hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新しい４次元ＣＴ血管造影を用いた脳動脈瘤破裂メカニズムの解明

4DCTAにおける脳動脈瘤壁運動について定量化,可視化について様々な手法,技術を用いて検討をおこなった。動脈瘤全体の拍動は正常血管より大きく,壁菲薄化部位で局所的拍動が観察された。画像処理技術(PhyZiodynamics technology)を応用した詳細な4D Imageは脳動脈瘤の拍動評価に有用であった。一方で,数値流体解析との検討では,瘤内血流条件による造影剤の分布不均一が拍動の可視化に影響を与えていると思われ,拍動運動は二次回旋流や乱流といった瘤内血流を二次的に捉えている可能性が示唆された。我々は新たな4D-CTA(DFA)を開発し、動脈瘤拍動の定量化を行なうべく研究を進めてきた。Zio soft社が開発した画像処理技術(PhyZiodynamics technology)は心臓の4DCTにおいて拍動の定量化を行なっており,我々はZiosoftの協力を得て,このtechnologyを脳動脈瘤の拍動解析に応用し,定量化をおこなった。今年度はDFAで可視化される壁の拍動と造影剤分布に影響すると推測される瘤内血流状態を比較するため、CFD解析を行った。【方法】CTはAquilion ONE,first passと注入開始から35秒後のsecond passでDynamic scanを3秒間ずつ施行した。再構成はRR interval 10%による1心拍10phaseとDFAのDICOM dataとし,Pnyziodynamics technologyを用いて瘤の拍動可視化、定量化をおこなった。CFD解析にはANSYS CFXを使用し、瘤内の3次元流線、血流速度を比較した。【結果】PhyZiodynamicsによる4DCTAにて観察された壁拍動部位は瘤壁近傍の血流が2次回旋流となっており、流速が遅い部分と一致した。これは上記血流条件では造影剤分布が不均一なため、可視化した際に拍動運動として可視化されていることが予測された。4D-CTAは瘤内血流を2次的に瘤内血行力学を観察している可能性が示唆された。Zio soft社が開発した画像処理技術(PhyZiodynamics technology)は心臓の4DCTにおいて拍動の定量化を行なっており,我々はZiosoftの協力を得て,このtechnologyを脳動脈瘤の拍動解析に応用し,定量化を試みた。再構成はRR interval 10%による1心拍10phaseとDFAのDICOM dataとし,瘤の拍動可視化、定量化をおこなった。【結果】PhyZiodynamicsによる4DCTAではスムーズな拍動が観察できるため、視覚的に非常に有用であった。また動脈瘤拍動を定量的に評価することも可能であった。DFAによる元データが最もmotion artifactが少なかった。撮影タイミングによる拍動の相違も観察された。この結果は,平成25年2月にCI学会などで一部報告した。Ziosoftの協力によりソフトウエア開発の目処がたったため。一方,PhyZiodynamics technologyは心拍動定量化の技術であり,脳動脈瘤拍動定量化を行なうためには,基準点の設定やコンター図での評価方法が必要であり, Ziosoftとソフトウエアの開発を行なっていく予定である。ソフトウエア開発のための費用ならびに物品また学会発表のための経費
レンチウイルスベクターによる視床-大脳新皮質相互結合の定量的解析

レンチウイルスは長期発現が可能であるという利点はあるものの、目的遺伝子の発現量が他のウイルスベクターよりも弱いという欠点があった。そこで、神経細胞特異的かつ高発現を可能にするレンチウイルスの開発を進めた。神経細胞特異的プロモーター(SYNプロモーターなど)の制御下でGFPを発現させた場合、ウイルス注入から一週間程度ではGFPの蛍光輝度は非常に弱く、GFPの発現を検出するには免疫染色法が必須となる。そこで、SYNプロモーター下でテトラサイクリン調節性トランス活性化因子(tTA:Tet-Off)を神経細胞特異的に発現するウイルス、Tet応答性プロモーター下でGFPを発現するウイルスを二重感染させるシステムを開発した(Double Lentiviral Vector Tet-Off Platform)。神経細胞特異的に発現したtTAはTREプロモーターを活性化し、その結果GFPの蛍光輝度は40倍程度まで増大した。8週間に渡ってGFPの発現を観察したが、神経細胞特異性に変化はなく、また細胞傷害性も認められなかった。本研究の最終目的は、逆行性経シナプストレーサー(Tetanus Toxin C fragment, TTC)もしくは順行性経シナプストレーサー(Wheat germ agglutinin, WGA)を発現する新規ウイルスベクターを開発し、その後成体ラットを用いて視床・大脳新皮質局所神経回路の定量的解析を目指すものである。本研究で用いるレンチウイルスはHIV-1由来であるが、長期発現が可能であるという利点はあるものの、目的遺伝子の発現量が他のウイルスベクターよりも弱いという欠点があった。そこで、SYNプロモーター下でテトラサイクリン調節性トランス活性化因子(tTA : Tet-Off)を神経細胞特異的に発現するウイルス、Tet応答性プロモーター下でGFPを発現するウイルスを二重感染させるシステムを開発した(Double Lentiviral Vector Tet-Off Platform)。よって本研究課題のように、目的遺伝子(TTCやWGA)の強発現を必要とする実験系には、有用なツールであると言えよう。今後は新たに開発した当システムを用い、本研究計画を進めて行く予定である。本研究の最終目的は、逆行性経シナプストレーサー(Tetanus Toxin C fragment, TTC)もしくは順行性経シナプストレーサー(Wheat germ agglutinin, WGA)を発現するウイルスベクターを開発し、その後成体ラットを用いて視床・大脳新皮質局所神経回路の定量的解析を目指すものである。昨年度は、神経細胞特異的かつ高発現を可能にするレンチウイルスの開発を行った(Hioki et al., 2009)。神経細胞特異的プロモーターであるSYNプロモーター下でテトラサイクリン調節性トランス活性化因子(tTA:Tet-Off)を発現するウイルス、Tet応答性プロモーター下でGFPを発現するウイルスを二重感染させるシステムを利用することで、目的遺伝子の発現量が従来のシステムに比し、40倍程度まで増強した。そこで本年度は、Tet-Offシステムを用い(a) TTCもしくはWGAとレポータータンパク(蛍光タンパク)を共発現するレンチウイルスの開発、(b) TTCもしくはWGAの検出法の最適化を試みた。(a) Tet応答性・双方向性プロモーター(TREB)を用いて実験を始めたが、2種の遺伝子発現量が感染細胞によって大きくばらつくといった問題に直面した。そこで共発現に最適なシステムの開発を行った結果、手足口病ウイルス由来の2Aシグナルを利用すればよいことが分かった。現在は2Aシグナルを用いたレンチウイルスの作成に着手したところである。(b)『抗体の作成・精製』『PAP法とTSA法を組み合わせた高感度増感法の開発』を行った結果、TTCについてはシナプスを逆行性に超えたタンパクの検出に成功した。ただし、染色毎にばらつきが生じるため、更なる改良が必要と思われる。WGAについては現時点でシナプスを超えた像を検出できていない。
自己修復性超分子機能性材料の開発

フラーレンを主鎖に組み込んだ超分子フラーレンポリマーとビスポルフィリンの分子認識を駆動力に重合する超分子ポルフィリンポリマーの合成を行った。今回,合成した超分子フラーレンポリマーの固体状態の構造を原子間力顕微鏡により検討したところ,ポリマーの形成を示唆する層分離構造が観測された。また,分岐構造をもつ拡張型超分子フラーレンポリマーネットワークの合成に成功した。このネットワークは一次元に成長したポリマーに比べ高い粘度応答やネットワークに特有の形態を与えた。また,ポルフィリンポリマーの溶液粘度は,非共有結合により生成する高分子にもかかわらず主鎖の絡み合いが起こっていることを示唆する結果を与えた。研究目的:本研究計画では,我々がこれまで開発してきた包接モチーフを基盤とした超分子ポリマーを利用して自己修復機能を有する高分子材料の開発を試みる。非共有結合により維持される超分子ポリマーから調製される高分子材料は非共有結合の可逆的性質により切断されても,切断面が結合の再形成により修復される。一方で,可逆的結合は共有結合に比べ非常に弱いため,材料としての物理的強度を得ることが非常に難しく,非共有結合を基盤とした超分子ポリマー材料の開発例は極めて少ない。この二つの矛盾する機能を解決するため,新たな超分子ポリマーを提案しこれらの問題を解決すると共に自己修復機能を有する新規な超分子ポリマー材料を開発する。超分子ポリマーの高次化により非共有結合を基盤としたネットワーク型超分子ポリマー構造を設計する。超分子ポリマーを形成するモノマーのゲスト包接部位を従来の二カ所から三,四カ所に拡張することで高次空間に広がった超分子ポリマーを構築することができる。この様にして形成されるポリマーは多点分子間相互作用が協同的に働くことで,一次元ポリマーに比べポリマー形成に寄与する結合が大きく安定化される。従って,高次に拡張された超分子ポリマー構造は,安定な自立膜を形成すると期待できる。この様にして大きく拡張された超分子ポリマーはそれぞれの結合が可逆的であるため,いったん結合の切断が起こっても容易に再結合ができるため,自己修復機能を実現できる。研究実績:現在多点結合部位をもつポリフィリンクレフト分子やビスカリックスアレーンホスト分子の合成をほぼ完了している。ポリマー主鎖を導入したホストやゲスト分子を合成し,ポリマーを基盤とした超分子ポリマーの開発にも着手している。本研究計画では,我々がこれまで開発してきた包接モチーフを基盤とした超分子ポリマーを利用して自己修復機能を有する高分子材料の開発を試みる。研究実績:現在多点結合部位をもつポリフィリンクレフト分子やビスカリックスアレーンホスト分子の合成を完了した。超分子ポリマーに架橋剤を添加することで,超分子ポリマーから自立膜を作り出すことに成功した。自己修正を実現するにはさらに検討が必要であるが,超分子ポリマーから自立膜を合成できたことは,当初の目的であった結合強度の問題を解決することができたことを示している。

超分子ポリマーを形成するモノマーのゲスト包接部位を従来の二カ所から三,四カ所に拡張することで高次空間に広がった超分子ポリマーを構築することができる。この様にして形成されるポリマーは多点分子間相互作用が協同的に働くことで,一次元ポリマーに比べポリマー形成に寄与する結合が大きく安定化される。従って,高次に拡張された超分子ポリマー構造は,安定な自立膜を形成すると期待できる。この様にして大きく拡張された超分子ポリマーはそれぞれの結合が可逆的であるため,いったん結合の切断が起こっても容易に再結合ができるため,自己修復機能を実現できる。研究実績:現在多点結合部位をもつポリフィリンクレフト分子やビスカリックスアレーンホスト分子の合成をほぼ完了している。今後これらの,会合に関する知見を得る予定である。初年度に計画した多点包接部位をもつホスト分子の合成が比較的順調に進行している。また,ポリマーとポリマーの結合部位となる分子認識モチーフの会合定数もすでに決定しており,ポリマーを結合するに十分な強さを有していることがわかった。今年度はコアとなるホスト分子の大量合成と共に自己修復の評価を行えると考えている。今後多用な構造をもつホスト分子とゲスト分子の合成を行いそれらの会合による超分子ポリマーの合成を行う。合成した超分子ポリマーの物性を明らかにしつつ,分子構造とポリマーの物性の関係を考察する。自立膜ができる程度の強度を有するポリマー材料へと展開を目的に,ポリマーとのハイブリッド化により実用可能なポリマー材料を開発する。自立膜ができる程度の強度を有するポリマー材料へと展開し,自己修復能を有する超分子ポリマー材料を開発する。次年度は本研究計画を進めるために,多用な有機分子の合成を行う。化学合成には非常に多くの溶媒や分離用シリカゲル,合成試薬が消耗品として必要になるので,消耗品を主な使途として計画する。その他,研究発表のための学会出席旅費,機器使用料,論文投稿料などを主な使途として計画する。
左ヒラメに右カレイの謎と健苗育成に向けた稚魚発生システムの解明

ヒラメ・カレイ類の左右非対称性の制御機構と脊椎骨発生機構を解析した.内臓と間脳の非対称性を制御するNodal経路がヒラメ・カレイ類の左右非対称制御を制御することが証明された.左ヒラメと右カレイを振り分ける発生機構にNodal経路に加え手綱核および視神経束交叉が関与していることが示された.体色の左右差は、背鰭基部に分布する色素前駆細胞が筋間膜を通って左右両側の皮膚に遊走する間に、有眼側でのみ色素芽細胞に分化することで形成される.レチノイン酸への暴露は、無眼側の色素前駆細胞も色素芽細胞に分化誘導し、無眼側黒化を起こすことが分かった.またレチノイン酸による脊椎骨機構の発生機序が解明された.ヒラメ・カレイ類の左右非対称性の制御機構と脊椎骨発生機構を解析した.内臓と間脳の非対称性を制御するNodal経路がヒラメ・カレイ類の左右非対称制御を制御することが証明された.左ヒラメと右カレイを振り分ける発生機構にNodal経路に加え手綱核および視神経束交叉が関与していることが示された.体色の左右差は、背鰭基部に分布する色素前駆細胞が筋間膜を通って左右両側の皮膚に遊走する間に、有眼側でのみ色素芽細胞に分化することで形成される.レチノイン酸への暴露は、無眼側の色素前駆細胞も色素芽細胞に分化誘導し、無眼側黒化を起こすことが分かった.またレチノイン酸による脊椎骨機構の発生機序が解明された.本研究では、ヒラメ・カレイ類に固有な眼の配置および体色の左右差形成の発生制御機構を解明するとともに、健苗育成技術開発に資することを目的として、外部環境要因(栄養素、水温、日照等)が眼位や体色、骨格系に発生異常を誘起するメカニズムを解明する。これまでの研究により左右決定遺伝子pitx2が変態期に脳内左側で発現し、眼位を制御することを明らかにしたので、今年は変態ホルモンが再発現の誘導に関与する可能性を試験した。pitx2の発現調節領域(左特異的エンハンサー)の配列を解析した結果、甲状腺ホルモン受容体あるいはコルチゾル受容体が結合する応答配列が存在することを発見した。さらにコルチゾルにpitx2の発現誘導効果が認められたことから、変態ホルモンによる発現調節機構のあることが示唆された。左右に形成された両眼のうち、変態期にヒラメでは右眼が、カレイ類では左眼が反対体側に移動するが、ヒラメとカレイで眼位を逆に振り分ける発生システムについて検討するため、頭部で最初に細胞増殖がヒラメとカレイで左右逆に発生する領域を調べた。増殖細胞核抗原PCNAの免疫染色により、視交叉の直上の間脳下部で最初にヒラメとカレイで左右逆な細胞増殖域が発生することを発見した。このような差異を発生する原因として、ヒラメでは右眼由来の視神経束が必ず背側を通るのに対し、カレイでは左眼由来の視神経束が必ず背側を通るため、視交叉直上の間脳に左右逆の捻れが発生することが考えられた。日照と色素形成との関係を検討するための墓礎データとして、魚類ではこれまで不明であった脳内時計の位置を時計遺伝子period 2(per2)の発現により解析した。その結果、視交叉上核、松果体基部、脳下垂体にper2が発現することが示され、これらの部位が概日リズムを刻む体内時計として機能することが示唆された。本研究では、増養殖種苗の生産技術開発に資することを目的として、ヒラメ・カレイ類に固有な眼と体色の左右非対称性形成の分子制御機構を解明するとともに、飼育環境要因(栄養素、日照等)により誘起される眼位や体色異常の発生メカニズムを解明する。23年度は日照と脳内分泌、色素異常との関連について解析した。24時間照明下でヒラメ仔魚を2週間飼育すると、視交叉上核のドーパミン(下垂体でのα-MSH発現と分泌を抑制する)の合成が強く抑制された。MCHニューロンへの影響は認められなかった。これらにより脳下垂体ではα-MSH合成が活性化されるが分泌は抑制されると言うアンバランスが生じ、過剰なα-MSH蓄積によりメラノトローフが膨満した。そのまま変態まで飼育を続けると、白化と黒化が高率に発生した。これらの現象について、MCHによりα-MSH分泌が抑制され続けた場合に白化が発生し、過剰に蓄積したα-MSHが血中に放出された場合には黒化となるものと解釈した。体色の左右差形成に関与する候補遺伝子をスクリーニングするために、マウスで色素形成に関与することが分かっている50種類の遺伝子、およびメダカdouble analの原因遺伝子zic1の発現をトラフグの背側皮膚、背側筋肉、腹側皮膚、腹側筋肉で比較した。背側皮膚と背側筋肉でのみ発現する遺伝子としてzic1、背側皮膚で強く発現する遺伝子としてメラノコルチン受容体メンバーの1種類、甲状腺ホルモン転換酵素dio2が見つかった。このうちzic1は、ヒラメにおいて仔魚期にはトラフグと同様に左右の背側筋肉と皮膚で発現したが、変態期に左の背腹の筋肉と皮膚に発現がシフトすることが分かった。メダカでは背側に発現するzic1が色素胞の背側への分布を誘導することが知られており、ヒラメではzic1発現の切り替えが体色の左右差形成に関与している可能性が予想される。

ヒラメ・カレイ類は変態過程に有眼側皮膚が褐色、無眼側皮膚が白色に着色することにより体色が左右非対称となる。養殖用種苗では、無眼側皮膚が着色する黒化と呼ばれる体色異常が出現することがあり、その原因解明が望まれている。前年度、色素前駆細胞が仔魚背鰭基部に存在し、変態期に筋間膜を通って左右皮膚に移動し、その間有眼側でのみ色素胞への分化が起こることを明らかにした。黒化と色素前駆細胞の挙動との関係を調べることを目的として、黒化の誘起物質であるレチノイン酸(RA:活性型ビタミンA)と変態期仔魚をインキュベートし、色素前駆細胞の挙動を解析した。仔魚をRAと3日間インキュベートすると、有眼側に分布する色素前駆細胞も有眼側と同レベルに色素芽細胞のマーカー遺伝子を発現した。また同時期の無眼側皮膚をRA存在下で培養すると、マーカー遺伝子を発現する色素芽細胞が出現した。これらの結果から無眼側に分布する色素前駆細胞は、外的RAにより色素前駆細胞から色素芽細胞へ分化誘導され、黒化が起こることが推定された。RAと黒化の関係を推定すると、無眼側には正常発生ではRAを分解して低レベルに維持するシステムがあり、外的RAにより体内のRAが均一的に全身で高濃度となり、色素芽細胞が分化することが考えられる。体色の正常な左右性形成機構と体色異常の原因を究明するためには、さらにRA分解酵素であるcytochrome P450系の酵素が発無眼側で発現する可能性を検討する必要がある。養殖魚全般の問題である脊椎骨異常の発生機序を理解する一助として、ヒラメを材料として次世代シーケンサーを使った脊椎骨のトランスクリプトーム解析を行った。ビタミンAからRAへの合成系の酵素遺伝子やRA受容体遺伝子が発現していることが明らかになり、骨格の発育でビタミンAの代謝や活性が重要な役割を果てしていることが推定された。ヒラメ体色形成に関するこれまでの研究により、成魚型色素胞前駆細胞の体幹正中部から皮膚への移動は左右に起こり、前駆細胞から色素胞への分化が有眼側のみで起こるために体色の左右差が生じることが示唆されている。今回は、体色の左右差形成の分子制御機構について手掛かりを得るために、メダカで背腹の体色パターンを制御することが知られているzic1(double anal fin)のヒラメ仔魚での発現を解析した。H期仔魚において、有眼側皮膚組織(表皮および真皮、近傍の結合組織)でzic1の発現が観察された。また同時期に、無眼側皮膚の表皮がアセチル化チューブリン抗体に陽性となることが観察された。このような左右差は両者ともにG期には検出されず、I期には一部個体のみで検出された。今回の結果は、変態期の皮膚組織で分子レベルの左右差を検出した初めての例であり、異体類体色の左右形成機構の解明への手掛かりとなるものと期待される。養殖魚ではしばしば脊椎骨奇形が問題となり、これまでの研究により幾つかの原因が特定されているが、その機序には不明な点が多い。この点を理解する手掛かりを得るために、レチノイン酸(RA:活性型ビタミンA)で脊椎骨異常を実験的に誘導し、骨奇形の進行過程を組織学的に解析した。RA処理個体では、一つの椎体前駆組織から複数の神経弓と血管弓が伸びる異常が観察され、RA処理によりリガメント組織(椎間板様組織が形成される部分の外周をリング状に囲む)が変性して複数の椎体前駆組織が一つの構造となっていると考えられた。これらの結果から、RA処理によりリガメント組織が変性し、それに伴い骨化の過程で脊索から形成される椎間板様組織が消失し、複数の椎体が融合することにより、脊椎骨融合が生じることが推定された。
非線形超音波法を用いた心筋浮腫の診断

様々な心疾患の急性期に出現する心筋浮腫は、非常に大きな臨床的意義を有する病態であるが、心疾患急性期における診断は困難である。非線形超音波法は、射出された超音波により標的内で副次的に生成される非線形信号を捕捉し画像化する画像診断法である。本研究の目的は、非線形超音波法を用いた心筋浮腫の診断である。ブタ心臓浮腫モデル、非線形超音波法、人工知能を用い、心筋浮腫特有の非線形信号パターンを抽出し、さらに非線形評価指数を併用し、浮腫の存在と程度を診断するアルゴリズムを作成する。本研究から非線形超音波診断法による心筋浮腫診断が可能となれば、急性期にベッドサイドで心筋浮腫の診断が可能となる。
寒冷な丘陵地の水稲環システムに関する現象学的研究

寒冷地域においては、降雪が年間降水量に占める割合が多い。すなわち積雪が水文機構に及ぼす影響は大きい。積雪は農業用水源として重要な水資源貯留機構である。融雪は豪雨と並ぶ土壌侵食力をもっている。したがって、積雪を含む水循環系を究明することは、水資源の確保と運用の上でも、土壌保全の立場からも極めて重要な課題となる。そこで、農地に直接、または、近傍にあって大きな影響を与える丘陵地の水循環機構を、寒冷地域の積雪中での水の流出移動がどのような現象特性をもっているかということまで明らかにしようと試みた。この結果について以下のように報告をする。1.水循環機構調査1)亜寒帯における冬季の水文:水面の氷結、地下凍結に特徴有。2)亜熱帯における冬季の水文:氷がない水の挙動に特徴有。3)高山帯における夏季の水文:越年性積雪の存在と水文地質・地形に特徴有。4)丘陵地における夏季の水文:土壌水分状態と地形の関係に特徴有。2.積雪水文1)小地形上の積雪:地形(斜面方向)、植生で影響有。2)小流域上の積雪:標高差の影響が小さい流域では小地形上と同様。3.融雪水文1)小地形上の融雪:積雪層の水移動が融雪時間に影響有。2)小流域上の融雪:南北斜面の融雪時間差が特徴有。4.融雪流出1)融雪水の流れ:積雪中では鉛直流の他、層平行・層直角流がある。2)河道流出成分:融雪流出成分は水温変化に影響を与えている。5.融雪流出量:寒冷な丘陵地の水源として水文的に有効である。寒冷地域においては,降雪が年間降水量に占める割合が多い.すなわち,積雪が水文機構に及ぼす影響は大きい.積雪は農業用水源として重要な水資源貯留機構である.融雪は豪雨と並ぶ土壌侵食力をもっている.したがって,積雪を含む水循環系を究明することは,水資源の確保と運用の上でも,土壌保全の立場からも極めて重要な課題となる.そこで,農地に直接,または,近傍にあって大きな影響を与える丘陵地の水循環機構を,寒冷地域の積雪中での水の流出移動がどのような現象特性をもっているかということまで明らかにしようと試みた.このために以下のような調査を実施し,現在,昭和62年度分を総括中である.また,現地での観測(河川流量,河川水温,積雪諸量)は継続中である.1水循環機構調査1)積雪・寒冷丘陵地の河川流量調査-上中の沢流域2)少積雪・寒冷丘陵地流域を水源とした低湿地の水文調査-釧路川流域3)高山地域の比較水文調査(植生,土壌,地形,地質状況に着目した視察)-長野県北アルプス山岳地,越年性雪渓4)多積雪地の比較水文調査-北海道内(山岳地を含む)等2積雪水文調査1)小地形上の積雪水量の変化-草地,林地,南向斜面,北向斜面,平地,低湿地2)試験流域の融雪水の移動調査-南向斜面,北向斜面調査によって得られたデータは演算処理過程にある.得られたデータの種類は水位,水温,雨量,積雪量,気温があるので,気象台資料とも合わせて現象モデルを考究中である.寒冷地域においては、降雪が年間降水量に占める割合が多い。すなわち、積雪が水文機構に及ぼす影響は大きい。このために以下のような調査を実施し、現在、昭和61年度分を総括中である。また、現地での観測(河川流量、貯水池水位、積雪量)は継続中である。1水循環機構調査1)積雪、寒冷な丘陵地河川流量調査ー上中の沢流域2)積雪、寒冷な丘陵地流域を水源とした農業用溜池の貯水状況調査ー大正池、瑞穂池3)非積雪・非寒冷な丘陵性地域の比較水文調査(植生および、土壌、地質状況に着目した視察)ー沖縄県内丘陵農地、自然地4)多積雪地の比較水文調査ー北海道内(山岳地を含む)等2積雪水文調査積雪量の変化と積雪各層における融雪水の移動調査ー草地、林地、南向斜面、北向斜面、平地、の場所分け調査によって得られたデータは演算処理過程にある。また、データの種類は、水位、雨量、気温、積雪量があるので、気象台資料とも合わせて、現象モデルを考究中である。

この結果について以下のように報告をする。1.水循環機構調査1)亜寒帯における冬季の水文:水面の氷結、地下凍結に特徴有。2)亜熱帯における冬季の水文:氷がない水の挙動に特徴有。3)高山帯における夏季の水文:越年性積雪の存在と水文地質・地形に特徴有。4)丘陵地における夏季の水文:土壌水分状態と地形の関係に特徴有。2.積雪水文1)小地形上の積雪:地形(斜面方向)、植生で影響有。2)小流域上の積雪:標高差の影響が小さい流域では小地形上と同様。3.融雪水文1)小地形上の融雪:積雪層の水移動が融雪時間に影響有。2)小流域上の融雪:南北斜面の融雪時間差が特徴有。4.融雪流出1)融雪水の流れ:積雪中では鉛直流の他、層平行・層直角流がある。2)河道流出成分:融雪流出成分は水温変化に影響を与えている。5.融雪流出量:寒冷な丘陵地の水源として水文的に有効である。
個人識別・親子鑑定におけるシングル遺伝子座位の高多型性DANプロ-ブの有用性

平成2年度には,singleーlocus DNAプロ-ブの個人識別・親子鑑定における有用性について検討を行った.用いたプロ-ブと制限酵素の組合せは,pYNH24ーMspI,pYNZ22ーMspI,pYNZ2ーRsaI,NR24/1ーHinfI,3'globinーPvuII,MucinーPvuII,HaーrasーPvuIIである.上記のプロ-ブと制限酵素の組合せを用いて日本人集団(138236名)における遺伝子頻度を求め,排除率・probability of matchingを得た.pYNH24ーMspIで対立遺伝子数は33,排除率は0.89であった.pYNZ22ーMspIでは対立遺伝子数15,排除率0.83,pYNZ2ーRsaIで対立遺伝子数5,排除出0.29,MR24/1ーHinfIでは対立遺伝子数37,排除率0.92,3'GlobinーPvuIIでは対立遺伝子数39,排除率0.86,MucinーPvuIIでは遺立遺伝子数10,排除率0.35,HaーrasーPvuIIでは対立遺伝子数5,排除率0.25であった.これら7種プロ-ブの総合排除率は0.999932という高い値となった.また各々について得られた2random personのprobability of matchingを総合いると,3.55×10^<-11>という優れた値が得られた.以上よりsingle locus DNAプロ-ブは,個人識別・親子鑑定に極めて有用であることが明らかになった.平成3年度にはPCR法による個人識別・親子鑑定について検討を加えた.Apo B遺伝子の3'末端領域に存在する反復配列数の相違に基づく遺伝的多型を日本人集団(134名)について検討した.その結果,14種類の対立遺伝子が検出され,反復配列数41(遺伝子頻度0.52)を中心に一峰性に分布していた.排除率は0.478,probability of matching(2random persons)は0.130であった.またRichardsらの報告した第4染色体上の繰返し配列(YNZ32)を増幅させるプロイマ-を作製し,日本人集団における多型性の検討を始めている.平成2年度には,singleーlocus DNAプロ-ブの個人識別・親子鑑定における有用性について検討を行った.用いたプロ-ブと制限酵素の組合せは,pYNH24ーMspI,pYNZ22ーMspI,pYNZ2ーRsaI,NR24/1ーHinfI,3'globinーPvuII,MucinーPvuII,HaーrasーPvuIIである.上記のプロ-ブと制限酵素の組合せを用いて日本人集団(138236名)における遺伝子頻度を求め,排除率・probability of matchingを得た.pYNH24ーMspIで対立遺伝子数は33,排除率は0.89であった.pYNZ22ーMspIでは対立遺伝子数15,排除率0.83,pYNZ2ーRsaIで対立遺伝子数5,排除出0.29,MR24/1ーHinfIでは対立遺伝子数37,排除率0.92,3'GlobinーPvuIIでは対立遺伝子数39,排除率0.86,MucinーPvuIIでは遺立遺伝子数10,排除率0.35,HaーrasーPvuIIでは対立遺伝子数5,排除率0.25であった.これら7種プロ-ブの総合排除率は0.999932という高い値となった.また各々について得られた2random personのprobability of matchingを総合いると,3.55×10^<-11>という優れた値が得られた.以上よりsingle locus DNAプロ-ブは,個人識別・親子鑑定に極めて有用であることが明らかになった.平成3年度にはPCR法による個人識別・親子鑑定について検討を加えた.Apo B遺伝子の3'末端領域に存在する反復配列数の相違に基づく遺伝的多型を日本人集団(134名)について検討した.その結果,14種類の対立遺伝子が検出され,反復配列数41(遺伝子頻度0.52)を中心に一峰性に分布していた.排除率は0.478,probability of matching(2random persons)は0.130であった.またRichardsらの報告した第4染色体上の繰返し配列(YNZ32)を増幅させるプロイマ-を作製し,日本人集団における多型性の検討を始めている.本研究には3種のVNTRプロ-ブpYNH24、pYNZ22、pYNZ2および4種のHVRプロ-ブMR24/1、3'Globin、Mucin、Haーrasを用いた。上記のプロ-ブと制限酵素の組合せを用いて日本人集団における遺伝子頻度を求め、排除率・probability of matchingを得た。対立遺伝子数・排除率については以下の通りである。pYNH24ーMspIでは236名について検査し、対立遺伝子数は33、排除率は0.89であった。

pYNZ22ーMspI(183名)では対立遺伝子数15、排除率0.83、pYNZ2ーRsaI(185名)では対立遺伝子数5、排除率0.29、MR24/1ーHinfI(141名)では対立遺伝子数37、排除率0.92、3'GlobinーPvuII(167名)では対立遺伝子数39、排除率0.86、MucinーPvuII(169名)では対立遺伝子数10、排除率0.35、HaーrasーPvuII(138名)では対立遺伝子数5、排除率0.25であった。これら7種プロ-ブの総合排除率は0.999932という高い値となった。また各々について得られた2random personのprobability of matchingを総合すると、3.55_x10^<ー11>という優れた値が得られた。以上よりsingle locusDNAプロ-ブは、個人識別・親子鑑定に極めて有用であることが明らかになった。本研究では,第1に,既に報告のある遺伝子増幅用プライマ-を作製し,日本人集団における遺伝子頻度を求めた。第2に高多型性遺伝子領域を増幅させる数種のプライマ-を設計・製作し検討を行なった。BoerwinkleらとLudwigらはヒトApo B遺伝子の3'末端領域に反復配列数の相違に基づく遺伝的多型が存在し,PCR法を用いてこの多型性を検出できることを報告している。我々はこれらの報告に基づきPCR用プライマ-を作製し,日本人集団(134名)における遺伝子頻度を求めた。その結果14種類の対立遺伝子が検出され,反復配列数41(遺伝子頻度0.52)を中心に一峰性に分布していた。BoerwinkleらおよびLudwigらは白人集団では二峰性の分布を示すことを報告しており,人種差が存在することが明らかとなった。異型接合度は0.682,排除率(Alleged father/Mother/Child)は0.478,probability of matching(2 random persons)は0.130であった。ここで得られた日本人集団における遺伝子頻度に関するデ-タは,個人識別・親子鑑定を行なうための基礎となるものである。またRichardsらの報告した第4染色体上の繰返し配列(YNZ32)を増幅させるプライマ-を作製し,日本人集団における多型性の検討を始めている。次に,ヒトinsulin遺伝子やヒトalpha globin遺伝子領域に存在する高多型性領域を特異的に増幅させる数種のプライマ-を新たに設計・合成して検討を行なっているが,現在のところ適切なプライマ-は得られていない。
輸出国家貿易による市場歪曲度の計量手法の開発

本研究では、(1)国内価格を高く維持し、輸出価格を引き下げ、国内販売と輸出販売をプールして支払う輸出国家貿易機関の価格差別、あるいは輸出市場によって異なる価格を設定し、それをプールして支払う輸出国家貿易機関の価格差別により生み出されている消費者負担型の「隠れた」輸出補助金に着目し、この価格差別による市場歪曲度を計測する手法を開発するとともに、「隠れた」輸出補助金を輸出補助金相当額(Export Subsidy Equivalent)の指標を開発して数量化し、(2)輸出国家貿易機関という輸出独占組織により小麦や乳製品の国際市場の参加者が少数になることで、国際市場が不完全競争下におかれていることを実証的に明らかにし、輸出国家貿易機関が解体されることにより国際市場の歪曲性がどれだけ緩和されるかをシミュレーションすることによって輸出国家貿易機関に起因する国際市場の歪曲度を計量し、さらに、(3)上記の2つの数量化が実践的なものになるように、輸出国家貿易機関の実態調査を行い、その仕組みと問題点を整理し、現実によくマッチしたモデルの開発を目指し、これらの総合的成果として、輸出国家貿易の市場歪曲度を計量する実践的手法を開発した。本研究は、従来、理論的にも実証的にも十分整理されていなかった輸出国家貿易の市場歪曲度の計量手法及びそれに基づく試算結果を提示し、現行WTO規定上は、輸出補助金としては捉えられていなかったため問題にできなかった輸出国家貿易の歪曲性を規定できる根拠とその実際の計量手法を与えるという形で、国際農産物貿易交渉に実践的に活用されることが期待される。本研究の目的は次の3点である.1.国内価格を高く維持し,輸出価格を引き下げ,国内販売と輸出販売をプールして支払う輸出国家貿易の価格差別により生み出されている「隠れた」輸出補助金に着目し,この価格差別による市場歪曲度の計測と「隠れた」輸出補助金を輸出補助金相当額(Export Subsidy Equivalent)のような指標を開発して数量化する.2.輸出国家貿易という輸出独占組織により小麦や乳製品の国際市場の参加者が少数になることで,国際市場が不完全競争下におかれていることを実証的に明らかにし,輸出国家貿易が解体されることにより国際市場の歪曲性がどれだけ緩和されるかをシミュレーションすることによって輸出国家貿易に起因する国際市場の歪曲度を計量する.3.上記の2つの数量化が実践的なものになるためには,CWB, CDC, AWB, ADC, NZ酪農ボード等の実態を詳細に把握し,現実によくマッチしたモデルが開発されねばならないので,それを可能にする十分な実態調査を行い,各輸出国家貿易の仕組みと問題点を整理する.そして,本年度における研究の概要をまとめると,以下のとおりである.1.カナダ小麦ボード(CWB),カナダ酪農委員会(CDC),豪州小麦ボード(AWB),豪州酪農公社(ADC)およびNZ酪農ボードの実態調査を行ない,急速に進められている組織体制の改革の評価も含めて,輸出国家貿易による市場歪曲度の計量という観点から論点を整理した.2.カナダにおける「隠れた」輸出補助金を生み出す価格差別による市場歪曲度の実用的な計測手法及び輸出補助金相当額(ESE)指標の開発と計測のためのデータ整備を行った.3.輸出国家貿易が解体されることにより国際市場の歪曲性がどれだけ緩和されるかをシミュレーションすることによって輸出国家貿易に起因する国際市場の歪曲度を計量できる国際貿易空間均衡モデルを開発した.本研究では、(1)国内価格を高く維持し、輸出価格を引き下げ、国内販売と輸出販売をプールして支払う輸出国家貿易機関の価格差別、あるいは輸出市場によって異なる価格を設定し、それをプールして支払う輸出国家貿易機関の価格差別により生み出されている消費者負担型の「隠れた」

輸出補助金に着目し、この価格差別による市場歪曲度を計測する手法を開発するとともに、「隠れた」輸出補助金を輸出補助金相当額(Export Subsidy Equivalent)の指標を開発して数量化し、(2)輸出国家貿易機関という輸出独占組織により小麦や乳製品の国際市場の参加者が少数になることで、国際市場が不完全競争下におかれていることを実証的に明らかにし、輸出国家貿易機関が解体されることにより国際市場の歪曲性がどれだけ緩和されるかをシミュレーションすることによって輸出国家貿易機関に起因する国際市場の歪曲度を計量し、さらに、(3)上記の2つの数量化が実践的なものになるように、輸出国家貿易機関の実態調査を行い、その仕組みと問題点を整理し、現実によくマッチしたモデルの開発を目指し、これらの総合的成果として、輸出国家貿易の市場歪曲度を計量する実践的手法を開発した。本研究は、従来、理論的にも実証的にも十分整理されていなかった輸出国家貿易の市場歪曲度の計量手法及びそれに基づく試算結果を提示し、現行WTO規定上は、輸出補助金としては捉えられていなかったため問題にできなかった輸出国家貿易の歪曲性を規定できる根拠とその実際の計量手法を与えるという形で、国際農産物貿易交渉に実践的に活用されることが期待される。
粗視化した軌道情報に基づく非平衡現象の有効記述

熱が流れるといった典型的非平衡現象についての研究を行い、物理的基礎に関わる一連の成果を得た。具体的には、熱ラチェットモデルにおける熱輸送機構の単純な猫像、分子を分別するくらい小さいスケールでの一般的な統計的性質、分子集団という大きいスケールで大事になる物理量の候補を与えた。生体分子モータをイメージした柔らかいラチェットモデルを取扱った.この系を異なる温度の熱浴を同時に接触させることによって調べたい非平衡状態を維持することが出来る.この際に生じる一方向運動を典型的な非平衡現象を精査するプロトタイプという位置付けで研究した.計算機シュミレーションによって得られるここの軌道と,その軌道に沿った熱流の計算を行い,平均法としてconditioned ensemble法を用いることで,熱浴の温度差によってもたらされる一方向運動の方向と強さを,1ステップ当たりの熱移動量に関係付けることが出来,線形応答領域では,輸送係数の表式が1ステップ当たりの熱移動量と明確な対応をもって表現されることを示し,数値計算の結果によって,その結果を確認した.また,結果の一般性は,モデルの表式を,特定の特殊なモデルに限らない,より一般的な表式に改めても同一の議論が適用可能であることから確認された.出版論文には,この一般的なモデルの表式を反映した.また,フランスLes HouchesにおけるワークショップとSan Diegoにおける会議に参加し議論を行った.前者のワークショップは,国際的な生体分子モーター関係の実験研究者と理論研究者が集まる貴重な場であり,多くの有益な議論,助言を受けることを行うことが出来た.また,非平衡ガラス系として化学反応ネットワーク系での取り組みに着手した.非平衡定常状態を統計力学的視点から研究した。特に、定常状態における微視的状態の定常分布の新しい表現として、(微視的状態に関連付けられた)エントロピー生成の組み合わせによって、理論的示唆に富む表現の構築に成功することが出来た。この成果の適用例としては、例えば温度が異なる熱浴が系に接した状況で、系内を流れる熱流によって非平衡へと駆動された非平衡定常状態や、電場によって電流が流れている定常状態など、非常に多くの非平衡定常状態を考えることが出来る。本研究によって得られた表式は、これまで既に良く知られた線形応答領域での分布表式を(当然ながら)包含しつつ、本質的な非平衡領域である非線形領域にまで踏み込む画期的なものである。また、本研究で得られた表式の持つ特徴として、分布表式がモデルの詳細や恣意的な設定によらない一般性を持つこと、したがって広い適用範囲を持つこと、過剰エントロピー生成という熱を測定することによって原理的には観測可能な量と分布表式を結びつけるものであること、などが挙げられる。ここで出てくる過剰量の測定という視点は、昨年度までの具体的モデル研究の積み上げによって、その有用性を見出すことが出来たことも指摘しておきたい。これらの結果は、スペインにおける研究会、国内の学会等で発表され、多くの有益な議論に結びつくことが出来た。また、物理系学術誌PHYSICAL REVIEW LETTERS誌において出版され公表された。統計力学的観点から非平衡定常状態の研究を行った。特に、昨年度までの成果として得ることが出来た非平衡定常系における定常分布の新しい表式を梃子として、定常状態熱力学を形成する巨視的物理量の探索を行った。熱平衡状態において重要な状態量であるエントロピーは、クラウジウス関係式として知られる関係式をもって熱の測定量から決めることが出来る。我々は、このエントロピーの非平衡定常状態への拡張が、熱測定量の自然な拡張によって可能であることを発見した。この新しい関係式を拡張クラウジウス関係式と呼ぶ。実に興味深いことに、この拡張クラウジウス関係式によって非平衡定常領域にまで拡張されたエントロピー(以下、非平衡エントロピー)は、微視的な非平衡定常分布の規格化因子として登場することが判った。さらに、熱平衡状態におけるエントロピーにはシャノンエントロピーという微視的表式が存在していることが知られているが、これに対応する形で、我々の非平衡エントロピーには、対称化シャノンエントロピーという微視的表現が存在していることを発見した。面白いことには、系に特殊な条件が課されない場合、一般にこれら二つの微視的表現の差違は非平衡度の2次から明確に現れる。非平衡状態における新しい我々のエントロピーが、実際に有用であるか否かを吟味するには、まだ地道な研究が必要であるが、今後、この方向での発展があることを期待している。
吸入麻酔薬の心保護作用における影響　－グルカゴン様ペプチドー１の役割－

グルカゴン様ペプチドー1(GLP-1)誘導体であるExendin-4または吸入麻酔薬イソフルランを前投与することで虚血再潅流障害における心筋梗塞サイズが減少することを明らかにした。また、イソフルランを加えた場合、GLP-1誘導体を加えた場合においてアポトーシスが抑制されることも明らかにした。さらに、GLP-1受容体拮抗剤を投与することで、これらのプレコンディショニング様心筋保護作用が棄却されることから、GLP-1のイソフルランによる心保護作用に対する影響を明らかにした。加えて、これらの心保護作用の経路を明らかにするためイムノブロッティング法やリアルタイムPCRを用いて考察を行った。マウスを人工呼吸下に開胸、血行動態を測定しながら、吸入麻酔薬であるイソフルラン刺激(APC刺激)を30分行った。その後、心臓冠動脈左前下行枝を30分間閉塞し、2時間の再潅流を行った。再び冠動脈を閉塞、Evans Blueを注入し心臓を取り出し、心臓をスライスし、TTCにて再染色を行い心筋梗塞サイズを測定した。それによると、APC刺激によって心筋の梗塞サイズは、コントロール群と比較して有意に減少することが確認された。このことは、以前の報告と同様の結果であり、この実験モデルを使用し、さらに以下のことについて研究を進めた。グルカゴン様ペプチドー1(GLP-1)誘導体であるExendin-4、GLP-1受容体拮抗剤Exendinをコントロール群及びAPC刺激群に投与し、同様の虚血再潅流実験を行ない、GLP-1のAPC作用に対する影響を明らかにしようと試みた。その結果、Exendin-4によってコントロール群の心筋梗塞サイズが減少した。このことから、Exendin-4にはAPC刺激と同様の心保護作用が存在することが明らかとなった。また、Exendin-4およびAPC刺激を加えることで、心保護効果は同様に保たれた。さらに、APC効果を及ぼさない、低濃度のイソフルランにExendin-4を加えることで心保護効果が表れたことから、これらの効果が相補的に行われていることが推測された。つぎに、GLP-1受容体の拮抗剤をAPC刺激の前に投与することでAPC刺激による心筋保護作用が棄却されたことから、APC刺激による心保護作用が、GLP-1受容体を介していることが推測された。以上のことから吸入麻酔薬の心筋保護作用とGLP-1の関連性が示唆された。去年度に行った実験における各群の心臓を虚血-再灌流前に取りだし、ホモジナイズし、APC作用のメディエイターと考えられているこれらタンパクが増加しているかどうかをイムノブロッティング法にて検討した。さらに、GLP-1受容体抗体とメディエイターの抗体とを共に蛍光抗体反応させ、共焦点顕微鏡を使用しタンパクの局在を同定した。また、サンプルからmRNAを抽出し、リアルタイムPCRにて解析し、細胞内分子輸送経路モデルを確立した。これらの結果から、吸入麻酔薬投与でGLP-1により修飾を受けたタンパクが心筋保護作用を誘導することが明らかとなった。また、吸入麻酔薬投与によりGLP-1受容体が活性化し、メディエイターを介し心筋保護作用が発現していることも併せて明らかとなった。麻酔科学研究計画書にある通りの進捗具合にて進行しているため、おおむね順調と思われる。前年度における研究結果を踏まえて、各群の心臓を虚血-再灌流前に取りだし、ホモジナイズし、APC作用のメディエイター(PKA、Akt、PKC、GSK3β、NOS、Src、PI3K等)と考えられているこれらタンパクが増加しているかどうかをイムノブロッティング法にて検討する。さらに、GLP-1受容体抗体とメディエイターの抗体とを共に蛍光抗体反応させ、共焦点顕微鏡を使用しタンパクの局在を同定する。また、サンプルからmRNAを抽出し、リアルタイムPCRにて解析し、細胞内分子輸送経路モデルを確立する。
免疫不全豚を用いた結節型肝癌実験モデル作成と血流動態-病理相関の検討

現在の癌治療の進歩において動物モデルを用いた基礎実験は重要である.特に肝癌の低侵襲治療である,ラジオ波,マイクロ波,さらには今後臨床応用が期待されるエレクトロポレーションや凍結治療開発において,担癌動物モデルを用いた,臨床研究前の安全性,有効性の検討は重要なステップである.現在大型動物の肝癌モデルは存在しない.すでに我々は重度免疫不全ブタ(Il2rg-KO)へのヒト肝細胞癌下株移植によるびまん性肝癌モデルの作成に成功している.しかし前述の局所治療の効果判定においては結節型肝癌モデルの作成が重要である.本研究では様々な肝癌株の移植方法を用いて,結節型肝癌のモデルの作成を行う.現在の癌治療の進歩において動物モデルを用いた基礎実験は重要である.特に肝癌の低侵襲治療である,ラジオ波,マイクロ波,さらには今後臨床応用が期待されるエレクトロポレーションや凍結治療開発において,担癌動物モデルを用いた,臨床研究前の安全性,有効性の検討は重要なステップである.現在大型動物の肝癌モデルは存在しない.すでに我々は重度免疫不全ブタ(Il2rg-KO)へのヒト肝細胞癌下株移植によるびまん性肝癌モデルの作成に成功している.しかし前述の局所治療の効果判定においては結節型肝癌モデルの作成が重要である.本研究では様々な肝癌株の移植方法を用いて,結節型肝癌のモデルの作成を行う.
リコンビナント牛LH抗原を用いた去勢ワクチンの開発

リコンビナント牛LHワクチンを作るために、トリオバアルブミンDNAに牛LHオリゴヌクレオチドを挿入し、合成蛋白の作成を試みた。1.オバアルブミンの主要抗原部位はアミノ酸50-72、80-98、250-269、300-324の4カ所が予測された。2.オバアルブミンに挿入する牛LHβサブユニットは、アミノ酸58-71が最も抗原性があり、特異性のあることが予測された。3.pTZ19UにオバアルブミンDNAを組み込んだプラスミドへの牛LHオリゴヌクレオチドの挿入はdutung点突然変異法で行い、サンガー法によるDNA配列からその挿入が確認された。しかしながら、1塩基の欠落が共通して観察され、2次構造による見かけ上の現象と推定された。4.このプラスミドから合成された融合蛋白はウエスタンブロティングによりオバアルブミンとして一部確認されたが、牛LHの反応性は確認されなかった。5.さらに合成蛋白量を増やして両蛋白を確認する目的で、大腸菌系で最も強力と言われるpET22bプラスミドにPCRで増幅した牛LH含有オバアルブミンDNAをサブクローニングした。ホルモンワクチンに使用する目的の融合蛋白の発現は十分でなかったので、さらに検討中である。1.レギュラープラズミドに牛LHオリゴヌクレオチドがオバアルブミンDNAに1個だけ挿入された大腸菌を用いて、オバアルブミンおよび牛LHの検出をウエスタンブロッチングで行った。オバアルブミンはマーカーと同じ部位のバンドとそれより短い部位のバンドとが検出された。短いバンドは分解産物と推定された。しかしながら、牛LHのバンドは量を変えて検出を試みたが、確認されなかった。2.先の合成プラズミドに2個の牛LHオリゴヌクレオチドを点突然変異法をもちいて、挿入した。挿入した部位付近のDNA配列をジデオキシ法で確認した。3.3個の牛LHオリゴヌクレオチドを含んだ大腸菌から回収されたタンパク質をウエスタンブロッチングに架けて、オバアルブミンは多量に検出されたが、牛LHは再び検出されなかった。4.以上の結果から、現在のプラズミドではプロモーターの機能が弱く、検出可能な量の蛋白質合成が出来ないことが予想されたので、大腸菌プラズミドの中で最も強力なプラズミドを有するとされるpETプラズミドに挿入を試みている。1.牛LHヌクレオチド1個を含んだトリオバアルブミンDNAをPCR法で増幅するために、両端のプライマーを合成し、増幅を計った。2.強力な蛋白発現能力を持つとされる大腸菌プラズミドのpETを増幅するために、コンピテント細胞にトランスフォームした。3.増殖したpETプラズミドを取り出し、2種類の制限酵素で切断した後、そのpETプラズミドにPCR法で増幅した牛LH含有トリオバアルブミンDNAを挿入した。4.挿入されたpETプラズミドをコンピテント細胞にトランスフォーム、増殖し、ミニプレップ材料の制限酵素切断により確認した。5.挿入大腸菌を増殖させ、蛋白抽出を行い、ウエスタンプロチングにより、オバアルブミンの明瞭なバンドと僅かなLHのバンドを検出した。6.牛LHオリゴヌクレオチドをトリオバアルブミンDNAに3箇所追加挿入した。7.挿入箇所の配列をジデオキシ法で確認した。8.現在、pETに新たにLHオリゴヌクレオチドを挿入したDNAをライゲーションし、その蛋白質の検出を行っている。