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インドネシア・オランダ裁判制度改革の比較：法の移植と経路依存的発展の実証的分析

本研究は、オランダとそのインドネシアの司法・実務の変化を歴史的に比較検証し、インドネシアの司法制度の発展と改革について考察した。特に法制度の発展は外部からの法と法制度の移植を契機とする「法の移植」論と、初期条件に規定される法制度の経路依存性という比較法方法論を用いた。研究成果は、オランダからの司法制度を含む、法令/法制度の移植が、現在のインドネシアにおける法の発展に与えた影響を明らかにした。特に裁判官人事制度については、制度として導入されたオランダ型官僚的司法制度と植民地特有の事情(原住民差別、法曹人材不足、法多元性)とが原住民裁判官のキャリアに大きな影響を与えたことを明らかにした。植民地期・独立後のインドネシアの(1)裁判人事制度(判事の任用および異動)、(2)訴訟指揮(公判および尋問の方法、判決執行)、(3)裁判組織制度(行政との関係、審級制度)にかんして、19世紀20世紀初頭における法制度および運用状況、ならびにインドネシア独立以降の変化について調査を行う。19世紀20世紀初頭にかけての調査は、オランダ国立ライデン大学法学部、オランダ国立公文書館、インドネシア国立公文書館の資料を基に行う。インドネシア独立後の変化については、文献調査に加えて、裁判官および法曹関係者、研究者への聞き取り、裁判所における観察による手法もとる。平成25年度は以下の通りであった。(1)先行研究および先行理論の調査および具体的な研究協力の策定(4月10月)については、本研究に関連する先行研究を調査し、先行理論を整理する。また、インドネシアおよびオランダにおける研究協力者と協議し、共同研究計画を具体化する。(2)研究協力(11月頃)については、インドネシアにおいて、研究協力者と具体的協力体制および成果物計画に関して会合を持つ。以上の計画のうち、(1)の先行研究の調査については、インドネシアにおける資料収集によって行った。先行研究の整理を現在行っており、2014年5月にマレーシア・マラヤ国立大学において行われるアジア法研究所年次会議で報告"The roots of bureaucratic judiciary in Indonesia: transfer and promotionof colonial judges in the Dutch EastIndies"を行う(受理済み)。(2)の研究協力者との打ち合わせについては、学務の都合により2014年3月にインドネシアにおいて行った。オランダ研究協力者の都合により、オランダでの調査は2014年度に行うこととした。本年度は、(1)資料調査として、オランダおよびインドネシア、日本における植民地期の公文書調査、(2)成果報告として、Asia Law Institute研究総会で研究報告、(3)研究協力として、オランダおよびインドネシアの研究協力者との勉強会を予定していた。(1)の資料調査について、2014年8月にインドネシア・ジャカルタにある国家公文書館、および2015年2月に京都大学東南アジア研究センターで行った。(3)研究協力者との交流については、2014年8月にエルランガ大学(インドネシア・スラバヤ市)において、オランダ・ライデン大学およびインドネシア・マタラム大学の研究協力者を含む、インドネシア法専門家とのワークショップを行った。本研究事業の目的は、インドネシア司法制度の問題を考察するために、その形成および発展過程に大きな影響を与えたオランダ植民地期の司法制度の特徴と、またその後のインドネシア司法制度の発展過程を明らかにすることである。本年度は、主に二つのテーマについて研究を行った。第一に、オランダ植民地期における原住民法曹の養成および司法制度内での位置づけについてである。そして、第二に、現在のインドネシア裁判所における、裁判所行政についてである。第一のテーマについては、オランダ植民地期の裁判官異動資料、原住民裁判官養成機関(バタヴィア法律学校)の資料を元に、原住民裁判官の植民地司法機構におけるキャリアと、オランダ人裁判官のキャリアと比較した。1900年以降、原住民裁判官の数は増えていくが、その配属先は小規模な地方裁判所であり、そのため複雑な法律問題について経験を積む機会を持たなかったこと、その背景には原住民裁判官は地方での人材不足に充てられたことがある。このことは、現在のインドネシアの裁判官採用にも見られ、裁判官の実地での経験蓄積に影響を与えている。この研究成果については、Asian Law Institute年次研究総会(台湾)で報告した。第二のテーマについては、インドネシア・西ヌサトゥンガラ州にある4つ地方裁判所(ロンボク島およびスンバワ島)について、非法曹裁判所職員(書記官など)の業務および採用・昇進、裁判官との関係についての調査を行った。2016年9月のアジア法社会学会(シンガポール)で報告するため研究成果をとりまとめている。またインドネシアの議会と司法に関する研究報告を欧州東南アジア学会(ウィーン)で行った。また、インドネシアにおける西洋近代法理論継受を日本と比較した報告を、スイス・フリブール大学で開催された国際会議で行った。この成果は論文集として出版する作業を行っている。本年度は、第一にオランダ植民地期における原住民法曹の養成および司法制度内での位置づけについて、そして、第二に、現在のインドネシア裁判所における、裁判所行政についての研究を行った。第一のテーマについては、この研究成果については、Asian Law Institute年次研究総会(台湾)で報告し、さらに2016年度に名古屋大学法政論集に論文として掲載するために準備している。資料は、オランダ植民地期の裁判官異動資料、原住民裁判官養成機関(バタヴィア法律学校)をオランダ・ライデン大学および公文書館、インドネシア国立図書館などで収集した。そして、原住民裁判官の植民地司法機構におけるキャリアと、オランダ人裁判官のキャリアと比較した。

第二のテーマについては、インドネシア・西ヌサトゥンガラ州にある4つ地方裁判所(ロンボク島およびスンバワ島)について、非法曹裁判所職員(書記官など)の業務および採用・昇進、裁判官との関係についての調査を行い、2016年9月のアジア法社会学会(シンガポール)で報告するため研究成果をとりまとめている。同学会での報告はすでに受理されている。またインドネシアの議会と司法に関する研究報告を欧州東南アジア学会(ウィーン)で行った。また、インドネシアにおける西洋近代法理論継受を日本と比較した報告を、スイス・フリブール大学で開催された国際会議で行った。この成果は論文集として出版する作業を行っている。2016年度は本研究課題最終年度として、複数の研究成果を公表した。その成果をベースとして、インドネシア司法の問題点を明らかにするために、新たに法の支配への重要性の一方、学術的な研究の対象となってこなかった法律関係職(弁護士、公証人、裁判所書記)の研究についても着手し、この研究は萌芽(挑戦)研究として科研費の申請を行っている。本年度に発表した研究のうち、特に本研究課題にかんれんするものおよびその概要は次の通りである:本研究は、オランダとそのインドネシアの司法・実務の変化を歴史的に比較検証し、インドネシアの司法制度の発展と改革について考察した。特に法制度の発展は外部からの法と法制度の移植を契機とする「法の移植」論と、初期条件に規定される法制度の経路依存性という比較法方法論を用いた。研究成果は、オランダからの司法制度を含む、法令/法制度の移植が、現在のインドネシアにおける法の発展に与えた影響を明らかにした。特に裁判官人事制度については、制度として導入されたオランダ型官僚的司法制度と植民地特有の事情(原住民差別、法曹人材不足、法多元性)とが原住民裁判官のキャリアに大きな影響を与えたことを明らかにした。2014年度については、オランダ・ライデン大学における資料調査を除き、予定していた資料調査を実施した。インドネシア国立公文書館は、通常の外国人によるアクセスが困難であるが、オランダ・ライデン大学所属の共同研究者からの支援を受け、多くの資料を入手することができた。また、研究成果報告についても、予定していた国際学会について実施した。この学会での報告は現在、出版に向けて論文として執筆中である。ロンドン大学におけるワークショップでの報告は、オランダ植民地における法政策として、本研究課題と密接に関連するものである。これについても、現在は研究論文として出版・発表するために執筆を行っている。共同研究については、当初、オランダ・ライデン大学での研究会を予定していたが、共同研究者がインドネシア訪問を予定していたために、ほかのインドネシア法研究者を交えた研究会とした。
消化管平滑筋の自発活動発現における細胞内貯蔵カルシウムの役割

摘出モルモット胃平滑筋にガラス微小電極を刺入し膜電位を記録すると、振幅およそ30mVで持続5-6秒の緩やかな電位が律動的に記録され、これを緩徐電位と呼んだ。緩徐電位は神経要素を除外しても観られ、またCa-拮抗薬で電位依存性Caチャネルを阻害しても変化しなかったので、平滑筋組織内で発現している自発活動と考えた。緩徐電位はDIDSやニフルミン酸で消失したので、Ca感受性塩素チャネルが活性化されることにより形成されると考えた。また緩徐電位は細胞内Caイオン濃度の上昇を伴っており、Caキレート剤で細胞内Ca濃度を極端に低下させたり、細胞内小胞体(カルシウム貯蔵部位)のカルシウムを枯渇させたり、小胞体膜にあるIP3受容体を阻害すると停止したので、IP3を介して小胞体からCaを遊離する機構が関与していることが判った。さらにミトコンドリアのプロトンポンプを抑制したり、ミトコンドリア膜のATP感受性Kチャネルを抑制しても緩徐電位の発生は阻止された。また緩徐電位発生には数秒の不応期があり、プロテインキナーゼCの活性と連関していた。これらの結果から、自発活動のもととなる歩調とり電位はミトコンドリアにおける電位変動で生じるカルシウムの局所的濃度変化がプロテインキナーゼ、ホスホリパーゼCなどのCa感受性酵素を活性化し、IP3の産生を増加させ、筋小胞体からCaを遊離させることによって細胞内Ca濃度を増加させ、その結果として活性化される細胞膜のCa感受性塩素チャネルを介する塩素イオンの流出により形成されると考えた。摘出モルモット胃平滑筋にガラス微小電極を刺入し膜電位を記録すると、振幅およそ30mVで持続5-6秒の緩やかな電位が律動的に記録され、これを緩電位と呼んだ。緩電位は神経要素を除外しても観られ、またCa-拮抗薬で電位依存性カルシウムチャネルを阻害しても変化しなかったので、平滑筋組織内で発現している自発活動と考えた。緩電位はDIDSやニフルミン酸で消失したので、カルシウム感受性塩素チャネルチャネルが活性化されることにより形成されると考えた。また緩電位は細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を伴っており、カルシウムキレート剤で細胞内カルシウム濃度を極端に低下させたり、細胞内小胞体(カルシウム貯蔵部位)のカルシウムを枯渇させたり、小胞体膜にあるIP3受容体を阻害すると停止したので、IP3を介して小胞体からカルシウムを遊離する機構が関与していることが判った。さらにミトコンドリアのプロトンポンプを抑制したり、ミトコンドリア膜のATP感受性Kチャネルを抑制しても緩電位の発生は阻止された。また緩電位発生には数秒の不応期があり、プロテインキナーゼCの活性と連関していた。これらの結果から、自発活動のもととなる歩調とり電位はミトコンドリアにおける電位変動で生じるカルシウムの局所的濃度変化がプロテインキナーゼ、ホスホリパーゼCなどのカルシウム感受性酵素を活性化し、IP3の産生を増加させ、筋小胞体からカルシウムを遊離させることによって細胞内カルシウム濃度を増加させ、その結果として活性化される細胞膜のカルシウム感受性塩素チャネルを介する塩素イオンの流出により形成されると考えた。胃平滑筋の自発活動発現機序を解明するため、細胞電位測定ならびにカルシウム蛍光指示薬(fura-2)によるカルシウム濃度測定を行い、特に細胞内貯蔵カルシウムの役割について研究した。摘出した胃幽門部輪走平滑筋は緩やかな電位(Slow Potentials)を律動的に発生しており、それに伴い細胞内カルシウム濃度が上昇した。筋小胞体のカルシウム貯蔵能を低下させる薬物(CPA、Thapsigardin)は膜を脱分極させ、細胞内カルシウムを一過性に増大させたのち低下させ、自発活動を停止させた。イノシトール三リン酸(IP3)受容体を2-APBで抑制しても自発活動は停止した。

またミトコンドリアのプロトンポンプ阻害薬(CPA)やミトコンドリア内膜のATP感受性Kチャネル開口薬は細胞内カルシウム濃度を増加させ、自発活動を停止させた。これらの結果から、胃平滑筋の自発活動の発現には細胞内カルシウム貯蔵部位からIP3受容体を介して遊離されるカルシウム濃度の増加を伴っており、その起動の中心的役割をミトコンドリアが担っていると推定した。ミトコンドリアでは解糖系活動によりATPを産生し、それに伴い生じる水素イオン(プロトン)の排出が電位勾配をつくる。ATPの濃度変化がミトコンドリア膜のATP感受性Kチャネルを開口させ電位勾配を消去する。このようなミトコンドリアにおける膜電位の律動的変化が未確認の機序を介してIP3の濃度変化を創り出し、カルシウム遊離を介して膜の電位変化(歩調とり電位)を生じさせると考えた。遺伝子欠損マウスの胃標本を用いた研究も行い、このような歩調とり機能は平滑筋組織内に分布するカハール細胞(Interstitial cells of Cajal)において行われていることを確かめた。
超臨界水中での有機無機複合ナノ粒子合成

有機無機複合ナノ粒子を一段のプロセスで合成する手法が開発できれば、ナノバイオ分野への展開等、ナノテクの飛躍的展開が図れるだけでなく、有機無機の融合した全く新たな学術分野を創成でき、その波及効果の大きさは計り知れない。そこで、超臨界水中で水熱合成された金属酸化物ナノ粒子の表面に様々な有機分子を複合化する手法を開発した。具体的には、水熱合成された酸化物表面は水酸基で終端されているため、水酸基との脱水反応が期待できるカルボキシル基、アミノ基などを有する有機分子との複合化を試みた。i)酸化物粒子を用いた反応系の探索まず、大きな表面積を有する酸化物粒子を用いて、有機無機複合化の可能性を探索した。ヘキシルアミンとの複合化を試みた試料のFTIR観測より、酸化物表面の水酸基基がアミノ基と結合し、酸化物粒子と有機分子が複合化していることが明らかとなった。その結果、粒子表面はメチル基で終端された形となり、疎水的な性質を示した。さらに、同様の手法によりアミノ酸分子による表面修飾も可能であることが明らかとなった。これにより、生体分子-無機化合物複合ナノ粒子の合成にも成功した。ii)超臨界水中における有機無機複合ナノ粒子の合成上記の結果より、酸化物粒子の水酸基と結合可能な官能基が明らかとなったので、これを元に、酸化物ナノ粒子の合成場複合化を試みた。酸化物ナノ粒子の原料である金属塩水溶液と、水酸基と結合可能な官能基を持つ有機分子を共存させ、高温高圧にすることにより、酸化物と有機分子が複合化された有機無機複合ナノ粒子の合成に成功した。同様の手法を用いて、生体分子-無機ナノ粒子複合体の1段合成にも成功した。
肝Dual-energy CTの新たな臨床応用：平衡相データを用いた肝線維化診断

DECTで撮像された臨床例を後方視的に収集し、平衡相のデータからヨード定量性の高い、ヨード密度画像を作成し、ECVを計算した。それをMRエラストグラフィ(MRE)による肝硬度(kPa)(n=42)、もしくは病理学的線維化指標(F0-4)(n=28)と相関させた。昨年までの検討で、通常のヨード-水密度画像ではヨードの定量性が今ひとつ良くないこと、さらに椎体周囲のノイズのため必ずしも通常CTデータによる従来法を凌ぐ結果は得られなかった。これに対し従来のヨード-水密度画像に代わってヨード-血液密度画像を用いること、血液プールとして大動脈ではなく下大静脈を用いることを新たに考案し、従来法のECV、血液プールを大動脈もしくは下大静脈、密度画像をヨード-水もしくはヨード-血液にして計算したECV4種、計5種のECVで比較した。結果、血液プールを下大静脈、ヨード-血液密度画像によるECVが最も正確にMREによる肝硬度、病理学的線維化程度F-gradeと相関し、良好な結果が得られた。本法は実臨床において高い有用性が期待できる。昨年まで、椎体周囲のアーチファクトのため血液プールのデータが不安定であったが、大動脈ではなく、下大静脈で測定することでデータが安定した。また、通常のヨード-水密度画像ではなく、ヨード-血液密度画像を用いることにより、ヨード密度画像の定量性が向上した。この2点によって、昨年までよりもより良い結果を得ることができた。これまでのデータを適切な学会で報告するとともに、論文化する予定である。これまで慢性肝疾患患者に対し行われた肝プロトコールDECT(4相撮像、ヨード造影剤600I/kg使用)の中から後方視的にMRエラストグラフィ(MRE)を1年以内に施行した例を抽出し、MREによる肝硬度(kPa)とDECT単純相及び平衡相から計算されたECV(細胞外液性容量分画)を相関させた。症例は40例。なを、当初の経験でDECT 40keV画像でのノイズ(椎体周囲のstreaking artifact)が顕著であり、これがECVの定量計算に悪影響をもたらすことが判明したため、前半の20例を用い、最適な計算のための関心領域(ROI)の置き方を検討した。その結果血液プールとしては従来の報告に従った大動脈は不適切であり、むしろ心直下の下大静脈を横断像、矢状断像、冠状断像で測定した値の平均値を用いることで、最も安定したノイズの少ない計測が可能となることを証明した。ついで、この心直下の下大静脈を血液プールとして用いたECVをMREによる肝硬度(40例)、及び病理(9例)と相関させた。結果、40keV、55keV画像で相関係数R2=0.57、0.54と中程度の相関が得られ、また、病理ではヨードマップ、40keVで相関係数rho=0.9、0.88と良好な相関が得られた。まだ症例数が少ないため、確定的な事は言えないが、現状としてはDECT平衡相を用いたECVは、簡便に通常の診療用CTデータを用いて肝線維化程度の予想が可能となる、極めて期待の持てる手法と言えると考える。今後症例数を増やし、検証していく予定である。当初予想しなかった40keVでのノイズの処理に戸惑ったが、何とかECV計算手法を確立することが出来た。今後は症例数を増やすことで、本法の検証を行えば良い段階である。今年確立した方法を用いて、今後は症例数を増やすことで、本法の検証を行う予定である。研究記録用インクカートリッジ等の購入を次年度に持ち越したため。研究記録用インクカートリッジ等の購入。
無形資産会計の比較制度分析

最終年度は暖簾の会計に関する研究を進める上で,Carnegie and Napier(1996)際比較会計史(Comparative International Accounting History)の立場から,アメリカの暖簾の実質的な意味内容と比較するために,イギリスの会計文献,特に判例と専門職雑誌にみられる暖簾の意味する事項について検討を行い,これを『産業経理』誌上において公表した。そこでは,特に19世紀のイギリスにおいては,小規模企業を前提とした暖簾の議論が主であり,特に法廷において暖簾が問題となるのは,暖簾と競争制限的行為との関係であった。企業の買収に際して暖簾が購入されるとき,当該暖簾の譲渡はその当事者,特に売り手がどの範囲まで競争的行為が制限されるかが問題であった。19世紀末になると,暖簾の売り手に課せられた競争的行為の制限が転じ,買い手の資産へと変化するが,これはアメリカ的なビッグ・ビジネスを前提とした超過収益力の表象たる暖簾とは似て異なるものであり,異なる背景が異なる概念をもたらしていることを説明した。現在,研究期間を終了した後であるが,概念の違いが会計処理の歴史的相違にいかなる相違をもたらしているか,そしてその相違は現在の会計に対していかなる影響をもたらしているかを研究している中途であり,これらをまとめて公表する予定である。本年度は無形資産会計の変遷に関する研究について,最初の年度であり基礎研究の年度であると位置づけている。具体的にはこれまでに行ってきた研究の再確認を行うと同時に,今後の歴史的アプローチを採用する上での方法論の研究を行った。会計史研究において,研究者自身の方法論を明らかにすることが求められるようになって久しいが,方法論の問題は我が国においてはそれほど明確には意識されていなかった。そこで諸外国,特にコモンウェルス諸国を中心として議論が活発となっている問題についてレビューを行った。そこで明らかになったのは,会計史における研究方法が,アプローチとして新古典派経済学に依拠する古典派が主流を占めてきたが,近年これに対する批判として新たな批判的研究が数を増加させているということであった。批判的研究の中でも,マルクス主義に基づいた労働過程説,そしてフーコーの研究に基づいたフーコディアンと呼ばれる研究者による研究が強い影響力を持つと同時に,互いに批判を繰り広げていることが明らかとなった。現在求められているのは多様な方法の併存であり,他者の研究を受け入れることである。同時に,自身の研究について,そのよってたつ方法論を明確にすることが求められていることが主張される。本年度は無形資産会計の変遷に関する研究について,同じ英語圈であるイギリスの無形資産会計を対象として検討を進めた。一般経済史及び経営史の文献サーベイを始めに行った。その結果,チャンドラーの『スケール・アンド・スコープ』による比較経営史の手法が,多くの問題点をはらんでいるもののメリットも多く,無形資産会計についてもこれに依拠した形での研究が可能であるという暫定的な結論を得た。それに従いイギリスの文献に見る19世紀の無形資産会計に関する著述のレビューを行った。The Accountantをはじめとする職業会計土団体が発行する会計雑誌において無形資産が登場するのは19世紀後半のことであり,当初,20世紀に入る直後まで会計的問題はほとんど取り扱われておらず,無形資産,特に暖簾(goodwill)が個人的な属性ときわめて深い結びつきを有していたことを明らかにした。個人企業という企業形態がより広く用いられ,巨大株式会社が多数発生しなかった国において,その価値を認める一方で価値を暖簾を資産とすることについての抵抗感が強いことは,経営史的な発見とも一貫するものである。現在この知見について研究成果をまとめている。また,このイギリスに関する結論はアメリカとの比較においてさらに明確となる。アメリカにおいては暖簾が市場に対するコーポレート・コントロールの一つの反映である一方,イギリスにおいては市場と暖簾との明確な関係は見いだしがたいのである。
磁場、回転を伴う重力崩壊型超新星爆発

今年度は、赤道面非対称超新星爆発の研究の総仕上げと、超新星における磁気リコネクションの数値研究のための数値コードの開発を行った。赤道面非対称超新星爆発の研究では初期に赤道面非対称磁場と高速自転を与えて数値シミュレーションを行った。そこでは、特に非対称爆発によって生み出されるマグネターの固有速度に焦点を当てた。初期条件としては、数値計算の結果得られた固有速度は平均的に秒速300-500km、中には秒速1000kmに達するモデルもあった。そこでの加速源は磁気圧力であった。得られた固有速度は、よく知られている通常の中性子星のものと似たものであった。これにより、マグネターも通常の中性子星と同様、大きな固有速度を持ち得るという重要な示唆が得られた。通常の中性子星では多くの固有速度の観測がある一方、マグネターのそれはかなり乏しいのが現状である。そのため、我々の研究は将来の観測に動機を与えるものとなる。これらの結果をまとめた論文はすでに雑誌に発表されている。数値コードは3次元抵抗磁気流体のものを独自に開発し、さまざまなテスト計算をクリアした。この数値コードの特性は空間3次元であること、電気抵抗の効果が含まれていること、高精度であることの3点である。この数値コードにより、重力崩壊型超新星爆発における磁気リコネクションの3次元的効果を調べることができる。この効果については今までほとんど研究されていない。その研究を世界に先駆けて行うことができるという意味で、この数値コードを開発したことは意義深い。今年度は中性子星の固有速度の由来に関する研究に力を注いだ。観測されている中性子星の固有速度は秒速500km程度のものが数多くあり、中には秒速1000kmを超えるものもある。これらは非対称超新星爆発に由来するものと考えられているが、ほとんどの数値シミュレーションではより小さい値の速度しか再現できていないのが現状である。そこで我々は、星内部の磁場の非対称性が非対称超新星爆発を起こし、中性子星に固有速度を与えるという新しいシナリオを打ちたて、強磁場超新星爆発の磁気流体数値シミュレーションによる研究を行った。磁場、回転の強さ、磁場の非対称度合いなどを初期パラメタとして系統的に変えて与え、それによる傾向も調べた。その結果、中性子星を加速するのに都合のよいパラメタは、強磁場、ある程度弱い回転、大きな磁場の非対称性であることが分かった。しかし、一番有望なモデルにおいても期待していた大きな固有速度は得られなかった。我々の計算したほとんどのモデルでは秒速500-1000kmに匹敵する大きな固有速度が一時的には得られたが、その速度は時間とともに減衰しながら振動し、最終的にはほぼ止まった状態となってしまった。原因は加速が中性子星のかなり内部の領域で起こることにある。中性子星の内部領域の運動エネルギーは、外部領域に伝わる間に散逸してしまうのである。このことから、中性子星を効率よく加速するためには、外部領域も直接加速させる必要があるという重要な示唆が得られた。今年度は研究テーマである「磁場、回転を伴う重力崩壊型超新星爆発」の中でも特にマグネターの固有速度の研究に力を注いだ。マグネターとはきわめて強い磁場を持つ中性子星のことであり、その強磁場はマグネターを生み出す超新星爆発のダイナミクスに強く影響を与える可能性がある。そのため、初期磁場の形状によっては、磁場が非赤道面対称爆発を引き起こし、結果マグネターが反跳を受けることも十分に考えられる。我々は、最近の星の進化計算で得られている磁場の形状を踏まえ、初期に赤道面非対称磁場を与えて、結果得られる超新星のダイナミクスとマグネターの固有速度について数値的に調べた。そのため、我々の研究は将来の観測を予測する類のものである。数値計算の結果得られた固有速度は平均的に秒速300-500km、中には秒速1000kmもの値をはじき出すモデルもあった。これは、よく知られている通常の中性子星の固有速度と似たものである。研究代表者が、2月に参加したアメリカでの研究会で得た情報によると、最近いくつかのマグネターにおいて、固有速度の観測が行われたようであり、その結果を書いた論文はまもなく出版されると思われる。マグネターの固有速度は、今後多くの研究者が興味を持つと考えられる対象なので、この時期にこうした数値計算結果を出した意義は大きい。この結果をまとめた論文は現在Astrophysical Journalに投稿中である。また現在、次の研究である「磁場、回転を伴う重力崩壊型超新星爆発の3次元シミュレーション」に向けて、数値コードを独自に開発中である。

これにより、マグネターも通常の中性子星と同様、大きな固有速度を持ち得るという重要な示唆が得られた。通常の中性子星では多くの固有速度の観測がある一方、マグネターのそれはかなり乏しいのが現状である。そのため、我々の研究は将来の観測に動機を与えるものとなる。これらの結果をまとめた論文はすでに雑誌に発表されている。数値コードは3次元抵抗磁気流体のものを独自に開発し、さまざまなテスト計算をクリアした。この数値コードの特性は空間3次元であること、電気抵抗の効果が含まれていること、高精度であることの3点である。この数値コードにより、重力崩壊型超新星爆発における磁気リコネクションの3次元的効果を調べることができる。この効果については今までほとんど研究されていない。その研究を世界に先駆けて行うことができるという意味で、この数値コードを開発したことは意義深い。
ポリエステル分解酵素の基質結合メカニズム

深海よりP(3HB)分解細菌Marinobacter sp.を単離した。この菌株から菌体外P(3HB)分鰭素を電気泳動的に精製し、その性質を調べた。さらに寸本酵素遺伝子をクローニングし、酵素が、3つの機能性ドメイン(触媒、リンカー、基質結合ドメイン)から構成されていることを明らかにした。本酵素の基質結合ドメインは、固体基質に有効に作用し、酵素分子を基質表面に濃縮すること明らかにした。また、真菌Penicillium funiculosumから精製したP(3HB)分解酵素をコードするcDNAのクローニングに成功した。その結果、本酵素は基質結合ドメインを欠く新規のP(3HB)分解酵素であることが判明した。本酵素遺伝子配列を、他の細菌由来酵素遺伝子配列に対して相同性解析したところ、本酵素遺伝子は、細菌より水平移動により伝播してきた可能性が高いことが示唆された。本酵素は、SBDを欠いているため基質結合能力が、バクテリア分解酵素と比較して劣っている。本酵素に、SBDを融合させると、基質結合能力が上昇した。このことから、SBDは、酵素の基質結合能力を決定する重用な因子の一つであることがわかった。また、自然環境中よりポリエチレンサクシナート(PESu)分解微生物を単離しその同定を行った。その結果、グラム陽性細菌および真菌類が主たる分解者であるととが判明した。本研究課題では、ポリ(3-ヒドロキシブタン酸)(P(3HB))分解酵素による基質分解メカニズムを分子レベルで解明することを目的とする。特にP(3HB)分解酵素が、不均一系で作用することに着目し、酵素のP(3HB)表面への結合メカニズムについて、生化学的あるいは遺伝子工学的手法を用いて詳しく調べる。本年度は、P(3HB)分解酵素の基質結合ドメインのアミノ酸残基への変異導入および、基質結合ドメイン蛋白質の大量合成に着手した。基質結合ドメインのポリエステル表面への結合能力評価については、領域内の共同研究として実施する予定である。本年度の補助金で購入申請した機器は全て納品、設置済みであり、支障なく稼動している。1 Marinobactersp.由来のP(3HB)分解酵素の構造と性質静岡県の相模湾1165mの海底から単離されたP(3HB)分解菌Marinobacter sp.NK-1の培養上清から、P(3HB)分解酵素をカラムクロマトグラフィーにより電気泳動的均一に精製した。本酵素の速度定数(ks)は、19±2.0(μmol/h/cm2)であり、一方、吸着平衡定数(K)は0.2±0.02mL/μgであった。このことから、本酵素は現在までに知られているバクテリア由来のP(3HB)分解酵素の内、P(3HB)に対して最も吸着親和性が低いことが明らかとなった。本年度は、Penicillium funiculosum由来の菌体外P(3HB)分解酵素による基質分解および吸着機構を詳しく調べた。さらに、本分解酵素遺伝子のクローニングを検討した。5種類のポリマーグラニュールを基質として用い、酵素吸着実験を行った。その結果、本分解酵素は用いたすべての基質表面に吸着したことから、本分解酵素とこれら基質の間には、バクテリアのSBDとポリエステルのような特異的な相互作用が存在しないということが示唆された。P. stutzeriとP. funiculosum由来の失活酵素を吸着させたP(3HB)微粒子を基質として用い、P. funiculosum P(3HB)分解酵素の酵素加水分解反応を行った。その結果、P(3HB)をP. stutzeri由来の失活酵素で処理したときの活性は、未処理のP(3HB)を用いたときの2%に減少し、P. funiculosum由来の失活酵素で処理した場合は48%の活性を保持していた。これはP. stutzeri由来の分解酵素と比べ、P. funiculosum由来の分解酵素のP(3HB)への吸着は他の酵素分子によって交換されやすいということを意味している。これらの結果は、P. funiculosum由来の分解酵素とP(3HB)表面の間には弱い相互作用しか働いていないということを示唆している。

一方、本酵素のN末端配列は、エドマン分解によりTALPAFNVNPNSVSVSGLSSG GYMAAQLGVと決定された。この配列に基づき縮退DNAプライマー(プライマー1、プライマー2)を設計し、ゲノムDNAを鋳型としてPCR法により、N末端をコードするDNA断片を取得した。本断片のシーケンシング後、この配列に基づきプライマー(プライマー3、プライマー4)を作成し、N末端をコードするDNA断片を得た。この断片をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、3.5kbpのEcoRI消化断片が本プローブと特異的に結合することが明らかとなった。さらに、N末端配列に基づきプライマー5を設計し、これを用いてmRNAを鋳型として、3'RACE法によりcDNAの全長を取得した。cDNA配列解析より、酵素遺伝子をコードしているゲノムDNA領域は、3つのイントロン配列を含むことが明らかとなった。また、本酵素は、バクテリアP(3HB)分解酵素に見られるSBDに相当する領域を欠損していることも明らかとなった。この結果は、本酵素が、バクテリアP(3HB)分解酵素と比較して、P(3HB)に対して非常に弱くかつ低い基質結合特異性しか有していないことを支持している。微生物が生産する生分解性ポリエステルであるポリ(3-ヒドロキシブタン酸)(P(3HB))は、土壌中では、主に真菌(カビ)類により分解されることが知られている。本研究では、カビ由来P(3HB)分解酵素の構造と機能を解明することを目的としている。昨年度までに、本酵素のcDNAを解析し、本酵素がバクテリアSBD様配列を有していないことを明らかにした。本年度は、高次構造の解明を目指して、酵母内での組み換え蛋白質の大量合成を検討した。分解酵素をコードするcDNAを、酵母発現ベクターpPICZαBに組み込んだ。この組み換えベクターをpPFDPと命名し、酵母Pichia pastoris KM7 1Hに形質転換した。組換え株の培養上清から、組換え型酵素を疎水性カラムクロマトグラフィーを用いて精製した。酵素精製表を、Table3に示す。最終的に活性は、回収率61.8%で、精製度6.8倍となり、培養上清200mlから1mgの精製酵素を得た。一方、野生株では、培養上清5Lから約3mgの精製酵素が得られる。このことから、組換え株は、野生株より分解酵素を多く分泌することがわかった。また、組換え型酵素の比活性は1U/mgであり、野生型酵素の比活性810U/mgと比較して低かった。抗野生株P(3HB)分解酵素抗血清を用いて、組換え酵素、組換え株上清および組換え株菌体に対して、ウエスタンブロッティングを行ったところ、組換え酵素およびその上清に対して強いシグナルが検出された。このことから、野生型酵素と組換え株由来のP(3HB)分解酵素が、免疫学的に同一であることが確認され、さらに、本組換え酵素は、培養上清中に分泌生産されていることがわかった。
ジベレリンによる生殖器官形成機構の進化学的解析

本研究では、GA合成や受容成立以前・以降を通してGAシグナルが生殖器官の形成にどのように関わるのか明らかにする。近年、GAシグナル経路上で働くGAMYB転写因子が、GA合成成立以前のコケの時代から造精器の発達にも関わることが報告された。コケ植物の一種ヒメツリガネゴケには二つのGAMYB遺伝子が存在する。そこで、両PpGAMYB遺伝子を破壊した二重破壊株を作出した。この二重破壊株では全く造精器が形成されず、二つのPpGAMYBが冗長的に機能していることが明らかとなった。次にPpGAMYBの下流で働く遺伝子を探索するため、造精器形成直前の野生型と破壊株の茎葉体茎頂からRNAを抽出してRNAシーケンスによる発現解析を行った。その結果、発現減少遺伝子の5'上流域にはGAMYB結合配列が高頻度に存在することがわかった。この結果は、転写因子GAMYBが転写活性化因子として雄性生殖器官形成を制御することを示唆する。さらに、GA合成成立が確認されているシダ植物の性決定について、そのメカニズムを明らかにすることができた。これまで、一部のシダ植物でジベレリンと類似した構造を持つ「アンセリジオーゲン」が前葉体上の造精器誘導に関わることが報告されていたが、その作用機構は不明であった。そこでアンセリジオーゲンの構造が決定されているシダ植物の一種カニクサを用いて造精器誘導の解析を行った。27年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、シダ植物であるカニクサを用いて、造精器(雄性生殖器官)誘導にジベレリンシグナルが関与していることを明らかにすることができた。カニクサのアンセリジオーゲンはジベレリンに類似した構造を持つが、3位水酸基が無く、6位カルボキシル基がメチル化されているといった相違がある。そこで3位水酸基の有無がアンセリジオーゲン機能に重要なのか調べるため、3位水酸基付加を行うGA 3-oxidaseの阻害剤(プロヘキサジオン)を処理して、造精器誘導に変化があるか観察した。結果、アンセリジオーゲンによる造精器誘導は、プロヘキサジオン処理により阻害されることが確認された。さらに、アンセリジオーゲンとジベレリンに応答する遺伝子を網羅的に調べるため、次世代シーケンサーによるmRNAの網羅的解析を行った結果、アンセリジオーゲンとジベレリンに応答する多くの遺伝子は重複することが確認された。以上の結果からアンセリジオーゲンは、ジベレリンに変換された後、造精器の誘導に関わっていると推論した。

今年度は、以上の研究成果を取りまとめた論文を報告することができ、当初の計画よりも進展していると言える。27年度が最終年度であるため、記入しない。上述したように、ヒメツリガネゴケにおいて、造精器形成直前の野生型とPpGAMYB遺伝子を破壊した二重破壊株の茎葉体茎頂からRNAを抽出してRNAシーケンスによる発現解析を行った。その結果、729個の発現変動遺伝子を見いだした。PpGAMYB遺伝子を破壊した二重破壊株における発現変動遺伝子が、種子植物でも共通的に機能するか否かを検討するため、全発現変動遺伝子についてイネやアラビドプシスのオーソログ遺伝子の抽出を行い、シロイヌナズナの花粉発達に働くAMSやMS1のオーソログ遺伝子が含まれることを確認した。さらにイネオーソログ遺伝子の器官別発現を調べたところ、多くのオーソログ遺伝子がイネの花粉で特異的に発現することが解った。これらの結果から、コケと種子植物の造精器形成にはPpGAMYBが必須で、両者の胞子発達・造精器形成における分子機構は類似していると想定した。今年度は、「コケ植物と種子植物間で、胞子形成や造精器形成に共通した転写ネットワークが機能する」という仮説を検証するために、ヒメツリガネゴケにおいてPpGAMYBによるPpAMSとPpMS1転写制御の確認およびPpAMSとPpMS1破壊株の表現型調査を行う。さらに、シロイヌナズナにおいてAMSやMS1の発現がGA信号伝達の制御下にあるかを検証する。
火山噴火災害の健康影響評価とサ-ベィランスシステムに関する研究

火山噴火災害の健康影響を把握し,継続的な健康管理にサーベイランスシステムを構築することを目的とした。長崎県雲仙普賢岳噴火の被災地である島原市と深江町で継続的に現地調査を行い、下記所見を得た。1)被災地の小中学生では噴火後「外で遊ぶことが減った」「テレビをみる・ゲームをする」など屋内の生活行動が増え、「夜中に起きる」「寝る時間が遅くなった」「朝起きるのがつらい」といった生活時間の変化も高頻度であった。「風邪を引きやすい」「咳・痰が出やすい」「喉が痛い」といった火山噴出物に由来する自覚症状も高頻度であった。また、これらの生活行動の変化・自覚症状が学校や家庭の避難で増強されていたことも特徴的であった。2)地域住民についてのアンケート調査では「眼の症状」が最も高頻度で、次いで「咳・痰の症状」であった。これらの有訴率は壮年期の女性、被害が大きい地区、避難住民で高かった。噴火活動の鎮静化とともに皮膚粘膜の刺激症状が低下したが、「咳・痰」「喘息」「呼吸困難」など呼吸器に関する症状は遷延化する傾向が認められた。3)スパイログラムによる呼吸機能検査では県内の非被災地に比べ閉塞性障害の頻度が高かった。4)避難住民に関する全般的健康調査(GHQ)では、壮年期の男女にストレスが強いこと、精神的健康度に頻回の避難、通院、自営業従事などが関わっていることが示唆された。以上の結果は、火山噴火の健康影響が火山噴出物による直接影響とともに避難・移住による生活環境や生業活動の変化をも包含していることを物語っている。雲仙普賢岳噴火の被災地である長崎県島原市(対象数約3500名)及び深江町(約1000名)において次のような調査を行った。1)感覚器官・皮膚粘膜への刺激に関するアンケート調査:最も高率であったのは眼の症状であり、島原市住民の46%、深江町住民の30%が訴えていた。続いて訴えの多いのは喉の症状(30%と26%)であり、皮膚がかゆいなどの皮膚症状も島原、深江ともに高率であった。これら平成6年度の有訴率は噴火が最も激しかった頃より低下していた。島原市の小中学生(約3000名)での調査でも最も高率なのは眼に関する症状であった。喘息発作の頻度が増えた、発作の症状が強くなったとの訴えも小学生では4-5%存在した。これらの児童での喘息発作と噴火や家庭環境等との関連については現在調査中である。2)スパイロメトリーによる呼吸機能障害:呼吸機能検査で被検者の約2割に呼吸機能障害が認めらた。特に大気汚染と関連の深いとされる閉塞性障害の頻度は噴火の影響のない地域より高率であった。現在自覚症状と呼吸機能の障害等との関連について検討中である。3)呼吸器疾患の死亡率:気管支炎・肺炎などの急性呼吸器疾患と肺気種・慢性気管支炎・喘息といった慢性呼吸器疾患の死亡率の推移を長崎県全県および島原半島各市町間で比較したが噴火影響と思われる差異は認められなかった。4)全般的健康状態の推移:深江町で噴火前から現在にいたる老人保健法の基本健診結果の推移をみると、噴火最盛期の平成3年にかけてはBMI(Body Mass Index)血圧、総コレステロールとも高値となったが、平成6年度では低値となる傾向が認められた。雲仙普賢岳の噴火活動は鎮静化し、終焉宣言も出されているが、本研究では噴火活動及び避難・仮設住宅居住等による健康への後影響を検討するために、前年度に引続き、噴火口東側の地域で下記の調査を行った。1)住民に対する皮膚粘膜の刺激症状

・及び呼吸器症状についてのアンケート調査40歳以上の島原市と深江町住民について眼・鼻・耳の症状(かゆみ、痛み、目脂など)、咽喉頭及び呼吸器の症状(咳・痰・喘鳴・呼吸困難、息切れ)について聞き取り調査を行った。噴火の盛んだった時期(平成4年)等と比較すると、眼、鼻、耳や喉の刺激症状に対する有訴率は顕著に減少していた。一方、咳痰、喘鳴等の呼吸器症状の有訴率は減少傾向がゆるやかであり、喘鳴では平成6年との比較するとむしろ増加している傾向が認められた。有訴率の性差、避難経験による差異は依然として存在しているが、島原市内の地区差は小さくなっていた。2)学童・生徒についての皮膚粘膜・呼吸器症状についてのアンケート調査島原市の全小中学校の全児童生徒に成人の場合とほぼ似通ったアンケート調査を行った。成人の場合と同じように噴火の鎮静化とともに、有訴率が顕著に低下していた。3)住民に対する呼吸機能検査昨年度とほぼ同じ対象についてレスピロメーターによる呼吸機能検査をおこなった。%肺活量と1秒率から判断された呼吸器障害の有病率はほぼ昨年と同様であり、噴火影響のない長崎県の他地域より高値であった。4)メンタルヘルスに関する調査被災地、特に避難・移住を余儀なくされ地域に継続的に訪問し、面接・対話或は質問票によるメンタルヘルス状態の分析と評価を行った。噴火鎮静後も依然として、噴火時の災害による精神的影響が残つていることが示唆されていた。
低栄養による認知機能低下促進経路の探索

中年期以降での高脂肪食摂取による肥満・生活習慣病が認知症の危険因子であることに対して、後期高齢期における食欲低下・低栄養に伴う体重低下も認知症を引き起こす重要な要因であることが明らかとなって来ている事から、本研究では、栄養状態の変化が異なるライフステージの個体の代謝、認知機能へ与える影響について解析を行い、根本的な認知症の発症機構を明らかにすることを目的としており、研究結果が新規の認知症予防および治療法の開発へと繋がることを目標としている。
高齢者による自然体験活動支援が子どもと高齢者の心身の健康に及ぼす影響

本研究は、高齢者(シニアボランティア)による自然体験活動支援プログラムが子どもと高齢者の心身の健康に及ぼす影響について明らかにすることを目的とした。分析の結果、自然体験活動支援プログラム後に子どもの自己効力感得点は上昇し(P<0.05)、高齢者の精神的満足感と社会的ネットワークは向上していた。本プログラムの実施が、参加した子どもと高齢者の双方の心身の健康に有益な影響を与えうる可能性が示唆された。【目的】自然体験活動が子どもの心身へ及ぼす影響に関する基礎的資料を得る目的で、キャンプ活動への参加が子どもの精神的健康度、自己効力感、生活習慣、規範意識、友人関係に及ぼす影響について検討を行った。【方法】研究参加者は、宿泊が伴うキャンプ活動に参加した小学4年生から中学1年生の男女15名(男子8名、女子7名。以下キャンプ群)と某市立A小学校4年生から6年生の男女145名(男子61名、女子84名。以下対照群)であった。調査は、指導者及び先生の指導のもと、自記式アンケート調査法により実施された。調査時期は、キャンプ事前、直後、1ヵ月後の3回であった。調査項目は、先行研究を参考にして、「基本的属性」「自己効力感」「不定愁訴」「生活習慣」「規範意識」「友人関係」を採択した。対照群を、これまでのキャンプ経験をもとに、3群に分類した。【結果と考察】自己効力感の合計点について、キャンプ群の事前と直後、事前と事後の間に有意な差がみられ、他群では有意な変化はみられなかった。野外活動に参加し、自然生活を経験することは、子どもの自己効力感の向上に効果的であることが示唆された。不定愁訴出現率を4群間で比較したところ、キャンプ群の子どもたちは他の3群の子どもたちよりも、各項目の不定愁訴出現率が低く、健康的な子どもは多いことが示唆された。各調査時期別に不定愁訴数平均値を4群間で比較したところ、事後においてキャンプ群と他の3群の間で有意な差がみられた。野外活動を経験することが子どもの不定愁訴の改善に結びつくことが示唆された。就寝時刻、起床時刻、朝食および夕食の摂取状況、友人関係については、各調査時期の間で変化はみられなかった。【結論】自然体験活動への参加が、子どもの自己効力感の向上と不定愁訴の抑制に影響を及ぼすことが示唆された。【目的】子どもの心身の健やかな発達と健全な青少年の育成を目指して、子どもが自然体験活動を行う試みが、近年活発化している。こうした中、兵庫県神戸市・国営明石海峡公園神戸地区棚田ゾーン(栗林地区)において、日本ユニセフ協会と栗林地区に関わる個人、行政、大学、研究機関が連携し、「子ども参加型公園づくり・ユニセフパークプロジェクト(UPP)」を企画した。本研究では、UPPに参加した子どもの意識の変化をグループインタビューにより、明らかにすることを目的とした。【方法】参加者は、幼稚園児から小学校6年生までの29人(男子17人、女子12人)、ファシリテーター(FA)18人(中高齢者を含む社会人7人、大学生11人)、日本ユニセフ協会兵庫県支部員6人、保護者8人、スタッフ8人であった。プログラムの内容は、「オープニングプログラム」「ユニセフプログラム(日本ユニセフ協会兵庫県支部):ユニセフの活動」「水問題がもたらす世界の子どもの現状・水問題に悩む世界の子どもの現状」「水くみ・水運び体験」「公園づくりプログラム」「FAの指導でビー玉などを埋めた平板を児童が各自1枚作成」「クロージングプログラム」であった。プログラムの終了後、各プログラムについて、聞き取り調査を行った。【結果】参加した児童を4グループに分けて、グループインタビューを行った。質問1「楽しかったこと」は、「セメントの平板づくり。水を運んだこと。ゲームや踊ったこと。地元のご飯を食べたこと」、質問2「水と世界の子どもたちのいのちについて」は、「世界にそういう子どもたちがいることを知られてよかった。水を運ぶのが大変なのに、水がないと生きていけない。水があんなに汚かったら飲めない。自分たちにできることはないかと考えた」、質問3「公園の園路づくりに参加して」は、「難しかったけど、また作りたい。ビー玉を埋めるのが楽しかった。きれいな道になったらいいなと思った」等の回答が得られた。【結論】世代間交流を通じた自然体験活動が、子どもの環境に対する意識の変容に寄与し得ることが示唆された。1)A市の小学校に通学する小学校1年生から6年生(22名)、及び同市内に在住する70歳以上の高齢男性(3名)に対して、自然体験活動(兵庫県姫路市大釜地区の里山)を中心とした世代間交流事業を実施し、その効果について検討を行なった。

小学生に対しては「運動をする時間」「自然体験活動以外の屋外で遊ぶ時間」「高齢者イメージ」「不定愁訴」についてアンケート調査、高齢者に対しては「健康度自己評価」「日常生活行動」「運動習慣」「外出行動の実態」「転倒の有無」「役割感」「生きがい感」等に関する個別インタビューをそれぞれ実施した。分析の結果、自然体験活動・教育支援活動の前後で小学生児童の高齢者イメージは向上していることがわかった。高齢者においては、役割感、生きがい感が増していることが認められた。自然体験活動が子どもと高齢者の双方に良い影響を及ぼすことが示唆された。2)小学5・6年生の児童を対象として、彼らが小学2・3年時に2年間にわたって受けたシニアボランティアによる小学校教育支援プログラムの影響について検討した。研究参加者は小学校教育支援プログラムを受けたA小学校5.6年生70名、教育支援プログラムを受けていないB小学校5・6年生120名であった。両校の児童に対して、「SD法による高齢者イメージ短縮版」「学校生活」、A小学校の児童に対してのみ「小学校教育支援プログラムの思い出」について、自記式アンケート調査法により回答を求めた。A小学校の児童の方がB小学校の児童より、有意に高齢者イメージは高かった(P<0.05)。A小学校の児童に対して、高齢者イメージを「一般高齢者」と「シニアボランティア」に分けて回答を求めたところ、シニアボランティアの方が一般高齢者より「正しい」「忙しい」「はやい」「大きい」「強い」のイメージ得点が有意に高かった(各P<0.05)。
ナス科植物における自他認識複合体の構造基盤

植物の多くは自らの花粉を拒絶し、他個体由来の花粉でのみ受精する「自家不和合性」と呼ばれる性質をもっている。ナス科植物の自家不和合性では花柱(めしべ)に存在するRNA分解酵素S-RNaseが花柱を伸長中の花粉管に侵入して、花粉のRNAを分解することにより花粉管の伸長を停止させる。一方、花粉にはSLFと呼ばれる複数のF-boxタンパク質が存在し、自己以外のすべてのS-RNaseを無毒化することにより、花粉管の伸長を可能にしている。本研究ではこれらのSLFによるS-RNaseの協調的非自己認識に関して、構造レベルでそのメカニズムを解明するために、SLFとS-RNaseについて結晶化と構造決定を試みた。前年度までにピキア酵母の発現系においてS5およびS9のRNaseについて発現系を構築した。本年度はこれらの結晶化スクリーニングを行い、糖鎖をEndoHにより切断したS9-RNaseから結晶を得ることができた。結晶化条件の精密化を行い、X線装置FR-Xにて回析データの収集を行ったところ、2.54オングストロームの分解能をもつ反射データを得ることができた。空間群はP6もしくはP3、格子定数はA=B=112, C= 29, a=b=90, r=120であった。分子置換法を用いて構造決定を試みたが、最適な解は得られなかった。今後、SPring-8等で回析データを取り直して、再度解析することで構造決定できることが期待される。SLFの発現は小麦胚芽の系では困難であったことから、本年度は昆虫細胞の系で発現を試みた。SLF16の全長とS-RNase認識領域のみをGST融合タンパク質として発現させたところ、SLF3のS-RNase認識領域のみを発現させた時に凝集していないSLFが回収された。発現条件をさらに改善していくことにより、SLFの大量発現に道が開かれると期待される。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度はSRNaseおよびSLFの発現条件の検討を行った。SRNaseはS5とS9RNaseについてFLAGタグの融合タンパク質としてピキアの分泌発現系を用いて発現させたところ、両者共に発現が確認できた。そこで、それぞれ30 Lの培養液を用いてSRNaseを発現させて、FLAGビーズで精製した後、HRV3CプロテアーゼによってFLAGタグを切断し、ゲルろ過クロマトグラフィーによって最終精製した。S5, S9RNaseともに約5 mgのタンパク質が回収できた。S5RNaseについて結晶化スクリーニングを行ったが、結晶が得られなかったため、EndoHおよびPNGaseを用いて糖鎖の切断を試みた。MALDI-TOF MSによって糖鎖を切断したRNaseの分子量を測定したところ、糖鎖の切断は部分的に行われていることが明らかとなり、複数箇所に糖鎖修飾を受けていることが予想された。S9RNaseについては現在結晶化スクリーニングを行っている。SLFについては小麦胚芽のin vitro発現系で発現を試みた。3種類のSLFについて発現を行ったところ、いずれも可溶性タンパク質として得ることができたが、SRNaseとの特異的相互作用は確認できなかった。一方、SLFと相互作用するSSK1については相互作用が観察できた。SLFのゲルろ過解析を行ったところ、SLFの数倍の分子量にピークが観察され、数分子が会合していることが予想された。

発現条件をさらに改善していくことにより、SLFの大量発現に道が開かれると期待される。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究により、ピキアの分泌系を用いてSRNaseの発現系を確立することができた。結晶が得られない問題については糖鎖を切断するもしくは糖鎖修飾部位に変異を入れることによって糖鎖修飾を阻害することにより、解決できると考えている。SLFについてはSRNaseとの相互作用は観察されなかったが、SSK1との相互作用が確認できたので、一部は機能的に発現していると考えられる。SRNaseとの相互作用が弱く、検出が難しいだけかもしれないので、今後は大量発現系の構築を優先する。SRNaseの結晶化については糖鎖を切断して結晶化を試みる。また、糖鎖修飾部位の特定を行い、糖鎖の修飾が行われるアスパラギンをアスパラギン酸に変換することによって、糖鎖修飾を阻害したSRNaseを作製する。これらのSRNaseを用いて結晶化スクリーニングを行い、構造決定を試みる。SLFについては昆虫細胞の発現系で安定な発現を試みる。また、分子表面にあると予想される疎水アミノ酸を親水性アミノ酸に変換することによって、SLFの会合が起こらなくなるコンストラクトの探索を行う。またSSK1との共発現も行い、SLFの安定化を試みる。