hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
元素ブロック－高分子複合材料を用いる腫瘍の高感度検出と治療

昨年度、元素ブロック色素ピロロピロールアザBODIPYやチオフェン架橋BODIPY二量体(以下TBD)をポリエチレングリコール(以下PEG)やPEGを結合したヒアルロン酸に結合させ、様々な元素ブロック高分子を合成した。今年度はこの材料の物性と造影能を詳細に評価した。開発した高分子材料は、元素ブロック色素が薄い疎水性層に集積化した中空ベシクル構造を有する自己集合体を形成した。この自己集合体型造影剤は構造を精査することで、市販の血管造影剤インドシアニングリーンと比較して、最大1.8倍強い光音響信号を発した。PEGと元素ブロック色素をヒアルロン酸に結合させた造影剤が最適構造であることを明らかにした。当初計画通りの成果をあげることができた。TBDを結合したヒアルロン酸誘導体を担がんマウス(HeLa細胞)に投与したところ、これまでに開発した最も集積性の高いヒアルロン酸誘導体に比べ、約1.5倍効率良く腫瘍へ集積した。光音響撮像法により、腫瘍部位がコントラスト良く可視化できた。開発した造影剤は、光照射によりほとんど退色せず、連続利用に適した造影剤である。このように、当初計画した元素ブロック高分子材料が強い光音響信号を発し、また生体内で期待通りの高い集積性、造影能を発揮することを明らかにした。この実用的な造影剤開発に関する成果はBiomacromolecules誌に掲載された。元素ブロック高分子が生体に利用できる優れた材料であることを示し、領域に貢献した。領域内共同研究により、元素ブロック炭素クラスターカーボンナノチューブとカーボンナノフープの複合化に成功した。scanning probe microscopyにより表面吸着型複合化と貫通型複合化の違いを見分けることに成功した。このように、計画通りの成果をあげることができた。得られた成果に関する論文を現在投稿準備中である。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、ピロロピロールアザボロンジピロメテン(以下PPABと略す)、チオフェン架橋ボロンジピロメテン二量体(以下TBDと略す)と様々な分子量のポリエチレングリコール(以下PEGと略す)を結合させ、両親媒性分子を創製した。また、独自に開発したヒアルロン酸の化学修飾法を応用し、TBDとPEGをランダムに結合させたヒアルロン酸誘導体を合成した。これらはいずれも水中で球状自己集合体を形成することを明らかにした。また、これらの水中での蛍光発光、光音響信号強度を測定することで、いずれもほとんど蛍光を発さないが、一方で強い光音響信号を発することを見出した。市販のインドシアニングリーン色素より1.11.5倍程度強い信号であった。これらの信号強度と分子構造を比較することで、色素自身よりもPEGやヒアルロン酸が熱膨張し発する光音響信号の方が強いことを明らかにした。得られた光音響造影剤の中で最も信号強度の強いTBDを結合したヒアルロン酸誘導体を担がんマウスに投与し、光音響腫瘍イメージングを行ったところ、腫瘍部位の可視化に成功した。腫瘍集積率も15%ID/g以上とかなり効率良く集積することを明らかにした。炭素クラスター材料として、[9]シクロパラフェニレンアセチレンを合成、単離し、これとカーボンナノチューブとの複合体形成を検討した。紫外可視吸収スペクトル、ラマンスペクトルなどから、複合体を形成していることを明らかにした。当初予定したジピロメテン系色素を結合した光音響造影剤の創製に成功した。PEGを結合させた造影剤として、いくつか候補を検討し、光音響信号が効率良く発せられる構造の検討を行い、分子設計の指針を明らかにした。これは当初予定した計画通りに順調に研究を進捗させることができたことを示している。合成したジピロメテン系色素結合造影剤のうち、最も強い光音響信号を発した造影剤を用いる光音響腫瘍イメージングを実施した。その結果、合成した造影剤が有効な光音響腫瘍造影剤であることを明らかにした。これは当初予定していた計画通りに順調に研究を推進したことを示している。昨年度の実施計画では示さなかったが、[9]シクロパラフェニレンアセチレンの合成とカーボンナノチューブとの複合化についても推進することができた。また、複合体形成が可能であることも明らかにした。これらは、当初予定以上に研究が進捗したことを示している。

開発した造影剤は、光照射によりほとんど退色せず、連続利用に適した造影剤である。このように、当初計画した元素ブロック高分子材料が強い光音響信号を発し、また生体内で期待通りの高い集積性、造影能を発揮することを明らかにした。この実用的な造影剤開発に関する成果はBiomacromolecules誌に掲載された。元素ブロック高分子が生体に利用できる優れた材料であることを示し、領域に貢献した。領域内共同研究により、元素ブロック炭素クラスターカーボンナノチューブとカーボンナノフープの複合化に成功した。scanning probe microscopyにより表面吸着型複合化と貫通型複合化の違いを見分けることに成功した。このように、計画通りの成果をあげることができた。得られた成果に関する論文を現在投稿準備中である。ジピロメテン系色素元素ブロックの構造最適化を行い、さらに強い光音響信号を発する材料の創製を目指す。また、これを結合した元素ブロック高分子材料を創製し、これが光音響腫瘍造影剤として有望であることを示す。昨年度見出した強い光音響信号を発する高分子自己集合体について、さらに精査し、高分子自己集合体の構造やサイズ、色素の密度やPEGの長さなどが信号強度に与える影響を明らかにする。炭素クラスターとして、サイズの異なるシクロパラフェニレンアセチレンとの複合体形成を目指す。また、ねじれを持つ大環状パイ共役元素ブロックを創製し、フラーレンやカーボンナノチューブとの複合体形成を目指す。28年度が最終年度であるため、記入しない。
未完の記譜法：創造の為のアーカイブの実践的研究～言語・身体・イメージから

「Notation.記譜法」とは、一般には、楽譜など芸術諸ジャンル内の「行為の記録」と「再生の指示」を行うものとされる。本研究では、厳密なスコアに加え、道具、地図、模様、庭園、詩、映画、建築、ダンス、遊技などを含めた「言葉・イメージ・身体に運動を起こす記譜法」の構築を目指した。それらを言葉・イメージ・身体に運動を起こす流動的な「装置」として広く記譜を捉え直し、「行為の記録」と「再生の指示」にとどまらない「領域横断的な創造的行為としての記譜法」という新たな可能性を探求した。成果の還元としては実験的な展示や公演を中心に進め、従来の芸術の記録や作品展示とは異なる新たなモデルの提示となった。「Notation記譜法」とは、一般には、楽譜、舞踊譜など芸術諸ジャンル内の「行為の記録」(書くこと)と「再生の指示」(読むこと)を行うものとされている。本研究「未来の記譜法言語・イメージ・身体に運動を起こす装置」においては、厳密なスコアを有したものだけでなく、「言葉・イメージ・身体」に運動を起こす流動的な「装置」として広く記譜を捉え返すことで、「記録」と「再生」にとどまらない「領域横断的な創造的行為」としての記譜法の可能性を探求する。多様な感覚・技術の交通という視点からの記譜へのアプローチは、読む、書く、視る、聴くという従来の諸ジャンルに固定された「鑑賞形態」、歴史的文脈内に於ける「作品」「作者」概念や「資料体・集蔵体」(アーカイブ)の場を転移し「創造的誤読」へと導く新たな理論と制作の実践となるであろう。初年度は、「法と星座Turn Coat / Turn Court」プロジェクトをヨコハマトリエンナーレ2014で行うと共に、その展開として「装飾と犯罪Sense / Common」プロジェクトをPARASOPHIA京都国際現代芸術際2015で展開している。上記のプロジェクトは、1983年から1985年に京都アンデパンダン展で展示されたCourtシリーズ(林剛+中塚裕子)を「創造行為を誘発する記譜」として捉え直したものであり、美術に於ける「視ること・話すこと」の位相を変えて身体・領土・健康・安全の再配置を試みる実験でもあった。それは、政治哲学の分野で使用されてきた「身体を貫通する権力」と「行為の記録・再生の指示」として芸術諸ジャンルで個別研究されてきた「記譜」との関連から捉える試みでもある。昨年度に引き続き、「言葉・イメージ・身体」に運動を起こす流動的な「装置」として広く記譜を捉え返すことで、ジャンルを超えた実験、研究、制作を進めた。成果の中間発表としては、京都国際現代芸術祭で京都市美術館を使用した大規模の展示を行った。建築、庭園、地図、映像、音声など複数のメディアを駆使し、読む、観る、歩くという行為や動作が、多様な系列で生起する多層的空間の創造を目指したものである。展示期間中は、鑑賞する場としてのみではなく、多様な相互作用が生まれる場としても美術館を活用する為に、複数プログラムの開催やシンポジュームへの参加も行った。また美術館アーカイブの創造的な誤読の実践としては、写真家ヘンリータルボットの著書「自然の鉛筆」(1844-46)から導かれるキーワードに基づき、美術館の収蔵作品を選び、再配置する構想を展示へと発展させた。リサーチや実験に加え、大規模な展示に関わるプロジェクトの実現、それらを検証する公開シンポジュームの開催なども活発に行うことで、多角的な視点から我々の研究の意義について、客観的に検証することができた。本研究は、読む、書く、視る、聴くという従来の諸ジャンルに固定された「鑑賞形態」、歴史的文脈内における「作品」、「作者」概念や「資料体・集蔵体(アーカイブ)」の場を転移し、「創造的誤読」へと導く新たな理論と制作の実践を目論むものである。具体的な研究例として、本年度は、大学移転プレ事業の一環として開催した「still moving:on the terrace」展(京都市立芸術大学ギャラリー@KCUA、2016年4月16日から5月29日)について報告する。「terrace」というコンセプトを函数として既存のギャラリー空間の誤用としての「読み替え図・記譜」(例えば、吹き抜けスペースは会議室、階段は劇場、可動壁面はホテルなど)を作成し、これを参加メンバーに割り当てた。これら図・記譜は、必ずしも固定化したものではなく、誤読も可能である。例えば、エレベーターとトイレを展示室に、可動壁をホテルに誤用するという指示であったが、制度の文脈とも重ねるために、エレベーター=学長室=工具箱、可動壁=芸術資料館、トイレ前のホワイエ=崇仁アーカイブズ(崇仁祭りのお囃子の譜面を壁紙にし、その前を崇仁小学校に設置されていた二宮金次郎像の複製が徘徊する。)へと誤読するなど。通常の展覧会におけるキューレーション、会場構成、作品配置とは異なり、従来の役割分担(キューレーション、デザイン、作家、事務職など)の「誤配」による不安定な場の生成が可能となった。ジャンル横断的な創造の媒介装置として記譜概念を捉え直し、多様な手法によるアウトプットの実験という意味で進展があった。留意する点は、「未完の記譜」プロジェクトそのものの、記録方法そのものについての創造的なアップローチ方法の確立である。本年度は「Re-Play/未完の記譜法」と題したプロジェクトを核とした実践的な研究を行った。

本研究は、身体行為を誘発する装置としての記譜という観点から開始したが、今回の試みは「展覧会」という形式それ自体を記譜として捉え直すものである。これは、東アジア文化都市2017京都「アジア回廊」との特別連携企画でもあった。観光客が集う二条城と京都芸術センターを結ぶ東西軸が、東アジア文化都市企画の主軸となったが、それらとは異質な視点を設定する為に、元崇仁小学校の体育館を使用し、南北の軸を形成する事を試みた。京都芸術センターでは初の試みとして運動場の展示使用を許可し、日独仏の若手建築家による「かげろう集落」展(2017年8月2 6日から9月3日)が、7日間の期間のみ開催された。それは街の中央に「原っぱ」のような自由な場を仮設的に産み出す試みだが、展示物としてのパビリオンは、期間終了後は廃棄される予定であった。「Re-Play/未完の記譜法」ではそれらを元崇仁小学校の体育館へ移設し「集団の身体相互行為を誘発する実験装置」として捉え直す企画へと転位させた。それは京都市内の明倫学区から崇仁学区への南北の移動が、ヒトのフルマイ自体をどのように変更させるかを検証する実験ともなった。また映画制作ワークショップ「トポグラフィックシネマxシネマチティックボディー」を開催し、芸術センターから移動させた建築が多様な表情で見えるような演出をおこなった。照明、スモーク、音響に加えて、小型ドローンやOSMOなど複数のカメラを使用し、そこからの多角的視点をライブ映像でスクリーンに投影したもので、ダンサーなどの身体行為を見せるのではなく、参加者がカメラをもって移動することで、かれらの視点と身体の移動そのものが、パフォーマンスともなるという実験となった。「Notation.記譜法」とは、一般には、楽譜など芸術諸ジャンル内の「行為の記録」と「再生の指示」を行うものとされる。本研究では、厳密なスコアに加え、道具、地図、模様、庭園、詩、映画、建築、ダンス、遊技などを含めた「言葉・イメージ・身体に運動を起こす記譜法」の構築を目指した。それらを言葉・イメージ・身体に運動を起こす流動的な「装置」として広く記譜を捉え直し、「行為の記録」と「再生の指示」にとどまらない「領域横断的な創造的行為としての記譜法」という新たな可能性を探求した。成果の還元としては実験的な展示や公演を中心に進め、従来の芸術の記録や作品展示とは異なる新たなモデルの提示となった。国内外の音楽家、科学者、哲学者、文学者と共同で連続5回シリーズのシンポジュームの開催、公開実験装置・作品としての展示・パフォーマンス講演・出版など領域横断かつ多角的な手法での研究・制作・検証が可能となった。また、国際的な文脈での発表とした為、国内外への波及効果も大きいアプローチとなった。建築、環境、制度、歴史との関係から総合的な研究と実践を進める。それを基盤に、多様な主体の身体の振る舞いとそれらの相互行為を生み出す開かれた場の生成へと発展させる計画である。また、「身体を貫通する権力」という視点から、記譜とダイアグラムの関係を捉え直し、既存の芸術の歴史やジャンルを横断する形での創作や海外でのリサーチを行う。最終年度は、「芸術経験を前提とした「作品(Art Works)とその記録(Documentation)」という関係にではなく、ヒト・モノ・状況との相互作用とその形成のプロセスの提示に重心を移動させる脱芸術実践であり、日常的な生の文脈へ直に接続することを目指したプロジェクトを推進する。29年度が最終年度であるため、記入しない。
LFJと木ダボのハイブリッドを用いた解体・再利用が容易な集成材接合部の開発

二年目は、昨年度の補強効果を元に新しい木ダボ挿入方法の提案と一方向ラーメン構法としての使用を考えた実験を行った。実験項目と試験方法、その結果について以下に示す。1.LFJコーナー接合部の新たな木ダボ挿入方法については、昨年の挿入方法の応用として二方向からを採用した。これらは、一方がダクティリティーのアップを目指し、もう一方が耐力を向上させることを目的としている。このタイプについてL字型試験を行った。その結果、1.2倍の耐力と1.5倍のエネルギー吸収量を得ることができた。この挿入方法が最終形というわけではないが、かなり向上できた。今後、発展型を続けて研究していきたい。また、解析的アプローチをするために、コンピュータを用いたデータ解析の準備を始めたところである。2.続けて、上記の成果をもとに、一方向ラーメン構法としての使用を考えた実験を本研究所所有の構面試験フレームを用いて行った。LFJについて現在行われている試験は、L字形のみであるため、新しい実験となった。破壊性状は、荷重方向の影響もあり、当初考えていた引張側からのものではなく、圧縮側の母材破壊となり、結果としては補強の効果があったのではないかと考えている。また、壁倍率として0.5程度の値を得ることができた。L字型で行った実験結果からの数値計算の値とは大きな差が無く、今後L字型の実験によるデータの積み重ねが実大実験へそのまま利用できる可能性が高いことがわかった。一方向ラーメン構法としての使用におけるディテールの一案を提案することができた。3.発展型として、新しい接着型のジョイントに挑戦した。これは、集成材をスライスして積層し、合板のような集成材を作成し、それをパネルゾーンとして利用することで、ラジアルストレス抵抗力を上げることを試みている。現状、うまくいっていないが、この実験についても申請費をもとに行わせてもらった。現在、狭小間口の建築物において良く用いられている一階の鉄骨フレームによる駐車スペースの確保などに取って代わることが可能となる成果を得られたと考えている。1.当初考えていた木ダボに関する実験を行うために、木ダボ作製記を購入し、これを用いてダボに関する接着実験を行った。ダボ自体の曲げ応力は集成材のそれに比べて強く、うまく接着ができることによって補強が可能であることがわかった。また、繊維直角方向に対する集成材の横引張に対する補強性能を確認するため、集成材の横引張および集成材自体の軸方向引張実験を行った。軸方向引張については、現在考えられている集成材の曲げの理論を元に引張強度を推定することが可能であることがわかった。また、ヤング係数については、曲げのヤング係数と引張のヤング係数では若干の違いがあるのではないかとの結論も得た。そして、横引張の強度については、実験結果より従来言われていた様々な値のうちから、約1MPaが妥当ではないかとの結論に達した。木ダボによって補強したものについて横引張実験を行ったが、補強しているため、実験が難しく、補強の効果について確信的な値を得るには至らなかった。しかし、明らかにラジアルストレスに対する補強の効果があり、剛性および強度に大きく寄与することは明らかにできた。2.LFJについてノーマル型、従来行われてきた鉄製のボルト補強型、木ダボ補強型TypeA、TypeBの実験を行った。この木ダボ補強タイプについては、TypeAはLFJ部に対して直角に、TypeBはLFJ部に対して平行に木ダボを挿入している。これらのタイプについて試験結果を比較したところ、当初から強いとされていた閉じる方向の加力については大きな差が見られないことがわかった。しかし、開く方向の加力については、ボルト補強型と木ダボ補強型TypeAは耐力、靭性等で大きな差がないことがわかった。ただし、他の補強についても言えるが、接着剤を使っている木ダボについてはその管理が重要であることがわかった。木ダボ補強型TypeBについては、耐力については向上が見られなかったが、靭性について大きな向上が見られた。そのため、この二つのダボ補強が有効であることがわかった。その特性を活かすことができるような木ダボの挿入方法について検討を進めていくことにより、来年度混合型の補強タイプを考える予定である。また、その補強を用いた門型の試験体についてフレーム解析を行う。

破壊性状は、荷重方向の影響もあり、当初考えていた引張側からのものではなく、圧縮側の母材破壊となり、結果としては補強の効果があったのではないかと考えている。また、壁倍率として0.5程度の値を得ることができた。L字型で行った実験結果からの数値計算の値とは大きな差が無く、今後L字型の実験によるデータの積み重ねが実大実験へそのまま利用できる可能性が高いことがわかった。一方向ラーメン構法としての使用におけるディテールの一案を提案することができた。3.発展型として、新しい接着型のジョイントに挑戦した。これは、集成材をスライスして積層し、合板のような集成材を作成し、それをパネルゾーンとして利用することで、ラジアルストレス抵抗力を上げることを試みている。現状、うまくいっていないが、この実験についても申請費をもとに行わせてもらった。現在、狭小間口の建築物において良く用いられている一階の鉄骨フレームによる駐車スペースの確保などに取って代わることが可能となる成果を得られたと考えている。
データマイニング技術を基盤とした新聞記事自動分類および検索支援に関する研究

新聞記事に対して各新聞社では大規模なカテゴリを定義しており、日々発行される大量の記事を人手によりカテゴリ分類を行っている。これは、記事の二次利用等のコンテンツとして再利用する際に、情報検索やコンテンツ流通を効率的に行うために必要な作業である。しかし、人手によるカテゴリ分類作業は非常に大きな負担であり、その自動化が長年求められている。それにもかかわらず、新聞記事特有の分類方法等に起因して自動分類の精度はあまり向上しないような状況である。本研究では、新聞記事に対してデータマイニング技術を適用して導出したルールを、文書分類の因子として用いることで分類精度を向上させる手法の研究開発を行っており、従来の手法に対しての優位性を示すことができた。また、自動分類した分類結果を学習データとして用いて、自動分類を時系列に沿って行う時系列再帰学習を行うことにより、適合率を低下させることなく再現率を向上させることが可能であることも示すこともできた。これらは、山梨日日新聞社から提供を受けた8年間におよぶ実際の新聞記事に対して評価実験を行うことにより検証した。一方,新聞記事をコンテンツとして扱う場合,コンテンツ配信にかかわる情報流通ネットワークの構築を考える必要があり,それをピアツーピアネットワークを用いて大規模かつ超分散環境における情報検索を行う手法を示した.ピアツーピアネットワーク上における有用なコンテンツを見つけ出すために,Web技術でスコアリングの基準として用いられる分類子や抽出子の概念を,ピアツーピアネットワーク情報検索に導入することにより,超分散環境下においても情報検索が可能とした.また,検索対象とする情報に概念階層を導入することにより,ネットワークのトラヒックを効果的に抑制できることも示した.さらに、多人数で情報を共有するサービスにおいて、P2Pネットワークの枠組みを利用して負荷分散を行う方法、ならびに、効率よくコンテンツを配置するためのアルゴリズムの開発研究を行った。さらに、他のユーザにデータ処理を依頼するP2Pモデルにおいて、依頼者にその中身を盗聴されずに処理が行える情報隠蔽上に関する手法の研究開発が行えた。新聞記事に対して,各新聞社では大規模なカテゴリを定義しており,さらに分類の大きさにより階層を成している.一般的に知られているように,カテゴリによっては分類精度を著しく悪化させるものがあるため,カテゴリおよびカテゴリ階層と文書分類手法との分類精度の関係の調査研究を行った.それにより,カテゴリ階層を用いて動的に自動分類を行うことで,分類精度を向上させることが可能であることを示した.また,自動分類した分類結果を学習データとして用いて,自動分類を時系列に沿って行う時系列再帰学習を行うことにより,適合率を低下させることなく再現率を向上させることが可能であることも示すことができた.これらは,山梨日日新聞社から提供を受けた8年間におよぶ実際の新聞記事に対して評価実験を行うことにより検証を行った.一方,新聞記事をコンテンツとして扱う場合,コンテンツ配信にかかわる情報流通ネットワークの構築を考える必要があり,それをピアツーピアネットワークを用いて大規模かつ超分散環境における情報検索を行う手法を示した.ピアツーピアネットワーク上における有用なコンテンツを見つけ出すために,Web技術でスコアリングの基準として用いられる分類子や抽出子の概念を,ピアツーピアネットワーク情報検索に導入することにより,超分散環境下においても情報検索が可能とした.また,検索対象とする情報に概念階層を導入することにより,ネットワークのトラヒックを効果的に抑制できることも示した.新聞記事に対して各新聞社では大規模なカテゴリを定義しており、日々発行される大量の記事を人手によりカテゴリ分類を行っている。

それにもかかわらず、新聞記事特有の分類方法等に起因して自動分類の精度はあまり向上しないような状況である。本研究では、新聞記事に対してデータマイニング技術を適用して導出したルールを、文書分類の因子として用いることで分類精度を向上させる手法の研究開発を行っており、従来の手法に対しての優位性を示すことができた。また、自動分類した分類結果を学習データとして用いて、自動分類を時系列に沿って行う時系列再帰学習を行うことにより、適合率を低下させることなく再現率を向上させることが可能であることも示すこともできた。これらは、山梨日日新聞社から提供を受けた8年間におよぶ実際の新聞記事に対して評価実験を行うことにより検証した。一方、新聞記事をコンテンツとして扱う場合、コンテンツ配信にかかわる情報流通ネットワークの構築を考える必要があり、それをピアツーピアネットワーク上で大規模かつ超分散環境における情報検索を効率よく行うためのアルゴリズム研究も進めている。今年度は、各コンテンツの分類結果を基にしたネットワークの構成法に関する研究を中心に行った。新聞記事に対して各新聞社では大規模なカテゴリを定義しており、日々発行される大量の記事を人手によりカテゴリ分類を行っている。これは、記事の二次利用等のコンテンツとして再利用する際に、情報検索やコンテンツ流通を効率的に行うために必要な作業である。しかし、人手によるカテゴリ分類作業は非常に大きな負担であり、その自動化が長年求められている。今年度は、多人数で情報を共有するサービスにおいて、P2Pネットワークの枠組みを利用して負荷分散を行う方法、ならびに、効率よくコンテンツを配置するためのアルゴリズムの開発研究を行った。
多剤耐性マイコプラズマ・ジェニタリウムの検出と治療に関する検討

M. genitaliumは男性尿道炎、女性の子宮頚管炎の原因微生物で、現在世界的にM. genitaliumの薬剤耐性化は顕著となっている。しかし、M. genitaliumの臨床検体からの分離培養は極めて困難であり、耐性株の分離による耐性機序の検討は重要である。我々はこれまで、マクロライド耐性、キノロン耐性(moxifloxacin;MFLX耐性およびsitafloxacin: STFX耐性)株を分離培養しており、その耐性機序の検討を行ってきた。マクロライド耐性は23SrRNAの遺伝子変異で起こり、我々の検討では臨床検体から分離されたM. genitalium遺伝子の42%はマクロライド耐性の変異を示していた。キノロン耐性のうちMFLX耐性はparC遺伝子のSer83がIleへのアミノ酸変異が高い関連性があることを報告してきた。今回、新たな株を分離することにより、同部位の変異が異なるアミノ酸変異となることで、MFLX耐性が感受性となることを見出した。Ser83のアミノ酸変異ではIleへの変異ではMFLX高度耐性となるが、他のアミノ酸変異ではキノロン耐性とならないことが判明してきた。この同部のアミノ酸変異の違いがキノロンへの感受性を決定する可能性がある。現在、我々は本変異の違いの解析を、遺伝子の立体構造の面およびキノロン薬への親和性の違いより解析している。これとは別に、キノロン耐性とefflux pumpとの関連を検討している、efflux pump inhibitorであるNMP, PAβNは高濃度で作用させると、キノロン耐性でM. genitaliumの増殖を阻害することを学会報告している。しかし、本作用の阻害効果はわずかであり、キノロン耐性の主体はgyraseおよびtopoisomeraseの変異であることを想定している。現在、M. geitaliumのキノロン耐性に関して、DNA gyraseおよびTopoisomerase IVに関連する遺伝子の解析およびefflux pumpに関わる機序の両面より検討している。遺伝子変異による検討は、新たな株の発見により今後、進んでいくと考えられるしかし、efflux pumpの関りはキノロン耐性全体から見て低いと考えられるため、efflux pump inhibitorによる増殖抑制効果を明確に示す実験を繰り返しており、やや進展が遅れていると言わざるを得ない。遺伝子変異に関わるキノロン耐性の検討は、新たな株の発見により新たな研究を行うこととなった。つまり、parC遺伝子のSer83がIleに変異するとキノロン高度耐性となり、他のアミノ酸に変異すると感受性となることが反映したため、このエビデンスを実証するため、DNAの3次元構造と抗菌薬との関連を行う方針である。M. genitaliumは男性尿道炎、女性の子宮頚管炎の原因微生物である。マクロライド耐性が世界的に蔓延し、マクロライド治療失敗例にはmoxifloxacin(MFLX)やsitafloxacin(STFX)が有効である。世界的にMFLXが使用されているが、近年MFLX治療失敗例が世界各地で報告されている。しかし、MFLX耐性の耐性機序は、parC遺伝子のpoint mutationのみの検討がなされているだけで、キノロン耐性のもうひとつの機序であるefflux pumpの増加によるキノロン薬の排出増加に関して、M. genitaliumにおける検討はない。我々はefflux pump inhibitorを用いて、キノロン薬の薬剤感受性への影響を検討し、多剤耐性M. geitaliumに対する新たな薬剤の可能性を検討した。efflux pump inhibitorである1-(1-naphthylmethyl)-piperazine(NMP)、phenylalaninearginine β-naphthylamide(PAβN)、carbonylcyanide m-chlorophenylhydrazone(CCCP)、reserpine(RSP)をM. genitaliumの増殖系に加え、キノロン薬への感受性を検討した。M. genitalium株は、マクロライド、MFLX、STFXの長期投与でも治療できなかった患者から分離培養したIMC-1株を用いた。高濃度のNMP, PAβNは単独でM. genitaliumの増殖を阻害した。本薬は単独で抗マイコプラズマ効果を示すことが、はじめて明らかとなった。CCCPは低濃度ではM. genitaliumの増殖を抑制しないが、MFLX, STFXのMICをわずかに低下させることが判明した。今後、容量を変えて、検討を加える。現在、抗菌薬治療に失敗した2症例から、多剤耐性M. genitalium株を分離、培養しており、さらに現在、数株の増殖が認められている。しかし、治療難治症例の尿検体の採取には苦慮しており、多剤耐性株の収集は予想より少ない。一方、キノロン耐性の機序としてefflux pumpの有効性を検討しており、一部のefflux pum阻害薬が、キノロンのMICを低下させる可能性があることがわかり、耐性機序の検討は始まったばかりである。。

今回、新たな株を分離することにより、同部位の変異が異なるアミノ酸変異となることで、MFLX耐性が感受性となることを見出した。Ser83のアミノ酸変異ではIleへの変異ではMFLX高度耐性となるが、他のアミノ酸変異ではキノロン耐性とならないことが判明してきた。この同部のアミノ酸変異の違いがキノロンへの感受性を決定する可能性がある。現在、我々は本変異の違いの解析を、遺伝子の立体構造の面およびキノロン薬への親和性の違いより解析している。これとは別に、キノロン耐性とefflux pumpとの関連を検討している、efflux pump inhibitorであるNMP, PAβNは高濃度で作用させると、キノロン耐性でM. genitaliumの増殖を阻害することを学会報告している。しかし、本作用の阻害効果はわずかであり、キノロン耐性の主体はgyraseおよびtopoisomeraseの変異であることを想定している。現在、M. geitaliumのキノロン耐性に関して、DNA gyraseおよびTopoisomerase IVに関連する遺伝子の解析およびefflux pumpに関わる機序の両面より検討している。遺伝子変異による検討は、新たな株の発見により今後、進んでいくと考えられるしかし、efflux pumpの関りはキノロン耐性全体から見て低いと考えられるため、efflux pump inhibitorによる増殖抑制効果を明確に示す実験を繰り返しており、やや進展が遅れていると言わざるを得ない。抗菌薬治療に抵抗性を示す尿道炎患者の尿検体の収集をさらに行う。また、基礎的研究としてefflux pumpとM. genitaliumのキノロン耐性との関連を、さらに検討する。遺伝子変異に関わるキノロン耐性の検討は、新たな株の発見により新たな研究を行うこととなった。つまり、parC遺伝子のSer83がIleに変異するとキノロン高度耐性となり、他のアミノ酸に変異すると感受性となることが反映したため、このエビデンスを実証するため、DNAの3次元構造と抗菌薬との関連を行う方針である。研究用の物品、消耗品を購入したが、約4000円の残金が発生した。しかし、年期末に4000円程度の物品、消耗品がなかったため、次年度に繰り越した。次年度には、より多くの検体より、M. genitaliumの株の検出を予定しているため、培養に必要なプラスチック製品や血清などを購入する予定である。主にM. genitalium株を分離、培養する尿検体の収取のための輸送費、および培養のための物品、消耗品を購入したが、収集できる検体数が少なかったため、輸送費の残金が生じた。
セロトニン受容体遺伝子のゲノムインプリンティング機構の解析

これまで、遺伝性網膜芽細胞腫患者の組織を用いた解析より、ヒトセロトニン受容体遺伝子のゲノムインプリンティングの可能性が示唆されてきた。患者由来の組織では、解析に適当な症例数も少なく、マウスのような交配実験などが不可能なため、ゲノムインプリンティングの詳細な機構の解析には限界がある。本研究では、マウスの遺伝学的解析を用いることにより、セロトニン受容体遺伝子のゲノムインプリンティングの機構を行った。近交系(C57BL/6J)マウスおよび野生(PWK)マウスのセロトニン受容体遺伝子のcDNAの遺伝的多型を用いて、F1マウスを解析した結果、ヒトと同様に母由来の遺伝子のみが発現していることが明らかとなった。また、網膜芽細胞腫の増殖に関連していることから、目における発現を調べたところ、F1の胎児の目でのみ発現し、生後は発現が認められず、やはり、母由来の遺伝子のみが発現していた。このことは網膜芽細胞腫が胎児性の腫瘍であることと考えあわせると非常に興味深い。一方、母親由来の遺伝子特異的な発現がどのような機構で制御されているかについては明らかとなっていない。そこで、ヒトセロトニン受容体遺伝子のプロモーターをルシフェラーゼのリポーター遺伝子の上流に組み込み、in vitroでメチル化した際に、遺伝子の発現がどのように影響を受けるかについて解析したところ、in vitroでメチル化したプラスミドを用いたところリポーターからの発現が抑制される結果が得られた。このことから、ヒトセロトニン受容体遺伝子のゲノムインプリンティングがメチル化によって制御されている可能性が示唆されてきた。遺伝性網膜芽細胞腫患者の組織を用いた解析より、ヒトセロトニン受容体遺伝子は母親由来の遺伝子のみが発現し、母親由来の遺伝子のみの上流域がメチル化を受けていることが明らかとなり、セロトニン受容体遺伝子のゲノムインプリティングの可能性が示唆されてきた。患者由来の組織では、解析に適当な症例数も少なく、マウスのような交配実験などが不可能なため、ゲノムインプリティングの詳細な機構の解析には限界がある。本研究では、マウスの遺伝学的解析を用いることにより、セロトニン受容体遺伝子のゲノムインプリティングの機構を行った。近交系(C57BL/6J)マウスおよび野生(PWK)マウスのセロトニン受容体遺伝子のcDNAをPCRによって増幅し直接DNA配列を決定し系統間で異なる配列を探したところ、数カ所に多型を見つけることができ、特にエクソン1には制限酵素Sphlによって識別できる遺伝子多型を見つけた。これにより、C57BL/6Jマウスと野生マウスPWKを交配することにより、遺伝子がどちらの親に由来して発現しているかを調べることが可能となった。これらのF1マウスを解析した結果、ヒトと同様に母由来の遺伝子のみが発現していることが明らかとなった。
高地居住慢性肺高血圧肺血管の血管緊張性に対する内皮由来血管収縮物質の関与

前年度に、低酸素暴露慢性肺高血圧肺血管において、Ach弛緩反応抑制に関与する血管収縮物質であると推定されたPGH_2について、次の事柄を検討した。(方法)(1)PGH_2が内皮細胞由来であることの確認:慢性肺高血圧肺血管のリング状血管片を作成したのち、ステンレス製の針を用いて、血管内皮細胞を除去する。マグヌス管に懸垂し、等尺性張力変化を測定する。PGH_2の受容体拮抗剤であるONO3708投与群、非投与群において、Achに対する用量作用曲線を描き、比較する。(2)PGH_2に対する血管平滑筋の感受性の検討:内皮除去リング状血管片を作成した後、マグヌス管に懸垂し、PGH_2を外因性に低濃度から段階的に加えて用量作用曲線を作成し、正常肺血管と慢性肺高血圧肺血管とのあいだで得られた用量作用曲線の結果を比較する。(結果)慢性肺高血圧肺血管では、ONO3708投与群、非投与群のAchに対する用量作用曲線の間に有意差は認められなかった。よって、PGH_2は内皮細胞由来であると考えられた。また、正常肺血管と慢性肺高血圧肺血管の内皮除去リング状血管片で、PGH_2の用量作用曲線を比較したところ、高濃度では正常肺血管の方が慢性肺高血圧肺血管の収縮より有意に大きいことが認められた。以上より、慢性肺高血圧肺血管では、PGH_2に対する血管平滑筋の感受性が増強しているのではなく、むしろPGH_2の血管内皮細胞からの産生放出が増強していることが推測された。(方法)低酸素暴露(1/2大気圧;380mmHg)チャンバー内で10日間飼育することにより作成した慢性肺高血圧モデルおよび正常ラットを、ペントバルビタール腹腔内投与により麻酔した後に肺外主肺動脈(外径1.4-1.6mm)および肺内主肺動脈(外径0.7-1.1mm)を摘出し、それぞれ長さ2mmのリング状血管片を作成し、クレブス液20mlで満たしたマグヌス管に至適張力で懸垂して等尺性張力変化を測定した。リング片は70mMKClで2回収縮させ、2回目の収縮を最大収縮とした。フェニレフリンでKCl最大収縮の40-70%前収縮を得た後、前述の受容体拮抗剤または合成阻害剤存在下にAchを低濃度から段階的に加え、等尺性張力変化を測定し、最後にパパべリン10^<-4>により最大弛緩を得、各濃度において惹起された弛緩をパパべリンによる最大弛緩に対する割合として用量作用曲線を作成した。正常肺血管、慢性肺高血圧肺血管において、薬剤投与、非投与におけるAch弛緩反応の用量作用曲線の結果を比較した。(結果)正常肺血管では、Achに対して用量依存性の弛緩反応を示し、前述の薬剤の存在下と非存在下のAChの弛緩反応は、いずれの薬剤でも有意差がなかった。一方、慢性肺高血圧肺血管では、弛緩反応は全濃度において著明に抑制され、ONO3708非存在下と比較しONO3708存在下で、Achの弛緩反応の抑制が部分的に改善された。他の薬剤では、どれも有意差が認められなかった。以上より、慢性肺高血圧肺血管におけるAchに対する弛緩反応の抑制には、PGH2の産生または放出が関与している可能性が示唆された。
集積冷却チャネルを有する積層インテグレーションチップの設計・実装

本研究の目的は、積層形のマイクロチップに共通する抜熱とシールの問題に注目して、冷却配管の集積化技術と層間接合技術を開発し、冷却チャネルやセンサをインテグレーションした積層チップを設計・実装することである。平成17年度は、まず金属製の積層チップにターゲットを絞って、(1)材質・加工法・接合条件の検討、(2)小形機能要素の開発・実装、という手順を踏んで積層インテグレーションチップのプロトタイプを試作した。まず、材質を選定し、当該材質に対する流路加工・レーザ溶接の条件出しなどの検討を行った。耐熱性、耐腐食性という使う側の評価基準と、加工性、接合性という作る側の基準との両面から総合的に検討した結果、材質はステンレス鋼(SUS316L)を想定し、加工法は流路形状、幅、深さなどに応じて、機械加工、ウェットエッチング、ビーム加工を使い分けるのが最適であることが分かった。また、溶接条件としては、各層の厚みによって最適なレーザ出力が決定され。たとえば300μm厚のとき50J/mm2程度の出力が最適である。平成18年度には、外部とのジョイントや、熱電対アレイなどの機能要素の小形化を図り、それらを集積化したときのレイアウト・流路設計を行い、試験的に3層のチップを試作した。試作したチップの評価のために、熱水・冷水の熱交換実験、およびベンゼンのニトロ化反応を行った。その結果、微細流路を用いていること、反応流路の他に冷却流路を統合していることの2点についてその効果を実証できた。また、抜熱性能を高めるにはチップの全面を接合する必要があること、また、1プロセスで多層を接合するには拡散接合のような一括プロセスがより有効であることを示した。本研究は、積層形のマイクロチップに共通する抜熱とシールの問題に注目して、冷却配管の集積化技術と層間接合技術を開発し、冷却チャネルやセンサをインテグレーションした積層チップを設計・実装することを目的とする。近年、微細な流路の中で物質を化学反応させるデバイスが注目されているが、さらなる高集積化のために積層すると放熱距離が長くなり、内部に熱がこもる。局所的には伝熱の効率が上がっているが、全体のとしては伝熱効率はマクロな構造と変わらず、温度に関しては小さくしたメリットが失われている。また、反応の並列化のために、積層形の微細流体システムが数多く提案されているが、層間のシールが難しいため、実際にはほとんど実現されていないのが現状である。以上のような背景を踏まえ、本研究では積層形のマイクロチップの実装のために抜熱とシール技術を開発する。具体的には、まず金属製の積層チップにターゲットを絞って、化学反応用の流路の他に温度や圧力等のセンサを集積化したプロトタイプを試作する。実装ために不可欠な層間のシール技術として入熱範囲が100μm以下のマイクロスポット溶接と、層内の抜熱技術として、10W/cm^2の熱をとる媒体を用いた冷却技術を開発する。平成17年度は、(1)材質・加工法・接合条件の検討、(2)小形機能要素の開発・実装、という手順を踏んで積層インテグレーションチップのプロトタイプを試作した。研究の分担は、研究代表者の土屋が全体を統括しながら、ターゲット反応の選定、流路設計、試作、評価実験を担当した。研究分担者は、大井がセンサ・ポンプ・ジョイントなどの小形機能要素の開発を、濱口がチャネル設計のための熱解析と応力解析を、中尾がチャネルの加工と層間接合法の検討をそれぞれ担当した。積層チップに冷却チャネルを組み込むには、より高密度で、多層に積層する技術が必要になる。本研究では、まず、インテグレーションチップの材質選定し、当該材質に対する流路加工・レーザ溶接の条件出しなどの検討を行った。

耐熱性、耐腐食性という使う側の評価基準と、加工性、接合性という作る側の基準との両面から総合的に検討した結果、材質はステンレス鋼(SUS316L)を想定し、加工法は流路形状、幅、深さなどに応じて、機械加工、ウェットエッチング、ビーム加工を使い分けるのが最適であることが分かった。また、溶接条件としては、各層の厚みによって最適なレーザ出力が決定され、たとえば300μm厚のとき50J/mm2程度の出力が最適である。さらに、外部とのジョイントや、熱電対アレイなどの機能要素の小形化を図り、それらを集積化したときのレイアウト・流路設計を行い、試験的に3層のチップを試作した。本研究は、積層形のマイクロチップに共通する抜熱とシールの問題に注目して、冷却配管の集積化技術と層間接合技術を開発し、冷却チャネルやセンサをインテグレーションした積層チップを設計・実装することを目的とする。近年、微細な流路の中で物質を化学反応させるデバイスが注目されているが、さらなる高集積化のために積層すると放熱距離が長くなり、内部に熱がこもる。局所的には伝熱の効率が上がっているが、全体のとしては伝熱効率はマクロな構造と変わらず、温度に関しては小さくしたメリットが失われている。また、反応の並列化のために、積層形の微細流体システムが数多く提案されているが、層間のシールが難しいため、実際にはほとんど実現されていないのが現状である。これらの問題を解決するために、抜熱とシール技術を開発した。具体的には、まず金属製の積層チップにターゲットを絞って、化学反応用の流路の他に温度や圧力等のセンサを集積化したプロトタイプを試作した。また、外部とのジョイントや、熱電対アレイなどの機能要素の小形化を図り、それらを集積化したときのレイアウト・流路設計を行い、試験的に3層のチップを試作した。試作したチップの評価のために、熱水・冷水の熱交換実験、およびベンゼンのニトロ化反応を行った。その結果、微細流路を用いていること、反応流路の他に冷却流路を統合していることの2点についてその効果を実証できた。また、抜熱性能を高めるにはチップの全面を接合する必要があること、また、1プロセスで多層を接合するには拡散接合のような一括プロセスがより有効であることを示した。
共役型官能基を有する新規ビスムトニウム化合物の構築と機能性材料への応用

1.本課題においては、非対称アリールビスムトニウム塩と求核種との反応における置換基効果を明らかにした。また、分子内にキラル中心を二つ持つ非対称テトラアリールビスムトニウム塩の化学について基礎的な検討を行った。さらに、共役型多環芳香族官能基を有するトリアリールビスムチンの合成に成功した。2.アリールビスムトニウム塩の反応性を知る自的で、アニシル、チオアニシル、トリル基を有する非対称アリールビスムトニウム塩を合成し、チオラート、フェノキシド、スルフィナ-トとの反応における置換基効果を検討した結果、求核種はより電子不足なアリール基と優先的に反応することが明らかとなった。3.機能性材料の中で光学活性化合物の果たす役割は重要である。我々は既に全てのアリール基が異なるテトラアリールビスムトニウム塩の一般的な合成方法を確立しているが、今回、キラル中心であるビスマス原子の異性化挙動に関する基礎的な知見を得る目的で、対イオンもしくはリガンドに別のキラル中心を持つジアステレオマ-の合成を行い、いずれも安定な化合物として単離することに成功した。定量化までには至っていないが、現在核磁気共鳴法を用いてその異性化挙動を検討中である。4.多環共役置換基を有するビスマス化合物はこれまでほとんど報告例がなかったが、ハロビスムチンとアリールリチウム、もしくはビスムチドとヨードアレーンとのカップリング反応によりアンセトラセン、フェナントレン置換基を持つビスムチンの合成に初めて成功した。吸収スペクトルの測定により、これらの化合物におけるビスマス置換基の置換特性が明らかとなった。今後、対応するジクロリド、オニウム塩も含めて多環共役系置換基を有する一連のビスマス化合物の構造と分子内電荷移動状態の相関をさらに詳細に検討する予定である。
iPS細胞を用いた肺の臓器再生と疾患病態解明のための革新的バイオリソースの開発

ヒトiPS細胞は細胞株によって分化効率が異なり、応用研究における大きなハードルだったが、表面抗原Carboxypeptidase Mを利用して呼吸器上皮幹細胞を単離し、三次元培養を行なって分化促進することで、気道や肺胞上皮細胞に安定して効率よく分化誘導が可能となった。II型肺胞上皮細胞については長期培養も可能になり、線維芽細胞との共培養なしでも分化誘導が可能となった。これを用いて、iPS細胞由来のII型肺胞上皮細胞を免疫不全マウスにオルガノイドとして移植する方法の開発を進め、疾患モデリングについては薬剤性肺障害、気道疾患、肺線維症、肺がんに対する領域別の応用研究を進めた。肺臓器の再生について、まずはヒトiPS細胞から分化誘導させたII型肺胞上皮細胞はヒト由来細胞が定着しやすいとされているNOGマウスの腎皮膜下になかなか定着が確認できず、工夫を要した。iPS細胞を用いた疾患病態研究についてはまず、CPMによる前駆細胞の単離や三次元培養だけでは気道や肺胞上皮細胞の効率よく安定した分化誘導が難しく、培地の組成などの条件検討を要し、それぞれより安定した効率のよい分化誘導法を確立するという課題から開始することになった。その結果、気道上皮も肺胞上皮細胞も効率よく分化させることができるようになったが、機能評価については容易ではなかった。気道繊毛上皮細胞の場合は三次元培養のままでは振動数や粘液繊毛クリアランスの定量化が技術的に難しかったため、分化の途中で平面に播きかえて繊毛上皮細胞を生やす手法を確立した。大阪大学月田研究室との共同研究も行い、蛍光ビーズをヒトiPS細胞由来の気道繊毛上皮細胞の上に乗せて、その動きをトラッキングすることにより定量化する手法を確立した。また、ヒトiPS細胞由来の気道繊毛上皮細胞はヒト成人肺から採取された気道繊毛上皮細胞と同等の振動数を有することも分かり、この成果は世界初の画期的なもので論文として報告するに至った(Konishi et al. Stem Cell Reports, 2016)。疾患病態モデルの作成にあたっては、CRISPR-CAS9を用いた遺伝子改変技術をiPS細胞研究所の堀田助教から技術指導を受けノックアウトや相同組み換え用の各種ベクターを作成した。肺臓器の再生については、ヒト由来細胞が定着しやすいとされているNOGマウスの腎皮膜下に移植を試み、1ヵ月後に腎臓を摘出して凍結切片を作成したが、定着は確認できなかった。そこで、初代細胞の線維芽細胞、血管内皮細胞を混ぜて細胞集塊としたもの「肺オルガノイド」をNOGマウスの腎臓被膜下に移植したところ、1ヵ月以上にわたり細胞が定着することを確認できたので、さらに期間を延長しながら、各呼吸器上皮細胞の成分を免疫染色などで確認中である。。iPS細胞を用いた疾患病態研究については、難治性呼吸器疾患患者の体細胞の入手が難しい場合には健常者由来のiPS細胞に対して遺伝子改変を行うことで、病態を再現する手法を採用することにした。また、すでに樹立されていたHermansky-pudlak症候群の疾患特異的iPS細胞についてはトランスジェニック法による遺伝子のレスキューが分化を不安定化させる傾向があったため、CRISPR-CAS9による相同組換え法に切り替え、遺伝子を修復するためのターゲティングベクターを作成した。肺の再生に向けて、ヒトiPS細胞から分化誘導した肺胞上皮細胞と線維芽細胞および血管内皮細胞を集塊状にした肺芽lungbudの開発を進めた。NOGマウスへの移植により腎被膜下への定着は達成できたので、肺への定着を目指して、経胸壁、経気管と手技を工夫して細胞移植を試みたが、すぐには定着は確認出来なかった。一方、腎被膜下については移植した肺芽が3ヶ月以上、定着していることが確認できた。しかし、NKX2.1陽性にも関わらず、SFTPCをはじめとするサーファクタント蛋白質の発現は著しく低下していた。iPS細胞由来のII型肺胞上皮細胞は試験管内では三次元共培養下に長期培養が可能になったが、平面に播くと数日以内にはサーファクタント蛋白質の発現が極端に低下してしまうため、三次元培養と線維芽細胞との共培養がII型肺胞上皮細胞の肺胞幹細胞としての性質を維持するために重要な役割を果たしていることが示唆された。そこで、細胞の移植・定着方法の開発と並行し、線維芽細胞なしでもII型肺胞上皮細胞を長期培養できる因子の同定作業も進めた。培地組成を工夫することにより一定期間、線維芽細胞との共培養なしで、サーファクタント蛋白質の発現を維持することができた。このことから、ヒトiPS細胞から分化させた肺胞上皮細胞を定着させるには移植後の微小環境のコントロールが重要と考えられた。またバイオリソースの開発に向けては、CRISPR-CAS9によるゲノム編集技術を応用し、疾患モデルとなるノックアウト細胞株の作成やDNA相同組換えによる疾患原因遺伝子の修復、新規レポーター細胞の開発を進めた。また、分化した呼吸器上皮細胞を用いて薬物負荷試験のモデル開発やレポーター細胞に依存しないII型肺胞上皮細胞の単離方法の開発をすすめた。H28年度はまず、ヒトiPS細胞から分化誘導した肺胞幹細胞と線維芽細胞および血管内皮細胞を集塊状にした肺芽lung budの開発を進めた。

NOGマウスへの移植により腎被膜下への定着は達成したが、経胸壁的には肺への定着は確認できなかったため、ブレオマイシンやナフタレンなどによる肺障害後の細胞定着の条件検討を進め、移植と定着のための新たな手法の開発を進めた。また、腎被膜下に定着したlung budの解析をしたところ、II型肺胞上皮細胞を示すサーファクタント蛋白質の発現が低下していることが分かり、別の細胞に分化してしまった可能性が考えられた。このため、試験管内で線維芽細胞なしでもII型肺胞上皮細胞を分化させずに維持できる条件を検討した。また、レポーター細胞がなくてもII型肺胞上皮細胞を単離出来る手法の開発を進めた。一方、新規疾患バイオマーカーの探索に向けては京都大学iPS細胞研究所の協力を得て、CRIPSR-CAS9を用いたヒトiPS細胞における遺伝子のノックアウトと呼吸器疾患の責任遺伝子をDNA相同組換えで修復するノックインの技術を確立した。この方法を用いて、時間はかかるが同一ゲノムを背景とした疾患モデル細胞と遺伝子修復後の細胞を高い精度で比較することが可能になった。例えば、Hermansky-Pudlak症候群の原因遺伝子の1つであるAP3B1(HPS2)遺伝子を修復して同一ゲノム背景下での表現系の比較が可能になった。それ以外にもヒトiPS細胞由来の呼吸器系への分化を検出し単離するためのレポーター細胞用ベクターの作成、呼吸器疾患の様々な原因遺伝子のノックアウト細胞株を樹立した。ヒトiPS細胞を用いた試験管内での疾患モデリングは、遺伝子発現だけでは評価が難しく、形態学や細胞動態などのパラメーターもバイオマーカーとして重要と考えられた。H28年度に引き続き、ヒトiPS細胞由来の肺胞上皮細胞と、線維芽細胞、血管内皮細胞でできた肺胞オルガノイドの移植実験を進めた。経気管的細胞投与により、移植した肺胞オルガノイドがマウスの肺胞に到達していることは確認できたが、肺胞への定着効率は著しく低く、より一層の条件検討が必要と考えられた。一方で、一部のヒト由来呼吸器上皮細胞が気道に定着することは確認できた。腎被膜下への肺胞オルガノイドの移植については6ヶ月に渡って定着できることを確認したが、肺胞上皮細胞の分化マーカーの発現を維持することは難しかったため、肺胞上皮細胞を取り巻くニッチ機能を解明のため、線維芽細胞の役割を調べる実験を進めた。試験管内においてII型肺胞上皮細胞を線維芽細胞なしでも培養できる条件検討を進めた結果、GSK3b阻害剤とTGFβ受容体キナーゼ阻害剤を組み合わせることで、少なくとも一定期間肺胞上皮細胞の分化マーカーの発現が誘導され維持されることを確認し、その成果を論文として発表した。バイオリソースの開発に向けてはCRISPR-CAS9を応用して呼吸器疾患モデルの開発を進めた。例えばHermansky-Pudlak症候群(HPS2)患者由来の線維芽細胞から樹立されたiPS細胞とその遺伝子修復後のiPS細胞株を用いて、II型肺胞上皮細胞の病的な機能異常を検出する方法の開発を進めた。特に肺サーファクタントの分泌機能を画像解析により定量化する技術を確立することができた。また、薬剤性肺障害への応用としてiPS細胞由来肺胞オルガノイドに対して、肺線維症を引き起こす副作用が知られているアミオダロンを負荷し、肺毒性を調べるためのモデルの開発を行ない、ヒトiPS細胞由来のII型肺胞上皮細胞における薬剤応答をトランスクリプトームのレベルで明らかにし、その成果を論文として発表することができた。