hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
インテグリン結合タンパクを介したインテグリン機能制御機構の解明と新規治療薬の開発

インテグリン機能に関与する疾患の治療に展開するため、インテグリンαIIbβ3の活性化シグナルにおけるα-actininの役割を検討した。血小板において、αIIbβ3の活性化様式とα-actininの局在やリン酸化の挙動との連関は、種々の生理的アゴニストの受容体からのシグナルに、共通の現象として観察された。巨核球系細胞株CMKでα-actininの発現量を増減させ、血小板で観察されたαIIbβ3活性化におけるα-actininの役割を証明した。α-actininはインテグリンαIIbβ3の活性化のinside-outシグナルに関与して、αIIbβ3の非活性化状態を安定化させる分子の一つであることが示唆された。この研究結果は学術雑誌Bloodに発表した。インテグリン機能に関与する疾患の治療に展開するため、今年度はその標的となりうる分子の解析を行った。ヒト血小板において、インテグリンαIIbβ3の活性化、インテグリン結合蛋白α-actininの挙動、顆粒の放出、細胞内Caイオン濃度を経時的に評価した。2つのトロンビン受容体(PAR1,PAR4)からのシグナルでα-actininの局在とリン酸化にそれぞれ異なるkineticsを認めた。このα-actininの挙動はαIIbβ3の活性化様式や細胞内Caイオン濃度変化と連動していたが、顆粒の放出は別のkineticsをとった。α-actininのリン酸化はphosphataseのSHP-1によって制御された。ヒト巨核球系細胞株のCMK細胞においては、過剰発現した野生型α-actininは内因性のα-actininの効果を増強したが、リン酸化を起こさない変異α-actininは、内因性のα-actininの効果には影響を与えなかった。また、P2Y_<12>ADPレセプター欠損血小板やP2Y_<12>antagonistを用いた解析でも、α-actininの挙動は、αIIbβ3の活性化やVASPのリン酸化と同じkineticsをとった。さらに、αIIbβ3欠損血小板の解析から、PARからのシグナルによるα-actininのリン酸化にαIIbβ3からのoutside-in signa1は関与しないことが明らかとなった。以上、α-actininはインテグリンαIIbβ3の活性化のinside-outシグナルに関与し、αIIbβ3の活性化を制御する分子の一つであり、治療の標的となる可能性が示唆された。前年度の研究で、α-actininがインテグリンαIIbβ3の活性化のinside-outシグナルに関与し、αIIbβ3の活性化を制御する分子の一つとして治療の標的となる可能性が示唆された。平成21年度では、Chinese hamster ovary cellとヒト巨核球系細胞株のCMK細胞において、gene-silencingの手法を用いて目的分子の発現を低下させ、インテグリンαIIbβ3の活性化を評価する方法を確立した。CHO細胞においては、short interfering RNAを用いてILKとtalinをknockdownした。さらに、それらの分子を過剰発現させることでknockdownしたCHO細胞でのαIIbβ3の活性化の表現系が再構成されるかを検討した。この研究結果は第22回国際血栓止血学会で発表し、Bloodに掲載された。CMK細胞では、レンチウイルスのトランスジーンベクターであるFG12を改編し、siRNAを発現させるウイルスを感染させることによってgene-silencingに成功した。ウイルスに感染したCMK細胞においても、生理的な血小板アゴニストによる内因性のαIIbβ3の活性化を評価する方法を確立した。α-actininをknockdownしたCMK細胞と過剰発現させたCMK細胞では、αIIbβ3の活性化において反対の表現系が得られ、α-actininがαIIbβ3のinside-outシグナルに関与して、αIIbβ3の活性化を制御する分子の一つである結果が得られた。これらの研究成果は次年度で発表する予定である。インテグリン機能に関与する疾患の治療に展開するため、前年度に引き続きその標的となりうる分子の解析を行った。ヒト血小板において、生理的アゴニストによるインテグリンαIIbβ3の活性化、インテグリン結合蛋白α-actininの挙動、顆粒の放出、細胞内Caイオン濃度を経時的に評価した。ヒト血小板でのαIIbβ3の活性化様式とα-actininの局在、リン酸化の挙動との連関は、トロンビンのみならず、ADPやトロンボキサンなど生理的アゴニストの受容体からのシグナルに共通の現象として観察された。次に、ヒト巨核球系細胞株のCMK細胞を用いてα-actininの発現量を変化させ、αIIbβ3の活性化を検討した。

野生型α-actininを過剰発現した細胞では、αIlbβ3の活性化が抑制された。一方、shRNAで内因性のα-actininをknockdownした細胞では、未刺激の状態でPAC-1の結合が優位に増加した。さらに、PAR1, PAR4の刺激下においても、コントロールと比べてPAC-1の結合が優位に増加した。これらのPAC-1の結合の増加は、野生型α-actininを過剰発現すると抑制されたが、リン酸化変異型α-actininを過剰発現しても抑制されなかった。以上、α-actininはインテグリンαIIbβ3の活性化のinside-outシグナルに関与して、αIIbβ3の非活性化状態を安定化させる分子の一つであることが示唆された。この研究結果は平成20年度、21年度の研究成果と合わせて、学術雑誌Bloodに発表した(Tadokoro S, et al.A potentialrole for α-actinin in inside-out αIIbβ3 signaling.Blood.2011Jan 6 ; 117(1) : 250-258.)。
震災後の家庭部門の意識変化が省エネ投資や環境施策の効果に与える影響の定量的評価

公的統計や電力・都市ガス会社の統計データをもとにしたマクロ調査によれば,節電意識には地域差があること,電力から他のエネルギー源へのシフトは明確には表れていないこと等が明らかになった。また,震災前後の意識変化・省エネ活動の状況などを調査したネット調査によれば,太陽光発電世帯の方が非導入世帯に比べて震災前から節電・省エネを実践している世帯が多いことや,震災後,太陽光発電導入世帯において買電量が大きく減少していることが明らかになった。さらに意識の経年変化の分析によれば,環境・エネルギー意識が高い太陽光発電導入世帯においても,いわゆる「意識の風化」が進行していることがうかがわれた。本研究は,次の二つの目的の下で実施されている。第一の目的は東日本大震災以降の日本社会における環境・エネルギー意識の変容を震災前の研究成果との比較によって明らかにすることである。第二の目的は,今述べたような環境・エネルギー意識の変容が一般世帯における省エネ投資(省エネ家電への転換,断熱材・二重サッシなどの家屋の改良,太陽光発電など再エネの導入)や省エネ活動(節電,冷暖房設定温度変更等),また補助金など環境施策への感度にどのような影響をもたらしているのかを明らかにすることである。本研究では,近年急速に普及している住宅用太陽光発電に着目し,戸建住宅居住者世帯で太陽光発電を導入している世帯と導入していない世帯とを比較しながら上述の問題に取り組むこととした。平成25年度は,平成24年度の継続的調査(ミクロ調査)としてネットリサーチによって,太陽光発電導入世帯と非導入世帯における震災前後の意識の変化,省エネ活動への取り組み,電力消費量の変化などを明らかにした。調査結果は平成24年度のものとほぼ同じであった。省エネ・節電・環境意識に関して太陽光発電導入世帯と非導入世帯とを比較した場合には,太陽光発電導入世帯の方が震災前から節電・省エネを実施している世帯が多く,また震災後,再生可能エネルギーに関心を寄せている世帯が多いという違いが見られた。非導入世帯における再生可能エネルギーへの関心は平成24年度に比べて低下していることも明らかになった。また,太陽光発電導入世帯について詳細調査を行うと,震災前には太陽光発電システムと同時に導入されることが多かったオール電化が,震災後には導入が避けられる傾向にあることがわかった。さらに,震災後,太陽光発電導入世帯では震災前に比べ買電量は大きく減少していることが明らかになった。非導入世帯でそれほど買電量の減少が見られないこととは対照的であった。本研究は,第一に東日本大震災以降の日本社会における環境・エネルギー意識の変容を,第二にそれらの意識の変容が一般世帯の省エネ投資(省エネ家電への転換、断熱材・二重サッシ・夜間蓄冷蓄熱機器・太陽光発電等の導入)や省エネ活動(節電・冷暖房設定温度変更等),また補助金など各種環境施策への感度にどのような変化をもたらしているのかを,震災前の研究成果との比較によって明らかにすることを目的としている。平成24年度は,マクロとミクロの2通りのアプローチによって震災前後の環境・エネルギー意識の変容および省エネ投資・省エネ活動の実態を明らかにした。前者では公的統計や電力・都市ガス会社の統計データを基に震災前後の一般世帯のエネルギー消費量の違いを明らかにした。後者ではネットリサーチによって,太陽光発電導入世帯と非導入世帯における震災前後の意識の変化,省エネ活動への取り組み,電力消費量の変化などを明らかにした。マクロ調査では地域ごとに震災後の一般世帯の節電量に違いがあること(つまり節電意識には地域差がある可能性が指摘できること),電力から他のエネルギー源へのシフトは明確には表れていないことなどが明らかになった。ミクロ調査において省エネ・節電・環境意識に関して太陽光発電導入世帯と非導入世帯とを比較した場合には,太陽光発電導入世帯の方が震災前から節電・省エネを実施している世帯が多く,また震災後,再生可能エネルギーに関心を寄せている世帯が多いという違いが見られた。本研究は,第一に東日本大震災以降の日本社会における環境・エネルギー意識の変容を,第二にそれらの意識の変容が一般世帯の省エネ投資や省エネ活動にどのような変化をもたらしているのかを明らかにすることを目的としている。平成26年度は,太陽光発電システム導入世帯400世帯と非導入世帯400世帯を対象としたミクロ調査(インターネット・アンケート調査)によって,環境・エネルギー意識の経年変化を明らかにした。

平成24年および平成25年に実施した調査結果によれば,太陽光発電システム導入世帯においても非導入世帯においても半数以上の世帯で震災後に節電・省エネ意識が高まり,同時に再生可能エネルギーへの関心も高まっていることが示された。しかし,太陽光発電導入世帯と非導入世帯の比較からは,省エネ投資に至るには経済状況の差が強く影響していることが示された。また,平成24年および平成25年の調査結果を比較すると,節電・省エネ・再エネ導入に関する意識は大震災からの時間の経過によって明確に減少している傾向も判明した。研究期間全体を通じて得られた研究成果としては,次のことが明らかになった。まず,公的統計や電力・都市ガス会社の統計データを基にしたマクロ調査によれば,節電意識には地域差があること,電力から他のエネルギー源へのシフトは明確には表れていないことなどが明らかになった。また,震災前後の意識変化・省エネ活動・電力消費量の変化などを調査したミクロ調査によれば,太陽光発電導入世帯の方が非導入世帯に比べて震災前から節電・省エネを実施している世帯が多いという結果や震災後,太陽光発電導入世帯では震災前に比べ買電量が大きく減少している結果が得られた。さらに意識の経年変化の分析によれば,環境・エネルギー意識が高い太陽光発電システム導入世帯においても,いわゆる「意識の風化」が進行していることがうかがわれた。建築設備平成25年度は計画通りにネットリサーチによる調査(ミクロ調査)の実施ができた。本研究では,近年急速に普及している住宅用太陽光発電に着目し,戸建住宅居住者世帯で太陽光発電を導入している世帯と導入していない世帯とを比較する手法をとっているが,ネットリサーチを利用して,太陽光発電導入世帯と非導入世帯それぞれ400世帯ずつを対象にアンケートを実施した。ネットリサーチによって,太陽光発電導入世帯と非導入世帯における震災前後の意識の変化,省エネ活動への取り組み,電力消費量の変化などを明らかにできた。すなわち,太陽光発電導入世帯の方が震災前から節電・省エネを実施している世帯が多く,また震災後,再生可能エネルギーに関心を寄せている世帯が多いこと,また太陽光発電導入世帯では震災前に比べ震災後は買電量は大きく減少していること等,平成24年度調査結果と同様の結果が明らかになった。以上のように,震災後の一般世帯における環境・エネルギー意識の変容,省エネ投資や省エネ活動への取り組みの変化を明らかにすることができ,おおむね順調に研究が進展したと考えられる。平成24年度は計画通りにマクロ調査およびミクロ調査の実施ができた。マクロ調査では公的統計や電力・都市ガス会社の統計データを基に震災前後のエネルギー消費量の違いを明らかにできた。すなわち,地域ごとに震災後の節電量に違いがあること(つまり節電意識には地域差がある可能性が指摘できること),電力から他のエネルギー源へのシフトは明確には表れていないことなどが明らかになった。ミクロ調査では,ネットリサーチによって,太陽光発電導入世帯と非導入世帯における震災前後の意識の変化,省エネ活動への取り組み,電力消費量の変化などを明らかにできた。
生涯スポーツとしての体操競技におけるトレーニング環境整備モデル作成

本研究は、わが国における「生涯スポーツとしての体操競技」のトレーニング環境整備に関する事例を提示を目的とする。それにあたり先ず、ドイツにおける「生涯スポーツとしての体操競技」のトレーニング環境を調査した。その結果ドイツでは体操クラブや「大学スポーツ」が存在しており、人々はそこで体操競技を楽しむことができる。一方のわが国では、大学体操競技部に外部の体操競技愛好家が練習参加する、合同練習方式が一般的である。従って、わが国における「生涯スポーツとしての体操競技におけるトレーニング環境整備」について考える際には、大学の課外活動を基盤とした地域に解放されたスポーツクラブ形式が適していると考えられよう。本研究は、わが国における、「生涯スポーツとしての体操競技」におけるトレーニング環境整備モデルの提示を目的とする。これにあたり、ドイツ連邦共和国における「大学体育施設を利用したスポーツクラブの実態調査」を経て、わが国の大学の体育施設を利用したシニア向けスポーツクラブの運営および指導体制について検討する。特に重視すべき研究課題は次の2点である。1大学の正課・課外活動との共存2スポーツクラブの指導体制以上の研究課題に関して、申請者の勤務校で開催するシニア向けスポーツクラブの運営を通して、「大学体育施設を利用したシニア体操競技選手のトレーニング環境整備モデル」を示す。上記の研究課題に対して平成28年度は、スイス連邦のベルン大学を訪問し、大学スポーツ(課外活動)としての器械運動の実施場面を視察することができた。ドイツやスイスといったヨーロッパにおけるドイツ語圏の国々では、日本のように「部活動」としての課外活動ではなく、学生・教職員などを対象とした福利厚生事業の一環として「大学スポーツ」が開催されている。大学スポーツでは当該大学の教員のみならず非常勤の指導者が指導に当たっている。シラバスなども準備されており、上記の参加対象者が様々なニーズのもとでスポーツ活動に参加していることが分かった。今回視察したベルン大学では実に110種目以上の種目が開設されていた。器械運動では、体操競技にこだわらず、器械・器具を用いた多様な運動を楽しんでいる姿が印象的であった。研究課題1に対しては、わが国における課外活動(部活動・サークル活動)とは異なり、課外活動としてのスポーツは、大学が様々なスポーツ活動の場を保証していることが明らかになった。この結果、部活動文化がベースになっているわが国においては、上記のような大学スポーツ文化を取り入れる際には、独自の工夫が必要になることが示唆された。当初はドイツにおける大学の課外活動を視察する予定であったが、2016年の欧州選手権視察と合わせて、同じドイツ語圏のベルン大学にて活動を視察することにした。同年9月にはドイツにおけるアウグスブルグ大学、カールスルーエ大学を視察した。当時は夏休み期間中であったが、大学におけるスポーツ施設の状況を調査することができた。現時点で、本研究におけるハード面に関する調査をおおむね終えることができた。次年度からは指導体制というソフト面に注目する予定である。本研究は、わが国における「生涯スポーツとしての体操競技」におけるトレーニング環境整備モデルの提示を目的とする。これにあたり、ドイツ語圏における「大学体育施設を利用したスポーツクラブの実態調査」を経て、わが国の大学の体育施設を利用したシニア向けスポーツクラブの運営および指導体制について検討する。平成29年度はドイツ体操祭を訪問し、ドイツにおけるスポーツフェラインでの体操競技のトレーニング環境について、参加者からヒアリングを行った。スポーツフェラインでは、公営のスポーツ施設のみならず地域の学校の体育館を利用して活動しているところもあるという。ドイツではわが国のような「部活動」が存在しないため、放課後の施設は、学生や地域のスポーツクラブが使用することになる。とりわけ、わが国では体操競技に関する公的な施設が非常に少なく、生涯スポーツとしての体操競技のトレーニング環境整備においては「学校」が重要な役割を担うことが明らかになった。すなわち、学校の「体操競技部」を活動拠点とするのである。2017年6月にスイス連邦のチューリヒを訪問し、チューリヒ大学におけるスポーツ施設の状況を調査する。その後は、大学スポーツにおける器械運動の指導内容について、具体的な内容呈示に努める予定である。この内容を踏まえ、わが国における大学体育施設を利用した体操競技のスポーツクラブの在り方について検討し、本研究のまとめとする予定である。

スポーツ運動学、生涯スポーツ論平成28年度に購入予定であったデスクトップ型パソコンを未購入のため次年度使用額が生じた。現在使用しているパソコンからの科研費にかかわるデータ移行の準備が整い次第、デスクトップ型パソコンを新規購入する予定である。
HIVアクセサリー・タンパクの構造と機能の解析研究

HIVタンパクの構造解析を行うプログラムの開発に取り組んだ。本年度は昨年度に引き続きプロテアーゼ阻害剤に対して薬剤耐性を獲得したプロテアーゼの構造予測に取り組んだ。薬剤耐性検査で得られた集合配列結果からクローニングをしないで単一配列候補を書き出すためのプログラムを作成し、その質的妥当性を検証するために、4症例について実際にクローニングをして実在する配列の確認を行った。其々の症例について10個前後の配列を特定した。プログラムによる結果と比較すると実査に得られた配列は作成したプログラムで得られたものよりも収束した配列群であることが明らかになった。これをもとにDeepView Swiss Prot ViewerとAMBER MD package version 8.0を用いて構造予測を行い、構造学的な視点から配列の収束について考察を行っている。本年度は新たにRNaseHの構造について核酸系逆転写酵素阻害剤耐性変異との関連について取り組んだ。100症例(未治療50例、薬剤耐性例50例)の逆転写酵素配列の解析を行い、核酸系逆転写酵素阻害剤耐性変異とRNaseH領域の変異についての連鎖解析を行った。関連が予測された変異をRNaseH上にプロットし、その構造学的意味についての考察を進めている。HIVタンパクの構造解析を行うプログラム開発のために本年度はプロテアーゼ阻害剤に対して薬剤耐性を獲得した16症例についてそのプロテアーゼの構造予測を試みた。通常の薬剤耐性検査で得られた遺伝子配列データは単一の配列ではなく、複数の配列の平均値として得られることから、そのままでは特定できない箇所が観察されることがある。そして特定できない箇所が複数個あると構造予測が困難となる。この問題を解決するために本年度は次のような実験に取り組んだ。(1)薬剤耐性検査で得られた集合配列結果から単一配列候補を書き出すためのプログラムを作成した。作成したプログラムを用いて特定できない箇所を考慮したうえで16症例について結果から予測される単一配列候補リストの作成を行った。(2)作成したプログラムの質的妥当性を検証するために、16例中4症例については薬剤耐性検査で解析した遺伝子をクローニングして実際に存在する配列の確認を行った。
情報教育担当教員のための教授スキル研修システムの開発

情報化にかかわる教員の資質向上を目的として開発した「教授スキル研修システム」を活用した研修にかかわる活動として、以下の活動を行った。(1)国内共同研究に参画し、情報教育の指導者育成の中核となる高等学校普通教科「情報」の教育内容、指導方法、必要な教授スキル等について検討した。(2)国内共同研究に参画し、学校の情報化を推進するための中核的存在と位置づけられている「司書教諭の情報化」を対象とする研修カリキュラム、指導方法、必要な教授スキル等について検討した。さらに、研修教材や研修システムを開発し、その評価・改善を通して、必要な教授スキル等を検討した。(3)教育の情報化に関する先進諸外国の教育・研修システムに関する情報を収集し、研修システムの運用にかかわる知見の収集を行った。(5)「教授スキル研修ゲーム」等を活用した実践を通じて、「情報科」や「司書教諭の情報化」の遠隔共同研修の展開方法について検討した。さらに、上記活動を通して得た成果を学会論文や研究発表等により公表した。情報教育担当教員の教授スキルを育成するための「研修システム」に関連して、(1)次期学習指導要領で、新たに実施されることになった高等学校普通教科「情報」の教員需要を収集可能なデータに基づいて予測し、情報教育担当教員の養成や研修を実施する際に配慮すべき事項等について検討した。また、関連する国内共同研究プロジェクト等に参加し、知見を収集するとともに、研究成果を適用した研修の在り方について検討を重ねた。(2)情報科の授業実施でのポイントとなる「課題解決型」授業スタイルを中心とした教授スキル項目のうち、特に、授業の準備段階にかかわる項目について、大学の教職課程における授業等の演習を通して検討した。(3)教育の情報化と題材として、メディア教育開発センターのSCS(Space Collaboration System)を活用した実践等を通して、遠隔研修を運用する際に配慮すべき知見の収集を行った。(4)開発中の「教授スキル研修ゲーム」を来年度以降ネットワークに対応させるために必要となる開発環境を検討し、その整備を行った。といった活動を実施し、その成果を学会論文や研究発表等により公表した。
霊長類ロコモーションにおける体肢の関節運動動態と体幹姿勢

1)ニホンザルの水平四足歩行における体肢運動パターンと体幹姿勢の変化の関連についての分析を行なった。双方とも、運動を包括的に把握するため、上肢セグメント、下肢セグメント、体幹セグメントという包括的な単位でわけたときに、関節角度の変化によって生じる各セグメントの長さの変化を分析対象とすることとした。体幹については空間中における長軸のなす角度の変化を分析の対象とした。実験と分析によって両者間の関係を明らかにすることができた。2)体肢運動は無制限に行なわれるわけではない。関節面の形状と、関節周囲の軟部組織による制限を受ける。一方、運動解析はこのような事実を顧みることなく、標点の変位だけに基づいて実施される。特に回旋運動のような現在の運動解析の精度ではとらえにくい運動については、解剖学的構造と運動許容度の関連を厳密に理解する必要があることに思い至った。この問題を解決するために、関節の受動的可動域を計測する技術を開発し、その結果を種特異的運動様式と関連付けることができた。3)運動時の体幹姿勢の制御が適正に行なわれるためには、体肢の関節の状態についての情報が正確にフィードバックされる必要がある。各関節ではこの情報収集を担うために特定の筋が利用されている可能性があると考えた。そこで肩関節でこのような働きをしている可能性のあるいくつかの筋について筋紡錘の定量的分析を試みた。その結果、筋紡錘数には種差があり、その差を運動様式の差と関連付けることができた。4)一連の実験を実施する過程で、連続的な歩行路などを用いた場合には、樹上性霊長類が本来有している運動特性を模擬出来ていない可能性に直面した。そこで、現実の樹上環境により近い実験条件として、梯子状の歩行空間を導入することとし、この環境での実験をニホンザルを用いて行なった。平成17年度は、霊長類の体肢関節構造の形態学的適応を中心に研究を行なった。1)前肢について、原猿3種(ワオキツネザル、スローロリス、ガーネットガラゴ)の肩甲上腕筋群の全筋連続切片を作製し、組織計測学的検討を行なった。筋組織に加えて特に筋紡錘の定量を行なった。結果は、緩慢な樹上四足歩行を行なうスローロリスにおいて筋紡錘数が少なく、跳躍を運動様式の中に含むワオキツネザルとガーネットガラゴでは筋紡錘数が多かった。このことは、運動中体幹姿勢を伸展位に固定する跳躍型霊長類では肩関節角度の調節が重要であるのに対し、柔軟な体幹運動によって姿勢を調整しながら移動するスローロリスでは肩関節の筋は筋力産生型の傾向が強いことを示している。(本研究結果については第59回日本人類学会大会にて報告し、"Cells, Tissues and Organs"誌に投稿中)2)後肢について、先と同じ原猿3種を用いて、移動運動中の体幹姿勢に大きな影響を及ぼすと考えられる膝関節について、膝関節の靭帯標本を作製し、電子式ゴニオメータを用いて受動的関節可動域を調べた。その結果、全体的な可動域は類似しているが、スローロリスにおいては膝関節伸展時の回旋運動域が大きいこと、ガーネットガラゴでは膝関節屈曲時の内外転運動域が広いことを認めた。これらの関節可動域の特徴はそれぞれの種特異的ロコモーターパターンによって解釈することができた。(本研究結果については現在「形態科学」誌に投稿中)3)運動について、ニホンザルの二足歩行および四足歩行時の足関節の運動について、足底圧分布の計測によって検討した。

その結果、足底圧の中心は、四足歩行時には足根部から第3、4趾にむけてまっすぐ進むのに対し、二足歩行時には足の外側を通った後、中足骨頭付近で内側に移行することを示した。(本研究結果は第22回日本霊長類学会大会にて報告)本年度は、実験室内の模擬的樹上環境におけるニホンザルの移動運動について定量的分析を行なうことを中心にした。霊長類におけるこの種の実験では、従来は平坦な歩行路や長いスチールパイプによって実験環境を構成することが行なわれてきた。しかしながら、現実の樹上環境では支持基体が不連続であり、このような連続的歩行環境を用いた実験では生態学的妥当性に問題があると考えた。本研究計画では、特に樹上における体幹運動と体肢の関節運動動態に着目して、種特異的な運動様式と形態特徴の関連を分析しようとしているが、この関係の分析が適切に行なわれるためには、本来その種が自然環境下で用いている運動様式を発現させる必要がある。そこで、本年は不連続な支持基体による模擬的環境構成として水平梯子の運動環境を構築した。これは長さ5mのスチールパイプ2本を、地表面から70cmの高さに、100cmの間隔をおいて平行に設置し、2本のスチールパイプに直行するスチールパイプを一定間隔で複数ならべたものである。直行するスチールパイプ間の間隔は40cmから80cmまで、10cm刻みで変化させた。ニホンザル2順について、この水平梯子上を四足性に、非牽引的に移動するように訓練し、2台のデジタルビデオカメラによって体幹および体肢の運動を記録し、観察した。その結果、間隔が70cmを越えると、後肢が交替性に1サイクル完了する間に、両側前肢が同期的に2回のサイクルを完了するという従来知られていなかった運動様式が生起することを発見した。この運動様式の発現には中枢プログラムの切換が起こっている可能性もある。この運動様式について主としてフットフオールパターンの解析を行なうとともに、体幹および体肢の主要な関節回転中心の運動変位についてのデータも記録した。運動変位データについては現在分析途上にある。1)実験室に設営した模擬的樹上環境としての水平ポール上におけるニホンザルの四足性移動時の標点変位を記録した。この結果に基づいて体幹長(肩峰と大転子の距離として定義)の変化と四肢のみかけの長さ(前肢については肩峰と尺骨茎状突起間の距離:後肢については大転子と腓骨外果の距離)の関係を分析した。その結果、a)体幹長は後肢の立脚相で延長し、後肢の遊脚層で短縮すること、b)前肢・後肢ともに体幹長の延長期と収縮期のそれぞれにおいて1回の延長・短縮期を示すこと、c)前肢・後肢の長さの変化は逆相になっていること、d)肩峰背腹方向の運動は主として後肢によってもたらされること、が示された。2)より生態学的妥当性の高い模擬的樹上環境として水平梯子上でのニホンザルの四足性移動分析については、前年度に実施した歩容分析に加えて体肢の関節角度について分析した。水平梯子の間隔を変化させると、体肢関節の運動動態が変化する。間隔が増加するにしたがって、関節の運動域も増加するが、この変化はとりわけ後肢関節において顕著であった。このような実験条件において、前肢は支持基体の位置を探索するリーチングの機能を示したと考えた。なお、この実験系は申請時においては構想していなかったが、実験を進める中で有効性を見出したため、追加したものである。3)形態学的分析としては、体肢関節の運動
破骨細胞を調節するシグナル伝達系と骨・歯周疾患における骨破壊機序の解明

破骨細胞の分化と機能を調節するシグナル伝達系の解析を目指してきた。PGE_2は、骨芽細胞の破骨細胞分化因子(RANKL)を誘導することは広く知られているが,破骨細胞前駆細胞に対しても強力に作用する。今回我々は,マウスとヒト破骨細胞形成におけるPGE_2の作用を解析し、以下の結果を得た。(1)PGE_2は、RANKL駕誘導するマウス骨髄マクロファージとマクロファージ細胞株RAW264細胞の破骨細胞への分化を促進した。PGE_2による促進効果は、cAMP-PKAの活性化により誘導された。(2)TGF-βactivated kinase 1(TAK1)が、PKAがリン酸化するモチーフ(RRXS)を有することを見出した。TAK1はPGE_2刺激でリン酸化され、H89はそのリン酸化を抑制した。(3)412番目のSerをA1aに置換したS412A-TAK1を発現させたRAW264細胞では、PGE_2の促進作用が消失した。(4)PGE_2は、RANKLおよびM-CSFが誘導するヒトCD14陽性細胞から破骨細胞への分化を強力に抑制した。H89はPGE_2による抑制作用を解除した。(5)CD14陽性細胞はPGE_2に反応して、強力な破骨細胞形成抑制因子を産生した。この抑制因子は、マウス破骨細胞形成も強力に抑制した。(6)CD14陽性細胞が産生する破骨細胞形成抑制因子は,破骨細胞形成を抑制することが知られている既知のサイトカイン(GM-CSF,IL-4,INF-γ)ではなく、新規のサイトカインである可能性が示された。以上の知見より、マウスとヒトの破骨細胞形成に対して、PGE_2は異なる作用を有することが明らかにされた。また、ヒト破骨細胞前駆細胞はPGE_2に反応して、破骨細胞形成を抑制する新規のサイトカインを産生することが示された。目的:骨吸収を司る破骨細胞の分化と機能は骨芽細胞により調節されている。最近、骨芽細胞の細胞膜上に発現し破骨細胞の分化と機能を調節するTNFファミリーに属する破骨細胞分化因子ODF/RANKLがクローニングされ、骨芽細胞による破骨細胞の分化と機能誘導機構が解明された。本研究は、破骨細胞の分化と機能を調節するシグナル伝達系の解析、及び代謝性骨疾患の骨吸収メカニズムを解明することを目的とした。今回我々は、(1)PTH/PTHrPレセプターを導入して樹立したヒト骨芽細胞様株細胞SaOS4/3細胞を用い、RANKLとM-CSFの発現様式を解析した。また、(2)骨芽細胞の細胞内カルシウムがRANKLの発現に及ぼす作用を解析した。結果:(1)SaOS-4/3細胞とマウス骨髄細胞の共存培養系にPTHを添加すると多数の破骨細胞が形成された。PTHはSaOS4/3細胞のRANKLとM-CSFmRNAの発現を共に誘導した。また、SaOS-4/3細胞の発現するRANKLとともにM-CSFはともに膜結合型として破骨細胞前駆細胞に提示されることが示された。(2)マウスの共存培養系において、A23187とIonomycinは破骨細胞の形成を誘導した。また、高濃度のカルシウム(10-30mM)存在下で共存培養を実施した場合も、破骨細胞形成が促進された。PKCの賦活剤であるPMAも共存培養系で破骨細胞形成を促進した。これらいずれの条件下においても、骨芽細胞におけるRANKLmRNAの発現とともにOPGのmRNAの発現上昇も観察された。考察:骨芽細胞の発現するM-CSFとRANKLはともに膜結合型として破骨細胞前駆細胞に提示された。また、骨芽細胞の細胞内カルシウム上昇はPKCを活性化し、そのシグナルがRANKLの発現を誘導した。これらの機序は、破骨細胞が骨組織にのみ形成される機序を説明するものと考えられた。本研究では、破骨細胞とその前駆細胞である骨髄マクロファージの機能に対するLPSの効果を解析し、以下の結果を得た。(1)破骨細胞と骨髄マクロファージはともにLPSの受容体であるTLR4とCD14mRNAを発現しており、LPSは両細胞のNF-κBを活性化した。純化した破骨細胞は48時間以内に死滅したが、LPSは破骨細胞の延命を促進し、更に吸収窩形成能を誘導した。一方、LPSは骨髄マクロファージの延命を促進しなかった。(3)LPSは骨髄マクロファージのIL-1β、TNFα、IL-6の産生は強く促進したが、破骨細胞のそれらのサイトカインの産生を全く促進しなかった。(4)p38MAPKの当為的阻害剤であるSB208530は、共存培養系で活性型ビタミンDが誘導する破骨細胞形成を抑制したが、骨器官培養系での骨吸収の亢進を抑制しなかった。骨芽細胞培養系において、SB208530は活性型ビタミンDが誘導するRANKLの発現を抑制しなかった。M-CSFとRANKLの存在下で、骨髄マクロファージは破骨細胞に分化したが、RANKL添加時にSB208530を短時間同時に処理するだけで、破骨細胞誘導は完全に抑制された。

(5)純化した破骨細胞はアポトーシスにより48時間以内に死滅したが、RANKLは破骨細胞の延命を促進し、更に吸収窩形成能を誘導した。SB208530は、RANKLが誘導する破骨細胞の延命と吸収窩形成を全く阻害しなかった。(6)破骨細胞と骨髄マクロファージはともに同じレベルのp38MAPKを発現していた。RANKLは骨髄Mfのp38MAPKのリン酸化を促進したが、破骨細胞のp38MAPKのリン酸化を全く促進しなかった。(6)IL-1とLPSは骨髄Mfのp38MAPKをリン酸化したが、破骨細胞のP38MAPKのリン酸化を促進しなかった。破骨細胞前駆細胞並びに純化した破骨細胞を用いて、破骨細胞の分化と機能を調節するシグナル伝達系を解析した。また骨吸収抑制薬であるビスフォスホネート(BP)の作用機序を解析した。更に、OPG欠損マウスを用いて骨吸収と骨形成の連関を解析し、以下のような結果を得た。(1)破骨細胞の分化と機能を調節するシグナル伝達系の解析し、(1)LPSとIL-1はPI3KとAKtを活性化し、破骨細胞の機能を誘導すること、(2)破骨細胞前駆細胞である骨髄細胞マクロファージ(MΦ)は、LPSに反応して炎症性サイトカインを産生したが、破骨細胞は産生しないことが明らかにされた。(2)p38MAPK阻害剤SB208530(SB)を用いた解析し、破骨細胞への分化にp38MAPKシグナル系がとりわけ重要であることが示された。(3)LPSとIL-1による破骨細胞形成促進機構を解析し、(1)LPS/IL-1は直接骨芽細胞に作用し、Ca/PKC-MEK/ERK経路の活性化を介してRANKL発現を誘導すること、(2)PGE_2産生誘導を介して間接的にOPGの発現を抑制することが明らかとなった。(4)破骨細胞によるBPの取り込み機構を解析し、BPの取り込みと破骨細胞による酸分泌の相関性が明らかにされた。BPは酸を分泌する破骨細胞に特異的に取り込まれ、細胞骨格を破壊することが示された。(5)OPG欠損マウスにBPを投与し、骨吸収と骨形成の代謝共役を解析した。(1)骨形態計測により、OPG欠損マウスは、骨吸収マーカーと骨形成マーカーが共に亢進していた。(2)BP投与により、骨吸収マーカーの低下と共に骨形成マーカーの著明な低下が認められた。(3)血清ALP活性は、OPG欠損マウスでは高値を示したが、BPの投与により正常値以下まで低下した。以上の結果は、骨吸収と骨形成は共役しており、共役因子が実際に存在する可能性が示された。本申請研究を遂行し、以下の結果を得た。1.破骨細胞前駆細胞(骨髄細胞マクロファージ)のサイトカイン産生、貧食および樹状細胞への分化にp38MAPKシグナルは必要ではないが、破骨細胞への分化に必須であることを見出した。2.OPG欠損マウスを用い、LPSとIL-1は骨芽細胞のRANKL発現を誘導すること、更にLPSとIL-1はPGE_2産生を介してOPGの発現を抑制することが破骨細胞の誘導に必要であることを証明した。3.MyD88欠損マウスを用い、LPSとIL-1は骨芽細胞において、MyD88を介しPKC-ERKシグナル系を活性化してRANKL発現を誘導することを明らかにした。また、LPSとIL-1はMyD88を介して破骨細胞を活性化することを証明した。4.菌体成分ムラミルジペプチド(MDP)はMyD88シグナルを介し、LPSとIL-1によるRANKL発現誘導を更に促進することを明らかにした。この促進機構はNod2の発現誘導を介することを示した。
ナノ界面制御技術を用いた機能紙の創製

本研究では紙と機能材料を複合化する新しい手法として、ナノ界面制御技術を利用して紙表面上でナイロン膜を直接合成・定着させることを試みた。有機溶媒の種類および水溶性モノマーであるエチレンジアミン濃度を変化させることで、カプセル状、ファイバー状および多孔状のナイロン膜が生成することが分かった。今後はこれらの形状を利用した応用展開を図るとともに制御技術の向上を図る。本研究では、"紙表面上のナノ界面制御"をキーワードに、紙の表面機能化を試みた。ナノ界面制御とは、紙表面上に形成したナノ界面領域を利用して、紙表面上で機能材料の合成と定着を同時に行う手法である。本年度は、エチレンンジアミンと二塩化テレフタロイルを用いて、ナイロン膜がマイクロカプセル状になる現象の解明を試みた。有機溶媒としてシクロヘキサンを用いることにより、マイクロカプセル状ナイロン膜が生成する。検討項目として、反応時間および基材がマイクロカプセル状ナイロン膜の形態に及ぼす影響を検討した。基材としてろ紙、エチレンジアミン濃度は25%、有機溶媒としてシクロヘキサンを用いて界面重合反応を行い、反応時間は1分-24時間で行った。反応時間が1分の場合、マイクロカプセルの径は、22.5μmに対し、反応時間が10分以上のマイクロカプセルの径は約4-5μmであった。このことから、反応時間が長くなるにつれ、マイクロカプセルの径は大きくなり、10分経過するとマイクロカプセルの径は変化しないと考えられる。基材がナイロン膜の形態に及ぼす影響を検討するために、ろ紙および不織布を用いた。実験条件は、有機溶媒としてシクロヘキサン、エチレンジアミン水溶液濃度は25%、反応時間1時間で行った。不織布を用いた場合、形成したマイクロカプセルの数がろ紙の場合と比較して、多く確認された。本実験の結果、基材の違いにより、その生成数が変化することが分かった。これらの結果より、ろ紙と不織布の表面構造因子や孔径の違いのような物理的な性質が一因であると考えられる。また、親水性であるろ紙と疎水性である不織布といった化学的な性質もまたそのような結果を引き起こした原因と推測される。これら物理的、化学的因子の差異により、基材の表面張力が変化したことから、形状が変化したと考えられる。電子顕微鏡およびFT-IR解析の結果、本手法により紙表面上でのナイロン膜の生成が確認できた。有機溶媒にシクロヘキサンを用いて界面重合処理した場合、カプセル状のナイロン膜が形成した。カプセル径を測定した結果、エチレンジアミン濃度2.5%では約0.50μm、5%では約0.65μm、10%では約0.78μm、25%では約1.07μmのマイクロカプセルが生成し、エチレンジアミン濃度の増加に伴い、カプセル径が大きくなる傾向を示した。有機溶媒としてシクロヘキサン:クロロホルム=3 : 1混合液を用いて界面重合処理を行った場合、エチレンジアミン濃度の増加に伴い膜形態が変化することが明らかとなった。エチレンジアミン濃度2.5%を用いた場合では紙表面上に多孔状のナイロン膜を形成した。それに対し、エチレンジアミン濃度25%を用いた場合にはファイバー状のナイロン膜を形成した。前者の多孔状構造の孔径は約1.66μmだった。後者のファイバー状高分子のファイバー径は約0.39μm(=390nm)でサブミクロンサイズのナノファイバーだった。エチレンジアミン濃度2.5%の調製条件で多孔状構造だった膜は、5%ではドーム状の構造、10%ではマイクロメートルオーダーのファイバー状高分子、25%ではナノファイバーで構成されるナイロン膜を形成した。ナノファイバーおよび多孔状構造の形成に関しては、拡張係数以外にエチレンジアミンおよび二塩化テレフタロイルの油相および水相におけるそれぞれの平衡分配係数、合成したポリマーの重合度、紙の表面自由エネルギーなどの因子が存在すると推測される。
シラ-Witting転位反応の開発とその有機合成化学的応用

α-アルコキシ有機リチウム化合物ではWittig転位反応が進行することがよく知られている。本申請者は、これまでに、ケイ素上にアリルオキシ基を有する(アリルオキシシリル)リチウムを、シリルスタンナンのスズ-リチウム交換から生成させて、[2,3]Wittig型転位反応(シラ-Wittig転位)が進行することを見いだした。これによって、さまざまな3級アリルアルコール誘動体を、官能性アリルシランへ変換する新規合成法を確立した。平成8年度では、2級アリルアルコール誘導体において、ケイ素上をο-トリル基のようなかさだかい置換基で立体的に保護することにより、アリルシランを合成することに成功した。また、3級プロパギルアルコール誘導体においてもシラ-Wittig転位が進行することをみいだし、アレニルシランを合成した。上記の転位によって得られたアリルシランを過酸化水素酸化することにより、アリルアルコールへと変換した。すなわち、シラ--Wittig転位と過酸化水素酸化を組み合わせることで、アリルアルコールの[1,3]骨格変換を達成した。次に、シラ-Wittig転位における酸素原子を窒素原子におきかえた、アザ-シラ-Wittig転位の開発をおこなった。[(アリルアミノ)シリル]スタンナンからシリルリチウムを生成した場合、12-crown-4を加えることにより、アリルシランを合成することができた。また、2級アミンをn-BuLiでリチオ化し、ジフェニルジハロシランと反応させて(アミノ)ハロシランを得た。これとリチウムから生成したシリルリチウムでは、12-crown-4を添加しなくても速やかに転位が進行し、対応するアリルシランが生成した。以上の転位反応は、立体選択的な炭素骨格形成に有用な反応として、有機合成化学的な応用が期待できる。
ハニカムマイクロアレイを用いた次世代型歯周組織再生医療の創生

本研究は、トポグラフィー作用を有するハニカムマイクロフィルムとCaイオン濃度などの細胞外微小環境の調節技術を組み合わせることで新規スキャフォールドを開発し、歯周組織再生治療テクノロジーを創生しようというものである。その結果、生体吸収ポリマー製ハニカムフィルムによるヒト歯根膜細胞シート作製の可能性を示すと共に、無機イオンによる歯周組織細胞の分化誘導にprostaglandin E2のオートクライン作用が重要であることに加えて、ナノ化ハイドロキシアパタイトによるBMP-2産生誘導を明らかにした。以上の結果、歯周組織細胞の増殖と分化の両方を誘導可能な新規スキャフォールド開発の基盤が確立された。本研究は、細胞に対してトポグラフィーを有するハニカムマイクロアレイフィルムを応用した進化型歯周組織再生治療を創生することを目的として、スキャフォールド技術と細胞環境コントロールを組み合わせることを着想した。ハニカムフィルムに作製した歯根膜細胞シートとサイトカインあるいは細胞外無機イオン(Ca^<2+>,PO_4^<2->)を同時に投与することで、より細胞にとってbiomimetics(生体模倣)に優れた環境を与えて、高い効率で歯周組織再生を行おうというものである。平成23年度は(1)ハニカムフィルムの開発ならびに(2)歯根膜(PDL)細胞に与える細胞外無機イオンの影響と無機イオン徐放性担体の開発を目指して研究を進めた。まずPDL細胞シート作製の至適条件を明らかにするために、polysterene (Pst)およびpoly(ε-caprolactone)(PCL)製のハニカムフィルムを作製して同フィルム上でPDL細胞を培養して4週間後に増殖と分化を評価した。その結果、孔径10μmのフィルムではいずれの材料を用いて生成してもPDL細胞がシート状構造を形成することが明らかとなった。一方、PDL細胞の分化についてオステオポンティン(OPN)発現および石灰化能を指標として検討したところ、Pst製フィルム上で培養した場合にはOPN mRNAおよびタンパク発現の上昇に加えて石灰化ノジュールの形成を生じることが示された。以上の結果からハニカムフィルムによるトポグラフィー効果は単にPDL細胞の増殖のみならず分化を亢進することが分かった。ただし硬い(リジッドな)材料の方が、分化誘導効果が高いため次年度にさらに検討を行う予定である。またPDL細胞のin vitro培養時に細胞外無機イオン(Ca^<2+>,PO_4^<2->)を上昇させるとBMP-2発現が上昇することも明らかとなった。本研究は細胞に対してトポグラフィーを有するハニカムマイクロアレイフィルムを応用した進化型歯周組織再生治療を創生することを目的としたものである。平成25年度における本課題に関わる研究計画を遂行の結果、以下の成果を得ることができた。まずハニカムマイクロアレイ上でヒト歯根膜(PDL)細胞を4週間にわたり培養した結果、ハニカムアレイ内に遊走した細胞とフィルム上で重層化した細胞の双方が認められ、自己組織化した歯根膜細胞シートを得ることに成功した。また同時期に硬組織形成細胞への分化マーカーを調べたところ、alkaline phosphataseを除くosteocalcin, osteocalcin, periostinの全ての発現上昇が認められ、元素分析・von Kossa染色のいずれでもCaの沈着が明らかとなった。以上の結果から、ハニカムフィルムが歯根膜細胞の増殖応答を刺激するばかりでなく、分化をも誘導することができるスキャフォールドであることを示した。また試験的にSCIDマウスへの移植により一部に石灰化を伴う歯根膜様組織が形成された。一方、細胞微小環境の最適化に関する研究の結果、これまでに明らかにしたnano-hydroxyapatiteが有するナノ粒子効果によるヒトPDL細胞のBMP-2発現誘導機構に加えて、CaイオンがPGE2/EP4レセプターというオートクライン機構により同様にFGF-2発現を誘導すること、さらには同じPGE2/EP4レセプター経路がPDL細胞の伸展刺激により発動して、BMP-2を発現するという知見を見いだした。以上の実績からこれまで炎症因子として考えられてきたPGE2の歯周組織再生に及ぼすポジティブな効果が明らかとなり、EP4レセプターの選択的アゴニストをハニカムアレイに吸着させた新たな歯周組織再生ストラテジーの可能性が見いだされた。平成24年度に本課題研究遂行の結果、以下に示す実績が得られた。まずハニカムフィルム(HF)がヒト歯根膜(PDL)細胞の増殖・分化に及ぼす影響について、各種分化マーカー発現を指標として検討を加えたところ、osteopontin (OPN)及びosteocalcin (OCN) mRNAの強発現がみられた。

HF上でPDL細胞を4週間培養することによりOPNをタンパクレベルで発現したたばかりでなく、硬組織形成の開始をアリザリン染色で確認することができた、加えてHFの形態のみならず素材を操作することにより、PDL細胞の骨芽細胞の分化を選択的に操作できる可能性が示された。一方、HFと組み合わせるカルシウムキャリヤとしてnano-hydroxyapatite (nano-HA)を試したところ、nano-HAはCa2+あるいはPO42-イオンの徐放に依存することなく、nano粒子としてPDL細胞に作用することにより、同細胞のBMP-2発現を増強することが明らかとなった。またoctacalciumphosphate (OCP)についても硬組織形成に関わるタンパク質吸着のパターンをプロテオーム解析で調べたところ、HAとは異なる吸着パターンが見られたことから、今後OCPに吸着させるべき細胞増殖因子選択に関わる重要な情報が得られた。分泌型糖タンパクであるWnt5aがBMP-2依存性の骨芽細胞形成に関わるという新たな知見もあり、最終年度に向けて動物実験を進めていく重要な情報を得ることができたものと考える。今回明らかになったハニカムフィルムがヒト歯根膜細胞の増殖のみならず分化をも誘導するという知見は、サイトカイン療法に頼らずともスキャフォールド自体が細胞にインタラクティブに働くということを明らかに示すもので、今後の研究を遂行する上でキーとなるものであるため。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究のうちin vitroでの系については予定を越える成果が得られており、歯根膜細胞の増殖・分化をコントロールし得るハニカムフィルムの素材や形態については概ね決定することができた。またそれと組み合わせるサイトカインや徐放性キャリヤについても、これまでの研究成果に加えて新たな可能性を見いだすことができた。一方、in vivoの系については予定より進捗にやや遅れがみられるため最終年度は動物実験に集中する。研究計画は予定通りに推進する。免疫不全動物については当初予定していたSCIDマウスに加えて、ヌードマウスあるいはヌードラットを用いた実験を行う予定である。[現在までの達成度]で述べたようにin vitroの系については予定を達成しているため、平成25年度は動物実験を集中して実施する予定である。