hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞内における核酸高次構造の機能解析を指向した低分子蛍光プローブの創製研究

グアニン残基の豊富な核酸塩基配列では、グアニン四重鎖構造(G-quadruplex:G4)と呼ばれる核酸高次構造がしばしば形成される。G4は、染色体末端に存在するテロメアや、種々の遺伝子プロモーター、mRNAに存在することが試験管レベルで知られている。G4はテロメア領域ではテロメア長の調節に関与し、遺伝子プロモーター領域やmRNAでは対応する遺伝子の転写、翻訳に関与することが示唆されている。しかし、G4が細胞内において形成されているかの直接的な証明、さらにはG4モチーフ(数多くの遺伝子プロモーターG4や、mRNA-G4はそれぞれ特有の構造モチーフを有する)を個々に選択的に安定化するリガンドの設計手法は開発されていなかった。昨年度までに、G4に対する蛍光低分子リガンド(蛍光G4リガンド)の開発を行い、細胞中においてG4が形成される可能性を示した。今年度は、開発したG4リガンド、大環状ヘキサオキサゾール(60TD)の側鎖部位に対し、人工核酸の一種であるペプチド核酸(PNA)を導入した60TD-PNAキメラ化合物の合成を行った。当該化合物は、60TD部位がG4を安定化すると同時に、PNA部位がG4の近傍に存在する核酸塩基配列と相補的水素結合を形成することで、強力な結合能とG4モチーフ選択的な安定化能が期待できる。実際に、G4形成配列を有するmRNAの一つであるN-RAS mRNAを用いて60TD-PNAキメラ化合物の結合定数を算出したところ、10-80pmol/Lの結合定数を示すことがわかった。一方、PNA部位のミスマッチ配列を用いて60TD-PNAキメラ化合物を評価したところ、結合様式がN-RAS mRNAの場合と異なることがわかった。今後、60TD-PNAを結合するリンカー部位の種類や長さ、PNA部位の残基数を調節することで、G4モチーフ選択的なリガンドの創製が期待できる。グアニン残基の豊富な核酸塩基配列では、しばしばグアニン四重鎖構造(G4)と呼ばれる三次元構造が形成されることがin vitroで報告されている。G4を形成し得る塩基配列は主に遺伝子プロモーターにおいて見出されており、G4は遺伝子の転写調節に関わることが示唆されている。そこで本研究では、G4に対する相互作用能の高い低分子化合物の創製を目的とし、大環状ヘプタオキサゾール(7OTD)の開発および機能評価を行った。すなわち、天然のG4結合剤であるテロメスタチンの平面性に着目した分子設計を行い、大環状ヘプタオキサゾール骨格7OTDを開発した。7OTDはテロメスタチンと同等以上の強力なG4安定化活性を示すと同時に、二本鎖DNAには相互作用しないことがわかった。また、7OTDの側鎖部位における構造活性相関の知見から、7OTD骨格自身がG4と強い相互作用能を有することが示された。さらに、アミノ基を側鎖に有するL1H1-7OTDは、細胞レベルでテロメアG4への相互作用が示唆され、がん細胞に対して極めて強力な増殖抑制活性が認められた。次いで、以上の結果をもとに蛍光G4リガンドの創製とG4可視化への応用を行った。前述したL1H1-7OTD側鎖に対して蛍光官能基であるBODIPYをアミド結合により結合させ、蛍光G4リガンドL1BOD-7OTDを創製した。L1BOD-7OTDはG4と強力に相互作用し(数ナノmol/Lレベルの解離定数)本構造を可視化することに成功した。さらに、生細胞(HeLa細胞)に対してL1BOD-7OTDを添加したところ、LIBOD-7OTDは細胞膜を透過し、核内へ移行することが示された。これによりヒト細胞内においてG4が形成される可能性を示すことができた。

一方、PNA部位のミスマッチ配列を用いて60TD-PNAキメラ化合物を評価したところ、結合様式がN-RAS mRNAの場合と異なることがわかった。今後、60TD-PNAを結合するリンカー部位の種類や長さ、PNA部位の残基数を調節することで、G4モチーフ選択的なリガンドの創製が期待できる。
プロリダーゼ欠損症の研究-特にプロリン代謝について

プロリダーゼ欠損症患者、酵素欠損ありで症状の殆どない妹,正常人対照2人の培養線維芽細胞を用いて以下の実験を行った。1)種々のイミノペプチドを用いてプロリダーゼ,プロリネース活性を測定した。結果、患者、妹ではGly-Pro,Leu-Pro,Val-Proに対して活性は殆ど認められなかったがMet-Pro,Ala-Pro,Phe-Proに対しては正常人の約1/21/6の活性を認めた。プロリネース活性は妹がやゝ高値を示した以外は正常人と大差なかった。2)Gly-Proを基質に用いてプロリダーゼ,プロリネース活性とMn濃度の関係を比較した。結果、正常人では各々100mM,1mMで活性最大となったが、患者、妹のプロリダーゼ活性は100mMで逆に活性低下を示した。3)Met-Proを基質に用い各々の酵素活性の熱安定性を測定した。結果50°C5分間のincubationで正常人ではプロリダーゼ活性は残存したが、患者、妹では活性は完全に消失した。プロリネースでは各々の間に差はなかった。5)Met-Proを基質にして酵素活性を測定する前に、Gly-Proでpreincubateしてその影響をみた。結果、正常人ではpreincubateしたものの方がtotalの活性は増加した。患者、妹では逆にpreincubateした方がtotalの活性は低下していた。考按、プロリダーゼ欠損症の患者においても、基質を変えることにより活性を認めるものもあり、酵素の欠損というより酵素蛋白の性質の変化したものと考えられた。熱安定性,Mn依存性,阻害剤に対する反応,Gly-Proの影響の正常人との反応性の違いはその現れと思われる。今回の実験では患者、妹の間に酵素活性に差は認められず、症状発現の機序については、今後の研究が必要である。
視覚障害者の心的負担の多角的評価とわかりやすいウェブサイトの構造解明に関する研究

インターネットのウェブページは複雑な構造・配置をしているものが多く,視覚に障害があると内容の理解は容易ではない。JISなどで対応方法は提案されているが,それらが,情報検索時にどの程度効果的かは明らかでない。本研究では,複数の評価手法を組み合わせて,検索状況をリアルタイムに観察・測定する。視覚障害者によってどのような階層構造,ボタン配置やメニュー表示などが望ましいかを明らかにし,ウェブサイトのユニバーサルデザインガイドラインの制作を目指す。
骨関連細胞ネットワークによるオッセオインテグレーション獲得機構の解明

インプラント治療は、失われた歯を回復して、機能的および審美的に満足をもたらしてくれる治療法のひとつです。インプラントの長期成功のためには、力がインプラント周囲骨にどのような影響を与えるかを知る必要があるものの、現在までそのような研究はほとんど行われてきませんでした。そこで本研究は、荷重がインプラント周囲骨細胞に与える影響を動物と細胞を用いて明らかにすることを目的としました。その結果、繰り返し荷重は、骨細胞ネットワークに影響を与え、しかも骨細胞を細胞死から遠ざけるように働くことで骨細胞ネットワークを増大させ、骨形成や骨微細構造の改質に影響を及ぼしている可能性が示唆されました。「研究の目的と研究実地計画」現在まで、静的状態におけるインプラント体と生体との相互作用については多くの研究が行われてきたが、荷重下のインプラント体と組織および細胞との相互作用はいまだ不明な点が多く存在する。本研究の目的は、インプラントに対する荷重と骨形成/吸収の関係を、骨細胞を中心に分子生物学的、組織化学的に解明することであり、具体的には、1)ラットによるインプラント埋入モデルを用いた、荷重に対する骨組織の反応性比較解析(in vivoの検索)と、2)培養骨細胞に伸展刺激を加えた際に起こる分子生物学的動態解析、ならびに骨芽細胞か破骨細胞との共培養による相互作用的な細胞動態解析を2年間で遂行することである。「研究実績の概要」本年度はラットを用いたin vivoの研究と、ラット頭蓋骨由来骨芽細胞を用いたin vitroの研究を行った。In vivoの研究に関しては、ラット第一大臼歯を抜歯し、ラット用に開発したインプラントを抜歯後2週間で埋入したものの、オッセオインテグレーション獲得成功率が50%であった。以上のことは実験結果に影響を与える可能性が高いため、現在成功率を80%程度に上昇させるべく、インプラントの規格変更と埋入術式の改変を行っている。一方In vitroの研究に関しては、ラット頭蓋骨由来骨芽細胞を独自に調整した3次元ゲルで培養し、骨細胞へと分化させることに成功した。さらに分化した骨細胞に一定条件の伸展刺激を加えた結果、3次元ゲル中での骨細胞の配列が若干規則性を有し、さらに遺伝子定量解析では、荷重に関与するといわれている各種遺伝子発現の相対的上昇もしくは相対的下降を認めた。このことは、生体内により近い状態で培養され、骨芽細胞から分化した骨細胞が荷重への反応性を示したことを意味し、in vivoの研究では解明が困難な分子生物学的基盤の構築に大きく貢献できると推察される。本研究は、機械的刺激が骨細胞ネットワークにどのような影響を与えているかを解明することを目的としている。申請者は前年度に、ラット頭蓋骨から骨芽細胞を分離し、特殊な培養条件下で簡易的に骨細胞様細胞に分化する方法を確立し、形態学的および遺伝子学的に骨細胞の特徴を有する細胞であることを証明した。本年度はこれら培養骨細胞用細胞に規則的な繰り返し荷重を付与することで、荷重(細胞へのずり応力と細胞自身の形態変化)が骨細胞に与える影響を分子生物学的に検索した。その結果、規則的な繰返し荷重(圧縮と進展)を加えると、培養骨細胞様細胞の細胞死関連遺伝子の発現が優位に変化し、全体として抗アポトーシス作用を示すことが分かった。さらにこれらの遺伝子は数個ではなくかなり多くの遺伝子が連動して作用していることも明らかとなった。さらに申請者らは、細胞死と表裏一体で動くと考えられているオートファジーに関する遺伝子に関しても検索を行った。その結果興味深いことに、オートファジーに関連する特定の遺伝子群が反応性を示し、オートファジー依存性細胞死抑制経路が存在することが強く考えられた。以上のことから、荷重を受けた骨細胞様細胞は、アポトーシスとオートファジーの両者の制御を受けながら荷重応答をしていることが示唆された。現在まで培養骨細胞様細胞に規則的な繰返し荷重を加えた報告はなく、ましてや荷重骨細胞とオートファジーとの関連性を示す基礎研究はわずかに数報にとどまることから、申請者らが明らかにしたことは、骨組織の荷重反応に対する細胞死とオートファジーの関係を解明する上で、極めて重要な足掛かりとなる可能性が考えられた。歯科補綴学In vivoの検索:ラットへのインプラント埋入に対するオッセオインテグレーション獲得成功率が現在50%であり、さらには上顎洞への穿孔も認められる場合があることから、研究結果への影響が懸念されるため、軌道修正が必要である。一方In vitroに関しては、予想以上の成果が達成されていることから、総合的に判断して、「おおむね順調に進展している」を選択した。In vivoの検索:インプラント埋入のオッセオインテグレーション獲得成功率を80%程度まで上昇させなければ実験結果にも影響を与えかねないため、現在既にインプラントの規格変更と術式の改変を行っている段階である。

成功率を上昇させた後は大きな問題点は起こらないことが強く考えられるため、残りの1年で組織検索まで行うことは可能であると考えられる。In vitroの検索:既に骨細胞の荷重への影響について遺伝子レベルまで明らかにされたことから、残りの1年では3次元ゲル中の細胞に対する免疫染色と、骨芽細胞か破骨細胞と共培養した骨細胞に伸展刺激を加え、各細胞間の相互作用を遺伝子レベル・タンパクレベルで明らかにする。追加で注文したラット用のインプラントと上部構造が、使用期限内には手元に届かなかったのが理由である。追加のラット用インプラントと上部構造を速やかに発注する。
機能的複合錯体システムによる特異的電子伝達系の構築

π-共役系高分子ポリアニリンは、可逆的な連続ポテンシャル場を形成している。我々はこのレドックス特性に着目し、酸素雰囲気下、酸化触媒として機能することを見い出し、合成金属触媒システムとして位置づけた。遷移金属を配位させ、互いに共役系で繋がった複合系合成金属触媒システムを構築し、より高い触媒活性を達成した。一方、遷移金属触媒反応において、ポリアニリンがレドックス機能配位子として作用する触媒システムを構築した。ここではポリアニリンと低原子価遷移金属化合物とのレドックスを伴った錯形成に関して検討した。パラジウム錯体とポリアニリン誘導体であるポリ(o-アニシジン)のレドックス過程は紫外-可視スペクトルで観測し、上記触媒反応のレドックス系を確認している。一電子還元能力を有する二価バナジウムは、ポリアニリンの還元に有効であった。三塩化バナジウムと亜鉛から調製した二価バナジウムで処理すると、紫外-可視スペクトルで、ポリアニリン酸化体に基づく630nm付近の幅広い吸収が消失した。この系に酸素を吹き込むと、600nm付近に幅広い吸収が現れた。ポリアニリンの酸化体を含む錯体が生成したと推測される。酸化状態の高い五価バナジウムVO(OEt)_3を二価バナジウムで還元したポリアニリンの溶液に加えることでも、同様な酸化過程が観測された。形式的に酸化状態の異なる二種類のバナジウム化合物を用いることで、ポリアニリンがレドックス相互変換できた。他の還元剤として、二価サマリウムを用いても、同様なポリアニリンの酸化体の還元が観測された。また、酸素による再酸化過程も見られた。さらに、Fc(II),Cu(I),Mn(II)でも、ポリアニリンの還元が誘起できた。以上の如く、ポリアニリン類は遷移金属化合物とレドックス系を形成できることが明らかにされた。
可搬型サブミリ波望遠鏡による中性炭素原子の銀河面の分布の研究

我々は可搬型サブミリ波望遠鏡により中性炭素原子の微細構造線(C_1:^3P_1-^3P_0:492.1607GHz)の広域マッピング観測を計画している。炭素原子の第一イオン化電位は11.266eVと宇宙空間で存在量の多い原子のなかで最も小さいことから電離されやすく、電子の量を支配する。そのために炭素原子の存在形態が星が形成される過程や星間空間での化学進化過程の鍵を握る。しかし、中性炭素原子線は地上大気の水蒸気によって減衰するため観測が難しく、これまでに飛行機実験などによる狭い領域のみしか調べられていない。我々は富士山頂が世界的にみて優れたサブミリ波観測サイトであることを、220GHzラジオメータによる大気等過度測定によって実証した。これによると冬季の40%の時間で中性炭素原子線の観測が可能である。銀河面での中性炭素原子の分布を効率よく観測するためには、小型のデータ収集・制御システムの開発が不可欠である。望遠鏡のデータ収集・制御システムの役割は1.望遠鏡の制御、2.データの収集・記録、3.オンラインモニターがあり、これらを同時におこなう必要がある。これまでの電波望遠鏡ではパソコンを組み合わせたデータ収集・制御システムが用いられてきた。パソコンはシングルタスクであるために1台で3つの仕事を同時にはできない。本研究ではマルチタスクデータ収集システムの開発をおこなうことに成功し、銀河面での中性炭素原子の広域分布を効率よく観測することが可能になった。さらに本システムはデータ通信が可能なことから、将来のサブミリ波望遠鏡の遠隔制御システムの基礎になる。
細胞レベルでの宿主病原菌相互作用機構解析による病害防除に向けた有用遺伝子の探索

べと病は重要病害であり、古くから抵抗性遺伝子による抵抗性品種が利用されてきたが、新レースの出現と抵抗性打破のリスクを常に招いている。宿主植物と病原菌の関係においては、病原菌が標的とする、感染するために必要な宿主側の遺伝子(罹病性遺伝子)が存在し、罹病性遺伝子を欠損させた植物体には病原菌は感染することができない。罹病性遺伝子は、病原菌にとって宿主侵入前後における必須因子であることが予想されるため、その作物への応用は安定的で持続的な病害抵抗性に貢献することが期待される。本研究では、“細胞レベルでの宿主病原菌相互作用機構解析"および“免疫不全変異体を用いた順遺伝学的スクリーニング"を通して、べと病に対する新規の罹病性遺伝子を同定し、その機能解析を行うと同時に有用作物への応用を目指す。■細胞レベルでの宿主病原菌相互作用機構解析昨年度までに、べと病菌が感染している細胞(シロイヌナズナ)由来のmRNAsを濃縮したサンプルにおける、トランスクリプトーム解析を実施し、得られたべと病菌の推定標的遺伝子(罹病性遺伝子候補)が、実際にべと病菌が感染している細胞で特異的に発現が誘導されることを確認していた。今年度、罹病性遺伝子候補の欠損および過剰発現シロイヌナズナを作製した。■免疫不全変異体を用いた順遺伝学的スクリーニング昨年度までに、EMS処理により変異導入したM2の免疫不全シロイヌナズナ変異体を用いて、べと病菌に対して抵抗性を示す変異体を選抜しており、その1ラインについて得られた抵抗性変異体の戻し交配(免疫不全変異体とのクロス)を行い、F2世代の表現型を基にしてゲノムシークエンスを行い、原因遺伝子(罹病性遺伝子候補)を同定していた。今年度、新たにもう1ラインの原因遺伝子(罹病性遺伝子候補)の同定に成功した。本研究では、“細胞レベルでの宿主病原菌相互作用機構解析"および“免疫不全変異体を用いた順遺伝学的スクリーニング"を通して、べと病に対する新規の罹病性遺伝子を同定し、その機能解析を行うと同時に有用作物への応用を目指している。上述の通り、両方のアプローチにより罹病性遺伝子候補が見つかってきており、すでにそれらの欠損および過剰発現シロイヌナズナの作製に着手しており、いくつかについてはすでに作製が完了している。また、特異的な細胞におけるトランスクリプトーム解析については、手法をまとめた形で論文の執筆を始めている。(1)得られた罹病性遺伝子候補の欠損および過剰発現シロイヌナズナを作製し、べと病菌に対する抵抗性の評価と共に、エリシターにより誘導される抵抗反応(活性酸素種生成、カロースの蓄積、防御関連遺伝子の発現など)の評価を行う。(2)過剰発現シロイヌナズナを用いた免疫沈降・質量分析法により、罹病性遺伝子候補産物の宿主(シロイヌナズナ)および病原菌(べと病菌)における相互作用因子を同定し、その欠損変異株や過剰発現株についても(1)と同様の解析を行っていく。(3)有用作物においてゲノム編集技術であるCRISPR法を使用することで迅速に得られた罹病性遺伝子と相同性の高い遺伝子の変異体を作製し、作物における有用性の評価(べと病菌に対する抵抗性の評価)を行う。厚生労働省の発表により、ゲノム編集で開発した作物の流通が認められ、今夏にも販売可能になる見通しとなった。商品化に向けた有用作物における罹病性遺伝子の変異体作製は、当初TILLING法を用いることを想定していたが、本アプローチにより作製する変異体がそのまま商品化に結びつけることが可能となり、本研究の応用への道筋が大きく開かれた。■細胞レベルでの宿主病原菌相互作用機構解析申請書にて示した手法を用いて、べと病菌が感染している細胞由来のmRNAsを濃縮することに成功し、トランスクリプトーム解析を行った。得られたべと病菌の推定標的遺伝子(罹病性遺伝子候補)のプロモーターにGUSを連結したコンストラクトを作製し、その形質転換シロイヌナズナを作製した。作製した形質転換体にベと病菌を接種し、べと病菌が感染している細胞で特異的に発現が誘導されることを確認した。■免疫不全変異体を用いた順遺伝学的スクリーニングこれまでに、EMS処理により変異導入したM2の免疫不全シロイヌナズナ変異体を用いて、べと病菌に対して抵抗性を示す変異体を選抜していた。今年度、得られた抵抗性変異体の戻し交配(免疫不全変異体とのクロス)を行い、F2世代の表現型を基にしてゲノムシークエンスを行い、原因遺伝子(罹病性遺伝子候補)を同定した。現在、上述の罹病性遺伝子候補の欠損および過剰発現シロイヌナズナを作製中であり、今後抵抗性の評価を行っていく。

本研究では、“細胞レベルでの宿主病原菌相互作用機構解析"および“免疫不全変異体を用いた順遺伝学的スクリーニング"を通して、べと病に対する新規の罹病性遺伝子を同定し、その機能解析を行うと同時に有用作物への応用を目指している。上述の通り、両方のアプローチにより罹病性遺伝子候補が見つかってきており、すでにそれらの欠損および過剰発現シロイヌナズナの作製に着手している。また、特異的な細胞におけるトランスクリプトーム解析については、手法をまとめた形で論文の執筆を始めている。べと病は重要病害であり、古くから抵抗性遺伝子による抵抗性品種が利用されてきたが、新レースの出現と抵抗性打破のリスクを常に招いている。宿主植物と病原菌の関係においては、病原菌が標的とする、感染するために必要な宿主側の遺伝子(罹病性遺伝子)が存在し、罹病性遺伝子を欠損させた植物体には病原菌は感染することができない。罹病性遺伝子は、病原菌にとって宿主侵入前後における必須因子であることが予想されるため、その作物への応用は安定的で持続的な病害抵抗性に貢献することが期待される。本研究では、“細胞レベルでの宿主病原菌相互作用機構解析"および“免疫不全変異体を用いた順遺伝学的スクリーニング"を通して、べと病に対する新規の罹病性遺伝子を同定し、その機能解析を行うと同時に有用作物への応用を目指す。■細胞レベルでの宿主病原菌相互作用機構解析昨年度までに、べと病菌が感染している細胞(シロイヌナズナ)由来のmRNAsを濃縮したサンプルにおける、トランスクリプトーム解析を実施し、得られたべと病菌の推定標的遺伝子(罹病性遺伝子候補)が、実際にべと病菌が感染している細胞で特異的に発現が誘導されることを確認していた。今年度、罹病性遺伝子候補の欠損および過剰発現シロイヌナズナを作製した。■免疫不全変異体を用いた順遺伝学的スクリーニング昨年度までに、EMS処理により変異導入したM2の免疫不全シロイヌナズナ変異体を用いて、べと病菌に対して抵抗性を示す変異体を選抜しており、その1ラインについて得られた抵抗性変異体の戻し交配(免疫不全変異体とのクロス)を行い、F2世代の表現型を基にしてゲノムシークエンスを行い、原因遺伝子(罹病性遺伝子候補)を同定していた。今年度、新たにもう1ラインの原因遺伝子(罹病性遺伝子候補)の同定に成功した。上述の通り、両方のアプローチにより罹病性遺伝子候補が見つかってきており、すでにそれらの欠損および過剰発現シロイヌナズナの作製に着手しており、いくつかについてはすでに作製が完了している。(1)得られた罹病性遺伝子候補の欠損および過剰発現シロイヌナズナを作製し、べと病菌に対する抵抗性の評価と共に、エリシターにより誘導される抵抗反応(活性酸素種生成、カロースの蓄積、防御関連遺伝子の発現など)の評価を行う。(2)過剰発現シロイヌナズナを用いた免疫沈降・質量分析法により、罹病性遺伝子候補産物の宿主(シロイヌナズナ)および病原菌(べと病菌)における相互作用因子を同定し、その欠損変異株や過剰発現株についても(1)と同様の解析を行っていく。(3)有用作物においてゲノム編集技術であるCRISPR
清代初期政治思想の多角的研究-朱子学中心として-

本研究においては、まずこの時期に関する先行諸研究の有した問題意識や視角を検討することを通じて、それらが看過してきた諸問題を明らかにすることを試みた。すなわち従来の思想史研究においては、朱子学や陽明学に関する既成の固定的なイメージに依拠して立論が組み立てられ、それらが歴史的に変容しつつ推移していった過程が必ずしも正確に迹づけられなかったこと、又、同一の思想を標榜する人びとの間にあっても、具体的な政治論においても地域的な偏差が顕著に存在することなどが等閑視されてきたことを明らかにした。その上で、清代初期に見られた朱子学の復興現象をその社会的思想史的意味に留意しつつ検証した。その際、特に個別的な政治理論を中心にそれぞれの思想の地域的特性を闡明することを心掛けた。こうした研究を通じて、この時期の朱子学は、当時の社会的な流動現象に対応しての社会的・思想的な秩序回復を企図するものであり、その点で、これに先行する明代末期の東林派系統の思想や同時代のいわゆる経世致用派の思想とも共通する志向を有していたことを論証した。又、その背後には、時に原理主義的な側面をも併せ持つ、一種の復古主義的な礼教理念への回帰が看取され、それが同時に社会のより広汎な層への具体的な礼教規範の滲透という時代的な流れや要請とも即応していたことをある程度、明らかにし得た。こうした思想のより理念的な局面においては、当時の思想家たちの間にかなりの程度、共通了解が成立していたことが類推され、地域的な偏差は、むしろ各地域の個別的な利害が現出し易い具体的な政治論などの局面に限られいてたことも併せて予測された。理念と実践の双方による礼教規範の全社会的な滲透は清代を通じて進行するが、かかる側面から考える時、結論として、一見、無関係に見える顔朱子派や考證学なども、清代初期以来の大きな社会的・思想史的展開のなかに確かに位置づけられよう。
ACTHの抗けいれん作用機序に関する臨床薬理学的研究及び実験形態学的研究

2.ACTH-Z250μgを7日間ラット腹腔内投与した結果、大脳皮質のbenzo-diazepine受容体密度(Bmax)が対照群に比し、有意に低下した。親和性Kdは有意な変化を認めなかった。一方ラット小脳では、Bmax,Kd共に変化を認めなかった。ACTH-Z投与により、ACTH-Zそのものあるいは副腎皮質ホルモンを介して、benzodiazepine受容体に作用すると考えられる内因性リガンドの動員の可能性が示唆される。またbenzodiazepine受容体とGABA受容体の関連性から、GABA作動性ニューロンへの影響も推察される。4.ACTH-Zのラット脳内カテコラミン,セロトニンへの影響を、カテコラミン蛍光法,抗セロトニン抗体を用いたPAD法により、組織化学的手法を用いて検討した。その結果、正常対照ラット比し、ACTH-Z投与ラット(100μg,5日間筋注)では、大脳皮質、扁桃核のカテコラミン蛍光強度が、やや増〓する傾向を認めた。カテコラミン線維の分布等、形態学的には有意差を認めなかった。脳内セロトニン含有神経に関しては、ACTH-Z投与群,対照群の間に、染色性,分布,形態等において、免疫組識形態学的に、差異は認められなかった。
CSアンプラグドのアルゴリズム学習法を支援する自作教材の効果

本研究は、コンピュータサイエンスアンプラグド学習法(以下、CSアンプラグドきと記す)について、学習効果の向上と学習対象の拡大を目的に、学習法の改善を試みたものである。CSアンブラグドはデータに見立てたカード教具などを動かしながらコンピュータの仕組みを体験的に学ぶ学習法である。AC駅米国計算機学会)のモデルカリキュラムの中でも推奨された優れた学習法である。しかし、CSアンプラグドは高等学校の情報教育や障害者職業能力開発校のために開発された学習法ではないため、それらの学校で適用するために、どのような工夫や改善が必要となるかは明らかにされていない。そこで、各学校での授業実践並びに教具と授業法の開発を行いながら、必要となる改善点を調査した。高等学校への適用については、必修科目情報科の授業と連携し、内容の理解を深めるための改〓点を調査した。情報を科学的に理解するために必要なアルゴリズムの学習について、教具や授業形態の違いが理解度に影響を与えるだろうという仮説を立て、学習条件を変えた複数の授業による比較実験を行った。その結果、アルゴリズムを実行する回数が理解度に影響を与えることと、グループ活動と個人活動を組み合わせることで理解が深まることを明らかにした。その論文は学術的価値を認められ、情報処理学会の論文誌(「教育とコンピュータ」特集号)にジャーナル論文として採録された。障害者職業能力開発校への適用については、エンジニアを目指す職業訓練コースと連携し、障害によって困難な動作の支援を調査した。カード教具の扱いが困難な上肢障害者に対して、カードの裏返し動作等を支援する教具を開発し、その利用状況を調査した。また、視覚情報を得られない視覚障害者に対しては、指先の感触や音声情報から本来求められる思考を実現するための教具を開発し、その利用状況を調査した。これらについては今後検証と考察を深めた上で、学会発表をしたいと考えている。
脳内ミクログリア細胞に発現する骨関連遺伝子の機能解析

本年度は、ミクログリア細胞における骨関連因子Runx2の機能的役割について更なる検討を行うため、Runx2を過剰発現させたミクログリア細胞株BV-2細胞を用いて各種ミクログリアの機能解析を行った。さらに、生体内のミクログリア細胞におけるRunx2の機能的役割について検討を行うため、Runx2欠損マウスを用いて解析を行った。その結果、ミクログリア細胞の機能の1つである遊走能を測定する目的でトランスウェルを用いて検討を行ったところ、Runx2過剰発現BV-2細胞において、走化因子であるM-CSFにより移動した細胞の数が有意に上昇した。また、Exon4を含む遺伝子領域をloxPで挟んだmutant alleleを持つRunx2 flox/+マウスと、ミクログリアなどに特異的にCre recombinaseを発現するLyz2-creマウスを交配させることにより、Cre-loxPシステムを用いた細胞特異的なノックアウトマウス(Runx2Lyz2-/-マウス)を作製した。さらに、このマウスの第4腰髄神経を切断することで神経障害性疼痛モデルマウスを作製し、von Freyフィラメントを用いて痛みの評価試験を行ったところ、痛みの過敏化がRunx2Lyz2-/-マウスで有意に抑制され、さらに脊髄後角で認められるミクログリア細胞の活性化も有意な抑制が観察された。以上の結果から、ミクログリア細胞において発現するRunx2は、その役割の1つとしてミクログリアの機能である走化能などを調節する可能性が示唆された。さらに、ミクログリア細胞の活性化により引き起こされる神経障害性疼痛の発症機序にRunx2が関与している可能性が示唆された。これらの解析がミクログリア細胞の更なる機能解明と、中枢の各種疾患に対する治療法や治療薬の開発に新たな展望をもたらすことを期待したい。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、ミクログリア細胞株BV-2細胞において、細胞内シグナル分子に対する各種阻害剤を用いることで、ミクログリア細胞における細胞外高濃度ATPによる骨関連因子Runt-related transcription factor 2(Runx2)の発現上昇メカニズムの更なる解析を試みた。さらに、実際の生体内におけるミクログリア細胞においても、Runx2の発現上昇が起こる可能性について検討を行うため、脳海馬の神経細胞死を誘発することが知られているカイニン酸を投与したマウスを用いて解析を行った。その結果、BV-2細胞において、細胞内シグナル分子に対する各種阻害剤によるRunx2発現量への影響について、RT-PCR法により解析を行ったところ、カルシニューリンの阻害剤として知られるシクロスポリンA及びFK506、さらにカルモジュリンのアンタゴニストであるW-7の添加により、高濃度ATPによるRunx2 mRNAの発現上昇が有意に抑制された。また、カイニン酸を投与したマウスの脳より凍結切片を作成し、ミクログリア細胞におけるRunx2の発現を免疫組織化学法により検討を行ったところ、カイニン酸を投与したマウスの脳海馬では、ミクログリア細胞のマーカータンパク質である坑Iba1抗体陽性細胞のうち、坑Runx2抗体陽性細胞数の割合が増加した。以上の結果から、ミクログリア細胞におけるRunx2の発現上昇はカルモジュリン-カルシニューリン経路の活性化を介したもの、さらにはこの反応は実際の生体内でも起こりうる反応であることが示唆された。様々な中枢神経系の疾患において、高濃度に上昇した細胞外ATPにより活性化されたミクログリア細胞が非常に重要であることが示唆されているものの、その役割や機能発現に関する細胞内メカニズムに関して、未だ十分な解析が行われていないのが現状である。本研究によるミクログリア細胞における高濃度ATPによるRunx2発現上昇メカニズムおよび機能的発現の解明は、神経変性疾患治療に新たな知見を与える可能性が考えられ、非常に意義あるものである。本年度は、ミクログリア細胞株BV-2細胞において、転写因子に対する各種siRNAによるノックダウン実験を行うことで、ミクログリア細胞における細胞外高濃度ATPによる骨関連因子Runx2の発現上昇を制御する転写因子の解明を試みた。さらに、ミクログリア細胞におけるRunx2の機能的役割について検討を行うため、Runx2過剰発現BV-2細胞を用いて各種ミクログリアの機能解析を行った。その結果、HEK293細胞において、ルシフェラーゼレポーターアッセイシステムにより、転写因子C/EBPβがRunx2プロモーターを活性化させることがわかり、またBV-2細胞において1 mM ATPを曝露した際に、核内においてC/EBPβの発現量が上昇することが明らかとなった。さらに、この時siC/EBPβにより発現量をノックダウンしたBV-2細胞では、1 mM ATPによるRunx2の発現量上昇が抑制されることがWestern blottingにより明らかとなった。また、Runx2発現レンチウイルスベクターにより、Runx2を過剰発現させたBV-2細胞において、RT-PCR法により各種遺伝子発現について検討を行ったところ、骨芽細胞においてすでに発現を制御することが知られているMMP/3や、ケモカイン受容体として知られるCX3CR1やCCR2のmRNA発現量の有意な上昇も観察された。次に、phagocytosisまたはpinocytosisを測定する目的で蛍光ビーズの取り込み能についてFlow cytometry analysisにより検討を行ったところ、Rnux2過剰発現BV-2細胞群において取り込み能の上昇が観察された。以上の結果から、ミクログリア細胞におけるRunx2の発現上昇は転写因子C/EBPβにより制御される可能性が示唆された。

さらにミクログリア細胞に発現するRunx2も転写因子として機能し、各種遺伝子の発現を制御することでミクログリアの機能を調節する可能性が示唆された。このことから、ミクログリア細胞に発現するRunx2の発現制御機構および機能的役割の詳細な解明は、未だ不明な部分の多いミクログリアの機能解明と共に、ミクログリア細胞をターゲットとした新たな知見を与える可能性が考えられ、非常に意義あるものである。本年度は、ミクログリア細胞における骨関連因子Runx2の機能的役割について更なる検討を行うため、Runx2を過剰発現させたミクログリア細胞株BV-2細胞を用いて各種ミクログリアの機能解析を行った。さらに、生体内のミクログリア細胞におけるRunx2の機能的役割について検討を行うため、Runx2欠損マウスを用いて解析を行った。その結果、ミクログリア細胞の機能の1つである遊走能を測定する目的でトランスウェルを用いて検討を行ったところ、Runx2過剰発現BV-2細胞において、走化因子であるM-CSFにより移動した細胞の数が有意に上昇した。また、Exon4を含む遺伝子領域をloxPで挟んだmutant alleleを持つRunx2 flox/+マウスと、ミクログリアなどに特異的にCre recombinaseを発現するLyz2-creマウスを交配させることにより、Cre-loxPシステムを用いた細胞特異的なノックアウトマウス(Runx2Lyz2-/-マウス)を作製した。さらに、このマウスの第4腰髄神経を切断することで神経障害性疼痛モデルマウスを作製し、von Freyフィラメントを用いて痛みの評価試験を行ったところ、痛みの過敏化がRunx2Lyz2-/-マウスで有意に抑制され、さらに脊髄後角で認められるミクログリア細胞の活性化も有意な抑制が観察された。以上の結果から、ミクログリア細胞において発現するRunx2は、その役割の1つとしてミクログリアの機能である走化能などを調節する可能性が示唆された。さらに、ミクログリア細胞の活性化により引き起こされる神経障害性疼痛の発症機序にRunx2が関与している可能性が示唆された。これらの解析がミクログリア細胞の更なる機能解明と、中枢の各種疾患に対する治療法や治療薬の開発に新たな展望をもたらすことを期待したい。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の研究成果により、研究の目的であったミクログリア細胞におけるRunx2の発現上昇メカニズムについて、その細胞内シグナル経路の大部分を明らかとすることができたこと、さらには、実際の生体内におけるミクログリア細胞においてもRunx2の発現が上昇する可能性が示唆されたことにより、研究の目的であったミクログリア細胞をターゲットとした脳疾患予防や治療というた臨床的応用性の可能性について示したことから、おおむね順調に進展していると考えられる。
有機・無機ハイブリッド・ペロブスカイト半導体における光照射下電気伝導機構の解明

本年度は、昨年度のMAPbI3の電気伝動機構の解析を引き続き研究した上で、構造解析を進めた。MAPbI3太陽電池は一定条件下で作成の上、XRDによる構造解析の結果、一般的なMAPbI3ピークを検出した。さらに長期大気放置、もしくはデバイスを窒素雰囲気で封止した後、低周波数を含む周波数変化に対して何れもイオン伝導性を含む周波数変化を示すものの、特にイオン伝導性の部分に経過時間に対する変化が見られた。この結果により、時間経過に対して電気伝動機構は変化している事が示唆される。一方、構造解析においては大きな変化は観測されなかった。以上の結果から時間経過により大幅な構造変化が生じるわけではないものの、構造内の微小変化、特に光電変化時の伝動機構に何らかの変化を生じ、同太陽電池対する長期信頼性、特に即時の封止処理が後の長期信頼性に重要な影響を与える事が示唆される。更にMAPbI3太陽電池の光劣化発現光源について、紫外光源を連続スペクトル光からLED光を用いた場合にも同様の経緯を示す事を確認し、必要となる光エネルギーがバンドギャップ光よりも大幅に大きいことが示された。以上より、MAPbI3の光劣化現象はバンドギャップを司る結合とは異なる部分に起因する現象である事が示され、400nm以上の波長領域ではほぼ光照射による発電性能低下が'生じないことが示された。この結果は同太陽電池は異種材料とのスタック構造を含めた紫外吸収材を用いることにより、長期安定性能の確保が可能となることを示唆するものである。当初予定していた計画では本年度で低温を含む温度変化時の計測を推し進める予定であったが、異動によりデバイス作成系および評価系の再構築、さらには評価においても当初計画より常温時の計測に時間を要し、温度変化に対する項目の部分では一部遅れも生じていが、計画のほとんどは計画通り進めることが出来、計画外の成果も得られている。平成31年度は昨年までの知見を元に、最終年度として長期信頼性に対する評価に特化した研究を推し進める予定である。特に高温でのデバイス動作時において、同太陽電池の材質変化が疑われ、変化量はデバイス作製時の品質、及び動作環境に強く依存じ、長期の安定動作に大きく影響を与える事が予想される。本年度では酸化を抑止する治具を用いた劣化抑止に関する研究を推し進め、将来の安定動作に必要となる知見を、電気伝導解析を含めた部分で推し進める予定である。近年、急速に変換効率向上を果たしたペロブスカイト太陽電池において、長期光安定性の確立、および大量生産に向けた各種要素技術の開発が急がれている。本研究では、光照射下における電気伝導機構解明のため、太陽電池構造として基本的なFTO/TiO2 compact/TiO2 Meso/ MAPbI3/ HTM/ Auを用い、光照射時C-f、およびG-f測定から伝動機構を考察する。初年度では、最初に太陽電池発電の製膜技術の確定、および同材料において広く知られる諸現象について確認を行った。まず、上記の太陽電池構造にて、疑似太陽光装置(白色光)での光照射実験にて、初期変換効率13%以上を達成し、自身の研究施設でも評価対象となり得るデバイス作製技術を実現した。ただ、同構造では予想される光劣化現象、すなわち連続光照射下では光電変換性能が明確に低下し、さらに暗所で大気中に放置することにより、変換性能は製膜初期にまで回復する事を確認した。上記のデバイスにおいて安定した光照射時測定系の確保のために、特に計測条件に注目し、測定時間間隔の調節により、安定した計測手法の確立を果たした。また、この計測は。光強度にも依存し、長期光照射下条件での計測にも応用可能であると考えている。今後は同手法を元に、光照射光源による影響も精査した上に、光電変換層などの各種材料に影響とバンド構造を換算した上での光照射下での伝導の挙動から、目的である同材料の伝動機構を明らかにする予定である。本年度では、光照射下での計測手法や研究指針の確立を図り、特に太陽電池特性導出の基本であるJ-V測定を行いながら、光応答性、すなわち光照射後からの安定状態に変遷擦るまで数秒程度の時間を要する同材料においての知見を得ることにより、本研究の目的である光照射下の伝動機構の導出や光劣化挙動を導出する際に必要となるためである。結果当初の研究計画に示したように、基礎構造の作成技術確立と、光応答性の知見を得ることが出来、これまで研究代表者が他の薄膜太陽電池材料で得たような知見、すなわち拡張指数関数による、電気伝動機構の考察手法がペロブスカイト半導体材料にも適用可能である事を強く示唆する知見を得た。以上の結果から、現状で計画通りに進んでいるものと考えている。

更にMAPbI3太陽電池の光劣化発現光源について、紫外光源を連続スペクトル光からLED光を用いた場合にも同様の経緯を示す事を確認し、必要となる光エネルギーがバンドギャップ光よりも大幅に大きいことが示された。以上より、MAPbI3の光劣化現象はバンドギャップを司る結合とは異なる部分に起因する現象である事が示され、400nm以上の波長領域ではほぼ光照射による発電性能低下が'生じないことが示された。この結果は同太陽電池は異種材料とのスタック構造を含めた紫外吸収材を用いることにより、長期安定性能の確保が可能となることを示唆するものである。当初予定していた計画では本年度で低温を含む温度変化時の計測を推し進める予定であったが、異動によりデバイス作成系および評価系の再構築、さらには評価においても当初計画より常温時の計測に時間を要し、温度変化に対する項目の部分では一部遅れも生じていが、計画のほとんどは計画通り進めることが出来、計画外の成果も得られている。平成30年度では、これまでの研究成果を論文にまとめ上げるため、更なる研究を行う予定である。すなわち、現状での光応答性に加え、光劣化現象にまで拡張させるものである。このためには光源波長の選択による同太陽電池性能への影響、さらには同太陽電池の動作温度への影響を考察し、光劣化現象の発現メカニズムを考察しながら、電子・正孔のキャリアのみならず、イオンによる伝動機構とデバイス動作への影響を精査する所存である。平成31年度は昨年までの知見を元に、最終年度として長期信頼性に対する評価に特化した研究を推し進める予定である。特に高温でのデバイス動作時において、同太陽電池の材質変化が疑われ、変化量はデバイス作製時の品質、及び動作環境に強く依存じ、長期の安定動作に大きく影響を与える事が予想される。本年度では酸化を抑止する治具を用いた劣化抑止に関する研究を推し進め、将来の安定動作に必要となる知見を、電気伝導解析を含めた部分で推し進める予定である。初年度の研究に予定されていた、材料購入費を本園度は別予算に使用する事が出来たためである。30年度では予定されている装置の購入、さらには試料材料の購入のために、余剰額を使用する予定である。年度末に物品費として、購入しようとした薬品に会社としての品質に一時的な不具合が生じ、出荷停止となっている。平成31年度中に再販予定となっている。同材料は他社からも販売されているが、原料は供給会社によって品質が変化し、同条件で作成してもサンプルの品質が異なることが多くある。よってこの金額相当分を次年度使用額として、販売再開された際に使用する必要が生じた。再販され次第即時購入予定である。
健康医学における検査法の体系化

「健康医学における検査法の体系化」として検査法を1.発病予知検査、2.ストレスの検査、3.機能検査に分類し、2年間かけて必要な検査法の開発と、検査室レベルで日常検査として行えるような検査法を確立した。(1)発病予知検査は特に遺伝子検査の確立を目標に、アンギオテンシン変換酵素、ビタミンDについてPCR法を基本にした臨床遺伝子検査法を確立した。(2)ストレスの検査については、副腎ホルモン系の尿中17OHCS、17KS、DHEAの検査方法を確立した。自律神経系の検査としては、ホルター心電図周波数解析法の応用、ドパミンD1レセプタの遺伝子検査法の開発をした。又、気管支の喘息患者をモデルに、交感神経だけでなく副交感神経の関与についても研究中である。(3)高齢期における機能検査の一つとして、肺機能をモニタリングできるように検査法を改良した。研究の最終年に「アンギオテンシン変換酵素およびビタミンDの遺伝子型と高血圧症との関係」について臨床的に実証した。又、スポーツと検査との関係につていも研究した。スポーツを発病予防の方法として実用するために、スポーツによる人間の血液成分(酵素、電解質、残余窒素など)の変動を解析し、最適運動量の検討をしている。1「健康医学における検査法の体系化」についてPolymerase Chaine Reaction(PCR)法を中心とした遺伝子検査法の検査室レベルのルーチン化が出来るように、手技の確立をした。性異常、不妊に関する遺伝子検査法を開発した。すなわちY染色体の睾丸因子のSRY、精子に関するマルチプレクス法を開発し、専門雑誌に発表した。2アンギオテンシン変換酵素の多型性についての遺伝子検査法を確立し、高血圧症との関係を研究し、専門雑誌に発表すると同時に、国際医学学会でも発表した。3高血圧症と血小板内Ca^<++>、Ma^<++>との関係を研究し、高血圧症の予防法の可能性を検討した。4超音波検査法による、動脈硬化を予測する循環機能検査を開発し、外国専門雑誌に発表した。今年度は研究を開始して2年目になり、次のような具体的な成果が得られた。1)アルギオテンシン変換酵素の遺伝子診断検査法の測定方法を確立し、高血圧症患者と健常者とのアンギオテンシン変換酵素の特徴について統計学的に解析した。2)骨代謝に関係する、ビタミンDレセプターの遺伝子診断検査法の測定方法を確立し、実際に臨床応用した。ビタミンDレセプターの遺伝子と骨代謝異常との関係および高血圧症との関係について成績を得た。3)呼吸機能を知るパルスオキシメトリーの生理的意義について解析し、呼吸機能のモニタリングとしての可能性があることを実証した。4)ストレスの検査の体系化について、ストレスと副腎皮質ホルモンとの関係、ストレスとホルター心電図との関係について成績を得た。5)ヒト血小板内の電解質、特にMg^<++>と高血圧症との関係を解明した。今年度は3年間続けた本研究の最終年になる。「健康医学における検査法の体系化」について集大成する年である。健康を維持・管理するための検査法として、発病予知検査に関して、各種遺伝子検査の開発をした。今年度は特に血管作動物質であるアンギオテンシン変換酵素の遺伝子多型性に関する検査法を確立し、高血圧症との関係について実際に臨床研究を行い、欧文医学雑誌に報告した。さらに、骨粗鬆症に関するビタミンDレセプタの遺伝子多型性の検査法を確立するとともに、その検査法を応用して高血圧症とビタミンDレセプタの遺伝子多型性との関係について臨床研究を行った。今年度は、ストレスの検査についても副腎ホルモン系の検査法を高速液体クロマトグラフィ(HPLC)法を用いて確立するとともに、自律神経系の交感神経由来のドパミンのD1レセプタの心筋細胞の存在を遺伝子検査を利用して実証し、国際学会で発表した。更に、健康の増進、発病予防を目的にスポーツの活用を視野に入れ、スポーツにより人間の血液成分がどのような変動をするかを研究し、その一部を邦文医学雑誌に報告した。スポーツと検査については、特に従来いわれているスポーツによって変動する血液成分以外の成分、Mg^<2+>などの電解質の変動などの新知見を得た。
ヒト刺激伝導系の分子生物学的同定法の開発

刺激伝導系に関する情報は心内修復術を行う上で非常に重要なものである。ヒトの刺激伝導系の走行は、疾患によって様々であり、今までに解明されていない点が非常に多い。そのために、発生に関するマーカーが必要である心室部の刺激伝導系のマーカーには報告例があるが、洞結節から末梢までの伝導系に共通でかつ特異的なマーカーは、まだその報告例はない。(心臓の刺激伝導系細胞にIP3Receptor遺伝子の発現が著明に認められるということが、L.Gorzaらにより93年に報告されている。人の心臓のホルマリン固定標本を用いて、刺激伝導系の部分を切り出しパラフィン包埋を行い、5μmの厚さの切片を作製を行った(本研究には剖検検体を使用したが、使用に際しては患者家族の承諾を得た)。その切片に対して、IP3Receptorのモノクローナル抗体を用いての免疫組織化学染色の施行した。そして、それらの染色結果より刺激伝導系の心筋細胞と作業心筋細胞との差異を検討することより開始した。刺激伝導系がリッチに存在する部位の染色陽性細胞の数としては、他の心筋細胞の存在する部位と比べて、有為な差異は今回の結果の範囲では認められなかった。しかし、刺激伝導系細胞の部位の陽性細胞の染色濃度は、他の心筋細胞と比べて濃かったことより、IP3Receptorの数が刺激伝導系細胞では増加していることが示唆された。また、実験動物の心筋標本を用いて、IP3ReceptorのcRNAによるin situ hybridizationにより、その発現を確認した。刺激伝導系での検索をすすめている段階である。
難治性パニック障害の予後予測因子解明と発達特性にマッチした修正型心理療法の開発

難治性のパニック障害の患者に対して、発達障害傾向、パニック障害の重症度、併存精神疾患を評価する。その後に介入として、疾患横断的に効果があるとされるアクセプタンス&コミットメント・セラピーを元とした独自のプログラムを施行する。その際に発達障害傾向がACTを行った際の予後予測因子となるかどうかを検討する。さらに発達障害傾向の高いものに対してACT治療後にインタヴューを行い、それをもとに発達特性に適した修正版ACTプログラムの開発を行う。
ＮＯＸ１を標的とするメタボリックシンドロームの治療戦略

糖尿病病態下の高血糖による活性酸素種(ROS)産生の亢進はメタボリックシンドロームの発症・進展に寄与することが知られている。今回生体内ROSの産生源であるNADPHオキシダーゼのNOX1分子種について慢性腎臓病モデルを用いてその関与を明らかにすることで新しい薬物治療の標的としての可能性を検討した。NOX1由来のROSは高血糖下において蛋白キナーゼPKCを介してp38/p27 Kip1シグナル伝達経路を活性化し、糸球体肥大を伴う細胞老化を促進することが示された。本研究からNOX1/NADPHオキシダーゼの阻害により細胞老化を抑制するという新しい治療戦略の道筋が示された。我々は血中遊離脂肪酸が増加する高脂肪食負荷ApoEノックアウトマウス(ApoEKO)の肝臓においてNOX1の発現が著明に上昇することを見出し、同時に経時的な血圧上昇を認めたことから(J Pharmacol Sci 111,260-8, 2009)、NOX1ノックアウトマウス(NOXIKO)と同腹野生型マウス(WT)の高脂肪食負荷メタボリックシンドローム(MB)モデルを用いてNOX1の病態生理学的役割を明らかにすることとした。NOXIKOとWTに10週齢より高脂肪食を負荷し、経時的に体重変化を観察したところ、高脂肪食負荷群では通常食負荷群よりも両遺伝子型で同程度の体重増加を認め、肝臓の中性脂肪含量について両遺伝子型間に差を認めなかった。WTの肝臓では高脂肪食負荷によりNOX1の発現に有意の増加がみられ、ApoEKOと同様の所見を認めた。高脂肪食負荷に伴う血中コレステロールと遊離脂肪酸増加については両遺伝子型で差を認めなかったが、肝臓逸脱酵素ALTの上昇はNOXIKOで有意に抑制されていた。他方、肝臓における炎症性サイトカインIL-1betaとTNF-alphaは両遺伝子型間で差を示さなかった。しかし肝細胞アポトーシスの指標であるcleaved-caspase 3のレベルはNOXIKOで有意に抑制されており、TUNEL陽性細胞もKOでは減少していることが観察された。以上の結果から、MBモデルにおいてNOX1由来の活性酸素種が肝障害の分子病態に関わっていることが明らかとなった。一方、NOX1トランスジェニックマウス(Nox1Tg)を用いて高脂肪食負荷を行い、血管石灰化に関わるBMP-2とBMP-2アンタゴニストとして働くMGPの発現を検討したが、同腹WTマウスとの間に差を認めなかった。腎臓は血圧調節に重要な器官であり,摘出ヘンレ係蹄上行脚(TAL)を用いた実験ではアンギオテンシン(Ang) II処置により活性酸素種ROSが産生され,ROSがNa+の再吸収を促進するとともに,蛋白キナーゼC (PKC)を介してNa+-K+-2Cl- cotransporter活性を亢進することが報告されている.しかしTALにおけるROSの産生源は明らかでない.腎臓のNOX1由来のROSが血圧調節に関わっている可能性を追究するために異なるNa+摂取量,すなわち通常食および低塩食給餌下に尿中イオン排泄量を検討した.マウスをメタボリックケージに入れ1匹ずつ7日間飼育し,体重,飲水量,食餌量,尿量,糞量,尿全量中における電解質の排出量を測定した.普通食,および低塩分食給餌下ともすべての項目において野生型マウス(WT)とNox1遺伝子欠損マウス(KO)に有意な差を認めなかった.続いてAng II投与による高血圧モデルを作製し解析を行ったが,すべての項目について両遺伝子型マウス間に差を認めなかった.一方,1型糖尿病モデルの腎臓でNOX1の発現が著明に上昇することから,ストレプトゾトシンで高血糖を誘発し,38週後NOX1発現上昇に伴う腎機能の変化を解析した.腎機能については血中BUN,血中および尿中クレアチニン,尿中アルブミン,尿細管傷害のマーカーN-acetyl-beta-D-glucosaminidase濃度を測定したが,いずれの遺伝子型マウスについても同様の変化を示し,差異を認めなかった.組織の炎症反応や線維化に関わる諸種の遺伝子の発現についても両遺伝子型間に差は無かったが,酸化ストレス亢進によるDNA傷害の指標である尿中8-OHDGと組織脂質過酸化の指標であるTBARSについては顕著な上昇を示すWTに比し, KOで低値を示した.生体内ROSの主要産生源であるNADPHオキシダーゼの触媒サブユニットNOXには複数の分子種が存在し,腎臓ではNOX1, NOX2, NOX4の発現が認められる.1型糖尿病モデルの腎臓でNOX1の発現が著明に上昇することから,Nox1遺伝子欠損マウス(KO)を用いて糖尿病性腎症におけるNOX1の役割を明らかにすることとした.7週齢のKOと同腹野生型マウス(WT)尾静脈からストレプトゾトシンを2回投与して高血糖を誘発した3週後の時点において,腎障害の指標となるアルブミン尿および血清尿素窒素の上昇,炎症や線維化に関わる諸因子の遺伝子発現,炎症性細胞の浸潤については両遺伝子型マウス間に差は認められなかった.しかしHE染色による組織学的解析ではWT群の腎臓で認められる糸球体体積およびメサンギウム領域の拡大はKOで有意に抑制されていた.一方,酸化ストレスの指標である腎組織中8-OHdGとTBARSはWT群で顕著に増加していたが,KOでは有意に抑制されていた.