hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
魚類病原菌Edwardsiella tardaの溶血素遺伝子の構造解析ならびに機能解析

ウナギ病魚から分離したE.tardaMZ8901株のゲノムDNAライブラリーをコスミドベクターSuperCos1および大腸菌XL1-Blueを用いて作製した。溶血素産生クローンはウサギ血液寒天平板上で選択した。次いで、ロ-コピー数ベクタープラスミドpSTU28およびpTWU228を用いてサブクローニングを行い塩基配列の決定を行った。溶血素産生クローンは約35kbのDNA断片を含んでおり、サブクローニングの結果、約7kbのDNA断片上に溶血素遺伝子が存在した〔ETH1〕。ETH1溶血素遺伝子の塩基配列について既知の溶血素遺伝子と比較したところ、Serratia marcescensおよびProteus mirabilisの溶血素遺伝子と約57および47%の相同性を示し、同一の祖先遺伝子から進化してきた遺伝子であると思われた。ETH1溶血素遺伝子の上流には、鉄により転写量が調節されるFur結合領域が存在し、本菌の溶血素が培地中の鉄の量により産生量が異なるとされる報告と一致した。また、S.marcescensおよびP.mirabilisの溶血素遺伝子の発現が、鉄の量によりにより制御されていることから、今回解析したEHT1は鉄の量により遺伝子の転写制御がされていると考えられた。ETH1の溶血素遺伝子の構造領域の上流には、タンパク質の分泌に関与している遺伝子と類似の遺伝子〔ETHR1〕が存在し、この領域を除くと溶血素は菌体外へ分泌されないことから、ETHR1はETH1の分泌に必須であることが明らかとなった。DNAハイブリダイゼーションにより、各地で分離されたE.tardaでのETH1の存在を調べたところ、全ての菌株がETH1と相同性を示したことからETH1はE.tardaに広く存在していることが分かった。
ヒトヘムオキシゲナーゼ遺伝子の熱ショックエレメントの機能の抑制機構

熱ショック蛋白質(HSP)は熱などの種々の環境因子によって誘導される一群の蛋白質であり、HSP遺伝子のプロモーター領域には熱ショックエレメント(HSE)と呼ばれる共通の塩基配列が存在する。HSEは熱ショック転写因子(HSF)の結合部位であり、HSEが1コピーでもプロモーター領域に存在すれば、その下流にある遺伝子の転写が熱ショックにより誘導される。ヘムオキシゲナーゼ(HO)はヘム分解の律速酵素であり、通常、組織・細胞におけるHO活性は低いが、基質であるヘムや重金属などで誘導される。実際、ラットHOは32kDaの熱ショック蛋白質として知られている。一方、ヒトHO遺伝子のプロモーター領域には、既知のHSEと完全に一致する塩基配列が存在するにもかかわらず、ヒト正常細胞では熱ショックによるHOの誘導がおこらない。我々は同遺伝子のプロモーター領域にHSEの機能を抑制するような塩基配列(サイレンサー)の存在を想定しており、同サイレンサーに関して、以下の成果を得た。1.ヒト正常細胞(肺胞マクロファージ)を42°Cで培養したところ、代表的なHSPであるHSP70は誘導されたが、HOは全く誘導されなかった。よって、ヒトHOはHSPではない。2.ヘミンによるヒトHOの誘導は熱ショックにより阻害される。HOはヘミンあるいはカドミウムなどの重金属によって、転写レベルの誘導を受ける。しかし、ヘミン処理を42°Cで行うと、HOmRNAの誘導が全く見られなかった。3.試験管内ではHSFはヒトHO遺伝子プロモーター領域に存在するHSE(HO-HSE)に結合する。熱ショック(42°C)後のまたは無処理のHeLa細胞より核抽出液を調製し、HO-HSEにHSFが結合することをゲルシフト法で確認した。なお、HeLa細胞の熱ショック蛋白質70(HSP70)は熱ショックにより誘導されるが、HOは誘導されない。4.HO-HSEに対するサイレンサー配列の存在。ヒトHO遺伝子の5'上流領域(約2kb)をプロモーターとし、その下流に大腸菌の遺伝子gpt(xanthine-guanine phosphoribosyltransferase)をレポーターとして持つような融合遺伝子をHeLa細胞に導入し、42°C処理がレポーター遺伝子の一時的発現に与える影響を調べた。なお、gptの発現をS1マッピングで定量した。HHO-HSEの近傍に種々の欠損を持つ融合遺伝子を用いて、熱ショックによる誘導の有無を解析し、サイレンサー機能を持つ塩基配列の存在を確認した。
キラルなマルチヘリシティー構造が生み出す集積型湾曲π共役分子の創製

分子内に複数のヘリセン構造を有する多重ヘリセン類は、その湾曲した興味深い構造と、それに起因した特徴的な物性を示すことから、近年活発な研究が展開されている。私は、その多重ヘリセン類の新たな合成戦略として、ヘリセン上に発生させたアライン(ヘリセニルアライン)を活用し、ユニークな構造、物性を有する高次多重ヘリセン(キラルナノカーボン)の創製を目指す。
多雪地域における木製グライド防止工を用いた防雪林造成法の確立

富山県の最大積雪深2mまでの急斜面において、間伐材を用いた木製三角枠工によって雪崩防止林の造成が可能であるかを検討した。スギ植栽から10年程度が経過した7箇所の林分を対象に調査を実施し、木製杭の残存率と、スギ植栽木のうち雪上直立木(樹高が最大積雪深の2倍以上で直立状態のもの)となった本数密度を経時的に評価した。その結果、木製杭の残存率は9年経過で約8割に、12年経過で約4割になると推定された。スギ植栽木は、一般的なスギの植栽密度である2,500本/haの場合、雪上直立木が9年経過で900本/haに、12年経過で1,500本/haに達すると推定され、雪崩防止林の造成が可能であることが示された。斜面積雪のグライドと全層雪崩が常襲し、樹林化が阻害された多雪地帯の急傾斜地では、新たな森林造成法が必要である。本研究では、林業活性化の観点から間伐小径材を用いたグライド防止工の施工地において、斜面積雪の安定度に対して、経年に伴う木製グライド防止工の効果の減衰と植栽木の成育による補完関係が成立し、安定した森林造成が可能かについて検討した。施工後813年が経過した富山県内5箇所の試験地で、木製グライド防止工の耐久性調査と植栽木の毎木調査を実施した。木製グライド防止工は、腐朽・損壊して減衰するのを残存率で評価した。植栽木は、成育過程で埋雪期を脱し、雪上直立木となった本数密度から斜面積雪安定度を定量化した。木製グライド防止工による斜面積雪安定度は、11年経過時に半減し、15年後にはほとんど期待できなくなっていた。一方、スギ植栽木の樹高は、グライド防止工により積雪の移動が抑制された条件下では、一般造林地と同等の良好な成長を示した。そこで、各施工地での最大積雪深に対する平均樹高の比と直立木の出現割合との関係を求め、スギ植栽密度を2550本/haと固定して、植栽木の生存率、直立木の出現率を乗じて求めた雪上直立木の本数密度を、斜面積雪の安定に必要とされる立木密度1000本/ha(既往文献)で除して、スギ植栽木の経年に伴う斜面積雪安定度を定量化した。その結果、最大積雪深が1.5m、2.0mの場合は、植栽からそれぞれ8年、11年で斜面積雪安定度が概ね1に達し、グライド防止工による斜面積雪安定度が半減する前に、速やかにスギ植栽木によって斜面積雪の安定度が補完されていた。また、最大積雪深2.5mでは、11年および15年経過時のスギ植栽木による斜面積雪安定度がそれぞれ0.71、0.91と算出され、グライド防止工による斜面積雪安定度と合わせて、概ね補完関係が成立していることが明らかになった。治山事業における植栽樹種として広く普及しているスギを主に植栽したものや、スギに広葉樹を混交させたもの、複数の広葉樹を植栽したものなど、植栽樹種や立地条件の異なる木製グライド防止工の施工地として、富山県内の5箇所を中心に調査を継続しており、グライド防止工の耐久性と植栽木の成育データ、さらに両者に対する積雪荷重データが蓄積しつつある。平成27年度は、これらのデータの中からスギ植栽木について、雪上直立木まで成長した本数密度から植栽木による斜面積雪安定度を定量化し、経年に伴うその推移をモデル化した。これと合わせて、グライド防止工の木材部材の腐朽に伴う折損の発生状況から、経年によるグライド防止工の残存率を求め、これを斜面積雪が安定し続けている面積率に置き換えて、斜面積雪安定度を求めた。以上により、スギ植栽木とグライド防止工による斜面積雪安定度の経年的な補完関係を定量化した。それにより、樹林化が阻害された多雪地帯の急傾斜地において、最大積雪深2.5mまでであれば、木製グライド防止工とスギ植栽木を併用することで、防雪林の造成が可能であることを示すことができ、最終計画年度である平成29年度までに最低限の目標は達成できる見通しが立った。グライド(積雪の斜面移動)やこれに伴う全層雪崩が常襲し、樹林化が阻害された多雪地帯の急傾斜地において、雪崩防止林造成方法の確立が求められている。本研究では、木製グライド防止工施工地において、経年に伴い木製グライド防止工が減少する一方で、植栽木が成育し積雪の安定に必要な立木密度を確保できるか定量的に評価し、雪崩防止林の成立につながるか検討を進めた。昨年度に続き、富山県内7箇所の施工地(914年経過)で、木製グライド防止工の耐久性調査と植栽木の毎木調査を実施した。スギ植栽木については、埋雪期を脱し雪上直立木となった本数密度を調べ、斜面積雪安定度の経年変化を求め、スギ林造成が可能であることを再確認した。一方、木製グライド防止工の残存率の評価ついては、木材部材(スギ間伐小径材)の腐朽被害度を6段階で目視により評価してきたが、目視被害度と残存強度との関係を明らかにすることで、残存率の評価の精度を高めることが期待できる。

そこで、木材部材を現地で直接曲げ試験する簡易装置を開発するとともに、14年経過した施工地にて同装置による曲げ強度試験を行い、目視被害度と残存強度との関係を明らかにした。針広混交林の造成について、木製グライド防止工の耐用年数を勘案して,初期成長が遅いブナやミズナラといった広葉樹を成長が速いスギと混植することで,斜面積雪の安定を維持しながら成林に繋がるか検討した。施工後11年経過したスギと広葉樹を混植した施工地を調査したところ,木製杭は腐朽による劣化に伴い残存率が40%となり,斜面積雪安定機能が大きく減衰していた。これに対して,ブナ,ミズナラの平均樹高は3.2m,3.3mであり斜立状態のものが多く,雪崩を防止するには不十分と考えられたが,スギは平均樹高が6.0mに達し,大半が直立状態となったことから,今後成林に至るまで,斜面積雪安定機能の主体を成すものと推察された。スギ(治山事業での植栽樹種として広く普及している)を中心に植栽したものや、スギに広葉樹を混交させたもの、広葉樹のみを植栽したもの、以上のような植栽樹種の異なる富山県内の7施工地(入善町舟見、魚津市平沢、氷見市棚懸、南砺市上田・大崩島・小山・下出)を対象に調査を継続している。これにより、木製グライド防止工の耐久性、植栽木の成育データ、さらにこれらに対する積雪荷重やグライド量のデータが蓄積しつつある。平成27年度は、これらデータの中からスギ植栽木について、雪上直立木まで成育した本数密度から植栽木による斜面積雪安定度を定量化し、その経年変化の予測モデルを作成した。これと合わせて、グライド防止工木材部材の腐朽に伴う折損の発生状況から、経年によるグライド防止工の残存率を求め、これを斜面積雪が安定し続けている面積率として位置付けて斜面積雪安定度を求めた。平成28年度は、針広混交林の造成について、木製グライド防止工の耐用年数を勘案して,初期成長が遅いブナやミズナラといった広葉樹に成長が速いスギと混植することで,斜面積雪の安定を維持しながら成林に繋げることが可能であることを示した。以上のように、斜面積雪安定度の経年変化を確認しながら、木製グライド防止工を用いることで、スギおよび針広混交の雪崩防止林を造成することが可能であることを示すことができた。平成29年度は、施工後12年経過した雪上木密度が異なる3箇所のプロットで、木製杭の支柱にかかる積雪荷重を測定し、比較した。雪上木密度が低い場合に比べて高い場合は、積雪荷重は7割程度に低減していた。雪上木が積雪荷重を分担し、積雪グライド量を5割程度に抑制するとともに、木製杭への積雪荷重の分担を減らしたものと推察された。以上のことから、雪上木が増えることで斜面積雪が安定し、積雪荷重の負担が減り、木製杭は不要になるものと考えられた。すなわち、木製杭は当初の役目を終え、成育した植栽木により斜面積雪は安定し、成林につながることが期待できる。研究期間全体を通じての成果は次のとおりである。積雪グライドにより樹林化が阻害された、最大積雪深2mまでの起伏の少ない平衡な急傾斜地において、木製杭によって雪崩防止林の造成が可能であるか検討した。調査は、このような立地条件で木製杭(防腐薬剤を加圧注入したもの)を斜面傾斜角35度、40度に対してそれぞれ450基、620基/ha設置すると同時に、樹木植栽して10年程度が経過した5箇所の林分を対象に35年間にわたって行った。そして、木製杭の残存率(当初の設置数から腐朽・損壊したものを除いて求めたもの)と、スギ植栽木のうち雪上直立木(樹高が最大積雪深の2倍以上で直立状態のもの)となった本数密度について経時的に評価した。その結果、木製杭の残存率は9年経過で約8割に,12年経過で約4割になると推定された。それに対して、スギ植栽木は中位の地位に相当する樹高成長を示したことにより、植栽密度2,500本/haにおいて、雪上直立木が9年経過で1,000本/ha(斜面積雪を安定させるのに必要な本数密度)に、12年経過では1,500本/haに達すると推定された。
大腸菌染色体複製開始における転写およびDnaA蛋白の機能

複製開始に関与するRNAを知る目的で、まず大腸菌プラスミドを用いてoriC近傍に存在するプロモ-タ-からの転写開始がプラスミドの複製能に及ぼす影響を検討した。複製能はpolA株トランスフォ-メ-ションの効率、トランスフォ-マント中でのプラスミドのコピ-数及び安定性、さらにin vitro複製反応における鋳型活性を測定することにより検定した。その結果、これまで示唆されていたmioCプロモ-タ-からの転写以上に、oriCに左接するgidプロモ-タ-からの左向きの転写が複製開始により大きく関与しており、両方の転写が協調的に寄与していることが示唆された。またこれら2つのプロモ-タ-からの転写は緊縮調節を受けていることが判明した。次に転写反応の複製開始への関与の様式を知る目的で、最少必須領域を含み、gidおよびmioCプロモ-タ-は含まないoriCとpBR322のキメラプラスミドを作成し、このプラスミドにラクト-スオペロンプロモ-タ-を挿入して、プロモ-タ-の位置および方向とプラスミドの複製能との関係を検討した。oriCの左側から左向きに進む転写が最も複製活性化に効果があり、次にoriC右外側から左向きにoriCを通過する転写が複製活性化能があることが判明した。また、oriCの左外側から右向きにoriCを通過する転写は複製活性化能が非常に低いことが判明した。in vivoでは転写はRーloop形成ではなくDNAに負の超らせん構造を与えることによりDnaAによる二本鎖開裂を引き起こすというモデルが、より妥当と考えられる。一方、宿主染色体上のgidおよびmioCの両プロモ-タ-を同時に欠失させても細胞の増殖に見かけ上の変化はあらわれないことが判明した。この菌株における開始反応の機構は不明である。
環境関連ガス検出用としての赤外線半導体レーザ材料の開発

3μm以上の発振波長の半導体レーザを実現可能な半導体混晶としてTlInAsの分子線結晶成長(MBE)法による成長を試みた。TlGaAsのMBE成長の場合と同様に、TlInAsのMBE成長においても成長温度を200°C以下に下げることでTlが取り込まれるのではないかと考えた。TlInAsの成長に先立ち、200°C以下でMBE成長した場合のInAs結晶の特性が知られていなかったので、これを調べる必要があった.そこで、150-200°CでInAsをMBE成長したところ、300°C以上で成長した場合にぐらべ、Asが0.5%程度過剰に含まれ、そのせいで格子間隔もInAs本来のものより膨張していることがわかった。次に、TlInAsを150-200°CでMBE成長したところ、やはり格子間隔がInAs本来のものより大きかったが、Tlのためではなくこれも過剰なAsのせいとわかった..Tl濃度の深さ方向の分布を調べたところ、150°Cで成長した場合は1.5%のTlが均一に分布していたが、200°Cで成長した場合は、成長層の中央での濃度が1/10程度になることがわやった.250°C以上で成長したり、Tl濃度を、2%以上にすると単結晶成長しないことがわかった。一方、低温成長によって取り込まれる過剰Asの除去のためアニール実験を行った.まず、低温でMBE成長したInGaAs/GaAs量子井戸構造について急速アニールを行ったところ、250-300°Cで成長した試料でも900°C程度の急速アニールにより、フォトルミネッセンス発光強度が増大し、400°Cで成長した試料と同程度になることがわかった.しかし、低温でMBE成長したTlGaAs/GaAs量子井戸構造についでアニールを行ったところ、450°C以上のアニールでTl組成が減少することがわかった。3mm以上の発振波長の半導体レーザを実現可能な半導体混晶としてTlInAsの分子線結晶成長(MBE)法による成長を試みた。TlInAsの成長に先立ち、200°C以下でMBE成長した場合のInAs結晶の特性が知られていなかったので、これを調べる必要があった。そこで、150-200°CでInAsをMBE成長したところ、300°C以上で成長した場合にくらべ、Asが0.5%程度過剰に含まれ、そのせいで格子間隔もInAs本来のものより膨張していることがわかった。次に、TlInAsを150-200°CでMBE成長したところ、やはり格子間隔がInAs本来のものより大きかったが、Tlのためではなくこれも過剰なAsのせいとわかった。Tl濃度の深さ方向の分布を調べたところ、150°Cで成長した場合は、1.5%のTlが均一に分布していたが、200°Cで成長した場合は、成長層の中央での濃度が1/10程度になることがわかった。250°C以上で成長したり、Tl濃度を2%以上にすると単結晶成長しないことがわかった。

TlGaAsのMBE成長の場合と同様に、TlInAsのMBE成長においても成長温度を200°C以下に下げることでTlが取り込まれるのではないかと考えた。TlInAsの成長に先立ち、200°C以下でMBE成長した場合のInAs結晶の特性が知られていなかったので、これを調べる必要があった。そこで、150-200°CでInAsをMBE成長したところ、300°C以上で成長した場合にくらべ、Asが0.5%程度過剰に含まれ、そのせいで格子間隔もInAs本来のものより膨張していることがわかった。次に、TlInAsを150-200°CでMBE成長したところ、やはり格子間隔がInAs本来のものより大きかったが、Tlのためではなくこれも過剰なAsのせいとわかった。Tl濃度の深さ方向の分布を調べたところ、150°Cで成長した場合は1.5%のTlが均一に分布していたが、200°Cで成長した場合は、成長層の中央での濃度が1/10程度になることがわかった。250°C以上で成長したり、Tl濃度を2%以上にすると単結晶成長しないことがわかった。一方、低温成長によって取り込まれる過剰Asの除去のためアニール実験を行った。まず、低温でMBE成長したInGaAs/GaAs量子井戸構造について急速アニールを行ったところ、250-300°Cで成長した試料でも900°C程度の急速アニールにより、フォトルミネッセンス発光強度が増大し、400°Cで成長した試料と同程度になることがわかった。しかし、低温でMBE成長したTlGaAs/GaAs量子井戸構造についてアニールを行ったところ、450°C以上のアニールでTl組成が減少することがわかった。
膵腫瘍のMRによる描出能向上に関する研究:脂肪抑制スピンエコー法の有用性

目的:MRによる膵腫瘍の描出能の向上を目的として、脂肪飽和法を用いた脂肪抑制画像を通常のT1強調賀増員追加撮像し、その有用性について検討した。対象と方法:膵癌9例、インスリノーマ5例、および嚢胞性膵腫瘍5例を対象とした。主観的評価法として、腫瘍と膵実質および膵周辺脂肪の間のコントラストを三段階、1)脂肪抑制画像が通常の画像に比べ優れている、2)差がない、3)劣っているで評価した。充実性腫瘍に対しては、客観的評価法としてコントラスト・ノイズ比(CNR)を測定した。結果:造影前は膵癌8例(89%)、インスリノーマ4例(80%)、嚢胞性膵腫瘍2例(67%)で脂肪抑制画像が優れ、造影後は膵癌4例(67%)、インスリノーマ3例(100%)、嚢胞性膵腫瘍3例(75%)で脂肪抑制画像が優れていた。造影前の膵癌と膵実質のCNRの絶対値は脂肪抑制後上昇し(p<0.001)、このため脂肪抑制画像が膵癌を膵実質より明瞭に分離させた。造影後は膵癌と脂肪とのCNRは、全ての症例で脂肪抑制により負から正に逆転した。膵癌は周囲の脂肪に比べ高信号となり、このため腫瘍が見えやすくなった。インスリノーマの症例でもCNRは同様の傾向を示した。考察:造影前の脂肪抑制画像では正常の膵実質が高信号を呈するため、低信号の腫瘍は通常のT1強調画像に比較し、より明瞭に描出されると考えられた。さらに膵周囲脂肪の信号強度を抑制することにより、造影剤投与後に濃染された腫瘍の膵実質外への進展をより明瞭に描出しえた。これらの点で、脂肪抑制画像は膵癌の進展範囲の推定および治療方針を決定する上で重要な情報を提供すると考えられた。一方、1)膵癌により正常の膵実質が消失した症例、2)後腹膜の脂肪が乏しい症例、3)嚢胞性膵腫瘍で薄い嚢胞壁を有する症例、4)出血を伴った嚢胞性膵腫瘍においては、脂肪抑制画像は通常のT1強調画像に付加的情報をもたらさなかった。
重い電子系の超伝導に関する極限条件下の物性測定

我々のグループでは、ダイヤモンドアンビルセルを用いた超高圧(20GPa)・極低温(50mK)下での電気抵抗・磁気測定の強相関電子系への適応を検討してきた。現状では予測される圧力の一軸性、分布のためにゼロ抵抗の観測には至っていないが、常伝導状態の電気抵抗およびTcの磁場変化の実験に成功した。今までに得られた結果は以下の通りである。CeCu_2Si_2でみられる高圧下でのTcの上昇とCeCu_2Ge_2のTcの圧力変化)1.CeCu_2Ge_2においてもP>16.5GPaの高圧下でTcの増大を観測した。2.Hc-Tc相図はCeCu_2Si_2,CeCu_2Ge_2それぞれの2つの超伝導相で類似している。すなわち重い電子系の超伝導の特徴を示している。3.超伝導相図のH=0近傍の立ち上がり(-dH_<C2>/dT)は、常伝導状態の電気抵抗から見積もられる有効質量の変化とTcの変化で説明できる。CeRu_2Ge_2における圧力誘起超伝導の探索)1.P=10GPa近傍を境界にして、低圧側では長距離秩序状態、高圧側ではフェルミ液体状態を反映した電気抵抗が観測された。2.P<15GPa、T>50mKの温度・圧力領域で超伝導は観測されなかった。3.5GPa<P<10GPaの圧力領域(長距離秩序状態)で比較的低磁場(H<4T)で減少する電気抵抗の磁場変化が観測された。これは秩序状態が強い強磁性相関をもっていることを反映しており、このために超伝導が出現しないと考えている。4.P=9GPa近傍でCeRu_2Si_2に類似した電気抵抗の温度変化が観測されたが、磁場変化ではメタマグによる異常は観測されなかった。
多角的アプローチによる繊毛内タンパク質輸送システムの解明

一次繊毛は細胞のアンテナとして機能するオルガネラであり、その異常は多様な重篤症状を呈する繊毛病を引き起こす。一次繊毛の形成や機能維持において基盤となるのが繊毛内に受容体等を輸送する繊毛内タンパク質輸送(intraflagellar transport: IFT)システムである。IFTシステムを司るIFT装置は合計40種類以上のタンパク質から成る巨大で複雑な分子マシンである。本年度はIFT装置のモータータンパク質であるヘテロ三量体キネシン2とダイニン2複合体に関する研究を行なった。IFT装置はヘテロ三量体キネシン2の働きによって繊毛基部から先端へ順行輸送され、ダイニン2複合体の働きによって繊毛先端から基部へと逆行輸送される。しかしIFT複合体とキネシン2と結合様式は不明であった。そこで私たちが開発した「観るだけでわかるタンパク質間相互作用解析法:visible immunoprecipitation (VIP)アッセイ」を駆使して相互作用解析を行い、キネシン2がIFT38、IFT52、IFT57、IFT88から成る四量体と結合することを発見した。さらにこの結合にはヘテロ三量体キネシン2のサブユニットであるKIF3BのC末端領域が重要であることを明らかにした。IFT装置の逆行輸送を担うダイニン2複合体は11種類のサブユニット(重鎖DYNC2H1、中間軽鎖DYNC2LI1、中間鎖WDR34、WDR60、軽鎖DYNLL1/2、DYNLRB1/2、DYNLT1/3、TCTEX1D2)から構成されるが、複合体全体の構築様式や各サブユニットの機能は不明であった。本年度はVIPアッセイを用いてダイニン2複合体の構築様式を解明しただけでなく、WDR34とWDR60ノックアウト細胞の表現型解析を行うことで、これらのサブユニットが繊毛内逆行輸送に不可欠であることを明らかにした。以上のように研究成果を複数の論文として発表できたことから、本研究課題は概ね順調に進展していると評価している。今後はIFT輸送装置を構成するIFT-A複合体とIFT-B複合体の複合体間の相互作用に関与するサブユニットの同定と、IFT複合体とダイニン-2との相互作用に関与するサブユニットの同定を目指す。これらの相互作用解析には私たちの研究室で開発したタンパク質間相互作用解析法であるVIPアッセイを用いる。IFT複合体のサブユニット遺伝子やダイニン-2サブユニット遺伝子をCRISPR/Cas9システムを用いてノックアウト(KO)し、そのKO細胞の表現型を蛍光顕微鏡観察することで、繊毛形成および繊毛内タンパク質輸送に対する影響を明らかにする。さらにレンチウイルスベクターを用いて、KO細胞に野生型遺伝子や変異型遺伝子を発現させたレスキュー細胞を樹立し、それらの細胞の表現型を比較することでIFT輸送装置の機能の分子基盤を解明する。また、繊毛のトランジションゾーン構成タンパク質や繊毛局在リン酸化酵素に関して、上記と同様に相互作用解析とKO細胞の表現型解析を行い、IFT輸送装置の制御機構を解明する。さらにレンチ

ウイルスベクターを用いて、KO細胞に野生型遺伝子や変異型遺伝子を発現させたレスキュー細胞を樹立し、それらの細胞の表現型を比較することでIFT輸送装置の機能の分子基盤を解明する。また、繊毛のトランジションゾーン構成タンパク質や繊毛局在リン酸化酵素に関して、上記と同様に相互作用解析とKO細胞の表現型解析を行い、IFT輸送装置の制御機構を解明する。
ファインバブルと低濃度オゾン水を融合した環境に優しいプラスチック改質法の研究

本研究は、ファインバブルと低濃度(1.52.0ppmが最適)のオゾン水を融合した新規のめっき前処理法を汎用のABS樹脂に適用した。現状のめっき法は、有害な6価クロム(発癌性物質)を含むエッチング液が世界中で使用されている。本法は従来法で必須であったエッチング液の回収や電解再生(3価→6価クロム)、中和・廃液・排水処理を全く必要とせず、サスティナブルケミストリーの前処理法が期待できる。最終年度は、本処理時のサンプル導入量(浴負荷量)変化を実施した。本処理は2030分が最適であり、現行の10分のクロム酸エッチング処理と同等の密着強度であるが、処理時間が長くなる。このエッチングは3価クロムの生成を抑制するため、浴負荷量は0.1dm2/L未満と極めて小さく、本処理法が数倍の負荷量で問題なければ、現行プロセスに影響を与えない。そこで、0.10.5dm2/Lの浴負荷量で密着強度を評価したところ,全く問題無いことを確認した。また、処理水に無機緩衝剤を添加しpHを4,7,10と変化させた結果、pH10ではアルカリによるオゾン分解により処理液が黒濁し、所定のオゾン濃度に出来なかった。また、pH4では密着強度が無添加液(従来法)と比較して低い値を示した。一方、pH7では密着強度は最も高い値を示し、処理時間延長に伴う密着強度の低下も抑制された。したがって、中性での無機緩衝剤の添加は非常に有効であった。更に、本処理システムを完全クローズド化し、処理水(ファインバブル低濃度オゾン水)中の改質された樹脂成分を濾過し、その後UVで処理液中に残存するオゾンを完全分解後、リファレンス槽に戻し、約250Lの水を循環使用した。クローズド化前後での密着強度や改質度合い等は殆ど変わらず、処理水の全有機炭素濃度等の成分分析は未実施であるが(今後実施予定)、新建浴から半年は問題無く使用できることを確認した。本研究は、最近話題のファインバブルと低濃度(0.32.0mg/L)のオゾン水を融合した新規のめっき前処理法を汎用プラスチックに適用した。現状、汎用プラスチックのABS樹脂にめっきを施す場合、有害な6価クロム(発癌性物質)を含むエッチング液が世界中で使用されている。本法は人にも環境にも優しい手法であり、従来法で必須であったエッチング液の回収や電解再生、廃液・排水処理を全く必要せず、処理水もリサイクル出来るため、サスティナブルケミストリーのエッチング法としてブレークスルーが期待できる。先ず、オゾン濃度に関しては低濃度の1.52.0 mg/Lが最適と判断した。約10倍の高濃度では、処理時間の短縮は可能となるが製造装置の配管等への影響も大きく、部品交換頻度が著しく高くなり、安定的な長期使用は難しいことが分かった。同時に、オゾン濃度が高くなるので作業時に人的危険が伴う可能性があった。次に、現在検討している工業化を目的としたファインバブル低濃度オゾン水製造装置は,加圧溶解法と気液二相流旋回法の両法を併用してファインバブルを生成する。特にバブル径に影響を与えるのは後者のチューブの長さであり、数水準長さを変えられる付属装置を設計し、製造が終了した段階である。本法の処理時間は2030分が最適であり、現行のクロム酸エッチング処理と同等の密着強度が得られる。また、TEMによる断面観察などから本処理により、ABSのB成分が溶出し、最大の表面粗さとなり、樹脂表面はマイクロレベルのB成分溶出痕とマトリックスのAS部分のナノレベルのアンカー効果の共存により高い密着強度を発現している(密着メカニズム)。更に、本装置稼働時のアイドリング時間は30分で、オゾン濃度は安定化することを確認した。処理水のリサイクル化は未実施であるが、新建浴から6ヶ月は問題無く使用できることを確認している。本研究の目的は、最近話題のファインバブルと低濃度(0.3-2.0mg/L)のオゾン水を融合した新規のめっき前処理技術(Fblow処理と呼称)の研究基盤の確立である。本研究では、最適なバブル径およびオゾン濃度を明らかにし、現状使用されている有害な6価クロム(発癌性物質)を含むエッチング液の代替技術とする。具体的な研究内容は、1オゾン濃度の最適化、2バブル径の最適化、3密着メカニズムの解析、4各種プラスチックにマッチングする前処理技術の確立、である。「研究実績の概要」で述べた通り、初年度(平成28年度)に1オゾン濃度は1.52.0 mg/Lが最適であり、3汎用のABS樹脂の密着メカニズムの解析が完了した。更に、装置稼働時のアイドリング時間は30分で、オゾン濃度は安定化することが分かった。次に、2バブル径の最適化はバブル径を数水準変化させることが可能な装置を設計・製造まで完了し、本年度早々に評価する予定である。また、処理水のリサイクル化は未実施であるが、新建浴から6ヶ月は問題無く使用できることを確認している。そこで、処理水の連続あるいは間欠のろ過、同時に処理水の活性炭ろ過を併用することにより、処理水のリサイクルも出来るため、サスティナブルケミストリーのエッチング法を達成できると考える。最後に4各種プラスチックにマッチングする前処理技術の確立であるが、Fblow処理の前後に酸処理を導入することにより、密着強度を改善出来ることが分かったので、本年度はこの酸処理の詳細な検討を行う予定である。

以上のことから、「(2)おおむね順調に進展している。」を選択した。先ず、PI樹脂に本処理を適用すると多数の針状突起が発現する。この発現メカニズムの解析を種々試みたが、解明は難しかった。恐らく、バブルが弾ける時に発生する熱により、PIが溶解しミルククラウン現象の様に針状突起が生成したと考えている。次に、現在検討中のファインバブル低濃度オゾン水製造装置は,加圧溶解法と気液二相流旋回法の両法を併用しファインバブルを生成する。特にバブル径を微小化するのは後者のチューブ長であり、7.550 mまで五水準変化(標準20 m)可能な付属装置を設計・製造した。それぞれのマイクロバブル及びウルトラファインバブル径を測定したが、システムに組み込まれた“バブル除去棟"の効果が絶大で、マイクロバブルは30-70個/mL程度であり、ほとんどが中心径90 nm程度のウルトラファインバブルが約30000000個/mLであった。また、ウルトラファインバブル径は殆ど変化無かった。このことはバブルがある程度の大きさになるとクラスターとして存在し、解析装置的にはバブル径が変化していないように見える可能性を示唆している。ABS樹脂に対し、本法の処理時間は30分が最適であり、本処理によりABS樹脂自体の表面硬度が増加し,同時に最表面に官能基を発現する。後続のアルカリ処理で強親水基も発現し,触媒吸着量が増加することで,めっきはスムースに反応し完全成膜に至る。最適処理で機械的な強度を示す改質層の厚さは400 nm,組成的に変化した改質層は800 nmであった。本処理中、ABS樹脂のB成分が優先的に溶出し、多数の溶出孔が形成され、最大の表面粗さを示す。この溶出孔周辺でNiPめっきとABS樹脂間にサブミクロンオーダーのアンカー効果が発現する。また、ASマトリックス部分とNiPめっき界面にナノレベルのアンカー効果を同時に発現することが分かった。本研究の目的は、最近話題のファインバブルと低濃度(0.3-2.0mg/L)のオゾン水を融合した新規のめっき前処理技術(Fblow処理と呼称)の研究基盤の確立である。本研究では、最適なバブル径およびオゾン濃度を明らかにし、現状使用されている有害な6価クロム(発癌性物質)を含むエッチング液の代替技術とする。具体的な研究内容は、1オゾン濃度の最適化、2バブル径の最適化、3密着メカニズムの解析、4各種プラスチックにマッチングする前処理技術の確立、である。「研究実績の概要」で述べた通り、平成29年度までに1オゾン濃度は1.52.0 mg/Lが最適であり、2バブル径は90 nm程度で、現製造装置のパフォーマンスで充分であると考えられる。また、装置稼働時のアイドリング時間は30分で、オゾン濃度は安定化することが分かった。3汎用のABS樹脂の密着メカニズムの解析は完了した。次に、処理水のリサイクル化は未実施であるが、新建浴から6ヶ月は問題無く使用できることを確認している。そこで、処理水の連続あるいは間欠のろ過、処理水の活性炭ろ過や処理水のオゾン処理(有機物や残留オゾンの分解)を導入することにより、リサイクル化も出来るため、サスティナブルケミストリーのエッチング法を達成可能と考える。
回転希薄原子系との類似性に基づく広義の量子ホール系に関する研究

量子ホール系と呼ばれる強磁場中の二次元電子系では,クリーンな系の特性は電子間クーロン相互作用によって決定される.この相互作用を粒子間の相対角運動量ごとに分解したものをHaldane擬ポテンシャルというが,半導体中の系ではこの擬ポテンシャルを連続的にコントロールするのは困難である.一方,トラップされた希薄原子系を高速回転させた系のハミルトニアンは,回転座標系で見ると実は磁場中の多粒子系のそれに他ならない.この希薄原子系ではFeshbach共鳴を用いることにより相互作用の短距離成分を連続的にコントロールできるうえ,相互作用の長距離成分も制御可能になりつつあり,従来のボーズ統計に加えてフェルミ統計に従う希薄原子系も実験的に追究されるようになった.つまり,クーロン相互作用するフェルミ系だけに限定されない広義の量子ホール系が観測対象となりつつある.我々はこの回転する希薄原子系に対して,まず低エネルギー励起と回転対称性の自発的破れとの関連を数値的及び解析的に詳細に調べた.この対称性の破れに関する南部・Goldstoneモードとしては,励起エネルギーがほぼギャップレスであるquadrupole modeとoctupole modeが候補となるが,我々は南部・Goldstoneモードが対称性の破れを回復しようとする特性に着目して,回転による渦糸侵入の際の密度空乏をどのモードが補償するかを,条件付き密度分布関数を角運動量分解することによって調べた.これにより,octupole modeが南部・Goldstoneモードにおける主要素であることを初めて明らかにした.また,Hartree-Fock-Bogoliubov近似を用いて,二層量子ホール系における横磁場起因の相転移に関して,相図を理論的に求めた.量子ホール系と呼ばれる強磁場中の二次元電子系では,試料がクリーンならば電子間のクーロン相互作用が系の性質を支配する.この相互作用を粒子間の相対角運動量ごとに分解したHaldane擬ポテンシャルが,量子ホール系における粒子間相互作用を完全に記述するが,半導体中の系ではこの量を連続的にコントロールするのが困難である.一方,トラップされた希薄原子系を高速回転させた際の現象が注目を集めているが,この系のハミルトニアンは実は,回転座標系で見ると磁場中の多粒子系のそれに他ならない.この希薄原子系ではFeshbach共鳴を用いることで相互作用の短距離成分を連続的にコントロールでき,その符号すら変えられる.さらに,相互作用の長距離成分も最近のレーザー技術によって制御可能となりつつあるうえに,従来のボーズ統計に加えてフェルミ統計に従う希薄原子系も実験的に追究されるようになってきた.つまり,クーロン相互作用するフェルミ系だけに限定されない広義の量子ホール系が観測対象となりつつある.そこで,我々はこの広義の量子ホール系における多彩な量子相転移の可能性を追求するために,量子モンテカルロ計算のプログラムを作成した.このプログラムによる静的な物理量の計算により,フェルミ統計に従う量子ホール系をまず追究した.さらに,このプログラムをボーズ系に対しても拡張した.また,外場に対する応答といった動的性質を追究するために,系の非線形性をボゾン展開法やself-consistentな乱雑位相近似を用いて記述し,グリーン関数に対する運動方程式を切断近似で解くアプローチに関しては,これらのアプローチの出発点となるHartree-Fock-Bogoliubov近似によって,量子ホール系における励起スペクトルと基底状態相関を追究した.量子ホール系と呼ばれる強磁場中の二次元電子系では,試料がクリーンならば系の性質は電子間クローン相互作用によって決定される.この相互作用を粒子間の相対角運動量ごとに分解したものをHaldane擬ポテンシャルというが,半導体中の系ではこのポテンシャルを連続的にコントロールするのは困難である.一方,トラップされた希薄原子系を高速回転させた系のハミルトニアンは,回転座標系で見ると実は磁場中の多粒子系のそれに他ならない.この希薄原子系ではFeshbach共鳴を用いることにより相互作用の短距離成分を連続的にコントロールできるうえ,相互作用の長距離成分も制御可能になりつつあり,従来のボーズ統計に加えてフェルミ統計に従う希薄原子系も実験的に追究されるようになった.つまり,クローン相互作用するフェルミ系だけに限定されない広義の量子ホール系が観測対象となりつつある.我々はこの回転する希薄原子系に対して,まず低エネルギー励起と回転対称性の自発的破れとの関連を詳細に調べた.この対称性の破れに関する南部・Goldstoneモードとしては,励起エネルギーがほぼギャップレスであるquadrupole modeとoctupole modeが候補となるが,我々は南部・Goldstoneモードが対称性の破れを回復しようとする特性に着目して,回転による渦糸侵入の際の密度空乏をどのモードが補償するかを調べた.これにより,octupole modeが南部・Goldstoneモードにおける主たる要素であることを初めて明らかにした.また,Hartree-Fock-Bogoliubov近似を用いて,二層量子ホール系における励起スペクトルと基底状態相関も追究し,さらには横磁場起因の相転移に関する相図も理論的に求めた.量子ホール系と呼ばれる強磁場中の二次元電子系では,クリーンな系の特性は電子間クーロン相互作用によって決定される.この相互作用を粒子間の相対角運動量ごとに分解したものをHaldane擬ポテンシャルというが,半導体中の系ではこの擬ポテンシャルを連続的にコントロールするのは困難である.

一方,トラップされた希薄原子系を高速回転させた系のハミルトニアンは,回転座標系で見ると実は磁場中の多粒子系のそれに他ならない.この希薄原子系ではFeshbach共鳴を用いることにより相互作用の短距離成分を連続的にコントロールできるうえ,相互作用の長距離成分も制御可能になりつつあり,従来のボーズ統計に加えてフェルミ統計に従う希薄原子系も実験的に追究されるようになった.つまり,クーロン相互作用するフェルミ系だけに限定されない広義の量子ホール系が観測対象となりつつある.我々はこの回転する希薄原子系に対して,まず低エネルギー励起と回転対称性の自発的破れとの関連を数値的及び解析的に詳細に調べた.この対称性の破れに関する南部・Goldstoneモードとしては,励起エネルギーがほぼギャップレスであるquadrupole modeとoctupole modeが候補となるが,我々は南部・Goldstoneモードが対称性の破れを回復しようとする特性に着目して,回転による渦糸侵入の際の密度空乏をどのモードが補償するかを,条件付き密度分布関数を角運動量分解することによって調べた.これにより,octupole modeが南部・Goldstoneモードにおける主要素であることを初めて明らかにした.また,Hartree-Fock-Bogoliubov近似を用いて,二層量子ホール系における横磁場起因の相転移に関して,相図を理論的に求めた.
肺および気道線維化のメカニズムの解明とその制御

本研究は肺および気道の線維化のメカニズムにおいて、特にT細胞およびSOCS分子の役割を明らかにすることを目的に検討してきた。T細胞クローンおよびSOCS-1分子の役割につき、次のような知見を得た。1.OVA特異的T細胞レセプター(TCR)のトランスジェュックマウスを用いて、Th1クローンの受身移入に引き続いてTh2の移入を行うことで肺の線維化が惹起される可能性が明らかになった。2.IPF由来の肺線維芽細胞と正常肺由来の線維芽細胞を比較すると、従来知られているとおり、コラーゲンの産生は前者で亢進していたが、SOCS-1の発現は低下していた。SOCS-IKOマウス由来胎生期線維芽細胞では、コラーゲン産生か亢進していること、SOCS-1を遺伝子導入することで抑制が認められたことから、コラーゲン産生とSOCS-1発現低下の間には因果関係があることが明らかになった。3.ブレオマイシン肺線維症モデルでは、SOCS-1mRNAはブレオマイシン投与1日後より速やかに誘導され、Day7まで有意に上昇していた。SOCS-1ヘテロマウスではブレオ投与7日におけるBAL中総細胞数、マクロファージ、リンパ球、好酸球の有意な増加が認められ、好酸球はDayl4においても有意な増加が認められた。全肺より得られたハイドロキシプロリン量はヘテロマウスで有意に上昇しており、SOCS-1発現低下によるブレオマイシン誘導性の線維化の増強が示された。SOCS-1導入アデノウイルスを投与すると、ハイドロキシプロリン量は低下し、肺の線維化が抑制された。マウスの喘息モデルでは、気道周囲に線維化を来たすことが知られているが、このようなモデルに抗原の経気道的チャレンジの直前にTh1細胞を受身移入するモデルを作成し、phenotypeの変化を検討した。Th1細胞の受身移入は、好酸球性気道炎症の軽減と気道過敏性の抑制を誘導し、同時に気道周囲の線維化を強く抑制することが明らかになった。マウスのKLH反応性Th2クローンの作成は現在進行中であり、いまのところ確立できていない。確立が不可能であれば、OVA-TCRトランスジェニックマウスからTh1,Th2を作成し検討したい。また、SOCS-1ヘテロマウスにおけるブレオマイシンによる肺線維症モデルを作成中である。また、培養線維芽細胞を用いて、IL-4およびTGF-bによるコラーゲン産生を検討したところ、IFN-gが両者のコラーゲン産生誘導を抑制するが、SOCS-1欠損線維芽細胞では、TGF-bによるコラーゲン産生はやはり抑制されるものの、IL-4による産生は抑制されず、むしろIFN-gにより増加させることが明らかになった。線維芽細胞をIFN-gで刺激し、野生型とSOCS-1欠損型の差をdifferentialに蛋白レベルで約25種類のサイトカインで検討すると、顕著なIL-6の産生がSOCS-1欠損線維芽細胞においてのみ認められた。また、IFN-gによる刺激で、SOCS-1欠損線維芽細胞においてのみCD40とCD40Lの発現が誘導された。IL-6とコラーゲン産生の関連や、CD40-CD40LによるコラーゲンあるいはIL-6の産生の関連は、現在検討中である。1.OVA特異的T細胞レセプター(TCR)のトランスジェニックマウスを用いて、サイトカインによるskewed Th1,Th2細胞を作成した。これを用いて受身移入を行うことで、Th2では好酸球性気道炎症を惹起した。この系を用いて、Th1クローンの受身移入に引き続いてTh2の移入の効果を検討中である。

単一細胞由来のTh2細胞クローンの作成は困難であり、引き続き作成条件を種々かえて努力している。今後、少なくともskewed Th1,Th2細胞を用いて局在と線維化過程でのTh2細胞の重要性を検証する。2.In vitroにおける線維芽細胞からのコラーゲン産生の制御については、wildおよびSOCS-1KOマウス由来胎生期線維芽細胞を用いて検討した。IL-4刺激によりコラーゲンの産生は増加し、IFN-γで抑制されるが、SOCS-1のKOマウス由来の線維芽細胞では、IFN-γにより抑制されず、レトロウイルスを用いてSOCS-1を遺伝子導入することで抑制が認められた。3.SOCS-1およびSOCS-3導入アデノウイルスをそれぞれ増殖させ、投与実験に十分な量を得た。現在、点鼻により、ブレオマイシンによる肺線維症モデルと喘息モデルにおける気道線維化に対する影響を検討中である。1.OVA特異的T細胞レセプター(TCR)のトランスジェニックマウスからskewed Th1, Th2細胞を作成した。この系を用いて、Th1リンパ球の受身移入に引き続きTh2リンパ球の受身移入を施行することで、肺胞領域の線維化をきたす可能性が示された。2.IPF由来の肺線維芽細胞を多数樹立し、コラーゲンの産生とSOCS-1の発現を検討した。無刺激の状態でコラーゲン産生は明らかに亢進しており、一方、SOCS-1の発現は正常肺由来線維芽細胞に比較して低下していた。しかし、インターフェロン刺激下ではSOCS-1の発現もコラーゲン産生も、正常線維芽細胞と同程度であり、インターフエロンがよりIPF由来の肺線維芽細胞に対し効果が高かった。3.ブレオマイシン肺線維症モデルを作成し、SOCS-1 mRNAの発現を検討した。SOCS-1はブレオマイシン投与1日後より速やかに誘導され,Day7まで有意に上昇していた。SOCS-1ヘテロマウスにおけるブレオマイシン肺線維症モデルは、投与7日におけるBAL中総細胞数,マクロファージ,リンパ球,好酸球の有意な増加が認められ,好酸球はDay14においても有意な増加が認められた。全肺より得られたハイドロキシプロリン量は有意に増加しており,SOCS-1発現低下によるブレオマイシン誘導性の線維化の増強が示された。
水中運動による抗動脈硬化作用機序の解明-3D管状ヒト血管モデルによる基礎的解析

急性冠症候群例の樹状細胞(DC)は、健常人や安定狭心症症例に比しCCL19,CCR7等の活性化マーカーの発現は高値であった。自発運動は、動脈硬化巣のDC、マクロファージ、リンパ球侵潤を抑制し、動脈硬化の発症や進展を抑制した。3次元管状ヒト血管モデルを用いた検討では、活性化DCとの共培養下で有意に血管炎症が惹起された。水中運動等の運動習慣を有する例は、運動習慣のない例に比し血中の高感度CRP値、CCL19が低値であった。したがって、水中運動等の運動習慣は、DCが関連する全身および血管炎症に対し、抗炎症および免疫調整作用を有することが示唆された。本研究の目的は、水中運動の抗動脈硬化作用を臨床的に明らかにするとともに、3次元管状ヒト血管モデルによる免疫学的基礎検討により解明することである。本年度は、研究代表者らのプロトコールにより作製した3次元管状ヒト血管モデル(ヒト大動脈血管平滑筋細胞・血管平滑筋細胞・type1コラーゲン)を用いて、樹状細胞・マクロファージ・CD4陽性リンパ球との共培養を行なった。管状ヒト血管組織において樹状細胞の活性化マーカーであるCD83やCD86、CCL19やCCR7の発現は、LPS刺激により増加した。TCR, CD40L, IFN-γの発現は、DCとの共培養下、特にLPS刺激により増加した。また、CD4陽性細胞の組織内への浸潤は、DCとの共培養下、特にLPS刺激により増加した。以上より、LPS刺激によるDCの活性化は、血管炎症を誘導することを、3次元管状ヒト血管モデルにおいて初めて証明した(Circ Res2008)。現在、樹状細胞とマクロファージとの差異、リンパ球サブセットとの関連について検討中である。さらに、東海地区の水中運動参加者における臨床指標と血液サンプルの収集を行なうため、計画書の倫理審査を申請し、承認を得た。インフォームドコンセントを取得した参加者から、実際に採血を行い、血清の保存を行なった。本課題は、水中運動の抗動脈硬化作用を基礎的、臨床的に検討を行う独創性の高い研究であるとともに、その結果から得られる知見は、社会的にも意義のあるものと考えられる。本研究の目的は、動脈硬化症の発症や進展に対する水中運動の効果を臨床的に明らかにするとともに、その磯序を、管状血管モデルにより免疫学的により解明することである。本年度の成果を総括する。1.動脈硬化症の発症や進展における免疫応答細胞群の役割:ヒト末梢血からCD14細胞をMACSにより分離しGM-CSFIIL-4刺激によりmyeloidDCに分化させた。急性冠症候群の患者より分化誘導したDCは、安定狭心症の患者より分化誘導したDCに比し、CD83/CD86の発現、CCL19、CCR7、TLR2、TLR4、TLR9の遺伝子発現は高値であった。また、IL-6、TNF-αの産生は高値であり、それぞれのDCの活性化マーカーとは有意な正相関を認めた。CCR7は動脈硬化の進展や退縮に関与する可能性が指摘されている。現在、CCR7のリガンドであるCCL19の役割も含めて、健常人および水中運動群との比較検討を行っている。2. 3次元管状ヒト血管モデルによる検討:研究代表者らのプロトコールにより作製した3次元管状ヒト血管モデル(Circ Res 2008)を用いて、樹状細胞・マクロファージ・リンパ球との共培養を行なった。リンパ球は、マクロファージに比しDCとの共培養により有意に活性化した。現在、活性化リンパ球とDCとの共培養、酸化LDLも含めたTLRリガンド刺激について検討を行っている。3.水中運動参加者における臨床的指標と免疫応答細胞群の役割:昨年度に引き続き、本年度も水中運動参加者も含めた一般健常人からインフォームドコンセント取得後に血液サンプルを採取した。水中運動等の運動習慣は、健康関連QOLの維持に役立つことが示された。心血管疾患に関連する種々のバイオマーカーや、前述のDCの遊走・分化に関与するCCLI9も含め測定し、現在検討を継続している。本課題は、水中運動の抗動脈硬化作用を基礎的、臨床的に検討を行う独創性の高い研究である。その結果から得られる知見は、社会的にも意義のあるものと考えられる。本研究の目的は、動脈硬化症の発症や進展に対する水中運動の効果を臨床的に明らかにするとともに、その機序を血管モデルにより解明することである。1.動脈硬化症の発症や進展における免疫応答細胞群の役割:CD14細胞をMACSにより分離しGM-CSF/IL-4刺激により樹状細胞(DC)に分化させた。

急性冠症候群例のDCは、健常人や安定狭心症症例のDCに比しCCL19, CCR7等の活性化マーカーの発現は有意に高値であった。動脈硬化モデルマウスでの検討では、自発運動により動脈硬化の発症や進展が有意に抑制され、運動量とは有意な負の相関を認めた。大動脈におけるDC、マクロファージ、リンパ球の侵潤は、自発運動により有意に抑制された。3次元管状ヒト血管モデルを用いたDC・マクロファージ・リンパ球との共培養系での検討では、活性化リンパ球単独に比較して、活性化DCとの共培養下で有意に血管炎症が惹起された。また、マクロファージに比しDCとの共培養により有意に活性化した。すなわち、DCの活性化が先行することが血管炎症に重要であることが示唆された。一方、マクロファージは、LPSと同様に酸化LDL刺激によりIL-8を含む種々の活性化マーカーの発現亢進を認めた。DNAマイクロアレイによりマクロファージサブセットの検討を行ったところ、酸化LDL刺激により活性化されるマクロファージは、主にM1であり、TGF-βを介する経路が重要で有ることが明らかとなった。2.臨床指標との比較:水中運動等の運動習慣を有する例は、運動習慣のない例に比し体脂肪量、血清脂質、血中の高感度CRP値が低値であった。運動、脂肪蓄積、慢性炎症がそれぞれ関連することが示唆された。3.研究成果の発表・意見交換:以上の成果を英文・和文誌に発表した。本課題は、水中運動の抗動脈硬化作用を基礎的、臨床的に検討を行う独創性の高い研究である。その結果から得られる知見は、社会的にも意義のあるものと考えられる。