hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
局在プラズモン共鳴測定用チップの開発と生体分子間相互作用解析

局在プラズモン共鳴の反応場として、様々な形状のナノホールアレイをナノインプリンティング法により作製した。この構造に金薄膜を蒸着後、金膜厚やナノホールアレイの深さ、中心間距離について検討した。さらに、最適化したプラズモニックナノホール構造をポリジメチルシロキサン製のマイクロフルイディスク中に実装し、基板からの反射光の測定行った。本センサチップを使用して、炎症マーカーの測定を行ったところ、濃度に応じたディップのシフトを確認できた。極めて簡便なセンサでありながらも、生体相互作用の一種である抗原抗体反応をリアルタイムで測定することに成功した。平成20年度は、局在プラズモン共鳴(LSPR)の反応場として、種々のナノ構造体をナノインプリンティング法により作製し、さらに金を蒸着後、形状変化と電場増強の関係性を検討した。本研究では様々な形状のナノホールアレイを作製した。はじめに、ホールの直径を300nmで統一し、そのホールの深さを50、100、150nmと変化させることにより、深さ方向による吸収ピーク波長変化について検討した。その結果、屈折率変化に対する感度については3種類の基板とも大きな違いはなかったものの、ホールの深さが50nmの時に最も先鋭な吸収ピーク波長を確認することができた。続いて前述の結果よりホールの深さを50nmに統一し、ホールの中心間距離を400、500、600、900nmと変化させることで、LSPRとホールの中心間距離の関係性を検討した。その結果、中心間距離を増大するほど、LSPR由来の吸収ピーク波長が長波長側にシフトすることを明らかにした。同時に中心間距離の増大とともに、屈折率に対するLSPRシフト量が増幅することを明らにした。屈折率変化に対するLSPRシフト量の関係には、極めて高い相関(相関係数0.999以上)を有していることを確認した。以上の結果より、ホールの深さ、中心間距離を最適化することで、高感度かつ精緻なLSPR現象をベースとしたセンサを作製できる見込みを得た。また、中心間距離を制御することで吸収ピーク波長を自由に決定できることから、可視光領域での簡便な生体試料分析への応用が可能であることが示唆された。さらに複数の中心間距離を有するナノホールアレイを作製することで多成分同時計測への応用も可能であると考えられる。平成21年度は、前年度に形状を最適化したプラズモニックナノホール構造をマイクロフルイディスク中に実装した。プラズモンセンサの基板にはペットフィルムを使用し、ナノインプリントにより構造を転写することで、安価かつフレキシブルな基板を作成した。微小流路は、ポリジメチルシロキサン(PDMS)をソフトリソグラフィと呼ばれる技術により加工し作成した。光透過性の高いPDMSを流路材料として利用することで、基板上側からの白色光の直接入射、基板からの反射光の測定を可能とした。作成したプラズモンセンサチップを使用して、ウシ血清アルブミン(BSA)の金基板に対する非特異的な吸着をモニタリングした。その結果、BSA溶液を導入するに従い、反射スペクトル中に存在するプラズモン共鳴由来のディップが徐所に長波長側にシフトする現象を確認することができた。これは金ナノホール構造表面にBSAが吸着することで、表面の屈折率が大きくなったことによると考えられる。続いて、作成したチップ上での抗原抗体反応をリアルタイムでモニタリングした。本測定では炎症マーカーの一種であるTNF-αを抗原として使用した。あらかじめ抗体を化学修飾により固定化した金ナノホール構造に種々の濃度のTNF-αを導入したところ、濃度に応じたディップのシフトを確認した。これより、我々は非常に簡便に作成されたセンサチップを用いて生体相互作用の一種である抗原抗体反応をリアルタイムで測定することに成功した。しかしながら、得られた検出限界は1μg/mL程度と従来のクレッチマン型SPRと比較すると2桁程度劣るものであった。そこで我々はさらなる検出限界の向上を目的として、抗原抗体反応を行った後、金コロイドを導入することでシグナルを増幅させた。その結果、検出限界は10ng/mLとなり、金コロイドを用いない時と比較し2桁程度の検出限界向上を達成した。
脱植民地化の比較からみた戦後日本をめぐる政府間和解の再検証

平成30年度の主たる研究課題は、以下の3点であった。(1)サンフランシスコ講和条約、日中・日韓国交正常化、アジア諸国との平和条約・賠償協定等の交渉プロセスにおいて、「和解」という観点が地域の特性に応じ、どのように組み込まれていたのか、残された課題は何か。(2)国交正常化問題や賠償問題の解決による「政府間和解」が、歴史問題の決着を意味せず、ナショナリズムと結びついて様々な形で噴出する過程は、上記課題(1)とどのように関連しているか、とくに1990年代の「戦後補償問題」との関連はどうか。和解の「持続」と「制度化」のためには何が必要なのか。以上の検討を踏まえ、東アジアに適合する公的和解のあり方はどのようなものか。(3)脱植民地化、脱帝国化、および和解の取り組みに関する国際比較の方法と課題に関する検討。以上の課題のうち、(1)(2)について、東南アジア諸国(インドネシア、ベトナム、フィリピン)との政府間和解(賠償協定、平和条約)は、それぞれの国民和解の推進に一定の効果を挙げたが、日中・日韓の政府間和解(日中共同声明、日韓基本条約)は、必ずしも国民間和解に結びつかなかったことが明らかとなった。こうした差異の背景として、賠償と政府開発援助(ODA)の受け止め方、国民的宗教のあり方(とくにフィリピンにおけるキリスト教と中韓における儒教)、慰霊事業のあり方、国民感情の持続性などが存在することが認められた。(3)について、分担者は、それぞれ国際比較の視点を念頭におきつつ、イギリス帝国の脱植民地化やドイツの和解事業について個別研究を進めた。代表者は、敗戦後の日本自身の「脱帝国化」(植民地国家から国民国家への変貌)と東アジア諸国(とくに韓国)の脱植民地化との関連について、予備的な研究論文を執筆した。サンフランシスコ講和条約を起点とする「政府間和解」(公的和解)の構造と機能、その効果と限界に関する研究、およびヨーロッパ(英帝国とドイツ)における脱植民地化と和解事業、東アジアにおける主要な脱植民地化の事例としての朝鮮半島(韓国、北朝鮮)に関する研究は順調に進んでいるが、敗戦後の日本の「脱帝国化」に関する研究は、関係資料の不足もあってやや遅れ気味である。日本の脱帝国化はアジア諸国の脱植民地化と交錯しながら進展したが、その過程を分析する必要がある。「公的和解」に関する研究蓄積を新たな「和解学」の創成につなげるためには、以下の検討が必要である。(1)これまでやや手薄であった敗戦後の日本の「脱帝国化」に関する研究を具体的な事例を通じて深める必要がある。たとえば、旧植民地人(台湾人、朝鮮人)が戦時は「帝国臣民」として処遇されながら、戦後処理の過程では日本人ではなく「外国人」として処遇され、遺族援護法の対象とならなかったこと、植民地を含む帝国日本を法的に支えたメカニズム(内外地法制)がどのように解体され、どのような遺制を遺したのか、といった問題である。(2)東アジアにおける和解のプロセスを構造的に把握するためには、国家間の和解(国交正常化、賠償、補償、謝罪等)を検証するだけでは不十分である。政府間の和解が社会の反発を生み、国民感情を刺激し、市民運動の契機となり、あるいは逆に市民団体、企業、国際組織の和解事業を促進する場合もある。そうした内外の動態をも含めて広がりのある和解研究のためには市民運動班(代表者・外村大)や歴史家ネットワーク班(代表者・劉傑)、和解文化・記憶班(代表者・浅野豊美)との密接な連携を図ることがこれまで以上に必要である。(3)世界的に盛んとなっている「移行期正義論」など和解に関する理論的研究に関する理解を深めるとともに、国際機関や国際NGOなどによる世界的な「和解」の取り組みにも視野を広げ、東アジアにおける和解アプローチとの関連や比較の可能性を探る研究が必要である。(4)日本の「脱帝国化」のプロセスを東アジア諸国(とくに韓国)の「脱植民地化」との関連で分析し、東アジアにおける和解アプローチの重層性を析出する。本研究は、平成29年7月から開始された新学術領域研究(和解学の創成:領域代表・早稲田大学・浅野豊美教授)の一環である。研究の初年度にあたり、まず研究補助者の採用、研究分担者(7名)との研究内容の調整と連絡体制の整備、領域代表者(総括班)との連携協力体制の構築に努めた。研究内容としては、代表者(波多野)は、それまでの研究を踏まえ、日本と周辺諸国との「政府間和解」の意義と限界を総括するとともに、日本自身の「脱帝国化」が歴史問題や和解プロセスに与えた影響を探った。その際、国際比較の視点を重視し、イギリスの脱植民地化のプロセス(半澤朝彦)およびドイツの戦後処理における賠償や補償の問題(川喜田敦子)を比較事例とした。なお、本年度の研究成果としては、第2次大戦末期の中国国民党と中国共産党との対立(国共対立)を日本がどのように受け止めたか、和解の可能性をどのように見通していたか、等について2本の論文をまとめた。分担者の役割としては、佐藤晋、権容ソク、神田豊隆および宮本悟は、それぞれ東南アジア、韓国、中国、北朝鮮と日本との戦後関係史の専門家として、対日国交正常化(政府間和解、北朝鮮の場合は平壌宣言)のプロセスを検証し、地域的・国内的影響、旧宗主国との関係の変化、市民社会の反応などを検証した。とくに日韓国交正常化は、朝鮮半島の脱植民地化と深くかかわっており、この問題について浅野豊美(領域代表者)の協力を得た。潘亮は、和解の観点から国連の紛争調停における日本の役割を検証した。

以上の研究遂行にあたっては、政府間和解の限界を意識しつつ、市民団体や企業の和解努力にも注目し、とくに市民運動班(外村班)と密接に協力すること、また、総括班が計画する和解学叢書の刊行計画、和解学事典(仮称)の編纂について積極的に協力することを2度の班会合および領域代表との会合で確認した。本研究は、新学術領域研究(和解学の創成:領域代表・早稲田大学・浅野豊美教授、H2933)の一環として実施される。採択が平成29年7月であったため、研究体制の整備(総括班との連携協力体制の構築、研究分担者7名との連携体制の整備、研究補助者の確保等)に多くの時間を費やした。総括班が実施したキックオフ・シンポジウム(昨年12月)を踏まえ、研究分担者との研究内容の調整を実施したのは本年1月であった。以上から研究そのものはやや遅れ気味である。平成30年度の主たる研究課題は、以下の3点であった。(1)サンフランシスコ講和条約、日中・日韓国交正常化、アジア諸国との平和条約・賠償協定等の交渉プロセスにおいて、「和解」という観点が地域の特性に応じ、どのように組み込まれていたのか、残された課題は何か。(2)国交正常化問題や賠償問題の解決による「政府間和解」が、歴史問題の決着を意味せず、ナショナリズムと結びついて様々な形で噴出する過程は、上記課題(1)とどのように関連しているか、とくに1990年代の「戦後補償問題」との関連はどうか。和解の「持続」と「制度化」のためには何が必要なのか。以上の検討を踏まえ、東アジアに適合する公的和解のあり方はどのようなものか。(3)脱植民地化、脱帝国化、および和解の取り組みに関する国際比較の方法と課題に関する検討。以上の課題のうち、(1)(2)について、東南アジア諸国(インドネシア、ベトナム、フィリピン)との政府間和解(賠償協定、平和条約)は、それぞれの国民和解の推進に一定の効果を挙げたが、日中・日韓の政府間和解(日中共同声明、日韓基本条約)は、必ずしも国民間和解に結びつかなかったことが明らかとなった。こうした差異の背景として、賠償と政府開発援助(ODA)の受け止め方、国民的宗教のあり方(とくにフィリピンにおけるキリスト教と中韓における儒教)、慰霊事業のあり方、国民感情の持続性などが存在することが認められた。(3)について、分担者は、それぞれ国際比較の視点を念頭におきつつ、イギリス帝国の脱植民地化やドイツの和解事業について個別研究を進めた。代表者は、敗戦後の日本自身の「脱帝国化」(植民地国家から国民国家への変貌)と東アジア諸国(とくに韓国)の脱植民地化との関連について、予備的な研究論文を執筆した。サンフランシスコ講和条約を起点とする「政府間和解」(公的和解)の構造と機能、その効果と限界に関する研究、およびヨーロッパ(英帝国とドイツ)における脱植民地化と和解事業、東アジアにおける主要な脱植民地化の事例としての朝鮮半島(韓国、北朝鮮)に関する研究は順調に進んでいるが、敗戦後の日本の「脱帝国化」に関する研究は、関係資料の不足もあってやや遅れ気味である。日本の脱帝国化はアジア諸国の脱植民地化と交錯しながら進展したが、その過程を分析する必要がある。今年度末に、領域研究代表者と総括
新規アレルギー治療法の開発に向けた粘膜型マスト細胞の解析

マスト細胞は存在部位や細胞内分泌顆粒の構成の違いにより結合組織型と粘膜型に分類され、主に前者が生体防御に、後者がアレルギーの発症に関与すると考えられている。アレルギーの予防・治療を考えた際には粘膜型マスト細胞を特異的に標的とする戦略が有効であると考えられるが、粘膜型マスト細胞の分化や活性化機構についてはほとんど解明されていないのが現状である。そこで本研究課題では、免疫学的・生化学的手法、ゲノム・プロテオーム解析を駆使し、未だ実現されていない粘膜型マスト細胞に特異的抗体の樹立と特異的分子の同定、ならびに生体内における粘膜型マスト細胞の分化・活性化機構を明らかにする。本研究課題の2年度にあたる22年度は、初年度に得られた4種類のマスト細胞特異的抗体のうち、1F11抗体を用いた免疫学的解析と生化学的解析を行った。その結果、1F11抗体は腸管や呼吸器に存在するマスト細胞には反応するが、皮膚に存在するマスト細胞には反応しないことを確認し、粘膜型のマスト細胞に特異的であることが判明した。また生化学的解析から1F11抗体は細胞外ATP受容体の一つであるP2X7を認識していることが明らかとなった。なた1F11抗体はin vitroだけではなく、in vivoにおいてもマスト細胞依存的な活性化を抑制できることを見いだした。これらの結果から、今後は、これらの抗体を用いた粘膜型マスト細胞を標的とした抗体療法、免疫療法が確立できるものと期待される。本研究課題の初年度にあたる本年度は、食物アレルギーの発症に伴いマウスの大腸固有層に浸潤してきたマスト細胞を抗原に用い、ラット、もしくはマスト細胞欠損マウスへ免疫することでマスト細胞特異的抗体を4種類樹立した。免疫学的解析を行った結果、これらの抗体は腸管や呼吸器に存在するマスト細胞には反応するが、皮膚に存在するマスト細胞には反応しないことを確認し、粘膜型のマスト細胞に特異的であることが判明した。また生化学的解析からこれらの抗体は免疫沈降法ならびにウエスタンブロットに用いることが出来ることを確認した。今後、これらの抗体が認識するリガンドを同定し、その生物学的機能を明らかにすることで、未だ多くが解明されていないマスト細胞の生物学的機能が明らかになると共に、粘膜型マスト細胞を標的とした抗体療法、免疫療法が確立できるものと期待される。
ニューモシスチスカリニ肺炎の高感度血清診断法の開発

カリニ肺炎は、免疫不全患者に発生する肺炎としてその頻度がきわめて高く、未治療であれば呼吸不全のため死に至る重篤な日和見感染症として認識されている。カリニ肺炎はエイズ患者の合併症として最も重要であるが、現在、経気管支的肺生検以外では確実な診断が困難である。しかし重篤な呼吸不全におちいっている患者に経気管支的肺生検を施行することは技術的な問題もあり重大な危険を伴うため、非浸襲的な方法、例えば血清診断法等の開発が望まれる。本研究では感染しているカリニ原虫から循環血内に放出される物質を検出し、非観血的にカリニ肺炎を診断することを試みた。カリニ循環抗原の検出に必要な条件の一つは特異性が高く、高力価の抗カリニ抗体を得ることである。従来の方法では、ラットの肺よりカリニシストを純化し、ウサギを免疫し、抗血清を得たのち、正常ラット肺組織で吸収するという操作を行なっていた。この方法によると炎症性蛋白に対する抗体等が混在する可能性があり、特異性に関する問題が残されていた。我々はステロイド処理したラットにカリニ原虫を感染させ、ステロイド投与を中止して回復させると同時に感作を成立させ、更に純化したカリニシストで追加免疫するという方法をとったためにカリニに特異的で高力価の抗カリニ抗体を得るのに成功した。そしてカリニ感染ラット血清をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、ウエスタンブロッティング法で蛋白をニトロセルロース膜に転写した後、抗カリニ過免疫抗血清を作用させた。ニトロセルロース膜上のカリニ蛋白,抗カリニ免疫複合体をペルオキシダーゼ標識抗ラット免疫グロブリンと反応させた後、基質を加え、発色させた。その結果、分子量29Kにカリニ特異的なバンドが検出されることを確認した。現在、この方法がカリニ肺炎の早期診断に利用可能か否かを検討中である。
教育改革における教育委員会の役割-地方教育行政に関する『中教審答申』以降の動向に注目して-

本研究のテーマは、『今後の地方教育行政の在り方について』以降、地方教育委員会がどのような改革に、どれだけ取り組んでいるか、そして、地域的バリエーションがあるとすれば、それは何に起因するものであるのかを明らかにすることであった。このために、郵送法による都道府県教委を対象の悉皆調査、市町村教委を対象の抽出調査を試みた。都道府県教委については、改革の全般的動きは明らかになったが、無回答の質問項目が散見されたこと、また、教育長に関する質問への無回答が目立ったことなどから、分析的考察はあきらめざるを得なかった。そのために、参考資料としてまとめた。市町村教委については、市町村教委の改革動向とその規定規程要因を(限られた視点からではあるが)解明することができた。これが本研究の主たる成果といえる。すなわち、市町村レベルにおいて全体として、中教審答申で提起された方向への改革の取組が進みつつあるのは確かである。しかし、市町村別や人口規模別の比較をするならば、改革動向に大きな格差が見られ、村教委や小規模教委は改革への動きが鈍い。それは、改革の進展度全般においてと同時に、たとえば「学校を支援する指導行政」にかかわる改革において、顕著に見られる。ここには、指導主事の配置率に象徴される教育行財政能力・リソースの不足という、小規模教委の抱える問題が反映されていると見ることができる。これは目新しい事実ではないが、教育委員会には「役割の再定義」が求められ、教育改善の鍵を握るとされている状況の中で、この事実は重い意味を持つと思われる。しかしまた、教育長の諸特性が改革の進展に大きくかかわっている。教育長の特性が市町村の壁を越えて改革や推進する力となりうる可能性を示唆する事実が明らかになった。高い政治・行政手腕や確かな教育識見、強い問題解決志向、首長との連携・一体化、あるいは、議員や地域住民など、教育にかかわるいわゆる「有権者」層との交流の幅広さやはたらきかけの強さ、こうした特性を持つ教育長のもとでは、教育委員会は自己革新の傾向が大きいことが現われている。中教審答申『今後の地方教育行政の在り方について』は、社会変化に対応する教育改革を進めるために教育委員会に対して自主的かつ積極的な教育行政を求め、その制度=機構、学校との関係、地域社会に対する役割において自己革新を要請している。こうした期待の高まる中で、各地の教育委員会がいかなる対応を行っているのか、その政策・制度の動向を探るために、すべての都道府県教育委員会を対象にしたアンケート調査を実施した。アンケートは、1.教育委員会の組織・運営の新しい動向、1)委員の選任、研修、定数2)事務処理体制の充実、3)地域住民への対応2.教育委員会と学校との関係、1)学校管理規則の見直し、2)学校への指導・助言、3)人事、研修、予算、4)校長人事・研修、3.「総合的学習の時間」に関する指導・助言、4.都道府県教育委員会と市町村教育委員会、5.都道府県教育長の5つのパートから構成された。32の教育委員会から回答があり、回収率は、68.08%であった。まず、組織・運営の動向であるが、全体として再編の動きはまだ活発ではないが、知事部局との連携機構、事務局や事務所の専門的職員の充実・強化策、カリキュラム・コーディネーターの設置、教育研修センターの改革、教育モニターの設置といった新しい動きが生まれている。学校との関係では、学校管理規則の見直しの動きは予想以上に鈍い。

学校への指示・命令と指導・助言の峻別のための工夫を講ずる動きや学校訪問のあり方を見直す動きも出始めていることは注目される。「総合的学習の時間」に関する指導・助言に関していえば、半数以上の教育委員会が対応を行っている。市町村教育委員会との関係では、指導通知のあり方を見直す動きが多くの教育委員会で始まっていることが、市町村教育委員会の自律性を尊重する動きとともに注目される。21世紀を展望した公教育の再編のための教育改革が時代の課題となる中で、教育委員会を地方教育行政機構の中核としてあらためて位置付け、教育委員会に対して主体的な自己改革と自主的で積極的な教育行政を求めた中教審答申『今後の地方教育行政の在り方について』が提出されて以降、教育委員会では、どのような改革にどの程度取り組んでいるのかという問題関心から、初年度は都道府県教委を対象にその改革の取組の実態を調査したが、本年度は、同じテーマで、市町村教委を対象に全国的なアンケート調査を実施した。全国の16府県500の市町村教委教育長に対して郵送調査を行った。その結果、市教委-138、町教委-105、村教委-31、合計274の教委から回答を得た(回収率、55%)。このサンプルについて、(1)市町村教委における改革の全般的動向-市町村教委はどのような改革にどの程度取り組んでいるのか。(2)改革の動向と地域特性-市町村教委における改革の動きは、その地域の特性によって規定されているのか。(3)改革の動向と教育長の特性-市町村教委の改革への取組は、その主体的条件ともいうべき教育長の特性により左右されるのか、の三つの観点から分析を試みた。分析の結果、今回の地方教育行政の改革動向に関して、二つのことが明らかになった。ひとつは、改革の進展に関して、行財政能力の不足に由来する小規模教委の置かれた困難な状況であり、もうひとつは、改革の動向を大きく左右する存在としての教育長の重要性である。つまり、人口規模3万人未満の小規模教委はそれ以外の規模の教委に比べ相対的に改革の動きに立ち遅れが見られるが、他方で、政治・行政手腕と教育識見を兼ね備え、問題解決志向が強く、交流の幅広さや議員や住民への働きかけの積極的さといった特性を持つ教育長のもとでは改革の進展度が著しいという結果が明白に現れており、教育長が改革の推進要因のひとつであることが明らかになった。
前立腺がんにおけるアンドロゲン応答性マイクロＲＮＡのエピゲノム作用機構の解明

多くの癌は進行すると肺、肝臓、骨などの他の臓器に転移する。骨に転移しやすい癌として、前立腺癌、乳癌、甲状腺癌が知られている。アンドロゲン応答性非コードRNAであるHOTAIRは前立腺癌の転移に関わり、ALPLは転移性前立腺癌の増殖に関与することが報告されている。平成30年度は骨芽細胞様骨肉腫細胞株以外に前立腺癌細胞株を用いて研究を広げ、癌の骨転移に着目して実験を行った。骨転移した前立腺癌より樹立されたVCaP細胞株でも石灰化が認められたため、前立腺癌細胞は転移巣である骨に到達すると骨特有の性質を示すことが考えられる。他の前立腺癌細胞株を用いて癌転移に関わるlncRNAの発現解析を行った結果、VCaP同様、骨転移した前立腺癌より樹立されたPC-3細胞株でも特定のlncRNAが過剰発現していることを見出した。現在はこの遺伝子の上流と下流遺伝子を調べ、作用機序を明らかにしている。今後は乳癌など、骨に転移する他の癌種において解析を広げ、骨転移のメカニズムを解明していく方針である。平成28年度は骨肉腫細胞株におけるアンドロゲン応答性非コードRNA (long non-coding RNA, lncRNA) HOTAIRの発現及び機能解析を行い、骨の石灰化においてHOTAIRがTNSAPの発現をエピジェネティックに制御することを明らかにした。初めに、ヒト骨肉腫細胞株Saos2の石灰化においてHOTAIRが関与するか調べた。HOTAIRをターゲットとしたsiRNAを細胞にトランスフェクションして石灰化を誘導した結果、HOTAIRの抑制により石灰化が亢進する傾向が認められた。siRNAを用いたHOTAIRの抑制によりTNSAPの発現誘導が定量的RT-PCR法で認められ、更にアルカリフォスファターゼ活性の上昇も認められたので、HOTAIRはTNSAPを介して石灰化を負に制御していることが示唆された。HOTAIRはターゲット遺伝子のプロモーターに結合し、ヒストンH3K27のメチル化、ヒストンH3K4の脱メチル化によって遺伝子の発現を抑制することが知られている。そこで、HOTAIRによるTNSAPの制御がエピジェネティックな機構によって行われているか、TNSAPのプロモーター領域のヒストンのメチル化状態をChIPアッセイ法で調べた。siRNAでHOTAIRを抑制した細胞ではコントロール細胞と比較して、TNSAPのプロモーター領域のヒストンH3K27のメチル化が減少し、逆にヒストンH3K4のメチル化が上昇していた。HOTAIRが骨肉腫細胞の石灰化においてTNSAPを抑制することが示唆され、そのメカニズムがヒストンの化学修飾の変化を介したエピジェネティックな制御方法であることが明らかになった。前立腺がんは進行すると骨に転移しやすいことが知られている。また、アンドロゲン応答性非コードRNAであるHOTAIRは前立腺がんの転移に関わることが報告されてきた。一方、骨の石灰化において中心的な役割を果たすTissue non-specific alkaline phosphatase (TNSAP)は転移性前立腺がんの増殖に関与し、患者の無病生存率に関与することが報告されている。本研究では前立腺がんと石灰化の関連性を調べ、HOTAIRがTNSAPの発現をエピジェネティックに制御することによって骨の石灰化のみならず、前立腺がんの骨転移にも関与しているという仮説を立て、実証実験を行った。ヒト骨肉腫細胞株Saos2の石灰化を誘導した際、HOTAIRを抑制した細胞では石灰化が亢進し、TNSAPの発現が誘導され、アルカリフォスファターゼ活性が上昇したので、HOTAIRはTNSAPを抑制することにより石灰化を負に制御していることが示唆された。ChIPアッセイ法ではHOTAIRがTNSAPのプロモーター領域のヒストンの化学修飾を変化させ、エピジェネティックな機構によってTNSAPを抑制していることを見出した。更に、石灰化に関与し得る新規lncRNAを公開データベースより探索し、TNSAPと共に石灰化を司る遺伝子のアンチセンス側からlncRNA-Aが発現していることを発見した。この遺伝子はアンドロゲン応答性であり、前立腺がん細胞で発現していることが報告されている。新規lncRNA-AのsiRNAを用いてSaos2に石灰化を誘導した際、lncRNA-Aを抑制した細胞では石灰化及びアルカリフォスファターゼ活性が抑えられる傾向が認められ、石灰化・骨転移のメカニズムを解明する新たな知見につながる手がかりを得た。SaOS-2細胞の石灰化誘導においてHOTAIRが関与するか調べるため、HOTAIRをターゲットとしたsiRNAを細胞にトランスフェクションしてMineralization Assay及びAlkaline Phosphatase Assayを行った。その結果、HOTAIRの抑制による石灰化の亢進、及びアルカリフォスファターゼ活性の上昇が認められた。定量的RT-PCR法により、石灰化を誘導したSaOS-2細胞においてHOTAIRの抑制によるALPLの発現誘導が認められ、HOTAIRはALPLを介して石灰化を負に制御していることが示唆された。HOTAIRがALPLの発現を抑制するメカニズムを明らかにするため、ALPLのプロモーターでドライブされるLuciferaseベクターを用いてReporter Gene Assayを行った。SaOS-2細胞にsiHOTAIR、またはコントロールのsiNCをレポーターベクターとコトランスフェクションして石灰化を誘導した結果、siHOTAIRによるLuciferase活性の上昇が認められた。この結果より、HOTAIRがALPLのプロモーターに作用することによって遺伝子の発現を抑制していることが示唆された。HOTAIRによるALPLの制御がエピジェネティックな機構によって行われているか、ALPLのプロモーター領域のヒストンのメチル化状態をChIPアッセイ法で調べた。

siRNAでHOTAIRを抑制した細胞ではコントロール細胞と比較して、ALPLのプロモーター領域のヒストンH3K4ジメチル化及びトリメチル化が上昇した。これまでの研究より、SaOS-2細胞の石灰化においてHOTAIRがヒストンのメチル化を介したエピジェネティックな機構によりALPLの発現を抑制していることが示唆された。前立腺がんは進行すると骨に転移しやすいことが知られており、アンドロゲン応答性非コードRNAであるHOTAIRは前立腺がんの転移に関わることが報告されてきた。一方、骨の石灰化において中心的な役割を果たすALPLは転移性前立腺がんの増殖に関与し、患者の無病生存率に関与することが報告されている。本研究では前立腺がんと石灰化の関連性を調べ、HOTAIRがALPLの発現をエピジェネティックに制御することによって骨の石灰化のみならず、前立腺がんの骨転移にも関与しているという仮説を立た。骨転移した前立腺がんより樹立されたVCaP細胞株はALPLを発現していることが報告されている。そこで、VCaP細胞を用いてSaOS-2と同様にMineralization Assayを行った。細胞を播種してほぼコンフルエントな状態で石灰化誘導培地に置換し、その後1週間程度で石灰化が認められた。前立腺がん細胞は転移巣である骨に到達すると骨特有の性質を示すことが示唆され、骨転移のメカニズム、及び骨での前立腺がん細胞の増殖に関する手がかりを得ることができた。多くの癌は進行すると肺、肝臓、骨などの他の臓器に転移する。骨に転移しやすい癌として、前立腺癌、乳癌、甲状腺癌が知られている。アンドロゲン応答性非コードRNAであるHOTAIRは前立腺癌の転移に関わり、ALPLは転移性前立腺癌の増殖に関与することが報告されている。平成30年度は骨芽細胞様骨肉腫細胞株以外に前立腺癌細胞株を用いて研究を広げ、癌の骨転移に着目して実験を行った。骨転移した前立腺癌より樹立されたVCaP細胞株でも石灰化が認められたため、前立腺癌細胞は転移巣である骨に到達すると骨特有の性質を示すことが考えられる。他の前立腺癌細胞株を用いて癌転移に関わるlncRNAの発現解析を行った結果、VCaP同様、骨転移した前立腺癌より樹立されたPC-3細胞株でも特定のlncRNAが過剰発現していることを見出した。現在はこの遺伝子の上流と下流遺伝子を調べ、作用機序を明らかにしている。今後は乳癌など、骨に転移する他の癌種において解析を広げ、骨転移のメカニズムを解明していく方針である。TNSAPのプロモーター領域を調べ、公開データーベースをもとに転写開始点より約15kb上流にRE1 Silencing Transcription Factor, REST結合領域が存在することを見出した。
常温ガラス化保存技術開発のための基礎的研究

本研究は、アルテミアなどの極限環境生物で保存されている特徴的なクリプトビオシスに注目し、生物資源保存のための新規保存技術の開発を目指して行われた。まず試験管レベルのゲルモデル系によるシミュレーションを行って、常温ガラス化のための適正条件を検索した。具体的には、アガロースゲルにトレハロース等の各種糖類を添加したゲルの水分含量と糖類別のガラス化傾向の対応関係を明らかにした。さらに、うずら卵ゲルに対して、トレハロースと乾燥耐性をもったLEAペプチドを添加したところ、LEAペプチド濃度に応じたガラス化促進作用が得られた。本研究のコンセプトは、自然界のいわゆる極限環境生物と知られている一群の生物が有する優れた耐性メカニズムであるクリプトビオシスを、試験管内で単純化したゲルモデル系で再現することによって、常温ガラス化に到達するための最適条件を見極めることにある。このため、初年度となる平成26年度は、条件検討に適したアガロースゲルモデルの開発と、当研究室でも扱ってきた極限環境生物アルテミア(A. franciscana)の乾燥耐久卵で認められるクリプトビオシスの例を参考にして、ガラス化達成のために必要な条件検討を中心に行った。まずガラスリングにより均質な円柱型アガロースゲルを作成し、減圧乾燥によってゲル内部の含水量は10%程度まで低下し、見かけ上はほぼ完全に乾燥した状態となった。続いて一定時間常温で保存後、再水和させたゲルの粘弾性測定とゲル表面の電子顕微鏡観察によって、品質評価を行った。その結果、糖質を添加していないインタクトなアガロースゲルでは、ゲル破断点が全く認められず(延性的破断)、ゲルの内部構造の破壊が顕著であったが、各種糖質を添加したアガロースゲルでは、明瞭なゲル破断点(弾性限界点)が確認でき、ゲルネットワーク構造が比較的保持されていることが明らかとなった。特に、トレハロース添加ゲルでは、すべての濃度で破断点が確認され、ゲル内部構造の良好な保持が推定された。平成26年度はゲルモデルでのガラス転移点の確認が最優先課題であったため、様々な組成からなるアガロースゲルを対象に、網羅的な示差走査熱量測定を実施し、減圧乾燥による脱水程度ごとのガラス化達成条件を検索した。その結果、40°Cの減圧乾燥後、100°Cの真空乾燥時間を追加してゲル含水量が5%以下になった場合、特徴的なガラス転移点(Tg=112.8°C)を示す基線シフトを今回初めて確認した。本研究のコンセプトは、極限環境生物が示すクリプトビオシス(乾眠)で起こっている生物学的現象を、アガロースゲルモデル系で再現することにより、この現象を引き起こす要因を理解することにある。即ち、様々な糖質やタンパク質を添加したアガロースゲルを作成し、減圧乾燥によって水分を適切に除去したあと、熱分析によってガラス化達成のための条件を調べていく。また、この研究によって得られた知見を利用し、組織や細胞の長期常温保存へ応用する基礎技術の開発に繋げていくことを最終的な研究目的としている。昨年度(1年目)の研究により、本研究で用いるアガロースゲルモデル系でのガラス化を達成させたことを受け、本年度(2年目)は添加する糖質やタンパク質によるガラス化条件の詳細な検討や、アガロースゲルのガラス化と水分子の挙動に注目し、ガラス化達成に必要な脱水程度などを中心に調べた。これにより、本研究が目指す常温ガラス化保存実現に向けた具体的な条件を見当づけることが可能となり、減圧乾燥によってアガロースゲルを常温ガラス化状態で長期間安定に保存できることが示唆された。また本年度より、クリプトビオシスで重要な役割をしている乾燥耐性タンパク質(LEAペプチド)をアガロースゲルモデル系に添加することで、減圧乾燥温度をなるべく常温に近づけ、食品成分を変性させないままガラス化が可能な条件の探索を開始している。本年度に得られたLEAペプチドの添加データについては解析中である。アガロースゲルは、一定口径のガラスリングで1.5%低融点アガロースゲルを作成し、0.1Mあるいは0.6Mのトレハロースを添加した。また、3種の主要なタンパク質、ゼラチン、卵白アルブミン、カゼインをそれぞれ一定濃度で混和し成型した。固化させたゲルは、減圧乾燥器内(0.4kPa)で常温もしくは100°Cに保ちながら、一定時間静置した。その後、一部の乾燥ゲルは赤外線微量水分計によって、ゲルに含まれる水分量を正確に測定し、残りの乾燥ゲルを示差走査熱量測定(DSC)によって、アガロースゲル内部の物質状態の熱分析を行った。減圧乾燥させたゲルは別途、走査型電子顕微鏡(SEM)によって、ゲル表面の観察も行った。本年度の研究計画に基づいて、様々な糖質やタンパク質添加による影響、異なる減圧乾燥条件による影響、特にトレハロース濃度によるガラス化効果などを網羅的に調査することができた。また、SEMによる観察では、DSCによってガラス転移点を測定できたゲルの表面が極めて平滑な状態(ガラス状)であることを確認した。以上より、トレハロース濃度とガラス化との関係、水分含量とガラス化との関係をある程度明確にすることができた。これらの基礎データは、今後、LEAペプチドを添加していく際、モル比の決定等に必要な情報となる。しかしながら、本年度に実施したLEAペプチド添加実験では、LEAペプチドの濃度によるガラス化温度の変化に一定の成果が得られたものの、明確なガラス化の判断については結論が得られていない状況である。

このため、本来の研究計画と比べて、やや遅れていると自己評価した。本研究は極限環境生物で保存されている共通したメカニズムであるクリプトビオシス現象を試験管レベルでシミュレーションを行い、常温ガラス化保存技術の開発に向けた基礎的研究を行う目的で3年間にわたり実施してきた。初年度は、糖質とタンパク質を添加させたアガロースゲル乾燥前後のゲルネットワーク構造の状態変化を粘弾性測定や走査型電子顕微鏡などによって評価を行った。その後、加熱下で減圧乾燥を行い、アガロースゲルモデルのガラス化達成条件を求めることを最優先した。安定した熱分析データを得ることに時間を要したが、ガラス化のための基本データが得られた。2年目は、様々な糖質組成を変更したアガロースゲルに対するガラス化条件を突き止めるため、添加糖濃度と含水分量に応じたガラス化条件の熱分析データを網羅的に回収した。特に、常温減圧乾燥時でのガラス化条件を探索するため、水分量とガラス化との対応関係を把握した。ただし、LEAペプチドを添加したアガロースゲルのガラス化効果については評価が難しく、2年目終了時点での結論は持ち越された。最終年度は、LEAペプチド添加によるガラス化条件を可及的速やかに対処すべき課題として取り組んだ。具体的には、アガロースゲルモデルからタンパク質性のうずら卵の卵黄及び卵白ゲルモデルへ変更を行い、減圧常温乾燥と常温送風乾燥を実施した。試行の末、適正濃度のトレハロースとLEAペプチドを添加したところ、LEAペプチド濃度に応じたガラス化傾向が認められた。特に、LEAペプチドの添加効果は、卵黄モデルより卵白モデルでのガラス化効果が著しかった。また、アルテミアの卵殻を脱殻処理によって取り除き、膜浸透性を改善した上で、トレハロースとLEAペプチド添加による孵化率改善を調べたが、3年目終了時点までに明確な結論を引き出すには至らず、今後の課題として残した。本研究は、アルテミアなどの極限環境生物で保存されている特徴的なクリプトビオシスに注目し、生物資源保存のための新規保存技術の開発を目指して行われた。まず試験管レベルのゲルモデル系によるシミュレーションを行って、常温ガラス化のための適正条件を検索した。具体的には、アガロースゲルにトレハロース等の各種糖類を添加したゲルの水分含量と糖類別のガラス化傾向の対応関係を明らかにした。さらに、うずら卵ゲルに対して、トレハロースと乾燥耐性をもったLEAペプチドを添加したところ、LEAペプチド濃度に応じたガラス化促進作用が得られた。平成26年度は研究計画の全体の要となるトレハロース含有アガロースゲルモデル系における減圧乾燥後のガラス転移温度の検出に注力したため、想定以上の時間がかかった。基準物質を使った示差走査熱量測定の校正にも時間を要したが、安定した基線シフトの条件設定に試行錯誤を重ねたことが主な原因である。このため、トレハロースを添加したアガロースゲルにLEAペプチドまで添加するに至っておらず、予定していた研究発表の機会が得られなかったことから、やや遅れているという自己評価である。しかしながら、これらの一連の実験により、試験管内で単純化したゲルモデル系においてガラス転移点が突き止められたため、この前後の条件をターゲットとして、トレハロース濃度およびLEAペプチドを添加していくことが順次可能となり、今後の進捗状況については劇的に改善されることが想定される。
寄生性原虫赤痢アメーバにおける貪食と病原性に関する研究

前年度の研究において、赤痢アメーバは赤血球の貧食初期にEhRab5が局在する空胞を形成することが、貪食効率とin vivoでの肝膿瘍形成という病原性に重要であることを示した。本年度では、前述の空胞(prephagosomal vacuole ; PPVと名付けた)の役割を更に詳細に解析した。哺乳類細胞のファゴソームにおいてはリソソームの融合とともにリソソーム酵素がファゴソーム内に輸送されると共に酸性化されることが報告されている。そこで、先ずPPVが酸性化されるかどうか調べるために、酸性化コンパートメントを染色する蛍光基質を用いて染色した。その結果、貪食開始初期(5分)のPPVは酸性化されていないが、貪食の継続と共にPPVの内部が酸性化されていくのが観察された。最終的に、30分後のPPVが消失する頃には赤血球を含むファゴソームが酸性化されていた。次に、PPVが含むプロテアーゼを探索するために、各種の抗体で染色したところ、システインプロテアーゼ2とアメーバポアAを染色する抗体が、定常状態で酸性化コンパートメントに蓄積していることを発見した。そしてシステインプロテアーゼ2とアメーバポアAは、ファゴサイトーシスの開始と共にPPVの中に取り込まれ、PPVが消失する30分後にはファゴソームに輸送されていた。以上のことは、ファゴサイトーシスを開始する以前の赤痢アメーバのリソソーム内には、システインプロテアーゼ2とアメーバポアAが蓄積しており、EhRab5が局在する小胞が融合して形成されたPPVにリソソームが融合することによってPPVが成熟し、その後成熟したPPVがファゴソームに融合することでファゴソームでの分解が開始すると考えられた。さらに、このモデルを証明するために、変異型EhRab5発現下ではPPVが形成できないことを昨年度報告したが、この変異型EhRab5発現株におけるアメーバポアAのファゴソームへの輸送される効率を観察したところ、ファゴソームへのアメーバポアAの輸送効率が有意に低下しているのが観察された。つまりこの結果は、PPVの形成がファゴソームに分解酵素を輸送するのに重要であることを示している。また、PPVの形成がde novoで小胞の融合によって起こることを証明するために、緑色蛍光タンパク質(GFP)融合EhRab5を発現することに赤痢アメーバで初めて成功した。ビデオを用いた観察により、GFP-EhRab5のシグナルが30秒以内に直径3-4ミクロンのPPVを形成することが分かった。以上のように赤痢アメーバのファゴサイトーシスの過程には非常にダイナミックな膜の動きがあり、多くの点で哺乳類細胞との相違点が明らかになった。赤痢アメーバはヒト腸管内で活発に細菌や赤血球を貪食しながら栄養分を摂取している。この貪食活性(ファゴサイトーシス)とアメーバの細胞上皮への侵入性や肝膿瘍形成といった病原性は相関があると従来から報告されていたが、分子メカニズムは明らかでなかった。平成15年度の研究では、低分子量GTPaseのEhRab5がファゴサイトーシスの効率だけでなく肝膿瘍形成能にも影響を関与することを示した。EhRab5は赤血球を取り込む初期過程(5-10分)に大きな空胞上に局在することが観察されている。EhRab5の活性化型と不活性化型変異型を発現する形質転換アメーバ株を作成し、それらにおけるファゴサイトーシスと病原性における効果を調べた。その結果、野生型EhRab5を発現する株は赤血球の貪食速度が上昇したのに対し、変異型を発現する株はどちらも取り込み抑制が観察された。間接蛍光抗体法により、変異型EhRab5発現株では、ファゴサイトーシス初期の空胞形成が阻害されていた。他種生物ではRab5はファゴサイトーシスだけでなくエンドサイトーシスにも関与することが報告されているが、EhRab5変異発現株ではエンドサイトーシスには影響が見られず、ファゴサイトーシス特異的に機能していることが示された。よって、EhRab5が局在する空胞形成がファゴサイトーシスと関連があることが示された。さらに、ハムスターの肝膿瘍形成モデルに形質転換アメーバを用いたところ、EhRab5大量発現株ではコントロール群よりも大きな肝膿瘍を形成した。このことは、ファゴサイトーシスの活性上昇が病原性と相関するというこれまでの報告を支持すると共に、それに関与する遺伝子を初めて同定したものである。しかしながら、貪食が低下するEhRab5活性化型変異形質転換株を肝膿瘍形成モデルに用いると、野生型の大量発現とコントロール群との中間の大きさの膿瘍を形成した。よってEhRab5の活性化状態に関係なく、EhRab5タンパク質の大量発現が肝膿瘍形成に影響を示すことを示唆していた。

そこで、先ずPPVが酸性化されるかどうか調べるために、酸性化コンパートメントを染色する蛍光基質を用いて染色した。その結果、貪食開始初期(5分)のPPVは酸性化されていないが、貪食の継続と共にPPVの内部が酸性化されていくのが観察された。最終的に、30分後のPPVが消失する頃には赤血球を含むファゴソームが酸性化されていた。次に、PPVが含むプロテアーゼを探索するために、各種の抗体で染色したところ、システインプロテアーゼ2とアメーバポアAを染色する抗体が、定常状態で酸性化コンパートメントに蓄積していることを発見した。そしてシステインプロテアーゼ2とアメーバポアAは、ファゴサイトーシスの開始と共にPPVの中に取り込まれ、PPVが消失する30分後にはファゴソームに輸送されていた。以上のことは、ファゴサイトーシスを開始する以前の赤痢アメーバのリソソーム内には、システインプロテアーゼ2とアメーバポアAが蓄積しており、EhRab5が局在する小胞が融合して形成されたPPVにリソソームが融合することによってPPVが成熟し、その後成熟したPPVがファゴソームに融合することでファゴソームでの分解が開始すると考えられた。さらに、このモデルを証明するために、変異型EhRab5発現下ではPPVが形成できないことを昨年度報告したが、この変異型EhRab5発現株におけるアメーバポアAのファゴソームへの輸送される効率を観察したところ、ファゴソームへのアメーバポアAの輸送効率が有意に低下しているのが観察された。つまりこの結果は、PPVの形成がファゴソームに分解酵素を輸送するのに重要であることを示している。また、PPVの形成がde novoで小胞の融合によって起こることを証明するために、緑色蛍光タンパク質(GFP)融合EhRab5を発現することに赤痢アメーバで初めて成功した。ビデオを用いた観察により、GFP-EhRab5のシグナルが30秒以内に直径3-4ミクロンのPPVを形成することが分かった。以上のように赤痢アメーバのファゴサイトーシスの過程には非常にダイナミックな膜の動きがあり、多くの点で哺乳類細胞との相違点が明らかになった。
ペプチド・MHCクラスI分子に対する免疫寛容の成立機構の解析

1.ヒトマイナー組織適合(hmH)抗原特異的CTLクローンが認識するhmHペプチドの解析HLA-B35分子に結合するhmHペプチドを以前にB細胞株より分離したが、さらに腎培養細胞から分離することができた。またHLA-B35分子の152番目をGluに置換したHLA-B35-152Eおよび171番目をHisに置換したHLA-B35-171H抗原はhmHペプチドを結合することができるが、hmH特異的T細胞によっては認識されないことを明らかにした。このことからHLA-B35分子のAポケットの構造変化がhmHペプチドの結合には大きな影響を与えないが、T細胞リセプターの認識に影響をあたえると考えられた。2.HLA-B35結合自己抗原ペプチドの解析2つのHLA-B^*3501分子結合自己抗原ペプチドを分離、同定することができた。この9アミノ酸からなるこれらのペプチドのHLA-B^*3501分子との結合能を、TAP欠損細胞RMA-SにHLA-B^*3501遺伝子を導入したトランスフェクタントを用いてフローサイトメトリーで測定する方法を開発した。この方法にてペプチドのアンカー部位がHLA-B^*3501分子との結合にきわめて重要であることを明らかにした。さらに12アミノ酸からなる長いペプチドもアンカーが保存されていれば結合することを明らかにした。
変形とキャビテーションを考慮した弾性プロペラの翼形状および剛性の最適化

一般的に商舶用のプロペラは金属製であるが、近年、複合材料製のプロペラの開発と実用化がなされている。複合材料となることによりプロペラの弾性変形を利用し、船尾伴流中でキャビテーションを抑えることが期待されている。本研究の目的は、キャビテーションを抑え、なおかつ効率の良い弾性プロペラの翼形状と剛性を見出すこと、またプロペラ翼形状、翼の変形とキャビテーションの関係性を明確にすることであった。本研究では、揚力面理論とFEMを組み合わせることにより、弾性プロペラの構造流体連成計算法を開発した。なお揚力面理論計算によるプロペラ翼形状と特性の変化の影響については組合せラインCCD法による弾性プロペラ模型の変形量計測結果と比較して再現可能であることを検証した。また、パネル法によるプロペラ性能計算法によりプロペラ効率とキャビテーションの発生範囲を関数とした多目的最適化手法を開発した。さらに、設計空間内における設計変数と設計変数間の複雑な応答を可視化およびイメージ可能な単純な関数に抽出することのできる固有直交分解法を開発した。本手法によって、プロペラの設計変数(ピッチやキャンバーなど)によるプロペラ特性の変化を、単独の設計変数による影響(主要因効果)と2つ以上の設計変数による影響(交互作用)として抽出し、可視化することが可能になった。これにより有効なパラメータの確認が可能となった。本研究の結果、弾性プロペラが変形することに流体特性の変化の予測、またキャビテーションの発生範囲を考慮した多目的最適化、さらに設計変数がプロペラ特性に与える複雑な応答を抽出して可視化することが可能になった。
ヒトDuchenne型進行性筋ジストロフィ-症の病因・病態の解明-特にアデニレ-トキナ-ゼを指標として-

生体のエネルギ-代謝や生理的制御機序においてアデニンヌクレオチドが利用され、その産生系と利用系は複雑な調節機構によって平衡を保持しており、本研究の対象であるアデニル酸キナ-ゼはその中心的役割を果たしている。特に、デュシェンヌ型筋ジストロフィ-症において分担研究者の一人(M.H.)は本酵素の変異型の存在を報告[J.Biol.Chem.(1985)、260、11595-11602]しており、その遺伝生化学的アプロ-チから本症病因の解明に資する研究に着手した。この変異型酵素は酵素化学的にはヒト成人肝ミトコンドリアや胎児骨格筋型を示し、免疫化学的には成人骨格筋型で、タンパク質化学的にはそれらとは大きい変化が認められた。本症の骨格筋においてこの変異酵素がATP消費を加速していることも、筋細胞膜ジストロフィン欠如に伴う病変を一層を悪化させていることが予測される。そこで、ヒト骨格筋型酵素の各種変換体を得るために人工合成遺伝子とその大量発現系の確立を計った[Prot.Eng.(1989)2、379-386]。最終的には、反応速度、基質親和性、触媒効率の差異などの比較検討のために基質結合部位[J.Prot.Chem.(1989)8、549-562]に関与するアミノ酸残基の各種変異体を作って発現させ、反応解析による基質と活性中心部位との相互作用に関する貴重なモデルを提示した[Biochemistry(1990)29、1107-1111]。以上のような基礎的成果により、前述の変異型アデニル酸キナ-ゼを正常な骨格筋、肝および脳、さらに胎児組織のそれらと比較することによって、変異型酵素の出現と病因病態との関連を究明したい。常にタンパク質レベルの変化とDNAレベルの変化の直接的な対応を念頭において遺伝子検索、変異酵素タンパク質の特徴を明らかにすることや、その他病態と直結するものを見出すことにより、筋細胞レベルにおける発生分化の正常な基盤や本症の病因を解明できるであろうし、診断や治療への手がかりもそこにあることが期待されよう。(1)ヒトアデニル酸キナーゼ遺伝子の設計:ヒトアデニル酸キナーゼ遺伝子の塩基配列は決定されていないので,アミノ酸一次構造をもとに遺伝子設計を行い,その596bp塩基配列を大腸菌に発現させるための構築を行った.(2)ヒトアデニル酸キナーゼ遺伝子の構築と合成:596塩基対よりなるヒトアデニル酸キナーゼの人工遺伝子を鎖長2533の40本のフラグメントに分割合成を行い, C_<18>シリカゲル担体による高速液体クロマトグラフィー(HPLe)により分析,分取後,イオン交換体を用いたHPLCによって単一に精製した.本遺伝子は40本のオリゴマーで構製され,これらを4つのセグメントに分けて結合を行った.(3)ヒトアデニル酸キナーゼの発現ベクターの構築と遺伝子発現:人工合成の本遺伝子を含む発現ベクターpAKを大腸菌HB101株に導入して組み換え体を得た.形質転換させた大腸菌プラスミドを調製し,精製したプラスミドDNAをdideoxy法で配列の確認を行った.菌体タンパク質量の10%発現が得られた.そこで菌体の大量培養により人工合成ヒトアデニル酸キナーゼを抽出精製した.得られた酵素タンパク質の活性は報告されているヒト骨格