hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
放射光を用いた高精細格子状照射による腫瘍および正常組織の生物学的効果の基礎的研究

高輝度放射光設備(SPring-8)から供給される放射光を用いて、正常脳組織および脳腫瘍に対する高精細格子状照射(MRT)の研究を行った。マウスの脳に対するMRTでは、ビーム間隔300μmの照射において、50%致死線量が600Gyと、従来の照射方法と比し極めて高線量の照射が可能であった。病理標本においてもMRT照射後は脳組織が保存されていた。マウスの正常脳の耐用線量は、高精細格子状照射におけるピーク部の線量よりも、谷となる低線量域の線量において規定されている可能性が示唆された。今回の研究は高輝度放射光設備(SPring-8)から供給される放射光を用いてグリッド幅25umの高精細格子状照射(synchrotron microbeamradiation therapy: SMRT)を行い、難治悪性腫瘍に対する新たな治療戦略の基礎研究を行うものである。SMRTでは100Gy以上の高線量照射においても脳・脊髄といった正常組織は耐容可能なことが明らかになっているが、なぜ1回100Gy以上の大線量照射に正常組織が耐容できるは明らかにされていない。一方、腫瘍組織はSMRTという格子状の照射において非照射領域があるにもかかわらず消失することが確認されている。これらの現象は腫瘍組織と正常組織において異なる経路の生物学的果等が存在することによるものと想定される。申請者らはこれまでの研究で、SMRTを用いた高精細格子状照射では、高線量を照射される部位(peak部分)では1001000Gyという大線量での1回照射が可能であることを確認している。正常組織反応においてはpeak部位は高線量を照射され細胞の脱落を認めるが、valley部位の正常組織の損傷は僅かであった。格子状の細胞脱落を来しても、周囲の細胞から再生反応が起こり、組織の壊死・脱落や大きな機能的欠損をもたらさなかったと考えらえる。今回の研究では、SPring-8のBL28B2ビームラインから取り出した放射光X線を8週齢オスのC57BL/6JJclマウスの脳に照射した。照射後は定期的に観察を行い、観察期間は最大3か月間とし、観察終了時に生存していたマウスに関しては4%パラホルムアルデヒドリン酸緩衝溶液で還流固定を行った後、組織切片を作成した。ビーム幅25μm、ビーム間隔200μmスリット照射群の半致死線量(LD50/90)は約500Gyであり、格子状照射では交点の線量が600Gyとなる条件でも1か月間の経過観察で全匹生存していた。本研究の目的は、高輝度放射光設備(SPring-8)から供給される放射光を用いて高精細格子状照射(synchrotron microbeam radiation therapy: SMRT)を行い、難治悪性腫瘍に対する新たな治療戦略の基礎研究を行うものである。SMRTとは、従来の放射線治療のようにターゲットに対して均一な照射を行わず、ターゲット内を格子状に照射を行う照射法である。今回の研究では、SPring-8のBL28B2ビームラインから取り出した放射光X線を用いて8週齢オスのC57BL/6JJclマウスに対し、全脳照射とスリット照射を行った。スリット照射では、ビーム幅25μm、ビーム間隔200μm、ピーク線量110Gy/secのマイクロビームを照射した。また、ブロード照射は線量率110Gy/secで照射を行った。照射後は定期的に観察を行い、観察終了時に生存していたマウスに関しては4%パラホルムアルデヒドリン酸緩衝溶液で還流固定を行い、組織切片を作成した。ビーム幅25μm、ビーム間隔200μmスリット照射群の半致死線量(LD50/90)は約500Gyであり、ビーム間隔100μm群、300μm群ではそれぞれ180Gy、700Gyであった。組織学的評価では照射部位に一致したスリット状の核の脱落がみられたが、異常行動等はみられておらず機能学的な異常はなかった。また、呼吸性移動がある部位への照射精度の検討のため、肺転移を有するマウスへの照射も行った。14週齢オスのDBA/2Jclマウスを麻酔下で固定し、右肺に放射光X線を照射した。スリット照射では、ビーム幅25μm、ビーム間隔200μm、ピーク線量120Gy/secのマイクロビーム照射を行った。組織学的評価では肺転移腫瘍の減少がみられた。呼吸性移動のある部位へのスリット照射を行っても重篤な有害事象は観察されなかった。高輝度放射光設備(SPring-8)から供給される放射光を用いて高精細格子状照射(synchrotron microbeamradiation therapy: SMRT)を行い、難治悪性腫瘍に対する新たな治療戦略開発のための基礎研究を行った。これまでの研究で、SPring-8のBL28B2ビームラインから取り出した放射光X線を用いて8週齢オスのC57BL/6JJclマウスに対し、全脳照射とスリット照射を行った。スリット照射では、ビーム幅25μm、ビーム間隔200μmのマイクロビームを照射した。

ビーム幅25μm、ビーム間隔200μmスリット照射群の半致死線量(LD50/90)は約500Gyであり、ビーム間隔100μm群、300μm群ではそれぞれ180Gy、700Gyであった。組織学的評価では照射部位に一致したスリット状の核の脱落がみられたが、異常行動等はみられておらず機能学的な異常はなかった。平成27年度の実験では、ビーム間隔を100μm、200μm、300μmとしファントムおよびマウスへの照射を行った。照射線量のピークと谷の線量比はビーム間隔100μm、200μm、300μmでそれぞれ、19、38、60であった。マウスへの照射では、50%致死線量となるピーク線量はそれぞれ、244、533、792Gyであった。一方、50%致死線量となる谷線量はそれぞれ13、14、13Gyであった。これらの結果からは、スリット照射を行った際の正常脳の耐用線量はピーク部の線量よりも、谷線量に依存する可能性が示唆された。これらの研究成果から、SMRTにより従来の照射より高線量での照射が可能と考えられ、SMRTにおける耐用線量の推定には谷線量の評価が重要であることが示された。高輝度放射光設備(SPring-8)から供給される放射光を用いて、正常脳組織および脳腫瘍に対する高精細格子状照射(MRT)の研究を行った。マウスの脳に対するMRTでは、ビーム間隔300μmの照射において、50%致死線量が600Gyと、従来の照射方法と比し極めて高線量の照射が可能であった。病理標本においてもMRT照射後は脳組織が保存されていた。マウスの正常脳の耐用線量は、高精細格子状照射におけるピーク部の線量よりも、谷となる低線量域の線量において規定されている可能性が示唆された。マウスに対する照射後の組織学的検討を遂行することができた。in vitro実験に関しては予定通りの実験を遂行することができず、当初想定していたよりも十分な実験結果がえられていないため、追試験が必要となった。Spring-8でのマシンタイムは無制限ではなく、追試験・再試験に要するマシンタイムの申請を行う必要があるため、本年度に施行できなかった追試験は平成27年度に実施予定である。放射線腫瘍学平成26年度の研究計画から追試が必要となったin vitro実験に関しては平成27年度に施行予定である。その他のin vivo実験に関しては当初の研究計画に則り施行する予定である。Spring-8でのマシンタイム申請を行い、当初計画したとおりの研究を遂行する予定である。マウスに対する照射後のin vivo実験は計画に沿って遂行することができた。しかし、in vitro実験に関しては予定通りの実験を遂行することができず、当初想定していたよりも十分な実験結果がえられていないため、追試験が必要となった。Spring-8でのマシンタイムは無制限ではなく、追試験・再試験に要するマシンタイムの申請を行う必要があるため、本年度に施行できなかった追試験は平成26年度に実施予定である。本年度計画していたin vivo実験にが予定どおりに遂行することができず、実際の使用額が予定より少なくなった。このため、次年度使用額が生じた。平成25年度の研究計画から追試が必要となったin vitro実験に関しては平成26年度に施行予定である。2014年度に進捗できなかったin vivo実験に対する実験計画をたてており、申請時の計画と同様の実験を遂行する予定である。
外分泌腺細胞単離小胞体標本によりリアノジン受容体の解明

ラット耳下腺及び膵腺房細胞に存在すると考えられるリアノジン感受性Ca^<2+>放出機構の特性を調べるために、単離小胞体標本によるCa^<2+>フラックスと、単離細胞標本によるCa^<2+>依存性K^+及びCl^-電流を測定した。1.耳下腺単離小胞体標本による^<45>Ca^<2+>フラックスの測定:1)カフェイン(1040mM)、低濃度(10μM)のリアノジンと環状ADPリボース(cADPR110μM)は小胞体よりCa^<2+>を放出させる。2)40mMのカフェインによるCa^<2+>放出は、10μMのリアノジンの前処理により効果が促進された。3)カフェイン(40mM)並びにcADPR(4μM)によるCa^<2+>放出は、500μMのリアノジンの前処理並びに、50μMのルテニウムレッドの存在で著明に抑制された。4)低濃度(0.5μM)のcADPRは、カフェインによるCa^<2+>放出の用量応答曲線を左に移動させた。2.膵腺房細胞単離小胞体標本によるCa^<2+>フラックスの測定:1)カフェイン(1040mM)、低濃度(10μM)のリアノジン並びにcADPR(0.14μM)は、小胞体より^<45>Ca^<2+>を放出させる。2)Ca^<2+>選択性電極を用いることにより、Ca^<2+>濃度の増加(懸濁液中のCa^<2+>濃度に換算して50μMの増加)が、小胞体よりCa^<2+>に放出を引き起こすことが示された。3.耳下腺単離小胞体標本によるCa^<2+>依存性K^+及びCl^-電流の測定: 1)140mMのカフェインは用量依存性にCa^<2+>で活性化されるK^+及びCl^-電流を誘発した。2)リアノジン(20μM)またはcADPR(12μM)を細胞内に注入すると、カフェイン(40mM)とアセチルコリン(30nM)による電流応答は、どちらの場合も増強された。3)リアノジン200μMを注入すると、カフェイン(40mM)の作用は抑制された。以上の結果より、筋肉や神経などの興奮性細胞で報告されている、リアノジン受容体と同様の性質を持つCa^<2+>放出機構が、ラット耳下腺や膵腺房細胞の小胞体膜上に存在し、分泌刺激時のCa^<2+>動員機構にも関わっていることが示唆された。以上の結果より、筋肉や神経などの興奮性細胞で報告されている、リアノジン受容体と同様の性質を持つCa^<2+

>放出機構が、ラット耳下腺や膵腺房細胞の小胞体膜上に存在し、分泌刺激時のCa^<2+>動員機構にも関わっていることが示唆された。ラット耳下腺腺房細胞のCa^<2+>ストアに存在すると考えられるリアノジン感受性Ca^<2+>放出機構の特性を調べるために、単離小胞体標本による^<45>Ca^<2+>フラックスと、単離細胞標本による、Ca^<2+>依存性K^+およびCl^-電流を測定した。1.単離小胞体標本による^<45>Ca^<2+>フラックスの測定:1)カフェイン(1040mM)、低濃度(10μM)のリアノジンと環状ADPリボース(cADPR110μM)は小胞体よりCa^<2+>を放出させる。2)カフェイン(40mM)によるCa^<2+>放出は,10μMのリアノジンの前処理により効果が促進されるが、500μMのリアノジン並びに50μMのルテニウムレッドの存在で著明に抑制された。3)cADPR(4μM)によるCa^<2+>放出も,500μMのリアノジンの前処理並びに50μMのルテニウムレッドの存在で著明に抑制された。4)低濃度(0.5μM)のcADPRはそれ自身、有意なCa^<2+>放出を起こさないが、カフェインによるCa^<2+>放出の用量応答曲線を左に移動させた。2.単離細胞標本によるCa^<2+>依存性K^+及びCl^-電流の測定:1)140mMのカフェインは用量依存性にCa^<2+>で活性化されるK^+及びCl^-電流を誘発した。2)リアノジン20μMを細胞内に注入すると、カフェイン(40mM)とアセチルコリン(ACh30nM)による電流応答は増強された。リアノジン200μMを注入すると、カフェイン(40mM)の作用は抑制された。3)cADPR(12μM)を細胞内に注入すると、カフェイン(40mM)とACh(30nM)の作用はどちらも増強された。4)ルテニウムレッド50μM存在下でカフェイン(40mM)の作用は著明に抑制された。以上の結果より、筋肉や神経などの興奮性細胞で報告されている、リアノジン受容体と同様の性質を持つCa^<2+>放出機構が、ラット耳下腺腺房細胞の小胞体膜上に存在し、分泌刺激時のCa^<2+>動員機構にも関わっていることが示唆された。尚,このCa^<2+>放出機構の受容体としての性質を調べる為に、^3Hで標識されたリアノジンによる結合実験も現在進行中である。平成7年度にラット耳下腺単離小胞体標本を用いて、カフェイン、リアノジン、環状ADPリボース(cADPR)が、著明なCa^<2+>放出を引き起こす等の結果を得て、リアノジン感受性Ca^<2+>放出機構についての確証を得たので平成8年度は、膵腺房細胞にも対照を拡げ、また耳下腺については、その放出機構の受容体としての特性も含めて検討することにした。1.膵腺房細胞単離小胞体標本による^<45>Ca^<2+>フラックスの測定:1)カフェイン(1040mM)、低濃度(10μM)のリアノジンとcADPR(0.14.0μM)は小胞体より^<45>Ca^<2+>を放出させる。2.Ca^<2+>電極法を用いた小胞体標本によるCa^<2+>フラックスの測定(耳下腺及び膵腺房細胞小胞体標本懸濁液中のCa^<2+>濃度の測定): 1)耳下腺単離小胞体標本の場合は電極で測定してもカフェイン、リアノジン、cADPR及びCa^<2+>がCa^<2+>放出を引き起こすという確証は得られなかった。2)膵腺房細胞の単離小胞体標本の場合は、Ca^<2+>濃度の増加(懸濁液中のCa^<2+>濃度に換算して50μMの増加)が、小胞体よりCa^<2+>放出を引き起こすことが示された。今後更に、このCa^<2+>
大径材及び高品位材の供給に関する研究

本研究によって、文化財修理用資析調査及び需要予測、高品位材の市場調査及び供給能力の予測、フィールド分布調査を整理した上で、分布台帳を作成するとともに、必要資材量について検討し、檜皮の剥皮実験を行った。その結果、1.文化財建造物の保存にとって修理技術者の育成と修理用資材の確保が不可欠であること、2.建造物文化財は、既指定数が増加傾向にあり、修理件数は必然的に増加すること、3.修理用資材を木材に限定した場合、その需要に対して重要な材は、樹種では、ヒノキ、スギ、マツ、ケヤキ、クリであり、材質等では大径材、高品位材、特殊材であること、4.一般市場に出回る木材は、規格材の生産に止まり、文化財修理に必要な木目の細い木目の詰んだ材は既に確保が困難な状況となっていること、5.大径材等については、天然林において修理用資材を採取出来る立木の確認が必要であり、これらの立木を育成できる森林を確保し、そのための育林方法の確立を図る必要があること、6.大径木のフィールド分布調査によると文化財修理用資材の安定的確保と言う観点からみて、大学演習林では十分な資源量とは言えないこと、7.供給サイドからはアカマツが資源として厳しい状況にあること、8.修理用資材の供給源の確保や整備を行うためには、修理用資材に求められる形質を明らかにし、立木の状態で選別できる基準を設定する必要があること、9.大経木のフィールド分布調査の対象を国有林や公有林に広げる必要があること、10.文化財の修理用資材確保を目的とした備林を設定する必要があること、11.文化財修理の資材調達の困難さの実状を社会的に明らかにし、森林所有者とともに、林業、木材業界全体の協力体制を大学演習林が率先してモデルを構築することが必要であり、それらを基礎に大学演習林を中心にして地域の関係者との体制作りへと進むべきであること、が明らかになった。文化財修理用資材調査では既存の補修修理の木拾いより、各年代や建築用途の違いごとに劣化部材、補修部材の樹種、寸法などの実態を調査し、今後の調査の主点を検討した。大径優良材市場調査では、平城京「朱雀門」復元工事に用いた用材の需要量及び流通経路について調べた。その結果、最重要材であるヒノキは奈良、三重、岐阜、長野、埼玉と広範囲から集められていることが明らかになった。フィールド分布調査では大学演習林における優良大径木の存在状況および檜皮材用ヒノキ剥皮実験を行った。存在状況調査ではスギ、ヒノキ、ケヤキ、ツガ、クリなど25樹種について文化財修理用優良大径木を全大学演習林で実施した。主たる調査目的は優良大径木の生育条件の普遍化を図ることであり、各優良大径木の生育する環境調査を行った。次に、檜皮資材を採取するための剥皮行為がヒノキにとって、どのような生理的影響があるかを検証するため、福岡から千葉の間にある4カ所の大学演習林のヒノキ80本を斜面方位、林縁効果、立木密度、獣害に大きな差異が生じないよう配慮して選び、うち40本について剥皮し、残りの40本については対照木として観察の対象とすることとした。この実験にはヒノキ林所有者がもつ檜皮材採取により樹木の生育阻害や品質低下がおこるのではないかという疑念を解消する効果が期待される。保存林事例調査では寺社など木造建築物の補修用材を確保するための用材林を育成管理し持続的な供給体制の確立を図っている事例として、伊勢神宮遷宮造営用材確保のための森林育成をあげ、神宮備林の経緯と伊勢神宮宮域林の森林管理について調査したが、地域差や森林の現存蓄積に差はあるものの、自給するには必ずしも充分ではないという結論を得た。次年度以降は、以上の4項目の研究課題に加え、データベースの作成、優良大径木育成林の造成、文化財補修用材用備林の設定について検討を続ける。本年度は以下の6項目について調査を行い、検討会を開催した。1)文化財修理用資材調査:重要文化財建造物の修理で使用された樹種とその品質及び数量等につき、過去の実績を調査した。文化庁所蔵の構成部材資料、重要文化財建造物の構造形式・主要寸法のデータベース化を行った。これを分析して、需要予測、文化財修理用資材として満たすべき必要な規格について検討を行った。2)高品位材の市場調査:近畿地方において修復用材及び檜皮の流通調査、佐賀県下において名護屋城茶室の復元用材の流通調査を行った。これをもとに修復用材の流通及び供給可能量の推計を行った。3)フィールド分布調査:昨年度の調査から需要が多く、流通量の少ないアカマツ、クロマツ、ツガ、ケヤキ、クリ、サワラの6樹種について調査対象の基準を見直したが、アカマツ、クロマツ、サワラについては大径木の本数が少ないことが明らかになった。檜皮剥皮の影響調査の実験木については直径測定と写真撮影を行った。1年目では顕著な変異は認められなかった。4)保存林の事例調査:長野営林局管内における「重要文化財等の特殊用材の注文販売」と「木曽ヒノキ文化財等大径材択伐生産群」及び諏訪神社の御柱(モミ)の資材調達について事例調査を行った。ヒノキについては数百本の大径木が調査された。5)データベース化の検討:フィールド分布調査の結果を整理し、画像及び位置情報を森林をGISに取り込み、文化財修理用資材提供のためのシステムの検討を行った。ネットワークでの情報提供についても検討したが、セキュリティ、公表内容についての課題が明らかになった。

6)育成技術研究の検討:北海道大学和歌山地方演習林、東京大学千葉演習林のスギ・ヒノキ長伐期施業実験林において大径木の成長経過を解析し、密度管理の方法など長期的な育成システムの検討を行った。本研究によって、文化財修理用資析調査及び需要予測、高品位材の市場調査及び供給能力の予測、フィールド分布調査を整理した上で、分布台帳を作成するとともに、必要資材量について検討し、檜皮の剥皮実験を行った。その結果、1.文化財建造物の保存にとって修理技術者の育成と修理用資材の確保が不可欠であること、2.建造物文化財は、既指定数が増加傾向にあり、修理件数は必然的に増加すること、3.修理用資材を木材に限定した場合、その需要に対して重要な材は、樹種では、ヒノキ、スギ、マツ、ケヤキ、クリであり、材質等では大径材、高品位材、特殊材であること、4.一般市場に出回る木材は、規格材の生産に止まり、文化財修理に必要な木目の細い木目の詰んだ材は既に確保が困難な状況となっていること、5.大径材等については、天然林において修理用資材を採取出来る立木の確認が必要であり、これらの立木を育成できる森林を確保し、そのための育林方法の確立を図る必要があること、6.大径木のフィールド分布調査によると文化財修理用資材の安定的確保と言う観点からみて、大学演習林では十分な資源量とは言えないこと、7.供給サイドからはアカマツが資源として厳しい状況にあること、8.修理用資材の供給源の確保や整備を行うためには、修理用資材に求められる形質を明らかにし、立木の状態で選別できる基準を設定する必要があること、9.大経木のフィールド分布調査の対象を国有林や公有林に広げる必要があること、10.文化財の修理用資材確保を目的とした備林を設定する必要があること、11.文化財修理の資材調達の困難さの実状を社会的に明らかにし、森林所有者とともに、林業、木材業界全体の協力体制を大学演習林が率先してモデルを構築することが必要であり、それらを基礎に大学演習林を中心にして地域の関係者との体制作りへと進むべきであること、が明らかになった。現在、重要文化財に指定されている建造物はおよそ3,600棟あり、その約90%が木造である。また、そのうちの約半数は、桧皮、こけら、茅等の植物性材料で屋根が葺かれている。こうした文化財建造物の修理には良質の木材や屋根に使用する植物性材料が必要である。しかし、近年、社会情勢の変化や経済状況の著しい変化にともない、文化財建造物の修理に不可欠の国産材のうち、大径材や高品位材及びケヤキ、クリ等の広葉樹の生産が極端に減少し、今後の文化財建造物の修理用資材の安定的確保が緊急の課題となっている。このような状況を踏まえて、研究・教育を目的として全国各地に設置されている大学演習林(26大学、94箇所、13万ヘクタール)を対象に、大径材や高品位材、一般建築に用いられることの少ない特殊材(ケヤキ、トガ、クリ、クス等)、及び桧皮材料の確保の可能性を検討した。本年度は最終年度に当たり文化財修理用資析調査及び需要予測、高品位材の市場調査及び供給能力の予測、フィールド分布調査をとりまとめ、整理した上で、分布台帳を整理作製するとともに、必要資材量の適否について検討した。データベース化の構築、フィールド分布調査により収集された各項目ごとのデータをGISシステムに取り込み、データベースの構築を図り、現状分布及び将来予測のための基礎資料を得た。高品位材等の基準設定大径材及び高品位析を組織的・計画的に育成するために、高品位材等の基準を明確にした。育成技術の研究として大径材及び高品位材の確保のための木材の育成方法に関する研究を行った。
高い水素発生活性を実現する[FeFe]型ヒドロゲナーゼの構造デザイン

緑藻Chlamydomonas reinhardtiiの[FeFe]ヒドロゲナーゼHydA1は、コンパクトで有りながら非常に高い水素発生活性をもつ酵素として知られているが、活性中心であるHクラスターの形成と保持に厳密に嫌気的な環境を必要とし、生化学的な解析や応用研究が困難である。本研究課題では、酸素分圧1 ppm以下の嫌気環境でのタンパク質生産を容易に実現できる、絶対嫌気性の光合成細菌Chlorobaculumtepidumの外来遺伝子発現系を利用し、高い水素発生活性を保持したHydA1の大量生産系を確立することを主な目的としていた。28年度までの研究により、C. tepidumにおいて高レベルのタンパク質発現は遺伝子のN末端領域の塩基配列に強く依存することを明らかにした。29年度はこの研究成果を利用し、Hクラスター形成に必要な成熟化タンパク質であるHydE、HydF、HydGのHydA1との高レベル共発現を試みた。全長にわたるコドン使用頻度の最適化と、N末端に付加するアフィニティータグの塩基配列を検討した結果、Strepタグ付きの遺伝子の導入によってC. tepidum内でHydEFGを高発現できることがわかった。HydA1と共発現させた結果、ほぼ全てのHydA1にHクラスターを保持させることに成功した。驚くべきことに、HydA1とHydEFGのC. tepidum共発現株は、培養中に光依存的に水素ガスを発生させていることがわかった。HydA1は本来、光合成伝達系で働くフェレドキシンPetFをプロトン還元の電子供与体としているが、その分子認識は厳密ではなく、C. tepidumの細胞内では別の電子供与体が機能している可能性が示唆された。28年度が最終年度であるため、記入しない。非常に高い水素発生活性をもつ緑藻Chlamydomonas reinhardtiiの[FeFe]ヒドロゲナーゼHydA1は、酵素活性中心として鉄と硫黄から成る金属錯体「Hクラスター」をもつ。本年度の研究では、ホロ型酵素の原子分解能構造解析を目指し、緑色硫黄光合成細菌Chlorobaculum tepidumの嫌気的な異種遺伝子の発現系(酸素分圧1 ppm以下)を利用し、Hクラスター成熟化タンパク質との共発現によるホロ型HydA1の大量発現を試みた。HydA1上でのHクラスター形成には、3種類の成熟化タンパク質HydE、HydF、HydGが必要である。大腸菌での過剰発現に成功例がある嫌気性細菌Clostridium acetobutylicum由来のhydEFG遺伝子クラスターをC. tepidumアポ型HydA1過剰発現株へ導入することで、HydEFGとHydA1の共発現を試みた。この際,導入するhydEFGの塩基配列について、GC含量、コドン使用頻度、mRNAの二次構造形成、N末端領域のアミノ酸配列を検討し、異種遺伝子の過剰発現に必要な塩基配の列条件を探った。その結果、C. tepidumでのHydEFGの発現量は、N末端領域をコードする塩基配列に強く依存していることがわかった。GFPを使った異種遺伝子発現のモデル実験から、C. tepidumでの異種タンパク質の発現には、開始コドンから10コドン程度までのmRNAの二次構造形成確率が大きく関係していることが示唆された。本年度の研究の主要な目的であった、Hクラスターの成熟化タンパク質HydEFGのC. tepidumでの異種発現に成功した。また、[FeFe]ヒドロゲナーゼのアポ型酵素のin vitro成熟化実験にも成功しており、次年度の研究でホロ型HydA1の異種発現が期待できる結果が得られている。

Hクラスターの成熟化タンパク質HydEFGのC. tepidumでの過剰発現系の構築を進める。本年度の研究から、タンパク質のN末端領域をコードする塩基配列がタンパク質発現量に大きく影響することがわかったので、N末端タグの検討や同義コドンの置換による塩基配列の最適化により、HydEFGの発現量の向上を目指す。また、HydA1についてもPetFの融合などを検討し、C.tepidumでの効率的なホロ型酵素の成熟化方法を探る。28年度が最終年度であるため、記入しない。
社会経済的地位ががん患者のQOLと遺族の精神的健康に与える影響

社会経済的地位(Social Economic Status:SES)の近いによる健康格差は医療・公衆衛生学分野で広く明らかになっているものの、緩和ケア/終末期ケアにおけるアウトカムである終末期がん患者のQuality of Life (QOL)や遺族の精神的健康に与える影響は明らかでない。そのため、具体的なアセスメント方法や支援方法が明らかではない。したがって、本研究の目的は、(1)患者・遺族のSESの違いががん患者び治療選択およびQOLに与える影響について明らかにすること、(2)患者・遺族のSESの違いが遺族の精神的健康(うつや悲嘆)に与える影響について明らかにすることの2点である。1年目として、研究データの取得元である日本ホスピス・緩和ケア研究振興財団研究事業である「遺族によるホスピス・緩和ケアの質の評価に関する研究4(J-HOPE4研究)」の進捗に準じ、質問紙の作成・印刷・送付・回収を行った。当初は1年目の計画として、データを受領し、データクリーニングと粗解析を行う予定であったが、J-HOPE4研究全体の進捗がやや遅れており、データが未受領である。質問紙の送付・回収は終了しており、2年目にデータは受領する予定である。また、わが国におけるSESの至適な指標について検討を行うために、本研究に関連する先行文献や関連図書のレビューを行った。国内のみならず、国際的にも終末期における意思決定や緩和ケアのアウトカムに影響を及ぼすSESに関連する研究は少なく、更なる情報収集及び検討が必要であり、本研究の重要性が確認できた。研究データの取得元である日本ホスピス・緩和ケア研究振興財団研究事業である「遺族によるホスピス・緩和ケアの質の評価に関する研究4(J-HOPE4研究)」の進捗が遅れており、1年目でデータ受領予定であったが、2年目で受領することとなった。やや時期は遅れたものの、質問紙の送付・回収は終了しており、J-HOPE4研究事務局で全体のデータ入力終了後にデータを受領する。2年目の計画として、受領したデータのクリーニングと粗解析と併行して、詳細な解析を行い、得られた結果を随時学術集会や学術誌等で公表する。解析のアウトカムは(1)終末期がん患者のQOL(望ましい死の達成度)と(2)遺族の悲嘆または抑うつの程度の2点であり、SESが、これらアウトカムにどのように関連しているかについて、単変量および多変量解析を行う。1年目の文献レビューもふまえ、結果の考察や社会への具体的な還元方法について、先行研究や関連図書とも比較しながら検討する。また、2-3年目で本研究結果を国内外の学術集会や学術誌で広く発表するとともに、社会的・臨床的示唆について検討する。データの受領が遅れているため、データクリーニング・解析のために使用する予定の資料や人件費にかかる経費を次年度に繰り越した。
構造健全性評価用エキスパ-トシステムの開発

本研究は、材料力学、破壊力学、材料科学、数値解析の各専門家の知識をコンピュ-タ上に蓄えた構造健全性評価エキスパ-トシステムを構築することを目的として行なわれた。主な成果は次のようにまとめられる。(1)3次元破壊力学デ-タベ-スの開発と健全性評価への応用半だ円表面き裂に対する線形、非線形破壊力学デ-タベ-スがき裂深さ及びき裂のアスペクト比の関数として求められた。さらに、それを組み込んだ健全性評価システムが完成した。(2)モデリング・システムFEMおよびBEMの自動要素モデリングシステムとして、あいまい知識処理手法、知識ベ-ス形状の符号化手法などに基づく研究が行われ、入力デ-タ数も少なく、制御性のよい2次元および3次元の自動要素分割システムが完成した。(3)解析デ-タ蓄積法膨大な数値解析結果の整理・圧縮法およびそのデ-タ・ベ-ス化について研究が行われ、そのプロトタイプシステムが完成した。(4)構造健全性評価解析に基づく原子力構造設計について、設計規格や経験を組み込んだ構造健全性評価部が完成した。(5)システムの統合化複数の数値解析コ-ドと健全性評価部、FEMモデラ-、デ-タベ-ス、IF-THENル-ルとファジイ推論によって経験的知識を組み込んだ設計変更モデジュ-ルなどをオブジェクト指向型の知識表現としてモジュ-ル化し、その間をデ-タフロ-型推論エンジンで緩やかに統合するエキスパ-トシステムの本体が完成した。本研究は、材料力学、破壊力学、材料科学、数値解析の各専門家の知識をコンピュータに蓄えた構造健全性評価エキスパートシステムの作成を目的として2年計画で進められている。本年度得られた主な成果は以下の通りである。(1)破壊力学データベースの開発引張り荷重作用下の平板内半楕円表面き裂および配管内半楕円表面き裂の線形および非線形破壊力学パラメータの解(J積分の全面塑性解)がき裂深さおよびき裂のアスペクト比の関数として得られた。(2)有限要素モデラーの開発あいまい知識処理手法を応用した2次元(線形三角形要素)および3次元(線形四面体要素)の有限要素モデラーが開発された。これにより、き裂や円孔などの応力集中部を含む複雑な形状の要素分割を少ないパラメータで数値解析の専門家と同程度に自由に制御できるようになった。(3)汎用システム利用支援エキスパートシステムの開発構造健全性評価用エキスパートシステムのユーザーインターフェースの基礎研究として、オブジェクト指向による汎用FEMコード利用支援システムを開発した。(4)複数の有限要素解析コードと応力・温度評価ルーチン、物性値データベース、経験的知識などをオブジェクト指向型の知識表現としてモジュール化し、その間をデータフロー型推論エンジンで緩やかに結合するエキスパートシステムの本体部分がほぼ完成し、応力基準に基づく簡単な健全性評価が可能となった。今後は(1)、(2)の成果に(3)のようなユーザーインターフェースを整備し、(4)のエキスパートシステムに組み込む予定である。
フォトンを工具とする超高密度三次元光記録装置の開発

現在、CDやDVDなどの高密度光記憶装置が普及しているが,近い将来に予想される高画質の動画を長時間にわたって記憶するような用途には,これらのメディアは記憶容量が不足している。これらの光記憶媒体は記憶容量が原理的な限界にほぼ達しており,新しい超高密度記録方法が求められている。そのような手法として,我々は石英ガラスを用いた三次元光記録方法の研究を行い,以下のことを明らかにした。1.ピコ秒およびフェムト秒レーザーの単一パルスを集光照射することにより,多光子過程によって石英ガラス中の微小空間において屈折率変化を誘起することができ(以下,屈折率が変化した点を「ビット」と表記する),この現象を用いて三次元光記録が可能なこと。2.ビットの生成速度は400ピコ秒程度であること。3.フェムト秒パルスで生成したビットの中心には微小空孔が生成されていること。4.ビットは熱的に極めて安定であり,ビットを記録した石英ガラスを1150°Cでアニールしても光学顕微鏡像に変化が現れないこと。5.生成したビットからは特有のスペクトルを持つ発光が観測されること。さらに,この発光強度はアニールすると減少し,500°Cでのアニールによってほぼ消滅すること。6.ビットを多層にわたって書き込んだサンプルでは,明視野像および発光像により各層のビットパターンを独立に読み出すことが可能であること。7.PMMAなど石英ガラス以外の材料においても同様の現象が観測されること。新しく導入したフェムト秒チタンサファイアレーザーを用いて石英ガラスへの三次元記録の実験を行った。その結果,再生増幅したフェムト秒パルス光の第二高調波(400nm,130fs)を集光照射することにより,ピコ秒Nd:YAGレーザーの場合と同様に,単一パルスでビットを形成することが可能であることが確認された。高効率で三次元記録が行えるような新しい材料を開発するためには,短パルスレーザーを集光照射した時に焦点付近にビットが形成されるメカニズムを詳細に解明する必要がある。そのため,ガラス板の内部に多数のビットを形成した石英ガラスの表面を原子間力顕微鏡で観察した。その結果,ガラス表面に凹状のくぼみが形成していることが明らかとなった。これは,レーザー照射した部分の体積収縮が生じたためと考えられる。したがって,ビット形成に伴いガラスの高密度化が誘起され,屈折率の上昇が生じているものと考えられる。また,ピコ秒のパルスレーザーを用いて書き込み速度の計測を行ったところ,ビット形成に伴う屈折率変化は400ピコ秒程度で完了していることが明らかとなった。これは,この石英ガラスの三次元光書き込みでは,従来の三次元光記録では不可能だった,極めて高速な書き込みが可能であることを示唆している。一方,しきい値の低い新たな三次元記録材料の候補の一つとして有機材料を考え,数種のポリマー系で実験を行った。その結果,PMMAを材料として光学的に透明な膜を作製することができ,その膜には石英ガラスよりも1桁低いレーザーパワーで書き込みが可能であることが明らかとなった。さらに,500nm付近に現れるビットからの蛍光を観察することによって,ビットそれ自身の像を観察するよりも高い分解能で記録を読み出すことができる可能性を見い出した。現在、CDやDVDなどの高密度光記憶装置が普及しているが,高画質の動画を長時間にわたって記憶するような用途には,これらのメディアは記憶容量が不足している。そのような手法として,我々は石英ガラスを用いた三次元光記録方法を提案し,研究を行っている。これまでに,ピコ秒およびフェムト秒のレーザーパルスによりコントラストが高く通常の光学顕微鏡で認識が可能なビットが石英ガラス中に生成し,これを用いて三次元記録が可能なことを報告してきた。これらに加え,ビットが光励起により発光を示すことを見出し,これを使った読み出しについて検討を行った。

多数のビットを書き込んだ石英ガラスを試料として,蛍光分光光度計で250nmの光を照射して発光スペクトルを測定したところ,283nm,468nm,558nmにピークを持つ3つの発光バンドが観測された。これらのバンドの発光強度はビット書き込みのパルス強度に依存し,書き込みを行っていない試料からは観測されないことから,ビットからの発光であることが確認された。次にこの発光によるビットの読み出しを試みた。励起光として400nmのレーザー光を用いて蛍光強度の二次元マッピングを行ったところ,明視野で観測されるビットのパターンが同様に観測された。多層にわたってビットを書き込んだサンプルでは,各層のビットパターンを独立に読み出すことが可能であった。現在、CDやDVDなどの高密度光記憶装置が普及しているが,近い将来に予想される高画質の動画を長時間にわたって記憶するような用途には記憶容量が不足している。これらの光記憶媒体は記憶容量が原理的な限界にほぼ達しており,新しい超高密度記録方法が求められてる。そのような手法として,我々は石英ガラスを用いた三次元光記録方法を提案し,研究を行っている。これまでに,ピコ秒およびフェムト秒のレーザーパルスによりコントラストが高く通常の光学顕微鏡で認識が可能なビットが石英ガラス中に生成し,これを用いて三次元記録が可能なことを報告してきた。さらに,本課題研究により,このビットは欠陥由来の発光を示し,発光を検出することによっても三次元的な読み出しが可能なことを示した。そこで,今年度は,書き換え型記録への応用を考慮して,ビットの消去について検討した。ビットは熱的に極めて安定であり,ビットを記録した石英ガラスを1150°Cでアニールしても光学顕微鏡像に変化が現れないことは既にわかっていたが,アニールしたガラスの室温における発光スペクトルを測定したところ,著しい変化を見出した。アニール温度300°Cで発光が減衰し始め,500°Cでアニールすると発光強度はほぼ0となった。この結果から,発光による読み出しを利用すると,書き換え可能なメモリーを構築できる可能性がある。また,前述のように光学顕微鏡像には変化が無いため,多重メモリーとしての利用も考えられる。さらに,各温度でアニールしたサンプルのESR測定を行い,発光を示す欠陥の起源について考察した。
微細針による毛細血管・細静脈からの採血システムの開発（蚊のバイオミメティクス）

本課題では,蚊の針の細さの摸倣のみならず,動物の皮膚への穿刺行動,毛細血管・細静脈からの吸血行動を詳細に観察し,その機能を工学的に摸倣して新規な穿刺・採血メカニズムを提案・開発することを目標とする.本年度の研究実績の概要を以下に示す.蚊が針を皮膚に穿刺する様子,および針を血管にアクセスさせて血液を吸引する様子を動物の皮膚を用いて観察した.針を回転させると同時に,振動させることにより皮膚を穿孔していることを解明した.針先端で血管を複数回突くことで血管を穿孔し,その穴より血液を吸引していることを解明した.蚊の針の運動を摸倣して穿刺抵抗および皮膚の撓みが少ない穿刺機構の開発に着手した.針の往復回転をステッピングモータで行い,ポンプにより針を介して血液を吸引できる携帯型採血装置を設計・製作した.これを用いて人工皮膚への穿刺実験を行った結果,穿刺抵抗力が回転の無い場合と比べて1/3以下に低減された.非線形有限要素法によるシミュレーションにより,穿刺方法の有効性を理論検証した.ソルバーとしてLS-DYNAを用い,大変形を許容するALE法を用いて針が皮膚に陥入していく様子のシミュレーション解析を行った.本年度は1本の針についての解析を行い,その際の穿刺抵抗力と,実験による穿刺抵抗力との比較を行った.境界条件等,適切なソルバーの運用を行うことにより,20%以内の誤差までに解析値と実験値を一致させることに成功した.蚊はランダムに血管を探索しているが,研究室で培った血管可視化技術を活用し,血管を狙って穿刺する手法の確立を本研究では目指す.そのために本年度は,2台のカメラをそれぞれ任意の位置・姿勢に固定して,動物の皮膚を様々な位置・角度から拡大観察できるシステムを考案して業者に製造発注し,これを導入した.今後このシステムを用いて,画像フィードバックを用いた自動採血システムの開発を目指す.1)動物の皮膚・血管を用いた蚊の穿刺メカニズムの解明:現有する倒立顕微鏡と高速度カメラによる動物皮膚の拡大観察を行い,蚊の口針および開発した針が皮膚・血管を穿刺する様子を観察した.針を回転・振動させることで皮膚を穿孔していること,針先端で血管を複数回突くことで血管を穿孔して血液を吸引していることを解明した.また蚊の口針を鞘のように包む下唇が,口針の座屈防止のみならず,皮膚に張力を与えて穿刺を容易にしていることを解明した.2)往復回転運動穿刺の提案とその効果の検証:申請者が取り組んできた鋸歯状突起で足場を作り,複数針を交互に振動させながら皮膚に刺し入れていく方法に加えて,工具の錐(キリ)のように往復回転運動による穿刺方法を提案した.回転工具(ドリル等)と同様に針を回転させることにより穿刺が容易になることが知られているが,マイクロサイズの針にこれを適用した例はない.本年度は,針の回転および血液の吸引ができる携帯型装置を開発した.これを用いて人工皮膚への穿刺を行い,回転により皮膚の撓みと穿刺抵抗力が大きく減少することを解明した.3)有限要素解析(FEM)による理論的な検証:蚊と同様に針を少し回転しては戻す往復回転運動を行うことにより,皮膚の撓みの防止と穿刺抵抗の低減が実現できるかどうかをFEMシミュレーションにより理論的に解析したい.本年度は,その準備段階として,1本の針を皮膚に単純に挿入した場合の穿刺抵抗力について,解析値と実験値を20%以下の誤差で一致させることに成功した.1)蚊の穿刺行動の観察:本年度に引き続き,動物皮膚を用いた蚊の穿刺行動の詳細な観察を行う.2)往復回転と縦振動の組み合わせ:本年度は1本の針の回転が可能な携帯型装置を開発した.来年度以降は,これに振動を加えられるようにする.また蚊の口針と同様に,束となった複数の針のそれぞれを互いに位相差を設けて振動させながら,針の束全体を回転させることができる携帯型の皮膚穿刺・血液吸引装置の開発を進める.3) FEM解析:前年度,穿刺抵抗力のシミュレーション値(解析値)と実験値の誤差を少なくすることに成功した.すなわち,現在FEMによる仮想穿刺実験が行える状態にある.そこで今後は,FEMにより針の回転運動の効果,皮膚に張力を与えることの効果,複数針を交互に振動させることの効果,等を検証する.4)画像を用いた採血システム:本年度,動物の皮膚を様々な位置・角度から顕微鏡を用いて拡大観察できるシステムを導入した.今後この装置を用い,蚊の穿刺行動の観察,開発した針の穿刺性能の評価を行う.後者においては,照明光の波長の工夫と画像処理により血管を強調することで,血管を狙って穿刺できるシステムの開発を行う.5)痛みの客観的な評価:動物の脊椎後角表層細胞に痛覚神経が繋がっており,この細胞の活動電位をin vivoで記録することで,動物が感じる痛みの程度を確認できる.微細針と市販の針の痛みの違い,本研究に基づく刺し方(回転穿刺,皮膚への張力付与,等)による痛みの違いを客観的に評価する.

実験は分担者の富山大学・歌大介の研究室で行う.本課題では,蚊の針の細さの摸倣のみならず,動物の皮膚への穿刺行動,毛細血管・細静脈からの吸血行動を詳細に観察し,その機能を工学的に摸倣して新規な穿刺・採血メカニズムを提案・開発することを目標とする.本年度の研究実績の概要を以下に示す.蚊が針を皮膚に穿刺する様子,および針を血管にアクセスさせて血液を吸引する様子を動物の皮膚を用いて観察した.針を回転させると同時に,振動させることにより皮膚を穿孔していることを解明した.針先端で血管を複数回突くことで血管を穿孔し,その穴より血液を吸引していることを解明した.蚊の針の運動を摸倣して穿刺抵抗および皮膚の撓みが少ない穿刺機構の開発に着手した.針の往復回転をステッピングモータで行い,ポンプにより針を介して血液を吸引できる携帯型採血装置を設計・製作した.これを用いて人工皮膚への穿刺実験を行った結果,穿刺抵抗力が回転の無い場合と比べて1/3以下に低減された.非線形有限要素法によるシミュレーションにより,穿刺方法の有効性を理論検証した.ソルバーとしてLS-DYNAを用い,大変形を許容するALE法を用いて針が皮膚に陥入していく様子のシミュレーション解析を行った.本年度は1本の針についての解析を行い,その際の穿刺抵抗力と,実験による穿刺抵抗力との比較を行った.境界条件等,適切なソルバーの運用を行うことにより,20%以内の誤差までに解析値と実験値を一致させることに成功した.蚊はランダムに血管を探索しているが,研究室で培った血管可視化技術を活用し,血管を狙って穿刺する手法の確立を本研究では目指す.そのために本年度は,2台のカメラをそれぞれ任意の位置・姿勢に固定して,動物の皮膚を様々な位置・角度から拡大観察できるシステムを考案して業者に製造発注し,これを導入した.今後このシステムを用いて,画像フィードバックを用いた自動採血システムの開発を目指す.1)動物の皮膚・血管を用いた蚊の穿刺メカニズムの解明:現有する倒立顕微鏡と高速度カメラによる動物皮膚の拡大観察を行い,蚊の口針および開発した針が皮膚・血管を穿刺する様子を観察した.針を回転・振動させることで皮膚を穿孔していること,針先端で血管を複数回突くことで血管を穿孔して血液を吸引していることを解明した.また蚊の口針を鞘のように包む下唇が,口針の座屈防止のみならず,皮膚に張力を与えて穿刺を容易にしていることを解明した.2)往復回転運動穿刺の提案とその効果の検証:申請者が取り組んできた鋸歯状突起で足場を作り,複数針を交互に振動させながら皮膚に刺し入れていく方法に加えて,工具の錐(キリ)のように往復回転運動による穿刺方法を提案した.回転工具(ドリル等)と同様に針を回転させることにより穿刺が容易になることが知られているが,マイクロサイズの針にこれを適用した例はない.本年度は,針の回転および血液の吸引ができる携帯型装置を開発した.これを用いて人工皮膚への穿刺を行い,回転により皮膚の撓みと穿刺抵抗力が大きく減少することを解明した.3)有限要素解析(FEM)による理論的な検証:蚊と同様に針を少し回転しては戻す往復回転運動を行うことにより,皮膚の撓みの防止と穿刺抵抗の低減が実現できるかどうかをFEMシミュレーションにより理論的に解析したい.本年度は,その準備段階として,1本の針を皮膚に単純に挿入した場合の穿刺抵抗力について,解析値と実験値を20%以下の誤差で一致させることに成功した.1)蚊の穿刺行動の観察:本年度に引き続き,動物皮膚を用いた蚊の穿刺行動の詳細な観察を行う.2)往復回転と縦振動の組み合わせ:本年度は1本の針の回転が可能な携帯型装置を開発した.来年度以降は,これに振動を加えられるようにする.また蚊の口針と同様に,束となった複数の針のそれぞれを互いに位相差を設けて振動させながら,針の束全体を回転させることができる携帯型の皮膚穿刺・血液吸引装置の開発を進める.
周期点におけるmultiplierを用いた複素力学系におけるモジュライ空間の研究

自己正則写像を反復合成したときの挙動を研究する複素力学系の理論において,近年,力学系のモジュライ空間(自己正則写像の族,パラメータ空間)の構造そのものに着目した研究も行われている。本研究では特に,1変数複素力学系において基本的な量である周期点におけるmultiplier(微分係数)を用いて,1変数複素力学系におけるモジュライ空間の構造を調べる。特に,固定点におけるmultiplierの値を全て指定したときに,それらを実現するような複素力学系がどの程度存在するのかを詳細に調べる。
RNA-ペプチド複合体による人工チャネルの進化工学的創製

分子ロボティクスにおいて外的環境に感応してリポソームのような人工細胞が自律的に運動し、外的環境に応じて外部と内部の物質的なやり取りが可能になればその医療応用への波及効果は計り知れない。そのような物質のやり取りは天然のチャネルも行っているが、人工的にチャネルを創製できれば外的環境をより人為的に操作可能となる。すでに進化工学的手法によりリポソームに特異的に結合するペプチド(LP-1)を取得していたため、このペプチドがどのようにリポソームに結合しているかを解析することは、上述のようなペプチドを創出する上で重要である。そこで、数種類のリポソーム結合ペプチド(LP-1)を化学合成しリポソームとの相互作用をレーザー共焦点顕微鏡を用いて観察し機能解析を行なった。その結果、N末端側がリポソームの2重脂質膜内部に埋め込まれ、C末端側がリポソーム表面に露出して存在することを明らかにした。このことから人工的な進化工学の手法により膜貫通するペプチドの取得可能性が示唆された。この結果を踏まえ、RNA-ペプチド複合体の進化システムの構築を目指した。まず、RNAとペプチドが複合体としてリポソームに結合・貫通するものをスクリーニングする上で、進化システム自体の効率化が重要となる。そこで、細胞分離用FACS(fluorescence activated cell sorting)を用いて、特定のリポソームを選択的に分離する系を構築した。スクリーニングにあたり、30残基のペプチドは20種類のアミノ酸を提示する場合、その組み合わせの数は膨大なため天然のチャネルを参考にしてαへリックスをもとに新規のライブラリをデザイン、構築した。これを用いてRNA-ペプチド複合体によるリポソーム結合ペプチドのスクリーニングを実施し、FACSにより結合ペプチドが選択されることを実証した。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、1)RNA-ペプチド複合体のランダムライブラリからリポソームに貫通した後、物理化学的ゆらぎの存在下で自己組織化し、人工チャネルを形成する分子を取得する。2)そのための試験管内進化系の構築と得られてきた分子の物理化学的解析を行う。3)最終的に脂質2重膜の内外で情報をやりとりできる膜貫通型RNA-ペプチド複合体の進化工学的分子設計を目指すしている。本年度は現在取得してリポソーム結合ペプチドの結合様式を明らかにすることを目標に、共焦点顕微鏡を用いて1)リポソームを形成する脂質の違い2)リポソームを形成する脂質中のコルステロールの存在比による違い3)リポソームの曲率の違い4)リポソーム結合ペプチドのN末端とC末端側の機能的役割、等を明らかにすべく実験を行った。その結果、このリポソーム結合ペプチドは、天然に存在してリポソームに結合するペプチドと異なり、コルステロールの比率が30%以上になってもリポソームに結合することを見出した。また、このリポソーム結合ペプチドは静電相互作用でリポソームに結合するだけではなく、そのN末端側の疎水領域がリポソームの脂質膜中にアンカーリングしているといることもわかった。このようなことは従来のペプチドでは見出されてはおらず、人工的な試験管内淘汰実験による結果と予想される。この結果から、RNA-ペプチド結合体による試験管内進化系の構築をする意義が明らかになった。また、以上の実験とは別に、温度感受性磁性体ゲルを用いた実験も行い、本学術領域の班員の方々と共同研究が進みつつある。すでに取得されているリポソーム結合ペプチドの機能解析に予想以上に時間がかかった。

今後、本来の目的向けて得られた知見を基に研究を加速して進めたい。FACSを用いたリポソーム選択のスクリーニング系をぜひとも確立する。人工チャネル形成の際には、大量のペプチド合成が必要になると実施が困難になる可能性がある。そのため、進化工学的というよりタンパク工学、ペプチド工学的にデザインの検討を行うこととする。