hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物のバイオマス増大をもたらすｍＲＮＡ転写後調節の分子機構

このことからポリA鎖長の制御は転写後制御の重要なステップであると見なすことができる。真核生物に広く保存されたポリA鎖の分解を行う脱アデニル化酵素複合体としてCCR4-NOT複合体があり,これは脱アデニル化酵素サブユニットとしてCCR4とCAF1を持っている。他の真核生物ではCCR4-NOT複合体と相互作用するRNA結合タンパク質が,CCR4とCAF1の標的mRNAの認識に働くことが知られている。シロイヌナズナの脱アデニル化酵素であるAtCCR4aおよびAtCCR4bの二重変異株(atccr4a/b変異株)ではエンドサイクルの亢進によってバイオマスの増大を示すが,その原因となる標的mRNAは明らかとなっていない。本研究ではatccr4a/b変異株が示すバイオマス増大の原因となる標的mRNAと,それを認識するRNA結合タンパク質を解明することを目的としている。本年度はAtCCR4a/bがどのような転写後調節に関わっているのかを明らかにするために,野生型株とatccr4a/b変異株を用いて,mRNAの翻訳量を網羅的に測定するRibo-seqおよびmRNAの蓄積量を網羅的に測定するRNA-seqの予備実験とデータ解析を行なった。各遺伝子においてmRNAの翻訳量をmRNA蓄積量で割ることにより翻訳効率を算出できる。atccr4a/b変異株では標的mRNAのポリA鎖長が野生型株に比べ長くなることで,翻訳効率が上昇することが期待され,実際に変異株では野生型株に比べ翻訳効率が上昇した遺伝子が多くみられた。また,その中には複数のエンドサイクルの制御に関わる遺伝子が見つかった。本年度の実施を予定していた網羅的ポリA鎖長同定のための実験に関しては,新規の方法が報告された。その方法ではmRNAの3'-末端に付加するアダプターを改良することで,従来の方法では大きな問題であったrRNAの混入を大きく抑えることができ,検出の感度を上げることができる。また,実験にかかるコストを大幅に削減することができる。そのため実験方法を変更することにし新規の方法に基づいた予備実験を進めた。網羅的ポリA鎖長同定の実施が遅れるため,先んじて翻訳効率の網羅解析であるRibo-seqやRNA蓄積量の網羅解析であるRNA-seqを行った。予備的な段階ではあるが,全体的にatccr4a/b変異株では野生型株に比べて翻訳効率が上昇している遺伝子が多く見られ,その中にはエンドサイクルの亢進に働く遺伝子も含まれていた。AtCCR4a/bの欠損により標的遺伝子のポリA鎖の短縮ができなくなった為に,翻訳効率が上昇した可能性がある。一方で, IP/MS解析によるAtCCR4a/bの相互作用因子の探索から見出されたPumilio RNA結合タンパク質,APUM5の解析を進めた。局在性解析からAPUM5はAtCCR4a/bと細胞質内のP-bodyに共局在することを明らかにした。また,先行研究で行われた遺伝学的解析から,APUM5は環境ストレス応答に関わっており,ストレス応答性遺伝子の発現を負に制御していると考えられている。
金融仲介機関の評判構築と金融危機

金融機関と金融危機に注目した2点の研究に関して進捗がみられた。1点目の論文「Ignorant Experts and Financial Fragility」では、アメリカの金融仲介機関が金融危機以前に情報収集能力を獲得してきたことを踏まえ、情報収集能力の獲得が社会に便益をもたらしうるのかという観点から理論分析を行っている。前年度からすでにこの研究に取りかかっていたが、今年度は本論文を2回国際学会で報告し非常に有益なコメントが得られたため、それをもとにさらなる分析を行った。その結果、将来収益がどの程度担保として利用できるのかに応じて、金融機関が情報収集能力を獲得するインセンティブが大きく変化するという結果を得た。特に、金融市場が高度に発展しており、将来収益の大部分が担保として用いられるとき、情報収集能力の獲得が過剰に行われるため、金融セクターに対する規制が経済厚生を改善できることを明らかにしている。2点目の論文「Corporate Governance and Fire Sales」は、金融セクターのコーポレート・ガバナンスと金融危機との関連性に着目した研究である。この論文では、金融機関によるマネージャーの取り合いが激化すると、金融機関はマネージャーに対するモニタリングを弱くし報酬額を高くするため、流動性ショックが起こったときにはマネージャーは資金調達が困難になり、資産の投げ売りが起こるという理論結果を得た。また、このとき、社会的に望ましい水準に比べて、均衡におけるモニタリングの水準は低くなりすぎるため、金融機関のガバナンスに対して政府介入の余地があることも明らかにしている。資産価格の変動をモデルに取り入れることができたため、金融機関の行動がマクロ経済に与える影響を分析するという目的にむかって順調に進んでいる。金融市場における情報の非対称性と流動性という観点から金融機関の行動を分析する予定である。アメリカの金融セクター、とりわけ急速に成長したシャドーバンキングは、近年の金融危機において、中心的な役割を担っていた。論文「Ignorant Experts and Financial Fragility」では、このような金融セクターの主要な活動であった貸借取引(レポ取引)に注目し、その取引で用いていた担保(ABSなどの証券化証券)に関する情報収集インセンティブと情報収集能力(financial expertise)に対する投資の関係性を理論的に分析している。この論文の貢献は、以下の2点を示したことにある。(1)金融セクターは高い水準のfinancial expertiseをもつという評判を築くことで、実際に情報収集を行うことなく高い報酬を受け取ることができる。(2)担保に関する情報収集を行わないことで、質の悪い担保も取引で用いられるようになり、金融市場での取引は拡大することになるが、financial expertiseに対する投資の結果、担保に関する悪いニュースに対して非常に敏感になるため、たとえささいな悪いニュースであっても、金融セクターはすぐに情報収集を行い始め、質の悪い担保を用いた取引はすべて停止してしまう。(1)の結果は、金融セクターにおける報酬の急激な上昇と、サブプライムローンなどの質の低い資産を含んだ証券化商品の普及を説明していると考えられる。(2)の結果は、金融セクターのfinancial expertiseに対する投資により、小さなショックが大規模な貸借取引の縮小をもたらすことを示唆しており、近年の金融危機で観察された事柄と整合的である。金融仲介機関の行動がマクロ経済に与える影響を分析するため、その基本的なモデルをつくることを今年度の目的としていた。現在、主要なメカニズムを明らかにするためのシンプルなモデルの作成、およびその解析的な分析まで完了しており、計画はおおむね順調だと言える。今後は、モデルのさらなる拡張が課題となる。現在の静学モデルは非常にシンプルであり、分析が容易であるが、より豊富な含意を導くためには、動学モデルに拡張する必要がある。しかし、情報収集インセンティブと情報の波及についての動学分析は基本的に困難であるため、先行研究の調査を丹念に行い、より高度な分析手法を身につける必要がある。また、シミュレーション分析が動学分析には極めて有用であるため、シミュレーションの手法も引き続き身につけていく予定である。
風波を伴う開水路流れにおける乱流ダイナミクスと物質輸送プロセスの解明

本研究では風波を伴う開水路流れの乱流構造について,流れが在る場合と湖沼のようなタンク状態の場合のそれぞれについて,可視化計測をもとに現象解明を行った.前半では主に鉛直2次元構造に焦点をあて,平均流・乱れ・波の3者間のエネルギー輸送動態プロセスや組織乱流の生成に与える波動の影響を定量評価した.後半では流れの3次元構造に着目した.特にラングミュアー循環流形成に関わる支配的パラメーターや循環流が流れ場に及ぼす影響を解明した.この解明にあたって,3台の高速度カメラを同期させるマルチカメラ可視化システムの開発した.このシステムではステレオPIVにより横断面における流速全3成分を計測するとともに,水面形状も画像情報より同時に評価することができる.この画期的な計測手法によって,循環流と波の位相関係,水路アスペクト比と循環流の生成特性の詳細が定量的に解明できた.本研究では風波を伴う開水路流れの乱流構造について,流れが在る場合と湖沼のようなタンク状態の場合のそれぞれについて,可視化計測をもとに現象解明を行った.前半では主に鉛直2次元構造に焦点をあて,平均流・乱れ・波の3者間のエネルギー輸送動態プロセスや組織乱流の生成に与える波動の影響を定量評価した.後半では流れの3次元構造に着目した.特にラングミュアー循環流形成に関わる支配的パラメーターや循環流が流れ場に及ぼす影響を解明した.この解明にあたって,3台の高速度カメラを同期させるマルチカメラ可視化システムの開発した.このシステムではステレオPIVにより横断面における流速全3成分を計測するとともに,水面形状も画像情報より同時に評価することができる.この画期的な計測手法によって,循環流と波の位相関係,水路アスペクト比と循環流の生成特性の詳細が定量的に解明できた.流速勾配,すなわちシアーが存在する乱流境界層では,ヘアピン形状をもつ組織乱流渦が発生することが知られている.T-S波とよばれる不安定挙動が発達するとヘアピン渦になり,さらにエジェクションによってヘアピン渦は上方へ輸送されるが,乱流斑点を伴って崩壊する.このような渦のライフサイクルが存在することが非常に興味深い点であり,この時間特性は点計測法による統計解析では隠れてしまうため,研究進展が遅れた.最近では可視化ハードウェアの飛躍的な性能向上によってその構造が定量評価されつつあり,再び脚光をあびているホットな話題である.特に自由水面に波が発生する場合における底面乱流構造を中心にその乱流構造を実験的に解明した.渦を視覚的に抽出することは比較的容易だが,得られたデータから数学的に抽出することは単純ではなく,Q値△法およびγ法といった様々な数学手法が提案されている.これらの方法を比較しながら本研究の瞬間流速データに適用して,ヘアピン渦の時間空間構造を解析した.自由水面にも組織渦構造が発生することがいくつかの研究グループでは報告されているが,いずれも定性的なもので具体的な構造は未解明である.そこで底面と水面におけるそれぞれの渦構造を特徴づける長さスケールや時間スケールを定量評価した.これによって乱流の全体形状の時間変化が数値シミュレーションのようにアニメーション化できることが本研究の目玉で,これらの結果から風波開水路における乱流組織渦の現象モデルを構築した.本研究では領域に対して3方向からレーザーライトシート(LLS)を照射し,風波を伴う閉鎖性水域の3次元的の流れ特性を解明した.特に海洋での観測が報告されているラングミュアー循環流に注目した.これは波と風の相互作用によって生成するとされるが,詳細なメカニズムについては不明な点が多い.本研究プロジェクトでは,流れの横断面の可視化計測を高速度PIVによって行い,循環流の時間平均構造や位相平均構造の特性を明らかにするとともに,渦構造の客観的な抽出に成功し,そのスケールを定量評価した.さらに平均流成分,波動成分と乱れ成分間のエネルギー輸送および乱れ生成特性の関係性を輸送方程式の相互項より計算した.また本実験結果を安定解析し,ラングミュアー循環流形成に関わる支配的パラメーターや循環流が流れ場に及ぼす影響を解明した.研究のまとめとして,これらの乱流現象の現象モデルを構築し,循環流とストリーク構造の立体構造を実験的に明らかにした.特に本年度では3台の高速度カメラを同期させたマルチカメラ可視化システムの開発に成功した.このシステムではステレオPIVにより横断面における流速全3成分を計測するとともに,水面形状も画像情報より同時に評価することができる.この画期的な計測手法によって,循環流と波の位相関係,水路アスペクト比と循環流の生成特性の詳細が定量的に解明できた.
肝再生過程におけるリン代謝動態と細胞内情報伝達機構との連関-リンMRSによる解析

本研究は肝臓に特異的な機能である肝再生のメカニズムを、^<31>P-MRS法によりリン代謝動態と細胞内情報伝達機構との関連から探る可能性を明らかにする目的で行い、以下の結果を得た。1.ラット灌流肝臓にコレラ毒素を投与した場合、投与量に依存して肝内ATPと無機リン(Pi)はともに徐々に減少することを明らかにした。この時、phosphomonoesters(PME)レベルおよびエネルギー状態の指標であるATP/Pi比はほぼ一定であった。2.アデニル酸シクラーゼを活性化することが知られているホルスコリンを投与することにより、コレラ毒素投与時と同様にATPが大幅に減少することを明らかにした。3.蛋白質リン酸化酵素の活性阻害剤であるk-252bを灌流開始前に静注後、コレラ毒素を投与した場合、ATPとPiの減少程度が有意に抑制されることを明らかにした。また、k-252bよりもより選択的にサイクリックAMP(cAMP)依存性蛋白質リン酸化酵素(Aキナーゼ)の活性を阻害するとされるH-89を前投与した場合も、同様にATPとPiの減少程度が抑制された。4.肝からの流出灌流液を経時的に採取し、cAMP濃度を測定した。この結果、コレラ毒素投与後cAMP濃度が投与量に依存して一過性に増加した。また、蛋白質リン酸化酵素活性阻害剤を前投与した場合も、cAMP濃度は同様の変化を示すことを明らかにした。5.以上の結果は、コレラ毒素やホルスコリン投与により、アデニル酸シクラーゼが活性化されて信号伝達の2次メッセンジャーであるcAMPが増加し、cAMP依存性蛋白質リン酸化酵素の活性化に伴い、蛋白質のリン酸化に大量のATPが利用され、臓器機能の発現に密接に関与していることを示唆している。本研究は肝臓に特異的な機能である肝再生のメカニズムを、^<31>P-MRS法によりATPを中心とするリン代謝動態と細胞内情報伝達機構との関連という観点から明らかにする目的で立案し、今年度は下記の成果を得た。1.既存FT-NMR装置と組み合わせる肝灌流システムの改良を行い、長時間安定な灌流を可能とした。また、ラット摘出肝からの^<31>P-NMRスペクトルの最適測定条件を検討し、測定手法を確立した。2.ラット正常灌流肝臓を対象にコレラ毒素を投与し、投与後60分間にわたりリンNMRスペクトルを計測した。この結果、コレラ毒素投与直後から肝内ATPと無機リン(Pi)はともに徐々に減少することを確認した。また、これらの減少程度はコレラ毒素投与量に依存する傾向を示した。なおATP/Pi比はほぼ一定であり、コレラ毒素投与後も肝内エネルギー状態はほぼ一定に保たれていることが示唆された。また、フォルスコリンの投与による効果を明らかにするために、現在最適投与法や投与量について検討中である。3.蛋白質リン酸化酵素活性阻害剤であるk-252bを灌流開始30分前に陰茎静脈より静注後の摘出肝臓にコレラ毒素を投与し、2.と同様の検討を行った。この結果、ATPとPiの減少程度は抑制されることを確認した。また、より選択性の高いHシリーズ阻害剤の投与条件についても検討中である。4.上記2.および3.において流出灌流液を経時的に採取し、サイクリックAMP(cAMP)濃度を本研究費で購入した全自動比色計を用いて測定した。コレラ毒素投与群では投与直後からcAMP濃度が一過性に増加するのに対して、コレラ毒素活性が低くATPやPiの変化が認められない場合にはcAMP濃度の一過性の増加も認められなかった。

本研究は肝臓に特異的な機能である肝再生のメカニズムを、^<31>P-MRS法によりリン代謝動態と細胞内情報伝達機構との関連から探る可能性を明らかにする目的で行い、以下の結果を得た。1.ラット灌流肝臓にコレラ毒素を投与した場合、投与量に依存して肝内ATPと無機リン(Pi)はともに徐々に減少することを明らかにした。この時、phosphomonoesters(PME)レベルおよびエネルギー状態の指標であるATP/Pi比はほぼ一定であった。2.アデニル酸シクラーゼを活性化することが知られているホルスコリンを投与することにより、コレラ毒素投与時と同様にATPが大幅に減少することを明らかにした。3.蛋白質リン酸化酵素の活性阻害剤であるk-252bを灌流開始前に静注後、コレラ毒素を投与した場合、ATPとPiの減少程度が有意に抑制されることを明らかにした。また、k-252bよりもより選択的にサイクリックAMP(cAMP)依存性蛋白質リン酸化酵素(Aキナーゼ)の活性を阻害するとされるH-89を前投与した場合も、同様にATPとPiの減少程度が抑制された。4.肝からの流出灌流液を経時的に採取し、cAMP濃度を測定した。この結果、コレラ毒素投与後cAMP濃度が投与量に依存して一過性に増加した。また、蛋白質リン酸化酵素活性阻害剤を前投与した場合も、cAMP濃度は同様の変化を示すことを明らかにした。5.以上の結果は、コレラ毒素やホルスコリン投与により、アデニル酸シクラーゼが活性化されて信号伝達の2次メッセンジャーであるcAMPが増加し、cAMP依存性蛋白質リン酸化酵素の活性化に伴い、蛋白質のリン酸化に大量のATPが利用され、臓器機能の発現に密接に関与していることを示唆している。
アイヌ語の補助動詞に関する記述言語学的研究

平成28年度はアイヌ語沙流方言の公刊テキストをもとにRoleand Reference Grammar(RRG)の理論的な枠組みを用いてアイヌ語の複雑述語(補助動詞構文および助動詞構文)を分析し、これに関連して査読付き論文1本の投稿をおこなった。RRGには複数の述語形式がどのレベル(節、中核、内核)で統語的にリンクしているかを表わす連接(juncture)という概念と、連接の関係にある単位同士がどのような接続関係(等位接続・従属接続など)にあるかを表す接合(nexus)という概念がある。アイヌ語の複雑述語をLSCに当てはめて分析した結果、補助動詞構文である「V1+接続助詞+V2」は内核連接・連位接合、助動詞構文である「V1+Vt(他動詞)」は中核連接・従属接合、「V1+Vi(自動詞)」は内核連接・従属接合であると示し、V1とV2の間の複合制約について考察した。RRGの理論をアイヌ語の分析に当てはめるには課題が山積であるが、今後もそれぞれの連接・接合タイプの妥当性を裏付けられるよう、統語的なレベルでの分析を進めていきたい。アイヌ語鵡川方言の言語学的フィールド調査(北海道勇払郡むかわ町)は、今年度は36回、調査時間にして約180時間実施することができた。これらの録音、データ分析・保存には特別研究員奨励費で購入した録音機(ICレコーダー)、ノートパソコン、外付けハードディスクを用いている。今年度も引き続きエリシテーションによるアイヌ語の語彙調査、文例調査およびアイヌ語による自由談話、口承文芸、伝統歌謡の調査・記録をおこなった。28年度が最終年度であるため、記入しない。アイヌ語沙流方言の補助動詞構文における述部の複合制約を指摘し、これに関連して口頭発表を2件おこなった。アイヌ語の補助動詞構文「V1+接続助詞wa+V2」は日本語のテ形補助動詞構文と類似する点があるが、形態的、統語的にはアイヌ語の補助動詞構文とは異なる点が多い。決着留保を表すテミル構文(「てみる」)は、アイヌ語でも「見る」を意味する語がV2に立って補助動詞としてふるまうのであるが、アイヌ語で「見る」にあたる動詞には自動詞inkarと他動詞nukarの両形式がある。しかし、テミル構文が成立する場合は自動詞inkarがV2に立つことから、アイヌ語の補助動詞構文にはV1とV2のあいだに自他に関わる複合制約があると考えられる(V2が他動詞の構文もある)。アイヌ語沙流方言の公刊資料の分析を通じ、V1とV2の照応する名詞項が同定される条件下で、V2の結合価に対してV1の結合価が等しいか多くない限りは、V2は独立的に名詞項と結びつくために補助動詞構文としての緊密性を失って二つの節に解釈されると考えられ、アイヌ語では複合制約が生じると考察・指摘した。補助動詞構文にみられる複合制約は、アイヌ語の動詞形式の複合プロセスにおける制約の問題と関連する。補助動詞構文の各形式の記述と合わせて、補助動詞構文に限らずアイヌ語の述部複合を扱い、制約を含めた統語的な特徴を明らかにしていきたい。また、並行して行っているアイヌ語鵡川方言の記述言語学的なフィールド調査については、エリシテーションによる語彙調査、文例調査のほか自由談話、口承文芸、伝統歌謡などの調査・記録を通年で継続的に行っており、今後も記録を続け、データの整理・分析をすすめ鵡川方言の記述言語学的な成果物をまとめていきたい。平成27年度はアイヌ語沙流方言の公刊テキストをもとに助動詞構文における述部の複合制約を指摘し、これに関連して口頭発表を1件、査読つきの論文1本の投稿をおこなった。アイヌ語沙流方言の助動詞構文(動詞+助動詞的な動詞、V1+V2)にみられる複雑述語構造を扱い、V1とV2の間に一種の自他制約があると仮定したうえで、動詞連続構造(Serial verb construction)の枠組みを用いて制約の説明づけを試みた。アイヌ語の助動詞には自動詞と他動詞から転成するものがあるが、他動詞からの転成が圧倒的に多く、自動詞からの転成例は非常に限られている。この制約はV1とV2の項の共有という点において他動詞は共有されるのに対し自動詞で共有されないという違いに起因するものと考えられ、項を共有せずに複雑述語として意味的にひとつとなる現象が非常に稀で制約的であることはAikhenvaldによる類型的な動詞連続構造(Serial Verb Construction)の研究における指摘と一致する。自動詞から助動詞への転成に制約があると考えたうえで、許容される形式の存在理由についてより理論的、実証的な説明づけが必要である。前年度の補助動詞構文(V1+接続助詞+V2)における自他の複合制約とあわせて、アイヌ語の動詞概念の複合における制約についてさらに研究を進めていく。アイヌ語鵡川方言のフィールド調査は、今年度は32回、調査時間にして約160時間実施することができ、エリシテーションによるアイヌ語の語彙調査、文例調査およびアイヌ語による自由談話、口承文芸、伝統歌謡の調査・記録をおこなった。これらのデータの整理・分析は順次おこなっているが現時点では未整理のデータが多く、調査内容の書き起こしや検索可能なデータベースの構築は引き続き課題である。口頭発表1件、査読つきの論文1本の投稿と、より積極的な成果発表が必要であるが、アイヌ語の複雑述語構造における補助動詞

構文と助動詞構文の分析・制約の指摘を昨年度、今年度で行うことができた。フィールド調査についても、調査協力者のご厚意により、継続的かつ詳密な言語調査が実現した。平成28年度はアイヌ語沙流方言の公刊テキストをもとにRoleand Reference Grammar(RRG)の理論的な枠組みを用いてアイヌ語の複雑述語(補助動詞構文および助動詞構文)を分析し、これに関連して査読付き論文1本の投稿をおこなった。RRGには複数の述語形式がどのレベル(節、中核、内核)で統語的にリンクしているかを表わす連接(juncture)という概念と、連接の関係にある単位同士がどのような接続関係(等位接続・従属接続など)にあるかを表す接合(nexus)という概念がある。アイヌ語の複雑述語をLSCに当てはめて分析した結果、補助動詞構文である「V1+接続助詞+V2」は内核連接・連位接合、助動詞構文である「V1+Vt(他動詞)」は中核連接・従属接合、「V1+Vi(自動詞)」は内核連接・従属接合であると示し、V1とV2の間の複合制約について考察した。RRGの理論をアイヌ語の分析に当てはめるには課題が山積であるが、今後もそれぞれの連接・接合タイプの妥当性を裏付けられるよう、統語的なレベルでの分析を進めていきたい。アイヌ語鵡川方言の言語学的フィールド調査(北海道勇払郡むかわ町)は、今年度は36回、調査時間にして約180時間実施することができた。これらの録音、データ分析・保存には特別研究員奨励費で購入した録音機(ICレコーダー)、ノートパソコン、外付けハードディスクを用いている。今年度も引き続きエリシテーションによるアイヌ語の語彙調査、文例調査およびアイヌ語による自由談話、口承文芸、伝統歌謡の調査・記録をおこなった。アイヌ語の補助動詞構文の総合的な機能記述にはいたらなかったが、複合制約という観点からアイヌ語の補助動詞構文の統語的特徴を捉えることができた点は、補助動詞に限らず助動詞やアイヌ語の述部複合について研究を進めていくうえで重要な手がかりとなると考えている。引き続き、アイヌ語沙流方言のテキスト分析を通じ、アイヌ語の複雑述語構造における制約を明らかにしていく。また、口頭発表や論文の査読を通じアイヌ語の補文構造をはじめ、研究遂行上関わる重要なテーマを多くご指摘いただいたため、関連研究を含めてアイヌ語の複雑述語構造を理論的、実証的に記述していく。28年度が最終年度であるため、記入しない。引き続きアイヌ語沙流方言の公刊資料を用いて述部複合に関する用例の分析を進める。これまでは口承文芸テキストにみられる用例の分析に偏り、用例分布にジャンルの影響があるおそれもあるため、今年度以降も公刊されている広いジャンルの資料の分析をおこなう(そのために、まずは検索可能な状態にするためのテキスト電子化を行う必要があるため、並行して作業していく)。関連する日本語の述部複合の現象との対照もふくめて、アイヌ語のなかで述部複合プロセスと制約の関係を明らかにできるよう分析を進めていく。
トンネル現象を用いた接合界面での奇周波数クーパー対に関する研究

本研究は強磁性体と超伝導体の接合界面において奇周波数クーパー対の生成を検証することを目標に開始し,以下の成果を得た。1.第一原理バンド計算からハーフメタルであると期待されるホイスラー合金Co_<2-x> Fe_xMnSiとRu_<2-x> Fe_xCrSiを合成し,それらがハーフメタルの候補であることを明らかにした。2.ホイスラー合金Co_<2-x> Fe_xMnSiのスピン分極率が組成xに依存せず,約50%であることを明らかにした。3.ホイスラー合金Ru_<2-x>Fe_xCrSiを合成のスピン分極率がx=1. 8のときに最大の63%であることを明らかにした。4.奇周波数を閉じ込める目的で, MgO基板上にフルエピタキシャルNbN/Co_2MnSiとNbN/Co_2FeSi多層膜とそのナノ接合を作製することに成功した。スピン分極率100%の電流は新しい量子流体であり,そのハーフメタル強磁性体/超伝導体接合における新奇な物性物理分野を開拓することが目標である。したがって,スピン分極率の高いホイスラー合金を創製し,ホイスラー合金と超伝導体の接合界面で生じるアンドレーエフ反射と奇周波数クーパー対による近接効果の役割について統一的な結論を導出するために,初年度は主に,「ハーフメタル特性をもつホイスラー合金の創製と磁性に関する研究」と「奇周波数クーパー対の近接効果に関する研究」に重点をおき,ホイスラー合金の物性測定およびスピン分極率の決定の研究に取り組んだ。具体的には,これまでの研究成果を踏まえ,ホイスラー合金Fe_<2-x>Ru_xCrSiやFe_2CrSiなどの電気抵抗率,磁化率,比熱などの測定により特性評価を行いながら,ホイスラー合金/超伝導金属の積層型接合を作製して微分コンダクタンスを測定した。Fe_<2-x>Ru_xCrSiは,Ru-richの試料は30K付近で反強磁性転移を示すが,Fe-richの試料は室温より十分高い温度でも強磁性体である。したがって,応用面からもFe-richの試料が高スピン分極率の材料として非常に有力できるが,現状ではスピン分極率が5055%程度であり,Fe-richの試料に関しても高スピン分極率は達成されていない。また,得られた微分コンダクタンスを用いて,奇周波数クーパー対の近接効果のモデルによる解析も進めている。ゆえに,今後は,試料表面の状態や磁気的性質の評価も併用しながら研究を継続する。さらに,ポイントコンタクト(点接触)型クライオスタットの作製にも着手したので,今年度はこのクライオスタットを用いた測定プログラムなどを整備して,ポイントコンタクト法による微分コンダクタンスの測定を開始する予定である。本年度は,ホイスラー合金における高スピン分極材料の開発とその超伝導接合界面で生じるアンドレーエフ反射や奇周波数クーパー対,近接効果の測定・評価に重点をおき,ホイスラー合金の物性測定およびスピン分極率の決定の研究に取り組んだ。ホイスラー合金Fe_<2-x>Ru_xCrSiに関しては,電気抵抗率,磁化率,比熱などの測定から,Ru-richの試料は30K付近で反強磁性転移を示した後,さらに低温でスピングラス相へ転移することが明らかになった。一方,Fe-richの試料は室温より十分高いキュリー温度をもち,高スピン分極率の材料として非常に有力であるが,現状ではスピン分極率は5055%程度である。そこで,2Kでのトンネル磁気抵抗(m)効果からハーフメタル性が報告されているCo_<2-x>Fe_xMnSiのスピン分極率測定も行った。スピン分極率は全ての組成で50%程度であった。さらにFe_2MnSiは60Kで反強磁性転移を示すが,微分コンダクタンスからは明瞭な反強磁性転移は観測されていない。この結果から,援合界面の更なる制御の必要性が示唆される。そこで,来年度は東北大学金属材料研究所の共同利用を活用して,原子レベルで制御されたホイスラー合金/金属超伝導体接合の作製と強磁場下の測定・評価を試みる。

現在,磁性体/超伝導体接合の新しいモデルによる解析にも取り組んでいるので,今後は新しいモデルによるスピン分極率の決定と奇周波数クーパー対の評価に関して,ポイントコンタクト型接合法と積層型接合法とを併用して進める予定である。第一原理バンド計算からハーフメタルであると期待されるホイスラー合金Ru_<2-x>Fe_xCrSiとCo_<2-x>Fe_xMnSiをアーク熔解法により合成し,L2_1構造であることを明らかにした。磁化や電気抵抗,比熱の測定から,Ru基ホイスラー合金についてはFe-richの化合物が,また,Co基ホイスラー合金についてはx≦1.5の化合物が強磁性ハーフメタルである可能性を見出した。そこで,ホイスラー合金/超伝導体接合を用いたアンドレーエフ反射法によりスピン分極率を測定したところ,Co基ホイスラー合金では全ての組成xで約50%のスピン分極率を得た。一方,Ru基ホイスラー合金でも組成xの広い範囲で53%55%のスピン分極率であったが,x=1.8の化合物はスピン分極率65%の高スピン分極率材料であることを明らかにした。また,MgO基板上にフルエピタキシャル成長させたNbN/Co_2MnSi構造の多層膜の作製に取り組んだ。その多層膜の特性としてNbNの超伝導転移温度T_c=16.0KとCo_2MnSiの飽和磁化M=800emu/ccという値から,NbNとCo_2MnSiの多層膜化の工程でNbNの超伝導性とCo_2MnSiの強磁性ともに劣化しないフルエピタキシャル多層膜の成膜条件を見出した。そこで,電子ビーム描画装置を用いて40μm×40μm400μm×40μmのナノ接合の作製を試み,ナノ接合の作製条件を確立した。次いで,アンドレーエフ反射法により微分コンダクタンスの測定を行った。以上のことから,新規ホイスラー合金の高スピン分極率材料の合成およびフルエピタキシャル成長させたナノ接合の作製技術と特性評価に成功した。特に,フルエピタキシャル成長させたホイスラー合金/超伝導体構造のナノ接合はこれまでに報告例がなく,ナノ接合の作製技術を確立できたことは,今後の超伝導体接合のスピントロニクスへの応用・発展に重要な成果である。ただし,現状では奇周波数クーパー対の明確な根拠となる実験データは得られていない。
分子シンクロフォトニッククリスタルによる光変調デバイスの開発

本研究では,フォトニッククリスタルによる光波モードの究極的閉じこめ制御により,高効率非線形光学現象の発現を確認し,この材料のデバイス化のための基礎的実証研究を行う.ここでは,コロイドネットワークのシンクロナイゼーション手法等を取り入れ,有機非線形効果を有する色素をドープしたポリマー粒子の三次元配列実現し,この三次元フォトニッククリスタルによる高効率非線形光学現象の発現を確認し,この材料のデバイス化研究を行う.具体的には,メガヘルツ程度の動作速度を有する電界印可による位相変化を利用した空間光変調デバイスの開発を目的として,試作するフォトニッククリスタルと平坦化集積回路のボンディングによる新しいデバイスの設計・試作・評価を行具体的には,有機非線形材料による微粒子を規則的に配列した構造に,外部電界を印可し,この構造の透過バンドの変調現象を確認し,電界印可による透過バンド変化を利用した空間光変調デバイスを開発すること目的にして,フォトニッククリスタルの試作と平坦化集積回路のボンディングによる新しいデバイスの設計・試作・評価を行う.まず,誘電体多層膜により,一次元完全格子フォトニッククリスタルを作製した.また,その完全格子に有機非線形光学材料(電場配向ポリマー例えば,DR1/PMMA,DR19/PMMAなど)の欠陥層を導入して,一次元不完全格子フォトニッククリスタルを作製した.上記の結果をもとに,一次元格子状電極をとりつけたデバイスの基本構成の検討を行い,変調度,屈折率変化,応答速度等の測定評価に基づきデバイスを設計,試作をおこなった.また,有機非線形光学材料を欠陥層としたフォトニッククリスタルの最適設計および平坦化Si集積化回路との光学的なマッチングの検討を行い,デバイスの最適化を検討した.光情報処理関連の材料、デバイス技術において、新しいパラダイムである分子シンクロナイゼーションによる研究がスタートようとしている。従来の光変調素子用の非線形光学材料としては、液晶、半導体材料、無機誘導体結晶、有機非線形材料等が知られていた。最近、フォトニッククリスタルという全く新しい概念により、設計製作された非線形材料を用い、従来材料では困難であった、高効率高性能空間光変調素子を開発する試みがなされている。本研究では、フォトニッククリスタルによる光波のシンクロナイゼーション制御により、高効率非線形現象の発現を確認し、この材料のデバイス化のための基礎研究を行う。ここでは、コロイドネットワークのシンクロナイゼーション手法をと入りいれ、有機非線形効果を有する色素をドープしたポリマー粒子の三次元配列材料のデバイス化研究を行った。具体的には、メガヘルツ程度の動作速度を有する電解印可による位相変調を利用した空間光変調期の開発を目的とし、試作するフォトニッククリスタルと平坦化集積回路のボンディングによる新しいデバイスの設計試作評価を行った。先ず、フォトニッククリスタル中の光波伝播特性評価のための白色干渉計と変調特性評価のための偏光解析装置の試作を行った。誘電多層膜により一次元完全フォトニッククリスタルの試作と、これに有機非線形膜(DR-19/PMMA)を取り込んだフォトニッククリスタルの作り、非線形光学効果の増強を確認した。さらに、シンクロナイゼーション効果を利用した、吸収バント付近の波長を用いて、吸収共鳴効果による増幅効果の観測にも成功した。本研究では,フォトニッククリスタルによる光波モードの究極的閉じこめ制御により,高効率非線形光学現象の発現を確認し,この材料のデバイス化のための基礎的実証研究を行う.ここでは,コロイドネットワークのシンクロナイゼーション手法等を取り入れ,有機非線形効果を有する色素をドープしたポリマー粒子の三次元配列実現し,この三次元フォトニッククリスタルによる高効率非線形光学現象の発現を確認し,この材料のデバイス化研究を行う.具体的には,メガヘルツ程度の動作速度を有する電界印可による位相変化を利用した空間光変調デバイスの開発を目的として,試作するフォトニッククリスタルと平坦化集積回路のボンディングによる新しいデバイスの設計・試作・評価を行具体的には,有機非線形材料による微粒子を規則的に配列した構造に,外部電界を印可し,この構造の透過バンドの変調現象を確認し,電界印可による透過バンド変化を利用した空間光変調デバイスを開発すること目的にして,フォトニッククリスタルの試作と平坦化集積回路のボンディングによる新しいデバイスの設計・試作・評価を行う.まず,誘電体多層膜により,一次元完全格子フォトニッククリスタルを作製した.また,その完全格子に有機非線形光学材料(電場配向ポリマー例えば,DR1/PMMA,DR19/PMMAなど)の欠陥層を導入して,一次元不完全格子フォトニッククリスタルを作製した.上記の結果をもとに,一次元格子状電極をとりつけたデバイスの基本構成の検討を行い,変調度,屈折率変化,応答速度等の測定評価に基づきデバイスを設計,試作をおこなった.また,有機非線形光学材料を欠陥層としたフォトニッククリスタルの最適設計および平坦化Si集積化回路との光学的なマッチングの検討を行い,デバイスの最適化を検討した.
高周波プラズマのモニタリングに関する研究

フラズマプロセシングで使用頻度の高い平行平板型の高周波放電に注目し両電極間の発光強度分布とプラズマパラメータとの関連を調べ、プラズマプロセシングへの応用を試みた。本研究では、高周波電源に13.56MHzの発振器を使用し、H_2、N_2、Arガスで分布を行った。高周波電源によって両電極間にプラズマを発生させると、陰極近傍にr電子によるものと思われる電子密度の高い領域が現れる。両電極間の発光強度分布を測定すると、この部分の発光強度が最も高くなりピークを示す。このピークの位置と、プレシースとプラズマ領域との境界とが極めて良い一致を示すことが、探針報によって明らかとなり、陰極とプレシース端との間のシース幅とプラズマパラメータとの関係をまず調べた。プラズマパラメータの中でも、電子の平均エネルギーはプラズマ中での反応機構を支配するので重要であり、探針法によって測定した。シース幅は、光ファイバーを走査させることにより得られた発光強度分布から求めた。その結果、シース幅と電子の平均エネルギーとの間にはほぼ比例関係にあることが解った。この事は、Langmuir-Childの式を使うことにより解析的に証明された。さらに、陰極に発生する直流バイアス電圧とシース幅によってプラズマ中の電子密度も測定できることが示された。この様に、プラズマに非接触でプラズマパラメータを把握できることは、プラズマを制御する上で非常に意義深いと思われる。発光強度分布もしくはシース幅の測定には、実際のプロセスへの応用を考えた場合、短時間の測定が好ましい。そこで、CCDカメラによる測定を試みた。その結果、ファイバーの走査より極めて高い分解能で、しかも短時間に強度分布及びシース幅を測定することに成功した。当初の計画に沿い62年度中は主に平行型高周波プラズマのイオンシース部のシース幅,発光強度分布とプラズマの生成条件との関連性について研究を行った.まず第一に光ファイバーを用いて電極間のプラズマ発光強度分布を測定した.プラズマ生成条件の一つであるガス圧力に対して,この発光強度分布から見積られるシース幅が大きく変化することが分かった.この結果からプラズマの生成条件と発光分布との間に密接な関係があり電極間の発光強度分布がプラズマの制御に適していることが推察された.実際のプロセシングでは速やかにしかも簡単な方法で測定することが必要になるためCCDカメラを導入し同様に実験を行った.この方法では瞬時にシース部を観測することができプロセシングへの実用化に近付いたと思われる.原料ガスの種類もH2.N2,Arに付いて行い発光強度分布の形状からプラズマの生成条件が推察でき,また再現性も良い.現在,実際のプロセスへの応用を検討するためCH4,などの反応ガスに付いても実験を始めている.63年度の計画にあるプラズマ内部パラメータ測定については白金製のラングミュアーブローブの作製及び装置内への装着は完了した. 63年度はこのブローブを用いてガス圧力,供給電力等のプラズマ生成条件を変化させた場合のプラズマ内部パラメータ(平均電子エネルギーT,電子密度n,電子エネルギー分布f,等)を測定し,プラズマのシース部の情報とプラズマ内部パラメータとの相関をさらに調べる予定である.画像処理的手法で測定した発光強度分布と探針法から得られるプラズマ内部パラメータを総括して考察し,実際のプロセシングへ応用を試みプラズマのモニタリング及びコントロールに対してのシース部の重要性を検討することにしている.前年度の研究では、CCDカメラを使用することによりより瞬時に電極間の発光強度分布を測定することに成功した。そこで、この発光分布から得られる情報と探針法によって得られたプラズマパラメータとの関係を調べた。平行平板型の高周波放電では、陰極近傍にr電子によるものと思われる電子密度の高い領域が発生し、この部分の発光強度が最も強くなり、発光強度分布においてはピークを示す。

このピークの位置と、プリシースとフラズマ領域との境界とが極めて良い一致を示すことが探針法によって明らかになった。高周波放電では、陰極側のシースを通してプラズマ中に電力が供給されるので、シース幅(プレシースを含めた)とプラズマパラメータとの間に何らかの関係が存在することが考えられる。そこで、シース幅と探針法によって測定した電子の平均エネルギーとの関係を調べたところ、ほぼ比例関係にあることが解った。この事は、Langmuir-Childの式を用いることにより解析的に証明することができた。さらに、陰極に発生する直流バイアス電圧とシース幅によりプラズマ中の電子密度も測定できることが解った。我々は、従来より原料ガスに炭化水素系ガスを用いることにより硬質炭素膜の作製を行なっているが、シース幅を測定することにより軟質膜から硬質膜へ変化する圧力条件を明解に把握することができた。一般に、プラズマの制御には外部パラメータである供給電力、ガス圧力、ガス流量等が使用されているが、本研究で調べたプラズマ内部からの情報を使って制御することにより、統一的な論議が可能になると思われる。
レトロウイルス感染症でのレドックス制御異常の分子機構

我々が単離したATL-derived factor (ADF)は、還元補酵素thioredoxin (TRX)のヒトホモローグである。我々はTRXが還元物質として作用し、TRXがレドックス状態を制御することにより細胞機能調節に関わっていることを示してきた。本研究は細胞環境のレドックスの制御機構の細胞機能への影響を解析し、免疫病とりわけレトロウイルス感染症の病態を明らかにする事を目的とする。今年度の研究成果として明らかとなったことは、1)TRX遺伝子のknockoutマウスは胎生致死であり、TRX遺伝子まマウス胎孔の早期分化および形態形成に重要な役割を果たしていたと考えられた。2)TRX遺伝子のプロモーターに新たに酸化ストレスに応答する遺伝子配列を同定した。3)酸化ストレスによりCD4のPKC依存性のdownregulationが抑制され、さらにその機構はlckを介する機構およびCD4のセリンリン酸化の機構とはいずれも異なった。4)NF-κB、Jun/Fosなどの転写因子の活性化に、TRXやRef-1蛋白などのレドックス制御蛋白が、重要な制御的働きをすることが明らかになっているが、ステロイドホルモンの核内移行と遺伝子活性化調節にも、レドックス制御機構の役割が重要と考えられた。さらにRef-1がTRXに結合し、AP-1転写活性への役割を新たに明らかとした。5)TRXの標的蛋白質としてphagocyte oxidase系の因子の1つであるp40-phoxおよび60kdのタンパク質を検出した。
森林の遮断メカニズムに関する研究

森林樹冠への雨水着量と遮断蒸発量を量的に把握することは、森林の水源かん養機能を明確に確立することからも非常に重要な研究課題である。近年社会的要求の中の水資源の確保の面からも、また環境保全問題の一つとしての水問題を解決するうえからもこの種の問題は大きなキ-ワ-ドとなっている。しかし、これらの問題を最終的に解決するには森林地の有効的な施業法の確立など、より実践的な研究が今後必要となる。森林地を取りまく環境が多岐にわたるため、樹木への付着水分量および蒸発散を的確に表現するには、幾多のブラックボックスが存在している。これまで樹冠遮断解析にあたり種々の方法が提案されている。しかし、より詳細なナカニズムの解明を行うには樹木・森林特性をも組み入れた考察が必要で、このことの究明が有効的施業法の確立に結びつく。本研究は、これらの問題解明の一つとしての、ブラックボックスである樹木特性を取り上げ、単木吊り下げ法をもちいて検討を行った。実験試料に28・8年生のヒノキ・スギをもちい、3種の降雨強度、4種のLAIで実験を行った。著者はHortonが示した式I=S+KETにおいて第2項決定には第1項が重要な役割を果たしているとの認識のもとに、気象・樹木因子を組み入れ考察を行った。樹冠内に貯留し蒸発散として消失する水分のほかに、樹冠を通じて林床に到達する雨水の量的把握も遮断機能を解明するうえで重要な要素である。本実験は、以上の観点から、樹水特性(葉面積指数、しなり、枝葉の垂直的分布、枝打ち条件等)が遮断量、樹幹流下量、樹冠内滴下量にどのように影響しているかについて実現象を主体に計測を行った。考察にあたり各降雨強度・樹木特性別に、降雨中、停止後に区分して検討した。その結果、樹木内条件が変化するに従い樹冠内滴下量、樹幹流下量、遮断量が大きく変化し、その原因として樹冠内の枝葉の垂直的配分と降雨中の枝葉のしなれおよび枝葉の樹冠内密度が大きく関係しており、樹冠遮断蒸発を考察するうえで微気象を組み入れた解析もさることながら、今回行った考察も非常に重要な関係因子になることを示唆したものと考える。今後、林分として検討した場合にこの樹木特性がどのような働きをするかについて考察を行う必要がある。森林樹冠への雨水付着量と遮断蒸発量の量的推移に大きく影響を及ぼすと考えられる気象環境因子には、降雨強度、風速等をはじめとして多くの因子が関係している。その中で熱エネルギ-の供給がどの様な係わり方をしているかという観点から特に遮断蒸発に関するメカニズムの解明がいそがれている。本研究は、この遮断蒸発に係わるメカニズムの解明を行うための基礎的資料を得るため、主に単木吊り下げ法をもちいて検討を行った。実験にはDIK式降雨装置を、実験試料に28年生のヒノキをもちい、3種(6.96、13.18、19.30mm/hr)の降雨強度、3段階(00.3、1.72.0、2.02.5m/s)の風速、4種(2.30、2.68、2.76、5.42)のLAIで実験を行った。樹冠遮断に関しては、HortonがI=S+KETで表し、樹体付着水分量と蒸発散量の2項より成り立っていることを示した。著者はこれまで遮断量を量的に支配している因子の中から樹木・森林特性を取り上げて、この特性変化による付着水分量Sについて考察を行ってきた。最近の遮断に関する研究において、降雨中における蒸発に関する考察の中で降雨強度の増加に伴い蒸発量も増加する傾向があるとの報告があり、この要因として降雨強度が増すに従い若干量風速が増える傾向があり、これが降雨中に葉面に付着した水分の蒸発を促進させるエネルギ-に成っているものと考えられる。本実験は、以上の点から、風の影響により樹体付着水分量Sと蒸発量Eがどのように推移するかを遮断時間曲線により、実現象を主体に計測を行った。考察にあたっては各降雨強度・LAI・風速別に、降雨停止後の樹冠遮断量につてい検討を行った。その結果、風速の増加に伴い若干量の付着水分量の減少が確認されており、その量だけ蒸発量も増加しているものと考えられる。今回風速の増減による遮断の実現象の確認のみを行った、今後、蒸発のメカニズムについて実現象と合わせて検討を行っていく。

実験試料に28・8年生のヒノキ・スギをもちい、3種の降雨強度、4種のLAIで実験を行った。著者はHortonが示した式I=S+KETにおいて第2項決定には第1項が重要な役割を果たしているとの認識のもとに、気象・樹木因子を組み入れ考察を行った。樹冠内に貯留し蒸発散として消失する水分のほかに、樹冠を通じて林床に到達する雨水の量的把握も遮断機能を解明するうえで重要な要素である。本実験は、以上の観点から、樹水特性(葉面積指数、しなり、枝葉の垂直的分布、枝打ち条件等)が遮断量、樹幹流下量、樹冠内滴下量にどのように影響しているかについて実現象を主体に計測を行った。考察にあたり各降雨強度・樹木特性別に、降雨中、停止後に区分して検討した。その結果、樹木内条件が変化するに従い樹冠内滴下量、樹幹流下量、遮断量が大きく変化し、その原因として樹冠内の枝葉の垂直的配分と降雨中の枝葉のしなれおよび枝葉の樹冠内密度が大きく関係しており、樹冠遮断蒸発を考察するうえで微気象を組み入れた解析もさることながら、今回行った考察も非常に重要な関係因子になることを示唆したものと考える。今後、林分として検討した場合にこの樹木特性がどのような働きをするかについて考察を行う必要がある。
脂質性ドメイン解析のための急速凍結・免疫電顕法の開発

脂質滴は内部にコレステロールエステルとトリグリセリドを貯蔵し,外周は燐脂質とフリーコレステロールでできた脂質一重層で覆われている構造である.前年度までの研究により、脂質滴の微細構造は通常の化学固定では保持されないことが確認された.今年度は,従来の急速凍結法を改良し,脂質滴構造を生きた状態のまま高度に保持し,脂質滴構造蛋白質の局在を詳細に明らかにするための方法を確立した.多数の脂質滴を内在性に持つHepG2細胞などの培養細胞を用い,PBSに溶解した10%BSAでリンスしたのち,少量の同液中で機械的に剥離し,短時間の遠心でペレットにした.Leica社製の加圧急速凍結装置EM-PACTの平板凹型の試料台(底部に小孔があり,底部から加圧されるもの)に1-2ulのペレットをいれ,10um厚の銅板を載せて,試料ポッドに規定の圧力で固定し,急速凍結した.ついでBAL-TEC社製の真空凍結割断装置BAF400にて-115°Cで割断し,白金・カーボンレプリカを作製した.常温に戻した試料台からレプリカの付着した細胞ペレットを回収し,2.5%SDS in PBS中で60°C,15分処理した.洗浄後,100u/ml DNase Iで37°C,一晩消化し,さらに25%SDS in PBS中で60°C,15分処理してSDS-FRL法による抗体標識に供した.上記の方法により氷晶のない試料のレプリカがコンスタントに得られ,脂質滴は膜内粒子のない平滑な割断面を持つ球として認められた.またADRPは凹面として割れた脂質滴に一面に,また脂質滴を横断するように割れた割断面の円周から一定の距離を持つ標識として観察された.今回の方法は,脂質滴だけでなく,化学固定が困難な他の構造にも応用可能であると考えられる.形質膜の機能ドメインであるカベオラとラフトはコレステロールやスフィンゴ脂質などの脂質成分を基盤として形成され,脂肪酸でアンカーする細胞内シグナル伝達関連分子が集中的に存在する.また中性脂質を含む細胞内脂質滴の表層も膜ドメインとしての性質を持つことが明らかになった.脂質は通常の試料作製に用いられる薬剤では固定されないため,急速凍結法を用いて脂質性ドメインにおける機能分子の微細局在を明らかにする方法の確立を企図した.今年度は精製した脂肪滴を用い,液体ヘリウム温度ステージを持つ極低温電子顕微鏡での無固定・無染色での観察と,凍結割断レプリカによる免疫電顕法を行い,両者の結果を比較検討した.前者の方法ではHepG2細胞から精製した脂肪滴の多くは,表面が高電子密度の1本線として観察され,燐脂質一重層であることが確認された.一部の脂肪滴には同心円状に等間隔で配列する多重線が認められ,複数種の脂肪滴の存在が示唆された.凍結割断レプリカ法でも,表層だけが割断されるものと,何重もの割断面が見られるものが観察され,極低温電子顕微鏡での観察結果を裏付けた.しかもレプリカ上で,脂肪滴に特異的な蛋白質であるADRPを金コロイド抗体標識すると,ラベルは重層する複数の割断面に観察された.通常のアルデヒド固定を行った試料では凍結切片,樹脂包埋切片とも脂肪滴表層や内部に膜状構造を見ることはできない.上記の結果は急速凍結法が脂肪滴の表層と内部の構造を保存し,従来の方法で同定し得なかった微細構造を観察するために有効であることを示した.前年度の研究により,脂質滴は内部にコレステロールエステルとトリグリセリドを貯蔵し,外周は燐脂質とフリーコレステロールでできた一重層で覆われている構造であることを明らかにした.今年度は脂質滴の構造保持と脂質滴特異蛋白質の免疫電顕的検索について検討した.1)光学顕微鏡レベルで脂質滴を検出するための方法として,中性脂質を特異的に標識するNile red, Sudan III, Oil red 0などによる染色が用いられている.従来の方法ではこれらの染色を二重に行うことができなかったが,我々はNile red染色・写真撮影・脱色・Sudan III(またはOil red 0染色)・写真撮影というシーケンスで観察し,同一細胞での二重染色を行った.その結果,Sudan III, Oil red 0の染色で使用するethanol, isopropanolなどの溶剤が脂質滴を変形・融合させ,Nile red染色とは異なる像をもたらすことを見出した.また封入剤に用いられるグリセロールも脂質滴を変形させることが明らかになった.これらの変形はグルタルアルデヒドで固定した試料でも認められた.2)脂質滴に局在する分子であるADRPについて,急速凍結・フリーズフラクチャー法で得たレプリカを金コロイド標識した.アミノ末端を認識するモノクローナル抗体を用いたが,標識は脂質滴表層の凸割断面(PF),凹割断面(EF)のみならず,脂質滴の中心部分を横断する割断面にも観察された.

この結果はADRPが従来の膜蛋白質とは異なり,多様な三次元構造をとり,時に中性脂質でできたコアの部分にも挿入される可能性を示唆した.通常のアルデヒド固定で脂質滴構造を保持することは困難であり,凍結技法を用いることによってのみ,分子レベルの微細局在を明らかにすることが可能であると考えられる.脂質滴は内部にコレステロールエステルとトリグリセリドを貯蔵し,外周は燐脂質とフリーコレステロールでできた脂質一重層で覆われている構造である.前年度までの研究により、脂質滴の微細構造は通常の化学固定では保持されないことが確認された.今年度は,従来の急速凍結法を改良し,脂質滴構造を生きた状態のまま高度に保持し,脂質滴構造蛋白質の局在を詳細に明らかにするための方法を確立した.多数の脂質滴を内在性に持つHepG2細胞などの培養細胞を用い,PBSに溶解した10%BSAでリンスしたのち,少量の同液中で機械的に剥離し,短時間の遠心でペレットにした.Leica社製の加圧急速凍結装置EM-PACTの平板凹型の試料台(底部に小孔があり,底部から加圧されるもの)に1-2ulのペレットをいれ,10um厚の銅板を載せて,試料ポッドに規定の圧力で固定し,急速凍結した.ついでBAL-TEC社製の真空凍結割断装置BAF400にて-115°Cで割断し,白金・カーボンレプリカを作製した.常温に戻した試料台からレプリカの付着した細胞ペレットを回収し,2.5%SDS in PBS中で60°C,15分処理した.洗浄後,100u/ml DNase Iで37°C,一晩消化し,さらに25%SDS in PBS中で60°C,15分処理してSDS-FRL法による抗体標識に供した.上記の方法により氷晶のない試料のレプリカがコンスタントに得られ,脂質滴は膜内粒子のない平滑な割断面を持つ球として認められた.またADRPは凹面として割れた脂質滴に一面に,また脂質滴を横断するように割れた割断面の円周から一定の距離を持つ標識として観察された.今回の方法は,脂質滴だけでなく,化学固定が困難な他の構造にも応用可能であると考えられる.