hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
酸化亜鉛半導体に可視光域での活性を賦与する新たな混晶系の創製と その原理

ZnOとβ-AgGaO2の混合粉末をターゲットとして、rf-マグネトロンスパッタ法により、ウルツ鉱型ZnOとウルツ鉱型の派生構造であるβ-NaFeO2型β-AgGaO2との混晶薄膜(1-x)ZnO -x(AgGaO2)1/2を作製した。0<x<0.33の範囲でウルツ鉱型の単相薄膜が生成することが明らかとされた。0.67ZnO-0.33(AgGaO2)1/2組成で、そのバンドギャップは2.55eV(波長485nm)であり、ZnOのバンドギャップを青色の領域まで小さくすることに成功した。平成24年度は、β-AgGaO2とZnOとの混晶化を中心に研究を進めた。固相反応法ではZnO-AgGaO2混晶は得られなかったので、ターゲットに以下の方法により作製したβ-AgGaO2とZnOの混合粉末を使用し、rf-マグネトロンスパッタ法により、混晶薄膜を作製した。炭酸ナトリウムと酸化ガリウムを混合・成形し、600°C、1100°Cでそれぞれ24時間仮焼・焼結し、固相反応法によりβ-NaGaO2を作製した。β-NaGaO2を粉砕し、KNO3およびAgNO3の混合溶融塩(温度180300°C)中で20時間加熱することで、NaとAgをイオン交換し、β-AgGaO2を合成した。基板に(0001)サファイア単結晶を使用し、基板温度200°C、スパッタガスに15%O2-85%Arを使用し、スパッタ時の圧力を0.5Paとして成膜することで(1-x)ZnO-x(AgGaO2)1/2表記においてx<0.35の組成域でウルツ鉱型の単相が得られた。光透過スペクトルおよび光電流スペクトルの測定からこの混晶においてZnOのバンドギャップを2.55eVまで小さくすることに成功した。これは青色の光に対応するエネルギーであり、当初の目的であるZnOのバンドギャップを可視光域まで小さくし、可視光域での活性を賦与することに成功した。as-depo薄膜では伝導性はきわめて小さく、電気伝導度を評価するには至らなかったが、ゼーベック係数の符号は負であり、ZnO電子伝導性は維持されているものと思われる。第一原理計算によりエネルギーバンド構造を評価しているが、準安定な構造であるため構造最適化によりウルツ型構造が崩れるという現象に遭遇し、今後計算に工夫が必要と思われる。平成23年度は、陽イオンの規則配列したβ-AgGaO2の合成方法を中心に研究を進めた。以下に、本年度行ったβ-AgGaO2単相試料の合成、結晶構造および光学特性の評価結果を報告する。イオン交換後、長時間大気に曝したり、水による塩類の洗浄に長時間を要したりすると、回収される相はデラフォサイト型のα-AgGaO2となった。イオン交換処理の終了後直ちに洗浄し、室温で真空乾燥することでβ-AgGaO2の単相試料を得られた。β-AgGaO2の色は黄色で、拡散反射スペクトルの測定から、エネルギーバンドギャップは約2.4eVであることが示された。また、大気中での示差熱・熱重量分析では710°C以上で758°Cをピークとする大きな吸熱ピークと、それに対応する重量減少が認められた。この結果はβ-AgGaO2では600°C以上の高温で、試料中のAg+が還元され金属銀となり析出し、Ga2O3を生成する分解反応が生じることが明らかとなった。しかしながら、加熱によってデラフォサイト型α-AgGaO2へと相転移することはなかった。このことは、β-AgGaO2は銀が還元され分解が生じる温度以下では、実際上安定な物質であることを示している。β-AgGaO2の精密な格子定数、原子座標などは未だ明らかでない。今後それらを詳細に調べ、エネルギーバンド構造を計算しβ-AgGaO2の電子材料としてのポテンシャルを明らかにしていく。β-AgGaO2単相試料の作製が、予想以上に難しく時間をとられた。その大きな原因がイオン交換後の洗浄中の水による相変態であることわかり、この課題は解決できた。

β-AgGaO2単相粉末をターゲットとして、rf-マグネトロンスパッタによれば、現状では極めて欠陥密度が大きく光学的には満足できる質のものではないがβ-AgGaO2の薄膜を作製できることがわかったので、今後はこれを用いて研究を進めるため、以後の展開には影響がない。拡散反射スペクトルから求めたβ-AgGaO2のエネルギーバンドギャップは従来報告されている値よりも大きかった。今後は、その薄膜化を中心に検討し、良質な薄膜を用いてバンドギャップの詳細な検討を行う。また結晶構造の詳細を明らかにし、得られた構造をベースにエネルギーバンド構造を計算する。それと並行し、光電子分光・逆光電子によるエネルギーバンド構造の実験的評価も進める。試料の作製方法がスパッタ法へと変更になったが、研究計画全体への影響はなく、当初の予定通りの計画を進めていく。
B・gingivalis27K特異抗原遺伝子の分子生物学的研究

B・gingivalis381株outer membrane画分に対する抗血清を用いた免疫学的スクリーニングで得られた遺伝子クローンMD111は、40K抗原蛋白質をコードしている。pMD111 plasmid中の挿入2.0kbDNAの全塩基配列の解読を行った。pMD111 2.0kb中には969bpより構成されているopen reading flameが存在し、start coden上流に、典型的なプロモーター領域は認められないが、パリンドーム配列をもつsterm partsより成るターミナル領域は認められた。塩基配列から推定したアミノ酸組成は、E・coliに産生させたりコンビナント40K蛋白質の組成とよく一致し、疎水性アミノ酸に富む(44%)ことが判明した。また、V8プロテアーゼ、リジルエンドペプチターゼ限定分解によるC末端を含むpeptidesのアミノ酸配列と塩基配列データからのアミノ酸配列とは良く一致した。遺伝子構造から推定したN末端アミノ酸配列は疎水性アミノ酸に富む領域(21アミノ酸)が存在し、これに続く20アミノ酸の配列はリコンビナント40K蛋白質のN末端アミノ酸配列と一致し、リーダーペプチド領域を確定した。また、40Kリコンビナント蛋白質に対する抗血清が先に報告したB・gingivalis特異抗原27K(Adv.dent.Res.2:310-314.1988.)と反応したことから、27K蛋白質のアミノ酸配列を検討したところ、N末端から114番目以降のアミノ酸配列とよく一致していた。すでに27K蛋白質は、B・gingivalis特異抗原であることが判明しているので、MD111が産生する40Kリコンビナント蛋白質はB・gingivalisに感染した患者の血清抗体価測定の為の有用な特異抗原となり得ること、さらにpMD111 DNAの全塩基配列が解読できたことから、DNA複製のprimerが作成出来れば、pMD111挿入DNAをprobeに用いて、DNA polymerase chain reaction法により、歯周ポケット内B・gingivalisの局在について診断することが出来よう。
馬鈴薯澱粉粕および有色馬鈴有色素成分の健康機能性

北海道は馬鈴薯の生産地として日本国内でも生産量の大部分を占めており毎年100万トンもの馬鈴薯が北海道内で澱粉へと加工されている.このとき,イモから澱粉を取り除いた粕が発生し,その量は年間10万トンにもおよぶ.この澱粉粕には約80%の炭水化物が残存しており,難消化性物質(レジスタントスターチおよびタンパク質など)の存在も確認している.さらに新規の有色馬鈴薯にはアントシアニンの存在も確認している.そこで本研究では馬鈴薯澱粉粕中に含まれる澱粉,タンパク質および色素画分の機能性について探求した.馬鈴薯澱粉粕および澱粉粕から抽出したタンパク質を酵素処理によりペプチドまで分解した試料,有色馬鈴薯からアントシアニンを抽出した色素画分を動物実験および細胞実験に供し,脂質代謝および抗酸化作用に及ぼす影響について検討した.その結果,本年度は馬鈴薯由来の高リン酸化澱粉で小腸でのアルカリホスファターゼ酵素活性が促進してミネラルおよび糖質の吸収を促進することが明らかとなった.また,澱粉粕から抽出・調製方法を検討した2種類のポテトペプチドでコレステロール低下作用が認められた.また有色馬鈴薯の色素抽出物が抗酸化酵素であるスーパーオキシジスムターゼ活性とその遺伝子発現を増加させることにより,抗酸化作用を高めることが明らかとなった.以上の結果より,馬鈴薯澱粉粕中の澱粉画分およびペプチド画分にはそれぞれレジスタントスターチおよびレジスタントプロテインとしてプレバイオティクス効果を有することが明らかとなった.また新規の有色馬鈴薯中のアントシアニン画分には強い抗酸化作用を有することも明らかとなった.このことより食品として有効利用できる可能性が認められた.得られた成果についてはJournal of Functional Foods,Nutrition Research,Plant Foods for Human Nutrition,日本食物繊維学会誌,日本消化吸収学会誌に論文が掲載された.北海道は馬鈴薯の生産地として日本国内でも生産量の大部分を占めており毎年100万トンもの馬鈴薯が北海道内で澱粉へと加工されている.このとき,イモから澱粉を取り除いた粕が発生し,その量は年間10万トンにもおよぶ.このような農産物加工副産物の中には家畜の飼料として有効利用されているものも少なくないが,大部分は廃棄処分されている.しかし澱粉粕には約80%の炭水化物が残存しており,難消化性物質(レジスタントスターチおよびタンパク質など)の存在も確認している.そこで本研究では馬鈴薯澱粉粕中に含まれる澱粉およびタンパク質の機能性について探求した.馬鈴薯澱粉粕および澱粉粕から抽出したタンパク質を酵素処理によりペプチドまで分解した試料を動物実験に供し,脂質代謝に及ぼす影響について検討した.その結果,馬鈴薯澱粉粕では難消化性炭水化物の影響で腸内発酵が促進し,短鎖脂肪酸の増加,胆汁酸の排泄を促進させ,体内の脂質代謝を改善することが明らかとなった.また,澱粉粕から抽出・調製したペプチドでは,コレステロール代謝に係わる遺伝子,とくにapoBmRNA発現の有意な低下, CYP7A1 mRNAやSR-B1 mRNA発現の有意な増加がみられ,さらに糞便中への中性ステロールの排泄を促進することにより脂質代謝を改善することが明らかとなった.さらにガラクトサミン薬剤を投与して肝毒性を誘発させた場合,腸内発酵の促進によりその毒性を軽減させることが明らかとなった.以上の結果より,馬鈴薯澱粉粕には脂質代謝および肝毒軽減効果を持つ難消化性澱粉およびペプチドが含まれており,食品として有効利用できる可能性が認められた.得られた成果についてはBioscience, Biotechnology, and Biochemistry Joumal of Oleo Science, Food Science and Biotechnobgyに論文が掲載された.北海道は馬鈴薯の生産地として日本国内でも生産量の大部分を占めており毎年100万トンもの馬鈴薯が北海道内で澱粉へと加工されている.このとき,イモから澱粉を取り除いた粕が発生し,その量は年間10万トンにもおよぶ.このような農産物加工副産物の中には家畜の飼料として有効利用されているものも少なくないが,大部分は廃棄処分されている.しかし澱粉粕には約80%の炭水化物が残存しており,難消化性物質(レジスタントスターチおよびタンパク質など)の存在も確認している.そこで本研究では馬鈴薯澱粉粕中に含まれる澱粉およびタンパク質の機能性について探求した.馬鈴薯澱粉粕および澱粉粕から抽出したタンパク質を酵素処理によりペプチドまで分解した試料を動物実験に供し,脂質代謝に及ぼす影響について検討した.その結果,本年度は馬鈴薯澱粉粕では難消化性炭水化物の影響で腸内発酵が促進し,短鎖脂肪酸の増加,盲腸内細菌である乳酸菌レベルを増加させることが明らかとなった.さらに馬鈴薯由来の高リン酸化澱粉ではミネラルの吸収を促進することが明らかとなった.

また,澱粉粕から抽出・調製したペプチドでは,ガラクトサミン薬剤を投与して肝毒性を誘発させた場合,腸内発酵の促進によりその毒性を軽減させることが明らかとなった.以上の結果より,馬鈴薯澱粉粕には腸内環境改善効果および肝毒軽減効果を持つ難消化性澱粉およびペプチドが含まれており,食品として有効利用できる可能性が認められた.得られた成果についてはEuropean Journal of Lipid Science and Technology, Nutrition Researchに論文が掲載された.北海道は馬鈴薯の生産地として日本国内でも生産量の大部分を占めており毎年100万トンもの馬鈴薯が北海道内で澱粉へと加工されている.このとき,イモから澱粉を取り除いた粕が発生し,その量は年間10万トンにもおよぶ.この澱粉粕には約80%の炭水化物が残存しており,難消化性物質(レジスタントスターチおよびタンパク質など)の存在も確認している.さらに新規の有色馬鈴薯にはアントシアニンの存在も確認している.そこで本研究では馬鈴薯澱粉粕中に含まれる澱粉,タンパク質および色素画分の機能性について探求した.馬鈴薯澱粉粕および澱粉粕から抽出したタンパク質を酵素処理によりペプチドまで分解した試料,有色馬鈴薯からアントシアニンを抽出した色素画分を動物実験および細胞実験に供し,脂質代謝および抗酸化作用に及ぼす影響について検討した.その結果,本年度は馬鈴薯由来の高リン酸化澱粉で小腸でのアルカリホスファターゼ酵素活性が促進してミネラルおよび糖質の吸収を促進することが明らかとなった.また,澱粉粕から抽出・調製方法を検討した2種類のポテトペプチドでコレステロール低下作用が認められた.また有色馬鈴薯の色素抽出物が抗酸化酵素であるスーパーオキシジスムターゼ活性とその遺伝子発現を増加させることにより,抗酸化作用を高めることが明らかとなった.以上の結果より,馬鈴薯澱粉粕中の澱粉画分およびペプチド画分にはそれぞれレジスタントスターチおよびレジスタントプロテインとしてプレバイオティクス効果を有することが明らかとなった.また新規の有色馬鈴薯中のアントシアニン画分には強い抗酸化作用を有することも明らかとなった.このことより食品として有効利用できる可能性が認められた.得られた成果についてはJournal of Functional Foods,Nutrition Research,Plant Foods for Human Nutrition,日本食物繊維学会誌,日本消化吸収学会誌に論文が掲載された.
炎症組織及び固形腫瘍における血管新生のケミカルメディエーターによる制御

Fibrosarcoma Meth A細胞をアガロース及びパラフィンオイルで被い、マウス背部皮下に移植すると、単にMeth A細胞を移植した場合に比べてインターフェロン-γ及び腫瘍壊死因子の産生が減弱し、Meth A細胞に対する免疫応答が抑制されることが示唆された。アガロース及びパラフィンオイルで被ったMeth A細胞をヒスチジン脱炭酸酵素欠損マウス、H_2受容体欠損マウス、H_1受容体欠損マウスおよびそれぞれに対応する遺伝子背景を持つ野生型マウスの背部皮下に移植したところ、7日後の固形癌の形成はヒスチジン脱炭酸酵素欠損マウス及びH_2受容体欠損マウスで減弱することが明らかになった。したがって、ヒスタミンのH_2受容体を介した作用が固形癌の進展に関与していることが示唆された。各マウス間で、インターフェロン-γの産生量に大きな差はなく、この固形癌形成の減弱は、ヒスタミンあるいはH_2受容体が存在しないことにより免疫増強が生じたためではないと考えられる。固形腫瘍中のヘモグロビン量及びVEGF量を測定したところ、ヒスチジン脱炭酸酵素欠損マウス及びH_2受容体欠損マウスにおいて低下が見られた。さらにH_2拮抗薬であるシメチジンはVEGF量を低下させ、固形癌の形成を減弱させた。以上の結果から、固形癌の形成期においてヒスタミンは、H_2受容体を介して、癌細胞に対する免疫応答を調節するだけでなく、癌形成に必要な血管新生にも関与していることが示唆された。以上の結果から、ヒスタミンは増殖型炎症における肉芽形成だけでなく癌形成における血管新生にも関与していることが明らかになり、ヒスタミンH_2拮抗薬を用いて血管新生を抑制する新しい治療法の可能性が示唆された。1.ヒスチジン脱炭酸酵素欠損マウス及びその対照マウスを用いた綿糸誘導増殖型炎症モデルの解析:(1)Acharan sulfateは本モデルに於いて血管新生を抑制し、肉芽形成を減弱させること、その作用機序はVEGFの産生抑制ではなく、その作用発現を抑制することを明らかにした。(2)ヒスチジン脱炭酸酵素欠損マウスでは、綿糸による血管新生が減弱しているが、これはVEGFに加えてangiopoietin-1の産生も低下していることをみいだした。このとき新生血管にはペリサイトの形成が不完全であった。さらに、ヒスタミンを投与することによりangiopoietin-1の産生が誘導されること、この誘導は抗VEGFで抑制されることを見いだし、angiopoietin-1の産生にはヒスタミンにより誘導されるVEGFが大きく関与していることを明らかにした。2.腫瘍細胞移植モデルの作製:マウスの背部皮下に腫瘍細胞を移植すると、免疫応答により拒絶され、腫瘍形成における血管新生の解析は難しいことがわかった。そこで、腫瘍細胞をリポソーム膜で被い、免疫応答を低下させることを試みた。固形腫瘍移植後、tumor necrosis factor-α及びinterferon-γの産生を指標に免疫応答を解析したところ、本法により、固形腫瘍に対する免疫応答が低下していることが明らかになり、固形腫瘍の形成における血管新生を解析できる実験モデルが確立できた。3.マウスマクロファージ様株RAW264.7細胞を用いたケミカルメディエーターによるVEGF産生系の確立:RAW264.7細胞をprostaglandin E_2あるいはphosphodi-esterase阻害薬で刺激すると、VEGF産生が亢進することを明らかにし、ケミカルメディエーター刺激によるVEGF産生誘導機構を解析する実験系が確立できた。
リンパ節転移癌細胞とストローマ細胞の相互作用による転移支援微小環境形成

癌のリンパ節転移は病態を左右する重要事象であるが、メカニズムはほとんど分かっていない。本研究は、リンパ節内における転移癌細胞の挙動と免疫細胞を含む組織細胞との相互作用に焦点を当てた詳細な観察を行い、転移の成立機序解明を目指した。マウス乳癌細胞の皮下投与により数週間後に転移したリンパ節では、辺縁洞内に癌細胞が定着し転移巣を形成、これが拡大していった。転移巣内部には特徴的な間質(ストローマ)細胞や血管網が形成されるとともに、マクロファージやT細胞の浸潤が認められた。共培養において乳癌細胞はストローマ細胞に選択的に接着したことから、生体内においてもストローマ細胞を足場とする転移の進行が示唆される。癌のリンパ節転移に関する理解は大きく遅れており、リンパ節の組織微細構造や非血球系ストローマ細胞についての最新知見を適用して、これまでにない観点と手法により転移成立機序の解明を目指す必要がある。リンパ節に浸潤した癌細胞は、細網細胞やリンパ管・血管内皮細胞などのストローマ細胞との接触・相互作用により、両者の性状変化や局所免疫抑制、最終的には遠隔転移に繋がる「転移支援微小環境」が形成されている可能性がある。本研究では、マウス上皮性癌転移モデルを用いて癌細胞のリンパ節内動態やストローマ細胞・免疫細胞との接触過程を詳細に観察するとともに、癌細胞と各ストローマ細胞の相互作用による性状変化を究明する解析システムを構築し、リンパ節転移を制御するための分子標的同定への足掛かりとすることを目的としている。今年度は、C57BL/6マウス由来の乳癌細胞株E0771を同系マウス皮下に移植し、数週間後に所属リンパ節への転移を確認するとともに、それによるリンパ節組織構造や免疫細胞の変化、ストローマ細胞との接触について詳細に検討するための実験系構築を進めた。また、生体イメージングを行うことを目的とし、EYFPあるいはtdTomato等の蛍光タンパク質発現ベクターをE0771細胞に導入することで安定発現クローンを取得し、フローサイトメトリーによる検出や蛍光顕微鏡観察が可能なことを確認している。一方、E0771細胞がリンパ節由来ストローマ細胞など線維芽細胞系細胞に効率良く接着することを見出したことから、E0771細胞が発現する接着分子、ケモカイン受容体発現についての検討を進めた。乳癌細胞株E0771の細胞の基本性状の確認や皮下移植によるリンパ節転移観察系の構築に予想以上の期間を要したため、リンパ節における組織構造や免疫細胞の変化、ストローマ細胞との相互作用の解析、生体イメージングの進行が若干遅れている。癌のリンパ節転移に関する理解は大きく遅れており、リンパ節の組織微細構造や非血球系ストローマ細胞についての最新知見を適用して、転移成立機序の解明を目指す必要がある。本研究では、マウス上皮性癌転移モデルを用いて癌細胞のリンパ節内動態やストローマ細胞・免疫細胞との接触過程を詳細に観察するとともに、癌細胞と各ストローマ細胞の相互作用による性状変化を究明する解析システムを構築し、リンパ節転移を制御するための分子標的同定への足掛かりとすることを目的とする。今年度は、C57BL/6マウス由来の乳癌細胞株E0771を同系マウスの第5乳腺皮下に移植後、1週間ごとに鼠径および腋窩リンパ節への転移を経時的に観察するとともに、リンパ節組織構造や免疫細胞の変化、ストローマ細胞との接触について検討を行った。直近の鼠径リンパ節転移癌巣は3週目頃から辺縁洞の底面リンパ管内皮層を破り、皮質に向かって拡大を始めていることが観察され、5週目には髄質に到達しているものが認められた。Desmin陽性のストローマ細胞ネットワークは転移癌巣の辺縁部で接触し、癌の増殖に従って次第に押し出され、転移癌巣内には見られなかった。したがって、転移癌細胞とストローマ細胞の相互作用はこの辺縁領域で進行すると考えられる。一方で、癌巣内には血管が入り込んでおり、ここから血行性の遠隔転移に移行する可能性が示唆された。また、転移癌巣内には多数のマクロファージの侵入が認められたが、リンパ球の侵入は限定的であった。これらの知見により、転移癌細胞がリンパ節内の微細構造を変えながら拡大していく過程の詳細が明らかになった。リンパ節転移癌細胞とストローマ細胞の相互作用や変化に関して、マイクロアレイ解析による遺伝子発現プロファイリングや生体イメージングによる可視化をさらに進める。

また、リンパ節転移支援微小環境の形成や遠隔転移に関わる因子の同定を試み、機能的な評価を行う。免疫学研究計画の実施に若干の遅れを生じており、当該年度に行う予定であったいくつかの重要な実験に関して、次年度に持ち越して行う必要が生じたため。使用するマウスの増加にともなう購入・飼育施設使用料、リンパ節に転移したがん細胞およびストローマ細胞の単離に用いる各種抗体および磁気細胞分離用試薬類、セルソーター使用料、マイクロアレイ解析、生体イメージングに関連した費用に関して、前年度未使用額を考慮し適正に支出していく。
甲殻類の生殖機構に関する共同研究

甲殻類の生殖の内分泌機構については未だ不明な部分が多く,基礎的な面からだけでなく,養殖という応用面からも研究の進展が望まれている.我々は,特に養殖上重要なエビ類を対象にして,雌の卵巣の発達を制御すると考えられているサイナス腺に含まれるペプチドについて,実際そのような活性を有するかどうかを明らかにするため,化学構造と機能の両面からイスラエルの研究者と共同で研究を行い,以下の結果を得た.1.これまでにクルマエビの眼柄内に存在するサイナス腺から7種類の血糖上昇ホルモン族ペプチド(Pej-SGP-I-VII)を単離し,これらのペプチドについてすべてアミノ酸配列を決定した.その結果,これらのペプチドはいずれも全体で72-77アミノ酸残基からなり,分子内に保存された6個のシステイン残基を有することがわかった.生物検定により,血糖上昇活性を調べたところ,IVを除いてすべて活性を示した。IVは別の実験から脱皮抑制活性を有することがわかった.また,イスラエル産のウシエビについても同様の精製と解析を行い,やはりこの族に属する6種類のペプチドを単離し,N末端のアミノ酸配列を明らかにした.これらの配列はクルマエビのペプチドの配列と高い相同性を示した.次に,これらのペプチドをコードするcDNAのクローニングを試みたところ,これまでにIIIとIVのクローニングに成功した.一方,このIIIとIVのC末端10残基に相当するペプチドを化学合成し,ウサギを用いてこれらに対する抗血清を作製し,免疫組織化学によって産生細胞を同定したところ,それぞれの抗血清で染まる細胞と両方の抗血清で染まる細胞が存在することがわかった.これらの染色性が卵巣の発達とともにどのように変化するのか,現在検討中である.2.クルマエビから得られたこれらのペプチドおよび同じくクルマエビのサイナス腺から純化した赤色色素凝集ホルモン(RPCH)と色素拡散ホルモン(PDH)についてウシエビの卵黄形成期の卵巣片を用いて^<35>S-メチオニンの取り込みによってタンパク合成に対する結果を調べた.その結果,血糖上昇活性を示した6種類のペプチドはすべてタンパク合成を抑制したが,IVおよびRPCH,PDHは促進活性も抑制活性も示さなかった.その抑制は,特定のタンパク質の合成を抑制するのではなく,全体の合成を抑制することもわかった.また,同じ検定系で20-ヒドロキシエクゾソン,メチルファルネソエ-トは何の効果も認められなかった.これらのことから,血糖上昇活性をもつ6種のペプチドの卵巣におけるタンパク合成阻害はかなり特異性の高いものであると推定される.同様の実験を^3H-ウリジンの取り込みによって転写のレベルで抑制されているかどうかを調べたところ,6種類のペプチドがすべて転写のレベルで抑制することがわかった.また,この抑制も特定遺伝子の転写の抑制ではなく,全体の転写活性を抑制していることがわかった.3.これまで甲殻類の卵黄タンパク質で構造の明らかになったものは皆無である.我々はウシエビの卵黄タンパク質の構造を明らかにするために,これを卵巣から抽出精製し,SDS-PAGEによってサブユニットに分け,PVDF膜にブロットし,直接配列分析した.その結果,卵黄タンパク質は少なくとも4つのサブユニットからなり,それらの分子量は160kDa,120kDa,96kDa,80kDaと推定された.N末端からの配列分析の結果,前の2者および後の2者はそれぞれ同じ配列を有することがわかった.また,タンパク分解酵素で消化した後,断片化したペプチドを配列分析することによっていくつかの部分配列を決定した.現在,ここから得られた配列の情報を基にして卵巣のcDNAライブラリーからクローニングを行っているところであるが,まだ成功するには至っていない.以上の結果の1については,すでに部分的に論文として公表しており,2については現在論文を作成中である.甲殻類の生殖の内分泌機構については未だ不明な部分が多く,基礎的な面からだけでなく,養殖という応用面からも研究の進展が望まれている.我々は,特に養殖上重要なエビ類を対象にして,雌の卵巣の発達を制御すると考えられているサイナス腺に含まれるペプチドについて,実際そのような活性を有するかどうかを明らかにするため,化学構造と機能の両面からイスラエルの研究者と共同で研究を行い,以下の結果を得た.1.これまでにクルマエビの眼柄内に存在するサイナス腺から7種類の血糖上昇ホルモン族ペプチド(Pej-SGP-I-VII)を単離し,これらのペプチドについてすべてアミノ酸配列を決定した.その結果,これらのペプチドはいずれも全体で72-77アミノ酸残基からなり,分子内に保存された6個のシステイン残基を有することがわかった.生物検定により,血糖上昇活性を調べたところ,IVを除いてすべて活性を示した。IVは別の実験から脱皮抑制活性を有することがわかった.また,イスラエル産のウシエビについても同様の精製と解析を行い,やはりこの族に属する6種類のペプチドを単離し,N末端のアミノ酸配列を明らかにした.これらの配列はクルマエビのペプチドの配列と高い相同性を示した.次に,これらのペプチドをコードするcDNAのクローニングを試みたところ,これまでにIIIとIVのクローニングに成功した.一方,このIIIとIVのC末端10残基に相当するペプチドを化学合成し,ウサギを用いてこれらに対する抗血清を作製し,免疫組織化学によって産生細胞を同定したところ,それぞれの抗血清で染まる細胞と両方の抗血清で染まる細胞が存在することがわかった.これらの染色性が卵巣の発達とともにどのように変化するのか,現在検討中である.

2.クルマエビから得られたこれらのペプチドおよび同じくクルマエビのサイナス腺から純化した赤色色素凝集ホルモン(RPCH)と色素拡散ホルモン(PDH)についてウシエビの卵黄形成期の卵巣片を用いて^<35>S-メチオニンの取り込みによってタンパク合成に対する結果を調べた.その結果,血糖上昇活性を示した6種類のペプチドはすべてタンパク合成を抑制したが,IVおよびRPCH,PDHは促進活性も抑制活性も示さなかった.その抑制は,特定のタンパク質の合成を抑制するのではなく,全体の合成を抑制することもわかった.また,同じ検定系で20-ヒドロキシエクゾソン,メチルファルネソエ-トは何の効果も認められなかった.これらのことから,血糖上昇活性をもつ6種のペプチドの卵巣におけるタンパク合成阻害はかなり特異性の高いものであると推定される.同様の実験を^3H-ウリジンの取り込みによって転写のレベルで抑制されているかどうかを調べたところ,6種類のペプチドがすべて転写のレベルで抑制することがわかった.また,この抑制も特定遺伝子の転写の抑制ではなく,全体の転写活性を抑制していることがわかった.3.これまで甲殻類の卵黄タンパク質で構造の明らかになったものは皆無である.我々はウシエビの卵黄タンパク質の構造を明らかにするために,これを卵巣から抽出精製し,SDS-PAGEによってサブユニットに分け,PVDF膜にブロットし,直接配列分析した.その結果,卵黄タンパク質は少なくとも4つのサブユニットからなり,それらの分子量は160kDa,120kDa,96kDa,80kDaと推定された.N末端からの配列分析の結果,前の2者および後の2者はそれぞれ同じ配列を有することがわかった.また,タンパク分解酵素で消化した後,断片化したペプチドを配列分析することによっていくつかの部分配列を決定した.現在,ここから得られた配列の情報を基にして卵巣のcDNAライブラリーからクローニングを行っているところであるが,まだ成功するには至っていない.以上の結果の1については,すでに部分的に論文として公表しており,2については現在論文を作成中である.日本産のクルマエビ(Penaeus japonicus)とイスラエル産のクマエビ(Penaeus semisalcatus)のサイナス腺を摘出し、日本においてそこから血糖上昇ホルモン族ペプチドを抽出、精製した。いずれの種からも6種類のペプチドが得られた。クルマエビのペプチドについてはすべて全一次アミノ酸配列を決定した。その結果、5つのペプチドは72残基からなり、それらのC末端はアミド化されており、お互いに高い相同性を示したが、残りの1つのペプチドは77残基からなり、C末端はアミド化されておらず、他の5つのペプチドとの相同性は30%前後という低い値を示した。一方、クマエビのペプチドについては質量分析の結果からクルマエビのペプチドと同程度の分子量をもつことがわかり、N末端からの配列分析の結果、40残基前後の配列を決定できたが、まだ全配列を決定するには至っていない。
大洋航行中の船舶の運航能力評価システムの開発

船舶が大洋中を航行し種々の事態に遭遇した時、船舶としての機能を喪失しないように航行するためには高度に知能化された船舶にする必要がある。従来、船長を始めとする人間がこの役割を果たしていたが無人化船を考えた場合にこの代役をどのようにシステム化するか考えることが重要な課題となる。本研究成果の概要は次のとおりである。(1)大洋航行中の船舶の航海能力という概念を明確にすることができ、そのことによって評価方式に一つの指針を与えることができた。(2)船体運動、抵抗増加、船速低下及びそれらの計算の基礎になる流体力の計算、船体主要目の入力、計算結果の出力形式など既開発プログラムの統合化を行い、一貫した計算が可能になった。(3)荒天中を航行する船舶にとって台風(低気圧)情報は大切である。この台風情報の精度がどの位の精度で必要なのか、情報の不正確さの度合が船速などの予測精度にどのように効いてくるのか等を数量的に明確にした。(4)船長の持っている知能をプロダクションルールの形式で表現した。次に数理計算(SUMUT法)で求められた最適航路(最短時間航路)に一致するように前記のプロダクションルールを修正あるいは付加した。その結果、多大な時間を要する数理計算の結果とほとんど変わらない航路をプロダクションルールの方法で決定でき、計算時間の短縮を実現できた。(5)計算結果をデータベース化して「データベース型避航システム」を作成した。これにより経験をデータベースの型で保存でき学習能力を身につけることになった。(6)これらの研究を通じて、船舶耐航性分野の研究成果と持絶操船分野の研究成果を容易に取り込めるシステムの考え方を操縦することができた。船舶が大洋を航行する場合に種々の事態に遭遇した時、船舶としての機能を喪失しないように航行するためには高度に知能化された船舶にする必要がある。従来この知能化された部分は船長を始めとして人間がその役割を果していたが、無人化航を考えた場合にこの代役をどのようにシステム化するかが重要な課題となる。さてこの「知能」を分析すると認識プロセス,判断プロセス,決定プロセスの三つに大きく分類することができる。このような過程を無人化して実行するためには船舶の諸性能が数量化されていなければならない。本研究は大洋航行中の船舶の運航能力を数量化し、それを評価する方法を確立することにその主目的がある。本年度は3ヵ年計画の初年度として次のような研究を行い成果を上げることができた。(1)大洋航行中の船舶の「航海能力」という概念を明確にすることができ、特に台風等の船舶にとって危険な状態になり得る数量的な尺度を明確にすることができた。(2)それをもとにして、その評価システムの構成を従来からの研究成果を使い再構成することができた。(3)船体運動,抵抗増加,船速低下及びそれらの計算の基礎になる流体力の計算,船体主要目の入力,計算結果の出力形式など既開発プログラムの統合化を行い、一貫した計算が可能になった。(4)これらの計算をパーソナルコンピューターで実行できるように簡易化を行った。(5)航海能力ということとともに最適に航行するという考え方の試論も行い確率分布をもったデータを使用した最適航法について一つの手懸りを得た。今年度は最終年度として過去2年間の研究成果を取りまとめることに主力を注ぎ、次のような成果を得ることができた。(1)荒天避航システムを危険度判定システムと避航操船システムに分け、前者を耐航性理論を利用し、後者をプロダクションルールで作成し各々が新期の目的を達成する性能を持っていることを確認した。(2)両システムを結合することにより航海に必要なある評価関数を最適にする航路決定及び操船法を指示するシミュレーション結果の蓄積が可能になった。

これらより「台風情報」と「台風と船との相対的な位置関係」を知ることにより操船指針を容易に作ることができる。(3)「危険度判定システム」は船長の「認識、判断作業」を表現するものとして有用である。ある船体運動など数個の現象をリアルタイムで計測することによって常時船舶の危険か安全かの状態を把握することができる。(4)各システムの計算結果をデータベース化して「データベース型荒天避航システム」を作成した。この各種シミュレーション結果と台風と船との相対的な位置関係などを簡単化したモデルを使った解析的考察から、船速の推定精度と台風の推定精度の相互関係を明らかにした。このことは実際のシステムを構築するうえで重要な知見である。(5)上記の研究を通じて、船舶耐航性分野の研究成果と操船性能分野の研究成果をデータベースとして容易に取り込めるシステムの考え方を提案することができた。
視覚と前庭覚のクロスモーダルな知覚現象の解明

本研究では視覚と前庭覚のクロスモーダルな2つの知覚現象を検討した。第1は視覚と前庭感覚の情報が一致しない場合の自己運動知覚である。自己運動の種類が直進運動あるいは回転運動の場合、前庭系と視覚系に反対方向の運動情報が与えられると、一方の情報に従った運動方向が知覚され、前庭系への情報が優位になるには、一定以上の加速度が必要であることが報告されている。しかし、与えられる運動情報の方向が正反対以外、例えば直交するような組み合わせに関しては明らかではない。我々は、常に加速度を伴う前庭情報と、運動方向が直交する視覚情報を同期させて観察者に呈示し、知覚される自己運動の方向を測定することで、脳はどちらかの情報を排他的に選択するのか、あるいはそれらの情報を統合して自己の運動方向を知覚するのかを検証した。さらに、自己運動の方向をより細かく変化させて、クロスモーダルな情報統合の限界を特定した。第2は、色彩に随伴した自己運動の残効である。縞パタンの方向に随伴する色彩残効はマッカロー効果として知られており、螺旋パタンの拡大・縮小運動に随伴する色彩残効もその生起が確認されている。しかし、クロスモーダルな随伴残効の存在は確認されていない。そこで、観察者の身体を前後方向に運動させると同時に前進時に赤、後退時に緑という異なる色を視覚的に継続呈示し、色彩随伴性の自己運動の残効が生起するかどうかを検証した。結果として、自己運動の方向と順応時の色彩との一貫した随伴性は認められなかったが、螺旋パタンの拡大か縮小という視覚と前庭覚のクロスモーダルな運動残効の存在は確認された。本研究課題は今年度後半に入ってから追加採択されたものであり、実質的活動は予算が執行可能となった11月以降から開始されたため、残念ながら論文等の研究成果を生み出すに至っていない。最初に行なったのは、研究実施計画に従って、なめらかな拡大・縮小運動をするRDPの画像を作成するため必要となる視覚刺激作成装置を、設備備品費で購入したことである。今回購入した装置はこれまで使用していた型とは異なるプログラミング環境で稼働するため、新たに実験用の設定を行なう必要が生じた。そこで、当該のプログラミング言語に詳しい者に設定を依頼し、1月と2月に、数日にわたって新規のプログラミング作業を行ってもらった。この装置導入作業と平行して、研究実施計画の第2点である、身体の運動に随伴した色彩残効の探索的な実験を行なった。縞パタンの方向に随伴する色彩残効はマッカロー効果として知られており、螺旋模様の拡大・縮小運動に随伴する色彩残効もその生起が確認されている。しかし、クロスモーダルな色彩残効の存在は確認されていない。そこで、被験者の身体を前後方向に運動させると同時に前進時に赤、後退時に緑という異なる色を視覚的に継続提示し、身体運動に随伴して色彩残効が生起するかどうかを、被験者に言語報告してもらった。予備実験を6名の被験者に対して行なったところ、被験者は色彩残効よりも、むしろ運動残効の生起を報告した。残効を報告した被験者は4名であり、内3名が陽性残効、1名が陰性残効であった。また、静止した状態で赤あるいは緑の画面を見ると、画面が縮んで見えるという報告が2名から得られた。これも運動残効と考えられる。実験後のインタビューから、運動残効を報告した被験者は乗り物酔いをしやすい傾向があると判明し、酔いのメカニズムとクロスモーダルな運動残効の関係があることが示唆された。これらの成果は、次年度の学会で発表する予定である。研究実施計画の第1点については、次のような成果を得て、研究会での発表と論文化を行なった。

検証したのは、視覚と前庭覚のクロスモーダルな自己運動知覚において、その情報統合がベクトル合成を行なっている可能性である。実験1では、同期した視覚と前庭覚の直交する運動情報から知覚された自己運動の方向が測定された。前後方向のベクションを生起させるのに拡大・縮小するランダムドットパタンが、前庭系に左右方向の継続的な加速度運動を与えるために振り子型可動椅子が、それぞれ用いられた。参加者にはロッドポインティングにより、知覚された自己運動の方向を報告させた。その結果、視覚と前庭覚に与えられた運動方向の中間の方向が知覚された。実験2では、ベクション刺激の拡大・縮小率を変化させた時の知覚された自己運動の方向に加えて、その距離もマグニチュード推定法で報告させた。その結果、刺激の拡大・縮小率に対応した自己運動の距離が知覚されたにもかかわらず、知覚された自己運動の方向は常に視覚情報と前庭覚情報の中間値であった。これらの結果から、視覚と前庭覚の情報統合でベクトル合成が行なわれている可能性よりも、自己運動の方向が距離とは独立に処理されている可能性が高いことが示唆された。研究実施計画の第2点である、身体の運動に随伴した色彩残効の探索的な実験では、現在までのところ予想された結果は得られていない。クロスモーダルな色彩残効の存在を確認するため、被験者の身体を前後方向に運動させると同時に前進時に赤、後退時に緑という異なる色を視覚的に継続提示して順応させ、その後、静止した状態で渦巻きパタンに重畳した赤あるいは緑の画面を見せて、運動残効が生起するかどうかを被験者に言語報告してもらった。実験を4名の被験者に対して行なったところ、全員が渦巻きパタンの拡大か縮小というクロスモーダルな運動残効の生起を報告したが、重畳した色彩と身体運動との関係からみて陽性残効である場合と陰性残効である場合が混在した。身体運動の方向と順応時の色彩との随伴性は認められないものの、クロスモーダルな運動残効の存在は疑われることから、装置の振り子型可動椅子に改良を加えて、実験を継続中である。
沖縄県におけるHTLV-1キャリア分布の解明および基盤データベースの構築

沖縄県の献血者データを基にHTLV-1キャリアの高分布地域であった石垣島をベースにして、HTLV-1キャリア調査を行い、石垣島、宮古島住民の抗HTLV-1抗体陽性割合が約4%であることを明らかにした。またHTLV-1キャリアは非キャリアに比べて、抗糞線虫抗体陽性割合が有意に高いことを明らかにした。さらに沖縄県のHTLV-1のサブタイプの分布が本土と異なっており、南米タイプが多いことを明らかにした。成人T細胞白血病・リンパ腫(ATL)の原因ウイルスであるヒトTリンパ球向性ウイルスI型(HTLV-1)の沖縄県内での分布を明らかにすること、さらにATLの沖縄県特有の臨床病態を明らかにする目的で、沖縄県内で血液内科診療をしている7病院で、2002年から2011年の10年間に発症しているアグレッシブATL(aggressive ATL)症例の後方視的解析を行った。10年間に発症したaggressive ATLは659例であった。発症年齢中央値は68歳と全国調査の結果と同様であったが、7080歳台に発症のピークがあり、発症の最高齢は102歳であった。aggressive ATL発症患者の生育地域を調べたところ、那覇市18%、うるま市15%と両市のATL発症の割合は、県内の1/3を占めていることが判明した。そして南部医療圏、中部医療圏(約110万人)でATLの発症の割合は4分の3を占めていた。一方名護市を中心とする北部医療圏(約10万人)では、ATL患者発症割合が県内の10%未満で、八重山医療圏(石垣島など:約5万人)、宮古医療圏(宮古島など:約5万人)のaggressive ATL発症の割合はそれぞれ12%であった。HTLV-1の地域分布は、ATL発症の分布とほぼ一致していることから、沖縄県内のHTLV-1キャリアの分布は南部医療圏および中部医療圏に集中している実態が明らかになった。沖縄県内で血液内科を有する7病院において20022011年の10年間に発症したaggressive ATL659例の後方視的解析を行った。発症年齢中央値は68歳でこれまでの報告と同等であったが、90歳以上の症例が2.6%、発症最高年齢102歳と沖縄のaggressive ATLは高齢発症である傾向が示された。治療成績については、生存期間中央値は6.5か月とこれまで報告された810か月と比べて不良であった。またJCOG9801の適格条件と合致しさらに研究で採用されているVCAP-AMP-VECP療法、CHOP-14療法が選択されている群を抽出して治療成績を比較検討した。沖縄症例とJCOG9801の生存期間中央値の比較で、CHOP群7.2か月vs11か月、VCAP-AMP-VECP群9.6か月vs13か月であった。これらのデータは沖縄のaggressive ATLが治療難反応性である可能性を示唆した。沖縄県は日本で唯一亜熱帯気候の地域であるが、特有の感染症である糞線虫の陽性割合は12.4%と極めて高い数値を示した。今回の後方視的解析で沖縄県島嶼部の症例は少数で、石垣島、宮古島はいずれも1%以下であった。しかし日本赤十字社九州ブロック血液センターの献血者データでは、沖縄本島と変わらない陽性率であった。そこで上善会かりゆし病院にて健診者、外来患者、入院患者を対象として、HTLV-1キャリア調査を開始した。約400名を検査した段階で、キャリア陽性率は34%前後であった。HTLV-1キャリアを対象としてフォローアップのためのキャリア外来を開始した。献血者データでHTLV-1キャリアの高分布地域である石垣島をベースにして住民1,139名を対象にHTLV-1キャリア調査を行った。そして石垣島、宮古島出身者のキャリア割合が約4%であることを明らかにした(47回Asia-Pacific Academic Consortium for Public Health口演発表)。HTLV-1キャリアのプロウイルスDNA定量(PVL)を行い、ATL進展のリスク因子の一つである100細胞中4コピー以上のキャリアが39例中14例存在することを明らかにした。またキャリア、非キャリアの血清を用いて網羅的抗寄生虫抗体の陽性割合を調べたところ、HTLV-1キャリアは抗寄生虫抗体陽性割合が高く、しかも最大6種類をはじめ、複数の抗寄生虫抗体を有していることが判明した。抗寄生虫抗体の中で特に保有者が多かった高糞線虫抗体、および抗トキソプラズマ抗体の陽性割合についてキャリアと非キャリア間で比較したところ、抗糞線虫抗体は非キャリアに比べキャリアが有意に陽性割合が高いことが分かった。一方抗トキソプラズマ抗体については有意差はみられなかった。HTLV-1サブタイプについてPCR法を用いて調査を行ったところ、本土で90%を占めるTax B (Japanese type)が、沖縄県全体ではTax Bが60%で南米タイプであるTax Aが40%を占め、分布に差があることが判明した。さらに島ごとに調べたところ石垣島はTax Aが約70%を占めていた。このように沖縄県HTLV-1キャリアコホートの基盤が構築され、沖縄県HTLV-1キャリアの特徴を明らかにした。コホートは現在も拡大しており、島嶼部を含めた沖縄全土に拡がるATL/HTLV-1研究ネットワークそして細胞バンキングシステムが構築された。沖縄県の献血者データを基にHTLV-

1キャリアの高分布地域であった石垣島をベースにして、HTLV-1キャリア調査を行い、石垣島、宮古島住民の抗HTLV-1抗体陽性割合が約4%であることを明らかにした。またHTLV-1キャリアは非キャリアに比べて、抗糞線虫抗体陽性割合が有意に高いことを明らかにした。さらに沖縄県のHTLV-1のサブタイプの分布が本土と異なっており、南米タイプが多いことを明らかにした。沖縄県本島のATL発症の実態は明らかにした。HTLV-1キャリア基盤構築のための石垣島でのキャリア調査、およびHTLV-1外来を通じてのフォローアップ体制の確立に向けての活動が進行中である。血液内科学石垣島におけるHTLV-1キャリア陽性割合、およびATL患者の実態、糞線虫の陽性割合などを明らかにする。また、沖縄県全体のHTLV-1キャリア、ATL患者のバンキング検体(末梢血リンパ球、リンパ節細胞など)を用いて分子生物学的解析によるHTLV-1Taxのパターン解析、HTLV-1プロウイルス量の測定を行い、沖縄県HTLV-1キャリア、ATLの分子生物学的特徴を明らかにする。本年度の研究において沖縄県内のATLおよびHTLV-1キャリアの地域分布、および好発地域を明らかにした。キャリア調査として行う抗HTLV-1抗体検査の検査数が予想を下回っており、外注検査費用が予定額を下回ったため。南部医療圏、中部医療圏の保健所、および地域中核病院と連携を図り、HTLV-1キャリアのフォローアップ体制構築基盤整備を図る。そしてキャリア検体の収集を開始する。今年度は石垣島でのキャリア検査数が急速に増加しており、抗HTLV-1抗体検査を行うための外注検査費用として消化する予定である。外注検査費用の発生が様相よりも少なかったため。次年度に外注検査費として使用する予定である。
ミトコンドリア病におけるミトコンドリアDNAのヘテロプラスミ-の病態解明

ミトコンドリア病はミトコンドリアDNA(mtDNA)の変異が主因であるが、患者は変異mtDNAと正常mtDNAのヘテロプラスミであり、それが病態の違いに深く関与していると考えられる。そのヘテロプラスミの割合が変異の部位により異なることを見いだした。研究方法はtRNAに変異を持つ群としてMELAS、MERRFの病因異変の各々A3243G変異、A8344G変異と蛋白をコードにする部位の変異を持つ群として、NAPRやLeigh脳症の病因変異のT8993変異に注目し、これらの変異を持つ患者の剖検組織、および生検筋組織、血液、尿沈渣細胞等の変異の割合を検討した。また培養線維芽細胞の一個毎の細胞間の変異率の違いをPCR法で検討した。さらに長期継代培養で変異率の変化を検討した。その結果、tRNAに変異を持つ群は各組織毎の変異率が大きく違っており、とくに増殖系細胞群(血球、培養細胞、皮膚、脾臓)では変異率が低く、まったくランダムなsegregationを受けていることがわかった。しかし蛋白をコードする群の変異は増殖系を含め組織毎の変異率にはほとんど差を認めず、家族検索でも個体間の差は認めるが、組織間の差を認めなかった。つまり変異部位により組織特異性を認める群と組織特異性を認めない群とがあることが判明した。次に培養細胞を用いて個々の細胞の変異率を検討した結果、tRNAに変異を持つ群の細胞毎の変異率は大きく違っており、蛋白をコードする群での細胞毎の変異はほとんど差を認めなかった。この事から、蛋白をコードする群の変異は受精卵早期にsegregationが完成し、細胞毎の差を認めないと考えられた。また継代培養ではtRNAに変異のある群では培養を繰り返すことにより変異率が低下したが、蛋白コードに変異のある群では変異率はほとんど変化しなかった。ミトコンドリア病はミトコンドリアDNA(mtDNA)の変異にて起こるが、その変異は通常正常と異常が混在するヘテロプラスミ-をとる。MELASはA3243G変異が80%を占め、MERRFはA8344G変異、Leigh脳症の一部にT8993G変異を共通に認める。ミトコンドリア病は難病でその治療は困難であるが、治療を考える場合ヘテロプラスミ-の病態を解明しなければならない。治療モデルin vitroで検討するためには、これらの変異mtDNAの割合が安定した細胞を樹立する必要がある。mtDNAの変異をもつ症例の培養線維芽細胞に複製開始部欠損SV40DNAをリポフェクチン処理して導入し、クローン化後形質が安定した細胞を得た。ミトコンドリアの変異の割合をPCRを用いて検討した結果変異率は35%から67%までの細胞が得られた。さらにmtDNA点変異のある培養線維芽細胞をサイトカラシンB処理後遠心し脱核したサイトプラストとエチジュウムブロマイド処理でmtDNAを完全に除去したHeLa細胞(ρ0細胞)をポリエチレングリコールで細胞融合させて樹立した細胞(サイブリッド)を作成した。今後これらの細胞を低酸素(10%),定常酸素(20%)、高酸素(30%)にて培養を続け、経時的に細胞を採取し,PCRを用いてmtDNAの変異率を求める。同様にグルコース濃度を0%、0.01%、0.05%、0.1%(定常)、0.2%、0.5%とした培地で培養を続け、経時的に細胞を採取し、PCRを用いてmtDNAの変異率を求る。

これらの実験では、変異mtDNAの割合が一定したライン化細胞を用いるが、その均一性については、マニュプレターによって細胞一個を選別し、細胞毎のPCRを行うことによって検討する。また変異率の推移は、細胞全体として検索するのみではなく、細胞一個毎のPCRの結果の総和を平均して求める。後半は次年度に行う予定である。ミトコンドリア病はミトコンドリアDNA(mtDNA)の変異が主因であるが、患者は変異mtDNAと正常mtDNAのヘテロプラスミであり、それが病態の違いに深く関与していると考えられる。そのヘテロプラスミの割合が変異の部位により異なることを見いだした。研究方法はtRNAに変異を持つ群としてMELAS、MERRFの病因変異の各々A3243G変異、A8344G変異と蛋白をコードする部位の変異を持つ群として、NARPやLeigh脳症の病因変異のT8993G変異に注目し、これらの変異を持つ患者の剖検組織、および生検筋組織、血液、尿沈渣細胞等の変異の割合を検討した。また培養線維芽細胞の一個毎の細胞間の変異率の違いをPCR法で検討した。さらに長期継代培養で変異率の変化を検討した。その結果、tRNAに変異を持つ群は各組織毎の変異率が大きく違っており、とくに増殖系細胞群(血球、培養細胞、皮膚、脾臓)では変異率が低く、まったくランダムなsegregationを受けていることがわかった。しかし蛋白をコードする群の変異は増殖系を含め組織毎の変異率にはほとんど差を認めず、家族検索でも固体間の差は認めるが、組織間の差を認めなかった。つまり変異部位により組織特異性を認める群と組織特異性を認めない群とがあることが判明した。次に培養細胞を用いて個々の細胞の変異率を検討した結果、tRNAに変異を持つ群の細胞毎の変異率は大きく違っており、蛋白をコードする群での細胞毎の変異はもほとんど差を認めなかった。この事から、蛋白をコードする群の変異は受精卵早期にsegregationが完成し、細胞毎の差を認めないと考えられた。また継代培養ではtRNAに変異のある群では培養を繰り返すことにより変異率が低下したが、蛋白コードに変異のある群では変異率はほとんど変化しなかった。