hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
異種移植に関する基礎的研究

ドナー細胞作成を試みているが、今年度中のクローン株化を得ていない。3)ミニブタ飼育員へのPERVの感染の有無を調べるために、ジャパンファームクラウン研究所(JFCI)従業員の末梢血からRNAおよびDNAを抽出し、PERV-gag、pol、env-A,B,C特異的PCRプライマーを用いてgenomic DNA PCRおよびRT-PCR法でPERVのゲノムDNAおよびRNAを調べたところ、Genomic-PCRおよびRT-PCRではPERV-gag、pol、envは検出されず、PERVの感染は認めなかった。この結果は、クラウン系ミニブタのPERVは、通常の飼育環境ではヒトへの感染性が低いことを示唆している。4)前年度までの研究から、異種移植の慢性拒絶反応に関与していると推定されるHMGB-1の放出は細胞の接着に依存し、HMGB-1のup-regulationとreleaseのtriggerはヒトT細胞の細胞膜上にあることを見出した。5)異種移植拒絶反応のin vitroモデルとしてブタ内皮細胞を傷害するヒト免疫系細胞の測定系の確立は重要な課題である。今年度は、ブタ内皮細胞を傷害するヒト細胞傷害性CD8細胞の機能を制御するヒト制御性樹状細胞、制御性T細胞の実験系を作成した。6)PERVを産生するブタ腎細胞に種々の薬剤を作用させ,PREVの産生抑制効果を調べたところ,フルオロキノリン誘導体のK-37に,PERV産生を抑制する効果があることを見出した。1)体細胞クローン胚由来の胚盤胞および胎仔にブタα-1,3-galactosyltransferase(αGalT)遺伝子のKOベクターの導入が確認でき、この体細胞クローン胎仔から増殖能の良好な遺伝子改変リクローン初代培養細胞系(ヘテロKO細胞)を樹立した。2)ヘテロKO細胞中にはLOHによりホモ(double)KO細胞が若干含まれ、α-Gal epitopeを認識するBS-I-B4lectin陰性として識別出来る。α-Gal epitopeを発現する細胞株をsaporin毒素標識のBS-I-B4 lectinで処理すると生存した98%の細胞はBS-I-B4lectin陰性となり、ホモKO細胞を濃縮するのに有効であることが判明した。3)クラウン系ミニブタPBMCとHEK293細胞の混合培養試験で、HEK293細胞でPERV ProvirusDNAがPERV-Pol領域プライマーを用いたgenomic DNA-PCRで確認されたが、RT-PCR検索ではPERV-Pol RNAは検出されなかった。4)ヒトT細胞・ブタ血管内皮細胞共培養下におけるHMGB1の放出をミサトールが抑制した。ミサトールは、anti-oxidant responsive element(ARE)配列を認識する転写因子、Nrf2を活性化し、抗酸化作用を有するヘムオキシゲナーゼー1(HO-1)の発現を惹起させる。すなわち、ヒトT細胞・ブタ血管皮細胞共培養下におけるHMGB1の放出は、抗酸化作用により抑制されることが示唆された。
動物モデルを用いた頭頸部癌に対する化学予防の研究

頭頸部癌患者の20ー30%に上部消化管、上気道の重複癌を認め、日常臨床の現場では大きな問題となっている。重複癌が多い理由として喫煙をはじめとした発がん要因が広範囲に上気道粘膜に暴露される(フィールド癌化)ことが挙げられる。本研究は、レチノイン酸(ビタミンA誘導体)により上記のフィールド癌化が予防(化学予防)できないかを、動物(ハムスター)発癌モデルを用いて解析した。13-cis-レチノイン酸にて一定の癌発生の抑制効果を認めたが統計学的に有意な結果には至らなかった。個体数をふやして研究は継続の予定である。頭頸部がん治療の現場では重複癌の発生が大きな問題となっている。これは、喫煙、過剰飲酒を主とした発癌要因に繰り返し、広範囲に上気道粘膜が暴露される(フィールド癌化:field cancerization)ことにより上気道粘膜上皮の多段階発癌が進行してゆくことによる。癌の化学予防(chemoprevention)とは薬剤やビタミン剤を積極的に内服することにより癌のプログレッションを抑制、再分化に向かわせ、癌(重複癌)の発症を予防することである。本研究は頭頸部領域の多段階発癌を薬剤にて化学予防できないかを検討することを目的としている。昨年度、シリアンハムスターの頬粘膜(頬袋)に7,12-dimethylbenz[a]anthracene(DMBA)(2回/週X20週)を塗布することで癌のprogressionハムスター口腔(Hamster buccal pouch)モデルの作成に成功した。このモデルハムスターにレチノイン酸(13ーcis RA, ATRA)を投与することによる発がん抑制実験を継続中である。個体によっては造腫瘍性が抑制されているものも認めるが、現時点では統計学的に有意な腫瘍抑制効果は認めていない。問題点としては、腫瘍ができるまでに時間(9-12週)を要すること、レチノイン酸の濃度(やや低濃度過ぎたか)、造腫瘍性の個体差などなどが挙げられる。昨年同様継続して腫瘍作成→予防治療を行い、肉眼病理、組織病理学的な抑制効果が確認でき次第、分子生物学的解析を行う予定である。頭頸部領域において臨床的に問題となる重複癌(二次癌)の発生を予防する方法の探索目的に本研究を行った。具体的には上気道粘膜に対するField Cancerization(がんのプログレッション)を薬剤やビタミン投与にて予防、停止できるかどうかを、ハムスターの頬粘膜モデルを用いて解析してきた。2年目までにシリアンハムスターの頬粘膜(頬袋)に発癌物質である7-12-dimethylbenz anthracene(DMBA)を塗布することでハムスターの口腔内に扁平上皮癌を作製し、肉眼的、病理学的に確認できた。この発癌モデルハムスターにレチノイン酸(13-cisRA, ATRA)を投与することによりDMBAによる発癌のプログレッションが抑制されるかどうかの確認を実験個体数を増やして行った。コントロール(媒体のみ)に比し13-cis RA投与により発癌に対する一定の抑制効果を認めたものの、有意差は得ることができなかった(個体によっては造腫瘍性が抑制されるレベル、個体数が少なく統計解析が難しい)。ATRAでは発癌の抑制効果は認められなかった。投与したレチノイン酸の口腔内での濃度、体内動態など不明な点が多く、実際化学予防剤として有効であったかわからない。個体数を増やしてゆくことで今後造腫瘍性を有意に抑制する結果が得られる可能性もあり、研究は継続させてゆく予定である。癌の化学予防(chemoprevention)とは薬剤やビタミン剤を積極的に内服することにより癌のプログレッションを抑制、再分化に向かわせ、癌の発症を予防することである。頭頸部扁平上皮癌は、連続した管腔臓器内の粘膜上皮が喫煙、過剰飲酒を主とした発癌要因に繰り返し、広範囲に暴露される(フィールド癌化:field cancerization)ことにより遺伝子変異の蓄積が起こることで、正常上皮→前癌病変→上皮内癌→浸潤癌へと進行(イニシエーション、プロモーション、プログレッション)してゆくという概念(多段階発癌)が確立している。この過程を停止、逆行させることが癌の化学予防の目的である。本研究は頭頸部癌の化学予防に対するレチノイン酸、カテキン(EGCG)の効果を動物モデル(ハムスター口腔モデル)を用いて解析することが目的である。シリアンハムスターの頬粘膜(頬袋)に7,12-dimethylbenz[a]anthracene(DMBA)(2回/週X20週)を塗布することで癌のprogressionハムスター口腔(Hamster buccal pouch)モデルの作成に成功した。発癌は肉眼的、病理学的に確認できているが、前癌病変(異型性)はまだ確認できていない。DMBAの曝露期間を細かく調整する必要がある。

このモデルハムスターにレチノイン酸(13ーcis RA, ATRA)を投与することによる発がん抑制実験を現在行っており、肉眼病理、組織病理学的な抑制効果が確認でき次第、分子生物学的解析を行う予定である。動物モデルの作成ならびに検証に時間を要するため、予定よりも研究の進行は遅れている。今後は動物個体数を増やして実験を進めてゆく必要がある。ハムスターを用いた頭頸部がんのモデルの確立には成功しているが、この発癌モデルに対するレチノイン酸の有用性はまだ確認できていない。腫瘍ができるまでに9-12週要することから、レチノイン酸の有効性を検証するのに時間を要している。さらにレチノイン酸の濃度やハムスターの造腫瘍性の個体差などが要因と考察している。当該年度はハムスターを用いた動物モデルの確立を行った。シリアンハムスターの頬粘膜(頬袋)に7,12-dimethylbenz[a]anthracene(DMBA)(2回/週X20週)を塗布することで癌のprogressionハムスター口腔(Hamster buccal pouch)モデルの作成に成功した。発癌は肉眼的、病理学的に確認できているが、前癌病変(異型性)はまだ確認できていない。DMBAの曝露期間を細かく調整する必要があると思われる。上記モデルハムスターにレチノイン酸(13ーcis RA, ATRA)を投与することによる発がん抑制実験は進行中である。動物モデルの作成/確認に時間を要したためDMBA発癌に対するレチノイン酸の抑制効果を、分子生物学的指標を用いて検討するには至っていない。ハムスターにおける癌の作成に時間を要するために、動物個体数を増やして研究を進めてゆく必要がある。また、レチノイン酸の濃度を変化させることで腫瘍抑制効果を証明し、その後分子生物学的なマーカーの検索へとつなげてゆきたい。前年度に引き続きハムスター口腔モデルを用いてレチノイン酸による化学予防モデルの作成を中心に行う。さらにカテキンであるEGCGの効果の検証も行う。動物モデルの作成ならびに検証に時間を要するため、動物個体数を増やして実験を進めてゆく予定である。肉眼病理、組織病理学的な抑制効果が確認でき次第、予定していた分子生物学的指標を用いた抑制効果検討:EGFR, p53, cyclinD1の発現の検討を免疫組織化学的な手法を用いて行う。前年度同様に動物モデルの作成に必要なハムスター、試薬の購入が中心となる。病理組織解析のための外注検査、成果発表のための旅費にも研究費を充てる予定である。動物モデル作成に必要なハムスター、試薬の購入が中心となる。病理組織解析のための作業(包埋、パラフィンブロック作製)は引き続き外注にて行う。成果発表のための旅費にも研究費を充てる予定である。
フランス絶対王政期における官職売買制度の展開とその再検討

本研究は、フランス絶対王政期において広範に展開し、社会システムの根幹に根を下ろしていた官職売買制度の歴史的な展開過程をあらためて包括的に再検討することを目的とした。当時の国王役人のほとんどは、その地位を金銭で購った者たちで占められていたことはよく知られている。従来の官職売買制度の研究では、官職保有者と任免可能で王権に忠実な直轄官僚とを二項対立的な関係として捉え、そして前者の後進性、家産官僚的性格のみがとりわけ強調される傾向にある。しかし本研究でえられた知見によれば、官職売買制度は、ブルジョワジーら社会的上昇を目指す階層にとって重要な足場として大きな社会的意義を有したのであり、一見無駄と思えるシステムのうちに社会の必要に応え、その根幹を支える十分な機能性・有効性を帯びているものであった。本研究では当時の王権の権威と権力の顕現した場であり、「模範的中央」と呼ぶべき存在であるフランス宮廷に焦点を絞って集中的に分析を行った。国王の宮廷の構造を明らかにし、とくに宮内府とその廷臣群についての分析を進め、彼らの果たした社会的象徴的な機能を析出した。その結果、彼らは宮廷内の煩瑣な儀礼体系に絡め取られた無力な存在として捉えるべきではなく、むしろ王の権威を具現する儀礼で積極的な役回りを果たしていることが明らかとなった。また宮廷(宮内府および近衛府)の組織の概要をできるかぎり詳細に捉えることに努力し、その大まかな全体像を描出した。また宮廷官僚とその他の国王役人(たとえば法服官僚)の相違についても考察した。その結果、宮廷貴族たちが占めるポストは、確かに売官職であったが、そうであるからといって必ずしも「前近代的」であるとはいえず、国王の身辺に「侍る」こと自体が重要な社会的意義を持つものであり、官職売買制度の積極的な(当時の社会の価値体系においてそれなりに有効かつ合理的な)側面を展望するものであることが判明した。今後はさらに廷臣たちのプロソポグラフィー的分析が必要であろう。本研究は、フランス近世(アンシァン・レジーム)期における官吏任用システムの形成と変容について、当時の社会全般に深く根を下ろしていた官職売買制度venalite desofficesの詳細かつ綜合的な再検討を通して分析し、その特質を明らかにすることを目的とする。これまでの官職売買制度の研究では、上記のような俯瞰図、とりわけ官職保有者と直轄官僚との二項対立的な関係が描かれているが、実際のところ具体的な官職売買の実際(どのように売買が成立していたのか、など)、そのポストを得た人々の集団的特質、といった具体的実相については充分に明らかにされているとはいえない。すなわち、官職保有者を前近代的な家産官僚として捉え、直轄官僚を近代的な官僚システムと見るだけでは、当時の複雑な統治システムのメカニズムは解明し尽くせないと考える。本年度の研究においては、従来の研究で主として取り上げられてきた、いわゆる統治エリートとしての法服貴族ではなく、王権の周囲に蝟集しながら実権を奪われ、無力化していくとされる宮廷貴族(帯剣貴族)に重点を置いた研究を試みた。彼らは宮廷内の煩瑣な儀礼体系に絡め取られ、王権の施す恩恵(年金や領地、ポストなど)をひたすら請い願うだけの無力な存在として見られてきたが、当時の王権が各種儀礼などの象徴的権威に大きく支えられている実態が明らかになるにつれ、こうした「お飾り」としての宮廷貴族が、実のところ統治構造においてより重要な役割を果たしていたのではないかと推測されるからである。

しかもこうした宮廷貴族たちが占めるポストは基本的に売官であった。彼ら宮廷貴族の実態を明らかにするため、今年度は、まず宮廷=宮内府の組織の概要を捉えることを試みた。その結果、大雑把であるが宮廷内の煩雑な構造(大きく括ると9部門にわかれ、それぞれに多くの官職保有者が配置されていた。また別途近衛府が存在する)が明らかとなった。本研究は、フランス近世(アンシァン・レジーム)期における官吏任用システムの形成と変容について、当時の社会全般に深く根を下ろしていた官職売買制度venalite desofficesの詳細かつ綜合的な再検討を通して分析し、その特質を明らかにすることを目的とする。これまでの官職売買制度の研究では、官職保有者と直轄官僚との二項対立的な関係が描かれているが、実際のところ売買の実態といった具体的様相については充分に明らかにされておらず、官職保有者を前近代的な家産官僚として捉え、直轄官僚を近代的な官僚システムと見るだけでは、当時の複雑な統治システムのメカニズムは解明し尽くせないと考える。本年度の研究においては、昨年から引き続いて、主たる分析対象とした国王宮廷の宮内府とその廷臣群についての考察を進めた。彼らは宮廷内の煩瑣な儀礼体系に絡め取られ、王権の施す恩恵を請い願うだけの無力な存在として見られてきたが、当時の王権が各種儀礼などの象徴的権威に大きく支えられている実態が明らかになるにつれ、こうした「お飾り」としての宮廷貴族が、実のところ統治構造においてより重要な役割を果たしていたのではないかと推測される。しかもこうした宮廷貴族たちが占めるポストは、原則として金銭によって購える売官職であった。彼ら宮廷貴族の実態を明らかにするため、今年度は、宮廷=宮内府および近衛府の組織の概要をできるだけ詳細に捉えることを試み、その組織の内実、配置された諸役人の役割などの解明に努めた。また、ブルボン朝期の国王宮廷が時代とともにどのような性質の変容をこうむるのかにつき、大まかな見取り図を示した。こうした研究成果を論文としてまとめ、『西洋史論叢』に掲載した。本研究は、フランス絶対王政期において広範に展開し社会システムの根幹に根を下ろしていた官職売買制度に関する包括的な再検討を行うことを目的とする。当時の国王役人のほとんどは、その地位を金銭で購った者たちで占められていた。これまでの官職売買制度の研究では、官職保有者と直轄官僚との二項対立的な関係、そして前者の後進性、家産官僚的性格のみがとりわけ強調される傾向にある。しかし実際のところ彼らの果たした政治的・社会的機能や売買の実態といった具体的様相については充分に明らかにされていない。本研究では当時の王権の権威と権力の顕現した場であり、「模範的中央」と呼ぶべき存在であるフランス宮廷に焦点を絞って集中的に分析を行った。最終年度の今年度は、国王宮廷の宮内府とその廷臣群についての考察をさらに進め、彼らの果たした機能(政治的というよりも、社会的象徴的な)を析出した。その結果、彼らは宮廷内の煩瑣な儀礼体系に絡め取られた無力な存在として捉えるべきではなく、むしろ王権が権威を体現する各種儀礼で積極的な役回りを果たしていることが明らかとなった。また宮廷(宮内府および近衛府)の組織の概要をできるかぎり詳細に捉えることに努力し、その大まかな全体像を描出することを行った。
宇宙背景放射の観測結果にもとづくインフレーション理論の検証

私は、「宇宙背景放射の観測結果にもとづくインフレーション理論の検証」という研究課題のもと、まずはインフレーション時において生成される非ガウス性が満たすべき、一般的な性質を導く事を目的とした。揺らぎの非ガウス性を考慮するためには、一般的に高次相関関数が使われる。インフレーションによって生成される揺らぎがもしも完全にガウシアン揺らぎを持つならば、その定義として3点相関関数は存在しないことになる。そのため、インフレーションによって生成される3点相関関数の大きさを予言し、それを観測と比較することによって、インフレーションの非ガウス性を検証することができる。次代のCMB衛生観測(PLANCK, etc)では、より高次の相関関数として4点相関関数も観測目標に入っており、より詳細にインフレーション起源の非ガウス性が検証されるだろうと考えられる。インフレーションシナリオが生成する揺らぎやその非ガウス性を計算する際に、δNformalismと呼ばれる手法が広く使われている。この手法は、インフレーション膨張によって、生成された揺らぎが無限に引き延ばされるという近似を使っており、揺らぎの非線形性を考慮するための非常に優れた手法である。我々はこのδNfbrmalismを使って、インフレーションによって予言される3点、4点相関関数を導き、その間に成り立つ一般的性質な関係式を考える。(抄録なし)私は、「宇宙背景放射の観測結果にもとづくインフレーション理論の検証」という研究課題のもと、まずはインフレーション時において生成される非ガウス性が満たすべき、一般的な性質を導く事を目的とした。次代のCMB衛生観測(PLANCK,etc.)では、より高次の相関関数として4点相関関数も観測目標に入っており、より詳細にインフレーション起源の非ガウス性が検証されるだろうと考えられる。インフレーションシナリオが生成する揺らぎやその非ガウス性を計算する際に、δN formalismと呼ばれる手法が広く使われている。我々はこのδN fbrmalismを使って、インフレーションによって予言される3点、4点相関関数を導き、その間に成り立つ一般的性質な関係式を考える。インフレーション理論が予言する、宇宙の揺らぎの非ガウス性について、当初の予想を超えた一般的な形を導くができ、学術論文として発表することが可能となったため。今年度の研究論文をもとに、さらなるインフレーション理論への理解を深め、理論のより詳細な研究を行う。(抄録なし)
植物におけるカドミウムの吸収・輸送動態におけるポジトロンイメージングを用いた研究

本研究課題の目的は、土壌および食糧の汚染が社会問題となっているカドミウムについて、カドミウムの経根吸収および植物体中の輸送の動態をポジトロン放出カドミウム核種を用いたリアルタイムイメージングによって明らかにすることである。それに対し、ポジトロン放出トレーサである^107Cdの沈殿法による精製方法、水耕液の自動維持システム、植物による吸水量と^107Cd吸収量をイメージングと同時にモニタリングするシステムを開発した。その結果、栄養成長期(播種後4週)および登熟期のイネを含む、植物体内におけるカドミウム輸送の挙動をポジトロンイメージングによって動画像として可視化することに世界で初めて成功するとともに、吸収などに関する定量的データを得た。これらを解析することにより、以下のことが明らかになった。栄養成長期のイネにおいては、水耕液からの吸収速度が0.05-100nmolL^<-1>の範囲で水耕液中のカドミウム濃度に比例すること、地上部では葉鞘基部へのカドミウムの集積が顕著に認められること、葉鞘基部には水耕液から吸収した量の約10%が約1時間程度のタイムラグを伴いつつ蓄積すること、根分け実験により、カドミウムを吸収させていない根(冠根)に対して葉鞘基部からカドミウムが移行すること。登熟期のイネにおいて、カドミウムが伸長茎(稈)、特に各節に強く集積すること、頴果にも集積が認められるものの葉鞘・葉身にはほとんど移行していないこと。以上の結果から、栄養成長期では葉鞘基部の節においてカドミウムが導管から篩管へ乗り換えていると考えるのが合理的であり、結論として、登熟期に根で吸収されたカドミウムは伸長茎の節において段階的に導管から篩管に乗り換えたのち、葉を経由することなく、玄米に移行・集積するという動態の全体像が推察された。カドミウムのxylem-to-phloemanferが節で行われることを実験的に示したのは本研究が初めてである。それに対し、17年度の成果としては、植物体内におけるカドミウム輸送の挙動を、ポジトロンイメージングによって動画像として可視化することに世界で初めて成功したことが挙げられる。この成果は平成18年3月に記者発表を行い、3月22日現在までに6紙に掲載されている。具体的な成果は以下の通りである。1.カドミウム吸収・輸送動態のポジトロンイメージングによる撮像ポジトロン放出トレーサである^<107>Cdの精製方法を確立した。また、水耕液の維持装置の開発も行い、これによりイメージング時間の制限が(原理的に)無くなった。これまでに最長で36時間のイメージングに成功している。供試植物として、イネ、アブラナ、ソルガムなどを用い、これらの植物体内のカドミウム移行の様子を動画像として得た。例えば播種後4週のイネにおいては、吸収開始後わずか1時間程度でカドミウムが茎(葉鞘基部)に到達し、その後も茎に蓄積していくことなどが明らかになった。

2.ポジトロンイメージングデータの数理的解析動画像データから、根、節、葉鞘などの各器官におけるトレーサ量の経時変化曲線(time-activity curve)を抽出した。一方、イメージングと同時並行して、植物による吸水量とトレーサ吸収量をモニタリングするシステムを開発した。これにより、time-activity curveと吸水曲線、トレーサ吸収曲線を合わせて解析することが可能になった。その結果、水耕液から茎(葉鞘基部)に到達するカドミウム量の割合を定量的に求めることなどに成功した。本研究課題の目的は、土壌および食糧の汚染が社会問題となっているカドミウムについて、カドミウムの経根吸収および植物体中の輸送の動態をポジトロン放出カドミウム核種を用いたリアルタイムイメージングによって明らかにすることである。それに対し、18年度の成果としては、幼個体だけではなく、現実的に重要な登熟期のイネに対するイメージングに初めて成功したこと、植物に与えるカドミウムの濃度を広い範囲で変化させてイネとソルガムについて定量的なデータを集めたことなどが挙げられる。具体的な成果は以下の通りである。1.カドミウム吸収・輸送動態のポジトロンイメージングによる撮像出穂後10日前後の登熟期のイネについて、根基部、地上部基部、節、穂のイメージングを行った。その結果、カドミウムが伸長茎(稈)、特に各節に強く集積すること、頴果にも集積が認められるものの葉鞘・葉身にはほとんど移行していないことが明らかになった。また、イネ幼個体を用いた根分け実験により、カドミウムを吸収させていない根に対する葉鞘基部からのカドミウムの分配が撮像された。これは葉鞘基部の節においてカドミウムが導管から篩管へ乗り換えることを示しているものと考えられる。このことと登熟期に伸長茎の節に強く集積したことを総合すると、カドミウムが玄米に移行・集積する際に伸長茎の節において段階的に導管から篩管に乗り換えるというメカニズムが推察される。2.ポジトロンイメージングデータの数理的解析根、節、葉鞘などの各器官におけるトレーサ量の経時変化曲線(time-activity curve)を解析した結果、登熟期のイネの節間において穂に向かうカドミウムの移行速度は約5cm/hであることが明らかになった。またソルガムではイネと異なり葉鞘基部から葉鞘・葉身へのカドミウムの再移行が認められ、カドミウムをより葉に集積しやすい性質が明らかになった。この性質はファイトレメディエーションへの利用に対する植物品種や環境条件の適性を計る具体的な指標となると考えられ、これに着目してさらに研究を進めることとした。それに対し、19年度の成果としては、カドミウムの吸収および輸送動態に関して、イネの品種間での比較を行ったこと、またアブラナにおいて根圏へのグルタチオン添加により、カドミウムの移行・蓄積に生じる変化を画像化することに成功したことなどが挙げられる。1.カドミウム吸収・輸送動態のイネ品種間差過去の研究によりカドミウムを地上部に高濃度で蓄積する品種として知られている「長香穀」と、対照として「日本晴」の2品種を用いて、根基部と地上部のイメージングを行った。その結果、経根吸収したカドミウムを地上部に輸送しやすい傾向が長香穀に認められた。これはカドミウムを玄米に輸送しにくい品種をポジトロンイメージングによって選抜するという戦略が現実的であることを示す結果である。2.根圏へのグルタチオン添加による方
失神とてんかんの鑑別診断を容易にする新しい失神診断ツールの作成

目的失神とてんかん患者の臨床的鑑別点を可能にする診断ツールの作成。方法てんかん患者320名、失神患者100名、健常対照群150名を対象。結果心原性失神患者に心電図上脚ブロック所見が多かった。てんかん患者は、自動症の存在、QT/QTc dispersionが有意に大きく、下方軸誘導(II, III, aVf誘導)での早期再分極異常(J点>0.1 mVおよび0.2mV)がてんかん患者で高頻度に出現。治療後には、上昇していたQT/QTc dispersionおよびJ波高は有意に減少。結論自動症、脚ブロック、QT/QTc dispersionとJ波の増大は、心原性失神とてんかんの鑑別に有用。本研究事業の最終目標である一過性意識消失発作の原因診断に有効な診断ツールを作成することが本研究の目的であるが、一過性意識消失発作に含まれる失神発作とてんかん発作の的症状の特徴を洗い出しを行うことが重要である。本年は、失神患者及びてんかん患者の臨床症状を整理することから開始した。当院でフォロー中のてんかん患者と失神患者を対象に発作時の臨床症状(発症年齢・性別・基礎疾患の有無・外傷の有無・前兆の有無・意識消失の持続時間・意識消失の回数と期間・発生場所(職場か自宅か)・目撃情報、等)と最終診断に至った期間・検査所見(脳波・臨床症状・Tilt検査・心電図検査、等)を比較検討することで、鑑別に有用であった検査項目を摘出し、失神の診断ツールを作成している。特に、一過性意識消失患者の初期評価において失神あるいはてんかん疑いと診断され、結果として誤診していた患者の原因精査は鑑別診断ツールの作成を行う上で極めて重要な情報をもたらす。これらの点を念頭に、現在診療録からそれぞれの症状の特徴の洗い出しを行っているところである。産業医科大学病院循環器内科及び神経内科において、これまで確定診断されたてんかん患者約50名と失神患者約56名を対象に、以下の調査を行っている。全ての患者の診療カルテから患者背景、病歴(過去の精査歴、併発疾患や基礎疾患の有無、初発症状から診断までの期間、発作回数、前兆の有無、外傷の有無、発作の発生時刻・発生場所、意識消失の持続時間、目撃情報の有無、けいれん発作の有無、自動症の有無、入院歴、脳波検査の有無と所見・回数、頭部CTやMRI検査施行の回数と所見、等)、発作から最終確定診断に至るまでの期間・検査数とその種類、検査の内容(Tilt検査や心臓電気生理検査、等)と結果、治療内容、初診時の受診診療科、等について詳細に解析し、最終的には失神とてんかん患者との違いを比較検討する。目的:一過性意識消失患者には、失神とてんかん発作が含まれるが、臨床症状の類似性からその臨床的鑑別には困難を伴う。本年度研究では、鑑別診断を容易にする診断ツールの作成のための臨床指標の抽出が目的であった。対象と方法:平成25年26年にかけて、産業医科大学病院で診断および治療、外来フォローされている患者の内、てんかん患者320名(平均31+/ー12歳)と性・年齢をマッチさせた健常者150名の心電図所見を比較し、てんかん患者では治療経過データを収集した。てんかん患者の確定診断は、主に脳波検査による診断であった。てんかん患者の内、側頭葉てんかんと診断された患者の意識消失時のけいれん発作の頻度、心電図所見(J波の有無、QT dispersion)を健常対照群と比較検討した。また、失神患者125名の内、失神時の心電図所見が得られている植込み型心電計(ILR)患者63名の臨床症状と発作時の心電図所見も併せて解析した。結果:1)てんかん患者では健常者に比し、心電図上有意にJ波の発生頻度が高く(26% vs. 13%, P<0.001)、特に下壁誘導で有意であったが(19% vs. 8%, P<0.001)、側壁誘導では有意差を認めなかった。てんかん患者のQT dispersionは対照群に比し有意に大きかった(P<0.001)。ILRを植込んだ意識消失患者において、意識消失時のけいれん発作の発生頻度は、心原性失神と反射性失神、てんかん患者の3群間で有意差を認めなかった。結論:意識消失時のけいれん発作の有無は、失神とてんかん発作の鑑別診断の指標とはならないことが判明した。また、てんかん患者では、健常者に比し有意に心電図異常(J波の出現やQT dispersionの増大)を認めることも明らかとなった。診断ツールの作成のための臨床指標の抽出が目的である。対象と方法:平成25年26年にかけて、産業医科大学病院で診断および治療、外来フォローされているてんかん患者320名(平均31+/ー12歳)と性・年齢をマッチさせた健常者150名の心電図所見を比較した。側頭用てんかん患者の意識消失時のけいれん発作の頻度、心電図所見(J波の有無、QT dispersion)を健常対照群と比較検討した。また、失神患者125名の内、失神時の心電図所見が得られている植込み型心電計(ILR)患者72名の臨床症状と発作時の心電図所見も併せて解析した。結果:

1)てんかん患者では、心電図上有意にJ波の発生頻度が高い(26% vs. 13%, P<0.001)。てんかん患者のQT dispersionは有意に大きかった(P<0.001)。ILRを植込んだ意識消失患者において、意識消失時のけいれん発作の発生頻度は、心原性失神と反射性失神、てんかん患者の3群間で有意差を認めなかった。結論:意識消失時のけいれん発作の有無は、失神とてんかん発作の鑑別診断の指標とはならないことが判明した。また、てんかん患者では、健常者に比し有意に心電図異常(J波の出現やQT dispersionの増大)を認めることも明らかとなった。意識消失で受診する患者において、けいれんの有無は失神と転換の鑑別に有用ではない。心電図以上の特徴も含めてかん別する必要がある。目的失神とてんかん患者の臨床的鑑別点を可能にする診断ツールの作成。方法てんかん患者320名、失神患者100名、健常対照群150名を対象。結果心原性失神患者に心電図上脚ブロック所見が多かった。てんかん患者は、自動症の存在、QT/QTc dispersionが有意に大きく、下方軸誘導(II, III, aVf誘導)での早期再分極異常(J点>0.1 mVおよび0.2mV)がてんかん患者で高頻度に出現。治療後には、上昇していたQT/QTc dispersionおよびJ波高は有意に減少。結論自動症、脚ブロック、QT/QTc dispersionとJ波の増大は、心原性失神とてんかんの鑑別に有用。本研究で最も重要な点は、てんかん患者の詳細な資料を以下に収集できるかであったが、平成25年度と26年度でてんかん患者320名の資料が収集できた。また、てんかん患者の心電図異常所見を明らかに出来たことは予想以上の成果であった。また、失神患者でもけいれん発作を有することが少なくなく、けいれん発作はてんかんと失神発作の鑑別の指標にはならないことも判明した。最終的に診断ツールを作成する上で、非常に大きな知見が得られていると考えている。循環器内科てんかん発作の場合に、出現する症状はてんかんの発生場所により大きく異なることが判明した。また失神でも心原性失神や血管迷走神経性失神でけいれん発作を認めることで鑑別のための指標とはならないことも判明した。前兆の有無、意識消失時間、自動症の有無等個々の症状で鑑別診断に有用な指標を検索する。また、てんかん患者での心電図異常所見は、今回の調査で始めて明らかになった。心電図異常とてんかんの関係を今後追求することでてんかん患者の突然死(Sudden Unexpected Death in Epilepsy: SUDEP)の原因解明になる可能性もあり、詳細に検討していく。失神患者とてんかん患者における症状の調査では、最終目標はそれぞれ200名の患者を対象とした解析を行う予定である。現在研究所年度で106名の患者データの収集を行っており、逐次対象患者を増やしている。平成26年度において目標症例数に達したいと考えている。予定されていたインド(ニューデリー)での国際学会(第7回アジア太平洋不整脈学会)に急遽出席不可能となり、使用予定であった旅費・宿泊費等をキャンセルし次年度に繰り越したため。平成26年度は、引き続き上記約400名の患者情報を調査解析する。得られた情報から最終診断に有用であった検査や臨床情報(病歴所見、等)と有用でなかった検査や臨床情報を抽出しランキング化し、てんかん発作に有用な診断ツールと失神に有用な診断ツールをそれぞれ作成する。
骨メタボリズム促進型インプラント治療の確立

本年度はインプラント支持能の検討を行った.昨年度に検証した同じ病態モデル動物(骨粗鬆症24羽および糖尿病24羽)をそれぞれ準備し,埋入条件は下記とした.1ポリリン酸結合人工骨+ PTH 2自家骨+PTH ⇒PTH投与群3ポリリン酸結合人工骨のみ4自家骨のみ⇒生食水投与群とした.インプラント体の埋入;両側大腿骨関節頭部に骨窩(直径6 mm,深さ5 mm)を形成後,骨窩中央部へインプラント体の埋入を行い周囲の欠損部へ各移植材をそれぞれ填入した.各病態モデル12羽にはPTHを4週間間歇投与し,他の12羽には生食水を同条件で投与した.埋入から毎週,共振周波分析装置によるインプラント安定係数を(ISQ値)を測定した.埋入8週後,インプラント体の除去トルクを測定(n=6),他方は骨組織ブロックを採取,非脱灰研磨標本を作製した(n=6).インプラント支持の評価;・インプラント支持能:除去トルク値およびISQ値の評価・組織学的評価:光学顕微鏡による観察・組織形態計測評価:骨・インプラント接触率の測定骨欠損部骨形成面積率の測定を行った.コントロールと比べ実験群1および2は除去トルク,ISQ値のいずれも高い値を示した.また組織形態計測の結果も同様に有意に高い値を示した.今年度は同様の骨質低下を惹起する骨粗鬆症モデルにおいて骨質改善効果の検討を行うため骨粗鬆症病態モデルにおける骨形成および骨強度促進効果の検討を行った.ニュージーランドホワイトラビット20羽に対して卵巣摘出手術を行った後,4週間副腎ステロイドホルモンを投与(1.0 mg/Kg/days)し骨粗鬆症モデルを作成した.うち10羽にPTHを4週間間歇投与し,他の10羽には生食水を同条件で投与した.動物の両側大腿骨に骨窩(直径:3 mm深さ:5 mm)を2カ所形成,各骨移植材を埋入する.埋入条件は下記に設定する(1条件:n=10).1ポリリン酸結合人工骨+ PTH 2自家骨+PTH ⇒PTH投与群3ポリリン酸結合人工骨のみ,4自家骨のみ⇒生食水投与群,にした.埋入から2および4週後,組織ブロックを採取,マイクロCT撮影後,脱灰標本を作製した.また,組織ブロックより移植材をトレフィンバーにて採取し,力学的試験の試料とした.評価項目として,組織学的評価:骨形成状態の様相を光学顕微鏡による観察,組織形態計測学的評価:新生骨骨面積の測定およびマイクロCTの画像解析による骨密度の測定,力学的評価:圧縮試験による骨強度の測定を行った.今年度の結果においては.骨粗鬆モデルに対して,PTHおよびポリリン酸吸着人工骨は有意な骨梁形成を構成する骨形成を認め,また圧縮試験による力学的評価においても同様の結果を示した.今年度予定とする動物実験の遂行およびデータ整理を行い,評価項目の検討が行えた.糖尿病モデルにおいて,骨代謝の低下した環境下での骨欠損部の骨形成および骨強度の検討を行った.●動物:雌性ニュージーランドホワイトラビット20羽(体重:3.0-3.5 kg)●骨移植材:ポリリン酸吸着人工骨(粒径0.5-1.0 mm)●薬剤:副甲状腺ホルモン(PTH:テリパラチド):アロキサン(アロキサン-水和物,和光純薬工業)・重度高血糖型糖尿病モデルを作成するため,動物20羽にアロキサンを静脈内へ投与し,その24時間後,皮下に5%グルコース溶液を1週間継続的投与し,高血糖I型糖尿病モデルを作成した.実験方法:動物の両側大腿骨に直径3 mm,深さ5 mmの骨窩を2カ所ずつ形成し,以下の各骨移植材を埋入した.1ポリリン酸結合人工骨+ PTH 2自家骨+PTH ⇒以上2群をPTH投与群,3ポリリン酸結合人工骨のみ4自家骨のみ⇒以上2群を生食水投与群(コントロール群)とした.埋入から2および4週後,組織ブロックを採取し,マイクロCT撮影後,脱灰標本を作製した.骨形成促進効果の評価;・組織学的評価:骨形成状態の様相を光学顕微鏡により観察した.・組織形態計測学的評価:新生骨骨面積の測定およびマイクロCTの画像解析による骨密度測定を行った.・力学的評価:圧縮試験による骨強度を測定した.以上の各評価項目において,コントロール群に対して.1ポリリン酸結合人工骨+ PTH 2自家骨+PTH ⇒PTH投与群が有意に高い値を示し,骨形成および骨強度の上昇を確認した.またISQによるインプラント支持も同様に上昇していた.年度別研究計画の進行に問題なく遂行できている.手技などの問題もみられておらず,来年度研究計画にすみやかに移行できる.本年度はインプラント支持能の検討を行った.昨年度に検証した同じ病態モデル動物(骨粗鬆症24羽および糖尿病24羽)をそれぞれ準備し,埋入条件は下記とした.1ポリリン酸結合人工骨+ PTH 2自家骨+PTH ⇒PTH投与群3ポリリン酸結合人工骨のみ4自家骨のみ⇒生食水投与群とした.インプラント体の埋入;両側大腿骨関節頭部に骨窩(直径6 mm,深さ5 mm)を形成後,骨窩中央部へインプラント体の埋入を行い周囲の欠損部へ各移植材をそれぞれ填入した.

各病態モデル12羽にはPTHを4週間間歇投与し,他の12羽には生食水を同条件で投与した.埋入から毎週,共振周波分析装置によるインプラント安定係数を(ISQ値)を測定した.埋入8週後,インプラント体の除去トルクを測定(n=6),他方は骨組織ブロックを採取,非脱灰研磨標本を作製した(n=6).インプラント支持の評価;・インプラント支持能:除去トルク値およびISQ値の評価・組織学的評価:光学顕微鏡による観察・組織形態計測評価:骨・インプラント接触率の測定骨欠損部骨形成面積率の測定を行った.コントロールと比べ実験群1および2は除去トルク,ISQ値のいずれも高い値を示した.また組織形態計測の結果も同様に有意に高い値を示した.H29年度は,骨粗鬆症モデルにおいて行った評価を同様の骨質低下を惹起する糖尿病モデルにて骨質改善の検討を行う予定である.骨メタボリズム促進部に埋入されたインプラント支持能の検討●動物:雌性ニュージーランドホワイトラビット48羽(体重:3.0-3.5 kg)●インプラント:チタン製機械研摩インプラント(直径:3 mm,長さ:10.0 mm)●骨移植材:ポリリン酸吸着人工骨(顆粒型,直径:0.5-1.0 mm)●薬剤:研究2と同じ病態モデル動物(骨粗鬆症24羽および糖尿病24羽)をそれぞれ準備する.埋入条件は下記とする.1ポリリン酸結合人工骨+ PTH 2自家骨+PTH ⇒PTH投与群3ポリリン酸結合人工骨のみ4自家骨のみ⇒生食水投与群.実験方法・インプラント体の埋入;両側大腿骨関節頭部に骨窩(直径6 mm,深さ5 mm)を形成後,骨窩中央部へインプラント体の埋入を行う.埋入されたインプラント周囲の欠損部へ各移植材をそれぞれ填入する.各病態モデル12羽にはPTHを4週間間歇投与し,他の12羽には生食水を同条件で投与する.埋入から毎週,共振周波分析装置によるインプラント安定係数を(ISQ値)を測定する.埋入8週後,インプラント体の除去トルクを測定(n=6),他方は骨組織ブロックを採取,非脱灰研磨標本を作製する(n=6).インプラント支持の評価;・インプラント支持能:除去トルク値およびISQ値の評価・組織学的評価:光学顕微鏡による観察・組織形態計測評価:骨・インプラント接触率の測定骨欠損部骨形成面積率の測定平成28,29,30年度の結果より,骨代謝活性低下病態モデルである骨粗鬆症および糖尿病におけるポリリン酸結合人工骨とPTH間歇投与による骨形成促進および骨質改善作用および骨再生部でのインプラントの支持能を検討し,有用性を明らかとする.これらより,「骨メタボリズム促進型インプラント治療の確立」を達成する.動物購入数および飼育期間が当初の予定より少ない状態で実験を遂行したため(期間中の骨折や死亡症例がなかったことによる),今年度,動物数を追加して,同期間での検討を予定している。
衛星データを用いた植生純一次生産量の推定モデルの研究

最終年度である本年度は、衛星データに対してNPP推定モデルを適用し、得られた結果と地上実測データとの比較・検証によるモデルの改良に重点を起き、研究を行った。紀伊半島の主要な樹林である杉・桧林において、試験領域を設定し、サンプリング木に対する胸高直径、樹高などの定期的な測定を行った結果をもとに、森林の年間純一次生産量を概算した。一方、同一領域のLandsat/ETM+データを用いて、前年度までに開発した推定モデルを適用し、年間純一次生産量を推定した。衛星による推定値と現地調査による概算値は、誤差の範囲内で一致し、モデルの妥当性が示された。これらの結果に関しては投稿論文として発表準備を現在進めている。また、全球を高頻度で観測するTerra/MODISやADEOS-II/GLIデータなどを利用し、植生純一次生産量の分布図を作成するために、これらの衛星データに対しても本推定モデルを適用し、検討を行った。紀伊半島周辺において上記森林における実測値、また、水田収穫量などの地上実測データと推定値を比較した結果、Landsat/ETM+と同様、誤差の範囲内で推定結果は実測値を再現することが明らかとなった。本研究により開発した推定モデルを用いることにより、多波長衛星データの情報を効率的に反映した植生指標VIPDをもとに、気温、日射量、日照時間などの気象データを併せて用いることにより、簡易に植生純一次生産量を推定するできることが示された。この手法を用いて、全球を高頻度で観測するTerra/MODISデータやADEOS-II/GLIデータから植生純一次生産量の時系列変化をモニタリングし、全球的な分布を把握することが可能であると期待される。本年度は、昨年度に引き続き、植生樹冠構造が植生全体の光学的特性や光合成に与える影響評価のため、室内における鉢植え植物の反射率、光合成測定を行った。植生樹冠内の放射伝達モデルや光合成モデルにより、前年度の実測データも含めて実測データの評価を行うと同時に、植物樹冠の反射率から樹冠全体の光合成を推定する手法を提案した。この結果を応用し、人工衛星データから得られる植生反射率より、純一次生産量推定を行う。この地上実測データにもとづいて構築した、多波長反射率データによる純一次生産量推定アルゴリズムに関しては学術論文としてまとめ、現在投稿中である。また、上記の地上実測によるモデルの提案と同時に、人工衛星データを用いて実際に純一次生産量推定を行い、実測データとの比較・検討を行った。モンゴルにおける地上実測データとLandsat/ETMデータから推定された純一次生産量との比較を行った結果、かなり整合性のよい結果が得られた。また、現在は、紀伊半島の杉林において、実測データを取得しつつあり、また、人工衛星データによる推定を進めている。今年度は、全球の多様な植生に対して人工衛星を用いた推定結果と実測データとの比較・検討を行い、推定モデルの精度を検討した上で、精度向上を図る予定である。最終的には、ADEOS-II/GLIデータを用いた全球純一次生産量分布図を作成する。
多置換芳香族有機金属化合物合成の新方法論開発

医薬品や天然物などの生理活性物質から、共役系高分子、液晶などの機能性有機材料に至るまであらゆる分子の機能発現に必須の構成単位である多置換芳香族化合物の新しい効率的合成法として、本研究ではメタル化を伴う不飽和化合物の環化付加反応の開発を目的とした。まず共役エンイン化合物のスタニル化を伴う環化二量化反応による多置換フェニルスズ化合物の合成を検討した。目的の反応を触媒するさまざまな遷移金属錯体、配位子の組み合わせを検討した結果、(η^3-allyl)PdCpとイミノホスフィン配位子から調製した触媒存在下、種々の共役エンインとヘキサブチルジスタノキサンを反応させると、エンインの環化二量化反応がスタニル化を伴って位置選択的に進行し、多置換フェニルスズ化合物が収率良く得られることを見つけた。反応はカルボニルやシアノ、シロキシ、アルケニル、アルキニル基などの官能基を有する共役エンインでも、これらを損ねることなく官能基選択的に進行することが分かった。1-ペンテン-3-インのスタニル化環化反応によって得られた2,5-ジメチル-3-トリブチルスタニルスチレンを鍵中間体として、海洋天然物Alcyopterocin Nの全合成に世界で初めて成功した。また置換基の電子的性質の異なる二種類のエンイン同士、あるいはエンインと共役ジインとの交差スタニル化環化付加反応が位置選択的に進行することも分かった。以上のように、本研究では共役エンインやジインとスタノキサンをパラジウム-イミノホスフィン触媒存在下反応させることにより、さまざまな置換基を有する多置換フェニルスズを位置選択的に簡便合成できることを明らかにした。医薬品や天然物などの生理活性物質から、共役系高分子、液晶などの機能性有機材料に至るまであらゆる分子の機能発現に必須の構成単位である多置換芳香族化合物の新しい効率的合成法として、本研究はメタル化を伴う不飽和化合物の環化反応の開発を目的とする。今年度は共役エンイン化合物のスタニル化を伴う環化二量化反応による多置換フェニルスズ化合物の合成を検討した。目的の反応を触媒するさまざまな遷移金属錯体、配位子の組み合わせを検討した結果、(η^3-allyl)PdCpとイミノホスフィン配位子から調製した触媒存在下、種々の共役エンインとヘキサブチルジスタノキサンを反応させるとエンインの環化二量化反応がスタニル化を伴って位置選択的に進行し、多置換フェニルスズ化合物が収率良く得られることを見つけた。反応はカルボニルやシロキシ基、アルケニル、アルキニル基などの官能基を有する共役エンインでも、これらを損ねることなく官能基選択的に進行することが分かった。1-ペンテン-3-インのスタニル化環化反応によって得られた2,5-ジメチル-3-トリブチルスタニルスチレンを鍵中間体として、海洋天然物Alcyopterocin Nの全合成も達成することができた。次年度以降は異なる二種類のエンイン同士、あるいはエンインと他の不飽和化合物とのスタニル化環化反応を検討し、本反応によって得られる多置換フェニルスズの置換パターンを拡充するとともに、スタニル基以外にボリル基やシリル基を導入する同様の反応を検討していく予定である。
マラリア原虫メロゾイトのロプトリー蛋白質の構造解析と赤血球結合能に関する研究

マラリア原虫の赤血球への侵入型であるメロゾイトの先端部にはロプトリー蛋白質複合体(RhopH複合体)が局在する。これまでの研究から、少なくとも熱帯熱マラリア原虫においては、RhopH複合体が赤血球膜に親和性を有することが示唆されている。しかし、RhopH1/2/3の分子がどの様に赤血球膜への接着に関与するかの分子機序は全く解明されていない。そこで、14年度はRhopH複合体のうち未だに構造が判明していないRhopH2の遺伝子解析を行った。ネズミマラリア原虫(Plasmodium yoelii)のPyRhopH2に対する単クローン抗体を用いてアフィニティ精製した蛋白質をSDS-PAGEにて分離し、リジルエンドペプチダーゼ処理した後に、部分アミノ酸配列の解析を行った。このアミノ酸配列を基にゲノムデータベースを検索し、またはアミノ酸配列を基に作成したPCRプライマーを用いてPyRhopH2遺伝子をクローニングした。この遺伝子のmRNAの塩基配列の解析を行った結果、PyRhopH2をコードする遺伝子は4.09kbで、10個のエクソンと9個のイントロンからなることが判明した。15年度はRhopH複合体の結合部位を同定する目的で、RhopH複合体をいくつかの部分に分けて組換え蛋白として発現し、赤血球膜への結合能の解析を行った。先ず、発現後の解析をスムーズに行うため発現ベクターを改良し、組み込みが簡便に出来るような系をインビトロジェン社のゲートウェイ・システムを用いて構築した。これらの系を用いて、熱帯熱マラリア原虫のRhopH複合体を構成する蛋白質のうち、結合部位である可能性が高いと思われるPfRhopH1を3つの部分に分け、増幅した遺伝子産物を発現ベクターに組み込んだ。現在、これらのベクターによる真核細胞系における発現を行っている。一方、各構成成分に特異的に反応する抗血清を作成し、蛍光抗体法及びウエスタンブロット法にて原虫蛋白との反応性を確認した。これらの抗血清を用いてマラリア原虫の蛋白質を直接免疫沈降することで、赤血球結合の特異性を検討している。マラリア原虫の赤血球への侵入型であるメロゾイトの先端部には、分子量155kDa,140kDa,110kDaの蛋白質からなるロプトリー蛋白質複合体(RhopH1/2/3)が局在する。本年度は、RhopH複合体のうち未だに構造が判明していないRhopH2の遺伝子解析を行った。ネズミマラリア原虫(Plasmodium yoelii)のPyRhopH2に対する単クローン抗体(#25)を用いてアフィニティ精製した蛋白質をSDS-PAGEにて分離し、リジルエンドペプチダーゼ処理した後に、部分アミノ酸配列の解析を行った。このアミノ酸配列を基にP.yoeliiゲノムショットガン・データベースを検索し、またはアミノ酸配列を基に作成したPCRプライマーを用いてPyRhopH2遺伝子をクローニングした。遺伝子クローニングには遺伝子増幅装置(マスターサイクラー)および多用途小型遠心器(CF16RX)を用いた。

次いで、この遺伝子のmRNAの塩基配列の解析を行った。その結果、PyRhopH2をコードする遺伝子は4.09kbで、10個のエクソンと9個のイントロンからなることが判明した。また、熱帯熱マラリア原虫のRhopH2は第9染色体上の単一の遺伝子によってコードされ、分裂体において転写されることが明らかになった。両種のRhopH2をコードする遺伝子から予想されるアミノ酸配列を比較すると、高い類似性を示し、42%のアミノ酸が一致し、73%が類似のアミノ酸であった。特に18個のシステインのうち17が一致していた。現在、熱帯熱マラリア原虫のRhopHの組換え蛋白発現用プラスミドベクターの構築を行っている。マラリア原虫の赤血球への侵入型であるメロゾイトの先端部にはロプトリー蛋白質複合体(RhopH複合体)が局在する。これまでの研究および我々の実験結果から、RhopH複合体が赤血球膜に親和性を有することが明らかとなっている。15年度はRhopH複合体のどの部分が結合部位であるかを同定する目的で、RhopH複合体をいくつかの部分に分けて組換え蛋白質として発現し、赤血球膜への結合能の解析を行った。まず、発現後の解析をスムーズに行うためmycタグおよび緑色蛍光蛋白との融合蛋白質として発現するように2種類の真核細胞発現用ベクター(pRE4およびpT8)を改良した。pRE4を元にしたベクターの方が緑色蛍光蛋白の発現がよく見られたため、以降はpRE4を用いた。最終的にできるプラスミドのサイズが非常に大きくなるため(10kb以上)、組み込みが簡便に出来るような系をインビトロジェン社のゲートウェイ・システムを用いて構築した。これらの系を用いて、熱帯熱マラリア原虫のRhopH複合体を構成する蛋白質のうち、他の実験結果から結合部位である可能性が高いと思われるPfRhopH1を3つの部分に分け、増幅した遺伝子産物を発現ベクターに組み込み、真核細胞系における発現を確認した。一方、RhopH複合体の各構成成分に特異的に反応する抗血清を、大腸菌で作製した組換え蛋白質もしくはDNA直接免疫法により作成した。蛍光抗体法及びウエスタンブロット法にてマラリア原虫蛋白質との反応性を確認した。真核細胞で発現させた組換え蛋白質を用いて赤血球結合能を検討することに加え、これらの抗血清を用いてRhopH複合体の赤血球結合を阻害することにより、RhopH複合体の赤血球結合部位を検討した。