hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
内視鏡用高強度先端部一体型赤外伝送路の開発

Er:YAGレーザは、各診療科目に急速にその応用が展開されている。それは中空ファイバにより、Er:YAGレーザ光の安定伝送が可能になったからである。内視鏡治療に対応可能な太径中空ファイバ(内径700μm)先端素子の製作に成功したが、接続方法に問題がある。本研究では、曲げ半径15mm、曲げ角270°で使用可能な長さ30cmの高強度先端部と長さ90cmの低損失伝送部を有する高強度先端部一体型中空ファイバ(内径700μm)を製作した。Er:YAGレーザ光と波長650nmの赤色LD光の伝送損失は、直線状態で1dBと6.9dB、曲げ角270°、曲げ半径15mmで、1.9dBと9.4dBであった。曲げ半径15 mm、曲げ角270°で使用可能な長さ30 cmの高強度中空ファイバ部、Er:YAGレーザ光を低損失に伝送可能な長さ70 cmの低損失中空ファイバ部、高出力なEr:YAGレーザ光を伝送可能な太径(内径0.7 mm)中空ファイバという特性を有する高強度先端部一体型低損失中空ファイバを開発する。平成26年度は、高強度先端部一体型銀中空ファイバの製作を行った。技術課題は、内径0.7 mmと太径で、曲げ半径15 mm、曲げ角270°で可動できる中空ファイバを製作することである。ガラスキャピラリ母材に、高反射膜の銀膜を成膜した後、中空ファイバの曲げ強度は劣化することが報告されている。劣化の原因は、銀鏡反応時の水溶液によるガラスキャピラリの微小欠陥の成長によるものである。ガラスキャピラリ内面に保護膜を形成すると、強度劣化を防ぐことができると分ったが、保護膜を成膜すると、表面が粗くなり、伝送損失は増加した。そこで、内視鏡治療において、曲げ強度を必要とする赤外伝送路の先端部分30 cmのみを高強度化することで、伝送損失の抑制を図った。高強度用無機保護膜として、ガラスキャピラリとの付着力、耐久性、耐熱性から、OCクリヤーNo.300を選択した。高強度用先端部の無機保護膜コーティング技術の開発として、簡易な液相法を用い、送液速度4 cm/min、溶液濃度9 wt%で、約0.1 μmの保護膜を成膜することに成功した。更に銀膜との付着力を改善するために、プライマー膜を成膜した。高強度先端部として、無機保護膜を長さ30 cm程度に成膜したガラスキャピラリ(内径0.7 mm、全長1 m)に銀鏡反応を用いて、銀膜を成膜した。高強度先端部一体型銀中空ファイバの可視近赤外波長損失特性の測定、曲げ強度試験を行い、曲げ半径15 mm、曲げ角270°で可動できる中空ファイバであることを確認した。最近、内視鏡治療に対応可能な太径中空ファイバ(内径700μm)先端素子の製作に見通しが立ってきたことによる。しかし、先端素子を伝送システムに導入する際、接続方法や結合損失の増加の問題がある。そこで、本研究では、曲げ半径15 mm、曲げ角270°で使用可能な長さ30 cmの高強度中空ファイバ部とEr:YAGレーザ光を低損失に伝送可能な長さ70 cmの低損失中空ファイバ部のある高出力なEr:YAGレーザ光を伝送可能な太径(内径700μm)中空ファイバという特性を有する高強度先端部一体型低損失中空ファイバを開発する。内視鏡に挿入可能で、Er:YAGレーザ光を低損失に伝送可能な高強度先端部一体型中空ファイバを実現するために、ガラスキャピラリ(長さ100 cm)に、無機保護膜を長さ30 cmで内装し、その後、銀膜を成膜して、高強度先端部一体型銀中空ファイバの製作を行う。Er:YAGレーザ光の高効率伝送に適した低損失化用光学ポリマー(環状オレフィンポリマー)を成膜することで、高強度部と低損失伝送部を有する高強度先端部一体型中空ファイバの製作を図る。高強度先端部一体型中空ファイバの製作として、人体組織に強く吸収され、効率のよい切開が可能なEr:YAGレーザ光と可視パイロット光を同時伝送可能な高強度先端部一体型中空ファイバの製作を行った。高反射膜として環状オレフィンポリマー(COP)を用い、膜厚を数十nmオーダーで精密に制御し、最適膜厚の成膜を行った。まず、低損失化用最適光学膜厚の設計として、銀膜との付着力があり、均一な成膜ができ、最適膜厚の成膜ができる高反射膜として、環状オレフィンポリマー(COP)を用い、Er:YAGレーザ光並びに可視パイロット光の同時伝送に最適な光学膜の設計を行い、0.36μmが適していることが分かった。次に、低損失化用光学膜コーティング技術の開発を行い、簡易な液相法を用いて、Er:YAGレーザ光並びに可視パイロット光の同時伝送に最適な光学膜の最適膜厚の一様成膜技術を確立した。

それは中空ファイバにより、Er:YAGレーザ光の安定伝送が可能になったからである。最近、内視鏡治療に対応可能な太径中空ファイバ(内径700 μm)先端素子の製作に見通しが立ってきたことによる。しかし、先端素子を伝送システムに導入する際、接続方法や結合損失の増加の問題がある。そこで、本研究では、1.曲げ半径15 mm、曲げ角270°で使用可能な長さ30 cmの高強度中空ファイバ部、2. Er:YAGレーザ光を低損失に伝送可能な長さ70 cmの低損失中空ファイバ部、3.高出力なEr:YAGレーザ光を伝送可能な太径(内径700 μm)中空ファイバという特性を有する高強度先端部一体型低損失中空ファイバを開発する。内視鏡に挿入可能で、Er:YAGレーザ光を低損失に伝送可能な高強度先端部一体型中空ファイバを実現するために、平成26年度において、ガラスキャピラリ(長さ100 cm)に、無機保護膜を長さ30 cmで内装し、その後、銀膜を成膜して、高強度先端部一体型銀中空ファイバの製作を行う。平成27年度以降において、Er:YAGレーザ光の高効率伝送に適した低損失化用光学ポリマー(環状オレフィンポリマー)を成膜することで、高強度部と低損失伝送部を有する高強度先端部一体型中空ファイバの製作を図る。達成すべき数値レベルは以下の通りである。1.高強度先端部は、曲げ角270 °、曲げ半径15 mmで使用可能。2.中空ファイバの内径は700 μm、長さは100 cmとする。Er:YAGレーザ光と可視光を同時に伝送し、その効率はEr:YAG光で70 %、可視光で10%。Er:YAGレーザは、各診療科目に急速にその応用が展開されている。内視鏡治療に対応可能な太径中空ファイバ(内径700μm)先端素子の製作に成功したが、接続方法に問題がある。本研究では、曲げ半径15mm、曲げ角270°で使用可能な長さ30cmの高強度先端部と長さ90cmの低損失伝送部を有する高強度先端部一体型中空ファイバ(内径700μm)を製作した。Er:YAGレーザ光と波長650nmの赤色LD光の伝送損失は、直線状態で1dBと6.9dB、曲げ角270°、曲げ半径15mmで、1.9dBと9.4dBであった。本申請では、内視鏡に挿入可能で、Er:YAGレーザ光を低損失に伝送可能な高強度先端部一体型中空ファイバを実現することを目的としている。平成26年度の技術課題は、太い径(内径0.7 mm)のガラスキャピラリ(長さ100 cm)に、無機保護膜をファイバ先端から長さ30 cmまで内装し、その後、全体に銀膜を成膜して、高強度先端部一体型銀中空ファイバを製作を行うための内装保護膜の成膜技術を確立することであり、達成すべき数値レベルは以下の通りである。2.中空ファイバの内径は0.7 mm、長さは100 cmとする。ガラスキャピラリとの付着力が強く、耐久性に優れた無機薄膜を選択し、簡易な液相法を用いて、無機保護膜を部分コーティングすることに成功した。また、銀膜の内装工程において、銀鏡反応の前処理工程を導入して、無機保護膜をコーティングした部分の反応時間を早くすることに成功し、低損失な銀中空ファイバを製作することができた。Er:YAGレーザ光伝送装置の構築と評価を行う。まず、Er:YAGレーザ装置への導入として、Er:YAGレーザ装置に高強度先端部一体型中空ファイバを組み込み、想定される様々な形態に用いた時の伝送特性の評価を行う。次に、高強度先端部一体型中空ファイバの評価として、高強度先端部一体型中空ファイバと従来の中空ファイバを比較し、透過率や曲がりの影響などについて詳細な評価を行う。
グリア細胞時系列制御とPET/MRI撮像の組み合わせによる炎症回路の遷延化解析

本研究では認知機能障害を伴う中枢神経疾患の病態解明・創薬標的の提示を目指す。近年、中枢神経疾患においては脳内炎症が病態に深く関与することが示唆されているが、そのメカニズムに関しては不明な点が多く残されている。そこで本研究では、脳内において神経細胞よりその数が多く存在しているグリア細胞に焦点を当てる。その過程では、遺伝子改変マウス等を用いて人為的にグリア細胞を制御し、放射性同位元素プローブを用いて描出化を行い、各グリア細胞の選択的分取による遺伝子発現解析も行い、どのグリア細胞が/どのタイミングで/どのようなメカニズムで/どの病態に関与しているかを追求する。
単一ガス濃度測定による隙間量推定法に関する研究

住宅の高気密化に伴い,空気質保全のために住宅内部の適切な換気経路および換気量の確保が必要となっている.任意の条件において定量的にこれらの検討を行えるようにするためには,各室間の隙間面積を知ることが必要となる.そこで、室間に温度差のある住宅の室内で1種類のトレーサーガスを発生させたときの各室の温度・濃度を用いて各室の質量収支式・濃度収支式を連立させて解くことにより,未知数である各室間の隙間面積を推定する方法を明らかにした.住宅の高気密化に伴い,空気質保全のために住宅内部の適切な換気経路および換気量の確保が必要となっている.任意の条件において定量的にこれらの検討を行えるようにするためには,各室間の隙間面積を知ることが必要となる.そこで、室間に温度差のある住宅の室内で1種類のトレーサーガスを発生させたときの各室の温度・濃度を用いて各室の質量収支式・濃度収支式を連立させて解くことにより,未知数である各室間の隙間面積を推定する方法を明らかにした.住宅の高気密化に伴い、空気質保全のために住宅内部の適切な換気経路および換気量の確保が必要となっている。任意の条件において定量的にこれらの検討を行えるようにするためには、各室間の隙間量(流量係数)を知ることが必要となる。そこで、1種類のトレーサーガスを用いて多室間の隙間量を推定する方法を検討した。室数が2つの場合についての推定方法は既に明らかにしていたが、3室以上の場合については明らかでなかった。そこで、室数に依存しない一般的な隙間量推定法を明らかにすることを目的として検討を行い、以下の推定方法を明らかにした。トレーサーガスの発生と発熱を任意の室で行い、濃度・温度の定常状態を得る。この定常状態に対応する各室の質量収支式と濃度収支式をつくる。このとき、各室間の隙間量と各室の床面圧力が未知数となる。これらの未知数を得るために、各室の質量収支式と濃度収支式を連立させて解く。1つの濃度・温度の定常状態だけでは、式の数と未知数の数が一致しないため、複数の濃度・温度の定常状態に対する式を得る。質量収支式と濃度収支式の数が未知数より多くなれば未知数の数と等しい数の式を用いるが、その式の組み合わせ方法は複数ある。隙間量と床面圧力の関係は非線形であるため、これは非線形連立方程式となる。非線形連立方程式の数値解法であるニュートン法を用いてこれを解くことにより、隙間量を推定する。連立方程式の組み合わせの中には線形依存などのために解けないものもあるため、全ての式の組み合わせについて解き、解が得られたものの平均を推定値とする。この推定方法について、4室8開口の建物モデルを対象として数値実験を行った結果、3%以内の誤差で流量係数を推定することができた。また、換気量に影響を及ぼさずに濃度・温度分布を均一にするためのトレーサーガスの攪拌方法について、模型実験を行って検討した。住宅の高気密化に伴い,空気質保全のために住宅内部の適切な換気経路および換気量の確保が必要となっている。任意の条件において定量的にこれらの検討を行えるようにするためには、各室間の隙間量を知ることが必要となる。そこで、室間に温度差のある住宅の室内で1種類のトレーサーガスを発生させたときの各室の温度・濃度を用いて各室の質量収支式・濃度収支式を連立させて解くことにより、未知数である各室間の流量係数を推定する方法を検討した。本推定法は、式(質量収支式・濃度収支式)の数と未知数(流量係数・床面圧力)の数を一致させるために、複数の温度・濃度状態を必要とする。その方法としては、複数の発熱・ガス発生条件における複数の定常状態の温度・濃度を用いる方法(定常法)と、1つの発熱・ガス発生条件における複数の時点の温度・濃度を用いる方法(非定常法)が考えられる。昨年度は、測定誤差がなく瞬時一様拡散かつ隙間特性値が2である理想条件下において定常法を用いる場合に本推定法が妥当であることを数値実験で確認した。本年度は、上記の理想条件は完全には満たされない場合における定常法および非定常法の推定可能性について、模型を用いて検討した。その結果、定常法では推定時に用いた複数の濃度変化を平均的に再現できる流量係数を推定し、非定常法では推定時に用いた1つの濃度変化を概ね再現できる流量係数を推定することを明らかにした。また、推定時と異なる温度状態の場合では、両者の推定値は誤差を含む流量を算出し、それは本推定法では隙間特性値を2としているのに対し実際の隙間特性値は2ではない為であることを明らかにした。ただし、本推定法で得られる流量係数は現在一般的に用いられている基準圧力差(9.8Pa)で実流量と一致するように決める流量係数よりも一般的な室間温度差の範囲では実際に近い流量を算出することを明らかにした。
臍帯血幹細胞のex vivo増幅デバイスの開発とその臨床応用

臍帯血は造血幹細胞移植に際し骨髄、末梢血に次ぐ第3の造血幹細胞供給源として近年注目を集めている。特に平成11年に発生した東海村における放射線被曝事故のような災害時には直ちに利用できる造血幹細胞供給源となる。しかし、臍帯血の最大の問題点は含有造血幹細胞数が限られており成人への適応が一部に限られていることである。申請者らは研究分担者である辻らが樹立したマウス骨髄ストローマ細胞株をfeeder layerとしたユニークな膜分離型共培養系を開発した。この培養系を利用して短期間に効率的な前駆細胞のex vivo増幅を可能にしたが応用する際の問題点として、(1)に由来する微生物、異種蛋白などの混入の可能性、(2)培養系のスケールアップ化、(3)培養造血細胞の生着と造血維持の評価が重要となる。申請者らは研究期間内に上記の問題点を解決し、2002年2月に第1例目の臨床応用を施行した。すなわち、(1)に関しては平成11年度に米国FDAのガイドラインに準拠した微生物、異種蛋白試験を米国のバイオベンチャー企業に委託し、われわれのシステムの安全性に問題のないことを確認した。(2)は平成12年度に100cm2のメンブレンを格子で仕切って各wellが1cm2になる培養バッグを試作した。(3)は平成12年度から13年度にかけて、NOD/SCIDマウスを用いて増幅前後の臍帯血CD34細胞のSRC頻度を測定した。増幅前後でCD34細胞当たりのSRC頻度がほとんど同じであったため、10倍前後増幅されていることが明らかとなった。学内倫理委員会の承認を得て、平成14年2月に第1例目の臨床応用を施行し、患者骨髄内にドナー由来細胞を確認した。申請者らはマウス骨髄ストローマ細胞株(HESS-5)をfeeder layerとした膜分離型共培養系による臍帯血造血幹細胞のユニークな体外増幅系の開発に取り組んでいる。今年度は臨床に応用するための前段階として臍帯血より分離したCD34陽性細胞と各段階の造血前駆細胞の増幅効率を検討するとともに、HESS-5細胞の安全性評価の検討を行い以下の結果を得た。I臍帯血CD34陽性細胞はFlk2/Flt3リガンド、トロンボポエチン、SCF, IL-3を含む無血清培地で5日間の培養でCD34陽性細胞を約5倍、CD34陽性CD38陰性細胞を100倍、長期培養開始細胞(LTC-IC)を25倍、さらに免疫不全マウス(SCID)再構築細胞(SRC)を約10倍に増幅することに成功した。IIマウス骨髄ストローマ細胞株(HESS-5)の安全性については異種細胞およびその産物に含まれる病原ウイルスおよび異種蛋白の混入について米国FDAのガイドラインに準拠してウイルス粒子の電顕、逆転写酵素活性、in vitroおよびin vivo感染試験など11項目の検査を米国ベンチャー企業に委託して実施し、すべてに陰性の結果を得た。以上の成績をふまえ、「臨床応用のための臍帯血幹細胞のex vivo増幅法の自主ガイドライン」(案)、「臍帯血幹細胞のex vivo増幅の手順書」(案)および「Ex vivo増幅臍帯血幹細胞の安全性と有効性に関する臨床試験実施計画書」(案)を作成し学内倫理委員会に審査を依頼した。臍帯血は造血幹細胞胞移植に際し骨髄、末梢血に次ぐ第3の造血幹細胞供給源として近年注目を集めている。しかし、膀帯血の最大の問題点は含有造血幹細胞数が限られており成人への適応が一部に限られていることである。この培養系を利用して短期間に効率的な前駆細胞のex vivo増幅を可能にしたが応用する際の問題点として、(1)異種細胞に由来する微生物、異種蛋白などの混入の可能性、(2)培養系のスケールアップ化、(3)培養造血細胞の生着と造血維持の評価が重要となる。昨年度は(1)をほぼ解決したので本年度は(2)を可能とする装置を開発し、(3)を定量的SRCアッセイを用いて評価した。1増幅デバイスの開発臨床応用に際しては50100倍のスケールアップが必要である。しかし、底面積が1cm^2以上のculture insertでは培養細胞が対流によってメンブレンの中央に集中して培養効率が低下する。従って単にculture insertのザイズを拡大するだけでは有効な増幅は得られない。そこで100cm^2のメンブレンを格子で仕切って各wellが1cm^2になる培養バッグを試作した。現在試作された培養バッグにより増幅された細胞のコロニーアッセイ、表面マーカー解析を施行中である。2増幅臍帯血の定量的SRCアッセイNOD/SCIDマウスを用いて増幅前後の臍帯血CD34細胞のSRC頻度を測定した。増幅前後でCD34細胞当たりのSRC頻度がほとんど同じであったため、SRCは10倍前後増幅されていることが明らかとなった。

特に平成11年に発生した東海村における放射線被曝事故のような災害時には直ちに利用できる造血幹細胞供給源となる。しかし、臍帯血の最大の問題点は含有造血幹細胞数が限られており成人への適応が一部に限られていることである。申請者らは研究分担者である辻らが樹立したマウス骨髄ストローマ細胞株をfeeder layerとしたユニークな膜分離型共培養系を開発した。この培養系を利用して短期間に効率的な前駆細胞のex vivo増幅を可能にしたが応用する際の問題点として、(1)に由来する微生物、異種蛋白などの混入の可能性、(2)培養系のスケールアップ化、(3)培養造血細胞の生着と造血維持の評価が重要となる。申請者らは研究期間内に上記の問題点を解決し、2002年2月に第1例目の臨床応用を施行した。すなわち、(1)に関しては平成11年度に米国FDAのガイドラインに準拠した微生物、異種蛋白試験を米国のバイオベンチャー企業に委託し、われわれのシステムの安全性に問題のないことを確認した。(2)は平成12年度に100cm2のメンブレンを格子で仕切って各wellが1cm2になる培養バッグを試作した。(3)は平成12年度から13年度にかけて、NOD/SCIDマウスを用いて増幅前後の臍帯血CD34細胞のSRC頻度を測定した。増幅前後でCD34細胞当たりのSRC頻度がほとんど同じであったため、10倍前後増幅されていることが明らかとなった。学内倫理委員会の承認を得て、平成14年2月に第1例目の臨床応用を施行し、患者骨髄内にドナー由来細胞を確認した。臍帯血は造血幹細胞胞移植に際し骨髄、末梢血に次ぐ第3の造血幹細胞供給源として近年注目を集めている。しかし、膀帯血の最大の問題点は含有造血幹細胞数が限られており成人への適応が一部に限られていることである。この培養系を利用して短期間に効率的な前駆細胞のex vivo増幅を可能にしたが応用する際の問題点として、(1)異種細胞に由来する微生物、異種蛋白などの混入の可能性、(2)培養系のスケールアップ化、(3)培養造血細胞の生着と造血維持の評価が重要となる。平成11、12年度で(1)(2)をほぼ解決し、本年度は(3)を定量的SRCアッセイを用いて評価した。1増幅臍帯血の定量的SRCアッセイNOD/SCIDマウスを用いて増幅前後の臍帯血CD34細胞のSRC頻度を測定した。増幅前後のCD34細胞を1x105,5x104,1x104,5x103個ずつ5-10匹のマウスに移植し、生着率を調べた。この結果よりSRC頻度を算出したところ、増幅前では1/46000、増幅後では1/48000の頻度であった。CD34細胞の増幅率が12倍であったので、SRCは10倍前後増幅されていることが明らかとなった。以上の成果を元に今後、臨床1/2相試験により本増幅系の安全性を検討していく予定である。
MRI併用Focused Ultrasoundにおける3次元温度計測の基礎検討

1.MRI用寒天ファントムの試作:従来RF加温の実験で使用していた筋肉等価寒天ファントムは本研究で使用するMRシーケンスでは良好な画像が撮像できなかった。また、既存のMRI用ファントムは硫酸銅あるいは硫酸ニッケル水溶液で液体状のため組織内加温の実験には不向きである。筋肉等価寒天ファントムに硫酸ニッケルを添加したMRI用寒天ファントムを試作し検討した。試作したファントムで平成9-11年度文部省科学研究費基盤B(課題番号09557070)で開発した温度シフト計測シークエンスによる温度計測が可能であった。2.ゲート回路の設計:MRI装置とFocused Ultrasound発生装量を同時に作動させるためにはRF信号の相互ゲート回路が必要となる。RFゲート回路の基本設計を検討し、プロトタイプのゲート回路を試作し、上記温度計測シークエンスの稼働に支障が無いことを確認した。3.3次元温度分布計測ソフトの開発:高速温度分布計測ソフト開発のための基礎検討として、上記温度計測シークエンスを使用し、温度計測間隔と測定結果の安定性の関係を調べた.phantomは4.5mM CuSO4 solutionを用い.microwave加熱後に温度低下を測定し、温度計による測定値と対比した。この計測間隔を変化させ、信号強度と温度変化の相関について調べた。統計学的には有意な相関が認められなかったが、測定間隔が長い方が安定した結果が得られる傾向が認められた。理由としては、測定間隔の磁場変動による影響が考えられ、測定の高速化,さらには三次元温度測定のためには、磁場の変動による影響が少ない温度計測シークエンスの開発が必要である。引き続き課題として検討する。高速温度分布計測ソフト開発のための基礎検討として、以前の研究で開発した温度シフト計測シークエンスを使用し、温度計測間隔と測定結果の安定性の関係を調べた。使用装置はMagnetom Open Viva 0.2T。使用シークエンスではreference phantomを使用したcalibrationにより磁場の変動を補正する方法を用い、reference phantomの信号を画像にマスクをかけることによって検出し、位相変化を計算、画像全体の位相を補正し、温度変化を計算した。温度変化がない場合の画像の信号強度を2000とし、1度の温度変化が信号強度50になるように設定。TR=42,TE=17,flip angle=60,thickness=5mm,FOV=180mm,scan time 13sec.とした。測定対象となるphantomとしては4.5mM CuSO_4 solutionを用い、microwaveにより80sec.加熱後に温度低下を温度計測シークエンスで、測定。温度計による測定値と対比した。この時計測間隔を17sec.,45sec.,75sec.と変化させ、信号強度と温度変化の相関について調べた。それぞれの結果について相関係数を求めたが、計測間隔17sec.ではγ=0.05879,45sec.ではγ=0.0235,75sec.ではγ=0.20967であり、統計学的には有意な相関が認められなかったが、測定間隔を十分とったほうが安定した結果が得られる傾向が認められた。これは測定に伴う磁場の変動による誤差により、正確な温度測定ができなかったことが理由として考えられ、測定の高速化,さらには三次元温度測定のためには、磁場の変動による影響が少ない温度計測シークエンスの開発が望まれ、引き続き課題として検討すべきと考えられた。

2.ゲート回路の設計:MRI装置とFocused Ultrasound発生装置を同時に作動させるためにはRF信号の相互ゲート回路が必要となる。RFゲート回路の基本設計を検討し、プロトタイプのゲート回路を試作し、上記温度計測ソフトの稼働に支障が無いことを確認した。3.3次元温度分布計測ソフトの開発:高速温度分布計測ソフト開発のための基礎検討として、上記温度計測シークエンスを使用し、温度計測間隔と測定結果の安定性の関係を調べた。phantomは4.5mMCuS04 solutionを用い、microwave加熱後に温度低下を測定し、温度計による測定値と対比した。この計測間隔を変化させ、信号強度と温度変化の相関について調べた。統計学的には有意な相関が認められなかったが、測定間隔が長い方が安定した結果が得られる傾向が認められた。理由としては、測定間隔の磁場変動による影響が考えられ、測定の高速化,さらには三次元温度測定のためには、磁場の変動による影響が少ない温度計測シークエンスの開発が必要である。引き続き課題として検討する。
尿路上皮癌に対するサバイビン・ペプチドを用いた癌ワクチン療法の確立

尿路上皮癌においてサバイビンが高率に発現し、かつ癌抗原として患者の免疫系に認識されていた。進行尿路上皮癌患者に対するサバイビン・ペプチドワクチン療法の臨床第一相試験を行い、安全性を確認し得た。また一部の患者では免疫学的・臨床的反応が認められた。1.尿路上皮癌におけるサバイビン発現率の検討尿路上皮癌手術標本88例をサバイビン免疫染色で検討した結果、88%と高率にサバイビン陽性であった。癌細胞表面にHLA class Iが発現していないことには免疫療法の標的となり得ない。そこでHLA class I分子を認識する新規単クローン抗体EMR8-5を樹立し、尿路上皮癌手術標本88例を免疫組織学的に検討した。その結果67%が陽性であった。3.尿路上皮癌患者におけるサバイビンの抗原性の検討サバイビンのリコンビナント蛋白を作成し、尿路上皮癌患者の血清抗サバイビン抗体価をELISA法により測定、健常者と比較検討した。尿路上皮癌患者および健常者血清中の抗サバイビン抗体価の中央値はそれぞれ0.69、0.44と前者で有意に高く、健常者の平均値+2SDをカットオフ値とした場合、55%の患者で抗体陽性と判断された。また尿路上皮癌患者から得られた末梢血リンパ球をテトラマー解析した結果、サバイビンを特異的に認識するCD8陽性Tリンパ球の存在が明らかになった。(小括)尿路上皮癌は高率にサバイビンを発現するだけでなく、HLA class Iの発現率も比較的高く、両者をともに発現する腫瘍は全体の約2/3に上った。これらの腫瘍ではサバイビンが癌抗原として提示され、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の標的になり得ると考えられた。一方、患者において抗サバイビン抗体が産生され、サバイビンを特異的に認識するCTLが存在していたことより、サバイビンは癌抗原として患者の免疫系に認識されていることが示唆された。以上よりサバイビンは膀胱癌に対する免疫療法の標的分子となり得ることが証明された。この結果は論文にまとめ、Urology誌に掲載予定である。4.尿路上皮癌患者に対するサバイビン・ペプチドワクチン療法臨床第I相試験前記研究成果を基に、臨床第1相試験を開始した。現時点では3例の試験を終えたところであるが、目標症例数12例を終えた段階で成果をまとめ、発表する予定である。1)表在性尿路上皮癌におけるHLA class I抗原の発現と臨床経過表在性膀胱癌に対するBCG膀胱内注入療法では、癌細胞表面におけるHLA class I抗原の発現低下は膀胱内再発のリスク要因であることが多変量解析の結果から明らかとなった。さらにBCG膀胱内注入療法後にCD8、CD20、CD68陽性T細胞の浸潤を認める場合には、これらの細胞の浸潤が少ない場合と比較して明らかに膀胱内再発が低いという結果であった。このことから、HLA class I抗原発現の程度はBCG免疫療法の効果に強く寄与することが判明したと同時に、この機序に細胞障害性T細胞の関与も明らかになった。浸潤性膀胱癌においてもHLA class I抗原発現の発現と臨床経過に関して検討した。74例の浸潤性膀胱癌では、25例の発現低下が認められた。発現正常群と低下群の5年生存率を比較すると、前者は61%、後者は33%と有意な差があった。多変量解析でも、発現の程度が独立した予後因子であることが判明した。3)尿路上皮癌に対するサバイビン・ペプチドワクチン療法臨床第1相試験これまでに、MVAC、TINなどの抗がん化学療法に抵抗性の再発尿路上皮癌7例に対して計34回のサバイビン-2Bペプチドワクチンの投与を行った。重篤な有害事象は認められなかった。免疫学的に評価可能であった4例中2例では、サバイビン特異的なCD8陽性Tリンパ球の増加が確認され、担癌状態でありながら2年以上にわたり病状の進行が抑えられた。このうちの1例はminor responseと評価された。4)まとめ(1)HLA class I抗原発現の程度は尿路上皮癌の臨床経過と相関した。この発現の改善を免疫療法ターゲットすることに期待がもたれる。(2)サバイビン-2Bペプチドワクチンは進行性尿上皮癌の治療に有効な場合があることが示唆された。1.尿路上皮癌に対するサバイビン・ペプチドワクチン療法の臨床第1相試験:当院IRBの承認(平成16年10月、平成19年4月)を受けて実施を継続している、種々の化学療法に抵抗性の進行性尿路上皮癌に対するサバイビン・ペプチド癌ワクチン療法は昨年度より症例が増加し、合計8例で実施が可能であった。これまでに、サバイビン2Bペプチドワクチン0.1mg+IFA1mgを4例に、サバイビン2Bペプチドワクチン1.0mg+IFA1mgを4例に行った。安全性に関しては問題がなく、臨床的の問題となる有害事象は経験しなかった。今年度に実施した症例(症例8)では腫瘍縮小効果は認められなかった。

これまでのところ、今年度の症例を含め評価可能であった5例中2例で何らかの腫瘍縮小効果を認め、うち1例はminor responseであった。さらに効果的な免疫原性を得るためにインターフェロン、インターロイキン2などのサイトカインとの併用療法も考慮する必要がある。2.浸潤性尿路上皮癌におけるHLA class I抗原の発現と臨床経過:浸潤性尿路上皮癌におけるHLA class I抗原の発現と臨床経過を昨年度の解析に加えさらに詳細に評価した。発現正常群と低下群との間に5年disease-free rateで明らかな差があったが、これをさらに解析するとpT3-4あるいはN+などの局所浸潤癌の症例でこの差が明確であった。このことから、HLA class I抗原の発現は特に進行癌症例で予測因子となることが示唆された。さらに、HLA class I拘束Tリンパ球が浸潤性尿路上皮癌の特に局所浸潤癌の症例の再発に関与する可能性があると思われた。1.尿路上皮癌に対するサバイビン・ペプチドワクチン療法の臨床第1相試験:当院IRBの承認(平成16年10月、平成19年4月)を受けて実施を継続している、種々の化学療法に抵抗性の進行性尿路上皮癌に対するサバイビン・ペプチド癌ワクチン療法は平成20年度までに合計9例で実施が可能であった。これまでに、サバイビン2Bペプチドワクチン0.1mg+IFA 1mg/週1回を4例に、サバイビン2Bペプチドワクチン1.0mg+IFA 1mg/週1回を5例に行った。前者の投与量では3例が6回投与を、1例が2回投与を受けた。後者の投与量では、3例:6回、1例:5回、1例:3回の投与回数であった。安全性に関しては問題がなく、臨床的に問題となる有害事象は経験しなかった。9例中2例に対象とした腫瘍の縮小(19.6%と17.6%の縮小)が得られた。サバビン・ペプチド・テトラマー解析では9例中5例でペプチド特異的CTLの有意な誘導が認められた。ワクチン投与毎にDHT皮膚試験を行い、2日後に判定したが陽性症例はなかった。2.腎細胞癌に対する免疫療法の基礎的検討:われわれのこれまでの研究成果により、hypoxia-inducible factor-prolyl hydrooxylase (HIFPH)-3が腎細胞癌培養細胞株および癌組織で発現していることが確認された。HLA-A24結合モチーフを含む8つのペプチドの中で、HIFPH-3-8ペプチドがペプチド特異的なCTLを誘導することがわかった。誘導されたCTLは腎細胞癌培養細胞に対して殺細胞的に作用する結果も得られた。このペプチドを用いたワクチン療法も可能であると考えられた。
マウス脾臓リンパ球におけるアクチビン/フォリスタチンの機能

本研究では、マウス腹腔内macrophagesにおけるactivinの発現と機能について検討した。先ず、macrophagesにおけるactivin関連タンパク質の発現をRT-PCRによって検討した結果、macrophagesはαsubunitを発現せず、βA subunitおよびFollistainのmRNAを発現することが示された。従って、macrophagesはInhibinを産生せず、activinとその調節因子であるFollistatinのにを産生すると思われる。一方、macrophagesはactivinを含む主要なTGF-βfamilyタンパク質の受容体を発現しており、activinはmacrophagesにおいてparacrineまたはautocrineで働く因子である可能性が示唆された。更に、我々は、macrophagesのmatrix metalloproteins (MMP)産生におよぼすactivinおよびFollistatinの効果について、glatin zymographyと定量的RT-PCR法を用いて検討した。その結果、LSP(100ng/ml)刺激の有無に拘わらす、macrophagesによるMMP-2のmRNA発現および活性はactivinによって促進され、逆にFollistatinによって抑制される事が明らかとなった。一方、macrophagesによるMMP-9の発現および活性に対しては、activinおよびFollistatinの効果は認められなかった。以上の結果から、macrophagesが産生するactivinは、paracrineまたはautocrineによってMacrophagesに働き、MMP-2の発現調節を介して、基底膜の分解や細胞の炎症局所への浸潤に働く因子である可能性が示唆された。本研究に於いて、我々は、マウス脾臓B lymphocytesがactivinのβAsubunit,activin結合タンパク質であるfollistatin、またactivin受容体(ActRs)のmRNA発現している事を示した。更に、B lymphocytesの活性化に伴いactivin/follistatin mRNA発現が著しい変化を起す事を明らかにした。培養Blymphocytesは、LPSに依ってポリクローナルに活性化されるとactivin βA subunitの発現を増加させたが、逆にfollistatinの発現は減少させた。B lymphocytesの培養上清中のactivin活性も、LPS刺激に依って上昇した。同様の結果は、マウスをovalbuminで免疫させた際にも認められた。即ち、免疫を施したマウスのB lymphocytesは、未処置のマウスに比して、βA subunitの発現が高く、follistatinの発現が低かった。これらの結果は、B lymphocytesは、活性化に伴い、activinの発現を増加させると共に、その活性を阻害するfollistatinの発現を減少させる事により、正味のactivin活性を増加させている事が示唆している。本研究により、B lymphocytesはactivinの産生源であるとともに、その標的である可能性を示唆された。

我々は、TGF-βfamilyに属する分化誘導因子であるActivinに着目して、その免疫担当細胞における発現と機能を検討している。本研究では、マウス腹腔内マクロファージ(Mφ)におけるActivinの発現と機能について検討した。先ず、MφにおけるActivin関連タンパク質の発現をRT-PCRによって検討した結果、Mφはαsubunitを発現せず、βA subunitおよびFollistatinのmRNAを発現する事が示された。従って、MφはInhibinを産生せず、Activinとその調節因子であるFollistatinのみを産生すると思われる。一方、MφはActivinを含む主要なTGF-βfamlliyタンパク質の受容体を発現して居り、ActivinはMφにおいてparacrineまたはautocrineで働く因子である可能性が示唆された。次に、MφのActivin産生に対する炎症性刺激の影響をEDFassayを用いて検討したところ、LPS刺激はMφによるActivin活性の産生を濃度依存的に促進する事が明かとなった。このLPSによるActivin活性の促進効果は、mRNAの転写レベルで調節されている事が、定量的RT-PCR法によって示された。一方、強力な炎症抑制性サイトカインであるTGF-β1およびその受容体の発現はLPSによって抑制された。炎症性刺激であるLPSによってTGF-βよびその受容体の発現が抑制され、逆にActivinの発現および活性が促進されると云う事は、Activinが炎症に際して促進的に作用する可能性を示唆している。つまり、TGF-βfarmilyの中で、炎症に際する機能的な分業が行われている可能性が示された事になる。更に、我々は、Mφのmatrix meta110proteinase(MMP)産生に及ぼすActivinおよびFollistatinの効果について、gelatinzymographyと定量的RT-PCR法を用いて検討した。その結果、LPS(100ng/ml)刺激の有無に拘わらず、MφによるMMP-2のmRNA発現および活性は、Activinによって促進され、逆にFollistatinによって抑制される事が明かとなった。
着床前発生過程におけるcompactionの成立機構に関する研究

1.Compactionへの【Ca^(2+)】-カルモデュリンの関与(1)Compactionを起していない8細胞期のICRマウス胚を、正常培養液で4,8または12時間培養したところ、それぞれ56.6,82.5および88.6%の胚がcompactionを起した。同じ発生段階の胚をカルモデュリン阻害剤W-7添加(25μM)培養液で4,8または12時間培養した場合、compactionを起した胚の頻度はそれぞれ0.9,1.3およびO%であった。それに対して、カルモデュリンに対する親和性がW-7の1/9ないし1/7しかないW-5添加(25μM)培養液で同様の培養を行ったところ、4,8および12時間でそれぞれ22.0,51.5および60.3%の胚がcompactionを起した。(2)8細胞期のICRマウス胚を正常培養液で4時間培養してcompactionを起させたものを、25μMまたは50μMのW-7添加培養液で培養したところ、それぞれ2時間および8時間以内にcompactionしていない状態にもどった(decompaction)。これに対して、50μM以下のW-5を添加された培養液中では、胚のdecompactionは起らなかった。以上の結果は、compactionへの【Ca^(2+)】-カルモデュリンの関与を示唆している。2.CompactionへのCキナーゼの関与2,4または8細胞期のICRおよびB6C3【F_1】(C57BL/6×C3Hの【F_1】)マウス胚を、Cキナーゼ活性化作用を有するPMA1nM添加培養液で8ないし72時間培養したところ、分割が抑制されて発生の進行が遅れたが、compactionおよび胚盤胞形成は行われた。そこで、Cキナーゼの選択的阻害剤H-7(25μM)とPAM(1nM)とを同時に添加された培養液で胚を培養したところ、PMA単独添加による影響は消失せず、同じ影響が高度に現われた。すなわち、Cキナーゼがcompactionに関与するという証拠は得られなかった。今後、抗Cキナーゼ抗体を使ってさらに検討したい。
脳炎フラビウイルスの神経侵入性に関わる要因の研究

ダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)の致死性に関わる病原性発現機序についてマウスモデルを用いた解析を行った。TBEVをマウスに皮下感染させると高接種量では早い時期、低接種量では遅い時期の致死性を示した。早い時期の致死性は中枢神経組織全体にわたる神経細胞へのウイルス感染が直接の致死性の原因であると考えられた。一方、遅い時期の致死性は脳炎に加えて全身性の特異的な炎症反応とストレス応答が関わっていることが示唆された。脳炎フラビウイルスの病原性発現機序に関わる要因を明らかにするために、ダニ媒介性脳炎ウイルスをマウスに感染させたモデルを用いた解析を行った。接種量を変えてマウスに皮下接種したところ,10^2PFU接種量以上のすべてのマウスで発症がみられすべてのマウスの脳からウイルスが検出された。ところが,致死性は接種量に依存せず10^2-10^6PFU接種では40-60%,10^7PFU以上では80-90%の致死率であった。これらの結果からマウスが死に至る過程で病原性発現には少なくても2つの異なる機序が関与していることが示唆された。10^7PFU以上の皮下接種マウスは感染後710日の早い時期に死にはじめ,脳でのウイルス増殖のピークと死の時期が重なった。脳・脊髄でのウイルス増殖は10^2-10^6PFU接種の場合より高く,さらに早い時期に大脳皮質の広範囲の神経細胞にウイルス感染がみられたことから,急性の脳炎,特に直接のウイルス感染による神経系のダメージが致死性の原因であることが考えられた。一方,10^2-10^6PFUの皮下接種マウスは感染後12日目以降の遅い時期に死に始めた。その際,脳・脊髄でのウイルス増殖のピークは感染後7-9日目であったため,神経系からウイルスが排除されはじめた後に致死性を示すことが明らかになった。したがって,神経細胞へのウイルス感染が直接の致死性の原因ではないと考えられた。脳炎フラビウイルスはマウスモデルにおいて致死性が接種量に依存せずLD_50を計算することができないことが1930年代から知られている。ところがその理由は明確に説明がなされていない。本研究で明らかとなった2つの異なる病原性の発現機序は他の脳炎フラビウイルスでも同様にみられると考えられ,致死性が接種量に依存しない機序の解明に役立つものと思われるダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)の致死性に関わる病原性発現機序についてマウスモデルを用いた解析を行った。TBEVOshima株をマウスに皮下感染させると10^2 PFU以上接種のすべてのマウスで発症・ウイルスの神経組織への侵襲がみられた。ところが、そのうち一部のマウスは回復して生き残ったため、必ずしも神経組織侵襲性は致死性の指標とならないことが示された。さらに詳細を調べると、高接種量(10^7 PFU)ではすべての個体で中枢神経系へのウイルス侵襲とそれに伴う炎症反応、神経症状がみられ、致死率は90%であった。マウスは感染後7日日から死にはじめ、中枢神経組織全体にわたる神経細胞へのウイルス感染が直接の致死性の原因であると考えられた。一方、低接種量(10^3 PFU)でもすべての個体で中枢神経系へのウイルス侵襲がみられたが、マウスが死ぬのは感染後12日目以降で、致死率は40%であった。中枢神経系でのウイルス感染は早い時期では大脳皮質、遅い時期では小脳で多くみられたが、致死個体だけでなく回復個体でも同程度のウイルス感染がみられた。さらに、脳内の浸潤炎症性細胞数、主な炎症性サイトカインの発現量は致死個体と回復個体で有意な差はなかった。一方、致死個体では血清中のコルチコステロン量とTNF-α量が回復個体にくらべ有意に上昇していたため、致死性には脳炎に加えて全身性の特異的な炎症反応とストレス応答が関わっていることが示唆された。
移入種タンポポおよび雑種タンポポの動態と定着過程

1.東京湾岸に導入された純度が高い移入種個体群について、以下の事実が判明した。(1)前年に引き続いて播種実験の結果、初夏生まれの実生は全滅し、秋生まれの実生には生き残るものがあった。(2)2002年の写真による生育個体数推定値と比較し、北側斜面では個体数の増加が認められたが、東側斜面では1/100のオーダーへの減少が認められた。(3)移入種種子では発芽温度幅が広く休眠がないが、4倍体雑種では同様に発芽温度幅が広く休眠がないが、高温による発芽抑制がわずかに見られ、在来種的性質も持つと考えられる。埋土実験により、種子の生存は在来種では秋までは良好であるが、移入種や4倍体雑種では生存率低下が顕著であった。(4)導入個体群における個体の花粉の形状比較から、直径が比較的均一なものと、大きさの大小が顕著なものが識別された。(5)導入個体群における個体の倍数性比率は、移入種の3倍体が約85%、2倍体が約15%、これに周辺からの侵入と考えられる雑種が少数検出された。移入種の比率が雑種より著しく高いことが他の東京都内の個体群との顕著な差異である。研究対象個体群から数百m離れた場所でも移入種の比率が高かったので、個体群周辺への移入種の拡散が認められた。2.東北・北海道地方では雑種より移入種の個体頻度が顕著に高いが、同様に寒冷地である本州山岳地帯では、雑種の進出が確認された。1.北海道及び東北地方においてサンプリングを実施し、フローサイトメーターによる相対DNA量の測定、及びtrnF-trnL領域(葉緑体DNA)をマーカーとして雑種の判定を行なった。北海道の5地点161個体、東北地方の16地点280個体を調べた結果、北海道ではどの地点でも純粋セイヨウタンポポが89割を占め、雄核単為生殖雑種は出現したが、3、4倍体雑種は存在しなかった。東北地方でも純粋セイヨウの割合は54%であり、全国平均(16%)と比較して高い値を示した。雄核単為生殖雑種は28.6%、3倍体雑種は0.4%、4倍体雑種は17%であり、2倍体在来種が分布しない東北北部北海道に雑種の頻度が低いことが明かになった。3種類のプライマーセットを用いてマイクロサテライト分析を行なったところ、純粋セイヨウは24もの多数のクローンからなるのに対し、雄核単為生殖雑種は12クローン、4倍体雑種はわずか3クローンであった。2.東京都でサンプリングした24個体は、相対DNA量から見ると純粋セイヨウタンポポから3倍体雑種、4倍体雑種との間に連続的出現が見られ、人為的移入種を加えた29個体については、相対DNA量の大小と種子発芽温度との間に相関は見られなかった。3.発芽可能温度の幅は、在来種のカントウタンポポで最も狭く(11-16°C)、3倍体雑種(16-23°C)、4倍体雑種(10-26°C)、純粋セイヨウタンポポ(12-30°C)の順に高温側に広くなった。これらの温度を東京の地表面温度の季節変化と対応させると、カントウタンポポ以外は初夏に発芽してしまうことになる。4.東京都内の移入種タンポポ人工個体群予備調査では、実生の発生は5、6月に集中し、死亡は6、7月で、秋まで生き残った個体数は75個体中2個体で、それらも冬までに死亡した。1.東京都内の移入種セイヨウタンポポ

人工個体群調査では、斜面の向きが北寄りの区画では個体密度が34.8±13.2/m^2および22.2±5.0/m^2、東寄りの区画では5.6±3.4/m^2であり、東寄りの区画での低密度化が顕著であった。データは残っていないが写真から判断すれば、個体群導入時点では東寄りの区画も北寄りの区画と同様の高密度の個体群を擁していたと推察できる。2.現地での播種実験では、北寄りの区画、東寄りの区画とも実生の発生は初夏播きでは57月に見られ、死亡は6月と7月中旬に起こり、実生は全滅した。秋播きでは10月に実生の発生が見られ、北寄りの区画で54.%±32.9(%)、東寄りの区画で59.3±37.6(%)の生存率であった。なお、発芽率は秋播き時には初夏播き時の1/21/3であった。また、圃場での播種実験によると、初夏播き区では6月に発芽が集中し、実生の死亡は6月末7月上旬に起こり、生残率は13.8±17.6%、秋播き区ではそれぞれ9月下旬、10月、67.2±30.1%であり、生育現場での生残傾向とほぼ一致した。人工的な播種によって、秋発芽が個体群維持に有効であることが明らかとなったが、生育現場での初夏発芽特性は、個体群維持にはそぐわない。この移入種個体群では数は少ないが夏や秋にも開花結実が見られ、北寄り区画ではそれらの種子が個体群維持に貢献している可能性が示唆された。また、東寄り区画で個体群の消滅が予想される。3.フローサイトメーターでのDNA相対量分析の結果、上述の移入種は、ドイツ・ミュンヘン近郊やロンドン近郊で採種されたセイヨウタンポポと、DNA相対量が一致した。4.南アルプスの山岳地帯に進出したセイヨウタンポポの事例では、3倍体雑種と4倍体雑種が亜高山帯の林道とキャンプ場で、4倍体雑種が高山帯の登山道沿いで確認された。1.東京湾岸に導入された純度が高い移入種個体群について、以下の事実が判明した。(1)前年に引き続いて播種実験の結果、初夏生まれの実生は全滅し、秋生まれの実生には生き残るものがあった。(2)2002年の写真による生育個体数推定値と比較し、北側斜面では個体数の増加が認められたが、東側斜面では1/100のオーダーへの減少が認められた。(3)移入種種子では発芽温度幅が広く休眠がないが、4倍体雑種では同様に発芽温度幅が広く休眠がないが、高温による発芽抑制がわずかに見られ、在来種的性質も持つと考えられる。埋土実験により、種子の生存は在来種では秋までは良好であるが、移入種や4倍体雑種では生存率低下が顕著であった。(4)導入個体群における個体の花粉の形状比較から、直径が比較的均一なものと、大きさの大小が顕著なものが識別された。(5)導入個体群における個体の倍数性比率は、移入種の3倍体が約85%、2倍体が約15%、これに周辺からの侵入と考えられる雑種が少数検出された。移入種の比率が雑種より著しく高いことが他の東京都内の個体群との顕著な差異である。研究対象個体群から数百m離れた場所でも移入種の比率が高かったので、個体群周辺への移入種の拡散が認められた。2.東北・北海道地方では雑種より移入種の個体頻度が顕著に高いが、同様に寒冷地である本州山岳地帯では、雑種の進出が確認された。
時間線量率が放射線感受性に与える影響の基礎的検討

今回の研究では,時間線量率が与える放射線感受性の差異を特に照射に関連したシグナル伝達を中心に,どのような違いが生じているのかを中心に検討した.腫瘍細胞株はwild-type p53を有し照射後早期のアポトーシスを認めるNMT-1,mutant-type p53を有し照射後のアポトーシスを認めずNMT-1と比較して放射線抵抗性を示すNMT-1R,p53 functionを欠損し薬剤に関してはp53非依存性にアポトーシスを誘導するとされているU937,mutant-type p53を有しかつEGFR発現が高度であり生存シグナル伝達と放射線感受性が関連するとされるA431を用いた.現在臨床で使用している照射装置での時間線量率は100-400cGy/minであるため、今回の実験系では実際に使用している時間線量率とほぼ同等の125cGy/minで照射をおこなった.NMT-1とNMT-1Rではp53依存性の照射後早期のアポトーシスとp53の発現変化と放射線感受性の差がみられ、p38の経時的発現増強と,JNKの発現増強を認めた.U937では2Gyの小線量では照射後早期のアポトーシスは認めず,20Gyの大線量で照射後のアポトーシスとJNKの発現増強傾向を認めた.これらの結果から,p53に関連しない放射線感受性にはMAP kinase familyの関与も重要なのではないかと考えられた。そこでA431細胞を用い同様の時間線量率で照射を行ったところ、EGFRのリン酸化を照射1時間後より,6時間後をピークとして9時間後まで認めた。また照射1時間後よりHERのリン酸化も認めた.その下流に位置するMEK1/2,Aktも6時間後より12時間後までリン酸化を認め,照射によるEGFR,HERの活性化とその下流の生存シグナルの活性化が放射線感受性に影響を及ぼす可能性が示唆された.今回の研究では,"時間線量率が与える放射線感受性の差異を分子生物学的因子,特に照射に関連したシグナル伝達を中心に,どのような違いが生じているのか"を中心に検討してきている.今年度は、放射線感受性,とくに照射後早期のアポトーシスと関連しているとされるp53を中心に実験を進めていくとしたため,用いた細胞株はwild-type p53を有し照射後早期のアポトーシスを起こすことが分かっているNMT-1,mutant-type p53を有し照射後のアポトーシスを認めずNMT1と比較して放射線抵抗性を示すNMT-1R, p53 functionを欠損し薬剤に関してはp53 independentにアポトーシスを誘導するとされているU937,を選択した.当科で所有している照射装置を用いた最も一般的な線量率の検討では,NMT-1とNMT-1Rに関してはp53 dependentな照射後早期のアポトーシスとそれに紐づく放射線感受性を示していたが,U937に関しては2Gy程度の小線量では照射後早期のアポトーシスは認めず,20Gyの大線量で照射後のapoptosisを認めた.また,以前報告している通りNMT-1ではp53 dependentapoptosisとして矛盾しない照射後のp53発現変化とその下流因子の発現変化を認めた.一方,今回の研究で新たに明らかになった結果として,NMT-Rでは照射後の変化としてMAP kinase familyの一つであるp38の経時的発現増強と,こちらは初期データなのではっきりとは言えないがJNKの発現増強を認めた.また,U937でも20Gy照射後にJNKの発現増強を認めた.これらの結果から,p53に関連しない放射線感受性にはMAP kinase familyの関与も重要なのではないかと考え,時間線量率を変えた照射で実験を継続中である.今回の研究では,時間線量率が与える放射線感受性の差異を特に照射に関連したシグナル伝達を中心に,どのような違いが生じているのかを中心に検討した.腫瘍細胞株はwild-type p53を有し照射後早期のアポトーシスを認めるNMT-1,mutant-type p53を有し照射後のアポトーシスを認めずNMT-1と比較して放射線抵抗性を示すNMT-1R,p53 functionを欠損し薬剤に関してはp53非依存性にアポトーシスを誘導するとされているU937,mutant-type p53を有しかつEGFR発現が高度であり生存シグナル伝達と放射線感受性が関連するとされるA431を用いた.現在臨床で使用している照射装置での時間線量率は100-400cGy/minであるため、今回の実験系では実際に使用している時間線量率とほぼ同等の125cGy/minで照射をおこなった.NMT-1とNMT-1Rではp53依存性の照射後早期のアポトーシスとp53の発現変化と放射線感受性の差がみられ、p38の経時的発現増強と,JNKの発現増強を認めた.U937では2Gyの小線量では照射後早期のアポトーシスは認めず,20Gyの大線量で照射後のアポトーシスとJNKの発現増強傾向を認めた.これらの結果から,p53に関連しない放射線感受性にはMAP kinase familyの関与も重要なのではないかと考えられた。また照射1時間後よりHERのリン酸化も認めた.

その下流に位置するMEK1/2,Aktも6時間後より12時間後までリン酸化を認め,照射によるEGFR,HERの活性化とその下流の生存シグナルの活性化が放射線感受性に影響を及ぼす可能性が示唆された.