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観光における「まちづくり」の意味と知識循環型クラスターについての研究

2018年12月に日本観光研究学会全国大会(跡見学園女子大学)において、米田誠司・大澤健「観光まちづくりにおけるイノベーションの源泉ー由布院におけるアートをめぐる一考察ー」の報告を行った。『日本観光研究学会全国大会学術論文集』33(pp.117-120)。2019年3月に大澤健・米田誠司共著『由布院モデルー地域特性を活かしたイノベーションによる観光戦略』(学芸出版社)を公刊した。この著書において、「観光まちづくり」の意味を1地域特性をつくる、2ひとのつながりをつくる、3観光の競争力をつくるという3つのフェーズから解明し、それらを組み合わせた観光まちづくりの「由布院モデル」の全体像を明らかにしている。1は観光まちづくりの「目的」を表すフェーズで、地域環境、地域社会、地域経済の3要素によって定義される。こうした地域特性が地域の包括的差別化化によるブランド形成を可能にしている。2は「主体と方法」を表していて、「動的ネットワーク」と名付けた分野横断的なフラットな人的なつながりの中で実践されている。これがイノベーションを生み出す母体になることを述べている。1のフェーズによるブランド化と、2のフェーズによるイノベーションが観光地としての由布院温泉の競争力の源泉になっている。こうした考察によって、「まちづくり」がなぜ観光振興に必要とされるのか、あるいは逆に観光振興のためにどのような「まちづくり」が必要なのかを解明した。前者の学会報告は、由布院モデルの実践例として考察したものであるが、後者の著書においては、他に由布院の宿、農業と食という分野から同モデルを例証している。また、同モデルの応用例として和歌山県田辺市における熊野古道を活用した観光振興について考察している。平成27年度の研究は、1由布院温泉において多発的なイノベーションが生じていること、2そのイノベーションの背後には動態的な知識循環クラスターがあること、を立証すること中心に進められた。1について、由布院らしさを体現するものとして、景観と調和した(小さな)宿泊施設、地元の食材を活用した食(農業と料理)、文化の雰囲気を演出するためのアートイベントやアート関連施設、環境や景観に配慮した取り組み、をリストアップした。今年度は主として前者3項目について調査を行っている。1については、宿泊施設の新規開業数の推移を調査した。この調査では、開業年のほかに、旅館の主要な施設構造、開業の経過等についての質問も行った。旅館組合加盟の全旅館に郵送でアンケートを行い、未回収分については追ってヒアリング調査を行った。また、旅館の料理部門の交流過程についてヒアリング調査を行った。さらには、アートイベントの経年的な開催状況について文献調査およびヒアリング調査を実施した。このほかに、域内の観光協会および旅館組合が発行している各種の資料(総会資料および観光新聞)、および湯布院町商工会の資料を収集した。また、由布院温泉のまちづくりに関する基本的な文献と、知識創造プロセスに関する文献の収集を行った。これらの調査と並行して、2の知識循環プロセスの存在を明確化する作業を行っている。宿泊施設の調査については、開業の経過を調べることによって、旅館の新規開業にたいして地域内での知識瞬間がどの程度影響しているのかを調査した。また、料理分野でのイノベーションを調べるとともに、料理人相互の交流と知識循環の様子についてもヒアリングしている。アートについても同様である。由布院「らしさ」=地域特性の具体的な内容を確定し、それを基盤にしたイノベーションの発生状況もある程度調査を行うことができている。宿泊施設については、開業年、施設構造など定量的な調査によってイノベーションの経過を明確化できると考えられる。その背後にある知識循環クラスターの存在については、さらに詳細に調査する必要がある。宿泊施設については詳細なアンケート調査を実施したが、旅館組合非加盟の宿泊施設への調査は28年度に繰り越された。これらがそろい次第、イノベーションの発生状況について定量的な分析を行える段階にある。アートと食については、どのようにして定量的にイノベーションの発生を示すのかが大きな課題になっている。イノベーションの背後にある知識循環プロセスについては、文献資料による調査を今後もさらに継続しなければならない。また、ヒアリングについてももっと手広く行う必要がある。これらは28年度に引き続き行われる。観光におけるまちづくりの重要性が強調されるようになって久しい。ところが、「まちづくり」がなぜ観光の振興および成功と結びつくのかは、必ずしも明確になっていない。本研究は、「イノベーション」を媒介環にすることによって、両者が結びつく理由を明らかにしようとしている。まちづくり型観光地の代表例とされる由布院温泉において、以下の手順で上のことを証明する。(1)由布院温泉では、持続的に活発なイノベーションが起こっている。それは、農業と食、環境と景観、文化とアートという三分野に集中している。(2)こうしたイノベーションを引き起こす要因となっているのは、1地域特性(いわゆる「由布院らしさ」)の保全と開発、2地域内の多様な主体を結びつける水平なつながりの存在(「共有」と「協働」の場の重層的な存在)の二つである。1を地域における「共通善」として共有しながら、地域の多様な主体が実践的に協働することによってそれを実現することによって、多様な知識がまじりあう場をつくっていることが由布院の大きな特徴になっている。(3)この二つの要因を組織的知識経営モデルを使ったソーシャルイノベーションの分析によって統合することで由布院温泉におけるイノベーションの多発化の理由を説明できる。

これは同時に、イノベーションクラスターの形成要件の解明であって、これによって観光地におけるイノベーション環境を創造するための要件を明らかにすることができる。熊本、大分を襲った震災に追って、由布院温泉も大きな被害を被った。幸いにして死傷者は出なかったものの、旅館など家屋の被害が大きく、旅館の再開が大きな課題となった。また、来訪者が激減して、その対策も緊急の課題となった。そのため、研究のための関係者へのヒアリング等も遠慮せざるを得ず、また共同研究者は当事者として復興に向けた研究を行う必要があった。そのため、予定よりも研究の進捗が遅れることになった。由布院温泉における観光まちづくりについて、現地調査を継続的に行った。「旅館」、「農と食」、「アートとデザイン」という3つの分野を「由布院らしさ」の中心的な領域と仮定して、まちづくりの経過を文献とヒアリングから追うとともに、それがどのような社会的な関係の中で営まれたのかを関係者から繰り返しヒアリングを行った。その中で、「動的コミュニティ」と名付けるべき社会的関係が繰り返し結ばれ、それが地域的な広がりを持った組織的知識経営の場となっていることを確認した。その結果として、由布院温泉では「由布院らしさ」を源泉としたイノベーションが持続的に発生して、市場競争力を保持していることを確認した。こうした研究成果とともに、「観光まちづくり」の先行理論を調査し、その理論的な課題を明確にした。先行理論はまちづくりがなぜ観光地の市場競争力の向上につながるのかを必ずしも十分に明らかにできておらず、それを知識経営に基づくイノベーションとして説明することの新規性を確認した。こうした研究成果をもとに、当初仮説として設けた観光まちづくりにおける「由布院モデル」を修正し、より普遍性の高いモデルを得ることができた。その成果として、以下の研究成果を得た。《学会発表》米田誠司、大澤健「観光まちづくりにおけるイノベーションの源泉ーゆふいん料理研究会からの一考察ー」日本観光研究学会第32回全国大会、2017年12月3日金沢星稜大学《論文》大澤健「観光まちづくりにおける理論的課題」、和歌山大学『経済理論』2018年3月由布院温泉は2016年に発生した熊本地震において被災地となった。そのため、観光関係者へのヒアリング調査が中断したため、研究に遅滞が生じている。2018年度まで研究期間を延長する申請を行った。2018年12月に日本観光研究学会全国大会(跡見学園女子大学)において、米田誠司・大澤健「観光まちづくりにおけるイノベーションの源泉ー由布院におけるアートをめぐる一考察ー」の報告を行った。『日本観光研究学会全国大会学術論文集』33(pp.117-120)。2019年3月に大澤健・米田誠司共著『由布院モデルー地域特性を活かしたイノベーションによる観光戦略』(学芸出版社)を公刊した。
3D-MEMS加工技術を利用したマイクロ宇宙推進機の抜本的な推進効率の向上

超小型人工衛星にも搭載可能な推進機の有力候補となっているエレクトロスプレースラスタを対象に、微細加工技術を利用したエミッタアレイ電極の製作、イオンビームの電圧電流特性評価を行うとともに、粒子計算モデルを利用したイオンビーム軌道解析を行った。その結果、安定してイオンを引き出し可能な電圧領域にはある幅があることが分かり、効率的なイオン引き出しにはこの電圧領域にて運用することが望ましいことが明らかになった。本年度はエミッタ製作に主眼を置きそれに必要なプロセス条件の洗い出しから研究を開始した。エミッタ電極の製作方法を以下に簡単にまとめる。(i)ピラニア溶液で洗浄したシリコン表面にCrを蒸着する。(ii)フォトレジストを塗布し、フォトマスクを密着させた状態で紫外線(UV)を照射する。(iii)現像液によりフォトマスクを転写したフォトレジスト層を製作する。(iv)不要なCrをエッチングし、ドライエッチングに使うマスクを製作する。(v)等方性ドライエッチングを行いシリコンウエハ上に鋭角状のエミッタを製作する。(vi)残ったCrをエッチング液とアッシャーを使うことで完全に除去する。エミッタ電極は1 cm ×1 cmのシリコン基板上に製作しており、その数は4, 12, 44個、ピッチは0.25, 0.5 mmの2種類とし、また、エミッタ先端への導電性を確保するためにAl蒸着を行ったものとシリコンそのままのものの2種類を用意した。本研究では推進剤としてイオン液体のうちEMI-BF4を用いた。宇宙空間を模擬する真空槽内部においてイオン液体のビーム抽出特性を調べるに当たり、まずはコレクタ電極に金属平板を用いて抽出開始電圧を測定した。その結果、エミッタ電極数に依らず電極間距離に応じてほぼ比例した引き出し開始電圧特性が得られた。なお、導電率を上げる目的でAl蒸着させたエミッタ電極の方がAl蒸着無しのシリコンのみのエミッタ電極よりも高い抽出開始電圧となり、予想に反する結果が得られた。この結果を踏まえ、抽出電極にTEMグリッド電極を用いたイオンビーム抽出実験を行った。両極性繰り返し高電圧パルスを印加することにより、陽イオン、陰イオンともにほぼ同じ電圧の絶対値で正負同程度のビーム電流が得られた。エミッタ一つ当たりの電流値は予測される電流値とほぼ一致していた。当初担当予定の大学院生数が確保できなかったため、エミッタ電極製作プロセスとビーム特性評価を共同研究先と並行して進める事が出来ず進捗は予定より遅れている。前年度のイオンビーム引き出し実験において、エミッタ電極と抽出電極との間でのショートが多発し安定的にイオンビームを引き出す事ができなかったため、今年度はエミッタ製作においてBoschプロセスを用いた異方性エッチングを長く行うことで貯蔵部をより深く製作した。また、抽出電極となるTEMグリッド電極の保持機構を改良することで、ショート問題を軽減させることに成功した。TEMグリッド電極を用いた予備実験では、TEMグリッド電極の直径が3 mmと小さいことからエミッタ電極数の上限が44であるため、推力を増加させるためにはエミッタ電極をより多く製作する必要がある。厚さ80 umのSUS薄板を化学エッチングすることで抽出電極製作し、エミッタ電極数を200まで増やし電圧電流特性を評価した。エミッタ先端とエクストラクタの電極間距離を0.20.4 mmで変化させたところ、以下の事が明らかになった。電極間の低下に伴い電場が強くなることでイオン引き出し開始電圧も低下する。一方、引き出される電流値に関しては、電極間距離ととも電位差が増加することで大きくなる。ただし、エクストラクタへの電流値も増加する。また、安定してイオンを引き出し可能な電圧領域にはある幅がある。上記電圧領域以上の電圧印加は電流値が不安定になる。なお、エミッタの構造としては、Boschプロセスを用いた異方性エッチングは不可欠となることが分かった。これは等方性エッチングのみで製作した円錐状のエミッタでは、エミッタ間の液溜めとエクストラクタ間で多数のショートが発生し、安定したイオン引き出しが不可能となるためである。また、ビーム発散角の見積から、現状のスケールで製作した電極構造の場合、エミッタのピッチとしては400 um程度までに留める事が必要ということも明らかになった。2016年度はシリコン製電界放出型電子源の製作で長年に渡り数多くの実績を持つ産業技術総合研究所ナノエレクトロニクス研究部門カスタムデバイスグループの協力(研究協力者)を得てエミッタ電極を含む素子製作を加速させる予定である。素子製作後、引き出されたイオン液体が純粋なイオンだけか、それとも、液滴状になっているかについて、飛行時間(TOF: Time of Flight)測定を行い判定する。さらに、電極にかける電位を反転させた際に、陰イオンが陽イオンと同じ引き出し特性になるかについて解析する。2015年度には電極の数が444においてイオンビーム抽出特性に関してスケーラビリティが得られることを確認している。

2016年度はこれを100、1,000と増やしていき同様にスケーラビリティが得られるかについて把握する。可能であれば推力が実用レベルに達する10,000へと電極数を増やしていく。もし一つの素子に多くの電極を配置することで必要な電流量を確保出来ない場合は、複数の素子を用いることを検討する。そして、抜本的な推進効率の向上に不可欠な機構であるPIR (Purely Ionic Regime)が得られる条件を突き詰めていく。最終的に、イオンビームの電流量や発散角を計測することで推進性能の評価を行う。また、キャピラリ構造の内径・長さ、ならびに電極間の電場構造の解析により最適な推進剤流量制御法の構築を目指す。工学次年度使用額が生じた額は当該年度所要予定額に対して0.25%であり、予定通り使用したと言える範囲と考えている。上述の通り残額は極僅かであり、当初予定通り次年度も使用を行う。
強発癌性B型肝炎ウイルスの同定

HBVキャリアが全て肝癌を発生するわけでは無く、何らかの付加的な因子の解明が必要である。臨床的観点から診ると、HBV感染者における肝発癌スクリーニングの問題点は、C型肝炎の場合と異なり「肝癌発生の高危険群」の設定ができないことである。将来肝癌を発生しやすいウイルスが同定できれば、肝癌を早期に察知して早期に治療することが可能となる。この目的のため、発現スイッチ・オン・システムを用いた機能的解析によって強発癌性B型肝炎ウイルスを同定べく、発現ベクターを構築した。まず患者血清からDNAを抽出し、B型肝炎ウイルス(HBV)X遺伝子を含む遺伝子断片をPCR法で増幅した。次いで、制限酵素DraIとBglIIで、X遺伝子とそのエンハンサー、プロモーターおよびポリAシグナルを切り出した。これをプラスミドに入れ、その後AluIサイトに、ファージ由来のloxP配列2個の間にネオマイシン耐性遺伝子とポリA選択シグナルを挟みこんだ遺伝子断片lneolpを挿入した。これを完全な癌化細胞ではないRat-1あるいはL細胞に導入し、一連の細胞株を樹立した。一人の患者血清から得られたHBV-DNAクローンについて樹立された、それぞれ複数の細胞株を10%FCSを含むあるいは含まない培地中で培養し、細胞株の増殖速度、ploidy、コロニー形成能を検討した。細胞株毎に増殖能にはバラツキが見られたが、ひとつのHBV-DNAクローンWT-2は他のクローンに比して明らかな増殖亢進を、繰り返しもたらした。本クローンの塩基配列を解析中である。次いで、制限酵素DraIとBg1IIで、X遺伝子とそのエンハンサー、プロモーターおよびポリAシグナルを切り出した。これをプラスミドに入れ、その後AluIサイトに、ファージ由来のloxP配列2個の問にネオマイシン耐性遺伝子とポリA選択シグナルを挟みこんだ遺伝子断片lneolpを挿入した。現在、これを完全な癌化細胞ではないRat-1あるいはL細胞に導入し、細胞株を樹立している。
インスリン受容体基質IRS-1遺伝子の細胞、組織特異的発現調節機構の解析

IRS-1(Insulin Receptor Substrate-1)はインスリン受容体の主要な基質であり,多様なインスリン作用を伝達している。今回,IRS-1遺伝子の発現が分子レベルでどのように調節されているかを以下に示すように解析した。(1)Notthern blot法にて数種の細胞におけるIRS-1 mRNA量を解析し,一番発現の高いHepG2細胞と低いCHO細胞を用いて更にIRS-1遺伝子発現の違いを検討した。(2)IRS-1遺伝子プロモーター5'端の様々なdeletionをCAT(chloramphenicol acetyltransferase)遺伝子の上流に組み込み,CHO,HepG2両細胞にてCATアッセイを行い,-1645-1605bpの領域(フラグメントA)はHepG2細胞にて転写を正に,-1605-1585bpの領域(フラグメントB)はCHO細胞にて転写を負に調節することを見い出した。(3)HepG2,CHO細胞より核蛋白を抽出,ゲルシフトアッセイを施行,フラグメントAのEboxに結合する両細胞に共通の核蛋白を1つ,HepG2細胞特異的核蛋白を1つ同定した。フラグメントBでは,各細胞においてC/EBP結合部位に結合する2つの核蛋白を同定した。(4)さらに,Ebox,C/EBP結合部位各々に変異を導入,転写因子が結合できない変異IRS-1プロモーターを用いてCATアッセイを施行した結果,Eboxの変異によりHepG2細胞における転写活性の増強が消失すること,C/EBP結合部位の変異によりCHO細胞における転写活性の低下が消失することが確認された。以上,本研究ではIRS-1遺伝子プロモーターのEboxとこれに結合する核蛋白がHepG2細胞において転写活性を増強させること,C/EBP結合部位とこれに結合するC/EBPがCHO細胞において転写活性を低下させることを明らかにした。本研究はインスリンの細胞内情報伝達に重要なIRS-1(insulin receptor substrate-1)の細胞,組織特異的発現が,分子レベルでどのように調節されるかを解析することを目的としている。本年度の研究実績を以下に示す。(1)Northern blot法にて数種の細胞におけるIRS-1 mRNA量を解析し,IRS-1 mRNA量の細胞特異的発現を確認,一番発現の多いHepG2細胞と少ないCHO細胞を用いてIRS-1遺伝子発現を検討した。(3)-1645-1585bpの領域を解析し,このうち-1645-1605bpの領域がHepG2細胞にて転写を正に,-1605-0585bpの領域がCHO細胞にて転写を負に調節することを見い出し,2つの調節領域の存在を示した。(4)この2つの領域をゲルシフトアッセイにて解析,HepG2,CHO各細胞において,調節領域に存在するE boxとC/EBP結合部位に結合する核蛋白の存在を明らかにした。(1)Notthern blot法にて数種の細胞におけるIRS-1 mRNA量を解析し,一番発現の高いHepG2細胞と低いCH0細胞を用いて更にIRS-1遺伝子発現の違いを検討した。(2)IRS-1遺伝子

プロモーター5'端の様々なdeletionをCAT(chloramphenicol acetyltransferase)遺伝子の上流に組み込み,CHO,HepG2両細胞にてCATアッセイを行い,-1645-1605bpの領域(フラグメントA)はHepG2細胞にて転写を正に,-1605-1585bpの領域(フラグメントB)はCHO細胞にて転写を負に調節することを見い出した。(3)HepG2,CHO細胞より核蛋白を抽出,ゲルシフトアッセイを施行,フラグメントAのEboxに結合する両細胞に共通の核蛋白を1つ,HepG2細胞特異的核蛋白を1つ同定した。フラグメントBでは,各細胞においてC/EBP結合部位に結合する2つの核蛋白を同定した。(4)さらに,Ebox,C/EBP結合部位各々に変異を導入,転写因子が結合できない変異IRS-1プロモーターを用いてCATアッセイを施行した結果,Eboxの変異によりHepG2細胞における転写活性の増強が消失すること,C/EBP結合部位の変異によりCHO細胞における転写活性の低下が消失することが確認された。以上,本研究ではIRS-1遺伝子プロモーターのEboxとこれに結合する核蛋白がHepG2細胞において転写活性を増強させること,C/EBP結合部位とこれに結合するC/EBPがCHO細胞において転写活性を低下させることを明らかにした。
大腸発癌におけるTNF-R1の検討

炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor: TNF)は、種々のサイトカインの誘導や細胞増殖、分化、アポトーシスによる細胞死の誘導など多様な細胞現象に重要な役割を果たしている。TNFの過剰な産生はさまざまな炎症性疾患や癌の発症(胃癌、乳癌など)に関与し、TNFはこれらの治療の標的となっているが、大腸癌においてはその臨床応用は未だ途上である。本研究ではこれらの知見に基づき、大腸発癌過程におけるTNF-R1関連因子の分子機構を明らかにし、また大腸癌におけるTNF-R1のバイオマーカーとしての臨床応用を目指すものである。TNFの過剰な産生はさまざまな炎症性疾患や癌の発症に関与し、TNFはこれらの治療の標的となっているが、大腸癌においてはその臨床応用は未だ途上である。本研究では、大腸発癌過程におけるTNF-R1関連因子の分子機構を明らかにし、また大腸癌の早期発見におけるTNF-R1のバイオマーカーとしての臨床応用を目指すものである。今回我々は、TNF-R1ノックアウトマウスやTNF-R2ノックアウトマウスを用いて大腸発癌実験を行い腫瘍形成への影響や、正常粘膜・腫瘍粘膜におけるTNF-αと受容体の発現などをPCR法や免疫染色法で検証し、その下流シグナルであるJNK、NF-κB、caspase3の発現をリン酸化ウエスタンや免疫染色法で検証した。さらには抗TNF-α抗体(MP6-TX22)を投与した大腸発癌モデルマウスを作成し、抗腫瘍効果を認めた。またTNF-αレベルは病態の活動性を反映するマーカーとしても注目されるが、TNF-αの血中半減期は20分以下と短く、しかもpg/mLという非常に低濃度のレベルで存在するため、測定を困難なものとしている。一方、TNF受容体の濃度レベルはng/mLと約1000倍高く、そのため測定による誤差が少なく、しかも可溶性受容体の半減期はとても長く安定性が高いため、その測定は良い指標になりうると考えられる。本研究において大腸腺腫患者における血清TNF-R1値を世界に先駆けて測定し、有意に高いことを突き止めた。またROC曲線下面積も0.928と高くバイオマーカーとしての有用性が示唆された。今回我々は、TNF-R1ノックアウトマウスやTNF-R2ノックアウトマウスを用いて大腸発癌実験を行い腫瘍形成への影響や、正常粘膜・腫瘍粘膜におけるTNF-αと受容体の発現などをPCR法や免疫染色法で明らかにしつつ、その下流シグナルであるJNK、NF-κB、caspase3の発現をリン酸化ウエスタンや免疫染色法で明らかにした。さらには抗TNF-α抗体(MP6-TX22)を投与した大腸発癌モデルマウスを作成し、抗腫瘍効果を確認した。一方、TNF-α受容体のTNF-R1、TNF-R2はTNF-α刺激による可溶化(Shedding)を受け、血中に可溶性TNF-R1、R2として放出される。TNF-R1については、潰瘍性大腸炎患者において健常者より有意に高いという報告があるが大腸癌に関する報告は少なく、我々は大腸腺腫患者における血清TNF-R1値を世界に先駆けて測定し、有意に高いことを突き止めた。我々はすでに、高脂肪食下での大腸腫瘍増大のメカニズムとしてJNKが活性化されることで腫瘍増殖が起こることを報告している。JNKの上流にはTNF-R1とTNF-R2があり、それぞれTNF-αの刺激により作動するが、大腸発癌におけるTNF-R1、TNF-R2の役割は明らかでない。一方、我々はヒト大腸組織において、免疫蛍光染色による共焦点顕微鏡でTNF-R2ではなくTNF-R1がp-JNKと同じ発現を大腸腺腫上皮細胞で認めることを突き止めており、また腺腫上皮

特異的TNF-R1の発現は、マイクロダイセクションによるRealTime-PCR法でも確認しており、TNF-R1/JNK経路が大腸発癌において重要な役割を果たしていると考えている。この仮説証明のためにTNF-R1ノックアウトマウスとTNF-R2ノックアウトマウスでの大腸発癌実験を行い腫瘍形成への影響を検証した。さらに細胞増殖やアポトーシス、正常部と腫瘍部のJNK活性や下流シグナルの発現をタンパク解析や免疫染色法で解析した。また一方で、抗TNF-α抗体(MP6-TX22)を投与した大腸発癌モデルマウスを作成し、抗腫瘍効果やTNF受容体発現状況、JNK活性などを解析した。消化器内科学大腸腺腫患者における血清TNF-α、TNF-R1、TNF-R2値の検討では、TNF-R1は対照群と比較して、大腸腺腫群で有意に高く、TNF-α、TNF-R2は両群間で有意差はなかった。また一人あたりの大腸腺腫の数別に血清TNF-R1値を比較すると、大腸腺腫数が3個以下の群のTNF-R1は337.4±93.5 ng/mL、4個以上有する群は405.9±55.4 ng/mLと高値であり有意差を認めた。これらの研究実績を基に、大腸癌患者における血清TNF-α、TNF-R1、TNF-R2値の解析を計画している。研究参加症例数は大腸癌患者100例、対象群50例を目標とする。なお、感染症、炎症性腸疾患、自己免疫性疾患、アレルギー性疾患、喘息など血清TNF-αレベルを上昇させる可能性が高い併存疾患をもつ者は除外する。また血清値の比較以外に、悪性度や治療効果との関係性を検証し大腸癌のバイオマーカーとして臨床的意義を明らかにしていく。
副格子交換エピタキシーによるテラヘルツLEDの研究

3つのブラッグ反射多層膜と2つの共振器層で構成する半導体多層膜結合共振器を使ったテラヘルツLEDを開発する。電流注入により室温でテラヘルツ波を発生させる全く新しいタイプの面発光素子で、赤外二波長レーザ発振とその差周波発生を同一素子内で行うことを原理とする。テラヘルツ波の発生効率を最大限に高める分極反転型の結合共振器薄膜は、高指数面上の副格子交換エピタキシー成長技術により作製する。放熱特性に優れる素子構造を実現し、その放射特性を明らかにする。さらに、テラヘルツ波の出力強度を最大限に高める集積構造をデザインし、マイクロワットからミリワット級の出力強度を得ることを目標として試作を行う。
ナイアシン合成の鍵酵素のモノクローナル抗体の作製とcDNAクローニング

ナイアシンはトリプトファンから生合成される唯一のビタミンであるが,ヒトではナイアシン欠乏になると,ペラグラなどさまざまな疾病をひきおこすため,トリプトファンからナイアシンへの転換率は栄養学上重要である。この転換率を支配しているのが,トリプトファン・ナイアシン代謝経路の鍵酵素であるアミノカルボキシムコン酸セミアルデヒド脱炭酸酵素(ACMSD)である。ACMSDは,栄養素やホルモンによって変動する(つまりトリプトファンからナイアシンへの転換率も変化する)が,これらの現象のメカニズムは依然不明のままである。そのメカニズムを分子レベルで解明するための第一段階としては,本酵素に対する抗体やcDNAが必要であるので,本年度の計画では,トリプトファンからナイアシン生合成経路の鍵酵素であるACMSDに対するモノクローナル抗体の作製およびcDNAのクローニングを試みた。モノクローナル抗体は,ACMSDで免疫したマウスの脾細胞とマウスミエローマ細胞を融合させて,ハイブリドーマを作製し限界希釈法によりクローニングし,5種類のモノクローナル抗体を得た。次に購入および供与さたcDNAライブラリーからは目的のクローンが得られなかったので,ACMSD活性が高くなるようにホルモン処理を行ったラットの肝臓のcDNAライブラリーの作製をおこなった。ホルモン誘導したラットの肝臓からAGPC法とCsCl法を併用しRNAを抽出し,Oligo(dT)セルロースカラムでpolyA^+RNAの精製をおこなった。これをもとにcDNAの合成を行い,ライブラリーを調製した。現在,作製したモノクローナル抗体でクローニングしている最中である。今後このモノクローナル抗体およびcDNAを用い,トリプトファンからナイアシンへの転換率の栄養素,ホルモンによる変動のメカニズムを分子レベルで調べる予定である。
ヘテロダインＴＨｚ－ＣＴ／分光システムの開発

昨年までにヘテロダインTHz-CT/分光システムを開発し、実際にプラスチック製品の3D-CT画像や遮蔽物下の分光イメージングを実現したが、is-TPGが波長可変光源ゆえに1パルスで1波長しか出力できず、分光する際に波長を掃引するため、測定時間が長かった。そこで昨年度からis-TPGの多波長化を推し進めており、波長可変を無くすことで、高速測定を目指してきた。今年度は、実際に分光イメージングに導入すると共に、高安定化、極微弱光の検出を目指したテラヘルツ波の高利得増幅装置開発を行った。is-TPGは励起光と注入光をLiNbO3結晶に入射することでテラヘルツ波を発生する。本研究では、多波長注入光を用い、5波長テラヘルツ波の同時発生を行った。EMS(Express Mail Service)封筒に隠蔽された糖類の分光イメージングを行ったところ、測定時間が従来のis-TPGに比べて5分の1に短縮されたにも関わらず、各試薬の分布の画像化に成功し、大幅な高速化が実現した。次に、発生するテラヘルツ波をサンプル側とレファレンス側の2ビームに分割して、常時校正を取る方式を導入した。3波長発生時において安定性の向上を確認したところ、パルス間のゆらぎだけでなく、長期的な出力変動も無視することが可能となった。他方、吸収ロスの大きなサンプルを透過した極微弱テラヘルツ波を検出するために、高利得テラヘルツ波増幅器も開発した。従来のテラヘルツ波増幅器では、雑音成分がパラメトリック利得により増幅されて、極微弱なテラヘルツ波増幅を邪魔していた。それを今回、増幅用結晶を1個から2個に増やし、その間にアイリスを用いて雑音成分のみを空間的に除去することで、所望の成分のみ2個目の結晶で増幅可能となり、-100dB程度減衰した極微弱テラヘルツ波入力に対し、20億倍以上と極めて高い増幅度を得ることが出来た。29年度が最終年度であるため、記入しない。透過性、直進性、試薬類に指紋スペクトルを有するなど優れた特徴を有するテラヘルツ(THz)波だが、未だに実用的な測定システムが無い。そこで私はTHz波の実用化を目指し、これまでにダイナミックレンジ7桁という優れた性能を有する光注入型THzパラメトリック発生検出システムの開発に成功した。さらにこのシステムの検出方式はコヒーレントなTHz波のみに感度を有するため、測定ターゲット中を直線的に透過した成分のみを計測し、散乱光は計測しないという、理想的な高精細イメージングが可能となる。本研究では、この新方式の長所を活用した透過型CTおよび分光イメージングを実現し、プラスチック製品やセラミクス製品内部の欠陥検査、小包や厚手の郵便物内に隠された禁止薬物や爆薬検出、調剤薬局での処方箋ミス検出などのTHz波に求められる様々な社会的ニーズに応え得るシステムを実現することを目的とする。その目的のもと、平成27年度はヘテロダインTHz-CT/分光システムの開発において最も重要である、テラヘルツ波光源の光注入型テラヘルツ波パラメトリック発生器(is-TPG)のさらなる高性能化として波長可変域の拡大を目指した。テラヘルツ波発生用結晶配置から根本的に見直すことで、結果として従来では難しかった3THzよりも高い周波数まで出力できるようになり、0.6-5THzと実に1桁の波長可変性を実現した。また、ヘテロダインTHz-CT/分光システムのデモンストレーションとしてis-TPGを用いたイメージング系を構築し、遮蔽物下の分光イメージング実験や単一波長での三次元テラヘルツ波CT測定を行った。従来では難しかった厚手の遮蔽物下の試薬同定に成功し、さらに単一波長ではあるが、プラスチック製品の内部欠陥を三次元でイメージング出来た。is-TPGの出力はここ数年で大幅に拡大した一方で波長可変域は0.6-3THzで、これまで15年以上改善されておらず、ヘテロダインTHz-CT/分光システム含め、今後の応用を考えるとその拡大は急務であった。そこで、平成27年度はテラヘルツ波光源の高性能化を目指して研究を行い、0.6-5THzと実に1桁の波長可変性を実現した。また、既にイメージング測定も行っており、二次元での分光イメージング、三次元でのCT測定なども、まだ改善の余地は残っているものの画像取得が出来、概ね順調に研究は進展していると考えている。昨年までにヘテロダインTHz-CT/分光システムで用いるテラヘルツ波光源の、光注入型テラヘルツ波パラメトリック発生器(is-TPG)の波長可変域の拡大を行い、実際にプラスチック製品の3D-CT画像や遮蔽物下の分光イメージングを実現した。しかし、それら測定には時間がかかるといった問題があった。これまで測定時間が長かった大きな要因として、is-TPGが波長可変光源ゆえに1パルスで1波長しか出力できず、分光する際に波長を掃引する必要があったことが挙げられる。今回そのis-TPGのテラヘルツ波発生方式を見直し、多波長同時出力を実現し、波長を変える必要をなくした。本方式により1パルスで即座に分光が終了し、リアルタイムでの測定が実現し、従来に比べて格段に測定時間が短縮される。is-TPGは励起光と注入光の2つのレーザーを結晶に入力して単一波長テラヘルツ波を発生する。その注入光を多波長化することによってテラヘルツ波の多波長化を行った。

今回用いた注入光は2台のECLDを半導体増幅器に入力し、その内部での4光波混合によって2波長以上の光を生成し、多波長テラヘルツ波発生を実現した。発生したテラヘルツ波は検出用のもう一つの結晶に励起光をとともに入力し、近赤外検出光を発生しビームプロファイラで検出した。この時、位相整合条件により波長毎に発生角が異なるので、多波長テラヘルツ波でも、各波長を分離して検出可能だ。4波長の同時発生及び検出を実現し、最大で6桁程度のダイナミックレンジが確認できた。次に本システムを用いて糖類の分光を行ったところ、各試薬を挿入すると同時に吸収スペクトルを観測出来、多波長テラヘルツ波により1パルスでの分光が実現した。本研究は現段階では34波長程度であるが、今後さらなる多波長化を行い、実用化を目指していく予定だ。昨年までに、光源の広帯域化を行い、実際にその光源を用いたヘテロダインTHz-CTや、分光イメージングのデモンストレーションを実現した。しかし、依然として問題が残っており、今年度はその問題点の一つである測定時間の改善を行った。従来では波長可変光源ゆえに測定の際に波長を変化させる必要があったが、多波長発生といった新たな方式を導入することにより、波長を変える必要がなくなり、測定時間の大幅な短縮可能性を示すことが出来た。試薬類も1パルスで分光が実現し、リアルタムで識別が出来ている。本研究の実現において、測定時間短縮は重要な課題であり、今年度はおおむね順調に研究は進展していると考えている。昨年までにヘテロダインTHz-CT/分光システムを開発し、実際にプラスチック製品の3D-CT画像や遮蔽物下の分光イメージングを実現したが、is-TPGが波長可変光源ゆえに1パルスで1波長しか出力できず、分光する際に波長を掃引するため、測定時間が長かった。そこで昨年度からis-TPGの多波長化を推し進めており、波長可変を無くすことで、高速測定を目指してきた。今年度は、実際に分光イメージングに導入すると共に、高安定化、極微弱光の検出を目指したテラヘルツ波の高利得増幅装置開発を行った。is-TPGは励起光と注入光をLiNbO3結晶に入射することでテラヘルツ波を発生する。本研究では、多波長注入光を用い、5波長テラヘルツ波の同時発生を行った。EMS(Express Mail Service)封筒に隠蔽された糖類の分光イメージングを行ったところ、測定時間が従来のis-TPGに比べて5分の1に短縮されたにも関わらず、各試薬の分布の画像化に成功し、大幅な高速化が実現した。次に、発生するテラヘルツ波をサンプル側とレファレンス側の2ビームに分割して、常時校正を取る方式を導入した。3波長発生時において安定性の向上を確認したところ、パルス間のゆらぎだけでなく、長期的な出力変動も無視することが可能となった。他方、吸収ロスの大きなサンプルを透過した極微弱テラヘルツ波を検出するために、高利得テラヘルツ波増幅器も開発した。従来のテラヘルツ波増幅器では、雑音成分がパラメトリック利得により増幅されて、極微弱なテラヘルツ波増幅を邪魔していた。それを今回、増幅用結晶を1個から2個に増やし、その間にアイリスを用いて雑音成分のみを空間的に除去することで、所望の成分のみ2個目の結晶で増幅可能となり、-100dB程度減衰した極微弱テラヘルツ波入力に対し、20億倍以上と極めて高い増幅度を得ることが出来た。今後は本システムのさらなる高性能化として測定時間の短縮を目指す。
生分解性マルチフィルムを用いた栽培体系における温室効果ガス排出とLCA評価

年度計画のとおり、1生分解性マルチの多様性と土壌特性を考慮した温室効果ガス発生とメカニズム解明(ライシメータ実験と室内培養実験)について、ライシメータ実験のガス観測は年度初めに終了し、生分解性マルチがすき込み後の作物(コマツナ)生育への影響調査を行った。室内培養実験は終了し、データ解析を進め、米国土壌科学学会2019年国際大会(2019年1月、アメリカ)にて一部の結果をポスター発表した。室内培養実験では生分解性マルチに伴うCO2排出から分解速度や分解率を評価できる一方、ライシメータ実験では、展張後生分解性マルチすき込み有無にかかわらずCO2排出量が有意な差がなかった。その理由はすき込み量が培養実験の1/600のため測定法の限界であると推察された。2LCA評価について、生分解性マルチの製造・施用・廃棄の過程において、既存ウェブツール(たとえば、農林水産分野のCO2「見える化」ポータブルサイトなど)や収集した既存文献からCO2排出原単位をまとめた。非生分解性マルチ(農業用ビニールマルチ)を対象技術として、製造・施用・廃棄の過程におけるCO2排出量を推定し、生産量または使用量に加えて全国評価を行った。3「最適管理指標」を推定するためのBPM指数(Best Management Practice Index)については、DNDCモデルを用いることにした。そのため、まずDNDCモデルの圃場レベルでの検証を行った上、後述の各栽培体系のBPM指数を推定した。また、「最適管理指標=BPM指数+LCA評価」を用いて、対照技術(a.慣行施肥・マルチ無し、b.慣行施肥・ビニールマルチ)に対して、生分解性マルチ(c.慣行施肥、d.減肥施肥)栽培体系における温室効果ガス排出の総合評価を行った。農業用ビニールマルチに対して、生分解性マルチを用いた栽培体系は、主に廃棄過程で異なることを明らかにした。年度計画の通り、【課題1】代表的な生分解性マルチ栽培体系における温室効果ガス発生の定量的評価(圃場実験)について、マルチ被覆条件下で自動開閉チャンバーによる観測できるための改良を加え、野外条件でのテストを行った。【課題2】生分解性マルチの多様性と土壌特性を考慮した温室効果ガス発生とメカニズム解明について:ライシメータ試験では、3種類の土壌タイプ(灰色低地土、褐色低地土、黒ボク土)のライシメータ(福島県農試)において、市販の生分解性マルチフィルムを2か月展張後、除去あるいは鋤き込んだ場合の温室効果ガス(CO2, N2O, CH4)発生量を調査した。その結果、土壌タイプによる温室効果ガス発生量の違いが認められたものの、マルチフィルムの鋤き込み由来の温室効果ガス発生量の違いが認められなかった。室内培養実験では、シャーレを用いた密閉チャンバー法(CC法)による土壌中での生プラマルチの生分解過程に伴う二酸化炭素(CO2)発生量を評価する測定手法を確立した。供試土壌として、先行研究で報告のあるPBSA生分解フィルムを早く分解する土壌(岡山土壌:沖積土)と極めて遅く分解する土壌(農環研土壌:黒ボク土)を用いて(乾土60g相当の土に1gPBSAを添加)、土壌による生分解の違いが検出できるのかを検討した。岡山土壌を用いた培養実験で、目視によりPBSAの分解を確認したところ、1週後には分解し始めており、その後分解は続いた。9週後にはほぼ回収することができなくなり、15週後には、完全に消失した。これに伴いCO2の発生速度の変化が見られた。CO2発生速度の経時変化から25週目でPBSAの理論分解率は88.8%と見積もられ、CO2評価法による完全生分解の確認ができた。また、生分解性フィルムを早く分解できる岡山土壌(沖積土)に対し、農環研土壌(黒ボク土)の場合CO2の発生速度は1/10程度であった。年度計画通り、課題1の自動開閉チャンバーの改良を行い、課題2のライシメータ試験と室内培養実験とも順調に進めている。特に課題2の室内培養実験は生分解性マルチの土壌中の生分解過程をCO2放出量から評価手法が確立され、それに伴うほかの温室効果ガス(N2OとCH4)に及ぼす影響の定量的な評価が可能となった。課題3についても、LCA評価のための作業時間やマルチの種類に対応するCO2原単位に関する論文収集とレビューも開始した。年度計画の通り、引き続き【課題1】代表的な生分解性マルチ栽培体系における温室効果ガス発生の定量的評価(圃場実験)、および【課題2】生分解性マルチの多様性と土壌特性を考慮した温室効果ガス発生とメカニズム解明(ライシメータ実験と室内培養実験)について、観測と実験を進め、データ解析を始めた。対照となるマルチ被覆していない圃場に対して、マルチ被覆した圃場では、大雨に伴う急激に増加するN2O排出が抑えられ、マルチ被覆によりN2O排出を低減することを明らかにした。3種類の土壌タイプ(灰色低地土、褐色低地土、黒ボク土)を持つライシメータにおいて、区を変えて昨年と同じ実験設計を行った結果、土壌タイプによる温室効果ガス発生量の違いが認められたものの、マルチフィルムの鋤き込み由来の温室効果ガス発生量の違いが認められないという結果を繰り返し確認できた。さらに生分解性マルチがすきこみ後、コマツナを播種し、生育への影響を調べた結果、マルチが完全分解されていないものの、生育および収量への影響が認められなかった。

培養実験では、市販の生分解性マルチを用いて、昨年確立した培養システムによる温室効果ガス排出量を評価した。その結果、分解の早いPBSA(昨年の実験)に対して、市販生分解性マルチの分解速度は1/3程度であった。また、土壌間の違いも認められた。そのため、生分解性ポリマーの分解速度は、ポリマーの構造および土壌中部生物の分解菌の活性および存在数により規定すると推測された。【課題3】について、LCA評価のための作業時間やマルチの種類に対応するCO2原単位のレビューおよび全国評価への活動量の収集を進めている。年度計画のとおり、順調に進めている。年度計画のとおり、1生分解性マルチの多様性と土壌特性を考慮した温室効果ガス発生とメカニズム解明(ライシメータ実験と室内培養実験)について、ライシメータ実験のガス観測は年度初めに終了し、生分解性マルチがすき込み後の作物(コマツナ)生育への影響調査を行った。室内培養実験は終了し、データ解析を進め、米国土壌科学学会2019年国際大会(2019年1月、アメリカ)にて一部の結果をポスター発表した。室内培養実験では生分解性マルチに伴うCO2排出から分解速度や分解率を評価できる一方、ライシメータ実験では、展張後生分解性マルチすき込み有無にかかわらずCO2排出量が有意な差がなかった。その理由はすき込み量が培養実験の1/600のため測定法の限界であると推察された。2LCA評価について、生分解性マルチの製造・施用・廃棄の過程において、既存ウェブツール(たとえば、農林水産分野のCO2「見える化」ポータブルサイトなど)や収集した既存文献からCO2排出原単位をまとめた。非生分解性マルチ(農業用ビニールマルチ)を対象技術として、製造・施用・廃棄の過程におけるCO2排出量を推定し、生産量または使用量に加えて全国評価を行った。3「最適管理指標」を推定するためのBPM指数(Best Management Practice Index)については、DNDCモデルを用いることにした。そのため、まずDNDCモデルの圃場レベルでの検証を行った上、後述の各栽培体系のBPM指数を推定した。また、「最適管理指標=BPM指数+LCA評価」を用いて、対照技術(a.慣行施肥・マルチ無し、b.慣行施肥・ビニールマルチ)に対して、生分解性マルチ(c.慣行施肥、d.減肥施肥)栽培体系における温室効果ガス排出の総合評価を行った。農業用ビニールマルチに対して、生分解性マルチを用いた栽培体系は、主に廃棄過程で異なることを明らかにした。当初の計画通り、課題1の圃場観測を9月より開始するとともに、課題2のライシメータ試験を進め、複数年のデータを取得するとともに、ポリマー組成が異なる生分解性マルチ(市販)を変えて試験を繰り返す。課題2の室内培養実験では、生分解性マルチの土壌中の生分解過程における温室効果ガスの変化を、異なる土・異なるポリマー組成の生分解性マルチを用いて実験を繰り返し行う。課題3のLCA評価も原単位の解析とともに、「最適管理指標」の試算のための情報を集約する。当初計画のとおり、引き続き圃場観測とともにデータ解析を進め、全国評価を行う。また、学会発表を行い、論文をまとめる。研究分担者は企画管理部へ異動した28年度は直接研究に携わる事が難しかった。そのため、当該者に係る消耗品費、学会発表や打ち合わせの旅費などの利用を次年度に繰り越した。消耗品等安価に購入できたため残額が発生した。
神経可塑性に関与するNOカスケード構成因子群の解析

我々は小脳の長期抑圧(long-term depression、LTD)を神経可塑性のモデルとして用い、その分子機構を解析した。多くの分子が小脳LTDの惹起に関与するが、この研究ではLTD惹起に必須の役割を果たすNO(一酸化窒素)に着目し、NOにより開始される情報伝達系の構成因子について詳細に解析した。NO-cGMP-PKG(cGMP-dependent protein kinase)の下流の因子として、プルキンエ細胞に特異的なPKG基質G-substrateの分子クローンニング及びその特徴付けを行った。ヒト、マウス、ラットのG-substrate cDNAを単離し、大量発現系を確立し、さらに抗体を作成した。また、マウスG-substrate遺伝子の構造を決定した。G-substrateのmRNA及びタンパク質は小脳プルキンエ細胞に特異的に発現し、G-substrateタンパク質はプルキンエ細胞体のみならず、樹上突起にも観察された。PKGによりリン酸化されたG-substrateはプロテインホスファターゼ-1および-2Aの強力かつ特異的な阻害剤であった。また、G-substrate遺伝子欠損マウスを作出し、基礎的解析を行った。遺伝子をホモに欠損したマウスの生殖機能、体重、体型など見かけ上は正常であった。しかし、小脳切片のLTDが観察されなかった。このことはプロテインホスファターゼ阻害剤として作用するG-substrateがLTD惹起に重要な役割りを果たすことを示唆している。今後、小脳依存性の学習、LTD依存性の学習におけるG-substrate遺伝子欠損の影響を解析することで、G-Substrateの神経可塑性、そして、記憶学習機構における生理的役割を明らかにすることができる。本研究では、神経可塑性に関与するNO(一酸化窒素)カスケードの下流因子であると考えられる小脳プルキンエ細胞に特異的なタンパク質、G-substrateの生理的役割りについて検討した。我々はヒトに加えマウス、ラットのG-substrate cDNAを単離同定し、G-substrateが種間で非常によく保存されたタンパク質であることを明らかにした。さらに、マウスのG-substrate遺伝子のエクソンーイントロン構造を決定し、現在、G-substrateのプロモーター領域の解析を行っている。G-substrateは小脳プルキンエ細胞に特異的に発現していることから、G-substrateのプロモーターは本細胞特異的に外来遺伝子等を発現させるために有効である。G-substrateのプロテインホスファターゼ阻害作用の生化学的特徴付けをおこなった。G-substrateのリン酸化部位に各種変異を導入したG-substrateを大腸菌で発現して用いた実験から、G-substrateのC-末端側にあるリン酸化部位がプロテインホスファターゼの阻害作用に重要な働きをしていることを明らかにした。さらに、G-substrateを"bait"として酵母2-ハイブリッドシステムによるスクリーニングを行い、G-sbstrateと相互作用するタンパク質として、細胞周期に関与するcdc37を単離した。さらに、我々はcdc37、cdk4がプルキンエ細胞に発現していることを組織化学的に明らかにした。増殖性を持たない神経細胞であるプルキンエ細胞にこれらのタンパク質が存在し、G-substrateと相互作用することは、細胞周期以外でもcdc37-cdk4-サイクリンDを介した転写制御が働いている可能性を示唆しており、G-substrateがその調節因子として神経可塑性に関与する可能性が考えられる。記憶学習機構の解明は現代の神経科学において基礎的ではあるが、最も魅力的な問題である。記憶が神経の柔軟性-神経可塑性-により形成されることは疑問の余地がなく、その機構を解明すべく様々な系を用いて神経可塑性に関する多くの研究が行われてきた。

数多くの分子が小脳LTDの惹起に関与するが、この研究では特にLTD惹起に必須の役割を果たすNO(一酸化窒素)に着目し、NOにより開始される情報伝達系の生理的役割について詳細に解析した。我々はすでにNO-cGMP-PKG(cGMP依存性プロテインキナーゼ)の下流因子として、プルキンエ細胞に特異的なPKG基質G-substrateに着目し、その分子クローニング及びその特徴付けを行い、リン酸化型G-substrateがプロテインホスファターゼ-1及び-2Aの強力な阻害剤として作用することを見い出した。さらに、G-substrate遺伝子の構造を決定し、その情報をもとに、今回、G-substrate遺伝子欠損マウスを作出し、その表現型の基礎的解析を行った。遺伝子をホモに欠損したマウスの生殖機能、体重、体型などは見かけ上正常であった。しかし、電気生理学的解析を行ったところ、G-substrate遺伝子をホモに欠損したマウスでは小脳切片のLTDが消失していることが観察された。これはNOの下流でPKGの基質となるG-substrateが、LTD惹起に重要な役割りを果たすことを示唆している。今後、G-substrate遺伝子欠損が小脳依存性の学習、LTD依存性の学習におよぼす影響を解析することで、G-substrateの神経可塑性、そして、記憶学習機構における生理的役割を明らかにすることができるであろう。
走査型電子顕微鏡の新しい手法によるゴルジ装置の立体微細構造機能解析

本研究では、光学顕微鏡的手技と走査電子顕微鏡観察法を効果的に組み合わせた、高分解能三次元形態観察法を新たに関発した。この手法は、下垂体前葉のような多数の細胞が混在する組織において特に有効であり、これまで困難であった「走査電顕による下垂体前葉細胞の同定」が可能となった。さらに、各下垂体前葉細胞のゴルジ装置の立体微細構造と機能の関係を超高分解能走査電顕により詳細に解析した。本年度の研究では、光学顕微鏡(光顕)免疫組織化学染色切片と走査型電子顕微鏡(走査電顕)標本を正確に対比する方法を開発した。具体的には、免疫組織化学染色した光顕像をもとに、隣接ブロックの対応部を走査電顕で観察し、染色された細胞と同一細胞の走査電顕観察を行うといった、今までにはない斬新な方法である。また、この手法は、下垂体前葉のような一つの組織中に多数の細胞が混在する複雑な組織において、特に有効であり、これまで困難であった「走査電顕による下垂体前葉細胞の同定」が可能となった。さらに、正確に同定した下垂体前葉細胞のゴルジ装置やミトコンドリア、粗面小胞体などの細胞小器官の立体微細構造の解析も行った。その結果、下垂体前葉細胞のなかで、性腺刺激ホルモン産生(GTH)細胞のゴルジ装置が、最も良く発達していることがわかり、その形状が球体であることも観察することができた。また、試料として下垂体を用いる利点としては、前葉細胞ごとに刺激と応答の因果関係が明瞭であり、特定の細胞の機能を亢進させることで、その変化を経時的に解析し、機能状態と細胞小器官との関係を、時間軸をいれた形で解析することができることである。例えば、最近は、去勢によって機能が亢進したGTH細胞の細胞小器官(ゴルジ装置など)の形態的変化を解析している。つまり、本研究では、これまでの光顕・透過電顕切片の平面的解析とは異なり、超高分解能走査電顕により、初めて下垂体前葉細胞の立体微細構造と機能の関係を解明することが可能となった。さらに、隣接切片を組織化学標識することで、走査電顕により個々の細胞を正確に同定できるようになったので、下垂体に限らず、複雑な組織中で目的の細胞の変化を解析するための他の研究に大いに貢献することが期待できる(例えば内分泌腺では、膵島や消化管の散在性内分泌細胞で起こる病態の解析など)。本研究は、Plyethylene Glycol(PEG)による包埋・脱包埋法による光学顕微鏡的手技と走査型電子顕微鏡(走査電顕)観察法を効果的に組み合わせた、高分解能三次元形態解析法を新たに開発し、下垂体前葉細胞の明確な同定と各前葉細胞の細胞小器官の立体微細構造と機能の関係を解析することを目的とした。本年度の研究実施計画として、はじめに、下垂体前葉細胞の細胞小器官の立体微細構造の解明を行った。21年度の研究により、分類可能となった下垂体前葉細胞の細胞小器官を超高分解能走査電顕により詳細に観察し、各前葉細胞のゴルジ装置、ミトコンドリア、粗面小胞体、分泌果粒の大きさなどを詳細に記録した。その結果、下垂体前葉細胞のなかで、性腺刺激ホルモン産生(GTH)細胞のゴルジ装置が最も良く発達していることがわかり、その形状が球状であることも観察することができた。さらに、下垂体前葉細胞のゴルジ装置における果粒形成機能序の解析をするため、ゴルジ装置のシスとトランスの正確な極性、層板構造、粗面小胞体との立体的な配置関係を明らかにした。また、去勢により機能を亢進させたGTH細胞のゴルジ装置の微細構造変化を経時的に観察し、その微細形態変化を時間軸を加えた形で解析した。その結果、去勢後早期には、正常時には球体であったゴルジ装置の断片化、特殊な形状の粗面小胞体の出現など、細胞生物学的に興味深い構造変化を確認することができた。本研究では、PEG法を用いることで、走査電顕により各前葉細胞の立体構造と機能の関係を解明することが可能となった。今後は下垂体に限らず、複雑な組織中での目的細胞の変化を解析するための他の研究に、大いに貢献することが期待できる(内分泌腺では、膵島や消化管の散在性の内分泌細胞の機能・病態解析など)。