脈硬化抑制機能は、TRAILによるPI3キナーゼ経路の他、PGI2によるPKA/CREB経路が重要であることが明らかとなった。血管壁における炎症性サイトカインや増殖因子の産生増加は動脈硬化を引き起こす主要な要因である。一方、HMG-CoA還元酵素阻害薬(スタチン)け、肝臓におけるコレステロール合成抑制作用だけでなく血管細胞における直接作用によって動脈硬化を抑制することが明らかにされている。本研究では、スタチンの血管への直接効果を分子レベルで明らかにするために、スタチンを培養ウシ大動脈血管内皮細胞(BAEC)およびヒト大動脈血管内皮細胞に添加することによって誘導される遺伝子をDifferential display法によってスクリーニングした。その結果TRAIL(TNFα-Related Apoptosis-Inducing Ligand)がスタチンによって明らかに誘導されることが明らかになった。そこで次にTRAILのポリクロナール抗体を作成し、ヒト組織における発現を検討した。また、TRAILをBAECに添加することによって、TRAILが内皮細胞のアポトーシスおよび細胞内情報伝達系に及ぼす効果を検討した。その結果、(1)TRAILは血管内皮細胞や気管支上皮、腎尿細管に発現すること、(2)TRAILはBAECの培養上清中に分泌されること、(3)TRAILを血管内皮細胞に添加すると、PI-3キナーゼが活性化し、Aktがリン酸化されること、および(4)TRAILは、IL-1βによる炎症反応を抑制する効果があることが明らかになった。以上から、TRAILは腫瘍細胞にアポトーシスを誘導する因子として同定された分泌蛋白であるが、血管内皮細胞に対しては保護作用をもつ因子であることが考えられる。

以上より、血管内皮細胞がもつ動脈硬化抑制機能は、TRAILによるPI3キナーゼ経路の他、PGI2によるPKA/CREB経路が重要であることが明らかとなった。
IL-12関連サイトカインIL-27によるがん治療の臨床応用を目指した包括的研究

本研究では、IL-27を用いた新しい有効ながん治療法の確立とその臨床応用を目指し、以下の4点、(1)がん治療の妨げに繋がると懸念される骨髄由来免疫抑制細胞への効果、(2)抑制性分子の発現増強の影響、(3)がん幹細胞の活性化の可能性、(4) DCワクチン療法への応用の可能性について明らかにしてゆく。我々は、最近IL-27が造血幹細胞に直接作用することを見出したので、がん幹細胞の活性化の可能性やその結果、腫瘍増殖の促進の可能性が指摘されている。そこで、今年度は、(3)のこれらの点について、慢性骨髄性白血病(CML)の原因融合遺伝子BCR-ABLをGFPとバイシストロニックに骨髄造血幹細胞にレトロウイルスで感染・発現させ、放射線照射したマウスに移植し発症させるCMLマウスモデルを用いて検討した。その際、内在性および外来性のIL-27の効果を調べるために、IL-27のレセプターのサブユニットの1つWSX-1とIL-27のサブユニットの1つEBI3、さらに、IL-27を高発現するトランスジェニックマウス(IL-27-Tg)を用いた。その結果、まず、WSX-1欠損マウスでは、野生型マウスに比べ、末梢血や脾臓、骨髄でのミエロイド系細胞割合や脾腫が増悪化され、CMLの発症が促進される傾向であった。一方、IL-27-Tgマウスでは、これらのミエロイド系細胞の割合や脾腫が軽減され、CMLの発症が抑制された。さらに、EBI3欠損マウスでは、CMLの発症が促進される傾向にあった。その作用機序としては、脾臓内でIL-27により活性化した細胞傷害性CD107a+CD8+T細胞の割合が増加し、GFP+BCR-ABL+細胞の割合がアポトーシスにより減少する傾向が見られた。以上の結果より、IL-27はBCR-ABL+CMLがん幹細胞の増殖を抑制する傾向にあることが示唆され、現在も検討中である。慢性骨髄性白血病のマウスモデルを用いて、IL-27の興味深い役割が明らかになりつつある。今後の研究の推進方策としては、これまでの検討をさらに進めると共に、さらに、(1)がん治療の妨げに繋がると懸念される骨髄由来免疫抑制細胞(MDSC)へのIL-27の効果と、(2) IL-27による抑制性免疫チェックポイント分子PD-L1の発現増強の影響について検討する。(1)まず、IL-27のin vivoでのMDSCへの効果を調べるため、IL-27発現ベクターを遺伝子導入したメラノーマ腫瘍B16F10をマウスに植えて、腫瘍内に浸潤したMDSCの割合と細胞数をFACSで解析する。次に、そのMDSCを、抗CD11b抗体とAutoMACS Proで精製後、卵白アルブミン(OVA)特異的なT細胞受容体のOT-Iマウス由来のCD8+T細胞の抗原特異的増殖への効果を、3H-thymidineの細胞内への取り込みで定量する。次に、マウス骨髄細胞をGM-CSF+G-CSF+IL-13存在下で培養しMDSCを分化誘導する培養系にIL-27を加え、in vitroでのMDSCへの分化抑制効果を明らかにする。(2) IL-27はPD-L1発現を増強すると既に報告があるので、IL-27発現ベクターを遺伝子導入したメラノーマ腫瘍B16F10を用いて腫瘍微小環境内でのPD-L1発現への影響を検討する。まず、IL-27発現B16F10を植えたマウスと、コントロール腫瘍を植えたマウスを比較し、腫瘍内に浸潤しているミエロイド系細胞でのPD-L1の発現をFACS解析、およびCD11+細胞を精製しリアルタイムRT-PCR解析により検討する。次に、抗PD-L1中和抗体を投与し、腫瘍増殖への影響を調べる。以上の検討より、IL-27は、腫瘍微小環境内でもPD-L1発現を増強し、その結果IL-27の抗腫瘍免疫効果を抑制している可能性が考えられるが、その際は、PD-L1に対する抗体との併用療法が有効と期待される。その結果、まず、WSX-

1欠損マウスでは、野生型マウスに比べ、末梢血や脾臓、骨髄でのミエロイド系細胞割合や脾腫が増悪化され、CMLの発症が促進される傾向であった。一方、IL-27-Tgマウスでは、これらのミエロイド系細胞の割合や脾腫が軽減され、CMLの発症が抑制された。さらに、EBI3欠損マウスでは、CMLの発症が促進される傾向にあった。その作用機序としては、脾臓内でIL-27により活性化した細胞傷害性CD107a+CD8+T細胞の割合が増加し、GFP+BCR-ABL+細胞の割合がアポトーシスにより減少する傾向が見られた。以上の結果より、IL-27はBCR-ABL+CMLがん幹細胞の増殖を抑制する傾向にあることが示唆され、現在も検討中である。慢性骨髄性白血病のマウスモデルを用いて、IL-27の興味深い役割が明らかになりつつある。今後の研究の推進方策としては、これまでの検討をさらに進めると共に、さらに、(1)がん治療の妨げに繋がると懸念される骨髄由来免疫抑制細胞(MDSC)へのIL-27の効果と、(2) IL-27による抑制性免疫チェックポイント分子PD-L1の発現増強の影響について検討する。(1)まず、IL-27のin vivoでのMDSCへの効果を調べるため、IL-27発現ベクターを遺伝子導入したメラノーマ腫瘍B16F10をマウスに植えて、腫瘍内に浸潤したMDSCの割合と細胞数をFACSで解析する。次に、そのMDSCを、抗CD11b抗体とAutoMACS Proで精製後、卵白アルブミン(OVA)特異的なT細胞受容体のOT-Iマウス由来のCD8+T細胞の抗原特異的増殖への効果を、3H-thymidineの細胞内への取り込みで定量する。次に、マウス骨髄細胞をGM-CSF+G-CSF+IL-13存在下で培養しMDSCを分化誘導する培養系にIL-27を加え、in vitroでのMDSCへの分化抑制効果を明らかにする。(2) IL-27はPD-L1発現を増強すると既に報告があるので、IL-27発現ベクターを遺伝子導入したメラノーマ腫瘍B16F10を用いて腫瘍微小環境内でのPD-L1発現への影響を検討する。まず、IL-27発現B16F10を植えたマウスと、コントロール腫瘍を植えたマウスを比較し、腫瘍内に浸潤しているミエロイド系細胞でのPD-L1の発現をFACS解析、およびCD11+細胞を精製しリアルタイムRT-PCR解析により検討する。次に、抗PD-L1中和抗体を投与し、腫瘍増殖への影響を調べる。以上の検討より、IL-27は、腫瘍微小環境内でもPD-L1発現を増強し、その結果IL-27の抗腫瘍免疫効果を抑制している可能性が考えられるが、その際は、PD-L1に対する抗体との併用療法が有効と期待される。端数をピッタリ合わすことが難しいため、次年度使用額が生じた。次年度請求額と合わせて、消耗品の購入に充てる。
新生児脳の可塑性と障害防御機構の特異性に関する研究

平成9年度は、熱ストレス蛋白の一つとして細胞防御的に働くとされるHeme oxygenase-1(HO-1)の、生後7日齢ラット低酸素性虚血性脳障害モデル(Rice's model)における発現様式を検討した。HO-1 mRNAレベルは、障害後3時間をピークとし、その後速やかに前値にまで低下した。HO-1蛋白レベルにおいても発現は迅速で、障害後12時間をピークとし、24時間後には低下していた。部位別では、障害の強い虚血側の海馬領域を含む部位で最強であった。既報告の成獣モデルに比べて、幼若ラットではHO-1の発現がより速やかであり、かつ短時間に限定されることを明かにした。平成10年度は、ラットグリオーマ細胞C6株を対象に、HO-1の発現制御機構を解析した。C6細胞では42度30分の熱刺激後30分以内に、HO-1 mRNAが豊富に発現し、12時間後には前値にまで減少した。HO-1蛋白も刺激後12時間でピークとなり、24時間後には減少した。次に、この内因性のHO-1発現亢進を利用して、HO-1の発現亢進がグリア細納の分化を修飾する可能性を検討した。C6細胞をレチノイン酸刺激すると、髄鞘蛋白であるプロテオリピッド蛋白(PLP)が発現するが、熱刺激の後にレチノイン酸刺激にてPLPを誘導させると、その発現が抑制され、別の分化方向であるアストロサイト系のグリア線維性酸性蛋白(GFAP)の発現が増加した。これらの結果から、HO-1は脳障害時に発現亢進して、脳細胞に対して防御的に作用子る反面、幼若グリア細胞の分化に影響を及ぼして、白質病変等を惹起する可能性が示唆された。ストレス蛋白の一つであるHemeoxygenase-1 (HO-1)は、抗酸化作用により低酸素・虚血負荷による神経細胞死に対して防御的役割を果たしている可能性があると考え、まずその動態を解明するために、幼若ラットの低酸素・虚血負荷モデルを作成し、HO-1蛋白の発現について検討した。日齢7のSprague-Dawleyぴラットの左総頸動脈を結紮切断し、8%酸素下で2時間の低酸素負荷をかけ新生児低酸素虚血性脳症(HIE)ラットを作成した。低酸素終了後0、3、6、24、36時間、72時間にパラホルムアルデヒドで灌流固定した後、脳を浸潤固定した。これをパラフィン包埋して冠状断を作成し、ヘマトキシリン-エオジン染色、抗HO-1抗体とABC法を用いた免疫染色を行った。さらに、ラットの脳を低酸素終了後0、6、12、24、48時間に摘出し抗HO-1抗体によるwestern blottingを行った。対照群には同日齢の幼若ラットを用いた。免疫染色では、HIEラットでは低酸素終了後3時間後より結紮側の大脳皮質、外包およびCAI領域を中心とする海馬においてHO-1陽性細胞が増加していた。Western blottingではHIEラットは低酸素終了後HO-1発現が徐々に増加し、低酸素12時間後で最も強く発現した。低酸素終了後24時間後には対照の発現レベルまで低下していた。また、低酸素12時間後に摘出した脳を用いて部位別に発現量を検討したところ結紮側の海馬を含む部分に多かった。既に報害されているadultの虚血ラットと比べると、HO-1蛋白の増加期間が短く、発現パターンも異なることがわかった。平成9年度は、ストレス蛋白の一つであるHeme oxygenase-1(HO-1)が、幼若ラット低酸素性虚血性脳障害モデルにおいて一過性に発現されることを確認した。

その発現は、mRNAレベルにおいても蛋白レベルにおいても、障害の強い虚血側の海馬を含む領域で最強であった。また、成獣モデルに比べて、HO-1の発現が速やかに、かつ短期間に限定されることを発見し、発達期脳の特異的な防護機構の存在を示唆する結果を得た。平成10年度は、培養ラット・グリオーマ細胞C6株を対象に、HO-1とHeat shockprotein 70(HSP70)に着目し、その発現制御機構を解析した。ノザンブロット法にて、無刺激のC6細胞ではHO-1 mRNAを僅かに認めるのみであるが、42度30分の熱刺激後30分以内に、HO-1、HSP70のmRNAが豊富に発現し、12時間後には前値にまで減少した。この迅速な発現亢進は、転写阻害剤actinomycinにて完全に抑制され、転写段階での亢進であることが確認できた。血清除去、低血糖、NMDA刺激などのストレスでは、mRNAの発現亢進は認められなかった。次に、熱ストレス蛋白の発現亢進がグリア細胞の分化を修飾する可能性を検討した。C6細胞をレチノイン酸刺激すると、髄鞘蛋白であるプロテオリピッド蛋白(PLP)が発現するが、熱刺激の後にレチノイン酸刺激にてPLPを誘導させると、その発現が抑制され、別の分化方向であるアストロサイト系のグリア線維性酸性蛋白(GFAP)の発現が増加した。HO-1あるいはHSP70の発現亢進が、グリア細胞の分化機構に影響を及ぼす可能性が示唆された。