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血中に存在するC型肝炎ウイルス粒子に関する免疫電子顕微鏡的研究

平成5年度からC型肝炎ウイルス(HCV)粒子の超微形態を明らかにすることを目的とし、抗HCV-Envelope(E1)抗体を用いた金コロイド免疫電子顕微鏡法を駆使し検討した。HCV抗体陽性・HBs抗原陰性・GPT高値供血者血漿13検体からRT-PCR法を用いてHCVgenotypeII(Okamotoらの方法、subtype1b)でありウイルス量4x10^7copies/ml以上の2検体を選び、この検体を1,000倍に濃縮後、蔗糖密度勾配遠心法にて密度別に分画した。各分画のウイルス量を定量し、HCV-RNA量10^8copies/ml以上であった浮上密度1.141.16g/mlの分画をウイルス抗原として用い、遺伝子組み換えワクチニアウイルスの発現糖蛋白質(HCV-E1抗原、subtype1b)を免疫原として作製したウサギポリクローナル抗HCV-E1抗体(RR-2)またはマウスモノクローナル抗HCV-E1抗体(4種類)を一次抗体として用いた。二次抗体にはヤギ抗ウサギIgGまたはプロテインA金コロイド(5nm)を用いた。免疫電顕下に金コロイド粒子と反応するウイルス粒子を観察した。その結果、HCV粒子は長さ7nmの繊細なスパイクを持つ直径約60nmの球形粒子であり、その内部に直径3035nmのコア粒子を有していることを明らかにし、英国紙Journal of General Virology,75,1755-1760,1994に論文を発表した。また、平成6年3月23日に朝日新聞社、日本共同通信社とNHKにこの研究結果を発表した。さらに、第二のエンベロープと考えられているHCV-E2/NS1抗原が、HCV粒子上に分布するか否かを明らかにすることを目的に金コロイド免疫電子顕微鏡法を用いて検討し、HCV-E2/NS1抗原もHCV粒子上に局在することを確認している。C型肝炎ウイルス(HCV)の超微形態を明らかにすることを目的とした。HCV抗体陽性・HBs抗原陰性・GPT高値供血者血漿13検体から、RT-PCR法を用いてHCV GenotypeII(Okamotoらの方法)でありウイルス量4x10^7copy/ml以上の2検体を選び、この検体を1000倍に濃縮後、蔗糖密度勾配遠心法にて密度別に分画した。各分画のウイルス量を定量し、HCV-RNA量10^8copy/ml以上の浮上密度1.141.16g/mlの分画をHCV材料として用いた。一次抗体としてHCV(GenotypeII)のEnvelopeに特異的なウサギポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体(4種類)を用いた。免疫前の正常ウサギ血清、抗Listerウサギ血清(ワクチニア)と抗ヒト血液型A抗原モノクローナル抗体を対照に用いた。二次抗体にはヤギ抗ウサギIgGおよびプロテインA金コロイド(5nm)を用いた。Murtiらの方法(1986年,Virology)を応用した金コロイド免疫電顕法を行った。上記2検体の密度1.141.16g/mlの分画中に抗HCV-Env抗体(ウサギ)と特異的に反応する直径5565nmの球形粒子を確認した。これらの球形粒子はモノクローナル抗体とも特異的に反応した。これらの粒子は長さ7nmの繊細なスパイク構造を有していた。HCV-Env抗体と反応し、スパイク構造を有する直径約60nmの球形粒子はHCV粒子と考えられた。

この内容は、The Journal of General Virologyに投稿し、acceptされました。今後、透過電子顕微鏡下にHCV粒子を観察する予定です。平成6年度に金コロイド免疫電子顕微鏡法を駆使し、C型肝炎ウイルス(HCV)粒子は長さ7nmの繊細なスパイクを持つ直径約60nmの球形粒子であり、その内部に直径3035nmのコア粒子を有していることを明らかにし、英国紙Journal of General Virology,75,1755-1760,1994に論文を発表しました。また、平成6年3月23日に朝日新聞社、日本共同通信社とNHKにこの研究結果を発表しました。その後、第二のエンベロープと考えられているHCV-E2/NS1抗原が、HCV粒子上に分布するか否かを明らかにすることを目的に金コロイド免疫電子顕微鏡法を用いて検討した。前回報告したHCV粒子(subtype 1b)を2検体の浮上密度1.141.16g/mlの分画(ウイルス量10^9copies/ml)をウイルス抗原として用い、遺伝子組み換えワクチニアウイルスの発現糖蛋白質(HCV-E2/NS1抗原、subtype 1b)を免疫原として作製したウサギポリクローナル抗HCV-E2/NS1抗体(RR-6)またはマウスモノクローナル抗HCV-E2/NS1抗体(6種類)を一次抗体として用いた。金コロイド免疫電顕下に金コロイド粒子と反応するウイルス粒子を観察した。更に金粒子のサイズを変えることによりHCV-E1、E2抗原の重染色も行った。その結果、HCV-E2/NS1抗原はHCV粒子の表面に存在することが明らかとなった。この研究結果を第42回日本ウイルス学会総会、第30回日本肝臓学会総会に発表しました。尚、論文も発表する予定です。今後、HCV粒子の凝集像を捕えること、さらにHCVの中和エピトープを決定することなどの研究を予定しています。
f-電子多体系の磁性と超伝導に対する微視的理論:j-j結合描像に基づくアプローチ

さまざまな格子上でj-j結合描像に基づいてΓ_8軌道縮退モデルを構築し、f電子のホッピングに関する2次摂動理論で多極子相互作用を導出して、多極子秩序状態を考察した。その結果、単純立方格子ではΓ_<3g>四極子秩序、体心立方格子ではΓ_<2u>八極子秩序、面心立方格子ではΓ_<5u>八極子秩序が現れることを明らかにした。面心立方格子の場合の八極子秩序は、NpO_2で現象論的に提唱されていた構造と一致する。次に、充填スクッテルダイト化合物を念頭において、a_uバンドの伝導電子と混成するf電子の多極子感受率を、まずは電子格子相互作用を含まない軌道縮退アンダーソン模型に基づいて、数値繰り込み群法を用いて評価した。f^2の場合の磁化率の温度依存性から、Γ_1が基底状態でも、わずかなエネルギー差でΓ_4が励起状態になっていれば、双極子および磁気八極子揺らぎが低温まで生き残ることを明らかにした。さらに、E_g対称性をもつヤーンテラーフォノンとe_u軌道のf電子の相互作用項を付け加えて、数値繰り込み群法によって多極子感受率を計算した結果、動的ヤーンテラー効果によって擬似的な近藤現象が起こることを見出した。動的ヤーンテラー効果によって、基底バイブロニック状態は二重縮退を持つが、これは、ヤーンテラー中心のまわりの回転モードの右回りと左回りの自由度に起因する。回転モードの反転に対応する特徴的なエネルギーよりも温度を下げれば、右回りと左回りの自由度は失われ、log2のエントロピーが解放されるので、擬似的な近藤効果が生じる。充填スクッテルダイト化合物におけるラットリングがE_g対称性をもてば、それはf電子のe_u軌道とヤーンテラー結合をするので、このような非磁性起源の近藤効果が生じると考えられる。j-j結合描像に基づくf電子系の微視的モデル構成法を用いて、ネプツニウム化合物に対する軌道縮退ハバード模型を構築し、様々な理論手法を駆使してその模型の性質を調べた。まず、二酸化ネプツニウムNpO_2の25K以下に現れる秩序状態を明らかにするために、面心立方格子上で軌道縮退模型を解析した。その結果、4方向の八極子モーメントが配列した構造が基底状態となることを見出した。これにより、1953年に発見され、半世紀にわたって謎のままであったNpO_2の基底状態の正体が八極子秩序であることを微視的観点から解明することに成功した。次に、正方晶の格子上で軌道縮退模型を解析し、ネプツニウム化合物NpTGa_5の磁気構造が遷移金属原子丁によって変化する様相を明らかにした。さらに、充填スクッテルダイト化合物PrOs_4Sb_12の磁性および超伝導機構を解明するために、軌道縮退アンダーソン模型を数値繰り込み群法によって解析した。その結果、基底状態が非磁性の一重項でも、わずかな励起エネルギーで磁気的な三重項が存在していれば磁気揺らぎが低温まで生き残ることを見出した。j-j結合描像に基づいて考えると、h充填スクッテルダイト構造に特徴的な異方的混成効果のためにf電子のT_7軌道は遍歴的、T_8軌道は局在的となり、軌道自由度に基づくf電子の二重性(duality)によってPrスクッテルダイト化合物の近藤効果を理解することができる。そして、j-j結合描像に基づく軌道縮退ババード模型を対相関最適化法によって解析し、一重項と三重項状態が入れ替わる領域で異方的非BCS型の超伝導相関が増強されることを見出した。

充填スクッテルダイト化合物におけるラットリングがE_g対称性をもてば、それはf電子のe_u軌道とヤーンテラー結合をするので、このような非磁性起源の近藤効果が生じると考えられる。
マイクロプラズマアクチュエーター組み込みマイクロ噴霧再生燃焼システムの開発

ミリサイズの円筒型マイクロプラズマアクチュエーターを金属メッシュを有する細径管燃焼器上流に設置し,マイクロプラズマアクチュエーターによる燃焼器への周囲空気供給により,細径管内の金属メッシュ背後に火炎を定在可能な条件が存在することが明らかとなった.また,熱還流による再生予熱を促進する燃焼器構造について,3次元数値計算を用いて確認を行った.これをもとに,液体燃料を用いた燃焼器の設計方針も示した.誘電体バリア放電を用いたセンチミリサイズのプラズマアクチュエーターの製作を行い,その誘引流特性について調べた.電極への印加電圧,周波数,電極寸法,電極間隔,電極形状の影響について詳細に調べた.その結果,細径管燃焼器と同程度のマイクロプラズマアクチュエーターにより燃焼器の空気供給に必要な流速が得られることが確認された.液体燃料を用いた細径管燃焼器における静電微粒化モードを改良し,また,再生予熱を促進する構造とすることにより,火炎定在可能条件の拡大が可能であることを確認した.再生予熱効果については3次元数値計算も行い確認を行った.金属メッシュを有する細径管マイクロコンバスターにおいて熱還流による再生予熱を促進する構造について,3次元数値計算と実験とを用いて確認を行った.熱還流としては管壁やメッシュを通した熱還流と,排気ガス循環時の熱還流とを対象とした.前者については,未燃側と既燃側の管壁の熱伝導率が,再生予熱割合,熱損失割合,火炎定在可能上限流速に与える影響について調べた.未燃側の管壁の熱伝導率が大きいほど火炎定在可能上限流速は低下するが,既燃側の管壁の熱伝導率が大きいほど増大することが明らかになった.後者については,管壁の熱伝導率が大きい場合には影響が小さいが,管壁の熱伝導率が小さい場合には火炎定在可能上限流速を増大させ有効であることを示した.また,液体燃料を用いる際の制約を考慮した場合も再生予熱効果についても数値解析を行い,液体燃料を用いた燃焼器の設計方針も示した.前年度誘引流特性を調べた誘電体バリア放電を用いたミリサイズの円筒型マイクロプラズマアクチュエーターを金属メッシュを有する細径管マイクロコンバスター上流に設置し,マイクロプラズマアクチュエーターによる燃焼器の空気供給を試みた.将来的な液体燃料適用への拡張のため,気体燃料を空気と予混合せず細径管から金属メッシュ上流に供給を行った.空気をボンベから供給せず,マイクロプラズマアクチュエーターにより外部空気を誘引し供給した場合でも,細径管内の金属メッシュ背後に火炎を定在可能な条件が存在することが明らかとなった.ミリサイズの円筒型マイクロプラズマアクチュエーターを金属メッシュを有する細径管燃焼器上流に設置し,マイクロプラズマアクチュエーターによる燃焼器への周囲空気供給により,細径管内の金属メッシュ背後に火炎を定在可能な条件が存在することが明らかとなった.また,熱還流による再生予熱を促進する燃焼器構造について,3次元数値計算を用いて確認を行った.これをもとに,液体燃料を用いた燃焼器の設計方針も示した.キーとなるマイクロプラズマアクチュエーターの基本特性も把握でき,計画は順調に進んでいるため.燃焼工学マイクロプラズマアクチュエーターと燃焼器とのマッチングに重点を置いて進める.見積もり額と納品額の差額による.物品費に充当して使用する.
酵素超薄膜の分子配列制御に基づく高性能バイオセンサーの開発

正または負の電荷を有する高分子電解質と反対電荷をもつ酵素分子の溶液に固体基板を交互に浸すと、これらが静電的に吸着されてナノメーター程度の厚さの酵素含有超薄膜が形成されることがわかった。用いる水溶液の濃度、イオン強度、およびpHなどを適切に調節すると、生成する超薄膜の厚さを制御できることが判明した。また、アビジンとビオチン標識酵素溶液に交互に基板を浸すと、アビジンとビオチンの強固な結合により酵素超薄膜が形成されることがわかった。この薄膜の中でアビジンと酵素はともに単分子層を形成していた。生成した酵素薄膜の中で酵素は触媒活性を保持しており、電極と組み合わせて高性能バイオセンサーとなることを確認した。この超薄膜は酵素累積層の数を任意に加減できるので、バイオセンサーの出力電流を制御することができる利点があった。酵素として、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、パーオキシダーゼ、などが利用できた。また、コンカナバリンAと糖タンパク質酵素を用いると、同様にして触媒活性な酵素超薄膜が形成できることもわかった。酵素が糖鎖を含有しない場合には、人為的に酵素表面に糖鎖を化学修飾することにより同様に用いること可能であった。コンカナバリンAを用いて作製した酵素超薄膜も触媒活性を保持しており、高性能バイオセンサーとして使用することができた。さらに、本研究で実施したアビジンを用いる超薄膜作製方法は、抗体分子の配列制御と薄膜作製にも応用可能であることがわかった。レクチンと糖鎖標識酵素を用いた固定化酵素膜の製造条件を検討した。糖鎖修飾酵素を調製するために、活性化マンノース試薬が有効であることがわかった。酵素としてグルコースオキシダーゼおよびラクテートオキシダーゼを用いてマンノース試薬を反応させると、1つの酵素分子対して510分子のマンノースが導入できることを見出した。この反応の条件を系統的に検討し、反応時間や反応温度、試薬の濃度などに関して最適条件を確立することができた。また、反応物の処理と精製法についても最適化を実施した。次に、調製したマンノース標識酵素とレクチンを用いて固定化酵素膜の分子配列制御を実現するために、固定化条件の最適化を実施した。その結果、固定化担体をレクチンと標識酵素の溶液に交互に浸す操作をくり返すことにより、酵素薄膜を調製できることが明らかになった。その際に用いるレクチンおよび標識酵素溶液の濃度は、0.1-0.01mg/ml程度が好ましいことがわかった。また、処理時間は20-30分程度で充分であった。色素修飾レクチンを用いて吸収スペクトルにより酵素薄膜の構造を検討したところ、1回の固定化操作によりレクチンおよび標識酵素は単分子層程度あるいはそれ以下の被覆率で薄膜を形成していることが判明した。また、これらの固定化操作の処理時間はレクチンや酵素の膜内での分子配列に影響を与えることがわかり、処理時間や処理温度を系統的に検討する必要があることが示唆された。レクチンと酵素を用いた酵素累積膜の作製条件の最適化を検討した。その結果、0.1mg/mlレクチン溶液(ダルベッコリン酸緩衝液生理食塩水、D-PBS)に電極を室温にて20分程度浸した後にD-PBSで洗浄すると、電極表面にレクチンがほぼ単分子層に吸着することがわかった。レクチン溶液の濃度、緩衝液の種類、処理時間などを種々変えて同様の実験を行ったが、上記の条件が最適であることが判明した。また、同様の条件で、レクチン修飾電極を酵素溶液に浸すと、レクチン層の上に酵素が固定化されることがわかった。この操作をくり返すことにより、酵素累積膜が作製できることが判明した。次に、作製した酵素超薄膜の触媒活性の評価を行った。

酵素超薄膜修飾電極を緩衝液に浸し、酵素基質と電子メディエーター(フェロセン誘導体)を添加した際のサイクリックボルタンメトリー(CV)の電流応答を測定して活性を調べた。CVの応答電流は累積膜の酵素層数に比例して増大した。この結果は、使用した電子メディエーター分子が累積膜の中に容易に浸透したいくことを示唆した。同時に、累積膜中の酵素の触媒活性が保持されていることを示している。フェロセンメタノール(電気的中性)、フェロセンカルボン酸(アニオン)、トリメチルアミノフェロセン(カチオン)、の使用した3種類の電子メディエーターのうち、フェロセンメタノールが最も良好なメディエーターとなることがわかった。これは、酵素累積膜の電荷が負であることと関係すると考えられるが、詳細は検討中である。さらに、ポリマーを用いたタンパク質累積膜の作製も検討した。ポリアニオンとアビジンの累積膜が良好に作製できることが明らかになった。レクチンと酵素の累積膜を用いたバイオセンサーの高性能化を検討し、酵素累積膜と高分子累積膜を組み合わせると、高選択性バイオセンサーが作製できることを見出した。すなわち、電極表面にボリアリルアミン(PAA)、ポリエチレンイミン(PEI)、ポリビニル硫酸(PVS)、およびポリスチレンスルホン酸(PSS)などを組み合わせて高分子交互累積膜を被覆し、その上に酵素累積膜を作製してパイオセンサーとした。酵素にはグルコースオキシダーゼ(GOx)を使用した。高分子交互累積膜を被覆しない時には、試料溶液中に存在するビタミンC、尿酸、アセタミノフェンなどの測定妨害物質のためにセンサーには大きな妨害電流が観察されたが、高分子交互累積膜を被覆するとこれらの妨害物質の影響をほとんど受けないセンサーとなった。とくに、PAAとPVSを組み合わせて作製した累積膜が良好な妨害除去特性を示した。この特性は、高分子累積層を2・3層とすることで充分な性能を示すことが明らかになった。このように作製したグルコースセンサーでは、血液中に含まれるこれらの妨害物質の影響を受けることなくグルコース濃度を正確に測定することができる。この場合の膜厚は10・20ナノメーター程度であり、ディッブ法やスピンコーティング法など従来の高分子被覆法では膜厚の制御が難しいことに比較して、今回用いた交互累積法がバイオセンサー用薄膜を作製する手段として優れていることが判明した。ウリカーゼとポリアミンを用いて配向制御された酵素超薄膜を作製し尿酸センサーへの利用を検討した。ポリアミンとしてポリアリルアミン(PAA)とポリエチレンイミン(PEI)を用いた。PAAとウリカーゼの超薄膜は交互累積法により大量の酵素を固定化するのに適していることがわかった。また、固定化される酵素量は累積回数に応じて増大することから、回数を加減して制御できることがわかった。一方、PEIを用いると固定化量はPAAを用いた時よりも少なかったが、膜から酵素が脱離することがないので水晶振動子ミクロバランス法により固定化量を正確に評価することが可能であった。PAAまたはPEIのいずれを用いた超薄膜でもウリカーゼは触媒活性を保持しており、この膜を白金電極に被覆して尿酸センサーとすることができた。PAAを用いて尿酸センサーとすると、膜を厚くすると尿酸の透過が制限されるために応答信号が飽和する傾向が見られたが、PEIを用いた場合には尿酸の透過性が高いためこのような現象は観察されなかった。
乾留過程にある古紙を原料とした綿状物質の熱物性に関する研究

物質としての炭素は、活性炭として或いはゴムの補強剤であるカーボンブラック等として、極めて有意義な物質である。そこで、著者らは昨今話題となっている古紙に目を向け、綿状にした古紙を乾留炭化させ、賦活を行ったところ、その炭化物は市販の活性炭の75%以上の活性度を示すことを見いだした。しかし、綿状古紙から活性炭を製造するためには、乾留過程にある綿状古紙の熱拡散率、熱伝導率及び比熱等と言った諸熱物性値を知って、適切な装置を設計・製作することが必要である。本研究では、未だ未知の乾留過程、即ち昇温過程にある綿状古紙の熱拡散率の測定法を確率し、その実測値を得ることを目的とした。測定は、外壁より連続加熱した半無限円筒容器に試料物質を詰め行った。具体的には、実測された初期及び境界条件を用いて、円筒状の試料層に対して導かれる非定常一次元熱伝導方程式を差分法により解き、試行錯誤的に熱拡散率を決定する方法を採用した。なお、本測定法の妥当性については、数値実験を行い、充分なる検討を行った。実験の結果によれば、昇温過程にある綿状古紙は収縮を伴うが、その収縮率は、300°付近より急激に増加し、450°付近を境にして一定値に近づくこと、また見かけ密度も同様に、300350°Cの間で急激に減少するが、500°Cを越えた付近からは殆ど変化しないこと等が分かった。一方、熱拡散率に関しては、300°C付近までは緩やかに増加するものの、300°Cを越えると綿状古紙は発熱分解反応を起こすため急激に増加し、330400°C付近で最大値を示した後、急激な減少に転じ、やがて各条件下で各々一定値に収斂することが分かった。炭状物質は吸着性等の優れた物理的特性を有するため、多くの分野で使用されているが、通常、このような炭状物質の原料には石油或いは椰子殻などが使用されている。しかし、古紙を綿状に加工して、乾留、賦活した綿状炭化物もまた、市販の活性炭の70%以上の活性度を示す。それ故、活性炭等の炭状物質の原料を、再生紙以外に殆ど使用されていない古紙に求めるならば、経済性、省資源及び環境保護と言った観点から、極めて大きな意味を持つ。本研究では、綿状古紙より炭状物質を製造することを想定し、その製造プロセスを開発する一段階として、設計に不可欠な乾留過程にある綿状古紙の熱拡散率k、及び熱伝導率λ等の熱物性値の測定法を開発し、その設計資料を得ることを目的とした。さて、綿状古紙の乾留過程では、試料の収縮及び発熱・分解反応が発生し、通常の測定法を用いることは出来ない。そこで、本研究では、非定常熱伝導方程式の初期及び境界条件に実測値を用い、数値計算法により、試行錯誤的にkを決定する方法を考案し、測定を行った。即ち、円筒容器に試料を充填し、その容器の側面を一様に連続加熱すると共に、かかる過程の非定常熱伝導方程式の初期及び境界条件を実測する。その後、非定常熱伝導方程式をそれら実測値を用い数値計算法により解くことにより、境界条件を満足するkを試行錯誤的に決定した。

その結果、昇温過程における綿状古紙のkは、(1)室温から250°C付近までは緩やかに増加するが、(2) 250300°Cの領域で急激に増加し(3) 300450°Cの領域では極小値及び極大値を示し、やがて(4) 450°C付近以上で次第に一定値に漸近していることが分かった。300°C付近でkの急激な増減が見られる理由については、この領域で激しいガスの発生が見られることより、発熱を伴う分解反応が生じていることが考えられる。物質としての炭素は、ゴムの補強剤であるカーボンブラック或い活性炭等として、極めて有意義な物質である。そこで、著者らは昨今話題となっている古紙に目を向け、綿状にした古紙を乾留炭化させ、賦活を行ったところ、その炭化物は市販の活性炭の75%以上の活性度を示すことを見いだした。しかし、綿状古紙から活性炭を製造するためには、乾留過程にある綿状古紙の熱拡散率、熱伝導率及び比熱等と言った諸熱物性値を知って、適切な装置を設計・製作することが必要である。本研究では、昨年(平成8年度)に引き続き、乾留過程にある綿状古紙の熱拡散率の測定法を確立し、その実測値を得ることを目的とした。実験は、半無限円筒容器に試料物質を詰め、容器外壁より連続加熱することにより行った。熱拡散率の測定は、実測された初期及び境界条件を用いて、円筒状の試料層に対して導かれる非定常一次元熱伝導方程式を差分法により解き、計算された試料内温度と測定された温度が一致するように熱拡散率を決定すると言う試行錯誤法により行った。実験の結果によれば、昇温過程にある綿状古紙は収縮を伴うが、その収縮率は、300°C付近より急激に増加し、450°C付近を境にして一定値に近づくこと、また見かけ密度も同様に、300350°Cの間で急激に減少するが、500°Cを越えた付近からは殆ど変化しないこと等が分かった。一方、熱拡散率に関しては、300°C付近までは緩やかに増加するものの、300°Cを越えると綿状古紙は発熱分解反応を起こすため急激に増加し、330400°C付近で最大値を示した後、急激な減少に転じ、やがて各条件下で各々一定値に収斂すること等が分かった。
分子生物学的アプローチによる敗血症発生機序の解明と高感度迅速診断法の開発

1。末梢血より直接DNAを抽出し、MRSAの薬剤耐性を担う遺伝子であるmecA遺伝子を2組のプライマーとDNAポリメレースであるTthを用いてPCRを行うわれわれが開発した方法により、4時間以内にMRSA敗血症を診断することが可能になった。また、TSST遺伝子を同時に同様の方法により検出することによりMRSAとMRSEとの鑑別も可能であった。本法の感度をMRSAの希釈系列で検討したところ、1m1中に数個存在すれば検出可能であった。また、従来の血液培養法でMRSAが検出されないような症例でも、本法によりMRSA敗血症が診断可能であった。2。ヒト末梢血より細胞分画を分離する事なくRNAを抽出し、IL-1,IL-2,TNF,IL-2RのサイトカインmRNA発現をPCR法にて検討した結果、正常健人ではいずれのサイトカインmRNAの発現も認められなかったが、重症感染症患者ではIL-1とTNFのmRNAが発現していた。なお、腎移植患者ではIL-1、TNFに加えてIL-2RのmRNAも発現しており,IL-2RmRNAを測定することにより免疫学的モニタリングが行える可能性もあることが判明した。3。敗血症発症・重症化の際に腎機能障害が発生することが多い。そこで、内因性エンドテリンがその機序として重要な役割を果たしていることを、ラットのエンドトキシンモデルで腎機能マーカーや血管作動性物質の変動を測定し、抗エンドテリン抗体を投与することにより証明した。さらに、内因性エンドテリンを制御することにより腎機能を改善をすることを目的として、エンドテリン変換酵素をラットのモデルに投与したところ、血中big endothelinの上昇と血中エンドテリンの低下が認められた。1。2。3。われわれは末梢血全血よりメトシリン耐性黄色ブドウ球菌のDNAを直接採取し、MRSAの薬剤耐性を担う遺伝子であるmec A遺伝子を2組のプライマーとDNAポリメレースであるTthをもちいてPCRにて増幅したのち、電気泳動にてmec A遺伝子を検出する方法を開発し、その感度をMRSAの希釈系列を作り本法で検討したところ、1mlあたり数個のMRSAが存在していればMRSAを検出可能であった。実際、外科領域の重症感染患者30例について従来からの血液培養法と比較検討した結果、従来の血液培養法でMRSAが検出し得た20症例では本法によっていずれも検出可能であった。さらに、臨床上明らかに敗血症症状を呈しかつMRSAを局所に同定しえるにもかかわらず従来の血液培養法では検出し得なかった2症例でも我々のPCR法を用いた診断法ではMRSAを検出可能であった。MRSA敗血症と診断されるまでの期間を両者で比較すると、従来の培養法では菌の同定に平均4日、感受性の判定までには5日間要していたのが、本法を使用すると同じ症例で4時間で感受性まで判定可能であった。ただ、本法の問題点として、表皮ブドウ球菌と黄色ブドウ球菌とでは、その臨床症状には大きな違いがあり、黄色ブドウ球菌の方がはるかに重篤であるのに両者を鑑別し得ないことである。両者を鑑別するために、臨床分離株についてはTSST-1遺伝子を同時に検出する試みを行い、良好な結果が得られた。来年度は実際の臨床例について行う予定であるさらに、これら重症感染患者の末梢血よりtotalRNAを抽出後にRT-PCRで各種サイトカインmRNAの発現を検討してみると、重症感染症患者ではIL-6のみでなくIL-1,TNFmRNAも活性化されていた。1。前年度の研究においてMRSA敗血症を高感度で迅速に診断する方法を開発し、臨床例に用いて良好な成績が得られた。

ただ、そのときの問題点として、MRSEとの鑑別が生まれてきたが、本年度はTSST遺伝子とmecA遺伝子を同時に検出することにより、臨床例でもMRSA敗血症とMRSE敗血症を鑑別可能であった。すなわち、12例のMRSA敗血症患者ではTSST遺伝子とmecA遺伝子が同時に検出されたが、血液培養法でMRSEが検出された症例でPCR法を利用したわれわれの方法を使用するとmecA遺伝子のみでTSST遺伝子は検出されなかった。2。正常健人より採血しRNAを抽出後、サイトカインmRNA発現を検討したところいずれのサイトカインmRNA発現も認められなかった。しかし、重症感染症患者では、末梢流血中の血液細胞においてIL-1とTNFサイトカインmRNA発現が認められた。これらの事実は、感染症患者では流血中の血液細胞が活性化していることを示していると考えられる。3。敗血症発症・重症化の際に腎機能障害が発生するが、その機序として内皮細胞から放出されるエンドテリンが密接に関与していることをわれわれは明らかにしてきた。このエンドテリンはbig endothelineから変換酵素によりプロセッシングを受けて生じることが知られているので、変換酵素阻害剤により内因性エンドテリンを抑制することにより腎機能の改善がみられるか否かをエンドテリン変換酵素阻害剤を用いて検討したところ、big endotherinが上昇し、内因性エンドテリンが低下し、今後の更なる検討は必要であるが治療薬として使用できる可能性が示された。
マボヤ卵内遺伝情報の網羅的解析による比較ゲノムのための物理遺伝地図の作成

脊索動物であるにも関わらずゲノムの重複のないホヤは脊椎動物のゲノムの機能研究の優れたモデル生物だと考えられる。本研究では、実験発生学的知見の最も多いマボヤの母性cDNAの塩基配列及び初期発生過程での発現パターンの解析を行いつつ、その結果を利用してゲノム上に遺伝子をマッピングしていくことでマボヤゲノム全体を俯瞰し、カタユウレイボヤのゲノム構造や発現パターンなどとの比較を可能にすることを目的とする。マボヤ受精卵cDNAのアレイドライブラリーの両側約500bpずつの塩基配列を決定し、約7千クローンの塩基配列の解析によって4千以上の遺伝子が数えられた。ホヤゲノム中には16,000程度の遺伝子がコードされていると推定され、卵内にはその半数弱の遺伝子が発現していると推測されるので、既に約6割の成果を挙げたことになる。発現パターンの解析についても、独自に開発した多検体同時処理可能なWMISH法を駆使して、約3,500クローンの発現プロファイルを収集した。その結果、大多数のものは胚全体に分布するものの,胚前方に隔離されるRNA、主に表皮に分化する動物半球に隔離されていくRNA、動物半球でも前側の細胞だけに局在するRNAや、筋肉や前後軸の形成に関する決定因子のある胚の後極に局在する多数のRNA、逆に後極を含む植物極側後方の細胞以外の細胞に受け継がれていくRNAなどがそれぞれ多数あることが見出された。さらにマボヤ単個体から精子DNAを集め、BACライブラリーを構築した。構築したライブラリーは20ゲノムイクイバレント以上をカバーすると推定される。現在は完成したBACライブラリーを3Dプール化し、次ステップであるマッピングに備えつつある。
現代バスク語諸方言の音韻と文法の記述　～地域差と世代間差の二つの側面から～

スペイン領バスク自治州ギプスコア県ウロラ・コスタ地方で話される現代バスク語の諸方言の音韻と文法(形態・統語)について,各方言間の地域差に基づく相違はもとより,世代間の相違にも着目しながら記述を行う.この地方の方言に関しては,すでにアスペイティア方言,セストア方言,サラウツ方言について調査を行っているが,これらに加えて,同地方の他の主要な地域変種であるアスコイティア方言,スマイア方言,エレシル方言について調査・研究することにより,すでに調査済みの上記の3方言と併せて,当地方のバスク語の様相を「地域間変種」,「世代間変種」という二つの面をクロスさせて総合的に捉えることができると考える.スペイン領バスク自治州ギプスコア県ウロラ・コスタ地方で話される現代バスク語の諸方言の音韻と文法(形態・統語)について,各方言間の地域差に基づく相違はもとより,世代間の相違にも着目しながら記述を行う.この地方の方言に関しては,すでにアスペイティア方言,セストア方言,サラウツ方言について調査を行っているが,これらに加えて,同地方の他の主要な地域変種であるアスコイティア方言,スマイア方言,エレシル方言について調査・研究することにより,すでに調査済みの上記の3方言と併せて,当地方のバスク語の様相を「地域間変種」,「世代間変種」という二つの面をクロスさせて総合的に捉えることができると考える.
N-sulfonate型麻痺性貝毒の分布と毒性に関する研究

1)N-sulfonate型麻痺性貝毒の自然界における分布:世界各地で毒化二枚貝を集め,液体クロマトグラフで毒組成を分析した.渦鞭毛藻Gymnodi niumcatenatumで汚染したスペイン,オーストラリア,山口県の試料には7590%の高濃度でN-sulfonate型毒が含まれていた.しかし,その内訳はスペイン,山口産がgonyautoxin V,VI(GTX5,6)を主成分とするのに対し,オーストラリア産試料ではその大部分がC1C4毒で占められるなど地域によって明瞭な差異が認められた.一方, Protogonyaulax tamarensisによって毒化したスペイン,北海道,岩手産二枚貝中のこの毒群の比率は低く, C1,C2毒が15%含まれるにすぎなかった.毒化原因不明の茨城産試料の組成は山口産二枚貝と近似し,同海域におけるG,catenatumの出現が疑われた.3)N-sulfonate型毒の毒性,安定性:C1, C2毒のマウス腹腔内毒性は29, 712MU/umoleを示し,従来報告されている数値より2, 3倍高かった.また,投与量・致死時間曲線は公定法に用いられるSTXと統計的に差は認められなかった.C1, C2を人工胃液中でインキュベートした場合, pH1.55, 5時間としう激しい条件下でも, GTX_2, GTX_3への変換率は8%にすぎなかった.以上の結果から,現行の麻痺性貝毒の規制値4MU/gをN-sulfononate型毒を多く含む貝に摘要しても問題無いと考えられる.1)N-sulfonate型麻痺性貝毒の自然界における分布:世界各地で毒化二枚貝を集め,液体クロマトグラフで毒組成を分析した.渦鞭毛藻Gymnodi niumcatenatumで汚染したスペイン,オーストラリア,山口県の試料には7590%の高濃度でN-sulfonate型毒が含まれていた.しかし,その内訳はスペイン,山口産がgonyautoxin V,VI(GTX5,6)を主成分とするのに対し,オーストラリア産試料ではその大部分がC1C4毒で占められるなど地域によって明瞭な差異が認められた.一方, Protogonyaulax tamarensisによって毒化したスペイン,北海道,岩手産二枚貝中のこの毒群の比率は低く, C1,C2毒が15%含まれるにすぎなかった.毒化原因不明の茨城産試料の組成は山口産二枚貝と近似し,同海域におけるG,catenatumの出現が疑われた.3)N-sulfonate型毒の毒性,安定性:C1, C2毒のマウス腹腔内毒性は29, 712MU/umoleを示し,従来報告されている数値より2, 3倍高かった.また,投与量・致死時間曲線は公定法に用いられるSTXと統計的に差は認められなかった.C1, C2を人工胃液中でインキュベートした場合, pH1.55, 5時間としう激しい条件下でも, GTX_2, GTX_3への変換率は8%にすぎなかった.以上の結果から,現行の麻痺性貝毒の規制値4MU/gをN-sulfononate型毒を多く含む貝に摘要しても問題無いと考えられる.
子宮体癌、卵巣癌の発生、進展に関与する情報伝達系クロストークの解析-Ras蛋白を介する経路を中心にして-

1.活性化型〔12val〕K-Ras導入により、腫瘍能をもつNIH3T3細胞においてERの発現の増加と機能の亢進がみられた。(K12V細胞)また、PRを活性化型Rasと共発現させると腫瘍能K12細胞抑制とERの機能の低下が認められた。ERのアンチセンスによりERの発現を減少させると腫瘍能の抑制が見られた。以上よりERはK-Rasを介する腫瘍能に重要であることが示された。2.野性型Ras蛋白のみを発現しているIshikawa(IK)細胞株と12Val変異型と野性型両方のK-Ras蛋白を発現しているHHUA、HOUA細胞株を用い、EGFに対する反応を解析した。IK細胞ではEGF依存性に活性化型Ras蛋白の割合が増加し、細胞増殖が促進されたのに対し、HHUA、HOUA細胞では両者とも変化はなかった。さらにIK細胞に野性型および12Val変異型ras遺伝子を形質導入し細胞株を樹立した(それぞれをIK Kwt細胞、IK K12V細胞と記す)。低血清培養下でIK細胞およびIK Kwt細胞ではEGF依存性に細胞増殖促進効果がみられたのに対し、IKK12V細胞ではこの効果が抑制された。この結果をもとにEGFレセプター阻害剤であるエルブスタチンを培養中に添加し各細胞株のコロニー形成率を比較したところ、IK細胞、IK Kwt細胞でコロニー形成率の著明な抑制が認められた。一方、IK K12V細胞では抑制率が低下し、HHUA細胞、HOUA細胞では抑制は認められなかった。以上よりRasの上流シグナルの阻害剤は野性型Ras蛋白を発現している子宮内膜癌細胞の腫瘍能抑制に有効であることが示唆された(Kato.K.et al 1998)。3.卵巣癌細胞株を対象としてHGF刺激による細胞運動能・浸潤能への影響、及びシグナル伝達経路について検討した。HGF受容体蛋白発現をウエスタンブロット法で解析したところ、卵巣癌細胞株8株中6株でHGF-Rの過剰発現を認めたが、ELISA法による測定では、各細胞株培養液上清中に有意なHGFの産生は認めなかった。Boyden chamberを用いたHGF刺激による細胞運動能・浸潤能への影響を検討では、8株中6株で促進を認め、HGF刺激によりHGF-Rリン酸化.MAPKの活性化の亢進も認めた。ras dominant negative(ras DN)を発現するアデノウイルスを感染させると、HGF刺激によるMAPKの活性化を抑制し、細胞運動能・浸潤能も抑制した.以上よりHGFR→ras→MAPKのシグナル伝達経路は卵巣癌細胞の運動能・浸潤能に関与することが示唆された(Ueoka.Y.Kato.K.et al.投稿中)1.活性化型〔12val〕K-Ras導入により、腫瘍能をもつNIH3T3細胞においてERの発現の増加と機能の亢進がみられた。ras dominant negative(ras DN)を発現するアデノウイルスを感染させると、HGF刺激によるMAPKの活性化を抑制し、細胞運動能・浸潤能も抑制した.以上よりHGFR→ras→MAPKのシグナル伝達経路は卵巣癌細胞の運動能・浸潤能に関与することが示唆された(Ueoka.Y.Kato.K.et al.投稿中)

今年度は、主に卵巣がん細胞に対するHGFの影響を解析した。1)まず、各細胞株を無血清培養液で培養し、培養液上清中のHGFの濃度をEIA法で測定したが、HGFの産生は認めなかった。また。細胞よりRNAを抽出後、逆転写酵素によりcDNAに転換後PCRで増幅し、Ras遺伝子(K-、H-)の12,61コドンの変異の有無をdot blot法でスクリーニングしたが、Ras変異の有無と運動能の間に関連は認められなかった。2)次に、10種類の卵巣癌細胞株の上清中に1,10ng/ml HGFを添加し、細胞の運動能の変化を解析したところ、5株で運動能の亢進を認めた。Western blot法でHGF-Rの発現をみたが、HGF-Rの発現と運動能の亢進の相関はなかった。3)上記の中で有為に運動能の亢進を認めた2株についてHGF-Rのリン酸化をHGF-Rを免疫沈降法Anti-Phosphotyrosine抗体を用いたWestern blot法で解析したところ、HGF刺激によるチロシンリン酸化の亢進が認められた。4)また、上記2株におけるHGF刺激下でのMAPKの活性能をAnti-MAPK抗体を用いたWestern blot法で解析したところ、活性化の亢進が認められた。以上より、卵巣癌細胞の運動能にHGF→HGF-R→MAPKのシグナルが関与しているところが示唆された。HGFは細胞の増殖性ばかりでなく運動性にも関与する。卵巣癌は腹腔内への播種性転移を特徴とする。近年卵巣癌においてHGF受容体遺伝子であるc-Met過剰発現が報告されている。そこで卵巣癌細胞株を対象としてHGF刺激による細胞運動能・浸潤能への影響、及びシグナル伝達経路について検討した。1)HGF受容体蛋白発現をウエスタンブロット法で解析したところ、卵巣癌細胞株8株中6株でHGF-Rの過剰発現を認めた。2)各細胞株培養液上清中のHGF濃度をELISA法により測定したところ、卵巣癌細胞株には有意なHGFの産生は認めなかった。3)Boyden chamberを用いてHGF刺激による細胞運動能・浸潤能への影響を検討したところ、HGF刺激により8株中6株で細胞の運動能の促進を認めた。4)4株でHGF受容体蛋白のリン酸化とMAPKの活性化を検討したところ、HGF刺激により全株でHGF・Rのリン酸化、MAPKの活性化、細胞浸潤能の亢進を認めた。5)ras dominant negative(ras DN)を発現するアデノウイルスを感染させ、HGF刺激によるMAPK活性および細胞運動能・浸潤能への影を検討したところ、ras DNの発現はHGF刺激によるMAPKの活性化を抑制し、細胞運動能.浸潤能も抑制した。HGFに対する弱い細胞運動能の亢進を認めたが、浸潤能への亢進は全く認められなかった。以上より1)HGFR→ras→MAPKのシグナル伝達経路は卵巣癌細胞の運動能・浸潤能に関与する。2)HGFに対する運動能と浸潤能の反応性の相違からそれぞれ異なるシグナル伝達経路の存在することが示唆された。卵巣癌細胞株を対象としてHGF刺激による細胞運動能・浸潤能への影響,及びシグナル伝達経路について検討した.HGF受容体蛋白発現をウエスタンブロット法で解析したところ、卵巣癌細胞株8株中6株でHGF・Rの過剰発現を認めたが、ELISA法による測定では、各細胞株培養液上清中に有意なHGFの産生は認めなかった。
高度標的化リポソーム製剤による腫瘍特異的DDSの確立と中性子捕捉療法への応用

ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)では、がん細胞へホウ素を送達し、次に中性子照射により核反応を誘起し治療を行う。正常細胞を損傷せず、ホウ素を取込んだがん細胞のみを細胞レベルで死滅させる為、高浸潤能の悪性脳腫瘍や播種性細胞による再発がん等、従来では治療が困難な難治性がんにも有効な治療法になる。BNCTでは、がん細胞へ選択的かつ高効率にホウ素を送達する必要があるが、確実な薬物送達システムがなく適応症例も限られている。本研究では、標的能を高機能化し、リボソームにより高効率にホウ素送達を行うシステムを確立する。腫瘍に応じて抗体やペプチドを選択できる"テーラーメイド"の標的選択性を有し、腫瘍部のホウ素濃度≧30ppm、ホウ素濃度比(腫瘍/血液)>3を満たす新規ターゲット型リボソーム製剤を開発する。平成23年度は、表面に結合した抗体により脳腫瘍へ標的化すると同時に、発光タンパクによりイメージング能を付与した「抗体結合型リボソーム」、卵巣がんの認識ペプチドを表面に結合した「ペプチド結合リボソーム」の2種類を設計・合成し、腫瘍標的を試みた。培養腫瘍細胞による検証では、リボソーム投与濃度依存的に細胞内へホウ素が送達され、製剤のターゲティング能が確認された。イメージングでは、リボソーム投与量の増加に伴い発光量が増加し、発光量と腫瘍細胞内のホウ素量には相関性が確認された。脳腫瘍モデルマウスによるホウ素送達能の検証では、腫瘍/血液比>4および腫瘍/正常部比>8と腫瘍組織に高度に標的化し、目標を達成した。一方で、腫瘍部のホウ素濃度は19.5ppmであり、24年度はホウ素の高集積化を目的にリボソームの組成・合成方法の改良を行った。その結果、従来の1.41.5倍のホウ素を含有するリボソームが開発できた。今後、この高度標的化リボソーム製剤により、目的がん細胞のみに高効率にホウ素を輸送できると期待される。正常細胞を損傷せず、ホウ素を取込んだがん細胞のみを細胞レベルで死滅させるため、高浸潤能の悪性脳腫瘍や播種性細胞による再発がん等、従来のがん治療では限界のある難治性がんにも有効な治療法になる。BNCTでの治療効果の向上には、がん細胞へ選択的に且つ高効率にホウ素を送達する必要があるが、確実な薬物送達システムは未だ存在せず、適応症例も限られている。そこで本研究では、標的能を高機能化し、リポソームによりホウ素送達を行うシステムを確立する。腫瘍に応じて抗体やペプチドを自由選択できる"テーラーメイド"の標的選択性を有し、目的がん細胞のみに高効率にホウ素輸送する新規ターゲット型リポソーム製剤を開発する。事業1年目である平成23年度は、2種類のリポソーム製剤を開発した。抗体結合型リポソーム製剤は、脳腫瘍を認識する抗体をその表面に結合し標的化を行うと同時に、発光タンパクによりその挙動を観察できるイメージング能を付与した。一方、他の難治性がんである卵巣がんを標的として、ペプチドを表面に結合したペプチド結合リポソームを作製した。培養腫瘍細胞によるin-vitro assayでは、投与したリポソーム濃度依存的に腫瘍細胞内へホウ素が送達され、開発したリポソーム製剤のターゲティング機能が確認された。イメージングでは、リポソーム投与量の増加に伴い強い発光シグナルが観察され、発光量が増加した。この発光量と腫瘍細胞内に取り込まれるホウ素量には相関性があった。また、脳腫瘍細胞U87deltaEGFRをヌードマウス脳内に移植して安定した脳腫瘍モデルが作製できるように準備し、さらにホウ素デリバリーを確認した。これにより、次年度以降、in-vivo評価へとスムーズに移行できるように準備が整った。脳腫瘍モデルマウスによるホウ素送達能の検証では、腫瘍/血液比>4および腫瘍/正常部比>

8と腫瘍組織に高度に標的化し、目標を達成した。一方で、腫瘍部のホウ素濃度は19.5ppmであり、24年度はホウ素の高集積化を目的にリボソームの組成・合成方法の改良を行った。その結果、従来の1.41.5倍のホウ素を含有するリボソームが開発できた。今後、この高度標的化リボソーム製剤により、目的がん細胞のみに高効率にホウ素を輸送できると期待される。本年度は、腫瘍に特徴的に発現している細胞表面抗原やレセプターを利用した腫瘍特異的ターゲッティング型の新規リポソーム製剤2種を設計・合成し、腫瘍標的を試みた。これら2種類の新規リポソーム製剤を各々、脳腫瘍または卵巣がん由来の培養腫瘍細胞に投与し、細胞内へのホウ素デリバリー動態を検証した。その結果、両リポソーム製剤において腫瘍特異的にターゲティングできることを確認した。さらに、腫瘍モデルマウスによるホウ素デリバリーの検証を行う準備として、ヌードマウスを用いて腫瘍胆癌モデルを作製した。このように全体の流れとして、本年度は、交付申請書に記載した「研究目的」に沿って研究を進めた。ただし、腫瘍モデルマウスの作製として、当初計画では、脳腫瘍モデルおよび卵巣がんモデルの作製を予定していたが、本年度は脳腫瘍モデル作製のみに留まった。卵巣がんを標的としたペプチド結合リポソームに使用するペプチド合成に時間を要したためである。したがって、卵巣がんモデルでの検証は次年度以降に行う予定である。また、当初計画では、BNCTによる治療効果の検証として細胞レベルでの評価を行う予定であったが、本年度では実施できなかった。培養細胞を用いたホウ素デリバリー検証に時間を要したのに加え、中性子照射を行う予定の京都大学原子炉実験所での使用可能な期間が限られているためである。したがって次年度、日程を調整し、細胞レベルでのBNCTによる治療効果の検証を行う予定である。このように、計画より若干の遅れはあるものの、おおむね順調に進展している。本年度(23年度)に引き続き、新規ターゲット型リポソーム製剤の合成を行う。培養腫瘍細胞や腫瘍モデルマウスを用いてホウ素デリバリーの検証を行い、フィードバックをかけながら更に検討・改良を重ね、ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)に最適な新規リポソーム製剤を開発する。培養腫瘍細胞を用いた検証では、新規リポソーム製剤を投与し、細胞内のホウ素濃度を定量的、経時的に測定し、細胞内へのホウ素デリバリー動態を検証する。腫瘍モデルマウスによるホウ素デリバリーの検証では、まず、本年度実施できなかった卵巣がんモデルを作製する。作製した脳腫瘍モデルおよび卵巣がんモデルに新規リポソーム製剤を尾静脈より投与後、種々の時間経過後、各臓器を摘出し、ホウ素濃度を測定し、臓器内のホウ素デリバリーを確認する。BNCTに最適な条件を模索し、治療部位であるがん細胞に30ppm以上の濃度で、かつ腫瘍/血液比が3を超えて確保できる新規ターゲット型リポソーム製剤を開発する。さらに、開発した新規リポソーム製剤のBNCTによる治療効果の検証を行う。中性子照射は、大阪府熊取町の京都大学原子炉実験所で施行する。まず、培養細胞を用いてコロニーフォーミングアッセイを行い、細胞レベルでの投与濃度、中性子照射時間と細胞増殖抑制効果について検討を行う。
トポロジーを応用した無限アーベル群論の研究

位相空間から離散整数群Zへの連続関数全体が作るアーベル群とその双対群について研究し、次の1と2の成果を得た。また、直積位相空間の次元に関するPasynkovの問題について、次の3の成果を得た。1.ある非可算順序数の中のnonreflecting stationary集合の存在を仮定して,強い意味で反射的でないアーベル群のZ-鎖を構成した。即ち、この仮定の下で、すべての整数nに対しA(n)の双対群がA(n+1)でありA(n)はA(n+2)と同型でないようなアーベル群の列{A(n)}が存在する。ここで、各A(n)は零次元位相空間上の整数値連続関数の群とその双対群である。また、この仮定だV=Lの下で成り立つ。結果はA.MeklerとP.C.Eklofの問題に肯定的に答える。2.ZFCの中で、すべての整数nに対しA(n)の双対群がA(n+1)であり、すべてのn<0に対しA(n)はA(n+2)と同型でNAKU、すべてのn>0に対してはA(n)とA(n+2)は同型であるが反射的でないようなアーベル群の列{A(n)}が存在する。この結果は上述の問題に対する部分解を与える。3.B.A.Pasynkovは1983年に位相次元の積定理に関して「位相空間XからYへの完全写像と位相空間Sから距離空間Zへの完全写像が与えられたとき,YとTの積が正規ならばXとSの積は矩形積であるか」という問題を提出した。空間XとSの積空間が零次元の場合には、この問題が肯定解を持つことを証明した。
子どもの健やかな運動発達に寄与する乳児期までの栄養環境

本研究は、乳児期までの栄養環境が、児の骨格筋の発達にどの様に影響し、それが乳幼児期以降の運動機能の個人差をどの様に決定づけるかを明らかにすることを目的としている。骨格筋の発達に関わる指標として、乳幼児において筋力および筋量を評価する。当該年度は、児の筋力を評価する試みとして、出生前コホート研究に参加している生後1か月児を対象に、乳幼児握力計(竹井機器工業株式会社)を用いた把握力の測定を開始した。把握力は、1か月健診時に左右2回ずつ測定し、左右いずれかの最大値を採用した。現在までに収集した10名のうち、データベースに組み入れた7名について解析を行った。その結果、対象児の把握力は、平均値(±標準偏差)で0.63(±0.23)kg、範囲は0.370.96kgを示した。対象者数が少ないことから、栄養環境や運動発達との関連性を検討することは難しいが、生後1か月時点での把握力に関する資料が得られ、臨床研究における測定の実行可能性を確認することができた。また、予備的な検討として、新生児1名を対象に生後5日目生後28日目にかけて、1日23試行(各試行で左右2回ずつ)の把握力測定を、週に23回継続して行った。各測定日における最大値を解析したところ、生後5日目から28日目にかけて、対象児の把握力は0.24kgから0.75kgへと増加する傾向がみられた。各試行において得られたすべての値を用いて、生後5日目から28日目までの変化を傾向検定を用いて検定したところ、有意な増加傾向が認められた(p=0.009)。これらの結果から、新生児期における把握力は個人における神経発達を反映する指標として有用である可能性が示唆された。研究開始1年目となる平成30年度は、骨格筋の発達に関わる指標として、乳児の筋力を評価する新しい研究をすすめた。都内大学病院と共同ですすめていた母児を対象とした出生前コホート研究において、児の精細なフォローアップを行う新しい研究(親子フォローアップ研究)を開始し、その研究において生後1か月児を対象に把握力の測定を開始した。倫理委員会の承認を得て8月より測定を開始し、現在までに約10名の握力のデータを収集した。しかし、出生前コホート研究の新規リクルートが中止となったため、その参加者を対象として行っていた親子フォローアップ研究についても年度末で実施が打ち切りとなってしまった。この点は想定外であったが、新しい研究をスタートしデータ収集をすすめられた現時点までは期待通りの進展であった。この他に、乳幼児における握力測定の信頼性を確認するために、生後5日の新生児1名および2歳児2名を対象に、1日23試行(各試行で左右2回ずつ)の(把)握力測定を、週に23回×1か月程度継続して行った。現在、これらのデータを解析する準備をすすめているところである。今後計画の見直しが必要であるが、生後1か月児の把握力の測定を国内外で初めて体系的に実施し、コホート研究における測定の実行可能性を確認することができた点や、その他にも関連するデータ収集および解析が行えた点を踏まて、「おおむね順調に進展している」と評価した。今後は、ニュージーランド・オークランド大学・Liggins研究所で行われているランダム化比較試験(DIfferent Approaches to MOderate & late preterm Nutrition: DIAMOND STUDY)の一部として、本研究を遂行する。DIAMOND STUDYにおいては、発達遅延のハイリスク群である早産児に対して、出生後から母乳栄養が確立するまで異なる栄養学的介入を行い、アウトカムとして2歳時点の神経発達の評価を行う。児の除脂肪量(≒筋量)の測定が当初より含まれているこの研究のプロトコルに、新たに児の筋力(握力)の測定を組み込む予定である。なお、この計画変更に伴い、渡航期間を当初予定の半年間から2年間に延長した上で、前倒しで平成31年3月中旬より渡航を開始した。