hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞質内単粒子運動の直接観察

細胞内の化学反応において、分子やオルガネラなど細胞内粒子の運動と衝突は最も基本となる現象である。細胞構造・細胞環境の複雑性のため、細胞内粒子の運動は単純なブラウン運動(熱拡散)からは、相当に逸脱していると予想される。本研究では、生細胞に直径50 nmの蛍光粒子を導入し、単一粒子運動計測を行った。その結果は、細胞質の粘性は水の粘性の1/10程度に過ぎないが、50 nm粒子の約4割の運動は100 nm程度の範囲に制限され、細胞内の空間が細かく区画されていることを示唆するものであった。ナノメートルサイズの単粒子の運動を細胞質溶液内で可視化計測することを目標に研究を行っている。細胞質での粒子混雑、局所閉じ込め、細胞質流動、遷移的な粒子間相互作用などが、蛋白質オルガネラサイズの細胞内粒子の運動に与える効果の実態を顕微鏡下で直視することを目指している。多数粒子の平均運動を取り扱う従来の細胞質内粒子運動の計測結果間には矛盾があり、単一粒子運動の直接観察が必要とされている。3次元・高速な細胞質内運動計測は挑戦的であるが、細胞内反応は基本的に粒子の拡散・衝突に依存しており、生物学として避けられない課題である。そのような逸脱は、粒子間の反応キネティクスに様々な影響を与え、細胞機能に影響する可能性がある。本年度は、運動計測法の確立を目指し、細胞内への粒子導入法の検討と、平均計測法での粒子運動評価、および高速カメラによる計測条件の最適化を行った。細胞はヒト乳癌由来の培養細胞MCF-7を用いた。蛍光色素tetramethylrhodaminを粒子内に共有結合するコロイドシリカ粒子(直径50 nm)を、電気穿孔法で細胞質へ導入することにより、細胞質内で単分散し、局所的には単純拡散運動をおこなう運動プローブとして利用できることがわかった。粒子の分散性や運動の評価は蛍光相関分光法(FCS)で行い、計測された平均運動は水の34倍の粘性を有する溶液内での50 nm粒子の単純拡散運動として記述できた。同様の試料で高感度カメラによる粒子観察を試みた。照明、計測条件を最適化し、現在の所、約5 msの時間分解能で単一粒子拡散運動が可視化された。静止粒子の計測から、位置精度は1 nm程度とされた。ナノメートルサイズの単粒子の運動を細胞質溶液内で可視化計測した。細胞質での生体高分子間の化学反応は、分子混雑、局所閉じ込め、細胞質流動、遷移的な粒子間相互作用などによって、単純なブラウン運動(熱拡散)からは、相当に逸脱している可能性が示唆されており、そのような逸脱は、分子間の反応キネティクスに様々な影響を与え、細胞機能に影響する可能性がある。直径50 nmの蛍光シリカ粒子を、ヒト肺癌由来の培養細胞MCF-7に電気穿孔法により導入し、高速カメラを接続した蛍光顕微鏡を用いて、細胞質内の1粒子運動を1 msのフレームレートで観測した。FCSによる可動粒子の平均運動計測では、粒子は1 um2/sの側方拡散係数を持って、0.1 um3の計測空間近傍を単純拡散運動していることが分かっている。1粒子可視化計測では、可動粒子の運動を平均60 ms追跡できた何らかの細胞質内構造に固く吸着したと考えられる約3割の静止成分を除外すると、6個の細胞から994個の可動粒子の運動を観測して、それぞれの粒子の運動モードとパラメータ値を推定した。その結果、単純拡散成分が56%で拡散係数が0.86 um2/s、平均50 msの計測時間中には410 nmの範囲を運動する。他の25%は100 nmの範囲に閉じ込められて拡散係数17 um2/s(この値はover estimationの可能性が高く、位置精度の向上が必要である)で運動しており、残りの20%は半値全幅80 nmのポテンシャル中で0.3 pN/nmのバネに繋がれた拡散運動を行っていると推定された。輸送速度を持つ運動をする粒子は観察されなかった。単純拡散およびバネ拡散運動から細胞質の粘度は0.01 Ps*sと求められ、水の10倍の値であった。以上の結果は、細胞質内の構造・環境の多様性を示している。総合理工当初から本年度は計測条件の確立を目標としていたが、現在の計測条件を外挿すると5 nmの位置精度で0.3 ms以上の時間分解能が達成できるはずであり、一方、FCSで計測された拡散係数1 um2/sから考えると0.3 msの間の移動距離は40 nm程度であるから、最終目標とするサブミクロン空間領域での運動評価は現状でも可能である。

照明強度を更に上げて時間分解能あるいは位置精度を数倍向上させることもできる。計測は当初GAPDアレイを用いる予定であったが、今回の計測に特化したソフトウェア開発に手間取っており、現在は高速・高感度のCMOSカメラを使用している。このカメラでも0.3 msの時間分解能の撮像が可能である。従って、本年度の目標はほぼ達成されたと言える。種々の環境下における細胞内ナノ粒子運動の計測と解析を行う。MCF-7細胞はheregulin投与によって分化し、短期的には大きな形態変化と運動性の向上、長期的には細胞内に脂質滴を蓄えるなど細胞質環境が動的に変化する。細胞内局所環境の計測に適した細胞である。この実験系で、以下の計測を行う。細胞質の有効粘度計測:従来報告された細胞質の粘度は、プローブおよび計測法によって全く異なる。粒子サイズや粒子表面の電荷などを変化させて、有効粘度の表面依存性を測る。拡散運動のアノマリー:粒子運動に影響をおよぼす種々の要因は異なった時間・空間スケールを持つため、粒子の拡散運動は抑制性の異常拡散になると予想されているが、従来のFCS計測結果は、わずか2成分の自由拡散で近似できてしまう。FCSよりも長距離・長時間の計測が可能な単一粒子計測で、異常拡散性の検証を行う。遷移的結合:従来観察されてきた同一サイズプローブ間の側方拡散係数の違いは、表面の性質に依存した遷移的な非特異結合を予想させる。単一粒子の運動軌跡から遷移的な拡散係数変化を検出し、遷移的結合のキネティクス解析を行う。細胞構造と拡散運動:仮足や細胞核内など微小領域中の拡散は、表面効果により、バルクの拡散とは異なっている可能性がある。微小領域ごとの粒子運動を計測し、微小環境における分子間相互作用に対する示唆を得る。研究の進捗に伴い、消耗品の購入に際して予算額との差異が生じたため、旅費からの流用をおこない、結果として軽微な差額が生じた。研究推進のための試薬・器具など消耗品購入に宛てる予定である。
生体細胞の膜-液系に関する固液連成問題の有限要素解析での適応型分散処理

現在,セル集合体である生体組織の工学的力学特性同定技術の診療・治療分野への導入が望まれるが,この特性は細胞レベルの特性に由来するものであることから,工学的な理論や技術を直接応用できない場合もある.まず,対象となる細胞組織の変形挙動を正確に観察する目的で,顕微鏡下用の十字型2軸引張試験機に関して駆動部にステップモータによる位置制御を可能とするシステムを付加した.特に,顕微鏡の水平ステージに乗せることを可能とするように,2基の小型駆動装置を予定通り設置した.これらの制御に関しては,PCおよびマイコンによる制御システムとなった.また,並列計算で分割領域毎に演算負荷が異なる場合に,その負荷を均一になるシステムの検証を行った.次に,顕微鏡下用の十字型2軸引張試験機システムを用いることで,研究対象となる細胞集合組織の挙動観察を行った,この結果,当初の予想に反して,細胞液めみと思われていた領域に繊維質等の構造体の存在が予測される結果となった.また併せて,異なる物質間で効率的に並列計算ができるアルゴリズムを開発した.さらに,大規模計算で対象となるマクロ変形挙動を対象としながら,特に生体軟組織の変形挙動,および多孔質材の変形挙動,という2つのアプローチにて有限要素解析に不可欠な構成関係の検討を実施した.特に,動的変形と多軸変形に焦点を置いた.これらの成果によっては,複雑なセル集合組織の変形挙動を理論的に反映させた数値シミュレーションの開発と,それと並行してバイオロボットによる研究領域が発展することによって,軟組織が生体挙動に与える影響を明らかに出来るが期待できる.現在,セル集合体である生体組織の工学的力学特性同定技術の診療・治療分野への導入が望まれるが,この特性は細胞レベルの特性に由来するものであることから,工学的な理論や技術を直接応用できない場合もある.まず,対象となる細胞組織の変形挙動を正確に観察する目的で,顕微鏡下用の十字型2軸引張試験機に関して駆動部にステップモータによる位置制御を可能とするシステムを付加した.特に,顕微鏡の水平ステージに乗せることを可能とするように,2基の小型駆動装置を予定通り設置した.これらの制御に関しては,PCおよびマイコンによる制御システムとなった.また,並列計算で分割領域毎に演算負荷が異なる場合に,その負荷を均一になるシステムの検証を行った.次に,顕微鏡下用の十字型2軸引張試験機システムを用いることで,研究対象となる細胞集合組織の挙動観察を行った,この結果,当初の予想に反して,細胞液めみと思われていた領域に繊維質等の構造体の存在が予測される結果となった.また併せて,異なる物質間で効率的に並列計算ができるアルゴリズムを開発した.さらに,大規模計算で対象となるマクロ変形挙動を対象としながら,特に生体軟組織の変形挙動,および多孔質材の変形挙動,という2つのアプローチにて有限要素解析に不可欠な構成関係の検討を実施した.特に,動的変形と多軸変形に焦点を置いた.これらの成果によっては,複雑なセル集合組織の変形挙動を理論的に反映させた数値シミュレーションの開発と,それと並行してバイオロボットによる研究領域が発展することによって,軟組織が生体挙動に与える影響を明らかに出来るが期待できる.現在,生体軟組織の工学的力学特性同定技術の診療・治療分野への導入が望まれるが,この特性は細胞レベルの特性に由来するものであることから,金属系を中心にこれまで発達してきた工学的な理論や技術を直接応用できない場合もある.とくに上述の軟組織の変形特性に関しては,それが細胞の構造と構成材である細胞膜/壁と細胞液/質の性質に大きく依存すると考えられていることから,この細胞スケールの変形メカニズムの明確化と巨視的な変形との相関性の明確化が望まれている.そこで本研究課題では,固液連成問題の解析手法を基礎として,とくに細胞膜と細胞液で構成したメゾスケールの細胞解析モデルを作成した上で,さらにこれを大規模化して冒頭に述べた症状による軟組織における力学的特性の症状による差異発現メカニズムを明らかにすることを目的とする.特にこれまでは,顕微鏡下で利用可能な1軸および2軸の引張試験機の開発を行ってきたが,これらの駆動は手動であったため,顕微鏡観察には作業者に熟練を要する上に実験者誤差が生じやすい状況にあった.そこで本計画研究の平成17年度においては,まず顕微鏡下用の十字型2軸引張試験機に関して駆動部にステップモータによる位置制御を可能とするシステムを付加した.特に,顕微鏡の水平ステージに乗せることを可能とするように,2基の小型駆動装置を予定通り設置した.これらの制御に関しては,PCおよびマイコンによる制御システムとなった.さらに本研究代表者らが併せて開発してきた分散処理システムに関して,8台のPCを増設してシステムを発展させた.今後は,特に階層的な固液連成解析に用いる有限要素法に関して,マルチスケール的な大規模解析環境を構築してシミュレーションを本格化させる計画である.現在,生体軟組織の工学的力学特性同定技術の診療・治療分野への導入が望まれるが,この特性は細胞レベルの特性に由来するものであることから,工学的な理論や技術を直接応用できない場合もある.そこで本研究課題では,固液連成問題の解析手法を基礎として,とくに細胞膜と細胞液で構成したメゾスケールの細胞解析モデルを作成した上で,さらにこれを大規模化して冒頭に述べた症状による軟組織における力学的特性の症状による差異発現メカニズムを明らかにすることを目的とする.特にこれまでは,顕微鏡下で利用可能な引張試験機に関して,PCおよびマイコンによる制御システムとなった.平成18年度においては,このシステムを用いることで,研究対象となる細胞集合組織の挙動観察を行った.

この結果,当初の予想に反して,細胞液のみと思われていた領域に繊維質等の構造体の存在が予測される結果となった.これに関しては,今後も継続して実験・観察を積み重ね,シミュレーションの検証に利用可能な良い実験結果を得られる対策をとる.また,引き続き開発中の分散処理システムに関して,細胞を模した固液連成の有限要素モデルに適用可能な分散処理手法に関して,その信頼性確認を目的とした様々な問題の解析を実施する.まず,平成19年度まで実験観察を続けてきた細胞の集合組織の観察結果について,ここで観られた多様な負荷形態への変形挙動のメカニクスを解明すべく,幾つか構造を仮定しながら数値シミュレーションを実施する.特に,逆解析的な手法を採用する訳ではないが,結果から構造を推定する手法への応用可能性についても考察を加える.また細胞ばかりでなく,広く生体運動が関連する課題の解析を実施する.具体的には,固液連成問題に生体が関連する課題として,水中動物の運動などを検討する,比較検証には,このロボットを作成して,シミュレーション結果と照らし合わせる予定である.現在,セル集合体である生体組織の工学的力学特性同定技術の診療・治療分野への導入が望まれるが,この特性は細胞レベルの特性に由来するものであることから,工学的な理論や技術を直接応用できない場合もある.そこで本研究課題では,セノ集合組織の解析手法の確立を目的として,とくに細胞膜と細胞液で構成したメゾスケールの細胞解析モデルを作成した上で,さらにこれを大規模化して冒頭に述べた症状による軟組織における力学的特性の症状による差異発現メカニズムを明らかにすることを目的とする.平成18年までの研究では,領域の変形特性に依存しない並列計算理論の構築と研究対象となる細胞集合組織の顕微鏡による2軸変形挙動観察を行った.さらに最終年度である平成19年度の研究では,大規模計算で対象となるマクロ変形挙動を対象としながら,特に生体軟組織の変形挙動,および多孔質材の変形挙動,という2つのアプローチにて有限要素解析に不可欠な構成関係の検討を実施した.特に,動的変形と多軸変形に焦点を置き;1)セル組織の動的変形挙動を実験的に調べ,構成式での表現を試みた.2)セル組織の多軸変形挙動を観察し,1)の構成式を拡張した.3)生体試料の粘弾性特性と組織の関係を考察し,実験環境を精査した.4)生体筋細胞の変形が生体運動に与える影響を客観的に調べられるロボットを開発した.これらの成果によっては,複雑なセル集合組織の変形挙動を理論的に反映させた数値シミュレーションの開発と,それと並行して生体運動を科学的に明らかに出来るバイオロボットによる研究領域が発展することが期待できる.
クマノミ類の宿主イソギンチャク類の分類学的混乱の解決に向けて

本年度は(1)試料の収集・解析方法の確立,(2)試料収集,(3)DNA解析の実施を計画していた.(1)試料の収集・解析方法の確立においては,採集時に撮影する画像について,後述する理由のため,当初のサンプリングプロトコルの修正を行った.解析方法の確立においては,既存マーカーに加え,海外研究者との連携により,次世代シーケンサーを用いたSNPs解析の試行を行い,種レベルのOTU判別に非常に有効となる結果を得ることができた.ただし,これらの種レベルのOTUの形態上の差異について検討中である.(2)隠蔽種の存在の可能性が非常に高いため,本研究においては,試料数をどれだけ集めることができるかが研究上の大きなファクターとなることから,当初計画より多くの地点において試料収集を実施したのに加え,研究協力者から多くの名義種のタイプ産地であるインドネシア・アンボンの試料を入手することができた.本年度新たに収集した試料数は130サンプルで,計205サンプルが利用可能となった.(3)DNA解析の実施については,一部海外研究者との連携により,ミトコンドリアCO3, 12S rDNA,16S rDNA及び核18S rDNA,28S rDNAの部分配列を決定し,約6,000塩基対を系統解析に用いることができた.ただし,これらをすべて使っても種レベルのOTUを検出するためには,解像度が不足していると考えられた.また本研究に関連して実施した国際共同研究において試験的に実施したSNPs解析によって,Entacmaea属に少なくとも4つの種レベルのOTUが存在することが示唆され,本手法が有効であることが示された.また,これまでの試料収集の結果から,対象種の1種であるサンゴイソギンチャクの北限生息地を特定し,これを論文発表した.また上記DNA解析の結果の一部が投稿中である.予備解析の結果から,ミトコンドリア・核の計約6千塩基対の配列データでは,種レベルのOTUを完全には解像できないことが判明したことから,DNA解析の手法の確立が遅れ,多くの試料について解析をペンディングしている状況である.また,予備的なDNA解析の結果から,より多くの試料を集める必要性が示唆されたことから,当初計画より多くの地点での試料収集を実施しており,全体的にDNA解析の実施が遅れている.本年度に引き続き試料収集を実施し,検討に利用できる試料数の確保については目処がたったところである.DNA解析については,予備解析で決定した配列のうち,優先度を決定したうえで,全試料について当該領域の配列決定を実施する.また,まだ未実施の領域(例えばミトコンドリアCOI領域などイソギンチャク類では一般的に使用されていない領域)の解析を実施し,その有効性を検証する.海外の研究者との連携により,次世代シーケンサーを用いたSNPs解析の有効性が確認できたが,そのコストは非常に高く,現在の科研費の助成金額でこれを実施するのは現実的ではない.ただし,将来的なSNPs解析に利用できるよう試料の蓄積を行い,これらの活用の機会を伺う.また,本研究において認識できた各OTUについて,フィールドで識別できる特徴をまとめた同定ガイドを作成するための準備を進める.本研究課題では,種レベルのOTUの認識が目標であるが,将来的には,これらのおよそ60種に及ぶ名義種との比較が必要であることから,並行して,これらのタイプ標本調査,DNA解析に利用できるトポタイプ標本の採集等について,それらの研究プランの検討・立案を進める.本年度の研究実施計画においては,研究の具体的進行手段について検討し,それらに基づいた試料収集,DNA解析を実施することを計画した.本年度,5月に沖縄において研究分担者,研究協力者が一同に介して検討を行い,研究遂行の具体的な手順,試料収集プロトコルの作成等を行った.同時に立案した試料収集プロコトルに基づいた試験的な採集を実施し,その実効性を確認した.試料収集については,上記プロトコルに則って奄美大島,鹿児島湾,トカラ列島,沼津,三浦半島の各地において実施した.収集した試料には個別の通し番号を与え,各種情報(産地,水深,共生生物等)を加えたリストを作成するとともに,採集時に撮影した当該個体の水中写真とともに,参画者が全員アクセスできる簡易データベースを作成し,試料管理・進行管理ができる体制を構築した.同様に準備期間中に採集していた個体についてもデータベースを作成した.以上により,本年度は,12形体型の計100試料(新規76試料および準備期間中の24試料)を収集し,これらの情報を整理した.得られた試料については,全て粗DNAの抽出を行うとともに,試験的にミトコンドリアDNAの3領域(12S,16S rDNA, COXIII)においてPCRによる増幅試験を実施した.各プライマーは花虫類用に設計されたものを使用し,一部個体のCOX IIIを除き,全てにおいて良好な増幅が確認された.これらの結果は,上記データベース上において進行管理できるような体制とした.本年度は詳細な研究計画の立案とその実効性の確認が最大の課題であった.特に生体からの非侵襲的な試料収集(触手数本の採集)について,作成したプロトコルにより、コンタミの防止・触手からのDNA抽出・PCRによる目的配列の増幅試験等が概ね良好に行えることが確かめることができた.また,水中観察による形体型の識別について,プロトコルによって撮影した写真データをもとに検討することができた.本年度は(1)試料の収集・解析方法の確立,(2)試料収集,(3)DNA解析の実施を計画していた.(1)試料の収集・解析方法の確立においては,採集時に撮影する画像について,後述する理由のため,当初のサンプリングプロトコルの修正を行った.

解析方法の確立においては,既存マーカーに加え,海外研究者との連携により,次世代シーケンサーを用いたSNPs解析の試行を行い,種レベルのOTU判別に非常に有効となる結果を得ることができた.ただし,これらの種レベルのOTUの形態上の差異について検討中である.(2)隠蔽種の存在の可能性が非常に高いため,本研究においては,試料数をどれだけ集めることができるかが研究上の大きなファクターとなることから,当初計画より多くの地点において試料収集を実施したのに加え,研究協力者から多くの名義種のタイプ産地であるインドネシア・アンボンの試料を入手することができた.本年度新たに収集した試料数は130サンプルで,計205サンプルが利用可能となった.(3)DNA解析の実施については,一部海外研究者との連携により,ミトコンドリアCO3, 12S rDNA,16S rDNA及び核18S rDNA,28S rDNAの部分配列を決定し,約6,000塩基対を系統解析に用いることができた.ただし,これらをすべて使っても種レベルのOTUを検出するためには,解像度が不足していると考えられた.また本研究に関連して実施した国際共同研究において試験的に実施したSNPs解析によって,Entacmaea属に少なくとも4つの種レベルのOTUが存在することが示唆され,本手法が有効であることが示された.また,これまでの試料収集の結果から,対象種の1種であるサンゴイソギンチャクの北限生息地を特定し,これを論文発表した.また上記DNA解析の結果の一部が投稿中である.予備解析の結果から,ミトコンドリア・核の計約6千塩基対の配列データでは,種レベルのOTUを完全には解像できないことが判明したことから,DNA解析の手法の確立が遅れ,多くの試料について解析をペンディングしている状況である.また,予備的なDNA解析の結果から,より多くの試料を集める必要性が示唆されたことから,当初計画より多くの地点での試料収集を実施しており,全体的にDNA解析の実施が遅れている.本研究課題においては,試料数の多寡が研究成果を左右すると考えられるので,引き続き精力的・網羅的に試料収集を行い,1形体型につき最低3ヶ所,10試料以上を解析対象に含められるようにする.また,増幅が確認された目的配列について,その有用性を検証するとともに,新たに導入するサーマルサイクラーを用いて,順次全ての試料について解析を進める.以上から得られたデータを検証するとともに,新規の配列あるいは解析手段についての必要性について検討を進める.本年度に引き続き試料収集を実施し,検討に利用できる試料数の確保については目処がたったところである.DNA解析については,予備解析で決定した配列のうち,優先度を決定したうえで,全試料について当該領域の配列決定を実施する.
深海熱水冷湧水生態系における真菌類の多様性と未知原始菌類の探索および分離

深海環境における真菌類の群集構造解析(環境抽出DNAクローン解析)と真菌類の分離培養法により、多様性を調査した。主に相模湾メタン冷湧水に由来する化学合成生態系環境からサンプリングを行い、出現菌類を比較した。培養法により得た真菌分離株の多くは子嚢菌類に属していた。一方、出現したクローンの3分の1以上がツボカビ類に由来したが、これらは今回用いた分離培養法では単離することができず、未知の特異な代謝系を有する可能性があった。初年度として、サンプルの取得を重点的に行った。相模湾深海底泥、相模湾鯨骨近傍底泥および鯨骨、鯨蝋サンプル、小笠原鳥島沖鯨骨近傍底泥サンプル、大西洋中央海嶺熱水噴出口サンプルを直接サンプリングまたは他研究者からの分与により得た。そのうち相模湾鯨骨サンプルを中心にDNA抽出を行った。まず比較的高密度に菌類が存在すると予想された鯨蝋抽出DNAを元に、菌類特異的プライマーの評価を行った。真核生物用のものを含む8つの組み合わせで調べたところ、18S rDNAの中間部を標的としたFUN0817とFUN1536の組み合わせによるPCRが感度および特異性に優れていたため、当面このプライマーセットを選択することとした。このセットを用いたPCRでは約6割のサンプルからのDNA増幅が確認され、さらにそのうちの半分から菌類クローンが検出された。検出された菌類クローンは分離源により大きく異なっていた。鯨骨由来および近傍サンプルではフンタマカビ菌綱(Sordariomycetes)に属するAcremonium属関連配列が大多数を占めた。これら配列は他の深海サンプルからは現れなかったことから、鯨骨の分解に深く関与する菌類群であると推測された。次年度以降の研究計画においてこれら菌群の分離培養を試みる予定である。小笠原鳥島沖鯨骨サンプルからはRhodotorula mucilaginosa、Galactomyces geotrichum、Candida boidiniiおよび未知担子菌類に関連する配列が出現した。これらは未知担子菌類以外これまでに同サンプルから単離培養されてきたものと同一であると思われる。大西洋中央海嶺からは小笠原鳥島沖サンプルから現れたものに加え、Trichosporon japonicus, Rhodotorula sphaerocarpum, Cryptococcus curvatus, Cryptococcus longus, Penicillium namyslowskiiに関連する配列が出現した。T.japonicus, R.sphaerocarpumはこれまでにしばしば深海から分離培養されているが、残りのものは深海からはクローンのみが報告されている。原始菌類としては鯨骨近傍底泥からツボカビ類、接合菌類と関連するものが極めて低頻度に取得された。次年度はこれらに照準を絞ったプライマーの設計も考慮する。本年度は、主にサンプルDNAの抽出と菌類クローン解析、および菌類の単離と培養を実施した。サンプリングは、5月と2月に他研究者の協力により、相模湾初島沖メタン冷湧水域において実施した。うち5月に得たサンプルから、DNA抽出と系統解析、菌体の分離培養を行った。前年度に用いた、FUN0817とFUN1536に加えて、ITSとLSU rDNA領域を標的としたFUNITS1とLR6によるPCRを基に、菌類クローン解析を行ったが、過半数以上、場合によっては98%以上、Acremonium spp.関連配列により占められた。これらは前年度には鯨骨のみに現れたが、この結果により日本近海に普遍的であると推測された、鯨骨と異なりこれ以外の子嚢菌クローンは現れず、僅かにツボカビおよびMesomycetozoa関連クローンが現れた。これらは鯨骨とも、大西洋や小笠原等の大洋域とも異なる傾向である。一方で分離培養による結果はクローンに基づくものとは大きく異なっていた。134株を分離し、そのLSU rDNA遺伝子とITS配列を指標として同定した。接合菌類3株、担子菌5株を除く全てが子嚢菌類であったが、Acremonium spp.関連株は全く現れなかった。LSU rDNAの99%以上の相同性を同一種とみなした場合、81種が認められ、高い多様性を持つことが示された。そのうち25種35株が既知LSU rDNA配列に対して2%以上の差異を持っていた。また日本海溝より分離した菌類が新規系統かつ原始的と思われる形態を示したため、Dipodascus tetrasporeus sp.nov.として報告した。冷湧水域のAcremonium spp.の大量クローンはコンタミの可能性も捨てきれないが、鯨骨由来Acremonium spp.と栄養要求性の異なる株が存在しているとも考えられる。本年度は、主に深海サンプルからの菌類クローン解析と菌類の培養を試みた。2008年1月と12月に相模湾冷湧水域、7月に沖縄黒島冷湧水域にてサンプリングを計画した(黒島航海は中止)。

まずこれまで使用していたDNA抽出キット(MOBIO社)に菌類の混入があることがわかったため、使用を中止しデータを破棄した。過去に現れたAcremonium spp.関連配列はこのキットの不良によることが判明した。よって別のキット(ニッポンジーン社)を代替とした。今回、1)培養法、2)底泥抽出DNAのPCRクローン解析法、の比較を行うことで菌類多様性を理解しようと試みた。培養法では、様々な条件下でコロニーを単離し、ITSおよび28S rDNAの配列に基づいて分子同定を行った。134株を分離した。接合菌類3株,担子菌5株を除く126株全てが子嚢菌類であった。LSU rDNAの99%以上の相同性を同一種とみなした場合、81種が認められ、高い多様性を持っていた。うち25種35株が既知配列に対して2%以上の差異を持っており、新種であることが推測された。高次分類群としては、フンタマカビ綱に属する分離株が約43%を占め最も多かった。クローン解析では得たクローンのうち約1/3がツボカビ類に属していた。これらは既知系統から大きく離れており、Basal Fungal Clone Lineage(BFC系統)とした。BFC系統は大きく分けて2タイプあり、それぞれBFC1、BFC2とした。BFC1は独自グループを形成したが,その位置は不明瞭であった。BFC2はRozella spp.とクレードを形成した。Rozella spp.はツボカビ寄生種であり、真菌類進化の最初期に分岐した可能性が報告されている。BFC系統は培養法では現れなかった。真菌類の初期進化において深海環境が重要な位置を占めていた可能性があることが示唆された。
過食を繰り返す1型糖尿病女性患者の糖尿病慢性合併症発症の要因に関する研究

[目的]摂食障害を合併した1型糖尿病女性患者における、糖尿病性網膜症および腎症の予測因子を同定した。[方法]1994年からの9年間の間に、当科を受診した摂食障害を合併した1型糖尿病女性患者は、109人(神経性大食症が70人、むちゃ食い障害が28人、神経性無食欲症が7人、特定不能の摂食障害が4人)であった。予測因子の候補として、以下の変数の調査を行なった。年齢;糖尿病発症年齢;糖尿病罹病期間;『むちゃ食い』、『インスリン自己中止(インスリン注射の自己判断での減量・中止)』、『自己誘発性嘔吐』および『下剤乱用』の期間(年数);精神科での治療経験;糖尿病による入院頻度;心理テストSDS(Zung Self-Ratillg Depression Scale)、STAI(State-Trait Anxiety Inventory)、EDI(Eating Disorder Inventory)の得点;HbA1c、BMI。糖尿病性網膜症、進行性糖尿病性網膜症(前増殖性網膜症+増殖性網膜症)、腎症の予測因子を解析するため、上記の諸因子を独立変数としたlogistic regression analysisを行なった。[結果]糖尿病性網膜症、進行性糖尿病性網膜症、腎症の予測因子は、いずれも、糖尿病罹病期間および『インスリン注射自己中止』の期間であった。[考察・結論]摂食障害に関連した様々な問題行動の中で、『インスリン自己中止』は糖尿病合併症の最も大きな予測因子であった。これは、我々が過去の研究において示した知見-摂食障害を合併した1型糖尿病女性において、HbA1cを悪化させる最も大きな要因は『インスリン自己中止』である-と関連があるかもしれない。また、糖尿病一般において報告されているように、糖尿病の罹病期間は合併症のもう一つの予測因子であった。摂食障害を合併した1型糖尿病女性の治療において、患者にインスリン注射を適切に行なわせることに合併症予防の努力の焦点をおくべきである。A.1994年からの9年間の間に、九州大学心療内科を受診した、摂食障害を伴った1型糖尿病女性は、109人であった。そのうち、神経性大食症が70人、むちゃ食い障害が28人、神経性食欲不振症が7人、特定不能の摂食障害が4人であった。これらの患者の糖尿病慢性合併症の発症について、以下のような検討を行なった。1.摂食障害を伴わない1型糖尿病女性(当科未受診のボランティア29名)に比べて、当科を受診した109名の摂食障害を合併した患者は、有意に血糖コントロールが不良で、糖尿病合併症(網膜症、腎症)の頻度も有意に高かった。2.摂食障害を伴った109人の1型糖尿病女性について、網膜症のある患者とない患者を比較すると、網膜症のある患者は、糖尿病の発症年齢が有意により若く、糖尿病や摂食障害の罹病期間がより長く、『むちゃ食い』、『インスリン注射の自己判断での中止』、『自己誘発性嘔吐』の期間がそれぞれより長いなどの、違いがあった。また、糖尿病性腎症に関しても、ほぼ同様の違いがあった。3.網膜症と腎症のそれぞれにおいて、2で有意差のあった因子を独立変数として多変量解析を行ない、独立して発症を促進する危険因子を同定した。これらの結果は、英文論文にまとめ、現在投稿中である。[方法]

1994年から9年間の間に、当科を受診した摂食障害を合併した1型糖尿病女性患者は、109人(神経性大食症が70人、むちゃ食い障害が28人、神経性無食欲症が7人、特定不能の摂食障害が4人)であった。予測因子の候補として、以下の変数の調査を行なった。年齢;糖尿病発症年齢;糖尿病罹病期間;『むちゃ食い』、『インスリン自己中止(インスリン注射の自己判断での減量・中止)』、『自己誘発性嘔吐』および『下剤乱用』の期間(年数);精神科での治療経験;糖尿病による入院頻度;心理テストSDS(Zung Self-Rating Depression Scale)、STAI(State-Trait Anxiety Inventory)、EDI(Eating Disorder Inventory)の得点;HbA1c、BMI。糖尿病性網膜症、進行性糖尿病性網膜症(前増殖性網膜症+増殖性網膜症)、腎症の予測因子を解析するため、上記の諸因子を独立変数としたlogistic regression analysisを行なった。[結果]糖尿病性網膜症、進行性糖尿病性網膜症、腎症の予測因子は、いずれも糖尿病罹病期間および『インスリン注射自己中止』の期間であった。[考察・結論]摂食障害に関連した様々な問題行動の中で、『インスリン自己中止』は糖尿病合併症の最も大きな予測因子であった。これは、我々が過去の研究において示した知見-摂食障害を合併した1型糖尿病女性において、HbA1cを悪化させる最も大きな要因は『インスリン自己中止』である-と関連があるかもしれない。また、糖尿病一般において報告されているように、糖尿病の罹病期間は合併症のもう一つの予測因子であった。摂食障害を合併した1型糖尿病女性の治療において、患者にインスリン注射を適切に行なわせることに合併症予防の努力の焦点をおくべきである。
テラビット級大容量光データリンクを可能とする多波長レーザアレー

次世代の加入入者系やローカルエリアネットワーク(LAN)において10ギガビット/秒以上の高速化のためには,波長分割多重方式が有効であり,小型で2次元アレイ化が可能な多波長面発光レーザアレーが期待される.本研究では凹凸のある基板上に減圧有機金属気相成長法で面発光レーザを結晶成長することにより,共振波長をウェハ面内で変化させ,多波長集積化を目指している.今年度は実験的にパターン形状と波長シフト量を見積もり,そこから等波長間隔多波長面発光レーザアレイの設計を行った.共振波長のパターン幅依存性を調べ、これを基に20nm間隔のパターン基板を設計した.20nm間隔,6チャンネルのレーザを実現し,その制御性について検討した.また有機金属成長法での境界層内の気相拡散モデルによる波長制御のシミュレーションを行い,このモデルによるパターン基板上の波長制御の設計指針を明らかにした.これらに必要なパラーメータを実験とのフィッティングで求め,より複雑なパターンの設計に対応するため,3次元に計算領域を拡大した,新しいパターン基板の設計を行った.発振波長20nm間隔,10チャネルを想定して180nmの波長範囲で線形に波長を変化させるパターンを設計した.この結果から,平坦な部分に溝,リッジを用いた場合と同じ程度の波長範囲をもつレーザアレーを作製することが初めて可能となった.このように,複雑なパターンを用いた場合の膜厚変化が予測でき,波長域拡大,高密度集積,波長制御性向上などに有効なツールになると考えられる.以上のように多波長面発光レーザアレイの基礎検討を行い,テラビット級大容量光データリンク実現の可能性を示した.面発光レーザは2次元的に多数のレーザを集積できるため,大容量光通信の光源として期待されている.更なる大容量化には波長分割多重(WDM)が有効であり,そのための光源として多波長面発光レーザが有望である.本研究では凹凸のある基板上に減圧MOCVD法で面発光レーザを結品成長することにより,共振波長をウェハ面内で変化させ,多波長集積化を目指している.今年度はパターン基板上へ成長したGaInAs/GaAs量子井戸の微小領域の測定および多波長面発光レーザの成長条件の検討,試作を行った.まず微小領域の反射スペクトル,フォトルミネッセンススペクトル測定を行い,パターン形状に対する量子井戸構造の発光波長及び共振器の共振波長のシフト量を初めて明らかにした.さらに,有機金属成長法での境界層内の拡散モデルによる波長制御のシミュレーションを行い,膜厚変調,組成変調量を明らかにした.このモデルとの比較によるパターン基板上の波長制御の設計指針を明らかにした.またパターン基板上のDBR,量子井戸のシフト量の成長圧力依存性を明らかにした.利得と共振波長シフトの差を小さくするためにはDBRは低い圧力,量子井戸は高い圧力で成長することが有効であることを見出した.この方法を用いて15μmの高さのパターン基板上に多波長面発光レーザアレイを成長したところ,同一ウェハ内で世界最大となる193nmの波長範囲のレーザ発振を得た.以上のように多波長面発光レーザアレイの基礎検討を行い,テラビット級大容量光データリンク実現の可能性を示した.次世代の加入入者系やローカルエリアネットワーク(LAN)において10ギガビット/秒以上の高速化のためには,波長分割多重方式が有効であり,小型で2次元アレイ化が可能な多波長面発光レーザアレーが期待される.本研究では凹凸のある基板上に減圧有機金属気相成長法で面発光レーザを結晶成長することにより,共振波長をウェハ面内で変化させ,多波長集積化を目指している.今年度は実験的にパターン形状と波長シフト量を見積もり,そこから等波長間隔多波長面発光レーザアレイの設計を行った.共振波長のパターン幅依存性を調べ、これを基に20nm間隔のパターン基板を設計した.20nm間隔,6チャンネルのレーザを実現し,その制御性について検討した.また有機金属成長法での境界層内の気相拡散モデルによる波長制御のシミュレーションを行い,このモデルによるパターン基板上の波長制御の設計指針を明らかにした.これらに必要なパラーメータを実験とのフィッティングで求め,より複雑なパターンの設計に対応するため,3次元に計算領域を拡大した,新しいパターン基板の設計を行った.発振波長20nm間隔,10チャネルを想定して180nmの波長範囲で線形に波長を変化させるパターンを設計した.この結果から,平坦な部分に溝,リッジを用いた場合と同じ程度の波長範囲をもつレーザアレーを作製することが初めて可能となった.このように,複雑なパターンを用いた場合の膜厚変化が予測でき,波長域拡大,高密度集積,波長制御性向上などに有効なツールになると考えられる.以上のように多波長面発光レーザアレイの基礎検討を行い,テラビット級大容量光データリンク実現の可能性を示した.
平衡重合を基盤とするポリマーリサイクルシステムの構築

本研究は平衡重合を基盤とするポリマーリサイクルシステムの構築を目的とする。平成10年度は二官能性双環状モノマーの合成とそのカチオン重合ならびに得られた架橋ポリマーの解架橋反応を検討した。エキソメチレン基を有するスピロオルトエステル、ビシクロオルトエステルとジチオールとのラジカル付加反応ならびに水酸基を有するスピロオルトエステル、ビシクロオルトエステルと二官能性カルボン酸クロリド、二官能性イソシアナートとの反応により二官能性スピロオルトエステル、ビシクロオルトエステルを合成した。得られた二官能性モノマーの架橋反応を四塩化スズ、三フッ化ホウ素工一テル錯体、トリフルオロメタンスルホン酸メチル等のカチオン重合開始剤を用い、塩化メチレン中(濃度1M)、0°Cで行い、対応する架橋ポリマーを定量的な収率で得た。IRスペクトルから、架橋ポリマーはスピロ環の1つの環状エ一テル部のみが開環した構造を有しており、二重開環ユニットはポリマー中に含まれていないことが判った。さらに、得られた架橋ポリマーを塩化メチレンに分散させ、カチオン重合開始剤を添加後室温で攪拌したところ、架橋ポリマーは数分で溶解し、反応混合物は均一になった。反応混合物からモノマーの二官能性双環状モノマーが収率70%程度で収率で回収された。残りの30%は溶媒に可溶のオリゴマーであった。以上のことから双環状モノマーの平衡重合性を利用した二官能性モノマーと架橋ポリマー間の相互転換の可能性が確認された。平成11年度は前年度の結果を受けて、側鎖にスピロオルトエステル、ビシクロオルトエステル基を有するポリマーを合成し、そのカチオン架橋反応と、得られたポリマーの解架橋反応を検討した。塩化メチレン中、0°Cで架橋反応は定量的に進行し、各種溶媒に不溶の架橋ポリマーが得られた。1Rスペクトルから、二官能性モノマーの架橋と同様に、架橋ポリマーはスピロ環の1つの環状エーテル部のみが開環した構造を有しており、二重開環ユニットはポリマー中に含まれていないことが判った。得られた架橋ポリマーを塩化メチレンに分散させ、カチオン重合開始剤を添加後室温で攪拌したところ、架橋前とほぼ同様の分子量のポリマーが良好な収率で回収された。以上のことから、側鎖にスピロオルトエステル、ビシクロオルトエステル構造を有する線状ポリマーと架橋ポリマー間の可逆的な架橋・解架橋の可能性が示された。得られた二官能性モノマーの架橋反応を四塩化スズ、三フッ化

ホウ素エーテル錯体、トリフルオロメタンスルホン酸メチル等のカチオン重合開始剤を用い、塩化メチレン中(濃度1M)、0°Cで行い、対応する架橋ポリマーを定量的な収率で得た。IRスペクトルから、架橋ポリマーはスピロ環の1つの環状エーテル部のみが開環した構造を有しており、二重開環ユニットはポリマー中に含まれていないことが判った。さらに、得られた架橋ポリマーを塩化メチレンに分散させ、カチオン重合開始剤を添加後室温で攪拌したところ、架橋ポリマーは数分で溶解し、反応混合物は均一になった。反応混合物からモノマーの二官能性双環状モノマーが収率70%程度で収率で回収された。残りの30%は溶媒に可溶のオリゴマーであった。以上のことから双環状モノマーの平衡重合性を利用した二官能性モノマーと架橋ポリマー間の相互転換の可能性が確認された。本研究は平衡重合を基礎とするポリマーリサイクルシステムの構築を目的とする。平成10年度は二官能性双環状モノマーの合成とそのカチオン重合ならびに得られた架橋ポリマーの解架橋反応を検討した。エキソメチレン基を有するスピロオルトエステル、ビシクロオルトエステルとジチオールとのラジカル付加反応ならびに水酸基を有するスピロオルトエステル、ビシクロオルトエステルと二官能性カルボン酸クロリド、二官能性イソシアナートとの反応により二官能性スピロオルトエステル、ビシクロオルトエステルを合成した。得られた二官能性モノマーの架橋反応を四塩化スズ、三フッ化ホウ素エーテル錯体、トリフルオロメタンスルホン酸メチル等のカチオン重合開始剤を用い、塩化メチレン中(濃度1M)、0°Cで行い、対応する架橋ポリマーを定量的な収率で得た。以上のことから双環状モノマーの平衡重合成を利用した二官能性モノマーと架橋ポリマー環の相互転換の可能性が確認された。平成11年度は前年度の結果を受けて、側鎖にスピロオルトエステル、ビシクロオルトエステル基を有するポリマーを合成し、そのカチオン架橋反応と、得られたポリマーの解架橋反応を検討した。塩化メチレン中、0°Cで架橋反応は定量的に進行し、各種溶媒に不溶の架橋ポリマーが得られた。IRスペクトルから、二官能性モノマーの架橋と同様に、架橋ポリマーはスピロ環の1つの環状エーテル部のみが開環した構造を有しており、二重開環ユニットはポリマー中に含まれていないことが判った。得られた架橋ポリマーを塩化メチレンに分散させ、カチオン重合開始剤を添加後室温で攪拌したところ、架橋前とほぼ同様の分子量のポリマーが良好な収率で回収された。以上のことから、側鎖にスピロオルトエステル、ビシクロオルトエステル構造を有する線状ポリマーと架橋ポリマー間の可逆的な架橋・解架橋の可能性が示された。
神経膠腫に対するWT1ペプチドワクチン・免疫チェックポイント阻害剤併用療法の確立

本研究ではWT1ペプチドワクチンと免疫チェックポイント阻害剤(Immune Checkpoint Inhibitor)の併用療法の有効性を検証し、さらにその先に認められると考えられる新たな耐性化の機序の解明とその克服技術の開発を目的とした。まず、過去に施行したWT1ペプチドワクチン療法(WT1療法)の臨床試験で、WT1療法開始前後に腫瘍摘出術が施行された症例(WT1療法無効例、もしくは耐性化獲得例と考えられる)の手術摘出標本を用いて、免疫染色で各種腫瘍内免疫応答の確認を行った。WT1療法後の標本ではWT1療法開始前と比較してWT1やHLA class1の発現が低下していることが明らかとなった。さらに、これらのWT1療法開始前における発現量は予後と相関することが明らかとなった。次に動物実験を行なった。マウスグリオーマ細胞株であるGL261に蛍ルシフェラーゼ遺伝子とWT1遺伝子を導入した細胞株を作成し、この細胞株を用いた担脳腫瘍マウスモデルを確立した。このモデルを用いて、WT1療法群、PD-1抗体群、併用群、コントロール群の4群に分けて治療を行なった。その結果、WT1療法群、PD-1抗体群、併用群はコントロール群と比較して有意に生存期間が延長した。併用群は単独群と比較しても有意に生存期間が延長しており、半数以上で長期生存が得られた。各群の各時期で腫瘍を採取し、免疫染色、及び、FACSを用いて各種腫瘍内免疫応答を確認した。これらの結果に関する論文を現在執筆中である。本研究ではWT1ペプチドワクチンと免疫チェックポイント阻害剤(Immune Checkpoint Inhibitor)の併用療法の有効性を検証し、さらにその先に認められると考えられる新たな耐性化の機序の解明とその克服技術の開発を目的とする。本年度はまず、過去に施行したWT1ペプチドワクチン療法(WT1療法)の臨床試験で、WT1療法開始後に腫瘍摘出術が施行された症例(WT1療法無効例、もしくは耐性化獲得例と考えられる)の手術標本を用いて、免疫染色で各種腫瘍内免疫応答の確認を行った。WT1療法開始前の標本とWT1療法施行後の標本の結果を比較したところ、WT1療法施行後の標本においてWT1やHLA class1の発現が低下し、TGFβの分泌が上昇していることが明らかとなった。現在追加でPD-1, PD-L1, CTLA-4, MDSC, IDOについても検討を行っている。一方、動物実験においては、マウスグリオーマ細胞株であるGL261にホタルルシフェラーゼ遺伝子を導入し(GL261-Luc)、この細胞株を用いた担脳腫瘍マウスモデルを確立した。このモデルをXenogen IVIS Lumina II (IVIS)で評価可能であることを確認し、撮影条件の条件検討を行った。さらに担脳腫瘍マウスモデルの無治療時の自然経過をIVISで評価した。その結果、細胞株の移植(Day0)後、腫瘍体積はDay2-3に一旦低下し、その後増大傾向を示すことが明らかとなり、少なくともDay6には腫瘍細胞の生着が確認できた。過去のWT1療法の臨床試験での手術標本が古い影響もあり免疫染色での染色性が悪く、免疫染色の条件検討に時間を要している。本年度は過去に施行したWT1ペプチドワクチン療法(WT1療法)の臨床試験で、WT1療法開始後に腫瘍摘出術が施行された症例(WT1療法無効例、もしくは耐性化獲得例と考えられる)の手術摘出標本を用いて、免疫染色で各種腫瘍内免疫応答の確認を行った。PD-1やPD-L1などを含めてすでに染色は終了し、この結果に関する論文を執筆中である。動物実験については、マウスグリオーマ細胞株であるGL261に蛍ルシフェラーゼ遺伝子とWT1遺伝子を導入した細胞株を作成し、この細胞株を用いた担脳腫瘍マウスモデルを確立した。Xenogen IVIS Lumina II(IVIS)での測定条件の検討や、無治療での自然経過を確認し、実験プロトコールを作成した。まずはWT1ペプチドワクチンや各種免疫チェックポイント阻害剤による単剤治療での実験を準備中である。臨床試験で採取された手術標本が古かった影響で免疫染色の条件検討に時間を要した。さらに、研究協力者の産前産後休暇のために動物実験の開始が延期となっていた。現在は研究協力者の復帰に伴い動物実験再開の具体的準備を進めている。

マウスグリオーマ細胞株であるGL261に蛍ルシフェラーゼ遺伝子とWT1遺伝子を導入した細胞株を作成し、この細胞株を用いた担脳腫瘍マウスモデルを確立した。このモデルを用いて、WT1療法群、PD-1抗体群、併用群、コントロール群の4群に分けて治療を行なった。その結果、WT1療法群、PD-1抗体群、併用群はコントロール群と比較して有意に生存期間が延長した。併用群は単独群と比較しても有意に生存期間が延長しており、半数以上で長期生存が得られた。各群の各時期で腫瘍を採取し、免疫染色、及び、FACSを用いて各種腫瘍内免疫応答を確認した。これらの結果に関する論文を現在執筆中である。引き続き過去のWT1療法の臨床試験の手術標本を用いて腫瘍内免疫応答の評価を行う。同時に、動物実験の実験系は昨年度までに確立することができたため、担脳腫瘍モデルマウスを用いてWT1ペプチドワクチンと免疫チェックポイント阻害剤の併用療法の有効性を検証する。延期となっていた動物実験を再開する。まずは各種薬剤の単剤での効果を確認し、次に併用療法による治療効果を評価する。さらに治療後の組織を採取し免疫染色等で免疫応答を確認する。昨年度購入を予定していたWT1ペプチドワクチン、モンタナイド(adjuvant)、各種免疫チェックポイント阻害剤などをまだ購入していないため。動物実験が延期となったため。本年度は動物実験施設利用料、実験動物購入費、治療薬購入費(WT1ペプチドワクチン、モンタナイド、各種免疫チェックポイント阻害剤)、免疫染色用の抗体購入費、DNAマイクロアレイ、などに使用する予定である。本年度は主に動物実験に研究費を使用する予定である。具体的には、動物実験施設代、実験動物購入、治療薬購入(WT1ペプチドワクチン、モンタナイド、各種免疫チェックポイント阻害剤)に使用する予定である。
ホモKOブタ個体作成のためのdouble KO細胞の標準的取得法の開発

本研究ではどんなタイプの遺伝子でもその遺伝子発現をノックアウトできるブタ細胞における汎用性の高いdouble KO細胞を作成する方法を開発することを目指した。具体的には、ヘテロKO細胞targeting vector(TV)を再度導入し、薬剤濃度を数倍高めた条件で選別する方法(repeated delivery of TV, RDTV)を用い、特定の遺伝子の発現を抑えることに成功した。特定の遺伝子機能が破壊されたいわゆるKOブタ個体を作成するには、マウスの場合と異なり、in vitroでのホモ(double)KO体細胞の作成、その体細胞核移植という経路を辿る。ブタの場合、ホモKO細胞の作成は、その後の実験のスピードを左右する重要な問題である。ヘテロKO細胞由来の個体に比べ、2年ほど実験時間が短縮されるからである。ホモKO体細胞の作成に至る種々の条件(薬剤耐性性等)が不明故、基本的な問題を検討した。その結果、ミニブタ胎仔性繊維芽細胞は、G418, puromycin, blasticydine S, hygromycin B, zeocinといった様々な薬剤に感受性があった。各薬剤耐性遺伝子導入細胞への高濃度薬剤耐性を調べた結果、G418、zeocinを除く他の薬剤では、濃度を高めることで、組換え細胞の死滅が誘導された。このことは、targeting vectorを導入されたヘテロKO細胞(片方のalleleに乗る遺伝子のみが破壊)に再度targeting vectorを導入し、高濃度の薬剤で細胞を選別すれば、ホモKO細胞が取れることを示唆する。現在、puromycin, blasticydine Sへの耐性遺伝子を内蔵したtargeting vectorを作成し、ホモKO細胞取得の可能性を検討している。特定の遺伝子機能が破壊されたいわゆるKOブタ個体を作成するには、マウスの場合と異なり、in vitroでのホモ(double) KO体細胞の作成、その体細胞核移植という経路を辿る。その結果、ミニブタ胎仔性繊維芽細胞(PEF)は、G418, puromycin, blasticidine S, hygromycin B, zeocinといった様々な薬剤に感受性があった(論文作成中)。薬剤遺伝子導入細胞への高濃度薬剤耐性を調べた結果、G418、zeocinを除く他の薬剤では、濃度を高めることで、組換え細胞の死滅が誘導された。このことは、一種類のKOベクターを導入されたヘテロKO細胞(片方のalleleに乗る遺伝子のみが破壊)に再度同一のKOベクターを導入し、高濃度の薬剤で細胞を選別すれば、ホモKO細胞が取れることを示唆する。しかし、KOベクターをヘテロKO細胞に遺伝子導入し、高濃度の薬剤で選抜するも、PEF自体が増殖性を失う結果となり、PEF以外の他のブタ細胞に代える選択を迫られた。現在、腎臓上皮由来の細胞(PKE)でこの点を検討している。一方、neo遺伝子を内蔵するKOベクターを導入されたヘテロKO細胞にpuromycin, blasticidine Sへの各種耐性遺伝子を内蔵したKOベクターを導入し、puromycin,blasticidine Sなどの他の薬剤で細胞を選別することにより、ホモKO細胞を取得しようとも試みている。特定の遺伝子機能が破壊されたいわゆるKOブタ個体を作成するには、マウスの場合と異なり、in vitroでのホモKO体細胞の作成、その体細胞核移植という経路を辿る。その結果、ミニブタ胎仔性繊維芽細胞(PEF)は、blasticydine S, hygromycin B, zeocin等の様々な薬剤に感受性があった(Sato et al., in press)。なお、予備的な検討では、puromycin等の薬剤では、濃度を高めることで、組換え細胞の死滅が誘導された。通常のKOシステムでは、内在性の標的遺伝子を破壊するために、いわゆるgene targeting (GT)vectorの構築が必要となる。今回細胞表面糖鎖であるα-Galepitopeを合成する酵素α-1,3-GalTをコードする遺伝子を標的とした。GT vectorとしてpuromycin耐性遺伝子(puro)を有するvector pPGalTを構築した。これを腎臓上皮由来細胞に遺伝子導入した(以前は、PEFをドナー細胞に用いていたが、重複の遺伝子導入には耐えられず、不適と判断)。得られたヘテロKO細胞に更にpPGalTを導入し、細胞を高濃度のpuromycinで選別することで、ホモKO細胞を得た(論文作成中)。この場合、ホモKO細胞は、α-Galepitopeを無くすので、それを識別するBS-I-B4レクチンに毒素(saporin)を結合させたIB4-SAPで遺伝子導入後の細胞を処理すると、簡単にホモKO細胞を濃縮出来る。

後は、体細胞核移植経由でブタ個体を作成するのみであるが、与えられた補助金の期限内ではまだ時間が足らなかった。現在、更なる実験を継続中である。