hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ペプチド機能を光制御する新手法の開発：環状化戦略

生理活性物質の活性を「光」を用いて制御する方法が注目を集めている。光で活性化できる化合物を用いれば、時間的・空間的に生命現象を制御できるためである。ペプチドがもつ多様な機能を光で制御できれば、多彩な研究に役立つと考えられる。我々は、光を用いて機能を制御できる「光応答性ペプチド」を設計・合成する一般的方法論の開発を目指して研究を進めている。本研究では、我々が提案する光応答性ペプチド開発に必要な、「光照射により切断されるユニット」、「効率的に環状ペプチドを合成する方法」の開発を中心に進めた。光応答性ペプチドは、基礎研究に役立つツールとしてだけではなく、副作用の少ない医薬品開発への応用も期待できる。本研究の目的は、ペプチド機能を光制御する簡便な手法の確立である。申請者は、ペプチドを環状化することで機能を制御する「環状化戦略」を提案しており、環状ペプチドに光切断性アミノ酸を導入することで、光応答性ペプチドを開発できる。本戦略に基づき、光応答性環状マトリクスメタロプロテアーゼ-3阻害ペプチドの開発に成功しているが、1光切断性アミノ酸に由来する欠点、2環状ペプチドの合成に由来する欠点、の2つの欠点が明らかとなった。平成25年度は、新規光切断性アミノ酸の開発と最適な環状ペプチド合成法の探索を並行して進めた。昨年度までに、1光切断後かさ高い構造をペプチド鎖中に残さない、2ペプチド固相合成に耐える、という本目的に適した性質を持つと期待される「新規光切断性ユニット」を開発した。本年度は、合成した光切断性ユニットの物性を詳細に検討した。光切断性ユニットはFmoc固相合成に適用でき、環状ペプチドへの導入が可能であった。環状ペプチドの緩衝液溶液に光照射し、光分解生成物をHPLCおよびMALDI-MSを用いて検討した。その結果、光照射時間依存的に目的とする直鎖ペプチドを与えたが、光分解速度が遅い、副反応が進行する、という問題点が明らかとなった。分子設計を見直し、新たな光切断性ユニットを合成した結果、ある程度の光分解速度の向上に成功したが、改善の余地を残す結果であった。そのため、継続して光切断性ユニットの改良を進めている。本年度は、環状ペプチドの合成法を検討した。環状ペプチドの合成によく用いられる方法である、1クロロアセチル基とシステインの反応、2閉環メタセシス反応、3アスパラギン酸を用いる方法、の3種類を中心に検討した。反応収率と簡便さの観点から、アスパラギン酸を用いる方法が本研究に最も適することが明らかとなった。今後、本手法を用いて環状ペプチドを合成する。平成24年度は、新規光切断性ユニットの開発を進めた。申請者が用いた光切断性ユニットFmoc-Anp-OHは、光切断性を示し、かつ固相合成に適用可能な唯一のアミノ酸であるが、光切断後、かさ高い構造がペプチド鎖に残ってしまう。そのため、光切断後の直鎖ペプチドの活性が弱い。また、光切断により生じるニトロソ基は反応性が高く、タンパク質等の生体試料との反応が懸念される。そこで、1光切断後かさ高い構造をペプチド鎖中に残さない、2反応性の高いニトロソ基を生成しない、3ペプチド固相合成に耐える、という性質を持つ新規光切断性ユニットを開発することとした。そこで、自己分解型ユニットをもつ光切断性アミノ酸を設計した。設計したアミノ酸は、光照射後、光切断性ユニット由来の構造が全く残らないと期待される。Fmoc固相合成に適した保護基をもつ新規光切断性ユニットを、11工程で合成することに成功した。環状ペプチドの水溶液に光照射し、光分解生成物をHPLCおよびMALDI-MSを用いて検討した。その結果、光照射時間依存的に目的とする直鎖ペプチドを与えた。だが、光分解速度が遅い、副反応が進行する、という問題点も同時に明らかとなった。現在、光分解速度が早い光切断性アミノ酸の開発、光反応条件の最適化、を進めている。光応答性ペプチドは、多面的応用が期待される重要な機能性分子群であるが、開発が難しく報告例も少ない。

本研究では、ペプチドを環状化することで機能を制御する。環状ペプチドに光切断性リンカーを導入することで、光応答性をもたせる。本研究では、1)光切断性リンカー、2)効率的なペプチド環状化反応、の開発に取り組んだ。1)光切断性リンカーの開発:当初用いていたリンカーでは、光照射後かさ高い部位がペプチド鎖に残る。そのため、光切断後に得られる直鎖ペプチドの活性が弱くなるという問題点があった。そこで、光切断後かさ高い部位をペプチド鎖中に残さず、ペプチド固相合成に耐える、新規光切断性リンカーの開発を進めた。まず、光増感剤である色素自身が一重項酸素により酸化される「自己増感酸化」に着目した光増感酸化型リンカーを開発した。開発したリンカーは、自己増感酸化反応を起こさなかったが、光増感剤を共存させることで、可視光照射による速やかかつ特異的な化学変換を達成できた。次に、リンカー由来の部分構造を全く残さない、traceless型リンカーの開発を進めた。光照射によりtracelessに切断されるリンカーの開発に成功したが、切断速度が遅いという問題点があり、現在改良を進めている。2)効率的なペプチド環状化反応:我々が採用していた環状ペプチド合成法は、工程数が多く、効率的ではなかった。そこで、効率的環状化反応を探索し、固相上でペプチドを環状化できる2種の効率的反応を見出した。「N末-C末」間および「N末-側鎖」間の環状化に適用できる反応である。上記で開発した技術を用い、マトリクスメタロプロテアーゼ-3阻害ペプチド、ヒストン脱メチル化酵素阻害ペプチド、の2種のペプチドの環状ペプチドを合成し、その機能の検証を進めている。ケミカルバイオロジー交付申請書に記載した研究目的は、「研究期間内に、1光切断性ユニット、2効率的なペプチド環状化反応、を開発し、環状化戦略を確立する」ことである。光切断性ユニットは、その機能に欠点を有するものの、プロトタイプの開発に成功している。種々誘導体を合成することで、光切断速度および副反応に影響を及ぼす部分構造についての知見も蓄積されつつある。これらの知見を活用することで、優れた機能をもつ光切断性ユニットの開発が期待できる。ペプチド環状化反応については、結果的に新規な方法ではなかったが、高収率かつ簡便な方法を見出すことができた。最終年度に、光切断性ユニットの最適化に注力することで、研究目的を期間内に達成できると考えている。以上の理由から、本研究の現在までの達成度は、「(2)おおむね順調に進展している」と評価する。交付申請書に記載した研究目的は、「研究期間内に、1光切断性ユニット、2効率的なペプチド環状化反応、を開発し、環状化戦略を確立する」ことである。光切断性ユニットは、その機能に欠点を有するものの、開発に成功している。また、ペプチド環状化反応についても、完全に新規な方法とはいえないが、効率的な方法を見出しつつある。今後、これらの知見をもとに、改良法の検討・最適化を進めることで、研究目的を期間内に達成できると考えている。
北方地域の景観資源植物として有望な,春植物の種子休眠機構の解明

北方地域の景観資源植物として有望でありながらその自生地が減少しつつある春植物のうち、札幌市周辺にも時折見られるキバナノアマナ、カタクリおよびエゾエンゴサクを取り上げ、その種子発芽特性を明らかにした。キバナノアマナの種子は、野外の自然条件下では5月下旬から6月上旬にかけて散布される。しかし、散布直後の種子の胚は形態的に未発達な状態にあり、すぐには発芽できない。野外では、10月中旬から11月中旬に発芽した後しばらくそのままの状態でとどまり、子葉は3月上旬から4月中旬に地上に出現する。室内実験で10°C、15/5°C、20/10°C、または15°Cに180日間置くと80%程度発芽した。あるいは、野外と同様に高温条件(25/15°C)を30日以上経験させた後低温(5°Cから10°C)に置くと、低温期間中に胚は急速に成長し、そのまま低温で90%以上の発芽率を示した。高温経過後の発芽適温は、5・10°Cであった。カタクリの種子も6月中旬に散布された直後は、未発達な胚を持っている。野外では、10月から12月の積雪下で発芽し、徐々に成長しながら積雪下の12月中旬から4月上旬に子葉が地上に出現する。10°Cまたは15/5°Cにおくと200日目にほぼ80-90%の発芽率を示した。また、30日から120日間の高温条件(25/15°C)に置いた後、低温(0-10°C)に移すと80-90%発芽した。高温経過後の発芽適温は、0-10°Cであった。エゾエンゴサクも散布直後の種子は未発達な胚を持っていた。5月中旬に散布された種子は野外では、9カ月後の翌年積雪下の3月上旬から発芽し4月下旬には85%に達した。子葉の出現は雪解け直前の3月中旬から始まり4月下旬には79%となった。高温(25/15°C、90日)→中温(15/5°C、60日)→低温(0°Cまたは5°C)の条件で、胚は中温期から低温期で発達し80-90%が発芽した。あるいは中温(10°C)を180日経過させた後に0,5°Cにおくと、80-90%の発芽率を得た。発芽適温は積雪下と同様の0°Cであった。北方地域の景観資源植物として有望な春植物のうち、札幌市周辺にも比較的多く見られるキバナノアマナとカタクリを取り上げ、その種子発芽特性を調査した。採取直後のキバナアマナの種子は、15,20,25°Cの恒温または25/15°Cの変温条件下では90日を経ても全く発芽しなかった。

25,10°Cの恒温または15/5,20/10°Cの比較的低温条件下では、45日目頃から発芽を開始し、10°Cでは90日目に30%程度発芽した。乾燥3°Cまたは25°Cで貯蔵した後に播種した場合、やはり15,20,25°Cの恒温または25/15°Cの変温条件下では全く発芽せず、10°Cで40-50%発芽した。湿潤3°Cで3ヶ月間貯蔵した後での播種実験では、10°Cで播種後5日目に発芽し始め、90日目には50%が発芽した。その他の発芽温度区では10%程度発芽した。ところが湿潤25°Cで3ヶ月貯蔵すると、10,15°Cで25日目から発芽し、40日目には95%以上発芽した。5°C、20/10°Cでも良好に発芽し90日目には90%以上の発芽率を示した。20,25,25/15°Cの高温条件下では発芽しなかった。カタクリの種子を6月8日に採取して、6月16日に10,15,20,25,15/5,20/10,25/15°Cの温度条件下に播種した。その結果いずれの温度条件下でも10月下旬まで発芽せず、11月中旬になって10°Cの温度区のみで発芽が認められて翌年の1月中旬には約70%発芽した。しかし25/15°Cの高温を34ヶ月間与えた後に5°C条件下に置くと速やかに発芽を開始し、1ヵ月後には95%以上発芽した。本年度の実験によってキバナノアマナとカタクリ種子の発芽に要求される温度条件をほぼ把握できた。来年度は、さらに詳細に温度と発芽の関係、温度と胚の成長過程を調べるとともに、野外の自然条件下での発芽との関わりを明らかにする。北方地域の景観資源植物として有望でありながらその自生地が減少しつつある春植物のうち、札幌市周辺にも時折見られるキバナノアマナ、カタクリおよびエゾエンゴサクを取り上げ、その種子発芽特性を明らかにした。キバナノアマナの種子は、野外の自然条件下では5月下旬から6月上旬にかけて散布される。しかし、散布直後の種子の胚は形態的に未発達な状態にあり、すぐには発芽できない。野外では、10月中旬から11月中旬に発芽した後しばらくそのままの状態でとどまり、子葉は3月上旬から4月中旬に地上に出現する。室内実験で10°C、15/5°C、20/10°C、または15°Cに180日間置くと80%程度発芽した。あるいは、野外と同様に高温条件(25/15°C)を30日以上経験させた後低温(5°Cから10°C)に置くと、低温期間中に胚は急速に成長し、そのまま低温で90%以上の発芽率を示した。高温経過後の発芽適温は、5-10°Cであった。カタクリの種子も6月中旬に散布された直後は、未発達な胚を持っている。野外では、10月から12月の積雪下で発芽し、徐々に成長しながら積雪下の12月中旬から4月上旬に子葉が地上に出現する。10°Cまたは15/5°Cにおくと200日目にほぼ80-90の発芽率を示した。また、30日から120日間の高温条件(25/15°C)に置いた後、低温(0-10°C)に移すと80-90%発芽した。高温経過後の発芽適温は、0-10°Cであった。エゾエンゴサクも散布直後の種子は未発達な胚を持っていた。5月中旬に散布された種子は野外では、9カ月後の翌年積雪下の3月上旬から発芽し4月下旬には85%に達した。子葉の出現は雪解け直前の3月中旬から始まり4月下旬には79%となった。高温(25/15°C、90日)→中温(15/5°C、60日)→低温(0°Cまたは5°C)の条件で、胚は中温期から低温期で発達し80-90%が発芽した。あるいは中温(10°C)を180日経過させた後に0,5°Cにおくと、80-90%の発芽率を得た。発芽適温は積雪下と同様の0°Cであった。
単位の実質化と自己学習力構築にむけた初年次英語教育カリキュラム評価方法の開発

科研申請書の3か年計画に基づき、一年目は情報・資料収集および訪問調査を行い、課題名に係る理論構築に専念した。他方、研究分担者を交え、シンポジウムを開催した。二年目は理論をもとに、初年次英語学習実態アンケート調査を実施し(関東・甲信越地区と九州・沖縄地区の国公私立大学対象)、大学・短大1年生2747名から回答を得た。加えて同地区の初年次英語教員対象アンケート調査も実施した。三年目はそれらの分析、考察、まとめと提言を所収した成果報告書を作成した。1年目の研究目的と研究計画にもとづき、英語学習者の自律学習におけるメカニズムについて理論的考察を行った。他方、カリキュラム理論の包括的研究を行い、1)学校教育、2)日本の英語教育、3)高等教育、4)初年次教育、5)欧米を中心とする言語政策、以上5つの分野から歴史的考察を行った。そのうえでカリキュラムの政策、構築、評価のあり方について、わが国の今後の大学英語教育の方向性を軸に理論的な総括を行った。その際、新たな検討材料として、小学校から高等学校における新学習指導要領の施行があげられる。そこで高大接続という現在の取り組みをこえ、小大連携を視野に入れた英語教育カリキュラムのあり方をユニバーサルな課題として捉え、そこから大学初年次英語カリキュラムはどう構築され、実践・評価されていくべきかという視点からも理論的考察を行った。その成果を2010年12月12日、鹿児島大学で開催された第39回九州英語教育学会鹿児島研究大会で発表した。研究分担者をパネリストに加える傍ら、地元の小、中、高校英語教育の関係者を招いたシンポジウムを開催し、大学初年次英語教育のあり方について包括的な議論を交わした。その内容の検証にむけてシンポジウムのアンケート調査結果を分析し、今回のカリキュラム研究の修正点を洗い出した。それを次年度の研究(カリキュラムに関するアンケート作成等)への布石とした。他方、大学初年次教育の研究動向を調査するため、計画どおり米国インディアナ大学高等教育研究センターを訪問した。新入生の大学生活全体に対するアンケート調査(CSEQ)の内容と最新データを収集する一方、それらがわが国の初年次英語教育カリキュラムにどのように関わっていくことができるか、同センター研究スタッフと議論を交わした。また同大学附属図書館にて、上記1)-5)に関する文献収集と新たに研究・調査すべき分野について検索活動を行った。2年目の研究目的と研究計画にもとづき、(1)1年目に行った理論的枠組みの整理、(2)それによる初年次英語授業カリキュラムのデザイン化、(3)理論的枠組みに照らしたアンケート調査を実施した。(1)では欧米の外国語教育政策の流れとカリキュラムの歴史的流れを照応して要点整理を行った。くわえて初年次国語教育政策はリベラルアーツの理念とどう複合的に交錯しているか調査するためにオクスフォード、ケンブリッジ両大学図書館を訪問し、両大学の外国語教育カリキュラムに関する資料収集を行い、共通点の洗い出しを行った。(2)では初年次英語授業を一部利用し、社会構築主義の英語教育カリキュラムモデルとその評価基準を考案し、そのモデルの問題点を考察した。これは(1)のカリキュラム理論の応用実践であると同時に、今年度から3年間の間に段階的に施行される小高の新学習指導要領(注:社会構築主義による教育カリキュラムの導入が注目される)との理論的共有化を考慮したものである。(3)では大学(短期大学含む)1年生を対象とした初年次英語授業および英語学習に関するアンケート調査を平成23年10月12月に行った(関東甲信越地区および九州沖縄地区の国公私立大学生:研究分担者の都合上、上記2地区で実施)。マークシート方式で2000名以上からの回答を得た。同地区の初年次英語教育担当教員宛にアンケート(質問兼回答用紙へ直接記入)の送付も行った。学生アンケートは回収済みで、これから集計結果の分析作業に入る。教員アンケートも回収がほぼ終了し(100名以上からの回答)、同じく集計・分析作業に入る。本研究の最終年度(3年目)として、昨年度(2年目)に実施した、関東・甲信越地区ならびに九州・沖縄地区の国公私立大学(注:国立大学校および私立短期大学(部)を含む)の1年生対象のアンケート調査(2747名回答)の結果分析、考察、そしてまとめとしての提言をおこなった。くわえて上記2地区で、初年次英語(1年次開講英語科目)に携わる大学・短期大学英語教員(注:非常勤含む)を対象としたアンケート調査も昨年度におこない、結果の分析と考察をおこなった。具体的には、これら2種類のアンケートに係る結果の分析から提言までをまとめあげ、研究成果報告書『単位の実質化と自己学習力構築にむけた初年次英語教育カリキュラム評価方法の開発』(課題番号22520620)として製本化した。この成果報告書には、本研究1年目の研究目的および成果である、研究課題に係る理論的枠組みの構築を踏まえた論考も所収されている。

アンケート調査(上記大学・短大1年生)に参加協力頂けた研究協力担当大学(アンケート実施協力英語教員)に対して、謝意とともに上記報告書を謹呈(郵送)する準備を進めている。また、教員対象のアンケートに協力いただけた英語教員に対しては、上記報告書のPDF版をメール送付する準備を進めている。郵送、メールの両方とも、平成25年4月中に発送もしくは送信し、完了となる。また、今回のアンケート関連とは別に、本研究の成果として、1年目の理論的枠組みとそれをもとにした授業実践(パイロットスタディ)を構築・実践した結果を、それぞれ研究ノート、研究論文としてまとめ、所属学会紀要へ投稿し、査読のうえ、数編が掲載となった。くわえて所属学会の研究大会でも研究成果の発表を行った。また、所属学会からの派遣(研究交流)として、RELC(シンガポール)主催の国際学会でも発表を行った。昨年度(1年目)、今年度(2年目)を含め、各年度当初の計画どおりに達成できている。今年度の主要プロジェクトの1つにアンケート調査(学生、教員、双方対象)があったが、統計分析を行う上で必要な被験者数を確保できたと考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。次年度(最終・3年目)に向けては、初年度研究実績(初年次英語教育カリキュラム評価に関する理論的考察と枠組みの構築)、今年度研究実績(理論ベースとのすり合わせにむけた実態アンケート調査)をもとに、(1)データの分析、(2)その結果をもとにした考察、(3)理論的枠組みとの刷り合わせに向けた最終段階としての考察、示唆、提言を本研究の集大成として行っていく。それを印刷媒体の形で公表し、学会等で発表していく予定である。
消化管コレステロール吸収におけるNPC1L1と胆汁中液性因子との相互作用の解析

in vitroにおいて見出されたNPC1L1によるNPC2の分泌抑制機構が生体内でも機能し得るのか検証すべく、NPC1L1ならびにNPC2を発現するアデノウィルスを用いてヒト肝臓と同程度に両蛋白質を発現するモデルマウスを構築し、胆汁中NPC2量の変動を解析した。その結果、NPC1L1を肝臓に発現するマウスは発現しないマウスに比べて、NPC2の胆汁分泌量が著しく低下しており、上記制御機構は生体内においても機能し得ることが示唆された。一方で、胆汁中NPC2の生理機能についても検証を行った。NPC2を発現するアデノウィルスをマウスに感染し、胆汁中NPC2量を増加させたところ、胆汁中へのコレステロール排出量が有意に上昇した。そこで、毛細胆管膜上に発現し肝細胞から胆汁中へのコレステロール排出を担うABCG5/G8のコレステロール排出活性に及ぼす分泌型NPC2の影響について、ABCG5/G8のin vitro機能評価系を用いて検討した。その結果、精製したNPC2蛋白質の添加によりABCG5/G8のコレステロール排出活性は有意に上昇し、分泌型NPC2がABCG5/G8の機能促進因子として働くことでコレステロールの胆汁排泄を制御している可能性が考えられた。以上の結果は、これまで未知であった胆汁中NPC2の生理機能を示唆した点で、またNPC2の胆汁分泌制御というNPC1L1の新たな生理機能を見出した点で生理学的に重要なものである。さらに、NPC2ならびにABCG5/G8がコレステロールに加えて植物性ステロールや幾つかの脂溶性物質に関して結合活性や排出活性を有していることから、NPC1L1によるNPC2の胆汁分泌抑制ならびに胆汁中NPC2の減少によるABCG5/G8の活性低下といった相互連関はコレステロールを含む様々な脂溶性物質の全身動態を考える上でも重要な知見であると考えている。ヒトNPC1L1による消化管コレステロール吸収を評価するために、Caco-2細胞に野生型または変異型ヒトNPC1L1を遺伝子導入したin vitro NPC1L1機能評価系を構築した。構築した評価系において、野生型NPC1L1の高発現によるコレステロール取り込みの増加、さらにこの増加がNPC1L1阻害剤であるエゼチミブによって濃度依存的に阻害されることが観察され、本評価系がヒトNPC1L1の機能評価系として有用であることが示唆された。また、本評価系により、NPC1L1の新たな基質としてビタミンE(α-tocopheol)が同定されるとともに、いくつかの変異型NPC1L1ではコレステロールやビタミンEの取り込み活性低下が見出され、NPC1L1遺伝子の変異によるコレステロール並びにビタミンEの消化管吸収の低下の可能性が示唆された。次に、構築した評価系を用いて、胆汁中液性因子とNPC1L1との相互作用の解析を試みた。まず、免疫沈降実験によりNPC1L1との共沈が確認されたNPC2蛋白質について、細胞培養液中に精製したNPC2を添加することで、NPC1L1のコレステロール取り込み活性が変動するか解析したところ、精製NPC2添加によるNPC1L1の活性変動は認められなかった。そこで、このNPC1L1-NPC2間の相互作用の生理的意義を明らかにするため、両蛋白質を内因性に発現するHepG2細胞を用いて、NPC1L1を標的としたsiRNA処理によりNPC1L1の発現量を低下させたところ、NPC2の細胞内発現量ならびに細胞培養液中への分泌量が有意に上昇した。これらの結果はNPC1L1がNPC2の発現量を負に制御している可能性を示唆するものであり、肝臓におけるNPC2の発現量・胆汁分泌量の制御というNPC1L1の新たな生理機能の解明に繋がりうるものである。
低温マトリクス単離顕微分光による単一分子ナノ集合体の光物性の解明

単一分子計測が可能な温度可変レーザー走査顕微分光装置を開発し,それを用いた分子・分子ナノ集合体の光物性と励起状態ダイナミクスに関する研究を推進した。それにより次の成果を得た。1)発光材料として有望なアントラセン誘導体に対して,高分子薄膜中における励起三重項寿命,項間交差収率,光退色量子収率を定量的に決定した。2)テトラセンとp-ターフェニルを組み合わせた複合有機ナノ粒子中における電子励起エネルギー移動を調べ,この系における非常に高効率なエネルギー移動の原因を理論的に解明した。3)シクロデキストリン薄膜中におけるペリレン誘導体の光誘起反応を単一分子分光によって調べ,この系では包接錯体内で水素原子移動反応が起こっていることを示唆する結果を初めて見出した。分子クラスターやナノ粒子をはじめとするナノメートルスケールの分子集合体では,構造の不均一性(構造異性体)と構造揺らぎ(構造異性化)が顕在化し,これらが集合体の物性に大きな影響を与える。このようなソフトなナノ物質系における静的・動的な不均一性の効果を考慮すると,それらの物性やダイナミクスを真に理解するためには,集団平均を排除して1粒子レベルの計測を行うことが有効なアプローチであると考えられる。本研究では,真空・低温条件でマトリクスに閉じ込めた分子ナノ集合体1粒子を分光分析することが可能な低温マトリクス単離顕微分光装置を独自に開発し,π電子系有機分子などから成る分子ナノ集合体の光物性や励起状態ダイナミクスを1粒子レベルで解明すること目的としている。単一分子分光は、通常のアンサンブルでは平均化されてしまう1つ1つの分子の動的挙動の解明やその周辺のナノ環境のプローブ、量子情報技術における単一光子光源の開発など、様々な分野の先端研究に用いられている。このような単一分子分光技術をクラスターに代表されるナノメートルスケールの物質群の光物性解明に応用するため、本研究では極低温真空条件下で測定可能なレーザー走査顕微分光装置を開発することを目指している。本年度はその実現に向けた第一段階として、まずは大気中における単一分子分光を可能とするための装置開発を重点的に行った。本装置では488nmレーザー光を対物レンズ(開口数0.55)によって回折限界まで絞り込み試料基板上に照射する。試料の発光イメージを取得するためレーザースポットの二次元走査と単一光子検出器による光子計数を同期させるプログラムを自作し、基板上の任意の範囲を任意の走査ステップ幅(最小0.4nm)で発光イメージを取得することを可能とした。現セットアップでの装置の空間分解能を評価するため、スライドガラス上に極希薄密度(2×10^<-5>粒子/μm^2)で固定化した蛍光ビーズ(粒径110nm)の点像分布関数(PSF)を測定した。PSFを解析した結果、本装置の空間分解能はRayleigh分解能(540nm)をほぼ実現できていることが分かった。また同一蛍光ビーズを複数回測定しても、それらのPSFのピーク位置は試料基板平面上の±10nm以下の範囲内に再現性良く観測され、任意の蛍光像(試料)の位置にレーザースポットを精度よく移動し、確実に光照射できることを確認した。以上により、大気中の単一分子の蛍光スペクトルや蛍光強度の時間変化を測定する準備が整った。来年度は装置のさらなる改良や高度化を進めるとともに、真空装置との融合を進める。本年度は単一分子ナノ集合体の光物性ならびに光物理化学挙動の計測のためのレーザー走査顕微蛍光分光装置の改良を進め、以下のような性能の向上を実現させた。アクチュエータ動作方式の改変によるレーザー走査の高速化を図り、基板上の数10μm四方領域の高解像度蛍光イメージを数分で取得できるよう改良した。また、高開口数ドライ対物レンズ(NA=0.95)の導入により空間分解能および光子検出感度を向上させ、検出光学系に穴径75μmピンホールを導入することで、散乱による背景光を著しく低減させた。このような改良を施すことにより、高分子薄膜マトリクス中に分散された単一色素分子の蛍光スペクトルや蛍光強度の時間変化を高い信号/背景光(S/B)比で測定を行うことが可能となった。本年度中に低温・真空条件下で単一分子測定を行うまでには至らなかったが、本研究計画の主要な目的であるマトリクス単離された単一分子ナノ集合体の光物性計測のための装置主要部分を完成させ、その良好な性能と動作を確認した。さらに本年度の終盤には、γ-シクロデキストリン(γ-CD)ナノマトリクス中におけるペリレン誘導体の単一分子蛍光分光を行い、1分子レベルでのγ-CD包接色素分子の光物理化学的挙動と高い光安定性を明らかにした。本年度は、研究実施計画に基づいて以下に記す1)、2)を実施した。

1)単一分子蛍光分光(SMFS)装置の高度化の推進:「測定開始時から光子が検出されるまでの時間」および「励起光パルス照射時から光子が検出されるまでの時間」を同時サンプリングできるシステムを構築し、蛍光強度、蛍光スペクトル、蛍光寿命の時間変化の並列測定および光子相関測定、さらに光子コインシデンス測定を行うことを可能にした。これにより1分子レベルでの光物理化学挙動の多角的な定量評価が可能となった。また、小型試料台チェンバーを自作し、高真空条件や各種ガス雰囲気条件下での測定、基板温度を-20°Cから50°C程度までの範囲で制御して測定を行えるシステムを構築した。以上により,本研究の目的の一つである温度可変SMFS装置の開発を達成した。これは今後の1分子計測の新しい展開を切り拓くものである。2)アントラセン誘導体分子およびそのナノ集合体の励起状態ダイナミクスの解明:発光材料として有望な9,10-ビス(フェニルエチニル)アントラセン(BPEA)をZeonex高分子薄膜中に分散させ、1分子のマルチパラメーターSMFS測定を行った。蛍光明滅の統計的挙動をヒストグラム法および自己相関関数を用いた解析を行い,蛍光明滅の原因が励起三重項状態への項間交差によるものであることを明らかにした。さらに、光子コインシデンス測定により光子アンチバンチング(単一光子発生)の観測に成功した。これにより"1個"の分子を測定していることへの実験的確証を得ることができた。BPEAナノ粒子の研究では、水溶液分散状態で蛍光スペクトル、蛍光寿命、蛍光偏光解消の各アンサンブル測定を行い、励起状態相互作用の理論に基づく実験データの解析から、ナノ粒子中の分子間の距離や配向角を決定した。これは集合構造の評価が難しい有機ナノ粒子の研究において大きな意義を持つ成果である。本年度は,研究実施計画に基づき,次の研究課題について研究を推進した。シクロデキストリン包接錯体内反応の単一分子分光:昨年度までに分子包接現象を示す代表的化合物であるシクロデキストリン(CD)の固体薄膜中において,ペリレンジイミド誘導体(PDI)が顕著な蛍光ブリンキングを示すことを見出してきた。本年度は,そのブリンキング挙動についての更なる詳細な実験および解析を行い,ブリンキングの原因となっている反応過程について考察を行った。CD薄膜中におけるPDIの蛍光強度の時間変化から,蛍光ブリンキング挙動の解析を行い,蛍光が観測されない持続時間(off-time, t_<off>)の確率密度分布P(t_<off>)を多数の単一分子に対して求めた。それらすべてのデータは不均一系における非指数関数的振る舞いを記述するのにしばしば用いられる拡張型指数関数(P(t_<off>)∝exp[-(t_<off>/τ_<KWW>^β])でよく再現され,各τ_<kww>とβから各単一分子のoff状態の寿命τ_<off>を求められた。このことから,この反応ではPDIと反応相手との距離が非常に狭い範囲に制限されていること,すなわち包接錯体内で反応が起こっていることが強く示唆された。PDIのS_0-S_1吸収とT_1-T_
脊椎構造の機械的特性が生み出す歩容の多様性の実験的数理的解析

本研究では,多様な歩容発現に脊椎構造が持つ特性が果たす役割について実験的数理的に明らかにすることを目的し,四脚以上で脊椎構造を模した胴体を有する多脚型受動的動歩行ロボットの実現とその運動の理論的解析を行ってきた.その結果,胴体部分のヨー方向の自由度が重要であること,機構の非対称性が歩容を変化させることなどを明らかにした.さらに,脊椎の様に胴体部分に複数の自由度や粘弾性を持たせた歩行ロボットを揺動励振し歩行を実現させた.その結果,胴体部分に与えた自由度や粘弾性によって機体の共振特性が変化し,実現される歩容が変化することを明らかにした.多様な歩容発現に脊椎構造が持つ特性が果たす役割について実験的数理的に明らかにするとした本研究の目的の達成に向けて,26年度では計画通り,脊椎構造を持つ多脚型受動的動歩行ロボットを作成し歩行実験を行うことを主に行った.重要な鍵となる脊椎構造部分に関しては,ヨー方向には曲がりやすくピッチ方向には曲がりにくく,さらにロール方向に関しては一定角度までの自由な回転が可能な胴体や,各自由度に対してばねを取り付け,ばねの張り方およびばねの種類を変えることによって復元特性を独立に調整することが可能な胴体など,脊椎構造が持つ様々な自由度や粘弾性といった機械的特性を取り出し,それらを細かく調整できる機構を複数種類作成して歩行実験を行ってきた.その結果,脊椎構造が持つ特性が実現される歩容に様々な影響を与えることが明らかになってきた.特に大きな結果としては,ヨー方向の自由度が重要であること,また,ヨー方向の自由度を入れることで,歩行スピードが向上する一方で歩行の安定性が落ちるといったトレードオフの関係があることを見いだした.以上の成果は,国内外の学会にて発表を行うと共に,現在,それらの結果をまとめて論文誌に投稿する準備を行っている.また,対象としている受動的歩行が揺動を強く利用した歩行であるため,揺動による受動的動歩行に関する理論解析もすすめてきた.その中で,揺動を励振することで平地歩行を実現する準受動的動歩行の一制御方策についての提案も行ってきた.この成果は,国際学会にて発表を行った後に,成果を再度まとめて論文誌に投稿し現在査読中となっている.27年度では計画通り,昨年度作成した脊椎構造を持つ多脚型受動的動歩行ロボットを用いた歩行実験(サブテーマ1-1)を行うとともに,脊椎構造が持つ機械的特性が果たす役割についての数理的解析(サブテーマ2)に着手した.具体的には,昨年度作成した脊椎構造部分や歩行ロボットを改良しつつ継続して実験を行うとともに,理論的解析については,シンプルな振動子系でロボットが見せる運動をモデル化し,その理論的解析を行ってきた.その結果,脊椎構造が持つ特性が実現される歩容に様々な影響を与えることが明らかになってきた.さらに,それまでの成果を受けて,脊椎構造にアクチュエータを埋め込み,それによって歩行を実現させようとする歩行ロボットも作成し,歩行実験を行ってきた(サブテーマ3「理論解析の妥当性を検証するための歩行ロボット(検証機2)作成及び歩行実験」に相当).大きな結果としては,脊椎構造に加え脚に非対称構造を加えることで,歩容に様々な変化を生み出すことも明らかにした点と,脊椎構造にて駆動する場合,身体構造によって歩容が異なること,そしてその変化の様子が生物に類似している結果を得られたことである.以上の成果は,国際学会にて一件発表を行い,さらに査読有りの国際学会に現在一件投稿中である.また,対象としている受動的歩行が揺動を強く利用した歩行であるため,揺動による受動的動歩行に関する理論解析もすすめてきた.まず,昨年度投稿中だった,揺動を励振することで平地歩行を実現する準受動的動歩行の一制御方策についての論文については無事採択掲載された.また,新たな歩行ロボットを作成し,歩行実験を行った.大きな結果としては,2つの周期入力の位相差にも関わらず,入力の振幅を大きくすると歩容が変化することを見いだした.本結果については,査読有りの国際学会に投稿し採択され,H28年度に発表予定である.研究計画での実施スケジュール案では,27年度は,「脊椎構造を持つ多脚型受動的動歩行ロボット(検証機1)の作成及び多様な歩容を発現させることができるかについての歩行実験(検証実験1)」を終わらせ,「脊椎構造が持つ機械的特性が果たす役割についての数理的解析」及び「理論解析の妥当性を検証するための歩行ロボット(検証機2)作成及び歩行実験」に着手することがが主な実施内容であった.研究実績で述べたように,「脊椎構造を持つ多脚型受動的動歩行ロボットの作成及び歩行実験」については順調に研究を進められていると考えられる.また,少し先行することにはなるが「理論解析の妥当性を検証するための歩行ロボット(検証機2)作成及び歩行実験」についても順調に研究を進められていると考えられる.従って,実機作成やそれを用いた歩行実験についてはかなり順調に進んでおり,スケジュールより早く進んでいると考えている.一方で,実機作成や歩行実験が順調な分,理論的解析については,着手し研究も進んではいるが,明確な大きな成果を出すまでには至っていない.よって,総合的には,「おおむね順調に進展している」という自己評価を行った.多様な歩容発現に脊椎構造が持つ特性が果たす役割について実験的数理的に明らかにするとした本研究の目的の達成に向けて,28年度では,まず27年度に引き続き「脊椎構造が持つ機械的特性が果たす役割についての数理的解析(サブテーマ2)」に関して研究を行ってきた.

具体的には,26, 27年度に作成した脊椎構造部分や歩行ロボットを改良しつつ継続して実験を行うとともに,また理論的解析については,シンプルな振動子系でロボットが見せる運動をモデル化し,その理論的解析を行ってきた.その結果,脊椎構造が持つ特性が実現される歩容に様々な影響を与えることが明らかになってきた.さらに,それまでの成果を受けて,ロボットにアクチュエータを搭載し少しのエネルギー印加を行うことで平地での歩行が実現可能な歩行ロボットも作成し,より多様な歩容を生み出すとともに,制御系と脊椎構造との相互作用について解析を行ってきた(サブテーマ3「理論解析の妥当性を検証するための歩行ロボット(検証機2)作成及び歩行実験」に相当).具体的な大きな結果としては,脊椎構造が歩容におよぼす影響について,機体の振動特性の観点から解析を行うことでそのメカニズム解明への道を示した点と,制御系と脊椎構造との関連については,低速域より中速域でその影響が顕著になることを示唆する結果を得られたことなどがあげられる.それらの成果は,国際学会にて二件,国内学会にて二件発表を行を行った.さらに,査読有りの国際学会に二件投稿し採択されており,国内の学会でも二件の発表を行う予定である.加えて現在,これまでの結果をまとめて論文誌に投稿する準備を行っている.本研究では,多様な歩容発現に脊椎構造が持つ特性が果たす役割について実験的数理的に明らかにすることを目的し,四脚以上で脊椎構造を模した胴体を有する多脚型受動的動歩行ロボットの実現とその運動の理論的解析を行ってきた.その結果,胴体部分のヨー方向の自由度が重要であること,機構の非対称性が歩容を変化させることなどを明らかにした.さらに,脊椎の様に胴体部分に複数の自由度や粘弾性を持たせた歩行ロボットを揺動励振し歩行を実現させた.その結果,胴体部分に与えた自由度や粘弾性によって機体の共振特性が変化し,実現される歩容が変化することを明らかにした.研究計画での実施スケジュール案では,26年度は,「脊椎構造を持つ多脚型受動的動歩行ロボット(検証機1)の作成及び多様な歩容を発現させることができるかについての歩行実験(検証実験1)」が主な実施内容であったが,研究実績で述べたように,脊椎構造を持つ多脚型受動的動歩行ロボットの作成及び歩行実験については順調に研究を進められていると考えられる.ただし,「様々な歩容を実現させる」ことを実現するといった点からは,脊椎構造やロボット自身にさらに改良すべき点があると考えられるため,総合的には,「おおむね順調に進展している」という自己評価を行った.26,27年度の実施内容は「おおむね順調に進展している」と考えられるため,28年度は研究計画での実施スケジュール案どおり,まずはサブテーマ2となる「脊椎構造が持つ機械的特性が果たす役割についての数理的解析」を少しの遅れを取り戻すべく注力して推進していく予定である.その成果を受けて,さらにサブテーマ3でとなる「理論解析の妥当性を検証するための歩行ロボット(検証機2)作成及び歩行実験」を引き続いて行っていく.ただし,現在までの達成度の項で述べたように,実機作成やそれを用いた歩行実験についてはかなり順調に進んでおり,成果も出ているため,その結果については先行して論文にまとめ投稿していくことも並行して行っていく.
フォノン阻止能の理論的研究

固体中を運動するイオンや原子のエネルギー損失過程の理論的研究を行い、これまでの理論では定量的に説明出来なかった現象の説明及び物理量の計算を行なった。スパッタリングされた原子のエネルギー損失過程や、放射損傷の終期過程を議論するために最も基本的な量である、フォノン励起による低速原子にたいする阻止能の理論的研究を行いスパッタリングの実験解析から指摘されている核的阻止能の原子番号振動特性を解析した。また、フォノン阻止能の理論を用いて原子の固体内多重散乱に多体効果が、どの程度影響を及ぼすかを議論した。これまでの理論を適用することができるエネルギーの下限は我々の評価で数十eVであり、スパッタリングされ表面から放出される原子にこれまでの理論を適用することはできない。この領域でのフォノン阻止能にかんしては自由衝突近似を用い、また、より低速領域にかんしては固体原子が衝突により変位を受けないとする静的近似を用いる理論を提案し、この2つの近似の適用領域を明らかにした。その結果、自由衝突近似が十分に広いエネルギー領域にわたって適当な近似であることが結論づけられた。高速イオンにたいする電子的阻止能に関して、上記のフォノン阻止能で用いたものと同様の理論的手法を用いてこれまでの摂動論的理論の改良を行った。局所密度近似を用いた調和振子モデルに基づく方法によって非摂動論的計算が可能になることを示した。この方法により阻止能の平均イオン化エネルギーを計算した。実験との一致はトーマス・フェルミ法の範囲内で満足のゆくものであった。摂動の高次項(バーカス項)の計算も同様に行なった。従来の理論とは異なり、近距離衝突の重要性を指摘した。また、高次項の計算値が、従来の理論に比べはるかに実験事実を定量的に説明することを示した。
小分子RNA二重鎖イメージングを可能にする超高親和性近赤外蛍光プローブの開発

本研究の目的は、遺伝子発現抑制により多彩な生命現象を制御している小分子RNA二重鎖を可視化(イメージング)するための新規な分析手法を開発することにある。小分子RNA二重鎖をイメージングするための技術開発のハードルは極めて高く、一般的な手法はいまだ確立されていない状況にあるが、本研究では小分子RNA二重鎖を強力かつ特異的に捕捉しうる近赤外蛍光プローブを新規に創出することで、小分子RNA二重鎖の動態をイメージングし、遺伝子発現抑制のキープロセスである局在化・タンパク質との複合体形成を時空間計測しうる新規な分析手法を開発することを目指す。本年度は、siRNA二重鎖を標的として、その3'末端オーバーハング構造ならびにオーバーハング構造近傍の二重鎖領域を同時に認識しうるThiazole orange(TO)擬塩基含有ペプチド核酸(Peptide Nucleic Acid: PNA)をベースとする蛍光プローブを用いてsiRNA二重鎖解析に適用した。昨年度見出したPyrene連結型プローブにおいて、Pyrene-PNA間のスペーサー長を変化させたプローブ群を合成し、これらの基礎特性解析を行った。最適化したプローブを用いることで、弱酸性条件下においてTotal RNA中の標的siRNAに対して選択的に結合し、TO擬塩基由来の発蛍光応答が得られることを見出した。一方、蛍光応答部位の改良を指向して、一連のシアニン色素群を擬塩基として導入した三重鎖形成性PNAを合成したところ、benzo[c,d]indoleを含むモノメチンシアニン色素が近赤外領域(>650 nm)において明瞭な発蛍光応答を示すことが分かった。夾雑系においても機能しうる蛍光性PNAプローブ設計指針が得られており、これは細胞内siRNA解析を実現する上で大きな進展である。さらに、イメージング解析に有用な近赤外蛍光応答を示す擬塩基に関して、モノメチンシアニン構造の有用性を示す結果が得られている。細胞内さらには生体内小分子RNA二重鎖解析で必須となる生理条件下での機能発現を指向したプローブ構造の更なる改良を進める。このためには、中性条件での三重鎖形成を可能にする人工核酸塩基が不可欠であるが、既報にあるシトシン塩基改変体に加えてナフチリジン誘導体など様々な水素結合性分子を用いることで、その開発を試みる。また本年度得られた予備検討の結果を踏まえて、より輝度が高く光安定性に優れたモノメチンシアニン色素を開発し、イメージング解析に適した蛍光応答機能の獲得を目指す。小分子RNAをイメージングするための技術開発のハードルは極めて高く、一般的な手法はいまだ確立されていない状況にあるが、本研究では小分子RNA二重鎖を強力かつ特異的に捕捉しうるRNA結合性近赤外蛍光プローブを新規に創出することで、小分子RNA二重鎖の細胞・個体レベルでのイメージング解析を実現することを目指す。本年度は、small interfering RNA(siRNA)を標的として、その3'末端オーバーハング構造(2塩基)ならびにオーバーハング近傍の二重鎖領域を同時に認識しうるペプチド核酸(Peptide Nucleic Acid: PNA)をベースとしたプローブを設計した。ここでは、オーバーハング塩基とのワトソンクリック塩基対形成、ならびに二重鎖とのフーグスティーン塩基対形成(三重鎖構造形成)を活用している。さらに、チアゾールオレンジ(Thiazole orange:TO)を擬塩基として用いることで、プローブ結合をTO部位のライトアップ応答として検出する。赤色蛍光タンパク質発現を抑制するsiRNAを標的としたプローブを合成し、その機能評価を行ったところ、標的siRNAのオーバーハング構造、二重鎖領域を同時に識別し、高い結合選択性を示すことを見出した。さらに、PNAのN末端にピレン部位を導入することで、siRNA二重鎖に対する選択性が向上することが分かった。このプローブを用いることで、細胞内に導入されたsiRNA二重鎖の高選択的な蛍光検出ならびに定量が可能であることを見出している。小分子RNA二重鎖に対して優れた結合能を示すPNAプローブ設計の有用性を示す結果が得られている。さらに、このPNAプローブ構造においてシアニン色素擬塩基を導入することで、プローブ/小分子RNA二重鎖相互作用を明瞭なライトアップ応答として検出することが可能であることを見出した。

最適化したプローブを用いることで、弱酸性条件下においてTotal RNA中の標的siRNAに対して選択的に結合し、TO擬塩基由来の発蛍光応答が得られることを見出した。一方、蛍光応答部位の改良を指向して、一連のシアニン色素群を擬塩基として導入した三重鎖形成性PNAを合成したところ、benzo[c,d]indoleを含むモノメチンシアニン色素が近赤外領域(>650 nm)において明瞭な発蛍光応答を示すことが分かった。夾雑系においても機能しうる蛍光性PNAプローブ設計指針が得られており、これは細胞内siRNA解析を実現する上で大きな進展である。さらに、イメージング解析に有用な近赤外蛍光応答を示す擬塩基に関して、モノメチンシアニン構造の有用性を示す結果が得られている。PNAプローブの結合機能のさらなる向上を目的として、ピレン/PNA間ならびに、オーバーハング構造認識PNA/二重鎖認識PNA間のスペーサーの検討を図る。また、シアニン色素構造の改変により近赤外領域で蛍光応答を示す新規誘導体を設計・合成し、細胞・個体における小分子RNA二重鎖イメージングに適した蛍光特性の発現を目指す。さらに、生理条件下での三重鎖形成を可能にするためのシトシン塩基改変体を導入し、生理条件下での優れた結合機能を有するプローブへと進化させることを試みる。細胞内さらには生体内小分子RNA二重鎖解析で必須となる生理条件下での機能発現を指向したプローブ構造の更なる改良を進める。このためには、中性条件での三重鎖形成を可能にする人工核酸塩基が不可欠であるが、既報にあるシトシン塩基改変体に加えてナフチリジン誘導体など様々な水素結合性分子を用いることで、その開発を試みる。また本年度得られた予備検討の結果を踏まえて、より輝度が高く光安定性に優れたモノメチンシアニン色素を開発し、イメージング解析に適した蛍光応答機能の獲得を目指す。
遺伝性周期性四肢麻庫の原因といてのNa,Kイオンチャンネルの異常

[従来の知見]我々はこれまで周期性四肢麻痺発作がNa-Kの透過性の変化によることを示してきたが、近年,この透過性の変化は実はNa、Kチャンネルの構造の異常、特にNa、Kチャンネルの構造をコードする遺伝子の異常によるとする知見が提出された。本邦には周期性四肢麻痺の種類が多いが、この中で1)高K血症性周期性四肢麻痺については人間のNaチャンネルがすでにクローニングされ、構造が決定し、今までに臨床例で3ヶ所の異常が示されているので、本邦例についてこれを検討する。2)低K血症周期性四肢麻痺についてはKチャンネルのうちanomalous rectifierの異常である可能性があるが、末だクローニングされていないのですぐには研究が困難である。[我々の研究方針]1)Naイオンチャンネルはクローニングされているものの、gemomic structureが明らかにされていないから、どれだけintronがあるかわからない。DNAに変異が見つかってもこれが本当に構造蛋白の異変につながり、イオンチャンネルの機能に影響を与え、本当に疾患の原因になっているかどうかを明らかにすることが必要である。2)これを実証するために、患者の皮膚から皮膚線維芽細胞を培養し、これにMyoD、Myogeninを導入して、筋肉としての形質を強制発決させること、Naチャンネルとしてadult skeletalmuscle Na channelが発現される可能性がある。この構造の異常をPCR法により検出するとともに、機能の異常についても微少電極法により検出できる。3)この方法は遺伝的筋疾患の異常の検出についてDNAの異常と機能の異常を同時に検出できる系として、新しい意義を持ち得るものである。[研究の現状]1)高K血症周期性四肢麻痺の一例について診断を確立し、生検により皮膚線維芽細胞を得た。2)これに筋形賃を強制発現させる方法として、MyoD、Myogeninを線維芽細胞の核内に導入するわけであるが、リポフェクチン試薬を用いて検討中である。
日本語とロマンス言語の統語論的対照研究

本研究は日本語とロマンス諸語の統語論及び形態論的相違点がどのような原理によって説明されるのかを解明することを目的とし、特に語順の違いとその他の統語的差異との係わりに着目して進められた。1データ収集日本語とロマンス諸語の語順に関する統語的特性を整理した。2データ整理文法項目毎に例文、注釈をパソコンに入力し、データベースを作成した。3データ分析次の2項目について考察を行った。(1)語順と複合述語の関係についてSOV語順の日本語とSVO語順のロマンス諸語とでは、複合述語構文、特に使役構文と所有構文の振る舞いに違いがある。この類型論的一般化に対し、最小主義の枠組みにおいて、全ての言語はSVOを基底語順とするという仮説と経済性の原理を応用することから原理的な説明が与えられるという成果が得られた。(2)語順と倒置現象について日本語、ロマンス諸語各々、広義の意味での倒置現象(語順の変化)が存在する。日本語のかき混ぜ規則、フランス語の複合倒置やイタリア語の自由倒置等がその例である。これらの語順の変化をもたらす規則やプロセスは一律のものではなく、異なる原理に従っている。今回はフランス語の複合倒置現象に着目し、機能範疇がある環境の下、複数照合を許すという特性を持つという仮説を立て、この現象の説明を試みた。
バクテリアべん毛輸送ゲートコア複合体の機能構造解析

本研究では、べん毛III型タンパク質輸送ゲートコア複合体の機能構造を原子レベルで理解するため、コア複合体を形成する相互作用ネットワークを遺伝学的および生化学的に解析するとともに、X線結晶構造解析法によりFliP, FliQ, FliRの構造を原子レベルで解明することを目指している。本年度の主な成果は以下に示す。1.FliP/FliQ/FliR輸送ゲート複合体は5分子のFliP, 1分子のFliQおよび4分子のFliQから構成されること、FliQおよびFliRはFliPと直接相互作用することが明らかとなった。さらに、輸送ゲート複合体がMSリングの中心孔に結合した状態で単離精製することに成功した。2.FliQの細胞質ループに存在する高く保存されているアミノ酸残基をアラニンに置換したところ、Gly-32, Gln-39, Thr-42, Glu-46, Leu-49およびLys-54がFliQの機能発現に重要であることが判明した。さらに、べん毛タンパク質輸送機能が著しく低下したfliQ(T42A)変異体およびfliQ(L49A)変異体から復帰変異体を単離することに成功した。それらのサプレッサー変異がFlhAおよびFliPに存在することが明らかとなった。3.FlhBがFliP/FliQ/FliR複合体に直接相互作用することが明らかとなった。さらに、べん毛構成タンパク質が輸送ゲート複合体に結合できた場合でも、FlhB(E230A)変異が存在すると、輸送ゲートコア複合体の中心孔が開かないことが示唆された。4.FlhAの細胞質ドメインが閉じた構造から開いた構造に変化するしくみを明らかにした。遺伝学的および生化学的解析から、輸送ゲート複合体の相互作用ネットワークを概ね明らかにすることができた。しかしながら、X線結晶構造解析に適した結晶は未だ得られていない。解析に適した結晶化スクリーニングを進める一方で、クライオ電子顕微鏡を用いてMSリングの中心孔に結合した輸送ゲート複合体の構造解析を進める。高額な消耗品を購入する必要がなったためである。次年度ではクライオ電子顕微鏡による構造解析を実施するため、高額なクライオ電子顕微鏡観察用グリッドや界面活性剤の購入にあてるとともに、老朽化したNanodrop超微量分光光度計の購入にあてる。