hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
1細胞マルチオミックス技術の開発

本課題では、1細胞からエピゲノム情報とRNA情報を取り出すことが出来るマルチオミックス技術の開発を目指した。課題推進中に、提案した方法の一部が達成されてしまったが、途中で方向転換して、新生RNAを含むポリアデニル化されていないRNA分子も捉えられるsingle-cell RNA-seq法を確立することに成功した。新生RNAを検出することで、ChIP-seqなどで検出される転写調節要素の、活性化状態を知ることが出来ると期待される。また、cell barcoding技術をランダムプライマーに持ち込むことを検討し、高出力化への道筋をつけた。ゲノムDNAのメチル化やクロマチン構造の変化などエピゲノム状態の変化が及ぼすRNA量への影響は未だに理解されていない部分が多い。これまでの方法ではエピゲノム状態とRNA量はそれぞれ細胞集団で測定されており、平均された情報同士の関連性比較になり、同ゲノム上のエピゲノムのパターン情報と遺伝子発現量の1細胞ごとの対応関係が消えてしまい、因果関係を解析できない。1細胞から両者の情報を同時に測ることでより詳細な解析が可能となり転写の深い理解につながると期待される。本申請課題では転写産物量(蓄積したRNA量)とエピゲノム情報(DNAメチル化などDNA情報)を1細胞から同時に測定するための次世代シーケンサーを駆使した1細胞マルチオミックス技術を確立する。そのためには、1細胞でエピゲノム状態を捉える方法、並びに、RNA量を定量する方法を単独で確立するとともに、両者を1細胞から同時に計測するための技術の確立の3つのパートを推進する。今年度は4つのことについて進めた。11細胞のクロマチン状態を計測するために、1細胞レベルでNucleosome patternが出現し、なおかつRNA情報得るために必要な、RNAの逆転写反応も同時に起きることを確認した。2エピゲノム状態を計測するには、断片化したdsDNAを高効率でシーケンスライブラリDNAに変換する必要が有る。市販のキットを改編することで変換効率を4-5倍上昇させた。3ランダムプライマーベースの方法で新生RNAなどを含むnon-poly-A RNAの検出に成功し、RNA側の情報を拡充出来た。これまで1細胞mRNA-seqではnon-poly-A RNAを検出できなかった。4ランダムプライマーにindexをつける条件を検討し、DNA情報とRNA情報をわけるために、RNA側由来のcDNAにIndex配列をつける条件を見つけた。ゲノムDNAのクロマチン構造やメチル化の変化などエピゲノム状態の変化が及ぼすRNA量への影響は未だに理解されていない部分が多い。本申請課題では転写産物量(蓄積したRNA量)とエピゲノム情報(クロマチン構造などのDNA情報)を1細胞から同時に測定するため、以下2つのパートに分けて技術開発を推進している。エピゲノム情報やRNA情報をとらえる検出技術の開発と、エピゲノム情報とRNA情報を分離/分画する技術の開発である。今年度は各々で下記内容を研究し、同時測定のための技術にむけて前進した。[検出技術]エピゲノム状態を計測するには、断片化したdsDNAを高効率でシーケンスライブラリDNAに変換する必要が有る。前年度は数十%のレベルであったが、約50-80%まで上昇させることができた。[分離・分画技術]2つの情報を同時に測定するためには、エピゲノムとRNAを物理的に分画する方式と、分子生物学的に2つを分ける方式が考えられる。本年度は前者に対して必要な、核抽出条件の確立、高精度な精製magnetic plate 384wellの開発、384well用分注装置の厳密な設定を行った。また前年度に引き続き、分子生物学的な分離の中心技術としてIndex配列をRNAにつける方式を引き続き開発を続けた。特にIndexの配列を研究連携者團野博士に協力してもらい、シーケンスレーベンシュタイン距離を考慮した12merの配列を持つ96種類の配列を計算・合成した。本申請課題では転写産物量とエピゲノム情報を1細胞から同時に測定するため、以下2つのパートに分けて技術開発を推進している。メチル化DNAとRNAの1細胞での同時測定に関しては、同課題進行中に論文が報告された。一方で、クロマチン構造とRNA量の同時測定は未だ達成されていない。本研究課題のなかの提案で、より報告の価値が高い後者の開発に専念することとした。方針の変更等のためにやや進行に遅れを感じられる。エピゲノムを捉えるために重要な、DNA捕捉効率は今年度の開発で、約50-80%まで上昇させることができた。1細胞レベルでのライブラリ作製を行う場合、ISO class6-7の通常実験室環境では空気中由来のDNAのコンタミネーション問題が有り、トラブルシュートのため問題を精査した。結果、ISO class 1クリーベンチによる調整で防ぐことが出来るのがわかり1細胞でのエピゲノム情報の取得での問題を減らすことが出来た。後者の分子生物学的に分ける手法は、世界的に見ても報告が殆ど無く、開発の価値が高いと思われる。分離の中心技術としてIndex配列をRNAにつける方式を引き続き開発を続けた。

新生RNAを含むnon-poly-A RNAの検出に関しては、前年度にある程度うまく行っており、Index配列をつけたオリゴを使うことで、情報科学的にあとで分離できるため同時測定が可能になると期待される。本技術は、よりハイスループットに全長RNAの情報を取得できる技術にもつながり、派生ではあるが1細胞RNA-seqにとっても重要な技術になると期待される。近年、1細胞RNA-seqの発達に伴い、細胞集団のmRNAのheterogeneityを計測することで、分化状態の異なる様々な細胞の種類を分類することが出来るようになってきた。一方で、細胞集団におけるエピゲノム変化によるRNA量への影響は、未だに理解されていない部分が多く、これらを理解するためには、同じ1細胞からエピゲノム情報とRNA情報を取り出す必要が有る。エピゲノム情報とRNA情報の1細胞同時計測は、物理的分画を主軸とする方法により、課題推進中に幾つかの方法が提唱されたが高出力化が求められている。また、GRO-seqなど新生RNAを計測する方法では、ChIP-seqなどのエピゲノムシーケンス技術によって発見される転写調節要素の、活性化状態を知ることが出来ることが知られている。新生RNAの計測は、エビゲノム変化によるRNAの転写制御への影響を計測していると考えられ、エピゲノム情報とRNA情報の同時計測の代替になる可能性がある。一方で、新生RNAの1細胞での計測はなされておらず、エピゲノムとRNA量の同時測定と同様に開発が望まれる。1細胞からの同時計測の高出力化や新生RNAなどの検出を達成するには、全RNAを対象と出来る高効率にindex配列をつける方法の達成が重要であり、また物理的分画を主軸とする同時計測方法については、数報同様の方法が発表されたため、よりオリジナリティーの高いこちらの手法開発に切り替えた。様々な編集距離を持ったindex配列を計算し、逆転写効率につかえるのか計測し、短いほうが長いよりより良いことがわかった。現在、シーケンス法への相性を検討中である。また研究連携者とともに数千個の1細胞RNA-seq dataを解析できる環境を構築し、パイプラインの一部設定を変えることで上記方法にも対応可能であることを確かめ方法としての実現可能性を高めた。本課題では、1細胞からエピゲノム情報とRNA情報を取り出すことが出来るマルチオミックス技術の開発を目指した。課題推進中に、提案した方法の一部が達成されてしまったが、途中で方向転換して、新生RNAを含むポリアデニル化されていないRNA分子も捉えられるsingle-cell RNA-seq法を確立することに成功した。新生RNAを検出することで、ChIP-seqなどで検出される転写調節要素の、活性化状態を知ることが出来ると期待される。また、cell barcoding技術をランダムプライマーに持ち込むことを検討し、高出力化への道筋をつけた。
エンケファリン含有節前神経支配を受ける交感神経節ニュ-ロンの標的組織特異性

交感神経系の節前神経細胞,節後神経細胞および標的組織との間に,どのような機能的特異性を持った線維連絡が成されているのか未だ明らかでない。本研究ではenkephalin(ENK)節前神経に注目し,これが交感神経節のどのタイプの節後ニュ-ロンに連絡し,さらにその節後ニュ-ロンは,どのような標的組織を特異的に支配しているのかを逆行性トレ-サ-実験,免疫組織化学によって調べた。1.イヌ交感神経節の二重蛍光免疫組織化学によって,上頚神経節,星状神経節,L_6ーS_1神経節の非カテコラミン性VIP陽性細胞が篭状ENK終末によって特異的に支配されることが明らかになった。2.Fast blue逆行性標識と免疫組織化学によって,星状神経節に投射するENK終末は主にTh_1ーTh_5脊髄中間質外側核に由来すること,また,ENK支配を受ける星状神経細胞はVIP/CGRP/SPを共存し,手掌に投射することが明らからなった。3.手掌の免疫組織化学によって,汗腺支配神経がVIP/CGRP/SPを共存することが明らかになり,脊髄中間質外側核ENK含有節前神経→星状神経節VIP/CGRP/SP含有神経細胞→汗腺という標的特異的線維連絡が解明できた。4.電子顕微鏡免疫組織化学により,篭状ENK終末は星状神経VIP/CGRP/SP陽性細胞体に直接接触し,樹状突起と非対称性シナプスを形成していることが明らかになった。5.追加研究において,イヌ喉頭内にVIP/-,VIP/SP,VIP/NPY,VIP/SP/NPY,VIP/ENK含有神経細胞からなる神経節を認め,これらの神経が喉頭腺,血管壁を標的特異的に支配していることが明らかになった。脊髄節前交感神経の一部にはacetylcholine(Ach)に加えてenkephalin(ENK)を含むものがあり、交感神経細胞にはnoradrenaline(NA)と共にneuropeptide Y(NPY)、somatostatin(SOM)またはvasoactiveintestinal peptide(VIP)を共存するものや非NA性でVIPやcalcitonin gene-related peptide(CGRP)を含むものが知られている。しかし、このように多様な節前、節後神経細胞および標的組織との間にどのような機能的特異性を持った連絡が成されているのか未だ明らかでない。本研究ではENK節前神経に注目し、これが交感神経節のどのタイプの節後ニュ-ロンに連絡し、さらにその節後ニュ-ロンはどのような標的組織を特異的に支配しているかを逆行性トレ-サ-実験、免疫組織化学のよって調べた。1.イヌ交感神経節の二重蛍光免疫組織化学によって、上頸神経節、星状神経節、L_6-S_1神経節の非カテコラミン神経節細胞が籠状ENK終末によって特異的に支配されることが明らかになった。3.手掌の免疫組織化学によって、汗腺支配神経がVIP/CGRP/SPを共存することが明らかになり、ENK節前神経→星状神経節VIP/CGRP/SP含有神経細胞→汗腺といいう標的特異的線維連絡が解明できた。4.追加研究において、イヌ喉頭内にVIP/-、VIP/SP、VIP/NPY、NIP/SP/NPY、VIP/ENK含有神経細胞からなる神経節を認め、これらの神経が喉頭腺、血管壁を標的特異的に支配していることが明らかになった。

本研究ではenkephalin(ENK)節前神経に注目し,これが交感神経節のどのタイプの節後ニュ-ロンに連絡し,さらにその節後ニュ-ロンは,どのような標的組織を特異的に支配しているのかを逆行性トレ-サ-実験,免疫組織化学によって調べた。1.イヌ交感神経節の二重蛍光免疫組織化学によって,上頚神経節,星状神経節,L_6ーS_1神経節の非カテコラミン性VIP陽性細胞が篭状ENK終末によって特異的に支配されることが明らかになった。2.Fast blue逆行性標識と免疫組織化学によって,星状神経節に投射するENK終末は主にTh_1ーTh_5脊髄中間質外側核に由来すること,また,ENK支配を受ける星状神経細胞はVIP/CGRP/SPを共存し,手掌に投射することが明らかになった。3.手掌の免疫組織化学によって,汗腺支配神経がVIP/CGRP/SPを共存することが明らかになり,脊髄中間質外側核ENK含有節神経→星状神経節VIP/CGRP/SP含有神経細胞→汗腺という標的特異的線維連絡が解明できた。4.電子顕微鏡免疫組織化学により,篭状ENK終末は星状神経VIP/CGRP/SP陽性細胞体に直接接触し,樹状突起と非対称性シナプスを形成していることが明らかになった。5.追加研究において,イヌ喉頭内にVIP/ー,VIP/SP,VIP/NPY,VIP/SP/NPY,VIP/ENK含有神経細胞からなる神経節を認め,これらの神経が喉頭腺,血管壁を標的特異的に支配していることが明らかになった。
地域における胆道がん死亡の危険因子に関するコーホート研究

佐久住民における平成15年12月末までの胆道がん死亡(135名:胆嚢がん51名、その他の胆管がん死亡84名)について、ベースライン調査よりえられたBMI,既往歴、婚姻状況、食習慣、閉経状況(女性のみ)について、性・年齢調整した比例ハザードモデルにより各因子の分析を行った。BMIについては、肥満者で胆道がん死亡は上昇していたが有意ではなかった。また、既往歴は肝疾患、胃・十二指腸潰瘍罹患、糖尿病罹患との関連は認めれなかった。婚姻状況、閉経状況、食習慣(脂っこいものが好き、あるいは塩辛いものが好き)については、いずれも胆道がん死亡との関連は認められなかった。さらに、昨年度に検討した推定栄養素摂取量のうち、エネルギー量、たんぱく質、脂質、炭水化物、脂肪酸・不飽和脂肪酸の3分位の推定摂取量、喫煙習慣、飲酒習慣、運動習慣に加えて、便通状況、BMIの3分位、肝疾患罹患の有無、胆石・胆嚢炎罹患の有無を入れたモデルを作成し、性・年齢調整したハザードモデルにより、各因子と胆道がん死亡との関連を検討した。このモデルにおいては、喫煙習慣のあるもの、BMI高値という因子が胆道がん死亡リスクを上昇させていたが有意ではなく、他の因子には関連が認められなかった。胆嚢がん・その他の胆管がんとに分けて分析した場合も同様の傾向であった。佐久住民における平成15年12月末までの胆道がん死亡(135名:胆嚢がん51名、その他の胆管がん84名)について、ベースライン調査より得られたBMI、既往歴、婚姻状況、食習慣、閉経状況(女性のみ)について、性・年齢調整した比例ハザードモデルにより各因子の分析を行った。また、既往歴は、肝疾患罹患者で胆道がん死亡は有意に高値を示したほかは、胆石・胆嚢炎罹患、胃・十二指腸潰瘍罹患、糖尿病罹患との関連は認められなかった。婚姻状況、閉経状況、食習慣(脂っこい物が好き、あるは塩辛いものが好き)については、いずれも胆道がん死亡との関連は認められなかった。さらに、昨年度に検討した推定栄養素摂取量のうち、エネルギー量、蛋白質、脂質、炭水化物、脂肪酸・不飽和脂肪酸の3分位の推定摂取量、喫煙習慣、飲酒習慣、運動習慣に加えて、便通状況、BMIの3分位、肝疾患罹患の有無、胆石・胆嚢炎罹患の有無を入れたモデルを作成し、性・年齢調整した比例ハザードモデルにより、各因子と胆道癌死亡との関連を検討した。このモデルにおいては、喫煙習慣のあるもの、BMI高値という因子が胆嚢癌死亡リスクを上昇させていたが有意でなかく、他の因子には関連が認められなかった。胆嚢癌・その他の胆管がんと分けて分析した場合も同様の傾向であった。平成元年に文部科学省の補助による大規模コーホート研究ベースライン調査に回答した佐久地区住民について、平成15年12月末までの胆道がん死亡はすでに把握しており、本年度は平成16年1月より平成21年末までの胆道がんの死亡状況を追跡した。その結果、平成21年末までの全追跡期間中、胆道がん死亡は135名(胆嚢がん51名、その他の胆管がん84名)であった。なお、この期間の対象者の転出状況も把握した。ベースライン時における33品目の食物摂取頻度より五訂日本食品標準成分表を用いて、エネルギー量、蛋白質、脂肪、炭水化物、ビタミン類、食物繊維、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸等の個人の推定栄養素摂取量を算出し、胆道がん死亡との関連を性・年齢調整したハザード比にて検討した。エネルギー、蛋白質の摂取量が多くなるほど、ハザード比は低くなる傾向を示し、脂肪、不飽和脂肪酸の摂取量が多くなるほど、ハザード比は高くなる傾向を示したが、いずれも有意差は認められなかった。炭水化物、食物繊維、ビタミン類では関連は認められなかった。さらに、喫煙習慣、飲酒習慣、運動習慣と胆道がん死亡との関連も検討した。運動習慣のある者は、ないものに比べ、胆道がん死亡のハザード比は低くなる傾向を示したが、有意ではなかった。

喫煙習慣、飲酒習慣は胆道がん死亡との関連は認められなかった。本年度については、前年度に予定していたベースライン項目の因子におけるハザード解析は終了し、その検討を実施した。さらに、現在までに分析した各因子について、単因子の解析のみでなく、関連が予想されるものをモデルにいれて胆道がん死亡との関連を検討することができた。本年度は、平成16年より平成21年までの胆道がん死亡の追跡を行うことと、ベースライン時における33品目の食物摂取頻度より五訂日本食品標準成分表を用いて、エネルギー量、蛋白質、脂肪、炭水化物、ビタミン類、食物繊維、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸等の個人の推定栄養素摂取量を算出し、胆道がん死亡との関連を検討を検討する計画であり、それらについて検討を実施した。さらに、胆道がん死亡との関連が示唆されている、喫煙、飲酒、運動習慣についても、ベースライン時の問診票データより、これら項目と胆道がん死亡との関連についても検討することができた。今後は、さらに詳細な検討を加えて、胆道癌死亡の危険因子を探索するとともに、胆嚢がん、その他の胆管がんに分けて、多重ロジステックモデルや比例ハザードモデルによる分析を行い、年齢を調整した各危険因子の影響や、相互作用について検討する。今後は、身体症状、既往歴、婚姻状況、食習慣、食品摂取頻度等のベースライン時の生活習慣に関するデータを用いて、胆道がん死亡の危険因子の探索をを行い、多重ロジステックモデルや比例ハザードモデルによる分析を行い、年齢別の危険因子の影響の違いや、因子間の相互作用についても検討する。平成25年度は生活習慣のデータ分析を実施し、胆道癌死亡の危険因子を胆嚢がん、その他の胆管がんに分けて探索するとともに、研究成果をまとめる。平成24年度は、身体症状、既往歴、婚姻状況、食習慣、食品摂取頻度等のベースライン時の生活習慣に関するデータを用いて、胆道がん死亡の危険因子の探索をを行う。さらに、胆道がん死亡を胆嚢がん死亡(C23)、その他の胆管がん死亡(C24)に分けて、それらと推定栄養素摂取量、生活習慣等の関連を検討する。
ナノ構造電荷伝搬/エネルギー変換高分子組織体の機能と解析

電荷伝搬/エネルギー変換中心分子として金属錯体をナノオーダーの分子間距離で高分子膜中に分散して高分子組織体を作り,その電荷伝搬および光エネルギー変換機能をあきらかにした.具体的には,亜鉛テトラフェニルポルフィリン(ZnTPP)を電極に被覆したポリ-4-ビニルピリジン(PVP)膜に分散すると,電気触媒化学的なプロトン還元触媒として高い活性を示し,水素を生成することを見いだし,またこれが可視光照射により著しく促進されることを明らかにした.電荷伝搬の錯体濃度依存性から膜中で電荷は物理的交換(拡散)により起こることを始めて明らかにした.電極から電子注入を受けて還元された錯体2分子がプロトンを還元して水素を発生すると思われる.また光励起により生じた錯体の励起一重項がカソード電位により消光されることから,電極からナノメーターオーダーの距離にある錯体の励起一重項が電極から電子注入により還元を受けて活性な状態となることによりプロトンを還元する機構が加わることを提案した.電荷伝搬/エネルギー変換中心分子として金属錯体をナノオーダーの分子間距離で高分子膜中に分散して高分子組織体を作り,その電荷伝搬および光エネルギー変換機能をあきらかにした.具体的には,亜鉛テトラフェニルポルフィリン(ZnTPP)を電極に被覆したポリ-4-ビニルピリジン(PVP)膜に分散すると,電気触媒化学的なプロトン還元触媒として高い活性を示し,水素を生成することを見いだし,またこれが可視光照射により著しく促進されることを明らかにした.電荷伝搬の錯体濃度依存性から膜中で電荷は物理的交換(拡散)により起こることを始めて明らかにした.電極から電子注入を受けて還元された錯体2分子がプロトンを還元して水素を発生すると思われる.また光励起により生じた錯体の励起一重項がカソード電位により消光されることから,電極からナノメーターオーダーの距離にある錯体の励起一重項が電極から電子注入により還元を受けて活性な状態となることによりプロトンを還元する機構が加わることを提案した.
白血病細胞増殖の分裂期制御におけるカルシニュウリンの役割

Ca^<2+>依存性蛋白脱リン酸化酵素カルシニュウリンがどうような分子機構によりヒト白血病細胞株HL-60細胞増殖を制御しているのかについては依然不明である。本研究はHL-60細胞を同調培養することにより、インムノフィリン/カルシニュウリン系がHL-60細胞の細胞周期の分裂期(M期)をどのような分子機構により制御しているのかを細胞骨格系及び微小管系蛋白群との関係を踏まえて解明することを目的とする。免疫抑制剤サイクロスポリンAやFK506がHL-60の増殖を主にG1期を短縮することにより促進することを見いだし、これら薬物のHL-60細胞の増殖促進作用が、結合蛋白であるインムノフィリンを介してカルシニュウリンを抑制することに起因することを明らかにした。共焦点レーザー顕微鏡を用いHL-60細胞におけるFKBP12,Cyclophilin A及びカルシニュウリンの局在を検討するとそれぞれの蛋白は主に細胞質に存在するがM期においてはいずれも分裂装置周辺に局在することから微小管系蛋白との関連が強く示唆された。また、発現すれば常に活性を有するカルシニュウリン変異遺伝子(ΔCN)をレトロウイルスベクター(LXSN)に構築しHL-60細胞にトランスフェクトを試みたが感染効率が悪く成功しなかったが現在更に検討中である。M期HL-60細胞を同調培養法により作製しカルシニュウリンの基質蛋白についても検討中である。
近接場光誘起アクティブ造影制御による超解像MRI技術の開発

近接場光は、微細構造近傍に局在する電磁場であり、従来は、この局在性を活かした高空間分解能顕微鏡の開発が行われてきた。研究代表者は、近接場光の持つ、空間的に非一様な電場・磁場分布によって局所的な磁気モーメントが生成されることを明らかにしている。本研究では、この、近接場光誘起の磁気モーメントを核磁気共鳴画像法(MRI)に活用したアクティブ制御超解像MRIの実現を目的として研究を行った。従来のMRIでは明瞭な画像を得るために造影剤が利用されるが、近接場光(ナノ磁石)を利用することで非磁性材料も造影剤としての機能発現が可能となる。近接場光は、光照射時にのみ誘起される、つまり造影剤として機能が光照射時のみで発生するため、光照射のオン・オフで造影効果が制御可能となる。従来の不可逆的な操作であった造影の考え方を覆し、造影・非造影のMRIを交互に実施して継時的な変化を追跡する新たなMRI診断技術の実現が期待される。昨年度までに、微細構造を有する近接場発生用コイルをMRI装置内に配置することで、MRI画像のコントラストが向上することを確認することに成功した。今年度は、MRI画像のさらなる高コントラスト化を実現するために、磁気プローブを用いて、実際に近接場光発生用コイルにおける微細構造での磁場増強効果の確認を行った。その結果、シミュレーションで得られた結果を支持する位置での磁場増強の効果を確認することに成功した。近接場光は、光が照射された物質の表面近くに局在する電磁場であり、この性質を利用すると光の回折限界を超えた高分解能光学顕微鏡が実現する。提案者は、空間的非一様性が非常に大きい近接場光によって局所的な磁気モーメント(ナノ磁石)が生成されることを明らかにしている。本研究では、近接場光誘起の磁気モーメントを核磁気共鳴画像法(MRI)に活用したアクティブ制御超解像MRIの実現を目的とする。従来のMRIでは明瞭な画像を得るために造影剤が利用される。造影剤には磁性材料が用いられているが、近接場光(ナノ磁石)を利用することで非磁性材料も造影剤としての役割を果たすことになる。近接場光は、外部から照射する光によって誘起される、つまり磁石として性質が光照射時のみで発生するため、光照射のオン・オフで造影効果がアクティブに制御可能となる。今年度は近接場光誘起による効果を確認するために、近接場発生用の微細構造の作製し、これをMRI装置内に配置することで、MRI画像としてどのような変化が現れるのかを確認した。その結果、近接場光が発生した場合に画像に変化が発生することを確認した。また、シミュレーションにより、近接場光誘起の磁場発生増強効果が得られる構造を明らかにし、最大2桁程度の増強効果が得られることを確認した。【研究実績の概要】に記載の通り、近接場光誘起によってMRI画像に影響を与えられることを実証しており、計画通りに進んでいる。一方、計算で得られた磁場増強構造が大きいため、MRI装置内に設置することができず、磁場増強の効果が最大限に発揮できていなのが現状である。使用するMRI装置の大きさを鑑みて、近接場光誘起の磁場増強効果が最大となる最適構造をシミュレーションにより明らかにする。得られた最適構造を作製し、これをMRI装置内に配置することで、最適な造影効果が得られる、条件を明らかにする。具体的には、従来の撮影であるスピンエコーのパラメータを測定対象である、プロトンに最適化した状態で、近接場光を誘起するパラメータ(周波数、印加時間、間隔、照射方向など)を最適化し、最大の造影効果と高分解能化を目指す。

【現在までの進捗状況】に記載の通り、MRI装置内に設置可能な構造体の最適化が完了することができず、そのために支出を予定して構造体の試作費用を計上することができなかった。今後早急に、最適構造を明らかにし、それを実証するための構造体の試作費の使用を予定している。また、成果をより広く周知するために発表する学術論文誌についてオープンアクセスのための経費を予定している。
ベイズ推定による位相アンラッピングの高速高精度化と屋内測位への応用

移動物体の位置を電波を用いて高精度に推定するために,搬送波位相を用いた測距・測角で問題となる位相アンラップを高確度・高精度に推定する課題に取り組んでいる.2年目にあたる当年度では,無線双方向時刻比較装置2機間の搬送波位相時系列を記録するシステムを開発し,初年度に論文発表した位相角時系列アンラップの推定アルゴリズムを適用させ,波長にアンラップ推定した波数を乗じて位相値を足すことで2機間の距離を推定することを試みた.精度検証のためレーザー測距値と比べた結果,種々のシステム不具合を修正し尽くしたにもかかわらず推定確度が向上しなかったが,双方向位相値を平均してから半周期,すなわち,πでアンラップしていた手順から双方向位相値を2πでアンラップしてから平均する手順に変え,さらに,1時刻前との位置がほぼ不変という仮定から1時刻前の速度がほぼ不変という仮定に置き換えた結果,推定確度及び精度がともに向上した.論文発表には至らなかったものの,無線双方向時刻比較技術の搬送波位相を活用した測距システム及び位相角推定アルゴリズムの作り込みが最終年度になる前に完了したため.位置がほぼ不変と仮定した推定モデルと,速度がほぼ不変と仮定する推定モデルに対してベイズ的モデル選択を行い,まず,人工データでモデルが適正に選択されることを確認した後,推定モデルの高速化を実現する近似式を導き精度の検証を行う.移動物体の位置を常時計測する技術としては,屋外における全地球航法衛星システムや屋内空間等における無線センサネットワークによる測位システムがある.高精度の位置決めを狙うには電波の強度や到来時間差ではなく,位相角を扱う.しかし,位相を用いた測距・測角では計測対象の距離や方位が計測される位相角の多価関数となっていることが問題となる.計測される位相角が主値の範囲(ーπ,+π]radのみに限られ包(くる)められてしまい,主値域幅2πの整数倍を加えるアンラップが必要になる.この整数値は計測だけでは一意に決めることができず,ノイズが重畳されている場合には正確に求めることが難しい場合がある.そこで,角度変数からなる時系列データのノイズ除去を行った先行研究(Traa and Smaragdis, 2013)が組み上げたフィルタアルゴリズムを,不連続遷移も含めた脳波解析原理の枠組み(本研究分担者等, Naruse et al., 2013,が確立させていたもの)を応用して位相アンラップの推定モデルに組み直した.模擬的な1次元測距データを位相の主値域内に包めノイズを加えた時系列から推定した結果,既存の位相アンラップ手法(Itoh, 1982)では出来なかったノイズリダクションを行ないながらの位相アンラップに成功した.また,実測データの取得を目指し,920MHz無線通信ネットワークによる測位システム及び精度検証のためにレーザー測距機能を有するトータルステーションから成る屋内測位試験システムを組み,まずは計測が正しく行うことができることを確かめた.模擬的なデータではあるが推定に成功したため,遅滞なく学術論文にまとめ初年度のうちに採択・発行されたため.移動物体の位置を電波を用いて高精度に推定するために,搬送波位相を用いた測距・測角で問題となる位相アンラップを高確度・高精度に推定する課題に取り組んでいる.2年目にあたる当年度では,無線双方向時刻比較装置2機間の搬送波位相時系列を記録するシステムを開発し,初年度に論文発表した位相角時系列アンラップの推定アルゴリズムを適用させ,波長にアンラップ推定した波数を乗じて位相値を足すことで2機間の距離を推定することを試みた.精度検証のためレーザー測距値と比べた結果,種々のシステム不具合を修正し尽くしたにもかかわらず推定確度が向上しなかったが,双方向位相値を平均してから半周期,すなわち,πでアンラップしていた手順から双方向位相値を2πでアンラップしてから平均する手順に変え,さらに,1時刻前との位置がほぼ不変という仮定から1時刻前の速度がほぼ不変という仮定に置き換えた結果,推定確度及び精度がともに向上した.論文発表には至らなかったものの,無線双方向時刻比較技術の搬送波位相を活用した測距システム及び位相角推定アルゴリズムの作り込みが最終年度になる前に完了したため.初年度に組み上げた推定モデルでは移動物体の移動過程をブラウン運動を仮定するという強い制限が課せられていた.この仮定を緩和し,様々な移動・運動に対応することのできる推定モデルに改良する予定である.そして,実測データでの推定も試みる.位置がほぼ不変と仮定した推定モデルと,速度がほぼ不変と仮定する推定モデルに対してベイズ的モデル選択を行い,まず,人工データでモデルが適正に選択されることを確認した後,推定モデルの高速化を実現する近似式を導き精度の検証を行う.高速計算を行う装置を導入する予定であったが,既存の計算機能力でも第一段階の学術論文を仕上げることができ,論文投稿及び出版を優先したため,計算装置の導入を次年度以降に見送った.無線双方向時刻比較装置の不具合を修正する期間が予定より長くなったため,精度検証用トータルステーションの借用期間を短くしたことや発表旅費を使う機会を延期したため,これらの経費を次年度に見送る.
生体高分子の機能発現における水素・水和水の静的・動的な役割の実証

2008年に共用を開始するJ-PARCの登場によって中性子を用いた結晶構造解析は新しい場面を迎えようとしている。蛋白質には非常に多様な個性があり、その個性を生み出すメカニズムを解明するためには中性子構造解析によって水素原子や水和水の情報を得ることが重要である。そこで、幅広い分野の蛋白質研究者を集め、水素水和構造がその機能に関与する解析対象を調査し、世界でも有数の中性子回折計を活用するための企画調査を行った。調査項目は下記の通りである。1)生体高分子における水素位置の決定方法に関する調査2)分子認識における水素や水和水の役割に関する調査3)酵素反応触媒における水素や水和水の役割に関する調査4)中性子構造解析が有効に活用できる新規解析対象の調査これらの項目を分担し調査を行った結果を持ち寄り、合計3回の会合を持った。そのうち一回については公開シンポジウム(開催日平成18年1月23日、(社)日本化学会化学会館にて開催)として調査を進めるとともに、一部の調査結果を報告した。本シンポジウムでは、生体高分子の立体構造解析研究に携わる第一線の研究者の講演が行われ、最新の研究成果が紹介されるとともに中性子による水素原子の観測の意義が深く議論された。また会議では中性子を用いた立体構造解析における問題点が提示され、その解決法に関する取り組みが紹介された。特に蛋白質を遺伝子工学的に改変して結晶化を促進するアプローチや、フェムト秒レーザーをもちいた結晶核形成による結晶化法が中性子構造解析をより身近にする技術として注目を浴びた。得られた調査結果を元に、1)シミュレーション等の理論計算、2)熱測定による脱水和効果の観測、3)水素や水和水の位置決定を統合した創薬研究を目的とした特定領域研究へと展開を図りたい。
胎生期の幹細胞ストレスによる生後の脳内リン脂質構成異常と発達障害発症機構の解明

前年度までの研究から、ラットの脳内リン脂質合成酵素遺伝子の活性化とリン脂質構成の変化が胎生期低栄養群の行動異常に関連することが示唆された。その中でも18:0p-22:6ホスファチジルエタノールアミン(PE)の前頭前皮質での増加が行動変化と関連することが明らかとなってきた。そこで、本年度はPEおよびホスファチジルコリン(PC)の産生阻害、ならびにホスファチジルセリンやホスファチジルイノシトールがシグナリングに関与するPKC経路の阻害剤(chelerythrine)を胎生期低栄養群のラットに投与し、リン脂質を介するシグナリング抑制時の行動変化を観察した。chelerythrineは対照群に対し高架式十字迷路試験でcrossingの減少やclosed armでの滞在時間の増加など不安様行動を誘発したが、低栄養群ではオープンフィールドおよび高架式十字迷路試験ともに変化が認められなかった。さらに、胎生期低栄養は生後の頭前皮質のモノアミン濃度を変化させなかった。したがって、胎生期低栄養による行動異常の原因として、以下のメカニズムが考えられた。2.行動を制御するPKC経路の感受性が胎生期低栄養ラットでは低く、行動異常はPKC経路の活性化を介していない。3.脳内モノアミン系との関連性は低い。また、胎生期低栄養ラットの不安様行動は若年期の毎日のハンドリングによって軽減されることから、生後の環境が胎生期低栄養による行動異常をキャンセルする可能性が示唆された。胎生初期の低栄養ストレスは生後の仔の行動異常や脳リン脂質代謝・構成異常を引き起こす。本年度は胎生初期の低栄養ストレスが誘因となる、生後の脳の各部位のリン脂質代謝・組成異常のパターンの詳細を明らかにするため、以下の研究を行った。1.胎生5.5日から10.5日に低栄養負荷を行った雄ラットの生後9週の脳において、多動に関連する前頭前皮質、側坐核、線条体のリン脂質組成を質量顕微鏡で調べた。低栄養ラットの前頭前皮質では対照群と比較して、18:0p-22:6ホスファチジルエタノールアミン(PE)および20:1リゾフォスファチジルエタノールアミン(lyso PE)が有意に増加していたが、側坐核および線条体ではこれらに変化がなかった。さらに、前頭前皮質ではジアシル型リン脂質合成酵素の他、Agpsなどプラズマローゲン合成酵素の遺伝子発現が増加していたが、側坐核ではGpat1の発現のみの減少が認められた。したがって、前頭前皮質のPE増加が行動異常と関連している可能性が示唆された。胎生10.5日の前脳でもホスホリパーゼA2などの遺伝子発現に変化が認められ、低栄養ストレスによるリン脂質代謝異常が神経幹細胞ですでに生じている可能性が示唆された。2.生後14週の成獣ラットに18:0p-22:6 PEを投与し、行動ならびに脳のリン脂質組成変化を解析した。投与5週前の行動解析結果と比較したところ、対照群と比べて低栄養群では週齢を経てもcrossingが高いレベルで維持されることが明らかとなった。また、PE投与群では前頭前皮質において18:0p-22:6 PEが有意に増加しており、側坐核や線条体では変化が無かった。上記1、2の結果により、胎生初期の低栄養は特に前頭前皮質のリン脂質代謝および組成異常を生じ、特にプラズマローゲン型PEがcrossingなどの行動変化に関わっている可能性が示唆された。本年度は以下の研究計画の実施を予定していた。1.胎生期低栄養ラットの胎仔および生後の脳の各部位のリン脂質組成変化の検討2.同部位のリン脂質生合成酵素遺伝子の発現異常の検討3.発現に変化のあった遺伝子のエピゲノム解析本年度は、胎生期低栄養負荷を行ったラットの生後の脳において、上記1、2の検討を行い、胎生10.5日の胎仔については上記2の検討を行った。これらの結果、胎生初期の低栄養ストレスにより増減するリン脂質、および発現変化の生じたリン脂質生合成酵素遺伝子が特定できた。そこで、上記3に優先して、次年度の研究実施計画のうち、低栄養により変化したリン脂質(18:0p-22:6 PE)の増加が行動異常の原因となり得るかどうかの検討を行った。これにより、少なくとも18:0p-22:6 PEは行動変化を誘発することが示唆され、また、その作用部位は前頭前皮質である可能性が示唆された。本年度の研究計画のうち一部遂行できなかった実験はあるが、次年度の計画を優先して実施することにより、脳におけるリン脂質の組成変化と行動異常を関連づけることができ、本研究の重要な目的の1つを達成できた。したがって、計画はおおむね順調に進展していると判断した。前年度の研究成果により、ラットの妊娠初期(胎生5.5日から10.5日)の低栄養による仔の行動異常の一部は、前頭前皮質でのリン脂質合成酵素遺伝子活性化により増加した18:0p-22:6ホスファチジルエタノールアミン(PE)により誘発されると考えられた。そこで、PEの親水性頭部が機能を発揮するのに主要な役割を果たすかどうか確かめるために、リポソームにPE(16:0-18:1)を組込みラットに投与して行動を観察したが、特に変化は認められなかった。したがって、本機能はPEに共通する性質では無く、特定の尾部構造を有するプラズマローゲンPEに特徴的であると考えられた。また、行動変化と密接に関連している活性化ミクログリア数も前頭前皮質で変化がないことを確認した。

一方、脳内リン脂質合成酵素遺伝子の発現変化には、胎児プログラミングによるエピゲノムの変化が関与している可能性がある。そこで、DNAやヒストンのメチル化に寄与する葉酸を妊娠期に投与し、仔の行動の改善作用について調べた。妊娠全期間中、標準の5倍量葉酸含有の飼料を投与した低栄養群および非低栄養群のラット産仔は、標準飼料を投与された低栄養群ラット産仔に比較して行動試験で活動性亢進と抗不安様行動を示した。また、対照群の仔ラットと比較し、標準飼料投与低栄養群の産仔では高架式十字迷路試験でのcrossingが減少していた。脳内モノアミン量による判別分析を行ったところ、その増減パターンは葉酸量と関係なく、低栄養群と非低栄養群間で判別された。この結果、葉酸は胎生期低栄養による行動変化を見かけ上改善するが、脳内のモノアミンバランスは変えないことが明らかとなった。以上の結果から、胎生初期の低栄養は、これまで注目されてきた脳内炎症やモノアミンではなく、少なくとも一部は特定のリン脂質の変化を介して行動に影響を与えることが明らかになった。これまでに以下の結果を得た。1.胎生初期の低栄養により、生後の仔の前頭前皮質においてジアシル型リン脂質およびプラズマローゲン合成酵素遺伝子の活性化が認められたが、側坐核や線条体では遺伝子の活性化は認められなかった。それと対応して前頭前皮質ではPE(18:0p-22:6 )とlyso PE(20:1)が増加していたが、側坐核や線条体ではPE・ホスファチジルセリン(PS)・ホスファチジルイノシトール(PI)量の増加は認められなかった。2.PE(18:0p-22:6 )投与により胎生期低栄養による生後の行動異常の一部を再現できることを明らかにし、尾部構造の異なるPE(16:0-18:1)が行動変化を誘発しないことから、その機能が親水性の頭部構造に依存するのではなく、尾部を含めた全体の構造に依存することを示した。3.胎生初期低栄養により前頭前皮質の活性化ミクログリア数の変化は生じなかった。4.葉酸は胎生初期の低栄養による生後の仔の脳内モノアミン量増減パターンは改善せず、行動異常のみを見かけ上改善することを明らかにした。これらの結果は、胎生期低栄養ストレスによる生後の行動異常が脳内炎症やモノアミンではなく特定リン脂質の変化によって生じている可能性を示唆しており、かつ、プラズマローゲンPE(18:0p-22:6)が不安様行動を改善する候補分子として挙げられたことから、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。前年度までの研究から、ラットの脳内リン脂質合成酵素遺伝子の活性化とリン脂質構成の変化が胎生期低栄養群の行動異常に関連することが示唆された。その中でも18:0p-22:6ホスファチジルエタノールアミン(PE)の前頭前皮質での増加が行動変化と関連することが明らかとなってきた。そこで、本年度はPEおよびホスファチジルコリン(PC)の産生阻害、ならびにホスファチジルセリンやホスファチジルイノシトールがシグナリングに関与するPKC経路の阻害剤(chelerythrine)を胎生期低栄養群のラットに投与し、リン脂質を介するシグナリング抑制時の行動変化を観察した。
ヘモグロビンの機能調節機序の比較生理学的研究

種々の動物のヘモグロビン(Hb)の酸素結合機能を,異なる実験条件下で測定・解析し,互いに比較することによって,各Hbに固有の,また逆に,全Hbに共通の機能発現の機序を見い出し,究極的には,成人Hbにおける構造機能連関の解明に役立つ知見を得る目的で,以下の研究を行なった.1.成人Hbのd89His残基がBohr効果に寄与しているという説があるが,根拠は1種の実験結果のみである.そこで,この説を検証するため,そのHis残基がTyrによって置換されているイヌのHbのBohr効果を精密に測定したところ,その説を積極的に支持するデータは得られなかった.2.両棲類有尾目の4種のサンショウウオ(ハコネサンシウウオ,中国産オオサンショウウオ,日本産オオサンショウウオ,アメリカオオサンショウウオ)の赤血球およびHb溶液の酸素平衡曲線を,種々の実験条件下で測定し,それら同士で,また,成人Hbの曲線と比較した.その結果,赤血球においても, Hb溶液においても,サンショウウオHbの酸素親和性はヒトHbのそれに比べて低く, Bohr効果は皆無もしくは非常に小さかった.また,サンショウウオHbは, Cl-, Ca2+,Co2, ATP, IHP,無機リン酸塩によるヘテロトロピック効果も,もっていなかった.4種のサンショウウオHbの内,ハコネサンショウウオHbのみが,他のHbに比べてやや異なる性質を示した.3.無尾目アフリカツメガエルの成体のHbが,硬骨魚類のHbと同様に, Root効果を示すかどうかについて,研究者達の意見が分かれているので,そのカエルのHb酸素平衡曲線を,広範囲のpH条件下において測定して, Bohr効果の強さを調べた.その結果,酸性領域でHill係数が小さくなったが, Hbの自動酸化が予想外に速いため, Root効果の存否に関する確固たる結論は得られなかった.種々の動物のヘモグロビン(Hb)の酸素結合機能を,異なる実験条件下で測定・解析し,互いに比較することによって,各Hbに固有の,また逆に,全Hbに共通の機能発現の機序を見い出し,究極的には,成人Hbにおける構造機能連関の解明に役立つ知見を得る目的で,以下の研究を行なった.1.成人Hbのd89His残基がBohr効果に寄与しているという説があるが,根拠は1種の実験結果のみである.そこで,この説を検証するため,そのHis残基がTyrによって置換されているイヌのHbのBohr効果を精密に測定したところ,その説を積極的に支持するデータは得られなかった.2.両棲類有尾目の4種のサンショウウオ(ハコネサンシウウオ,中国産オオサンショウウオ,日本産オオサンショウウオ,アメリカオオサンショウウオ)の赤血球およびHb溶液の酸素平衡曲線を,種々の実験条件下で測定し,それら同士で,また,成人Hbの曲線と比較した.その結果,赤血球においても, Hb溶液においても,サンショウウオHbの酸素親和性はヒトHbのそれに比べて低く, Bohr効果は皆無もしくは非常に小さかった.また,サンショウウオHbは, Cl-, Ca2+,Co2, ATP, IHP,無機リン酸塩によるヘテロトロピック効果も,もっていなかった.4種のサンショウウオHbの内,ハコネサンショウウオHbのみが,他のHbに比べてやや異なる性質を示した.3.無尾目アフリカツメガエルの成体のHbが,硬骨魚類のHbと同様に, Root効果を示すかどうかについて,研究者達の意見が分かれているので,そのカエルのHb酸素平衡曲線を,広範囲のpH条件下において測定して, Bohr効果の強さを調べた.その結果,酸性領域でHill係数が小さくなったが, Hbの自動酸化が予想外に速いため, Root効果の存否に関する確固たる結論は得られなかった.種々の動物のヘモグロビン(Hb)の酸素結合機能を、異なる実験条件下で測定・解析し、互いに比較することによって、各Hbに固有の、また逆に、全Hbに共通の機能発現の機序を見い出し、究極的には、成人Hbにおける構造機能連関の解明に役立つ知見を得る目的で、以下の研究を行なった。1.本研究費で購入した高速液体クロマトグラフシステム(ファルマシア製FPLCシステム)を用いて、動物の溶血液からHbを精製した。2.イヌのHbの酸素平衡曲線を5.59.1の範囲の種々のPH条件で測定して、Bohrプロットを作成し、ヒトHbのプロットと比較すると、両HbのBohr効果が、酸性領域で微妙な差を示すことが分かった。3.ハコネサンショウウオ(Onychodactylus gaponics)のHbでは、ヒトHbに比べて、酸素親和性が低く、Bohr効果はほとんど無く、協同性はやや減少し、有機リン酸塩の効果は全くみられないという機能特性を示した。4.アメリカ・オオサンショウウオ(Cryptobranchus alleganiensis alleganiensis)のHbでは、ヒトHbに比べて、酸素親和性が低く、Bohr効果は逆方向で、協同性は同程度、有機リン酸塩の効果はほとんどみられないという機能特性を示した。また、赤血球とHb溶液との間に、酸素親和性の差異がみられた。このサンショウウオの酸素親和性は、ハコネサンショウウオのそれに比べると、赤血球においてもHbにおいても、高い値を示した。
淡水産板鰓類の適応と保護に関する研究

タイ、ラオスの河川から8種、インド、バングラデッシュの河川から4種の淡水エイを採集した。タイのチャオフラヤ川からHimantura signiferとH.chaophrayaの2種、ナン川からH.gerrardii,H.bleekeri,未同定種H.spの3種、バンバコング川からH.krempfiとPastinachus sephanの2種、ラオスのメコン川からDasyatis laosensisを確認した。インドのガンジス川からH.chaophraya,H.bleekeri,H.gerrardii,P.sephenの4種を確認した。これらの種と汽水、沿岸域から採集したアカエイ科のエイ類を用いてミトコンドリアDNA塩基配列分析を行い、系統類縁関係を調べたところ、Himantura属、Dasyatis属でそれぞれ1つのグループを作った。しかしながら、Pastinachus属の種と両属との系統的な関係を明らかにできなかった。タイ、インドの両地域から採集された同一種はそれぞれ同じグループにまとめられたが、遺伝学的にかなり離れた個体群であることが示唆された。淡水域から採集されたこれらの種の浸透圧や塩類排出器官の直腸腺の構造から判断すると、これらの種は完全には淡水に馴化しておらず、汽水域との往来があることが示唆された。淡水エイの平衡砂のストロンチウム/カルシウム比を調べたところ、調査地域の汽水域、沿岸域から採集したエイのその比よりも明らかに低い価を示した。淡水エイと汽水産エイの筋肉、肝臓中の遊離アミノ酸を分析した結果、淡水エイでは明らかに尿素とタウリンが少なく、また、TMAOとベタインも低い値を示し、これらの物質が浸透圧調節に関与していることが示された。これらの種のうち、H.signiferはチャオフラヤ川に比較的多く棲息しているが、他の種の生息数は多くないものと考えられた。H.signiferは雄で体盤幅210-230mm,年齢1-2歳、雌で250-260mm,2-3歳で成熟し、寿命は5年以上であることが判明した。他の種も成熟には2-6年かかることがわかった。しかしながら,本調査での最大種であるH.chaophrayaは成熟するまで7年以上かかり、体盤幅2m以上に成長することからより詳細な調査を必要とする。本課題の"適応と保護"のうち、保護に関する調査は糸口を見いだした段階にあり、今後の淡水域の環境悪化を想定した場合、さらなる継続調査を必要とする。タイ王国のチャオプラヤ川とメコン川での調査は平成8年10月31日から11月11日の間、カセサート大学のWongrat博士とともに行い、チャオプラヤ川では淡水エイHimantura signifer5個体、H.chaophraya 1個体から各研究分野の試料を採取し、メコン川ではDasyatis laosensisと考えられる1個体が得られ、現在分類学的な研究を行っている。

また、事前にWongrat博士により採集された淡水エイD.laosensisとH.krempfi各1個体を調査した。汽水、沿岸域から淡水エイと近縁な2種類のエイを採集し、比較標本として試料の分析を行っている。H.chaophrayaは体盤幅で2m近くなる大型な淡水エイであるが、大型個体は年間数個体しか捕獲されず、生息数の減少が危惧されている。平成9年3月5日から3月12日の調査ではラオス領パクセ近郊のメコン川で標本入手を試みたが、入手できなかった。しかしながら、カンボジヤとの国境近くのコーン周辺のメコン川及びアタプ周辺のセコング川で入手可能である情報を得たので、次年度その周辺での調査を行う予定である。また、12月から2月にかけてWongrat博士により採集されたH.chaophrayaとH.signiferの計測解剖を行い試料を得、更に未記載種と思われる個体を日本に持ち帰り分類学的な研究を行っている。インドではカルカッタにあるインド動物調査局に保存されている約100年前にフ-グリ川河口で採集されたGlyphis gangeticusと思われる個体の調査を行った。ガンジス川中流域の調査ではバ-ガルプール大学のSrivastava教授を訪問し、12月に近郊で採集したという4種のエイHimantura bleekeri,H,uarnak,H.gerrardi,H.sp.の調査を行い、更にそれらが採集できるファラッカ周辺のガンジス川を視察した。バングラデッシュではダッカ、ラシャヒ周辺のガンジス川下流域、コックスバザ-ル周辺の沿岸域でのサメ、エイ類の分布状況をダッカ大学のQuddus教授とともに聞き込み調査を行い、夏季にガンジス川で採集可能であるとの情報を得た。本年度は昨年度行った予備調査をもとに8-9月にガンジス川で、12-1月にメコン川で調査を行った。ガンジス川調査時に研究分担者のSrivastava教授の案内でまずHooghly川の河口域で汽水産のエイの採集を行った。その後、Bhagalpur大学に保存されているエイの分類学的調査、野外での生鮮標本の採集調査を行った。保存されていたエイは汽水産のものも含め5種が確認され、更に野外調査において2種の淡水エイを採集することが出来た。それらの個体からは生理・生化学的研究を行うための試料を入手した。メコン川では淡水エイであるDasyatis laosensisの生鮮個体2個体と事前に採集保存されていた3個体の標本を調査し、試料を得た。チャオフラヤ川水系からの標本は研究分担者のWongrat博士により、活魚、冷凍、あるいはフォルマリン標本として保管されており、それらをインド、ラオスでの調査の帰路に調査し、試料を得た。ガンジス川下流域の調査は研究分担者のQuddus教授により行われた。しかしながら邦人研究者はインドのガンジス川中流域での調査に主体を置いたため、下流域での調査に参加できなかった。Quddus教授は河口域で少なくとも3種の汽水産のエイを採集した。これらの調査で得られた標本・試料を基に各研究者が分析・解析を行い、以下の結果を得た。形態学的な分類では汽水産の種も含め8種が同定できたが、いまだ3種以上の未同定種がおりそれらの中には新種も含まれている可能性が示唆された。mtDNAを用いた遺伝学的解析では調査で得られた淡水エイの類縁関係や地域偏差に関する情報が得られ、それらの系統や起源を論じる資料を得た。