hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超微細粒形成機構解明とそれを活用する「インテリジェント鍛造」の創成

開発合金であるCOBARION(CCM合金)の相当材について、鍛造、および伸線加工などの熱間加工における加工条件を最適化するため、その指標となるProcessing mapの構築を行った。また、さらなる高精度化のため、微細組織観察を行い、微細組織観察結果とProcessing mapの対応を行った。ひずみ0.6において、COBARION-LC、およびCOBARION-HCのどちらの合金においても、Processing mapの予測と微細組織はほぼ対応していた。また、Instability mapの塑性安定領域(Stable)において、動的再結晶による微細化の可能性が示唆された。(I)高温圧縮試験用合金と単結晶試料の作製(I-1)試料合金溶製:I.CCW合金、II.CNCM合金III.CCM合金を30kg真空誘導溶解炉を用いて作製した。(I-2)試料合金の熱間鍛造:(I-1)で溶製した各種Co基合金の30kgインゴットを均一化熱処理を施した後に、50mm/s以上のスライド速度で熱間プレス鍛造加工をい直径60mm程度の棒材に仕上げた。その後1200°C以上に加熱し、熱間溝圧延加工により、直径約30mmの棒材を作製した。(II)高温変形挙動の定量化3種類のCo基合金の高温での高精度な応力-ひずみ応答を圧縮試験により調べ、高温変形挙動の高精度定量化を行った。その結果、700°C以上でも変形双晶が形成され、定常変形の加工硬化/回復機構を担うこが分かった。(III)動的再結晶挙動の解析動的再結晶が開始する応力、動的再結晶完了応力、Zenar-Hollomon因子と動的再結晶粒径の関係の定式化、試験後の組織観察、組織解析をTEM、EBSD、X線回折により行った。その結果、連続動的再結晶挙動の特徴を見出した。各種Co基合金の圧縮試験による応力-ひずみ曲線を基にしてProcessing mapを作成した。熱間鍛造の最適化に資する成果である。(V)EBSD中でのその場引張り変形挙動解析:塑性変形挙動の定量化EBSD観察が可能なFEM-SEM内で、多結晶試料に室温から800°Cの温度で引張り変形を与えながら結晶粒内に形成されるひずみ誘起マルテンサイトの形成過程を追跡し、結晶粒内のひずみの蓄積過程を定量評価を試みた。結集粒界焼鈍双晶界面からのひずみ誘起マルテンサイト、変形双晶の形成を見出した。(VI)インテリジェント(型)鍛造法による人工股関節プロトタイプの試作(VI-1)鍛造シミュレーション人工股関節ステムと骨頭のプロトタイプを熱間型鍛造法により製造する工程設計を鍛造シミュレーション(FEM解析)により行った。シミュレーション結果をIVで作成するProcessing mapより意味づけし、ステム全体に微細結晶粒が形成される鍛造加工条件の最適化を行った。(VI-2)試作最適化された加工条件での熱間型鍛造(半密閉型鍛造)加工を、300トン油圧サーボプレス機を用いて行った。これらの曲げ治具・金型の設計には3D-CAD(solid works)を用いて行った。鍛造シミュレーションにより金型の設定温度における面圧、温度分布を見積もり、最適金型の材質・形状を決定した。作製したプロトタイプの任意断面の組織をX線回折,EBSDなどで解析した.また,力学特性の評価として,硬さ測定を行った.さらにミニュチュア引っ張り試験片を採取して、引っ張り特性を評価した.以上の評価結果をVI-1の工程設計にフィードバックさせることによりインテリジェント鍛造の方法論の確立に資する知見を得るよう試みた。(VII)SFEと塑性変形挙動の結晶塑性学的調査:単結晶を用いた塑性変形挙動の解明加工硬化また,ひずみ誘起マルテンサイトはSFEの値が高いCo基合金(II)、(I)において消失し,代わって変形双晶が主に起こり、塑性変形挙動、加工硬化性に影響を及ぼすことをこれまでの研究により明らかにしている.そこで、各種Co基合金の単結晶試料を作製して,ひずみ誘起マルテンサイト変態、変形双晶形成の結晶方位依存性、SFE依存性について室温から1200°Cの温度領域において圧縮試験、EBSD,TEM観察により調べた。これにより各種Co基合金の塑性変形挙動を転位機構に基づいて考察した。(VI)インテリジェント(型)鍛造法による人工股関節プロトタイプの試作(VI-1)鍛造シミュレーション人工股関節ステムと骨頭のプロトタイプを熱間型鍛造法により製造する工程設計を鍛造シミュレーション(FEM解析)により行った.シミュレーション結果を昨年度作成したProcessing mapより意味づけし,ステム全体に微細結晶粒が形成される鍛造加工条件(被加工物

断面形状,加工速度,加工温度,金型加熱温度)の最適化を行った.(VI-2)試作最適化された加工条件での熱間型鍛造(半密閉型鍛造)加工を、300トン油圧サーボプレス機を用いて行った.骨頭とソケットのプロトタイプの試作を行った.使用した金型は、ステムの場合は初期素材の曲げ加工用金型と半密閉型鍛造用金型の二つを製作した.骨頭とソケットの場合は押し出し金型を作製した.これらの曲げ治具・金型の設計には3D-CAD(solid works)を用いて行った.鍛造シミュレーションにより金型の設定温度における面圧、温度分布を見積もり、最適金型の材質・形状を決定する.作製したプロトタイプの任意断面の組織をX線回折,EBSDなどで解析した.また,力学特性の評価として,硬さ測定により行った.さらにミニュチュア引っ張り試験片を採取して、引っ張り特性を評価した.以上の評価結果をVI-1の工程設計にフィードバックさせることによりインテリジェント鍛造の方法論の確立に資する知見を得た.(VII) SFEと塑性変形挙動の結晶塑性学的調査:単結晶を用いた塑性変形挙動の解明各種Co基合金の単結晶試料を作製して,ひずみ誘起マルテンサイト変態、変形双晶形成の結晶方位依存性、ひずみ速度依存性について室温において圧縮試験,EBSD,TEM観察により調べた。これにより各種Co基合金の塑性変形挙動を転位機構に基づいて理解することができた。計画された実験項目をほぼ予定通り実施し、成果を得ていると考えることができるため。24年度が最終年度であるため、記入しない。24年度は、23年度の研究内容をさらに進化させ、精度を上げることを目標に推進したい。
腸管寄生原虫の初期感染定着動態に関する研究

発展途上国では未だに腸管寄生原虫の高度蔓延をみるが、乳幼児の身体発育不良と原虫感染の相関については基礎データが定まっていない。本研究では、インドネシアにおいて乳幼児を対象とした観察的コホートを設定し、「病原性」および「非病原性」原虫の出生直後からの初期暴露を評価、さらに宿主免疫応答と健康状態を指標とすることで、乳幼児の身体発育不良に対する腸管寄生原虫感染/定着の影響を解明し、寄生虫を原因とする身体発育不良に対する有効な介入策を構築する発展途上国では未だに腸管寄生原虫の高度蔓延をみるが、乳幼児の身体発育不良と原虫感染の相関については基礎データが定まっていない。本研究では、インドネシアにおいて乳幼児を対象とした観察的コホートを設定し、「病原性」および「非病原性」原虫の出生直後からの初期暴露を評価、さらに宿主免疫応答と健康状態を指標とすることで、乳幼児の身体発育不良に対する腸管寄生原虫感染/定着の影響を解明し、寄生虫を原因とする身体発育不良に対する有効な介入策を構築する
子宮内膜症の発生に関与するサイトカインおよびそのレセプター遺伝子の遺伝子多型解析

子宮内膜症は、多遺伝子性の素因のもとに環境因子が加わつて発生する慢性炎症性疾患である。natural killer (NK)細胞の機能低下が本疾患の病態と関連する。killer immunoglobulin-like receptor(KIR)はNK細胞表面に発現し、標的細胞のHLAクラスI分子を認識する。KIRと対応するHLAリガンドとの組み合わせで分析すると、活性化遺伝子型群の頻度が対照と比較して内膜症群で有意に少なく、かつ抑制性遺伝子型群の頻度が内膜症群で有意に多かった。KIRの遺伝子多型が子宮内膜症の疾患感受性に関連している可能性が示唆された。子宮内膜症は、性成熟期女性の約10%に発生すると推定され、少産・晩婚化に伴って増加傾向にある慢性疾患である。病因は未だ不明であるが、遺伝的要因も一部ではあるがその発生に関与している。我々はすでに、遺伝子多型解析によりエストロゲン・レセプターα、CYP19、PPAR-γ、HLA-Class I(-A,B,-Cw)およびClass II(-DR,-DQB)遺伝子などが疾患感受性遺伝子の候補であることを報告してきた。そこで、本研究では、子宮内膜症の発生・進展に関連することが示されているサイトカインおよびそのレセプター遺伝子の遺伝子多型を、800名規模の患者-対照研究により集中的に解析することによって、子宮内膜症の発生、進展に関与する遺伝子群を同定することを目的としている。子宮内膜症ではnatural killer(NK)細胞活性の低下が知られている。昨年度はそのレセプターであるkiller immunoglobulin-like receptor(KIR)の遺伝子多型について解析した。標的細胞である子宮内膜組織にはHLAが発現している。KIRと対応するHLAリガンドとの組み合わせで分析すると、抑制性遺伝子型であるKIR3DL1^+/3DS1^-/HLABw4^+が、子宮内膜症群で有意に多かった。さらに、KIR3DS1、KIR3DL1/HLABw4、およびKIR2DL1/HLA-Cグループ2の有無により8群に分類し、これを活性化、中立性、抑制性の3群の遺伝子型に大別したところ、活性化遺伝子型群の頻度が子宮内膜症群で有意に少なく、かつ抑制性遺伝子型群の頻度が子宮内膜症群で有意に多かった。以上より、抑制性KIR/HLA-クラスI遺伝子型、およびHLA-B7の頻度が子宮内膜症患者で有意に高いことが明らかとなった。これらがNK活性を抑制することから、KIRおよびHLAの遺伝子多型が子宮内膜症の疾患感受性に関連している可能性が示唆された(Kitawaki Jet al. Am JReprod Immunol, 2007)。我々はすでに、遺伝子多型解析によりエストロゲン・レセプターα、CYP19、PPAR-γ、HLA-Class I (-A,B,-Cw)およびClass II (-DR,-DQB)遺伝子などが疾患感受性遺伝子の候補であることを報告してきた。そこで、本研究では、子宮内膜症の発生・進展に関連することが示されているサイトカインおよびそのレセプター遺伝子の遺伝子多型を、800名規模の患者一対照研究により集中的に解析することによって、子宮内膜症の発生、進展に関与する遺伝子群を同定することを目的としている。現在までに腹腔内所見をもとに疾患の有無、合併症、進行度等を詳細に記載した750名分の末梢血DNA検体を得ている。H20年度にはさらに50名以上の検体を採取した。同時に、非子宮内膜症である対照群の患者検体を収集した。また、表現型についても同時に解析を加えるために、末梢血血清および腹水も採取した。子宮内膜症ではnatural killer (NK)細胞活性の低下が知られている。そこで、そのレセプターであるkiller immunoglobulin-like receptor (KIR)の遺伝子多型について解析した。その結果、NK活性抑制型のKIRが子宮内膜症で多かったことから、従来の結果を支持している。その結果を英文論文として発表した(Am J Reprod Immunol,2007)。この結果をもとに、KIRの表現型について検討を加えており、遺伝子多型の結果と相反しない結果を得ている。今後引き続き遺伝子多型とタンパク発現の関連について検討を加えていく予定である。
塩素転生サイクル系におけるリサイクル性に関する研究

食塩分解で製造される塩素から消費されて再び塩として戻る塩素転生サイクル過程を物質流構造分析(SFA)により追跡しながら、この構造にリサイクル経路を導入した場合のサイクルにおける物質混合の予測手法、リサイクル物質のLCA手法に関する研究を行った。社会における物質循環モデル:塩素は化学品から製品へ、製品が市場へ上市され、そこで消費される。役割を終えたものは最終的に環境へ放出、廃棄される。環境へ排出される量はリサイクルによって縮減することが可能である。しかしある物質のリサイクル性の評価を行うには製造から消費という流れの中で社会における当該物質の汚染・劣化を見積もることが必要である。汚染機構は社会での混合過程が主であり、このモデル化を検討した。塩素の転生構造は樹枝状構造で近似されるので、単一物質については単純な物質社会循環モデルで社会における混合過程を近似した。他の物質に転生する場合は反応項を加えることによって考慮することができる。リサイクルが社会での混合過程に及ぼす影響を物質の単位量のパケットを仮定して各パケットの社会における年齢分布および汚染濃度分布をPopulation Balanceにより記述した。社会のストック容量は一般に一定ではなく増加、減少する。得られた頻度関数から、物質の年齢分布や、環境影響量が求められる。社会のストック容量が一定の場合の年齢分布は社会における混合機構及びリサイクル状況の関数である。
軟X線CTによるECH球状トカマクプラズマの観測

昨年度製作した軟X線CTシステムを用いて、LATE球状トカマク装置でのECHによる中心ソレノイド無し球状トカマクプラズマ立上げ実験の観測を行った。(1)ECH球状トカマクの観測:LATE装置では、2.45GHz,30kWのマイクロ波を用いた2秒放電において、電子サイクロトロン加熱(ECH)により、プラズマ電流をゼロから立上げ、垂直磁場をゆっくりとランプすることで、平衡を保ちながらIp=7.2kAまでランプすることに成功した。電流増加と共に軟X線信号、硬X線信号が増大し、高速電子生成が示唆された。軟X線信号分布の中心は、磁気解析による電流中心と一致して第二高調波共鳴層付近に位置し、電子密度がプラズマ遮断密度の3倍になっていることと併せて、電子バーンスタイン波による第二高調波共鳴加熱を示唆した。また磁気解析から推定される電流分布は最外殻磁気面よりも外側まで存在していたが、軟X線信号分布も磁気計測に一致した分布を示し、最外殻磁気面よりも外側での電流の存在を示唆した。周回高速電子の弱磁場側への軌道シフト、もしくは再外殻磁気面外でのプリセッション電流などが考えられる。また、磁気解析から高いポロイダルベータ値(βp1)が推定され、上記観測結果と併せて、高速電子テイルによる高Pp平衡にあると推測された。(2)CTコードの検討:トロイダル磁場に定常垂直磁場を印加した下でECHを行うと、自発的にプラズマ電流が発生し、閉じた磁気面をもったトカマク平衡にまで至る。この様なオープンな磁気形状から閉じた磁気面形成に至る過程において軟X線2次元発光像を調べるため、楕円境界を仮定するフーリエベッセル法とは異なる、境界を仮定しないCTコードを試験的に作成した。真空容器内を15x30程度のメッシュに区切り、各20chの計測データをスプライン補完で仮想的にデータ数を増加させて、最小二乗法で発光分布を求めた。CCDによる可視光画像や磁気計測などの他の計測と併せて評価し、最適なコードの検討を進めている。LATE球状トカマク装置に軟X線CT像再生システムを設計・製作し、プラズマ計測を開始した。(1)LATE装置に2台の軟X線カメラを新規追加し、上下及び外側ポートに計4台80chの視線でプラズマを計測するカメラアレイを設置した。通常のスリットに加え、トロイダル方向の視野を絞るスリットを設け、センタースタックを挟んだ反対側プラズマからの寄与を抑えた。(2)CAMAC規格の高速データ収集を整備し、1分以内に全80chのデータ収集が可能となった。(3)CTコードを開発し、像再生コードの試験を行った。フーリエベッセル展開法を用い、長山ら(Rev.Sci.Instrum 63,4757(1992))の手法に従い楕円境界が円形となるよう線形座標変換を行ってからCTをすることで、低次展開モードでもより適した楕円プラズマ表現ができるCTコードとした。像再生試験として、真空容器内に縦長楕円状に束ねた発光体(殺菌灯)の像再生を行い、視線分解能以内の精度で空間位置および広がりを表現できることを確認した。(4)ECH球状トカマクプラズマの観測を行った。中心ソレノイドの無いLATE装置では、2.45GHz,10kW,4秒のマイクロ波を用いた長時間電子サイクロトロン加熱(ECH)によりプラズマ電流をゼロから立ち上げ、Ip=4kAまでランプすることに成功した。電流の増加と共に電子密度・温度ともに上昇し、軟X線検出器にCTに充分な信号レベルが得られた。CT再生像は縦長楕円形状で、磁気解析による磁気面形状とよく対応し、像の中心位置は磁気解析によるプラズマ電流中心の位置にほぼ一致していた。また、この中心位置は第二高調波EC共鳴層付近に位置し、電子密度がプラズマ遮断密度の約3倍に達していることから、電子バーンスタイン波による第二高調波加熱起こっていることを示唆した。(5)問題点として、楕円のみを考慮した現CTコードではD-shapeであるLATEプラズマの内側部分での弱い発光分布を適切に表現できず、内側に弱いハロー状の分布として表現された。さらに適切なコードの検討を進めている。

(2)CTコードの検討:トロイダル磁場に定常垂直磁場を印加した下でECHを行うと、自発的にプラズマ電流が発生し、閉じた磁気面をもったトカマク平衡にまで至る。この様なオープンな磁気形状から閉じた磁気面形成に至る過程において軟X線2次元発光像を調べるため、楕円境界を仮定するフーリエベッセル法とは異なる、境界を仮定しないCTコードを試験的に作成した。真空容器内を15x30程度のメッシュに区切り、各20chの計測データをスプライン補完で仮想的にデータ数を増加させて、最小二乗法で発光分布を求めた。CCDによる可視光画像や磁気計測などの他の計測と併せて評価し、最適なコードの検討を進めている。
崩壊した共同体をめぐる文学の想起の比較研究

本研究課題の実施開始よりおよそ半年という短期間であるため、計画の全体からみれば一部分の研究対象を扱い始めたところである。その中でまず、以前の研究との連続性がある旧東ドイツの記憶の問題に関しては、昨年までの博士課程での研究成果をふまえ、日本独文学会でのドイツ語での口頭発表と、受入機関である筑波大学のドイツ文学の雑誌に日本語論文を投稿(採用決定)し、成果を発表することができた。それらでは、ユリア・ショッホとアンゲラ・クラウスという東ドイツ出身の作家の小説を手がかりに、東ドイツ出身者が東ドイツ崩壊後に直面することがある時間感覚の変化について考察した。東ドイツ時代における進歩思想の退却には西側にはない失望も伴っている。また、急な資本主義社会への転換においては社会の変化の速度への戸惑いも生じる。そうした諸条件のもとで時間認識が変化する中、未来だけでなく、過去も固定されたものとしてではなく、複数の可能性を伴って思い出されるという傾向がこれらの作品には見て取れる。次に、チェルノヴィッツ出身でフランスに亡命した詩人パウル・ツェランの作品の研究に着手した。ツェランはホロコーストの記憶との関連で有名な詩人であるが、本研究課題にとって彼の作品は、現在との断絶のなかで<失われたもの>として現れる過去とはいかなる存在であるかを考える手がかりとして位置づけられる。このような視点において「氷、エデン」という詩を扱い、東ドイツの例と比較したうえで9月の国際学会で発表した。本研究課題の視点で試みた分析結果は以下である。この詩における氷のイメージが示すのは、この世から失われた死者の記憶は手の届かないものだという一種の想起不可能性と、それでもなお想起を試みる体験である。というのもこの詩では、謎めいた詩的言語を読むという体験が、氷のイメージを介して、決まった答えのない対象に取り組み続ける想起の様態の体験となるからだ。(抄録なし)本研究課題の実施開始よりおよそ半年という短期間であるため、計画の全体からみれば一部分の研究対象を扱い始めたところである。(抄録なし)
学習者特性適応型eラーニング教材の構築に関する研究

平成17年度に開発したeラーニングシステムでは、AHS(Adaptive Hypermedia System)の技法を用いて、学習者の知識レベルを因子とする学習者モデルに基づいて、動的にナビゲーションを適応させることで、各学習者の学習時における知識レベルに適応した教材の配信を行うことに成功していた。平成18、19年度は、大学の論理学の講義の復習用のeラーニングシステムを構築し、学習者の特性のモデル化において、知識レベルのみならず認知スタイルを因子として用いた。認知スタイルへの適応は、各ページの提示内容や提示の順番を認知スタイルに応じて変化させることで行った。認知スタイルの分類モデルとしては、Richard Ridingらによる認知スタイルラベルの「全体型-分析型特性」を採用し、学習者のそれぞれの認知スタイルに適合すると考えられる教材デザインのAHSを用意し、認知スタイルに適合したAHSを利用した場合と適合しないAHSを利用した場合の学習効果の比較を行った.。認知スタイルに適合した場合の方が高い学習効果を得られるということを明確に示す結果は得られなかったが、全体型向けの教材デザインには,認知スタイルに関わらず学習効果に一定の有効性が見られ,今後のAHS構築の研究への示唆は得られた。また、システムサイドからの適応の制御とは別に、学習者サイドからの適応機能の選択を可能にした場合の学習効果についても検証を行い、システムサイドからの制御による場合との比較を行い、学習者が選択を行った場合に高い学習効果が見られ、今後の類似システムの構築における重要な示唆を得ることができた。1.研究準備フェーズAdaptiveHypermediaやUser Modelingといった技術的基盤をもった、既存の教育システムに関する諸研究を整理し、特に認知スタイルや学習スタイルに基づいたシステムの研究を精査した。2.試行版システムの設計・開発フェーズ2005年度は論理学と言語学を対象にした学内の授業をひとつ選び、これについて学習者の知識レベルに適応する試行版システムを構築することとした。まず、授業内容全体をその構成要素に細分化し、要素間の関係を定義することで、この授業の知識モデルを構築した。この要素間の関係の定義においては、ある任意の知識要素について、その前提となる知識要素がなんであるのかを決定し、また前提となる複数の知識間での重要度を重みという形で表現した。このモデルに基づいて、各ユーザの知識レベルをモデル化するオーバーレイモデルを今回は採用した。また、これと平行して、ラーニングサイトとしてのコース構成をコースマップとして決定し、知識モデル上での要素間の関係をリンクとして表現した。このリンクの特性(リンクの開閉や推奨の有無など)が、ユーザモデルとして表現された各ユーザの知識レベルに動的に対応して変化することで、学習者特性の実現が可能になった。3.試行版システムの運用実験フェーズ2005年12月に試行システムが一応完成したので、2006年1月に、当該授業で全受講学生を対象に実験を行った。任意に2つのグループに全学生を分け、一つ目のグループには特性適応型教材を、2つめのグループには適応機能の無い、通常の教材を配信し、その学習効率や学習効果についてポストテストを行った。この実験のデータ自体については現在も解析中であるが、少なくともシステムの動作レベルでは、大きな不具合無く、システム設計段階で意図していた適応機能は十全に実現したことを確認済みである。今年度は、適応を知識レベルのみならず、認知スタイルや学習方法などの因子に対して行い、実験を行う予定である。・18年度の研究概要平成17年度末に構築した学習者適応型のeラーニングシステムでは、学習者の知識をオーバーレイモデルの手法を用いて、モデル化し、このモデルに基づいた適応を、主としてナビゲーションレベルにおいて行うことにはある程度成功した。18年度は、このシステムの学習者に対する有効性を検証するための実験を行い、その学習効果について実証を行うことができた。特に、汎用的な非適応型ハイパーメディアシステムでの学習効果との比較実験において、学習者の学習効率や学習の継続率において、適応型システムが優れていることを証明することができた。

また、学習者の「知識レベル」から学習が完了したと判断される内容に関しては、積極的な配信を行わないか全く配信を行わないことで学習の効率化を目指す適応型システムには、学習時間は短縮されるが繰り返しの学習が行われにくいために、学習で得た知識を忘れ易く、長期間保持出来ないという問題点があるのではないかという懸念があったので、対応型システムと通常の非適応型システムのどちらのタイプの教材が知識の保持に有効かを明らかにするべく、学習直後のみならず、学習後一定の期間後に事後テストを行い、データの比較・分析を行った。この結果、適応型・非適応型で長期的な知識保持に優劣が無いことが確認された。また、適応機能の実装において、単に学習者の知識レベルにとどまらず、学習者の多様な特性を因子として設定することが大きな課題となっており、18年度は、どのような因子を採用するかのか、またその因子に対して、システムがどのような適応を提供するのかを検討した。19年度にはこれらの機能の実装を目指す。前年度までに構築したeラーニングシステムでは、AHS(Adaptive Hypermedia System)の技法を用いて、学習者の知識レベルを因子とする学習者モデルに基づいて、動的にナビゲーションを適応させることで、各学習者の学習時における知識レベルに適応した教材の配信を行うことに成功していた。平成19年度は、大学の論理学の講義の復習用のeラーニングシステムを構築し、学習者の特性のモデル化において、知識レベルのみならず認知スタイルを因子として用いた。認知スタイルへの適応は、各ページの提示内容や提示の順番を認知スタイルに応じて変化させることで行った。認知スタイルの分類モデルとしては、Richard Ridingらによる認知スタイルラベルの「全体型-分析型特性」を採用した。学習者のそれぞれの認知スタイルに適合すると考えられる教材デザインのAHSを用意し、認知スタイルに適合したAHSを利用した場合と適合しないAHSを利用した場合の学習効果の比較を行った.。認知スタイルに適合した場合の方が高い学習効果を得られるということを明確に示す結果は得られなかったが、全体型向けの教材デザインには,認知スタイルに関わらず学習効果に一定の有効性が見られ,今後のAHS構築の研究への示唆は得られた。また、システムサイドからの適応の制御とは別に、学習者サイドからの適応機能の選択を可能にした場合の学習効果についても検証を行い,システムサイドからの制御による場合との比較を行い,学習者が選択を行った場合に高い学習効果が見られ、今後の類似システムの構築における重要な示唆を得ることができた。
植物の澱粉生合成および貯蔵タンパク質集積における制御機構の解明

本研究は,澱粉・貯蔵タンパク質生合成における制御機構を,タンパク質翻訳後修飾および細胞内mRNA輸送レベルで解明することを目的とした.1.澱粉生合成においては,昨年度の研究からインゲンマメstarch branching enzyme 2(PvSBE2)をプロセシングする酵素として,セリンプロテアーゼの一種であるsubtilase(PvSLP1)を同定した.今年度は本プロテアーゼcDNAのクローニングを行った.登熟種子から調製したcDNAライブラリーをスクリーニングし,PvSLP1をコードするcDNAを単離した.塩基配列の解析から,本cDNAは2414bpからなり,769アミノ酸残基のORFを含むことが明らかとなった.また予想されるアミノ酸配列は,ダイズ由来subtilaseと高い相同性を示した.精製酵素のN末端配列およびPvSLP1の推定アミノ酸配列から,2つの異なる翻訳開始点が予想された.現在,形質転換体タバコを用いた細胞内局在性の解析を試みている.2.貯蔵タンパク質生合成においては,イネプロラミンmRNA輸送に関与すると考えられる,細胞骨格結合120kDaタンパク質(Rp120)と複合体分子を形成するタンパク質の同定を目的とした.昨年度の研究からtwo hybrid systemを用いたスクリーニングにより,glycine rich RNA binding protein, unknown proteinを候補タンパク質として見出した.今年度は,これら候補タンパク質をコードする遺伝子の単離および大腸菌発現系を構築し,得られた発現酵素を用いて抗体を作成した.今後は免疫沈降法等によってin vitroにおける結合活性を検討する予定である.本研究は、澱粉・貯蔵タンパク質生合成におけるタンパク質・mRNAレベルの機能ならびに局在性制御の解明を目的とした。澱粉生合成においては、2種のアイソフォームとして存在する、インゲンマメstarch branching enzyme 2(PvSBE2)をプロセスする酵素活性の同定を試みた。大腸菌発現したPvSBE2を基質とし、プロセッシング活性を追跡した。インゲンマメから抽出した粗酵素液をイオン交換カラムクロマトグラフィー等に供し、プロテアーゼを精製した。精製酵素は単量体であり、SDS-PAGEの結果から分子質量87kDaと見積もられた。阻害剤に対する活性から精製酵素はセリンプロテアーゼでありN末端および内部配列はsubtilaseと呼ばれるセリンプロテアーゼと高い相同性を示した。現在は、本プロテアーゼcDNAのクローニングを試みている。貯蔵タンパク質生合成においては、イネプロラミンmRNA輸送の関連タンパク質と考えられる、細胞骨格結合120kDaタンパク質(Rp120)と複合体分子を形成するタンパク質の同定を試みた。イネ登熟種子からcDNAライブラリーを構築し、Rp120をプローブとしtwo hybridスクリーニングを行った。その結果、複数の結合タンパク質候補が見いだされた。その中でも、結合力の指標となるβ-ガラクトシダーゼ活性の結果から、glycine rich RNA binding protein、unkown proteinが有力な結合タンパク質候補と考えられた。今後は、これらの候補タンパク質の大腸菌発現系を構築し、in vitroにおける結合活性の検討をする予定である。本研究は,澱粉・貯蔵タンパク質生合成における制御機構を,タンパク質翻訳後修飾および細胞内mRNA輸送レベルで解明することを目的とした.1.澱粉生合成においては,昨年度の研究からインゲンマメstarch branching enzyme 2(PvSBE2)をプロセシングする酵素として,セリンプロテアーゼの一種であるsubtilase(PvSLP1)を同定した.今年度は本プロテアーゼcDNAのクローニングを行った.登熟種子から調製したcDNAライブラリーをスクリーニングし,PvSLP1をコードするcDNAを単離した.塩基配列の解析から,本cDNAは2414bpからなり,769アミノ酸残基のORFを含むことが明らかとなった.また予想されるアミノ酸配列は,ダイズ由来subtilaseと高い相同性を示した.精製酵素のN末端配列およびPvSLP1の推定アミノ酸配列から,2つの異なる翻訳開始点が予想された.現在,形質転換体タバコを用いた細胞内局在性の解析を試みている.2.貯蔵タンパク質生合成においては,イネプロラミンmRNA輸送に関与すると考えられる,細胞骨格結合120kDaタンパク質(Rp120)と複合体分子を形成するタンパク質の同定を目的とした.昨年度の研究からtwo hybrid systemを用いたスクリーニングにより,glycine rich RNA binding protein, unknown proteinを候補タンパク質として見出した.今年度は,これら候補タンパク質をコードする遺伝子の単離および大腸菌発現系を構築し,得られた発現酵素を用いて抗体を作成した.今後は免疫沈降法等によってin vitroにおける結合活性を検討する予定である.
ヒト胃癌における第1番染色体欠失地図の作成と癌抑制遺伝子の単離

今回の研究で我々は、RFLP markerおよびmicrosatellite markerを用いて、胃癌におけるdeletion mapの作成を行い、世界で初めてchromosome 1における共通欠失領域を決定し、chromosome 1に存在する胃癌癌抑制遺伝子の単離を目指す。markerとして、microsatellite markerを用いることから、同時にRER(replication error)の検出も可能であり、最近注目されている、胃癌とDNA修復機構の関係も明らかにすることができる。近年、胃分化型腺癌と胃低分化型腺癌の発癌メカニズムの違いも指摘されてきていることから、組織型の違いによる異常の検索もあわせて行う。また、新たなRFLP markerおよびmicrosatellite markerを単離することは、今後、他臓器の癌や遺伝性疾患の原因遺伝子の解明に新たなる道を開き、国際的評価に耐えうる研究と考えている。胃癌は世界で最も発生頻度の高い癌であるが、その発癌過程はいまだあきらかでない。Erb B2, k-sam, p53などの遺伝子異常の報告や、染色体1,5,7,12,17,18番といった染色体において欠失の報告がされ、missmatch repair systemの異常も報告されている。第1番染色体はヒト染色体において最も大きな染色体であり、その欠失は神経芽腫、多発性内分泌腫瘍2型、乳癌、肝細胞癌、大腸癌などで報告され、未知の癌抑制遺伝子の存在が示唆されている。今回我々は胃癌の発癌機構の解明を目指し、胃癌における第1番染色体の欠失地図の作成および新たな癌抑制遺伝子の単離をこころみた。詳細なるdeletion mapを作成するために、ヒト染色体1番をのみを含むgenomicDNAのcosmid libraryをから、cosmid DNAを抽出した。健常者のリンパ球から抽出したgenomic DNAをMsp I, Taq I, Pst I, Pvu IIなどの制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動をした後、メンブレンに転写し、抽出したcosmid DNAをプローブとして、Southern hybridizationを行い、新たに57個のRFLP(restriction fragment length polymorphism)markerを単離した。また、CAの繰り返し配列を10個もったオリゴDNAを作製し、それをプローブとしてcosmid DNAとハイブリダイズさせることで、新たに7個のmicrosatellite markerを単離した。これらmarkerと、既知のRFLP markerとmicrosatellite markerをあわせて、胃癌25症例についてLOH(loss of hetrozygosity)studyを行った。Informativeなmarkerは、RFLP markerでは3個、microsatellite markerでは9個であった。その結果、D1S201からD1S197の間に共通欠失領域を見い出した。現在この領域より癌抑制遺伝子の単離をこころみている。Erb B2,k-sam,p53などの遺伝子異常の報告や、染色体1,5,7,12,17,18番といった染色体において欠失の報告がされ、missmat ch repair systemの異常も報告されている。詳細なるdeletion mapを作成するために、ヒト染色体1番をのみをふくむgenomicDNAのcosmid libraryをから、cosmid DNAを抽出した。健常者のリンパ球から抽出したgenomic DNAをMsp I,Taq I,Pst I,Pvu IIなどの制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動をした後、メンブレンに転写し、抽出したcosmid DNAをプローブとして、Southern hybridizationを行い、新たに57個のRFLP(restriction fragment length polymorphi sm)markerを単離した。また、CAの繰り返し配列を10個もったオリゴDNAを作製し、それをプローブとしてcosmid DNAとハイブリダイズさせることで、新たに7個のmiocrosatellite markerを単離した。

胃癌は世界で最も発生頻度の高い癌であるが、その発癌過程はいまだあきらかでない。Erb B2, k-sam, p53などの遺伝子異常の報告や、染色体1,5,7,12,17,18番といった染色体において欠失の報告がされ、missmatch repair systemの異常も報告されている。第1番染色体はヒト染色体において最も大きな染色体であり、その欠失は神経芽腫、多発性内分泌腫瘍2型、乳癌、肝細胞癌、大腸癌などで報告され、未知の癌抑制遺伝子の存在が示唆されている。今回我々は胃癌の発癌機構の解明を目指し、胃癌における第1番染色体の欠失地図の作成および新たな癌抑制遺伝子の単離をこころみた。詳細なるdeletion mapを作成するために、ヒト染色体1番をのみを含むgenomicDNAのcosmid libraryをから、cosmid DNAを抽出した。健常者のリンパ球から抽出したgenomic DNAをMsp I, Taq I, Pst I, Pvu IIなどの制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動をした後、メンブレンに転写し、抽出したcosmid DNAをプローブとして、Southern hybridizationを行い、新たに57個のRFLP(restriction fragment length polymorphism)markerを単離した。また、CAの繰り返し配列を10個もったオリゴDNAを作製し、それをプローブとしてcosmid DNAとハイブリダイズさせることで、新たに7個のmicrosatellite markerを単離した。これらmarkerと、既知のRFLP markerとmicrosatellite markerをあわせて、胃癌25症例についてLOH(loss of hetrozygosity)studyを行った。Informativeなmarkerは、RFLP markerでは3個、microsatellite markerでは9個であった。その結果、D1S201からD1S197の間に共通欠失領域を見い出した。現在この領域より癌抑制遺伝子の単離をこころみている。
免疫抑制剤による新しいケロイド治療を目指して  ～共培養モデルを用いた検討～

ケロイドは慢性炎症性線維化疾患であり、炎症を抑制することは重要な治療アプローチの一つである。Rapamycinやtacrolimusなどの免疫抑制剤がケロイドに抑制的に作用する可能性があるが、ケロイドは適切な動物モデルがないため実際の作用の詳細は不明である。ケロイド線維芽細胞ーCD4陽性T細胞共培養モデルを用いて、より生体に近い条件で免疫抑制剤のケロイドに対する作用を検証した。免疫抑制剤がケロイドを抑制する可能性を示した。初年度の計画に従い、最初にサンプル収集を実施した。ケロイド患者よりケロイド組織と末梢血を採取した。ケロイド組織よりケロイド線維芽細胞を初代培養し,細胞株の樹立と凍結保存を行った。また、末梢血より濃度勾配を用いて単核球を分離し凍結保存した。同様にコントロールとして非ケロイド患者より皮膚、末梢血を採取し、線維芽細胞や単核球を培養、分離した後、凍結保存した。次に、免疫抑制剤であるrapamycinのケロイド線維芽細胞やCD4陽性T細胞に対する効果を確認する方針とした。採取したケロイド組織に対して免疫組織学的染色を行い、rapamycinの標的タンパクであるmammaliantarget of rapamycin(mTOR)およびリン酸化し活性化したmTOR(p-mTOR)がケロイド組織内に存在することを確認した。ケロイド患者及び非ケロイド患者の単核球から磁気細胞分離法によりCD4陽性T細胞を分離した。分離したCD4陽性T細胞を抗CD4抗体、抗CD25抗体、抗FOXP3抗体で染色しフローサイトメーターで解析した。現時点で解析数は少ないが、ケロイド患者及び非ケロイド患者間でCD4陽性T細胞中の制御性T細胞(CD25強陽性、FOXP3陽性細胞)の比率に差はなかった。CD4陽性T細胞を抗CD3抗体、抗CD28抗体、抗IL-2で活性化した群と抗CD3抗体、抗CD28抗体、rapamycinで刺激した群とを同様に解析し比較した。rapamycinで刺激した群ではCD4陽性T細胞中の制御性T細胞の比率が増加していたが、ケロイド患者及び非ケロイド患者間で現時点で増加率に明らかな差はなかった。代表的な免疫抑制剤であるrapamycin、tacrolimusのケロイドに対する効果を検討した。より生体に近い条件下での効果を検証するため、我々の開発したin vitroケロイド線維芽細胞ーCD4陽性T細胞間接共培養モデルを用いた。Tacrolimusで刺激したCD4陽性T細胞または通常の方法で活性化したCD4陽性T細胞とケロイド線維芽細胞とを共培養した。非共培養群と比較して、共培養群では共培養後のケロイド線維芽細胞のI型コラーゲン、TGF-βのmRNAが低下し、IL-6のmRNA発現が増加した。今回の実験条件ではtacrolimus刺激と通常の活性化方法との間で共培養後のケロイド線維芽細胞のI型コラーゲン、TGF-β、IL-6のmRNA発現に明確な差はなかった。通常の方法で活性化したCD4陽性T細胞とケロイド線維芽細胞を共培養し、ウェル内にrapamycinまたはtacrolimusを添加した。コントロール群(非添加群)では共培養後のケロイド線維芽細胞のIL-6産生が増加したが、rapamycin添加群、tacrolimus添加群ではIL-6産生が低下する可能性があった。Rapamycin、tacrolimusの抗炎症作用を示唆する結果であった。得られた結果について関連学会にて発表した。創傷治癒学初年度の目標としてサンプルを収集し、免疫抑制剤のケロイド線維芽細胞やCD4陽性T細胞に対する抑制効果のポテンシャルを確認する必要があった。免疫抑制剤であるrapamycinの標的タンパクであるmTORおよびmTORの活性化(p-mTOR)をケロイド組織内に確認することができた。これによって収集したサンプルにおいて、rapamycinがケロイド線維芽細胞に何らかの作用を及ぼす可能性を示すことができた。また、免疫抑制剤のCD4陽性T細胞に対する抑制効果の指標として、免疫反応を抑制する作用を持つCD4陽性T細胞である制御性T細胞を設定した。CD4陽性T細胞をrapamycinで刺激し制御性T細胞(CD25強陽性、FOXP3陽性細胞)の誘導を確認しているが、マウスと違いヒトではFOXP3陽性細胞が必ずしも制御性T細胞と一致しないことがある。今回我々は抗CD127抗体を用いた染色も同時に行った。制御性T細胞とCD127陽性率は負の相関をみせるが、我々のプロトコール、サンプルでもFOXP3陽性細胞の8595%がCD127陰性であり、研究計画、プロトコールが妥当であることとrapamycinの確実な免疫抑制性を示すことができた。

以上のことから、研究の前提となるサンプルやプロトコールの妥当性、rapamycinのケロイド線維芽細胞やCD4陽性T細胞に対する抑制効果のポテンシャルが確認されたと判断し、初年度の達成度としてはおおむね順調に進展していると考えられた。今後はrapamycinの他に、代表的な免疫抑制剤の一つであるtacrolimusについてもケロイド線維芽細胞やCD4陽性T細胞に対する抑制効果を確認する。rapamycin同様に、tacrolimusにてCD4陽性T細胞を刺激し、制御性T細胞の誘導性を確認する。ケロイド線維芽細胞をrapamycin、tacrolimusで刺激し、細胞増殖抑制効果、コラーゲン産生抑制効果、TGF-β産生抑制効果などをMTS assay、ウェスタンブロット、ELISA、real time PCRなどで検証する。さらに、ケロイド線維芽細胞ーCD4陽性T細胞共培養モデルを用い、両者の相互作用が生じている、より生体に近い条件下でrapamycin、tacrolimusによるケロイド線維芽細胞、CD4陽性T細胞刺激を行い、細胞増殖抑制効果、コラーゲン産生抑制効果、TGF-β産生抑制効果、制御性T細胞の誘導性を前述の方法で検証する。それぞれの実験はコントロールとして非ケロイド患者由来の皮膚線維芽細胞、CD4陽性T細胞についても実施し、ケロイド群と比較する。また、初年度に引き続きサンプルの収集や免疫組織学的染色、末梢血CD4リンパ球の解析などを継続実施し、解析数を増やす方針である。薬剤による効果の差異、ケロイド患者ー非ケロイド患者間での薬剤感受性の差異も検討する。得られた結果については統計学的解析を行った後、関連学会にて発表し、論文の作成、投稿などを行う予定である。研究はおおむね順調に進展し、予算と支出にほぼ差は生じなかったが、41981円の次年度使用額が発生した。抗体、試薬等の購入を予定していたが、いずれも50000円程度であったため、次年度使用額が発生した。細胞培養ための培地、生化学試薬、Real-time PCRの試薬、各種抗体、その他のシャーレ、ピペット等の実験機材の各種物品等の購入に充てる予定である。
絵単語によるコミュニケーションに関する-研究

通常人間は、特別な事情の無い限り、音声言語を主体としたコミュニケーション手段に依存している。しかしながら、音声言語に問題を持つ障害者や高齢者、さらにその言語を十分に習得していない人たちにとって、それに取って代る、あるいは、それを補完するコミュニケーション手段の必要性は、非常に大きいものがある。本研究では、カナダで1980年に開発され世界的に使用され始めている、絵単語を主体にしたコミュニケーション・システム「Pictogram Ideogram Communication(以下、省略してPICと呼ぶ)」を、実用的なコミュニケーション手段として、日本で使用することが可能なように修正し、日本版PICを作成することを目的とした。そのため、文化差からくる絵単語認識の問題を始め、絵単語の認知や記憶に関する基礎的研究、ならびに、障害児教育の実践場面での訓練プログラムの改善など、具体的な成果が得られるまでの、一連の広範な問題を総合的に研究した。具体的には、カナダで開発されたオリジナルの400の絵単語について、意味明瞭度と日常重要性を心理学的に測定した。また、この結果と臨床活動から得られたデータと併せて、6個の絵単語のデザインを修正するとともに、24個の新たな絵単語を日本版で追加した。このような作業を経て、絵単語によるコミュニケーション・システム「日本版PIC」の作成と、それを用いた日本版独自の訓練プログラムを開発した。また、そのプログラムに従って学習する場合のデータ収集も試みた。さらに、これらの絵単語を用いた異言語間コミュニケーションの具体的な方法論も心理言語学の立場から提唱した。本研究では、海外で開発されたPIC(Pictogram Ideogram Communication)と呼ばれる、コミュニケーション・システムを日本に導入して、実際に使用可能なものに修正しててくことを研究のねらいとしている。しかしながら、単に、コミュニケーション障害を持つ人たちのみが、使用するような限られたコミュニケーション手段としてではなく、異言語間のコミュニケーション手段として、また、一般の人々が日常生活のなかで、日本語と併用する形で、ごく普通に活用できるシステムとしてのの作成をめざしている。コミュニケーション障害の臨床家(協力者)から得られたデータやビデオによる資料、意見を参考に「日本版PIC」の訓練マニュアルを作成して、それをもとに新たにその方法論を取り入れた訓練結果の分析を現在急いでいる。また、コミュニケーション障害の領域に限定せず、人間の情報処理の基本的な問題であるところの、認知や記憶に関する基礎的な心理学研究として、日本で新たに追加・修正した40のシンボルについて意味透明度の調査および分析を行ない、来年度の「日本版PIC」の作成の中心となる作業を終了した。海外で開発されたシステムの応用を考えるときには、比較文化的な視点も無視できず、日本でのデータとカナダを始めとした諸外国での心理学的なデータの比較、さらに、その他の社会文化的要因、言語的要因なども考慮する必要があるが、この領域での先行研究は残念ながら乏しい。異言語間コミュニケーションとしての絵単語の使用についての研究成果は、本年度の異文化間教育学会の大会で発表済みである。通常人間は、特別な事情の無い限り、音声言語を主体にしたコミュニケーション手段に依存している。しかしながら、音声言語の使用に問題を持つ障害者や高齢者、さらにその言語を十分習得していない人たちにとつて、それに取って代る、あるいは、それを補完するコミュニケーション手段の必要性は、非常に大きいものがある。

また、この結果と臨床活動から得られたデータと併せて、6個の絵単語のデザインを修正するとともに、24個の新たな絵単語を日本版で追加した。このような作業を経て、絵単語によるコミュニケーション・システム「日本版PIC」の作成と、それを用いた日本版独自の訓練プログラムを開発した。また、そのプログラムに従って学習する場合のデータ収集も試みた。さらに、これらの絵単語を用いた異言語間コミュニケーションの具体的な方法論も心理言語学の立場から提唱した。
アクチン線維形成の動的制御機構の解析

Actin Interacting Protein 1(XAip1)は、two-hybrid systemによりアクチンと相互作用する因子として出芽酵母より見いだされた因子であり、真核生物に広く保持されているアクチン結合タンパク質である。そのXenopusホモログであるXAip1は、コフィリンの結合したアクチン線維に選択的に結合し、そのdisassemblyを促進する。また、その際にアクチン線維の重合端に結合し重合を阻害することをこれまでに報告してきた。そこで、XAip1がどのようにしてコフィリンとともにアクチン線維のdisassemblyを促進するのか、さらなる解析を行った。まず、組み替え体XAip1をバキュウロウイルスを用いた系で発現・精製し、内在性のXAip1と同様の活性を持つことを生化学的解析により確認した。アクチン線維のdisassemblyにはアクチン線維の断片化と、脱重合の2要素が考えられる。そこで、XAip1がコフィリンによるアクチンの脱重合を促進するかどうか、生化学的な解析を行った。まずあらかじめゲルゾリンを加えて重合させておいたアクチン線維にコフィリン・XAip1、更にゲルゾリン:アクチン複合体を重合端をブロックするために加えた後、Gcグロブリンを加えて脱重合を開始させた。その結果、XAip1の濃度を増加させたときに見られる脱重合の初速度の増加は、コフィリンのそれに比べ優位な差は認められなかった。すなわち、XAip1はコフィリンの脱重合活性を促進しないと考えられる。XAip1はコフィリンの共存下でアクチン線維の重合端をキャップすることをこれまでに報告したが、人工的に切断されたアクチン線維の末端もキャップすることが出来るか解析を行った。アクチン線維にコフィリン・XAip1を加えた後にピペッティングを行い、アクチン線維を切断したものを様々な時間インキュベートしてアクチン線維をannealingさせ、Gーアクチンを加えて重合初速度を測定した。その結果、コフィリン・XAip1両者を加えた実験群においては、いずれの時間点においても対照実験に比べ重合は抑制されており、重合端がキャップされていることが確認された。更にコフィリン非存在下におけるXAip1のアクチン結合能についてヌクレオチド依存性があるか解析を行った。あらかじめATPまたはADP存在下で重合させたアクチン線維にXAip1を加え、ピペッティングによりアクチン線維を切断した後様々な時間インキュベート後、遠心してアクチン線維を回収した。その結果、XAip1のアクチン線維への結合量には優位な差異は認められなかった。以上の結果より、XAip1単独でのアクチン結合能はヌクレオチド非依存的であり、また重合端のキャッピングはコフィリン存在下において顕著であること、またXAip1はコフィリンの脱重合活性に影響しないことを明らかにした。

以上の結果より、XAip1単独でのアクチン結合能はヌクレオチド非依存的であり、また重合端のキャッピングはコフィリン存在下において顕著であること、またXAip1はコフィリンの脱重合活性に影響しないことを明らかにした。
スフィンゴミエリナーゼ阻害剤をバイオプローブとした細胞機能の解析

平成13年度は、酵素アッセイによる中性および酸性スフィンゴミエリナーゼ(SM)阻害剤の探索を継続するとともに、ヒトTリンパ球系癌細胞であるJurkat細胞を用いて、中性SM特異的阻害物質として見い出されたchlorogentisylquinoneの細胞レベルでめSM阻害作用を評価した。土壌などから分離した放線菌、糸状菌およびバクテリアの培養液を対家に約3000サンプルについてスクリーニングを行った。その結果、一糸状菌、FO-7436株より抗生物質として報告されているalutenusinが選択された。本化合物は中性SMに対して、IC50値で41.3μMを示し、酸性SMに対しては、350μMまで阻害活性を示さなかった。またこの阻害活性は非可逆的な阻害であることが示唆された。しかしながら今回のスクリーニングでは酸性SMを特異的に阻害する化合物は得られなかった。一方、chlorogentisylquinoneをバイオプローブとし、SMを介するシグナル伝達の解明を行うことを目的に、Jurkat細胞を用いた細胞評価系を構築した。本年度はまずchlorogentisylquinoneのJurkat細胞に対する細胞毒性およびSM阻害活性を検討した。MTT法により、薬剤添加から20時間後の細胞毒性を評価したところ、chlorogentisylquinoneは50μMまで細胞毒性を示さなかった。しかしSM阻害活性を測定したところ、30μMまではSMの活性を阻害できなかった。chlorogentisylquinoneは中性SMに特異的であることから、現在、より特異性の高い細胞評価系を構築中である。平成12年度は、酵素アッセイによる中性および酸性スフィンゴミエリナーゼ(SM)阻害剤の探索を実施すること。細胞を利用したSM阻害剤の評価系を構築することを目的に研究を実施した。土壌、海水などから分離した放線菌、糸状菌およびバクテリアの培養液を対象に約3,000サンプルについてスクリーニングを行った。その結果、糸状菌FO-7022およびFOM-8092株、放線菌WK-6130株の培養液に中性酵素に対する阻害活性が見い出された。しかしながら、今回のスクリーニングでは酸性酵素に対する阻害剤は見い出されなかった。次に、中性酵素に阻害活性を示した3株について大量培養を行い、活性物質の単離を行った。NMR等の器機分析の結果、糸状菌FO-7022株からはコラゲナーゼ阻害活性が報告されているfunalenoneが、FOM-8092株からはエンドセリン受容体アンタゴニストRES-1149-1および殺線虫活性が報告されているophiobolin Kを同定した。一方、放線菌WK-6130株からは、血小板凝集抑制作用を有するPI6621を同定した。またこれら化合物の中性SM阻害活性はそれぞれIC50で14、1.8、8.2および7.2μMと算定されたが、いずれの化合物も酸性酵素に対しては260μMまで阻害活性は見られなかった。一方細胞を用いた評価系の構築につては、ヒトTリンパ球系ガン細胞であるJurkat細胞を放射性塩化コリンで標識し、TNF-alpha刺激による放射性スフィンゴミエリンの減少量を測定することを試みた。その結果、放射性スフィンゴミエリン量は、TNF-alpha刺激から30分まで経時的に減少し、90分までに定常状態に戻ることが確認できた。今後、阻害剤の評価に応用すると共に、SMが関与するシグナル伝達経路の解明へと展開する予定である。