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西田哲学およびバルト神学の継承者としての滝沢克己の思想の総合的研究

1.滝沢克己の中期思想の解明については、「「滝沢哲学」の成立」によって行はれた。しかし『仏教とキリスト教』の積極的な意義の解明については、果たすことができなかった。2.滝沢克己のデカルト哲学およびサルトル哲学の研究の評価については、「ルネ・デカルトと滝沢克己(上、中その1、その2、その3)」および「ジャン=ポール・サルトルと滝沢克己(上)」によって行なはれた3.滝沢克己のカント哲学およびヘーゲル哲学の研究の評価については、「滝沢克己のカント」および「滝沢克己のヘーゲル」によって行われた。4.K.バルトとピェティスムスとの関係を解明することについては、「ヤコービそしてヘーゲルにおけるピェティスムス」によってその究明の入り口まで到達したが、ピェティスムスの視点からバルト神学を考察するところまでには至らなかった。5.滝沢克己と西田幾多郎・京都学派との関係を解明することについては、担当者は「西田幾多郎と滝沢克己」を執筆しながらも完成させることができなかった。まして京都学派との関係については考察できなかった。6.滝沢克己の生涯に関する学術調査については、宇都宮小学校東校、宇都宮高等学校、東京大学、九州大学、山口大学、および各地の公立図書館にて行った。7.滝沢克己に関わるビブリオグラフイについては、「滝沢克己関連書誌」によって刊行書籍についてのみ纏めることができたが、学術論文についてはできなかった。8.今年度は研究の最終年度であるので、研究成果報告書を作成した。1.滝沢克己の生涯に関する調査について:平成15年8月20日同23日、九州大学にて、その学生時代および教官時代の調査を行い、その成績原簿、卒業論文の題目(不明)、勤務に関する記録等を確認できた。9月4日同7日東京大学にて資料を確認し、一高同窓会にて寮関係の資料を購入した。また滝沢克己の姪と甥に面接して聞き取り調査をおこなった。平成16年3月2日同4日まで山口大学及び鳳陽会にて山口高商教官時代の調査を行った。2.滝沢克己の中期思想の解明について:初期を代表する『西田哲学の根本問題』(1936年)及び『カール・バルト研究』(1941年)にて、初期滝沢哲学の輪郭を確認し、中期滝沢哲学の成立に深く関係する『平和はどこから来るか』(1949年)、その内容は実存哲学と史的唯物論との批判とその和解の可能性をバルト神学、西田哲学および聖書の研究を背景にして論じたもの、を読み込み、文字通り滝沢哲学を確立した『現代哲学の課題』(1950年)に至るまでを考察した。3.滝沢克己のデカルト哲学・サルトル哲学の研究について:『平和はどこから来るか』にて実存哲学がとりあげられたが、中期滝沢克己哲学の確立に大きく寄与をなしたのはデカルト哲学研究である。『デカルト「省察録」研究(上)』(1950年)及び『同(中)』(1951年)は画期的なその注釈書である。「近代精神と近代主義」(1950年)にはデカルト哲学研究のエッセンスが述べられている。J.-P.サルトルの《L'etre et le neant》の研究は1951年の初めから始められた。同年の秋の学会では「二つのヒューマニズムと今日の日本」という講演でその成果を披露している。同じ頃スピノザ哲学の研究も始まる。4.滝沢克己のカント哲学・ヘーゲル哲学の研究について:滝沢克己の主要著作を通読し、カントやヘーゲルに関する叙述の箇所をカードに整理し、以降の研究の下準備とした。5.K.バルトに大きな宗教的影響を与えたブルームハルト親子の思想について(特にピエティスムスとの関連で):必ずしもブルームハルト親子はピエティスムスに積極的な評価は与えていない。しかし有限者における絶対者の現象という精神性において彼らは明らかにヴュルテンベルクのピエティスムスの影響を受けている。このヴュルテンベルクの宗教性を論文「ヴュルテンベルクの宗教的風土--その歴史的素描--」において歴史的に通観した。6.滝沢克己と西田幾多郎・京都学派について:「戦時山口時代の滝沢について」という論文を発表している。

1.滝沢克己の生涯に関する学術調査を、研究協力者の前田保とともに、3月9日、10日と、東京大学総合図書館及び同大学法学部事務室、さらに同大学駒場図書館及び同美術博物館(「第一高等学校展」)、同一高同窓会事務所にて、昭和2年の東京帝国大学のこと、大正13年同15年の第一高等学校について行う。本年度の実施計画にあげていた宇都宮市での調査は行うことができなかった。2.滝沢克己の中期思想を画期づける二著作の積極的意義に関しては、『デカルト「省察録」研究』のみ--ただしこの著作だけでなくこの時期の滝沢克己のデカルトに関する全ての論稿にまで対象を広げた--を取り上げることができたにすぎない。従って『仏教とキリスト教』について、またそのサルトル哲学研究の意義の解明については次年度にまわさざるをえなくなった。3.滝沢克己のカント・ヘーゲル哲学の研究について:初期ヘーゲルが滝沢克己に与えた影響を『現代哲学の課題』に探り、その研究成果を紀要論文にまとめた。滝沢克己のカント哲学研究に関しては、研究の端緒についたばかりで未だ成果をまとめるにはいたっていない。4.K.バルトに大きな影響を与えたブルームハルト親子の思想について(特にピエティスムスとの関連で):現在、ピエティスムス的信仰を哲学的に表現したヤコービの哲学を中心に、ピエティスムス全般について研究している。夏にはその成果を学会で発表する予定である。また、本年度中にその成果を論文にまとめるつもりでもある。ブルームハルト親子の思想については、ピエティスムスの研究を土台にして研究にとりかかっている段階である。5.滝沢克己と西田幾多郎・京都学派について:本年度は滝沢と西田の思想的対決の真相を探ることを主眼に研究を進めた。その成果を著作『西田幾多郎と滝沢克己...交流の真実』(平成17年5月または6月に出版予定)にまとめている。1.滝沢克己の生涯に関する学術調査については、協力者前田保と3月1日および2日宇都宮市の宇都宮小学校東校、宇都宮高等学校、同県立図書館、同市立図書館にておこなう。2.滝沢克己のデカルト哲学・サルトル哲学研究の評価については、『デカルト「省察録」の研究』を詳細に紹介した「ルネ・デカルトと滝沢克己(中その二、その三)によって、また「ジャン=ポール・サルトルと滝沢克己(上)」によってほぼおこなった。特に前者に時間をとられ『仏教とキリスト教』の積極的な意義の解明については行うことができなかった。3.そのカント哲学研究の評価については、「滝沢克己のカント」で行うことができた。また「バルトとピエティスムスとの関係」については、「ヤコービそしてヘーゲルにおけるピエティスムス」でその究明の入り口にまで到達したが、ピエティスムスの視点からバルト神学を考察するところまではいけなかった。4.「滝沢克己と西田哲学・京都学派」については、担当執筆者は「西田幾多郎と滝沢克己」を執筆しつつも完成させることができなかった。滝沢克己の中期思想の成立の解明に別の角度から照明するものであったのだが。5.滝沢克己に関わる研究書誌については、「滝沢克己関連書誌」によって刊行書籍についてはまとめることができたが、論文についてはまとめることができなかった。
非B非C肝発癌に対する腸内細菌を用いた予防効果の検討

ウイルス性肝炎のない非B非C肝癌が増加しており、NASH由来の肝細胞癌が原因と考えらえている。NAFLD/NASHの病態は未だ不明な部分も多く、NASH由来の肝細胞癌についても同様である。我々はこれまでにNASHと腸内細菌由来のエンドトキシン(ET)との関係について検討を行ってきた。本研究では、NAFLD病態を認める肝発癌マウスモデルの作成および、同マウスモデルを用いて非B非C肝癌の腸内細菌による発癌予防に焦点を当てて研究を行う。
ヒト角膜内皮細胞における発現遺伝子の分子生物学的機能解析

ヒト角膜内皮細胞からmRNAを抽出し、作成したヒト角膜内皮細胞cDNAライブラリーの中で、発現率の高いDDB2 (damaged DMA-binding protein 2)に着目した。培養ヒト角膜内皮細胞(HCEC)を用いて、紫外線照射後のNER関連遺伝子の発現をRNase protection assayにて検討したところ、紫外線障害時には速やかにNER関連遺伝子の発現増加が認められ、それらの中でDDB2は最も発現増加率が高かった。さらにDDB2発現アデノウイルスベクターを用いて培養ヒト角膜内皮細胞にDDB2を感染させ、紫外線照射後のDNA修復活性を検討したところ紫外線障害DNA修復が有意に促進された。以上より、ヒト角膜内皮において多く発現するDDB2は、紫外線照射時にはさらに発現を増加させ、紫外線障害DNA修復の一役を担っていると考えられた。次に角膜内皮細胞より得られた新規DDB2スプライシングバリアント(D1-D4)を同定し、紫外線障害DNA修復における機能とそのメカニズムについて分子生物学的検討を行った。スプライシングバリアントを同定し、D1-D4発現プラスミドを作成し、リポフェクション法にてHeLa細胞にD1-D4を一過発現させた条件下において、紫外線障害DNA修復を検討したところ、D1、D2において修復抑制効果が認められた。免疫沈降法を用いた検討では、DDB2-WTはDDB1と結合し、さらにWT同志で結合することが示された。一方D1、D2はDDB1とは結合しなかったが、D1においてはDDB2-WTとの結合が認められ、DDB2-WTとD1のDDB1への競合阻害がDNA障害修復抑制の原因である可能性が示唆された。正常角膜内皮細胞に関する遺伝子情報は、角膜内皮細胞の機能を明らかにするためにも、また遺伝子異常に基づくヒト角膜内皮疾患の研究にとっても不可欠である。そこで我々は、アメリカアイバンクの協力を得て、ヒト角膜内皮細胞からmRNAを抽出し、2663個の遺伝子情報よりなるヒト角膜内皮細胞cDNAライブラリーを作成した。次にこれらの遺伝子をもとに作成されたライブラリーのなかで新規の遺伝子であり、かつ角膜内皮細胞に発現率の高いもの(GS3582=遺伝子発現数21個他の全身臓器、組織で発現した全遺伝子数に占める角膜内皮遺伝子における遺伝子発現率75%)につき、遺伝子のクローニングを行った。別に作成したphage cDNAライブラリーより、角膜内皮細胞genesigniture(GS)前後の配列を決定することができた。これまで本配列と完全に一致する配列の報告がなかったため、Gene Bankに登録した(登録番号Af484960)。DDB2(damaged DNA-binding protein 2)も角膜内皮細胞における発現率の高い遺伝子であり、DNA障害の修復にかかわる蛋白である。角膜は日常的に紫外線に曝され、DNA障害を受ける可能性がある。そこで角膜内皮細胞における機能解析を行うために、まず角膜内皮細胞におけるDDB2のcDNAの全長を検討した。結果として従来の配列のものに加えて、選択的スプライシングにより生成される4つの派生体を同定した。FLAGタグを付加した派生体タンパク質をHeLa細胞にて発現させ共焦点レーザー顕微鏡にて細胞内局在を検討したところ、これらすべてが核に局在することが明らかとなった。
腫瘍内エピゲノム不均一性を解明する1細胞クロマチン構造解析技術の開発

エピゲノムの異常をターゲットとした創薬の開発が期待される一方、多種多様なヒストンマークを1つずつ調べる従来の手法では、エピゲノムの全体像を理解することは難しい。そこで本研究では、オープンクロマチン領域をゲノムワイドで検出するATAC-seqという技術に改良を加え非常に少数の細胞を用いたクロマチン構造解析を行った。細胞数の限られる成人T細胞白血病(ATL)の臨床サンプル30例のクロマチン構造を健常人サンプルと比較解析することでATLで特異的に機能が亢進している転写因子と、機能が減弱している転写因子の絞り込みを行った。エピゲノム制御の異常は発がん及び薬剤抵抗性に大きな影響を及ぼすことが示唆される一方、その一因となる腫瘍内のエピゲノム不均一性を解明する解析手法は開発途上である。本研究課題では1細胞クロマチン構造解析法を開発し、それを用いて治療抵抗性を持つ腫瘍細胞で共通しているクロマチン構造を同定、そこから治療抵抗性に重要な役割を果たす領域、およびその領域に機能すると考えられる転写因子の同定を目指す。また、並行してシークエンス効率を上げるためにミトコンドリアDNAを特異的に排除する手法を開発し、1細胞クロマチン構造解析の効率化を目指す。初年度は1細胞クロマチン構造解析技術の開発およびミトコンドリアDNAを特異的に排除する手法の開発を行った。一般的にクロマチン構造解析では1×10の6乗オーダー以上の細胞数を必要とするが、最近開発されたATAC-Seq (Assay for Transposase Accessible Chromatin using sequencing)法により、500個程度の細胞から約3時間でDNAの断片化が終了し、そのDNA断片の配列を解析することでオープンクロマチン領域の検出が可能となった。そこでATAC-seqをさらに改良し、またFluidigm社のマイクロフルイディクスを用いることで1細胞からのクロマチン構造データを取得することに成功した。ミトコンドリアDNAを特異的に排除する方法としてin vitroで合成したミトコンドリアDNAに相補的な配列を持つRNAの合成を現在行っている。当初の研究計画通り、初年度は1細胞クロマチン構造解析法の開発に成功した。他の研究室との共同研究も進み、ATAC-seqを用いてiPS細胞から心筋や血液へ分化する際のクロマチン構造解析も行った。これらの研究成果を第40回内藤コンファレンスにて報告した。また、共同研究者として論文がCell Reports誌にアクセプトされた。なお、平成28年1月より産休・育休のため研究中断期間に入っており、中断期間が終了次第研究を再開する。本年度は4-6月の研究中断を経て、7月に研究復帰した。昨年度から立ち上げを行っていた、少ない細胞からのクロマチン構造解析技術を用いた京都大学iPS細胞研究所での共同研究が4報発表になった。また、シーケンサーから出る膨大なデータの解析手法の習得が必須となり、2016年7月より京都大学iPS細胞研究所から京都大学大学院医学研究科に籍を移し、研究を継続している。医学研究科に移籍後は、成人T細胞白血病(ATL)の発症分子メカニズムの解明にオープンクロマチン解析の技術を用いている。成人T細胞白血病はヒトT細胞白血病ウイルスが原因により発症する白血病であるが、感染者のうち白血病を発症する割合は数%である。そこで昨年度から立ち上げを行っていた少ない細胞からのATAC-seq法を活用し、ATL細胞のオープンクロマチン状態の解析を行った。具体的には、ATL6症例と比較対照用の健常人5例、ATLの細胞株3種類のATAC-seqデータを取得し解析した。その結果、ATLの細胞では、健常人のサンプルと比較してクロマチンの状態が大きく異なり、ATL特異的なクロマチンの状態であることがわかった。さらに詳細な解析によりATL細胞のクロマチンにはforkhead box (FOX)transcription factor familyの1つである転写因子のモチーフが濃縮していることを明らかにした。またATLのクロマチンの状態はATL特異的なもので、健常人と大きく変化していることも明らかにした。次年度はこのデータをもとに、ChIP-seqやノックダウン実験で検証を進めていく。本年度は4報の共同研究に貢献した。本年7月の研究復帰後に開始した成人T細胞白血病(ATL)のクロマチン構造解析により、以下の2点を明らかにした。(ア)ATL症例でのみクロマチンがオープンとなっている領域が約3000箇所あることを明らかにした。そして、この領域をゲノム情報解析ツールの一つであるGREAT (Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool)を用いたOntology解析を行うと、ATL特異的に発現上昇する遺伝子近傍にオープンクロマチンが濃縮していることを明らかにした。この結果はATL発症時では、ATL特異的なクロマチン状態をとっていることを強く示唆する。(イ)次に、ATL特異的にオープンとなっている領域をHomer (Heinz et al., Mol. Cell, 2010)を用いて、モチーフ解析した。その結果、オープン領域にはforkhead box (FOX)transcription factor familyの転写因子のモチーフが高い有意性をもって濃縮していることを明らかにした。次年度は上記のデータをもとに、ChIP-seqやノックダウン実験など、検証実験を行っていく。本研究ではがん細胞におけるエピゲノムの不均一性を調べるために、シングルセルレベルでのオープンクロマチン解析を目指し手法の開発を進めた。ATAC-seq法を改良した結果1000細胞という非常に少量の細胞からのオープンクロマチン解析が可能となり、貴重なサンプルを用いたオープンクロマチンの解析が可能となった。

本研究の後半はこの技術を用い、貴重な細胞でのクロマチン構造解析に焦点を当て研究を進めた。成人T細胞白血病(ATL)はヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV-1)により引き起こされる予後不良な白血病である。ATLでは網羅的なクロマチンの構造解析が行われておらず、本研究ではATAC-seq法を用いてエピゲノムの構造異常の解析を行った。平成29年度をもってATL30症例と比較対照用の健常人9例、またATLと同様にヒトT細胞白血病ウイルスにより引き起こされるHTLV-1関連脊髄症(HAM)7例のATAC-seqデータの取得を完了した。これらの実験では、ATL症例という細胞数が限られたサンプルを使って実験を行う。そのためこれらの実験には初年度に確立させた"少数の細胞からのクロマチン構造解析技術"の有用性が高い。また、本研究に必須であるHTLV-1ゲノムにコードされるウイルスたんぱく質がATL発症にどのような影響を与えているのという知見をまとめた総説がFrontiers in Microbiologyに掲載された。現在膨大なシークエンスデータの解析により、ATL発症に関わると推定される転写因子の絞り込みが完了し、実験的な検証の準備を開始している。今後はこの転写因子のノックダウン実験を行うなど、実験的にさらなる検証を行いATL発症機序の解明を目指す。また同じウイルスが原因で引き起こされるにも関わらず全く異なる病態を示すATLとHAMにはクロマチン構造に違いがあることが明らかとなった。今後はATLとHAMという違いを引き起こす因子の同定を目指し、さらなる解析を進める。エピゲノムの異常をターゲットとした創薬の開発が期待される一方、多種多様なヒストンマークを1つずつ調べる従来の手法では、エピゲノムの全体像を理解することは難しい。そこで本研究では、オープンクロマチン領域をゲノムワイドで検出するATAC-seqという技術に改良を加え非常に少数の細胞を用いたクロマチン構造解析を行った。細胞数の限られる成人T細胞白血病(ATL)の臨床サンプル30例のクロマチン構造を健常人サンプルと比較解析することでATLで特異的に機能が亢進している転写因子と、機能が減弱している転写因子の絞り込みを行った。今後はATAC-seqを用いて腫瘍細胞および、薬剤耐性を持つ腫瘍細胞のクロマチン状態のデータを収集する。その後、得られたデータを用いてOntology解析及びGenomatixを用いたモチーフ解析を行い、治療抵抗性に重要な役割を持つと考えられる転写因子の同定・機能解析へ向けた検討を行う。平成28年度にATL症例を用いたATAC-seqのデータから絞り込まれた「ATL細胞で重要な機能を果たしていると考えられる転写因子」のノックダウン実験やChIP-seqを行う。またこの転写因子はforkhead box(FOX)
ゲノムを基盤とする植物生理学に関する日仏共同研究

本研究は、近年急速な勢いで蓄積されつつあるシロイヌナズナやイネなどの高等植物のゲノム情報及び各種突然変異体を有効に活用し、これまで本分野について多くの研究実績及び研究交流がある日仏双方の研究者が、互いの材料・情報・技術・知識を持ち寄り、植物生理学上の重要な問題を解明するために企画された国際学術研究(国際共同研究)であり、採択時に科学研究費補助金の枠組みの変更に伴って基盤研究へと変更されたものである。本研究で取り上げた主要な生理反応は、胚発生、維管束形成、花成誘導、自家不和合性等であり、このような多様な生理反応の基盤となっている細胞分裂、細胞構築、細胞死等の細胞レベルでの研究、ならびに、このような生理反応を制御している主要な因子である植物ホルモンの生合成、細胞内情報伝達、生物時計等についても研究を実施した。また、このような研究の社会的利用場面として、遺伝子組換え植物を利用した有用農作物、有用二次代謝物生産植物、環境修復用植物の開発も進められていることから、そのような応用研究についても日仏双方の抱えている問題点を意識しつつ共同研究を実施した。3年間の共同研究により、植物ホルモンの1種であるアブシジン酸(ABA)の生合成経路の律速段階の酵素遺伝子の同定・単離、ABAの細胞内情報伝達因子の同定・単離・胚特異的遺伝子の同定・単離とその発現制御機構、オーキシン、サイトカイニン、ブラシノステロイド等の植物ホルモンによって発現が制御される遺伝子と生理反応の関係、胚発生、維管束形成、花芽形成等を制御している遺伝的プログラムの概要、遺伝子組換え農作物の新しい検知方法の開発等多くの研究成果が得られた。平成13年秋には、関係する日仏双方の研究者が一堂に会する日仏合同会議をフランスにて開催し、本研究によって得られた研究成果の報告及び討議を行うと共に、今後の共同研究の実施策等についても協議した。シロイヌナズナとイネで蓄積されつつあるゲノム情報を活用し、日仏共同で形態形成を中心に植物の各種生理反応の分子機構解析を行った。植物ホルモンの一種であるアブシジン酸(ABA)の生合成の最終反応を触媒する酵素遺伝子の単離に成功し、その特性を明らかにした。また、胚特異的なABA情報伝達因子であるABI3/VP1のニンジンホモローグ(C-ABI3)を単離し、その発現解析を行うと同時に、培養細胞で異所的に過剰発現させることで、ABA処理によって乾燥耐性を誘導できることを明らかにした。さらに、シロイヌナズナのT-DNAタグライン10000系統をスクーニングし、ABA感受性は示すが、種子休眠性が低下している変異体を2系統選抜することに成功した。一方、シロイヌナズナで単離された胚の形態形成制御遺伝子であるLeclのニンジンホモローグ(C-Lec1)を単離し、ニンジンの種子胚および不定胚における発現特性を解析し、本因子がニンジンにおいても胚発生の中期過程を制御する胚特異的な転写制御因子として機能する可能性を示した。維管束における主要な構成細胞である環状要素の分化については、ファージディスプレイ法によって単離したCN8抗体を用いることで、細胞壁成分の極性が存在することを明らかにするとともに、2次細胞壁合成直前に多量に蓄積するブラシノステロイドが環状要素の分化を誘導することを明らかにした。一方、花芽形成については、典型的な短日植物であるアサガオ品種紫から単離された光周的花成誘導に関連する時計制御遺伝子を短日植物であるタバコ品種メリーランドマンモスに導入して過剰発現させたところ、長日条件下でも早期に花芽が形成されることが明らかとなり、この遺伝子が光周的花成誘導おいて重要な役割を果たすことが明らかとなった。

また、ペプチド性植物増殖因子PSKについても、PSKが影響を及ぼす細胞分裂制御因子の候補が決まりつつある。シロイヌナズナとイネで蓄積されつつあるゲノム情報を活用し、日仏共同で形態形成を中心に植物の各種生理反応の分子機構解析を行った。植物ホルモンの一種であるアブシジン酸(ABA)の生合成の最終反応を触媒する酵素遺伝子の詳細な発現解析を行った。また、胚特異的にABA誘導的に発現するニンジンの数種DcECP遺伝子についてそのプロモーター領域の詳細な解析を行い、DcECP31については、シス領域として3種類のABA responsive elements(ABRE)を決定し、その相互関係を明らかにすると共に、このシス領域に結合するトランス因子の候補遺伝子を単離した。一方、胚特異的なABA情報伝達因子であるシロイヌナズナのABI3およびニンジンホモローグであるC-ABI3についてそのプロモーター領域の詳細な解析を進め、C-ABI3のシス領域を決定し、このシス領域に結合するトランス因子の単離を進めている。一方、ニンジンにおける胚の形態形成制御遺伝子であるC-Lec1についてその時空間的な詳細な発現解析を行い、ECPsの発現調節におけるC-ABI3とC-Lec1の相互作用について検討した。さらに、多数の突然変異体が単離されているシロイヌナズナを有効に利用するため、シロイヌナズナを用いて体細胞不定胚誘導系の開発を行い、連続的不定胚誘導法および植物ホルモンを用いないストレス不定胚誘導法の開発に成功した。維管束における主要な構成細胞である環状要素の分化に異常をきたした突然変異体の単離や環状要素形成時に見られるプログラム細胞死を引き起こす因子の単離に成功した。一方、花芽形成については、短日植物であるアサガオ品種紫から単離された光周的花成誘導に関連する時計制御遺伝子のシロイヌナズナホモローグを単離し、その構造解析、発現解析、機能解析を進めた。特に、PnC401のシロイヌナズナホモローグであるAtC401についてはその蛋白質がリン酸化されることを明らかにした。シロイヌナズナやイネ等で蓄積されつつあるゲノム情報及び各種突然変異体を有効に活用し、形態形成反応を中心とする高等植物の各種生理反応について、その分子機構を日仏共同で研究した。植物ホルモンであるアブシジン酸(ABA)の生合成についてはその最終段階の反応を触媒する酵素について、生化学的・遺伝学的・分子生物学的解析を進め、シロイヌナズナの当該遺伝子を同定・単離し、その発現についても全容を明らかにした。ABAに対する応答・情報伝達に関しては、ニンジン不定胚形成系を活用し、胚特異的にABA依存的に発現するECP遺伝子群のプロモーターを詳細に解析し、その応答に必須なシス配列を同定するとともに、そのシス配列に結合するトランス因子及びトランス因子に結合する転写調整因子等も明らかにした。また、高温発芽性を示すシロイヌナズナ突然変異体を探索し、ABAとの関連を明らかにすると同時に、その原因遺伝子の単離を進めた。一方、シロイヌナズナのマイクロアレーを活用し、オーキシンにより極めて短時間に発現誘導されるシロイヌナズナ遺伝子、ストレスによる不定胚形成能獲得時に発現するニンジン遺伝子等多くの遺伝子を同定した。さらに、シロイヌナズナの子葉における葉脈形成に異常を示す突然変異体を探索し、この変異体が維管束の連続的形成に異常を持つことを明らかにし、その原因遺伝子の単離を進めた。
生体内における皮膚ストローマ細胞の形態と機能の解析

1.ストローマ細胞に対するモノクローナル抗体の作成ストローマ細胞をラットで免疫し,通常の方法でモノクローナル抗体を作成することを試みているが,スクリーニングに際してストローマ細胞に特異的い染まる抗体を得るのが困難で,いまだ満足すべきモノクローナル抗体を作成するに至っていない.2.ストローマ細胞のSCIDマウス生体内での分布と形態の観察.ストローマ細胞株を蛍光色素で標識し,SCIDマウスに注入し,継時的に薄切切片を作成してその皮膚における分布ならびに形態を蛍光顕微鏡あるいは共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察することを試みているが,in vitroにおいて蛍光色素でストローマ細胞を染色し得ても,それをin vitroに戻した際,すぐに蛍光色素が代謝されてしまい,in vivoでのストローマ細胞の観察はうまくいっていない.3.三次元培養系でのストローマ細胞の培養と,免疫担当細胞との相互作用間質細胞株をコラーゲン等の細胞間基質を含んだ半固形培地内で培養し,とり得る形態を位相差ないし電子顕微鏡で観察する.人口真皮を用いて,その上にストローマ細胞株をsuspensionにしてその上に播き,通常の培地で培養後固定,観察したが,こうした条件下ではストローマ細胞は膠原線維上に点状に分布し,明瞭な形態をとらなかった.1.ストローマ細胞に対するモノクローナル抗体の作成ストローマ細胞をラットで免疫し,通常の方法でモノクローナル抗体を作成することを試みているが,スクリーニングに際してストローマ細胞に特異的い染まる抗体を得るのが困難で,いまだ満足すべきモノクローナル抗体を作成するに至っていない.2.ストローマ細胞のSCIDマウス生体内での分布と形態の観察.ストローマ細胞株を蛍光色素で標識し,SCIDマウスに注入し,継時的に薄切切片を作成してその皮膚における分布ならびに形態を蛍光顕微鏡あるいは共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察することを試みているが,in vitroにおいて蛍光色素でストローマ細胞を染色し得ても,それをin vitroに戻した際,すぐに蛍光色素が代謝されてしまい,in vivoでのストローマ細胞の観察はうまくいっていない.3.三次元培養系でのストローマ細胞の培養と,免疫担当細胞との相互作用間質細胞株をコラーゲン等の細胞間基質を含んだ半固形培地内で培養し,とり得る形態を位相差ないし電子顕微鏡で観察する.人口真皮を用いて,その上にストローマ細胞株をsuspensionにしてその上に播き,通常の培地で培養後固定,観察したが,こうした条件下ではストローマ細胞は膠原線維上に点状に分布し,明瞭な形態をとらなかった.
日本とアメリカの数学教育における「授業研究」に関する比較研究

本研究は、算数科の「授業研究」に関する目的、役割・機能について、日本とアメリカの実際の「授業研究」をもとに詳細に分析するものである。平成15年度は、日本の小学校で行われている算数科の「授業研究」を収集した。具体的には、甲府市立琢美小学校、境川村立境川小学校、竜王町立竜王小学校、新宿区立市谷小学校の校内研究会を分析した。特に、甲府市立琢美小学校と新宿区立市谷小学校では、共同研究者及び海外共同研究者を交えた授業研究会を行い、授業の展開、協議会の内容について分析した。そこでは、日本の教師が教材の内容と共に子どもの活動について授業観察を行い、授業後の協議会でも教材の価値を子どもの反応から捉えていることが分かる。尚、ここで観察した授業、および、協議会の内容はプロトコールを作成し、映像はDVD化している。アメリカで行われている算数科の「授業研究」については、平成15年8月にシカゴ日本人学校で行われた授業研究会、平成16年5月にニュージャージー州パターソン公立学校、デュビューク地区授業研究会、サンノゼ地区授業研究会に参加し、アメリカの教師の授業や授業参観に関する資料を収集した。平成16年度は、新宿区立市谷小学校で行われた6年生の授業及び協議会は、DVD英訳化の映像を作成した。また、シカゴの4年生の授業及び協議会も同様にDVD日本語訳化の映像を作成した。これらのDVDによって、日本とアメリカの授業について、アメリカの教師と日本の教師が「授業研究」に関する観察や分析の視点などについてアンケート調査を行い、日米教師の比較研究を行った。この比較分析を通して、日本の算数科授業の改善に関する具体的な指針を明らかにすることができた。本年度は、小学校段階における授業研究に焦点を当てて研究する。日本で行われている算数科の「授業研究」は、甲府市立琢美小学校、境川村立境川小学校、竜王町立竜王小学校、新宿区立市谷小学校の校内研究会を分析した。特に、甲府市立琢美小学校と新宿区立市谷小学校は、共同研究者及び海外共同研究者を交えた授業研究会を行い、授業の展開、協議会の内容について分析した。アメリカで行われている算数科の「授業研究」については、2003年8月にシカゴ日本人学校で行われた授業研究会に参加し、アメリカの教師の授業観察に関する資料を収集した。そこでは、教材を中心に話し合われることが多く、子どもの活動については関心が低かった。また、Chicago Lesson Study Groupが行った授業及び協議会をビデオで撮影し、DVD化した。また、来年度の研究のために、新宿区立市谷小学校で行われた6年生の授業及び協議会は、英語訳を作成し、DVDに英語字幕をつけている。シカゴの4年生の授業及び協議会は、日本語訳を作成し、DVDに字幕を入れている。これは、日本とアメリカの授業について、アメリカの教師と目本の教師が「授業研究」に関するの観察や分析の視点などについて比較研究を行うためである。そこでの比較分析を通して、日本の算数科・数学科の授業改善の具体的な指針を探る。

特に、甲府市立琢美小学校と新宿区立市谷小学校では、共同研究者及び海外共同研究者を交えた授業研究会を行い、授業の展開、協議会の内容について分析した。そこでは、日本の教師が教材の内容と共に子どもの活動について授業観察を行い、授業後の協議会でも教材の価値を子どもの反応から捉えていることが分かる。尚、ここで観察した授業、および、協議会の内容はプロトコールを作成し、映像はDVD化している。アメリカで行われている算数科の「授業研究」については、平成15年8月にシカゴ日本人学校で行われた授業研究会、平成16年5月にニュージャージー州パターソン公立学校、デュビューク地区授業研究会、サンノゼ地区授業研究会に参加し、アメリカの教師の授業や授業参観に関する資料を収集した。平成16年度は、新宿区立市谷小学校で行われた6年生の授業及び協議会は、DVD英訳化の映像を作成した。また、シカゴの4年生の授業及び協議会も同様にDVD日本語訳化の映像を作成した。これらのDVDによって、日本とアメリカの授業について、アメリカの教師と日本の教師が「授業研究」に関する観察や分析の視点などについてアンケート調査を行い、日米教師の比較研究を行った。この比較分析を通して、日本の算数科授業の改善に関する具体的な指針を明らかにすることができた。
理科における認知的能力, 実験に関する能力および科学的態度の相互関連に関する研究

理科の「応用」・「高次の過程・「実験観察の技能」の3つの目標領域での児童・生徒の到達度と科学的な態度との関連を調べること,また,上の3つの目標領域の成績が15年前に比べてどうなっているかを調べることが主目的であった.調査の対象は小学校4年の児童と中学校2年の生徒それぞれ1500人とし, 20の都道府県から選んだ.また,調査は昭和62年23月に実施した.その結果,主に次のようなことがわかった.(1)理科の成績と児童・生徒の背景に関する質問紙項目との関連をみると,「将来の進学計画(希望)」(中学校)との相関がかなり高く,自己評価による「理科の成績」,「数学(算数)の成績」,「家庭の蔵書数」などとの相関も小・中学校ともに高い.」(2)理科の成績と学習に関する質問紙項目との関連をみると,小学校では,「教科書の使用」,「楽しい理科の授業」,「理科の試験」,「児童実験」および「グループ実験」などが相関があり,中学校では,「理科の試験」,「グループ実験」などが相関がある.(3)小学校の理科の成績と態度尺度との関連をみると,総得点および目標領域などの部分得点と「学校に対する好悪」の尺度との相関がかなり高く,「科学に対する価値観」尺度との相関は低い.また,中学校では,「理科への興味尺度」との相関が高く,「科学的職業に対する好悪」尺度との相関が低い.(4)理科の成績について15年前と比べると,小学校では「応用」,「高次の過程」のそれぞれの目標領域でも,これらの全体でも変化がない.また,中学校では「応用」,「高次の過程」,「実験」のそれぞれの目標領域でもこれらの全体でも変化がない.理科の「応用」・「高次の過程・「実験観察の技能」の3つの目標領域での児童・生徒の到達度と科学的な態度との関連を調べること,また,上の3つの目標領域の成績が15年前に比べてどうなっているかを調べることが主目的であった.調査の対象は小学校4年の児童と中学校2年の生徒それぞれ1500人とし, 20の都道府県から選んだ.また,調査は昭和62年23月に実施した.その結果,主に次のようなことがわかった.(1)理科の成績と児童・生徒の背景に関する質問紙項目との関連をみると,「将来の進学計画(希望)」(中学校)との相関がかなり高く,自己評価による「理科の成績」,「数学(算数)の成績」,「家庭の蔵書数」などとの相関も小・中学校ともに高い.」(2)理科の成績と学習に関する質問紙項目との関連をみると,小学校では,「教科書の使用」,「楽しい理科の授業」,「理科の試験」,「児童実験」および「グループ実験」などが相関があり,中学校では,「理科の試験」,「グループ実験」などが相関がある.(3)小学校の理科の成績と態度尺度との関連をみると,総得点および目標領域などの部分得点と「学校に対する好悪」の尺度との相関がかなり高く,「科学に対する価値観」尺度との相関は低い.また,中学校では,「理科への興味尺度」との相関が高く,「科学的職業に対する好悪」尺度との相関が低い.(4)理科の成績について15年前と比べると,小学校では「応用」,「高次の過程」のそれぞれの目標領域でも,これらの全体でも変化がない.また,中学校では「応用」,「高次の過程」,「実験」のそれぞれの目標領域でもこれらの全体でも変化がない.1.教育的ねらい(目標)としての「応用」と「高次の過程(科学的思考)」に属する問題各10題および「実験観察の技能」の問題10題、総計で30題をそれぞれ小学校4年生用、中学校2年生用として作成した。(約半数の問題についてはIEA理科調査の問題を参考にした。)2.一方、児童・生徒の背景(となる要因)、科学的態度、学習に関すること、および科学観を調べる質問項目として、小学校4年生用34問、中学校2年生用55問をIEA理科調査の質問紙項目を参考にして作成した。3.調査対象として、小・中学校とも20都県から各2校1学級を選んで、約1500人に、2月3月に調査を実施した。4.現在、調査用紙をすべて回収し、集計にかかったところである。5.来年度は、調査結果を分析検討し、理科の高次の過程に属する領域についての児童・生徒の学習到達度とそれに影響をおよぼすと思われる諸要因との関連を明らかにする予定である。
腎癌の新しい腫瘍マーカー

ネフロカルチンは腎結石の再発予防の研究中に発見された糖蛋白で蓚酸カルシウム結晶の成長を抑制する。本物質が腎細胞癌の原発巣および骨転移巣の細胞培養液から分離・精製されたことにより、腎癌患者の尿中ネフロカルチンをELISA法を用いて測定した。測定法はネフロカルチンをウサギの皮下に注射し、血液から抗体を精製した。精製IgGはネフロカルチンとは反応するが、アルブミンやTamm-Horsfall蛋白とは反応しなかった。このIgGを使って、尿中にネフロカルチンを、直接ELISA法で測定した。すなわち、ウサギに対するヤギの抗体を第二抗体として使い、ABC法により、horseradish peroxidaseと過酸化水素を加えて、オルト・フェニレンジアミンと共役させる。オルト・フェニレンジアミンの酸化による発色の強度を470nmで測定した。その結果、腎細胞癌患者の尿中ネフロカルチン値は対照例に比して統計学的に有意に上昇を認めた。スポット尿では、その陽性率は63%であった。また、根治的腎摘除前後の尿中ネフロカルチン値の変動をみると有意に減少した。19例中14例で減少を認められた。なお、尿中ネフロカルチン濃度と血中ネフロカルチン濃度とは相関関係があった。この点についてはさらに検討中である。これらの結果より尿中ネフロカルチンは腎細胞癌の治療効果判定の指標になりうることが示唆された。
リーラーマウスにおける三叉神経運動核および中脳路核ニューロンの細胞移動障害

リーラー奇形マウス(以下リーラーreeler,rl/rl)では、咀嚼筋を支配する三叉神経運動核ニューロンや咀嚼筋の深部知覚を支配する三叉神経中脳路核ニューロンの移動が障害され、これらのニューロンが異所性に存在する。そこで胎児期および生後幼若期のリーラーおよび正常マウスの三叉神経運動核ニューロンおよび中脳路核ニューロンの移動に対するリーラー遺伝子座の作用を検討した。生後各時期のリーラーおよび対照動物の顎二腹筋前腹および側頭筋にファーストブルーを注入し、12-48時間後、パラホルムアルデヒドにて潅流固定した。脳の完全連続凍結切片を作成し、蛍光顕微鏡にて、標識された三叉神経運動核および中脳路核ニューロンを蛍光観察し、写真撮影した。正常マウスおよびリーラーマウスともに、側頭筋注入例では三叉神経運動核に、顎二腹筋前腹注入例では副三叉神経核に標識ニューロンがあったが、リーラーマウスの標識ニューロンはより内方の異常な位置に存在した。また側頭筋注入例では、正常マウスおよびリーラーマウスともに三叉神経中脳路核ニューロンが標識されたが、正常マウスに比較してリーラーマウスの標識三叉神経中脳路核ニューロンはより広い領域に分布した。リーラーマウスの顔面神経核ニューロンも異所性に存在することより、鰓弓に由来する運動ニューロン(顔面神経核、三叉神経運動核)の細胞移動に、リーリン遺伝子産物が関与していることが明かとなった。そこで、もう一つの鰓弓由来運動ニューロンである疑核ニューロンに細胞移動障害があるかどうか、調べる必要がある。また三叉神経中脳路核ニューロンが異所性に存在することより、神経堤に由来して二次的に脳内に進入するニューロンもリーラー遺伝子により影響されることがわかった。指に外奇形をもつハンマーツ-(Hammer-toe,Hm)マウスをジャクソン研究所より新たに導入し、リーラーヘテロマウス(rl/+)とハンマーツ-ヘテロマウス(Hm/+)を交配して、ダブルヘテロミュータント(Hm/+,rl/+)を作成した。このダブルヘテロミュータントのペア-を交配して得るF1は、指が正常であるならばリーラーで(+/+,rl/rl)、指が奇形であるならばリーラーではない(Hm/?,+/?)ので、実験の効率が著しく改善した。こうして作成したリーラーマウスとハンマーツ-マウスのダブルヘテロミュータントを交配し、腟栓確認後12-19日に母マウスを開腹し胎児を得た。胎児をパラホルムアルデヒドにて潅流固定し、三叉神経運動根を剖出して、ここにカルボシアニン系蛍光色素Dilの微小な結晶をタングステン針を用いて置いた。2週から6箇月後、マイクロスライサ-を用いて脳の連続切片を作成し、標識三叉神経運動核および中脳路核ニューロンを蛍光顕微鏡にて観察した。標識された三叉神経運動核ニューロン(特に腹内側亜核あるいは副三叉神経核accessory trigeminal nucleus)は、リーラーマウスでは正常マウスに比較して、背腹方向に広く分布した。また中脳神経堤に由来する三叉神経中脳路核ニューロンは、リーラーでやはり吻尾方向に広く分布した。以上より、三叉神経運動核および三叉神経中脳路核ニューロンは、胎生期に既に異常位置を占めていることが判明した。以上よりリーラー遺伝子座は、三叉神経運動核(の少なくとも一部)のニューロンの細胞移動と、三叉神経中脳路核ニューロンの細胞移動に関与していることあ、明らかとなった。

リーラー奇形マウス(以下リーラーreeler,rl/rl)では、咀嚼筋を支配する三叉神経運動核ニューロンや咀嚼筋の深部知覚を支配する三叉神経中脳路核ニューロンの移動が障害され、これらのニューロンが異所性に存在する。そこで胎児期および生後幼若期のリーラーおよび正常マウスの三叉神経運動核ニューロンおよび中脳路核ニューロンの移動に対するリーラー遺伝子座の作用を検討した。生後各時期のリーラーおよび対照動物の顎二腹筋前腹および側頭筋にファーストブルーを注入し、12-48時間後、パラホルムアルデヒドにて潅流固定した。脳の完全連続凍結切片を作成し、蛍光顕微鏡にて、標識された三叉神経運動核および中脳路核ニューロンを蛍光観察し、写真撮影した。正常マウスおよびリーラーマウスともに、側頭筋注入例では三叉神経運動核に、顎二腹筋前腹注入例では副三叉神経核に標識ニューロンがあったが、リーラーマウスの標識ニューロンはより内方の異常な位置に存在した。また側頭筋注入例では、正常マウスおよびリーラーマウスともに三叉神経中脳路核ニューロンが標識されたが、正常マウスに比較してリーラーマウスの標識三叉神経中脳路核ニューロンはより広い領域に分布した。リーラーマウスの顔面神経核ニューロンも異所性に存在することにより、鰓弓に由来する運動ニューロン(顔面神経核、三叉神経運動核)の細胞移動に、リーリン遺伝子産物が関与していることが明かとなった。そこで、もう一つの鰓弓由来運動ニューロンである疑核ニューロンに細胞移動障害があるかどうか、調べる必要がある。また三叉神経中脳路核ニューロンが異所性に存在することにより、神経堤に由来して二次的に脳内に進入するニューロンもリーラー遺伝子により影響されることがわかった。
家族性アルツハイマー病脳内アミロイド形成におけるγセクレターゼ機能障害の意義

プレセニリン遺伝子に変異を有する家族性アルツハイマー病における脳内アミロイド形成機序を解明すべく、プレセニリン/γセクレターゼの機能障害及び神経細胞膜脂質(ガングリオシド)のアミロイド形成誘導能に着目し、γセクレターゼ活性低下による神経細胞膜脂質組成の変化の有無について検討した。その結果、神経系培養細胞のγセクレターゼ活性低下により、アミロイド形成起始部である突起末端部においてガングリオシド量の増加が観察された。このことから、プレセニリン遺伝子変異に起因するγセクレターゼ機能障害が、膜脂質環境の変化を介して脳内アミロイド形成を誘導している可能性が示された。本研究では、プレセニリン遺伝子に変異を有する家族性アルツハイマー病の脳内アミロイド形成機序について、当該遺伝子変異による膜脂質組成変化に着目し、膜脂質誘導性アミロイド形成反応の関与を検討するとともに、γセクレターゼ機能障害をその両者を繋ぐ要因として位置づけ、γセクレターゼ機能障害による膜脂質代謝への影響を検討している。本年度はγセクレターゼ機能障害による膜脂質代謝への影響について、培養細胞を対象に検討を進めた。初めに、神経栄養因子で神経様に分化誘導させたPC12(PC12N)を、各種濃度のγセクレターゼ阻害剤(DAPT)で処理し、γセクレターゼ活性とアミロイドβ蛋白(Aβ)産生量の変動について検討した。その結果、低濃度DAPT処理において培養上清中のAβ濃度が増加し、高濃度DAPT処理においてAβ濃度が低下することが観察された。このことから、γセクレターゼの機能障害によってAβ産生量が増加しうることが示されたとともに、家族性アルツハイマー病関連のプレセニリン遺伝子変異によってγセクレターゼの機能障害が生じている可能性が示唆された。次に、γセクレターゼ機能障害による膜脂質組成への影響を検討するため、解析対象試料である突起末端部試料の回収をショ糖密度勾配遠心法により試みた。各種細胞小器官のマーカー蛋白質を用いたウエスタンブロット法により当該試料分画の成否を検討したところ、突起末端部試料が分画されていることを確認した。本研究では、プレセニリン遺伝子に変異を有する家族性アルツハイマー病の脳内アミロイド形成機序について、当該遺伝子変異による膜脂質組成変化に着目し、膜脂質誘導性アミロイド形成反応の関与を検討するとともに、γセクレターゼ機能障害をその両者を繋ぐ要因として位置づけ、γセクレターゼ活性低下による膜脂質代謝への影響を検討している。本年度はγセクレターゼ活性低下による膜脂質代謝への影響について、神経様に分化誘導させたPC12(PC12N)を対象に検討を進めた。具体的には、昨年度確認した、γセクレターゼ阻害剤(DAPT)処理によりプレセニリン遺伝子変異において観察されているのと同様のAβ産生様式を呈する条件下における、Aβ沈着起始部である突起末端部の膜脂質組成変化の有無を検討した。突起末端部の細胞膜は昨年度確立したショ糖密度勾配遠心法により回収し、脂質解析は質量分析を駆使し網羅的に行った。その結果、DAPT処理により、コレステロール、スフィンゴミエリン、並びにフォスファチジルコリンの量的変化は観察されなかった一方で、GM1、GD1a、及びGT1a+bガングリオシド量の増加が観察された。また、細胞体画分においてはDAPT処理による各脂質分子の量的変化は観察されなかった。このことから、γセクレターゼの活性低下により、突起末端部特異的なガングリオシド代謝変化もしくは膜脂質輸送障害が誘導されている可能性が示唆された。GM1ガングリオシドはAβ重合を促進すること、また、アルツハイマー病脳内のアミロイド陽性シナプス膜においてはGM1ガングリオシド量の増加が観察されていることを考慮すると、本研究の結果からプレセニリン遺伝子変異において観察されているγセクレターゼ活性低下が、細胞膜脂質環境の変化誘導を介して脳内アミロイド形成に寄与している可能性が示された。
抑制性伝達物質の発達期スイッチングの制御機構の解明

LSOへの抑制性(GABA/グリシン)シナプスの発達再編成において、未熟LSOへの主な入力がGABA作動性であり生後2週間でグリシン作動性ヘスイッチすることを見い出した。未熟期における主要伝達物質GABAが、なぜ同様にC1-チャネル(GABA-A受容体とグリシン受容体)を活性化するグリシンヘスイッチするのか、その意義についてGABAとグリシンの作用の相違をもとに考察するためGABAのみに存在する代謝型受容体(GABA-B受容体)の発達変化による伝達物質GABA-グリシン発達期スイッチへの関連について検討した。LSOへ入力するGABA/グリシン入力終末には生後幼若期にはGABAB受容体が機能的に存在し、GABA/グリシン入力を抑制している。発達に伴いこのGABAB受容体による抑制は次第に減弱し、生後3周目にはGABAB受容体による抑制は消失した。LSOへの抑制性入力の起始核である内側台形体核におけるGABAB受容体の発現変化を調べるために,GABAB受容体mRNAの変化をin situ hybridyzationにて調べた結果、生直後には強く発現しているが発達とともに減弱することが判明した。これらの結果から、伝達物質の発達スイッチングに関連する機能的意義の一つとして、入力する終末のGABAB受容体を介する抑制の発達減弱が挙げられる。GABAB受容体ノックアウト動物を用いて、幼若期発現するGABAB受容体の意義を検討した結果、ノックアウト動物では成熟期においてNMTB-LSOシナプス伝達の連続刺激中のシナプス応答の変化に大きなばらつきがあることが判明した。これは未熟期におけるシナプス伝達特性と類似している。この結果から、未熟期のGABA放出はGABAB受容体の活性化によりシナプス伝達の成熟化に重要な働きをしていることが示唆された。申請者はLSOへの抑制性(GABA/グリシン)シナプスの発達再編成において、未熟LSOへの主な入力がGABA作動性であり生後2週間でグリシン作動性へスイッチすることを見い出した。そのメカニズムが、興奮性回路での一般的に起こる余剰神経終末の除去(synapse elimination)とは異なり、同一終末内の伝達物質がGABAからGABA+グリシンのco-releaseの時期を経てグリシンへ単一終末内でスイッチすることを報告した。未熟期における主要伝達物質GABAが、なぜ同様にCl-チャネル(GABA-A受容体とグリシン受容体)を活性化するグリシンへスイッチするのか、その意義についてGABAとグリシンの作用の相違をもとに考察するためGABAのみに存在する代謝型受容体(GABA-B受容体)の発達変化による伝達物質GABA-グリシン発達期スイッチへの関連について検討した。平成18年度はGABAB受容体ノックアウト動物を用いた解析を行なう予定である。

未熟期における主要伝達物質GABAが、なぜ同様にCl-チャネル(GABA-A受容体とグリシン受容体)を活性化するグリシンヘスイッチするのか、その意義についてGABAとグリシンの作用の相違をもとに考察するためGABAのみに存在する代謝型受容体(GABA-B受容体)の発達変化による伝達物質GABA-グリシン発達期スイッチへの関連について検討した。LSOへ入力するGABA/グリシン入力終末には生後幼若期にはGABAB受容体が機能的に存在し、GABA/グリシン入力を抑制している。発達に伴いこのGABAB受容体による抑制は次第に減弱し、生後3周目にはGABAB受容体による抑制は消失した。LSOへの抑制性入力の起始核である内側台形体核におけるGABAB受容体の発現変化を調べるために、GABAB受容体mRNAの変化をin situ hybridyzationにて調べた結果、生直後には強く発現しているが発達とともに減弱することが判明した。これらの結果から、伝達物質の発達スイッチングに関連する機能的意義の一つとして、入力する終末のGABAB受容体を介する抑制の発達減弱が挙げられる。GABAB受容体ノックアウト動物を用いて、幼若期発現するGABAB受容体の意義を検討した結果、ノックアウト動物では成熟期においてNMTB-LSOシナプス伝達の連続刺激中のシナプス応答の変化に大きなばらつきがあることが判明した。これは未熟期におけるシナプス伝達特性と類似している。この結果から、未熟期のGABA放出はGABAB受容体の活性化によりシナプス伝達の成熟化に重要な働きをしてることが示唆された。