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ビタミンB12不足の臨床栄養学的意義に関する研究

有意水準には達しなかったが、下肢筋力は血清葉酸濃度の第3三分位では第1三分位(p=0.061)、第2三分位(p=0.057)よりも高かった。しかし、重回帰分析において年齢以外では血清葉酸濃度のみが有意な寄与因子であった。また、血清葉酸濃度、ビタミンB12濃度の両方が中央値以上の群では下肢筋力が有意に高値であった。高齢女性において血清葉酸濃度が低いことは身体機能低下に対してホモシステインとは独立した危険因子であると考えられた。昨年度ビタミンB12不足が骨粗鬆症性骨折リスクに及ぼす影響について研究を行った。今年度はその成果を承けて、高齢者の筋力・日常生活動作に及ぼす影響を検討した。高齢者における運動器の健康維持におけるビタミンB12の役割について、おおむね順調に成果を挙げているものと考えている。【背景・目的】ビタミンB12(以下B12)は、胃酸によって食品から遊離し、胃の壁細胞から分泌された内因子と結合した複合体が、回腸末端から吸収される。すなわちB12の吸収において、胃が重要な役割を果たしており、胃切除後にはB12吸収障害のため、巨赤芽性貧血が起こる。しかし肝臓に大量のB12が貯蔵されているため、実際に貧血が起こるのは、手術の数年後とされている。しかしわが国では、胃がんのほとんどは萎縮性胃炎をベースとして発症するため、胃がんにて手術を受ける以前から、B12吸収障害が起こり、肝臓での貯蔵が少なく、より早期から貧血が発症すると仮説を立てて、調査を行った。【方法】胃切除予定患者及び術後患者を対象に、血中B12・葉酸・ホモシステイン(Hcy)濃度を測定した。【結果】B12濃度は、胃切除後患者が切除前患者より低く、両者とも健常者に比べ低値であった。B12欠乏者(220pmol/L未満)は術前患者で33%、術後患者で64.4%であり、術後患者の欠乏者のうち44%が術後経過2年以内であった。胃切除後患者では、B12濃度とHcy濃度に有意な負の相関関係がみられた。貧血を有する者ではB12・フェリチン濃度が低く、鉄欠乏性貧血とB12欠乏性貧血の合併が示唆された。【考察】胃がん患者において術前からおよび術後早期からのB12吸収障害が示唆された。また、鉄欠乏性貧血とB12欠乏性貧血の合併が示唆され、機序として吸収障害が考えられたが、日常臨床ではB12を測定しないため見落とされやすいと考えられた。以上、ビタミンB12吸収障害は、従来考えられているより、はるかに早期から起こり、臨床栄養学的に重要な課題と考えられた。2016年度において、骨粗鬆症性骨折のリスクを上昇させないために必要なビタミンB12・葉酸の必要量に関して、コホート研究の結果に基づいた解析を行い、英文論文として投稿することができたので、2017年度は、心血管疾患のリスクを増加させないために必要な、ビタミンB12・葉酸の必要量に関して、コホート研究データの解析を行う。昨年度・今年度の成果を踏まえて、高齢者の健康維持におけるビタミンB12の重要性をさらに広く調査するとともに、ビタミンB12不足をきたす原因に関しても、検討を進めていく。おおむね計画通りの支出を行ったが、消耗品の支出に関して、若干の余剰を生じた。血液検査外注費用にかなりの金額を要するものとして、当初計上していたが、予想を下回る支出ですんでしまったため、次年度使用額を生じた。消耗品支出にて調整する。
ミトコンドリア感染性ウイルスの感染機構の解明と有効利用

ミトウイルスは菌類を宿主とし1本鎖(ss)RNAゲノムを持つ唯一無二のミトコンドリア感染性ウイルスである。このうち、Cryphonetria parasitica mitovirus 1(CpMV1)は世界3大樹病の病原であるクリ胴枯菌(子のう菌)に感染し、複雑な3者間相互作用(クリ樹-子のう菌、子のう菌-ウイルス:2つの宿主・パラサイトの関係が存在)を織りなす。本研究は、このユニークなウイルスの感染機構(宿主範囲、水平伝染搬能、宿主防御機構への対抗手段、病徴発現機構などのウイルス学的命題)の解明した世界最初の例としてなる。=ミトウイルスの感染様式(移行、伝染、宿主範囲、病原性)を主に細胞融合法を用いてに明らかにする=1.感染菌から非感染の菌糸融合和合性菌へ菌糸融合により水平移行が起こることを、クリ胴枯病菌標準株で確認した。2.ミトコンドリア感染率を検定するため、クリ胴枯病菌株NB631(CpMV1に感染)から細胞分画法によりミトコンドリアの精製を試みた。現在ミトコンドリア標的マーカーでラベルした蛍光蛋白質遺伝子でミトウイルス感染菌株を形質転換に成功した。この菌株を使用して精製をモニターする予定である。3.ハイグロマイシン耐性遺伝子をもつシロイヌナズナT87培養細胞(既に整備済み)あるいはタバコBY2培養細胞をクリ胴枯病菌NB631とプロトフージョンさせた。しかし、これまでのところ、結果は陰性である。4.ウイルス感染、非感染の同質遺伝子系統を比較し、ミトウイルスの病原性(宿主菌の呼吸機能、生育、植物へ病原性)を常法により調べた結果、病原性の衰退を引き起こさないことが判明した。5.ミトコンドリアで複製するミトウイルスがRNAサイレンシング(核支配の宿主防御機構)の影響を受けるかをRNAサイレンシング欠損株(クリ胴枯病菌標準株EP155の遺伝子破壊株、Nuss博士から分譲を受けた)を用いて調べたが、その影響は認められなかった。修士課程の学生が就職のため退学したため、予定より若干遅れている。現在、留学生とともに、本研究を進めている。実施項目8bでは、ミトコンドリア画分(Neurospora crassa由来のミトコンドリア局在性蛋白質NTPase Subunit 9とGFPの融合蛋白質:Su9:GFP標識)の形質転換体の作製に前年度成功した。しかし、継代中にGFP蛍光が低下するという問題が生じた。RNAiが関与しているとの想定のもと、これを解消すべくRNAi欠損株を用いて同じ実験を繰り返したが、問題の解決には至らなかった。実施項目9感染性クローンについてであるが、bの核型コンドンに変換した完全長cDNAあるいはRNA依存RNA合成酵素(RdRp)遺伝子コンストラクトは作製済みである。これらは、H29年度の感染性クローンの構築に利用される。他の実施項目は今後の課題となっている。一昨年度、期待していた修士課程の学生が就職のため退学したため、予定より若干遅れている。昨年度、新たに入学した修士課程の留学生と本研究を強力に推進しているし、今後も推進していく予定である。=ミトウイルス複製部位の確認と感染性クローンの構築を目指す=昨年度、途中まで進めたミトウイルス感染性クローンの作成を今年度も試みた。クリ胴枯病菌由来のミトウイルス(Cryphonectria mitovirus 1,CpMV1)の完全長cDNAクローン2種類作成した。1種類は、CpMV1のcDNAであり、もう一方は8箇所でミトコンドリア型のトリプトファンコドン(UGA)(核型では停止コドンとして機能する)は保存されていた。従って、まずこれらのUGAコドンを核型トリプトファンコドン(UGG)に変更したcDNAも同時に合成した。尚、試験管内でウイルスゲノムと同一の配列を有するRNAの合成を可能とするため、5'末端にT7プロモーター、3'末端にSal Iを付加した。これらのクローンを核型コドンに変更したRdRp発現クリ胴枯病菌、あるいは非形質転換体にトランスフォームあるいはトランスフェクションを行った、しかし、感染性クローンの構築に至らなかった。そこで、さらにミトウイルスとは同科のナルナウイルスの感染性クローンをスペインのR. Esteban博士より共同研究の一環として分譲を受けた。本クローンは自然宿主でありSaccharomyces cerevisiaeでの感染性が確認されている。しかし、本クローンも自然免疫欠損クリ胴枯病菌系統(ダイサー遺伝子、アルゴノート遺伝子欠失株)でも感染性は認められなかった。=ミトウイルス複製部位の確認と感染性クローンの構築を目指す=8. a.ミトウイルス(CpMV1)の複製がミトコンドリアで行われることを証明するため、精製ミトコンドリア画分を用いてミトウイルスのin vitro複製装置の再構築を試みる。

In vitroまたはin vivoで合成したウイルスRNAとタンパク質(RdRp)を各細胞画分のライセートに添加し、マイナス鎖RNA合成を指標としてウイルス複製を評価する。石川らによって開発されたタバコモザイクウイルスin vitro複製系を参考とし、ミトコンドリア成分共存下において特異的にミトウイルスが複製することを示す。b. CpMV1-RdRpとウイルスRNAの複合体がミトコンドリアのどの部位で検出されるかを免疫電顕法で詳細に観察する。ミトコンドリアの切片を得やすくするために、ミトコンドリア画分(Neurospora crassa由来のミトコンドリア局在性蛋白質NTPase Subunit 9とGFPの融合蛋白質:Su9:GFP標識)を精製し、超薄切片を作製する。9.ミトコンドリアで使われるtRNA(RNA用)とATPase(RdRp蛋白質用)の輸送系に牽引させる手法を採る。a. tRNA配列をミトウイルスへ付加する。リボザイムにより輸送後にtRNA領域が分離されることを期待する。導入ウイルス核酸としてDNA(核ゲノムからウイルスRNA供給)あるいはRNA(電気穿孔法により直接供給)ベースの試料を用いる。b.ミトウイルスRdRpにATPaseの輸送シグナルを付加、細胞質内でミトウイルスRNA(核ゲノムから供給)-RdRpの特異的結合の後、ミトコンドリアへの輸送・放出を期待する。核型コドンに改変したRdRp遺伝子を合成後、輸送シグナルとの融合タンパク質遺伝子を構築し、宿主の核染色体へ導入する。10.逆遺伝学を用い、ウイルス複製、病徴発現に必要な領域の同定、ベクター化を進める。昨年積み残しとなっている下記の課題を推進する。8. a.ミトウイルス(CpMV1)の複製がミトコンドリアで行われることを証明するため、精製ミトコンドリア画分を用いてミトウイルスのin vitro複製装置の再構築を試みる。タバコモザイクウイルスin vitro複製系を参考とし、ミトコンドリア成分共存下において特異的にミトウイルスが複製することを示す。b.ミトウイルス
RCAS1を用いた妊娠高血圧症候群の予知についての研究

我々は、RCAS1蛋白の遺伝子発現を抑制することで、妊娠マウスの血圧上昇や、蛋白尿の出現を見るのではとの仮説を検証した。妊娠7.5日の妊娠マウスの子宮内にsiRNA(against RCAS1)をHVJ-Eを用いて導入した。血圧と尿蛋白の測定を行った。siRNA導入は妊娠8.5日目に、western blotting、免疫組織染色を用いて確認した。その結果、RCAS1 siRNAgroupでは血圧が妊娠9.5、10.5、11.5、15.5日において有意に上昇していた。また、尿蛋白は9.5日においてのみ上昇していた。この結果はRCAS1蛋白の妊娠高血圧症候群の病態における重要性を示していると考えられた。この結果を踏まえて、妊娠高血圧症候群の早期発見のマーカーをなりうるかについて検討した。母体のサンプルは妊娠11-13,20-22,32-34,37-38週と分娩後に採取した。RCAS1蛋白濃度はELISAにて測定した。また、母体の血清のmRNAは(RT)-PCRを用いて測定した。RCAS1蛋白濃度は妊娠11-13,20-22週において妊娠32-34週に比して有意に増加していた。母体血中RCAS1mRNAは妊娠11-13週に妊娠37-38週に比べて有意に増加していた。また、妊娠11-13週のRCAS1蛋白濃度と分娩数週および、分娩時臍帯ガスのbase excessに正の関連が認められた。この研究結果より、RCAS1蛋白濃度と妊娠予後に何らかの関連があることが示唆された。これはおそらく、免疫学的な経路を介したものと考えられた。現在までの実験では、子宮における腫瘍関連抗原RCAS-1の発現を、非妊娠マウス(8週令)と妊娠マウス(8週令)において、免疫組織染色、ウェスタンプロット、リアルタイムPCRを用いて検討した。子宮におけるRCAS-1mRNA発現は、非妊娠マウスにおいては、di-oestrus phaseにおいて発現が増強している傾向にあったが他のphaseに比して有意な差は認められなかった。また妊娠子宮を用いた検討では、day7(placentationの時期)に有意に発現が増強していた。免疫組織染色とウェスタンプロットの結果も同様であった。次の実験として、siRNAとHVJ-E vectorを用いて子宮においてRCAS1の発現を抑制する研究を現在施行中である。pcDNA3-Luciferse gene,pcDNA3-LacZ geneをHVJ-E vectorを用いてday7の子宮に遺伝子導入したところ、子宮と胎盤において卵膜よりも高い遺伝子導入効率が確認された。ベーダガラクトシダーゼ染色においても、胎盤と脱落膜と羊膜に遺伝子導入が確認された。現在のところの結果からは、腫瘍関連抗原RCAS-1の胎盤形成期における重要性が示唆されている。また、胎盤の形成は妊娠高血圧症候群の成因の重要な過程と考えられており興味深い結果である。今後はRCAS1の発現を抑制した妊娠マウスにてどのような症状を来たすかを検討する予定である。
少子化に伴う労働人口減少に関する経済分析のための複雑雑系数理経済モデルの構築

本研究は次の2つの学術的意義を持っている:(i)今までに十分な研究がされていない経済地理モデルの中心的な問題の複雑系数理経済モデルを構築した.(ii)数理経済学の有力な数学的道具と看做されながら,その数学的な困難さから十分に使われてこなかった最先端の数値解析技法であるエージェント・ベースド・モデルを,使いやすい数値計算プログラムパッケージの形で経済学者に提供し,数理経済地理モデルを構築した.さらに,本研究はこのような学術的意義だけでなく,大きな社会的意義を有している.元来,Weidlich-Haagの人口移動モデルは,EU域内の人口移動予測を目的とした社会貢献指向の実証性重視の数理モデルである.日本では少子高齢化に伴って,地域間の人口移動は緩やかになると,かつては信じられていた.しかし長期に渡る過疎化によって人口減少が続いている地方では,集落が短期間に消滅するような人口流出が起き,それと同時に東京のような大都市では,急激な人口の流入が起きることが確実視されている.このように都市の人口集中と地方の人口流出は,人口爆発する都市を多く抱える中国や東南アジアは勿論,日本にとっても重要政策課題の一つである.本研究は,このようなアジアの重要政策課題に対して数理経済学的アプローチを試みるものであった.本研究はこの政策に対して重要な示唆を与えるものであり,大きな社会的意義を有していると言える.本研究は次の2つの学術的意義を持っている:(i)今までに十分な研究がされていない経済地理モデルの中心的な問題の複雑系数理経済モデルを構築した.(ii)数理経済学の有力な数学的道具と看做されながら,その数学的な困難さから十分に使われてこなかった最先端の数値解析技法であるエージェント・ベースド・モデルを,使いやすい数値計算プログラムパッケージの形で経済学者に提供し,数理経済地理モデルを構築した.さらに,本研究はこのような学術的意義だけでなく,大きな社会的意義を有している.元来,Weidlich-Haagの人口移動モデルは,EU域内の人口移動予測を目的とした社会貢献指向の実証性重視の数理モデルである.日本では少子高齢化に伴って,地域間の人口移動は緩やかになると,かつては信じられていた.しかし長期に渡る過疎化によって人口減少が続いている地方では,集落が短期間に消滅するような人口流出が起き,それと同時に東京のような大都市では,急激な人口の流入が起きることが確実視されている.このように都市の人口集中と地方の人口流出は,人口爆発する都市を多く抱える中国や東南アジアは勿論,日本にとっても重要政策課題の一つである.本研究は,このようなアジアの重要政策課題に対して数理経済学的アプローチを試みるものであった.本研究はこの政策に対して重要な示唆を与えるものであり,大きな社会的意義を有していると言える.平成19年度には、人口動態のセンサスについての統計資料を精査し、労働力移動の主要要因の分析を行った。また、人口減少の効果は、主に微分方程式で記述される連続力学系について詳しく研究されてきたが、本研究では、エージェント・ベースド・モデルにこの効果を組み込むために、離散力学系の基本的な性質を研究した。さらに、少子化現象を伴う労働力移動の複雑系数理経済モデルの解析の準備として、少子化を伴わない(出生率と死亡率が等しい)人口移動のみを行う複雑系数理経済モデルの構築を試みた。先ず、この構築された人口移動モデルの正確さを検証するために、日本国内にある種のレトロウイルス(ヒト成人T細胞白血病ウイルス)の感染分布に適用して、同ウイルスのキャリアが地理的に大きく偏っている様子を正しく再現できるかを試みた。これは、構築した労働力移動モデルの精度を検証するために、必要な補助的研究と言える。その結果を論文として発表したが、構築したモデルが十分に正しく現象を記述する事ができる実証性の高いモデルであることが判明した。エージェント・ベースド・モデルを用いて人口移動を表現する場合、人口移動の際に各個人が収集する移動情報量のエントロピーの問題が重要になってくる。この数理経済モデルの数値シミュレーション結果を、この情報量のエントロピーを使って解析することが必要になるわけである。そのため準備としてエントロピー係数の問題を解決して、論文として発表した。しかし、このような解析では、総人ロ一定という条件の下で数理解析が実行されており、総人口が不変量として重要な役割を果たしている。しかしながら,総人口が短期間で急激に減少する場合、このような不変量は使うことができず、人口減少の効果によって,エントロピーの評価がどんどん悪くなるという困った現象が現れる.この困難の解決が平成20年度の大きな研究課題である。昨年度は,労働人口の地理的移動を記述する複雑系数理経済モデルを構築したが,本年度は,昨年度までの研究成果を発展させて,数理人口移動論で懸案であった人口移動現象一般を記述するマスター方程式の解を表示するために,クラマース・モイヤル展開における剰余項の評価を試み,その広汎な評価式を得ることができた.その成果を論文にして“Nonlinear Analysis"に発表した.この剰余項評価方法は適用範囲が広く,人口と資本の地理的移動現象を表す非線形拡散方程式の解の差に評価を与えるものである.また,年齢構造のポピュレーション・ダイナミックスのモデルへの組み込み方法を検討し,人口減少の効果と年齢構造の両方が組み込まれた力学系の漸近挙動を数値解析的手法によって体系的に調べた,特に人口減少の効果の年齢構造による積み重なりの結果生じるエージェントの挙動の不安定化が,どのようなオーダーで起きるのかを,力学系の漸近挙動の数値解析的手法を用いて体系的に詳しく調べた.

これは,数値実験により,年齢構造との効果を決定するパラメーターの値を変化させ,エージェントの挙動の不安定化が起きないパラメーターの範囲を推定した.この成果は,学術雑誌に投稿中である.さらに,人口減少と経済成長との関連で,中華人民共和国の計画生育法(人為的な少子化)が経済に与えた影響を研究した。その政策は所得の地域格差を生み出すとともに,社会問題も起こしていることが判明した.この研究成果は東海大学総合経営学部紀要に発表した。数理社会学的に容認できる仮定をモデルに科して,証明をし易くした.関数方程式論を専門とする田畑と数理社会学を専門とする高木・顧が,人口爆発モデルを関数方程式論の立場から十分に検討した.また、非線形Fokker-Planck方程式の解は,社会力学のmaster方程式の解と,時間局所的に幾何学的相似であることが知られているが,人口爆発モデルは数理生物モデルに似ていると予想していた.しかし基盤研究(C)理論経済学「少子化に伴う労働人口減少に関する経済分析のための複雑系数理経済モデルの構築」(代表者:高木,分担者:田畑)において多くの数値実験を行った結果,このような幾何学的相似は時間局所的にしか成立せず,人口爆発が起きる場合は2つのモデルの挙動は時間大域的には全く違ったものになることを発見し,研究目的の要旨で述べた命題を予想するに至った.しかし,この数値実験は,理論経済学への応用を目的としており,モデルのパラメータの範囲が制限されている.そこで,この制限を緩めて数値実験を行った.もしも制限を緩めた場合に予想命題が成立しないならば,パラメータの範囲を制限した命題を新たな予想命題とした.社会力学のmaster方程式の数値実験には長い時間を要するので,研究代表者によって開発された方法を使って計算効率を高めた.これらの数値計算は,いままで同方程式の数値解析を行ってきた田畑が行った.高木・顧が数値実験結果を数理社会学の立場から検討した.
Direct reprogramming法による疾患特異的肝内胆管上皮細胞の作製

ヒトの口の中から、綿棒でこすった先に着いてくる細胞を用いて、そこに数種類の遺伝子を入れることによって、肝臓の中にある胆管細胞を作成する研究を行いました。遺伝子導入は上手くいき、細胞の形質転換をすることができましたが、残念ながら胆管上皮という性質を獲得するには至りませんでした。しかし、類縁細胞の膵管上皮細胞で認められるアミラーゼ産生が確認されたため、もう少しの工夫で目的の細胞にいたる可能性は高いと思います。平成26年度は胆管上皮細胞へとdirect reprogrammingに必要な因子は何であるかということの基礎検討のために先ず線維芽細胞の細胞株を用いてトランスフェ区ションの方法についての基礎的検討を行った。一般的にトランスフェクションに用いられる方法はlipofectionやgene pulse法などがあるが、今年度の検討ではリポフェクタミンを用いるlipofection法を採用した。その結果、ある因子の単独の遺伝子導入は両行で会ったものと、複数の遺伝子導入、とりわけ4つ以上の因子の遺伝子導入に関しては、導入される因子のtransfection効率が安定しないという問題が生じていた。この不安定さを回避するために、複数の遺伝子導入法を用いる方法、最初からベクターに複数の因子を組み込んだものを一度のトランスフェクションする、などといった変法を試みたが、いずれも成功せずレトロウイルスによるトランスフェクションを採用して、複数の因子をそれぞれ別個に導入して、各因子毎の効率を検討することを行った。また、導入された細胞がいかなる形質転換がなされたかということを検証するために、上皮細胞より分泌される因子の発現を定量的PCR法にて行った。その結果いくつかのトランスフェクションが成立した細胞株では、一部肝胆膵領域の上皮細胞に発現が認められる因子の産生を確認するに至った。しかし導入する遺伝子の効率の違いにより作成できる場合の頻度が極端に異なるために、安定的に形質転換を行い得たという段階ではなく、今後はさらに各因子の導入効率を安定させるべくレトロウイルスベクターの選択や導入法についてさらなる調整が必要と判断した。平成27年度はより向上した遺伝子導入法に基づき実際のヒト線維芽細胞の初代培養株にトランスフェクションを行い、形質転換が効果的になされるかどうかを検討する。また、現在複数ある遺伝子導入因子のさらなる絞り込みが可能かどうかについても検討する。本研究では厚生労働省の定める難治性疾患である原発性胆汁性肝硬変(PBC)における標的細胞である肝内胆管上皮細胞を、患者皮膚の線維芽細胞より近年報告されたdirect reproduction法を用いてiPSやES細胞といった幹細胞に戻ることなく分化させて、疾患特異的なin vitroの解析モデルを作成することを目的とする。PBCは現在最適な疾患モデルが無く、治療法についても根本的な治療法はない。Direct reproduction法ではStem Cellに細胞を戻すことなく、またES細胞のような分化能を持たない細胞の形質転換法であり、Stem cellやES細胞に関わる様々な法的規制を受けないため、疾患特異的な研究には最も適した研究手法として期待される。平成27年度は前年に引き続き、口腔内線維芽細胞に数種の遺伝子を導入することにより、胆管上皮細胞に近い膵管上皮細胞に特徴的なアミラーゼ産生を認める娘細胞用の細胞を作成することに成功した。この細胞が普遍的に膵管細胞としての特徴を保持しているかを検討するとともに、胆管上皮への形質転換を認める因子をさらに検索することが重要と考えられた。口腔内線維芽細胞に遺伝子購入することは可能となったが、最終目標である胆管上皮細胞への形質転換には至っていないため。本年度は肝幹細胞から肝実質細胞への分化の際に重要とされる遺伝子群の中から、1分子ずつの削り込みを行った。初代培養後に三日月の形状をしていた口腔内線維芽細胞は、遺伝子導入後にその形態が変化し、一部は上皮細胞上の形態を示した。その中でもFoxa3、Hnf4aを導入した細胞では上皮細胞用の形態を示した。さらに導入する遺伝子の種類を変えることにより、形態や細胞分裂はさらに変化した。そのうち、形態学的に肝内胆管上皮細胞に近いものを取り出して、細胞生物学的な検討を行った。その結果、サイトケラチン7染色を行ったが陽性となる細胞株は得られなかった。さらに、イムノブロッティングを行い、サイトケラチンの他に胆管上皮細胞の特性を検討したが、今回の研究では胆管上皮細胞としての特性を見せたクローンは得ることができなかった。しかし、陰性細胞のうち一部の細胞でアミラーゼ産生を認める細胞を見出した。この細胞は、胆管上皮細胞としてのトランスポーターの発現などは認められなく、また胆汁分泌作用も確認できなかった。したがって現状のままでは胆管細胞上皮細胞を作成したといえず、導入遺伝子のさらなる検討が必要と考えられたために、さらに導入遺伝子の組み合わせを変えるなど方法の見直しを行った。残念ながら本研究計画期間内に最終的な因子を確定できなかった。しかし、類縁細胞である膵管上皮細胞への分化傾向のある細胞を得たとも考えられ、この遺伝子導入に近いコンディションをさらに検討した。今後は今回検討した因子以外の遺伝子導入を試みることにより、本来の目的に近い細胞を作成することが期待される。

しかし、類縁細胞の膵管上皮細胞で認められるアミラーゼ産生が確認されたため、もう少しの工夫で目的の細胞にいたる可能性は高いと思います。トランスフェクション自体は実施することができ、一部形質転換がなされたことは確認したが、その公立がまだまだ安定しておらず、その成果を公表できるまでに至っていない。また、遺伝子導入する因子についても現行の因子で必要十分なのかの確認もできていないため、将来の実用化に至る前に十分この点での基礎検討も必要であることがわかったため。類縁細胞である膵管上皮細胞用への形質転換は可能となった。この点は大きな進歩であるが、本来の目標である胆管上皮細胞への形質転換を促すためにさらなる導入因子の策定を急ぐ必要がある。また、導入遺伝子の安定性についてもさらに検証が必要であり、この点についてはH27年度に作成したアミラーゼ産生細胞を用いてさらに検討を進める予定である。消化器病学新年度ではレトロウイルスベクターの複数回実施による遺伝子導入を行い、線維芽細胞の形質転換を安定して行う。その際に用いる細胞を線維芽細胞株とともに健常人から採取した口腔内線維芽細胞初代培養に応用することを今年度の目標とする。そのために必要な施設内倫理審査も終了しており、安定的な実験条件が整い次第直ちに実施に移れる状態となっている。平成26年度は当初予定していたヒト献体からの初代細胞への遺伝試験導入ではなく、これまで保持していた線維芽細胞株を用いたため、分離培養に関わる経費と試薬が平成27年度に持ち越しとなったため。平成27年度は、上述のヒト線維芽細胞の分離と培養に多くの時間と費用が費やされる見込みである。分離のための消化酵素薬と、初代培養のためのコラーゲンなどの細胞外マトリックスの購入費用やディスポーザブルの培養器具を大量に購入する見込みである。
羊膜と口腔上皮細胞による培養上皮シートの開発に関する実験的研究

口腔上皮細胞をヒト乾燥羊膜上で培養した新たな培養重層上皮シートについて研究を行った。本複合培養上皮シートは、組織学的に口腔粘膜上皮組織と同様の重層上皮化構造が認められた。免疫組織学的検討では、口腔粘膜上皮と類似のバリア構造が確認され、かつ高い増殖活性を示していた。本複合培養上皮シートは、培養上皮開発における有望な供給源となり得る事が示唆される結果であり、歯科医療のみならず熱傷治療など幅広い分野において臨床応用できる可能性を有していると考えられた。富山大学と信州大学により共同開発した無細胞性ヒト乾燥羊膜を口腔上皮細胞のscaffoldとし、この基質上で口腔上皮細胞を気相下培養する事により、feeder細胞やウシ血清などの未知因子を使用すること無く、ヒト本来の口腔粘膜構造である重層化上皮化シートを作成することに世界で初めて成功した。この羊膜・口腔上皮培養複合上皮シートを組織・免疫組織学的に検討した後、実験動物へ移植し生物学的解析を試みた。羊膜・口腔上皮複合培養重層上皮シートの形態学的検討では、口腔上皮細胞がヒト乾燥羊膜でほぼ均一な約10層以上からなる重層化が認められた。また重層化に伴う核の消失は認めらなかった。免疫組織学的検討では、cytokeratin 10/13、laminin-5、さらには上皮のタイトジャンクションマーカーであるZO-1およびoccludinにおいて正常な口腔上皮組織とほぼ同様な発現パターンを示した。上皮stem-cellや上皮の増殖マーカーであるkeratin-19やPCNAでは、正常な口腔上皮と比べ、培養上皮全層で陽性細胞の発現が認められた。本複合培養上皮シートは口腔粘膜上皮組織と類似のTJ構造の獲得が確認された。さらに本培養上皮シートは正常口腔粘膜上皮組織と比較し、より高い細胞活性と増殖能を有していることが判明した。さらにヒト乾燥羊膜には、接着性タンパクであるlaminin-5の発現も認められ口腔粘膜上皮細胞培養における細胞外マトリックスとして、有用かつ妥当な組織であると思われた。本複合培養重層上皮シートの実験動物への移植実験では、速やかな上皮形成が認められた。本複合培養重層上皮シートは、培養上皮シート開発における有望な供給源となり得る事が示唆される結果であり、歯科医療のみならず熱傷治療など幅広い分野において臨床応用できる可能性を有していると考える。われわれの研究室で開発した無細胞ヒト乾燥羊膜を口腔上皮細胞のscaffoldとし、この基質上で口腔上皮細胞を気相下培養する事により、feeder細胞やウシ血清などの未知因子を使用すること無く、口腔粘膜上皮本来の構造である培養重層上皮シートの作製を行った。実験の手順は、1,抜去歯から口腔上皮細胞を単離。2,口腔上皮細胞を23継代培養。3,ヒト乾燥羊膜上に培養口腔上皮細胞を播種し4日間液相下培養。4,無血清培地のカルシウム濃度を上げ約3週間気相下環境にて培養。5,組織標本による形態学的・免疫組織学的検討を行った。口腔上皮細胞は、ヒト乾燥羊膜上で気相下培養を行っても増殖を続け、複合培養重層上皮シートの形態学的検討では、口腔上皮細胞がヒト乾燥羊膜でほぼ均一な約10層以上からなる重層化が認められた。免疫組織学的検討では、cytokeratin 10/13、laminin-5において、正常口腔上皮と類似した発現パターンを示した。さらに上皮のタイトジャンクションマーカーであるZO-1およびoccludinにおいても、正常な口腔上皮組織とほぼ同様な発現パターンを示した。上皮stem-cellや上皮の活発な増殖能を示すマーカーであるkeratin-19やPCNAでは、正常な口腔上皮と比べ、培養上皮全層で陽性細胞の発現が認められた。本複合培養重層上皮シートは正常口腔粘膜上皮と比較し、より高い細胞活性と増殖能があることが判明した。本複合培養重層上皮シートは、ヒューマンセルによる培養上皮シート開発における有望な供給源となり得る事が示唆された。ヒト乾燥羊膜と口腔上皮細胞により作製された上皮シートの形態学的・免疫組織学的検討については、当初計画の各種蛋白(cytokeratin 10/13、laminin-5、keratin-19、PCNA、ZO-1、occludin)の発現状況まで行なう事が出来た。

形態学的・免疫組織学的検討にかなりの時間を要したため、羊膜・口腔上皮複合培養上皮シートを実験動物へ移植し、創傷治癒に関連の深い上皮の分化、増殖過程と創収縮機構などについて細胞生物学的解析を試みるには至らなかったのでやや遅れていると判断される。平成23年度には、本羊膜・口腔上皮複合培養上皮シートについての形態学的検討が終了した。今後は、本複合培養シートを実験動物へ移植実験を行う。その後、自家口腔上皮細胞により作成した羊膜・口腔複合培養上皮シートを生体へ移植し、実際の臨床応用に向けた検討を行う。<平成24年度、研究計画・方法>(1)羊膜・口腔上皮複合培養上皮シートを実験動物へ移植実験し、創傷治癒に関連の深い上皮の分化、増殖過程と創収縮機構などについて細胞生物学的解析を試みる。(2)羊膜・口腔上皮複合培養上皮シート移植部や対象部の切除切片を作製し、免疫学的・形態学的な検討を行う。(3)羊膜・自家口腔上皮複合培養上皮シートを生体へ移植実験する。その際には倫理面で十分な配慮を行うともに、信州大学医倫理委員会においても再度、承認を得る予定である。羊膜・自家口腔上皮複合培養上皮シートの生体移植を行う対象は、インフォームドコンセントが得られた待機的手術患者とする。事前に健常部より採取した少量の自家組織片から羊膜・自家口腔上皮複合培養上皮シートを作製する。それを口腔内の粘膜実質欠損部へ移植し、経時的な創傷治癒経過や拒絶反応の有無、生着率などについて検討を行う。(4)平成23/24年度の実験より得られた結果を整理し、国内・外の学会、学術誌へ研究成果を発表する。平成24年度は主に、羊膜・口腔上皮複合培養上皮シートを動物へ移植実験を中心に実施・検討を行い、国内・外の学会にて研究成果を発表するため、研究費は以下のとおり使用する予定である。<直接経費>1,000,000円物品費(550,000円):試薬200,000円、ガラス器具類50,000円、実験動物300,000円旅費(300,000円):成果発表50,000円(国内学会:23日間)、成果発表250,000円(国際学会:約5日間)謝金(50,000円):外国論文の校閲50,000円その他(100,000円):研究成果投稿料80,000円、印刷費20,000円
除去土壌の再資源化のための試行的研究：分離・混合技術の適用基準確立に向けて

福島第一原発事故後の除染事業に伴い発生した、2000万m3もの除去土壌の安全な利活用が急がれている。土壌の放射能濃度を低下させ再資源化を図るためには、放射性Csの多くが取り込まれている細粒分を分離する「分級」技術と、幅広い粒径の材料を混ぜることで工学的特性を改善する「混合」技術との併用が有効と考えられる。本研究では、土を分離すべきか混合すべきかの判断指標の提示を目指し、(1)粒度の良い土に粘性土を混合したときの地盤工学特性の評価と影響因子の解明、(2)セシウム濃度低減効果が期待できる市街地土壌と農地土壌の配合条件の探索、(3)分離・混合技術の適用指標の提案を行う。
内因性急死における心筋細胞内ミトコンドリアDNAの部分欠損検出

方法論的には、mtDNAの精製、PCR増幅、欠失DNAの検出・確認に分けられる。現在までのところ、各段階を問題なく行える系は確立できている。この方法を用いて、心臓性突然死と他の死因の症例において、心臓数ケ所と肝・腎等他臓器の欠失mtDNA出現パターンを比較検討を加えている。現在のところ、心臓における欠失バンドの出現に部位差は特になく、また、多くのバンドは肝・腎等でも同様に出現してくるが、いくつかのバンドは比較的心臓特異的であろうと考えられる、という結果を得ている。これら結果の一部は、口頭発表を行い、例数を増やした上で、論文としてまとめる予定である。
飼料変換の消化管内ダイナミックスからみた反芻家畜のエネルギ-および蛋白質利用

反芻家畜の消化管内における飼料変換とそれに関与する要因およびエネルギ-および蛋白質利用との関連を検討し、以下の結果を得た。(1)牛およびめん羊に濃厚飼料75:粗飼料25の混合飼料および乾草を給与し、消化管内の飼料片粒子を測定したところ、1180Mm以上の粒子は反芻胃で30ー46%、第3胃以下では10%前後であった。45Mm以下の粒子は下部消化管ほど多くなった。飼料片ヘイウッド経は反芻胃で1100ー1200Mm、第3胃以下では牛600ー800、めん羊300ー400Mmであった。希土類元素マ-カ-で測定した粒度別通過速度もあわせて、反芻胃内での飼料変換ダイナミックスを検討すると、刈取り時期の異なる乾草によって、その様相が異なることが判明した。(2)異なるデンプン源、芻白質源を牛に給与し栄養素の消化を調べたところ、コ-ン給与時に高dg大豆粕を添加すると反芻胃内有機物およびデンプン消化率が低dgコ-ングルテンミ-ル添加にくらべ高くなった。繊維質消化率は芻白質源よりもデンプン源の影響を強くうけた。第4胃へ注入したデンプンの小腸内消化率は7586%であり、小腸移行繊維量が増えると低下する傾向にあった。(3)めん羊にアンモニア処理イナワラと無処理ワラを給与したところ、有機物および繊維質の全消化管および反芻胃消化率が向上し、VFAの産生も増加した。あわせて反芻胃および直腸の全細菌数、反芻胃のセルロ-ス分解菌も増加した。ロ-ルチュ-ブ法での測定では反芻胃の総培養可能菌およびセルロ-ス利用菌が増加した。(4)泌乳および乾乳山羊で粗飼料のみおよび濃厚飼料多給下での脂質代謝を調べたところ、濃厚飼料多給時には血中FFAが低く、皮下脂肪組織の脂肪合成能が高カった。乳腺組織での脂肪酸合成能は泌乳山羊で高く、飼料による差は認められなカった。平成元年度は異なる飼料給与下での消化管内飼料変換、飼料変換に関与する微生物叢および脂肪代謝について測定を行い、以下の結果を得た。1.粗飼料:濃厚飼料割合をかえた飼料を山羊およびめん羊に給与し、繊維質のル-メン内分解を調べた。イタリアンライグラス乾草のNDF分解はアルファルファヘイキュ-ブにくらべ高く、いずれも濃厚飼料割合を高めると低下した。ル-メン内での飼料粒子微細化について異なる品質の乾草をめん洋に給与、測定したところ、1180Mm以上のLarge particleは飼料給与後の時間経過とともに減少、Small particleおよび可溶区分はつねに一定量存在していた。乾草の品質低下により嚥下食塊の粒度低下、Small particleの消失速度低下が認められた2.若牛にデン粉源(コ-ン、大麦)と蛋白質源(大豆粕、コ-ングルテンミ-ル)をかえて給与し、消化管部位別利用を調べた。デン粉消化率はル-メン内では大麦区が、小腸、大腸ではコ-ン区が高く、全消化管では大麦区が高かった。

大豆粕区はコ-ンがグルテンミ-ル区にくらべdgが高く、小腸からのN吸収は低くなった。N蓄積にはデン粉および蛋白質源の違いによる影響は認められなかった。3.アンモニア処理ワラの消化とル-メンおよび直腸の微生物叢をめん羊で調べた。アンモニア処理ワラの繊維質消化率は無処理ワラおよび無処理ワラに尿素または大豆粕を添加した飼料とくらべて高く、ロ-ルチュ-ブ法で測定したル-メン内培養可能総菌数、セルロ-ス分解菌数も多かった。直腸の微生物叢には処理間に差はなかった。4.泌乳および乾乳山羊を用い、粗飼料のみ給与および濃厚飼料多給下での脂質代謝を調べた。濃厚飼料多給時には血中FFAが低く、皮下脂肪組織の脂肪合成能が高かった。乳腺組織での脂肪酸合成能は泌乳山羊で高く、飼料による差は認められなかった。反芻家畜の消化管内における飼料変換とそれに関与する要因およびエネルギ-および蛋白質利用との関連を検討し、以下の結果を得た。(1)牛およびめん羊に濃厚飼料75:粗飼料25の混合飼料および乾草を給与し、消化管内の飼料片粒子を測定したところ、1180μm以上の粒子は反芻胃で30ー46%、第3胃以下では10%前後であった。45μm以下の粒子は下部消化管ほど多くなった。飼料片ヘイウッド径は反芻胃で1100ー1200μm、第3胃以下では牛600ー800、めん羊300ー400μmであった。希土類元素マ-カ-で測定した粒度別通過速度もあわせて、反芻胃内での飼料変換ダイナミックスを検討すると、刈取り時期の異なる乾草によって、その様相が異なることが判明した。(2)異なるデンプン源、蛋白質源を牛に給与し栄養素の消化を調べたところ、コ-ン給与時に高dg大豆粕を添加すると反芻胃内有機物およびデンプン消化率が低dgコ-ングルテンミ-ル添加にくらべ高くなった。繊維質消化率は蛋白質源よりもデンプン源の影響を強くうけた。第4胃へ注入したデンプンの小腸内消化率は7586%であり、小腸移行繊維量が増えると低下する傾向にあった。(3)めん羊にアンモニア処理イナワラと無処理ワラを給与したところ、有機物および繊維質の全消化管および反芻胃消化率が向上し、VFAの産生も増加した。あわせて反芻胃および直腸の全細菌数、反芻胃のセルロ-ス分解菌も増加した。ロ-ルチュ-ブ法での測定では反芻胃の総培養可能菌およびセルロ-ス利用菌が増加した。(4)泌乳および乾乳山羊で粗飼料のみおよび濃厚飼料多給下での脂質代謝を調べたところ、濃厚飼料多給時には血中FFAが低く、皮下脂肪組織の脂肪合成能が高かった。
大腸菌のエネルギー代謝変異株の解析-糖代謝の新規制御機構と発酵生産の効率化-

大腸菌K-12株由来のリボ酸要求性ピルビン酸生産菌を新株として、形質導入法によりF_1-ATPaseの欠損変異遺伝子atpA401を導入して得られたTBLA-1株では、生育は親株の70%に低下したが、菌体当りのグルコース消費速度及びピルビン酸生産速度が親株の2倍及び2.5倍に増大し、その結果ピルビン酸の生産効率が大幅に向上した。平成7年度はTBLA-1株の性質解明とともに、新たに大腸菌K-12株野生株からも同様なF_1-ATPaseの欠損変異株を導き、この株についての性質も検討し、以下の結果を得た。1.TBLA-1株における解糖系諸酵素活性の変化:グルコースの取込みにかかわるホスホトランスフェラーゼ系を除く解糖系の全ての酵素活性の測定を行い、ホスホグリセリン酸キナーゼ及びピルビン酸キナーゼIの活性が対数増殖期において親株の最大1.5倍に増大していることを認めた。この二つの酵素は共に基質レベルのリン酸化を触媒するものであり、F_1-ATPaseの欠損変異におけるエネルギー(ATP)欠乏を補うレスポンスとして合目的的と考えられた。その他の酵素については両株間で有意な差が認められなかった。2.大腸菌K-12株野生株からのF_1-ATPase欠損変異株の取得:大腸菌K-12株野生株W1485に、形質導入法によりF_1-ATPaseの欠損変異遺伝子atpA401を導入しHBA-1株を取得した。3.培養条件の検討:TBLA-1、HBA-1両株の培養条件を検討し、鉄イオンの添加と、有機窒素源としてポリペプトンの添加が有効であることを認めた。4.HBA-1の糖代謝:3の条件でTBLA-1、HBA-1両株を培養した結果、HBA-1株の培養では著量のピルビン酸が生成した。ピルビン酸生産株でない野生株由来のF_1-ATPaseの欠損株でもピルビン酸が蓄積することから、F_1-ATPaseの欠損株では解糖系が強く活性化されていることが示唆された。
緑色蛍光タンパク質付加ノロウイルス様粒子の新規合成

ウイルスによる感染性胃腸炎を起こす主要な原因としてノロウイルスが挙げられる。ノロウイルスは培養細胞で増やす方法が見つかっておらず,ウイルスの感染機構,複製機構など基礎的な研究が遅れている。本研究ではバキュロウイルス-昆虫細胞発現系を用いてノロウイルス様中空粒子(NoVLP)に緑色蛍光タンパク質GFPを付加したウイルス様粒子NoVLP-GFPを合成することを目指す。NoVLP-GFPはノロウイルスと物理化学的特性が類似しているが感染性がなく,GFPによる緑色蛍光によりその検出が容易であるという特徴を持つ。NoVLP-GFPの合成に重要な,バキュロウイルスに組み込むノロウイルス由来タンパク質遺伝子およびGFP遺伝子の組み合わせ,及び昆虫細胞1個あたりに感染させるバキュロウイルスの量(multiplicity of infection:MOI)について検討した結果,ノロウイルス遺伝子のORF2とGFP遺伝子とノロウイルス遺伝子のORF3を合成した遺伝子GFP-ORF3を組み合わせ,昆虫細胞に同時感染させることでもっとも効率よくNoVLPが合成されることを確認した。また,MOIの検討を行った結果,ORF2とGFP-ORF3のMOIがそれぞれ2・1,3・3とした2条件が良いことが確認できた。さらにこの合成条件ではTEMによりNoVLPが,トランスイルミネータによりGFPの緑色蛍光が確認された。したがって,本手法によりNoVLP-GFPの合成に成功したことが示唆された。ノロウイルスは世界中で急性感染胃腸炎を引き起こしているヒト病原ウイルスである.しかしノロウイルスは組織細胞を用いて実験室で培養させる事が不可能であるため,ノロウイルス粒子を用いた実験を行う事は困難である.そこで本研究では,バキュロウイルス発現系を用いたノロウイルス様粒子(Norovirus-like Particle : NoVLP)の合成を行い,さらにNoVLP内部に緑色蛍光タンパク質(Green Fluoreorecent Protein : GFP)を導入した緑色蛍光タンパク質付加ノロウイルス様中空粒子(Norovirus-like Particle with GFP : NoVLP-GFP)の合成に挑戦する.今年度は,バキュロウイルス発現機構を利用してNoVLPの合成を行った。ノロウイルスゲノムから取得したNoVLP合成に必要な遺伝子をバキュロウイルス遺伝子に組み込むことで,バキュロウイルスの複製機構を利用してNoVLPの合成に成功した。さらに,NoVLP-GFP合成に向けて,ノロウイルス遺伝子とGFP遺伝子を結合した遺伝子を組み込んだバキュロウイルスを作製した。結合部分にはアミノ酸Gly-Ser-Gly-GlyのLinkerを用いて,発現時にそれぞれのタンパク質が柔軟に動けるように設計した。遺伝子組換え後,塩基配列解析により目的の遺伝子ができていることを確認した。以上の方法により,様々な組み合わせ及び順序で各遺伝子を持つ組換えバキュロウイルスを5種類合成した。合成したバキュロウイルスはプラック法によりその濃度を決定した。
受容体型チロシンホスファターゼSAP-1の消化管における生理的、病態的意義

本研究では、消化管に高度に発現する新規受容体型チロシンホスファターゼSAP-1の生理的、病態的意義を明らかにするために、SAP-1遺伝子破壊(KO)マウスを用いたin vitroおよびin vivoでの解析を試みた。前年度の解析をさらに進め、SAP-1が消化管上皮細胞特異的な発現様式を示すこと、また、腸管腫瘍自然発症マウスモデルであるApe minマウスとSAP-1 KOマウスとの交配実験から、SAP-1が消化管における腫瘍形成の制御に関与することを明らかにした。さらに、腸管における主要な疾患の一つである腸炎へのSAP-1の関与につき解析を試みた。腸炎のマウスモデルの作製に広く使用される硫酸デキストラン(DSS)を用いSAP-1 KOマウスおよび野生型マウスに腸炎を誘導したところ、その発症と重症度がSAP-1 KOマウスにおいて抑制される傾向が認められた。一方、炎症性腸疾患のマウスモデルとして知られているIL-10 KOマウスとSAP-1 KOマウスとの交配を行い、IL-10、SAP-1二重遺伝子破壊(DKO)マウスを作製し解析を行ったところ、IL-10 KOマウスに比べIL-10、SAP-1 DKOマウスにおいて腸炎の発症度と重要度が強まることを見出した。これらの実験結果から、SAP-1は腸炎の発症やその病態の制御に関与し、腸炎の発症機序の違いにより相反する作用を示すことが示唆された。現在、SAP-1によるこれら腸炎発症制御の分子機構の解析を進めている。SAP-1は、ヒトの胃がん細胞株より同定された受容体型チロシンホスファターゼであり、これまで大腸がんや肝臓がんの分化度と相関するとの報告や、培養細胞を用いた検討では過剰発現により細胞増殖を抑制すること、アポトーシスを誘導することなどの報告があるが、生体内での生理的、病態的意義は明らかではない。私共は、ヒトSAP-1塩基配列をもとにしてマウスのSAP-1ホモログを同定した。Northern blotting,western blottingにより、SAP-1は、マウスにおいては消化管に高度に発現することを明らかにした。さらに、蛍光顕微鏡および電子顕微鏡を用いた解析により、SAP-1は特に腸上皮細胞の微絨毛に局在を示すことを明らかにした。ヒト腸上皮細胞でも同様に管腔面に局在を認めた。また、マウスにおいて、SAP-1は胎児期後期より発現を認めるが、生後、発達とともに発現量の増加を認めた。さらにSAP-1の消化管における生理的、病態的意義を検討する目的で、SAP-1ノックアウトマウスを作製し解析を行った。SAP-1ノックアウトマウスの小腸の構造は、光学および電子顕微鏡を用いた検討では、野生型マウスと大きな違いは見いだせなかった。しかし、腸管腫瘍自然発症モデルであるApc minマウスとの交配により、SAP-1の欠損が、大型腫瘍の発生数を抑制することを見いだした。その分子機序に関して現在検索を進めている。
ロドコッカス属細菌における難分解性環境汚染物質分解制御系の網羅的解析

ビフェニル分解菌Rhodococcus jostii RHA1株は2成分制御系BphT1S1によるビフェニル分解酵素系の転写活性化によりPCBなどの難分解性環境汚染物質を分解する能力を有する。本研究では、BphT1によって活性化されるORFをChIP-chipを用いて網羅的に解析した。その結果、BphT1はビフェニル分解酵素以外の遺伝子発現の転写活性化を行っていることが明らかとなった。ロドコッカス属細菌における難分解性環境汚染物質分解制御系の網羅的解析を行うために、始めにRhodococcus jostii RHA1株のビフェニル/PCB分解系の主要な2成分制御系遺伝子bphT1と高い相同性を有するbphT2遺伝子破壊を行った。pK18mobsacBを用いた二次組換え体のサザンハイブリグイゼーション解析から、目的の遺伝子が破壊されていることを確認した。またbphT1/bphT2二重破壊株も同様な方法で作製し、以後の解析のコントロール株として用いることとした。次にRHA1株の全ゲノム配列を網羅的にカバーするマイクロアレイを用いたChIP-chip解析のため、本菌株を用いた免疫沈降法の確立を行った。BphT1抗体(ポリクローナル抗体)を作製し、RHA1株からの全タンパク質を用いたウェスタン解析を行った結果、BphT1以外の非特異的な結合は認められず、今回作製したBphT1抗体がBphT1-DNA複合体の免疫沈降に有効であることを確認した。また、本法によって得られたサンプルDNAを定量的に測定することを目的として、既知BphT1結合領域の定量的PCRを試みた。その結果、既知BphT1結合領域として報告されている5種類のプロモーター領域を区別するプライマーセットを用いることで、これらのDNA断片を特異的に定量できることを確認した。今後、RHA1野生株と今回作製したbphT2破壊株、bphT1/bphT2破壊株をそれぞれビフェニルにさらし、各株からBphT1-DNA複合体を免疫沈降で経時的に単離する。さらに定量PCRによって既知領域が得られていることを確認するとともに、RHA1株のマイクロアレイにハイブリダイゼーションを行うことで、BphT1が結合する新規DNA領域の全ゲノム配列中の網羅的な同定を試みる。Rhodococcus jostii RHA1はポリ塩化ビフェニルおよびフタル酸エステル類などの広範囲の難分解性芳香族化合物を分解する能力を有するグラム陽性の土壌微生物である。本研究では、ビフェニルの代謝に必須である二成分制御系BphS1T1による転写制御系の網羅的解析を行うことを目的とし、BphT1がビフェニル代謝中に転写活性化する領域を特定するためにChIP-chip解析を行った。始めにRHA1染色体上にはBphT1S1と高い相同性を示すビフェニル代謝に必須ではないBphT2S2が存在していることから、bphT2遺伝子破壊株の構築を行った。対数増殖機中期まで生育したbphT2遺伝子破壊株に10mMのビフェニルをさらし、ホルムアルデヒドを添加しDNA-たんぱく質を架橋した。菌体破砕の後、BphT1抗体を用いて免疫沈降を行い、BphT1に特異的に結合しているDNAを単離した。コントロールとしてビフェニルにさらす前の菌を同様に免疫沈降を行いDNAを調整して、RHA1の全ゲノムに対応するマイクロアレイにハイブリダイズした。その結果、ビフェニルに応答してBphT1が結合する100カ所以上の領域を同定した。ビフェニルで生育した菌体ではピルビン酸で生育した菌体と比べて1,000以上の遺伝子発現に変化があったことを報告しており、この結果と統合し新規なBphT1レギュロンを同定した。BphT1はビフェニル代謝酵素遺伝子bphAa、etbAa以外に、転写レギュレーターおよび転写物分解を行うと考えられるエンドリボヌクレアーゼをビフェニルに応答して高発現していることが明らかとなった。この結果は、BphT1はビフェニル分解酵素系を転写誘導する以外に、転写制御因子や翻訳制御を担うORFの転写を活性化するマスターレギュレーターとしてRHA1株のビフェニル代謝に関与していることを示唆している。
大強度イオンビームを用いた材料作製のためのイオン源開発

本研究の目的は、パルスイオンビームを用いた材料作製における動作安定、長寿命、高信頼性を持つイオン源を開発することである。その方法として、従来使用されるフラッシュオーバー方式イオン源の代わりにガスパフ方式イオン源を開発する。平成9年度中での研究内容:1)ガスパフ部及び駆動電源の作製と動作評価。2)ガスパフより発生されたガスをパルス放電により電離・加速するプラズマガン及びその駆動電源の作製と動作評価。以上の研究結果より得られた成果:1)発光観測により、プラズマは均一に生成され、加速されていることを確認した。2)プラズマガンの下流97mmの位置で、中性ガスの熱膨張速度(300m/s)に比べ十分大きなプラズマ進展速度(1Okm/s)を得た。このときのプラズマ電流密度100/Acm^2である。3)窒素ガスを使用した場合、プラズマ中のイオンは主に窒素の1価と2価イオンである。以上の成果より、イオン源のためのプラズマの生成が確認され、次の段階としてのイオンビーム引き出し実験へ進めるための準備ができた。