hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
網膜双極細胞終末部の形質膜近傍におけるシナプス小胞とCaイオンの動態解析

本研究の目的は、近接場光顕微鏡を用いて膜近傍.(150nm以下)における蛍光プローブの強度変化を高速イメージングすることによって、神経終末部におけるCaチャネルの活性化に伴う細胞内Caイオンの動態とシナプス小胞の動態を明らかにすることである。実験には、キンギョの網膜から単離したオン型双極細胞を用いた。蛍光性Ca指示薬Fluo-4FFを記録用パッチ電極から双極細胞の軸索終末部に導入し、膜電位固定した。脱分極パルスを与えたときの蛍光強度の変化を近接場光顕微鏡で計測すると共に、Ca電流及び開口放出に伴う微小膜容量変化を記録した。脱分極すると、複数の明るいパッチが現れた。Ca電流を阻害した条件下ではこのようなパッチは観察されなかったので、Caドメインであると結論した。複数のCaドメインの時空間的変化をミリ秒オーダーで解析した結果、各Caドメインの中心部と約500nm離れた周辺部でのCaイオン濃度上昇の時間遅れは、微小膜容量変化の測定から推定された即時の開口放出と遅れて生じる開口放出の時間差を説明できるほど大きくはなかった。その原因として、蛍光イメージングに起因するアーティファクトである可能性や、Caドメインの中心部と周辺部で開口放出に関与するCaセンサーの感受性が異なる可能性等が考えられる。シナプス小胞の動態を調べるために、細胞外からFM1-43をシナプス小胞に取り込ませ、近接場光顕微鏡で観察した。複数の輝点はそれぞれ染色された1個のシナプス小胞であることがわかった。脱分極パルスを与える前後での輝点の強度変化から、シナプス小胞が細胞膜に融合(開口放出)した場合と、シナプス小胞が細胞膜から細胞深部に遠ざかった場合を区別することができた。前者はCa電流が活性化されているときに輝点が消失し、後者はCa電流の活性化とは無関係に消失した。神経細胞からの化学伝達物質の放出には速い成分と遅い成分があり、それぞれシナプス小胞のプールサイズや放出確率が異なっていると考えられている。シナプス小胞の動態はシナプス伝達の促進や抑制といった可塑的変化に関連しており、伝達物質の放出・調節機構の分子基盤を明らかにする上でも詳細な解析が必要である。本研究は、近接場光顕微鏡を用いて膜直下におけるCa蛍光指示薬の強度変化を高速イメージングすることによって、軸索終末部におけるCaチャネルの開閉に伴う細胞内Caイオンの動態、および、開口放出とエンドサイトーシスにおけるシナプス小胞の動態を明らかにすることである。本年度は、膜近傍のCaイオン動態に的を絞って実験を行った。キンギョ網膜から単離したオン型双極細胞をパッチ電極で膜電位固定してCa電流を計測すると共に、パッチ電極からCa蛍光指示薬を導入して軸索終末部の膜近傍(<150nm)におけるCa動態を近接場光顕微鏡と高速イメージング装置(時間分解能約3ms)を組み合わせて観察した。その結果、Ca電流を短時間(約5ms)活性化させると、培養用ディッシュのガラス面に張り付いた軸索終末部に複数の明るいスポットが瞬時に生じた。これらのスポットは、Ca電流をCoイオンで阻害すると消失したことから、Caチャネルのクラスターを介して流入したCaイオンによって生じていることが明らかになった。このCaスポットの密度は1平方pmあたり約0.1個であり、また、最も隣接したスポット間の平均距離は約2.5μmであった。これらの値は、キンギョ網膜のオン型双極細胞軸索終末部を超薄連続切片法で電子顕微鏡観察し、シナプスリボンの密度および最も隣接したリボン間の距離を計測した値にほぼ一致した。したがって、これらのCaチャネルのクラスターはシナプスリボン周辺に存在していることが推測される。

本研究は、近接場光顕微鏡を用いて膜近傍(150nm以下)における蛍光プローブの強度変化を高速イメージングすることによって、神経終末部でのCaチャネルの活性化に伴う細胞内Caイオンの動態とシナプス小胞の動態を明らかにすることを目的としている。実験には、キンギョ網膜から単離したオン型双極細胞を用いた。蛍光性Ca指示薬Fluo-4FFを記録用パッチ電極から双極細胞の軸索終末部に導入し、膜電位固定下で脱分極パルスを与えたときの蛍光強度の変化を近接場光顕微鏡で計測すると共に、Ca電流及び開口放出に伴う微小膜容量変化を記録した。観察された複数のCaドメインの時空間変化をミリ秒オーダーで解析した結果、各Caドメインの中心部と約500ミクロン離れた周辺部でのCaイオン濃度上昇の時間遅れは、微小膜容量変化の測定から推定された早い開口放出と遅い開口放出の時間遅れの半分以下であった。時間遅れの不一致の原因として、Ca測光系のアーティファクトである可能性や、Caドメインの中心部と周辺部で開口放出に関与するCaセンサーの感受性が異なる可能性等が示唆された。細胞外からFM1-43をシナプス小胞に取り込ませ、近接場光で励起された蛍光像(輝点)を計測した。双極細胞に脱分極パルスを与える前後で輝点がどのように変化するかを解析した結果、シナプス小胞が細胞膜に融合(開口放出)したのか、あるいは、細胞膜から単に遠ざかったのかを区別することができた。
非直交変換に基づく高速・高精度・安定な行列計算アルゴリズムの設計手法の確立

今年度は,昨年度に引き続き,時間依存固有値問題の解法とシフト線型方程式の解法の2つのテーマについて,非直交変換を用いたアルゴリズムの開発と解析を行った。(1)時間依存固有値問題とは,時間に依存する行列A(t)の固有値・固有ベクトルをtの関数として求める問題である。本研究では,A(t)が実対称の場合を扱う。本問題に対し,昨年度の研究では,荻田・相島の固有ベクトル反復改良法に基づく効率的なアルゴリズムを提案したが,今年度はその理論的解析を行った。特に,近似固有ベクトル行列が与えられたときに,それに対応する真の固有ベクトル行列がある条件の下で一意的に存在することを示すとともに,真の固有ベクトル行列を求めるためのニュートン型解法の収束半径と収束率について,荻田・相島の原論文の結果を改良した結果を与えた。これらの理論的結果は,提案手法の高信頼化のために重要である。また,提案手法をメニーコアプロセッサXeon Phi上で実装し,1ステップごとに固有値問題を解き直す素朴な解法に比べて,最大7倍程度の高速化が実現できることを示した。(2)シフト線型方程式とは,(A+σI)x=bの形の方程式で,特にAが実対称またはエルミート,σが純虚数の場合は,シュレーディンガー方程式の時間発展の計算など,多くの応用がある。本問題に対しては, CG法(共役勾配法)を複素対称行列に拡張したCOCG法が広く使われているが,本研究では,shifted MINRES法と呼ばれる解法を用いることを提案し,同手法が,計算の安定性,残差の単調減少性,反復あたりの行列ベクトル積の回数などで,COCG法よりも優れた性質を持つことを示した。また,電子状態計算ソフトELSESから得られる実問題の行列を用いて,これらの結果を実験的に確認した。非直交変換に基づきながらも安定性を実現しているアルゴリズムを取り上げ,その理論的解析を行うという目標に向かい,研究がほぼ順調に進展している。これまでに取り上げた時間依存固有値問題の解法とシフト方程式の解法は,ともに非直交変換を効果的に活用できているアルゴリズムの例であるが,本研究での理論的解析により,その安定性の理由の一端を明らかにできたと考えている。引き続き,既存アルゴリズムの解析を行い,その安定性の理由を探るとともに,安定性を実現しているメカニズムを一般的な形で理解し,ベクトルの直交化,B-直交化など,新たなアルゴリズムの開発に役立てる。今年度は,時間依存固有値問題の解法とシフト線型方程式の解法の2つのテーマについて,非直交変換を用いたアルゴリズムの開発を行った。自明な解法として,tごとに固有値問題を解き直す方法があるが,1ステップ前のtの値を利用することで,計算量をより少なくできる解法が望まれる。本研究では,荻田・相島の固有ベクトル反復改良法に基づくアルゴリズムを提案した。荻田・相島法は,固有ベクトルを並べた行列X(t)を,途中で非直交行列となることも許しつつ,X^T(t)X(t)が単位行列かつX^T(t)A(t)X(t)が対角行列に近づくように更新してゆく手法である。この方法では,固有値が近接あるいは重複する場合に収束性が悪化するが,本研究では,部分対角化による前処理を導入することでこの問題を解決し,効率的なアルゴリズムを構成した。(2)シフト線型方程式とは,(A+σI)x=bの形の方程式で,特にAが実対称,σが純虚数の場合は,シュレーディンガー方程式の時間発展の計算など,多くの応用がある。本問題の解法としては,COCG法が広く使われている。COCG法はCG法(共役勾配法)を複素対称行列に拡張した手法であるが,内積の代わりに疑似内積を使うため,生成されるクリロフ部分空間の基底が直交性を持たず,CG法の持つ無破綻性,誤差のAノルムの単調減少性などの優れた特徴を一般には持たない。にもかかわらず,シフト方程式に対するCOCG法は多くの場合,比較的安定に収束する。本研究ではこの理由について理論的な検討を行った。その結果,ある種のシフト方程式については,無破綻性と残差の準単調性が成り立つことを示し,収束の安定性の理由をある程度解明できた。当初の予定では,固有値問題と直交化を取り上げるはずであったが,シフト方程式に対するCOCG法という応用上重要な例が見つかったため,直交化に代えてそちらの解析を先に行った。

特に,近似固有ベクトル行列が与えられたときに,それに対応する真の固有ベクトル行列がある条件の下で一意的に存在することを示すとともに,真の固有ベクトル行列を求めるためのニュートン型解法の収束半径と収束率について,荻田・相島の原論文の結果を改良した結果を与えた。これらの理論的結果は,提案手法の高信頼化のために重要である。また,提案手法をメニーコアプロセッサXeon Phi上で実装し,1ステップごとに固有値問題を解き直す素朴な解法に比べて,最大7倍程度の高速化が実現できることを示した。(2)シフト線型方程式とは,(A+σI)x=bの形の方程式で,特にAが実対称またはエルミート,σが純虚数の場合は,シュレーディンガー方程式の時間発展の計算など,多くの応用がある。本問題に対しては, CG法(共役勾配法)を複素対称行列に拡張したCOCG法が広く使われているが,本研究では,shifted MINRES法と呼ばれる解法を用いることを提案し,同手法が,計算の安定性,残差の単調減少性,反復あたりの行列ベクトル積の回数などで,COCG法よりも優れた性質を持つことを示した。また,電子状態計算ソフトELSESから得られる実問題の行列を用いて,これらの結果を実験的に確認した。非直交変換に基づきながらも安定性を実現しているアルゴリズムを取り上げ,その理論的解析を行うという目標に向かい,研究がほぼ順調に進展している。これまでに取り上げた時間依存固有値問題の解法とシフト方程式の解法は,ともに非直交変換を効果的に活用できているアルゴリズムの例であるが,本研究での理論的解析により,その安定性の理由の一端を明らかにできたと考えている。引き続き,既存アルゴリズムの解析を行い,その安定性の理由を探るとともに,安定性を実現しているメカニズムを一般的な形で理解し,新たなアルゴリズムの開発に役立てる。引き続き,既存アルゴリズムの解析を行い,その安定性の理由を探るとともに,安定性を実現しているメカニズムを一般的な形で理解し,ベクトルの直交化,B-直交化など,新たなアルゴリズムの開発に役立てる。2017年9月に国際学会での発表を予定していたが,より研究を進めた段階で発表したほうがよいと判断したため,次年度使用額が生じた。2018年度の国際学会のための旅費として使用する。共同研究先のスロバキア国立科学アカデミーが企画する研究会が,予定より遅れて2019年度の開催となったため,参加のための旅費と,参加後に投稿予定の論文の出版費用とを次年度に使用する。
液晶エラストマーの異方収縮を利用したキンク導入の試みとそれによる高分子材料の強化

液晶エラストマーの異方収縮を利用したキンク導入とそれによる高分子材料の強化を行なう。液晶エラストマーと結晶性高分子鎖からなるブロック共重合体を合成し、この材料に対してキンクを発現させ、材料強化を図る。キンク導入のために液晶エラストマーの異方的収縮を利用する。我々はすでに、高分子材料(SBSトリブロック共重合体)にキンクが発現する場合の小角X線散乱パターンの計測を行なっており、一軸延伸するとキンクが発現するという知見を踏まえ、本研究の着想に至ったが、材料強化には結びついていないので、キンクを一軸延伸によって導入すべきではなく、延伸せずにキンクを導入することが材料強化のために重要である。
心筋細胞のDNA損傷応答におけるDNAメチル化制御機構の役割

抗がん剤投与マウスの心筋組織を用いて、抗がん剤誘導性DNA損傷におけるANP・BNP遺伝子のプロモーター領域とエピジェネティック修飾の変化と意義、特にDNAメチル化及びDNMTとの機能的物理的な相互作用を明らかにするとともに、DNA損傷応答におけるDNAメチル化の役割について検討する。
液相粒子分散組織の結晶粒成長とそのピン止め効果

液相を分散させた多相組織の結晶粒成長について実験と解析を行い、次の結果を得た。(1) Fe-Bi、Zn-Bi、Al-Bi系では粒界近傍に無析出ゾーン(PFZ)を形成し、母相内では微細な液相粒子が、又粒界上には粗大液相粒子が形成され、粒成長が著しく抑制される。(2) Fe-Mn-Al基合金におけるフェライト(α)、オーステナイト(γ)及びα+γ組織の粒成長に及ぼす液相Biの影響を調査した結果、母相がαの場合PFZの形成と粒界上の粗大Bi粒子が形成される。一方、母相がγ相の場合は粒内の微細分散は確認されず、粒界上に粗大粒子が存在する。α+γ組織の場合は、α相とγ相の量比によって組織形態が異なる。偏晶型合金の粒成長の実験を行い、次の結果を得た。1.予め冷間加工を施したFe-Bi、Zn-Bi、Al-Bi及びAl-Sn合金を再結晶及び結晶粒成長させたところ、母相結晶粒内には微細な液相粒子が分散していた。また、粒界移動に伴い無析出物帯及び粒界状粗大粒子が形成されていた。2.予め冷間加工を施したFe-In、Al-In、Al-Bi、Al-Pb合金を再結晶及び結晶粒成長させたところ、母相粒内には液相粒子が存在していなかった。大部分の粒子は粒界上特に3重点上に存在していた。さらにこれらの合金の粒成長に関して速度論的解析を行い次の事がわかった。3.粒内に微細に分散した液相粒子はマトリックス中の溶質元素の体拡散により成長し、3乗則により整理する事ができる。4.結晶粒界上に存在する粒子の成長機構は組織形態及び体積分率により変化する。PFZ形成型の場合、粒界上の粒子は粒界拡散に従い成長し、4乗則により整理できる。5.3重点凝集型の場合、体積分率が少ない場合は界面拡散に従い成長するため4乗則に従い成長するが、体積分率が大きくなるにつれ、液相中の拡散が支配的になり3乗則により整理できる。6.組織形態には違いがあるものの、いずれの組織形態の合金においても著しく結晶粒成長が抑制されることが判明した。7.Zn-Bi合金における結晶粒成長過程に関して、高温ステージを用いたその場観察を行った。粒界移動とともに液相Bi粒子が引き摺られながら移動していく様子や、移動する粒界上にて液相Bi粒子が著しく粗大化する様子が観察された。また、粒界の曲率とは反対方向へと粒界が移動する様子が観察された。よって、粒界移動に伴い無析出物帯が形成されるような合金系の場合、粒界移動の駆動力としてGibbs-Thomson効果以外の力が作用しうることが判明した。Fe-Mn-Al基合金のフェライト(α)とオーステナイト(γ)およびα+γ組織の粒成長に及ぼす液相Biの影響を調べ、次の結果が得られた。1)母相がα相の場合、Fe-Bi合金等で観察されたように結晶粒界の移動に伴い、液相粒子が引き摺られ、無析出物帯及び粒界に粗大液相粒子が形成され、また粒内のα相に微細な液相Biが分散していた。2)母相がγ相の場合、母相粒内には液相粒子は殆ど分散しておらず、結晶粒界に粗大な粒子が多数存在していた。3) α相及びγ相に液相Biを分散させた場合、組織形態の違いはあるものの、母相の結晶粒成長は著しく抑制された。4) α+γ組織の粒成長に及ぼす液相Biの影響を調べた結果、母相結晶粒径は更に微細になる事がわかった。5) α+γ+液相Biの3相の組織形態は主相がα相の場合とγ相の場合とで異なる事がわかった。即ち、α相が主相の場合、α相内には微細なBi粒子が分散し、結晶粒界の移動に伴い無析出物帯が形成されるが、γ相内の粒内にはBi粒子は存在しない。一方、γ相が主相の場合は大部分のBi粒子は結晶粒界上に存在する。6) α+液相Biの2相組織の場合、液相Bi粒子の成長はBiの体拡散に支配され時間の3乗則に従う。また粒界上の粒子は母相と粒子間の界面を拡散路とするので、その成長速度は4乗則に従う。母相の結晶粒成長も粒界上の粒子の成長に律速されるため粒子と同様に4乗則に従う。

7) γ+液相Biの2相組織の場合、大部分の粒子は粒界上に存在し、母相と粒子の界面を拡散路とするため4乗則に従い、母相の結晶粒成長も粒子と同様4乗則に従う。8) α+γ+液相Biの3相組織の場合、粒界上の粒子は界面拡散により4乗則に従い、母相も同様に4乗則に従う。Phase-field法を用いた液相分散2相組織の結晶粒成長シミュレーションを行うとともに液相粒子を含む2相および3相組織の結晶粒径相関と速度論について熱力学的解析を行い、次の結果を得た。1) Al-Bi合金の熱力学データを用いてシミュレーションを行い、実験で得られた粒界移動に伴う液相粒子の引き擦り現象やそれに伴う無析出物帯の形成に類似した組織をシミュレートする事が出来た。2) Al-Pb合金の結晶粒成長過程をシミュレートした結果、実験で確認されたように粒界3重点上に多くの液相Pb粒子が凝集していく様子がシミュレートされた。3)双結晶や円形上の結晶粒組織を用い、液相の分散状況を制御したシミュレーションを行った結果、結晶粒成長の駆動力が曲率に依存するGibbs-Thomson効果に加え、粒内に分散している液相粒子の界面エネルギーの寄与が存在する事が確認された。4) α+γ+液相の3相組織におけるα相、γ相および液相粒子の各相の相関関係について界面エネルギー極小の条件より導き出し、次の結果が得られた。イ:主相の粒径RMと体積分率fMの平方根の比は副相の粒径RSとその体積分率fSの平方根の比と等しい。ロ:主相の粒径RMは粒子の粒径rに比例し、その体積分率fの平方根に反比例する。ハ:副相の粒径RSは主相の粒径と同様に粒径rに比例し、その体積分率fの平方根に反比例する。これらの3相組織の各相間の粒径の相関関係は本合金の他、Cu合金等にも適用でき、汎用的な関係であると言える。26年度が最終年度であるため、記入しない。フェイズフィールド法によるシミュレーションの専門的知識を有する研究協力者を採用予定であったが、本人の都合により参画できなくなった。材料工学フェイズフィールドシミュレーションについても、当初の計画通りに推進していく予定である。当初の実験計画にほぼ沿って実験が遂行するとともに、粒成長のメカニズムの解析も予想以上に順調に進行している。当初の実験計画に沿って今後も推進していく予定である。そのための技術職員も確保している。
複数の人間が作成した大規模データベースにおける概念相違発見手法の研究

本年度は大規模データベースからの知識発見という観点に立ち、高速に(データ数nに対してO(n^3)程度の規模で)複数の人間の間に存在する概念の相違を検出するシステム構築のために、従来から我々が提案してきた手法の計算量解析を行った.一般的に人々は異なった視点や観点を持つため,たとえ同じ事象に対しても異なる概念を持つ可能性がある.概念における相違が存在する場合には同じ事象に対してでも意見を交換して相互理解を深めることが不可能となるため,概念の相違を除くことは背景知識が異なる人々がグループとして共同作業を行う場合に特に重要となる.ユーザーの知識を具体的な決定木として構造化し,概念の差異を決定木間の構造における差異として検出を行うという我々の枠組みにおいて,決定木の生成手法として情報量基準に基づくID3を利用する手法と,「多様な構造化」というコンセプトに基づく遺伝アルゴリズムを利用する手法を提案してきた.遺伝アルゴリズムを利用する手法により概念相違検出精度の向上は達成したものの,非常に長い計算時間を必要とするという新たな問題も明らかになった,このため,大規模データベースからの知識発見という観点に立ち、高速に(データ数nに対してO(n^3)程度の規模で)複数の人間の間に存在する概念の相違を検出するシステム構築のために、遺伝プログラミングを利用した手法の計算量解析を行い,概念相違検出の高速化のための基礎検討を行った.本年度は大規模データベースからの知識発見という観点に立ち、高速に(データ数nに対してO(n^3)程度の規模で)複数の人間の間に存在する概念の相違を検出するシステム構築のために、従来から我々が提案してきた手法の計算量解析を行った.一般的に人々は異なった視点や観点を持つため,たとえ同じ事象に対しても異なる概念を持つ可能性がある.概念における相違が存在する場合には同じ事象に対してでも意見を交換して相互理解を深めることが不可能となるため,概念の相違を除くことは背景知識が異なる人々がグループとして共同作業を行う場合に特に重要となる.ユーザーの知識を具体的な決定木として構造化し,概念の差異を決定木間の構造における差異として検出を行うという我々の枠組みにおいて,決定木の生成手法として情報量基準に基づくID3を利用する手法と,「多様な構造化」というコンセプトに基づく遺伝アルゴリズムを利用する手法を提案してきた.遺伝アルゴリズムを利用する手法により概念相違検出精度の向上は達成したものの,非常に長い計算時間を必要とするという新たな問題も明らかになった,このため,大規模データベースからの知識発見という観点に立ち、高速に(データ数nに対してO(n^3)程度の規模で)複数の人間の間に存在する概念の相違を検出するシステム構築のために、遺伝プログラミングを利用した手法の計算量解析を行い,概念相違検出の高速化のための基礎検討を行った.
類書(古代的百科全書)の書承と日本文学への影響に関する基礎的研究

当該年度は、人物故事を扱った類書の中で、広く流布した『蒙求』の成立資料の可能性のある『類林』について、基礎的な書誌・諸本調査を行い、同書と『蒙求』との影響関係が立証できるか、『類林』自体も日本文学に影響していると判断できるか等の観点で研究を行った。まず、日中における典籍中に、『類林』の書名を含む書の調査を行った所、日本書で15種、中国書で3種が確認できた(佚亡書を含む)が、現存典藉・佚文中のいずれにも、原撰たる『類林』に関する記述が見当たらなかった。また、それらの名称の出現も、撰述期の唐代よりはるか後代の近世期に頻出される故、「類林」の名称は、書名としてよりも「類聚編纂物」という普通名詞的な理解で原態から乖離した状況で広まっていたと判断した。さらに、『類林』の書誌・諸本調査所収の故事と最古注系『蒙求』所収の故事の比較検証を行った所、両書には極めて親近度の高い内容の故事が記述されるが、必ずしも直接的な受容関係を求めるべきではなく、両書の撰述された時代状況に眼を向けるべきとの結論に至った。しかし、両書は唐代宋代の修史作業を経た後の典籍と内容を異にする記述内容を伝える点で、非常に広範かつ息の長い伝達媒体として機能していた点で大きな存在意義があるといえる。また、調査の過程で『白氏六帖』よりも、後代に撰述された『白氏六帖』の方が、古態の記事を伝存しているという指針を得たが、その実証にはより幅広い諸本の収集が不可欠なため、これについては次年度以降の課題としたい。なお、本年度研究の遂行にあたり、OCRソフト利用による初期入力、データベースソフト利用のデータ形成が有効であった故、『人文学と情報処理』(勉誠社)誌の研究者の連載原稿にて、次年度にその成果の一端を紹介する予定である。
合理的分子設計に基づく逆フォトクロミック分子の創製

光照射によって2つの異性体間で物性変化が生じるフォトクロミック分子は機能性材料への応用が研究されているが、光照射時に消色する“逆フォトクロミズム"を示す分子は報告例が少ない。その一因として、分子設計段階で逆フォトクロミズムを示すことが明確に予測できる分子骨格が確立されていないことが挙げられる。本研究では、通常のフォトクロミック分子では不可能であった新たな物性を発現する分子を開拓して今までにない機能性材料へと展開させることを目的として、逆フォトクロミズムを示す分子骨格の検討を行った。本研究では、ノルボルナジエン誘導体のフォトクロミック挙動に及ぼす置換基効果を精査して、逆フォトクロミック分子の合理的な分子設計と創製手法を確立する。本研究では、逆フォトクロミズムを示す分子骨格を明らかにし、通常のフォトクロミック分子では不可能であった新たな物性を発現する分子を開拓することで、これまでにない機能性材料への応用へと展開させることを目的とする。ボルボルナジエン(NBD)は光照射により二重結合部位の結合組み換えが起こることで、クアドリシクラン(QC)と呼ばれる多環状炭化水素へと変化し、触媒または熱的に元のNBDに戻ることが報告されている。この系では、光照射によりNBDの2つの二重結合が開裂してQCが形成される際、共役長が減少するために逆フォトクロミズムが生じることが期待される。また、NBDは適切なドナーおよびアクセプター性置換基を導入することで、ドナー部位からアクセプター部位へのエネルギー移動に起因する吸収が長波長領域に現れることも報告されている。実際に量子化学計算結果から、ドナー性置換基としてp-メトキシベンゼン、アクセプター性置換基として-COPh基を導入したNBD誘導体が逆フォトクロミズムを分子として適切であることが示唆された。そこで、平成27年度は設計した目的化合物の合成およびそのフォトクロミック特性についての検討を行った。設計した分子は目的どおり、逆フォトクロミズムを示すことが明らかとなったが、その光異性化率は非常に低く、置換基の再検討が必要な結果となった。平成27年度は計画どおり、量子化学計算から“逆フォトクロミズム"を示すことが示唆される適切な分子を設計し、その合成に成功した。また、紫外可視分光光度計を用い、光照射前後の溶液の吸収スペクトル、および光照射によって生成する異性体の熱戻り反応過程の経時変化を測定して、フォトクロミック挙動の大枠を検討した。その結果、設計した分子は目的どおり、逆フォトクロミズムを示すことが明らかとなり、本研究の戦略は正しいことを示すことができた。しかし、設計した分子の光異性化率は非常に低く、最終目標である機能性材料への応用には、分子設計の再検討が必要な状況である。本研究では、ノルボルナジエン誘導体のフォトクロミック挙動に及ぼす置換基効果を精査して、逆フォトクロミック分子の合理的な分子設計と創製手法を確立することを目的とする。ノルボルナジエン(NBD)は光照射により二重結合部位の結合組み換えが起こることで、クアドリシクラン(QC)と呼ばれる多環状炭化水素へと変化し、触媒または熱的に元のNBDに戻ることが報告されている。実際に量子化学計算結果から、ドナー性置換基としてパラメトキシベンゼン、アクセプター性置換基としてCOPh基を導入したNBD誘導体が逆フォトクロミズムを示す分子として適切であることが示唆された。平成28年度は、前年度に設計・合成を行った新規ノルボルナジエン誘導体のフォトクロミック特性についての検討を詳細に行った。ドナー性、アクセプター性置換基の異なる誘導体も数種合成を行い、それらのフォトクロミック特性についての検討も行ったが、光異性化率のよい誘導体の開発には至らなかった。

本研究では、通常のフォトクロミック分子では不可能であった新たな物性を発現する分子を開拓して今までにない機能性材料へと展開させることを目的として、逆フォトクロミズムを示す分子骨格の検討を行った。平成27年度の研究成果を踏まえ、分子設計の再検討、合成、フォトクロミック特性の検討を行い、これまでにない機能性材料へと展開するための礎を構築する。すでに、分子設計の再検討は行っており、現在合成を検討中である。前年度で、誘導体の合成方法はある程度確立されているので、ドナー性置換基、アクセプター性置換基の組み合わせにより、数種類のノルボルナジエン誘導体を合成し、そのフォトクロミック特性を検討することも視野に入れ、本研究を推進させる。有機光化学当該年度は、分子設計・合成を行った目的分子が、期待したフォトクロミック特性を発現しなかったために、当初購入を予定していた物性測定に必要な装置の購入を見送った。そのため、翌年度分として助成金の請求を行う。28年度はフォトクロミズムの検討に不可欠である、光照射器の購入を予定している。また、測定に必要となる物品の購入も検討している。
琵琶湖生態系の変動の鍵を握る動植物プランクトンに関する研究

2004年度は、昨年度までに明らかにした分析結果に基づき、以下の2点についてより詳細な解析を行った。最初に、(1)琵琶湖の過去100年にわたる動植物プランクトンの定量的データと既存の文献資料に基づく環境条件の2つの時系列データセットを用いて、変動要因に関する相関関係の解析を行った。さらに、琵琶湖では生態系のKey species, Daphniaが1980年頃より休眠卵を作らない生活史に変化していることが判明しているが、(2)なぜ1980年代以降、Daphniaが有性生殖しなくなったのかについて、考えられる3つの仮説を検証した。(1)の変動要因に関する解析では、琵琶湖冬季の代表的な植物プランクトンA.nipponicaが1980年代以降、減少したのは冬季温暖化に伴う鉛直混合の低下に起因すること、この種と対照的に80年代以降、大幅に増加したF.crotonensisはA.nipponica減少による珪酸余剰と窒素負荷の増大によることが示唆された。また、夏期に卓越して出現するようになった大型緑藻類Staurastrumは成層が強化されると増加する傾向にあることが判明した。(2)のDaphniaが有性生殖しなくなった理由に関しては、1980年以後は浮遊個体として越冬が可能になったため休眠卵を作らない個体群へと選択圧がかかったとする説が最も有力であった。つまり、Daphniaにとって食べにくいA.nipponicaが1980年以前は冬期の卓越植物プランクトンであったが、1980年以後はDaphniaにとって食べやすく良い餌のCryptomonasが冬期に卓越するようになった。その結果、餌環境が好転し、Daphniaは浮遊個体として越冬出来るようになり、休眠卵を作る遺伝型が減少したのではないかと推察された。2003年度に、京都大学が実施している琵琶湖の定期観測サンプル1980年から2000年までの過去20年間分について、特に動物プランクトン群集の変動を定量的に解析した。その結果、近年の大型優占種Eodiaptomusは、過去20年間ほとんど変動が無いのに対し、同じく大型優占種であるDaphniaは、年によって大きく変動し、両種の出現パターンが大きく異なることが明らかになった。そこで、生態系の鍵を握る、現存量変化の激しいDaphniaの変動要因について、出現する季節性の変化、特に生活史を維持する上で重要な冬季の出現パターンに着目し、データ解析を行った。その結果、1980年頃よりそれまで越冬不可だった冬季にDaphniaが越冬可能になり、しかもその時期以降、越冬可能時期が数年連続して続く、という出現パターンに大きな変化が生じていることが判明した。さらに、興味深いことにその時期は、それまで大量に作っていたDaphniaが休眠卵を作らなくなった時期に一致していることも明らかになった。今年度は、さらに過去100年の珪藻・緑藻の植物プランクトン群集の変動について、地球温暖化に関わる琵琶湖での冬季鉛直循環の強弱変化との関連を、気象情報などを加味した鉛直循環パラメーターを用いて詳細に検討した。そして植物プランクトン群集変化に影響を与えると考えられうる栄養塩、水温などの指標、特に、琵琶湖の代表的な固有種プランクトン動態と各種の環境要因の関係を単回帰あるいは重回帰分析を用いて検証し、その固有種の動態へ寄与する環境要因寄与率まで具体的に明らかにした。以上これまでの解析結果は、第68回大会の日本陸水学会にて発表し、植物プランクトン群集の変動解析結果についても、現在、取りまとめ中で近日中に、国際誌Limnology and Oceanographyに投稿する予定である。
腎癌組織特異抗原の解析と腫瘍特異的抗体治療法の研究

本学総合医科学研究所・免疫学部門黒澤教授より供与を受けたヒト抗体型ファージ・ライブラリー(AIMS5ライブラリー)を用い、3種類腎ガン細胞株で計5回のスクリーニングを行い、cp3フォームを有するファージ抗体343種類が単離された(黒澤、赤堀)。また、本学のIRBに申請し認可を受けたプロトコールのもと充分なインフォームド・コンセントにより得られた臨床検体(病理診断で淡明細胞癌であった臨床検体5組織)による2次スクリーニングにて腎癌に特異的かつ正常組織に反応しない抗体を選別した。これらの抗体でのFACSは腎癌樹立細胞株および当科にて樹立した腎癌細胞株にてより強い陽性像を示し、腎癌組織特異的であることを強く示唆した。また、これら7種類の抗体はいずれも淡明細胞癌に起因した樹立細胞株であったことより腎細胞癌の中でも最もその頻度の多い淡明細胞癌に対する抗原の同定およびそれに対するより純化された抗体の単離が可能と考えられる。また、選別されたこれら抗体と腎癌細胞株を用いたWestern blotおよび免疫沈降法により得られたBandを切り出し、MSを用いることにより癌特異的抗原を同定したところ、複数の癌特異的抗原が同定された。このように選択された抗体をIgG化し、ADCC活性などの生理活性の検索を行ったところ、我々が取得した抗体が十分な生理活性を有していることが示された。現在、担癌マウスを用いた投与実験を行っているが、生体内でも十分に効果が期待できるものと考えている。共同研究者である黒澤らより供与されたヒト抗体型ファージ・ライブラリー(AIMS5ライブラリー)を用い完全ヒト型の腎癌組織特異的抗体の作製を目指している。このファージ・ライブラリーにより様々な抗原に対してヒト抗体単離調製を実施した結果、自然界に存在する抗原となり得る様々なエピトープに対して特異的に結合する抗体が必ず含まれていることが既に証明されている。既存腎ガン細胞株(3種類)を用い計5回のスクリーニングを行い、cp3フォームを有するファージ抗体331種類が単離された。臨床検体(病理診断で淡明細胞癌であった臨床検体5組織)による2次スクリーニングにて既に7種類の腎癌に特異的かつ正常組織に反応しない抗体を選別している。これらの抗体でのFACSは腎癌樹立細胞株により強い陽性像を示し、腎癌組織特異的であることを強く示唆した。また、これら7種類の抗体はいずれも淡明細胞癌に起因した樹立細胞株であったことより腎細胞癌の中でも最もその頻度の多い淡明細胞癌に対する抗原の同定およびそれに対するより純化された抗体を単離した。また、選別されたこれら抗体と腎癌細胞株を用いたWestern blotおよび免疫沈降法により得られたBandを切り出し、MSを用いることにより癌特異的抗原を同定する。現在までに有力と考えられる抗原を5種類同定している。癌組織特異的と考えられた抗体をIgG型ヒト抗体に変換し、腎癌樹立細胞株を用いたIn vitroでのADCC作用およびCDC作用にて、これらの抗体の機能を測定し腎癌特異的な抗腫瘍活性を有することが示された。以上のように、本ファージ・ライブラリーを用いたスクリーニングにて腎癌に特異的な抗体を検出し、腎癌に特異抗原を解析することにより、治療の標的となる癌抗原を同定し、ヒト抗体ライブラリーより特異的抗体を生成抽出している。ヒト腎癌に対する治療用抗体を作成することが本研究の最終的な目的である。

これらの抗体でのFACSは腎癌樹立細胞株および当科にて樹立した腎癌細胞株にてより強い陽性像を示し、腎癌組織特異的であることを強く示唆した。また、これら7種類の抗体はいずれも淡明細胞癌に起因した樹立細胞株であったことより腎細胞癌の中でも最もその頻度の多い淡明細胞癌に対する抗原の同定およびそれに対するより純化された抗体の単離が可能と考えられる。また、選別されたこれら抗体と腎癌細胞株を用いたWestern blotおよび免疫沈降法により得られたBandを切り出し、MSを用いることにより癌特異的抗原を同定したところ、複数の癌特異的抗原が同定された。このように選択された抗体をIgG化し、ADCC活性などの生理活性の検索を行ったところ、我々が取得した抗体が十分な生理活性を有していることが示された。現在、担癌マウスを用いた投与実験を行っているが、生体内でも十分に効果が期待できるものと考えている。
冗長アクチュエータ系の自己最適化によるスケーラビリティ獲得の研究

この研究の目的は、冗長性を有するアクティブ除振装置を連続的に稼動しながら必要に応じてアクチュエータの数を増減する能力つまりスケーラビリティを獲得し、自動的に各アクチュエータに対して最適に負荷を分散する方法を構築することである。これにより劣化したアクチュエータを交換しながら連続的に運用したり、除振台が支持する負荷に合わせて数を増減することが可能となる。最適出力分配法を改良することで、アクチュエータ数を滑らかに増減することを可能とする、より一般的な動的最適出力分配法を構築し、スケーラビリティの獲得を実現する方法を示した。この研究の目的は、冗長性を有するアクティブ除振装置を連続的に稼動しながら必要に応じてアクチュエータの数を増減する能力つまりスケーラビリティを獲得し、劣化したアクチュエータを交換しながら連続的に運用したり、除振台が支持する負荷に合わせてアクチュエータの数を増減することを可能とし、さらに自動的に各アクチュエータに対して最適に負荷を分散する方法を構築することである。平成25年度には、おおよその位置に配置されたアクチュエータの正確な位置を制御系が自ら推定する自己位置推定法、さらに適切な出力分配割合を自動的に導出する最適出力分配法の基礎的研究を行った。すべてのアクチュエータの配置を同時に推定するのは大変難しいことが分かったため、1台ずつをおおよその位置に追加挿入して発生力を段階的に変化させることで、追加された正確な位置を、テーブルに作用する力とモーメントのつり合いから、その都度同定する方法を採用した。これを再帰的に繰り返すことで、全ての配置を同定可能な方法を計画どおり構築できた。副次的な成果として、この方法を実機で実現するためには、全アクチュエータの有効受圧面積の推定が必要であることが分かったため、この方法についても構築し、さらに出力分配割合を動的に変化させる方法についても数学的基礎を構築した。また、実験装置についても、計画に合わせてマイコンを制御器としたアクチュエータ2台を構成した。得られた成果はこの研究の根幹を成す重要な成果である。加えて、有効受圧面積の推定と、動的な最適出力分配法への拡張といった大変有用な副次的な成果も得られた。この研究に関する成果は、当該研究分野の主要な会議であるMovic 2014国際会議へのアブストラクトが採択されフルペーパーの査読中であり、日本機械学会機械力学・計測制御部門主催のD&D 2014への講演申込みを行い採択が決定している。平成25年度に構築した適切な出力分配割合を自動的に導出する基礎的な動的最適出力分配法はスケーラビリティを獲得するための基礎的な手法として高い汎用性と有効性を持つことが分かったため、平成27年度に実施予定であった、スケーラビリティの獲得手法の構築を前倒しし、平成26年度には8個のアクチュエータを有する大規模な除振装置を稼動したままアクチュエータを増減する方法の研究を遂行した。これらを実現するために、アクチュエータの出力分配割合を滑らかに更新し、加えて制御系を稼働したまま振動などの不安定な挙動を生じることなくアクチュエータ数を滑らかに増減する方法を構築した。ここで得られた成果は、この研究の最終目標であるスケーラビリティの獲得のために最も重要であり根幹をなす成果である。加えて、アクチュエータの破損を自己検出し、自動的に他のアクチュエータに負荷を引き継ぐ方法についても本年度に研究を遂行し、制御性能を維持したまま破損したアクチュエータを取り除く方法についての研究成果が得られた。これらの成果は、当該研究分野の国際会議である2014年8月の国際会議Movic 2014、日本機械学会計測制御部門主催のD&D 2014で講演発表を行った。また上述のシステム稼働中のアクチュエータ増減手法に関する論文を投稿して採択され、日本機械学会の英文ジャーナルMechanical Engineering Journalへの掲載が決定している。平成25年度には、適切な出力分配割合を自動的に導出する基礎的な動的最適出力分配法を構築した。平成26年度にはスケーラビリティの獲得手法の構築を実施し、制御系を稼動したままアクチュエータを増減する方法の研究を遂行した。出力分配割合の更新方法として動的最適出力分配法を改良することで、アクチュエータの出力分配割合を滑らかに更新し、加えて制御系を稼働したまま振動などの不安定な挙動を生じることなくアクチュエータ数を滑らかに増減する方法を構築した。

構築した方法は冗長なアクチュエータ出力の分配割合を動的に変更するための一般的な手法となっており工学的のみならず学術的にも大きな意義を持ち、研究の目的を達成する上でも根幹をなす重要な成果である。この手法を適用することで本研究の目標を達成した。加えて、アクチュエータの破損を自己検出し、他のアクチュエータに負荷を引き継ぐ方法についても研究を遂行し、制御性能を維持したまま破損アクチュエータを取り除く方法の研究成果が得られた。平成27年度には、この研究全体を通して得られた成果を取りまとめ、連続的にアクチュエータ増減を行う方法に発展させた。この中で、アクチュエータ数を安定に増加(追加)する場合と減少(除去)する場合では、異なる手順を実行する必要があることが分かったが、これについても解決した。研究期間を通じて論文2編、国際会議発表3件、全国規模学会2件、地方支部講演会4件の成果発表を行った。この研究の目的は、冗長性を有するアクティブ除振装置を連続的に稼動しながら必要に応じてアクチュエータの数を増減する能力つまりスケーラビリティを獲得し、自動的に各アクチュエータに対して最適に負荷を分散する方法を構築することである。これにより劣化したアクチュエータを交換しながら連続的に運用したり、除振台が支持する負荷に合わせて数を増減することが可能となる。最適出力分配法を改良することで、アクチュエータ数を滑らかに増減することを可能とする、より一般的な動的最適出力分配法を構築し、スケーラビリティの獲得を実現する方法を示した。平成26年度には、除振台実験装置を構築して平成25年度で得られた基礎的な動的最適出力分配法の実証実験を行う事を計画していたが、実験装置を構築して設置するための十分なスペースを確保できなかったため、研究代表者の前所属の北海道大学に設置されている除振台実験装置を移設することができなかった。そのため、平成27年度に実験を行う計画に変更し、平成27年度に計画していたアクティブ除振台のスケーラビリティ獲得のためのアルゴリズムの構築を、計算機シミュレーションを用いて平成26年度に前倒して実施した。これらを実現するためにまず、アクチュエータの出力分配割合を滑らかに更新する方法、ならびに、システムを稼働したままアクチュエータ数を滑らかに増減する方法を構築した。得られた成果は、本研究課題の最終目標のスケーラビリティの獲得のための根幹をなす成果である。さらに、アクチュエータの破損を自己検出し、自動的に他のアクチュエータに負荷を引き継ぐ方法の構築についても、計画していた平成27年度から前倒しで平成26年度に遂行し、アクチュエータ破損時に自動的に破損アクチュエータを検出して取り除きアクチュエータ数を動的に減少する方法についても研究成果が得られた。したがって、アルゴリズム構築の観点からは、計画を大きく上回る達成度が得られたと言える。しかしながら、大規模な除振台の実験環境の整備が遅れており、平成27年度には実証実験を行う必要がある。平成26年度末の3月には除振台実験装置の移設の準備ならびに手続きを進行中であり、平成27年度早期には移設作業が完了して実験環境の整備を完了する見込みである。これにより大規模システムの実験が可能となる見込みであり、当初平成26年度に予定していた実験による実証試験、実験が必要な研究が可能となる。以上が「概ね順調に進展している」と評価した理由である。工学平成27年度前半中に除振台実験装置を研究代表者前所属の北海道大学から移設して改修を行いアクチュエータ数が8脚の大規模除振台実験装置を完成させる。
Ah受容体による遺伝子転写調節と慨日リズムの新たな相互作用の解明

転写調節因子アリルハイドロカーボン受容体(AHR)は、パートナータンパク質であるAHR nuclear translocator (ARNT)と2量体を形成し、異物代謝酵素であるシトクロムP450(CYP)1A1などの転写調節を行う。私はこれまでに、オールトランスレチノイン酸がAHR/ARNTの転写調節を抑制することを明らかにしてきた。さらに、今年度はAHR自身の転写調節を行う因子としてRetinoic acid receptor-related orphan receptor α(RORα)を初めて見出した。過去の報告から、AHRの発現量は発育段階や組織ごとに異なることや概日リズムを示すことが知られてきた。しかしながらAHR自身の転写調節機構についての研究は少なく、詳細は明らかになっていなかった。私は、ヒトAHRの転写開始点から約500bp上流にROR反応領域(RORE)が存在することを見出した。さらにsiRNAによりRORαをノックダウンすることでAHRのmRNA発現量が3。6倍に増加した。またAHR上流の配列を用いたレポーターアッセイを行ったところ、ROREの欠損または変異によってレポーター活性が増大した。これらのことから、RORαはROREを介してAHRの転写を抑制する因子であることが示唆された。RORαは、AHRの示すさまざまな発現パターンを制御する因子の候補となりうると考えられる。本研究は、いまだ不明なAHRの生理的作用についてさらなる理解を深めるのに大きく貢献すると考える。申請者は強力な抗酸化作用を有するカロテノイドであるアスタキサンチンがヒトおよびラットの肝癌由来培養細胞においてシトクロムP450 (CYP) 1A1のmRNAを誘導することを明らかにした。CYP1A1の転写調節因子であるAhR (Ary1 hydrocarbon receptor)の典型的リガンドに比べて、CYP1A1mRNA発現量の増大を早く引き起こすがその誘導は短く弱いものであることがわかった。Green Fluorescent Protein (GFP)-AhRを発現させたCOS-7細胞において、アスタキサンチンによる刺激の10分後からAhRの核内移行が観察された。さらに、レポーターアッセイによりCYP1A1の上流1.2kbのプロモーター領域の転写活性がアスタキサンチン刺激によって増大すること、その領域内に複数存在するXRE (xenobiotic responsive element)コア配列が標的であることをゲルシフトアッセイ法により明らかにした。これらの研究結果は従来のリガンドとまったく異なる化学構造・物性を有するアスタキサンチンがAhRの核内移行を引き起こし、XREを介して下流のCYP1A1の転写を促進することを示すものである。AhRの生理的リガンドはいまだ明らかにされておらず、その生体内での働きにも不明な点が多い。食事を介して日常的に摂取するカロテノイドがもたらすAhR介在細胞内シグナルカスケードの詳細な変化を初めて示したことが本研究の特に重要な成果であると考える。アリルハイドロカーボン受容体(AHR)は重要な転写調節因子であり、パートナータンパク質であるAHR nuclear translocator(ARNT)と2量体を形成し、異物代謝酵素であるシトクロムP450(CYP)1A1などの転写調節を行う。私は、ヒト肝癌由来培養細胞株であるHepG2においてオールトランスレチノイン酸がAHR/ARNTの転写調節を抑制することを明らかにした。1-100nMの低濃度のオールトランスレチノイン酸はヒトCYP1A1のエンハンサー/プロモーター領域における転写活性化能を抑制し、CYP1A1のmRNA発現量を大きく減少させた。また、このレチノイン酸による転写抑制作用はレチノイン酸受容体(RAR)の遺伝子ノックダウンおよびRARアンタゴニストAGN193109の添加によって打ち消されたことから、RARを介していると考えられた。さらに、クロマチン沈降法により1-100nMのオールトランスレチノイン酸がヒトCYP1A1のエンハンサー/プロモーター領域におけるARNTのリクルートを阻害することが明らかになった。本研究により、AHRによる転写調節が低濃度のレチノイン酸により抑制を受けることが初めて明らかになった。また、これらの成果はAHR/ARNTとRARが機能的に相互作用することを示唆するものであり、いまだ不明なAHRの生理的作用についてさらなる理解を深めるのに大きく貢献すると考える。6倍に増加した。

これらのことから、RORαはROREを介してAHRの転写を抑制する因子であることが示唆された。RORαは、AHRの示すさまざまな発現パターンを制御する因子の候補となりうると考えられる。本研究は、いまだ不明なAHRの生理的作用についてさらなる理解を深めるのに大きく貢献すると考える。本年度の研究実施計画に従い、カロテノイドおよびレチノイン酸がAHRによる転写調節機構に与える影響について調べることができ、予想していたようにレチノイン酸によってAHRのパートナータンパク質であるARNTのリクルートが阻害されることを明らかにできたためである。また、研究を進めるうえで多くの新しい実験手技を身につけることができたことも大きな収穫の一つであった。これまでの研究から、レチノイン酸がRARを介してAHR/ARNTによる転写調節を抑制することが初めて明らかになった。そこで、私は「RARとAHR/ARNTカスケードの間に相互作用が存在する」という仮説を立てた。今後はこの仮説を検証するために、共免疫沈降法などを用いてこれらのタンパク質の相互作用を調べる予定である。
NAAG分解酵素阻害薬の臨床応用に向けての基礎研究

NAAG分解酵素阻害薬を用いて、NAAGの作用を検討した。NAAG分解酵素阻害薬である2PMPA・ZJ43などを全身投与・髄腔内投与・脳室内投与・末梢投与することにより、鎮痛効果が得られることが報告されてきた。今回は特に青斑核に注目し、青斑核に2PMPAを選択的に投与することによる鎮痛効果を検討した。2PMPAは、青斑核を介して脊髄でのノルアドレナリンの放出を増加させることにより鎮痛効果を示すこと、この2PMPAの作用がmGluR3を介することを確認した。NAAG分解酵素阻害薬は、多くの部位で作用することが確認でき、臨床応用を検討すべき薬物であることを確認した。NAAG分解酵素阻害薬の脳室内投与により鎮痛効果があることは知られているが、その詳細な作用部位は知られていない。本研究では、NAAG分解酵素阻害薬をステレオ手術の技術を用いて青班核(LC)に投与して、その効果を検討した。NAAG分解酵素阻害薬としては、2PMPAとZJ43を用いた。痛みモデルは、ラットホルマリンテストを用いた。2PMPA、ZJ43は、ホルマリン皮下注側と同側・対側に投与しても鎮痛効果が確認されたが、対側に投与した時のみLY341495腹腔内投与・idazoxan髄腔内投与にて拮抗された。従って、NAAG分解酵素阻害薬の鎮痛効果は、同側・対側で異なることが示された。腹腔内投与した2PMPAの効果は、idazoxan髄腔内投与にて完全に拮抗された。このことから、全身投与した際は、ホルマリン皮下注と対側LCを介した鎮痛効果が主であることが示唆された。Microdialysisによる検討では、2PMPA全身投与により腰膨大部近傍の脳脊髄液内のノルアドレナリン含量が有意に上昇することが示された。このことは、2PMPAの効果がidazoxan髄腔内投与にて拮抗された事実と一致する。ラットの青斑核(Locus coeruleus; LC)に、ステレオ手術の手法にて選択的にカニュラを挿入した。このカニュラを介して、NAAG peptidase inhibitorである2-PMPAをLCに選択的に投与した。鎮痛効果を検討するために、炎症性痛モデルの一つであるホルマリンテストを用いた。ホルマリンテストは、5%ホルマリン50μlをラット後肢に皮下注することにより作成した。2-PMPAをホルマリン皮下注側と同側・対側に投与すると、いずれの場合も良好な鎮痛効果を示した。ただ、対側に投与した場合は、mGluR3の拮抗薬であるLY341495にて2-PMPAの鎮痛効果を拮抗できたが、同側に投与した場合はLY341495にて拮抗できなかった。さらに、対側に投与した場合のみ、腰部の髄腔内へ投与したα2拮抗薬であるidazoxanにて拮抗できた。従って、LCに投与した2-PMPAは痛みの部位の同側に投与した場合と対側に投与した場合で、機序が全く違うことが示された。2-PMPAを全身投与しても良好な鎮痛効果が示された。全身投与による鎮痛効果は、腰部の髄腔内へ投与したα2拮抗薬であるidazoxanにて拮抗できた。また、microdialysisの手法を用いて、腰部の髄腔内へのノルアドレナリン放出に対する効果を検討したところ、ホルマリン皮下注のみではノルアドレナリン放出は軽度にしか増加しないが、2-PMPA全身投与を行うと、ノルアドレナリン放出は著しい増加がみられた。このように、LCのNAAGは、複雑な機序ではあるが、鎮痛と関係していることが示された。麻酔科予定通りLC投与によるNAAG分解酵素阻害薬の鎮痛効果を確認することが出来、この効果が下降性疼痛抑制系賦活化によるノルアドレナリンの放出の増加によることを、痛みの行動モデルとマイクロダイアリシス方を用いて示すことができた。ただ、本年度はホルマリンモデルを用いた研究しか行えなかった。次年度は、予定通り、ホルマリンモデル以外の痛みモデルを用いた研究を進めていき、NAAG分解酵素阻害薬の有効性を確認していきたい。このことにより、臨床応用の可能性を確認していくことが出来ると考えている。本年度は、予定通りにLC投与によるNAAG分解酵素阻害薬の鎮痛効果を、ホルマリンテストを用いて確認できた。しかしながら、ここまでの成果を出すのに時間がかかってしまい、本年の予定であった他の痛みモデル(神経障害性痛モデルなど)での研究を行うことが出来なかったため、執行額が少なくなった。本年度は、神経障害性痛モデルとして坐骨神経部分結紮モデルを用いて、LC投与によるNAAG分解酵素阻害薬の鎮痛効果を検討する。

さらに、従来からの計画であるNAAGとグリアとの関係、NAAG分解酵素阻害薬と他の鎮痛薬との相互作用、NAAG分解酵素阻害薬長期投与による耐性形成の有無、の検討を行う予定である。