hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
協調ソフトウェア開発学習における継続的知識と断片的知見の獲得および有機的連携手法

ソフトウェア技術者育成には,協調開発過程の実際的体得が重要だが,大学等の演習授業では,独特の制約ゆえに,ノウハウ蓄積とそれを活用した訓練が十分に行えていない現状がある.本研究では,協調ソフトウェア設計開発演習における実際的な経験知識の習得を目指し,演習上の様々な制約に対応可能な知識・知見の蓄積活用支援手法の開発を試みた.まず,素性の異なる知識・知見を準独立的に獲得・蓄積し,その間の関係性を分析する手法を開発した.その上で,知識・知見の獲得から管理・視覚化までの支援を見据えたシステム的枠組みをデザインした.これにより,協調ソフトウェア開発演習におけるノウハウ習得支援の新たな可能性を示した.ソフトウェア設計開発に携わる人材の育成には,協調開発過程における実際的ノウハウを,演習を通して体得させることが重要である.しかし,大学等の演習授業では,独特の制約ゆえに,ノウハウの効率的な蓄積とそれらを活用した訓練が十分に行えていない現状がある.そこで本研究では,協調ソフトウェア設計・開発演習における実際的な経験知識の習得を目指し,演習上の制約に対応可能な知識・知見の蓄積活用支援手法の開発を目標とする.そのために,まず,素性の異なる知識・知見を準独立的に獲得・蓄積し,その間の関係性を分析する手法を開発する.その上で,知識・知見の獲得から集約・視覚化までの支援を見据えたシステム的枠組みデザインを検討し,協調ソフトウェア開発演習におけるノウハウ習得支援の新たな可能性を探る.平成25年度は,主に以下の作業に取り組んだ.・協調ソフトウェア開発学習支援システムの試作:技術文書とその構成(継続的知識),学習者による質問・コメント等の編集意図(断片的知識)に焦点をあて,学習メンバ間で編集意図を共有しながら,文書間の関連性に留意した技術文書作成・推敲作業を体得させるための学習の流れをデザインした.その上で,支援システムのプロトタイプを開発した.本システムは,技術文書作成と対応づけ,編集意図の蓄積・共有,それらに基づいた推敲作業のための環境を提供する.さらに,学習者が技術文書間の関連付けを誤っている可能性がある箇所についての注意喚起を行う.・支援システムの評価:まず,予備実験を経て主な機能の動作等について基本的な検証を行った.その上で,教授者による演習準備作業,学習者による技術文書作成・推敲作業について,それぞれ実験協力者に実際の演習に準じた作業を行って頂き,実践的側面を含めた評価を試みた.基本的有効性を確認し,手法面と操作性などシステム面双方について課題を含めた知見を得ることができた.ソフトウェア技術者育成には,協調開発過程の実際的体得が重要だが,大学等の演習授業では,独特の制約ゆえに,ノウハウ蓄積とそれを活用した訓練が十分に行えていない現状がある.本研究では,協調ソフトウェア設計開発演習における実際的な経験知識の習得を目指し,演習上の様々な制約に対応可能な知識・知見の蓄積活用支援手法の開発を試みた.まず,素性の異なる知識・知見を準独立的に獲得・蓄積し,その間の関係性を分析する手法を開発した.その上で,知識・知見の獲得から管理・視覚化までの支援を見据えたシステム的枠組みをデザインした.これにより,協調ソフトウェア開発演習におけるノウハウ習得支援の新たな可能性を示した.ソフトウェア設計開発に携わる人材の育成には,協調開発過程における実際的ノウハウを,演習を通して体得させることが重要である.しかし,大学等の演習授業では,独特の制約ゆえに,ノウハウの効率的な蓄積とそれらを活用した訓練が十分に行えていない現状がある.そこで本研究では,協調ソフトウェア設計・開発演習における実際的な経験知識の習得を目指し,演習上の制約に対応可能な知識・知見の蓄積活用支援手法の開発を目標とする.そのために,まず,素性の異なる知識・知見を準独立的に獲得・蓄積し,その間の関係性を分析する手法を開発する.その上で,知識・知見の獲得から集約・視覚化までの支援を見据えたシステム的枠組みデザインを検討し,協調ソフトウェア開発演習におけるノウハウ習得支援の新たな可能性を探る.本年度は,主に以下の作業に取り組んだ.・知識・知見情報獲得蓄積システム群の設計:実際の演習過程で生じる知識・知見を観察し,その発生状況や開発工程との関係・意味を整理した.その結果に基づいて,取得する知識・知見情報の種類や属性情報,それらの観察・取得に関するシステム面について検討した.・知識・知見情報の連携手法の開発:定型的知識と非定型知見の間の特徴的な関係に焦点を当てた知識知見情報の観察分析を行った.その上で,素性の異なる知識・知見情報の関連づけについて,手法・システムの両面から検討した.・知識・知見情報間関係抽出手法の開発:特徴語出現状況や属性情報等の分析により,関連づけされた知識・知見情報群が体言する話題とその遷移過程を抽出する手法・システムを開発し,その視覚化について検討した.個別の分析結果については勿論見込みと異なるものもあったが,作業は概ね予定通り進捗した.今後は,主に以下の作業を遂行する.(1)プロトタイプシステムの開発にあたる.また,既存の協調ソフトウェア開発学習環境と連携等を含めた検証を行い,問題・留意点などを整理する.(2)協調ソフトウェア開発学習にプロトタイプを導入し,実践的評価を試みる.この際,本申請課題の性格を鑑み,効果・メリットの一面的な確認に陥ることなく,問題点や留意すべき点,新たな課題などを出来る限り記録・整理するよう努める.また,研究成果を随時取りまとめ,学会発表・論文投稿の準備を行う.概ね,以下の通り予定している.備品:主に,支援システム運用・評価用マシンを購入予定である.旅費:研究打合せ,情報収集,研究成果報告のための旅費を予定している.
マイコプラズマ肺炎のマウスモデルの解析と治療への応用

肺炎マイコプラズマの菌体成分Mp extractを用いて、マイコプラズマ肺炎マウスモデルを作成し、解析した。培養細胞の研究により、Mp extractは、p38、PI-3K、NF-kBなどの細胞内シグナル伝達を賦活化することが判った。マウス肺の組織学的所見では、本マウスは、重症型のマイコプラズマ肺炎と考えられた。ステロイドやクラリスロマイシンは、本マウスの炎症に影響を及ぼしたが、そのパターンから、マイコプラズマ肺炎がNF-kB依存性およびNF-kB非依存性の宿主免疫の過剰反応を惹起している可能性が示唆された。I.具体的内容(1)背景これまでに、我々は、マイコプラズマ肺炎マウスモデルを確立した。本マウスの気管支肺胞洗浄液中のサイトカインを経時的かつ網羅的に測定したところ、1日目にピークを持つサイトカインと2日目にピークを持つサイトカインがあることが判った。(2)平成21年度の研究結果さて、平成21年度は、本マウスを用いて、Clarithromycin (CAM)とDexame thasone (DEX)が炎症に与える効果を検討した。興味深いことに、CAM投与群では、気管支肺胞洗浄液中のIL-6やTNF-αに代表される一群のサイトカイン濃度が上昇した。これらは、第1日目あるいは第2日目のいずれに濃度のピークを持つかとは無関係であった。ステロイドの単独投与は、この群のサイトカインレベルに有意な影響を及ぼさなかった。その一方でIL-17などCAMやDEX投与の影響を受けないサイトカインも存在した。ステロイドとクラリスロマイシンの共投与により、クラリスロマイシンで増加作用を認めたサイトカインと影響をほとんど受けないサイトカインの両者とも抑制した。(3)考察クラリスロマイシンについてのこれまでの報告、あるいは、クラリスロマイシンで増加作用を示したサイトカインのパターンを考察したところ、本モデルマウスではNF-kBを介する細胞内シグナル伝達の活性化が重要な機能を果たしていると考えられた。II.意義と重要性クラリスロマイシンには、抗微生物作用と免疫調整作用があると考えられている。我々のマウスモデルにより、クラリスロマイシンが免疫調整作用を有する可能性が示唆された。また、そのメカニズムの一つにNF-kBを介する細胞内シグナル伝達をコントロールすることにより遺伝子発現を制御している可能性が示唆された。本モテルを使用してクラリスロマイシンの免疫調整作用の解明とマイコプラズマ感染症の病態態を検討することが可能と考えられる。マイコプラズマ肺炎患者の臨床的観察より、マイコプラズマ肺炎は「宿主免疫反応」の過剰な反応であることが推定されている。さらにマクロライド系抗菌薬は、抗菌作用だけでなく、「免疫調整作用」も有する。以上より、我々は、マイコプラズマ肺炎をマクロライド系抗菌薬で治療する、ということは、実は、「肺炎マイコプラズマ感染が惹起した宿主免疫の過剰反応をマクロライドの免疫調整作用により、制御することである。」という仮説を立てた。本仮説を検討するため、マイコプラズマエキスを用いたマウスモデルを作成し、研究を行っている。(1)研究の成果マイコプラズマエキスを用いて作製したマイコプラズマ肺炎マウスモデルをクラリスロマイシン、デキサメサゾン、あるいは、その両者を投与し解析した。炎症性サイトカイン、ケモカインを網羅的に測定したところ、クラリスロマイシンとデキサメサゾンがマイコプラズマ肺炎へ与える影響が2パターンあることが判った。クラリスロマイシンやデキサメサゾンがNF-kBを介した細胞内シグナル伝達を制御することから、いずれか一方のパターンに属する炎症がNF-kBに関連するものと考えられた。(2)研究成果の意義、重要性等本年の研究により、マイコプラズマ肺炎がNF-kBを活性化して宿主免疫の過剰反応を惹起している可能性が示唆された。マイコプラズマ肺炎に罹患すると、気管支喘息や慢性閉塞性肺疾患などの気道の炎症性疾患を悪化させることは知られており、そのメカニズムとしてNF-kBを介する細胞内シグナルの活性化が想定されていた。我々の研究結果は、マイコプラズマ肺炎発症にNF-kBの活性化が関与を示す間接的なエビデンスと考えられる。これまでの我々の研究では、マイコプラズマ肺炎発症にNF-kB依存性の炎症が関与していると考えられる。この結果、気管支喘息や慢性閉塞性肺疾患chronic obstructive pulmonary disease(COPD)が増悪する原因となると考えられる。

一方、NF-kB非依存性の炎症反応もあると考えられた。マイコプラズマエキスを用いて作製したマイコプラズマ肺炎マウスモデルを作成し、上記の研究結果を発表してきたが、本マウスはアジュバントを投与しており、結果は重症マイコプラズマ肺炎を反映していると思われた。一方、我々が罹患するマイコプラズマ肺炎の多くは軽症であると考えられる。そこで、アジュバントを用いないマウスモデルも作成し、解析を行った。(1)研究の成果アジュバントを用いない軽症のマイコプラズマ肺炎モデルでも、アジュバントを用いたマウスと同様、気道の炎症反応がみられた。さらにIL-17の産生を認めた。(2)研究成果の意義、重要性等本年の研究により、アジュバントの使用の有無に関係なくマイコプラズマ肺炎がNF-kBを活性化して宿主免疫の過剰反応を惹起している可能性が示唆された。
領域一般的な因果的認識の発生機序に関する認知発達的検討

本研究では、生後6ー7ヶ月の乳児を対象に、被験者内計画による2つの実験をおこなった。実験1では、2つの対象の運動における物理的因果関係を示したLaunching事象の因果性認知について、実験2では、対象の動きの目標指向性(心理的因果性)の認知について検証した。その結果、実験1でのパフォーマンスと、実験2でのパフォーマンスの間に関連がみられた。つまり、実験1において物理的因果性への感受性が相対的に高かった乳児は、実験2の心理的因果性課題においても目標指向性を認知しており、逆に、物理的因果性への感受性が低かった乳児は、心理的因果性課題においても目標指向性の認知が見られない傾向が示された。平成25年度は、まず、物理的因果性課題と心理的因果性課題という馴化ー脱馴化法を用いた2つの実験の実施に向け、実験装置の整備と刺激の作成をおこなった。物理的因果性課題では、Leslie and Keeble(1987)とNewman et al.(2008)を参考に、動く対象Aが静止する対象Bに向けて動き、接触すると対象Bが動き始める事象(衝突駆動事象)を刺激事象とした。対象どうしの接触と静止した対象の始動の時空間的関係を操作し、因果的事象と非因果的事象を作成した。心理的因果性課題では、Luo and Baillargeon (2005)を参考に、馴化刺激として、行為主体(長方形の対象)が対象Aと対象Bのうちの1つに接近・接触する事象を、テスト事象として、対象Aと対象Bの位置が入れ替えられ、行為主体の動く軌道もしくは目標となる対象が馴化事象から変化する事象を作成した。これらの刺激事象(フラッシュムービー)は、Adobe Creative Suite 6を用いて作成した。刺激事象を22インチのPCモニタ上に提示し、それに対する乳児の注視反応を測定、記録、分析する装置を作成した。とくに、乳児の注視行動をとらえたカメラの映像をPCに取り込み、提示中の刺激事象とリアルタイムで同期させるシステムに工夫を要した。今年度は、両課題を別々の乳児群を対象に実施する予備的実験をおこない、得られたデータと先行研究のデータを比較し、実験課題の妥当性を評価した。対象となった乳児は6ー9ヶ月児、計10名であった。注視反応の分析の結果、先行研究と同様、両課題において、乳児が因果的認識をしていた可能性が示唆された。この他、因果的認識の初期発達に関する文献調査をおこない、その結果を紀要論文としてまとめた。平成25年度に引き続き、7ヶ月児を対象に、物理的因果性課題と心理的因果性課題という馴化ー脱馴化法を用いた2つの実験をおこなった。実験は、静岡県袋井市内の保健センターの乳児相談事業の場において実施した。今年度はまず、両課題を別々の乳児群を対象に実施する予備的実験をおこなった後、両課題を同じ乳児群に実施する本実験もおこなった。予備的実験の結果は、各課題において、7ヶ月児に因果的認識が見られることを示唆している。本実験では、各乳児に対し、複数の実験課題を実施するため、むずかり等が頻発し、実験を完遂する乳児が少なくなることが予想された。そのため、保健センターの協力を仰ぎ、課題間のインターバルを確保し、乳児のコンディションを良好に保つことができるようにした。その結果、大きな問題はなく本実験を実施できている。本実験については、現在注視反応の計測を進めている段階であり、データ分析が不十分である。そのため、両課題におけるパフォーマンスの連関をとらえるに至っていない。次年度は、データ分析と不足するデータの収集を継続する。上述の調査に加え、今年度は、1名の乳児を対象に、生後510ヶ月の期間、両課題をくり返し実施する縦断的調査を実施した。また、育児日誌の記述をもとにこの乳児の対象操作的行為の産出について調べた。これらの調査結果をもとに、因果性知覚の発現の時期と行為産出との関連について検討した。その結果、この乳児の物理的因果性と心理的因果性の発現の時期が同じ生後7ヶ月ごろであり、その頃までに、対象操作的行為のレパートリーが増えていることが示唆された。この調査の結果は、紀要論文として報告した。平成25-26年度に引き続き、6ー7ヶ月児を対象とした2つの実験をおこなった。実験は、静岡県袋井市内の保健センターにおいて実施した。実験1は、動く対象Aが静止する対象Bに向けて動き、接触すると対象Bが動き始める事象(衝突駆動事象)を刺激事象とする馴化ー脱馴化法による実験であった。この実験の結果、調査対象となった乳児において、因果的事象と非因果的事象を区別していること、衝突駆動事象における原因と結果の関係を知覚していることが示唆された。実験2では、慣化刺激として、行為主体(長方形の対象)が対象Aと対象Bのうちの1つに接近・接触する事象を、テスト事象として、対象Aと対象Bの位置が入れ替えられ、行為主体の動く軌道もしくは目標となる対象が慣化事象から変化する事象を用いた。この実験の結果、乳児は、行為主体の動きの目標の変化にとくに注意を向けたことが示唆された。さらに、実験1と実験2の両方を完遂した乳児のデータの分析を進め、両実験におけるパフォーマンスに関連があるかどうかを調べた。その結果、実験1において因果的知覚を示した乳児は、そうでなかった乳児に比して実験2におけるパフォーマンスがよいという弱い傾向があったことが示唆された。

今年度はさらに、成人女性を対象にコンピュータ画面上に上述の実験1で用いた衝突駆動事象を呈示し、それに対する注視反応をアイトラッキングシステムを用いて計測、分析する実験をおこなった。その結果、注視が集まる領域に刺激事象の因果性の有無による違いが見られ、そこに因果的認識が関係している可能性が示唆された。本研究では、生後6ー7ヶ月の乳児を対象に、被験者内計画による2つの実験をおこなった。実験1では、2つの対象の運動における物理的因果関係を示したLaunching事象の因果性認知について、実験2では、対象の動きの目標指向性(心理的因果性)の認知について検証した。その結果、実験1でのパフォーマンスと、実験2でのパフォーマンスの間に関連がみられた。つまり、実験1において物理的因果性への感受性が相対的に高かった乳児は、実験2の心理的因果性課題においても目標指向性を認知しており、逆に、物理的因果性への感受性が低かった乳児は、心理的因果性課題においても目標指向性の認知が見られない傾向が示された。前年度までの遅れを取り戻すべく、データ収集に努め、実験的調査を進展させることができた。また、対象は1名ではあるが、縦断的調査をあわせて実施することができ、貴重なデータを得た。社会科学すでに実施した本実験(各乳児が2つの実験課題をおこなう調査)のデータ分析をおこない、適宜追加実験を実施していく。また、2つの実験課題の刺激事象をより年長の子どもや大人がどのように認識しているのかを調べる実験をおこない、乳児実験の結果の解釈の資料にしたい。さらに、文献調査を引き続きおこない、この領域の研究の動向を精査する。乳児の注視反応をとらえた映像と提示中の刺激事象を同期させるシステムの作成に時間を要している。予備的な実験の実施が当初の予定から遅れており、調査対象数が少ない。旅費および人件費が当初の見積もりよりも少なくなったため。人件費については、乳児の注視時間の計測作業への謝金にあてる予定であったが、この作業を依頼した学生たちのスケジュールの都合で、当初の予定よりも作業時間が少なくなった。予備的な実験の続きを早急に実施し、それと平行して実験装置の整備を完了させる。その結果を踏まえ、二つの実験課題を被験者内計画で(つまり、各乳児が両方の課題をおこなう)実施する本実験に移行する。実験的研究と平行して、乳児の行動観察を実施し、実験の考察の資料としたい。文献調査を継続し、この領域の研究の動向を精査し、研究計画に反映させる。平成26年度に実施できなかった注視時間の計測作業および追加の実験を平成27年度に実施するので、未使用額はこの作業、実験の経費にあてることとしたい。人件費については、予備的実験に遅れが生じたことが原因となっている。遅れが生じた実験については、平成26年度に実施するので、未使用額はこの実験の経費に充てることとしたい。
車椅子利用者の視覚情報収集に関する基礎的研究

本研究は,屋外空間において車イス利用者がアイカメラを頭部に装着して,手動車イスを操作しながら移動する実験をおこなったものである.実験とその結果は以下の通りである.1.建物にアプローチするために設けられたスロープや平坦部分での車イス利用者の注視傾向について検討した.実験の結果,(1)平均注視時間では個人差は認められないが,スロープの上りでは下りや平坦部での平均注視時間より長い.上りでは移動速度が速くなれば平均注視時間は短くなる.(2)注視対象は路面など安全性に関するものが主である.(3)注視距離は平坦部の方が6m程度,スロープでは23m程度であり,平坦部がスロープよりも長くなる.2.信号待ちや移動中の注視傾向を車イス利用者と健常者について検討した.実験場所は交差点付近である.実験の結果,(1)平均注視時間では通常歩行,車椅子移動とも個人差は認められないが,移動中よりも信号待ちの方が長くなる.(2)注視対象は安全性に関するものが主である.移動中の場合は健常者と車イス利用者では異なる.信号待ちの場合は概ね同じ傾向である.(3)注視距離は移動中あるいは信号待ちのいずれの場合でも車イス利用者よりも健常者の方が長い.(4)健常者は車イス利用者より先行情報をより多く得る.3.高齢者や身体障害者にも配慮して設計された眺望の良い登山道における注視傾向について検討するために移動実験を実施した.その結果,(1)平均注視時間や平均注視回数は空間側の影響は受けない.(2)注視対象は車イス利用者の場合は安全性に関するものが主である.健常者は周辺の快適性に関する注視対象まで拡大する.(3)注視方向は正面方向が主である.それに加えて健常者は視野が開放された方向に視線が向く.本研究は,屋外空間において車イス利用者がアイカメラを頭部に装着して,手動車イスを操作しながら移動する実験をおこなったものである.実験とその結果は以下の通りである.1.建物にアプローチするために設けられたスロープや平坦部分での車イス利用者の注視傾向について検討した.実験の結果,(1)平均注視時間では個人差は認められないが,スロープの上りでは下りや平坦部での平均注視時間より長い.上りでは移動速度が速くなれば平均注視時間は短くなる.(2)注視対象は路面など安全性に関するものが主である.(3)注視距離は平坦部の方が6m程度,スロープでは23m程度であり,平坦部がスロープよりも長くなる.2.信号待ちや移動中の注視傾向を車イス利用者と健常者について検討した.実験場所は交差点付近である.実験の結果,(1)平均注視時間では通常歩行,車椅子移動とも個人差は認められないが,移動中よりも信号待ちの方が長くなる.(2)注視対象は安全性に関するものが主である.移動中の場合は健常者と車イス利用者では異なる.信号待ちの場合は概ね同じ傾向である.(3)注視距離は移動中あるいは信号待ちのいずれの場合でも車イス利用者よりも健常者の方が長い.(4)健常者は車イス利用者より先行情報をより多く得る.3.高齢者や身体障害者にも配慮して設計された眺望の良い登山道における注視傾向について検討するために移動実験を実施した.その結果,(1)平均注視時間や平均注視回数は空間側の影響は受けない.(2)注視対象は車イス利用者の場合は安全性に関するものが主である.健常者は周辺の快適性に関する注視対象まで拡大する.(3)注視方向は正面方向が主である.それに加えて健常者は視野が開放された方向に視線が向く.バリアの少ない歩行専用空間を対象に手動車椅子を使用しての移動実験を実施した。アイカメラを装着した被験者が決められたルートを手動車椅子を操作して移動を行った。アイカメラを装着して得られるデータは景色の映像、アイマークのX、Y座標である。アイマークのX,Y座標から注視点を抽出し,注視時間や注視回数についてパソナル・コンピュータで分析した。景色の映像は抽出された注視点の注視対象を抽出するのに利用した。注視対象はVTRを再生し,コマ送による手作業で読みとり分析した。その結果、1回当たりの平均注視時間,1秒当たりの平均注視回数は空間側の影響は受けないこと、注視対象は手動の車椅子を操作した場合には安全正に関するものが主であり、快適性に関する注視対象まで拡大していないこと,注視方向は正面方向が主な方向であることなどの知見を得た。手動車椅子を操作して歩行する場合の視覚情報収集は比較的限定された空間のものである。車椅子使用者の視覚情報収集が広範囲にまでおよぶような空間構成がより重要であると考えられる。手動車椅子使用時の視覚情報収集の特性について明らかにすることを目的とした。バリアの少ない歩行者専用の傾斜路での歩行実験についての解析結果から多くの知見を得ることができた。屋外実験の場合,天候に左右される面を無視することはできない。そのため多少の失敗もあったが,目標とするデータを得ることができた。また,研究方法としてはアイカメラを使用する方法を採用したが,屋外で被験者にアイカメラを装着し、歩行をしてもらう場合,歩行前と歩行後のアイマークのずれが大きくなることがある。

何回か実験をやり直し,必要とされるサンプルを収集することができ、当初の目的を達成することができた。脊髄損傷者が手動車イスを使用して,建物にアプローチするために設けられたスロープや平坦部分において移動実験を実施した.アイカメラを装着した被験者が決められたルートを日常的に使用している手動車イスを操作しての移動を行った.実験ではできるだけ日常的な行動をすることが望ましいために,目的地まで往復するように指示するのみで,その他については被験者に委ねた.実験の結果,1注視当たりの平均注視時間では個人差は認められないが,空間条件による差が認められる.スロープの上りでは短く(0.28秒),下り(0.36秒)や平坦部(0.32秒)では上りより長いこと,移動速度との関連では上りにおいては高い負の相関が認められ(-0.87),移動速度が速くなれば平均注視時間は短くなる.1秒当たりの平均注視回数は個人差,空間条件の差の影響は受けないものの,移動速度との関連では下りにおいては高い負の相関が認められ(-0.97),移動速度が速くなれば平均注視回数は少なくなること,注視対象は安全性に関するものが主である.特にこの傾向はスロープの上りにおいて顕著であり,快適性に関する注視対象まで拡大していないこと,注視距離は平坦部の方が6m程度,スロープでは23m程度であり,平坦部がスロープよりも長くなるなどの知見を得た。手動車イスを操作して移動する場合の視覚情報収集は比較的限定された空間のものである.車イス使用者の視覚情報収集が広範囲にまで及ぶような空間構成がより重要であると考えられる.バリアの少ない歩行者専用空間での移動実験についての解析結果から多くの知見を得ることができた.脊髄損傷者の場合,半身不随になった原因がさまざまであり,車イス生活経験年数も異なり,年齢もさまざまである.同じ条件の被験者を揃えることは困難であるが当初の目的を達成することができた.脊髄損傷者が手動車イスを使用して,交差点を横断する移動実験を実施した.アイカメラを装着した被験者があらかじめ決めておいたルートを日常的に使用している手動車イスを操作しての移動を行った.実験ではできるだけ日常的な行動をすることが望ましいために,出発地点から交差点を一周して出発点まで戻ってくるように指示するのみで,その他については被験者の判断に委ねた.実験の結果,歩行を維持するために空間側から得る視覚情報のうち注視の占める割合は移動中では通常歩行6065%,車椅子移動4045%,信号待ちでは通常歩行,車椅子移動とも70%である.平均注視時間では通常歩行,車椅子移動とも個人差は認められないが,移動中よりも信号待ちの方が長くなる.注視対象は安全性に関するものが主である.移動中の場合は,通常歩行では静的注視対象が46%を占めるのに対して車椅子移動では路面が72%を占める.信号待ちの場合は,自動車への注視が通常歩行では41%,車椅子移動では35%,信号への注視は通常歩行では20%程度,車椅子移動では10%程度である.注視距離は移動中の場合は,通常歩行では8m程度,車椅子移動では6m程度である.信号待ちの場合は,通常歩行では11m程度,車イス移動では8m程度であり,移動中よりも信号待ちの方が長くなるなどの知見を得た。手動車イスを操作して移動する場合の視覚情報収集は比較的限定された空間のものである.車イス使用者の視覚情報収集が広範囲にまで及ぶような空間構成がより重要であると考えられる.
ヨード造影剤のヒスタミン遊離作用における薬物相互作用

ヒスタミン遊離作用におけるヨード造影剤とモルヒネとの相互作用を明らかにするために、ラット腹腔肥満細胞からのヒスタミン遊離作用(in vitro)、ラットへの静注後の血漿ヒスタミンの変化(in vivo)を検討した。ラット腹腔より採取した未精製の肥満細胞浮遊液をプレインキュベートした後、いろいろな濃度の各種ヨード造影剤を添加し、さらに5分間のインキュベーションを行い、上清と沈査のヒスタミン量をHPLC-蛍光分析法により測定し、ヒスタミン遊離率を計算した。in vivoではイオパミドール静注3分後にエーテル麻酔下に採血を行った。ヒスタミンの自然遊離は5.7【plus-minus】0.5%であった。ヨード(I)造影剤65mgI/mlの濃度ではいずれも有意なヒスタミン遊離を示さなかったが、135mgI/mlの濃度では、イオパミドール20.3【plus-minus】0.5%、イオベルソール10.5【plus-minus】0.7%、ミオメプロール9.2【plus-minus】0.2%といずれも有意なヒスタミン遊離を示した。イオヘキソ-ルも9.5%の遊離を示したが有意差は認められなかった。モルヒネは3mMの濃度まで有意なヒスタミン遊離を示さなかった。イオパミドール20mgI/mlによるヒスタミン遊離は9.7【plus-minus】0.4%(有意差はない)であったが、モルヒネ1、3、10mMの添加により15.6【plus-minus】1.3%、47.7【plus-minus】2.4%、81.4【plus-minus】2.4%と著明に増大した。in vivoの検討ではイオパミドール単独での明らかなヒスタミン遊離作用も確認できなかったが、ヒトではヒスタミン遊離の報告があり、ラットとヒトの感受臨床ではヒスタミン遊離作用を有する薬物が使用されることがあるが、今回明らかになったイオパミドールとモルヒネの相互作用は、それら薬物服用患者におけるX線造影検査に一層の注意を払うよう提起するものである。
メタボリックシンドローム病態形成におけるプロテインホスファターゼ2Aの役割

脂肪細胞のモデル細胞である3T3-L1細胞において、パルミチン酸(PAL)およびC2セラマイド(CER)孵置によりインスリン抵抗性が惹起されたが、その作用点とは、Aktレベルであると考えられた。CER合成阻害剤であるミリオシン孵置はPALの効果を消失させた。さらに、CERの合成基質とならないミリスチン酸(MYR)やオレイン酸はインスリン抵抗性を惹起しなかった。以上の結果よりFFAを基質として細胞内でde novo合成されるスフィンゴ脂質の一つであるCERがインスリン抵抗性の原因であることが示唆された。さらに、PALおよびCERによりPP2A活性が刺激され、PP2A抑制剤であるオカダ酸前孵置により、PAL、CERによるAkt抑制が解除された。CERは以前よりPP2Aを活性化すること、PP2AはAktを不活性化することが知られており、以上より、Akt活性の抑制機序として、細胞内CER合成亢進を介してPP2A活性を直接刺激し、Aktを脱リン酸化することを見出した。一方、肝臓のモデル細胞であるFao細胞においてもPALとCERはAktリン酸化を抑制したが、MYRでも抑制された。しかし、PP2A活性化は伴わず、オカダ酸、ミリオシンの抑制効果も認めなかった。さらに、筋肉細胞のモデル細胞であるL6細胞においては、PALとCERによりAktリン酸化を抑制したが、これは、オカダ酸により部分的に解除された。PALの効果はミリオシンにより部分的に解除された。MYRの効果は認めなかった。このことより、L6細胞におけるAkt抑制作用は、一部はPP2Aの活性化を介するが、その他の機序も関与していると考えられた。以上より、FFAによるインスリン抵抗性惹起機構は、単一ではなく、各臓器において異なることが示唆された。【高遊離脂肪酸血症によるインスリン抵抗性の分子機構の解明】脂肪細胞のモデル細胞である3T3-L1細胞において、パルミチン酸孵置(PAL,1mM,24時間)によりインスリン抵抗性(Aktのリン酸化及び糖取り込みの抑制)が惹起された。インスリン受容体及びIRS-1のリン酸化やPI3キナーゼ活性には影響がなかったことより、PALの作用点はAktレベルと考えられた。C2セラマイド(100μM)処置によりPALと同様の結果が得られ、セラマイド合成阻害剤であるミリオシン孵置はPALの効果を消失させた。さらに、セラマイドの合成基質とならないミリスチン酸やオレイン酸はイシスリン抵抗性を惹起しなかった。以上の結果よりFEAを基質として細胞内でde novo合成されるスフィンゴ脂質の一つであるセラマイドがインスリン抵抗性の原因であることが示唆された。【高遊離脂肪酸血症によるAktリン酸化障害の分子機構】PALとC2セラマイドはセリンスレオニン脱リン酸化酵素の一つであるprotein phosphatase2A(PP2A)を活性化すること、PP2A抑制剤であるオカダ酸処置によりPALとC2セラマイドによるインスリン抵抗性惹起作用が消失したこと、PP2AがAktを直接脱リン酸化してその活性を抑制することから、FFA(PAL)は、細胞内セラマイド合成亢進を介して、PP2A活性を直接刺激し、Aktを脱リン酸化することによりインスリン抵抗性を惹起すると考えられた。一方、肝臓のモデル細胞であるFao細胞においてもPALとC2セラマイドはAktリン酸化を抑制したが、PP2A活性化は伴わず、オカダ酸の抑制効果も認めなかった。

さらに、ミリスチン酸でもインスリン抵抗性が惹起されたことからFEAによるインスリン抵抗性惹起機序は組織により異なることが示唆され、現在、その機構を解明中である。【高遊離脂肪酸血症によるインスリン抵抗性の分子機構の解明とその臓器特異性】昨年の我々の検討から、脂肪細胞のモデル細胞である3T3-L1細胞において、パルミチン酸(PAL)およびC2セラマイド孵置によりインスリン抵抗性が惹起されたが、その作用点として、インスリン受容体、IRS-1のリン酸化およびPI3キナーゼ活性には影響がなかったことより、Aktレベルであると考えられた。セラマイド合成阻害剤であるミリオシン孵置はPALの効果を消失させた。さらに、セラマイドの合成基質とならないミリスチン酸(MYR)やオレイン酸はインスリン抵抗性を惹起しなかった。以上の結果よりFFAを基質として細胞内でde novo合成されるスフィンゴ脂質の一つであるセラマイドがインスリン抵抗性の原因であることが示唆された。さらに、Akt活性の抑制機序として、細胞内セラマイド合成亢進を介して、PP2A活性を直接刺激し、Aktを脱リン酸化することを見出した。一方、肝臓のモデル細胞であるFao細胞においてもPALとC2セラマイドはAktリン酸化を抑制したが、PP2A活性化は伴わず、オカダ酸の抑制効果も認めなかった。さらに、MYRでもインスリン抵抗性が惹起された。さらに、筋肉細胞のモデル細胞であるL6細胞においては、PAL、MYRとC2セラマイドによりAktリン酸化を抑制したが、これは、オカダ酸により解除された。以上のことより、FFAによるインスリン抵抗性惹起機構は、単一ではなく、各臓器において異なることが示唆された。
枯草菌における非翻訳型RNAによる遺伝子発現制御ネットワーク解析

様々な生物種において、ゲノム解析が進むにつれ、これまでの予想を超える数の非翻訳型RNAが存在することが明らかとなってきた。大腸菌においても、30種類の非翻訳型RNAが同定されているが、機能の詳細は明らかになっていない。これらの多くは菌の生育に必ずしも必須ではなく、外部環境の変化に対応するための遺伝子発現制御に関与している。BS190 RNAは、枯草菌において同定された安定かつ、大量に存在する非翻訳型RNAである。遺伝子破壊株を用いた解析を行い、機能解析を行った。DNAマイクロアレイ解析の結果、BS190 RNA遺伝子破壊株では、6個の遺伝子の発現が野生型と比べ、20倍以上に上昇していた。これらの遺伝子はすべて同一のオペロン上に存在し、分岐状の側鎖を持つアミノ酸(Ile,および、Val, Leu)の生合成に関与している。さらに、BS190 RNAは、このオペロンのプロモーター下流のリーダー配列と10塩基の相補配列を2ヶ所持ち、ゲルシフト解析の結果、mRNAのリーダー配列と相互作用することが明らかとなった。以上の結果より、BS190 RNAは、5'リーダー配列と相互作用することにより、転写レベルで負に発現制御することが示唆された。これまで、非翻訳型RNAの機能については、翻訳レベルでの報告に限られており、転写レベルでの機能を示した最初の報告として、本研究は意義深い。現在、枯草菌で同定された他の非翻訳型RNAの機能解析を進めると同時に、5'上流のアテニュエーター領域が直接代謝産物と結合して機能するリボスイッチの制御機構についても解析を行っている。
透析患者の診療内容，バイオマーカーと予後に関する大規模観察研究の計画

計2,292名の透析患者を対象とした後向きコホート研究では,高リン血症を有する患者において炭酸ランタンの使用が生命予後を改善する可能性が示された。一方,良好な血糖管理やレニン・アンジオテンシン系阻害薬の使用に関しては,生命予後との有意な関連性は見出されなかった。前向きコホート研究には654名の透析患者が参加し,3年間の観察を完遂した。FGF23の中央値は1,878 pg/ml,分泌型Klothoの平均値は377 pg/mlであった。今後,FGF23や分泌型Klothoを含む患者データが生命予後や心血管イベントに及ぼす影響を検討する予定である。この研究は,カルテ調査による介入をともなわない観察研究である.2013年度には,まず後ろ向き研究として,関連施設の維持透析患者2292名(予定2500名)を登録した.患者背景の解析を行ったところ,この東海透析コホートの患者集団が,日本透析医学会のレジストリーによるわが国の透析患者の平均像に近似していることが確認された.さらに,より具体的な解析として,リン吸着薬の使用と生命予後の関係,低Na血症と総死亡の関係,RAS阻害薬使用と生命予後の関係,血糖管理状況と生命予後の関連性の解析を行った.また,前向き研究として,657名の患者の登録行ない,観察開始時の患者背景のデータ収集と解析を行った.予定症例数は800例であったが,あらかじめ20%の脱落,データ欠損を想定しており,問題のない範囲と考えられる.さらにこれらの患者について,観察開始時に採血を行い,一部特殊検査を行った.今後イベントの記録をすすめつつ,検査データも含めた患者背景の検討を行う.後ろ向き大規模コホート研究の解析:2007年12月31日の時点で3ヶ月以上にわたって安定した血液透析を週3回受けていた18歳以上の患者計2292名について、患者背景、透析条件、処方内容、定期検査結果、アウトカム(骨折、心血管イベント、死亡)などのデータを収集し、解析を開始した。この中で、リン吸着薬処方の生命予後に対する影響を、傾向スコアマッチングを用いて解析し、感度分析も行ったところ、血清リン濃度6.0mg/dl以上の患者においては、炭酸ランタンの処方が良好な生命予後と関連していることを示すことができ、この論文はNephrology Dialysis Transplant誌に掲載された。前向き大規模コホート研究のデータ収集と解析:計657名の患者を登録し、現ベースラインデータの解析を行うとともに、経過を追跡中である。また、追跡開始時に血液サンプルを採取し、特殊検査の一部の結果も得ている。後向き大規模コホート研究の解析:2292名の血液透析患者を対象に,患者背景,透析条件,処方内容,定期検査結果などのデータを収集し,アウトカム(骨折,心血管イベント,死亡)に及ぼす影響を解析し。われわれは前年度に,血清リン値6.0 mg/dl以上の症例において炭酸ランタンの処方が生命予後の改善に関連することを論文に発表しているが,さらに死因を詳細に検討し,心血管合併症による死亡に限定した場合は,炭酸ランタンによる生命予後の改善は,血清リン値6.0 mg/dl以上の症例に限定されないことを見出した。現在,本研究の観察期間を3年から7年に延長し,この結果を再検証する予定としている。前向き大規模コホート研究の解析:計654名の患者が同意の上,本研究に参加した。観察開始時の患者背景は,平均年齢65.6歳,男性67.0%,糖尿病性腎症32.7%,透析歴の中央値75ヶ月であり,日本透析学会の統計調査の報告に近い患者集団であった。特殊検査に関しては,FGF23の中央値1878 pg/ml,分泌型Klothoの平均値377 pg/mlであった。現在,アウトカム調査を行っており,約8割のデータ回収を終えている。今後,これらのバイオマーカーが予後に及ぼす影響を検討する予定である。後ろ向き研究については、複数のクリニカルクエスチョンについて解析が進行しており、順次論文化に取り掛かっている。前向き研究については、観察期間の終了前であるので、ベースラインデータの解析ならびに採取した血液で特殊検査の一部を行い結果を得ている。腎臓内科学後ろ向き研究については、解析の進んだものから論文化を強力に進めるとともに、新たに加わったクエスチョンに対するデータセットの抽出を行い、解析の準備を進める。前向き研究については、観察期間終了次第、データの固定を行い、ただちに解析に取りかかれるようにする。また、血液サンプルについて、追加の特殊検査を行う予定である。現在までに以下の解析をまとめ,国内外の学会にて発表を行った.

目下,英文論文化を進めている.非カルシウム含有リン吸着薬である炭酸ランタンの使用によって生命予後が改善する可能性が示唆された.透析患者において低Na血症が総死亡の予測因子になることが示された.透析患者では,HbA1cで評価される血糖管理状況と生命予後に関連性が乏しいことが示された.RAS阻害薬が生命予後を改善する可能性が示唆されたが,患者背景で調整すると統計的に有意ではなかった.特殊検査について追加で行う必要がある項目が生じたため、その測定キット代をくりこした。後ろ向き研究については,特定の薬剤使用の有無と予後との関係,ルーチン検査値の異常と予後の関係について複数の解析が予定されているので,順次実施する.前向き研究については,特殊検査データも含めた患者背景の整理を行いつつ,イベントの記録を進め,最終解析に備える.また未測定の特殊検査を実施する.特殊検査キット代、英文校正、報告書印刷代で振り分ける。前向き研究の採血サンプル収集のタイミングにより,予定していた特殊検査の一部が年度内に終了しなかったため,次年度送りとなった.残った検査を行うためのキット代,消耗品費,解析のためのパソコン費用として使用予定である.
対流圏OHラジカルの収支を支配する大気化学反応の解明

対流圏OHラジカルは、メタンなどの炭化水素や人為起源物質と効率よく反応するため、それらの大気寿命や消滅経路を決める重要なラジカルである。しかし、現存の大気化学モデルでは、大気中のOHラジカルの定常濃度の計算値が、フィールド計測と一致せず、OHラジカルの生成消滅過程には、未知の反応経路があることが指摘されている。最初に書いたように、OHラジカルは反応性が高いので、OHのモデル・実測の不一致は、対流圏化学の根幹をなす重要な問題である。そこで、本研究課題では、OHの生成に敏感に影響するオゾンの紫外光反応過程や、OHラジカルそのものの反応性などについて、ラボ実験による詳細な研究を行った。その成果は、合計10報の論文としてまとめられ、国際的な学術誌に掲載された(裏面参照)。オゾンの光分解実験では、230-300nmの光解離反応で生成するO(^1D)の量子収率を真空紫外レーザー誘起蛍光分光法で求めた。2nm間隔で測定を行ったのは、我々が初めてである。これにより、230-300nmにおけるO(^1D)の生成量子収率は、波長にほとんど依存せず、だいたい一定の値(_》0.91)であることが明らかになった。また、大気モデルの世界標準となっているNASA・ジェット推進研究所のデータベース推奨値(0.95)に比べて、小さいことも分かった。次に、一次元光化学モデルにより、OHラジカルの定常濃度の変化を調べた。つまり、本研究で得られたO(^1D)の新しい量子効率の結果と、300-330nmにおける実験結果とをモデルに入力し、地球大気におけるHOx(=OH+HO_2)の定常濃度にどのように影響するかを調べた。その結果、対流圏では、オゾンの光解離反応で生成するO(^1D)が増加するため、H_2Oとの反応によるHOxの生成効率が増加するが、成層圏では本研究の結果を使うことで、HOxの生成効率が小さくなることが分かった。本研究の目的は、オゾンなど対流圏OHラジカルの直接的前駆体であると考えられている分子に注目し、光分解反応や二分子反応で生成する反応生成物を同定すると同時に、その生成量子収率の波長や温度、圧カへの依存性を定量的に測定することである。平成13年度は、実験に用いる反応チャンバーの組み立て、およびシステムの構築を行った。反応チャンバーは、試料ガスを貯めたままで実験するタイプのいわゆる光化学スモッグチャンバーではな<、常時新しい試料ガスを流し入れつつポンプで排気する、"流通法"を用いた。これにより、反応物や光分解生成物が反応チャンバー内に蓄積して副反応が起こるのを防ぐことができるので、定量的な計測ができる。完成させた装置を使って、炭化水素とハロゲンとの反応速度係数の測定、オゾンの紫外光分解で生成する基底状態酸素原子O(^3P)原子と電子励起酸素原子O(^1D)との分岐比の波長依存性を研究した。ハロゲンや酸素原子の検出には、高感度で新しいレーザー技術である波長可変真空紫外レーザー誘起蛍光分光法を用いた。この高感度検出法により、低濃度な試料ガスでの実験を行うことが可能となり、副反応からの干渉を抑えるのに大変有効である。エタンやプロパンとハロゲンとの反応では、OHとの反応よりも反応速度定数が小さいため、大気中でのOHの消滅機構としては、炭化水素があまり重要ではないことが明らかになった。オゾンの紫外光分解では、NASA/JPL(2000)が大気モデリングに推奨しているO(^3P)/O(^1D)分岐比が、実測と違うことを初めて明らかにした。以上の成果をまとめた論文は、米国化学会(ACS)、米国物理学会(AGU)の機関雑誌に投稿し、すでに掲載、または、掲載を受理されて印刷中である。

つまり、本研究で得られたO(^1D)の新しい量子効率の結果と、300-330nmにおける実験結果とをモデルに入力し、地球大気におけるHOx(=OH+HO_2)の定常濃度にどのように影響するかを調べた。その結果、対流圏では、オゾンの光解離反応で生成するO(^1D)が増加するため、H_2Oとの反応によるHOxの生成効率が増加するが、成層圏では本研究の結果を使うことで、HOxの生成効率が小さくなることが分かった。
ペプチドを用いるタンパク質アミロイドの形成機構解析と制御

狂牛病やヒトのヤコブ病、アルツハイマー病をはじめ、近年、タンパク質の組織化・増幅現象としてタンパク質の3次元構造変化(ミスフォールディング)に起因したアミロイド線維形成に高い関心が集まっている。このような特性を有するタンパク質の立体構造形成および構造転移の原理を解明し、その制御物質を開発することは非常に重要である。本研究では、人工的に設計したペプチド群等を用いてアルツハイマータンパク質Aβ等のアミロイド線維化を制御する物質の創製とアミロイド線維化の解析に貢献する物質を創製することを目的にする。アルツハイマー病アミロイドAβペプチドの線維化を制御する人工ペプチドの創製:Aβペプチド(1-42)のアミロイド線維化を増幅できる人工ペプチドの創製を、蓄積したアミロイドペプチド科学研究成果をもとに実施した。6種の人工アミノ酸を含む短鎖の設計ペプチドを新規に合成し、既存のLFより強力にアミロイド線維化を増輻する機能性ペプチドを獲得した。また本人工ペプチドはAβペプチドの細胞毒性を大きく軽減させた。アルツハイマー病アミロイドAβペプチドの線維化を制御する人工タンパク質の創製:Aβペプチド(1-42)のアミロイド線維化を阻害・検出できる人工タンパク質の創製を、タンパク質工学手法により実施した。Aβを特異的に認識し、結合する人工タンパク質GFP-Aβを数種合成した。これら人工タンパク質はアミロイド線維化とくにオリゴマー生成の阻害能を有する。アルツハイマー病アミロイドAβペプチドのアミロイド線維化を制御する人工ペプチドの創製:Aβペプチド(1-40)および(1-42)のアミロイド線維化を制御(増幅・阻害・検出)できる人工ペプチドの創製を、申請者らが長年蓄積してきたアミロイドペプチド科学研究成果をもとに実施した。種々の短鎖の設計ペプチドを合成し、アミロイド線維化を制御できる機能性ペプチドを獲得した。アルツハイマー病アミロイドAβペプチドのアミロイド線維化を制御する人工RNAの創製:Aβペプチド(1-40)および(1-42)のアミロイド線維化を制御(増幅・阻害・検出)できる人工RNAの創製を、申請者らが蓄積してきた進化分子工学手法により実施した。Aβを特異的に認識し、結合する人工RNAをRNAライブラリの進化分子工学により獲得した。RNAはアミロイド線維化の阻害能を有している。
遺伝子導入により修飾されたキラーT細胞の抗腫瘍効果の解析

マウスグリオーマに特異的に反応するキラーT細胞株を同系マウスから樹立し、この細胞にマウスγーインターフェロン遺伝子をマウスレトロウイルスに組込んだ形にして導入した。この細胞の性質を検索するとγーインターフェロン遺伝子が持続的に発現して、γーインターフェロン産生が著しく高まっているほかクラスIIのMHCの発現が高まっていた。しかしクラスIのMHCの発現は元の細胞株と同程度であった。この細胞株のグリオーマ細胞障害性を検索すると、その作用は著しく強くなっていた。グリオーマ細胞はγーインターフェロンで前処理してからキラーT細胞と混合すると、キラーT細胞に対する感受性が高まる故に、上記の細胞障害性の昂進はその細胞の産生するγーインターフェロンによると考えられた。次にγーインターフェロン遺伝子を導入したキラーT細胞のin vivoにおける効果を検索した。マウスにグリオーマ細胞を皮下接種し、5日後に上記細胞を静脈内接種すると、腫瘍の生着がほとんどのマウスにおいて阻止された。遺伝子を導入していない元のキラーT細胞にはその効果は非常に弱く、この抗腫瘍効果の増進はin vitroでの細胞障害活性の増進をうわまわるものであり、in vivoにおいてはキラーT細胞が腫瘍細胞を直接障害するほかに、その産生するγーインターフェロンが生体の免疫機能を活性化して間接的に抗腫瘍効果を発揮していると考えられた。
光駆動型ナトリウムポンプの生理的意義とイオン輸送機構の解明

微生物型ロドプシンは、色素レチナールを内包する膜タンパク質である。レチナールの光吸収をきっかけとして、複数の構造の異なる中間体を経由する光反応サイクルを周り、この間にイオンの膜輸送や光情報伝達を行う。本研究では、外向きにNa+を輸送するNa+ポンプ型ロドプシン(NaR)の機能解析を行い、以下の成果を得た。1)タンパク質表面へのカチオン結合が暗状態の構造を変調し、光反応初期に出現する中間体を決定する。2)NaRのNa+取込みと放出が、O中間体の生成・崩壊に同期して起こることを、Na+濃度変化の直接観測から明らかとした。ロドプシンは、光センサーや光駆動型イオンポンプとして機能する膜タンパク質である。イオンポンプ型ロドプシンは、「光で瞬間的に活性化できる」という性質によって、輸送に含まれる要素反応を詳細に検討できる優れたモデルタンパク質である。本研究では、2013年に真正細菌から見出された新規のイオンポンプ型ロドプシンであるNa+ポンプ型ロドプシン(NaR)の要素反応を明らかとし、そこに係る重要アミノ酸残基の同定を通して、NaRの分子機構を考察する。本年度は以下の成果を得た。1.海洋性真正細菌を中心に10種ほどのNaRが報告されている。その中から、ポルトガルの温泉流水に生息する真正細菌がもつ2種のNaR(TR1、TR2)について、大腸菌発現系を構築した。低温下で、長時間の発現誘導を行うことによって、1 L培地あたり5 mgの収量が得るに至った。2.多くのNaRは、相互に高い相同性を有しているが、TR1, TR2は、他のNaRとは際立って相同性が低い。そのため、これらの機能解析を通して、Na+輸送にとって真に重要な機構の知見が得られると期待される。これまでに報告されたNaRでは、光照射後に、短波長側に吸収をもった光反応中間体(M中間体)が生成する。しかし、TR1とTR2では、この中間体が出現しないことが明らかとなった。M中間体は、ロドプシンが内部に保持している色素からH+イオンが解離することで生成する中間体である。このH+移動は、正電荷をもつNa+イオンのタンパク質内移動と密接に係ると考えられている。しかし、TR1とTR2の結果は、真に重要な反応は、H+移動そのものではなく、H+移動のきっかけとなり得る構造変化であることを示唆している。本研究では、2013年に真正細菌から見出された新規のイオンポンプ型ロドプシンであるNa+ポンプ型ロドプシン(NaR)の要素反応を明らかとし、そこに関わる重要アミノ酸残基の同定を通して、NaRの分子機構を考察する。1.真正細菌Truepera radiovictrixがもつNaR(TR1)の光反応サイクルの解析とイオン輸送活性の測定結果から、NaRのタンパク質表面には、Na+, K+などのカチオン結合サイトが存在すること。また、ここへのカチオン結合が、暗状態の構造を変調し、その結果、光反応初期に出現する中間体が変化すること。さらに、カチオンが結合しない場合にのみ、H+ポンプとして機能する、という知見を得た。2.光反応サイクル中のNa+放出・取込みを直接的に検出するため、Na+感応膜を用いた測定系を構築した。クラウン化合物をイオノフォアとして用い、0.1 mM 1 MのNa+濃度範囲で、直線的な膜電位応答を示す感応膜を作成した。脂質膜に再構成したNaR懸濁液に定常光を照射したところ、Na+濃度の減少を示す膜電位変化を観測した。よって、NaRは、光反応の初期にNa+を取込み、次いで放出することが、直接的な観測から明らかとなった。本研究では、NaRを膜輸送担体のモデル蛋白質として捉え、その輸送分子機構の解明を目指している。目的達成のための具体的な研究項目として、以下の3点を設定している。1.各輸送中間体で起こる要素反応を明らかとする。2.輸送に重要なアミノ酸残基を同定する。3.NaRの生理的意義を解明する。本年度は、概要欄に記載したように、項目1に大きな進展があった。TR1を用いた解析から、NaRは、溶液中に存在するカチオンの種類に依存して、Na+-pumping cycle、non-pumping cycle, H+-pumping cycleの3種類の光反応サイクルを回ることが示唆された。3つのサイクルの相互比較から、輸送中間体で起こる要素反応を予測することができた。また、項目2に関連して、光反応サイクルに影響を及ぼす、カチオン結合サイトの存在を予想した。一方、項目3の知見を得るために、T. radiovictrixがNaRを発現する条件を検索したが、発現は検出できなかった。本研究では、2013年に真正細菌から見出されたNa+ポンプ型ロドプシン(NaR)の分子機構解明を目指してきた。