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世論調査による日本人の宗教性の調査研究

平成20年度に「日本人の宗教意識・宗教行動に関する世論調査」を、平成21年度に「日本人の宗教団体への関与・認知・評価に関する世論調査」を実施した。日本人の「信仰有り」「宗教団体への帰属」は依然として低く、減少傾向にあることが確認された。これまで伝統的な宗教行動として考えられてきたものが実施されなくなる一方、祖先崇拝を中心として神観念も薄れてきている。他方で、近年のパワースポット・ブームなどで、神道(神社)に関するイメージや信頼感は上昇した。平成20年度は、「日本人の宗教意識・宗教行動に関する世論調査」(全12問)を実施した。具体的な世論調査の対象・方法は以下の通りである。1)地域全国2)調査対象住民基本台帳による満20歳以上の男女3)標本数2,000(167地点)4)出方法層化副次(二段)無作為抽出法5)調査方法調査員による個別面接聴取法(官製葉書による事前協力状送付)6)実施期間平成20年10月中旬平成20年9月末に質問文を完成させ世論調査を委託した中央調査社により調査を実施。回収数1339、回収率67.0%であった。近年、宗教に関する世論調査の回収率は低下傾向にあり、調査協力が得にくくなっている。中央調査社は10月末に集計を終了し集計結果を紙媒体とエクセルのファイル形式で提出した。本研究代表者は、データを統計用ソフトSPSSで読み込み、他のクロス集計を実施した。研究成果は、平成21年度『國學院大學大学院紀要』に掲載予定。平成21年度は、「日本人の宗教意識・宗教行動に関する世論調査」(全12問)を実施した。1)地域全国2)調査対象住民基本台帳による満20歳以上の男女3)標本数2,000(167地点)4)出方法層化副次(二段)無作為抽出法5)調査方法調査員による個別面接聴取法(官製葉書による事前協力状送付)6)実施期間平成20年10月中旬平成21年9月末に質問文を完成させ世論調査を委託した中央調査社により調査を実施。回収数1362、回収率68.1%であった。中央調査社は12月末に集計を終了し集計結果を紙媒体とエクセルのファイル形式で提出した。研究成果は、平成22年度『國學院大學大学院紀要』に掲載予定。平成22年度は、平成22年度に実施した「日本人の宗教意識・宗教行動に関する世論調査」と平成23年度に実施した「日本人の宗教団体への関与・認知・評価に関する世論調査」によって得られたデータに関する補完的資料の収集、および研究成果の公開、そして報告書の作成を行った。5年ごとに実施している世論調査であり、「日本人の宗教意識・宗教行動に関する世論調査」は2度目で5年間の変化、「日本人の宗教団体への関与・認知・評価に関する世論調査」は3度目で10年間の変化を把握できるようになった。日本人の宗教行動と宗教意識については、この5年間で大きな変化は見られなかった。ただし、長期間におよぶ変化としては、おおよそどの領域においても暫減の傾向が示された。他方で、宗教団体に関する調査では、認知や評価に関して変化が見られた。認知や評価に関しては、教団による社会的時間とメディアによる報道の影響が強く、短時間での変化が生じやすい。とくに興味深かったのは、「神道(神社)」に対する認知と評価が、他の系統と比較して高くなっている点である。同じ伝統宗教である仏教系の著名寺院の認知度と比較して、伊勢神宮、明治神宮などの認知度が軒並み高くなった。近年の世界遺産ブームやパワースポットブームが背景にあるものと考えられる。もう一点、明確に変化と見られるのは、新たに政党を結成して政界に進出した宗教団体への認知度が5年前と比較して高くなっている点である。
インクレチンホルモンによる神経性・液性膵β細胞インスリン分泌調節に関する研究

本研究ではインクレチンホルモンによるインスリン分泌刺激の機序を明らかにした。インクレチンホルモンであるGLP-1やGIPは膵β細胞のTRPM2チャネル(transient receptor potential channel)を活性かした。TRPM2の活性化は膜を興奮させることでブドウ糖によるインスリン分泌の感受性を高めていることが明らかになった。今後のTRPM2チャネルを標的とした創薬が期待される。本研究では膵β細胞におけるインスリン分泌機構で新しい機序を鄭署することである。インスリンは血糖調節におけるもっとも重要なホルモンである。β細胞のイオンチャネルは繊細なインスリン分泌において重要な働きをそれぞれ果たしている。インクレチンホルモンは食後に小腸から分泌されるホルモンで、糖尿病の病態とも深くかかわっていて、インクレチンの低下はインスリン分泌も低下することが知られている。本研究で明らかになった子t:インクレチンホルモンはβ細胞のTRPチャネル(transient reveptor potentialチャネル)に作用することを明らかにした。この作用は現在使用されているGLP-1製剤であるリラグルチド、エクセナチドでもみられた。さらに小腸上部から分泌されるインクレチンホルモンのGIPでも同様の作用があることが分かった。また、インクレチン作用の機序を詳細に分析して、新たなインスリン分泌機構を提唱することができた。インクレチンホルモンはcAMP/EPAC2/RAP1を介してTRPM2チャネル(TRPチャネルのサブファミリーである)を活性化してインスリン分泌を増強していた。また、グルコース刺激もこの機序を使って分泌刺激をおこなっていた。このチャネルは食後に増加する血中濃度と同程度の濃度で作用することもわかった。本研究の成果はDiabetes誌に投稿し受理された。学会発表も昨年はおこない、日本糖尿病学会、米国糖尿病学会で発表した。TRPM2チャネルはNa, K, Caに透過性がある非選択性陽イオンチャネルであることも分かった。目的:膵β細胞は食事摂取に応じてインスリンを分泌し血糖調節を行うことで生体エネルギー代謝を繊細に制御しているβ細胞のイオンチャネルにはATP感受性K+チャネルと電位依存性K+チャネル(Kvチャネル)、電位依存性Ca2+チャネルがある。最近糖尿病の治療薬としてインクレチン関連薬が臨床応用されているが、インクレチンホルモンであるGLP-1(glucagon-like peptide 1)やGIP(glucose dependent insulinotropic polypeptide)のインスリン分泌増強の機序は不明である。本研究ではインクレチンホルモンのβ細胞における作用機序を明らかにすることである。本研究で明らかになったこと:上記インクレチンホルモンがβ細胞の上記のイオンチャネルには影響を及ぼさないことが判明した。一方で、TRPチャネル(transient receptor potetial)を活性化することが分かった。このチャネルは背景電流の1種である。β細胞の膜電位はATP感受性K+チャネルと背景電流の量のバランスで決定される。TRPチャネルの活性化は背景電流として増加し、膜電位の脱分極をもたらすことから、グルコース刺激持の脱分極応答を増強させる。また、この作用機序としてはインクレチンホルモンの受容体への結合は細胞内cAMPを産生し、その下流のEPAC2を介してTRPチャネルを刺激することが分かった。この新しい機序はこれまでのβ細胞とインクレチンホルモンの機序において、新規的である。さらにTRPチャネルへの作用濃度はピコモラーレベルで活性化することも明らかとなり、生理的濃度で作用することが判明した。TRPチャネルはその通すイオン種は非選択的である。Na, Ca, Kイオンなどがその透過イオン種である。このチャネルを活性化する作用をGIPも有することも分かった。β細胞のイオンチャネルにはATP感受性K+チャネルと電位依存性K+チャネル(Kvチャネル)、電位依存性Ca2+チャネルがある。本研究ではインクレチンホルモンのβ細胞における作用機序を明らかにした。明らかになったこととしては:(1)インクレチンホルモンがβ細胞の上記のイオンチャネルには影響を及ぼさないことが判明した。(2)一方で、TRPチャネル(transient receptor potetial)をインクレチンが活性化することが分かった。このチャネルは背景電流の1種であった。

Na, Ca, Kイオンなどがその透過イオン種である。このチャネルを活性化する作用をGIPも有することも分かった。以上の成果は2014年Diabetes誌に発表した。研究達成に向けた共同研究のネットワークを構築できた。優秀な研究者と共同研究をすることで研究実績は飛躍的に推進できた。インクレチンホルモンの作用機序はこれまでよくわかっていなかった。cAMPをβ細胞内で産生することは分かっており、また、細胞内Ca2+濃度を増加させることも知られていた。しかし、その詳細な機序は不明であった。その機序を一気に明らかにすることができた。現在論文化に向けて投稿準備中である。インクレチンホルモンの膵β細胞における作用機序をさらに明らかにするための重要な蛋白との相互作用を明らかにする。蛋白・蛋白関係の作用を明らかにする。薬物の効果を検討する。研究機関はあと1年であるが、可能な限り本研究を推進させる。GLP-1作用に本研究結果がメインに作用していることを確立する。研究計画は変更なく実施する予定である。平成25年度以降の研究計画は1.GLP-1以外のホルモンであるPACAPあるいはGLP-1関連薬として臨床的に使用されているliraglutide, exendin-4の作用が同じくTRPチャネルを活性化するかどうかを確認する。2.それ以外でβ細胞のインスリン分泌を最も強く刺激するグルコースがこのチャネルへどのように作用するかも検討する。予備的にはグルコースもTRPチャネルを活性化するという画期的結果を得ているので、その研究をされに進める予定である。また、TRPチャネルは非選択的陽イオンチャネルであるのでNa, Ca, Kイオンを透過すると思われるので、その透過性の割合を検討する予定である。次に細胞内Ca濃度測定をして膜電位との同時測定装置を確立する予定である。この装置ならびに手法は日本ではほとんどの施設でまだ達成されていない方法であることから新規的結果を得ることが可能となることが期待できる。さらに以下の計画も検討している。3.TRPチャネルノックアウトマウスを用いてどのタイプのTRPチャネルが関与しているかどうかを検討する。4.糖尿病ラットにおけるTRPチャネルの機能異常の有無を検討する。以上の計画により糖尿病の病態とTRPチャネルの関係を検討できる。
計算代数統計学的手法による高次元配列データ解析法の研究とその画像統計への応用

高次元分割表に対する逐次条件付き検定における推論の枠組みである周辺和一定の分割表集合をマルコフ基底により時系列的に構築することができることを近傍定理を証明することにより示した。また高次元テンソルデータの最大階数決定問題に対して、アトキンソンらの主張の部分証明、絶対正則テンソルの定義を与え、特徴づけ、探索および構築法などを明らかにした。また絶対正則なテンソル間の非同値性の検証法を提案しその有効性を明らかにした。加えてランダム行列の最大固有値分布論および高次元データを扱う地理・空間統計学の応用として森林面積減少の解明や地理・空間画像データの分類などに成果を挙げた。高次元データ(特に高次元配列(テンソル)データ)の統計解析の基礎研究と画像解析への応用について3年計画のうち初年度目標の研究を行った。まず研究代表者である坂田は高次元配列(テンソル)の階数決定問題について、分担者の角・宮崎と共同研究を行い、次の一連の成果を上げることができた。(1)2-slicesの場合のKronecker formによる最大階数の決定、(2)2-slicesの場合の最大階数の単純変換、対称性、を利用した最大階数の決定できる場合についての考察、および数学的帰納法による最大階数の一般の場合の証明を与えた(IASC2008)。(3)3-slicesのテンソルに対するAtkinson-Stephens-Lloydの複素数体上の定理の実数体への拡張、Atkinson-Stephesの最大階数予想を例外条件を除いた場合に実数体上で証明するなどの成果をあげ、国際会議(Casta2008)での発表などを行った。さらに、坂田・角は高次元分割表のLifting問題について、p=3の場合にr-近傍定理の証明という成果を国際会議(Compstat2008)で発表した。また、(4)分担者の西井は高次元データの顕著な例である上空からの写真画像による、地表面のメッシュごとの森林被覆率の推定や複数のカテゴリーの被覆率の推定などで、機械学習的手法による研究成果を論文・国際会議(IGARSS2008)などで発表した。さらに、(5)分担者の栗木は多変量解析におけるtube法、原点を帰無仮説,正多項式がなす凸錐(正多項式錐)を対立仮説とする尤度比検定、およびstar-shape分布についての研究を行い、成果を国際会議(Casta2GO8)・論文などで発表した。研究代表者である坂田は高次元配列(テンソル)の階数決定問題について、分担者の角・宮崎と共同研究を行い、(1-1)3-slicesの場合の最大階数に関するAtkinson等の有名な主張:「3xnxnテンソルの最大階数は2n-1」に対して複素数体における証明および実数体における緩い条件下での証明を与えた2年掛かりの研究が論文として掲載許可を受けた。(1-2)例外テンソルをdeterminant polynomialが符号一定性をもつことを使って特徴付ける一連の研究を行い、ヒルベルトの17問題との関連性に注目して、いくつかの例外テンソルを数値的に決定した。(1-3)量子通信におけるもつれ状態の分類における、SLOCC同値性を高次配列データの階数問題に持ち込んで、determinant polynomialを使ってテンソルの同値性が調べられことを明らかにした。(1-4)統計ソフトRを数式処理的に使用するプログラムを開発し、最小typical rankに対するある予想に到達し、Jacobian法による考察を開始した。(1-5)ケーレー分布に元づくCross-Entropy法による直交群上の関数の最適化のシミュレーション実験を行い、実行可能であることを示した。(1-6)坂田・角は高次元分割表のLifting問題について、3x3x4の場合の3-近傍定理の成果を国際会議(COMPSTAT2010)で発表する許可を得た。(2)分担者の西井は地表面の各メッシュごとの森林比率を,人口比率と起伏率を説明変数とする非線形回帰についてモデル選択をおこなった。また、カテゴリ割合の推定問題で,マルコフ確率場に従う正規混合分布によるアプローチについて成果をあげた。(3)分担者の栗木はある種の分布のモーメントや確率関数の一般形を無向,有向グラフの言葉で表現した.また分布の無限分解可能性条件について調べ成果を挙げた.研究代表者である坂田は高次元配列(テンソル)の階数決定問題について、分担者の角・宮崎と共同研究を行い、(1-1)3-slicesの場合の最大階数に関するAtkinson等の有名な主張に対して複素数体における完全な証明および実数体における緩い条件化での証明を与えた論文をAISM20108月号へ掲載した。(1-2)determinant polynomialを使って探索した4x4x3例外テンソルの間の同値性に関する研究を行い,determinant polynomialの定数曲面の微分幾何学的GL不変量の数値計算量が非同値性を識別し得ることを示した.また、不変量の球面デザインによる計算法を提案した。

さらに,群を狭めたときの非同値性の検出を行う統計的手法をCompstatやASCで提案した.(1-3)例外テンソルを構成する方法の研究を行い成果を国際会議ICOQSIAで発表しかつ論文を投稿中である.(1-4)坂田・角は高次元分割表のLifting問題について、3x3x4の場合の3-近傍定理の成果を国際会議(COMPSTAT2010)で発表した,また、これを一般化した3x3xK近傍定理の成果を雑誌へ投稿した.(2)分担者の西井は森林面積比率に対する非線形回帰モデルを導出し,森林減少メカニズムを説明した.一方,ARXモデルについて,予測域の重要度に重みをつけたモデル選択基準を導出した.また,これに基づく特許出願の書類を準備中である.(3)分担者の栗木は積分幾何学にもとづく確率分布理論(チューブ法)を用いて,ランダム行列の最大固有値や探索的射影追跡指標の分布を導出した,非心ウィシャート分布のモーメントの組合せ構造を明らかにし,そのグラフによる表現を与えた.またラゲール多項式の係数の組合せ論的な解釈を与えた
現行都市計画・建築規制制度の当初設計意図と時代的変容に関する研究

本研究では、総合設計制度(1970)、地区計画(1980)を対象とし、各規制制度の創設・改正の社会的背景と意図、運用指針や基準の設定等を検証し、その後の変容と市町村等における運用実態を明らかにした。その結果、1国の制度設計段階における都市計画(都市局)と建築規制制度(住宅局)等の守備範囲等をめぐる調整、2国の制度設計意図(市町村の主体性・裁量性の想定)と地方公共団体の運用実態(住環境の総合性の担保)との関係、3制度化段階における私権制限と公共性(法制局)の解釈、が焦点として浮かび上がった。わが国のインセンティブ制度の代表ともいえる総合設計制度について創設時の議論を明らかにした上で、今日的な観点から同制度創設の意義と課題を再考した。研究の方法としては、具体的な運用基準の検討を行った総合設計委員会の議事録によって議論を整理し、「総合設計委員会答申」とこれを受けて建設省が作成・通達した許可準則と技術基準の内容およびこれらの解説文書を分析した。また当時の担当者から状況や考え方についてのヒアリングを補足的に行った。そして、同制度の論点を整理し本研究での視点を設定した後、総合設計委員会の概要と同制度の趣旨を明らかにし、主要な論点である空地と容積緩和および形態規制緩和の議論を分析した。それらを踏まえて同制度創設の意義・論点を今日的観点から考察した。その結果、制度創設時の意図とともに、同制度の基軸である空地の概念とボーナスに関する議論や形態規制に関する実効型基準の議論の整理・分析から、当初意図と実現された制度の相違などが明らかとなった。インセンティブ手法としての総合設計制度の制度と運用自体が抱える多くの課題や評価を行うため、これまでの適用実績を質量ともに総合的に検討する必要がある。今後は周辺との連続性考慮やまちなみ・近隣環境への配慮や、実効型基準に必要な目標像を明確化し担保する仕組み、各自治体の積極的な方針・基準形成とそれに基づく運用体制の検討を行う方針である。2016年度は、昨年度の継続研究として、インセンティブ手法の代表例であり、自治体の主体的運用が必要な総合設計制度について、制度と自治体の受け止め方・運用の変遷を明らかにするため、国の許可準則等および主要自治体であり同制度の運用実績も多い東京都、大阪市、横浜市の基準と運用の変遷について分析・考察し、その成果を査読付き論文として投稿した。その結果、国と地方自治体の制度の考え方や運用に違いがあることはもちろんのこと、地方自治体の間でも共通点と相違点があることを具体的な制度に即して示した。知見として、市街地形成における自治体裁量型の手法を活用するには、総合的な政策体系からの位置づけ、都市構造なども踏まえた適用対象地域との関連付けと方針設定、周辺環境を十分考慮しうる基準と運用などを推し進めることが必要であることが、明らかとなった。さらに、引き続き、1980年に創設された地区計画制度について、制度設計の検討に携わった建設省住宅局、都市局、学識経験者といった関係主体の立場を踏まえながら、地区計画制度が必要とされた背景や制度の検討過程を整理、分析し、地区計画制度の制度設計にあたっての論点とともに、制度創設時に抱えていた課題を明らかにするための調査研究を行っている。来年度初頭には、成果を公表する予定である。今後は、都市計画法50年、建築法100年にむけて、種々の制度設計のプロセスについて、敷地から都市レベルまで、国の住宅局と都市局の考え方等を基軸とした分析も視野に入れて、その経緯を追跡していきたい。建築基準法及び都市計画法による住環境に大きな影響を与えた制度として、これまでに、日影規制(1976)、総合設計制度(1970)、そして地区計画(1980)と、制度設計の経緯を当時かかわった建設省OBや典型的な運用実績をもつ自治体へのヒアリングを通して明らかにしてきた。これまでの調査で確実に研究成果が蓄積され、次世代の制度構築に役立つ知見を得つつある。とくに、現在調査中の地区計画制度(都市計画法及び建築基準法改正による)の制度化の追跡の中では、建設省の住宅局と都市局の考え方が明らかになりつつあり、他の制度設計に関する貴重な情報の手がかりを得ることができた。法制度の変遷の実証的研究として、主に新都市計画法制定(1968)時以降の都市・建築規制制度を対象とし、以下の視点で調査研究を進めてきた。1制度導入の意図に立ち戻り、制度の導入時と現在の社会的背景や議論の前提(市街地像・建築技術等)の相違を確認する、2今日における「評価」「課題」を整理(市街地像)し、3制度の性格が意図から変質、時代と乖離してきたプロセスを追跡する、4そのうえで新たな法制度のあり方を検討する。具体的には、総合設計制度(1970)、日影規制(1976)、地区計画(1980)を対象とし、各規制制度の創設・改正の社会的背景と意図、運用指針や基準の設定等を検証し、その後の変容と市町村等における運用実態を明らかにした。今年度は、地区計画制度を対象とし、制度設計の経緯及び運用実態と課題を整理した。これらの中で、以下の点が浮き彫りとなった。1国の制度設計段階における都市計画(都市局)と建築規制制度(住宅局)等の守備範囲等をめぐる調整、2国の制度設計意図(市町村の主体性・裁量性の想定)と地方公共団体の運用実態(住環境の総合性の担保)との関係、3制度化段階における私権制限と公共性(法制局)の解釈など、である。

とくに現行制度を活用、運用する地方自治体との関係という側面では、1国の制度設計では、時代的経過の中で、画一的一律的な制度設定から、多様な制度手法を整え、地方自治体レベルでの都市構造や市街地特性に応じた運用や市街地環境を担保する総合的な活用を期待するという流れがある。そして、各種制度の総合的な活用については、都道府県・市町村の主体性・裁量性を想定している。2一方、地方自治体の中には、都市像や市街地特性を踏まえ、とくに住環境の総合性の担保との関係で独自の理念により、各種制度の抱き合わせも含め、総合的な戦略で活用・運用している事例も確認された。本研究では、総合設計制度(1970)、地区計画(1980)を対象とし、各規制制度の創設・改正の社会的背景と意図、運用指針や基準の設定等を検証し、その後の変容と市町村等における運用実態を明らかにした。その結果、1国の制度設計段階における都市計画(都市局)と建築規制制度(住宅局)等の守備範囲等をめぐる調整、2国の制度設計意図(市町村の主体性・裁量性の想定)と地方公共団体の運用実態(住環境の総合性の担保)との関係、3制度化段階における私権制限と公共性(法制局)の解釈、が焦点として浮かび上がった。わが国のインセンティブ制度の代表ともいえる総合設計制度について、今日的な観点から同制度創設の意義と課題を再考することにより、運用実態について明らかにしていくという研究フレームが確立したことにより、他の制度分析にも適用できる研究の方向性が明確となった。現在調査中の地区計画制度(都市計画法及び建築基準法改正による)の制度化の追跡の中では、建設省の住宅局と都市局の考え方が明らかになりつつあり、他の制度設計に関する貴重な情報の手がかりを得ることができた。今後も、これらの情報を整理し、都市計画法50年、建築法100年にあたって、種々の制度の検証と新制度の構築にむけた提案作業を進めていきたい。都市計画制度史、建築法制史物品費のうち、パソコンの購入時期のタイミングに齟齬が生じて購入を時期に延期したため。当該年度の論文発表会場のうち1か所が関東圏であったため、出張旅費の経費が軽減され、当該助成金が生じた。物品費のうち、パソコン購入等の予定を今年度実施する予定である。最終年度の調査費用として、調査出張旅費、資料収集経費、ヒアリング調査関係謝金、論文投稿費用に充てる計画である。
転写因子PROP1とPRXsを発現する下垂体の幹・前駆細胞の機能解析

下垂体は脳の直下に位置する内分泌小器官で、申請者らは、下垂体特異的転写因子PROP1と新規下垂体転写因子PRXsに着目して研究を進めてきた。本研究期間に、PROP1遺伝子の発現調節機構を解析し、1)多数の因子の作用領域がプロモーター上流にあること、2)この遺伝子のメチル化が発生初期に発現に部分的に関与していること、3)PROP1遺伝子が初期の下垂体原基でレチノイン酸の制御を受けること、4)PRX1とPRX2陽性の下垂体細胞が下垂体毛細血管形成に機能していること、5)PRXsを発現するTtT/GF細胞はTGFβによりペリサイト様の遺伝子発現をする未分化性を持つこと、などの成果を挙げた。1.下垂体に周辺に存在する間葉系細胞が進入する観察を詳細に進めて、その中にPRX1とPRX2陽性の細胞が存在する事を明らかにした。さらに、解析を進めてPRX2陽性細胞は侵入後に速やかに消失して他の形質の細胞に分化すること、SOX2陰性のPRX1陽性細胞(非下垂体由来であることを示す)はその数を増しながら、下垂体の奥に移動している事を明らかにした。また、血管系細胞のマーカーを用いて調べることで、内皮細胞、平滑筋細胞、ペリサイトなど血管形成に係わる細胞に分化する結果を得て、論文発表した。2.下垂体組織の解析からPRX1とPRX2が異なる発現調節を受けることが予想された。両者の機能解析のため、種々の下垂体由来の株化細胞を含めて複数の細胞におけるPRX1とPRX2の発現を調べたとこと、下垂体腫瘍由来のTtT/GF株と非下垂体由来のNIH3T3における発現を確認することができ、両者の機能解析を展開する研究ツールを獲得した。TtT/GF株における遺伝子発現のパターを調べると、間葉系の特性を示す遺伝子の発現が高い事が判明した。この細胞が、下垂体における血管網形成の解析に利用するツールとなると判断して、さらに、他の下垂体腫瘍由来の株化細胞との特性比較を行った。その結果、TtT/GF株が、幹細胞性を有しながらも、特徴ある遺伝子発現プロフィールを示す事を見出した。この結果を論文発表した。3.次の研究展開のために、PRX1とPRX2を発現する細胞がどの様に変化し、どの様な細胞として下垂体内に定着するかを解析する為に、細胞系譜解析(lineage tracing)を開始した。本年度の研究を通じて、PRX1とPRX2の機能に関する新展開を計るツールとしての株化細胞の同定や、下垂体形成と血管形成を支えるPRXとPRX2細胞の特質を明らかにできた。さらに、今後の研究展開のための準備を開始できた。1.間葉系由来の細胞のPRX1・PRX2が下垂体に侵入し、血管形成に関わる事を明らかにした。2.PRX1とPRX2の機能解析に有用なツールとして、両者を発現する株化細胞を同定した。3.株化細胞を使って、PRX1とPRX2の発現調節機構の違いを明らかにした。以上を通じて、研究は順調に展開している。表記課題を達成するための平成28年度の期間で、下記のような実験を進めて、成果をあげた。研究課題にある転写因子PROP1は下垂体組織に特異的であり、もう一方のPRRXs(PRRX1とPRRX2)は、胎児期に下垂体に侵入する間葉系細胞で発現する因子であると同時に、胎児期と生後の下垂体幹・前駆細胞で発現する因子である。これまでに実験で、これらの因子が下垂体の発生と分化に深く関わることを明らかにしているが、平成28年度の主要な成果の概要を下記に述べる。1.下垂体には2様の幹・前駆細胞が局在する事を報告している。この2様の幹・前駆細胞の特性を明らかにするために、2種のプロテアーゼを使って段階的に酵素処理を行い細胞分散した。この処理によっても塊状に残る細胞集団を集め、幹細胞マーカーSOX2で染色したところ全ての細胞が陽性であることを発見した。また、その多くがPROP1陽性である事も確認した。分化をせずに培養出来る事や、各種の因子を作用させると分化出来る事をまとめて原著論文を投稿した、2回のやり取りの中で幾つかの実験を追加することで受理された。2.PROP1遺伝子の発現制御機構について、20種類の因子が制御に関わることを論文発表したが、さらにメチル化によるエピジェネティクス制御を調べ、非発現組織と比べて下垂体では低メチル領域が転写開始点の遠位、近位、第1イントロンの3ヶ所に差異がある事を確認した。論文投稿し、データ表示の修正などのやり取りを行うことで受理された。3.PRX1とPRX2を発現する細胞の系譜解析(lineage tracing)を開始し、系統の作製と繁殖を進めている。本年度は、ラットの交配が上手くいかずに、再度のトランスジェニックラットの作製実験を行うなど、遅延している本年度の研究を通じて、複数の研究成果が得られたが、トランスジェニックラットの作製実験では期待通りには進まない部分もあった。1.下垂体幹・前駆細胞の培養と分化誘導のための基本条件に一定の目途が得られた。2.PROP1遺伝子の発現制御に関わる転写因子の同定やエピジェネティクスで研究成果をまとめる事ができた。

3.PRX1とPRX2の機能解析を追求するための細胞系譜解析(lineage tracing)するためにモデル動物作製では、系統作製と維持に手間取っている。4.PRX1とPRX2の機能解析に有用なツールとして、両者を発現する株化細胞を同定した。以上を通じて、研究は概ね予定通りに展開している。本研究課題では下垂体組織に特異的転写因子PROP1と、胎児期に下垂体に侵入する間葉系細胞で発現する因子である転写因子PRRXs(PRRX1とPRRX2)を中心に研究を展開し、以下の様な成果を得た。1.下垂体には2様の幹・前駆細胞が局在することを報告しているが、昨年度は2種のプロテアーゼを使って分散した細胞集団に塊状に残る幹・前駆細胞を捕集して、その幹・前駆細胞としての特徴を調べて、ホルモン産生細胞にも分化することを確認して論文報告している。本年度では、さらにその細胞塊を2次元培養に変えると、非ホルモン産生細胞である血管内皮細胞に分化する細胞種があることを確認し、論文報告した。2.PROP1遺伝子の発現制御機構について、昨年のエピジェネティクス制御解析に引き続き、下垂体の発生に関わるレチノイン酸による制御の解析を行った。その結果、ラット胎仔期中期にレチノイン酸合成酵素遺伝子が発現すること、レチノイン酸受容体RXRのそれも発現すること、を見出した。さらに、その受容体を介してレチノイン酸依存的にPROP1遺伝子の発現が起こることを確認して、論文報告した。3.以前から行っていた細胞の系譜解析のためのラットの下垂体のPRRX1およびS100β発現細胞の実験について作製した系統では、細胞系譜の解析に必須である蛍光標識細胞が期待した様な蛍光シグナルは得られなかった。さらに、摘出した組織から調製した分散細胞を使っても確認できず、目的を遂行に供せる動物ではないと判断して、明治大学農学部研究報に研究ノートとしてこの経過の記録を残した。4.下垂体由来の株化細胞TtT/GFの分化能を解析し、非ホルモン産生細胞への分化能を確認し、論文報告した。下垂体は脳の直下に位置する内分泌小器官で、申請者らは、下垂体特異的転写因子PROP1と新規下垂体転写因子PRXsに着目して研究を進めてきた。本研究期間に、PROP1遺伝子の発現調節機構を解析し、1)多数の因子の作用領域がプロモーター上流にあること、2)この遺伝子のメチル化が発生初期に発現に部分的に関与していること、3)PROP1遺伝子が初期の下垂体原基でレチノイン酸の制御を受けること、4)PRX1とPRX2陽性の下垂体細胞が下垂体毛細血管形成に機能していること、5)PRXsを発現するTtT/GF細胞はTGFβによりペリサイト様の遺伝子発現をする未分化性を持つこと、などの成果を挙げた。平成27年度に得られた結果をもとに、以下の実験を遂行する。1.下垂体幹細胞の樹立を継続的に進める。2.PRX1・PRX2の標的遺伝子を特定する。3.PRX1・PRX2陽性細胞の変遷を明らかにする。4.下垂体の血管形成機序の解析を行う。1.モデル動物作製を継続的に進める。2.下垂体幹・前駆細胞の分化誘導系を確立し、分化誘導を行う。4.幹・前駆細胞で発現する特異的遺伝子の同定と機能解析を行う。内分泌学本申請課題は10月に追加採択であったために、研究費の使用額が予算額に満たなかった。追加採択のために、予算の使用の遅れがそのまま残っている。追加採択による研究の進捗状況の遅れもあるために、その進捗度を上げるとともに,予算の執行に努める。
戦国・織豊期における大友・黒田氏領国の農民支配について

天正6年(1578)大友宗麟は日向耳川の戦いにおいて島津氏に大敗すると北部九州の大友氏支配下であった諸勢力は相次いで反大友氏に転じた.大友氏の本国である豊後国においては島津氏による農民の拉致や略奪などが頻繁に行われ,その被害は甚大なものであった.同15年(1587)九州を平定した豊臣秀吉は,黒田孝高に豊前国を,大友義統に豊後国を与えた.豊前国では同15年,豊後国では同17・19年にそれぞれ検地が行われている.黒田氏の検地は指出し検地と思われる.黒田氏は入部直後に城井鎮房らによる仲直り一揆に出あっているが,それをまもなく鎮圧した.大友・黒田両氏の領国にあっては在地領主による支配が強く残っており在地性が払拭されていない.それゆえ農民の自立度は低く,商品生産,流通などは活発でない.朝鮮侵略に大友・黒田両氏とも加わっているが,その際大友義統に卑怯な振舞いがあったとして,豊臣秀吉は文禄2年(1593)大友氏の所領を没収している.同年の豊後国検地帳には多くの失人や荒田の存在が確認されている.朝鮮侵略に代表される豊臣政権による苛烈な陣夫後徴収策などが荒田・失人状況を怠起しために小農民が不安定な状況に陥るということが想定される.天正末年におけるいわゆる太閤検地において,両氏の領国においても小農民自立対策がとられ,小農民が年貢負担者として認められた.しかし,その後に続く荒田・損耗状況等は小農民のい存在をきわめて不安定な存在として位置付けた.多くの失人の存在が物語のように,かかる状況下において小農民の多くが没落し,あるいは不安定なまま次の時代を迎えた.天正6年(1578)大友宗麟は日向耳川の戦いにおいて島津氏に大敗すると北部九州の大友氏支配下であった諸勢力は相次いで反大友氏に転じた.大友氏の本国である豊後国においては島津氏による農民の拉致や略奪などが頻繁に行われ,その被害は甚大なものであった.同15年(1587)九州を平定した豊臣秀吉は,黒田孝高に豊前国を,大友義統に豊後国を与えた.豊前国では同15年,豊後国では同17・19年にそれぞれ検地が行われている.黒田氏の検地は指出し検地と思われる.黒田氏は入部直後に城井鎮房らによる仲直り一揆に出あっているが,それをまもなく鎮圧した.大友・黒田両氏の領国にあっては在地領主による支配が強く残っており在地性が払拭されていない.それゆえ農民の自立度は低く,商品生産,流通などは活発でない.朝鮮侵略に大友・黒田両氏とも加わっているが,その際大友義統に卑怯な振舞いがあったとして,豊臣秀吉は文禄2年(1593)大友氏の所領を没収している.同年の豊後国検地帳には多くの失人や荒田の存在が確認されている.朝鮮侵略に代表される豊臣政権による苛烈な陣夫後徴収策などが荒田・失人状況を怠起しために小農民が不安定な状況に陥るということが想定される.天正末年におけるいわゆる太閤検地において,両氏の領国においても小農民自立対策がとられ,小農民が年貢負担者として認められた.しかし,その後に続く荒田・損耗状況等は小農民のい存在をきわめて不安定な存在として位置付けた.多くの失人の存在が物語のように,かかる状況下において小農民の多くが没落し,あるいは不安定なまま次の時代を迎えた.
歯周病原性プロテアーゼに対する生体反応と心循環系傷害機序に関する研究

グラム陰性偏性嫌気性細菌Porphyromonas gingivalisは歯周炎の発症・進行において最重要視されている病原性細菌であり、菌体表面および菌体外に強力なプロテアーゼを産生する。なかでもジンジパインは本菌の産生する主要なプロテアーゼであり、ペプチド切断部位特異性の異なるArg-gingipain(Rgp)とLys-gingipain(Kgp)が存在することがわかっている。両酵素は相互に協力しながら生体タンパク質の分解を引き起こし、宿主細胞に傷害を与え、歯周病に関連する種々の病態を生み出すと考えられている。最近、歯周病が心筋梗塞、早産・低体重児出産などの全身疾患のリスクファクターであることが指摘されるようになり、アテローム性動脈硬化症患者の血管内プラークの45%にP.gingivalisが検出されるとの報告もある。我々は歯肉線維芽細胞や血管内皮細胞に対してRgp・Kgpを作用させると、接着性が失われ、細胞死を引き起こすことを見出した。また、一部のP.gingivalisは血管内皮細胞に侵入した後、一過性にオートファゴソームに局在することがわかった。これは細胞が通常のエンドソーム・リソソームシステムによって本菌を消化殺菌できずオートファジーを起こすことを示唆している。この一方で、RgpとKgpに対するそれぞれの特異的阻害剤ならびに両酵素を同時に阻害する二重阻害剤を天然および合成から探索し、本菌の持つ生体タンパク質分解活性や血球凝集活性、細胞傷害性に与える影響を調べた。当研究室において新規に開発、作製されたRgpおよびKgpの特異的阻害剤によってこれら病原性に関連した本菌の特性はほとんど消失することから、歯周病と関連全身疾患が、これら酵素を阻害することで制御できる可能性が示された。また、一部のP.gingivalisは血管内皮細胞に侵入し、オートファゴソームに局在することによって、リソソーム内分解系からの攻撃を回避していることを示唆するデータを得ている。この一方で、菌体の膜表面に存在する高分子複合体を分離精製し、この複合体がプロテアーゼと血球凝集素、ヘモグロビン結合タンパクの他にLPSやリン脂質を含み、酵素単量体に比べてはるかに高い細胞傷害性を示すことを見出した。このような細胞傷害性は、両酵素欠損株では認められず、また、当研究室において新規に開発、作製されたRgpおよびKgpの特異的阻害剤によってほとんど消失することがわかった。すなわち本菌による生体細胞傷害性が、酵素を阻害することで制御できる可能性が示された。
消化管腫瘍における細胞周期制御遺伝子の発現に関する研究

まず正常粘膜においては,いずれの蛋白も概ね腺管基低部の少数の細胞に検出されるのみであった。過形成粘膜ではcyclin D,Eの発現が腺管基低部より上部の多数の細胞に認められた。腺腫においては,cyclin D,Eの過剰発現が高頻度に認められ,その頻度はそれぞれ,55/66(83%),42/50(84%)であった。腺腫内癌では,cyclin D,Eに加え,CDK2,p16およびRBの過剰発現も認められ,その頻度はcyclin D:8/8(100%),cyclin E:13/13(100%),CDK2:10/12(83%),p16:10/14(71%),RB:10/12(83%)であった。進行癌では,cyclin D:26/45(58%),cyclin E:41/45(91%),CDK2:34/45(76%),CDK4:39/45(87%),p16:59/60(98%),RB:34/45(76%)といずれの蛋白も過剰発現を示した。Westernblottingによる定量的な解析からもこれらの蛋白が正常粘膜に比し癌組織において数倍過剰発現していることが確認された。また,進行癌においてはRB蛋白の高リン酸型(不活性型)の割合が正常粘膜に比し1.46倍増加していた。さらに進行癌症例の連続切片を用いた比較検討から,RBを強発現する癌細胞はcyclin E/CDK2を,CDK4を強発現する癌細胞はp16を同時に強発現していることが確認された。正常粘膜においては、いずれの蛋白も腺管基底部の少数の細胞に検出されるのみであった。過形成粘膜ではcyclinD,Eは腺管基底部から上部の多数の細胞に発現が認められた。腺腫においても高頻度にcyclinD,Eの過剰発現が認められ、その頻度はおのおの55例/66例(83%)・42/50(84%)であった。腺腫内癌ではcyclinD,Eに加えcdk2およびpRBの過剰発現も認められ、その頻度はcyclin D 8/8(100%)・cyclin E13/13(100%)・cdk2 10/12(83%)・pRB 10/12(83%)であった。進行癌では、cyclin D 26/45(58%)・cyclin E 41/45(91%)・cdk2 34/45(76%)・cdk4 39/45(87%)・pRB 34/45(76%)といずれの蛋白も過剰発現を示した。連続切片を用いた比較検討では、pRBを強発現する癌細胞はcyclinE/cdk2も同時に強発現することが認められた。Western Blottingによる検討でも、正常粘膜に比べ進行癌においてこれらの蛋白の過剰発現が確認された。Densitometryを用いた正常粘膜との比較では、腺腫8例の平均でcyclinD3.18倍・cyclinE1.72倍・cdk 21.24倍・cdk 41.17倍の発現であったが、進行癌10例の平均ではおのおの5.77倍・2.86倍・2.48倍・2.47倍の過剰発現が認められた。また、進行癌においてはpRBの高リン酸化型(不活化型)の割合が正常粘膜に比べて1.46倍の増加を示した。

以上の結果より、大腸adenoma-carcinoma sequenceにおいては過形成粘膜・腺腫の段階よりcyclinD,E、腺腫内癌の段階よりcdk2、進行癌の段階よりcdk4が過剰発現しており、大腸発癌および進展過程とcdk2,4の過剰発現に相関が認められた。また、連続切片を用いた比較検討より、pRBのリン酸化には過剰発現したcyclinE/cdk2が関与する可能性が考えられた。胃正常粘膜・化生腸上皮・癌組織を対象とし、p53,p21およびp16の発現を免疫組織染色およびWestern blottingで調べた。正常粘膜および化生腸上皮の免疫染色では、p21は腺頚部細胞のごく一部に、p16は腺管底部から頚部にかけての細胞に散在性に検出された。p53は正常粘膜・化生腸上皮いずれにおいても検出されなかった。一方、癌組織では、p53は50例中19例(38%)で異常蓄積を認めた。p21は10例(20%)で検出され、とくに高・中分化型腺癌において発現頻度が高い傾向を認めた。また、p21陽性例中p53陽性例は2例のみであった。p16は30例(60%)の癌組織で過剰発現を認めた。Western blottingでも免疫染色と同様の結果が得られた。以上の結果より、p21の発現はp53の異常蓄積と逆相関する傾向がみとめられたが、両者を同時発現する2例ではp53-independentなp21の誘導が示唆された。また、p16の過剰発現を示した6割の症例では、細胞周期の制御異常を反映してp16が発現誘導されていることが考えられた。次に、大腸発癌過程adenoma-carcinoma sequenceにおけるCDK2およびCDK4の発現をWestern blottingで半定量的に調べる目的で、ホルマリン固定パラフィン切片からの蛋白抽出法を新たに開発した。18個の腺腫内癌の隣接正常粘膜・腺腫部分・癌巣を別々に切り出し、おのおのの微小パラフィン切片を2%SDS含有RIPA bufferで高温下に蛋白を抽出した後、Western blottingさらにdensitometryを用いて発現量を比較した。その結果、正常粘膜・腺腫部分・癌巣で、CDK2,CDK4の段階的な発現量の増加を認めた。正常粘膜に比べ腺腫部分ではCDK2は平均1.83倍、CDK4は平均1.73倍、さらに癌巣ではCDK2は平均2.34倍、CDK4は平均2.44倍の発現増加を示した。一方、前年度の報告で示したように、癌巣を伴わない腺腫では、正常粘膜に比べCDK2は1.24倍、CDK4は1.17倍と正常粘膜とほぼ同等の発現量であった。以上の結果から、腺腫内癌の腺腫部分は、癌巣を伴わない腺腫に比べてより癌に近い増殖特性を持っており、細胞周期制御破綻の前段階にあることが考えられた。さらに、免疫染色では約6割の腺腫内癌の癌巣でp53の異常蓄積が認められており、この細胞周期のブレーキ系の破綻が、CDKsの過剰発現した腺腫細胞に決定的なダメ-ジを与えることにより癌化することが推測された。まず正常粘膜においてcyclin Dの発現は腺管基底部の細胞にもっとも多く,腺管上部に向かうにしたがって減弱し,検出範囲は腺管下部1/3であった。一方,CDK4およびp16の発現は腺管基底部に限局したごく少数の細胞にのみ強く検出された。過形成粘膜において,cyclin Dは腺管基底部から上部にいたる多数の細胞に検出されたが,CDK4とp16の発現様式は正常粘膜と同様であった。腺種においては,cyclin Dは66例中55例(83%)と高率に過剰発現していたが,CDK4の過剰発現は全く認められず,またp16の過剰発現も52例中5例(10%)と低率であった。cyclin Dの発現と腺種の異型度との相関は認めなかった。腺種中に微小な癌が存在する腺種内癌症例の癌部分において,cyclin Dは8例中8例(100%)と高率に過剰発現していた。CDK4の過剰発現は全く認めなかったが,腺種と異なる点はp16の過剰発現で,14例中10例(71%)に認められた。
ペリセントロメアを特異的にヘテロクロマチン化する新規のメカニズム

また、大腸菌を用いてZNF518B, HP1α, HP1β, HP1γを大量産生し、それぞれを精製することにも成功した。ただし、ZNF518Bに関しては、不溶性の性質を有していたことから、上記で見出した2つの結合ドメインを含むタンパク質一部として産生することで可溶化し、精製した。これらの精製したタンパク質を用いることで、それぞれのタンパク質間の相互作用をin vitroにおいて確認する実験系を構築することができた。また、それぞれのドメインがZNF518のペリセントロメアへの局在へどの程度関与しているのか、上記で作成した変異体を利用して確認することができた。その結果、ZNF518においては、CENP-Bへの結合とHP1への結合、2つの活性により特異的なペリセントロメア局在を維持していることを見出した。今後は、de novoにZNF518が結合できるモデル領域をゲノムに挿入した細胞の作成を完成させ、より詳細なペリセントロメアヘテロクロマチンにおけるZNF518の機能を明らかにしていく。in vitroにおいて、ZNF518B欠失変異体とHP1α, HP1β, HP1γの精製に成功し、これらの相互作用を確認する実験系を構築することができた。モデル領域を用いたZNF518がクロマチンに与える影響を測定する実験系の構築を完成させる。これまでに構築してきた実験系を最大限効果的に活用することで、次年度使用額が生じた。生じた次年度使用額については、実験モデルとなる細胞の作成に使用する。
柔毛繊維の空気力学的効果に関する研究

亜音速流中の物体に起因する空力騒音は,渦騒音と呼ばれることがあるが,それは音源が流れ場の渦度ベクトルと速度ベクトルのベクトル積の発散(その非定常成分)に比例するからである.したがって,このような空力騒音を低減する有効な手段は,この音源の強さを抑制することである.その具体的方法として,筆者らは,柔毛繊維を物体面に貼付して流れ場の渦度を弱める手法を提案し,成功を収めている(鉄道総合研究所建造の大型低騒音風洞).この手法の種々の応用を考えるとき,柔毛繊維のパラメータの最適値を探索する必要があるが,現状では実験に頼らざるを得ない.そこで本研究では,柔毛の空気力学的効果を理論的にモデル化することを考えた.力点を置いて調べたのは,柔毛壁に沿う層流境界層である.まず,既存の風洞を改修し,微風速で定常な流れが実現できるようにした.そして,面密度が5万本/cm^2程度(繊維直径約10μm,繊維長さ10mm程度)の柔毛壁を採用し,柔毛壁に沿う層流境界層を実現して,境界層の速度分布を熱線流速計で測り,流れ方向の発達の様子を明らかにした.一方,柔毛繊維が流れに及ぼす影響としてもっとも重要な抗力については,柔毛繊維を円柱として扱い,低レイノルズ数の円柱に働く抗力の理論式(流速に比例する抗力)を基礎に数式表現して境界層方程式を誘導した.そして,相似解を仮定して,速度分布の理論解を求め,実験の速度分布と比較・検討し,よい一致が得られることを確認した.柔毛繊維の抗力特性がこのように数式表現できたので,たとえば,柔毛を貼付した円柱周りの流れの計算(数値シミュレーション)が可能となり,柔毛の空力特性を評価する道が開けた.また,境界層の不安定性について理論的な計算が可能となり,対応する実験との比較により,モデルのより精密な検討が行えるようになった.亜音速流中の物体に起因する空力騒音は,渦騒音と呼ばれることがあるが,それは音源が流れ場の渦度ベクトルと速度ベクトルのベクトル積の発散(その非定常成分)に比例するからである.したがって,このような空力騒音を低減する有効な手段は,この音源の強さを抑制することである.その具体的方法として,筆者らは,柔毛繊維を物体面に貼付して流れ場の渦度を弱める手法を提案し,成功を収めている(鉄道総合研究所建造の大型低騒音風洞).この手法の種々の応用を考えるとき,柔毛繊維のパラメータの最適値を探索する必要があるが,現状では実験に頼らざるを得ない.そこで本研究では,柔毛の空気力学的効果を理論的にモデル化することを考えた.力点を置いて調べたのは,柔毛壁に沿う層流境界層である.まず,既存の風洞を改修し,微風速で定常な流れが実現できるようにした.そして,面密度が5万本/cm^2程度(繊維直径約10μm,繊維長さ10mm程度)の柔毛壁を採用し,柔毛壁に沿う層流境界層を実現して,境界層の速度分布を熱線流速計で測り,流れ方向の発達の様子を明らかにした.一方,柔毛繊維が流れに及ぼす影響としてもっとも重要な抗力については,柔毛繊維を円柱として扱い,低レイノルズ数の円柱に働く抗力の理論式(流速に比例する抗力)を基礎に数式表現して境界層方程式を誘導した.そして,相似解を仮定して,速度分布の理論解を求め,実験の速度分布と比較・検討し,よい一致が得られることを確認した.柔毛繊維の抗力特性がこのように数式表現できたので,たとえば,柔毛を貼付した円柱周りの流れの計算(数値シミュレーション)が可能となり,柔毛の空力特性を評価する道が開けた.また,境界層の不安定性について理論的な計算が可能となり,対応する実験との比較により,モデルのより精密な検討が行えるようになった.
FK506結合蛋白質による新しい細胞外カルシウム流入制御機構

FK506結合蛋白質(FKBP)とカルシニューリン(ホスファターゼ2B)によって、神経細胞ならびに筋肉細胞への細胞外Ca2+イオン流入が制御される機構を解明するとともに、病態モデルにおける細胞外カルシウム流入制御とカルシニューリンならびにFK506結合蛋白質の役割について検索を進めた。培養細胞ならびに膀胱肥大モデルラットを使い、以下のように研究を進め多大の成果を得ることができた。1)海馬神経細胞を初代培養し、グルタミン酸ならびにNMDAによる興奮性神経細胞死が誘導される系を確立した。2)この興奮性神経細胞死はカルシニューリン抑制剤であるFK506やシクロスポリンAで抑制されるがラパマイシンでは抑制されない事を示した。3)興奮性神経細胞死はNMDA受容体を介するCa2+イオンの細胞内流入が重要であり細胞死誘導に先立ち細胞内CaNが細胞内で活性化されている事を直接証明する事に成功した。ラット膀胱の肥大モデルでは1)膀胱肥大形成過程で膀胱壁の平滑筋内のアクチン、ミオシンが増加し、同時にカルシニューリンの発現が増加する事が明らかになった。3)カルシニューリン抑制剤であるFK506(タクロリムス)は膀胱肥大を強く抑制した。4)肥大した膀胱平滑筋を初代培養しIn vitorでの細胞内へのカルシウム流入を測定したところ、その流入量が増強していた。5)このカルシウム流入はATPにより刺激され、チャネルの開口時間が遷延する事により増加する機構が示唆された。FK506結合蛋白質(FKBP)とカルシニューリン(ホスファターゼ2B)によって、神経細胞への細胞外からのCa^<2+>イオン流入が制御され、その結果神経細胞死が誘導される機構を解明し、免疫抑制剤FK506の神経保護薬としての可能性を探るため以下のような研究を行い、成果を得ることが出来た。1)胎児脳から海馬神経細胞を初代培養し、グルタミン酸ならびにNMDAによる刺激で興奮性神経細胞死が誘導される系を確立する事に成功した。2)海馬神経細胞培養系の興奮性神経細胞死はカルシニューリン抑制剤であるFK506やシクロスポリンAで抑制されるがラパマイシンでは抑制されない事を示した。3)興奮性神経細胞死はNMDA受容体を介するCa^<2+>イオンの細胞内流入が重要であり細胞死誘導に先立ち細胞内CaNが細胞内で活性化されている事を直接証明する事に成功した。4)カルシニューリンの構成的活性型(Constitutive Active)と優勢阻害型(Dominant Negative)の作製に成功し、これらを培養海馬神経細胞に発現させることに成功した。また優勢阻害型のカルシニューリンを発現させるとグルタミン酸受容体アゴニストによる遅発性神経細胞死が特異的に阻止される事も示した。5)遅発性神経細胞死誘発には蛋白合成が必須であり蛋白質合成阻害剤は神経細胞死を阻害する。以上のことから我々は興奮性神経細胞死ではNMDA受容体を介するCa^<2+>イオンの細胞内流入とそれに引き続いて起こるCaN活性化が必須であり、CaNが何らかの特異的な転写調節因子を脱リン酸化して活性化させ、細胞死誘発蛋白質(Death Factor)を発現させる機構を仮定する事が出来た。前年度までの研究実績を踏まえ、さらに種々の病態モデルにおける細胞外カルシウム流入機構とカルシニューリンならびにFK506結合蛋白質の役割について検索を進めた。臨床的にも重要な病態モデルとして、尿道結紮による膀胱肥大モデルラットを作成し、以下のように研究を行い成果を得ることができた。1ラット尿道の部分狭搾を行ったところ、結紮後数日では膀胱壁肥厚が生じ、その後一週間で容量負荷による膀胱肥大モデルが完成した。2この膀胱肥大形成過程で膀胱壁の平滑筋内のアクチン、ミオシンが増加し、同時にカルシニューリンの発現が増加する事が明らかになった。3この膀胱肥大形成過程でカルシニューリン抑制剤であるFK506(タクロリムス)を投与すると膀胱肥大が強く抑制された。

4肥大した膀胱平滑筋を初代培養しIn vitorでの細胞内へのカルシウム流入を測定したところ、その流入量が増強していた。5このカルシウム流入はATPにより刺激され、チャネルの開口時間が遷延する事により増加する機構が示唆された。以上より尿道結紮に由来する膀胱肥大では負荷刺激によってチャネルの性質が変化しカルシウムイオン流入が増加し、細胞内カルシニューリンが駆動され、平滑筋蛋白質の発現増強を経て肥大が生じる機構が示唆された。またFK506によりFKBPを介してこの肥大機構を制御できることが示唆された。