hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自家培養表皮移植による乳輪乳頭の色素再建に関する研究

乳癌による乳房切除後の乳房再建は、インプラントによる再建が保険収載されるなど、患者のQOL向上に寄与している。しかし、現状乳房再建は可能であっても、乳頭乳輪再建には健常な乳輪乳頭に侵襲が及ぶなど改善すべき問題が多い。そこで今回、この乳頭乳輪の再建に、再生医療技術を応用し、色素細胞を含む培養表皮細胞移植による乳頭乳輪再生を試みた。今回健常乳輪部分より極めてわずかな(1x5mm)皮膚を採取し、色素細胞を多く含む培養表皮の作成を可能にした。この色素細胞を豊富に含む培養表皮を、再建乳房のアブレージョン後の皮膚移植することで良好な生着を得た。着色が弱い場合には光線療法等で対応可能であった。本年度乳房全摘出患者数例よりIC取得後、術中の余剰皮膚の提供を受けた。得られた皮膚は、大量の脂肪組織が付着していたが、細切を十分に行うことで除菌ならびに酵素消化も可能であった。酵素消化後の皮膚から得られた遊離細胞は、通常の培養表皮移植に用いるための採皮とは異なるため若干収率は低い傾向にあったが、表皮細胞の培養は十分可能であった。培養された表皮細胞には、色素細胞も温存されており、位相差顕微鏡下においてその存在が容易に確認できた。得られた培養表皮細胞がシート化され、このシート化された培養表皮の剥離が試みられた。乳頭乳輪面積は通常の培養表皮移植に比べると面積的に小さいため、培養表皮細胞をシート状に剥離するためには、特殊なキャリアが必要となる。そこでポリL乳酸不織布に植物由来多糖体をラミネートした全く新たなキャリアの開発を同時に考案した。その結果、この多糖体ラミネート量を変化させることで、シート剥離性とシート移植性のハンドリングを両立するキャリアも完成した。以上の結果から、乳頭乳輪周囲への移植のための培養表皮の作成技術、移植のための新規デバイスの準備ができた。一方で移植法シミュレーションとして、ヌードマウスを用いて前臨床研究を行った。麻酔下のヌードマウス背部の消毒後、ローター型グラインダーを用いてアブレージョンして薄削した。その後、上記で得られた培養表皮シートを新規キャリアとともに移植し、キャリアの剥離後ワセリンを塗りこんだ非固着性ガーゼで被覆したのちタイオーバー固定をした。術後1日で薄削した移植部位はすでに表皮が生着しており、正常皮膚部分にまで割り込んで移植をした培養表皮は乾燥壊死して脱落し、極めて明瞭に移植の成果が目視出来た。現在も問題なく生存中であり、2カ月をめどに屠殺後組織化学的検討を行う予定である。乳房全摘後の患者は、整容的面から大変大きな精神的苦痛を伴う。乳房再建は、この苦痛を改善する効果的な治療手段であるが、再建した乳房には乳頭乳輪が存在しない。そのため乳頭乳輪の再建は、片側の健常乳房から乳輪部を一部採皮もしくは陰部皮膚を採皮して移植する方法あるいは刺青を入れる方法が主体である。しかし前者の乳輪皮膚、陰部皮膚の移植は侵襲も大きく再生医学的手法による治療技術の開発が望まれていた。今回の研究は、この問題を解決する一つの手段である。これまでの移植用培養表皮作成技術と異なり著者らの培養技術は、表皮細胞だけでなく色素細胞も温存培養できることである。そのため移植された培養表皮は、自然な体色となるため、著者らの表皮細胞培養法は特に尋常性白斑などの治療に優れた技術であった。一方で移植時に不適切な患部の皮膚の剥離は、移植後の瘢痕治癒の原因となり、醜形を残す原因となる。カラーマッチする部位から採皮した皮膚を用いて色素細胞温存培養表皮を作成しても、醜形を残す移植法では、期待される成果は得られない。今回用いたアブレージョン後による培養表皮移植術は術後の経過も良好であり、傷跡もまったく目立たない手技である。本研究で具現化しようとする治療技術は、移植部位の侵襲も少なくドナーサイトの侵襲もほとんどないという再生医療技術を駆使した理想的な手術方法といえる。また、今年度の研究で色素細胞の増殖を調節することで培養中に一定程度の色素沈着量を調整できる培養手技が開発される可能性も出ており、乳輪部やその他の色調不一致部位へのカラーマッチ技術は当初の計画以上に推移している。同時にこれまでは表皮の培養には動物由来成分が必須であったが、共同研究者の開発した多血小板血漿を用いた新規培養技術は、動物由来成分を一切使わず、患者への潜在的な危険性を回避できるようになった。昨年度確立した色素細胞含有表皮細胞の培養技術を用い本年度、実際に乳頭乳輪周囲の皮膚より、色素含有培養表皮細胞を作成した。健側側の乳頭乳輪より採取できる組織はその特徴から極めてわずかな組織しか採取できない。また、採取後の乳頭乳輪は形態を損なわないこと、醜形を伴わないことが重要であり、その結果採取できる培養用皮膚組織は1x5mmの組織程度に過ぎない。この組織から得られる総細胞数は最大でも105細胞程度であるため、これまでの常法的培養技術では培養できないが、我々は独自の培養技術で102細胞からの表皮細胞培養を可能としており、色素細胞を含有している培養表皮シートの作成が可能であった。得られた培養表皮シートは、昨年度開発した多糖体ラミネートポリ乳酸不織布によって剥離が可能であった。

しかしながら、この不織布の柔軟性の問題から乳頭ならびに円錐型立体構造表面への創部追従性が不十分であり、乳頭部のキャリアシートくりぬきなど、今後新たな技術開発が求められた。このような問題があったが、実際の臨床において移植後の培養表皮の経過も良好であった。成熟色素形成には一定期間の時間を必要とするため、経過観察中である。前年においても報告したが、乳房全摘後の患者は整容的側面で大きな精神的苦痛を伴う。近年インプラントによる乳房再建術が保険収載され、費用的にも自費診療に比べると大幅に医療費負担が軽減され普及しつつある。しかしこれは乳房形態を再建するだけであり、乳頭乳輪の整容的再建はできない。これまでは、刺青や健側乳頭乳輪を採取して植皮をする(この場合健側の乳頭乳輪が縮小してしまい、侵襲が大きい)。もしくは大陰唇から採取した皮膚の植皮などを必要とし、精神的負担と肉体的苦痛も大きい。今回の再生医療技術による乳頭乳輪再建は、健側側の乳頭乳輪からの皮膚採取を必要とするが、侵襲を抑えた現場における最良の技術と考えられる。今年度は、乳頭乳輪皮膚からカラーマッチした培養表皮の作成と移植をおこなったが、後半においては正常皮膚から色素細胞のみを選択培養できる技術の確立に着手しており、この技術が確立できれば患者の健側側の乳頭乳輪、大陰唇からの採皮を不要としさらに患者の苦痛を軽減できる。すでに確立した色素細胞含有表皮細胞の培養技術を用い本年度、実際に乳頭乳輪周囲の皮膚より、色素含有培養表皮細胞を作成し、2例の患者へ移植が実施された。移植当初はカラーマッチが不十分であったが、その後の経過観察と色素脱失患者への治療に用いられるpuva、レーザーによって患者が満足する乳頭乳輪の再生が可能となった。ここでしかし大きな問題があった。当該治療は現状健側側の乳頭乳輪から、一部皮膚の採取が必要となる。これは患者にとって大きな苦痛となり、形態を温存するためには採取できる組織は、限定され極めてわずかな組織しか採取できない。こういった制約下で健常側の乳頭乳輪からの採皮は1x5mmの組織程度に過ぎない。この組織から得られる総細胞数は最大でも105細胞程度であるため、これまでの常法的培養技術では培養できないが、我々は独自の培養技術で102細胞からの表皮細胞培養を可能としており、色素細胞を含有している培養表皮シートの作成が可能ではある。しかし、健側に侵襲を加えることは事実である。そこで本年度は、これまでの実績を踏まえて希望する患者への乳頭乳輪培養表皮移植は実施したが、乳頭乳輪部位での採皮によらない全く新しい色素細胞培養と表皮細胞培養技術を確立し、この両者を手術前に混合してカラーマッチをより自然にできる色素細胞混合培養技術の確立に成功した。得られた培養表皮シートは、昨年度開発した多糖体ラミネートポリ乳酸不織布によって剥離が可能であった。得られた色素細胞混合培養表皮細胞シートは、dopa染色で、明確な着色の違いが確認されるとともに、得られたシートはヌードマウスに移植も可能であった。現在色素細胞の移植部分は、明確に色調の変化が観察され、生着が確認された。乳癌による乳房切除後の乳房再建は、インプラントによる再建が保険収載されるなど、患者のQOL向上に寄与している。しかし、現状乳房再建は可能であっても、乳頭乳輪再建には健常な乳輪乳頭に侵襲が及ぶなど改善すべき問題が多い。そこで今回、この乳頭乳輪の再建に、再生医療技術を応用し、色素細胞を含む培養表皮細胞移植による乳頭乳輪再生を試みた。
アカデミック・レジリエンスの形成に有効な教育政策の経済学的研究

社会経済的に不利な状況に置かれていても,その不利な状況に適応し,学業および関連する諸側面において一定水準以上の成果を達成する生徒が少なからず存在する一方で,不利な状況に適応できない生徒も存在する。前者はアカデミック・レジリエンスが高い生徒,後者はそれが低い生徒,と考えることができるが,両者の違いはどこにあるのか。生まれながらにして個々人に備わった特性であれば介入の余地は小さいが,ある程度の介入可能性も考えられる。本研究では,アカデミック・レジリエンスを生徒個人レベルで観察・計測し,その規定要因を経済学的な観点から探索的に研究することを通じて,介入可能性の有無および介入の効果を検証する。
浅海堆積物中の生痕化石の古生態・古環境情報の解明:現世海浜からのアプローチ

研究の目的:沿岸域(潮間帯陸棚)は地圏,水圏,大気圏が交わる場所であり,地球表層で最も多様な環境を有する領域である.沿岸域で形成された地層には,様々な生痕化石が存在する.それらを解析することで,多くの古生態・古環境情報を得ることができ,沿岸域生態系の変遷・発達史を読み取ることが可能となる.しかしそのためには,まず対応する現世生痕についての知見を得る必要がある.このことから,沿岸域の現世生痕についての研究がなされてきた.しかしながら,先行研究のほとんどは内湾の干潟環境において行われたものであり,またそれらの対象領域は汀線付近に限定されていた.このことから,沿岸域における現世生痕の調査は十分とはいえず,生痕化石に適用できる知見が不足していた.研究成果:前々年度,前年度に引き続き,当該年度においても茨城県神栖市に位置する波崎海岸において,前浜内側陸棚上部にかけての堆積環境で,底生生物相・生痕相・堆積相に関しての調査を実施した.それにより,海浜特性を考慮した生痕相モデルを構築した.すなわち,底生生物と生痕の同時観察,および安定同位体比解析から,(1)どのような生痕がどこに分布しているか,(2)その生痕の形成者は何か,(3)その生痕はどのような生態学的意義があるのか,(4)その生痕は地層中のどの生痕化石に対応しどのような古生態学的意義があるのか,を解明した.以上の結果により,地層中の生痕化石相を古生態・古環境学的に解釈する上で重要な知見を得ることができた.本研究で得られた結果をまとめ,外洋からの波浪の影響を強く受ける逸散型海浜の生痕相分布モデルについてを,国内外の学会で発表を行った.今現在,日本各地で砂浜海岸は海岸浸食のため減少し,その存在自体が危機的な状況にある.砂浜海岸の減少を食い止め,その場の豊かな生態系を保全するためには,漂砂現象および生物についての基本的な知見を得ることが必要不可欠である.しかしながら,汀線付近の調査は比較的容易に出来るものの,沖合の海底を実際に調べることは容易ではなかった.当該年度において,研究代表者は茨城県の波崎海岸周辺において潜水調査をおこない,その場の海底面や生物分布,そして堆積構造の状況を明らかにした,その結果,水深が深い地点(水深1020m)では,干潟に見られるような巣穴が大量に見られることが明らかになってきた.すなわちアナジャコ類やブンブクウニ類およびその生痕が,開放的な砂浜海岸の沖合にも豊富に存在していることが明らかとなった.また,ウバガイやチョウセンハマグリといった二枚貝類による堆積物の撹拌作用も明らかとなった.本研究により得られた知見は,沖合の細砂底における堆積学・生態学分野そして古生物学分野に対して,多大なインパクトを与えることが期待される.沿岸域(潮間帯陸棚)は地圏,水圏,大気圏が交わる場所であり,地球表層で最も多様な環境を有する領域である.沿岸域で形成された地層には,様々な生痕化石が存在する.それらを解析することで,多くの古生態・古環境情報を得ることができ,沿岸域生態系の変遷・発達史を読み取ることが可能となる.しかしそのためには,まず対応する現世生痕についての知見を得る必要がある.このことから,沿岸域の現世生痕についての研究がなされてきた.しかしながら,先行研究のほとんどは内湾の干潟環境において行われたものであり,またそれらの対象領域は汀線付近に限定されていた。このことから,沿岸域における現世生痕の調査は十分とはいえず,生痕化石に適用できる知見が不足していた.今年度,太平洋に面した海浜である茨城県鹿島灘の全域70kmにわたって船上観測および潜水調査を実施し,水深1020mにアナジャコ類の巣穴が大量に存在することを明らかにした.さらに,砂浜海岸と干潟のアナジャコ類の生態を比較をおこなった.その結果,両者は同一種であり,また類似した生態(食性や繁殖期)および巣穴内共生者を持つことが判明しつつある.このことは,外洋に面した砂浜海岸の沖合においても,干潟同様の豊かな海底生態系が存在していることを意味する本研究により得られた知見は,沖合の細砂底における堆積学・生態学分野そして古生物学分野に対して,多大なインパクトを与えることが期待される.研究の目的:沿岸域(潮間帯陸棚)は地圏,水圏,大気圏が交わる場所であり,地球表層で最も多様な環境を有する領域である.沿岸域で形成された地層には,様々な生痕化石が存在する.それらを解析することで,多くの古生態・古環境情報を得ることができ,沿岸域生態系の変遷・発達史を読み取ることが可能となる.しかしそのためには,まず対応する現世生痕についての知見を得る必要がある.このことから,沿岸域の現世生痕についての研究がなされてきた.しかしながら,先行研究のほとんどは内湾の干潟環境において行われたものであり,またそれらの対象領域は汀線付近に限定されていた.このことから,沿岸域における現世生痕の調査は十分とはいえず,生痕化石に適用できる知見が不足していた.研究成果:前々年度,前年度に引き続き,当該年度においても茨城県神栖市に位置する波崎海岸において,前浜内側陸棚上部にかけての堆積環境で,底生生物相・生痕相・堆積相に関しての調査を実施した.

それにより,海浜特性を考慮した生痕相モデルを構築した.すなわち,底生生物と生痕の同時観察,および安定同位体比解析から,(1)どのような生痕がどこに分布しているか,(2)その生痕の形成者は何か,(3)その生痕はどのような生態学的意義があるのか,(4)その生痕は地層中のどの生痕化石に対応しどのような古生態学的意義があるのか,を解明した.以上の結果により,地層中の生痕化石相を古生態・古環境学的に解釈する上で重要な知見を得ることができた.本研究で得られた結果をまとめ,外洋からの波浪の影響を強く受ける逸散型海浜の生痕相分布モデルについてを,国内外の学会で発表を行った.交付申請書に記載した研究の目的:「本研究の目的は,沿岸域,中でも砂浜海岸で形成された地層中に見られる生痕化石についての古生態・古環境学的情報を得ることである.」研究達成度:上記の目的を達成するために現世海浜での調査を完了し,生痕化石に適用できる知見を得た.野外調査で得たサンプルの分析・解析を実施し,研究結果を総括する.そして,古生物学・堆積学・生態学の関連雑誌に研究成果を順次投稿していく.
イネ小胞子に潜在する個体分化能と倍数化能を活用した育種基盤の新構築

植物の未成熟葯を培養すると、小胞子からカルスや胚が形成され植物個体が得られる。葯培養は広い植物種で普及した技術であるが、なぜ小胞子が高い個体分化能を保持するのか、未だに明らかではない。本申請に先駆けて、アジアイネとアフリカイネのF1雑種の葯培養から倍数性を獲得し稔性を有する複数の個体を得た。本研究では、イネの小胞子がもつ個体分化能を理解し、小胞子から直接植物体を得る培養法を開発する。倍数体がなぜ発生し、アジアイネとアフリカイネの雑種不稔を回避できたのかを探る。得られた知見をもとに、新しい育種素材として異なるゲノムを持つ4倍体を小胞子培養によって作出し、育種基盤の構築をめざす。葯培養は種々の作物で利用される半数体育種技術であるが、なぜ小胞子が高い個体分化能を保持するのかは明らかではない。本研究では、イネの小胞子がもつ優れた個体分化能をエピゲノムの観点から理解し、小胞子から直接植物体を得る培養法を開発する。また、アジアイネとアフリカイネの不稔のF1雑種の葯培養で得た稔性を有する個体が、倍数性を獲得した経緯を探る。個体再生の効率に品種・系統間差異が大きいため、葯培養は半数体育種の汎用技術とは未だなっていない。小胞子の個体分化能の分子レベルでの理解は、再生効率の系統間差異の原因解明につながり、低効率系統の効率向上をもたらすことが期待される。また、本研究により、単離した小胞子から直接植物体を得る培養法の効率化が図られることが期待される。
母体ストレスと胎児側因子の交互作用による脳発達障害モデルの確立

母体低栄養モデル(摂餌-30%)を妊娠10.5-18.5日に行い、胎生期低栄養マウスモデルを作成した。GAD67ヘテロマウスへの低栄養負荷ではACTH、CORT値はヘテロ仔でのみ有意に上昇し、胎仔では母体と逆のGAD67-低栄養相互作用が認められた。塩分調節因子のWNK3ノックアウトモデル静止膜電位が深く、膜抵抗減少、発火閾値上昇、発火間膜電位上昇により、連続発火など神経興奮性が低下していた。行動異常とパルブアルブミン陽性GABA細胞発生異常を呈するGAD67ヘテロ欠損と母体拘束ストレス負荷の交互作用モデルでは神経細胞の発生と移動に関連する遺伝子のメチル化が亢進していた。1.母体低栄養モデルの作製:母獣の摂餌制限(-30%)を妊娠10.5-18.5日に行い、胎生期低栄養マウスモデルを作成した。胎生18.5日でも野生型でも出生体重が有意に低下した。2.母体高食塩食モデルの作製:母獣の摂餌中塩分(0.9% wt/wt)を妊娠10.5-19.5日に4% wt/wtに増加させたモデルを作製した。さらにWNK3ノックアウトモデルを用いて母体塩分負荷モデルを作製した。3. GAD67ヘテロ欠損と母体拘束ストレス負荷の交互作用:母体拘束ストレス(妊娠15日目から1回45分の拘束ストレスと光ストレスを毎日3回3日間)はGABA合成酵素のGAD67ヘテロ欠損(GAD67+/GFP)仔の内側線条体原基での(生後にparvalbumin陽性となる)GABA細胞の発生を選択的に障害した。そこで、母体拘束ストレスを野生型母マウスに与え、同腹のGAD67+/+仔でBrdUによる細胞発生のアッセイを行ったところ、発生障害は見られなかった。従って、母体ストレス(環境要因)とGAD67ヘテロ欠損(遺伝要因)が重複して初めて、内側線条体原基でのGABA細胞の発生が阻害されることが証明された。1.GAD67-GFP knock-inマウスへの低栄養負荷:母獣の摂餌制限(-30%)を妊娠10.5ー18.5日に行った胎生期低栄養モデルで、GAD67遺伝子型-低栄養の相互作用を野生型母体とGAD67ヘテロ母体の低栄養モデル各々に関して、野生型胎仔とGAD67ヘテロ胎仔を用い母仔双方で検討した。母体血中コルチコステロン(CORT)濃度は、栄養制限によって野生型でのみ有意に上昇し、GABAがCRH分泌増加に働く可能性が示唆された。母体CORTの影響を排するため、ヘテロ母体由来の胎仔で検討した結果、ACTH、CORT値はヘテロ仔でのみ有意に上昇し、胎仔では母体と逆のGAD67-低栄養相互作用が認められた。2. Wnk3 KOマウスの大脳皮質神経細胞の電気生理学的解析:WNK-SPAK/OSR1-NKCC1/KCC2のリン酸化カスケードはClホメオスタシスを変化させGABA作動性抑制のトーンを変化させるので、Wnk3 KOマウスの神経細胞の全般的な電気生理学的特性の変化を解析した。静止膜電位が深く、膜抵抗減少、発火閾値上昇、発火間膜電位上昇により、連続発火など神経興奮性が低下していた。また、抑制性シナプス活動が興奮性シナプス活動に比べ上昇していた。3.食餌塩分量の変化にWNK-SPAK/OSR1-NKCC1/KCC2のリン酸化カスケードが素早く応答する。視床下部はKCC2が最も早く胎生期から発現するので、WNK1-SPAK/OSR1が下流のKCC2のリン酸化を介して、どのようにCl-ホメオスタシスを制御し、高食塩食や低栄養時のGABA作用を変化させ交互作用や神経発達に影響するのかを、KCC2のリン酸化部位特異的に変異を導入し持続的にKCC2のリン酸化状態を疑似できる変異マウスをKahle (Yale大)との共同研究で入手し検討した結果、神経機能発達に異常が見られた。本年度の成果として、学会での公開もできている。27年度計画としては、大部分を実行でき、ほぼ予定通りの目的を達成できた。加えて、塩分負荷モデルより直接的なリン酸化部位変異KCC2発現マウスの系を立ち上げることが出来たので、残りの計画を28年度年度で達成するめどができた。1.GAD67ヘテロ欠損母体ストレスモデル胎仔脳の網羅的DNAメチル化解析:RRBS法でのパイロットスタディの結果、GABA細胞の発生・移動・シナプス可塑性に関連する遺伝子のメチル化が亢進していた。本年度は再現性を確認する実験を再度行った。メチル化が亢進していた遺伝子の発現が実際に変化しているか確認するための実験をさらに行い、マイクロアレイ法により解析した。GABA作動性微小シナプス後電流をパッチクランプで解析したところ頻度が有意に減少していた。2.KCC2のWNK-SPAK-OSR1によるリン酸化部位に変異を導入したマウス胎仔脳の神経細胞の発生・移動・神経機能の解析:EdUによる細胞分裂アッセイで導入当日に発生した細胞(EdU陽性)の発生/移動を解析した。海馬、中隔核、大脳皮質、視床下部で細胞分布・数に異常が見られたが、2光子顕微鏡で観察したシナプススパイン形成は正常であった。

3.タウリントランスポーターKOマウスの大脳皮質神経細胞の電気生理学的解析:タウリンはWNK-SPAK/OSR1-NKCC/KCCのリン酸化カスケードを活性化する。タウリンは低栄養で減少し、塩分や細胞容積の調節と関係する。タウリントランスポーターKOで細胞内タウリンが減少した状態での大脳皮質神経細胞ではGABA作動性微小シナプス後電流の振幅と頻度が減少していたが、受容体の感度は正常であった。また、網羅的リン酸化アッセイで解析したところpSTAT3とAKTに大きなリン酸化の変化があった。4.前年度に見出した所見の検討:母体ではGABAがCRH分泌増加に働く可能性が示唆されたので、正中隆起へのCRHニューロン軸索終末へのGABAの投射が弓状核から出ていることを発見した。2光子顕微鏡によるCaイメージングの結果GABA作用が興奮性と判断した。しかし、胎仔ではこの系の発達がまだないことも示唆された。母体低栄養モデル(摂餌-30%)を妊娠10.5-18.5日に行い、胎生期低栄養マウスモデルを作成した。GAD67ヘテロマウスへの低栄養負荷ではACTH、CORT値はヘテロ仔でのみ有意に上昇し、胎仔では母体と逆のGAD67-低栄養相互作用が認められた。塩分調節因子のWNK3ノックアウトモデル静止膜電位が深く、膜抵抗減少、発火閾値上昇、発火間膜電位上昇により、連続発火など神経興奮性が低下していた。行動異常とパルブアルブミン陽性GABA細胞発生異常を呈するGAD67ヘテロ欠損と母体拘束ストレス負荷の交互作用モデルでは神経細胞の発生と移動に関連する遺伝子のメチル化が亢進していた。WNK3ーKOマウスの繁殖に苦労したが、WNK3はX染色体随伴遺伝子なので、WNK3-KOの雄とWNK3-hetroの雌の交配により、雄の出生仔はWNK3ーKOかWNK3-wildの何れかになるので、今後はlittermateの雄を実験対象として用いる。本年度の成果として、学会や論文としての公開もできている。計画全体としては、26年度に予定の大部分を実行でき、特に計画の大きな変更もなく、ほぼ予定通りの目的を達成できた。したがって、残りの実験を27年度と28年度年度で達成するめどができた。1.GAD67ヘテロ欠損母体ストレスモデル胎仔脳の網羅的DNAメチル化解析:当該モデルではパルブアルブミン陽性GABA細胞が特異的に減少する。RRBS法でのパイロットスタディの結果、GABA細胞の発生・移動・シナプス可塑性に関連する、Dlx2, Fktn, Nkx6-2、Cdk5r2, Pax6などの遺伝子のメチル化が亢進していた。これらの蛋白質の発現変化を確認するとともに、GABA機能関連分子の機能的変化を電気生理学的に解析する。2.KCC2のWNK-SPAK-OSR1によるリン酸化部位に変異を導入したマウス胎仔脳の神経細胞の発生・移動・神経機能の解析:EdUによる細胞分裂アッセイで導入当日に発生した細胞(EdU陽性)を同定し、脳室帯での皮質板細胞、内側線条体原基でのGABA細胞、第三脳室周辺でのCRH細胞などの発生と移動を解析する。また、2光子顕微鏡でシナプス形態を観察する。低栄養でもタウリンが減少し、また塩分や細胞容積の調節と関係する。タウリントランスポーターKOマウスにおける細胞内タウリンが減少した状態での神経発達を、大脳皮質神経細胞の膜特性およびシナプス特性で解析する。
口腔マイコプラズマ細胞のプロテインA様活性に関する研究

ヒト血清160検体をMS抗原で吸収することによって、M.salivariumならびにM.oraleに対するIgG抗体価は、それぞれ、84.24(±8.01)%そして31.14(±17.31)%減少した。2.MS細胞はタンパク質分解酵素あるいは過ヨウ酸ナトリウムで処理されるとヘモリジン感作赤血球に対する凝集活性を失う。3.MS細胞はルテニュウム・レッドで染まる物質で包まれており、この物質はタンパク質分解酵素による処理によって除去される。4.MS細胞には糖タンパク質が存在する。MS細胞タンパク質をSDSーPAGEで分画し、PAS染色すると、すくなくとも13本のバンドが染まり、これらのバンドと移動度の一致するバンドが銀染色でも染まった。精製された細胞膜でも同様の所見が得られた。5.MS細胞の糖タンパク質はIgGと結合する。SDSーPAGEで分画したMS細胞タンパク質をニトロセルロ-ス膜に転写し、ウサギ血清、ウサギIgG、ヒト血清あるいはヒトIgGを作用させ、最後にprotein AーgoldでIgGを発色させることによって、IgGと結合する糖タンパク質のバンドが検出された。31Kと60Kのバンドが主要なバンドであった。結論:口腔マイコプラスマの一つであるMycoplasmasalivariumにプロテインA様活性を担った糖タンパク質の存在することが明らかにされた。SF細胞(タンパク量にして3mg)を0.1%のtrypsinあるいはpronase溶液1mlに浄遊させ37°Cで1時処理したところ、感作ヒツジ赤血球に対する凝集活性は消失した。SF細胞(タンパク量にして15mg)を0.5%過ヨ-素酸ナトリウム液3mlに浄遊させ、5°Cで1時間処理したところ、trypsinあるいはpronaseで処理した場合と同様の成績が得られた。以上の成績からM.salivariumにはprotein A様活性があり、その活性をになっている物質は細胞表層に存在する糖タンパク質であると結論された。この糖タンパク質を精製するために、M.salivarium ATCC23064の細胞を現在収集している。この細胞の収量は細菌のそれの50分の1以下である。2.MS細胞はルテニュウム・レッドで染まる物質で包まれており、この物質はタンパク質分解酵素による処理によって除去される。MS細胞の最外層(幅:約11nm)はルテニュウム・レッドで濃く染まり、その表層には細かい繊毛様の構造物が認められた。しかしながら、MS細胞をプロネ-スで処理することによって、ルテニュウム・レッドで染まる層は完全に消失した。3.MS細胞には糖タンパク質が存在する。4.MS細胞の糖タンパク質はIgGと結合する。31Kと60Kのバンドが主要なバンドで、これらのバンドを形成しているタンパク質の中にprotein A様活性を担った糖タンパク質が含まれているものと推測される。
心臓の発生分化における分子メカニズムの解明と心筋細胞分化誘導への応用

私たちは、心筋特異的転写因子CSXと相互作用するLIMタンパクCalを同定し、CalがCSXと協調的に標的遺伝子の転写を活性化していることを報告した。今回は、CSXの転写活性に対するCalの作用機構について検討を行った。まず、CalとGal4 DNA結合ドメインとの融合タンパクはGal4結合配列を含むルシフェラーゼのレポーター遺伝子の転写活性を有意に増強させることから、Cal自身に転写活性化ドメインが存在することが示された。次に、Calには核外移行シグナル(nuclear export signal:NES)が存在し、NESによる核外移行を阻害するleptomycin Bで処理すると、Calの細胞内局在が細胞質から核内に移行すること、さらにロイシンリッチな配列を欠損したCal変異体が核内に局在することを見いだした。さらに、カルシウムイオノフォアA23187の投与10分後にCalの局在が細胞質から核内に変化することから、通常CalはNESにより細胞質に局在しているが、細胞内カルシウム濃度を上昇させるような刺激によって核内へとその局在を変えることが示唆された。また、NESを欠損し核内に局在するCal変異体(Cal-ΔNES)は、野生型のCalよりもCSXによる心房性ナトリウム利尿ペプチド遺伝子プロモーター活性をさらに増強させ、Cal-ΔNESを恒常的に発現するP19Cl6細胞は通常のP19CL6細胞よりも高率に心筋細胞に分化し、GATA-4やsarcoplasmic reticulum Calcium-ATPase 2、connexin 43、Calreticulin、ANPなどの遺伝子発現も亢進していた。以上より、Calは細胞内局在を変化させ、核内ではCSXと結合してCSXの転写活性を制御することで、心筋細胞分化を調節していると考えられる。我々は、心筋細胞分化誘導のin vitroでの機構を検討するために、GFP transgenic mouseより単離した骨格筋細胞を新生仔ラット心筋細胞と共培養し、骨格筋細胞に心筋蛋白が発現するかについて免疫細胞染色法により検討した。その結果、GFP陽性骨格筋由来細胞の一部はcTnT、ANP、GATA4、CSX/Nkx2.5を発現し、また、周囲の心筋細胞との細胞間接着部位にcadherinとconnexin43を発現して電気的機械的接着部位を形成することが明らかになった。また、骨格筋の幹細胞が多く含まれる分画として、FACSにより得られたSP (side population)分画とを骨格筋初代培養上清中の遅延接着細胞群を、それぞれ心筋細胞と共培養した。その結果、骨格筋のSP分画細胞にはMP (main population)分画に比較して、心筋細胞に分化するGFP陽性骨格筋由来細胞が多く存在した。また、骨格筋細胞培養上清中の遅延接着細胞には、筋芽細胞を主体とする早期接着細胞と比較して、心筋細胞との共培養によりcTnTを発現するGFP陽性骨格筋由来細胞が多く存在した。このことは、骨格筋内に含まれる幹細胞が心筋細胞に分化していることを示唆する。次に、このような骨格筋由来細胞の心筋細胞への分化に関与する因子を明らかにするために以下の検討を行った。GFP transgenic mouseの骨格筋由来細胞を新生仔ラット心筋細胞と、(1)通常の培養液、(2)nifedipine 5μM加培養液、(3)nifedipine 5μM加培養液内で周期的受動的伸展刺激を加えて共培養した。その結果、心筋細胞と共培養時にcTnTを発現するGFP陽性骨格筋由来細胞数はnifedipine5μM添加により対照に比較して減少したが、周期的受動的伸展刺激を加えることにより、nifedipineによる抑制効果は消失した。したがって、骨格筋細胞が心筋細胞との共培養において心筋細胞に分化するためには、Ca^<2+>シグナルと機械的刺激が重要であると考えられた。
プラズマ対向材料表面における水素同位体の挙動

プラズマ対向材料における水素同位体の透過は,表面での解離と再結合反応及びバルブでの拡散と捕獲に影響される。理論的な検討により,任意の材料と実験条件下における水素透過フラックスが予測できた。しかし,水素の再結合係数は,材料だけでなく表面状態(表面欠陥の密度及び不純物原子の吸着量等)に依存しているため,材料表面における水素同位体の挙動を明らかにしなければならない。そこで,ベリリウムの表面に銅を蒸着し,表面被覆による水素透過フラックスの変化を求め,さらにそれを基準にして国際熱核融合実験炉(ITER)ダイバータにおけるトリチウムの透過及びインベントリ-を検討することにした。ITERの工学設計によると,Be/CuまたはW/Cuがダイバータの有力候補になっている。Be/Cuオプションの場合,ダイバータでのトリチウムの透過とインベントリ-は,それぞれ0.81mg/sと6.0kgであった。また,プラズマ側での水素の再結合係数をBe表面のデータの10^<-5>10^<10>の倍率で変化させてトリチウムの透過及びインベントリ-の変化を検討した。さらに,エロ-ジョンの影響も調べた。エロ-ジョンの進行とともにトリチウム透過は増加するが,インベントリ-は減少する。一方,W/Cuオプションの場合では,ダイバータでのトリチウムの透過とインベントリ-は,それぞれ00071mg/sと6.7gであった。また,エロ-ジョンの進行とともにトリチウム透過は増加するが,インベントリ-ははじめは徐々に減少しながら後で急に増加する。
腸内細菌叢のプロバイオティクス化を目指したファージによる生体内遺伝子導入の試み

本研究では、腸内細菌叢を遺伝子工学的にプロバイオティクス化するための基礎技術として、バクテリオファージを利用した腸内細菌叢への生体内遺伝子導入法の端緒を開くことを目的とした。申請者は今回、宿主域が比較的広いファージ種を用いた腸内細菌叢への遺伝子導入に関する方法論について、種々の条件検討を行った。その結果、大腸菌の野生株やラット腸由来大腸菌群の一部に対して、ファージによる遺伝子導入が可能であることを見出した。ただしその効率や他細菌種への導入などの点で、生体内遺伝子導入の実用的実施には、今後のさらなる検討が必要と考えられた。近年、人体生理に対して常在の腸内細菌叢が予想外の諸影響を及ぼす事実が明らかとなってきた。これは常在の腸内細菌の機能を制御することで、人体の多面的な健康増進が可能なことを示している。そこで本研究では、腸内細菌叢を遺伝子工学的にプロバイオティクス化(善玉菌化)するための基礎技術として、バクテリオファージを利用した腸内細菌叢への生体内遺伝子導入法の確立を試みる。本研究では、導入したい遺伝子/プラスミドを有するファージを腸内に送り込み、腸内細菌への遺伝子導入を行う方法論を確立することを目標とする。本年度は、年度計画に基づき、ファージを用いた腸内細菌への遺伝子導入実験と条件検討を行った。P1ファージを用いた大腸菌へのプラスミド導入に関して検討を行い、これまでの前段階実験で成功していた研究室株に加え、天然株(野生株)へのプラスミド導入も可能であることを明らかにした。特に通常のベクター部分を有するプラスミドのみでなく、蛍光タンパク質GFP遺伝子を含むプラスミドの全長の導入を確認し、GFPタンパク質の発光も確認できた。このことから、ある一定の大きさの外来遺伝子の導入と機能的発現が可能であることを示した。腸内サンプルを用いた遺伝子導入実験は現在遂行中である。またP1以外のファージとして、天然株大腸菌由来の新規なP22/λ類縁ファージを新たに単離・同定した。現在このファージの環境耐性を検証すると共に、このファージを用いたプラスミド導入を条件検討中である。本研究では、導入したい遺伝子/プラスミドを有するファージを経口投与で腸内に送り込み、腸内細菌への遺伝子導入を行う方法論を確立することを目標とする。研究は、三段階で行うことを予定しており、平成24年度計画として「腸内細菌叢への遺伝子導入に用いるファージと遺伝マーカーの比較・選択」を目指した。まずは予備実験で複数種の大腸菌に対して特定プラスミドの導入効率が高かったP1ファージの一種を用いて、大腸菌研究室株・野生株や他のグラム陰性菌へのプラスミド導入に関して検討を行った。その結果、殆どの大腸菌研究室株に関しては、高い効率でプラスミド導入が確認されたが、大腸菌野生株各種や他のグラム陰性細菌Pseudomonasなどについては、必ずしも安定したプラスミド導入が見られなかった。そこでより導入効率の高いファージを見出すため、大腸菌野生株の標準コレクションであるECOR72株からファージ産生株を選択し、感染力が高い天然ファージの単離を試みた。その結果、λ類縁ファージの一種を単離/同定することができ、これの遺伝子導入への利用に関して予備実験を遂行中である。遺伝マーカーに関しては、種々の抗生物質耐性遺伝子やGFP遺伝子の利用について検討を行った。その結果、腸内細菌中には多くの抗生物質耐性遺伝子保有細菌が存在するため、複数の抗生物質耐性遺伝子の利用や、さらにGFP遺伝子も併用することが、遺伝子導入の検出に有用であることが示唆された。近年、人体生理に対して、常在の腸内細菌叢が予想外の諸影響を及ぼす事実が明らかとなってきた。そこで、本研究では、腸内細菌叢を遺伝子工学的にプロバイオティクス化(善玉菌化)するための基礎技術として、バクテリオファージを利用した腸内細菌叢への生体内遺伝子導入法の確立を試みる。本年度は、昨年度の進捗を受けて「ファージの利用による腸内細菌叢への遺伝子導入実験と条件検討」を目指した。

まず、昨年度までに複数種の大腸菌に対してプラスミドの導入効率が高かったP1ファージを用いて、ラット盲腸などから採取した大腸菌群へのプラスミド導入に関して検討を行った。その結果、低効率であったものの、一部でプラスミド導入が確認された。次いで、ラットから摘出した盲腸・大腸・小腸の内容物を用いて、上記ファージの適用実験を検討した。またそれら摘出腸へのファージの直接注入実験を試みた。結果としては、これら実験では系の複雑性が高かったため、種々の条件検討は行ったものの、想定の方法では導入細胞の検出ができなかった。これら実験は、昨年度、大腸菌野生株の標準コレクションであるECOR72株から単離したλ類縁ファージを用いても行ったが、同様の結果であった。このような結果の理由については、腸内細菌叢が膨大な数の細菌で構成されていること、また腸内細菌中には多数の抗生物質耐性遺伝子保有細菌が存在すること、などが一因と考えられた。微生物学ファージによるプラスミド導入効率を上げるための条件検討に予想外の手間が掛かっており、当初計画に比べ、やや遅れを生じている。当初計画時に適用範囲が広いファージ候補と見ていたP1ファージの一種について、種々の遺伝子導入実験の結果、利用は可能だが適用範囲が予想よりもやや狭いことが示唆された。そのため、遺伝子導入細菌の適用範囲をさらに広げるため、現在、他のファージの利用を模索している。現在使用中のファージおよびその他のファージを利用して、より遺伝子導入効率が高く、導入範囲も広い方法の確立を目指す。またそれらファージ単独または混合物を用いて、現在のin vitro実験からよりin vivoに近い実験を試みる予定である。用いるファージの種類を増やすことで、より遺伝子導入範囲の広い方法の確立を目指す。またそれらファージ単独または混合物を用いて、マウスやラットの腸内細菌サンプルに対する遺伝子導入実験を行う。この実験はまずin vitroで準備実験を行った後、半in vivo, in vivo実験へと進める予定である。計画の中で当初予想と異なる展開があったため。当初予想と異なる展開部分を含めた計画推進の効率化のため、次年度に予算を集中的に使用する。平成24年度研究では、新規単離ファージ分析の必要性が生じたため、当初予定のオートクレーブ等に代えて、当初予定には入れていなかったファージDNA分析を行うための電気泳動装置類を購入した。また消耗品も当初予定より少なめの購入となった。平成25年度では、新たな実験に取り組むため、物品費は前年度より多めに使用することが予想される。このため繰越金に加え、25年度予定の金額を要する。
共同学習空間としてのミュージアムのエスノメソドロジー的・CSCL的研究

1ミュージアムにおける共同学習研究の一環として、公立はこだて未来大学において、ミュージアムにおける解説者と聴衆の関係についての研究を行った。具体的には、公立はこだて未来大学で展示物を陳列し、そこで解説者がことばと身体的行為を通してどのように解説行為を行うかをビデオ撮影し、エスノメソドロジー的手法で分析した。その結果、解説者のことばの発話と関連した、頭の動き(および視線の動き)の重要性がわかった。2 1の分析に基づき、解説を行う解説ロボットの開発を行った。特に、人間が発話のどこで聴衆に視線を向けるかの分析に基づき、解説の途中で視線を聴衆に向けるよう設計した。3そのロボットが、ミュージアムにおける共同学習においてどのような効果をもつかを、さらにまた人間の解説者と同様の親しみやすさを持つかどうかを、科学技術館において、検証するための実験を行った。その結果、視線を解説の途中に適切に聴衆に向けるほうが、聴衆にとって好ましいという結果がでた。さらにまた、エスノメソドロジーの手法で、ビデオデータを分析した結果、人間の解説者に向けた行動と同様の行動を聴衆がロボットに向けて行っていることがわかった。その結果は、コンピュータ科学の国際学会であるECSCW2005にポスターで発表した。また、電子情報通信学会の研究会で発表した。4ミュージアムの共同学習研究の一環として、どのように解説行動が行われているかを、科学技術館におけるメディアアートの展覧会において、ビデオ撮影し分析を行った。今年度は、(1)地域におけるミュージアムの基本的調査と、地域との連携に基づく特別展の試み(2)ミュージアムにおける鑑賞実験、インストラクション実験に基づく遠隔操作型の鑑賞支援ロボットの制作(3)フィールドワーク調査のための準備を行った。以下、それぞれ具体的に示す。(1)においては、まず地域におけるミュージアムについての基本的調査を行った。そのうえで地域施設としてのミュージアムを十分に発揮するためには、地域社会・環境とどのようなインターフェースを築くべきかを検討し、地域社会・環境との連携実態を明らかにするとともに、現況における課題を整理した。そのための具体的な検討を行なうために、さいたま市立浦和博物館と共同で特別展「サッカーdeきずな」を開催した(平成16年10月2日11月28日)。現在、その評価を手がけているところである。(2)においてはミュージアムにおける鑑賞行為やインストラクションの基本的問題を明らかにするための鑑賞実験を行った。さらにその鑑賞実験に基づいて、遠隔操作型の鑑賞支援ロボットのデザインのための基本的要件を明らかにした。そして、その要件に基づきGestureMan3という鑑賞支援のための遠隔操作ロボットを制作した。来年度は、GestureMan3を用いた鑑賞支援および共同学習の実験を科学技術館で行う予定である。(3)フィールドワークにおいては、ロサンジェルスの全米日系ミュージアム及びゲッティーセンターの予備調査を行った。また、科学技術館で、ミュージアムにおける鑑賞行為と共同学習のフィールドワークを行うための準備を行った。これらフィールドワークに基づく研究については、来年度本格的に行う予定である。
河口砂州の発達と変形に関する研究

河口においてはしばしば河川流砂と海岸漂砂の相互作用により、河口砂州が発達・変形し、それが河川の洪水疎通能に大きく影響するため、河口砂州のこうした時間変形過程を適切に記述・予測するモデルが要求される。モデル構築のためには、河川流砂、海岸漂砂の運動機構を適確に把握する必要があるが、一般的にみて、比較的一次元的、定常的な河川流砂に比べ、海岸漂砂の簡便な表示が難しいし、その機構も必ずしも明解には明らかにされていない。そこで、まず、河口地形に最も貢献すると考えられる岸沖方向漂砂が実験的に調べられ、その向きはアーセル数によって支配されるものの量としては、シールズ数を用いて、ほぼ河川流砂と相似な関数形、すなわち、限界シールズ数を用い、シールズ数が充分大きい時はほぼその3/2乗で流砂量が増加する形で表現されることが明らかにされた。しかしながら波浪特性とシールズ数は、河川流量とシールズ数のように単純には結びつけられず、そのため、底面流速を媒介に、リニアフィルター法による関連づけの適用性を明らかにした。上述のような基礎的知見をべースに、次に、河口砂州の変形特性を従来の現地河川実測資料をもとに調べ、とくに河口水深の大きい、そして導流堤のような付属構造物の無い場合では、側岸侵食型で現象が進行することを示し、これを簡略モデル化した一次元解析の基礎式を誘導した。河川、海岸流砂量関数の簡単な関数形を用い、基礎式が非線型ながら解析解の容易に得られる形まで近似表現した結果、いわゆる緩和過程を表わす式を得、一定の外力のもとでは、平衡河口断面が主要なパラメータとして集約できることを示した。これにもとづき、従来の現地河川実測資料より、平衡河口断面についての検討を行い、逆にそれを用いて河口砂州の変形モデルのパラメータを推測することができた。河口に発達した砂州は,中小洪水時の河川流の疎通能力を低下させ,時として洪水を引き起こす原因となる.通常,河口の発達・減衰を支配する主要因としては,河川流による流出土砂と海波による岸沖漂砂および沿岸漂砂の3つが挙げられる.沿岸漂砂は汀線に対し波が斜めに入射する際に発生し,その場所的変化率が負になる所に砂州が成長するが,ここでは,沿岸漂砂の影響は除外し,岸沖漂砂のみを対象とした基礎的研究を行った.すなわち,河川流により流下し,河口部に堆積した土砂は,どの様な場合に侵食され,またどの様な場合にさらに堆積が増大するのかを,一様勾配移動床斜面に波を当てて実験的に考察した.その結果,砕波帯内から河口部に至る地形が,侵食型になるか堆積型になるかという区分は,従来,砂村の提示した沖波波形勾配と底勾配および相対粒径を用いた区分に良く一致し,さらに,侵食型,堆積型および中間型のいずるの海岸の場合も,無次元漂砂量φとシールズ数4との関係は,従来渡辺らが提示した式に近いφ=8(4ー0.06)4^<1/2>のような関係式が得られた.次に,このような岸沖漂砂の移動機構を考察するための基礎的研究として,電磁流速計により,1/30および1/10勾配の固定床斜面上の多数の点で水粒子速度を測定した.得られた流速値は,水面変動からリニアフィルター法で計算した値と比較した結果,海底勾配の比較的緩やかな場合に生じる崩れ波および巻き波では,砕波点のみならず砕波後も,水面変動からの計算値が妥当な値を与えることが判明した.

このことは,岸沖漂砂の移動を予測する上で,水面変動が非常に重要な要素であり,かつまた,砕波後の水粒子速度をある程度予測することができることを確認したものとして重要である.反面,急勾配斜面上で発生する砕け寄せ波では,戻り流れと反射波の影響により,実測値と計算値は一致しないことが分った.河口砂州の発達・変形は河川・海岸の砂の移動機構の複合した相互作用の結果であるという観点から、これまでの両者の移動機構に関する研究成果をレビューし、とくに河口周辺での非定常、非一様な流砂過程という問題にスポットを当てた。流砂、漂砂の力学をベースにした移動機構の研究成果を充分にらみながらも、両者が適度な斉合性を保って記述できる解析モデルを得ることが、ここでは最重要と考え、また現象自体顕著な非平衡性を有するものと判断されたことから、非平衡流砂過程を表現する論理を詳細に検討した。その結果、緩和過程表示、あるいはインパルス応答を用いた畳み込み積分モデルの一搬性が指摘された。なお砂州の変形過程そのものも、数学的アナロジーでこの緩和過程モデルと同じ型式の得られることもわかった。上述の基礎的研究を踏え、河口砂州の発達・崩壊を含む変形過程のモデリングを行った。とくに河口部水深が充分にあるときの洪水時の河口砂州の変形は、主として側岸侵食に依っていることが、従来の現地観測例から指摘され、これを仮定することで簡単な微分方程式(Bernonlli型非線型微分方程式)を誘導した。非線型性を示すパラメータmにより、ゆっくりした発達、急激な崩壊といった砂州の変形過程の特徴が良く表現された。また、外力を一定とすることから得られる平衡開口幅について、解析モデルから得られるその表示と、現地の観測データを比較し、解析モデル中のパラメータや、解析モデルを得る際の仮定についての検討を行った。
糖部エポキシ構造を利用する分岐糖ヌクレオシドの合成

不飽和糖ヌクレオシドをジメチルジオキシランのアセトン溶液で酸化することにより、不安定で今迄に例のない1',2'-および4',5'-エポキシドを調製することが可能になった。これらのエポキシドを有機金属試薬との反応で開裂し、糖部1'位および4'位に炭素鎖が分岐したヌクレオシドを合成した。合成した新規な分岐糖ヌクレオシドの化学変換を行ない、得られた誘導体の抗ウイルス活性を調べた結果、4'位にエチニル基を有するチミンヌクレオシドに強い抗HIV活性が認められた。本化合物は、現在エイズ患者の治療に臨床の場で使用されているスタブジンよりも強い活性を有し、細胞毒性は極めて低い。HIV逆転写酵素の阻害剤として機能するヌクレオシド系抗HIV薬には、副作用の1つとして末梢神経障害が知られている。この副作用はミトコンドリアDNA合成の抑制によるものと考えられているが、本化合物はミトコンドリアDNA合成に対してほとんど影響を与えないことが明らかになった。上述したエポキシドを経由する合成方法は、ジメチルジオキシランの高濃度アセトンの調製ができないために、本化学物を大量に合成する目的には適していない。安全性試験や将来の臨床試験を視野に入れて、本化合物の大量合成が可能な新たな合成方法を開発すべく研究を展開した。その結果、4',5'-不飽和チミンヌクレオシドに四安息香酸鉛を反応させると4'位にベンゾイルオキシ基が導入されることを見い出した。このベンゾイルオキシ基を脱離基とし、有機アルミニウム試薬を用いる求核置換反応によって4'位にエチニル基を導入する方法を試みた。現段階では、エチニル体の収率は60%程度に留まっているが、4'位における立体選択性を完全に制御することに成功している。またこの反応の機構に関する研究から、糖部4'位がまずクロル化されることが引き続くエチニル基の導入に必須であることも明らかになった。今後は他の工程も含めた収率の向上をめざして、反応条件の検討を進める予定である。本化合物の薬理学的な研究は、共同研究者であるチェン教授(米国、エール大学)によって実施される予定になっている。この研究に必要なラベル化合物を合成するために、その前駆体も合成した。ここでは詳細には触れないが、本化合物の構造活性相関に関する知見を得る目的で、糖部分に炭素環や4'-チオ糖を有する4'-エチニル誘導体の合成も行った。不飽和糖ヌクレオシドをジメチルジオキシランのアセトン溶液で酸化し、これまで単離されたことのない糖部分1',2'位および4',5'位のエポキシドを調製した。これらのエポキシドはシリカゲルカラムクロマトによって精製することはできないが、NMR等による構造確認が可能であった。有機金属試剤を用いてこれらのエポキシドを開環することにより、各々1'位および4'位に炭素側鎖が分岐したヌクレオシド誘導体を合成することができた。

有機アルミニウム試剤との反応において、立体化学を支配する要因について詳細な検討を進めた。1',2'-エポキシドの開環においては、1'位に導入される炭素官能基がエポキシドに配位した試剤のリガンドに由来するのか塩基部のカルボニル基に配位したリガンドに由来するのかが問題となる。塩基部N3位にベンジルオキシメチル基などの保護基を導入すると、2位カルボニル基への試剤の配位が阻害され、1'位α側からの反応が有利となり望みの生成物が選択的に得られた。一方チミジンから調製した4',5'-エポキシドと有機アルミニウム試剤との反応では、3'位水酸基の立体配置が影響を与え、4'位β側からの試剤の攻撃が有利になる。スレオ体を用いて望みの立体異性体を選択的に合成できた。この研究の応用として、抗HV薬として臨床で用いられているd4Tの4'位炭素置換体を種々合成した。これらの中で4'位にエチニル基を有する化合物にd4Tよりも強い抗HIV活性が認められた。本化合物は、細胞毒性やDNA-polymerase-γに対する阻害もd4Tよりも低く注目に値する。不飽和糖ヌクレオシドをジメチルジオキシランのアセトン溶液で酸化することにより、不安定で今迄に例のない1',2'-および4',5'-エポキシドを調製することが可能になった。これらのエポキシドを有機金属試薬との反応で開裂し、糖部1'位および4'位に炭素鎖が分岐したヌクレオシドを合成した。合成した新規な分岐糖ヌクレオシドの化学変換を行ない、得られた誘導体の抗ウイルス活性を調べた結果、4'位にエチニル基を有するチミンヌクレオシドに強い抗HIV活性が認められた。本化合物は、現在エイズ患者の治療に臨床の場で使用されているスタブジンよりも強い活性を有し、細胞毒性は極めて低い。HIV逆転写酵素の阻害剤として機能するヌクレオシド系抗HIV薬には、副作用の1つとして末梢神経障害が知られている。この副作用はミトコンドリアDNA合成の抑制によるものと考えられているが、本化合物はミトコンドリアDNA合成に対してほとんど影響を与えないことが明らかになった。上述したエポキシドを経由する合成方法は、ジメチルジオキシランの高濃度アセトンの調製ができないために、本化学物を大量に合成する目的には適していない。安全性試験や将来の臨床試験を視野に入れて、本化合物の大量合成が可能な新たな合成方法を開発すべく研究を展開した。その結果、4',5'-不飽和チミンヌクレオシドに四安息香酸鉛を反応させると4'位にベンゾイルオキシ基が導入されることを見い出した。このベンゾイルオキシ基を脱離基とし、有機アルミニウム試薬を用いる求核置換反応によって4'位にエチニル基を導入する方法を試みた。現段階では、エチニル体の収率は60%程度に留まっているが、4'位における立体選択性を完全に制御することに成功している。またこの反応の機構に関する研究から、糖部4'位がまずクロル化されることが引き続くエチニル基の導入に必須であることも明らかになった。今後は他の工程も含めた収率の向上をめざして、反応条件の検討を進める予定である。本化合物の薬理学的な研究は、共同研究者であるチェン教授(米国、エール大学)によって実施される予定になっている。この研究に必要なラベル化合物を合成するために、その前駆体も合成した。ここでは詳細には触れないが、本化合物の構造活性相関に関する知見を得る目的で、糖部分に炭素環や4'-チオ糖を有する4'-エチニル誘導体の合成も行った。