hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
上皮組織構築における細胞接着－細胞骨格インターフェースの機能解析

癌細胞の多くは上皮に由来し、正常な細胞がgenetic, epigeneticな変化により組織内で増殖異常をきたして原発巣を形成し、その中の一部が実質組織周辺へと浸潤して血管内やリンパ管内に侵入して遠隔臓器へと移動する転移性を示す。この過程においては、癌細胞にEpithelial-Mesenchymal Transition (EMT)と呼ばれる変化が起き、上皮としての特徴を喪失して線維芽細胞様の状態に移行すると想定されている。EMTの典型的な特徴として、タイト結合・アドヘレンス結合といった上皮細胞間接着構造の消失が知られているが、同時に起こる細胞骨格構造の変化に関して分子レベルの知見は限られている。そこで、上皮細胞間接着構造に局在して細胞骨格制御に働く可能性がある分子の発現を、正常上皮細胞、非転移性癌細胞、転移性癌細胞の間で比較解析した。その結果、調節分子の発現が、癌細胞の転移能の有無によって転写レベルおよびタンパク質レベルで差を示すことが明らかになった。さらに詳しく遺伝子解析を行ったところ、非転移性癌細胞と転移性癌細胞では異なるアイソフォームが発現していることを見出した。また、特定のアイソフォームのみを認識する抗体を作製し、異なるアイソフォーム分子が実際にタンパク質として細胞内で発現していることを確認することができた。おおむね順調に進展しているとした理由は、「正常上皮」と「異常上皮」の間で、上皮細胞間接着と細胞骨格をつなぐインターフェースに差があることを、具体的に明らかにすることができたからである。特に、転移性癌細胞という臨床的にも大きなターゲットを対象とした知見である点を、自身では評価している。以下に述べる今後の推進方策を通じて、社会に還元可能な研究成果をえられるよう努めたい。本年度は、昨年度より取り組んだ研究課題である、癌の転移能に関連する解析をさらに発展させる研究を行った。上皮に由来する癌が浸潤・転移する過程には、上皮としての特徴を喪失して線維芽細胞様の状態に移行する上皮間葉転換Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT)が多くの場合関係している。EMTでは、上皮細胞間接着構造の消失と同時に、細胞骨格構造も変化するが、この点に関して分子レベルの知見は限られている。そこで、上皮細胞間接着構造に局在して細胞骨格制御に働く可能性がある分子の発現について、非転移性癌細胞と転移性癌細胞の間で比較解析した結果、転移能の有無によって転写レベルおよびタンパク質レベルで差を示すことが明らかになった。この知見を元に、標的分子の過剰発現および発現抑制を、培養癌細胞を用いて行った。しかしながら、発現変化を起こした細胞において細胞骨格構造の顕著な変化を認めることはなかった。したがって、転移能の獲得に伴う癌細胞の細胞骨格構造変化が、標的とした調節分子の発現変化そのものが原因となって起きる可能性は低いものと考えられる。一方、調節分子の中の一つについて、非転移性癌細胞と転移性癌細胞では異なるアイソフォームが発現していることを見いだている。そこで、CRISPR/Cas9法を用いて、転移性癌細胞に発現するアイソフォームを欠損する細胞の樹立を行った。
心臓におけるアルドステロンのインスリンシグナルを介した生理及び病態生理作用の解明

アルドステロンとインスリンシグナルは共に心不全の病態において中心的な役割を担っている。本研究では心筋細胞に対するアルドステロンの直接的作用として、二相性にインスリンシグナルを活性化する点に注目した。この経路を介し、長期的にはミネラロコルチコイド受容体(MR)依存性に悪影響を及ぼす一方で短期的にはMR非依存性に一過性に糖代謝を亢進させることで細胞保護効果を発揮する可能性が示唆された。これらの結果はアルドステロン産生が不全心において活性化されている生理的意義を示唆するものと考えられた。アルドステロンは心不全の病態生理において中心的な役割を担っていると考えらが、心筋細胞に対する直接的な生理作用については未だ十分に解明されていない。一方、糖代謝におけるアルドステロンの位置づけが最近注目されてきている。我々はアルドステロンの心筋細胞に対する直接的生理作用を短期的効果(非ゲノム作用)と長期的効果(ゲノム作用)とに分けて考え、特にインスリンシグナルとの関わりに注目し解析を行った。仔ラット培養心筋細胞にアルドステロンの短時間あるいは長時間刺激を加え、インスリンシグナルの下流蛋白であるAktやGSK-3β活性の経時的変化について検討した。アルドステロンの長時間持続刺激によりAktやGSK-3βのリン酸化は増加した。ヒト不全心ではAktが持続的に活性化しており、negative feedbackを介して上流蛋白を阻害、インスリン抵抗性を引き起こしていることを我々は以前報告している。MR阻害薬がこれらのリン酸化を緩和したことから、アルドステロン長期刺激が不全心におけるインスリンシグナル阻害に深く関わっている可能性が示唆された。興味深いことにアルドステロンは極短時間刺激においても一過性にAktやGSK-3βのリン酸化を上昇させた。つまりアルドステロンはインスリンシグナルを二相性に活性化させる可能性が考えられた。これらの現象の病態生理学的意義を検討するため、次に心筋細胞に過酸化水素による酸化ストレスを加え、細胞障害を引き起こした。驚くべきことに、アルドステロン短期刺激は細胞障害を有意に緩和した。この細胞保護作用はPI3K阻害薬により失われたものの、MR阻害薬は特に有意な影響を与えなかった。以上の結果から、アルドステロンがインスリンシグナルを介し、障害心筋に対して長期的には悪影響を、逆に短期的には好影響を与えている可能性が示唆された。我々はこれまで、アルドステロンの心筋細胞に対する直接的生理作用を短期的効果(非ゲノム作用)と長期的効果(ゲノム作用)とに分けて考え、仔ラット培養心筋モデルを用い、in vitroで検討を行ってきた。そして、アルドステロンが心筋糖代謝と深く関わっている可能性を見出した。本年度は心筋細胞におけるアルドステロンのインスリンシグナル活性化のメカニズムをより詳細に検討した。昨年度と同様、仔ラット培養心筋細胞にアルドステロン刺激を加え、インスリンシグナルの下流蛋白であるAktやGSK-3β活性を特に、短時間非ゲノム作用を中心に検討した。同じシグナル伝達経路に関し、ゲノム作用がミネラロコルチコイド受容体依存性であったこととは対照的に、短時間刺激による一過性Akt、GSK-3βのリン酸化はミネラロコルチコイド及びグルココルチコイド非依存性に上昇することが分かった。さらに、インスリン受容体そのものの関与についても検討した。しかしながら、アルドステロンによる直接的なインスリン受容体リン酸化、つまり活性化、及びインスリンとの相乗効果に関しても有意な所見は認められなかった。現在、介在するメカニズムについて、NHE1を中心に解析を進めている。さらに本年度は心臓組織におけるアルドステロンの効果をインスリンシグナルと心機能の相関性の観点から捉えるために、Langendorff摘出心灌流実験の系統を立ち上げた。Preliminay dataとして、アルドステロン短時間灌流により、GSK3のリン酸化の有意な上昇所見を認めた。不全心におけるレニン-アンジオテンシン-アルドステロン系(RAAS)及び糖代謝の活性化はいわば生体の防御反応的機構とも捉えられる。本研究結果はその架け橋としてのアルドステロンの役割を解明することで心不全におけるRAAS活性化の病態生理学的意義の一端を樹立するものであると考える。
受精に関与する新しい細胞外ユビキチン-プロテアソーム系の解明

哺乳類やホヤ,ウニの受精において,細胞外ユビキチン-プロテアソーム系は非常に重要な役割を果たしていることが知られているが,その詳細なメカニズムならびに関与している酵素に関してはほとんど明らかにされていなかった.そこで,本研究者は精子ユビキチン化酵素の同定ならびに精子プロテアソームの受精における役割に着目し,以下の研究を進めた.(1)精子膜表面タンパク質や,精子先体反応時に放出されるタンパク質をLC-MS/MSを用いて網羅的に同定し,受精に関与するユビキチン-プロテアソーム系に関与する酵素の同定を試みた.その結果,受精において重要な働きをしていると考えられているマボヤHrTTSP1のカタユウレイボヤオルソログ,ならびにチャネルタンパク質,そして,何種類かのユビキチン化に関与すると予測されるタンパク質が同定された.今後はこれらのタンパク質が受精においてどのような役割を果たしているかを明らかにすることで受精におけるユビキチン-プロテアソーム系の全貌が明らかにされることが期待される.(2)精子プロテアソームの受精時の挙動を明らかにするために,カタユウレイボヤにおいてGFP融合αサブユニットを持つプロテアソームを発現するTGホヤの作製を試みた.TGホヤの作出には成功したが,GFPの蛍光は観察されなかったため,今後はノックインボヤの作製も視野に入れて研究を進めて行くことを計画している.(3)これまで受精におけるユビキチン-プロテアソーム系は新口動物を用いてのみ行われてきた.そこでこの系が動物において普遍的か否かを明らかにするために旧口動物であるクサイロアオガイ,タマクラゲ等を用いて研究を行った結果,これらの生物の受精もプロテアソーム阻害剤MG-132によって阻害されることが明らかになった.(1)プロテアソームの細胞外ソーティング機構解明のため,マボヤ各組織から20Sプロテアソームを精製し,それらのサブユニット構成を比較,確認した.その結果,マボヤ精子と卵,筋肉においてα6サブユニットの分子量がそれぞれ異なっていることが明らかになった.レクチンブロッティングや,抗リン酸化タンパク質抗体を用いた翻訳後修飾の有無の確認を行なったが,翻訳後修飾を受けていることを示すデータは得られなかった.LC/MS/MS解析の結果,精子由来α6サブユニットはC末端側の16アミノ酸残基が欠失していることが判明した.また,選択的スプライシングの可能性を示唆するデータは得られなかった.本研究の結果,マボヤ精子,卵には特異的なサブユニットが存在しており,精子特異的サブユニットではC末端から16アミノ酸残基までが翻訳後プロセッシングによって切断されていることが示された.これは組織特異的なαサブユニットのC末端部分のプロセッシングが存在することを明らかにした始めての研究であり,この組織特異性が細胞外で働くことに関与している可能性も考えられ,今後の詳細な解析によりこのプロセッシングの重要性が明らかになると期待される.(2)プロテアソームの局在性解析のためのGFP融合プロテアソームを発現するトランスジェニック動物の作成を試み,マウス,ホヤへの遺伝子導入のためのコンストラクト作成まで完了し,現在遺伝子導入を試みている.(3)受精に関与するユビキチン化酵素を明らかにするためにユビキチン化酵素に関する研究を行い,カタユウレイボヤ精巣で特異的に発現しているユビキチン結合酵素を同定し,この酵素が精子形成の後半に発現していることを明らかにした.これは,このユビキチン結合酵素が受精もしくは精子形成において重要な役割を果たしている可能性を強く示唆している.哺乳類やホヤ,ウニの受精において,細胞外ユビキチン-プロテアソーム系は非常に重要な役割を果たしていることが知られているが,その詳細なメカニズムならびに関与している酵素に関してはほとんど明らかにされていなかった.そこで,本研究者は精子ユビキチン化酵素の同定ならびに精子プロテアソームの受精における役割に着目し,以下の研究を進めた.(1)精子膜表面タンパク質や,精子先体反応時に放出されるタンパク質をLC-MS/MSを用いて網羅的に同定し,受精に関与するユビキチン-プロテアソーム系に関与する酵素の同定を試みた.その結果,受精において重要な働きをしていると考えられているマボヤHrTTSP1のカタユウレイボヤオルソログ,ならびにチャネルタンパク質,そして,何種類かのユビキチン化に関与すると予測されるタンパク質が同定された.今後はこれらのタンパク質が受精においてどのような役割を果たしているかを明らかにすることで受精におけるユビキチン-プロテアソーム系の全貌が明らかにされることが期待される.(2)精子プロテアソームの受精時の挙動を明らかにするために,カタユウレイボヤにおいてGFP融合αサブユニットを持つプロテアソームを発現するTGホヤの作製を試みた.TGホヤの作出には成功したが,GFPの蛍光は観察されなかったため,今後はノックインボヤの作製も視野に入れて研究を進めて行くことを計画している.(3)これまで受精におけるユビキチン-プロテアソーム系は新口動物を用いてのみ行われてきた.そこでこの系が動物において普遍的か否かを明らかにするために旧口動物であるクサイロアオガイ,タマクラゲ等を用いて研究を行った結果,これらの生物の受精もプロテアソーム阻害剤MG-132によって阻害されることが明らかになった.
都市的生活様式とその変動要因の解明―時系列比較と国際比較から―

今回の研究成果としては、第一に、現代日本における都市的生活様式とその生成メカニズムを体系的に明らかにしたことが挙げられる。その結果、現代日本においてフィッシャー・ウェルマンの第三の潮流の議論が支持されることが明らかとなり、成果は単著として出版している。また、第二に新しい都市度尺度の開発を進めた。GIS(地理情報システム)によって全国調査の抽出地点の人口ポテンシャルを算出し、人口ポテンシャルと人口規模をはじめとした従来の都市度尺度とその有効性について比較した。その結果、人口ポテンシャルのほうが全体として説明力が高かったため、新しい都市度尺度としての人口ポテンシャルの可能性が示唆されたといえる。平成25年度は研究計画初年度であるため、今後都市社会学の観点から国際比較や時系列比較をおこなっていくにあたり重要な尺度である、都市度尺度の再検討と確立に関する議論を計画していた。そこで平成25年度は、平成の大合併以後、都市度尺度としての有効性を失いつつあるとの指摘がなされている自治体人口に代わる、新しい都市度尺度としての人口ポテンシャルを提案し、その有効性についての実証的検討をおこなった。そうした検討をおこなうにあたり、情報化社会に関する全国調査や、格差と社会意識についての全国調査などの全国調査を用いている。そして、従来利用されていたものよりも詳細な、抽出地点の町丁・字の情報も用いて、抽出地点の町丁・字から半径40kmの範囲の人口ポテンシャルを算出した。そのことにより、町丁・字ごとに算出可能であり、なおかつ近隣自治体に都市的な地域が多いかどうかという、周辺の状況も反映した都市度尺度を構成することができるといえる。そこで、そのようにして算出した人口ポテンシャルと、個人を対象にした全国調査データを結合し、自治体人口と人口ポテンシャルが人々の意識や行動・ネットワークに与える影響の大きさについて検討した。その結果、従来の都市度尺度である自治体人口よりも、本研究が提示する新しい都市度尺度としての人口ポテンシャルのほうが、人々の意識やネットワークのあり方に対してより大きい効果をもつことが明らかとなった。このことは、従来の都市度尺度よりも、本研究で提示する都市度尺度のほうが、都市度による人々の意識やネットワークの差異を明らかにしていくうえで有益であることを示しているといえるだろう。今年度は、これまでの研究成果をまとめた書籍『現代日本における都市メカニズムー都市の計量社会学』を執筆し、ミネルヴァ書房より出版した。その結果、(1)農村と比べて都市のほうが非親族的な紐帯がむしろ豊富であり、ネットワーク密度が低い傾向にあること、(2)都市では趣味的な同類結合がより促進される傾向にあるため、新しい文化や価値観が生まれやすい傾向にあること、(3)一般に流布している、都市における無力感や孤独感の増大、規範の崩壊といった言説については、計量分析からは支持されないこと、(4)都市においては、創造性を含む非通念性(通念にとらわれない傾向)が高い傾向にあり、それは(1)や(2)でみられた都市のネットワーク特性によって生み出されていること、といった点が明らかとなった。したがって、「無縁社会」の源泉として語られる都市は、現代日本においてはそうしたイメージとは逆に、むしろ活発なコミュニティが存在する場所であり、そうした活発なコミュニティによって、都市の創造性が高められているといえるのである。また、そうした研究の一環として人々のつながりを表すソーシャル・キャピタルに関する国際比較研究も行い、社会学における代表的な国際学会である国際社会学会(International Sociological Association)で報告を行うなど、研究成果の海外に向けた発信についても、議論が進められたといえる。研究計画最終年度である平成27年度においては、主に以下の2点の研究活動を行った。(1)都市的生活様式の時系列分析に着手したこと、(2)都市の計量社会学の議論を理論・方法の両面からまとめたこと、である。1点目については、「第2回都市生活と家族に関する意識調査」に参加し、親密な友人に関する時系列分析を行った。「第2回都市生活と家族に関する意識調査」は、1994年に朝霞市と山形市を対象に行われた「第1回都市生活と家族に関する意識調査」と比較可能な設計で約20年後の現代において再び調査したものである。そして第1回調査と第2回調査の比較分析を行った結果、日本における親密な友人における年齢や趣味に関する同質性が高まっていることを明らかにした。そしてそのような傾向は特に山形で強く生じており、地方都市の状況により大きな変化があった可能性を示唆するなど、都市社会学の新展開にもつながる内容を調査報告書にて報告している。また、2点目については、数理社会学会が監修した『計量社会学入門』において、都市の計量研究における理論と方法に関する内容を担当した。これまでの代表的な都市理論の議論をまとめ、調査・分析手法との対応関係について議論し、都市社会学の理論と方法についてまとめた。研究期間全体をとおして、(1)都市度尺度の再検討と確立に関する議論については、GISを用いた研究成果を査読付き論文を含めて公表し、(2)時系列分析については都市社会学の代表的な調査の一つである「都市生活と家族に関する意識調査」の時系列分析に取り組んだ。また、(3)国際比較研究に関しては国際社会学会での査読付き報告をはじめとして、学会報告を複数回行っている。さらに、これまでの研究成果をまとめた単著を出版することもできたことから、当初計画していた以上に研究を進めることができたといえる。

その結果、現代日本においてフィッシャー・ウェルマンの第三の潮流の議論が支持されることが明らかとなり、成果は単著として出版している。また、第二に新しい都市度尺度の開発を進めた。GIS(地理情報システム)によって全国調査の抽出地点の人口ポテンシャルを算出し、人口ポテンシャルと人口規模をはじめとした従来の都市度尺度とその有効性について比較した。その結果、人口ポテンシャルのほうが全体として説明力が高かったため、新しい都市度尺度としての人口ポテンシャルの可能性が示唆されたといえる。おおよそ予定通り、これまでの研究をまとめた書籍を出版することができたのに加え、国際学会での報告を行うなど、研究成果の海外への発信という点でも進展が見られたため。都市社会学データ分析を進めながら国際比較研究を行い、国際学会での報告と、海外ジャーナルへの論文の投稿を行っていく。当初の計画では、平成25年度は、地理情報システム(GIS)も活用しながら新しい都市度尺度を構成していくことを主な目的としていた。そしてその点についてはほぼ完全に達成することができており、査読付きの学術論文としても刊行されている。また、それに加えて、平成25年度のうちに人々のつながり(ソーシャル・キャピタル)に関する国際比較にも着手しはじめており、当初の予定以上に計画が進行していると考えることができる。次年度は日本社会学会での報告を含め、出張が多くなることが予想されたため、出張旅費を想定して次年度への繰り越しが発生した。今後の研究の推進方策としては、大きく二点のものを考えている。第一に、これまでの自身の研究から明らかになっている知見をまとめ、都市社会学に関する書籍として刊行する準備を進めることである。この書籍については日本国内の検討をおこなったものを予定しており、今後の研究課題として、国際比較研究の必要性を指摘する研究として位置づけることができる。そして第二に、実際に都市効果や人々のつながり(ソーシャル・キャピタル)に関する国際比較研究をおこない、都市や人々のつながりに関する従来の仮説が当てはまる社会と当てはまらない社会の差異とともに、そうした差異が生じる要因についても検討をおこなう。次年度は学会報告を中心とした出張が多くなることが予想されるため、海外の国際会議や学会への参加も想定し、出張旅費としての使用を多めに計画している。それらに加え、海外ジャーナルへの投稿を行う際の英文校閲費や図書の購入に関する費用も計画している。
有機-無機ナノハイブリッドにおける高効率りん光発光機構の解明と発光素子への応用

1.共蒸着による有機-無機ナノハイブリッドの作製とナノハイブリッドにおけるelectrophosphorescence1)有機半導体4,4'-N,N'-ジカルバゾールジフェニル(CBP)とEuI_2,CeI_3,CeBr_3,CeF_3,TbI_3,PbI_2とを重量比2:1で二元共蒸着することにより、均質な薄膜をえることができた。これらの薄膜の電子顕微鏡観察から、CBPを媒体として半径数nm数十nmの金属ハライド微粒子が分散した有機-無機ナノハイブリッドが形成されていることが明らかとなった。2)いずれのナノハイブリッド薄膜においても、CBPからの蛍光が観測されCBPからのりん光や無機ナノ粒子からの発光は観測されなかった。3)有機-無機ナノハイブリッド薄膜を発光層として有機肌素子を作製した。いずれの素子においてもCBPのりん光発光(electrophosphorescence)が観測された。2.Electrophosphorescenceの発光機構ホール輸送性および電子輸送性の有機半導体を用い、CeF3との6種の有機-ナノハイブリッドを作製した。1)光励起の場合、いずれのナノハイブリッドも有機物の蛍光を示した。2)肌素子とした場合、ホール輸送性の有機物を用いた場合には有機物のりん光発光が観測された。これに対して、電子輸送性の有機物からの発光は観測されず、CeF_3からの発光が観測された。以上の結果より、f軌道に電子を一つ持つC^<3+>はその電子を放出して閉殻構造をつくりC^<4+>になりやすい。このC^<4+>はさらに電子を捕獲してC^<3+*>となる。ホール輸送性の有機物はこのC^<3+*>とデクスタータイプのエネルギー移動を起こし、励起三重項状態が生成されりん光が観測されたものと考えられる。これに対して、イオン化ポテンシャルの大きな電子輸送性の有機物ではこのエネルギー移動が起こらず、CeF_3からの発光が観測されたものと考えられる。1)共蒸着による種々の金属ハライドを分散させた有機-無機ナノハイブリッド薄膜の作製有機半導体4,4'-N,N'-ジカルバゾールジフェニル(CBP)とEuI_2,CeI_3,CeBr_3,CeF_3,TbI_3,PbI_2とを重量比3:1二元共蒸着することにより、均質な薄膜をえることができた。2)有機-無機ナノハイブリッド薄膜の発光特性いずれのナノハイブリッド薄膜においても、CBPからの蛍光が観測されCBPからのりん光や無機ナノ粒子からの発光は観測されなかった。3)有機-無機ナノハイブリッド薄膜を発光層とした有機EL素子の特性有機-無機ナノハイブリッド薄膜を発光層としてITO/ジアミン誘導体(TPD)/有機-無機ナノハイブリッド/バソクプロイン/アルミキノリノール錯体(Alq3)/AILiの有機EL素子を作製し、その素子特性を評価した。EuI2を用いた場合にはEu2+の5d-4f遷移に起因した発光が観測されたが、その他の金属を用いた場合には、CBPのりん光スペクトルと一致したELスペクトルが観測された。また、ELの過渡応答から、その発光寿命は19μsecと非常に長いことがわかった。

以上のことから、これらのナノハイプリットからの発光はCBPのりん光に起因したものであることが明らかとなった。1)光励起の場合、いずれのナノハイブリッドも有機物の蛍光を示した。2)EL素子とした場合、ホール輸送性の有機物を用いた場合には有機物のりん光発光が観測された。これに対して、電子輸送性の有機物からの発光は観測されず、CeF_3からの発光が観測された。以上の結果より、f軌道に電子を一つ持つC^<3+>はその電子を放出して閉殻構造をつくりC4+になりやすい。このC^<4+>はさらに電子を捕獲してC^<3+*>となる。ホール輸送性の有機物はこのC^<3+*>とデクスタータイプのエネルギー移動を起こし、励起三重項状態が生成されりん光が観測されたものと考えられる。これに対して、イオン化ポテンシャルの大きな電子輸送性の有機物ではこのエネルギー移動が起こらず、CeF_3からの発光が観測されたものと考えられる。
体外循環時のリンパ球減少におけるアポトーシスの関与

人工心肺後や補助循環後には、免疫能が障害され、患者はcompromised hostの状態となる。免疫能低下の主たる要因は、体外循環によるリンパ球減少であり、とくにリンパ球サブセットの面ではhelper Tcell優位のリンパ球減少が生じ、免疫系全体に影響を与える。このようなhelper Tcell優位のリンパ球減少におけるアポトーシスの関与を検討した。2.長時間の体外循環であるPCPS(Percutaneous cardiopulmonary support)においても、同様にアポトーシスによるリンパ球減少が生じたが、生存例と死亡例における末梢リンパ球数の推移をみると、生存例ではlymphocytopeniaからの回復が早く、PCPS終了後5日目には正常値となるのに対し、死亡例ではlymphocytopeniaが遷延する現象が認められ、離脱後、lymphocytopeniaからの回復状態が予後を占う指標となり得ることが示唆された。アポトーシスは炎症反応、宿主の免疫反応、そして組織障害のメカニズムなどの制御に重要な役割を果たしているとされる。脂肪酸生成酵素(fatty acid synthetase:Fas)は、細胞膜に結合したタンパクのひとつであって、Fasリガンド(Fas ligand:Fas-L)の仲介を経てアポトーシスを誘導する物質の一つとして広く知られている。可溶性のFas(sFas)はメッセンジャーRNA(mRNA)の合成経路の途中で生成され(translation product)、FasとFas-Lとの連携を介した細胞膜Fas分子の働きに拮抗している。一方、sFasのリガンド(sFas-L)は細胞表面から放出され、アポトーシスを誘導する物質としての働きをしている。アポトーシスおよび心臓手術における外科的侵襲と、FasとFas-Lが仲介して示す作用との関連性を研究するために、心臓手術患者14例においてsFasおよびsFas-Lの血漿中のレベルを調べた。方法:血液サンプルは手術前、人工心肺終了時、手術終了時、および手術終了12時間後に採取した。血漿中のsFasおよびsFas-Lレベルはsandwich enzyme-linked immunosorbent assey法を用いて調べた。結果:手術前と比較すると、手術終了時にはsFasの血漿中のレベルは有意に上昇し、そして手術12時間後には手術前のレベルにまで戻ることが認められた。一方、手術中あるいは手術後において、血漿中にsFas-Lは検出されなかった。結論:メカ二ズムや意義はまだ不明なるも、心臓手術患者において血漿中のsFasレベルが上昇することが認められた。
複数装置使用時における時間差補正メカニズムの解明

行為とそれに伴う感覚結果の時間的間隔が知覚的にどのように補正されるのかという課題に関して,本年度は主に以下の内容について検討を行い,成果について国内外の学会で研究発表を行った。1行為と感覚結果の時間的結合において,事象間の感覚変化の対応関係が重要であるという仮説を立て,行為と結果の種類の組み合わせが時間評価に及ぼす影響を検討した。その結果,刺激の出現が感覚結果として呈示された場合には,Press条件の方がRelease条件よりも時間が短く評価されたが,刺激の消失が感覚結果として呈示された場合には逆にRelease条件の方がPress条件よりも時間が短く評価された。これらの結果から,事象間における感覚変化の一貫性が時間的結合に関与することが示唆された。2時間的結合の生起メカニズムを検証するため,知覚タイミングの変化量とばらつきの関係性を調べた。実験の結果,感覚結果の知覚タイミングのばらつきが高い場合には,低い場合に比べて感覚結果のタイミングの変化は大きくなった。この結果に基づき,行為から予測された時間と実際の時間が確率的に統合され,時間的変化が生じる可能性について考察を行った。3空間的近接性が知覚タイミングに及ぼす影響について,刺激の位置による視認性の違いを考慮して再度検討を行った。その結果,前回の結果と同様に偏心度条件間で違いは見られなかった。以前に行った時間間隔評価の実験結果との比較から,空間的な情報は時間間隔の計時の際に生じること,また実験方法によって時間的結合の生起メカニズムが異なることを考察した。本研究は,行為と感覚フィードバック間の時間的間隔が知覚的にどのように補正されるのかについて,多様な装置や感覚情報を利用して検討することを目的としている。平成27年度は,主に行為後に複数の感覚情報(視覚・聴覚情報)を呈示し,順序判断や同時性判断を行うことで感覚情報間の知覚タイミングの違いを調べるとともに,刺激特徴を変化させてそれが及ぼす影響について検討を行った。その結果,視覚刺激の方が聴覚刺激よりも少し先行して呈示されたときに,それらの呈示タイミングが同時に知覚されることが示された。この結果は,視聴覚情報間の神経伝達速度の違いを反映していると考えられる。一方で,視覚刺激を運動させて呈示した場合には知覚タイミングの違いは消失し,物理的に同じタイミングで呈示されたときに同時に知覚されるという結果が示された。この結果は,順序判断課題においても同時性判断課題においても同様であった。また運動速度を操作して速度条件間の比較もおこなったところ,どの速度条件においても同じ呈示タイミングで視聴覚刺激の出現が同時だと知覚された。この結果から,運動速度自体は知覚タイミングの補正に重要でないことも明らかとなった。この運度情報による感覚間の同時性の変化は,行為(身体運動)と結果(運動刺激)の類似性によるものである可能性が考えられる。そこで今後は,感覚フィードバックの刺激特徴による影響も考慮に入れ,行為と結果の時間的間隔の変化についてより直接的に検討を行う。研究機関の異動により実験環境を新たに整備する必要があり,当初行う予定であった複数装置を用いての遅延時間評価の検討については実験実施に至ることができなかった。しかし,既に機材や方法論の面で準備の整っていた感覚間の同時性判断については,実験を重ねることができた。この実験結果から予備的な知見を得ることができ,今後の研究計画の円滑な実施に向けて準備は整ってきている。これらの点から,当初の計画に比べてやや遅れているものの問題なく進展していると言える。本研究は,行為とそれに伴う感覚結果の時間的間隔が知覚的にどのように補正されるのかについて,特に使用する装置や感覚情報の違いに着目して検討することを目的としている。平成28年度は,主に行為に伴う感覚結果の空間的位置が,知覚されるタイミングに及ぼす影響について検討を行った。具体的には,画面上のターゲットに対して行為をおこなった後,遅延時間を挟んで呈示される感覚刺激の偏心度を操作し,遅延時間の評価に及ぼす影響を調べた。また物理的に行為をおこなう対象やその位置の重要性についても同時に調べるため,マウスやタッチパネルディスプレイなど,複数の入力装置を用いて影響の比較を行った。その結果,入力装置による違いは見られなかったが,画面上の行為ターゲットの位置と刺激出現位置との空間的隔たりによって知覚タイミングが変化することを確認した。この成果については,国内で開催された研究会で発表された。またこの結果から,特定の入力装置を用いた刺激操作の経験が,知覚タイミングの変化に影響する可能性が示唆されたため,これを踏まえて新たな実験計画の立案と実験準備をおこなった。この研究については,共同研究者によって先行研究の調査や予備的な実験も既に進められており,すぐにデータの収集に取りかかれる状況にある。今後は,今年度の研究で示された空間的位置の影響について更に実験を積み重ねると共に,経験による影響に関しても実験を進める予定である。平成28年度は研究代表者の異動に伴い研究機関が再びの変更となり,実験環境を再度整備し直す必要が生じたが,前年度から準備を進めていた実験については十分に検討することができ,また経験による影響を調べるという新たな研究の方向性も見出すことができた。当初の計画にはまだ遅れがあるものの,目標に近づきつつあることから,おおむね順調に進んでいると判断する。

本年度は,主に以下の内容について検討を行った。1特定の入力装置を用いた刺激操作経験が,行為と結果の時間間隔の知覚に及ぼす影響について実験的に検討した。刺激がレバーを倒した向きと同方向に動く経験を事前に学習した群では,レバーを倒したときに刺激が同方向に動く条件の方が,反対方向に動く条件よりも時間間隔が有意に短く評価された。一方で,刺激がレバーと反対方向に動く経験を事前に学習した群では,時間間隔の評価に有意な差は見られなかった。これらの結果から,行為と結果の時間間隔の知覚に,経験に基づく空間的な対応関係の予測が関わることを明らかにした。2前年度に示された空間的近接性の影響について,Libet clockパラダイムを用いて行為と感覚結果の知覚的タイミングを測定したところ,偏心度条件間で有意な差が示されなかった。このことから,持続時間の判断の場合にのみ空間的近接性の影響が生じることが示唆された。ただし刺激の呈示方法の違いが影響した可能性も考えられるため,今後は呈示方法を揃えて再検討を行う予定である。3自発的行為に伴う主観的時間の変容に関して,過去10年の動向をまとめたレビュー論文や最新の実証的研究などの文献を紹介し,行為主体感との関係性について議論した(山本, 2017)。4行為の種類が時間間隔の判断に及ぼす影響について,行為とフィードバック時の感覚情報変化の一貫性が寄与しているという仮説を立て,先行研究を整理し実験計画を作成した。研究期間中に生じた研究機関の異動により,実験環境の再整備や新たな機関での業務への対応に時間がかかり,当初の計画に比べて遅れが生じてしまった。計画していた研究を完了させるために事業期間延長を申請し承認が得られたため,この期間を利用して残された研究の実施と成果の公表を行う。行為とそれに伴う感覚結果の時間的間隔が知覚的にどのように補正されるのかという課題に関して,本年度は主に以下の内容について検討を行い,成果について国内外の学会で研究発表を行った。1行為と感覚結果の時間的結合において,事象間の感覚変化の対応関係が重要であるという仮説を立て,行為と結果の種類の組み合わせが時間評価に及ぼす影響を検討した。その結果,刺激の出現が感覚結果として呈示された場合には,Press条件の方がRelease条件よりも時間が短く評価されたが,刺激の消失が感覚結果として呈示された場合には逆にRelease条件の方がPress条件よりも時間が短く評価された。これらの結果から,事象間における感覚変化の一貫性が時間的結合に関与することが示唆された。2時間的結合の生起メカニズムを検証するため,知覚タイミングの変化量とばらつきの関係性を調べた。実験の結果,感覚結果の知覚タイミングのばらつきが高い場合には,低い場合に比べて感覚結果のタイミングの変化は大きくなった。この結果に基づき,行為から予測された時間と実際の時間が確率的に統合され,時間的変化が生じる可能性について考察を行った。3空間的近接性が知覚タイミングに及ぼす影響について,刺激の位置による視認性の違いを考慮して再度検討を行った。
エピジェネティック制御による機能的ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞由来心筋細胞の取得法の確立

ヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞(hESC/iPSC-CMs)は、移植治療などへの実用化が最も期待されている組織細胞であるが、一般的に未成熟で胎児性心筋細胞と類似しており、成人の心機能とは異なる。今回、HDAC阻害剤の添加により、hESC/iPSC-CMsの心機能を亢進し、hERGチャネル阻害剤に対する応答性を改善できた。また、多能性幹細胞の撹拌の不必要な三次元培養法を開発し、効率的な増殖生産を可能とした。これらを組み合わせることで、実用化に必要な機能細胞の安定的な供給に大きく貢献することが期待できる。ヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞(hESC/hiPSC-CMs)は、一般的に胎児性心筋細胞と類似し、成人の心機能とは異なる。本研究ではin vitroにおける機能的hES/iPSC-CMsの短期間での取得法の確立を目指す。これまでに浮遊培養は短期間で明確にhESC-CMsの心筋特異的遺伝子の発現誘導を引き起こすことから、接着培養条件下で化合物添加により浮遊培養を再現できれば、hESC-CMsの心機能の亢進・成熟へと繋がると考える。一般的に遺伝子発現の増強には、ヒストンのアセチル化が関与するクロマチンの活性化が関連するので、ヒストンのアセチル化レベルをimmunoblotting法にて確認した。その結果、明らかに浮遊培養において増強が認められた。従って、HDAC阻害剤が接着培養条件下におけるhESC-CMsのヒストンのアセチル化レベルを増強できるかを調べたところ、HDAC阻害剤で処理したhESC-CMsは、対照実験のDMSO処理と比べて、2.7倍の増強が認められた。また、実際に遺伝子発現を誘導できるかを定量PCR法で調べたところ、HDAC阻害剤処理群では心筋特異的な遺伝子のERG1bやKCNQ1、HCNの発現増強が認められた。次に細胞外電位(MEA)を用いて、hESC-CMsの電気生理学的な機能を解析した。分化誘導間もない未成熟なhESC-CMコロニーは、hERGチャネル阻害剤であるE4031に対してQT延長や頻脈などを示し、その応答性は同質ではなかった。これらをHDAC阻害剤で処理すると、すべてのhESC-CMコロニーにおいてQT延長が認められた。また、いくつかのHDAC阻害剤を添加したところ、拍動数に対する応答性が異なることが認められた。従って、より効果的な化合物の同定により、エピジェネティックな制御がどのように機能細胞の取得に関与しているかを示唆できると考える。このように、HDAC阻害剤の処理により、同質で機能的なhESC-CMsを取得できることが分かった。浮遊培養は短期間で明確にhESC-CMsの心筋特異的遺伝子の発現誘導を引き起こすことから、接着培養条件下で化合物添加により浮遊培養を再現できれば、hESC-CMsの心機能の亢進・成熟へと繋がると考える。

浮遊培養では、ヒストンのアセチル化レベルの増強が認められたことから、接着培養条件下でHDAC阻害剤で処理ところ、ヒストンのアセチル化レベルの増強および心筋特異的遺伝子の発現増強を誘導でき、浮遊培養を再現できた。細胞外電位(MEA)を用いた機能解析では、分化誘導間もない未成熟なhESC-CMコロニーは、hERGチャネル阻害剤であるE4031に対してQT延長や頻脈を示し、その応答性は同質でなかった。これらをHDAC阻害剤で処理すると、すべてのhESC-CMコロニーにおいてQT延長が認められた。いくつかのHDAC阻害剤を添加では、拍動数に対する応答性の違いが認められた。つまり、より効果的な化合物の同定により、エピジェネティックな制御が機能細胞の獲得に貢献することが示唆される。さらに、再生医療などへの実用化には、均質な細胞の大量供給が求められる。一般的に成体心筋細胞はその増殖能力を失っているため、大量の機能細胞の獲得に、多能性幹細胞の大量培養法の開発が不可欠である。しかし、多能性幹細胞の浮遊培養系では、撹拌による細胞ダメージのため、効率的な増殖生産はできなかった。今回、機能性高分子の使用で、細胞塊を三次元的に浮遊し、撹拌の不必要な三次元培養法の開発し、効率的な増殖生産を可能とした。これにより、実用化に必要な機能細胞の安定的な供給に大きく貢献することが期待できる。幹細胞生物学昨年度までに、当初予想した様に、エピジェネティックを制御する化合物の添加は、hESC-CMsにおいてヒストンのアセチル化レベルを増強し、心筋特異的遺伝子の発現を増加させることを明らかにした。つまり、エピジェネティックの制御は、接着培養条件下で浮遊培養の効果を再現できた。また、心筋特異的遺伝子の発現増加に伴い、hESC-CMの機能に関しても同様に増強でき、同質な機能細胞を獲得できることを明らかにした。本年度は、より効果的な化合物を同定する為に化合物のスクリーニングを行った。様々なHDAC阻害剤を添加したところ、拍動数に対する応答性が異なることが認められた。従って、定量PCR法を用いて、その効果の機能解析を行う予定であったが、実施に至らなかったので、やや遅れている結果となった。当初予想した様に、エピジェネティックを制御する化合物の添加は、hESC-CMsにおいてヒストンのアセチル化レベルを増強し、心筋特異的遺伝子の発現を増加させることを明らかにした。従って、エピジェネティックを制御することで、長期再接着培養を介さず機能的hESC-CMsを取得可能であることを示唆できたことから、おおむね順調に進展している結果である。平成25年度に引き続き、化合物による心機能亢進に関する解析を定量PCRやMEA測定法を行う。特に、化合物により拍動数に対する応答性が異なることが示唆されたので、その再現性と効果的な化合物の特定解析を行う予定である。化合物を特定することで、エピジェネティックな制御がどのように機能細胞の取得に関与しているかを示唆できると考える。
超伝導接合における非平衡輸送現象と奇周波数クーパー対

奇周波数クーパー対とは、従来の仮定の下では現れない新奇なクーパー対である。この新奇電子対は、たとえ超伝導体が従来型であっても、その表面や界面には必ず現れる事が解っている。奇周波数クーパー対の物理を発展させることで、従来理論では説明不可能だった未解明問題を解決できる可能性がある。本研究では超伝導接合系における奇周波数クーパー対の振る舞い、特に、非平衡輸送現象における役割を明らかにする。
癌におけるＣＤ４４を介したＲＯＳ制御機構の解明と治療への応用

腺癌および扁平上皮癌の腫瘍増大のみならず転移巣形成においてもCD44vはシスチントランスポーターであるxCTタンパク質との相互作用により癌細胞の酸化ストレス抵抗性を亢進させることを見出した。固形癌の原発巣だけでなく循環癌細胞であるCirculating Tumor CellにおいてもCD44/xCT相互作用が、重要な機能を果たすことを示した。さらにCD44発現を制御するmicroRNAとしてmiR-328を同定し、胃癌の発癌・進展における意義を明らかにした。申請者らはCD44vがシスチントランスポーターのサブユニットであるxCTタンパク質と相互作用し安定化することで、細胞外からのシスチンの取り込みを増大させると共に、主要な抗酸化物質である還元グルタチオンの産生を高め、癌細胞の抗酸化能を亢進させること。シスチントランスポーターの特異的阻害剤であるスルファサラジンには、肺転移巣の形成や腫瘍増大を抑制すると共に抗癌剤感受性を向上させる効果があることを見出した。さらに頭頸部扁平上皮癌細胞におけるCD44v-xCTによる酸化還元状態制御機構の意義を明らかにすると共に、xCT阻害剤が、CD44v陽性腫瘍細胞を選択的に標的とすることを報告した。本年度は、肝細胞癌におけるxCT発現と腫瘍進展ならびに予後との関連性について示した。更には、胃癌自然発症モデルマウスを用いたスルファサラジン治療実験の結果、胃癌の前がん病変と考えられるspasmolytic polypeptide-expressingmetaplasia (SPEM)の発生を抑制することにより多段階的な胃癌発生を予防する可能性がある事を生体レベルで明らかにした。以上より、xCTを標的とした治療はCD44v陽性の未分化な癌細胞を標的とするだけでなく、前がん病変であるmetaplasiaにおいてもCD44v陽性の化生細胞を標的とすることが明らかとなり、癌の治療および予防に効果的な治療法を開発できる可能性が示唆された。これまでの研究で、申請者らはCD44vがシスチントランスポーターのサブユニットであるxCTタンパク質と相互作用し安定化することで、細胞外からのシスチンの取り込みを増大させると共に、主要な抗酸化物質である還元グルタチオンの産生を高め、癌細胞の抗酸化能を亢進させることを見出している。今回の研究において、シスチントランスポーターの特異的阻害剤であるスルファサラジンには、肺転移巣の形成や腫瘍増大を抑制すると共に抗癌剤感受性を向上させる効果があることを見出した。しかし、xCT阻害剤が、癌幹細胞様の腫瘍細胞に対して選択的に効果を有するかについては不明瞭なままであった。そこで、頭頸部扁平上皮癌細胞におけるCD44v-xCTによる酸化還元状態制御機構の意義を明らかにすると共に、xCT阻害剤が、CD44v陽性腫瘍細胞を選択的に標的とするかについて生体レベルで検討した。その結果、頭頸部扁平上皮癌細胞においてはxCT阻害剤による細胞増殖抑制効果はCD44vの発現量と相関し、CD44v発現が高い癌細胞は、低い細胞と比較してxCT活性への依存性が高いことが分かった。また、担癌マウスにおけるスルファサラジン治療は、選択的にCD44v陽性腫瘍細胞にアポトーシスを誘導するものの、CD44v陰性細胞にはほとんど影響しないことが分かった。一方、スルファサラジン感受性が低いCD44v陰性腫瘍細胞では、上皮成長因子受容体(epidermal growth factor receptor : EGFR)の活性化を示し、xCTの活性よりもEGFRの活性に依存することが分かった。以上より、xCTを標的とした治療はCD44v陽性の未分化な癌細胞を、EGFRを標的とする治療はCD44v陰性の分化した癌細胞を標的とすることが明らかとなり、両者を併用することで、より効果的な治療法を開発できる可能性が示唆された。これまでの研究結果から、腫瘍増大および転移巣形成においてCD44vはシスチントランスポーターであるxCTタンパク質との相互作用により癌細胞の酸化ストレス抵抗性を亢進させることを見出した。今回、申請者らは消化器癌患者の末梢血中に存在するCTC(circulating tumor cell)の分離をおこない、免疫不全マウスへの移植継代をおこなった。腫瘍の細胞分画解析の結果、CD44陽性CTCはxenograft modelにおける腫瘍形成能が高い事ならびに循環癌細胞であるCTCにおいてもCD44/xCT相互作用が重要な機能を果たすことを示した。また、これまで明らかになっていないCD44発現制御メカニズムとしてmicroRNAに注目し、miRNA PCR Arrayを用いた網羅的解析によりCD44発現を制御するmicroRNAとしてmiR-328を見出した。更に腫瘍間質中に存在するマクロファージが産生する活性酸素により癌細胞のmiR-328発現が低下、その結果CD44発現が誘導される事を明らかにした。この発現制御メカニズムを介して高発現するCD44は癌幹細胞としての性質獲得や維持に働いているだけでなく、胃癌の背景粘膜である化生胃粘膜上皮においても高発現しており、ヘリコバクターピロリを介した胃癌の発癌過程にも深く関わる可能性が示された。

今年度の研究成果並びに前年度までの胃癌自然発症マウスモデルを用いた解析結果からCD44は消化器癌の発癌から転移巣形成の過程で、多くのステップに関与しており癌治療・予防における治療標的としての意義が大きい事が示唆された。消化器外科学当初の研究計画に基づいて研究を遂行しており、得られた研究成果を学会発表ならびに科学研究誌へ報告している。当初の研究計画に基づいて研究を遂行しており、得られた研究成果を学会発表ならびに科学研究誌へ報告している。これまでの研究結果からCD44v発現が高い癌細胞は、低い細胞と比較してxCT活性への依存性が高いこと、胃癌自然発症モデルマウスであるK19-Wnt1/C2mEマウスにおいてxCT阻害剤の治療効果はCD44v陽性の未分化な癌細胞を標的とするだけでなく、前がん病変であるmetaplasiaにおいてもCD44v陽性の化生細胞を標的とすることが示された。さらに今回の結果を踏まえて、癌細胞においてCD44vが高発現するメカニズムを明らかにすることで、xCT阻害剤だけでなく新たな治療標的を創出するための解析を進めていく。申請者らは、CD44発現を制御する因子としてmicroRNAに注目しており、microRNAを介した発現制御メカニズムについて網羅的解析に基づき同定されたmicroRNAの機構解析を進める。また、臨床検体からの解析も同時に進めており術後検体のみならず末梢血中に存在するCTC(circulating tumor cell)の分離をおこない、CD44およびxCT発現意義について解析をおこなっていく。細胞株や胃癌自然発症モデルマウスによる解析から見出したCD44v-xCTによる酸化還元状態制御機構の意義をhuman sampleを用いて検証することが可能であり、臨床応用へ向けた礎となり得る。これまでの研究結果からCD44v発現が高い癌細胞は、低い細胞と比較してxCT活性への依存性が高いことが明らかになり、xCT阻害剤による細胞増殖抑制効果はCD44vの発現量と相関することが示された。今回の結果から、癌細胞においてCD44vが高発現するメカニズムを明らかにすることで、xCT阻害剤だけでなく新たな治療標的を創出するための解析を進めていく。また申請者らは、これまで胃癌モデルマウス(トランスジェニックマウス)を用いた解析にてマウス胃がん細胞はCD44を高発現することを示してきた。この胃癌自然発症モデルマウスであるK19-Wnt1/C2mEマウスにおいてxCT阻害剤による治療効果について評価をおこなう。このマウスは自然発症胃癌モデルであり、これまでの解析から20週齢から30週齢にかけて腫瘍が急速に増大することを確認しているので、この時期に阻害剤の投与をおこなうことで治療効果を評価するとともに、20週齢以前に阻害剤の投与をおこなうことで腫瘍の予防効果についての評価も行う予定である。得られる結果はXenograft modelに比べて自然発癌における治療効果の検証が可能であり、臨床応用へ向けた礎となり得る。当初の想定より、消耗品を安価で購入することができたため。
外生菌根共生の分子研究基盤整備と共生機構の解明

本研究では,森林樹木アカマツ・コナラなどの代表的外生菌根種であるマツタケ(Tricholoma matsutake),バカマツタケ(Tricholoma bakamatsutake),ホンシメジ(Lyophylum shimeji)ならびに非菌根性近縁菌ハタケシメジ(Lyophylumdecastes)などを対象に,半数体菌株の作出ならびに特性評価,形質転換法の検討を行った。菌根共生解明の研究基盤として利用可能なホンシメジならびにハタケシメジ半数体株それぞれ1株ずつを選定し,ゲノムDNA解析に供試した。外生菌根菌の分子研究基盤として必要不可欠な,形質転換手法と相同組替に基づく遺伝子破壊実験系の構築について,ホンシメジ,バカマツタケ,マツタケならびにショウロの保存菌株を用いて検討した.ホンシメジならびにマツタケではプロトプラスト・PEG法による形質転換が可能であるが,バカマツタケは培地における生育がきわめて遅く形質転換に必要なプロトプラストを得ることは困難であった.そこで,プロトプラストを用いず形質転換が可能なAgrobacterium法を用いた形質転換実験を外生菌根菌種に試みた.また,対比の為に,エノキタケ,ブナシメジ,マイタケ,ヒラタケ等の材腐朽性の担子菌類もあわせて用いた.その結果,外生菌根菌種では,形質転換株は得られなかった.エノキタケやブナシメジをもちいた対照実験では耐性株が高効率に得られていることから,Agrobacterium法で用いた形質転換プラスミド上の耐性遺伝子プロモーターが外生菌根菌種に対して不適当であった可能性が示唆された.プロトプラスト・PEG法でのプラスミドをもとにベクターの改変を行っている.また,相同組換率の算出ならびに相同組換体を効率よく選抜する為の手法として,殺菌剤耐性ならびに,ポジ・ネガ選抜マーカーの開発を試みている.また,菌株採集を行った.その結果,バカマツタケ,マツタケ,ショウロの新たな菌株を得ることができた.同時に,バカマツタケならびにマツタケの担胞子形成時の核行動ならびに,担胞子発芽法についても研究を行った.マツタケならびにバカマツタケ成熟担子胞子の核数を調べたところ,マツタケは基本的に単核性であるが,バカマツタケでは2核性のものが多かった.担子器上での担胞子の発達過程を観察した結果,マツタケではpost-meiotic mitosisが担胞子中で同調的におこるが,バカマツタケでは非同調的で娘核が担子器に逆移行せず,2核性の胞子と単核性の胞子が同一の担子器に生ずることが明らかとなった.両者の有性生殖における遺伝制御は異なっている可能性が示唆された昨年度予定していた,半数体分離株作出実験が培養機器故障で遅延したため,本繰り越し期間を用いて再度実験を行った。さらに,外生菌根菌ホンシメジの近縁種であり非菌根性と考えられているハタケシメジも供試し,半数体分離株作製を行った。ハタケシメジ(Lyophyllum decastes)は,外生菌根形成可能との報告もあるので,アカマツ実生を用い、菌根形成能の有無について調べた。その結果,本実験に供試したハタケシメジは菌根形成せず,腐生性の強い系統であると思われた。さらに,rDNA ITS配列を明らかにし,データベースデータと比較し分子系統解析を行った結果,本邦でLyophyllum decastesと認識されているグループに分類可能で,ホンシメジLyophyllum shimejiの極近縁種であることを確認した。ハタケシメジの2系統について得られた子実体から単胞子分離を試みた。発芽培地としては1/5GY寒天培地を用い,胞子落下法で分散後,発芽胞子をマニュプレーションして分離しようとした。しかしながら,2系統とも胞子発芽率はきわめて低く,単胞子分離株は得られなかった。そこで,ホンシメジの担子胞子発芽に有効な酪酸を培地に添加したところ,発芽率は10%ほどに上昇した。このようにして得られたハタケシメジ半数体分離株,ならびにホンシメジ半数体株をそれぞれ,対峙培養し交配型の決定を行いコンパチブルな複数菌株組み合わせを標準菌株候補として選抜した。また,外生菌根菌オオキツネタケ(Laccaria bicolor sens Jpn Auct)についても,子実体組織分離株の保存菌株の中にクランプコネクション消失株を見いだした。本菌株については,核行動を観察し,本菌の半数体分離株として利用可能か調査している。本年度は,外生菌根菌ホンシメジならびに近縁種で非菌根性ハタケシメジの重相株ならびに半数体株を用い,Agrobacterium法による形質転換法の検討を試みた.昨年度までに,宿主担子菌の前培養日数ならびに菌糸分断処理後,感染処理までの培養日数が形質転換効率に影響を及ぼし,且つ菌種・菌株によって異なることが明らかになっていたため,供試株で最適化を行った。