hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腎線維化病変に浸潤するマクロファージの機能解析

進行性腎障害の予後規定因子である腎線維化の病変形成に浸潤マクロファージは重要な役割を果たしているが、浸潤マクロファージの活性化調節機構は未だ不明な点が多い。本研究は腎線維化病変に浸潤するマクロファージの低酸素誘導因子-1 (HIF-1)の役割について検討した。マクロファージのHIF-1は腎臓の線維化を抑制する方向に働くことがわかったがマクロファージを含め腎全体のHIF-1を抑制すると線維化に対する効果は消失した。これらの結果から、腎線維化病変に存在するHIF-1は細胞種により線維化に対する態度が異なることが示唆された。マクロファージ特異的にHIF-1αを欠損させたマウスを用い、腎線維化モデル(一側尿管閉塞)におけるマクロファージの役割を検討した。その結果、尿管閉塞7日目においてHIF-1欠損マウスにおいて腎線維化が増悪することがわかった。しかしながら線維化病変部位に浸潤するマクロファージ数に差はなく、尿細管障害やアポトーシスの程度に差は認められなかった。浸潤した炎症細胞のflow cytometryによる単球/マクロファージ分画の解析においてもLy-6C hiおよびLy-6C loの細胞数は両群とも同程度の増加が認められた。線維化促進因子として知られるTGFβ, CTGFのUUO腎における遺伝子発現を調べたところ、TGFβはUUOにより対照群・HIF-1α欠損群共に著明な発現亢進を認めたが、両群間で有意差を認めなかった。CTGFはUUOにより対象群・HIF-1α欠損群共に著明な発現亢進を認め、対象群に比べHIF-1α欠損群で有意な発現の増加を示した。同様の結果はCTGFの蛋白発現においても認められた。CTGF発現細胞について探るため、HIF-1α欠損群のUUO腎よりCollagenaseを用いて腎細胞を単離し、CD11b MACS beadsを用いて主にマクロファージからなるCD11b陽性細胞と、尿細管上皮細胞・線維芽細胞等の腎実質細胞からなるCD11b陰性細胞にわけて検討したところ、CTGF遺伝子発現は主としてCD11b陰性細胞に認められたことからHIF-1α欠損に伴うCTGFの発現増強は腎実質細胞に由来することがわかった。マクロファージ特異的にHIF-1α欠損により腎線維化モデル(一側尿管閉塞)において腎線維化が増強した機序を検討するため、マクロファージ特異的にHIF-1αを欠損したマウスおよび野生型マウスより骨髄由来マクロファージを調製し、低酸素下に培養して得られたconditioned mediumを用いマウス培養近位尿細管細胞mPROX24およびマウス培養腎線維芽細胞の各種線維化関連分子の遺伝子発現に対する効果を検討した。しかしながら、HIF-1α欠損マクロファージの培養上清は尿細管細胞や線維芽細胞の線維化関連分子の遺伝子発現に影響を与えなかった。他家の報告によると近位尿細管特異的なHIF-1α欠損により腎線維化および腎マクロファージ浸潤が抑制されることが報告されており、我々のマクロファージ特異的HIF-1α欠損による腎線維化亢進効果と対照的である。そこで、腎臓全体ではHIF-1α欠損により腎線維化がどのように修飾されるかについて検討を開始した。Ubc-Cre ERT2マウスは全身性にtamoxifen誘導性に核内でCre recombinase活性を発現する。そこでhif-1 floxedマウスと上記マウスを掛け合わせることでtamoxifen誘導性に全身の組織でHIF-1α欠損を生じるマウスを繁殖し検討に用いた。Tamoxifen投与により腎におけるhif-1 mRNA発現は95%以上抑制された。しかしながらHIF-1α欠損によっても尿管閉塞モデルにおける腎臓の線維化は影響を受けずマクロファージの浸潤も野生型と差が認められなかった。腎線維化の病変形成と進展に局所に浸潤した単球/マクロファージが深く関与している。本研究ではマクロファージの機能調節に関わる転写因子の低酸素誘導因子HIF-1に特に焦点を当て、腎線維化におけるマクロファージHIF-1の役割についてマクロファージ特異的にHIF-1を欠損させたマウスを用いて検討した。その結果、マクロファージのHIF-1はマウス閉塞性腎症における腎線維化の進行に抑制的に働く事が明らかとなった。腎内には尿細管細胞や間質細胞にもHIF-1が存在しているが、これらの細胞のHIF-1とマクロファージHIF-1の腎線維化における相対的意義を検討するため全身性にHIF-1の欠損を誘導したマウスを用いて検討した。しかしながら腎臓全体でHIF-1を欠失させても腎線維化は同程度に生じた。従ってマクロファージ以外の腎構成細胞のHIF-1は逆に線維化を促進している可能性が示唆された。最終年度では全身性にHIF-1した際の腎線維化病変における線維化関連因子の遺伝子発現について、さらに詳細に検討を加えた。腎組織のHIF-1遺伝子発現は野生型に比し95%程度抑制されたにもかかわらず線維化関連分子の遺伝子発現は野生型と差はなかった。またHIF-1依存性に増加し線維化への関与が知られるLysyloxidase (Lox)の遺伝子発現は線維化に伴い著増したがHIF-1を欠損させても影響を受けなかった。

また同様にHIF依存性の血管新生因子であるVEGFの発現は予想に反し線維化に伴い低下し、HIF-1の有無によっても影響を受けなかった。これらの結果から今回用いた腎線維化モデルにおけるLysyl oxidaseやVEGF遺伝子発現はHIF-1が関与していないことが明らかとなった。これらの研究成果はHIFを標的とした創薬における腎臓の応答に関する貴重な情報となると考えられる。進行性腎障害の予後規定因子である腎線維化の病変形成に浸潤マクロファージは重要な役割を果たしているが、浸潤マクロファージの活性化調節機構は未だ不明な点が多い。本研究は腎線維化病変に浸潤するマクロファージの低酸素誘導因子-1 (HIF-1)の役割について検討した。マクロファージのHIF-1は腎臓の線維化を抑制する方向に働くことがわかったがマクロファージを含め腎全体のHIF-1を抑制すると線維化に対する効果は消失した。これらの結果から、腎線維化病変に存在するHIF-1は細胞種により線維化に対する態度が異なることが示唆された。マクロファージのHIF-1αの腎線維化における意義については原著論文として既に報告した。全身性に誘導的にHIF-1alphaの欠損ではマクロファージ選択的に欠損させた場合と異なり、腎線維化の程度に影響がないことを明らかにしたから薬効安全性学前年度の検討によりマクロファージ選択的なHIF-1α欠損によって腎線維化が促進されたにもかかわらず全身性にHIF-1αを欠損させても腎線維化の程度に変化が見られないことがわかった。この結果は腎内においてマクロファージ以外の細胞に発現するHIF-1αの欠損により線維化が軽減している可能性を示唆している。この仮説を明らかにするためにtamoxifen誘導性に全身の組織でHIF-1α欠損を生じるマウス(Ubc-Cre ERT2 hif-1αf/f)および野生型マウスから骨髄液を採取し、それぞれを全身X-線照射をあらかじめ行い骨髄破壊したUbc-Cre ERT2 hif-1αf/fマウスおよび野生型マウスに骨髄移植を行い、骨髄キメラマウスを作成し、腎線維化の程度がどのように変わるかを検討する。マクロファージHIF-1αの欠損により腎線維化が増強する機序の一つとして腎実質細胞に由来するCTGF発現増強が関与する可能性を示したから今年度はマクロファージ特異的にHIF-1α欠損により腎線維化モデル(一側尿管閉塞)において腎線維化が増強した機序をさらに詳細に検討する。マクロファージ特異的にHIF-1αを欠損したマウスおよび野生型マウスより骨髄由来マクロファージを調製し、低酸素下に培養して得られたconditioned mediumを用いマウス培養近位尿細管細胞mPROX24およびマウス培養腎線維芽細胞の各種線維化関連分子の遺伝子発現に対する効果を検討する。また、腎線維化形成のより早い時期における浸潤マクロファージの特性をHIF-1欠損マウスおよび野生型で比較するため尿管閉塞後早期の腎臓より単離細胞を調製し、flow cytometryによる単球/マクロファージ分画の解析を行うと共に単球/マクロファージ分画をCD11b magneticbeadsで調製し、遺伝子発現を比較する。
慢性病患者のセルフケア構造と看護の役割に関する研究

1.対象:本研究用に開発した5つの測定具(【○!1】患者-医療者関係スケ-ル、【○!2】ソ-シャルサポ-ト-PRQ日本語版、【○!3】セルフケア達成感スケ-ル、【○!4】セルフケア意識スケ-ル、【○!5】日常生活スキルスケ-ル)を含む8部構成の質問紙調査を13総合病院外来において慢性病患者を対象に行った。回答数は615、有効回答はそのうち498件(81%)、回答者の平均年齢は58歳、男女費は6:4、最多疾患は心血管系36%であった。2.分析結果:点数化したデ-タの相関マトリックスによる分析結果を、本研究の概念枠組の要素でみた場合、セルフケア構成要素(セルフケア意識と日常生活スキル)とセルフケア達成度(同達成感と医学的指標による評価の総合)との間に(r=.348,p<.001)、またセルフケア資源(患者-医療者関係、PRQ、民間療法利用度)とセルフケア達成度の間に正の相関がみられた(r=.481,p<.001)。前者は本研究の仮説を棄却し後者は支援した。また、セルフケア構成要素と同資源との間にも正の相関がみられ(r=.401,p<.001)、セルフケア構成要素と同資源の総合およびセルフケア達成度の間にも、同様に正の相関がみられた(r=.461,p<.001)。この場合も前者は仮説を棄却し、後者は支持した。セルフケア達成度の構成要素とみなした個人の主観的な達成感と医学的指標に基く価値の間には、関係が見出せなかった(r=.074,p<.100)。さらに、このセルフケア達成度を基準変数として、民間療法利用度のほか6つの予測変数をもつ重回帰分析を行い、予測値の高い変数としてセルフケア意識、患者-医療者関係、ソ-シャルサポ-トを検出できた(R^2=.4761,F=6.012,p.<.001)。これは先行諸研究を概ね支持していた。また日常生活スキルと民間療法利用度はセルフケア達成度に大きく影響していないこともわかった。これらの結果により、看護婦の役割は患者のセルフケア意識に働きかけ、患者関係を確立する方向に導き出せる。本研究のために開発した測定具(民間療法利用度質問表、治療処方の難易度質問表、患者-医療者関係スケール、セルフケア達成度スケール、ソーシャルサポートスケース日本語版)のもつ内部整合性を検討するため、予備調査を行った。調査手続き:平成元年2月3日15日までの間に都内2総合病院の内科外来においてサンプルング基準に照らして選択した通院患者110名に質問紙を配布、郵送法による回答を依頼し、75名の回答者をえた。このうちすべてのスケールに完全に回答しているものを完全回答(n=37)として扱い、この分について統計的解析を行った。また75名中20名から同意を得て面接を行った。統計的解析結果のおもなものを以下に記す。結果:(1)患者-医療者関係スケール;当初作成した10項目のうち1項目のみ全体スコアとの相関が-0.2521(p=0を棄却するrの限界値=0.325)であったため、これを除いて9項目で構成したものを主成分分析した結果、第1因子寄与率52.7、累積比は第2因子で65.1%、内部整合性はα係数でみたところ0.835で高い信頼性がえられた。(2)セルフケア達成度スケール;当初設けた12項目それぞれの全体スコアとの相関はすべて上記のrの限界値を越えていたため、そのまま12項目を採用した。主成分分析の結果は第1因子寄与率39.8、累積比は第2因子で53.3%、内部整合性はα係数で0.835と、これまた高い信頼性スコアをえた。(3)ソーシャルサポートスケール;これはオリジナル版(Brandt,PA et al,1981)25項目を翻訳して用い、α係数0.889をえた。この値はオリジナル版についての報告0.89と一致していた。上記のごとく、作成したスケールの内部整合性はいすせれも大であった。なお、変数相互の関係や面接データについての分析結果は省略する。2.分析

結果:点数化したデ-タの相関マトリックスによる分析結果を、本研究の概念枠組の要素でみた場合、セルフケア構成要素(セルフケア意識と日常生活スキル)とセルフケア達成度(同達成感と医学的指標による評価の総合)との間に(r=.348,p<.001)、またセルフケア資源(患者-医療者関係、PRQ、民間療法利用度)とセルフケア達成度の間に正の相関がみられた(r=.481,p<.001)。前者は本研究の仮説を棄却し後者は支援した。また、セルフケア構成要素と同資源との間にも正の相関がみられ(r=.401,p<.001)、セルフケア構成要素と同資源の総合およびセルフケア達成度の間にも、同様に正の相関がみられた(r=.461,p<.001)。この場合も前者は仮説を棄却し、後者は支持した。セルフケア達成度の構成要素とみなした個人の主観的な達成感と医学的指標に基く価値の間には、関係が見出せなかった(r=.074,p<.100)。さらに、このセルフケア達成度を基準変数として、民間療法利用度のほか6つの予測変数をもつ重回帰分析を行い、予測値の高い変数としてセルフケア意識、患者-医療者関係、ソ-シャルサポ-トを検出できた(R^2=.4761,F=6.012,p.<.001)。これは先行諸研究を概ね支持していた。また日常生活スキルと民間療法利用度はセルフケア達成度に大きく影響していないこともわかった。これらの結果により、看護婦の役割は患者のセルフケア意識に働きかけ、患者関係を確立する方向に導き出せる。
脊髄損傷後の脊髄再生プロセスにおけるNa^+-K^+ATPaseの役割

脊髄損傷による四肢麻痺は、脊髄外傷や大血管手術後のみならず、稀だが麻酔中や痛みの治療後にも発生する。さまざまな予防的処置や治療にもかかわらず、一旦脊髄損傷(下肢麻痺)が生じるとそれからの快復は極めて難しい。しかしこの数年間の神経科学の進歩は、脊髄のニューロンや軸索の再生の知見も集積し、麻酔薬の神経保護効果という視点から検討した。局所麻酔薬、テトラカインのアポトーシスに影響を観察し、テトラカインは濃度依存性にPC-12細胞のアポトーシスを誘導し、重要な細胞膜関連のシグナル誘導酵素であるphospholipaseD(PLD)が、DGやPKCの活性を介して細胞をアポトーシス阻止し、PLDの活性が細胞の再生にも影響している可能性示唆する結果を得たので、更に新しく臨床導入されたロピバカインとレボブピバカインのアポトーシスシグナル伝達分子への影響を検討した。現在までの結果として、PC12細胞をもちいてWestern blot法で検討した。ATPsensitiveK+チャネル作動薬は、MAPKカスケードの内、主に細胞増殖刺激により活性化されるERKを賦活する。局所麻酔薬、ロピバカインとレボブピバカインのアポトーシスシグナル伝達分子PLDの活性へ影響し、またその異性体の細胞内シグナル伝達タンパクのリン酸化への影響は、局所麻酔薬によっては異なるが、その光学異性体のMAPKのリン酸化に対する影響は同じであるとの結果を得た。臨床的視点から、大動脈遮断による脳・脊髄虚血後、その解除後の中枢神経血管の反応性を検討した。大動脈遮断後の中枢神経系微小血管は収縮状態が持続しているが、PDE阻害薬(milrinone)との活性(colforsin)によって軽減されることから、虚血回復後の微小循環障害の原因として、血管反応に細胞内機序も役割を担っていると示唆された。脊髄損傷による四肢麻痺は、脊髄外傷や大血管手術後のみならず、まれだが麻酔中や痛みの治療後にも発生している。さまざまな予防的処置や治療がなされているものの、一旦脊髄損傷(下肢麻痺)が生じるとそれからの快復は極めて難しい。しかしこの数年間の神経科学の進歩は、脊髄のニューロンや軸索の再生の知見も集積し、損傷脊髄の再生(四肢麻痺の治療)の可能性もみえてきた。(Bulsara KR etal.Spine,2002;Wickekgren I.Science,2002)初年度の研究計画は、ラットの脊髄損傷モデルを作成し、損傷脊髄におけるNa^+-K^+ATPase(Na^+ポンプ;Na^+3個とK^+2個を細胞外内に移動させ、細胞膜を介するelectrochemical gradientを維持)の役割を検討する予定であったが、大学の移転などで予定通り進んではない。しかし、局所麻酔薬、テトラカインのアポトーシスに影響を観察し、テトラカインは濃度依存性にPC-12細胞のアポトーシスを誘導し、重要な細胞膜関連のシグナル誘導酵素であるphospholipase D(PLD)が、DGやPKCの活性を介して細胞をアポトーシスから守ることなどを明らかとし、PLDの活性が細胞の再生にも影響している可能性示唆する結果を得ている。現在論文を誌筆中である。しかしこの数年間の神経科学の進歩は、脊髄のニューロンや軸索の再生の知見も集積し、損傷脊髄の再生(四肢麻痺の治療)の可能性がある。初年度の研究で、局所麻酔薬、テトラカインのアポトーシスに影響を観察し、テトラカインは濃度依存性にPC-12細胞のアポトーシスを誘導し、重要な細胞膜関連のシグナル誘導酵素であるphospholipaseD(PLD)が、DGやPKCの活性を介して細胞をアポトーシスから守ることなどを明らかとし、PLDの活性が細胞の再生にも影響している可能性示唆する結果を得たので、更に新しく臨床導入されたロピバカインとレボブピバカインのアポトーシスシグナル伝達分子への影響を検討する。しかし、本年度の研究計画は、大学の移転などで進んでいない。現在までの結果として、PC12細胞をもちいてWestern blot法で検討し、ATPsensitiveK+チャネル作動薬は、MAPKカスケードの内、主に細胞増殖刺激により活性化されるERKが賦活することを見出している。また引き続き、新しく導入された局所麻酔薬、ロピバカインとレボブピバカインのアポトーシスシグナル伝達分子PLDの活性への影響を検討している。

ATPsensitiveK+チャネル作動薬は、MAPKカスケードの内、主に細胞増殖刺激により活性化されるERKを賦活する。局所麻酔薬、ロピバカインとレボブピバカインのアポトーシスシグナル伝達分子PLDの活性へ影響し、またその異性体の細胞内シグナル伝達タンパクのリン酸化への影響は、局所麻酔薬によっては異なるが、その光学異性体のMAPKのリン酸化に対する影響は同じであるとの結果を得た。臨床的視点から、大動脈遮断による脳・脊髄虚血後、その解除後の中枢神経血管の反応性を検討した。大動脈遮断後の中枢神経系微小血管は収縮状態が持続しているが、PDE阻害薬(milrinone)との活性(colforsin)によって軽減されることから、虚血回復後の微小循環障害の原因として、血管反応に細胞内機序も役割を担っていると示唆された。
物体認識プロセスにおける視覚的注意の抑制機能の解明

本研究では注意の抑制現象を実験的に作り出すパラダイムを用いて注意が極端に少ない位置を作り出し,その位置に提示された刺激の認識プロセスについて検討した。今年度実施した主な研究活動は以下の通りである。非注意による見落としが,局所的な特徴検出の不全により生起する可能性について検討するにあたり,昨年度は先行研究のレビューを行なった。本年度は,レビューをまとめた論文が国内誌(認知科学)に受理された。また昨年度から,非注意による見落としが,局所的な特徴検出の不全により生起する可能性について検討するため,注意の抑制が生起した位置での線分刺激を検出および識別するまでの反応時間および正答率を測定してきた。昨年度は検出課題では先行研究と同様に先行刺激位置での成績が悪くなったが,識別課題では,先行刺激位置での成績は低下しないことが示された。本年度は,検出課題において線分刺激の大きさをパラメトリックに変化させて検討した結果,線分刺激の大きさが小さい場合には抑制に伴う見落としが生起したが,刺激が大きい場合には見落としは生起しなかった。以上より,非注意位置における見落としは1)「刺激強度」と「構え」の2つの要因による影響を受けること,2)刺激の出現を判断するような低次のプロセスの不全が生じていることが示された。注意の抑制が日常場面における視覚探索課題に及ぼす影響を検証するために,視覚的印付けに伴う抑制が三次元空間マップ上の位置に生起するかについて検討した。実験では,探索刺激は配置を固定したままY軸を中心として回転したが,このような状況でも視覚的印付けは頑健に生起した。すなわち視覚的印付けに伴う抑制は三次元空間マップ内の位置に生起することが明らかとなった。この一連の研究成果をまとめた論文をVision Research誌に投稿し,アクセプトされた。今年度,実施したことは主に次の4点である。1)前年度から引き続き心理物理実験を中心に行なった。検出課題において線分刺激の大きさをパラメトリックに変化させて検討した結果,線分刺激の大きさと見落としの生起の関係性を見出した。この成果を国内学会でポスター発表した。現在は,効果の頑健性を確かめるために追加実験を行っている。2)視覚的印付けの先行研究のレビュー論文を投稿し,「認知科学」に受理された。3)視覚的印付けに伴う抑制が三次元空間マップ内の位置に生起するかについて検討した。この一連の研究成果をまとめた論文をVision Research誌に投稿し,受理された。4)前年度に,非注意状態での視覚処理が記憶への符号化に及ぼす影響を検討するために,注意の抑制が単純接触効果に及ぼす影響について検討したが,本年度はこの研究成果の論文化を進めた。心理物理実験については,実験パラダイムの最適化に難航し,研究の進展が遅れている。一方で,研究計画の見直しのために行なった先行研究のレビューが論文化される,または本来の研究計画よりも前倒しで行なっている「注意の抑制が記憶成績に及ぼす影響の検証」,「日常場面に近い三次元空間での抑制範囲の検証」など,前倒しで研究を開始した部分については研究成果を蓄積することが出来た。前年度に得られた成果を論文にまとめ,国内誌および国際誌に投稿する。研究成果の蓄積が見込まれる2年次から3年次の研究計画を中心に行うとともに,課題が残る心理物理実験(1年次の計画)の挽回もはかる。本研究の目的は非注意(注意が向かない状態)での視覚特性を解明し,物体認識のどの段階(局所的な特徴検出,背景からの分節化,作業記憶への符号化)における処理が非注意により不全になるかを検討することであった。この問題を検討するために,本研究では注意の抑制現象を実験的に作り出すパラダイムを用いて注意が極端に少ない位置を作り出し,その位置に提示された刺激の認識プロセスについて検討した。(1)非注意による見落としが,局所的な特徴検出の不全により生起する可能性について検討した。注意の抑制(視覚的印付け)が生起した位置での線分刺激を検出および識別するまでの反応時間および正答率を測定した。その結果,検出課題では先行研究と同様に先行刺激位置での成績が悪くなった。一方,識別課題では,先行刺激位置での成績は低下しなかった。この結果は,刺激の出現を判断するプロセスでは抑制による不全が生じるが,特徴を分析するプロセスまでが課題に含められた場合には,抑制による影響が無くなる可能性を示している。現在,この結果の頑健性を確かめるための追加実験を行っている。尚,実験実施にあたり先行研究のレビューを行い,論文としてまとめて国内誌に投稿中である。(2)非注意状態での視覚処理が記憶への符号化に及ぼす影響を検討するために,注意の抑制が単純接触効果に与える影響について検討した。より現実場面に近い状況として,ホームページを観察中にバナー広告が出現する実験事態を設定した。突然出現するバナー広告を無視しながら,ホームページを観察した結果,バナー広告に表示されていた文字の好意度がチャンスレベルよりも有意に低下した。この結果は,課題と無関係な刺激への注意が抑制された結果,その刺激の符号化が阻害され,選好判断に影響したことを示している。現在この成果をまとめて論文化を進めている。2017年度上旬は,所属機関での実験環境の構築と設定にやや手間取った。下旬は申請書のスケジュールに沿って,研究を行うことができた。今年度,実施したことは主に次の5点である。

1)実験室の環境を整備し,心理物理実験を行うための実験室を新たに構築した。研究を効率的に進めるためにカレンダー型の被験者募集システムを導入した。2)注意の抑制現象(視覚的印付け現象)が最適に生起する実験条件を特定するために,12人程度の被験者を募集した実験を繰り返し行った。視覚的印付けが最適に生起する条件を特定した。3)視覚的印付けによる抑制効果がプローブ刺激の検出課題では示されるが,識別課題では示されないことが明らかとなった。現在は,効果の頑健性を確かめるために追加実験を行っている。4)視覚的印付けの先行研究をまとめ,いまだ明らかになっていない点について議論するレビュー論文を国内誌に投稿した。5)非注意状態での視覚処理が記憶への符号化に及ぼす影響を検討するために,注意の抑制が単純接触効果に及ぼす影響について検討した。当初の計画通り、順調に実験結果を得る事が出来ている。心理物理実験については環境構築の都合上,進展が遅れているが,代わりに注意の抑制が記憶成績に及ぼす影響については研究計画よりも前倒しで研究が進んでいる。本研究では注意の抑制現象を実験的に作り出すパラダイムを用いて注意が極端に少ない位置を作り出し,その位置に提示された刺激の認識プロセスについて検討した。今年度実施した主な研究活動は以下の通りである。非注意による見落としが,局所的な特徴検出の不全により生起する可能性について検討するにあたり,昨年度は先行研究のレビューを行なった。本年度は,レビューをまとめた論文が国内誌(認知科学)に受理された。また昨年度から,非注意による見落としが,局所的な特徴検出の不全により生起する可能性について検討するため,注意の抑制が生起した位置での線分刺激を検出および識別するまでの反応時間および正答率を測定してきた。昨年度は検出課題では先行研究と同様に先行刺激位置での成績が悪くなったが,識別課題では,先行刺激位置での成績は低下しないことが示された。本年度は,検出課題において線分刺激の大きさをパラメトリックに変化させて検討した結果,線分刺激の大きさが小さい場合には抑制に伴う見落としが生起したが,刺激が大きい場合には見落としは生起しなかった。以上より,非注意位置における見落としは1)「刺激強度」と「構え」の2つの要因による影響を受けること,2)刺激の出現を判断するような低次のプロセスの不全が生じていることが示された。注意の抑制が日常場面における視覚探索課題に及ぼす影響を検証するために,視覚的印付けに伴う抑制が三次元空間マップ上の位置に生起するかについて検討した。実験では,探索刺激は配置を固定したままY軸を中心として回転したが,このような状況でも視覚的印付けは頑健に生起した。すなわち視覚的印付けに伴う抑制は三次元空間マップ内の位置に生起することが明らかとなった。この一連の研究成果をまとめた論文をVision Research誌に投稿し,アクセプトされた。今年度,実施したことは主に次の4点である。1)前年度から引き続き心理物理実験を中心に行なった。検出課題において線分刺激の大きさをパラメトリックに変化させて検討した結果,線分刺激の大きさと見落としの生起の関係性を見出した。
都市の緑に対する市民意識構造の日英比較に関する研究

この研究は、緑に対して市民がもっている意識を様ざまな角度から問い、その多元的な構造を明らかにし、環境の改善・再生に寄与し得る実践的な方法を提起しようとしたものである。ことに意識構造の解明にあたって都市、農村といった地域性や、さらには日英といった国民性による対比を試みた。分析手法として林知己夫博士の数量化3類を用いた。分析の結果、都市の緑に対する市民意識はつぎのように解明された。1日英両国に共通の意識構造軸は、一つは「緑に対する関与の姿勢」で、「積極的関与か、消極的関与か」に分化し、もう一つは「関与の対象」で、「自然物志向か、人工物志向か」に分化している。2これら2本の構造軸を組合せ、つぎの日英共通の4つの意識類型を設定できた。(1)積極的関与+自然物志向(2)積極的関与+自然物志向(3)積極的関与+人工物志向(4)消極的関与+人工物志向3これら共通する意識構造、意識類駅に対し、構造軸解釈の補助概念、「公園」のような「みどり」にかかわる言葉の解釈、構造軸の優先順位等に、日英間の違いがあらわれた。4サンプル分布図では、日本側で「積極的関与+人工物志向」(人工的な「みどり」を対象に積極的直接的に関与しようとする類型)に、また英国側で「消極的関与+自然物志向」(自然界の'green'を対象に消極的に距離をおこうとする類型)に片寄る傾向がみられた。今後両国間の分化交流や、環境再生に向けてのパートナーシップ関係の構築にあたって、本研究で解明された日英両国の意識構造、意識類型の共通性と差異性が充分配慮されるべきであろう。1研究目的-今日都市生活者にとって緑といえば、単に色彩をあらわすだけではなく、環境の質にかかわる象徴的な意味をもっている。そこでこの研究は、緑に対して市民がもっている意識を様ざまな角度から問い、その多元的な構造を明らかにし、環境の改善・再生に寄与し得る実践的な方法を提起しようとするものである。初年度はその意識構造を都市、農村といった地域性にもとづいて対比しながら、それぞれの特質を明らかにする。2今年度の調査経過と成果-調査を開始するにあたって、調査票を作成する枠組みを把握するため、日英両国で「都市と緑」というキーワードの提示し、そのイメージを自由に記述してもらった。その一方で「都市の緑」に限定せず、一般的な地域イメージを日本側大都市地域(横浜市青葉区)、農村部(長野県山形村)の住民にたずね、当初予定した分析方法を用いて意識構造の抽出を試みた。とくに日英両国で実施した「都市と緑」イメージ調査の結果、緑にたいするイメージは、(1)色彩としての緑、文学における緑、人名などの緑、(2)公園、街路樹など具体的に都市空間を構成している部材としての緑、(3)都市を囲む農村、農業、自然を含めた環境として認識される緑、(4)環境問題にたいする認識から生活様式や社会システムを再検討する契機としての緑・・・と重層していることがわかった。とくに日英を対比してみると、日本では(1)、(2)にたいする認識が強いのに比べ、イギリスでは(3)、(4)と、環境問題としての認識が強くなっている。研究の第2年度は、初年度の分析結果にもとづく調査票によってアンケート調査を実施し、都市の緑に関する日英両国の市民意識構造を統計的に解明する。1研究目的今日都市生活者にとって緑といえば、単に色彩をあらわすだけではなく、環境の質にかかわる象徴的な意味をもっている。

そこでこの研究は、緑に対して市民がもっている意識を様ざまな角度から問い、その多元的な構造を明らかにし、環境の改善・再生に寄与し得る実践的な方法を提起しようとするものである。2年度目の今年は、昨年度日英両国で抽出した「都市と緑」のイメージにもとづき、意識調査票を作成し、事例地で実際に調査することにした。2今年度の調査経過と成果(1)調査票(1)公園、街路樹など具体的に都市空間を構成している部材としての緑、(2)都市を囲む農村、農業、自然を含めた環境として認識される緑、(3)環境問題にたいする認識から生活様式や社会システムを再検討する契機としての緑、(4)人生観を中心に36問、6ページの調査票を作成した。(2)事例地とサンプル数日本首都圏近郊:331、地方都市市街地:275、農村部:242英国大都市近郊:261(3)集計作業現在、調査結果のデータ入力、単純集計まで終了した。今後事例地ごとに林知己夫の数量か3類を用いて意識類型を抽出し、日英の意識構造の違いを明らかにする予定であるこの研究は、緑に対して市民がもっている意識を様ざまな角度から問い、その多元的な構造を明らかにし、環境の改善・再生に寄与し得る実践的な方法を提起しようとしたものである。ことに意識構造の解明にあたって都市、農村といった地域性や、さらには日英といった国民性による対比を試みた。分析手法として林知己夫博士の数量化3類を用いた。分析の結果、都市の緑に対する市民意識はつぎのように解明された。1日英両国に共通の意識構造軸は、一つは「緑に対する関与の姿勢」で、「積極的関与か、消極的関与か」に分化し、もう一つは「関与の対象」で、「自然物志向か、人工物志向か」に分化している。2これら2本の構造軸を組合せ、つぎの日英共通の4つの意識類型を設定できた。(1)消極的関与+自然物志向(2)積極的関与+自然物志向(3)消極的関与+人工物志向(4)消極的関与+人工物志向3これら共通する意識構造、意識類駅に対し、構造軸解釈の補助概念、「公園」のような「みどり」にかかわる言葉の解釈、構造軸の優先順位等に、日英間の違いがあらわれた。4サンプル分布図では、日本側で「積極的関与+人工物志向」(人工的な「みどり」を対象に積極的直接的に関与しようとする類型)に、また英国側で「消極的関与+自然物志向」(自然界の'green'を対象に消極的に距離をおこうとする類型)に片寄る傾向がみられた。今後両国間の文化交流や、環境再生に向けてのパートナーシップ関係の構築にあたって、本研究で解明された日英両国の意識構造、意識類型の共通性と差異性が充分配慮されるべきであろう。
L1_2型trialuminideの電気抵抗異常

Al-Ti-X及びAl-Zr-X系でXとして数%の3d遷移金属を含んだL1_2型金属間化合物の電気抵抗を4.2Kから1200Kまで測定した.その結果,(1)全ての化合物で電気抵抗の温度依存性は極めて小さい,(2)残存抵抗値はX=Feのあたりをピークに極大を示し,(3)抵抗値の温度依存はMn,Feを加えた場合に負を示す,ことを見いだした.また,(2),(3)は添加元素のd電子数に依存し,Xとして複数の添加元素を加え4元系にした場合にも成立していることを明かにした.これらの実験結果は以下のように説明される.数%存在する遷移金属がL1_2構造の中でAlの位置にランダムに分布するため電子状態を乱し散乱中心として働き,伝導電子の平均自由行程は最近接原子間距離の数倍程度にまで短くなっている.このため,温度上昇に伴うフォノン散乱の影響をほとんど受けない.遷移金属が供給する電子とイオンの周りに作る新たな準位とが影響してフェルミ準位近傍の電子構造が変化する.残留抵抗値のd電子数依存性は仮想束縛状態を仮定したMott-Friedel-Anderson理論によって説明できる.一方電気抵抗の温度依存性は温度上昇に伴うフェルミ準位近傍の電子構造変化が複雑に作用しており統一的な解釈は出来なかった.しかし,Moojiの経験則(負の温度依存を示す物質の電気抵抗が高い)は確認された.Al-Ti-X及びAl-Zr-X系でXとして数%の3d遷移金属を含んだL1_2型金属間化合物の電気抵抗を4.2Kから1200Kまで測定した.その結果,(1)全ての化合物で電気抵抗の温度依存性は極めて小さい,(2)残存抵抗値はX=Feのあたりをピークに極大を示し,(3)抵抗値の温度依存はMn,Feを加えた場合に負を示す,ことを見いだした.また,(2),(3)は添加元素のd電子数に依存し,Xとして複数の添加元素を加え4元系にした場合にも成立していることを明かにした.これらの実験結果は以下のように説明される.数%存在する遷移金属がL1_2構造の中でAlの位置にランダムに分布するため電子状態を乱し散乱中心として働き,伝導電子の平均自由行程は最近接原子間距離の数倍程度にまで短くなっている.このため,温度上昇に伴うフォノン散乱の影響をほとんど受けない.遷移金属が供給する電子とイオンの周りに作る新たな準位とが影響してフェルミ準位近傍の電子構造が変化する.残留抵抗値のd電子数依存性は仮想束縛状態を仮定したMott-Friedel-Anderson理論によって説明できる.一方電気抵抗の温度依存性は温度上昇に伴うフェルミ準位近傍の電子構造変化が複雑に作用しており統一的な解釈は出来なかった.しかし,Moojiの経験則(負の温度依存を示す物質の電気抵抗が高い)は確認された.
胃腸管間質腫瘍における低酸素応答関連分子異常の臨床病理学的意義に関する研究

まず、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)標本より、DNAを抽出し、KIT, PDGFRAについて、PCR,シークエンス法にて遺伝子変異を検出した。特定のKIT変異パターンがGISTの悪性度、遠隔転移を相関することが判明した。また、SDHBの免疫組織化学染色を行った。SDHB発現消失例はGISTの5%未満であったが、リンパ管侵襲やリンパ節転移と相関することが判明した。今後はSDHAの免疫染色も行い、臨床病理学的意義を検討する予定である。なお付随して行ったGISTならびに類縁腫瘍におけるInsulin-like growthfactor II mRNA-binding protein 3 (IMP3)の発現の検討においては、IMP3高発現はGISTでは観察されず、臨床病理学的意義は低いと考えられた。しかし悪性黒色腫、平滑筋肉腫、悪性中皮腫、炎症性筋線維芽細胞腫瘍などでは悪性度が高い症例において高発現していることが判明した。GISTと類縁腫瘍の鑑別にIMP3が有用であることが示唆された。胃腸管間質腫瘍(GIST)において、KITまたはPDGFRA遺伝子の機能獲得型変異に加え、低酸素応答に関連するHIF(hypoxia-induced factor)の蓄積やHIFの蓄積に影響を与えるTCA回路構成因子であるSDH(succinate dehydrogenase;コハク酸脱水素酵素)の異常を解析し、GISTの発生や高悪性化への関与を解明することを目的とした研究である。多数例のGISTにおいて、免疫組織化学染色を用いて解析したところ、HIF-1αの過剰発現例は有意に無病生存期間が短かかった。また、腫瘍径、核分裂数、血管浸潤とも有意に相関していた。さらにmicroRNA arrayを行い、HIF-1αの標的遺伝子であることが報告されているmiR-210が高悪性度GISTで発現が上昇していることが判明した。定量的RT-PCRにおいてもmiR-210高値は、腫瘍サイズや組織学的悪性度と相関することが確認され、HIF-1α発現とも相関する傾向が認められた。従って、通常型GISTにおいて、HIF-1αの蓄積やそれに伴うmiR-210過剰発現はGISTの悪性化進展に関与することが示唆された。一方、SDH欠失はGIST全体の約5%に認められた。少数例のため統計学的解析は困難だが、SDH欠失型GISTの全例においてHIF-1α高発現が認められた。これは、SDH欠失により細胞内に過剰に蓄積したコハク酸がHIF-1αの蓄積を促すという、これまでにパラガングリオーマなどで報告されている現象に合致しており、SDH欠失型GISTにおいても同様のメカニズムが腫瘍発生に重要な役割を果たしていることが示唆された。人体病理GISTのgenotypeの臨床病理学的意義がある程度判明した点、SDHBの発現消失がリンパ節転移やリンパ管浸潤と相関することが判明した点では概ね順調に進行していると考える。当初計画のKIT, PDGFRA遺伝子変異解析については、これまでの報告例とほぼ同様の結果が得られ、ほぼ計画通りに進行した。SDHやVHLの遺伝子変異ならびにメチル化解析については、終了していないが、SDH, HIFの免疫組織化学染色やmicro RNAのRT-PCRは当初予定より早く開始できた。よって概ね順調に進展していると判断した。SDH遺伝子変異の解析を行う。またHIFとその制御分子(SDH, FH, VHL,リン酸化mTOR)の蛋白発現を免疫組織化学染色およびWestern blottingにて引き続き解析する。HIF標的遺伝子(VEGF, GLUT-1, CAIX)については、蛋白発現(免疫組織化学染色)およびmRNA発現レベル(定量的RT-PCR)を解析する。以上の解析結果とKIT/PDGFRA遺伝子変異パターンを総合して、HIF関連分子の異常、標的遺伝子の発現レベルと臨床病理学的因子、病理組織学的特徴ならびに予後との相関を統計学的に解析する前年度に引き続き、SDHやVHLの遺伝子変異ならびにメチル化解析を行う。またHIFと制御分子(SDH, FH, VHL,リン酸化mTOR)の蛋白発現を免疫組織化学染色およびWestern blottingにて引き続き解析する。以上の解析結果とKIT/PDGFRA遺伝子変異パターンを総合して、HIF関連分子の異常、標的遺伝子の発現レベルと臨床病理学的因子、病理組織学的特徴ならびに予後との相関を統計学的に解析する。免疫組織化学染色やウエスタンブロットの抗体ならびに染色関連試薬、PCR(シークエンスや定量的PCR)関連試薬の購入が主な研究費の用途である。また国内学会で当該年度までの研究成果を発表予定であり、その旅費に使用する予定である。
魚類における解凍硬直のメカニズムに関する研究

即殺したコイとマダイを急速凍結し,-40°Cに貯蔵後,18°Cで流水解凍を行った。解凍に伴ってATPなどは顕著に分解し,同時に筋収縮が始まった。筋肉の温度がコイで-1.1°C,マダイで-1.6°Cで最も解凍硬直が著しく,ATPは完全に消失し,乳酸は最大に蓄積した。解凍硬直中に解糖系が速やかに進行し,供給されたATPが解凍硬直エネルギーとして使われ,筋肉が強く収縮することがわかった。さらに,即殺直後および解凍中のコイから筋原線維と筋小胞体(SR)を調製し,その性状変化を調べ,解凍硬直のメカニズムの解明を行った。即殺直後から解凍中にかけて筋原線維ATPase活性,すなわち、Mg^<2+>(Ca^<2+>)-ATPase,Mg^<2+>(EGTA)-ATPaseおよびCa^<2+>-ATPase活性に変化はみられなかった。一方,SRの性状を調べたところ,凍結と解凍によってSRのCa^<2+>-ATPase活性はやや上昇したが,SRのCaイオン取り込み能はほぼ消失した。SRのSDS-PAGEによってCaイオン結合能を有するタンパク質の変性が考えられた。そこで,透過型電子顕微鏡観察を行ったところ,即殺後に明瞭にみられたSRの膜構造は崩壊していた。そのため,Caイオンの大量漏出が起ったと考えられる。以上の結果より,コイの解凍硬直のメカニズムは次のように説明できる。凍結と解凍によってSRの膜構造が破壊され,SRのCaイオン取り込み能が消失するため筋細胞内のCaイオン濃度が高くなる。さらに,未変性筋原線維Mg^<2+>-ATPaseは遊離されたCaイオンによって賦活されてATPの急激な分解が起こり,著しい解凍硬直が発現するのである。
砒素,アンチモンを含むリサイクル資源からの有価金属の回収に関する基礎的研究

複雑硫化鉱の製錬で大量に生成する溶錬ダスト,ドロス,III-V化合物半導体のスクラップ中には大量の砒素,アンチモンの他に種々の有価金属が含まれる.有価元素を金属鉛で抽出し,同時に砒素,アンチモンをスパイスとして濃縮,分離するプロセスが考えられる.このプロセスを検討するために,本研究ではPb-Fe-Cu-Sb,Pb-Fe-As-Sb系の1473Kにおける2液相分離範囲を実験によって決め、Pb-Fe-As,Pb-Fe-Sb,Pb-Fe-Cu-As等の相平衡に関する報告と共に考察した.またPb-Fe-As3元素においてスパイス組成が25,30,35mass%Asでの2相間の微量元素の分配挙動について実験を行い次の様な結論を得た.1.製練中間産物に最も多く含まれる鉛によって有価金属を回収し,砒素をスパイス中に濃縮して分離するためには系に銅が含まれないPb-Fe-As系の,スパイス-鉛相間の相互溶解度が小さい鉄系スパイスを用いれば,分離,回収のプロセスを効率よく進めることが可能であることが明らかになった.3.共存するGa,Co,Niはスパイスに分配され,鉛による回収はできない.4.微量の銅はスパイス成分にもかかわらず2相間の分配係数は1に近く,鉛によりある程度回収することが可能であるが,銅濃度が上昇するとスパイスへの分配割合が増加し,鉛中の砒素濃度が高くなり,また金,銀のスパイスへの損失も増大することから,銅を含む二次資源を用いないことが望ましい.複雑硫化鉱の製錬で大量に生成する溶錬ダスト,ドロス,III-V化合物半導体のスクラップ中には大量の砒素,アンチモンの他に種々の有価金属が含まれる.有価元素を金属鉛で抽出し,同時に砒素,アンチモンをスパイスとして濃縮,分離するプロセスが考えられる.このプロセスを検討するために,本研究ではPb-Fe-Cu-Sb,Pb-Fe-As-Sb系の1473Kにおける2液相分離範囲を実験によって決め、Pb-Fe-As,Pb-Fe-Sb,Pb-Fe-Cu-As等の相平衡に関する報告と共に考察した.またPb-Fe-As3元素においてスパイス組成が25,30,35mass%Asでの2相間の微量元素の分配挙動について実験を行い次の様な結論を得た.1.製練中間産物に最も多く含まれる鉛によって有価金属を回収し,砒素をスパイス中に濃縮して分離するためには系に銅が含まれないPb-Fe-As系の,スパイス-鉛相間の相互溶解度が小さい鉄系スパイスを用いれば,分離,回収のプロセスを効率よく進めることが可能であることが明らかになった.3.共存するGa,Co,Niはスパイスに分配され,鉛による回収はできない.4.微量の銅はスパイス成分にもかかわらず2相間の分配係数は1に近く,鉛によりある程度回収することが可能であるが,銅濃度が上昇するとスパイスへの分配割合が増加し,鉛中の砒素濃度が高くなり,また金,銀のスパイスへの損失も増大することから,銅を含む二次資源を用いないことが望ましい.砒素,アンチモンは化合物半導体成分として注目されているが,素材生産工程で発生する工場スクラップ,使用済みスクラップの増加が予想され,環境問題を起こす可能性がある.また種々の有価金属が含まれる製錬ダスト,ドロスにも砒素,アンチモンが濃縮される.これ等の有価金属を回収する乾式処理工程では金属鉛とスパイスの2相平衡が見られる.そこでプロセス中の各成分の挙動を明らかにするために本年度は砒素,アンチモンを含む多元系の2液相分離範囲を,処理温度に近い1200°Cで決定する実験を行い次のような結果を得た.1.GaAs,InSbの処理のように砒素とアンチモンが共存する場合が多い.Pb-Fe-As-Sb 4元系の2液相分離範囲は,Pb-Fe-AsおよびPb-Fe-Sb各3元系と同様に広範囲にわたりFe-As-SbスパイスとPb-Sb硬鉛の2相に分離する.すなわち,砒素は鉛相への溶解度が非常に小さくスパイス相へ濃縮され,アンチモンは両相に分配され,砒素とアンチモンをある程度分離することが可能であることを示している.2スクラップ,ドロスには大量の銅が関係することからPb-Fe-Cu-Sb 4元系の実験を行った.基本のPb-Fe-Sb系スパイス中の鉄の20%以上を銅で置換すると,鉛とスパイスの2相共存は消滅して均一相となる.反対にPb-Cu-Sb系に鉄を添加しスパイス中銅の約10%を鉄で置換すると固体鉄飽和となり,溶融鉛,スパイスとの3相共存となる.すなわち銅,鉄が共存するアンチモン系では溶融金属鉛を用いて有価金属を抽出する乾式の回収プロセスは,できないことを初めて明らかにした.それ故,原料中に大量の銅が共存する時には,予め別の工程で銅を除去し,鉄系スパイスを用いて処理するプロセスが効果的であるものと推察される.複雑硫化鉱の製錬で発生するダストおよびドロス,あるいは化合物半導体の素材製造工程および使用済み半導体スクラップ等には砒素,アンチモンと同時に種々の有価金属が含まれる.これを金属鉛で回収するプロセスに関する基礎データを得るために昨年度の相平衡に関する実験に引き続き,本年度はPb-Fe-As3元系の溶融鉛-スパイス間の微量成分の分配について実験を行い次のような結果を得た.

なお分配係数は次の定義による.L=[mass%X in speiss/mass%X in Pb]1.ドロスに鉛と共存する銅は微量含まれる時の分配係数がほぼ1となるものの,大量に共存する場合にはスパイス中濃度が鉛の10倍以上となり,鉛による回収効率が低下すると同時に鉛相への砒素溶解が増大し,有価金属と砒素の分離,回収が悪くなる.2.銀はスパイス相に比較し,鉛中の濃度が約30倍となるが銅の共存によりスパイスへの溶解度が急増する.3.金の分配係数は約0.2で銀に比べスパイス損失が約5倍多くなり,さらに銅との共存によりこの値は増加する4.アンチモンの分配係数は約2でスパイスだけには濃縮せず,鉛相にも多く溶解する.これはアンチモン濃度が増加してもほぼ同じである.5.ガリウムは鉛による回収が困難であるが,インジウムは可能である.6.鉄族元素のニッケル,コバルトの分配係数は100以上であり鉛による回収はできない.7.その他にBi,Cd,Sn,Se,Te,Znに関する分配実験を行い,亜鉛は回収できないが,他の元素は鉛による回収が可能であることが明らかとなった.8.分配係数に関する結果から,スパイス中の微量成分の活量係数を導出した.
酵母PCAライブラリーによる人工抗体分子のスクリーニング

各種細胞、特に大腸菌細胞を用いたPCA (Protein fragment complementation assay)法は、細胞内における異なる2つの分子の相互作用を検出する方法として報告、確立されつつある。動物培養細胞などの真核生物を用いた同手法についても報告があるが、増殖速度が極めて速い大腸菌を用いた場合に比べて、コストや時間の面で不利となることが多い。本研究課題では生化学・分子生物学実験における真核生物のモデルとして汎用されている酵母Saccharomyces cerevisiaeを用いたPCA法の確立に取組んだ。分子間相互作用の検出方法としてのPCA法を、標的分子のリガンドスクリーニングへ応用することを視野に実験を開始した。昨年度までに、細胞内情報伝達系に関わるタンパク質(Gタンパク質ならびにその下流のタンパク質)分子間の相互作用の検出をモデルとして、PCA法のプロトコル確立のための準備実験を行った。タンパク質相補性の指標には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)を利用するため、DHFR遺伝子のクローニングとベクターを構築した。2年目に当たる本年度は、他のタンパク質フラグメントを用いるPCA法についても検討を行い、LacZを用いたPCAプラスミドの構築も行った。昨年度DHFR分子を2つに分割してそれぞれのベクターに導入して、ターゲットとなる細胞内情報伝達分子と融合させたプラスミドを用いて形質転換を行い、スルファニルアミドを添加することで、トリメトプリムの増殖阻害効果を向上させた。本研究で宿主とした酵母MT8-1株では、一定モル比で培地に添加した場合、増殖が最も阻害されることが確認でき、PCAでのスクリーニング条件としての指標物質の最適濃度を確認した。さらにβガラクトシダーゼ(LacZ)を用いた検出系では、前培養条件や検出に必要なβガラクトシダーゼの基質の検討を行い、短時間で相互作用を検出できるめどが立った。このように、ターゲットにアフィニティ結合を示す人工抗体のPCAスクリーニング手法の基礎が完成した。大腸菌細胞を用いたPCA(Protein fragment complementation assay)法は、細胞内における異なる2つの分子の相互作用を検出する方法として確立されつつある。動物培養細胞などの真核生物を用いた同手法についても報告があるが、大腸菌を用いた場合に比べて、コストや時間の面で不利となることが多い。そこで、本研究課題では生化学・分子生物学実験における真核生物のモデルとして汎用されている出芽酵母を用いたPCA法の確立を目指した。計画1年目である本年度は、細胞内情報伝達系に関わる分子間の相互作用の検出をモデルケースとして、PCA法のプロトコル確立のための準備実験を重ねた。タンパク質相補性の指標には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)を利用するため、DHFR遺伝子のクローニングとベクターの分子設計、構築を進めた。本PCA法では、DHFR分子を2つに分割してそれぞれのベクターに導入して、ターゲットとなる細胞内情報伝達分子と融合させるが、1つ目の細胞内情報伝達分子を含むプラスミドについては構築が終了し、2つ目の構築準備を引き続き行っている状況である。さらに、宿主となる酵母のDHFRは、大腸菌の場合に阻害剤として知られているトリメトプリムに対して影響を受けないことが報告されている。そこで、スルファニルアミドを添加することで、トリメトプリムの増殖阻害効果を向上させることを目指した。用いた出芽酵母では、モル比で1:80-1:100(トリメトプリム:スルファニルアミド)の濃度で培地に添加した場合、増殖が最も阻害されることが確認でき、PCAでのスクリーニング条件としての指標物質の最適濃度を決定した。