hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
5-FU関連酵素のアンチセンスDNAの導入によるヒト肺癌の5-FU治療効果

<H13年度>5-FUの治療効果に最も影響する酵素thymidylate synthase(TS)の発現をdown regulateするために有効なantisense oligonucleotideの配列決定するため、Open reading frame(ORF)の始め、exon1内、exon1-intron1の境界部分をターゲットとするFITC化S化したantisense oligonucleotide(ODNs)及びrandom ODNs(control)を作製した。cationic型のHVJ-リポソーム(アンチセンスDNAを含む)を調整し、肺癌細胞株Ma10、Ma25(2x10^5細胞)に導入しTSの発現をRT-PCRにて測定した。ORFの始めのantisense ODNsによって、最高でTSの発現が50%抑制された(RT-PCR及び酵素活性にて)。そして、5-FUのIC50を約20%低下させることがわかった。しかし、その発現低下は細胞株によって異なり、antisense ODNsによるdose-respose curveを描いていない。蛍光顕微鏡にてFITC化ODNsが細胞の核に入っているかどうかを検討し、細胞内へのantisense ODNsの導入効率が悪いことに原因があることがわかった。コンピューター解析にて新しいTS antisense ODNsを作製した。612及び617である。しかし、両antisense ODNsとも有意にTSの発現を低下させることができなかった(Fig.4)。<H14年度>効果的なTS antisense ODNsを作製できないため、リポソームに抗癌剤を封入しin vitroの抗腫瘍効果を検討し、in vivoでの経気道投与の可能性を検討した。ローダミン標識CDDPリポソームを使用した。CDDP単独のIC50が40ug/mlであるのに対して(48,96hr incubationのIC50は変化なし)、CDDP-liposomeは48hrincubationでは10ug/ml、96hrincubationでは1.5ug/mlであった。CDDP-liposomeはCDDP単独よりIC50は低く、長期incubationすることでその抗腫瘍効果は増大する。次にSCIDマウスをプラスチック・ボックスに入れ、ネブラーザーによりローダミン標識CDDPリポソームをエアゾル化しボックス内に投与した。蛍光顕微鏡にて観察するとコントロールのマウスの肺では、ローダミンが検出されないのに対してローダミン標識CDDPリポソーム投与群はローダミンが検出された。ローダミンの検出される領域は散在性で、瀰漫性ではない。投与されたマウスによってもローダミンの検出量には違いがある。リポソームに抗癌剤を封入し、経気道投与による肺癌の治療の可能性があることが示唆された。5-FUの治療効果に最も影響する酵素thymidylate

synthase(TS)の発現をdown regulateするために有効なantisense oligonucleotideの配列決定するため、Open reading frame(ORF)の始め、exon1内、exon1-intron1の境界部分をターゲットとするFITC化S化したantisense oligonucleotide(ODNs)及びrandom ODNs(control)を作製した。cationic型のHVJ-リポソーム(アンチセンスDNAを含む)を調整し、肺癌細胞株Ma10、Ma25(2x10^5細胞)に導入しTSの発現をRT-PCRにて測定した。ORFの始めのantisense ODNsによって、最高でTSの発現が50%抑制された(RT-PCR及び酵素活性にて)。そして、5-FUのIC50を約20%低下させることがわかった。しかし、その発現低下は細胞株によって異なり、antisense ODNsによるdose-respose curveを描いていない。蛍光顕微鏡にてFITC化ODNsが細胞の核に入っているかどうかを検討し、細胞内へのantisense ODNsの導入効率が悪いことに原因があることがわかった。現在、最も良いantisense ODNsの導入効率の細胞株を選択している。さらに、antisense ODNsの塩基配列を変え、TSの発現がさらに低下するantisense ODNsを検討している。TSの発現を抑制する効果的なTS antisense ODNsを作製できないため、リポソームに抗癌剤を封入しin vitroの抗腫瘍効果を検討し、in vivoでの経気道投与の可能性を検討した。最初に、肺癌細胞株とリポソームとの親和性を検討した。12 welldishに肺癌細胞株(Ma44-3,Ma25,FT)1x10^4細胞を注入し24時間培養した。各wellにローダミン標識ステロイドリポソームを添加し、mediumの濃度を0,10,50ug/mlとした。親和性を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。Ma44-3細胞とリポソームの親和性は高く、Ma25細胞は中等度,FT細胞は低い。以下の実験には親和性の高いMa44-3を使用した。ローダミン標識CDDPリポソームを使用した。CDDP単独のIC50が40ug/mlであるのに対して(48,96 hr incubationのIC50は変化なし)、CDDP-liposomeは48hrincubationでは10ug/ml、96hrincubationでは1.5ug/mlであった。CDDP-liposomeはCDDP単独よりIC50は低く、長期incubationすることでその抗腫瘍効果は増大する。
葉緑体分化におけるチラコイド膜糖脂質とクロロフィル合成系の協調的な制御機構の解明

本研究では葉緑体発達時におけるチラコイド膜形成とクロロフィル合成の協調的な制御機構の解明を目的としている。これまでの解析から、クロロフィル合成系遺伝子の発現制御には、転写因子であるHY5が関与しているとともに、サイトカイニン、オーキシンといった植物ホルモンがそれぞれポジティブ、ネガティブに作用することを見出した。そこでさらに、チラコイド膜形成に必須な糖脂質合成酵素遺伝子の制御やクロロフィル合成への関与について調べた。遺伝子発現解析の結果、光形態形成時における糖脂質合成遺伝子の発現には、クロロフィル合成系遺伝子と同様、HY5の他にサイトカイニンシグナルが大きく関与していることが分かった。このことから、クロロフィル合成と糖脂質合成は遺伝子の転写レベルでの協調的な制御を受けていることが明らかとなった。さらに、クロロフィル合成量が減少した変異体では、その減少量に応じて糖脂質合成酵素遺伝子の発現が減少していたことから、これらの遺伝子発現制御に、クロロフィル合成経路がなんらかの関与をしていると考えられる。興味深いことに、反対に糖脂質合成を欠失した変異体では、クロロフィル合成系遺伝子の発現が大幅に減少していた。これらの結果から、チラコイド膜糖脂質合成とクロロフィル合成は、お互いにそれぞれの遺伝子の発現に影響を与えていることが明らかとなった。葉緑体発達時におけるチラコイド膜の脂質二重層形成やクロロフィル合成は、それぞれ協調して進行することが正常な葉緑体の発達に重要であると考えられるが、上記に見られた制御はその協調的におこる光合成系の構築に重要であると考えられる。光合成に必須の色素であるクロロフィルやその前駆体は光酸化作用をもっているため、高等植物は転写、翻訳、酵素の活性化といった様々な段階でクロロフィルの代謝制御を行う。本研究では、クロロフィル合成遺伝子群の協調的な発現制御メカニズムを明らかにするために、根でのクロロフィル合成に注目して研究を行った。通常、根ではほとんどクロロフィル合成は起こらないが、サイトカイニンを処理した根ではその合成が活性化することが分かった。また、サイトカイニンレセプターの変異体では根の緑化が抑制されたことから、サイトカイニンシグナルは根におけるクロロフィル合成促進することが分かった。それに対し、オーキシンシグナル変異体では根での強いクロロフィル蓄積を示したことから、オーキシンシグナルは根の緑化に対して抑制的に働くと考えられた。そこで、DNAマイクロアレイ解析やリアルタイムPCR解析を行ったところ、これらのホルモンによるシグナルは、CHLH,CHL27,CHLPといったクロロフィル合成系のキー遺伝子や光合成アンテナ遺伝子であるLHCAやLHCBの協調的な発現制御に関与していることが分かった。さらに、光シグナルに深く関わる転写因子の変異体hy5では、ホルモンシグナルの有無に関わらず、根の緑化はまったく見られなかった。hy5の根ではCHLHなどのクロロフィル合成系の遺伝子の発現が顕著に減少していたことから、これらの遺伝子の発現誘導にHY5は必須であることが分かった。ホルモンシグナルは根におけるHY5のレベルに影響を与えなかったことから、サイトカイニン、オーキシンといった植物ホルモンは、光シグナルとは別の経路を介してクロロフィル合成に関与している可能性が考えられた。本研究では、高等植物の葉緑体発達時におけるクロロフィル合成系の協調的な制御機構の解明を目的としている。これまでの解析から、サイトカイニンとオーキシンは根でのクロロフィル合成に対してそれぞれポジティブ、ネガティブに作用することを明らかにした。この結果は、クロロフィル合成は組織分化と協調した形で、これらの植物ホルモンによって厳密に制御されていることを示している。そこでさらに、光照射時におこる子葉でのクロロフィル合成におけるこれらのホルモンの関与を調べた。変異体解析から、オーキシンシグナル変異体であるaxr2やshy2、slrでは光形態形成時のクロロフィル量が増加するのに対し、サイトカイニンレセプター変異体のahk2ahk3では反対に大きく減少することが分かった。さらに、クロロフィル合成系遺伝子の発現も同様にこれらの変異体では増減していた。これらの結果は、光形態形成時のクロロフィル合成に関しても、オーキシンシグナルが抑制的に働くのに対し、サイトカイニンは促進的に作用することを示している。しかし、根でのクロロフィル合成系遺伝子の発現は、光シグナルに関わる転写因子であるHY5の制御を極めて強く受けるが、子葉ではHY5はそれほど重要ではなく、オーキシン変異体とhy5との二重変異体も、大きなクロロフィル量の減少を見せなかった。さらに、クロロフィル合成の鍵酵素遺伝子であるCHLHのプロモーターにおいて、HY5が結合すると考えられるG-boxの削除によって発現活性が根ではほとんど見られなくなったのに対し、地上部では依然として強いプロモーター活性が見られた。これらの結果は、根ではHY5依存的にクロロフィル合成制御が行われるのに対し、地上部ではHY5以外のファクターが大きく寄与していることを示している。

さらに、クロロフィル合成量が減少した変異体では、その減少量に応じて糖脂質合成酵素遺伝子の発現が減少していたことから、これらの遺伝子発現制御に、クロロフィル合成経路がなんらかの関与をしていると考えられる。興味深いことに、反対に糖脂質合成を欠失した変異体では、クロロフィル合成系遺伝子の発現が大幅に減少していた。これらの結果から、チラコイド膜糖脂質合成とクロロフィル合成は、お互いにそれぞれの遺伝子の発現に影響を与えていることが明らかとなった。葉緑体発達時におけるチラコイド膜の脂質二重層形成やクロロフィル合成は、それぞれ協調して進行することが正常な葉緑体の発達に重要であると考えられるが、上記に見られた制御はその協調的におこる光合成系の構築に重要であると考えられる。
環境中アレルゲンの一次構造並びに高次構造を認識する高感度エピトープ解析手法の開発

(1)ファージディスプレイ法で同定したソバ主要アレルゲンで2Sアルブミンである16-kDaタンパク質(BWp16)の、エピトープの候補領域を確認した。(2)くるみ及びダイズの主要アレルゲン,2Sアルブミン及びGlymBd30kの単離を行い,エピトープ解析に供した.(3)バイオインフォマティクス手法による既知のアレルゲンに特徴的なアレルゲンユニーク断片(AUF)のインデックスを用いたアレルゲンエピトープ予測法に関して、タンパク質立体構造の揺らぎ(配列の動的構造)B因子,並びに抗体との結合部の確率を併用することで、アレルゲンエピトープ予測の精度の上昇が確認された。(1)ファージディスプレイ法を用いる立体構造を含むエピトープを解析する手法の開発...そば主要アレルゲンであるペプシン耐性を有する16-kDaタンパク質のcDNAを大腸菌に組込み、組換えタンパクの発現、精製を行った。ランダムなアミノ酸配列を有するペプチドを提示しているM13ファージライブラリーを用いて、16kDaタンパクのエピトープ様の配列(ミモトープ)を同定し、ペプチドの段階的重複鎖(overlapping peptide)を固定した(spot)膜を用いて得られた一次構造エピトープ配列との比較を行った。(2)野生型組換えアレルゲンタンパク質及びその変異体の大腸菌での作製...アレルゲンの立体エピトープの形成に関与すると思われるシステイン残基の変異体を作成し、そばアレルギー患者IgE抗体との反応性を検討し、システイン残基の立体エピトープへの関与の有無を検討し、特定の位置のシステイン残基による分子内ジスルフィド結合が、IgE抗体との結合活性、ペプシン分解性に大きく影響を与えることが判明した。(3)アレルゲンのエピトープ付近に特徴的なアミノ酸配列の物理化学的因子の特徴の解明...バイオインフォマティクス手法による既知のアレルゲンに特徴的なアレルゲンユニーク断片(AUF)のインデックスを用いたアレルゲンエピトープ予測法の検討を開始した。AUFインデックスのプロットのピークは、二次構造の端に近いところに存在していることが確認された。(4)そば以外のアレルゲンの主要アレルゲンの解析...これから、遺伝子改変体の開発が予想されるさけの主要アレルゲンの解析を行った。手法としては、二次元電気泳動にて試料中のタンパク質の分離を行い、アレルギー患者血清中のIgE抗体が認識するタンパク質をウェスタンブロット法で解析した。コラーゲン、パルブアルブミンに加え、GAPDHもアレルゲンの候補として考えられた。(1)ファージディスプレイ法を用いる立体構造を含むエピトープを解析する手法の開発...そば主要アレルゲンであるペプシン耐性を有する16-kDaタンパク質の、ミモトープを、12残基のランダムペプチドを発現するM13ファージライブラリーを用いて同定し、ミモトープ部位アミノ酸とIgE抗体の親和性をEHSA法、Biacore法にて測定した。(2)野生型組換えアレルゲンタンパク質及びその変異体の大腸菌での作製...アレルゲンの立体エピトープの形成に関与すると思われるシステイン残基のシングル及びダブル変異体を作成し、そばアレルギー患者IgE抗体との反応性を検討し、特定の位置のシステイン残基による分子内ジスルフィド結合の、IgE抗体との結合活性を検討した。また、リニアエピトープの候補領域のアミノ酸の変異体についでも作成を行った。(3)アレルゲンのエピトープ付近に特徴的なアミノ酸配列の物理化学的因子の特徴の解明...バイオインフォマティクス手法による既知のアレルゲンに特徴的なアレルゲンユニーク断片(AUF)のインデックスを用いたアレルゲンエピトープ予測法に関して、タンパク質立体構造の揺らぎ(配列の動的構造)B因子を併用することで、アレルゲンエピトープ予測の精度の上昇が確認された。(5)そば以外のアレルゲンの主要アレルゲンの解析...これから、遺伝子改変体の開発が予想されるコメの主要アレルゲンの解析を行った。アミラーゼインヒビター、グリオキサレースに加え、50-60kDaタンパク質もアレルゲンの候補として考えられた。(1)ファージディスプレイ法を用いる立体構造を含むエピトープを解析する手法の開発-ミモトープで同定したソバ主要アレルゲンである16-kDaタンパク質(BWp16)の、エピトープの候補領域のアミノ酸をアラニンに置換した変異体を作成し,一部の変異体でIgE抗体との結合活性の減少を確認した。

(2)野生型組換えアレルゲンタンパク質及びその変異体の大腸菌での作製---BWp16の構造解析を行うために,N末端部のアミノ酸を切断したΔN-rBWp16を大腸菌に発現させ,精製後,結晶を形成させてからX線による構造解析を行い,2Sアルブミンに特徴的なα-ヘリックス構造を有することが判明した。また,精製したrBWp16に対する単クローン抗体を用いて抗原抗体複合体の構造解析に着手した。(3)アレルゲンのエピトープ付近に特徴的なアミノ酸配列の物理化学的因子の特徴の解明-バイオインフォマティクス手法による既知のアレルゲンに特徴的なアレルゲンユニーク断片(AUF)のインデックスを用いたアレルゲンエピトープ予測法に関して、タンパク質立体構造の揺らぎ(配列の動的構造)B因子,並びに抗体との結合部の確率を併用することで、アレルゲンエピトープ予測の精度の上昇が確認された。(5)そば以外のアレルゲンの主要アレルゲンの解析-くるみ及びダイズの主要アレルゲン,2Sアルブミン及びGlymBd30kの単離を行い,性質を調べると共に,それらタンパク質に対する抗体を作成し,これらタンパク質のELISAによる測定系を開発した。
RNAiを用いた緑内障に関連する神経保護機能遺伝子の探索・同定

緑内障は視神経の特徴的な構造的・機能的異常をきたす疾患であり、中途失明の原因の第一位を占めている。そこで、神経損傷・保護に機能する遺伝子とその分子機構の探索・同定を行った。網羅的発現解析(Yasuda et al., 2014)から得られた遺伝子をターゲットとしてRNAiおよび過剰発現等のアデノ随伴ウイルスベクターを用いて緑内障モデルを用いた解析を行ったところ、網膜神経節細胞の細胞死パスウェイにおいて小胞体ストレスが関与していることが示唆された。本研究により、緑内障をはじめとした難治性網膜疾患がもたらす神経損傷の分子機構の解明と神経保護薬の開発につながることが期待される。しかし、そのメカニズムについては未解明の部分も多い。本研究では、緑内障の病態の解明のため、各種障害を与えた疾患モデル動物を用いて、神経損傷・保護に機能する遺伝子およびその分子機構の探索・同定を目的とする。そのために、RNAi法を用いた探索を行う。すなわち、種々の遺伝子をRNAiによりノックダウンし、それによって現れる影響を疾患モデルにより機能面から評価することで新規機能性遺伝子を同定し、その詳細を分子生物学的手法と機能プローブを用いたイメージングなどの手法を駆使することで解析する。そのためにまずは、緑内障モデルにおける眼内でのin vivo RNAi法の確立を目指した。発現解析(Yasuda et al., 2014 in press)から得られた小胞体ストレス関連の遺伝子をターゲットとして、作製した種々のsiRNAおよびshRNA発現ベクターを用いてRNAiの手法とその導入方法等に関して条件検討を行った。その結果、shRNA発現ベクターをアデノ随伴ウイルスを用いて網膜神経節細胞に遺伝子導入する方法において、緑内障モデルでの標的遺伝子の有意な発現量の低下とさらにその下流の遺伝子の発現の変動が見られた。このことは、この方法が緑内障モデルにおける有効なRNAi法であることを示している。現在は、緑内障モデルマウスの発現解析により得られた遺伝子をRNAi法によりノックダウンし、機能面から評価することで候補遺伝子の絞り込みを行っている。本研究では緑内障の病態の解明のため、各種障害を与えた疾患モデル動物を用いて、神経損傷・保護に機能する遺伝子およびその分子機構の探索・同定を目的とする。そのために、RNAi法を用いた網羅的な探索を行うこととした。そのためにまずは、条件検討を行った。種々のsiRNAおよびshRNA発現ベクターを作製し、RNAiの手法とその導入方法等に関して検討したところ、shRNA発現ベクターをアデノ随伴ウイルスを用いて遺伝子導入する方法が良好であった。しかしながら、実際の解析には不十分である可能性があったため、過剰発現系も用いて行うこととした。26年度が最終年度であるため、記入しない。分子生物学26年度が最終年度であるため、記入しない。種々の条件検討を行い眼内でのin vino RNAiの手法を構築した。現在は発現解析により得られた遺伝子のRNAiを進めることで緑内障関連遺伝子の候補を機能面から絞りこんでいる。また、機能解析のためのイメージングの立ち上げに既に着手しており、遺伝子を同定後は、速やかに神経機能活動における生理学的意義の検証にスムーズに移行できる。引き続きRNAiを用いて神経損傷・保護に機能する遺伝子およびその分子機構の探索・同定を行う。同定後はその遺伝子が機能する経路をRNAi、過剰発現、レポーターアッセイ等の分子生物学的手法を用いて解析する。さらに、発現解析を行うことで機能する場所と時期を明らかにしていく。また、in vivoイメージングを用いた分子機能の評価も行っていく。
立体画像で与えた仮想臓器への操作に現実感を伴う教育用手術解剖シミュレータ

研究期間全般にわたって,両眼視差立体視切離に関する新しい技術の開発と改良を行った。最終的には,仮想切離器具の遠隔操作が可能で仮想物体の切離が可能なマスタースレーブ鋏型デバイスを完成した。なお,これまでのナイフ型,鋏型,鋸型の3種のデバイスの操作性をも改善し円滑な動作が可能なことをも確認した。切離時の微妙な抗力実現のために,粘弾性力学モデルで生体構成物質の物性を実現するための基礎的な研究を行い,破壊モデルを含めて表現する方法を完成した。これらの成果をもとに,立体視切離感覚実現のために遠隔操作が可能なフォースディスプレイシステムを製作し,それを手術解剖シミュレータに応用した。これらと並行して,眼球の視線調節機能についての研究を行い,視標の運動に依存した眼球の統合運動をハードウェア的に実現し立体視に応用した。さらに手術および解剖時の切断面の明示など画像表現上の技術も向上させた。また,一様な物性もつ弾性体を切離デバイスにより種々の速度で切離するときの抗力を生体臓器を構成する物質を切離するときに発生する抗力と比較検討した。今後は三次元臓器画像の立体視切離の操作感覚,現実感の向上を目指した新たなマスタースレーブ型切離デバイスを開発し,さらに小型通信機能機器の開発を行う予定である。今年度は,両眼視差立体視切離に関する技術の完成度を高めるとともに,切離デバイスとしてナイフ型,鋏型,鋸型のデバイスを開発しその操作性を改善した。同時に,微妙な抗力実現のために生体構成物質の物性に関する基礎的な研究を行なった。これらの実験結果をもとに立体視切離感覚実現のためのフォースディスプレイシステムとそれを利用した手術解剖シミュレータの製作を行った。まず,両眼視差を利用した立体視切離について,切離デバイスの使用時の画像の歪など実際の形状との差を極力締めるような研究を行った。そのために眼球運動による視線調節機能についての研究を行い,視標の運動に依存した眼球の統合運動を実現した。さらに手術および解剖時に切断面を明示するようなインディケータを開発し,これを用いて目的にあった円滑な切離が行えるようにした。なお,一様な物性もつ弾性体を実際に切離デバイスにより種々の速度で切断するときの抗力の発生機序について理論的な解明を試みた。さらに生体臓器を構成する組織を切離デバイスで切断するときに発生する抗力の測定装置を開発し,これを用いて切断時の切離デバイスに加わる抗力を実測した。つぎに,ホログラフィを利用した臓器画像の立体表示の基礎研究を行った。具体的にはレーザ発生装置を用いて干渉縞を作り,これを移動して一定空間内に立体画像を再現した。立体画像との位置関係から画像切離時に切離デバイスに抗力を与えながら,切離された臓器のホログラムを高速合成し,その映写を一部試みた。今後は3次元臓器画像の立体視切離を含む種々の操作に,インディケータを含めて抗力および接触時の円滑な感覚実現のためのハードウェアの改良とソフトウェアの開発を行い,人間の脳解剖および手術に関する教育支援システムの実用化を目指した研究を行う。具体的にはコンピュータからの指令で空間の任意の方向に抗力を発生し,これを切離デバイスに伝える小型の電子機器装置を開発する。また画像として構成した仮想物体を立体視しながら,上記のデバイスと電子機器装置からなるフォースディスプレイシステムを用いてこれを切断し,その結を果瞬時に画像合成するための処理システムを開発する。なお,解剖教育のために,両眼視差で立体視した臓器画像を現実感をもって切離できる大型ディスプレイ装置を用いたシステムの開発を試みる。今年度は,両眼視差立体視切離に関する新しい技術の開発を行った。具体的には,仮想切離器具の遠隔操作が可能な昨年度までに開発した鋏型切離デバイスと異なるマスタースレーブ鋏型デバイスを開発した。また,これまでのナイフ型,鋏型,鋸型の3種のデバイスの操作性を改善し円滑な動作を確認した。同時に,微妙な抗力実現のために区分的に力学モデルで表現した生体構成物質の物性を仮相物質で実現するための基礎的な研究を行った。

これらのシュミレーション実験結果をもとに,立体視切離感覚実現のためにすでに開発したフォースディスプレイシステムとそれを利用した手術解剖シュミレータの改良を行った。これと並行して,両眼視差を利用した立体視切離に関連する眼球の視線調節機能についての研究を行い,視標の運動に依存した眼球の総合運動を一部ハードウェア的に実現した。さらに手術および解剖時に切断面を明示するように,インディケータを用いて目的にあった円滑な切離が行えるようにした。なお,一様な物性もつ弾性体を切離デバイスにより種々の速度で切離するときの抗力の発生の数学的ダイナミクスを生体臓器を構成する物質を切離するときに発生する抗力と比較し,数式のパラメータ同定を行った。つぎに,ホログラムを用いて一定空間内に再現した臓器画像の切離時に切離デバイスに抗力を与えながら,切離された臓器のホログラムを高速合成しその映写を一部試みた。現在は3次元臓器画像の立体視切離の操作に,抗力および接触時の円滑な感覚実現可能なマスタースレーブ型切離デバイスの制御用ソフトウェアの充実を図っている。今後はコンピュータからの指令で空間の任意の方向に抗力を発生し,これを切離デバイスに伝える小型の電子機器装置を開発する。また画像として構成した仮想物体を立体視しながら,上記の切離デバイスと電子機器装置からなるフォースディスプレイシステムを用いてこれを切離し,その結果を瞬時に画像合成するための処理システムを開発する。なお,手術解剖に関する教育支援のために,両眼視差で立体視した臓器画像を現実感をもって切離できる大型ディスプレイ装置を用いたシステムの開発を予定している。今年度は,これまでに開発した両眼視差立体視切離に関する新しい技術である仮想切離器具の操作が可能なマスタースレーブ鋏型デバイスの改良を行った。その結果,デバイスの操作性が大幅に改善され円滑な動作が実現できた。同時に,粘弾性力学モデルにより生体構成物質の物性を表現し,仮想物体を実現することができた。これらの結果をもとに,遠隔操作可能なフォースディスプレイシステムを再構成し,それを手術解剖シミュレータに応用した。これと並行して,両眼視差を利用した立体視切離に関連する眼球の視線調節機能と視標運動に依存した眼球の統合運動をハードウェア的に完成した。さらに手術および解剖時に切断面を明示し円滑な切離が行えるようにした。なお,一様な物性もつ弾性体を切離デバイスにより切離するときの抗力を生体臓器を構成する物質を切離するときに発生する抗力と比較検討した。さらに,3次元臓器画像の立体視操作時に抗力および接触感を実現するためにマスタースレーブ型切離デバイスの位置制御を行い,力を操作者に伝達する通信機能を備えた小型の電子機器装置を開発した。現在は,画像として構成した仮想物体を立体視しながら切離しできるより拘束の少ない新たな遠隔操作可能なフォースディスプレイシステムと高速画像合成システムを開発している。なお,両眼視差で立作視した臓器画像を大画面で切離できる画像プロジェクタを用いたシステムの開発を進めている。同時に,区分けした領域をディスプレイするだけでなく,外科手術シミュレータとして切離不可能な部分や生命維持に不可欠な部分への侵襲禁止の警報を発するような装置も開発している。
逆ミセル連続反応法によるインスリンの液相完全化学合成

逆ミセル反応場を用いた新たな方法の導入により、選択的ジスルフィド結合形成の精密制御とフラグメント合成技術を組み合わせることによって、目的のペプチド分子の合成を試みた。その結果、分子間架橋形成反応を行った複数のペプチドフラグメントについて、それぞれを任意の位置関係で結合させるための合成法を確立した。また、各フラグメントには一つの疎水性タグを結合させ、逆ミセル反応場により、当量反応によるペプチド鎖伸長反応を実現した。さらに、ペプチド骨格が形成された後、疎水性タグ、その他の脱保護反応を実施した。これらの新たな方法を組み合わせ、インスリンを構成する基本ユニットをそれぞれ効率よく合成することに成功した。ペプチドフラグメントの連続液相合成とSS架橋形成アミノ酸残基の伸長・脱保護反応毎に、生成物と不要な試薬等を、迅速かつ効率的に分離することが極めて重要な課題である。逆ミセル反応法では、合成途上の疎水性タグ付ペプチドフラグメントが低極性溶媒中で逆ミセルを形成させ、アセトニトリルなどの高極性溶媒を添加、二相分離によって反応を行った結果、過剰な試薬等は容易に除去することができた。また、別途同様に合成したチオール保護フラグメント同士を、さらに逆ミセル構造を形成させることにより縮合させ、目的とするSS結合ペプチドフラグメントを合成した。両フラグメントのチオール保護基は脱保護に伴いフラグメント間クロスカップリングを進行させることができた。合成を困難にする、難物性ペプチドフラグメント中間体の効率的液相合成法の開発ペプチド合成の進行を妨げる最も大きな課題として、合成中間体を含む反応溶液の粘度の急激な上昇や生成物の不溶化による反応・分離が困難になる点が掲げられる。特にアミノ酸残基数の大きなペプチドの合成では、必ずこのような問題点に遭遇するため、多くの場合、全合成が達成できない問題点を有していた。本研究では、濾過操作を必要としない、生成物の沈殿分別法を新たに検討した。本法は、疎水性溶媒中に疎水性タグに結合したペプチド逆ミセルと共に、疎水性磁性ナノ粒子(平均粒径1020nm)を分散させることを基本原理とする。疎水性磁性ナノ粒子は、酸化鉄およびオレイン酸を用いて合成するが、この方法についてはすでに予備実験を完了し、目的とする粒子を調整できた。この粒子を用い、ペプチド鎖伸長反応が完結する度に、溶液にメタノール等の極性溶媒を添加し、疎水性タグを有するペプチドは疎水性磁性ナノ粒子に捕捉、凝集させることにより、生成物であるペプチドだけを選択的に磁気回収することができた。ペプチド合成中間体のアミド水素結合ブロック法の開発本研究では、申請者らがこれまでに重点的に開発研究した電解合成法を応用し、保護基を新たにペプチドアミド結合保護基として導入することによって、ペプチド合成中間体の異常物性変化を抑制し、多段階合成を実現する新たな方法を開発した。この方法の最大の特徴は、アミド水素結合をブロックする保護基の脱保護反応を、酸・アルカリを使用せず、電極電子移動によって目的を達成した。これによって、低電位で反応が進行し、アミノ酸残基や側鎖保護基に影響を与えずに選択的に切断する一般的な方法となることが期待される。選択的分子内ジスルフィド結合形成の制御法に関する研究インスリンの完全化学合成を達成するためには、分子内ジスルフィド結合を選択的に実現する必要がある。昨年度までの研究により、電気化学的な方法を用いることによって極めて選択的かつ効率的に達成できることを明らかにした。この方法はAcm基で保護した2つのシスティン残基を有するペプチドを臭素イオンを含む支持電解質存在下、カーボンフェルトを陽極に用いて電解酸化することによって、分子内ジスルフィド結合形成を実現したものであり、保護基を適宜変換することにより複数のジスルフィド結合を形成できる可能性を大きく広げる事ができた。本年度は、この手法を発展、応用して、分子内ジスルフィド結合の選択的形成方法の確立を目指した。その結果、チオール保護基のかさ高さおよび酸化電位を制御することにより、電解反応により反応の順序を制御できる新たなシステムを構築することに成功した。アミノ酸残基を分子内に3050以上有し、さらには数多くの分子内ジスルフィド結合を持つペプチド化合物の完全化学合成は、合成方法に関する数々の原理的な問題から、達成することが困難なものが多い。特にこのようなアミノ酸残基数が多い架橋ペプチドでは、その一部のフラグメントを合成する過程でも、高い粘度や、溶解性が困難になる等の問題に遭遇し、その後の合成反応の継続が困難になる。本研究では、これまで申請者らが独自に開発した逆ミセル液相反応を応用し、120段階以上の反応を溶液反応として迅速かつ効率的に実施する新しい化学合成法を開発、導入することにより、合成困難なペプチドホルモンであるインスリンの完全化学合成を達成するための合成経路を確立することを目的とした。

本研究では逆ミセル反応場を用いた新たな方法の導入により、選択的ジスルフィド結合形成の精密制御と、フラグメント合成技術を組み合わせることによって、目的のペプチド分子の合成を試みた。分子間架橋反応を行った複数のペプチドフラグメントについて、それぞれを任意の位置関係で結合させるための合成方法を確立するため、各フラグメントには一つの疎水性タグを結合させ、逆ミセル反応場により、当量反応によるペプチド鎖伸長反応を実現した。また、ペプチド骨格が形成された後、疎水性タグ、その他の脱保護反応を実施した。これらの新たな方法を組み合わせることによって、インスリンを構成する基本ユニットをそれぞれ効率よく合成することに成功した。26年度が最終年度であるため、記入しない。農学26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画の全ての項目について、計画通りまたは、やや上回る内容で研究が順調に進展している。本研究ではアミノ酸残基を30以上有し、分子内に複数のジスルフィド結合を有する化合物の化学合成を達成することを目的としている。これを達成するための重要な項目として、1)液相反応系において多段階反応を実現する反応システムの構築、2)ジスルフィド結合を選択的に形成するための新たな方法の開発、3)合成途上で遭遇することが予想されるペプチドの物性による合成継続の障壁に対する対策、があげられる。これらの課題について平成25年度内に一通りの検討を行い、いずれも最終年度末までに解決し、目標を達成できることが見込みとなった。実用的な方法として広く応用することを含め、計画に基づき研究を推進する。ペプチド合成の進行を妨げる最も大きな課題として、合成中間体を含む反応溶液の粘度の急激な上昇や生成物の不溶化による反応・分離が困難になる点が掲げられる。特にアミノ酸残基数の大きなペプチドの合成では、必ずこのような問題点に遭遇するため、多くの場合、全合成が達成できない。本研究では、濾過操作を必要としない、生成物の沈殿分別法を新たに開発・導入し、この問題を克服する。本法は、疎水性溶媒中に疎水性タグに結合したペプチド逆ミセルと共に、疎水性磁性ナノ粒子(平均粒径1020 nm)を分散させることを基本原理とする。疎水性磁性ナノ粒子は、酸化鉄およびオレイン酸を用いて合成するが、この方法についてはすでに予備実験を完了し、目的とする粒子を調整できることを確認している。この粒子を用い、ペプチド鎖伸長反応が完結する度に、溶液にメタノール等の極性溶媒を添加し、疎水性タグを有するペプチドは疎水性磁性ナノ粒子に捕捉、凝集させることにより、生成物であるペプチドだけを選択的に磁気回収する方法を実用レベルで適用可能にすることを計画している。この方法では、沈殿物をフィルター等を用いて濾過する必要がなく、たとえ粘度が高い沈殿となった場合にも、連続的に精製、溶解、反応の操作を一つの容器内で進めることができるものと期待される。特に、総計120段階以上のペプチド分子の合成を実現するためには、反応・分離毎の分離精製による迅速かつ高い回収率の実現が極めて重要であり、本法が重要な役割を果たすものと考える。
国民国家システムの危機とその影響に関する研究-コソボと南オセチアの事例から

本研究は、セルビアからのコソボ独立問題とグルジアからの南オセチア・アブハジア独立問題という2つの紛争事例を調査し、共通性と差異を浮き彫りにしつつ、両者の間の相互作用にも注目し、今後の国際政治に与える影響を分析することを目的としていた。具体的には、(1)紛争の背景、(2)紛争の推移、(3)国際関係と国際関係主体に対する影響の3点について、現地調査も踏まえて比較分析を進めた。各計画年度に多くの現地調査を実施し、現地から研究者を招聘し、研究会を開催し、研究成果を公表してきた。比較研究の総合化へは道半ばであるが、政治学や国際関係論、歴史学など様々なディシプリンの成果を援用しつつ、紛争を複数の視点から考察することの意義と有用性については、三年間の間で本研究参加者の間で共通の認識を得ることができたと考える。本研究の成果は今後のより地域横断的かつ総合的な研究に活かされていくことが期待される。本研究の目的は、セルビアからのコソボ独立問題とグルジアからの南オセチア・アブハジア独立問題という二つの紛争事例を詳細に調査し、共通性と差異を浮き彫りにしながら、両者の間の相互作用にも注目して、今後の国際政治に与える影響を精査・分析することである。より具体的には、(1)紛争の背景、(2)紛争の推移、(3)国際関係と国際関係主体に対する影響、の3点について、現地調査も踏まえて比較分析を進めていくことを目的としている。平成21年度は、紛争の歴史的経緯と現状の把握を目的とし、二つの事例についての資料収集を行うと同時に、多くの研究協力者から専門的な知識を得ることを試みた。伊東は全体の統括にあたるとともに、ケント大学のBieber博士、元UNMIK職員の茂野玲博士などを招聘して国際ワークショップを合計3回実施し、コソボとグルジアに関する第一人者からの情報提供を得ることができた。研究分担者の久保は平成21年度にセルビアとコソボにおいて現地調査を実施し、多くの資料を収集すると同時に、政治家や官僚、研究者等多くの要人に聞き取り調査を行った。同じく研究分担者の前田は、グルジアに関する書籍等の収集に努めたほか、グルジアからサニキゼ教授を招聘し、現地情勢に関する専門的知識の提供を受け、研究会を開催してその知見を日本の多くの研究者と共有した。これらの活動を通じて、セルビアとグルジアの比較分析のために必要な基礎的資料を整備することができた。これらの基礎的資料は、平成22年度以降に本研究計画において進められる体系的・総合的な比較分析にとって不可欠の資料となるであろう。平成22年度は、21年度に引き続き、紛争の歴史的経緯と現状の把握を目的とし、2つの事例についての資料収集を行うと同時に、多くの研究協力者から専門的な知識を得ることを試みた。伊東は全体の統括にあたるとともに、2回の国際ワークショップを開催し、日本紛争予防センター(JCCP)事務局長の瀬谷ルミ子氏を招聘して研究会を行った。研究分担者の久保は平成22年度にセルビアにおいて現地調査を実施し、多くの資料を収集すると同時に、政治家や官僚、研究者等多くの要人への聞き取り調査を行った。同じく研究分担者の前田は、グルジアに関する書籍等の収集に努めたほか、スイス在住の著名ジャーナリスト、チェテリアン氏、プリンストン大学のレイノルズ博士、グルジア東洋学研究所のナチュケビア博士、グルジア地理学研究所のロミナゼ博士らを招聘し、現地情勢に関する専門的知識の提供を受け、研究会を開催してその知見を日本の多くの研究者と共有した。これらの活動を通じて、セルビアとグルジアの比較分析のために必要な資料の整備をさらに進めることができた。これらの基礎的資料は、平成23年度に進められる体系的・総合的な比較分析にとって不可欠の資料となるであろう。本研究の目的は、セルビアからのコソボ独立問題とグルジアからの南オセチア・アブハジア独立問題という2つの紛争事例を詳細に調査し、共通性と差異を浮き彫りにしつつ、両者の間の相互作用にも注目し、今後の国際政治に与える影響を分析することである。

具体的には、(1)紛争の背景、(2)紛争の推移、(3)国際関係と国際関係主体に対する影響の3点について、現地調査も踏まえて比較分析を進めていくことを目的とする。平成23年度は、22年度に引き続き、紛争の歴史的経緯と現状の把握を目的とし、2つの事例についての資料収集を行うと同時に、多くの研究協力者から専門的な知識を得ることを試みた。伊東はセルビア、ボスニア、ポーランド、ロシアを訪問し、現地の専門家や政治家、外交関係者らに対する聞き取り調査を行い、セルビアとグルジアをとりまく国際関係に関して多くの知見を得た。前田は、グルジア現地において現地調査を実施し、有識者等への聞き取りの他、グルジア・南オセチア紛争に関連する書籍の収集に努めた。また、大阪大学の招聘で来日したコーカサス民族研究の泰斗スーニーシカゴ大学名誉教授などから現地情勢に関する専門的知識の提供を受けた。こうした成果の一部は論文として刊行され、主にグルジア国内政治の視点から2008年の紛争勃発に至る過程を明らかにした。久保は、セルビアで現地調査を実施し、現地の専門家、市民団体のメンバーなどへの聞き取り調査とコソボ問題に関する書籍等の資料収集に努めた。比較研究の総合化へは道半ばであるが、政治学や国際関係論、歴史学など様々なディシプリンの成果を援用しつつ、紛争を複数の視点から考察することの意義と有用性については、三年間の間で本研究参加者の間で共通の認識を得ることができたと考える。本研究の成果は今後のより地域横断的かつ総合的な研究に活かされていくことが期待される。
高等植物を用いた老化始源細胞から伝播する老化進行プログラムの顕微分子細胞学的解析

これまでに私は、イネの子葉鞘を用いてその老朽化及び通気組織形成時における細胞死の課程を組織・細胞・オルガネラレベルで明らかにしてきた。これら二つの細胞の死の進行過程は組織レベルでは大きく異なるものの、細胞レベルでは、極初期におけるプラスチドDNAの分解、プラスチド内部の分解から、終期における液胞の崩壊に至るまで、各現象が保存されていることが明らかになっている(Inada, N. et al., 2002International Review of Cytology)。2001年より、通気組織における細胞死、及び老化の進行について分子遺伝学的解析を行うため、カリフォルニア大学バークレー校フリーリング研究室において、1年半にわたってイネと同じ単子葉であり、ゲノム構造もよく保存されているトウモロコシの子葉鞘変異体の解析を行った。フリーリング研究室では独自の変異体探索により、子葉鞘が本葉と同様の形を取る変異体(leafy coleoptile, lco)が発見されており、私はすでに、この変異体における子葉鞘は、通常の子葉鞘に比べ老化が著しく遅れることを明らかにしている。これは、lco子葉鞘における維管束系の発達・葉緑体の発達に伴う栄養供給などの、細胞環境の変化によるものと思われる。本年度はこの変異体の遺伝子単離を目的とし、2つの方向からの解析を進めた。(1)lco変異をヘテロで持つ植物(ホモ致死)と、トランスポゾン活性の高い植物との掛け合わせ実験を行い、得られたF1のスクリーニングを行った。約15,000の植物のスクリーニングを行い、3つの候補変異体が得られた。各ラインをそれぞれlcoヘテロ接合体、及びコントロールのインブレッドラインとかけあわせ、確認を行ったが、いずれもlco変異体ではなく、また表現形が次世代に保持されないことがわかった。(2)アメリカにあるトウモロコシストックセンターには、トランスポゾン活性の高い植物との掛け合わせで得られた変異体が保存・維持されている。そのストックの探索により、lcoと同様の表現形を示す子葉鞘変異体を5つ発見した。多くは次世代で表現形が消えたものの、一つはメンデル則に従わないながらも子葉鞘変異体の表現形が4世代目にも保持された。
自律移動ロボットの感情発現メカニズムおよび生成モデルの構築に関する研究

本研究では自律移動ロボットの知能化の中でも論理的知識などに比べて表現が比較的困難である感情を効率的にロボットに表現させることを目的としている。今年度はまずはじめにブライテンベルグの模型をベースに同レベルの感情をファジィルールのみを用いてロボットに持たせることが可能なことを検証した。またこの実験をベースにいくつかの感情要素を抽出し、基本感情(喜・怒・哀)の感情発現メカニズムを提案した。すなわち、喜び(joy)・怒り(Anger)・悲しみ(Sadness)の3つの基本心理状態を直交ベクトルと仮定し、これらの合成により他のさまざまな感情を表現できる自律移動ロボットの感情シミュレータをファジィルールのみを用いて開発し、マイクロマウスを用いた感情移入実験でその効果を確認した。さらにこの結果をふまえ、周囲の環境や状況により、自動的に感情が変化する感情発生機構を持った自律移動ロボットの感情自動生成モデルをサブサンプションアーキテクチャ(SSA)の概念を用いて表現した。これについてもマイクロマウスを用いてモデルの有効性検証実験を行った。以上の検証実験において、感情自動生成モデルを用いることにより、周囲の環境や状況により3つの基本ベクトル(joy,Anger,Sadness)が自動的に変化し、それに対応して自律移動ロボットの感情行動も適切に実現されていることが確認された。今年度はシステム構築を中心に研究を進め、実験およびシミュレーションを実施し、その成果について国内学会(1件)、国際学会(1件)にて発表を行った。尚、来年度にも国際学会(1件)の発表が予定されている。
植物における導管を介した無機窒素栄養物質の輸送とその制御

「目的」本研究では、硝酸イオンが導管内を輸送される過程でどのようにシグナルとしての機能を発現し、葉での硝酸同化系遺伝子の発現を制御しているのかを明らかにすることを目的とした。「経過か」水耕栽培のオオムギ幼植物に硝酸塩を種々の濃度で与えたときの葉組織の硝酸イオン蓄積量、導管液および葉部アポプラスト液の硝酸イオン濃度および硝酸同化系遺伝子の転写産物量を経時的に測定した。また、切断葉に対しても同様な実験を行った。オオムギの根を中心柱と皮層に分け、それぞれから単離した全RNAより作成したcDNAを用いてcDNAサブトラクション法を行い中心柱特異的に発現していると期待される遺伝子をクローニングした。「結果と考察」培地に硝酸塩を低濃度(μM)あるいは高濃度(mMレベル)で与えても、導管液中の硝酸イオン濃度は速やかに20-30mMに達した。その植物を無硝酸培地に移すと導管液の硝酸イオン濃度は急速に低下した。葉部アポプラスト液の硝酸イオン濃度は、導管液の硝酸イオン濃度の変化に連動して変動したが、その濃度範囲は1-10mMの間であった。一方、葉での硝酸還元酵素(NR)および亜硝酸還元酵素(NiR)遺伝子の発現量は高いレベルで維持されていた。これは導管液の硝酸イオン濃度レベルが高濃度で一定に保たれているという結果と合致する。一方、切断葉に低濃度(μMレベル)の硝酸イオンを与えた場合はNR、NiR遺伝子の転写産物量は検出できなかった。このことは、葉での硝酸同化系遺伝子の高い発現量を維持するため、導管における硝酸イオン濃度が数mM以上に保たれる必要があることを示す。中心柱全RNA由来のcDNAをtester、皮層全RNA由来のcDNAをdriverとしてサブトラクション法を行い、現在までに75クローンを得た。そのうちの5個については、ノーザン解析で中心柱特異的発現が確認できた。
iPS細胞とリン酸化プルランを用いた新規骨補填材の開発

本研究成果として、1)マウスiPS細胞から神経堤様細胞(NCLC)の誘導に成功した。2)マウス頭蓋骨欠損モデルの動物用CT、組織切片による評価においてTCP+NCLC群はTCP+MC3T3群に比較して治癒傾向が強いことが示された。3)ラット抜歯窩の動物用CTによる評価においてTCPおよびリン酸化プルランを埋入した群のCT値が他の群と比較して高い傾向があることが示された。以上より、iPS細胞から誘導したNCLCと徐放化キャリアとしてのリン酸化プルランを用いることにより細胞の足場と増殖分化因子の徐放化を可能とした新規骨組織再生誘導が実現できる可能性が示唆された。唇顎口蓋裂患者の顎裂部に対する骨修復は歯科、整形外科分野における重要な課題である。Tissue Engineeringによる組織の再生は、細胞の足場(scaffold)、細胞、増殖分化因子の3つの重要な役割に加え、各種増殖分化因子の放出期間をコントロールする徐放化キャリア(担体)の併用が必須である。リン酸化プルランは、骨や歯に対して強固に接着し、生体内で吸収されることから、接着性を有する人工骨の材料としての実用化が期待されている。また、iPS細胞から骨芽細胞への分化や、組織幹細胞としての性質を備えている神経堤様細胞(NCLC)への誘導が報告されている。本研究は、iPS細胞から誘導した骨芽細胞や神経堤様細胞(NCLC)と徐放化キャリアであるリン酸化プルランが骨再生へ及ぼす影響を動物実験にて検証する。平成27年度は、骨組織再生誘導補填材の条件を決定するために、マウスiPS細胞の培養と神経堤様細胞(NCLC)の誘導を行った。Otsuらの報告(Otsu K et al. Stem Cells Dev. 2012)に準じて、iPS細胞から神経堤様細胞の誘導に成功した。また、マウス頭蓋骨欠損モデルを作製し、様々な組み合わせのTCP scaffold、NCLC、増殖分化因子、リン酸化プルランを埋入した。埋入後4、12週に各群から2匹ずつ屠殺を行い、動物用CT撮影後、抜歯窩および歯周組織の凍結ブロックを作製し、非脱灰凍結切片の骨標本を、粘着フィルムを用いた川本法によって作製した。現在、新生骨形成過程を動物用CT、組織定量学的に解析を行っているところである。平成27年度は、マウス頭蓋骨欠損モデルに様々な組み合わせのTCP scaffold、NCLC、増殖分化因子、リン酸化プルランを埋入し、新生骨形成過程を動物用CT、組織定量学的、遺伝組織学的に評価するところまで終了する予定であったが、マウスiPS細胞の培養から神経堤様細胞(NCLC)への誘導、マウス頭蓋骨欠損モデルの作製に時間を要し、やや遅れている。現在動物(マウス)実験は終了し、解析を行っている所であり、その後の進行は順調である。平成28年度は、ラット顎裂モデルの作製を行った。4週齢Wistarラット上顎口蓋粘膜切開後、規格化された顎裂モデルをフィッシャーバーで形成し、粘膜縫合し、1w、2w、3w、4w、8wと経時的にCT撮影を行なった。また、それぞれの週における非脱灰組織切片を作成し、ビラヌエバ骨染色を行い、新生骨形成状態を評価し、顎裂形成後何週で顎裂モデルとして機能するかの確認した。さらに、平成29年度に予定しているビーグル犬の歯の移動実験の予備実験を開始した。ビーグル犬の飼育、全身麻酔、歯の移動装置の作製および装着、歯列印象の採取、歯列模型の作製などの技術を習得した。平成28年度は、ビーグル犬の口蓋裂モデルを用いた効果の検証まで行う予定であったが、ラットの顎裂モデルの作製に時間を要し、やや遅れている。具体的には、ラット口蓋粘膜の縫合技術、規格化されたサイズで顎裂部を形成する技術の取得に時間を要した点があげられる。現在はそれらの技術を確実に習得し、安定した顎裂モデルの作製が行われており、その後の進行は順調である。

本研究は、iPS細胞から誘導した骨芽細胞や神経堤様細胞と徐放化キャリアであるリン酸化プルランが骨再生へ及ぼす影響を動物実験にて検証する。平成29年度は、ビーグル犬の顎裂モデルの作製および歯の移動実験を行った。ビーグル犬の飼育、全身麻酔、歯の移動装置の作製および装着、歯列印象の採取、歯列模型の作製などの技術を習得した。現在12か月齢雄性ビーグルを4頭用い、顎裂部に再生誘導補填材の埋入を行い、再生骨内へ歯の移動を行っているところである。研究期間全体の成果として、iPS細胞から神経堤様細胞(NCLC)の誘導に成功したこと、マウス頭蓋骨欠損モデルにおいて、材料埋入21日後、リン酸三カルシウムおよびリン酸化プルランを埋入した群のCT値が他の群(対照群、リン酸化プルランのみ埋入した群)と比較して高い傾向があるという結果が得られたことなどがあげられる。本研究成果から、リン酸化プルランを徐放化キャリアとすることで、細胞の足場と増殖分化因子の徐放化を可能とした新規骨組織再生誘導が実現できる可能性が示唆された。本研究成果として、1)マウスiPS細胞から神経堤様細胞(NCLC)の誘導に成功した。2)マウス頭蓋骨欠損モデルの動物用CT、組織切片による評価においてTCP+NCLC群はTCP+MC3T3群に比較して治癒傾向が強いことが示された。3)ラット抜歯窩の動物用CTによる評価においてTCPおよびリン酸化プルランを埋入した群のCT値が他の群と比較して高い傾向があることが示された。以上より、iPS細胞から誘導したNCLCと徐放化キャリアとしてのリン酸化プルランを用いることにより細胞の足場と増殖分化因子の徐放化を可能とした新規骨組織再生誘導が実現できる可能性が示唆された。マウス頭蓋骨欠損モデルにおける解析を終了後、平成28年度は実験計画通り、ラット顎裂モデルを用いた効果の検証を行う予定である。すでにラット顎裂モデルの作製には成功していることから、予定通りの進行が予想される。平成29年度は、大型動物(ビーグル犬を予定)での顎裂モデルの作製と歯の移動実験を予定している。平成28年度にビーグル犬の歯の移動の予備実験を行なっていることから、予定通りの進行が予想される。歯科矯正学