hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ラパマイシンで惹起されない新しいオートファジー機構を用いた新規薬剤スクリーニング

申請者らは、窒素源飢餓によるオートファジー誘導系に、ラパマイシンで惹起される経路の他に、惹起されない経路があることを見いだしたさらに、後者の経路もラパマイシンで惹起される経路と同程度に飢餓応答に必要な経路であることを明らかにした。ラパマイシンが免疫抑制剤、抗ガン剤さらには寿命を延ばす薬剤としても注目を集めていることから、本研究では、後者のオートファジーを惹起する物質も同様に有用なものであると考え、この物質を、新しいオートファジー機構を利用してスクリーニングする系の開発を行うために、以下の2点について研究した。薬剤スクリーニング系の確立を目指した研究ラパマイシンで模倣できない新しいオートファジー経路で分解されるタンパク質として酵母の細胞質にあるYpk1に注目し、蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現させ顕微鏡で観察できる系を確立した。主要な液胞(哺乳動物のリソソーム)のタンパク分解酵素を欠損させた細胞を使うことにより、薬剤添加時に、このオートファジー経路が活性化されれば、融合タンパク質が細胞質から液胞に運ばれるため、細胞質の蛍光強度が減少し、液胞の蛍光強度がすることが判定できる。また、適当なYpk1の断片を使うことにより、より一層観察しやすい系を確立した。また、簡便な系としては野生株を用いてSDS-PAGE後に、western blotを行い、分解の有無で判断するシステムを確立した。セリン/スレオニンキナーゼ欠損株のスクリーニングラパマイシンで惹起されない経路に於ける、Ypk1の上流のキナーゼがTORC1と同様、セリン/スレオニンキナーゼであると仮定して、セリン/スレオニンキナーゼ欠損株のスクリーニングを行った。その結果、ある種のセリン/スレオニンキナーゼがin vivoあるいはin vitroにおいてもYpk1をリン酸化することを見出した。申請者らは、窒素源飢餓によるオートファジー誘導系に、ラパマイシンで惹起される経路の他に、惹起されない経路があることを見いだしたさらに、後者の経路もラパマイシン惹起され経路と同程度に飢餓応答に必要な経路であることを明らかにした。(1)薬剤スクリーニング系の確立を目指した研究ラパマイシンで模倣できない新しいオートファジー経路で分解されるタンパク質として酵母の細胞質にあるYpk1に注目し、蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現させ顕微鏡で観察できる系を確立した。主要な液胞(哺乳動物のリソソーム)のタンパク分解酵素を欠損させた細胞を使うことにより、薬剤添加時に、このオートファジー経路が活性化されれば、融合タンパク質が細胞質から液胞に運ばれるため、脂肪質の蛍光強度が減少し、液胞の蛍光強度がすることが判定できる。(2)セリン/スレオニンキナーゼ欠損のスクリーニングラパマイシンで惹起されない経路に於ける、Ypk1の上流のキナーゼがTOPC1と同様、セリン/スレオニンキナーゼであると仮定して、セリン/スレオニンキナーゼ欠損株のスクリーニングを行った。
教科・教材に対する認識活動における事象関連電位の解析

事象関連電位(Event-Related Potentials:ERP)は、ある特定の情報や刺激に対する生体反応として、脳波の中でも精神的な活動を捉えるときに有効である。ERP反応は脳の活動全体の指標ではなく、むしろ特定刺激に対する反応を捉えることができる。本研究では、このERP反応を測定することにより、教材に対する認識活動の特徴を、情報入力段階で検討することを目的としている。今回の萌芽的研究では補助金を得ることにより、(1)シールドルームによるノイズの除去、(2)脳波から必要な反応のみを選択しERP反応を純粋に取り出すこと。(3)提示用画像の時間的制御の3点の問題を解決することができた。この改善により、正確なERP反応を安定的に得ることができるようになった。本研究では、2つの情報を連続提示したときの関係づけ・意味づけ課題が、ERP反応に及ぼす影響を実験した。提示した情報は視覚情報で、文字単語(清音2音節、清音3音節)、数字(2桁の和算、減算)、実物画像(動物、道具)の3群で、2情報セットで60種類をコンピュータ制御により提示した。提示時間は、1提示400ms、間隔1600msであり、各実験の被験者は大学生16名とした。その結果、ERP反応に次の特徴が明らかになった。(1)N200以前の反応(受容反応)では大きな差異はないが、P300以降の反応(処理反応)は、情報の持つ意味が高い(明確な)ほど、単語≧数字>画像の順で早く、強く出現する傾向がある。(2)連続した2つの情報では、1つ目の情報の受容・処理よりも2つ目の情報の方が反応潜時が早い。(3)教示した課題が、明確になるほどERP反応は明確になり、曖昧な課題になると出現しにくい。(4)複雑な情報になると、ERP反応のピーク強度が小さく同定が困難になる。この研究から、課題の明瞭性、教材の複雑さや有意味性などの指標としてERP反応が有効であることを明らかにすることができた。本研究では、学習活動を子どもの認識活動とその発展という視点から、教科や教材を検討考察することを目標としている。子どもが対象(教科・教材)を認識する活動を把握する1つの方法として、認識活動の初期段階に焦点を当て、そのときの学習者の脳波における事象関連電位(ERP反応)の変化から、教科・教材に対する受容・処理の初期段階の解析を試みた。大学生を被験者として、意味情報や画像情報を提示したときのERP反応を分析した。被験者に(1)連続する清音2音節単語の意味関連性、(2)連続する画像(昆虫及び動物)、(3)連続する2つの数の掛け算を提示したとき、Fz、Cz、Pz、C3、C4部位の脳波から算出したERP反応との関連性を明らかにした。その結果、次の点を明らかにすることができた。(1)連続する2枚の画像を提示したとき、2枚目に対するP300の強度が強くなる傾向がある。(2)課題の有無にかかわらず、連続する2枚の画像に対して同様のERP反応が生じることから、何らかの関係づけ・意味づけの活動を行っていると推察できる。(3)親近性がある内容に対するP300の反応潜時は早まる。(4)親近性が低い内容よりも、高い内容の方がそれぞれのピーク潜時及び強度に与える効果が大きい。(5)単語の認識課題で課題がある方が、単語の持つ有意味性による影響が大きい。(6)暗算課題で、繰り上がりがある掛け算の方がある方よりもP300の反応潜時は遅く、強度は大きくなる。(7)繰り上がりがある掛け算課題では、提示順序によりP300の反応潜時・強度が大きく影響される。

(3)教示した課題が、明確になるほどERP反応は明確になり、曖昧な課題になると出現しにくい。(4)複雑な情報になると、ERP反応のピーク強度が小さく同定が困難になる。この研究から、課題の明瞭性、教材の複雑さや有意味性などの指標としてERP反応が有効であることを明らかにすることができた。
血液細胞の分化と機能発現の制御機構の解明

a)GATA因子群の転写制御:GATA転写因子群の発現に対して行われている転写調節様式をトランスジェニックマウス系を用いて個体レベルで検討した.GATA-1,GATA-2のそれぞれの細胞系列(赤血球・巨核球・マスト細胞・好酸球)での発現に必要なシスエレメントの同定を行い,GATA-1の赤血球と巨核球における発現には,個別の制御領域が必要であることを明らかにした.b)個体レベルでの転写因子蛋白質のドメイン解析:我々はGATA-1遺伝子の発現制御領域の解析を通じて,すでに赤血球系におけるGATA-1の発現に必要十分な制御領域を同定している.この制御領域を用いて,GATA-1蛋白質の各ドメインの機能を個体レベルで解析した.その結果,培養細胞レベルの解析で同定された転写活性化ドメインは,生体内における赤血球分化において必要ないことが明らかとなった.c)個体レベルでのGATA因子群の機能解析:GATA転写因子群は良く保存されたDNA結合領域を有しており,それぞれの転写因子にどのような機能の違いが存在するかは,未だに明らかになっていない.そこで,上述のGATA-1発現制御領域を用いて,それぞれのGATA因子を同じ場所・タイミングでGATA-1欠損個体に発現させ,それによって引き起こされる表現型の違いを解析することにより,GATA因子間に存在する機能の類似性と特異性を明らかにすることを試みた.その結果,GATA-1欠損個体はGATA-2でも,GATA-3でもレスキューされることが明らかになった.一方,それらのレスキュー個体では,GATA-1でレスキューされた個体と比較して明らかな貧血があり,GATA-1とGATA-2,3とには明らかな機能的な違いも存在することが示唆された.赤血球特異的な遺伝子発現制御機構を解明する目的で,転写因子間相互作用に基づく転写制御ネットワークが赤血球前駆細胞の増殖・分化の方向性決定に果たす役割の解明と,赤血球系転写因子自身の発現制御機構の解明とを試みた.その結果,以下の点を明らかにした.1.GATA-1の転写制御機構が胎児型造血細胞と成人型造血細胞とで異なることを発見した.また,GATA-1遺伝子の部分破壊により,同遺伝子が胎児型造血細胞・成人型造血細胞それぞれの成熟過程に必須であることを実証した.2.NF-E2転写因子の小サブユニットであるMafKの転写が造血細胞・間葉細胞と神経細胞との間で異なるプロモーターにより,独立に制御されることを発見した.3.NF-E2の大サブユニットであるCNCファミリー蛋白質と会合し,その細胞内局在を制御する新しい蛋白質Keap1を発見し,その構造と機能を解析した.4.GATA-2遺伝子の転写制御には2つの異なるプロモーターが関与しており,造血細胞で特異的に機能するプロモーターが存在することを明らかにした.本研究において,GATA-1遺伝子部分破壊マウスの解析から,GATA-1が胎児造血細胞分化に必須であることが理解された.ところで,個体レベルで遺伝子破壊を行い,その表現型の変化を調べる方法の問題点は,その個体が胎生致死となった際に,原因となった細胞系列以外に対する影響を解析できない点にある.GATA-1遺伝子破壊マウスでは,成人造血細胞に対するGATA-1欠失効果を解析できない.そこで,試験管内で胚幹細胞を血球分化させる系や,ネオマイシン耐性遺伝子をLoxP配列に挟んだ形で挿入した部分破壊マウス系の確立に取り組んでいる.今後は,これらシステムを用いて,造血細胞の増殖・分化に対するGATA-1の機能的貢献や,さらに胎児造血と成人造血の関係等を検討する予定である.本年度において、1.赤血球組織特異的転写因子GATA-1のin vivoでの機能を解析するために、GATA-1遺伝子破壊マウスを作製したところ、GATA-1欠失マウスは胎生12.5日までに重篤な貧血により胎生致死となった。卵黄嚢において未分化な赤血球前駆細胞の大量蓄積が観察されることから1次造血における赤血球系細胞の終末分化にGATA-1が必須であることを示した。2.β-ガラクトシダーゼをレポーターとしたトランスジェニックマウスを用いたマウスGATA-1の遺伝子発現制御領域の解析結果から、赤血球型第1エクソンの上流2.63.9Kbの領域に転写制御エレメント(アップストリームエレメント)の存在を同定した。このアップストリームエレメント単独では1次造血における赤血球系細胞のGATA-1発現の再現には十分であったが、1次および2次造血におけるGATA-1発現の再現には第1イントロンが必要であった。以上からGATA-1遺伝子発現が1次造血と2次造血とでは異なった転写制御エレメントによって制御されることを示した。3.NF-E2とともにCNCファミリーを構成する転写因子Nrf2の遺伝子破壊マウスの作製およびその解析の結果から、解毒系第2相反応に関わるグルタチオンS-トランスフェラーゼおよびヘム分解酵素ヘムオキシゲナーゼIの誘導にNrf2と小Mafのヘテロ2量体が関わることを明らかにした。上記の研究成果を発展させ、本研究では平成10年度においても発生工学的手法を駆使して赤血球特異的な遺伝子発現の分子機構の理解を総合的に進める。赤血球特異的な遺伝子発現制御機構のを明らかにする目的で、転写因子間相互作用に基づく転写制御ネットワークの増殖・分化における役割の解明を試みた。その結果以下の点を明らかにした。1. GATA-

1遺伝子の転写制御機構が胎児型造血細胞と成人型造血細胞とで異なることを発見した。また、GATA-1遺伝子の部分破壊により、同遺伝子が胎児型造血細胞・成人型造血細胞それぞれの成熟過程に必須であることをを実証した。さらに胚性幹細胞(ES細胞)の試験管内分化実験やGATA-1遺伝子の部分破壊マウスを用いた実験で、GATA-1遺伝子が積極的に細胞増殖の抑制に働いていることを明らかにした。2. GATA-1遺伝子の部分破壊マウスを用いたレスキュー実験で、赤血球分化に充分なGATA-1遺伝子の発現制御領域を明らかにした。3. NF-E2転写因子の小サブユニットであるMafKの転写が造血細胞・間葉細胞との間で異なるプロモーターにより独立に制御されることを発見した。4. NF-E2転写因子の大サブユニットであるCNCファミリー蛋白質と会合し、その細胞内局在を制御する新しい蛋白質Keap1を発見し、その構造と機能を解析した。5 GATA-2遺伝子の転写制御には2つの異なるプロモーターが関与しており、造血細胞で特異的に機能するプロモーターが存在することを明らかにした。今後はGATA-1遺伝子の発現制御領域を用いたレスキュー実験で赤血球特異的な遺伝子の、造血細胞の増殖・分化に対する機能的貢献を、個体レベルで解析する予定である。a)GATA因子群の転写制御:GATA転写因子群の発現に対して行われている転写調節様式をトランスジェニックマウス系を用いて個体レベルで検討した.GATA-1,GATA-2のそれぞれの細胞系列(赤血球・巨核球・マスト細胞・好酸球)での発現に必要なシスエレメントの同定を行い,GATA-1の赤血球と巨核球における発現には,個別の制御領域が必要であることを明らかにした.b)個体レベルでの転写因子蛋白質のドメイン解析:我々はGATA-1遺伝子の発現制御領域の解析を通じて,すでに赤血球系におけるGATA-1の発現に必要十分な制御領域を同定している.この制御領域を用いて,GATA-1蛋白質の各ドメインの機能を個体レベルで解析した.その結果,培養細胞レベルの解析で同定された転写活性化ドメインは,生体内における赤血球分化において必要ないことが明らかとなった.c)個体レベルでのGATA因子群の機能解析:GATA転写因子群は良く保存されたDNA結合領域を有しており,それぞれの転写因子にどのような機能の違いが存在するかは,未だに明らかになっていない.そこで,上述のGATA-1発現制御領域を用いて,それぞれのGATA因子を同じ場所・タイミングでGATA-1欠損個体に発現させ,それによって引き起こされる表現型の違いを解析することにより,GATA因子間に存在する機能の類似性と特異性を明らかにすることを試みた.その結果,GATA-1欠損個体はGATA-2でも,GATA-3でもレスキューされることが明らかになった.一方,それらのレスキュー個体では,GATA-1でレスキューされた個体と比較して明らかな貧血があり,GATA-1とGATA-2,3とには明らかな機能的な違いも存在することが示唆された.
中枢神経系の発生におけるbcl-2遺伝子の機能の解析

ヒト濾胞性リンパ腫に関与するがん遺伝子bcl-2は、過剰発現されるとリンパ球や神経系細胞の細胞死を抑制するという非常に特異的な活性を持つ。我々は中枢神経系の発生過程におけるプログラム死に対するbcl-2及びその関連遺伝子bcl-xの関与を検証し、その機構を明らかにするため、神経系、あるいは全身で同遺伝子を構成的あるいは調節的に発現するトランスジェニックマウスの作成を試みた(現在進行中)。また、Bcl-2が細胞死を抑制する分子機作に関して、最近Antioxidantとして働くことが示唆されているが、これに反する知見を得た。Bcl-2がAntioxidantとして働くかどうかを検証するために、低酸素下で誘導される細胞死とそれに対するBcl-2の機能を検討した。ラット肝がん細胞株7316AとラットPheochromocytoma株PC12は低酸素条件下で48時間培養すると約半数の細胞が細胞死を起こす。これらの細胞にBcl-2又はBcl-xLを発現させると、この細胞死は抑制された。ESR spin trap法により活性酸素量を定量したところ、低酸素条件下では活性酸素量は検出限界以下であり、また、DNA、蛋白質、脂質の過酸化は検出できなかった。検出限界以下の活性酸素が低酸素条件下で誘導される細胞死に関与している可能性を否定するため、活性酸素スカベンジャー(N-acetylcysteine)及び活性酸素スカベンジャー阻害剤(diethylmaleate)を加えたが、Bcl-2、Bcl-xLの存在、非存在にかかわらず、この細胞死は全く影響を受けなかった。以上の結果は、Bcl-2は活性酸素を介さない機構で細胞死を抑制することを示している。活性酸素が関与する細胞死もBcl-2により抑制されるものがあり、Bcl-2はその細胞死においては活性酸素が機能するステップの下流を制御しているというモデルを提唱することができた。
悪性腫瘍骨転移に関わる細胞接着分子の解析 -特にβ3インテグリンの役割について-

腫瘍組織において、副甲状腺ホルモン関連蛋白(PTHrP)の発現と局在、オステオポンチン受容体であるαvβ3 integrinの発現と局在を病理組織学的に検討した。乳癌転移症例を用いた検討ではαvβ3 integrinの発現が転移臓器特異性を示すことを示唆する知見を得た。更に、手術、剖検材料を用いて腫瘍のαvβ3 integrin発現と臨牀的な骨転移との相関について臨牀病理学的検討を行い、腫瘍細胞の産生するPTHrPは骨芽細胞を介して破骨細胞を活性化して骨吸収を促進し、さらに吸収窩に露出する骨基質蛋白のひとつであるオステオポンチンと腫瘍細胞との結合がαvβ3 integrinを介して行われている可能性を示す結果を得た。過去の病理組織標本を用いて、αvβ3 integrinについては組織分子雑種法で、PTHrPについては免疫組織化学法にて、これらの発現や局在を腫瘍の組織型や分化度との関連において解析するとともに骨転移の有無や転移巣毎の比較検討を行なった。組織分子雑種法については、通常のホルマリン固定パラフィン包埋の病理組織標本に対して施行可能なように、更に骨転移巣についても通常の脱灰標本を検討に供することができるようにブロモデオキシウリジン標識した独自のプローブを作成し、より高感度な系で組織分子雑種法が行えるよう方法を改良も行った。生化学的にRT-PCRを用いた症例解析を行い、組織分子雑種法という形態学的観察を補強しながら実験を遂行し、多くの研究論文と症例解析の報告を内外の学術誌に掲載した。私どもは、1980年より悪性腫瘍随伴性高カルシウム血症の原因因子である副甲状腺ホルモン関連蛋白(PTHrP)の腫瘍組織における発現と局在について多くの知見を集積してきた.それらの検討を通じて,乳ガン骨転移はPTHrPの発現と相関のあることを既に報告した.一方,骨転移の成立には,腫瘍細胞と骨気質,とくにRGDペプチドを有するオステオポンチン等との親和性を考慮する必要がある.骨髄微小環境において,腫瘍細胞の産生するPTHrPが破骨細胞を活性化して骨吸収を促進し,骨組織における腫瘍増殖の場を拡大することが予想された.私どもと,米国ワシントン大学Dr. Teitelbaumとの共同研究の結果,マウス骨髄マクロファージの分化に際し,細胞表面のαvβ3 integrinの発現量を規定するのは,β3 subunitであることを明らかにし,Journal of Biological Chenistryに発表した.αv subunitはβ1, β3, β5という複数のβsubunitとheterodimerを形成する一方,β3 subunitは,巨核球をのぞきαv subunitのみとheterodimerを形成する事実も,私どもの結果を支持するものである.また,これらの研究成果に基づき,骨転移を示す腫瘍細胞におけるαvβ3 integrinの発現,特にβ3 integrinの発現調節機序に注目し,乳癌外科手術材料を用いて,原発巣,臓器別転移巣におけるβ3 subunit発現を分子雑種法を用いて解析した.その結果,β3 subunit発現は,骨転移巣で高度に認められ,原発巣ではheterologousに陽性腫瘍細胞がみられた.骨転移の成立には,1)腫瘍由来のPTHrPをはじめとする破骨細胞活性化因子の放出,2)活性化された破骨細胞による骨気質の露出,3)腫瘍表面に発現するintegrinをはじめとする接着分子と骨気質との相互作用という機序の存在が推定された.この成果はClinical Orthopaedics and Related Researchに発表した.前年度までの組織形態学的観察に加え、8年度には、インテグリンの生化学的解析とRT-PCR法を用いた症例解析の積み重ねを行った。

手術、剖検材料を用いて腫瘍のαvβ3 integrin発現と臨牀的な骨転移との相関について臨牀病理学的検討を行い、腫瘍細胞の産生するPTHrPは骨芽細胞を介して破骨細胞を活性化して骨吸収を促進し、さらに吸収窩に露出する骨基質蛋白のひとつであるオステオポンチンと腫瘍細胞との結合がαvβ3 integrinを介して行われている可能性を示す結果を得た。過去の病理組織標本を用いて、αvβ3 integrinについては組織分子雑種法で、PTHrPについては免疫組織化学法にて、これらの発現や局在を腫瘍の組織型や分化度との関連において解析するとともに骨転移の有無や転移巣毎の比較検討を行なった。組織分子雑種法については、通常のホルマリン固定パラフィン包埋の病理組織標本に対して施行可能なように、更に骨転移巣についても通常の脱灰標本を検討に供することができるようにブロモデオキシウリジン標識した独自のプローブを作成し、より高感度な系で組織分子雑種法が行えるよう方法の改良も行った。骨折治癒過程における種々の遺伝子発現を観察し、骨転移モデルに応用出来るように基礎的検討を行い、国際学会で報告するとともに、多くの研究論文と症例解析の報告を内外の学術誌に掲載した。
2本鎖RNAによるNK細胞非依存性感染抵抗性増強機構の解明

二本鎖RNA(PolyI:C)の細菌感染症に及ぼす影響について解析した。今年度はナチュラルキラー細胞に加えて、インバリアントナチュラルキラー細胞に及ぼす影響についても解析した。インバリアントナチュラルキラー細胞の解析にはαガラクトシルセラミドをロードしたCD1dテトラマーが必要なことから、ドイツマックスプランク感染生物学研究所においてαガラクトシルセラミドをロードしたCD1dテトラマーを作成し、細菌感染後の本細胞の動態について解析した。インバリアントナチュラルキラー細胞は他の臓器と比べて肝臓に高頻度に存在することから、肝臓に存在する本細胞の動態を中心に解析した。その結果、予めマウスに二本鎖RNA(PolyI:C)を投与すると、肝臓に存在するαガラクトシルセラミドをロードしたCD1dテトラマー反応性細胞、即ちインバリアントナチュラルキラー細胞が検出出来なくなることが明らかとなった。本細胞が検出出来なくなる要因は、申請者等のこれまでの研究によりインターロイキンー12の大量産生によることが明らかになっていることから、二本鎖RNA(PolyI:C)を投与すると、インターロイキンー12が大量に産生され、その結果として、I型免疫応答が強く誘導され、細菌感染に対して防御的に働いていると推測される。このように、本研究によって、二本鎖RNA(PolyI:C)の投与はナチュラルキラー細胞のみならず、インバリアントナチュラルキラー細胞に対してもインターロイキンー12の産生を誘導することにより、影響を及ぼしていることが明らかになった。これまでは実験室が無償で使用出来ていたが、突然年間にして250万円程度を支払わなければならなくなり、実質上研究が出来なくなった。そのため、計画通りに研究が行えず、結果として大幅に研究が遅延する結果となった。上述した通り、実験室が実質上使用不能となったため、現在共同研究してもらえそうな企業を探している。残念ながら名乗りを上げてくれる企業がいないことから、申請者が以前に勤務していたドイツマックスプランク感染生物学研究所のロバート・フルヴィッツ博士に協力してもらい研究を遂行する予定である。2本鎖RNA(Polyinocinic-polycytidylic acid: PolyI:C)による細胞内寄生細菌感染抵抗性増強機構にNK細胞は必須であると考えられているが、申請者等のこれまでの研究により、Poly I:Cによる細胞内寄生細菌感染抵抗性増強機構にNK細胞非依存性経路の存在することが明らかとなった。そのため、本研究では、マウスリステリア感染症をモデルとして、PolyI:CによるNK細胞非依存性感染抵抗性増強機構を細胞・タンパク・分子レベルで明らかにすることにより、PolyI:Cによる真の感染抵抗性増強機構を解析することとしていた。当該年度は、Poly I:CがNK細胞非存在下において各種免疫担当細胞にどのような影響を及ぼすかを検討することとした。即ち、NK細胞および/またはiNKT細胞欠損マウス並びにコントロール(C57BL/6)マウスにPoly I:Cを投与し、標的臓器(肝臓・脾臓)の肉眼的変化、標的臓器に存在・集積する各種免疫担当細胞の動態を比較検討する予定であった。しかし、以下に記すように致命的な問題が発生し、再度最初から実験をしなければならなくなった。また、理由は不明であるが、遺伝子欠損マウスの交配が非常に難しく、コントロールマウスと比較して10分の1以下しか繁殖出来ないため、今後どのように交配すれば良いのかを検討する予定である。何れにせよ、遺伝子欠損マウスの交配が難航していること、および遺伝子欠損マウスが蟯虫に感染してしまったことから、最初から実験を行わなければならないのが現状である。これまで、二本鎖RNAはナチュラルキラー細胞(NK細胞)上に発現したToll-like receptorー3(TLRー3)に結合すること、並びにTLRー3からのシグナルを介して本細胞を強く活性化することが知られていた。しかし、申請者はNK細胞の増殖に必須のILー15を遺伝的に欠損したマウス並びにTLRー3を遺伝的に欠損したマウスに二本鎖RNAを予め投与しておくと、細胞内寄生細菌であるListeria monocytogenes (リステリア)に対する感染抵抗性が著しく増加することを見出した。そのため、そのメカニズムを解明するべく、実験を重ねてきた。その結果、確かにNK細胞を欠損しているマウス(ILー15遺伝子欠損マウス並びにTLRー3を遺伝的に欠損したマウス)に二本鎖RNAを投与すると、Listeria monocytogenesに対する感染抵抗性が著しく増加すること、並びに肝臓や脾臓のような標的臓器における炎症の著しく抑制されることが明らかとなった。通常、Listeria monocytogenesをマウスに感染すると、主要標的臓器である肝臓に多数の好中球の浸潤が認められるが、予め二本鎖RNAを投与しておくと、Listeria monocytogenesを感染しても殆ど好中球が肝臓に浸潤しないことも明らかにした。このことは、二本鎖RNAを介したListeria monocytogenesに対する感染抵抗性の増加には確かにNK細胞非依存性の経路が存在していることを示すと共に、感染の極めて早期に二本鎖RNAが作用し、Listeria monocytogenesの増殖のみならず、組織障害を抑制していること、並びにListeria monocytogenesを早期に排除することにより、炎症性の細胞が速やかに炎症局所から撤退していることを示唆している。遺伝子欠損マウスの繁殖が全く思うように進まず、著しく遅延している。

二本鎖RNA(PolyI:C)の細菌感染症に及ぼす影響について解析した。今年度はナチュラルキラー細胞に加えて、インバリアントナチュラルキラー細胞に及ぼす影響についても解析した。インバリアントナチュラルキラー細胞の解析にはαガラクトシルセラミドをロードしたCD1dテトラマーが必要なことから、ドイツマックスプランク感染生物学研究所においてαガラクトシルセラミドをロードしたCD1dテトラマーを作成し、細菌感染後の本細胞の動態について解析した。インバリアントナチュラルキラー細胞は他の臓器と比べて肝臓に高頻度に存在することから、肝臓に存在する本細胞の動態を中心に解析した。その結果、予めマウスに二本鎖RNA(PolyI:C)を投与すると、肝臓に存在するαガラクトシルセラミドをロードしたCD1dテトラマー反応性細胞、即ちインバリアントナチュラルキラー細胞が検出出来なくなることが明らかとなった。本細胞が検出出来なくなる要因は、申請者等のこれまでの研究によりインターロイキンー12の大量産生によることが明らかになっていることから、二本鎖RNA(PolyI:C)を投与すると、インターロイキンー12が大量に産生され、その結果として、I型免疫応答が強く誘導され、細菌感染に対して防御的に働いていると推測される。このように、本研究によって、二本鎖RNA(PolyI:C)の投与はナチュラルキラー細胞のみならず、インバリアントナチュラルキラー細胞に対してもインターロイキンー12の産生を誘導することにより、影響を及ぼしていることが明らかになった。これまでは実験室が無償で使用出来ていたが、突然年間にして250万円程度を支払わなければならなくなり、実質上研究が出来なくなった。そのため、計画通りに研究が行えず、結果として大幅に研究が遅延する結果となった。研究開始(遺伝子欠損マウス交配)後かなり日数が経過してから、実験動物施設で飼育しているマウスが蟯虫に感染していることが明らかとなり、最初から遺伝子欠損マウスの交配を行わなければならなくなったこと並びにこれまでの研究データの信憑性に疑問が持たれることとなった。そのため、一から実験をやり直さなくてはならなくなり、研究が著しく遅延してしまった。遺伝子欠損マウスのブリーディングペアを再度購入し、繁殖からやり直したほうが良いのではないかと考えている。上述した通り、実験室が実質上使用不能となったため、現在共同研究してもらえそうな企業を探している。残念ながら名乗りを上げてくれる企業がいないことから、申請者が以前に勤務していたドイツマックスプランク感染生物学研究所のロバート・フルヴィッツ博士に協力してもらい研究を遂行する予定である。上述した理由により、研究(遺伝子欠損マウスの交配)を最初からやり直す必要が生じたことから、本来であれば既に完了している筈の研究を最初からやり直す予定にしている。遺伝子欠損マウスの繁殖に失敗し、思うように実験が行えなかったため。
ヒト性分化機構に対するプロテオミクスからのアプローチ

1990年、精巣決定因子としてSRY(sex determining region on the Y chromosome)が発見されたが、どのような機構でSRYが発現され、どのような機構で性決定されるか明らかとなっていない。そこで、私たちはSRY影響下にある因子を解明するため、ヒト精巣腫瘍由来の細胞を用いて、SRYを過剰発現させ、それにより発現量が変化する因子をプロテオミクス、マイクロアレイの手法を用いて解析を行った。その結果、プロテオミクス解析からはSRYの過剰発現により、多くのタンパク質の発現が抑制されており、抑制されたタンパク質の多くはタンパク質の合成やおりたたみ(folding)といった分子シャペロン的機能をもつタンパク質であることがわかった。マイクロアレイ解析からはup regulateされた遺伝子の多くは転写調節因子であるzincfinger proteinであることがわかった。また、SRYの発現は細胞周期におけるG2/M期にダメージを与え、細胞増殖に影響を及ぼしていることも明らかとなった.現在、これらの因子について性分化との関わりについての解析を行っている。次に、SRY近傍の塩基配列のデータベース解析から、SRYの成り立ちについて仮説設定を行い、それを証明すべく実験を行った。その結果、SRYの発現調節において重要な転写因子を発見した。転写因子を過剰発現させると、SRYの発現が増加し、RNAiによりKnock downさせると、SRYの発現量が低下した。さらにプロモーター解析やESMA解析により、転写因子はある特定のSRYプロモーター領域にダイレクトに結合することを示した。従って、この転写因子はSRYの発現調節にとって極めて重要であることを示した。精巣決定因子としてSRY(sex determining region on the Y chromosome)が発見されてから15年間が経つが、未だにどのような機構で精巣が形成されるか分かっておらず、また、SRYはDNA結合領域をもち転写調節因子だと考えられているが、そのターゲット遺伝子も明らかとなっていない。そこで、私たちはSRY影響下にある因子を解明するため、ヒト精巣腫瘍由来の細胞を用いて、SRYを過剰発現させることにより、発現量が変化する因子をプロテオミクス、マイクロアレイの手法を用いて解析を行った。その結果、プロテオミクス解析においてはSRYの過剰発現により、多くのタンパク質の発現が抑制されており、抑制されたタンパク質の多くはタンパク質の合成やおりたたみ(folding)といった分子シャペロン的機能をもつタンパク質であることがわかった。この中でZNF208は各臓器と比べ、精巣において最も強く発現していることがわかった。また、SRYの発現は細胞周期におけるG2/M期にダメージを与え、細胞増殖に影響を及ぼしていることも明らかとなった。以上の結果より、通常なら女性に進むはずの分化がSRYが発現したことにより、細胞の増殖が抑制的に働き、細胞の分化が変化し、男性の決定へと導かれる可能性が考えられた。
飲酒マーカーであるホスファチジルエタノールの簡易的測定法の開発

過度の飲酒は種々の健康被害を引き起こす原因となる.わが国において女性や高齢者の飲酒量が上昇している事実は看過出来ない.飲酒量を客観的に評価する指標として種々の飲酒マーカーが使用されているが,鋭敏度が高くないという問題点がある.最近ではアルコールの代謝物を飲酒マーカーとして使用する流れができている.ホスファチジルエタノール(Phosphatidylethanol; PEth)もその一種である.以上の背景より申請者は簡便なPEthの測定法を構築することを目標とし,研究を行うこととした.多量飲酒は多くの国で問題となっているため,本研究は国内外で大きな需要を見込むことのできる研究であると考える.過度の飲酒は種々の健康被害を引き起こす原因となる.わが国において女性や高齢者の飲酒量が上昇している事実は看過出来ない.飲酒量を客観的に評価する指標として種々の飲酒マーカーが使用されているが,鋭敏度が高くないという問題点がある.最近ではアルコールの代謝物を飲酒マーカーとして使用する流れができている.ホスファチジルエタノール(Phosphatidylethanol; PEth)もその一種である.以上の背景より申請者は簡便なPEthの測定法を構築することを目標とし,研究を行うこととした.多量飲酒は多くの国で問題となっているため,本研究は国内外で大きな需要を見込むことのできる研究であると考える.
古代日本語引用助詞の記述的研究

本研究では、古代語の引用助詞「と」「とて」「など」の3種の持つ文法的な働きを記述した。まず、「と」が「無し」に係る構造、「と」に指定辞「なり」が後接する構造について分析し、さらに、「聞く」「いらふ」「答ふ」などの動詞と共起する場合の意味的な構造も明らかにした。また、「とて」については、従来の研究で同義とされてきた「と言ひて」「と思ひて」等との相違点を明らかにし、「など」については、共起する述部の語彙的な傾向を観察することによって、その意味的な機能を記述した。(1)本年度は、古代語における引用助詞の網羅的な用例収集と分析の結果、次の事実を明らかにし、論文ないし口頭発表の形で報告することができた。(a)引用表現「と聞く」は、現代語では、耳にした他者の発言を引く表現として用いられるが、古代語では、音声情報を聞いて把握した現状という、「聞く」主体の認識内容を引く表現として用いられていた。(雑誌論文、『國學院雜誌』118-2)(b)中古前期中期において、「といらふ」は働きかけを伴わない発言も含め、耳にした他者の発言に反応することを表す表現だった。これに対し類義表現の「とこたふ」は質問・命令等の言語的な働きかけに対応することを表す表現だった。(口頭発表、第36回山陰<知>の集積ネットワーク研究会)(c)中古語の引用助詞トテは、従来の研究で同義とされてきた「と言ひて」「と思ひて」などの表現と比較すると、前接する語句の種類や、後接する係助詞・副助詞のあり方等に関して複雑な相違が存在する。これらの現象は、トテの持つ、後続節事態に関わる事柄を提示する機能によると考えられる。(『米子工業高等専門学校研究報告』52)(2)以上の他、引用表現に由来する複合辞が存在することに示唆を受け、古代の複合辞の一つであるニソヘテという形の機能を考察した。「添ふ(下二段)」は本来、物理的な動作を表すところに意味の重点があるが、ニソヘテは情意に関わる表現としての使用が主であることが分かり、複合辞化に伴う意味の変容を観察することができた(口頭発表、第13回形式語研究会)「とて」の機能を考察するにあたり、説明の難しい現象が予想以上に多く見出され、それらについて考察を行うのに時間がかかった。この点で研究の進展は遅れた。一方で、「と聞く」「とこたふ」「といらふ」などの種々の引用表現の持つ意味について考察結果を発表でき、また、引用助詞「と」「など」についても用例の分析をかなり進めることができた。この点は、研究計画以上の進展だった。以上の状況から、本研究はおおむね順調に進展しているものと判断したい。本年度は、昨年度に引き続き古代語の引用句「と」「など」に関して分析を行った。「と」に関しては、現代語の「と」との相違点と言えるいくつかの文法現象を見出し、また、「と」と「など」との間にも相違点を見出した。それらについて検討を進め、次のうち(1)(2)(3)の成果を得た。その過程で得られた用例を整理し、(4)に示すような試論も行った。その他、より広く古代語文法について考察する中で(5)の成果が得られた。(1)「と」に指定辞が接続した「となり」という形の形態的・意味的な構造を分析し、「とならば」とそれ以外の形態とで表現性が異なることを明らかにした(『ことばとくらし』29号掲載)。(2)「と」を形容詞「無し」が受ける「となし」という形の形態的・意味的な構造を分析した。(『米子工業高等専門学校研究報告』53号掲載)(3)「など」と「と」について係り先となる述部の語彙的な相違点を見出して分析し、「など」は、述部の表す発言・思考の内容として、前接する語句(顕在語句)の他に、文中に現れない別の語句(潜在語句)が想定され、それらが時間的に離散して発せられるという意味的構造で用いられることを明らかにした。(『国語と国文学』95巻7号掲載予定)(4)昨年度、「と」と述語動詞との関わりを考えるケーススタディとして類義の表現である「といらふ」と「とこたふ」を取り上げて検討したが、さらに古辞書の記述も傍証として考察を深め、論文化した。(『文学・語学』(掲載号未詳)掲載予定)(5)昨年度、複合辞についての試論として「にそへて」という形式を取り上げて考察し、口頭発表を行ったが、本年度はそれについての考察を深め、論文化した。(『形式語研究の現在』所収予定)本研究では、古代語の引用助詞「と」「とて」「など」の3種の持つ文法的な働きを記述した。

また、「とて」については、従来の研究で同義とされてきた「と言ひて」「と思ひて」等との相違点を明らかにし、「など」については、共起する述部の語彙的な傾向を観察することによって、その意味的な機能を記述した。今後は、次の4点を中心に分析と考察を進め、結論を得ることにより、古代語の引用助詞が持つ文法的なふるまいの全体を明らかにすることを目指す。(1)現代語の引用構文「と述語」の分類方法等が古代語の引用構文にも適用しうるものかどうかを検証する。(2)「となり」のように引用句に断定の助動詞を伴う表現の持つ意味や統語的な構造を明らかにする。(3)形容詞や形容動詞を述語とする引用表現の用いられ方を観察し記述する。(4)「など」の引用助詞用法について、「と」と比較しながら分析を行う。29年度が最終年度であるため、記入しない。日本語学29年度が最終年度であるため、記入しない。
心筋細胞の興奮・収縮機構

本研究班は、心筋細胞の興奮収縮連関及びその制御機構を究明し、心筋細胞機能の生物科学的基盤を明確に捉えることを目標とする。研究主題の重点を(1)細胞膜におけるイオンチャネル機構,(2)アドレナリン・アセチルコリン受容体における細胞内過程、(3)心筋収縮性とエネルギー状態、の三つに置き解析を行なっている。以下主題別に本年度の経過を列挙する。(1)に関して、野間らはNaチャネル活性を単一チャネルレベルで測定する新しい膜電位固定法(オイル間隙法)を開発し、その特性を解析している。単一Caチャネルはパッチクランプ法により測定可能となり、大地らはCa拮抗薬、βアドレナリン作動物質の作用から、Caチャネル開閉のゲート過程の修飾機構を解析、又、平岡らは細胞膜障害時に出現する心筋異常自動能の発現機序の検討を行い、低K^+高Ca^<2+>条件下に誘発され易いことを見出した。外山らは心筋細胞接合部電流に及ぼす細胞内環境の影響を調べ、ATP依存性を明らかにした。(2)に関して、芳賀らはムスカリン性アセチルコリン受容体を精製し、受容体サブタイプと複数のG蛋白質との対応関係、相互作用の解明を行いつつある。多田らは、CAMP依存性に心筋小胞体Ca輸送調節を行うホスホランバンを発見し、その蛋白質一次構造をCDNAより決定し、さらに分子内機能部位の解析を行なっている。(3)に関して、遠藤らは細胞内Ca濃度変化を示すエクオリ収縮力を同時測定することにより、収縮蛋白質はCa感受性がアドレナリンα刺激で増し、β刺激で減少することを示した。松原らは、ミオシン分子の動きを高速X線回析法にて解析し、アクチンフィラメントへ移動する10ミリ秒ごとの時間経過と発生張力とがほぼ平行することを見いだした。櫨木らは、心筋活動の維持に必須なエネルギー状態を経時的無侵襲的に計測するため、組織吸収スペクトルの中からミトコンドリア近傍の環境を特異的に知る分光学的方法を解析しつつある。
ギリシア・ローマ文学における他者との共生に関する研究

本研究は、西洋古代世界における他者差別や他者排除からの脱却化指向にともない、必然的に生じてくるより高次元の他者との共存の観念と共生の意識に着目し、そうした新たな人間観・社会観・自然観の形成と発達のプロセス、そして問題点などの実相について、ギリシアとローマの両古典文学のジャンル横断的な分析と考察によって明らかにした。本研究は、西洋古代世界における固定的な他者差別や他者排除からの脱却化指向にともない必然的に生じてくるより高次元の他者との共存の観念と共生の意識に着目し、そうした新たな人間観・社会観・自然観の形成と発達のプロセス、そして問題点などの実相について、ギリシアとローマの両古典文学のジャンル横断的な分析と考察によって明らかにすることを目的とする。具体的には、(1)叙事詩文学を対象として、個人および共同体の諸関係における自由と共生の観念の変遷を跡づける。(2)他者としての自然との共生の観念と意識について、教訓詩文学を対象として分析する。(3)悲劇・喜劇において、社会的関係における優位・劣位の他者との共生のテーマを考察する。(4)思想家・宗教家における人間の自由と人類共生に関する言説を比較検討する。(5)歴史書や地理学書に見られる異民族・異宗教との共存・共生の事例について検証する。ギリシア初期からローマ帝政時代までの叙事詩文学を対象として、個人および共同体の諸関係における共生の観念を探り、その変容を跡づけた。(1)まず前8世紀末のホメロスの叙事詩には、その後のギリシア古典期(前54世紀)に高度化する自己と他者の二項対立の構図の萌芽が見られる。とくにこの構図は、他民族との関係を戦争と平和という両極の状況としてとらえた場合顕著である。ホメロスのトロイア戦争の神話的物語『イリアス』では、戦争と平和の間に深く乗り越えがたい溝が存在していることがテクストの分析から明らかになった。他方ウェルギリウスのローマ叙事詩では、戦争の価値は平和の確立という明確な目的によって相対化され、他民族との融和の意識が強く表れていることを検証することができた。(2)ウェルギリウスの『アエネイス』を対象として、ローマ時代の共生の観念について詳細に考究した。この作品では、ローマ帝国という多民族を統合した市民共同体の成立を背景として、個人・家族・社会・民族などの次元でギリシア文明時代とは異なる他者像が描かれており、それらを文学テクスト内外の歴史的文脈(コンテクスト)と関連づけることによって、ローマ文明の広がりの中での新たな共生意識の形成と発達を浮かび上がらせた。この考察の成果は、岩波書店より単著『ウェルギリウス『アエネイス』-神話が語るヨーロッパ世界の原点』として出版した。(3)さらに今年度は、イタリア・フランス・スイスの古代ローマ遺跡・考古学博物館等において、とくにヨーロッパ先住民・異民族の社会的・文化的コンテクストとローマ文明のコンテクストとの接触と共生に関する事象を探るために歴史・考古学的現地調査を行ない、文献学的研究を補強した。他者としての「自然」を取り上げ、自然との共生の観念と意識について、主にギリシア初期からヘレニズム期を経てローマ時代までの教訓詩文学を対象として分析した。(1)初期ギリシア詩人ヘシオドスの『仕事と日』、およびヘレニズム期の詩人アラトスの『パイノメナ』を中心的テクストとしてギリシア的自然観の変容をたどり、自然との共生の観念を探った。(2)自然との共生を考えるうえで最も重要な古典文献であるウェルギリウスの『農耕詩』を対象とし、この詩人が哲学詩人ルクレティウスの『万物の本質について』を踏まえながら、自然の中での人間のあり方を深く追究したプロセスに関して、この詩人独自の自然観について論じた小川の単著『ウェルギリウス研究』(1994年)および同詩人の『牧歌』と『農耕詩』の全訳(2004年)に付した詳細な注解と解説を応用しつつ考察を深め、さらにその後の新たな知見も加えて、ローマ文明における自然との共生意識に関して考究した。また今年度は、ヨーロッパ・地中海周辺地域の古代ローマ文明圏の遺跡・考古学博物館等(チュニジア、イタリア)において、古代都市文明と自然環境との共生に関する歴史・考古学的現地調査を行ない、さらに比較文明論的観点から、東西交流と多民族共生、東洋・アジアの自然環境と西洋文明との共生に関しても研究するために北京市と大同市(中国)において現地調査を行なった。ギリシア・ローマの悲劇と喜劇の諸作品において、社会的関係における優位・劣位の他者との共生のモチーフを考察した。(1)ギリシア悲劇に関しては、異民族観を扱った『ペルシア人』、男と女の対立を内包する『オレステイア』、女性の反逆を描いた『アンティゴネ』、疎外者のドラマ『ピロクテテス』、女性と異民族と非市民の要素の結合した『メディア』、異民族の女性と奴隷の境遇に焦点をあてた『トロイアの女たち』などを中心にして他者との共生の問題点を探った。またギリシア古喜劇(アリストパネス)については、『女の平和』『女の議会』『女だけの祭』を対象として、男性と女性、父権と母権、自民族と異民族、主人と奴隷の二項対立のドラマに共生の可能性についての問題意識を分析した。

(2)ローマ共和政時代のプラウトゥスとテレンティウスの喜劇をめぐって、奴隷、遊女、内妻、非市民の外国人など伝統的に男性市民に対して劣位の他者として位置づけられる人間たちとの共生が、奴隷解放の増加や女性の権利拡大を背景としてどのように模索されているかを検討した。(3)また今年度は、地中海周辺地域(小アジア・トルコ西岸)の古代遺跡・考古学博物館等において、ギリシア・ローマ文明と異民族・異文明との共生に関する歴史・考古学的資料調査を行ない、さらに比較文明論的観点から東洋・アジアの伝統的社会と西洋文明との接触と摩擦および共生に関しても中国(上海図書館、蘇州大学等)において資料調査を行なった。プラトン、アリストテレスからストア、エピクロス学派等を経てキケロ、セネカおよびキリスト教父などローマの思想家・宗教家までの著作の中で展開された人間の自由と人類共生に関する言説を比較検討し、さらにそうした思想・宗教の背後にあった古代文明史上の歴史的変化についても調査した。具体的には研究の概要は以下の4点に要約できる。(1)プラトンの『法律』と『国家』、アリストテレスの『政治学』を中心にギリシア古典期の思想における人間の自由の問題、異民族・奴隷観、人類共生の問題について考察した。(2)ヘレニズム期ストア学派のコスモポリタニズム、エピクロス学派の友愛思想、ローマ時代のキケロのフーマニタースの概念、セネカの『恩恵について』における奴隷との共生の思想、アウグスティヌスの『神国論』『告白』における異教との共生の問題を検討した。(3)中国の伝統文化と西洋文明との接触と共生に関して、比較文明論的観点から考察した。(4)地中海アジアにおけるギリシア・ローマ文明と異民族文化との接触や摩擦および共生に関する調査のため、トルコ共和国の中央部アナトリア高原、東部シリア国境付近、西部エーゲ海岸に位置するヒッタイト時代、ペルシア帝国時代、ヘレニズム・ローマ時代、ビザンチン時代の古代遺跡および考古学博物館を訪問し、文字文献資料を収集するとともに、古代諸都市の遺構・墳墓群・地理的景観・発掘出土品に関して約6,000枚の詳細な画像資料を作成した。ギリシア・ローマの歴史書や哲学書に見られる異民族・異宗教との共存・共生および戦争における敗者や犯罪者に対する寛恕の精神の形成について検証する。(1)ギリシア古典期のヘロドトス『歴史』やクセノポン『キュロスの教育』における狭隘な民族主義を超えた人間観、ヘレニズム期のポリュビオス『歴史』における世界国家思想を検討した。(2)ホメロス『イリアス』『オデュッセイア』、ウェルギリウス『アエネイス』、ユリウス・カエサル『ガリア戦記』『内乱記』、キケロの演説と哲学書、サッルスティウス『カティリーナ戦記』『ユグルタ戦記』、セネカ『恩恵について』『寛恕について』を対象として、異民族との共存・共生および戦争における敗者や犯罪者に対する寛恕の精神の形成について分析した。(3)西洋古代における異民族との共存・共生のあり方および戦争の罪責と敗者への寛恕の精神の特質を比較文明論的に明らかにするために、20世紀の中国大陸における日本人の戦争加害と戦後裁判などの実態にもとづきながら、戦争と共生をめぐる現代史の動向とギリシア・ローマ文学との接点を模索して論考にまとめた。また、同じく比較文明論的観点から、韓国における近代日本の植民地政策と朝鮮民族の抗日独立運動について現地調査を行なった。
胎児期栄養環境がエピゲノム制御に及ぼす影響の解明

胎児エピゲノムは成人期まで遺残し、遠隔期の疾病発症に関与しているかもしれないと考えられいてる。我々は、胎児期の環境が出生時にどのようにエピゲノムに影響するのか、胎児期栄養環境に着目し、胎児エピゲノムに及ぼす影響とその制御機構を明らかにする目的で研究を行った。妊娠合併症のない母体60例を対象に、臍帯血を採取しDNAを抽出後、メチル化値測定アレイを用いて約85万か所のメチル化値を測定した。胎児期栄養環境として、妊娠期体重増加量(gestational weight gain; GWG)に着目し、推奨増加量を指標にその影響を検討した。これまでに他者らによる大規模コホート研究で、GWGと量的に関連するDNAメチル化変化は存在しないと報告されている。我々は、GWGの影響は、推奨増加量を起点に不足か過剰かで標的が異なると考え、先行研究のように、その区別なくGWGとDNAメチル化の量的関連を見ることはできないと考えた。そこで、推奨量の上限以下のグループと下限以上のグループに分けて解析を行った。その結果、推測したとおり、すべての検体を対象に量的関連を観たところ、4か所でしか関連部位が検出されなかったが、推奨量の上限以下のグループだけで解析すると、GWGと量的に関連するDNAメチル化部位が44ヵ所で検出された。一方、推奨量の下限以上のグループでは量的関連は4か所でしか検出されなかった。本研究より、GWGが不足していることが影響するDNAメチル化部位のほうが、過剰である影響より多く検出されることを見出した。日本人妊婦GWGは欧米諸国に比べ、少ないことが特徴であることより、過剰であることの影響は見られにくかったと考えられる。いっぽうで、不足であることが、胎児細胞内で、DNAメチル化変化と関与していることを明示し、エピゲノムの点からも、適正な妊娠期体重増加が胎児発育に重要である事を裏付けた。当初の目的の通り、胎児期栄養環境が胎児エピゲノムに及ぼす影響を解明することができた。今後は、この機構を明らかにするため、胎児期栄養環境の中でも各栄養素に着目し、栄養環境が胎児エピゲノムに及ぼす役割について、明らかにする目的である。新生児が正常出生体重であっても、胎児期の栄養環境、すなわち母体の妊娠期体重増加量が適正ではないとエピゲノム制御に乱れが得られやすいという、研究代表者がこれまでに発表した結果が、異なるサンプルセットでも再現性が得られるのかを明らかにし、結果の信頼性を高めることを本研究の目的とした。この研究は、結果として、低出生体重児に分類されず正常範囲であったとしても、不適切な胎児期の栄養環境がどの程度時のエピゲノムに影響するのかを解明することを目的としている。本研究では、これまでより検出箇所が優れたディバイスを用いて、よりエピゲノムワイドなメチル化変動情報を得た。これら多くの情報に対し、独自の解析手法を加え、エピゲノム制御の乱れ、をあぶりだす方法を構築中である。解析検体の中には、この方法を用いることで、特徴的なエピゲノムの乱れを示す検体が散見され、エピゲノムの乱れに関与する因子を同定するにあたり、胎児期栄養環境との関連を様々な指標から明確にすることを試みている。海外の関連研究では、胎児期栄養環境の違いが臍帯血のDNAメチル化レベルで認められているが、同一人物の幼児期、思春期にはその変化が消失していることも報告されている。胎児期栄養環境がその児に及ぼす影響を長い視野で観ようとした場合、臍帯血と胎盤のどちらのエピゲノムの情報が将来の児の健康と関連した情報を持っているのか、についてもさらに検討する予定である。H28年度に計画した研究に予定通り着手できており、H29年度以降の研究に予定通り、進めそうである。

いっぽうで、不足であることが、胎児細胞内で、DNAメチル化変化と関与していることを明示し、エピゲノムの点からも、適正な妊娠期体重増加が胎児発育に重要である事を裏付けた。当初の目的の通り、胎児期栄養環境が胎児エピゲノムに及ぼす影響を解明することができた。H28年度に採取したデータをもとに、当初考えていた解析手法以外の解析法や最新の知見も含めて、解釈を進めていく。今後は、この機構を明らかにするため、胎児期栄養環境の中でも各栄養素に着目し、栄養環境が胎児エピゲノムに及ぼす役割について、明らかにする目的である。本年度予定していた学会参加を翌年度以降に見送ったため、旅費の使用がなかった。次年度使用額が生じた理由は、学会発表のための旅費が今年度は抑えられた結果である。翌年度は実験に必要な物品費のほかに、学会発表、論文発表のための費用が必要となるため、使用予定である。学会にて成果報告を行う。