hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
カオスダイナミクスに基づく組み合わせ最適化技法を用いた配列モチーフ解析

ゲノム情報解析技術の急速な発展により,生命を記述する膨大な量の遺伝情報が解読されつつある.どのような情報が遺伝子のどの位置に埋め込まれているかを解析する技術の開発が急務である.この中でも特に,DNAからのモチーフ抽出は,蛋白質の機能・構造の推定に関する知見を与える重要課題である.本研究は,研究代表者らが既にその有効性生を十分に示してきたカオスダイナミクスを用いた組み合わせ最適化技法を用いて,モチーフ抽出問題に関する効果的な解法を実現する.その際,提案アルゴリズムを配列モチーフ解析問題に適した形に改良し,それをハードウェアとして実装することにより,大量の配列モチーフ解析を高速実行できる解析装置のコア部分の開発に繋げることが眼目である.本年度は,公募班として一年目であるため,以下の課題を中心に検討した.1.ギプスサンプラの改良による抽出技法の開発モチーフ抽出の従来技法の一つにギプスサンプリング法がある.この手法は,対象となる塩基配列中のモチーフ候補群から推定される尤度に比例した確率分布により,モチーフ候補を更新する手法であり,従来技法の中でも最も強力な手法の一つであるとされている.提案技法では,推定された尤度に基づいて決定論的に抽出を行うが,その際に生じる局所最適解への収束という問題を,タブーサーチ法の導入により解決を図るものである.大量の数値実験に基づく解析の結果,ギプスサンプリング法を充分に凌駕する手法であることが分かった.2.新しいタブーサーチアルゴリズムによる抽出技法の開発モチーフ抽出問題にタブー・サーチ法を適用する場合に,探索過程において不要な振動が発生することがある.そこで,探索履歴をタブーとする時間を強制的に遅延させることによる探索過程の多様化を実現する新しいタブーサーチ法を提案した.大量の数値実験に基づく解析の結果,ワーストケースにおいても従来の単純なタブーサーチ法の性能を充分に上回る性能を有することが示された.ゲノム情報解析技術の急速な発展により,生命を記述する膨大な量の遺伝情報が解読されつつある.どのような情報が遺伝子のどの位置に埋め込まれているかを解析する技術の開発が急務である.この中でも特に,DNAからのモチーフ抽出は,蛋白質の機能・構造の推定に関する知見を与える重要課題である.本研究は,研究代表者らが既にその有効性生を十分に示してきたカオスダイナミクスを用いた組み合わせ最適化技法を用いて,モチーフ抽出問題に関する効果的な解法を実現する.その際,提案アルゴリズムを配列モチーフ解析問題に適した形に改良し,それをハードウェアとして実装することにより,大量の配列モチーフ解析を高速実行できる解析装置のコア部分の開発に繋げることが眼目である.本年度は,公募班として一年目であるため,以下の課題を中心に検討した.1.ギプスサンプラの改良による抽出技法の開発モチーフ抽出の従来技法の一つにギプスサンプリング法がある.この手法は,対象となる塩基配列中のモチーフ候補群から推定される尤度に比例した確率分布により,モチーフ候補を更新する手法であり,従来技法の中でも最も強力な手法の一つであるとされている.提案技法では,推定された尤度に基づいて決定論的に抽出を行うが,その際に生じる局所最適解への収束という問題を,タブーサーチ法の導入により解決を図るものである.大量の数値実験に基づく解析の結果,ギプスサンプリング法を充分に凌駕する手法であることが分かった.2.新しいタブーサーチアルゴリズムによる抽出技法の開発モチーフ抽出問題にタブー・サーチ法を適用する場合に,探索過程において不要な振動が発生することがある.そこで,探索履歴をタブーとする時間を強制的に遅延させることによる探索過程の多様化を実現する新しいタブーサーチ法を提案した.大量の数値実験に基づく解析の結果,ワーストケースにおいても従来の単純なタブーサーチ法の性能を充分に上回る性能を有することが示された.
テラヘルツ帯の電磁エネルギーによる血清タンパク可視化技術の研究

本研究では,抗体反応を利用して染色しなければ可視化することができなかったタンパクの電気泳動技術に,テラヘルツ帯の電磁波を利用した可視化技術を組み合わせることにより,染色すること無く泳動後の処理結果を可視化するTHzイメージング技術を開発した.さらに,分画されたタンパクの質量推定手法を新たに考案し,妥当性を検討した.本研究では,抗体反応を利用して染色しなければ可視化することができなかったタンパクの電気泳動技術に,テラヘルツ帯の電磁波を利用した可視化技術を組み合わせることにより,染色すること無く泳動後の処理結果を可視化するTHzイメージング技術を開発した.さらに,分画されたタンパクの質量推定手法を新たに考案し,妥当性を検討した.本研究では,従来,抗体反応を利用して染色しなければ可視化することができなかった血清タンパクの電気泳動技術に,テラヘルツ帯の電磁波を利用した可視化技術を組み合わせることにより,低コストに複数の生体由来物質を同定し,病態の迅速診断を可能にする検査技術を研究開発することを目的としている。平成22年度は生体由来物質を対象として,THz帯での「(1)エネルギー吸収スペクトルの計測」と「(2)イメージング技術の構築」を試みた。(1)吸収スペクトルの計測:電気泳動法に用いられる代表的なタンパク質,アミノ酸をセルロースアセテート膜に塗布・乾燥し,吸収スペクトルを測定するためのサンプル調整法を構築した。さらに,新たに導入されたテラヘルツ帯のスペクトラム装置を用いてこれらのサンプルのエネルギー吸収スペクトルの取得に成功した,現在,再現性の検証実験を進めている。(2)イメージング技術の構築:TUNNETTをTHz発信素子としたイメージング装置において,SBDの位置に依存した出力変動があり,現象の解明が急務とされていた。そこで平成22年度の技術開発においてイメージング装置に精密電動ステージを導入し,TUNNETT発信素子の位置と取得画像との関係を調べることで,位置依存性の出力変動の要因が戻光である証拠を得た。現在,戻光を抑制する光回路を設計している段階である。一方,連続体として注入する生体由来物質をサンプルとして観察するためには,流入・排出路を備えた特殊なサンプルフォルダ(試料台)を新たに設計・開発する必要があった。そこで,本研究では三次元CADデータからそのまま構造体(ABS樹脂)を製作できる熱溶解積層(FDM)法による試料台の造形を試みた。本研究では,従来,抗体反応を利用して染色しなければ可視化することができなかった血清タンパクの電気泳動技術に,テラヘルツ帯の電磁波を利用した可視化技術を組み合わせることにより,低コストに複数の生体由来物質を同定し,病態の迅速診断を可能にする検査技術を研究開発することを目的とした.そこで,当該年度は「セルロース膜電気泳動法」を利用し,タンパク,アミノ酸等の存在を迅速に可視化可能な生体由来物質に特化したテラヘルツ透過イメージング技術の構築に取り組んだ.本研究で得られた成果を以下に列記する.1入力信号でサンプルを透過してきた信号を規格化することで計測感度を1,00010,000階調に向上させることを意図し,これまでのテラヘルツイメージングシステムに「SBD検出器」および「Lock in Amplifier」をそれぞれ1台増設し,試料に入射するTHz波の強度をモニタすることが可能な装置構成に改良した.2ハーフミラーを設置し,試料に入る入射波強度をモニタすることで,CW-THz波に固有の定在波が発生していることを明らかにした.3TUNNETTおよびアパーチャ間の距離を微調するための微動ステージを組み込んだ計測系を新たに構築した.これにより,定在波が光路長に依存していることを明らかにし,試料の吸収スペクトルを収集するために最適なステージ位置の調整条件を構築した.本研究では,従来,抗体反応を利用して染色しなければ可視化することができなかった血清タンパクの電気泳動技術に,テラヘルツ帯の電磁波を利用した可視化技術を組み合わせることにより,低コストに複数の生体由来物質を同定し,病態の迅速診断を可能にする検査技術を研究開発することを目的とした。そこで,THz帯の電磁波を活用した卵白および血清タンパクの分画・可視化技術の構築を目指した。分画手段には電気泳動の中でも発ガン性物質を使用しない「セルロース膜電気泳動法」を利用し,従来は必要不可欠だった染色法に頼らず,タンパク,アミノ酸等の存在を迅速に可視化可能な生体由来物質に特化した透過・反射測定技術の構築に取り組んだ。本研究で得られた成果を以下に列記する.1THzイメージング技術の構築:電気泳動後のサンプルを染色処理すること無くCW-THz波で可視化できることを実証し,再現性良く測定するために必要となるイメージング装置の走査部(サンプルフォルダ)および検出プローブを構築し,TUNNETT発振素子およびSBD検出器の設置条件に関する要素技術を構築した.2電気泳動後のタンパク質質量分布の計測手法を考案し,卵白を対象とした評価実験により,主要成分であるオバルブミン,オボトランスフェリン,オボムコイドの質量分布を可視化できることを示した.さらに,THz Polarizerを組み込んだTHz反射イメージング技術を開発した.3卵白由来タンパク質のTHz領域およびFIR領域の吸収スペクトルを計測し,吸収スペクトルの変化を尺度とした紫外線等の環境評価手法を提案した.当初の計画通り,システムの改良を完了しており,これにより新たな課題も顕在化することができた.

一方,タンパクの吸収スペクトルを計測するための分光分析装置が震災により故障したため,吸収スペクトルの計測は次年度に延期せざるを得ない状況となった.そのため,ここでは,顕在化されたCW-THz波に固有の定在波の課題解決に取り組んだ.この挙動を明らかにするために,新たに微動ステージを導入することでTUNNETTの位置をPCから調整できる様に計測系を再構築した.本装置を用いて定在波の挙動を調べた結果,THz波の透過強度がピークとなる位置が必ずしもタンパクのTHz透過イメージングに適しているわけではないことを明らかにし,再現性の高い計測技術を構築することができた.24年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度である次年度に実施する研究開発および到達目標を以下に挙げる.1THzイメージング技術の構築とサンプル調製技術の確立を目指す.2THzイメージングの特徴を活かした電気泳動後のタンパク質量分布の計測手法を考案する.3卵白由来タンパク質のTHz領域およびFIR領域の吸収スペクトルを計測し,環境ストレスが吸収スペクトルに及ぼす影響を調べる.24年度が最終年度であるため、記入しない。
歯根膜組織の歯槽骨吸収抑制メカニズムの解析に関する分子生物学的研究

歯根膜組織は線維芽細胞や上皮細胞、骨芽細胞およびセメント芽細胞に分化しうる未分化間葉細胞など多彩な細胞によって構成されており、いずれの細胞が破骨細胞に対して分化抑制に作用しているのか、あるいは分化促進に作用しているのか明らかにされていない。本研究では歯根膜組織を構成する細胞群から細胞を単離し、クローン化した後、破骨細胞分化促進支持能および抑制能を指標としてクローン細胞をスクリーニングする。同時に破骨細胞の分化因子である破骨細胞分化誘導因子(ODF(OPG/OCIFligand))とOPG/OCIFとのmRNAの発現を検索し、破骨細胞の分化支持能との関係を解析とBIACORE(生体分子相互作用解析装置)を使用して未知のリガンド探索を研究目的とした。その結果、312種類のマウス株化歯根膜細胞を単離、確立し、すべてのマウス株化歯根膜細胞とマウス骨髄細胞を共存培養することにより破骨細胞の誘導を行った結果、7株化細胞に破骨細胞誘導能が認められた。7株化細胞のうち3株化細胞(MPDL-7,27,30)には破骨細胞分化支持細胞であるMC3T3-G2/PA6と同等の破骨細胞誘導能が示された。MPDL-7,27,30細胞はOsteopontin mRNA, Osteonectin mRNA発現およびALPase産生が認められたが、Ostecalcin mRNA発現は認められなかった。さらに、すべての細胞にODFmRNAの発現が認められ、MPDL-27,30にはOPG/OCIFmRNAの発現が認められた。しかしながら、OPG/OCIFとOPG/OCIFligandに対する未知のリガンド探索をBIACOREを用いて新たなリガンドの発見を試みたが、すべて既知のリガンドしか認められなかった。これらの結果から、歯根膜細胞は破骨細胞分化に直接関与するODFmRNAとOPG/OCIFmRNAを発現し、破骨細胞の分化を制御することにより歯槽骨吸収抑制に関与していることが示された。マウス歯根膜組織から株化歯根膜細胞を確立し破骨細胞分化支持能の有無を指標としてスクリーニングを行い各株化細胞のOPG/OCIFとOPG/OCIF ligandのmRNAの発現をPCR法およびNorthern blot analysisにより検索することを本年度の研究目的とした。その結果、312種類のマウス株化歯根膜細胞を単離、確立した。すべてのマウス株化歯根膜細胞をTypeI collagen上にconfluentになるまで培養後、1×10^4cells/dishのマウス骨髄細胞を播種し、20%FCS、10^<-8>M1α,25(OH)2D3、および3×10^<-8>M Dexamethazone含有のα-MEM中で7日間培養することにより破骨細胞の誘導を行った結果、7株化細胞に破骨細胞誘導能が認められた。7株化細胞のうち3株化細胞(MPDL-7,27,30)には破骨細胞分化支持細胞であるMC3T3-G2/PA6と同等の破骨細胞分化誘導能が示されたため、これらの細胞のOPG/OCIFmRNAとODFmRNAの発現をPCR法で確認した結果、すべての細胞にODFmRNAの発現が認められた。また、MPDL-27,30にはOPG/OCIFmRNAの発現が認められた。一方、破骨細胞誘導能が認められなかったマウス株化歯根

膜細胞のMPDL-19,20にはOPG/OCIFmRNAの発現が認められたが、ODFmRNAの発現は認められなかった。現在までの結果においては、破骨細胞の分化誘導能の有無はOPG/OCIFとOPG/OCIFligandのシグナルの有無と相関した結果であった。マウス歯根膜組織から312の株化歯根膜細胞を確立し7株化細胞に破骨細胞誘導能が認められた。7株化細胞のうち3株化細胞(MPDL-7,27,30)に破骨細胞分化誘導能が示され、これら細動のOPG/OCIFmRNAとODFmRNAの発現をPCR法で確認した結果、すべての細胞にODFmRNAの発現が認められた。また、MPDL-27,30にはOPG/OCIFmRNAの発現が認められた。一方、破骨細胞誘導能が認められなかったマウス株化歯根膜細胞のMPDL-19,20にはOPG/OCIFmRNAの発現が認められたが、ODFmRNAの発現は認められなかった。BIOCOREによるOPG/OCIFとOPG/OCIFligandとの結合解離作用については、現在までの結果において破骨細胞誘導能との相関関係および結合解離作用速度との間においても明らかな関係は示されなかった。OPG/OCIFligand未発現細胞においては破骨細胞分化支持能を有する細胞はスクリーニングされなかった。現在は新規破骨細胞分化誘導因子の発見の為、破骨細胞分化支持能を有する株化歯根膜細胞を抗OPG/OCIFligandにより中和させ破骨細胞誘導能の変化を検索中である。本研究は歯根膜組織の歯槽骨吸収抑制メカニズムを分子生物学的に明らかにすることを目的とする。マウス歯根膜から破骨細胞分化支持能を指標として歯根膜クローン細胞をスクリーニングした結果、7株化細胞(312歯根膜クローン細胞)に破骨細胞分化誘導能が認められた。これらのクローン細胞を用いて破骨細胞分化誘導因子(ODF(OPG/OCIFligand))とOPG/OCIFとのmRNAの発現を検索し破骨細胞の分化支持能との関係を解析した結果ではOPG/OCIFligandとOPG/OCIFとのmRNAの発現が確認された。しかしながら、BIACOREによるOPG/OCIFとOPG/OCIFligandのリガンド探索を行ったが破骨細胞分化に関与する未知のリガンドは発見されなかった。また、OPG/OCIFligandを抗体中和後も破骨細胞分化支持を示す歯根膜細胞に焦点を絞り、新たなリガンドの発見を試みたが同様に未知のリガンドは発見されなかった。本研究結果から、歯根膜組織の歯槽骨吸収抑制メカニズムには歯根膜細胞のOPG/OCIFligand mRNAとOPG/OCIF mRNAを発現が原則として関与して、破骨細胞の分化を制御していると考えられる。本研究では、未知の破骨細胞分化因子の発見には至らなかったが、マウス破骨細胞ライブラリーの作製とマウスDNAチップへの応用が可能になったことは大きな成果だと考えられる。
iPS細胞を用いた脳梗塞再生医療の臨床実用化に関する研究

脳梗塞の新規治療法として神経幹細胞移植が考えられているが,適切な移植時期の検討は行われていない.従来は脳梗塞後急性期での移植の検討が多く行われていたが,本研究ではマウス脳梗塞モデルで亜急性期に細胞を移植し,効果と機序を検討した.脳梗塞3週後の亜急性期においても,iPS細胞由来神経幹細胞の移植により機能回復が促進された.しかし非移植群においても緩徐に機能障害は回復し,梗塞14週後の時点では両群に大きな差異は認められなくなった.また機能回復の促進は移植細胞の生存とは関連がなく,この効果は移植細胞が新規神経回路を構築するneural replacement効果によるものではないと推測された.脳梗塞の機能回復に向けての治療法として神経幹細胞等の移植療法が考えられているが,その際の適切な移植時期等の検討は行われていない.現在までに報告されている基礎実験では梗塞作成後1週間以内での細胞移植が行われているが,亜急性期での移植による効果を検討した報告はないため,本年度は梗塞作成の3週間後の亜急性期に細胞を移植する実験を行った.具体的には,マウスにおいて40分間の一過性中大脳動脈閉塞にて梗塞巣を作成,その3週間後にiPS細胞由来の神経幹細胞を脳内巣周囲に移植,適切な時期に行動解析(staircase test)を行い,移植後11週後の脳切片での組織学的検討を行った.行動解析においては,梗塞後8週(移植後5週)において,細胞移植群の方がvehicle投与群に比して有意に機能障害が少なかったが(unpaired t-test p= 0.029),その後vehicle投与群の機能障害も改善傾向となり,移植11週後では両群に差は認められなかった.細胞移植群での移植11週後での細胞の生存を検討したところ,6匹中2匹で生存を確認し得たが,4匹では細胞は生着していなかった.以上の結果より,梗塞後亜急性期のiPS細胞由来の神経幹細胞移植により移植後比較的早期において機能改善を認めたが,非移植群の機能も自然回復したために,移植による機能回復の効果の持続があるかは確認できなかった.また移植後に細胞が生着した個体は半数以下であった.脳梗塞の機能回復に向けての治療法として神経幹細胞等の移植療法が考えられているが,その際の適切な移植時期等の検討は行われていない.現在までに報告されている基礎実験では梗塞作成後1週間以内での細胞移植が行われているが,亜急性期での移植による効果を検討した報告はないため,本研究では梗塞作成の3週間後の亜急性期に細胞を移植する実験を行った.具体的には,マウスにおいて40分間の一過性中大脳動脈閉塞にて梗塞巣を作成,その3週間後にiPS細胞由来の神経幹細胞を脳内巣周囲に移植,適切な時期に行動解析(staircase test)を行い,移植後11週後の脳切片での組織学的検討を行った.行動解析においては,梗塞後8週(移植後5週)において,細胞移植群の方が非移植群に比して有意に機能障害が少なかったが(unpaired t-test p= 0.029),その後非移植群の機能障害も改善傾向となり,移植11週後では両群に差は認められなかった.細胞移植群での移植11週後での細胞の生存を検討したところ,6匹中2匹で生存を確認し得たが,4匹では細胞は生着していなかった.また移植群と非移植群の間で,梗塞+萎縮体積に有意な差は認められなかった.以上の結果より,梗塞後しばらく時間が経過した亜急性期においてもiPS細胞由来の神経幹細胞移植により機能改善効果を認めたが,非移植群の機能も時間経過とともに自然回復したために,移植による効果は機能回復が早期に促進されるということであった.また移植群での機能回復は細胞の生存とは関連してなかったため,移植後早期の機能回復促進効果は,移植細胞が新規の神経回路を構築するneural replacement効果ではないと類推される.脳梗塞の新規治療法として神経幹細胞移植が考えられているが,適切な移植時期の検討は行われていない.従来は脳梗塞後急性期での移植の検討が多く行われていたが,本研究ではマウス脳梗塞モデルで亜急性期に細胞を移植し,効果と機序を検討した.脳梗塞3週後の亜急性期においても,iPS細胞由来神経幹細胞の移植により機能回復が促進された.しかし非移植群においても緩徐に機能障害は回復し,梗塞14週後の時点では両群に大きな差異は認められなくなった.また機能回復の促進は移植細胞の生存とは関連がなく,この効果は移植細胞が新規神経回路を構築するneural replacement効果によるものではないと推測された.行動解析の結果を慎重にかつ長期に観察した為に,組織学的検討の開始が遅れた.脳卒中今後は移植群と非移植群における梗塞体積の比較や,生着した移植幹細胞の分化を組織学的に検討する.併せて炎症の程度等を両群間で比較する予定であるが,脳組織をとりだした時点での行動解析では両群間に有意差を認めていないため,再度実験を繰り返し,機能障害に差を見出した時点(移植後5週)での脳組織を採取し,そのメカニズムを検討する必要性もあると考えられる.
古人骨のプロテオミクス・ホルモン分析による妊娠マーカー検出法の開発

本研究では、(1)妊娠経験既知の現代人より提供された親知らずの歯髄に残存するタンパク質・ホルモンを分析し、妊娠出産に関わるマーカーを同定する。(2)こうして確立した分析系を応用し、過去の妊娠出産を古人骨から復元できるか確かめる。妊娠出産の際には母体の分子生理状態が変化するため、タンパク質を網羅的に調べるプロテオクミス分析や、特定のホルモンの濃度を調べる分析によって、妊娠状態を区別できると期待される。本研究は、あまり応用されてこなかったタンパク質やホルモンに着目し、古人骨では直接復元の方法がなかった妊娠経験の推定にアプローチする挑戦性の高いものである。
炎症性骨疾患へのLOX-1の寄与とその分子機構の全容解明そして創薬へのアプローチ

細胞外LDLのLDL受容体を介した細胞内への取り込みが破骨細胞の細胞融合に重要な役割を持つこと、その細胞融合にLDL受容体に依存したABCG1発現と細胞膜リン脂質内葉から細胞膜外葉へのphosphatidylethanolamineの分布変換が大きく関わっていることが2018年度で大きく進歩した。また、炎症性骨破壊の治療薬の候補として、ポリメトキシフラボノイドであるスダチチンが有効であることを動物実験から明らかにし、その成果をPlos ONEに掲載した。しかし、LOX-1のconditional knockoutマウス実験に関しては、進行が遅れていたが,本年度でようやくconditiona lknockoutマウスの飼育が順調になり、来年度に向けて実験可能になった。総じて、現在の進捗状況は概ね順調に進展している。2018年度で、破骨細胞の細胞融合に細胞内へのコレステロールの取り込み機構と細胞膜外葉へのphosphatidylethenolamine (PE)の局在変換が大きく関わっていることが明らかとなり、その局在変換にリン脂質のflip-flopを司るATP-bindingcassette (ABC) transporterであるABCG1やABCB4などが関与することが明らかとなった。そこで2019年度は、さらにそのABC transportersと細胞内コレステロール量との関係、それと関連した転写因子LXRの活性化との連携を分子レベルで解析する。それと同時に、ABCG1 KOマウスを用いて破骨細胞の細胞融合におけるABCG1の役割と細胞膜外葉へのPE局在転換の意義を分子生物学的に明らかにして行く。また、遅れ気味であった破骨細胞特異的LOX-1 cKOを用いた炎症性骨破壊実験モデルの作成を合わせて遂行して行く。細胞内の酸化状態を標的とした新しい炎症性骨破壊治療薬の探索に関しては、スダチチンに変わる新たな抗酸化化合物を探索する。1)LOX-1の破骨細胞及び骨芽細胞特異的cKOマウスの作製破骨細胞分化のトリガー分子RANKLの受容体であるRANKのプロモーターにCreをつけたrank-Cre Tgマウスとfloxed LOX-1マウスの交配による破骨細胞特異的LOX-1 cKOの作製はほぼ順調に進み、破骨細胞形成における基本的な情報伝達経路及び破骨細胞分化マーカー遺伝子の発現の解析が進んでいる。次年度の平成29年度からのLPS誘導炎症性骨破壊モデルに用いるめどがついた。しかし、骨芽細胞特異的LOX-1 cKOはosterix-Cre Tgマウスの繁殖が計画通り進まず、もう一度、Jackson Laboratoriesから購入せざるを得ない状態にあるため、作製が中断している。2)LOX-1による前破骨細胞融合抑制の分子機構の解明破骨細胞の細胞融合に対して、LOX-1は抑制的に、一方、LDL受容体(LDLR)は促進的に作用することから、LOX-1およびLDLRの破骨細胞細胞融合における役割を分子レベルで解明する目的から、LOX-1/LDLR double KO (dKO)マウスの作製を試み系統化に成功した。LOX-1/LDLRdKOマウスのin vitroの破骨細胞形成は野生型マウスと比較して、破骨細胞分化関連分子のmRNA及びタンパク質レベルで同等の発現を示すとともに、破骨細胞分化シグナルに対しても同等の活性化を示した。これらのことと一致して、同等の破骨細胞形成を示した。しかし、dKOマウスの前破骨細胞の培養ディッシュでの接着は、野生型マウスに比べ明らかに弱く破骨細胞の骨吸収に重要な役割を示すインテグリンなどの細胞接着分子への影響が考えられ、この点に関しては、新たな知見となった。現在、dKOマウスとLOX-1 single KO (sKO)およびLDLR sKOマウスの破骨細胞形成解析は進行中である。平成28年度は、主力研究分担者の他機関への移動により本研究課題に費やすエフォートが減り、現在でも主力研究分担者と密接に連携はしているものの研究がやや遅延している。また、骨芽細胞特異的LOX-1 cKOの作製に必要なosterix-Cre Tgマウスの繁殖が計画通り進まず、もう一度、Jackson Laboratoriesから購入せざるを得ない状態にあるのも、やや遅れている理由である。我々は、LOX-1およびLDL receptor (LDLR)の前破骨細胞の細胞融合過程を調節する分子機構の解明を目的として、野生型(WT), LOX-1 single KO (sKO), LDLR sKOおよびLOX-1/LDLR double KO (dKO)マウスを作成し実験を行なった。LOX-1 sKOのin vitroの破骨細胞形成は既報通り、破骨細胞分化シグナルおよび破骨細胞分化関連分子の発現に変化しないにも関わらず、前破骨細胞の細胞融合が促進し破骨細胞形成が大きく増加した。一方、LDLR sKOの破骨細胞形成はLOX-1欠損マウスとは全く逆の表現系を示した。そこでLOX-1とLDLRの両方を欠損したdKOを作成し、破骨細胞形成を検討した結果、形成された多核の破骨細胞数はWTをほぼ同等であったにも関わらず、1つの破骨細胞に含まれる核数および細胞の大きさがWTに比べ大きく減少し、その表現系はLDLR sKOマウスに類似した。このように、LDLおよび酸化LDLの細胞内への取り込み機構と破骨細胞分化の間には密接かつ多様な関係のあることが示された。

最近、破骨細胞の細胞融合機構に関して、細胞膜の脂質二重層内層に多く分布するphosphatidylethanolamin (PE)の脂質二重層外層への分布変換が重要な役割を持つことが報告された。そこで、破骨細胞形成過程におけるPEの分布を4種類のマウスで比較した。その結果、LDLR sKOおよびdKOマウス破骨細胞系細胞において、PEの脂質二重層外層への変換が著しく減少していることを見出した。さらに、PEの脂質二重層外層への変換を触媒するABCG1の発現がLDLRsKOおよびdKO破骨細胞系細胞で著しく減少した。すなわち、破骨細胞の細胞融合に必要なPEの細胞膜脂質二重層外層への変換が細胞外からのLDLの取り込み機構に大きく依存することが明らかとなった。細胞外LDLのLDL受容体を介した細胞内への取り込みが破骨細胞の細胞融合に重要な役割を持つこと、その細胞融合にLDL受容体に依存したABCG1発現と細胞膜リン脂質内葉から細胞膜外葉へのphosphatidylethanolamineの分布変換が大きく関わっていることが本年度で大きく進歩した。また、炎症性骨破壊の治療薬の候補として、ポリメトキシフラボノイドであるスダチチンが有効であることを動物実験から明らかにし、その成果をPlos ONEに掲載した。しかし、LOX-1のconditional knockoutマウス実験に関しては、新研究分担者が不慣れのため、進行が遅れている。総じて、現在の進捗状況は概ね順調に進展している。細胞外LDLのLDL受容体を介した細胞内への取り込みが破骨細胞の細胞融合に重要な役割を持つこと、その細胞融合にLDL受容体に依存したABCG1発現と細胞膜リン脂質内葉から細胞膜外葉へのphosphatidylethanolamineの分布変換が大きく関わっていることが2018年度で大きく進歩した。しかし、LOX-1のconditional knockoutマウス実験に関しては、進行が遅れていたが,本年度でようやくconditiona lknockoutマウスの飼育が順調になり、来年度に向けて実験可能になった。平成29年度から、新たな研究分担者(新任の当教室助教)が本研究者に加わり、研究推進のための研究体制を速やかに再構築する。やや遅延となっている原因のosterix-Cre Tgマウスの繁殖不良に関しては、現在保有しているosterix-Cre Tgマウスの飼育を諦め、新たに、osterix-Cre TgマウスをJackson Laboratoriesから購入し骨芽細胞特異的LOX-1 cKOの作製を進める。前年度で、破骨細胞の細胞融合に細胞内へのコレステロールの取り込み機構と細胞膜外葉へのphosphatidylethenolamine (PE)の局在変換が大きく関わっていることが明らかとなり、その局在変換にリン脂質のflip-flopを司るATP-bindingcassette (ABC) transporterであるABCG1やABCB4などが関与する。
乳幼児の末梢静脈持続点滴時の留置針での血栓形成機構解明とその点滴事故防止への展開

本研究の目的は,乳幼児点滴時のカテーテルと静脈の相対的位置変化の流れ場や血栓生成への影響を調べることにある.そのために,(1)透明円管チューブおよび2次元セルを用いたカテーテル周りの血栓生成観察と流れ場計測,(2)カテーテル先端の壁面への接触応力を実験や理論から算出し,(3)カテーテルおよび静脈血管の固定状態のモデル内の流れを,CFD (コンピュータを使った流体シミュレーション)を用い,血栓の形成しやすい場所やその程度の予測を行うことである.本研究の目的は,乳幼児点滴時のカテーテルと静脈の相対的位置変化の流れ場や血栓生成への影響を調べることにある.そのために,(1)透明円管チューブおよび2次元セルを用いたカテーテル周りの血栓生成観察と流れ場計測,(2)カテーテル先端の壁面への接触応力を実験や理論から算出し,(3)カテーテルおよび静脈血管の固定状態のモデル内の流れを,CFD (コンピュータを使った流体シミュレーション)を用い,血栓の形成しやすい場所やその程度の予測を行うことである.
脳出血後のリハビリによる上肢機能の回復過程に関与する神経回路の解析

脳血管障害による運動機能障害の軽減には集中的なリハビリテーション(以下リハ)が重要である。集中的なリハは残存した神経回路の再編成を介して運動機能の再獲得を促進すると考えられているが、どの回路が、どのタイミングで関わるのかといった詳細な作用機序については不明な点が多い。本研究では、内包出血モデルラットに対して麻痺側前肢の集中使用を課し、それによる皮質-脳幹回路の変化および機能回復との因果性を検証した。これまでの検討により、リハによる機能回復には皮質赤核路が重要であること、皮質赤核路を遮断してリハを行うと皮質網様体路において豊富な軸索分枝を生じること等が示されている。本年度は、皮質赤核路および皮質網様体路に対しウイルスベクターを予め感染させ両経路を選択的に機能遮断できる系を用い、運動機能との関連性を検証した。結果として、皮質赤核路を遮断しリハを行い、その後皮質網様体路の選択的な抑制を行うと、改善した運動機能が低下することが示された。これは皮質赤核路遮断により生じた皮質網様体路の賦活化が運動機能回復と関連を有することを証明するものである。更に、リハ終了後に皮質赤核路を遮断すると改善した運動機能が低下するものの遮断を維持すると運動機能が徐々に改善してくる。この時点で皮質網様体路を遮断すると、運動機能が再度低下することが示された。これらの結果は、皮質赤核路が遮断されると皮質網様体路へのダイナミックなスイッチングが生じ、この現象がリハによる運動機能の回復と密に関わることを示唆するものであり、脳血管障害後のリハにおける神経回路レベルでの作用機序の一端を詳らかにするものであると考える。本年度においては更にウイルスベクター感染に関する電気生理学的および組織学的証明を加え、海外誌(J. Neuroscience)に投稿を行い、現在revise中で近く受理される見込みである。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。脳血管障害後の有効なリハビリテーション法に麻痺側上肢の集中的な使用(CIMT法)があるが、CIMT法による運動機能の獲得過程そのものに皮質赤核路が関わるのか、他の残存する下行路と関連性はあるのか等の詳細な作用機序については未だ不明である。本研究では、二重ウイルスベクター感染法により運動野-赤核路および運動野網様体の選択神経遮断法を可能とし、脳出血後のCIMT法による運動機能の回復過程における皮質赤核路および皮質網様体路の果たす役割を解析しすることを目的としている。H29年度は、予め皮質赤核路および皮質網様体路をウイルスベクター二重感染法により各々選択遮断が可能な状態としたのち、内包部近傍の脳内出血を作成し、出血1ー8日にCIMT法を実施した。その結果、CIMT開始時から皮質赤核路をドキシサイクリン(DOX)投与によって選択神経遮断しても、CIMTによる運動機能の回復が認められた。また、皮質に投与したBDAによる神経線維ラベルによって脳幹部網様体にBDA陽性線維が確認されることが示された。すなわち、リハビリテーション時に皮質赤核路の神経遮断をすると皮質網様体路を経由する新たな神経回路が形成される可能性が示された。次に、皮質赤核路のDOX投与に寄る遮断に加え皮質網様体路をCNO投与により更なる選択神経遮断させる実験を行った。その結果、CIMTに寄る運動機能改善野効果は全くは認められなくなった。以上の結果から、脳内出血後のリハビリテーションにより、まず皮質赤核路が働くようなメカニズムが働き、さらにこのルートが作動しない場合には皮質網様体路が働くようなメカニズムが働くことが示された。赤核における促通性亢進関連因子の探索、オプトジェネティクス法を用いた実験の準備を実施する予定であったが実施できなかった。しかし、前述のよう予想以上の結果が得られ、全体としては概ね良好に進脳血管障害による運動機能障害の軽減には集中的なリハビリテーション(以下リハ)が重要である。

これらの結果は、皮質赤核路が遮断されると皮質網様体路へのダイナミックなスイッチングが生じ、この現象がリハによる運動機能の回復と密に関わることを示唆するものであり、脳血管障害後のリハにおける神経回路レベルでの作用機序の一端を詳らかにするものであると考える。本年度においては更にウイルスベクター感染に関する電気生理学的および組織学的証明を加え、海外誌(J. Neuroscience)に投稿を行い、現在revise中で近く受理される見込みである。リハビリテーション時に皮質赤核路を選択遮断すると皮質網様体路を経由する新たな神経回路が形成される可能性が示されため、皮質赤核路の選択遮断に加え皮質網様体路の更なる選択遮断する実験の思考回数を増やし、より確かな結果を得ていく。さらに、脳内出血後のリハビリテーションにより、皮質赤核路がまず働くようなメカニズムや場合によっては皮質網様体路が働くようなメカニズムに関与する、促通性亢進関連因子の探索を進めていく。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
クローン病狭窄症に対するRNA干渉技術を用いた内視鏡治療法開発

本研究では、クローン病患者のQOLを著しく損なう原因である腸管狭窄症に対する新規治療法として、究極の分子標的治療と呼ばれるRNA干渉技術を用いたsiRNAの腸管粘膜下注入療法を、動物実験モデルに対する実験により開発した。研究成果として、消化管狭窄症の原因遺伝子に対する特異的RNA干渉薬「STNM01」によるクローン病狭窄症新規治療法をステリック再生医科学研究所と共同で確立し、平成24年1月より第I相臨床試験を開始するための基礎データを得ることができた。本研究では、クローン病患者のQOLを著しく損なう原因である腸管狭窄症に対する新規治療法開発のために、究極の分子標的治療と呼ばれるRNA干渉技術を用いる。近年抗TNFα製剤レミケードによりクローン病治療成績が格段に向上したが、最大の合併症である消化管狭窄に関しては外科的切除など侵襲的な治療法しかなく、患者は入退院を繰り返している。我々はこれまで、ステリック再生医科学研究所と共同で、膓管肥満細胞の発現する消化管線維化狭窄の責任遺伝子(G#1)を明らかにした。さらにG#1に選択的なRNA干渉薬「STNM-01」を作成し、マウス急性腸炎モデルにおける治療効果を確認した。これらの独創的かつ実現可能性の高い研究成果を臨床に還元し、これまで著しく損なわれてきた患者QOL改善を目指すために、本研究ではSTNM-01の抗線維化効果を慢性線維化腸炎モデルで検証し、次に埋想的Drug DeliverySystemと考えられるSTNM-01の内視鏡的粘膜下注入療法を実験腸炎モデルラットで検討する。平成21年度の研究実施計画に沿って、慢性線維化腸炎ラットをマウスおよびラットで作成し、Atellocollagen-STNM01腹腔内投与実験を行い治療効果判定を行った。臨床評価スコアであるDisease Activity Index(DAI)はSTNM01治療群で有意差を持って改善が見られた。組織学的解析でも大腸における炎症、線維化面積は治療群で有意な改善がみられた。RT-PCRによるmRNA発現の解析でも治療群において有意に炎症性サイトカイン、TGF-b、CollagenI、IIIの発現抑制が認められた。上記の結果はSTNM01が動物実験レベルで線維化腸炎を治療しうることの証明であり、ヒトクローン病における腸管線維症の新規治療法になりうることを示唆する点で、臨床応用上も極めて重要な研究結果と考えられる。我々はこれまで、ステリック再生医科学研究所と共同で、腸管肥満細胞の発現する消化管線維化狭窄の責任遺伝子(G#1)を明らかにした。さちにG#1に選択的なRNA干渉薬「STNM-01」を作成し、マウス急性腸炎モデルにおける治療効果を確認した。これらの独創的かつ実現可能性の高い研究成果を臨床に還元し、これまで著しく損なわれてきた患者QQL改善を目指すために、本研究ではSTNM-01の抗線維化効果を慢性線維化腸炎モデルで検証し、次に理想的Drug Delivery Systemと考えられるSTNM-01の内視鏡的粘膜下注入療法を実験腸炎モデルラットで検討する。平成22年度の研究実施計画に沿って、慢性線維化腸炎ラットをマウスで作成し、Atellocollagen-STNM01腹腔内投与実験を行い治療効果判定を行った。臨床評価スコアであるDisease Activity Jndex (DAI)はSTNM01治療群で有意差を持って改善が見られた。RT-PCRによるmRNA発現の解析でも治療群において有意に炎症性サイトカイン、TGF-b, CollagenI, IIIの発現抑制が認められた。腸管線維化においては線維芽細胞や筋線維芽細胞の動態を把握することが必須であることから、蛍光多重染色法を新たに開発し、上記実験モデルにおける組織染色を本研究年度で開始した。慢性線維化腸炎モデルの大腸において活性型線維芽細胞と筋線維芽細胞が増加し、これらが腸管組織の線維化に重要な働きをしていることを明らかにし論文発表した(K Suzuki et al.Pathol Int 2011:61;228-238.)今後、これらの方法を使いながら、STNM-01の作用機序も解析していく予定である。

近年抗TNFα製剤レミケードによりクローン病治療成績が格段に向上したが、最大の合併症である消化管狭窄に関しては外科的切除など侵襲的な治療法しかなく、患者は入退院を繰り返している。我々はこれまで、ステリック再生医科学研究所と共同で、腸管肥満細胞の発現する消化管線維化狭窄の責任遺伝子(G#1)を明らかにした。さらにG#1に選択的なRNA干渉薬「STNM-01」を作成し、マウス急性腸炎モデルにおける治療効果を確認した。これらの独創的かつ実現可能性の高い研究成果を臨床に還元し、これまで著しく損なわれてきた患者QOL改善を目指すために、本研究ではSTNM-01の抗線維化効果を慢性線維化腸炎モデルで検証し、次に理想的Drug Delivery Systemと考えられるSTNM-01の内視鏡的粘膜下注入療法を実験腸炎モデルラットで検討する。平成23年度の研究実施計画に沿って、慢性線維化腸炎をマウスで作成し、STNM01を内視鏡的粘膜下注入投与実験を行い治療効果判定を行った。臨床評価スコアであるDisease Activity Index (DAI)はSTNM01治療群で有意差を持って改善が見られた。組織学的解析でも大腸における炎症、線維化面積は治療群で有意な改善がみられた。RT-PCRによるmRNA発現の解析でも治療群において有意に炎症性サイトカイン、TGF-b, Collagen I,IIIの発現抑制が認められた。平成22年度の研究実績で慢性線維化腸炎モデルの大腸において活性型線維芽細胞と筋線維芽細胞が増加し、これらが腸管組織の線維化に重要な働きをしていることを明らかにし論文発表した(K Suzuki et al.Pathol Int 2011 : 61 ; 228-238.)平成23年度にはSTNM-01の粘膜下注入によりこれら線維化促進間葉系細胞が減少することで慢性線維化腸炎が改善したことを明らかとした。これらの実績をもとにSTNM01のヒト臨床応用試験をPMDAに申請、認可を受け、平成24年からステリック再生医科学研究所との共同研究でヒトでの臨床試験が開始されることになった。
粗粒度投機的並列処理システム

投機的処理とは、将来利用されるか利用されないか確定される前に実行を開始する処理である。本研究では、プロセスやファイルを粒度とする投機的処理を支援するオペレーティング・システムを設計し、実現方法を示した。そのオペレーティング・システムの特徴は、「世界」と呼ばれる抽象を提供する点にある。世界は、プロセスやファイルを入れる箱である。世界の間には、親子関係があり、システム全体では、複数の世界が1つの根を持つDAGを構成する。子世界は、自分の世界にあるものを除き、親世界の内容(プロセスとファイル)を引き継ぐ。本研究では、世界という抽象を用いて投機的処理を行う方法を示した。投機的処理は、子世界で実行される。投機的処理の結果が必要であることがわかると、その投機的処理に対応した子世界は、親世界に融合され、子世界の内容が瞬時に親世界で利用可能になる。投機的処理の結果が利用されないことがわかると、その投機的処理に対応した子世界は、削除され、子世界の内容も削除される。本研究では、世界という抽象を提供するオペレーティング・システムの構成を明らかにした。その中心は、世界サーバとファイル・サーバにある。世界サーバは、世界のDAGを管理する。ファイル・サーバは、世界とファイル名を引数としてファイル・オブジェクトを指定することを可能にする。本研究では、応用プログラムの例としてUNIXのmakeユ-ティリティを取り上げ、投機的処理を行うアプリケーションの実現方法を示した。その特徴は、投機的に更新するファイルごとに世界を作ること、および、イベント駆動形式によりプログラムが構成されている点にある。今後の課題は、提案方式に基づきシステムを完成させ性能を評価することである。
角膜上皮幹細胞とその特異分化に関わる遺伝子の同定

角膜上皮幹細胞の同定、特性解析を目的として、まず輪部基底細胞の遺伝子発現解析を行うこととした。そのためには輪部基底細胞だけを選択的に採取する手法が必要となる。これにはレーザーマイクロキャプチャー法が最適である。しかしそれから採取できるRNA量は極めて微量で1ng程度しかなく、ここから正確な遺伝子発現解析を行うにはそれに特化した方法論の確立が絶対的に必須であった。このためまずレーザーマイクロキャプチャーで採取できる微量なtotal RNAから正確な遺伝子発現解析を行うための方法論の確立を行った。条件検討を行ううちcDNA合成時の効率を改善することがもっとも重要であることが明らかとなった。また増幅時に生じる遺伝子発現プロファイルの歪みを低減するために従来法とは違うアダプターをデザインした。結果としてあたらしい増幅おける増幅時の歪みは従来法にくらべ著明に低減し、1ng程度の微量RNAからでも十分に正確な遺伝子発現解析が可能であることが判明した。この新しいiAFLP法を使って角膜、輪部、結膜の基底、中間層、表層細胞の遺伝子発現解析を行い、角膜特異的に発現する遺伝子をいくつか同定した。この中に含まれるCLCA2に対しては特異抗体を作成し、CLCA2が皮膚表皮細胞、角膜上皮細胞を含むケラチノサイト系上皮細胞の基底細胞で極めて特異的に発現していることを見いだした。またCLCA2の他には、角膜上皮幹細胞に特異的な遺伝子としてNGF receptor(p75NTR)を見いだした。カウンターパートであるTrkA, TrkBの発現を調べたところ、TrkAも角膜輪部基底に特異的に染色され、さらにこれらの遺伝子はケラチン12陰性細胞にて強く発現していることが明らかとなり、リガンドであるNGFが輪部基底に存在する角膜上皮ステムセルの維持や特異的な細胞学的性質に強く関連している可能性が示唆された。ヒト角膜上皮細胞、角膜輪部上皮細胞、結膜上皮細胞の凍結切片を作成し、これよりそれぞれの組織の基底層、中間層、表層細胞をレーザーマイクロキャプチャーにて採取した。ここからRNAを採取した後に競合的に増幅し、iAFLP法にて約480遺伝子について相対遺伝子発現を解析した。その結果、輪部基底層にあるとされている角膜上皮細胞の幹細胞のに特異的な発現パターンをとる遺伝子がいくつか得られた。特に特異性が高いと考えられたのは、低親和性NGFレセプターp75NTR、インテグリンα6、インテグリンα7、Bad、ケラチン18、TNFレセプター2であった。これらについて免疫染色を行ったところ、p75NTR、インテグリンα6については輪部基底細胞に特異的な発現をしていることが確認された。両者はともに細胞表面マーカーであり、セルソーターによる幹細胞の単離を行うにあたり、豚角膜上皮細胞を用いて一連の操作の条件検討を行った。その結果これまでの最高の条件にて約50%の上皮細胞がセルソーター後にも培養に十分なバイアビリティーを維持していた。p75NTRとともにNGFのシグナル伝達に関わるTrkAについても免疫染色を行ったところ、p75NTRよりも広い範囲に、非常に強い染色が認められた。ニューロトロフィンの飢餓状態はアポトーシスを引き起こすことから、NGFは角膜上皮幹細胞の生存維持にとって重要な意味を持つと考えられた。マウスバルジ細胞を角膜上皮へ分化転換させる可能性について検討した。バルジ細胞をエクスプラント法にて培養した。

通常の培養条件下では細胞は細胞質の大きい平坦な分化した細胞に変化したが、培養条件を最適化することで、小型の核細胞質比の大きな未分化様の細胞が培養でき、これらは十分に分化転換するポテンシャルを維持していると考えられた。角膜上皮幹細胞の同定、特性解析を目的として、まず輪部基底細胞の遺伝子発現解析を行うこととした。そのためには輪部基底細胞だけを選択的に採取する手法が必要となる。これにはレーザーマイクロキャプチャー法が最適である。しかしそれから採取できるRNA量は極めて微量で1ng程度しかなく、ここから正確な遺伝子発現解析を行うにはそれに特化した方法論の確立が絶対的に必須であった。このためまずレーザーマイクロキャプチャーで採取できる微量なtotal RNAから正確な遺伝子発現解析を行うための方法論の確立を行った。条件検討を行ううちcDNA合成時の効率を改善することがもっとも重要であることが明らかとなった。また増幅時に生じる遺伝子発現プロファイルの歪みを低減するために従来法とは違うアダプターをデザインした。結果としてあたらしい増幅おける増幅時の歪みは従来法にくらべ著明に低減し、1ng程度の微量RNAからでも十分に正確な遺伝子発現解析が可能であることが判明した。この新しいiAFLP法を使って角膜、輪部、結膜の基底中間層、表層細胞の遺伝子発現解析を行い、角膜特異的に発現する遺伝子をいくつか同定した。この中に含まれるCLCA2に対しては特異抗体を作成し、CLCA2が皮膚表皮細胞、角膜上皮細胞を含むケラチノサイト系上皮細胞の基底細胞で極めて特異的に発現していることを見いだした。またCLCA2の他には、角膜上皮幹細胞に特異的な遺伝子としてNGF receptor (p75NTR)を見いだした。カウンターパートであるTrkA,TrkBの発現を調べたところ、TrkAも角膜輪部基底に特異的に染色され、さらにこれらの遺伝子はケラチン12陰性細胞にて強く発現していることが明らかとなり、リガンドであるNGFが輪部基底に存在する角膜上皮ステムセルの維持や特異的な細胞学的性質に強く関連している可能性が示唆された。
運動失調症に対するリハビリテーションの研究(磁気刺激を用いた研究)

平成10年度は、うつ症状に効果があるといわれている経頭蓋反復磁気刺激(rTMS)の安全性について正常マウスを用いて検討し、臨床応用への可能性について検討した。rTMSを10Hz、100回投与群と3Hz、180回投与群とrTMS非投与群の3群に分け、各群に刺激閾値の130%、90%の2種類の刺激強度で磁気刺激を行い、学習・記憶能への影響について検討した。学習.記憶能の検討には、Morris水迷路試験を用いた。結果は、rTMS投与した群では、一過性に影響がみられるものの、記憶の保持には影響はみられなかった。また、実験中にけいれんがみられたマウスはいなかった。rTMSは、磁気刺激の強度、頻度、回数、一連の反復刺激を繰り返す回数を検討することにより、安全に臨床応用が行なうことができると考えられた。平成11年度は、健常者に反復磁気刺激を行ない、臨床応用について検討した。上腕二頭筋を磁気刺激し、筋収縮パターンを記録し、収縮時間、弛緩半減時間を測定した。次に、50Hz、0.5秒間の反復磁気刺激を行ない、強縮性収縮を起こさせ、その前後にて単収縮を行なった時の筋収縮パターンにおける張力の変化について検討した。結果は、男性では出力50%の時に張力比は最大に達し、女性では出力70%の時に最大に達した。収縮時間では男女差はみられなかったが、弛緩半減時間では女性の方が有位に長く、これは、slow twitsh unitとfast twitch unitの比率が男女間で差が見られるためと考えられた。強縮性収縮前後での単収縮の張力比は、男女ともに反復磁気刺激後において単収縮の張力は増大していたが、これは男性においてより増大傾向であった。この現象は、Post-tetanic potentiationを示していると考えられた。連続磁気刺激は、ヒトの近位筋の生理学的解析に有用な方法であり、臨床応用に発展させることができると考えられた。rTMSはうつ症状に効果があるといわれており、経頭蓋反復磁気刺激(rTMS)の安全性について正常マウスを用いて検討し、臨床応用への可能性について検討した。方法は、7週齢雄マウスを用い、rTMS投与として、10Hz、100回投与群と3Hz、180回投与群、さらに、rTMS非投与群(対照群)の3群に分け、各々rTMSの学習・記憶能への影響について検討した。磁気刺激強度は刺激閾値の130%の出力とし、磁気刺激投与は3週間とした。学習・記憶能の検討には、磁気刺激投与後、Morris水迷路試験を10日間用い、記憶の保持の検討については、磁気刺激投与終了後24日目に同様の迷路試験を用いた。結果は、Morris水迷路試験2日目に対照群の学習効果が他の群よりも著明であった。しかし、その変化は一過性であり、rTMSによる記憶の保持には影響はみられなかった。次に、磁気刺激強度を刺激閾値の90%の出力として上記と同様の方法で正常マウスに対するrTMSによる学習・記憶能への影響について検討した。結果は、対照群が第2日目に学習効果が著明に認められたが、5日目以降では3群間において差はみとめられず、また、記憶の保持に対する差も認められなかった。

以上より、rTMSの学習・記憶能への影響は一過性であり、また、実験中けいれんがみられたマウスはみられなかった。rTMSは、磁気刺激の強度、頻度、回数、一連の反復刺激を繰り返す回数を検討することが重要であるといわれており、これらを考慮することにより、安全に臨床応用ができると考えられた。rTMSは様々な疾患に対する効果が期待され、今後は運動失調患者に対して、安全性を厳重に検討した上で、症状に対する改善目的に臨床応用したいと考えている。磁気刺激を用いて健常者の上腕二頭筋の筋収縮パターンを検討した。対象は健康な成人13名(男性6名、女性7名)で、平均年齢は男性24.8±2.5歳、女性23.9±4.6歳である。方法は、被験者は安静座位をとり、ひずみ計のプレートに前腕伸側があたるように手関節を固定した。上腕二頭筋の筋腹に円形コイルを設置し磁気刺激を行い筋収縮パターンをひずみ計にて記録した。刺激出力は40%100%まで変化させ、筋を単収縮させた。収縮時間、弛緩半減時間を測定した。次に、50Hz、0.5秒間の連続刺激を行い、強縮性収縮を起こさせ、その前後で単収縮を行った時の筋収縮パターンにおける張力の変化について検討を行った。結果は、男性において出力50%の時に張力比は最大に達し、女性においては70%で最大に達した。出力40%、50%における男女間の張力比は男性の方が有意に高かった。収縮時間は男性が76.3±6.8ms、女性が77.7±21.8msで、男女間において有意差は認めなかった。弛緩半減時間は男性が69.7±6.4ms、女性が100.6ms±13.9msで、女性の方が有意に長かった。男女間での差は、slow twitch unitとfast twitch unitの比率が男女間で差がみられるためと推測された。次に、連続磁気刺激前後での強縮性収縮前後での単収縮における張力比は、男性女性ともに連続磁気刺激後の方が単収縮の張力は大きくなっていたが、男性においてより増大傾向がみられた。この現象は、post-tetanic potentiationを示していると考えられた。磁気刺激による筋収縮の分析は、近位筋の生理学的解析に有用な方法であり、臨床応用に発展させ得ると考えられた。