hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
福島原子炉事故時の放射性核種の放出機構と化学的状態の解明

本研究課題において設定した、(1)炉内事象化学模擬実験、(2)核種運搬経路実験、(3)微量・難測定放出核種の環境分布測定、の3つのテーマについて、それぞれ進展が得られた。(1)炉内事象化学模擬実験:福島第一原子力発電所の事故においては、不溶性の粒子として放射性核種が放出されたことが知られている。この粒子生成過程に注目し、本研究ではこれらの粒子の成分の分析と、室内実験でこれらの粒子の生成を実施した。これまでに環境中で見つかっている粒子と非常に良く似た粒子を生成することに成功している。粒子に微量に含まれる金属元素の含有プロセスについても検討し、金属元素を導入することに成功した。(2)核種運搬経路実験:実際に放出された放射性核種の原子炉建屋内、環境中での運搬経路を明らかにするために、人工エアロゾル発生装置の開発とともに、環境中の不溶性粒子の分布から不溶性粒子の放出過程についての考察を行った。本課題では、不溶性粒子の分析により、少なくとも3種類の不溶性粒子が存在することを明らかにしており、テーマ3の研究成果とあわせることで、それぞれの不溶性粒子がどの原子炉から、どのタイミングで放出されたのかについて検討を行った。(3)微量・難測定放出核種の環境分布測定:福島第一原子力発電所近隣の未除染地域において本プロジェクトの初年度に土壌サンプリングを実施した。本年度はこの試料のストロンチウム分析を進めた。これにより放射性ストロンチウムの移動に関する知見が得られ、特に放射性セシウムに比べて放射性ストロンチウムの環境中の移動は早いことが明らかとなった。また、土壌試料からいくつかの放射性粒子の分離を行い、これらのストロンチウム分析を行った。テーマ2で指摘したようにいくつかの種類の不溶性粒子の分析を行ったが、得られた放射性ストロンチウムの量は、土壌で得られたSr/Csとおおよそ一致することが分かった。テーマ(1)においては、放出された化学形態での放射性物質の室内生成実験を実施した。これまでの成果として環境中で発見されたものと非常に良く似た粒子の生成に成功していたが、より微量な元素の存在状態やそれらの元素の導入実験を行い、環境中で見つかっている放射性粒子とかなり近い組成のものを作ることに成功した。テーマ(2)に関して、環境中に存在する放射性粒子の分布や土壌中に存在する全放射能に占める放射性粒子の放射能の測定を行った。特に原発近傍で採取された土壌試料に注目して、数十の放射性粒子を取り出し、電子顕微鏡や蛍光X線分析、さらに放射能測定からこれらの粒子を系統的に分類した。これらの一部については、過去に報告された粒子との類似性も見られたが、これまでに見つかっていないタイプのものも見つかった。これらの粒径や風向き、また水素爆発のタイミングなどから、放出タイミングについて議論を行い、それぞれの放射性粒子がいつ放出されたかの仮説を立てた。テーマ(3)については、福島第一原子力発電所近隣において、初年度に実施した帰還困難区域を中心として100箇所程度で土壌調査で得た試料について分析を行った。今年度は放射性ストロンチウムに注目し、原発周辺の様々な方向で採取した試料について分析を行い、放射性ストロンチウム移動度について明らかにした。土壌に含まれる有機物の量との相関を調べ、また放射性セシウムの移動度との比較を行った。おおむね放射性ストロンチウムは放射性セシウムより環境中の移動が早いことが明らかになった。また放射性粒子に含まれる放射性ストロンチウムの分析を進めた。いくつかのタイプの放射性粒子について分析を行ったが、予想とは異なり、タイプが違ってもSr/Cs比はほとんど同じであることが分かった。テーマ(1)については、これまでの研究で、炉内で生成した放射性粒子の生成模擬実験について一定の成果を得ることができた。その生成過程について良好な再現実験ができているといえる。今後はより微量な元素に注目した模擬実験を実施する。テーマ(2)について、これまで多くの放射性粒子を発見、分離し、その性状を明らかにしてきた。しかし放射性粒子の環境中の分布については十分理解が得られておらず、どの方角やどの距離に放射性粒子が多く存在しているのかについて、より詳細な研究が必要であるといえる。そのため、今後は放射性粒子のインベントリー決定を目指して研究を実施し、事故時の放射性粒子の運搬経路について明らかにする。テーマ(3)に関して、これまで原発周辺で採取された土壌試料について、セシウムの分析と一部についてはストロンチウムの分析を行うことができた。今後はストロンチウムの分析をより進めていくとともに、アクチノイド元素の分析について推進していく。これらの微量元素の分布は、事故時の放射性物質の放出過程の解明、事故時の炉内環境の推測において非常に有効である。(1)炉内事象化学模擬実験:福島第一原子力発電所の事故においては、様々な化学形態で放射性核種が環境中に放出されている。その中で不溶性の放射性核種の生成過程に注目し、本研究ではこれらの粒子の成分の分析(テーマ(3)での成果)をもとに、室内においてこれらの粒子の生成実験を実施した。その結果、直径数マイクロメートルの電子顕微鏡の観察下においては、非常に良く似た粒子を生成することに成功した。

これらの模擬粒子生成過程の条件から、いまだに不明な事故時の炉内環境に強い制約を与えることができるようになった。(2)核種運搬経路実験:実際に放出された放射性核種の原子炉建屋内、環境中での運搬経路を明らかにするために、噴霧乾燥法による人工のエアロゾル発生システムを開発した。本年度は開発した装置の性能試験を中心に行い、発生したエアロゾルの粒径や形状について、多くの情報が得られた。なお、本課題に関連し真空ポンプの調達を行った。これは当初の計画には備品では無かったが、より性能の高いものを調達することでより汎用性の高い実験システムが構築できるために、備品として調達を行った。(3)微量・難測定放出核種の環境分布測定:福島第一原子力発電所近隣の未除染地域において土壌サンプリングを実施した。この試料から、事故初期に放出された放射性の粒子の採取を行い、電子顕微鏡や備品として本年度調達した元素分析システムにより、その組成を明らかにした。これらの研究成果はテーマ(1)の実験へのフィードバックを行った。本年度計画していた研究について、順調な進展が得られた。テーマ(1)においては、放出された化学形態での放射性物質の室内生成実験を実施したが、今年度の成果として環境中で発見されたものと非常に良く似た粒子の生成に成功している。テーマ(2)に関して、今年度はエアロゾル発生システムの開発を中心に行い、その性能評価を通して、本研究の目的に合致したシステムを開発することができた。植物等への沈着挙動を調べるなど、先行して様々なテスト実験をすでに進めている。テーマ(3)については、福島第一原子力発電所近隣において、期間困難区域を中心として100箇所程度で土壌調査を行い、事故初期の情報を保存した貴重な試料を多数得ることができた。これらの分析についてもすでにすすめており、放射性ストロンチウムをはじめとした微量元素の分析についてもすでに結果が得られている。本研究課題において設定した、(1)炉内事象化学模擬実験、(2)核種運搬経路実験、(3)微量・難測定放出核種の環境分布測定、の3つのテーマについて、それぞれ進展が得られた。(1)炉内事象化学模擬実験:福島第一原子力発電所の事故においては、様々な化学形態で放射性核種が環境中に放出されている。本研究ではその中でも不溶性の放射性核種の生成過程に注目し、本研究ではこれらの粒子の成分の分析(テーマ(3)での成果)をもとに、室内においてこれらの粒子の生成実験を実施した。電子顕微鏡の観察下において、環境中で見つかっている粒子と非常に良く似た粒子を生成することに成功した。(2)核種運搬経路実験:実際に放出された放射性核種の原子炉建屋内、環境中での運搬経路を明らかにするために、人工エアロゾル発生装置の開発とともに、環境中の不溶性粒子の部分布から不溶性粒子の放出家庭についての考察を行った。
インフルエンザ関連脳症モデルラットのグリア細胞機能破綻による病態形成の解明

乳幼児に発生するインフルエンザ脳症は症状の経過が急速で予後は不良であるが、病態メカニズムは不明な点が多い。しかし最近の報告から脳内の炎症性サイトカインの異常増多が原因と推察されている。今回ラットの髄液中にリポポリサッカライド(LPS)を投与し、中枢神経内に高サイトカイン状態を誘導し、それが中枢神経および全身に及ぼす影響を検討した。LPS髄注により髄液中のTNFαをはじめとする炎症性サイトカインは上昇し、LPS大量投与群のみ血清中の炎症性サイトカインも上昇した。脳組織内にサイトカインmRNAが認められ、免疫染色にてNFkB陽性細胞が認められることよりサイトカイン産生細胞はmicrogliaと推察された。組織学的検討では神経細胞、glia細胞のapoptosisが証明され、またLPS髄注により血液中のFITC-DEXTRANの脳組織内への漏出が認められ脳血管関門の破綻が組織学的に証明された。さらに脳組織内でcytochrome cの細胞質内への流出が認められ細胞障害がTNFαによるapoptosisであることが示唆された。以上のことよりLPSによるmicrogliaの活性化により中枢神経内の高サイトカイン状態が誘導され、過剰な炎症性サイトカインは神経細胞のapoptosisにより中枢神経機能不全をきたし、同時にastrocyteの障害により脳血管関門は破綻し、全身性に高サイトカイン血症をきたすことが実験的に証明された。毎年冬季のインフルエンザ流行期に乳幼児を中心にインフルエンザ脳症が発生し、高頻度に死亡したり後遺症を残し予後不良であるが、その病態は不明である。臨床経過および臨床検査の結果から推察すると,インフルエンザウイルスの鼻粘膜への感染により嗅神経経由でGlia細胞の活性化を引き起こされ、炎症性サイトカインの異常産生増多により脳内が高サイトカイン状態になり、神経細胞障害、脳浮腫が引き起こされる.また炎症性サイトカインにより脳血液関門は破壊され全身にサイトカインが波及するために高サイトカイン血症となり,DIC, MOFが起こると推察される。病態解明のためラットを用いて脳内に高サイトカイン状態を誘導し、それが全身に及ぼす影響について検討した。ラットの髄腔内にLPSを投与し定時的に髄液、血清を採取し、サイトカインの測定を行った。また定時的に犠牲死させ、組織からmRNAを抽出し、RPA(Rnase Protection assay)にて種々のmRNAの発現の検討をし、さらに組織染色を行い高サイトカインが組織に及ぼす影響について検討した。LPS髄腔内投与により、髄液中のIL-1β、IL-6、TMFαは投与後26時間をピークに上昇した。血清中サイトカインもLPS大量投与群で上昇し、脳内の炎症性サイトカインにより脳血液関門が破壊され、全身にサイトカインが波及することが示された。またLPS投与30分後から脳内にIL-1β、IL-6、TNFαmRNAの発現がみられ、脳実質内の細胞より炎症性サイトカインが産生されていることが証明された。また組織ではGFAPの増加が見られ,LPS投与によりastrocyteの活性化が示唆され,さらにTUNEL陽性細胞が多く見られ炎症性サイトカインにより神経細胞、Glia細胞にアポトーシスが誘導されることが証明された。今回ラットの髄液中にLPSを投与し、中枢神経内に高サイトカイン状態を誘導し、それが中枢神経および全身に及ぼす影響を検討した。脳組織内にサイトカインmRNAが認められ、免疫染色にてNFκB陽性細胞が認められることよりサイトカイン産生細胞はmicrogliaと推察された。

組織学的検討では神経細胞glia細胞のapoptosisが証明され、またLPS髄注により血液中のFITC-DEXTRANの脳組織内への漏出が認められ脳血管関門の破綻が組織学的に証明された。さらに脳組織内でcytochrome cの細胞質内への流出が認められ細胞障害がTNFαによるapoptosisであることが示唆された。以上のことよりLPSによるmicrogliaの活性化により中枢神経内の高サイトカイン状態が誘導され、過剰な炎症性サイトカインは神経細胞のapoptosiisにより中枢神経機能不全をきたし、同時にastrocyteの障害により脳血管関門は破綻し、全身性に高サイトカイン血症をきたすことが実験的に証明された。
自励振動発生時の流れの可視化

平成24年度当初の計画の通り、下記の三項目を実施した.1)小型流体振動子の設計・製作および実験による流動特性調査2)高速度PIVを用いた振動時の流れの詳細解明3)振動数決定メカニズムに関する検討古くから知られる流体振動子はこれまで乱流条件で利用されることが多く,ストローハル数一定という特性を活かして,流量計などに応用されていた.しかしながら、小型の流体振動子はこれまであまり報告例が多くない.メゾスケール,マイクロスケールの振動子の場合はフィードバック流路が3本以上存在するものがあるが,非常に複雑な形状をしており,設計パラメータがわかっていない.本研究では1対のフィードバック流路のみで発振する振動子を設計・製作した.発振レイノルズ数としては200-800程度のものを想定した.作成した振動子について,発振の有無,発振する場合はその振動発生条件や振動数など,基本的な特性を明らかにした-次に,作成した小型流体振動子について,通常のPIVよりもダイナミックレンジが大きい高速度PIVによって,詳細な流れ場情報を取得した.これにより1周期の間の流れの変動の詳細を明らかにした.また,得られたデータを用いて,流れ場の圧力を算出し,系全体における速度変動と圧力変動,噴流の挙動などの関係を明らかにした.以上によって得たデータをもとに,その振動数決定機構を明らかにした.したがって、平成25年度に数値シミュレーションを実施する予定であったが.予定を前倒しし,数値シミュレーションにも着手した.数値流体シミュレーションを併用して,振動数決定メカニズムを検証した.平成24年度当初の計画の通り、下記の三項目を実施した.1)小型流体振動子の設計・製作および実験による流動特性調査2)高速度PIVを用いた振動時の流れの詳細解明3)振動数決定メカニズムに関する検討古くから知られる流体振動子はこれまで乱流条件で利用されることが多く,ストローハル数一定という特性を活かして,流量計などに応用されていた.しかしながら、小型の流体振動子はこれまであまり報告例が多くない.メゾスケール,マイクロスケールの振動子の場合はフィードバック流路が3本以上存在するものがあるが,非常に複雑な形状をしており,設計パラメータがわかっていない.本研究では1対のフィードバック流路のみで発振する振動子を設計・製作した.発振レイノルズ数としては200-800程度のものを想定した.作成した振動子について,発振の有無,発振する場合はその振動発生条件や振動数など,基本的な特性を明らかにした-次に,作成した小型流体振動子について,通常のPIVよりもダイナミックレンジが大きい高速度PIVによって,詳細な流れ場情報を取得した.これにより1周期の間の流れの変動の詳細を明らかにした.また,得られたデータを用いて,流れ場の圧力を算出し,系全体における速度変動と圧力変動,噴流の挙動などの関係を明らかにした.以上によって得たデータをもとに,その振動数決定機構を明らかにした.したがって、平成25年度に数値シミュレーションを実施する予定であったが.予定を前倒しし,数値シミュレーションにも着手した.数値流体シミュレーションを併用して,振動数決定メカニズムを検証した.
東北地方の高齢者虐待の実態及び介入に関する研究

本研究は東北地方における保健医療福祉職等を対象に、高齢者の虐待に対する虐待の現状と、保健・福祉職等が困難であると捉えた状況を明らかにすることである。平成14年度は研究者が27名に対して研究者が面接調査を行った。対象者は訪問看護ステーションの訪問看護師、介護老人福祉施設の福祉職、市町村の保健師等であった。研究目的を口頭及び文書で説明し、同意書に署名して調査を行い、面接は1時間を要した。面接は、半構成的面接を行い、テープ録音と筆記により記録をとり、トランスクリプションをした。あげていた東北地方特有の高齢者の状況では、寒いのに、暖房や保温をしない、または寒い時期だけ街中の家族と同居することがある、農村地区では血縁や地縁で閉鎖的な部分が残っており、家族が高齢者を介護するという気風が残っていた。面接した事例からは、直接暴力を行っている事例は少なく、家族の介護力の不足や介護に対する考え方、家族間の関係による介護の放棄の型の虐待が多いことが明らかになった。介護保険実施後は介護保険制度の利用はされている。しかし、介護保険制度導入により、手軽に介護サービスを利用できる長所と、介護サービスまかせで家族は最低限しか介護しない家族もある短所が示された。東北地方は寒冷地であることは、体温調節へのケアの必要性と、高齢者の移動の手段のサービスをも考慮する必要がある。また、事例の中で積極的にサービス提供者が関わっていても事態が変化せず、緊急時になって変化したことにより、児童や配偶者間の虐待の対処と同じく、高齢者の緊急時に対応できる法的な根拠や対処方法の必要性があることが示された。平成15年度には、本年度の面接調査をふまえ、東北6県にわたり、保健医療福祉職等を対象に、高齢者の虐待に対する虐待の現状と.保健・福祉職等が困難であると捉えた状況をアンケートにより明らかにする計画である。
口腔扁平上皮癌におけるアポトーシス阻害遺伝子survivinの発現について

東京歯科大学倫理委員会の承認をうけ、38名の口腔扁平上皮癌患者から同意をえて腫瘍組織、正常組織を採取した。そのすべてにおいてDNAの抽出を終了した。また、10名においてRNAを抽出した。そのRNAのうち無作為に3名を選びMicroarrayを用いて全ゲノム網羅的に、口腔扁平上皮癌患者の遺伝子発現解析を行った。その結果3名で共通して過剰発現、発現低下を示したアポトーシス関連遺伝子は認めなかった。20名の口腔扁平上皮癌患者の腫瘍組織、正常組織でSurvivinのDNAコピー数を、また、5つの口腔扁平上皮癌由来細胞株を用いSurvivinの遺伝子発現をReal-timePCR法にて解析した。その結果、口腔扁平上皮癌患者の腫瘍組織で20名中5名(25.0%)でDNAコピー数の増幅を認め、細胞株の全て(100%)でSurvivin遺伝子の過剰発現を認めた。本研究は、口腔扁平上皮癌患者における診断や治療において新たなツールを見出すのに、有意義なものと考えられる。また、本研究の発展により、アポトーシスのカスケードおいて新たな因子を見いだすことが予想される。研究実績:倫理委員会へは現在申請中である。また、PCR用プライマーの設計、PCR反応試薬、検体採取、免疫組織学的染色に必要な試薬の準備は終了している。倫理委員会が承認し次第実験を進めていく予定である。平成21年度東京歯科大学の倫理委員会の承認を得、東京歯科大学倫理委員会の承認をうけ、38名の口腔扁平上皮癌患者から同意をえて腫瘍組織、正常組織を採取した。20名の口腔扁平上皮癌患者の腫瘍組織、正常組織でSurvivinのDNAコピー数を、また、5つの口腔扁平上皮癌由来細胞株を用いSurvivinの遺伝子発現をReal-time PCR法にて解析した。
デッドタイムフリー電子回路を用いた太陽ニュートリノの広帯域実時間観測

KamLANDにおける太陽ニュートリノ観測においては,主たるバッググラウンド事象は,検出器外部から入射するガンマ線,検出器内部の放射性不純物,宇宙線ミュー粒子による原子核破砕事象に由来する不安定核によりもたらされる.ガンマ線はKamLAND中央部を選択的に用いることにより効果的に減らすことができ,また不純物に関しては,20072009にわたり,液体シンチレータの蒸溜を行い,極限まで低減した.一方,原子核破砕事象および,その後の不安定核の崩壊事象は既存電子回路が不感状態になるためにデータ収集が不十分であった.この点を補うため,新規にデッドタイムフリー電子回路を開発した.本年度の研究においては,デッドタイムフリー電子回路を用い,宇宙線ミュー粒子による原子核破砕由来の不安定核の崩壊事象同定を第一の目標として,ついで,それによる太陽ニュートリノの高精度観測を第二の目標として研究を行った.まず,不安定核の検出に必須である,データ収集の安定化と正当性を保証するために,データ収集系に改良を加え,オンラインデータ解析ツールによるデータの常時評価を行った.この結果とデータ収集コントロールツールの改良により,異常の自動発見と異常時のデータ収集の自動再起動を可能とし,これによって正常データ収集時間の最大化を図った.これにより,データ収集時間のうちの90%以上のデータ利用を可能とした.ついで,取得したデータについて不安定核の同定の解析を行った.ここで,不安定核の生成と同時に生成され,不安定核崩壊事象同定に必須である中性子事象同定の解析を行い,その結果を用い,短寿命の不安定核^<10>Cの事象同定により評価を行った.この結果,データ収集の時間のvetoを行わない状態で60%の同定効率,データ収集時間の7%のvetoにより85%の同定効率を達成した.さらに不安定核^<11>Cの事象同定が今後の鍵である.研究目的および計画:「デッドタイムフリー電子回路を用いた太陽ニュートリノの広帯城実時間観測」のための平成22年度の研究目標は,1.新電子回路を用いた定常データ収集用のソフトウェアの構築,2.太陽ニュートリノのバックグラウンド事象となるKr特定のための新規トリガロジックの開発,である.研究活動結果の概要:1.に関して,本年度12月までに基本的なデータ収集ソフトウェアの構築は終了した.その結果,観測目標エネルギー閾値(350 keV600 keV)に応じて,300500GB/日程度の定常データ収集を可能とした.本研究期間において,これまでデッドタイムフリーなデータ収集に対する阻害要因であった,オンボードデジタルロジックの不具合を大幅に低減した.残存する不具合は,その発生を瞬時に判定し,測定を自動で切り替えるシステムを構築した.これにより.データとその解析への影響を最小限にしている.また平行してこれらの解消を達成するために,KamLANDにおいて実際のデータ収集を行いながら,通常のデータパスに影響を与えないデータパスで調査を行っている.2.に関して,Kr特定のためには,遅延同時計測において,後発信号のエネルギーのみがしきい値を超える大きさである特性から,時間逆行型遅延同時係数トリガロジックを開発し,FPGAロジックレベルで開発が終了している.上記オンボードデジタルロジックの問題解決とともにKrをターゲットとする測定を開始する.KamLANDにおける太陽ニュートリノ観測においては,主たるバッググラウンド事象は,検出器外部から入射するガンマ線,検出器内部の放射性不純物,宇宙線ミュー粒子による原子核破砕事象に由来する不安定核によりもたらされる.ガンマ線はKamLAND中央部を選択的に用いることにより効果的に減らすことができ,また不純物に関しては,20072009にわたり,液体シンチレータの蒸溜を行い,極限まで低減した.一方,原子核破砕事象および,その後の不安定核の崩壊事象は既存電子回路が不感状態になるためにデータ収集が不十分であった.この点を補うため,新規にデッドタイムフリー電子回路を開発した.本年度の研究においては,デッドタイムフリー電子回路を用い,宇宙線ミュー粒子による原子核破砕由来の不安定核の崩壊事象同定を第一の目標として,ついで,それによる太陽ニュートリノの高精度観測を第二の目標として研究を行った.まず,不安定核の検出に必須である,データ収集の安定化と正当性を保証するために,データ収集系に改良を加え,オンラインデータ解析ツールによるデータの常時評価を行った.この結果とデータ収集コントロールツールの改良により,異常の自動発見と異常時のデータ収集の自動再起動を可能とし,これによって正常データ収集時間の最大化を図った.これにより,データ収集時間のうちの90%以上のデータ利用を可能とした.ついで,取得したデータについて不安定核の同定の解析を行った.ここで,不安定核の生成と同時に生成され,不安定核崩壊事象同定に必須である中性子事象同定の解析を行い,その結果を用い,短寿命の不安定核^<10>Cの事象同定により評価を行った.この結果,データ収集の時間のvetoを行わない状態で60%の同定効率,データ収集時間の7%のvetoにより85%の同定効率を達成した.さらに不安定核^<11>Cの事象同定が今後の鍵である.
切歯歯胚の外エナメル上皮には新規シグナリングセンターが存在するか？

切歯の発生を調べる過程で,外エナメル上皮内に細胞を供給する特殊な領域を見いだした(dental epithelial bulge of outer enamel epithelium: DEB of OEE)。上皮特異的赤色蛍光マウスの透明標本による3次元的な観察から,唇側上皮は90度傾いた鐘状期歯胚の唇側部の外側から伸張していた。またDEB of OEEはG1/G0期の細胞集団として観察され,グリコーゲンを貯蓄細胞であることも明らかとなった。以上から,唇側上皮は外側歯堤の亜型であり,DEB of OEEは切歯唇側上皮の成長と上皮幹細胞ニッチ形成のための起点となっていると推測した。我々は,切歯の発生過程のメカニズムを調べるために,発生過程で細胞がどのように動いているかをライブイメージングによって観察した。その結果,胎生16日齢のマウス切歯歯胚において唇側のエナメル上皮が伸張する時に,外エナメル上皮の中央部に切縁方向と形成端方向の両方に細胞を供給している特殊な領域(Dental Epithelial bulge of Outer Enamel Epithelium; DEB of OEE)を見いだした。その動きは,まさに毛の幹細胞が存在するバルジの細胞の動きとよく似ていた。そこで,その部位の細胞生物学的特性を明らかにして,切歯発生の新しいメカニズムの発見を目的に研究を行った。まずより詳細な形態を明らかにする目的で3次元的に歯胚を観察する新規方法の開発に取り組んだ。上皮のみが赤色蛍光を示すCK14cre-tdTomatoマウスを作出し,さらに標本を透明化することで,胎生15日齢の切歯歯胚が顎骨の中に存在する状態を3次元的に観察することに成功した。また細胞周期をモニターするFucciマウスを使うことによって切歯歯胚細胞を形成する細胞の周期をリアルタイムで観察することにも成功した。上記の方法によって,切歯歯胚には臼歯の歯胚とは異なる歯堤の形態をとっていることが明らかとなり,さらにDEB of OEEの位置は口腔粘膜上皮と連続する舌側の歯堤と相対的な位置として存在することが明らかとなった。この結果は歯胚の形態形成や成長が歯堤の位置や細胞の動きと密に関連していることを示唆していた。細胞周期を観察した結果から,このDEB of OEEは他の上皮と異なって増殖が停止している領域であることが明らかとなり,臼歯歯胚のエナメル結節との類似性を認めた。さらにこのDBの細胞はグリコーゲンを貯蓄していることも示された。その結果,胎生16日齢のマウス切歯歯胚において唇側のエナメル上皮が伸張する時に,外エナメル上皮の中央部に切縁方向と形成端方向の両方に細胞を供給している特殊な領域を見いだした(dental epithelial bulge of outer enamel epithelium: DEG of OEE)。胎生14日の切歯の発生過程での上皮特異的赤色蛍光マウスの下顎骨透明標本では,近遠心的に傾いた帽状期の歯胚の外側からさらに遠心方向に伸張する上皮が観察された。この切歯歯胚の3次元立体構築像を横断面を軸に唇側と舌側を180度回転させると下顎第1臼歯の像とよく似ていることを見いだした。下顎臼歯歯胚の歯堤の部分が切歯の唇側の上皮であるかのように見られた。fucciマウスを用いて唇側上皮の成長における細胞周期を観察したところ, DEG of OEEは細胞分裂を起こさないで,形態形成の起点となっている可能性が示唆され,さらに培養期間を延長して観察するとDEG of OEEは唇側上皮に複数存在する可能性が示唆された。このDEG of OEEはグリコーゲンを貯蓄している細胞でもあることが明らかとなった。以上の結果から推測すると,切歯の唇側上皮は切歯の歯堤から発生した外側歯堤の亜型ではないかと考えられた。研究申請書の作製時期と比べ,いくつかの新しい研究手法を取り入れることができた。CK14cre-tdTomatoを用いた透明標本による歯胚の作製や細胞周期の新規観察方法などの技術により,計画した内容よりも予想以上に多くの新規知見を得ることができた。一方で計画書記載の遺伝子解析については計画よりも遅れている。総合的に判断すると,目的達成に向けては順調に進んでいると言える。口腔組織発生学1)CK14cre-tdTomatoを用いた切歯歯胚3次元観察による切歯歯胚発生過程の観察を行う。この方法によって,切歯歯胚の歯堤とDEB of OEEの発生過程での変化,ならびに切歯幹細胞の形成過程を明らかにする。

2)DEB of OEEでの遺伝子発現についての解析を昨年度に引き続き継続して行う。3)切歯器官培養を用いてDEB of OEEで特異的に発現する遺伝子について,過剰発現と機能抑制実験を行うことで,DEB of OEEの役割を明確にする。上記の結果から,DEB of OEEの生物学的意義や発生過程での役割,進化との関係,臼歯発生との相違点などを整理して,恒常的に成長し続ける器官の発生について考察する。研究は概ね順調に進行しているが,遺伝子発現解析等においての実験が少し遅れている。そのために必要な試薬等の購入が一部行われなかったためである。遺伝子発現解析や機能獲得・喪失実験に使用する培養用試薬や分子生物学的試薬の購入に充てる。研究成果発表(第57回歯科基礎医学会)のための学会出張旅費を支出する。論文作製のための英文校正のための費用等として使用予定である。
破骨細胞分化における転写因子Nfatc1アイソフォームの機能解析

関節リウマチでは骨破壊とともに、パンヌスと呼ばれる異常な滑膜細胞の増殖と骨への浸潤がみられる。パンヌス中に破骨細胞が見られるが、一方パンヌスの中に骨芽細胞は存在しない。そのためパンヌス中の主たる細胞である滑膜線維芽細胞が骨芽細胞の代わりに破骨細胞の分化誘導をしている可能性が考えられた。しかし、その後の実験によりマウス破骨細胞の分化がヒトのM-CSFとRANKLによりin vitroで誘導可能であるにも関わらず、ヒト滑膜線維芽細胞はマウス骨芽細胞と異なりマウス破骨細胞前駆細胞と共培養しても破骨細胞の分化を誘導できなかった(キメラ共存培養系)。従ってヒト滑膜線維芽細胞は破骨細胞誘導能に関してはマウス骨芽細胞と異なる性質を持つ。さらに解析したところ、ヒト滑膜線維芽細胞はビタミンD3(1,25(OH)2D3)とプロスタグランジンE2(PGE2)の刺激によってもRANKLを産生せず、逆にOPGを高産生していた。また、マウス骨芽細胞はRANKLを産生したが、意外なことにより多くのOPGを産生していた。この結果を受けて、マウス新生児の頭蓋冠から調整した骨芽細胞とマウス骨髄細胞を共存培養、あるいはバスケットを用いた分離培養に供した。破骨細胞はは酒石酸耐性酸ホスファターゼ染色により同定した。従来の共存培養とは異なり、骨芽細胞と骨髄細胞を分離して培養すると、ビタミンD3+PGE2の存在下でも破骨細胞は誘導できなかった。誘導にはM-CSF, RANKLの外部からの添加を必要とした。このことから破骨細胞分化には可溶性RANKLではなく膜型RANKLの存在が重要であることが示された。これは破骨細胞が異所性に分化することを防ぐためのメカニズムである可能性がある。また破骨細胞前駆細胞の生存には骨芽細胞由来のM-CSFだけでは不十分であることが示唆された。Nfatc1アイソフォーム特異的ノックアウトマウスが作出されるまでの予備実験としてin vitroの共存培養系の立ち上げを試みており、ある程度の成果をあげているため。今回研究機関の異動があったが早急に動物実験の出来る体制を作り上げ、遅くとも最終年度には遺伝子改変マウスの解析に取りかかる予定である。次年度使用額は5万円を切っており、ほぼ予定通りとなっている。
温度センサーTRPチャネルの機能制御機構と生理学的意義の検討

(1)海馬神経細胞においてTRPV4が体温下で恒常的に活性化して静止膜電位の形成を介して神経興奮性に重要な役割を担っていることを明らかにした。(2)体温下での膀胱伸展をTRPV4が感知して、その情報をATPを介して感覚神経に伝達するという新しい感覚メカニズムを発見した。(3)ケラチノサイトでは主にTRPV3が温度を感知して、その温度情報をATPを介して感覚神経に伝達していることを見いだした。(4)低温電子顕微鏡を用いた単粒子解析によってTRPV4の3次元構造を3.5 nmレベルで明らかにした。(5)皮膚ケラチノサイトでは、環境温度をTRPV4で感知して細胞内にCa^<2+>を流入させてアドヘレンスジャンクション、タイトジャンクション構造を強めて細胞接着性バリア機能を果たしていることを見いだした。(6)ニシツメガエルTRPV3遺伝子をクローニングし、温かい温度で活性化する哺乳類TRPV3と異なり、ニシツメガエルTRPV3は17度以下の冷たい温度で活性化することが分かり、進化の過程で活性化温度が逆転したものと考えられた。目的:細胞や個体は様々な温度環境の中で生きており、その温度という環境外情報を感知してよりよい生存応答へと細胞・個体を導いている。著しく高いあるいは低い温度は侵害刺激として細胞や個体に忌避行動をとらせる。カプサイシン受容体TRPV1が1997年にクローニングされ、温度受容体として機能することが明らかになってからこれまでに哺乳類では9つの温度センサー(TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4, TRPM2, TRPM4, TRPM5, TRPM8, TRPA1)が報告されてきた。このように9つのTRPチャネルが温度刺激によって活性化することが明らかになったが、温度によるイオンチャネルの活性化のメカニズムはTRPV1, TRPM8, TRPM4, TRPM5においてしか報告されておらず、感覚神経以外に発現する温度センサーTRPチャネルの機能も明らかでない。そこで、本研究では、感覚神経での発現が少なく表皮ケラチノサイトや視床下部に発現しており、その温度感受性を私たちが見いだしたTRPV4と、同じくケラチノサイトに発現するTRPV3に焦点をあて、それら温かい温度を受容する温度センサーTRPチャネル活性化の分子メカニズムを明らかにすることを主目的とする。そのために、TRPV3, V4チャネルの温度活性化の構造機能解析、TRPV3, TRPV4の結合蛋白質との相互作用による温度センシング機能制御の解析、TRPV3欠損マウス、TRPV4欠損マウス用いたセンサー分子の個体への作用解析、複数の種のTRPV4チャネルの活性化温度閾値の違い(モーダルシフト)から異なる活性化温度閾値の構造基盤解析を行うものである。計画:(1)新生仔マウスケラチノサイトの初代培養系を確立し、TRPV3, TRPV4の機能的発現を確認する。(2)マウスケラチノサイトがTRPV3, TRPV4を発現していることをin situ hybridization法、免疫組織化学法を用いて検討する。(3)TRPV4の温度活性化機構(電流の大きさや活性化温度閾値が)がリン酸化によって制御を受けていないか、種々の蛋白質リン酸化酵素およびその刺激剤、阻害剤を投与してTRPV4膜電流を検索する。(4)Yeast Two-hybrid法を用いてTRPV3, TRPV4のN末あるいはC末と結合する蛋白質を探索する。さらに、HEK293細胞あるいはCHO細胞に共発現させて、刺激物質によるTRPV3, TRPV4活性がTRPV3あるいはTRPV4単独発現細胞と違いがあるかを電気生理学的に検討する。(5)TRPV4の体温調節機構における役割を検討するためにマウス腹腔内に温度プローブを埋め込み、自由行動下で体温と行動量を観察する。(6)各種のTRPV4の活性化温度閾値を定量化するとともに、アラインメントやキメラ体の解析も加えてTRPV4の温度センシング機構に関わるドメインを同定する。(7)視床下部神経細胞におけるTRPV4の意義を明らかにする目的で、種々の蛋白質との多重染色を行い、TRPV4発現細胞のcharacterizationを行う。また、GFP-TRPV4 transgenic mouseを作成して、TRPV4発現細胞の詳細な電気生理学的characterizationを行う。(8)温度感知は生物にとっても最も基本的な感覚である。温度センサーTRPV4のインシリコ解析によって、両生類で複数種(5種類)のTRPV4が存在すること、およびカエルTRPV4のアミノ末端に進化上いくつかの変異が生じてきたことが明らかになっている。そこで、両生類のTRPV4の中で活性化温度閾値に違いがないかを検討して関与するアミノ酸同定を試みるとともに、進化で生じた変異を人為的に哺乳類TRPV4に導入して活性化温度閾値を測定して、その変異アミノ酸の温度受容への関与を解析する。

(5)皮膚ケラチノサイトでは、環境温度をTRPV4で感知して細胞内にCa^<2+>を流入させてアドヘレンスジャンクション、タイトジャンクション構造を強めて細胞接着性バリア機能を果たしていることを見いだした。(6)ニシツメガエルTRPV3遺伝子をクローニングし、温かい温度で活性化する哺乳類TRPV3と異なり、ニシツメガエルTRPV3は17度以下の冷たい温度で活性化することが分かり、進化の過程で活性化温度が逆転したものと考えられた。新生仔マウスの表皮ケラチノサイトと後根神経節細胞の共培養系を確立した。その共培養の細胞に温度刺激を加えて、細胞内Ca^<2+>濃度の変化を観察した。40度までの温度刺激によって両細胞で細胞内Ca^<2+>濃度増加が観察された。しかし、ケラチノサイトに比べて神経細胞で細胞内Ca^<2+>濃度増加の遅れがみられ、平均して1.2秒の遅れであった。この遅れは、ケラチノサイトから感覚神経細胞に情報が伝達されるという仮説を支持する結果である。ケラチノサイトからは種々の刺激に応じてATPを放出することが知られている。そこで、ATP受容体阻害剤であるPPADSもしくはsuraminで前処理したところ、感覚神経細胞での細胞内Ca^<2+>濃度増加のみが特異的に阻害された。この結果から、温度刺激によってケラチノサイトからATPが放出されて感覚神経に発現するATP受容体に作用することが強く示唆された。温度刺激によるケラチノサイトからのATP放出をより直接的に検出する目的で、HEK293細胞にイオンチャネル型ATP受容体P2X2をバイオセンサーとして強制発現させて、ケラチノサイトと共培養した。ケラチノサイトに温度刺激を加えるとP2X2活性化によると考えられる特徴的な内向き整流性を有する膜電流の活性化が観察された。体温近傍の温度で活性化するTRPV4の脳での発現を調べたところ、海馬でmRNAの強い発現が観察された。海馬神経細胞の単離培養系を確立して、TRPV4の発現と機能を検討した。TRPV4は海馬神経細胞およびグリア細胞に蛋白質レベルでの発現が確認され、シナプスでの発現が強く示された。パッチクランプ法でも単離海馬神経細胞においてTRPV4活性化電流が観察され、TRPV4が海馬で機能していることが示唆された。しかし、シナプス機能の解析では、野生型マウスとTRPV4欠損マウスでは有意な差は認められなかった。TRPV4は体温下で恒常的に活性化していると考えられ、温度上昇によって単離海馬神経細胞での細胞内Ca^<2+>濃度の増加が観察された。野生型マウスとTRPV4欠損マウスで海馬神経細胞の静止膜電位を調べたところ、室温では約-62mVで差がみられなかったが、37度では野生型マウスの海馬神経細胞でより大きな脱分極がみられ(約-51mV)、TRPV4欠損細胞より約5mV浅かった。また、野生型マウスの海馬神経細胞はTRPV4欠損細胞と比べて発火しやすいことが明らかとなった。海馬神経細胞に発現するTRPV4は体温で活性化して細胞を脱分極させて、神経の興奮性を制御しているものと考えられた。
クロライドイオンによるAkt/JNKの活性制御を介した細胞生存・死の決定機構

腎遠位尿細管出来培養細胞であるA6細抱では、細胞内クロライド濃度を増大させると細胞が生存するシグナルが活性化して細胞は増殖へと導かれ、逆に減少させると細胞死(アポトーシス)のシグナルが活性化して、細胞はプログラムされた死へと導かれる可能性が示唆された。このように、細抱の生死は、細胞内クロライドイオン濃度により制御され、最終的には細胞内クロライドイオン濃度を積極的に制御するクロライドイオン輸送体(NKCC)の発現・活性制御が重要であることが示された。このようなイオン輸送体による細胞の生死の制御という考え方は、これまでにない新しいアプローチである。我々は、クロライドイオンが細胞生存の重要な制御因子であるAktおよびJNKの活性制御を介して細胞の運命(生死)を決定している可能性があると考えた。一方、細胞内のクロライドイオン濃度は、クロライド分泌を担うイオン輸送体転写・活性制御により調節され、NKCCやC1-channelがチロシンリン酸化依存的な制御を受けることも明らかにしており、増殖因子などによる制御の可能性も示唆されている。そこで、「細胞内クロライドイオン濃度を制御するNKCCの転写・活性制御によるAktおよびJNKの活性制御を介し細胞の生死が決定される」という研究仮説に基づいて研究を行った。そこで、平成19年度において次のことを明らかにした。(1)培養細胞(腎尿細管由来上皮細胞A6細胞)において、人為的に細胞内のクロライド濃度を様々に変化させると、細胞の生死の制御に関わるシグナル分子であるAktおよびJNKのチロシンリン酸化レベルが、クロライド濃度依存的に増大することを明らかにした。(2)Aktのチロシンリン酸化増大のメカニズムは、src kinaseの活性化に見られたようなチロシン脱リン酸か酵素の不活性化によるものではなく、上流のチロシンリン酸か酵素の活性化に依存することを明らかにした。一方、細胞内のクロライドイオン濃度は、クロライド分泌を担うイオン輸送体転写・活性制御により調節され、NKCCやCl- channelがチロシンリン酸化依存的な制御を受けることも明らかにしており、増殖因子などによる制御の可能性も示唆されている。そこで、平成20年度において次のことを明らかにした。(2)Aktのリン酸化増大のメカニズムは、src kinaseの活性化に見られたようなチロシン脱リン酸化酵素の不活性化によるものではなく、上流のリン酸化酵素の活性化に依存することを明らかにした。
膵癌のras癌遺伝子産物の分子標的治療

ヒト膵癌の90%にk-ras癌遺伝子の点突然変異が認められ,rasの遺伝子産物である活性型p21rasを分子標的とする阻害剤の開発が注目されている.p21ras蛋白はそのC末端がfarnesyl化され細胞膜に結合し,初めてその機能を発揮する.farnesyl化阻害剤である(α-hydroxyfarnesyl)phosphonic acid(HFP),farnesylamine(FA)の膵癌細胞とNIH3T3 fibroblastのras形質転換細胞(ras細胞),raf-形質転換細胞(raf細胞)を用いて,p21rasのfarnesyl化抑制,各細胞に対するcytotoxicity,アポトーシス誘導について検討した.また,従来からfarnesyl化阻害剤として知られているgliotoxin,manumycinとの抗腫瘍活性についても比較し,さらにヌードマウスに移植したras細胞に対するFAの腫瘍増殖抑制効果についても検討した.(研究結果)1.farnesyl化阻害剤はp21rasのfarnesyl化を抑制した.FAのIC50は約3μMであり,FAの添加後約18時間後に抑制された.FAとHFPはPK-1,ras細胞に対し選択的にcytotoxicityを示したが,NIH3T3,raf細胞にはcytotoxicityを示さなかった.3.HFP,FA,gliotoxin,manumycinはそれぞれ50,3,0.3,10μMの濃度よりPK-1,ras-細胞にアポトーシスを誘導した。HFP,FAはそれぞれ100,30μMの濃度でもNIH3T3にアポトーシスを誘導しなかった.raf細胞ではras細胞より高濃度で初めてアポトーシスの誘導を認めた.4.FAによるアポトーシス誘導時にICE様プロテアーゼである32KDaのCaspase3が活性化され,17KDaの活性型を形成することが確認された.(結語)farnesyl化阻害剤,特にFAは活性型p21rasの脱farnesyl化によりRas-Raf-MA PKのシグナル伝達を抑制し,ICE様プロテアーゼの活性化を介し,膵癌細胞およびk-ras形質転換細胞特異的にアポトーシスを誘導した.FAはヌードマウス移植腫瘍の増殖を抑制し,膵癌特異的癌化学療法の可能性が示された.ヒト膵癌の90%にk-ras癌遺伝子の点突然変異が認められ,rasの遺伝子産物である活性型p21rasを分子標的とする阻害剤の開発が注目されている.p21ras蛋白はそのC末端がfarnesyl化され細胞膜に結合し,初めてその機能を発揮する.farnesyl化阻害剤である(α-hydroxyfarnesyl)phosphonic acid(HFP),farnesylamine(FA)の膵癌細胞とNIH3T3 fibroblastのras形質転換細胞(ras細胞),raf-形質転換細胞(raf細胞)を用いて,p21rasのfarnesyl化抑制,各細胞に対するcytotoxicity,アポトーシス誘導について検討した.また,従来からfarnesyl化阻害剤として知られているgliotoxin,manumycinとの抗腫瘍活性についても比較し,さらにヌードマウスに移植したras細胞に対するFAの腫瘍増殖抑制効果についても検討した.(研究結果)1.farnesyl化阻害剤はp21rasのfarnesyl化を抑制した.FAのIC50は約3μMであり,FAの添加後約18時間後に抑制された.FAとHFPはPK-1,ras細胞に対し選択的にcytotoxicityを示したが,NIH3T3,raf細胞にはcytotoxicityを示さなかった.3.HFP,FA,gliotoxin,manumycinはそれぞれ50,3,0.3,10μMの濃度よりPK-1,ras-細胞にアポトーシスを誘導した。HFP,FAはそれぞれ100,30μMの濃度でもNIH3T3にアポトーシスを誘導しなかった.raf細胞ではras細胞より高濃度で初めてアポトーシスの誘導を認めた.4.FAによるアポトーシス誘導時にICE様プロテアーゼである32KDaのCaspase3が活性化され,17KDaの活性型を形成することが確認された.(結語)farnesyl化阻害剤,特にFAは活性型p21rasの脱farnesyl化によりRas-Raf-MA PKのシグナル伝達を抑制し,ICE様プロテアーゼの活性化を介し,膵癌細胞およびk-ras形質転換細胞特異的にアポトーシスを誘導した.FAはヌードマウス移植腫瘍の増殖を抑制し,膵癌特異的癌化学療法の可能性が示された.rasに点突然変異を有するヒト膵癌細胞株に対して,FTIはcytotoxicityを示すことを今まで明らかにしたが,その作用がras-p21のfarnesyl化を抑制している事実をwestern blottingにて検討した。ras-p21は泳動度の違いによりfarnesyl化された膜型p21とfarnesyl化されていない細胞質型p21にwestern blottingにより別けられる。FT1処理によりヒト膵癌細胞株では処理後12hr.位より膜型p21が減少し,細胞質型p21が増加して観察され,FTIがras-p21のfarnesyl化を抑制している事実を明らかにした。また,12hr.-24hr.でapoptosisの誘導がアガロースゲル電気泳動により観察された。Farnesyltransferase inhibitor(FTI)であるfarnesylamineを,新たに合成した.【研究結果】1)FarnesylamineはMTT assayにて用量依存性のcytotoxicicityを示し,IC50(μM)はPK-1,-8,-9,HPC-1,-3,-4で各々

24,28,9,15,18,17であり、k-ras mutationを持つ膵癌細胞株では9-28μMのIC50を示した.しかし,NIH3T3では100μM以下ではcytotoxicityを示さなかった.また,NIH3T3のc-raf-1transformantであるRAF細胞では42μM以下ではcytotoxicic resistantであった.2)0.3,3,30μMのfarnesylamine濃度の48時間incubationにて,膵癌細胞株およびK-R細胞にてアガロース電気泳動によりラダー形成がみられ,アポトーシスが誘導された.しかし,NIH3T3にてはアポトーシス誘導は認めなかった.4)Western blot法によりfarnesylamineのras-p21蛋白のposttranslational processingに対する検討をK-R細胞で行った,コントロールではmembrane associated ras-p21(m-p21)とunprocessedcytoplasmic ras-p21(c-p21)の2つのバンドをみるが,30μM濃度のfarnesylamine存在下では,m-p21のバンドは認めなかった.以上より,新たに合成したfarnesylamineはk-ras mutationを有する膵癌細胞特異的にcytotoxicityを示し,それはアポトーシス誘導によること,およびfarnesylamineはras-p21のfarnesyl化を阻害していることが判明した.また,farnesylamineは膵癌細胞にcytotoxicityを示す濃度では,NIH3T3細胞に対しcytotoxicityを示さないことより,farnesylamineは癌細胞特異的な有効な化学療法剤としての可能性が示唆された.(研究結果)1)HFPは50μMの濃度で膵癌細胞(PK-1,-8,-9),ras-cellにアポトーシスを誘導した.アポトーシスはアガロース電気泳動によるDNAラダーの検出,細胞をヘキスト33258で染色し蛍光顕微鏡にて観察し,核の凝集,断片化を検出する事で確認した,しかし,HFP100μMの濃度でもNIH3T3にアポトーシスを認めなかった.2)raf-cellではras-cellより高濃度(FA40μM,HFPでは100μM)でアポトーシスの誘導を観察した.3)FAによるアポトーシスの誘導時にICE様プロテアーゼである32KDaのCaspase3が活性化され,17KDaの活性型を形成する事が抗Caspase3抗体を用いたWestern Blottingにて確認された.結論,farnesyltransferase阻害剤であるFAおよびHFPは活性型p21rasの脱farnesyl化によりRas-Raf-MAPKのシグナル伝達を抑制し,ICE様プロテアーゼの活性化を介し膵癌細胞およびK-ras形質転換細胞特異的にアポトーシスを誘導した.FAはヌードマウス移植腫瘍の増殖を抑制し,膵癌特異的癌化学療法の可能性が示された.
高等真核細胞におけるDNAポリメラーゼεの機能解析

DNAポリメラーゼε(polε)は、高等真核細胞において染色体DNA複製・修復そして細胞周期の進行のチェック機構に関与し、多様な機能を持っている。polεの機能を分子レベルで明らかにすることを目的に研究を進めた。まず、マウスpolεを構成する4つのサブユニットPOLE(活性サブユニット)・DPE2・DPE3・DPE4の構造を明らかにした。増殖誘導時や紫外線照射後、POLE・DPE2とDPE3・DPE4では転写レベル、翻訳レベルの発現様式がやや異なり、必ずしも一致した挙動をしているわけではないことを示唆した。また、POLE・DPE2の相互作用が活性の安定化に寄与していた。酵母の2ハイブリットの実験系から2番目のサブユニット(DPE2)とSAP18の相互作用を見いだした。SAP18はSin3複合体の構成因子であり、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)とも関係しクロマチンの構造変換や転写調節に関与している。レポータープラスミドを用いたマウス細胞内での転写活性測定法により、DPE2がSAP18とin vivoでも相互作用すること示した。界面活性剤やDNaseIを用いた細胞分画から、SAP18はヘテロクロマチン領域に多く存在しpolεの挙動と似ていた。しかしグリセロール密度勾配遠心や細胞染色による解析から、POLE、Sin3、SAP18が複合体は形成しているが量的にはわずかであり、常には結合してなかった。また、免疫沈降実験からPOLEとSin3が直接結合していた。DPE2とSAP18はその結合を安定化していると思われた。以上より、polεとSin3複合体の相互作用の発見は、DNA複製フォーク上にHDAC活性を導くpolεの新しい機能を見いだした。この結果は、複製後のクロマチンの再凝縮機構を理解する上で重要な知見となると考えられる。これまでにマウスからpolεのサブユニットと思われる4つのcDNA(POLE、DPE2、DPE3、DPE4)を単離している。出芽酵母のpolεとアミノ酸配列を比較すると、特に小さなサブユニットの方で蛋白質の大きさに大ききな違いがあった。このことは、基本的な機能は共通だが、他の機能の存在、調節制御や機能の発揮する時期の相違を示唆する。そこで、小さなサブユニットDPE4が活性サブユニットと発現レベルでの挙動を比較した。細胞を血清飢餓によりG0状態にし血清を添加することで増殖を誘導すると、活性サブユニットがDNA合成とともに発現が誘導されるのに対して、DPE4は誘導前にもmRNAが存在し、DNA合成よりやや遅れて誘導されることがわかった。さらに、polεが修復にも関与していることが指摘されているので、紫外線照射後のpolεの各サブユニットの発現を検討した。その結果、POLE、DPE2は紫外線照射後発現がやや上昇した後、2時間後から減少し始めた。一方、DPE3、DPE4の発現量にはあまり大きな変動がなく発現していたのが観察された。以上から、大きなサブユニットと小さなサブユニットの間に発現の相違が見られること、また、DPE3、DPE4が転写因子と相同性が比較的高いところから、活性サブユニットと複合体を作らない形で存在し、別の機能も持っている可能性も考えられ、今後解析をする予定である。機能の不明なサブユニットの機能を探る目的で、酵母の2ハイブリットの系で相互作用する因子の検索を行った。DPE2と相互作用すると思われるものに、G蛋白質のサブユニットの一つやε14-3-3などのシグナル伝達系の因子や、pendulinなどの核移行時に機能する因子があった。その他再現性良くヒストンデアセチラーゼの複合体の一つの因子が見つかった。