hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
産業事故防止のための危険体験教育の高度化

危険事象を擬似的に体験することで事故・災害の防止につなげようとする「危険体験型教育」は、危険感受性の向上を図る教育手法として普及してきた。本研究では、ヒアリング調査を通じ危険体験型教育の現状を再確認するとともに、質問紙調査を通じて教育効果の把握を試みた。また、実験を通じて擬似体験の評価要素について検討した。危険体験型教育に対するニーズはある程度あるものの、本格的な導入の実現を妨げる要因があることが示唆された。しかし、客観的評価に基づく教育の手順や規準、手続き等は未だに確立されておらず、その教育効果も十分に把握されていない。本研究では、研究計画の1年目において、危険体験型教育の開発の経緯、及びこれまでの変遷、現状の実態について改めて把握するため、教育実施機関等を対象としたヒアリング調査を実施した。調査対象は、体験型教育を実施する4施設であった。組織内若年者の危険感受性低下が懸念されたことを契機として教育手法の開発に着手し、やがて外部へも対象を広げた施設がある一方、既存の教育手法を参考にしつつ自らの組織の実態に合致するようアレンジを行ったケースもある。このように、開発および展開の経緯については、従来の知見を改めて確認することが出来た。教育効果については、定量的評価が困難という課題を抱える一方で、受講後のアンケート等から意識変化をとらえることで一定の評価を行っていた。繰り返し受講する場合には、説明方法の工夫、導入部分の変更、事例の変更等で、マンネリ化の防止に努めている実態が伺える。また、本研究においては、自動車の運転を対象とした危険体験型教育の受講経験がある大学生を対象に、教育時の知識の定着度、およびかつて教育を受けた経験が現在の安全行動に及ぼす影響等について、質問紙による調査を実施した。受講時に普通自動車運転免許を取得していた群(A群)、受講後に免許を取得した群(B群)、受講時・調査実施時ともに免許を取得していない群(C群)の間で比較を行った。知識の定着度については大きな差が認められなかった一方で、受講後には一定の意識変化が生じていたことが伺える結果となった。しかし、客観的評価に基づく教育の手順や規準、手続き等は未だ確立されておらず、その教育効果も十分に把握されていない。本研究では、昨年度に引き続き「危険体験型教育」の実態について調査を行った。主たる検討対象の候補であった一般社団法人全国登録教習機関協会「危険再認識教育」の「講師養成研修」は、2015年3月に開講予定であったものの、受講申込が一件もなく中止を余儀なくされている。その背景として、危険体験型教育に対する現状のニーズが必ずしも高くないこと、教育内容の一部が技術や製品の進展に対応できていないこと、教育を担う人材の確保が困難であること等が考察される。また、危険体験型教育の実施において重要な要素となる「危険事象の提示手法」に関しては、日常的危険場面として「歩きスマホ」場面および自動車運転場面を取り上げ、評価実験を行った。実験はいずれも疑似的な仮想空間を提示し、その空間内で歩行あるいは運転行動を行うものである。その結果、映像としての完成度が高くとも、操作時の反応(フィードバック)が適正に行われず違和感を感じさせるものであると、提示される危険場面に対する評価も現実感に乏しいものとなることが示唆された。これは、疑似的な体験を通じた教育への発展という観点からは、重要な課題である。2014年度に調査対象とした一般社団法人全国登録教習機関協会「危険再認識教育」に関しては、2015年度は中止にこそならなかった(当初の予定通り、2回開催)ものの、ここ数年は受講希望者の減少傾向が続いている。このことから、危険体験型教育に対する現場ニーズの落込みが推察されるところであった。しかし一方で、2015年度に実施した電力会社およびその協力企業を対象とした質問紙調査の結果からは、身近なリスクを直感的に理解することができる手法として、危険体験型教育に対する要望が未だ強いことが示された。質問紙調査における他の項目との関連からは、危険体験型教育に「積極的に取組みたい」と考える一方で、「予算が足りない」「教育に人員を割けない」「教育手法開発の余裕がない」といった理由から、実現に至っていないケースが多数存在している。すなわち、事故・災害の防止のための教育手法としての危険体験型教育に対するニーズは依然として存在するものの、関連する様々な要因、例えば景気変動に伴う予算不足や労働力不足に起因する繁忙感などから、こうした手法を取り入れた安全教育の展開が抑制されている構図を伺うことができる。単独の会社組織が危険体験型教育を展開するための設備構築や手法開発等を行うことは、大きな負担となることは間違いない。そのため、設備を含め、公的あるは共同での教育機会の提供が望まれるところである。

危険事象を擬似的に体験することで事故・災害の防止につなげようとする「危険体験型教育」は、危険感受性の向上を図る教育手法として普及してきた。本研究では、ヒアリング調査を通じ危険体験型教育の現状を再確認するとともに、質問紙調査を通じて教育効果の把握を試みた。また、実験を通じて擬似体験の評価要素について検討した。危険体験型教育に対するニーズはある程度あるものの、本格的な導入の実現を妨げる要因があることが示唆された。これまでの調査結果・実験結果等は、概ね当初予測された範囲内に収まっており、今のところ、今後の計画の変更等が必要となる事態にはなっていない。一方で、危険事象の擬似的な体験を通じた「危険体験教育」は、急速に普及が進んだ時期を過ぎ、各実施施設等において内容の充実を図る時期に差し掛かっていることも伺える。これは、「体験の目的化」(体験することのみが目的となる)を脱し、実践的教育内容に発展するものとの期待もある一方で、実施施設内での発展に留まる場合には、外部から情報を捉えにくくなる、という側面も持つ。そのため、今後も実態把握のための調査を継続するものの、より緻密かつ密度の高い情報収集が必要となる。安全教育研究計画の最終段階を迎えることから、これまでの結果を踏まえ、擬似的な体験を踏まえた教育上の重要点の整理および体系化、効果的な体験手法、教育・指導上の重点事項等について、改めて検討する。検討に当たっては、経済的な変動や大震災の経験を経て大きく変化してきた危険体験型教育へのニーズを踏まえ、体験型教育に取り組む諸施設の最新情報の把握に努めることとする。当初計画通り、複数の教育実施機関等を対象としたヒアリング調査を実施し、それぞれの教育機関が危険体験型教育に取り組む契機やその後の展開、および現状の課題等について情報収集を行っている。また、教育効果の検討については、過去に、自動車の運転場面を対象とした体験型教育を受講した経験がある大学生を対象に質問紙による調査を行い、教育時に獲得したはずの知識が現時点でどの程度定着しているか、および教育時の経験等が現在の安全行動にどのような影響を及ぼしているか等について調査を行っている。これらの結果は、研究計画において想定した内容を概ね満たすものであり、今後の研究を推進する上で有用である。なお、教育手法・内容等については、今後も様々な変遷が予想されるため、研究計画の最終年度に至るまで、予備的な調査を継続する。研究計画初年度において実施した調査では、対象が比較的近隣に存在したことから、ヒアリング調査等に要する交通費を当初予定通りに執行するに至らなかった。また、研究において扱うデータ量がそれほど大きくなかったため、調査実施補助者やデータ分析要員が不要であり、雇用に要する人件費等を当初予定通りに執行するに至らなかった。一方で、計画二年目は概ね当初計画通りの執行となっている。これまでの調査結果を踏まえ、教育実施者(インストラクター等)のスキル向上、擬似的な体験を踏まえた教育的ポイントの整理および体系化、効果的提示方法、指導・教育上の重点事項等について検討する。検討にあたっては、一般社団法人全国登録教習機関協会が展開する「危険再認識教育」の実施
末梢神経損傷による視床シナプス外部GABA電流の変化と視床神経回路改編への影響

末梢感覚神経の損傷は、中枢神経回路を機能的・構造的に再改編させるが、その分子基盤は未だ不明である。本研究では、眼窩下神経切断マウスを用い、求心性内側毛帯線維の再改編を受ける視床細胞において選択的にシナプス外GABA-A受容体電流が増加し、この増加が、求心性内側毛帯線維の再改編とマウス下顎領域における異所性痛覚過敏反応誘導の一因になることを明らかにした。以上の結果は、眼窩下神経切断によるシナプス外GABA-A受容体電流の増加が、眼窩下神経の支配領域外から新たに内側毛帯線維を動員して神経回路の再改編を誘導することで、末梢からの体性感覚情報入力を補正していると推察している。平成27年度は、1正常マウスVPM核へのシナプス外GABA-A受容体作動薬慢性処置による内側毛帯線維配線への影響および2眼窩下神経切断による内側毛帯線維再改変へのlentivirus vectorによるVPM細胞tonic GABA電流欠損の影響について検討した。項目1の実験においては、osmotic mini-pumpを用いてシナプス外GABA-A受容体作動薬であるTHIPあるいは生理食塩水を正常マウスのVPM核へ7日間慢性処置し、スライスパッチクランプ法でVPM細胞への内側毛帯線維入力を電気生理学的に検討した。生理食塩水処置マウスでは、約75%のVPM細胞が1本の内側毛帯線維入力を受けるのに対し、THIP慢性処置マウスでは、その細胞の割合が約50%まで低下し、残りの細胞は2本ないし3本の内側毛帯線維入力を受けることを明らかにした。また、申請者は項目2の実験において、GABA-A受容体alpha4サブユニットfloxマウスとlentivirus vectorを用い、視床VPM細胞におけるtonic GABA電流欠損が、眼窩下神経切断による内側毛帯線維再改編を抑制するか否かについて検討した。実験では、生後14日齢alpha4サブユニットfloxマウスのVPM核へiCre発現lentivirus vectorを処置した1週間後に眼窩下神経を切断し、神経切断1週間後のVPM細胞における内側毛帯線維入力を項目1と同様に記録した。その結果、眼窩神経切断による内側毛帯線維再改編は、対照群と比較して、tonic GABA電流の欠損により有意に抑制される可能性を明らかにした。現在、項目2の検討について実験例の追加を行っている。以上の結果より、眼窩神経切断による視床VPM細胞でのtonic GABA電流増加は、内側毛帯線維の再改編を誘導する一因となっている可能性が示唆された。Osmotic mini-pumpを用いた検討はほぼ終了し、lentivirus vectorを用いた検討は順調に進み始めている。lentivirus vectorを用いる検討では、十分な匹数のfloxマウスを必要とするため、交配から繁殖までの過程にある程度の時間を要するが、交配実施数や交配ペア数を増やすなどして一定匹数の動物を確保しながら平成28年度も継続して実験を行う。概ね計画通りに研究が進んでいるため、28年度も引き続き現状の実施速度で実施計画を遂行させる。上述するように、本研究では遺伝子改変マウスの交配・繁殖が律速段階にあるので、交配の実施数や交配ペア数を適切に加減しながら、動物倫理に適した十分な匹数のマウスを確保するように務める。神経生理、神経薬理
衛星観測と数値モデルを組み合わせたアジア域での水循環予測

平成18年度においては,CEOPで収集されている気象予測モデル出力を用いて,アジア域の観測点における2001年から2004年での降水の日周変化の比較を行った.比較には米国環境予測センター,英国気象庁,気象庁(日本),ヨーロッパ中期予報センターなどの気象予報センターのモデルによるデータを用いた.本研究では現在実施されている統合地球水循環強化観測プロジェクト(Coordinated Enhanced Observing Period : CEOP)によって収集されている衛星観測データ,現地観測データおよび数値予報データを統合的に活用し,夏季インドモンスーンの季節進行の詳述を目指すとともに,モデルによる降水量の予報性能評価に取り組む.平成17年度においては,CEOPの活動の一環として蓄積された気象庁長期債解析データ(Japan Re-Analysis 25 years : JRA25)から算定した可降水量と日本域におけるGPS観測による可降水量を用い,2001年の夏季アジアモンスーン機関における比較を行い,モデルによる水蒸気量の再現性の評価を行った.詳細な解析の結果,比較対象とした各観測地点において,JRA25による可降水量の方が大きいという結果を得た.しかし,可降水量の空間分布に関しては,観測結果と同様の傾向を示し,JRA25による同化手法の向上を示す結果であった.また,夏季インドモンスーンの季節進行に関しては,10月から12月のポスト・モンスーンシーズン(あるいは冬季モンスーン)に吹く北東モンスーン風に着目した解析を行った.解析対象には,インド北東部での10月から12月の降水量が多かった2003年と,平年並みの降水量であった2004年を選んだ.JRA25を用いた解析の結果,2003年にはベンガル湾上に強い低気圧が発達しており,これによって多量の降水がもたらされたことが明らかになった.今後,北東モンスーンシーズンの大気場や水蒸気場の特徴などをまとめるとともに,年々変動等に着目した詳細な解析を行っていく予定である.平成18年度においては,CEOPで収集されている気象予測モデル出力を用いて,アジア域の観測点における2001年から2004年での降水の日周変化の比較を行った.比較には米国環境予測センター,英国気象庁,気象庁(日本),ヨーロッパ中期予報センターなどの気象予報センターのモデルによるデータを用いた.
マイクロＲＮＡの発現解析を応用した口腔癌転移予測マーカーの確立

本研究では口腔癌の転移予測マーカーとして、マイクロRNAを正常口腔粘膜組織と口腔癌組織で網羅的に比較解析した。その結果、12のマイクロRNAで発現の亢進をみとめ、11のマイクロRNAで発現の低下を認めた。発現の亢進および低下が認められたマイクロRNAに関して口腔癌の原発巣と転移巣で比較検討したところ数種類のマイクロRNAで発現の亢進や低下の可能性を認めものの有意な変化は認められなかった。これらのマイクロRNAを口腔癌細胞に導入したが、細胞増殖への影響は認められたもの、転移能への影響は認められなかった。平成24年度で口腔癌組織と正常口腔粘膜組織の網羅的解析により、癌組織において発現の増加が認められた12のmiRNA(MiR-31*, miR-31, miR-135b, miR-193a-5p, miR-103, miR-224, miR-93, miR-200c, miR-183, miR203, miR-21, miR-223)を口腔癌原発巣と転移巣で比較したところ数種類で転移巣における発現量の増加が認められた。唾液と血清からの候補miRNAの同定においては癌患者のからの試料を集めつつ、転移予測マーカーとなりえる候補miRNAの道程のための解析を行っている。平成24年度の研究実績を以下に示す。2)口腔癌組織において発現亢進の認められたmiR-221について、口腔癌細胞株(SAS, SCC-111, CA 9-22, HSC-2,3,4)に対する細胞増殖への影響を検討したところ、miR-221 inhibitorをトランスフェクションすることにより、SAS, SCC-111, CA 9-22, HSC-2, SC-3において細胞増殖の抑制を確認することが出来た。またHacaT細胞株(ヒト皮膚角化細胞株)においては細胞増殖抑制を認めないことが確認できた。平成26年度の実績平成26年度は25年度において予定していた唾液、血清からの候補miRNAの同定、すなはち、候補miRNAが口腔癌の転移予測マーカーとなり得るかを検証するために、口腔癌患者より唾液・血清からRNAを抽出し、目的となるmiRNAをreal time PCR法を用いて定量する予定であったが、十分な量のmiRNAの抽出が困難であり、そのため原発巣、転移巣での発言量の比較ができなかった。また、12個の候補miRNAを遺伝子導入することによって、発現変化をうける標的候補遺伝子を同定する予定であったが候補となる12個のmiRNAを口腔扁平上皮癌細胞株にトランスフェクションし,トランスフェクションした口腔扁平上皮癌細胞よりRNAを抽出する。ReversetranscriptionしてcDNAを合成し遺伝子発現を解析したが、いずれも発現に有意な差は認められなかった。したがって候補遺伝子の同定もできなかった。口腔外科癌患者における唾液と血清の試料を集めるが遅れておりこの結果転移予測マーカーの候補miRNAの同定には至っていない。平成24年度の研究計画では以下を予定していた。2)標的miRNAの機能解析口腔扁平上皮癌細胞に網羅的miRNA解析より抽出したmiRNAを口腔扁平上皮癌細胞にトランスフェクションを行い、細胞増殖、抗癌剤(5-FU、CDDP、タキソテール)に対する影響をMTTアッセイを用いて検討する。このうち口腔がん組織からのmiRNAの網羅的な解析により正常組織に比べ発現量に変化のあったmiRNAを同定した。細胞株での網羅的解析は現在解析中である。また、発現量に変化のあったmiRNAを扁平上皮癌細胞株にトランスフェクションを行い細胞増殖に対して影響を及ぼすことを確認することができた。抗がん剤に対する影響に関しては現在解析中である。以上のようにおおむね順調に進展していると考える。患者における唾液と血清の試料は26年度において当初の計画のサンプル数の確保は可能と思われるため、唾液と血清からの候補miRNAの同定を行う予定である。また、同定できたmiRNAを口腔扁平上皮癌由来の細胞株にトランスフェクションを行い、さらに遺伝子発現の解析を行い標的遺伝子の検索、同定を行う予定である。現在解析中の口腔扁平上皮癌細胞株における網羅的なmiRNAの解析やmiRNAがトランスフェクションされた扁平上皮癌細胞株への抗がん剤の影響を行っていく予定である。さらに今後唾液や血清からもRNAを抽出し、miRNA定量を行い、口腔がんおよび転移巣の候補miRNAとの相関を解析し腫瘍マーカー、転移予測マーカーとなりえるかを検証する予定である。さらに候補miRNAの標的遺伝子の同定をも行う予定である。唾液と血清におけるmiRNAの転移予測マーカーの同定が進んでおらず、これらの予定支出額が年度内で使用されていないため25年度において使用予定であった転移予測マーカーmiRNAの同定の研究実行に伴い、これらの経費が必要となる予定である。

24年度においては計画していた口腔扁平上皮癌株(HSC2, HSC3, HSC4, SAS, Ca9-22, SCC111)におけるmiRNAの網羅的解析が終了に至っておらず、また、miRNAの抗がん剤の感受性に対する影響も解析できていない。これらに使用する予定の試薬類にかかる経費が年度内で使用されていないが今後上記の解析途中の研究の実行に伴い研究計画に沿った経費が必要となる予定である。
トランスポゾンを用いたGal4エンハンサートラップ法による脊椎動物初期発生研究

我々は、モデル脊椎動物ゼブラフィッシュにおいてTol2トランスポゾンを用いたGal4エンハンサートラップ法・遺伝子トラップ法の開発に成功し、発生過程において時空間特異的にGal4を発現するトランスジェニックフィッシュ約1000系統の作製を行った。これらを基にして、側線、リンパ管、レンズ、網膜、脊索等の器官形成メカニズム、Fanconi貧血症原因遺伝子の機能を明らかにした。さらに、脊髄の感覚神経、介在神経、および特定の嗅神経の機能を阻害し、それらに起因する行動異常の解析を行った。また、カルシウムイメージングによる運動神経活動の可視化に成功した。このように脊椎動物における発生生物学、神経科学研究のための基盤を構築した。モデル脊椎動物ゼブラフィッシュにおいてGal4エンハンサートラップ法を開発し、細胞・組織・器官でGal4を特異的に発現するトランスジェニックフィッシュ系統を作製する。またGal4-UASシステムを開発し、Gal4発現細胞の視覚化、機能改変、機能阻害を行う。本研究は脊椎動物遺伝学に新しい方法論を確立し、遺伝子機能・ゲノム機能解析のための基盤を築くものである。1.Tol2トランスポゾンベクターに、スプライスアクセプター部位、Gal4遺伝子、SV40ポリAシグナルを組み込んだGal4遺伝子トラップコンストラクト、及びhsp70プロモーター、Gal4遺伝子、SV40ポリAシグナルを組み込んだGal4エンハンサートラップコンストラクトを構築した。2.これら遺伝子トラップ・エンハンサートラップコンストラクトをゼブラフィッシュゲノムにランダムに挿入させ、Gal4を組織・細胞・器官特異的に発現するゼブラフィッシュ系統の分離、同定、系統化を行った。3.Gal4の認識配列UASの下流にGFP遺伝子、mRFP遺伝子、破傷風毒素遺伝子を組み込んだトランスジェニックゼブラフィッシュ系統を樹立した。これらエフェクターフィッシュをGal4特異的発現ゼブラフィッシュとかけあわせ、Gal4発現細胞において、UASからの転写が実際に活性化されることを明らかにした。4.121のGal4トランスジェニックフィッシュ系統をUASの下流に破傷風毒素遺伝子をもつエフェクターフィッシュとかけあわせ、刺激に対する応答(touch response)に異常を示すGal4系統を分離した。このスクリーニングにより、脊椎内の感覚神経あるいは介在神経で特異的にGal4を発現する系統を得た。この研究から、これらの神経回路がゼブラフィッシュのtouch response行動に重要であることを明らかにした。(1)Tol2トランスポゾンベクターに、スプライスアクセプター部位、Gal4遺伝子、SV40ポリAシグナルを組み込んだ遺伝子トラップコンストラクトを構築した。また、hsp70プロモーター、Gal4遺伝子、SV40ポリAシグナルを組み込んだエンハンサートラップコンストラクトを構築した。(2)これら遺伝子トラップ・エンハンサートラップコンストラクトをゼブラフィッシュゲノムにランダムに挿入させ、Gal4の認識配列UASの下流にGFPを組み込んだトランスジェニックフィッシュとかけあわせGal4発現をGFP発現で視覚化することにより、Gal4を組織・細胞・器官特異的に発現するゼブラフィッシュの作製を行った。ゼブラフィッシュにおけるGal4を用いたスクリーニングを世界に先駆けて実施した。(3)Gal4を後脳の介在神経、脊椎内の介在神経、感覚神経で発現するトランスジェニックフィッシュの系統化を行った。これらトランスジェニックフィッシュをUASの下流にテタナス毒素遺伝子とCFP遺伝子との融合遺伝子を組み込んだトランスジェニックゼブラフィッシュとかけあわせた。免疫抗体法により融合遺伝子の特異的神経回路における発現を確認した。さらに、Gal4遺伝子とテタナス融合遺伝子の二重トランスジェニックフィッシュがGal4を発現している神経回路に応じた行動異常を示すことを示した。これらのことから、テタナス毒素が特異的な神経回路の機能を阻害すること、及びそれらの神経回路がゼブラフィッシュの異なる行動パターンを制御していることを明らかにした。1.Tol2ベクターに、スプライスアクセプター、Gal4遺伝子、SV40ポリAシグナルを組み込んだ遺伝子トラップコンストラクト、及びhsp70プロモーター、Gal4遺伝子、SV40ポリAシグナルを組み込んだエンハンサートラップコンストラクトをゲノムにランダムに挿入させ、Gal4を細胞・組織・器官特異的に発現するトランスジェニックゼブラフィッシュを200系統以上作製した。これらGal4の発現はGal4認識配列UASの下流にGFPを組み込んだトランスジェニックフィッシュとかけあわせることにより視覚化した。Gal4を血管特異的、中枢神経系特異的に発現するゼブラフィッシュが得られた。これらは脊椎動物血管系の形態形成、神経機能の研究に有用である。2.UASの下流に改変型毒素遺伝子を組み込んだトランスジェニックフィッシュを作製した。この系統を神経特異的Gal4系統とかけあわせたところ、我々が開発したこれまでの毒素遺伝子発現系統より、はるかに効果的に神経機能を阻害できることがわかった。脊椎動物神経機能解析のブレークスルーとなる。3.UASの下流にカルシウム濃度に応答して蛍光強度が強くなるGCamp

遺伝子を組み込んだトランスジェニックフィッシュを作製した。この系統を神経特異的Gal4系統とかけあわせたところ、神経活動に依存して蛍光の増強が観察された。脊椎動物神経活動を生きている胚において検出できる画期的なシステムである。4.UASの下流に光に応答して開閉するチャンネルロドプシンをコードする遺伝子を組み込んだトランスジェニックフィッシュを作製した。この系統を神経特異的Gal4系統とかけあわせたところ、光照射により行動を誘起できることがわかった。脊椎動物神経活動を生きている胚において制御する画期的なシステムである。1.To12ベクターに、改変型Ga14遺伝子を組み込んだ遺伝子トラップコンストラクト、エンハンサートラップコンストラクトをゼブラフィッシュゲノムにランダムに挿入させた。平成21年度にはGa14を細胞・組織・器官特異的に発現するトランスジェニックゼブラフィッシュを新たに200系統以上作製した。これらGa14の発現はGa14認識配列UASの下流にGFPを組み込んだトランスジェニックフィッシュとかけあわせることにより視覚化した。特にGa14を神経細胞特異的に発現するゼブラフィッシュは100系統以上得られ、当初の目的を達成した。またIRESを組み込んだ遺伝子トラップコンストラクトを構築しパイロットスクリーニングを行い、IRESの有効性を明らかにした。2.UASの下流にボツリヌス毒素遺伝子を組み込んだトランスジェニックフイッシュを作製し、この系統が、我々がこれまでに開発したUASテタヌス毒素遺伝子トランスジェニック系統より、はるかに効果的に神経機能を阻害できることを明らかにした。またこれをCre-loxPシステムと組み合わせ、条件的神経機能阻害システムを構築しつつある。3.UASの下流にカルシウム濃度に応答して蛍光強度が強くなるGCaMP遺伝子を組み込んだトランスジェニックフィッシュを作製した。この系統を運動神経特異的にGa14を発現する系統とかけあわせて得られた二重トランスジェニックフィッシュにおいて、運動神経の規則的な活動を蛍光の増強として可視化することに成功した。これは生きている脊椎動物の神経活動を観察できる画期的なシステムである。4.Ga14を嗅覚神経特異的に発現するトランスジェニックフィッシュを作製した。この嗅覚神経の機能をUASの下流に神経毒素遺伝子を組み込んだトランスジェニッフィッシュとかけあわせ、行動を解析することにより、アミノ酸の認識に関与する嗅覚神経群を明らかにした。
皮膚へのUV-B照射によるグルタチオンS-トランスフェラーゼ分子種の発現誘導機構

本年度は、生体内における4-HNEエナンチオマーの解毒機構の解明の一環として、生体内に種々存在するGSTアイソフォームによる4-HNE-GSH抱合反応の立体選択性を明らかにすることを第一の目的とした。また、この4-HNEの解毒反応の種間差について検討する目的で、モルモット肝における4-HNE-GSH抱合反応の立体選択性についても併せて検討を加えた。その結果、下記の1)-4)を初めて明らかにすることができた。1.ラット肝可溶性画分から単離・精製された7種類の主要GST分子種の4-HNE-GSH抱合解毒反応の立体選択性は、全て4(3)>4(R)であったが、腎可溶性画分から単離・精製されたrGSTP1-1に1には立体選択性が認められなかった。中でもrGSTM2-2分子種が最大の立体選択性((S)/(R)=6.3)を示した。2.モルモット肝可溶性画分における4-HNEエナンチオマーの解毒反応は、速度論的解析(Vimax/Km)から、GSH抱合反応>NAD依存的酸化反応の順に低下し、その立体選択性は、前者で4(S)>4(R)、後者で4(R)>4(S)であった。また、4-HNEエナンチオマーは、モルモット肝ではラットと異なりNADH依存的な還元反応を受けなかった。3.モルモット肝ミクロソームならびにミトコンドリア画分における4-HNEエナンチオマーの解毒反応は、NAD依存的な酸化反応のみで、その立体選択性は4(R)>4(S)であった。また、両画分における解毒反応の寄与率は、上記GSH抱合解毒反応の約1/20であった。4.モルモット肝の4-HNE-GSH抱合は、4種類の主要GST分子種(gpGSTA1-1、M1-1、M1-2、およびM1-3)により行われ、その立体選択性はラット分子種と同様、全て4(S)>4(R)であった。また、これら分子種の解毒抱合反応の寄与率は、Vmax/kmならびにそれら分子種の肝中存在量よりgpGSTM1-1が最大で、ついでA1-1>M1-2>M1-3の順であることが併せて明らかとなった。生体膜リン脂質の過酸化反応に伴い、n-6系多価不飽和脂肪酸ヒドロペルオキシドの分解産物として生じ1る4-hydroxy-2(E)-nonenal(4-HNE)は、強力な細胞毒性物貿である。また4-HNEと蛋白質との付加体が、動脈硬化病巣、アルツハイマー患者の脳組織あるいは皮膚癌誘導時のUV-B照射部位等より検出されることから、4-HNEとこれら疾病との因果関係が注目されている。一方、生体内における4-HNEの主要解毒経路はglutathione(GSH)S-transferase(GST)A4-4によるGSH抱合経路であることから、本酵素の役割は極めて重要であると考えられている。

皮膚へのUV-Bの照射は照射部位での4-HNEの生成を誘導するが、その不活性化機構は未だ不明である。本年度は、皮膚での4-HNEの解毒機構を解明する一環としてUV-B照射皮膚におけるGST分子種の変動について検討し、下記の1)-3)を初めて明らかにすることが出来た。1)ヒト、ラットおよびマウス肝における4-HNEの主要解毒代謝酵素であるrGSTA4-4は、ラット皮膚中には存在しない。2)ラット皮膚に対してUV-Bを照射すると、皮膚中に顕著なrGSTA4-4の発現誘導が認められ、その発現部位が表皮および真皮中の皮脂腺に特異的である。3)ラット皮膚の常在性GST分子種のうち、Mu(rGSTM1-1,M1-2,M2-2)ならびにAlphaクラス(rGSTA3-3)のGST分子種は、UV-Bの照射に伴い酵素タンパク貿の顕著な発現誘導が認められたのに対し、rGSTP1-1では顕著な発現低下が認められた。4-Hydroxy-2(E)-nonenal(4-HNE)は、生体膜リン脂質の過酸化反応に伴い、アラキドン酸やリノール酸のn-6系多価不飽和脂肪酸のヒドロペルオキシドからラセミ体として生成することが知られている。また、この4-HNEラセミ体のラット肝臓での主要解毒経路は、glutathione(GSH)S-transferase(GST)A4-4によるGSH抱合であることから、本酵素の役割は極めて重要であると考えられている。平成11年度では、ラット皮膚へのUV-B照射が、皮膚中のrGSTA4-4の顕著な発現誘導を惹起し、更にUV-B照射時に皮膚中で生成される4-HNEラセミ体は、この時誘導されるrGSTA4-4で主に解毒抱合されることを初めて明らにした。本年度は、UV-B照射時に皮膚中で生成される各種の過酸化物ならびに4-HNEラセミ体の構成成分の4(S)-および4(R)-HNEの解毒代謝と4-HNEの両エナンチオマーの毒性発現の立体選択性について、当初の予定通り実施した。その結果、下記の1)-4)を初めて明らかにすることができた。1)ラット皮膚ならびに肝臓の主要GST分子種の脂肪酸ヒドロペルオキシドに対するGSHPx活性は、Thetaクラス(rGSTT2-2)が最大で、ついでAlphaクラス(rGSTA1-1(2),rGSTA1-3,rGSTA3-3,rGSTA4-4)そしてMuクラス(rGSTM1-1,M2-1,M2-2)の順に低下した。2)コレステロール7-ヒドロペルオキシドに対するGSHPx活性は、ラット皮膚中には存在しないrGSTA1-1(2)およびrGSTA1-3のみが示し、その他の6種のGST分子種は同基質に対する還元活性を示さなかった。3)4-HNEエナンチオマーのrGSTA4-4によるGSH抱合反応は、4(S)-HNE>>4(R)-HNEの立体選択性を示した。4)4-HNEエナンチオマーは、解糖系酵素のglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenaseおよびphosphofructokinaseの酵素活性を立体選択的(4(S)-HNE>4(R)-HNE)に不可逆阻害した。本年度は、生体内における4-HNEエナンチオマーの解毒機構の解明の一環として、生体内に種々存在するGSTアイソフォームによる4-HNE-GSH抱合反応の立体選択性を明らかにすることを第一の目的とした。また、この4-HNEの解毒反応の種間差について検討する目的で、モルモット肝における4-HNE-GSH抱合反応の立体選択性についても併せて検討を加えた。1.ラット肝可溶性画分から単離・精製された7種類の主要GST分子種の4-HNE-GSH抱合解毒反応の立体選択性は、全て4(S)>4(R)であったが、腎可溶性画分から単離・精製されたrGSTP1-1には立体選択性が認められなかった。
ネットワーク読み出し機能搭載コンパクトGHzデジタイザモジュールの開発

今後の高度な研究活動を強力に支援するためには、種々の検出器による信号を高精度かつ高速に行う必要がある。その際、信号の情報をより正確に捉えるためにはノイズの抑制等の条件から検出器からの距離が近いほうが良く、検出器に直付け可能であることが最良と考えられる。これを実現するためには大抵の場合において測定器が小型軽量であることが求められる。また、どんなに高性能であっても導入が複雑で必要な工数が多い測定器では、効率的な研究活動を阻害する要因となる。以上より、小型・軽量・高速・導入が容易という4点の条件を満たすデジタイザモジュールを開発することを目的として研究を行った。まず、高速デジタイザである要件を満たすため、帯域幅1GHz・サンプリングレート5GSPSのADコンバーターを導入し、小型・軽量という要件を満たすために可能な限り部品点数を削減した。部品点数の削減とADコンバーターからの5Gbpsのデジタル信号を処理するために、これが可能なXilinx社製Virtex-6を搭載することとした。導入の容易さを実現するために、現在主流となっているEthernetによるTCP/IP通信を可能とし、PoE(Power Over Ethernet)機能の導入によりEthernetの通信ケーブルと電源ケーブルを統合することとした。現在、モジュールの製造は完了しており、各種要件を満たすモジュールが完成した。今後は、加速器のビームロスモニタや原子核実験におけるシンチレータからの信号処理を計画中である。
家庭での新たな採血法を用いたがん郵送法スクリーニング手法の開発

【はじめに】簡便な手法を用いた家庭で可能な新たな"がん"スクリーニング法の開発を目的として本研究を実施してきた。3年間の研究期間で、肺がん、乳がん、大腸がん患者と一般人を対象として血漿中のアミノ酸プロファイル(AAP)を用いた判別分析によって、新たな方法によるスクリーニングの可能性を検索した。【資料と方法】3年間の対象がん患者は、肺がん、大腸がん、乳がん、前立腺がんの患者250人で、コントロールは研究協力者の所属する三井記念病院の人間ドック受診者で、対象のがん患者と性、年齢を一致させた方でがん罹患が確認されなかった一般人として解析を行っている。対象もコントロールも肘静脈より採血(氷温)を行い、2時間以内に血漿を分離・凍結保存を行い、凍結後1ケ月以内に解凍してLC/MSによりアミノ酸を計量した。解析は判別分析を用い、ROC_AUCにて判定を行っている。【結果】AAPによる肺がん、大腸がん、乳がん、前立腺がんのAUCはそれぞれ0.850、0.868、0.892、0.834であった。女性について大腸がんと乳がんの判別を行い、AUC0.850と良好な結果が得られた。前立腺がんについてはPSAによる判別能と比較したところ、AAPが高い判別能を示した。前立腺がんと肥大症との判別ではAUC=0.758と算定された。【考察とまとめ】血漿中のAAPにより肺がん、乳がん、大腸がん、前立腺がんのスクリーニングの可能性が示唆され、さらに、部位別のがん判別の可能性も示唆される結果が得られた。PSA検診では困難であった前立腺がんと前立腺肥大症も、AAPによる判別が有効であることが示された。これら3年間の結果より、1回の肘静脈採血による血漿中のAAPによって複数部位のがんのスクリーニングの可能性が示唆された。今後は家庭での少量採血の方法と血液保存の新たな手法の開発に取り掛かる必要がある。【はじめに】現行のがん検診が十分な効果を示していないことから、血液を用いた新たなスクリーニング法の開発と、拇指球採血による新たな検診システムの構築を目的として本研究を実施している。平成17年度は、新たな腫瘍マーカー探索のために症例-対照研究を行い、検診システム開発のために拇指球からの微量採血法の検討を行った。【資料と方法】症例-対照研究では、胃・大腸・肺・乳・前立腺・甲状腺のがん患者を症例とし、対照は一般ボランティアとした。早朝空腹時に肘静脈より採血を行い、血漿中のアミノ酸分析とプロテオーム分析を行っている。両者の値を多変量解析によって比較し、新たな腫瘍マーカーを抽出する。拇指球採血を検討するために一般ボランティアから肘静脈と拇指球からの採血も行った。【結果と考察】これまでに43症例(肺がん29例、他がん14例)、対照85名の協力が得られている。中間解析として肺がん20例、一般85例のアミノインデックス解析を行った結果、感度88.0%、特異度85.0%、ROC曲線下面積0.88のカットオフ値が得られた。この結果は、肺がんX線検診の感度72.0%より良好であるが、X線検診の特異度95.0%より低い結果であった。

また、拇指球血に関してはボランティア150人の協力が得られ、肘静脈血と拇指球血とのアミノ酸量の比較を行ったが、両者には相関関係が見られなかった。さらに、拇指球の採血箇所によってもアミノ酸値に相違があったことから、現段階では肘静脈血の代わりに拇指球血を用いることは無理があることを明らかにした。【今後】感度88.0%を示したアミノインデックスは、新たな腫瘍マーカーとしての可能性が高いことから、症例数を増やして検討を加えたい。プロテオミックスについては、現在解析中である。拇指球に関しては、安定性の高い採血法の検討を行う予定である。【はじめに】昨年度の本研究により、肺がん患者と非がんコントロールの血漿中アミノ酸プロフナィルを比較検討することにより、新たなスクリーニング法の可能性が示唆されたことから、本年度は乳がん患者と大腸がん患者について資料の収集を行ったが、大腸がんの症例が未だ少ないため、女性乳がんについての検証を行った。【資料と方法】2006年3月から2007年1月までに入院した乳がん患者のなかで、インフォームドコンセントにより了解が得られた30名を症例とし、2004年12月から2006年2月までの期間に三井記念病院のがん検診・人間ドックの受診者360名を対照とした。症例は手術(治療)前に、対照は検診受診時に、肘静脈より早朝空腹時EDTA採血を行った。血漿中のアミノ酸41種類はhigh-performance liquid chromatography (HPLC)法(日立、高速アミノ酸分析計L-8500)で定量、解析はSPSS12.0.1JとHalwin6.12の判別分析を用いた。【結果と考察】乳がん症例の病理病期は、stage O-6名、stageI-10名、stageII-12名、stageIII-1名、,stageIV-1名で、組織型はadenocarcinoma 16例、ductal and lobular neoplasms 14例であった。年齢、喫煙歴、全例定量できたアミノ酸24種をデータとして判別分析を行い、感度80.0%(24/30)、特異度91.1%(328/360)の判別関数が得られた。また、AUCは0.934であった。ステップワイズ法によってアルギニン、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、オルニチン、セリン、トリプトファンが抽出された。昨年実施した肺がんの揚合は、タウリン、α-アミノ酪酸、バリン、オルニチン、トリプトファンが抽出されている。このように、がんの部位別に抽出される有意なアミノ酸が異なっていることは、1回の採血によって、血漿中のアミノ酸プロファイルを調べることによって部位別の「がん」の早期診断の可能性を示唆しているものと思われる。【今後】次年度は本研究の最終年であることから、血漿中アミノ酸プロファイルによる早期診断法を確立したい。【はじめに】簡便な手法を用いた家庭で可能な新たな"がん"スクリーニング法の開発を目的として本研究を実施している。これまでの2年間の研究で、肺がん患者と一般人を対象として血清中の新たな腫瘍マーカーの検索と血漿中のアミノ酸プロファイル(AAP)を用いた判別分析を行い、AAPを用いた方法によるスクリーニングの可能性を示唆する結果を得ている。本年度は肺がん以外のがんについてスクリーニングの可能性を検討した。【資料と方法】対象は大腸がん50例、乳がん30例、前立腺についてはPSA4ng/ml以上のがん30例・肥大症23例とし、コントロールは対象の性、年齢を一致させた人間ドッグを受診した方でがん罹患が確認されなかった一般人同数とした。
近代沖縄の文学資料の収集・研究とデータベース化

合計2年間の研究実施期間に我々は本研究計画にもとづいて購入した設備(パソコン2台、ノート型パソコン5台、イメージスキャナー等)を使用して、明治・大正期(明治31年大正7年)に沖縄で発行された『沖縄毎日新聞』『琉球新報』に掲載された短歌と琉歌の資料の収集・研究とデータベース化をおこなった。データベース化に際して、(1)本文、(2)作者名、(3)結社名、(4)題、題詠、(5)当座・兼題、(6)選者、点者、(7)判定・評価、(8)開催日、(9)掲載紙、(10)掲載日、(11)掲載号、(12)コラム名、(13)備考のインデックスを付し、さまざまな観点から検索できるようにした。これによって、明治以降の琉歌と短歌の年毎の発表歌数、結社数とその動向、結社とそれに属する作者、選者と結社の関係、短歌と琉歌の両方を創作した作者、その属する結社、その選者などが把握できるようになった。『沖縄毎日新聞』『琉球新報』に掲載された短歌と琉歌の総数(両紙の重複を含む)はつぎのとおりであった。短歌〔『沖縄毎日新聞』7016首、『琉球新報』17921首、計24937首〕、琉歌〔『沖縄毎日新聞』9781首、『琉球新報』5352首、計15133首〕総計40070首。琉歌のばあい、明治以前に創作された伝統的琉歌が約5千首であり、その3倍もある。この数字が何を物語っているのか、何故このような増加をもたらしたのか等の解明は今後の課題である。これらパソコンに入力された資料によって明治以前の「伝統琉歌」と明治以降に創作された「明治琉歌」という時代を異にする同一ジャンルの比較研究、および、短歌と琉歌という使用言語はことなるが、ほぼ同じ長さの短詩(短歌が57577の31文字で、琉歌が8886の30文字)の比較研究が可能となった。また、明治琉歌に関しては約17万5千件の単語を見出し語にした単語索引も作成した。単語索引によって、明治以前の伝統琉歌との表現の違いについての詳細な比較研究が可能になった。当初は、短歌、俳句、詩、小説などの明治以降に創作された文学資料のデータベース化を予定していたが、追加採択で、研究の着手がおくれ、限られた期間内での作業となったため、明治期に発行された新聞に掲載された短歌と琉歌の資料の収集・研究とデータベース化をおこなうことに主眼をおくことにした。短歌と琉歌は共に短詩型の文学で、短歌が五七五七七の31文字の文学であるのに対して、琉歌が八八八六の30文字の文学であり、同じ時期に創作されながら、表現形式、および表現手段(日本語か琉球方言か)のちがいがある。そのことが表現内容にどのような影響を与えているか等、比較検討することによつて明らかにできるものと思われる。また、短歌や琉歌は、詩や小説などの文学資料と異なり長さが一定しているので、まず手始めにデータベース化するのにも最も都合がよい。明治以前につくられた琉歌については『琉歌全集』(島袋盛敏著)や『南島歌謡大成・沖縄偏(下)』(外間守善編)、などがあり、研究者はこれを参考にして研究をすることができるが、明治以降の琉歌や短歌については利用できる資料がなかったので、今年度はその資料収集とデータ入力に多くの時間と労力を要した。明治期に沖縄で発行された「琉球新報」については琉歌と短歌の入力作業をほぼ完了しつつある。入力に際して、(1)本文、(2)作者名、(3)結社名、(4)題、題詠、(5)当座・兼題、(6)選者、点者、(7)判定・評価、(8)開催日、(9)掲載紙、(10)掲載日、(11)掲載号、(12)コラム名、(13)備考などのインデックスを付し、さまざまな観点から検索できるようにした。八重山地方での資料収集を行ない、石垣市立図書館、石垣市史編纂室などに保管されていた文学関連資料の目録をつくり、今後の研究にそなえる作業を行なった。短歌

〔『沖縄毎日新聞』7016首、『琉球新報』17921首、計24937首〕、琉歌〔『沖縄毎日新聞』9781首、『琉球新報』5352首、計15133首〕総計40070首。琉歌のばあい、明治以前に創作された伝統的琉歌が約5千首であり、その3倍もある。この数字が何を物語っているのか、何故このような増加をもたらしたのか等の解明は今後の課題である。これらパソコンに入力された資料によって明治以前の「伝統琉歌」と明治以降に創作された「明治琉歌」という時代を異にする同一ジャンルの比較研究、および、短歌と琉歌という使用言語はことなるが、ほぼ同じ長さの短詩(短歌が57577の31文字で、琉歌が8886の30文字)の比較研究が可能となった。また、明治琉歌に関しては約17万5千件の単語を見出し語にした単語索引も作成した。単語索引によって、明治以前の伝統琉歌との表現の違いについての詳細な比較研究が可能になった。2年目(最終年度)の今年は、本研究計画にもとづいて購入した設備(パソコン2台、ノート型パソコン5台)を使用し、前年度にひきつづき、沖縄で明治・大正期(明治31年大正7年)に発行された『沖縄毎日新聞』『琉球新報』に掲載された短歌と琉歌の資料の収集・研究とデータベース化をおこなった。データエ-ス化に際して、(1)本文、(2)作者名、(3)結社名、(4)題、題詠、(5)当座・兼題、(6)選者、点者、(7)斑点・評価、(8)開催日、(9)掲載紙、(10)掲載日、(11)掲載号、(12)コラム名、(13)備考のインデックスを付し、さまざまな観点から検索できるようにした。これによって、明治以降の琉歌と短歌の毎年の発表歌数、結社数とその動向、結社とそれに属する作者、選者と結社の関係、短歌と琉歌の両方を創作した作者、その属する結社、その選者などが把握できるようになった。『沖縄毎日新聞』『琉球新報』に掲載された短歌と琉歌の総数(両紙の重複を含む)はつぎのとおりであった。短歌〔『沖縄毎日新聞』7016首、『琉球新報』17921首、計24937首〕、琉歌〔『沖縄毎日新聞』9781首、『琉球新報』5352首、計15133首〕総計40070首。琉歌のばあい、明治以前に創作された琉歌(伝統的琉歌)が約五千首であり、その三倍もある。これらパソコンに入力された資料によって明治以前の「伝統琉歌」と明治以降に創作された「明治琉歌」という時代を異にする同一ジャンルの比較文学論的研究、および、短歌と琉歌という使用言語のことなる比較ジャンル論的研究が可能となった。
口腔癌の浸潤・転移における低酸素応答がん幹細胞マーカーの意義

口腔扁平上皮癌の治療において頸部リンハ節転移は最大の予後因子であり、治療成績向上にはその制御が不可欠である。そのためには転移のメカニズムを解明する必要があるが、その詳細は未だ不明な点が多い。近年、がんの浸潤・転移とがん幹細胞の関係が注目され、がん細胞が上皮間葉移行(EMT)の過程でがん幹細胞様性質を獲得する可能性が示唆されている。申請者らはこれまでに低酸素環境において口腔扁平上皮癌細胞がNotchシグナルを介してEMTを誘導することを見出しているが、本研究では低酸素環境におけるがん幹細胞マーカー(Bmi-1)の発現を解析することによって、浸潤・転移のメカニズムを明らかにすることを目的とした。口腔扁平上皮癌の治療において頸部リンパ節転移は最大の予後因子であり、治療成績向上にはその制御が不可欠である。われわれはこれまでに低酸素環境において口腔扁平上皮癌細胞がNotchシグナルを介してEMTを誘導することを見出しているが、本研究では低酸素環境におけるがん幹細胞マーカー(Bmi-1等)の発現を解析することによって、浸潤・転移のメカニズムを明らかにすることを目的としている。平成28年度は口腔癌患者組織を用いた実験を行った。すなわち下記に示す癌幹細胞マーカーおよびEMTマーカー発現と転移や予後などの臨床病理学的因子との関連を分析を行い、現在解析中である。癌幹細胞マーカーおよびEMTマーカーの発現を患者サンプルを用いた免疫組織化学にて検討中である。癌幹細胞マーカーとして、Bmi-1、CD44、Oct3/4、Sox2、Nanog、ALDH1を、EMTマーカーとしてTwist、Snail、ZEB1、E-cadherin、Vimentinの発現を評価し、臨床病理学的因子との比較検討を行っている。臨床病理学因子として浸潤様式(YK分類)、化学放射線治療の組織学的治療効果(大星下里分類)、頸部リンパ節転移の有無、予後(全生存率、疾患特異的生存率、無病生存期間)等との関連を検討中である。当初想定していた患者サンプル数が収集できていないことや分析予定のバイオマーカーのいくつかの発現が安定しないなどの理由から最終的な結果が得られるまで時間を要している。われわれはこれまでに低酸素環境において口腔扁平上皮癌細胞がNotchシグナルを介してEMTを誘導することを見出しているが、本研究では低酸素環境におけるがん幹細胞マーカー(Bmi-1)の発現を解析することによって、浸潤・転移のメカニズムを明らかにすることを目的としている。われわれはまず患者サンプルを用いた臨床病理学的検討において次のことを確認した。1病理学的頸部リンパ節転移を認めた(pN+)群はpN-群と比べ有意に予後不良であった。2浸潤様式YK-3群と比較してYK-4c、4d群が有意に予後不良であった。3化学放射線療法の組織学的治療効果が低い群は効果が高い群に比べ有意に予後不良であった。臨床検体においてBmi-1が周囲組織に比べ癌組織で高発現することや癌組織に隣接する異形成上皮では基底層細胞に多く発現することを確認した。さらに口腔癌細胞4株(HSC2、HSC4、OSC-19、KON)において低酸素下でBmi-1が一過性に発現が増強することを明らかにした。進捗状況が遅れている原因として、以下のことが挙げられる。1患者サンプルの回収と癌幹細胞マーカーの発現(mRNA、タンパクレベル)の確認の遅滞3機能解析実験において遺伝子導入率が低い口腔扁平上皮癌の治療において頸部リンハ節転移は最大の予後因子であり、治療成績向上にはその制御が不可欠である。昨年度に引き続き臨床サンプルにおける各種マーカーの発現と臨床因子との関連を分析していく。1患者サンプルの回収と癌幹細胞マーカーの発現(mRNA、タンパクレベル)の確認の遅滞→関連部署と連携し患者サンプル数の増加をはかる2in vitroの低酸素下培養において予想より細胞株の発育が不良→低酸素濃度や培地などの条件を個別または組み合わせで変更し検討3機能解析実験において遺伝子導入率が低い→現行のエレクトロポレーションシステム以外の導入法の検討当初購入を予定していた画像解析装置が共同施設の使用によって削減できたため。
S. mutans ピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子(pfl)の発現調節機構の解析

S. mutansの糖代謝において、特に歯垢深部の様な高度の嫌気的条件下では、ラジカル酵素であるピルビン酸ギ酸リアーゼ(PFL)がNAD/NADHバランスに重要な役割をはたしている。申請者らはS. mutansの染色体DNAにランダム変異を導入し、大腸菌以外では未だクローニングされていなかったピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子(pfl)をクローニングし、その全塩基配列の決定(S. mutansのpflは塩基数2.325kbで、コードされているアミノ酸残基数は775、分子量は87, 533Daであった。Yamamoto, Y., et al., 1996, Infect. Immun., vol. 64 : 385-391)とこの遺伝子の上流域および下流域の塩基配列の解析を行った。S. mutansのpflは、大腸菌のpflがこの酵素の活性化酵素遺伝子(act)と供に近接して存在し、ArcAやFNRらのタンパク質によってその嫌気的条件下での誘導が制御されているのに対し、申請者らによるこの遺伝子の上流域および下流域の塩基配列解析の結果(pflの上流域には0.6kb異常のORFを、下流域にも約1.7kbのORFの存在を確認し、これらの領域の挿入失活変異株をつくり糖アルコール代謝性への影響を検討したが、大きな変化は確認できなかった。)から単独で存在することが示唆され、また本菌のように呼吸鎖を持たない菌ではFNRタンパク質は存在しないとされる等の理由から、大腸菌のそれとは明らかに異なった発現調節を受けているものと考えられた。さらに申請者は、pflの発現がS. mutans内で容易にモニターできる融合遺伝子を作成し、種々の発酵条件下におけるpflの発現調節機構を明らかにしようと考え、大腸菌において融合遺伝子(pfl :: lacZ, S. mutansにはβ-ガラクトシダーゼが存在しない)を構築している。