hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
免疫病態における免疫応答のプロテインホスファターゼによる解析

免疫担当細胞の情報伝達におけるプロテインホスファターゼの役割を明らかにする目的で,自己免疫疾患モデルマウス(1prマウス)およびその対照マウス由来の免疫担当細胞における本酵素の病態変異を解析した。またこれら慢性疾患における変異の機構の解明の目的で,サイトカインによる免疫応答における本酵素の動きを観察した。また1prマウスにおいては、PP1活性では,T・Bいずれの細胞でも著変を示さなかったが,PP2A活性ではT細胞では明らかな上昇を認めた。PP2B活性では,1pr脾で1.5倍の上昇を認め,これはダブルネガティブT細胞における高活性によることがわかった。チロシンホスファターゼ活性については,可溶画分で病態による上昇を認めた。次にサイトカインによる免疫応答では,CTLL-2をIL-2で刺激し,経時的に本酵素の動きを観察した。CTLL-2をIL-2でインキュベートすると,直ちにPP1のポテンシャル活性が減少した。この減少は,刺激後20分で最大に達し,全体の20-30%に達する。また一過性で,20分までは減少,その後は上昇し,45分でコントロールレベルまで回復した。IL-2濃度は,0.025nM以上でみられ,これはIL-2の細胞増殖刺激効果の発揮する濃度とほぼ同程度であった。このPP1活性減少にかかわる分子種の細胞内局在を調べたところ,細胞質に選択的にみられ,顆粒画分は不変であった。IL-2刺激では,PP2A,PP2Cの活性は不変であったので,この現象はPP1分子に特異的にみられる。またCTLL-2細胞以外にも,C57BL/6マウスからConAによって誘導されたT細胞においても,同様の応答が確認された。またPP1の抗体を用いて,PP1蛋白を定量したところ,IL-2刺激によって変化はみられなかった。以上の知見より,IL-2によるPP1の変動は,転写・翻訳よりもリン酸化などの2次修飾によると結論される。免疫担当細胞の情報伝達におけるプロテインホスフアターゼの役割を明らかにする目的で,免疫担当臓器および細胞の粗抽出液でのセリン/スレオニン残基特異的プロテインホスフアターゼの分子種PP1,PP2A,PP2B(カルシニューリン),PP2Cの分別定量法を確立し,これを用いと自己免疫疾患モデルマウス(1prマウス)における活性を測定し,病態変異を解析した。さらにチロシン残基特異的プロテインホスフアターゼ(チロシンホスフアターゼ)の測定も行った。その結果以下の知見を得た。PP1活性では,T細胞はB細胞より明らかに高値を示し,1prではT,Bいずれにおいても著変を認めなかった。したがって,組織レベルの1prにおけるPP1活性の上昇は,B細胞より高値を示す1prの異常T細胞の集積によると結論された。PP2A活性では,T,B両細胞とも正常では同程度の活性を有していたが,1prでは,B細胞ではほとんど活性の変化を認めなかったが,T細胞では1prで明かな活性上昇を認めた。したがって,組織レベルでの,1prにおけるPP2A活性の明かな上昇は,1prで集積する異常T細胞の高いPP2A活性によることが結論された。PP2Bでは,1prの脾で1,5倍の上昇が認められたが,細胞レベルでみると,B細胞で著変はなく,T細胞で特異的な上昇が認められた。チロシンホスフアターゼ活性については,至適条件の検索が終り,現在組織レベルで活性測定を行っているが,CD45が局在する膜画分の活性よりも,可溶画分での活性の上昇が顕著のように思われる。また1prの肝で著明なPTP活性の上昇を認めた。以上より,本酵素の活性の1prでの変異について,組織レベルでの変化を細胞レベルで捉えることに成功した。これらの免疫担当細胞における本酵素の病態変異の意義について,とくに細胞内伝達情報機構の立場から解析を進めている。IL-

2刺激では,PP2A,PP2Cの活性は不変であったので,この現象はPP1分子に特異的にみられる。またCTLL-2細胞以外にも,C57BL/6マウスからConAによって誘導されたT細胞においても,同様の応答が確認された。またPP1の抗体を用いて,PP1蛋白を定量したところ,IL-2刺激によって変化はみられなかった。以上の知見より,IL-2によるPP1の変動は,転写・翻訳よりもリン酸化などの2次修飾によると結論される。免疫担当細胞の情報伝達におけるプロテインホスファターゼの役割を明らかにする目的で,免疫担当細胞の粗抽出液でのセリン/スレオニン残基特異的プロテインホスファターゼ分子種PP1,PP2A,PP2Cの分別定量法を用いて,T細胞株CTLL-2のIL-2刺激に対する応答について解析した。CTLL-2をIL-2でインキュベートすると,直ちにPP1のCa^<2+>-トリプシン処理活性すなわちポテンシャル活性が減少した。この減少は,刺激後20分で最大に達し,全体の20-30%に達する。また一過性で,20分後活性は上昇し,45分でコントロールレベルまで回復した。IL-2の濃度の影響を調べたところ,0.025nM以上の濃度でみられ,この濃度は,IL-2の細胞増殖刺激効果が発揮される濃度とほぼ同程度であった。次にこのPP1活性減少のみられる分子種の細胞内局在を調べたところ,この減少は,PP1分子の細胞質局在を示す分子に選択的に起こることがわかり,顆粒画分のPP1はIL-2に対して不変であった。またIL-2刺激で,PP2A,PP2Cの活性も不変であったので,PP1分子に特異的にみられる現象である。次に,この現象がCTLL-2に特異的にみられるものか,他のT細胞にもみられるかを調べるために,C57BL/6マウスからConAによって誘導されたIL-2感受性細胞を調製してIL-2に対する影響をみたところ,CTLL-2におけると同様の応答が確認された。またPP1触媒サブユニットに対する抗体を用いて,IL-2刺激後のPP1蛋白をウエスタンブロット法で解析したところ,PP1蛋白量は一定であった。したがって,IL-2刺激によってみられるT細胞のプロテインホスファターゼ応答は,分子種PP1に特異的にみられ,分単位で可溶画分に限局して観察され,IL-2濃度依存性で一過性に現れるので,PP1分子の2次的修飾によることが強く示唆される。
締固め球根基礎工法の適用性と実用化に関する研究

構造物基礎のうち最も簡単で安価な直接基礎形式を,砂・礫質土や岩屑の緩い地盤に適用するために,しばしば締固め工法がとられる。この締固め工法の一つ重錘落下締固め工法がある。この工法は,対象とする地盤全体を一様に締固めることを目標にしているが,打撃点直下では高密度に締まった領域が球根状に成長していくことが見出されている。これを直接基盤に応用する工法を「締固め球根基礎工法」と名付け,遠心模型実験を用いてこの工法を再現し,この工法に関わる要因の影響を調べた。本研究は,まず,5種類の材料を対象にして土の種類が締固め球根の支持力特性に与える影響を遠心模型実験によって調べた。次に,施行機械開発を念頭に,従来よりも重錘規模と落下高を小さくし,この工法を小型化した場合の支持力特性に与える打撃条件(重錘質量,重錘底面積,落下高,打撃回数)と基礎底面積の影響を遠心模型実験によって調べた。以上から,この工法の実用化方法を検討した。本研究で得られた結論は,1)パス施行時の埋戻し土量がわざわいするため,20t打撃地盤の方が40t打撃地盤よりも地盤反力係数は大きい,2)今回用いた最大粒径,細粒分含有率を変えた資料の範囲では,この工法に与える土の種類の影響は余りない,3)総打撃エネルギー一定でも総運動量が大きくなるような打撃条件を選んだ方が締固め球根の支持力は大きくなリ,その場合には全般破壊を呈することからもより良好な基礎地盤と考えられた,4)重錘底面積が大きい方が地盤反力係数は大きく,基礎底面積と重錘底面積の比が大きいほど全般破壊を呈する。これらの結果から,締固め球根基礎工法を実用化する場合の設計法,施行機械の必要条件および施行管理手法を提案した。またこの工法は,地盤の液状化対策にもなり,杭基礎のような地盤との複雑な相互作用を考える必要はなく,現地材の締固めのみによるので建設残土が生じることもなく,非常に経済的であることを提示した。緩い砂・礫質地盤や岩屑盛土の地盤改良工法の一つに重錘落下締固め工法がある。本研究は,この点に着目して基礎位置となる地点を重錘打撃と埋戻しを繰り返して強い締固め球根を生成させ,これを直接基礎へ応用する「締固め球根基礎工法」の適用性と実用化の検討を研究目的としている。今年度は,この工法に関わる要因として重錘条件(質量,底面積),基礎の底面積および土の種類を取り上げ,締固め球根の支持力特性に与える各要因の影響を遠心模型実験によって調べた。

今年度で得られた結論は,1)締固め球根基礎は,未打撃の初期地盤に比べて極限支持力は200倍以上,地盤反力係数は約10倍に増加し,高い支持力を得ることできる,2)重錘質量20t,40t打撃地盤では,ともに載荷板面積(基礎の底面積)が小さい方が高い支持力が得られる,3)載荷板面積が小さい場合に地盤反力係数は40t打撃地盤よりも20t打撃地盤の方が大きい値が得られたことから,埋戻し土量が大きくなる40t打撃地盤の埋戻し層の締まり方が小さいことが推察された,4)今回用いた試料の範囲では,締固め球根の支持力特性に与える土の種類の影響は小さかった。以上の成果を踏まえて来年度の研究に着手する予定である。緩い砂・礫質地盤や岩屑盛土の地盤改良工法の一つに重錘落下締固め工法がある。この工法は,対象とする地盤全体を一様に締固めることを目標にしているが,打撃点直下では高密度に締まった領域が球根状に成長していくことが見出されている。本研究は,この点に着目して基礎位置となる地点を重錘打撃と埋戻しを繰り返して強い締固め球根を生成させ,これを直接基礎へ応用する「締固め球根基礎工法」の適用性と実用化の検討を研究目的としている。昨年までの研究で,重錘質量がある程度以上大きくなると,増加する埋戻し層がわざわいして支持力が低くなる結果が得られた。また,大規模な重錘を現場で用いるためには専用の大型クレーンが必要となり,施工効率が悪いことも予想される。そこで今年度は,この工法を効率よく適用するために,これまでよりも重錘の規模と落下高を小さくし,その場合の支持力特性に与える打撃条件(重錘質量,重錘底面積,落下高,打撃回数)と基礎底面積の影響を遠心模型実験によって調べた。今年度得られた結論は,1)荷重強さ-沈下量関係から,重錘質量10tでは局部破壊を呈するのに対し,5tでは全般破壊を呈し,むしろ重錘質量が小さい方が良好な基礎地盤となる,2)重錘質量5t,落下高5mのように小さくても打撃回数を多くとれば良好な支持力を得ることができる,3)重錘底面積が小さいほど,極限支持力は大きくなるが,地盤反力係数は逆に小さくなる,したがって良好な支持力を得るには,ある程度の重錘底面積の大きさが必要である。以上の成果を踏まえて来年度,この工法の実用化の研究に着手する予定である。3年間の研究で,この工法の遠心模型実験手法を開発し,まず,重錘落下締固め工法と同規模の条件で,重錘質量,重錘底面積,打撃回数,基礎底面積,および土の種類の影響を遠心模型実験で調べた。次に,大規模な重錘を現場で用いるためには専用の大型クレーンが必要となり,施工効率が悪いことも予想されるため,この工法を効率よく適用するために,重錘の規模と落下高を小さくした場合の支持力特性に与える打撃条件(重錘質量,重錘底面積,落下高,打撃回数)と基礎底面積の影響を遠心模型実験によって調べた。本研究で得られた結論は,1)締固め球根の支持力は,未打撃地盤に比べて100倍以上,地盤反力係数は約10倍に増加する,2)締固め球根の支持力は,単位面積当たりの重錘質量に依存し,同じ重錘質量では重錘底面積が大きい方が高い,3)想定する基礎底面積より大きな底面積をもつ重錘で打撃した方が高い支持力が得られる。ただし,パス施工時の埋戻し層の締まり方は支持力に影響する,4)この工法に与える土の種類の影響はあまり大きくない,5)重錘質量5t,落下高5mのような小規模な打撃条件でも打撃回数を多くとれば良好な支持力を得ることができる。以上の成果を踏まえて,この工法の実用化のための提言を行った。
脳の機能と疾患におけるグルタミン酸受容体の動態

本研究の目的は、グルタミン酸受容体の発現と安定性、さらにシナプスへの移行と除去が細胞の種類や脳部位により異なった様式で調節され、このことが単純な入力を多様な出力に変換し、複雑な神経機能発現の基礎課程となるという作業仮説を証明することである。この解析ために、4種類のAMPA型グルタミン酸受容体、4種類のNMDA型受容体はじめとして複数のfloxed型標的マウスを樹立した。また、GAD67-Creマウスなど幾つかのCreドライバーマウスを樹立した。これらのマウスを交配させ解析した結果、海馬CA3では、GluN2BがシナプスでのNMDA型受容体の機能発現に必須であることを明らかにした。また、小脳TARPγ-2とγ-7がAMPA型受容体の発現に必須であることを見出した。さらに発達期のシナプスにおいて、GluN2AとGluN2Bが異なった様式でAMPA型受容体を抑制することを単一神経細胞でのノックアウトを用いて示した。このために、グルタミン酸受容体サブユニットのfloxedマウスと部位選択的にCreリコンビネースを発現するマウスを交配して作出したコンディショナルノックアウトマウスを用いて、脳の様々な部位での各グルタミン酸受容体サブユニットの動態、受容体活性、個体表現型を多角的に解析する。また、受容体の動態変化が惹起する個体の機能変化を神経疾患と関連させて解析する。本年度の成果として、NMDA型受容体GluN2Bサブユニットを海馬CA3興奮性細胞で選択的にノックアウトするマウスを作出して解析をおこなった。その結果、GluN2BはNMDA型受容体の活性化に必須であり、かつシナプスにおけるNMDA受容体自身の安定化とシナプス後肥厚(PSD)の分子複合体の維持に関与していることが示唆された。さらにNMDA受容体のシグナルがアクチンを介してPSD蛋白質の複合体の集積と安定性に関与する知見を得た。これとは別に、AMPA型受容体の活性調節の機序を知るために、この受容体各サブユニットの定量をおこなった。その結果、海馬ではGluA1とGluA2が豊富に発現しているのに対して、大脳皮質ではGluA1に代わりGluA3が高い発現をしていた。一方、小脳ではGluA1-4おのおのの量がほぼ同じであった。さらにTARPγ-8欠損マウスが示すAD/HD様多動の原因領域は、大脳皮質である可能性が高いことが、コンディショナルノックアウトの解析から明らかになった。今年度は、AMPA型、カイニン酸型及びNMDA型受容体を構成する全サブユニットを定量するために、それぞれの特異抗体の力価を決定した。この値を用いて、定量的ウエスタンブロット法により各サブユニットの量を測定しているが、これまでにカイニン酸型受容体量はAMPA型受容体よりも相当に低いことが明らかになった。一方、NMDA型受容体は部位にもよるが、AMPA型受容体よりやや少ない程度であった。小脳プルキンエ細胞選択的にGluA1サブユニットを欠損したマウスでは、GluD2の量が減少し、GluA2を欠損したマウスではGluD2の量が増加することが明らかになった。このことは、GluD2がAMPA型受容体の活性を何らかの形で調節していることを示唆しており、更なる解析を進める。TARPγ-8欠損マウスが示すAD/HD様多動の原因として、線条体でのドーパミン量が上昇していることが明らかになった。

また、その責任領域は、大脳皮質である可能性が高いことが、コンディショナルノックアウトの解析から明らかになった。本研究の目的は、グルタミン酸受容体の発現と安定性、さらにシナプスへの移行と除去が細胞の種類や脳部位により異なった様式で調節され、このことが単純な入力を多様な出力に変換し、複雑な神経機能発現の基礎課程となるという作業仮説を証明することである。このために、グルタミン酸受容体及びその補助サブユニットTARP分子群のfloxedマウスと部位選択的にCreリコンビネースを発現するドライバーマウスを交配して作出した変異マウスを用いて、脳の様々な部位での各グルタミン酸受容体サブユニットの動態、受容体活性、個体表現型を多角的に解析する。また、受容体の動態変化が惹起する個体の機能変化を神経疾患と関連させて解析する。これまでにCreリコンビナーゼを発現する新規マウスの開発を進め、ドーパミン受容体D1R及びD2R遺伝子プロモーターで駆動するCreマウスをそれぞれ樹立した。また、NMDA型受容体サブユニットfloxedマウスを用いて、発達期神経細胞ではNMDA型受容体サブユニットの種類によりAMPA型受容体が異なった制御を受けることをシングル細胞レベルで明らかにした。さらに、定量的ウエスタンブロット法により、ほぼ全てのグルタミン酸受容体各サブユニットの量を測定した。その結果、AMPA型受容体に比してNMDA型サブユニットの量が少ないことが明らかになった。また、カイニン酸型受容体の量は、さらに一桁低いものであった。一方、小脳プルキンエ細胞に特異的だと考えられてきたGluD2サブユニットが、カイニン酸受容体と同程度に海馬や大脳皮質にも存在することが明らかになった。ヒト神経脊髄炎の中にNMDA型受容体サブユニットに対する自己抗体が原因であるものが存在することを新たなスクリーニング法により見出した。
廃棄物埋立地の現状診断・適正化手法提案および埋立地管理者の知識啓発に関する研究

ガストレーサー試験により,準好気性処分場においては底部集排水管から流入した空気が,廃棄物層を通過してガス抜き管から流出することを明らかにした。カラム実験の結果より,そのメカニズムは自然換気モデルが適合する。ガス抜き管出口のガス温度と流速が,埋立地内エアレーションの大きさの指標となることから,全国の廃棄物処分場の現状を調査した。しかし集排水管が水没していたとしても周辺のガス抜き管などから空気が流入し,出口としてのガス抜き管の存在がもっとも重要である。日本全国の埋立面積1ヘクタール以上の準好気性埋立地を対象とし、埋立地構造および管理状況に関するアンケート調査を行った。回答のあった238施設のうち,集排水管とガス抜き管を接続していない施設は12%を占め,集排水管末端水没が40%、ガス抜き管出口の閉鎖が30%あった。またガス抜き管からのガス排出については,発生なし30%,不明20%,ガス濃度の測定なしが90%であった。これはガス測定が,埋立中の施設には義務付けられていないためであるが,準好気性構造における空気供給の重要さが理解されていないことが明らかとなった。ガス抜き管設置本数が多く,日常的に埋立ガスの排出が認められ,さらに定期的なガス流量測定が行われていることから良好な準好気埋立構造が保たれていると考えられた産業廃棄物埋立地を対象とし,現地調査を行った。全てのガス抜き管において,ガス流れの方向,ガス流速,温度を測定したところ,集排水末端以外に,一部の管から空気が流入していることがわかった。また各ガス抜き管において,ガス流量と温度の間には良い相関がみられ,埋立地内部の温度と気温の差により生じた浮力を駆動力として,集排水管から空気を吸引するモデルがよく適合した。以上のことから,集排水管から供給された空気は,埋立地内を通過してガス抜き管に集められると推定された。この仮定を定量的に証明するため,埋立ガス中には存在しない一酸化炭素を空気流入管から注入し,ガス流出管でガス濃度の連続測定を行うトレーサー試験を行った。その結果,集排水管から埋立地内を通過してガス抜き管に流入する流れ以外に,埋立地内の他の箇所からガス抜き管に向かって流入する流れがあることがわかり,ガス抜き管が大きなエアレーション効果を持つことが明らかとなった。2年目までで,現地調査により集排水管から流入した空気が廃棄物層を通過し,ガス抜き管から流出することを明らかにした。ガス温度と流速の間の正の相関,および気温と比較したガス温度の高さが空気流れの指標となることから,全国の一般廃棄物処分場を対象に調査を行い,埋立地内の空気流動が見られる処分場が少ないことがわかった。3年目は,対象を産業廃棄物処分場へと広げ,現地調査も行ってより一般性の高い知見を得ること,および空気流動のメカニズムを明らかにすることを目的とした。メカニズムについては,高さ50cmのアクリル製カラムに乾燥機で一定温度に加熱したアルミナビーズを充てんし,上部に設けたオリフィスで流速を測定した。温度が高いほど流速が大きく,実験結果はエネルギー保存則にもとづく自然換気理論がよく適合した。すなわち,内部温度が高いと浮力が生じ,空気の上昇によって内部が負圧となり、下部から空気を誘因することがわかった。また産廃処分場において,1年目と同様のトレーサーガス応答などの調査を実施した。底部に浸出水が滞水しているにもかかわらずガス抜き管からのガス流出が見られ,周辺のガス抜き管から流入していた。ガス抜き管の収支は流入<流出であり,周辺の斜面部からも流入していたと考えられる。

すなわち,埋立地への空気供給で最も重要な要素は出口であるガス抜き管の健全さであり,底部集排水管が空気を安定的に供給する役割を持つ。周辺ガス抜き管,斜面からも補助的に空気が流入するが,出口,入口を健全に保つことが廃棄物の安定化を促進することになる。3年間の研究によって,埋立地の現状診断,適正化手法を提案し,埋立地管理者の知識啓発に十分な知見を得た。今後,論説,講演,報告書等によって周知をはかる予定である。ガストレーサー試験により,準好気性処分場においては底部集排水管から流入した空気が,廃棄物層を通過してガス抜き管から流出することを明らかにした。カラム実験の結果より,そのメカニズムは自然換気モデルが適合する。ガス抜き管出口のガス温度と流速が,埋立地内エアレーションの大きさの指標となることから,全国の廃棄物処分場の現状を調査した。しかし集排水管が水没していたとしても周辺のガス抜き管などから空気が流入し,出口としてのガス抜き管の存在がもっとも重要である。2年目までの研究の主な成果は,以下のとおりである。準好気性埋立地における埋立地内部の空気・ガス流れのメカニズムが,第一の目的であった。COガスを利用したトレーサー応答試験により,集排水管から流入した空気が埋立地内を通過してガス抜き管から排出されること,ガス抜き管出口におけるガス流速,温度の測定より,浮力が流れの駆動力となっていること明らかにした。これは,世界で初めての知見であり,準好気性構造の理論的根拠を与えた。また,ガス抜き管出口の温度と流速によって準好気性の機能が発揮されているかどうかを知ることができるため,全国の一般廃棄物処分場を対象として調査を行った。その結果,機能を発揮できている処分場は1割にとどまることが分かった。従来は集排水管出口の水没による機能障害が4割程度あると認識されていたが,それ以上に状況が悪いことが明らかとなった。27年度が最終年度であるため、記入しない。廃棄物処理工学埋立地は、廃棄物の法的分類に基づいて一般廃棄物処分場と産業廃棄物処分場に分かれている。2年目の調査は一般廃棄物処分場に対して行ったが、全国の状況を把握するため、最終年度は産業廃棄物処分場を対象に調査を行う。この調査の実施においては、廃棄物資源循環学会の産廃研究部会,埋立部会の協力を得る(申請者が両部会の部会長である)。また、全国産業廃棄物連合会の処分場部会にも協力を求める。調査方法は、1アンケート調査,2測定データ入手,3測定依頼,4現地調査(必要に応じて)である。また,準好気性埋立地におけるエアレーションが、どの程度の範囲に及ぶか、長期的には有機物分解をどれだけ促進するかを明らかとするためシミュレーションモデルを作成する。このモデルにより明らかとすることは、1空気流れ(浮力による集排水管からの吸引,廃棄物層通過,排出)、2エアレーションと好気性分解(有機物量の仮定必要),その範囲、3有機物の安定化進行である。これによって、準好気性埋立の設計方法を提案する。与える条件は埋立廃棄物種類,空隙率であり,集排水管,ガス抜き管の管径,配置を設計変数とする。また埋立層の厚さ,埋立順序(面的に広げるかどうか),覆土の厚さなど,埋立作業方法もいくつかの選択がありうる。数値シミュレーションによって,さまざまな条件における好気領域の拡大,有機物の分解の経時的変化を予測し,支配的要因を明らかにする。
封入体筋炎治療への架け橋となる新規モデルマウスの開発

孤発性封入体筋炎(sIBM)は高齢発症の難治性炎症性筋疾患である。病態には不明な点が多く、有効な治療法は未だ存在しない。患者血清中には骨格筋を標的とする自己抗体「抗cN1A抗体」が存在し、骨格筋にはリンパ球浸潤を認めることから自己免疫機序が病態に関与する。一方で筋形質内には異常蛋白凝集を認め、蛋白分解機構の障害も関与している。この自己免疫機序と蛋白凝集のどちらが一次的であるか、双方の相互作用が存在するかについては未解明である。本研究ではcN1Aに対する自己免疫応答が筋毒性を有するか、また蛋白分解機構に影響するかを明らかにするために、cN1Aペプチド能動免疫マウスを開発し、疾患特異的治療法の開発を目指す。既報告論文のエピトープ候補部位を参考に合成した3種類のマウスcN1Aペプチドを、完全アジュバンド、百日咳菌毒素とともに8-10週齢の雌マウスの足底および尾部に投与した(1ペプチドにつき、n= 5匹)。コントロールではペプチドを含まないアジュバンドのみを投与した(n= 5匹)。cN1Aペプチド免疫は1週間ごとに4週間反復投与した。cN1Aペプチドを接種されたすべてのマウスにおいて、対応する抗cN1A抗体が血清中に検出された。行動解析として体重推移、トレッドミルテストおよび握力テストにより運動機能を経時的に評価したところ、cN1Aペプチドを接種した1群で体重が減少し、2群でトレッドミルテストによる運動機能の低下が見られた。筋病理学的評価では、cN1Aペプチド接種群で内在核線維が増加し、CD8陽性リンパ球の浸潤がみられ、p62やLC3-IIの発現が亢進していた。cN1Aペプチド能動免疫マウスは、sIBMに類似の臨床病理学的な表現型を模倣した。本マウスモデルは、sIBMの病態を解明し新規の治療戦略を探索するための有用なツールとなることが期待される。申請者は先行研究において、抗cN1A抗体の骨格筋に対する病原性を検討するためにin vitroおよびin vivoでの抗体移入実験を行い、ヒト横紋筋肉腫細胞(RD細胞)およびC57BL6マウス骨格筋の双方で選択的オートファジーに関与するp62の筋形質内異常凝集を認めることを明らかにし、本抗体並びに骨格筋への自己免疫応答が直接的に骨格筋の蛋白分解機構に影響を及ぼす可能性を初めて示した(Tawara et al.Ann Neurol. 2017)。加えてcN1Aペプチド能動免疫マウスは、sIBMに類似の臨床病理学的な表現型を模倣することから、抗cN1A抗体の病因的意義がより明確になったと考えられる。これまでcN1A蛋白に対する自己免疫応答に着目したsIBMの病態研究に関する報告はこれまでに国内、国外ともになく、本研究の重要性が再確認されたものと考える。我々は、抗cN1A抗体のみならず、cN1A抗原特異的リンパ球がsIBMの病態において重要な役割を果たす可能性を考えている。抗原特異的リンパ球が筋毒性や蛋白分解機構への直接的な病原性を有するかを解析することを目的に、リンパ球移入検証を行う。cN1A蛋白能動免疫マウスの脾臓からリンパ球を採取し、免疫したcN1Aペプチドと混合することでcN1A抗原特異的リンパ球を活性化させる。その後野生型マウスにリンパ球移入を行い、行動学的および血清学的、筋病理学的解析を行う。またリンパ球と抽出した抗cN1A抗体を単独で野生型マウスに移入し、表現型や筋病理の違いについても検証することで自己抗体の病原性、リンパ球の病原性について明らかにする。さらにcN1A蛋白能動免疫マウスについて、封入体筋炎類似の自己免疫応答の誘導と蛋白分解機構の障害が再現される場合には、本マウスを用いて免疫治療と蛋白分解を促進する治療を組み合わせたCombination therapy(例:大量免疫グロブリン療法+ラパマイシン投与など)を検討する。

行動解析として体重推移、トレッドミルテストおよび握力テストにより運動機能を経時的に評価したところ、cN1Aペプチドを接種した1群で体重が減少し、2群でトレッドミルテストによる運動機能の低下が見られた。筋病理学的評価では、cN1Aペプチド接種群で内在核線維が増加し、CD8陽性リンパ球の浸潤がみられ、p62やLC3-IIの発現が亢進していた。cN1Aペプチド能動免疫マウスは、sIBMに類似の臨床病理学的な表現型を模倣した。本マウスモデルは、sIBMの病態を解明し新規の治療戦略を探索するための有用なツールとなることが期待される。申請者は先行研究において、抗cN1A抗体の骨格筋に対する病原性を検討するためにin vitroおよびin vivoでの抗体移入実験を行い、ヒト横紋筋肉腫細胞(RD細胞)およびC57BL6マウス骨格筋の双方で選択的オートファジーに関与するp62の筋形質内異常凝集を認めることを明らかにし、本抗体並びに骨格筋への自己免疫応答が直接的に骨格筋の蛋白分解機構に影響を及ぼす可能性を初めて示した(Tawara et al.Ann Neurol. 2017)。加えてcN1Aペプチド能動免疫マウスは、sIBMに類似の臨床病理学的な表現型を模倣することから、抗cN1A抗体の病因的意義がより明確になったと考えられる。これまでcN1A蛋白に対する自己免疫応答に着目したsIBMの病態研究に関する報告はこれまでに国内、国外ともになく、本研究の重要性が再確認されたものと考える。我々は、抗cN1A抗体のみならず、cN1A抗原特異的リンパ球がsIBMの病態において重要な役割を果たす可能性を考えている。抗原特異的リンパ球が筋毒性や蛋白分解機構への直接的な病原性を有するかを解析することを目的に、リンパ球移入検証を行う。cN1A蛋白能動免疫マウスの脾臓からリンパ球を採取し、免疫したcN1Aペプチドと混合することでcN1A抗原特異的リンパ球を活性化させる。その後野生型マウスにリンパ球移入を行い、行動学的および血清学的、筋病理学的解析を行う。またリンパ球と抽出した抗cN1A抗体を単独で野生型マウスに移入し、表現型や筋病理の違いについても検証することで自己抗体の病原性、リンパ球の病原性について明らかにする。さらにcN1A蛋白能動免疫マウスについて、封入体筋炎類似の自己免疫応答の誘導と蛋白分解機構の障害が再現される場合には、本マウスを用いて免疫治療と蛋白分解を促進する治療を組み合わせたCombination therapy(例:大量免疫グロブリン療法+ラパマイシン投与など)を検討する。次年度に大量にペプチドを能動免疫したマウスの実験が必要であり、前年度の経費を繰り越す必要があったため。
虚血/再灌流に伴う骨格筋NOS産生スパーオキサイドによるショック発現機構

虚血/再灌流(I/R)後のショック発現における一酸化窒素合成酵素(NOS)によるスーパーオキサイド(O_2-)産生の役割をマウス緊縛性ショックモデルを用いて検討した。緊縛性ショックモデルはマウス(C57BL/J,雄性)をイソフルラン吸入麻酔下に一側大腿を輪ゴムで3時間緊縛し、解除することにより作成した。I/R後のO_2-産生を検出するためには蛍光プローベ(hydroethidine)を用いるin situ O_2-検出法を用いた。緊縛解除後5分で緊縛側腓腹筋の毛細管、骨格筋鞘及び細胞質でO_2-産生増加が認められ、ミトコンドリアの局在と一致した。緊縛側筋肉でNADPH diaphorase活性染色は著しく増加し、抗NOS抗体及び抗4-hydroxy-nonenal(HNE)抗体による免疫染色でdも強い陽性を示した。しかし、抗nitrotyrosine(NT)抗体による免疫染色は陰性だった。これらの所見はxanthine oxidaseと同様にNOSも再灌流後のO_2-産生に関与していることを示唆する。再灌流後、肝臓及び腎臓でも抗HNE抗体による免疫染色は陽性を示し、心臓では抗NT抗体による免疫染色が陽性だった。さらに、HPLCによるコレステロール過酸化物及びNO代謝物の定量を行った。緊縛側筋肉及び腎臓で再灌流後にコレステロール過酸化物濃度が増加した。また、血漿中NO代謝物濃度も再灌流後に増加し、定量結果と組織学的所見は一致した。これらの結果はI/R後のNOSによるO_2-及びNO産生が局所傷害のみでなく遠隔臓器傷害にも関与することを示唆する。我々は今回の研究でNOSによるO_2-産生がI/R後のショック発現のイニシエーターのひとつである可能性を示すことができた。緊縛性ショックでは、局所筋肉は横紋筋融解を呈し、下肢の再潅流によりショックや多臓器不全が発現する。骨格筋細胞はNitric Oxide Synthase(NOS)を構造的に発現しており、一方、NOSは条件によってはNOの替わりにO2-を産生することが、近年明らかになった。そこで、我々は骨格筋組織に内在するNOSによる虚血/再潅流後のO2-産生を組織学的に観察した。緊縛性ショックモデルは、C57BL/6Jマウス(雄、9-15週齢)を吸入麻酔下に一側大腿を輪ゴムで3時間緊縛し、解除した。緊縛開始15分前に尾静脈からHydroethidine 200μg(Molecular Probe社)を投与し、NOS阻害薬は緊縛解除30分前に腹腔内一回投与した。解除後一定時間に吸入麻酔下に心臓血採血し、屠殺後、腓腹筋及び各臓器を採取した。腓腹筋は直ちに10μm厚凍結切片とし、MitoTrackFMGreen(Molecular Probe社)でミトコンドリア染色、VECTRASHIELD with DAPI(Vector社)で核染色及び封入し、蛍光顕微鏡で観察した。緊縛解除後5分では、緊縛側腓腹筋では毛細血管、骨格筋鞘及び細胞質でO2-産生増加が認められ、ミトコンドリア局在に一致した増加が著明であった。既に筋線維は膨化し、解除後30分で筋線維間浮腫が見られ、1時間以降、筋線維の壊死が観察された。NOS阻害薬前投与(L-NAME又はL-NMMA:30mg/kg)により筋線維によるO2-産生は著名に抑制された。

従って、骨格筋組織に内在するNOSは再環流に伴い直ちにO2-を産生するといえる。この過剰なO2-が横紋筋融解をもたらし、また、生成過酸化物が血流により遠隔臓器機能に影響を与える可能性が考えられ、更に検討が必要である。マウスを用いた緊縛性ショックモデルにより、再灌流直後に骨格筋NOSがO2-を産生することを前年度の実験結果で明らかにした。そこで、本年度はNOSによる過剰なO2-産生と過酸化ストレスが遠隔臓器に与える影響を検討した。[方法]C57BL/Jマウスを吸入麻酔下に一側大腿を輪ゴムで3時間緊縛し、解除した。解除後一定時間に臓器を採取し、凍結切片を作成し免疫染色を行った。また、一酸化窒素(NO)測定のためには、解除直後、15分後、1時間後に心臓より採血した。血漿を分離し、血漿中NO代謝物の亜硝酸塩(NO2-)と硝酸塩(NO3-)をHPPLCにより定量した。[結果]抗HNE(4-hydroxynonenal)抗体による免疫染色は肝では解除後30分1時間で、腎では緊縛解除前から解除後まで強い陽性像を示し、遠隔臓器で過酸化反応を示した。抗NT(nitrotyrosine)抗体による染色では心臓で解除後15分1時間で陽性像を示し、NOS活性を示すNADPH活性も心臓では解除後1530分で強い陽性像を示した。一方、肝・腎では緊縛によりNADPH活性が上昇し、解除後経時的に減弱した。NO代謝物に関しては対照マウスでは、NO3-はNO2-よりも10倍以上濃度が高かった。緊縛解除直後ではNO代謝物濃度(NO2-とNO3-の和)は対照マウスとほぼ同じであった。15分でNO2-とNO3-ともに2.5倍に上昇し、1時間後にNO代謝物濃度は対照マウスとほぼ同じ値へ戻った。[考察]免疫組織染色の結果により緊縛による過酸化反応による細胞膜の不安定化と緊縛解除後の心機能の変化が見られ全身状態の悪化が示唆された。NOについては、足立らは駆血帯を用いで整形外科手術患者の血中NO代謝物を測定し、解除直前にはNO代謝物濃度は対照と差がないが、解除5分後に15%の上昇が見られ、翌日元に戻ったという結果を得ている。再灌流後短時間でNOの上昇がみられることは、今回の結果と同じ傾向を示した。これらのことは、免疫組織染色の結果とも合致する。従って、今回緊縛/再灌流モデルを用いて、再灌流傷害へのNOS産生O2-やNOの初期段階での関与を明らかにすることができた。
自動診断システム開発用医用画像データベースの整備

本研究では日本人に多い胃がんと肺がんに焦点をあわせ、既に整備済みのマンモグラムデータベースと併せて、主ながん検診用画像のデータベース化の整備を行うことを目的としている。本研究は2年度にわたるが、この間に整備されたデータベースについて以下にその概要を述べる。胃X線二重造影像:本データベースは診断の難易度や病変の種類などのバランスがとれるように選別されたFCR像76枚から成る。このうち65枚が異常陰影を含む。胸部CT像:本データベースでは、肺がん検診に利用されるスライス厚10mmのものと、精密な検査に用いられるより薄いスライス厚のもの2種類を含む。肺がん検診用は症例数70症例であり、25症例が肺癌症例である。精密検査用については、症例数7症例で、いずれも肺癌症例である。胸部単純X線像:本データベースは間接撮影像50症例、直接撮影像50症例から成る。工学サイドの利用者であっても、一般的には撮影法やその読影法の基礎もわからないのが普通である。そのため、アルゴリズムの組立てに助けとなるように、それらに関する解説を用意したり、専門医のスケッチ画や診断所見を各画像ごとに与えるように努めた。本研究ではがんの検診を支援するための計算機システム、あるいはより進んだ形の自動診断システムの開発に必要な医用画像データベースの整備を目的としている。乳房X線像のデータベースについては既に別のプロジェクトによって整備済みであり、それ以外でがんの検診で重要な胃X線二重造影像、胸部CT像、胸部単純X線像のデータベース化を目的としている。初年度に当たる本年度は胃X線二重造影像の整備完了、およびその他の医用画像のデータベース用画像の収集を主目的とした。胃X線二重造影像については、データの収集と分類、各データの所見やスケッチ画の作成、工学者に対する胃X線二重造影像読影方法の執筆、等を実行し、それらをマニュアルの形で整備した。最終的にはそれぞれをすべて電子化し、広く利用者に配布できる形に整備することとし、その作業もほぼ予定通り進みつつある。まもなくCD ROMの形に整備を終えることができる見込である。胸部CT像のデータベース化については、一症例についての画像枚数が膨大であることから、代表的な症例を数例取り上げ、各症例に対する各スライスのスケッチ等を整備すべく、症例を分担して収集を進め、スケッチなどの作業も一部で進めている。胸部単純X線像のデータベース化でも、直接撮影像および間接撮影像をデータベース化することとし、そのデータ収集を進めている。
イネ科におけるグリシンベタイン合成・輸送・蓄積機構の関する研究

アカザ科では、浸透圧調節物質グリシンベタイン(GB)の合成は、葉緑体でコリンからの2段階の酸化反応(葉緑体型コリンモノオキシゲナーゼ(CMO)とベタインアルデヒド脱素酵素(BADH))で起こることが明らかにされた。申請者らは重要な穀物イネ科のオオムギから、新奇GB合成・輸送・蓄積機構を発見した。イネ科のグリシンベタイン(GB)合成の鍵酵素コリンモノオキシダーゼ(CMO)の実態は全く未知であった。また、GBの輸送・蓄積機構も分かっていない。そこで、イネ科のオオムギを用いて、CMO遺伝子の特定、CMOタンパク質の組織特異性、GBトランスポーターの解析とGBの組織特異的蓄積の関連について研究を行う。オオムギCMO遺伝子のクローニングに成功し、大腸菌で合成させたCMOタンパク質を用いて、コリンからベタインアルデヒドに変換する酵素活性を測定することに成功した。これまで知られているアカザ科のCMOは葉緑体のチラコイド膜に依存するものであったが、オオムギCMOはチラコイド膜に依存せず、ミクロソーム画分を必要とした。活性の測定はまだ再現性に乏しく、さらにGC-質量分析機をも用いて解析の精度を高めていく必要がある。また、CMOタンパク質をGFPとの融合タンパク質として、タマネギ表皮細胞で発現させたところ、ER膜に局在することが明らかになった。CMOに続く酵素BADHがサイトソルにあることを考えると非常に理にかなっている。アカザ科ではCMOもBADHも葉緑体に局在する。全く違うグリシンベタイン合成経路がイネでは使われていることが明らかになってきた。また、グリシンベタイン輸送体の解析を行った。本輸送体はグリシンベタイン以外にもプロリンやGABAも基質とするが、グリシンベタインに対するKm値が一番低く、これを基質としている可能性が一番高い。また、この遺伝子の発現は古い葉で高く、新しい葉で低い。グリシンベタインの蓄積は新しい組織で多いことを考えると、このグリシンベタイン輸送体は古い葉から新しい組織にグリシンベタインを輸送している可能性が高いことを示す。グリシンベタインには分解系が知られておらず、このグリシンベタイン輸送体がストレスのあるないに関わらず、新しい組織における浸透圧調節にためにグリシンベタインを輸送していることを示唆した。イネ科のオオムギでのグリシンベタインの合成経路について、コリンモノオキシダーゼ(HvCMO)の遺伝子を酵母で発現させ、リコンビナントHvCMOが酵素活性を持つことを明らかにした。また、イネもグリシンベタインを検出限界以下しか有しないのに、ベタインアルデヒド脱水素酵素(OsBADH)の遺伝子を2個持つ。2個のリコンビナントOsBADHの酵素学的解析の結果、OsBADH1は、ベタインアルデヒドを基質とせず、OsBADH2はベタインアルデヒドを良い基質とした。また、両酵素ともアミノアルデヒドやトリメチルアルデヒドを良い基質とした。さらに、OsBADH1はアセトアルデヒドを良い基質とし、冠水ストレス下でペルオキシソームでのアセトアルデヒドの解毒に関与するという新しい知見を得た(Mitsuya et al.FEBS Lett.2009)。なおOsBADH2はアセトアルデヒドを基質にしなかった。20年度には、オオムギのBADHがグリシンベタインばかりでなく、β-alanineやGABA、カルニチンの前駆体を合成する可能性を明らかにしている。イネのOsBADHsも同様の傾向を示した。植物のBADHが実際どのような生理学的役割をしているかをさらに追求することは重要である。GBの輸送体(HvProT2)について、研究成果を得た。本輸送体は葉では、メストム鞘細胞で、根では側部根冠で発現した。メストム鞘細胞の役割ははっきりしていないが、アポプラストとシンプラストが切り代わるところで、出現する組織であることから、GBの長距離輸送を含む組織間の輸送に関与することが示唆された。また、20年度の研究で塩ストレス下ではGBは木部柔細胞で合成されることを明らかにしているので、木部柔細胞からメストム鞘細胞への輸送にHvProT2が関与する可能性もある(Fujiwara et al. Planta Online)。1.オオムギのコリンモノオキシゲナーゼ(HvCMO)のさらなる解析:前年度までに得た知見は、これまで知られていたアカザ科の葉緑体CMOと全く異なり、イネ科オオムギではERにCMO活性を有するたんぱく質が存在することを明らかにした。これを論文にまとめて投稿中であるが、ERに局在することを確実にするために、ER局在シグナルを同定するようにとのエディターからのコメントがあり、N-末端とC-末端を削り、どこにER局在シグナルがあるか検討している。これにはかなり時間を必要としている。2.イネ科オオムギについで、葉緑体型でないCMOとBADHをもつのではないかと推測されるのが、ヒマワリ、キクである。これらの植物からCMOとBADHをクローニングを開始した。

3. GB輸送体については、オオムギからメストム鞘細胞に局在するものをクローニングして、その結果を既に論文にしたが、その他にも局在性の異なるものがあることが考えられるので、そのクローニングを試みている。我々はプロリン特異的な適合溶質輸送体をクローニングし、詳しい解析を行って来た。プロリンは根冠で特異的に発現しており、GBとプロリンは共に適合溶質であるが、全く異なる働きを持っていることが明らかになった。今後、さらに広く双子葉植物を含め解析をする。1.オオムギのコリンモノオキシゲナーゼ(HvCMO)のさらなる解析:前年度までに得た知見は、これまで知られていたアカザ科の葉緑体CMOと全く異なり、イネ科オオムギではペルオキシソームにCMO活性を有するたんぱく質が存在することを明らかにした。これを論文にまとめて採択された。この結果はグリシンベタインの機能に関する極めて新しい情報である。ペルオキシソームに局在することを確実にするために、N-末端とC-末端を削り、どのアミノ酸配列に局在シグナルがあるかを検討中である。2.グリシンベタインについては、合成・輸送・蓄積に関する研究が進んできたので、海藻類のアオサの適合溶質であるDMSPの合成酵素の同定、クローニングを進めてきたが、まだ成功していない。3.GB輸送体については、オオムギからメストム鞘細胞に局在する新奇なものをクローニングして、その結果を既に論文にしたが、その他にも局在性の異なるものがあることが考えられるので、そのクローニングを試みている。我々は過去にプロリン特異的な適合溶質輸送体をクローニングし、詳しい解析を行って来た。平成24年度の研究実施計画に従って研究を行った。耐塩性の高いイネ科植物ヤン草についても、オオムギと同様の結果を得た。但し、遺伝子の発現は恒常的であり、オオムギの塩誘導性とは異なった。オオムギにおいて、グリシンベタイン合成経路の酵素CMOとBADHの組織局在性を調べた研究は論文となった(Tissue supecificity of the Glycine Betaine Biosynthetic Enzymes in Barley Leaves, Plant Prod. Sci. 16,117-112(2013))。グリシンベタイン合成の律速酵素CMOは古い葉に多いと考えた時期もあったが、今回新しい葉にCMOもBADHも存在するという結果に至った。この結果は浸透圧調節において大切な役割をするふたつの酵素の局在場所が一致したことを示す。当初の目的はほぼ達成し、新しく始めた海藻類の適合溶質の研究はまだ時間を要する。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初の推進方策に従い、実行する。
エキシマレーザー照射による眼球組織への影響

1.エキシマレーザー表層角膜切除術(家兎)による影響(1)角膜上皮直下に出現する混濁部分(臨床的にはhazeと呼ばれる)には、線維芽細胞様に変化した実質細胞が集合し、III型およびIV型コラーゲン、コンドロイチン-G-硫酸、ラージプロテオグリカンが局在していた。(2)角膜デスメ膜内に沈着する異常物質は、術後3日目頃より出現し、術後1年経過しても残存していることが明らかとなった。また、その構成成分について、免疫組織化学的検索およびRT-PCR法を用いたRNAレベルでの検索の結果、少なくともVI型コラーゲンが含まれていることが明らかとなった。(3)術後3年経過しても、上皮の基底膜および接着装置、上皮下実質浅層の創傷治癒は不完全であることが確認された。(4)手術15分後の前房水中のアスコルビン酸(水晶体過酸化指標物質の一つ)量を紫外線吸光光度計を用いて検索したところ、非照射眼に比べ、照射眼で有意に増加していたが、その臨床的意味は不明であった。2.機械的表層角膜切除術(家兎)による影響1.の(1)(2)(3)の結果は、機械的角膜表層切除術を施行した角膜においても、ほぼ同様の所見が観察された。1.2.の結果から、エキシマレーザーによる表層角膜切除術後の角膜では、非特異的な創傷治癒過程が進行しているものと考えられた。3.エキシマレーザー角膜内切削形成術(家兎)による影響術後9ヵ月まで病理組織学的に観察したところ、レーザー照射部には実質組織の増殖性変化は観察されず、その組織障害は軽微であった。しかし一方で創傷治癒傾向が弱いことが懸念された。白色家兎角膜にエキシマレーザー角膜手術装置(ニデック社、EC-5000)を用いて、角膜表層切除術(PTKモード)を施行した。また、トレパンおよびスパーテルを用いた機械的角膜表層切除術も施行した。術後20日目に角膜を固定・包埋し、組織学的および免疫組織化学的に観察した。免疫組織化学的検索用として、I型、III型、IV型コラーゲン、コンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、ケラタン硫酸、ラージブロテオグリカン、acidic-FGF、basic-FGF、TGF-βに対する抗体を使用した。エキシマレーザー表層角膜切除術後20日目の角膜を光学および電子顕微鏡で観察すると、表層切除部分の角膜上皮は既に再被覆が終了していた。しかし、上皮直下の実質前層には線維芽細胞様に変化した多数の角膜実質細胞が集合し、細胞間隙には無構造または細線維様の細胞外マトリックスの沈着が観察された。これらの所見は、臨床的に"haze"と呼ばれる上皮下混濁に一致するものと考えられた。この上皮下混濁部分を、免疫組織化学的に観察すると、III型、IV型コラーゲン、コンドロイチン-6-硫酸およびラージプロテオグリカンに対する抗体で強く染色された。一方、正常角膜実質に多く認められるI型コラーゲン、ケラタン硫酸、コンドロイチン-4-硫酸に対する抗体では、それぞれわずかな陽性所見のみを示した。また、acidic-FGF、basic-FGF、TGF-βについては正常角膜に比べ、特異的な局在または明らかな強弱を示す所見は得られなかった。また、スパーテルを用いた機械的角膜表層切除術を施行した角膜においても、術後の角膜所見は上述の観察結果と全く同様であった。

以上のことより、エキシマレーザーによる表層角膜切除後の角膜実質では通常の非特異的な創傷治癒・瘢痕形成が進行しているものと考えられた。1.エキシマレーザーで表層切除術を行った家兎角膜について最長3年間にわたり長期的な変化を検索した。術後2及び3年の時点でも、角膜の上皮基底膜の一部に凹凸不正があった。また、上皮直下の実質浅層コラーゲン線維に走行の乱れがあった。免疫組織化学的には、抗III型、抗IV型コラーゲン抗体が中央部実質浅層に陽性所見を示した。これら角膜実質浅層のIII型とIV型コラーゲンに対する陽性所見は、瘢痕組織がまだ局在しているものと解釈された。VII型コラーゲンに対する抗体は、切除部の基底膜上での染色性が弱く、上皮接着装置の再生が不十分であることを示した。これらの所見から家兎角膜の創傷治癒は、術後3年でも不完全であると考えられた。2.エキシマレーザー照射後、デスメ膜内に沈着する物質について、電顕免疫組織化学法により検索した。すなわち、I・III・IV・V・VIコラーゲンに対する抗体およびケラタン硫酸、コンドロイチン4硫酸、コンドロイチン6硫酸、ラージプロテオグリガンに対する抗体を用いてそれぞれの反応を観察したところ、抗VI型コラーゲン抗体のみがデスメ膜内の沈着物に陽性所見を認めた。現在CompetitiveRT-PCR法を用いてRNAレベルで経時的に、VI型コラーゲンの発現を検討中である。3.エキシマレーザー照射後の家兎前房水中のアスコルビン酸(水晶体過酸化指標物質の一つ)量の変化を検索するための予備実験として、正常家兎の前房水内のアスコルビン酸を高速クロマトグラフィーを用いて検索した。前房水中アスコルビン酸濃度は個体差が大きいものの左右差はほとんど無いことが明らかとなった。現在エキシマレーザーを片眼にのみ照射した後の前房水アスコルビン酸量を測定中である。1.エキシマレーザー角膜手術装置を用いて、表層切除術を行った家兎角膜のデスメ膜内に沈着する物質について、病理組織学的に検索した所、内皮細胞が術後3日目頃から異常物質を産生し、デスメ膜内に沈着することが明らかになった。また、電顕免疫組織化学的検索では、抗VI型コラーゲン抗体のみが、沈着物質に陽性所見を示した。そこで、エキシマレーザー照射後から術後14日目まで、Competitive RT-PCR法を用いて、RNAレベルで経時的にI型およびVI型コラーゲンのα1鎖の発現を検討した。I型コラーゲン[α1(I)]の発現は術後2日目から7日目まで術前に比べ低下していたが、VI型コラーゲン[α1(VI)]のmRNAの発現は術後3日目から7日目に増加していた。以上の結果から、エキシマレーザー照射後のデスメ膜内沈着物には、VI型コラーゲンが含まれていると考えられた。一方、スパーテルを用いた機械的な角膜表層剥離術後にも、上記と同様のデスメ膜内沈着物が出現し、Competitive RT-PCR法を用いて[α1(VI)]のmRNAの発現を検索した所、エキシマレーザー照射角膜と同様の発現パターンを示した。これらの結果から、角膜内皮細胞がVI型コラーゲンを産生するのは、何らかのストレスが加えられた際の内皮細胞の一般的な反応であることが示唆された。2.エキシマレーザー照射後の前房水中のアスコルビン酸(水晶体過酸化指標物質の一つ)を紫外線吸光光度計を用いて測定し、対照眼のそれと比較した。照射後15分で、照射眼の前房水中のアスコルビン酸量は対照眼に比べ有意に増加していた。しかし、その臨床的意味は不明である。3.家兎角膜にレーザー角膜内切削形成術(laser in situ keratomileusis, LASIK)を施行し、術後9ヶ月まで病理組織学的に観察した。