hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒアルロン酸を標的とした癌微小環境の制御による新規膵癌治療法の開発

平成29年に引き続き、ヒト膵癌細胞株を用いて培養細胞レベル、各種マウス膵癌モデルを用いた組織レベルでMUによるヒアルロン酸合成抑制の意義を明らかにした。当初の予定通り、1.各種細胞株におけるMUによるヒアルロン酸合成抑制の確認試験。2.組織レベルでのMUによるヒアルロン酸合成抑制の確認試験。3. MU投与下の、抗癌剤の膵癌細胞への移行に関する定量試験。4.間質減少の細胞障害性リンパ球の挙動の変化に関する検討。5. gemcitabine, nab-paclitaxelとMUとの併用効果に関する検討。6.CD44を介した細胞内シグナル伝達への影響に関する検討。7.膵癌幹細胞(CD44発現細胞)の増殖能への影響、MU併用抗癌剤投与による幹細胞制御に関する検討、の順に研究を進めており、4.までの研究成果を論文化した。本年度の研究成果は、膵癌間質内に浸潤するγδT-cells量が、MUにより増加し、その結果膵癌腫瘍増殖速度が低下することを明らかにした点である。昨年までの研究で、MUによるヒアルロン酸制御が抗がん剤の腫瘍内到達を高めて、抗腫瘍効果を示すことを明らかにしたが、今年度の研究では、MUによるヒアルロン酸制御によりより多くの細胞障害性リンパ球が腫瘍間質に浸潤し、抗腫瘍活性を高める可能性が示された。平成30年に引き続き、ヒト膵癌細胞株を用いて培養細胞レベル、各種マウス膵癌モデルを用いた組織レベルでMUによるヒアルロン酸合成抑制の意義を明らかにする。研究の最終年に当たることから、研究の全体像を俯瞰し、MUによるヒアルロン酸合成抑制の新規膵癌治療について提言する。具体的な検討項目は以下の通りである。1.各種細胞株におけるMUによるヒアルロン酸合成抑制の確認試験。7.膵癌幹細胞(CD44発現細胞)の増殖能への影響、MU併用抗癌剤投与による幹細胞制御に関する検討。本研究課題では、膵癌間質組織の主要構成成分であるヒアルロン酸を標的として、ヒアルロン酸合成阻害作用を持つ4-Methylumbelliferone (MU)による新規膵癌治療の開発を目的とし、平成28年度は、当初の研究実施計画に従って(1)膵癌細胞株に対するMUによるヒアルロン酸合成抑制の確認試験、(2)組織レベルでのMUによるヒアルロン酸合成抑制の確認試験、(3)CD44を介した細胞内シグナル伝達への影響に関する検討、を行い、以下の結果を得た。まず、MUがMIA-paca2, Capan-1等複数の分化度の異なる膵癌細胞株の細胞外マトリックス中ヒアルロン酸量を低下させ、電子顕微鏡観察で細胞外マトリックスの被薄化を確認した。さらに、MUが濃度依存的に腫瘍細胞の増殖速度を抑制することを明らかにした。その作用は細胞壁の破壊による細胞障害作用ではなく、アポトーシスの誘導によることも判明した( Oncol Lett. 2016 ;12:2337-2344.)。次に、MIA PaCa-2細胞株を用いて増殖能、遊走能、浸潤能を評価し、MUの存在下では、それぞれ26.4%, 14.7%, 22.7%.低下することを示した。さらにMUによるアポトーシス誘導を確認した。これらの変化においてMUはCD44発現やヒアルロン酸結合能に影響を与えていなかった。さらに膵癌細胞の免疫不全マウスへの移植実験で、MUがヒアルロン酸合成を抑制し、腫瘍移植マウスの生存期間を向上させることが判明した(Pancreas. 2017;46:190-197)。本研究課題では、当初(1)各種細胞株におけるMUによるヒアルロン酸合成阻害作用の確認、(2)組織レベルでのMUによるヒアルロン酸合成抑制の確認試験、(3)MU投与下の、抗癌剤の膵癌細胞への移行に関する定量試験、(4)間質減少の細胞障害性リンパ球の挙動の変化に関する検討、(5)gemcitabine, nab-paclitaxelとMUとの併用効果に関する検討、(6)CD44を介した細胞内シグナル伝達への影響に関する検討、(7)膵癌幹細胞(CD44発現細胞)の増殖能への影響、MU併用抗癌剤投与による幹細胞制御に関する検討、を主な検討項目とした。現時点で、(1)、(2)、(7)はすでに検討を終えている。なお、この間一時的に動物実験施設の稼働が停止したものの、現在は復旧し、今後設備環境面で問題はない。進捗状況としては予定通りである。成果は前述のごとく、3編の英文論文をまとめ、1編は投稿中である。4-methylumbelliferone(MU)によるヒアルロン酸(HA)合成抑制作用が膵癌の増殖・進展や薬物効果に及ぼす影響を検討する目的で、当初以下の4つの課題に取り組む予定とした。

1)膵癌細胞への抗がん剤移行がどのように変化するか、2)間質の減少に伴い免疫担当細胞による腫瘍制御がどのように変化するか、3)ヒアルロン酸の減少によりコラーゲンや線維芽細胞などの他のECMがどのように変化するか、4)CD44の発現やCD44を介した細胞シグナル伝達がどのように変化するか。平成29年度は昨年度の課題1)から2)に移行し、重点的に検討を行った。具体的には、4種のヒト膵癌細胞株を用いて、健常成人ドナーから採取した末梢血単核球分画から分離培養したガンマデルタT cell(以下T cell)を用いてHA合成抑制作用が免疫担当細胞の膵癌細胞に対する細胞障害性に与える影響について検討した。また、膵癌モデルマウスに対するMUおよびPBMC投与の効果を1)腫瘍体積の増大率、2)腫瘍組織のHA量、3)Tcell腫瘍浸潤数について検討した。結果、MU1.0mM添加培地で培養した膵癌細胞にT-cellを加えると、膵癌細胞の生存率は有意に低下した。腫瘍組織HAはMU投与群で有意に減少しており、PBMCおよびMU投与群で腫瘍体積は有意に減少していた。腫瘍組織のCD3免疫染色にて、MU投与群では腫瘍内へのγδTcell浸潤は有意に増加していた。以上から、MUはヒト膵癌細胞株の増殖とHA合成をin vitroおよびin vivoで抑制しγδTcellによる細胞障害性を増強した。MUは免疫担当細胞の抗腫瘍効果を増強することが期待された。当初予定した研究段階は以下のごとくである。1.各種細胞株におけるMUによるヒアルロン酸合成抑制の確認試験。2.組織レベルでのMUによるヒアルロン酸合成抑制の確認試験。3. MU投与下の、抗癌剤の膵癌細胞への移行に関する定量試験。4.間質減少の細胞障害性リンパ球の挙動の変化に関する検討。5.gemcitabine, nab-paclitaxelとMUとの併用効果に関する検討。6.CD44を介した細胞内シグナル伝達への影響に関する検討。7.膵癌幹細胞(CD44発現細胞)の増殖能への影響、MU併用抗癌剤投与による幹細胞制御に関する検討。このうち平成28年度は1-3を実施し、平成29年度は1-3の追試に加えて4を重点的に行い、一定の成果を得た。平成29年に引き続き、ヒト膵癌細胞株を用いて培養細胞レベル、各種マウス膵癌モデルを用いた組織レベルでMUによるヒアルロン酸合成抑制の意義を明らかにした。当初の予定通り、1.各種細胞株におけるMUによるヒアルロン酸合成抑制の確認試験。5. gemcitabine, nab-paclitaxelとMUとの併用効果に関する検討。7.膵癌幹細胞(CD44発現細胞)の増殖能への影響、MU併用抗癌剤投与による幹細胞制御に関する検討、の順に研究を進めており、4.までの研究成果を論文化した。本年度の研究成果は、膵癌間質内に浸潤するγδT-cells量が、MUにより増加し、その結果膵癌腫瘍増殖速度が低下することを明らかにした点である。昨年までの研究で、MUによるヒアルロン酸制御が抗がん剤の腫瘍内到達を高めて、抗腫瘍効果を示すことを明らかにしたが、今年度の研究では、MUによるヒアルロン酸制御によりより多くの細胞障害性リンパ球が腫瘍間質に浸潤し、抗腫瘍活性を高める可能性が示された。現在は上記(4)「間質減少の細胞障害性リンパ球の挙動の変化に関する検討」に取り組んでいる。
受動型ワイヤレスセンサを集合した高機能センサシステムに関する研究

受動型ワイヤレスセンサを集合した高機能センサシステムの実現に向けて、本年度は主として、複数の中継トランスポンダ間における通信プロトコル、高周波における回路技術設計、および、デジタル信号処理に関しての検討を行なった。まず、昨年度の検討で作製した近距離多機能無線中継用プラットフォームを利用し、中長期の無線中継試験を行なった。その結果、6ノードによる情報収集およびデータ中継を、市販単3アルカリ電池を使用することで、最長一ヶ月以上にわたり運用可能な、極めて消費電力の小さい多機能無線中継機が実現可能であることを確認した。なお、この試験結果をもとに推定したところ、更なる最適化により、市販アルカリ電池使用で半年程度の運用が可能であることをあきらかにした。次に、末端センサからデータ収集を行なうための送信装置の効率化について、特に、高周波回路技術の検討を行なった。この中で、反射による増幅器への影響を軽減する手法について検討を行ない、90°ハイブリッドを利用した反射抑圧手法について提案した。また、収集データのデジタル信号処理についても検討を行った。センサ収集データを利用する上で、必要に応じ、高度なデジタル信号処理をすることがある。そこで、本年度はディジタルシグナルプロセッサ(DSP)を用いた信号処理技術を導入するための準備を行なった。以上の検討により、本年度はワイヤレスセンサネットワークの構築、および、データ収集装置の開発で必要となる技術について新たな知見を得た。受動型ワイヤレスセンサを集合した高機能センサシステム実現に向けて、主として無線トランスポンダの回路設計ならびにその実装についての検討を行った。まず、中継用トランスポンダ開発のためのプラットフォームを設計・試作した。この結果、極めて低消費電力な近距離多機能無線中継用プラットフォームの作製に成功した。これにより、このプラットフォーム使用を前提としてのワイヤレスセンサシステム構築に関する研究が可能となった。なお、ここで作製した無線中継用プラットフォームは、ワンチップマイコンを用いたことで容易に仕様変更可能となっており、さまざまな無線中継アプリケーションに対し柔軟に対応することが可能となっている。したがって、これら応用についても、検討を行っていく予定である。さらに、この検討で得られた回路技術を応用し、光ファイバリング干渉計を利用した振動検知センサにおけるパルス分離装置やSAWの伝搬可視化における高速測定システムの構築も行った。次に、再現性の良いBAWワイヤレスセンサユニットの構造について検討を行った。具体的には、従来のセンサ構造を見直し、基板裏面の反射抑制層として、金属紛を混合した樹脂を塗布する方法を詳細に検討した。数値シミュレーションの結果、適切な混合比の樹脂を用いることで、容易にBAWセンサの構成が可能であることが確認され、今後、この技術を利用したセンサ構成を実現する予定である。また、本年度は、周波数挿引型トランシーバの初段で利用することを想定し、超広帯域なSAWフィルタについての検討も行った。これにより、高周波における超広帯域フィルタの構成や、設計方法についての知見が得られた。以上の成果を踏まえ、引続き受動型ワイヤレスセンサを集合した高機能センサシステム実現に向けた検討を行う予定である。
虚偽自白発生防止を重視した被疑者面接技法の開発

本研究では虚偽自白防止機能を組み込んだ被疑者面接技法の開発を試みた。日本の被疑者面接事例のコミュニケーションのプロセスを分析し、(1)取調官がもつ仮説の検証を志向する「ストーリー駆動型コミュニケーション」、(2)出来事の詳細部や背景情報の重視する「物語的真実への志向」、(3)「パターナルな倫理的態度」という特徴を見出した。これらをふまえ、虚偽自白発生の危険因子である(1)を除去した新たな被疑者面接技法を提案した。平成23年度は(1)複数の自白事例(取り調べ事例)を収集し、そこにみられる取り調べコミュニケーションの問題点を抽出する作業、(2)サセックス警察(イギリス)における取り調べ実務とトレーニングに関する聞き取り調査。および(3)ハワイ州警察(アメリカ)における取り調べ実務の聞き取り調査を実施した。(1)については足利事件における検察官取り調べの録音テープ反訳等、研究代表者および研究分担者が過去に鑑定等で関与した事件からのデータおよび今回新たに入手した取り調べ記録データの検討を行った。新データの収集においては取り調べの問題点が表面化しやすいことから知的障害者を対象とした取り調べの記録を主に収集した。その結果、質問話法や構造化など基本的な取り調べ技術の不十分さ、犯罪の構成要件の構造を過度に反映した質問項目の設定による混乱、犯行意図にかかわる質問への応答の困難、被疑者の供述特性に応じた対応の不十分さ、といった問題が生じていることが明らかになった。(2)については、被疑者取り調べについて先端的な取り組みを行っているイギリスの取り調べ技術(PEACE)の具体的内容とそれを用いた実際の取り調べの状況、取り調べ担当者のトレーニングシステム、取り調べをめぐる制度改革の経緯と現状について有用な情報を得ることができた。(3)についても、イギリスとは異なる取り調べ技術(Reidテクニック)が使用されているアメリカにおける取り調べ実務の問題点について情報を得ることができた。(2)(3)で得られた情報を(1)における日本の取り調べ実務の問題点と対照することによって、来年度以降、日本の捜査実務において有効に機能する取り調べ技法を開発していくための検討事項が複数が得られるものと期待できる。平成25年度はまずイギリス、アメリカ、および日本の取調べ技法の比較検討を行い。日本の取調べ実務におけるコミュニケーションの構造的特性と、そこに作用する自白圧力の特性の解明に向けた研究を行った。3カ国の取調べの特性を確証/実証(取調官の仮説と合致する情報の収集/被疑者の供述を通して犯行体験の有無を確認)、反省/情報(被疑者から反省の弁を得ることを重視する/被疑者から事件についての説明を得ることを重視する)という2次元で整理したところ、日本における冤罪など重大な問題のある取調べは確証と反省が重視されている傾向があることが確認された。また比較的適切と評価できる取調べの場合は、情報収集を重視しつつ取調べの過程で確証から実証への移行がみられることが見出された。このうち確証が重視される傾向はアメリカのREIDテクニックにもみられた。しかし反省を重視する傾向についてはイギリス、アメリカの取調べでは確認できなかった。以上の分析を通して見出された日本の取調べにおける反省を重視するという特異的な傾向は、取調べの過程で被疑者に不必要な圧力をかけることに結びつく危険性があることから、なんらかの是正的な対応が必要となると考えられる。しかし、予備的に実施した文化心理学的な検討によれば、日本の捜査や裁判においては被疑者・被告人による反省と供述の信用性を不可分に結びつけて捉える強い文化的傾向性があり、その是正は容易ではない可能性が示唆されている。したがって日本において有効に機能する取調べ技法を提案する場合には、反省をめぐる文化的信念の解明と、それに対する対処方策の検討が不可欠となると予想される。平成26年度は、この点についてさらに実証データの収集を含めて検討を深めていく予定である。本研究の目的は虚偽自白防止機能を組み込んだ被疑者面接技法を法心理学の知見と手法を用いて開発することにある。平成26年度は日本の捜査実務において有効に機能する虚偽自白防止機能を組み込んだ被疑者面接技法のデザインの基礎となる日本型取調べの諸特性(コミュニケーション特性および文化的特性)の詳細な解明と、それに基づく被疑者面接技法の全体デザインの検討に取り組んだ。前者に関しては、日本型取調べにおいては(1)被疑者の心理状態についての理解の明示またはほのめかし、(2)被疑者の心理状態の代弁、(3)被疑者の心情等への配慮、(4)被疑者への倫理的態度の要求など、取調官が事件の出来事情報だけではなく被疑者の内的状態に積極的に関与する傾向(人物志向型コミュニケーション)が見られることが確認された。また被疑者から情報を収集することを通して事件の構図や詳細を明らかにしていくのではなく、捜査側があらかじめ事件の構図や詳細についての仮説を用意し、それと供述の一致、不一致を確認する傾向(確証型コミュニケーション)も確認された。これらの研究成果は法と心理学会第15回大会等で発表した。これらの分析結果をふまえ被疑者面接技法の全体デザインを決定した。人物志向型コミュニケーションと確証型コミュニケーションはどちらも日本の取調べにおける虚偽自白発生の大きな原因であると考えられるので、これらを適切に抑止するコミュニケーション・デザインが不可欠である。そこで人物志向型コミュニケーションについては、事件に関する客観的情報を収集するフェーズと、動機なども含めた被疑者の心情等について聴取するフェーズを明確に区分する段階法を採用することとした。

確証型コミュニケーションについては、オープン・クエスチョンを適切に用いて犯行体験の聞き取りを行うイギリス型の供述聴取技法を援用することが可能であると判断された。本研究では虚偽自白防止機能を組み込んだ被疑者面接技法の開発を試みた。開発にあたっては、日本の司法システムや捜査実務において実用的に機能することを重視した。まず先行技法のコミュニケーション構造を検討した。その結果、被疑者由来情報を基盤にしてコミュニケーションを構造化する「情報駆動型」のPEACEモデルが、虚偽自白と真犯人による嘘への対処を同時に可能にしている点で優れた技法であることが確認された。次に日本の被疑者面接の問題点を明らかにするために、問題のある被疑者面接事例におけるコミュニケーション構造とそれらの制度的、実践的文脈を検討した。その結果、(1)取り調べる側の仮説を基盤にして展開する「ストーリー駆動型」のコミュニケーション、(2)物語的真実(narrative truth)の重視、(3)パターナルな倫理的態度という特徴が見出された。これらの成果をふまえ、自白への転回過程で虚偽自白発生の危険因子である(1)を除去して情報駆動型の面接を実施し、自白の内容展開過程の前半部で開かれた質問を用いて事情を聴取したのち、後半部にオプションとして(2)と(3)を無害なかたちで位置づける技法が提案された。日本の被疑者面接事例のコミュニケーションのプロセスを分析し、(1)取調官がもつ仮説の検証を志向する「ストーリー駆動型コミュニケーション」、(2)出来事の詳細部や背景情報の重視する「物語的真実への志向」、(3)「パターナルな倫理的態度」という特徴を見出した。これらをふまえ、虚偽自白発生の危険因子である(1)を除去した新たな被疑者面接技法を提案した。本年度は「日本型取調べ」の特性をより明確に把握するために、イギリスで開発された被疑者取調べ技法であるPEACEアプローチと、アメリカで提案されているReidテクニックとの比較検討を中心に研究を進めた。日本型取調べについては、複数の取調べ場面の録画記録および逐語記録の分析を通して、尋問者がコミュニケーションのフレームを明示しないまま会話を展開し、被疑者を自白に導く「仄めかし型」の取調べという特徴を持つ可能性が高いことが見出された。さらに、この仮説を精緻化していくために、PEACEおよびReidテクニックの特徴を検討し比較を行った。その結果、PEACEアプローチでは被疑者を自白に導くことではなく、被疑者の釈明を十分に聞き取り、そこに証拠との齟齬や論理的な矛楯があれば、さらなる釈明を求めるという枠組みをもつことが確認された。また日本型取調べとは異なり取調べの冒頭でコミュニケーションのフレーム(被疑者の釈明の聞き取り)が尋問者によって明示され、以降のコミュニケーションがそれに強く拘束されていることも明らかになった。
動脈硬化症診断のための超音波高精度血管動態計測法の開発

本年度は,本研究プロジェクト初年度として,研究開発内容の詳細について海外共同研究者と打ち合わせを行うとともに,日本側研究代表者および研究分担者が海外共同研究者の研究室(スウェーデンルンド大学)を訪問しキックオフミーティングを開催し,相互の研究内容や研究環境について情報交換を行った.本年度の研究開発内容として,今後血管壁や血流の動態を計測するために必須となる計測対象の移動変位・速度の推定法に関する検討を進め,従来主に変位・速度推定法として用いられているスペックルトラッキング法の精度を向上させる方法を開発した.本研究では,超高速超音波イメージングにより得られる毎秒数千枚の超音波断層像を処理する必要があるため,計算効率も考慮する必要がある.日本側研究グループ,海外共同研究者グループともに,受信超音波信号の位相や周波数を用いた変位・速度推定法の開発を行っているため,今後は双方の手法の特性を詳細に検討し,最適な手法を開発する.また,本研究では血管壁長軸方向変位・ひずみや血流により血管壁内腔境界に生じるずり応力,動脈壁を養う微小血管vasa vasorumの描出などを目的としているため,それら計測法の評価を行うためのファントムの製作方法について検討を開始した.血管壁のように変形を発生させる必要があるため,適切な弾性を有する材料や,その材料を用いたファントム作成方法に関する情報交換を行った.血流により発生するずり応力を,様々な血管形状について実験的に検討することは困難であるため,流体シミュレーション等も活用することとした.動脈壁を養う微小血管vasa vasorumの描出法については,vasa vasorumは直径0.1 mm以下と微小であることから,それを模擬するファントムの製作方法を今後研究開発することとした.本研究において必須となる,超音波信号を用いた計測対象の移動変位・速度の推定方法に関する新たな知見を既に得ており,また,本研究における各種計測・イメージング法の評価に必要なファントムについても既に検討を開始しており,おおむね順調に進展していると言える.これまで血管壁移動変位・速度の推定に用いていたスペックルトラッキング法は,2枚の超音波断層像の類似度関数を算出して変位量を決定するため,類似度関数の離散算出間隔,つまり超音波断層像のピクセル分解能以下の変位を推定するためには補間が必要であり,計算負荷は大きい.特に本研究で使用する超高速超音波イメージングでは秒間数千枚の断層像を処理する必要があるため,計算効率の向上が必要である.日本側研究グループ,海外共同研究者グループともに,超音波信号の位相や周波数を用いた,補間を要しない変位・速度推定法の開発を進めているため,今後はそれら手法の特性の検討,精度等の比較などを行い,最適な手法を開発する.また,日本側研究グループ,海外共同研究者グループそれぞれが所有する超音波計測システムの仕様について確認し,相違点も明らかとなったため,それら仕様のもとで同様な超高速超音波イメージングを実現できる送受信シーケンス,ビームフォーミング法について日本側研究グループが検討を行う.海外共同研究者グループは血管壁長軸方向変位・ひずみおよび動脈壁を養う微小血管vasa vasorumを模擬するファントムの製作方法について検討を進める.日本側研究グループが検討を行う超高速イメージングを,海外共同研究者グループが所有する超音波計測システムに実装し,海外共同研究者グループが製作するファントムのテストを行うため,日本側研究グループが海外共同研究者グループに滞在して共同で実験を行う.また,日本側研究グループは構造力学,流体力学に基づく血管壁および血流のシミュレーション環境の構築を進める.本年度は,本研究プロジェクト初年度として,研究開発内容の詳細について海外共同研究者と打ち合わせを行うとともに,日本側研究代表者および研究分担者が海外共同研究者の研究室(スウェーデンルンド大学)を訪問しキックオフミーティングを開催し,相互の研究内容や研究環境について情報交換を行った.本年度の研究開発内容として,今後血管壁や血流の動態を計測するために必須となる計測対象の移動変位・速度の推定法に関する検討を進め,従来主に変位・速度推定法として用いられているスペックルトラッキング法の精度を向上させる方法を開発した.本研究では,超高速超音波イメージングにより得られる毎秒数千枚の超音波断層像を処理する必要があるため,計算効率も考慮する必要がある.日本側研究グループ,海外共同研究者グループともに,受信超音波信号の位相や周波数を用いた変位・速度推定法の開発を行っているため,今後は双方の手法の特性を詳細に検討し,最適な手法を開発する.また,本研究では血管壁長軸方向変位・ひずみや血流により血管壁内腔境界に生じるずり応力,動脈壁を養う微小血管vasa vasorumの描出などを目的としているため,それら計測法の評価を行うためのファントムの製作方法について検討を開始した.血管壁のように変形を発生させる必要があるため,適切な弾性を有する材料や,その材料を用いたファントム作成方法に関する情報交換を行った.血流により発生するずり応力を,様々な血管形状について実験的に検討することは困難であるため,流体シミュレーション等も活用することとした.動脈壁を養う微小血管vasa vasorumの描出法については,vasa vasorumは直径0.1 mm以下と微小であることから,それを模擬するファントムの製作方法を今後研究開発することとした.本研究において必須となる,超音波信号を用いた計測対象の移動変位・速度の推定方法に関する新たな知見を既に得ており,また,本研究における各種計測・イメージング法の評価に必要なファントムについても既に検討を開始しており,おおむね順調に進展していると言える.

これまで血管壁移動変位・速度の推定に用いていたスペックルトラッキング法は,2枚の超音波断層像の類似度関数を算出して変位量を決定するため,類似度関数の離散算出間隔,つまり超音波断層像のピクセル分解能以下の変位を推定するためには補間が必要であり,計算負荷は大きい.特に本研究で使用する超高速超音波イメージングでは秒間数千枚の断層像を処理する必要があるため,計算効率の向上が必要である.日本側研究グループ,海外共同研究者グループともに,超音波信号の位相や周波数を用いた,補間を要しない変位・速度推定法の開発を進めているため,今後はそれら手法の特性の検討,精度等の比較などを行い,最適な手法を開発する.また,日本側研究グループ,海外共同研究者グループそれぞれが所有する超音波計測システムの仕様について確認し,相違点も明らかとなったため,それら仕様のもとで同様な超高速超音波イメージングを実現できる送受信シーケンス,ビームフォーミング法について日本側研究グループが検討を行う.海外共同研究者グループは血管壁長軸方向変位・ひずみおよび動脈壁を養う微小血管vasa vasorumを模擬するファントムの製作方法について検討を進める.日本側研究グループが検討を行う超高速イメージングを,海外共同研究者グループが所有する超音波計測システムに実装し,海外共同研究者グループが製作するファントムのテストを行うため,日本側研究グループが海外共同研究者グループに滞在して共同で実験を行う.また,日本側研究グループは構造力学,流体力学に基づく血管壁および血流のシミュレーション環境の構築を進める.
微生物のアルドキシム-ニトリル経路の発見と酵素的ニトリル合成への利用

本研究の開始にあたって(1)天然界のニトリルはどこから来たのか?(2)酵素的にニトリルを合成できるか?を明らかにする計画を立てた。すでに、(1)については、Bacillus sp. OxB-1株において、アルドキシム・デヒドラターゼとニトリラーゼが連関して存在することを明らかにしている。(2)については、新酵素アルドキシム・デヒドラターゼを用いて定量なニトリル合成に世界で初めて成功している。今回、さらに(1)についてニトリル・ヒドラターゼやアミダーゼ等との遺伝子的な連関を明らかにする。アルドキシム・デヒドラターゼ、ニトリル・ヒドラターゼおよびアミダーゼあるいはニトリラーゼという代謝と遺伝子の関係を明らかにした。特に、アルドキシム・デヒドラターゼ欠損株では、その代謝の上流にどのような前駆体や酵素が存在するかについて探索した。(1)アルドキシム・デヒドラターゼの構造の解明と連関する酵素群の構造の解明:Bacillus sp. OxB-1株等のゲノムライブラリーより、本酵素遺伝子(oxd)を単離し、大腸菌等において大量発現させた。遺伝子上において、アルドキシム脱水酵素とニトリルヒドラターゼやアミダーゼ等のニトリル分解酵素が連関して存在することを明らかにした。(2)ニトリル生合成経路の解明とニトリル発酵:アルドキシムを生合成する経路は、全く不分明である。その酵素活性を見いだし、続いて酵素化学的諸性質を明らかにする。安価な基質から、微生物を用いるニトリル発酵の可能性を探る。一方、アルドキシム・デヒドラターゼを大量に精製する手法を開発した。(3)植物のP450を用いるニトリル合成:一方、デンマークのHalkier教授らは、植物において、L-フェニルアラニンからα-ヒドロキシフェニルアセトアルドキシムを生成するP450様酵素遺伝子の一次構造を報告している。Halkier教授に微生物のアルドキシム・デヒドラターゼ遺伝子を送付し、アラビドプシス等において遺伝子導入を開始した。ニトリル・ヒドラターゼやニトリラーゼ等の加水分解酵素は産業上の有用性ばかりが強調されてきたが、アルドキシム脱水酵素と連関して存在する意義を明らかにした。(1)新酵素アルドキシム・デヒドラターゼの分布:土壌からアルドキシム分解菌Bacillus sp.OxB-1株、Rhodococcus sp.YH3-3、およびRhodococcus sp.等を単離し、アルドキシム・デヒドラターゼの分布を明らかにした。(2)アルドキシム・デヒドラターゼの構造の解明と連関する酵素群の構造の解明:微生物界において、アルドキシム・デヒドラターゼのニトリル・ヒドラターゼ等のニトリル加水分解酵素は連関して存在することを明らかにした。すなわち、アルドキシム分解菌は、ニトリル加水分解酵素活性を持ち、ニトリル分解菌は、アルドキシム・デヒドラターゼ活性を持つことを明らかにした。Bacillus sp.においては、酵素活性レベルのみならず、遺伝子上でもこれらの遺伝子が連関していることを明らかにした。

(3)アルドキシム・デヒドラターゼを用いるニトリル化合物の合成:Rhodococcus sp.YH3-3および大腸菌形質転換株を用いて、最適条件下で各種のアリールおよびアルキルアルドキシムを基質として、良好な収率で対応するニトリルを合成した。(4)アルドキシム・デヒドラターゼの酵素化学的諸性質の解明:土壌より分離したRhodococcus sp.等において、培地の炭素源および有機窒素源等の培地成分や合成化合物等の添加による酵素の誘導条件を明らかにした。(5)アルドキシム・ニトリル経路の解明:Rhodococcus sp.YH3-3よりニトリル・ヒドラターゼを高度に精製し、酵素化学的諸性質を明らかにした。ニトリル・ヒドラターゼやニトリラーゼ等のニトリル加水分解酵素は産業上の有用性ばかりが強調されてきたが、本研究の開始にあたって(1)天然界のニトリルはどこから来たのか?(2)酵素的にニトリルを合成できるか?を明らかにする計画を立てた。(1)については、Bacillus sp. OxB-1株において、アルドキシム・デヒドラターゼとニトリラーゼが連関して存在することを明らかにした。(2)については、新酵素アルドキシム・デヒドラターゼを用いて定量なニトリル合成に世界で初めて成功した。(1)新酵素アルドキシム・デヒドラターゼの分布:土壌からアルドキシム分解菌Bacillus sp. OxB-1株、Rhodococcus sp. YH3-3、およびRhodococcus sp.等を単離し、アルドキシム・デヒドラターゼの分布を明らかにした。(2)アルドキシム・デヒドラターゼの構造の解明と連関する酵素群の構造の解明:微生物界において、アルドキシム・デヒドラターゼのニトリル・ヒドラターゼ等のニトリル加水分解酵素は連関して存在することを明らかにした。すなわち、アルドキシム分解菌は、ニトリル加水分解酵素活性を持ち、ニトリル分解菌は、アルドキシム・デヒドラターゼ活性を持つことを明らかにした。Bacillus sp.においては、酵素活性レベルのみならず、遺伝子上でもこれらの遺伝子が連関していることを明らかにした。(3)アルドキシム・デヒドラターゼを用いるニトリル化合物の合成:Rhodococcus sp. YH3-3および大腸菌形質転換株を用いて、最適条件下で各種のアリールおよびアルキルアルドキシムを基質として、良好な収率で対応するニトリルを合成した。(5)アルドキシム・ニトリル経路の解明:Rhodococcus sp. YH3-3よりニトリル・ヒドラターゼを高度に精製し、酵素化学的諸性質を明らかにした。
農耕地生態系の潜在的物質循環ポテンシャルを可視化する

微生物生態系のメタゲノム情報から農耕地・森林土壌の物質循環能を可視化するため、熊本、東京、山形の各都県6箇所で3回ずつ採取された18農耕地サンプル及び北海道から沖縄に至る人工林20、天然林20の土壌サンプル(計40)のメタゲノム解析をMAPLEシステムを用いて行った。約730種類のKEGGモジュールに対する充足率、アバンダンスに基づく代謝機能、リボソームタンパク質に基づく菌叢組成を用いて非計量多次元尺度構成法(NMDS)を用いて解析した結果、菌叢、機能アバンダンスとも水田と畑地が有意な検定結果をもって差別化され、人工林と天然林の代謝機能、菌叢組成は土壌pHと相関することがわかった。物質循環プロセスが微生物の多彩な代謝系によって駆動されていることに着目し、微生物群集のメタゲノム情報から見える生態系の多様な物質循環能を独自に開発した生理・代謝ポテンシャル評価システム、MAPLEを用いて網羅的に可視化することが、本研究課題である“農耕地生態系の潜在的物質循環ポテンシャルを可視化する"の、大きな目的の一つである。平成28年度は、まず、解析に用いる土壌サンプルの選定とDNA抽出を行なった。熊本、東京、山形の各都県6箇所で3回ずつ採取された18サンプルのメタゲノム配列決定を行った。配列決定は、Illumina HiSeqを用いて行い各サンプルから300万配列以上の400 base以上の配列を産出することができた。現在、産出された塩基配列から遺伝子領域の抽出作業とアミノ酸配列への変換作業中である。これとは別に、メタゲノム配列に基づく生理・代謝機能の解析に用いるMAPLEシステムの高速化をはかるため、これまでのBLASTに替わる検索エンジンであるGhost Xを用いた解析を検討し、MAPLEシステムの最初のステップである遺伝子のホモジー検索にかかる時間を1/10程度短縮することができた。また、システム全体にかかる計算時間としては1/3程度にまで短縮可能であることが分かった。本研究課題は、7月中旬に採択が決定し、実質9月からのスタートとなったが、平成27年末までに選定された農耕地土壌サンプルの一部ではあるが、水田、畑を中心に18サンプルのメタゲノムDNA抽出、配列決定を行い、MAPLEシステムでの解析に必要な400 base以上の塩基配列を各サンプルから300万以上得ることができた。また、これとは別に、できるだけ数多くのメタゲノム配列の解析を迅速に行うため、解析に用いるMAPLEシステムの高速化を図った。今後詳細な検討が必要ではあるが、従来の1/3程度にまで解析時間の短縮が見込まれた。平成28年度は、27年度に山形、東京、熊本の水田、畑地、各3地点から採取した土壌のメタゲノム配列(全18サンプル)各300万リードをMAPLEシステムに供試し、約730種類のKEGG機能モジュールに対する充足率、アバンダンス、リボソームタンパク質に基づく菌叢組成などを算出した。このうち、菌叢の組成比と完成モジュールのアバンダンスをもとにそれぞれ、非計量多次元尺度構成法(NMDS)を用いて統計解析を行った。その結果、菌叢、モジュールアバンダンスとも水田と畑地が有意な検定結果をもって差別化され、水田と畑の菌叢とモジュールアバンダンスには明らかな違いがあることが分かった。また、水田は、環境要因のアンモニアと畑地は硝酸の濃度と相関が強いこともわかった。地域性については、水田、畑地を問わず東京と熊本は菌叢、モジュールアバンスのパターンが極めて類似しているのに対し、山形では大きく異なることがわかった。これとは別に機能アバンダンスに基づき正準相関分析(CCA)を行ったところ、その傾向はNMDSと同様に水田と畑地は明確に差別化され、地域性についても山形が他の2地点と比べ明らかに異なる傾向を示した。CCA解析では、畑地と相関が強い機能として酸性を感知する2生物制御系、セロビオース輸送システム、イノシン一リン酸塩の合成などが、水田と相関が強い機能として、リン酸塩輸送システム、C10-C20イソプレノイド合成などが示唆された。平成28年度は、27年度までに配列決定がなされた18サンプルのMAPLEシステムによる解析を予定していたが、これまで、MAPLEによる解析が終了し、これらの結果に基づく非計量多次元尺度構成法や正準相関分析法による解析を行い、水田と畑に明らかに違いがあることを明らかにした。また、全国各地から集めた天然林土壌20サンプル、人工林土壌19サンプルおよび牧草地1サンプルからDNAを抽出し、HiSeq 2500を用いてMAPLシステムでの解析に必要な400 base以上の塩基配列を各サンプルから300万配列得ることができた。さらに、MAPLEシステムを一部改良し、モジュールアバンダンスの表示方法をこれまでの最高値から、合計値に変えることでその後の解析の解釈を容易にすることができた。さらに、MAPLEの結果をグラフ化するソフトも開発し、解析にかかる時間が軽減された。物質循環プロセスが微生物の多彩な代謝能によって駆動されていることに着目し、微生物生態系のメタゲノム情報から農耕地・森林土壌の物質循環能を可視化することが、本研究課題の目的である。まず、熊本、東京、山形の各都県6箇所で3回ずつ採取された18土壌サンプルからメタゲノム解析用のDNA抽出、配列決定を行い、得られた300万配列を独自に開発した生理・代謝機能評価システム(MAPLE)に供試した。

これにより得られた約730種類のKEGGモジュールに対する充足率、アバンダンス、リボソームタンパク質に基づく菌叢組成等をもとに非計量多次元尺度構成法(NMDS)を用いて解析した。その結果、菌叢、アバンダンスとも水田と畑地が有意な検定結果をもって差別化された。また、水田はアンモニアと畑地は硝酸濃度と強い相関を示し、東京と熊本は水田、畑地を問わず菌叢、アバンスのパターンが極めて類似していた。また、アバンダンスに基づく正準相関分析では、酸性を感知する2生物制御系、セロビオース輸送システム、イノシン一リン酸塩の合成等が畑地との相関が強く、リン酸塩輸送システム、C10-C20イソプレノイド合成などが水田との強い相関を示した。次に、北海道から沖縄に至る人工林20、天然林20サンプル(計40)のメタゲノム配列を農耕地土壌と同様に解析したところ、バクテリアの菌叢は主にProteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria、Firmicutes門に属する菌種によって構成され、菌叢組成は土壌のpHと相関を示した。また、天然林の土壌は低pH、人工林は高pHの傾向があり、NMDSによる統計解析の結果からも支持された。また、MAPLEで得られた各モジュールアバンダンスに基づくNMDS解析でも菌叢組成と同様に土壌pHとの相関が支持され、低pHは天然林、高pHは人工林という傾向を示した。微生物生態系のメタゲノム情報から農耕地・森林土壌の物質循環能を可視化するため、熊本、東京、山形の各都県6箇所で3回ずつ採取された18農耕地サンプル及び北海道から沖縄に至る人工林20、天然林20の土壌サンプル(計40)のメタゲノム解析をMAPLEシステムを用いて行った。約730種類のKEGGモジュールに対する充足率、アバンダンスに基づく代謝機能、リボソームタンパク質に基づく菌叢組成を用いて非計量多次元尺度構成法(NMDS)を用いて解析した結果、菌叢、機能アバンダンスとも水田と畑地が有意な検定結果をもって差別化され、人工林と天然林の代謝機能、菌叢組成は土壌pHと相関することがわかった。平成28年度は、平成27年度までに配列決定がなされた18サンプルのMAPLEシステムによる解析を行う。これにより、熊本、東京、山形の各都県の水田、畑地の特徴、傾向などを、KEGG機能モジュールの充足率%、モジュールのabundance (存在度)、モジュールを充足する生物種の内訳などから詳細に検討する。また、この結果をもとに更なる解析に用いる、農耕地、森林土壌等を選定し、DNA抽出、メタゲノム配列決定を行い、先と同様にMAPLEによる解析を行う。平成29年度は、28年度までに配列決定された人工林、天然林と牧草地由来の土壌40サンプルの塩基配列各300万リードをMAPLEに供試し、昨年度の水田、畑の場合と同様に、リボソームタンパク質に基づく菌叢組成、モジュールの充足率、アバンダンスを算出し、非計量多次元尺度構成法や正準相関分析などを行って、人工林、天然林、及び牧草地の特徴付けを行い、それぞれの土壌に特徴的な生物種や機能などをハイライトする。また、人工林、天然林の地域性による生物種の違いや相関する機能の違いを明らかにし、環境要因との相関を考察する。
ナノ結晶、ナノワイヤへの機能性不純物ドーピングと新物性

Siナノワイヤ(SiNWs)、およびその基本構造のSiナノ結晶(SiNCs)に関し、(1)問題となるダングリング・ボンド型界面欠陥の水素、重水素による制御の開発研究と(2)その手法を使用し、機能性不純物ドープされたSiナノ構造に特有の新物性発現について研究を進めた。これにより、SiNWsへのドーピング、酸化に伴う偏析挙動とSiNCsの新物性(光学的、磁気的)の可能性、およびそれらの最大固溶度について明らかにした。主に、機能性を示すドナー及びアクセプター不純物をSi系ナノ構造体(Siナノ結晶(SiNCs)及びSiナノワイヤ(SiNWs)に対してドーピングを試み、その中のキャリアー数を決定する活性不純物の状態とその界面での欠陥の制御効果を明らかにする実験的研究を行った。特に、問題となるSi/SiO_2界面のダングリング・ボンド型界面欠陥の水素、重水素によるパッシベーション制御を試み、その効果を調べ、最適手法を開発研究した。SiNWsの作製はレーザーアブレーションで行い、SiNCsはRFスパッタ法によりSiリッチのSiO_X膜から高温アニールによりSiO_2中に埋め込まれた高密度なSiNCsを作製した。そのナノ構造体にイオン注入で不純物ドープした、まずアニールによって電気的に活性化を行い、ドープした不純物の評価を行い、次いで水素原子処理によりその系に含まれる欠陥の水素パッシベーション効果を行い、同様にラマン散乱、光ルミネッセンス(PL)と電子スピン共鳴(ESR)測定で調べた。その結果、第一にSiNCsへのPイオン注入によりPL強度が低注入量では増加し、注入量が増加するに伴いAuger効果によりPL強度が減少していくことが明らかになった。この現象は界面欠陥の水素パッシベーションを行うことにより得られた結果である。第二にSiNCsにドープされたPドナーおよび擬伝導電子について低温ESR測定でしらべ、常磁性帯磁率に対応するESR強度がドープしたP濃度に依存しないことが見出された。これも、水素パッシベーションした試料で初めて判明したことである。SiNWsについてのドーピングと電気的活性についてさらに研究を進めている。機能性を示すPドナー及びBアクセプター不純物をSi系ナノ構造体であるSiナノ結晶(SiNCs)及びSiナノワイヤ(SiNWs)に対して成長時ドーピングとイオン注入法によるドーピングを行った。適当な熱処理や水素パッシベーション後にその中のキャリアー数を測定する実験的研究を進めた。前年度に、問題となるSi/SiO_2界面のダングリング・ボンド型界面欠陥の水素、重水素によるパッシベーション制御を試み、500°Cが最適処理温度であることを示した。SiNWsの作製はレーザーアブレーションとCVD法で行い、SiNCsはRFスパッタ法によりSiリッチのSiOx膜から高温アニールによりSiO_2中に埋め込まれた高密度なSiNCsを作製した。そのナノ構造体にイオン注入で不純物ドープし、熱アニールによって電気的に活性化を行い、ドープした不純物の評価を行った。測定にはラマン散乱、光ルミネッセンス(PL)と電子スピン共鳴(ESR)測定を用いた。その結果、高濃度のイオン注入では室温注入よりも300°C程度でのホットインプランテーションの方がSiNWsのドーピング効率が良いことを明らかにした。さらにSiNWsへの酸素イオン注入により、ナノワイヤ中にSiNCsを高密度に作製できることを示し、高PL特性が得られる事を明らかにした。SiNCsに関しては、光照射によりスピンメモリー効果が現れること見い出し、それにサイズ依存性があり、不純物ドープレベルと水素パッシベーションの度合いによっても変化することを明らかにした。最終年度は,これらの現象を中心に研究を進める予定である。最終年度はSiNWsに的を絞って研究を進めた。第一の研究、BドープSiナノワイヤについて酸化とHF処理を用いたSiO_2膜のエッチングを繰り返し行い、Siナノワイヤ中のB動径方向濃度分布を調べた。その結果、Siナノワイヤ中のBは界面付近に安定して存在しやすいことが明らかになった。また、CVD法で作製した径の太いSiナノワイヤでは、表面界面の影響が小さくドープしたBは界面付近で僅かに多く、均一に分布していることがわかった。第二の研究、(I)Siナノワイヤ中のB偏析挙動に関して、ラマン散乱測定により等時熱酸化温度依存性および等温熱酸化時間依存性について調べた。その結果、熱酸化温度800°C、900°Cの場合に30分の短時間処理であってもSiナノワイヤ中のB濃度は急激な減少を示すことがわかった。低温の600°C熱酸化では、Bの偏析挙動は起きず、酸化も進行しない。それに代わり600°C以下の低温オゾン酸化は、900°C熱酸化と同等または、それ以上に酸化が進行することがわかった。(II)

Siナノワイヤ中のP偏析挙動に関して、低温ESR測定を行い結晶Si中のPドナー伝導電子g=1.998のシグナル強度が熱酸化温度の上昇に伴い減少するが、シグナルの線幅は増大することがわかった。さらに800°C以上の等温熱酸化処理時間依存性の実験から、時間に依存して伝導電シグナルの線幅が増大する。その結果、一部のPドナー原子は熱酸化過程で、B原子とは逆に酸化膜側から結晶Siへと偏析することが確かめられた。(III)BおよびPコドープSiナノワイヤ中のB、Pの偏析挙動に関して、等時熱酸化温度依存性について調べた。900°C以上の熱酸化により、Si結晶コア中の補償されていたPがBの酸化膜側への偏析により再活性化することがわかった。これは、酸化膜にB原子が偏析したことにより結晶コア内部に誘起された欠陥が、アニールにより消滅しPドナー原子が再活性化したことによることを示した。
変異型タウ遺伝子導入によるヒト痴呆疾患モデルマウスの作製と解析

老年期認知症の主な原因であるアルツハイマー病(AD)の特徴である神経原線維変化と神経細胞死は、タウ遺伝子の変異による前頭側頭型認知症でも見られ、タウの異常自身がこれらの病変の原因と考えられている。そこで本研究では、1)ヒト変異型タウcDNAをマウス遺伝子座に導入したノックインマウス2)Cre-loxPの系を用いてヒト変異型タウを神経特異的に過剰発現するトランスジェニックマウスを作製し、それらをAPPの変異マウスなどと交配して、その神経組織での神経病理学的所見(神経原線維変化、細胞死)やDNA microarrayで正常マウスとの遺伝子発現の違い等を解析し、変異型タウが如何にして神経原線維変化や神経細胞死を引き起こすかを解明することを試みている。1については、現在ノックインマウスと変異APPを過剰発現するマウス(Tg2576)を交配しているが、まだ神経原線維変化や神経細胞死は見られていないため、引き続き飼育している。2については、Cre recombinaseの存在下で変異型タウを過剰発現するマウスとCre recombinaseを神経特異的に発現するマウス(Nestin-Cre)及び前脳特異的に発現するマウス(Emx1-Cre)と交配してその表現型を観察した。その結果、Nestin-Creとのdouble Tgマウスでは出生するものの、体重の低下や生後数週での死亡が認められ、脳体積の著明な減少が認められた。また、Emx1-Creとのdouble Tgマウスでは、出生後の死亡は見られなかったが、前脳の著明な体積の低下が認められた。これらの部分ではタウは発現しているものの、過剰発現は見られなかったので、タウを過剰に発現する細胞は解析する時点までに脱落してしまうものと考えられた。
革新的変異原性試験開発のための基礎的検討

次々世代DNAシーケンサーと呼ばれる、パシフィックバイオサイエンス社のSMRTDNAシーケンサーは、一分子リアルタイムのシーケンスが可能である。これを用いることにより任意の組織の任意の遺伝子における突然変異を検出することが可能になるかもしれない。そこで、この「SMRT法」の開発をめざし、SMRT DNAシーケンサーに関する情報収集するとともに、テンプレート作成法の開発を進めた。一方、これとは別に、イルミナ社の次世代シーケンサーを用いて、化学物質が誘発する突然変異をゲノムワイドに検出する手法を考案した。パイロット試験として、変異原処理したサルモネラ菌5クローンと、未処理の5クローンをランダムに選択し、全ゲノムシーケンスを行った結果、変異原処理したクローンで複数の突然変異を検出できた。これにより、表現型によらない、機器分析による突然変異の検出に道を開いた。本研究では、任意の生体試料における任意の遺伝子に生じる体細胞突然変異の頻度とスペクトルを、SMRT^<TM> DNAシーケンサーを用いて直接検出する画期的な突然変異検出法の開発をめざしている。SMRT^<TM>DNAシーケンサーは2010年に発売された最新鋭のDNAシーケンサーで、単一DNA分子の塩基配列をリアルタイムで検出できる唯一の機器である。また、これは極めて高速で、1時間でヒトゲノムを30回ぐらい読む能力がある。本年度は、試験方法の基本的なコンセプトの考案と、開発の過程で予想される種々の問題点とその解決策について文献調査を行った。試験方法の基本的なコンセプトは、DNAから調べたい遺伝子配列を濃縮し、環状のテンプレートを作成し、これをSMRT^<TM> DNAシーケンサーにより直接塩基配列の解析を行い、突然変異を検出する。このDNAシーケンサーはDNAポリメラーゼを用いているが、DNAポリメラーゼの単純な読み間違えに関しては、環状テンプレートを3回以上読むことで回避できると予想された。一方、テンプレート上のDNA損傷が引き起こす読み間違えについては、塩基の取り込み速度の遅延により検出できるという可能性を指摘した。しかし、DNA中に存在するウラシルは、10^5塩基に5個ほど存在し、非常に量が多いため、今後は、DNAポリメラーゼによるウラシルを含むテンプレートへの塩基取り込みのキネティクスを調べる必要があることがわかった哺乳動物細胞を用いた体細胞突然変異の検出系はHPRT遺伝子やTK遺伝子などの試験系に限られており、変異原物質によって発がんに関連する遺伝子にどのくらい変異が生じるかを調べることは不可能であった。しかし、近年の次世代DNAシーケンサーの性能向上により、遺伝学的手法ではなく、機器分析手法により、変異原物質による低頻度の体細胞突然変異を検出できる目が出てきた。中でも、次々世代DNAシーケンサーと呼ばれる、パシフィックバイオサイエンス社のSMRT DNAシーケンサーは、一分子リアルタイムのシーケンスが可能である。テンプレート作成法として、まず、ヒトゲノムDNAを制限酵素pstIで切断し、p53遺伝子のエクソン5-9を含む領域を切り出し、エキソヌクレアーゼによる限定分解後、固相に担持したプローブでキャプチャした後、制限酵素HindIIIでエクソン7-9の領域を切り出す方法を考案した。この後、末端処理してSMRT DNAシーケンサー用の環状アダプターを付け、シーケンスに供することになる。残念ながら、研究期間中にSMRTシーケンサーにアクセスできなかったので、実証試験は今後の課題である。これにより、表現型によらない、機器分析による突然変異の検出に道を開いたことになる。