hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
補体制御因子CD59の活性部位の同定

CD59は補体系より自己細胞を守る制御因子で、補体が活性化されて膜攻撃複合体(MAC)を形成する際、C5b-8へのC9の結合を阻止することによりこのMAC形成を阻害する。この阻害はヒト特異的で、他種の動物の補体には働かない。CD59は77個のアミノ酸よりなり5個のジスルフィド結合を持つ。合成ペプチドを用いた解析で立体構造が大事ではあるがN末より27番目から38番目までのアミノ酸が活性に重要である事がわかった。当初、活性部位と思われる部分のアミノ酸を変異させたリコンビナントを作成し、活性を確認する予定であったが上記の部分由来の5から6個の小さなペプチドにも活性があり重要な残基を絞り込む事が困難で有ると思われた。強い活性を示すのにそのジスルフィド結合による立体構造が重要であることが示唆されたので、CD59が持つ5個のジスルフィド結合を変異により1個ずつ無くしたコンビナントCD59の作成を試みた。しかし、発現ベクターを種々検討したが収量が低く、活性の確認はできなかった。以上の事より、活性部位のさらなる確認は断念し、合成ペプチドを用いて医薬品としての可能性を検討できるかまず、調べることにした。上記のようにヒトCD59はヒト補体系にしか働けないので合成ペプチドが他種の動物の補体系にも働けるかまず検討したが、活性測定系の確立が難しく、活性の評価には至らなかった。N末41アミノ酸と42番目以降のC末36アミノ酸に分け、ペプチドP1-41とP42-77を合成し、ジスルフィド結合を再構築後、MAC形成阻害活性を測定した。N末部に活性が有り、そこでP4-18とP19-41を合成再構築し、活性を測定した。P4-18にも活性は有るものの、P19-41は膜結合型のCD59よりは弱いが可溶型CD59と同程度の強い活性を示した。更に小さくし、P20-25とP27-38を合成したが、これらは弱い活性しか持たず、P19-41に存在するジスルフィド結合による立体構造が重要であることが示唆された。P27-32、P33-38、P30-34も合成し、活性を測定したとろP19-41の10倍濃度は必要で有ったがかなりの活性を示し、立体構造が大事ではあるがN末より27番目から38番目までのアミノ酸が活性に重要である事がわかった。当初、活性部位と思われるN末より19残基目から41残基目のアミノ酸を変異させたリコンビナントを作成し、活性を確認する予定であったが上記のようにこの部分由来の5から6個の小さなペプチドにも活性があり重要な残基を絞り込む事が困難で有ると思われた。そこでP19-41が強い活性を示すのにそのジスルフィド結合による立体構造が重要であることが示唆されたので、CD59が持つ5個のジスルフィド結合を変異により1個ずつ無くしたリコンビナントCD59の作成を試みた。合成ペプチドを用いた解析で立体構造が大事ではあるがN末より27番目までのアミノ酸が活性に重要である事がわかった。

当初、活性部位と思われる部分のアミノ酸を変異させたリコンビナントを作成し、活性を確認する予定であったが上記の部分由来の5から6個の小さなペプチドにも活性があり重要な残基を絞り込む事が困難で有ると思われた。強い活性を示すのにそのジスルフィド結合による立体構造が重要であることが示唆さされたので、CD59が持つ5個のジスルフィド結合を変異により1個ずつ無くしたリコンビナントCD59の作成を試みた。しかし、発現ベクターを種々検討したが収量が低く、活性の確認はできなかった。以上の事より、活性部位のさらなる確認は断念し、合成ペプチドを用いて医薬品としての可能性を検討できるかまず、調べることにした。上記のようにヒトCD59はヒト補体系にしか働けないので合成ペプチドが他種の動物の補体系にも働けるかまず検討したが、活性測定系の確立が難しく、活性の評価には至らなかった。
肝ならびに小腸上皮細胞におけるリポタンパク質合成・分泌の制御機構

リポタンパク質の合成・分泌の調節機構、特にプレーゴルジ領域(小胞体)でのアポリポタンパク質の分解機構を明らかにするため、ヒト肝癌細胞HepG2及びヒト小腸上皮モデル細胞Caco2を用い、生合成されたapoB、apoA-1、apo(a)等の細胞内分解過程を解析した。その結果、以下に示す新しい知見を得た。1.HepG2をbrefeldin A存在下[^<35>S]Metでパルス-チェイスし、生合成されたapoBの小胞体内での分解過程を検討した。オレイン酸添加により細胞内トリグリセリド量を増加さすと、apoB分解が抑制されることが明らかになった。すなわち小胞体内での脂質とapoBのアセンブルがapoB分解を調節していることが示唆された。2.HepG2を[^<35>S]Metでラベル後、シギトニン処理したセミインタクトな細胞系でapoB分解が再現できた。また細胞分画により[^<35>S]apoBを含む小胞体を単離することが可能になった。両系においてALLNやALLMなどのチオールプロテアーゼ阻害薬がapoB分解を強く抑制することが明らかになった。3.Caco2をパルス-チェイスした結果、本細胞にもHepG2同様、小胞体内にapoB分解系が存在することが明らかになった。一方Caco2はHepG2と異なりapoA-1も一部分解することが明らかとなり、分解系に相違があることが示唆された。4.HepG2及びCaco2ともapo(a)を生合成していないことが明らかになった。よってapo(a)合成・分泌の調節機構解析のため、apo(a)cDNAのtransfectionを計画している。以上、リポタンパク質合成・分泌の調節に係わる小胞体内アポリポタンパク質分解機構の一端が明らかにされた。今後、さらに詳細な解析を進めたい。
バリアフリー未対応空間でも走行可能な小型全方向移動パーソナルモビリティの開発

都市機能のコンパクト化を背景に、近距離移動時の利便性が高い移動支援システムが求められている。これに対し、即座にどの方向にも移動できる全方向移動パーソナルモビリティを提供することができれば、有用であると考えられる。しかし、従来のパーソナルモビリティは左右に移動できず、利便性に問題があった。また、前後左右に移動可能な特殊な車輪機構も提案されているが、走破性や大きさに問題があった。そこで、本研究では一般的な構造の車輪を用いて全方向移動可能な移動装置の開発を目的とする。これにより、どの方向にも移動でき、凸凹道などでも走行可能な小型のパーソナルモビリティの実現を目指す。全方向移動パーソナルモビリティ開発の基礎となる技術として、これまでに一般的な構造の車輪を用いた全方向移動機構を提案した。本年度には、凸凹道などの悪路の走行に対応するために、提案した機構のフィードバック制御器の構築を行った。本システムの非線形性に対して、フィードバック線形化の手法を導入することにより、車輪の拘束条件も考慮した厳密な線形化を行えることを示した。その中でシステムへの入力が定まらなくなる特異点が発生することを指摘し、本機構に特有の要素である直進ジョイントの挙動を利用して、この特異点を回避する方法を提案した。全方向移動機構実機を製作して実験を行い、構築した制御システムが有効に動作することを確認した。実験結果を数値解析によるシミュレーションの結果と比較し、今後の課題について議論した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
除皮質ラット灌流標本を用いた吸啜・咀嚼運動の生後発達変化の解析

除脳灌流標本を用いて、咀嚼・吸啜のリズムを調べるための新たな実験モデルを開発することを目的に研究を行った。まず、標本の呼吸状態を観察したところ、正常呼吸状態とアシドーシス状態では舌根部や舌骨下筋群を支配する神経の活動パターンが異なっていることが示された。咀嚼、吸啜の誘発のために硬口蓋の電気刺激およびNMDA投与を行ったところ、咬筋神経、顎舌骨筋神経でリズム活動を誘発することが出来た。吸啜から咀嚼への摂食運動転換のメカニズムを調べるために、体外循環法により幼児期から成体の齧歯類を生かすことの出来る"A decerebrated and arterially perfused in situ rat preparation"を作成し、生後5日21日までのラットで、三叉神経、舌下神経の活動を調べた。この標本では、ほとんどの場合、吸気の際に開口運動が見られ、舌下神経および開口筋を支配する三叉神経の活動が、吸息時に活動する横隔神経の活動と共に現れた。このような活動のパターンは、実験を行った生後5日21日までの間で変化しなかった。また、人工体液の灌流量を変化させても、基本的な呼吸に伴う神経活動パターンは変化しなかった。呼吸の頻度は、人工体液の灌流量を増加させることによって増加していった。これは、灌流量の増加に伴い、標本の交感神経活動が増強されたためと思われる。しかしながら、一部の標本では、標本の作成方法が同じであるのに関わらず、横隔神経の活動と逆位相で、三叉神経の活動が見られた。これは、一部の標本では、呼息時に開口運動が起きていることを示している。このような状態になる原因を調べるために、標本の呼吸状態を変化させる実験を行った。その結果、人工体液中にシアン化合物を投与することにより、末梢および中枢の化学受容器の活動を変調させると、投与前には吸息時に見られた三叉神経活動が、呼息時にシフトすることが確認された。これらの結果から、呼吸状態の変化により、開口運動のパターンが変化することが示唆された。吸啜運動や咀嚼運動は、その性質上、呼吸運動や嚥下運動と密接な関わりがある。本年度は、口腔顎顔面から咽喉頭部までを含めた広い範囲での運動の協調を調べるための実験を行った。除脳ラット経動脈灌流標本を用いて、左側の横隔神経、上喉頭神経、舌骨下筋群を支配する第一、第二頸髄神経の枝(C1ー2)、舌根を支配する舌下神経声門の開大、閉鎖を支配する反回神経から吸引電極を用いて複合活動電位を記録した。その結果,横隔神経の吸息性活動とほぼ同期して、全ての神経で呼吸性活動が記録された。灌流液に曝気する二酸化炭素濃度を上昇させ、灌流液のpHを7.2に低下させると、呼吸頻度は15%減少した。また,全ての神経の活動の振幅は増大した。横隔神経の活動を基準として各神経の活動開始のタイミングを比較すると、pHの低下により、横隔神経の活動より上喉頭神経およびC1ー2の活動が、より先行して見られるようになった.これらの結果から、pHの低下により中枢の化学受容野が刺激され、呼吸数の変動や神経活動の振幅の増大を引き起こし、また顎顔面や頸部の筋肉と横隔膜の活動タイミングに変化を起こすことが示唆された.一方で、二酸化炭素濃度上昇に用いる混合ガスでは酸素分圧が低下するので、酸素濃度低下により末梢の化学受容器である頸動脈小体、大動脈体が興奮し、呼吸パターンに影響する可能性がある。そこで、二酸化炭素濃度を変化させずに酸素濃度を低下させたガスを用いて同様の実験を行った。その結果、呼吸数,神経活動の振幅、神経活動の開始のタイミングに有意な差は見られなかった。これらの結果から、pHの変化が顎顔面を支配する神経や頸部を支配する神経の活動タイミングを変調させることが明らかとなった。吸啜運動や咀嚼運動は、その性質上、咽頭、喉頭の動きと密接な関わりがある。本年度は、昨年度に引き続き、口腔顎顔面から咽喉頭部までを含めた広い範囲での運動の協調を調べるための実験を行った。除脳ラット経動脈灌流標本を用いて、左側の横隔神経、舌根を支配する舌下神経、舌骨下筋群を支配する第一、第二頸髄神経の枝(C1ー2)、声門の開大、閉鎖を支配する反回神経、声門の緊張に関与する上喉頭神経から吸引電極を用いて複合活動電位を記録した。その結果、横隔神経の吸息性活動とほぼ同期して、全ての神経で吸息性活動が記録された。反回神経に関しては、呼息相にも活動が見られた。活動のタイミングは頸髄神経が最も早く、舌下神経と上喉頭神経の活動が50ミリ秒ほど遅れて起こり、さらに100ミリ秒ほど遅れて反回神経の活動が起こっていた。また、横隔神経の活動を伴わない神経発射が、他の神経に同期してしばしば起こっていた。標本の二酸化炭素濃度を上昇させ、呼吸に負荷をかけると、活動パターンが変化した。頸髄神経と舌下神経、上喉頭神経の活動は、ほぼ同時期に起こるようになり、反回神経の活動は、頸髄神経の活動開始から400ミリ秒ほど遅れるようになった。さらに、横隔神経の活動は、喉頭、咽頭の神経活動から1秒近く遅れるようになった。

これらの結果から、通常呼吸の場合と努力性呼吸の場合の咽頭喉頭の動きの違いが示唆された。さらに、横隔神経の活動を伴わない呼吸以外の咽頭、喉頭の協調運動も、常に起こっていることがわかった。除脳ラット灌流標本を用いたことにより、生後一週間から四週間まで、顎顔面から頸部の神経まで安定して記録がとれるようになった。標本の条件設定に時間が掛かり、咀嚼様の活動を誘発する条件設定を充分に行えなかった。どの週齢においても、薬剤投与による誘発は出来ているが、電気刺激による誘発の条件が週齢によって違うようで、充分な安定性を得られない。ラット除脳灌流標本を用いて、咀嚼・吸啜に伴う顎運動についての解析を行うため、閉口筋の活動を調べるための咬筋神経と、開口筋の活動を調べるための顎舌骨筋神経を剖出し、複合活動電位の記録を行った。また、咀嚼・吸啜に伴う舌の運動を同時に調べるために舌下神経も合わせて剖出し、複合活動電位の記録を行った。呼吸のモニターとして横隔神経の活動も同時記録した。横隔神経で見られる吸息活動と同期して、顎舌骨筋神経と舌下神経では神経活動が見られたが、咬筋神経では、呼吸に関連する活動は見られなかった。硬口蓋を電気刺激したところ、2-5 Hzの連続刺激で咬筋神経、顎舌骨筋神経、舌下神経にリズム活動が誘発された。これらの活動は、横隔神経では見られなかった。リズムの頻度は、2-2.5 Hzで、刺激頻度によって変化しなかった。生後727日齢までのWistarラットを用いてこの実験を行ったところ、生後15日齢より小さなラットでこれらのリズム活動が出現し、日齢が小さいほどリズム活動の発生率も、持続時間も長かった。これらのことから、ラット除脳灌流標本をもちいて、硬口蓋の電気刺激により、吸啜様の運動を誘発できることが示唆された。さらに、脳幹摘出標本への投与で、吸啜様のリズムを誘発することが知られているNMDAの投与も行った。灌流液中に溶かしたNMDAを20-100 μMの濃度で投与したところ、40 μM以上の濃度で、咬筋神経、顎舌骨筋神経、舌下神経にリズム活動が誘発された。このようなNMDAにより誘発されるリズムも生後15日齢以前で高頻度に出現した。除脳灌流標本を用いて、咀嚼・吸啜のリズムを調べるための新たな実験モデルを開発することを目的に研究を行った。まず、標本の呼吸状態を観察したところ、正常呼吸状態とアシドーシス状態では舌根部や舌骨下筋群を支配する神経の活動パターンが異なっていることが示された。咀嚼、吸啜の誘発のために硬口蓋の電気刺激およびNMDA投与を行ったところ、咬筋神経、顎舌骨筋神経でリズム活動を誘発することが出来た。申請書に記載したとおり、除脳ラット経動脈灌流標本を用いることで、吸啜運動を行っている時期である新生ラットからの神経活動の記録のみならず、咀嚼運動に摂食運動の様式が以降した後である、生後45週齢のラットでも神経活動の記録が出来るようになった。また、口腔顎顔面領域や頸部の神経から、広く同時に神経活動を記録することも出来ている。顎顔面から喉頭、咽頭の神経活動は良く記録出来、薬剤投与による咀嚼様活動の誘発も出来るので、電気刺激にこだわらずに、薬剤投与による咀嚼の誘発を行い、脳内イメージングをする予定である。口腔生理学今後は、脳内の神経回路の局在を調べるため、脳内イメージングを行う予定である。申請時には、カルシウム感受性色素や膜電位感受性色素を取り込ませることを計画していた。しかしながら、色素の取り込みが上手くいかない可能性があるため、ウィルスによる蛍光カルシウムプローブの脳内への導入を計画している。
分子のダイナミクスとカオス

本研究では、「多チャネル・高エネルギーの化学反応のダイナミクス」を、動力学における複雑性が典型的に表れる対象と捉え、新しい化学反応理論を構築する立場からその解明を行っている。多チャネル・高エネルギーの化学反応は、少数の遷移状態が速度過程を決めるのではなく、カオスによる混合性とその階層構造によって時系列データが決められる反応のことである。これに関連して,多くの成果を得ている。本年度の研究成果として、特筆すべきことをは、以下の通りである。(1)1970年ごろに発見された、化学反応における生成物分布に関する経験則である、線形サプライザルを、統計理論の観点から根拠付けることに成功し,その新しい性質を予測した。従来、線形サプライザルの成立根拠は明らかではなく、情報理論(最大円トロピー原理)によって曲りなりの説明がなされていた。(2)構造転移のスペクトルを計算するためには多次元カオスの量子化が必要であるが,従来の理論に依っていては全く不可能であった。そこで、新しい半古典理論を構築し、その数値的検証を行った。その結果、極めて精度よく、従来不可能であった量子化が可能になった。これは量子カオスの歴史上、画期的な成果である。量子カオスと分子振動論において、新しい研究分野が開けたと言ってもよい。(3)非断熱遷移による真の意味の量子カオスの同定に成功した。(4)蟻酸二量体の二重プロトン移動のメカニズムの解明を行った。(5)温度の時空間揺らぎをあらわに考慮した結合セルオートマトンを構築し、表面化学反応の形態形成とその制御の研究を行った。これに関連して,次の成果を得た.(1)保存系クラスターの構造転移反応において,マイクロカノニカル温度を定義し,それが構造転移速度とアルレニウス関係式に有ることを見出した.(2)この研究を通して,いわゆる線形サプライザルを統計理論の観点から根拠付けることに成功し,その新しい性質を予測した.(3)構造転移において出現する構造がマルコフ的な時系列を作るための条件としてinter-basin mixingという概念を提唱した.(4)構造転移のスペクトルを計算するためには多次元カオスの量子化が必要であるが,従来の理論ではとれも扱うことができないため,新しい半古典表式を作った.現在,これを基にアルゴンクラスターの構造転移スペクトルを計算中である.(5)多次元トンネル化学反応等の理論を構築し,非経験的電子状態理論が決めるポテンシャル面上でのトンネルダイナミクスに応用した.この際,安定性行列を効果的に計算するための常微分方程式のアルゴリズムを併せて開発した.本研究では、「多チャネル・高エネルギーの化学反応のダイナミクス」を、動力学における複雑性が典型的に表れる対象と捉え、新しい化学反応理論を構築する立場からその解明を行っている。これに関連して,次の成果を得た.(1)保存系クラスターの構造転移反応において,マイクロカノニカル温度を定義し,それが構造転移速度とアルレニウス関係式に有ることを見出した.(2)この研究を通して,いわゆる線形サプライザルを統計理論の観点から根拠付けることに成功し,その新しい性質を予測した.(3)構造転移において出現する構造がマルコフ的な時系列を作るための条件としてinter-basin mixingという概念を提唱した.

(4)構造転移のスペクトルを計算するためには多次元カオスの量子化が必要であるが,従来の理論ではとれも扱うことができないため,新しい半古典表式を作った.(5)これを基にアルゴンクラスターの構造転移スペクトルを計算した.(6)非断熱遷移による真の意味の量子カオスの同定に成功した。(7)蟻酸二量体の二重プロトン移動のメカニズムの解明を行った。(8)並列オートマトンによる散逸構造の研究を開始した。本研究では、「多チャネル・高エネルギーの化学反応のダイナミクス」を、動力学における複雑性が典型的に表れる対象と捉え、新しい化学反応理論を構築する立場からその解明を行っている。多チャネル・高エネルギーの化学反応は、少数の遷移状態が速度過程を決めるのではなく、カオスによる混合性とその階層構造によって時系列データが決められる反応のことである。これに関連して,多くの成果を得ている。本年度の研究成果として、特筆すべきことをは、以下の通りである。(1)1970年ごろに発見された、化学反応における生成物分布に関する経験則である、線形サプライザルを、統計理論の観点から根拠付けることに成功し,その新しい性質を予測した。従来、線形サプライザルの成立根拠は明らかではなく、情報理論(最大円トロピー原理)によって曲りなりの説明がなされていた。(2)構造転移のスペクトルを計算するためには多次元カオスの量子化が必要であるが,従来の理論に依っていては全く不可能であった。そこで、新しい半古典理論を構築し、その数値的検証を行った。その結果、極めて精度よく、従来不可能であった量子化が可能になった。これは量子カオスの歴史上、画期的な成果である。量子カオスと分子振動論において、新しい研究分野が開けたと言ってもよい。(3)非断熱遷移による真の意味の量子カオスの同定に成功した。(4)蟻酸二量体の二重プロトン移動のメカニズムの解明を行った。(5)温度の時空間揺らぎをあらわに考慮した結合セルオートマトンを構築し、表面化学反応の形態形成とその制御の研究を行った。
顕微鏡と細胞特異的解析技術を基盤とした初期発生におけるｍＲＮＡ分解ライブセル解析

本研究ではmRNA分解の場であるP-bodyとそこで機能するDCP1とDCP2が、初期発生においてどのような役割を果たすのか理解することを目的とした。具体的には、「どの細胞でどのmRNAを分解すること」が初期発生に重要なのかに着目した。同時にmRNA合成のボトルネックとなる転写制御や翻訳制御し、それが生殖細胞の機能にどう関与するかにも着目することで、植物初期発生における遺伝子発現制御の包括的な理解を目指した。採用最終年度となる本年度はこれまで作成してきた形質転換植物などを用いて、様々な解析を進めた。まず前年度に作出したDCP1とDCP2を任意のタイミングでノックアウトできる植物を用いて、個体レベルにおけるこれらの遺伝子の重要性を確認した。前年度の予備的な結果を踏まえて個体においてDCP1とDCP2のノックアウトを行ったところ、致死的な表現型が観察されないことが分かった。この結果により、従来どんな細胞でもハウスキーピング的に働くと考えられていたRNA分解系が、実はより特定の発生段階で重要な働きを担っていることを示唆された。また、特に生殖細胞におけるRNAの機能にフォーカスするため、年度の後半は世界トップクラスの生殖業界研究者である、オーストリアのGregor Mendel Institute、Frederic Berger博士の研究グループのもとで研究を行った。世界有数の技術を学んで自分の実験に応用することで、花粉や精細胞など、特定の細胞だけを精製単離することに成功し、これらの組織からRNAを抽出してトランスクリプトーム解析を行った。変異体などでの解析の結果、これらの組織においてRNAはダイナミックに変動していることが明らかとなった。現在は成果報告を進めている。年度初めにはこれまでの成果を国内外の学会に報告した。更にこれらの研究に関連した論文を現在2本執筆中である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。多細胞生物の生殖や発生の過程で個々の細胞は大きく転写産物の構成を変えることが知られている。mRNA分解も、多数の遺伝子、あるいはそこに含まれる特定の機能に重要な遺伝子の分解制御に関わることが想定される。実際に、ショウジョウバエの卵ではRNA分解に関与する酵素がモルフォゲンの濃度勾配の形成に関与することが明らかとなってきている。植物初期発生においてもmRNA分解調節は重要な役割を担うことが示唆されているが、解析の難しさから研究がなされてこなかった。そこで本研究では、植物初期発生において遺伝子発現制御の根幹をなす、mRNA分解制御の詳細な生理学的意義を解明することを目指している。そのための第一歩として、本研究ではmRNA分解の場であるP-bodyとそこで機能するDCP1とDCP2が、初期発生においてどのような役割を果たすのか理解することを目的とする。具体的には、「どの細胞でどのmRNAを分解すること」が初期発生に重要なのかを明らかにする。また、並行してmRNA合成のボトルネックとなるエピジェネティックな転写制御にも着目することで、植物初期発生における遺伝子発現制御の包括的な理解を目指している。本研究で明らかになった観察結果に加え、dcp1とdcp2欠失変異体が発芽直後に致死であることを考慮すると、DCP依存的なmRNAの選択的分解が分化・分裂の盛んな組織で重要な機能をはたす可能性が高い。これらの結果を受けて、mRNAが発生段階でどのような役割を果たすのかについてを考察し、国際学会を含む3つの学会に発表した。また、本特別研究員がこれまで行ってきた研究分野の知識を活かし、国際誌にRNA分解に関する総説を発表した。また、エピジェネティック制御に関与する変異体における結果から、この遺伝子の制御下で新奇細胞融合現象が起きることを発見し、国際誌に研究成果を発表した。本研究ではまず初期発生過程のどこでDCP1とDCP2が働くのか調べるため、特別研究員が作出したDCP1とDCP2を蛍光タンパク質で可視化したシロイヌナズナを用いて、植物初期発生におけるこれらのタンパク質の発現部位を特定した。様々な発生段階で観察を進めた結果、成熟葉などと比較して、分裂組織や胚では非常に蛍光が強く、多数の顆粒構造が観察された。また未成熟な胚珠など特定の発生段階においてはこれらのタンパク質は発現しておらず、RNA分解系タンパク質の時期特異的な発現パターンが示唆された。それと並行してmRNA分解が細胞分化と分裂のどちらに寄与するか調べるため、細胞膜マーカーと様々な胚組織特異的な分化マーカータンパク質を異なる色の蛍光タンパク質で可視化し、申請者が持つdcp1またはdcp2欠失変異体に導入した。その結果、地上部の幹細胞マーカー、地下部の幹細胞マーカーどちらに関しても、dcp1変異体, dcp2変異体の後期胚において共に異所的な発現パターンを示すことが明らかとなった。これらの結果より、胚発生においてDCP1とDCP2が行うRNA分解が細胞分化状態に影響することが示唆された。これらの実験で得られた“mRNA分解が機能している組織"という情報は初期発生は勿論のこと、植物個体全体を通じても初めての情報である。また、本研究課題に関連した総説も執筆できており、一年目に計画された実験は多少の遅れはあるものの、ほぼ予定通り進んでいるといえる。加えてRNA分解と協調的に働くことが予想されるエピジェネティック制御に関する研究成果についても国際誌に発表することができたため、本研究はおおむね順調であると判断した。

mRNA分解も、多数の遺伝子、あるいはそこに含まれる特定の機能に重要な遺伝子の分解制御に関わることが想定される。本研究では、植物初期発生において遺伝子発現制御の根幹をなす、mRNA分解制御の詳細な生理学的意義を解明することを目指している。本年は初期発生過程のどこでDCP1とDCP2が働くのかをより詳細に解析するため、これらの遺伝子を任意のタイミングでノックアウト・ノックダウンできる2種類の植物を作出した。作出したノックアウト・ノックダウン植物を用いて、個体レベルにおけるDCP1またはDCP2の重要性を確認した。発芽前からノックアウト・ノックダウンを誘導することで発芽以降のRNA分解が異常となる状態の植物を観察したところ、意外なことにdcp1またはdcp2欠失変異体で見られたような致死性の表現型は観察されず、大きな異常は無く成長し続けた。この結果より、発芽以降の発生ステージにおいては、DCP1とDCP2が関与するRNA分解系は必須の働きを持っているわけではないことが示唆された。これらの研究と並行して、転写阻害剤や翻訳阻害剤存在下で受精直後の胚珠の発達をイメージングしたところ、これらの阻害剤存在下では正常な助細胞胚乳融合現象が起きないことが明らかとなった。更に細胞周期阻害剤においても細胞融合が起きなかったことから、これらの現象が助細胞胚乳融合に必須の役割を持っていることが明らかとなった。この結果を論文にまとめ、国際誌に発表した。本研究では、植物初期発生においてmRNA分解制御の生理学的意義を解明することを目指している。そのための第一歩として、本研究ではmRNA分解の場であるP-bodyとそこで機能するDCP1とDCP2が、初期発生においてどのような役割を果たすのか理解することを目的とする。具体的には、「どの細胞でどのmRNAを分解すること」が初期発生に重要なのかを明らかにする。また、並行してmRNA合成のボトルネックとなる転写制御や翻訳制御にも着目することで、植物初期発生における遺伝子発現制御の包括的な理解を目指している。本年は遺伝子を任意のタイミングでノックアウト・ノックダウンできる植物を作出することで、DCP1とDCP2が初期発生過程のどこで働くのかを解析することに成功した。概要で示した結果より、発芽以降の発生ステージにおいては、DCP1とDCP2が関与するRNA分解系は必須の働きを持っているわけではないことが示唆された。この結果より、従来どんな細胞でもハウスキーピング的に働くと考えられていたRNA分解系は、実はより特定の発生段階で重要な働きを担っている可能性が明らかとなった。dcp1とdcp2欠失変異体が発芽直後に致死であることも踏まえて考察すると、これらのタンパク質は胚発生後期から発芽直前までという非常に短い期間において特定のRNA分解を行うことで、致死性の回避を行っている可能性が高い。これらの結果を受けて、mRNAが発生段階でどのような役割を果たすのかについてを考察し、複数の学会に発表することができた。
口蓋形態が発音機能に及ぼす影響について-特にMajor connectorの形態と設置位置について-

今回の研究では、口蓋形態および補綴物の形態構造と構音機能との関連を検討するのが目的である。本年度は研究システムの構築に時間がかかり研究実施計画のうち、健常有歯顎者における歯および口蓋形態と構音機能との関連を検討するための、被験者の上顎模型作製とデータの採得まで行った。I被験者は、東京近郊を出身地とした正常歯列者であり、これらの上顎模型を作製し、口蓋部分に咬合平面を基準とした等高線を描出した。描出した等高線をデジタルカメラを用いてコンピューターに入力後、そのパターンから、口蓋形態の分類を行った。現在、被験者数を増やし、分類の結果について検討中である。II口蓋形態と関連の深い被験語を含む文章を、ソニー社製マイクロフォン(ECM-959A)により採得し、ソニー社製DATレコーダー(TCD-D7)に防音室にて録音した。III録音したデータをKAY社製ソナグラフ(5500 DSP)に入力し、ソナグラムおよびパワースペクロラムを確認した。その後、コンピューターインターフェイス(5636)を介して、音声データの原波形を、コンピューターに記録、入力し、原波形について、波形分析ソフトにより分析を行った。IV口蓋形態を等高線のパターンから分析した、形態学的な分類とソナグラフおよび原波形分析より得られた音声データの分析による構音機能について、両者の関連を検討中である。
フグが「ミステリーサークル」を建設するロジックを解明する

アマミホシゾラフグTorquigener albomaculosusは,近年奄美大島南部沿岸域で発見された新種のフグである。本種は全長約10cmであるが,オスは砂底で直径2mもある円形幾何学模様の構造物(ミステリーサークル)を単独でおよそ1週間のうちに完成させている。これは繁殖に利用する産卵床であることがわかっている。しかしながら,フグが体の20倍もある精巧な円形幾何学模様の構造物を一体どのように建設しているのか全く不明である。そこで,その建設ロジックを解明するために,行動観察と実験・理論を融合したアプローチにより解明を進めてきた。2017年6月には前年度に引き続き奄美大島南部の沿岸でスキューバ潜水を行い,フグの行動観察を行った。これまで一度建設したミステリーサークルは再利用されないと考えられていたが,繁殖周期中に繁殖できなかった個体の中には次の繁殖周期に再利用する個体のもいることが明らかになった。ミステリーサークルを3D復元するために,従来の方法に加えて既定の形状のマーカーをミステリーサークルの周りに目印として設置して撮影を行った。これにより,PC上での3D復元作業の簡略化に成功し,モデルの精度向上にもつながった。建設ロジックのシミュレーション用に定点ビデオ撮影を行っているが,今回は海底に高さ2.5mのポールを設置して真上に近い角度からの撮影を行った。この動画については,現在解析準備中である。これまでの研究成果のうち,最初期のミステリーサークルの発見とその形状変化については学術論文として発表した(Kawase et al. 2017)。その変化の様子を臨場感を持って一般市民に伝えるため,博物館の企画展示でハイビジョン映像を実物大で床に投影して公開した。また,展示解説書では論文に使用した写真入りで研究成果の概要を紹介した(川瀬,2018)。29年度が最終年度であるため、記入しない。アマミホシゾラフグは全長約10cmの小型のフグで,オスは繁殖のために放射状に並ぶ山と谷および中央部の産卵床から成る直径約2mもの「ミステリーサークル」を砂底につくることが知られている。本研究では,フグが自分の体長の20倍もある精巧な3D構造物をいかにしてつくるのか,そのロジックを行動観察と実験・理論を融合したアプローチにより解明を行ってきた。2016年6月に奄美大島南部の沿岸域でSCUBA潜水を行い,最初期のミステリーサークルの探索とフグの行動観察,ミステリーサークルの砂採集,ミステリーサークルの撮影,フグの定点動画撮影を行った。フグの行動観察によると,ミステリーサークルをつくり始める際いきなり谷を掘り進めるのではなく,まず体を様々な角度から海底に押し当ててくぼみをつくることが今回初めて明らかになった。この発見により,ミステリーサークル外側に形成される放射状構造の形成シミュレーションでは,フグが外側から窪みのエリアを目指して掘り進めること,定点動画の行動解析によりある半径以内のランダムな地点から谷掘りを繰り返すことなどを条件設定すると,実物と類似した放射状構造の出来上がることが確認された。ミステリーサークル各部位の砂をレーザー光による粒度分析を行ったところ,中央部には粒度の細かい砂(50300μm)が徐々に堆積して産卵後すぐに荒い砂に戻ること,粒度組成の異なる底質の場所でも中央部に堆積する砂の粒度は類似していることが明らかとなった。フグが中央部へ砂を飛ばすときと同じ速さに設定したスクリューを用いて現地で採集した砂を飛ばす実験を行ったところ,野外と同様な粒度の砂が堆積することが確認された。また,4Kビデオカメラにより様々な角度からミステリーサークルを撮影した動画コマ(静止画)により,3D構造を初めて定量的に復元することに成功した。本研究の成否はフィールド観察の出来具合に大きく左右されるが,2016年度は約3週間の調査期間中海況が比較的安定して毎日SCUBA潜水を行うことができたことから,当初の予定以上に潜水観察を行うことができ,解析に必要なサンプルやデータを十分に得ることができた。フグの産卵前日に中央部に形成される放射状の模様形成シミュレーションは2017年度に行う予定であったが,十分な動画を撮影することができたため前倒しで行うことができた。

建設ロジックのシミュレーション用に定点ビデオ撮影を行っているが,今回は海底に高さ2.5mのポールを設置して真上に近い角度からの撮影を行った。この動画については,現在解析準備中である。これまでの研究成果のうち,最初期のミステリーサークルの発見とその形状変化については学術論文として発表した(Kawase et al. 2017)。その変化の様子を臨場感を持って一般市民に伝えるため,博物館の企画展示でハイビジョン映像を実物大で床に投影して公開した。また,展示解説書では論文に使用した写真入りで研究成果の概要を紹介した(川瀬,2018)。これまでのところほぼ当初の計画通り研究が進んでいるが,実際に実験・解析を行ってみると,手法を修正の上さらにデータを採取したほうがよい点が浮き彫りになった。静止画によるミステリーサークルの3D構造復元は2016年度の調査で概ね成功したが,指標となるマーカーとして1本の定規で行ったため若干精度に問題が生じた。そこで2017年度の調査では,複数のマーカーを海底に固定して継時的に撮影を繰り返し,ミステリーサークル各部位の変化の様子を定量的に明らかにする。フグがミステリーサークルの中央部へ砂を飛ばすときと同じ速さに設定したスクリューを用いて現地で採集した砂を飛ばす実験を行ったところ,野外と同様な粒度の砂が堆積することが確認された。一方,粒度が荒めの全く別の場所の砂で実験を行ったところ,ほとんど砂が飛ばず堆積しなかった。このことからミステリーサークルの形成には,想定していた以上に海底の砂の粒度組成が重要な意味を持っているらしいことが明らかになった。このため,粒度(砂の飛ばされやすさ)をファクターに取り入れたシミュレーションを行い,砂底の粒度によりミステリーサークルの形状がどのように変化しうるのか明らかにする。29年度が最終年度であるため、記入しない。
ボリノスタットによるオートファジー誘導とMGMT抑制効果に関する研究

ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるボリノスタットには、悪性神経膠腫の薬剤耐性のひとつであるMGMT活性を抑制する作用を有するが、その機序は不明な点が多い。本研究では、オートファジーとの関係に注目し、ボリノスタットによるMGMT活性を抑制する機序について検討した。MGMTがテモゾロミド耐性を発揮するためには、核内に局在している必要がある可能性が示唆された。さらに核外で過剰に発現したMGMT蛋白は、シャペロン介在性オートファジーで分解される可能性が示唆された。本研究を通して、MGMT蛋白をはじめとする薬剤耐性酵素の局在を変化させることは、薬剤耐性克服の新たな治療戦略である可能性が示唆された。当該年度は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるボリノスタットを用いて、悪性神経膠腫のテモゾロミド耐性に関わるMGMT発現抑制効果について検討した。MGMTが高発現している悪性神経膠腫細胞株T98Gを用いて、ボリノスタットによる治療実験を行った。これまでに報告されているように濃度および時間依存性の細胞増殖抑制効果が認められた。当初ボリノスタットによりMGMT発現が抑制されると考えていたが、逆にMGMT発現が増加することがわかった。治療前後のタンパク(全分画)を回収し、Western blot法により増加を確認した。免疫染色によりMGMTの局在を確認すると、治療前のコントロール群では核内に強く発現が認められた。一方で、ボリノスタット治療群は、MGMTの発現が核内ではなく核外に強く発現していた。この結果から、ボリノスタット治療により、MGMTの発現が核内から核外へ移行した可能性が示唆された。DNA修復酵素であるMGMTは、核内になければ十分に機能を発揮できない可能性があり、ボリノスタットによるMGMTの核内から核外へ移行する効果は、新たな治療戦略のひとつとなりうると考えられた。今年度は、さらに検証実験をすすめ、テモゾロミドとの併用実験をすすめる予定である。検証実験では、MGMTの非発現株であるU251、T98Gに対してsiRNAを用いてMGMT発現を抑制した状態でのボリノスタットの影響についても検討する。【研究の概要】ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるボリノスタットには、悪性神経膠腫の薬剤耐性のひとつであるMGMT活性を抑制する作用を有するが、その機序は不明な点が多い。本研究では、オートファジーとの関係に注目し、ボリノスタットによるMGMT活性抑制機序について検討した。【具体的内容】1細胞増殖抑制効果:悪性神経膠腫の代表薬であるテモゾロミド、今回注目したボリノスタットには、いずれも悪性神経膠腫細胞株に対して、容量依存性の細胞増殖抑制効果を認めた。両者を併用することで、さらに強力な細胞増殖抑制効果が認められた。2MGMT蛋白の発現と局在:MGMT蛋白の発現を、Western blot法で確認すると、ボリノスタット群においてMGMT蛋白の発現が亢進していた。その局在について、蛍光免疫染色法で確認すると、MGMT蛋白の局在は核内から核外へ移行していた。さらに、細胞質内に移行したMGMTは、選択的オートファジーであるシャペロン介在性オートファジーの指標であるLAMP2aと局在が近接していた。【意義と重要性】MGMTがテモゾロミド耐性を発揮するためには、核内に局在している必要がある可能性が示唆された。本研究を通して、MGMT蛋白をはじめとする薬剤耐性酵素の局在を変化させることは、薬剤耐性克服の新たな治療戦略である可能性が示された。研究開始当初、ボリノスタットによりMGMT発現が低下すると考えていたが、逆に増加していたため。検証実験に時間を要したため、予定よりも遅れる結果となった。脳腫瘍その後は、TMZとの併用実験を行い、細胞周期に対する影響、細胞増殖抑制効果について検討していく。MGMTのタンパク発現について、ウェスタンブロット法および傾向免疫染色での検討を中心に行う必要があったため。当該年度の結果を踏まえて、次年度はsiRNAによるMGMTの発現抑制、RT-PCRによるMGMTのmRNAの発現、MGMTのpromoter領域のメチル化への影響について検証をすすめる。
飛灰上でのダイオキシン類再合成機構の解明およびその抑制技術の評価

本年度は,焼却過程におけるダイオキシン類の発生を抑制する化学的手法として尿素の添加に着目し,飛灰上におけるダイオキシン類の再合成機構および抑制機構の解明に関する研究を行った.まず,再合成実験として,活性炭と塩化カリウム,塩化銅(II)二水和物を混合した模擬飛灰に尿素を添加して,管状型の電気炉内で酸素10%,窒素90%の雰囲気下で加熱した後,飛灰および排ガスの分析を行った.尿素の添加量,温度,時間がダイオキシン類の前駆体であるクロロベンゼンとPCBsの生成に及ぼす影響について調べた結果,300°C,120分の条件下では約80%の抑制率が得られた.尿素自体の熱重量示差熱分析を行い,尿素の熱分解生成物との反応の観点から考察すると,飛灰上に分解生成物がとどまることで,ダイオキシン類の再合成を抑制しているのではないかと考えられた.つまり,共存する窒素含有有機物がダイオキシン類再合成への反応を抑制していると考えられた.ダイオキシン類の再合成機構には,有機物および触媒となる金属が関与する.この点を明らかにするために,新たにその場の温度,雰囲気での有機物のラジカル,銅の挙動を観察するため,高温対応のESRのセルを作成し,ラジカル挙動を確認した.この手法によると,尿素の添加の有無によりESRスペクトルが変化し,尿素添加によりダイオキシン類の生成温度域でのラジカル量が減少することが確認された.また,大型放射光を用いたin situ XAFS実験では,銅の挙動に大きな変化は認められないことから,尿素の場合は主に有機ラジカルによるダイオキシン類生成抑制が主なメカニズムであると推定された.以上より,in situ XAFSとin situ ESRを組み合わせることで,これらダイオキシン類の生成機構の解明に格段の知見を与えることがわかった.本研究では、銅を中心としたダイオキシン類の生成機構を解明し、その結果を抑制技術に利用するために、時間分解能を高めたin situ XAFS分析(時分割XAFS)などにより詳細な銅の化学形態変化を追究することを第一の目的としている。昇温過程での変化がわかれば、この酸化還元反応がどの温度から開始するのかがわかり、実際の焼却施設における温度管理等に極めて有益な情報を与える。時分割XAFS実験からは、塩化銅を用いた模擬飛灰において、210°Cから塩化銅の触媒作用によるダイオキシン類生成が始まることがわかった。260°Cで最も強く還元されたが、その後は炭素消費により、還元状態から酸化状態へと移行し、300°C以降では銅の価数変化は進行しなかった。時分割XAFSは従来型のステップスキ・ヤンのXAFSに比べスペクトル分解能は高くないが、ほぼ同じ現象を把握することができ、また反応開始温度について正確な値を求めることができた。次に、ダイオキシン類の生成抑制作用をもつことで知られているNaOHを添加して300°Cで加熱実験を行い、その抑制効果が経時的にどのように現れるかを調べる目的で、VUV-TOFMS実験を行った。上記と同様塩化銅を用いた模擬飛灰を実験に用いた。NaOH添加の場合、モノクロロベンゼンが加熱開始前のベースとなる量の2倍である300ppb生成したものの、ジクロロ、トリクロロベンゼンはほとんど生成しなかった。NaOHを添加すると、120min加熱しても全ての時間でクロロベンゼン類はほとんど生成されずに、平行な直線グラフのようなグラフ形状を示したことから、ダイオキシン類も抑制されると考えられた。今後、NaOHを添加し、加熱した時の銅の挙動をおうことで抑制機構の解明につながると考えられる。本年度は,焼却過程におけるダイオキシン類の発生を抑制する化学的手法として尿素の添加に着目し,飛灰上におけるダイオキシン類の再合成機構および抑制機構の解明に関する研究を行った.まず,再合成実験として,活性炭と塩化カリウム,塩化銅(II)二水和物を混合した模擬飛灰に尿素を添加して,管状型の電気炉内で酸素10%,窒素90%の雰囲気下で加熱した後,飛灰および排ガスの分析を行った.尿素の添加量,温度,時間がダイオキシン類の前駆体であるクロロベンゼンとPCBsの生成に及ぼす影響について調べた結果,300°C,120分の条件下では約80%の抑制率が得られた.尿素自体の熱重量示差熱分析を行い,尿素の熱分解生成物との反応の観点から考察すると,飛灰上に分解生成物がとどまることで,ダイオキシン類の再合成を抑制しているのではないかと考えられた.つまり,共存する窒素含有有機物がダイオキシン類再合成への反応を抑制していると考えられた.ダイオキシン類の再合成機構には,有機物および触媒となる金属が関与する.この点を明らかにするために,新たにその場の温度,雰囲気での有機物のラジカル,銅の挙動を観察するため,高温対応のESRのセルを作成し,ラジカル挙動を確認した.この手法によると,尿素の添加の有無によりESRスペクトルが変化し,尿素添加によりダイオキシン類の生成温度域でのラジカル量が減少することが確認された.また,大型放射光を用いたin situ XAFS実験では,銅の挙動に大きな変化は認められないことから,尿素の場合は主に有機ラジカルによるダイオキシン類生成抑制が主なメカニズムであると推定された.以上より,in situ XAFSとin situ ESRを組み合わせることで,これらダイオキシン類の生成機構の解明に格段の知見を与えることがわかった.
メタボローム解析とPK-PDモデルを活用した大黄甘草湯エキス品質評価法の開発

これまでにダイオウ品質管理指標成分センノシドA, Bから瀉下活性を有するレインアンスロンを生成する腸内細菌の代謝活性について,センノシドA, B以外の大黄甘草湯エキス含有成分が影響を及ぼす可能性を示した。当該年度において,レインアンスロン生成を促進する成分を同定した。これにより,大黄甘草湯エキスの品質評価の新しい指標成分を提示し,さらに様々な成分を含有する大黄甘草湯ならではの薬効発現機序が存在することを示した。さらに,当該代謝活性は,腸内細菌側や周辺に存在する栄養成分にも影響を受けることが示された。この知見をもとに患者の腸内細菌叢や栄養状態に介入を行うことで,大黄甘草湯の効果が得られにくい患者に対しても,その効果を有効に引き出せる可能性が期待できる。様々なダイオウ,カンゾウ材料を入手し,それらを組み合わせることにより様々な成分組成の大黄甘草湯エキスを調製した.当該エキスをLC/MSに供し,メタボリックプロファイルデータを取得した.さらに,当該エキスをマウス糞便に添加し,ダイオウの品質指標成分センノシドが腸内細菌により代謝され生成する瀉下活性成分レインアンスロンについて,その生成量をLC/MSにより解析した.その結果,特にダイオウ試料の種類によってレインアンスロン生成量が大きく変動することが明らかになった.得られたメタボリックプロファイルデータとのレインアンスロン生成量データを多変量解析に供し解析することにより,LC/MSメタボリックプロファイルデータから,糞便中で生成するレインアンスロン生成量を予測するモデルを構築した.構築したモデルから,レインアンスロン生成量はセンノシドA, B含量のみに依存するのではなく,その他のエキス成分の影響も大きいことが示唆された.また本研究では,レインアンスロン生成代謝について,生薬材料に含まれる成分の影響を評価することを目的としているが,実験系を確立する中で,腸内細菌側の因子が及ぼす影響についても検証した.その結果,センノシド代謝反応に必要な因子を見出すことができた.この因子は,腸内細菌叢によってはセンノシド代謝反応が大きく減弱する要因となっていることが示唆され,大黄甘草湯エキスに限らず,センノシドを用いた便秘治療の際に有用な知見となる可能性がある.当初の予定であった大黄甘草湯エキスを糞便に添加し,生成するレインアンスロン量の解析,およびエキスのLC/MSメタボリックプロファイルデータとの相関解析を行うことができた.これらは当初の予定より前倒しで実施できた.また,レインアンスロン生成代謝について腸内細菌側の因子の影響は当初計画していなかったが,この影響を示唆する結果が得られた.一方,マウス個体を用いた実験に関しては進捗が遅れており,今後,改善する.前年度の研究の結果、ダイオウ品質管理指標成分センノシドA、Bから瀉下活性を有するレインアンスロンを生成する腸内細菌の代謝活性について、センノシドA、B以外の大黄甘草湯エキス含有成分が影響を及ぼす可能性を示した。当該年度は、当該代謝活性に影響を及ぼす可能性が示唆された大黄甘草湯エキス含有成分について、精製化合物を用いたマウス糞便代謝実験を行い、その検証実験を行った。その結果、いくつかの成分について、レインアンスロン生成量の増加が観測された。本結果は、大黄甘草湯エキスの品質評価の新しい指標を提示できるものと期待でき、さらには、センノシド製剤では見られない、様々な成分を含有する大黄甘草湯ならではの薬効発現機序が存在することを示した有用な知見であると言える。また、前年度に、当該代謝活性は、大黄甘草湯エキス成分の組成だけではなく、腸内細菌側の様々な因子に影響を受ける可能性を見出していた。そこで、当該年度では、マウス糞便代謝実験時に、酸素や補酵素などの濃度を変化させて、代謝活性の評価を行った。その結果、腸内細菌の電子伝達系の活性化度が重要であることを示唆する結果が得られた。本現象をさらに精査し、レインアンスロン生成代謝反応の詳細な分子機構を解明できれば、その知見をもとに患者の腸内細菌叢や栄養状態に介入を行うことで、大黄甘草湯の効果が得られにくい患者に対しても、その効果を有効に引き出せる可能性が期待できる。マウス個体を用いた実験を計画していたが,研究代表者の所属先の異動などにより,計画通りに実施できなかった.これまでにダイオウ品質管理指標成分センノシドA, Bから瀉下活性を有するレインアンスロンを生成する腸内細菌の代謝活性について,センノシドA, B以外の大黄甘草湯エキス含有成分が影響を及ぼす可能性を示した。大黄甘草湯エキスを経口投与し,マウス腸管内のレインアンスロン生成量の濃度を解析する。また,レインアンスロンを合成し,これを様々な濃度で注入し,瀉下活性を評価する.

さらに,これまでに構築した予測モデルを詳細に解析することにより,レインアンスロン生成代謝に影響を及ぼす成分の探索を行い,その機構を明らかにする.研究を遂行できる環境を整備できたため,昨年度計画していたマウス個体を用いた実験を実施する.当該年度に減圧遠心機を購入予定であったが,当初予定していた機器では必要とする機能が備わっていなかった為,購入を見合わせていた。2017年12月16日付で大阪大学医学系研究科に異動となったが,採用過程での準備や採用後の新業務の習得などで,約半年ほど当該研究に十分な時間を割くことができなかった.しかし,今後は現所属ラボで当該研究に従事する時間が確保できる見込みであり,研究期間延長を申請した。今後,マウス個体を用いた実験に必要な物品を購入するとともに,論文投稿に必要な英文校閲費,投稿費に使用する予定である.本年度未使用分に相当する額で,必要とする機能が備わった機器を手配することができたので,次年度早々に購入する予定である。
脂溶性リガンド感知機構に関する基盤的研究

イソチオシアネート化合物は、イソチオシアネート基(N=C=S)の炭素原子の電子不足からチオール化合物による抱合反応を受けやすく、刺激がマスクされた抱合体を形成する。しかし、抱合体は不安定であり、別のチオール化合物と交換反応が進行する(トランスチオカルバモイル化)。クリックケミストリーを用い、6-HITCのアルキン誘導体による細胞タンパク質のトランスチオカルバモイル化を調べたところ、複数のタンパク質に結合することが分かり、さらに標的タンパク質としてHsp90βを同定した。さらに熱ショック応答につながる翻訳後修飾であることを明らかにした。生物は様々な脂溶性化合物に曝されており、これらの化合物は健康や寿命に大きく影響しているものと考えられる。こうした化合物には、環境中の様々な有機化合物だけでなく、ポリフェノールやイソチオシアネート化合物などの機能性食品成分、酸化ストレスにおいて生成される酸化脂肪酸なども含まれる。こうした脂溶性化合物は細胞膜あるいは細胞内受容体に作用し、受容体刺激による適応応答の誘導に関与することが明らかとなってきている。例えば、PPARgの天然リガンドとして様々なアラキドン酸代謝産物が同定されているが、これらのリガンドは脂肪細胞分化やマクロファージ泡沫化抑制などの活性を示す。しかし、食品素材に含まれる脂溶性化合物の多くはその活性発現機構などについて、ほとんどが未解明のままである。そこで本研究では、食品成分としてイソチオシアネートを用い、センサータンパク質への直接的相互作用を介したシグナリング機構の解析を行った。腸管上皮細胞Caco-2を用い、イソチオシアネート代謝産物(グルタチオン抱号体)などレドックス感受性因子によるプロテオーム解析法によるイソチオシアネート感受性タンパク質の網羅的検出・同定を行った。プロテオミクスにはレドックス感受性のケミカルプローブを用いたクリックケミストリーを導入した。その結果、熱ショックタンパク質90b(Hsp90b)を主なセンサータンパク質として同定することに成功した。また、その下流のシグナル伝達機構の解析を行い、Hsp90bを介した熱ショック応答の詳細を明らかにすることができた。そこで本研究では、食品成分としてイソチオシアネート-グルタチオン抱合体を用い、センサータンパク質への直接的相互作用を介したシグナリング機構の解析を行った。腸管上皮細胞Caco-2を用い、イソチオシアネート-グルタチオン抱合体によるプロテオーム解析法によるイソチオシアネート感受性タンパク質の網羅的検出・同定を行ったが、プロテオミクスにはレドックス感受性のケミカルプローブを用いたクリックケミストリーを導入した。これらの研究成果により、イソチオシアネート-グルタチオン抱合体がタンパク質のチオール基とのトランスアルキル化を介して、イソチオシアネート修飾を受けることを初めて見いだした。こうした脂溶性化合物は、細胞膜あるいは細胞内受容体に作用し、受容体刺激による適応応答の誘導に関与することが明らかとなってきている。例えば、PPARgの天然リガンドとして様々なアラキドン酸代謝産物が同定されているが、これらのリガンドは、脂肪細胞分化やマクロファージ泡沫化抑制などの活性を示す。しかし、食品素材に含まれる脂溶性化合物の多くは、その活性発現機構などについて、ほとんどが未解明のままである。本年度は、自然免疫における異物の認識に不可欠なToll様受容体(TLR)の中でも細胞膜上に発現しているTLR2およびTLR4に焦点を当て、TLRシグナル伝達経路を抑制する食品成分の探索を行うため、評価系の構築を行った。HEK293細胞に、TLRおよびその下流に位置する転写因子NF-kBのルシフェラーゼレポーター遺伝子を共導入した安定発現細胞を樹立した。