hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中性子-γ線混在場における歯エナメル質を用いたESR線量計測法に関する基礎研究

放射線源として、自発核分裂によりウラン燃料とほぼ同等のエネルギー分布で中性子及びγ線を放出させるCf-252を使用した。実験には、頭部を簡単な形状で模擬したメタクリル樹脂(PMMA)製の物理模型(ファントム)を使用した。このファントムの口腔領域に空孔を設けて、その中に中性子に対する感度の差がある熱ルミネセンス線量計(TLD)を配置した。空間中にも、二種類のTLDを同様に配置した。これら二つの条件で配置されたTLDによる実測値の差から、頭部ファントムで生成した二次γ線の寄与を求めた。そまた、実験条件と想定される全身被ばく条件の幾何条件(全身-頭部のみ)、材質(人体組織-PMMA)が二次γ線の生成に与える影響については、既に開発した事故時の線量評価システムで定量的に評価した。計算解析に基づき、実測値の補正、線源カプセルで発生するγ線の寄与の調査を実施した。解析の結果、口腔部の全γ線量に対する二次γ線の寄与は最大でも10%程度であり、ESR計測における不確かさ(20%程度)と比較しても小さいことを明らかとした。
諸分野連携によるネットワーク数理の展開

ネットワーク数理の構築に向けて、非可換解析を軸とした分野融合研究を推進した。同位体分離におけるエネルギー準位の長時間挙動を量子ウォークのスペクトルから導出して、物理実験との整合性を確認した。有向パスのマンハッタン積に対して、複素スペクトルを導出した。強正則グラフを2変数直交多項式によって記述して、漸近的スペクトル密度としてガウス・ポアソン分布を導出した。2次元の制限正方格子にクロネッカー積を応用して、スペクトル密度を楕円積分で表示した。ケーリー・ツリーのパーコレーションに対して、臨界相における連結成分の分布を導出した。複数の感染源をもつ感染症モデルに対して、感染爆発のメカニズムを解析した。古典および量子確率解析・微分方程式・グラフ理論などの数学理論をネットワーク数理の要として、物理学・情報科学におけるモデル解析・数値計算、生命系・社会系を含む応用系における現象分析を一貫するような数理体系の構築が目標である。そのため、様々なバックグラウンドをもつネットワーク研究者との研究交流を推進して研究課題の整理を行う。今年度は、準備期間として、研究課題の整理と数値計算や応用系に明るい研究補助者の人選を進めた。1.ネットワーク構造ネットワークのもつ階層構造・積構造・モチーフに注目した接続構造などが主要なテーマである。有向グラフのマンハッタン積に対する量子確率論的取り扱い、2変数直交多項式による量子分解の拡張などについて検討した。2.ネットワーク上のダイナミクスネットワーク上の拡散過程・パーコレーション・振動子系・量子ウォークの統計的性質をネットワークスペクトルの立場から再構築することを目指している。今年度は、有向グラフ上の振動子系の協同現象を、スペクトル解析の観点から整理した。線形問題について見通しを得た[学会発表]が、本来の非線形系との関連は大きな課題である。3.ネットワークの制御ネットワークの頑健性の数理を目標にしている。次年度から、感染症モデルに対して、統計物理的アプローチや数値シミュレーションを取り入れるための準備を行った。予定していた研究補助者の着任が遅れて次年度となったため。今年度は、若手研究者を中心とした「複雑ネットワークウィンターセッション2016」(茨城大学、2016年3月)を開催した。また、数値計算や応用系に明るい研究補助者を雇用して、共同研究の幅を広げる模索をしている。グラフのメラン積を導入して、確率分布のメラン積との直接関連させ、2次元格子における道の数え上げを楕円積分で記述した[論文投稿中]。辞書式順序積・ストロング積について、隣接行列のスペクトル分布を求める公式を得た[論文発表・学会発表]。2変数直交多項式による量子分解法については継続的に検討中である。ケーリーツリー上の臨界相におけるパーコレーションに対してクラスターサイズの統計を明らかにし、また複数の感染源をもつ感染症モデルにおける感染爆発のメカニズムを数値シミュレーションを援用して解析した[論文発表・学会発表]。感染症モデルに対して、統計物理的アプローチや数値シミュレーションを継続して、モデルによらない取り扱いを模索している。(1)今年度当初より、あらたに研究補助者を雇用することができたため、前年度に滞っていた応用数学関係の研究交流が進展した。(2)若手研究者を中心に60名の参加を得て「複雑ネットワークウィンターセッション」を開催して、研究課題の整理が進んだ。古典および量子確率解析・微分方程式・グラフ理論などの数学理論を基に、物理学・情報科学などから広がる応用分野を視野に入れたネットワーク数理の体系化を目標としている。そのため、研究交流を推進して研究課題の整理を継続的に行い、グラフ積とスペクトル、及びネットワーク上のダイナミクスに研究の進展があった。スペクトル解析を中心として、関連する若手研究者を内外から招聘して研究課題の探索を行った。また、数値計算や応用系に明るい研究補助者を雇用して、共同研究を実施した。グラフのメラン積を導入して、確率分布のメラン積との関連を明らかにして、道の数え上げに応用している[論文投稿中]。距離行列のスペクトル解析によって、グラフの星形積のユークリッド埋め込みのための条件を明らかにした[学会発表]。パーコレーションにおける臨界相の性質を知るため、ケーリーツリー上のボンドパーコレーションを扱い、臨界相における連結成分の分布の統計的な性質を母関数解析から明らかにした。また、複数の感染源をもつ感染症モデルにおける感染爆発のメカニズムを数値シミュレーションを援用して解析した[論文発表・学会発表]。

3.ネットワークの制御ネットワークの頑健性については物理的な解析や数値シミュレーションによる研究が多い中で、数理的な厳密理論を目標として、平衡モデルを検討し、パーコレーション閾値の導出を試みた[継続研究中]。ネットワーク数理の構築に向けて、非可換解析を軸とした分野融合研究を推進した。同位体分離におけるエネルギー準位の長時間挙動を量子ウォークのスペクトルから導出して、物理実験との整合性を確認した。有向パスのマンハッタン積に対して、複素スペクトルを導出した。強正則グラフを2変数直交多項式によって記述して、漸近的スペクトル密度としてガウス・ポアソン分布を導出した。2次元の制限正方格子にクロネッカー積を応用して、スペクトル密度を楕円積分で表示した。ケーリー・ツリーのパーコレーションに対して、臨界相における連結成分の分布を導出した。複数の感染源をもつ感染症モデルに対して、感染爆発のメカニズムを解析した。ネットワークの制御に関する研究を推進するために、研究分担者を加える。複雑ネットワークスクールなどを開催して、幅広い分野の研究者との研究交流の場を設ける。前年度に引き続いて、若手を主体とした研究集会を開催して研究交流を促進する。分野横断的なテーマに関して、ネットワーク数理における位置づけを明確にしながら、課題の整理を継続する。現在準備中の研究分担者との共著本を年度中に発刊することを目標とする。28年度が最終年度であるため、記入しない。量子確率論・スペクトル解析研究補助者の着任が次年度にずれ込んだため、人件費に余剰が出た。初年度に計上していた研究補助者のための経費が、補助者の採用が遅れたことで次年度に繰り越されたため。2年目から研究補助者が着任したため、その人件費に充てる。前年度に引き続いて、研究補助者を雇用する経費に充当する。
尿路上皮がんにおけるＡＤＡＭＴＳ１遺伝子の解析および転移予測指標・治療標的の確立

当初の研究計画ではシスプラチン耐性株T24R-RC、UMUC3-RCおよびゲムシタビン耐性株T24R-RG、UMUC3-RGに対してADAMTS1遺伝子の発現を抑え、さらに毒性試験を行うことで薬剤感受性の再獲得を目指していた。現在の研究結果において薬剤抵抗性尿路上皮癌に対してADAMTS1遺伝子をターゲットとした分子標的薬の可能性がある。この結果については今までの報告はなく、予後不良な転移を有する尿路上皮癌の新たな治療標的になり得る可能性が見出された。さらにADMTS1遺伝子のDNAメチル化について検討を進めている。シスプラチン耐性株T24R-RC、UMUC3-RCおよびゲムシタビン耐性株T24R-RG、UMUC3-RGに対するADAMTS1遺伝子の発現の確認をしたのみならず、ADAMTS1遺伝子の発現を抑えることで細胞増殖能自体を抑制することを確認できた。当初の計画ではシスプラチン耐性株T24R-RC、UMUC3-RCおよびゲムシタビン耐性株T24R-RG、UMUC3-RGに対してADAMTS1遺伝子の発現を抑え、さらに毒性試験を行うことで薬剤感受性の再獲得を目指していた。この結果については今までの報告はなく、予後不良な転移を有する尿路上皮癌の新たな治療になり得る可能性が見出された。シスプラチンおよびゲムシタビンに長期に暴露されることにより、膀胱癌細胞株がADAMTS1を含めた多数の遺伝子の発現亢進・減弱に関与する因子としてエピジェネティックな変化が考えられる。確立したシスプラチン耐性株T24R-RC、UMUC3-RCおよびゲムシタビン耐性株T24R-RG、UMUC3-RGを用いてDNA Methylatipn Arrayを行い、薬剤耐性獲得前後でのDNAメチル化の変化を、ADAMTS1を含めて検討する予定である。その後シスプラチン耐性株T24R-RC、UMUC3-RCおよびゲムシタビン耐性株T24R-RG、UMUC3-RGに対して5-azacytidineによるゲノム網羅的な脱メチル化を行い、細胞増殖能およびADAMTS1遺伝子発現に関して検討する。さらに5-azacytidineによる脱メチル化を行ったシスプラチン耐性株T24R-RC、UMUC3-RCおよびゲムシタビン耐性株T24R-RG、UMUC3-RGに対するシスプラチン、ゲムシタビン毒性試験を施行し、脱メチル化によりシスプラチンおよびゲムシタビンに対する感受性が再獲得されるかを検討する。脱メチル化によりシスプラチンおよびゲムシタビンに対する感受性が再獲得された場合に、5-azacytidineによるゲノム網羅的な脱メチル化剤ではなく、ADAMTS1を中心とした遺伝子をターゲットとした脱メチル化剤を開発し、創薬製品化を目指す。
分子夾雑下での生命分子の直接修飾／機能解析を実現する有機化学

現在までに、申請者がこれまでの研究で見いだした特異的タンパク質修飾戦略に基づいて、分子夾雑環境で機能する新しい有機化学反応の探索を行い、その反応特性(反応速度論、官能基選択性)を明らかにした。リガンド指向性化学に関しては、新規に見いだしたN-acyl-N-alkyl sulfonamide (NASA)を反応基とするタンパク質化学修飾反応が、従来最速として報告されているbioorthogonal反応(Clickや逆電子要請型Diels Alder反応)に匹敵する反応速度定数とアミノ酸側鎖官能基選択性を示す事を見いだした。また、本反応が様々な内在性細胞内タンパク質や細胞膜受容体の特異的化学修飾反応に適用可能であることを明らかにした。さらに、リガンド指向性NASA化学の適用により、多くの癌細胞治療において標的となっている内存性HSP90の活性を効果的かつ不可逆的に阻害可能なコバレントインヒビターの設計を世界に先駆けて達成した。細胞内環境依存的ラベル化技術に関しては、オルガネラへの局在化モチーフと、生体分子と反応する反応基を連結した「オルガネラ局在型反応性分子(ORM)」を設計し、特に核、ミトコンドリア、小胞体という三つのオルガネラにORMを局在させ、各オルガネラに存在するタンパク質群をオルガネラ選択的に同時ラベル化し、プロテオミクスとイメージングによって解析する基本戦略を確立した。また、近年、生体内シグナル分子として注目される一酸化窒素に応答して活性化し、周辺のタンパク質と反応する「環境応答性反応分子」の開発に成功した。さらに、多成分複合型超分子自己集合体の利用により分子夾雑系を人工構築する方法論の開発を行った。具体的には、分子会合様式が異なるゲル化剤ペアが形成するダブルネットワーク型ヒドロゲルを用いて、レオロジー特性や内包物質放出速度の双方向制御等を実現した。平成30年度に計画していた研究目標を進展することができ、計画研究・方法が概ね順調に進行しているものと判断している。特に、細胞内や生体組織といった分子夾雑環境下に適用可能な新規リガンド指向性NASA化学反応や、細胞内小器官特異的なタンパク質動的変化を網羅的に追跡可能な細胞内環境依存的ラベル化技術を開発することができ、「分子夾雑の化学」という新しい学問分野の創造に有機化学から貢献しているものと自負している。また当初に設定した計画に、「多成分複合型超分子自己集合体の利用により、分子夾雑系を人工的にデザインし、その機能を独立に制御する方法論の開発」を新たに追加した。これから得られた知見は、分子夾雑環境の構成的理解につながるだけでなく、細胞内や生きた動物個体中のような分子夾雑環境下で使用可能な新規機能性ソフトマテリアルや診断材料へと波及するものと期待できる。これらの成果の多くが世界トップレベルの論文誌へ掲載され、プレスリリースもあることは、研究計画の達成度の高さを示唆している。しかしながら、リガンド指向性NASA化学のみでは、分子夾雑系における細胞解析に適用困難な場合も想定されるため、タンパク質表面での有機反応に適用可能な新反応系のさらなる探索を今後進める。また、細胞内オルガネラの機能と役割を分子レベルで理解するためには、タンパク質の動態解析のみでは不十分と予測されることから、これまでに開発した細胞内環境依存的ラベル化技術をさらに進展させることで、細胞オルガネラを構成する生体分子群(脂質等)の分子夾雑環境下での時空間依存的かつ網羅的解析を目指す。加えて、「環境応答性反応分子」によるプロテオミクスに関しては、鉄、銅といった金属イオンや過酸化水素等の活性酸素種応答への拡張を試みる。また、多成分夾雑システムの人工構築では、合成高分子やタンパク質・酵素の取り込みによる機能化へと進む。今回、我々が新規に見いだしたリガンド指向性NASA化学の分子夾雑環境下で適用可能な有機化学反応としてのさらなる最適化と拡張を目指す。これまでに開発した細胞内環境依存的ラベル化技術をさらに進展させることで、様々な細胞オルガネラ(ER,ミトコンドリア,核等)を構成する生体分子群(特にタンパク質や脂質)の分子夾雑環境下での網羅的解析を目指す。「環境応答性反応分子」によるプロテオミクスに関しては、鉄、銅といった金属イオンや過酸化水素等の活性酸素種応答によるプロテオミクスへの拡張を試みる。加えて、分子夾雑環境下で適用可能な有機化学のさらなる開拓を目指し、様々なヘテロ原子を含む求核置換反応、芳香族求電子置換反応、ラジカル反応や、遷移金属元素を用いた触媒系を活用した、タンパク質表面での修飾反応を検討する。さらに、特異的な共有結合ラベル化法と質量分析技術を組み合わせて、薬剤標的タンパク質の同定技術も開発する。最終的には、これまでの知見をまとめて統合化し、生細胞内分子夾雑の有機化学に関する重要な要素や分子設計指針を確立する。具体的には、これまでに得られた知見に基づくラベル化剤分子設計やラベル化条件の最適化によって、実用的レベルで高効率かつ確度の高いタンパク質ラベル化技術を確立し、内在性タンパク質の生細胞内その場解析を実現する。さらに、細胞内環境依存的ラベル化技術や環境応答性反応分子を用いて病態モデル細胞と正常細胞間でのオルガネラ構成成分や細胞内環境の差異を定量化し、これらの状態異常が引き起こす疾患の分子メカニズムを明らかにする。また、細胞内や生きた動物個体内における多成分頬雑システムの人工構築と機能発現を試み、新規生体適合性ソフトマテリアルや薬剤放出システムとしての応用を目指す。

これまでに我々は、幾つかのリガンド指向性化学やアフィニティ駆動型触媒化学など、分子夾雑系でも有効な有機化学的方法論を開発してきたが、反応効率や選択性に今なお問題があり、細胞機能解析への適用は数例に限られている。そこで初年度では、ヘテロ原子を含む求核置換反応、芳香族求電子置換反応など、タンパク質表面での新反応開発を行った。FKBP12やeDHFRなどのモデルタンパク質を用いて、精製した試験管内実験系によって反応効率、速度定数、アミノ酸選択性を定量的に求めた。それを基盤に分子構造最適化のための知見を収集した。続いて生細胞でのラベル化実験について検討した。細胞夾雑系での実験では、ラベル化後に細胞を破砕したウェスタンブロッティングや生細胞そのままを使った蛍光イメージングなどを駆使し、標的タンパク質に対する選択性や反応効率について検証を行った。その結果、これまでのリガンド指向性化学よりも有望なラベル化反応を発見する手掛かりとなる結果を得た。また、細胞オルガネラを構成する生体分子群(タンパク質、脂質、糖、小分子など)を網羅的に解析する戦略として、標的オルガネラに自発的に局在・濃縮しその場で反応する標識試薬の検討を行った。具体的には、オルガネラへの局在化モチーフと、反応基を連結したオルガネラ局在型反応性分子(ORM)を設計し合成した。幅広い化学標識を実現するために、新規反応基も含めた様々な反応性官能基を有するORMのライブラリーを構築した。培養細胞を用いて、核、ミトコンドリア、小胞体(ER)を標的としたORMのオルガネラ局在能、修飾率、細胞内安定性等を評価し、優れた分子の選別を行った。特にER局在を示すORMは、これまでにない新規なものであり、ER-ORM試薬によって局在タンパク質を化学修飾し、CIBICに配置された顕微鏡や質量分析計を駆使してその網羅的解析を行った。上記の実績概要で述べたように、基軸となる二つの研究テーマは初年度計画した成果がほぼ得られており、順調に推移していると判断できる。特にリガンド指向性化学に関する定量的な評価にほぼ目処が立ったことは、特筆すべきことであり、これによって既存のbioorthogonal chemistryの反応との比較が行える可能性が出てきた。また、本計画には大きくは含まれていなかったが、分子夾雑システムを人工的に構築する方法論として、非共有結合的な相互作用を主な駆動力とする自己組織化分子(超分子)を用いたself-sorting繊維の複合化、多成分化に成功し、これが刺激に応じて双方向に力学特性を変化させる新しいソフトマテリアルとなることも明らかにした。これは分子夾雑というコンセプトが、材料設計にも大きな指針を与えることを示すものであり、当初予定していなかった想定外のものとして、本領域にとっても有益な知見を与えると考えている。現在までに、申請者がこれまでの研究で見いだした特異的タンパク質修飾戦略に基づいて、分子夾雑環境で機能する新しい有機化学反応の探索を行い、その反応特性(反応速度論、官能基選択性)を明らかにした。リガンド指向性化学に関しては、新規に見いだしたN-
メタンハイドレート分解時の地盤変形シミュレーションと分解圧密試験によるその検証

平成19年度は,構成式中でMH飽和率依存性を考慮し、また透水係数・透気係数にMH飽和率依存性を取り入れ、開発した分解変形解析手法を拡張した。研究代表者は既に,不飽和土の多相連成解析手法をもとに,平均間隙圧力を用いた有効骨格応力を定義し,不飽和土の構成則中の応力変数とする方法を提案しており,本研究でもこれを拡張した.ハイドレートの地盤中での存在形態については,現在のところ,ハイドレート粒子が土粒子間隙中に浮遊して存在する"間隙浮遊型",あるいはハイドレートが土粒子間を固着しセメンテーションの役割を果たす"土粒子固着型"のいずれか,またはこれらが混在した状態であるとされている.いずれの場合にも,MH含有地盤の力学挙動はハイドレート含有率に大きく依存すると考えられる.そこで方法を参考にし,降伏曲面の移動・縮小によって,ハイドレート分解に伴う粘着力の減少および構造劣化をモデル化する方法を用いた.提案した構成式中の材料定数については基礎試錘で採取された天然コアによる力学試験結果をシミュレーションすることにより決定した.上述の解析手法を用いて海底面から南海トラフにおけるMH含有層までをモデル化した大規模モデルの解析を行い、加熱法・減圧法それぞれについて分解時の間隙圧力変化、地盤変形、温度変化等を予測した。特に透水係数にMH飽和率依存性を考慮することによる影響、境界条件の影響について検討を行った。平成18年度は,構成則におけるMH飽和率依存性のモデル化を行った.研究代表者は既に,不飽和土の多相連成解析手法をもとに,平均間隙圧力を用いた有効骨格応力を定義し,不飽和土の構成則中の応力変数とする方法を提案しており,本研究でもこれを用いた.ハイドレートの地盤中での存在形態については,現在のところ,ハイドレート粒子が土粒子間隙中に浮遊して存在する"間隙浮遊型",あるいはハイドレートが土粒子間を固着しセメンテーションの役割を果たす"土粒子固着型"のいずれか,またはこれらが混在した状態であるとされている.いずれの場合にも,MH含有地盤の力学挙動はハイドレート含有率に大きく依存すると考えられる.そこで方法を参考にし,降伏曲面の移動・縮小によって,ハイドレート分解に伴う粘着力の減少および構造劣化をモデル化する方法を用いた.提案した構成式を用いて,模擬MH含有試料を用いた実験結果をシミュレーションし,改良および検証を行う.また,基礎試錘で採取された天然コアによる力学試験結果と併せて,構成則および必要となる材料パラメータについて分析した.また、上述の構成モデルを検証するため,MH含有地盤材料の強度特性,特にMH飽和度が強度変形特性に及ぼす影響を調べた.試料は間隙浮遊型,土粒子固着型のそれぞれを模擬したハイドレート含有地盤材料を使用する.南海トラフでの開発対象地盤は砂質土と粘性土の互層からなることから,それぞれの地盤材料の模擬試料を用いて試験を行った.ハイドレート飽和率を20%60%に変化させた種々の試料を用いて,強度,変形特性を比較し,力学特性におけるMH飽和率依存性を調べた.また,軸ひずみ速度を0.005%/min,0.05%/min,0.5%/minに変化させ,ひずみ速度依存性を調べるとともに,弾粘塑性構成式中の粘塑性パラメータを決定した.地盤材料,MH粒子の存在形態,MH飽和率による挙動特性の違いを詳細に検討し,構成モデルの検証および各材料パラメータの決定を行った.平成19年度は,構成式中でMH飽和率依存性を考慮し、また透水係数・透気係数にMH飽和率依存性を取り入れ、開発した分解変形解析手法を拡張した。
弱い垂直衝撃波に一様等方性乱流が及ぼす影響の定量評価

弱い垂直衝撃波に一様等方性乱流が及ぼす影響の評価に関して,本年度は(1)弱い垂直衝撃波の生成手法の開発,および(2)弱い垂直衝撃波面が一様等方性乱流(格子乱流)との干渉によって受ける影響の評価に取り組んだ.(1)衝撃波過剰圧力の急峻な立ち上りを残したまま一様な背後過剰圧力場のみを低減するため,金属製の多孔平板を積層させた衝撃波減衰装置を開発した.衝撃波管内にこの衝撃波減衰装置を挿入し,その減衰特性を評価したところ,垂直衝撃波の鋭い立ち上がりと一様な背後静圧という特性をそのままに,衝撃波過剰圧のみを減少させた垂直衝撃波を形成することに成功した.また,衝撃波過剰圧の減衰率は入射衝撃波マッハ数や多孔平板の空隙率および枚数に依存することが明らかになった.本手法を用いることで,従来では実現困難であった衝撃波マッハ数1.01程度の非常に弱い垂直衝撃波を衝撃波管内に生成することが可能となり,衝撃波研究における実験領域が大幅に拡張された.(2)衝撃波と乱流の条件を独立に設定可能な対向衝撃波管を用いて,垂直衝撃波-格子乱流干渉実験を,乱流に対する衝撃波の相対的な強度および干渉距離(観測時点での乱流の先頭と衝撃波面の距離)を変化させて行った.必要であれば(1)で開発した衝撃波減衰機構を用い,最小で衝撃波マッハ数1.01の垂直衝撃波を実験に利用した.乱流に対して相対的に弱い垂直衝撃波が格子乱流と干渉した場合には,シャドウグラフ可視化画像上での衝撃波面の実効厚みが干渉距離とともに増大した.これは,乱流中の局所的な速度変動が変垂直衝撃波面に凹凸を生じためであると考えられる.一方で,衝撃波が相対的に強い場合には,衝撃波面の変調は軽微であり,乱流が衝撃波に与える影響は衝撃波の相対的な強さに依存することも明らかとなった.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
ミトコンドリアcyclophilin Dをターゲットとした尿路結石予防法の開発

私たちは結石モデル動物を用いて、尿路結石形成の過程において腎尿細管細胞内のミトコンドリア傷害が重要な因子であると証明した。ミトコンドリア傷害は細胞が酸化ストレスなどの外的刺激を受けた際にミトコンドリア内のcyclophilin D (CypD)が活性化されることによって起こる。またミトコンドリア傷害を受けた細胞は細胞死を起こし、最終的に尿路結石形成へと至る。そこでCypDの活性化を抑制するcyclosporineA (CsA)をモデル動物に投与しミトコンドリア傷害や尿路結石形成に関する評価を行った。本研究では結石モデルラットを用いた。ラットをエチレングリコール(EG)自由飲水群とEG自由飲水+CsA胃管投与群の2群に分けて評価した。2群間において尿路結石形成量に明らかかつ統計学的に優位な差を認めた(0.99% vs 0.09%)。EG自由飲水群では腎臓に多数の尿路結石形成を認めたが、CsAを投与することによってその形成量は約10分の1にまで抑制された。また2群間の比較において、CsA投与群は酸化ストレスの発生やミトコンドリア傷害も抑制されていた。つまりモデルラットにおいて、CsAを投与されることによりCypDの活性化が抑制され、その結果、腎尿細管細胞内の酸化ストレス発生も抑制され、最終的には細胞死と尿路結石形成も抑制されることが示された。本研究は実験動物におけるものであるが、実験結果からCypDの活性化を抑制する薬剤は将来的に人の尿路結石を予防できる可能性があることが示されたと考える。本研究では、(a) CypD活性化阻害薬による結石形成抑制効果、(b)ヒト検体におけるCypDと結石形成の関連性、(c) CypDをバイオマーカーとした結石予防法の有効性の3つの事案の検討を計画していた。現在のところは動物実験にて(a)が示されたと考えている。モデル動物としてはある程度確立された実験系であると考えるが、EGやCsAの至適投与量決定のためのプレリミナル実験に手間取ったこともあり、進捗はやや遅れている。(b)ヒト検体におけるCypDと結石形成の関連性に関しては健常者と結石患者の尿中CypD排泄量をELISA法にて測定し、CypD排泄量と尿路結石の有無、結石成分、再発率との関連を検討する予定である。これによりCypDがヒトにおいて尿路結石形成時のバイオマーカーとなりうるかを明らかにしたいと思う。(c) CypDをバイオマーカーとした結石予防法の有効性に関しては、飲水、食事指導、CypD活性化阻害薬といったヒトにおける結石予防法の有効性をバイオマーカーとして期待されるCypD排泄量の測定により定量的に検証したいと考えている。

(c) CypDをバイオマーカーとした結石予防法の有効性に関しては、飲水、食事指導、CypD活性化阻害薬といったヒトにおける結石予防法の有効性をバイオマーカーとして期待されるCypD排泄量の測定により定量的に検証したいと考えている。
トラフグのポストゲノム解析に関する基礎研究

1.成魚および稚魚トラフグの15組織から24,398ESTの塩基配列を解析し、ゲノムデータに10,116ESTをアノテーションした。ゼブラフィッシュとの比較から魚類に共通した遺伝子と種特異的遺伝子の存在が明らかになった。2.筋特異的遺伝子のミオシン重鎖遺伝子(MYH)、トロポミオシン遺伝子(TPM)、さらには筋分化制御因子MyoDファミリーの遺伝子MyoDおよびmyogeninなどのin silicoおよびin vivo解析を行った。その結果、MyoDファミリーは哺乳類とほぼ同数であったが、MYHおよびTPMについてはトラフグの方がより多く存在した。これは魚類におけるゲノム倍化現象に関連すると思われた。3.トラフグには少なくとも13速筋型、5心筋型、2遅筋型、1 superfast型、2平滑筋型および5非筋型の合計28種類のMYHが存在し、ヒトよりも多かった。4.哺乳類では6種類の速筋型MYHが1箇所でクラスターを形成しているのに対し、トラフグではMYHは5箇所に分散し、うち3箇所でクラスターを形成していた。クラスターを形成していない2箇所が哺乳類のMYH領域に対応していることから、硬骨魚類と哺乳類のMYHクラスターは両者の共通祖先が分岐した後、独自の進化を遂げたことが示唆された。5.トラフグ体表粘液のパフレクチンで凝集される菌は体表に付着しにくいことを見出した。6.粘液中に免疫グロブリンを運搬する分子としてpIgRの構造を解明し、哺乳類と異なり、消化管など内側の表面だけでなく体表でも発現していること、同分子が確かに免疫グロブリンと結合していることを明らかにした。7.抗原提示細胞のマーカー分子として知られるCD11c、CD40、MHC class IIα鎖に加え、共刺激分子B7ファミリーであるB7-H1、B7-H3、B7-H4の3つの遺伝子を魚類で初めて見出した。1.トラフグの人工授精を行い、胚発生段階の試料を経時的に採取した。これら試料全体からfirst strand cDNAを合成するとともに、in situ hybridization用の試料を作製した。2.他生物種で報告されている塩基配列およびアミノ酸配列を利用して、トラフグゲノムデータベースを用いて筋特異的遺伝子であるミオシン重鎖、トロポミオシン遺伝子および筋分化制御因子であるMyoDファミリー遺伝子群の遺伝子領域の推定を行った。MyoDファミリー遺伝子群は哺乳類と同数であったが、ミオシン重鎖およびトロポミオシン遺伝子についてはトラフグのほうがより多くの遺伝子を有していることがわかった。これは魚類におけるゲノム倍化現象によるものと思われた。3.ミオシン重鎖、トロポミオシン遺伝子およびMyoDファミリー遺伝子群につきアミノ酸配列を演繹し、GENSCANおよびSpideyを利用してエキソン・イントロン構造を予測し、第1エキソン上流の5'側の領域を転写調節領域と推定した。4.予測された遺伝子の塩基配列をもとにプライマーを作製し、first strand cDNAおよびゲノムDNAをテンプレートにしたPCRを行い、塩基配列およびスプライシングサイトの確認を行った。5.first strand cDNAを用いたPCRにより発現が確認された遺伝子につき、ヒト、マウスなどの哺乳類、さらにはゼブラフィッシュやミドリフグと、トラフグの当該遺伝子の推定転写調節領域をPipMakerを利用して比較し、両者で保存されている領域を抽出した。6.トラフグのIgM、IgDの他、サイトカインとしてIL-8、IL-12、細胞マーカーとしてT細胞のCD3〓、ヘルパーT細胞のCD4、細胞障害性T細胞のCD

8βの構造を決定したことにより、トラフグ生態防御機構に関する研究の基礎知見が得られた。1.ミオシン重鎖遺伝子(MYH)の解析を行った。In silicoクローニングされたトラフグMYHは16速筋型、9心筋型、5遅筋/superfast型、11平滑筋/非筋細胞型の合計41遺伝子であった。2.筋分化制御因子のコード遺伝子MyoDおよびmyogeninとともに、上記遺伝子の一部を対象にwhole-mount in situ hybridizationによる発現部位の解析を行った。その結果、受精後72および96時間のトラフグ胚体の筋節において、MyoDの発現に続き、myogeninが発現することが示された。さらに、これら筋分化制御因子の発現に誘導され、トラフグ胚体の筋節で速筋型および遅筋型MYHの発現が確認された。また、平滑筋/非筋細胞型MYHは胚全体に発現がみられた。3.トラフグゲノムのBACエンドシークエンス、cosmidエンドシークエンスおよびランドマークBACシークエンスのデータを活用し、トラフグ速筋タイプMYHを含むmayffold同士の位置関係を詳細に解析した。その結果、トラフグではヒト速筋型MYHクラスターに対応する遺伝子座が2種類あることが見出された。4.成魚および稚魚トラフグの15組織から24,398ESTの塩基配列を解析し、トラフグ・ゲノムデータに10,116ESTをアノテーションした。ゼブラフィッシユESTとの比較から魚類に共通した遺伝子と種特異的遺伝子の存在が明らかになった。5.トラフグの温度適応機構を明らかにするために魚類で見つかった高温馴化特異的タンパク質Wap65の構造および遺伝子発現パターンをメダカで調べた。その結果、Wap65には2つのアイソフォームがあり、その中の1つはヘム結合能を有することを示した。6.トラフグ皮膚の粘液から新規レクチンをクローニングするとともに精製を行い、本レクチンが植物由来のものに良く似ることを明らかにした。1.既存のトラフグゲノムデータベース、BACおよびコスミド末端・内部配列データベースを使用し、トラフグミオシン重鎖遺伝子クラスターの物理マップを作成した。この際、公開されているミドリフグおよびゼブラフィッシュのゲノム配列を利用し、トラフグで不足しているゲノム配列データを補完した。その結果、トラフグ速筋型ミオシン重鎖遺伝子は5つの領域に存在し、そのうち3領域でクラスターを形成していた。しかしながら、魚類で得られたミオシン重鎖遺伝子クラスターは、哺乳類のクラスターとは進化的に異なる祖先遺伝子から形成されたことが示唆された。2.トラフグの温度適応機構を明らかにするため、淡水魚でみつかった高温馴化特異的タンパク質Wap65のcDNAクローニングを行った。その結果、以前メダカで得られた2種類のアイソフォームがトラフグにおいても存在することが明らかとなった。3.QTL解析により遺伝的に優良な品種を確立することを目的として、マイクロサテライトマーカーを用いてトラフグ連鎖地図を作成した。
抗HIV薬ドルテグラビルのTDM実臨床応用に向けた薬物動態解析

本研究では、抗HIV薬のTherapeutic Drug Monitoring (TDM)実臨床応用に向けた基礎的情報蓄積を目指し、インテグラーゼ阻害薬ドルテグラビルの薬物動態制御因子の同定を試みた。その結果、ドルテグラビルは薬物排出トランスポータであるBCRPの基質となることを明らかにした。以上より、ドルテグラビルの薬物動態制御因子の一つとしてBCRPが関与していることが示唆され、将来的にヒト血液を用いた臨床研究への展開に向けて有用な基礎的知見を得た。HIV感染患者において抗HIV薬は一生飲み続けなければならない薬剤である。しかし、副作用の発現などにより、服薬アドヒアランス(患者が主体的に治療に取り組み、薬を服用すること)が低下し、適切な血中濃度が維持できなくなり、HIVに耐性が獲得され、治療継続が困難となる例も多い。よって、服薬アドヒアランスの確認および適切な血中濃度維持のため、抗HIV薬のTDM(Therapeutic Drug Monitoring)を確立することは重要である。本研究では、服用患者数の多いドルテグラビルを対象薬とし、実臨床での血中濃度モニタリングによるTDMの確立に向けて、ドルテグラビルの薬物動態学的特徴を明らかにすることを目的とする。初年度は、LC/MS/MSを用いたドルテグラビル血中濃度測定系の確立およびドルテグラビル服用患者の臨床情報の収集を行い、以下の成果を得た。ドルテグラビルの細胞内濃度や血中濃度を測定するため、LC/MS/MSにおけるドルテグラビル測定系を構築した。ヒト血清中にドルテグラビルを種々濃度で添加したスパイク検体を繰り返し測定することによって本測定系の真度、精度などを確認し、定量性を評価した。京都大学医学部附属病院に通院中で、ドルテグラビルを服用している患者カルテより、年齢、性別、ドルテグラビル服用量、併用薬、有害事象、腎機能や肝機能に関する検査値等、基本的な情報を収集した。今後、培養細胞系を用いた輸送実験、ヒト血液を用いた臨床研究や薬効との相関研究を行うにあたり、有用な基礎的情報となるものと考える。初年度の目標は、ドルテグラビルの体内動態制御因子を特定し、基礎的情報を収集することであった。LC/MS/MSを用いたドルテグラビル血中濃度測定系を確立することが出来たが、測定系の確立までに予想以上の時間がかかったこと、および次の段階である細胞実験を行うに当たり環境整備に時間を要していることなどから、予定より遅れが生じている。また、患者検体を用いる臨床試験の実施計画書は、京都大学大学院医学研究科・医学部及び医学部附属病院医の倫理委員会に提出準備中である。本研究では、服用患者数の多いドルテグラビルを対象薬とし、実臨床での血中濃度モニタリングによるTDMの確立に向けて、ドルテグラビルの薬物動態学的特徴を明らかにすることを目的とし、以下の研究成果を得た。平成28年度は、ドルテグラビルの細胞内濃度や血中濃度を測定するため、LC/MS/MSにおけるドルテグラビル測定系を構築した。平成29年度は、ヒト胎児腎由来HEK293細胞に薬剤排出トランスポータであるBCRPを過剰発現させた系を用いてドルテグラビルの排出実験を行い、ドルテグラビルがBCRPの基質となることを明らかにした。さらにBCRPの主な遺伝子多型であるABCG2 421C>AをHEK293細胞に発現させ、輸送実験を行うことで、BCRPを介したドルテグラビル輸送への遺伝子多型の影響を観察することを計画している。本研究成果は、将来的にヒト血液を用いた臨床研究や薬効との相関研究を行うにあたり、有用な基礎的情報となるものと考える。トランスポータ発現細胞を用いた輸送実験に早期に着手し、ドルテグラビルの体内動態に関与するトランスポータを同定する。同時並行でドルテグラビル使用患者の血液検体を用いる臨床試験の実施計画書を、京都大学大学院医学研究科・医学部及び医学部附属病院医の倫理委員会に提出し、承認を得た上で臨床研究に着手する。医療薬剤学本年度着手予定であった細胞を用いた実験などにかかる経費を次年度に繰り越したため。
優れたファウリング耐性を有する高機能性ナノシート積層膜の開発

これまでの検討により,ニオブ酸化物ナノシート(NbO)膜が比較的高い膜性能を有し,ファウリング耐性を有することを明らかとした.一方ファウリング耐性の向上を狙いとして,助触媒として期待される酸化グラフェン(GO)との複合膜の作製を検討したところ,透水性能が飛躍的に向上することもわかっている.このように新規ナノシート種の利用は膜性能のさらなる向上に向けて重要である.本年度の研究では,GOナノシートを利用した新規積層膜を作製し,膜性能や構造安定性について複合膜と比較検討を行った.1.架橋剤にNbO膜で利用されていたトリエタノールアミン(TEOA)を用い,吸引ろ過法によりニトロセルロース支持膜上にGO膜を作製した.湿潤状態においてX線回折による積層構造を評価したところ, TEOAが無い場合は膨潤による層間距離の拡大もしくは積層構造の乱れが示唆された.これに対して,TEOAを利用した場合はやや膨潤が起こるものの積層構造が確認でき,構造安定性が向上することがわかった.2.TEOA/GO比が膜性能に与える影響について検討した.TEOA添加によって透水性は減少するもの,塩阻止性は向上した.層間におけるサイズ排除,またGO膜の負電荷による静電反発の影響であると考えられる.また膜間差圧の影響について評価したところ,TEOAの無いGO膜の場合は圧力の増加と共に透水性および塩阻止率は共に低下した.一方GO-TEOA膜は高圧下においても安定な透水性を示し高い阻止性を示した。TEOA架橋によってGO膜の構造安定性が向上し,そのため高い塩阻止性が保持されたと考えられる.これらの結果から,NbOとGOの複合膜においてもTEOAによる架橋効果が作用し,構造安定性や阻止性の向上に寄与したと考えられる.アモルファスシリカやチタニア膜,また精密な細孔構造を有するゼオライト膜などに代表される多孔性無機膜は,一般に耐熱性や耐薬品性,機械的強度に優れており,逆浸透法による脱塩や浸透気化法による有機水溶液の脱水など水処理に向けた様々な研究が精力的に進められている.本研究では,高い透水性能と分離性能,さらに優れたファウリング耐性を併せ持つ機能性無機膜の開発を目指し,二次元ナノシートを利用したナノシート積層膜の開発を行う.本年度の研究では,高分子多孔膜上へのニオブ酸ナノシート積層膜の作製と透水性能の評価を行った.1.簡易な吸引ろ過法を利用し,高分子支持膜上に数十nmの膜厚さを有するナノシート積層膜を作製した.支持膜の表面処理,またナノシート間における有機バインダーの効果により,水中において高い安定性を有する積層膜の作製に成功した.2.クロスフロー型透水試験装置により,膜性能の評価を行った.透水性能や分離性能は,積層膜の膜厚さや吸引ろ過操作の減圧乾燥時間によって大きく変化した.ポリエチレングリコールを利用した阻止性評価により,分画分子量4.3kDaの分離性能を有することがわかった.また各種アニオン性有機色素では90%以上,Na2SO4で約80%の高い阻止率を示し,ナノろ過膜として機能することがわかった.3.得られた透水性能や分離性能は同様な方法で作製した酸化グラフェン積層膜よりも高いことがわかった.ニオブ酸ナノシートは負に帯電した二次元結晶構造を有しているため,膜荷電と各アニオン種間の静電相互作用により高い阻止率が得られたと考えられる.また構造評価の結果より,従来とは異なる透水メカニズムが考えられ,それにより高い透水性能が得られたものと考えられる.以上より,簡易な吸引ろ過法により作製したニオブ酸ナノシート積層膜は,水中で安定かつ高い膜性能を有することが確認できた.本年度は多孔質膜上にナノオーダーの膜厚さを有するナノシート積層膜の作製と透水性能の評価を行った.簡便な吸引ろ過法を利用し,様々な支持膜の検討,膜厚さの制御を行った.ナノシート間の相互作用を強めることによって,水中での高い構造安定性が得られ,また透水試験において高い透水性能と優れた溶質の分離性能が得られた.これら膜性能については,ナノシート積層膜として近年注目されている酸化グラフェン膜よりも高いことがわかった.このように当初の目的は十分達成されており,また分離性能の評価など2年目の実施計画も一部すでに進められていることから,おおむね順調に進展していると判断できる.本研究では,高い透水性能と分離性能,さらに優れたファウリング耐性を併せ持つ機能性無機膜の開発を目指し,ナノシート積層膜の開発を行う.本年度の研究では,積層構造の制御と膜性能に及ぼす影響およびファウリング耐性について評価を行った.1.これまで水熱合成法(ボトムアップ法)により得られたナノシートを利用していたのに対し,従来法である剥離法(トップダウン法)を利用し,層間に異なる分子サイズのカチオンを導入した積層膜を作製した.この場合,層間隔が増大することによってNaClやNa2SO4の阻止率はやや減少したが,分子量600以上のアニオン性色素では90%程度の高い阻止率を保持し,透水性は2倍程度向上することがわかった.2.NbO積層膜の更なる性能向上を目指し,酸化グラフェン(GO)との複合膜を作製した.ニオブ酸ナノシート積層膜にGOを複合することにより透水性が向上し,NbO55/GO45は元のNbO膜より7倍高い透水性能を示した.

分離性能に関しては,Acid red265(分子量635.6)においてはいずれの膜も95%以上の阻止率を示した.また興味深いことに,Na2SO4ではGO比が45%までは透水性と共に阻止率が向上する傾向が得られた.細孔径の増加に伴い透水性が向上し,またGOナノシートの複合化により膜荷電とアニオン種間の静電反発(Donnan排除)の効果が高められ,阻止率が向上したと考えられる.3.ファウリング物質を利用した膜性能変化について,市販NF膜と比較したところ,NbO膜の方が透水性能の変化がやや抑制され,安定な高い透水性が得られた.NbO膜の光照射前後における透水性能を評価したところ,暗室下ではファウリングによりやや減少するものの,光照射後はその透水性が回復する傾向が得られている.ファウリング耐性の詳細な検討については,次年度においても引き続き行う予定である.本年度はナノシート積層膜の積層構造の制御と膜性能に及ぼす影響およびファウリング耐性について評価を行った.異なるサイズのカチオンやGOの導入により,細孔径を制御し,膜性能の向上が確認できた.またファウリング耐性の基礎的な知見が得られた.このように当初の計画は予定通り遂行されており,また積層構造の制御など3年目の実施計画も一部すでに進められていることから,おおむね順調に進展していると判断できる.これまでの検討により,ニオブ酸化物ナノシート(NbO)膜が比較的高い膜性能を有し,ファウリング耐性を有することを明らかとした.一方ファウリング耐性の向上を狙いとして,助触媒として期待される酸化グラフェン(GO)との複合膜の作製を検討したところ,透水性能が飛躍的に向上することもわかっている.このように新規ナノシート種の利用は膜性能のさらなる向上に向けて重要である.本年度の研究では,GOナノシートを利用した新規積層膜を作製し,膜性能や構造安定性について複合膜と比較検討を行った.1.架橋剤にNbO膜で利用されていたトリエタノールアミン(TEOA)を用い,吸引ろ過法によりニトロセルロース支持膜上にGO膜を作製した.湿潤状態においてX線回折による積層構造を評価したところ, TEOAが無い場合は膨潤による層間距離の拡大もしくは積層構造の乱れが示唆された.これに対して,TEOAを利用した場合はやや膨潤が起こるものの積層構造が確認でき,構造安定性が向上することがわかった.2.TEOA/GO比が膜性能に与える影響について検討した.TEOA添加によって透水性は減少するもの,塩阻止性は向上した.層間におけるサイズ排除,またGO膜の負電荷による静電反発の影響であると考えられる.また膜間差圧の影響について評価したところ,TEOAの無いGO膜の場合は圧力の増加と共に透水性および塩阻止率は共に低下した.一方GO-TEOA膜は高圧下においても安定な透水性を示し高い阻止性を示した。TEOA架橋によってGO膜の構造安定性が向上し,そのため高い塩阻止性が保持されたと考えられる.これらの結果から,NbOとGOの複合膜においてもTEOAによる架橋効果が作用し,構造安定性や阻止性の向上に寄与したと考えられる.本研究では簡易な吸引ろ過法により,これまでほとんど報告例のないニオブ酸ナノシート積層膜の作製に成功した.しかしながら,現状のナノシート積層膜には,さらなる透水性の向上,また新たな種類のナノシート積層膜の検討が求められている.
確率微分方程式を用いた地下水中のラドン濃度の時系列データ解析

測定装置内の物理現象を表現する確率微分方程式を、状態空間表示することで連続型カルマンフィルタのアルゴリズムを適用した。もともとの確率微分方程式は線形であるが、その係数が温度の非線形関数となっているため、そのままの形で解くことができない。本研究では、非常に短い時間間隔(微小時間幅)内は温度は一定という仮定を行い、解くべき方程式を完全に線形にする工夫を行った。本研究では微小時間を1分とした。ただ水温は1時間毎しか計測されないので、水温データ内挿の処理が必要になった。もともと測定装置の周りの気温は制御されているため1時間内で大きい変化が生じることはなく、この内挿処理は現実離れしたものではない。これらの仮定のもとにプログラムを開発し、ワークステーションに実装する作業を次に行った。始めは、以前獲得された典型的な地震活動前後の気層中ラドン濃度から類推された地下水中のラドン濃度のパターンを入力とした、シミュレーション観測データ(つまり気層中ラドン濃度データ)を作製し、それに本研究で開発したソフトウェアを適用してみた。気層中ラドン濃度から、逆に推定された地下水中ラドン濃度が、入力データとどの程度一致するのかを検討した。得られた結果はきわめて満足のいくものであり、本研究で開発したシステムが有効であることが確認できた。この後、実際の観測データを開発したソフトウェアで解析した。推定されたラドン濃度は、地震後はっきりとした減少をしていることがあらためて確認できた。これとともに、本研究で開発したシステムは、計測装置内の物理現象を直接確率微分方程式で表現しているため、正確に値が同定されていない物理定数の値を、データの尤度を最大にする手続きで初めて明らかにできた。地震と関係の無い変動は、ほぼ観測ノイズによることも初めて明らかとなった。
単為発生卵を支持細胞とする牛核移植胚の作出に関する研究

屠場由来牛卵巣を実験室まで運び、採取した卵母細胞を5%牛血清+0.01mgFSHを含むTCM-199培地内に移し、38.5°C、5%CO_2気相条件下で3032時間培養したのち、同液内で7%エタノールで10分間感作させ、第2極体の放出を阻止するためサイトカラシンD液内で5時間培養して2nの単為生殖卵を作出して実験に供した。授精卵は同様に屠場由来牛卵母細胞を5%牛血清+0.01mgFSHを含むTCM-199培地内に移し、38.5°C、5%CO_2気相条件下で2024時間成熟培養したのち、体外受精して216細胞期に発生したものを用いた。単為生殖卵と受精卵との集合は次の要領で行った。(1)受精16細胞期の2ブラストメア-を4細胞期の単為生殖卵と集合(2)受精16細胞期の4ブラストメア-を4細胞期の単為生殖卵と集合(3)受精8細胞期の4ブラストメア-を単為生殖8細胞期の4ブラストメア-と集合(4)受精8細胞期の8ブラストメア-を単為生殖8細胞期の8ブラストメア-と集合これらの集合した卵を5%牛血清+5μg.m^<-1>インスリン+50μg.m^<-1>ゲンタマイシンを含むTCM-199培地に移し、38.5°C、5%CO_2気相条件下で8日間培養した。これらの実験の結果、受精卵と単為生殖卵の全卵同士を集合したものでは2/16、4/16受精卵を4/4単為生殖卵、4/8受精卵を4/8単為生殖卵とを集合したものに比べて桑実胚や胚盤胞胚への発生率が有意(P<0.05)に高かった。また(2)で集合した胚を移植した1頭の受卵牛からXYの染色体を持つ1卵性双子、(4)で集合した胚を移植した受卵牛からはXXXYの染色体を持つキメラ牛が得られた。本研究では、黒毛和種牛から得られた卵母細胞を同種精液で体外受精し、その24時間後に褐毛和種牛から得られた卵母細胞を成熟させ、エタノール処置により単為発生させた。体外受精後48時間目に発生した16細胞の割球の一個または2個をマイクロマニュピレーションにより、24時間遅れで単為発生した4細胞期の支持細胞と集合した。その後、これらの集合胚を卵丘細胞でシートされたTCM-199培地内で9日間体外培養した。細胞集合後6日目に発生の早い胚は胞胚腔を形成し透明帯からの脱出がみられた。これらの集合胚のうち、割球の1個または2個集合別では、移植可能胚が前者で29.6%,後者で40.7%となり、2個を集合した例で有意に高かった。また、胚別の集合構築胚得数は3個から7個までの範囲であり、得られた移植可能胚の数は、5個が1例、4個が2例、3個が3例、2個が3例、1個が3例、0個が4例の順であった。

これらの成績から、本法では同一遺伝子を持つクローニング胚の作出の可能性が示唆されが、5個以上の移植可能胚の作出は困難であった。これらの作出された胚盤胞胚が実際に受精胚由来のものか否かを確認するため現在カリオタイピングによる確認を行っている。本研究の基礎として単為生殖卵そのものの受胎性を検討した実験では、単為生殖後48時間目に2個の8細胞期胚を集合して8日間体外培養してコルセミドで染色体を分析したところ4N(XXXX)となり、単為生殖胚の大きさも2倍化した。これらの胚を受胚牛に移植したところ5頭中3頭が妊娠した。しかし妊娠67日までに胎子は子宮へ吸収され消失した。これらの結果を踏まえて次の実験を試みた。16細胞期の受精胚2細胞を4細胞期の単為生殖胚にインジェクションして集合した実験では30個中9個(30%)が胚盤胞胚となった。8細胞期の単為生卵と受精胚をスプリッテングして、それぞれ4細胞ずつを集合したとき胚盤胞胚は36個中16個(44%)が胚盤胞となった。また8細胞期の単為生殖卵と受精胚とを集合した実験では37個中24個(65%)が胚盤胞胚となり、集合細胞数の増加に伴い胚盤胞への発生率が増加した。受精胚(黒毛和種)の8細胞期からのブラストメア-の2個ずつを単為生殖卵(褐毛和種)の4細胞期と集合して胚盤胞胚を作り出し、その2個を受胚牛に移植した実験で形態的に同一の雄の1卵性双子が得られた。分娩産子の染色体を分析したところ、いずれもXYとXXの両染色体を持ちキメラ化していた。これは単為生殖卵が支持細胞としてだけではなく、胎子体形成にも関与していることを示唆しており、大変興味深い結果が得られた。屠場由来牛卵巣を実験室まで運び、褐毛和種由来卵巣から採取した卵母細胞を5%牛血清+0.01mgFSHを含むTCM-199培地内に移し、38.5°C、5%CO_2気相条件下で3032時間培養したのち、同培養液で7%エタノールで10分感作させ、更に第2極体の放出を阻止するためサイトカラシンD液内で5時間培養して2nの単為生殖卵を作出し、培養の48時間目に4細胞期に達したものを支持細胞として用いた。受精卵は黒毛和種由来の卵母細胞を用い、単為生殖卵と同様にTCM-199培地内で成熟させ、21時間目に精子と受精させて培養3日目に16細胞期に達した時2%プロナーゼで透明帯を融解したた。こうしてバラバラにした16細胞のそれぞれ4個のブラストメア-を4細胞期に達した単為生殖卵の透明帯内に挿入して更に8日間培養した。培養の6日目になって培養した4個中3個が胚盤胞胚に発生したことから、事前に性周期を同調しておいた受卵牛2頭へ非手術的に2個と1個ずつ移植したところ、2個を移植した牛が妊娠し、妊娠267日目に双子を分娩した。血液の診断の結果同一遺伝子を持つクローン牛であることが確認された。妊娠期間は正常のものに比べて2週間程度短かく生後直死であった。胎子の生時体重は27.8kgと31.5kgであり、正常な形態を成していた。産子の細胞分析ではいずれもXYの性染色体で、計60個の正常な数を持っていた。また、これらの牛からは支持細胞として用いた単為生殖卵の褐毛は身体に発現しなかった。この結果から、単為生殖卵は受精卵の支持細胞として有効である可能性は示唆されたが、実用化のためにはもっと例数を重ねて実証しなければならない。
音声認識・自動翻訳を利用したネットワーク上の言語学習支援システム

音声合成エンジン(日本語、英語)と機械翻訳エンジン(日英、英日)を用いたネットワーク上での対話システムを開発し、その評価実験を行った。本システムの特徴は、日本語の文章を入力すると、その文章はサーバマシンに渡され、日本語から英語に翻訳される。翻訳された文章は相手則のマシンに送られ、音声出力される(ディスプレイ上でも出力される)。逆もまた同じである。ユーザは画面上で、日英もしくは、英日の翻訳を行うか、また、音声出力をするかどうかの選択を行える。実際に本システムを使用して、相手に手持ちの絵を説明するという評価実験を行い、被験者に実験後に自由記述のアンケートを行ってもらった。そこからは、「相手が異言語を使用していることを意識しない」だとか、「音声があると画面を見なくてすむ」などの好意的な解答が得られた。また、被験者が実際に書いた絵は、元々の絵の特徴を良く掴んでおり、機械翻訳をとおした異言語間でも、十分にコミュニケーションをとれることがわかった。さらに、中間言語として英語を用いて、日露・露日の自動変換によるチャットシステムを開発した。このシステムを用いて、実際に日本人学生とロシア学生が、東京とモスクワで会話を行って、その有効性を評価した。その結果、本システムがコミュニケーションにおける学習支援になりうることを、実証した。逆もまた同じである。