hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リガンドポケットのない核内受容体に対する天然由来アゴニスト探索と活性化機序解析

本研究では新たな核内受容体活性化の指標として、ヘテロダイマー活性化という点に着目して、リガンドポケットの無い核内受容体の活性化制御をおこなうことを目的として研究を進めている。本年度は本課題関連研究についての研究成果発表とスクリーニングデータの総まとめをおこなった。当初の研究計画では、昨年度までであったところ所属機関の異動があったため、研究成果発表と総まとめをおこなう時間を取ることが難しく、研究機関の延長をおこなっった。したがって、具体的な研究結果の大きな進展があるわけではないが、日本生薬学会第65回年会(広島)においてポスタープレゼンテーションにより研究成果の発表をおこなった。また、これまでの研究成果とあわせて、ヘテロダイマー活性化という点において、多く市販されている核内受容体RXRの合成アゴニストについても、NR4A2とのヘテロダイマー活性化には選択性があることがわかり、基準とするポジティブコントロールとなる試薬の選び方も重要であることがわかった。これまでの単独のRXRを中心としたスクリーニングで発見してきたコウボクやサンズコンなどにも同様の活性が認められたが、その方法では発見できなかった生薬エキスにヘテロダイマー活性化作用が今回新たに見出せたことが重要である。本研究で作製したヘテロダイマー活性化スクリーニングシステムは、リガンドポケットを持たない核内受容体がRXRリガンド依存的に転写因子として活性化しているかを判断することができることを示すことができ、今後のリガンド探索に有用なツールとなると考えられる。本研究では新たな核内受容体活性化の指標として、ヘテロダイマー活性化という点に着目し、リガンドポケットを持たない核内受容体の活性化制御をおこなうことを目的として研究を進めている。今年度は、スクリーニング系の作製を目的として、リガンドポケットを持たない核内受容体NR4A1,NR4A2の発現プラスミドのクローニングをおこなった。また、これまでに取得済みの核内受容体RXRの発現プラスミドと組み合わせてルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。既存の合成RXRアゴニストを5種類ほどアッセイ系により評価をおこなったが、ヘテロダイマー活性化を示唆するRXRアゴニストは見いだせなかった。さらに、NR4A2の転写活性化が報告されている化合物を取得し、アッセイ系に加えたがその化合物に関しても直接的なヘテロダイマー活性化作用を見いだせなかった。本研究で用いているアッセイ系は、GAL4融合タンパクとしてNR4A2を発現し、GAL4結合配列を持つレポータープラスミドと一緒に、核内受容体RXRを強制発現するアッセイ系であり、RXRアゴニストによりNR4A2とのヘテロダイマーを形成し、転写活性化することを期待して作製したものである。これまで試した化合物は、RXRアゴニストとしての活性の報告があるものや、NR4A2の転写活性化を遺伝子発現などで確認した化合物であり、ヘテロダイマー活性化に関する報告は無いものである。また、NR4A2に関して同様なGAL4融合タンパクを用いたレポーターアッセイの報告を見つけ、XCT0135908という化合物が活性化するということがわかるとともに、市販されていないことから、この化合物の有機合成による作製をおこなっている。探索に用いるアッセイ系の作製をおこなっているが、発現プラスミドの構築はできているのだが、ポジティブコントロールとすることができる化合物がないことが問題となっている。このような点からも挑戦的な研究内容になるのであるが、可能性がありそうな化合物に関しては、市販されていないことから、有機合成による作製という想定外の作業が入ってきたため、進捗状況としてはやや遅れているとした。昨年度までスクリーニングの作製をおこない核内受容体NR4A2とRXRの発現プラスミドを作製してきたが、問題点としてヘテロダイマー活性化をおこす既知のポジティブコントロールとなる市販されている化合物がなく、アッセイ系が機能しているかどうかがわからないということがあった。本年度はこの問題を解決するため、有機合成によるポジティブコントロールとなる化合物の作製をおこない、その化合物を用いてアッセイ系の最適化をおこなった。作製した化合物は濃度依存的なNR4A2/RXRαのヘテロダイマー転写活性化作用を示し、また既知のRXRリガンドに関しては、その化合物の種類によって活性化を示すものと示さない化合物が存在していた。その後、本研究の目的となるスクリーニングとして、研究室で維持管理している植物エキスを用いてNR4A2/RXRαのヘテロダイマー転写活性化のスクリーニングおよび、RXRα単独の転写活性のスクリーニングを実施した。このスクリーニング系はリガンドポケットを持たない核内受容体NR4A2を、ヘテロダイマーを形成する核内受容体RXRにリガンドが作用することによって、ヘテロダイマー活性化をさせるという実験系のため、RXR単独と比較をおこなっている。スクリーニングの結果、数種類の植物エキスに関して差のある植物エキスを見出しており、NR4A2/RXRを活性化していると考えられる。現在、これらの植物エキスによる遺伝子発現や細胞分化に及ぼす効果を検討している。本年度は、昨年度までの問題点であったポジティブコントロールとすることが出来る化合物(XCT0135908)が市販されていないという点について、学内の連携研究者に有機合成による化合物作製を依頼し、手に入れることが出来たことにより改善できた。

また、この化合物を利用し、ルシフェラーゼレポーターアッセイ系の最適化をおこなうことをおこない、完成したアッセイ条件により、植物エキス800種類ほどのスクリーニングをおこなった。このスクリーニングに関しては核内受容体NR4A2とRXRαのヘテロダイマーに対する転写活性化のスクリーニングとRXRαのみに対する転写活性化のスクリーニングをおこない、比較検討をおこなった。その結果、2つのスクリーニング結果で差のある植物エキスが数種類見出された。本研究では新たな核内受容体活性化の指標として、ヘテロダイマー活性化という点に着目して、リガンドポケットの無い核内受容体の活性化制御をおこなうことを目的として研究を進めている。本年度は本課題関連研究についての研究成果発表とスクリーニングデータの総まとめをおこなった。当初の研究計画では、昨年度までであったところ所属機関の異動があったため、研究成果発表と総まとめをおこなう時間を取ることが難しく、研究機関の延長をおこなっった。したがって、具体的な研究結果の大きな進展があるわけではないが、日本生薬学会第65回年会(広島)においてポスタープレゼンテーションにより研究成果の発表をおこなった。また、これまでの研究成果とあわせて、ヘテロダイマー活性化という点において、多く市販されている核内受容体RXRの合成アゴニストについても、NR4A2とのヘテロダイマー活性化には選択性があることがわかり、基準とするポジティブコントロールとなる試薬の選び方も重要であることがわかった。これまでの単独のRXRを中心としたスクリーニングで発見してきたコウボクやサンズコンなどにも同様の活性が認められたが、その方法では発見できなかった生薬エキスにヘテロダイマー活性化作用が今回新たに見出せたことが重要である。本研究で作製したヘテロダイマー活性化スクリーニングシステムは、リガンドポケットを持たない核内受容体がRXRリガンド依存的に転写因子として活性化しているかを判断することができることを示すことができ、今後のリガンド探索に有用なツールとなると考えられる。現在合成中のXCT0135908を早急に取得し、アッセイ系による活性化の確認をおこなう。また、並行して生薬・植物抽出エキスの活性を前倒しで評価し、アッセイ系の活性化作用を持つエキスが無いかの検討もおこなうこととする。これらの検討をおこない、標的遺伝子発現の変化などをさらに評価することで、研究課題の推進を早めることができると考えている。所属組織の異動があるため、より精度の高い成果を得るために補助事業期間の延長をおこなうこととし、スクリーニングにより見出された植物エキスの遺伝子発現や細胞の分化に及ぼす影響を調べることをおこなうこととする。また、研究成果の学会発表もおこなう予定である。年度末に学会参加があり、数日間実験を止める必要があるため、試薬類などの発注を次年度にまわしたことによる繰り越しであり、ほぼ計画通りに執行されていると考えている。研究代表者の雇用任期が年度末で切れることとなり、異動のための活動に時間が必要となったため、研究にあてることが出来る時間が本年度はおおよそ半減した。
アフリカ大陸におけるホットスポット火山活動の地球物理学的研究

(1)地球上でアフリカ大陸及びその周辺部にホットスポット火山が集中する原因は地球深部特にマントル下部から地球中心核(コア)の不均質性の空間分布に起因することを明らかにした.従来の解釈ではコアは均質な構造をもつものと解釈されてきたが,コア最上部の外核の地震波速度分布には半球的な次数1の不均質パターンが存在することが明らかになった.更に,観測データを増やしアフリカ直下の構造の特異性について内核・外核境界近傍の速度構造をPKP(-BC,-DF)波を用いて調べた.その結果,内核最上部のP波速度は経度0°を通る子午線を境に,東側のアフリカ側で標準走時より0.5%速く,西側で0.5%遅いという半球的なパターンが存在することが示された.これらの結果からアフリカ直下の地球深部は不均質性の符号が変化する境界に位置する特異な領域であることが判明した.(2)アフリカ大陸のように標準時報の受信できない地域での地震観測の最大の障害は刻時精度の維持にある.この問題はGPS(Global Positioning System)衛星からの時刻情報を受信して校正するGPS時計を開発し解決した.本年度は低消費データロガーを自作しそれとGPS時計を組み合わせて長期無人観測の測器の開発に成功した.さらにそれらを基に製品化への移行に取り組み,ハード面に加えて,自然地震やその他の計測に利用できるようソフト面を整備した.その結果,アフリカでの臨時地震観測で高品質の観測データが取得可能となった.(3)東アフリカ地溝帯のホットスポット火山の中でも調査対象としてザイール東部のニイラゴンゴとニアムラギラ火山を中心に観測・調査を継続してきた.これらの火山は平成6年6月23日及び7月4日に相次いで噴火を開始した.ちょうどこの時期にルワンダの政情不安に端を発し100万人に達する難民が噴火活動中の極近傍の難民キャンプに避難してきた.このため,この地域の火山災害の防止という観点から緊急調査を実施すると共に調査内容を再検討せざるを得なくなった.更に,我が国からもルワンダ難民救援隊がゴマに派遣され,救援活動を実施した.このような情勢下に於いて,外務省及び国連難民高等弁務官事務所(UNCHR)からの現地調査依頼もあり,当初の調査・観測計画全体の見直しを行うと共に噴火観測体制の強化を図った.それらの結果は現地行政機関やUNCHR等に伝達し火山災害の防止に役立てている.(4)ニイラゴンゴ火山の噴火開始は6月23日であるが,前兆的火山性微動は約2週間前の6月9日から間欠的に発生した.噴火後も火山性微動は間欠的に継続している.微動の発現期間は火映現象や噴煙が目視された期間と完全に一致していることから,溶岩湖へのマグマの供給に伴う運動が微動の原因と推測された.噴火の初期の頃にはこの運動は傾斜計にて「傾斜微動」として観測され,その周期には数100秒の成分が含まれていることが確認された.平成6年12月中旬に間欠性の周期に変化が起きた後,微動は連続的発生様式に移行した.これらの観測データは,噴火開始以来約6カ月間かけてニイラゴンゴ火口直下にマグマが抵抗なく上昇できる火道が形成された事を示唆するものである.(5)平成6年8月15日から平成7年3月8日の期間に2.8x10^7m^3の溶岩が火口に供給された.この間の供給率はは1.4x10^5m^3/日である.この値は12年前の溶岩湖の出現した際の最大供給率(2.5x10^6m^3/日)に較べて1桁小さい.現在の供給率が継続すると仮定すると1年8ケ月後には溶岩湖面は第1テラスに達し,側噴火の可能性が高まる.(6)噴火活動に伴う火山性A型地震はニイラゴンゴ火山の直下ないしやや北側に発生している.しかし,震源の深さは約15kmと深く,浅発の地震はない,地震は数組のEarthquake Familyに分類され深部で選択的な破壊が進行している事を示唆する.(7)上記の地震活動の発生期間には微動の発生はなく,また,微動の発生期間には地震は発生せず,これらの間には相補的な関係がある.(8)地殻変動データからは噴火開始以来ニイラゴンゴ火山の山体が膨脹する傾動が認められる.火山周辺の100万人に達する異常な人口密集地帯の極近傍で,以上の観測結果に示されるマグマ活動が今日も継続している事から,噴火災害の防止の観点に立ち現地の観測体制を更に強固なものにし,観測の継続実施が将来的に必要であると理解された.(1)地球上でアフリカ大陸及びその周辺部にホットスポット火山が集中する原因は地球深部特にマントル下部から地球中心核(コア)の不均質性の空間分布に起因することを明らかにした.従来の解釈ではコアは均質な構造をもつものと解釈されてきたが,コア最上部の外核の地震波速度分布には半球的な次数1の不均質パターンが存在することが明らかになった.更に,観測データを増やしアフリカ直下の構造の特異性について内核・外核境界近傍の速度構造をPKP(-BC,-DF)波を用いて調べた.その結果,内核最上部のP波

速度は経度0°を通る子午線を境に,東側のアフリカ側で標準走時より0.5%速く,西側で0.5%遅いという半球的なパターンが存在することが示された.これらの結果からアフリカ直下の地球深部は不均質性の符号が変化する境界に位置する特異な領域であることが判明した.(2)アフリカ大陸のように標準時報の受信できない地域での地震観測の最大の障害は刻時精度の維持にある.この問題はGPS(Global Positioning System)衛星からの時刻情報を受信して校正するGPS時計を開発し解決した.本年度は低消費データロガーを自作しそれとGPS時計を組み合わせて長期無人観測の測器の開発に成功した.さらにそれらを基に製品化への移行に取り組み,ハード面に加えて,自然地震やその他の計測に利用できるようソフト面を整備した.その結果,アフリカでの臨時地震観測で高品質の観測データが取得可能となった.(3)東アフリカ地溝帯のホットスポット火山の中でも調査対象としてザイール東部のニイラゴンゴとニアムラギラ火山を中心に観測・調査を継続してきた.これらの火山は平成6年6月23日及び7月4日に相次いで噴火を開始した.ちょうどこの時期にルワンダの政情不安に端を発し100万人に達する難民が噴火活動中の極近傍の難民キャンプに避難してきた.このため,この地域の火山災害の防止という観点から緊急調査を実施すると共に調査内容を再検討せざるを得なくなった.更に,我が国からもルワンダ難民救援隊がゴマに派遣され,救援活動を実施した.このような情勢下に於いて,外務省及び国連難民高等弁務官事務所(UNCHR)からの現地調査依頼もあり,当初の調査・観測計画全体の見直しを行うと共に噴火観測体制の強化を図った.それらの結果は現地行政機関やUNCHR等に伝達し火山災害の防止に役立てている.(4)ニイラゴンゴ火山の噴火開始は6月23日であるが,前兆的火山性微動は約2週間前の6月9日から間欠的に発生した.噴火後も火山性微動は間欠的に継続している.微動の発現期間は火映現象や噴煙が目視された期間と完全に一致していることから,溶岩湖へのマグマの供給に伴う運動が微動の原因と推測された.噴火の初期の頃にはこの運動は傾斜計にて「傾斜微動」として観測され,その周期には数100秒の成分が含まれていることが確認された.平成6年12月中旬に間欠性の周期に変化が起きた後,微動は連続的発生様式に移行した.これらの観測データは,噴火開始以来約6カ月間かけてニイラゴンゴ火口直下にマグマが抵抗なく上昇できる火道が形成された事を示唆するものである.(5)平成6年8月15日から平成7年3月8日の期間に2.8x10^7m^3の溶岩が火口に供給された.この間の供給率はは1.4x10^5m^3/日である.この値は12年前の溶岩湖の出現した際の最大供給率(2.5x10^6m^3/日)に較べて1桁小さい.現在の供給率が継続すると仮定すると1年8ケ月後には溶岩湖面は第1テラスに達し,側噴火の可能性が高まる.(6)噴火活動に伴う火山性A型地震はニイラゴンゴ火山の直下ないしやや北側に発生している.しかし,震源の深さは約15kmと深く,浅発の地震はない,地震は数組のEarthquake Familyに分類され深部で選択的な破壊が進行している事を示唆する.(7)上記の地震活動の発生期間には微動の発生はなく,また,微動の発生期間には地震は発生せず,これらの間には相補的な関係がある.
完全透過チャネルを有する乱れた量子細線系における電気伝導

ジグザグ端グラフェン・ナノリボンでは,不純物等による乱れがあっても後方散乱無しで電子を完全透過させる完全透過チャネルが発現するためアンダーソン局在が生じない.この様な特徴を持つナノリボン系における電気伝導の性質を明らかにすることを目的として研究を進めた.結果として,電気伝導の統計的な振る舞いはチャネル数が非対称なユニタリ普遍クラスによって記述されることを明らかにした.また,ナノリボン系における完全伝導チャネルは位相緩和に対して極めて頑健であることを示した.ジグザグ端グラフェン・ナノリボンでは,不純物等による乱れがあっても後方散乱無しで電子を完全透過させる完全透過チャネルが発現するためアンダーソン局在が生じない.この様な特徴を持つナノリボン系における電気伝導の性質を明らかにすることを目的として研究を進めた.結果として,電気伝導の統計的な振る舞いはチャネル数が非対称なユニタリ普遍クラスによって記述されることを明らかにした.また,ナノリボン系における完全伝導チャネルは位相緩和に対して極めて頑健であることを示した.今年度は,乱れた量子細線系のモデルとして,一本の右向きカイラルチャネルとM本の左向きカイラルチャネルがランダムにトンネル結合した系(完全伝導チャネル数:M-1)を提案し,任意のMに対してコンダクタンスの平均値と揺らぎを解析的に求めることに成功した.平均値と揺らぎの細線長および完全伝導チャネル数に対する依存性は,当研究代表者が過去に導いたスケーリング理論の結果と完全に一致した.また,インコヒーレントな高温領域における単層ジグザグ端グラフェンナノリボン(完全伝導チャネル数:1)のコンダクタンスの振る舞いについて調べるため,ボルツマン方程式に基づいて平均コンダクタンスを計算した.その結果,平均コンダクタンスはオームの法則から大幅に逸脱し,リボンが長い極限で量子化コンダクタンスに収束することを見出した.この結果は,高温領域においても完全伝導チャネルが一つ生き残ることを意味しており,応用の観点からも大変興味深い.なお,今年度に予定していたグラフェンナノリボンにおけるコンダクタンスの大規模数値シミュレーションは,プログラムの作成が難航しているため次年度以降に行うことにした.現在,乱れを含む二層ジグザグ端グラフェンナノリボン(完全伝導チャネル数:2),二層ジグザグ端/クライン端グラフェンナノリボン(完全伝導チャネル数:1)および二層クライン端グラフェンナノリボン(完全伝導チャネル数:0)におけるコンダクタンスの数値シミュレーション用プログラムを開発中である.昨年度,インコヒーレント領域における単層グラフェンナノリボン(完全伝導チャネル数=1)の平均コンダクタンスをボルツマン方程式に基づいて調べた結果,完全伝導チャネル(PCC)がデコヒーレンスに対して堅固であることが分かった.これはカーボンナノチューブにおけるPCCの振る舞いとは対照的である.デコヒーレンスに対して堅固なPCCはインコヒーレント領域における様々な電気伝導特性に大きな影響を与えると期待される.今年度は二層グラフェンナノリボン(PCC数=02)におけるコンダクタンスを数値シミュレーションによって調べる予定であったが,プログラムの作成が難航していることに加え,PCCに対するデコヒーレンスと云う重要且つ新しい課題が見つかったので,方針を変更し主としてデコヒーレンスの影響について検討した.手始めとしてショットノイズに注目し,完全伝導チャネルの影響について検討した.その結果,通常の量子細線において知られている「ショットノイズの1/3抑制」等の普遍則からは大きく逸脱し,極めて特異な振る舞いを示すことを明らかにした.この成果は査読付き論文として発表済みである.また,平均コンダクタンスの振る舞いとコヒーレンス長の関係を明らかにするため,平均コンダクタンスのリボン長依存性を,デコヒーレンスの効果を取り込んだ数値シミュレーションによって調べている.予備的な結果ながら,コヒーレンス長が非常に短い場合においてもPCCの存在を確認することができた.この数値シミュレーションにより,コヒーレント領域からインコヒーレント領域に渡るコンダクタンスの振る舞いを明らかにできるものと期待している.本年度は,乱れを含むジグザグ端グラフェンナノリボン(GNR)におけるコンダクタンスの数値シミュレーションを実行し,完全伝導チャネル(PCC)に対する位相緩和の影響を検討した.その結果,GNRにおけるPCCは強い位相緩和の下でも存在し得るだけでなく,むしろ位相緩和によって安定化されることを見出した.GNRにおけるPCCは谷間散乱を引き起こさない長距離不純物のみが存在する場合に発現する.位相緩和によるPCCの安定化は,僅かながら存在する谷間散乱によって誘起されたアンダーソン局在が位相緩和によって抑制されたためと考えられる.比較のため,発現原理の異なるカーボンナノチューブ(CNT)におけるPCCについても数値シミュレーションを用いて検討し,それが位相緩和によって簡単に破壊されてしまうことを確認した.また,フェルミ準位がディラック点から離れている場合,励起スペクトルに現れる三回対称歪みの影響によりCNTのPCCは消失することも確認した.GNRにおけるPCCは位相緩和および三回対称歪みの影響を受けないので,PCCの実験的検証を行う舞台として極めて有利であるだけでなく,デバイス材料としても有望と考えられる.これらの成果は国際会議において口頭発表した.関連する問題として取り組んだグラフェン系におけるジョセフソン効果については,汎用性の高いジョセブソン電流の公式を導くことに成功した.また,この公式を用いた数値計算によってジョセブソン電流の振る舞いを解析し,理想的な極限において見出されていたグラフェン系に特有の振る舞いがより現実的な領域においても発現し得ることを確認した.この成果については国際会議においてポスター発表を行った.その他,トポロジカル絶縁体表面のディラック電子系や半無限グラフェン系のコーナーエッジに注目し,その電子状態の特異性を特徴付ける研究を遂行した.特に線状の結晶転位のある弱いトポロジカル絶縁体中にはPCCが現れ得ることを示し,その発現原理を解明した.
イネの転び型及び挫折型倒伏における耐性メカニズムの解明

倒伏は、収量、品質並びにコンバインによる収穫効率の低下を引きおこすイネの栽培における最も深刻な障害である。現在まで短稈化が主要なターゲットとして育種が進められてきた。一方で短稈化は、バイオマス生産性を低下させる。そのため短稈化に換わる新たな耐倒伏性ターゲットが望まれていた。植物体の支持力を高めることは耐倒伏性向上に繋がると考えられていた。しかしながら、植物体の支力の評価方法は確立されておらず、遺伝学的な研究はほとんど行われていなかった。特定の量的形質遺伝子座(QTL)を除いた染色体領域がコントロールと相同である準同質系統は、目的形質を決定する生理学的なメカニズムの解析に適した供試材料である。本研究において、下位部の支持力を評価する方法を確立しその手法を用いて関与するQTL(pr15)を特定した。更にpr15を導入した準同質系統を用いて、下部のバランス支持力の増強が、耐倒伏性に及ぼす影響を解析した。その結果、染色体部分置換系統の倒伏耐性は日本晴の約2倍の値を示し、pr15が耐倒伏性を向上させることが明らかになった。また、耐倒伏性が非常に低いコシヒカリでもpr15の導入により耐倒伏性が向上した。pr15の作用特性を明らかにするために染色体部分置換系統の形態特性、稈の物理的特性及び化学成分の分析を行った。その結果、下葉の老化の遅れが、稈の炭水化物再蓄積の増加を引き起こし、その結果程の剛性が増加することで、耐倒伏性が向上することが明らかになった。pr15は収量特性等の他の形質に影響を及ぼさないこと並びに複数の環境条件下で作用することが確認されたことから、pr15は実用品種の耐倒伏性の向上において有用性が高いと考えられた。これらの結果から、「下位部の支持力」を高めることが短稈化に換わる耐倒伏性向上に向けた新たなターゲットとなりえることが明らかになった。良食味品種のコシヒカリは、他の品種に比べ倒伏が発生しやすく、直播きの導入を抑制する主要な要因となっている。倒伏耐性品種の育種に向けて、耐性を決定するメカニズムを明らかにすることが望まれている。特定の遺伝子座(QTL)を除いた染色体領域がコントロールと相同である準同質系統は、目的形質を決定する生理学的なメカニズムの解析に適した供試材料である。本研究では、倒伏耐性のQTLを導入した準同質系統を用いて、下部のバランス保持能力(押し倒し抵抗)の増強が、転び型倒伏耐性に及ぼす影響を解析する。本年度は、日本晴(日本型イネ)とカサラス(インド型イネ)間の染色体置換系統(NILs)から倒伏耐性のQTL(prl5)を持つ3系統(No.43,60,63)を選抜し、押し倒し抵抗値を指針として倒伏試験を行った。その結果、染色体部分置換系統において、倒伏耐性は日本晴の約2倍の値を示し、prl5が倒伏耐性のためのQTLとして作用することが確認された。

また他の余分なカサラス由来の染色体断片が最も少なく、他の形質の変化が少ないと考えられるNo.63について茎の形態的、物理的特性及び成分の分析と生理学的解析を行った。その結果、下葉の老化の遅れが、稈の炭水化物再蓄積の増加を引き起こし、その結果稈の剛性が増加することで、倒伏耐性が向上すると考えられた。prl5の収量への影響は認められなかったことから、prl5は倒伏耐性の向上に向けて実用性が高いと考えられた。倒伏は、収量、品質並びにコンバインによる収穫効率の低下を引きおこすイネの栽培における最も深刻な障害である。良食味品種のコシヒカリは、他の品種に比べ倒伏が発生しやすく、直播きの導入を抑制する主要な要因となっている。倒伏耐性品種の育種に向けて、耐性を決定するメカニズムを明らかにすることが望まれている。特定の遺伝子座(QTL)を除いた染色体領域がコントロールと相同である準同質系統は、目的形質を決定する生理学的なメカニズムの解析に適した供試材料である。茎径の大きさと倒伏耐性間に正の相関があることが報告されている。日本晴とカサラスの自殖後代系統を用いてイネの茎径に関与するQTL解析を行った。その結果、茎径に関与するQTLsを染色体1、7、8並びに12番に計4個見出した。日本晴準同質系統を用いて、見出したQTLが茎径引いては倒伏耐性に及ぼす影響を解析した。見出したQTLの中で、染色体8番に見出されたQTL(sdm8)は最も強い作用を持ち、sdm8を含む準同質系統において、茎径は1.2倍となった。しかし倒伏耐性の指標である押し倒し抵抗値に影響は見られなかった。sdm8と染色体1、7、12番に見出された4個のQTLsを含む準同質系統では、下部の茎径が1.6倍になり、茎の剛性はコントロール(日本晴)に比べ有意に増加した。押し倒し抵抗値はコントロールの2.5倍に増加していた。これらの結果から、茎径の増加により倒伏耐性を増加させるためには、複数のQTLsを集約し、茎径を1.6倍程度する必要があることが明らかになった。昨年までの研究で、「下位部の支持力を高めること」が耐倒伏性向上に向けた新たなターゲットであることを明らかにし、日本晴とカサラス間のBILsを用いて下位部の支持力を高めるQTL(pr15)を特定した。QTLは検出に用いた植物材料に規定される。そのため、日本晴以外のコシヒカリ等の品種においてpr15が作用するかどうか明らかではなかった。コシヒカリの遺伝的背景にpr15を含むカサラス由来の染色体断片を有する染色体置換系統は,下位部の支持力がコシヒカリの1.7倍に、個体の耐倒伏性の指標である押し倒し抵抗値は2.4倍に増加し、短稈で耐倒伏性品種であるキヌヒカリよりさらに優れた耐性を示した。茨城県つくば市にある農業生物資源研究所の圃場で栽培してみると、台風の通過により登熟がほぼ終了した出穂後27日(移植後92日)にコシヒカリの大半は倒伏したが、染色体置換系統では植物体上位部の稈にたわみが見られるもののほとんど倒れていなかった。これらの結果から、pr15が品種を超えて広く機能することが明らかになった。また、草丈の異なる9品種を用いて下位部の支持力と他の形質間の相関を解析した。草丈、地上部重と下位部の支持力間には相関が見られなかった。一方で茎の密度と高い正の相関が見られた。これらの結果から、茎の密度が下位部の支持力ひいては耐倒伏性向上に向けたターゲットになることが示唆された。
インフルエンザウイルスにおける分節化ＲＮＡゲノムパッケージング機構の解析

インフルエンザウイルスはマイナス鎖RNAウイルスであり、ゲノムが8本に分節化していることが特徴の一つである。一つの粒子中には8種8本のウイルスゲノムが取り込まれていると考えられているが、その分子機構は明らかとなっていない。本研究では、ウイルスゲノム分節が効率的に粒子内に取り込まれるために必要なRNAモチーフの探索を行った。この結果、ウイルスゲノムのパッケージングに影響を及ぼすと考えられる塩基を同定した。同定した塩基に変異を持つウイルスは転写複製は野生型と同程度あるが、培養上清中に回収されるウイルスRNA量が減少していたことから、ゲノムパッケージングの段階で影響を受けることが示唆された。本研究では分節化したインフルエンザウイルスゲノムが一つの粒子にパッケージングされる機構を明らかとする事を目的とする。平成25年度はパッケージングに必要な塩基を同定するため、ランダムな配列を持つウイルスの作製とその作製したウイルスが今後の研究に使用可能であるかの評価を行った。HAまたはM2発現MDCK細胞(MDCK-HA、MDCK-M2)の樹立およびHAまたはM2を発現しない組換えウイルス(HAstop virus、M2stop virus)の作製をそれぞれ行った。HAstop virus、M2stop virusをMDCK-HA、MDCK-M2細胞にそれぞれ感染させ、培養上清中に含まれるウイルスを定量した結果、どちらの組み合わせにおいてもウイルス増殖が確認された。また、HAstop virus、M2stop virusをMDCK細胞に感染させた場合のウイルス増殖サイクルについても検討を行った。この結果、HA、M2欠損時にも8本に分節化されたゲノムの集合は野生型ウイルス感染時と同様に行われている事を明らかとした。この結果はHAstop virus、M2stop virusを予定通り今後の分節化ゲノム集合機構の解析に向けて使用可能であることを示している。平成26年度は平成25年度に作成したHAタンパク質を発現しないウイルス(HAstopウイルス)感染細胞におけるウイルスゲノムパッケージングの解析およびウイルス粒子にパッケージングされるために必要な塩基の同定を行った。HAstopウイルス感染細胞において、転写、複製、ウイルスゲノム輸送、出芽を野生型ウイルス感染細胞と比較した結果、子孫ウイルス出芽が減少していることを明らかとした。インフルエンザウイルスは脂質ラフトから出芽する報告がなされていることから、HAstopウイルス感染細胞から脂質ラフト画分を分離し、脂質ラフト画分に回収されるウイルスタンパク質について野生型ウイルス感染細胞と比較を行った結果、脂質ラフト画分中に回収されるウイルスゲノム結合タンパク質が減少していることが示唆された。HAまたはM2をコードする分節の一部にランダムな配列を持つウイルスをMDCK-HAまたはMDCK-M2細胞を用いて継代を行い、選択を受け優先的にパッケージングされる配列の解析を行った。Stopコドンの挿入によりウイルスがコードするHAタンパク質またはM2タンパク質は発現しない系を構築しているので、選択される配列はタンパク質発現ではなくゲノムパッケージングによるものだと考えられる。継代1代目、3代目、5代目のウイルスプールを回収後、RNA抽出を行い、ランダム配列が挿入されている部位について、支援型新学術領域「ゲノム支援」の支援を受け、次世代シークエンサーにより読み取りを行った結果、主にM2をコードする分節において選択を受ける塩基が同定された。同定された塩基に変異を入れた組換えウイルスを作成し、転写、複製、出芽について解析を行った結果、ウイルスゲノムからの転写、複製に変異の影響はなく、感染細胞上清中に回収されるウイルスゲノム量の低下が確認された。ウイルス学目的の細胞株を構築し、HAまたはM2欠損ウイルスの増殖を確認した。また、ランダムな配列を持つ組換えウイルスの作製も行い、継代によるセレクションも完了しているので、研究計画は概ね順調に進展している。今後は継代したウイルスのシークエンスを行い、パッケージングに必要な塩基の同定を進める。シークエンスは次世代シークエンサーを用いて網羅的に同定する予定である。同定したパッケージングに必要な塩基に変異を入れた組換えウイルスを作成し、変異がウイルス増殖に与える影響について解析を進めていく。試薬、消耗品の割引の利用、予定していた旅費の不使用のため。試薬、消耗品については購入時期の調整により使用額が予定よりも低くなった。この結果、本年度に消耗品で使用できる経費が昨年度とほぼ同額となった。「理由」の項で記入した様に、本年度の消耗品の購入に当てる。昨年度とほぼ同額の消耗品の購入を予定している。
嗅細胞及びフェロモン受容細胞における単ー細胞レベルでの分子識別と情報変換

カメおよびカエルの嗅細胞を用いて、単一の嗅細胞がどのような種類のにおい物質に応答するかを調べた。この結果、単一の嗅細胞は多くのにおい物質に応答すること明らかになつた。また、嗅細胞における情報変換機構を明らかにするために、サイクリックGMP(cGMP)が二次メッセンジャーとして働いている可能性を調べた。カメ嗅細胞にcGMPを注入すると、内向き電流が生した。種々検討の結果、この内向き電流はcAMP依存性チャネルを介して応答を発現することがわかつた。すなわち、嗅細胞においては、cAMPが二次メッセンジャーであり、cGMPを介する固有の情報伝達経路はないと結論した。ラットの尿中には、さまざまな種類のフェロモンが含まれている。たとえば、オスの尿中にはメスの性的な成熟を促進するフェロモン、メスの尿中にはメスの性的な成熟を抑制するフェロモンが含まれている。われわれは、メスラットのフェロモン受容細胞に各種の尿を与え、電気的な応答を記録した。この結果、単一フェロモン受容細胞は、一種類の尿にしか応答しないことがわかつた。すなわち、ある細胞はオスの尿のみに、別の細胞はメスの尿のみにしか応答しなかった。このようにフェロモン受容細胞は、高い特異性を有することが明らかになった。つぎに、ラットのオスの尿を用いて、フェロモンの同定を試みた。この結果、フェロモン活性成分は、分子量5000以下のペプチドであることがわかった。また、フェ□モン受容細胞における情報変換機構を調べた。ラットフェロモン受容細胞に尿を与えると、イノシトールトリスリン酸(IP3)のレベルが増大した。また、IP3チャネルの阻害剤やIP3産生の阻害剤は、フェロモン受容細胞の尿に対する応答を阻害した。これらの結果は、ラットのフェロモン受容には、IP3が二次メッセンジャーとして働いていることを示唆した。単一の嗅腺毛から匂い応答を記録した。この結果、単一の嗅綿毛は、ほとんど全ての匂いに応答することがわかった。この結果は、一つの嗅細胞には1種類の嗅覚受容体しか存在しないと言う分子生物学の結果とは大きく異なるものである。また、遊離した単一嗅細胞から匂い応答を記録したが、同様な結果が得られた。ラットの鋤鼻器感覚細胞の情報変換機構を調べた。cAMPを注入しても応答は生じなかったが、1P3を注入すると内向き電流が流れた。この応答は、1P3チャネルの阻害剤で抑制された。また、ラットの尿(フェロモンを含む)を鋤鼻器に与えると、感覚細胞にインパルスが発生した。このインパルス応答は、1P3チャネル阻害剤やPLC阻害剤で抑制された。以上の結果から、ラット鋤鼻器のフェロモンに対する応答は、1P3経路を介して発現することが明らかになった。ラットの尿中にはいろいろなフェロモンが含まれている。たとえば、オスの尿中には、メスの性的な成熟を促進するフェロモンが含まれている。ウィスターラットのメスの鋤鼻器感覚細胞に、ウィスターラットのオスの尿、ウィスターラットのメスの尿、ドンリュウラットのオスの尿を与え応答を測定した。鋤鼻器細胞は、各尿に敏感に応答した。オスの尿に応答する細胞は、非常に特異性が高く、他の尿には応答しなかった。嗅細胞は匂いに対し特異性が低いのに対し、鋤鼻器感覚細胞はフェロモンに対し高い特異性を示した。

サイクリックGMP(cGMP)が、嗅細胞において、二次メッセンジャーとして働いているかどうかが注目されている。そこで、われわれは、カメの嗅細胞を用いてcGMPの効果を調べた。嗅細胞にcGMPを注入すると、内向き電流が生じた。内向き電流が脱感作により消失した後、膜透過性のサイクリックAMPを与えたところ、応答は発現しなかった。この結果は、cGMPはcAMPチャネルを介して応答を発現することを示唆した。すなわち、嗅細胞においては、cAMPが二次メッセンジャーであり、cGMPを介する固有の情報伝達経路はないと結論した。ラットの尿中には、さまざまな種類のフェロモンが含まれている。たとえば、オスの尿中にはメスの性的な成熟を促進するフェロモン、メスの尿中にはメスの性的な成熟を抑制するフェロモンが含まれている。われわれは、メスラットのフェロモン受容細胞に各種の尿を与え、電気的な応答を記録した。この結果、単一フエ口モン受容細胞は、一種類の尿にしか応答しないことがわかった。すなわち、ある細胞はオスの尿のみに、別の細胞はメスの尿のみにしか応答しなかった。一方、単一の嗅細胞は多数の匂いに応答した。このように、フェロモン受容細胞と嗅細胞は、応答特異性に大きな差があることがわかった。ラットのオスの尿を用いて、フェロモンの同定を試みた。この結果、フェロモン活性成分は、分子量5000以下のペプチドであることがわかった。ラットのフェロモン受容細胞に尿を与えると、イノシトールトリスリン酸(IP3)のレベルが増大した。また、IP3チャネルの阻害剤やIP3産生の阻害剤は、フェロモン受容細胞の尿に対する応答を阻害した。これらの結果は、ラットのフェロモン受容には、IP3が二次メッセンジャーとして働いていることを示唆した。
T細胞初期分化における分子機構の解明

申請者はT細胞系列分化決定およびTCR遺伝子再構成を含むT細胞初期分化の機構を解明することを目的として、マウス胎仔胸腺より、TCR遺伝子再構成を起こしていない、T細胞への分化能を保持したプロT細胞を同定し、その性状を詳細に検討した。その結果、1,TCRβ遺伝子のgerm-line転写、2,TCRβ遺伝子の脱メチル化、3,CD3の転写および細胞内での蛋白質発現、4,Ly-1抗原の細胞膜上への発現がTCR遺伝子再構成に先行して現れることが判明した(投稿中)。特にTCRβ遺伝子のaccessibilityとの関連から、TCRβ遺伝子の転写産物およびその誘導機構について調べたところ、germ-line転写産物はDβ領域上流およびDβ-Jβイントロンから転写される少なくとも2種類が見出され、さらにその近傍にT細胞特異的転写因子CATA3、TCF-1の結合配列が存在し、そこに結合する蛋白質を同定した。その中で、T細胞特異性の非常に高いGATA3に注目し、そのT細胞分化におけるマスター遺伝子としての可能性を追求するため、未熟B細胞株にGATA3遺伝子を導入し、上記の4つ現象を指標にT系列への分化進行を調べたところ、TCRβ遺伝子の脱メチル化が顕著に観察された。その他のマーカーについては現在解析中であるが、GATA3の発現がT細胞分化決定およびTCR遺伝子の構造変化に重要な役割をはたしていることが証明された。今後はTCRの発現に重要と考えられる転写因子をさらに導入し、T細胞初期分化の分子機構を明らかにしたいと考えている。
唾液腺における情報伝達機構とその共役因子の生後変化

ラット耳下腺・顎下腺の発生原基は口腔上皮に由来し、その発生・分化の大部分は生後に進行し、自律神経線維による神経支配も生後に進行する。本研究はこの系を用いて分泌シグナルの伝達機構と細胞分化との関連性を追求するものであり、本年度は下記の成果を得た。実験には生後3日以後の各週齢のウィスター系雄ラットを使用した。母乳から固型飼料への切替えは生後21日に行い、生後2週までのラットは雌雄の区別をせず使用した。[1]耳下腺細胞膜と[^3H]dihidroalprenolol(DHA)との結合実験の結果、Bmax値は生後急激に増加して4週齢でピークに達し、以後2年齢までほとんど変化が認められなかった。Kd値は生直後から2年齢までほとんど変化がなかった。[2]耳下腺細胞膜と[^<35>S]GTPγSとの特異的結合は1週齢のラット耳下腺においてさえ既に認められ、そのBmax値は、2週齢から4週齢の間で急激に増加して4週齢でピークに達し、8週齢から12週齢で急激に低下して以後2年齢までゆるやかな低下が続いた。Kd値は1週齢より4週齢まで増加してピークに達し、8週齢以後2年齢まで徐々に低下した。コレラ毒素あるいは百日咳毒素で処理した耳下腺細胞膜を[^<35>S]GTPγSとの結合実験に供すると、Bmax値は無処理膜の約半分に低下したものの、加齢に伴う変化は無処理膜の値とほぼ平行であった。[3]授乳期を長くして離乳を遅くするとDHA結合実験もGTP結合実験もBmax値のピークに達する時期は遅れた。Kd値はDHA結合については生後から2年齢まで変化せず、GTP結合についてはBmax値がピークとなる時期にKd値もピークとなった。[4]前年度に電気泳動により低分子量であることを確かめた分泌顆粒のGTP結合蛋白質は結合実験の結果Kd値が24.3±2.6nM、Bmax値は55.9±4.2pmol/mg prot.であった。この蛋白質の生理的役割については不明な点が多く、現在研究を進めている。本研究は細胞の分化・成長に伴う薬物受容体を介する情報伝達機構の動態とその機序を解明する目的で,耳下腺におけるβーアドレナリン受容体ーアデニル酸シクラ-ゼ系の情報伝達機構とその共役因子であるGTP結合蛋白質(G蛋白質)の生後変化を耳下腺細胞の刺激に対する応答であるアミラ-ゼ分泌との関連において追究するものであり,本年度は下記の成果を得た.各週齢のラットより調製した耳下腺切片をイソプロテレノ-ル(IPR)で刺激するとアミラ-ゼ分泌に対するIPRのEC_<50>値はラットの成熟に伴って低下し,耳下腺のβー作動薬に対する感受性が加齢とともに上昇することが示された.これらの結果はラットの成熟とともに[ ^3H]ジヒドロアルプレノロ-ルのラット耳下腺細胞膜に対する特異的結合のBmax値が上昇し,この特異的結合に対するIPRのIC_<50>値が低下するとの,すでに報告した私達の実験結果とよい対応を示していた.

一方,上記切片をフォルスコリン(F)で刺激すると,著しいアミラ-ゼ分泌が惹起されたが,この反応性は幼若ラットにおいて最も強く,加齢とともに低下した.各週齢のラットより得た耳下腺細胞膜への[ ^<35>S]GTPγSの結合実験を行って,G蛋白質の生後変化を調べたところ,Bmax値,Kd値はもとに生後急激に上昇して4から8週齢の間でピ-クとなり,以後2年齢まで徐々に低下した.さらに,百日咳毒素あるいはコレラ毒素で処理した耳下腺細胞膜を用いた実験結果からGsあるいはGi蛋白質とGTPとの結合能は無処理膜の場合と同じ生後動態を示した.以上の結果から,耳下腺のβー受容体刺激に対する反応性の生後変化はβー受容体の生後の動態を反映しており,Gsの出現とその後の変化を示しているものと考えられた.また,Fに対する耳下腺の反応性の生後変化はGiの出現を示しているものと考えられた.ラット耳下腺・顎下腺の発生原基は口腔上皮に由来し、その発生・分化の大部分は生後に進行することが知られている。また,自律神経線維による神経支配も生後に進行する。したがって、唾液腺は細胞の一連の生後変化の過程を研究するのに適した臓器の一つである。本研究はこの臓器を用いて分泌シグナルの伝達機構と細胞分化との関連性を追究するものであり,本年度は下記の成果を得た。実験には生後3日以後の各週齢のウィスター系雄性ラットを使用した。母乳から固型飼料への切替は生後21日に行い,生後2週までのラットは雌雄の区別をせず使用した。【1】耳下腺のアデニル酸シクラーゼ(AC)はホルスコリン(F)によって活性化されてc-AMPは著しく増量し,アミラーゼ(AM)分泌が惹起された。このACのFに対する感受性は生後2週まで極めて高かったが,その後急激に低下して生後4週で成熟ラットのレベルまで低下した。この変化はAM分泌に対するFのEC_<50>値の生後変化とよい対応を示した。【2】耳下腺細胞膜と[^3H]ジヒドロアルプレノロール(DHA)との特異的結合は生後3日で既に認められ,その後このBmax値は著しく増量して,生後4週で成熟ラットのレベルに達することが明らかにされた。[^3H]DHA結合に対するイソプロテレノール(IPR)のIC_<50>値は生後著しく減少し,感受性の増強が示された。この変化は耳下腺切片からのAM分泌に対するIPRのEC_<50>値の生後変化とよい対応を示していた。そして,この変化はACのFに対する感受性の生後変化とは全く反対であった。【3】耳下腺細胞膜と[^<35>S]GTPγSとの特異的結合は生後1週のラット耳下腺において既に認められた。このBmax値は生後2週以後急激に増加して,生後4週で成熟ラット耳下腺のレベルに達し、以後このレベルは生後12週まで維持されていた。その後この値は生後56週まで徐々に低下した。【4】耳下腺分泌顆粒であるチモーゲン顆粒膜にも[^<35>S]GTPγSとの特異的結合が認められ,この結合はボツリヌス毒素によって著しく抑制された。さらにこのGTP結合蛋白質は細胞膜のそれとはちがって低分子量であった。ラット耳下腺・顎下腺の発生原基は口腔上皮に由来し、その発生・分化の大部分は生後に進行し、自律神経線維による神経支配も生後に進行する。本研究はこの系を用いて分泌シグナルの伝達機構と細胞分化との関連性を追究するものであり、本年度は下記の成果を得た。実験には生後3日以後の各週齢のウィスター系雄ラットを使用した。母乳から固型飼料への切替えは生後21日に行い、生後2週までのラットは雌雄の区別をせず使用した。[1]耳下腺細胞膜と[^3H]
代数幾何と可積分系の融合 - 種々のモジュライ空間と数学・数理物理学の新展開 -

齋藤は、学術研究員の光明と射影直線上の階数2の確定特異点のみをもつ放物接続および放物接続の見かけの特異点およびその双対パラメータを詳しく調べた。特に、ベクトル束のタイプが変化する跳躍現象を詳しく記述した。特に、確定特異点の個数が5点の場合の、モジュライ空間およびその上の放物接続および放物Higgs束の普遍族の具体的構成を与えた。齋藤はSzaboと一般種数の代数曲線上の放物接続や放物Hiigs束の見かけの特異点理論の研究を継続し、モノドロミー保存変形の理論や幾何学的ラングランズ対応について研究した。また学術研究員の光明はモノドロミー保存変形をハミルトニアン形式で記述する方法について、変形理論を用いたアプローチを提案した。稲場は、分岐を許す一般の不確定特異点をもつ放物接続のモジュライ空間の構成を行い、この場合のモノドロミー保存変形の微分方程式の幾何学的パンルヴェ性について考察した。また、ある種の退化ガルニエシステムに対応する分岐する不確定特異点を持つ階数2の放物接続とモノドロミー保存変形の詳しい記述から、DubrovinとKapaevが見出した解が動く分岐点をもつ非線形微分方程式とモノドロミー保存変形の関係を調べ、その幾何学的構を調べた。野海、山田は、梶原と、離散パンルヴェ方程式の幾何学的側面について、射影曲線の2つの直積からなる有理曲面の8点の配置として統一的に取り扱う方法について、詳細な解説を学術誌から出版した。三井は、非特異代数群の主等質空間の一般整概形上のモデルを構築した。また佐野は、重み付きFano完全交叉多様体の有効消滅定理を示した。29年度が最終年度であるため、記入しない。
レーザー抜髄に関する研究

直接抜髄即時根管充填時の術後の臨床症状の出現を可及的に予防する方法としてPulsed Nd : YAGレーザーを応用した。また、根管貼薬剤として従来より使用されているFCについても検討が行われ、術後疼痛の原因とされているためにCa (OH)_2ペーストを応用した。動物実験の結果によると、Pulsed Nd : YAGレーザーを根尖部のアピカルシート部に照射すると、アピカルシート部に残存していたデブリスが蒸散し、その部の表層、約10μmの深さで象牙質表層が溶岩状を呈することが明かになった。また、根尖部分岐内の残存歯質はレーザーエネルギーにより凝固壊死し、その直下の根尖部分岐管内には石灰化が生じていた。以上の反応は、レーザーエネルギーが、3W, 20pps, 0.5秒、2W, 20pps, 1秒、1W, 20pps, 2秒の照射条件下で最も良好であった。これらの条件下で臨床治験を行ったところ、30症例中25例(83%)に術後疼痛が出現しなかった。以上の結果は従来の報告に比較すると極めて、良い成績であり、本法は臨床応用が可能であり、有用な治療法ということができた。
組換え感染性クローンウイルスによる新規ＩＢＶワクチンの研究開発

リバースジェネティクス技術によって構築された伝染性気管支炎ウイルス(IBV)クローン作製技術を用いてIBVワクチン株のウイルスベクターを作出した。このIBVクローンをプラットフォームとして、近年流行している野外株由来のSタンパク質遺伝子と置換した組換えIBVを作製した。さらに、組換えウイルスの性状解析を行ったところ、これら組換えウイルスはIBVクローンの弱毒性を維持しつつ、組換えに用いられた野外株に対する感染防御免疫を誘導した。この新規ワクチン株作製技術は、従来の弱毒ワクチン株の作製に代わる、より迅速かつ有効なIBVワクチンの開発法に進展する事が期待される。鶏伝染性気管支炎ウイルス(IBV)の高頻度の遺伝子変異により、その主要中和抗原であるSタンパク質は血清型多様性を示し、交差防御も乏しいことから単一のワクチンによる防御は困難である。現在の養鶏業界では、一羽の鶏に対して複数の血清型の異なるIBVワクチン接種に加え、様々な感染症に対するワクチン接種が行なわれているが、ワクチンのコスト、接種労力削減の為にワクチンの多価化が強く望まれている。このような背景から、IBVの血清型多様性、新規野外株の流行、ならびに鶏ワクチンの多価化に対応する次世代IBVワクチンの研究開発が必要である。本研究はIBVクローンウイルス作製技術を基盤として遺伝子組換えウイルスを作製することで、次世代組換えIBVワクチン、ならびにIBVをウイルスベクターとする組換え多価鶏ウイルスワクチンの構築を目的としている。本年度は野外分離株の構造タンパク質遺伝子領域を用いて組換えIBVの作製を試みた。その結果、発育鶏卵内において、組換えIBVを安定的に増殖させることに成功した。現在、組換えウイルスの性状解析、ならびに感染血清を用いた中和抗体価の測定を行っている。一方、C78株の野外分離株、及び長期継代により弱毒化された株の全ゲノム塩基配列を決定した。さらに、他のIBV株について強毒及び弱毒株の全ゲノムシークエンス解析を行っており、今後、両株のゲノム塩基配列を比較することで遺伝子変異部位を同定する予定である。この塩基配列の比較により、IBVの病原性関連遺伝子の同定、ならびに長期継代による弱毒化の機構解明に繋がることが期待される。現在の養鶏業界では、一羽の鶏に対して複数の血清型の異なるIBVワクチン接種に加え、様々な感染症に対するワクチン接種が行なわれていることから、IBVの血清型多様性ならびに鶏ワクチンの多価化に対応する次世代IBVワクチンの研究開発が必要である。本研究はIBVクローンウイルス作製技術を基盤として遺伝子組換えウイルスを作製することで、次世代組換えIBVワクチンならびにIBVをウイルスベクターとする組換え多価鶏ウイルスワクチンの構築を目的としている。平成26年度は、IBVクローン(弱毒株)の構造タンパク質遺伝子を、野外分離株(強毒株)の同領域と入れ替えて作製された組換えIBVを用いて、鶏免疫試験を行い、組換えウイルスの性状解析ならびに中和交差の検討を行った。その結果、野外分離株の構造タンパク質遺伝子が組み込まれた組換えIBVは、弱毒性および免疫原性を保持しており、得られた抗血清は、組換えに用いられた野外分離株に対して高い中和活性を示した。この手法は、次世代IBVワクチン作製の基盤となる技術であり、上記成果により本システムが有用であることが示された。遺伝子型の異なる3株のIBVについて、強毒および弱毒株の全ゲノムシークエンス解析により遺伝子変異部位の探索を行い、IBVの病原性関連遺伝子の同定を試みたところ、いくつかの候補遺伝子を同定した。今後、さらに候補遺伝子を絞り込む予定である。IBVに関しては、病原性に関わる遺伝子が明らかになっておらず、本研究は、病原性関連遺伝子の同定ならびにIBVの長期継代による弱毒化の機構解明に繋がり、今後のワクチン開発に重要な知見となることが期待される。本研究はIBVクローンウイルス作製技術を基盤として、次世代組換えIBVワクチンならびにIBVをウイルスベクターとする組換え多価鶏ウイルスワクチンの構築を目的としている。平成27年度は、平成26年度に構築された組換えIBV作製技術を応用し、実用化に向けた検討を行った。近年、養鶏場で流行している遺伝子型のIBVをスクリーニングし、選別されたIBV野外株(平成26年度に使用した野外株とは異なる遺伝子型の株)の構造タンパク質遺伝子を用いて組換えIBVの作製を試みたところ、これまでと同様の作製方法では組換えIBVを作製することができなかった。このことから、再度、組換えIBVの作製方法を検討したところ、一部の領域の遺伝子を変えることで組換えIBVの作製に成功した。平成26年度に行った、強毒株および弱毒株の全ゲノムシークエンス解析による遺伝子変異部位の探索から同定された、IBVの病原性関連遺伝子の候補因子について機能解析を行った。IBVクローンウイルス作製技術を用いて病原性関連遺伝子の同定を試みているが明確な結論には至っておらず、一つのウイルス由来の因子に限らず複数の因子が関与している可能性が推察された。