hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
放射性物質の都市河川および都市沿岸域における挙動把握

内湾に流入する放射性物質は、細粒土砂に吸着しているが、通常は河口部でコロイド化して沈降して、堆積する。しかし悪天候時には、河川流量の大幅な増加により河床が削られ下流に移動する。特に内湾では、河川水が内湾の表層を低塩分水と伴に移動するために、河口から10km以上離れた地点にも到着するため、その輸送過程は、主に河川流量や内湾の流動などによって変化する。また内湾に堆積した細粒土砂は、波に伴う巻き上げや潮汐等の様々なスケールの現象により輸送され、再び湾内に分布するが、このような細粒土砂に伴う放射性物質の輸送には不明な点が多い。そこで、河口周辺や湾内において、表層泥のサンプリングを定期的に行い。大堀川やその下流にある手賀沼、隅田川や荒川や江戸川やその下流にある東京湾内において、放射性物質の流入不可の算定と流域ごとの違いについての検討を行った。これらの測定結果については、塩分や粒径の分析結果と併せて検討を実施している。河床に堆積した細粒土砂は、専攻晴天日数によってその量が大きく異なるため、同規模の降雨であっても先行晴天日数によってもフラックスが変化するため、年に数回のイベント的な出水を集中的に観測しただけでは、細粒土砂の輸送を把握するには不十分である。そこで2年以上にわたって観測を継続して多くの観測結果を蓄積することが出来た。26年度が最終年度であるため、記入しない。内湾に流入する放射性物質は、細粒土砂に吸着しているが、通常は河口部で懸濁物質に吸着したりにコロイド化して沈降していくのに対して、悪天候時には、河川流量の大幅な増加と伴に、内湾の表層を低塩分水と伴に這うように移動して、河口から10km程度離れた地点にも到着するなど、その輸送過程は主に河川流量や湾内流動によって大きく変化する。また内湾に堆積した細粒土砂や沈降した植物プランクトンは、波に伴う巻き上げや潮汐等さまざまなスケールで輸送され、再び湾内の植物プランクトンに利用される可能性があるが、このような細粒土砂に伴う放射性物質の輸送には未解明な点が多い。そこで、河口周辺や湾内において表層泥のサンプリングを行い。東京湾等の都市沿岸への放射性物質の流入負荷、雨天時合流式下水道越流水等の影響把握と定量化を行った。これら測定結果については、塩分や粒径、有機物含量の結果と併せて検討することで、流入負荷やその生態系への影響把握を行う。河床に堆積した細粒土砂成分は、先行晴天日数によってその量が大きく異なるため、同規模の降雨であっても先行晴天日数によって、そこに吸着した放射性物質の物質フラックスは大きく変化する。年に数回のイベント的な出水を集中的に計測しただけでは、精緻な微細粒径成分の輸送を把握するには不十分である。そこで2年間以上に渡って様々な降雨イベント前後で計測する必要があるが、2011年10月より定期的な観測を行い、多くの観測結果を蓄積することが出来た。2011年10月よりおよそ3ヶ月おきの定期観測を実施して、堆積物コアなどの取得を行った。同時にこれらの結果から放射性物質フラックスを算定して、流域毎の違いについても検討を行っていることから、当初の計画以上と判断した。今後も現地観測を継続するが、今年度は特にコアの取得に注力する。これは放射性物質の移動が既にほぼ終了したためである。コアを精力的に取得することで、2011年3月からの放出過程を把握することができると判断した。また、放射性物質の今後の予測につながるシミュレーションを実施する。同時に上記の成果発表についてもこれまで以上に積極的に行う予定である。
微小重力環境における宿主-病原体の相互作用変化をもたらす分子基盤の解明

宇宙環境における微生物感染は、宇宙飛行士の健康に深刻な影響を与えうるリスク要因の一つである。近年、宇宙環境ではヒト-病原体の相互作用の変化が微生物感染リスクに深く関わる可能性が明らかになってきたが、微小重力がいかにして宿主-病原体の関係性に影響を与えるのかについて、詳細な分子機構は明らかになっていない。そこで本研究では、三次元オルガノイド培養系ならびにメダカを用いて、我々がこれまで注目してきた重力-YAPシグナル伝達系が、宿主-病原細菌間の相互作用に及ぼす影響を解析することにした。1.腸オルガノイドの安定的な培養系の樹立と細菌感染実験系の確立:本年度は、大腸オルガノイドに対してサルモネラの感染を試みたが、宿主細胞内へのサルモネラの侵入を確認するには至らなかった。そこでマイクロインジェクション法により、オルガノイド内腔へサルモネラを直接導入し現在まで感染効率の向上を試みている。次にGFP発現サルモネラを感染させたヒト結腸癌由来Caco-2細胞において、YAPシグナル系分子の遺伝子発現をq-PCR法により精査した。その結果、サルモネラの感染により、YAPの下流遺伝子のひとつであるCTGFの発現が大きく減少することを見出した。2.メダカ個体を用いたトランスクリプトーム解析: RNA-seq法によりメダカ野生型胚とYAP変異体胚との間の比較トランスクリプトーム解析を行った結果、免疫系のシグナル伝達分子などに顕著な発現変動が認められた。そこでヒトRPE1細胞においてq-PCR法により詳細な解析を行ったところ、YAPのノックアウトに伴い免疫系のシグナル分子の発現が上昇する傾向が認められた。以上の結果から、重力耐性遺伝子YAPによる免疫系シグナルの制御は、魚類からヒトに至るまで進化的に広く保存されている可能性が考えられた。29年度が最終年度であるため、記入しない。宇宙船内環境における細菌などの微生物感染は、宇宙飛行士の健康に深刻な影響を与えうるリスク要因の一つである。近年、微小重力環境において宿主に対する微生物の増悪化が報告されるなど、宇宙環境では宿主(ヒト)-病原体の相互作用の変化が微生物感染リスクに深く関わる可能性が明らかになってきた。しかしながら、微小重力がいかにして宿主-病原体の関係性に影響を与えるのかについて、詳細な分子機構は依然として不明な点が多い。そこで本研究では、ヒト三次元オルガノイド培養系ならびにモデル生物メダカを用いて、微小重力環境と地上における病原細菌感染時の比較解析を行い、発現変動の顕著なシグナル伝達系を網羅的に明らかにすることを目的とした。特に、我々がこれまで注目してきた重力-YAPシグナル伝達系の影響に着目し解析を試みた。細菌感染オルガノイドを用いたトランスクリプトーム解析を実施するため、腸の三次元オルガノイド培養系の樹立を目指した。マウス小腸組織から幹細胞を含む陰窩構造を分離し、マトリゲルに包埋後に成長因子を含む培地を添加した結果、培養8日目には体内の陰窩構造に類似した構造体を観察することができ、その後数週間の長期培養を行うことに成功した。現在、作成したオルガノイドにサルモネラ菌を感染させる実験系の確立を試みている。また、RNA-seq法によりメダカ野生型胚とYAP変異体胚との間の比較トランスクリプトーム解析を行った結果、免疫系のシグナル伝達分子などに顕著な発現変動が認められた。このことから、重力耐性遺伝子YAPが多数の感染制御分子の発現を制御していることが明らかとなった。実験計画に沿って腸組織から幹細胞を含む陰窩構造を分離し、腸オルガノイドの数週間にわたる長期培養を行うことに成功しており、現在では作成した腸オルガノイドにサルモネラ菌を感染させる実験系の樹立を試みる段階まで達しており、おおむね一連の研究は順調に進展している。

以上の結果から、重力耐性遺伝子YAPによる免疫系シグナルの制御は、魚類からヒトに至るまで進化的に広く保存されている可能性が考えられた。今回樹立に成功した三次元オルガノイドは、年単位の長期的な培養が可能であることに加えて、ゲノム編集技術を適用して遺伝子改変することが容易であることから、将来の宇宙実験におけるモデル実験系として中心的な役割を果たすことが期待される。今後、微小重力環境におけるサルモネラ感染オルガノイドを用いた解析を進めることにより、宇宙環境が食中毒原因菌に及ぼす影響を明らかにすることにつながり、将来の超長期の宇宙飛行における食品衛生リスクマネージメントの観点から重要な知見をもたらすものと考えている。29年度が最終年度であるため、記入しない。
メルケル細胞の細胞生物学的特性の研究-メルケル細胞癌の治療への手がかり

今回、私たちは、メルケル細胞の初代培養を試み、培養条件下での形態、構造について検討した。実験1では、材料としてラットの足蹠Footpad足の裏の皮膚を用いた。メルケル細胞の局在をCK20で確認すると表皮突起の先端に陽性に染まる細胞として同定可能であった。そこで、メルケル細胞は基底細胞層に存在するためその部位を露出させた。つまりWister ratの4週齢のオスの足蹠の表皮シートを作成し、得られた表皮シートを適度に消化し、基底細胞層の細胞のみを剥がし、ろ過を行った。それを、遠心分離機にかけると、メルケル細胞を含む基底細胞がcell pelletとして採取できた。これらを培養液に入れ、培養した。培養3日目には、突起を伸ばし周囲のケラチノサイトとは明らかに異なる形態の細胞が存在し、CK20で陽性にそまり、メルケル細胞と同定した。そのほか、培養細胞でも、隣接するケラチノサイトに突起を突き出している像もみられ、生体での所見と一致していた。実験2として、実験1で獲得したメルケル細胞を用いて、生体で特異的な接着を示すといわれている神経細胞との混合培養を行った。その結果、神経細胞との混合培養条件の方が、より多くのメルケル細胞を獲得することができた。培養3日目には、メルケル細胞と神経細胞の混合培養条件下において、特異的な接着が観察された。CK20とシナプトフィジンの二重染色では、メルケル細胞と神経細胞の特異的な接着が観察された。神経細胞培養液のみを添加した状態での培養では、メルケル細胞には変化は見られなかったため、直接接触する因子が必要ではないかと考えた。透過型電顕でも有芯顆粒をもつメルケル細胞と、神経終末との特異的な接着所見が得られた。神経細胞の混合培養条件下では、より多くのメルケル細胞を獲得することが定量的に確認できた。総括として、(1)メルケル細胞の初代培養に成功した。(2)メルケル細胞と神経細胞の混合培養条件下で、メルケル細胞の機能を示唆する神経細胞との特異的な接着がみられた。(3)メルケル細胞と神経細胞の混合培養条件下で、より多くのメルケル細胞を得ることができた。今回我々は11例のtrichoblastoma,2例の基底細胞癌に分化した病巣を併発するtrochoblastomaについて検討を行なった。2例の基底細胞癌に分化した病巣を併発するtrochoblastomaのうち、基底細胞癌は辺縁や線維性の間質へ突出する深在の部分に局在した。基底細胞癌を伴わない9例のうち5例、そして基底細胞癌を伴う2例のtrichoblastomaについてサイトケラチン20および15について免疫組織化学的に検討した。その結果、基底細胞癌を伴う2例のtrichoblastomaにおいて、サイトケラチン20陽性のメルケル細胞は認められず、サイトケラチン15の発現も認めなかった。これとは対照的に基底細胞癌を伴わない5例のtrichoblastomaの全例においてメルケル細胞は増加し、サイトケラチン15の発現も観察された。

基底細胞癌を伴わない5例のtrichoblastomaのうち、2例では"pop out"or"shell out"現象と呼ばれる特徴的な線維性間質を取り囲むような厚い線維性被膜を有する部分に多数のメルケル細胞が集籏していた。これらはメルケル細胞と間質との相互作用を示唆する所見と考えられた。メルケル細胞の増殖に関与する間質成分について見当を加える予定です。今回、私たちは、メルケル細胞の初代培養を試み、培養条件下での形態、構造について検討した。実験1では、材料としてラットの足蹠Footpad足の裏の皮膚を用いた。メルケル細胞の局在をCK20で確認すると表皮突起の先端に陽性に染まる細胞として同定可能であった。そこで、メルケル細胞は基底細胞層に存在するためその部位を露出させた。つまりWisterratの4週齢のオスの足蹠の表皮シートを作成し、得られた表皮シートを適度に消化し、基底細胞層の細胞のみを剥がし、ろ過を行った。それを、遠心分離機にかけると、メルケル細胞を含む基底細胞がcell pelletとして採取できた。これらを培養液に入れ、培養した。培養3日目には、突起を伸ばし周囲のケラチノサイトとは明らかに異なる形態の細胞が存在し、CK20で陽性にそまり、メルケル細胞と同定した。そのほか、培養細胞でも、隣接するケラチノサイトに突起を突き出している像もみられ、生体での所見と一致していた。実験2として、実験1で獲得したメルケル細胞を用いて、生体で特異的な接着を示すといわれている神経細胞との混合培養を行った。その結果、神経細胞との混合培養条件の方が、より多くのメルケル細胞を獲得することができた。培養3日目には、メルケル細胞と神経細胞の混合培養条件下において、特異的な接着が観察された。CK20とシナプトフィジンの二重染色では、メルケル細胞と神経細胞の特異的な接着が観察された。神経細胞培養液のみを添加した状態での培養では、メルケル細胞には変化は見られなかったため、直接接触する因子が必要ではないかと考えた。透過型電顕でも有芯顆粒をもつメルケル細胞と、神経終末との特異的な接着所見が得られた。神経細胞の混合培養条件下では、より多くのメルケル細胞を獲得することが定量的に確認できた。総括として、(1)メルケル細胞の初代培養に成功した。(2)メルケル細胞と神経細胞の混合培養条件下で、メルケル細胞の機能を示唆する神経細胞との特異的な接着がみられた。(3)メルケル細胞と神経細胞の混合培養条件下で、より多くのメルケル細胞を得ることができた。
江戸時代の藩校における音楽教習・楽実践から楽思想構築に至る楽文化の総合的研究

今年度は奥羽関係を中心に検討した。まずは弘前における調査を完了させ、口頭及び論文発表を行った。また、山形の庄の藩校の状況を調査した。現在の山形県の範囲の、江戸期の藩の統治状況は複雑である。本藩としては山形藩・米沢藩・庄内藩が主要な藩であり、状況は大きく異なる。山形藩は初期は最上氏が統治したが、改易されて以後度々譜代または親藩が転封された。それにより、藩校が継続的に設置されることはなかった。明治以降の教育関連は史料が残るものの、江戸期の山形藩内の教育関連史料はほぼどまとまった状態では残存しておらず、楽の教習に関しても明らかにできなかった。米沢藩の領主は幕末に至るまで上杉氏であった。四代綱憲の代、元禄10(1697)年に釈奠を挙行、学問所と聖堂を設立し、藩士教育を行ったが、財政悪化のため享保9(1724)年に廃止した。九代治憲の代の安永5(1776)年に再建され、興譲館と名付けられ、幕末まで藩士の教育と釈奠を行ってきた。この興譲館には、再建当初の安永6年に実施した釈奠を詳述した『釈菜行事』が残されているが、奏楽に関する記録は一切なかった。また、興譲館の史料はその一群中に奏楽関連と考えられる楽譜史料あるいは理論書等は見られなかった。藩校における楽の教習及びそれに関連した教育は行われておらず、蔵書としても所蔵がなかったと考えられる。庄内藩は譜代の酒井氏が一貫して統治していた。文化2年(1805年)、庄内藩七代目藩主・酒井忠徳によって藩校・致道館が創設された。致道館では楽の教習を行っていたとされるが、今回の調査では天候不順のために期間の縮小もあり、その史料を発見するには至らなかった。興譲館と致道館の教習の相違は、学問の方向性の違いである可能性があるが、天候不順による調査日程短縮により十分な調査ができず、結論には至らなかったので、今年度も引き続き研究を進める予定である。夏を中心に調査活動を予定していたが、台風や大雨などの天候不順に見舞われ、調査を切り上げたり、中止せざるを得ない状況が続き、想定していた調査が行えなかった。昨年度調査を行えなかった箇所については、今年度実施する予定である。今年度は九州の藩校を中心に調査を実施する予定である。佐賀藩、熊本藩、平戸藩を予定している。ただし、熊本藩については、先行研究も存在するので、それらを検討しながら、より効率よく九州および西日本の状況を調査していく予定である。また昨年度天候不順等で調査ができなかった米沢及び庄内藩校、会津藩関係についても引き続き調査を行っていく予定である。今年度は岡山県を対象とした。岡山は岡山藩を中心とし、藩校が全国的にも最初期から設立されていた地域である。学問も盛んで、陽明学者熊沢蕃山(1619ー1691)や文人・浦上玉堂(1745-1820)等も輩出していることから、当該年度は岡山藩を中心に調査研究を進めた。岡山藩は鴨方藩と生坂藩の2つの支藩を有していたが、在国における独自の政治的・教育的・文化的機能はほぼなく、藩校支藩独自の学校は持たず、岡山藩の藩校に入学し、教育を受けていた。初代藩主池田光政は寛文6年(1666)に藩校を開設し(石山仮学館)寛文8年に正式な藩校として機能するようになった(国学)。これは全国的に見ても最初期の藩校である。光政隠居後は低迷し、再度盛り返すのは5代藩主治政(1750-1819)の時代だが、藩校は初等教育を行い、より専門的な学問は私塾で行われた。したがって、岡山藩校は次代を担う優秀な人材の育成という機能を持ち得なかった。藩校での教育は儒学と武芸が中心であったが、光政時代には、神職教育の一環として雅楽教習が行われた。ただし藩校の縮小とともに排除されたと推測できる。光政は雅楽を藩校で教習させるだけでなく、自身も雅楽を愛好し、保護・奨励していた。そのような環境は、熊沢蕃山の楽思想の展開や、浦上玉堂を生み出す原動力となっただろう。鴨方藩士・浦上玉堂もまた、雅楽を得意とし、城下で雅楽を教えていたとされ、さらに脱藩後には会津で神楽の再興に携わった。また、鴨方藩士時代雅楽の一種・催馬楽を琴の伴奏で復元し、寛政3年(1791)に『玉堂琴譜』を刊行した。これらは、熊沢蕃山から続く岡山藩の楽思想や楽教習に係る学問的土壌を有していたことと無関係ではないだろう。岡山藩は、藩校において楽教習は行っておらず、藩校もまた人材育成という側面を持たなかったが、培われた学問的展開は、独自の形態があったと考えられる。岡山藩の調査はほぼ終了した。藩校での雅楽教習とともに、それがもたらす影響を検討しつつ、楽思想の在り方と実際の雅楽の環境を検討することができた。この2点の意味で概ね順調に進展してると考えている。今年度は水戸藩の藩校と琴の教育を中心に研究を進めた。

水戸藩は水戸学と呼ばれるように、学問が盛んな地であったが、藩校では音楽が教習されていた。藩校に置ける音楽の教習については、まだ調査途中であるが、中でも水戸藩で特筆すべきなのは、琴の存在ではないかと考えた。琴は一般的に儒学ととても近い関係にあるが、藩校内や藩校関係者の側でその存在の確認をできる事象は少ない。水戸は、明末清初の帰化僧、東皐心越が、徳川光圀に招かれて祇園寺の住職となり、以後定住したことが知られているように、江戸時代の琴学の最初期の最も重要な地である。その東皐心越が将来した琴が献上されて、藩邸内に保存されていた。これを巡っての藩内の儒者や琴を愛好する藩外の人物とのやり取りや琴の動向から、あらためて水戸藩と琴の関係性を考察した。これによって、水戸藩における琴の扱われ方やそれをめぐる状況も多少解明することができたと考える。一方、本年度は機会を得て、中国及び日本国内の孔子廟視察が可能となり、格子生誕の地である曲阜の孔子廟を視察し、また山東省の山東大学で、日本の儒学と音楽についての講演を行った他、南京の夫子廟、上海の文廟、北京の孔子廟、台南(台湾)の孔子廟、台北の孔子廟、沖縄の孔子廟を視察した。また台南では復元された釈奠も視察し、孔子廟を巡る各国の捉え方を検討した。沖縄では、孔子廟の釈奠のあり方、その際の音楽に関する記録の有無、王宮内での楽の捉え方を調査し、釈奠等の記録が未詳なこと、中国音楽との関係についてもほとんど研究されていない上、それらの資料もほぼないことから、探求は難しいことを確認した。年度初めに提出した計画は少々変更したが、水戸藩の調査は予定通り進めており、また年度をまたぐ予定であった孔子廟調査も機会を得て実施することができた。沖縄については、藩校としては入らないが、孔子廟および釈奠、さらには中国文化の輸入という観点からは調査をしておきたい部分であったので、それを実施することができ、また現地にて関係者や研究者へのインタビュー調査ができたことも成果として大きかった。予定変更をしているので、次年度に持ち越した会津藩などについては、順番が入れ替わったと認識しているため、概ね順調と言えるのではないかと考えている。今年度は奥羽関係を中心に検討した。まずは弘前における調査を完了させ、口頭及び論文発表を行った。また、山形の庄の藩校の状況を調査した。現在の山形県の範囲の、江戸期の藩の統治状況は複雑である。本藩としては山形藩・米沢藩・庄内藩が主要な藩であり、状況は大きく異なる。山形藩は初期は最上氏が統治したが、改易されて以後度々譜代または親藩が転封された。それにより、藩校が継続的に設置されることはなかった。明治以降の教育関連は史料が残るものの、江戸期の山形藩内の教育関連史料はほぼどまとまった状態では残存しておらず、楽の教習に関しても明らかにできなかった。米沢藩の領主は幕末に至るまで上杉氏であった。四代綱憲の代、元禄10(1697)年に釈奠を挙行、学問所と聖堂を設立し、藩士教育を行ったが、財政悪化のため享保9(1724)年に廃止した。九代治憲の代の安永5(1776)年に再建され、興譲館と名付けられ、幕末まで藩士の教育と釈奠を行ってきた。この興譲館には、再建当初の安永6年に実施した釈奠を詳述した『釈菜行事』が残されているが、奏楽に関する記録は一切なかった。また、興譲館の史料はその一群中に奏楽関連と考えられる楽譜史料あるいは理論書等は見られなかった。藩校における楽の教習及びそれに関連した教育は行われておらず、蔵書としても所蔵がなかったと考えられる。庄内藩は譜代の酒井氏が一貫して統治していた。文化2年(1805年)、庄内藩七代目藩主・酒井忠徳によって藩校・致道館が創設された。致道館では楽の教習を行っていたとされるが、今回の調査では天候不順のために期間の縮小もあり、その史料を発見するには至らなかった。
肝動脈化学塞栓術におけるナノミセルを用いた薬剤導入と集積方法に関する研究

ナノミセル凝集体はナノDDSとして腫瘍に対する効率的な薬剤導入方法であるとされている。このようなナノ粒子は一般的には一辺が100nm未満の物質と定義されており、多くの薬剤が効率よく腫瘍に集積し副作用を減ずることができるという劇的な効果をもたらしている状況である。一方で多血性腫瘍の分野においては現在マイクロスフィアが臨床使用されており、抗癌剤を含浸させた粒子を経動脈性に投与し、抗癌剤が徐放されることにより抗腫瘍効果が得られている。今回我々はラット、家兎の正常肝・腫瘍肝におけるナノ粒子と薬剤溶出性のマイクロスフィアでの組織の薬剤分布計測を行い、ナノ粒子がより効率的である可能性を示唆する知見を得た。本年度は資料収集ならびに基礎実験の一部を行い,動物実験に関しては基礎的検討を行っている.基礎実験としては欧米にて肝細胞癌治療に用いられているマイクロメートルサイズの粒子に対する薬剤の吸着やマイクロカテーテル内での動態の観察を行い,粒子の通過性の確認とカテーテル内部あるいはカテーテル流出部からの均一な粒子の流れを確認した.また,リピオドールを用いたナノエマルジョン作成については界面活性剤を用いたエマルジョン作成やナノミセル構造を形成できる微粒子鉄剤を用いたエマルジョンの安定化実験を行った.これらの安定化実験に関してはさらに顕微的観察方法も含めて良好な観察方法の検討も行う必要があると考えられ,次年度も引き続き観察検討を行っている予定である.動物実験については滋賀医科大学放射線科に協力を要請し,家兎の動脈造影ならびに塞栓術を行い,さらに肝腫瘍モデルの作成についても協力の承諾を得た状況である.本年度は滋賀医科大学にてのみの実験となった.また,薬剤キャリアーとして使用予定であった球状塞栓物質については本邦にて導入予定であったが,予定がずれ込みPMDAならびに厚生労働省への申請中状態が続いたため入手できない状態であったため次年度以降に持ち越しの状態となった.来年度には順次収集した資料をもとに動物実験を軌道に乗せ,具体的な成果を上げられるように遂行する予定である.多血性腫瘍に対する化学塞栓療法においては、高濃度の抗癌剤を効率的に腫瘍内に停留させ、腫瘍内で徐放させることによって効率的な抗腫瘍効果をめざすことが重要となってくる。本研究では動物を用いて経動脈的に抗癌剤を動注する際に抗癌剤を吸着して腫瘍内に送り込むことが可能となるような王立的なドラッグデリバリー粒子の開発をめざしている。研究において主に使用する粒子は従来より用いているマイクロメートルサイズの粒子に加えてなのサイズの粒子を用いることで新生腫瘍血管の深部まで到達可能にすることに主眼を置いて粒子作成と動物への経動脈的投与の療法を同時に研究している。動物実験については家兎血管造影を行い、マイクロカテーテルにて肝動脈を直接選択し、球状塞栓物質を動注し血管塞栓を行っている。血管造影については鼠径部の大腿動脈からのアプローチで、同一個体で複数回の塞栓術あるいは造影検査に対応可能である実験系が確率可能であった。ナノパーティクルについてはSPIO(超常磁性体酸化鉄)粒子については抗癌剤(アントラサイクリン系のエピルビシン)との親和性のinvitroの実験を行っている。こちらについてはエピルビシン吸着可能な微粒子であるDC Beadへの親和性との比較も同時に行っている。DC Beadについてはイオン交換による電気的な結合であり、ナノ粒子よりも抗癌剤の吸着が良好であることが示された。今後はナノ粒子への吸着性能の向上をめざしさらに異種の粒子の検討も行う予定である。さらに、血管の透過性を更新させるような物質を同時併用することで効率的に薬剤を組織内に注入することが可能となると考えたので、血管作動物質についても分担研究者とともに研究開発中であり、こちらについては家兎よりも小型のラットも用いて実験を開始中である。こちらの動物については経動脈的な実験系は未だ確立できておらず、今後の課題としている。インターベンショナルラジオロジーの手法を用いたドラッグデリバリーシステム(DDS)導入は、腫瘍などの標的部位に効率的に高濃度の抗癌剤等薬剤の到達を可能とする。この種の研究は最も注目されている先端医療分野のひとつである。肝細胞癌のような多血性の腫瘍は新生血管が豊富であり経動脈的に治療薬を導入することにより非腫瘍部と腫瘍部の治療薬の分布に大きな格差を生じさせることは可能である。また、抗癌剤を通常使用する濃度よりも高濃度化することで効率的な治療が可能であると考えられ、従来の油性造影剤に混和させることやDDSとしての球状塞栓物質よりも効率的に抗癌剤を腫瘍に集中させるシステムを構築することを目標にしている。本研究では、家兎に対して複数回の血管造影手技に耐えうるような経大腿動脈的な造影手技を確立した。本手技はを要するものの、標的臓器へカテーテルを導入し、選択的造影やDDS導入を行うことが可能となった。さらに、細径のマイクロカテーテルを用いれば、血管損傷をおこすことなく標的動脈の選択を行う事ができ、DDS注入やその後の評価のための複数回の血管造影が可能であった。DDSとしての鉄ミセルへの抗癌剤吸着し肝動脈からの注入を行い得たものの、球状塞栓物質によるいわゆる塞栓術(DEB-TACE:薬剤溶出性ビーズによる塞栓術)に比して効率的に薬剤導入できたという結果にはたどり着けなかった。

末梢到達性についてはDEB-TACEは粒子の大きさに縛られてミセル構造を持つようなDDSほどの成果が得られないと思われる結果が示された。しかしながら、肝腫瘍モデルにおいてはある程度の結果を期待できる結果を得た。さらに、より効率的なDDS確立については、血管作動性物質等との組み合わせによりさらに効率的な治療効果が得られるような組織の変化を目指せる状況となっており、さらなる研究の礎となったと考えられる。ナノミセル凝集体はナノDDSとして腫瘍に対する効率的な薬剤導入方法であるとされている。このようなナノ粒子は一般的には一辺が100nm未満の物質と定義されており、多くの薬剤が効率よく腫瘍に集積し副作用を減ずることができるという劇的な効果をもたらしている状況である。一方で多血性腫瘍の分野においては現在マイクロスフィアが臨床使用されており、抗癌剤を含浸させた粒子を経動脈性に投与し、抗癌剤が徐放されることにより抗腫瘍効果が得られている。今回我々はラット、家兎の正常肝・腫瘍肝におけるナノ粒子と薬剤溶出性のマイクロスフィアでの組織の薬剤分布計測を行い、ナノ粒子がより効率的である可能性を示唆する知見を得た。肝動脈塞栓術の目的であれば家兎での実験系が確立している関係上、さらに実験を推進していくことが可能であるが、腫瘍の作成が比較的困難であることから腫瘍内への塞栓物質の取り込み状態の把握が困難であると思われた。今年度は家兎の腫瘍モデルはVX2腫瘍モデルであり、腫瘍の成長とともに腫瘍内部の変性が目立つようになるため、肝細胞癌とは異なった血行動態を示す傾向にあることがわかった。したがってこれに追加してラットの肝細胞癌モデルの活用を視野にいれつつ実験を行ってきた。これについてはラットの経動脈的選択的血管造影の実験系の確率をめざしてきたが、小型動物であることから手技が困難なことが多く、倫理的観点から動物を無駄にすることのないようにするために、実験系の確立した施設と連絡を取り情報を得ながら進めているために遅滞が生じている状況である。インターベンショナルラジオロジー来年度においても家兎モデルを使用した動脈塞栓術による種々の塞栓物質における組織学的な抗癌剤の沈着状態と溶出薬剤の生体における濃度や反応を検討・評価する。新たなナノ粒子開発や粒子内への抗癌剤封入の効率的な方法の開発も同時に行う予定である。ラットについては実験系の確立を年度初期段階の目標として掲げ、なかば以降は正常肝モデルのみならずVX2腫瘍モデルと家兎では未だ可能となっていない肝細胞癌モデルにおける薬物動態の把握と腫瘍組織内において正常肝実質よりも効率的な薬物デリバリーをめざして、粒子の大きさや、粒子の安定性向上ならびに、血管作動物質等の併用による薬剤の効率的投与方法の確立を目指していく方針である。基礎的な粒子の観察やエマルジョンの観察は行っているものの,薬剤キャリアーとして使用予定であった球状塞栓物質については本邦にて導入予定であったが,予定がずれ込みPMDAならびに厚生労働省への申請中状態が続いたため入手できない状態であったため次年度以降に持ち越しの状態となったことに加え,実験棟の建設に伴う設備の不十分から実験計画に遅滞が生じている.
東日本大震災が三陸沿岸域のサケやアユの資源に及ぼした影響

サケ放流稚魚の耳石の微量元素組成と酸素・炭素安定同位体比の分析結果から、それらが同一地域内における由来判別に有効であることを明らかにした。また、北海道沿岸域に回帰したサケとベーリング海で採集された未成熟サケの耳石Sr:Ba比が周期的に変化することが判った。これらの研究成果は震災前後における母川回帰率や回遊履歴の変化を明らかにする上で重要な知見を提供する。震災直後の遡上アユの生活史特性を調べ、震災前に遡上個体群の主体を形成した早生まれ個体が選択的に減耗したことを明らかにした。2013、14年には震災前と同様に早生まれ個体が遡上個体群の主体を形成する状態に回復したが、遡上体長の小型化がみられた。1)東日本大震災がサケの初期生活史に及ぼした影響:岩手県沿岸域の3孵化場で養成された放流用種苗(放流魚)を平成24年34月に採集した。ビワマスの放流魚と野生魚の耳石の酸素・炭素同位体比(δ^<18>O、δ^<13>C)の分析から炭素同位体比(放流魚:-14.1‰;野生魚:-14,1‰)に有意な違いは認められなかったものの、野生魚の酸素同位体比(-6.4‰)が放流魚(-7.9‰)に比べて1.5‰高く、両者の識別に有効であることが明らかになった。2)東日本大震災がサケの母川回帰に及ぼした影響:岩手県沿岸域の4河川において回帰親魚を平成24年1112月に採集した。岩手県の主要なサケ孵化場のある4河川水のSr安定同位体比(^<87>Sr/^<86>Sr)を分析し、同位体比が河川間で異なり、母川回帰魚の判別に有効であることが示された。-3)東日本大震災がアユ資源に及ぼした影響:岩手県鵜住居川(釜石市)と盛川(大船渡市)において平成24年6月に遡上魚、平成24年9月平成25年1月に流下仔魚の採集を実施した。採集された遡上魚の耳石Sr:Ca比や日周輪紋解析から孵化日は鵜住居川で9月24日11月24日(平均:10月24日)、盛川で10月14日11月20日(平均:10月27日)で遡上魚の90%は10月中旬に孵化しており、いずれの河川においても震災前に比べて遅生まれ個体が遡上の中心をなしていた。仔魚の河川流下は鵜住居川では9月初旬12月下旬にみられピークは10月下旬にあった。受精から孵化までの期間を10日とすれば、産卵盛期は10月中旬と考えられた。盛川では9月初旬翌年1月初旬に流下がみられピークは10月中旬、産卵盛期は10月初旬と考えられた。いずれの河川においても遡上魚の孵化日組成と産卵盛期が震災前に比べて遅くなっており、このことがアユ資源に及ぼす影響を検討していく必要がある。1)東日本大震災がサケの初期生活史、及び母川回帰に及ぼした影響:本州太平洋地側地域(岩手県)本州日本海側地域(山形県、福井県)、北海道地域(太平洋側、オホーツク海側、日本海側)のサケふ化場、それぞれ4、2、8ヶ所で平成24、25年度に採集した放流直前のサケ稚魚の耳石炭素・酸素安定同位体分析(δ13C、δ18O)を行い、安定同位体比によるふ化場、あるいはふ化場の立地する地域(出生地域)の判別の有効性を検討した。δ13Cとδ18Oはそれぞれ9.714.0、-7.3-8.5の範囲にあり、一部のふ化場間での値の重複がみられたが、ふ化場判別の可能性が示唆された。一方、出生地域については、各地域間での重複のために安定同位体比のみでは困難であり、微量元素分析を合わせて実施する必要があることが明らかになった。三陸沿岸域で採集されたサケ稚魚を採集し、それらの耳石の輪紋解析を現在、鋭意解析中である。ビワマスの放流稚魚と野生稚魚の耳石安定同位体比分析から、両者間でδ18Oに大きな違いがあること、安定同位体比により両者を100%判別することが可能であることを明らかにした。本分析結果に基づいて、岩手県で平成24、25年度に採集した回帰親魚の解析も開始した。2)東日本大震災がアユ資源に及ぼした影響:盛川(岩手県大船渡市)で平成24、25年度に採集した遡上アユ、及び流下仔魚の耳石の輪紋解析とSr:Ca比分析を行い、ふ化日、遡上日、遡上日齢、遡上体長を調べ、震災前の調査結果と比較した。その結果、遡上体長は減少したもののふ化日、遡上日、遡上日齢は震災前とほぼ同様になったことが分かった。このことは、並行して調査している鵜住居川(岩手県釜石市)の状況(ふ化日、遡上日がいずれも震災前に比べて遅れている)と異なり、震災からの回復過程が河川により異なることが明らかになった。(1)東日本大震災がサケの初期生活史、および母川回帰に及ぼした影響:20112012年に計23孵化場(北海道10ヵ所、岩手県8

ヵ所、北陸地方と東北地方の日本海側5ヵ所)で得たサケ放流稚魚について耳石の酸素・炭素安定同位体比(δ18O、δ13C)分析した。δ18Oとδ13Cはいずれも同一の孵化場の稚魚はそれぞれほぼ同様の値を示した。各地域内の孵化場間で比較すると、一部の孵化場間で値の重なりがみられるもののδ18Oとδ13Cを組み合わせることでほぼ全ての孵化場を判別することができた。さらに北海道・西別川、岩手県・安家川、福井県・手取川の孵化場産サケ稚魚の耳石について微量元素組成を分析したところ、Li/Ca、Mg/Ca、Ba/Caに孵化場間の違いがみられ、さらにSr/Ca、Zn/Caに成長に伴う変化がみられた。これらの結果からδ18O・δ13Cと微量元素組成を組み合わせることで高い精度の産地判別が可能であることが予想された。また、それらの生活史断面での分析を行うことで回遊履歴の推定も可能であるものと考えられた。現在、回帰サケについてδ18O・δ13Cと微量元素組成による母川回帰の状況に関する解析をを鋭意進めている。(2)東日本大震災がアユ資源に及ぼした影響:大船渡市盛川で2012年秋季の仔アユの流下時期と2013年6月に採集された遡上アユ(2012年孵化群)の孵化日、推定遡上日、推定遡上日齢、推定遡上体長、産卵時期を調べ、2010孵化群(津波被災年級群)、2011年孵化群の調査結果と比較した。その結果、流下時期と遡上魚の孵化日組成が若干早まるとともに推定遡上日齢が増加して震災前に近くなったものの、推定遡上体長の顕著な低下がみられた。推定遡上日に変動はなかった。仔アユの流下時期(産卵時期)や遡上日齢の変化に震災後再開された稚アユ放流の影響が考えられた。【東日本大震災が三陸地域のサケ資源に及ぼした影響】北海道、岩手県および新潟県の合計23孵化場で得られた放流幼稚魚の耳石微量元素、酸素・炭素安定同位体比化学分析を進め、同一地域内の孵化場を高い精度で判別することを確認した。また、北海道太平洋側沿岸域に回帰したサケとベーリング海で採集された未成熟サケの耳石微量元素による回遊履歴の検討を行い、耳石Sr:Ba比が周期的に大きく変動すること、またその最初の上昇が耳石分析ライン上の核から約20%の部分で起こることが明らかになった。これらの成果は、北太平洋におけるサケの回遊経路を明らかにする上で重要な情報を提供するものである。今後、これらの成果に基づいて、震災前後のサケの耳石の微量元素・酸素・炭素安定同位体比特性を比較解析することで、震災が三陸地域のサケの回遊過程や母川回帰に及ぼした影響の一端を明らかにすることが可能になるものと考える。【東日本大震災が三陸地域のアユ資源に及ぼした影響】鵜住居川(岩手県釜石市)と盛川(岩手県大船渡市)において、平成25年、26年同様に仔魚の流下状況と遡上アユの日齢、孵化日、遡上日齢、遡上日、遡上体長を調べ、相互に比較した。その結果、遡上アユは震災前と同様に早生まれ個体を主体とする構成に回復したものの遡上体長が平成25年、26年同様に震災前に比べて小型化した傾向がみられた。また、仔魚の流下時期は震災前と同様に10月上旬をピークに9月下旬から11月下旬まで続いた。これらの結果より、アユの生活史特性はほぼ震災前の状況に回復したものの、冬季の水温や餌状況などの沿岸域の冬季の沿岸環境がアユ仔稚魚の成長に影響を及ぼしていることが伺える。なお、東日本大震災がアユ資源に及ぼした影響については、投稿論文にまとめ、国際学術誌に投稿した(審査中)。サケ放流稚魚の耳石の微量元素組成と酸素・炭素安定同位体比の分析結果から、それらが同一地域内における由来判別に有効であることを明らかにした。また、北海道沿岸域に回帰したサケとベーリング海で採集された未成熟サケの耳石Sr:Ba比が周期的に変化することが判った。これらの研究成果は震災前後における母川回帰率や回遊履歴の変化を明らかにする上で重要な知見を提供する。震災直後の遡上アユの生活史特性を調べ、震災前に遡上個体群の主体を形成した早生まれ個体が選択的に減耗したことを明らかにした。2013、14年には震災前と同様に早生まれ個体が遡上個体群の主体を形成する状態に回復したが、遡上体長の小型化がみられた。
骨特異的に作用するT3誘導体の開発(平成元年)

我々は骨粗鬆症の治療薬として骨に特異的に作用し、心臓に対する作用ならびに基礎代謝亢進作用の弱い甲状腺ホルモン誘導体の開発を試みた。Underwoodらにより報告された心臓に対する作用の弱いSK&F L-94901に加えてOCU-A,OCU-Bの2つの誘導体合成を行った。オスSpraque-Dawleyラットの肝、心、腎、脳より核分画を調整し、[^<125>I]triiodothyronineと種々の濃度の非標識T_3および誘導体とインキュベ-トした後、レセプタ-結合^<125>I放射能をカウントした。[^<125>I]-triiodothyronineのみとインキュベ-トしたときのspecific bindingを100%とし、各非標識リガンドによる抑制率として表した。抑制率50%の濃度(IC_<50>)を求め、誘導体のIC_<50>に対するLーT_3のIC_<50>の比をrelative receptor bindingとした。つぎに[^<125>I]triiodothyronineおよび0-1×10^<-7>moles/100 gbody weightの各誘導体をオスSpraque-Dawleyラットの尾静脈より注入した。1時間後に脱血死させ、肝・心より上記方法により核分画を調整し、^<125>I放射能をカウントした。In vitroの実験と同様にrelative receptor bindingを算出した。骨に対する結合は右第6ー10肋骨の骨軟骨移行部を中心に長さ6mmに切り出し^<125>I放射能をカウントした。誘導体OCU-Aの合成においてはβ環の3′位の一部にどうしてもBrが1つ多く結合してしまい合成不能であった。肝の核レセプタ-へのin vitroでの結合を検討した結果、relative receptor bindingはLーT_3 100,DーT_3 10,SK&F L-94901 1,OCU-B 10であった。さらにin vitroでの核レセプタ-への結合には臓器による差は認められなかった。In vivo投与においては骨軟骨移行部を中心に高い集積がみられ現在、各誘導体投与ラットより得られた右第6ー10肋骨の骨軟骨移行部の放射活性総量より各誘導体による[^<125>I]triiodothyronineのdisplacementを検討段階中である。Natureに報告されたL-94901に加えて2つの誘導体の合成を試みた。A、Bを合成しようとした理由は、Aに用いたR′が入ると心とともに肝に対する作用も弱くなること、またBのようにアラニン側鏡を変えると下垂体抑制作用が弱くなるのでR′′をBrのままにしてその2点を変えた化合物を作製した。化合物のA、Bの全合成工程はそれぞれ11工程、7工程と数多くの工程が必要であり、その一つ一つの化学反応も容易でなかった。結局化合物AはどうしてもR′の一部にBrが一つ多く結合してしまい合成不可能となった。

甲状腺ホルモン(L-T_3)およびその誘導体(D-T_3,SK&F L-94901,OCU-B)のin vitroでの核レセプタ-との結合には肝臓、心臓、腎臓、脳において差は認められなかった。今回はin vitroでの結合を検討した。甲状腺ホルモン(L-T_3)およびその誘導体(SK&F L-94901,OCU-B)を50% ethanolおよび溶解に必要とする量のNaOHで1mg/mlに溶解し、さらに20mM Tris buffer(pH 7.0)、0.03% bovine serum albuminを用いて希釈した。核レセプタ-へのin vivoでの結合を検討するためにトレ-サ-〔^<125>I〕triiodothyronineおよび0-1×10^<-7> moles/100gbody weightの各誘導体をオスSprague-Dawleyラットの尾静脈より注入した。1時間後に脱血死させ、肝・心よりOppenheimerらの方法により核分画を調整し、^<125>I放射能をカウントした。〔^<125>I〕-triiodothyronineのみ静注したときのspecific bindingを100%とし、各非標識リガンドによる抑制率として表した。抑制率50%の濃度(IC_<50>)を求め、誘導体のIC_<50>に対するL-T_3のIC_<50>の比をrelative receptor bindingとした。In vivoにおける〔^<125>I〕triiodothyronineの肋骨の骨・軟骨への集積を検討した結果、骨軟骨移行部を中心に高い集積がみられ、この結果より骨軟骨移行部を中心に6mmの長さで切り出すこととした。現在、各誘導体投与ラットより得られた右第6-10肋骨の骨軟骨移行部の放射活性総量より各誘導体による〔^<125>I〕triiodo-thyronine結合のdisplacementを検討段階中である。
赤血球凝集機構および抑制に関する基礎的研究

種々の高分子化合物の架橋による赤血球集合体形成や速度をビデオカメラ,画像処理装置およびコンピューターを装着したオスコープ(ずり応力および温度可変調節)で測定した.1.系の物理化学的条件:(1)pHを増すと集合体形成速度は増加する.アルカリ性pHでの集合体はずり応力でこわれ難い.(2)温度を上昇させると集合体形成速度は増すが,血漿中での集合体形成は15°C以下を著しく促進される.フィブリノーゲンとIgGによる集合体の形態は20°C以上で異なる.(3)浸透圧を増すと集合体形成速度は増加するが, 400mOsm以上では減少する.2.分子量の大きい高分子ほど集合体は形成されやすいが,その有効濃度は分子種により異なる.3.IgGによる赤血球集合はアルブミンにより抑制されるが,フィブリノーゲンによるものはアルブミンにより促進される.4.フィブリノーゲンは主にAα鎖C末端領域(残基No.207-303),部分的にはγ鎖のC末端領域(残基No.375-411)で赤血球問を架橋している.5.プラスミンによるフィブリノーゲン分解物(FDP)ではフィブリノーゲン>フラグメントX>フラグメントYの順に集合体を作りやすい.フラグメントDおよびEは集合体を形成しない.6.赤血球集合にあたり高分子化合物は赤血球表面の特定の部位に結合していることがデキストランとポリグルタミン酸による赤血球集合の結果から示唆された.7.赤血球表面の糖タンパクはそのシアル酸とともに赤血球集合に抑制的に作用している.8.免疫グロブリン製剤と代用血漿の影響:(1)免疫グロブリン製剤ではその組成(時に各種酵素分解物),血液型による赤血球と製剤との相互作用の差,抗Aおよび抗B凝集素の混在,に注意を要する.(2)代用血漿ではグルコースの添加は赤血球集合を抑制する上で効果的である.種々の高分子化合物の架橋による赤血球集合体形成や速度をビデオカメラ,画像処理装置およびコンピューターを装着したオスコープ(ずり応力および温度可変調節)で測定した.1.系の物理化学的条件:(1)pHを増すと集合体形成速度は増加する.アルカリ性pHでの集合体はずり応力でこわれ難い.(2)温度を上昇させると集合体形成速度は増すが,血漿中での集合体形成は15°C以下を著しく促進される.フィブリノーゲンとIgGによる集合体の形態は20°C以上で異なる.(3)浸透圧を増すと集合体形成速度は増加するが, 400mOsm以上では減少する.2.分子量の大きい高分子ほど集合体は形成されやすいが,その有効濃度は分子種により異なる.3.IgGによる赤血球集合はアルブミンにより抑制されるが,フィブリノーゲンによるものはアルブミンにより促進される.4.フィブリノーゲンは主にAα鎖C末端領域(残基No.207-303),部分的にはγ鎖のC末端領域(残基No.375-411)で赤血球問を架橋している.5.プラスミンによるフィブリノーゲン分解物(FDP)ではフィブリノーゲン>フラグメントX>フラグメントYの順に集合体を作りやすい.フラグメントDおよびEは集合体を形成しない.6.赤血球集合にあたり高分子化合物は赤血球表面の特定の部位に結合していることがデキストランとポリグルタミン酸による赤血球集合の結果から示唆された.7.赤血球表面の糖タンパクはそのシアル酸とともに赤血球集合に抑制的に作用している.8.免疫グロブリン製剤と代用血漿の影響:(1)免疫グロブリン製剤ではその組成(時に各種酵素分解物),血液型による赤血球と製剤との相互作用の差,抗Aおよび抗B凝集素の混在,に注意を要する.(2)代用血漿ではグルコースの添加は赤血球集合を抑制する上で効果的である.高分子化合物による赤血球の非免疫学的凝集機構を解明するため、前年度にひきつづいて、レオスコープ-動画像処理法により定量的解析を進めた。1.フィブリノーゲンによる赤血球凝集機構:フィブリノーゲンを各種酵素処理することにより赤血球膜と相互作用している分子サイトを解明した。(1)天然に存在する305kDaの低分子フィブリノーゲンは340kDaの高分子フィブリノーゲンと同じ凝集作用を示す。(2)分子内シアル酸はフィブリノーゲンと赤血球との相互作用には関与しない。(3)プラスミンによる分解物のうちFDP-X,FDP-Yには凝集作用はあるが、この順に著しく弱くなる。FDP-Dおよび-Eには凝集作用はみられない。各フラグメントのフィブリノーゲンによる赤血球の凝集作用に対する影響は加算的であり、凝集促進および抑制効果はみられない。(4)フィブリノペプチドおよび人工フィブリン形成抑制ペプチドはフィブリノーゲンによる赤血球凝集に影響しない。(5)結論的に、フィブリノーゲンはD-ドメインのAα鎖C末端側基部で赤血球と相互作用している。2.免疫グロブリン製剤と赤血球凝集:ポリエチレングリコール処理、スルホ化、ペプシン処理、プラスミン処理各製剤について各種血液型赤血球の凝集作用を検討した。(1)製剤には抗A、抗B活性が残存している。(2)製剤によって赤血球凝集作用が異なる。(3)血液型によって各製剤の赤血球凝集作用が異なる。

(4)結論的には製剤の使用にあたっては十分な配慮が必要であり、O型の人にはいずれの製剤も比較的安全である。3.赤血球凝集に対する温度の影響:特製恒温ステージを用いて実験した。(1)血漿中では20°C附近で最も赤血球凝集はおこり難く、、高温側、特に低温側では赤血球は凝集しやすい。(2)多糖類,ポリグルタミン酸は温度上昇とともに赤血球は凝集しやすい。(3)結論的には温度の影響は媒質粘度の変化、赤血球膜変化だけでは説明できない。
転写因子Mrf2遺伝子による血管平滑筋細胞・心筋細胞への分化誘導の試み

我々は、平滑筋細胞のin vitro分化モデルからクローニングし、血管平滑筋に豊富に存在し平滑筋の分化に関連すると報告したMrf2について、次のような研究結果を得た。1,Mrf2遺伝子の発現形式の解析:Mrf2C末側の蛋白質を大腸菌で発現し作成したラビット抗Mrf2ポリクローナル抗体は、組織染色に用いるには不適と考えられた。そこで、オリゴペプチドを用いて、β特異的、αβ共通2種類の、計3種類の抗体を作成した。並行して、α特異的発現を検討するためにin situ hybridizationに使うためのコンストラクトを作成した。現在、両方法で、組織発現を検討中である。2,Mrf2遺伝子による平滑筋細胞の分化誘導のメカニズムについて:プロモーターアッセイで、Mrf2蛋白が、平滑筋分化に重要なCArG boxを含むプロモーター、及び平滑筋特異的プロモーターを活性化するか検討したが、明らかな活性化は認められなかった。また、Mrf2がSRFと共同で、同プロモーターを制御するかを検討したが、やはり活性化は認められなかった。さらに、Mrf2のdeletion mutantを作成して、平滑筋細胞の分化誘導のメカニズムを検討中である。Mrf2の属する遺伝子の一群はクロマチン構造の制御に関すると報告されており、Mrf2も、プロモーターアッセイでは評価できないクロマチンを介した制御をしている可能性がある。3,Mrf2-adenovirusの作成:Mrf2レトロウイルス・アデノウイルスのコンストラクトを作成した。なお、Mrf2遺伝子のノックアウトマウスが他の研究室から報告され、Mrf2の脂肪細胞の分化・増殖への関連、肥満との関わりが指摘された。動脈硬化と肥満の関係からもMrf2の脂肪細胞での役割についての検討を加えてゆく必要があると思われる。1.Mrf2遺伝子の発現形式の解析自家製ラビット抗Mrf2ポリクローナル抗体は、ウエスタン・ブロッティング法で抗体作成のために作成した蛋白を認識し、3T3細胞に導入した遺伝子産物を蛍光抗体法で染色することに成功した。しかし、培養平滑筋細胞や大動脈から抽出した蛋自中のオリジナルなMrf2遺伝子は同定できなかった。特異性・感受性の問題の可能性があり、組織染色に用いるには不安がある。そこで、オリゴヌクレオチドを用いた新たな抗体作成を計画し、同時にin situ hybridizationに使うためのコンストラクトを作成した。2,Mrf2遺伝子による平滑筋細胞の分化誘導のメカニズムについてMrf2遺伝子によるプロモーター制御を検討するために、既報のMrf2 binding site,平滑筋細胞の分化に重要とされているCarG Boxと、minimum promoterを組み込んだLuciferase constructsや、平滑筋細胞に特異的なSM22αpromoterを組み込んだLuciferase constructsを、Mrf2 constructsと培養細胞内で共発現したが、これまでのところ、明らかな活性化は認められていない。平滑筋細胞の分化に重要なSRFとの共発現などをテストしている。なお、Mrf2遺伝子のノックアウトマウスが昨年秋に他の研究室から報告され、Mrf2の脂肪細胞の分化・増殖への関連、肥満との関わりが指摘された。我々が血管平滑筋に豊富に存在し平滑筋の分化に関連すると報告したMrf2が脂肪細胞でも重要な働きを示していることは興味深い。動脈硬化と肥満の関係からも脂肪細胞での役割についての検討を加えてゆく必要があると思われる。

1,Mrf2遺伝子の発現形式の解析:Mrf2C末側の蛋白質を大腸菌で発現し作成したラビット抗Mrf2ポリクローナル抗体は、組織染色に用いるには不適と考えられた。そこで、オリゴペプチドを用いて、β特異的、αβ共通2種類の、計3種類の抗体を作成した。並行して、α特異的発現を検討するためにin situ hybridizationに使うためのコンストラクトを作成した。現在、両方法で、組織発現を検討中である。2,Mrf2遺伝子による平滑筋細胞の分化誘導のメカニズムについて:プロモーターアッセイで、Mrf2蛋白が、平滑筋分化に重要なCArG boxを含むプロモーター、及び平滑筋特異的プロモーターを活性化するか検討したが、明らかな活性化は認められなかった。また、Mrf2がSRFと共同で、同プロモーターを制御するかを検討したが、やはり活性化は認められなかった。さらに、Mrf2のdeletion mutantを作成して、平滑筋細胞の分化誘導のメカニズムを検討中である。Mrf2の属する遺伝子の一群はクロマチン構造の制御に関すると報告されており、Mrf2も、プロモーターアッセイでは評価できないクロマチンを介した制御をしている可能性がある。3,Mrf2-adenovirusの作成:Mrf2レトロウイルス・アデノウイルスのコンストラクトを作成した。なお、Mrf2遺伝子のノックアウトマウスが他の研究室から報告され、Mrf2の脂肪細胞の分化・増殖への関連、肥満との関わりが指摘された。動脈硬化と肥満の関係からもMrf2の脂肪細胞での役割についての検討を加えてゆく必要があると思われる。