hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マイクロ多孔質体内気液二相流の熱流動解析モデルの確立

固体高分子形燃料電池の実用化・高性能化のために,電極拡散層部を流れる酸素を含む空気・水蒸気と水分液体の気液二相の流動を対象として,マイクロスケール多孔質体内の気液二相流動に関して,圧力損失の測定と流動様相の観察の実験を行い,その結果に基づいて数値解析モデルを作成し,解析計算を実施した.これらより,以下の結果を得た.1.拡散層の圧力損失は層をなす基材部と撥水材部に分けて考える必要があることを指摘し,あわせて,細孔容積分布に基づき基材部と撥水材部の空隙率の値をそれぞれ決定した.2.ガス単相流れの測定値に基づき,基材部および撥水材部の絶対透過率の値をそれぞれ決定した.3.ガス単相流れの圧力損失に及ぼす湿分の影響は,ほとんどないことを明らかにした.4.気液二相流れの測定値に基づき,液相および気相に対する各相対透過率に関する値を得た.マイクロ多孔質体における相対透過率は,従来良く用いられるWyllieの式と比べてかなり低めの値を示す.5.基材部と撥水材部の液相相対透過率と気相相対透過率は,細孔径分布からそれぞれの毛管圧力を見積もり,Burdineの式に適用することで,比較的よく再現できる.6.拡散層の基材部と撥水材部の接触角をそれぞれ測定した.7.数値解析より,基材部と撥水材部の境界で水の蒸発が生じていること,および基材部の飽和度が大きくなって酸素の拡散を阻害しやすいことがわかった,また,撥水材部の細孔分布を基材側に近づけることで基材部の飽和度を小さくできるものの,電解質膜で十分な水分を保持できなくなることを示した.固体高分子形燃料電池の実用化・高性能化のために,電極拡散層部を流れる酸素を含む空気・水蒸気と水分液体の気液二相の流動を対象として,マイクロスケール多孔質体内の気液二相流動に関して,圧力損失の測定と流動様相の観察の実験を行い,その結果に基づいて数値解析モデルを作成し,解析計算を実施した.これらより,以下の結果を得た.1.拡散層の圧力損失は層をなす基材部と撥水材部に分けて考える必要があることを指摘し,あわせて,細孔容積分布に基づき基材部と撥水材部の空隙率の値をそれぞれ決定した.2.ガス単相流れの測定値に基づき,基材部および撥水材部の絶対透過率の値をそれぞれ決定した.3.ガス単相流れの圧力損失に及ぼす湿分の影響は,ほとんどないことを明らかにした.4.気液二相流れの測定値に基づき,液相および気相に対する各相対透過率に関する値を得た.マイクロ多孔質体における相対透過率は,従来良く用いられるWyllieの式と比べてかなり低めの値を示す.5.基材部と撥水材部の液相相対透過率と気相相対透過率は,細孔径分布からそれぞれの毛管圧力を見積もり,Burdineの式に適用することで,比較的よく再現できる.6.拡散層の基材部と撥水材部の接触角をそれぞれ測定した.7.数値解析より,基材部と撥水材部の境界で水の蒸発が生じていること,および基材部の飽和度が大きくなって酸素の拡散を阻害しやすいことがわかった,また,撥水材部の細孔分布を基材側に近づけることで基材部の飽和度を小さくできるものの,電解質膜で十分な水分を保持できなくなることを示した.固体高分子形燃料電池の実用化・高性能化のために,電極拡散層部を流れる酸素を含む空気・水蒸気と水分液体の気液二相の流動を対象として,マイクロスケール多孔質体内の気液二相流動に関して,圧力損失の測定装置を製作して実験を行い,撥水材の割合をいくつか変えた繊維状ポーラスカーボンの拡散層について,それぞれ,窒素単成分,窒素ガス+水蒸気2成分,および窒素ガス+水蒸気の2成分ガスに水分(液体)を付加した気液二相流の圧力損失を測定して,以下の結果を得た.1.拡散層の圧力損失は層をなす基材部と撥水材部に分けて考える必要があることを指摘し,あわせて,細孔容積分布に基づき各拡散層の基材部と撥水材部の空隙率の値をそれぞれ決定した.2.ガス単相流れの測定値に基づき,各拡散層について,基材部および撥水材部の絶対透過率の値をそれぞれ決定した.さらに,平均貫通細孔径およびピーク気孔径をパラメータとする絶対透過率の整理式を作成した.3.ガス単相流れの圧力損失に及ぼす湿分の影響は,ほとんどないことを明らかにした.4.気液二相流れの測定値に基づき,液相および気相に対する各相対透過率に関する値を得た.得られた液相および気相の相対透過率の関係を,従来良く用いられるWyllieの式と比較し,マイクロ多孔質体における相対透過率はWyllieの式と比べてかなり低めの値を示すことを明らかにした.5.圧力損失実験とは別に,拡散層の基材部と機水材部の接触角をそれぞれ測定した.固体高分子形燃料電池の実用化・高性能化のために、電極拡散層部を流れる酸素を含む空気・水蒸気と水分液体の気液二相の流動を対象として、マイクロスケール多孔質体内の気液二雄流に関する圧力損失の測定と流動様相観察の実験を行い、その結果に基づいて、数値解析モデルを完成した。

実験では、前年度に引き続き、窒素ガス+水蒸気の2成分ガスに水分(液体)を負荷した気液二相を試験多孔質体を通過して流し、気液二相流中に液相が少ない場合あるいは逆に多い場合について、特に詳細な圧力損失の測定と流動様相の観察を行った。解析では、前年度また本年度得た種々の条件の実験データと、流動様相の観察結果ともつきあわせて、数値解析モデルの改良を行い、電極拡散層部を対象とした2次元モデルの数値解析を実施した。これらより、以下の結果を得た。1.基材部と撥水材部の液相相対透過率と気相相対透過率は、水銀圧入法による細孔径分布からそれぞれの毛管圧九を見積もり、Burdineの式に適用することで、再現できる。2.流出様相の観察より、液体流量の増加にともなって、流出細孔の数が増加することがわかった。3.数値解析より、基材部と撥水材部の境界で水の蒸発が生じていること、基材部の飽和度が大きくなって酸素の拡散を阻害しやすいこと、また撥水材部の細孔分布を基材側に近づけることで基材部の飽和度を小さくできるものの、液相圧力が低下し電解質膜で十分な水分を保持できなくなるため、両者の兼ね合いにより最適拡散層の設計を行う必要があることがわかった。
生産環境・流通環境の影響を考慮した果実品質向上のための新流通システムの提案

新鮮なマンゴー果実の供給システムの現状を改善するために,マンゴー果実の生産環境,流通環境ならびに流通中の果実品質の変化特性を把握する必要がある.したがって,本研究では,タイ王国のピッサヌロークとプラオの輸出用果実を生産している商業圃場を調査対象として,マンゴー生産における水管理状況を評価するとともに,実際の流通環境を再現した流通温度区ならびに1535°Cの一定温度で貯蔵した果実品質の経時変化について調査した.現地調査に先立ち,タイ・チェンマイにおいてキックオフセミナーを開催し,生産環境,流通環境,品質管理の各ユニットの調査項目を確認することにより,研究全体の方向性を相互に共有した.現地調査は,チェンマイ県プラオ郡ならびにピッサヌローク郡の輸出用マンゴー栽培農場で実施した.調査項目は以下のとおりである.1生産環境ユニット:圃場環境(土壌水分,気温,地温,湿度,日射量,風速,土質化学),栽培技術(水管理,土壌表面管理,農薬,花成誘導時期,剪定,摘蕾・摘果),マンゴー樹の生理情報(葉温等).2品質評価ユニット:品質項目(糖含量,L-アスコルビン酸含量,デンプン含量,硬度,色度),マンゴー果実の生理活性(呼吸)に関する実験.3流通環境ユニット:流通環境(コンテナ内温度,湿度,振動,ガス環境,輸送距離,輸送時間),流通技術(輸送方法,包装技術,包装素材)の調査.タイの流通構造,システムの聞き取り調査.具体的な取り組みとして,1のユニットでは,今年度は,プラオおよびピッサヌロークにおいて,土壌サンプルを採取し,それぞれの圃場の保水性,透水性および粒度組成を実験によって求め,圃場の土壌特性の違いを明らかにした.また,土壌中の水分および物質移動を表現するシミュレーションモデルを構築し,モデルのインプットデータを収集した.2および3ユニットでは,本年度は,マンゴーの果実表皮の色度と果肉品質指標(硬度、糖度、ビタミンC)の関係性について,機械学習の一手法であるランダムフォレストを用いて解析した.結果として,果実表皮の色から,品質指標を高精度に推定できることを明らかにした.全体構想として,本課題では,タイ王国産のマンゴー果実を対象とし,その生産体系と流通過程の最適化モデルを構築し,栽培および輸送技術の高度化指針の提案を行うとともに,効率的な流通マネジメントシステムの提案を行うことを目的としている.具体的には,タイ王国チェンマイ県ならびにピッサヌローク県のマンゴーのプランテーションを行っている商業圃場にて輸出用果実の生産地をフィールドとしている.生産環境評価ユニットにおいては,水管理手法が生産環境に及ぼす影響を定量評価するために,土壌中の水分・熱同時輸送モデルと土壌ー植物ー大気の連続系モデルを組み合わせた生長収量予測モデルを構築を行っている.このモデルへの入力データは,品種,気象環境,栽培条件(環境,技術)であり,その結果,マンゴー果実の収量および品質が出力される.さらに,マンゴー樹への水ストレスを土壌水分モデルにより定量的に評価している.流通環境ユニットは,収穫直後のマンゴー果実の品質および生理活性変化を分析している.ここで,品質評価では,全糖含量,アスコルビン酸(ビタミンC)含量,デンプン含量,硬度,表面色度および糖酸度を測定し,生理活性評価では,果実の呼吸速度を計測した.続いて,生産地から消費地までの輸送経路や距離,輸送手段,流通形態,輸送中の温湿度および振動等の流通環境について調査した.以上に基づき,収穫後のマンゴー果実の品質および生理活性変化を定量評価する数理モデルを構築を行っている.なお,輸送中(約3週間)の環境条件はブラックボックス化されているため,計測データに基づいて輸送環境を日本の実験室内で再現することにより,経時的な生理活性評価を行っている.全体構想として,本課題では,タイ王国産のマンゴー果実を対象とし,その生産体系と流通過程の最適化モデルを構築し,栽培および輸送技術の高度化指針の提案を行うとともに,効率的な流通マネジメントシステムの構築を行うことを目的とした.具体的には,タイ王国チェンマイ県ならびにピッサヌローク県のマンゴーのプランテーションを行っている商業圃場にて輸出用果実の生産地をフィールドとして調査した.生産環境評価ユニットにおいては,マンゴー圃場における生産環境を明らかにするため,圃場を掘削し,深さ5cm,25cmおよび65cmに誘電式土壌水分センサー(5TE,Decagon)を埋設し,体積含水率,地温およびバルクECの経時変化を測定した.また,センサーの設置個所において土壌サンプルを採取し,飽和透水係数と水分特性曲線を求めた.流通環境ユニットは,収穫直後のマンゴー果実の品質および生理活性変化を分析した.ここで,品質評価は,重量,全糖含量,デンプン含量,果実硬度および表皮色を測定し,生理活性評価では,果実の呼吸速度を計測した.また,異なる貯蔵温度条件を設定し,品質変化からプレミアムなマンゴーの開発を試みた結果,輸入タイ産マンゴーをプレミアムな商品として販売するには,消費地における貯蔵中に,褐変がなく,重量減少率が5%以下であるうちに,デンプンの糖化による全糖含量の増加量を最大にする必要があることが明らかになった.新鮮なマンゴー果実の供給システムの現状を改善するために,マンゴー果実の生産環境,流通環境ならびに流通中の果実品質の変化特性を把握する必要がある.

したがって,本研究では,タイ王国のピッサヌロークとプラオの輸出用果実を生産している商業圃場を調査対象として,マンゴー生産における水管理状況を評価するとともに,実際の流通環境を再現した流通温度区ならびに1535°Cの一定温度で貯蔵した果実品質の経時変化について調査した.生産環境ならびに流通環境に関する各種基礎データを収集し,データマイニング手法のための基礎データの蓄積を順調に行っているため.27年度が最終年度であるため、記入しない。ポストハーベスト工学データマイニング手法のための基礎データの蓄積を順調に行っているので,それらのデータを活用し,生産環境と流通環境が果実品質に及ぼす影響を定量的に評価する.生産環境,流通環境,品質評価ユニットそれぞれが独立した部分と連携した部分があるが,全体ではお互いが協力し合い概ね順調であるといえる.しかしながら,一点,タイの流通構造に関する聞き取り調査については,調査項目の選定等の準備は進行しているものの,現地調査に至っていたないため,やや遅れているといえる.27年度が最終年度であるため、記入しない。謝金で雇用する予定の方が,保育園に子供預けることができずに,育児休業から復帰できなかったため,謝金が100万円ほど余剰となった.27年度が最終年度であるため、記入しない。生産環境ユニットにより構築中のモデルを用いることにより,マンゴーの生育期間を通して灌漑および施肥のタイミングを予測することが可能であると考えられるが,それを,品質評価ユニットの行う収穫実果実品質評価との相互評価を実施することにより,もう一段階進めて高品質なマンゴー果実生産のための指標となり得るモデル構築に取り組む.流通環境ユニットおよび品質評価ユニットの成果から,果実表皮の色度をモニタリングすることにより,非破壊的に内部品質の経時変化を評価可能になると考えられたので,実際の流通環境を実験室にて再現することにより,実際の流通に即した環境における果皮色のみならず,内部品質評価の可能なモデル構築に取り組む.また,流通システムについては,ステークホルダーの業務に対する意識を明確にし,問題を顕在化するための聞き取り調査を実施する.今年度に,人件費ならびに旅費として支出する.27年度が最終年度であるため、記入しない。平成27年度の配分金額が少ないが,27年度も充分な調査や報告会が実施できるように配慮し,タイ現地で行うフィールド調査やミーティングの際には最低限の渡航人数となるよう調整し,旅費を圧縮したことと,アルバイトを雇用せず,ほとんどの作業を自分でやることで人件費を削減したため.平成27年度にタイへ数回渡航するための資金として利用する.
ＩｇＧ４関連腎臓病モデルマウスの確立とその病態への自己反応性Ｔｈ２細胞の役割

転写因子IRF-1を欠損するSLEモデルマウス(MRL/lpr系統)における腎病変とヒトIgG4関連腎臓病との比較を行い、本マウスのヒトIgG4関連腎臓病モデルとしての有用性について検討した。IRF-1欠損MRL/lprマウスでは、9週齢から腎の尿細管間質に炎症性細胞浸潤を認めた。腎組織の病理解析の結果、好酸球・CD4陽性T細胞・IgG1陽性形質細胞の浸潤が認められた。また、MRL/lprマウスの蛋白尿の主要因となる糸球体病変がIRF-1欠損下では改善されたが、蛋白尿ならびにBUN高値を示した。以上より、本マウスがIgG4関連腎臓病の腎障害を研究するモデルとして有用であることが一部示された。IgG4関連疾患は近年注目を集めている慢性炎症性疾患である。本疾患では自己免疫の関与が示唆され、血清IgG4高値、病変部でのTh2優位のサイトカイン産生などが報告されているが未だその病態機序はほとんど明らかにされていない。我々はこれまでに転写因子Irf-1を欠損する自己免疫疾患モデルマウス(MRL/lpr系)、Irf1-KO MRL/lprマウスが12週齡以降でIgG4関連腎臓病と類似した間質性腎炎を自然発症し、一方、非自己免疫系のIrf1-KO C57BL/6マウスでは発症しないことを報告した。Irf1-KO MRL/lprマウスでは腎間質へのCD4陽性T細胞・好酸球の高度浸潤、ならびに腎臓・脾臓におけるIL-4産生性Th2細胞の著明な増加を認め、ヒトIgG4関連腎臓病のモデルとして有用であると考えられた。そこで、我々はIrf1-KO MRL/lprマウスの間質性腎炎を病理組織学的、血清生化学的、病態生理学的に詳細に解析してヒトIgG4関連腎臓病の病態と比較することで、そのモデルとしての有用性を明らかにし、さらに病態形成における自己反応性Th2細胞を介したメカニズムを推定しようと考えた。これまでは主に病理組織学的な解析を行ってきた。その解析の結果からは本マウスは腎の病変像がヒトIgG4関連腎臓病のそれと酷似していることから有用な疾患モデルとなり得ることに加え、肺にCD68陽性マクロファージの浸潤・異物型巨細胞形成・類上皮細胞結節を主体とするびまん性の肉芽腫性炎症を認め、肺に炎症性病変を来す症例のメカニズム解明にも有用なモデルとなると考えられた。本疾患では自己免疫の関与が示唆され、血清IgG4高値、病変部でのTh2優位のサイトカイン産生などが報告されているが未だその機序は明らかにされていない。我々はこれまでに転写因子Irf1を欠損する自己免疫疾患モデルマウス(MRL/lpr系)、Irf-KO MRL/lprマウスが12週齡以降でIgG4関連疾患腎臓病と類似した尿細管間質性腎炎を自然発症し、一方、非自己免疫系(C67BL/6系)Irf1-KOマウスでは発症しないことを報告した。Irf1-KO MRL/lprマウスでは、腎間質へのCD4陽性T細胞・好酸球の高度浸潤、ならびに腎臓・脾臓におけるIL-4産生Th2細胞の著明な増加を認め、ヒトIgG4関連腎臓病のモデルとして有用であると考えられた。そこで、我々はIrf1-KO MRL/lprマウスの尿細管間質性腎炎を病理組織学的、血清生化学的、病態生理学的に詳細に解析してヒトIgG4関連腎臓病の病態と比較することで、そのモデルとしての有用性を明らかにし、さらに病態形成における自己反応性Th2細胞を介したメカニズムを推定しようと考えた。その結果からは本マウスは腎の病理像がヒトIgG4関連腎臓病のそれと酷似していることから有用な疾患モデルとなり得ることに加え、肺にCD68陽性マクロファージの浸潤・異物型巨細胞形成・類上皮細胞結節を主体とするびまん性の肉芽腫性炎症を認め、肺に炎症性病変をきたす症例のメカニズム解析にも有用なモデルとなると考えられた。病理組織学的検討をさらに進めたため、血清学的評価およびステロイド反応性の評価などの予定していた計画を終了できていない。また、Irf1-KO MRL/lprマウス由来のTh2細胞の移入実験を予定していたが、レシピエントとなるMRL/lprマウスは放射線感受性が強く、免疫抑制状態と死亡の間の域値が非常に狭く、X線照射条件を確立できなかった。本年度の研究では、自己免疫を示すMRL/lprマウスのIrf1+/+、Irf1+/-、Irf1-/-各群について、18週齢における血清・尿の解析ならびに、免疫組織化学染色による腎臓の病理組織学的評価を行い、ヒトIgG4関連腎臓病の病態との比較を行った。血清中のBUN値について各群で比較を行った結果、3群間の有意差は認められなかったが、3群共に健常マウスと比較して高値を示した。尿中のアルブミン量を測定した結果、野生型と比較してIrf1-/- MRL/lprマウスで低値を示す傾向であったが、有意差は認められなかった。BUNの結果より、野生型で起こる糸球体病変がIrf1-/-

群では改善されるのに対し、間質の炎症性病変を発症するために腎機能の改善が認められないことが示唆された。18週齢のIrf1-/- MRL/lprマウスの腎の免疫染色の結果、浸潤領域のほぼ全域が形質細胞マーカーであるCD138陽性を示した。さらに、同領域の一部に抗マウスIgG1抗体で染色される細胞が検出され、IgG1産生性の形質細胞がIrf1-/- MRL/lprマウスの腎に浸潤していることが示唆された。マウスはIgG4アイソタイプの抗体を産生しないが、ヒトのIgG4と最も類似した性質を持つマウスの抗体クラスはIgG1であると言われている。我々のマウスにおけるIgG1陽性形質細胞の浸潤が病態形成に関わるのか、発症の結果見られているものかは定かではないが、浸潤細胞における類似の病態が認められた。その他のCD138陽性領域の細胞については、これまでに検出していたCD4陽性T細胞ではないことも明らかにしたが、細胞種の同定はできておらず、今後の検討項目として考えている。転写因子IRF-1を欠損するSLEモデルマウス(MRL/lpr系統)における腎病変とヒトIgG4関連腎臓病との比較を行い、本マウスのヒトIgG4関連腎臓病モデルとしての有用性について検討した。IRF-1欠損MRL/lprマウスでは、9週齢から腎の尿細管間質に炎症性細胞浸潤を認めた。腎組織の病理解析の結果、好酸球・CD4陽性T細胞・IgG1陽性形質細胞の浸潤が認められた。また、MRL/lprマウスの蛋白尿の主要因となる糸球体病変がIRF-1欠損下では改善されたが、蛋白尿ならびにBUN高値を示した。以上より、本マウスがIgG4関連腎臓病の腎障害を研究するモデルとして有用であることが一部示された。病理組織学的検討に時間を要し、平成26年度に予定していた病態生理学的および免疫血清学的検索を終了できていない。まずは、血清学的評価を中心に研究を進めていく。その後、主に腎病変についてのステロイド反応性の評価を行っていく予定である。これらと並行して尿細管間質性腎炎の病態形成における自己反応性Th2細胞の役割を明らかにするため、Irf1-KO MRL/lpr-EGFPマウス由来のTh2細胞の移入実験に必要なRag2ノックアウトマウス(C57BL/6系)のMRL/lpr系へのバッククロスを行っていく。膠原病・リウマチ内科学これまでは主に18週齢のIrf1-KO MRL/lprマウスの解析を行ってきたが、さらに9、12、15週齢の血清、尿、腎の採取をほぼ終了しており、間もなく目的の検体がすべてそろう予定である。そのため、今年度中にそれらの解析を行い病態がどのように形成されていくのかを検討していく。また、血清、尿の血清免疫学的解析を行ってヒトIgG4関連腎臓病の臨床所見と対比させ、Irf1-KO MRL/lprマウスがIgG4関連腎臓病の疾患モデルマウスとして有用であるかどうかをさらに詳しく検討する。また、その間質性腎炎の病態形成における自己反応性Th2細胞の役割を調べるため、レシピエントマウスのX線照射による移入前処置条件を検討中であるが、MRL/lprマウスは放射線感受性が高く、免疫抑制状態と死亡の間の域値が非常に狭いため、現時点では条件設定が確立できていない。そのため、X線照射による条件検討をすすめるとともに、免疫抑制薬投与による移入前処置も考え条件を検討中の他、Rag2ノックアウト系のマウスの使用も考慮している。研究の進行の遅れから、まだ購入していない試薬等があるため。
細胞周期特異的局在性を利用した卵子特異的リプログラミング因子の網羅的探索

クローン動物の作製効率の改善に向け、マウスを用いて卵子特異的なリプログラミング因子の探査を行った。標的は「核を除去した前核期卵の細胞質と比較して、未受精卵に多く存在するタンパク質」であり、卵子由来サンプルを質量分析装置で解析することで、この条件に合致したタンパク質の内で最大比であったヌクレオプラスミンをリプログラミング因子の第一候補として研究を進めた。本研究期間中に、ヌクレオプラスミンのmRNAを核移植の際に同時注入することでクローン胚を作製し、体外培養および移植試験により発生への効果を確認するに至っている。核移植によるクローン動物の作製効率の改善に向け、ドナー核がリプログラムされるメカニズムやその誘導因子(リプログラミング因子)の解明に取り組んでいる。本課題では、「標的因子は卵子内で局在性を示す」という仮説を基に、「核を除去した間期の卵子細胞質には存在せず、その除去した核を含む細胞質に存在し、且つ未受精卵細胞質中に存在するタンパク質」の分離・解析を実施することで、卵子特異的なリプログラミング因子の探査にあたる。平成25年度においては、標的タンパク質を分離・解析するための材料であるマウスの未受精卵、間期受精卵(前核期卵)、核を除去した前核期卵の細胞質、および前核期核とその周辺細胞質の収集作業にあたった。PMSGとhCGの投与により過剰排卵誘起処置を施したBDF1雌を供試し、未受精卵の場合はhCG投与から16-18時間目に排卵卵子を回収し、酸性液で透明帯を除去した後、-80°Cで約2,800個を保存した。前核期卵の場合は雄マウスとの交尾を設定してhCG投与から20-24時間目、もしくは体外受精後8-12時間目の受精卵を回収し、同様の手順で約2,200個を保存した。核を除去した前核期卵の細胞質および前核期核とその周辺細胞質の場合は、前述の手順で回収した受精卵について細胞骨格重合阻害剤を含むPBI液中で顕微操作することでそれぞれを分離し、同様の手順で各々約1,000個を保存した。その他、リプログラミング関連遺伝子の解析について予備的実験を行った。また、今後の予定・方針について、分担研究者ならびに技術委託予定の専門業者と打合せを行い、最新情報の収集と予定確認を行った。その結果、タンパク質分離手段として予定していた二次元電気泳動法と比較して2倍程度の分解能を持つ新規手段を利用可能であることがわかり、材料収集の目標を半分程度に削減することとした。平成26年度においては、前年度より引続いて、標的タンパク質を分離・解析するための材料収集作業を行い、マウスの未受精卵3,239個、間期受精卵(前核期卵)2,800個、核を除去した前核期卵の細胞質およびその周辺細胞質5,042個(組)を収集するに至った。先ず、未受精卵および核を除去した前核期卵の細胞質を解析の対象とすることとして、BCA法によりタンパク質定量を実施した結果、それぞれ約35.0μgおよび24.0μgであった。次に、これらをiTRAQ試薬でラベルした後にLC-MS/MS分析に供してタンパク質発現・相対定量解析(株式会社アプロサイエンスに依託)を実施した結果、825種類のタンパク質を検出することができ、818種類について定量的比較が可能であった。本研究で標的とするタンパク質は「核を除去した前核期卵の細胞質と比較して、未受精卵に多く存在する」ものであり、818種類中93種類がこれに該当した。特に1.5倍以上のものは2種類あり、最大比(2.812倍)のものをリプログラミング因子の第一候補とした。現在、卵子・受精卵・細胞における遺伝子発現と免疫染色による分布を確認中であり、同時にリプログラミング能力の検証に向けて発現ベクターの構築を進めている。本課題では、核移植によるクローン動物の作製効率の改善に向け、「標的因子は卵子内で局在性を示す」という仮説を基に、「核を除去した間期の卵子細胞質には存在せず、その除去した核を含む細胞質に存在し、且つ未受精卵細胞質中に存在するタンパク質」の分離・解析を実施することで、卵子特異的なリプログラミング因子の探査にあたる。平成26年度までに、卵子由来サンプルをLC-MS/MS分析に供することで818種類のタンパク質について定量比較し、サンプル間の存在比が仮説に相当した93種類のタンパク質内で最大比(2.812倍)であったヌクレオプラスミンをリプログラミング因子の第一候補として研究を進めた。平成27年度では、先ず免疫染色により卵子中の分布を調べることで想定通り細胞周期間期では核に局在することを確認した。次にタグ遺伝子を連結したヌクレオプラスミン発現ベクターを作製し、これを用いて精製したmRNAを卵子にインジェクションすることで、タンパク質合成と発生への影響を調べた。未受精卵にインジェクションした後に活性化処置を施して作製した前核期卵についてタグ抗体での免疫染色により調べた結果、タンパク質合成と核における局在を検出することができた。

また、体外培養により発生への影響を調べた結果、注入量が約100ng/microL x 0.5pL、約500ng/microL x 0.5pL、約1,000ng/microL x 0.5pLのいずれの場合でも胚盤胞への発生率に差は認められなかった。これらの結果を受けて、約1,000ng/microL x 0.5pLを核移植の際に同時注入することでクローン胚を作製し、体外培養および移植試験により発生への影響を確認するに至っている。クローン動物の作製効率の改善に向け、マウスを用いて卵子特異的なリプログラミング因子の探査を行った。標的は「核を除去した前核期卵の細胞質と比較して、未受精卵に多く存在するタンパク質」であり、卵子由来サンプルを質量分析装置で解析することで、この条件に合致したタンパク質の内で最大比であったヌクレオプラスミンをリプログラミング因子の第一候補として研究を進めた。本研究期間中に、ヌクレオプラスミンのmRNAを核移植の際に同時注入することでクローン胚を作製し、体外培養および移植試験により発生への効果を確認するに至っている。当初計画では、本研究における標的タンパク質を分離・解析するためには150μg程度のタンパク質を得る必要があり、マウス卵子1個あたりのタンパク質量を30ng程度と見込み、未受精卵5,000個程度、間期受精卵(前核期卵)5,000個程度、核を除去した前核期卵の細胞質10,000個程度、ならびに前核期核とその周辺細胞質15,000個程度の収集を目標とした。その後に得たタンパク質分析に関する新規情報により、当初予定していたタンパク質分離手段の2倍程度の分解能を持つ新規手段を利用できることがわかり、材料の収集目標数を当初計画の半分程度とした。この材料収集を初(平成25)年度中に完了する予定であったが、材料採取担当として予定していた人員(連携研究者)の確保、ならびに当初の想定に比して材料採取効率(マウス受精卵採取と顕微操作作業の効率)の見込み違い等の理由から、この予定を達成することができなかった。この為、次の行程であるタンパク質の分離・解析に開始時期について、当初計画からは約6ヶ月程度の遅滞を生じ、現時点でもこの遅滞分が当初研究予定に対する遅れとなっている。しかしながら、その後にこれらの問題は改善・解決され、平成26年度中に材料採取およびタンパク質の分離・解析は順調に進展することで完了した。また、次のステップであるリプログラミング因子の候補遺伝子の選抜、卵子・受精卵・細胞における遺伝子発現と免疫染色による分布の確認、ならびにリプログラミング能力の検証に向けて発現ベクターの構築に着手するに至っている。生殖工学標的タンパク質を分離・解析の材料採取の行程において当初計画に遅延が生じたが、その後の進捗は順調であり、リプログラミング因子の候補を選抜する為の基盤データとなるタンパク質発現・相対定量解析(iTRAQ試薬でラベルした後にLC-MS/MS分析)の結果が得られている。定量的な比較が可能であった818種類のタンパク質の内、本研究で標的とする「核を除去した前核期卵の細胞質と比較して、未受精卵に多く存在する」ものとして93種類が該当した。計画当初は、定量比が比較的大きいと考えられる2.0倍以上のものが複数検出されると想定していたが、本解析では1種類(2.812倍)だけであった為、リプログラミング因子の候補としてこれに注力して今後の研究を進める予定である。
温熱および非温熱性因子の相加刺激に対する褐色脂肪組織の熱産生能及びガングリオシド

〔目的〕代謝性寒冷馴化で促進する非ふるえ熱産生(NST)の主要部位は、熱産生専門器官である褐色脂肪組織(BAT)である。また、ラットにおいて非温熱性刺激である拘束ストレスは、NST亢進を介し耐寒性を改善させ、寒冷との間に正の交叉適応を発現させる。しかし、BAT熱産生能をin vitro組織酸素消費量を指標にして調べると、単位重量当たりの熱産生能が寒冷暴露群では対照群に比べ低下し、拘束群では逆に増加するという相反する結果を示す。そこで本実験では、寒冷暴露群に拘束ストレスを施すことでin vitro熱産生能の変化を調べた。〔結果と考察〕1.拘束ストレスや寒冷暴露の単独負荷群に比べ、寒冷+拘束群では体重の減少が有意に大きく、また、その3群では顕著なBAT湿重量の増加がみられた。2.in vitro熱産生能は、拘束単独群ではBAT単位重量あたりの基礎組織酸素消費量が増加したのに対し、寒冷+拘束群では対照群と拘束単独群の中間的値を示す傾向にあった。3.一方、BATの機能調節因子であるノルアドレナリンやグルカゴン投与による組織酸素消費量の最大増加量を見ると、寒冷+拘束群は、対照群並びに寒冷単独群レベルまで低下し、顕著な増加を示す拘束単独群とは異なっていた。このように、寒冷暴露下の拘束ストレスは、ラット肩甲骨間のBATの増大を引き起こすが、拘束単独刺激とは異なり、BAT単位重量当たりの熱産生能を増加させなかった。このことは、寒冷刺激が拘束ストレスに対し競合的にBATに作用し、その相加刺激の結果、拘束単独群で見られるBAT熱産生能の亢進に対して抑制的に働いたと推測される。
ニワトリ胚における尾部側形成機構の解析

当研究では、ニワトリ胚及びマウス胚における尾部形成機構について研究を行ってきた。我々は、尾部の形成過程においてシグナルセンターと推測されてきたVentral ectodermal ridge(VER)に着目し、解析を行った。我々の研究の結果から、ニワトリ胚のVERは1)原始線条から由来すること、2)上皮-間充織細胞転換(EMT)を経て細胞を供給していること、3)EMTの誘導にBMPシグナルが関与していることが明らかになった。さらに、VERからの細胞供給が減少すると尾部末端部の椎骨の欠失及び、外生殖器の低形成が生じる。また、供給が増加すると尾芽の過形成が生じることが判った。このことから、ニワトリVERからの間葉細胞の供給量は厳密に制御される必要があると考察された。そこで、ニワトリVER近傍のBMPシグナルがどのような分子機構によって制御されているのか解析したところ、このBMPシグナルはNogginの時間的・空間的発現によって阻害され、この結果としてVERからのEMTが抑制され、細胞供給量を制御していることが判った。次にマウスのVERについて解析したところ、マウスVERはニワトリVERとは異なり、EMTを受けていないことが判った。マウスVERの近傍にはNogginが強く発現していることから、マウスVERはNogginによってEMTが抑制されていると考察された。そこで、Noggin遺伝子欠損マウスについて解析したところ、同マウスのは尾芽間葉の異常な増加を示した。このことはVERでのEMT抑制に破綻が生じたためと考察された。我々の研究結果から、羊膜類の尾部形成に貢献する間葉細胞の供給はVERでのEMTの制御を介して調節され、この調節にBMP-Nogginの相互作用が必須であることが示された。これまで、脊椎動物の後方体軸はGastrulationの継続よって形成されると考えられてきた。我々は、ソノポレーション法によるニワトリ胚への遺伝子導入と、遺伝子改変マウスを用いて、羊膜類胚(マウス胚、ニワトリ胚)のTail形成過程の比較から、種によってGastrulationの継続が抑制されていることを明らかにした。Fate解析と組織学解析を用いてGastrulationの継続について解析した結果、ニワトリVERはEMTを受け、Tail ventral mesodermへ細胞を供給していることから、ニワトリtail形成過程でのGastrulationの継続が示唆された。しかし、マウスのVERからTailbud mesodermへの細胞供給は確認できず、Gastrulationが継続している証拠は得られなかった。さらに、遺伝子発現解析の結果、VER直下に発現するNogginの時間的・空間的発現パターンは両種間で違いがあることが判った。そこで、NogginKOの解析とニワトリ胚を用いたNoggin過剰発現実験を行った。Noggin KOマウスではVERが異常なEMTを受け、TVMの肥大を示した。また、ニワトリ胚を用いたNoggin過剰発現実験では、VERでのEMTが阻害され、TVMの著しい縮小と後肢同士が融合するという形態異常を生じた。本研究において我々は、ニワトリのtail形成過程ではVER形成後もGastrulationの継続が必要であるが、マウスのtail形成過程では、原始線条からVERが形成された後、NogginによるGastrulationの継続を抑制することが必要であることが明らかになった。
三元系ポリイオンコンプレックスを用いた全身投与型光応答性遺伝子ベクターの開発

本年度は、まず光応答性遺伝子ベクターの物性をより詳細に明らかにするために、光増感剤を搭載していない状態のポリイオンコンプレックスミセルを、ABC型トリブロック共重合体PEG-poly{N-[N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl]aspartamide}-poly (L-lysine)(PEG-PAsp (DET)-PLys)とプラスミドDNA (pDNA)の混合比を変えて調製し、その構造を透過型電子顕微鏡により評価した。その結果、カチオンの量が増えることでpDNAの形状がスフィア状からロッド状に変化した。また、光増感剤を加えた状態でのポリイオンコンプレックスミセル(光応答性遺伝子ベクター)においても、光増感剤の量に依存してpDNAのロッドの長さが変化したことから、PAsp (DET)が中間層を形成してそこに光増感剤が搭載されていることが強く示唆された。次に、光応答性遺伝子導入のコンセプトをより明確に実証するため、今までのHeLa細胞に対する遺伝子導入の評価に加えて、HCT116細胞に対する遺伝子導入効率の評価も行った。その結果、HCT116培養細胞に対しても、光応答性遺伝子ベクターは光照射下で遺伝子導入効率を飛躍的に上昇させることが明らかになり、さらに重要なことに、マウスのHCT116皮下腫瘍モデルに対しても全身投与後の光に応答した遺伝子の導入に成功した。全身投与後の光応答性遺伝子導入に成功したのは本研究が世界で初めてである。本研究で開発した光応答性遺伝子ベクターを応用することで、がんや動脈硬化などの難治性疾患に対する低侵襲的な治療方法が開発できるものと期待される。(抄録なし)具体的には、IVRTCLSMを用いて、実際に生きた実験動物の血流中において、典型的なDDSであるポリプレックス及びポリプレックスミセルがどのような挙動を示すかを評価した。ポリプレックス形成には、ブランチポリエチレンイミン(BPEI)、ポリ-L-リシン(PLys)及びポリアスパルタミド誘導体PAsp(DET)の3つのポリカチオンを用いた。一方、ポリプレックスミセル形成にはポリエチレングリコールとPLysのブロック共重合体(PEG-PLys)、及びポリエチレングリコールとPAsp(DET)のブロック共重合体(PEG-PAsp(DET))を用いた。これらのDDSの、耳介皮膚血管を流れる挙動をIVRTCLSMにより観察したところ、BPEI、PLys、PAsp(DET)ポリプレックスは血流中において即座に凝集体を形成し、血小板と共局在している状態が観察された。一方、PEG-PLys、PEG-PAsp(DET)ポリプレックスミセルは血流中において凝集体を形成せず、血小板との共局在を示すこともなかった。さらに、画像解析により凝集体量の定量、血小板との共局在の定量を行った。その結果、ポリエチレングリコールによるポリプレックスの血流中動態の改善を定量的に示すことに成功した。この成果はJournal of Controlled Release誌に報告し、さらにはその表紙に採用された。今年度は全身投与型光応答性遺伝子ベクターの細胞内動態評価及びin vivoでの血流中挙動評価、遺伝子発現評価を行った。まず、構造照明化法(超解像蛍光顕微鏡)によりin vitroでの細胞内動態を観察した。その結果、光増感剤がGFPでラベル化されたリソソーム膜に局在していることが明らかとなった。光増感剤がリソソーム膜に局在することは、photochemical internalization(PCI)によるプラスミドDNA(pDNA)の細胞質移行を促進する極めて重要なステップであり、全身投与型光応答性遺伝子ベクターはそれを達成できていることが示された。さらに光照射で光増感剤を活性化するとpDNAが徐々に細胞質に移行する様子が共焦点レーザ顕微鏡により観察された。この細胞質移行促進の結果、遺伝子導入効率が約100倍上昇することが確認されている。次に全身投与型光応答性遺伝子ベクターが血流中において凝集体を形成していないことを確認した結果、光応答性遺伝子ベクターは凝集体を形成せずに血流中を流れていることが明らかになった。最後に、マウスのHeLa皮下腫瘍モデルを用いて、全身投与型光応答性遺伝子ベクターが静脈注射後に光照射選択的に遺伝子導入効率を上昇させることができるかを検討した。蛍光タンパク質をコードしたpDNAを内包した遺伝子ベクターを静脈注射してから24時間後に腫瘍に対して680nmのレーザを照射し、その48時間後に腫瘍を取り出して蛍光タンパク質の発現を共焦点レーザ顕微鏡により観察した。その結果、光照射を行った群からは、光照射を行わなかった群と比較して、明らかに高い蛍光シグナルが得られた。このことから、本研究で開発した遺伝子ベクターは全身投与後に光照射部位選択的に遺伝子導入効率を上昇させることができるということが示された。

また、光増感剤を加えた状態でのポリイオンコンプレックスミセル(光応答性遺伝子ベクター)においても、光増感剤の量に依存してpDNAのロッドの長さが変化したことから、PAsp (DET)が中間層を形成してそこに光増感剤が搭載されていることが強く示唆された。次に、光応答性遺伝子導入のコンセプトをより明確に実証するため、今までのHeLa細胞に対する遺伝子導入の評価に加えて、HCT116細胞に対する遺伝子導入効率の評価も行った。その結果、HCT116培養細胞に対しても、光応答性遺伝子ベクターは光照射下で遺伝子導入効率を飛躍的に上昇させることが明らかになり、さらに重要なことに、マウスのHCT116皮下腫瘍モデルに対しても全身投与後の光に応答した遺伝子の導入に成功した。全身投与後の光応答性遺伝子導入に成功したのは本研究が世界で初めてである。本研究で開発した光応答性遺伝子ベクターを応用することで、がんや動脈硬化などの難治性疾患に対する低侵襲的な治療方法が開発できるものと期待される。ドラッグデリバリーシステム(DDS)が実際に生きた動物の中でどのような挙動を示すかを直接的に評価する方法を、生体内共焦点レーザ顕微鏡システム(IVRTCLSM)を用いて確立することに成功し、血流中におけるDDSの定量、及び凝集体形成や血小板との共局在など、動的な情報を容易に獲得することが可能となった。これらの技術は一般的なDDSに応用することが可能で、IVRTCLSMを応用した研究は既に3本の雑誌論文に報告した。今年度の検討の結果、本研究で開発された全身投与型光応答性遺伝子ベクターが、in vivoにおいて光照射部位選択的に遺伝子を導入することができることが明らかとなった。現在までに、全身投与後にPCIにより遺伝子導入効率を上昇させた報告例はなく、本研究が初めての成功例となる。現在のところ、光応答性キャリアに搭載しているデンドリマー型光増感剤の生体内における蛍光強度は検出するのに必ずしも十分ではなく、定量的な評価を行うことが容易ではない。それ故に、より強い蛍光を発する光増感剤を用いた光応答性キャリアを構築することが必要であると考えられる。今後は、in vivoで光応答性キャリアを評価するにあたって適切な光増感剤を検討し、その光増感剤を搭載した光応答性キャリアの評価方法を構築する。全身投与後に光照射部位選択的に遺伝子導入効率を高めることに成功した。この成果を学術雑誌に報告すべく、遺伝子ベクターの物性をより詳細に調べていく予定である。(抄録なし)
減数分裂染色体タンパク質のステージ特異的リン酸化とその機能的意義

哺乳類の減数分裂に必須なタンパク質であるHORMAD1やその近縁分子で減数分裂チェックポイントに必要なHORMAD2は複数のリン酸化修飾を受けることが知られているが、各リン酸化の機能的意義はほとんど明らかにされていない。今年度は、主にHORMAD2のSer284を、ゲノム編集によりアラニン(非リン酸化型)やアスパラギン酸(リン酸化模倣型)に置換したマウスの遺伝的背景の均一化を進めながら表現型解析を行った。その結果、非リン酸化型およびリン酸化模倣型の雌雄共に妊性は正常であったが、非リン酸化型雌では野性型雌より小さい卵巣をもつ個体が多く見られ、卵母細胞の細胞死が亢進する可能性が示唆された。また対合不全を多数生じるSPO11欠損との二重変異体を作製した結果、SPO11単独欠損雌に比べてリン酸化模倣型雌の卵巣は有意に大きく、リン酸化模倣型雌では対合不全による卵母細胞の細胞死が抑制されることが示された。以上の結果は、HORMAD2のSer284のリン酸化によって、対合不全による卵母細胞の細胞死が抑制的に制御されることを示唆する。これらの結果について、日本分子生物学会および日本解剖学会で発表を行った。HORMAD1のリン酸化状態の解析については、Ser309のリン酸化について、内在分子を組織学的に検出できるモノクローナル抗体が得られなかったため、ポリクローナル抗体を作製しその検出を試みているが、抗体の精製段階で遅れが生じたため、補助事業期間の延長を行い解析を継続している。HORMAD1のSer307周辺のリン酸化について、当初計画していた様々なリン酸化状態特異的に結合する分子の同定に関する研究にはほとんど着手できていないことが、計画から遅れている点である。一方で、ゲノム編集によるリン酸化部位の点変異マウスの作出について、当初計画では可能であれば最終年度に着手する、という予定であったが、既にHORMAD2 Ser284の非リン酸化型およびリン酸化模倣型の変異体の表現型解析が順調に進み、その結果を基にした研究課題「減数分裂チェックポイントによる細胞死誘導とその制御機構」が基盤研究(C)に新たに採択された点においては、当初計画以上の進展が見られている。全体として、HORMAD1のリン酸化特異的結合分子の同定が遅れているのは問題であるが、残された課題であるSer309のリン酸化について詳細な形態学的解析を着実に進めることで、HORMAD1のリン酸化の機能解明につながる基礎的知見を得て、論文として発表したいと考えている。内在分子を組織学的に検出できるモノクローナル抗体が得られなかったHORMAD1 Ser309のリン酸化について、既に作製済みのポリクローナル抗体を利用可能な状態になるよう精製する。この精製抗体を用いて、マウスの精母細胞や卵母細胞におけるHORMAD1 Ser309のリン酸化の局在およびタイミングについての形態学的解析を行う。既に結果を得ているSer305およびSer307のリン酸化の結果と合わせて、減数分裂の進行に伴うHORMAD1のリン酸化状態の変化についての詳細な解析結果を論文として発表する予定である。哺乳類の減数分裂に必須なタンパク質であるHORMAD1やその近縁分子で減数分裂チェックポイントに必要なHORMAD2は、複数のリン酸化修飾を受けることが知られているが、各リン酸化の機能的意義はまだわかっていない。今年度の研究成果として、HORMAD1のSer307周辺のいくつかのリン酸化状態に特異的なモノクローナル抗体を樹立し免疫組織染色を行うことにより、これらのリン酸化がSPO11によるDNA切断の調節機構に重要な役割を果たす可能性が示された。現在主に形態学的手法により、このリン酸化にATMキナーゼが関与する可能性や、DNA切断を行う分子複合体がHORMAD1の特定のリン酸化状態依存的に減数分裂染色体にリクルートされるかどうか解析中である。またHORMAD2について、以前にリン酸化特異的抗体を用いた形態学的解析によりSer284のリン酸化がチェックポイント機構に関与する可能性を示唆する結果を得ているが、このリン酸化の重要性を直接的に検証するため、ゲノム編集の手法によりSer284をアラニン(非リン酸化型)やアスパラギン酸(リン酸化模倣型)に置換した変異マウスの作製を行い、実際にこれらの点変異を導入することに成功した。今後各ホモ変異マウスを作製し遺伝的背景を均一にした上で表現型解析を行うことにより、これらのリン酸化の機能的意義を明らかにすることが出来ると思われる。また、ゲノム編集の副産物としてHORMAD2のC末端を欠損する変異マウスも複数作出された。これらのマウスもHORMAD2の分子機能を理解するために重要であるため次年度以降解析を進め、リン酸化部位の点変異マウスとの表現型の違い等を明らかにする予定である。HORMAD1のリン酸化については、モノクローナル抗体を用いた局在解析を順調に進めることが出来た結果、各リン酸化の減数分裂ステージ特異性やDNA切断依存性などを明らかにすることが出来た。一方、当初予定してたリン酸化特異的に結合する因子の同定には着手できていないので、その点ではやや遅れ気味ではあるが次年度以降に着実に進展させる予定である。HORMAD2のリン酸化については、以前にザイゴテン期後期の対合不全チェック機構に関与する可能性があるリン酸化部位を同定していたが、今年度の成果としてゲノム編集により該当するリン酸化部位の点変異マウスの作出に成功した。

この点では明らかに当初の計画以上の成果が得られたと考えており、総合的に概ね順調な進展状況と判断した。哺乳類の減数分裂に必須なタンパク質であるHORMAD1やその近縁分子で減数分裂チェックポイントに必要なHORMAD2は複数のリン酸化修飾を受けることが知られているが、各リン酸化の機能的意義はほとんど明らかにされていない。今年度は、減数分裂初期に起こるHORMAD1のリン酸化について、Ser305のリン酸化がSPO11によるDNA切断に依存することを示した上で、そのリン酸化酵素がATMである可能性を、ATM遺伝子欠損マウスを用いて解析したが、予想に反しATM欠損マウスの精母細胞でもHORMAD1Ser305のリン酸化が観察された。また、SPO11によるDNA切断に必要な因子であるMEI4およびHORMAD1 Ser305のリン酸化の減数分裂染色体上の局在を比較したところ、MEI4の減数分裂染色体軸上への分布はSer305のリン酸化よりも明らかに早期に見られることが示された。このことから、Ser305のリン酸化はSPO11によるDNA切断よりも後のステップで起こる現象、例えば相同染色体間の組換えなどに関与する可能性が考えられたので、現在組換え関連分子との関係についての解析を計画中である。HORMAD2については、ゲノム編集によりSer284をアラニン(非リン酸化型)やアスパラギン酸(リン酸化模倣型)に置換したマウスの作出に成功し、現在遺伝的背景の均一化を進めながら表現型解析を行い、いくつかの表現型が見られることを確認している。その一部については日本解剖学会で発表を行った。HORMAD1のSer307周辺のリン酸化について、関与するキナーゼ候補についての解析や、DNA切断時期との関連を検討したが、当初想定していたようにSPO11によるDNA切断の際にATMによってSer305のリン酸化が起こる、という可能性は否定され、このリン酸化の機能的意義についての解析の進め方について計画の変更が必要となった。また当初計画していた様々なリン酸化状態特異的に結合する分子の同定に関する研究にはほとんど着手できていないことが計画からは遅れている点である。一方で、ゲノム編集によるリン酸化部位の点変異マウスの作出については、当初計画では可能であれば最終年度に着手する、という予定であったが、本研究課題では、既にHORMAD2 Ser284の非リン酸化型およびリン酸化模倣型の変異体の作製が順調に進んでおり、この点においては計画以上の進展が見られている。全体としては、現状では関連分子の同定が遅れているのは問題であると認識しているが、ゲノム編集により作製したリン酸化部位点変異マウスを利用して関連分子の同定を大きく進展させることで、今後遅れを取り戻せるよう努力したいと考えている。今年度は、主にHORMAD2のSer284を、ゲノム編集によりアラニン(非リン酸化型)やアスパラギン酸(リン酸化模倣型)に置換したマウスの遺伝的背景の均一化を進めながら表現型解析を行った。