hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
In vitro 類肝組織形成と生体内移植による第2肝臓作製のための基礎的研究

私は、成熟ラット肝臓より肝幹細胞の一種と考えられるsmall hepatocytesを分離培養し、成熟肝細胞に分化させ、肝非実質細胞との相互作用により3次元的な立体構造を構築することを見いだした。Small hepatocytesはコロニーを作るように増殖し、肝上皮様細胞や星細胞に囲まれるようになるとコロニーの上に盛り上がるように大型の細胞が増殖してくる。そのようなコロニーの縦断面を観察すると、small hepatocytesのコロニーの下に非実質細胞が潜り込んでいる。比較的扁平なsmall hepatocytesがその体積を増し立方形や直方形の細胞になっている。その大型の細胞ではミトコンドリア、ペルオキシゾーム、小胞体などの細胞内小器官が発達し、グリコーゲン顆粒を豊富に持っており明らかな成熟肝細胞であった。肝細胞と非実質細胞の間には細胞外基質が蓄積しており、基底膜様構造を形成しているものと考えられた。実際、その構造にはtypeI,typeIII,typeIV collagens,lamininの沈着が見られ、また培養細胞がそれらのmRNAを発現していること、培養液中にそれらを多量に分泌していることをNorthern blot法,Western blot法で確認した。また、small hepatocytesが3次元構造を作る時期に一致して、成熟肝細胞に発現するTryptophan 2.3-dioxygenaseやギャップ結合タンパク質であるConnexin32のmRNAが発現するようになる。又、urea cycleに関係する酵素のglutamine synthetaseやcarbamoylphosphate synthetase Iも盛り上がった細胞に強く発現するようになる。この盛り上がった細胞の上を非実質細胞が覆うと肝細胞は腺腔を作るようになった。Small hepatocytesは非実質細胞と細胞外基質の誘導により成熟化することがわかった。我々は、水に不溶性の紙であるKimwipe上にラット肝細胞を培養することを試みた。肝細胞はコラーゲンをコートしたセルロースの繊維上に接着し、増殖することができる(Mizuguchi etal:Artificial Organ,in press,2000)。L-15/2%DMSO(成熟肝細胞の増殖と分化の制御ができる実験系)で培養した時、数層に不規則に交差した繊維間にできたくぼみに接着した肝細胞は増殖し、くぼみを埋めるようになる。走査電子顕微鏡でそれらの細胞の表面を観察すると密生した微絨毛が覆っている。縦断面を光学顕微鏡や透過電子顕微鏡で形態学的に観察すると、23層の大型の背丈の高い細胞が存在し、とくに上層の細胞はよく分化した肝細胞であった。紙の上で培養された肝細胞のアルブミンなどの合成・分泌機能は培養皿上で培養した場合と比較して非常によく維持されていた。セルロースが培養液を吸収し細胞の接着面からも栄養分が補給されるため、培養液面から遠い細胞でも壊死することがないためと推測される。本研究からsmall hepatocytesと肝非実質細胞を組み合わせると類肝組織を培養皿上で作ることが可能であることがわかった。本研究助成期間内に生体内に移植する試みまでは到達できなかったが、その小組織ごと動物体内に移植し生着させ、生体の持つ機能を利用して第2肝臓を作ることを今後の研究目標としたい。また、個々の細胞単位では凍結保存が難しい肝細胞も、小肝組織ごと凍結保存することで長期間の保存に耐えられることが予備実験によりわかったので、培養皿上で増やした肝細胞を凍結保存し、必要なときに解凍し、移植できるようなシステムを作る研究を合わせて推進したい。
アンジオテンシンIIのRhoキナーゼ系を介した血管収縮・弛緩機構の解明

アンジオテンシンIIは、強力な血管収縮印紙であり高血圧発症に重要な役割を演じている。これまで、アンジオテンシンIIによる血管収縮は、アンジオテンシンIIが、アンジオテンシンタイプ1(AT1)受容体に結合し、細胞内のカルシウム濃度が上昇することによるミオシン軽鎖キナーゼの活性化が重要であるとされてきた。しかし、ミオシン軽鎖キナーゼの活性化に比べ、ミオシン軽鎖ホスファターゼの不活性化がより重要であることが明らかとなった。そして、このミオシン軽鎖ホスファターゼの不活性化は、AT1受容体、Src、EGF受容体、Erk1/2、Rho-キナーゼにより調節されていることも明らかとなった。アンジオテンシンII(Ang II)のAng IIタイプ1(AT1)受容体を介した血管収縮にはRho-キナーゼ系が重要であることが明らかとなってきた。そこで、Ang IIのAT1受容体を介した血管収縮へのRho-キナーゼの関与をRho-キナーゼ阻害剤を用いて検討したところ、Ang IIのAT1受容体を介した血管収縮はRho-キナーゼ系がより重要であることがを確認した。次に、Ang IIのAT1受容体を介した血管平滑筋細胞増殖には、ADAM17の活性化を介し、上皮成長因子(EGF)受容体によるシグナル伝達系へと伝えられえることから、Ang IIによる収縮にこの系が関与するかについて検討したところ、少なくとも正常動物におけるAng IIのAT1受容体を介した血管収縮はADAM/EGF系の関与は少ないかあるいはほとんど関与していないとの結果が得られた。次に、Ang IIのAT1受容体を介した血管収縮にMAPキナーゼ系が関与しているかを確認したところ、Ang IIによる収縮の一部にMAPキナーゼ系が関与していることを認めた。さらに、Rhoキナーゼの活性化はミオシン軽鎖ホスファターゼ(MLCP)の構成サブユニットであるMYPTのリン酸化を介したMLCP不活化によることを確認した。加えて、MAPキナーゼ系の活性化は、EGF受容体シグナルにより起こることから、Ang IIによりMAPキナーゼ系(Erk1/2、JNK、p38)の一因子、Erk1/2の収縮及びリン酸化にAng IIが関与しているかを検討したところ、Ang IIは、Erk1/2を活性化しており、この活性化がRhoキナーゼ系を介したMLCPの不活性化に関与していることを確認した。現在、この系の活性化機序が正常動物と高血圧動物の間において違いが認められているかにつき検討を加えている。高血圧モデル動物における解析に若干の遅れが認められるものの、研究はおおむね順調に進行している。アンジオテンシンII(Ang II)のアンジオテンシンタイプ1受容体(AT1受容体)刺激によるMAPキナーゼ経路を介した血管収縮機構について検討を行ってきた。Ang IIがAT1受容体に結合すると、Epidermal Growth Factor(EGF)トランスアクティベーション経路を介しMAPキナーゼ系を活性化することが知られている。我々は、血管においてチロシンホスファターゼを阻害することにより、EGF受容体活性化、Rhoキナーゼ系の活性化を介し血管が収縮することを明らかとした。そこで、Ang IIのAT1受容体刺激が、EGF経路、MAPキナーゼ経路、Rhoキナーゼ経路を介し、血管の収縮に寄与しているかの検討を行った。さらに、Ang IIによるRhoキナーゼの活性化には、JAKが関与するとの報告があることから、その可能性についても検討を加えた。リング標本にAng IIを添加すると収縮が認められ、その収縮は、EGF受容体自己リン酸化阻害剤、MAPKKであるMEK阻害剤、Erk1/2阻害剤により抑制された。加えて、Rhoキナーゼ阻害剤は、Ang IIによる収縮をほぼ完全に抑制した。この結果から、Ang IIによる血管収縮は、EGF経路、MAPキナーゼ経路、Rhoキナーゼが中心的な役割を演じているものと思われた。さらに、Ang IIにより、EGF受容体のリン酸化、Erk1/2のリン酸化、Rhoキナーゼの活性化が起こることをウエスタンブロッテイング法により確認した。しかしながら、Rhoキナーゼの活性化、それに伴う収縮にJAKの関与は認められなかった。次に、高血圧動物の血管リング標本について検討を行ったところ、正常血管同様、Ang IIによる血管収縮は、EGF経路、MAPキナーゼ経路、Rhoキナーゼ経路が関与していた。さらに、これら血管ではJAK、Srcの関与も認められた。これまで、血管を含め平滑筋の収縮はミオシン軽鎖キナーゼのミオシンリン酸化で説明が行われてきた。血管の収縮についてGタンパク共役型受容体のアゴニストを用い検討を行ったところ、同じGタンパク共役受容体であってもアゴニストにより、ミオシン軽鎖キナーゼを介して収縮させるもの、ミオシン軽鎖ホスファターゼの不活性化を介して血管を収縮させるものがあることがわかってきた。アンジオテンシンがどちらの系に依存しているかを慎重に検討した結果、研究の進捗に若干の遅れが生じた。アンジオテンシンによる血管収縮は、ミオシン軽鎖ホスファターゼの不活化によるが、アゴニストには、ミオシン軽鎖キナーゼの活性化を介し収縮を起こすものがある。このアゴニストを比較対象として研究を進めたため、研究の進行にやや遅れを来している。アンジオテンシンII (Ang II)を介した血管収縮にはRhoキナーゼを介したミオシン軽鎖ホスファターゼ(MLCP)の不活性化が重要な役割を演じている。

本研究室では、MLCPの不活性化にMitogen-activated Protein Kinase系が関与していることを報告している。しかしながら、正常動物の血管と高血圧動物の血管において、Ang IIによるMLCPの不活性化を介した血管収縮に違いがあるかは不明である。【実験】高血圧モデルラットの作製は、4週齢の雄性Wistarラット右腎動脈にクリップを装着し、腎動脈に狭窄部位を作製することで行った(2K1C処置)。血圧は、2K1C処置、あるいは、Sham処置7週後にtail-cuff法を用いて測定した。血管収縮実験は、ラットの胸部大動脈からリング標本を作製し、マグヌス装置に装着することで行った。【結果と考察】Extracellular signal-regulated kinase (Erk)阻害剤およびERK1/2 kinase (MEK)阻害剤を前処置しAng IIによる血管収縮を検討したところ、これら阻害剤によってAng IIによる血管収縮は抑制された。また、Rho-キナーゼ阻害剤によっても、Ang IIによる血管収縮は抑制された。加えて、2K1C処置群では、Src阻害薬、JAK阻害薬によりAng IIの収縮が有意に抑制されたのに対し、Sham処置群では、それら阻害剤による抑制は認められなかった。アンジオテンシンIIは、強力な血管収縮印紙であり高血圧発症に重要な役割を演じている。これまで、アンジオテンシンIIによる血管収縮は、アンジオテンシンIIが、アンジオテンシンタイプ1(AT1)受容体に結合し、細胞内のカルシウム濃度が上昇することによるミオシン軽鎖キナーゼの活性化が重要であるとされてきた。しかし、ミオシン軽鎖キナーゼの活性化に比べ、ミオシン軽鎖ホスファターゼの不活性化がより重要であることが明らかとなった。そして、このミオシン軽鎖ホスファターゼの不活性化は、AT1受容体、Src、EGF受容体、Erk1/2、Rho-キナーゼにより調節されていることも明らかとなった。前年度の研究結果を基に、高血圧ラット血管標本におけるAng IIのAT1受容体刺激によるErk1/2、Rhoキナーゼ経路を介した血管収縮及び各経路の活性化ついて、高血圧モデル動物、即ち2K1C高血圧モデル、本態性高血圧モデル、大動脈狭窄モデル圧負荷血管において、正常時と比べ、収縮、EGF受容体系、MAPキナーゼ系、Rhoキナーゼ系に変化が認められるかを検討する。また、EGF経路の活性化はその下流に位置するMAPキナーゼ系の活性化を誘導するから、Ang IIのAT1受容体を介したEGF経路、MAPキナーゼ経路の活性化がAng IIの収縮に寄与しているかについてより詳細な検討を行う。すなわち、Erk1/2以外、p38やJNKの活性が血管腫宿に関与するかについて検討を加える。加えて、Ang IIによるRhoキナーゼの活性化にJAKが関与しているとの報告がある。しかしながら、JAK活性化の経路及びJAKがどのような因子を活性化するかについては明らかにされていないことから、JAK活性化の経路ならびにMAPキナーゼ系との関わりにについても検討を加える。さらに、申請者等はチロシンホスファターゼの阻害がSrc、EGF受容体を介してRhoキナーゼの活性化をおこし、その結果、血管は収縮することを報告している。
屋外使用環境下における難燃処理木材の性能低下メカニズムの解明

難燃処理木材は、屋外使用環境下では、薬剤の溶脱にともなう性能低下が懸念される。難燃処理木材の耐候性試験を行ない、薬剤残存量と防火性能の関係を評価したところ、薬剤の種類と塗装方法を適切に選択すれば、難燃処理木材の屋外耐候性を著しく向上させることが可能であることが明らかとなった。また、薬剤の溶脱は細胞内腔から起こり、かなりの量の薬剤が溶脱しても細胞壁中には薬剤が残存していることが明らかになった。本研究は,難燃処理木材の屋外での使用環境下における性能低下現象を把握し、その劣化機構を明らかにするとともに塗装の有効性を検証することを目的とする。解明すべきポイントは、(1)屋外使用環境下での難燃処理木材の防火性能低下の把握、(2)塗装による防火性能低下抑制効果の解明、(3)難燃薬剤の溶脱機構の解明であり、これらを達成するため、以下のとおり、研究計画を定めた。(1)試験体の調整準不燃材料レベルの難燃処理木材となるよう、減圧・加圧法により難燃薬剤を木材に注入し、乾燥後に塗装を施した試験体を調整する。薬剤の種類はりん酸系、ほう砂・ほう酸系など数種類、塗料の種類は水性・油性、造膜型・半造膜型・含浸型、隠蔽型・半透明型・透明型などから数種類を選択する(2)耐候性試験の実施耐候性試験として、促進耐候性試験(ウェザメータ試験)及び屋外暴露試験を行い、所定の期間暴露後の、薬剤残存量、はっ水度、色差を測定し、各処理条件の試験体について、耐候性試験経過時間と耐候性の関係を明らかにする。(3)防火性能試験の実施各処理条件について、一定時間の耐候性試験を実施した試験体の防火性能をコーンカロリーメータ試験(ISO5660-1)により評価し、耐候性試験経過時間と防火性能劣化の関係を明らかする。SEM-EDXA分析により、試験体内の薬剤の分布を把握し、耐候試験による薬剤の溶脱メカニズムを明らかにする。(5)いろいろな難燃薬剤と塗装の組合せによる試験を繰り返し、最適な組合せに関する検討を行う。本研究は、難燃処理木材の屋外での使用環境下における性能低下現象を把握し、その劣化機構を明らかにするとともに、塗装の有効性を検討することを目的とする。18年度は以下の検討を行った。1.屋外使用環境下での難燃処理木材の性能劣化を評価するため、木材に難燃薬剤を注入し、表面を塗装した試験体を作製した。試験に供した木材は、屋外暴露(南向き垂直面)用は厚さ18mmのスギ材、ウエザメータ試験(JISK5600-7-7キセノンランプ法)用は厚さ8mmのスギ材で、これに、難燃薬剤として市販の窒素・りん酸系の薬剤と自家調製した薬剤(りん酸アンモニウム、ほう砂、ほう酸の混合物)を減圧・加圧法により注入し(薬剤固定量は200230kg/m^3)、さらにその表面に外装用の木材保護塗料による塗装(含浸または造膜タイプ、着色系)、あるいは内装用の木部用ウレタン難燃塗料による塗装(造膜タイプ、透明系)を施した。2.上記の試験体について、ウエザメータ試験と屋外暴露試験を開始した。ウエザメータ試験については1000時間までの試験を実施したところ、無塗装の材料については時間の経過とともに著しい防火性能の低下が見られたが、外装用の木材保護塗料で塗装された試験体は含浸、造膜タイプともに1000時間経過時においても150kg/m^3以上の難燃薬剤が残存しており、防火試験においても準不燃材料程度の性能が維持されていることが明らかとなった。屋外暴露試験については、経過観察を行っているところである。3.難燃処理木材の屋外使用環境下での性能劣化機構を明らかにするためには、難燃薬剤の各成分が木材内部でどのように分布するかを明らかにすることが不可欠であるが、難燃薬剤を注入した木材をSEM-EDXAを用いて観察することにより成分ごとの分布状況を可視化する方法を開発した。本研究は、難燃処理木材の屋外使用環境下における性能低下現象を把握し、その劣化機構を明らかにするとともに、塗装の有効性を検討することを目的とする。19年度は以下の検討を行った。市販の薬剤A(窒素りん酸系難燃薬剤)と自家調整した薬剤B(りん酸アンモニウム、ほう砂、ほう酸混合物)を注入し、その表面に含浸タイプ、造膜タイプ、透明系、着色系の塗装を施したスギ材を屋外に暴露した。

薬剤Aは薬剤Bに比べ屋外暴露による溶脱は少なかったが、暴露開始時に220kg/m^3程度木材内に注入されていた薬剤Aの残存量は、6ケ月後にはウレタン系難燃クリア塗料で塗装したもので200kg/m^3、油性含浸・油性半造膜型塗料で塗装したもので160kg/m^3、無塗装で60kg/m^3、12ケ月経過後では、ウレタン系難燃クリア・油性含浸・油性半造膜型塗料で70100kg/m^3、無塗装で40kg/m^3まで減少し、残存量に応じて防火性能も低下した。しかし、薬剤Aを注入し、ウレタン系難燃クリア塗料または油性含浸型、油性半造膜型塗料を塗布した試験体は、18ケ月経過後の薬剤残存量が70kg/m^3まで低下するものの、防火性能ではコーンカロリーメータ試験による10分間の総発熱量が8MJ/m^2以下で、準不燃材料の性能を維持していることが明らかとなった。さらにSEM-EDXAによる薬剤分布の観察を行い、薬剤注入時には木材全体にわたりその細胞壁内及び細胞内孔に薬剤が入っているが、耐候操作を行うと、表層に近い側の細胞内孔から薬剤が溶出するものの、細胞壁内の薬剤は残留していることが明らかとなった。本研究は、難燃処理木材の屋外使用環境下における性能低下現象を把握し、その劣化機構を明らかにし、塗装の有効性を検討することを目的とする。20年度は以下の検討を行った。難燃薬剤を注入し、塗装を行った木材の促進耐候性試験並びに屋外暴露試験は、4種類の難燃薬剤(薬剤A(カルバミルポリりん酸アンモニウム系)、薬剤B(ほう砂、ほう酸、りん酸アンモニウム混合物)、薬剤C(無機りん酸・窒素系)、薬剤D(りん酸グアニジン系))と、水性・油性、造膜・半造膜・含浸、隠蔽・半透明・透明の特徴を有する9種類の塗料を組合せた試験体について実施中である。難燃薬剤そのものの溶脱性については、無塗装の試験体の薬剤残存量を500時間までのウエザメータ試験で比較すると、薬剤残存量はD>A>Cの順となり(Bのウエザメータ試験は未実施だが、屋外耐候性試験の結果からCと同等と推察)Dの残存性が良いことがわかった。塗装の効果については、(1)水性・造膜・隠蔽型(茶)と(2)油性・含浸・半透明型(茶)、(3)油性・半造膜・半透明型(茶)、(4)油性・造膜・透明型(難燃性)を塗装した薬剤A注入試験体を比較したところ、2000時間のウエザメータ試験での薬剤残存量は(2)>(3)=(1)>(4)で、透明型より顔料が含まれるものの方が溶脱が少なかったが、12ヶ月の屋外暴露では(4)>(3)>(2)>(1)となり、異なる傾向が見られた。この差異は、屋外暴露では、試験体が厚く、試験体が厚いほど乾燥割れが発生しやすくなり、薬剤の溶脱が進んだのではないかと考えられる。ウエザメータ試験後の試験体のSEM-EDXA分析でも塗装した難燃処理木材からの薬剤の溶脱は、割れの個所から進んでいる様子が観察された。21年度は以下の検討を行った。本研究においては、A(ポリリン酸系薬剤)、B(ホウ砂・ホウ酸・リン酸アンモニウム混合物)、C(リン酸・窒素系薬剤)、D(リン酸系薬剤)の4種類について検討を行った。ウエザメータ最大2000時間までの各薬剤の無塗装状態での薬剤残存量を比較すると、D>A>C(Bは未実施)、屋外暴露6ヶ月でD>A>B>C、1年ではD>A>B(Cは6ヶ月で終了)で、薬剤Dの性能が良いことが明らかとなった。さらに油性造膜形塗料を塗装したものではウエザメータ1000時間を超えても薬剤A、薬剤Dを注入したものは依然として準不燃材料程度の燃焼発熱性を維持しており、優れた耐候性を示すことが明らかとなった。
高分解能衛星データによる東アジア全域の草原バイオマス推定とその長期変動解析

本年度は,高分解能バイオマスマップの作成及び検証用の衛星データの高頻度観測をチベット高原サイトで行った。収集したデータはASTER, SPOT/HRG, TerraSARXの各データであり,フェノロジー観測を行うために春先の4月から10月にかけてひと月に一枚以上のデータを取得することができた。その一方で,チベット地域の政情不安などの理由により現地に赴いて現場観測を行うことはできなかった。また,初期解析としてSPOT/VEGETATIONとTerra/MODISの10年近くにわたるデータセットから二つの植生指数(EVI, NDWI)を計算しバイオマス変動の把握を試みた。そしてアジア地域の草原の10年スケールの変動を1kmの空間解像度で評価した。その結果,この地域のバイオマス変動は,バイオマス分布図を国境データと重ね合わせるとモンゴルと中国の国境付近で明瞭な違いが見受けられた。まずモンゴル国内のゴビ砂漠の北の半乾燥草原では,広い領域にわたって草原バイオマスが減少していることが明らかとなった。一方で,ゴビ砂漠の東に位置する中国国内の内モンゴル自治区内の半乾燥草原においては,バイオマスの減少は確認されなかった。こうした国毎の違いは,半乾燥草原のバイオマスが単に雨量や気温などの気候変動によって変化しているのではなく,人為起源の影響(国毎に異なる土地利用の方策の違い)が大きな要因となっていることを示す結果である。今後,高分解能データを用いて詳細に検討することでこのバイオマスの変動をより詳細に把握することができると考えられる。
フラジリス菌の表層抗原性を制御する部位特異的組換え酵素の同定および発現解析

1.class IIおよびclass VI領域のDNA逆位を制御する候補遺伝子破壊株の作成2.BF0667による逆位制御が腸管内への定着に果たす役割BF0667による逆位制御が腸管内への定着に関与しているのかを検討するために、野生株とBF0667欠失破壊株を用い、無菌マウス腸管への競合定着試験を行った。野生株と変異株を1:1で混合し、無菌マウスに経口投与した後、経時的に大腸糞便中の菌数割合を計測したところ、経時的に変異株の割合が減少したことから、BF0667による逆位制御が腸管への定着性に重要であることが示唆された。このようなグローバルな制御系によって、刻々と変化する腸内環境に応じて表層抗原性を変化させ、表層抗原性の組合せレパートリーを増やすことで様々な宿主腸内環境へ適応しているものと考えられる。Class IV領域の各種ON-OFF phenotypeが腸管内への定着にどのように関与しているのかを推測するために、野生株と4種類のBF2766欠失破壊株を用い、無菌マウス腸管への競合定着試験を行った。その結果、OMVsの形成が顕著なON/0N変異株は極めて腸管への定着が悪かったが、その他のOFF/0N変異株、OFF/0FF変異株あるいはON/0FF変異株の定着率は野生株と差を認めなかった。
歯周組織幹細胞による組織再生・治癒様式の解析と新規再生療法の開発

(1)実際の治療を目的として誘導されたiPS細胞、すなわちヒト治療用iPS細胞を用いることができるようになった。(2)少しでも将来の実用化に向けた治療用iPS細胞を使用することから、培養に用いるフィーダー細胞(動物由来栄養供給細胞)の使用も課題となっていることから本研究課題の重要なステップとして、フィーダーフリー培養法を確立した。フィーダーフリー培養法を確立した後は、同じく臨床実用化の重要なステップになる無血清培養法、すなわちゼノフリー培養法を確立した(3)フィーダーフリ/ゼノフリー培養法でのヒト治療用iPS細胞の維持と、歯周組織の発生学的起源である神経堤細胞への誘導を実現させた。現在主に行われている歯周組織再生療法には1.歯周組織再生誘導法(GTR法)、2.エナメルマトリックスタンパク質(EMD)を応用した手術法、3.骨移植術などがある。これらはすべて歯周組織に内在すると想定される幹細胞(Periodontal tissue stem cell; PTS細胞と定義する)に依存した治療法と考えられる。有効な歯周組織再生が期待されている組織幹細胞としてこれまで歯根膜幹細胞や歯髄幹細胞が報告されている。しかしこれらの細胞は培養皿上で付着増殖した細胞を幹細胞と定義していることから、実際のPTS細胞の本質を明らかにするには不十分であると考えられる。これまで申請者らはマウスおよびヒト間葉系幹細胞特異的マーカーを同定し、間葉系細胞分画を直接生体から分離する技術を確立した。計画している具体的な研究項目は1現在主に行われている歯周組織再生療法において、組織再生に寄与している歯周組織幹細胞をフローサイトメーターにより分離・同定する。21で同定した歯周組織幹細胞を遺伝子発現、細胞増殖能、分化能の観点から比較する。3野生型マウスや免疫不全マウスに実験的歯周炎を惹起させ、現行の歯周組織再生療法と1で同定した歯周組織幹細胞を用いた新規再生療法の組織再生及び治癒様式を解析し、ヒトへの応用方法を検討する、の3つである。平成25年度は実験計画1に重点を置きp75-EGFPトランスジェニックマウスの長管骨および顎骨におけるマウスMSCマーカー(PDGFRα+Sca-1+)とマウスNCSCマーカー(CD271=p75)を組み合わせてコロニー形成能や分化能を比較し、PTS細胞のマーカーの同定を試みた。2)歯周外科手術時に各組織を少量採取し、ヒトMSCで同定された細胞表面マーカー(CD271=p75=ヒトNCSCマーカー、CD90)とFCMを用い、培養操作なしで各組織における直接PTS細胞を分離する実験系の確立を予定した。昨年度の報告から、ヒト細胞を研究に使用できるようになればすぐに口腔組織からの間葉系幹細胞分離に着手すると予定していた。本学における倫理委員会申請書類が許可されたため、患者検体から間葉系幹細胞を分離することが可能となった。また、本学生理学教室との共同研究でiPS細胞を用いた新規歯周組織再生療法の確立に向けた研究を開始した。具体的には1ヒトiPS細胞からのヒト組織幹細胞(間葉系幹細胞)の確立。2ヒトiPS細胞をから歯および歯周組織の発生学的起源である歯原性上皮細胞、歯原性間葉細胞の誘導方法の確立を目指した。将来の臨床応用への対応も考え、ヒトiPS細胞培養はマウスフィーダー細胞を用いない、いわゆるフィーダーフリー培養の確立を試みた。さらにヒト以外の動物由来血清の使用もやめ、ゼノフリーでの培養方法の確立も試みた。このフィーダーフリー・ゼノフリーの培養方法は当初なかなか細胞が増えにくく、従来方法に比べて困難であったが、AJINOMOTOの無血清培地を使用することで安定して細胞培養ができるようになってきた。これらのヒトiPS細胞から歯原性上皮細胞および歯原性間葉細胞へ誘導することができれば、試験管内で歯や歯周組織の発生を模倣することができれば新たな歯・歯周組織再生療法の確立につながると考え、現在誘導方法の確立を目指し、研究を進めている。本研究課題の当初予定していたヒト口腔組織から直接、歯周組織を再生させるポテンシャルを有する歯周組織幹細胞の同定を目的としていた。しかしながら、歯周組織に限定せず顎骨や末梢神経の再生も視野に入れた幹細胞が分離あるいは誘導できれば、多くの間葉細胞から構成される歯周組織再生にも大きく寄与することが容易に想像できる。そこで申請者はヒト口腔組織から歯周組織幹細胞を分離・解析する方法を探索すると同時に、iPS細胞から歯周組織の発生学的起源である外胚葉性間葉組織構成細胞=神経堤細胞を誘導することも研究計画として追加した。これまでの研究成果は1iPS細胞は京都大学と提携し、実際の治療を目的として誘導されたiPS細胞、すなわち治療用iPS細胞を用いることができるようになった。2少しでも将来の実用化に向けた治療用iPS細胞を使用することから、培養に用いるフィーダー細胞の使用も課題となっていることから本研究課題の重要なステップとして、フィーダーフリー培養法を確立した。3フィーダーフリー培養法を確立した後は、同じく臨床実用化の重要なステップになる無血清培養法、すなわちゼノフリー培養法でのiPS細胞の維持と神経堤細胞への誘導を実現させた。この123の結果本研究課題の(研究期間に限定されない)最終的ゴールであるヒト歯周組織再生に向けた非常に重要かつ必須のステップとその成功だったと考えている。

現在はフィーダーフリー/ゼノフリーの条件で培養した治療用iPS細胞から神経堤細胞に誘導し、その増殖能や分化能に加え、神経堤細胞の重要な性質の一つである遊走能に関してもin vivo実験で評価を行っている。また、現在歯周組織再生の候補として基礎・臨床研究が進んでいる間葉系幹細胞系統への誘導と分化能に関しても確認中である。さらに誘導幹細胞による口腔組織再生に向けた画像評価法の確立も検討している。(1)実際の治療を目的として誘導されたiPS細胞、すなわちヒト治療用iPS細胞を用いることができるようになった。(2)少しでも将来の実用化に向けた治療用iPS細胞を使用することから、培養に用いるフィーダー細胞(動物由来栄養供給細胞)の使用も課題となっていることから本研究課題の重要なステップとして、フィーダーフリー培養法を確立した。フィーダーフリー培養法を確立した後は、同じく臨床実用化の重要なステップになる無血清培養法、すなわちゼノフリー培養法を確立した(3)フィーダーフリ/ゼノフリー培養法でのヒト治療用iPS細胞の維持と、歯周組織の発生学的起源である神経堤細胞への誘導を実現させた。ヒト細胞を用いた実験計画は、主にヒトiPS細胞を用いることに研究計画を一部変更したこどで概ね順調に進んでいる。倫理委員会申請書も通過したことから、今後はこのiPS細胞から誘導した間葉系幹細胞や歯原性上皮細胞、歯原性間葉細胞とヒトの生体内に存在する純化間葉系幹細胞を比較することで新規歯周組織再生療法につながると考えている。また実験的歯周炎については再現性が取れないことや、従来の方法がヒトの病態とかなりかけ離れていることが問題となっていたが、Abe T, Hajishengallis G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. J Immunol Methods. 2013Aug 30;394(1-2):49-54.にヒトの病態と非常に近似したモデルが作製できると報告されているので、この方法を元に免疫不全マウスに実験的歯周炎を惹起させ、再生療法を試みる予定である。幹細胞生物学今後の実験計画は、主にヒトiPS細胞を用いた研究を行っていく予定である。まずは現在iPS細胞から誘導を試みているヒト純化間葉系幹細胞、歯原性上皮細胞、歯原性間葉細胞が確実にその細胞に誘導されているかどうかを過去の論文を参考に免疫染色にて評価する。また、新規歯周組織再生療法の移植実験は、T細胞欠損のnude mouseや、T細胞・B細胞欠損のNOD/SCIDマウスなどの免疫不全マウスをレシピエントに考えている。倫理委員会申請書も通過したことから、今後はこの1iPS細胞から誘導した間葉系幹細胞2歯原性上皮細胞3歯原性間葉細胞、そして組織幹細胞としてヒトの生体内に存在する4純化間葉系幹細胞を比較することで新規歯周組織再生療法につながると考えている。免疫不全マウスの実験的歯周炎については再現性が取れないことや、従来の方法がヒトの病態とかなりかけ離れていることが問題となっていたが、Abe T, Hajishengallis G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. J Immunol Methods. 2013
超精密研削加工を実現するための基盤技術に関する研究

「超精密研削加工を実現するための基盤技術に関する研究」を推進するために,以下の2項目の研究計画を有機的に組み合わせて研究を実行した。[1]超精密研削加工を実現させるための寸法・形状ならびに表面粗さの熱変形速度制御加工法の開発超精密研削加工における寸法・形状精度ならびに表面粗さを,工作物の熱変形速度をインプロセスで計測しながら制御するためには,超精密研削盤のコントロールパネルとシーケンサーパネルにパソコンのD/Aコンバータからパルス状の指令信号を発振させてリアルタイムに適応制御できる制御加工法を確立することが不可欠である。そのためには,まず研削現象量つまり寸法生成量,形状生成量,研削抵抗値,砥石摩耗量,表面粗さなどのデータを高速A/Dコンバータで検出・格納し,これらの現象量を定量的に演算し,さらに超精密研削盤のシーケンサーへ割り込み制御するためのプログラムを構築することが必要となる。そこで,この熱変形速度制御研削加工法の研究計画が本研究の根幹をなすものであるから,際優先に全力で傾注した。[2]超精密研削加工ニューロ&ファジィ制御法の構築上記の研究計画で確立した熱変形速度制御法ならびにインプロセスオンライン計測システムに,新情報理論すなわちニューロ&ファジィ理論による制御システムを組み合わせることにより,確度の高い寸法・形状精度と表面粗さの知能的予見制御が実現した。
システム生物学・構成的生物学に基づく細胞内分子コンピュータ設計と構築

AND論理ゲートとして作動するよう設計したデュアル・プロモーターの動作を蛍光プローブで確認した。このタイプのプロモーターを組み合わせ、複数のAND回路からなる遺伝子回路を構築することにより、微生物細胞を用いた三目並べゲームの構成可能性を議論した論文をIET SyntheticBiology誌から出版した。遺伝子回路のみならず、代謝系も含めた細胞内化学反応系の包括的設計を目指して、カロテノイド生合成経路の収率向上を試みた。カロテノイドは色素であるため、レポーター分子として利用した。まずコンピュータ・シミュレーションによって、カロテノイド生合成経路を形質転換した場合の大腸菌細胞内の代謝流束と菌体成長速度を予測した。シミュレーション結果より、形質転換した大腸菌がほぼ正常に成育し、かつ従来株よりも高いカロテノイド合成能を持つことが予測された。この結果に基づき、当該遺伝子群をOGAB法(Ordered Gene Assembly in B.subtilis)を用いて集積・形質転換した。結果、培地上にコロニーが出現したことから、菌体の正常な生育が確認できたと解釈している。また、遺伝子回路の性能を左右する因子として、オペロンにおける各遺伝子の並び川頁が寄与していることが知られている。最適な遺伝子並び順を探索するため、DNAコンピューティングで確立されたランダムアセンブリの技術を応用し、従来知られているものとは異なる並び順を得た。現在、カロテノイド合成量の定量を行うとともに、当該遺伝子群をプラスミドから染色体DNAに移した場合の生産量の変化についても観察を試みている。「大腸菌in vivo分子コンピュータ」の設計・構築を目指した研究を行った。設計にはシステム生物学および構成的生物学(synthetic biology)の知見・手法を応用し、細胞内化学反応から成る演算機構実現へ向けた第一歩として、論理ゲートの構築を試みた。購入した画像解析ソフトは細胞が発する蛍光の強度測定に用いた。大腸菌の菌体内に論理ゲートを実現するため、緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子の上流にLacIタンパク質およびLuxRタンパク質それぞれの結合配列を挿入した。ラクトース存在下においてはLacIによるGFPの発現抑制が取り除かれ、アシルホモセリンラクトン(AHL)存在下ではLuxRがGFPの発現を促進する。したがって、ラクトースおよびAHLの両方が存在する培地においてのみ、GFPが発現することが設計上期待される。実験の結果は設計通り、ラクトースおよびAHLの両方が投与された場合のみ、GFPの有意な発現が観察できた。よって、ラクトースとAHLを入力信号とするANDゲートが実現できた。基本論理ゲートの構築はほぼ初年度計画通りに行えた。19年度は細胞による演算を多細胞系に拡張し、並列計算を目指したセルオートマトンの構築に取り組む。セルオートマトンはチューリング機械と同等の計算能力を持っことが証明されているため、その実現によって、細胞に汎用的な演算機構を付与できる。
区別機能を有する無機高分子担持触媒に関する研究

アンモニウム塩を活性基として有するカチオン性高分子化合物は種々の反応試薬、触媒、触媒担体として利用することが可能である。従って、この化合物を利用して標題反応を行なった。即ち、前記高分子の合成及びそれを利用する反応について考察した。高分子としてシリカ(日揮化学K.K製、323m^2/g)を用い、シリカカップリング試薬(東レシリコンK.K製...(a)オクタデシルジメチル〔3-(トリメトキシシリル)プロムピル〕アンモニウムクロリド、(b)γ-(2-アミノエチル)アミノプロピルトリメトキシシチン、(c)γ-クロロプロピルトリメトキシシラン、(d)γ-アニリノプロピルトリメトキシシラン)を反応させて官能基修飾を行なった。(a)の場合、アンモニウム基を利用してテトラブロモオキソモリブデート(Br_4MoO^-)を担持した。ついでヒドロペルオキシドによる酸化触媒として利用し、アルコールの酸化、オレフィンのエポキシ化を行なった。(b)の場合、アンモニウム基を出来るだけ多く導入する目的でエチレンイミン結合を構成した。ジトシルオキシエチルアミン-N-トシレートを反応させ、サイクラム類似構造を構成しアンモニウム塩として、三相触媒に利用した。(c)の場合、(S)-(+)-2-(アニリノメチル)ピロリジン、(S)-(+)-2(2.6-キシリジノメチル)ピロリジンを反応させアンモニウム塩を構成し、光学活性三相触媒として利用する。(d)の場合、導入されたアミノ基を用いてプロリノールトシレートを反応させて光学活性基を導入した。それぞれについて導入されたピロリジニル基の割合を元素分析値より求めた。シランカップリング剤の約50モル%にピロリジニル基の導入していることがわかった。(b)、(c)、(d)についてベンジルカロリドのシアン化反応、ノ-ブロモエチルベンゼンのシアン化反応を行なった。-CH_2Cl→CH_2CNは定量的に進行するが、二級Br化合物の場合は-OHの生成、脱HBrによるオレフィンの生成が認められた。
クィア・ヒストリーによる西洋史再考

近代ドイツを事例に、軍隊宮廷内における「男性」性の歴史的構築過程および「同性愛の歴史的機能」の分析を進めた結果、ヘテロ・セクシュアルによって解釈されてきたと考えられる歴史を別の観点から考察することの重要性が明らかとなった。また、who's Who in Gay and Lesbian History,London,2001の翻訳作業を進めるなかで、古代、中世、近世、近代、現代といった時代による特質を抽出した。さらに、クィア学会や性同一性障害学会等との交流を通じて、歴史学のみならず社会学や臨床心理学、精神医学などセクシュアリティに関する隣接学問からの知見を得ることで、そもそも「同性愛」「同性愛者」が問題なのではなく、それを作り上げていく社会や政治を解明することの必要性も浮き彫りになった。こうした作業をもとに、歴史の中で「性」=関係性(あるいは差別の体系)がいかにして作り上げられたのかを、西洋史全体の中に位置づけることが可能となった。本研究は、従来のジェンダー史を展開させセクシュアリティ的観点を導入した歴史像=クィア・ヒストリーの構築を目指すものである。初年度である平成20年度は、その準備段階という位置づけのもとで、(1)基本的資料の収集およびデータベースの作成、(2)国内アドヴァイザーとの交流を行った。(1)については、近年の欧米圏におけるクィア、セクシュアリティに関する文献リストを作成し、その成果を、新たに開設したホームページにて公開している。(2)については、ジェンダーに関する研究会(於西南学院大学、2009年2月14日)や性同一性障害学会(於長崎大学、2月15日)への参加・交流を通じて、女性史や性同一性障害に関する最新情報の把握・整理に努めた。特に性同一性障害については、そのリサーチを進めるなかで、「男」「女」の性別理解が現在の教育言説の隅々まで行き渡っているという新しい知見を得た。他の実績としては、共著として2月に刊行された『ドイツ近現代ジェンダー史入門』において「ナショナリズム・男性性」を執筆し、「男性」性が軍隊と宮廷という二つの空間の中で、いかに歴史的に構築され、クィア理論の一つの着目点であるホモソーシャルな関係がどう展開したのかを論じた。これらの研究を通して、「ホモセクシュアリティ」概念の形成過程を考察しながら、ヘテロ・セクシュアルによって解釈されてきたと考えられる歴史を別の観点から考察することを通して新たな歴史像の構築を目指すことが可能となった。平成21年度は、(1)基本的資料の収集およびデータベースの整理、(2)国内アドヴァイザーとの交流、(3)海外におけるネットワーク構築、(4)適宜情報発信を推進した。本年は、セクシュアリティ関係コレクションをほぼすべて入手し、Who's Who in Gay and Lesbian History, London,2001の翻訳作業もすすめた。またドイツ(ベルリン)への資料収集およびドイツ研究者との意見交換を行った。また、京都大学で開催された「感情学の展望」(2009年7月11日)に討論者として参加し、「感情」という理性的領域ではない側面が歴史や政治にもたらす影響をも学問として俎上にあげる必要性を認識するに至った。クィア学会(2009年10月17日)では、現在日本においてゲイ、レズビアン、バイ、トランスジェンダー/セクシュアルといった特定のセクシュアリティとほぼ同義語で使われることが多い「クィア」の複雑な歴史的・文化的文脈に注目し、「クィア」の属性が自明視されることの問題点や特定のアイデンティティに還元されない「クィア」の可能性に焦点をあてるというアプローチから示唆を得た。情報発信については、熊本県立大学文学部フォーラム(2009年11月21日開催)にて報告した内容をもとに、同大学文学部紀要『文彩』(6号)に「つくられる「おんな」の身体、「おとこ」の身体-その歴史的形成過程」を執筆した。以上の研究活動をもとに、セクシュアリティを西洋史全体のなかに位置づけることで、古代、中世、近世、近代、現代といった時代による特質が抽出された。また、そこから派生する「家族」や「友情」といった様々な関係性や「公」「私」の問題の歴史も浮かび上がった。本研究は、従来のジェンダー史を展開させ、セクシュアリティ的観点を導入した歴史像=クィア・ヒストリーの構築を目指すものである。最終年度にあたる平成22年度は、基本的資料の収集・整理、国内アドヴァイザーとの交流、適宜発信を進めると同時に、総合的なまとめの作業を開始させた。

資料収集・整理については、これまで収集してきたクィアおよびセクシュアリティに関する文献の翻訳作業を進めてきた。国内アドバイザーとの交流については、ジェンダーという横断的学際領域であるため、歴史学だけではなく、社会学、人類学などの隣接学問の専門家との交流を進めるために、こうした分野での一線におられる研究者との交流を深めた。特に、シンポジウム「占領期・ポスト占領期の視聴覚メディアと受容」(2011年3月5日・東京大学)において、米陸軍・国務省作成のプロパガンダ映画「戦争花嫁」の日本での上映を通じて、「アメリカ」を模範とする家庭のあり方(=女性のあり方)が喧伝され、日本社会のなかで「アメリカ」が受容されていくツールとなったという知見を得た。アメリカに引きつけた業績としては、1970年代にサンフランシスコ市議会議員となったハーヴェイ・ミルク氏を題材とした「1970年代のアメリカのジェンダー状況」と題する講演(2010年12月20日・明治大学)を行った。2011年1月に刊行された『権力と身体』(明石書店)では「同性愛の歴史的機能」を執筆し、「同性愛」「同性愛者」が問題なのではなく、それを作り上げていく社会や政治を解明することの必要性を強調した。
非定常渦列発生の混合強化を応用した高速・高発熱反応の遷移状態解析

最終年度となる平成30年度は,高速・高発熱反応であるシュードイオノンからβ-イオノンへの環化をモデル反応とし,μOBRを使った反応速度解析を行った.また,高速度カメラを用いて流動の可視化を行い,混合の様子を観察した.さらに,反応速度解析の結果及び測定した混合時間を基に,混合ダムケラー数Da_mixを定義し,反応速度と混合速度の評価を行った.流動可視化用に透明アクリルプレートを切削してμOBRを作製した.水を満たした流路にローダミンBの着色水溶液をステップ的に流入させ,高速度カメラによって混合の様子を撮影した.バッフル区画の中心領域について,フレーム毎の撮影画像を切り取り,並べることによって混合の時空間パターンを形成させた.振動レイノルズ数を大きくすると,流路径方向への混合及び押出し流れ性能が向上していることが観察できた.次に,シュードイオノンの環化反応を,μOBRを用いて行った.滞留時間を変化させ,各種濃度を反応機構モデルに対してフィッティングし,反応速度定数を求めた.計算値と実験値は十分一致した.本研究で測定した速度定数と,スラグフローを応用した先行研究の解析結果を比較すると,本研究で求めた反応速度定数の方がいずれも大きい値であった.反応器の混合速度が反応解析結果に与える影響を定量的に評価するため,混合ダムケラー数Da_mixを定義したところ,先行研究の解析では0.21 - 25.2であり,μOBRでは0.017 - 1.47を示した.μOBRの方が小さな値を示しており,正確な反応速度解析結果を与えたといえる.また,アレニウスプロットを行うことで,反応ネットワーク上で最も大きな活性化エネルギーを持つ経路が変わることがわかり,マイクロチャネル内の混合方法を改善することで反応の選択性が変わることがわかった.平成28年度は、本研究で新規開発するマイクロリアクターの混合性能、伝熱性能、流動特性を調べることを申請書における目標とした。当該年度では、3Dプリンターを用いて、内径0.5 mm、長さ10 mmの管内に、内径0.25 mmのオリフィス状バッフルを等間隔(0.75 mm)に11個配置したマイクロリアクターを製作した。さらに、本リアクターに各種振幅と周波数の振動流を与え、そのミクロ混合特性を調べた。ピストンポンプを用いて振幅2.8 - 6.9 mm、周波数1.2 - 3.1 Hzの振動流を与えた。同時に正味の流量7.5 mLh-1で流通させ、連続式反応器とした。ミクロ混合性能評価にはVillermaux-Dashman反応(VD反応)を用いた。VD反応は競争反応であり、迅速なミクロ混合が行われている場合、速い反応が優位になり、遅い反応の生成物であるI3-濃度は低下する。各種振動条件のVD反応結果は、振動流れの強度を表す無次元数の振動レイノルズ数Reoによりまとめた。Reoを上昇させると、混合性能が向上することがわかった。これは、振動流によりバッフル前後に非定常的に渦流が発生し、さらに、Reo上昇に伴う渦流の成長によって、カオス混合が強化されたためと考えられる。次に、VD反応における混合時間を吸光度との相関式より算出し、既往の同サイズのチャネル型マイクロリアクターと比較したところ、本OBRの混合時間は1桁以上小さく、0.02 s程度であった。以上より、マイクロサイズのOBRは高速反応の遷移状態を精密に解析できる反応器であることが示せた。平成28年度の計画に含まれる伝熱性能評価を試みたが、表面温度測定の精度が低かったため、良好な結果を得ることができなかった。滞留時間分布測定も流量が微量であることから、精度の高い結果が得られなかった。また、混合状態の可視化もマイクロサイズであることから、困難であった。その一方で、VD反応の解析によって高いミクロ混合性能を持つことが明らかとなったため、バッフル間の各区画の混合は非常に高いといえる。それらが連結された本リアクターは、高い押し出し性能も同時に達成しうる連続式反応器であることが示唆された。平成29年度は、高速・高発熱反応であるシュードイオノンからβ-イオノンへの環化をモデル反応として,原料,中間体,生成物濃度から反応機構ネットワークを構築することを,申請書における目標とした。この反応には濃硫酸を流通させる必要があり,ポリマー製のμOBRではなく耐薬品ガラス製のμOBRが必要となった。そのため,ガラスプレートを微細掘削することによって作製した。ガラス平板上に流路を掘削することから,オリフィス状のバッフルではなく,断面が矩形の流路に対して,流路断面の左右側壁に周期的に流路を狭める構造に変更した。なお,微細ドリルの回転運動によって掘削を行うことから,流路上方からみると,楕円上の溝が連なったような構造として確認できる。流路長さは30 mm,流路幅0.4 mm,深さ0.2 mm,バッフル間隔は0.6 mm,バッフル部分は0.2 mmである。これまでと同様に,本リアクターに各種振幅と周波数の振動流を与え,そのミクロ混合特性を調べた。構造が異なっても,混合時間は0.02 s程度であり,前年度のμOBRと同等のミクロ混合性能を有していることが明らかとなった。

また,レイノルズ数とミクロ混合時間(ミクロ混合時間を流路径の2乗で割った値)のチャートに,本μOBRの性能をプロットすると,多くの既存のマイクロリアクターの性能が,ある直線に並ぶのに対して,本μOBRは逸脱した値を示し,非常に低いReに対して小さい混合時間を与えることが分かった。このことから強制的な非定常渦流に起因するカオス混合が優位に働く可能性が示唆された。平成29年度の計画に含まれる高速・高発熱反応であるシュードイオノンからβ-イオノンへの環化をモデル反応を予定していたが,反応器材質に問題があったため,ガラス製のμOBRを再度製作し,評価する必要があった。反応実験の準備は整っており,30年度には速やかに本実験を遂行する。また,伝熱および滞留時間分布に関する実験についても,様々な手法を試みたが,いずれも成功しなかった。そのため,混合状態を可視化するための実験を加えて行っている。ローダミンBによる着色実験などを行う予定である。最終年度となる平成30年度は,高速・高発熱反応であるシュードイオノンからβ-イオノンへの環化をモデル反応とし,μOBRを使った反応速度解析を行った.また,高速度カメラを用いて流動の可視化を行い,混合の様子を観察した.さらに,反応速度解析の結果及び測定した混合時間を基に,混合ダムケラー数Da_mixを定義し,反応速度と混合速度の評価を行った.流動可視化用に透明アクリルプレートを切削してμOBRを作製した.水を満たした流路にローダミンBの着色水溶液をステップ的に流入させ,高速度カメラによって混合の様子を撮影した.バッフル区画の中心領域について,フレーム毎の撮影画像を切り取り,並べることによって混合の時空間パターンを形成させた.振動レイノルズ数を大きくすると,流路径方向への混合及び押出し流れ性能が向上していることが観察できた.次に,シュードイオノンの環化反応を,μOBRを用いて行った.滞留時間を変化させ,各種濃度を反応機構モデルに対してフィッティングし,反応速度定数を求めた.計算値と実験値は十分一致した.本研究で測定した速度定数と,スラグフローを応用した先行研究の解析結果を比較すると,本研究で求めた反応速度定数の方がいずれも大きい値であった.反応器の混合速度が反応解析結果に与える影響を定量的に評価するため,混合ダムケラー数Da_mixを定義したところ,先行研究の解析では0.21 - 25.2であり,μOBRでは0.017 - 1.47を示した.μOBRの方が小さな値を示しており,正確な反応速度解析結果を与えたといえる.また,アレニウスプロットを行うことで,反応ネットワーク上で最も大きな活性化エネルギーを持つ経路が変わることがわかり,マイクロチャネル内の混合方法を改善することで反応の選択性が変わることがわかった.平成28年度目標の項目について、実験方法を再検討する。伝熱性能評価には、マイクロサイズの温度測定が可能な非接触の装置を導入する予定である。局所的な温度測定しかできないが、多点測定により評価可能である。流動状態の可視化については、3Dプリンターとは異なる手法を用いて、内部の状態が観察しやすいマイクロリアクターをポリジメチルシロキサン(PDMS)などを利用して製作予定である。また、これらの反応器性能評価と並行して、β-イオノンの環化反応を遂行する。ガラス製のμOBRを用いてシュードイオノンからβ-イオノンへの環化を実行する。
遺伝子改変マウスを用いた体性感覚野ヒゲ関連パターン形成の分子機構の研究

高等動物の脳の生後発達において外界からの刺激が重要な役割を持つ。マウスなどのげっ歯類の大脳皮質体性感覚野では、主要な体性感覚器であるひげの分布に応じた特徴的なニューロンのパターン(バレル構造)が生後1週間に形成される。このパターンの形成、修飾は外界からの刺激に依存する脳発達のモデルとして注目されている。バレル形成における、NMDA型グルタミン酸受容体(NMDA受容体)の関与については、永年議論されているがいまだ決着していない。本年度は、大脳皮質特異的にCre組み換え酵素を発現するEmx1-Creマウス(昨年度実績報告書)とNMDA受容体のNMDAR1サブユニットを2個のloxPで挟んだ構造を持つfloxNMDAR1マウスを交配した。その結果として得られたマウスが、大脳皮質特異的NMDA受容体欠損(CxNR1KO)マウスであることを、分子生物学的、生化学的、電気生理学的な手法によって確認した。バレル形成について組織学的解析を行い、CxNR1KOマウスでは(1)ヒゲの配列に対応した、視床から大脳皮質への軸索投射のパターン(バレルのシナプス前要素)が形成はされるが、不完全である、(2)大脳皮質の神経細胞の細胞体の配列のパターン(バレルのシナプス後要素)は全く形成されないということを見つけた。このことは、バレル形成における大脳皮質NMDA受容体の働きを初めて明らかにするとともに、それが、シナプス前と後の二つの機構に分離できることをはじめて示すものである。高等動物の脳の後期発達において外界からの刺激が重要な役割を持つ。バレル形成における、NMDA型グルタミン酸レセプター(NMDAレセプター)の関与については、永年議論されているがいまだ決着していない。最大の問題は適当な方法論が欠如していることである。本実験は、Cre/loxP組み換えシステムを応用し、この問題を解決するための新しい遺伝子ノックアウトシステム、すなわち大脳皮質特異的遺伝子ノックアウトシステムを構築することである。本年度の実績としては、1)大脳皮質特異的Emx1プロモーター領域の分離と制限酵素地図の作製、2)ターゲティングベクターの作製、3)ES細胞での相同組み換えを利用して、Emx1プロモーターの下流にCre組み換え酵素を組み込み、4)胞胚へのマイクロインジェクションによるマウスの作製、4)そのマウスにおけるCre依存的組み換えの特異性をレポーターマウスを用いて解析したことがある。その結果、胎性11.5日ですでに大脳皮質特異的に高頻度の組み換えが起きていること、また、生後7日の段階でも大脳皮質特異的な組み換えのパターンは維持されていることが確認できた。これらの結果は目的とするマウスの作製に成功したことを意味する。今後は、組み換えのパターンをより詳細に解析すると共に、このマウスを用いてNMDAレセプターを大脳皮質特異的にノックアウトする段階に移行する。また、さらにトランスジェニック技術をもちい、よりすぐれたマウスの開発をめざす。