hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腎線維芽細胞の特殊性の解明

本研究は、申請者がこれまで行ってきた「線維芽細胞ー免疫細胞相互作用」の解析を基盤に、腎臓の線維芽細胞に特異的な免疫学的働きとして新たに見出された「コラーゲン産生ミエロイド系細胞」の誘導機構についての解析を進めた。腎線維芽細胞および腎ミエロイド系細胞(コラーゲン産生性・非産生性ミエロイド系細胞)の遺伝子プロファイリングから得られた結果から、コラーゲン産生能を保持したミエロイド系細胞は、TGFやPDGF等の線維化関連因子の発現が非常に高いことが示された。さらに、このミエロイド系細胞は、腎線維芽細胞によって骨髄由来前駆細胞から誘導もしくは増殖してくることが示されている。つまり、腎線維芽細胞は自身から産生する細胞外マトリックスに加えて免疫細胞に作用することで腎尿細管間質の線維化を促進している可能性が示された。さらなる詳細な定量的RT-PCRによる解析から、この細胞集団は間葉系細胞のマーカー遺伝子を発現していることが明らかとなった。そこで、間葉系マーカーを発現する血球系細胞のコンディショナル骨髄キメラマウスを作製した。このマウスモデルに腎線維化を誘導し、コラーゲン産生性ミエロイド細胞の除去を行うことで、当該細胞の線維化への寄与について解析を進めた。主に、コラーゲンの沈着並びに活性化線維芽細胞の増生ヘの影響について解析し、組織染色やフローサイトメトリーを用いてデータを蓄積した。その結果、腎線維芽細胞とコラーゲン産生性ミエロイド系細胞の相互作用が、線維化の促進に寄与していることが示され、この細胞間相互作用に係る分子群は新たな線維化標的に成り得ると考えられる。本研究から、新たな慢性炎症移行プロセスの一端が明らかとなった。本研究は、申請者がこれまで行ってきた「線維芽細胞ー免疫細胞相互作用」の解析を基盤に、腎臓の線維芽細胞に特異的な免疫学的働きとして、新たに見出された「コラーゲン産生ミエロイド系細胞」の誘導機構についての解析を進める。本研究は、腎線維芽細胞の特殊性の解析を通じて、慢性炎症移行プロセスの究明を目指す新たな取り組みとして位置付けられる。研究初年度においては、腎線維芽細胞および腎ミエロイド細胞群の遺伝子プロファイリングを行い線維化関連遺伝子の発現について解析を行った。その結果、コラーゲン産生能を有する腎ミエロイド産生群においては、TGF、PDGFなどの線維化促進因子の産生能も顕著に高いことが見出された。このミエロイド細胞は腎線維芽細胞によって誘導もしくは増殖することが示されていることから、腎線維芽細胞は自身から産生する細胞外マトリックスに加えて免疫細胞に作用することで線維化を促進していることが示された。本研究では、腎線維化の新たな治療標的分子の探索を主眼とし、コラーゲン産生細胞群の遺伝子プロファイリングならびに特異的発現分子の同定、阻害抗体を作製といった研究項目を設定し、実用化に向けた基礎基盤の確立を目指している。初年度においては、新たに線維化促進する候補遺伝子を同定しており、CRISPR Cas9ゲノム編集法によって遺伝子欠損マウスを作製している。研究2年次においては、当該マウスを用いて線維化解析を進める。さらに、線維化阻害抗体の作製にも着手しており、新たな腎線維化治療のシーズとしての可能性が期待される。研究開始初年度に作製した、新規線維化関連分子の欠損マウスの解析ならびに阻害抗体を用いた実験を進める。さらに腎線維芽細胞によって誘導されるミエロイド細胞の形質についても誘導因子の同定を中心に解析を進め、腎線維化促進機構の解明を目指す。
非線形連続系の同定法の開発とその応用に関する研究

動的設計の有力な手段として現在広く用いられているモ-ド解析法は,原理的に,非線形性を有する系の同定法として用いることはできない.近年,非線形性を有する機械・機器・構造物などの同定が重要になってきたので,この研究では,非線形連続系を対象とした,新しい同定法を提案した.提案した同定法は,モ-ド関数の直交性を利用した変数変換によって対象物の数学モデルの表示を簡単化し,ハ-モニックバランスの原理に基づいて数学モデルに含まれる未知パラメ-タを定めるものである.提案した同定法が有効であることを,数値シミュレ-ションによって確認した.次に,実際の対象物に対しても本同定法が有効であることを確認するため,まずパ-ソナルコンピュ-タをベ-スにして,加振力のコントロ-ル,振動デ-タの取り込みや,フ-リエ交換,微積分演算など同定のための演算ができるように,同定システムを開発した.ついで簡単な対象として非線形はりをとり上げ,実際に振動実験を行い,そのデ-タを,開発した非線形同定システムに取り込んで同定を行った.得られた同定結果を用いて対象としたはりの動的挙動を予測し,実験デ-タと比較することによって,同定結果が妥当なものであることを確かめ,提案した同定法が実際の対象物に対しても有効であることを確認した.今後は,より複雑な対象への適用性を検討し,また同定結果を有効に活かす最適設計の手法を開発して,提案した同定法の応用性を高めたい.動的設計の有力な手段として現在広く用いられているモ-ド解析法は,原理的に,非線形性を有する系の同定法として用いることはできない.近年,非線形性を有する機械・機器・構造物などの同定が重要になってきたので,この研究では,非線形連続系を対象とした,新しい同定法を提案した.提案した同定法は,モ-ド関数の直交性を利用した変数変換によって対象物の数学モデルの表示を簡単化し,ハ-モニックバランスの原理に基づいて数学モデルに含まれる未知パラメ-タを定めるものである.提案した同定法が有効であることを,数値シミュレ-ションによって確認した.次に,実際の対象物に対しても本同定法が有効であることを確認するため,まずパ-ソナルコンピュ-タをベ-スにして,加振力のコントロ-ル,振動デ-タの取り込みや,フ-リエ交換,微積分演算など同定のための演算ができるように,同定システムを開発した.ついで簡単な対象として非線形はりをとり上げ,実際に振動実験を行い,そのデ-タを,開発した非線形同定システムに取り込んで同定を行った.得られた同定結果を用いて対象としたはりの動的挙動を予測し,実験デ-タと比較することによって,同定結果が妥当なものであることを確かめ,提案した同定法が実際の対象物に対しても有効であることを確認した.今後は,より複雑な対象への適用性を検討し,また同定結果を有効に活かす最適設計の手法を開発して,提案した同定法の応用性を高めたい.
地域福祉を推進する中間組織体制の日韓比較と実践モデルの構築

本研究の目的は、日本の社会福祉協議会と韓国の社会福祉館を取り巻く状況や事業、ソーシャルワーカーの意識に関する比較を通じ、危機的状況の実態とその原因を分析し、これらを解決する実践モデルを開発することである。平成29年上半期には、日韓ソーシャルワーカーの意識調査(日本393名、韓国318名)やインタビュー調査の結果を分析し、一部の研究成果を学会にて報告した(日本地域福祉学会自由研究発表、6月4日)。現在、韓国社会福祉行政学会への投稿に向けて論文作成も行っている。そして、釜山広域市社会福祉館協会セミナーに参加し、社会福祉館の役割と展望について発表・討論した。ソーシャルワーカーを対象にしたアンケート調査結果については、大阪府社会福祉協議会や大阪市社会福祉協議会、堺市社会福祉協議会、釜山社会福祉協議会に対して中間報告を行い、中間組織の機能および危機に関するインタビュー調査を実施した。韓国釜山広域市では、社会福祉館の中間管理者で構成されている「実践研究会」を4回開き、福祉とコミュニティの融合を図る「敬老食堂モデル事業」(7ヵ所)や「小地域福祉計画モデル事業」(1ヵ所)を進めた。コンセプトマッピング(concept mapping)を用いてモデル事業の成果を明確にし、敬老食堂の利用者を対象に「主体性・関係性」に関するアンケート調査を実施した(n=210)。こうしたモデル事業の推進は、中間組織実践モデルの適用可能性を高めるためのものである。業績としては、社会福祉協議会の危機と持続可能性に関する自由研究発表(日本地域福祉学会)、社会福祉館の役割と展望に関する発表(釜山広域市社会福祉館協会セミナー)が挙げられる。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、日本の社会福祉協議会と韓国の社会福祉館を取り巻く状況や事業、ソーシャルワーカーの意識に関する比較を通じ、危機的状況の実態とその原因を分析し、これらを解決するための実践モデルを開発することである。平成28年度には、日韓ソーシャルワーカーの意識調査をはじめ、ヒアリング調査10回(半構造化面接)、実践研究会による中間組織モデルの開発など、多様な調査・研究を行った。まず、ソーシャルワーカー意識調査は、大阪府内にある市区社会福祉協議会63ヵ所の393名と、釜山市にある社会福祉館53ヵ所の318名を対象にしたものである。大阪府社会福祉協議会や大阪市社会福祉協議会、堺市社会福祉協議会、釜山社会福祉館協会の協力を得て調査を実施し、両国調査の回収率が95%を超えている。そして、韓国の社会福祉館6ヵ所や釜山社会福祉館協会、京都府社会福祉協議会、堺市社会福祉協議会などでフィールドワークやインタビュー調査を実施した。韓国では、中間組織実践モデルの構築のため、社会福祉館中間管理者を中心メンバーとする「実践研究会」を3回開催した。業績としては、学術論文1編、学会発表1回、セミナー・講演会3回が挙げられる。主に日本の地域福祉理論や実践を海外に発信したもので、地域福祉の国際的な展開に貢献できたと考える。社会福祉協議会と社会福祉館を取り巻く状況を多角的に分析するため、当初8名のインタビュー調査を計画していたが、実際には10名の調査ができた。日韓ソーシャルワーカーの意識調査は、【同志社大学「人を対象とする研究」に関する倫理審査委員会】の承認(申請番号16070号)を得てから実施した。大阪府内にある市区社会福祉協議会63ヵ所の393名と、釜山市にある社会福祉館53ヵ所の318名を対象にしたが、調査票の回収率が95%(651部)を超えている。韓国では社会福祉館中間管理者を中心メンバーとする「実践研究会」を3回開催し、地域福祉を推進する中間組織のモデル事業が行われている。モデル事業は、当事者組織化を活用した給食サービス(高齢者)と小地域福祉計画の策定のことである。実践者とともに研究と実践を融合する形で多様な調査が進んでいる。

本研究は、アクションリサーチを用いた実践者との協働的研究であるため、実践現場の事情により調査方法が変更される可能性がある。柔軟性をもって調査方法を変えながら、実践モデルの構築に取り組む予定である。まず、平成28年度の調査結果を学術論文や学会発表などの研究成果物としてまとめていく予定である。そして、日韓の先進事例から、社会福祉協議会と社会福祉館が中間組織として機能するための方策を導出する。また、社会福祉館の中間管理者で構成されている「実践研究会」を中心に中間組織の実践モデルの開発に取り組む。実践モデルの適用可能性を高めるため、福祉コミュニティ論に基づき、モデル事業を実施し、具体的な方策を探る。同時に、コンセプトマッピングやノミナルグループ法、デルファイ法など、参加型調査方法を用い、多様な視点を反映する形で実践モデルを構築する。最後に、成果報告会(日韓地域福祉ラウンドテーブル)を開き、研究成果を日韓の実践者・研究者と共有し、新たな知見を得る。29年度が最終年度であるため、記入しない。
生細胞試験用3次元磁気テザーシステムの開発

本研究は,6本の磁極を用い,磁気浮上の原理を用いて微小磁性粒子を非接触駆動する磁気テザーについて,作業空間内に存在する微小磁性粒子への印加力を制御し,浮遊している粒子の位置制御または粒子が付着した試料の剛性等の測定を可能とすることを目指したものである.発生力強度と周波数および力の異方性が許容範囲に納まる作業領域サイズの目標仕様を満たすため,磁極材質と形状,コイル巻き数の決定手法を明らかにし,それに基づいて装置を設計・試作したのに加えて,各磁極後端の磁束密度の測定情報に基づき駆動電流を決定する,発生力のセミクローズドループ制御系を構築した.この装置を用いて発揮される性能を実験検証した.平成27年度は,以下に注力して研究を行った.1.磁気テザーの発生磁力の理論解析モデルの構築:磁極に取り付けたコイルへの印加電流が生成する磁場は,磁極先端を介して作業領域に放出され,プローブである微小磁性粒子の磁化は複数の磁極が生成した磁場の重ね合わせで求められる.コイル印加電流と磁性粒子に生じる磁力との関係を解析的に求めるための理論モデルとして,これまでに申請者らのグループが提案している集中磁荷モデルを,作業領域の中心から遠い領域まで精度良く近似するために改善を試みた.具体的には,様々な磁極配置状況やコイル印加電流の組合せについて,FEM解析結果と集中磁荷モデルの解析結果とを比較し,1本の磁極に対して印加電流ー発生磁場の支配係数が異なる複数の集中磁荷を割り当てることで磁場生成の非線形性を高い精度で近似可能とする改良されたモデルの構築を試みるなどである.2.磁化のヒステリシスのモデル化と,それを低減する制御入力の決定:磁気テザーの解析モデルにヒステリシスの項を設け,その影響を低減可能とする手法に関して,既存の磁場解析・ヒステリシス解析手法を調査し,本問題への適用可能性について検討した.所望の作用力を実現可能とするコイル電流の組合せが無数に存在する冗長駆動系である事に着目し,それら無数の解の中からヒステリシスを最小化可能であるものを選択する制御戦略を組み込むことを試みた.また,磁気テザー本体と試料駆動ステージ機構および画像計測系の改善に関しては,コイルの巻き数や線径を変えて発生磁力が強く制御性も良くなるコイルの設計について検討した.この結果から,改良型のプロトタイプの設計・試作を試みる予定である.初年度は,申請時に掲げた研究計画に概ね沿ったスケジュール・内容により進められたため,上記の進捗状況であると判断する.本研究では,6本の磁極を用いて微小磁性粒子を非接触駆動する3次元磁気テザーについて,発生力強度と周波数,および力の異方性が許容範囲に納まることを規範として,理論式と有限要素解析に基づき磁極の材質・形状・先端同士の間隔および駆動コイルの巻数と最大印加電流を決定する際の手順を明らかにし,この手順に従って得られた設計パラメータに基づいて生細胞の剛性測定に適する磁気テザー装置を製作した.各磁極のコイル印加電流に対する発生力強度の非線形性を解消するため,各磁極後端に磁気センサを取付け,これを用いた磁束密度の測定情報に基づき駆動電流を決定する,発生力のセミクローズドループ制御系を構築した.製作した磁気テザー装置の発生力強度を計測するため,硝子製のマイクロピペット先端に直径4.5マイクロメートルの磁性粒子を複数接着したプローブを製作し,磁極駆動コイルに電流を印加した際のプローブの先端変位を画像計測により計測し,これに有限要素解析を用いて算出したプローブ剛性を乗じて発生力を算出した.この結果,コイルに225アンペア・ターンの電流を印加した際の発生力は140pNとなり,事前計算での予測値166pNに対して15%の低下となった.この違いは,ピペットの剛性の計算誤差や磁極先端形状の加工誤差,組立誤差等に由来すると思われるが,得られた値は細胞の変形を生じるのに十分な強さとなった.装置の有用性のデモンストレーションとして,育成条件が異なる2種類の酵母細胞群に対して力を加えた際の変形に基づき剛性を計測し,ヒストグラムを作成した.この結果,42°Cで1時間の熱ストレスを加えた細胞群のヒストグラムが,常温に置かれていた細胞群のものよりも高い剛性値を示し,かつ分布範囲が広がるという傾向が得られた.この結果は他の文献に記載された現象と一致しており,本装置が細胞の力学特性の計測に利用可能であることが示された.本研究は,6本の磁極を用い,磁気浮上の原理を用いて微小磁性粒子を非接触駆動する磁気テザーについて,作業空間内に存在する微小磁性粒子への印加力を制御し,浮遊している粒子の位置制御または粒子が付着した試料の剛性等の測定を可能とすることを目指したものである.発生力強度と周波数および力の異方性が許容範囲に納まる作業領域サイズの目標仕様を満たすため,磁極材質と形状,コイル巻き数の決定手法を明らかにし,それに基づいて装置を設計・試作したのに加えて,各磁極後端の磁束密度の測定情報に基づき駆動電流を決定する,発生力のセミクローズドループ制御系を構築した.この装置を用いて発揮される性能を実験検証した.平成28年度は,引き続き磁気テザーの理論解析モデルの改善を行うのと同時に,実験的な発生磁力のキャリブレーション方法や強い発生力の達成に取り組む予定である.1.磁気テザーの発生磁力の測定手法の開発:昨年度に構築

・試作した解析モデルと磁気テザーシステムにより作用力を発生させた際,目的の力の大きさと方向に対して出力がどれだけ近い値になっているかを計測する.既知の粘度を持つ媒質中で作用力を生じさせ,その際の磁性粒子の速度の測定結果を用いて計算する方法や,より精度の高い他の方法,PDMSゲルで作成した多数のピラー状構造物の先端に磁性粒子を接着した力計測用プローブを用いる方法などの実施も試みる.2.磁気テザーの理論解析モデルの実験的キャリブレーション:磁気テザーの作用力を良好な精度で推定するためには,解析モデルの改良と共に実験的なキャリブレーションも行う必要がある.上記の発生力の測定結果を用いたオフラインでのモデルの改良と平行して,オンラインで制御入力の補正を行う手法の構築も試みる.例えば,コイルへの印加電流と磁極の磁化との間には大きなヒステリシスがあるため,駆動用のコイルとは別に磁極の磁化を検出するためのコイルを取り付けるなどの装置の改造を行い,その測定結果を順解析モデルへ代入して得られた残留磁化による磁力を補償する制御入力の項を新たに加える等の方法が考えられる.以上のようなオンライン・オフラインのモデル改良手段を用いて,作用力の推定精度を向上させた上で,最終的な変位と作用力の制御精度を検証する.機構学,設計工学,磁気駆動,画像計測
液膜法によるマクロライド系抗生物質分離プロセスの開発

マクロライド系抗生物質の1つであるエリスロマイシンは,ろ過された培養液に対し抽出および逆抽出を繰り返すことにより濃縮,粗分離されている。この抽出,逆抽出を同時に行うことのできるものにW/O/W液膜法がある。水相中におけるエリスロマイシンの平衡関係は,高pH域では水素イオン化されていないエリスロマイシン(以下Eとする)側に,低pH域では水素イオン化されたエリスロマイシン(以下EH^+とする)側に移動する。したがって,液膜系の平衡(供給相中のE濃度と回収相中のそれが等しい)状態に至ると,理論的に回収相中のエリスロマイシン(EおよびEH^+)は供給相中の最大で数万倍程度にまで濃縮される。これまでに,本分離法に関して,支持液膜に対してはその速度過程について詳細に検討されているのに対し,実用上重要である乳化液膜に対する検討は比較的少ない。そこで当該研究においては,乳化液膜における透過の速度過程について検討した。まず,比較的エリスロマイシンの分配係数の大きいと予想されるキシレンを用いて(乳化液膜に関する既往の研究はエリスロマイシンの分配係数の非常に小さいヘプタンが用いられている),キシレン-水相間におけるエリスロマイシンの分配平衡を測定した。なお,キシレンは毒性などの面から実用的な膜液ではないが,その物性が速度過程を検討する上で好ましいため採用した。Eのキシレンに対する分配係数は,ヘプタンに対する場合(既往の研究)の約10^3倍程度であった。ついで,膜液としてキシレンを用いて乳化液膜透過実験を行った。ヘプタンを膜液とした場合においては,Eの総括透過容量係数は供給・回収両水相のpHによらず,透過は液膜相支配であった(既往の研究)が,キシレンを用いた場合には,供給相のpHの増加とともにEの総括透過容量係数は増加し,物質移動抵抗は供給相側にも存在した。
青枯病菌エフェクターをツールとした過敏感細胞死メカニズムの解明

本研究は感染生理における最重要課題である過敏感(HR)細胞死のメカニズムを解明する研究である。本研究では、MEK2の構成的活性化(MEK2DD)によるHR様細胞死を抑制する青枯病菌エフェクターを探索し、エフェクターが標的としている細胞機能や因子を同定及び解析することで、課題の解明を試みる。申請者らは、MEK2DDの過剰発現により誘導されるHR様細胞死を、共発現により抑制する青枯病菌エフェクターを複数同定した。これらの中でclone 42を本研究の中心に据えている。これまでの研究により、clone 42は共発現したタンパク質のレベルを非特異的に低下させていることが示された。この現象が転写抑制によるものであるかを確認するため、RT-qPCRを用いた発現解析を行った結果、タンパクレベルの低下は転写抑制が原因であることが明らかとなった。また、clone 42の単独発現においては、明瞭なクロロシスを誘導し、宿主の防御関連遺伝子の発現を増加させることも示されていた。よってclone 42は、宿主に何らかのメカニズムで認識される可能性が示唆された。clone 42の発現を媒介するAgrobacteriumの菌体数の増減を解析した結果、宿主認識によって誘導される防御応答の影響による菌体数の減少が確認された。以上より、これまでclone 42の病原性と考えられた転写抑制などの機能は、Agrobacteriumの感染効率の低下に起因することが明らかとなった。また興味深いことに、clone 42のC末端欠損変異型では宿主認識によるクロロシスが認められなくなることから、宿主認識にはC末端が重要な役割を担っていることが示唆された。ナス科植物では複数の抵抗性(R)タンパク質が誘導するHR細胞死に、MEK2が構成するMAPキナーゼ経路が介在している。しかしながら、本経路の制御因子や本経路以降HR細胞死までの機構は十分に解明されていない。clone 42は、N末端領域の14-3-3タンパク質結合モチーフと、それ以外のヌクレオシド-2リン酸類縁体(Nudix) hydrolase様ドメインから構成されている。clone42において、どの領域がMEK2DDの過剰発現により誘導されるHR様細胞死抑制に必須であるか明らかにするため、種々の変異型を作製し、HR様細胞死抑制能を解析した。また、MEK2DD誘導性HR様細胞死をclone42がどのような仕組みで抑制するかmRNAレベルやタンパク質レベルについて解析した。さらに、14-3-3タンパク質との結合やNudix様ドメインとHR様細胞死抑制能との関係を解析した。28年度の研究計画は、1)clone42によるMEK2DD誘導性HR様細胞死抑制がmRNAまたはタンパク質レベルで起きているのか解析する。2)clone42のN末端部分に存在する14-3-3タンパク質結合モチーフの必要性を解析する。3)Nudix様ドメインの必要を解析する。4)14-3-3タンパク質との結合を解析する、以上を上げていた。28年度の研究の結果、1)についてはclone42の発現が共発現遺伝子のmRNAレベル低下を招くことが明らかとなった。2)と3)についてはclone42に関する種々の欠損変異体を作製し、HR様細胞死抑制能を評価することで行った。その結果、14-3-3タンパク質結合モチーフやNudix様ドメインの活性中心と予測されるアミノ酸の置換によっても、clone42のHR様細胞死抑制に影響がみられなかったことから、これらは必須でないことが明らかとなった。4)についても解析を行った。以上の結果から、おおむね28年度の目標は達成されたと判断した。これまでの研究によりclone42のNudix様ドメインを含むC末端領域の欠損(clone42ΔC)では、HR様細胞死抑制、及びclone42単独発現によるクロロシスが不全となった。このことから、clone42のC末端領域がHR様細胞死抑制、及びclone42単独発現によるクロロシスに必須であることを明らかにした。また、clone42ΔC変異型は14-3-3タンパク質と結合したことから、14-3-3タンパク質はclone42過剰発現によるHR様細胞死抑制、およびクロロシスには関与しない可能性が示唆された。

さらに、clone42各変異型を形質転換したアグロバクテリウムをベンサミアナタバコ葉に接種し、増殖を比較したところ、clone42ΔCを有するアグロバクテリウムは、野生型および他の変異型と比較してより高いコロニー数を示した。以上の結果から、clone42はベンサミアナタバコによって認識され、その認識にC末端領域が関与する可能性が示唆された。また、この発現コンストラクトによるアグロバクテリウムの増殖効率の違いが、コンストラクトによるHR様細胞死抑制やクロロシスの有無と関連すると考えられた。clone42各変異型で見られるMEK2DD誘導性HR様細胞死抑制やクロロシス誘導の違いについて、その主因を明らかにすること、また、これと14-3-3タンパク質との関係を明らかにすることを目的とした。まず、clone42がベンサミアナタバコにより認識される可能性を検証した。clone42野生型を単独で発現させた場合、ベンサミアナ葉ではクロロシスが観察された。各変異型では14-3-3タンパク質結合モチーフの変異型やNudix様ドメインの活性中心と予想されるアミノ酸を置換した変異型では、野生型と同様にクロロシスが観察された。一方、clone42ΔC変異型ではクロロシスが観察されなかった。この結果を受けて、野生型及びclone42各変異型を挿入したT-DNAベクターを有するアグロバクテリウムをベンサミアナタバコ葉に接種し、単位面積あたりのコロニー数を定量する接種試験を行ったところ、clone42ΔCを有するアグロバクテリウムは、野生型および他の変異型と比較してより高いコロニー数を示した。この結果から、clone42はC末端領域を介してベンサミアナタバコに認識され、その結果ベンサミアナタバコの防御反応を誘導し、結果としてアグロバクテリウムの感染効率が低下することで、共発現しているMEK2DDの発現効率が低下したと考えられた。この現象が、見かけ上のclone42によるMEK2DDのHR様細胞死抑制と観察された可能性が考えられた。さらに、clone42野生型と上記の各変異型を用いて14-3-3タンパク質との相互作用をBiFC法にて解析したところ、全てのコンストラクトと14-3-3タンパク質が結合したことから、ベンサミアナタバコによるclone42の認識に14-3-3タンパク質は必須でない可能性が示唆された。以上の結果から、おおむね29年度の目標は達成されたと判断した。本研究は感染生理における最重要課題である過敏感(HR)細胞死のメカニズムを解明する研究である。本研究では、MEK2の構成的活性化(MEK2DD)によるHR様細胞死を抑制する青枯病菌エフェクターを探索し、エフェクターが標的としている細胞機能や因子を同定及び解析することで、課題の解明を試みる。申請者らは、MEK2DDの過剰発現により誘導されるHR様細胞死を、共発現により抑制する青枯病菌エフェクターを複数同定した。これらの中でclone 42を本研究の中心に据えている。これまでの研究により、clone 42は共発現したタンパク質のレベルを非特異的に低下させていることが示された。この現象が転写抑制によるものであるかを確認するため、RT-qPCRを用いた発現解析を行った結果、タンパクレベルの低下は転写抑制が原因であることが明らかとなった。
アミノ酸栄養によるIGF-I及びIGFBP-2遺伝子発現の制御機構の解明

これまでの研究で、飼料に添加されるアミノ酸がIGF-I及びIGFBP-2遺伝子発現に影響を及ぼしていることが明らかとなっているが、特定のアミノ酸がIGF-I及びIGFBP-2遺伝子発現を制御しているのか否か調査するために、ニワトリヒナ(ブロイラー)を30羽購入し、3週齢まで市販飼料を用いて生育させた。その後必須アミノ酸の中で第一制限アミノ酸になりやすいメチオニン及びそのメチオニンの代謝経路に関わっているグリシンに注目して、それぞれのアミノ酸を低蛋白質飼料に要求量を満たすように添加した飼料及びアミノ酸を添加していない飼料を用いてニワトリに5週齢まで給与した。低蛋白質飼料へのメチオニン添加により、増体、飼料効率及び筋肉重量は有意に改善された。また低蛋白質飼料へのグリシン添加については、増体、飼料効率及び筋肉重量は改善する傾向が見られたが、メチオニン添加とグリシン添加の交互作用は見られなかった。血漿中のIGF-I濃度については、アミノ酸添加による影響を受けなかった。個々のアミノ酸がニワトリの初代肝細胞培養系を用いた血漿IGF-I濃度制御機構に及ぼす影響を調査するために、5週齢まで成育させたブロイラーから肝臓を取り出し、コラゲナーゼを還流することにより肝細胞を採取した。血清レベルを低下させた低栄養状態の培養液にメチオニン及びグリシンを添加した培養液を用いて採取した肝細胞の培養を行ない、培養液に放出されたIGF-I濃度を測定した。培養液中の1GF-I濃度は、アミノ酸添加による影響が見られなかった。以上の結果より、低蛋白質飼料にアミノ酸を添加することによりニワトリの成長に改善は見られた。しかしながら血漿中のIGF-I濃度については今回設定したアミノ酸の添加レベルによる影響を受けなかったため、今後さらなる検討が必要であると考えられた。個々のアミノ酸がニワトリの初代肝細胞培養系を用いた血漿IGF-1濃度制御機構に及ぼす影響を調査するために、ニワトリヒナ(ブロイラー)を10羽購入し、5週齢まで市販飼料を用いて生育させた。その後ニワトリから肝臓を取り出し、コラゲナーゼを還流することにより肝細胞を採取した。次に肝細胞における低栄養条件を確立するために、培養液中の血清レベルを段階的に変えた培養液を用いて採取した肝細胞の培養を行ない、培養液に放出されたIGF-I濃度をラジオイムノアッセイにより測定することで培養条件の設定を行なっている。さらに個々のアミノ酸が筋胃組織培養系を用いたIGFBP-2遺伝子発現制御機構に及ぼす影響を調査するために、プライマーを設計したのちニワトリのIGFBP-2cDNAを作製している。また、これまでの研究で、飼料に添加されるアミノ酸がIGF-I及びIGFBP-2遺伝子発現に影響を及ぼしていることが明らかとなっているが、特定のアミノ酸がIGF-I及びIGFBP-2遺伝子発現を制御しているのか否か調査するために、ニワトリヒナ(ブロイラー)を30羽購入し、3週齢まで市販飼料を用いて生育させた。その後必須アミノ酸の中で第一制限アミノ酸になりやすいメチオニン及びそのメチオニンの代謝経路に関わっているグリシンに注目して、それぞれのアミノ酸を低蛋白質飼料に要求量を満たすように添加した飼料及びアミノ酸を添加していない飼料を用いてニワトリに給与した。5週齢まで実験飼料を給与した後、血液、肝臓及び筋胃を採取した。現在、血漿中のIGF-I濃度の測定及び肝臓と筋胃におけるIGFBP-2の遺伝子発現量の測定を行なっている。
強震動水平上下3成分同時入力が高層免震建物の地震応答性状に及ぼす効果に関する研究

1995年兵庫県南部地震以降に各地に多くの高層免震マンションが建設されているが、これらアスペクト比の大きな高層免震建物を対象として、強震動3成分が作用する場合のアイソレータの引き抜きに関する地震応答性状について研究したもものである。免震構造は、アイソレータに建物重量が圧縮荷重として作用していることが前提であるが、アスペクト比の大きな高層免震建物になると、アイソレータに引き抜きが生じ、ゴム層が損傷・破断する可能性も生じかねない。また、市街地に建設される高層集合建物は建物高さの法規上の制約を受けやすく、セットバックした立面形状を有する高層集合住宅として計画されることが多い。そこで研究は、セットバック立面形状を有する高層免震建物を対象に、その隅角部アイソレータの引張・圧縮地震応答性状を把握することを目的としたものである。建物解析モデルは、平面形状は桁行方向5スパン(7mスパンのラーメン)、梁間方向1スパン(12mスパンの連層耐震壁)、立面形状は高層部18階からセットバックして低層部は14階となる建物と、高層部14階、低層部10階の建物の、2種類のRC造基礎免震建物(階高3m)である。これら2種類のセットバック高層免震建物を対象に、近年国内外で観測された53組の強震動記録の水平上下の合計3成分を同時入力し、耐震壁及び床スラブの曲げ剛性を考慮した3次元立体振動地震応答解析を行って下記の知見を得た。(1)隅角部アイソレータの引張面圧は、高層部よりも概して低層部に大きな引張面圧が生じる傾向にあり、低層部アイソレータには、免震建物の耐震性能目標とされる引張面圧σ_t=1N/mm^2を超える強震記録が少なからず存在し、引張面圧σ_t=2N/mm^2を上回る強さを有する強震動の存在も確認された。(2)隅角部アイソレータの最大圧縮面圧は約,σ_c=2070N/mm^2程度と広く分布しているが、概して低層部分アイソレータは高層部に比して大きな最大圧縮面圧となる傾向にあり、アスペクト比の大きな高層部分18階モデルでは、メーカーが提案している圧縮限界強度を上回る強震記録が多数存在し、アイソレータが座屈する可能性が大きくなることが知れた。市街地に設計・建設される高層集合建物には、整形立面形状のものに加えて、建築法規規制によるセットバックした立面形状を有する高層集合住宅が多く見られる。そこで本年度は、(1)セットバック立面形状を有する高層免震建物の隅角部アイソレータの地震応答性状と整形立面形状免震建物のそれとを比較検討し、(2)整形及びセットバック立面形状を有する高層免震建物のアイソレータの引き抜きに関する強震動水平成分と上下動成分の強さの評価尺度に関する提案を行い、以下の成果を得た。(1)強震動が作用するセットバック高層免震建物の隅角部低層部分アイソレータには、隅角部高層部分アイソレータに比べ概してより大きな引張面圧及び圧縮面圧が作用し、また整形立面形状を有する同規模の高層免震建物の隅角部アイソレータに比べてより大きな引張面圧及び圧縮面圧が作用する傾向にある。(2)高層免震建物において、隅角部低層部分アイソレータに作用する引張面圧σt≒1N/mm2^を超えるような強震動では、上下動によるアイソレータの引き抜きに及ぼす上下動の影響は水平動よりも概して大きい。(3)アイソレータに生じる強震動の引き抜き強さを簡便に評価する尺度として、上下動成分については上下動実効加速度(0.1秒0.3秒の周期帯域のバンドパス・フィルターを施した上下動最大加速度振幅値)、水平動成分については水平動やや長周期実効加速度(2秒6秒の周期帯域のバンドパス・フィルターを施した水平動最大加速度振幅値)を提案した。この二つの評価尺度を用いて、アスペクト比34程度の高層免震建物では上下動実効加速度が200cm/s^2を超え、また水平動やや長周期実効加速度が70cm/s^2を超えると、低層部分アイソレータに1N/mm^2を超える引き抜きが生じる可能性が高くなる。日本において近い将来に高い確率で発生が予想されている地震は、東海・東南海・南海連動地震、首都圏直下地震及び仙台周辺域に発生する地震である。また、近い将来に高い確率で発生が予想されているわけではないものの、社会的に重要性の高い建築構造物(例えば地域の基幹病院建物)の設計にあたって想定されるべき地震(例えば首都圏における南関東地震、近畿圏における上町断層地震、福岡市における警固断層地震、仙台市における長町・利府断層地震など)も地震工学的に重要な想定地震である。そこで、仙台本町、東京丸の内・新宿、横浜みなとみらい、名古屋駅前地区、大阪梅田及び福岡天神の7地区を対象として、それぞれの想定地震による模擬地震動を作成し、高層免震建物(アスペクト比2.55.0)の3次元立体骨組振動系モデルによる地震応答解析を行った。

これによれば、東京、横浜、名古屋及び大阪の対象サイトではM8クラスの地震及び巨大連動地震によりアスペクト比4.55程度以上の高層免震建物の隅角部アイソレータに引き抜きが生じる可能性が高いこと、仙台、東京、大阪及び福岡におけるM7クラスの直下地震では水平動による付加軸力が小さくとも上下動成分による影響が支配的となり、大きな引き抜きを生じさせる可能性が高くなること、長町・利府断層地震や警固断層地震によっては、アスペクト比4.5以上では隅角部アイソレータに過大な引張面圧を生じさせる可能性が高くなることを示した。また、免震建物の設計におけるアイソレータの選定に当たっては、対象サイトの地震基盤より上の基盤構造によるやや長周期帯域の増幅特性に留意して選定することが望ましいことを指摘した。
細胞周期停止によるアポトーシスの分子機構に関する解析

リンパ球において細胞周期回転を停止させたときにアポトーシスが誘導されるが、細胞周期停止がどのようにアポトーシスを誘導するかその分子機構は不明である。そこで細胞周期回転を停止によるアポトーシス関連遺伝子の単離を目的とした。マウスBリンフォーマ細胞株WEHI-231を用いて細胞周期回転停止によるアポトーシス関連する分子を単離するための系を昨年確立した(昨年度本報告書)。この系を利用して、WEHI-231を用いて細胞胞周期停止によるアポトーシスを誘導したものや無処理のものからレトロウィルスベクターを用いたcDNAライブラリーを細胞に導入して、細胞周期停止によるアポトーシスを誘導して、アポトーシス抵抗性細胞を回収した。これらの細胞からレトロウィルスベクターによって染色体に組み込まれたDNA断片を回収し、もう一度同じベクターに導入してスクリーニングを繰り返し、複数の遺伝子断片を得た。この中の一つとしてc-Myc遺伝子断片がレトロウィルスベクターにアンチセンス方向に導入に挿入され、細胞周期停止によるアポトーシスを阻害することを昨年度確認した。c-Mycを過剰発現させた細胞では細胞周期停止によるアポトーシスが亢進することを、逆にc-Mycの機能を抑制するとアポトーシスが抑制されること示した。このことからc-Mycが細胞周期停止によるアポトーシスに深く関与していることが明らかとなった。また、この遺伝子単離系を用いてさらにスクリーニングを行ったところ、細胞周期やアポトーシスと関連していると思われる遺伝子断片が複数得られた。それらの機能については現在解析中である。リンパ球において細胞周期回転を停止させたときに誘導されるアポトーシスに関連する分子を検索するための系を確立することを目的とした。マウスBリンフォーマ細胞株WEHI-231を用いてこれまでに知られている数種の細胞周期停止を誘導する試薬についてアポトーシスの誘導を検討した。DNA複製阻害剤であるミモシンがWEHI-231細胞に効率よく細胞周期停止とアポトーシスを誘導することを見出した。このアポトーシスはアポトーシス阻害因子であるBcl-2により抑制されることを確認し、Bgl-2遺伝子をポジティブコントロールとして細胞周期停止に関したアポトーシスに関連分子の単離システムの条件検討を行い、Bcl-2遺伝子が2000倍以上濃縮できる条件をみつけた。WEHI-231を用いて細胞周期停止によるアポトーシスを誘導したものや無処理のものからレトロウイルスベクターを用いたcDNAライブラリーを構築し、至適化された条件で、細胞周期停止によるアポトーシスを誘導して、アポトーシス抵抗性細胞を回収した。これらの細胞からゲノムDNAを調製し、レトロウィルスベクターによって染色体に組み込まれたDNA断片の回収をPCRにて行った。PCRにより回収されたDNA断片の混合物をもう一度同じベクターに導入して、さらに細胞に導入してスクリーニングを繰り返したところ、c-Myc遺伝子が得られた。この遺伝子断片はレトロウィルスベクターにアンチセンス方向に導入に挿入されており、このベクターをWEHI-231に導入したものにおいて細胞周期停止によるアポトーシスを阻害することを確認した。このことからc-Mycが細胞周期停止によるアポトーシスに関与していることが強く示唆された。この系を利用して、WEHI-231を用いて細胞周期停止によるアポトーシスを誘導したものや無処理のものからレトロウィルスベクターを用いたcDNAライブラリーを細胞に導入して、細胞周期停止によるアポトーシスを誘導して、アポトーシス抵抗性細胞を回収した。この中の一つとしてc-Myc遺伝子断片がレトロ

ウィルスベクターにアンチセンス方向に導入に挿入され、細胞周期停止によるアポトーシスを阻害することを昨年度確認した。c-Mycを過剰発現させた細胞では細胞周期停止によるアポトーシスが亢進することを、逆にc-Myc機能を抑制するとアポトーシスが抑制されること示した。このことからc-Mycが細胞周期停止によるアポトーシスに深く関与していることが明らかとなった。また、この遺伝子単離系を用いてさらにスクリーニングを行ったところ、細胞周期やアポトーシスと関連していると思われる遺伝子断片が複数得られた。それらの機能については現在解析中である。
メタンハイドレートの高温高圧下の相変化と海王星・天王星氷マントルの状態の推定

メタンハイドレートは、外惑星やその衛星の主要な構成成分の一つと考えられている。海王星や天王星などの氷惑星では、構成成分や内部構造が探査機や理論計算から予測されており、氷層にメタンハイドレートが存在している可能性がある。しかし、氷惑星内部に匹敵する温度圧力下でのメタンハイドレートの状態を調べた実験はなかった。また、太陽系で最も豊富に存在する水素のハイドレートが氷衛星やプロトスターに存在する可能性が示唆さているが、水素ハイドレートの高圧相変化なども明らかにされていなかった。さらに、メタンハイドレートと水素ハイドレートは、他のガスハイドレートと比較して際立った安定性を示しており、メタンハイドレート、水素ハイドレートのみに高圧安定性を保証する特異的な分子間相互作用が働いていることが予測できる。そこで本研究では、氷惑星内部条件におけるメタンハイドレートの状態や、水素ハイドレートの高圧相転移を明らかにし、またハイドレート内の分子間相互作用を調べることを目的として、メタンハイドレート、水素ハイドレートの高圧実験を行った。本年度は、主に水素ハイドレートの高圧実験を行った。X線回折実験により、水素ハイドレートは、3540GPa付近で、フレームワーク水分子に水素結合対称化が生じ、これに誘発されて、新たな高圧相へ転移することが示された。さらに、分光学的な実験により、固体水素では一般的に観察されるカップリング現象が、水素ハイドレート内では抑制されることを明らかにした。また、ゲスト水素分子の回転が抑制されることをとらえた。固体水素では、水素分子の回転が止まるためには160GPa以上の高圧が必要であることを考慮すると、構造内での回転抑制はフレームワークによる強い相互作用が働いる結果であると考えられた。しかしながら、氷惑星内部に匹敵する温度圧力下でのメタンハイドレートの状態を調べた実験はこれまで報告されていなかった。そこで、本研究では、高温高圧実験を行い、氷惑星内部条件におけるメタンハイドレートの状態を明らかにした。実験の結果メタンハイドレートは、10GPa、2000Kで氷とメタンに溶融・分解し、溶融したメタンはさらに分子重合して、エタンを生成することが明らかとなった。この結果から、天王星や海王星内部には水、メタン、エタンの高温高圧流体が存在している可能性が示された。また、メタンハイドレートは他のガスハイドレートと比較して、際立った高圧安定性を示している。このことから、メタンハイドレートの構造内では、高圧安定性を保証する特異的な相互作用が働いていることが予測される。この相互作用を検出し、その高圧安定性への寄与を明らかにすることも本研究の目的であった。メタンハイドレート内のメタン分子の振動状態を調べた結果、構造内のゲストメタン分子が、15から20GPa付近で配向の秩序化を起こすことが明らかとなった。さらに40GPa付近では、フレームワークの水分子に水素結合の対称化が起こる可能性が示された。これらのゲストメタン分子の配向の秩序化やフレームワーク水分子の水素結合対称化によって、新たな相互作用がゲストーゲスト問およびゲストーホスト間で生じ、この分子間相互作用がメタンハイドレートの安定性を導いていると考えられた。
遺伝子機能を特異的に制御する新規機能性ポリアミドの開発

本研究は、申請者の開発してきたアルキル化反応性Py-Imポリアミドの分子設計を基盤として新たな機能性Py-Imポリアミドを創成することを目的とした。具体的には、細胞内での応用における利便性を高める機能性を付与することによって、特定遺伝子の発現を制御する汎用的な方法論の確立を目指した。本研究の実施によって得られた研究成果は速やかに生物化学系の論文として報告し、本研究を遂行した。遺伝子機能や動態に対する関心が高まる研究背景のもと、申請者は、DNA遺伝子配列中の1塩基対の差異をも認識する能力を有する様々な機能性ピロール(Py)-イミダゾール(Im)ポリアミドの研究開発を進める。将来的に、培養細胞内の遺伝子発現を機能性Py-Imポリアミドの配列特異性によって制御可能であることを実証し、様々な関連遺伝子に対する有効な機能調節分子としての評価を確立することを目指す。Fmoc固相合成技術を基盤とする本研究の進展により、培養細胞中の目的の遺伝子群に対して特異的に作用する機能性Py-Imポリアミドも開発できると考える。2012年度の研究進展状況:島津製ペプチド合成機を用いたFmoc固相合成機を活用し、細かな合成条件の改善を進めながら、各種標的塩基配列に対応する機能性Py-Imポリアミドを合成した。その結果、(2)アルキル化能を有するPy-Imポリアミドについても、本年度に新しい知見を報告することができた。現在、タンデム型Py-Imポリアミドの合成に関しても、新しい効率的な方法論を用いてヒトテロメア配列を標的とするタンデム型Py-Imポリアミドの合成、機能評価を進めている。また、環状Py-Imポリアミドについて得られた知見、実験結果をまとめ投稿準備も進めている。特定遺伝子発現の化学的な機能分子による制御法の実現に向けて、申請者はDNAの遺伝子配列中の1塩基対の変異体の差異を認識する能力を持つ機能性ピロール(Py)-イミダゾール(Im)ポリアミドの研究開発を進めている。将来的に、培養細胞内の特定遺伝子の発現を機能性Py-Imポリアミドの配列特異性によって制御可能であることを証明し、遺伝子発現制御分子としての有用性を示していく。2013年度も島津製Fmoc固相合成機を活用し、合成条件を工夫、改善しながら、標的塩基配列に対応する機能性Py-Imポリアミドを合成、機能評価を進めた。その結果を以下に示す。(1)SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid)をPy-Imポリアミドに連結させた誘導体によって、ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)中の様々な遺伝子を特異的に活性化した。(2)ヒトテロメア配列を標的とする蛍光性タンデム型Py-Imポリアミドの合成、機能評価を行なった。(3)システインークロロアセチル基との間の反応を利用した環状Py-Imポリアミド二量体を合成した。(4)アルキル化能を有するPy-Imポリアミドについて、Kras遺伝子配列の1塩基の変異型を認識可能であることを報告した。Fmoc固相合成技術を基盤とする本研究の進展により、培養細胞中の特定遺伝子群に対して特異的に作用する機能性Py-Imポリアミドが開発できると考える。現在、SAHA以外のエピジェネチックスを制御する可能性のある機能性Py-Imポリアミドの新規合成を進めており、得られる知見、実験結果をまとめ、論文として投稿する予定である。2014年度は、以下に示すように島津製Fmoc固相合成機を本格的に駆使することによって、様々な標的塩基配列に対応す各種機能性Py-Imポリアミドを合成し、それらの機能評価を進めた。(1)SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid)をPy-Imポリアミドに連結させた誘導体によって、ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)中の様々な初期化遺伝子群を特異的に活性化したことを報告した。(2)ヒトテロメア配列を標的とする蛍光性タンデム型Py-Imポリアミドの合成、機能評価。(3)CAG繰り返し配列を標的とするクロラムブシル- Py-Imポリアミドの合成、機能評価。(4)アルキル化能を有するタンデム型Py-Imポリアミドの合成、機能評価。(5)次世代シーケンサーを用いるSAHA Py-Imポリアミドの特異的結合、認識能評価。本研究の進展により、培養細胞中の特定遺伝子群に対して特異的に作用する機能性Py-Imポリアミドの開発研究が進展している。現在、特許に出願中であるエピジェネティクスを制御する可能性のあるCTB Py-Imポリアミドの機能評価を進めており、得られる知見、実験結果を論文としてまとめる予定である。機能分子による化学的な特定遺伝子発現制御法の実現に向けて、申請者はDNAの遺伝子配列中の1塩基対の変異体の差異を認識する能力を持つ機能性ピロール(Py)-イミダゾール(Im)ポリアミドの研究開発を進めている。これまでに培養細胞内の特定遺伝子の発現を機能性Py-Imポリアミドの配列特異性によって制御可能であることを証明し、遺伝子発現制御分子としての可能性を示してきた。

2015年度は、島津製Fmoc固相合成機を駆使して、様々な標的塩基配列に対応する機能性Py-Imポリアミドを合成し、それらの機能評価を進めた。(1)ヒストンアセチル基転移酵素を活性化する機能分子であるCTBをPy-Imポリアミドに連結させた誘導体によって、ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)中の遺伝子群を特異的に活性化することに成功した。(2) KRASの変異Codon12配列を特異的に認識してアルキル化するPy-Imポリアミドを合成し、その変異をもつ癌細胞を移植したマウス実験にて抗がん活性を評価した。(3)ヒトテロメア配列を標的とする蛍光性タンデム型Py-Imポリアミド三量体の合成と評価を実施。(4)共同研究として特定遺伝子発現制御能を持つPy-Imポリアミドの合成と評価を実施。本研究成果として、培養細胞中の特定遺伝子群に対して特異的に作用する機能性Py-Imポリアミドの開発研究が進展した。現在、エピジェネティクスを制御する機能性Py-Imポリアミドについてまとめるために、次世代シーケンサーを積極的に用いて解析評価を進めている。得られた知見、研究成果は2016年度に論文としてまとめる予定である。本研究は、申請者の開発してきたアルキル化反応性Py-Imポリアミドの分子設計を基盤として新たな機能性Py-Imポリアミドを創成することを目的とした。具体的には、細胞内での応用における利便性を高める機能性を付与することによって、特定遺伝子の発現を制御する汎用的な方法論の確立を目指した。本研究の実施によって得られた研究成果は速やかに生物化学系の論文として報告し、本研究を遂行した。特許出願を優先したため、論文報告が遅れた研究もあるが、全体として研究の核となる研究知見は十分に見出されており、機能性Py-Imポリアミドの研究を蛍光によるイメージング、HDAC阻害活性による遺伝子発現活性化、アルキル化反応へと広く展開することができた。三年目の研究実績として、順調に進展していると考える。27年度が最終年度であるため、記入しない。ケミカルバイオロジーヒトテロメア配列を標的とする蛍光性Py-Imポリアミドの合成の改良を行い、それらの機能評価の結果を論文としてまとめる。また、最新の次世代シークエンサーを用いたDNA塩基配列認識能評価の結果、現在得られている結合認識能に関する知見、実験結果も論文としてまとめる予定である。論文としてまとめる作業がやや遅れている研究領域もあるが、全体として研究のseedとなる研究知見は見出されており、機能性Py-Imポリアミドの研究を展開するために必要な初年度の実績を達成することができた。従って、概ね順調に進展していると考える。論文として報告する作業が遅れている研究もあるが、全体として研究の核となる研究知見は見出されており、機能性Py-Imポリアミドの研究を広く展開することができた。二年目の研究実績として、概ね順調に進展していると考える。外国への試薬代と論文校正代を3月支払いに予定していたものが、4月のカード払いとなったため。ヒトテロメア
ヒストンH3K36メチル化酵素に着目した転写解剖

ヒストンH3K36のメチル化は、種を越えて転写活性領域をマークするようにゲノムクロマチン上に分布しているにも関わらず、この修飾をヒストンメチル化酵素遺伝子の欠損によって除いても、mRNAレベルで転写に顕著な変化は見出せない。哺乳類には少なくとも5種類のヒストンH3K36メチル化酵素が存在し、その一つであるNSD2 (別名WHSC1, MMSET)は、ヒト4番染色体短腕の片アレル欠損によって発症する発育不良、精神遅滞を特徴とする4p-症候群の主要な原因遺伝子である。ヒストンメチル化酵素活性領域であるSETドメインを含んだC末側半分を欠損したNSD2変異マウスは、出生直後に致死で特にB細胞を含む脾臓の低成長を示す。胎仔肝細胞の造血幹細胞を単離して、ストローマ細胞との共培養によるex vivoのB細胞分化系を用いて、NSD2欠損が、B細胞への分化決定には影響しないが、V(D)J組み換えを正常に進行できないことを見出した。そこで異常が見られるproB段階の細胞をex vivo培養で調整してmRNA及び新規合成RNAの次世代シークエンサーを用いた解析を行った。その結果、B細胞分化に影響するおよそ50種類の制御因子の発現では顕著な変動は見いだせなかった。一方で、NSD2タンパク質はクロマチンに高塩濃度でも安定に結合するタンパク質であり、次世代シークエンサーを用いたクロマチン免疫沈降実験解析の結果、特に転写活性が高いクロマチン領域に多く分布していることが明らかになった。以上の結果は、転写活性領域に集積するNSD2が転写以外のDNA代謝反応に関与する可能性を示唆している。NSD2欠損マウスにおけるV(D)J組み換え異常から、二本鎖切断修復応答への関与が考えられる。以上の結果から、ヒストンH3K36のメチル化が転写活性領域のゲノム維持を担う転写とDNA修復の分子共役モデルを提唱する。28年度が最終年度であるため、記入しない。転写活性領域に高度に分布するH3K36メチル化を担う酵素の一種であるWhsc1の欠損マウスは、B細胞の分化異常を示す。Whsc1は様々な転写因子の機能発現に関与するが、Whsc1自体の機能は定かでない。そこで造血幹細胞からストローマ細胞との共培養によってB細胞に分化させるex vivo培養系を用いて(1)新生RNAの解析(2)タンパク複合体解析を進め、新規の転写サイクル機構の解明を目指した。前者の、Whsc1欠損による新生RNAの質的、量的変化の解析では、分化誘導したB細胞を4-チオウリジンでパルスラベルしてビオチン化し、新規合成RNAだけ回収し次世代シークエンサーによって解析するサンプルの調整まで完了した。後者のB細胞におけるWhsc1複合体解析では、当初、preBの培養細胞でタグ付きWhsc1を過剰発現させて精製する予定を変更して、より生体に近いない財政のタンパク複合体の精製を試みることにした。具体的にはex vivo培養系でWhsc1の発現が高いproB細胞に分化誘導して細胞抽出液を調整し、Whsc1抗体を用いてWhsc1複合体を精製し、複合体の構成因子を多数同定した。複合体には転写とDNA複製、さらに修復に関わる因子が複数含まれ、異なるDNA代謝反応のカップリングが示唆された。培養細胞系に加えて、造血幹細胞特異的にWhsc1を欠損したマウスが樹立され、個体レベルでB細胞の分化異常の解析が可能になった。新生RNAの調整と次世代シークエンサーを用いた解析のためのサンプル調整する実験系の立ち上げが完了した。また、Whsc1複合体解析では当初、培養細胞の強制発現系で精製することを計画したが、生体を反映した内在性のWhsc1を抗体を用いて、遺伝子欠損で分化異常が明確に認められる段階の複合体を精製することができた。さらに複合体に含まれる因子を網羅的に同定することができたので、これから得られる新生RNAの異常の解析結果と統合して、新規の転写サイクル制御機構のモデルを構築する目処を付けることができたと判断する。