hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
不適切環境光入力による概日リズム障害発生機序の究明とその回避方策の検討

時差ぼけ時におけるゲーティングのシフト様式について:光入力を遮断して視交叉上核概日リズムに影響を及ぼさない機構はゲートと呼ばれ、光に反応しない時間帯をdeadzoneと読んでいる。このようなゲートが時差ぼけ時にどのように位相変位するのかを視交叉上核におけるc-Fos遺伝子の光による誘導現象を観察することによって明らかにした。この研究で、デッドゾーンの位相がSCNのシェル領域からのタイミング信号の制御下にあることを示唆する。さらにゲートは時差ぼけ時における主観的夜での光暴露を遮断しないことが明らかになった。(Nagano et al. Brain Research2019)網膜のゲート位相を決定している機構の検索:網膜は視交叉上核(SCN)の中心概日時計を同調させるために光信号を送信する。SCNは末梢概日生理機能を調節するが周囲光も含まれるので網膜の細部は不明のままである。我々は何をどのようにマウスの網膜概日システムを調節するかを調べた。我々は最初に網膜内で概日リズムの位相特異的に光に反応する領域を明確化した。これは、周囲光ではなくSCNがグルココルチコイドを介して網膜リズムを調節することを示した。(共同研究者である池上が時間生物学会、生理学会にて発表済み。論文投稿予定。)概日リズムをもつ脳領域の迅速スクリーニング系の確立とその結果:教室に導入された機器Multiversaによって、Per2::luc knock inマウスの脳スライスの全体像を捕らえ概日リズムを持つ領域をスクリーニングすることが容易になった。このスライスは副腎ホルモンの影響下にないことから理想的な条件である。海馬、大脳皮質、小脳などほとんどの領域で概日リズムをとられることができなかった。一方、線条体に概日リズムが存在することが明らかとなった。(未発表。)中枢神経系への光入力を概日リズムの位相依存性に制御する仕組みであるゲート機構の解析については大きな進展が見られた。その一方で、中枢神経系で明瞭な概日リズムを発振可能な領域への探索は、c-Fosを用いて行う予定であったが、対象とする領域の広範な事から網羅的な解析が困難であった。しかし今年度、脳スライス培養全領域が観察可能な装置を用い、迅速化に成功した。しかし未だ、脳全体のスクリーニングが終わっていない。2年目においては終了すべき検討でありやや遅れていると判定した。視交叉上核以外の中枢神経系でどの領域が概日リズムを明瞭に示すのかを明らかにする。現在までに、脳領域で時計遺伝子の発現を指標として、概日リズムの有無を検討した報告がある。しかしそのほとんどが副腎摘除によって失われる。よって自立性のリズムとは言い難い。今回、発光イメージング装置の導入によって、スライス培養において、脳の前額断や矢状断全体の発光を経時的に捉える事ができるようになった。これを用いて、中枢神経系において振動をもつ領域を迅速につきとめる。(2)今回の申請の中心となる課題である概日リズムを参照した場合の不適切光照射、外部環境による不適切覚醒(昼間に刺激を与えることで断眠とする。)状態での中枢神経概日リズムの変化、神経新生、神経細胞死についての検討を、脳スライス培養とマウス個体を対象として、進めていく。1.環境の光条件変化に対する生体反応の検索環境の光条件を変化させ,その際にどのような反応が中枢神経系のどの領域に起きるのかを検索する。この検討は、まず恒常明条件を作り、海馬を中心として神経活動がどのような変化を受けるかを再想起遺伝子であり神経活動の指標であるc-Fosを用いて検討した。不適切な光環境(LL条件)によるマウス脳の海馬の歯状回におけるc-Fos陽性細胞数をカウントし、ZT2 (ZT, Zeitgeber time、明期12時間、暗期12時間の光環境下で、明期の始まりをZT0とした。)とZT10で比較した。その結果から、LL条件におけるZT2ではコントロール(LD)に比べてLL1、LL5、LL13の全ての条件においてc-Fos陽性細胞数が減少していた。さらに恒常明条件にて不適切な睡眠覚醒リズム(睡眠妨害)によるマウス脳の海馬の歯状回における各条件でのc-Fos陽性細胞数をカウントしてグラフを作成した。その結果から、コントロールに比べ、睡眠妨害を行うと灌流固定を行ったすべての時間(ZT0,ZT4,ZT8,ZT12)においてc-Fos陽性細胞数が減少していた。次にPER2-LUC KIおよびPer1-luc TGマウスのコロナルスライス(150um厚)で検討を行った。培養開始直後には、海馬に発光細胞の存在を認めた。しかし発光は次第に減弱した。Dex刺激(1または2時間のパルス)を与えても、概日リズムの誘導はできなかった。2.海馬、嗅球における細胞新生の概日リズムによる制御の検討BrdU陽性細胞が僅少なため、アポトーシスの検討をcaspase 3抗体を用いて行った。その結果断眠の影響を認めなかった。海馬を中心として、不適切な光照射の神経活動に対する影響を一年目は検索した。すなわち恒常明の条件において、概日リズムが影響を受けることを明瞭に提示できることを期待して海馬を中心に検討を行った。しかしその際に問題が生じた。海馬自身が概日リズムを発振する能力が非常に低いことが明らかになった。

すなわち、Per1::lucを発現する海馬のスライス培養に対して、デキサメサゾン(Dex)を投与して、概日リズムを発光モニター系によって検討した。すると、Dexの反応は挑められたものの概日リズムの継続は認めなかった。すなわち海馬においてはインビトロの系で概日リズムに対する光入力の影響をin vitroで検証することは困難である。中枢神経系のほとんどの細胞では、概日リズムのフィーバックを概日リズムを発振する能力、少なくともダンピングオシレーターをもつはずであるが、神経系では視交叉上核以外では自立した概日リズムを自律的に発振可能な領域は存在しない。よって今後、中枢神経系で概日リズムを明瞭に発振する領域を探り当てる必要がある。このような検討は初年度に行うべき検討であり、やや遅れていると判定した。時差ぼけ時におけるゲーティングのシフト様式について:光入力を遮断して視交叉上核概日リズムに影響を及ぼさない機構はゲートと呼ばれ、光に反応しない時間帯をdeadzoneと読んでいる。このようなゲートが時差ぼけ時にどのように位相変位するのかを視交叉上核におけるc-Fos遺伝子の光による誘導現象を観察することによって明らかにした。この研究で、デッドゾーンの位相がSCNのシェル領域からのタイミング信号の制御下にあることを示唆する。さらにゲートは時差ぼけ時における主観的夜での光暴露を遮断しないことが明らかになった。(Nagano et al. Brain Research2019)網膜のゲート位相を決定している機構の検索:網膜は視交叉上核(SCN)の中心概日時計を同調させるために光信号を送信する。SCNは末梢概日生理機能を調節するが周囲光も含まれるので網膜の細部は不明のままである。我々は何をどのようにマウスの網膜概日システムを調節するかを調べた。我々は最初に網膜内で概日リズムの位相特異的に光に反応する領域を明確化した。これは、周囲光ではなくSCNがグルココルチコイドを介して網膜リズムを調節することを示した。(共同研究者である池上が時間生物学会、生理学会にて発表済み。論文投稿予定。)概日リズムをもつ脳領域の迅速スクリーニング系の確立とその結果:教室に導入された機器Multiversaによって、Per2::luc knock inマウスの脳スライスの全体像を捕らえ概日リズムを持つ領域をスクリーニングすることが容易になった。このスライスは副腎ホルモンの影響下にないことから理想的な条件である。海馬、大脳皮質、小脳などほとんどの領域で概日リズムをとられることができなかった。一方、線条体に概日リズムが存在することが明らかとなった。(未発表。)中枢神経系への光入力を概日リズムの位相依存性に制御する仕組みであるゲート機構の解析については大きな進展が見られた。その一方で、中枢神経系で明瞭な概日リズムを発振可能な領域への探索は、c-Fosを用いて行う予定であったが、対象とする領域の広範な事から網羅的な解析が困難であった。しかし今年度、脳スライス培養全領域が観察可能な装置を用い、迅速化に成功した。しかし未だ、脳全体のスクリーニングが終わっていない。2年目においては終了すべき検討でありやや遅れていると判定した。
てんかん,てんかん精神障害の治療の前臨床的研究

1.傾頭葉てんかんの動物モデルとして低頻度電気刺激によるラット海馬部分発作を用いた薬理学的研究を行った。興奮性アミノ酸受容体拮抗薬、特にAMPA型受容体拮抗薬の抗てんかん薬としての可能性を指摘し、同時にそのための神経毒性の軽減化の必要性を示した。更にK^+チャネル解放薬の抗てんかん、てんかん促進作用を示しこれらの効果にCa^<++>チャネル阻害作用が関与していることを指摘した。2.海馬への電気刺激にアデノシン受容体1型拮抗薬を前投与することにより、発作波(特にSecondary afterdischrge)が延長してんかん重積モデルを作成できることを示した。更に免疫組織学的方法によりこのモデルにおいて熱ストレスタンパク質が10分以下の発作でも出現しうること、さらにカイニン酸投与重積モデルにおいて種々の後期遺伝子群が発作の程度に応じて誘発されることをISH法、免疫組織法を用いて示した。3.興奮性アミノ酸アンタゴニストの大量投与によりラット帯状回に神経変性、熱ストレスタンパク質(HSP)の発現がみられることを示した。HSPの発現はAMPA型受容体、ムスカリン受容体、cAMP分解酵素の各拮抗薬で抑制されることを示したが、このHSP発現抑制時にも神経変性がみられることを指摘した。in vivoにおけるHSPの機能的役割について考察を加えた。セロトニン、神経ペプチド、および各ドパミン受容体亜型拮抗薬のドパミン機能への効果を電気生理学的に検討し、非定型抗精神病薬の作用機序に迫った。更に依存性薬物(コカイン、MDMA)などのドパミン機能への効果を検討し、特に依存性薬物の離脱時におけるA10ドパミン系での機能低下を示し、離脱症状(an hedonia,craving)との関連について考察した。1.側頭葉てんかんの動物モデルとして低頻度電気刺激によるラット海馬部分発作を用いた薬理学的研究を行った。3.興奮性アミノ酸アンタゴニストの大量投与によりラットの帯状回に神経変性、熱ストレスタンパク質(HSP)の発現がみられることを示した。4.セロトニン、神経ペプチド、および各ドパミン受容体亜型拮抗薬のドパミン機能への効果を電気生理学的に検討し、非定型抗精神病薬の作用機序に迫った。

更にK^+チャネル解放薬の抗てんかん、てんかん促進作用を示しこれらの効果にCa^<++>チャネル阻害作用が関与していることを指摘した。2.海馬への電気刺激にアデノシン受容体1型拮抗薬を前投与することにより、発作波(特にSecondary afterdischrge)が延長してんかん重責モデルを作成できることを示した。更に免疫組織学的方法によりこのモデルにおいて熱ストレスタンパク質が10分以下の発作でも出現しうること、さらにカイニン酸投与重責モデルにおいて種々の後期遺伝子群が発作の程度に応じて誘発されることをISH法、免疫組織法を用いて示した。3.興奮性アミノ酸アンタゴニストの大量投与によりラット帯状回に神経変性、熱ストレスタンパク質(HSP)の発現がみられることを示した。HSPの発現はAMPA型受容体、ムスカリン受容体、cAMP分解酵素の各拮抗薬で抑制されることを示したが、このHSP発現抑制時にも神経変性がみられることを指摘した。in vivoにおけるHSPの機能的役割について考察を加えた。4.セロトニン、神経ペプチド、および各ドパミン受容体亜型拮抗薬のドパミン機能への効果を電気生理学的に検討し、非定型抗精神病薬の作用機序に迫った。更に依存性薬物(コカイン、MDMA)などのドパミン機能への効果を検討し、特に依存性薬物の離脱時におけるA10ドパミン系での機能低下を示し、離脱症状(an hedonia,craving)との関連について考察した。
腸管上皮細胞におけるオートファジーの生理的役割

オートファジーは細胞質内の変性タンパク質や障害を受けたオルガネラを分解する機構の一つであり、細胞の恒常性維持に重要である。本研究では腸管上皮に着目し、定常状態及びストレス環境下におけるオートファジーの役割を検証した。腸管上皮特異的なオートファジー欠損マウスで放射線照射後の上皮再生に低下が認められ、主な原因に劇的なLgr5+幹細胞の減少とTA細胞内ミトコンドリアの機能障害が考えられた。本研究によりオートファジーがLgr5+幹細胞とTA細胞の恒常性維持を通じて腸管上皮の再生に重要な役割を担う事が明らかになった。これまでの研究で我々は腸管上皮特異的にオートファジー関連分子のAtg5を欠損するATG5f/f Villin-Creマウスにおいて放射線照射により生じる腸管上皮破壊からの再生に障害があることを見出していた。この知見はオートファジーが腸管上皮細胞の再生に重要な役割を担っていることを示唆するものであり平成25年度はそのメカニズムを検討した。ATG5f/f Villin-Creマウスの腸陰窩(クリプト)を構成する分裂性の未分化細胞(progenitor細胞)では野生型マウスに比べミトコンドリアのエネルギー産生能が低下していること、さらに同細胞には多くの活性酸素種(ROS)が蓄積していることがフローサイトメーターを用いた解析から明らかになった。ミトコンドリアはエネルギー産生に伴いROSを産生するためミトコンドリアは少しずつ損傷を受ける。生体内ではこうしたミトコンドリアがオートファジー機構により絶えず排除されそのエネルギー産生能が維持されている。ATG5f/f Villin-Creマウスにおける腸上皮細胞の再生障害についてもミトコンドリアのエネルギー産生能の低下が主因と考えられ、現在電子顕微鏡を用いたミトコンドリアの形態解析などのさらなる研究を進めている。興味深いことに抗酸化剤のN-acetyl-L-cysteinを投与したATG5f/f Villin-Creマウスではprogenitor細胞におけるミトコンドリアのエネルギー産生能の増強と腸管上皮細胞の再生能の回復が確認された。従って腸管上皮細胞ではオートファジーの欠損でも酸化ストレスを抑制することでprogenitor細胞におけるミトコンドリアの機能が回復し恒常性が維持されることが示唆される。平成26年度は前年度に引き続きオートファジー欠損に伴う腸管上皮の再生能低下におけるメカニズムを検討した。前年度の研究において腸管上皮特異的にオートファジー関連遺伝子、Atg5を欠損するマウス(ATG5fl/fl Villin-Creマウス)の腸陰窩(クリプト)に存在する未分化細胞(progenitor細胞)で活性酸素種(ROS)が高い状態にある事を見出していた。これまでにミトコンドリアが主要なROSの産生源であり、機能低下に陥るとその産生が亢進する事が報告されている。当該研究においてもROS量の多いオートファジーを欠損するprogenitor細胞でミトコンドリアの機能低下が確認され、こうしたミトコンドリアの形態異常が電子顕微鏡による観察から明らかになった。免疫学平成25年度の研究計画に掲げた項目は概ね実施されていることから。近年の研究でクリプトを構成する細胞の一つであるPaneth細胞が腸幹細胞の増殖に関わることが明らかになっている。そこでPaneth細胞から産生されるWnt3a、EGF、Dll4等の腸幹細胞増殖因子の発現がオートファジーの欠損で変化するか検討する。さらにオートファジーの欠損で腸上皮細胞の再性能が低下することからオートファジーが炎症性腸疾患の原因の一つとなっていることが考えられマウス腸炎モデルで関連性を検討する。事務手続きの関係上次年度の使用額として計上することになったため。事務手続き上のことにより次年度の消耗品として計上する。
腎疾患時のヒト腎近位尿細管における薬物トランスポータの変動と発現制御因子

腎臓は薬物排泄に重要な臓器であり薬物腎排泄には、尿細管に発現するトランスポータが重要な役割を果たしている。これらトランスポータの変動は尿中への薬物排泄に重要である。本研究では病態下におけるトランスポータの変動について検討するとともに腎疾患時に変動する調節因子との関連性について検討した。その結果アシドーシス時に有機アニオントランスポータが低下し、アニオン性薬物の排出低下を引き起こすことを見いだした。尿細管における物質輸送には細胞膜上に発現する膜タンパク輸送体(トランスポータ)が重要な役割を果たしている。薬物トランスポータの発現並びに機能変動は、薬物動態と密接に関わることが報告されている。一方、慢性腎疾患の進展には様々な生体因子が関わることが報告されている。しかし、ヒト慢性腎疾患時において機能するような制御因子と薬物トランスポータの変動に関する情報は未だ皆無である。そこで本研究では腎疾患進展に関わる増殖因子と薬物トランスポータ発現変動との関連を解明することを目的とした。初年度は日本での主要な慢性腎疾患、メサンギウム増殖性糸球体腎炎の増悪に関与する増殖因子・サイトカイン類に焦点をあてた。具体的にはTGF-betaやPDGF、IL-6、BMP-7等を中心に解析を進めた。まず、これらサイトカインの発現量を測定するため、Real-time PCRによる測定条件を確立した。またレーザーマイクロダイセクション法による腎近位尿細管の単離及びRNAの精製にも成功した。そこで、TGF-beta、PDGF、IL-6、BMP-7について、予備的な検討をおこなったところ、腎皮質においてこれらサイトカインの発現が確認された。しかしながら、これら予備的検討において、サイトカインとトランスポータ発現量との間に相関は認められなかった。本年度は限られた例数での検討において有意な相関は観察されなかったが、さらに症例数を重ねて増殖因子・サイトカイン類と薬物トランスポータの機能・発現変動との関連について検討を進めていく予定である。また、トランスポータタンパクの発現変動についても検討を加える予定である。しかし、ヒト慢性腎疾患時における薬物トランスポータの変動に関する情報は不明な点が残されている。そこで本研究では薬物トランスポータ発現変動機構を解明することを目的とした。代謝性アシドーシスとは、体内における酸性代謝物の産生や体外からの酸負荷の増大によって血液が酸性化される病態である。これまで、代謝性アシドーシス時にH+排泄に関わるNa+/H+exchanger 3やsystem N glutaminetransporter SN1の活性及び発現量が上昇することが報告されているが、代謝性アシドーシス時における腎薬物トランスポータの発現変動と薬物腎排泄能への影響については不明であった。そこで代謝性アシドーシスモデル動物を用いて薬物トランスポータの変動と薬物腎排泄について検討した。代謝性アシドーシスモデルラットのフェノールスルホンフタレイン(PSP)腎排泄への影響について調べた結果、代謝性アシドーシスモデルラットにおいてPSPの血中濃度はNormalラットと比べ高値を示し、全身クリアランス及び腎クリアランス両方とも有意に低下した。一方、メトホルミン投与群では変動が見られなかった。これらの結果から、代謝性アシドーシス時には、アニオン性薬物の体内動態が変化することが示唆された。さらに薬物トランスポータの発現量について検討したところ、側底膜に発現する有機アニオントランスポータOAT3タンパク発現量が代謝性アシドーシスモデルラットではNormalラットと比べ顕著に低下した。一方、OAT1や刷子縁膜のトランスポータ群では変動が見られなかった。これらの結果から、代謝性アシドーシス時には、rOAT3のタンパク発現量が減少し、PSPの全身クリアランス及び腎クリアランスの低下を引き起こすことが示唆された。
人工現実感を用いた内部構造の視覚化システムの構築

本研究では、人工現実感を利用して、仮想空間内の対象物を任意の断面で観察できる手法とそのシステムを提案した。さらに、具体的なアプリケーションとして、携帯できる小型ディスプレイを用いた医療画像の視覚化を実現した。この医療画像視覚化システムは、実際の医療担当者に試用から、一定の評価を得た。仮想空間内に配置された対象物の断面を取得するためには、切断平面と対象物との交線(共有点の集合)を抽出する必要がある。そこで、切断平面を仮想空間内にマッピングし、マッピングされた平面を構成する点集合を作成する。この集合に含まれる対象物の画素値を抽出する。これにより、切断面のサイズ、対象物の大きさや個数などに依存せずに、常に定数計算量で切断面の作成が完了する。また、この研究の具体的なアプリケーションとして、医療画像の1つであるMRI画像の視覚化を行った。MRI画像は生体を一定方向、一定間隔で切断した複数の断面画像(スライス画像)から構成される。このMRI画像を仮想空間内に一定間隔で配置しておき、本システムで提案した切断面作成の手法を適用することでMRI画像を任意に切断することが可能となる。さらに、小型の携帯ディスプレイと三次元位置センサーを使えば、携帯ディスプレイの位置に応じた切断面を構成することができ、より直感的なMRI画像の観察が行える。携帯ディスプレイの大きさが既知であれば、MRI画像スケールを考慮し、実物大のMRI画像を観察することもでき、医療分野での効果的な利用が期待される。この研究では,可搬型の小型のディスプレイを利用者が自由に動かして,そのディスプレイ面を通して人工空間内の物体を知覚できるシステムの構築を目指している.本年度の研究により,人工現実感を用いた内部構造の視覚化システムの構築に必要な表示デバイスとサーフェイスモデルの断面形状の生成について成果が得られた.1.軽量な小型液晶ディスプレイを用いた表示デバイスの設計と作成を行った.このデバイスは小型であることから,手で容易に持ち上げることができ,計算機により構築された人工空間を表示デバイスに出力することで,利用者の自由な視点からディスプレイを通して,その中に人工空間を見ることができる.利用者は表示デバイスを実空間に空いた「窓」として認識でき,その結果,実空間には存在しない物体を実物大で知覚できるようになった.2.表面モデルで構成されたモデルから断面図を作成する手法として,モデルと断面との交線を求め,それらの線分から適切な断面を生成する手法を用いることで,断面の生成が可能となった.本研究で開発したオブジェクト集合演算ライブラリにより,任意のサーフェイスモデルについて,その断面の生成が可能であり,1.で作成した可搬表示デバイスの位置に応じて断面の生成を行い,リアルタイムで内部構造を視覚化できるようになった.本研究では、人工現実感を利用して、仮想空間内の対象物を任意の断面で観察できる手法とそのシステムを提案した。
医療用iDCにおける医薬品副作用シグナル検知システムの応用に関する研究

本研究の目的は、薬剤疫学データウェアハウスの医薬品副作用シグナル検知システムを、医療用インターネット・データセンターに設置した医用データ管理システムと連携させ、そこに蓄積された情報を用いて、「外部から提供された医薬品副作用情報および相互作用情報に対するエビデンスレベルの格付け」と、「データマイニング手法を用いた副作用シグナル検知システムによる薬剤監査支援」を実現する手法を確立することである。我々は、総合病院情報システムから抽出した処方例(匿名情報)から、模擬的な患者情報を作成し、その中に有害事象と思われるデータを有する患者情報も含め、その検知を試みた。具体的には、前立腺癌で治療中の患者に対して、化学療法を施行している患者の投薬情報、検査結果情報を元に、模擬患者のデータを作成した。有害事象としては、汎血球減少、肝障害と判断されるような副作用発症の模擬症例データを作成し、正常な模擬患者データに混入させた。本研究で開発したシステムでは、複数のデータマイニング手法で副作用シグナルを探索させ、その結果を元にシステムの評価を行った。使用したデータマイニング手法は時系列アソシエーション分析、知識ベース辞書フィルタ、アプリオリアルゴリズムである。有害事象の性質や頻度等により、有用なマイニング手法に差があることが確認できた。今後は、これらのデータマイニング手法に加え、カルテ記事からも有害事象キーワードを発見できるようにテキストマイニング技術も含めて本研究を継続して行きたい。本研究は、既に開発された薬剤疫学データウェアハウスの医薬品副作用シグナル検知システムを、医療用インターネット・データセンターに設置した医用データ管理システムと連携させ、そこに蓄積された情報を用いて、「外部から提供された医薬品副作用情報および相互作用情報に対するエビデンスレベルの格付け」と、「データマイニング手法を用いた副作用シグナル検知システムによる薬剤監査支援」を実現する手法を確立する。平成18年度は、主に、薬剤疫学データウェアハウスシステムを構築し、総合病院情報システムの処方データを抽出し登録した。さらに併用禁忌・相互作用データベースを含む薬剤添付文書情報の登録を行い、併用薬に関する調査を行った。また、実験用の医療版インターネット・データセンターとして、医用データ管理システムサーバの立ち上げを行った。平成18年度の具体的な研究の進捗と成果について説明する。1.薬剤疫学データウェアハウスサーバおよび実験用医用データ管理システムサーバの立ち上げと、データベース構築を行った。2.総合病院情報システムのデータを抽出し、連結不可能匿名化等のデータ変換を行なう為のデータクレンジング処理システムを開発した。3.開発したデータクレンジングシステムを用いて、薬剤疫学データウェアハウスにデータ転送を行った。4.構築した薬剤疫学データウェアハウスに薬剤添付文書データベースを登録した。5.統計的手法を用い、検査結果項目単位で結果値の偏差等から、正常域からの開離(異常値)に対する重み付け係数を決定する手法の開発をおこなった。(試行中)6.薬歴の変動と、検査結果の変動の関連性をスコアとして算定する手法の開発を行なった。(試行中)平成18年度中には、計画していた重み付け係数や関連スコアの算定手法に関する評価を完了するまでは至れなかったが、平成19年度に引き続き評価を行う予定である。本研究は、既に開発された薬剤疫学データウェアハウスの医薬品副作用シグナル検知システムを、医療用インターネット・データセンター(iDC)に設置した医用データ管理システムと連携させ、そこに蓄積された情報を用いて、「外部から提供された医薬品副作用情報および相互作用情報に対するエビデンスレベルの格付け」と、「データマイニング手法を用いた副作用シグナル検知システムによる薬剤監査支援」を実現する手法を確立する。平成19年度は、構築した薬剤疫学データウェアハウスシステムに、さらに新規に総合病院情報システムの処方データ,検査結果データ,症状所見データを抽出し登録した。さらに併用禁忌・相互作用データベースを含む薬剤添付文書情報の最新情報の追加登録を行い、併用薬に関する情報も登録した。構築された薬剤疫学データウェアハウスのデータに対して統計的手法を用い、検査結果項目単位で結果値の偏差等から、正常域からの開離(異常値)に対する重み付け係数を決定する手法の開発と評価を行った。薬歴の変動と、検査結果の変動の関連性をスコアとして算定する手法の開発と評価も行なった。

さらに副作用と判断する為の重み付け係数や副作用関連スコアの算定手法に関する開発と評価も行った。また、実験用の医療版インターネット・データセンターとして立ち上げた医用データ管理システムサーバと薬剤疫学データウェアハウスシステムのインターフェースを開発し、その評価として実験的に登録された薬歴と関連する(副作用と判断されるべき)検査結果値を登録し、薬剤疫学データウェアハウスが算出するスコアについて検証している。また副作用シグナルとして有効なスコアの閾値等の調査・評価も継続して行っている。平成20年度は総合テストとさらなる判定ロジックの開発を行う。本研究の目的は、薬剤疫学データウェアハウスの医薬品副作用シグナル検知システムを、医療用インターネット・データセンターに設置した医用データ管理システムと連携させ、そこに蓄積された情報を用いて、「外部から提供された医薬品副作用情報および相互作用情報に対するエビデンスレベルの格付け」と、「データマイニング手法を用いた副作用シグナル検知システムによる薬剤監査支援」を実現する手法を確立することである。平成20年度は、総合病院情報システムから抽出した処方例(匿名情報)から、模擬的な患者情報を作成した。その中に有害事象と思われるデータを有する患者情報も含めた。具体的には、前立腺癌で治療中の患者に対して、化学療法を施行している患者の投薬情報、検査結果情報を元に、模擬患者のデータを作成した。有害事象としては、汎血球減少、肝障害と判断されるような副作用発症の模擬症例データを作成し、正常な模擬患者データに混入させた。本研究で開発したシステムに、副作用シグナルを探索させ、その結果を元にシステムの評価を行った。まずは単純に時系列アソシエーション分析にて、有害事象を検出可能であるか試みたが、全ての投薬の変化と検査結果の変化がアソシエーションとして表示されるにとどまり、知識発見とは言い難い結果となった。そこで、白血球数,血小板数,AST値,ALT値等の各検査値に異常閾値を設け、投薬と検査結果のアソシエーションの単純化を図った。また抗がん剤投与に対するPSA値の低下のような、薬剤の効果として想定される変化について、知識辞書を作成し、辞書に無いものを有害事象とするような知識ベースフィルタを適用した。これらの前処理とフィルタを組み合わせることにより、想定する有害事象を有する模擬患者を発見できた。今後は、この知識辞書の自動作成方法と、テキストマイニング技術を応用し、カルテ記事からも有害事象キーワードを発見できるよう、本研究を継続して行きたい。
南海トラフ地震津波による石油流出火災シミュレーションと津波避難ビルの火災被害予測

本研究は,将来,南海トラフ地震が発生した際の津波により,石油コンビナート周辺での発生が予想される石油流出火災に着目し,予想される火災の全体像と津波避難ビルで生じる火災被害を,複数の予測モデルの開発とそれらを用いた統合シミュレーションによって数値的に明らかにすることを目的としている.2018年度は,1津波に起因する石油流出火災性状の予測モデルの開発,2地震動と津波の統一シミュレーションのための断層モデルの開発,3地震動・津波・火災の連続作用による津波避難ビルの被害予測モデルの開発,の3つの課題に取り組んだ.津波に起因する石油流出火災性状の予測モデルの開発については,津波による石油の拡がり,出火後の石油の燃焼拡大,燃焼範囲から周辺への熱的影響を物理的に定式化し,数値シミュレーションのための計算プログラムを作成した.また,東日本大震災において宮城県の気仙沼湾で発生した石油流出火災の再現シミュレーションを行い,開発したモデルが当時の火災拡大の定性的な傾向を説明できることを確認した.地震動と津波の統一シミュレーションのための断層モデルの開発については,南海トラフ地震が発生した際のコンシステントな予測地震動と予測津波を数値シミュレーションによって得るため,すべり欠損分布に基づいたすべり量の設定の考え方,深部と浅部で一貫性のあるすべり時間関数の設定の考え方を整理した.地震動・津波・火災の連続作用による津波避難ビルの被害予測モデルの開発については,鉄骨造の津波避難ビルを対象に,地震力と津波波力による建築物の応答解析と火災加熱による応答解析を連成させることによって,津波後の火災を受ける津波避難ビルの構造安全性を評価する手法を開発した.また,開発した手法を津波避難ビルの設計例に適用し,津波避難ビルの火災安全設計で注意すべき点について示唆を得た.2018年度に計画していた複数の予測モデルの開発を実施し,最終的な目標である南海トラフ地震の地震動・津波・石油流出火災・建物被害の統合シミュレーションの実現可能性を見出せていることから,おおむね順調に進展していると判断した.2019年度は,最終的な目標に向けて,次の課題に取り組む.1南海トラフ地震の地震動・津波予測用統一断層モデルの開発を進め,地震動シミュレーションと津波シミュレーションを実施し,すべり量やすべり時間関数の与え方が地震動や津波に与える影響を確認する.2南海トラフ地震の予測地震動と予測津波を基に,津波による石油流出火災シミュレーションを行い,火災拡大性状や熱的影響範囲のばらつきを評価する.3津波避難タワーが津波後に火災を受ける状況を想定し,構造の安全性と避難スペースの安全性を評価するための手法を開発する.本研究は,将来,南海トラフ地震が発生した際の津波により,石油コンビナート周辺での発生が予想される石油流出火災に着目し,予想される火災の全体像と津波避難ビルで生じる火災被害を,複数の予測モデルの開発とそれらを用いた統合シミュレーションによって数値的に明らかにすることを目的としている.2018年度は,1津波に起因する石油流出火災性状の予測モデルの開発,2地震動と津波の統一シミュレーションのための断層モデルの開発,3地震動・津波・火災の連続作用による津波避難ビルの被害予測モデルの開発,の3つの課題に取り組んだ.津波に起因する石油流出火災性状の予測モデルの開発については,津波による石油の拡がり,出火後の石油の燃焼拡大,燃焼範囲から周辺への熱的影響を物理的に定式化し,数値シミュレーションのための計算プログラムを作成した.また,東日本大震災において宮城県の気仙沼湾で発生した石油流出火災の再現シミュレーションを行い,開発したモデルが当時の火災拡大の定性的な傾向を説明できることを確認した.地震動と津波の統一シミュレーションのための断層モデルの開発については,南海トラフ地震が発生した際のコンシステントな予測地震動と予測津波を数値シミュレーションによって得るため,すべり欠損分布に基づいたすべり量の設定の考え方,深部と浅部で一貫性のあるすべり時間関数の設定の考え方を整理した.地震動・津波・火災の連続作用による津波避難ビルの被害予測モデルの開発については,鉄骨造の津波避難ビルを対象に,地震力と津波波力による建築物の応答解析と火災加熱による応答解析を連成させることによって,津波後の火災を受ける津波避難ビルの構造安全性を評価する手法を開発した.また,開発した手法を津波避難ビルの設計例に適用し,津波避難ビルの火災安全設計で注意すべき点について示唆を得た.2018年度に計画していた複数の予測モデルの開発を実施し,最終的な目標である南海トラフ地震の地震動・津波・石油流出火災・建物被害の統合シミュレーションの実現可能性を見出せていることから,おおむね順調に進展していると判断した.2019年度は,最終的な目標に向けて,次の課題に取り組む.1南海トラフ地震の地震動・津波予測用統一断層モデルの開発を進め,地震動シミュレーションと津波シミュレーションを実施し,すべり量やすべり時間関数の与え方が地震動や津波に与える影響を確認する.2南海トラフ地震の予測地震動と予測津波を基に,津波による石油流出火災シミュレーションを行い,火災拡大性状や熱的影響範囲のばらつきを評価する.3津波避難タワーが津波後に火災を受ける状況を想定し,構造の安全性と避難スペースの安全性を評価するための手法を開発する.
植物の乾きを伝達する新たなシグナル機構の解明

本研究では,蒸散によって生じる"水圧シグナル(hydraulic signal)"が,地上部の乾きを素早く根系に伝達するシグナルとなり得るかどうかを検証した.ササゲを,高大気湿度条件下と低大気湿度条件下,すなわち葉面にかかる水要求度が異なる環境下で生育させ,根系における水の通導コンダクタンスをハイプレッシャーフローメータ法で測定した.高湿度条件では生育させたササゲでは,葉の水分要求度が低く水欠乏が生じなかった.そのような個体では,照明点灯後39時間の間に根系の通導コンダクタンスが上昇しなかった.一方,低湿度条件に曝された個体では,照明点灯後36時間の間に葉に軽度の水欠乏が生じるとともに,根系の通導コンダクタンスが有意に上昇した.気孔コンダクタンスを測定した結果,低湿度条件下,すなわち高蒸散要求条件に曝された個体でも,気孔が閉鎖していなかった.すなわち,低湿度条件下に曝されたササゲは,地上部の乾きを感知して,蒸散要求に見合うように根の吸水能力を高めていた.次いで,葉の乾きを根に伝達する経路について検討を行った.導管のみが地上部と根系の連絡路となっている個体を用いて同様の測定を行った結果,師部の物質輸送能力を消失させても根の通導コンダクタンスが上昇した.地上部を切除しその切り口から吸引圧をかけた個体でも同様の反応が起こった.また,地上部の水ポテンシャル(吸引圧)が低下した個体ほど通導コンダクタンスは大きく上昇した.以上の結果から,ササゲには地上部の水欠乏や水要求を感知して,根の吸水能力を高める適応性があることを明らかにした.その乾きを伝達するシグナルは,化学物質の合成と輸送を要する師部経由ではなく,導管を経由する吸引圧であることが示唆された.本研究では,蒸散によって生じる"水圧シグナル(hydraulic signal)"が,地上部の乾きを素早く根系に伝達するシグナルとなり得るかどうかを検証した.ササゲを,高木気湿度条件下と低大気湿度条件下,すなわち葉面にかかる水要求度が異なる環境下で生育させ,根系における水の通導コンダクタンスをハイプレッシャーフローメータ法で測定した.高湿度条件では生育させたササゲでは,葉の水分要求度が低く水欠乏が生じなかった.そのような個体では,照明点灯後39時間の問に根系の通導コンダクタンスが上昇しなかった.一方,低湿度条件に曝された個体では,照明点灯後36時間の間に葉に軽度の水欠乏が生じるとともに,根系の通導コンダクタンスが有意に上昇した.気孔コンダクタンスを測定した結果,低湿度条件下,すなわち高蒸散要求条件に曝された個体でも,気孔が閉鎖していなかった.すなわち,低湿度条件下に曝されたササゲは,地上部の乾きを感知して,蒸散要求に見合うように根の吸水能力を高めていた.次いで,茎基部を加熱することによって師部の輸送能力を消失させ,導管のみが地上部と根系の連絡路となっている個体を用いて同様の測定を行った.高湿度条件に曝された個体では,師部の物質輸送能力を消失させても根の通導コンダクタンスが上昇した.以上の結果から,ササゲには地上部の水欠乏や水要求を感知して,根の吸水能力を高める適応性があることを明らかにした.また,その乾きを伝達するシグナルは,化学物質の合成と輸送を要する師部経由ではなく,導管を経由する新たなシグナル機構であることが明らかとなった.本研究では,蒸散によって生じる"水圧シグナル(hydraulic signal)"が,地上部の乾きを素早く根系に伝達するシグナルとなり得るかどうかを検証した.ササゲを,高大気湿度条件下と低大気湿度条件下,すなわち葉面にかかる水要求度が異なる環境下で生育させ,根系における水の通導コンダクタンスをハイプレッシャーフローメータ法で測定した.高湿度条件では生育させたササゲでは,葉の水分要求度が低く水欠乏が生じなかった.そのような個体では,照明点灯後39時間の間に根系の通導コンダクタンスが上昇しなかった.一方,低湿度条件に曝された個体では,照明点灯後36時間の間に葉に軽度の水欠乏が生じるとともに,根系の通導コンダクタンスが有意に上昇した.気孔コンダクタンスを測定した結果,低湿度条件下,すなわち高蒸散要求条件に曝された個体でも,気孔が閉鎖していなかった.すなわち,低湿度条件下に曝されたササゲは,地上部の乾きを感知して,蒸散要求に見合うように根の吸水能力を高めていた.次いで,葉の乾きを根に伝達する経路について検討を行った.導管のみが地上部と根系の連絡路となっている個体を用いて同様の測定を行った結果,師部の物質輸送能力を消失させても根の通導コンダクタンスが上昇した.地上部を切除しその切り口から吸引圧をかけた個体でも同様の反応が起こった.また,地上部の水ポテンシャル(吸引圧)が低下した個体ほど通導コンダクタンスは大きく上昇した.以上の結果から,ササゲには地上部の水欠乏や水要求を感知して,根の吸水能力を高める適応性があることを明らかにした.その乾きを伝達するシグナルは,化学物質の合成と輸送を要する師部経由ではなく,導管を経由する吸引圧であることが示唆された.
細胞内小器官の動態までも着実に観察し得る高性能共焦点レーザー顕微鏡の開発-Living Cells および永久保存標本にも適用される観察法の確立-

CLSM(Conforcal Laser Scaning Microscopy)が医学、生物学領域に導入されてからほぼ10年にもなるが、その間の技術進歩、またその応用発展には目覚ましいものがある。細胞内での色々な生物活性物質の精密な測定、三次元観察を含めた局在観察、更にliving cellsの観察の可能性も拡がって来たことから、時間的変化も追えるようになった事は特記すべき進展である。しかし、通常の光顕と較べ抜群の解像力を利用して電顕にせまる細胞内小器官を含めた微細構造(living cellsのそれを含めて)の観察はやや置き去りにされた感がある。我々はこの面でのCLSMの再開発を目指して本研究を計画した。この目的のため、まず平面的な横軸の解像力を抜群に良くするのみではなく、living cells中の小器官などの観察の場合を考え、一寸したキズ、隆起をも認識出来るよう縦軸方向の解像力を上げることも目論んだ。このような目的にあったプロトタイプのCLSMとして、常識を越えて、半導体の表面の超微細変質をdetectするために作製されたJDLM-6602(日本電子ライオソニック)を選んだ。本機の特性に加え、前述のような横軸、縦軸両方向の解像力のさらに上げるためレーザー光学理論より割り出し、紫外線領域のさらに波長の短いもの(ここではHe-Cdレーザー、波長325nm)をJDLM-6602に組み込むことにした。このため、鏡体とそれを支える台に大幅な改造を要することになった。この改造、改良に加え、微弱なシグナルを効率良く検出するため高性能フォトンカウン-を設置した。プロトタイプのJDLM-6602で、乳癌培養細胞のliving cell観察を試験的に行ったが、ミトコンドリア、或いはライソゾームらしき小顆粒の隆起が確認出来た。本研究で作製を試みた′′新CLSM′′は、やっと組み立てが終わった所で実物の観察にとどかなかったが、通常の光顕電顕観察用の標本、またliving cellの観察で期待した結果が得られると信じている。本研究の目的とする所は通常のCLSMによるダイナミックな細胞内物質局在観察の特質を失わず、なおかつ光顕用の標本を用いながら、細胞内小器官の形態(電顕に匹敵する)観察を可能にすること、さらにliving cellsの微細構造をも観察出来る新しいCLSMの開発の可能性を追求することである。そこで本研究では、通常の生物学用CLSMから離れて、別の観点からCLSMを見直すこととし、半導体のような物質の表面の超微細変質をdetectするために作られた工業用のCLSMの特色を生かすことにした。本研究は、先ず(1)日本電子ライオソニック社のCLSM (JDLM-6601)を当研究室に設置した。次いで、上記の目的達成の一ステップとして(2)レーザー光源を紫外領域のヘリウム-カドミウム(325nm)に変更するため藤井光学を通してレンズ系の改変、鏡体の改良を行っている。また、(3)ルーチン操作上、局所場光学効果をあげるためと工業用プログラムソフトを生物学仕様に変えるため東芝エンジニアリング社よりパソコン(SS-R590)を購入し、検討を開始した。平成8年度研究実績報告書、CLSMは電顕にせまる解像力を持ち、3次元観察も可能な顕微鏡として開発されたが、純然たる形態学観察への応用例は意外と少ない。

living cellの観察への応用を含めて従来のCLSMの開発方向とは異なった新CLSMの開発を試みることにした。この目的のため、まず平面的な横軸の解像力を抜群に良くするのみではなく、living cells中の小器官などの観察の場合を考え、一寸したキズ、隆起をも認識出来るよう縦軸方向の解像力を上げることも目論んだ。このような目的にあったプロトタイプのCLSMとして、常識を越えて、半導体の表面の超微細変質をdetectするために作製されたJDLM-6602(日本電子ライオソニック)を選んだ。本機の特性に加え、前述のような横軸、縦軸両方向の解像力のさらに上げるためレーザー光学理論より割り出し、紫外線領域のさらに波長の短いもの(ここではHe-Cdレーザー、波長325nm9をJDLM-6602に組み込むことにした。このため、鏡体とそれを支える台に大幅な改造を要することになった。この改造、改良に加え、微弱なシグナルを効率良く検出するため高性能フォトンカウンターを設置した。本年度は、プロトタイプのJDLM-6602で、乳癌培養細胞のliving cells観察を試験的に行ったが、ミトコンドリア、或いはライソゾームらしき小顆粒の隆起が確認出来た。本研究で作製を試みた“新CLSM"は、やっと組み立てが終わった所で実物の観察にとどかなかったが、通常の光顕電顕観察様の標本、またliving cellsの観察で期待した結果が得られると信じている。
ナノ空間に閉じ込めた人工膜の開発

膜タンパク質の機能を1分子で定量的に評価することは、重要かつ困難な課題である。本研究は、膜タンパク質機能を計測する新しい方法論を創出することを目的として、ガラス基板と高分子エラストマー(ポリジメチルシロキサン:PDMS)にはさまれた厚さ10100 nmのナノ空間にパターン化人工膜を形成し、膜タンパク質を超高感度(1分子)で解析する技術を開発した。接着層として、高分子ブラシ被覆シリカ微粒子を用いることで、厚さを厳密に制御し、非特異的吸着を抑制したナノ空間を実現した。モデルタンパク質として、ウシガエル視細胞由来のロドプシンを導入し、ナノ空間内部で1分子蛍光観察することに成功した。本研究は、膜タンパク質機能を計測する新しい方法論を創出することを目的として、ガラス基板と高分子エラストマー(ポリジメチルシロキサン:PDMS)にはさまれた厚さ10100 nmのナノ空間にパターン化人工膜を形成する技術を開発する。そして、モデル膜タンパク質としてロドプシン光受容体を再構成し、機能を超高感度(1分子)で解析する技術を開発する。平成27年度には、1ナノギャップ構造の作製、2ナノギャップ構造の評価、にかかる技術開発を行い以下の成果を得た。1ナノギャップ構造の作製:ポリマー脂質膜と流動性脂質膜からなるパターン化人工膜をガラス基板表面に作製し、ポリマー脂質膜の表面に原子移動ラジカル重合(ATRP)を利用した表面開始ラジカル重合法により、鎖長が均一で高密度な高分子ブラシを作製した。親水性で生体適合性が高い2-methacryloyloxyethyl phosphoryl choline (MPC)を高分子材料として用い、重合時間により鎖長を制御することに成功した。また、水溶液中でATRP反応を行うことにより、流動性脂質膜と共存するポリマー脂質膜に高分子ブラシを形成した。一方、ナノギャップ構造の作製は、接着層として脂質ベシクル、シリカ微粒子を用いた接合を行った。パターン化人工膜とPDMSとの間に厚さ10100 nmの空隙(ナノギャップ構造)を作製することに成功した。2ナノギャップ構造の評価:高分子ブラシとPDMSの接合は、水溶性蛍光色素を用いて検証した。ギャップ内における水溶性蛍光色素の蛍光強度を測定することでナノギャップ構造の厚さを推定でき、シリカ微粒子の粒径に応じてギャップの厚さを制御できることが示された。以上の結果は、現在論文投稿中であり、国内外での学会でも発表した。本研究は、ガラス基板と高分子エラストマー(ポリジメチルシロキサン:PDMS)にはさまれた厚さ10100 nmのナノ空間にパターン化人工膜を形成し、その中で膜タンパク質機能を計測する新しい方法論を創出することを目的としている。平成27年度には、ポリマー脂質膜と流動性脂質膜からなるパターン化人工膜をガラス基板表面に作製し、ポリマー脂質膜の表面に原子移動ラジカル重合(ATRP)を利用した表面開始ラジカル重合法により、鎖長が均一で高密度な高分子ブラシを作製した。また、接着層として脂質ベシクル、シリカ微粒子を用いた接合を行った。これらの成果は、現在論文投稿中であり、海外での招待講演でも高く評価されている。今後の課題としては、膜タンパク質再構成法、ナノギャップ構造への導入法、ナノギャップ構造内部での計測法の確立、などが挙げられる。平成28年度はこれらの技術課題に取り組む予定である。生体膜は、多様な脂質と膜タンパク質からなる精密な超分子システムであり、局所的な分子集合状態(例:脂質ラフト)が細胞機能に大きな影響を与えることが分かってきた。しかし、膜タンパク質の機能を分子レベルで定量的に理解することは困難な課題である。本研究は、厚さの極めて薄い接着層を用いてパターン化人工膜とPDMSとを接合し、厚さが10100 nmで制御されたナノ空間(ナノギャップ構造)を作製する技術を開発した。そして、ナノ空間に閉じ込められた人工膜において膜タンパク質機能を超高感度(1分子)で解析する技術を開発した。接着層として脂質ベシクルもしくはシリカナノ微粒子を用いることで、人工膜とPDMSの間に厚さが100nm以下のナノ空間を形成することに成功した(特願2015-1194, Langmuir. 32: 7958 (2016))。そして、脂質膜とタンパク質との特異的な結合を用いることで、多種類の夾雑分子が存在する溶液から特定のタンパク質分子を選択的にナノギャップ構造に導入した。また、より薄い接着層を用いることでより高いシグナル・ノイズ比で蛍光観察することが可能になった。このことは、ナノ空間において特定分子を高感度に計測する原理を実証する重要な結果である。さらに、膜に結合したタンパク質の側方拡散をナノ空間において1分子蛍光観察することに成功した。一方、現在使用している接着層は脂質膜を材料として用いているので、脂質修飾されたタンパク質が非特異的に吸着してしまうという問題があることが分かった。この問題を解決すべく、現在はシリカ微粒子と生体適合性高分子材料を組み合わせた接着層を開発している。

接着層として脂質ベシクルもしくはシリカナノ微粒子を用いることで、人工膜とPDMSの間に厚さが100nm以下のナノ空間を形成することに成功した。また、脂質膜とタンパク質との特異的な結合を用いることで、多種類の夾雑分子が存在する溶液から特定のタンパク質分子を選択的にナノギャップ構造に導入した。そして、より薄い接着層を用いることで、より高いシグナル・ノイズ比で蛍光観察することが可能になった。このことは、ナノ空間において特定分子を高感度に計測する原理を実証する重要な結果である。さらに、膜に結合したタンパク質の側方拡散をナノ空間において1分子蛍光観察することに成功した。一方、現在使用している接着層は脂質膜を材料として用いているので、脂質修飾されたタンパク質が非特異的に吸着してしまうという問題があることが分かった。この問題を解決すべく、現在はシリカ微粒子と生体適合性ポリマー材料を組み合わせた接着層を開発している。また、膜タンパク質の導入効率の改善などが今後の課題である。膜タンパク質の機能を1分子で定量的に評価することは、重要かつ困難な課題である。本研究は、膜タンパク質機能を計測する新しい方法論を創出することを目的として、ガラス基板と高分子エラストマー(ポリジメチルシロキサン:PDMS)にはさまれた厚さ10100 nmのナノ空間にパターン化人工膜を形成し、膜タンパク質を超高感度(1分子)で解析する技術を開発する。平成29年度には、人工膜とナノ空間を一体化したバイオチップ作製および膜タンパク質1分子観察技術を開発した。人工膜とナノ空間を一体化したバイオチップ作製では、光重合性リン脂質を用いて、ポリマー脂質膜、流動性膜を含んだパターン化人工膜を作製した。そして、厚さの制御された接着層として高密度な親水性高分子鎖(高分子ブラシ)を被覆したシリカ微粒子を用い、人工膜とPDMSを結合することで流動性脂質膜部位の膜とPDMSの間に厚さ10100 nmのナノ空間が形成した。これまでの検討では接着層に脂質ベシクルや脂質被覆シリカ微粒子、高分子ブラシなどを用いてきたが、今回、高分子ブラシ被覆シリカ微粒子を用いることで、(1)ナノ空間の厚さを厳密に制御、(2)脂溶性分子の非特異的吸着の抑制、(3)安定性の向上(ナノ空間を1週間以上保持できる)、などを実現した。そして、モデルタンパク質として、ウシガエル視細胞由来のロドプシンおよびトランスデューシンを用いて、ナノ空間内部で膜タンパク質を1分子蛍光観察することに成功した。以上の結果の一部は、Langmuir誌に掲載され(Nishimura, Langmuir 33, 5752 (2017))、国内外での学会でも発表した。また、現在、論文執筆中である。本研究は、膜タンパク質機能を計測する新しい方法論を創出することを目的として、ガラス基板と高分子エラストマー(ポリジメチルシロキサン:PDMS)にはさまれた厚さ10100 nmのナノ空間にパターン化人工膜を形成し、膜タンパク質を超高感度(1分子)で解析する技術を開発した。接着層として、高分子ブラシ被覆シリカ微粒子を用いることで、厚さを厳密に制御し、非特異的吸着を抑制したナノ空間を実現した。
新規電位感受性フォスファターゼの生理機能の解明

新規電位センサー蛋白の動作原理の解明のため、VSPとVSOP1について以下の実験を行った。(1)VSP:電位センサードメインのS4の陽電荷が電位感知に重要であることがわかっているが、これとカウンターバランスして構造変化する部位(おそらく陰性チャージ)がVSP蛋白内に由来するのか、脂質などの環境に由来するのかは明確でない。そこで、Ci-VSPの電位センサードメインの陰性チャージをもつ酸性アミノ酸を中性アミノ酸であるアスパラギンに置換し、アフリカツメガエル卵母細胞を用いてゲート電流の計測を行った。S2の酸性アミノ酸151Dをアスパラギンに置換したものではゲート電流のQ-Vカーブ(電荷-電圧曲線)が脱分極側へシフトし、S2の164Dと186Dを同時にアスパラギンに変更したものでは、逆にQ-Vカーブが過分極側へシフトした。このことは、異なる部位の酸性アミノ酸がS4に大して異なる役割をもっており、電位センサーが膜電位を感知するのに貢献するが、ひとつの酸性アミノ酸が必須の役割を担っている訳ではないことが示唆された。今後他の酸性アミノ酸についても変異導入実験を行い、電位感知におけるカウンターバランスの機構を理解し、電位依存性チャネルの場合との比較を行いたい。(2)VSOP1:VSOP1は細胞内外のpHに依存して電位活性化曲線が変化する。pHと膜電位にクロストークの分子実体の解明がこの蛋白の動作原理の理解にもっとも重要である。そこでS4の様々な領域にアミノ酸置換を行い、これらの分子の膜電位依存性とpH依存性を計測した。多くの例で電流電圧曲線およびコンダクタンス電圧曲線はシフトが認められたが、pH感受性が失われた例は見られなかった。このことから、電位感知に関わる部位とpHの感受性を決定する部位とは異なる可能性が示唆された。ホヤゲノムから電位依存性チャネルの電位センサーを有しながらイオンが通るポア領域を欠きC末端側にガン抑制遺伝子として知られるPTENと相同性の高い酵素ドメインを有する新規分子を発見した。膜貫通領域がイオンチャネルと同様なゲート電流を示し、電位センサーとして機能することを明らかにした。細胞内ドメインを大腸菌に発現させマラカイトグリーンアッセイとTLCによるイノシトールリン脂質の脱リン酸化活性を定量し、VSPの細胞内ドメインが脱リン酸化活性を有することがわかった。さらにイノシトールリン脂質のうちPIP2によって活性が変化することが知られているKチャネルをVSPタンパクとともにアフリカツメガエル卵母細胞へ強制発現させ計測し、酵素活性が膜電位依存的に制御されることを見出した(Nature, 2005)。更に電位センサードメインをもちポア領域を欠く別の膜タンパクがチャネル活性をもつことを発見した(Science, 2006)。