hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新奇時計関連因子の生化学的な解析

概日リズムは多くの生物の多様な活動に見られる約24時間周期のリズムである。植物の概日リズムを生み出す仕組み(概日時計)の分子的な実体解明を目指すため、機能的ゲノム解析を行った。その結果、午後に発現ピークをもつシロイヌナズナの時計遺伝子群の上流に時計タンパク質CCA1が結合することが分かった。さらにCCA1の直接的な標的遺伝子群を明らかとし、その中に環境ストレス応答の鍵となる遺伝子群を多数発見した。これらの遺伝子群の発現は朝に抑制され、夕方に誘導される。言い換えるとCCA1により、これらの遺伝子の発現時刻は夕刻に限られている。本研究により時計機構による遺伝子発現の時刻制御が明らかとなった。シロイヌナズナの時計関連転写因子PSEUDO-RESPONSE REGULATOR 5 (PRR5)は、昼すぎから夜半にかけてタンパク質として発現し、ゲノムDNAにて特定の遺伝子の近傍に存在する。我々はクロマチン免疫沈降カップルドシークエンス法により、PRR5の結合する遺伝子座を60個ほど同定した。これらの遺伝子群は、PRR5によって直接的に転写抑制されることも示唆された。このPRR5直接的なターゲットの中には、核内タンパク質をコードする遺伝子があった。この遺伝子とその相同遺伝子は共にPRR5により直接的に制御され、またこの遺伝子群の二重変異体の概日リズムは、長周期化することが分かった。つまりこの遺伝子群は時計調節機構に関わることが見いだされた。しかし、タンパク質の挙動の解析が遅れており、この遺伝子群がどのように時計機構に関わっているかはあまり分かっていない。そこでこの二重変異体の長周期形質を当該遺伝子とFLAGの融合遺伝子の導入によって相補させた。さらにこの相補株をクロマチン免疫沈降に供与し、このFLAG融合タンパク質の特定の染色体領域への結合を解析した。その結果、このFLAG融合タンパク質は、生体内において、PRR5の上流領域に結合することが分かった。さらにこのタンパク質を一過的に発現することで、PRR5の転写活性が上昇することが明らかとなった。すなわちPRR5とこの遺伝子間で直接的な転写フィードバッックがあることが示唆された。植物の概日時計の分子機構の解明をめざし、時計関連転写因子であるPRR5タンパク質の標的遺伝子群に着目した。その中のX1とX2遺伝子は互いに相同性が高く、これら遺伝子の二重変異体の概日リズムは長周期になることを見いだした。しかしこの時点で別の研究グループから、X1とX2遺伝子が時計周期に関わることが報告され、X1とX2はそれぞれLNK1とLNK2と命名された。またLNK1とLNK2タンパク質は、PRR5遺伝子の転写活性化に関わることも報告された。しかしこの転写活性化は、夕刻のみに認められ、朝に見られるPRR5遺伝子の転写抑制の仕組みは不明のままであった。そこで本研究では、PRR5遺伝子の転写制御の実体の解明を目指した。まず発光レポーター測定により、PRR5遺伝子の転写制御領域を決定した。この領域には他の時計関連転写因子であるCCA1が結合する可能性があることが示唆された。そこでクロマチン免疫沈降-高速DNAシークエンス法、レポーターアッセイ、変異体における遺伝子発現解析を進め、CCA1タンパク質がPRR5遺伝子の転写を直接的に抑制することを明らかとした。CCA1タンパク質によるPRR5遺伝子の転写抑制はlnk1 lnk2二重変異体においても認められた。朝にみられたLNK1とLNK2によるPRR5転写誘導の抑圧の実体は、CCA1タンパク質(およびその相同タンパク質であるLHY)であることが分かった。またCCA1タンパク質の直接制御する遺伝子座も一挙に同定し、時計が環境ストレスの鍵遺伝子を直接制御する経路を発見した。本研究は、時計機構における転写制御回路を明らかとしただけでなく、時計による環境ストレスの制御の分子経路を示した。本研究の成果はThe Plant Cellに掲載された。申請時には明らかとなっていなかった、PRR5のターゲット遺伝子の生化学的な機能が以下の解析により明らかとなったから。(1)局在解析により、この遺伝子の産物は核内に局在することが明らかとなった。(2)機能的であることが証明されたタンパク質を発現する植物を用いたクロマチン免疫沈降実験によって、このタンパク質がPRR5遺伝子の上流領域に結合することが明らかになった。(3)一過的発現系解析により、このタンパク質はPRR5遺伝子の転写活性化因子であることが示唆された。植物生理分子生物学当該タンパク質の染色体への結合領域を、クロマチン免疫沈降後のサンプルを高速DNAシークエンサーによって同定する。またこの領域近傍に存在する遺伝子の発現パターンを網羅的に解析することにより、当該タンパク質の制御する転写ネットワークシステムを理解する。
種々の幾何構造に於ける共形不変性

現在ではGauge理論と呼ばれるH.WeylのConformal Structure(共形構造)の理論を多様体のRiemann幾何学のみならず,他の種々の幾何学に展開して,新たな幾何構造と不変量を見つけることを研究した。そのために我々は多様体上の幾何構造に対して次のプロジェクトを考え,下記の様な成果を得た。多様体上のGeometric Flow(流れ)とGlobal Rigidity(剛体性).球面を実(複素)双曲空間の境界とみなす時,等長変換(isometry)はその境界上にそれぞれ共形変換(Cauchy-Riemann変換)として作用することが知られている。同様にして,(4n+3)次元球面S^<4n+3>は4元数双曲空間の境界とみなされ,4元数双曲空間H^<n+1>_F上の等長変換群Iso(H^<n+1>_F)=PSp(n+1,1)はその境界S^<4n+3>上に射影変換として作用する。この幾何学(PSp(n+1,1),S^<4n+3>)を疑-4元数平坦構造(pseudo-quaternionic flat structure)という。この幾何学に局所的にモデルされる(4n+3)次元多様体を疑-4元数平坦多様体という。我々はgeometric flow(幾何構造を保つ流れ)に関して次のrigidity(剛体性)を得た。この結果は共形変換群に関する小畠,Lelong-Ferrandの定理に関する4元数双曲幾何の場合の一般化である。また,3次元球面S^3上の任意の零でないC^r-flow(r【greater than or equal】1)は少なくともひとつの閉軌道をもつかというSeifert予想に対して考えた。この予想自体は現在,球面に限らず任意のコンパクト3-多様体において閉軌道を持たないC^1-flowがあり,一般に成り立たない。しかしながら,我々は幾何構造を持つコンパクト多様体上の幾何構造を保つflowに対してはSeifert予想は肯定的ではないかと予想し,特に,Conformal flow,CR flowに対しては正しい事を示した。さらに上の結果により疑-4元数平坦flowに対してもSeifert予想は肯定的に解かれることを示した。
流体界面のフラクタル的挙動に関する研究

微小な隙間内において低粘性流体が高粘性流体を置換する場合、流体間界面に不安定性が生じてフラクタルなパタ-ンを形成する。本研究では、0.8mmの隙間をもつアクリル板を2枚重ねたHeleーShaw実験モデルを製作し、この上下板間の微小な隙間に満たされたある流体が他の流体により置換される時の流体界面の形状を観察した。上下のアクリル板は、各々、直径60cmと66cmの円板であり、厚さ2cmである。実験では、まずモデル内に一方の流体を満たした後、下板の中心に開けられた径1mmの注入孔より、他の流体を放射状に圧入する。本年度は、濃度200、500、1000ppmのポリアクリルアミド水溶液を水で置換する場合の流体界面の形成過程の観察を行い、流体のレオロジ-特性が流体間の界面の不安定成長に与える効果について解析した。観察デ-タを画像解析した結果、以下のことが言える。(1)低粘性のニュ-トン流体が高粘性の擬塑性流体を置換する場合は、ニュ-トン流体同士の置換の場合に比べて、その流体間界面にはより大きな不安定性が生じる。この置換パタ-ンのフラクタル次元d_fは1.691.81の値であり、前年度に得られたニュ-トン流体同士の置換の場合の1.801.96に比べて小さくなる。(2)流体間の界面に生じる不安定性(フラクタルなパタ-ン)は、時間経過とともに大きなフィンガ-(指状体)に成長していく。この成長過程においては、流体のレオロジ-特性が大きな影響を及ぼす。2次元流れの数値シミュレ-ションでは、差分法を用いてラプラス方程式を解いた。計算の初期条件として、流体間の界面にゆらぎを与えることにより、流体界面の不安定性の成長過程はある程度予測できた。しかし、実験に特徴的であった樹枝状のフィンガ-の成長は再現できなかった。微小な隙間における異種流体の置換現象を観察するため、アクリル板を2枚重ねたHeleーShaw実験モデルを製作した。この上下板間の微小な隙間に満たされたある流体が他の流体により置換される時に生じる流体界面の形状を観察した。モデルは、この隙間を0.5mm、0.8mm、1mmに調整できるように設計した。最近の研究で、低粘性流体が高粘性流体を置換する場合、流体間界面に不安定性が生じてフラクタルなパタ-ンを形成することがわかってきた。本研究では、水(粘度約1mPa・s)と2種類のグリセリン水溶液(粘度約100mPa・s、600mPa・s)を用いて、流体置換時における界面の形成過程を観察した。実験では、まずモデル内に一方の流体を満たした後、下板の中心に開けられた径1mmの注入孔より、他の流体を放射状に圧入した。この時、一方の流体には青色染料で色をつけてあり、流体間の界面形状の変化を可視化した。実験中の界面の発達の様子は、モデル上方に設置したCCDカメラを通してビデオテ-プに録画した。録画したデ-タを画像解析して、流体界面の形状の抽出、その発達過程の解析を行った結果、以下のことがわかった。(1)低粘性流体が高粘性流体を置換する場合は、その界面がフラクタルなパタ-ンを形成した。このパタ-ンは、粘性比が大きく置換流速が大きいほど複雑な発達をした。パタ-ンが複雑になるほどフラクタル次元d_fは小さくなり、1.961.8の値が得られた。(2)置換流体の粘度が被置換流体の粘度より大きいまたは等しい場合は、その界面に乱れは発生せず、安定的な放射状の置換がみられた。この場合のフラクタル次元は、2.0であった。

この成長過程においては、流体のレオロジ-特性が大きな影響を及ぼす。2次元流れの数値シミュレ-ションでは、差分法を用いてラプラス方程式を解いた。計算の初期条件として、流体間の界面にゆらぎを与えることにより、流体界面の不安定性の成長過程はある程度予測できた。しかし、実験に特徴的であった樹枝状のフィンガ-の成長は再現できなかった。
低次元相関電子系の相転移現象に現れる多体問題と3次元系へのクロスオーバー

本年度は、相互作用する一次元電子系の通常相である朝永・ラッティンジャー(TL)流体の伝導問題を研究した。一様なTL流体においては、相互作用を取り込んだ集団励起の長波長揺らぎにより電荷が運ばれる。特に絶対零度近くに限定すればこの長波長集団励起だけが、系の振る舞いを決定する。一方、非一様なTL流体においては(たとえば不純物一つの存在は非一様性を生む)、一様系における長波長の集団励起と1粒子励起の短波長成分とが複雑に絡み合い、その影響で電気伝導特性も一様系のものと大きく変わる。不純物1つを含む斥力相互作用する皿流体において、不純物による電子の散乱振幅(もしくはTL流体の集団励起の反射率)が、絶対零度に向かい温度の関数として急激に増強され、電気伝導度はゼロにスケールされる。さらに、相互作用が引力であれば、逆に絶対零度に向かい散乱振幅が抑制され、電気伝導度は不純物のない量子細線の値(量子コンダクタンス)にスケールされる。相互作用の正負によりスケールされる方向が変わるのである。こういった非一様なTL流体の不純物スケーリングは90年代初頭に理論的に示され、カーボンナノチューブなどの実験でも確認されている。この不純物スケーリングの理論は、スケール前の一体の電子が感じるポテンシャル強度が十分に強いか、十分に弱いかの2つの極限で調べられている。ただし一般の多成分TL流体(通常の電子系ならばスピン自由度を含めて2成分である)の場合、相互作用空間の中での散乱振幅のスケール方向が変わる場所(固定点)が両極限で異なるため、両極限の間を固定点がつながるのかなど、まだ明らかにされていない。本年度のわれわれの研究では、不純物を含む2成分TL流体の伝導度を、任意のポテンシャル強度・任意の相互作用の強さで調べる手法を開発し、それらのパラメータ空間でのグローバルな相図をわれわれの手法により決定した。カーボンナノチューブや量子細線などの相関一次元電子系の理論的モデルとされる朝永-Luttinger液体(TL液体)における不純物問題の研究を行った。特に最近スピントロニクスへの応用の観点から磁場中のTL液体の研究が成されるようになってきた。本年度は不純物が二つある場合に起こる共鳴トンネル現象の理解を深めるために、電気伝導率のゲート電圧やゲート磁場による振動特性を解析的に求めた。特に一次元細線全体に一様な磁場がかかり、TL液体特有であるスピン-電荷分離が壊れた系において、ゲート電圧・ゲート磁場空間で電気伝導率のピークが作る格子構造が、磁場の強さに比例した角度で回転することを示した。これによりスピン密度波と電荷密度波の混成度が電気伝導率を通して実測されうることが明らかになった。またTL液体において電子間相互作用が斥力か引力かにより、絶対零度において不純物を電子が透過できるか否かが完全に分かれることが、不純物スケーリングの問題として知ちれている。この不純物スケーリング問題も磁場下でスピン・電荷分離が実現されていない状況での研究はされていなかった。この磁場下TL液体の不純物スケーリングの問題について取り組み、磁場下TL液体では磁場に対して特定の方向を向いた電子のみを透過し逆方向を向いた電子は完全反射するという新しい相が出現することを示し、不純物によりスピンカレントを生み出せる可能性を示した。以降、現在に至るまで不純物スケーリングの理論的研究を進め、最近は不純物ポテンシャルが弱い極限、強い極限のみでこれまで開発されてきたスケーリング則の導出法を拡張し、現実系への応用を可能にするために、有限の強さの不純物ポテンシャルを取り扱える理論を構築している。本年度は大きく分けて3つの研究に従事した。(1)一次元強相関電子系における不純物問題。一次元電子系の大きな特徴として局所的なポテンシャルがあると、極低温でゼロバイアス近傍での電気伝導が大きく阻害され、絶対零度でコンダクタンスが零になることが知られている。これは不純物ポテンシャルが温度の関数として実効的にスケールされるからである。この不純物のスケーリングに関しての研究は、不純物ポテンシャルが弱い極限と強い極限で、摂動的な繰り込み群解析に基づいて理解されて来たものの、中間領域におけるスケーリングの流れはほぼ理解されておらず、さらにスピンに依存する相互作用のある電子系では手つかずだった。本研究で、任意の強さのポテンシャルとスピンに依存する相互作用を同時に取り扱える枠組みを開発し、境界条件付のボソン化法の手法(Open Boundary Bosonization)を一般化し、絶対零度での相図を得た。(2)一次元電子系における二重バリア構造の共鳴トンネル問題に関する研究。磁場によりスピン空間の対称性を破れた朝永・ラッティンジャー流体(TL流体の共鳴トンネルによるコンダクタンスの振動を調べた。本年度はバリアの高い極限で、二重バリア内の電子数がほとんど揺らがないことを仮定したsequential tunnelingの描像でコンダクタンスを求めた。結果、弱いバリアのときと同様、スピン・電荷の混成角を反映し振動模様が回転することが分かった。(3)疑一次元物質(一次元鎖)の金属・絶縁体転移には、鎖間ホッピングが大きな関係があると考えられている。特に、電荷ギャップが鎖間のホッピングエネルギーより大きいときに絶縁体転移が起きるなど、それを支持する実験的事実もあるが、その全貌は理解されていない。我々は鎖間ホッピングと相互作用に関する繰りこみ方程式を求めその定性的な理解に至った。

本年度は、相互作用する一次元電子系の通常相である朝永・ラッティンジャー(TL)流体の伝導問題を研究した。一様なTL流体においては、相互作用を取り込んだ集団励起の長波長揺らぎにより電荷が運ばれる。特に絶対零度近くに限定すればこの長波長集団励起だけが、系の振る舞いを決定する。一方、非一様なTL流体においては(たとえば不純物一つの存在は非一様性を生む)、一様系における長波長の集団励起と1粒子励起の短波長成分とが複雑に絡み合い、その影響で電気伝導特性も一様系のものと大きく変わる。不純物1つを含む斥力相互作用する皿流体において、不純物による電子の散乱振幅(もしくはTL流体の集団励起の反射率)が、絶対零度に向かい温度の関数として急激に増強され、電気伝導度はゼロにスケールされる。さらに、相互作用が引力であれば、逆に絶対零度に向かい散乱振幅が抑制され、電気伝導度は不純物のない量子細線の値(量子コンダクタンス)にスケールされる。相互作用の正負によりスケールされる方向が変わるのである。こういった非一様なTL流体の不純物スケーリングは90年代初頭に理論的に示され、カーボンナノチューブなどの実験でも確認されている。この不純物スケーリングの理論は、スケール前の一体の電子が感じるポテンシャル強度が十分に強いか、十分に弱いかの2つの極限で調べられている。ただし一般の多成分TL流体(通常の電子系ならばスピン自由度を含めて2成分である)の場合、相互作用空間の中での散乱振幅のスケール方向が変わる場所(固定点)が両極限で異なるため、両極限の間を固定点がつながるのかなど、まだ明らかにされていない。本年度のわれわれの研究では、不純物を含む2成分TL流体の伝導度を、任意のポテンシャル強度・任意の相互作用の強さで調べる手法を開発し、それらのパラメータ空間でのグローバルな相図をわれわれの手法により決定した。
多孔質構造を利用したp型、および、n型有機熱電材料の開発

超分子相互作用能を有するπ共役系分子を用いた多孔質有機材料の開発を目的として、主に以下の成果を得た。(2)n型有機材料:シアノ基はハロゲン結合、水素結合アクセプター部位であることから、シアノ基を有するテトラシアノキノジメタン(TCNQ)、およびそのテトラフルオロ体(F4TCNQ)とN-methyldiazabicyclooctane cation(M)との塩、M2(TCNQ)3、M(F4TCNQ)を作製した。結晶中でMはCーH...Nによる一次元鎖を形成しており、この一次元鎖とTCNQ、F4TCNQの積層カラムとの間に水素結合が形成されていた。また、これらの塩は半導体的導電性を示した。さらに、M2(TCNQ)3を1,4-diiodotetrafluorobenzeneと少量のCH2Cl2を加えて、混合磨砕することで得た粉末の赤外スペクトルを測定したところ、C≡N伸縮バンドのシフトが観測された。この結果よりTCNQが持つシアノ基とヨウ素の間にヨウ素結合が生成したと考えられる。当初、平成30年度はヨウ素結合ドナー分子であるジヨードベンゾチエノベンゾチオフェン(I2BTBT)、ジヨードナフトジチオフェン(I2NDT)を合成する予定であったが、現在までにI2BTBTの合成に成功したが、I2NDTの合成には至っていない。しかしながら、ハロゲン結合ドナー分子であるEDO-TTF-Br2、EDO-TTF-I2、ハロゲン結合、水素結合アクセプター分子であるTCNQ、F4TCNQを用いた新規ラジカル塩の作製、単結晶構造解析に成功しており、それらの物性評価にも着手している。また、ハロゲン結合ドナー部位とハロゲン結合アクセプター部位の両方を有するクアテルチオフェンの合成に成功し、単結晶構造解析により構造が明らかになりつつあることから、研究目的の達成に向けて着実に進展していると考えられる。超分子相互作用能を有するπ共役系分子を用いて多孔質有機材料を開発するために、以下の研究を進める。(1)ハロゲン結合ドナー分子:EDO-TTF-Br2、EDO-TTF-I2の陽イオンラジカル塩の構造・物性を明らかにする。I2BTBTの物性評価、およびI2BTBTを用いた電荷移動錯体の開発を行う。(2)ハロゲン結合アクセプター分子:ハロゲン結合アクセプター分子であるTCNQ類縁体とハロゲン結合ドナー分子を用いた電荷移動錯体の開発を行う。(3)ハロゲン結合ドナー部位、アクセプター部位の両方を有する分子:合成に成功したハロゲン結合ドナー部位とハロゲン結合アクセプター部位の両方を有するクアテルチオフェンの構造を明らかにし、これを用いた電荷移動錯体の開発を行う。

(3)ハロゲン結合ドナー部位、アクセプター部位の両方を有する分子:合成に成功したハロゲン結合ドナー部位とハロゲン結合アクセプター部位の両方を有するクアテルチオフェンの構造を明らかにし、これを用いた電荷移動錯体の開発を行う。【理由】当初、備品費として高真空排気装置を計上していたが、現有設備が故障なく、利用することができた。その分を次年度以降の物品費、旅費等に充当することにしたため次年度使用額が生じた。【使用計画】主として、研究を推進するための物品費、研究成果発表、研究打合せ等の旅費、大型計算機利用料に使用する。
lamininpeptideと筋由来神経突起伸長因子を利用した人工神経の開発

1.ラミニンペプチドを結合したキトサンチューブの開発カニ腱を化学処理することによりチューブ状にし(キトサンチューブ)、これを人工神経用にデザインする方法を考案した。ラミニンペプチドを共有結合させ、その神経再生に及ぼす効果を判定した。ラミニンとラミニンペプチド(YIGSR、IKVAV配列)をキトサンチューブに共有結合させた。これらのチューブを用いてSDラットの右坐骨神経に長さ15mmの架橋移植を行った(各群N=20)。同系神経移植を対照とした(N=5)。縫合後1,2,4,6,8週で3匹ずつ、実験群の移植チューブより試料を採取して組織学的観察を行った。移植後12週で実験群と対照群の移植チューブ中央部、及び遠位縫合部より10mm末梢から試料を採取して組織学的観察を行なうとともに、再生軸索占有率を計測した(各群N=5)。さらに、移植部の近位で電気刺激して左右のM波を記録し、その比を求めた。次に、HApコーティングした三角形のキトサンチューブにラミニンとラミニンペプチド(YIGSR、IKVAV配列)を吸着させ、SDラットの右坐骨神経に架橋移植して(各群N=5)、12週後に同様の方法で神経再生を評価した。ラミニン群とラミニンペプチド群の両群において、チューブ壁に沿って活性化線維芽細胞が配列し、その間に神経組織が再生された。これは、チューブに結合したラミニンやラミニンペプチドが、再生神経組織の伸長を直接促進する効果を及ぼすことを示唆する。全観察期間を通して再生組織とチューブ壁の接触長はラミニン群>YIGSR群>IKVAV群>無処理群だった。また、移植後12週での軸索占有率(ラミニン群が最大)、終末潜時の比(ラミニン群が最小)もこの順に良好な結果を示した。以上の成績を検討すると、YIGSRに次いでIKVAV配列の結合がラミニンに匹敵する神経再生促進効果を示している。2.rhMDPの運動神経再生促進効果1.ラミニンペプチドを結合したキトサンチューブの開発カニ腱を化学処理することによりチューブ状にし(キトサンチューブ)、これを人工神経用にデザインする方法を考案した。2.rhMDPの運動神経再生促進効果実験1:atelocollagenの架橋法と生体適合性[方法]紫外線(UV)架橋、熱架橋、グルタールアルデヒド(GA)化学架橋を加えたatelocollagen tube(直径2.5mm、長さ15mm)をSD ratの右坐骨神経に移植した(各群N=5)。未架橋のcollagen tubeを移植した群を対照とした(N=5)。術後8週で試料を採取し、光顕と透過型電顕で観察した。[結果]UV架橋群5/5、熱架橋群1/5、GA架橋群0/5、未架橋群3/5で再生神経のtube内架橋が確認された。UV架橋群はtube壁が分解・吸収されつつあったが、tubeの形態は保持されていた。熱架橋群ではtubeがすでに吸収されて分節化し、瘢痕中に再生神経組織が観察された。GA架橋群ではtubeがそのまま残存していた。未架橋群はtube壁が数層に剥離し、細胞が浸潤していた。UV架橋群と未架橋群間で再生有髄軸索の%axon areaを比較したが、有意差はなかった。実験2:架橋法の相違による神経再生成績の比較[方法]

UV架橋、無架橋のcollagen tubeと同系の坐骨神経を用い、SD ratの右坐骨神経に15mmの架橋移植を行った(N=6)。術後12週で誘発筋電図を記録後、実験1と同様に組織学的観察を行った。[結果]latencyはUV群(p<0.05)と同系移植群(p<0.01)が無架橋群に比し有意に小さかった。また、% axon areaはUV群と同系移植群が無架橋群に比し有意に大きかった(p<0.01)。[実験1,2の考察]神経架橋用collagen tube作製に際しては、細胞活性を温存したままtube壁の強度を向上できる紫外線照射がcollagenの架橋法として最適である。実験3:ニワトリ除神経筋由来の神経突起伸張因子の末梢神経再生に及ぼす影響【結果と考察】架橋の形成率はNull群が67%に対し、NC群は83%、MDP群は94%であり、これらの因子の神経再生促進効果が示唆された。MDP77(10)群の軸索の直径は、Null群・NC(10)群に対して有意に大きく(p<0.05)、MDP77の再生軸索の成熟促進作用が推察された。軸索密度はNC群で高い傾向を認めた。NC(10)群の%axon areaは、Null群・MDP77(10)群に比し有意に大きく、NCは軸索発芽の誘導により再生を促進すると考えられた。カニの腱を利用した神経再生材料神経架橋用チューブの素材として、天然素材から合成したキトサンが利用できることが明らかになってきた。キトサンは抗菌剤や健康食品として広く用いられているが、セルロースに似た骨格をもつ多糖類で、分解産物(グルコサミン)は人体に無害である。キトサンは、節足動物(エビ、カニ、昆虫など)の外殻や腱の主成分であるキチンから合成される。カニの腱を化学処理することにより、チューブ状にする技術を開発した。初めに、カニの腱を薄いアルカリ水溶液とエタノールで処理して腱に含まれる脂質やタンパク質を除去する。次いで、高濃度のアルカリ水溶液で脱アセチル化反応を進めて、キチンからキトサンに変換する。得られたキトサンはほとんど不純物を含まず、形状も平板からチューブに変化する、このチューブの断面は、神経断端から遊走してくる再生神経線維が最も入りやすい形状に採型することが出来る。キトサンチューブの強度向上のため熱処理して分子間結合を強くし、さらに無機物(リン酸カルシウム)をチューブの外側表面に修飾する処理を行う。同時に、再生神経がチューブ内壁に接着し、伸張しやすいように細胞接着因子であるラミニンペプチドを結合(酸アミド結合)させることも可能である。神経組織の再生ラットの坐骨神経にキトサンチューブ(内径2mm、長さ15mm)を架橋移植した。チューブの断面は円形と三角形の2種類用意し、未処理、熱架橋、熱架橋+ハイドロキシアパタイト(HAp)コーティング処理したチューブを使用した。手術用顕微鏡下に縫合後、組織学的観察を行った。誘発筋電図も記録し、再生神経と筋肉の機能的結合も評価した。未架橋チューブは管腔狭小化が著しく、神経再生は遅延した。熱架橋処理、HApコーティングを加えると力学的強度が向上し管腔構造が保持された。その結果、46週で未熟な神経組織の再生が見られたが、後者の方が神経再生は促進された。また、チューブの断面を三角形(異型断面)にすることで再生神経との接触面積が拡大し、神経組織がチューブ全体に広く分布した。
性器ヘルペス患者の無症候性ウイルス排泄に関する研究

【平成12年度の目的】アシクロビルを長期投与されているImmunocompetent hostの性器へルペス病変部から薬剤耐性株が分離されるかを検討すること、その病原性を検討すること【方法】慈恵医大皮膚科ヘルペス外来を受診している性器ヘルペス患者から上記目的を説明し承諾をとったうえで、性器ヘルペス病変部水疱内容液を採取した。検体はVero細胞に接種してウイルスを分離した。2継代目にアシクロビル添加(5,10,20%W/V)培養液を用い細胞変成効果(CPE)の有無を確認した。同一患者から分離されたウイルス株はHirt変法によりウイルスDNAを抽出後Restriction fragment length polymorphismにより株の異同を検討した。【結果】対象者:免疫異常が明らかでない男性5名(年齢中央値37歳[29歳から42歳]でアシクロビル投与期間平均3年6ヶ月)と免疫異常が明らかでない女性2名(28歳、30歳でアシクロビル投与期間平均3年1ヶ月)の計7名。うち6名が再発時にアシクロビルを内服で投与され、1名が約10ヶ月間のアシクロビル少量(200mg/day)持続投与されていた。観察期間中の再発性性器ヘルペスおよび予後:平成12年4月から平成12年12月各患者の再発回数中央値2回(範囲:1回6回)で、のべ再発回数18回。アシクロビル少量持続内服中患者は明らかな再発1回で、それは1ヶ月間の休薬中であった。のべ18回の再発に対し、アシクロビル内服1000mg/dayx5日間投与したところ、痂皮化(治癒)するまでの期間中央値5日間(範囲:3日間7日間)であった。病変部からのべ16検体を採取した。ウイルス分離結果:全検体より単純ヘルペス2型を分離した。同一患者から分離されたウイルス株はすべて同一株であった。アシクロビル存在下でCPEが確認された分離株はなかった。【結論】健常者から薬剤耐性株が分離されることはなかった。健常者であればアシクロビル少量持続投与で薬剤耐性株が誘発されることはなかった。【研究課題】性器ヘルペス患者の無症候性ウイルス排泄に関する研究【目的1】性器ヘルペスの症状がない時期にも,PCR法を用いて患者外陰部にHSVゲノムが検出できるかどうか,その期間や月経などとの関連について検討した。【対象】男女2組の性器ヘルペス患者【方法】2ヵ月間にわたり連日外陰部を綿棒で擦過して検体を採取した。ウイルスDNAポリメラーゼをcodeする領域の一部に330bpのサイズのプライマーを設定した。PCR生成物をサザンハイブリダイゼーションにて確認した。【結果】男性Aは,PCR検出日は60日中0日.女性Aは,アシクロビル持続投与によるsuppression treatment中で,PCR検出日は59日中4日(6.8%),再発の期間に一致していた.男性Bは,PCR検出日は59日中0日.女性Bは,PCR検出日は60日中0日.【目的2】健常人性器ヘルペス患者からはアシクロビル耐性株が分離されるか否かを検討する。【目的3】アシクロビル耐性株が分離された場合、アシクロビル感受性株に比較し、果たしてその病原性が軽度であるか否かを検討する。【対象、方法】免疫不全のない健常人の性器ヘルペス患者の病変部(vesicle fluid)より検体を採取し、アシクロビル存在下で、単純ヘルペスウイルスを分離する。アシクロビル耐性株が存在すれば、マウスの角膜やfoot padに接種し、mortality rate、死亡までの期間、麻痺の出現頻度、感染病理等につき検討する。【結果】目的2および3に関しては、現在検討中。

のべ18回の再発に対し、アシクロビル内服1000mg/dayx5日間投与したところ、痂皮化(治癒)するまでの期間中央値5日間(範囲:3日間7日間)であった。病変部からのべ16検体を採取した。ウイルス分離結果:全検体より単純ヘルペス2型を分離した。同一患者から分離されたウイルス株はすべて同一株であった。アシクロビル存在下でCPEが確認された分離株はなかった。【結論】健常者から薬剤耐性株が分離されることはなかった。健常者であればアシクロビル少量持続投与で薬剤耐性株が誘発されることはなかった。
先進セラミックスの実働荷重における疲労損傷加速現像のナノメカニズム的研究

セラミックス材料である窒化ケイ素を用いて,変動荷重下における疲労き裂進展試験を行い,徐荷弾性コンプライアンス法によって巨視的なき裂進展速度とき裂開閉口挙動を調べた.特に最大荷重値をそろえて過大荷重比も固定し,頻度比のみを変化させた試験を行うことで,き裂進展に及ぼす頻度比の影響について検討した.その結果,変動荷重下のき裂進展速度は一定振幅荷重下に比較して加速すること,加速の程度は頻度比が小さいほど顕著であることを明らかにした.これは過大荷重負荷によってインターロッキングの破砕が促進され,開口点が上昇するために加速が生じると考えられる.また頻度比が小さいほど,1ブロック中の開口点が低くなるために加速は顕著となる.さらに,CT試験片に荷重を負荷したままき裂先端近傍を電子顕微鏡(SEM)により観察することが可能なジグにより,疲労き裂進展経路の詳細観察とき裂開口変位(COD)の計測を行った.その結果,一定振幅荷重下だけでなく変動荷重下においても疲労き裂は結晶粒界を進展するため,結晶粒がき裂上下面を橋渡しするいわゆるインターロッキングを確認することが出来た.また,インターロッキング部のかみ合部分の前後において,CODの変化が認められ,インターロッキングがき裂開口荷重を分担するためにき裂先端における真の応力拡大係数(K_<tip>)を減少させていることが判明した.また,き裂進展経路の微視的SEM観察から得られるき裂進展速度は,除荷弾性コンプライアンス法から求められる巨視的き裂進展速度と必ずしも一致せず,き裂進展機構解明のためには,本研究のような微視的な経路観察が有効であることを示した.一方,過大荷重負荷後のCODは減少しており,過大荷重がインターロッキングの摩耗,破砕を促進し,き裂進展速度を加速させることが判明した.先進セラミックス材料として窒化ホウ素/窒化ケイ素複合セラミックスBN/Si_3N_4材を用いて一定振幅荷重ならびに過大荷重、2段繰返し変動荷重試験を行い徐荷弾性コンプライアンス法によりき裂開閉口挙動を調べた。さらに、高分解能の顕微鏡により破面情報を得ることによりセラミックス材料の繰返し荷重下の疲労き裂進展機構の解明を目指した。また、微小三角形断面を有する小型曲げ試験片を用いることにより窒化けい素セラミックスの繰返し荷重下のき裂発生・微小き裂進展挙動の観察を行った。得られた主な結果は以下の通りである。1 BN/Si_3N_4の一定振幅荷重下におけるき裂進展速度は、応力比が小さくなるにつれて加速することがわかった。これは応力比が小さい、すなわち荷重振幅が大きいほど荷重繰返しによるインターロッキング部の摩耗、破砕がより顕著となり、応力遮へい効果が減少したためである。2 2段繰返し変動荷重下のき裂進展速度は、一定振幅荷重下の進展速度に比べ加速することがわかった。また、高レベル荷重が大きくなるほど加速は顕著になる。この進展速度の加速現象は、過大荷重負荷後と同様に、高レベル荷重負荷によってインターロッキング部の破砕が促進されるためである。3 SEM等を用いた疲労き裂進展経路の微視的観察によりき裂ウェイク部には結晶粒子によるインターロッキングが形成され、このインターロッキング部は、荷重を分担するため応力遮へい効果が生じていることが確認された。また,疲労および静的破壊ともに粒界破壊が支配的であり、疲労破面ではき裂上下面の破面間のすり合わせによって、インターロッキング部が摩耗した様相が観察された。セラミックス材料である窒化ケイ素を用いて,変動荷重下における疲労き裂進展試験を行った.この時,徐荷弾性コンプライアンス法により巨視的なき裂進展速度とき裂開閉口挙動を調べた.さらに,CT試験片に荷重を負荷したままき裂先端近傍を高分解能顕微鏡である原子間力顕微鏡(AFM)あるいは電子顕微鏡(SEM)により観察することが可能なジグを製作し,過大荷重負荷直後における疲労き裂先端近傍の詳細観察とき裂開口変位(COD)の計測を行った.その結果,一定振幅荷重下だけでなく変動荷重下においても疲労き裂は結晶粒界を進展するため,結晶粒がき裂上下面を橋渡しするいわゆるインターロッキングを確認することが出来た.また,インターロッキング部のかみ合部分の前後において,CODの変化が認められ,インターロッキングがき裂開口荷重を分担するためにき裂先端における真の応力拡大係数(K_<tip>)を減少させていることが判明した.このようなインターロッキングは荷重の繰返しにより,摩耗,破砕されると考えられているが,き裂進展経路の微視的観察によって,実際に結晶粒の抜け落ちなどが観察され,インターロッキングの摩耗,破砕機構が実験的に明らかにされた.また,き裂進展経路の微視的SEM観察から得られるき裂進展速度は,除荷弾性コンプライアンス法から求められる巨視的き裂進展速度と必ずしも一致せず,き裂進展機構解明のためには、本研究のような微視的な経路観察が有効であることを示した.一方,過大荷重負荷後のCODは減少しており,過大荷重がインターロッキングの摩耗,破砕を促進し,き裂進展速度を加速させることが判明した.セラミックス材料である窒化ケイ素を用いて,変動荷重下における疲労き裂進展試験を行い,徐荷弾性コンプライアンス法によって巨視的なき裂進展速度とき裂開閉口挙動を調べた.特に最大荷重値をそろえて過大荷重比も固定し,頻度比のみを変化させた試験を行うことで,き裂進展に及ぼす頻度比の影響について検討した.

その結果,変動荷重下のき裂進展速度は一定振幅荷重下に比較して加速すること,加速の程度は頻度比が小さいほど顕著であることを明らかにした.これは過大荷重負荷によってインターロッキングの破砕が促進され,開口点が上昇するために加速が生じると考えられる.また頻度比が小さいほど,1ブロック中の開口点が低くなるために加速は顕著となる.さらに,CT試験片に荷重を負荷したままき裂先端近傍を電子顕微鏡(SEM)により観察することが可能なジグにより,疲労き裂進展経路の詳細観察とき裂開口変位(COD)の計測を行った.その結果,一定振幅荷重下だけでなく変動荷重下においても疲労き裂は結晶粒界を進展するため,結晶粒がき裂上下面を橋渡しするいわゆるインターロッキングを確認することが出来た.また,インターロッキング部のかみ合部分の前後において,CODの変化が認められ,インターロッキングがき裂開口荷重を分担するためにき裂先端における真の応力拡大係数(K_<tip>)を減少させていることが判明した.また,き裂進展経路の微視的SEM観察から得られるき裂進展速度は,除荷弾性コンプライアンス法から求められる巨視的き裂進展速度と必ずしも一致せず,き裂進展機構解明のためには,本研究のような微視的な経路観察が有効であることを示した.一方,過大荷重負荷後のCODは減少しており,過大荷重がインターロッキングの摩耗,破砕を促進し,き裂進展速度を加速させることが判明した.
グローバル社会における国語力育成のための「手書き」を生かしたICT教材の検討

グローバル化に伴い英語力の向上が求められる一方で、今まで以上に国語力が重要になる。筆者は、既に「手書き」の有効性を確認している。しかし昨今の国語の授業は、交流活動で「話す・聞く」時間が長くなり、ICTの活用によっても「手書き」場面は減少している。そこで本研究では、まず学習者の観察と学びの成果の検証により「手書き」が有効な場面とICTを活用できる場面とを精査する。次に教員の経験に基づき、主に定番教材の有効な授業展開の情報を収集する。それらを基に、書字支援ツール及びICTを活用した効果的な授業展開を確立する。AI化の将来を見据えて、人にしかできない書写・書道等の表現活動についても検証していく。
機能性流体の内部構造および流動状態把握への超音波応用に関する研究

本年度は,昨年度までの成果を踏まえ,印加磁場下における磁性流体とMR流体中の超音波伝播速度変化,磁性流体中の減衰率変化を精密に測定した。磁性流体とMR流体中の伝播速度は,磁場印加によって増加した。また,磁場の増減によるヒステリシスも存在した。この伝播速度変化は,流体中に形成されるクラスターが密接に関係していると考えられる。MR流体では,内部粒子が大きく,磁場印加で半固体になるため,磁性流体よりも大きな伝播速度変化が得られた。クラスターの形成過程も,磁性流体では鎖状クラスターの成長が見られたが,MR流体では瞬時に塊状クラスターが形成される。磁場を除去した時も磁性流体ではクラスターは崩壊せず保持されているが,MR流体では内部粒子が大きいため,崩壊に転じるという両流体に特徴的な変化が得られた。磁性流体中の減衰率変化においても,内部粒子の挙動を推測しうる特徴的な結果が得られた。鎖状クラスター方向に超音波が伝播する時,磁場印加後に減衰率は大幅に増加しており,内部粒子が鎖状クラスターの形成に向けて活発に運動していると考えられる。鎖状クラスターが形成されると超音波の減衰に与える影響は小さくなり,減衰率変化も小さくなる。また,鎖状クラスターに垂直に超音波が伝播する時は,超音波の減衰に与える影響が非常に大きく,その結果も複雑であった。このように磁気機能性流体中の超音波伝播には,内部に形成されるクラスターが密接に関係していると考えられる。今後,MR流体中の減衰率も測定し,磁性流体と比較することを考えている。この超音波伝播のメカニズムは理論的にも非常に複雑であり,その解明にはさらなる詳細な実験と理論的な検討が必要である。本年度は,磁性流体の超音波伝播特性(静止場)と超音波(UVP)を用いた磁性流体管内振動流の速度分布特性(流動場)を実験,測定し,これらの特性と磁性流体中に形成される鎖状クラスターとの相関を検討した。静止場における磁性流体中の超音波伝播では,超音波の音速は磁性流体の温度や磁場印加によって変化し,異方性,ヒステリシスなどの特性が得られた。これは内部に形成される鎖状クラスターや磁性流体内部の強磁性体微粒子の構造が大きく関係していると考えられる。また,強磁性体微粒子の濃度分布変化で超音波伝播特性も劇的に変化することから,この時の流体の状態をより詳細に検討していく必要がある。これらの特性を詳細に計測,検討することで,今後,超音波を用いて磁性流体の内部構造を解析することが期待できる。また,流動場における計測と位置づけた,長時間の磁場印加によって鎖状クラスターを形成させた状態の管内振動流において,興味深い実験結果を得た。ピストン始動直後に鎖状クラスターが原因と考えられる特異な速度分布が見られ,時間経過と共に安定な速度分布へ推移していく過程が明らかとなった。ここで,鎖状クラスター成長の目安として擬似流量による評価方法を新たに提案した。疑似流量の変化率を調べることにより,印加磁場による鎖状クラスターが流れにおよぼす影響を評価でき得ることが分かった。また,疑似流量の変化率の挙動から,管内での鎖状クラスターの成長には限界があることが判明した。これは,静止場における超音波による検討と合致している。以上を総括して,磁性流体は不透明流体で,磁性流体内部に形成される鎖状クラスターは非常に崩れやすいため,超音波を用いた計測は非常に有効である。今後,超音波を用いた流体内部構造解析や流動計測の研究は非常に意義深いと考えている。

本年度は昨年度に引き続き磁性流体の超音波伝播特性と超音波速度分布法(UVP)を用いた磁性流体管内振動流の速度分布特性に関する実験を遂行した。また,磁性流体よりも内部粒子径の大きなMR流体の超音波伝播特性も調べた。静止場における磁性流体中の超音波伝播では,磁化特性の異なる磁性流体を用いた。その結果,磁化強度に対応した超音波の音速変化や,異方性,ヒステリシスなどの特性が得られた。これには内部に形成される鎖状クラスターや磁性流体内部の強磁性体微粒子の構造が大きく関係していると考えられる。また,MR流体中の音速変化は磁性流体に比較し非常に大きなものであることが分かった。さらに,印加磁場に対する応答性も非常に高いことがわかった。磁場印加速さ(スイープレイト)を変化させる実験も行い,磁場印加速さと内部のクラスター成長との関連が,定性的に明らかになった。流動場における計測として位置づけた,長時間の磁場印加によって鎖状クラスターを形成させた状態の管内振動流において,管軸方向に磁場を印加する実験を行った。昨年までの管軸に対して垂直印加する場合と異なる速度分布結果が得られた。これは,磁場強度分布の違いにより,内部に形成されるクラスター構造の形態変化に起因しているものと考えられる。磁場印加方向も考慮した速度分布評価法の構築を試みたが,現段階では,明確な結論は得られなかった。磁化率の低い磁性流体を用いて,管軸に垂直な磁場を印加した実験も遂行した。磁化特性の影響で,この場合も,昨年度とは異なる速度分布が得られた。速度分布から求めた疑似流量により,磁性流体の磁化特性や磁場印加時間の影響を説明し得ることが明らかとなった。本年度は,昨年度までの成果を踏まえ,印加磁場下における磁性流体とMR流体中の超音波伝播速度変化,磁性流体中の減衰率変化を精密に測定した。磁性流体とMR流体中の伝播速度は,磁場印加によって増加した。また,磁場の増減によるヒステリシスも存在した。この伝播速度変化は,流体中に形成されるクラスターが密接に関係していると考えられる。MR流体では,内部粒子が大きく,磁場印加で半固体になるため,磁性流体よりも大きな伝播速度変化が得られた。クラスターの形成過程も,磁性流体では鎖状クラスターの成長が見られたが,MR流体では瞬時に塊状クラスターが形成される。磁場を除去した時も磁性流体ではクラスターは崩壊せず保持されているが,MR流体では内部粒子が大きいため,崩壊に転じるという両流体に特徴的な変化が得られた。磁性流体中の減衰率変化においても,内部粒子の挙動を推測しうる特徴的な結果が得られた。鎖状クラスター方向に超音波が伝播する時,磁場印加後に減衰率は大幅に増加しており,内部粒子が鎖状クラスターの形成に向けて活発に運動していると考えられる。鎖状クラスターが形成されると超音波の減衰に与える影響は小さくなり,減衰率変化も小さくなる。また,鎖状クラスターに垂直に超音波が伝播する時は,超音波の減衰に与える影響が非常に大きく,その結果も複雑であった。このように磁気機能性流体中の超音波伝播には,内部に形成されるクラスターが密接に関係していると考えられる。今後,MR流体中の減衰率も測定し,磁性流体と比較することを考えている。この超音波伝播のメカニズムは理論的にも非常に複雑であり,その解明にはさらなる詳細な実験と理論的な検討が必要である。
心筋細胞内カルシウム動態からみた心筋保護法の特殊性に関する研究

今回われわれは生後7日以内の新生兎43尾犠牲死させ未熟心筋のカルシウム動態観察を施行した。しかし新生兎心筋は極めて小さいが為、Krebs-Henseleite Bicarbonate BufferによるLangendorff潅流が施行しえたものは18尾であり、また多少心毒性のあるfura-2負荷に耐え得たものは12尾であった。当初の予定の15分間虚血を施行した8尾では、再潅流後心泊動が得られず、現在虚血時間を10分に短縮した実験群でcontrolの心機能回復のdataを集計中である。現時点で得られている3尾のdataは次の通りである。再潅流時のintracellular calcium transients(%control)38%,66%,57%,Diastoric intracellular calcium F340/F380 ratio 0.87,1.42,1.13。LVDP(%control)45%,57%,38%,LVEDP 28mmHg,21mmHg,29mmHg。まだcontrolのdataが十分に取れておらず(最低7尾は必要と考えている)現在追加実験中である。極小心筋であるため思いのほかに実験が進んでいないのが実情であるが、虚血時間を10分とした後はdataが得られはじめてはいる。心筋保護群ではcontrol群よりは実験は容易と考えられるが、現時点ではまだ評価できる段階には至っておらず現在追加実験中である。
乳癌細胞のアポトーシスを指標とした抗エストロゲン剤感受性試験法の開発

12年度は昨年度実績報告書で報告した通り、次の通りの検討した。1)培養乳癌細胞MCF7を用いた各種抗エストロゲン薬の持つアポトーシス誘導能の比較を行ったが、それぞれの細胞傷害作用に差があることが認められ、この差が薬剤あるいは細胞機能のどのような差によるものかの検討を続けた。2)乳癌組織の微細断片を各種抗エストロゲン薬で処理した後、凍結切片を作成し、この切片を用いてTunnel法あるいは断片化DNA染色法を用いてアポトーシスを起こした細胞を検出し、薬剤による違いは確認されたが、薬剤の濃度、処理時間などとの関係についての更なる検討を行った。3)抗エストロゲン薬の使用に際しては乳癌細胞に発現しているエストロゲン受容体の種類が非常に問題で、エストロゲン受容体アルファが多く出現している乳癌細胞ではタモキシフェンによる血中濃度により、細胞増殖を強く促進させる傾向が確認され、乳癌細胞の受容体の種類の確定が必要となり、受容体の免疫組織的染色法の開発を検討した。4)タモキシフェンの細胞への影響をアポトーシス誘導の重要なステップと考えられるミトコンドリア呼吸系酵素複合体への影響を中心に解析し、タモキシフェンはこれら酵素複合体のいくつかを阻害することを見出だしたが、他の抗エストロゲン薬についても検討を行った。以上の検討項目についてある程度の結論が出たところで、抗エストロゲン薬以外の制癌剤との併用実験行う予定であったが、実験を開始すると当然であるが、問題点が多くみつかり、それぞれを解決するのに時間を要し予定通り研究を進められない状況であった。また、臨床への応用まで到達出来なかった。なお、研究結果及び成果は最終報告書にて報告する。本研究は乳癌の外科手術の直後から、患者個々の切除乳癌組織を用いて、患者にもっとも適合した抗エストロゲン剤を中心とするの選択を短時間の内に行い、術後の化学療法に役立てることを目的とするものである。今年度に行った実験と結果は以下の通りである。1.培養乳癌細胞MCF7を用いてタモキシフェン、トレミフェン、トリオキシフェン、TAT-59、ドロロキシフェン等の抗エストロゲン薬のもつアポトーシス誘導能の比較を行った。この結果それぞれの細胞傷害作用に差があることが認められた。この差が薬剤あるいは細胞機能のどのような差によるのかは現在検討中である。2.乳癌組織の微細断片をタモキシフェン、トレミフェン、トリオキシフェン、TAT-59、ドロロキシフェン等の抗エストロゲン薬で処理した後、凍結切片を作成した。この切片を用いてTunnel法あるいは断片化DNA染色法を用いてアポトーシスを起こした細胞を検出した。薬剤による違いは認められるものの、現在の段階では薬剤の濃度、処理時間などについて更なる検討が必要と考えられる。3.抗エストロゲン剤の使用に際しては乳癌細胞に発現しているエストロゲン受容体の種類が非常に問題となる。それはエストロゲン受容体アルファが多く発現している乳癌細胞はタモキシフェン等によりその増殖を強く促進されるからである。これに関しては現在エストロゲン受容体アルファの免疫組織的染色法の開発を行っている。4.抗エストロゲン剤によるアポトーシス誘導の詳しい機構を解析することはこれらの薬剤の効果を検討する上で重要であると考えられる。そこでタモキシフェンの細胞への影響をアポトーシス誘導の重要なステップと考えられるミトコンドリア呼吸系酵素複合体への影響を中心として解析した。この結果タモキシフェンはこれら酵素複合体のいくつかを阻害することを見いだした。現在他の薬剤についても検討中である。次の通りの検討すべき項目について、平成12年度に検討を行った。1)各種抗エストロゲン薬の持つアポトーシス誘導能が、それぞれの細胞傷害作用に差があることが認めらた。

この差が薬剤あるいは細胞機能のどのような差によるものかの検討を続けた。2)乳癌組織の微細断片を各種抗エストロゲン薬で処理した後、凍結切片を作成し、この切片を用いてTunnel法あるいは断片化DNA染色法を用いてアポトーシスを起こした細胞を検出し、薬剤の濃度、処理時間などとの関係についての更なる検討した。3)エストロゲン受容体アルファが多く出現している乳癌細胞ではタモキシフェンによる血中濃度により、細胞増殖を強く促進させる傾向が確認され、乳癌細胞の受容体の種類の確定が必要となり、受容体の免疫組織的染色法の開発を検討した。4)ミトコンドリア呼吸系酵素複合体への影響を中心に解析し、タモキシフェンはこれら酵素複合体のいくつかを阻害することを見出だしたが、他の抗エストロゲン薬について検討を行った。以上の検討項目についてある程度の結論が出たところで、抗エストロゲン薬以外の制癌剤との併用実験行う予定した。しかし、実験を開始すると当然であるが、問題点が多くみつかり、それぞれを解決するのに時間を要し予定通り研究が十分にを進められなかった。また、臨床への応用まで到達出来なかった。
混合栄養性渦鞭毛藻から探る葉緑体消失進化の研究

渦鞭毛藻の約半数は葉緑体を持っておらず,これは一度獲得した葉緑体が進化の過程で消失したためだと考えられている。しかし,渦鞭毛藻の葉緑体消失進化がどのように進行するかについては研究が少ない。本研究では,葉緑体を持ちながら捕食も行う,混合栄養性の渦鞭毛藻を含むParagymnodinium属に注目する。本属が葉緑体消失進化の中間段階に位置するという仮説を立て,これを検証するとともに,光合成関連機能・遺伝子や,捕食メカニズムの解析を行う。