hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アイヌ語鵡川方言の音声資料による記述的研究

資料について、千葉大学の大学院生および札幌大学のアイヌ人子弟を含む学生の協力により、約150時間分のテープすべての聞き起しを終え、また辞書の項目となる単語と例文を抽出して、エクセル上で分類番号をつけて整理するところまで終了した。また、その語彙と例文に対応する音声データをパソコン上で切り出し、ファイル化を行ってきたが、それについても半分以上終了している。鵡川方言はこれまで沙流川下流域の方言とほとんど同じものだと考えられてきたが、この作業過程においてさまざまな違いが確認されており、アイヌ語の方言研究におおいに貢献することが期待できる。また現在、アイヌ文化の維持復興運動にともないアイヌ語の学習熱が高まりを見せているが、特に辞書類に関しては、方言的にも沙流・千歳方言に偏っているだけでなく、多くは非常に高額かまたは刊行数の限定されたものであり、一般の学習者が利用するのにあまり良い状況ではない。語学学習には音声による教材が不可欠だが、アイヌ語のような消滅危機言語において、新たに母語話者の音声を記録することはきわめて困難である。本研究の作業で抽出・整理された語彙・例文・音声データは、最終的にウェブ上で活用できる音声付日本語ーアイヌ語辞典として、またアイヌ語の音声アーカイヴとして一般公開する予定であり、アイヌ語学習への寄与は非常に大きなものが期待される。平成23年度は150時間分の音声テープすべてをデジタル化した上で、その半分強の約90時間分について、聞き起こし作業を完了している。2年目までですべてのテープの聞き取りを終え、データベース化するという目標から見て、順調な進行と言える。25年度が最終年度であるため、記入しない。現在の時点ですでに音声資料の聞き取りと単語例文の抽出はすべて完了しており、音声データの切り出し作業も順調に進んでいる。後はウェブ上で辞書として活用できるようにするための作業であるが、プログラム自体は別予算で外注の予定であり、8月までにほぼ完了する予定である。それと並行して文法の分析も進めており、進行に関してなんら問題はない。本年度は引き続き残りのテープの聞き起こし作業を行い、すべてのテキスト化を完了する。それと並行して、各単語や短文に対応する音声データの切り出し作業を行い、順次データベース化していく。本年度末までにアイヌ語部分のテキストに対応する音声の切り出しを終えることが目標である。次年度の作業としては音声データの切り出し作業と、聞き取りの最終チェック作業を行い、それらを音声付日本語ーアイヌ語辞典としてウェブ上で活用できるプログラムの作成を業者に依頼。12月頃までに実動できる体制を目指す。それと並行してアイヌ語鵡川方言の文法概説を執筆し、両者を報告書としてまとめる。
セルロース系バイオマスからの新液体燃料バイオレブリネートの開発

セルロースから誘導可能なディーゼル油相当液体燃料としてのポテンシャルを持つ有用化合物として「バイオレブリネート」なる物質を見いだし、検討を進めた。バイオレブリネートとは、糖の酸加水分解物により得られる有機酸である「レブリン酸」とアルコール類がエステル結合したレブリン酸エステル骨格を持った化合物である。種々の製紙スラッジやスギ木材を原料に用いたバイオレブリネートの製造を1-ブタノール、1ーペンタノール、1-ヘキサノールを用いて検討し、理論生成量の6080%という高収率を達成した。バイオ由来の液体燃料として、バイオエタノールは、デンプン等の糖類由来は既に商用化され、加えてセルロースからも糖化・発酵法等で製造可能であり開発が進んでいる。一方、ディーゼル油、灯油、ジェット燃料に相当する液体燃料は、パームオイル等の植物油や微細藻類の産するオイルの研究開発が進んでいるものの、地上に最も多量に存在する有機化合物であるセルロースから直接に製造した例はほとんどみられない。我々は、セルロースから誘導可能なディーゼル油相当液体燃料としてのポテンシャルを持つ有用化合物として「バイオレブリネート」なる物質を見いだし、検討を進めている。レブリネート類の燃料としての物理パラメータ(沸点や引火点)は、石油化学でいうケロシンに相当し、ディーゼル油、灯油、ジェット燃料源として期待されている。加えて、MTBE(メチルターシャリープチルエーテル)やETBE(エチルターシャリープチルエーテル)に替わるクリーンなガソリン添加剤(ブースター)としても期待される。これまで、1-ブタノールを用いて、セルロースを処理して理論収率の約60%程度のブチルレブリネートの収率を達成した。また、1-ペンタノールを用いてセルロースを常圧下で酸加溶媒分解したところ、理論収率の約70%の高収率でのペンチルレブリネートの製造を達成した。さらに、セルロース系の未利用バイオマスとして、種々の製紙スラッジを原料に用いたバイオレブリネートの製造を検討したところ、ペンタノールでの処理では理論収率の約70%以上の高収率を達成した。当該成果の一部はセルロース学会大会、国際セルロース学会、紙パルプ研究発表会で発表した。セルロースから誘導可能なディーゼル油相当液体燃料としてのポテンシャルを持つ有用化合物として「バイオレブリネート」なる物質を見いだし、検討を進めている。加えて、MTBE(メチルターシャリーブチルエーテル)やETBE(エチルターシャリーブチルエーテル)に替わるクリーンなガソリン添加剤(ブースター)としても期待される。初年度は、1-ブタノールや1ーペンタノールを用いて、セルロースを処理して理論収率の約60%程度のブチルレブリネートの収率を達成した。本年度は、1-ヘキサノールを用いてセルロースを常圧下で酸加溶媒分解して、同程度の高収率でレブリネートの製造を達成した。加えて、セルロース系の未利用バイオマスとして、種々の製紙スラッジやスギ木材を原料に用いたバイオレブリネートの製造を上記の3種の媒体中で検討したところ、ペンタノール系では理論収率の約70%以上の高収率を達成した。また、ブチルレブリネートを減圧蒸留で製造するスケールアップしたモデル実験を行い、ブチルレブリネートの蒸留精製に成功した。触媒の適正化においては、硫酸触媒については20%程度の添加が適量と判断している。また、固体酸触媒等を検討しているが、現在の所、硫酸の効率を超えるには至っていない。当該成果の一部はバンクーバーで行われた国際会議ISWFPC2013で発表した。我々は、セルロースから誘導可能なディーゼル油相当液体燃料としてのポテンシャルを持つ有用化合物として「バイオレブリネート」なる物質を見いだし、検討を進めた。レブリネート類の燃料としての物理パラメータは、石油化学でいうケロシンに相当し、ディーゼル油、灯油、ジェット燃料源として期待されている。

加えて、MTBEやETBEに替わるクリーンなガソリン添加剤としても期待される。我々は、1-ブタノールや1ーペンタノールを用いて、セルロースを処理して理論収率の約60%程度のブチルレブリネートの収率を達成した。加えて、1-ヘキサノールを用いてセルロースを常圧下で酸加溶媒分解して、同程度の高収率でレブリネートの製造を達成した。また、セルロース系の未利用バイオマスとして、種々の製紙スラッジやスギ木材を原料に用いたバイオレブリネートの製造を上記の3種の媒体中で検討したところ、ペンタノール系では理論収率の約70%以上の高収率を達成した。加えて、ブチルレブリネートを減圧蒸留で製造するスケールアップしたモデル実験を行い、ブチルレブリネートの蒸留精製に成功した。触媒の検討においては、パラトルエンスルホン酸を用いた試行を開始し、硫酸系よりも約10%収率を向上させる事に成功した。26年度が最終年度であるため、記入しない。バイオマス変換化学26年度が最終年度であるため、記入しない。ブタノールを用いた検討に加えて、ペンタノールを用いた系で、セルロースや製紙スラッジを分解し、高収率のレブリネート収率を達成した点等、大きな成果が得られており、おおむね順調に進行している。バイオレブリネートをブタノール以外の高沸点アルコール類からの製造に展開させた事や、製紙スラッジを用いた実証に成功している点、加えて、減圧蒸留におけるスケールアップしたモデル実験でブチルレブリネートの蒸留精製に成功した点等が示すように、おおむね順調に進捗している。非水溶液中の酸塩基反応で重要なパラメーターである溶媒の比誘電率との相関等を明らかにして、最適なレブリネート製造条件を提示する。本年度は、実用化を見据えたレブリネート類の分留の試験を中心に展開するが、その際に留意すべき点を明らかにしてプロセスを確立する必要がある。分留前の混合溶液中にも、多種な副産化合物が生成するので、その同定等を行い、目的レブリネートの最適な精製条件を見出す。また、夾雑物を除くための、処理の温度や圧力との関係も明らかにする。最終的にはセルロース系バイオマスからバイオレブリネートを製造する一連の工程として、最適な条件を見出して、プロセスとして確立する。また、実際に評価できる程度の量のバイオレブリネートが取得可能となれば、その特性評価も開始する。物理パラメーターとして重要な、溶媒の比誘電率の測定において、昇温下の反応に対応可能な、温度補正機能が付いた液体用誘電率計等の導入に使用する。最終年度に向かった研究を進めるにあたり、ルーチンワークを要する部分が多く、そのため、非常勤職員の労力が必用となった。よって、次年度は賃金として使用できる予算枠を充実させる必要があり、次年度使用額として確保した。バイオレブリネートの製造と精製試験における実験補助の非常勤職員の賃金として計上する。
現代農業における高齢者の就労形態と労働力互助に関する実証的研究

一般的には、現代農村における高齢者の就労形態は、後継世代の農外就業の深化によって、農業経営における高齢者の役割の増大と特化が顕著にみられ、労働力互助を困難にさせている。秋田県内における農業経営の典型的な4事例においても、この傾向はあてはまり、高齢化社会における農業の将来展望に問題を残している。高付加価値をめざす大曲市松倉地区の有機無農薬栽培グループの活動は、平成5年度の朝日農業賞の対象ともなったものであるが、稲作と畜産農家という農家相互の互助はあるが、労働力の互助はほとんどない。また、農業労働力の高齢化につれて、有機無農薬栽培そのものが大きな岐路にたたされている。メロンの主産地形成をはかってきた八竜町浜口地区においても、多少の労働力交換が行われているが、農業労働の主体が高齢者であることから、家々の経営に他の家の高齢者労働が組み込まれることはない。大潟村は、入植者の高齢化にともない、高齢者の生活が大きな問題となっている。もともと農業経営における手間替えやユイが極端に少ない大潟村の高齢者労働は、経営委譲者を中心に、大潟村特産振興公社の内部につくられた野菜生産グループを通しての活動主体となっており、また老人クラブの活動として行われている。これらに対して、家々の複合経営の形態が異なる羽後町嶋田では、個々の作業部分に労働力の互助が行なわれることによって複合経営が可能となっており、また、高齢者の日常の活動も多く行われている。これらの事例を通して、現代の農業経営における高齢者の労働力交換は地域の内部で、組織的系統的に行われることはないが、個別の対応では農業経営の継続が困難となっている農家も多いことからも、そうした方向が模索される必要がある。いずれにしても、本研究は、3年間の継続研究として申請したものであり、残された課題も多く、今後引き続き研究を進めていく予定である。
マルチエージェント技術を用いた人間の社会的行動の分析

本研究では,人間行動の分析に対してエージェントベースシミュレーションを用いて分析した.具体的には,(1)公共財保全に寄与する社会システムの設計と比較,(2)非対称な利得構造をもつゲーム分析,(3)協調ゲームにおける複数均衡問題,(4)意思決定における社会規範の影響,(5)社会的ネットワークの形成を取扱っており,以下のように実施した.(1)については,くじと寄付の財源調達の効率性に関する比較および,理論と被験者を用いた実験結果との関係の分析するために,シミュレーションを実施し,結果を論文にまとめ,国際学術雑誌に投稿中である.(2)については,マッチングペニーゲームを計算機上で,多くのエージェントに長期的に繰返し実施させるためのモデルを開発し,シミュレーションを実施し,結果を論文にまとめ,国際学術雑誌に投稿中である.(3)については,最小値ゲームおよび平均値ゲームを計算機上で,多くのエージェントに長期的に繰返し実施できるシステムを開発した.このシステムを用いて,さまざまなパラメータを変動させ,シミュレーションを実施した.結果を分析し,H21年6月の国際会議で発表する.(4)については,各エージェントが社会規範を遵守するかどうかを毎期決定し,これを繰返して長期的にその社会規範の信奉率がどのように変化するかを調べるためのモデルを開発し,シミュレーションを行い,結果を分析した.結果を,論文にまとめ,国際学術雑誌に投稿し,採録予定となっている.(5)については,社会的ネットワーク形成に関して,直接的なコストや便益だけではなく,ネットワークに参加することで得られる社会的評判も考慮したモデルを考察した.この成果を論文にまとめ,国内雑誌に採録された.本研究計画では,人間の社会的行動の分析に対してエージェントベースシミュレーションを用いて分析するが,具体的には,(1)公共財保全に寄与する社会システムの設計と比較,(2)非対称な利得構造をもつゲーム分析,(3)協調ゲームにおける複数均衡問題,(4)意思決定における社会規範の影響,(5)社会的ネットワークの形成について取扱っており,以下のとおり実施した.平成18年度には(1)のテーマについては,今後,慈善くじと寄付による財源調達の効率性に関する比較および,理論と被験者を用いた実験結果との関係の分析をシミュレーションを通じて比較した.(2)のテーマに関しては,各エージェントの意思決定に関する情報として過去の自分の戦略および利得だけでなく,対戦相手の戦略や利得を用いる.ゲームの非対称性のパラメータ,エージェントのリスクに対する態度に関するパラメータ,意思決定の誤差に関するパラメータを変化させてシミュレーションを行い,結果を分析した.(3),(4),(5)についてはシミュレーションモデルの設計した.とくに,(3)については,最小値ゲームおよび平均値ゲームの強意にパレートランク付けされた複数均衡をもつゲームでプレイヤーはどのような戦略を選択するのかを分析するためのシミュレーションシステムを設計し,プロトタイプを開発した.(4)については,シミュレーションを用いて,規範を遵守する場合の利得や遵守しない場合のペナルティなどのパラメータを変化させ,複数均衡の存在やその特徴について調査した.(5)については,社会的ネットワーク形成に関して社会的評判を考慮した理論的考察を行った.本研究計画では,人間行動の分析に対してエージェントベースシミュレーションを用いて分析するが,具体的には,(1)公共財保全に寄与する社会システムの設計と比較,(2)非対称な利得構造をもつゲーム分析,(3)協調ゲームにおける複数均衡問題,(4)意思決定における社会規範の影響,(5)社会的ネットワークの形成を取扱っており,以下のように実施した.(1),(2)については,論文としてまとめ,雑誌に投稿中である.(3)については,最小値ゲームおよび平均値ゲームを計算機上で,多くのエージェントに長期的に繰返し実施させ,さらに情報の公開やさまざまパラメータを設定できるモデルを設計し,システムを開発した.このシステムを用いて,さまざまなパラメータを変動させ,シミュレーションを実施し,結果を分析し,論文にまとめている.(4)については,各エージェントが社会規範を遵守するかどうかを毎期決定し,これを繰返して長期的にその社会規範の信奉率がどのように変化するかを調べるためのモデルを開発した.利得関数のパラメータ,規範を遵守しない場合のペナルティ,嗜好の分布を変化させてシミュレーションを行い,結果を分析し,論文にまとめている.(5)については,社会的ネットワーク形成に関しては相互作用を協調ゲームで表現し,プレイヤーがゲームにおける行動の選択とゲームを行う相手を選択できるモデルを構成し,均衡選択とネットワークの形成に着目し,長期的安定的均衡について理論的に考察した.今後この成果を論文にまとめる予定である.本研究では,人間行動の分析に対してエージェントベースシミュレーションを用いて分析した.具体的には,(1)公共財保全に寄与する社会システムの設計と比較,(2)非対称な利得構造をもつゲーム分析,(3)協調ゲームにおける複数均衡問題,(4)意思決定における社会規範の影響,(5)社会的ネットワークの形成を取扱っており,以下のように実施した.(1)については,くじと寄付の財源調達の効率性に関する比較および,理論と被験者を用いた実験結果との関係の分析するために,シミュレーションを実施し,結果を論文にまとめ,国際学術雑誌に投稿中である.(2)については,マッチングペニーゲームを計算機上で,多くのエージェントに長期的に繰返し実施させるためのモデルを開発し,シミュレーションを実施し,結果を論文にまとめ,国際学術雑誌に投稿中である.(3)については,最小値ゲームおよび平均値ゲームを計算機上で,多くのエージェントに長期的に繰返し実施できるシステムを開発した.

このシステムを用いて,さまざまなパラメータを変動させ,シミュレーションを実施した.結果を分析し,H21年6月の国際会議で発表する.(4)については,各エージェントが社会規範を遵守するかどうかを毎期決定し,これを繰返して長期的にその社会規範の信奉率がどのように変化するかを調べるためのモデルを開発し,シミュレーションを行い,結果を分析した.結果を,論文にまとめ,国際学術雑誌に投稿し,採録予定となっている.(5)については,社会的ネットワーク形成に関して,直接的なコストや便益だけではなく,ネットワークに参加することで得られる社会的評判も考慮したモデルを考察した.この成果を論文にまとめ,国内雑誌に採録された.
チアノ-ゼ心筋におけるHeat Shock Proteinの誘導に関する研究

(目的)チアノ-ゼ性心筋に対するHSP(Heat Shock Protein)の虚血再灌流障害軽減作用について実験的に検討した。(方法)チアノ-ゼ性ラットとしてFiO2=0.10のHypoxic Chamber内で2週間飼育した10週齢のラットを用いた。13日目に直腸温42度にて15分間のHeat Shockを加えた群をHS(+)群、加えない群をHS(-)群とした。Isolated Working Rat Heart Modelを用い37度15分間の常温虚血とし、大動脈流量・冠灌流量・心拍出量・心拍数・大動脈圧の虚血後回復率を検討した。(結果)2週間FiO2=0.10で飼育することによりHSPの発現を認めた。また、HS(+)群で大動脈流量・心拍出量の虚血後回復率は有意に良好であった。(考察)慢性のストレス(2週間FiO2=0.10で飼育)によってHSPが発現していたが、心筋保護効果を示すには至らなかった。(平成7年度、課題番号07671472の研究実績報告書にて、チアノ-ゼ性心筋の、常温虚血に対する抵抗性低下は報告)しかし、Heat Shockを加えることにより、チアノ-ゼ性心筋においても虚血再灌流時の心筋保護効果を認めた。(今後の研究の展開)1、本モデルでのHSPの発現が右室優位なのか、左室優位なのかを検討する。2、心筋保護液使用時の、HSPによる心筋保護効果の検討を行う予定である。
補償光学適応走査型レーザー検眼鏡を用いた糖尿病網膜症における赤血球列の動態解析

糖尿病網膜症は網膜微小循環の障害がその本体である。補償光学(Adaptive Optics: AO)の眼底イメージングへの応用は、眼底の細胞レベルでの形態イメージングを実現できるようになった。我々は、補償光学を利用した走査型レーザー検眼鏡(adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy: AO-SLO)を用いて正常眼および糖尿病網膜症患者、糖尿病患者(非糖尿病網膜症)の傍中心窩毛細血管網を観察し、赤血球列の伸長率、速度に差があることを示した。時空間画像による血流の可視化、分類は糖尿病網膜症の病態解明や早期発見方法の確立に応用できると考えられる。補償光学(adaptive optics: AO)を適用した走査型レーザー検眼鏡(AO-SLO)は、眼球光学系全体の収差を補正し眼底を細胞レベルで観察、また網膜毛細血管において非侵襲的に血流動態を観察することが可能である。これまでに我々は、AO-SLOを用いて傍中心窩網膜毛細血管内を流れる高輝度粒子がその光学的特性から白血球あるいは血漿であることを報告した。また白血球の上流側に赤血球列が形成され、それが伸長する生理現象が網膜毛細血管にも存在することを発見した。今日まで網膜血流に関する研究は微小循環に限定すば、移動体の速度に関する評価が主であったが、赤血球列の伸長率は新たなパラメーターとしてより詳細な血流評価に使用できる可能性がある。また、我々の正常眼を用いた検討では、赤血球列は傍中心窩においてすべての毛細血管の中を流れているわけではなく流れやすい血管(preferential pathway)、流れにくい血管の2種類が存在することがわかっている。病糖尿病における毛細血管の閉塞は、このような血管の役割・分布の変化をきたすと考えられる。眼底観察装置に眼球全体の収差を補正する補償光学(AO)を導入することにより高分解能の網膜形態イメージングを実現できる。AO scanning laser ophthalmoscope(SLO)を用いると、毛細血管網の中を移動する血球を直接、非侵襲的に観察することができる。本研究を通じて、毛細血管内を流れる血球成分の識別法、速度計算、流出抵抗を表すと考えられる、赤血球列の伸長率の計算法、移動体の軌跡から血管造影を造影剤なしに得られる方法論の確立がなされた。正常被験者(N)、糖尿病患者(非糖尿病網膜症患者)(DM)、糖尿病網膜症患者(DR)の3群において赤血球列の動態を調べたところ、速度はDRがDM、Nと比較して有意に速く、また、伸長率はDM、DRがNと比較して有意に小さいことがわかった。これは糖尿病では、恒常的に赤血球列の形成が起こっているために、相対的に1コずつ分離して流れる赤血球の数が少なくなっているためと想像される。伸長率は糖尿病網膜症の早期発見の手掛かりとなり得ると期待される。また、傍中心窩毛細血管網には、赤血球列が流れやすい血管(LPPs)と流れにくい血管(PGCs)が存在することが解明された。このような役割分担は、白血球や赤血球列といった大きな物体がLPPsに流入することで発生する急激な血流変化をPGCsが緩和する(relief valve)という仕組みを持つことで傍中心窩毛細血管網の安定した血流の維持に役立っていると考えられる。もし、何かの理由でPGCsが閉塞すれば、隣接するLPPsにおける流速の上昇を、LPPsの閉塞は隣接するPGCsにおける赤血球列のpluggingを誘発すると考えられ、このような役割分担の破たんが疾患におけるcapillary dropout進行の理由の一つになると想像される。医師薬学赤血球列という循環動態を評価する新たなAO-SLO所見を用いてどのような解析が可能であり、どのように数値化できるのか検討に時間を要したため。赤血球列を用いて次のパラメーターが創出できる。1)速度、2)伸長率、3)分布(全体の血管総延長に対するpreferential pathwayの割合)。これらを用いて糖尿病網膜症を有する患眼を対象に撮影、評価を行う。
腎細胞癌の転移における癌細胞内イオン輸送体活性の意義

Na-HCO_3共輸送体(NBC1)は腎近位尿細管基底側に発現しておりこの部位の重炭酸輸送を司る。実際にNBC1の変異により近位尿細管性アシドーシスが生じることが示されているが、この輸送過程においてNBC1の2種のvariant(腎型輸送体kNBC1と膵型輸送体pNBC1)のうちどちらかより重要なのかはっきりと示されていなかった。この点を明らかにするために我々はNBC1variantに対する特異的抗体を用いて免疫組織化学的検討を行った。平成14年度:NBC1に対する特異的抗体を用いてヒト腎組織で免疫組織化学的検討を行った。ヒトの正常腎臓の尿細管上皮の基底側膜にはkNBC1蛋白のみが有意に発現していた。また、kNBC1は腎癌細胞内にも細胞内に広く分布していた。このことは腎癌細胞においてNBC1が特殊な役割を担っていることを示唆していた。その他、腎細胞癌の培養細胞を用いて、1)細胞内pH測定で、Na-HCO_3共輸送体活性が培養腎癌細胞に存在すること、2)Western法で腎細胞癌細胞内にNBC1蛋白の発現すること、3)腎癌細胞の移動能はNBC1を含む重炭酸輸送体の阻害剤であるDIDSにより著明に抑制されることなどを示した。平成15年度:ラット腎におけるNBC1の局在を検討するため、前年度と同一抗体を用いて、免疫組織化学的に検討したした結果、ラットの正常腎臓尿細管上皮の基底側膜にはヒトと同様にkNBC1蛋白が発現していることがわかった。局在部位について詳細に検討した結果、これらNBC1は尿細管のS3 segmentに主として限局する傾向か見られた。さらに、ヒトとは異なり、pNBCも部分的に尿細管に存在することがわかった。Western法でも同様に確認された。このpNBC1のラット腎における意義に関しては現在検討中てある。また、腎尿細管アシドーシスの患者にはSLC4A4遺伝子の突然変異かあり、この突然変異が病気の成立と重要な関係が示唆された。そこで、突然変異遺伝子のcRNAをアフリカツメガエルの卵母細胞に注入して電気的な共輸送活性の確認と免疫組織学的ないし、分子生物学的同定を行った。その結果kNBC1に特有な電気的活性は認められなかった。また、抗kNBC1抗体で認識できる物質(full-lengthのNBC1)は存在しなかった。実際にNBC1の変異により近位尿細管性アシドーシスが生じることが示されているが、この輸送過程においてNBC1の2種のvariant(腎型輸送体kNBC1と膵型輸送体pNBC1)のうちどちらがより重要なのかはっきりと示されていなかった。さらに近位尿細管由来とされる腎癌においてもNBC1が発現しているのかどうか、またもしそうならどのような役割を持つのか全く不明であった。これらの点を明らかにするために我々は昨年度は、NBC1variantに対する特異的抗体を用いて免疫組織化学的検討を行った。

その結果、ヒトの正常腎臓の尿細管上皮の基底側膜にはkNBC1蛋白のみが有意に発現していることを確認した。一方、腎癌細胞内にもkNBC1の発現のみを認めたが、この場合は、正常腎の尿細管上皮細胞と異なり細胞内に広く分布していた。このことは腎癌細胞においてNBC1が特殊な役割を担っていることを示唆しているため、さらに各種培養腎癌細胞株においてNBC1の役割を検討した。1.細胞内pH測定を施行したところ、確かにNa-HCO_3共輸送体活性が培養腎癌細胞に存在することを確認した。2.Western法による解析でも腎細胞癌細胞内にNBC1蛋白の発現を認めた。3.細胞移動度の解析を行ったところ、腎癌細胞の移動能はNBC1を含む重炭酸輸送体の阻害剤であるDIDSにより著明に抑制されることが示された。これらの知見は腎癌細胞の転移機構においてイオン輸送体、特にNBC1が重要な働きをしていることを示唆している。現在さらにNBC1の特異的阻害剤の効果を検討中である。Na-HCO_3共輸送体(NBC1)は腎近位尿細管基底側に発現し、この部位の重炭酸輸送を司る。この輸送過程にNBC1の2種のvariant(腎型輸送体kNBC1と膵型輸送体pNBC1)のどちらが重要なのかを検討した。平成14年度はNBC1に対する特異的抗体を用いてヒト腎組織で免疫組織化学的検討を行った。ヒトの正常腎臓の尿細管上皮の基底側膜にはkNBC1蛋白のみが有意に発現していた。また、kNBC1は腎癌細胞内にも細胞内に広く分布していた。このことは腎癌細胞においてNBC1が特殊な役割を担っていることを示唆していた。その他、腎細胞癌の培養細胞を用いて、1)細胞内pH測定で、Na-HCO_3共輸送体活性が培養腎癌細胞に存在すること、2)Western法で腎細胞癌細胞内にNBC1蛋白の発現すること、3)腎癌細胞の移動能はNBC1を含む重炭酸輸送体の阻害剤であるDIDSにより著明に抑制されることなどを示した。平成15年度:ラット腎におけるNBC1の局在を検討するため、前年度と同一抗体を用いて、免疫組織化学的に検討したした結果、ラットの正常腎臓尿細管上皮の基底側膜にはヒトと同様にkNBC1蛋白が発現していることがわかった。局在部位について詳細に検討した結果、これらNBC1は尿細管のS3 segmentに主として限局する傾向が見られた。さらに、ヒトとは異なり、pNBCも部分的に尿細管に存在することがわかった。Western法でも同様に確認された。このpNBC1のラット腎における意義に関しては現在検討中である。また、腎尿細管アシドーシスの患者にはSLC4A4遺伝子の突然変異があり、この突然変異が病気の成立と重要な関係が示唆された。そこで、突然変異遺伝子のcRNAをアフリカツメガエルの卵母細胞に注入して電気的な共輸送活性の確認とや免疫組織学的ないし、分子生物学的同定を行った。その結果kNBC1に特有な電気的活性は認められなかった。また、抗kNBC1抗体で認識できる物質(full-lengthのNBC1)は存在しなかった。
有機薄膜太陽電池用アクセプターの開発を目的とする拡張ビフルオレニリデン類の合成

本研究では、バルクヘテロ接合型有機薄膜太陽電池の研究において課題となっている新規アクセプターの開発を目的として、インデノフルレン中間体の二量化反応を利用し、良好なアクセプター性を示すと期待されるビフルオレニリデン部分構造を含む新奇な構造を有する多環状芳香族化合物を合成し、それらの有機薄膜太陽電池用アクセプターとしての機能を調査した。その結果、目的の多環状芳香族が一般に用いられているフラーレン誘導体よりも優れた光エネルギー変換効率を示すことがわかったが、骨格に導入できる置換基に制限があることがわかった。理論計算に基づきその理由を考察するとともに、類似の構造をもつ多環状芳香族を合成した。バルクヘテロ接合型有機薄膜太陽電池の研究においては、多種多様な電子ドナー成分が開発されているのに比べてアクセプターとしてはフラーレン誘導体しか用いられておらず、エネルギー変換効率の飛躍的向上には新種のアクセプターの開発が求められている。本研究では、ビフルオレニリデン部分構造を有する新奇な拡張共役パイ電子系を基盤とする多環状芳香族化合物を合成し、それらの有機薄膜太陽電池用アクセプターとしての機能を調査することを目的としている。まず、すでに合成したビフルオレニリデン部分構造を有する拡張パイ電子系化合物をアクセプターとし、ポリ(3ーヘキシルチオフェン)をドナーとする太陽電池素子の性能評価を行ったところ、フラーレン誘導体(60PCBM)を用いた場合よりも高いエネルギー変換効率を示すことを見出した。我々の従来のビフルオレニリデン合成に基づき、鍵中間体であるインデノフルオレンを発生させ、その[4+4]付加反応によりフルオレニリデン骨格を有する8員環化合物の合成について検討した。その結果、置換基をもたない化合物では比較的良好な収率で目的の化合物が得られたのに対し、予想に反して置換基がある化合物ではおそらく遷移状態における立体障害のため、対応する[4+4]付加物が全く得られないことが分かった。そのため、インデノフルオレン中間体を発生させる反応条件の検討に着手した。また、関連する構造をもちアクセプターとしての機能が期待される分子であるビインデニリデン誘導体が、環状共役アセチレンのハロゲンにより誘起される二重の環化反応により選択的に合成できることを見出した。バルクヘテロ接合型有機薄膜太陽電池の研究においては、電子ドナー成分開発の目覚ましい発展に比べて、アクセプターとしては一部のフラーレン誘導体しか用いられておらず、エネルギー変換効率の飛躍的な向上のためには新種のアクセプターの開発がカギであるとされている。本研究では、ビフルオレニリデン部分構造を有する新奇な拡張共役パイ電子系を基盤とする多環状芳香族化合物を合成し、それらの有機薄膜太陽電池用アクセプターとしての機能を調査することを目的とした。前年度に引き続き、我々が見出したビフルオレニリデン合成法にもとづき、鍵中間体であるインデノフルオレン誘導体を発生させ、その[4+4]付加環化によるビフルオレニリデン骨格をもつ8員環化合物の合成を検討した。その結果、予想に反してメチル基やフェニル基をもつ誘導体では、無置換体で進行した[4+4]付加環化が進行せず、わずかに中間体が酸化されたジケトンが生成することがわかった。そのため理論計算による反応機構の調査を行い、遷移状態において置換基が及ぼす立体障害について検討した。以上のように、目的の反応が進行する場合が限られていることが明らかとなったので、全く異なる方法によりインデノフルオレン骨格をもつ8員環化合物を合成し、その基本物性の調査を行ったところ、低いLUMOレベルをもちアクセプターとして機能する可能性が示唆された。有機化学すでに合成したビフルオレニリデン部分構造を有する拡張パイ電子系化合物をアクセプターとし、ポリ(3ーヘキシルチオフェン)をドナーとする太陽電子素子の性能評価を行ったところ、フラーレン誘導体(60PCBM)を用いた場合よりも高いエネルギー変換効率を示すことを見出した。これは予想したように、環状構造に組み込まれたビインデニリデンがアクセプターとして優れた分子であることを示す結果である。インデノフルオレン中間体を発生させ、その[4+4]付加反応によりフルオレニリデン骨格を有する8員環化合物の合成について検討したところ、無置換体では比較的良好な収率で目的の化合物が得られた。これにより次の目的分子の合成への端緒が開けた。また、さらなる発展として、ビインデニリデン骨格を持つ化合物の合成も行った。以上を総合すると、計画通り順調に進展していると判断できる。インデノフルオレン中間体の[4+4]付加反応によるフルオレニリデン型化合物の合成については、無置換体では比較的良好な収率で目的の化合物が得られたのに対し、置換基がある化合物では対応する[4+4]付加物が全く得れなかった。

今後はこの問題を克服するため、インデノフルオレン中間体を発生させる反応条件の検討を行う。合成上の問題が解決された場合は、先と同様に太陽電池のアクセプターとしての性能について評価する。環状共役アセチレンのハロゲンにより誘起される二重の環化反応により、アクセプターとしての機能が期待されるビインデニリデン誘導体が、選択的に合成できることを見出したので、今後はこの種の分子の物性や構造について詳細に検討する。25年度において太陽電池用アクセプターとしての性能評価に用いた化合物の一部はすでに合成していたため、試薬等の物品費が計画よりも少なく済んだ。それに関連して予定していた実験補助のための人件費も使用しなかった。26年度は25年度よりも計画に占める新化合物の合成の割合が多く、試薬等の化合物合成に用いる費用が多くなると予想されるため、次年度使用額はそれに充当する予定である。
PDMSを用いたマイクロ流体システムにおける光デバイスの集積化

本研究は、シリコーンゴムを材料としたソフトリソグラフィ法を用いて、マイクロ流体回路を構成し、これに反応や分析結果を検出するための光源、検出器ならびに光導波路を集積化することを目指すものである。2年目の平成14年度には、昨年度に開発したPDMSを用いたマイクロレンズ構造と光ファイバとを組み合わせたマイクロチップについて、レンズの形状を曲率70μm160μmの範囲で変化させたデバイスを製作し、その詳細な評価を行った。流路内に蛍光色素を含む溶液を流し、これを光ファイバから導入する光によって励起し、流路から発せられる蛍光の計測を行った。その結果、変形が小さい場合には、レンズの近傍においては励起光強度が大きいが、ビームの広がりも同時に大きいため、レンズからの距離が遠い部分の検出には向かないこと、また、レンズ型が大きい場合には、レンズ近傍における光強度はさほど強くはならないが、レンズから離れた部分でもビームが広がらないため、レンズから離れたところまで複数の流路を同時に励起するなどの用途に適することが明らかになった。また、光源の集積化を行うため、昨年度より検討を進めてきた有機発光ダイオード(0LED : Organic Ljght Emitting Diode)を同一チップ上に製作する方法を開発し、上記のレンズ構造と組み合わせて計測を行うことによって、チップ上に集積化された検出系としての可能性の評価を行った。具体的には、0LEDから発生された光を、マイクロレンズを通してカップリングしている光ファイバで集光し、その強度を計測した。すなわち、流路内を流れる蛍光溶液にOLEDからの励起光がどの程度吸収されるかを測ったことになる。その結果、1μM100μM程度の濃度のRhodamine B溶液について、十分に検出系として使用できることを確認した。
低酸素応答転写因子ががん転移に与える影響の解析

低酸素応答転写因子HIFは様々な生理機能を有している,経尾静脈転移モデルを用いて血管内皮細胞におけるHIF機能解析を行った結果,宿主血管の低酸素応答性とりわけHIF-2alphaの活性が低いとき転移巣形成が低下することを見いだした.また低酸素応答に対し抑制性に働くHIF-3alphaが肺血管内皮細胞においてVEカドヘリンを抑制性に制御していることも明らかにした.またHIF-2alphaの活性をある一定水準以下に低下させるとHIF-1aphaが代償性に活性化される現象も見いだした.低酸素応答転写因子(HIF: hypoxia inducible factor)は低酸素を感知し,標的遺伝子の発現を制御し低酸素ストレスに対応させる働きを有している.最近HIFが低酸素ストレス応答だけでなく,様々な生理機能を有していることが分かってきた.特に血管内皮細胞におけるHIF機能は赤血球造血やがんの転移及び浸潤に関与している事が分かってきている.我々はこの研究課題において,in vivo経尾静脈転移モデルを用いて,宿主血管の低酸素応答性とりわけHIF-2alphaの活性が低いとき転移巣形成が低下することを見いだした.肺血管内皮細胞におけるHIFー2alphaの標的遺伝子は様々であるが,この現象には接着因子であるVEカドヘリン及びVCAM-1の関与が示唆された.また低酸素応答に対し抑制性に働くHIF-3alphaが肺血管内皮細胞においてVEカドヘリンを抑制性に制御していることも明らかにした.さらにその機能を細胞生物学的に解析するために,野生型およびHIF-3alpha欠損マウスより肺血管内皮細胞を単離培養し,増殖能および血管形成能の評価を行った.その結果HIF-3alpha欠損細胞においてはVEカドヘリンの過剰産生が認められ,増殖性や管腔形成に影響を与えていることが明らかとなった.さらにHIF-2alphaと同じく経尾静脈転移モデルにて検証した結果,転移巣形成が増加していた.このことからHIF因子群が血管内皮細胞おける接着因子の発現制御を介して転移巣形成に関与していることが明らかとなった.今後はこれらを標的とした転移抑制へと応用するため詳細な解析を進める.低酸素応答転写因子HIFは様々な生理機能を有している,経尾静脈転移モデルを用いて血管内皮細胞におけるHIF機能解析を行った結果,宿主血管の低酸素応答性とりわけHIF-2alphaの活性が低いとき転移巣形成が低下することを見いだした.また低酸素応答に対し抑制性に働くHIF-3alphaが肺血管内皮細胞においてVEカドヘリンを抑制性に制御していることも明らかにした.またHIF-2alphaの活性をある一定水準以下に低下させるとHIF-1aphaが代償性に活性化される現象も見いだした.低酸素応答転写因子(HIF: hypoxia inducible factor)が低酸素ストレスに対する応答だけでなく,様々な生理機能を有していることが明らかになりつつある.特に血管内皮細胞における接着因子の制御にHIFが関与している事が興味深い.血管形成に関与しているHIF-2α, HIF-3αが血管内皮細胞で発現していること,また血管構造とがん転移は高い相関性を示すことから考えてHIF因子ががん転移に関与している事が予想される.そこで本申請課題では血管におけるHIFとがん転移の関連を,遺伝子改変マウスを用いてin vivo, in vitroの両面から明らかにすることを目的とする.HIFの研究分野においては,低酸素応答と腫瘍血管新生や腫瘍の増殖に関連する研究が主であり報告が多数あるが,転移と宿主細胞におけるHIFの関連性を詳細に解析している報告は無い.そこで本申請課題では血管内皮細胞におけるHIF-2αおよびHIF-3αの転移臓器における機能だけでなく,原発腫瘍において腫瘍細胞が転移性を有するに至る過程にどのような関わりがあるのか解析する.これまでの解析において,血管内皮細胞におけるHIF-2αが転移結節数に影響を及ぼすことは分かっていた.血管内皮細胞のHIF因子が転移形成に重要であることはレスキューマウス実験から明らかとなったため,転移好発部位である肺から血管内皮細胞を野生型HIF-3a欠損マウスより単離して,関連因子の発現解析を行った結果,血管を構築する上で重要なアンジオポエチン,VEカドヘリンの発現が亢進していることが明らかとなった.またHIF-3α欠損体では,他のHIF因子の活性が上昇していたことから,標的遺伝子制御において直接的な作用だけでなく,HIFの制御を介した作用の存在を示唆するデータが得られた.転移に血管内皮細胞が重要である事だけでなく,そこで発現する関連因子の制御にもHIF因子群が重要である事が明らかとなった.さらにその制御機構に新しいメカニズムの存在を示唆する結果が得られ始めており,計画は予定通り進行していると考えている.血管内皮細胞を材料として,新たに存在が示唆された,HIF因子間の相互制御の分子機構を明確にしていくと共に,HIF遺伝子機能を的確に解析できる遺伝子改変動物実験モデルとして,より実際の病態に近い原発巣からの転移モデルにて転移能と関連因子の発現との相関性を解析する.またHIF-2αおよびHIF-3αの複合変異マウスを作製し,その機能をin vivo, in vitroの両側面から解析を勧める.これまでに血管内皮細胞におけるHIF-2αが血行性肝転移巣形成の初期に関与していることを示唆するデータが得られている.またHIF-3α欠損血管内皮細胞ではHIF-2αの活性が亢進している結果も得られており,これらの因子が転移巣形成に関与している可能性は非常に高く,研究の成果が期待できる.該当無し
NSAID反応性シクロオキシゲナーゼ-2発現大腸腺腫の内視鏡的・組織学的解析

私共は、COX-2が多段階発癌の示唆される大腸癌で、ある種の特徴的な腺腫に発現するかもしれないと想定し、この種の腺腫の内視鏡的、組織学的特徴を明らかにし得れば、どの腺腫のどの時期にNSAIDを投与すれば腺腫から癌への発症を阻止しうるかを明らかにできると考えた。私共は従来、胃粘膜防御に関わるプロスタグランジンに着目し、その律速酵素であるCOXについて胃粘膜における発現と役割を検討しており、一連の検討で、COX-2特異抗体の作製とCOX-2遺伝子発現のRT-PCR法による半定量法を開発し、胃潰瘍周辺上皮細胞や増殖因子刺激をうけた胃粘膜上皮細胞では、正常では発現のないCOX2遺伝子や蛋白が発現することを見い出している。そこで今回の検討では、ヒト特異的COX2抗体を作製し大腸腺腫や大腸癌でどの様な組織形態でCOX2遺伝子や蛋白が発現するのかにつき検討した。(1)COX2に特異的なアミノ酸配列に対してペプチドを作製しポリクローナル抗体を作製した。(2)大腸腺腫については、大きさ、肉眼分類(隆起、表面型)、表面構造の特徴を理解したうえでポリペクトミ-、粘膜切除術を選択し、標本採取後パラフィン包埋した。(3)COX-2C端特異抗体を用いて、LSAB法にてCOX-2蛋白を免疫染色し、同一切片内の染色性の違いは計測細胞数に対する染色細胞数によって3段階評価している。これらのデータについて組織型生との関係や、癌との関係につき解析中である。
脊椎動物の胚発生に関与する糖鎖分子の研究

ゼブラフィッシュの胚型α(1,3)フコース転移酵素(zFT1)の詳細な性質解析を行った結果、本遺伝子が神経胚時期特異的に発現していることを確認し、また基質特異性の解析により、Lewis x構造の合成に特異的であり他の構造は合成できないことを示した。N-アセチルラクトサミンを3つ持つ直鎖の糖鎖に対するzFT1の基質特異性を調べたところ、非還元末端よりも中のN-アセチルラクトサミンユニットに転移しやすいことが分かった。In situハイブリダイゼーション実験により、神経管およびその周辺に分散して発現していることが判明した。さらに、ゼブラフィッシュの胚で発現している糖鎖の構造を網羅的に解析した結果、N-結合型糖鎖は哺乳類と同様な構造を持ち、その内の複合型2本鎖糖鎖の発現は、神経胚時期から顕著に増加することを明らかにした。また、ゼブラフィッシュの胚のフコース含有糖鎖を検索したところ、当該酵素のプロダクトであるLewis x構造はN-結合型糖鎖に複合型二本鎖糖鎖の非還元末端として存在しており、酵素の発現時期と同期して現れることが明らかとなった。Lewis xの末端ガラクトースに、さらにガラクトース残基がβ1-4で結合している新規な構造も見出された。蛋白質に結合しているものに加え、相当量の遊離の糖鎖も検出された。次にそれら糖鎖を結合している糖蛋白質の検索を行った結果、Lewis x含有N-結合型糖鎖は、62kの分子量を持つ糖蛋白質に主に存在することが判明した。我々は、この糖蛋白質をzGP62と名付けた。一方、zFT1酵素がGalβ1-4Galβ1-4GlcNAcβ1-R構造を基質にできるか否かを測定した結果、zFT1酵素はその構造を基質として使用できなかったので、フコースの転移によりルイスX構造が出来た後に、未知のガラクトース転移酵素によって当該の構造が生合成されると考えられた。脊椎動物の胚、特に神経外胚葉には、Lewis xと呼ばれる糖鎖抗原が特異的に発現していることが従来から知られていた。しかしその糖鎖を生合成する酵素の遺伝子が同定されていなかったために、その生理機能の分子基盤に関する研究は進んでいなかった。この状況に対して、我々はその生合成酵素遺伝子の単離と性質の解析を目的として胚型α(1,3)フコース転移酵素のクローニングを試み、ゼブラフィッシュから単離することに成功した。本研究では、ゼブラフィッシュの胚型α(1,3)フコース転移酵素の詳細な性質解析を行った。その結果、本遺伝子が神経胚時期特異的に発現していることを確認し、また基質特異性の解析により、Lewis x構造の合成に特異的であり他の構造は合成できないことを示した。さらに、in situハイブリダイゼーション実験により、神経管およびその周辺に分散して発現していることが分かった。さらに、超高感度な蛍光標識法を用いてゼブラフィッシュの胚で発現している糖鎖の構造を網羅的に解析した結果、N-結合型糖鎖は哺乳類と同様な構造を持ち、その内の複合型2本鎖糖鎖の発現は、神経胚時期から顕著に増加することを明らかにした。また、当該のフコース転移酵素がゼブラフィッシュの胚で生合成している糖鎖を突き止めるために、フコシダーゼ消化による構造変化を指標として、フコース含有糖鎖のスクリーニングを行った。

その結果、当該酵素のプロダクトであるLewis x構造はN-結合型糖鎖に存在しており、酵素の発現時期と同期して現れることが明らかとなった。進化の上で脊椎動物に特徴的な糖鎖構造の一つにN-アセチルラクトサミン構造がある。そして、このN-アセチルラクトサミン構造にフコースがα1,3で付加したものが、ルイスX構造である。ルイスX構造は、神経胚の時期に顕著に発現し、抗ルイスX抗体が神経誘導を阻害することから、神経誘導に何らかの関与をしていることが予測されている。しかしその糖鎖を生合成する酵素の遺伝子が同定されていなかったために、その生理機能の分子基盤に関する研究は進んでいなかった。我々は胚においてルイスX構造を生合成している酵素遺伝子の単離と機能の解析を目的として、胚型α(1,3)フコース転移酵素のクローニングを試み、ゼブラフィッシュから単離することに成功した。本研究では、前年度までにこの胚型α(1,3)フコース転移酵素の性質を明らかにし、生合成産物である糖鎖の構造を解析してきた。本年度は引き続き、生合成産物であるルイスX構造含有糖鎖をゼブラフィッシュの胚から調製し、その構造解析を行った。その結果、ルイスX構造は、糖タンパク質N-結合型糖鎖の上に複合型二本鎖糖鎖の非還元末端として存在していた。また、二本の鎖の内、一方のみに付加している糖鎖と、二本共に付加している糖鎖が混在していることが明らかになった。さらに、同様の構造で、タンパク質に結合せず、遊離の状態で存在している糖鎖がゼブラフィッシュの胚中に存在することも明らかとなった。今後は、これら新規な糖鎖の時期特異性や部位特異性に関する解析を進めていく。我々は胚時期特異的に発現するα(1,3)フコース転移酵素遺伝子をゼブラフィッシュから単離することに成功し、zFT1と名付けた。この酵素はルイスX構造を合成する活性を持ち、受精後12時間から発現を始め、18時間でピークに達し、以後急激に減少する。本年度の研究においては、まず、このフコース転移酵素が生合成している糖鎖の、ゼブラフィッシュ胚における検索と、構造決定を行った。その結果、2本鎖複合型糖鎖の二つの非還元末端にそれぞれルイスX構造を持つ糖鎖が見出された。この糖鎖は、やはり受精後12時間頃から現れ18時間後に最大量を示した。また、ルイスXの末端ガラクトースに、さらにガラクトース残基がβ1-4で結合している新規な構造も見出された。興味深いことに、蛋白質に結合しているものに加え、相当量の遊離の糖鎖も検出された。これら、胚時期特異的な発現を示すルイスX含有N-結合型糖鎖の機能を解析するために、次に我々はそれら糖鎖を結合している糖蛋白質の検索を行った。免疫沈降法とウェスタンブロット法をピリジルアミノ化による超高感度糖鎖構造解析法と組み合わせることにより検出を行った。その結果、ルイスX含有N-結合型糖鎖を持つ糖蛋白質は限定されており、特にSDS-PAGE上で62kの分子量を持つ糖蛋白質が、主たる蛋白質であることが判明した。我々は、この糖蛋白質をzGP62と名付けた。一方、今回の研究で見出したGalβ1-4Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-R構造の生合成経路を明らかにするため、zFT1酵素がGalβ1-4Galβ1-4GlcNAcβ1-R構造を基質にできるか否かを測定した。その結果、zFT1酵素はその構造を基質として使用できなかったので、フコースの転移によりルイスX構造が出来た後に、未知のガラクトース転移酵素によって当該の構造が生合成されると考えられた。
疾患プロテオミクス情報に基づいた画期的創薬のための新規DDSの確立

疾患プロテオミクス情報に基づいた画期的創薬のための新規DDSの確立,即ち,細胞内疾患関連たんぱく質を標的とした細胞内ターゲティング技術(細胞内薬物動態制御)の開発を試み,以下の結果を得た。1)既存の主たる細胞内侵入ペプチド(PTD;Tat,Antp,Rev,VP22)のキャリアー特性を比較検討することによって,PTDを用いた細胞内薬物動態制御法の確立には,細胞内移行活性と安全性の両立およびエンドソーム脱出能の付与が必須であることを見出した。2)ファージ表面提示法を利用した独自のPTD創出基盤を開発し,医薬価値に優れた改良型PTDを自在に創出可能とした。また本方法を適用することで,既存のPTDと比較して,安全性に優れ,さらに細胞内移行活性のみを選択的に向上させた改良型PTD(mT5)の創製に成功した。3)PTD,エンドソーム破壊ペプチド,オルガネラ移行シグナルを組み合わせた独自の細胞内ターゲティング技術を考案し,本手法を適用することによって分子量数万の蛋白質をも核内へと積極的に送達可能であることを実証した。本細胞内ターゲティング技術を適用することによって,細胞質や核に局在する蛋白質を標的としたペプチド性抗がん剤の薬効を飛躍的に増強可能であることを明らかとした。以上,本研究で確立した細胞内薬物動態制御技術は,蛋白質のみならず,低分子化合物や遺伝子,さらには機能性ナノマテリアルといった粒子状物質にまで適用可能な極めて汎用性の高い方法論であることから,将来的にはポストゲノム時代の創薬基盤技術としてゲノム、プロテオーム情報を最大限に活用した治療戦略の開発に大きく貢献できるものと期待される。蛋白質の細胞内局在の変動を、健常時と病態時において比較評価し、疾患関連蛋白質を探索しようとするオルガネラ(細胞小器官)プロテオミクスが、現在、加速度的に進展しつつある。そのため、今後、細胞内の特定オルガネラに局在する蛋白質を有効な医薬品として開発しようとする試みが益々期待されるものと考えられる。ところが、生理活性蛋白質などの生体内高分子物質は、細胞外から細胞内への膜透過性が極端に悪く、そのままの状態で投与しても、細胞内に導入することが出来ないため、効果の発現は期待できない。従って細胞内の特定オルガネラに導入されて、初めて機能発現できる「転写因子やシャペロン蛋白質」などを薬物として使用した場合は、薬効を殆ど期待できないのが現状である。従って、このような蛋白質を有効な医薬品として開発するために必須の最重要基本戦略は、これら蛋白質を効率よく細胞膜から細胞内へ移行させ、標的オルガネラへデリバリーすることにある。以上の観点から本年度は、蛋白質等の薬物を、細胞外から細胞内へ効率よく導入可能なペプチド性キャリアを開発していくための基盤情報を得るために、既存のPTDに関して、蛋白質等の細胞内導入効率やその特性を評価し、興味深い知見を得た。また蛋白質等の薬物を、細胞外から細胞内へ効率よく導入可能なペプチド性キャリアを網羅的に探索可能とするため、ファージペプチドライブラリを作製し、細胞外から細胞内へ効率よく移行する多くのペプチド候補を得た。今後は、これらペプチド候補の機能評価や有用性、安全性評価等を進めていく予定である。平成17年度は、蛋白質等の薬物を、細胞外から細胞内へ効率よく導入可能なペプチド性キャリアを網羅的に探索するため、新規ファージペプチドライブラリを作製し、細胞外から細胞内へ効率よく移行する多くのペプチドを得た。平成18年度は、細胞内動態制御技術確立のための基礎情報集積を目的に、代表的な細胞内侵入ペプチド(Tat, Antp, Rev, VP22)について、それらの特性評価を行うとともに、細胞内オルガネラへのターゲティングを可能とする方法論を考案・評価した。その結果、その細胞内移行メカニズムにマクロピノサイトーシス経路が関与していること、これら細胞内侵入ペプチドとfusogenic peptide、およびオルガネラ移行シグナルを併用することで、薬物を細胞外から細胞内の特定オルガネラへと効率よく送達できることを明らかとした。