hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
理科学習の有用性を実感できるキャリア教育プログラムの開発とハブシステムの構築

理科の好嫌度や有用性に関する中学生の意識に対して明らかな有効性が示され、科学や科学技術系職業に対する生徒の認識に改善が見られた。本プログラムの有効性が示された。2)基礎的・汎用的能力評価のための新しい実践プログラムによる授業を実践し、授業導入可能な評価シートを作成した。3)「化学変化とイオン」と「光・音の性質」に関するキャリア教育差し込み教材を新規に開発し、前者については2校で導入実践し、後者については新規に実践協力校1校を得て導入実践した。新教材開発の価値も大きいが、新規に1協力校、1官庁、2企業の賛同・協力を得たことは評価できると考える。4)複数の大学研究者を始め、地域科学館代表、教育行政官、現場教員および企業の研究者や技術者協働のもとに、書籍「キャリア教育を理科で学習の有用性とキャリア発達」を刊行し、静岡県下全中学校約300校への提供によって、研究成果公開の促進とキャリア教育の浸透と進行を図った。事業当初から開設しているホームページについても改善を重ねてきたが、今後さらに公開性の高いものに移行し研究成果公開を図る。科学教育(理由)1)実践協力校を5校に増やし、実践教員および本事業への賛同教員を増やすことができ、キャリア教育プラットホームとしての役割を一部果たすことができたこと。2)実践協力校において授業実践前後のアンケート調査の結果、学校での教科学習や理科と日常生活の関わりに関する認識、科学や科学技術系職業に対する生徒の意識の多様性が明らかになったこと、また授業実践後の事後アンケートにより生徒の学校学習やキャリア意識についての変容の分析から、今後のプログラム開発や導入方法への示唆を得ることができたこと。3)新規の実践協力校において、教師が企業の研究所に出向き、そこで得た知識や感動を活用するといった、新しい教育プログラムを開発し授業実践できたこと。4)公立校で4年間継続してきた複数企業によるキャリア教育を25年度も実践でき、学校の年間カリキュラムとして位置づけたこと。研究実践校でも、企業、教師、大学の研究者が協同開発したプログラムを、引き続き実践することができたこと。5)中央教育審議会答申による「キャリア教育で身につけさせたい基礎的・汎用的能力(2011年1月)」の育成に関する評価法について協議し、評価基準(案)を作成し、1年生の単元「大地の変化」と2年生「電流とその利用」の単元で試行することができた。生徒の自己評価項目については、7割程度の達成度が見られた。1.3校の実践協力校に対する“理科や科学技術系職業"に関する生徒の実態調査の結果、学校での教科学習や理科と日常生活の関わりに関する認識、科学や科学技術系職業に対する生徒の意識の多様性が明らかになったこと、また授業実践後のアンケートによる生徒の学校学習やキャリア意識についての変容の分析から(現在分析中)、今後のプログラム開発や導入方法への示唆を得ることができたこと。2.公立校で3年間継続してきた複数企業によるキャリア教育を24年度も実践でき、新規に2企業の賛同を得、ネットワークが拡がったこと。企業、教師、大学の研究者が協同開発したプログラムが、開発にとどまらず24年度中に実践することができたこと、さらにこの一連の協同作業が企業の社内研修にも有効であったこと。
最小跡の構造とリーマン計量

リーマン多様体の1点の最小跡について,曲面の場合には,C^2級のリーマン計量ならば最小跡の長さは有限となることが示され,Ambroseの問題(曲面)が肯定的に解決した.また,最小跡がフラクタル集合となるC^<1,1>級リーマン計量が存在することとも示されている.本研究では,これらの事実の一般次元の場合について調べ,以下のような結果を得た.1.最小跡がフラクタル集合によるのはいつか?を決定した.任意の自然数κに対して,C^κ級リーマン計量で最小跡がフラクタル集合になるものを構成した.C^∞級リーマン計量では,フラクタル最小跡はないことを田中(分担者)との共同研究で示した.どちらの結果も,現在,執筆を終え投稿準備中である.2.最小跡の面積(n-1次元Hausdorff測度)が無限になるのはいつか?に関しては,C^2級リーマン計量で最小跡が面積無限大となる例を構成した.C^3級リーマン計量では,面積有限となることは,3の問題がC^3級で肯定的に解けれれば,その系となることが分かった.3.最小跡はrectifiableになるか?に関しては,単位接空間ではの大円弧上の点を初期方向とする測地線の最小跡までの距離関数の有界変動性を示すことにより,肯定的な解決を試みているが,今の所,完全な解決には至っていない.しかし,第1共役跡までの距離関数のLipschitz性(田中との結果)と,曲面の最小跡が長さ有限となる証明のアイデアを用いて,特殊な場合を除けば解決したので,このままの方向で研究を続けることが望ましい.この証明に成功すれば,最小跡に距離空間として曲率を導入することもでき,最小跡の幾何学の発展が期待される.4.一般次元のAmbroseの問題.計量の滑らかさと,最小跡がある意味でtree的な構造をしているという条件下では,部分的解決が期待され,また,3次元以上では一般には,反例が構成できるのではないかと思われるが,解決には至っていない.しかし,大域リーマン幾何への応用としては,この問題が,今後,重要になるものと思われる.無限遠点の最小跡の構造の解明の必要性や,閉曲線の頂点とその最小跡の構造との関係なども,最近,指摘されており,この研究の重要性と継続の必要性が益々増してきている.リーマン多様体の1点の最小跡について,曲面の場合には,C^2級のリーマン計量ならば最小跡の長さは有限となることが示され,Ambroseの問題(曲面)が肯定的に解決した.また,最小跡がフラクタル集合となるC^<1,1>級リーマン計量が存在することとも示されている.本研究では,これらの事実の一般次元の場合について調べ,以下のような結果を得た.1.最小跡がフラクタル集合によるのはいつか?を決定した.任意の自然数κに対して,C^κ級リーマン計量で最小跡がフラクタル集合になるものを構成した.C^∞級リーマン計量では,フラクタル最小跡はないことを田中(分担者)との共同研究で示した.どちらの結果も,現在,執筆を終え投稿準備中である.2.最小跡の面積(n-1次元Hausdorff測度)が無限になるのはいつか?に関しては,C^2級リーマン計量で最小跡が面積無限大となる例を構成した.C^3級リーマン計量では,面積有限となることは,3の問題がC^3級で肯定的に解けれれば,その系となることが分かった.3.最小跡はrectifiableになるか?に関しては,単位接空間ではの大円弧上の点を初期方向とする測地線の最小跡までの距離関数の有界変動性を示すことにより,肯定的な解決を試みているが,今の所,完全な解決には至っていない.しかし,第1共役跡までの距離関数のLipschitz性(田中との結果)と,曲面の最小跡が長さ有限となる証明のアイデアを用いて,特殊な場合を除けば解決したので,このままの方向で研究を続けることが望ましい.この証明に成功すれば,最小跡に距離空間として曲率を導入することもでき,最小跡の幾何学の発展が期待される.4.一般次元のAmbroseの問題.計量の滑らかさと,最小跡がある意味でtree的な構造をしているという条件下では,部分的解決が期待され,また,3次元以上では一般には,反例が構成できるのではないかと思われるが,解決には至っていない.しかし,大域リーマン幾何への応用としては,この問題が,今後,重要になるものと思われる.無限遠点の最小跡の構造の解明の必要性や,閉曲線の頂点とその最小跡の構造との関係なども,最近,指摘されており,この研究の重要性と継続の必要性が益々増してきている.
慢性膵炎におけるCFTR遺伝子の役割:非コード領域による発現調節と発症との関係

嚢胞線維症の原因遺伝子であるCFTRは、上皮細胞に発現し陰イオンチャネルとして機能する。CFTRの機能低下は汗中のクロール濃度の高値によって評価できる。我々の以前の研究では、慢性膵炎患者の約半数でCFTRの機能低下が示唆されたが、CFTR遺伝子の翻訳領域の変異/多型とは必ずしも一致しなかった。本研究では、CFTR遺伝子のプロモーター領域(翻訳領域の上流約2kb)の遺伝子解析を行い、慢性膵炎患者に特有な変異-1523G/Aと-790ΔTを同定した。上皮細胞に発現するcAMP依存性のイオンチャネルCFTR(cystic fibrosis transmembraneconductance regulator)の遺伝子多型と慢性膵炎との関連を解明するため、慢性膵炎患者(69人)、健常人(48人)を対象にCFTR遺伝子多型の解析を行った。翻訳領域の遺伝子多型の解析は既に終了しているため、転写調節に影響を及ぼすと推定される非翻訳領域(プロモーター領域を含む翻訳領域の上流約2kb)の遺伝子解析を行った。その結果、これまでに世界でも報告のない変異-1523G/Aが患者群と健常人で1例づつ、-790delTは患者群にのみ3例見つかった。その他、-895T/G、125G/Cの遺伝子多型が見つかった。-895T/Gのアレル頻度は健常群で46.9%、患者群で50.7%、125G/Cのアレル頻度は健常群で6.3%、患者群で5.2%であった。また表現型の解析として、慢性膵炎患者(48人)、健常人(40人)を対象に指先汗クロライド試験法(Naruse,2004)を用いで汗のCl^-濃度を測定した,その結果、アルコール性慢性膵炎患者のうち17例(47.2%)が基準値(60mmol/l)を超える高値を示した。特発性慢性膵炎患者で基準値を超えた症例は3例(25.0%)、健常群では7例(17.5%)であった。現在、翻訳領域および非翻訳領域の遺伝子多型と汗のCl^-濃度との相関を検討中である。また、非翻訳領域の遺伝子多型が転写量に及ぼす影響を検討するために、患者および健常人の鼻の粘膜よりRNAを抽出した。現在、リアルタイムPCR法によりCFTR遺伝子の発現量を定量するため、最適なプライマーの設計を行っているところである。上皮細胞に発現するcAMP依存性のイオンチャネルCFTR(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)の遺伝子多型と慢性膵炎との関連を解明するため、慢性膵炎患者88人(アルコール性慢性膵炎患者65人、特発性慢性膵炎患者23人)および健常人118人を対象に、CFTR遺伝子多型の解析を行った。翻訳領域の遺伝子多型の解析は既に終了しており、本年度は、転写調節に影響を及ぼすと推定される非翻訳領域(プロモーター領域を含む翻訳領域の上流約2kb)の遺伝子解析を行った。その結果、アルコール性慢性膵炎患者に特有な変異-1523G/A(1例)、-790ΔT(3例)が見つかった。-1523G/Aはこれまで報告がない。-790ΔTはトルコ人のCF家系での報告はあるが、その他の人種での報告はなく疾患との関連も不明である。TFSEARCHを用いた解析により、-790付近は転写調節因子HFH-2(FOXD3)の結合配列モチーフを持つことがわかった。今後これら変異が遺伝子発現量に及ぼす影響をルシフェラーゼアッセイ法で測定する予定である。CFTRの機能低下を簡便に診断するために、親指の指腹からの自然発汗のCl^-濃度を測定する方法を開発した。左右の同じ部位からの発汗量がほぼ等しいことを利用し、片側の親指からの発汗率をデジタル発汗計で測定し、対側の親指から採取した汗のCl^-量を測定して、汗中Cl^-濃度を求める。Cl^-量の測定は、キャピラリー電気泳動法あるいは高感度Cl^-電極を用いた。健康正常人の汗中Cl^-濃度は平均38 mMであった。高感度Cl^-電極を用いれば安価に短時間に測定できるので、嚢胞線維症あるいは慢性膵炎の早期診断に有用と考えられる。
食品に含まれる疑似ビタミンB12群が生体に及ぼす影響の精密解析

食品に含まれる疑似ビタミンB12(B12)を精密に分析し,疑似B12の生体に及ぼす影響を検討した.B12の主要な供給源である魚介類や乳製品などに含まれる疑似B12を液体クロマトグラム質量分析機を用いて精密に分析した.ほとんどの食品には真のB12が主要なコリノイドであったが、食用藍藻や一部の巻貝は疑似B12の一種であるシュードB12が含まれていた.食品に含まれるシュードB12は,ヒトでB12の腸管吸収に関与する内因子との結合能が低いために腸管吸収され難く,体内に吸収された場合でも細胞内のB12依存性酵素に対して阻害作用を示さないことが明らかとなり,生体に悪影響を及ぼさないことが示唆された.我々が日常的に摂取している一部の食品に多種多様な疑似ビタミンB12(B12)が多量に含まれていることを明らかにした.しかし,疑似B12の生体に及ぼす影響や細胞内代謝については不明であり,日常的に疑似B12を摂取することがB12の吸収を妨げ,細胞内でB12の代謝系を阻害することになれば,B12欠乏症に基づく疾患(神経障害)の発症が危惧される.そこで,食品に含まれる疑似B12を網羅的に分析すると共に多種多様な疑似B12を大量に調製し,B12の腸管吸収や細胞内輸送に関与するB12結合タンパク質やB12依存性酵素に及ぼす影響を分子レベルで検討することで,疑似B12類の生体に及ぼす影響を精密に解析することが本研究の目的である.平成25年度には,我が国の主要なB12供給源である食用貝類や食用藻類についてLC/ESI-MS/MS法を用いて疑似B12の存在量や分子種を検討した.その結果,二枚貝で摂取頻度が高いアサリやカキにはB12のみが検出されたが,シジミや赤貝などの多数の二枚貝で少量の疑似B12が検出された.一方,巻貝ではバイ貝を除きサザエやエスカルゴにはB12以外に多量で多種類の疑似B12が検出され,食性の相違がこれら貝類に含まれるB12化合物の種類に影響を及ぼすことが示唆された.食用藻類では,多種類の紅藻に多量のB12が含まれていたが,すべての食用藍藻では疑似B12が主要なB12化合物であった.また,キノコの加工品の多くに天然に存在しないB12[c-lactone]が検出された.B12[c-lactone]は,キノコに含まれるB12が塩素系殺菌剤と反応することで生成したことが明らかとなった.多種類の疑似B12の大量調製法や生体に及ぼす影響を検討するためのツールとしてB12の腸管吸収や血中輸送に関与するB12輸送タンパク質の大量調製法も検討した.我々が日常的に摂取している一部の食品に多種多様な疑似ビタミンB12(B12)が多量に含まれていることを明らかにした.しかし,疑似B12の生体に及ぼす影響や細胞内代謝については不明であり,日常的に疑似B12を摂取することがB12の吸収を妨げ,細胞内でB12の代謝系を阻害することになれば,B12欠乏症に基づく疾患(神経障害)の発症が危惧される.そこで,食品に含まれる疑似B12を網羅的に分析すると共に多種多様な疑似B12が生体に及ぼす影響を精密に解析することが本研究の目的である.平成26年度は平成25年度に続き,我が国の主要なB12供給源である食用貝類や食用藻類に加え,多種類の加工食品に含まれるB12化合物をLC/ESI-MS/MS法を用いて疑似B12の存在量や分子種を検討した.世界各地で食されている多種類の食用紅藻類のB12化合物を分析した結果,B12が主要なコリノイド化合物であったが,疑似B12を含む紅藻類があることが明らかとなった.また,栄養補助食品として流通している緑藻類クロレラ19種類を分析した結果,B12含量の高いクロレラの一部に疑似B12や未同定のB12様化合物が存在することが明らかとなった.乳加工品のチーズ30種類に含まれるB12化合物を分析した結果,ほとんどのチーズでB12が検出されたが,一部の青カビチーズで未同定のB12化合物が含まれていた.また,牡蠣の加工品である干し牡蠣やオイスターソースならびに卵の加工品であるピータンについてもB12化化合物を精密に同定した.新規なB12酵素の拮抗阻害剤を開発して,哺乳動物由来の培養細胞をB12欠乏状態にさせることが可能となった.我々が日常的に摂取している一部の食品に多種多様な疑似ビタミンB12(B12)が多量に含まれている.しかし,疑似B12の生体に及ぼす影響や細胞内代謝については不明であり,日常的に疑似B12を摂取することがB12の吸収を妨げ,細胞内でB12の代謝系を阻害することになれば,B12欠乏症に基づく疾患(神経障害)の発症が危惧される.

そこで,平成25年度から平成27年度まで,我が国の主要なB12供給源である貝類・乳類・卵類・藻類に加え,キノコ類などに含まれるB12化合物をLC/ESI-MS/MS法を用いて疑似B12の存在量や分子種を検討した.多種類の食用紅藻類のB12化合物を分析した結果,B12は主要なコリノイド化合物であったが,少量の疑似B12を含む藻類があることが明らかとなった.平成27年度に栄養補助食品として流通している緑藻類クロレラ19種類を分析した結果,一部のクロレラに疑似B12や脱コバルトコリノイドが含まれていることを世界ではじめて明らかにした.チーズ26種類に含まれるB12化合物を分析した結果,ほとんどのチーズでB12が検出されたが,一部で擬似B12化合物が微量に含まれていたが同定には至らなかった.鶏卵においてB12は卵黄のみにタンパク質と結合して存在しており,極めて消化性が悪かったが,卵加工品ピータンの卵黄に含まれているB12は消化性が良いことを平成27年度に明らかにした.また,貝類では,二枚貝や肉食性の巻貝には多量のB12が含まれていたが,藻食性巻貝のアワビやサザエならびにエスカルゴのB12含量は低く,擬似B12が主要なコリノイドであることも平成27年度に明らかにした.また,COS-7培養細胞を用いて擬似B12(シュードB12)がB12酵素に及ぼす影響を検討した結果,シュードB12は培養細胞のB12酵素の補酵素として機能することも,阻害物質として作用することもないことを明らかにした.食品に含まれる疑似ビタミンB12(B12)を精密に分析し,疑似B12の生体に及ぼす影響を検討した.B12の主要な供給源である魚介類や乳製品などに含まれる疑似B12を液体クロマトグラム質量分析機を用いて精密に分析した.ほとんどの食品には真のB12が主要なコリノイドであったが、食用藍藻や一部の巻貝は疑似B12の一種であるシュードB12が含まれていた.食品に含まれるシュードB12は,ヒトでB12の腸管吸収に関与する内因子との結合能が低いために腸管吸収され難く,体内に吸収された場合でも細胞内のB12依存性酵素に対して阻害作用を示さないことが明らかとなり,生体に悪影響を及ぼさないことが示唆された.食品中の疑似ビタミンB12(B12)類の分布と含有量については,我が国における主要なB12の供給源である魚介類・乳類・卵類において,ほぼ分析が完了した.一方,疑似B12類の調製法については,6種類の疑似B12のなかで3種類は大量調製法の条件を確立したが,残り3種類については市販されていない構成成分を有機合成化学的に調製する必要があるため,未だ大量調製法の確立に至っていない.また,B12依存酵素ならびにB12輸送タンパク質の組換えタンパク質の調製法を検討したが,未だ機能を保持したタンパク質の大量調製の確立に至っていない.以上の結果から,食品に含まれる疑似B12の精密分析は完了したが,疑似B12が生体に及ぼす影響の解析が遅れている.よって,本研究課題全体としては,やや遅れていると判断した.食品栄養科学残期間が1年間となったので,疑似B12化合物のなかで大量調製できた疑似B12について生体に及ぼす影響を解析する.また,機能的な組換えタンパク質や酵素の調製が困難となり,疑似B12と直接的な相互作用の解析ができない場合は,当初計画を変更して,ヒトのモデル動物である線虫C.elegansや哺乳動物由来COS7細胞を用いて疑似B12がB12の細胞内代謝や機能及ぼす影響を精密に解析する.食品中の疑似ビタミンB12(B12)類の分布と含有量については,我が国における主要なB12の供給源である魚介類において,摂取頻度の高い食品についてはほぼ分析が完了した.今後は一部の食用藻類や畜肉(内臓肉を含む)ならびに乳製品・鶏卵を残すのみとなったことから,プロジェクト期間内に分析が完了できると考えられる.疑似B12類の調製については,6種類の疑似B12のなかで3種類は大量調製法の条件を確立した.残り3種類については,市販されていない構成成分の有機合成も含めて今後検討する必要がある.B12依存酵素ならびにB12輸送タンパク質の組換えタンパク質の調製については,2種類のB12酵素と3種類のB12輸送タンパク質の遺伝子をクローン化し,大量発現系を構築中である.
揮発性有機化合物の低濃度発生源におけるモニタリング方法と除去特性および評価

揮発性有機化合物(VOC)含有空気試料に対する総括測定方法の開発と光触媒法の適用性評価を行った。VOCを吸着剤で捕集し、濃縮成分をFID検出器で測定しトルエン換算で濃度表示する測定方法での吸着剤や採取条件等の最適化を図った。光触媒小規模試験装置を作成し、アルコール含有空気の処理で対供給比数%程度の濃度でアルデヒド化合物が生成する現象に関し、ガス空間速度、温度および共存炭化水素が生成に対する影響因子であることを見出した。サブテーマ1として、総括的な検出方法に基づく迅速・簡便なモニタリング手法開発の基礎検討を行った。模擬調製した揮発性有機化合物(VOC)低濃度含有ガスを吸着剤によって濃縮後、加熱脱離によって総括検出信号を得る方法の適用性を試験し、可能であることを確認した。この後、最適な吸着剤の選択と脱離条件等の最適設定に向けた方法の確立に移行する予定である。この方法を確立できれば、これらの施設における環境保全上の管理機能は格段に向上し、この指標をモニタリング管理すれば、処理設備を良好に維持し、化学物質による環境への影響を十分に低いリスクで制御できると想定される。サブテーマ2として、新設された廃プラスチック類中間処理施設において、圧縮梱包工程からの排気に含まれるVOCおよび多環芳香族化合物(PAH)等について濃度を測定した。さらに、新規の排気処理設備として設けられた光触媒分解装置および活性炭吸着装置からなる処理プロセスでの同物質群の除去・挙動特性を測定・評価した。さらに、周辺環境の敷地境界において測定を行い、施設の排気口(活性炭処理後)の測定値に基づいた拡散計算予測値との比較評価を行った。その結果、VOCのうち発生源ではアセトン、トルエン、アルデヒド類が比較的高濃度(数十μg/m^3)であったほか、アルデヒド類等では光触媒装置の通過により濃度が増加する現象がみられた。PAHはナフタレンがもっとも高濃度(数μg/m^3)であり、また処理工程でよく低減されるという対照的な特性が見出された。以上によって、汚染物質排出に係る特性を明らかにし、光触媒法の処理特性と重要な課題を明らかにすることによって初年度の目標を達成した。なお、周辺環境中のVOCはほとんどがバックグラウンド汚染に起因することを計算によって明らかにした。総括測定方法の開発と光触媒分解技術の処理特性評価に関し、研究を行った。総括測定方法に関しては、VOC成分が低濃度(各化合物概ね数数十μg/m^3)で混合する空気試料に関する総括測定を可能とする濃縮および測定方法を開発した。方法の基本的な流れは、吸着剤に対象物質を捕集し、濃縮された加熱脱離ガスを水素炎イオン化検出器で測定し、トルエン換算で濃度表示を行うものである。BTX類(ベンゼン、トルエン、キシレン、スチレン、エチルベンゼン)を対象として模擬ガスを用いた実験により、吸着剤や採取条件等の最適化により、試料空気採取量最大200Lで定量下限0.3μg/m^3まで測定可能であり、また非芳香族化合物が共存する影響を排除するための測定方法として確立した。次に、初年度の研究において廃プラスチック類中間処理施設でのVOC排出濃度実態、光触媒分解および活性炭吸着からなる排気処理プロセス工程でのVOCの挙動把握から、光触媒反応においてアルデヒド化合物濃度の増加を観測したことを踏まえて、光触媒の流通型模擬試験装置を用いて反応特性を評価した。メタノールおよびエタノールからそれぞれホルムアルデヒド、アセトアルデヒドが生成する現象を再現した。定量的には、1,5002,500μg/m^3のアルコール含有ガスを45°C、ガス空間速度SV:500650h^<-1>で通気することにより、供給濃度に対し0.31%相当のアルデヒド化合物が生成することを明らかにした。さらに、空間速度や湿度条件の影響に関し、それらが増すと生成濃度が増加することを把握した。廃プラスチックがリサイクル中間処理施設において圧縮・摩擦などの物理化学的作用を受ける結果排出される低濃度で多種類の揮発性有機化合物(VOC)を対象とし、新規処理技術となってきた光触媒分解法での分解反応特性について、小規模試験装置を組み立てて検討した。課題となっていたVOCの分解処理時にアルデヒド化合物が濃度増加することに関し、これまでに、メタノールおよびエタノール含有空気を光触媒試験装置に流通させることで、供給濃度に対し数%程度の濃度でそれぞれホルムおよびアセトアルデヒドが生じることを見出したことを踏まえて、単独化合物の供給系において、供給物質濃度に対するアルデヒド類の生成濃度の比率すなわち生成率に対し、温度、供給濃度、雰囲気中湿度、光触媒試験装置へのガス流通時の空間速度(SV)といった影響因子を詳細に試験・検討した。得られた結果から、影響の比較的大きい因子はSVおよび温度であることが明らかになった。すなわち、実際に廃プラスチック中間処理施設において光触媒方式装置の運転で適用される約50,000(1/h)というSV値に対し、12,00074,000(1/h)の範囲においてSVの低下にともないアルデヒド類の生成率は大きく増大し、ガス流速に留意すべきことを見出した。

SVを1,000(1/h)程度まで小さくすると分解効果が卓越し、反応速度が重要な因子であった。温度については、4050°Cの範囲で温度が高くなると生成率は増加した。また、共存物質として、アセトンまたはエチレンをアルコールに加えて供給すると、生成率がおよそ1570%増大する結果が見出された。このことは、実際のVOC複合排気試料に対する光触媒反応のもとで、種々の酸化還元反応等が複合的に起こり得る条件下では、共存物質の影響が無視できない場合があることを示すと考えられた。実態調査は初年度に終え、その後、総括的な測定方法についてほぼ研究開発を終え、論文作成中であること、光触媒分解の特性について、研究が進捗していることなどから自己評価した。24年度が最終年度であるため、記入しない。光触媒分解過程での中間生成物生成特性を明確にすること、活性炭吸着処理の限界を明らかにすること、リスク評価手法へのフィードバックを図ること。
先例のないフェノタイプを惹起する細胞周期阻害剤の創薬展開と作用機序解明

先例のない新規フェノタイプを伴う細胞周期阻害剤1は、従来の抗がん剤とは全く異なる分子細胞生物学的性質を示したことから、今までにない抗がん剤に進化することが期待される。今年度は、化合物1の誘導体合成と評価をさらに進めた。誘導体合成の方針としては、1R1R3を変換した化合物&新たな官能基(FG)を導入した化合物の合成と評価、2置換基R4の探索によるバリエーション拡充、3上記1および2のハイブリッドの3つの方策で検討した。その結果、細胞増殖阻害活性が増強した化合物を見出すことに成功し、抗がん剤リード化合物創製に向けて前進した。この誘導体合成&評価に伴って、R1R4における必要な構成要素を特定することができ、詳細な構造活性相関を解明した。次に、これらの構造活性相関を基盤として、標的分子探索用プローブ分子を合理的に設計し、実際に合成することに成功した。具体的には、導入タグとしてケミカルバイオロジー研究において実績のあるアミノ基(各種樹脂に固定化可能な化学標識)を導入し、リンカーとしてアルキル鎖を活性とは無関係な位置に有する化合物を設計・合成した。さらに標的分子探索に向けて、プローブ分子のアフィニティビーズへの固定化に関する予備実験、細胞培養の条件検討や使用予定機器の調整等を実施し、次年度の研究にスムーズに移行できる体制を整えた。化合物1誘導体の合成により、目標とする活性値に相当に近づいた化合物を見出すとともに、最終年度で検討予定である標的分子探索に用いるプローブ分子の合成に成功したため。当初計画通り、誘導体合成の継続により抗がん剤リード化合物を創製する。また、合成したプローブ分子を活用したケミカルバイオロジー研究により化合物1の標的分子を同定する。同定した標的分子は、真の標的分子であることを検証するとともに、抗がん剤標的分子としての適格性を立証する。比較的少ない化合物合成により活性向上ならびに構造活性相関解明に成功したため、試薬の購入が当初計画以下であった。
ミオシンVaカーゴ受容体(Slac2)による神経回路網形成機構の解明

タイプI型Griscelli症候群はアクチン依存性のモーター蛋白質をコードするミオシンVa遺伝子の欠損により発症し、毛髪の部分白化(メラノソームの輸送異常)、神経疾患(特に小脳樹状突起形成不全によるてんかん)などの症状を示す。メラノサイトにおいてミオシンVaはSlac2-aと命名したミオシンVaカーゴ受容体を介して間接的にカーゴ(メラノソーム)を認識することが明らかになっているが、神経細胞においてミオシンVaがどのようなメカニズムでカーゴとなるべき膜(小胞)を認識し、どのようなメカニズムで神経突起先端へと輸送するのかはこれまで明らかではなかった。本研究では神経細胞においてもメラノサイトと同様にミオシンVa・Slac2・Rab27の三者複合体が神経突起先端部へ特定の膜を輸送するのではないかと考え、その可能性を検討した。その結果、マウス脳においてはRab27Aではなく近縁のアイソフォームRab27Bが、Slac2-aではなくSlac2-cという相同分子が発現することが明らかとなった。Slac2-cはSlac2-aと同様に、Rab27結合ドメイン及びミオシン結合ドメインを有することから、神経細胞でもミオシンVa・Slac2-c・Rab27Bの三者複合体が機能する可能性が示唆された。しかしながら、その後の生化学的・細胞生物学的解析から、Slac2-cはミオシンVaではなくミオシンVIIaの機能的カーゴ受容体であることが明らかとなり、神経細胞においてミオシンVaはSlac2以外のカーゴ受容体を利用するものと考えれられた(J.Biol.Chem.(2005)280,28015-28022)。
抗炎症作用を持つタンパク質を利用した新たな抗炎症剤のＩｎ　ｖｉｖｏでの検証

申請者は、核内酸性タンパク質(MTI-II)は、炎症性転写因子NF-κBのコリプレッサーとして働き、強力な抗炎症作用を持つことを見いだした。MTI-IIを利用すれば、ステロイド薬と同じ作用機序で強力な抗炎症作用を持つが重篤な副作用を持たない新しい抗炎症剤が開発できる。そこで、MTI-IIを抗炎症剤として開発するために細胞内導入配列と融合させたMTI抗炎症剤を作製した。本研究の目的は、ステロイド薬の適応疾患(特にアレルギー性免疫疾患である花粉症や自己免疫疾患である関節リウマチ)でのMTI抗炎症剤の有効性を検証することである。新しいタイプの核内受容体コアクティベーター(MTI-II)は、ステロイド薬と同じ作用機序で強力な抗炎症作用を示すが、ホルモン作用(ステロイドの副作用)は認められない。MTI-IIを利用すればステロイド薬と同じ作用機序を持つので、ステロイド薬と同程度に強力でより副作用の少ない抗炎症剤が開発できる。実際に、細胞内導入配列と融合させたMTI-II抗炎症剤が炎症モデル動物で強力な抗炎症作用を示すが、血糖値を上昇させないことを確認した。本研究の目的は、ステロイド薬の適応疾患でのMTI-II抗炎症剤の有効性を検証することにより、ステロイド薬より使いやすく、ステロイド薬に代わる新たな抗炎症剤を開発することである。当初は細胞内導入配列をN末端とC末端に付加した2種類のMTI-II抗炎症剤(H11RMとHM11R)で検証する予定であったが、現状ではタンパク質の発現量が少なく、研究開発が十分に進められないことがわかった。そこで、化学合成できる長さのMTI-II抗炎症剤の開発を試みた。その結果、中央部の酸性アミノ酸領域(AR; acidic resion)にタンパク質導入配列(アルギニン8連打;R8)を付加したペプチド(ARR8)が、in vitroで全長のMTI-IIと同程度強力にNF-κBの転写活性を抑制することが確認できた。ARR8は全長で48アミノ酸残基なので、化学合成可能な長さである。これにより当初の予定通りにステロイド薬の適応疾患でのMTI-II抗炎症剤(ARR8)の有効性を検証した。ステロイド薬はグルココルチコイド受容体(GR)に結合し、GRが炎症性転写因子NF-κBを直接阻害することにより、その抗炎症作用を発揮する。申請者は核内受容体コアクティベーター(MTI-II)がステロイド薬と同じ作用機序で強力な抗炎症作用を有していることを見出した。そこで、MTI-IIを抗炎症剤として開発するために細胞内導入配列と融合させたMTI-II抗炎症剤を作製した。本研究の目的は、ステロイド薬の適応疾患でのMTI-II抗炎症剤の有効性を検証し、その有効性(ステロイド薬と同程度に強力な抗炎症作用とより少ない副作用)を確認することにより、ステロイド薬より使いやすく、ステロイド薬に代わる新たな抗炎症剤を開発することである。当初は細胞内導入配列をN末端とC末端に付加した2種類のMTI-II抗炎症剤(H11RMとHM11R)で検証する予定であったが、現状の分子生物学的方法(大腸菌、酵母菌、昆虫細胞および無細胞系での発現)ではタンパク質の発現量が少なく、研究開発が十分に進められないことがわかった。そこで、当該年度は化学合成できる長さのMTI-II抗炎症剤の開発を試みた。まず、MTI-IIの抗炎症作用を発揮する部位の同定をおこなった。MTI-IIのN端側と中央部およびC端側をそれぞれ発現するベクターを作製して、NF-κBの転写活性に及ぼす影響を解析した。その結果、中央部の酸性アミノ酸領域(AR; acidic resion)が抗炎症作用を持っていることがわかった。次にこのARにタンパク質導入配列(アルギニン8連打;8R)を付加したペプチド(AR8R)を発現するベクターを作製して、細胞内で発現させた。その結果、AR8RはMTI-IIと同程度強力にNF-κBの転写活性を抑制することが確認できた。これによりMTI-II抗炎症剤を化学合成できるようになり、実用化のための研究開発を促進させることができる。研究の目的:核内酸性タンパク質(MTI-II)は、炎症性転写因子NFκBの転写共役阻害因子(コリプレッサー)で強力な抗炎症作用を持つ。MTI-IIを利用すればステロイド薬と同じ作用機序を持つので、ステロイド薬と同程度に強力で副作用の少ない抗炎症剤が開発できる。これまでにタンパク質導入配列と融合させたMTI抗炎症剤が、炎症モデル動物(カラゲニン足浮腫とクロトン油誘導結膜炎モデル)で強力な抗炎症作用を示すが血糖値を上昇させないことを確認した。本研究の目的は、ステロイド薬の適応疾患でのMTI-II抗炎症剤の有効性(抗炎症作用と副作用)を検証することにより、ステロイド薬より使いやすく、ステロイド薬に代わる新たな抗炎症剤を開発することである。

研究の成果:まず、MTI-IIの抗炎症作用の作用中心となるアミノ酸領域を決定し、化学合成できる長さのMTIペプチド抗炎症剤(MPAID)の開発を試みた。中央部の酸性アミノ酸領域にタンパク質導入配列を付加したペプチド(MPAID)が、in vitroで全長のMTIと同程度強力にNFκBの活性を抑制することを確認した。次に化学合成したMPAIDの抗炎症効果をステロイド薬の適応疾患(アトピー性皮膚炎とリウマチ)モデル動物で検証した。その結果、MPAIDはダニ抗原誘発アトピー性皮膚炎モデルマウスとコラーゲン誘導関節炎(リウマチ)モデルラットで強力な抗炎症作用を発揮した。ステロイド薬の副作用の指標となる血液生化学検査(血糖値、白血球数、コルチコステロン濃度、肝逸脱酵素など)でMPAID投与群は溶媒投与群(ネガティブコントロール)の結果と同じであった。すなわち、MPAIDがin vivoで抗炎症効果を発揮すること、さらに副作用が少ないことがわかった。MPAIDはステロイド薬の長期投与が必要なアトピー性皮膚炎、リウマチなどに有効な薬となりうる。生化学・分子生物学MTI-II抗炎症剤を化学合成できるようになり、これまで困難であった多量発現と高純度精製の問題点が解決した。化学合成MTI-II抗炎症剤(ARR8)の抗炎症効果をステロイド薬の適応疾患(アトピー性皮膚炎)で検証した結果、ARR8がアトピー性皮膚炎に対して有効であること、塗布投与が可能であること、ステロイド薬がもつ副作用(コルチコステロンの低下と白血球数の減少)を持たないことが確認できた。特にARR8の塗布投与の可能性が示せたことは、(1)常温で軟膏基剤と混合してもペプチドARR8は変性沈殿しないこと、さらに(2)ARR8の二次構造の維持が(少なくとも細胞内に入るまでは)薬効の発揮に必要でないことを示している。これらのことは、ペプチド製剤であるARR8を薬剤として開発する上で非常に重要な発見で、今後の研究開発を大きく発展させるものである。本研究の目的であるステロイド薬の適応疾患(特にアレルギー性免疫疾患である花粉症や自己免疫疾患である関節リウマチ)でのMTI-II抗炎症剤の有効性の検証を達成するためには、MTI-II抗炎症剤を多量に発現させて、かつ高純度に精製する必要がある。しかし、現状の方法(大腸菌、酵母菌、昆虫細胞および無細胞系での発現)ではMTI-II抗炎症剤(H11RMとHM11R)の発現量が少なく、研究開発が十分に進められなかった。また、MTI-II抗炎症剤はアミノ酸112残基からなるタンパク質なので、このままでは長過ぎて化学合成はできない。50残基以内の長さにまでMTI-II抗炎症剤を短くすることができれば、MTI-II抗炎症剤を化学合成できるので、これまで困難であった多量発現と高純度精製をおこなう必要がない。そこで、まず化学合成できる長さのMTI-II抗炎症剤の開発を試みた。MTI-IIの抗炎症作用の作用部位を解析した結果、中央部の酸性アミノ酸領域(AR; acidic resion)が抗炎症作用を持っていることが明らかになった。次にこのARにタンパク質導入配列(アルギニン8連打;8R)を付加したペプチド(AR8R)を細胞内で発現させ、MTI-IIと同程度強力にNF-κBの転写活性を抑制することが確認できた。
極微弱発光を利用した白血球の活性酸素生成機構の研究

白血球の活性酸素生成酵素(NADPH酸化酵素)系は、NADPHから電子を受け取り0_2へ電子を渡す、一種の電子伝達系と考えられている。電子伝達因子の一つとしてフラビン蛋白の存在が示唆されているが、その局在については諸説があり、未だ確定されていない。極微弱発光を利用したフラビンの微量定量法を検討し、フラビンの局在を調べた。1.極微弱発光測定装置を試作した。2.バクテリアのルシフェラーゼを利用したFMNの微量定量法を検討し、100fmolまでのFMNを再現性良く定量できる系を確立した。3.ホスホジエステラーゼ(5′-エクソヌクレアーゼ)を用いてFADをFMNに分解し、2と全く同様な方法で100fmolまでのFADを再現性良く定量できる系を確立した。4.未刺激の白血球(R)とミリスチン酸で刺激した白血球(S)より細胞膜と細胞質を分離し、それぞれについてフラビン含量を測定した。細胞膜中のフラビンは、ほとんどがFAD(FAD:FMN〓100:2)であり、RとSで量的な差は認められなかった。細胞質では、FAD:FMN〓4:1とFMNの割合が増大するものの、RとSで量的な差はなかった。5.細胞質を脂肪酸(ミリスチン酸、アラキドン酸)やSOSで処理すると、NADPH酸化酵素を構成する因子であるp67-phoxとp47-phoxが選択的に沈殿する。この処理によって得られる沈殿と上清のフラビンを測定し、それらが対照と差がなかったことより、p67-phoxとp47-phoxはフラビン蛋白でないことを明らかにした。極微弱発光を利用したフラビンに特異的な定量法を利用することで、NADPH酸化酵素系の因子の一つであると考えられるフラビン蛋白が、未刺激の状態の時から細胞膜に局在し、活性化に伴ってその局在は変化しないことを明らかにした。
思春期の双極性障害傾向と自己制御機能との関連に関する発達心理学的研究

本研究は,思春期の双極性障害の一次予防の観点から,心理学的な要因として抑うつ症状や躁症状と関連の深い自己制御に着目し,子どもの双極性障害傾向と自己制御との関連を明らかにするために,縦断調査データを用いて検討することを主な目的とした。本研究の結果は,思春期の双極性障害傾向と関連をもつ自己制御の下位次元が異なることを明らかにし,子どもの双極性障害傾向の低減のためには興味・関心の一貫性を促すような働きかけが有効である可能性を示唆した。双極性障害の平均発症年齢は20代前半とされているものの,それ以前の発達段階については注目されてこなかった。しかしながら,近年,子ども特有の双極性障害の存在が取り上げられるようになってきており,児童期の発症も少なくないことが報告されている(e.g., Blader et al., 2007)。とりわけ思春期は,双極性障害の発症を決定づけるリスクの時代(age of risk)となる可能性が懸念されており(Weissman et al., 1996),成人期の双極性障害の病像が見られる開始時期のピークは1519歳の間に起こると指摘されている(Alloy et al., 2006)。さらに,双極性障害はうつ病よりも自殺企図率や再発率が高いことから,重症化する前段階での早期発見や早期介入が重要である。双極性障害の関連要因については,臨床群や非臨床群を対象とした研究から,自己制御機能が双極性障害の脆弱性に関わる重要な特徴となる(Heissler et al., 2014)ことや,双極性障害やうつ病を含む精神疾患は,同時に認知機能の低下や障害を引き起こしている可能性も示されている(Millan et., 2012)。そこで本研究課題では,自己制御機能や認知機能が,どのようなプロセスを経て双極性障害傾向と関連しているのかを縦断的に検討することを目的とした。平成27年度においては,思春期(1518歳)を対象に調査研究を実施した。その結果,自己制御機能に関わる「ねばり強さ」や「興味・関心への一貫性」という特性が,双極性障害傾向と負の関連をもつことが認められた。本年度計画していた調査研究を実施することができた。平成27年度に得られたデータについては,できるだけ早く研究成果として発表し,平成28年度以降の研究における資料としても活用できるように分析を進めている。しかしながら,近年,子ども特有の双極性障害の存在が取り上げられるようになってきており,児童期の発症も少なくないことが報告されている(Blader et al., 2007)。特に子どもの場合,注意欠陥・多動性障害(ADHD)との識別が難しいことが指摘されているため,ADHDの徴候を含めた検討が必要であると考えられる。そこで,平成28年度の調査では,昨年度の1波目の調査に引き続き2波目の調査と9-16歳の子どもがいる母親回答による質問紙調査を実施した。とりわけ本年度は,双極性障害傾向とその影響要因との関連についてより詳しく調べるために,双極性障害傾向と併存症の高いADHD傾向の徴候の有無による比較検討をおこなった。その結果,(1)ADHD傾向の評価基準を超えていない群では,パーソナリティ特性の一つである自己制御の低さが双極性障害傾向を高めるという結果が得られた。一方,ADHD傾向の評価基準を超えている群では,自己制御と双極性障害傾向との間に関連は認められなかったものの,双極性障害傾向の下位尺度である攻撃性に対して自己制御が負の影響を及ぼすことが示された。また,(2)ADHD傾向の有無にかかわらず,環境要因としての母親の抑うつは子どもの双極性障害傾向を高めることが示された。これらの結果から,ADHD傾向の徴候に留意した検討は,双極性障害傾向に影響を及ぼす子ども自身の特徴の違いを明らかにし,より効果的な改善・予防につながる知見を得られる可能性も示唆された。また,来年度実施予定であった認知機能と双極性障害傾向との関連についての予備調査を行うこともできた点で,おおむね順調に進展していると考える。これまでに得られたデータについては,できるだけ早く研究業績としてまとめることができるよう努めている。また,成人期の双極性障害の病像を見ると,その発症年齢のピークは15-19歳であることが指摘されており(e.g., Alloyet al., 2006),うつ病よりも自殺企図率や再発率も高いことから子どもの双極性障害の早期発見や早期介入は重要である。そこで,本研究課題は,抑うつ症状や躁症状と関連の深い自己制御機能に着目し,思春期の双極性障害傾向に自己制御機能や認知機能がどのように関わっているのかを縦断的に検討することを目的とした。

とりわけ,平成29年度においては,当初の予定通り第3波目のデータの取得と認知機能に関する実験課題調査を完了し,双極性障害傾向と自己制御機能や認知機能との関連について縦断データを用いた分析を実行している。これまでに得られた縦断データから,自己制御機能と双極性障害傾向の同時点でのレベル間の関連だけでなく,両変数の個人内変化における関連についての分析を行った。その結果,(1)自己制御機能に関わるPerseverance of effortと双極性障害傾向のレベル間に有意な負の相関が得られた(r=-.20, p<.01)。また,(2)Consistency of interestと双極性障害傾向にはレベル間での関連だけでなく,両変数の変化の間にも負の相関が認められた(r=-.25, p<.01)。このことは,自己制御機能のなかでも,特に子どもの物事(目標や計画など)に対する興味や関心の一貫性を増加させるような働きかけは,双極性障害傾向の低下にもつながることを示している。本研究は,思春期の双極性障害の一次予防の観点から,心理学的な要因として抑うつ症状や躁症状と関連の深い自己制御に着目し,子どもの双極性障害傾向と自己制御との関連を明らかにするために,縦断調査データを用いて検討することを主な目的とした。本研究の結果は,思春期の双極性障害傾向と関連をもつ自己制御の下位次元が異なることを明らかにし,子どもの双極性障害傾向の低減のためには興味・関心の一貫性を促すような働きかけが有効である可能性を示唆した。平成28年度以降は,本研究課題の目的である縦断的な検討を行うため,引き続き調査研究を実施する。また,本年度の調査で得られたデータ分析の結果を踏まえながら,認知機能検査の準備および実施を進める予定である。必要に応じて,精神医学・精神神経科学・教育心理学・心理統計学など他領域の専門家にも知識提供を仰ぎながら研究を遂行する。現時点において,研究計画書からの変更や修正などの予定はなく,研究を遂行する上での問題点もない。次年度も,引き続き本研究課題の目的である縦断研究のため調査を実施する。また,必要に応じて精神医学・精神神経科学・心理統計学など他領域の専門家にも知識提供を仰ぎながら研究を遂行する。発達心理学本年度に実施した2回の質問紙調査のデータ入力にかかる費用のうち,1回分のデータ入力の費用が若干不足してしまったため,次年度の予算を得て改めて使用することとした。このため,次年度使用額が発生してしまった。本年度分の余剰額は,回収済みの調査票のデータ入力と次年度の質問紙調査の実施に充てる予定である。
蛍光計測と超微形態解析から探るヒト象牙質の糖化過程の解明

象牙質における老化現象(歯質の脆性化、色調の変化)においても糖化現象が関与していると考え、本研究を行った。蛋白質による糖化反応は複雑で未解明の部分も多いが、最終的に非常に安定なAGE架橋がコラーゲン線維間に生成される。AGEs架橋が過度の架橋構造を構成しコラーゲン線維の伸展性が失われ、組織の外力に対する抵抗性が低下する。象牙質におけるAGEsの局在および蓄積を光学的及び形態学的に分析することで糖化レベルを評価ことが可能であることが分かり、糖化現象が象牙質の物性や構造に影響を与えるメカニズムを解明できた。H25年度においては、糖化による象牙質内コラーゲン内のAGE架橋の形成機序、局在および生成物の種類を明らかにすべく研究を行った。形成機序においてはグルコース浸漬試験とAGEsの。ナノ秒蛍光法マッピングにより象牙質コラーゲン分子間のAGEs産生の確認およびwestern blottingなどによる糖化レベルの定量化を行い年齢により明確な差があることが分かった。また、コラーゲンの浸漬試験を行うことにより人工的な糖化をriboseとコラーゲンゲルを用いたin vitro実験にて再現しTCSPC法を用いて自己蛍光寿命を測定することに成功した。この手法によりコラーゲンの蛍光寿命を簡便に分析することが可能となり、コラーゲンが糖化されると蛍光寿命が短くなるという報告から、糖化試験を行いながらリアルタイムで糖化レベルを測定できるようになった。ただ、蛍光寿命を変化させる因子はコラーゲンの劣化やリボース自体のもつ性質が関連するなど複数考えられるため、原因物質の特定も並行して行っていく予定である。蛍光寿命変化の原因物質の特定に関しては、特異的にAGEを認識する抗体を使用して免疫組織化学的染色を行い象牙質内におけるAGEs沈着部位の局在を明らかにした。さらに特定抗体を用いた免疫電顕法を行うことにより象牙細管周囲におけるAGEの局在を明らかにすることが可能となった。これらの進展により、象牙質内でもAGEの産生が起こっていることが明確となり、それが加齢に伴う歯の色調の変化や齲蝕に対する抵抗性の変化などと関連していることが考えられる。他にも、グルコースやリボースと行った還元糖が糖化の原因物質であることから、糖尿病といった全身疾患と歯の加齢変化との関連も示唆された。本年度においては、象牙質の加齢変化における評価法の確立として、ウェスタンブロッティング法及び免疫電顕法による定量化に取り組み多くの成果と学会および論文を発表した。特に基質蛋白に付着したAGEsを分離するためにコラゲナーゼや塩酸を用いる手法を確立し多くのデータを得ることが出来た。これらの評価手法と既に確立しているTCSPC法を用いたナノ秒蛍光法を組み合わせることにより生体内での糖化現象をリアルタイムで評価が出来るとともに生体内のAGEsを単離し物理化学的な特性を評価することも可能となった。これによりコラーゲン線維自体を劣化させる因子を特定することが出来、原因物質の精製にも今後取り組んでいく予定である。免疫電顕法よりAGEsの沈着も象牙質内で均一ではなく歯髄周囲においておよびミクロオーダーでは象牙細管周囲において集積が起こっていることが確認された。これらの集積のメカニズムは石灰化や加齢に伴う色調の変化とも関連があると考えられ今後それらの発生メカニズムに関して調べていく予定である。また、糖化現象は血中の糖とも大きな関係があるため糖尿病や生活習慣の影響に関しても調べていく予定である。また、蛍光寿命測定を生体に応用することにより歯のみでなく皮膚や歯肉から架橋形成を評価することが出来ると考え装置の開発や応用なども検討している。従来の蛍光を用いた肌寿命測定器などは、蛍光のintensityを指標としているため肌の色といったコンディションに左右されやすいことが指摘されており、蛍光寿命を指標とすることで精度の改善がはかれるものと考えられる。象牙質における加齢の評価方法の確立として、糖化による象牙質内コラーゲンにおけるAGE架橋の1)形成機序および2)局在、3)生成物の種類を明らかにすることを目的として研究の遂行を行った。1,グルコース浸漬試験とAGEsの自己蛍光を応用したナノ秒蛍光法マッピングにより象牙質コラーゲン分子間のAGEs産生の確認および糖化レベルの定量化および可視化をを行った。ナノ秒蛍光法に関しては、TCSPCシステムを改良した形で精度検証を行い微細オーダーまでの観察がリアルタイムに出来ることが確認された。さらにプローベなどを用いることで医療応用を視野に入れた生体試料への応用も可能であることが確認された。2,透過型電子顕微鏡および電子線トモグラフィー法にて、象牙質基質内コラーゲン線維におけるAGEs架橋構造の微細構造解析を行った。コラーゲン内における架橋構造の局在を調べるため、固定処理や超薄切片加工方法のプロトコルを作成しコラーゲン染色技術および超高圧電子線トモグラフィーによる観察手法を確立することが可能となった。また、架橋領域の染色方法によりしてコラーゲン分子間架橋構造に対してはカテキンを用いたポジティブ染色を用いることにより、コラーゲン線維におけるAGEsの局在を観察することが出来た。3,免疫電顕法にてAGEs架橋の種類の特定を行うとともに、象牙質コラーゲンの架橋メカニズムの探索を行った。免疫電顕的手法に関しては精度の高いプロトコルが完成し、超微形態領域での金コロイドカウントにより定量的な分析が可能となった。

蛋白質による糖化反応は複雑で未解明の部分も多いが、最終的に非常に安定なAGE架橋がコラーゲン線維間に生成される。AGEs架橋が過度の架橋構造を構成しコラーゲン線維の伸展性が失われ、組織の外力に対する抵抗性が低下する。象牙質におけるAGEsの局在および蓄積を光学的及び形態学的に分析することで糖化レベルを評価ことが可能であることが分かり、糖化現象が象牙質の物性や構造に影響を与えるメカニズムを解明できた。今年度は、コラーゲンの糖化および硬組織の分析関連の技術として2本の論文が掲載されており、2015年4月現在でさらにAGEsの定量手法と分析に関する論文も採択が決定しており順調に結果が出ている。AGEsの分析が進んでいるため前倒しで歯や歯肉から蛍光寿命を指標とした加齢分析装置の開発を進めていく予定である。保存修復今後は、定量化の精度をより上げるとともに、ELISAや質量分析と言ったより感度の高い定量化手法により微細な試料でもAGEsの量が測定できるように計画を立てている。また今研究において加齢に伴い象牙質のコラーゲン線維自体も酵素耐性が上がっている様相が認められたことから、加齢に伴う齲蝕耐性などを関連付けて最終年度の研究を進めていく予定である。今年度は、硬組織の加齢変化に関して加齢およびコラーゲンの糖化、および硬組織の分析技術に関した報告として、3本の論文報告が行われた。未脱灰でないと観察が不可能である象牙質内微小破折と加齢との関連性がMicroscopy (IF:1.46)にて報告され、さらに加齢と象牙質基質への糖化最終生成物の沈着に関しての報告がArchives of Oral Biologyに掲載され象牙質疾病メカニズムに関連する研究として注目を集めている。mまた、硬組織の試料加工法が疾患モデルマウスのPhenotype分析に共同研究がPLOS Geneticsに掲載され、エナメル質形成不全症を示すためBackscatterおよびEDX元素分析が応用されておりさまざまな領域にも応用可能な技術であることを示している。実験が順調に進んだため泳動用のゲルや抗体といった高額の消耗品の消費が最低限度行うことが出来た。今後は、ELISAや免疫組織化学染色を用いてAGEs架橋の種類および部位の詳細な情報を収集して、象牙質コラーゲンの架橋メカニズムの解明を行う。また、象牙質コラーゲンの架橋分析と共に架橋形成阻害及び分解の手法に関しての検討を行っていく予定である。来年度においては、ELISAといった1施行あたりの単価の高い実験手法を用いる予定がありそれ以外にも様々な実験系を行うため、検出キットや抗体などを予定よりも多く使った際などに今年度からの繰り越しも用いる予定である。本年度は、電気泳動装置と転写装置を購入してwestern blottingの実験系を稼働させたが、予備実験が順調に進みゲルの購入とPVDF膜の購入が比較的低額で行えたため物品費などに次年度仕様に回せる額が生じた。本年度においても電気泳動装置の消耗品にあてるため使用計画に変更はない。