hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本近代コスメトロジー（化粧学）の展開と女性の衛生～美容家藤波芙蓉の事跡を中心に

藤波芙蓉(明治5昭和27年(18721952))は、ちょうど日本の化粧品業界が大きな成長を遂げた明治末から昭和初期にかけて、新聞・雑誌・映画撮影などで活躍した男性美容家である。本研究は芙蓉の美容家としての活動が、日本人、とりわけ女性の近代化を意識した啓蒙的な性格を強く持つものであったことを明らかにした。申請時の予想を遙かに超えて、化粧家として立つ以前の芙蓉の活動は多彩であり、著作も数多く残っていることがわかってきた。そのため、25年度は化粧家としての活動よりも、それ以前の活動に比重を置いた調査研究となった。その成果は「近代コスメトロジーの普及と展開をめぐる一考察美容家・藤波芙蓉の分析を通じて」(『コスメトロジー研究報告』21号、2013年9月)、「近代日本における化粧研究家の誕生ー藤波芙蓉の事跡をめぐって」(武田佐知子編『交錯する知衣装・信仰・女性』所収、思文閣出版、2014年3月)の二本の論文を通じて公開した。これらの論文の中で藤波芙蓉が仙台の第二高等中学校出身であることや、このころ米国人女性宣教師を通じて西洋式化粧法についての知識を習得したこと、その後上京して尾崎紅葉の弟子となり、作家として文壇デビューしたこと、新聞記者としての活躍、社会福祉問題との関わりなどを明らかにしえた。こういった様々な活動のなかで、芙蓉が当時の政財界やアカデミズム、さらに皇族とも繋がりを形成していった様子も明らかになった。その人脈は、のちの芙蓉の西洋式化粧法普及活動に対する主たる支持層とも重なって行く。化粧の近代化の推進には、国際社会の中で近代国家として承認されるために女性風俗を改良するという、当時の国家的課題が大きく関わっていたことが浮かび上がってきた。またイギリスにおいて、19世紀から20世紀にかけての女性風俗に関する資料収集を行った。いっぽう、近代の状況との比較のために、研究分担者によって近世の女性が置かれた地位と衛生環境に関する問題について考察が進められた。これらについても論文と学会報告の形で成果が公表された。今年度は、藤波芙蓉が美容家として立つまでのキャリア形成過程と、美容家としての初期の活動実態を明らかにするために、国会図書館を中心に以下の7点について資料調査・収集を行った。1,少年時代の芙蓉に西洋生活文化と外国語を教えた、「ブラウン嬢」と芙蓉が記している仙台の明治20年代キリスト教女性宣教師に関する調査。2,芙蓉の学問的土台を検証するための、母校第二高等中学校関係の教育資料収集。3,上京後籍を置いた『都新聞』の美容記事収集。4、『東京市養育院月報』の芙蓉の署名入り記事収集。5,芙蓉が美容家として活動を開始した初期に執筆した美容記事収集。対象は主として『婦人画報』『女子文壇』『処女』。6,芙蓉の業績の位置づけを検討するため、明治40年代から大正前期に活躍した美容家(主として北原十三男)による雑誌美容記事の収集。7,明治・大正期に描かれた美人画に関する資料収集。上記の調査によって、「ブラウン嬢」なる人物がハリエット・M・ブラウンであり、西部・婦人バプテスト外国伝道教会宣教師として1886年12月10日塩釜港へ、翌日仙台入りしていることを突き止めた。これを手がかりに、当時の婦人宣教師の仙台における布教・教育活動を精査し、彼女と第二高等中学校生徒達との関係も明らかに出来た。また、『都新聞』記者時代に「相談の相談」欄担当であったこと、この時期の美容記事は他の記者が担当したが、後の芙蓉の美容活動と類似するスタンスの記事であることを明らかにした。『東京市養育院月報』では、後の渋沢栄一との関係、福祉問題との関わり、小説家としての活動の実態を明らかにした。婦人雑誌記事の収集から、明治末年に次々に刊行された婦人雑誌というメディアのなかで、美容家が競合する時代が到来していることを明らかにした。なお、研究分担者分の遊女風俗研究は近代遊女の生活に関する史料分析を行った。26年度は、主として仙台市内と国立近代美術館フィルムライブラリーでの調査を行った。仙台での調査先と調査史料は、東北大学史料館所蔵旧制第二高等中学校卒業生・在校生名簿、宮城県立公文書館所蔵旧制宮城中学校卒業生・在校生・入学生名簿、東北学院大学所蔵仙台神学校卒業生・在校生・入学生名簿である。尚絅学院では尚絅女学校関係資料を調査し、芙蓉が仙台時代に通ったバイブルクラスを担当したミスブゼルと、当時の女性宣教師風俗について考察を深めることができた。明治期の知識人・文化人の教養形成には、学校教育だけでなく、多様な教育の場を想定する必要があることが明らかになった。フィルムライブラリーでは、映画製作現場での化粧について調査を行った。撮影用化粧に携わったことが芙蓉の西洋映画化粧の研究につながり、新しい芙蓉式化粧の展開をもたらした可能性を見いだした。

これまでの全研究期間を通じて、藤波芙蓉の化粧哲学と化粧法は同時代の英仏化粧書と映画フィルムの影響を強く受けて形成されたこと、さらにここに当時のナショナリズムや芙蓉の啓蒙家的活動要素が加わって、単なる西洋化粧法の技術移転ではなく、近代日本社会のあり方に適合した日本のコスメトロジーが形成されたことが明らかになった。芙蓉の化粧情報は婦人雑誌を中心とする近代メディアを介して広がり、女性達の身体観や衛生意識を化粧という生活文化レベルから変えていくことになる。日本史申請時に掲げた研究課題は、藤波芙蓉の活動の全体像の確定、出自と学問的背景の調査、著作物全般の収集と分析、芙蓉の化粧品製造・販売業の実態調査、映画産業への関与の調査、国外の化粧事情との比較、奈良女子高等師範学校蔵書調査の7項目である。このうち、芙蓉の活動の全体像の確定と、出自等に関する調査、著作物収集、奈良女子高等師範学校蔵書調査の成果については、25年度、「9、研究実績の概要」に記した二本の論文にまとめた。申請時における平成24年度の研究計画は1,『婦人画報』(明治・大正期分)の藤波連載記事分析2,『女子文壇』の藤波連載記事分析3,仙台現地調査4,藤波と同時代の国内美容書・美容記事の収集・分析の4点であったが、仙台の現地調査以外は全て予定通り進行した。仙台関係の資料については、現地入りする以前の事前調査段階で多くの資料を入手できたため、その分析に時間を取られたためである。・東北大学所蔵史料調査を行い、藤波芙蓉が仙台で受けた教育についてさらに詳細に明らかにする。・当該時期におけるフランスの女性風俗に関する現地資料調査を行い、藤波芙蓉が発信した化粧情報の質について明らかにする。・芙蓉が執筆した婦人画報連載記事の分析を行い、芙蓉が中流の女性たちに与えた影響、特に衛生意識に与えた影響について考察する。・研究分担者による、近世の衛生環境及び女性風俗に関する研究結果との比較考察を行う。2012年度に引き続き芙蓉の美容家としてのキャリア形成過程を明確にするために、出身地仙台の現地調査を行う。また、芙蓉の美容家としての活動実態を昭和期まで含めて明らかにするために、執筆記事とその関連資料の収集を継続する。また、研究分担者分の研究は、近世・近代に於いて女性風俗の1つのモデルとされた遊女風俗について、近代を中心に史料収集を進める。該当なし
船乗りたちの「語り」から読み解く近世イングランドの海事史研究

本年度の研究成果は以下の通りである。(1)1553年1564年にかけて行われたギニア航海の実態について分析を行った。従来、この時期のギニア航海に関しては、R.ハクルートが著した『主要な航海』(1589年)の記述が基本史料となってきた。しかしながら、今回、残存する史料を検討した結果、その基になった史料が、R.エデンが著した『新世界ないし西インドに関するここ数十年間の記録(1555年)であり、そこから複写する際に省略箇所や記載の誤りが少なからず認められることが明らかとなった。そこで、当時のギニア航海に関する残存史料を渉猟し、ハクルートの描いたギニア航海の記述の修正を行い、より史料に即した航海の実態を明らかにした。(2)これまでのギニア航海に関する記述は、船長などの士官層の記述や記録によるとこが多く、その間に一般船員たちがいかなる航海をおこなっていたのかについては、殆ど検討されてこなかった。そこで、本研究では、船上遺言書を用いながら、一般船員たちが見たギニア航海について検討を試みた。今回は史料の検討に時間を要するため、15534年の第1回航海における船上遺言書の分析を、(1)で明らかにしたギニア航海の実態と照らし合わせながら、ギニア航海時の一般船員たちの航海の実態や、船上共同体のあり方について検討を行った。(3)研究成果の公開については、2018年5月に三田史学会(於:慶應義塾大学)、2018年8月に西欧中世史研究会(於:お茶の水女子大学)において研究発表を行い、また『西洋史学報』(広島西洋史学研究会)に論文を投稿し、査読の結果、採択が決定し、2019年8月に発行の予定である。本年度の成果を査読付き雑誌『西洋史学報』に投稿し、掲載が決定したが、発行が2019年8月にずれ込んだのは、予定外であった。しかしながら2019年5月に三田史学会(於:慶應義塾大学)、8月に西欧中世史研究会(於:お茶の水女子大学)にて成果の報告をおこなったので、研究計画は概ね順調に進展している。今年度は、15531564年に9度に渡り行われたギニア遠征と交易の間に作成され、現在に残っている93通の遺言書の内容の本格的な検討に入る。1)船上遺言書の作成手続き:遺言者は船上遺言書をいつの時点で作成したのか、誰が遺言書を書き留めたのか、最終的に遺言書の検認はいかにして行われたのか。2)遺言書の形式を分析し、当時の一般的な遺言書と比較を行う:専門の書記者ではなく、船員が記録したことにより、いかなる問題が生じたのか検討する。特に遺言者に読み書きができない船員がいた場合、いかなる対応が取られたのか検討する。3)遺言書の内容の検討:何を誰に遺しているのか、遺言者と遺贈者との関係について検討する。遺贈物として何を遺していたか検討しながら、彼らの経済状態について検討する。4)遺言書のデータベース化を行う。5)学会発表2019年8月に広島西洋史学研究会大会において報告を行う予定である。また来年度に、広島史學研究会大会において日本史・東洋史の研究者と近世海事史研究のシンポジウムを行うので、その準備にとりかかる。2020年2月にThe National Archive in KewならびにBritish Libraryにおいて、船上遺言書ならびに海事史関係の史資料の渉猟を行う予定である。6) 2019年8月911日に開催される広島西洋史学研究会大会において、本年度の研究成果の報告を行う。7)広島史學研究会が発行している『史學研究』に10月に論文(単著)を投稿予定である。

本年度の成果を査読付き雑誌『西洋史学報』に投稿し、掲載が決定したが、発行が2019年8月にずれ込んだのは、予定外であった。しかしながら2019年5月に三田史学会(於:慶應義塾大学)、8月に西欧中世史研究会(於:お茶の水女子大学)にて成果の報告をおこなったので、研究計画は概ね順調に進展している。今年度は、15531564年に9度に渡り行われたギニア遠征と交易の間に作成され、現在に残っている93通の遺言書の内容の本格的な検討に入る。1)船上遺言書の作成手続き:遺言者は船上遺言書をいつの時点で作成したのか、誰が遺言書を書き留めたのか、最終的に遺言書の検認はいかにして行われたのか。2)遺言書の形式を分析し、当時の一般的な遺言書と比較を行う:専門の書記者ではなく、船員が記録したことにより、いかなる問題が生じたのか検討する。特に遺言者に読み書きができない船員がいた場合、いかなる対応が取られたのか検討する。3)遺言書の内容の検討:何を誰に遺しているのか、遺言者と遺贈者との関係について検討する。遺贈物として何を遺していたか検討しながら、彼らの経済状態について検討する。4)遺言書のデータベース化を行う。5)学会発表2019年8月に広島西洋史学研究会大会において報告を行う予定である。また来年度に、広島史學研究会大会において日本史・東洋史の研究者と近世海事史研究のシンポジウムを行うので、その準備にとりかかる。2020年2月にThe National Archive in KewならびにBritish Libraryにおいて、船上遺言書ならびに海事史関係の史資料の渉猟を行う予定である。6) 2019年8月911日に開催される広島西洋史学研究会大会において、本年度の研究成果の報告を行う。7)広島史學研究会が発行している『史學研究』に10月に論文(単著)を投稿予定である。消耗品等を効率的に使用したため,当初予定より多く次年度使用額が生じたため。
再生・分化のモデル生物ヤマトヒメミミズの生活史における遺伝子発現プロファイル作成

ヤマトヒメミミズは環境に応じて無性生殖と有性生殖二つの生活史を使い分け繁殖する日本産の環形動物である。本研究では再生・分化のモデル生物としての研究環境の充実を目的に二つの生活史を5つのステージに区分しcDNAライブラリーの作成と塩基配列決定を試みた。成熟期と再生期の完全長cDNAライブラリーの約3800個ついて塩基配列を決定した結果、ライブラリーはヤマトヒメミミズと他の貧毛類の既知遺伝子32個を含む236個の相同遺伝子を含んでいた。無性生殖では成熟した個体が自ら約10断片へと破片分離して、7日から10日で完全な成体個体へと再生するが個体密度や温度などをコントロールすることで分節断片は再生過程で有性化し二個体の間で有性生殖を行う。ヤマトヒメミミズは実験室内での飼育環境下で二つの生活史をコントロールできることから、再生と分化のモデル動物として有用性が報告されている。分化に関与する幾つかの遺伝子に関しsiRNAを用いた遺伝子発現ノックダウンによる表現型への影響が調べられているものの、ゲノム生物学的手法による情報は限られたものにとどまっている。本研究では二つの生活史を通した広範囲にわたる遺伝子発現を明らかにするため、無性生活史ステージとして1)成熟個体、2)砕片期、3)再生期の3ステージと有性生活史の4)有性期、5)卵包中の初期発生個体の計5つのステージに区分し、検鏡により選別した個体より調整した転写産物を出発材料にcDNAライブラリーの作成を試みた。作成した成熟個体(A)と再生期(R)のcDNAクローンを無作為に選択しインサートサイズ3001000bpのクローン(Aライブラリー;14191, Rライブラリー;1804)の塩基配列を決定した結果、ヤマトヒメミミズの既知遺伝子を含む相同遺伝子を見出しており、各ステージで発現している遺伝子をカバーするため十分なシークエンシング作業と解析を継続している。本研究では有性化ステージのライブラリー作製に充分な個体を得るため有性化を誘導する条件を検討した。一定温度と低密度環境に加え、飼料の栄養価を上げることで23%であった有性化率が2030%まで上昇することが出来た。この誘導により応答する遺伝子の同定は有性化決定機構をあきらかにする手掛かりになる。無性生殖では成熟した個体は自ら約10断片へと分節化し、7日から10日で完全な成体個体へと再生するが、個体密度や温度などコントロールすると有性化し他の個体と交尾し産卵する。ヤマトヒメミミズは実験室内でも飼育可能で、二つの生活史をコントロールできることから、再生と分化のモデル動物として有用性が報告されており、分化に関与する幾つかの遺伝子に関しsiRNAを用いた遺伝子発現ノックダウンによる表現型への影響が調べられているがゲノム生物学的網羅的情報は未だ乏しい。本研究ではヤマトヒミミズの研究基盤の充実を目指すと共に、二つの生活史において再生と分化に関与する遺伝子の発現プロファイルの作成と表現型との関連付けを目指す。生活史を無性生活史1)成熟個体、2)砕片期、3)再生期と有性生活史の4)有性期、5)卵包中の初期発生個体の計5ステージに区分し、各ステージの均質化cDNAライブラリーの作成し、各ライブラリーのcDNAの塩基配列決定により各ステージで発現する遺伝子を集積、恒常的に発現するハウスキーピング遺伝子やステージ特異的に発現する遺伝子とその発現プロファイルを作成する。またステージに特異的する遺伝子はsiRNAを用いた遺伝子発現ノックダウンによる発現プロファイルと表現型との関連付けを目指す。1年目は成熟個体と再生期の転写産物より作成したcDNAの塩基配列とBLASTによる相同解析を進めており、各ステージで発現する約300のcDNAについて解析した。成熟個体では発現する6割が既知遺伝子であるのに対して、再生期では機能未知遺伝子が成熟期の1.5倍程度発現していることがわかった。今度各ステージの解析数を増やし、生活史全体を網羅する遺伝子発現プロファイル作成を進める。(1)ステージ毎のcDNAシークエンスシングの試料の整備:ヤマトヒメミミズの全遺伝子数を15000個と推定すると、各ステージ3000遺伝子分のcDNAの配列データを集積により各ステージで特異的発現を示す遺伝子とハウスキーピング遺伝子の同定が可能と考えている。本研究を始める当たり用意していた無性生活史成熟期のcDNAライブラリーを既知のハウスキーピング遺伝子を指標として評価した結果、各ステージとも遺伝子発現を充分カバーすることが出来ないと判断した。平成23年度は大幅に変更し、各ライブラリーのcDNAの塩基配列決定とその解析から各ステージの個体よりmRNAを用いGatewayシステムによるcDNAライブラリーの作成へ研究の中心を変更することとした。

各ステージの個体を確保するのに約3ヶ月の時間を要したため、5ステージのcDNAライブラリーのうち無性生活史の成熟個体と再生期について順次シークエンシングと解析をはじめており、砕片期はmRNAの調製する段階である。有性生活史のcDNAライブラリーは有性個体の頻度が低く、有性分化個体と卵胞中の初期発生個体より充分な転写産物を確保できないために、新たなライブラリー作製出来ていない。個体数を管理した飼育環境で有性化を試みたが、現状では有性化が低い(25%40%)こと計画が遅れる原因と考えられる。(2)遺伝子発現プロファイルの作成と確認:解析数がまだ僅かであるため、無性個々の遺伝子の発現パターンを比較する迄には至ってはいない。(1)ステージ毎のcDNAシークエンスシングの試料の整備:平成23年度はcDNAライブラリーを再構築することになった為、5つのcDNAライブラリーについてクローンの塩基配列決定と発現プロファイル作製の計画が大幅に遅れる結果となった。平成24年度では平成23年度に引き続き砕片期と有性生活史の2つのライブラリー作製を行うと共に、各ライブラリーのcDNAのシークエンシングと解析を並行して行う。有性生活史のライブラリーの作製と解析を行う。有性生活史の2ステージ分のcDNAライブラリー作製に充分なmRNAを有性個体と卵を得ることが出来なかった。個体数を管理した飼育環境で有性化を試みたが、現状では有性化が低い(25%40%)ことから高頻度に有性化を誘発する飼育条件を確立する。(2)遺伝子発現プロファイルの作成と確認:得られた配列データを順次、既存のデータベースと照合し整理する。各ステージに発現するcDNAを比較し、ステージ特異的な遺伝子や全てのステージに共通するハウスキーピングな遺伝子を同定により、ヤマトヒメミミズの生活史の各ステージの特色を明示する発現プロファイルを作成する。ステージ特異的な遺伝子は定量的RT-PCRにより発現確認を並行して行う。時間的に可能であればsiRNAを用いた遺伝子発現ノックダウン実験で表現型との相関を検討する。(3)研究の総括と研究資源としての公開準備:本研究で得られたcDNA配列はESTデータとしてデータベースに登録する。生活史の各ステージにおける遺伝子発現をデータベース化する。また、今後のさらなる解析のために研究資源として提供出来るようしかるべき学会等で確立されたリサーチリソース上に公開し、新しい再生分化の実験動物としての普及を図る。(1)ステージ毎のcDNAシークエンスシングの試料の整備:平成23年度に引き続き解析に無性生活史および有性生活史のcDNAライブラリーについてcDNAシークエンシングを進める。平成23年度までにcDNAのシークエンシングに必要な機器等の設備は整っており、本研究費はシークエンシングの試薬消耗品に物品費を使用する。(2)遺伝子発現プロファイルの作成と確認:遺伝子発現プロファイルを確認のため、各ステージの転写産物を用い定量的RT-PCRによる発現量を検出し、発現プロファイルとの比較を行う。定量的RT-PCRのキット試薬およびプライマーの合成費として物品費を使用する。
受光部に光ファイバーを装着した分光器を用いた低光量領域における固相の透過光測定

イオン交換体等の固相に目的成分を有色化学種として吸着・濃縮させ、その固相減光度を直接測定する固相分光法では、固相による吸収や散光による光強度の減少のため光量確保が重要となる。前年度までの研究で、光源に高輝度のハロゲンランプを、また投受光に光ファイバーを装着したマルチチャンネル検出器を用いれば、減光度値が4を越えるような低光量の領域における透過光測定が可能であることが確認された。またキャピラリー型白金セルを用いた場合、セル長を5cmまで伸長してもLambert則、Beer則の両法則がとも成立することが確認された。これら測光システムを用いて鉄(II)-フェナントロリン鎖生成系(バッチ発色系)に応用したところ、光路長4cm、試料溶液体積5cm^3の場合、その検出限界は0.15ngと非常に良好な結果を得られた。そこで本測光装置をさらに条件的に厳しい流れ系に関しても展開した。ライン内で発色させた目的成分をフローセル(内径1.5mm、光路長5mm)に充填した固相に吸着濃縮させ、その固相減光度を連続的にモニターすることを試みた。その結果、通常の分光光度計では光量確保のための特別な工夫をしなければ測定困難な、フローセル中の固相減光度を容易に測定可能であることが分かった。Cr(III)-Cr(VI)、Fe(II)-Fe(III)、V(IV)-V(V)等の酸化状態別流れ分析に適用したところ、これまでの分析法では得られなかった数種の興味ある知見を得ることにも成功している。以上の結果から、本研究により構築された測光システムが固相分光法の汎用性を高める上での重要な役割を果たすだけでなく、特に水試料中の微量成分分析が重要となる環境化学、地球化学等の分野で応用されることが期待される。イオン交換体等の固相に目的成分を有色化学種として吸着・濃縮させ,その固相減光度を直接測定する固相分光法では、光量不足をきたさない範囲内で固相の光路長を長くすることが高感度化のためには効果的である。しかしながら固相による吸収や散光による光量不足から、通常の分光光度計では光路長を1cmよりも長くすることができなかった。今回、光源に高輝度のハロゲンランプを,また投受光に光ファイバーを装着したマルチチャンネル検出器を用いれば、減光度値が4を越えるような低光量の領域における透過光測定が可能であることが確認されたので,同領域における定量性の確認を行った。発色系は鉄(II)-フェナントロリン錯生成系を用いた。錯体を吸着させた固相をセルに充填し、その正味の固相減光度(錯体の極大吸収波長の514nmと錯体の吸収の無い800nmでの固相減光度の差)を測定した。光路長が1cm以下の場合には、固相減光バックグラウンドと吸着化学種による正味の吸収との和が4を越し5にせまるような領域においても、Lambert則、Beer則の両法則が成立することが確認された。またその測定精度は、固相減光度値が4前後を示す領域では±0.5%以内と良好であった。減光度が5を越えるような低光量の領域でもサンプリングタイムを長くすればかなりの精度で測定することが可能であった。1cm以上の光路長については、角形石英セル、キャピラリー型石英セル、キャピラリー型白金セルについて検討した。白金セルの場合には他のセルとは異なり、固相による散乱光がセル壁により反射され受光部側のオプティカルファイバーに効率的に導かれるため、固相減光バックグラウンドが特に低く、セル長を5cmまで伸長しても透過光測定が可能であり。Lambert則、Beer則の両法則もまた成立することが確認された。

以上の結果から、本研究により構築された測光システムが固相分光法の汎用性を高める上での重要な役割を果たすだけでなく、特に水試料中の微量成分分析が重要となる環境化学、地球化学等の分野で応用されることが期待される。
病態解析を通じたH5N1高病原性鳥インフルエンザ治療法の確立

高病原性鳥インフルエンザH5N1の病態は、AH1N1pdmにおける重症肺炎及び多臓器不全を伴う脳症に近似していた。宿主の遺伝子発現を検討し、肺炎と脳症では発現する遺伝子に差が認められること、また、肺炎マウスモデルにおいて酸化ストレスによる障害と炎症の抑制が重要であり、チオレドキシン(TRX)がその両方に効果があることが判明した。これらはH5N1ヒト重症例の治療における重要な知見と思われた。2009pdmでは小児の重症肺炎がしばしば認められた。その病態として肺でのウイルスの増殖を伴い、また種々の炎症性サイトカイン・ケモカインが上昇し、また酸化ストレスの亢進も重症化に関与することが示唆された。患者のマイクロアレイ解析においても、神経症状を示した群とは異なっていた。一方、マウスのインフルエンザ感染による致死的肺炎モデルにおいては、レドックス制御が大きな役割を示していることが明らかになった。すなわち、マウスにインフルエンザウイルスを感染させた時、感染後5-6日で全例死亡するが、レドックス制御蛋白であるチオレドキシン(TRX)投与において有意に死亡率が減少した。その際TRXは酸化ストレスの軽減のみならず、炎症性サイトカイン産生の抑制など、抗炎症としても効果があることが判明した。このことは従来抗炎症として主にステロイドなどが臨床の場で使用されてきたが、免疫抑制作用の影響が懸念されていた。しかし、TRXなど抗酸化ストレス作用を持つ薬剤が抗炎症効果を持ちうることが明らかになった点は重要である。サイトカインストームを起こし、また多臓器での増殖が報告されているH5N1ウイルスは、その治療において免疫抑制薬は使いづらいのが現状である。本研究におけるTRXの効果について、H5N1実験動物モデルでの確認が次の課題である。・2009pdmの治療成績が、諸外国より突出して優れていた日本の治療の基本は、「病態に基づいた治療」である。これを、未だ治療法の確立されていないH5N1に応用し、「H5N1の治療法の確立」をめざすことが本研究の目的である。・その手掛かりとなるのが、2009pdmの病態解明である。2009 pdm自験例のマイクロアレイの解析で、「これまでに関連が報告されていない」遺伝子の関与が示唆された。神経症状と肺炎症状を呈した群では、明らかな違いが存在し、これらの遺伝子群の解明はH5N1の肺炎・脳症の病態解明にも有用であると考えられた。・重症インフルエンザ治療の基本は従来、1抗ウイルス薬、2抗サイトカイン・ケモカイン(抗炎症)であったが、3本目の柱となりつつあるレドックス制御について、マウスモデルにおいてインフルエンザ肺炎の重症化をチオレドキシン(TRX)が治療効果(生存率の有意な改善)を示すことが明らかになった。その病態は、抗サイトカインによるものだけでなく、酸化ストレスの抑制によるものであった。この結果に基づき次年度は、H5N1感染動物に対するTRXの治療効果を検討し、新しい治療法の確立に挑戦する。2009pdm感染マウスモデルにおける、レドックス制御の関与の検討を行い、評価項目を以下のごとく設定し検討した:生存曲線、炎症性サイトカイン・ケモカイン(TNF-α, IL-1β, IL-6, KC, IL-12,IFN-γ等)酸化還元マーカー(血清d-ROMs、尿中8-OHdG)肺組織8-OHdGと4-HNEの免疫染色。その結果、チオレドキシン(TRX)は、抗サイトカイン・ケモカインの抑制のみでなく、抗酸化ストレスとしても効果があり、マウスの生存率を有意に改善した。これらは、今後H5N1の治療に応用可能となる可能性を示唆している。また、小児において2009pdm肺炎において急性期発現増強する遺伝子群は、神経症状を示した遺伝子群とは大きく異なることが示唆された。これは、インフルエンザ脳症に対する治療と重症肺炎に対する治療とは必ずしも同一ではないことが考えられ、これも重要な結果と思われた。2009pdm重症肺炎において明らかになった急性期発現増強する遺伝子群についてSNPsおよびメチレーションによるepigeneticsの関与などについて検討を進める。またTRXのH5N1感染動物に対する炎症抑制効果についても研究していく予定である。研究費は主に消耗品を購入し、主としてサイトカイン・ケモカイン・マウスの購入・酸化ストレスマーカーの測定キットの購入に充てる。
根伸長過程で作動する、細胞外放出物質による酸性ストレス回避戦略、に関する研究

(1)Al^<3+>の特異的初期作用座の解明:同じ3価であるがイオンポテンシャル順位のAl^<3+>>Yb^<3+>>La^<3+>であることを利用して調査した。その結果、根端から得たプロトプラスト表面でのβ-グルカン合成量はAl》Yb>LaでAl耐性種は原形質膜上に均一に分布するのに対して、Al感受性種は不均一な島状に分布し、これにはβ-1、3結合が含まれ、FDA viaabilityはAl<Yb<Laであり、根における金属分布はAl>Yb>Laの順に外側に多く、Laでは根全細胞で不可逆的原形質分離が顕著になり、根伸長阻害とK含有率低下が3種金属の中で最も著しく、グルカン非合成条件下でのプロトプラスト凝集性はAl>Yb>Laであった。以上の結果は、Alの特異的初期作用座は根端細胞の原形質膜であることを示している。(2)根端細胞原形質膜の表面負荷電量に基づくAl耐性細胞の分離:Al耐性種間差は根端CECと無関係であったが、原形質膜の表面負荷電量の小さい種でAl耐性であった。そこで無毒なAl(OH)_3を混合したシリカマイクロビーズ(SMB)を調整した。これはpH5.3で最高正荷電を有しており、精製根端プロトプラストと混合し、密度勾配遠心によって、viableな状態でAl耐性プロトプラストほど底部に多数集められた。(3)Al非含有固形培地の調整と根からの放出有機酸分析:実際の土壌に類似の物理条件のAl非含有寒天状固形培地は、SMBに少量の培養液を加える事によって調整可能であり、根からの放出有機酸は吸引濾液から得られた。(4)Al耐性と放出有機酸の関係:Al^<3+>とのcomplex形態能の強いクエン酸+リンゴ酸+酒石酸の合量はイネ》トウモロコシ>エンドウであり、またトウモロコシ品種間においても、Al耐性品種程、合量値が高かった。しかしながら、有機酸濃度はAl^<3+>濃度よりも著しく低く、さらに土壌との収着量も著しいので、放出有機酸によるAl^<3+>の解毒効果は過大評価に注意する必要がある。根伸長過程で作動するAl過剰害は(1)根端細胞分裂阻害、(2)根伸長阻害の両面から解析される必要がある。しかし、他及び本研究結果から、Alは根端・外側表面から高濃度に集積することが明らかとなった。それゆえ、前述の(1)(2)は根細胞自体にとっては同一の害作用を意味する可能性があると推定される。従って、細胞レベルでは根端細胞は何故Alを集積するかという点に問題が整理される。Alイオンの細胞への取り込み機構や細胞内の局在性を支配するのはイオンポテンシャル(IP)と予想されるので、Alイオンの特異的反応座を明らかにするために、同じ三価陽イオンでIPがAl^<3+>>Yb^<3+>>La^<3+

>であることを利用した。その結果、根精製プロトプラスト表面でのグルカン合成量はAl》Yb>Laで、Al耐性種は原形質膜上に均一に分布するが、Al感受性種は不均一に島状に分布する。このグルカンにはβ-1、3結合が含まれ、FDA viabilityはAl>Yb>Laで、グルカン非合成条件下でのプロトプラスト凝集性はAl>Yb>Laであった。それゆえ、Alは原形質膜に特異的に結合し、そのため原形質膜上に存在するGSIIを活性化させβ-1、3-グルカン量を増大させるが、Al感受性種は膜自体の損傷が著しいためにグルカン合成が抑えられる。グルカン非合成条件下での凝集性の結果もAlの原形質膜との強い結合を支持している。一方、別の実験から、Al耐性種ほど根端プロトプラスト負荷電量が少なかった。そこで、無毒なAl(OH)_3でコートし正に帯電させたシリカマイクロビーズ(SMB)を反応させた結果、Al耐性種から得たプロトプラストほど密度勾配遠心によって底部に多数集められた。Al害やAl耐性細胞は原形質膜へのAl吸着性に起因するものと示唆された。SMBに少量の水溶液を加えることによって寒天状の固形培地が得られた。Al耐性種ほど錯形成能の強い有機酸を大量に放出した。Al害程度は培地中のAl濃度と有機酸放出速度とにより決定されると推定された。(1)Al^<3+>の特異的初期作用座の解明:同じ3価であるがイオンポテンシャル順位のAl^<3+>>Yb^<3+>>La^<3+>であることを利用して調査した。その結果、根端から得たプロトプラスト表面でのβ-グルカン合成量はAl》Yb>LaでAl耐性種は原形質膜上に均一に分布するのに対して、Al感受性種は不均一な島状に分布し、これにはβ-1、3結合が含まれ、FDA viaabilityはAl<Yb<Laであり、根における金属分布はAl>Yb>Laの順に外側に多く、Laでは根全細胞で不可逆的原形質分離が顕著になり、根伸長阻害とK含有率低下が3種金属の中で最も著しく、グルカン非合成条件下でのプロトプラスト凝集性はAl>Yb>Laであった。以上の結果は、Alの特異的初期作用座は根端細胞の原形質膜であることを示している。(2)根端細胞原形質膜の表面負荷電量に基づくAl耐性細胞の分離:Al耐性種間差は根端CECと無関係であったが、原形質膜の表面負荷電量の小さい種でAl耐性であった。そこで無毒なAl(OH)_3を混合したシリカマイクロビーズ(SMB)を調整した。これはpH5.3で最高正荷電を有しており、精製根端プロトプラストと混合し、密度勾配遠心によって、viableな状態でAl耐性プロトプラストほど底部に多数集められた。(3)Al非含有固形培地の調整と根からの放出有機酸分析:実際の土壌に類似の物理条件のAl非含有寒天状固形培地は、SMBに少量の培養液を加える事によって調整可能であり、根からの放出有機酸は吸引濾液から得られた。(4)Al耐性と放出有機酸の関係:Al^<3+>とのcomplex形態能の強いクエン酸+リンゴ酸+酒石酸の合量はイネ》トウモロコシ>エンドウであり、またトウモロコシ品種間においても、Al耐性品種程、合量値が高かった。しかしながら、有機酸濃度はAl^<3+>濃度よりも著しく低く、さらに土壌との収着量も著しいので、放出有機酸によるAl^<3+>の解毒効果は過大評価に注意する必要がある。
沈み込み帯マントルの不均質性の解明:地球化学トモグラフィーに向けて

沈み込み帯の火山岩組成から、沈み込んだスラブ由来成分を取り除き、マントル同位体組成およびその地球規模での不均質性を読取ることに成功した。海洋玄武岩と合わせた解析の結果、地球のマントルがおよそ東西半球に分かれることが分かった。超大陸下への集中した沈み込みが原因で、水溶液成分が東半球下に濃集した一方、西半球下はそのような成分に乏しいことを表すと考えられる。本研究は、全地球規模のマントルの地球化学独立成分マップとその構造の成因を解明すること、いわば、地球化学トモグラフィーを構築することを目的とする。このために、まず沈み込み帯マントルの不均質の地球化学的性質と広域変化を、日本列島での詳細研究に基づいて明らかにし、その知見・手法を世界の沈み込み帯に応用する。その結果得られる沈み込み帯マントルの不均質構造と、海洋玄武岩から得られるマントル不均質構造を統合して解析し、全世界を覆う高密度な地球化学独立成分マップを描くことができると期待される。本年度は、日本列島の火山岩から島弧下のマントルウエッジの同位体組成を推定する目的で、データが不足する北海道、東北南部、西南日本、九州の火山岩の収集や分析をすすめた(一部、北海道大学、JAMSTECおよび京都大学との共同研究)。また、微量元素組成解析に有効な紫外フェムト秒レーザーアブレーション装置の導入を行い、立上げ作業を行った。レーザーパワーやデフォーカシング距離と、ビーム径・深度・形状との関係を詳細に調べ、対象物に応じた適切なパワー設定が可能となった。また、NISTガラス、産業技術総合研究所などの標準試料をもちいて、微量元素濃度の検量線法を、ガラス試料および粉末ペレットに対して確立すべく、試料調整方法や分析条件の探索を開始した。またグローバルな沈み込み帯データのコンパイルに基づく統計解析も開始した。予察的な解析では、沈み込み帯のマントル組成は、火山岩組成からスラブ由来流体の影響を取り去ることで推定可能であること、そのマントル組成には、数千km規模での同位体不均質が存在する可能性があることが分かった。今後、日本列島での知見と合わせて、より精密な解析を進める予定である。本年度は、昨年度に導入されたフェムト秒レーザーアブレーション装置と既存のICP-MSを用い、火山岩、変成岩、鉱床岩などの全岩および構成鉱物試料の微量元素組成の分析方法を確立すべく、複数の手法を組み合わせて手法構築を行った。まず、全岩試料については、標準試料を用いて岩石粉末ペレットを作成し、検量線法によって分析ルーチンを作成した。プラスチックパイプ(内径約3mm)に岩石粉末を詰め、プレスして小型ペレットを作成した。このペレットを、レーザーのライン分析を繰り返すことによって面分析し、十分な総カウントと感度を得る条件を探した。その結果、火山岩や変成岩の解析に必要なおよそ30元素について、誤差10%20%(繰り返しのばらつき)を安定に得る条件を求めた。XRF分析によって予めCaおよびSiの含有量を求めることにより、内標準とした。また、標準ガラス試料、標準岩石試料とともに、試料を溶液化し、ICP-MSで濃度測定し、クロスチェックを行い、繰り返し誤差の程度で確度があることも確認した。この方法を応用し、日本列島の第四紀火山岩、特に中部地方から東北地方南部については、十分な密度でデータを得た。これらのデータから、独立成分統計解析を行い、マントルウエッジ、スラブ由来流体、混染源としての地殻成分などの独立成分とその組成を同定をすすめている。同時に、中部地方にみられるアダカイトの成因について、微量元素組成と同位体システマティクスを用いた定量的解析を進め、これらの岩石が冷たいスラブからの多量の流体と、柘榴石の安定領域での比較的低い部分溶融によって生じたことを明らかにした。本年度は、これまでに蓄積されたデータを解析することによって、(1)スラブ由来流体の量と組成の同定、(2)それらを考慮したマントルのpristineな組成推定、(3)(2)の島弧スケールでのマッピングを進めた。特に、Independent Component Analysis (ICA;独立成分分析)を用いた方法によって解析を行い、流体成分、マントル成分の分離に成功した。この方法を、全世界の島弧に応用し、グローバルなマントルマッピング、いわばgeochemical tomographyを行うことに成功した。その結果、これまで南半球に存在すると考えられていたマントルの組成異常が、東半球全体に広がっていること、およびそれらは数億年前の超大陸に向かう集中した沈み込みによって形成された可能性があることが分かった。沈み込み帯に注目した場合、西太平洋の沈み込み帯(ニュージラーンドとケルマディックを除く)は、ほぼすべてがこの「東半球」ドメインに属する一方、カムチャッカからアリューシャンの間でシャープに組成変化が起こり、日付変更線付近でマントル組成が大きく変化することを世界で初めて明らかにした。この成果を論文として発表した。

当初の予定通り、レーザーを用いた全岩微量元素組成測定方法を確立し、それに基いて、火山岩および変成岩のデータを得ることができた。また、データから、日本列島下のマグマ生成(温度圧力条件、流体組成・量、マントル組成)を区別することに成功した。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、これまでに蓄積されたデータを解析することによって、(1)スラブ由来流体の量と組成の同定、(2)それらを考慮したマントルのpristineな組成推定、(3)(2)の島弧スケールでのマッピングを進める。特に、Independent Component Analysis (ICA;独立成分分析)を用いた方法によって解析を行い、流体成分、マントル成分の分離をはかる。日本列島についてこれらの試みがうまく進めば、それを全世界の島弧に応用し、グローバルなマントルマッピング、いわばgeochemical tomographyに結びつける試みを行う予定である。そのためには、PetDB、GEOROCなどのデータベースを活用する。最終年度であるため、これらの出版を順次進める。
脳動脈瘤発生増大破裂の機構解明と新規治療法の開発

脳動脈瘤の発生、増大、破裂の機構を解明し、新たな治療法を開発することを目的とし、脳動脈瘤誘発動物モデルを用い、7T-MR装置を用いたMRA画像による追跡を行い、分子生物学的解析から得られた脳動脈瘤関連因子を抑制することで脳動脈瘤の発生、増大が制御できるかを検討した。これまでの報告と同様に、ラットにおいてスタチン製剤による脳動脈瘤形成に対する抑制効果、各種因子の発現抑制効果を確認し、またTNF-α抑制剤による新たな脳動脈瘤形成抑制効果を発見した。さらにサルにおける脳動脈瘤形成モデルを確立し、画像追跡を行っている。くも膜下出血は、高率な死亡率と後遺症率を有する重篤な疾患である。また、生産年齢層に好発することから社会的損失も少なくない。しかし、脳動脈瘤が発生増大し破裂に至る分子機構は不明であり、現時点での未破裂脳動脈瘤の治療は、侵襲を伴う外科的な脳動脈瘤クリッピング術ないしは血管内手術によるコイル塞栓術のみであり、非外科的治療の開発は皆無である。脳動脈瘤動物モデル(ラット、マウス)を用いて証明してきた脳動脈瘤発生増大に関わる因子を、新たな脳動脈瘤モデル(ラビット、サル)において分子生物学的、組織学的に検証し、さらに破裂モデルを確立したのち、脳動脈瘤破裂に至る機構の解明を行い、破裂予測因子が同定された場合、これをMR画像追跡する。また、ラットモデルにおいて証明してきたstatin製剤による薬物治療の効果を大型動物(ラビット、サル)においてMR画像を含め検討し、臨床応用展開への基礎資料とする。本年度においては、1)ラット脳動脈瘤破裂誘発モデルの開発とラビット・サル脳動脈瘤モデルの解析システムの確立のための環境整備、2)新たなstatin製剤を用いラット脳動脈モデルでの効果判定と増大に関わる因子解析、3)ラット、マウスにおける7TMR撮像条件の設定、を行った。結果として、複数のstatin製剤により脳動脈瘤形成が抑制されること、ラットにおいてMRA撮像は可能であるが、動脈瘤描出は困難であること、が確認された。また、サル使用のための計画書作成と本学での実験遂行可能性の検討を行った。来年度は、ラット、白色ウサギ、カニクイザルを用いて脳動脈瘤モデルを作成し、MRトラッキング可能な因子の同定を行い、脳動脈瘤発生増大の形態的変化の過程と薬物による効果の検証を、おもに7T-MRにて画像追跡する予定である。本年度においては、1)サル脳動脈瘤モデルの解析システムの確立のための環境整備とMR撮像条件設定、2)新たなstatin製剤によるラット脳動脈瘤モデルでの効果判定と増大に関わる因子解析、3)ラット、マウスにおける7TMR撮像条件の設定、を行った。結果として、複数のstatin製剤により脳動脈瘤形成が抑制されること、ラットにおいてMRA撮像は可能であるが、動脈瘤描出は困難であること、サルにおいてはMRA撮像が可能であることを確認した。来年度は、ラット、白色ウサギ、カニクイザルを用いて脳動脈瘤モデルを作成し、経時的にMR撮像を行い、脳動脈瘤発生増大の形態的変化の過程と薬物による効果の検証を、7T-MRを用いて行う予定である。本年度においては、1)ラット脳動脈瘤破裂誘発モデルの開発とラビット・サル脳動脈瘤モデルの解析システムの確立、2)脳動脈瘤形成から破裂に至る各段階での脳動脈瘤壁内の細胞群における遺伝子発現、3)脳動脈瘤形成から破裂に至る各段階での脳動脈瘤壁におけるプロテオミクス解析を中心に進めた。ラット脳動脈瘤モデル(Hashimoto N et al Surg Neurol 10:3-8,1978)を用い、血行力学的ストレスを追加する、ないしは、炎症反応を惹起することにより破裂率を上昇させることを検討した。また、ラビット、サル脳動脈瘤誘発モデルにおいて、発生増大に関わる因子として、ラットモデルで重要性が証明されているマクロファージの浸潤につき画像化の可能性を検討した。

ラット、カニクイザルを用いて脳動脈瘤モデルを作成し、脳動脈瘤発生増大の形態的変化の過程を、おもに7T-MRにて画像追跡するが、昨年度において行ったラット、サルにおけるMR撮像条件の設定の再確認とMR trackingの至適条件の確立を行った。また、脳動脈瘤壁で特に破裂に至る過程で変動する遺伝子群を解析し、ラット脳動脈瘤摘出標本から抽出したたんぱく質を用いて発現解析を行った。本年度でラット、サルの7T-MRA撮像条件が確定し、特にサルにおいては脳動脈瘤作成前の撮像を終了した。現在、脳動脈瘤誘発処置を進行中である。さらにstatin製剤を投与後1ヶ月の採血データを収集し安全性を確認した。ラットにおいては、炎症抑制剤を投与し、脳動脈瘤発生・増大に及ぼす影響を分子生物学的および組織学的に検討した。結果として、ある種の抗炎症剤が炎症カスケードを有意に抑制し、かつ脳動脈瘤発生・増大を抑制することがわかった。
タンパク質多量体分子がタンパク質結晶の成長ならびに品質に及ぼす影響

本研究は、共有化合物多量体を含めた不純物タンパク質に注目し、これがどのようにタンパク質結晶に吸着し、成長に影響を与え、そして結晶内にとりこまれていくかというメカニズムを明らかとすることを目的とした。ターゲットとなるモデルタンパク質としては、現在最も高純度な試料が大量かつ安価に入手でき、かつ、共有結合多量体の存在が確認されているリゾチームを選択した。また、結晶表面への不純物の吸着、取りこみ過程の観察には原子間力顕微鏡を、結晶に取りこまれた分子の密度分布の測定については蛍光顕微鏡を用いた。その成果の具体的な概要は以下の通りである。(1)タンパク吸着観察システムの開発タンパク不純物分子が結晶表面に吸着する過程を、原子間力顕微鏡によって直接観察するための溶液交換システムを新たに構築することに成功した。(2)タンパク質吸着を左右する因子の検討上記のシステムを用いて、(不純物を含まない)リゾチーム分子が結晶表面に吸着する様子を観察し、リゾチームは、おおよそ4分子を基準として吸着すること、静電相互作用が重要な役割を果たすこと、等が示された。(3)不純物分子の結晶形状に及ぼす影響の分子レベルでの検討仮想多量体としてovotransferinを不純物として用い、蛍光顕微鏡及び原子間力顕微鏡により結晶中の不純物及び結晶表面の観察を行った結果、(110)面と比べ(101)面により不純物が多く吸着し、取りこまれることを明らかとした。さらに、結晶の形状の変化が、このような選択的吸着・取りこみによって説明できることを明らかとした。本年度は、原子間力顕微鏡(AFM)による、(1)多量体不純物の結晶表面への吸着、脱離過程の分子スケール観察、および、(2)結晶表面における成長ステップの移動速度(成長速度)の測定を中心として研究をおこなった。特に、従来中心に研究が行われていたリゾチームのTetragonal結晶に加え、25°C以上で安定とされるOrthorhombic結晶についてもAFM観察を行い、いくつかの新たな知見を得た。以下、その概略について記す。(1)共有結合多量体の吸着課程の観察Orthorhombic結晶についても、分子レベルでの高分解能AFM観察を行い、Tetragonal結晶同様に、多量体不純物の吸着を確認することに成功した。Orthorhombic結晶は主に(110)、(010)、(011)面という三種類というfacet面をもっているが、その中でも(110)面には不純物多量体が吸着しにくく、(010)面には吸着しやすいことが新たに確認された。また、不純物はステップ近傍ではなく、表面にほぼ均一に吸着していることが明らかとなった。これは多量体不純物が特別な構造をとっており、特定の種類のマクロボンド(数多くの水素結合をつくる接触部位)にのみ優先的に吸着することを示唆している(投稿準備中)。(2)成長ステップの観察Orthorhombic結晶の(110)(010)面について、らせん転位由来によるスパイラル成長、および二次元核形成による成長をそれぞれ確認し、そのステップの高さ及び移動速度を測定した。現段階では過飽和度の調整が十分ではないため、定量的な議論は困難であるが、不純物の効果によりステップ移動の異方性が強調されている可能性がある。本年度は、前年度の研究結果を踏まえ、比較的多くの研究例があるLysozyme Tetragonal(正方晶)結晶に加え、分子配列の異なるOrthorhombic(斜方晶)結晶に着目し、この系に対する多量体不純物取り込み過程のさらなる一般化を目指した。1.原子間力顕微鏡(AFM)による結晶表面ステップの観察Lysozyme Orthorhombic,Tetragonal両結晶の表面についてステップの高さ及び移動速度を測定し、その不純物による影響を吟味した。

また、ほぼ平衡に近い条件での二次元島の観察より、Orthorhombic結晶表面のステップエネルギーがマクロボンドモデルから予測される値と近いことが明らかとなった。また、この際、過飽和度を正確に制御しながら分子レベルでのAFM観察を可能とする温度制御ステージを新たに開発した。現在、このステージを用いて、より定量的なデータの収集を行っている。2.多量体不純物吸着メカニズムの検討疎水性・親水性の物質に対して変成していないLysozymeと共有結合多量体を形成したLysozymeにおいてどのように吸着特性が異なっているのかを原子間力顕微鏡及び、分光光度計にによる濃度変化の測定から検討することを試みた。現在、変成していないlysozymeについてその吸着現象を上記の方法で捕らえることに成功している(春の物理学会にて発表予定)。3.蛍光顕微鏡による不純物取りこみの定量化以前に測定されたTetragonal結晶に加え、Orthorhombic結晶についても測定を行い、この手法が応用可能であることを確認した。今後、上記の結果と対応させて定量測定を行う予定である。本年度は、さらなる展開として、不純物がどのように結晶にとりこまれていくかを明らかとするために、吸着過程を定量的に議論するシステムの開発を行った。さらに、異種タンパク質についてもこれまでと同様の実験を行い、結晶の外形と不純物取り込みとの相関を明らかとした。(1)原子間力顕微鏡(AFM)によるタンパク分子吸着過程観察法の開発疎水性・親水性の物質に対して、変成していないlysozymeと共有結合多量体を形成したlysozymeにおいてどのように吸着特性が異なっているのかを、AFM観察及び分光光度計にによる濃度変化の測定から捉えることを試みた。この目的のために溶液を交換しながらAFM観案することが可能なシステムを新たに開発し、これを用いてまず、変成していないlysozymeが雲母基板上に吸着する過程を調べた。この結果、濃度がごく薄い(未飽和な状態)においてもlysozymeが層状に吸着し、また、濃度に依存し、その厚さを不連続に変化させることが明らかとなった。また、この時の吸着速度、吸着量は溶液のpHに依存することから、lysozymeのもつ電荷と基板との静電的相互作用が重要な役割を果たしていることが示された。(2)異種タンパク不純物の取りこみ量と結晶外形の関係lysozymeよりやや大きなサイズをもつタンパク分子(ovotransferin)を不純物として用い、AFMによる不純物吸着過程の「その場」観察ならびに蛍光顕微鏡による不純物量の定量測定を行った。この結果、多量体不純物と同様に(101)面と(110)面では有意に取りこみ量が異なっており、また、これに伴って結晶の外形に変化が見られた。このような外形の変化は、結晶の成長速度が不純物により変化することによって説明することができる。