hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト疾患モデルウサギの精子バンク構築に向けての関連技術の整備

我々は、ヒト疾患モデルウサギの精子バンク構築のために必須であるウサギ精子凍結保存手技、および凍結融解精子を用いた人工授精条件等に関する検討を行った。その結果、凍結保存溶液の改良、凍結条件の見直しを行うことにより凍結融解後の精子運動率を従来の方法より向上させることができた。また、実際に、我々が確立した方法を用いて、遺伝子改変ウサギ6系統について凍結精子による保存を実施した。これまでに、ウサギの精子凍結保存液については、いくつかの凍害防止剤を用いた方法が報告されている。いずれも凍結融解後に生存精子が得られること、人工授精後に産仔が得られることが報告されている。まず、これらの中からもっとも安定した成績を示す凍結保存液を確認するとともに、凍結融解後の精子運動率を指標に精子の冷却速度等について検討を進めた。その結果、卵黄アセトアミド溶液が最も安定した結果を示した。次に、卵黄アセトアミド溶液を用いて冷却速度の検討を実施した。冷却速度が遅くなるにしたがい凍結融解後の精子運動率は高い値を示す傾向が観察された。-0.8°C/minよりも速い速度で冷却した場合、融解後の精子運動率は有意に低下した。さらに、凍結融解後の精子を用いた人工授精の効率的な条件についても検討を行った。人工授精に用いる精子数を増やすことにより妊娠率、平均産子数ともに向上する傾向が観察された。人工授精に用いた精子数あたりの産子数で比較した場合、40×10^6個の運動精子を用いたときが最も効率よく産子を得られることが示唆された。また、人工授精における精子注入とドナーウサギの排卵誘発時間について、人工授精後5時間と10時間で排卵させる群で比較検討を行ったが、両者で有意な差は認められなかった。以上のようにウサギ精子の凍結保存液として卵黄アセトアミド溶液を用いて、凍結方法、凍結融解後の精子を用いた人工授精について効率的な条件を見いだすことができた。しかし、卵黄アセトアミド溶液にはニワトリの卵黄が含まれている。卵黄は、家畜の精子凍結の際も凍結保存液にしばしば加えられているが、品質が安定しない、微生物汚染、海外へ輸送する場合には卵黄自体が検疫対象物となるなどの問題点を有している。そのため、卵黄を含まず化学的に構成成分が明らかな新規の凍結保存液の開発も検討したい。昨年度に引き続き、新たな保存液の探索を行うとともに精子凍結条件の検討を実施した。現在使用している凍結保存液には、ニワトリの卵黄が含まれている。そのため、卵黄を含まず、化学的に構成成分が明らかな新規の凍結保存液の開発が必要である。これまでに様々な試薬を試しているが、現行の凍結保存液(卵黄-アセトアミド溶液)に代わり得る保存液の開発には成功していない。今後も継続して探索を行う予定である。しかし、現行の凍結保存手技の改善として、ウサギ精子にCholesterol-loaded cyclodextrin(CLC)を添加することで、凍結融解後の精子運動率が有意に向上する事を確認した。さらに、CLCを添加した凍結融解精子を用いて人工授精後の卵の受精率(人工授精後24時間で評価)を検討したが、非添加群に比べて高い受精率を示した。これについては、今後、CLC添加の効果について、人工授精後の妊娠率、平均産子数で再評価する予定である。また、近年、マウスでは、凍結配偶子の輸送にドライシッパーを使用しない簡便な手段として、ドライアイスを使用した方法が利用されている。サギ凍結精子においてもドライアイスによる輸送が可能であれば、有用な手段どなる。そこで、ウサギ凍結精子について、ドライアイス中の保存性について検討を行った。その結果、凍結後、ドライアイス中に2日間保存された後融解した精子において人工授精に必要な数の運動精子が得られることが確認できた。今後、実際にドライアイスを用いた凍結精子の輸送を行い、融解後の精子から産子が得られるかについての検討を行う予定である。卵黄は、家畜の精子凍結の際も凍結保存液にしばしば加えられているが、品質が安定しない、微生物汚染、海外へ輸送する場合には卵自体が検疫対象物となるなどの問題点を有している。今年度の検討で、我々は凍結保存液に卵黄の代わりに大豆由来のレシチンを加えることで、凍結融解後の精子運動率について同等の成績が得られるという結果を得た。したがって、当初、本年度に予定していた凍結精子での輸送に関する検討を遅らせ、凍結保存液へのレシチンの添加が卵黄の代替となり得るかどうかについてさらに検討を進めた。

まず、凍結保存液に添加するレシチンの至適濃度を決定した。現在、レシチンを添加した凍結保存溶液を用いて凍結した精子を用いて人工授精を実施し、妊娠率、産仔数等について評価中である。これまでの成績と比較して差がなければ、今後、レシチンを使用した凍結保存液に変更する。また、新規保存液の開発と平行して、従来の卵黄を含む凍結保存液を用いて、我々が保有する遺伝子改変ウサギ系統について凍結精子による系統保存の実施を進めてきが、本研究期間内に6系統すべてについて凍結精子の保存を実施することができた。我々が保存するこれらのウサギ系統については、ホームページ上にて公表を行っている(http://www.animal.med.saga-u.ac.jp/index.php?id=2)。本研究により、ヒト疾患モデルウサギの精子バンク確立のための基盤技術の整備と実際に凍結精子による系統保存の実施を進める事ができたと考えられる。当初の研究計画にしたがい実験を実施しており、概ね予想された成果が得られている。24年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、これまでの検討(H22H23年度)で得られた結果をもとに、実際に、凍結精子の輸送を実施し、その実行性を確認することを計画している。また、新規の凍結保存液の開発は、試行錯誤で様々な候補の試薬の効果を検討する必要がある。今後も継続して適切な試薬の探索を進める。これらの検討を通して、ウサギバイオリソースの保存、供給体制の整備に必要な基盤技術の整備を行う。
真性膵嚢胞の病理学的本態に関する組織化学的・遺伝子学的研究

【背景と目的】画像診断の進歩に伴い嚢胞性膵病変が無症状で多数発見されるようになったが、嚢胞性膵病変の臨床的鑑別診断は必ずしも容易ではない。とくに「粘液産生膵腫瘍」(国際的には膵管内乳頭粘液性腫瘍(IPMT))・粘液性嚢胞腫瘍(MCT)は、組織学的本態が曖昧で、同一の病変ですら病理学者によって診断が異なることがある。病理診断が不確実であると、臨床診断・手術適応も不確かなものになる。そこで、IPMTおよびMCTの病理学的本態(腫瘍性or非腫瘍性)に迫るべく遺伝子学的検索を試みた。【対象と方法】IPMTおよびMCT切除例のうち、クロナリティ解析が可能であった女性は11例(IPMT7,MCT4)であった。ホルマリン固定標本から各異型度(grade0-3)の上皮を選択的に採取し、DNAを抽出・精製した。クロナリティ解析はX染色体上PGK遺伝子のメチル化による不活化を利用して行った。制限酵素非消化で2本のPCRプロダクトバンドが消化後1本になればmonoclonal(mono)、2本のままならばpolyclonal(poly)と判定した。K-ras変異はコドン12についてnested PCR法で検討した。【成績】IPMTでは、1例を除き異型度のgradeによって上皮のクロナリティは異なっていた。則ち、大部分の例はgrade 0においてpolyclonalityを示し、異型度が増すごとにmonoclonalityとなった。gradeごとにmonoclonalityの出現頻度をみると、grade 0では29%、grade 1では33%、grade 2では100%、grade 3でも100%であった。MCTでは、1例でgrade 0がpoly、grade 1と2がmonoclonalであった。K-ras変異に関してはIPMTではgradeが増大するにつれて上昇し、grade 0で0%、grade 1で33%、grade 2で50%、grade 3では75%であった。controlの上皮に変異はみられなかった。MCTでは変異はなかった。なおクロナリティとK-ras変異は、相互関係に一定の傾向は認められなかった。【総括】1.IPMTでは異型度が増すにつれmonoclonality、K-ras変異の頻度は増加した。2.MCTは、異型の乏しい上皮のみから成るものでは、polyclonalな細胞集団であり、非腫瘍性の可能性も示唆された。IPMTとの異同は明らかにできなかった。3.monoclonalityとK-ras変異との関係では、monoclonalityはK-ras変異よりも早期の段階で腫瘍化に関与する可能性が示唆された。

【背景と目的】真性膵嚢胞においては腫瘍性および非腫瘍性の鑑別が必ずしも明確でない。また腫瘍性の膵嚢胞を構成する上皮には、種々の程度の異型を示す上皮がみられるが、どの上皮からが腫瘍成分であるかについては一定の見解が得られていない。我々はクロナリティ解析の手法により、上皮の異型度別に腫瘍性病変の特定を試みた。【対象と方法】膵管内粘液性乳頭腫瘍7例(腺腫3,癌4)、粘液性嚢胞腫瘍2例、漿液性嚢胞腺腫1例、膵リンパ管腫1例を対象とした。病変のDNAの採取は、フォルマリン固定標本からマイクロダイセクション法にて組織を形態学的異型度に分類して行った。クロナリティの評価は、X染色体不活化の原理を用いた方法(PGK遺伝子の多型性を利用)と、K-rasの点突然変異(codon12、13)を解析して行った。【結果】真性膵嚢胞の上皮は形態学的異型度が強くなるにつれて、モノクローナルな病変と、K-rasの点突然変異のみられる病変の頻度は高くなる傾向がみられた。【総括】膵嚢胞の上皮において腫瘍性性格を示すものは、形態学的に過形成以上の上皮であり、異型のない嚢胞上皮の大部分は腫瘍成分ではないと考えられた。背景と目的:膵嚢胞性病変が多数発見されるようになったが、その鑑別診断は必ずしも容易ではない。とくに膵管内乳頭粘液性腫瘍(IPMT)は、組織学的本態が曖昧で、同一の病変ですら病理学者によって診断が異なることがある。そこで、IPMTの病理学的本態(腫瘍性or非腫瘍性)に迫るべく遺伝子学的検索を試みることとした。対象と方法:IPMTおよび粘液性嚢胞腫瘍(MCT)切除例のうち、クロナリティ解析が可能であった女性は11例(IPMT7,MCT4)であった。ホルマリン固定標本から各異型度(grade0-3)の上皮を選択的に採取し、DNAを抽出・精製した。クロナリティ解析はX染色体上PGK遺伝子のメチル化による不活化を利用して行った。K-ras変異はnested PCR法で検討した。成績:monoclonalityもK-ras変異もgradeが増すにつれて出現頻度が高くなった。則ち、gradeごとにmonoの出現頻度をみると、monoはgradeO:27%、grade1:43%、grade2:100%、grade3:100%であった。K-ras変異はgradeO:0%、grade1:29%、grade2:50%、grade3:75%であった。monoとK-ras変異がどのgradeから出現するかについて検討すると、相互関係に一定の傾向は認められなかった。gradeごとにみると、monoの方がK-ras変異に比べて高い傾向が認められた。総括:1.IPMTでは異型度が増すにつれmonoclonality、K-ras変異の頻度は増加した。2.異型の乏しいMCTは、polyclonalであり、非腫瘍性である可能性が考えられた。3.monoclonalityはK-ras変異よりも早期の段階で腫瘍化に関与することが示唆された。【背景と目的】画像診断の進歩に伴い嚢胞性膵病変が無症状で多数発見されるようになったが、嚢胞性膵病変の臨床的鑑別診断は必ずしも容易ではない。
タイヘイヨウサケ属サクラマスの降海回遊期の若齢化とその要因の解明

東北地方の広瀬川において、サクラマスが従来よりも半年早い0歳魚の秋に川から海に降海すること、またこれらの降海魚は、仙台沿岸域を回遊し、翌春に河川に遡上することが示された。この現象の機構を解明するため、類縁種であるスチールヘッドトラウトを用いた行動解析を行ったところ、本種は水温が上昇した際に高水温域を忌避して移動することが示された。このことから、降海期の若齢化には河川内の水温環境が関係することが示唆された。また、同じく類縁種であるマスノスケの稚魚を円筒水槽で飼育し、上層・下層の魚を分離したところ、上層の魚がより若齢で降河行動を起こすことが示され、若齢降河魚を人為的に作出し得ることも示された。(1)東北地方南部、宮城県広瀬川中流域における定点採集調査により、昨年と同様、サクラマスの稚魚(0+年魚)が従来知られているよりも半年早い10月11月にかけて、降河行動を起こしていることが明らかとなった。(2)そこでこれらの稚魚12尾に小型超音波発信器を腹腔内挿入して放流し、流域に設置した5カ所のアンテナにより降河行動を追跡したところ、5尾の降河行動が確認され、さらにそれら5尾のうちの2尾が、11月下旬に太平洋にまで降海したことが確認された。一方、既に報告している通り、広瀬川では春に海から川に遡上する、小型のサクラマス遡上親魚が存在する。そこでこれらの筋肉中のセシウム量を測定したところ、測定値は放射線量が比較的高い河川残留型よりも低く、オホーツク海まで回遊したと考えられる大型の遡上親魚よりも低かったことから、これらの小型親魚は東北地方沿岸海域を回遊していたと考えられる。以上の結果から、広瀬川では一部のサクラマスが本来知られている時期よりも半年早い満一歳の秋に川から海に降海し、東北地方沿岸海域を回遊した後の翌春に従来よりも小型の体サイズで河川に遡上することが示された。この結果は、本研究が提唱している仮説通り、一部のサクラマスの回遊パターンがより南方に分布する同属近縁種であるサツキマス化していることを示すものと考えられる。(3)オレゴン州立大学において、スチールヘッドの稚魚をモデルとして、水温変動が稚魚の行動に及ぼす影響をY字水路を用いて調べた。その結果、稚魚は特に水温が上昇した場合に、水温が上昇した水域を忌避することが明らかとなった。この結果かから、稚魚は河川の水温が通常よりも大きく上昇した場合、より水温が低い上流域に移動する可能性が示された。(1)東北地方南部、宮城県広瀬川中流域における定点採集調査により、本来は1歳半の春に川から海へ降海するとされるサケ類であるサクラマスの稚魚が、本河川では半年早い0歳の秋(1011月)にも降河行動を起こしていることが明らかとなった。また、これらの稚魚を研究室に移送し、Sea water Challenge testを行った結果、これらの稚魚は春に降河する稚魚と同様、海水適応脳が備わっていることも判明した。(2)また6月、広瀬川の中流域においては、オホーツク海まで回遊するとされる降海群(体長約5060cm)よりも小型のサクラマス(体長約2545cm)が現れることが確認された。そこでこれらの小型のサクラマスの12個体を採捕して音波発信器(Vemco社、V6)を腹腔内装着し、移動を観察したところ、受信が確認された全実験魚が広瀬川を下流域から上流域に向けて遡上したことが明らかとなった。以上の結果から、東北地方南部の広瀬川においては、(1)従来の降海期よりも半年早く川から海に降海する群、および従来よりも小型の体サイズで海から川に遡上すると考えられる群が見られることが明らかとなった。上記の2群の存在から、広瀬川のサクラマスの一部は、0歳の秋に川から海に降り、河口海で約半年間を過ごし、1歳半となったタイミングで川に遡上する群が存在する可能性が考えられた。サクラマスの近縁種であり、南西日本に分布するサツキマスは、上記の広瀬川のサクラマスのように、やはり0歳の秋に川から海に降り、1歳半の春に川に遡上することが知られている。以上の結果から、広瀬川の一部のサクラマスの回遊パターンは、より南方に分布するサツキマス型に近づいている可能性が考えられた。

(1)東北地方広瀬川のサクラマスは、従来知られているよりも半年早い、0歳魚の秋に降海し、東北沿岸で回遊して翌年の春に広瀬川に回帰することが示唆された。一方、広瀬川にはこうして海から遡上する個体の他、春に小型(体長27cm程度)の1歳半の魚が見つかる。そこで5月に中流域で採集した5個体に電波発信機(Lotek nano tag)を装着し、その後の行動を定期的に調査した。結果、5個体のうち3個体は放流地点から河川を遡上し、9月に本川の産卵場に到達したことから、秋に銀化魚様稚魚となって降河行動を行った0歳魚の一部は、河川残留型に分化して、回帰魚と同様、翌春に河川内を遡上し産卵することが示唆された。(2)水産庁増養殖研究所においてスチールヘッドトラウト銀化魚をモデルとして降海機構を検討した。実験河川にスチールヘッドトラウトを収容し、カオリンによる人工濁りによって降河行動を誘起し、これらの行動とホルモン、体サイズとの関係を解析したところ、降河行動を起こしたスチールヘッドトラウトは、既に実験の1ヶ月前から甲状腺ホルモンやコルチゾルの濃度が高いこと、また降河個体は眼径の比率が大きいことが明らかとなった。(3)オレゴン州立大学において、マスノスケをモデルとして降海機構を検討した。まずふ化稚魚を円筒形の水槽で飼育し、上層、下層に分布した稚魚をさらに別々の水槽に収容して飼育を続けた。その後、0歳の秋にこれらの稚魚を海流水槽に7尾ずつ収容し、冷却した飼育水を導水して回流行動を観察したところ、上層魚は、下層魚よりもより活発に水槽内を降下することが判明した。これらの結果は、降河回遊行動の若齢下には、孵化後以降の成長プロファイルやそれに伴う生理的・形態的変化が深く関係していることを示す。魚類行動生理学本研究の目的は、東北地方南部の一部の河川において、サクラマスの降海年齢の若齢化と、降海期間の短縮が起こっているか否か、すなわちサクラマスの生息域の南部において、降海回遊のパターンが本種の同属近縁種であり、より南方に分布するサツキマスに近づいているか否かを明らかにすることである。本年度の研究では、小型超音波発信器の装着実験により、スモルト化した稚魚(12尾中2尾)がサツキマスと同様に11月に川から海に降海することが判明した。また、筋肉中のセシウム量の測定値から、こうした個体は沿岸域を回遊し、約半年後の春に海から川に遡上することが示唆された。以上の結果は、広瀬川の一部のサクラマスが、サツキマスとほぼ同様の回遊パターンを発現している可能性を示唆する。以上の研究成果が得られたことから、本年度の研究は概ね順調に進展したものと考えられる。本研究の目的は、東北地方南部の一部の河川において、サクラマスの降海年齢の若齢化と、降海期間の短縮が起こっているか否かを明らかにすることを目的としている。これはすなわち、サクラマスの生息域の南部に相当する広瀬川のサクラマスの降海パターンが、本種のより南方に分布する同属近縁種であるサツキマスの降海回遊パターンに近づいているか否かを明らかにすることである。本年度は、宮城県広瀬川において、一部のサクラマスがサツキマスに類似する回遊生活史を示す可能性があることが判明した。すなわち、一部のサクラマスがサツキマス同様、0歳の秋に川から海に下ること、またこれらの魚が1歳半の春に降河するサクラマスと同様に海水適応能を備えていること、すなわち銀化変態を行っていることも明らかとなった。サクラマスが0歳の秋に銀化変態を行うことは、一部の養殖・研究施設における選抜育種によって確認されていたが、自然河川でこのような現象が確認されたことははじめてであり、意義深いと考えられる。また、本研究では、広瀬川のサクラマスの一部が従来よりも小型の体サイズで春に海から川に遡上していることが判明した。これは、これらのサクラマスの降海期間が従来知られている約1年間よりも短くなっている可能性を示唆する。
バベシア原虫のヘモグロビン分解経路の解明と新規治療薬の開発

本研究は、バベシア原虫の赤血球内寄生機構の一環としてヘモグロビン分解経路の解明に焦点を当て、それに基づいた新規治療法の開発を目指して企画した。前年度までに以下の結果が得られている。(1)ウシバベシア原虫(Babesia bovis)のヘモグロビン分解に関わると推定されるロイシンアミノペプチダーゼ(BbvLAP)遺伝子をクローニングし、組換えBbvLAPを作製した。(2)抗組換えBbvLAP抗体を作製し、虫体におけるBbvLAPの局在を特定した。(3)組換えBbvLAPの酵素活性を確認した。今年度は主に以下の結果が得られた。(1)組換えBbvLAPのアミノペプチダーゼ活性を詳細に調べたところ、K_m値が139,3±30.25μMで、V_<max>値は64.83±4.61μM/minであった。(2)組換えBbvLAPの酵素活性はロイシンアミノペプチダーゼのインヒビターとして知られるベスタチンにより特異的に抑制された。(3)試験管内培養における虫体増殖抑制試験を行ったところ、IC_<50>値は131.7±51.43μMであった。(4)これらの結果は、BbvLAPを標的としたウシバベシア原虫感染症の治療薬開発の可能性を示唆するものである。本研究では、バベシア原虫の赤血球内寄生機構の一環としてヘモグロビン分解経路の解明に焦点を当て、それに基づいた新規治療法の開発を試みる。本年度に実施した研究内容と得られた研究成果は以下の通りである。1.バベシア原虫のESTデータベースの作成。当研究室での研究実績が多いイヌバベシア原虫(Babesia gibsoni,NRCPD株)からmRNAを抽出し、完全長cDNAライブラリーを構築した。次に約1万クローンの塩基配列を解読し、ESTデータベースを作成した。2.ヘモグロビン分解経路に関わる遺伝子の同定。イヌバベシア原虫のESTデータベースと既に公表されているマラリア原虫のESTデータベースを網羅的に比較検討したところ、ヘモグロビン分解の各段階に関わると推定される酵素遺伝子cysteine protease2(BgCP2)、cathepsin C(BgCTC)、leucine aminopeptidase(BgLAP)などを特定できた。3.組換えタンパク質の発現。BgCP2、BgCTC、BgLAP遺伝子をそれぞれ大腸菌発現系にて発現を試みたところ、BgLAPのみが機能解析に適した可溶性組換えタンパク質として発現できた。得られた組換えBgLAPをマウスに免疫し、抗BgLAP特異抗体を作製した。得られた特異抗体を用いてイムノブロットを行ったところ予想通りの分子量をもつ57kDaのB.gibsoni虫体由来の天然BgLAPが同定できた。また、特異抗体を用いて蛍光抗体法を行ったところ、BgLAPはB.gibsoniの赤血球寄生の全ステージにその発現が認められた。次に、精製した組換えBgLAPの酵素活性を調べたところ、典型的なロイシンアミノペプチダーゼ活性が認められた。ウシバベシアゲノムデータベースよりヘモグロビン分解に関わると推定されるロイシンアミノペプチダーゼ(BbLAP)遺伝子を同定した後、cDNAライブラリーから完全長遺伝子をクローニングした。BbLAP遺伝子を大腸菌発現系にて発現したところ、機能解析に適した可溶性組換えタンパク質として発現できた。得られた組換えBbLAPをマウスに免疫し、抗BbLAP特異抗体を作製した。得られた特異抗体を用いてイムノブロットを行ったところ予想通りの分子量をもつ57kDaのB.bovis虫体由来の天然BbLAPが同定できた。また、抗BbLAP特異抗体を用いて蛍光抗体法を行ったところ、BbLAPはB.bovisの赤血球寄生の全ステージにその発現が認められた。次に、精製した組換えBbLAPの酵素活性を調べたところ、典型的なロイシンアミノペプチダーゼ活性が認められた。この酵素活性はロイシンアミノペプチダーゼのインヒビターであるBestatinにより特異的に抑制された。

(3)試験管内培養における虫体増殖抑制試験を行ったところ、IC_<50>値は131.7±51.43μMであった。(4)これらの結果は、BbvLAPを標的としたウシバベシア原虫感染症の治療薬開発の可能性を示唆するものである。当初掲げた研究目標をおおむね達成したため。今後は、ロイシンアミノペプチダーゼのインヒビターであるBestatinの原虫増殖抑制活性をin vitroおよびin vivoにて調べ、バベシア原虫感染症に対する治療薬としての可能性を検討する。
La、Ce及びSmを含をむ高純度金属間化合物の作製とそのフェルミ面の研究

4f電子を持つ化合物の中で、特に重い伝導電子系を形成すると考えられているCeNiと、その参照物質としてのLaNiの高純度単結晶を作製し、高磁場磁気低抗効果及びドハース・ファンアルフェン(dHvA)効果を測定して、そのフェルミ面を調べた。単結晶試料をチョコラルスキー法で作成し、さらに高純度化を目的として、固相電解法による精製を行った。その結果、残留低抗案がLaNiで0.13μΩ・cm(残留低抗比RRRにして200)、CeNiで3.5μΩ・cm(RRRにして160)の高純度試料を得ることに成功した。温度1.5K0.5K、磁場15Tまでの条件下で、横磁気低抗P_Hを測定した。その結果LaNi、CeNiともに(i)電子と正孔の数が等しい補償された金属であること、(ii)磁場をa軸方向及びc軸方向にかけたときのいづれの場合にも、b軸方向への開いた軌道を作るような多重連結したフェルミ面を持つこと、(iii)さらにb軸方向に磁場をかけたとき、c軸方向への開いた軌道ができること、がわかった。またP_Hの方向依存性および磁場依存性ともに、LaNiとCeNiで差異はなく、フェルミ面が大筋で同じ形をしていると考えられる。LaNiではdHvA効果を測定することができた。dHvA振動数0.6MGから、100MGにわたる4つのブランチが測定され、結果は、b軸方向に軸をもつ円筒形のフェルミ面が存在することを示唆している。またb軸方向で1.5MG及び40MGの振動数をもつ振作に寄与している電子の有効質量は、それぞれ0.93m_o及び1.85m_oであった。今後さらにCeNiのdHvA効果を測定するとともに、ここで得られた結果をバンド計算の結果と比較検討して、フェルミ面の全体像を明らかにしてゆく計画である。
両親媒性高分子間の会合制御による新規ナノ組織体の構築と機能

本研究ではブロック型の両親媒性多糖の合成と、その機能について検討した。アミロースは螺旋形成能を有する多糖であり、その螺旋空洞内に種々の疎水性低分子物質を取り込むことによって包接錯体を形成する事が知られている。しかし、アミロース自体は凝集・沈殿しやすいことからその溶液内挙動、高分子ホストとしての利用は十分検討されているとはいいがたい。そこでアミロースの螺旋形成能を乱すことなく、水、及び有機溶媒に可溶な両親媒性多糖としてアミロース鎖末端にPEO(ポリエチレンオキシド)鎖をブロック型で導入したPEO-アミロースを合成し、水及び有機溶媒中での会合特性とその機能について検討した。分子量が約5000のPEO鎖の末端にマルトペンタオースを導入したプライマーを合成し、グルコース-1ーリン酸存在下、ホスホリラーゼを用いた酵素反応により、アミロース鎖の重合度26,36,及び73から成るPEO-アミロースを合成した。酵素反応時間により重合度を制御しえ、比較的単分散な高分子が得られた。PEO-アミロース(n=73)を一旦DMSOに溶解した後に混合することによりPEO-アミロースをクロロホルムに可溶化しえた。この際の水分含量は通常0.02wt%以下であった。DLS測定により会合体の大きさ(Dh)は約46nmであった。アミロースはクロロホルムに全く溶解しないことから、PEO-アミロースはアミロース鎖を内核とした高分子ミセルを形成していることが示唆される。また、アミロース内核は水を安定に保持し得ることから、低分子界面活性剤等でみられる逆ミセル構造をとっているといえる。逆相ミセル内水相では、アミロース鎖は螺旋形成が可能で特異な分子認識場として有効に機能することが分かった。
鶏胚肢芽にレチノイン酸によって誘導される遺伝子の探索・解析

まず、内在性のレチノイン酸の形態形成への関与を調べた。レチノイン酸合成阻害剤、シトラルを培養下のニワトリ肢芽に作用させたところ、作用させた部分の軟骨パターンが不完全になる事が分かった。このことは、内在性のレチノイン酸が肢芽形態形成に関与することを示唆する。以上の内容を論文としてまとめた。次に、ニワトリ肢芽内でレチノイン酸によって転写調節される遺伝子の探索を行い、ディファレンシャルディスプレイ法によって2つの興味深い遺伝子断片を得た。それぞれは、発生中の肢芽で領域特異的に発現し、しかも、レチノイン酸に非常に早く応答し、転写が調節されることが分かった。現在、これらの遺伝子の全長をクローニングしている。また、ニワトリ肢芽背腹軸の形成に関する研究、カエル肢芽の前後軸形成に関する研究を行い論文をまとめた。
放射線による小核形成を起源とする染色体不安定化メカニズムの解明

本研究は放射線誘発染色体不安定化に染色体分配異常に起因する小核が関与するというモデルを検証した。そのために、ライブセルイメージングを用いてX線誘発小核形成とその後の運命を細胞系譜解析により調べた。その結果、放射線により染色体分配異常に起因する染色体由来小核の生成が促進されることがわかった。また、染色体由来小核には、主核のDNA合成期にDNA2本鎖切断が蓄積し、一部の小核は次の分裂期に主核に再取り込みされることがわかった。さらに、放射線被ばくした染色体由来小核にはDNA2本鎖切断が誘発され、その小核が主核に取り込まれることにより、複雑な染色体再構成が生じる可能性があることが明らかになった。X線誘発小核の運命を明らかにするために、動原体由来タンパク質CENP-Aを蛍光色素mKOで、ヒストンH3を蛍光色素Plumで標識したヒト線維肉腫細胞HT1080を作成し、ライブセルイメージングで1Gy、または2Gy照射後に出現する小核について調べた。この細胞を用いれば、小核を断片由来か、あるいは染色体由来か区別できる。線量当たりの染色体由来小核出現頻度は、0Gy、1Gy、2Gyでそれぞれ、5%、14%、26%と増加した。さらに、生じた小核が次の分裂で消失するか否かを調べたところ、1Gy及び2Gy照射による消失の割合は、断片由来で31%、28%であり、染色体由来では、それぞれ42%、19%であった。このことは、小核の由来にかかわらず、形成した2040%の小核が次の分裂時に主核に取り込まれるか、あるいはアポトーシスを起こして消失することを示唆している。そこで、小核が主核に取り込まれる際に、両者のDNA複製のタイミングに差異があるのかについて興味を持ち、同調培養法を用いて調べた。マウスm5S細胞にノコダゾールを処理してM期に同調後、解除して最初のDNA複製のタイミングをBromodeoxyuridine(BrdU)の取込みにより主核と生じた小核とで解析した。その結果、p53野生型細胞では、主核と小核のDNA複製のタイミングはほぼ合致しているのに対し、p53ノックダウン細胞では、小核のDNA複製のタイミングがずれて主核よりも少し遅れる傾向がみられた。このことは、p53機能が失われると主核と小核の同調的なDNA複製のタイミングが失われることを示唆している。この場合、小核におけるDNA複製タイミングのずれによってDNA損傷が生じるのか否かを明らかにすることが次の課題である。ライブセルイメージングを用いて、X線誘発染色体分配エラーとDNA2本鎖切断(DSB)生成との関連性を解析した。細胞はヒストンH3を蛍光色素mcherryで可視化したマウスm5S細胞を用い、染色体分配エラーとしてクロマチン架橋形成に着目し、架橋形成した細胞の系譜を解析した。X線を2 Gy被ばくした細胞271系統について調べた結果、分裂異常が起きた系統は53%であり、そのうちの69%(99系統)がクロマチン架橋であった。クロマチン架橋が断裂した後、解析不能例を除くと、45%の細胞が持続的な増殖、22%がG1期停止、及び4%がアポトーシスを示した。このうち、G1期停止は、分裂終期における架橋の断裂により、DSBが新たに誘発されたことが原因でp53依存的に生じたものと推定される。以上の結果は、誤った再結合により生じた二動原体染色体を持った細胞の運命として、分裂期でクロマチン架橋を形成するが、およそ半数は増殖を持続し、20%程度がp53依存的期G1停止に至り、アポトーシスが誘導される例は稀であることを示している。次に、X線(4 Gy)被ばくした小核を同調培養したp53野生型マウスm5S細胞に取り込ませた後の主核及び小核由来染色体の安定性を解析した。その結果、4 Gy被ばくした小核由来染色体は、G1期のm5S細胞に取り込まれた場合には、S/G2期のm5S細胞に取り込まれた場合に比べて、環状染色体や断片化などを含む複雑な構造異常や数的異常が起きやすいことが分かった。また、非被ばく染色体は、被ばく染色体に比べると取り込まれた後の変異が少ないことが分かった。平成27年度の研究推進計画では、1)ライブセルイメージングによるX線誘発クロマチン架橋形成とDNA2本鎖切断との関連性を解析する、2)X線未照射、あるいは照射した小核を同調培養した細胞に取り込ませた後の主核及び小核由来染色体の安定性を解析する、以上、主に2つの項目について実施する予定であった。このうち、1)のクロマチン架橋形成した細胞の運命に関するライブセルイメージングを用いた解析では、架橋断裂による新たなDSB形成がG1期停止を誘発していることを示す結果が得られた。また、2)のX線被ばくした小核由来染色体をG1期、またはS/G2期細胞に取り込ませる実験では、G1期とS/G2期で被ばく小核由来染色体の安定性が異なることを示す結果が得られた。以上の結果から、ほぼ計画通り研究を進めることができたと評価した。平成28年度は、小核形成を起源とする染色体不安定化メカニズムの解明に向けて、1)X線、又は薬剤で形成された小核の運命、並びに2)X線被ばくさせた小核由来染色体の不安定化という2つの視点から解析を進めた。

まず、小核の運命に関しては、ヒストンH3をmcherryで蛍光ラベルして核を視覚化したマウスm5S細胞を用いて、紡錘糸形成阻害剤ノコダゾール処理、及びX線(2Gy)照射により誘発した小核に着目してライブセルイメージングにより解析した。その結果、ノコダゾール誘発小核では、10個のうち2個(20%)が次の分裂期で主核に再取り込みされたのに対し、X線誘発小核では、35個のうち主核に再取り込みされたものは無かった。この相違は、ノコダゾール誘発小核が主に1本のラギング染色体全体から構成されるのに対して、X線誘発小核は主に染色体断片から構成されることに原因があると推定される。そこで次に、ノコダゾール(100ng/mL,6h)処理により、分裂期で同調したm5S細胞に、細胞周期の進行ともに生じるDNA2本鎖切断(DSB)陽性小核の数を解析した。その結果、主核のDNA合成が進行するのに伴い、DSB陽性小核数が増加することが明らかとなった。そこで、DSBを蓄積した小核が主核に取り込まれることによる染色体不安定化について調べるために、X線(4Gy)照射した小核をG1期、またはS/G2期に同調したマウスm5S細胞に移入して染色体不安定化を解析した。その結果、X線被ばく染色体の不安定化に移入細胞周期による影響はみられなかったが、被ばく染色体の中には複雑な染色体内再構成を示す例が見られた。以上の本研究の成果は、ラギング染色体由来の小核内に蓄積したDSBが主核に取り込まれると、がん細胞にみられるchromothripsisのような複雑な染色体内再構成が引き起こされる可能性を示唆している。本研究は放射線誘発染色体不安定化に染色体分配異常に起因する小核が関与するというモデルを検証した。そのために、ライブセルイメージングを用いてX線誘発小核形成とその後の運命を細胞系譜解析により調べた。その結果、放射線により染色体分配異常に起因する染色体由来小核の生成が促進されることがわかった。また、染色体由来小核には、主核のDNA合成期にDNA2本鎖切断が蓄積し、一部の小核は次の分裂期に主核に再取り込みされることがわかった。さらに、放射線被ばくした染色体由来小核にはDNA2本鎖切断が誘発され、その小核が主核に取り込まれることにより、複雑な染色体再構成が生じる可能性があることが明らかになった。平成26年度の研究実施計画では、1)ライブセルイメージングによるX線誘発小核の形成と消失の細胞系譜解析、2)53BP1可視化細胞を用いた染色体分配エラーのライブセルイメージングを用いた解析、3)主核と小核におけるDNA複製タイミングの解析、以上の3項目を実施する予定であった。このうち、2)の53BP1可視化細胞を用いる解析に関しては、実験計画通りに進めることができなかった。その理由は、検出に適した53BP1の蛍光量を有した細胞が得られなかったからである。一方、1)ライブセルイメージングによるX線誘発小核の形成と消失の細胞系譜解析と3)主核と小核におけるDNA複製タイミングの解析は、ほぼ計画通りに進めることができた。1)小核において、p53依存的にDNA複製によってDSB蓄積が生じることを実験的に明らかにする。p53野生型マウスm5S細胞に、紡錘糸形成阻害剤ノコダゾールを処理して小核形成させ、小核におけるDNA複製進行をブロモデオキシウリジン(BrdU)の取り込みで、DSBの蓄積をγ-H2AXフォーカスでモニターして、両者の関係を調べる。さらに、p53をノックダウンした細胞でも同様に調べる。2)ライブセルイメージングを用いて、小核が主核に取り込まれる頻度を明らかにする。
横紋筋細胞内膜系の三次元画像解析

1.三次元画像解析法の開発(1)試料作製骨格筋細胞横細菅系の三次元画像解析のため、資料の作製から始めた。カエル骨格筋を材料として、ゴルジ銀法により横細菅系を選択的に染色した。その染色法では、全ての筋細胞が同じように染色されるわけではなく、横細菅系が選択的に染色される細胞のほかに、筋小胞体が染まった細胞、膜系が全く染まらない細胞も混在していた。興味深いことに、このような膜系の染色性の違う筋細胞が光学顕微鏡下で区別できることが明らかになった。すなわち、横細菅のみが染まった細胞は反射光下でわずかに黄色調で透明に見え、筋小胞体が染まった細胞は赤褐色を呈し、全く染まっていない細胞は黒色を呈した。このような資料から13μmの厚い切片を作製、中高圧電子顕微鏡にて立体対写真を撮影した。これにより、当初の計画通り、三次元画像解析のための立体電子顕微鏡写真を準備できた。(2)三次元画像解析撮影された立体対写真について、米国の共同研究者の研究室でコンピューターを用いて、三次元画像解析法の開発を進め、そのためのプログラムを作成し、応用を開始した。基本的には、異なる試料傾斜の電子顕微鏡像をまず数値化し、これをコンピューター・ワークステーションのディスプレイ上に立体対として映し出し、立体眼鏡で立体視しながら、染まった横細菅のみを選び、その走行をたどることによって、コンピューターグラフィック・モデルを作ることを行なった。さらにこれを立体的にトレースすることによって定量化を計るものである。この方向で、現在もプログラムの開発・改良を進めている。(3)反射共焦点レーザー顕微鏡による立体観察金属染色した試料は共焦点レーザー顕微鏡の反射モードの観察対象になることが期待されたので、ゴルジ銀法で横細菅系を選択的に染色した筋細胞を、樹脂包埋ののち、厚いスライスのまま反射モードで観察した。その結果、予想通り、横細菅系はレーザー光をよく反射し、鮮明な像として観察することに成功した。共焦点レーザー顕微鏡にて光学的(断層)連続切片を得て、これからコピュータ-による三次元再構築もできた。横細菅の分布を広く立体的にたどることができ、筋原線維のZ板レベルを横走する王再関係の網工平面がラセン配列をとっていることが明らかになった。光顕・電顕相関法の開発ニワトリ胚心筋細胞を用いて、筋原線維形成過程を光顕・電顕とを相関させる方法の開発を試みた。金製グリッドに支持膜を張り、その上に心筋細胞を培養し、筋原線維成分について、アクチン、α-アクチニン、ミオシン、またビンキュリンなどを蛍光抗体染色し、共焦点レーザー顕微鏡で光学的連続切片観察を行なった。次に、同じ試料を電子顕微鏡用に固定、脱水、臨界点乾燥し、全載標本として、中高圧電子顕微鏡にて立体的に観察した。両像を立体的に対比することによって、同一試料について点対点で対応、相関させることができた。現在、膜オルガネラについても、DiOC_6,DiIなどの蛍光色素で染色し、同様に、共焦点レーザー顕微鏡と電子顕微鏡とを用い相関させることも試みた。組織切片についても、光顕・電顕相関法を考案した。型のごとく、骨格筋組織からクライオスタット切片を作り、抗ジストロフィン抗体で染色し、共焦点レーザー顕微鏡で光学的連続切片を作り、観察したのち、電子顕微鏡用に固定、脱水、樹脂包埋して、電子顕微鏡観察し、相当するレベルで両像を相関させることができた。

共焦点レーザー顕微鏡にて光学的(断層)連続切片を得て、これからコピュータ-による三次元再構築もできた。横細菅の分布を広く立体的にたどることができ、筋原線維のZ板レベルを横走する王再関係の網工平面がラセン配列をとっていることが明らかになった。光顕・電顕相関法の開発ニワトリ胚心筋細胞を用いて、筋原線維形成過程を光顕・電顕とを相関させる方法の開発を試みた。金製グリッドに支持膜を張り、その上に心筋細胞を培養し、筋原線維成分について、アクチン、α-アクチニン、ミオシン、またビンキュリンなどを蛍光抗体染色し、共焦点レーザー顕微鏡で光学的連続切片観察を行なった。次に、同じ試料を電子顕微鏡用に固定、脱水、臨界点乾燥し、全載標本として、中高圧電子顕微鏡にて立体的に観察した。両像を立体的に対比することによって、同一試料について点対点で対応、相関させることができた。現在、膜オルガネラについても、DiOC_6,DiIなどの蛍光色素で染色し、同様に、共焦点レーザー顕微鏡と電子顕微鏡とを用い相関させることも試みた。組織切片についても、光顕・電顕相関法を考案した。型のごとく、骨格筋組織からクライオスタット切片を作り、抗ジストロフィン抗体で染色し、共焦点レーザー顕微鏡で光学的連続切片を作り、観察したのち、電子顕微鏡用に固定、脱水、樹脂包埋して、電子顕微鏡観察し、相当するレベルで両像を相関させることができた。1.三次元画像解析法の開発骨格筋細胞横細管系の三次元画像解析のための試料作製を行なった。カエル骨格筋を材料とし、ゴルジ法により銀染色を試み、横細管系を選択的に染色することができた。この方法では、すべての筋細胞が同じように染色されるわけではなく、横細管のみが選択的に染まった細胞のほかに、筋小胞体が染まった細胞、膜系が全く染まらない細胞も混在していた。興味深いことに、膜系の染色性の違いが光学顕微鏡下でも同定できた。横細管のみが染った細胞は透明に見え、筋小胞体染色の細胞は赤味を帯び、全く染まっていない細胞は黒色を呈した。このような試料から13μmの厚い切片を作製、中高圧電子顕微鏡にて立体的写真を撮影した。これにより、当初の計画通り、三次元画像解析のための立体電子顕微鏡写真の一部の準備することができた。また、ゴルジ法で染色した筋細胞を樹脂包埋ののち、共焦点レーザー顕微鏡にて反射モードで立体的観察を試みた。その結果、横細管系の立体的配置の全体像を鮮明に可視化することに成功した。今後、これゆよる立体配置と機能との相関を明らかにしていきたい。2.光顕・電顕相関法の開発培養ニワトリ心筋細胞を用いて、筋原線維形成過程および関連した膜オルガネラの動態を光顕と電顕とを相関させて分析することを試みた。金製グリッドに支持膜を張り、その上にニワトリ胚心筋細胞を培養し、筋原線維に関してはアクチン.ビンキュリンなどを蛍光染色し、膜オルガネラについてはDiOC_6,DiIなどの蛍光色素で染色した。この試料を共焦点レーザー顕微鏡で立体的に観察したのち、固定、臨界点乾燥を施し、全載標本として同一細胞について光顕・電顕相関観察を行うことができた。1.三次元画像解析法の開発カエル骨格筋細胞について横細管系を三次元画像解析するため、ゴルジ銀染色法を試み、横細管系を選択的に染色することができた。
新規に樹立したグレリン細胞株によるグレリン生合成、分泌機構の解明

独自に樹立したグレリン分泌細胞株MGN3-1細胞を用いて、栄養素がグレリン分泌に与える影響について検討を行った。グルコース濃度はグレリン分泌に大きな影響が無く、脂肪酸では、オクタン酸添加時に活性型グレリンの分泌が上昇、長鎖脂肪酸添加時にグレリン分泌は低下した。また、いくつかのアミノ酸がグレリン分泌を刺激することを見いだした。今回の検討で、栄養素がグレリン分泌調節に関わることが明らかとなった。これまでの研究で、我々は、世界で初めてグレリン分泌細胞株MGN3-1細胞を樹立することに成功した。昨年度までに、ペプチドホルモンのうち、オキシトシンがグレリン分泌を刺激し、一方で、ソマトスタチンがSSTR2受容体を介して、インスリンがインスリン受容体を介して、グレリン分泌を抑制することを見いだした。また神経伝達物質のうち、アドレナリンがβ1受容体を介して、また、ドーパミンがD1受容体を介してグレリン分泌を刺激することを報告してきた。グレリン細胞は主に胃や十二指腸といった消化管に存在することから、グレリンは、ペプチドホルモンや神経伝達物質による調節以外にも、栄養素によって調節を受ける可能性が考えられる。よって、今年度は特に、栄養素のグレリン分泌に与える影響について検討を行った。グレリン血中濃度は、摂食によって低下することから、グルコースの影響をまず検討した。培地中のグルコース濃度を変化させてもグレリン分泌には大きな影響は認められず、グルコースの役割は大きくないと考えられ、むしろインスリン等を介した間接的なグレリン分泌抑制が考えられた。脂肪酸に関しては、中鎖脂肪酸、特にオクタン酸、活性型グレリンの分泌を有意に増加させた。一方で長鎖脂肪酸であるオレイン酸はグレリン分泌をむしろ低下させた。アミノ酸については、一部のアミノ酸がグレリン分泌を有意に上昇させることを見いだし、現在さらに詳細な分子機構について検討中である。以上の結果から、栄養素がグレリンの産生、分泌調節に重要な役割を果たしていることが明らかとなり、さらに検討を進めることがグレリンの病態生理学的意義のさらなる理解につながることが期待される。昨年度からの検討で、ペプチドホルモンのうち、オキシトシンがグレリン分泌を刺激し、一方で、ソマトスタチンがSSTR2受容体を、インスリンがインスリン受容体を介して、グレリン分泌を抑制すること、また神経伝達物質のうち、アドレナリンがβ1受容体を介して、また、ドーパミンがD1受容体を介してグレリン分泌を刺激することを見いだし、本年7月に論文報告を行った。今年度はさらに、セカンドメッセンジャーについても検討を行い、β刺激薬がグレリン分泌を刺激する際に、グレリン細胞内cAMP濃度を上昇させることを確認した。Folskolinによって細胞内cAMPを上昇させると、グレリン分泌が刺激されることからも、cAMP経路がグレリン分泌調節の一つの重要なシグナル伝達経路であることを確認した。現在、さらにCa2+を介した経路に関しても、PKC阻害薬の添加や、培地中のCa濃度変化などがグレリン分泌へ与える影響を検討している。シグナル分子に介しても、インスリン添加によるシグナル伝達経路の確認などを進めつつある。ステロイドホルモン添加の影響に関しても、検討を開始している。栄養素に関しては、糖質、脂質、アミノ酸、ビタミン等がグレリン分泌へ与える影響の検討を開始しており、一部変化が認められたものについては、その分子機構の詳細を検討していく予定である。当初計画のペプチドホルモン、神経伝達物質に関しては、受容体発現の検討、受容体サブタイプの同定、セカンドメッセンジャーの検討などがほぼ終了している。ステロイドホルモン、栄養素に関しても、ある程度結果は出そろいつつああるが、ペプチドホルモンや神経伝達物質と比較すると、ステロイドホルモンは、核内受容体を介して転写調節に関与することや、栄養素は必ずしも単純に受容体を介して、分泌調節に働くというわけでは無いということもあり、やや解析に時間を要している面があるが、おおむね順調に進展していると考える。平成23年度予定のステロイドホルモンおよび各種栄養素によるグレリン分泌調節への影響の検討に関しては、これまでに得られているデータに基づき、さらに、詳細に受容体、シグナル経路にまで踏み込んで解析を行っていく予定である。同時に、元々24年度解析の予定であった、グレリン分泌の分子機構の解明という点からも、特にCaの影響などを中心に解析を進める予定である。当初24年度計画のグレリン生合成機構の検討については、特に脂質合成、代謝関連遺伝子のグレリン生合成における役割を検討しながら、同時に、脂肪酸を含めた栄養素がグレリン生合成に与える影響も検討していく。当初、可能であれば前倒しで研究を進めることも考え、平成23年度分の配分を多くしたが、当初見込みほどの進展が得られなかったため、わずかに、当初見込み研究費の残余を生じた。本年度の研究費の使用内容としては、主には、細胞培養のための培地、培養皿、ピペットなどの消耗品、培地中へ添加する試薬、グレリン抽出、測定のための、C18カラムや試薬等、RNA抽出や定量PCR、その他遺伝子導入実験などの試薬を中心に研究費の使用を考えている。
皮膚創傷治癒および色素沈着に対するレチノイン酸の作用機序の分子生物学的解明

メラノサイトのメラニン産生に対するall-trans retinoic acid(atRA)、ハイドロキノン、ハイドロコーチゾンの影響を三次元培養皮膚、単層培養を用いて調べた。三次元培養皮膚における総メラニン量、単層培養における総メラニン量、チロジナーゼ活性などを測定した。細胞数(蛋白量)をもとに相対値で比較した。ハイドロキノンでは強いメラニン産生抑制効果、細胞毒性が見られたが、レチノイン酸では明らかではなかった。ハイドロコーチゾン、ハイドロキノンとの相乗効果は特に観察されなかった。AtRAのケラチノサイトに対するHB-EGFmRNA誘導能を単層培養を用いて調べた。MRNA量はreal-time PCRを用いて、GAPDHとの相対値で比較、検討した。AtRA刺激12時間後で正常にくらべて10-30倍のHB-EGFmRNA増加が見られた。この変化は未分化なケラチノサイトよりも分化誘導されたケラチノサイトでより著明であった。他の天然および合成レチノイドとの比較では、Ch55においてレチノイン酸よりも強い誘導能が観察された。13cisRAおよび9cisRAではatRAとほぼ同程度の誘導能が観察された。他の天然および合成レチノイドではさらに誘導能は弱かったが、濃度を40-100倍にあげることにより、レチノール、レチナールではatRAとほぼ同程度のHB・EGFmRNA誘導能が観察された。他の天然および合成レチノイドではさらに誘導能は弱かったが、濃度を40-100倍にあげることにより、レチノール、レチナールではatRAとほぼ同程度のHB-EGFmRNA誘導能が観察された。

他の天然および合成レチノイドではさらに誘導能は弱かったが、濃度を40-100倍にあげることにより、レチノール、レチナールではatRAとほぼ同程度のHB-EGFmRNA誘導能が観察された。
臨界点近傍における流体水銀の濡れ現象

ガラス板上に水銀をのせると球状の液滴になる。この現象は、水銀がガラスなどセラミクスに濡れないことを端的に示すものである。ところが、液体-気体臨界点近傍では水銀がサファイアに濡れることが、我々の実験から判明した。しかも、この濡れ現象はprewetting transition(前駆濡れ転移)と呼ばれる一次相転移として起こり、濡れ転移固有の臨界点がバルク水銀の臨界点より低温・低圧の1468°C・159MPaにあることが明らかになった。本研究では、上記の研究を更に発展させることに努めた。具体的にはまず、高温高圧の極端条件下でも適用可能な偏光解析の実験技術を開発し、これを用いた反射率測定結果から、濡れ転移の秩序変数である被覆度Γなど、濡れに関わる主要な物理量を定量的に得ることに成功した。この成果に基づき、二次元液体としての濡れ層の性質を調べることが可能になり、濡れ層が半導体的な性質を有することを結論した。この結果は、「何故水銀がサファイアに濡れるのか」を考える上でも重要な情報である。さらに我々は、試料からの熱輻射強度測定が濡れ現象を調べる有力な手段であることを見出し、特に、前駆濡れ転移の超臨界相では、臨界揺らぎのため二次元の圧縮率である(δΓ/δμ)_Tが極大になると予測されていた領域で、熱輻射強度が非常に小さくなることを見出した。但し、ここでμは化学ポテンシャルである。以上のように、本研究では濡れ現象に関わる平均量とその揺らぎの双方について実験的に高精度で調べる方法を開拓した。この手法は、我々が取り扱った水銀とサファイアの系以外にも直ちに適用することができる。本研究の成果は、濡れ現象の専門家が一堂に会したトリエステでの国際シンポジウムで招待講演として報告された。また、本研究の代表者は日本物理学会において初めて、「濡れ現象」に関わるシンポジウムを企画した。高温高圧下での偏光解析測光法の実験技術を確立し、これによって流体水銀がサファイア界面における光反射率を、これまでより詳細に測定することに成功した。その結果、バルク水銀の光学定数を決定することができたのみならず、液体-気体臨界点近傍の高温・高圧下で流体水銀がサファイアに濡れる現象を再確認し、その濡れ層厚みを正確に決定することができた。我々は温度・圧力平面上での濡れ転移の相図を決定した。濡れ層の厚みは蒸気圧曲線から少し低圧側に存在するライン(prewetting line)で不連続に変化する(前駆濡れ転移(prewetting transition))。この厚みの跳びΔLは高温高圧になるにつれて減少し、前駆濡れ臨界点で消失する。我々はΔLにスケーリング則を適用することにより、臨界指数を見積もることが出来た。また我々は濡れ層厚みの温度変化にヒステリシスがあることを見出し、前駆濡れ転移が一次転移であることを、確固たるものにした。さらに我々は、前駆濡れ臨界点を超える温度・圧力領域でも測定を行った。その結果、前駆濡れ転移線の他にも光反射率が異常を示す領域を新たに見いだした。この反射率異常は、2次元での密度ゆらぎを反映しているものと思われる。今後、濡れ現象と金属-非金属転移の関係などについて検討を加える。また、濡れ現象のダイナミックス(スピノ-ゲル分解など)についても実験をとおして検討を加える予定である。日常経験からも明らかなように、ガラス基板上の水銀は球形の液滴になる。この現象は水銀がセラミックスに殆ど濡れないことを示している。