hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
餌となる細菌の種類によって色が変わる蛍光スプライシングレポーター線虫の作製

本研究課題では、所属研究室で開発された生体内選択的スプライシングパターン可視化法を応用して、線虫のメチオニン代謝回路の酵素であるメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素をコードするmthf-1遺伝子の選択的スプライシングパターンの違いを2色の蛍光タンパクで生きたまま観察するレポーター線虫を作製することにより、餌が遺伝子発現へ与える影響のセンサーを構築することを目的とした。そのために、mthf-1遺伝子の蛍光スプライシングレポーターミニ遺伝子を作製し、線虫生殖巣へ微量注入して、全身でmthf-1遺伝子の蛍光スプライシングレポーターを発現するトランスジェニック線虫株を作製した。このレポーター線虫を大腸菌0P50株又はComamonas属DA1877株で2世代飼育して観察したところ、腸においてレポーターの発現が異なることを見出した。一方、mthf-1プロモーターのトランスジェニックレポーター線虫を作製したところ、mthf-1遺伝子は主に腸、咽頭筋と下皮で発現していることを見出した。これらのことから、mthf-1遺伝子の選択的スプライシング制御には組織特異性があり、餌の違いによりmthf-1遺伝子のスプライシングパターンが異なるのは、主に腸での選択性が変化することに起因するように見える。今後は、今回作製したレポーター線虫を用いて、蛍光タンパク質の発現を指標として、さまざまな細菌がmthf-1のスプライシングへ与える影響を確認する。また、変異誘導を行ない、餌の種類を変えても遺伝子発現が応答しない突然変異体線虫の単離を試みる。これらの解析により、餌がmthf-1遺伝子のスプライシングに影響を与える分子機構の解明やmRNA前駆体上の応答配列同定など、今後の様々な研究が進むことと期待される。
光アフィニティーキャプチャーによるナノモルタンパク質の機能部位解析法開発

創薬技術の進歩により、現在ではコンピューター画像でタンパク質の構造を描き出し、その中枢部にうまくフィットするように設計した薬物(分子標的治療薬)を合理的に開発することが可能となっている。本研究では、この薬物設計のポイントとなる鋳型タンパク質の構造を明らかにする上で、化学的方法ではこれまで困難とされていた痕跡量の試料に適用できる新光反応性試薬を開発し、その適用により代謝系酵素の解析に成功した。タンパク質3000プロジェクト推進の結果、多くのタンパク質に発現の目処がついたが、結晶化や安定性の問題で解析に至らなかったタンパク質も数多く、これらは化学修飾法の適用対象となる。この目的に有用な、既存の光アフィニティー法は、光アフィニティーラベル後の処理過程で、多くの解析試料が失われることに原因があり、機能部位ペプチドの配列解析に至るまでには、マイクロモル量のタンパク質量から始める必要がある。本研究では、タンパク質の機能構造解析をさらに前進させるため、操作性に優れる固相法を基盤とする光アフィニティーキャプチャー法を導入することで解析過程を効率化し、ナノモルで可能な光アフィニティー法の開発を検討し、膜タンパク質などの分光学的方法の適用が難しいタンパク質の機能構造解析に応用する。この研究推進により、我が国のプロテオミクスや創薬に資することを目的に、平成20年度は、まずアシルスルホンアミド系による切断法を適用する方針で新しいアシルスルホンアミド型光プローブの合成と検証を行った(論文発表済)。さらに、ポリプロピレン固相のキャプチャー系構築と、タンパク質捕捉の条件検討を検討する過程で、効率化を目的に質量分析用の金膜基盤上で解析する可能性を予備的に検討したところ、質量分析の操作で捕捉試料が金膜基盤から遊離する新知見が得られた。この新たな知見を生かすため、ポリプロピレン固相に加え、金膜基盤を用いたタンパク質キャプチャー系について実験を追加し検討した。この追加実験の結果、金薄膜固相上に捕捉したペプチドがMALDI-TDF質量分析のレーザー光照射により金薄膜から遊離し、そのまま質量分析計で検出可能であることが分かった。この結果は、解析サンプルが特に微量の際に有望であり、本課題の目的実現に新たな選択肢を加える上で重要な新知見を得た。タンパク質の構造、とりわけその機能部位の構造解明は創薬・生命科学の進展に欠くことが出来ない。このため、結晶構造解析やNMR構造解析の手法が発展し、これらを支えるタンパク質発現技術も大きく進歩してきた(例えばNature Methods,5,135-146)。しかし一方で、これらの解析に必要な「結晶化」や「安定性」の条件を満たせず、未利用のまま放置される発現完了タンパク質も数多い。本研究では、これらのタンパク質解析へ有効な手段を提供するため、光アフィニティー法に注目し、その効率法開発を目的に検討した。既存の光アフィニティー法は、機能部位ペプチドの配列解析に至るまでには、マイクロモル量の多量タンパク質を必要とするのが通例である。本研究ではこの点の改良に焦点を絞り、膜タンパク質等の発現量の実際的上限とされるナノモル量タンパク質の機能部位解析のための方法確立を課題として設定した。平成20年度は微量ペプチドを効率よく扱える固相技術の開拓に取り組み、金膜基盤上での直接質量分析に新知見を得たが、平成21年度はタンパク質レベルでの効率法開拓に取り組み、光アフィニティーラベル後の混合試料から目的のラベルタンパク質のみを迅速に取り出し、ラベル体が濃縮された解析用ペプチド試料を調整する効率法の開拓に成功した。ビオチンタグを含むアシルスルホンアミド型光プローブは目的タンパク質の特異的ラベル化とつり上げに有効であり、アビジン上に濃縮捕捉したラベルタンパクのみを、プローブ中のアシルスルホンアミドの切断能を利用して再遊離させることで、その酵素消化物からラベルペプチドの候補を容易に同定できる新技術を開拓した(論文発表済)。この方法で、実際にナノから数十ナノモルレベルのタンパク質を効率よく扱うことが可能であり、本課題の目的であるナノモルタンパク質の機部位解析に有用な方法論を確立するうえで重要な知見を得た。最終年度の平成22年度は、本研究で開発した光プローブを用いてタンパク質機能部位のペプチド配列解析までを検討した。

本学薬学部の今中教授と協力し、ペルオキシソームに存在する脂質代謝系のタンパク質に的を絞り、まずビオチンを導入した多機能型パルミチン酸光プローブを合成し、このプローブがβ酸化酵素のperoxisomal multifunctional enzyme type2(MFE2)を特異的にラベルする事を見いだした。ついで、発現MFE2タンパク質を用いてその機能部位解析へと研究を進め、プローブの多機能性を生かしたラベルタンパク質選択的な釣り上げ精製を実施した。この結果、100μg(1.25nmol)のMFE2(80kDa)からTrp249-Arg251の機能部位ペプチド配列を同定し、本研究の目的であるナノモルタンパク質の機能部位解析に成功した。この方法は新規ATPプローブ開発に発展した。
海外日本語学習者の運用能力養成のためのシャドーイング教材の開発と実践研究

本研究の目的は,海外の日本語教育の現状を踏まえ,国内外の共同研究者13名とともに,現在開発中である海外日本語学習者の運用能力を向上させるためのシャドーイング教材を完成させることである。平成30年度は,主に以下の2つを行った。1.教材の修正と補充:まず,国内外の共同研究者とともに,平成29年度までに完成させた試用版シャドーイング教材(24ユニット分)の見直しを行った。その際,(1)より適切な日本語表現,(2)音声の修正,(3)表記の統一,(4)挿絵の追加修正,(5)そのユニットに含まれる文化的な情報を短く説明する「文化ノート」の新規作成,(6)より易しいレベルの教材追加,について提案がなされた。その後,まず日本語能力試験のN5レベルの教材を4ユニット追加作成した。それから,モノローグ,プレゼンテーション,ダイアローグ,場面設定の計52トラック分の音声収録を行った。シャドーイング教材の内容を反映させた挿絵については,デジタルデータ(計6カット分)での新規作成を始めた。2.シャドーイング音声の自動評定システムの試用と改善案の提出:現在開発中の「日本語学習者のシャドーイングの遂行成績から彼らの日本語能力を推定するシステム」を共同研究者とともに体験,確認した。その結果,現在までに作成したシステムでは,(1)調査協力者の日本語能力(J-CAT日本語テストのスコア)の幅が狭かったこと,(2)収集した調査協力者のシャドーイング音声に音質が低いものが含まれていたこと,が原因で想定していたような質で日本語能力の推定が出来ていないことが明らかになった。このシステムについては,データを追加収集する形で計画を立て直した。加えて,日本語シャドーイングの遂行成績自体が得点又はパーセンテージで表示されるシステムの開発についても検討を行った。(1)日本語シャドーイングの音声コーパスを精緻化するために,平成30年度はデータを追加収集することを計画していたが,そのシステムの改善案を提出するところまでしかできなかった。その原因は,当初初夏に予定していた共同研究者との打合せが晩秋になったため,自動評価システムの試用とその改善点の取りまとめも遅くなったからである。(2)シャドーイング教材自体の修正と補充は,ほぼ当初の計画通りに進められた。これらの理由により,「やや遅れている」と判断した。平成31年度は,「システム開発チーム」は,日本語シャドーイング音声の自動評価システムを改善するために,データの再収集,データ処理,データ分析,再プログラミングを行う。「教材開発チーム」は,JLPTのN5レベルのユニット追加,挿絵作成,文化ノート作成等を行い,教材としてのまとまりをつける。また,「実践研究チーム」は,開発した教材や自動評価システムを用いてシャドーイングの効果検証や教材自体の効果検証を順次行う。(1)シャドーイング音声の自動評価システムの再構築が次年度にずれ込むことになったこと,

(2)海外在住の研究協力者が東京での打ち合わせに参加できなかったこと,が原因で未使用額が生じた。その未使用額分は,平成31年度に行うことになった自動評価システムの再構築と教材の音声収録・編集に必要な謝金にそれぞれ充てる計画である。
抗酸化フラボノイドの酸化ストレス標的臓器への蓄積代謝と活性発現機構

野菜果実に含まれるフラボノイド類は生活習慣病の予防に関わる食品由来抗酸化物質であると期待されている。本研究の目的は予防効果の科学的評価の観点から、摂取したフラボノイドが酸化ストレス標的臓器に移行蓄積するプロセスと活性発現機構を解析することである。まず、野菜の代表的フラボノイドであるケルセチンを対象成分として、ケルセチン配糖体を含む高コレステロール食で1ヶ月間飼育したウサギから血管大動脈を摘出した。その結果、大動脈中にケルセチン代謝物が蓄積することを明らかにした。さらにラットにケルセチン添加食を2週間自由摂取させたところ、単回摂取の場合とは血中の代謝物パターンが異なることが明らかになった。一方、標的臓器へのフラボノイドの蓄積代謝を組織学的に評価するために、ヒト血中の代表的なケルセチン代謝物であるケルセチン3-グルクロニド(Q3GA)を特異的に認識するモノクローナル抗体を新規に作成した。ヒト粥状動脈硬化巣では本抗体により顕著な陽性染色がみられたことから、ケルセチンが血管障害部位である動脈硬化巣に選択的に蓄積することが明らかになった。そこで、血管大動脈における抱合体代謝物の活性発現機構について培養細胞モデルを用いて検討した。その結果、Q3GAはマクロファージにとりこまれ、さらに細胞内で脱抱合することが示された。また外部刺激によりマクロファージへの取り込みや脱抱合産物が上昇したことから、ストレス下のマクロファージはケルセチンをより活性の高いアグリコンに変換してストレス防御能を高めることが示唆された。一方、ヒト血漿中のケルセチン代謝物のほとんどはアルブミン画分に存在したことから、血漿アルブミンが代謝物の運搬体として働き、ストレス下でアルブミンから遊離した代謝物がマクロファージへ積極的にとりこまれる経路が考えられた。本研究の目的は予防効果の科学的評価の見地から、摂取したフラボノイドが酸化ストレス標的臓器に移行蓄積するプロセスと活性発現機構を解明することである。今年度は野菜の代表的フラボノイドであるケルセチンを対象成分としてラット、ウサギ、マウスへの体内蓄積と酸化ストレスへの影響を検討した。ラットヘケルセチン(200mg/kg)を胃内投与し、0.5時間後の血液と各臓器を摘出してHPLCクーロアレイ分析を行った。血中にはケルセチン代謝物がおよそ10uMの濃度で存在したが、脳中にもごく少量(0.1-0.2nmol/g)のケルセチン代謝物の存在が確認された。そこで、酸化ストレス標的臓器としての脳におけるケルセチンの作用機構の検討を現在進めている。一方、高コレステロール食(2%)で1ケ月間飼育したNZWウサギから酸化ストレス標的臓器として血管大動脈を摘出した。大動脈の脂質過酸化マーカーは高コレステロール食摂取により増大したが、高コレステロール食にケルセチン配糖体(quercetin 3-glucoside)を添加することにより大動脈の脂質過酸化マーカーは減少し、ビタミンE濃度が増加した。さらに大動脈中にはケルセチン代謝物がビタミンEと同程度蓄積したことから、食餌由来のケルセチンは大動脈に移行して抗酸化活性を発現したと考えられた。次に酸化ストレス標的臓器としての消化管粘膜組織を対象として、DSSを用いた潰瘍性大腸炎モデルマウスにケルセチンあるいはルチシを0.1%含む飼料を摂取させた。摘出した大腸粘膜では、ルチン投与の場合のみ脂質過酸化マーカーを減少させた。ルチンはケルセチンとは異なり小腸で吸収されずにそのまま大腸に移行して抗酸化活性を発現すると推定した。

野菜果実に含まれるフラボノイド類は生活習慣病の予防に関わる食品由来抗酸化物質であると期待されている。本研究の目的は摂取したフラボノイドが酸化ストレス標的臓器に移行蓄積するプロセスと活性発現機構を解明することである。今年度は昨年度に続いて野菜の代表的フラボノイドであるケルセチンを対象成分としてラットへの体内蓄積を検討した。ラットへ2%ケルセチン添加食を2週間自由摂取させたところ、血中のケルセチン代謝物分布は単回投与の場合とは異なり、抗酸化性代謝物であるケルセチン3-グルクロニド(Q3GA)の含量が少なく、より高極性の抱合体が多いことが明らかになった。この結果から、食事摂取したケルセチンは一過性には小腸における代謝産物が血中にそのまま移行するが、連続的な摂取では、肝臓でさらに代謝変換した高極性抱合体が血中に蓄積しやすいことが示唆された。酸化ストレス標的臓器である脳においては、脱抱合後にケルセチンおよびそのメチル体であるイソラムネチンが検出された。さらに、脳におけるケルセチンは全て抱合体として存在するが、イソラムネチンの一部はアグリコンとしても存在することが明らかになったことから、脳へ移行して活性を発現するケルセチン代謝物としてケルセチン抱合体とともにイソラムネチンを検討する必要があることがわかった。次に標的臓器へのフラボノイドの蓄積代謝を組織学的に評価するために、Q3GAを特異的に認識するモノクローナル抗体を新規に作成した。本抗体はケルセチン配糖体とも結合したが、硫酸抱合体やアグリコンとの結合性は著しく弱かった。本抗体によるケルセチン長期摂取ラット脳の免疫組織染色を行ったところ、特異的な検出はみられなかった。しかし、ヒト粥状動脈硬化病巣においては本抗体により顕著な陽性染色がみられたことから、ケルセチンが血管障害部位である動脈硬化巣に蓄積するという新たな知見を得ることができた。野菜果実に含まれるフラボノイド類は生活習慣病の予防に関わる食品由来物質であると期待されている。本研究の目的は摂取したフラボノイドが酸化ストレス標的臓器に移行するプロセスと活性発現機構を解明することである。本年度はまず、代表的なフラボノイドであるケルセチン配糖体を高含有するタマネギ摂取による血中へのケルセチンの移行プロセスをヒトボランティア試験で検討した。その結果、吸収されたケルセチン配糖体は主に抱合体代謝物として血漿アルブミン画分に存在することが明らかになった。前年度われわれはヒト動脈硬化巣にケルセチン抱合体代謝物が蓄種することを明らかにした。そこで本年度は血管大動脈における抱合体代謝物の活性発現機構について、培養細胞モテルにより検討した。抱合体代謝物のひとつであるquercetin3-glucuronide(Q3GA)はマクロファージ細胞に取り込まれて細胞内で脱抱合することを明らかにした。さらに外部刺激によりQ3GAの細胞への取り込みや脱抱合反応が上昇することをみとめた。この結果はストレス下のマクロファージはケルセチンをより活性の高いアグリコンに変換してストレス防御機能を高めることを示唆する。実際にQ3GAは内皮細胞によるLDL酸化を抑えるとともに、マクロファージのスカベンジャー受容体発現を抑制した。一方、内皮細胞では脱抱合は起こらなかったことから、細胞種により抱合体代謝物の挙動が異なることが考えられた。
微量元素の化学状態(価数・結合状態)の直接測定に基づく新しい微量元素地球化学

平成14年度は主にXANES法を用いた微量元素の状態分析に基づく以下の研究を行った.マンガン団塊への微量元素の濃集機構Ce、Co、Pb、Asなどはマンガン団塊へ濃集する微量元素であり、いずれもFe/Mn比とよい相関を示す.XANESによるマンガン団塊中のCe、Co、Pb、Asの価数の測定などから、マンガン団塊への微量元素の濃集機構には少なくとも2種類あることが分かった.ひとつはCeやCoのようなイオン性の強い元素の場合で、マンガン酸化物による酸化的吸着が主要因となる.この場合、CeやCoの濃集は速度論的な因子により決定されると考えられ、一般にFe/Mn比の増大に伴い減少する成長速度によって制限されると推定された.一方PbやAsなどの共有結合性の強い元素では、鉄酸化物との親和性の大きさが濃集をもたらしていると推定された.これらの結果は、XANES法による化学状態の直接測定によって初めて明確に示されたものであり、本研究の大きな成果である.ジルコン中のCe^<IV>の放射線還元正のCe異常を示すジルコン試料にCe^<IV>が含まれることをXANES法で確認した.しかし正のCe異常を示してもCe^<IV>がみられない試料もあった.γ線照射実験からCe^<IV>は放射線により還元されることが分かった.このときの放射線量とCe^<IV>の還元量は、Ce異常が見られるもののCe^<IV>が確認されないジルコンで生じたと考えられるCeの還元量と、オーダーとしては一致した.これはCe異常のCeの還元量が、天然での放射線量を反映することを意味する.このように、Ce異常の程度とXANESから得たCe^<IV>の割合に相関がみられないのであるが、この場合、REEパターンは試料の生成時の情報を保持し、XANESの結果はその後の変化に応答していると解釈できる.これはCeの価数を測定することにより初めて手にできる情報といえる.微量元素の濃度および同位体比は、地球科学試料の成因や物質循環を知る上で広く利用されているが、微量元素の化学状態(価数・結合状態)をもとに地球化学的知見を得る研究はまだ発展途上にある.本研究では、主にXANES法やレーザー誘起蛍光法を用いて岩石・土壌などに含まれる元素(Ce, Fe, Mn, As, Cmなど)の価数を調べ、これらの元素の酸化還元状態から以下の知見を得た.1.鉄-マンガン酸化物への微量元素の濃集:マンガン団塊に含まれるCe、Co、Pbの酸化還元状態を調べた.CeやCoは酸化形である4価・3価の状態で含まれており、酸化的吸着が主要な濃集メカニズムであることが分かった.一方Pbではこれまで示唆されていた酸化形である4価は主要な化学状態ではなく、他の濃集メカニズムを考える必要が生じた。選択的溶出法などの結果から、鉄酸化物への高い親和性がPbの濃集には作用していることが推定された.2.ジルコン中のCeの酸化還元状態:ジルコンの希土類元素パターンは正のCe異常を示し、Ce(IV)がジルコンには含まれていることがこれまで予想されてきた.XANES法によるCeの価数の直接測定を行ったところ、Ce(IV)の寄与が見られ、上の予想が正しいことが分かった.しかし一部のジルコンにはCe(IV)は殆ど含まれおらず、ジルコン生成後にCe(IV)の還元が生じたと考えられる.γ線照射等の実験から、このCe(IV)の還元量はジルコンに含まれるU・Thとその系列核種から放出される放射線の効果によって説明され得ることが示唆された.3.モンモリロナイト-フルボ酸複合体上のCmの化学状態:レーザー誘起蛍光法によるCmの水和数測定などから、フルボ酸の存在下でCmはフルボ酸錯体としてモンモリロナイトに吸着されることが分かった.平成14年度は主にXANES法を用いた微量元素の状態分析に基づく以下の研究を行った.マンガン団塊への微量元素の濃集機構Ce、Co、Pb、Asなどはマンガン団塊へ濃集する微量元素であり、いずれもFe/Mn比とよい相関を示す.XANESによるマンガン団塊中のCe、Co、Pb、Asの価数の測定などから、マンガン団塊への微量元素の濃集機構には少なくとも2種類あることが分かった.ひとつはCeやCoのようなイオン性の強い元素の場合で、マンガン酸化物による酸化的吸着が主要因となる.この場合、CeやCoの濃集は速度論的な因子により決定されると考えられ、一般にFe/Mn比の増大に伴い減少する成長速度によって制限されると推定された.一方PbやAsなどの共有結合性の強い元素では、鉄酸化物との親和性の大きさが濃集をもたらしていると推定された.これらの結果は、XANES法による化学状態の直接測定によって初めて明確に示されたものであり、本研究の大きな成果である.ジルコン中のCe^<IV>の放射線還元正のCe異常を示すジルコン試料にCe^<IV>が含まれることをXANES法で確認した.しかし正のCe異常を示してもCe^<IV>がみられない試料もあった.γ線照射実験からCe^<IV>は放射線により還元されることが分かった.

このときの放射線量とCe^<IV>の還元量は、Ce異常が見られるもののCe^<IV>が確認されないジルコンで生じたと考えられるCeの還元量と、オーダーとしては一致した.これはCe異常のCeの還元量が、天然での放射線量を反映することを意味する.このように、Ce異常の程度とXANESから得たCe^<IV>の割合に相関がみられないのであるが、この場合、REEパターンは試料の生成時の情報を保持し、XANESの結果はその後の変化に応答していると解釈できる.これはCeの価数を測定することにより初めて手にできる情報といえる.
フラクタルブラウン運動による乱流速度場の表現

確率微分方程式のランダム項にフラクタルブラウン運動の増分(フラクショナルノイズ)を用いることによって、発達乱流場の速度成分のシミュレーションをおこなった。実験データからもとめるパラメータをもとに、シミュレーション速度信号にはエネルギースペクトルの普遍法則(Kolmogorov -5/3乗則)を再現でき、散逸スペクトルの形も指数型とした。その減衰指数は、実験データに一致させることにより、散逸スペクトルについても良い一致を示した。さらに、高次モーメントの考察から、シミュレーション信号に間欠性を付加した。これは、一次元の間欠性カオスに基づく写像である。これにより、速度構造関数の高次モーメントまで実験と一致した信号波形を構成できた。最終的なチェックは、以下の2種類の方法でおこなった。(1)乱流信号の局所のハ-スト指数のゆらぎをWaveletにより取り出し、その確率密度関数を比較することによっておこなった。シミュレーション信号と実験データは良好な一致を示し、本速度シミュレーションが有効であることを確認した。(2)速度差の確率密度関数の形を実験データのものと比較するために、情報幾何学の分野で用いられているカルバックライブラ-のダイバージェンスを用い、定量的な評価をおこなった。両者は慣性小領域内で良く一致し、本シミュレーションの妥当性を確認した。以上の論議は一次元での内容であったが、連立確率微分方程式を用い、二次元に拡張した。エネルギースペクトルに付いては、一次元の場合と同様な結果となったが、高次モーメントに付いては今後の課題である。本シミュレーション方法が、今後工学的な応用面での研究に役立つように、さらに改良を加える予定である。
オープン・データを活用した思春期・青年期・成人期早期における主体価値の諸相の解明

質問紙を用いた多くの調査データは自記式の回答に基づく場合がほとんどであるが,それには言わずもがな各尺度項目に対する回答者自身の反応傾向などの回答バイアスが色濃く反映される。しかも,思春期を含む比較的低年齢層を対象とした自記式回答データではこの問題は更に大きくなり,調査データの信頼性は低くなる傾向にある。取りも直さず,信頼性の低いデータからは分析結果に関する適切な推論も困難となる。そこで,本研究計画では,自記式の調査データには反応傾向という回答バイアスが含まれることは所与とし,それらを統計モデルを用いて柔軟に補正することによって,結果からより適切な解釈を導くことが目的としていた。その回答バイアスの補正のための方法として近年最も有力視されているのが係留寸描法である。この方法を用いたバイアス補正は,バイアス含みの自己評定を行った後に,関心下の特性について複数の仮想的な人物に関して描写された情報も併せて読んでもらい,それらの人物について評定も得た上で,その情報をその前で得ている自己回答のバイアス補正に活用する。そもそもは政治学分野で開拓されたが,近年は健康科学や心理学においても活用され始めているが未だ黎明期にあるため方法論や分析手法は十分に確立されているとは言い難い。本研究計画の最終年度である平成30年度では,昨年度から引き続き,PISA調査で実際に用いられた係留寸描項目を対象に分析を行い,統計的に適切な補正をかけた後の結果に関する解釈について論文としてまとめることを目指した。また,バイアス除去のための統計的な方法論としての側面からもアプローチし,思春期の子どもたちが回答傾向がどの程度経時的に不安定であるのか検証し,現在,英文誌に投稿中である。ビッグデータの時代にあって世界規模の公開個票データを活用していくことは非常に重要であると考えるため今後も本研究を発展させるべく努力する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。質問紙を用いた多くの調査データは自己記入式の回答に基づく場合がほとんどであるが,それには各尺度項目に対する回答者各自の反応傾向が色濃く反映される。思春期を含む比較的低年齢層を対象とした自記式回答データでは問題は更に大きくなり,調査データの信頼性は低い傾向にある。言わずもがな,信頼性の低いデータからは分析結果に関する適切な推論も困難となる。そこで,自記式の調査データには反応傾向というバイアスが含まれてしまうことは織り込み済みのものとし,それらを統計モデルを用いて補正することによって,より適切な解釈に導くことが必要である。その回答バイアスの補正方法として,近年もっとも有力視されているのが係留寸描法を用いた方法である。この方法を用いたバイアス補正は,バイアス含みの自己評定を行ったのちに,関心下の行動特性について複数の仮想的な人物に関して描写された情報も併せて読んでもらい,それらの人物について評定も得たうえで,その情報をその前で得ている自己回答のバイアス補正に活用するものである。そもそもは政治学分野で開拓されたが,近年は健康科学,心理学においても活用され始めている。高橋(2017)では,OECD PISA 2012調査で用いられた係留寸描項目を対象に分析を行い,統計的に適切な補正後,思春期の子どもたちの回答する学級や教員に対するポジティブな評価は学業達成とより正に相関するようになること,そしてそれらの評価は子どもたちのパーソナリティ特性と有意な関連性が消失することを報告した。また,Okada, Hojo, & Takahashi (2017)では,2時点の縦断調査データの分析結果を報告し,思春期の子どもたち個人のパーソナリティ特性尺度に対する回答傾向には経時的な安定性が見受けられると同時にかなりの個人差が存在することを示した。本研究課題の目標は,オープン・データを取得したうえで,思春期・青年期期における価値観の発達の様子を複数の観点から明らかにし,統計学的により適切なモデリングを用いてそれらの集団差と個人差を同時に描き出すことであるが,本年度はそれらの目標に照らして十分な研究報告を行うことが出来たと考えられる。

本研究計画の最終年度である平成30年度では,昨年度から引き続き,PISA調査で実際に用いられた係留寸描項目を対象に分析を行い,統計的に適切な補正をかけた後の結果に関する解釈について論文としてまとめることを目指した。また,バイアス除去のための統計的な方法論としての側面からもアプローチし,思春期の子どもたちが回答傾向がどの程度経時的に不安定であるのか検証し,現在,英文誌に投稿中である。ビッグデータの時代にあって世界規模の公開個票データを活用していくことは非常に重要であると考えるため今後も本研究を発展させるべく努力する。現状において,本研究計画に関する後ろ向きな計画変更の予定は無い。昨年度から引き続いて,よりインパクトの高い研究誌への論文採録を目指す。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
周術期急性腎障害発生メカニズムにおける好中球細胞外トラップの寄与に関する検討

好中球細胞外トラップ(NETs)の形成が、腎機能障害を引き起こすとの仮説を立て、ラットを用いた動物実験を計画した。7.5%カゼイン溶液を腹腔に注射し、24時間後に腹腔洗浄する形で好中球を回収することで、好中球溶液を作成し、これをPMA処理する形で、NETsを形成させたが、細胞外トラップとしての収量が安定せず、実験モデルの作成に至らなかった。また、臨床研究への応用を図るため、ラットの血液を用いて、フローサイトメトリーでNETsを定量する方法についても検討したが、NETs形成に伴う細胞形態の変化が起こる関係で、標的とするゲートの設定が難しく、この方法による定量も困難と判断し、臨床研究も中止した。ラットを用いたNETs形成好中球投与によるNETs血症モデルの作成および同モデルにおける腎機能障害の検討を開始した。ラットを、ペントバルビタールによる深麻酔下に安楽死させ、心室穿刺により、ヘパリン加シリンジに採血し、Histopaque 1077を等容量加えて400g×45分間遠心し、上層を廃棄し、下層を6%デキストラン添加0.15M NaClに懸濁する。37°Cで20分間インキュベーションした後、270g×20分間遠心し、ペレットに塩化アンモニウム溶液を加えて氷上で15分間処理することで溶血させる。さらに、480g×10分間の遠心により、細胞成分を回収し、HBSS溶液で洗浄した後、270g×10分遠心し、ペレットを1mL HBSS溶液で懸濁し、好中球溶液とする。この好中球懸濁溶液に600nM PMAを加え、4時間5%CO2インキュベータ内で静置し、NETs形成を誘導し、細胞外二重鎖DNA量をPico-Green法で測定する。NETsの投与量を細胞外二重鎖DNA量で規定し、3段階の投与量を決定し、別なラットの外頚静脈よりNETs形成好中球懸濁溶液を投与し、NETs血症モデルを作成する。投与後1時間後、2時間後、4時間後、24時間後に頸動脈に挿入したカテーテルより採血し、血清クレアチニンおよび血清二重鎖DNA濃度、DNase活性、DNaseI抗原濃度、サイトカイン濃度の測定を行う。さらに、NETs形成好中球懸濁溶液投与後24時間後の採血が終了した時点で、深麻酔下にラットを安楽死させ、両側の腎臓を摘出し、ホルマリン固定を行い、HE染色および免疫組織染色による観察を行う。このプロトコールに従い、実験を進行中である。好中球を効率よく遊離する作業において、複数の方法を試す形で試行錯誤があった。また、研究代表者が平成27年10月から平成28年3月まで産休・育休を取得した。2016年度の計画として、ラットを用いた好中球細胞外トラップ(NETs)形成、好中球投与によるNETs血症モデルの作成および、同モデルにおける腎機能障害の検討を計画した。この計画では、ラットを、ペントバルビタールによる深麻酔下に安楽死させ、心室穿刺により、ヘパリン加シリンジに採血し、Histopaque 1077添加後に遠心処理を行うなどの後、好中球を分離し、これをHBSS溶液で懸濁し、好中球溶液を作成し、600nM PMAを加えて、NETs形成を誘導し、これを経静脈的に投与することで、腎臓に組織障害が観察されるかどうかを検討するというものだった。2016年4月以降、研究代表者は産休・育休明けで復帰し、臨床と両立する形で研究を再開する形となったが研究の進行に遅延が生じたため、研究を遂行するために、2017年度まで研究期間を延長することとした。2016年4月以降、研究代表者は産休・育休明けで復帰し、臨床と両立する形で研究を再開する形となったが研究の進行に遅延が生じたため、研究を遂行するために、研究期間を延長した。本研究では、ラットを用いた好中球細胞外トラップ(NETs)形成、好中球投与によるNETs血症モデルの作成および、同モデルにおける腎機能障害の検討を計画した。ラットをペントバルビタールによる深麻酔下に安楽死させ、心室穿刺により、ヘパリン加シリンジに採血し、Histopaque1077添加後に遠心処理を行い、好中球を分離し、これをHBSS溶液で懸濁し、好中球溶液を作成した。また、別な方法として、1mLの7.5%カゼイン溶液を腹腔に注射し、24時間後に10mLの好中球分離メディウムを腹腔内注射し、腹水として回収する方法で好中球溶液とする方法も試みた。これらの好中球溶液に対して、600nM PMAを加えてNETs形成を誘導し、この懸濁液を別なラットの外頚静脈より投与して、腎臓に組織障害が観察されるかどうかを検討することを計画した。しかし、好中球の収量が安定しない、NETs形成に関する評価が定まらないなど、安定した結果が得られない中、研究代表者が産休・育休に入り、研究は中断した。研究期間を延長し、フローサイトメトリー法を用いた定量法(Am J Hematol. 2015(12):1155-8)の適用を含める形で、心臓血管手術を受ける患者を対象として、前向き臨床研究を計画した。しかし、同論文における所見と同様の方法での定量に関する実用性について見込みが立たず、臨床研究の実施には至らなかった。

最近Okuboらは、Macrophage extracellular trapが横紋筋融解における腎機能障害の成因と関係があるとする報告を出している(Nat Med. 2018;2:232-238)が、これらの知見も総合し、周術期腎障害の発生機構に細胞外トラップが関係しているかを調べていく必要がある。好中球細胞外トラップ(NETs)の形成が、腎機能障害を引き起こすとの仮説を立て、ラットを用いた動物実験を計画した。7.5%カゼイン溶液を腹腔に注射し、24時間後に腹腔洗浄する形で好中球を回収することで、好中球溶液を作成し、これをPMA処理する形で、NETsを形成させたが、細胞外トラップとしての収量が安定せず、実験モデルの作成に至らなかった。また、臨床研究への応用を図るため、ラットの血液を用いて、フローサイトメトリーでNETsを定量する方法についても検討したが、NETs形成に伴う細胞形態の変化が起こる関係で、標的とするゲートの設定が難しく、この方法による定量も困難と判断し、臨床研究も中止した。引き続き、ラットを用いた上記動物実験を行う。呼吸器外科84症例について、術前・術直後・手術翌日に採血を行い得られた血清サンプルについて、血清二重鎖DNA濃度を測定し、過去に得られた心臓手術におけるデータとの比較検討を行う。心臓血管外科の予定手術患者を対象に、急性腎障害とNETs形成に関する前向き研究をデザインし、フローサイトメータを用いたNETs形成の評価を加える形で施行し、心臓手術後の急性腎障害発症におけるNETs形成の寄与度について検討する予定である。周術期管理医学機器や消耗品の購入の後、比較的少額の残額が発生した。産休・育休から復帰後、臨床と研究を両立する形で研究の再開を図ったが、研究体制の構築が難しく、研究の進行に遅延を生じたため。平成28年度に繰り越された使用額は、動物実験・臨床研究における試薬をはじめとする消耗品の購入に使用する予定である。臨床研究の施行に必要な採血管、試薬、検体保存用のチューブ類等の購入を行う予定である。
教職追放が地方教育行政機構・教育団体に及ぼした影響ー北海道を事例としてー

1.資料調査・収集を中心とする本年度の計画は、以下のようにほぼ計画どおりの成果をあげることができた。(1)GHQ/SCAPのCIE(民間情報教育局)、GS(民政局)およびCAS(民事局)の各文書を調査し、教職追放および北海道にかかわる相当数の資料をマイクロフィッシュ形で収集することができた(CIE文書...287枚、CAS文書...84枚、GS文書...24枚等)。(2)国内文書として、道庁文書の調査を行ったが、占領期に関する文書が現在のところ殆ど収集されていないことが判明した。他方、占領下の北海道に関する系統的記録としての意味を有する北海道連絡調整事務局『執務月報』(外務省外交資料館所蔵)はマイクロフィルムの形で収集することができた。また、教職追放にかかわる「新聞切り抜き」をマイクロフィルムの形で、さらに占領下期に北海道内で発行されていた新聞(『北海道新聞』、『北海タイムス』等)をマイクロフィルムの形で収集した2.以上の資料調査・収集をもとに、教職追放のうちレッド・パージが北海道の教職員組合(北教組)の幹部構成、性格等に及ぼした影響の検討に着手した。現在のところ、(1)左派に属する組合幹部の相当数が直接追放の対象とされ、また組合内に反共的雰囲気が強まる中で組合幹部構成における左派の比率は大幅に低下した、(2)左派の影響下にあった教育研究団体「民主主義教育協会」(民教協)が解体状態に追い込まれ、(3)北教組が「民同」路線を鮮明にした、ことが明らかになった。
木材の音弾性効果

木材(ブナ・スプル-ス)の繊維方向に圧縮および引張力を与え,同時に超音波縦波・横波を負荷方向とは垂直(半径方向)に伝播させて音弾性実験を行い,応力-ひずみ-音速の関係を調べた。その結果,横波を用いた実験では,圧縮応力の増大とともに音速は減少したが,引張応力の増大に対しては,音速ははじめ増加し,その後減少に転じた。この現象は樹種に関わらず得られた。一方,縦波を用いた実験では,例えば引張応力下では応力の増大とともに音速は増加し,圧縮応力下では現象が樹種によって異なるなど,横波を用いた場合とは異なる結果が得られた。このときの応力と音速変化との関係より音弾性定数を求めたところ,これまでに得られた他のモードの値より小さかったが,同モードによる金属材料のそれよりも1桁大きかった。次に,このような木材の音弾性特性を利用して,木材(板材)の曲げ応力分布の測定を試みた。試験体は気乾状態の板状で,長さ・高さ・厚さの各方向が繊維・接線・半径方向に一致した板目板である。試験体の長軸方向の中央部にスパンを設け,試験体の両端に重錘を載荷して支点間に曲げモーメントを作用させた。また,試験体スパン中央部で板厚(半径)方向に超音波(縦波・横波)を伝播させ,高さ(梁背)方向の所定の各位置で載荷前後の音速差及び初期音速に対する比の分布を求めた。これらと上記で求めた音弾性定数により応カ値を求めた。一方,音弾性法による曲げ応力推定値の比較検討のため,音速測定位置に沿う各位置にひずみゲージを試験体の長軸方向に一致させて貼付し,これらのひずみ測定値より曲げ応力の分布を求めた。その結果,初期音速は位置により異なり,概して中心(中立軸)付近の音速が他に比べて比較的大きかった。これは,超音波の伝播方向(半径方向)と年輪との直交度が中心付近で最もよいことに関係している可能性がある。また,スプル-ス材の初期音速はブナ材よりも全体的に大きかった。各測定位置での音速は負荷の大きさにより変化した。例えばスプル-ス材で横波を用いた測定では,音速の変化割合は材の中心より上側の各位置では正で,下側の各位置では負であった。上記の音弾性特性に関する結果より,材の上側では引張応力域,下側では圧縮応力域であることが判明した。これらの値は負荷が大きくなるほど,また,中心から離れるほど概略において大きくなった。これらを対応する位置の音弾性定数で除すと応力が求められた。同時にひずみゲージより求めた応力と材料力学により求めた応力の値を比較すると,3種の方法により求めた応力値は大略において一致しており,音弾性法による応力推定値がほぼ妥当な結果を得ていることが裏付けられる。以上の結果は,木材の応力測定に関する音弾性法の適用の可能性を示唆するものであるが,この方法の実用化のためには木材の音弾性特性に関する更なる詳細把握と測定技術上の諸問題の解決が望まれる。目的:木材の音弾性現象を把握すること目的として,木材の繊維・半径・接線の各方向に圧縮力を与え,同時に負荷方向に沿って伝播させた超音波縦波の音速の変化について,実験方法の検討・確立ならびに測定を試みた。実験:試料としてベイヒバ,ヒノキ,ブナ,タモ,ホオ,スプル-ス,ヘムロックの7樹種を用いた。試験片は気乾状態のもので寸法が6x3x3cmの直方体である。1樹種につき10-15体を用意した。圧縮力は試験片の長軸に平行に材料試験機を用いて加えた。圧縮応力下における超音波音速は本補助金により購入したシングアラウンド式音速測定装置を用いて測定した。圧電型の超音波探触子を用い,超音波の伝播方向は負荷の方向に一致させた。なお,この探触子を圧縮力から保護するために新たに実験技術として考案したジュラルミン製のホルダーを作製,使用した。音速はこのホルダーの影響と負荷中の試験片長の変化を逐次補正して求めた。結果:現時点で得られている結果の概略は以下のようである。1.木材における音弾性現象の存在を確認した。2.音速の変化の仕方は,木材の種類と方向により,応力の増大とともに(1)はじめ増大し,やがて減少に転じる場合と,(2)はじめから減少する場合に大別できた。このことは,金属材料の一般的傾向と異なり,木材に特徴的な現象と考えられる。さらに木材の音弾性現象と細胞組織構造との関連性を示唆するものと考えられる。3.初期応力域における音速と応力,および大変形領域における音速とひずみとの間には,比較的良好な直線関係が認められた。4.木材の音弾性定数は繊維方向より半径・接線方向で大きく,また金属材料のそれよりも大きかった。このことは,応力の変化に対して音速が敏感に反応することを意味し,木材の応力測定に対する音弾性の適用の可能性を示唆するものである。問題点と今後の展望:ここで得られた音弾性定数はバラツキが大きいこと,また,音速と応力が比例関係を示す領域が極めて小さい初期応力域に限られるなど,現段階で直ちに応力測定に結びつけるのは困難である。また,実際問題として,超音波の伝播方向は今回の実験のように応力軸に平行な場合よりも垂直な場合のほうが有用であると予想される。このため,他の超音波の種類・モードによる音弾性現象をさらに詳細に把握する必要があると考える。

木材(ブナ・スプル-ス)の繊維方向に圧縮および引張力を与え,同時に超音波縦波・横波を負荷方向とは垂直(半径方向)に伝播させて音弾性実験を行い,応力-ひずみ-音速の関係を調べた。その結果,横波を用いた実験では,圧縮応力の増大とともに音速は減少したが,引張応力の増大に対しては,音速ははじめ増加し,その後減少に転じた。この現象は樹種に関わらず得られた。一方,縦波を用いた実験では,例えば引張応力下では応力の増大とともに音速は増加し,圧縮応力下では現象が樹種によって異なるなど,横波を用いた場合とは異なる結果が得られた。このときの応力と音速変化との関係より音弾性定数を求めたところ,これまでに得られた他のモードの値より小さかったが,同モードによる金属材料のそれよりも1桁大きかった。次に,このような木材の音弾性特性を利用して,木材(板材)の曲げ応力分布の測定を試みた。試験体は気乾状態の板状で,長さ・高さ・厚さの各方向が繊維・接線・半径方向に一致した板目板である。試験体の長軸方向の中央部にスパンを設け,試験体の両端に重錘を載荷して支点間に曲げモーメントを作用させた。また,試験体スパン中央部で板厚(半径)方向に超音波(縦波・横波)を伝播させ,高さ(梁背)方向の所定の各位置で載荷前後の音速差及び初期音速に対する比の分布を求めた。これらと上記で求めた音弾性定数により応カ値を求めた。一方,音弾性法による曲げ応力推定値の比較検討のため,音速測定位置に沿う各位置にひずみゲージを試験体の長軸方向に一致させて貼付し,これらのひずみ測定値より曲げ応力の分布を求めた。その結果,初期音速は位置により異なり,概して中心(中立軸)付近の音速が他に比べて比較的大きかった。これは,超音波の伝播方向(半径方向)と年輪との直交度が中心付近で最もよいことに関係している可能性がある。また,スプル-ス材の初期音速はブナ材よりも全体的に大きかった。各測定位置での音速は負荷の大きさにより変化した。例えばスプル-ス材で横波を用いた測定では,音速の変化割合は材の中心より上側の各位置では正で,下側の各位置では負であった。上記の音弾性特性に関する結果より,材の上側では引張応力域,下側では圧縮応力域であることが判明した。これらの値は負荷が大きくなるほど,また,中心から離れるほど概略において大きくなった。これらを対応する位置の音弾性定数で除すと応力が求められた。同時にひずみゲージより求めた応力と材料力学により求めた応力の値を比較すると,3種の方法により求めた応力値は大略において一致しており,音弾性法による応力推定値がほぼ妥当な結果を得ていることが裏付けられる。以上の結果は,木材の応力測定に関する音弾性法の適用の可能性を示唆するものであるが,この方法の実用化のためには木材の音弾性特性に関する更なる詳細把握と測定技術上の諸問題の解決が望まれる。
超精密切削加工における切削熱に関する研究

超精密切削加工における超微小切削機構を明らかにするため、切削熱の観点より超精密ダイヤモンド切削実験ならびに解析を行った結果、以下のような知見を得た。1.走査型電子顕微鏡内で超微小2次元切削実験を行い、超精密切削過程の直接観察およびせん断角,切削力の測定を行った結果、切りくず生成は極めて薄いせん断域に集中して起り、また超精密切削加工機を用いた高速の超微小2次元切削実験結果と良い一致がみられた。これらの測定値を用い、また単一せん断面モデルを仮定して求めた平均切削温度は実験測定結果と良い一致がみられた。2.実験に用いた工具及び被削材の3次元有限要素モデルを作成し、実験的に同定した切削熱を熱源として与えた場合のそれらの熱伝導及び熱変形解析を行なった結果、工具のチップ近傍では5°C程度まで温度上昇するのに対して、被削材ではほとんど温度上昇がみられなかった。また、工具を送る方向によっても温度上昇の仕方ならびに最高温度上昇の値が異なることがわかった。これらの結果は、実験結果と良い一致がみられた。3.発生した切削熱による工具および被削材の熱膨張加工誤差を測定した結果、0.40.6μmもの相対加工誤差を生じた。切削速度が高速から低速になる側に工具を送った場合、そうでない場合に比べて加工誤差が大きく生じた。送り方向に対する加工形状誤差は工具シヤンクの温度上昇の変化の傾向に非常に良く一致して生じた。1.単結晶ダイヤモンド工具を用いて、nmオ-ダの超微小切込みによる無酸素銅の超微小2次元切削実験を行い、測定した切削力(主分力,背分力)に基づいて、発生した切削熱量と工具、切りくず,工作物への流入割合を算定した。観常切削では、切削熱のほとんどは切りくずによって持ち去られるのに対して、微小切削では大半は工作物に流入することが計算によりわかり、またその熱量は熱変形において無視できない大きさであることがわかった。2.切削熱を算定するのに必要な工具と被削材の接触面積を同定するため、工具表面の接触痕のSEM観察画像をコンピュ-タ画像処理することにより、接触領域、面積を精度よく求めることができた。通常切削に比べて、切込みに対する接触長さの割合は23オ-ダ大きくなることが明らかとなった。3.工具の温度上昇と被削材の形状誤差の測定ならびに有限要素法による解析を行った結果、切削熱が加工精度に及ぼす影響は無視できないことが明らかとなった。工具の温度上昇は数°Cとなり、被削材の形状誤差は数μmにも及ぶことがわかった。4.被削材表面にケロシンを塗付することにより、工具の温度上昇ならびに被削材の形状誤差を小さくすることができた。油剤をミスト状にして吹き付け、強制的に熱を奪うことによってさらに温度上昇を低くなることが明らかとなった。
パラインフルエンザ2型ウイルスV蛋白と関与する宿主因子の網羅的検索と解析

パラインフルエンザ2型ウイルス(hPIV2)のV蛋白と結合する宿主蛋白の網羅的検索を試みるため、Yeast Two-hybrid法を使った。その結果、約1000個の陽性クローンを得、シークエンスの結果、約100個の蛋白を同定した。その1つのImportinαの結合部位を欠損させるとウイルスの増殖が阻害される事が明らかになった。また、マイクロアレイの結果より、V蛋白の有無により遺伝子発現が変化し、V蛋白と結合する宿主蛋白が幾つか見つかった。1.V蛋白はL蛋白と結合し、ウイルスゲノムの転写複製を抑制している事が明らかになった。V蛋白は宿主細胞の抗ウイルス活性に抵抗する機能、ウイルスの増殖を促進する機能も同時に担っており、ウイルス増殖が最適な状態になるようにバランスをとっていると考えられる。またL蛋白上の他のウイルス蛋白との結合は全てN末側にある事を同定し、さらにL蛋白の機能に重要な新たな領域も同定した。2. Yeast Two-hybrid法によってV蛋白と結合する宿主蛋白を網羅的に検索するため必要なベクターを構築し、スクリーニングを行った。スクリーニングにより得られたコロニーを大きいものから陽性コロニーとして平板培地に取得した(約2000個)。3.陽性コロニーの酵母よりDNAを回収し、プラスミドを得た。細菌選択マーカーの違いを利用しライブラリー蛋白の入ったプラスミドのみを大腸菌で増やし、そこからプラスミドを精製し、シークエンスを行った(約1000個)。4.得られた遺伝子をヒトゲノムのBLASTを使ってアライメントし、蛋白を同定した(約100個)。同定したものの中に既にV蛋白と結合する事が明らかになっているSTAT1,Mda-5が含まれていたので、今回行ったスクリーニングには信憑性があると考えて良い。5.同定した蛋白のうち、V蛋白に機能に関連があるのではないかと考えられるものを幾つか選び、動物細胞内での蛋白の相互作用等について検討に入るためのベクターの構築を行った。1.Yeast Two-hybrid法によってV蛋白と結合する宿主蛋白の1つにImportin αの存在が明らかになった。V蛋白は核に局在する事が解っているので、そのメカニズムについて検討を試みた。2.V蛋白と結合するImportinはImportinα5とImportinα7であった。Importinα5をN末側とC末側に分け、V蛋白との結合を検討した結果、N末側と結合する事が明らかになった。また、Importinαと結合するV蛋白上の領域はP/V共通領域にあった。3.V蛋白の核移行シグナルはP/V共通領域にある事から、P蛋白も核に移行しうるのに、P蛋白は細胞質に分布する。P蛋白特異的領域に核外移行シグナルが存在すると考え、そのシグナルに必須のアミノ酸を同定した。また、Leptomycin B存在下でP蛋白は核に留まる事から、P蛋白上の核外移行シグナルはCRM1-dependentである事が明らかになった。4.核移行シグナルならびに核外移行シグナルと考えられるアミノ酸とβ-galactosidaseの融合蛋白を発現させ、シグナルである事を同定した。5.P蛋白は核と細胞質を行き来しているが、その移動がウイルス増殖に及ぼす影響をミニゲノムの系を用いて検討した。P蛋白の核移行シグナルを欠損させると増殖が悪くなり、核外移行シグナルを欠損させるとさらに悪くなった。パラミクソウイルスは細胞質で増殖するため、増殖に必須であるP蛋白は主に細胞質に存在する事が不可欠であるだけでなく、P蛋白が核と細胞質を行き来する事もウイルス増殖に影響を与える事を明らかに出来た。6.V蛋白欠損ウイルスを感染させたLLC-MK_2細胞ではwtに比べて明らかに激しい細胞傷害を引き起こした。Yeast Two-hybrid法によってV蛋白と結合する宿主蛋白の中で、アポトーシスに関与する蛋白を中心にさらなる検討を継続している。1.Yeast two-hybrid systemによるパラインフルエンザ2型ウイルスのV蛋白と結合する宿主細胞蛋白の検索結果とマイクロアレイによるwtおよびV蛋白欠損ウイルス感染細胞RNA比較の結果、V蛋白と結合し、V蛋白欠損ウイルスによる遺伝子発現が変化する蛋白が幾つか存在することか明らかになった。2.明らかになった宿主蛋白の中で、サイトカインやインフラマザゾーム関連を中心にmammalianの細胞でもV蛋白と結合するかを検討した。3.ウイルス細胞傷害性を検討するため、HN蛋白に変異を入れた細胞融合をおこさないリコンビナントウイルスF13を作製した。そのF13のV蛋白のC末欠損リコンビナントウイルス(F13-VdC)を作製した。V蛋白欠損ウイルスを作製しようとしたが、うまくいかなかった。5.V蛋白と宿主細胞膜の蛋白との関連を検討するため、まずウイルス膜蛋白とV蛋白、ウイルス膜の裏打蛋白であるといわれているM蛋白との相互作用を解析するため、新たにDUAL membraneシステムを構築した。6.パラインフルエンザ2型ウイルスと比較するため、既に幾つかの事が明らかになっている同じパラミクソウイルス科のセンダイウイルスのDUAL membraneシステムも構築した。

7.ウイルスポリメラーゼであるL蛋白がV蛋白と結合し、ウイルスの転写複製を調整している事が解ったので、その結合に重要な領域を明らかにした。8.既に構築した、ミニゲノムの系を使って、L蛋白の機能に重要な領域を特定する事が出来、その領域はmRNAのキャッピングに重要である事が推測された。