hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中性子位相差・暗視野顕微鏡の開発

波長1nm前後の中性子は、鏡面にすれすれに入射(斜入射)させると全反射を起こす。本研究では、X線の結像用に開発してきたウオルターミラー(ひとつの焦点を共有する軸対称の双曲面ミラーと楕円面ミラーを連結したガラス製のミラーで、反射面に白金をコートし、反射率を上げた)を用いて中性子の集光および結像を試みた。原子炉からの中性子(波長0.61nm)をウオルターミラーで集光結像した結果、倍率280分の1の縮小像を得た。検出器には中性子用のイメージングプレートを用いた。中性子位相差顕微鏡用の4分の1波長板材料として銅を用いた場合、波長0.6nmの中性子に対し9ミクロンの厚さが必要な事が示された。中性子顕微鏡実験を目的としたJ-PARC中性子実験施設のビームラインの検討を行った。本研究で用いる中性子の波長領域は0.11.0nmで一般に冷中性子と呼ばれている。中性子実験施設のビームラインの内、この波長域を満足しかつ中性子顕微鏡光学系が設置できるビームラインを検討した結果、BL05のビームラインが最適であるとの結論に達した。中性子顕微鏡光学系は、照明および対物用共にウオルター型ミラーを利用することにし、その組み合わせについて検討を行った。対物用は、前年度中性子結像に成功したウオルター型ミラーを使用することにし、照明用は同程度の性能を有するウオルターミラーを中性子集光照明に使うことにした。双方のミラー共、波長0.15nmのX線結像の評価を行った結果、5ミクロン以下の結像性能を有することが確かめられた。観察対象として水を含む生体試料を予定しているため、その試料環境について検討を行った。含水試料を顕微鏡観察する際、観察前と後で試料が水を含んでいたかどうかを確かめるため、実験室系の軟X線顕微鏡を利用して実験を行った。試料槽はSiNの2枚の薄い膜を窓とし、試料はこの2枚の薄膜ではさまれた形で作った。炭素の吸収端波長4.3nm前後で軟X線像を撮影すると、試料槽に水がある時、吸収端より短波長側では有機物(炭素を含む)の像が暗くなり、長波長側では明るいコントラストが得られることが分かった。本手法は、軟X線・中性子顕微鏡以外の様々な顕微鏡観察に際し、試料が観察前後で含水状態であるか否かの判別に有効であることを示している。J-PARC中性子実験施設における中性子顕微鏡光学系の準備を進めた。本研究で用いる中性子の波長域は0.11nmの冷中性子と呼ばれている。この波長域を満足しかつ中性子顕微鏡光学系の組み立てが可能なビームラインを検討した結果、BL05ビームラインが最適であると結論付けられたので、当該ビームラインの課題申請を行い受理された。中性子の集光および対物光学素子として、波長0.15nmのX線結像に使用したウオルター型ミラーを利用することにした。また、中性子画像検出器としてGd2O2S中性子シンチレーターと可視光CCDカメラの組み合わせた光学系を準備した。この検出器の性能をチェックするためにシンチレータに感度のある実験室系X線源(波長0.150.3nm)を用いて、検出器の空間分解能を測定し、100ミクロン程度の解像力があることを確かめた。予定している中性子顕微鏡の倍率が10倍なので、物体面での空間分解能が10ミクロンになる。また、中性子位相差顕微鏡で使う位相板(4分の1波長板)についても検討した。位相板として、銅を使う場合、波長0.4nmの中性子に対して約6ミクロンの厚みが必要と計算された。波長サブナノメートル領域の位相差顕微鏡開発の一環として、波長0.2nmの放射光を利用したX線微分位相コントラスト顕微鏡の予備実験を行い、定量性の高い結果を得た。中性子はX線と同様に物質に対する透過力が高く、物体構造の内部を非破壊的に観察するプローブとして使える。特に、水素を含む物質の中性子の吸収率はX線に比べて高く、水や有機物などの水素含有物の観察には適している。この性質を利用して中性子イメージング(投影法)が行われているが、像の分解能は検出器の解像度によって決まり、0.1mm前後に留まっている。微細な構造を観察するためには、中性子自身を結像できる光学素子が必要となる。本研究では、中性子結像素子を開発し、中性子顕微鏡を組み立て、像コントラストを増大させる映像システムを構築する。(1)中性子結像素子の開発波長0.11nmの中性子結像素子として、斜入射全反射ミラーの可能性を確かめるために、同波長領域のX線結像用ウオルターI型ミラーの中性子集光実験を行った。実験は日本原子力研究開発機構の原子炉JRR-3のビームラインCNRF(cold neutron radiography facility)で行った。

中性子集光画像をイメージングプレートで検出し、検出器の解像限界(100ミクロン)の分解能で集光像を得た。(2)中性子位相差および暗視野顕微鏡用位相板の検討物体に対する中性子の透過率が高いことは非破壊検査用として非常に有利な性質であるが、観察対象が小さくなると像コントラストが得にくくなる。その問題の解決手段として物体中の密度差を位相差として表現する方法がある。本研究では、その内の一つの方法として、ツェルニケの位相差法を採用する。本方法は、対物素子によって物体透過光を素子後方でフーリエ変換し、直接光と回折光に4分の1波長分の位相変調を施し、コントラスト増大を図る手法である。平成23年度は、当該中性子波長域におけるガドリニウム、ボロン、銅、ニッケルなどの光学定数(位相および吸収に関係)を調べ、位相板としての検討を行った。斜入射全反射ミラーを対物素子として中性子の集光結像を試み、中性子位相差・暗視野顕微鏡の基礎データを得た。全反射ミラーとしてX線結像に用いたウオルターミラーを利用した。平均斜入射角7mradの白金コート反射面は、0.6nmより長波長の中性子の結像を可能にした。中性子の集光結像実験では、イメージングプレートを検出器に用い、約100μmの分解能を持つ集光(縮小)結像スポットを得た。定量性の高い短波長位相差顕微鏡の可能性を示すために、波長0.2nmのX線を用いて微分位相コントラスト顕微鏡を試作した。ゾーンプレートの後焦平面にフーコーナイフエッジをフィルターとして用い、定量可能な位相像を得た。この手法はツェルニケ型位相差顕微鏡に比べて定量性が高いので、中性子位相コントラスト顕微鏡への利用の可能性が示された。中性子の全反射斜入射臨界角は、同じ波長のX線に比べ2倍以上小さく、高倍率にするには光学系が非常に長くなってしまう。この問題を解決するために、ウオルターミラーに2枚の双曲面ミラーを加えた4段ミラー光学系を考案し、設計・試作を行った。設計の結果、従来とほぼ同じ光学系の長さで2倍の倍率と開口数が得られることが示された。また、光学系の集光効率も4倍近く向上する事が示された。本設計の有効性を示すために、真空レプリカ法によって4段ミラーの試作を行った。可視光による結像の結果、設計の正しさが示された。今後は、反射面にニッケルをコートして中性子の反射率を向上させ、中性子位相差顕微鏡の対物素子として用いる予定である。応用光学ウオルターミラーによる冷中性子(波長0.11nm)集光実験は順調に行われたが、結像実験は原子炉停止の影響で本年度は出来なかった。また、中性子シンチレーターとCCDカメラの組み合わせによる中性子カメラの組み立ては行えたが、これも原子炉中性子源の利用が出来なかったため、実機としての性能評価が行えなかった。冷中性子集光が実証されたので、ウオルターミラーを用いた中性子顕微鏡光学系の組み立てが可能になった。また、J-PARCの中性子実験施設の運転が再開され、中性子顕微鏡実験の可能性が出て来たので、本研究課題に適した冷中性子ビームラインのマシンタイム申請を行った。幸いにして、平成25年度上期にマシンタイムが確保できたので予備的な実験を開始する条件は揃った。中性子顕微鏡光学系の組み立ておよび検出系の構築と空間分解能の測定は順調に進んだ。
神経発芽を制御するHPC-1の脱分極刺激海馬スライスにおける遺伝子発現

HPC-1/syntaxin 1Aは、細胞内小胞の形質膜への融合過程を制御することで、シナプス伝達、発芽といった神経可塑的な現象に関与するものと考えられる。HPC-1mRNAの3'非翻訳領域には最初期遺伝子様の不安定化シグナル配列が存在し、HPC-1が神経細胞への刺激に応じて早い時間経過で遺伝子発現のレベルから調節を受ける可能性が考えられた。そこでHPC-1が比較的多量に発現するラット海馬神経細胞において、刺激に応じてmRNAのレベルで量的な変動が引き起こされるかについて検討した。30mM KC1で脱分極刺激したラット海馬スライスでは、刺激後1時間にわたってHPC-1mRNA量が減少しその後もとのレベルまで回復した。non-NMDA型グルタミン酸受容体アゴニストのカイニン酸をラット個体に投与した痙攣刺激では、刺激後数時間にわたってHPC-1 mRNA量が減少した。in situ hybridizationによりCA3領域の海馬錐体細胞において歯状回顆粒細胞よりも大きな発現量の減少効果が見られた。また海馬初代培養細胞において脱分極およびカイニン酸による刺激がHPC-1 mRNA量を一過性に減少させた。こらのことから脱分極、あるいは強い興奮性のシナプス入力が、海馬神経細胞のHPC-1 mRNAの発現量に対して一過性に抑制的に作用することを明らかにした。以上については第十八回日本神経科学大会(H2P7)、第十八回日本分子生物学会(1P284、1P283)において発表した。今後、Ca^<2+>influxとHPC-1遺伝子発現調節の関係、HPC-1のmRNA量の減少の生理的な意義について明らかにする必要があると考えられる。
自己血からの多血小板血漿と容量結合型電場刺激法を併用した骨形成促進効果の研究

本研究の目的はウサギ頭頂骨にGBRの原理によるキャップを用いた人工的な空間を作り,キャップ内部にPRPと骨補填材の担体を入れて骨形成を行い,キャップ内の新生骨量を計測することによってPRPの骨形成促進効果を担体別に比較検討することである.最初にPRPの採取法の検討を行った.次に,ウサギ頭頂骨にポリプロピレン製キャップを2個ずつ骨面上に設置し,キャップ内にコラーゲン,β-TCP,トロンビン・β-TCP複合体,アルギン酸ナトリウムを充填した対照群それぞれの担体にPRPを浸潤させた実験群で,8週目に非脱灰研磨標本を作製し,組織観察と新生骨を計測した.さらに,β-TCP・PRP複合体の経時的骨形成の観察を行った.最適なPRP採取法は,ダブルスピン法で1回目:2400回転10分,2回目:3600回転15分で血小板濃縮率は13.5倍であった.どの担体においてもPRP(+)の実験群が,PRP(-)の対照群に比較してキャップ内の新生骨量が多かった.β-TCP・PRP複合体が他の群と比較して新生骨量が一番多かった.β-TCP・PRP複合体による骨形成過程において,PRPの効果は比較的早期に現れた.本実験において,トロンビンを併用せずにβ-TCP・PRP複合体で骨形成促進効果が確認されたことより,臨床においてもβ-TCP・PRP複合体単独で骨形成が促進されると思われる.また,動物由来のトロンビンを使用しない本方法は,未知のウィルスの感染や,血液凝固異常を予防することができるため有用だと思われた.4,8週においてPRP/β-TCP複合体とCCEF刺激によるモデルの方がPRP/β-TCP複合体に比べて骨の増生量は多かった.また,CCEF刺激法の新生骨形成促進効果と骨の緻密化も認められた.本研究の目的はウサギ頭頂骨にGBRの原理によるキャップを用いた人工的な空間を作り,キャップ内部にPRPと骨補填材の担体を入れて骨形成を行い,キャップ内の新生骨量を計測することによってPRPの骨形成促進効果を担体別に比較検討することである.最初にPRPの採取法の検討を行った.次に,ウサギ頭頂骨にポリプロピレン製キャップを2個ずつ骨面上に設置し,キャップ内にコラーゲン,β-TCP,トロンビン・β-TCP複合体,アルギン酸ナトリウムを充填した対照群それぞれの担体にPRPを浸潤させた実験群で,8週目に非脱灰研磨標本を作製し,組織観察と新生骨を計測した.さらに,β-TCP・PRP複合体の経時的骨形成の観察を行った.最適なPRP採取法は,ダブルスピン法で1回目:2400回転10分,2回目:3600回転15分で血小板濃縮率は13.5倍であった.どの担体においてもPRP(+)の実験群が,PRP(-)の対照群に比較してキャップ内の新生骨量が多かった.β-TCP・PRP複合体が他の群と比較して新生骨量が一番多かった.β-TCP・PRP複合体による骨形成過程において,PRPの効果は比較的早期に現れた.本実験において,トロンビンを併用せずにβ-TCP・PRP複合体で骨形成促進効果が確認されたことより,臨床においてもβ-TCP・PRP複合体単独で骨形成が促進されると思われる.また,動物由来のトロンビンを使用しない本方法は,未知のウィルスの感染や,血液凝固異常を予防することができるため有用だと思われた.4,8週においてPRP/β-TCP複合体とCCEF刺激によるモデルの方がPRP/β-TCP複合体に比べて骨の増生量は多かった.また,CCEF刺激法の新生骨形成促進効果と骨の緻密化も認められた.PRPの骨形成促進能を検討するため、ウサギ頭頂骨に実験母地を形成後、容積を規定した半円球状のキャップを遮断膜の代用として使用し、垂直的骨増生を行った。キャップに充填した担体ごとに、(担体なし、コラーゲン、β-TCP、アルギン酸ナトリウム、アトロピン)骨形成の影響を観察し、それらの担体とPRPの複合体を作り、PRPの骨形成促進効果を検討した。実験動物には日本白色ウサギ(オス約2.5kg)を用いた。術後、8週間でウサギを屠殺し、灌流固定した後、キャップを含む頭頂骨を採取し、キャップ内の垂直的骨増生の病理組織学的検討を行った。評価方法として1.矢状縫合と平行にキャップの中央付近を切断し、非脱灰研磨標本を作製後、塩基性フクシン・メチレンブルー重染色にて、骨形態計測と組織学的観測を行った。2.画像解析装置を用いて、塩基性フクシン・メチレンブルー重染色標本の新生骨様組織の面積率を求めた。結果1.組織像において新生骨は既存骨と連続していた。2.β-TCP群、PRP/β-TCP群ともに新生骨がβ-TCP顆粒の周囲に観察された。また、キャップ底面部において、β-TCPを多く吸収していた。3.担体別では、画像分析の結果、β-TCP>コラーゲン>担体なし>トロンピン>アルギン酸ナトリウムの順で骨の増生量は多かった。(キャップ全体に対する新生骨量の割合は、β-TCPでは約20%、コラーゲン約10%、その他の担体は10%以下であった。)4.担体とPRP/

担体の複合体を比較した場合、全ての群においてPRP/担体複合体が骨の増生量は多かった。これらの結果よりβ-TCPを担体として用いた場合、新生骨組織の増生が確認された。またPRPを併用することで更に増生に有利に働いたと思われる。今後、容量結合型電場刺激法を用いることでさらなる骨形成促進効果について検討していく予定である。PRPと容量結合型電場刺激(CCEF)法を併用した骨形成促進効果を検討するため、ウサギ頭頂骨に実験母地を形成後、容積を規定した半円球状のキャップを遮断膜の代用として使用し、垂直的骨増生を行った。キャップに充填したβ-TCPとPRPの複合体を作り、PRPの骨形成促進効果を検討した。(平成14年度)その後,PRPとCCEF刺激法を併用したものの骨形成促進効果を検討した.実験動物には日本白色ウサギ(オス約2.5kg)を用いた。術後、CCEFの刺激装置(OSTEOTRON II)を用いて埋入翌日より1日8時間の刺激を行った.4,8,12,16週間でウサギを屠殺し、灌流固定した後、キャップを含む頭頂骨を採取し、キャップ内の垂直的骨増生の病理組織学的検討を行った。評価方法として1.矢状縫合と平行にキャップの中央付近を切断し、非脱灰研磨標本を作製後、塩基性フクシン・メチレンブルー重染色にて、骨形態計測と組織学的観測を行った。2.画像解析装置を用いて、塩基性フクシン・メチレンブルー重染色標本の新生骨様組織の面積率を求めた。結果1.4,8週の実験期間においてPRPを併用しないβ-TCPにCCEF刺激を行ったものと,行っていないものとでは骨面積比率で1.3倍から1.4倍の差があり,CCEF刺激法の新生骨形成促進効果が認められ,その効果が比較的早期に現れることが確認された.またCCEF刺激によって作られた骨の緻密化も認められた.2.4,8週の実験期間においてPRP/β-TCP複合体とCCEF刺激による併用モデルの骨の増生量は多かった。以上のことから、PRPに容量結合型電場刺激法を使用することで新生骨形成促進効果が増強されたことにより,PRPと容量結合型電場刺激法を併用することで治療期間短縮の可能性が示唆された.
風応力が誘起する密度成層水域の水質挙動に関する実験・解析

(1)吹送密度流の外力特性を実証するために風速・風向の観測を行った。山間部の貯水池と近隣気象台で観測される風のデータの比較より,風速の相関性が高い場合にも風向に関しては両地点での時系列特性が大きく異なることが明らかとなった。また,成層水域の水面に供給された風力エネルギーのうち内部波エネルギーとして下層へ放射される割合を明らかにするために,内部波の観測とその解析を行うとともに,内部波の伝播特性と躍層厚さとの関係を理論的に明らかにした。閉鎖水域の吹送循環流と水質混合現象に関してはk-ε乱流モデルによる二次元解析を行った。(2)躍層面でのせん断渦の乱流構造と水質輸送過程の関連性を明らかにするために,K-H不安定波に関する可視化計測とLES解析を実施した。せん断層の流動場は高速ビデオカメラにより可視化計測され,平均流と乱れの構造がPIVを用いた画像解析により検出された。壁面乱流場と類似の組織構造が水質輸送に対して重要な役割を果たしていることが実験およびLESによって明らかとなり,順流形風成密度流の躍層面における水質輸送モデル定式化のための基礎的知見を得ることができた。(3)大阪・東京湾域を対象にして半閉鎖水域における吹送密度流の水理実験・数値解析を行い,風域湧昇速度・鉛直混合量と吹送流パラメーターとの関係に関する経験式を得た。成層湾内の風成流動は三次元数値解析により再現され,潮流・恒流系に関する種々の現地観測結果との比較・検証が行われた。解析結果は湾内の風成流を的確に記述し得ることが実証され,これを水域環境の予測・評価業務に供することが可能である。さらに,閉鎖水域の流れを明快に表現することを目的として,実験・数値解析結果の可視化プレゼンテーション技術を開発した。初年度ならびに本年度の研究成果は最終報告書としてまとめられた。(1)道奥は密度成層化した湾奥部のように一方の境界が開放され他方が閉鎖した二次元水域に発生する吹送密度流をk-ε乱流モデルによって再現し,開放境界端を出入りする質量/物質輸送量と密度成層度との関係を明らかにした。また,貯水池天端において風向・風速を自動計測し,ダムが立地する渓谷部と気象台が位置する平地部での風特性の違いについて実証的に検討した。(2)神田は吹送流の水面付近に発達するせん断層の乱流構造を明らかにするために自由せん断層における流速の画像計測を行った。計測結果に種々の条件付き抽出を施してせん断層の乱流構造と水質混合特性との相関性を明らかにした。(3)中辻は吹送密度流に関する水理実験を行い,道奥による乱流解析結果と比較検討した。一方,大阪湾を対象とした吹送流の三次元数値解析モデルの定式化を施し,種々の観測結果と比較検討した。(1)[道奥]:貯水池における風速・風向観測を継続し,強風時と海陸風の特性を明らかにした.風速データとして一般に採用されるスカラー風速はベクトル風速よりも過大に評価されることが明らかとなり,風成流の外力評価に対する問題提起がなされた.風応力が成層水域に作用することにより生ずる素過程として,本年度は境界混合と水面での外力により駆動される内部波について検討した.境界混合による循環流と水質混合特性はk-ε乱流モデルにより解析され,躍層の振動条件と環境混合強度の相関関係が明らかとなった.非粘性・非圧縮性流体を仮定した理論解析により躍層厚さが内部波の伝播

特性におよぼす影響について検討を行った.(2)[神田]:せん断渦の乱流/混合特性について高速ビデオカメラとPIVを併用した画像計測を行った.乱流の組織構造と水質混合過程との関連性が実験的に明らかにされるとともに,実験で観測された流動構造はLESによっても的確に再現された.これらの実験解析を通して順流型風成密度流の躍層面における水質輸送モデル定式化のための基礎的知見を得ることができた.(3)[中辻]:三次元数値モデルにより大阪湾・東京湾の恒流系,風成循環流の特性を解析した.また,粒子追跡法による潮流場の可視化・流動解析を行い,密度構造・風応力場・地形条件などが湾内の流動構造におよぼす影響を明らかにした.数値モデルは現地観測で得られた流れを良好に再現しており,これを湾域環境の予測・評価に適用することは十分可能である.分担者相互の連絡会議を適宜開催し,本年度ならびに昨年度の研究成果を最終報告としてとりまとめた.
地球大気化学国際協同研究計画(IGBP/IGAC)の推進

(1)重点領域研究「対流圏化学グローバルダイナミクス」申請のため、研究の実行計画案を検討するための企画会議を開催し、研究計画を検討した。特に国際地球大気化学協同研究(IGAC)のコア研究であるAPARE(東アジア北太平洋地域研究)に対して、重点領域研究の中でどう位置づけ、研究を推進するかについて検討した。(2)わが国の大気化学研究は、広い範囲にわたる多くの学会に属する研究者によって実行されており、従来研究成果もそれぞれの所属学会で別個に発表されてきた。わが国における大気化学研究者が一堂に会して、研究成果を議論するための場として本年度より「大気化学討論会」を発足させ、その第1回を1995年5月12,13日に東京で開催した。(3)IGAC/APAREの第5回国際ワークショップを1996年1月11,12日に東京で開催した。ワークショップにはわが国の他、米国、中国、台湾、香港、韓国からの大気化学研究者、約30名が参加し、これまでのIGBP/IGACの第1期の研究成果の総括、および今後の第2期の研究計画について議論を行った。特に今後の国際協力プログラムとして、東アジアにおけるエアロゾル研究、大気境界層内物質輸送研究、地上リモートステーションネットワーク、航空機観測などが採択された。(4)学術会議IGAC小委員会などを中心に、わが国におけるIGAC第2期計画をとりまとめた。特に、IGACコア研究であるAPARE,RICE,PASCその他にたいしてわが国がどのように寄与してゆくかについての議論がなされた。
DNA修復調節サイトカインと神経障害

結節性硬化症(TS)患者血清中因子(TSSF)の分離抽出と,その因子がヒト細胞の形質突然変異誘発を修飾するか否かについて本年度は主として行った。TSは中枢神経発生の奇型症候群であること,遺伝子変異によると考えられている癌が高頻度で発生することから,目的のTSSFは突然変異誘発を促進するのではないかと予測した。過去に見い出したインターフェロンによる変異誘発の抑制効果とは逆の作用を期待したわけである。期待通りTSSFの形質突然変異誘発促進活性が見い出された。この活性は、分離抽出の初期段階から約100万倍高純度化した製品でも見い出され,高純度化と共にタンパク量あたりの比活性は増大した。このTSSFによる誘発促進は,紫外線や4nitroquinolineいずれの変異誘発でも見い出され,種々の培養ヒト細胞で確認された.TSSFは抗ウィルス活性がないにもかかわらず,plasminogen actirator-like protease誘発に関して,インターフェロンβとエピトープが同一であることをすでに見い出していたが,今回の変異誘発促進活性も抗インターフェロンβ抗体により阻害された。今後は高純度製品を用いたアミノ酸配列決定により,インターフェロンβとの構造上の異同を判明させたい。そのために,TS患者由来培養細胞よりTSSFを見い出そうと前年度に引き続き,培養液中より目的因子の分離抽出を行ない,これも約100万倍の高純度化に成功した。また,この培養液中の因子についても突然変異誘発促進活性が確認された。従って,TS患者体液中には,TSSFが遊離しており,変異原・癌原因子による患者体細胞での変異誘発が常時促進されうることが示唆された。TSSFは高純度発癌の一因かもしれない。なお神経発生の異常との関連については,限られた予算枠では不可能であり,今後TSSFの大量精製が可能となった段階で究明することとした。DNA修復異常による神経障害発現の機序を知るため,神経皮膚症候群の1つである結節性硬化症(TS)を対象とした。すでにDNA傷害因子であるMNNGによるplasminogen activator-like protease(PA)活性誘発を異常に促進するタンパク質因子の解析を行なった。このPA誘発促進因子の分離精製は,約100万倍高純度化することに成功した。この高純度精製には,インターフェロンβ抗体アフィニティークロマトグラフィーおよびカラーカラムオレンジAが役立った。従来我々はTS患者血清中より,上記PA活性誘発促進因子を精製、分離し,この因子がインターフェロンの如く,ウィルス増殖抑制や癌細胞増殖抑制活性はないことを発見した。さらにTS患者由来の線維芽細胞を系代培養し,その培養上清中に血清由来因子と同様の因子が放出されていることが確認された。即ち,PA誘発促進活性を有し,インターフェロンβとエピトーブを同じくするが,インターフェロンの様な上記生物活性を有していない因子であった。現在TS線維芽細胞を大景培養し,上清を回収し分離精製を精力的に行なっている所である。一方この培養液中に産生されてくる因子は,正常ヒト由来線維芽細胞培養液中には全く放出されておらず,TS由来細胞特有因子であることが示唆された。現在はこの因子の神経細胞への効果を検討中である。特に培養神経グリア細胞においても,PA活性誘発促進効果が認められており,さらにグリア細胞での高分子(タンパク質,DNA,RNA)合成の代謝が,この因子処理により変動するか否か検証中である。DNA修復異常による神経障害発現の機序を知るため、神経皮膚症候群の一つである結節性硬化症(TS)を対象とした。

MNNGによるplasminogen activator-like protease(PA)活性誘発を異常に促進する因子をTS患者血清中より精製、分離した。さらにTS患者由来繊維牙細胞を継代培養し、その上清中に血清由来因子と同様の因子が放出されていることが確認された。即ちPA誘発促進活性を有し、インターフェロンβとエピトープを同じくするが、ウイルス増殖抑制や癌細胞増殖抑制活性はないことを発見した。一方この培養液中に産生されてくる因子は、正常ヒト由来繊維牙細胞培養液中には全く放出されておらず、TS由来細胞特有因子であることが示された。一方TSでは遺伝子変異によると考えられている癌が高頻度で発生することから、上記のTS因子は突然変異誘発を促進するのではないかと予測した。実際に誘発促進活性は、分離抽出の初期段階から約100万倍高純度化した製品でも見いだされ、高純度化と共に蛋白量あたりの比活性は増大した。このTS因子の誘発促進は、紫外線や4-nitroquinolineいずれの変異誘発でも見いだされ、種しゅの培養ヒト細胞でも確認された。この変異誘発促進活性は、上記PA誘発促進活性同様抗インターフェロンβ抗体により阻害された。従ってTS患者体液中には、このTS因子が遊離しており、変異原因子による患者体細胞での変異誘発が常時促進されうることが示唆された。なおTS因子と神経発生異常との関連は、限られた予算枠では不可能であったが、今後TS因子の大量精製が可能となった段階で究明することとした。
不揮発生メモリーへの応用のため、静的および動的EXAFS法を用いた相変化材料の研究

今年度においては、メモリ応用の相変化材料の実験と第一原理シミュレーションを行った。ゲルマ過剰Ge-Sb-Teアロイの局所構造解析の為、高輝度光科学研究センター(SPring-8)においてX線吸収分光法実験を多数行った。この実験とその分析結果は、常に相変化材料に存在する局所的な歪み(ブラッグ回折に見えない)の問題に対して明確な答えを導きだした。X線吸収分光法を用いたGe2Sb2Te5その場結晶・アモルファス相転移サブナノ秒時間分解構造解析実験を行った。この実験の結果により、アモルファス状態が、通常考えられていた融点から急冷経由で作られたのではなく、直接個々相転移によって作られたことが分かった。英国のケンブリッジ大学と共同でシミュレーションを用いて、アモルファスGe2Sb2Te5の局所構造は4面体対称ビルディングブロックで構成されただけではなく、ピラミッド形も存在していることを証明した。平成20年9月末より独立行政法人産業技術総合研究所近接場光応用工学研究センターにて外来研究者として業務に従事している。スプリング8の実験(4課題)に参加するにあたり、グループメンバーと共に事前に実験内容について考察や準備に当たった。この実験ではGe-TeSb2Te3疑似二元相図タイ・ラインに乗っている相変化材料材料の局所的な順序を観察した。特に相変化材料基づく電気メモリー(PC-RAM)がスイッチング最中に一時的に存在すると思われる溶融状態の局所的な順序をX線吸収分光法を用いて調べた。多重散乱X線吸収端近傍構造理論計算し実験データーを比較して、局所的な構造を解明した。当グループでは、電気メモリーを安価にし、効率を良くするため、各素子を小さく(素子スケーリング)作る必要があるため、スケーリングについてがPC-RAMに使われているGe2Sb2Te5薄膜厚さを変更し、ある厚さより薄くなるとスイッチングが不可能になるかどうかも調べた。この実験のデーターは現在解析中であるが、クルバル本人もこの実験に参加した。当グループでの「高圧によるGe2Sb2Te5に非熱平衡相構造変更」の実験データーをもとに論文を投稿し、現在査読中である。
総腓骨神経の走行に異常を示す変異マウスの原因遺伝子の同定

総腓骨神経の走行異常により先天的に腓骨筋が萎縮する変異マウスについて、連鎖解析を行い、その原因遺伝子がゲノム中約1.1Mbpの領域内に存在することを明らかにした。さらに、その範囲内に存在が予想される転写産物の総てのエクソン並びにエクソン/イントロンの境界部分について、変異マウスと野性型マウスの塩基配列の比較を行った。フレームシフトやナンセンス変異等は見られず、それ以外の遺伝子変異に起因する可能性が示唆された。運動神経は、発生期に特定の筋へ投射するが、その仕組みについては不明である。pma (peroneal muscular atrophy)マウスは実験動物中央研究所で発見された自然発症の変異マウスで、先天的に腓骨筋の萎縮が見られ、その原因は発生期に神経が腓骨筋に投射しないことであると考えられている。従って、特定の神経投射のみに異常が見られるpmaマウスは、運動神経の軸索ガイダンスの分子機構を解明する上で有用なモデル動物である。本研究では、pmaの原因遺伝子を同定し、運動神経軸索ガイダンスの機構を明らかにすることを目指している。平成16年度に、pmaマウスを用いて、運動神経特異的にEGFPを発現するトランスジェニックマウスを作成した。前年度まで行ってきた、ニューロフィラメントの免疫染色では、運動神経軸索のみならず知覚神経軸索も染色されるために、運動神経走行の詳細を見ることは困難であった。このトランスジェニックマウスでは運動神経細胞とその軸索がEGFPによって標識されるため、運動神経軸索の発達を経時的に調べることができ、上記の問題点を克服することができた。本年度は、このマウスを用いて、胎生10日胎生14日にかけて蛍光蛋白で標識された運動神経軸索の走行を蛍光実体顕微鏡を用いて観察した。その結果、pmaマウスでは、胎生12日頃に下肢に向かう座骨神経束の一部に正常と異なる走行を示す繊維が見られ、運動神経軸索伸長の比較的早期に異常が現れることが明らかになった。また、既に最終的な表現型が類似することが報告されている2種類の遺伝子破壊マウスとは、神経走行の異常の詳細が異なっていることが明らかになった。連鎖解析により決定された原因遺伝子の候補領域内に存在する遺伝子16個の発現を、RT-PCRとin situ hybridization法を用いて調べた結果、幾つかの遺伝子に関してはpmaマウスで発現が低下しているものが見つかった。これらの遺伝子に関しては、原因遺伝子の候補となる可能性があるため、今後詳細な解析を行う予定である。脊髄運動神経は、発生期に特定の筋へと投射するが、特定の運動神経軸索を特定の筋肉へ誘導する仕組みについては不明である。Pma(Peroneal muscular atrophy)マウスは実験動物中央研究所で発見された自然発生の変異マウスで、先天的な腓骨筋の萎縮が見られ、その原因は、発生期に総腓骨神経が腓骨筋に投射しないことであると考えられている。Pmaマウスでは、特定の運動神経投射のみに異常が見られることから、運動神経の軸索ガイダンスの分子機構を解明する上で有用なモデル動物になると考えられる。これまで、連鎖解析による候補領域の絞り込みを行い、その結果を基に、原因候補遺伝子の検索とそれらの発現解析を行ってきた。更に最近、全ての脊髄運動神経に特異的にEGFPを発現するトランスジーンを持つPmaマウスの作成に成功し、発生期の運動神経軸索の走行を可視化できるようになった。その結果、発生のどの時期にどのような軸索ガイダンス異常が起こるかを知ることができるようになった。今年度は、ゲノムデータベースの進展に伴い遺伝子の注釈などについて、大幅に精度が高まったことを踏まえ、改めて、原因遺伝子の候補範囲内に存在する転写産物について解析を行った。具体的には、候補範囲内に存在する全ての転写産物候補の全エクソンの内これまで未解析であったエクソンについて、Pmaマウスと野性型マウスのゲノムDNAからPCR法を用いてDNAを増幅し、これを鋳型として塩基配列を決定し、変異マウスと野生型マウスの塩基配列の比較を行った。その結果、幾つかのエクソンについては候補から除外することができた。脊髄運動神経は、発生期に特定の筋へと投射するが、特定の運動神経軸索を特定の筋肉へ誘導する仕組みについては不明な点が多い。Pma(peroncal muscular atrophy)マウスは実験動物中央研究所で発見された自然発生の変異マウスで、先天的な腓骨筋の萎縮が見られ、その原因は、発生期に総腓骨神経が腓骨筋に投射しないことであると考えられている。

更に最近、全ての脊髄運動神経に特異的にEGFPを発現するトランスジーンを持つPmaマウスの作成に成功し、発生期の運動神経軸索の走行を可視化できるようになった。その結果、発生のどの時期にどのような軸索ガイダンス異常が起こるかを知ることができるようになった。今年度も引き続き、ゲノムデータベースの進展に伴い遺伝子の注釈などについて、大幅に精度が高まったことを踏まえ、改めて、原因遺伝子の候補範囲内に存在する転写産物について解析を行った。具体的には、候補範囲内に存在する全ての転写産物候補でこれまで未解析であった全エクソン並びにエクソン/イントロンの境界部分について、Pmaマウスと野性型マウスのゲノムDNAからPCR法を用いて増幅したDNA断片を鋳型として塩基配列を決定し、変異マウスと野生型マウスの塩基配列の比較を行った。さらに系統差によりゲノムから増幅することが不可能である部分はRT-PCR断片を用いて解析を行った。フレームシフトやナンセンス変異は見られなかった。
連続発話における文間・文中ポーズの挿入とそれに伴う発話調節に関する研究

本研究の目的は、連続発話における文間(文末)・文中ポーズ挿入とそれに伴う発話調節の詳細を明らかにすることである。研究代表者による一連の先行研究から、単独発話における文中ポーズの実態が明らかにされてきているが、本研究では、これらの知見をもとに分析対象をさらに連続発話へと広げ、より大きな発話単位の産生において、発話とポーズが、また文間ポーズと文中ポーズが、互いにどのように影響を及ぼし合うかを明らかにすることを目指した。平成18年度は、文中ポーズと文末ポーズによるpre-pausal lengthening(ポーズに先行する発話部分の伸張)を比較し分析した結果、両者ともポーズに先行しない場合との比較結果は有意だったが、両者間におけるlengtheningの差は有意ではなかった。ただ、文末ポーズによるlengtheningは、文中ポーズによるlengtheningと比べて、ばらつきが大きいという結果が得られ、文末は文中と比べて発話のリズムの制約がより少ないことを示唆するものと考えられた。平成19年度は、複数の文からなる連続発話(パラグラフ)を対象として、文中ポーズの挿入が文間ポーズや発話部分にどのような影響を及ぼすかについて分析した。その結果、文中ポーズの挿入によって文間ポーズ長は変化すること、また変化の方向(より長くなるか短くなるか)については個人差があることなどが明らかにされた。文中ポーズと文間ポーズは、本来それぞれ独立にコントロールされうるものであるが、今回の結果から、文中ポーズの挿入という局所的な発話の調節が、文間ポーズ長の変化という、より大きな発話の範囲にかかると考えられる調節に関与しうることが明らかになった。本研究の成果は、基礎面では発話産生理論の構築に対して、また応用面では、たとえば工学分野で改良が進んでいる音声応答システムにおいて、よりユーザが理解しやすい合成連続発話の実現に対して、有用な知見を提供でき、学術的かつ社会的な意義が大きいと考える。本研究の目的は、連続発話における文間・文中ポーズ挿入に伴う発話の調節の詳細を明らかにすることである。すでに、研究代表者による一連の先行研究から、単独発話における文中ポーズの実態が明らかにされてきているが、本研究では、これらの知見をもとに、分析対象をさらに連続発話へと広げ、文中ポーズに加えて文間ポーズについて解析を行う。そして、より大きな発話単位の産生において、発話とポーズが、また文間ポーズと文中ポーズが、互いにどのように影響を及ぼし合うかを明らかにすることにより、ポーズを含む連続発話の産生の背後にある規則性の解明を目指す。今年度は、文中ポーズに先行する発話部分と文末ポーズに先行する発話部分に着目し、これらを、ポーズに先行しない場合と比較して、発話部分の時間的伸張について分析した。その結果、(1)文中ポーズに先行する発話部分の伸張も文末ポーズに先行する発話部分の伸張も、ポーズに先行しない場合との差は有意であったが、(2)文中ポーズに先行する発話部分の伸張と文末ポーズに先行する発話部分の伸張とを比較した場合、後者の伸張の度合いの方がやや大きいという傾向がみられたものの、両者の間に有意な差は認められなかった。ただ、(3)文末ポーズに先行する発話部分の伸張は、文中ポーズに先行する発話部分の伸張と比べて、サンプル間のばらつき(特に母音部分の伸張度のばらつき)が大きいという結果が得られ、文末においては(文中と比べて)「発話のリズム」の制約がより少ないことを示唆するものと考えられた。

本研究の目的は、連続発話における文間・文中ポーズ挿入に伴う発話の調節の詳細を明らかにすることである。すでに、研究代表者による一連の先行研究から、単独発話における文中ポーズの実態が明らかにされてきているが、本研究では、これらの知見をもとに、分析対象をさらに連続発話へと広げ、文中ポーズに加えて文間ポーズについて解析を行う。そして、より大きな発話単位の産生において、発話とポーズが、また文間ポーズと文中ポーズが、互いにどのように影響を及ぼし合うかを明らかにすることにより、ポーズを含む連続発話の産生の背後にある規則性の解明を目指す。初年度は、単文を分析対象として、文中ポーズと文末ポーズが調音に及ぼす影響を比較したが、今年度は、複数の文からなる連続発話(パラグラフ)を対象として、文中ポーズの挿入が、パラグラフを構成する文や文間ポーズの産生にどのような影響を及ぼすかについて分析した。その結果、パラグラフを構成する文に文中ポーズを挿入して発話した場合、そうでない場合と比べて、文間ポーズが伸張するという傾向がみられた。文中ポーズと文間ポーズは、本来それぞれ独立にコントロールされうるものであるが、今回の結果から、文中ポーズの挿入という局所的な発話の調節が、文間ポーズ長の変化という、より大きな範囲にかかる発話の調節を引き起こすことが示された。
労働者における慢性腎臓病の発症に関する大規模前向きコホート研究

慢性腎臓病の発症リスクの検討をするため9648人を対象として多変量解析を行った。推算糸球体濾過量低下の発症リスクの関係では、体格指数増加に伴いリスクが上昇し、中性脂肪増加に伴いリスクが上昇し、HDLコレステロール増加に伴いリスクが低下した。蛋白尿の新規発症のリスクの関係では、喫煙習慣、高血圧はリスクが高くなった。一方で体格指数はU字の関係であったが、少量頻回飲酒者はリスクが低下し多量飲酒者は頻度に関係なくリスクが上昇した。さらに、飲酒量の増加で糸球体過剰濾過のリスクが上昇した。さらに、高血圧は進行した慢性腎臓病のステージG3b発症の危険因子であった。慢性腎臓病は、末期腎不全や循環器疾患の重要な危険因子であり、早期の慢性腎臓病を捉え、その危険因子を明らかにすることは極めて重要な課題である。慢性腎臓病はその進行が緩徐であるため早期のリスクを検討するには、長期間繰り返して腎機能を評価する必要がある。我々は、職域の前向きコホート研究から、6年間の毎年の定期健康診断時のeGFR、蛋白尿の結果を用いて早期の慢性腎臓病の発症に対する危険因子を検討してきた。その結果から血圧の構成因子との関連性、喫煙との関連性、慢性炎症との関連性について報告してきた。しかし、慢性腎臓病の発症に関する危険因子はまだ十分に解明されておらず、さらに長期にわたる観察研究による検討が必要である。平成25年度はデータベースの追加の整備、特に、データのクリーニングを中心に実施した。1年ごとの健康診断の結果(身体計測の結果、血液検査の結果、尿検査の結果、問診)を結合し経年的なデータベースの構築を行った。これにより1万人規模の慢性腎臓病の危険因子を検討する前向きコホート研究を整備した。データの管理、解析に関しては、大阪市立大学大学院医学研究科産業医学にて行った。平成25年度は、そのデータの解析を行い「生活習慣と早期の慢性腎臓病の発症」について検討した。BMI、ウエスト周囲径と慢性腎臓病の関係について研究を行い、学会発表(第24回日本疫学会学術総会(2014/1/24;仙台)にて「男性のウエスト周囲径・BMIと蛋白尿・推算糸球体濾過量低下との関係」)を行った。慢性腎臓病は進行が緩徐であるため早期リスクを検討するためには、長期間繰り返して腎機能を評価する必要がある。我々は、職域の前向きコホート研究から、6年間の毎年の健康診断時のeGFR、蛋白尿の結果を用いて早期の慢性腎臓病の発症に関する危険因子を検討してきた。平成26年度は、平成25年度からの継続としてデータベースの整備、データベースのクリーニングを行い1万人規模の慢性腎臓病の危険因子を検討する前向きコホート研究の構築を行った。平成26年度は、11年間のコホートを用いた解析を行い、平成25年度に引き続き「生活習慣と早期の慢性腎臓病の発症」について検討した。アルコール飲酒パターンと慢性腎臓病との関係(American journal of nephrology 2014;40(6):516-22)について論文発表を行った。さらに、「生活習慣病と早期の慢性腎臓病の発症」について検討した。糖尿病ステイタスと独立した因子であるBMIと慢性腎臓病について学会発表(第74回アメリカ糖尿病学会(2014/6/13-17;サンフランシスコ))を行った。慢性腎臓病はその進行が緩徐であるため、早期の発症リスクを検討するには、長期間繰り返して腎機能を評価する必要がある。しかし、慢性腎臓病の発症に関する危険因子は未だ十分に解明されておらず、さらに長期にわたる観察研究による検討が必要である。課題1.慢性腎臓病の発症の危険因子を検討するコホートの整備を行う;データベースの整備を行いデータベースの構築を行った。課題2.生活習慣と早期の慢性腎臓病の発症の関係についての関係を検討する;整備されたコホートを用いて、生活習慣と慢性腎臓病の関連について解析を行った。アルコール飲酒パターンと慢性腎臓病について論文発表した。課題3.生活習慣病と早期慢性腎臓病の発症の関係についての関係を検討する;整備されたコホートを用いて、生活習慣と慢性腎臓病の関連について解析を行った。

糖尿病と独立した危険因子である体格指数と慢性腎臓病について学会で発表した。課題4.進行した慢性腎臓病の発症についての関係を検討する;整備されたコホートを用いて、生活習慣と慢性腎臓病の関連について解析を行った。課題5.糸球体過剰ろ過に対する危険因子について検討する;整備されたコホートを用いて糸球体過剰ろ過について解析を行った。産業保健課題1.慢性腎臓病の発症の危険因子を検討するコホートの整備を行う(研究代表者である上原、研究分担者である林、佐藤);平成26年度までに構築したデータベースをもとに、さらにコホートの整備を継続する予定である。データの管理、解析に関しては、大阪市立大学大学院医学研究科産業医学にて行う。課題2.生活習慣と早期の慢性腎臓病の発症についての関係を検討する(研究代表者である上原、研究分担者である林、佐藤);飲酒習慣、体格指数などの生活習慣と早期の慢性腎臓病の発症関係を順次検討する。課題3.生活習慣病と早期の慢性腎臓病の発症についての関係を検討する(研究代表者である上原、研究分担者である林、佐藤);脂質や血圧などの生活習慣病と早期の慢性腎臓病の発症関係を順次検討する。課題4.進行した慢性腎臓病の発症についての関係を検討する(研究代表者である上原、研究分担者である林、佐藤);生活習慣や生活習慣病と進行した慢性腎臓病の発症関係を順次検討する。課題5.糸球体過剰ろ過の危険因子を検討する(研究代表者である上原、研究分担者である林、佐藤);生活習慣や生活習慣病と糸球体過剰ろ過との関係を順次検討する。課題1.慢性腎臓病の発症の危険因子を検討するコホートの整備を行う;職域の健康診断の結果を用いた大規模コホートの整備を行った。1年毎の健康診断の結果(身体計測の結果、尿検査の結果、血液検査の結果、問診)データの確認、入力、およびクリーニングを行った。1年毎のデータを結合しコホートのデータベースの構築を行った。課題2.生活習慣と早期の慢性腎臓病の発症についての関係を検討する;整備したコホートデータを用いて、生活習慣と慢性腎臓病の関連について解析を行った。初年度は、体格指数、ウエスト周囲計と慢性腎臓病の関係について学会で報告した。当初予定していた平成26年度の雑誌掲載数が減ったため。課題1.慢性腎臓病の発症の危険因子を検討するコホートの整備を行う(研究代表者である上原、研究分担者である林・佐藤・圓藤);平成25年度に構築したデータベースに健康診断の結果を追加する。コホートの整備を継続する予定である。課題2.生活習慣と早期の慢性腎臓病の発症についての関係を検討する(研究代表者である上原、研究分担者である林・佐藤);飲酒習慣などの生活習慣と早期の慢性腎臓病の発症関係を順次検討する。課題
ROBO4プロモーターの転写制御機構の解明とウイルスベクターへの応用

血管内皮細胞特異的にRobo4遺伝子が発現するメカニズムを解明するため,ROBO4プロモーター中に存在する転写制御配列の機能をトランスジェニックマウスを用いて解析した.その結果,上流,下流の転写制御配列(REn,ETS)は両者ともプロモーターの活性化に寄与し,血管内皮細胞特異性は転写開始点上流300bpの配列で生み出されていることが明らかとなった.また,ROBO4プロモーターを用いて作製したアデノウイルスを用いた検討から,ROBO4プロモーターはアデノウイルス中においても血管内皮細胞特異性を保っていることが明らかになった.血管内皮細胞特異的にRobo4遺伝子が発現するメカニズムを解明するため,ROBO4プロモーター中に存在する転写制御配列の機能をトランスジェニックマウスを用いて解析した.その結果,上流,下流の転写制御配列(REn,ETS)は両者ともプロモーターの活性化に寄与し,血管内皮細胞特異性は転写開始点上流300bpの配列で生み出されていることが明らかとなった.また,ROBO4プロモーターを用いて作製したアデノウイルスを用いた検討から,ROBO4プロモーターはアデノウイルス中においても血管内皮細胞特異性を保っていることが明らかになった.我々は血管内皮細胞特異的に遺伝子が発現するメカニズムを明らかにするため、Robo4遺伝子の発現制御機構の解析を行っている。これまでに、Robo4プロモーター中の-119 ETSサイトに転写因子GABPが結合し、転写を活性化することをゲルシフトアッセイ、クロマチン免疫沈降法、ルシフェラーゼアッセイ等の手法を用いて明らかにしてきた。今回我々は、このETSサイトがin vivoにおいてもRobo4の発現制御に重要な配列であることを、遺伝子改変マウスを用いて明らかにしようと考えた。まず、Robo4プロモーターのETSサイトに変異を加え、これにLacZ遺伝子を連結した。次に、このトランスジーン1コピーを相同組換え法を用いて、マウスES細胞のHprt遺伝子座上流に挿入し、得られたES細胞を用いてトランスジェニックマウスの作製を行った。このマウスと、以前に作成した天然型Robo4プロモーターを持つマウスにおける、LacZの発現を比較したところ、天然型のRobo4プロモーターを持つマウスでは、全ての臓器において血管内皮細胞特異的にLacZが発現しているのに対し、ETSサイトに変異を持つマウスでは、LacZの発現が大幅に減少していることが明らかとなった。また、マウスRobo4遺伝子をLacZに置換したノックインマウスと、このマウスのETSサイトに変異を加えたマウスを用いて同様の実験を行ったところ、血管内皮細胞特異的であったLacZの発現は、ETSサイトへの変異導入により大きく減少した。これらの結果から、Robo4プロモーターのETSサイトは、in vivoにおいても転写活性に重要性な配列であることが明らかとなった。本成果は、生理的条件下に最も近いプロモーター解析法を提唱するものであり、エピジェネティックな転写制御研究など、今後の転写研究の有用なツールとなると考えられる。我々は血管内皮細胞特異的に遺伝子が発現するメカニズムを明らかにするため、血管内皮細胞に特異的に発現するRobo4遺伝子の発現制御機構の解析を行っている。これまでに、Robo4遺伝子の発現制御を担うプロモーター配列に転写因子SP1、GABPが結合し、転写を活性化することを明らかにした。しかし、これらの転写因子は血管内皮細胞以外の細胞にも発現しているため、これらの因子が血管内皮細胞特異性を生み出しているとは考えにくい。そこで我々は、他の転写因子の関与を考え、新たなRobo4発現制御因子の探索を行った。まず、phylogenetic footprint法を用いて、様々な種におけるRobo4プロモーター配列を比較し、種間で高度に保存されている3つの転写因子結合配列(NF-kB、ETS、AP1)を同定した。さらにスーパーシフトアッセイにより、各配列に結合する転写因子を6種同定することに成功した。現在、これらの転写因子がRobo4の発現を制御するメカニズムについて解析を進めている。また、我々は転写因子を介さないエピジェネティックな転写制御メカニズムで、Robo4の発現が制御されている可能性についても検討を行った。Robo4を発現する血管内皮細胞と発現しない非血管内皮細胞におけるプロモーター配列のDNAメチル化状態を比較したところ、転写開始点付近の領域は、血管内皮細胞では全くメチル化されておらず、非血管内皮細胞では高度にメチル化されていることが明らかとなった。この結果から、プロモーターのDNAメチル化パターンがRobo4の発現制御や、血管内皮細胞特異性の創出に寄与している可能性が示唆された。現在、転写因子、エピジェネティクスの両側面から、Robo4発現制御メカニズムについて更に研究を進めている。