hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マイクロマシン技術を応用した生体適合性材料表面の微細修飾と評価法に関する研究

初年度は、表面プラズモン顕微鏡の開発と試料の作成法の確立を中心に研究を行った。表面プラズモン顕微鏡については、これまでのプロトタイプの製作の経験に基づき、コンピュータ制御による自動調整を取り入れて新たに設計を行い、新規に製作した。この結果、初期に充分な調整を行うのみで必要な精度が得られ、迅速に試料交換、観察が行える装置を開発できた。試料については、初期には銀蒸着膜を使用したが、表面酸化やガラス基板への密着不良が見られた。そこで、ガラス基板と親和性の高いクロム、金の多層薄膜を採用した。観察対象となる生体適合性高分子膜についても、塗布厚のむら、気泡の形成などに悩まされたが、乾燥温度、乾燥時の周囲雰囲気などに工夫を加え、ほぼ満足すべき結果が得られた。次年度は、生体適合性材料及び、電極材料表面への血漿タンパクの吸着について実時間計測を行った。生体適合性材料としてポリウレタンを、電極材料として金-クロム蒸着膜を用いた。血漿タンパクはアルブミン、ガンマグロブリンについて計測を行った。アルブミンのポリウレタンへの吸着曲線は、約7分の時定数を持つ比較的速い部分と、約2時間の時定数を持つ遅い反応が混合したものであった。ガンマグロブリンは、無機物である金に対しても強固に吸着することが判明した。さらに、材料表面における電界がタンパク吸着に及ぼす影響を検討した。あらかじめ表面電界を加えた状態で、材料に接している溶液を生理食塩水からタンパク溶液に置換すると、タンパク吸着の抑制が観察された。しかし、すでに材料表面にタンパクが吸着した状態に電界を加えても、タンパク吸着量に目立った変動は見られなかった。現在電界を材料の表面方向に加える形状の微細加工を電極に施して、電界によるタンパク吸着の制御の可能性について検討を進めている。さらに、直流電界のみならず交流電界での影響についても実験を行っている。本年度は、表面プラズモン顕微鏡の開発と試料の作成法の確立を中心に研究を行った。表面プラズモン顕微鏡については、まず、これまでのプロトタイプの製作の経験から、特に精度が要求される機構部品、調整法上困難な点を洗いだした。この知見に基づいて全体の構造を見直し、コンピュータ制御による自動調整を取り入れて新たに設計を行った。さらに、Knollらの原法では、プリズムの頂角の直下付近のみの観察範囲であったが、この点にも改良を加え広い観察範囲を得られる機構を採用した。プラズモン顕微鏡で特徴的な金属薄膜については、現在は銀蒸着膜を使用しているが、表面酸化に起因すると思われる顕微鏡解像度の劣化が観察された。また、銀蒸着膜は、ガラス基板への密着性に問題がある。そこで、ガラス基板との親和性の高いクロムおよび金の多層薄膜に関し、検討を進めている。観察対象となる生体適合性高分子膜の作製法については、塗布する厚みのむら、気泡の形成などに悩まされたが、乾燥温度、乾燥時の周囲雰囲気の溶媒濃度などに工夫を加えることでほぼ満足すべき結果が得られている。また、この高分子膜の微細加工法として、フォトリソグラフィ、リアクティブ・エッチングについて検討を開始した。今後、光重合あるいは、光重合切断型の高分子膜を用いたフォトリソグラフィのみによる表面微細加工法についても検討する予定である。現在、本顕微鏡を用いて、生体適合性材料試料表面での各種タンパク溶液(アルブミン、フィブリン、ガンマグロブリン)の吸着反応の観察を進めている。

本研究で得られた結果と走査電子顕微鏡での観察、免疫染色法による観察との比較を行うため、新たな実験手法を検討している。本年度は、生体適合性材料及び、電極材料表面への血漿タンパクの吸着について実時間計測を行った。生体適合性材料として、セグメント化ポリウレタン(KP-13:鐘が淵化学)を、電極材料として、金-クロム蒸着膜を用いた。血漿タンパクはアルブミン、ガンマグロブリンについて計測を行った。アルブミンのポリウレタンへの吸着曲線は、約7分の時定数を持つ比較的速い部分と、約2時間の時定数を持つ遅い反応が混合したものであった。これは、アルブミンが多層膜として材料表面に吸着する事を示している。すなわちアルブミンの材料表面への吸着が速い時定数を形成し、アルブミン吸着の多層化の過程が遅い時定数を成すものと考えられた。ガンマグロブリンは、無機物である金に対しても強固に吸着し、生理食塩水での洗浄を加えてもわずかに吸着量が減少したのにとどまった。さらに、材料表面における電界がタンパク吸着に及ぼす影響を検討した。プラズモン励起用の金蒸着膜を一方の電極とし、観察用キュベットに試料と対向させて対電極を置き、双方の電極間に数100mV数Vの電位を与えた。すなわち電界は材料表面に対して垂直方向に生じる。あらかじめ表面電界を加えた状態で、材料に接している溶液を生理食塩水からタンパク溶液に置換すると、タンパク吸着の抑制が観察された。しかし、すでに材料表面にタンパクが吸着した状態に電界を加えても、タンパク吸着量に目立った変動は見られなかった。現在電界を材料の表面方向に加える形状の微細加工を電極に施して、電界によるタンパク吸着の制御の可能性について検討を進めている。さらに、直流電界のみならず交流電界での影響についても実験を行っている。実験動物に装着し、長期にわたりin vivoでのタンパク吸着を観察するため、レーザーダイオードを用いた小型の装置を製作している。
カルシニューリン調節蛋白を介した甲状腺ホルモンの骨形成・代謝に及ぼす作用

甲状腺ホルモン(T3)は骨の形成・代謝に大きな影響を及ぼす.T3により発現が増加するRCAN2は、骨の形成・代謝にも重要な作用を及ぼすカルシニューリンの調節蛋白であることから、T3の骨に対する作用がRCAN2発現調節を介するものであるかを検討した.その結果、新生仔期に於いてはT3が骨でのRCAN2発現を調節し、RCAN2ノックアウトマウスで骨形成が遅延することが示された.したがって、新生仔期におけるT3の骨形成に対する作用の一部はRCAN2の発現調節を介していると考えられた.甲状腺ホルモン(T3)は骨の形成・代謝に大きな影響を及ぼす.T3により発現が増加するRCAN2は、骨の形成・代謝にも重要な作用を及ぼすカルシニューリンの調節蛋白であることから、T3の骨に対する作用がRCAN2発現調節を介するものであるかを検討した.その結果、新生仔期に於いてはT3が骨でのRCAN2発現を調節し、RCAN2ノックアウトマウスで骨形成が遅延することが示された.したがって、新生仔期におけるT3の骨形成に対する作用の一部はRCAN2の発現調節を介していると考えられた.甲状腺ホルモン(T3)が骨形成や代謝に重要な役割を果たしていることは、臨床的によく知られているが、その作用の分子機構には不明な点が多い。我々が以前、T3応答性遺伝子としてクローニングに成功したRCAN2は、神経系で強く発現しているカルシニューリン(CN)の内在性調節蛋白をコードしている。最近、CNが骨形成および代謝に重要な役割を演じてことが報告されたことから、T3はRCAN2の発現調節を介して、CNの活性を調節することにより骨形成や代謝に作用を発揮するのではないかと想定して、本研究を企画した。そこで、初年度である2007年度では、T3が新生仔マウスの骨組織でRCAN2の発現を調節しているか否か、また甲状腺機能低下マウスの骨の発達はどのように障害されるかを検討した。このため、母獣マウスに妊娠14日より実験終了までメチマゾールを投与し、甲状腺機能低下新生仔マウスを作製した。また、メチマゾールを投与しない群をコントロールとした。長幹骨として脛骨と腓骨、扁平骨として頭蓋骨よりRNAを抽出し、定量的RT-PCRによりRCAN2 mRNAを定量した。また、両群生後16日マウスの脛骨をHE染色して、甲状腺機能低下マウスにおける骨の形成異常を解析した。その結果、RCAN2mRNAの発現は脛骨・腓骨、頭蓋骨共に甲状腺機能低下マウスではコントロールに比べ3分の1以下に低下していた(脛骨・腓骨:p<0.05,頭蓋骨:p<0.005)。また、甲状腺機能低下マウスの脛骨では、生後16日の時点でも2次骨化中心が形成されていないなど、骨形成の遅延が明らかであった。一方、我々はRCAN2のノックアウトマウスの作製に成功した。このノックアウトマウスは、大きな奇形を示すことがなく、生殖能も保たれている。現在、RCAN2のノックアウトにより骨形成や代謝にどのような変化が生ずるかを形態学的に解析している。甲状腺ホルモン(TH)が骨形成や代謝に重要な役割を果たしていることは、臨床的によく知られているが、その作用の分子機構には不明な点が多い。我々が以前、TH応答性遺伝子としてクローニングに成功したRCAN2は、神経系で強く発現しているカルシニューリン(CN)の内在性調節蛋白をコードしている。最近、CNが骨形成および代謝に重要な役割を演じてことが報告されたことから、THはRCAN2の発現調節を介して、CNの活性を調節することにより骨形成や代謝に作用を発揮するのではないかと想定して、本研究を企画した。2008年度では、THが成獣マウスの骨組織でRCAN2の発現を如何に調節しているかを検討した。このため、成獣雄マウスにメチマゾールを1ヶ月間投与し、甲状腺機能低下マウスを作製し、また、過剰のLT4を1ヶ月間腹腔内投与して甲状腺機能亢進マウス群を作成した。その結果、成獣マウスの骨では、新生仔マウスに比べ、RCAN2の発現は低く、甲状腺ホルモンによる調節も減弱していることが明かとなった。一方、RCAN2ノックアウトマウス(RCAN2-/-)の骨に対し、走査型電顕を始めとする詳細な形態学的検討を加えた。その結果、RCAN2-/-の新生仔(P1)では、膜性骨化が有意に遅延していることが示された。一方、成長過程(P28)および成獣(P118)の骨組織の形態は、野生型マウスと有意な違いは観察されなかった。以上より、THは骨に於けるRCAN2 mRNAの発現を主として新生仔期に調節しており、RCAN2も骨の発生・発達に影響を及ぼしているものの、成獣での骨形態には影響しないことが示唆された。
わが国周辺海域任意地点における51年浅海波浪推算システムの構築

わが国周辺海域任意地点における波候とその長期変化を高精度で推定しうる実用的波浪推算システムを確立するため,NCEP表面風解析値資料と1点浅海波浪推算モデルを組み合わせた「51年浅海波浪推算システム」を構築するとともに,わが国沿岸の波浪観測地点で波浪推算を実施し,本システムの適用性を検討したのち,51年間の長期波浪推算結果に基づいて波高の長期変化特性を推定した.得られた結果の概要はつぎのようである.1.波浪推算結果と観測結果の比較によれば,NCEP風を入力条件とした本システムは,波候,波高の傾向変動の再現において高い精度をもつといえる.2.外洋ブイ地点での観測風とNCEP風資料の比較から,NCEP風資料が高風速時に観測風速を過小評価する傾向を有することが明らかになった.したがって同風資料を用いる本システムは,異常波浪時の波高を過小に見積もる傾向を有する.こうした異常波浪時のうち台風時については,NCEP風資料に台風モデル風を組み込むことにより,波候の推定精度を変えることなく推算精度を向上させることができた.3.本システムはNCEP風資料の空間解像度がECMWF風資料より劣るので,波候の推定精度においてECMWF風を入力値とした波浪推算結果(ECMWF波資料)より劣るものの,風資料の等質性で優るので,波高の傾向変動においてECMWF波資料より高い精度を有する.4.NCEP風資料の精度に問題があると考えられる最初の10年間を除いた年平均波高に対する傾向変動解析によれば,わが国沿岸における波高は統計的に有意な傾向変動をもたないといえる.5.韓国沿岸におけるブイ地点で波浪推算結と観測結果の両者から推定した波候の比較から,本システムは韓国沿岸においても適用可能であることが確認された.また,韓国沿岸においてもわが国沿岸と同様に,統計的に有意な波高の長期的な増加傾向は認められなかった.わが国周辺海域任意地点における波候とその長期変化を高精度で推定しうる実用的波浪推算システムを確立するため,NCEP表面風解析値資料と1点浅海波浪推算モデルを組み合わせた「51年浅海波浪推算システム」を構築するとともに,わが国沿岸の波浪観測地点で波浪推算を実施し,本システムの適用性を検討したのち,51年間の長期波浪推算結果に基づいて波高の長期変化特性を推定した.得られた結果の概要はつぎのようである.1.波浪推算結果と観測結果の比較によれば,NCEP風を入力条件とした本システムは,波候,波高の傾向変動の再現において高い精度をもつといえる.2.外洋ブイ地点での観測風とNCEP風資料の比較から,NCEP風資料が高風速時に観測風速を過小評価する傾向を有することが明らかになった.したがって同風資料を用いる本システムは,異常波浪時の波高を過小に見積もる傾向を有する.こうした異常波浪時のうち台風時については,NCEP風資料に台風モデル風を組み込むことにより,波候の推定精度を変えることなく推算精度を向上させることができた.3.本システムはNCEP風資料の空間解像度がECMWF風資料より劣るので,波候の推定精度においてECMWF風を入力値とした波浪推算結果(ECMWF波資料)より劣るものの,風資料の等質性で優るので,波高の傾向変動においてECMWF波資料より高い精度を有する.4.NCEP風資料の精度に問題があると考えられる最初の10年間を除いた年平均波高に対する傾向変動解析によれば,わが国沿岸における波高は統計的に有意な傾向変動をもたないといえる.5.韓国沿岸におけるブイ地点で波浪推算結と観測結果の両者から推定した波候の比較から,本システムは韓国沿岸においても適用可能であることが確認された.また,韓国沿岸においてもわが国沿岸と同様に,統計的に有意な波高の長期的な増加傾向は認められなかった.わが国周辺海域任意地点における波候とその長期変化を高精度で推定しうる実用的波浪推算システムを確立するために,ECMWFによる表面風解析値資料に台風モデル風を組み込んだ海上風資料を20年間にわたり作成するとともに,表面風解析値資料を入力条件とする長期波浪推算をわが国沿岸の波浪観測地点で実施し,観測資料との比較に基づいて本システムの適用性を検討した。得られた結果の概要は次のようである。1.中心気圧980hPa以下に発達した台風時を対象として,台風モデル風をECMWF表面風解析値資料に埋め込んだ海上風のデータセットを20年間にわたり作成した。この拡張型表面風解析値資料を入力条件とする20年間波浪推算システムは外洋ブイ地点や沿岸波浪観測地点における台風時高波浪に対して推算精度の向上をもたらす。2.日本海西部の玄界灘に位置する4沿岸波浪観測地点における20年にわたる長期波浪推算資料と観測資料や計算資料相互の比較によれば,本システムは1020kmの水平スケールをもつ海域において島の遮蔽効果や沿岸地形の影響を受けた波浪をよく再現する。3.わが国沿岸に設置された40箇所以上の波浪観測地点においてECMWF表面風解析値資料を入力条件として,20年にわたり行った波浪推算結果は,波候とその傾向変動および波高極値からみた観測資料の特性とよく符合することから,本システムはわが国沿岸任意地点の長期波浪推算に対して十分な実用性を有する。

4.51年間のNCEP表面風解析値資料を入力条件とする長期波浪推算システムは,わが国沿岸のほぼ全波浪観測地点における波候とその経年変化を高い精度で再現する。また,表面風解析値資料の精度に問題のある最初の10年間を除けば,わが国沿岸における波高は傾向変動をほとんど与えない。わが国周辺海域任意地点における波候とその長期変化を高精度で推定しうる実用的波浪推算システムを確立するため、NCEP表面風解析値資料と1点浅海波浪推算モデルを組み合わせた「51年浅海波浪推算システム」を構築するとともに、わが国沿岸の波浪観測地点で波浪推算を実施し、本システムの適用性を検討したのち、3年間の長期波浪推算結果に基づいて波高の長期変化特性を推定した。得られた結果の概要はつぎのようである。1.波浪推算結果と観測結果の比較によれば、NCEP風を入力条件とした本システムは、波候、波高の傾向変動の再現において高い精度をもつといえる。2.外洋ブイ地点での観測風とNCEP風資料の比較から、NCEP風資料が高風速時に観測風速を過小評価する傾向を有することが明らかになった。したがって同風資料を用いる本システムは、異常波浪時の波高を過小に見積もる傾向を有する。こうした異常波浪時のうち台風時については、NCEP風資料に台風モデル風を組み込むことにより、波候の推定精度を変えることなく推算精度を向上させることができた。3.本システムはNCEP風資料の空間解像度がECMWF風資料より劣るので、波候の推定精度においてECMWF風を入力値とした波浪推算結果(ECMWF波資料)より劣るものの、風資料の等質性で優るので、波高の傾向変動においてECMWF波資料より高い精度を有する。4. NCEP風資料の精度に問題があると考えられる最初の10年間を除いた年平均波高に対する傾向変動解析によれば、わが国沿岸における波高は統計的に有意な傾向変動をもたないといえる。5.韓国沿岸におけるブイ地点で波浪推算結と観測結果の両者から推定した波候の比較から、本システムは韓国沿岸においても適用可能であることが確認された。また、韓国沿岸においてもわが国沿岸と同様に、統計的に有意な波高の長期的な増加傾向は認められなかった。
慢性移植片対宿主病における調節性T細胞のBH3プロファイリング

平成24年度においては末梢血中のCD4陽性調節性T細胞(Regulatory T cell以下Treg)とnon-TregであるCD4 conventional T cell(以下Tcon)のBH3プロファイリング法を確立した.平成25年度においては,まずTregとTconをセルソーターにて分離し,各々の細胞集団のテロメレース活性とテロメア長を測定した.その結果Treg, Tconともに検出感度以上のテロメレース活性を有していた.一方テロメア長については,Tregのテロメア長はTconより短縮しており,胸腺からの分化過程においてTregのテロメレース活性はテロメア長の短縮予防には働いていないことが示唆された.次に分離したTreg, Tcon各々をIL-2存在下で培養し,培養終了後の細胞のテロメレース活性,Bcl-2蛋白の発現,BH3プロファイリングを各々測定した.その結果テロメレース活性はIL-2投与3日目よりTreg, Tconともに上昇していた.Bcl-2蛋白発現についてはTcon,TregともにIL-2投与により発現の増加を認めたが,IL-2低用量にておいてはTregの方が強く発現が増強していた.さらにBH3 profilingにおいてはTregとTconで異なるprofilingを呈しており,IL-2投与に伴うアポトーシスの感受性の変化を見出した.TMRE色素によるBH3 profilingが,JC-1色素によるBH3 profilingと同様のTregおよびTconのパターンが得られたため.25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題は,予定通り進んでおり当初の計画のとおりすすめている.このため研究計画に変更はありません.25年度が最終年度であるため、記入しない。
テザードシステムによる小型海洋探査機構の開発

本研究では、主にテザーの進展、回収機構に着目し、これまでに提案した柔軟なテザーと先端剛体系から成るテザードシステムのモデリング、定式化に対し、テザーの長さ変化を考慮するための新たな手法を開発した。この方法では、従来の有限要素を用いた柔軟体のモデリングに対し、非線形力学で議論される多重尺度法を導入し、特に非線形時間尺度を採用している。これにより、テザーの長さ変化を考慮するにもかかわらず、質量マトリクス、剛性マトリクスが共に時間依存しない形式で表現される。これは、複雑なテザードシステムの運動解析にあたり、要素数の設定を行えば、毎時各マトリクスを書き換える必要がないという、計算コストに優れた画期的な手法である。この理論解析手法を用いて、テザーと質点から成るシンプルな系に対して数値シミュレーションを行った。この結果の妥当性を確認するために、特性曲線法を用いた数値解との比較を行い、要素数の設定によって極めて精度の良い数値シミュレーションが可能であることを実証した。またこれに伴い、既存の実験装置を改良し、鋼線を巻き取り、繰り出し可能とし、実験を行った。この実験結果についても、本手法を用いた数値シミュレーション結果は良い一致を見た。さらに、水槽実験装置に水を満たし、流体の影響下でのテザーの運動について、実験および理論解析を行った。特に、テザーと流体の運動の相互干渉が大きくなく、速度に依存した抵抗力として流体がテザーに作用するような場合に対して、流体の影響を考慮した数値シミュレーション結果は、実験結果と定性的な一致を見た。これらの知見により、テザードシステムの流体中の運動解析は、平面問題ながら、大変位、大回転、大変形問題および長さ変化を取り込むことができるようになった。これにより、先端機の位置姿勢制御を数値解析によって確立、検証する基礎理論が構築されたと言える。1.概要平面運動に対する大変位,大変形を伴う弦・剛体系の運動に対するモデリング,定式化,制御系設計を行った。また,先端機を2リンクロボットとして,姿勢制御に関する制御系の実装,アクチュエータ,姿勢角検出センサの配置などを行なうと共に微小重力下における実験も実施してシステムの運動を観測した。2.理論解析本研究課題で対象とするシステムは,マルチボディダイナミクスと制御系との融合課題である。したがって,理論解析の立場からは,以下の克服すべき研究課題すなわち,(1)超柔軟体と剛体との混在系,(2)・大変形,大変位,大回転を伴う非線形課題,(3)制御系,(4)時変系(伸展回収によるテザーの長さ変化),(5)流体力の連成,などへの取り組みが必要である。今年度は,上記(1)(3)の課題に対して2次元問題について理論の構築を行った。弦・剛体系の平面問題における運動解析手法は確立されたので,今後はこれを3次元モデルとし,テザーの長さ変化を考慮できる定式化を行なう。長さ変化については近似的な手法を提案したが,今後より厳密なモデルとする必要があり,また制御系については位置制御も含めた検討が必要となる。3.実験初年度には基礎実験装置を研究室内に作成し,大変位,大変形を伴うテザーの運動について理論の検証を行なった。このときのテザーの運動は撮像の上画像解析(14年度購入)によりデータ化した。また,先端機部を試作し,機能確認を目的に基本的実験を行った。実験装置はテザーとアームおよびベース部より構成され,テザー先端にアームを連結する。アームは回転関節により構成されサーボアクチュエータにより駆動され,ベース部には加速度センサが取り付けられ,姿勢が検出される。この先端機を微小重力場においてテザーと連結し,姿勢制御の可否を観測した。

姿勢制御は概ね達成されているが,なお検証の余地があり,次年度も引き続き実験を継続する予定である。今年度は,実験および理論解析の双方について下記の進展をみた。・実験初年度では,水槽を備えた実験装置および測定システムの確立が完了したが,実験の実行は流体力を考慮した数値解析技術の進展を待ち来年度に持ち越すこととした。本年度の実験の位置付けは,理論解析手法について,そのモデリング,定式化の妥当性を検証することで,ケーブルの伸展,回収時の長さ変化,また大変位,大変形時の3次元挙動を実験的に捉えることとした。これらの諸現象が実現容易な落下式微小重力環境の利用を実現し,このための実験装置の製作および測定システムの整備を行なった。実験では微小張力下におけるテザーの特有の挙動が実現され,これと後述する理論解析との比較検討を行なうことで理論解析手法の妥当性が確認された。・理論解析上記実験に対応する系に対しモデリング,定式化をさらに詳細に検討した。特に今年度は微小変形を仮定した線形範囲において,長さが変化するテザーの運動解析を,有限要素を用いて高効率,高精度に行なう手法を開発した。この解析手法を用いた数値解析結果は,過去に行なわれた実験結果とよく一致しており,今後この手法を非線形問題に拡張することとで大変位,大変形,長さ変化,剛体との連成運動などを網羅した運動解析手法への対応の足がかりとすることができた。一方,3次元解析は多くの進展をみたものの完了には至らなかった。水中でのテザーの運動は3次元的となることが必至であり,来期上半期にこの完成を目指す。本年度は、主にテザーの進展、回収機構に着目し、これまでに提案した柔軟なテザーと先端剛体系から成るテザードシステムのモデリング、定式化に対し、テザーの長さ変化を考慮するための新たな手法を開発した。この方法では、従来の有限要素を用いた柔軟体のモデリングに対し、非線形力学で議論される多重尺度法を導入し、特に非線形時間尺度を採用している。これにより、テザーの長さ変化を考慮するにもかかわらず、質量マトリクス、剛性マトリクスが共に時間依存しない形式で表現される。これは、複雑なテザードシステムの運動解析にあたり、要素数の設定を行えば、毎時各マトリクスを書き換える必要がないという、計算コストに優れた画期的な手法である。この理論解析手法を用いて、テザーと質点から成るシンプルな系に対して数値シミュレーションを行った。この結果の妥当性を確認するために、特性曲線法を用いた数値解との比較を行い、要素数の設定によって極めて精度の良い数値シミュレーションが可能であることを実証した。またこれに伴い、既存の実験装置を改良し、鋼線を巻き取り、繰り出し可能とし、実験を行った。この実験結果についても、本手法を用いた数値シミュレーション結果は良い一致を見た。さらに、水槽実験装置に水を満たし、流体の影響下でのテザーの運動について、実験および理論解析を行った。特に、テザーと流体の運動の相互干渉が大きくなく、速度に依存した抵抗力として流体がテザーに作用するような場合に対して、流体の影響を考慮した数値シミュレーション結果は、実験結果と定性的な一致を見た。
抗腫瘍薬耐性因子を分子標的とする治療開発の基礎的研究

ヒトT細胞白血病株とそのイダルビシン耐性白血病細胞を用いた耐性腫瘍細胞特異的な抗腫瘍薬耐性に関わる分子機構を解明することを目的として、イダルビシン薬剤耐性に関わる変異遺伝子の探索をミトコンドリアDNAと核DNAの両面から検討した。ミトコンドリアDNA比較配列解析とアレイCGH解析を用いることで、イダルビシン耐性白血病細胞にみられる遺伝子変異の抽出を試みた結果、イダルビシン薬剤耐性にはND3やGALNT2遺伝子などの複数の遺伝子変異が関与している可能性が示唆された。癌治療の大きな障壁である抗腫瘍薬耐性の機序について、細胞パネルを用いて耐性の原因となる因子を探索した。今年度は、Comparative Genomic Hybridization(CGH)アレイを用いて抽出した抗腫瘍薬耐性因子の候補遺伝子群とミトコンドリアDNA配列の比較検討を継続した。ヒト急性白血病細胞MOLT-3(抗腫瘍薬に感受性のある親株細胞)と急性白血病の代表的治療薬である抗腫瘍薬イダルビシンに耐性化した細胞MOLT3/IDRについて、抗腫瘍薬耐性因子の候補遺伝子群とミトコンドリアDNA配列の比較検討を継続した。解析に当たって、研究協力者である米国Vanderbilt大学癌センター定量科学部門長・Yu Shyr教授より助言を得た。エキソーム解析を用いて、各々の耐性因子の候補遺伝子について、アミノ酸置換変異とフレームシフト変異などタンパク質に影響を与える変異とアレル頻度情報による変異の絞り込みを実施した。多様性が確認された耐性因子の候補遺伝子に関して、遺伝的多型を定量的に評価し、耐性と関連すると考えられるパスウエイ解析から、親株細胞と耐性株細胞との遺伝子多様性の関係を検討した。これによって、1つの遺伝子については、遺伝子機能予測解析からタンパク質の立体構造予測を行い、タンパク質-リガンド相互作用解析をin silico解析を実施し、イダルビシン耐性に関わる分子機構を検討した。今年度はその手法として、Comparative Genomic Hybridization(CGH)アレイとミトコンドリアDNA配列の比較を用いた。ヒト急性白血病細胞MOLT-3(抗腫瘍薬に感受性のある親株細胞)と急性白血病の代表的治療薬である抗腫瘍薬イダルビシンに耐性化した細胞MOLT3/IDRについてCGHアレイを用いてコピー数の解析を実施した。その結果、MOLT3/IDRで特異的に変化している領域を抽出し、そのうち683領域がマルチコピー化した候補領域、889領域がdeletionあるいはmutationが入った候補領域であった。そして、MOLT3/IDRでマルチコピー化した683プローブから9プローブを抽出した。その中からさらにシグナル強度4倍以上で比較したところ、5つの候補遺伝子まで絞ることができた。そのうちの1つの遺伝子について、抗体を用いウエスタンブロッティングで、そのタンパク質の発現を確認した。さらに、細胞周期やアポトーシスの調節などにも大きく関わっているミトコンドリアDNA全配列を決定し配列を比較したところ、2つの細胞株で4か所のタンパク質コード領域に変異があることが確認された。急性骨髄性白血病の治療薬には、アントラサイクリン系抗腫瘍薬の一種のイダルビシンIdarubicin(IDR)が使用されている。この薬は治療薬の中核的薬剤であるが、薬剤耐性の問題が存在し、治療する際に非常に大きな障壁となっている。本研究では、ヒトT細胞白血病株(MOLT-3)とイダルビシン耐性白血病細胞(MOLT-3/IDR)を用いた腫瘍細胞特異的な抗腫瘍薬耐性に関わる分子機構を解明することを目的として、イダルビシン薬剤耐性に関わる変異遺伝子の探索をミトコンドリアDNA(mtDNA)と核DNAの両面から試みた。MtDNA比較配列解析の結果、MOLT-3親株とMOLT-3/IDR耐性株間では、COX2のエクソン領域の7966番目の塩基がT(チミン)からC(シトシン)に置換、ND3のエクソンで10242番目の塩基がC(シトシン)からY(CあるいはT)に置換、D-Loopの16194番目にC(シトシン)塩基の挿入が確認された。さらに、それぞれのエクソン領域のアミノ酸の置換に注目をしたところ、COX2の127番目のアミノ酸はフェニルアラニン(Phe)からセリン(Ser)に置換し、ND3の61番目のアミノ酸はトレオニン(Thr)からイソロイシン(Ile)に置換していた。特にND3の変異サイト(p.Thr61Ile)はイダルビシン耐性白血病細胞のオリジナルな変異であることが分かった。次に、アレイCGH解析結果から、薬物耐性に関する5つの耐性候補遺伝子に絞ることができた。

そのうち、GALNT2遺伝子配列を確認したところ、MOLT-3/IDR耐性株だけ1716番目の終止コドン(TAG)がG(グアニン)からK(GあるいはT)のヘテロに置換し、アミノ酸配列では終止コドンがチロシン(Tyr)に置換していた。このことからアミノ酸配列は次の終止コドンまでの18残基多く読まれており、リアルタイムPCRでも0.35の発現量が確認された。臨床薬理学CGHアレイを用いて抽出した抗腫瘍薬耐性因子の候補遺伝子群とミトコンドリアDNAについての解析が進行している。CGHアレイを用いて抗腫瘍薬耐性因子の候補遺伝子を5つまで絞ることができ、そのうちの1つについて解析が進行している。抗腫瘍薬耐性細胞において特異的に変化している候補遺伝子群とミトコンドリアDNAの解析を継続し、抗腫瘍薬イダルビシンの耐性化に関わる遺伝子の抽出とその分子機構の解明を試みる。抗腫瘍薬耐性細胞において特異的に変化している他の4つの候補遺伝子とミトコンドリアDNAの解析を継続し、抗腫瘍薬イダルビシンの耐性化に関わる遺伝子の抽出とその分子機構の解明を試みる。エキソーム解析を用いた耐性因子の候補遺伝子探索に関して、エキソーム解析を実施する細胞株の数が予定より若干少なくなったため。2014年度には、エキソーム解析を実施する細胞株の数を増やして解析を行う予定である。抗腫瘍薬耐性因子の候補分子に対して、抗ペプチド抗体を作成中であり、抗体価は上昇するのに数ヶ月を要するためにウエスタンブロッティングへの使用が次年度となる。
建て替えできない住宅団地の閉塞感とコミュニティ再生－代替建替えに関する参加型研究

マンションの建替えは法制度が整備され多くの建替え事例が生まれているが、大規模な団地はほとんど建て替えられない。その多くは建築基準法86条の一団地認定され建替えで居住者の全員合意が必要であるからである。研究は、この困難な状況を乗り越える代替方法を探求する。研究期間中に公共団体施行の再開発の方法が制定され一歩可能性に近づいたが、公共の財政難から不可能な状態である。研究成果として、団地の理事会の修復して建て替える方法の意欲を確認し、長屋建て住宅としての現行法制度内の建替え方法の提案と,ヨーロッパで行われているエリアマネジメントや近隣住区計画の市民による建替え事業に可能性があることを見出した。都市郊外住宅地の典型的で主要なニュータウンや大規模住宅団地を構成する公共賃貸住宅、分譲住宅および戸建てのいずれの住宅団地も、再生に行き詰まり閉塞感に苦しんでいる。特に分譲住宅団地(団地型マンション)は劣化し建替えを必要としている。高齢化、所得減、容積活用の増床の売却も人口減や市場縮小で所有者負担が大きく建替え意欲の低下、さらに都市計画の制約と合意形成困難から多くの団地は再生できない。そこで分譲住宅団地の困難な再生の解決方法を探ることを目的に、今年度(初年度)は、1団地類型別に建替え等の計画とその制約要因の調査と、2団地の居住者の閉塞感および自身の解決の考え方の予備調査を実施した。1については、首都圏の団地を、立地(都心からの距離)、規模、人口条件、余剰容積等を基準に類型化を行い、海浜NT、多摩NT、浦安NT、その他からそれぞれ2団地を選定し、建替え等の計画とその制約要因について、図面、ヒアリングにより調査を行い、制約要因を明らかにした。関連して「日本団地型マンションの建替えの方法と課題ーマンション地域の将来」と題する集会を行い、団地建替え関係者(建替えできた団地、今後検討する団地、頓挫した団地の、コンサル、管理組合等)とともに、課題についてのディスカッションを行い、建替えに係る制約要因を明らかにした。2については、次年度(2年度目)の研究課題であるが、予備調査をweb調査で実施し、アンケート内容や調査の精度を高めるための材料を得た。初年度に計画していた研究課題1団地類型別に建替え等の計画とその制約要因の調査が実施できたこと、次年度に計画していた2団地の居住者の閉塞感および自身の解決の考え方の予備調査が実施できたため。初年度(H27):対象住宅地を千葉市稲毛海岸三丁目団地、タウンハウス黒砂台団地、多摩市多摩ニュータウン諏訪団地、東京都杉並区ライブタウン浜田山団地に設定し、一団地認定のマンション型団地について、現地視察と資料調査を行うとともに、行政機関の訪問調査を行ない整理した。対象団地視察では、管理組合役員にヒアリングした。特に、黒砂台タウンハウスでは、管理組合への面談を行った。併行して、団地管理に実態について、居住者の配布式アンケート調査を行った。その結果、いずれも建て替え不可能の実態が判明し、将来の団地生活の閉塞感が語られた。アンケートの一部の成果である増加する空き家対策については、管理組合と協働で、参加型研究として対策を検討することになった。2ヶ年度目(H28):H27年度末のアンケート調査の追加分析を行い、統計的に団地の生活意識と今後の計画を把握できた。東京のライブタウン浜田山及び黒砂台タウンハウスについて、建築計画の図面資料を収集し,同時に担当行政機関へ,建て替えなどの可能性をヒアリングした。いずれも困難な状況が明確になった。関連する有識者2名(国交省研究機関及びコンサル)から資料を収集し,特に都市再開発法の「地域貢献」内容を含む再開発の可能性が明らかになったが、実際の適用にはまだ数年が必要である。今後当面の建て替え待ち期間の対処方法と研究課題について、団地管理組合と協働し、建て替えなどの提案を前提に調査研究する方針である。団地居住者との協働による参加型研究を方法としているので、この面での成果がまだ目標段階に達していないが、完全建て替え以外のこれまで見えていなかった修復型建て替えの方法が必要である事が明らかになったので、最終年度の研究目標が具体化しており、順調に目標を達成できると考える。修復型建て替えは、団地計画の既存状態を担保しながら、一団地認定の制限を超えない方法で、団地を維持存続していく方法で、現在では明確に提示されたことがない。特にタウンハウスのような低層型団地型マンションでは、適切な方法になると考えられる。研究目的「分譲住宅団地の困難な再生の解決方法を探る」:マンション団地が建設され50年が経過し建替えの実現が課題になってきたが、単棟マンションを除きほとんど進んでいない。国の団地型マンションの再生会議が結成された。また一団地認定の解消を都市計画の行政事業として行う点まで法の改正が行われてきた。研究期間内で一歩前進したといえるが、結果は実行性を生み出していない。研究のねらい:1)合意形成の困難性および建替えイメージの硬直化が固有の本質的難点という認識:一団地認定解消に関わる社会発信を行い、公衆討論で再認識された。参加者である団地管理組合のメンバーは、行政の財政難の中で建替えの事業を行う自治体はない、あるいは、土地の一筆所有の原則にメスを入れない改正は意味がないという意見がクリティカルであった。2)分譲の団地型マンションの建替え再生方法を探る参加型研究:首都圏に立地するタウンハウス団地で適用を開始したが、建替えの本質的な計画に入る前で、現在の問題ー大規模修繕計画で賛成が取れないなどー頓挫した。

こうした状況に対するWEB調査では、再生の計画に現実感がないこと、大規模住民の賛成を必要とする点の不可能性をどうするかなどが、目立って出た点に通じる。研究の成果:このような日本の団地建て替えと再生の現場からヨーロッパに目を転じ、有効な成果を得ている意欲的な団地のエリアマネジメント(ドイツ)あるいは近隣計画(イギリス)を見たが、早いモノ勝ちという欠点でなく、意欲的なコミュニティづくりを優先して長期戦の再生に取り組む方法として評価でき、今後普及すべきと考える。また、人口減少や住宅過剰の時代に、再生でなく現在の住宅資産を寿命まで使い切る考え方もあるという結論を得たので、新しい方法論として修復型再生(ライブタウンのケース)をひとつの有効な可能性として提案した。マンションの建替えは法制度が整備され多くの建替え事例が生まれているが、大規模な団地はほとんど建て替えられない。その多くは建築基準法86条の一団地認定され建替えで居住者の全員合意が必要であるからである。研究は、この困難な状況を乗り越える代替方法を探求する。研究期間中に公共団体施行の再開発の方法が制定され一歩可能性に近づいたが、公共の財政難から不可能な状態である。研究成果として、団地の理事会の修復して建て替える方法の意欲を確認し、長屋建て住宅としての現行法制度内の建替え方法の提案と,ヨーロッパで行われているエリアマネジメントや近隣住区計画の市民による建替え事業に可能性があることを見出した。1団地の居住者の閉塞感および自身の解決の考え方の調査と分析:首都圏に立地いする20の団地居住者に対して、建替えや団地再生に対する意識調査と分析を行う。2団地の再編方法の調査と建替え方法の提案(市民協力による):建替え方法の理論的な選択肢および事業後の土地・住宅の所有関係等の選択肢に対する意見聴取やワークショップによる分譲団地向きの方法の探究を行う。また、土地利用の変更は全員合意の条件であるので、次の多様な建替計画を可能にする敷地分割や土地所有関係について多様な選択肢を検討し、団地敷地の分割方法の意見調査を行う。3結果の意見交換会と公開:市民・専門家の聴衆に研究公開説明会を開催し、「新しい建替えを含む再生方法」の評価を行うワークショップによる意見交換会を行う。千葉の黒砂台タウンハウスと杉並区の浜田山ライブタウンにおける修復型更新、および稲毛海岸三丁目団地における空き家活用による建て替え準備期間の合理的計画という、二種類の計画方法について,具体化を検討する。これらは,従来提案されてこなかった新しい方法であり、可能性を追求したい。建築・都市計画
「脚本クロニクル」サイト構築とその教育活用および国際発信

一次資料としての資料保存(散逸の危機にある現物脚本の救済とオーラルヒストリーの継承)については、追記入力含め8000件のデータを入力し、データベース化した。新規データベースに1万件のデータを移行掲載した。「脚本クロニクル」の構築については、1一次資料としての脚本を活用するため、書誌のデータ化、典拠記録の付加、現物の所在情報等を掲載公開する作業の一環として、900冊の脚本表紙・スタッフ・キャストの画像をデジタル化した。2アーカイブ利用を促すインターフェースの開発のため、試行的に時代劇『水戸黄門』の脚本に登場した舞台を地図上にプロットして検索できるシステムを作成した。3すでに構築していた『永六輔バーチャル記念館』のインタビュー音声を文字起こしして、テキストも掲載できるようにした。4脚本データベースのβ版を完成させ、2019年3月に公開することができた。また、「脚本クロニクル」の利活用(エンターテイメント・エデュケーションのモデル)については、■初等・中等教育対象の活用モデル:1中学校でのオーディオドラマ作成講座、2ショートムービー実演講座、3アフレコ講座を開催し多数の小学生中学生の参加があった。■研究者や高等教育対象の活用モデル:1次の脚本家のオーラルヒストリーを蓄積した(敬称略)。羽原大介、伴一彦、池端俊策(インタビュー)。2日本語の変遷のコーパス研究では、試行的な研究として『市川森一ノスタルジックドラマ集』『市川森一メメント・モリドラマ集』をテキスト化し、計量言語学的分析を試みた。「脚本アーカイブズ・シンポジウム2019」を2019年3月23日にボワソナードタワー・スカイホールで開催し、2018年度の成果報告を行った。一次資料としての資料保存(散逸の危機にある現物脚本の救済とオーラルヒストリーの継承)については、当該年度の研究目標であった、追記入力含め8000件のデータを入力し、データベース化した。新規データベースに1万1000件のデータを移行掲載することができた。「脚本クロニクル」の構築については、1書誌のデータ化、典拠記録の付加、現物の所在情報等を掲載公開する作業の一環として、300冊の脚本表紙・スタッフ・キャストの画像をデジタル化することができた。2脚本データベースのβ版を完成させ、2019年3月に公開することができた。また、「脚本クロニクル」の利活用(エンターテイメント・エデュケーションのモデル)については、初等・中等教育対象の活用モデルのオーディオドラマ作成講座、ショートムービー実演講座、アフレコ講座に多数の小学生中学生の参加があった。研究者や高等教育対象の活用モデルでは、羽原大介、伴一彦、池端俊策のオーラルヒストリーを蓄積することができた。日本語の変遷のコーパス研究では、試行的な研究として『市川森一ノスタルジックドラマ集』『市川森一メメント・モリドラマ集』をテキスト化し、計量言語学的分析を行うことができた。一次資料としての資料保存については、今年度も追記入力含め8000件のデータを入力し、データベース化する。新規データベースに1万件のデータを移行掲載する。「脚本クロニクル」の構築については、書誌のデータ化、典拠記録の付加、現物の所在情報等を掲載公開する作業の一環として、900冊の脚本表紙・スタッフ・キャストの画像をデジタル化を引き続きおこなう。2019年3月に公開した脚本データベースのβ版の操作性を向上させる。また、「脚本クロニクル」の利活用については、■初等・中等教育対象の活用モデル:1中学校でのオーディオドラマ作成講座、2ショートムービー実演講座、3アフレコ講座を引き続き開催する。■研究者や高等教育対象の活用モデル:1脚本家のオーラルヒストリーを蓄積を進める。2日本語の変遷のコーパス研究では、脚本のテキスト化をさらに行い、計量言語学的分析を進展させる。「脚本アーカイブズ・シンポジウム2020」を開催し、今年度の成果報告を行う。今年度特に重点的に取り組む事業としては、脚本データベースの国際発信力を高めるべく、海外の研究機関との連携を強化していきたい。本研究では貴重な脚本を収集し脚本家に焦点をあてたオーラルヒストリーを実施。インタビューや脚本を公開するWeb版「脚本クロニクル」を作成する。脚本の体系化により1放送史を読み解き、2当時の経済・家族関係などをとらえ、3言語学の見地より言葉の変遷も可視化できる。また4映像と脚本の対比研究、創作やセリフ実演等を教育現場で試行し、国語やコミュニケーション教育での実用化を検討する。さらに「脚本クロニクル」を多言語化し日本の放送文化アーカイブとして国際発信を目指す。このサイトにより脚本家の時代背景や社会現象を可視化でき、放送と社会の相関関係を社会学的見地からも考察する。(1)一次資料としての資料保存(散逸の危機にある現物脚本の救済とオーラルヒストリーの継承)......放送脚本を収集保存し、公共機関等で一般公開することは「脚本アーカイブズ活動」と位置付けられる。本研究においては、脚本アーカイブズ活動およびその活用研究を行う。(2)「脚本クロニクル」の構築......一次資料としての脚本を活用するため、書誌のデータ化、典拠記録の付加、現物の所在情報等を掲載公開する。(3)「脚本クロニクル」の利活用(エンターテイメント・エデュケーションのモデル)......■初等・中等教育対象の活用モデル:自発的な学びを「エンタテイメント・エデュケーション」モデルにより実現することを目的とする(初等・中等教育)。■研究者や高等教育対象の活用モデル:オーラルヒストリーと脚本閲覧により、放送史や社会、経済を読み解くことができる。

また言語学の見地より、日本語の変遷をコーパス研究により読み取ることができる。さらに、映像と脚本を対比する研究も大きな目的となる。(4)「脚本クロニクル」の国際発信......作成した「脚本家クロニクル」をインターネット発信するとともに、海外の日本研究者のために多言語化を行い広く活用されることを目的とする。平成29年度は、上記研究目標に照らして次のような成果を得ることができた。(1)一次資料としての資料保存(散逸の危機にある現物脚本の救済とオーラルヒストリーの継承)......新たに約6000冊の脚本の寄贈を受け入れた。追記入力含め8000件のデータを入力し、データベース化した。新規データベースに1万件のデータを移行掲載した。(2)「脚本クロニクル」の構築......1一次資料としての脚本を活用するため、書誌のデータ化、典拠記録の付加、現物の所在情報等を掲載公開する作業の一環として、900冊の脚本表紙・スタッフ・キャストの画像をデジタル化した。2アーカイブ利用を促すインターフェースの開発のため、試行的に時代劇『水戸黄門』の脚本に登場した舞台を地図上にプロットして検索できるシステムを作成した。3すでに構築していた『永六輔バーチャル記念館』のインタビュー音声を文字起こしして、テキストも掲載できるようにした。(3)「脚本クロニクル」の利活用(エンターテイメント・エデュケーションのモデル)......■初等・中等教育対象の活用モデル:1中学校でのオーディオドラマ作成講座、2ショートムービー実演講座、3アフレコ講座を開催し多数の小学生中学生の参加があった。■研究者や高等教育対象の活用モデル:1次の脚本家のオーラルヒストリーを蓄積した(敬称略)。奥山侊伸(インタビュー)、布勢博一、山田太一、竹内日出男(収録済データを掲載)。2日本語の変遷のコーパス研究では、試行的な研究として『市川森一ノスタルジックドラマ集』『市川森一メメント・モリドラマ集』をテキスト化し、計量言語学的分析を試みた。(4)「脚本クロニクル」の国際発信......「脚本家クロニクル」を国際的にインターネット発信するために、トップページの英語訳、中国語(簡体字)訳を行った。一次資料としての資料保存(散逸の危機にある現物脚本の救済とオーラルヒストリーの継承)については、追記入力含め8000件のデータを入力し、データベース化した。「脚本クロニクル」の構築については、1一次資料としての脚本を活用するため、書誌のデータ化、典拠記録の付加、現物の所在情報等を掲載公開する作業の一環として、900冊の脚本表紙・スタッフ・キャストの画像をデジタル化した。
タイレリア原虫のゲノム情報に立脚したワクチン開発

牛小型ピロプラズマ症は牛に貧血を引き起こし、我が国における主たる放牧病として大きな問題となっている。しかし、効果的なワクチン及び治療薬は未開発でありその候補となる原虫抗原もほとんど明らかでない。このような状況を打破すべく、本研究では比較ゲノム解析によるin silicoでの抗原探索、およびウシ血液置換免疫不全マウスとマダニを用いたラボ内でのタイレリア感染実験系の確立を行った。原虫各発育期における転写発現解析を行い、ワクチン候補抗原リストの作成を行った。本実験系及び得られた遺伝子発現情報は今後、T. orientalisの生物学特性を解明していく上で必要不可欠なツールとなりうる。Theileria orientalisによる牛小型ピロプラズマ症は牛に貧血を引き起こし、我が国における主たる放牧病として大きな問題となっている。また本原虫は培養や実験動物を用いた実験が出来ない事もあり、基礎的研究が大きく立ち後れている。私はこのような状況を打破すべく、比較ゲノム解析によるin silicoでの抗原探索、および免疫不全マウスとマダニを用いたラボ内でのタイレリア感染実験系の確立に着手した。これまでにウシ血液置換免疫不全マウスを用いたT. orientalis原虫赤内型ステージの維持を行い、さらにこれら感染マウスをマダニに吸血させる事で、マダニ唾液腺内においてスポロゾイトを形成させる事に成功し、そのRNAを抽出してRNAseqを行った。本実験システムおよび得られた遺伝子発現データは今後T. orientalisの生物学特性を解明していく上で必要不可欠なツールとなりうる。しかし、効果的なワクチン及び治療薬は未開発であり、その候補となる原虫抗原もほとんど明らかでない。そこで1比較ゲノム解析、及び2原虫各発育期のトランスクリプトーム解析に基づくin silicoでのワクチン抗原探索を行った。1T. orientalis2株の全ゲノムを解読し、これらの比較ゲノム解析を進化選択圧解析を行うことでin silicoでのワクチン候補遺伝子の選定を試みた。ここで高いdNdS値を示し、すなわち宿主免疫系に曝されている候補に挙がってきた遺伝子は、すでに悪性タイレリアT. parva/T.annulataにおける有力なスポロゾイトワクチン候補抗原のオルソログ遺伝子であった。この事は、本手法で絞り込んだ幾つかの抗原が本種においても、有力なワクチン候補になりうる事を示唆する。2本種は培養をする事ができず、また牛・マダニにおける各発育期原虫を手に入れるのは容易ではない。そこでSCIDマウスの脾臓を外科的に摘出し、そこに牛の赤血球を定期的に輸血する事によって牛タイレリア症のマウスへの感染させ、さらにそれをマダニに吸血させてスポロゾイトを得ることに成功した。このような実験室内におけるタイレリア感染モデルは世界でも始めての報告である。これらは次世代シーケンサーによるトランスクリプトーム解析に供した。3上記2つの情報により、有望なワクチン候補と考えられた抗原1種類についてリコンビナント抗原を作製し、マウスに免疫して抗原を得た。今後、本抗原の各原虫発育期における性状解析や、ワクチン候補としての可能性について検証をおこないたい。今年度は昨年度に引き続き、比較ゲノム解析とマウスを用いた感染実験を行った。条件検討を重ねるうちに、牛血液置換免疫不全マウスとマダニを用いてT. orientalisの維持を安定して行う事ができた。結果、各発育期原虫RNAから次世代シーケンスによるトランスクリプトーム解析を行う事に成功した。これらの解析により、ワクチン候補遺伝子の絞り込みを行い、数抗原のクローニングと、その大腸菌蛋白発現、および抗血清作製を行った。これら一連の実験は順調に進んでいる。しかし、効果的なワクチンおよび治療薬は未開発であり、その候補となる原虫抗原もほとんど明らかでない。そこで本研究では比較ゲノム解析、及び原虫各発育期のトランスクリプトーム解析に基づくワクチン抗原候補探索を行った。初めに、T. orientalis池田株・千歳株のゲノム情報を用いて全遺伝子について進化選択圧解析を行い、高いdNdSを示す、すなわち宿主免疫系に曝されている可能性のある遺伝子のリストを作成した。また、本種は培養をすることができず、牛・マダニにおける各発育期原虫を手に入れるのは容易ではない。そこでSCIDマウスの脾臓を外科的に摘出し、さらに牛の赤血球を輸血することによって牛タイレリア症のマウスモデルを作成した。それらをマダニに吸血させてスポロゾイトを得ることに成功し、これらピロプラズムとスポロゾイトの発育期原虫をトランスクリプトーム解析に供した。上記の進化選択圧と遺伝子発現情報の2つの情報を突き合わせワクチン抗原候補リストを決定した。本リストの中に、すでに海外悪性タイレリアであるT. parvaやT. annulataにおいて有望なワクチン候補とされているp67/SPAGのオルソログ抗原が含まれていた。そこで本抗原ToSPAGの組換え蛋白を作成してマウスに免疫して抗血清を得た。その結果、本ワクチン候補抗原はタイレリアスポロゾイト期において発現していることが確認された。