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組織修復過程における間葉系幹細胞の起源と役割に関する分子生物学的研究

組織修復過程における間葉系幹細胞の起源と役割を明らかとするために,まず,移植した細胞を拒絶反応なしにin vivoで追跡可能なモデルを開発し,種々の組織において細胞追跡における本モデルの有用性を確認した.次にこれを用いて間葉系幹細胞の分化に関する研究を行った.移植モデルには導入遺伝子からタンパク発現がない雌トランスジェニック(T G)ラット細胞をドナーとし,その雌近交系ラットをレシピエントとして使用した.これらラットのDNAは理論的には導入遺伝子以外は同じであり拒絶反応なしに移植したTGラット細胞内の導入遺伝子を近交系ラット組織内でin situ hubridization法により追跡することが可能である.さらにTGラット細胞の使用によりin vitroでの移植細胞へのマーカー導入操作を必要としない.本研究課題では,本移植モデルとBrduに対する免疫組織化学染色により,移植した滑膜細胞が4週間は関節内で生存し増殖することを明らかとした(TransORS1998,Cell&TissueRes1999).また,新たに開発した微小インデンテーション試験器を応用することで,関節軟骨欠損への骨軟骨移植後に移植骨軟骨片細胞が内軟骨骨化を起こし,修復軟骨組織の粘弾性の回復に深く関与することを明らかとした(TransORS1999).以上の如く本移植モデルを応用することにより,様々な組織修復に関しての生物学的および生体工学的評価を組み合わせた多角的な研究が可能であった.一方,骨髄は間葉系幹細胞の一つの起源として広く知られている.本研究ではTGラット骨髄細胞を近交系ラットに作製した膝内側側副靭帯損傷部に移植し,移植細胞の分化を形態学的に検討した.この結果,骨髄細胞が靭帯修復過程において線維芽細胞へ分化し,靭帯組織を構成することが明らかとなった(Hilton Head Workshop 1999).組織修復過程における間葉系幹細胞の起源と役割を明らかとするために,まず,移植した細胞を拒絶反応なしにin vivoで追跡可能なモデルを開発し,種々の組織において細胞追跡における本モデルの有用性を確認した.次にこれを用いて間葉系幹細胞の分化に関する研究を行った.移植モデルには導入遺伝子からタンパク発現がない雌トランスジェニック(T G)ラット細胞をドナーとし,その雌近交系ラットをレシピエントとして使用した.これらラットのDNAは理論的には導入遺伝子以外は同じであり拒絶反応なしに移植したTGラット細胞内の導入遺伝子を近交系ラット組織内でin situ hubridization法により追跡することが可能である.さらにTGラット細胞の使用によりin vitroでの移植細胞へのマーカー導入操作を必要としない.本研究課題では,本移植モデルとBrduに対する免疫組織化学染色により,移植した滑膜細胞が4週間は関節内で生存し増殖することを明らかとした(TransORS1998,Cell&TissueRes1999).また,新たに開発した微小インデンテーション試験器を応用することで,関節軟骨欠損への骨軟骨移植後に移植骨軟骨片細胞が内軟骨骨化を起こし,修復軟骨組織の粘弾性の回復に深く関与することを明らかとした(TransORS1999).以上の如く本移植モデルを応用することにより,様々な組織修復に関しての生物学的および生体工学的評価を組み合わせた多角的な研究が可能であった.一方,骨髄は間葉系幹細胞の一つの起源として広く知られている.本研究ではTGラット骨髄細胞を近交系ラットに作製した膝内側側副靭帯損傷部に移植し,移植細胞の分化を形態学的に検討した.この結果,骨髄細胞が靭帯修復過程において線維芽細胞へ分化し,靭帯組織を構成することが明らかとなった(Hilton Head Workshop 1999).本は、自家骨軟骨移植モデルとして遺伝子を導入したトランスジェニックラットをdonerに用いて同系骨軟骨移植を行い、生存軟骨細胞の起源を探るとともに軟骨の粘弾性特性の経時的変化から移植軟骨基質の機能の変化について検討することを目的とした実験を行った。実験は、recipientとしてFisher ratを、donorとして構造遺伝子を導入したトランスジェニックラットを用いた。膝蓋大腿関節の大腿骨関節軟骨部に骨軸に垂直方向に骨欠損を作成し同じ大きさのdonor骨軟骨片を移植した。移植後2週、6週、12週に大腿骨を摘出し、微少粘弾性測定装置を用いて軟骨の押し込み試験を行った。測定は、平型インデンターをもちいて時間-変位曲線を得た。軟骨の厚さも測定した。試験後に試料をin situ hybridization法を施行し、組織学的に移植細胞の局在を観察した。また健側の同部位に同様に試験を行って正常軟骨群とした。【結果】平衡時の歪み及び瞬間弾性歪みは、正常軟骨に比し、2週で増加したが経時的に減少した。遅延時間は、2週で短縮したが、経時的に遅延した。また、軟骨の厚さは、各群において有意な差異を認めなかった。組織学的には、donorの軟骨細胞が12週生存していたが、細胞の配列は、正常と異なった。【考察】ラットを用いた同系骨軟骨移植では、移植後2週で軟骨の粘弾的性質が減弱するが、経時的に正常に近づくことが判明した。組織学的には、donorの骨軟骨細胞が12週においても生存していることが、確認され、産生された基質が、donorの骨軟骨細胞が機能的なvariabilityを有し、力学的環境の復元に寄与している可能性があると考える。この実験における結果は、力学的特性の変化については、第23回日本バイオメカニクス学会に於いて報告した。

また、力学的特性、組織学的変化及び細胞の由来について、米国整形外科基礎学会(ORS)に於いて報告し、New Ivestigators Recognition Awaradにnominateされた。組織修復過程における間葉系幹細胞の起源と役割を明らかとするために、まず、移植した細胞を拒絶反応なしにin vivoで追跡可能なモデルを開発し、種々の組織において細胞追跡における本モデルの有用性を確認した。次にこれを用いて間葉系幹細胞の分化に関する研究を行った。移植モデルには導入遺伝子からタンパク発現がない雌トランスジェラック(TG)ラット細胞をドナーとし、その雌近交系ラットをレシピエントとして使用した。これらラットのDNAは理論的には導入遺伝子以外は同じであり拒絶反応なしに増殖したTGラット細胞内の導入遺伝子を近交系ラット組織内でin situ hybridization法により追跡することが可能である。さらにTGラット細胞の使用によりin vitroでの移植細胞へのマーカー導入操作を必要としない。本研究課題では、本移植モデルとBrdUに対する免疫組織化学染色により、移植した滑膜細胞が4週間は関節内で生存し移植することを明らかとした(Trans ORS 1998,Cell&Tissue Res 1999)。また、新たに開発した微少インデンテーション試験器を応用することで、関節軟骨欠損への骨軟骨移植後に移植骨軟骨片細胞が内軟骨骨化を起こし、修復軟骨組織の粘弾性の回復に深く関与することを明らかとした(TransORS1999)。以上の如く本移植モデルを応用することにより、様々な組織修復に関しての生物学的および生体工学的評価を組み合わせた多角的な研究が可能であった。一方、骨髄は間葉系幹細胞の一つの起源として広く知られている。本研究ではTGラット骨髄細胞を近交系ラットに作製した膝内側側副靱帯損傷部に移植し、移植細胞の分化を形態学的に検討した。その結果、骨髄細胞が靱帯修復過程において線維芽細胞へ分化し、靱帯組織を構成することが明らかとなった(Hilton Head Workshop 1999)。
視神経の再生過程における遺伝子発現機構の解析

ホ乳類の中枢神経系は、一度破壊されると非常に再生しにくいのに対して、両セイ類・魚類の視神経は中枢神経であるにもかかわらず再生能力が良く保たれている。本研究においては、中枢神経系の再生実験モデルとして用いられているカエルの視神経を用いて、網膜よりメッセンジャ-RNAを抽出精製し、各種のDNAプロ-ブとのノザ-ンハイブリダイゼ-ションによって遺伝子レベルにおける神経再生機構の解析を行なった。まずカエルの視神経を切断し、組織学的及び生化学的手段によって神経の再生を確認した後に、ハイブリダイゼ-ションを行ない以下のような結果を得た。1)細胞骨格を形成し、神経の成長・再生に深く関与しているαーチュ-ブリン、アクチン遺伝子の発現を検討したところ、チュ-ブリンmRNAは視神経切断後一時間で著明に増加し、四時間で通常のレベルまで減少した。これに対してアクチンmRNAには有意な変化を認めなかった。2)視神経切断後2日目から28日目までのチュ-ブリン及びアクチン遺伝子の発現を検討したところ、チュ-ブリンmRNAは一過性の増加後28日目まで徐々に増加したのに対して、アクチンmRNAは7日目に強い発現が認められた。3)視神経切断後4時間までにおける、癌遺伝子群及びオルニチン脱炭酸酵素の発現を検討したが、有意な発現の増加を認めなかった。神経再生に関与する未知の遺伝子を検索するのは通常の方法では困難な事が明らかになったので、現在DNAポリメラ-ゼ増幅法(PCR法)によって未知遺伝子を検索する方法を検討している。1.視神経再生モデルの作製について,ウシガエル視神経をmicrosurgeryにより切断して3カ月後の視神経の組織標本(HE染色)を作製したところ軸索の伸長が認められた.これにより,形態学的には再生していると推測されたが,はたして本当に軸索輸送が回復しているかどうか,これを検討するために硝子体腔にアイリトープラベルのアミノ酸([3H]leucine)を注入し,網膜神経節細胞の神経終末である視蓋部での放射活性を測定したところ,視神経切断カエルでは対照と同程度の放射活性が認められた.以上の結果より,視神経の再生が形態面,機能面から証明された.この視神経再生モデルの作製については,視神経切断時に伴走血管を損傷し出血させなければ,ほぼ全例視神経の再生が確認できた.2.Northern hybridizationによる遺伝子発現の解析について,発癌遺伝子群(src,myc,ras,erb B,fos)の発現は認められなかったが,視神経を切断して, 1.2時間をピークとしてtubulin mRNAの強い発現が認められた.これまでに,金魚の視神経切断後, 4日目よりtubulin mRNAの発現がみられたという報告(Burell et al.,Brain Res.,168(1979)628-632)があるが,今回の我々の結果は,これとは発現時期が異なるため違った現象をとらえたものと思われる.このように視神経切断後に発現する遺伝子の解析については,細胞骨格であるtubulinのmRNAが視神経切断後の早期に一過性に発現するという大変興味ある結果が得られた.今後は,視神経切断後のより長期間のtubulin mRNAの動向について検索すると同時に,入手可能な他のDNA probeを用いたNorthern hybridizationによる遺伝子発現の解析も行いたい.我々は、これまでに視神経再生時にどのような遺伝子が発現しているか検討した結果、切断して1、2時間目にtubulin mRNAの強い発現が認められるという大変興味深い所見が得られた。今回はさらに再生時におけるtubulin,actinの変化を長期的(1ケ月)観察した。その結果、tubulin mRNAは切断してから1カ月間徐々に増加したのに対して、actin mRNAは切断して1週間目に強い増加が認められ、その後も増加は続いた。この所見は大変興味深い。形態学的には、切断して10ー14日目に切断部断端よりgrowth coneが形成され軸索の伸長が始まる。

さらにこのgrowth coneは大部分actin filamentsからできており、これらの事実からこのactin mRNAの強い発現は、growth cone形成に必要なactinを供給するために起こったと考えられる。したがって、これらの事に時間を費やしたため、本来の目的であるcDNA libraryの作製、クローンの選択、塩基配列の決定については十分な成果が得られなかった。しかし、我々の実験でみられた結果は今までに報告がなく大変注目している。今後は、今回の所見が再生可能なウシガエルに特徴的なものであるのかどうか検討するために、哺乳類を用いて同様の実験を行うのと同時に引き続き残りの予定分を行うつもりである。ホ乳類の中枢神経系は一度破壊されると非常に再生しにくいのに対して、両セイ類・魚類の視神経は中枢神経であるのにもかかわらず再生能力が良く保たれている。本研究においては、ウシガエルの視神経を研究対象として遺伝子レベルにおける神経再生のメカニズムの解析を行なってきた。既に神経切断後短時間におけるチュ-ブリン遺伝子の特異的な発現を明らかにしているが、本年度においてはさらに組織が完全に修復するまでの長期間にあたっての網膜における遺伝子の発現を解析した。その結果、チュ-ブリン及びアクチン遺伝子に関して神経切断後2日目から28日目までの間で、発現が異なる事が明らかとなった。チュ-ブリンmRNAは、切断後に一過性の増加を示し、さらに28日目まで徐々に増加した。これに対してアクチンmRNAは、切断後7日目に強い発現が認められた。このアクチン遺伝子の発現が、例えば成長円錐の形成などの神経の増殖・再生機構と関与しているかを明らかにする事が今後の課題である。これまでの研究により、神経再生に関与する未知の遺伝子を検索するのは通常の方法では困難な事が明らかになったので、本年度より新たにDNAポリメラ-ゼ増幅法(PCR法)を応用して未知遺伝子を検索する方法を立案し検討を加えている。
門脈学の総合的研究領域の策定

門脈病態が決して稀なものではなく、深刻な転帰を回避するためにはより適切な診断法と治療の開発が求められているということについて、先ず調査・検討した。往時と異り、当今は、生体肝移植に伴う門脈異常循環、門脈血栓症の合併の病態診断と治療に関心が向けられるようになった。今回の調査では肝硬変を中心とした右肝グラフトの場合、最高13%、平均6%に門脈血栓の合併がみとめられているが、この合併によりその11%は血栓の摘除・溶解を含む血行再建が奏功せずに死亡している。また腫瘍外科における門脈合併切除再建においても、端々吻合の場合には最大6%、平均4%に血栓閉塞が合併し、やはり血栓の摘除・溶解が奏功しない場合には、20%が死亡している。また、安全と思われている摘脾術でも、多い処では43%の門脈血栓が合併しており、その5%に門脈閉塞によるとおもわれる肝機能障害が合併しているが、このことは余り知られていない事実であろう。更に、硬変肝などで以前から指摘されていた門脈逆流や腎静脈などとのシヤントといった病態は肝移植術後の小さくない問題のひとつになっている。また、肝切除の適応拡大のために開発され汎く普及している門脈枝塞栓術の方法と効果予測は、未だ向上の余地が少なくない。さて、以上に挙げた各門脈病態に対する診断法として、微小気泡造影剤を用いた超音波診断法の応用と工夫が行われたが、今後の展開には多くの期待が寄せられた。さて、これらの臨床的問題の解決には、門脈を中心に据えた肝の微小循環研究、脾臓ビリルビン代謝、小腸吸収能・腸管リンパ輸送能、腸管免疫能・パイエル板を介したリンパ動態、門脈壁縱層筋、自発性収縮能、肝再生の検討に加えて、門脈に焦点を当てた門脈血栓機序の研究と血栓溶解療法の開発といった広域な研究組織が必須であると認められた。
地域の持続・再生支援拠点としてのコミュニティ・スクール再編

地域利用を前提に計画された全国の公立小中学校について、地域利用可能ゾーンと普通教室ゾーンの立体的な構成を類型化し、利用実態に関するアンケート調査を実施し、空間構成、学校運営、地域の体制の視点から分析した。さらに、現地で空間構成の確認と学校および地域関係者へのヒアリングを行い、学校を地域に開く際の課題を整理し、地域利用可能ゾーンを計画運営する際の考慮点を考察した。次に、学校と公共施設の連携を検討する上で、英国・ロンドン市のタワーハムレッツ区立図書館「Idea Store」とイタリアのボローニャ市立図書館を対象に、地域の持続・再生支援拠点として公共施設を計画するにあたっての可能性と課題を考察した。本研究は、わが国の現行のコミュニティ・スクール(CS)を、地域再生と持続可能な地域社会の創出をささえる地域拠点として再考・再編する検討を行い、Center of Communityとして再編されようとする大学(特に地方大学)を含めて、広域かつ包括的に教育機関をネットワーク化し、整備するための要件と課題を検討し、そのモデルを提示する事事を目的としている。2013年度は、学校をコミュニティ施設として再定義し、各種公共施設との連携を学術的に検討し、必要となる空間的要件と学校・地域連携体制やネットワーク構築における課題と可能性を明らかにするため、以下の研究を実施した。1学社連携による校舎改築と学校・地域づくりを進める北海道東川町立東川小学校と、コミュニティ・スクールとしての基盤やネットワークを活かして地域づくりを進めようとする三重県いなべ市石榑小学校の学校と地域関係者の交流機会を設け(8月に東川町、12月にいなべ市)、地域と学校の協働による学校づくりと地域づくりの課題と可能性について、議論した。22005年に竣工した石榑小学校の地域開放が可能なゾーンを地域住民の居場所として活用するため、学区住民のアンケート調査(10月)と居場所づくり事業の社会実験(11月2月)を行った。この調査と社会実験は、いなべ市からの受託研究(委託先名古屋大学小松研究室)により実施したが、そのための企画や分析を本科研費で実施した。3学校と地域施設の連携の可能性を検討するため、ロンドンの公立図書館(アイデア・ストア)とボローニャの公立図書館(サラ・ボルサ)、トリノのコミュニティ施設(地区の家)について現地踏査と関係者へのヒアリングを実施し、これからの公共施設が提供すべき公共サービスの内容や公共空間としての公共施設のあり方の分析を開始した。(1)地域利用を前提に計画された全国の公立小中学校について、建築系専門誌への掲載図面を元に地域利用可能ゾーンと普通教室ゾーンの立体的な構成を類型化し、特に両者を接続する空間・機能の特性を分析した。さらに、地域利用可能ゾーンと普通教室ゾーンを接続する空間がメディアセンター、多目的ホール、ランチルームとなっている24校の利用実態を分析するためにアンケート調査を実施し(14校が回答)空間構成、学校運営、地域の体制の視点から分析した。さらにその中の2校については現地で空間構成の確認と学校および地域関係者へのヒアリングを行い、より詳細な分析を行った。この分析の結果として、学校を地域に開く際の課題を整理し、地域利用可能ゾーンを計画運営する際の考慮点を考察した。(2)一方、人口減少社会において公立学校をより地域社会に開き、地域の持続・再生支援拠点として計画・運営する上で、日本の公立学校やコミュニティスクールにおいて本研究が期待する段階に到達した事例は、上記(1)の調査分析を通しても確認できなかった。そこで、昨年度に引き続き、公共施設が特定のサービス提供拠点として以上に、公共空間として計画されて機能している英国・ロンドン市のタワーハムレッツ区立図書館「Idea Store」とイタリアのボローニャ市立図書館を対象に、1立地性を重視した配置計画、2周辺の都市空間との連続性を重視した建築計画、3公共図書館の基本機能を保持しながらも社会構造の変化に対応するために図書館の基本機能を活かした社会サービスの開発・実施や、市民のニーズに応対する窓口機能の設置という公共空間としての計画、等について成果と課題、将来展望を分析した。さらに、それを支える公共政策の戦略性と実施体制について分析し、地域の持続・再生支援拠点として公共施設を計画するにあたっての可能性と課題を考察した。建築計画2年目に予定していた学校・地域関係者によるワークショップを通じたコミュニティ・スクール再編の課題や可能性の検討を2013年度に実施できた。また社会実験による課題と可能性の把握も実施できたため、これらを考慮し、総合的には順調に進んでいると判断できる。まず、2013年度に実施した調査結果の分析を行う。具体的には、海外事例の調査結果から、学校との連携が可能な公共施設(図書館やコミュニティ施設)の分析を進める。空間・運営・連携体制に関する要件とともに申請書にも示した大学の役割について明らかにしたい。また、申請時には当初2013年度に実施予定だった全国のコミュニティ・スクールを対象にした悉皆調査は、このようなインテンシブな分析の進捗状況を見ながら、実施するか否かを判断する。

2013年度に全国のコミュニティ・スクールの悉皆調査(アンケート調査)を実施しなかったため、次年度使用額が生じた。2013年度は石榑小学校と東川小学校との交流や石榑小学校での住民アンケート調査や社会実験、海外調査など研究上必要となるデータ収集が、当初の計画よりも進んで行われた。これを分析し、発表するための経費が当初の支出計画よりも必要となると予想されるため、それに活用する。
学習者の論理的思考力の育成に向けた理科教員養成プログラムの開発研究

本研究は、学校理科教育での学力形成に関わる現状を踏まえ、理科授業において学習者が概念的理解の論理一貫性を築くために必要な科学的思考、特に論理的思考力のさらなる育成を目指して、彼らの指導者となる理科教員の資質・力量を高めるための教員養成プログラムのあり方について検討することを目的とした。具体的には、次に示すような研究方法により、本年度の研究を推進した。(1)平成15・16年度の研究結果から得られた、実験観察を伴った理科授業での児童・生徒の探究過程における概念理解と思考の論理性の特徴を踏まえて、児童・生徒の論理的思考力の育成に向けた教授支援方略についての知見について、小・中学校での理科教育実践視察やそこでの教員との意見交換、さらには研究協力者として連携を図った国立・公立学校教員との検討会を通じて教育実践レベルからの検討を継続するとともに、その有効性を研究協力校における試行結果から明らかにした。(2)さらに、教員養成課程所属学生の実践的指導力の育成に向けて、児童・生徒への教授支援方略に関連する技法を修得するのに有効な教員養成プログラム教材のあり方について、臨床的な試行を通じて検討を加えたうえで、カリキュラム開発を行った。なお、その際には、平成15・16年度に収集した記録データを適宜加工し、VTR教材・関連資料を作成した。(3)開発したカリキュラムに関しては,国内の理科教育研究者等から専門的知見を踏まえた意見を聴取する機会を設けて、さらなるプログラム改善へ向けた検討を行った。本研究は、学校理科教育での学力形成に関わる現状を踏まえ、理科授業において学習者が概念的理解の論理一貫性を築くために必要な科学的思考、特に論理的思考力のさらなる育成を目指して、彼らの指導者となる理科教員の資質・力量を高めるための教員養成プログラムのあり方について検討することを目的とする。具体的には、次の2点を明らかにする。(1)小学校理科における物理系領域の授業を題材に、そこでの児童・生徒の探究過程を各種記録等から浮き彫りにして、思考の論理性を吟味する。また、教員養成課程所属学生に対して同様に思考の論理性を吟味したうえで、両者の類似点・差異点を明らかにする。(2)(1)を踏まえて、教員養成課程所属学生の実践的指導力の育成のため、児童・生徒の論理的思考力の育成に向けた教授支援方略を検討するとともに、その関連技法の修得のために有効となる教員養成プログラム教材のあり方について、臨床的な試行を通じて検討を加える。上述の目的に従い、本年度は次のように研究を推進した。(1)に関しては、島根大学教育学部附属小学校を協力校に設定し、担任教員との討議を重ねて授業立案を行った後、第4学年電気回路単元の全授業における児童・生徒の探究過程を(a)ビデオカメラや音声レコーダーによるAVデジタル記録、(b)授業観察者や学習者の筆記録、の両形式で記録に収めた。現在、記録データをPC等で多面的に分析し、学習者の概念理解と思考の論理性を吟味しているところである。また、島根大学教育学部理科教育選修に所属する第2学年の学生に対して、講義において類似した電気回路課題を提示した実験を導入することで、彼らの探究過程を筆記録で収め、分析を行うことで思考の論理性を吟味した。(2)に関しては、(1)で被験者となった学生に対して、実験の後に同じく被験者の小学校児童の探究過程を記録した授業VTRの提示を試み、これによる効果がどの程度得られるかを吟味した。得られた知見をもとに、次年度はプログラムの作成と試行を行う。次に示すような研究方法により、本年度の研究を推進した。(1)平成15年度の研究結果から得られた、小学校理科B区分(特に小学校教員が学習指導上の課題として認識している力学領域及び電磁気領域)に関連する実験観察を伴った理科授業での児童・生徒の探究過程における概念理解と思考の論理性の特徴を踏まえて、児童・生徒の論理的思考力の育成に向けた教授支援方略について、研究協力者との連携を図りながら教育実践レベルで検討するとともに、その有効性の検討を研究協力校における試行結果から行った。(2)さらに、教員養成課程所属学生の実践的指導力の育成に向けて、児童・生徒への教授支援方略に関連する技法を修得するのに有効な教員養成プログラム教材のあり方について、大学講義における臨床的な試行を通じて検討を加えたうえで、具体的なカリキュラムを設計した。平成15年度に収集した記録データについて適宜加工を行うことにより、VTR教材や関連資料を作成することにも配慮した。(3)(1)・(2)について検討した結果から得られた示唆について、国内の他の研究者や熟練教員から成る研究協力者、さらには海外高等教育機関の理科教育研究者(科学的スキル育成を軸にした理科カリキュラム(FOSS)開発で著名なカリフォルニア大学バークレイ校ローレンス・ホール・オブ・サイエンスの研究者)から意見聴取を行い、再度検討を加えた。

(1)平成15・16年度の研究結果から得られた、実験観察を伴った理科授業での児童・生徒の探究過程における概念理解と思考の論理性の特徴を踏まえて、児童・生徒の論理的思考力の育成に向けた教授支援方略についての知見について、小・中学校での理科教育実践視察やそこでの教員との意見交換、さらには研究協力者として連携を図った国立・公立学校教員との検討会を通じて教育実践レベルからの検討を継続するとともに、その有効性を研究協力校における試行結果から明らかにした。(2)さらに、教員養成課程所属学生の実践的指導力の育成に向けて、児童・生徒への教授支援方略に関連する技法を修得するのに有効な教員養成プログラム教材のあり方について、臨床的な試行を通じて検討を加えたうえで、カリキュラム開発を行った。なお、その際には、平成15・16年度に収集した記録データを適宜加工し、VTR教材・関連資料を作成した。(3)開発したカリキュラムに関しては,国内の理科教育研究者等から専門的知見を踏まえた意見を聴取する機会を設けて、さらなるプログラム改善へ向けた検討を行った。
生命科学におけるネットワーク結合力学系の大域的構造解明のための位相的計算理論

2)gene regulartory networkなどの複雑なネットワーク・ダイナミクスの時系列データから、大域的構造を復元するための理論の構築と計算について、前年度に続いて論文執筆中である。新たに望月の講演を元に、発生などのモデルを扱えないか模索中である。3) J.Sugihara et al.の提唱したいくつかの変数の時系列データから変数間の因果関係を結論するconvergentcross mappingを、数学的な立場から見直し、Groobner基底を用いてTakensの埋め込み定理を具体的な力学系についてその関係を考察した。まだ、まとまった結果は得られていないが、さらに考察を進めるつもりである。(N.Nakano, Y.Ishizuka, H.Koumotoとの共同研究。)4)武蔵野大学連携シンポジウム(2019年2月7日)で「遺伝子制御ネットワーク系のモース分解について」というタイトルで講演した。大学院の学生の課題の指導に時間が取られた。自分の研究分野と多少異なるため、表現論やデータ解析の人との共同研究が始まったが、予想より時間が取られたが、今後の進展にはプラスであると思う。switching systemに関しては、7月にicicm2019(バルセロナ)にいき、K.Mischakow氏、T.Gedeon氏、H.Kokubu氏と議論する予定である。switching systemの研究は今年度で完成させる予定である。また、C. Shih, H.Kokubuらと結合振動子系のsynchronizationの問題も進める。本年度の実績は以下のとおりである.1)生命科学でよく扱われるある種のネットワーク結合系であるswitching systemについて、2次元の場合に限るが、位相的計算理論を用いて、大域的構造解明のための理論を構築し、さらに、それを摂動した一般のベクトル場についてもモース分解が存続することを示した。これは、Physica Dに掲載された。(k.Mischaikowらとの共同研究)2)1)での理論を2次元以上で使えるようにするために、switching systemの設定を見直す作業を行った。(T. Gedeon, H.Kokubu, k.Mischaikowらとの共同研究)3)gene regulartory networkなどの複雑なネットワーク・ダイナミクスの時系列データから、大域的構造を復元するための理論の構築とMirskyのmammalian circadian rhythmを例として計算を行った。(B.Fiedler, A.Mochizukiらとの共同研究)4)パターン・ダイナミクスを生じる典型的な例として、1次元Swift-Hohenberg方程式を取り上げ、そのパターンのパーシステンス・ダイアグラムの時系列データから大域的構造がどの程度復元されるかについて考察した。また、一般的な方程式に対して、ある条件下でモース分解が復元されるという定理と、1次元Swift-Hohenberg方程式をコンピュータで計算することにより、定理を支持する計算結果を示した。5)生物学の分野の人と議論をし、これらの方法(位相的計算理論を用いた大域的構造計算)を実際の生物個体数の変化のデータに対して使用するための準備をした。やや遅れている理由のひとつは、申請時に2016年度の主任は決まっていたが、主任業務が予想していたより仕事量が多く、研究に時間がとれなかったことである。本年度の実績は以下のとおりである:1)生命科学でよく扱われる生体分子の制御ネットワーク結合系を区分線形な常微分方程式系とそれの連続系への摂動系として捉え、その性質を抽出したswitching systemとして数学的に定式化した。前年度では、2次元の場合に限っていたが、一般次元で定式化する方法について確立し、まず、きつい条件の元で、位相的計算理論を用いて、大域的構造を求める理論を構築し、それを摂動した一般のベクトル場についてもモース分解が存続することを示した。現在、この条件を弱めた場合について、議論を進めており、論文はきつい条件の元ではほぼ完成している。(T. Gedeon, H.Kokubu, k.Mischaikowらとの共同研究。)2)gene regulartory networkなどの複雑なネットワーク・ダイナミクスの時系列データから、大域的構造を復元するための理論の構築と計算を行った。これは、Fiedler,Mochidukiらの研究におけるregulatorynetworkのFeedback vertex setの考え方を時系列データに対して拡張したものであり、この考えかたは、アトラクタのみでなく力学系の大域的構造を再現するもので、Takensの力学系の時系列解析を発展させたものである。この結果については、University of Aukland, AMS conference ,MCA2017で講演した。論文は執筆中である。3)離散力学系とそのサスペンションとして得られる連続力学系のConley indexの関係をMrozekのConley index over the circleという観点から考察した。この結果は、2018日本数学会年会で講演した。前年度の主任業務後の仕事と今年度カリキュラム改革等の仕事量が多く、研究に時間がとれなかった。

(N.Nakano, Y.Ishizuka, H.Koumotoとの共同研究。)4)武蔵野大学連携シンポジウム(2019年2月7日)で「遺伝子制御ネットワーク系のモース分解について」というタイトルで講演した。大学院の学生の課題の指導に時間が取られた。自分の研究分野と多少異なるため、表現論やデータ解析の人との共同研究が始まったが、予想より時間が取られたが、今後の進展にはプラスであると思う。switching systemについては、本年度中に2次元以上の場合を完成させたい。(4)については、共同研究者のM.Kramerが、東北大からパリの研究実績の概要INRIAに異動したため、多少遅れるかもしれないが、出来るだけ早く完成させる。(5)は始まったばかりなので、取り敢えず予備的計算を行い様子をみる。以上に、最適なコンピュータを早期に購入する予定である。switching systemに関しては、7月にicicm2019(バルセロナ)にいき、K.Mischakow氏、T.Gedeon氏、H.Kokubu氏と議論する予定である。switching systemの研究は今年度で完成させる予定である。また、C. Shih, H.Kokubuらと結合振動子系のsynchronizationの問題も進める。申請時に2016年度の主任は決まっていたが、主任業務が予想していたより仕事量が多く、研究に時間がとれなかったことである。(理由)前年度の主任業務後の仕事と今年度カリキュラム改革等の仕事量が多く、研究に時間がとれなかった。また、パーシステント・ダイアグラムやdistance matirxの計算を主に実行していたMiro Kramerが2017年4月に東北大AIMRから、パリのINRIAに異動の影響が今年度にも影響した。switching systemについては、ほぼ完成しているが、共同研究者の意向により、より難しい場合も含めて論文にすることになり、論文完成は本年度中にできなかった。(使用計画)今年度は、研究会に参加するための国外・国内出張旅費とコンピュータ購入に使用予定である。自分の研究分野と多少異なるため、表現論やデータ解析の人との共同研究が始まったが、予想より時間が取られた。そのためコンピュータの購入時期が遅くなった。2019年度は、いくつかの海外出張で本研究の発表の予定があるため、国外旅費に使う予定である。スパコン使用料、国外、国内旅費に使用する。
内皮細胞の運動特性を基盤とする血管新生のメカニズムの解明

血管新生では内皮細胞同士の追い越しやすれ違い、入れ替わりと言った複雑な集団的細胞運動が明らかとなっているが、本研究では、この運動パターンを制御する仕組みの解明を目的としている。これまで血管内皮細胞株MS-1細胞を用いた単一細胞動態の解析から、内皮細胞が示す特有の協調運動として、細胞接着による方向性のある運動の亢進、血管新生のすれ違い運動に相当する回転運動、回転運動における運動速度の増加を明らかとしてきた。さらに細胞動態の詳細な解析から、MS-1細胞では接触した2細胞間で、一方の細胞運動が亢進している時、もう一方の細胞運動は抑制される傾向を見出している。この隣接細胞間に生じる相反的な運動性は、血管新生における内皮細胞同士のすれ違い時にも認められており、隣接した細胞同士が互いの運動の足場となることによって方向性のある運動を獲得していることが示唆された。次に、本研究では上記の協調動態を生み出す分子メカニズムとして内皮細胞特有の接着分子VE-カドヘリンの役割に注目し、CRISPR-Cas9システムを用いてVE-カドヘリンをノックアウト(KO)したMS-1細胞を作出した。VE-カドヘリンKO MS-1細胞では野生型MS-1細胞が示す細胞外基質(ECM)中での発芽・伸長が退縮し、単一細胞レベルでの解析においては、細胞接着は維持されながらも、運動の方向性が失われ、特徴的な2細胞での回転運動はむしろ亢進し、2細胞の経時的な運動速度が互いに相関性を示すようになることを見出した。さらに、当該年度は共同研究において、上記で同定した内皮細胞の運動特性を数理モデルに取り入れ、血管新生の数理シミュレーションとしてin silicoでの血管網の構築に成功している。また、VE-カドヘリンをKOしたMS-1細胞の挙動の数理モデル化にも取り組み、発芽的血管新生の退縮現象を再現することも出来た。当該年度は、当初予定していたより早く内皮細胞に特徴的な細胞動態の抽出が完了し、さらにCRISPR-Cas9システムを利用したVE-カドヘリンKO MS-1細胞の作出と解析にまで進むことが出来た。その結果、これまで同定した血管新生を可能にする内皮細胞動態について、VE-カドヘリンに依存した方向性のある運動とVE-カドヘリンに依存しない回転運動(血管新生では内皮細胞のすれ違い現象に相当)から構成されていることを明らかとすることが出来た。現在、VE-カドヘリン依存性、非依存性の細胞動態について各々の分子機構の解明に取り組んでいるが、VE-カドヘリンに依存した運動特性については、VE-カドヘリンの機能変化(特に細胞接着面で受けるエンドサイトーシスによる機能変化)とMS-1細胞の協調動態の関連が新たに示唆されている。さらに、VE-カドヘリンKO MS-1細胞が示す回転運動では、互いの接着面を軸に回転する2細胞の運動速度に経時的な相関性が認められると言う特性が明らかになり、数理モデルによるin silicoの血管網構築に新しい要素を加えることが出来た。また、当初想定していなかったVE-カドヘリンによる接着班の制御を介した内皮細胞の協調動態制御の可能性が示唆されており、こちらもVE-カドヘリンのエンドサイトーシスとの関連を含めその分子メカニズムの解析を進めている。また、VE-カドヘリンKO MS-1細胞における回転運動では、細胞接着面における活発なラフリング現象と細胞接着の保持(CD31の免疫染色による)が明らかとなり、一般的な細胞運動の接触阻害とは異なる接着による運動の亢進と言う内皮細胞に特徴的な協調動態を生み出す新たなメカニズムとして注目している。以上の様に、当該年度は当初の計画以上に研究計画が進展し、また想定外の新しい知見も得られたことから計画以上に進展していると評価した。今後の方針としては、これまで本研究において着目してきた血管新生を可能にする内皮細胞に特徴的な動態であるVE-カドヘリンに依存した方向性のある運動とVE-カドヘリンに依存しない回転運動について各々の分子メカニズムを明らかにしていくことである。先ず、VE-カドヘリンに依存した運動特性については、VE-カドヘリンのエンドサイトーシスとの関連に着目し、VE-カドヘリンKO MS-1細胞に、細胞内へのエンドサイトーシスが抑制されるVE-カドヘリン変異体(DEE変異体)と野生型VE-カドヘリンによるレスキュー実験を行い、両者の細胞動態の比較からVE-カドヘリンのエンドサイトーシスによる機能変化が内皮細胞の特徴的動態にどの様な役割を担っているかを明らかにする。また、VE-カドヘリンによる接着班の制御を介した内皮細胞の協調動態制御の可能性にも注目しているため、こちらもVE-カドヘリンのエンドサイトーシスと接着分子のリン酸化などの分子動態について解析を進める予定である。VE-カドヘリンに依存しない回転運動については、細胞接着面における低分子量Gタンパク質活性の関与を低分子量Gタンパク質の活性阻害剤を用いて解析すると共に、FRETを用いたライブイメージングによる、より直接的な解析にも挑戦していく予定である。また、VE-カドヘリンKO MS-1細胞に発現する遺伝子群が所属研究室のRNA-Seq解析により明らかになっているため、この中から接着分子を中心に内皮細胞の回転運動に関わる候補分子をピックアップし、CRISPR-Cas9システムを用いてVE-カドヘリンとのダブルKO MS-1細胞を作出、解析することにより内皮細胞にユニークな回転運動に関わる分子を同定する予定である。

血管新生では内皮細胞同士の追い越しやすれ違い、入れ替わりと言った複雑な集団的細胞運動が明らかとなっているが、本研究では、この運動パターンを制御する仕組みの解明を目的としている。これまで血管内皮細胞株MS-1細胞を用いた単一細胞動態の解析から、内皮細胞が示す特有の協調運動として、細胞接着による方向性のある運動の亢進、血管新生のすれ違い運動に相当する回転運動、回転運動における運動速度の増加を明らかとしてきた。さらに細胞動態の詳細な解析から、MS-1細胞では接触した2細胞間で、一方の細胞運動が亢進している時、もう一方の細胞運動は抑制される傾向を見出している。この隣接細胞間に生じる相反的な運動性は、血管新生における内皮細胞同士のすれ違い時にも認められており、隣接した細胞同士が互いの運動の足場となることによって方向性のある運動を獲得していることが示唆された。次に、本研究では上記の協調動態を生み出す分子メカニズムとして内皮細胞特有の接着分子VE-カドヘリンの役割に注目し、CRISPR-Cas9システムを用いてVE-カドヘリンをノックアウト(KO)したMS-1細胞を作出した。VE-カドヘリンKO MS-1細胞では野生型MS-1細胞が示す細胞外基質(ECM)中での発芽・伸長が退縮し、単一細胞レベルでの解析においては、細胞接着は維持されながらも、運動の方向性が失われ、特徴的な2細胞での回転運動はむしろ亢進し、2細胞の経時的な運動速度が互いに相関性を示すようになることを見出した。さらに、当該年度は共同研究において、上記で同定した内皮細胞の運動特性を数理モデルに取り入れ、血管新生の数理シミュレーションとしてin silicoでの血管網の構築に成功している。また、VE-カドヘリンをKOしたMS-1細胞の挙動の数理モデル化にも取り組み、発芽的血管新生の退縮現象を再現することも出来た。当該年度は、当初予定していたより早く内皮細胞に特徴的な細胞動態の抽出が完了し、さらにCRISPR-Cas9システムを利用したVE-カドヘリンKO MS-1細胞の作出と解析にまで進むことが出来た。その結果、これまで同定した血管新生を可能にする内皮細胞動態について、VE-カドヘリンに依存した方向性のある運動とVE-カドヘリンに依存しない回転運動(血管新生では内皮細胞のすれ違い現象に相当)から構成されていることを明らかとすることが出来た。現在、VE-カドヘリン依存性、非依存性の細胞動態について各々の分子機構の解明に取り組んでいるが、VE-カドヘリンに依存した運動特性については、VE-カドヘリンの機能変化(特に細胞接着面で受けるエンドサイトーシスによる機能変化)とMS-1細胞の協調動態の関連が新たに示唆されている。さらに、VE-カドヘリンKO MS-1細胞が示す回転運動では、互いの接着面を軸に回転する2細胞の運動速度に経時的な相関性が認められると言う特性が明らかになり、数理モデルによるin silicoの血管網構築に新しい要素を加えることが出来た。また、当初想定していなかったVE-カドヘリンによる接着班の制御を介した内皮細胞の協調動態制御の可能性が示唆されており、こちらもVE-カドヘリンのエンドサイトーシスとの関連を含めその分子メカニズムの解析を進めている。
人工多能性幹細胞由来の腸上皮細胞株の確立と大腸癌幹細胞モデルの構築

人工多能性幹細胞(iPS細胞)は、胚細胞(ES細胞)を使わない理想的な幹細胞である。本研究では、マウスiPS細胞から分化誘導した内胚葉系前駆細胞に、腸上皮細胞特異的ホメオボックス転写因子Cdx2を遺伝子導入し、正常腸上皮細胞株を樹立する。されに大腸癌関連遺伝子を遺伝子導入し、iPS由来大腸癌細胞株を樹立後、網羅的遺伝子解析により、大腸癌関連遺伝子の新規標的遺伝子の同定を試みる。iPS細胞は未分化な状態で維持された多能性幹細胞であるが、培養の条件によって分化しやすく継代培養中の条件設定が必要であり、この設定を行った。次にiPS細胞を内胚葉系の前駆細胞に誘導する目的でActivin Aを低濃度(10ng/ml)とFGF-2の存在下(4ng/ml)で5日間培養した。各段階の分化を蛍光抗体免疫染色などで評価を行い、内胚葉分化へのマーカーの1つであるSox17の発現を認めたが、分化誘導の効率が10-20%であった。そこで、分化誘導の方法をfeeder cellの上でmonolayerに培養する方法とEmbryonic bodyを形成して分化誘導する方法を検討した。Embryonic bodyでは、分化誘導が高頻度に認められたが、一方で内胚葉以外の系にも分化することから、分化の誘導方向のコントロールが困難であることが判明した。現在、これらの条件を設定しながらレトロウイルス発現ベクターpBABE-HygroにCDX2 cDNAを組み込んでレトロウイルスを作製し、内胚葉への分化誘導後の遺伝子(CDX2)導入を試みている。本研究では、マウスiPS細胞(iPS-MEF-Ng-20D-17)をフィーダー細胞(SNL76/7,MEF(RCHEFC003))上で培養して用いた。マウスiPS細胞から正常腸上皮細胞株を樹立する目的で、予備実験で確認された細胞分化が生じる際に腸上皮に分化誘導するため、腸の分化増殖に関与する腸上皮細胞特異的ホメオボックス転写因子Cdx2の遺伝子導入を試みた。pBA:BE-Hygro(RTV-001-hygro)にCdx2のcDNA組み込んだレトロウイルスを作製し、CDX2タンパク非発現大腸癌細胞株であるRKOに感染させて、作製ウイルスが機能することを確認した。その後outgrowth cultureを行い、細胞の分化誘導を以下の方法で評価した。内胚葉系前駆細胞へ誘導後の培養細胞に対して、内胚薬マーカーとなるSOX17に対する抗体を用いた免疫染色を行った。またウイルス感染後の培養細胞に対して抗CDX2抗体による免疫染色を行った。いずれのタンパク発現も増強が見られなかった。続いてSox17およびCdx2遺伝子の発現レベルを比較するために、培養細胞からRNAを回収後、逆転写を行ってcDNAを作製した。このcDNAを鋳型として定性的polymerase chainreaction(PCR)およびreal time PCRを行ったが、いずれも分化誘導前の細胞と比較して明らかな発現増加を確認できなかった。以上より、マウスiPS細胞(iPS-MEF-Ng-20D-17)に対して、高濃度のactivinAと低濃度血清による培養と、レトロウイルスによる遺伝子導入では有効な分化誘導が得られなかった。
内毒素気管内投与による肺傷害に対する陽圧換気の効果

本年度はうさぎ少量内毒素気管内投与モデルを用いて、陽圧換気の換気量(大きな一回換気量(20ml/kg)・小さな一回換気量(5ml/kg))が与える影響について検討するため、以下の4群に分け実験を行った。1)LE群:大きな一回換気量(20ml/kg)+内毒素投与群、2)LC群:大きな一回換気量+生理食塩水投与群、3)SE群:小さな一回換気量(5ml/kg)+内毒素投与群、4)SC群:小さな一回換気量+生理食塩水投与群。4時間の陽圧換気の後、肺微小血管透過性の指標としてpermeability index(BAL中アルブミン濃度/血清アルブミン濃度)を、内毒素への反応の指標としてBAL中及び血中の腫瘍壊死因子(TNF)濃度を求め、肺損傷の程度につき検討した。Permeability indexはLE群のみで有意に上昇していた。2元配置分散分析の結果より、大きな一回換気量による陽圧換気と少量の内毒素気管内投与の交互作用が有意であった。TNFは生理食塩水投与群(LC、SC群)ではBAL中、血中ともに検出されなかったため、内毒素投与群(LE、SE群)に関して検討した。BAL中TNFは2群ともに検出されたが、群間で有意な差は認められなかった。血中のTNFはLE群で有意に上昇していた。我々のモデルにおいては、大きな一回換気量による陽圧換気と少量の内毒素気管内投与が相乗的に働き、肺損傷が招来された。また、大きな一回換気量により内毒素刺激に対する過剰反応が誘導され、肺内のTNFが血中に漏出し、LE群において血中のTNFが有意に上昇したと考えられた。これらの実験結果は2002年5月に開催される米国胸部疾患学会総会において発表予定である。
胆嚢癌の発癌と増殖形態調節に関する研究

胆嚢癌の増殖形態調節因子の検討のために正常胆嚢粘膜上皮および複数の胆嚢癌株細胞を使用し,コラーゲンゲル内培養を行った.正常胆嚢粘膜上皮細胞はゲル内初代培養で嚢胞形態形成を示し,EGF,HGF,epimorphinには程度の差はあるが促進活性が認められた.しかし,ゲル内継代培養では対照群,EGF,HGF,epimorphin単独投与群では嚢胞形成は観察されず,線維芽細胞培養上清の添加あるいは線維芽細胞との同時培養でのみ嚢胞形成能が再獲得され,線維芽細胞は細胞間接着を再獲得させる何らかの因子を産生している可能性が示唆された.TGF-βには嚢胞形成促進活性は見られず,放射状分枝形態を形成させた.一方,胆嚢癌株細胞の通常コラーゲンゲル内培養では分枝状形態形成が主体で嚢胞形成をほとんど認めず,EGF,HGF,線維芽細胞培養上清の添加や線維芽細胞との同時培養でも嚢胞形成は観察されなかった.ただGB-dlは浮遊コラーゲンゲル内培養で嚢胞形成を促進したが,EGF,HGF,線維芽細胞培養上清にはこの促進活性を認めなかった.EGF,HGF線維芽細胞培養上清は胆嚢癌細胞株培養系においては管状・分枝状形態形成を促進する傾向にあった.上記のような正常細胞と癌細胞との間,また各種胆嚢癌株細胞間で生じる形態形成活性の違いは,それぞれの細胞におけるシグナル伝達様式の違いや接着因子の発現の差などに起因する可能性を考えている.胆嚢癌の増殖形態調節因子の検討のために正常胆嚢粘膜上皮および複数の胆嚢癌株細胞を使用し,コラーゲンゲル内培養を行った.正常胆嚢粘膜上皮細胞はゲル内初代培養で嚢胞形態形成を示し,EGF,HGF,epimorphinには程度の差はあるが促進活性が認められた.しかし,ゲル内継代培養では対照群,EGF,HGF,epimorphin単独投与群では嚢胞形成は観察されず,線維芽細胞培養上清の添加あるいは線維芽細胞との同時培養でのみ嚢胞形成能が再獲得され,線維芽細胞は細胞間接着を再獲得させる何らかの因子を産生している可能性が示唆された.TGF-βには嚢胞形成促進活性は見られず,放射状分枝形態を形成させた.一方,胆嚢癌株細胞の通常コラーゲンゲル内培養では分枝状形態形成が主体で嚢胞形成をほとんど認めず,EGF,HGF,線維芽細胞培養上清の添加や線維芽細胞との同時培養でも嚢胞形成は観察されなかった.ただGB-dlは浮遊コラーゲンゲル内培養で嚢胞形成を促進したが,EGF,HGF,線維芽細胞培養上清にはこの促進活性を認めなかった.EGF,HGF線維芽細胞培養上清は胆嚢癌細胞株培養系においては管状・分枝状形態形成を促進する傾向にあった.上記のような正常細胞と癌細胞との間,また各種胆嚢癌株細胞間で生じる形態形成活性の違いは,それぞれの細胞におけるシグナル伝達様式の違いや接着因子の発現の差などに起因する可能性を考えている.今年度はこれまでの研究の連続性から、胆嚢癌細胞に対する増殖形態形成因子についての実験を行った。まず、正常胆嚢粘膜上皮細胞の初代および継代培養細胞のコラーゲンゲル内培養系ではMRC5との同時培養で得られる嚢胞形成能の促進活性が、WI-38,BALB/3T3など数種類の線維芽細胞にある程度普遍的に認められ、EGF,HGF,epimorphinにもその促進作用が活性の差異はあるものの認められた。一方、TGF-βの添加では全く異なった放射状分枝形態を示した。しかし、継代培養細胞に対してはMRC5との同時培養でのみ嚢胞形成能の再獲得がみられ、MRC5には細胞間接着を再獲得させる何らかの因子が産生されているものと推測され、この因子はfreeze-thaw,60°C30minにて失活する分子量10万以上の蛋白質であることが判明した。また、免疫組織化学的および電子顕微鏡的解析では、その形態形成には細胞-細胞間隙に存在するデスモゾームや接着複合体、その接着因子であるデスモコリンやカドヘリン、さらに細胞骨格を形成しているケラチンフィラメントおよびアクチンフィラメントの形成が関与してることが明らかとなった。他方、胆嚢癌株細胞のコラーゲンゲル内培養によるゲル収縮実験から、通常のコラーゲンゲル内培養では管状分枝構造をとるのに対し、浮遊コラーゲンゲル内培養ではゲルは著明に収縮し、胆嚢癌株細胞が正常胆嚢細胞に類似した嚢胞構造を再獲得することが認められ、胆嚢癌の増殖形態には周囲の間質のdensityや環境に大きく左右されることを明らかにした。今年度は引き続き胆嚢癌細胞に対する増殖形態形成因子を明らかにするために複数の胆嚢癌株細胞を使用し,コラーゲンゲル内培養を行った.我々が樹立した胆嚢癌株細胞GB-d1以外に,GBK-1(熊本大学第2外科),KMG-C(久留米大学第1病理学),G-415(筑波大学内科),HAG-1(九州大学第1内科)の分与を受け,それぞれについてコラーゲンゲル内に通常立体培養,および浮遊培養を行い各種増殖因子(HGF,EGF,TGF-β1)の形態形成に及ぼす影響について観察した.胆嚢癌株細胞GB-d1は通常培養で管状形態をとるのに対し浮遊培養ではゲルは収縮し嚢胞形態を形成した.しかし今回用いた4つの株細胞はゲル収縮を見たものの,通常培養と浮遊培養では形態形成に明らかな変化は見られなかった.

また株細胞の種類により多様な形態形成が観察され,GBK-1は放射状分枝形態をとるのに対し,G-415やKMG-Cは細胞のコロニーを形成した.これまでの実験でHGF,RGFは分枝状形態形成促進傾向が確認されており、今回の実験でも管状形態形成,または細胞質の樹枝状形態形成を促進した.TGF-β1は細胞増殖を抑制し正常胆嚢細胞ゲル内培養で見られた放射状分枝形態は観察されなかった.また間質線維芽細胞との相互作用観察のため、それぞれの株細胞とヒト胎児肺線維芽細胞MRC-5との同時培養を行ったが、それぞれの形態形成はHGF添加時の形態に類似しており、またそれらはMRC-5調製培地添加によって再現された.以上の結果より胆嚢癌の増殖形態には周囲真質のdencityなどの環境因子に加え,胆嚢癌株細胞自体の性質も関与していると考えられた.その性質を左右する因子にはカドヘリン,カテニンなどの細胞間接着因子,インテグリンなどの細胞-基質間接着因子,あるいはケラチンフィラメントやアクチンフィラメントなどの細胞骨格、また各種増殖因子などのオートクリン作用が考えられた.