hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腹膜偽粘液腫の臨床応用に向けたシークエンス解析とマウスモデル作製による基盤研究

本研究の目的は、腹膜偽粘液腫の病態メカニズムを明らかにすること、動物モデルを作製することである。方法として、腹膜偽粘液腫の臨床検体を用いて、全ゲノムシークエンス・網羅的発現解析を行い、遺伝子変異を同定した。また腹膜偽粘液腫で高頻度に変異が認められるKRAS遺伝子変異とGNAS遺伝子変異を大腸特異的に発現させたマウスを作製する。腹膜偽粘液腫のマウスモデル作製については、CDX2-Creにより大腸特異的に変異型GNASを発現させても腫瘍形成はされないが、GNAS, KRASを大腸特異的に発現させると虫垂に腫瘍が形成された。しかし、粘液産生過多などのフェノタイプを再現することができなかった。そのため、patient-derived xenograftの作製に変更した。ヌードマウスに細片化した腫瘍組織を腹腔内に同所性移植したところ、腫瘍が形成された。本研究は、希少がんである腹膜偽粘液腫の臨床検体を用いて、全ゲノムシークエンス・網羅的発現解析を行い、病態メカニズムを明らかにすること、また腹膜偽粘液腫で高頻度に変異が認められるKRAS遺伝子変異とGNAS遺伝子変異を大腸特異的に発現させたマウスを作製することにより、臨床応用のためのPMP動物モデルを確立することを目的としている。腹膜偽粘液腫の臨床検体を用いた全ゲノムシークエンスについて、実験は終了し、現在解析中である。また、腹膜偽粘液腫のマウスモデル作製については、初回に作成したCDX2-Creマウスにおいて胎生致死が生じて、CDX2-Creマウスの変更を行い、時間がかかった。作製されたマウスにおいて虫垂に腫瘍は形成されたものの、疾患の特徴である著しい粘液産生のフェノタイプは認められなかった。現在はGNAS・KRAS変異マウスおよびKRAS変異マウスについて数を増やし、病理学的に差が生じるのかどうか経過観察している。解析終了後、速やかに論文作成に移る。網羅的発現解析については実験、解析は終了し、現在論文作成中である。現在はGNAS・KRAS変異マウスおよびKRAS変異マウスにて数を増やし、病理学的に差が生じるのかどうか経過観察している。有意差が出ない場合は、Cre-mouseの変更を行うことや、腹膜偽粘液腫の腫瘍組織をヌードマウスに移植してつくる、患者由来ゼノグラフトを行うことを検討している。
咬合感覚閾値の経時的変化が心理的ストレスにより可塑性変調する可能性に関する研究

歯根膜感覚および咬合感覚は,日常的な出来事や外界変化に応じて一定の範囲内で経時的に変動しつつ,心理的刺激因子の種類や程度によっては可塑性変調する可能性がある.本研究では視覚的に心理的ストレスを与えた場合の歯根膜感覚と咬合感覚の経時的変化に関して検討を加えた.その結果,心理的ストレスの増加に伴って歯根膜感覚は鈍磨化を主とした変化を示すものの,咬合感覚は鋭敏化する可塑性変化を示す可能性があることが明らかとなった.申請内容に従って,健常成人22名(男性12名,女性10名,平均年齢26.7±4.1歳)を対象とし,脳電図を記録しつつ上顎右側第一大臼歯の歯根膜感覚閾値(Force Perceptional Threshold; FPT)および咬合感覚閾値(Voluntary Biting Force; VBF)を,5分間の閉眼安静直後,5分間の視覚的心理的ストレス呈示直後,および再度の5分間閉眼安静直後に計測した.実験終了後に,呈示スライドに対する心理的ストレスの主観評価をVisual Analog Scaleによって行い,その結果から,被験者を低ストレス群,中ストレス群,高ストレス群に分けて解析を行った.脳電図に関しては,全群において閉眼安静時にα波が優位に観察され,スライド呈示時には前頭部優位にβ波が観察された.FPTに関しては,低ストレス群においてスライド呈示後に有意に増加した(one way repeated ANOVA, p = 0.006).中ストレス群では計測時期における有意差はみられず,スライド呈示前後には有意な相関(R = 0.772, p = 0.003)がみられた.高ストレス群では,初回と2度目の閉眼安静直後のFPT値に統計的有意差がみられた(one way repeated ANOVA, p = 0.007).一方,VBFに関しては,中ストレス群においてスライド呈示後に有意な減少がみられ(one way repeated ANOVA, p = 0.032),低ストレス群ではスライド呈示後に有意な相関を示したが(R = 0.995, p = 0.000),統計的有意差はみられなかった.高ストレス群では統計的な差と相関が計測時期間においてみられなかった.以上の結果から,心理的ストレスの程度によって歯根膜感覚閾値と咬合感覚閾値は異なる可塑性変調を示すことが示唆された.歯根膜感覚および咬合感覚は,日常的な出来事や外界変化に応じて一定の範囲内で経時的に変動しつつ,心理的刺激因子の種類や程度によっては可塑性変調する可能性がある.本研究では視覚的に心理的ストレスを与えた場合の歯根膜感覚と咬合感覚の経時的変化に関して検討を加えた.その結果,心理的ストレスの増加に伴って歯根膜感覚は鈍磨化を主とした変化を示すものの,咬合感覚は鋭敏化する可塑性変化を示す可能性があることが明らかとなった.研究計画書に則って以下の研究を行った;【咬合感覚閾値記録】咬合力を検出するシステムはシート型感圧センサを用いることとし,本センサを後述するEEG信号記録装置に外部入力として接続し,EEGおよびEMG信号と同期記録できるようにした.咬合感覚閾値としては,自覚可能な最小咬合力とともに,下降系列の繰り返しによって自己調整した結果被験者自身が再現可能な咬合力も検討する予定である.【感情喚起スライドIAPSがEEG信号に与える影響についての検討】6名の被験者の頭皮上に国際10-20法に従って,F3,F4,Fz,C3,C4,Czの位置に電極を貼付してEEG信号を導出した.EEG記録中は,IAPS提示の間を除いて安静,閉眼状態を維持させた.記録開始から5分経過後にIAPSを提示した.提示したIAPSスライドは,IAPSの感情価評定のうちNegative情動価が設定されている21枚のスライドとし,各スライドを30秒間提示した.IAPS提示終了直後に再び安静,閉眼を指示し,その後11分間EEG記録を行った.各部位のEEG信号のうちβ波を対象として解析を行った.解析時間は30秒間とし,解析開始点は,IAPS提示1分前,直後,終了5分後および10分後の4時点とした.各時点から30秒間のβ波のパワー値を各部位において算出し,Friedman検定によって時系列変化の解析を行った.解析の結果,F3でのβ波パワー値は,開始前108.48μV^2,IAPS直後196.87μV^2,IAPS終了5分後116.71μV^2,IAPS終了10分後99.30μV^2を示し,時系列データ間の有意差がみられた(p=0.035<0.05).F3以外の各点においても,IAPS直後のβ波エネルギーが増加する傾向を示したが,統計学的有意差はみられなかった.以上の結果を勘案して,本実験のプロトコールを最終決定することとした.咬合感覚閾値計測システムは完成したが,計測対象となる現象の再現性に検討の余地がある.当初の研究計画では,咬合感覚閾値として,自覚しうる最小の咬合力と定義していた.このことに関して数名を対象に問診を行ったところ,再現性に疑問が生じる回答が得られた.

したがって,当初予定していた咬合感覚閾値を計測するとともに,外部基準に従った咬合力の記録を新たに加えることとした.具体的には,計測用センサを臼歯部に介在させた後に,強めの噛みしめを行わせ,モニター上の出力値を視覚的に確認しつつ徐々に発揮咬合力を低下させる下降系列調節を繰り返し行わせることによって,設定した強さの咬合力を発揮させるようにすることとした.咬合力の設定値は咬筋筋電図記録を参照しつつ決定予定である.感情喚起スライドIAPSが心理的ストレスとして用いることの有用性については確認できたとともに,実験プロトコールの時間的手順の根拠を得ることが出来た.現在までの達成度の内容を踏まえて,予定通り本実験を行う予定である.ただし,記録する信号における個体間変動が大きいことが見込まれるため,予定被験者数では統計学的に有効な検出力が得られない可能性がある.研究途中に適宜結果の統計解析を行い,被験者数が不足する場合には随時追加して本実験を遂行する予定である.研究計画書の通り,申請研究遂行のための消耗品,成果発表のための国内外旅費および成果投稿料に使用する予定である.
開放大気中への放出ガズフラックスの半導体レーザによるその場・非接触計測

1.光学ヘッドの完成独Muetek社の協力を得て、液体窒素で冷却し、数ミリケルビンの精度で温度制御できるデュワー瓶に鉛塩半導体レーザと赤外線検出素子を装着し、軸外し反射光学素子のみを用いたレーザビーム放射・検出ヘッドを整備した。大気中のメタンガスのスペクトルを正確に捉えるために半導体レーザが縦マルチモードで発光することを押さえ、感度を保証するために100メートル以上の遠方でも光ビームが拡散しないような横モードの制御が必要であった。2.大気中メタンガス濃度の測定上記試作装置を用いて、屋外の大気中メタンガス濃度を、10ミリ秒の高時間分解能で、しかも連続的に測定することに成功した。数多くの実験を繰り返して、このような測定の手順をマニュアル化した。実験の場所を岡山大学キャンパスから離れた地域共同センターから岡山大学内に移動し、実験の回数を稼いだ。3.信号処理系の整備と、メタン吸収線の選択。電気信号処理系を整備し、レーザ温度を2mKの範囲で制御することに成功した。但し、これは室内の値なので、今後戸外での運用実績を積み、さらに改良の必要がある。また、最近のコンピュータの発達に伴い、新しい信号処理方式が可能になってきたので新たな方式を考案する必要が認められた。4.エアロゾルの測定大気の気象条件への寄与が強い、エアロゾルについてもレーザーレーダを用いて観測を行い、世界的な観測組織、KOSA-net、に協力した。1.光学ヘッドの製作液体窒素を冷媒として用い、赤外光を発する鉛塩半導体レーザおよび赤外線検出器2個を収容する特殊デュワーを独、MUTEK社と共同で設計、製作を行った。その間、同様の仕様を持つ別の装置で大気中のメタンガス濃度を測定する実験を行い、過去15年間悩まされ続けてきた、レーザ出力の横モードの不安定さに対処する方法を発見し、1時間以上にわたって極めて安定した測定値が得られるようになった。2.大気中メタンガス濃度の測定上記試作装置を用いて、屋外の大気中メタンガス濃度を、赤外レーザ光に対する共鳴吸収を利用して、10ミリ秒の高時間分解能で、しかも連続的に測定することに成功した。その結果従来は、大気の密度ゆらぎに隠されて見えなかったメタンガス濃度のゆらぎが観測にかかり、我がグループの提唱する仮説が実証された。3.信号処理系の整備本年度はアナログ信号系のSNR向上に努力したが、安定な測定のためにはレーザ温度を液体窒素領域で制御して±2mKの範囲に収める必要があるが、±10mKの精度しか得られず、次の課題として残った。
若年者スポーツにおける運動障害を予防する遺伝子健康教育

4年目の教育活動として、所属大学の初期演習等4回、小学校主催3回(小学生対象、一部保護者)、高校での出張授業に対して、遺伝子検査・遺伝子教育を含むゲノム科学リテラシーセミナーを開催した。他大学を含む初年次教育の一環として飲酒時のような一過性の症状だけでなく、運動機能や熱代謝といった常に意識できる形質についても遺伝子と形質を説明する教材を活用できた。初期演習以外では、遺伝子検査と同時に過去の熱中症あるいはインフルエンザ等の高発熱時に関するアンケート調査を実施した。アンケート項目と遺伝子タイプとの相関性検証では更に50例程度を解析したが、重症事例は若干増に留まった。小学生の「遺伝と個性」に関する教育では、昨年度より遺伝や遺伝子に興味を持って次世代の指導者となるための教育を意識した内容を増やしている。中・高生への教材研究も合わせて、引き続き改良が必要である。新規校での導入授業の形態について、昨年度からの協議者とは別の私立校ではあるが実践できたことにより、次のステップへ移行できるように調整を始めた。学内の健康スポーツ科学科では、昨年度と同程度の実施はできたが発展はなかった。そのため一般の人への訴求力の高い文化祭での研究・教育活動発表を実施した。高校教員や大学院生など様々な立場の方の賛同を得られたので、今後の実施対象の拡大に繋がるよう連携していく。さらに学内にコンディショニング研究を実施しているクラブがあり、運動機能や熱中症について共同で勉強会ができるよう協議を開始した。また女子とスポーツとの関連で重要な生理痛などに関連する遺伝子群においても簡便な遺伝子検査が可能となったため、熱中症と組み合わせて対象者に合わせた話題提供が可能になった。遺伝子に関するリテラシーセミナーに関してほぼ研究計画通りに実施できた。出前実験に関しては、各校教員と実施内容・時期・事前準備について協議を重ね、昨年度から模索してきた教育現場での遺伝子導入教育について、私立高校1校での導入授業を実施できた。中学・高校ともに更なる連携先拡大が急務である。大学では、遺伝子タイプと熱中症重症化に関するデータは予定した追加収集をすることができなかったが、運動機能に関するコンディショニング研究を実施している学内団体との連携を始めることができた。小学校では、運動や熱中症、インフルエンザ等の発熱時の症状について関連性を説明するプログラムを実施しつつ改良を続けている。今後も教材としての提示方法を工夫して実際の運動や学校生活に活かせるようにする。教育法では、大学の教員養成課程における理科指導法での考察を基に、教育カリキュラムとの整合性について実施方法の拡充を図った。以上より遺伝子教育・遺伝子検査のリテラシー教育という観点から4年目の目的をほぼ達成できた。中学校および高等学校での出前実験・講義について導入講義も含めて範囲と対象者および方法を拡充し、教育法を再検討する。運動遺伝子関連および熱中症関連の授業・指導および研修についても実施対象を拡充する。ツール開発における理論的な面を探求し、指導教員と共に学ぶ機会を作って継続させる。大学初年時教育では、スポーツや熱中症の遺伝教育を継続的に実施する。コンディショニング研究団体との連携を深めて信頼度を上げるとともに、遺伝子検査の継続により統計的な解析を可能にする。小学校では、養護教諭や学校薬剤師の教育活動の中で、自分自身の問題として感じ取ってもらえる教材として、更に改良を続ける。本研究における初年度の教育活動として、高等学校3校(2回の実験講義含む)、所属大学の初期演習等6回、小学校主催2回(小学生対象、一部保護者)に対して、本研究が対象とする遺伝子検査・遺伝子教育を含むゲノム科学リテラシーセミナーを開催した。高校では指導教員との意見交換により、事前・事後の遺伝子に関する授業の一環として実施することにより、技術としての実験だけでは得られない、生徒の遺伝子への意識改革に於いて少しずつではあるが効果を実感できた。大学では初年時教育の一環のため、アルコール健康教育も含めた遺伝子リテラシーセミナーの中での実施となった。遺伝子と形質を説明するためにアルコールパッチテストの実証論文を作成したので、スポーツ関連遺伝子も含めた教材を新たに策定した。薬学科および健康・スポーツ科学科での実施では、遺伝子そのものや遺伝情報の利用法について、より具体的な意見・感想が多かった。遺伝子検査と同時に過去の熱中症あるいはインフルエンザ等の高発熱時に関するアンケート調査も行い、それぞれの項目と遺伝子タイプとの相関性を検証した。特定の遺伝子タイプと重症化について傾向としては関連性が見られたが、重症事例が少ないため統計的信頼性を得ることができなかった。来年度以降も継続してデータを収集する必要がある。研究期間後半では小学生にも対象を広げて「遺伝と個性」に関する啓蒙活動のなかで実施し、本教育研究のもう一つの主旨である「次世代の指導者を育てる」ことの重要性と難しさを再認識した。教育効果測定では、大学に於いては健康・スポーツ科学科があるため、遺伝子検査の結果を今後の競技生活の中でどのように活かしていくかという効果測定が可能である。本年度に遺伝子検査を受けた学生に対して、研究期間中に追跡調査をするために、過去のアンケート項目を参考に効果測定用のアンケート作成を開始した。遺伝子に関するリテラシーセミナーおよび出前実習に関してほぼ研究計画通りに実施できた。高校では、講義のみ、実験をメインにしてその内容を講義する、講義メインで模擬実験を間に挟む3パターンを実施できたこと、実験をした学校では本学出身の理科教員が在籍していたため、実施前から授業の進行状況の中で出前講義が果たす役割を確認できたことで、遺伝子教育の効果と、今後の改善のための課題を得ることができた。

大学では健康・スポーツ科学科および対照群としての薬学科の学生協力により、遺伝子タイプと熱中症重症化に関する相関解析が可能になった。遺伝子頻度分布の偏りにより統計的有意性が得られていないため、来年度も継続してデータ収集を行うことで、教育する上で実証が得られたデータを用いる説得力のある教育ツール開発へと繋げられると考えている。小学校では、遺伝子の多様性に関する説明の中で、運動や熱中症、インフルエンザ等の発熱時の症状について話をすることで、これまではアルコール等の周囲の大人をイメージする教育であったものが、自分自身の遺伝と体質に関する具体例として実感できるようになり、教育効果の向上が期待された。教材としての提示方法を工夫して実際の運動や学校生活に活かせる講義内容に改良する必要があることが、今後の課題として明らかとなった。またその効果を測定するためのアンケート作成にも着手する予定である。以上より遺伝子教育・遺伝子検査のリテラシー教育という観点から1年目の目的をほぼ達成できた。2年目の教育活動として、中学校・高等学校一貫校2校(実験講義含む)、所属大学の初期演習等6回、小学校主催4回(小学生対象、一部保護者)に対して、遺伝子検査・遺伝子教育を含むゲノム科学リテラシーセミナーを開催した。中高一貫校では事前に指導教員と打合せを行い、対象生徒の学習状況や理解度について意見交換した。教科書および学習指導要領を詳細に調査し、探求すべき課題を設定して教材の改良を始め、また授業で使用する単語(専門用語)についても準拠し、教育的効果を得られるよう内容を工夫することができた。普段の授業では実施が難しい実験のデモンストレーションと一部体験を実施し、理解度の高い生徒でも、探究心を満たし参加意識を継続できる内容とした。大学では、遺伝子と形質を説明する教材として、飲酒時のような一過性の症状だけでなく、運動機能や熱代謝といった常に意識できる形質についても加えた教材とした。初期演習以外では、引き続き遺伝子検査と同時に過去の熱中症あるいはインフルエンザ等の高発熱時に関するアンケート調査を実施した。遺伝子検査効率化のための実証実験も実施した。アンケート項目と遺伝子タイプとの相関性を検証したが、今年度は100例弱を解析し累積で600例程度であり、重症事例がまだ少なく統計的信頼性は得られなかった。来年度以降も継続してデータを収集する必要がある。小学生でも「遺伝と個性」に関する教育を実施したが、まだ多様性中心の内容であり、「次世代の指導者を育てる」教育となっておらず、中学生への教材研究での経験を元に今後の改良課題である。学内の健康スポーツ科学科との連携では、昨年度作成した教育効果を追跡調査するためのアンケートを試しに回答してもらい、項目の答えやすさ等の意見をもとに今後改良する。指導者育成プログラムの中に遺伝子検査と競技生活の質を関連付けるような教育について協議を始める予定である。
Ndxファミリー酵素の加水分解反応に共役するプロトン移動のその場観察

Ndxファミリーに属するADPリボースピロリン酸分解酵素を対象に、その加水分解反応過程におけるプロトン移動をその場観察することを目標として、J-PARCの茨城県産業利用ビームラインの中性子回折計iBIxを利用した中性子回折実験を行い、時間分割解析の目標達成に向けた目処をたてた。ADPRaseは,2価金属イオンの存在下,ADPRをAMPとリボース5'リン酸に加水分解する.我々はこれまでの研究から,ADPRaseとADPRの複合体結晶に2価金属イオンをソーキングして反応を開始させ,SPring-8の超高輝度X線を利用して加水分解反応をその場観察することに成功した.その結果ADPRaseでは,その加水分解反応と同期して,プロトンを酵素内部で一方向へ運搬するプロトン移動経路が形成されているとする仮説を提案した.本申請では,プロトンの追跡に適した中性子回折による反応のその場観察を行って,この仮説を実証することを目的とする.本年度は,(1)中性子回折で用いる大型結晶を作成するには大量のADPRase試料が必要となるため,IPTG発現誘導による収量の増大を試みた.その結果ADPRaseの発現系では,lacオペロンのリプレッサーの作用が弱く,IPTGなしでも既にADPRaseは大量に発現しており,逆にIPTG誘導による発現量の増大は望めないことが判明した.試料の大量調製には,大腸菌培養のためのインキュベータを増設して,試料調製のサイクルを増やすことで対応することとした.(2)従来結晶化法として用いてきたハンギングドロップ法をシッティングドロップ法に切り替え,従来と比べ10倍の体積をもつ結晶を得ることに成功した.中性子回折にはさらに10倍の体積の結晶が必要となるため,次年度も結晶の大型化に向けた条件検討を継続する.(3)上記の結晶に対してADPRと2価金属イオンのソーキング条件を最適化し,SPring-8において,分解能1Aを上回る高分解能X線回折強度データを得ることができた.構造解析の結果,従来と比べて10倍大きい結晶に対しても,従来と同様に反応を追跡できることが確認された.ADPRaseは,2価金属イオンの存在下,ADPRをAMPとリボース5'リン酸に加水分解する.我々はこれまでの研究から,ADPRaseとADPRの複合体結晶に2価金属イオンをソーキングして反応を開始させ,SPring-8の超高輝度X線を利用して加水分解反応をその場観察することに成功した.その結果ADPRaseでは,その加水分解反応と同期して,プロトンを酵素内部で一方向へ運搬するプロトン移動経路が形成されているとする仮説を提案した.本申請では,プロトンの追跡に適した中性子回折による反応のその場観察を行って,この仮説を実証することを目的とする.本年度は,(1)結晶化法を従来のハンギングドロップ蒸気拡散法からシッティングドロップ法に切り替えることにより,ADPRaseの結晶の大きさ(体積)を従来の20倍,辺の長さで3倍以上とすることに成功したが,目標とする中性子回折実験を行うにはさらに数倍,辺の長さで1.5倍以上とする必要がある.(2)辺の長さで従来の3倍以上に大型化した結晶にADPRとMn(II)イオンをソーキングし結晶構造解析を行ったところ,すでにこの段階でも,ソーキングに要する時間が10倍以上に伸びており,ソーキング時のADPRやMn(II)イオンの濃度を調整する必要があることが判明した.(3)従来の結晶より2倍程度大きい結晶に対してADPRとMn(II)イオンをソーキングし,SPring-8を利用して,1Åを上回る高分解能において時間分割回折強度データを得ることに成功した.構造解析の結果から,反応に重要な役割を果たすアミノ酸のカルボキシル側鎖のプロトン化/脱プロトン化の程度を検討し,ADPRaseの反応過程におけるプロトン移動経路を推定した.ADPRaseは,2価金属イオンの存在下,ADPRをAMPとリボース5'リン酸に加水分解する.我々はこれまでの研究から,ADPRaseとADPRの複合体結晶に2価金属イオンをソーキングして反応を開始させ,SPring-8の超高輝度X線を利用して加水分解反応をその場観察することに成功した.その結果ADPRaseでは,その加水分解反応と同期して,プロトンを酵素内部で一方向へ運搬するプロトン移動経路が形成されているとする仮説を提案した.本申請では,プロトンの追跡に適した中性子回折実験による反応のその場観察を行って,この仮説を実証することを目的とした.本年度は,(1)昨年度までに調製したADPRaseの大型結晶(体積で従来の20倍,辺の長さで3倍以上)に対して,ADPRとMn(II)イオンをソーキングする際のpH条件を変更し,従来と同様に1時間程度の時間内に酵素反応を終結させるための実験条件を確定させた.(2)異なる反応時間でクライオトラップした結晶についてSPring-8を利用してX線結晶構造解析を行い,従来の結晶と実験条件で得られたその場観察の結果と本質的に同じ結果が得られることを見いだした.(3)この結晶を用いた中性子回折実験は,昨年3月の東日本大震災により東海村の研究用原子炉(JRR-3)とJPARCがともに被災し,運転が再開されなかったため,今なお実現できていない.

(4)従来の結晶より2倍程度大きい結晶に対してADPRとMn(II)イオンをソーキングし,SPring-8を利用して,1Aを上回る高分解能において時間分割回折強度データを得ることに成功した.構造解析の結果から,反応に重要な役割を果たすアミノ酸のカルボキシル側鎖のプロトン化/脱プロトン化の程度を検討し,ADPRaseの反応過程におけるプロトン移動経路を推定した.
EBウイルスベクターを用いた系統的遺伝子機能解析システムの構築

ゲノム解析によって明らかになった塩基配列情報を元に、系統的に簡便にかつ迅速に機能解析を進めることができる網羅的な機能解析手法の開発を目的として研究を進めている。本年度は、Epstein-Barrウイルスのレプリコンを応用したEBVベクターの利点を生かした、複数の解析を多角的に遂行し、以下のような結果を得ることができた。1)大規模プロモーターライブラリーの構築各遺伝子の発現制御に必要十分なプロモーター・エンハンサーの効率よい回収方法の確立を目指し、ヒトゲノムDNA断片をEGFPにつないだライブラリーをEBベクター上に構築し、細胞に導入後、EGFPの蛍光を指標にセルソーティングを行い、様々な強度のプロモーター活性を示すDNA断片を回収した。これらの塩基配列を決定しデータベースの検索を行った結果、約4割のクローンについてゲノム上での位置が特定できた。現在、これらのクローンがin vivoにおいても遺伝子発現制御に関わっているかどうかについて確認することで、申請者のスクリーニング系の評価を進めている。2)テトラサイクリン(Tet)制卸発現系の発展型の開発申請者のこれまでのEBVベクターを応用した解析から、現在広く使われているTet制御発現系はまだまだ改良の余地が多く、いくつかの改変をほどこすことで、より優れた発展型を開発できることを見い出していた。そこで本研究では、発展型Tet制御発現系の構築を行い、非誘導時の発現のモレが非常に小さく、誘導時には強力な遺伝子発現を得られる発現システムの構築に成功した。その評価のために行った細胞毒性の強い遺伝子の調節発現系の構築にも成功したことから、今回開発した発現系は極めて厳密な調節が可能であることが明らかとなった。現在このシステムのトランスジェニックマウスへの応用を進めている。
染色体移入を用いたヒト遺伝病細胞の放射線高感受性の解析

放射線の生物作用のメカニズムを解析する一つの手段として、ヒトの放射線高感受性の突然変異体である劣性遺伝病のataxia telangiectasia(AT)患者由来の細胞を用い、細胞の放射線感受性に関するこの突然変異の遺伝子座位の染色体上での位置づけを染色体移入という手法を用いて行なうことが本研究の目的である。1.染色体移入実験の受容細胞として、AT患者の皮膚線維芽細胞から樹立した永代細胞株AT2KYSVを、染色体供与細胞として、薬剤耐性マ-カ-で標識したヒト染色体を含むマウス細胞株を用いた。微小核融合法により染色体移入をおこない、薬剤耐性を用いて染色体移入細胞を単離して染色体構成と放射線感受性を調べた。2.ネオマイシン耐性マ-カ-で標識した第11番染色体、11pter→q23、11p12→qter、11pter→q13領域を含むX/11転座染色体、X染色体、の5種の供与染色体を用いたところ、前3者に由来する微小核融合細胞のクロ-ンは顕著な放射線抵抗性を獲得したが、後2者に由来するクロ-ンは親株AT2KYSVと同様放射線高感受性であった。AT遺伝子座位が11q13→q23領域内にあることが示唆された。3.11p12→qter領域を含むX/11転座染色体の移入からHAT耐性であるのに中間的な放射線抵抗性しか示さないクロ-ン2859/4が得られた。さらに2859/4由来の1クロ-ン2859/4ー1では放射線抵抗性の消失と同時に11q23領域の染色体欠失が認められた。このことからAT遺伝子座位は11q23領域内にあることが示唆された。クロ-ン2859/4ー1に含まれる転座染色体は、今後AT遺伝子を解析・単離する上で重要な出発材料になるとおもわれる。放射線の生物作用のメカニズムを解析する一つの手段として、ヒトの放射線高感受性の突然変異体である劣性遺伝病のataxia telangiectasia(AT)患者由来の細胞を用い、細胞の放射線感受性に関与するこの突然異変とその遺伝子座位の染色体上での位置づけを染色体移入という実験手法を用いて行なうことが本研究の目的である。本研究の初年度である今年度は、染色体移入実験の受容細胞となるAT患者由来の細胞株の樹立とその特性の解析および染色体移入実験系の完備に重点を置いた。1.複数のAT患者から採取した皮膚より培養線維芽細胞系をつくり、これらにSV40ゲノムを含むプラスミドDNAトランスフェクションを行なって増殖性形質転換細胞を得、さらにこの中から無限増殖能を有する永代細胞株を選別した。得られた永代細胞株の一つは高い増殖性、親株と同様の放射線高感受性を示すと共に近二倍体の安定した染色体構成を有するため染色体移入の受容細胞として極めて適していることが判った。2.ネオマイシン抵抗性の優性選択マ-カ-で標識したヒト染色体を含むマウス細胞株から微小核融合法による染色体移入実験を試みたところ、薬剤耐性を用いた染色体移入クロ-ンの単離、単離クロ-ン由来細胞における放射線感受性試験や染色体解析、等が可能なことが確認できた。3.数種類の染色体種を用いた染色体移入実験を行ったところ、ヒト正常第11番染色体の移入から得られたクロ-ンのなかに放射線抵抗性を示すものが見いだされた。予備的な実験段階ではあるが目的とする染色体種の有力な候補が示唆されたと考えられる。

放射線の生物作用メカニズムを解析する一つの手段として、ヒトの放射線高感受性の突然変異体である劣性遺伝病のataxia telangiectasia(AT)患者由来の細胞を用い、細胞の放射線感受性に関与するこの突然変異とその遺伝子座位の染色体上での位置づけを染色体移入という実験手法を用いて行なうことが本研究の目的である。本研究計画の第二年度である今年度は、AT患者由来の細胞株を用いて昨年度に得られたAT関連遺伝子の染色体座位に関する予備的な知見を確認し、さらに詳細な染色体マッピングをおこなう事に重点をおいた。1.染色体移入実験の受容細胞として、昨年度にAT患者の皮膚線維芽細胞から樹立した永代細胞株を、染色体供与細胞として、薬剤耐性マ-カ-で標識したヒト染色体を含むマウス細胞株を用いた。微小核融合法により染色体移入をおこない、薬剤耐性を用いて染色体移入細胞を単離して染色体構成と放射線感受性を調べた。2.ヒト第11番染色体の移入によりAT細胞が放射線抵抗性を獲得することがより多数のクロ-ンの解析から確認された。また放射線抵抗性を獲得しなかったクロ-ンでは、第11番染色体長腕が欠失しており、放射線抵抗性を付与する遺伝子が染色体の長腕部にあることが示唆された。3.さらに第11番染色体の種々の部分とX染色体との転座染色体を供与染色体に用いた実験から、第11番染色体の長腕q13→q23領域が放射線抵抗性の獲得と関連しているという予備的な結果を得た。これはATの放射線感受性に関連する遺伝子が第11番染色体に位置することを確証すると共に、この染色体上でのさらに詳細な領域の解析への手がかりとなる成果であると考えられる。放射線の生物作用のメカニズムを解析する一つの手段として、ヒトの放射線高感受性の突然変異体である劣性遺伝病のataxia telangiectasia(AT)患者由来の細胞を用い、細胞の放射線感受性に関与するこの突然変異とその遺伝子座位の染色体上での位置づけを染色体移入という実験手法を用いて行なうことが本研究の目的である。本研究計画の最終年度である今年度は、AT患者由来の細胞株を用いて昨年度までに得られたAT関連遺伝子の染色体座位に関する予備的な知見を確認し、さらに詳細な染色体マッピングをおこなう事に重点をおいた。1.染色体移入実験の受容細胞として、初年度にAT患者の皮膚線維芽細胞から樹立した永代細胞株を、染色体供与細胞として、薬剤耐性マ-カ-で標識したヒト染色体を含むマウス細胞株を用いた。徴小核融合法により染色体移入をおこない、薬剤耐性を用いて染色体移入細胞を単離して染色体構成と放射線感受性を調べた。2.第11番染色体p12→qter領域を含むX/11転座染色体を移入するとAT細胞は放射線抵抗性を獲得するがHAT耐性であるのに中間的な放射線抵抗性しか示さない亜クロ-ン2859/4が得られた。クロ-ン2859/4の解析から、このクロ-ンは放射線感受性と抵抗性との2種の細胞群より成り、前者の群から放射線抵抗性を消失すると同時に染色体11q23領域の徴小欠失をもつ1クロ-ン2859/4ー1が得られた。3.クロ-ン2859/4ー1を得たことは、第11番染色体q13→23領域にATの放射線高感受性に関連する遺伝子が存在するという、昨年度までの知見を確証すると同時にその領域をq23領域に限定した。さらに、この徴小欠失をもつ転座染色体は、AT遺伝子そのものを解析・単離する上で重要な出発材料になるとおもわれる。
ライブセルイメージング法を用いた脊髄血流維持機構の解明と麻酔薬作用に関する新研究

実験的には脊髄実質内の血管は摘出が困難なため、その薬理学的研究は今まで全く行われていなかった。本研究では、われわれが独自に開発した微小血管研究システムを用い、血管内径が10マイクロメートル以下の極めて微細な脊髄血管をコンピュータ画面上で詳細に解析する点に学術的な独創性がある。また本研究では脊髄神経組織に埋没した実質内血管を観察するため、血管とそれに隣接する神経組織との関係が維持された生体内環境に近い状態での血管反応性を観察出来る点において、摘出血管を用いた実験と一線を画する。さらに、K+チャネルおよび一酸化窒素合成酵素阻害薬を用いた薬理学的手法のほか、神経型一酸化窒素合成酵素ノックアウトマウスおよびATP感受性K+チャネルトランスジェニックマウスを用いて遺伝工学的に脊髄血流維持機構と麻酔薬作用の機序を解明にするところに学術的意義がある。本研究により、脊髄血流維持機構の脊髄内での部位差、麻酔薬の種類による脊髄内微小血管反応性の違い、さらにこれらの相違がK+チャネル、一酸化窒素合成酵素活性の変化に依存していることを明らかにすることができた。以上の知見は、虚血時における脊髄循環維持機構の生理学的、薬理学的機序解明のみならず、脊椎手術や大血管手術時など脊髄保護を必要とする手術や脊髄損傷患者に対する脊髄保護を指向した治療等において、麻酔、救急および集中治療管理の発展に大いに寄与すると考えられた。最終年度には各種遺伝子ノックアウトマウスおよびトランジェニックマウスの脊髄実質内血管について検討を行う予定であったが、資格喪失のため施行できていない。脊髄は、末梢組織からの情報を脳へ伝達する経路であると同時に、脳からの情報を末梢に伝達し、生命機能を統合維持するための極めて重要な器官である。脊髄神経細胞を直接栄養している脊髄実質内微小血管はその摘出が困難であるため、これら血管における薬理学的研究はこれまで成功していない。本研究では、人工脊髄脳液で還流した脊髄スライス切片を用い脊髄実質内に走行する血管径10μm以下の極めて細い細動脈の血管収縮拡張反応を観察する。各種イオンチャネルの選択的作用薬および拮抗薬による薬理学的手法だけでなく神経型一酸化窒素合成酵素ノックアウトマウスなどの遺伝子改変動物を用いることで脊髄血流調節機構およびその機構に及ぼす麻酔薬作用を明らかにすることを目的とした。ハロタンで麻酔したラットもしくはマウスを開胸し、冷却したクレブス液約50mlを100mmHgの圧をかけながら左心室より潅流し、血管内血液をすべて洗い流したあと頚髄を摘出した。次に、ビブラトームを用いて脊髄の腹側と背側を含むスライス標本(厚さ約125 μm)を作成する。この際、脊髄標本は酸素95% +炭酸ガス5%で通気した4°C冷却クレブス液内を作成した。ついで、この脊髄スライス標本を酸素93% +炭酸ガス7%(われわれのシステムではこの条件下でpH=7.4となる)で通気し、37°Cに加温したクレブス液で満たした観察用チャンバーに入れ、顕微鏡を用いて脊髄内動脈(径5-10 μm)を観察した。顕微鏡に装着したビデオカメラで動脈の画像を撮影し、メディアコンバータを介してコンピュータに取り込んだ後、動脈径の変化をコンピュータ画面上で血管径測定用のソフトウエアを用いて解析した。脊髄神経細胞を直接栄養する脊髄実質内微小血管はその摘出自体が困難であるため、これら血管における脊髄血流調節機構の病態時変化について、その生理的機構を含め包括的に解明した研究はこれまでに見当たらない。本研究では、人工脊髄脳液で還流した脊髄スライス切片を用い脊髄実質内に走行する血管径10μm以下の極めて細い細動脈の血管収縮拡張反応を観察することを確認した。各種カリウムイオンチャネルの選択的作用薬および拮抗薬による薬理学的手法を用いることで脊髄血流調節機構およびその機構に及ぼす麻酔薬作用を明らかにするため実験を重ねているが、結果の解析をまとめるまでには至っていない。25年度に得られた実験結果の解析を完了させる。

引き続き一酸化窒素合成酵素阻害薬(L-NAME;100μM)、可溶性グアニレートシクレース阻害薬(ODQ;1μM)、NMDA受容体拮抗薬(MK-801;10μM)および各種フリーラジカルスカベンジャー(スーパオキシドディスムテース[SOD;150U/ml]、カタラーゼ[1200U/ml]、デフェロキサミン[1mM])処置で抑制されるか否かを検討する予定である。共焦点顕微鏡のレーザー照射装置の増設を行う予定であったが、本年度は脊髄血管を倒立顕微鏡にて観察することを可能にすることを最大の目的としたため、この装置の購入に至っていない。共焦点顕微鏡のレーザー照射装置の増設を行う予定である。
肝組織由来スフェロイド（LTOSs）を用いた複合型肝細胞シートの開発

正常肝組織からCTOS作成法を応用してLTOSsを分離し、1間葉系幹細胞シートあるいは2多孔性RCPとの複合共培養によって複合型LTOSsシートを作成する。得られたLTOSsシートにおける細胞間接着、シグナル伝達経路を解析し、肝組織再生における制御メカニズムの解明を行う。さらに、確立した複合型LTOSsシートを積層する技術を確立し、同様に形態、増殖再生能および機能評価を行い、最適化した複合型LTOSsシートを作成する。作成した複合型LTOSsシートを免疫不全マウスに移植し生着、形態、増殖再生能および機能評価を行う。さらに、肝不全マウスモデルを作成し、LTOSsシート移植法を確立する。
偏微分方程式の諸問題

時間的おくれのある放物型発展方程式の基本解を構成した.その種の方程式の可能性については,おくれの項の係数の滑らかさの緩い条件のもとで種々の事実が知られているが,その係数がヘルダー連続ならば基本解を構成出来ることがわかった.おくれのない場合との著しい相異は,おくれの巾の整数倍の時点毎に基本解の導関数の特異点が現れることである.この基本解を用いておくれの項の作用素が有界である場合に神戸大工学部の中桐信一氏が行なっている制御の理論の相当な部分を,それらの作用素が非有界の場合に拡張出来ることがわかった.そのために空間を拡大して解が半群S(t)を用いて表される様にするのであるが,その共役作用素S^*(t)が登場するので中桐氏の方法をそのまま用いることは出来ない.そこで方程式をヒルベルト空間の中の方程式,主作用素が強楕円型二次型式で定められるものとして,方程式を必要に応じ負ノルム空間の中でも考えることにすれば中桐氏の結果の多くが拡張出来ることがわかった.即ち共役方程式から同様に定められる半群S_T(t)とS(t)を結びつける第一構造作用素Fが定義され,基本解を用いて定義される第二構造用素を通じてFS(t)=S^*_T(t)F, S^*(t)F^*=F^*S_T(t)-が成立することが示される.この様にしてもとの方程式の可制御性と共役方程式の可観測性が同値であることが示された.ただしこの種の理論を展開するには拡大された方程式の半群S(t)の生成素のスペクトルが離散的であるか,又一般化された固有関数が完全であるか等の問題があり,特殊な場合はそれが示されるが一般な場合ついては今後の研究課題である.以上の他複数個の凸な物体の外での波動の減衰,散乱行列の極の分布,確立微分方程式の近似理論,量子相対力学のハミルトン作用素の本質的自己共役性等に関する真事実が研究分担者によって明らかにされた.時間的おくれのある放物型発展方程式の基本解を構成した.その種の方程式の可能性については,おくれの項の係数の滑らかさの緩い条件のもとで種々の事実が知られているが,その係数がヘルダー連続ならば基本解を構成出来ることがわかった.おくれのない場合との著しい相異は,おくれの巾の整数倍の時点毎に基本解の導関数の特異点が現れることである.この基本解を用いておくれの項の作用素が有界である場合に神戸大工学部の中桐信一氏が行なっている制御の理論の相当な部分を,それらの作用素が非有界の場合に拡張出来ることがわかった.そのために空間を拡大して解が半群S(t)を用いて表される様にするのであるが,その共役作用素S^*(t)が登場するので中桐氏の方法をそのまま用いることは出来ない.そこで方程式をヒルベルト空間の中の方程式,主作用素が強楕円型二次型式で定められるものとして,方程式を必要に応じ負ノルム空間の中でも考えることにすれば中桐氏の結果の多くが拡張出来ることがわかった.即ち共役方程式から同様に定められる半群S_T(t)とS(t)を結びつける第一構造作用素Fが定義され,基本解を用いて定義される第二構造用素を通じてFS(t)=S^*_T(t)F, S^*(t)F^*=F^*S_T(t)-が成立することが示される.この様にしてもとの方程式の可制御性と共役方程式の可観測性が同値であることが示された.ただしこの種の理論を展開するには拡大された方程式の半群S(t)の生成素のスペクトルが離散的であるか,又一般化された固有関数が完全であるか等の問題があり,特殊な場合はそれが示されるが一般な場合ついては今後の研究課題である.以上の他複数個の凸な物体の外での波動の減衰,散乱行列の極の分布,確立微分方程式の近似理論,量子相対力学のハミルトン作用素の本質的自己共役性等に関する真事実が研究分担者によって明らかにされた.1.時間変数に関して高階のヴォルテラ型放物型積分微分方程式に関して、境界条件が時間変数に無関係で時間変数に関する微分を含まない場合に、アグモン・ニーレンバーグによる比重付楕円型評価を用いて基本解を構成し、【L^P】空間の中で初期境界値問題を解くことが出来た。そのために先ず積分項を含まない場合の放物型方程式の基本解を構成して解を表示する公式を求め、解の一意性を示し、次いで積分項を攝動項と見てヴォルテラ型方程式の基本解を構成し、解の一意性と表示を得た。2.時間変数に関して一階の放物型方程式の解の無限未来での漸近行動に関して従来知られていたことが【L^1】空間の中でも成立することがわかった。解の収束については楕円型境界値問題のアプリオリ評価とソボレフの埋藏定理を用いて基本解の積分核を評価して所要の結果を得た。漸近展開についても楕円型境界値問題を逐次解いて解を表示する作用素の積分核の評価を用いて所要の結果を得た。3.ヘルダー連続関数から成る関数空間の中での放物型方程式を発展方程式の理論を用いて解くために、係数をなす作用素が生成する半群が解析的とは限らず、又定義域が稠密でない場合に基本解を構成し、解の存在と微分可能性について満足すべき結果を得た。

生成作用素の定義域が稠密でないことによる初期条件の意味について特に工夫を要した。4.幾つかの凸な物体の外での波動の減衰についても満足すべき結果を得た。今後も上記の研究を引き続き行なう計画である。特にヴォルテラ型方程式に関しては境界條件が時間変数に関係する場合を探研する。以上の研究を行なうに際して補助金ビ購入した文献は大いに役に立った、又研究集会で他大学研究者との交流は大変参考になった。
いもち病菌染色体における非病原性遺伝子アイランドの同定とその転移・分解機構の解析

イネ品種CO39に対する非病原力遺伝子AVR1-CO39のいもち病菌集団における分布について検討したところ、本遺伝子を保有している菌株は単一種P.oryzaeに限定されていた。P.oryzae菌株はほとんど本遺伝子を保有していたが、例外的にイネ菌は本遺伝子領域に大規模な構造変異を起こしていた。以上のことから、AVR1-CO39はP.oryzae進化(種分化)初期段階に出現・成立し、その後イネ菌の進化(寄生性分化)初期段階においてrearrangementによって機能を喪失したと考えた。また、P.oryzaeに見出されたAVR1-CO39ホモログはすべて機能を保有していた。一方、対応する抵抗性遺伝子Pi-CO39のOryza spp.における分布について調査したところ、本抵抗性遺伝子保有accessionはきわめてまれであることが明らかとなった。以上のことから、イネ菌はPi-CO39が高頻度で分布するごく限られた地域でAVR-CO39にrearrangementを起こすことによって成立し、その欠失型が固定したのち世界各地に広がったと考えた。つぎに、イネ菌のイネ品種特異性を支配する非病原力遺伝子AVR-Pitaについて解析した。本遺伝子ホモログはイネ菌以外にも広く存在し、さらにその座乗染色体が菌群ごとに異なっていた。そこで、本遺伝子はいもち病菌の進化の過程でかなり古くから存在し、座乗染色体を変えてきたと考えた。周辺領域の解析の結果、筆者は、いもち病菌の祖先型では、AVR-Pitaは染色体内部で静止していたが、あるとき偶然にレトロトランスポゾンがその両側に挿入されることによって「放浪癖」を獲得し、異所的組み換えによって染色体上を彷徨したのち、テロメアにたどり着いたと考えた。我々はすでに、いもち病菌Pyricularia spp.が種分化、寄生性分化の過程でダイナミックに染色体構造を変化させてきたことを明らかにしてきた。本年度は、その染色体構造変化に伴って、非病原力遺伝子がどのようにその座乗染色体を変えてきたかを、すでにクローニングされているAVR-Pita(イネ品種ヤシロモチの持つ抵抗性遺伝子Pi-taに対するイネ菌の非病原力遺伝子)をモデルとして検討した。まず、さまざまな植物から分離されたいもち病菌84菌系の染色体をパルスフィールドゲル電気泳動で分離し、これをメンブレンにブロッティングした後、AVR-Pitaをプローブとしてハイブリダイゼーションを行ったところ、本遺伝子のホモログがイネ菌のみならず、アワ菌、エノコログサ菌、キビ菌など他のP.oryzae菌系、さらにはメヒシバ菌(P.grisea)、Cenchrus菌(P.sp.)など他種にも存在することが判明した。それらのホモログの座乗染色体はミニクロモソーム、常染色体などさまざまで、本遺伝子がいもち病菌の種分化、寄生性分化の過程で頻繁に座乗染色体を変えてきたことが明らかとなった。さらに、それらのホモログならびに周辺領域をクローニングしたところ、遺伝子本体は高度に保存されているのに対し、その周辺領域はきわめて多様性に富むことが判明した。しかしながら、多くの場合、新規LTRレトロトランスポゾンならびにその小断片が存在するという若干の共通性も認められた。我々は、いもち病菌が抵抗性遺伝子による認識をすばやく回避するために、マラリア病原体と同様にテロメアの可塑性を利用する戦略をとっているのではないかと考えた。そこで、AVR1-Pita(イネ品種ヤシロモチの持つ抵抗性遺伝子Pitaに対応するイネ菌の非病原力遺伝子)をモデルとして取り上げ、この仮説を検討した。本遺伝子は、クローニングされた菌系統においてはテロメアに存在することが知られている。

ところが、さまざまないもち病菌における本遺伝子の座乗染色体を調べた結果、イネ菌のなかにもテロメアではないところに本遺伝子を持っているものが見つかった。また、その座乗染色体はさまざまで、生存に必須でないミニクロモソームに座乗する菌株も存在した。イネ菌株のAVR-Pita周辺の構造を調べたところ、レトロトランスポゾンのLTRと思われる小断片が列をなして存在した。そこで、イネ菌以外の菌株におけるAVR-Pitaとその周辺領域をクローニングしたところ、イネ菌のオリジンに近いと考えられているエノコログサ菌、キビ菌において片側にそのレトロトランスポゾンの本体が現れ、さらにイネ菌・エノコログサ菌・キビ菌のオリジンに近いと考えられるメヒシバ菌においては、両側にレトロトランスポゾン本体が現れた。一方、上記の菌からかなり早い段階で分化したと思われるCenchrus菌においては、AVR-Pita周辺に当該レトロトランスポゾン本体のみならず、LTRの断片さえも存在しなかった。一方、各菌株のAVR-Pita配列の系統樹を作成したところ、それらの分化の順序が明らかとなった。それらを総合的に考察した結果、筆者は、いもち病菌の祖先型では、AVR-Pitaは染色体内部で静止していたが、あるとき偶然にレトロトランスポゾンがその両側に挿入されることによって「放浪癖」を獲得し、異所的組み換えによって染色体上を彷徨したのち、テロメアにたどり着いたと結論した。
毒素受容体を介した標的細胞ノックアウト法の開発

1人工毒素受容体の作製:増殖因子活性を失い且つ毒素結合活性を維持している変異型毒素の作製を行った。DT(ジフテリア毒素)とHB-EGF(毒素受容体)とが結合した状態の3次構造は明らかにされており、結合に重要なアミノ酸やその領域(EGF相同領域)も明らかにされている。逆にEGFやTGFの研究により、どのアミノ酸が変異すると増殖因子としての活性を失うかも報告されている。これらの情報を総合的に判断し蛋白質立体構造をシミュレートすることにより、純粋毒素受容体を得るために必要なアミノ酸変異部位候補をしぼり、そのアミノ酸について部位特異的変異を導入した。具体的にはHB-EGFの5種のアミノ酸(I117,V124,R128,Y138,L148)を種々のアミノ酸に置換した変異のうち、ほぼ増殖因子活性を失ったものとして、Y138D,Y138L,L148Vの3種が、ま.た3分の1程度に低下したものとして、I117V,I117A,V14Fの3種が明らかとなった。この中でさらに毒素受容体活性を測定した結果、野生型と同様の活性を有している変異が3種(I117V,I117A,L148V)、1桁感受性が低下している変異が2種(Y138L,V124F)あることが判明した。昨年行ったプロテアーゼ耐性型のL148S/P149THB-EGFについても現在検討中である。2本法が肝細胞以外にも使えるかどうかを明らかにするため、インスリンプロモーター下流にHB-EGFをつないだtransgeneを作製し、膵臓ランゲルハンス島β細胞に毒素受容体を発現するトラシスジェニックマウスを作製した。これらのマウスに毒素を投与することによりβ細胞を破壊し、糖尿病が引き起こされるかどうかを確かめている。現在毒素投与により血中のグルコース濃度が顕著に上昇することが観察されており、狙い通り毒素により糖尿病を引き起こしている可能性が高いと考えている。申請者が考案した「毒素受容体を介した標的細胞ノックアウト法」(TRECK法)は、疾患モデルマウス作製に有効な方法である。TRECK法の毒素受容体として用いる「ヒト由来ヘパリン結合性EGF様増殖因子(hHB-EGF」は、ジフテリア毒素受容体としての機能ももっているが、本来の増殖因子としての活性も有しておりTRECK法の目的としては最適な分子ではない。そこで増殖因子活性を失いかつ、分泌型にプロセスを受けない変異型hHB-EGF、すなわち人工ジフテリア毒素受容体を作製することが本研究の目的である。毒素とhHB-EGFとの結合に重要なアミノ酸が既に明らかになっており、またhHB-EGFと相同性をもつEGFの増殖活性に重要なアミノ酸もわかっている。これらの情報をもとに、増殖因子活性を失いかつ毒素結合活性を保持するようなアミノ酸変異6箇所、10種類を作製し、その増殖因子活性と毒性とを調べたところ、117番目のlをVに置換したもの、148番目のLをVに置換したものが有効であることが明らかとなった。さらに、膜プロテアーゼ耐性に変異を導入するために、148番目のLをSに、149番目のPをTに置換したhHB-EGFを作製したところ、予想通りプロテアーゼ耐性を示すことがわかった。今後は、上記の変異型hHB-EGFの増殖因子活性と毒素結合活性を定量的に同定し、目的の人工毒素受容体を作製し、それを用いて肝炎モデルトランスジェニックマウスを作製する。
NUP98融合遺伝子を有する白血病の発症・維持機構の解明

私はNUP98融合タンパク質にヒストンアセチル化酵素ASH1Lが結合することを見いだしていた。そこで、当該年度はNUP98融合遺伝子を有する白血病の発症・維持に、ASH1Lが関与するかをAsh1lコンディショナルノックアウト(cKO)マウスを用いて検討した。NUP98-HOXA9融合遺伝子を発現させ不死化したマウス骨髄細胞からAsh1lをノックアウトしてもin vitroにおけるコロニー形成には影響はなかったが、この細胞をマウスに移植して白血病発症能について検討するin vivoの実験を行った結果、Ash1lが欠損すると顕著にNUP98-HOXA9による白血病発症が遅延することが明らかとなった。次にこのAsh1lを欠損した白血病細胞を、別のレシピエントマウスに移植した。その結果、Ash1lを欠損した白血病細胞は、マウスで白血病を発症させることができないことが明らかとなった。この結果はAsh1lがNUP98融合遺伝子による白血病発症に必須であることを示唆している。また、私はNUP98融合タンパク質に脂肪酸合成酵素FASNが結合し、その活性をNUP98融合タンパク質は負に制御することをすでに見いだしていた。そこで、当該年度はNUP98融合遺伝子を有する白血病細胞に対するFASNの関与を検討するため、Fasn cKOマウスを用いて検討した。FasnをノックアウトするとNUP98融合遺伝子を有する細胞のコロニー形成は阻害されたが、それ以外の白血病で見られる融合遺伝子によるコロニー形成は阻害されなかった。この結果は、今までに得ているFASN阻害剤を用いた実験結果ならびにFASNに対するshRNAを用いた実験結果と一致するものである。当初、当該年度はAsh1l、FasnそれぞれのcKOマウスを用いて解析を進める予定であったが、予定通りそれぞれのcKOマウスを用いた解析を進められたと考えている。Ash1l cKOマウスを用いた実験では、in vivoの系でAsh1lの重要性が示されたので、in vivoの移植の実験を行い、Ash1lを欠損させた時にどのような遺伝子の発現が抑制されるのか網羅的に解析する予定である。すでに既存の白血病発症に重要な遺伝子群の発現に関しては検討しているが、これら発現はAsh1lを欠損させても変化がなかったことから、新規の白血病発症に重要な遺伝子発現を明らかとする予定である。Fasn cKOを用いた実験では、まだin vivoの白血病発症実験でFasnの重要性が評価できていないので、こちらを優先的に行い、Fasnの重要性をin vitro、in vivoの系で明らかとし、脂肪酸合成経路を中心とした代謝経路を詳細に調べて行く予定である。次年度の物品費として使用する。物品の価格変更等で計画通りの金額とはならなかった。