hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ペプチドワクチン療法における免疫抑制解除と免疫賦活の分子機構の解明

本研究ではペプチドワクチン療法におけるシクロホスファミド併用の効果を免疫抑制解除と免疫賦活の分子機構に着目して解明し、今後のがん免疫療法分野の発展に有用な科学的基盤を築くことを目的とした。臨床的アプローチとして、シクロホスファミドとがんペプチドワクチン療法の併用療法を受けた胆道がん患者から採取された末梢血リンパ球(PBMC)を用いて、IFN-γELISPOT法により投与ペプチドに対する細胞傷害活性(CTL)を解析した。ペプチド特異的CTL反応が陽性の患者群において生命予後が延長することが示唆された。シクロホスファミド併用群とがんワクチン療法併用とがんワクチン療法単独群における生命予後への影響を解析したところ、がんワクチン療法とシクロホスファミド併用群では生命予後が延長する可能性が示唆された。また、ペプチドワクチン療法およびシクロホスファミド併用によるT細胞表面分子(CD4、CD8、CD45RA、BTLA、LAG3、CTLA4、PD-1等)の変化をフローサイトメトリーにより解析した。がんワクチン単独群またはシクロホスファミド併用群におけるワクチン投与前・後での細胞表面分子の発現に有意な差は見られなかったが、ワクチン投与後ではシクロホスファミド併用群においてCD8の発現が単独群よりも有意に高く、特にCD45RA+CD8+が有意に高いことが示唆された。さらにシクロホスファミドのがんワクチンにおける免疫応答への作用機序を解明するためのマウスモデルの確立に着手した。マウスを用いた腫瘍モデルおよび特異的細胞傷害活性の評価系を確立した。
モジュールを基にした蛋白質の動的構造特性の解析

モジュールは、球状ドメイン内のコンパクトで力学的に安定な構造単位である。蛋白質立体構造の構築・進化の単位と考えられているモジュールが折れ畳み過程で果たす役割を理解する為に、バルナーゼの水中での498Kにおける熱変性過程の分子動力学シミュレーションを静電相互作用のカットオフなしで3ns×5回行った。昨年度の5回分と合わせて10回のシミュレーション結果を統合的に解析することにより、カオス的な振る舞いを見せる各シミュレーションから共通な特徴をより曖昧さを少なく抽出することを目的とした。その結果、10回のシミュレーションに共通な特徴として、変性過程において二次構造や疎水性コアなどの構造要素は徐々に失われていくのに対し、天然モジュール境界はほぼ100%維持され、モジュールは変形しながらも相対的にコンパクトな構造をかなりの間保つことがわかった。これは主にモジュール内両末端領域残基間の疎水性相互作用が維持されているためであった。生理条件での自由エネルギー曲面が498Kのものと定性的に違わないとすれば、今回の結果を逆に辿ることで、バルナーゼはまず折れ畳み初期の非特異的な疎水性相互作用により、個々のモジュールが進化的に疎水性残基が局在する両末端領域間が閉じてコンパクトに凝縮し、その後特異的相互作用を形成しながら天然構造に折れ畳むことが示唆された。折れ畳み初期に個々のモジュールがコンパクトにまとまることは構造空間の劇的な縮小を伴うので、蛋白質の折れ畳み問題におけるLevinthal Paradoxを解く要因になり得る。これらの結果から、ゲノム情報は、進化的にモジュールの末端領域に疎水性アミノ酸残基が多いという情報を内包することによって、蛋白質の折れ畳みの情報をもコードしていることが示唆され、本研究はゲノム構造と蛋白質の折れ畳みのメカニズムを初めて直接関連付けることができたと言える。
デバイス応用に特化した単層カーボンナノチューブ成長条件の最適化に関する研究

本研究では、最初にアルコール分解CVD条件の最適化を行い、良質(高純度)な垂直配向したカーボンナノチューブ(CNT)の作製に成功した。例えば、温度依存性の実験では、10分の合成時間で、700750°Cが最適であることが分かって、CNT膜の高さが約60μmになる。次に、単層CNT(SWCNT)の垂直成長の鍵となる酸化アルミナ(Al-O)と超薄膜コバルト(Co、0.5nm)触媒に関して集中的に研究を行った。触媒サポート層のAl-O(20nm)は、400°C、空気中でAl金属を熱酸化させ、様々な装置(AFM、XPS)を用いて解析を行った。良質のAl-Oを得、Coの役割も明確にすることができた。その後、導電性基板(SUS310S)にSWCNTの直接合成がSiO_2/Si基板と同様に成功し、電気化学キャパシターの電極を作製した。これらの成長に基づき、電気化学キャパシターの開発を行い、世界最高の容量値584F/g(at lmV/s)を得た。イオン液体を電解液として使用し、色んな電気化学特性を測った。サイクリック・ボルタンメトリー(CV)や充放電の測定では、シンプルな300°Cでの熱処理を加えることで、容量が倍ぐらい高くなったことが分かった。以上、本研究は、高性能な単層CNTを導電基板に効率よく成長させ、それらを用いて高性能な電気化学キャパシターを得たものであり、学術的にも工業的にも大変期待できる研究内容だと信じる。今後、デバイスの容量をさらに伸ばすことを前提で研究を進める。例えば、Co触媒の配列制御で、さらなる電解液のイオンや電子の近接性、吸着が期待され、チャージ貯蔵のポテンシャルも拡大させる。本研究では、エネルギー貯蔵デバイスである電気化学キャパシターの作製や評価を最終目的としている。キャパシターの両電極には、垂直配向単層カーボンナノチューブ(VA-SWCNT)を用いる。SWCNTは、アルコールCVD法で合成されるが、電気化学キャパシターに向けた成長条件の実験を行ってきた。温度依存性の実験では、10分の合成時間で、700750°Cが最適であることが分かって、SWCNT膜の高さが約60μmになる。それ以上のCVD温度では、SWCNTの質が低下し、高温度による熱劣化をしていた。CNT垂直合成には、触媒サポート層のアルミナ(Al-O)が必要であり、アルミナに関する解析も様々な装置を用いて行った。その結果、熱酸化のアルミナの表面が化学量論的に電子受容体型を示し、垂直成長に役割を果たした。CVのスキャンレート1mV/sでは、467F/gの高い容量が測定され、CNTキャパシター研究グループの中では、高い値を示している。これからは、このキャパシターをどう良くさせるのと、容量をさらに伸ばすことを前提で研究を進めていきたいと思っている。例えば、コバルト触媒の配列制御で、さらなる電解液のイオンや電子の近接性、吸着が期待される。チャージ貯蔵のポテンシャルを拡大したいと考えている。
原発性胆汁性肝硬変の新しい分子標的の同定と胆管・肝細胞傷害機構の解析

ヒト胆管培養細胞(HIBEC)を用いて、主にin vitroでTLRの発現、リガント刺激によるシグナル伝達経路、サイトカイン・ケモカインの分泌機構について解析をすすめた。HIBECはLPSなどの細菌成分の刺激によりTLR4-NF-kBと-MAPK経路を介して、IL-6,IL-8,MCP-1を分泌すること(Yokoyama et al.,International Liver 2006 in press)、ウイルスdsRNAの刺激によりTLR3-TRIF-IRF3経路とRIG-1-MAVS-IRF3経路を介してIFNbetaを産生することが判明した(Nakamura M et al.,in preparation)。また、肝臓生検組織凍結バンクの標本を用いて、原発性胆汁性肝硬変の病初期では、病変局所のTLR-3-type1 IFN系が活性化していること(Takii Y et al.,Lab.Invest,2005,85:908-920)が判明し、自己免疫性胆管炎発症におけるTLR3の役割について注目して研究をすすめている。来年度は、これらの結果を踏まえ、分子標的のさらなる探索、胆管・肝細胞障害機構の分子レベルでの解析を進める予定である。原発性胆汁性肝硬変(PBC)は、慢性非化膿性破壊性胆管炎(CNSDC)を病理学的特徴とし、中年女性に好発する原因不明の肝疾患であるが、末期には肝不全、黄疸を合併し、肝移植以外に救命方法がない難病である。PBC患者の90%以上の症例に抗ミトコンドリア抗体(AMA)(標的抗原:PDC-E2、PDC-E3BP、PDC-E1α、OGDC-E2、BCOADC-E2)が出現するが、30-50%には抗核抗体(ANA)(標的抗原:gp210、p62、1amin B receptor、sp100、PML、centromere B)が出現する。しかし、PBCで出現するこれらの自己抗体に関してのsystematicなcohort studyはなく、その臨床的意義に関しては明らかではなかった。我々は、国立病院機構肝疾患共同研究グループ(NHOSLJ)に登録されている肝生検で確定診断されたPBC276症例(男35、女241、年齢30-83、中央値58歳、観察期間1-292M、中央値60.5M、初回肝生検時Scheuer's stage1,2:217例、stage3,4:59例)について、血清中のAMA(MIT3)とANA(gp210、sp100、centromere、chromatin)を経時的に測定し、これらの自己抗体とPBCの進行、転帰、病理因子との関係を解析した。以上から、抗gp210抗体と抗セントロメア抗体はPBC進行の異なった危険因子であり、PBCは進行パターンにより、肝不全型進行(gp210type)と門脈圧亢進症型進行(centromere type)に分類できることが示唆された。PBC患者をこれら2種類の病型に分類することにより、それぞれの病型に特徴的なHLA polymorphism、サイトカインや薬物代謝に関する遺伝子のSNPsが存在することが判明しつつあり、今後は、これらのPBCの進行因子を同定することにより、より正確な予後予測に基づく分子標的治療が可能となるものと期待される。
日本人アルツハイマー病に対するプレセニリン2遺伝子スプライシング多型の影響

今回はこの研究課題の2年目(最終年度)の報告である。前年度、われわれは孤発性アルツハイマー病とプレセニリン2遺伝子の新たなスプライシング多型の関連の先の報告(J. Neurochem.72,2498-,1999)に関して追試実験を行った。まず、RT-PCR法を用いて合成した末梢血(白血球)中RNA由来のcDNAをテンプレートにしてnested-PCR法をおこなったが、PCR産物の生成が不安定であった。その後、PCRの条件設定を変えて再挑戦したところ、ある程度の安定したPCR産物か得られるようになった。さらに、PCR産物を電気泳動したところ、予想外のサイスのバンドが複数(3ないし4本)出現したため、それぞれのPCR産物がどのような塩基配列であるかを確認することにした。そこでわれわれは次に、任意の症例を選びそれぞれのPCR産物をプラスミドベクターを用いてサブクローニングした後、プラスミドを精製し制限酵素処理をしたうえでシークエンスをおこなった。その結果、各バンドの塩基配列が判明した。その中には先の報告にあったプレセニリン2のエクソン5が完全に欠失しているものは存在せず、エクソン4のみが完全に欠失しているものが含まれていた。この結果は興味深い事実であった。この事実についてわれわれが考えたことは、脳内と末梢血ではプレセニリン2の遺伝子発現に差異があり、末梢では脳内とは異なるスプライシングが起こっているのではないかという推測であった。そこで文献を検索してみたところ、1996年1997年にかけて同様の実験結果に関して2,3の文献で報告されていることが判明した。しかし、エクソン4のみが完全に欠失したという報告はいまだないようであり、その結果をさらに解析してみる必要がありそうである。但し、末梢血でのプレセニリン2遺伝子のスプライシング多型の差異がそのまま脳内における発現の差異にあてはまるわけではないため、今後も充分な検討が必要と考える。今回われわれがこの研究を行うきっかけとなった、孤発性ADとPS-2の新たなスプライシング多型の関連の先の報告(J.Neurochem.72,2498-)に関して追試実験を行った。RT-PCR法を用いて末梢血の白血球から市販のキットを用いてRNAからcDNAを合成し、そのcDNAをテンプレートにしてPCRを行った。先の報告では、nested-PCRを用いてあったので、われわれもその方法に従って実験をおこなったが、目的のPCR産物の生成が不安定であった。そのため、幾度もPCRの条件設定を変えて再挑戦したが、期待できるほどの安定したPCR産物が得られなかった。しかし、電気泳動により予想外のサイズのバンドが複数出現したため、それぞれのPCR産物がどのような塩基配列であるかを確認することにした。そこでわれわれは次に、任意の数例に関してのみそれぞれのPCR産物をプラスミドベクターを用いてサブクローニングした後、プラスミドを精製し、制限酵素処理をしたうえでシークエンスをおこなった。その結果、各PCR産物の塩基配列は判明したが、それは先の報告にあるようなプレセニリン2のエクソン5だけが完全に欠落しているものではなかった。しかし、まだその具体的な差異に関する充分な検討ができてはおらず、これ以上の考察はまだできない状況であるため、この研究計画の2年目に当たる本年度中に引き続いて研究を続けていく予定である。cDNAサンプルはすでにコントロールを含めて約150例余りあるため、実験サンプルを増やしてさらに検討する予定である。

しかし、エクソン4のみが完全に欠失したという報告はいまだないようであり、その結果をさらに解析してみる必要がありそうである。但し、末梢血でのプレセニリン2遺伝子のスプライシング多型の差異がそのまま脳内における発現の差異にあてはまるわけではないため、今後も充分な検討が必要と考える。
救急医療をめぐる臨床法医中毒学的緊急薬毒物スクリーニング

三年間の研究成果の概要は基礎的研究と応用研究に分けられる。基礎的研究は更に1.薬物の動態学的分析、2.検査試料の精度管理に関する研究及び3.薬毒物の分析法の開発等に細分される。1.薬物の動態学的分析において、(1)体内動態解析のためのラジオレセプターアッセイによる微量定量法を開発した。また母集団パラメータを用いた患者個別投与設計方法を確立し、臨床に応用している。(2)病態時における遺伝子製剤の有効利用のため、サイトカイン遺伝子製剤と併用薬の効果、その機序を検討した。(3)薬物の腹膜透過速度と脂溶性との相関関係式を11種の薬物で確立したが、促進拡散の機構の存在もわかった。2.検査試料の精度管理等に関する研究において,IRMA,EIA及びCLEIA法による測定値を比較して、測定法やその精度管理の重要性を研究した。3.薬毒物の分析法の開発等において、(1)ペンゾジアゼビン系薬物等抽出法の開発及び超臨界クロマトグラフィーによる定性・定量分析法を開発した。(2)REMEDI-HSによる迅速薬毒物スクリーニングシステムを用いて、迅速定量方法の有用性についてブロムワレリルル尿素等6種の薬物を例に基礎的に研究し、更に救急患者試料及び剖検試料等に適用し、そのシステムの利点と問題点を研究した。(3)キューリ-ポイント・バイロライザーにより吸入麻酔薬を含む揮発性物質の分析法を開発した。(4)ホルマリン固定臓器からメタンフェタミン、揮発性物質、向神経薬を抽出・分析し、薬毒物が固定・定量できた。応用面では救急患者試料や剖検試料中の薬毒物を分析し、その結果、救急患者がブロムワレリルル尿素中毒と判明し救命された例等、治療方針の決定や予後の判定に役立った。更に剖検試料において、覚醒剤中毒で死亡した例だけでなく、バルビタール等治療レベルの薬物が検出された例においても、死者の死亡直前の状態を客観的に判断する分析結果が得られ、各々非常に重要な情報となった。I.薬毒物スクリーニングについて、本システムの中心となるREMEDiシステムの本格的活動は遅れているが、本年度は以下の点で新知見を得た。1.REMEDiシステムの予備実験:トリアゾラム及びブロムワレリル尿素を薬毒物検索ライブラリーに追加し、15μg/mlの範囲で定量できることが明らかになった。但し、これより低濃度域では定量がかなり困難であり、今後の検討課題として残った。2.REMEDiシステムにより11例の救急患者試料(血液または尿)からジフェンヒドラミン(抗ヒスタミン剤)及びその代謝物デスメチルジフェンヒドラミン、クロルプロマジン及びプロメタジン(精神神経用剤)並びにそれらの代謝物、スルピリド(抗うつ剤・消化性潰瘍治療剤)、ブロムワレリル尿素(催眠・鎮静剤)等が検出された。また、16例の剖検試料(血液または尿)からもジフェンヒドラミン、デスメチルジフェンヒドラミン、ベラパミル(冠血管拡張剤)及びその代謝物N-ジスメチルベラパルミ、カフェイン等が検出された。REMEDiはHPLCを原理としているので、薬毒物の代謝物も同時に検出できる点が長所で、今後更に広範囲の薬毒物に対象を拡大して検討する予定である。II.薬毒物の動態について、これまで主として塩基性薬物の体内動態、特に組織分布について検討してきた。

今回この研究を更に展開し、細胞内オルガネラへの分布動態について検討した。その結果塩基性薬物の細胞内分布比は経時的に変化し、時間経過に伴って特にリソソームへの寄与が増大することがわかった。リソソームへの蓄積は薬効、毒性の発現に深く関与することから、今後の検討課題としたい。1.REMEDiシステム等を用いて、本年度は以下の点で新知見を得た.(1)REMEDiシステムデータの充実・改善:メチルエフェドリン等計5種の薬物をライブラリーに新規追加した。またREMEDiシステムでは半定量の機能しかない。そこでカルバマゼピン等計8種の薬物の検量線を作成し,同時的に定性・定量できるようにした。これにより薬物中毒の迅速診断が可能になったが、現在更に多数の薬物に対応するように追加中である。(2)スクリーニング予備実験:市販感冒薬をボランティアに服用させ、それらを分析した。尿より、感冒薬成分であるメチルエフェドリンとその代謝物エフェドリンが検出された。血清からは薬物は検出されず、REMEDiシステムの検出感度の上で課題として残った。(3)剖検試料・救急患者試料についての検討:各々19例、13例で薬物が検出された。剖検例では、交通事故死亡例試料から、治療レベルではあるがメチルエフェドリンとその代謝物エフェドリン更にジヒドロコデインが検出され、感冒薬服用が判明し、生前の状況が客観的に明らかになった。また救急例では、昏睡状態で病院搬送された患者の血清・尿をREMEDiシステムにより分析し、ブロムワレリル尿素中毒と診断し、治療の指針となる例があった。同例では、GC/MSと定量結果を比較し、高い相関が得られ(相関関数0.939、n=6)、同システムの正確性が示された。一方投与記録がない例で、リドカインが偽陽性として検出された例も散見され、現在、動物実験を含め検討中である。2.薬毒物の動態について、これまで主として塩基性の薬物の体内動態、特に組織分布について検討してきた。1.薬毒物動態の観点から腹膜透過性について検討し、11種類のバルビタール酸系薬剤の脂溶性と腹膜透過速度との間に相関関係が成り立つこと、並びにモノカルボン酸化合物の腹膜透過には特殊輸送系が存在する可能性を示唆する結果を得ている。現在、抗悪性腫瘍剤について検討中であるが,腹膜内に貯留傾向を示す薬剤や、腹膜に特殊輸送系が存在する可能性を示唆される薬剤についての研究結果も得られており、今後更に薬物の性状と腹膜透過性についての研究を進めてゆく予定である。2.REMEDiシステム等を用いて,本年度は以下の点で新知見を得た.(1)REMEDiシステムの充実・改善:昨年度に引き続きフェニトロチオン等計4種の薬物をライブラリーに新規追加した.更にヒドロキシジン等計10種の薬物の検量線を作成し,同時的に定性・定量できるようにした.更に、REMEDiシステムのパラメーターも検討し、これにより薬物同定の信頼性の向上及び迅速定量が可能になった。(2)ボランティアによる服用
分子動力学に立脚した高効率二酸化炭素回収材の開発

本研究の目的は二酸化炭素が円筒,円錐、ラバールノズルなどのような多様な形状の多孔質材料内に溜まることによって,変形する細孔が吸着現象の全般に与える影響を解明し,それをもとに理想的な吸着材を設計することである.現在の科学技術では高分子やイオン材料などを用いて孔隙の性質および長さと太さなどを設計することが可能だが,材料のパラメータの相関関係が複雑なため理想的な回収効率はいまだに不明である.既存の二酸化炭素回収物質の研究は試行錯誤と実験結果の解析からのトップ・ダウン型が大半であったことに比べ,本研究は分子レベルで二酸化炭素の吸着を向上させる因子を先に調べ,それと細孔が変形することをもとに吸着メカニズムを解明および理想的な細孔を設計するボトム・アップ型である.その結果から得た知見は新しい吸着材料を作製する際,使う基礎データだけでなく,既存の回収材の吸着性能の理解にも幅広く使用できる.本年度は、本研究に先立って行われた気泡、結晶の異方核生成に関する分子シミュレーションの研究を学術論文にまとめた.多孔質材料内部における吸着の問題においても、初期吸着からポアフィリングに至るプロセスにおいて同様の現象が観察され、本研究との関連性は高い.また,多孔質材料のモデリングについて,当初は円筒型細孔など,単純な構造をもつ細孔を対象に研究を進める予定であったが,金属有機構造体など具体的な材料のモデリングも行った.吸着等温線,ひずみ変化等温線のみならず,細孔内部の吸着物質の構造的,動的性質についても実験との比較検討が可能となり,今後の研究の進展が期待される.本年度は,当初の計画に沿って,吸着の分子シミュレーションのソフトウエアを作成した.また,多孔質材料のモデリングについて,当初は円筒型細孔など,単純な構造をもつ細孔を対象に研究を進める予定であったが,金属有機構造体など具体的な材料のモデリングも行った.吸着等温線,ひずみ変化等温線のみならず,細孔内部の吸着物質の構造的,動的性質についても実験との比較検討が可能となり,今後の研究の進展が期待される.基本的には当初の研究計画の通りに研究を推進する予定であるが,特長のある様々な多孔質材料についても計算の対象とする予定である.また,細孔内部の吸着物質の構造的,動的性質について,実験結果と計算結果の比較検討を行う予定である.本研究の目的は二酸化炭素が円筒,円錐、ラバールノズルなどのような多様な形状の多孔質材料内に溜まることによって,変形する細孔が吸着現象の全般に与える影響を解明し,それをもとに理想的な吸着材を設計することである.現在の科学技術では高分子やイオン材料などを用いて孔隙の性質および長さと太さなどを設計することが可能だが,材料のパラメータの相関関係が複雑なため理想的な回収効率はいまだに不明である.既存の二酸化炭素回収物質の研究は試行錯誤と実験結果の解析からのトップ・ダウン型が大半であったことに比べ,本研究は分子レベルで二酸化炭素の吸着を向上させる因子を先に調べ,それと細孔が変形することをもとに吸着メカニズムを解明および理想的な細孔を設計するボトム・アップ型である.その結果から得た知見は新しい吸着材料を作製する際,使う基礎データだけでなく,既存の回収材の吸着性能の理解にも幅広く使用できる.本年度は、本研究に先立って行われた気泡、結晶の異方核生成に関する分子シミュレーションの研究を学術論文にまとめた.多孔質材料内部における吸着の問題においても、初期吸着からポアフィリングに至るプロセスにおいて同様の現象が観察され、本研究との関連性は高い.また,多孔質材料のモデリングについて,当初は円筒型細孔など,単純な構造をもつ細孔を対象に研究を進める予定であったが,金属有機構造体など具体的な材料のモデリングも行った.吸着等温線,ひずみ変化等温線のみならず,細孔内部の吸着物質の構造的,動的性質についても実験との比較検討が可能となり,今後の研究の進展が期待される.本年度は,当初の計画に沿って,吸着の分子シミュレーションのソフトウエアを作成した.また,多孔質材料のモデリングについて,当初は円筒型細孔など,単純な構造をもつ細孔を対象に研究を進める予定であったが,金属有機構造体など具体的な材料のモデリングも行った.吸着等温線,ひずみ変化等温線のみならず,細孔内部の吸着物質の構造的,動的性質についても実験との比較検討が可能となり,今後の研究の進展が期待される.基本的には当初の研究計画の通りに研究を推進する予定であるが,特長のある様々な多孔質材料についても計算の対象とする予定である.また,細孔内部の吸着物質の構造的,動的性質について,実験結果と計算結果の比較検討を行う予定である.
火星隕石ナクライトの再現実験

当該研究期間において、以下を実行した。(1)2つの異なるナクライト隕石の研究により類似する親マグマ組成を質量保存計算法を用いて決定し、その結晶化過程を調べ、その結果を国内外の学会等で口頭発表した。やまとナクライトの親マグマの計算および結晶化過程などの岩石学的研究の成果はMeteoritics and Planetary Science誌に発表した。(2)常圧縦型酸素雰囲気制御炉を立ち上げた。この装置を用いて、QFM条件下で、ナクライト親マグマの相平衡関係を決定する実験を行うとともに、ナクライト親マグマの結晶化実験を行った。実験開始当初、出発物質作成時に混入したステンレス片が見つかるなど実験技術が未熟であった。このとき以降、乳鉢を瑞垣に変え、実験を継続して行った。装置を使いやすくするなど工夫を行った結果、再現性の商い実験法を自ら確立し、実験精度を大きく向上することができた。一部の実験に追試実験を行った。これまでの実験結果に基づくと、一つのナクライト親マグマ組成のリキダス温度は、1140°Cでチタノマグネタイトと普通輝石が晶出する。ソリダス温度は980°Cである。(3)質量保存計算により導いたナクライトの親マグマ組成を用いた実験により、ナクライトに見られる普通輝石斑晶のコアと同一組成の輝石が析出することがわかった。このことは求めた親マグマ組成が正しいことを強く示唆する。4.2°C/時間の冷却実験で、南極産のMIL 03346ナクライトにきわめて良く類似する組織ができた。ナクライトの輝石斑晶のリム組織は2層からなり、2層目にヘデンバージヤイトを出すMIL型と2層日にCaに乏しい輝石を出すやまと型に分けられる。1°C/時間の冷却実験でやまと型のリムを再現し、4.2°C/時間の冷却実験でMIL型のリムを再現することに成功した。実験は継続しており今年の夏までに完了見込みである。これらの一連の実験結果は、今年の春から夏の国内外の学会等で発表する。また今年中に国際誌に投稿予定である。平成15年度は、まず、ナクライト母マグマ組成の相平衡実験および同組成からの冷却実験のための酸素雰囲気制御炉の立ち上げを行った。既存の縦型環状電気炉に、水素と2酸化炭素ガスとの混合ガス導入のガス混合器およびその配管を完成させた。試薬を調合し、SiO_2,MgO,FeO,CaO,TiO_2,Al_2O_3,Na_2O,K_2O,の主成分元素からなる母マグマ組成を作成した。これを、還元雰囲気内で溶融・急冷によりガラスにした。作成したガラスを乳鉢にて粉末にし、実験出発物質とした。100200ミリグラムのペレットを作成し、Ptワイヤーループ法により、QFMバッファー付近での酸素雰囲気で10201275°Cの範囲で加熱・平衡化させた。実験は、これまでに23回行った。結果・考察:1200°C以上では、ほぼ全溶融し、磁鉄鉱が1200°C付近で初晶であることがわかった。次に、1150°C以下で、自形のオージャイトが析出を始めた。約10°Cの差でかんらん石が析出した。

かんらん石は不定形で、オージャイトよりはるかに低い数密度である。サイズはオージャイトより大きい。この結果は、実際のナクライトの特徴と調和的である。オージャイト組成は、ナクライトで観察されたオージャイト斑晶コア組成に一致する。かんらん石組成は、オージャイト組成と高温で平衡に存在した組成である。こうした結晶の析出は、12001030°Cの範囲で、一般的なマグマから析出する結晶の温度としては低い。これはナクライトマグマを特徴づけている鉄に富むマグマから形成したことによる。2年目以降は、ナクライトマグマからの冷却実験を開始する。また、再現が無水ナクライトの再現が成功すれば、水質変成実験に進展させる。昨年度から継続していた定酸素分圧(fayalite-magnetite-quartz buffer)、一定温度(1275°C付近から1000°C付近)下での相平衡実験から液相温度と固相温度を決定後、定温実験で決定した液相温度と固相温度の範囲で冷却実験を開始した。出発物質はいずれもナクライト親マグマを想定した組成を用いた。冷却実験は、主として冷却開始温度と冷却速度を変えて、7回行った。ナクライトに含まれるかんらん石の累帯構造から、ナクライトを作った溶岩流の冷却速度は、0.11°C/時間程度と見積もった。その結果、一回の実験時間は長くて2ヶ月を要することから、一台の電気炉で行える実験回数は限られた。冷却実験から、やまとナクライトの普通輝石の結晶成長に類似した累帯構造が確認されるなどナクライトに見られる特徴の一部を再現することに成功した。こうした定温・冷却実験の一連の結果は、国内外の学会やシンポジウムで口頭発表を行った。また、やまとナクライトの観察分析を続け、ナクライトを作った親マグマを3つの異なる手法で求め、整合的な結果を得た。ナクライトを作った結晶化過程の考察をさらに進め、これまでより確からしいモデルを提出し、やまとナクライトの一連の岩石学的研究を国際誌に投稿した。この研究の中で、親マグマ組成のNa_2O, K_2O, TiO_2の副成分組成の見直しを行い、現在新たな出発物質を作成して再度定温・冷却実験を行う準備をしている。実験装置はジルコニア酸素センサを導入するなどの改良を行った。さらに、新たに見つかった南極産ナクライト(MIL 03346)の観察・分析を通じてナクライトの形成史をより一般化して捉える研究も始めている。当該研究期間において、引き続き常圧酸素雰囲気制御炉を用いて、QFM条件下で、ナクライトマグマの相平衡関係を決定する実験を行うとともに、ナクライトマグマの結晶化実験を行った。実験は継続して行い、装置を使いやすくするなど、実験精度を向上するための工夫を行った。一部の実験に出発物質作成時に混入したステンレス片が見つかり追試実験を行った。このとき以降、乳鉢を瑪瑙で行った。その結果、一部結果が修正された。すなわち、リキダス温度は、1140°Cでチタノマグネタイトと普通輝石(En_<45>Fs_<18>Wo_<37>)が共析する。ソリダス温度は980°Cである。4.2°C/時間の冷却実験で、南極産のMIL 03346ナクライトにきわめて良く類似する組織ができた。またこの中の普通輝石のコアと鉄に富むリムの化学組成の特徴もMIL 03346と良く一致する。実験は継続しており今年の夏までに完了見込みである。
合金組成および熱処理がニッケルチタンファイルに与える影響

Ni-Tiファイルの機械的性質は,熱処理によって大きな影響を受ける.そこで,本研究では,熱処理がNi-Tiファイルの曲げ特性,根管形成能および疲労特性に与える影響を明らかにすることを目的とした.Ni-Tiファイルを用い, 400°C, 450°Cおよび500°Cの3条件で熱処理を行った.熱処理時間は各群とも30分に設定した.熱処理を行わなかった群をコントロールとして使用した.まず,片持ち梁式曲げ試験を行い,弾性領域および超弾性変形領域において,熱処理による曲げ特性の変化を計測した.アクリル樹脂製模擬湾曲根管模型を使用し,根管形成を行った.形成前後の根管形態の重ね合わせを行い,内湾側および外湾側の切削量について,根尖部より6mm以内部の計測を行った.また,回転曲げ疲労試験を,回転速度250rpmで,ファイル先端2mmを1. 0および2. 0mm変位させ,その変位量を一定としたまま,回転数250rpmで,破断するまでファイルを回転させる,回転曲げ疲労試験を行った.同試験より,破断に要した回転数を記録した.片持ち梁式曲げ試験の結果から,弾性領域において, 400°Cおよび450°C熱処理群は, 500°C熱処理群およびコントロールに比較し,低い曲げ荷重を示した.一方,超弾性領域では,全ての熱処理群で,コントロールに比較し,低い曲げ荷重を示した.根管形成能の評価から,根尖部の形成において,コントロールに比較し,全ての熱処理群で,湾曲外湾側への切削量が少なかった.回転曲げ疲労試験から,コントロールと比較し, 450°Cおよび500°C熱処理群は, 1. 0mmよび2. 0mm変位時両方において,高い疲労寿命を呈した.一方, 400°C熱処理群は, 1. 5mm変位時においてのみ,疲労寿命の向上を認めた.以上の結果から,熱処理によりニッケルチタンファイルの柔軟性および疲労寿命が向上することにより,特に湾曲根管において,より効果的に根管形成が行える可能性が示唆された.Ni-Tiファイルの機械的性質は,熱処理によって大きな影響を受ける.そこで,本研究では,熱処理がNi-Tiファイルの曲げ特性,根管形成能および疲労特性に与える影響を明らかにすることを目的とした.Ni-Tiファイルを用い, 400°C, 450°Cおよび500°Cの3条件で熱処理を行った.熱処理時間は各群とも30分に設定した.熱処理を行わなかった群をコントロールとして使用した.まず,片持ち梁式曲げ試験を行い,弾性領域および超弾性変形領域において,熱処理による曲げ特性の変化を計測した.アクリル樹脂製模擬湾曲根管模型を使用し,根管形成を行った.形成前後の根管形態の重ね合わせを行い,内湾側および外湾側の切削量について,根尖部より6mm以内部の計測を行った.また,回転曲げ疲労試験を,回転速度250rpmで,ファイル先端2mmを1. 0および2. 0mm変位させ,その変位量を一定としたまま,回転数250rpmで,破断するまでファイルを回転させる,回転曲げ疲労試験を行った.同試験より,破断に要した回転数を記録した.片持ち梁式曲げ試験の結果から,弾性領域において, 400°Cおよび450°C熱処理群は, 500°C熱処理群およびコントロールに比較し,低い曲げ荷重を示した.一方,超弾性領域では,全ての熱処理群で,コントロールに比較し,低い曲げ荷重を示した.根管形成能の評価から,根尖部の形成において,コントロールに比較し,全ての熱処理群で,湾曲外湾側への切削量が少なかった.回転曲げ疲労試験から,コントロールと比較し, 450°Cおよび500°C熱処理群は, 1. 0mmよび2. 0mm変位時両方において,高い疲労寿命を呈した.一方, 400°C熱処理群は, 1. 5mm変位時においてのみ,疲労寿命の向上を認めた.以上の結果から,熱処理によりニッケルチタンファイルの柔軟性および疲労寿命が向上することにより,特に湾曲根管において,より効果的に根管形成が行える可能性が示唆された.昨年度においては,自作疲労試験器を用い,既存製品および,ニッケルチタン合金原線から加工した試料を使用し,各種条件における疲労試験を行った.超弾性特性,直線記憶のニッケルチタン合金原線を使用した疲労試験の結果より,同合金試料における疲労破壊は,ある一定変形量を境に,高寿命側と低寿命側に2分されているという結果が得られた.さらに,試料の荷重変位曲線から,疲労破折の分極点は,弾性変形から超弾性変形領域に移行する超弾性変形誘起応力相当付近の変形量に存在することが推察された.以上の研究から,これまでの臨床において,ニッケルチタン合金の超弾性は根管形成において,本来の根管への追従性に関し,既存のファイルに比較し有用であることが報告されてさたが,疲労破折に対しては,その破折を促進させてしまう可能性が示唆された.一方,既存製品を使用した疲労試験から,同一変形条件においても,その分散挙動は,正規性を示さなかった.さらに,疲労-荷重曲線においては,疲労変形初期段階に,荷重の上昇を認めた群と,認めない群に2分された.荷重の上昇は,疲労初期における加工硬化によるものと推察され,また荷重の上昇を認める群で,有意に破折が生じやすいという結果が得られた.以上の研究から,たとえ同一既存製品を同一条件化で使用しても,破折しやすさは,正規分布曲線に一致せず,かなりのばらつきがあることが示唆された.

さらに,破折を促進させる要因として,製造工程に導入される,加工硬化が影響していることが推察された.つまり,日常臨床において,ニッケルチタンファイルの破折を予防するには,新品を使用する事はもとより,単回使用であっても,可能な限り負荷を与えない使用が推奨される.今後は,今年度の研究をもとに,ニッケルチタン合金の機械的特性の相違が上記性質に与える影響について,研究を推進していく予定である.本年度においては,熱処理をおこなったファイルを使用し,機械特性である曲げ特性および疲労特性の計測を行った.さらには,同熱処理ファイルを使用し,アクリル樹脂製模擬湾曲根管模型を使用し,根管形成に与える影響について,評価を行った.まず,曲げ試験から,熱処理を適正温度で行うことによって,弾性領域および超弾性領域において,曲げ荷重が減少し,柔軟性が向上することが明らかとなった.さらに,自作の回転曲げ疲労試験機を使用した,疲労試験から,曲げ試験と同様に,適正温度条件化において,疲労寿命が向上することが,示唆された.以上の結果は,冷間加工を中心とした,製造工程上で発生する,金属格子内のひずみや転位が生じ,内部ひずみとなる.熱処理は,金属原子に自由エネルギーを付与することにより,再配列を促し,結果内部ひずみを報酬することが可能となる.そして,原子の移動がスムーズになることから,柔軟性や延性が向上し,亀裂の発生や進展を防ぐことで,疲労に対する抵抗性を向上させると推察された.一方,根管形成能の評価においては,熱処理群は無処理群に比較し,特に根尖において追従性の高い根管形成が可能であった.さらに特筆すべきは,これまでのニッケルチタンファイルの根管形成で大きな問題となっていた,根管形成中に突然破断するという問題に対し,本実験条件下においては,熱処理群では,無処理群に比較し,破折の発生率が低く,耐破折に対し有用であることが推察された.以上の結果から,熱処理によりニッケルチタンファイルの柔軟性および疲労寿命が向上することにより,特に湾曲根管において,より効果的に根管形成が行える可能性が示唆された.
分岐高分子のグラフト化による無機粉体表面への相溶化能の付与

本研究では、以下の研究成果が得られた。したがって、本研究課題の当初の目的が達成された。1.粒子表面からのグラフト重合の開始基となるアゾ基の導入は、粒子表面をトリレンジイソシアナートで処理することにより導入したイソシアナート基4,4'-アゾビス(4-シアノバレリン酸)との反応により行った。2.アゾ基を導入したシリカの存在下で、スチレン(St)とアクリル酸クロリド(AC)との共重合を行うと、粒子表面へペンダントにアシルクロリド基を持つポリマー、すなわち、poly(St-co-AC)が効率よくグラフトすることを見い出した。また、グラフト鎖のアシルクロリド基はACの仕込み組成を変えることにより制御できることもわかった。3.poly(St-co-AC)をグラフトしたシリカに水酸基末端のポリジメチルシロキサンやアミノ基末端のポリエチレンイミンを反応させると、グラフト鎖のペンダントアシルクロリド基とポリジメチルシロキサンの末端人酸基やポリエチレンイミンのアミノ基と容易に反応し、枝の分子量と化学構造が明確な枝分かれポリマーがグラフトしたシリカが合成できることが分かった。なお、このような系では、シリカ表面へのポリマーの総グラフト率が100%を超えるものも得られた。4.このような枝分かれ高分子をグラフトしたシリカは、様々な有機溶媒中やポリマーマトリックス中へ容易に、しかも安定に分散する性質を持つことが明らかとなった。さらに、シリカ表面の1次グラフト鎖や枝ポリマーの分子量を調節することにより、シリカ表面の濡れ性を任意に制御できることも見い出した。
環境ホルモン類の生体高分子系複合素材への取り込みに関する基礎研究

研究代表者の研究グループでは、廃棄されているあるいは未利用の生物資源中の生体高分子成分を有効利用して、地球環境に優しい素材の開発を目指している。サケ白子中のDNA、カニ殼・エビ殻中のキチン・キトサン、牛皮・牛骨・サケ皮からのコラーゲン、褐藻類からのアルギン酸等と、シクロデキストリン、ペプチド、合成ポリマー等とを複合化させ、様々な機能性素材を開発してきた。人や野生動物の内分泌作用に影響を及ぼす懸念のある内分泌撹乱化学物質、すなわち環境ホルモンについては、近年、世代を越えた深刻な影響が指摘され、早急な対応が求められており、我が国においても、環境ホルモン類の中でもその象徴的存在で猛毒のダイオキシン類に社会的関心が集まり、急速に対応策が検討されている。我々は以前、DNAを含む素材を用いて、ベンツピレン等を集積・除去するフィルターの開発を行った。多くの環境ホルモン類は芳香環を含む疎水的な構造を持っており、このような構造のためにDNAの塩基対間にインターカレーションで入り込むわけである。上記フィルターの開発は、このような環境ホルモン類の構造的特徴を利用した結果といえる。本研究では、ダイオキシン等の環境ホルモンを選択的に除去する素材の開発を目的に、生体高分子系複合素材、特にDNA系素材への環境ホルモン類の取り込みに関する研究を行った。その結果、ダイオキシン類、PCB、ベンツピレン等の環境ホルモン類がこれらの素材に効率的に取り込まれる事がわかった。これらの結果は、環境浄化の分野に大きく貢献できると思われる。研究代表者の研究グループでは、廃棄されているあるいは未使用の生物資源中の生体高分子成分を有効利用して、地球環境に優しい素材の開発を目指している。サケ白子中のDNA、カニ殻・エビ殻中のキチン・キトサン、牛皮・牛骨・サケ皮からのコラーゲン、褐藻類からのアルギン酸等と、シクロデキストリン、ペプチド、合成ポリマー等とを複合化させ、様々な機能性素材を開発してきた。本研究では、DNA、シクロデキストリン、環状ペプチド、環化高分子を含む生体高分子系複合素材を調整し、これらによる環境ホルモン類の取り込みを、吸収スペクトル、CD等、主として分光学的手法で調べ、これらの素材による環境ホルモン類の濃縮・分離システム開発のための次の基礎研究を行った。(1)DNA含有複合素材による環境ホルモン濃縮・分離効果の検討:前述のアルギン酸によるDNA固定化法に加えて、紫外線照射によりDNAを多孔性ガラスビーズ、不織布等の各種素材に化学結合で固定化する方法を見出した。これらのDNA含有複合素材による環境ホルモン類の濃縮・分離効果を、DNA複合素材にインターカレートすることが予想され、現在大きな問題になっている環境ホルモンである、ダイオキシン、PCB、ベンツピレン等で行い、有効な捕捉・除去効果を確認した。(2)環状オリゴ糖含有複合素材による環境ホルモンの濃縮と分離:シクロデキストリンを含む高分子素材を合成し、これらの複合素材によるビスフェノールA、ノニルフェノール等の環境ホルモン捕捉能を詳しく調べた。また、環境ホルモン類との相互作用の様子を主として分光学的手法で調べた。その結果、シクロデキストリン系素材は特にビスフェノールAに対して良好な捕捉・除去効果がある事がわかった。我々の研究グループでは、廃棄され、利用されていない生物資源中の生体高分子成分を有効利用して、人間や地球環境に優しい素材の開発を目指している。サケ白子中のDNA、カニ殻・エビ殻中のキチン・キトサン、牛皮・牛骨・サケ皮からのコラーゲン、褐藻類からのアルギン酸等と、シクロデキストリン、ペプチド等とを複合化させ、様々な機能性素材を開発してきた。本研究ではDNAを中心とする生体高分子系複合素材を調整し、これらによる環境ホルモン類の取り込みを、吸収スペクトル、CD等、主として分光学的手法で調べ、これらの素材による環境ホルモン類の濃縮・分離システム開発のための基礎研究を行った。昨年度(平成11年度)は主として、(1)DNA含有複合素材による環境

ホルモン濃縮・分離効果の検討(2)環状オリゴ糖含有複合素材による環境ホルモンの濃縮と分離、を行った。本年度は上記(1)に関連して、紫外線照射により不溶化させたDNAフィルムの構造や物性を調べ、このフィルムへの環境ホルモン類の取り込みを詳しく検討した。このDNAフィルムはDNA分子間の架橋により巨大な分子を形成しているが天然型の構造を保持しており、ヌクレアーゼ耐性になっている。環境ホルモン類のうち平面構造をとるダイオキシン、PCB、ベンツピレン等はインターカレーション様式で、このDNAフィルムに取り込まれるが、一方平面構造をとらないビスフェノールA等は全く取り込まれず、基質特異性が極めて高いことがわかった。ミルク中に含まれるダイオキシン、PCBの除去等、高い選択性が要求される目的に応用可能と考えられる。我々の研究グループでは、廃棄されているあるいは未利用の生物資源中の生体高分子成分を有効利用して、地球環境に優しい素材の開発を目指している。サケ白子中のDNA、カニ殻・エビ殻中のキチン・キトサン、牛皮・牛骨・サケ皮からのコラーゲン、褐藻類からのアルギン酸等と、シクロデキストリン、ペプチド、合成ポリマー等とを複合化させ、様々な機能性素材を開発してきた。本研究では、DNA、シクロデキストリン、環状ペプチド、環化高分子を含む生体高分子系複合素材を調製し、これらによる環境ホルモン類の取り込みを、吸収スペクトル、CD等、主として分光学的手法で調べ、これらの素材による環境ホルモン類の濃縮・分離システム開発のための基礎研究を行うことを目的とする。昨年度までは主としてDNA含有複合素材による環境ホルモン濃縮・分離効果の検討、及び環状オリゴ糖、環化高分子による環境ホルモンの濃縮と分離に関する基礎研究を行った。特にDNA素材、シクロデキストリン素材と環境ホルモン類の相互作用に関しては顕著な知見を得る事ができた。その過程で特に、DNAに紫外線を照射すると架橋構造をもつ水不溶性DNAフィルムが形成される事、またこの方法でDNAを多孔性ガラスビーズ等各種素材と固定化できる事等が明らかになり、これらDNA素材とこれらに特異的に結合するダイオキシン、PCB、ベンツピレン等の平面構造をとる環境ホルモン類との相互作用を詳しく検討した。本年はこの相互作用の詳細を明らかにするため、紫外線照射した水不溶性DNAの化学構造を明らかにした。またこのDNA素材で母乳中のダイオキシンを選択的に除去するための基礎研究を進めた。さらに、紫外線照射法に続くDNA固定化の一方法としてゾルーゲル法の応用を検討した。
高周波散乱現象の局所性と相反性に基づいた計算負荷の低減

高周波散乱現象の局所性を、定量的に普遍的に表現する指標として、フレネルゾーン数を用いた領域の定義を行い、数値積分の分割数の決定や重み関数の表現もこの指標を用いて統一的に扱うことにより、大規模問題の計算量低減の方針を示した。3次元平板に対して具体的に精度の評価と計算量の低減効果を評価したが、原理的には、計算負荷が波源観測点の位置、波長に依らぬものとなる可能性を示した。電磁界解析の分野で、波長に比して大きな散乱体を扱う高周波近似解法において、原理的には周波数に計算量が依存しない算法を提案し実証する。幾何光学に象徴される散乱現象の局所性を定量的そして陽に表現し、従来の低周波数解法にこれを反映した、概念の全く新しい近似計算法を構築する。散乱体上の全表面の誘起電流を一度に求める従来手法と対照的に、観測点毎に定義される、必要最小限の領域についてのみ誘起電磁流を求めるもので、この研究では領域の輪郭の定義にフレネル数を適用することの妥当性の検証と、曲面や多重反射を含む具体的な散乱問題への適用の基礎を構築する。平成22年度は、散乱現象の局所性を、定量的に表現する指標として、フレネル数を用いた領域の定義を行い、高周波散乱現象の概念の確認と、これを積極的に大規模問題の計算量低減へ適用する方針を示した。まず2次元問題について、多重散乱などが少ない単純な散乱体として、平板柱上散乱体および曲面柱状散乱体を考え、以下の項目を明らかにした。・散乱現象の局所性を、フレネル数を引数とする窓関数で表現した。・散乱断面積に着目し、曲面散乱体へのアルゴリズムの拡張を行う。・電流を求める問題に対し、精度の確認、計算量の低減効果を波長依存性の観点で評価した。次に、アルゴリズムの3次元への拡張を検討し、矩形板における放射積分領域の局所化に成功した。・フレネル窓関数の適用に修正法線ベクトル(相反定理)の考え方を併用することを提案し実証した。・電流を求める問題における計算量低減効果を、推定した。・後方散乱断面積の形で、入手可能な実験結果との照合を行った。平成23年度には、この考えを拡張して、市販のシミュレータを適用する際にも、必要最小限の領域を解くことで十分な精度を有する散乱界を得ることができる利点を確認する。平成22年度は、散乱現象の局所性を、定量的に表現する指標として、フレネル数を用いた領域の定義を行い、高周波散乱現象の概念の確認と、これを積極的に大規模問題の計算量低減へ適用する方針を示すとともに、精度の評価と計算量の低減効果を評価した。平成23年度は、これらの検討を深め、以下の項目に知見を得た。・放射面積分の局所化過程において、複数の散乱中心が接近した際に生じる誤差を特定し、重み関数の急峻な変化がもたらす人為的(Fictitious)な寄与が原因であることを見出した。これを解消する滑らかな新しい3次元重み関数を提案し、精度向上に成功した。・局所化の窓関数およびアルゴリズムを自作のモーメント法と比較し、電流分布を求め、計算量低減効果を確認した。市販シミュレータと組み合わせ任意曲面の問題を扱うためには、フレネル数と散乱体の交線により輪郭を定義する必要があるが、市販シミュレータの開示情報が十分に得られず、このアルゴリズムは完了するには至らなかった。・今後、多重散乱を生じるさまざまな形状に対する検証に備え、後方散乱断面積の実験結果を取得し、市販シミュレータに加えもう一つの参照解となる「修正物理光学法と繰り返し幾何光学法を相補的に用いる解法」の手順を整備した。
乳癌組織中のAP-1を介したERβ遺伝子発現に関する研究

転写共役因子であるAP-1が、乳癌におけるホルモン治療抵抗性に関与している可能性を見い出すことが本研究の目的である。まず、40例の原発性乳癌症例に対して乳癌組織中のERαおよびERβ、AP-1のmRNAの発現をRT-PCR法を用いて解析した。19例にERαの発現を認めた。RT-PCR法とElA法によるERαの陽性率は,ほぼ相関した。ERβを発現した症例は、4例のみであった。AP-1はc-Fos、cJunの発現を解析した。c-Fos20例、cJun18例、両方発現した症例は1例のみであった。ERαとc-Fos、cJunに明らかな相関は認められなかった。同様にERβとc-Fos、cJunにも明らかな相関は認められなかった。さらに、腫瘤の比較的大きい症例19例の乳癌組織中のAP-1蛋白の発現をWesternblotting法を用いて行った。抗c-Fos抗体、抗Jun抗体を用い乳癌組織中のAP-1蛋白を解析した。ERαの陽性例にAP-1蛋白の発現が多くみられた。ERβの陽性例とAP-1蛋白の発現には明らかな相関は認められなかった。症例数が少ないため統計上の有意差は検討できなかった。乳癌症例においてERαおよびERβは、AP-1との相互作用上、異なった機能を担っている可能性が示唆された。そのため、細胞株(293T)にERαおよびERβ遺伝子ならびに組み替え遺伝子を移入し、その蛋白の発現を観察した。E2の存在下においてERαとERβ、さらに組み替えERαとERβおのおのの蛋白発現に差があった(未発表)。現在までのところ、約40例の原発性乳癌症例に対して乳癌組織中のERαおよびERβ、AP-1の発現をRT-PCR法を用いて解析し、さらにAP-1蛋白の発現をWestern blotting法を用いて解析中である。1.原発性乳癌組織中のERαおよびERβの発現の解析RT-PCR法とEIA法によるERαの陽性率は、ほぼ相関した。また、ERβを発現した症例は、4例のみであった。2.原発性乳癌組織中のAP-1蛋白の発現の解析腫瘤の比較的大きい症例の乳癌組織中から、核蛋白を抽出し、Westernblotting法を用いて抗c-Fos抗体、抗Jun抗体による組織中のAP-1蛋白を定量した。
機能スクリーニング法を用いた塩生植物からの環境ストレス耐性団子群の単離と応用

マングローブ等の「環境ストレス耐性植物」は進化の過程で、通常の植物とは異なる多彩な環境ストレス耐性機構を獲得し、現在に至ったと考えられる。よって、その遺伝子は植物の環境ストレス耐性を向上させるための重要な遺伝子資源と言える。本研究では環境ストレス耐性植物として、マングローブ植物(Bruguiera sexangula, Avicenia marina)、アカザ科植物(Suaeda japonica, Salsola komarovii)、そしてアイスプラント(Mesembryanthemum crystallinum)に着目し、大腸菌を用いた機能スクリーニング法で「環境ストレス耐性因子遺伝子」の探索を試みた。1次スクリーニングで約2000cDNAを導入した大腸菌に耐塩性の向上が認められたが、このうち、安定したストレス耐性強化機能を有するものは64cDNAであった。これらの塩基配列を解析した結果、大別して、浸透圧調節物質の合成系タンパク質(phosphoehanolamine N-methyl transferase)、シャペロニン等のヒートショックタンパク質(TCP-1)、イオン輸送タンパク質(H+ATP ase)、LEAタンパク等がコードされていると考えられるcDNAの他、上記の分類に属さない機能未知のタンパク質が多数得られた。特にBruguiera sexangulaから発見した新規耐塩性強化因子mangrinを発現した大腸菌は耐塩性の他、浸透圧耐性、耐熱性、凍結耐性が向上していることも確認された。マングリンcDNAを導入した酵母や大腸菌にも大腸菌で得られた結果と同様な効果が確認された。さらに、本研究ではマングリンの他、TCP-1についても詳細な機能解析を行い、TCP-1がモノマーの状態でも分子シャペロンの機能を有することを明らかにした。Bruguiera sexangulaの培養細胞系を用いて,cDNAライブラリーを構築し,大腸菌を用いた機能スクリーニング法により耐塩性に関与する遺伝子の探索を行った。そして大腸菌の耐塩性を向上させる256アミノ酸からなるタンパク質をコードする遺伝子の単離に成功し,このタンパク質を「mangrin」(特許願第235910号)と命名した。本研究ではmangrinの耐塩性強化機構の解析の第一歩として最小機能領域を決定するために,Mangrin cDNAのデリーションクローンを大腸菌に導入し,その耐塩性を評価した結果,mangrinの16-86番目のアミノ酸領域がmangrinが耐塩性強化機能を維持するために必要な領域であることが明らかになった。また,Mangrin cDNAを導入した酵母は耐塩性が強化され,1.2 M NaClを含む培地でも通常の培地での生育と同等の生育を示した。さらに,Mangrin cDNAを導入したタバコ培養細胞でも,150mMのNaClを加えた培地で13日間培養したときの新鮮重量がmangrinを導入していないものに比べ上昇し,耐塩性の向上が明らかになった。Mangrinを導入したタバコ植物体を150 mMNaClを含む寒天培地で育成させると,mangrinを導入していないものに比べ,葉や茎の生長だけでなく,発根状態にも顕著な差が見られた。これらのことからmangrinが原核生物だけでなく,酵母やタバコ培養細胞及び植物体などの真核生物においても耐塩性強化機能を有することが明らかになった。またタンパク質レベルでの実験を行うため,大腸菌で発現させたmangrinを精製し,これを用いて抗mangrin抗体を作成した。塩生植物は、沿岸域や砂漠化した塩性土壌等の過酷な自然環境で生育する能力を有する。この事から塩生植物は進化の過程で通常の植物とは異なる多彩な環境ストレス耐性機構を獲得してきたと考えられる。よって、その遺伝子(cDNA)は植物の環境ストレス耐性を向上させるための重要な遺伝子資源と言える。