hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
扁平足の３次元空間構造偏位の解明－新規装具療法の開発を目指して

近年,偏平足障害の発生要因として足根骨の形態変異(形態的な個人差)が重要視されている.特に踵骨の形態変異が偏平足の発生に関与すると推察されるが,実際にどのような骨形態の変異が偏平足の病態発生に関与するかは未解明である。そこで本研究では,仮想荷重装置を用いて扁平足の内部で生じる骨動態の特徴とその骨形態要因を探索し,扁平足障害の病態発生メカニズムに迫ることを目的とした。具体的には、仮想荷重装置の妥当性・再現性の検証、踵骨形態の変異の調査、扁平足症例における踵骨形態と仮想荷重に伴う踵骨の動態の特徴を調査した。作製した仮想荷重装置は,自然立位と同様の足底圧状態(足底接地面積、足底圧、足圧中心位置)を再現し、前後方向の足圧中心位置以外の項目においては,中等度から高度の再現性を示した。71足のCT画像を対象とした踵骨の形態解析から,踵骨後関節面の前額面上の傾斜角度に大きなバリエーションが存在することが示された。さらに,症例数が少ないが,実際の偏平足症例においては,非荷重・荷重条件ともに踵骨の外反・内旋角度が高値を示す可能性が示唆された。本研究から,踵骨後関節面の前額面上の傾斜角度に大きな個人差が存在し,この形態変異が偏平足に特徴的な荷重条件における踵骨の外反角度の増大を引き起こす可能性が示唆された。扁平足内部の骨格構造および骨動態の特徴を解明することは、扁平足障害の病態発生メカニズムの解明のために重要であり,扁平足障害に対する効果的なリハビリテーション治療の開発,膝関節を含む下肢の運動器疾患に対する新規保存治療方法の開発に貢献すると考えられる.本研究では、扁平足構造を複合的なアーチ構造から成る3次元空間構造として捉え、足根骨の3次元空間内における偏位、足根骨の偏位に影響を及ぼす足部関節肢位および関節形態を特定する。当該研究の遂行により、扁平足の構造偏位に立脚した新規足底板の設計、足部内在筋の筋力増強を目的とした効果的な運動療法開発を進めるための基盤情報を得る。平成29年度は、CT画像撮影環境において生理的立位条件を模倣するための仮想荷重装置を開発した。仮想荷重装置は、足底板、背板、肩パッドの3部位から成り、被験者の身体へ体重比100%の軸圧を加えることが可能となるよう設計された。仮想荷重環境が立位姿勢を模倣しているか確認するため、健常成人5名10足を対象に、立位及び仮想荷重の2条件における足底荷重値・圧を計測した。仮想荷重条件の計測肢位は、背臥位、膝関節伸展0度、足関節中間位とし、荷重値のモニターのために足底に体重計を設置した。体重計が体重比100%の荷重量を示すまで、荷重装置の負荷量を調整した。軸荷重負荷に伴い被験者が疼痛を自覚することはなく装置の安全性が確認された。また、立位・仮想荷重の2条件において、足底全体の荷重値に有意差は認められなかった。さらに、足底全領域及び前・中・後足部領域それぞれの足底圧は、立位・仮想荷重条件間で有意差を認めなかった。以上の結果から、仮想荷重装置適用の妥当性と安全性が担保された。平成30年度は、開発した仮想荷重装置を用い、扁平足症例の荷重CT画像から構築した足部骨モデルを対象に、扁平足の足根骨の偏位を探索する。平成29年度において仮想荷重装置の開発が完了したが、扁平足症例のデータ収集までには至っていない。扁平足内部の骨格構造および骨動態の特徴を解明することは、扁平足障害の病態発生メカニズムの解明のために重要であり,扁平足障害に対する効果的なリハビリテーション治療の開発,膝関節を含む下肢の運動器疾患に対する新規保存治療方法の開発に貢献すると考えられる.前年度に開発した仮想荷重装置を用い、速やかに扁平足症例の荷重CT画像データを収集する。得られたCTデータから扁平足の3次元骨モデルを構築し、空間座標内における足根骨の偏位を特定する。

さらに、扁平足の足根骨偏位と関連する足部関節肢位および関節形態を探索し、有効な足底板設計の検討を進める。初年度の購入備品である3D-CADソフトウェアを予定額より安価に購入したことから、次年度使用額が発生した。次年度使用額は、得られた研究成果を発信するための渡航費及び論文投稿費に割り当てる。
恐怖記憶の制御機構における扁桃体グルココルチコイド受容体の機能解明

グルココルチコイド受容体(GR)はストレス応答および恐怖記憶の制御に重要な役割を果たすことが示唆されている。恐怖記憶の連合を司る扁桃体外側核(LA)にはGRが高発現しているが、恐怖記憶制御におけるLAGRの機能は明らかにされていない。本研究では、我々が作製したLA選択的GR欠損(LAGRKO)マウスを用いて、LAGRが通常状態の音依存的恐怖記憶の形成に重要な役割を果たすことを明らかにした。また、ストレス負荷1時間後の音依存的恐怖記憶の抑制がLAGRKOマウスでは起こらないことを見出した。これらの結果から、LAGRがストレス状態に応じた音依存的恐怖記憶の制御に重要な役割を果たすことが示唆された。ストレスホルモンのグルココルチコイドは、恐怖記憶の制御だけでなく、心的外傷後ストレス障害(PTSD)の病態にも関わっている。扁桃体にはグルココルチコイド受容体(GR)が豊富に発現し、グルココルチコイド作用の重要なターゲット部位である。申請者らは、扁桃体外側核(LA)選択的GRノックアウト(LAGRKO)マウスを作製し、LAGRKOマウスにおいて、扁桃体依存性の恐怖記憶の形成に異常があることを見出した。昨年度では、LAGRKOマウスで認められた記憶障害に関わる分子・細胞メカニズムを明らかにするために、記憶形成に重要な転写因子のひとつであるcAMP response element binding protein (CREB)の活性化レベルを、恐怖条件付け30分ならびに90分後の脳スライスを用いて検討した。その結果、LAGRKOマウスではLA部位のCREBの活性化がコントロールマウスに比べ有意に低下していることが明らかとなった。また、LAのGR欠損が視床下部-下垂体-副腎(HPA)軸の機能に与える影響を調べるため、通常状態、恐怖条件付け30分後ならびに90分後の血漿中コルチコステロンの量を測定したところ、いずれの条件においても、コントロールとLAGRKOマウスの間で統計学的有意さが認められなかった。これらの結果から、LAのGRを介するCREBの活性化が、恐怖記憶の形成に重要な役割を果たすことが示唆された。適当なストレスは記憶を促進する作用があるが、慢性的あるいは強いストレスは逆に記憶形成を抑制することが示唆されている。LAのGR欠損がストレス負荷後の記憶形成にどのような影響を与えるかを調べるため、拘束ストレスの1時間後に恐怖条件付けを行った。その結果、ストレスによる恐怖記憶の抑制の程度が、LAGRKOマウスで低かったことが認められた。これらの結果から、LAのGRは通常状態だけでなく、ストレス負荷時の記憶の形成にも重要な役割を果たすことが強く示唆された。恐怖記憶制御における扁桃体外側核(LA)グルココルチコイド受容体(GR)の機能を明らかにするため、LA選択的GRノックアウト(LAGRKO)マウスを作製し、LAGRKOマウスにおいて通常状態での恐怖記憶の形成に異常があることを見出した。昨年度では、アデノ随伴ウイルス(AAV)を用いて、GRをLAGRKOマウスのLAに強制発現させ、LAGRKOマウスで認められた恐怖記憶の異常がレスキューできることを確認した。また、通常時のLA神経細胞の自発性の微小興奮性シナプス後電流(mEPSC)の頻度と振幅を検討したところ、コントロールマウスとLAGRKOマウス間で統計学的有意差は認められなかった。GRはストレス応答においても重要な役割を果たしていることから、ストレス負荷後の恐怖記憶形成におけるLAGRの機能を解析した。拘束ストレス負荷1時間後に音恐怖条件付けを行った実験では、コントロールマウスでは通常と比べ恐怖反応が顕著に低下するのに対し、LAGRKOマウスでは、急性ストレスによる恐怖反応の抑制作用が弱かった。また、コントロールマウスでは恐怖条件付け30分後に比べ、90分後では血中コルチゾールの量が有意に低下したのに対し、LAGRKOマウスでは統計学的有意な低下が認められなかった。これらの結果から、LAGRの活性化が通常時の恐怖記憶の形成に必要である一方、ストレス負荷状態では恐怖記憶の抑制に関わることが示唆された。ストレス応答時に副腎皮質から分泌されるグルココルチコイドは、恐怖記憶の制御だけでなく、心的外傷後ストレス障害(PTSD)の病態にも関わっていることが示唆されている。情動の中枢である扁桃体にはグルココルチコイド受容体(GR)が豊富に発現し、グルココルチコイド作用の重要なターゲット部位である。我々は、GR遺伝子を扁桃体外側核(LA)選択的に欠損させた(LAGRKO)マウス系統を作製し、恐怖記憶制御におけるLAGRの機能を明らかにする目的で研究を実施した。本年度は、記憶形成に重要な転写因子のひとつであるcAMP response element binding protein (CREB)の活性化レベルを、恐怖条件付け90分後のLAならびに海馬でそれぞれ検討し、LAGRKOマウスのLA部位において、恐怖条件付け後のCREBの活性化の維持に障害があることを見出した。また、通常時、拘束ストレス負荷後ならびに恐怖条件付け後の血中グルココルチコイドの濃度を測定し、LAGRKOマウスの視床下部-下垂体-副腎(HPA)系の機能に異常がないことを明らかにした。ストレスによる恐怖記憶の制御におけるLAGRの機能を明らかにするため、拘束ストレス負荷1時間後に恐怖条件付けを行い、LAGRKOマウスではコントロールマウスで認められたストレス負荷による音依存的恐怖記憶の抑制が起こらないことを明らかにした。これらの結果から、LAGRは通常時だけでなく、ストレス負荷後の恐怖記憶の制御に重要な役割を果たすことが示唆された。

グルココルチコイド受容体(GR)はストレス応答および恐怖記憶の制御に重要な役割を果たすことが示唆されている。恐怖記憶の連合を司る扁桃体外側核(LA)にはGRが高発現しているが、恐怖記憶制御におけるLAGRの機能は明らかにされていない。本研究では、我々が作製したLA選択的GR欠損(LAGRKO)マウスを用いて、LAGRが通常状態の音依存的恐怖記憶の形成に重要な役割を果たすことを明らかにした。また、ストレス負荷1時間後の音依存的恐怖記憶の抑制がLAGRKOマウスでは起こらないことを見出した。これらの結果から、LAGRがストレス状態に応じた音依存的恐怖記憶の制御に重要な役割を果たすことが示唆された。当初の計画以上に進展している部分(AAVによるレスキュー実験)とやや遅れている部分(電気生理学的実験)があるため、全体としては概ね順調に進んでいると判断できる。分子神経科学昨年度までの研究で、LAGRの活性化が通常時の恐怖記憶の形成に必要である一方、ストレス負荷状態では恐怖記憶の抑制に関わることを明らかにすることができたため、本年度中に論文発表する予定である。本年度は電気生理学的実験を引き続き行い、恐怖条件付け後ならびに拘束ストレス負荷後のLA神経細胞の自発性の微小興奮性シナプス後電流(mEPSC)の頻度と振幅の変化を検討する。また、PTSDモデルを作製し、LAのGR欠損がPTSD様の行動発現に与える影響を解析する。計画した研究の一部が予定とおり進行し、恐怖記憶制御におけるLA特異的なGR機能の一端を明らかにすることができた。現在、アデノ随伴ウイルス(AAV)を用いて、GRをLAGRKOマウスのLAに強制発現させ、LAGRKOマウスで認められた表現型のレスキュー実験を優先的に行っている。当初計画した電気生理学的ならびに形態学的解析については少し遅れているが、計画以上に進んでいる部分もあるため、全体としては概ね順調に進んでいると判断できる。東京大学医科学研究所に申請者が出向き、電気生理学実験を実施する予定でしたが、実験計画が少し遅れたため、試薬購入費ならびに旅費の支出が少なくなった。昨年度の研究により、LAのGRは通常状態だけでなくストレス負荷時の記憶形成においても重要な役割を果たすことを明らかにすることができた。本年度は、AAVによるレスキュー実験を引き続き行い、成果が出る時点で論文発表する予定である。LAGRの細胞レベルでの機能を明らかにするため、当初計画した電気生理学的ならびに形態学的解析を進める。また、LAGRの機能とPTSDの病態との関連性を明らかにするため、PTSDのモデル作製実験を行い、その感受性を評価し、GRをターゲットとするPTSDの新規治療戦略の可能性を検討する予定である。電気生理学実験のための試薬購入費ならびに旅費に割り当て使用する予定である。当初計画した電気生理学実験は、東京大学医科学研究所に申請者が出向き、実施する予定でしたが、実験計画の進行が少し遅れたため、試薬購入費ならび旅費の支出が少なくなった。次年度使用額につきましては、その大部分を電気生理学解析に割り当て使用する予定である。
腫瘍内でステルス性を速やかに解除しナノ粒子の腫瘍集積を積極化する革新的シェル分子

本研究の目的は、正常組織と腫瘍組織との差異を鋭敏に認識し、腫瘍組織内では速やかなステルス性の解除・ポリカチオンへの変貌によりナノ粒子のがん細胞への取り込みを積極化する新規シェル分子の開発である。前年度までに、ポリアミノ酸由来のカルボン酸ベタインの開発に成功し、それがpH応答挙動を有しており、腫瘍組織へのナノ粒子集積が向上することを明らかとしている。今年度では、ナノ粒子表面へのシェル分子の導入密度を変更し、その血液動態や臓器分布を調査した。すると、導入密度の増加に応じて血中滞留性が向上し、理論上の最大密度において最も良い血中滞留性を示した。その血中滞留性は、既存の高分子のシステムを明らかに凌駕するものであり、卓越したantifouling能を有していることが示唆されている。その際に、肝臓や脾臓への集積は大幅に抑えられており、極めて高いステルス性を獲得可能であることがわかった。また、異なるナノ粒子を用いた際にも、前年度と同様に卓越した腫瘍集積性は維持されており、開発された新規シェル分子の機能は確実なものとなった。興味深いことに、腫瘍組織切片を取得することによりナノ粒子の腫瘍内分布を観察すると、血管に近い領域に比較してより酸性度の高い腫瘍深部の領域にナノ粒子が集積することが明らかとなった。このことから、開発したシェル分子は、腫瘍組織への集積量増大だけでなく、腫瘍組織内分布をも制御可能とすることが明らかとなった。開発したカルボン酸ベタインを被覆したナノ粒子において、被覆密度と体内動態との相関が明らかとなった。さらに、腫瘍内分布においては既存の高分子シェルと異なる挙動を示しており、より深部への送達を可能とする可能性を見出した。カルボン酸ベタインに関してだけでなく、他のアニオン性基を有するベタイン構造に関しても知見を深めていく。例えば、スルホン酸ベタインとカルボン酸ベタインでの水和の差異はantifouling能の差異を見出し、最適なシェル分子の開発を推進する。平成29年度では、カルボン酸ベタイン由来のポリアミノ酸ベタインを合成し、そのpH応答挙動を確認した。結果として、正常組織内pHでは中性だが、腫瘍組織内pHではカチオン性となることが明らかとなった。次に、培養細胞に対するポリアミノ酸ベタイン単体の相互作用、生体適合性を評価した。腫瘍内pH依存的に細胞取り込み量が上昇し、目立った毒性も確認されなかった。さらに、ポリアミノ酸ベタインを量子ドット表面に導入することで、シェル分子として用いた際の細胞取り込み量・速度への寄与とpHとの相関を評価した。ポリマー単体と同様の傾向が得られたことから、ナノ粒子表面でもポリマーが挙動を維持していることを確認した。そして、担がんマウスにおける体内動態評価(正常組織・腫瘍組織への集積量評価)及び腫瘍組織での細胞内取り込み評価を行なった。この際に、電荷が常に中性のベタイン分子で被覆した系をコントロールとして用いた。すると、常に中性のベタイン分子で被覆した系と同等の血中滞留性や正常組織への集積性を示した。さらに、腫瘍への集積量は、常に中性のベタインの系に比べて3倍だった。腫瘍組織において電荷がカチオン性へと切り替わる構造を開発することで、腫瘍組織への集積能を向上できることがわかった。カルボン酸ベタインの系において、腫瘍内pHに応答して電荷が切り替わる高分子の開発に成功した。それは腫瘍内pHにおいてカチオン性を帯びるため、細胞表面の糖等のアニオン性分子との相互作用を促す。結果として、それが腫瘍集積へ有効であることも実証された。当該結果は特許出願および論文発表として結実した。

さらに、腫瘍内分布においては既存の高分子シェルと異なる挙動を示しており、より深部への送達を可能とする可能性を見出した。ベタイン構造と生体分子との相互作用に関する究明を進める。カルボン酸ベタイン内において、カチオン性部位とアニオン性部位との距離やそのイオン性基の検討に注力する。とりわけ、pH応答性はベタイン内の分子構造と深く関わるため、それに関する洞察を進めていく。カルボン酸ベタインに関してだけでなく、他のアニオン性基を有するベタイン構造に関しても知見を深めていく。例えば、スルホン酸ベタインとカルボン酸ベタインでの水和の差異はantifouling能の差異を見出し、最適なシェル分子の開発を推進する。
開口放出を制御するタンパク質複合体群の立体構造解析

開口放出は,神経伝達物質や顆粒の放出,受容体の細胞表面への呈示に関わる重要な生命現象であり,積荷を載せた小胞が,細胞膜と融合することにより起きる.小胞と細胞膜との融合は,繋留因子と呼ばれるタンパク質複合体が,小胞膜と標的膜とを繋留した後,小胞膜上のSNAREと標的膜上の別のSNAREが複合体を形成し,小胞膜と標的膜が互いに引き寄せられることによって生じると考えられている.また,これら一連のタンパク質間相互作用によって行われる膜融合反応は,Rabを初めとする特定の低分子量GTPaseとの相互作用によってGTP依存的に制御されている.低分子量GTPaseは,GTP・GDPの結合により,活性・不活性型の変換を行うが,GTP型からGDP型への変換は,GTPase活性化タンパク質(GAP),そしてGDP型からGTP型への変換は,グアニンヌクレオチド交換因子(GEF)の助けを借りて行われる.本研究では,膜融合反応に重要な低分子量GTPaseとそのエフェクター,GEF,およびGAPの立体構造をX線結晶構造解析あるいは電子顕微鏡によって決定し,低分子量GTPaseによる膜融合制御機構をタンパク質の立体構造に基づいて理解することを目的とする.今年度は,Ral GTPaseのエフェクターであり,繋留因子として働くExocyst複合体(分子量760kDa)の電子顕微鏡による解析と,Sec4(酵母のRab GTPase)のGEFであるSec2のX線結晶構造解析を行なった.Exocyst複合体は,ブタ脳あるいはラット脳から,精製し,電子顕微鏡をつかって,酢酸ウラニルによる負染色像を観察した.当初は,粒子の均一性に問題があったが,精製条件を改善することにより,Exocyst複合体全体と考えられる約150Åの大きさの粒子を多く観察できるようになった.しかしながら,解離した複合体と考えられる約60Åと120Åの大きさの粒子が依然として残っており,解析の妨げとなっている.粒子の均一性を高めることにより,単粒子解析が可能な試料調製法を確立することが,今後の課題である.また,極低温電子顕微鏡による解析および結晶化に向けて,試料調製のスケールアップも行ないたい.一方,Sec2については,Sec4との相互作用領域の結晶構造を3.0Å分解能で決定した(R_<free>=0.29).Sec2のSec4結合領域は,二量体であり,200Åの長さをもつトロポミオシン様のcoiledcoilを形成していた.現在,立体構造にもとづいてin vitroおよびin vivoでの機能解析を進めている.また,得られた立体構造情報を利用して,GEF活性を担う領域全体とSec4との複合体の結晶構造解析を進めて行く.開口放出は,神経伝達物質や顆粒の放出,受容体の細胞表面への呈示に関わる重要な生命現象であり,積荷を載せた小胞が,細胞膜と融合することにより起きる.小胞と細胞膜との融合は,繋留因子と呼ばれるタンパク質複合体が,小胞膜と標的膜とを繋留した後,小胞膜上のSNAREと標的膜上の別のSNAREが複合体を形成し,小胞膜と標的膜が互いに引き寄せられることによって生じると考えられている.また,これら一連のタンパク質間相互作用によって行われる膜融合反応は,Rabを初めとする特定の低分子量GTPaseとの相互作用によってGTP依存的に制御されている.低分子量GTPaseは,GTP・GDPの結合により,活性・不活性型の変換を行うが,GTP型からGDP型への変換は,GTPase活性化タンパク質(GAP),そしてGDP型からGTP型への変換は,グアニンヌクレオチド交換因子(GEF)の助けを借りて行われる.本研究では,膜融合反応に重要な低分子量GTPaseとそのエフェクター,GEF,およびGAPの立体構造をX線結晶構造解析あるいは電子顕微鏡によって決定し,低分子量GTPaseによる膜融合制御機構をタンパク質の立体構造に基づいて理解することを目的とする.今年度は,Ral GTPaseのエフェクターであり,繋留因子として働くExocyst複合体(分子量760kDa)の電子顕微鏡による解析と,Sec4(酵母のRab GTPase)のGEFであるSec2のX線結晶構造解析を行なった.Exocyst複合体は,ブタ脳あるいはラット脳から,精製し,電子顕微鏡をつかって,酢酸ウラニルによる負染色像を観察した.当初は,粒子の均一性に問題があったが,精製条件を改善することにより,Exocyst複合体全体と考えられる約150Åの大きさの粒子を多く観察できるようになった.しかしながら,解離した複合体と考えられる約60Åと120Åの大きさの粒子が依然として残っており,解析の妨げとなっている.粒子の均一性を高めることにより,単粒子解析が可能な試料調製法を確立することが,今後の課題である.また,極低温電子顕微鏡による解析および結晶化に向けて,試料調製のスケールアップも行ないたい.一方,Sec2については,Sec4との相互作用領域の結晶構造を3.0Å分解能で決定した(R_<free>=0.29).Sec2のSec4結合領域は,二量体であり,200Åの長さをもつトロポミオシン様のcoiledcoilを形成していた.現在,立体構造にもとづいてin vitroおよびin vivoでの機能解析を進めている.また,得られた立体構造情報を利用して,GEF活性を担う領域全体とSec4との複合体の結晶構造解析を進めて行く.
シリコン結晶中における不純物原子拡散のモデリング

近年のMOS素子の微細化に伴うイオン注入の低エネルギー化によって、これまでのプロセス条件では見られなかった様々な異常拡散現象が新たに観測されている。しかし、従来のプロセスシミュレータには、これらの現象を再現する適切なモデルが組み込まれておらず、また、そのメカニズムはほとんど解明されていない。このような背景から、本研究では、プロセスシミュレータの精度を向上させることを目的とし、シリコン結晶中に低エネルギーイオン注入したボロンについて研究を行った。本年度は極低エネルギー注入ボロンのアップヒル拡散の特性とメカニズムについて詳細に調べ,さらに,モデリングを行った。まず,広範囲なイオン注入,アニール条件でボロンの拡散実験から,アップヒル拡散のアニール温度,注入エネルギー,ドーズ量依存性を調べた。その結果,以下のことが明らかになった。●アニール温度依存性が非常に小さい。●高エネルギー,高ドーズ注入であるほど起こりにくい。さらに,シリコン注入を用いた実験から,アップヒル拡散がアニール初期に存在する多量の自由な格子間シリコン原子とシリコン/酸化膜界面でのドーズロス現象に密接に関連していることを明らかにした。以上の結果を踏まえてモデリングを行い,シミュレーションでボロンのアップヒル拡散を再現するためには,(1)ボロン-格子間シリコン原子ペア(BI)の結合エネルギーE_<BI>は0.8eV,(2)界面でのBIの捕獲速度は十分大きく,捕獲が拡散律速,(3)アニールは試料の昇温過程を考慮,(4)シリコン結晶中は真性状態とする必要があることを示した。このような背景から、本研究では、プロセスシミュレータの精度を向上させることを目的とし、シリコン結晶中に低エネルギーイオン注入したボロンの拡散実験を行い、詳細な解析を行った。本年度はシリコン/酸化膜界面におけるボロンのドーズロス現象の特性について詳しく調べた。ボロンを極低エネルギー注入した試料を用いた実験から、熱処理初期の表面方向へのボロンのアップヒル拡散と多量のドーズロスとが密接に関連していることを初めて確認した。また、ドーズロス量の時間変化は注入ドーズ量に大きく依存し、低、中、高ドーズの3通りのバターンに分類できることを見出した。低ドーズでは、熱処理初期のドーズロスに加えて、その後もドーズロス量は増加するが、ある時間から減少に転じる。中ドーズでは、熱処理初期に多量のドーズロスを生じるが、その後は単調に減少し続ける。高ドーズでは、熱処理初期のドーズロス量は少ないが、長時間にわたってドーズロスが続く。さらに、シリコンと酸化膜の間にインターフェース層を仮定した3層モデルを用いた解析により、シリコン/酸化膜界面からのボロン放出速度を抽出した。
マウスにおけるミトコンドリアDNA母性遺伝を規定する原因の解明

精子由来ミトコンドリアが排除される時期を詳細に特定するために、野生型であるC57BL/6J(♀)とmtGFP-Tgマウス(♂)を用いた体外受精を実施し、精子由来ミトコンドリアのEGFPのシグナルが消失する様子を共焦点レーザー顕微鏡により解析した。また、マウス精子形成過程における雄性生殖系列細胞におけるmtDNAコピー数の測定を行うために、野生型であるC57BL/6J(♂)の精巣から機械的調整法により細胞を分離し、精母細胞、円形精細胞、伸張期円形精細胞、精子および残余体を単離した。DNA精製の過程で起こりうる試料の損失を防ぐために、単一の細胞をプロティナーゼK(P.K.)-非イオン性界面活性剤反応液中に導入し、得られた反応液は95°CでP.K.を失活させ、そのまま次のPCR法に用いる方法を採用した。リアルタイムモニタリングPCR法(RTD-PCR法)によりmtDNAを選択的に増幅するために、特異的なプライマーおよび両末端を蛍光標識したプローブを作製した。段階希釈したコントロールコピーの増幅曲線から、用量反応曲線を作製し、同時に目的の試料中に存在するmtDNAのコピー数を測定し、PCR後の増幅産物はアガロースゲル電気泳動法により展開し、非特異的な増幅のないことを確認した。その結果、それぞれの細胞群の間では細胞あたりのmtDNAコピー数に大きな差が観察され、最大でおよそ1000倍の差があることがわかった。現在、その原因について、分子生物学的解析を行っている。マウス初期胚における精子由来ミトコンドリア排除に関するタンパク分解系の探索(1)精子由来ミトコンドリア排除の詳細な時期の特定精子由来ミトコンドリアが排除される時期を詳細に特定するために、野生型であるC57BL/6J(♀)とmtGFP-Tgまたは、mtDsRed2-Tgマウス(♂)を用いた体外受精を実施した。これらのTgマウスは、蛍光タンパクであるEGFPまたはDsRed2によりミトコンドリアを標識したマウスで、それぞれの励起条件によりミトコンドリアを直接観察することが可能である。時間単位で精子由来ミトコンドリアのEGFP, DsRed2のシグナルが消失する様子を、共焦点レーザ顕微鏡を用いて解析し、その形態変化を定量化した。その結果、受精後、10時間で精子由来ミトコンドリアが断片化していく様子が観察された。しかし、蛍光量については現在までのところ、変化する様子は観察されなかった。現在、さらに観察を続けるとともに、膜電位依存的に染色する試薬を使用して、精子由来ミトコンドリアの活性を観察している。(2)初期発生過程における卵由来ミトコンドリアの形態学的特徴を検討するために、初期発生過程における卵由来ミトコンドリアの観察をmtGFP-Tgおよび共焦点レーザ顕微鏡を用いて行った。その結果、前核期には核の周囲にミトコンドリアが多く局在する様子が観察された。(3)既知タンパク分解系の阻害剤等を用いた精子由来ミトコンドリアの排除の形態学的解析これまでに、報告されたタンパク分解系である、ユビキチン-プロテオソーム系・オートファゴソーム系等の阻害剤を用いて、精子由来ミトコンドリアの排除がされるか否かを検証するために、塩化アンモニウムを用いた実験を行った。濃度条件1,5,10mMとして初期胚が少なくとも4細胞期まで発生可能な条件を検討したが、現在のところ全ての場合において発生が確認できず、すでに報告されている条件では、発生させることが不可能であると思われる。引き続き詳細な条件を模索する。
発生分化におけるコレステロール代謝系の意義を探索するための新しい動物モデルの開発

発生や分化におけるコレステロールの新たな役割が注目されている。コレステロール合成系を構成する酵素の異常症は種々の奇形を合併することが知られる。中でも、中枢神経系を含めて多彩な奇形を呈するSmith-Lemli-Opits症候群はコレステロール合成の最終段階である△7還元酵素の先天異常に起因ることが明らかにされた。同様に、アポBやミクロゾームトリグリセリド転移タンパクなどのノックアウトマウスは重篤な中枢神経奇形を呈する。Hedgehogと呼ばれる形態形成ホルモンはコレステロールと共有結合して初めて機能することが明らかにされ、上述の神経奇形の発症に関わっている可能性が示唆されている。コレステロール合成系の中で、ステロール経路の最初のステップを触媒するスクワレン合成酵素(SS)の異常は知られていない。この酵素の異常はコレステロールの産生のみ特異的に抑えるため、コレステロールの発生と分化における役割を調べるには格好の分子標的である。そこで、ジーンターゲティングによってSSの欠損マウスを作成した。ヘテロ接合体(SS+/-)同士の交配を行うと、ホモ接合体(SS-/-)はE12.5以前に子宮内死亡するため出生は確認されなかった。E9.5-10.5のSS-/-は成長障害を示し、約半数に神経管の閉鎖不全を認めた。神経組織のアポトーシスを示唆する核濃染の所見が得られた。母マウスを2%スクワレン含有食や1.25%コレステロール含有食で飼育して、血中のスクワレンやコレステロール濃度の上昇を期しても、SS-/-の出生は確認されなかった。一方、SS+/-の肝臓におけるSSのmRNAの発現量は半減し、肝臓と精巣のSS活性も50%に低下していた。ところが、肝臓でのコレステロール合成量には、野生型マウスとの間に差は認められなかった。血中脂質値もリポタンパクプロフィールも、野生型マウスとの間に差は認められなかった。漿尿膜循環が成熟する以前においては、SSの欠損は胎児のコレステロール欠乏をきたし、その結果、胎生致死をもたらす神経奇形を呈すると考えられた。コレステロールは細胞膜の主要構成要素であり、コレステロール代謝系は生体機能の広汎な領域において重要な役割を果たしている。特に、発生分化の過程におけるコレステロール代謝系の重要性が近年注目されている。本研究ではコレステロール生合成系に異常を有するマウスを作製し、発生分化研究の実験動物として提供することを目的とした。特に、HMGCoA還元酵素(HMGCoAR)とスクアレン合成酵素(SS)に注目し、これらの酵素をノックアウアトマウスの作成するため、ゲノムDNAのクローニングを行い、ターゲティングベクターを作製した。HMGCoARとSSについては酵素活性中心のネオマイシン耐性遺伝子で置換し、酵素活性の完全欠損を期待するNull型ベクター、SSについてはLoxPで置換部位をはさんで、条件付ノックアウトを期待するCre/LoxP用のベクターでを作成した。それぞれのターゲティングベクターをES細胞にトランスフェクションし、変異をヘテロ接合体にもつES細胞を獲得した。Null型ベクターに関しては、更に、ブラストシストにマイクロインジェクションを行い、キメラマウスを獲得した。いずれもジャームラインに入り、ヘテロ接合体マウスを獲得した。表面的には正常で、成長や生殖能に異常は認められていない。

コレステロール合成系を構成する酵素の異常症は種々の奇形を合併することが知られる。中でも、中枢神経を含めて多彩な奇形を呈するSmith-Lemli-Opits症候群はコレステロール合成の最終段階である△7還元酵素の先天異常に起因ることが明らかにされた。同様に、アポBやミクロゾームトリグリセリド転送タンパクなどのノックアウトマウスは重篤な中枢神経奇形を呈する。Hedgehogと呼ばれる形態形成ホルモンはコレステロールと共有結合して初めて機能することが明らかにされ、上述の神経奇形の発症に関わっている可能性が示唆されている。コレステロール合成系の中で、ステロール経路の最初のステップを触媒するスクワレン合成酵素(SS)の異常は知られていない。この酵素の異常はコレステロールの産生のみ特異的に抑えるため、コレステロールの発生と分化における役割を調べるには格好の分子標的である。そこで、ジーンターゲティングによってSSの欠損マウスを作成した。ヘテロ接合体(SS+/-)同士の交配を行うと、ホモ接合体(SS-/-)はE12.5以前に子宮内死亡するため出生は確認されなかった。E9.5-10.5のSS-/-は成長障害を示し、約半数に神経管の閉鎖不全を認めた。神経組織のアポトーシスを示唆する核濃染の所見が得られた。母マウスを2%スクワレン含有食や1.25%コレステロール含有食で飼育して、血中のスクワレンやコレステロール濃度の上昇を期しても、SS-/-の出生は確認されなかった。一方、SS+/-の肝臓におけるSSのmRNAの発現量は半減し、肝臓と精巣のSS活性も50%に低下していた。ところが、肝臓でのコレステロール合成量には、野生型マウスとの間に差は認められなかった。血中脂質値もリポタンパクプロフィールも、野生型マウスとの間に差は認められなかった。漿尿膜循環が成熟する以前においては、SSの欠損は胎児のコレステロール欠乏をきたし、その結果、胎生致死をもたらす神経奇形を呈すると考えられた。
mRNA-Seq解析を用いた難治性小児てんかんKCNQ2脳症の治療薬候補探索

早期乳児てんかん性脳症(KCNQ2脳症)は、KCNQ2遺伝子のミスセンス変異に起因する小児難治性てんかんであり、未だ効果的な治療薬はない。本研究は、KCNQ2脳症の分子病態の解明と治療薬開発の基盤確立を目的とし、KCNQ2脳症モデルマウスの海馬組織を次世代シーケンサーでRNA-Seq解析することで、疾患の病態に関わる分子の発現変化を、mRNAレベルで網羅的に同定する。また、同定された変化を指標としながら、in silicoスクリーニングで選出された化合物の投与実験を行うことで、KCNQ2脳症の新規治療薬候補となる化合物を探索する。
Ｗｎｔシグナルを介した骨と造血幹細胞制御の組織間ネットワークの分子機構

骨芽細胞において古典的Wntシグナルは,造血幹細胞の遊走を促進するCXCL12の産生を負に調節していた.この作用により破骨細胞分化も抑制された.骨細胞から造血幹細胞へのシグナル伝達分子として,古典的Wntシグナルを抑制する分子であるsclerostinを同定した.骨芽細胞においてNeuropeptide Yの受容体の発現がBMPによって調節されるとともに,オートクラインに制御されていた.本研究から,骨細胞・骨芽細胞とWntシグナルを介して,造血系と全身の異種組織間とに機能的なクロストークの存在が明らかになった.骨芽細胞において古典的Wntシグナルは,造血幹細胞の遊走を促進するCXCL12の産生を負に調節していた.この作用により破骨細胞分化も抑制された.骨細胞から造血幹細胞へのシグナル伝達分子として,古典的Wntシグナルを抑制する分子であるsclerostinを同定した.骨芽細胞においてNeuropeptide Yの受容体の発現がBMPによって調節されるとともに,オートクラインに制御されていた.本研究から,骨細胞・骨芽細胞とWntシグナルを介して,造血系と全身の異種組織間とに機能的なクロストークの存在が明らかになった.Wntシグナルの骨と造血系への相互作用の解析について,造血幹細胞を支持する骨髄ストローマ細胞であるST-2細胞の培養系で古典的Wntシグナルを活性化させるとケモカインの一種であるCXCL12の発現および産生が著しく減少することを見出した.また,TRUE gene silencing法を用いGSK-3betaの発現のノックダウンを行い,CXCL12の発現を調べたところ,有意に減少が認められた.さらにとWntシグナルの機能について,より詳細なメカニズムを解析する古典的Wntシグナルの活性化により造血幹細胞から破骨細胞の分化が著しく抑制された.CXCL12は破骨細胞の遊走を活性化し,破骨細胞形成に促進的に作用することが最近報告されている.これらより,今回見出された結果は,古典的Wntシグナルが,OPG,RANKLの調節(研究代表者らがすでに報告した)のみならずケモカインの産生をも調節しうるという新たな機構である.また,この結果は造血環境において古典的WntシグナルがCXCL12産生の制御を介して血液細胞の分化を調節していることを意味するものと考えられた.また,種々のWnt及びSostのcDNAを発現ベクターに挿入し,これらのタンパク質を精製し,Western blotを用いて確認した.また,造血幹細胞および骨芽細胞をフローサイトメトリーにより採取し,これらの細胞からtotal RNAを回収し,RT-PCR法によりFrizzleds,5種のDkk,2種のKremenなどのWntの受容体の発現を調べたところ,骨芽細胞とは異なる発現パターンが観察され,Wntシグナル分子による骨と造血系の組織間クロストークには,組織特異的な調節機構の存在を示唆する結果が得られた.本研究は,骨芽細胞・骨細胞と造血幹細胞の異種組織間における機能的クロストークとこれを介する分子としてのWntシグナル分子の役割を明らかにすることを目的とする.Wnt3a及びWnt5a発現プラスミドをトランスフェクトさせたL cellを培養し,培養上清中のWnt3a及びWnt5aタンパク質を得,Western Blotにて確認を行った.Kusa-0,ST-2細胞の培養系に得られたWntタンパク質を加え,細胞からRNAを抽出し,造血幹細胞の遊走を促進するCXCL12,CCL17,CCL22等のケモカインのmRNA発現量をリアルタイムPCR法により測定した.Wnt3aの添加により,これらケモカインのmRNA発現量は減少し,古典的Wntシグナルを活性化させるとケモカインが抑制されることが明らかになった.TRUE gene silencing法を用いたノックダウン及び低分子WntインヒビターIWR-1を用いて,古典的Wntシグナルのノックダウンを行うと,CXCL12の発現低下は抑制され,古典的Wntシグナルの細胞内シグナル分子を介してケモカインを調節していることを示唆する結果が得られた.また,骨細胞からtotal RNAを回収し,RT-PCR法によりFrizzleds,5種のDkk, 2種のKremenなどのWntの受容体の発現を調べたところ,骨芽細胞とは異なる発現パターンが観察された.また造血系細胞においてpTOP-FLASHやBMP応答領域-luciferaseレポーターを用いて,ルシフェラーゼ活性を測定したところ,Wntタンパク質もしくは骨細胞の培養上清の添加によって,それらの活性の変化が観察された.以上の結果から,Wntシグナル分子による骨と造血系の組織間クロストークには,組織特異的な調節機構の存在を示唆するものと考えられた.本研究は,骨芽細胞・骨細胞と造血幹細胞の異種組織間における機能的クロストークとこれを介する分子としてのWntシグナル分子の役割を明らかにすることを目的とした.骨細胞特異的にジフテリア毒受容体を発現させたトランスジェニックマウスは,この毒素を投与することで骨細胞を死滅させることができる.このマウスを用いて骨細胞が及ぼす影響について検討した.Bリンパ球やTリンパ球が著しく減少し,胸腺が委縮した.また全身の脂肪組織の脂肪が減少し体重が減少した.またこのマウスの視床下部を破壊すると脂肪肝が発症した.骨細胞は免疫機能や脂肪組織・肝臓などの機能を制御していることが示された.これらの結果から,骨細胞と全身の異種組織間との機能的クロストークの存在を示唆するものと考えられた.

Neuropeptide Y (NPY)は36アミノ酸残基よりなるペプチドで中枢神経系に広く存在し,食欲,エネルギー消費などに関与する.NPYのGタンパク質共役型受容体の一つであるY1 receptor (Y1R)の骨芽細胞特異的遺伝子欠失マウスでは骨量の増大が報告されている.C2C12細胞にBMP2を加え培養するとY1R mRNA発現が誘導された.Smadの導入によってもY1R mRNAの発現が誘導された.マウスY1R遺伝子プロモーターの解析およびChIP assayからY1R遺伝子のー373 bpより下流にSmad結合領域の存在が認められた.Y1R siRNAをMC3T3-E1細胞に導入しY1Rの発現をノックダウンするとRunx2, osterix, ALPやオステオカルシンのmRNA発現が増加し,NPY-Y1Rシステムはautocrineに作用して分化を負に制御している可能性が示唆された.これらの結果より骨細胞から神経ペプチドによる制御機構が存在することが明らかになった.本研究は,骨芽細胞・骨細胞と造血幹細胞の異種組織間における機能的クロストークとこれを介する分子としてのWntシグナル分子の役割を明らかにすることを目的とする.マウス骨髄から採取した未分化間葉系細胞およびST-2細胞の培養系に,本研究で前年度調整したWnt3aもしくはWnt5a組換えタンパク質を加え,細胞からRNAを抽出した.造血幹細胞の種々の活性に影響を与えるTGF-b, Cripto(TDGF-1),PDGFなどのmRNA発現量をリアルタイムPCR法により測定した.Wnt3aにより未分化間葉系細胞でのCriptoの発現が有意に増加することが明らかになった.また,ウエスタンブロット解析からWnt3aとBMP-2の添加によりMMP-13のタンパク量が増加した.GSK-3beta sgRNAを用いたノックダウンや低分子Wntシグナル阻害剤であるIWR-1を加えCripto mRNA発現を検討したところ,著しく発現が低下した.CriptoはST-2細胞においてTGFβの作用を抑制した.骨細胞様細胞の培養上清を添加して培養した.これらの細胞からRNAもしくは総タンパク質を回収し,マイクロアレイもしくはリアルタイムPCR法を用いて遺伝子発現を検討した.また,ウエスタンブロットを用いてタンパク質の発現量の変動を調べた.造血幹細胞の分化機能に影響を及ぼす因子,造血幹細胞から血液細胞への分化に及ぼす因子およびWntシグナル関連分子などいくつかの因子の発現が変動することを見出した.BMP応答領域-luciferaseレポーターやWnt応答領域-luciferaseレポーターの転写活性も変化した.また,培養上清の添加により,エリスポイエチンmRNAの発現は増大した.これらの結果は,骨芽細胞・骨細胞と造血幹細胞の異種組織間における機能的クロストークの存在を示唆するものと考えられた.Wntシグナルの骨と造血系への相互作用の解析が進行し,造血幹細胞の遊走を促進するCXCL12,CCL17,CCL22等のケモカインの役割が重要であることが見いだされた.
ブナ科樹木萎凋病における通道阻害発生機構の解明

本研究は,ブナ科樹木萎凋病における病原菌Raffaelea quercivoraに起因する通水阻害の発生機構を明らかにし,病原菌が宿主の萎凋枯死機構において果たす役割を明らかにすることを目的とする.本年度(平成25年度)は,ブナ科樹木萎凋病における通水阻害発生機構との比較のために,前年(平成24年)に引き続き,本病と同様に媒介昆虫のマスアタックによって感染・枯死するエゾマツ青変病菌Caratocystis polonicaの通水阻害の発生機構の調査を行った.病原菌を接種したエゾマツ苗の水分状態は試験期間(4ヶ月)を通じて対照苗および無処理苗と有意な差は認められなかったが,接種苗では,接種4日後以降にC. polonicaが接種点付近から放射組織通って樹体内へと侵入し,接種7日後以降に通水阻害が接種部の軸方向と放射方向に拡大していた.一連の観察から,菌糸は放射組織内に侵入して水平方向に分布拡大し,壁孔を通って仮道管内へと侵入し垂直方向に分布拡大していることが明らかになった.エゾマツ青変病では菌糸分布の拡大が通水阻害に先行して起こっていたことから,放射組織の柔細胞の防御反応の結果としてキャビテーションが連続的に発生し,通水阻害が引き起されている可能性が示唆された.この結果はブナ科樹木萎凋病では通水阻害が菌糸分布拡大に先行するのとは相反しており,これらの病害における通水阻害は異なる発生機構によって引き起こされていると考えられた.一方,中国重慶市で発生した未知のシイ類の衰退・枯死現象について,本病との比較のために現状把握を行った.その結果,土壌環境の影響を受け根や菌根菌の状況が悪化したことで幹の通水機能が弱まり,個体全体の衰退にっながった可能性が示唆された.(抄録なし)本研究は,ブナ科樹木萎凋病における病原菌Raffaelea quercivoraに起因する通道阻害の発生機構を明らかにし,病原菌が宿主の萎凋枯死機構において果たす役割を明らかにすることを目的とする.本年度(平成23年度)は,菌糸動態と通道阻害の位置関係をより詳細に特定するとともに,その発生要因を明らかにすることを目的として,低温走査型電子顕微鏡(Cryo-SEM)による樹体内の詳細な水分布の観察を行うとともに,FITC標識コムギ胚芽レクチン(F-WGA)による菌糸の樹体内分布の観察を行い,宿主樹体内の菌糸分布と水分布との位置関係を比較した.Cryo-SEMを用いたミズナラ樹体内の水分布観察の結果,接種木・対照木でも水の分布に違いは認められなかった.接種部から離れた当年道管内には水が保持されており,主要な水分通道を担っていると考えられた.当年輪以前の木部の大径道管には水がないものの,周囲仮道管には水が保持されており,木部では主に周囲仮道管で通水していると考えられた.菌糸分布と通道阻害の発生時に認められるチロースの分布は,接種木の方がより接種部位から離れた道管内に分布していたことから,接種木の方が広い範囲で通道阻害が起こっていると考えられた.先行研究(Takahashi et al. 2010)で,菌糸分布域とその付近では水が流れていないことが示されているが,本研究の結果から,色素染色法で通水していないと判別された菌糸分布域とその周辺部においても,周囲仮道管と木部柔組織には水が保持されていることが明らかになった.一方で,通水機能があるかは判別することができなかったことから,色素染色法とCryo-SEMを組み合わせることにより通道水と停滞水をする必要があると考えられた.本研究は,ブナ科樹木萎凋病における病原菌Raffaelea quercivora起因する通水阻害の発生機構を明らかにし,病原菌が宿主の萎凋枯死機構において果たす役割を明らかにすることを目的とする.本年度(平成24年度)は,前年度(平成23年度)の研究結果から手法を改善して接種試験を行った.病原菌菌糸を蔓延させた湿潤爪楊枝または対照として無菌の湿潤爪楊枝を接種したミズナラポット苗および無処理苗に対し,水ポテンシャル測定による水ストレス評価,酸性フクシン水溶液染色法による通水部位の染色と低温走査電子顕微鏡(Cryo-SEM)による水分布の詳細な観察,および,rDNA-ITS領域の塩基配列を元にしたR. quercivora特異的プライマーによる検出とFITC標識コムギ胚芽レクチン(F-WGA)による菌糸分布の観察を行った.観察から得られた画像データを解析し,各処理区の樹体内の菌糸分布と水分布の位置関係を比較した.無処理および1から7日後までの接種点付近の観察結果から,空洞化している道管の周辺に菌糸が分布していても,周囲仮道管や柔組織中で通水している場合があることが確認された.また,菌糸分布域の当年の大径道管内に流れていない停滞水が存在していた.一連の観察から,R. quercivoraの接種によって道管の水の流れが停止するが,阻害の発生機構はキャビテーションではない可能性が示唆された.今後,高さの異なる部位での調査を行い,全貌を明らかにしていく予定である.

一方,樹木の枯死機構の特性の理解を目的として,本病と同様に媒介昆虫のマスアタックによって感染・枯死するエゾマツ青変病菌の接種試験を行い,ブナ科樹木萎凋病との比較を行った,今後,詳細な水分布と菌糸分布の観察を行い,病原菌菌糸と通水阻害の位置関係を調査するとともに,広葉樹と針葉樹の通水阻害の発生機構と比較する予定である.本研究は,ブナ科樹木萎凋病における病原菌Raffaelea quercivoraに起因する通水阻害の発生機構を明らかにし,病原菌が宿主の萎凋枯死機構において果たす役割を明らかにすることを目的とする.本年度(平成25年度)は,ブナ科樹木萎凋病における通水阻害発生機構との比較のために,前年(平成24年)に引き続き,本病と同様に媒介昆虫のマスアタックによって感染・枯死するエゾマツ青変病菌Caratocystis polonicaの通水阻害の発生機構の調査を行った.病原菌を接種したエゾマツ苗の水分状態は試験期間(4ヶ月)を通じて対照苗および無処理苗と有意な差は認められなかったが,接種苗では,接種4日後以降にC. polonicaが接種点付近から放射組織通って樹体内へと侵入し,接種7日後以降に通水阻害が接種部の軸方向と放射方向に拡大していた.一連の観察から,菌糸は放射組織内に侵入して水平方向に分布拡大し,壁孔を通って仮道管内へと侵入し垂直方向に分布拡大していることが明らかになった.エゾマツ青変病では菌糸分布の拡大が通水阻害に先行して起こっていたことから,放射組織の柔細胞の防御反応の結果としてキャビテーションが連続的に発生し,通水阻害が引き起されている可能性が示唆された.この結果はブナ科樹木萎凋病では通水阻害が菌糸分布拡大に先行するのとは相反しており,これらの病害における通水阻害は異なる発生機構によって引き起こされていると考えられた.一方,中国重慶市で発生した未知のシイ類の衰退・枯死現象について,本病との比較のために現状把握を行った.その結果,土壌環境の影響を受け根や菌根菌の状況が悪化したことで幹の通水機能が弱まり,個体全体の衰退にっながった可能性が示唆された.東日本大震災と東京電力福島第一原子力発電所事故に伴う節電要請と計画停電の実施から,安定的に電力供給を要する大型実験機器の使用の見通しが立たず,実験の一部に支障が生じたため.新しい手法を試みるため実験をやり直したり,cryo-SEMの故障修理に時間を要したりしたため,当初計画に比べて多少の遅れが生じているが,キャビテーション以外の原因による通水阻害発生の可能性という新事実が明らかになるなどの成果が上がっており,おおむね順調に進展していると考えている.昨年の電力供給の傾向を元に,大型実験機器の使用時期をずらし,試料採集の時期と試料観察の時期を計画的に調整し,年間を通じてコンスタントに実験運用を行う.また,大型実験機器を使わない別の実験を行う.これまでの研究から,本病の発生機構がキャビテーション以外の要因である可能性が示唆された.通水組織の物理的な閉塞が予測されたことから,蛍光染色シリコン材を用いて道管の通道を調査し,閉塞物質による通水阻害が発生しているかを明らかにする.また,化学的要因について検証するために,病原菌を培養した培養液を用いた接種実験を行い,通常の病原菌を用いた接種実験と同様の操作を行い,病原菌培養液接種により通水阻害の発生が見られるかを調査するとともに,植物組織の細胞死についても併せて調査する.(抄録なし)
微小抵抗血管の収縮機構の発達に伴う変化に関する基礎的研究

体循環の抵抗をつかさどる細動脈の収縮機構の発達に伴う変化についてはよくわかっていない.本研究では抵抗血管の発達に伴う収縮機序の変化を調べた.方法:家兎の腸間膜動脈を使い実験を行った.胎生29日(満期31日)の胎仔、生後3-5日の新生仔、及び生後4-8ヵ月の成獣家兎を使用した.血管収縮機構の検討には、Caチャンネルの阻害剤であるジルチアゼムを投与し収縮にどれだけ影響があるかをみることで、Caチャンネルを通して細胞外から内へ流入するCaの役割を推定した.また、細胞内のCa貯蔵器官からCaを放出させる働きをもつ、カフェインやノルアドレナリンを使用して細胞内Ca貯蔵量を推定した.また電子顕微鏡で小胞体をはじめとする微細構造を検討した.結果:高KC1で得られた最大の発生張力は発達とともに増加した.ジルチアゼムを投与し、血管収縮がコントロールの何%にまで低下したかを成獣、新生仔、胎仔で比較すると、10^<-7>-10^<-5>Mのジルチアゼムの血管弛緩作用は成獣に比べ、新生仔、胎仔で有意に少なかった.つぎに細胞内Ca貯蔵量を推定するため、カフェインを使用して細胞内Caの放出を起こし、ひきおこされる収縮を測定した.カフェインによる収縮をKC1による収縮と比べると、胎仔ではKC1収縮の30%で,新生仔での値(35%)と有意差はなかった.一方成獣では9%にすぎず、胎仔や新生仔での値より有意に少なかった.次に血管平滑筋細胞で微細構造、特に小胞体の発達を調べた.成獣では小胞体はほとんど認められないのにくらべ、新生仔や胎仔では豊富に小胞体が認められた.結論:以上の結果は、細動脈では、未熟な血管では細胞内Ca貯蔵が豊富で、その収縮は成熟血管に比べよりCaチャンネルを通しての細胞外Ca流入に依存しないことを示唆する.体循環の抵抗をつかさどる細動脈の収縮機構の発達に伴う変化についてはよくわかっていない.本研究では抵抗血管の発達に伴う収縮機序の変化を調べた.方法:家兎の腸間膜動脈を使い実験を行った.胎生29日(満期31日)の胎仔、生後3-5日の新生仔、及び生後4-8ヵ月の成獣家兎を使用した.血管収縮機構の検討には、Caチャンネルの阻害剤であるジルチアゼムを投与し収縮にどれだけ影響があるかをみることで、Caチャンネルを通して細胞外から内へ流入するCaの役割を推定した.また、細胞内のCa貯蔵器官からCaを放出させる働きをもつ、カフェインやノルアドレナリンを使用して細胞内Ca貯蔵量を推定した.また電子顕微鏡で小胞体をはじめとする微細構造を検討した.結果:高KC1で得られた最大の発生張力は発達とともに増加した.ジルチアゼムを投与し、血管収縮がコントロールの何%にまで低下したかを成獣、新生仔、胎仔で比較すると、10^<-7>-10^<-5>Mのジルチアゼムの血管弛緩作用は成獣に比べ、新生仔、胎仔で有意に少なかった.つぎに細胞内Ca貯蔵量を推定するため、カフェインを使用して細胞内Caの放出を起こし、ひきおこされる収縮を測定した.カフェインによる収縮をKC1による収縮と比べると、胎仔ではKC1収縮の30%で,新生仔での値(35%)と有意差はなかった.一方成獣では9%にすぎず、胎仔や新生仔での値より有意に少なかった.次に血管平滑筋細胞で微細構造、特に小胞体の発達を調べた.成獣では小胞体はほとんど認められないのにくらべ、新生仔や胎仔では豊富に小胞体が認められた.結論:以上の結果は、細動脈では、未熟な血管では細胞内Ca貯蔵が豊富で、その収縮は成熟血管に比べよりCaチャンネルを通しての細胞外Ca流入に依存しないことを示唆する.