hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分子内に空孔を有するカゴ型化合物の希土類錯体の合成とその有機反応触媒への応用

金属イオンの配位場を空間的に固定させ、水を含む系においても効果的に機能するために大きな疎水構造を持つ配位子としてピリジン環を含む一連の大環状化合物を合成した。本研究により空間的に異なる種々の配位場を持つ化合物の合成法を確立した。トリアザ[3.3.3]ピリジノファンは2、6-ビスブロモメチルピリジンとトシルアミドとの反応で得られた。反応条件を選ぶことにより、ジアザ[3.3]ピリジノファン1を約40%の収率で得ることができる。Eu^<3+>, Gd^<3+>, Tb^<3+>, Sm^<3+>の1:1錯体を合成した。3と4(1のルチジレン架橋2量体と3量体)は1より出発し1段階で総収率約70%で得られた。3(架橋2量体)は約6分子の水を吸収する特異な性質を有する。金属イオンのみならずグアニジニウム、尿素などの有機化合物を包接する。3のSm^<2+>錯体の結晶を単離した。ヘキサメタルチジレンテトラミンは2。6-ビスブロモメチルピリジンと2。6-ビスアミノメチルピリジンの1段階反応により得られた。この"Preorganized Structure"のためカチオンを取り込みやすくその錯体は安定である。3つのEu^<3+>が配位した錯体が得られた。アザカリクサレン類はドナー原子に窒素原子のほかにフェノール性酸素を持つ。2、6-ビスヒドロキシメチルフェノール類あるいはオリゴマーと第一アミンを非プロトン性溶媒中で加熱するだけで得られる。架橋窒素原子に各種配位能を持つ側鎖を導入でき、また酸素上にも種々の置換基を導入することが可能で多点認識場を持つ配位子として有望である。
末梢循環性間葉系細胞の発生学的起源探索と表皮水疱症剥離表皮再生メカニズムの解明

研究の概要表皮水疱症患者皮膚は生直後より繰り返す表皮剥離により表皮幹細胞を喪失しているにもかかわらず、表皮再生能を維持している。研究代表者は骨髄由来間葉系細胞と壊死表皮のクロストークによる表皮再生メカニズムを世界に先駆けて報告した。本研究は、表皮水疱症剥離表皮の再生能を持つ末梢循環性間葉系細胞(mesenchymal blood cell、MBC)の発生学的起源を探索するとともに、1細胞レベルでの網羅的トランスクリプトーム解析技術、網羅的エピゲノム解析技術を用いて間葉系細胞から表皮細胞への分化転換に関わる分子基盤を解明し、表皮幹細胞再生医学領域を開拓する。
比較地域生態学を基礎とした農村生態系保全研究の新展開

本研究は企画研究であるため,研究の方向性について議論することが中心である.1.目的と背景農耕地生態系に関わる研究の現状を整理し,今後の農耕地における生態系の保全・回復プログラムを研究サイドから如何に進めてゆくかについての方向性であった.ここでは,(1)農業土木学分野における自然環境保全研究と生態学分野の研究とが乖離する要因把握と修正の方策,(2)現在ある生態系評価モデルの不完全さの認識と新たな汎用予測モデルの方向性,(3)空間スケールの重要性に関する再認識,(4)合意形成や事業における官学民のコラボレーションなどの社会科学的アプローチ,等が主要な議題となった.重要かつ具体的な例として,農業土木サイドの研究が施工を意識したものに偏りがちであり,結果としてマイクロハビタットスケールには対応するものの,それ以上の空間スケールを意識していない場合が多いため,断片的な対応となりやすい点が挙げられ,生態学サイドは具体的な対応を意識しない評価にとどまっている点を指摘した.2.生態系評価に関する普遍性と特殊性地域の空間構造にかかわらず普遍的な評価を行うためにはどのような評価法が合理的であるかについて議論した.これには,地域性にもとづく,特殊性の整理を一方で行う必要性が指摘され,その上で生物の種やギルドに応じた普遍性を再構築する事が,解決への糸口に在りうるという結論に至った.これに従って,空間スケールや地域性を比較する本研究の意義が確認され,継続的にこの研究グループで取り組むべき課題であるという共通認識を得た.本研究は企画研究であるため,研究の方向性について議論することが中心である.1.目的と背景農耕地生態系に関わる研究の現状を整理し,今後の農耕地における生態系の保全・回復プログラムを研究サイドから如何に進めてゆくかについての方向性であった.ここでは,(1)農業土木学分野における自然環境保全研究と生態学分野の研究とが乖離する要因把握と修正の方策,(2)現在ある生態系評価モデルの不完全さの認識と新たな汎用予測モデルの方向性,(3)空間スケールの重要性に関する再認識,(4)合意形成や事業における官学民のコラボレーションなどの社会科学的アプローチ,等が主要な議題となった.重要かつ具体的な例として,農業土木サイドの研究が施工を意識したものに偏りがちであり,結果としてマイクロハビタットスケールには対応するものの,それ以上の空間スケールを意識していない場合が多いため,断片的な対応となりやすい点が挙げられ,生態学サイドは具体的な対応を意識しない評価にとどまっている点を指摘した.2.生態系評価に関する普遍性と特殊性地域の空間構造にかかわらず普遍的な評価を行うためにはどのような評価法が合理的であるかについて議論した.これには,地域性にもとづく,特殊性の整理を一方で行う必要性が指摘され,その上で生物の種やギルドに応じた普遍性を再構築する事が,解決への糸口に在りうるという結論に至った.これに従って,空間スケールや地域性を比較する本研究の意義が確認され,継続的にこの研究グループで取り組むべき課題であるという共通認識を得た.
プロアクティブエラープロファイリングによる実行時エラーの原因推定に関する研究

本年度の目標は、既存の様々な仮想環境をサーベイし、「地獄仮想環境」を実装するための足がかりを構築することである。そのため本年度は、コンテナ型仮想環境Docker、ハイパーバイザ型仮想環境VirtualBoxおよびVMwareについて、サーベイを行い、Dockerについては予備実験を行った。その結果、Dockerを地獄仮想環境として改良することをすることが以下の観点より最も良いと考えた。1.人工的なエラー発生能力についての調査:Dockerにおける人工的なエラーの発生能力は、Dockerがコンテナ型の仮想環境であることから、PCマシンをエミュレートするVirtualBoxやVMwareなどのハイパーバイザベースのシステムに比べ、単なるメモリ破壊や通信内容破壊も可能であるが、特にシステムコールのベースのエラー生成が容易に可能である。そのため、システムコールごとのエラー発生プロファイルを比較的容易に生成することができることがわかった。2.エラー検出の能力:ハイパーバイザ型では、直接的かつ安易に観測できるエラーの発生はプロセッサの例外やMMUのページフォールトや割り込みに限られる。Dockerでは、標準出力/標準エラー出力等のハイレベルなエラーの読み取りが可能であることがわかった。3.メンテナンス性:DockerおよびVirtualBoxはオープンソースであるため、地獄仮想環境は構築が行いやすい。特にDockerは、go言語にて記述されハイレベルに実装が可能なためDockerでの環境構築が望ましい。4.実際の実行環境との互換性:地獄仮想環境は実際に運用に用いられるシステムと人工的なエラーが発生すること以外は異なる点が無いことが良い。その点、ハイパーバイザー型とコンテナ型では問題がないと考える。本年度の目標は、コンテナ型仮想環境Dockerを「地獄仮想環境」として機能拡張を行うことであった。機能拡張のうち、システムコールのエラー生成モジュール、エラー発生時にプロセスが出力するエラーの収集を標準エラー出力から取得するモジュールの実装を行った。人工的なエラー発生も実装できた。一方、メモリ/通信のエラー発生や破壊を行うモジュールはカーネルに手を入れなければ実現が難しいことが判明した。また、生成したエラーから派生し発生したエラーの収集をどこからどこまで行うのか、何を派生したエラーとするのかの判断について、アドホックな判断基準では難しいことが判明した。そのため、機械学習を利用し、どこまでがエラーでそうでないのかを学習させることを考えた。そのための機械学習の手法をサーベイし、システム管理での異常値検出の手法が応用できるのではないかと、現在いくつかの方法を検証中である。また、人工的にエラーを生成する環境では、既存の異常値検出の手法と前提が異なるので、新たな手法を検討する必要があることが判明した。意味のあるエラープロファイリングを行うためには、生成したエラーから派生し発生したエラーの収集をどこからどこまで行うのか、何を派生したエラーとするのかの判断について、アドホックな判断基準では難しいことが判明した。そのため、派生したエラーの検出に重点を置いて、今後研究を進めていく必要があると判断した。本研究では人工的にエラーを発生させるため、これまでの機械学習によるOS環境での異常検出の研究について、そのままの適用は難しいと判断し、新たな機械学習手法を考案し、適用することを考えている。具体的には、本研究では、OSやアプリケーションのアップデート、CPUやネットワーク利用の動的に変化していく環境への素早い適応が重要である。そのため、新たに教師なしアルゴリズムと教師ありアルゴリズムの組み合わせによる新たな機械学習手法を構築、検証し、生成したエラーと派生し発生したエラーの切りわけや、エラープロファイリングデータベースの構築を進めていく。当初の提案にはコンテナ型の仮想環境は検討項目に含まれていなかったが、サーベイの結果、他の仮想環境よりも理想的と考えられるため、サーベイ対象に入れ予備実験を行うために予備実装を行った。その結果、改変を行う目処が立った。

本年度の目標は、既存の様々な仮想環境をサーベイし、「地獄仮想環境」を実装するための足がかりを構築することである。そのため本年度は、コンテナ型仮想環境Docker、ハイパーバイザ型仮想環境VirtualBoxおよびVMwareについて、サーベイを行い、Dockerについては予備実験を行った。その結果、Dockerを地獄仮想環境として改良することをすることが以下の観点より最も良いと考えた。1.人工的なエラー発生能力についての調査:Dockerにおける人工的なエラーの発生能力は、Dockerがコンテナ型の仮想環境であることから、PCマシンをエミュレートするVirtualBoxやVMwareなどのハイパーバイザベースのシステムに比べ、単なるメモリ破壊や通信内容破壊も可能であるが、特にシステムコールのベースのエラー生成が容易に可能である。そのため、システムコールごとのエラー発生プロファイルを比較的容易に生成することができることがわかった。2.エラー検出の能力:ハイパーバイザ型では、直接的かつ安易に観測できるエラーの発生はプロセッサの例外やMMUのページフォールトや割り込みに限られる。Dockerでは、標準出力/標準エラー出力等のハイレベルなエラーの読み取りが可能であることがわかった。3.メンテナンス性:DockerおよびVirtualBoxはオープンソースであるため、地獄仮想環境は構築が行いやすい。特にDockerは、go言語にて記述されハイレベルに実装が可能なためDockerでの環境構築が望ましい。4.実際の実行環境との互換性:地獄仮想環境は実際に運用に用いられるシステムと人工的なエラーが発生すること以外は異なる点が無いことが良い。その点、ハイパーバイザー型とコンテナ型では問題がないと考える。本年度の目標は、コンテナ型仮想環境Dockerを「地獄仮想環境」として機能拡張を行うことであった。機能拡張のうち、システムコールのエラー生成モジュール、エラー発生時にプロセスが出力するエラーの収集を標準エラー出力から取得するモジュールの実装を行った。人工的なエラー発生も実装できた。一方、メモリ/通信のエラー発生や破壊を行うモジュールはカーネルに手を入れなければ実現が難しいことが判明した。また、生成したエラーから派生し発生したエラーの収集をどこからどこまで行うのか、何を派生したエラーとするのかの判断について、アドホックな判断基準では難しいことが判明した。そのため、機械学習を利用し、どこまでがエラーでそうでないのかを学習させることを考えた。
日中古代墳墓副葬品の比較研究

古墳時代を中心とする日本列島各地の墳墓副葬品等にみられる渡来系遺物や外来的要素のなかで、中国を源流とするものついては、鏡や帯金具の一部のように直接もたらされた場合と武器・武具や馬具のように韓半島を経由した場合があることが明らかになった。また、古墳時代における騎兵装備の導入については、受容する側が選択的に受け入れるといった状況であったことを明らかにし、東アジア各地域の交流のあり方の一端を知ることができた。中国遼西地域の45世紀を中心とする墳墓副葬品のなかで、馬具、武器・武具、金銅製品を中心に、個々について、製作技術の検討も含め、日本列島の古墳副葬品との詳細な比較研究をおこなった。馬具については、鞍金具の外観、金銅装の例にあってはその装飾文様や製作技法等、さらには、鞍橋木部が遺存する例等について、韓半島出土例も考慮して検討を加えた。その結果、馬具は基本的にセットとして製作されていると見做せることから、日本の古墳時代の初期の馬具は、主として、4世紀初頭、遼西地域の三燕文化の馬具が遼東地域の高句麗に流入し、高句麗を経て朝鮮半島南部の新羅、百済、伽耶地域に伝わり、それが5世紀初頭に朝鮮半島南部を経由して日本に入ってきた蓋然性が高まった。また、〓金具をはじめとする〓具についての検討結果も加える等、総合的に分析することにより、一例をあげれば、藤ノ木古墳出土馬具の系譜は、高句麗と密接に関係している可能性を指摘しうるにいたった。また、攻撃用武器のなかでも普遍的な鉄鏃については、鏃身の形態を中心に比較検討し、多様性に富む日本列島出土例のなかでも、長頸鏃において、かなりの共通性を見出すことができた。これらは、いずれも、日本列島において、5世紀第2四半世紀以降普遍化する外来的要素の一端を示すものである。その一方で、日中それぞれにのみ見られる遺物の存在、あるいは、重装騎兵が日本列島において普及していない事実、さらには、三燕文化の墓制が、日本列島の古墳と異なり、墳丘を伴わない木槨墓や石室墓、磚室墓である、といった点からは、日本列島に対する三燕文化の影響は、馬具で検討したように、高句麗や韓半島南部を経由した結果であったと考えられるであろう。45世紀代の高句麗王陵に関する報告書が刊行され、高句麗古墳の副葬品の内容がある程度明らかになったことにより、5世紀第2四半世紀の日本列島に出現する騎兵装備、さらには時を同じくして普及し始める馬具は、やはり高句麗を含む中国東北地方を源流とし、韓半島を経由してもたらされたとする蓋然性がさらに高くなった。これに対し、生産形態は、それぞれの気候風土によって大きく異なってくるものであるが、斧、鋤、鍬のような生産用具類について検討すると、その器種や出土量の多寡は、日本列島では水田耕作を主とするのに対し、中国東北地方では畑作が主であることを如実に示していた。今年度は、文献等からも日中の直接的な交流を指摘しうる67世紀についても検討をおこなった。副葬品に在地のほかに中原、北方、西方の要素が混在していることが指摘されている遼西地域の隋唐墓から出土した遺物を比較検討の対象とした。一例をあげると、隋唐墓の副葬品としてしばしば登場する銅製の帯金具は、これと同工のものが日本列島においても出土し、律令制において〓の大小が位階を表示するか否かといった点が問題にされている。隋唐墓には、墓誌が出土し、被葬者が明らかな場合もあり、また、帯金具のみならず出土した墓葬をあわせ比較検討することは、上記の問題を解明する手懸りにも繋がるものである。なお、隋唐墓の資料については、遼寧省文物考古研究所の協力を得て、データベース化を開始するとともに、遺物の実測にあたっては、非接触3次元デジタイザを活用した。中国東北地方において4世紀に成立した騎兵装備のなかで、ヒトが着用する鎧は、漢代にあった2種の鎧甲のうち、鞐形あるいは楕円形に近い小札を用いた鎧甲ではなく、細長い長方形の小札を用いた鎧甲の系譜につながることが明らかとなった。ただ、漢代の後者の鎧甲では、胴部の小札を固定綴にしているのに対し、4世紀の騎兵装備における鎧甲では、それを可動綴とした点で大きく異なってくる。馬上における動きやすさを考慮してのことと考えられるであろう。騎兵装備は、韓半島を経由し、5世紀の中葉以降の日本列島において、その存在を確認することができるのであるが、挂甲が数多く出土するのに対して馬甲・馬冑の出土が極めて稀であることから、重装騎兵は普及しなかったと考えられる。これは、当時、日本列島においては、重装騎兵による戦いを必要としなかったことを示すとともに、騎兵装備が騎兵戦という戦闘方法と一体のものとして取り入れられたのではなく、単により性能の高い新しい武装として導入されたことを物語っているのであろう。

一方、昨年に引き続き調査した隋唐墓から出土した俑には、大別して焼成による陶俑と乾燥による泥俑がある。それらの製作技法を検討した結果、同じ笵から作られた俑にあっても、「工人のくせ」とでもいうべき違いを見出すことができたことから、一定量以上の数を必要とする同笵俑の製作にあたっては、複数の工人が関与している状況を想定することができるであろう。また、あわせて、施釉や加彩のある俑に対する理化学的分析に向けての予備調査もおこなった。これまでに調査を実施してきた遼西地域の唐墓から出土した副葬品のなかで、施釉や加彩のある俑に使用された顔料等について元素分析をおこなった結果、顔料としては、水銀朱、鉛丹、鉛白、墨、さらには銅を用いていることが判明した。また、加彩俑にあっては、彩色の下地に鉛白を用いる場合があることも明らかになった。一方、頭部、胴部等をそれぞれ笵型を用いて成型した後、各部を組み合わせて製作する人物俑等の同笵関係の有無に関しては、非接触3次元デジタイザによって取得したデータを活用することにより、より確実性の高い結果が得られ、遠隔地の資料についても比較検討しうるとの見通しを得た。次に、日本列島の墳墓副葬品にみられる外来の製品、あるいは源流が主として中国等に求められる製品については、直接的に日本列島にもたらされたもののほかに、高句麗や韓半島南部を経由したと考えられるものがあったことが明らかになった。前者は同工の製品が日中で出土しているもので、中国中原地域との結びつきを示す鏡や帯金具等がある。後者には、中国東北地域から高句麗の一帯を源流とし、韓半島南部を経由してきたと考えられる馬具や騎兵装備がある。後者のなかでも、5世紀の日本列島に出現した騎兵装備は、基本的に馬甲・馬冑を欠いていた。この重装騎兵の欠如は、中国や韓半島、さらには高句麗古墳の壁画に見られるような、高い城壁や土塁で囲まれた防禦施設が存在しないという、日本列島の事情を反映したものであった。したがって、騎兵装備は、列島内の戦いにおける、より性能の高い装備として導入されたと考えられるであろう。
包括的・高性能３次元イメージングプラットフォームの開拓

本研究では、高性能で包括的な3Dレーザスキャナを開発することを目的として、独自の光変調方式及び光検出方法を駆使し、従来の3Dレーザスキャナが測定困難な材料や表面粗さにより生じる干渉性フェージングの課題を解決する計測手法を確立する。レーザ光に独自の高速偏波変調を施して偏波検出することで、レーザスキャナの測定制限要因である干渉性フェージングを除去する。また、独自提案手法に基づいてビームフォーミングにおける焦点深度拡張及びビームスポット狭窄化を実現し、高精細3Dレーザスキャナに適用するための高品質ビームフォーミング技術および非機械式で高速掃引・広視野のビームスキャンニング技術を開拓する。
ビタミンＫ誘導体のＤＮＡ合成酵素分子種特異的阻害活性による新規な抗癌機能性開発

ビタミンK誘導体およびそのアシル化化合物のDNA合成酵素(pol)分子種に対する選択的阻害活性を調査した。そして、本活性に基づく生理活性として抗がん作用を解析した。合成した化合物のうち、JugloneとPlumbaginで阻害を示し、がん細胞の増殖を抑制した。さらにUV照射との併用効果があり、その変異率を下げた。アシル化Plumbaginのpol阻害活性はC18:1 plumbaginがpol alphaおよびgammaを最も強く阻害し、さらにがん細胞の増殖を抑制した。その抗腫瘍活性は、C18:1 jugloneよりも強く、実験時の体重減少はみられなかった。ビタミンK誘導体から有効な新規医薬品または抗癌機能性食品、もしくは分子プローブとして生体内におけるDNA合成酵素(pol)研究のツールの開発を目的とする。ビタミンK誘導体の化学合成、DNA合成酵素であるDNAポリメラーゼ、DNAのねじれを巻き戻す酵素であるDNAトポイソメラーゼ、これらの活性に対する阻害作用を指標として新規機能性をもつビタミンK誘導体の化学合成をすすめてきた。得られた誘導体を用いて有効な新規医薬品、機能性食品または分子プローブとして生体内におけるDNA合成酵素研究のツールの開発を展開するために平成23年度で得られたビタミンK誘導体Jugloneのさらなるメカニズム解析と併用効果の調査を実施した。1、ビタミンK誘導体Jugloneのpol eta阻害活性についての分子作用機序(メカニズム)解析:ビタミンK誘導体Jugloneはpol etaを強く阻害し、がん細胞増殖抑制も示した。しかし、細胞周期への影響はみられず、アポトーシスも引き起こしていなかった。この結果を裏付けるためにpol etaノックダウン細胞の作成を試みた。2、ビタミンK誘導体JugloneのUV照射等との併用効果:ヒト癌細胞においてビタミンK誘導体と紫外線照射のタイミングの違いによる細胞増殖抑制活性への影響についてコロニーアッセイ法を用いて調査した。その後、添加量を複数点とっての癌細胞増殖抑制活性を調査した。ビタミンK誘導体から有効な新規医薬品または抗癌機能性食品、もしくは分子プローブとして生体内におけるDNA合成酵素(pol)研究のツールの開発を目的とした。ビタミンK誘導体Jugloneのさらなるメカニズム解析及び、ビタミンK誘導体Plumbagiinに脂肪酸を結合させたアシル化Plumbaginのpol阻害活性、がん細胞増殖抑制活性、抗腫瘍活性を調べた。1、ビタミンK誘導体Jugloneのpol eta阻害活性についてのさらなるメカニズム解析平成24年度に得られた結果を裏付けるために、ウアバインアッセイを用いて変異率について調べたところ、ヒト大腸がん細胞(HCT116 cells)においてJugloneは変異率を下げた。そこで、pol eta欠損細胞を用いてコロニーアッセイを行った。その結果、pol eta存在細胞ではコロニー形成率が低下した。しかしながら、pol eta欠損細胞では変化が見られなかった。そこで損傷の程度を調べるために、コメットアッセイを行ったところ、pol eta存在細胞ではDSBが減少し、pol eta欠損細胞では増加していた。これらの結果から、損傷乗り越え複製の正確さに何らかの影響を与えていることが考えられた。2、アシル化Plumbaginのpol阻害活性、がん細胞増殖抑制活性、抗腫瘍活性(1)pol阻害活性:C18:1plumbaginがpol alphaおよびgammaを最も強く阻害し、C22:6 plumbaginがpol kappaおよびlambdaを最も強く阻害することがわかった。(2)がん細胞増殖抑制活性:C18:1plumbaginが最も強くがん細胞の増殖を抑制することがわかった。その増殖抑制はアシル化Jugloneと同程度のものだった。C22:6 plumbaginはTNF-alpha産生抑制活性、マウス耳介抗炎症活性を示し、C22:6 jugloneよりも強かった。さらに、C22:6 plumbaginは抗アレルギー活性も有していた。(3)抗腫瘍活性:C18:1 plumbaginはC18:1 jugloneよりも強い抗腫瘍活性を示した。さらに、体重の減少はみられなかった。ビタミンK誘導体の化学合成、DNA合成酵素であるDNAポリメラーゼ、DNAのねじれを巻き戻す酵素であるDNAトポイソメラーゼ、これらの活性に対する阻害作用を指標として新規機能性をもつビタミンK誘導体の化学合成をすすめた。得られた誘導体を用いて抗酸化活性、ヒト癌細胞増殖および細胞周期に対する影響を調査した。1.新規機能性をもつビタミンK誘導体の化学合成: pol γを阻害するビタミンK3をリード(中心)として、K3とK2の中間体、K3の二量体など誘導体を有機化学合成した。原料となるビタミンK3は市販試薬を購入した。最も強く阻害する構造を次のリードとして化合物を有機化学合成し、その構造と阻害活性の相関を調べた。

2.1で得られた誘導体を用いてのpolの活性測定:基質は合成DNAであるpoly(dA) / oligo(dT)18とRI標識ヌクレオチドである[3H]-dTTPを用いて、pol反応によって重合されたdTTPの放射活性をシンチレーションカウンターで定量した。3.1で得られた誘導体を用いてのヒト癌細胞増殖抑制試験:ヒト由来の大腸癌などの癌細胞を用いてWst-1法で調査する。4.1で得られたビタミンK誘導体を用いての癌細胞増殖抑制活性におけるメカニズム解析(アポトーシス誘導、抗酸化活性試験、細胞周期解析など)1、ビタミンK誘導体Jugloneのpol eta阻害活性についての分子作用機序(メカニズム)解析(1)ノックダウン細胞の作成:siRNAを用いてpol etaノックダウン細胞の作成したが、siRNA効果が弱かったので、今後さらなる検討が必要である。(2)変異率:ウワバインアッセイを用いて調査したところ、併用効果がみられた。2、ビタミンK誘導体JugloneのUV照射等との併用効果(1)紫外線照射のタイミング:ヒト大腸癌細胞HCT116を用いて、ビタミンK誘導体Juglone添加と紫外線照射のどちらが先がより細胞増殖抑制が強いかをコロニーアッセイ法を用いて調査した。その結果、ビタミンK誘導体juglone添加が紫外線照射より先の方がより効果的であることがわかった。(2)添加量:Jugloneの濃度を複数点とり、コロニーアッセイ法により細胞増殖抑制を調べたところ、濃度依存的に強い細胞増殖抑制を示した。次のようなビタミンK誘導体から有効な新規医薬品、機能性食品または分子プローブとして生体内におけるDNA合成酵素研究のツールの開発を展開する。1、ビタミンK誘導体Jugloneのpol eta阻害活性についてのさらなる分子作用機序(メカニズム)解析2、ビタミンK誘導体Jugloneの併用効果の調査と動物実験次のようなビタミンK誘導体から有効な新規医薬品、機能性食品または分子プローブとして生体内におけるDNA合成酵素研究のツールの開発を展開する。(1)ビタミンK誘導体Jugloneのpol eta阻害活性についての分子作用機序(メカニズム)解析(2)ビタミンK誘導体JugloneのUV照射等との併用効果ビタミンK誘導体Jugloneのさらなるメカニズム解析と併用効果の調査および動物実験を実施する。動物実験については、抗炎症活性はマウス耳へ起炎剤であるTPAを塗布して、阻害物質の塗布の有無による耳の重量差を測定する。1、ビタミンK誘導体Jugloneのpol eta阻害活性についてのさらなる分子作用機序(メカニズム)解析(1)pol etaノックダウン細胞による確認:現在よりも高率にノックダウンした細胞を用いたメカニズム解析(2)変異の解析
アミロイド病モデルマウスを使ったヒトリゾチーム変異体の線維の形成機構と毒性の解析

これまで不明であった全身性アミロイドーシスを引き起こすヒトリゾチーム変異体の毒性について細胞レベルと生体レベルで検証できた。リゾチーム変異体は分子シャペロンGRP78/BiPと結合したまま小胞体内に蓄積し、IRE1-XBP1-GRP78/BiPを活性化させ、小胞体ストレスを誘導することを明らかにした。蓄積したタンパク質は細胞内でアミロイド線維を形成し、これが長期間影響し、細胞傷害を与えることで組織機能の不全となり、重篤な疾患になると推定した。分泌性タンパク質で起こるいくつかのアミロイドーシスは分子シャペロンとの異常な相互作用が原因となり、疾患を引き起こすことが示唆された。ヒトリゾチームは分子内のアミノ酸の置換により全身性アミロイドーシスを引き起こすことが知られ、タンパク構造と病気発症の機構の解明が急がれている。今回、野生型と病気を引き起こす4つの変異体のヒトリゾチーム遺伝子をマウスに導入することが出来た。野生型およびW64Rはそれぞれ第1染色体と第7染色体に挿入されていることが確認された。いずれも作製したマウスはheterogeneousであった。野生型の解析から、導入されたヒトリゾチームは肝臓、腎臓および脾臓においてタンパク質の発現を観察した。現在、残るI56T, F57IおよびD67Hについて挿入された染色体在位の決定を行っており、homogeneousマウスの作製を行っており、各臓器での遺伝子発現、タンパク発現そして変異体の蓄積による細胞毒性と病気発症の機構について追究する。一方、ヒト胚腎293細胞を使って、リゾチーム変異体の細胞毒性を調べた。変異体は野生型に比べ、分泌はかなり減少し、細胞不溶性画分に大量に見られることが観察された。そして細胞内に凝集体を形成し、蓄積していた。この凝集体の蓄積は細胞の小胞体内であることが観察され、変異体はタンパク構造が不安定であるため小胞体内でフォールディングがうまく行かず、凝集していると結論した。小胞体内では小胞体ストレスとなり、UPRシステムが働いており、細胞防御を行っているとされた。UPRシステムではPERK系およびATP6系は変化がないが、IRE1系に顕著な変化が見られた。IRE1の下流にある活性型XBP-1の亢進しているとともに、タンパク質のフォールディングに関わる小胞体分子シャペロンGRP78/Bipが変異体タンパク質と共に凝集体となっていた。細胞はこの蓄積によりアポトーシスに向かっていると推定された。変異体の毒性は小胞体ストレスを引き起こすことによって発現すると考えられた。アルツハイマー病を代表とアミロイド病は社会的に大きな問題である。その原因は異常タンパク質の細胞内外での蓄積とされ、神経系や多くの組織に多く見られ、発病のメカニズムの解明や治療の研究が進められている。生体の抗菌性タンパク質であるリゾチームにおいてもその遺伝的変異により全身に異常タンパク質の蓄積が起こり、全身性アミロイドーシスを発症することが知られているが、発症のメカニズムや治療法は不明である。本年度は発症のメカニズムに焦点を当て、変異体リゾチームの分泌異常による細胞内蓄積と小胞体(ER)ストレスについて研究を進めた。遺伝的変異リゾチームのヒト細胞での発現系の構築を行い、分泌異常、細胞内局在、タンパク質の蓄積を観察した。また、これまで作製したリゾチーム変異体トランスジェニックマウスについて解析を行うと共に、pLIVEベクター導入システムを用いてマウス肝臓でリゾチームの発現を観察した。リゾチーム変異体は分泌が悪く、細胞内のERに大量に蓄積していることが観察された。それに伴い、ERでのUPR機構がはたらき、IRE1-XBP1-GRP78/BiP経路が最も動いており、ERの分子シャペロンであるGRP78/BiPが動員されていた。当初、GRP78/BiPはIRE1と結合しているが、異常タンパク質の発生に伴い、解離し、異常タンパク質のフォールディングを行うが、リゾチームの場合、GRP78/BiPは異常リゾチームと結合したまま凝集体を作り、ERに蓄積して、ERストレスを引き起こすと結論した。これがヒトで見られる全身性アミロイドーシスの発症の原因と考えられ、今回、そのメカニズムの一端を明らかに出来た。たリゾチーム変異体トランスジェニックマウスについてリゾチームの発現は見られなかったが、pLIVEベクター導入マウスでは肝臓で変異体の発現を確認でき、今後、観察を行う。アミロイドジェニックリゾチーム変異体は小胞体内に蓄積し、小胞体ストレスを引き起こす。小胞体ストレスはIRE1-XBP1-GRP78/BiP経路を特異的に稼働させており、GRP78/BiPの動員が亢進しており、変異体タンパク質のフォールディングを促進しているが、フォールディングがうまく行かず、変異体とGRP78/BiPは結合したままとなり、両タンパク質が不溶化して小胞体内に蓄積していくことが明らかになった。リゾチームには疎水性に富むアミロイド線維形成コア領域が存在しているが、GRP78/BiPによってこの領域がフォールディングを受けるためのαードメイン内にポケットと呼ばれる入り口が見つかり、GRP78/BiPはそこから挿入され、フォールディングを行うと推定された。αードメインは規則的に疎水性アミノ酸が配置され、その構造は厳密に構成されていることも分かった。また、アミロイドジェニックリゾチームの変異はコア領域およびその周辺に起こっており、I56

T変異体の場合、イソロイシンと同様の分枝状アミノ酸はGRP78/BiPとの結合は見られず、短鎖のアミノ酸や親水性のアミノ酸はGRP78/BiPと結合したままとなり小胞体内に蓄積する。よって、これまで不明であったアミロイドジェニックリゾチームが起こす細胞傷害の原因の一つを明らかに出来た。同じ分泌性タンパク質・トランスサイレチンもその変異体はアミロイド線維を形成するが、これもGRP78/BiPと結合したまま小胞体内に蓄積することから分泌性タンパク質の変異体によるアミロイド線維形成は小胞体内で起こる可能性が強く示唆された。変異体リゾチームーpLIVE導入トランスジェニックマウスを作製し、肝臓での発現を観察した結果、細胞同様、生体内でもGRP78/BiPと結合した状態で小胞体内に蓄積が観察され、小胞体ストレスを誘発していることが確認された。これまで不明であった全身性アミロイドーシスを引き起こすヒトリゾチーム変異体の毒性について細胞レベルと生体レベルで検証できた。リゾチーム変異体は分子シャペロンGRP78/BiPと結合したまま小胞体内に蓄積し、IRE1-XBP1-GRP78/BiPを活性化させ、小胞体ストレスを誘導することを明らかにした。蓄積したタンパク質は細胞内でアミロイド線維を形成し、これが長期間影響し、細胞傷害を与えることで組織機能の不全となり、重篤な疾患になると推定した。分泌性タンパク質で起こるいくつかのアミロイドーシスは分子シャペロンとの異常な相互作用が原因となり、疾患を引き起こすことが示唆された。本研究の主題であるこれまで不明であったヒトでの異常リゾチームの蓄積によるアミロイドーシス発症のメカニズムに関して、分泌異常、細胞ERでの蓄積が原因でることを細胞レベルで明らかに出来た。異常なリゾチームはわずか1個のアミノ酸の違いで小胞体内でのフォールディングがうまく行かず、URPシステムのIRE1がはたらき、分子シャペロンの動員が図られるがリゾチームと分子シャペロンGRP78/BiPが相互作用したまま凝集するという新たな知見を見出した。これによりERストレスが発生し、細胞にダメージを与えるという結論を得ることが出来た。何故、変異体リゾチームはGRP78/BiPと結合したままなのか?GRP78/BiPにはリゾチームと結合する部位が見つことが出来た。N末端側28-36の疎水性領域を特定することが出来た。リゾチーム患者は長期間にわたり、全身にリゾチーム・GRP78/BiP凝集体がERに蓄積し、細胞が機能不全となり、病気が発症すると思われる。マウスの実験も進んでいるが、作製したトランスジェニックマウスの発現があまり、うまく行かず、肝臓に特異的に発現するpLIVEシステムの導入により、肝臓で異常タンパク質の発現に成功したことから今後、個体レベルでの解析により、長年不明であったリゾチーム変異体の発症機構を解明することが出来る。生化学1. 27年度以降は異常リゾチームが何故、GRP78/BiPとの相互作用したまま、凝集するのか?その分子メカニズムを明らかにする。立体構造予想ソフトによる野生型と変異体のシミュレーションモデルの解析と特定アミノ酸変異体の作製によるGRP78/BiPとの相互作用の変化の検証2.変異体導入安定株細胞の作製とERストレスによる毒性の解析
肺サーファクタント蛋白質受容体と感染防御へ向けた分子基盤の解明

本研究により、1)SP-Dがトル様受容体(TLR)介在炎症応答を制御すること、2)肺サーファクタント蛋白質がレジオネラなどの細胞内寄生菌と直接結合すること、さらに、肺サーファクタント蛋白質が、レジオネラの有するマクロファージへの膜障害作用を抑制すると共に、レジオネラの細胞内増殖を抑制することが明らかとなった。このことから、肺サーファクタント蛋白質がTLRを介する炎症制御ならびに細胞内寄生菌感染過程において重要な生体防御機能を担っていることが示された。近年,細胞内寄生菌の非定型抗酸菌やレジオネラ菌による呼吸器感染症が増加している。これら感染症は治療が困難な場合があり,生体が有している自然免疫を有効に作動させることが重要である。肺コレクチン(肺サーファクタント蛋白質A及びD:SP-A,SP-D)は,肺の自然免疫で重要な役割を果たしている。そこで本研究では,肺コレクチンを介するマクロージによる細胞内寄生菌の貪食促進分子機構を明らかにするために,肺コレクチンとこれら細胞内寄生菌に対する直接作用,及び,結合部位の同定を中心に研究をすすめた。本研究の遂行により,肺コレクチンは,非定型抗酸菌の1つであるMycobacteria avium(M.avium)とカルシウム依存性に直接結合することが明らかとなった。さらに,M.aviumの細胞壁構成成分の1つである,lipoarabinomannnann(LAM)は濃度依存性にM.aviumとSF-Dとの結合を抑制した。しかし,SP-AとM.aviumとの結合にLAMは全く影響を及ぼさなかった。さらに,肺コレクチンは,いずれもカルシウム存在下でM.aviumの凝集を促進させ,EDTA存在下では肺コレクチンによる凝集効果は認められなかった。また,LAMの存在下においても,SP-DのみM.aviumの凝集が阻害された。以上の結果から,肺コレクチンはカルシウム依存性にM.aviumを凝集し,SP-DのリガンドであるLAMは,SF-DによるM.avium凝集効果を阻害することが明らかとなった。また,肺コレクチンは,レジオネラとも直接結合することが明らかとなった。さらに,SP-Aとレジオネラとの結合は,SP-Aの糖鎖認識領域(CRD)をエピトープにもつ抗SP-AmAbで有意に抑制したことから,SP-Aのレジオネラに対する結合部位はCRDであることが示唆された。本研究により肺コレクチンはレジオネラおよびM.aviumに直接結合すること,さらに,M.aviumに対する肺コレクチンの凝集効果が明らかとなった。本研究は、肺コレクチン(肺サーファクタント蛋白質A及びD : SP-A, SP-D)の炎症制御機構、および、肺コレクチンによるマクロファージの細胞内寄生菌貪食促進分子機構を解明し、肺の感染防御及び臨床応用を目指し、その基盤確立を目的として遂行された。以下に本年度の研究成果を要約する。1. Sp-DがLPS惹起炎症性細胞応答を抑制することを明らかにした。SP-Dは、LPSとその受容体との相互作用を変化させることにより、LPS惹起炎症応答を抑制し、SP-Dの十字架様構造がその抑制効果に重要であることを示した。2.肺コレクチンとレジオネラ菌体が直接結合することを見いだした。肺コレクチンは、糖鎖認識ドメイン(CRD)を介し、レジオネラ菌体とカルシウム依存性に直接結合することが明らかとなった。さらに、肺コレクチンは、レジオネラ菌体由来LPSとカルシウム依存性の結合を示した。3.コレクチンは培地中でのレジオネラの増殖を抑制することを明らかにした。さらに、その効果はEGTA及び菌体由来LPSの添加で失われることが示された。4.肺コレクチンがレジオネラのマクロファージ細胞膜障害活性を抑制することを明らかにした。5.肺コレクチンはマクロファージによるレジオネラの貪食を促進し、細胞内増殖を抑制することを見いだした。レジオネラは、マクロファージに被貪食後、ファゴソームとリソソームの融合を阻害し、消化を逃れることで細胞内に寄生する。しかし、肺コレクチン存在下におけるレジオネラの貪食では、貪食されたレジオネラが細胞内で肺コレクチンと共局在しており、肺コレクチンが、リソソームのマーカー蛋白であるLAMP-1とレジオネラとの共局在を増加することを明らかにした。以上のことから、SP-DはLPS惹起炎症応答を抑制することが明らかとなった。さらに、肺コレクチンはレジオネラと直接結合し、マクロファージヘの膜障害作用を抑制すると共に、貪食後のファゴソームとリソソームの融合を促進することにより、細胞内増殖を抑制していることが明らかとなった。
マルチボアホールからなる地殻エネルギー抽出システムの最適化に関する研究-貯留層拡大と抽熱量の飛躍的向上を目指して-

断裂型貯留層を対象として申請者らが開発したFRACSIM-3Dを用いて、マルチボアホール貯留層システムからの抽熱を最適化するための検討を行った。研究(1)天然き裂モデル、流体移動モデルの開発と水圧破砕・抽熱解析コードの確立水圧破砕時に得られる貯留層の進展方向ならびに体積に関する知見を基に、FRACSIM-3Dを用いて妥当な天然き裂分布モデルを決定する方法を考案し、本法をEUのソルツフィールドの水圧破砕実験結果に適用することにより、その有効性を検証した。ボーリングコア中に含まれる天然き裂面のフラクタル特性に基づき、せん断膨張角ならびに透水き裂最大開口量を規定するき裂面粗度を推定する手法を考案した。天然き裂面上の突起分布の標準偏差と水力学的に有効なき裂間隔の関係を定式化し、簡易な天然き裂面流体移動モデルを構成し、これらの成果を合わせて従来のFRACSIM-3Dのアルゴリズムを移植し、水圧破砕・抽熱解析コードを構成した。研究(3)マルチボアホール貯留層システムの流体・熱移動解析1つの注入井と4つの生産井からなる貯留層を抽熱ユニットとし、この抽熱ユニットを正方形型に配置したマルチボアホール貯留層システムを対象にして、水循環時の流体・熱移動解析を行った。マルチボアホール貯留層システムにおける流体の回収率および抽熱量は、単独に抽熱ユニットを同一の数だけ増大させた場合と比較してほぼ同じであることを明らかにし、所要の抽熱量に対して要求される坑井数を大幅に低減できることを示した。研究(4)マルチボアホール貯留層システムの最適化に関する研究マルチボアホール貯留層システムの抽熱性能を最適化するための方法論に関する検討を行った。所定の貯留層システムに対して、注入流量を変化させた流体・熱移動解析を行うことにより所要の貯留層寿命に対して総抽熱量を最大にする条件を決定する方法を提案した。平成12年度には、以下の研究1-3を行い、これまで申請者らが開発してきたFRACSIMをさらに高度化することにより抽熱性能を予測するための基礎を構築した。研究1.天然き裂面の性状とせん断すべり挙動の推定法に関する研究ボーリングコア中に含まれる天然き裂面のフラクタル特性に基づき、任意の寸法の天然き裂面性状を予測するためのアルゴリズムを開発した。本アルゴリズムに基づき、せん断膨張角ならびに透水き裂の最大開口量を規定するき裂面粗度を推定する手法を考案した。特に、せん断膨張角の破面寸法依存性をフラクタル理論を基に明らかにしそのスケーリング則を提案した。研究2.フラクタルき裂内の流体移動モデルに関する研究天然き裂面上の突起分布の標準偏差と水力学的に有効なき裂間隔と寸法依存性を数値解析ならびに1m規模の試験片を用いた実験により評価した。これにより、水力学的に有効なき裂間隔と突起分布の標準偏差の関係を定式化した。この知見に基づき、簡易な天然き裂面流体移動モデルを構成し解析アルゴリズムを開発した。研究3.き裂型貯留層の水圧破砕・抽熱解析コードの確立に関する研究従来のFRACSIMに,上述の研究1、2の成果であるアルゴリズムを移植し、水圧破砕・抽熱解析コードを構成した。これを用いて、EUのソルツフィールドの水圧破砕実験結果を模擬し、開発した解析コードにより実験結果の貯留層領域の規模ならびに形状をほぼ予測しうることを示した。

平成13年度には、以下の研究(1)-(3)を行い、申請者らが開発したFRACSIM-3Dを用いてマルチボアホール貯留層システムの流体移動ならびに熱移動解析に基づく抽熱性能に関する検討を行った。研究(1)き裂型貯留層の天然き裂分布の推定法に関する研究水圧破砕時に得られる貯留層の進展方法ならびに体積に関する知見を基に、FRACSIM-3Dを用いて天然き裂分布を推定する方法を考案した。フタクタルネットワークモデルに基づき、乱数系列を用いて任意に発生させた天然き裂分布に対してFRACSIM-3Dによる水圧破砕の数値解析を行い、フィールドデータと比較することにより最も適合する天然き裂分布を決定する方法を提案した。本法を、EUのソルツフォールドの水圧破砕実験結果に適用することにより、その有効性を検証した。研究(2)マルチボアホール貯留層システムの流体・熱移動解析1つの注入井と4つの生産井からなる貯留層を抽熱ユニットとし、この抽熱ユニットを正方形型に配置したマルチボアホール貯留層システムを対象にして、水循環時の流体・熱移動解析を行った。計算容量の制限を考慮して、4つの抽熱ユニットからなる貯留層システムを対象とした。マルチボアホール貯留層システムにおける流体の回収率および抽熱量は、単独に抽熱ユニットを同一の数だけ増大させた場合と比較してほぼ同じであることを明らかにし、所要の抽熱量に対して要求される坑井数を大幅に低減できることを示した。研究(3)マルチボアホール貯留層システムの最適化に関する研究研究(2)の成果を踏まえて、マルチボアホール貯留層システムを用いて抽熱性能を最適化するための方法論に関する検討を行った。所定のマルチボアホール貯留層システムに対して、注入流量を変化させた水循環時の流体・熱移動解析を行うことにより所要の貯留層寿命に対して総抽熱量を最大にする条件を決定する方法を提案した。
まちづくり情報の収集・蓄積・提供・高度化に必要となる情報基盤の運用に関する研究

インターネット上に公開された地図の任意の地点に、不特定多数のユーザが、任意の情報を入力することができ、これらの情報を自由に検索・閲覧できる、双方向・開放型のinternet Mapped Information Boardsystem :iMIBs(通称:カキコまっぷ)を機能拡張し、新しいタイプの運用実験をおこなった。【拡張したiMIBsの機能】・複数の利用主体がそれぞれのレイヤーを所有し、それらのレイヤーを1つの地図として重ね合わせてインターネット上で提供できる機能。・利用主体それぞれの目的・利用者層にあったユーザエンド・インターフェイスを作るためのカスタマイズ機能。【運用実験の概要と成果】1)多主体の情報を1つの地図に整理した地域防犯マップの作成板橋区志村第一小学校区を対象として、児童(4年生)による校区内の危険個所などの調査(まちあるき)、PTAによる校区内の危険個所の調査(防犯教室と自主的な現地調査)、および16年生の児童と保護者へのアンケート調査(記入用地図付き)を実施し、それぞれの調査結果をiMIBs上に記入、地図上に重ね合わせた。また、このiMIBsをインターネットを通じて保護者などに公開し、インターネット上での情報交換もおこなった。その結果、異なる視点を有する複数の主体による情報を、相互に確認し合い、地域としての防犯意識向上に寄与した。2)行政によるひったくり情報の提供iMIBsの新しい機能である、ユーザエンド・インターフェイスのカスタマイズ機能を用い、行政担当者のみが記入できる「ひったくりマップ」の公開を板橋区でおこなった。行政からの情報提供型WebGISには先行事例もあるが、本研究では、行政担当者との調整を密に実施し、簡単な操作で情報の追加・更新ができるよう配慮したユーザインタフェイスを採用したことで、週に1度の迅速な情報公開を実現することが出来た。1)ワークショップ(WS)支援システムとしての活用まち歩きをして地区の資源・課題を発見・整理することを目的とするWSの支援システムとしてiMIBsを活用した。多摩センター地区では2時間程度のまち歩きの直後に集まった情報を整理するWSを行った。本実験では、本研究で開発したiMIBs(名称は「カキコまっぷ」)を情報蓄積・整理・提供ツールとして用いた他、中西泰人らが開発した「時空間パーサー」をGPS・カメラ付き携帯電話からの投稿ツールとして用いている。WSで、地図上に投稿された情報を整理する場合、情報が持つ位置関係と意味関係の両方を整理する必要がある。カキコまっぷでは、特定の情報に対してコメントを追記することで意味関係を付加していくことは可能であったが、複数の情報の「意味」が相互に関係している様子を図化して整理する際には、従来のように模造紙上でのKJ法を用いた。2)多様な手法・主体により集められた情報のデータベース(DB)としての活用岐阜県山県市では、市民参加型WSや市全域を巡回して情報収集するキャラバン隊などの方法で「まちの資源・課題」を収集した。複数の手法で集めた情報はカキコまっぷで一元的に蓄積・公開した。また、世田谷区の市民団体「ママパパぶりっじ」では、カキコまっぷを用いて区内の子育てに関する情報をDB化した。子育て団体に限らない他分野の主体との協働が課題として明らかになった。
タンパク質の動的複合体形成による細胞骨格制御の構造生物学

細胞内シグナル伝達系タンパク質やゲノム維持の酵素についての構造生物学的研究を行った。その結果、Rhoキナーゼの細胞内局在制御ドメイン、ERMタンパク質とCD44との複合体、RacGEFのTiam1の新規なPHCCExドメイン、CLIP170のCAP-Glyドメインとα-チューブリンのC-末端酸性テールとの複合体、植物ホルモンのジベレリン受容体の三者複合体、三量体Gタンパク質と薬剤との複合体、Werner症候群のヘリカーゼWRNとDNAとの複合体の構造解析に成功して、構造機能相関を解明した。(1) Rhoキナーゼの局在制御の構造的基礎:細胞骨格を制御するRhoキナーゼは,細胞生物学のみならず循環器病や脊髄損傷等への応用の観点からも極めて重要である.本研究では,Rhoキナーゼの細胞内局在を制御するドメインの特異性やRhoキナーゼ特有の性質を三次元構造の観点から解明する.(2) ERMタンパク質の標的認識の多様性:Rhoキナーゼの重要な基質の一つであるERMタンパク質は,膜タンパク質とアクチン細胞骨格を連結する足場タンパク質の一つである.本研究では,CD44やCD43,あるいはPSGL-1といった重要な細胞接着因子や,NEP, MT1-MMPといった膜プロテアーゼとの複合体を解析してアクチン細胞骨格系を通した膜タンパク質の機能制御の構造的基礎を明らかにする.(3)微小管伸張の動的制御:Rhoシグナルは微小管細胞骨格の制御にも関わっており,細胞極性の決定等においても極めて重要である.そこで微小管制御タンパク質+TIPの代表であるEB1, CLIP-170, CLASP等の微小管認識や+TIP間での相互作用を解析する.(4)発展研究課題:以上の研究が順調に進んだ場合には,更にタンパク質の動的複合体の構造研究を発展させるために,細胞運動・極性の制御や癌細胞の転移・浸潤に関わるタンパク質の研究や,植物でのシグナル伝達の研究を開始して,研究の幅を拡大する.細胞内シグナル伝達系タンパク質やゲノム維持の酵素についての構造生物学的研究を行った。Rhoキナーゼの機能制御の構造的基礎の研究では、キナーゼドメインの柔軟性をドッキング計算実験と分子動力学計算で解析した結果、X線結晶構造解析で提案していた薬剤の芳香環結合部位を確認した。また、P-ループの柔軟性と薬剤系結合様式の相関関係を解析した。更に、C-末端に存在する新規な細胞膜にリクルートドメインであるPHn-C1L-PHcドメインの構造研究を目指したタンパク質試料調製を行った結果、C1L-PHcドメインに関しては、良好のNMRスペクトル収集の目処が立った。細胞膜タンパク質のアクチン細胞骨格系を通した機能制御の構造的基礎の研究では、radixinのFERMドメイン(残基1-310)とII型膜タンパク質であるNEPの細胞質テールの合成ペプチド(22残基)との複合体の構造を決定し、得られたFERM-NEP複合体結晶中では、ペプチドの両親媒性領域はFERMドメインのサブドメインCの浅い溝に結合して、β-鎖とそれに続くヘヤピン構造を形成しており、このβ-β相互作用は、ICAM-2などのI型膜タンパク質の接着分子とのものと極性が同一であり、「II型膜タンパク質であるNEPではβ-β相互作用の極性が逆を向く」ということは起こっていないことが判明した。当初計画にはなかったEB1とCLASPの複合体の結晶は、繰越計画に沿ってX線結晶構造解析を進めて、これまで予測されていなかった特異的相互作用の詳細を三次元構造上で解明して、結合モチーフ「bxSbIPb(bは塩基性,xは任意のアミノ酸残基,SはSer,IPはIle-Pro配列)」を同定した。1)血管平滑筋収縮制御するRhoキナーゼの機能制御の構造的基礎前年度に調製したRhoキナーゼのC-末端局在ドメインを用いて,構造決定のための基礎実験を進めた結果,前年度に良好のNMRスペクトル収集の目処が立ったPHn-C1L-PHcドメイン試料については構造決定できた.また,キナーゼドメインのP-loopの安定性を分子動力学の手法で解析して,論文発表した.2)細胞膜タンパク質のアクチン細胞骨格系を通した機能制御の構造的基礎ERMタンパク質による接着分子,イオンチャネルあるいは受容体などの膜タンパク質の細胞内ドメイン(またはテール)の認識に関わるN-末端のFERMドメインとCD43,CD44,MT1-MMPとの結晶化を進めて,構造決定した.CD43ならびにCD44との複合体構造については論文発表した.3)微小管伸張の動的制御前年度からCLIP-170と相互作用するCLASPの実験も進めていたが,その中で,EB1-CLASP複合体結晶の構造解析に成功した.pull-down実験や現有のBIAcoreやITC等を用いて解析すすめており,これらをまとめて来年度に論文発表する準備をしている.4)その他重要な植物ホルモンであるジベレリンとその受容体,ならびに,受容体の標的タンパク質との複合体の構造決定して,英国科学雑誌Nature誌に論文発表した.