hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
「温熱・放射線+免疫・化学療法」に対する口腔癌の同時感受性に関する研究

当科における口腔扁平上皮癌症例の部位別頻度は、舌、下顎歯肉、上顎歯肉、頬粘膜、口底の順であるが、これらの組織を広範切除した場合、たとえ原発巣の治癒が得られたとしても咀嚼、言語、嚥下に及ぼす機能障害、加えて顔貌変形による審美的、心理的障害は測り知れず、患者の著しいQ.O.L.の低下を招来している。当教室では京都大学医学研究科・放射線医学講座との共同研究により、口腔癌症例に対し1980年より温熱・放射線療法、1992年より温熱・放射線療法に加えて免疫・化学療法を施行し、患者におけるQ.O.L.の低下を最小限に止め、かつ生存率の向上(全症例で80%以上)に努めて来た。症例の中には後者の「温熱・放射線+免疫・化学」療法のみで治癒をみた進行癌、あるいは同療法と切除手術で手術不能症例が治癒するという例も少なからず経験している。従って課題は、口腔癌に対し「温熱・放射線+免疫・化学」療法を基盤とした、切除手術を完全に回避すべく保存的治療法、あるいは少なくとも、真のMinimum invasive surgeryの確立が要求されるべきものであろう。本研究の目的は、「温熱・放射線+免疫・化学」療法に対する口腔癌の同時感受性を基礎的、臨床的に検討し、相互治療法が最も有効的かつ相乗的に働く接点を求め、上記目的にかなった最至適治療様式を確立する点にある。温熱・放射線療法では、深部腫瘍に対する温熱療法の改良とともに限局領域への高線量放射線照射、超分割照射療法の普及がみられ、両者の組み合わせにより有効性を認めて以来、「温熱・放射線+免疫・化学」療法の臨床適用を施行して治療成績の改善を確認しており、公表した。しかし、本研究で従来の集学的治療に追加した温熱療法、免疫療法の臨床効果については現在未知の部分も多く、これらのさらなる解明と臨床適用は口腔癌症例の5年生存率、Q.O.L.に寄与するものと考える。口腔癌に対する集学的治療の成果を以下に述べる。1.舌扁平上皮癌70例(19901997),T1:20例,T2:33例,T3:6例,T4:10例,N(+)症例32例に対し,本研究の臨床モデルとなる治療体系のプロトコールに準じ根治治療を施行した。St1:93.3%,St2:86.9 %,St3:68.6%,St4:61.5%,全例で82.9%の5年累積生存率を示し、本治療体系の有用性を示した。(日本頭頸部腫瘍学会Vol.25,No2,P301)2.口腔扁平上皮癌178例(19901997),StI:30例,StII:54例,StIII:38例,StIV:56例に対し、上記1.と同様プロトコールの下で根治治療を施行。5年累積生存率はStI:93%,StII:86%,StIII:85%,StIV:70%であり,全症例で82%を示し,舌:83%,下顎歯肉:83%,頬粘膜:65%,上顎歯肉:89%,口底:84%であった。本研究を進めてゆく上で、期待できるデータである。(第18回日本口腔腫瘍学会,平成12年1月22日,23日)

当科における口腔扁平上皮癌症例の部位別頻度は、舌、下顎歯肉、上顎歯肉、頬粘膜、口底の順であるが、これらの組織を広範切除した場合、たとえ原発巣の治癒が得られたとしても咀嚼、言語、嚥下に及ぼす機能障害、加えて顔貌変形による審美的、心理的障害は測り知れず、患者の著しいQ.O.L.の低下を招来している。当教室では京都大学医学研究科・放射線医学講座との共同研究により、口腔癌症例に対し1980年より温熱・放射線療法、1992年より温熱・放射線療法に加えて免疫・化学療法を施行し、患者におけるQ.O.L.の低下を最小限に止め、かつ生存率の向上(全症例で80%以上)に努めて来た。症例の中には後者の「温熱・放射線+免疫・化学」療法のみで治癒をみた進行癌、あるいは同療法と切除手術で手術不能症例が治癒するという例も少なからず経験している。従って課題は、口腔癌に対し「温熱・放射線+免疫・化学」療法を基盤とした、切除手術を完全に回避すべく保存的治療法、あるいは少なくとも、真のMinimum invasive surgeryの確立が要求されるべきものであろう。本研究の目的は、「温熱・放射線+免疫・化学」療法に対する口腔癌の同時感受性を基礎的、臨床的に検討し、相互治療法が最も有効的かつ相乗的に働く接点を求め、上記目的にかなった最至適治療様式を確立する点にある。温熱・放射線療法では、深部腫瘍に対する温熱療法の改良とともに限局領域への高線量放射線照射、超分割照射療法の普及がみられ、両者の組み合わせにより有効性を認めて以来、「温熱・放射線+免疫・化学」療法の臨床適用を施行して治療成績の改善を確認しており、公表した。しかし、本研究で従来の集学的治療に追加した温熱療法、免疫療法の臨床効果については現在未知の部分も多く、これらのさらなる解明と臨床適用は口腔癌症例の5年生存率、Q.O.L.に寄与するものと考える。
磁化誘起第二高調波発生による金ナノ構造における界面磁性の解明とナノ材料への応用

銅フタロシアニン誘導体(CuPc)-金ナノロッド(AuNR)複合膜の光電流は参照系であるCuPc膜の場合より大きくなり、増強効果は近赤外領域まで波長の増加に伴って大きくなった。この増強効果はAuNRの長軸の局在表面プラズモン共鳴(LSPR)による増強効果が短軸のLSPRによる場合より大きいためと考えられる。色素-AuNR複合膜における第二高調波発生(SHG)を測定した。スチルバゾリウム誘導体(C18Stil)-AuNR複合膜ではSH光強度はC18Stil膜に比較して減少した。また、アゾベンゼン誘導体(C12Azo)-AuNR複合膜ではSH光強度はC12Azo膜に比較して少し増加した。金ナノロッド(AuNR)は棒状の金ナノ粒子で異方的形状に由来した二つの表面プラズモン(SP)吸収を持つ事が知られている。最近、我々は強磁場を用いた金ナノロッドの磁場配向を報告している。この磁場配向から、金ナノロッドが強磁性であり、磁性には界面磁性が関与していると推察している。本研究では磁化誘起第二高調波発生(MSHG)を用いて、金ナノロッド表面のスピンの存在を調べることを目的の一つとした。今年度はSHG活性分子であるスチルバゾール誘導体(C18Stil)のSH強度に及ぼすAuNRの影響について検討した。ガラス基板上に交互吸着法を用いて、アニオン性ポリマー(PSS)で表面修飾した(PSS -AuNR)とカチオン性ポリマー(PEI)を浸漬によってn回繰り返し行い、glass/(PEI/PSS-AuNR)nを得た。この基板にさらにPEI、PSSを浸漬によって固定した後に、Langmuir-Blodgett法によってC18Stilを一層固定してサンプル基板(glass/(PEI/PSS-AuNR)n/ PEI/PSS/C18Stil)を作製した。サンプル基板の消失、蛍光スペクトル及びSHGを行った。消失スペクトルにより、積層回数を増加するにつれてAuNRの2つのSP吸収は大きくなった。次に、蛍光スペクトルにより、C18Stil蛍光強度はAuNRの積層回数が多いほど強くなった。この結果より、AuNRの短軸のSPによる増強電場によってC18Stilの蛍光が増強したと考えられる。次に、SHG測定を行うと、C18StilによるSHGフリンジパターンが観測できた。しかしながら、AuNRの積層回数が増加するにつれて、C18StilのSH強度は減少した。AuNRによる増強電場の強い位置にC18Stilが適切に配置できなかったためと考えられる。本研究では磁化誘起第二高調波発生(MSHG)を用いて、AuNR表面のスピンの存在を調べることを目的の一つとした。最終度は初年度で行ったSHG活性分子であるスチルバゾール誘導体(C18Stil)のSH強度に及ぼすAuNRの影響について検討すると共に、SHG活性分子としてアゾベンゼン誘導体(C12Azo)についても検討を行った。ガラス基板上に交互吸着法を用いてアニオン性ポリマー(PSS)で表面修飾した(PSS -AuNR)とカチオン性ポリマー(PEI)を浸漬によってn回繰り返し行いglass/(PEI/PSS-AuNR)nを得た。この基板にさらにPEI、PSSを浸漬によって固定した後に、Langmuir-Blodgett法によって、C18StilまたはC12Azoを一層固定してサンプル基板(glass/(PEI/PSS-AuNR)n/ PEI/PSS/C18Stil)を作製した。消失スペクトルにより積層回数を増加するにつれてAuNRの2つのSP吸収は大きくなった。AuNR層とC18Stil層の間の(PEI/PSS)n中間層の層数(n)を多くすると、C18StilのSH強度が増加した。しかしながら、AuNRによる大幅なSH強度の増加は観測できなかった。そこで、C12Azoについて同様のSHG測定を行った。AuNR有りの基板で、AuNR無しの基板よりも約1.3倍のSHG強度を観測した。これはAuNRによる消光効果のためや増強電場の強い位置にC18StilおよびC12Azoを適切に配置できなかったためと考えられる。ナノ化学、磁気科学AuNRの表面

プラズモンによる増強電場が関与するSHG活性分子のSH強度の大幅な増強が期待されたが、この増強効果を観測できなかった。SHG活性分子の変更やSHG活性分子の固定化方法の改善により、AuNRによるSH強度の増強を目指す。AuNRによるSH強度の増強の観測後に、磁化誘起第二高調波発生による金ナノロッド表面のスピンの存在と機構解明を進めてゆく計画である。
甲殻類の生殖および脱皮調節機構の生理学的解析

1.熱帯産のオニテナガエビを12L12D、15L9Dの異なる光周期と24、28、32°Cの異なる水温を組合せた6実験区で飼育し、成熟・産卵に適した環境条件を求めた。その結果、高温になるほど生殖脱皮の頻度が上昇し、脱皮間隔も短くなることが判明した。本種は温帯産のテナガエビに見られるような明瞭な光周性を示さなかった。生殖脱皮および普通脱皮の各脱皮ステ-ジにおける血リンパ中のエクダイソン濃度を測定したところ、いずれの脱皮においても、エクダイソン濃度はD1期から上昇し、D3期にピ-クに達することが判った。脱皮はこの直後に起こり、生殖脱皮の場合はそのご雌は雄と交尾し、産卵した。血中ビテロジェニン濃度を同様な個体から採血し測定した。その結果、生殖脱皮過程においてビテロジェニン濃度はC期から上昇を始め、D2期にピ-クに達した後、減少することが、また普通脱皮過程においては、ビテロジェニンの産生は起こらないことが明らかになった。2.オニテナガエビの最終卵成熟は成熟脱皮直前のエクダイソン濃度のピ-ク時にほぼ同期して起こることから、エクジソンあるいはその代謝産物が卵成熟誘起物質である可能性が示唆された。3.クルマエビの最終卵成熟過程における血リンパの採集を行った。4.オニテナガエビの成熟中の卵巣および卵発生中の卵からエクジステロイドを抽出し定量したところ、卵黄蓄積に同期して卵巣中にエクジステロイドが蓄積され、これが受精後10日目まで徐々に消費されること、しかし、その後生合成が開始されて急増し、18日目に孵化することが判明した。5.キチナ-ゼのラジオイムノアッセイ系を作製し、脱皮周期とキチナ-ゼ活性との関連性を調べた。1.テナガエビを15時間明期-水温28°C下で飼育し、繰り返し産卵を確認した後、各脱皮周期において卵巣および血液を採取し、血中ビテロジェンニン量を酵素免疫測定法で、エクジステロイド量をラジオイムノアッセイで測定した。生殖腺体重比(GSI)はC1期より増加し始めD3期に10%とピ-クを示した。雌エビはまもなく産卵脱皮をし、交尾したのち産卵した。血中ビデロジェニン量はB期より増加を始めD0からD1期にかけてピ-クを示したのちやや減少したが、産卵直前まで高値を維持し、産卵脱皮後急減した。血中エクジステロイド量はD1期より増加し始めD3期にピ-クを示したが脱皮後急減した。産卵後A1期に小ピ-クを示したがB1期には減少しD0期まで低値が維持された。2.テナガエビを12時間明期-水温28°C下で飼育し、産卵せず普通脱皮を繰り返すことを確認したのち、各脱皮周期において卵巣および血液を採取した。血中ビデロジェニン量を酵素免疫測定法で、エクジステロイド量をラジオイムノアッセイで測定した。GSIは常に1%以下であり血中ビデロジェニン量も測定限界以下であったが、エクジステロイド量は産卵脱皮の場合と同様の変化を示すことが判明した。3.産卵脱皮および普通脱皮の各周期において肝膵臓、サイナス腺等を免疫組織学的に調べたところ、ビテロジェニンの産生場所が肝膵臓であることが判明した。4.脱皮抑制ホルモンの精製のためY器官の組織培養系の検討を行った。5.クルマエビにおけるビテロジェニンの酵素免疫測定系を作製するためクルマエビの卵巣からビテリンの精製を各種のクロマトグラフィ-により行い部分精製の段階に至っている。
トリプトファンメタボローム分析による悪性リンパ腫の病態解析および免疫機構の解明

「研究目的」必須アミノ酸であるトリプトファンは、その律速酵素であるインドールアミン酸素添加酵素(IDO)の酵素誘導によりキヌレニン経路に代謝され、種々の代謝産物による免疫制御機構が注目されている。本研究において、悪性リンパ腫細胞におけるIDOの発現および標準的治療法(R-CHOP療法)を施行した場合の治療効果の判定と免疫機構の解明に、トリプトファン代謝が有用な指標と成り得るかを解析した。「研究方法と成果」悪性リンパ腫患者(DLBCL)113例より得られたリンパ節組織で抗IDO抗体および抗CD20抗体を用いて蛍光二重染色を行った結果、38症例のリンパ腫細胞においてIDOの発現が観察された。さらに、IDO-negative群およびIDO-positive群に分類し、治療効果の判定として完全寛解率および生存率を解析した結果、IDO-negative群はIDO-positive群と比較して有意に完全寛解率の増加および生存率の延長が認められた。トリプトファンメタボローム解析として血清中トリプトファン代謝産物を測定したところ、kynurenine、3-hydroxykynurenine、QUINが健常人と比較し有意に増加していた。現在の臨床検査において、悪性リンパ腫の予後指標あるいは治療効果判定の指標は未だ少なく、新たなバイオマーカーの発見および免疫制御機構解明による新規治療戦略が望まれる。本研究により、リンパ腫細胞がIDOを発現・活性化した結果として、種々のトリプトファン代謝産物を生成し、周囲免疫機構を制御していることが予想された。今後の課題として、マウスリンパ腫モデルによるIDO阻害実験および遺伝子欠損マウスを使用することで新規治療薬の開発とトリプトファン代謝による免疫制御機構の解明が必要と考えられる。
新しい鉄強化食品開発のための鉄供給源となる食品素材としての鉄含有乳酸菌の有効性

【目的】副作用を抑えた鉄供給源となりうる新たな食品素材として、昨年度の検討で鉄欠乏ラットにおいて高い生物利用能を示した鉄含有パン酵母(以下、パン酵母鉄)(鉄含有5%、Grow Company, Inc.製)の人への経口負荷による影響を検討することを目的とした。【方法】健常な成人女性24名を対象に、プラセボ群ならびにパン酵母鉄群に無作為に分け、プラセボあるいはパン酵母鉄(鉄含量4mg)のカプセルを1錠1日、4週間にわたり毎日継続摂取することを依頼した。なお、本研究は、公立大学法人首都大学東京の研究安全倫理委員会の審査を受け、倫理的な配慮のもとに実施した。【評価項目と結果】1.給与期間中にプラセボ群とパン酵母鉄群ともに服用を離脱するものが現れなかったことより、コンプライアンスが得られたことが認められた。2.給与前後ならびに期間中毎週1回実施したGSRS質問調査の結果、両群ともGSRSスコアには変化がなく、パン酵母鉄服用による消化器症状の副作用は出現しなかったことが確認された。3.給与前後で評価した血液性状(ヘモグロビン、ヘマトクリット、総鉄結合能、鉄、フェリチン)は両群とも変化はみられず、また、毎週1回実施した末梢血管モニタリング装置によるヘモグロビンの経過観察においても、変動は認められなかった。健常成人においては、4週間のパン酵母鉄摂取による血液性状への影響は認められなかった。本研究によって、パン酵母鉄は、コンプライアンスが高く、消化器症状の副作用の少ない鉄補給素材として有用である可能性が示唆された。今後は、ヒトを対象とした鉄欠乏状態の改善効果など、臨床上あるいは公衆栄養上の検証が必要であると考える。【目的】鉄欠乏性貧血は発展途上国のみならず先進国においても重要な栄養課題である。鉄の強化では、形態により異なる利用効率や過剰摂取による便秘や胃腸症状などの副作用、酸化ストレス亢進の問題などを十分考慮した鉄素材を検討する必要がある。本研究ではラットを対象に、鉄塩としてクエン酸第二鉄、エチレンジアミン四酢酸鉄ナトリウム(III)(EDTA鉄)、食品として認可されているものの十分検討されていない鉄含有パン酵母および鉄含有乳酸菌を用い、鉄欠乏改善効果を検討した。【方法】4週齢のWistar系雄ラットを鉄欠乏飼料にて3週間飼育し貧血状態を作成した後、35ppmに相当するクエン酸第二鉄(クエン酸鉄)、EDTA鉄、鉄含有パン酵母(酵母鉄)、鉄含有乳酸菌(乳酸菌鉄)を添加した4種類の飼料にて1週間飼育した。飼育開始3週間後(貧血状態の確認)と飼育終了後に解剖・採血を行い全血中のHb、Ht、血清の鉄濃度およびUIBC、SH基、GOT、GPTを測定した。データはStudentの独立したt-検定、一元配置分散分析および最小有意差法にて検定した。【結果】血液性状からは、酵母鉄群とEDTA鉄群、次いでクエン酸鉄群において鉄欠乏改善効果が認められた。しかし、乳酸菌鉄群では改善効果が確認できなかった。EDTA鉄群は、酸化ストレスの指標である血清SH基量が対照群に比べ有意に低値を示した。鉄欠乏状態からの鉄負荷による肝機能への影響は認められなかった。本研究では乳酸菌鉄の効果を確認することはできなかったが、酵母鉄は利用効率が高い鉄強化剤として有用である可能性が示唆された。鉄含有パン酵母は食品として認可されているものの、鉄強化食品などへの応用展開は十分なされていない。今後、主に鉄含有パン酵母に焦点をあて検討することを予定している。
ヒト胃粘膜腸上皮化生細胞における細胞分化異常と遺伝子不安定性に関する研究

昨年度の実績に基づき,本年度は以下の成果を得た.1)胃型(化生なし),胃腸混合型,腸型のタイプ別に分別収集し保存された胃粘膜非腫瘍部幽門腺腺管約50例を対象に,1腺管からのDNA採取と複数のマイクロサテライトマーカーを用いたrepilication error (RER)の解析を試みた.PCRの至適条件の検討を重ねたが,1腺管からのDNAを用いた解析は困難であった.その最大の理由として,粘膜採取腺管分離染色の過程で60分以上有しており,DNAの劣化により解析に耐えうるだけの良質かつ豊富なDNAの収集が困難であったためと考えられた.2)進行胃癌症例70例のホルマリン固定パラフィン切片を対象に,細胞分化に基づく分類とhMLH1遺伝子の発現につき免疫組織化学的に検討した.hMLH1遺伝子の発現は17例で明らかに低下を認めた.17例は,胃型4例,胃腸混合型2例,腸型6例,分類不能型5例であり,腫瘍の細胞分化と遺伝子不安定性との間には有意な関連性は見られなかった.3)上記70例の癌周囲粘膜に見られる腸上皮化生と正常粘膜についても,hMLH1遺伝子の発現を免疫組織化学的に検討した.化生粘膜では,症例により胃腸混合型化生の一部に発現低下を認めたものの,概ね発現は保たれていた.正常粘膜では発現低下は全く認めなかった.4)3)の結果を得たことより,マイクロダイセクション法を用いての癌周辺部化生粘膜,ならびに正常粘膜におけるRER解析はあまり意味がないのではないかと考え,施行しなかった.5)進行胃癌約20例の癌部についてのRER解析では,すでに報告したとおり,形質発現とMSI,hMLH1遺伝子の発現との間には明らかな関連性は見出されなかった.6)以上の結果より,今回検索した限りでは,遺伝子不安定性と腸上皮化生腺管における細胞分化異常との間,あるいは胃癌の細胞分化との間には有意な関連性を証明することはできなかった.今後はより良好なDNAを得るために,化生の有無と程度を迅速かつ確実に分類できる方法の確立が必要と思われる.その結果腺管単位で,細胞分化の状態と密接にリンクした遺伝子不安定性の解析が可能になると考えられる.昨年度の実績に基づき,本年度は以下の成果を得た.1)胃型(化生なし),胃腸混合型,腸型のタイプ別に分別収集し保存された胃粘膜非腫瘍部幽門腺腺管約50例を対象に,1腺管からのDNA採取と複数のマイクロサテライトマーカーを用いたrepilication error (RER)の解析を試みた.PCRの至適条件の検討を重ねたが,1腺管からのDNAを用いた解析は困難であった.その最大の理由として,粘膜採取腺管分離染色の過程で60分以上有しており,DNAの劣化により解析に耐えうるだけの良質かつ豊富なDNAの収集が困難であったためと考えられた.2)進行胃癌症例70例のホルマリン固定パラフィン切片を対象に,細胞分化に基づく分類とhMLH1遺伝子の発現につき免疫組織化学的に検討した.hMLH1遺伝子の発現は17例で明らかに低下を認めた.17例は,胃型4例,胃腸混合型2例,腸型6例,分類不能型5例であり,腫瘍の細胞分化と遺伝子不安定性との間には有意な関連性は見られなかった.3)上記70例の癌周囲粘膜に見られる腸上皮化生と正常粘膜についても,hMLH1遺伝子の発現を免疫組織化学的に検討した.化生粘膜では,症例により胃腸混合型化生の一部に発現低下を認めたものの,概ね発現は保たれていた.正常粘膜では発現低下は全く認めなかった.4)3)の結果を得たことより,マイクロダイセクション法を用いての癌周辺部化生粘膜,ならびに正常粘膜におけるRER解析はあまり意味がないのではないかと考え,施行しなかった.5)進行胃癌約20例の癌部についてのRER解析では,すでに報告したとおり,形質発現とMSI,hMLH1遺伝子の発現との間には明らかな関連性は見出されなかった.6)以上の結果より,今回検索した限りでは,遺伝子不安定性と腸上皮化生腺管における細胞分化異常との間,あるいは胃癌の細胞分化との間には有意な関連性を証明することはできなかった.今後はより良好なDNAを得るために,化生の有無と程度を迅速かつ確実に分類できる方法の確立が必要と思われる.その結果腺管単位で,細胞分化の状態と密接にリンクした遺伝子不安定性の解析が可能になると考えられる.本年度は以下の成果を得た.1.サンプルの採取と化生の分類:胃癌により外科的切除された70例の新鮮胃非腫瘍部幽門部粘膜より,腺管分離法を用いて幽門部腺管を単離後,化生(-),胃腸混合型化生,腸単独型化生に選別した.各タイプにつき約20症例ごとに-20°Cでストックした.同時に隣接部胃粘膜の組織切片を作製し,化生の有無とタイプのチェックを行った.2.分離腺管からのDNA採取とマイクロサテライトマーカーを用いたreplication error (RER)解析:分離した新鮮な胃粘膜腺管は少量であるため,抽出されるDNAもごく少量であり,複数のマイクロサテライトマーカーを対象とするPCRが手技的に困難な場合がしばしばあった.現在もサンプルの採取と化生のタイプによる選別を継続している.

3.腫瘍組織からのDNA採取とマイクロサテライトマーカーを用いたRER解析:進行癌20症例では腫瘍組織の採取を同時に行い,病理組織切片を作成後,胃型,腸型の細胞分化マーカーを用いた染色により腫瘍の形質発現(胃型,胃腸混合型,腸型)を検討するとともに,免疫組織化学的にミスマッチ修復遺伝子hMLH1の発現を検討した.同時に新鮮腫瘍組織からDNAを抽出,RER解析を施行しmicrosatellite instability (MSI)と腫瘍の細胞分化との関係を調べた.4.胃癌の形質発現とMSI, hMLH1発現との関係:MSIを検索した20例中MSI-high症例は5例であり,すべてhMLH1発現が陰性,形質発現では胃型2例,胃腸混合型0例,腸型2例,分類不能型1例であった.今回検索した20例においては,明らかな関連性は見出されなかった.5.来年度は,新たに分離した化生腺管を用いて化生のタイプとMSIとの関連性を検討する.さらに隣接部分の組織切片中の化生腺管を対象に,マイクロダイセクション法を施行し同様の検索を進める.昨年度の実績に基づき,本年度は以下の成果を得た.1)胃型(化生なし),胃腸混合型,腸型のタイプ別に分別収集し保存された胃粘膜非腫瘍部幽門腺腺管約50例を対象に,1腺管からのDNA採取と複数のマイクロサテライトマーカーを用いたrepilication error(RER)の解析を試みた.PCRの至適条件の検討を重ねたが,1腺管からのDNAを用いた解析は困難であった.その最大の理由として,粘膜採取腺管分離染色の過程で60分以上有しており,DNAの劣化により解析に耐えうるだけの良質かつ豊富なDNAの収集が困難であったためと考えられた.2)進行胃癌症例70例のホルマリン固定パラフィン切片を対象に,細胞分化に基づく分類とhMLH1遺伝子の発現につき免疫組織化学的に検討した.hMLH1遺伝子の発現は17例で明らかに低下を認めた.17例は,胃型4例,胃腸混合型2例,腸型6例,分類不能型5例であり,腫瘍の細胞分化と遺伝子不安定性との間には有意な関連性は見られなかった.3)上記70例の癌周囲粘膜に見られる腸上皮化生と正常粘膜についても,hMLH1遺伝子の発現を免疫組織化学的に検討した.化生粘膜では,症例により胃腸混合型化生の一部に発現低下を認めたものの,概ね発現は保たれていた.正常粘膜では発現低下は全く認めなかった.4)3)の結果を得たことより,マイクロダイセクション法を用いての癌周辺部化生粘膜,ならびに正常粘膜におけるRER解析はあまり意味がないのではないかと考え,施行しなかった.5)進行胃癌約20例の癌部についてのRER解析では,すでに報告したとおり,形質発現とMSI,hMLH1遺伝子の発現との間には明らかな関連性は見出されなかった.6)以上の結果より,今回検索した限りでは,遺伝子不安定性と腸上皮化生腺管における細胞分化異常との間,あるいは胃癌の細胞分化との間には有意な関連性を証明することはできなかった.今後はより良好なDNAを得るために,化生の有無と程度を迅速かつ確実に分類できる方法の確立が必要と思われる.その結果腺管単位で,細胞分化の状態と密接にリンクした遺伝子不安定性の解析が可能になると考えられる.
なぜ風評被害はやまないのか？: 進化社会心理学的観点からの検討

福島第一原子力発電所の事故から数年たったが、消費者は福島の食品の安全性に懸念をもっていると言われている。行動免疫システム理論によれば、罹患の懸念が高まると、リスク回避的な認知・行動が促進される。本研究はこの理論にもとづき、消費者の罹患に対する懸念が福島の食品の回避を促進する可能性を検討した。加えて、消費者の懸念を払拭するために現在実施されている情報提供が必ずしも有効ではない可能性を検討した。実験の結果、これらの仮説は支持された。昨年度は進化心理学的観点から,まず病気回避目標が福島第一原発近郊の土壌汚染範囲の推定に及ぼす影響を2つの実験を通じて検討した。実験の結果,病気回避目標が活性化した場合には活性化していない場合に比べて土壌汚染範囲を広く推定していた。またこの結果は,実験状況に多くの他者が存在するなど,罹患確率が高いと判断される場合に顕著になっていた。これらの結果は,病気に対する懸念を下げることが福島県近郊の食品の風評被害を収束する上で重要であることを示すとともに,実験的には放射性物質とは無関連な病気によって病気回避目標を活性化させているため,福島県近郊の食品の安全性を周知するだけでは風評被害が収まらない「可能性」も示唆している。なおこれらの研究は下田俊介(東洋大学)の協力を得て実施された。この結果をもとに,病気に対する懸念を払拭するために現在行われている取り組み,その中でも官公庁が作成しているリーフレットが実際に病気に対する懸念を払拭しているかどうかを検討した。実験の際,参加者が意識できない指標(潜在指標)を用いたところ,官公庁が現在作成しているリーフレットでは病気に対する懸念が高まる可能性が示唆された。なお,この結果は埴田健司(東京未来大学)の協力を得て実施された。昨年度は病気回避目標と風評被害の関連について検討する予定であったが,実験が順調に実施されたこともあり,今年度実施予定であった次の研究に着手することができている。平成28年度は、まず現行の風評被害対策の一つである、一般市民への情報提供の有効性について検討した。具体的には、現在利用されているリーフレット(あるいは、それとは無関連なリーフレット)を実験参加者に提示し、リーフレットを読んだ後に罹患に対する懸念が低下するかどうかを検討した。その結果、風評被害対策として利用されているリーフレットを読んだ場合、それとは無関連なリーフレットを読んだ場合に比べて、罹患懸念が高まることが示唆された。すなわち、現在利用されているリーフレットは罹患懸念を下げるという意味で必ずしも有効ではない可能性が示された(この成果については、日本社会心理学会で口頭発表を行い、また心理学研究という学術誌に投稿した)。そこで、現行のリーフレットを読む際(すなわち、情報を受け取る際)に、罹患の懸念を高めない方法について検討を行った。具体的には、他者に対する援助動機が高まることで、罹患に対する懸念を抑えつつ、情報を受け取ることができるかどうかを検討した。実験では(原発事故や風評被害と無関連な)援助に関するパンフレット(あるいは、援助とは無関連なパンフレット)を読んだ後、上記で用いたリーフレットを提示し、最後に罹患懸念を測定した。その結果、援助に関するパンフレットを読んだ場合に、そうではない場合と比べて、むしろ罹患懸念は高まっていた。この結果は、仮説を支持するものではなかったが、パンフレットや測定上の問題により生じていた可能性が考えられた。平成28年度は予定していた実験を実施することができ、また予定どおりに成果発表も行うことができたため。本年は、まず樋口・埴田(2017)の概念的追試を行なった。樋口・埴田(2017)の結果は、福島第一原発事故に伴う食品の風評被害対策としてとられている現在の情報提供が必ずしも有効ではなく、現在使われている情報を読んだ後では、かえって罹患の懸念が高まる可能性を示唆するものであった。本年は、この実験の概念的追試を行い、独立変数の操作は変更せず、従属変数を非意識的測定(IAT)から意識的測定(感情温度計)に変更した実験を行なった。結果は、樋口・埴田(2017)の結果と同様のパターンを示しており、現在の情報提供が必ずしも有効ではないことが示唆された。続けて、こうした情報提供を有効にするための方法について心理学的観点から検討を行なった。具体的には、Sacco et al. (2014)の研究から、現在提供されている情報が罹患回避目標を高めるならば、情報を読む前に別の目標を高めることで、罹患回避目標を高めないようにすることが考えられた。そこで、情報を読む前に内集団協力目標を高める条件と高めない条件を設け、その後に情報を読んでもらい、他の目標の活性化が罹患回避目標を低減させるかどうかを2つの実験を通じて検討した。その結果、いずれの実験においてもこの仮説は支持されなかった。そのため、情報提供のあり方については、今後さらに検討することとなった。加えて本年は、これまで得られた研究結果について、日本社会心理学会にて学会発表を行い、また心理学研究などの学会誌や紀要、報告書に論文としてまとめ、成果報告を行った(e.g.,樋口・埴田, 2018;樋口・下田, 2017;埴田・樋口, 2017;田戸岡・樋口・唐沢, 2018)。

行動免疫システム理論によれば、罹患の懸念が高まると、リスク回避的な認知・行動が促進される。本研究はこの理論にもとづき、消費者の罹患に対する懸念が福島の食品の回避を促進する可能性を検討した。加えて、消費者の懸念を払拭するために現在実施されている情報提供が必ずしも有効ではない可能性を検討した。実験の結果、これらの仮説は支持された。上記の結果にもとづき,今年度は現在使われているリーフレットが有効に活用されるための方略について検討する。さらに進化心理学的な究極要因の観点からだけではなく,至近要因から福島県の風評被害の生起因についても検討したいと考えている。平成28年度の研究成果から、風評被害対策として行われている情報提供の有効性について疑問が生じた。今後はまず、慎重を期す上でも、知見の再現可能性や外的妥当性を検討してみたい。加えて、情報提供自体は重要な事柄であるため、どのような態度で情報提供を受ければ、罹患の懸念が高まらないのか、その方法について検討したい。社会心理学研究成果について国際学会での発表を予定していたが,学務などの事情により発表できなかったことが原因である。平成28年末に所属の異動が決定し、引き継ぎ等の想定外の用務が増加したことと、異動に伴い前所属校での実験が難しくなったことによる。今年度は国際学会にも参加し,また当初予定していなかった一般市民を対象とした調査を行いたいと考えている。平成28年に実施できなかった実験・調査の費用としてあてる予定である。
ニワトリBリンパ細胞株での、RAD遺伝子群の、DNA組換えと、修復機能の解析

ゲノムDNA上に2本鎖切断が起こり、それが修復されないと真核細胞は死亡する。真細胞は、組み換え修復(相同組み換え)とend joiningという2種類のDNA2本鎖切断修復経路を持つ。これらの生化学反応に関わるタンパク群は、その1次構造が酵母からヒトに至るまで非常によく保存されている。組み換え修復に関わる遺伝子群をRAD52エピスタシスグループと呼び、10種類以上の遺伝子が酵母とヒトでそれぞれ知られている。RAD51は、このエピスタシスグループの一員であり、酵母のRad51欠損株は、増殖可能であるが、ゲノム上に2本鎖切断を誘導する電離放射線照射に対して著しく感受性がある我々は、高等真核細胞(ニワトリBリンパ細胞株、DT40)からRad51コンデイショナルミュータント細胞を世界で初めて作成した(Sonoda et al,EMBO J.,Vol.17;598-608,1998)。このミユ-タントのRad51の発源を停止させると、少数のランダムな染色体断裂がM期で観察され、ほとんどの細胞は分裂後、死亡する。この結果は、高等真核細胞では増殖中に染色体断裂が起き、Rad51はその断裂を修復するのに必須の働きをしていることを示唆する。
DRIL1の機能解析と口腔発癌における関与

本共同研究では、DRIL1がp53と協調的に働く転写因子としてp53標的遺伝子とp53蛋白質の両方に結合し、p53の翻訳後修飾を仲介する重要な因子であることを明らかにするとともに、DRIL1遺伝子の異常が口腔癌におけるp53耐性機序の獲得に関与している可能性を検討することを目的としている。(1)p53による転写制御におけるDRIL1の役割既に癌抑制遺伝子p53の制御に重要なPMLタンパク質が核マトリクス結合因子DRIL1と直接結合することを明らかにしている。本年度はDNA障害で誘導された内在性p53が内在性DRIL1と結合することを見出した。さらにp53とDRIL1がin vitroで直接結合する知見を得た。(2)p53タンパク質の翻訳後修飾におけるDRIL1の役割siRNAを用いたDRIL1ノックダウン実験の結果、p53の機能が著しく抑制されることを見出している。さらに詳細に解析するため、導入効率の高いアデノウイルスを用いてshRNA発現ベクターを用いて実験をおこなったが、十分なノックダウン効果が得られなかった。現在、使用するベクターをより長期間の発現に優れたレンチウイルスベクターに変更して解析をおこなっている。(3)口腔癌細胞株癌におけるDRIL1の制御異常口腔癌細胞株癌におけるp53の制御異常について、セリン46のリン酸化障害がp53のアポトーシス誘導に対する口腔癌細胞株の抵抗性獲得に重要であることを既に報告している。本年度、DRIL1とp53を同時にp53抵抗性細胞株に導入するとアポトーシスが誘導されることを見出した。さらにp53のリン酸化非依存性にp53を直接活性化する化学物質ニュートリン3を用いてさらに解析し、ニュートリン3存在下でもp53によるアポトーシス誘導にはセリン46のリン酸化が必要であることを見出した。癌抑制遺伝子p53は、DNA傷害によって誘導され、細胞増殖停止やアポトーシスに関与する遺伝子(p53標的遺伝子)の発現を誘導する転写因子として機能する。p53の機能発現には、p53蛋白質の翻訳後修飾(リン酸化、アセチル化など)が重要であることが報告されている。しかしながら、翻訳後修飾の分子機構、およびヒト癌細胞における異常についてはよくわかっていない。そこで本年度は、DRIL1がp53と協調的に働く転写因子として重要であり、p53の翻訳後修飾に関与していることを明らかにすることを目的として研究をおこなった。p53の転写制御におけるDRIL1の役割DRIL1がアポトーシスに関与するp53標的遺伝子の活性化に関与する可能性をレポーターアッセイおよびクロマチン沈降法等により調べ、その結果、アポトーシス関連p53標的遺伝子のプロモーター領域にDRIL1が直接結合し、転写活性化に関与していることを明らかにした。さらにDRIL1を特異的にノックダウンするshRNA発現アデノウイルスベクターを作成した。現在、作成したベクターを用いてDRIL1をノックダウンし、p53標的遺伝子の転写制御およびp53の機能におけるDRIL1の役割を解析している。p53タンパーク質の翻訳後修飾におけるDRIL1の役割p53の翻訳後修飾には、タンパク質に富む核内構造(PML核ボディ)との相互作用が関与している。しかしながら、PML核ボディにおけるDRIL1の機能についてはよくわかっていない。申請者らは、既にDRIL1がPML核ボディにおけるp53の修飾に関与していることを強く示唆する結果を得ている。そこで、DRIL1タンパク質とPML核ボディの核内局在を免疫組織学的に検討した。さらに、免疫沈降法等を用いて、DRIL1およびPMLタンパク質それぞれの欠失変異体タンパク質を作成し、タンパク質相互作用を解析した。その結果、DRIL1がPMLと直接結合することを明らかにし、タンパク質相互作用に必要なそれぞれのタンパク質ドメインをほぼ同定した。

さらにp53のリン酸化非依存性にp53を直接活性化する化学物質ニュートリン3を用いてさらに解析し、ニュートリン3存在下でもp53によるアポトーシス誘導にはセリン46のリン酸化が必要であることを見出した。
牧草の再生時におけるフルクタン分解酵素遺伝子の発現誘導機構の解明

刈取り後のチモシーの基部(球茎など)における、再生のためのエネルギー源供給に、フルクタン分解酵素遺伝子であるPp6-FEH1が関与することが示唆された。またその遺伝子発現誘導には単少糖含量が関与にした。さらにPp6-FEH1は低温によっても発現誘導されることから、フルクタン分解による凍結保護物質の生成に関与する可能性が示唆された。その発現誘導に関わるプロモータ領域が明らかになった。1.RACE法により3種類のフルクタン分解酵素遺伝子Pp6-FEH1のホモログを単離した。これらはいずれもアミノ酸レベルでPp6-FEH1と92%の相同性を示した。3つのβ-フルクトシルトランスフェラーゼ保存モチーフを有し、またインベルターゼ活性と関連するAsp239はMetに置換されているなど、配列の面からフルクタン分解酵素遺伝子である可能性が高いと考えられた。Tail-PCR法によりPp6-FEH1の5'UTRの上流約2kbpの3種類の配列を取得した。これらは相互に保存性が高く、同一の対立遺伝子の上流配列であると考えられた。シス配列の探索の結果、ABAやサイトカイニンによる誘導、CBFによる低温誘導、糖飢餓誘導に関するシス配列などが認められた。2.刈取り処理後のチモシー球茎におけるPp6-FEH1の発現は3時間で誘導され、96時間後には140倍に達した。一方3時間後以降、分解酵素活性の上昇およびフルクタン含量の低下も認められたことから、Pp6-FEH1の遺伝子発現誘導がフルクタン分解酵素活性の増加およびフルクタン分解に関与していることが示唆された。チモシー幼苗における植物ホルモンのPp6-FEH1発現量への影響を評価した結果、ABAおよびカイネチン処理により発現が誘導されることが明らかとなった。また、FEH活性を負に制御すると報告のあるグルコースとスクロースの影響を評価した結果、これらの糖の添加により刈取り処理後のPp6-FEH1発現量増加が有意に抑制された。以上よりこれらの物質の増減がPp6-FEH1の遺伝子発現を制御している可能性が示唆された。(1)フルクタン分解酵素遺伝子の発現様式の解明チモシー由来フルクタン分解酵素遺伝子Pp6-FEH1の発現に対する低温応答を評価した結果、越冬前後の圃場(札幌)においては、積雪前のマイナス温度期における一過的な発現量の増加、およびフルクトースの増加が認められた。また人工条件下の幼苗において気温を4°Cから一3°Cに低下させると遺伝子発現量は3日で約40倍に増加した。これらのことからPp6-FEH1はセカンドハードニング(マイナス温度期の低温馴化)におけるフルクタン分解による耐凍性の向上に寄与している可能性が示唆された。(2)フルクタン分解酵素遺伝子の発現誘導物質の同定刈取り処理後のPp6-FEH1の遺伝子発現誘導におけるリン酸化シグナル伝達経路の関与を明らかにするため、MAPキナーゼ阻害剤であるUO126およびPP2K阻害剤であるオカダ酸を刈取り処理前後のチモシー幼苗に処理したが、Pp6-FEH1の発現量に処理の有無による有意な変動は認められなかった。(3)フルクタン分解酵素遺伝子発現誘導に関わるプロモータ領域の同定チモシーから単離したPp6-FEH1の候補プロモータ配列について、推定転写開始点からそれぞれ-186,-416,-696および-1035塩基をルシフェラーゼ遺伝子に接続したベクターを構築し、一過的発現によるデュアルレポータアッセイによりプロモータ活性の評価を行った。打ち込み効率の高かった播種後16-18日目の幼苗の第3葉を用いた試験の結果、-695bpが最も高い活性を示した。また、刈取り後の遺伝子発現を抑制するグルコースの有無による活性の有意差は認められなかった。刈取り処理後発現誘導に関与するプロモータ領域を同定するには、評価に用いる組織などさらに検討が必要であると考えられた。一方、低温(4°C)処理を行うと常温(22°C)と比較し-416,-696および-1035bpプロモータの活性は約2倍に増加し、-186bpでは処理間で有意差は認められなかった。-186bpと-416bpの間に存在する3つのCRT配列がPp6-FEH1の低温誘導に関与する可能性が示唆された。
細胞外基質としてのアリールスルファターゼ機能の解析

アリールスルファターゼ(Ars)遺伝子ファミリーの発現異常は、さまざまな疾患をもたらす。したがって、Arsは生命活動に重要な役割を果たしていると予想される。しかし、生体内の基質は不明であり、その分子機構は全く解明されていなかった。我々は、これまでの研究で、ウニ胚では酵素としてではなく、形態形成運動の足場として機能していることを見いだしており、当該研究では細胞外基質としてのArsという観点で、哺乳動物における以下の機能解析を行った。(1)酵素活性ではなく、Arsタンパク質の実体を検出する目的で、マウスおよびラットのArs-A、Ars-Bに対する特異抗体を作製した。(2)これらの抗体を用い、肝臓におけるArs-A、Ars-Bの存在様式を調べたところ、肝実質細胞および血管内皮細胞ともに、両ArsともArsタンパク質の大部分は細胞表層に存在することが明らかになった。一方、人工基質に対する酵素活性は細胞内に局在していた。(3)抗ヘパラン硫酸抗体で、二重染色を行ったところ、ヘパラン硫酸の分布と一致することが明らかになり、細胞表層においてヘパラン硫酸とともに細胞外基質として機能することが強く示唆された。我々は、ウニ胚ではArsがOtxにより直接調節を受けていることを示している。また、4.56.5日マウス胚では内胚葉が前方へ移動するが、Otx2ノックアウトマウスではその移動が妨げられることが報告されている。そこで、(4)マウス胚におけるArsの発現を検出したところ、顕著な発現が見られ、マウス胚においてもArsがOtxに支配され、形態形成運動にかかわる可能性が示唆された。
飼料タンパク質由来ペプチドがニワトリの生理機能に及ぼす影響

近年、食事由来の高分子ペプチドが消化酵素の影響を受けずにそのまま血中へと移行することが報告されているが、血中へと移行した飼料由来の高分子ペプチドがニワトリの生理機能へ及ぼす影響について調査した報告は無い。昨年度は、反転腸管法を用いて小麦グルテンのトリプシン消化産物由来の高分子ペプチドが吸収されるか否か調査し、空腸よりも回腸で多くの高分子ペプチドの吸収が認められた。そこで本年度では、ウェスタンブロットによって検出された高分子ペプチドのアミノ酸配列およびタンパク質の種類をLTQ OrbitrapおよびMascotにより同定したが、高分子ペプチドはいずれも血中タンパク質であることが示唆され、ウェスタンブロット時に用いた一次抗体の特異性が低いことが示唆された。飼料タンパク質由来ペプチドの吸収機構を分子レベルで調査するためには、小腸上皮細胞を用いたin vitroでの試験が必要不可欠である。そこで、Wnt3a、R-spondin3、Nogginを産生するL-WRN細胞からconditioned mediumを調製した後、培地中へ添加し、さらにA-83-01およびY-27632を添加することで、高効率での腸管オルガノイドの形成を可能とした。また、ニワトリ腸管オルガノイドを免疫組織化学染色した結果、分化マーカーの染色が確認され、分化した状態の腸管オルガノイドの培養を可能となった。次に、調製した腸管オルガノイドを用いて、高分子ペプチドの吸収を調査することが可能か否か調査することを計画した。予備実験としてマイクロマニュピレーターを用いて腸管オルガノイドに蛍光標識デキストランを注入し、蛍光顕微鏡下でサンプルが漏出するか否か観察したところ、注入したデキストランは腸管オルガノイドから漏出してしまい、腸管オルガノイド中にサンプルを打ち込むことで物質の吸収を調査することは困難であることが示唆された。28年度が最終年度であるため、記入しない。しかし、小腸上皮細胞の初代培養は、未だ培養条件が確立されていない。近年、フィーダー細胞としての筋線維芽細胞が小腸上皮幹細胞を長期間維持することが報告された(Lahar N et al., PLoSONE, 6: e26898. 2011.)。そこで、フィーダー細胞としてニワトリの線維芽細胞を用い、ニワトリの小腸上皮幹細胞の維持が可能か否か調査した。また、培養液中の牛胎児血清(FCS)濃度が小腸オルガノイド形成に及ぼす影響も調査した。その結果、フィーダー細胞として線維芽細胞を用い、培養液中にFCSを20%添加することで、オルガノイドの長期間培養が可能であることを示した。以上の成果を日本家禽学会2014年度秋季大会で口頭発表し、優秀発表賞を受賞した。これまでに、分子量毎に分画した小麦グルテン消化産物をニワトリへ経口投与し、腸管からのアミノ酸吸収に及ぼす影響を調査したところ、高分子ペプチドを含む画分が腸管からのアミノ酸吸収を促進したことが明らかとなった。この結果を査読論文として投稿しており、現在、二回目の再審査を行っているところである。さらに、アミノ酸吸収を促進したペプチドのアミノ酸配列を予測するため、BLAST検索を用いてニワトリが分泌するホルモンと類似するか否か調査したが、ニワトリの分泌するホルモンと類似するぺプチドは検出できなかった。近年、食事由来の高分子ペプチドが消化されずに血中へと移行することが報告されている。そこで、小麦グルテン消化産物由来の高分子ぺプチドが腸管から吸収されるか否か調査するために、小麦グルテンのポリクローナル抗体をニワトリを用いて調製し、ウェスタンブロットにより検出を試みたが、抗体がニワトリ血中タンパク質と非特異的に結合し、血中の小麦グルテンぺプチドを検出することができなかった。近年、小腸上皮細胞を長期間培養する為にはWnt、EGF、R-spondinなどの小腸上皮幹細胞維持因子が必須であることが明らかとなった(Sato T et al., Nature, 459: 262-266. 2009.)。そこで、様々な動物種のオルガノイド培養に成功している東京農業大学の岩槻健准教授の協力の下、EGF、R-spondin 1、Noggin、Wnt-3aを添加した培養液でニワトリの腸管オルガノイドの培養を試みた。その結果、14日以上の腸管オルガノドの培養が可能となった。引き続き、ニワトリ腸管オルガノイドの調製を行い、細胞の形態を免疫組織化学法により解析し、腸管上皮細胞の種類を同定する予定である。近年、食事由来の高分子ペプチドが腸管から吸収され、そのまま血中へと移行することが報告されている。しかし、血中へと移行した飼料由来の高分子ペプチドがニワトリの生理機能へ及ぼす影響について調査した報告は無い。そこで、反転腸管法を用いて小麦グルテンのトリプシン消化産物由来の高分子ペプチドが吸収されるか否か調査した。ニワトリから小腸を採取し、空腸は空腸近位部、中間部、遠位部に分け、回腸は回腸近位部、中間部、遠位部に分けた。

腸管を反転した後、管腔内に5%O2,5%CO2のガスを吹き込んだHank's液で満たした。小麦グルテン溶液とHank's液を1:1で混合し、反転腸管をサンプル溶液中に浸した後、37°Cで95%O2,5%CO2のガスを吹き込みながら1時間インキュベートした。その後、抗小麦グルテン抗体を用いたWestern blotを行い、空腸よりも回腸で多くの高分子ペプチドの吸収が認められた。これまで、小腸上皮細胞の初代培養は困難とされてきた。しかし、近年、培養液中へ特定の成長因子を添加することで、小腸上皮細胞が三次元組織構造体(オルガノイド)を形成することが明らかとなった。そこで、EGF、R-spondin 1、Noggin、PGE2、インスリン,ニコチンアミドを培養液中に添加し、ニワトリから小腸クリプトを培養した結果、ニワトリ腸管オルガノイドの形成を可能にした。また、培地中にWnt-3aを添加することで、14日以上の培養が可能となった。近年、食事由来の高分子ペプチドが腸管から吸収され、そのまま血中へと移行することが報告されている。しかし、血中へと移行した飼料由来の高分子ペプチドがニワトリの生理機能へ及ぼす影響について調査した報告は無い。そこで、反転腸管法を用いてニワトリ腸管からの高分子ペプチド吸収を調査したところ、高分子ペプチドは空腸より回腸で吸収されることを示した。現在は、ニワトリ腸管オルガノドの長期培養と増殖を目的として、上記の成長因子の他にY-27632やA-83-01を添加した培地で培養する準備を行っている。また、吸収された高分子ペプチドのアミノ酸配列を決定する準備も行っている。近年、食事由来の高分子ペプチドが消化酵素の影響を受けずにそのまま血中へと移行することが報告されているが、血中へと移行した飼料由来の高分子ペプチドがニワトリの生理機能へ及ぼす影響について調査した報告は無い。昨年度は、反転腸管法を用いて小麦グルテンのトリプシン消化産物由来の高分子ペプチドが吸収されるか否か調査し、空腸よりも回腸で多くの高分子ペプチドの吸収が認められた。そこで本年度では、ウェスタンブロットによって検出された高分子ペプチドのアミノ酸配列およびタンパク質の種類をLTQ OrbitrapおよびMascotにより同定したが、高分子ペプチドはいずれも血中タンパク質であることが示唆され、ウェスタンブロット時に用いた一次抗体の特異性が低いことが示唆された。飼料タンパク質由来ペプチドの吸収機構を分子レベルで調査するためには、小腸上皮細胞を用いたin vitroでの試験が必要不可欠である。そこで、Wnt3a、R-spondin3、Nogginを産生するL-WRN細胞からconditioned mediumを調製した後、培地中へ添加し、さらにA-83-01およびY-27632を添加することで、高効率での腸管オルガノイドの形成を可能とした。また、ニワトリ腸管オルガノイドを免疫組織化学染色した結果、分化マーカーの染色が確認され、分化した状態の腸管オルガノイドの培養を可能となった。次に、調製した腸管オルガノイドを用いて、高分子ペプチドの吸収を調査することが可能か否か調査することを計画した。
酸化ストレスに対する適応応答のセンサーアクチベータ蛋白OxyRの機能ドメイン解析

大腸菌OxyR蛋白は、細胞が酸化ストレスにさらされた時に発現する遺伝子群の転写活性化蛋白である。この研究では、OxyR蛋白の持つストレスセンサー、特異的DNA結合能、RNAポリメラーゼとの相互作用などの諸機能が、蛋白内のどの部分によって担われているかを分子遺伝学的手法により明かにすること、及び、OxyR蛋白により発現の調節される遺伝子のうち、未同定のものについて、それをクローン化し構造解析を行うことにより、酸化ストレス応答のうちOxyR応答の全体像を明かにすることを目指している。今年度は、次のような結果が得られた。1)OxyR蛋白が相互作用すると考えられるRNAポリメラーゼ上の部位の同定を行うため、OxyR蛋白による転写活性化に欠損を持つRNAポリメラーゼの変異体を得ることを試み、そのような性質を示す変異体を18クローン得た。変異部位の同定、変異蛋白による試験管内の実験の結果、OxyR蛋白は、RNAポリメラーゼのαサブユニットのC末端に近い部位のうち、2ヶ所と物理的に接触していることを示す証拠が得られた。2)1)で得られたRNAポリメラーゼ変異をサプレスするoxyR遺伝子の変異を同定することにより、RNAポリメラーゼと相互作用するOxyR蛋白内の部位の同定を行うため、oxyR遺伝子にランダムに変異を導入したライブラリーを作成した。現在、これを用いて、oxyR変異株のスクリーニングを行っている。3)OxyR蛋白により発現の調節される遺伝子を修種クローン化した。そのうちのいくつかについては構造解析を行った。現在引き続き残りのクローン構造解析、それらの遺伝子を欠損する変異株の作成などの作業を行っている。