hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
免疫拒絶が生じない自己組織から作製する体性幹細胞樹立法開発の基礎的研究

自己組織から採取し、自己への応用を将来的に目指した、15代以上の継代が可能な体性幹細胞作製法の確立を目的として以下の検討を行った。1.検討した細胞ソースA)皮膚:真皮層を含む皮膚片を細片化した後、培養皿へ付着させ接触部分からの細胞の移行を得たB)骨髄:大腿骨より骨髄を採取し、pipettingにより骨髄細胞を単離したC)小腸粘膜:十二指腸粘膜上皮をトリプシン消化した後、細胞を単離したD)胎盤・羊膜:コラゲナーゼもしくはトリプシン消化後、細胞を単離したE)肝臓:コラゲナーゼ灌流消化した後、比重遠心法により肝実質・非実質細胞分画に分離したF)膵管:膵をコラゲナーゼ消化後、膵管をピックアップし、ディスパーゼにて膵管上皮細胞を単離した2.培養条件A)基本培地:αMEM3.結果A)皮膚(全層)からは130回の分裂が可能な継代可能な細胞が得られた。この細胞は、凍結・解凍の処置を行っても増殖活性の低下は見られず、B27,EGF,FGF添加および無血清の培養条件において、Nestinに対して陽性の染色性を示し、体性幹細胞と類似した性格を有した。ヌードマウス皮下移植実験では、奇形腫の形成能を認めなかった。B)骨髄、小腸粘膜、胎盤・羊膜、膵管由来の細胞からは、in vitroで増殖可能な細胞を獲得できなかった。細胞株化に至る培養条件、添加物のさらなる検討が必要である。しかしながら、胎盤由来細胞より、インスリン発現細胞への分化誘導に成功し、糖尿病細胞移植療法への可能性が示唆された。C)肝非実質細胞分画より、in vitroで肝細胞特異的機能を保持したまま増殖可能な小型の肝細胞(小肝細胞)を得た。ラット70%肝切除モデルにおける倍数体および増殖性の解析により、肝臓におけるstem/progenitor cellとしての役割を示唆する結果を得た。4.結語A)全層皮膚からは、長期(130代以上)継代可能な類体性幹細胞を樹立したB)骨髄、小腸粘膜、胎盤・羊膜、膵管由来の細胞からの体性幹細胞の樹立には成功しなかったC)分離された小肝細胞は、細胞移植ソースとしての可能性が示唆された15代以上の継代が可能な体性幹細胞作製法の確立を目的として以下の検討を行った。1.細胞ソースa.皮膚b.骨髄c.頬粘膜d.小腸粘膜2.培養条件3.培養結果骨髄、頬粘膜、小腸粘膜の細胞からは継代できるようなcell line化には今のところ成功していない。しかし、皮膚(全層)からは100回の分裂が可能な継代可能な細胞が取得された。この継代細胞は、凍結解凍しても増殖活性の低下は見られず、体性幹細胞と類似した性格を有している。また、nestinに対して陽性の染色性を示している。引き続き、細胞分化能、奇形腫形成能を検討すると共に、stem化検討していく予定である。4.結語A)全層皮膚からは、長期(130代以上)継代可能な類体性幹細胞を樹立したB)骨髄、小腸粘膜、胎盤・羊膜、膵管由来の細胞からの体性幹細胞の樹立には成功しなかったC)分離された小肝細胞は、細胞移植ソースとしての可能性が示唆された
翻訳リボゾーム親和精製法による弓状核におけるインスリンシグナルの標的遺伝子の同定

本研究では、視床下部弓状核のAGRPニューロン特異的な遺伝子発現解析に、Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP)法を利用し、EGFPとlarge-subunit ribosomal protein L10aのN末端との融合蛋白を特異的に発現させるトランスジェニックマウスの作製を試みた。2ラインの陽性マウスを得、このマウスとニューロン特異的Cre recombinase発現トランスジェニックマウスを掛け合わせ、ニューロン特異的の遺伝子発現解析を行う。我々は、これまでAGRPニューロンにおける3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1 (PDK1)のノックアウトマウス(AGRPPdk1^<-/->)が、コントロールマウスに比べ、エネルギー消費、行動量の増加、体重の低下を示し、同ニューロンでの転写活性抑制型FoxO1(△256FoxO1)の過剰発現が、その表現型を抑制することを報告した(PLoS ONE 6(4):el8324.doi:10.1371/journal.pone.0018324)。しかしながら、Pdk1-Foxo1のAGRPニューロンにおける標的遺伝子の同定には至らなかった。本研究では、PDK1のノックアウトおよび転写活性抑制型FoxO1の過剰発現による同ニューロンの遺伝子発現の変化をニューロン特異的に解析し、PDK1-Foxo1経路の標的遺伝子を同定することを目的とした。当該年度において、直接にAGRPニューロンの遺伝子発現解析を目的に可能にする方法として、Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP)法を確立するため、まず、EGFPとlarge-subunit ribosomal protein L10aのN末端との融合蛋白をAGRPニューロン特異的に発現させるトランスジェニックマウスの作製を試みた。現在1ラインが、陽性であることを、確認し、AGRP-Creトランスジェニックマウスと掛け合わせ、両マウスのダブルミュータントマウスを得ている。今後、AGRPニューロン特異的なEGFP-L10a蛋白の発現を、免疫染色により、確認する予定である。本研究では、視床下部弓状核のAGRPニューロンにおける3-phosphoinositide-dependent protein kinase1(PDK1)-Foxo1経路の標的遺伝子を同定することを目的としている。そのためのニューロン特異的遺伝子発現解析の方法として、Translating Ribosome Affnity Purification(TRAP)法を利用することを選択した。すなわち、EGFPとlarge-subunit ribosomalprotein L10aのN末端との融合蛋白をAGRPニューロン特異的に発現させるトランスジェニックマウスを作製し、抗EGFP抗体による免疫沈降を利用し、AGRPニューロン特異的な遺伝子発現解析を網羅的に行うことを計画した。HEK293培養細胞において、EGFP-L10aを一過性発現させ、抗EGFP抗体にて免疫沈降することにより、RNAを回収しうることを確認した。現在、EGFP-L10aを組織特異的に発現させるtransgeneの構築を終了した。さらにこのtransgeneが、Cre recombinaseにより、発現が誘導されることを細胞レベルで確認した。並行して、組織特異的EGFP-L10a発現トランスジェニックマウスを樹立するため、これまで2回にわたり、transgeneのinjectionを行ったが、いままでのところ、陽性Founderマウスは得られていない。今後、さらにinjectionを続けることにより、陽性ラインを得る試みを行う予定である。本研究では、視床下部弓状核のAGRPニューロンにおける3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1 (PDK1)-Foxo1経路の標的遺伝子を同定することを目的としている。そのためのニューロン特異的遺伝子発現解析の方法として、Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP)法を利用することを選択した。並行して、組織特異的EGFP-L10a発現トランスジェニックマウスを樹立するため、transgeneのinjectionを行い、2ラインの陽性マウスを得ることができた。今後、このマウスとニューロン特異的Cre recombinase発現トランスジェニックマウスを掛け合わせることにより、実際にTRAP法を試み、ニューロン特異的の遺伝子発現解析を行う予定である。CAG-CAT-EGFP-L10aトランスジェニックマウスの陽性ラインが2回のinjectionにもかかわらず、得られていないこと。

24年度が最終年度であるため、記入しない。現在、3回目のtransgeneのinjectionを行っている。得られたFounderマウスをtransgeneのスクリーニングを行った後、transgene陽性マウスをAlbumin-Creトランスジェニックマウスと掛け合わせ、肝臓におけるtransgeneの発現が認められるマウスラインを陽性ラインとし、その後の解析に使用する。
高解像度細菌叢解析による口腔微生物環境の恒常性維持メカニズムの解明

口腔は多くの異物に曝され,体内に侵入してくる細菌の最初の門戸となる.この口腔細菌叢解析を高精度に行い,どのように口腔微生物環境の恒常性が維持されているのかのメカニズムを明らかとすることを目的とする.口腔環境は複雑かつ変動が大きく,細菌種,特に古細菌については,正確なデータは存在しない.そこで,健常な口腔細菌叢と,う蝕,歯周病時の細菌叢との比較解析から,各状態に特異的な構成種を明らかとし,そのなかでも重要な役割を果たすと考えられる種についてはゲノム解析をすることで細菌叢による口腔恒常性維持機構の解明を目指した。その結果、10歳程度の子供では、すでに細菌叢は、大人と変わらない状態であることが判明した。その一方で、単離株のゲノム解析を行った結果、細菌の獲得免疫機構であるCRISPRが口腔というニッチにおいて、細菌の生存に極めて重要であることがわかった。これらの知見は、引き続くメタゲノム解析の基盤となるものである。口腔は多くの異物に曝され,体内に侵入してくる細菌の最初の門戸となる.この口腔細菌叢解析を高精度に行い,どのように口腔微生物環境の恒常性が維持されているのかのメカニズムを明らかとすることを目的としている.口腔環境は複雑かつ変動が大きく,細菌種,特に古細菌については,正確なデータは存在していない.そこで,健常な口腔細菌叢と,う蝕,歯周病時の細菌叢との比較解析から,各状態に特異的な構成種を明らかとし,そのなかでも重要な役割を果たすと考えられる種についてはゲノム解析をすることで細菌叢による口腔恒常性維持機構の解明を目指している.まず平成22年度は,う蝕のない,または完全に治療した412歳の子と母の母子16組,32人の口腔細菌叢を調べるための試料を採取した.系統マーカー遺伝子としては,最も使用されている16SrRNA遺伝子を用いる.これまでにも細菌のみ,古細菌のみのuniversal primerが複数種類報告されているが,本研究では,当研究室で独自に開発した細菌および古細菌の両者を増幅可能なuniversal primerを用いている.本プライマーは,本研究で用いる高速シーケンサーRoche 454 FLX titatnium kitに適した約400bpを増幅するものであり,実際の試料を用いたDNA抽出方法およびPCR条件を決定した.これから,全サンプルにおいて高速シーケンサーに十分量のPCR産物を準備し,一人約32,000配列を取得,系統解析を行うことを予定している.現在,32試料のうち,半数について試料の調製を終了しており,調製後すぐにシーケンスを行なうことを可能としている.口腔は多くの異物に曝され,体内に侵入してくる細菌の最初の門戸となる.この口腔細菌叢解析を高精度に行い,どのように口腔微生物環境の恒常性が維持されているのかのメカニズムを明らかとすることを目的としている.口腔環境は複雑かつ変動が大きく,細菌種,特に古細菌については,正確なデータは存在していない.そこで,健常な口腔細菌叢と,う蝕,歯周病時の細菌叢との比較解析から,各状態に特異的な構成種を明らかとし,そのなかでも重要な役割を果たすと考えられる種についてはゲノム解析をすることで細菌叢による口腔恒常性維持機構の解明を目指している.まず平成22年度は,う蝕のない,または完全に治療した412歳の子と母の母子16組,32人の口腔細菌叢を調べるための試料を採取した.系統マーカー遺伝子としては,最も使用されている16SrRNA遺伝子を用いる.これまでにも細菌のみ,古細菌のみのuniversalprimerが複数種類報告されているが,本研究では,当研究室で独自に開発した細菌および古細菌の両者を増幅可能なuniversalprimerを用いている.本プライマーは,本研究で用いる高速シーケンサーRoche454FLXtitatniumkitに適した約400bpを増幅するものであり,実際の試料を用いたDNA抽出方法およびPCR条件を決定した.これから,全サンプルにおいて高速シーケンサーに十分量のPCR産物を準備し,一人約32,000配列を取得,系統解析を行うことを予定している.現在,シーケンスが終了しており、細菌群集構造の解析を進めている。口腔は多くの異物に曝され,体内に侵入してくる細菌の最初の門戸となる.この口腔細菌叢解析を高精度に行い,どのように口腔微生物環境の恒常性が維持されているのかのメカニズムを明らかとすることを目的としている.口腔環境は複雑かつ変動が大きく,細菌種,特に古細菌については,正確なデータは存在していない.

そこで,健常な口腔細菌叢と,う蝕,歯周病時の細菌叢との比較解析から,各状態に特異的な構成種を明らかとし,そのなかでも重要な役割を果たすと考えられる種についてはゲノム解析をすることで細菌叢による口腔恒常性維持機構の解明を目指している.まず平成22年度は,う蝕のない,または完全に治療した412歳の子と母の母子16組,32人の口腔細菌叢を調べるための試料を採取した.系統マーカー遺伝子としては,最も使用されている16S rRNA遺伝子を用いる.これまでにも細菌のみ,古細菌のみのuniversal primerが複数種類報告されているが,本研究では,当研究室で独自に開発した細菌および古細菌の両者を増幅可能なuniversal primerを用いている.本プライマーは,本研究で用いる高速シーケンサーRoche 454 FLX titatnium kitに適した約400 bpを増幅するものであり,実際の試料を用いたDNA抽出方法およびPCR条件を決定した.これから,全サンプルにおいて高速シーケンサーに十分量のPCR産物を準備し,一人約32,000配列を取得,系統解析を行うことを予定している.現在,シーケンスが終了しており、細菌群集構造の解析も終了している。論文作成をはじめたところである。研究の進捗に偏りがあり、当初予定した順番で進行していないため。しかしながら、着実に研究成果はでていることから、概ね順調に進展しているものと判断できる。24年度が最終年度であるため、記入しない。推進方策に特に変更はない。本研究における各項目の達成度には偏りが見られるものの、本年度内に目的の達成は可能であると判断できるため。むしろ、現在のペースを保ち、予定にこだわらず柔軟な姿勢で望むことで、これまで以上の成果を継続して発表していくことができると考えている。
日本における文字研究史・文字意識史の基礎的研究

本年度も、昨年度以前に引き続き、近世文学研究書の原本調査作業を行った。国文学研究資料館や東京大学付属図書館等において、昨年度までの調査の遺漏を補う作業を継続するとともに、加えて新たに亀田鵬斎・清水浜臣・高橋残夢の三人の文学研究にかかわる著作に就いては特に集中的な調査を行った(高橋残夢については、岡山県立図書館・京都大学付属図書館を中心に調査を行った)。また、これまでに得られた近世の文学研究に関する基礎的データは、随筆等の非研究書における文字に関する記述の集積も含めて、データーベース化を進めており、公開を目指して今後、整備を継続する予定である。更に、文字に関する思索が研究の形式を採る以前の時代の文字意識史に関する研究も継続的に行い、今年度は、近年、文字研究市場で特別な位置を与えられてきた藤原定家の文字意識について、その書き残した書記資料から実証的に再検討した論として「定家の表記再考」を、また、更に平安時代におけるより一般的な文字意識のあり方を文字教育の実態という方面から検討した論として「平安後・末期における初歩的な書字教育のあり方について」を、それぞれ公にすることを得た。本年度は、日本文字研究史の全体像把握の第一段階として、近世の文字研究書に関して、東京大学附属図書館所蔵資料を中心に、国文学研究資料館・大阪府立中之島図書館等に於いて調査を行った。本年度の調査資料が研究対象とするものの範囲は、主として仮名の起源及び字母に関するものと漢字字体に関するものとである。その成果は「文字研究の歴史」(『朝倉日本語講座2文字・書記』朝倉書店・2005年3月刊行予定)に概略的に公にすることを得た。それと同時に、今後、仮名遺書など、より調査範囲を広げることにより、更に巨視的な観点から日本文字研究史を捉え直すことが目標として定まったところであり、また、調査の過程で、所謂狭義の文字研究書のみならず、随筆等の中に見える文字に関する言説を集成することによってより広汎な文字意識史を記述する必要性が認識されるに至り、現在その収集・整理にも着手したところである。また、文字研究史の概略的記述の副産物的成果として、以下のものを得た。一には、個別資料の問題だが、これまでの文字研究史記述に於いて特に重要資料とされてきた『倭片仮字反切義解』の成立に関わる問題点が明らかとなったことであり、これは「『倭片仮字反切義解』の成立年代について」(『神戸大学文学部紀要』第32号、2005年3月刊行予定)に於いて論じることを得た。二には、文字研究史の反省的な捉え直しから文字研究の方法論について理論的に考究する足掛かりを得たことであり、「仮名書記史研究の方法論について」(『文化學年報』神戸大学大学院文化学研究科、第24号、2005年3月刊行予定)及び「定家の表記再考」(第5回表記研究会口頭発表、2005年1月)に於いてその点を明らかにした。本年度は、前年度に引き続き、日本文学研究史の全体像把握のため、東京大学附属図書館、国文学研究資料館、大阪府立中之島図書館等において、近世文学研究書の原本調査、マイクロフィルムによる調査を行った。中でも『和字大観鈔』とその著者である無相文雄のその他の著作に関しては重点的に調査を行った。その成果の一部は、「無相文雄『和字大観鈔』について」(『文化學年報』25・神戸大学大学院文化学研究科・2006年3月)として公にすることを得た。これは、国語学史上重要な著作の一とされながら、これまで翻刻・影印などによる紹介の無かった同書について、初版本と再治本とを対校した校本の形で全本文を初めて活字で学界に提供したものである。近世文字研究の集成作業としては他に、所謂狭義の文字研究所以外の、随筆等の中に見える文字に関する言説についても、『日本随筆大成』等に所収された基本的資料を中心に、その探索・整理を進めている。また、本年度も文字研究史の概略的記述の副産物的成果として、以下のものを得た。いずれも、近世文字研究史上に現れたものを含めて、前近代の文字意識の一端を明らかにし、改めて現代的な文字観察の問題点をあぶり出す作業の成果である。一は「定家の表記再考」(『国語文字史の研究』9、2006年刊行予定)で、これは現代の書記史研究で特別扱いされることの多い藤原定家の書記態度を相対化したものである。二は、「誤記・誤写と書記史」(『神戸大学文学部紀要』33、2006年3月刊行予定)で、誤記・誤写現象を手がかりに前近代の文字意識と書記の歴史的変化の様態との関係を論じたものである。

更に、文字に関する思索が研究の形式を採る以前の時代の文字意識史に関する研究も継続的に行い、今年度は、近年、文字研究市場で特別な位置を与えられてきた藤原定家の文字意識について、その書き残した書記資料から実証的に再検討した論として「定家の表記再考」を、また、更に平安時代におけるより一般的な文字意識のあり方を文字教育の実態という方面から検討した論として「平安後・末期における初歩的な書字教育のあり方について」を、それぞれ公にすることを得た。
胎盤細胞で働くエンドソーム膜タンパク質MLN64のコレステロール輸送における役割

オルガネラ膜間が生む極小ゾーンは,コレステロール等の低分子物質の移動が起こる極めて重要な機能を有する。この極小ゾーンで起こる輸送機能を明らかにする研究が世界的に進められているが,得られた知見は意外に少ない。研究代表者は,胎盤細胞においてエンドソームとミトコンドリアが接近することを発見し,小胞体を経由したミトコンドリアへのコレステロール輸送経路の説に新たな展開が期待された。また研究代表者は,脂質の有無によってエンドソームとミトコンドリアとの間で接近と離脱を繰り返すことを見出し,オルガネラ間の極小空間で起こる接近と離脱の動的平衡を制御する巧妙な未知の機構の存在に興味を持った。そこで本研究は,エンドソーム-ミトコンドリア膜間ゾーンが生むコレステロール輸送機構の詳細解明を目的とする。そこで本年度は,下記(1)(4)の成果を得た。(1)この接近を免疫電顕法により定量的に評価することで,エンドソームとミトコンドリアとの間のオルガネラ近接を確実に証明した。(2)エンドソーム膜タンパク質MLN64ノックダウン細胞では接近できないことを明らかにすることを目的に,免疫染色を介した3D電子線トモグラフィーによる新規解析法を考案して実施し,MLN64がエンドソームとミトコンドリアの接近に必要であることを示した。(3)JEG3細胞抽出液を用いたショ糖密度勾配遠心法によりオルガネラ分画を行った。MLN64抗体を用いたimmuno-isolationをし,MLN64を含むエンドソームの単離を試みた。培地の血清から脂質を除いた培地を用いた条件も検討し,脂質有無のエンドソームを準備した。(4)MLN64のN末領域と相互作用する因子を免疫沈降実験により同定する目的で,MLN64のN末から膜貫通領域までの領域とGFPとの融合遺伝子を作製した。ヒト胎盤細胞におけるエンドソーム-ミトコンドリア間オルガネラネットワークは,大量かつ恒常的なプロゲステロン産生に極めて重要な役割を持っていると考えられている。しかしながら,プロゲステロン産生に必要なコレステロールがどのようにミトコンドリアへ輸送されているのか,未だ謎は多い。そこで本年度研究計画は,コレステロール輸送を担うエンドソーム-ミトコンドリア間極小ゾーン理解に務めた。(1)エンドソームとミトコンドリアとの間の接近を定量的に評価するため,MLN64ノックダウン細胞と,そのコントロール配列導入JEG3細胞のエンドソームを,エンドソームマーカーであるLamp1抗体で標識し,電子顕微鏡を用いてエンドソームとミトコンドリアとの接近を観察した。その結果,コントロール細胞においてLamp1標識区画にミトコンドリアが接近している割合は15.8 ±2.8%(n=497)に対し,MLN64ノックダウンでは4.1 ±1.1%(n=372; p < 0.01)まで減少した。(2)抗Lamp1抗体標識したノックダウン細胞での3D電子線トモグラフィー解析を行ったところ,MLN64ノックダウンではエンドソーム膜の面においてもミトコンドリアと接しておらず,離れていることがわかった。(3)MLN64が存在するエンドソームの生化学的単離を目的に,JEG3細胞の破砕抽出液をショ糖密度勾配遠心による細胞分画を行ったところ,オルガネラに乗るMLN64は本来の分子量サイズより若干大きいバンドも得られ,MLN64のリン酸化の新規知見を得ることができた。(4)エンドソームミトコンドリア間極小ゾーンを制御する候補因子MLN64のN末領域で相互作用する因子を免疫沈降実験により同定する目的で,MLN64のN末から膜貫通領域までの領域とGFPとの融合遺伝子を作製した。本年度の研究から,MLN64がエンドソームとミトコンドリアとの接近に必要であることがわかった。この結果は,研究代表者が考案した免疫標識法とカップルさせた3D電子線トモグラフィーを行うことでクリアに証明された。さらに,MLN64のリン酸化の新規知見を得ることができたことから,脂質の有無によるMLN64の挙動やリン酸化を検討することを今後積極的に行う。エンドソームミトコンドリア間極小ゾーンを制御する候補因子MLN64のN末領域で相互作用する因子を免疫沈降実験により同定する目的で,MLN64のN末から膜貫通領域までの領域とGFPとの融合遺伝子を作製した。この融合遺伝子の発現や局在などを確認するとともに,N末領域で相互作用する候補因子の検索実験を今後行ってゆく。候補因子の機能として,エンドソームとミトコンドリアとの間の接近を制御するものである可能性もあり,本研究の発展性が期待される。ヒト胎盤細胞のミトコンドリアで大量に産生されるプロゲステロンは、妊娠維持に働く極めて重要なステロイドホルモンである。プロゲステロンを大量に産生するには、その原料となるコレステロールを大規模かつ効率よくミトコンドリアへ輸送する必要があるものの、その輸送分子機構についてほとんど分かっていない。研究代表者は、胎盤細胞においてエンドソームとミトコンドリアが接触することを発見した。このエンドソームに存在するコレステロール結合タンパク質MLN64を欠くとプロゲステロンを産生できないことから、本研究では、胎盤細胞におけるエンドソーム-ミトコンドリア間の接触による新規コレステロール輸送の分子機構解明を目指し,下記研究結果を得た。(1)強制的に後期エンドソームとミトコンドリアを接触させるコンストラクトを構築し,発現誘導に成功した。

免疫染色等の方法を用いた細胞生物学的手法により,発現タンパク質が後期エンドソームとミトコンドリアの近傍に存在し,小胞体やゴルジ体とは異なる区画に存在することもわかった。(2)リン酸化が示唆されるMLN64アミノ酸点変異コンストラクト構築に着手した。リン酸化が示唆される4箇所のセリン残基の全ての点変異コンストラクトのうち,8種類の変異体構築をシーケンス解析により確認し完了した。これら変異体を細胞に発現させると,初期エンドソーム様の特異な区画に局在することも判明し,どの様な特徴を持つ区画なのかについても解析を進めている。年度内に計画予定であった3D電顕解析が電顕のカメラ故障により画像取得できず,修理に時間がかかっていることが理由である。今年度7月に修理し部品交換を予定している。そのため,次年度以降行う予定であった研究計画を前倒しで行った。ヒト胎盤細胞のミトコンドリアで大量に産生されるプロゲステロンは、妊娠維持に働く極めて重要なステロイドホルモンである。プロゲステロンを大量に産生するには、その原料となるコレステロールを大規模かつ効率よくミトコンドリアへ輸送する必要があるものの、その輸送分子機構についてほとんど分かっていない。研究代表者は、胎盤細胞においてエンドソームとミトコンドリアが接触することを発見した。このエンドソームに存在するコレステロール結合タンパク質MLN64を欠くとプロゲステロンを産生できないことから、本研究では、胎盤細胞におけるエンドソーム-ミトコンドリア間の接触による新規コレステロール輸送の分子機構解明を目指す。本年度では,強制的にエンドソームとミトコンドリアを接触させる新規誘導コンストラクト系を構築した。昨年度作製したコンストラクト発現細胞を蛍光顕微鏡や電子顕微鏡を用いて詳しく解析したところ,正しくミトコンドリアへ局在化していない可能性が認められた。そこで今年度は,改めてミトコンドリア外膜タンパク質Tomm70Aのミトコンドリア移行シグナルに換えた新規コンストラクトを構築した。このコンストラクトを胎盤由来培養細胞に発現させると,エンドソームとミトコンドリアは極めて近傍に接することが電子顕微鏡解析で判明した。しかし一方で,エンドソーム内腔にミトコンドリアやコンストラクト発現タンパク質が取り込まれている像も観察された。今年度構築したコンストラクト発現実験では,エンドソーム内腔にミトコンドリアが取り込まれる予想外の結果が得られた。当初,エンドソームとミトコンドリアとの接触する部位が単に増えることを予想し,もちろん,予想通りの画像も得ることができた。この予想外の結果は,オルガネラ間接触が極めて厳密に制御されていることを示唆するものであり,新たな知見をもたらした。オルガネラ膜間が生む極小ゾーンは,コレステロール等の低分子物質の移動が起こる極めて重要な機能を有する。この極小ゾーンで起こる輸送機能を明らかにする研究が世界的に進められているが,得られた知見は意外に少ない。研究代表者は,胎盤細胞においてエンドソームとミトコンドリアが接近することを発見し,小胞体を経由したミトコンドリアへのコレステロール輸送経路の説に新たな展開が期待された。
最初期発現遺伝子Arcを用いたフェロモンの受容機構と記憶機構の解析

脳が外界からの刺激をどのようなメカニズムによって記憶するのかは非常に興味深い問題である。我々は鋤鼻系神経路をモデルとしてフェロモン記憶をシナプスの形態変化で捉えようと研究を続けている。しかし、まさに無数に存在する脳内のシナプスから特定の記憶に関連したシナプスのみを同定することは困難である。そこで、本研究においては、近年新しく発見された最初期遺伝子Arcを用いて、フェロモン記憶に関連したシナプスを標識することを目的として研究を行った。その結果として僧帽房飾細胞層において顆粒細胞の樹状突起がArc陽性であることが観察され、さらに興奮シナプスの後膜周辺にも強い陽性反応が観察された。これは光学顕微鏡下での結果同様にArcタンパクが顆粒細胞の樹状突起に分布し、それがシナプス周辺へ運ばれていることを示した。Arc蛋白が交尾後、相反シナプスの後膜肥厚にまで達しているのは興味深い。この結果は二つの大きな意義を持つものである。すなわち1)特定の刺激に対して反応性の上昇したシナプスをin vivoの状態で標識することが可能になった。2)Arcが同所で記憶形成に関して何からの重要な役割を演じていることを強く示唆している。このことからArcは中枢神経系の一般的な記憶機構の解明に対する有効なマーカーとして広く神経科学の分野の研究に用いることができると推察できる。本研究の研究成果が鋤鼻系におけるフェロモン記憶にとどまらず記憶機構の基礎システム解明に重要な指標を示すと考えている。私は本研究において、鋤鼻系神経路をモデルとしてフェロモン記憶をシナプスの形態変化で捉えようと研究を続けている。本年度はArcによる解析の前段階として記憶形成後の雌マウスにおけるシナプスの形態変化を経時的に詳細に観察した。これまでに雌マウスに交尾時に形成される記憶に関しても電子顕微鏡を用いた形態学的な解析でこの記憶が副嗅球内に存在するシナプスの形態変化によって形成されていることを報告した。そのシナプスとは副嗅球僧帽房飾細胞層に存在する相反シナプスである。相反シナプスは興奮性と抑制性のシナプスが互いに逆方向に一組として存在している特殊なシナプスである。興奮性のシナプスと抑制性のシナプスはその形態から容易にかつ確実に区別することができる。電子顕微鏡でシナプス画像を取得し、画像解析装置により後膜肥厚のサイズを長さとして平面的に計測し、群間で比較検討した。その結果、非常に興味深いデータが得られたのである。交尾後(記憶形成後)およそ24時間で、まず興奮性のシナプスのサイズが有意に大きくなる。この変化は交尾後5日程度まで持続する。そして5日ごろから同様に抑制性のシナプスのサイズが大きくなるのである。統計学的な有意差は5日しか検出できないが、抑制性シナプスのサイズの増大傾向は20日頃まで持続する。そして50日後にはこの変化は完全に消失する。もちろんこの形態変化だけで雌マウスにおける長期記憶が維持されているとは断定できないが、長期記憶を考えるときに異なる二種類のシナプスの連続的な形態変化は非常によいモデルになるのではないかと考えている。本研究においては、私は鋤鼻系神経路をモデルとしてフェロモン記憶をシナプスの形態変化で捉えようと研究を続けている。昨年度までに、雌マウスに交尾時に形成される記憶に関しても電子顕微鏡を用いた形態学的な解析でこの記憶が副嗅球内に存在するシナプスの形態変化によって形成され、それが長期にわたり保存されていることを報告した。記憶に関する形態変化の基礎には神経の可塑性が存在する。ニューロンは一般的に不変のように考えられているが、柔軟にその形態を変える。このような形態学的な変化を観察する準備段階として、神経再生をOMP(olfactory marker protein)を指標として、主嗅覚系への損傷を最小にして、鋤鼻神経線維を切断する方法を用いて検討した。本研究においては、麻酔下のマウス頭蓋骨を嗅球部分で除去し、micro scissorsを用い

副嗅球前端部で両側性に鋤鼻神経束を切断した。その後、1,6,20,60,120日後に灌流固定を行い、OMPを標識する染色を行った後、嗅球・鋤鼻器・嗅上皮を観察した。その結果、鋤鼻上皮におけるOMP陽性細胞数は切断後急激に減少し、20日および60日で完全に消失した。また、120日後の個体の一部においてOMP陽性細胞の再発現が観察された。これらの各実験群において、すべての個体で嗅上皮および主嗅球には、ほとんど損傷が観察されなかった。このように本研究に採用された新しい鋤鼻神経切断法は非常に効果的であることが示された。また、この方法では主嗅覚系にほとんど損傷を与えないことが確認された。これは今後鋤鼻系をモデルとした神経可塑性を検討する上で重要な指標となると考える。本研究においては、私は鋤鼻系神経路をモデルとしてフェロモン記憶をシナプスの形態変化で捉えようと研究を続けている。昨年度までに形態学的な変化を観察する準備段階として、神経再生をOMP (olfactory marker protein)を指標として、主嗅覚系への損傷を最小にして、鋤鼻神経線維を切断する方法を用いて検討し、新しい鋤鼻神経切断法は非常に効果的であることが示された。本年度はこれをよりいっそう発展させ、新しいミュータントマウスであるVN12-tau-LacZマウスを用いて、鋤鼻神経の再生機能を特異的に観察した。これまでのOMP-tau-LacZマウスを用いた実験でも鋤鼻神経の再生能力が示されていたが、今回用いるマウスによって特定のレセプターを持った神経を可視化することが可能になった。その結果、VN12-tau-LacZマウスを用いることによってVN12レセプターを発現した鋤鼻ニューロンのみを特異的に染め分けることに成功した。そして前年新たに開発された神経切断法を用いて、鋤鼻神経の再生能力を検討した。嗅覚系に損傷を与えない方法を用いて、副嗅球直前で鋤鼻神経を特異的に切断した。切断後1,5,12,20,30,60日後に断頭の後、Xgal染色を施し、VN12発現ニューロンを可視化した。鋤鼻ニューロンは切断後、いったん完全に嗅球周辺部から退縮した。しかし、20日後には再び、VN12陽性ニューロンが伸展を始め、60日後には副嗅球に再投射することが確認できた。しかも興味深いことに、この再投射ニューロンは再投射を完了する前に鋤鼻レセプターVN12を発現していた。このように鋤鼻神経は再生能力に富み、確実にターゲットに再投射することが確認された。
アデノ随伴ウイルスを応用した脳神経疾患に対する遺伝子治療

非病原性のアデノ随伴ウイルス(AAV)に由来するベクターは、頭蓋内での炎症反応も起こしにくく、神経組織や筋肉などにおいて、単回の投与で長期間安定した発現が可能である。本研究では、脳神経疾患への臨床応用をめざした次の研究段階として各種血清型AAVを用い、併用薬剤を用いた遺伝子発現増強効果、発現制御システム、およびベクターの筋注による蛋白質補充療法の効果を検討した。1. ApoE欠損マウスにAAVベクターを用いてIL-10を体内発現させ、炎症制御による粥状硬化病変の進展予防効果と、IL-10による血清コレステロール値低下作用を証明した。2.ウイルス宿主細胞の培養において、通常の研究室で実施可能なガス交換システムを用いた大規模培養系を開発し、従来の作業効率を大きく改善した。3.ハンチンチン病モデルマウス線条体にAAVベクターを用いて標的分子に対するshRNAを導入し、発症した後でも凝集体を減少させ症状の悪化進行を遅延できる可能性を示唆した。4. AAVベクターのゲノムは標的細胞への感染後ただちに核内でピストン修飾され、ピストン脱アセチル化酵素阻害剤により、自殺遺伝子の発現と効果が増強されることを証明した。5. AAVベクター粗製物の精製において、新規強イオン交換膜を利用した中空粒子の回収および除去方法を開発した。6.間葉系幹細胞の腫瘍集積性を利用し、ベクター産生細胞に改変した腫瘍標的化細胞を構築した。これを用い、担癌動物モデルにおける腫瘍組織内での導入遺伝子増幅効果を確認した。炎症反応を起こしにくく、単回投与で長期間安定した発現が可能であるアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いて、各種脳神経疾患に対する遺伝子治療基盤技術の開発を行った。ラット初代培養細胞では2型AAVは神経細胞に、5型AAVは星状膠細胞でより高い遺伝子発現が認められた。スナネズミ海馬における遺伝子発現様式は血清型およびプロモーターにより著しく異なり、CMVプロモーターを搭載した2型AAVではCA1領域を中心に発現がみられたが、5型AVでは海馬全体に強い発現がみられた。一方、RSVプロモーターを搭載した2型AAVでは錐体細胞層に、5型AAVでは顆粒細胞層に強い発現が認められた。腫瘍細胞の系で、AAVベクターによる遺伝子導入においてヒストン脱アセチル化酵素阻害剤FR901228の遺伝子発現増強効果を検討した。EGFPを発現する各種血清型AAVベクターをFR901228と共に培養上清に添加し、経時的にFACSにてEGFP陽性細胞率、発現強度およびウイルス受容体の発現変化を測定した。U251MG細胞株では2型、9L細胞株では5型AAVベクターの発現が増強され、発現増強は受容体非特異的と思われた。遺伝子発現はFR901228の量に依存して増強したが、細胞内に取り込まれたベクターのコピー数への影響は少なく、受容体の発現増強効果も軽度であったことから、転写の段階で発現が増強されたと推察された。また、抗炎症性サイトカインであるIL-10をAAVベクター筋注法で動脈硬化疾患動物モデルに発現させ、その多面的作用を検討した。粥状硬化症モデルであるApoE欠損マウスでは、IL-10の体内発現により粥状硬化病変におけるMCP-1の発現が減弱し、動脈硬化面積が減少していた。この際、HMG-CoA還元酵素の産生制御によるコレステロール低下作用が示唆された。非病原性アデノ随伴ウイルス(AAV)に由来するベクターは頭蓋内での炎症反応も起こしにくく、神経組織や筋肉などにおいて単回の投与で長期間安定した発現が可能であることから、脳神経疾患モデルにおいてAAVベクターを用いた治療蛋白質発現の治療効果を検討してきた。今年度は、応用をめざした次の研究段階として各種血清型AAVの感染様式、分子標的薬剤を用いた遺伝子発現増強効果、発現制御システム、およびベクターの筋注による蛋白質補充療法の効果を検討した。1各種血清型AAVを利用した治療ベクター各種血清型AAV由来のベクターを用いて、内耳における遺伝子発現様式を検討した。さらに、神経栄養因子であるGDNFを発現するベクターを構築した。

これらの治療ベクターをラット蝸牛に注入し、アミノグリコシドによる内耳有毛の細胞死抑制効果と難聴予防効果を確認した。2ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を用いた遺伝子発現増強腫瘍細胞の系で確認された遺伝子発現増強効果をさらに解析し、薬剤投与の至適条件を検討した。また、Luciferase発現ベクターを用いて小動物の肝臓、前脛骨筋や皮下腫瘍に遺伝子導入を行い、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の投与による遺伝子治療発現増強効果を経時的に評価した。3変異rtTAを用いたtet-on遺伝子発現制御系変異rtTAを用いたtet-on遺伝子発現制御系をsiRNAの発現制御に応用する。THおよびGDNFの発現を制御するsiRNAの配列を選択し、これらをTet制御型H1プロモーター下に発現するベクターを構築した。Doxycycline投与に伴って制御されるsiRNAの効果を培養細胞の系で確認した。4抗炎症性サイトカインの体内発現による動脈硬化の治療脳卒中易発症高血圧ラット(SHR-SP)にIL-10発現ベクターを筋注し、持続的体内発現による治療効果を検討した。血圧、脳卒中スコア、炎症性サイトカインの発現、マクロファージの浸潤、および腎機能の改善効果を認め、IL-10発現AAVベクターを利用した炎症制御による脳卒中の発症予防効果を証明した。非病原性のアデノ随伴ウイルス(AAV)に由来するベクターは、頭蓋内での炎症反応も起こしにくく、神経組織や筋肉などにおいて、単回の投与で長期間安定した発現が可能である。本研究では、脳神経疾患への臨床応用をめざした次の研究段階として各種血清型AAVを用い、併用薬剤を用いた遺伝子発現増強効果、発現制御システム、およびベクターの筋注による蛋白質補充療法の効果を検討した。1ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を用いた遺伝子発現増強腫瘍細胞の系で確認された遺伝子発現増強効果をさらに詳細に解析し、薬剤投与の至適条件と作用機序を検討した。また、マウス皮下腫瘍モデルを用いてHSV-tk/GCV治療を行い、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤としてFK228を併用し、遺伝子発現増強効果と抗腫瘍効果の増強作用を証明した。2各種血清型AAVベクターと変異rtTAを用いたtet-on遺伝子発現制御系の検討AAVベクターを用いて、引き続き内耳における遺伝子発現様式と神経栄養因子を用いた治療効果を検討した。副反応への対策として、変異rtTAを用いた発現制御型GDNF発現ベクターを構築した。これらの治療ベクターをラット蝸牛に注入し、生体内での治療タンパク質発現制御と、アミノグリコシドによる内耳有毛の細胞死を抑制する効果を証明した。3抗炎症性サイトカインの体内発現による動脈硬化の治療脳卒中易発症高血圧ラットにIL-10発現ベクターを筋注し、持続的体内発現による治療効果を引き続き検討した。血圧、脳卒中スコア、炎症性サイトカインの発現、マクロファージの浸潤、および腎機能を経時的に測定し、遺伝的素因を有する高危険因子群における脳卒中の発症予防効果を考察した。
行列型電極刺激法による皮質線条体シナプスの学習機構の解明

われわれ含め動物は、常に変化する環境に適応するため、学習し記憶しながら生活している。特に、皮質線条体は学習に関わる脳部位であり、この皮質線条体シナプスにおける長期的なシナプス結合の変化(シナプス可塑性)が学習の神経機構であると考えられている。本研究の目的は、皮質線条体のシナプスにおいて、複数の入力を受けたときの情報選択機構と、報酬ドーパミンのタイミングに着目し、神経細胞の学習機構を実験上で再現することである。はじめに、電気生理学的手法でマウスの脳細胞記録を計測し、二組の異なる電気刺激からの入力に特異的なシナプス可塑性を計測した。二組とも長期抑圧(LTD)が起こったが、これは細胞が情報選択できないということではなく、入力のみ行った対照実験の結果、二組の入力の相互作用によるものであることがわかった。上記の成果は、アメリカの大脳基底核Gordon Research Conferenceにおいて、口頭及びポスターで発表した。続いて、光操作による報酬ドーパミンのタイミングと組み合わせたシナプス可塑性実験を行うため、以下三点の実験方法の整備を完了した。(1)光源を調整し(2)チャネルロドプシン(ChR2)の発現に関しては、ウイルス注入手術ではなく、ChR2を発現したマウスと、ドーパミン細胞に特異的に発現させるDAT-Creマウス、及び細胞種を特定するタンパクを発現したマウスを交配することにより、安定したChR2の発現を実現する方法を確立した。(3)また、ファストスキャンサイクリックボルタンメトリー法で脳スライス上のドーパミンレベルを計測し、光操作によるドーパミンの放出を確認した。この光操作と組み合わせた複数入力下のシナプス可塑性実験は、さらに実験が必要であり、現在遂行中である。一年目に計画していた実験方法の整備は完了したが、現在も、当初の一年目の計画である光操作とシナプス可塑性の組み合わせ実験を行っており、進捗は計画よりやや遅れている。しかしながら、(1)光操作に関しては、当初計画していたマウスへのウイルス注入手術ではなく、三種類のマウスを交配することにより、安定したChR2の発現及び細胞種の特定を実現する方法を確立したため、手術及び術後回復にかける時間を短縮することができる。また、(2)推進方策で後述するように、8組ではなく2組の電極を用いた実験をさらに発展させることにより、研究計画を遂行する。以上二点の変更により、総合的に今後の計画内容は遂行可能であると判断する。当初の研究計画では、最終的には計8組の電極を用いて多数の複数入力を再現する予定であったが、整備した行列型電極で記録を行ったところ、一細胞が受け取れる皮質入力の範囲には限界があり、同時に最大でも2-3組からの記録しか取れないことが判明した。そこで、2組の電極を用いた実験を、さらに踏み込んで別の条件・薬理的手法による比較検討をすることにより、複数入力からの情報選択機構とドーパミンの影響という当初の研究目的達成することを目指す。現在、ドーパミン光操作との組み合わせによる神経可塑性実験を進めているところである。

当初の研究計画では、最終的には計8組の電極を用いて多数の複数入力を再現する予定であったが、整備した行列型電極で記録を行ったところ、一細胞が受け取れる皮質入力の範囲には限界があり、同時に最大でも2-3組からの記録しか取れないことが判明した。そこで、2組の電極を用いた実験を、さらに踏み込んで別の条件・薬理的手法による比較検討をすることにより、複数入力からの情報選択機構とドーパミンの影響という当初の研究目的達成することを目指す。現在、ドーパミン光操作との組み合わせによる神経可塑性実験を進めているところである。
全身性疾患に関連する歯周組織の状態及び歯周ケアの個別要因に関する探索的研究

本研究は、歯周疾患や歯周ケアが全身性疾患に与える影響を検証するためのコホート研究の立ち上げに先立って、具体的な作業仮説を提示することを目的としている。調査対象集団は、協力の得られる事業所(従業員約4万人)の全従業員であり、対象者の歯周組織の状態や歯周ケアの状況を調査し、これらの要因が全身性疾患の危険因子、健康因子になりうるかを、既存のデータと新たに収集するデータを用いて検証する。本年度の主要な成果は以下のとおりである。(1)既存のデータから、歯周組織の状態、歯周ケアの状況、全身性疾患の罹患状況などを把握できた28,765人について、相互の関連を分析した。これら対象者のうち、397人(1.4%)に消化性潰瘍(胃潰瘍、十二指腸潰瘍)の罹患があった。交絡要因等を考慮した多変量ロジスティック解析の結果、消化性潰瘍罹患のオッズ比は、喪失歯数5本以上で1.41(95%信頼区間1.13-1.76)、歯周炎で1.28(1.03-1.59)、歯周病リスクスコア(1ポイント上昇ごと)で1.17(1.04-1.30)であった。これらの要因以外に、年齢、喫煙、糖尿病罹患、職業性ストレスが消化性潰瘍罹患と関連していた。歯周ケア(歯磨きの回数)と消化性潰瘍罹患について有意な関連は見られなかった。(2)当該事業所の従業員を対象に新たにデータを収集するための調査については、最近の急激な経済情勢悪化のため、当該事業所との調整の結果、次年度以降に延期することとなった。
先駆企業(Vanguard)におけるマーケティング活動とイノベイティブ組織

先駆企業(Vanguard)は、企業経営において、重要な方向と機能を示すものと思われる。先駆企業とは、変革的、発展的、というイメージで表現されるように、マネジメントおよび組織を絶えず変革しつつ、新規事業および新製品開発などのイノベーションを積極的に展開する企業として評価される。われわれはこのような先駆企業を、これらのイノベーションに対して積極的で、また経験十分なイノベータ企業として規定し、他のそれほどイノベーティブでない企業を不断にリードするプロアクティブ戦略型企業群として特徴づけている。こうしたタイプの企業は、現在進行しはじめている。'イノベーションの大波'の時代において、変化を常に先取りするポジションをキープし、過去の技術-市場の枠組みを大幅に変化させるだけでなく、これを脱脚した全く新しい技術-市場の枠組み形成を率先して実現していく企業群である。このような企業ないし企業群においては、当然、経営者、管理者のみならず一般従業員の能力発揮、自己実現のチャンスも多く与えられ、先駆企業に所属する人々の生活意識も、他の安定志向企業に比較して高い充実感と企業としての高い収益性が指摘される。以上の論点からまずわれわれは、概念レベルで、松下電器の「事業部制」トヨタ自動車の「生産管理システム」、ニッカウヰスキーの「製品政策」雪印乳業の「新規事業の展開」、さらに吉田工業の「経営者哲学」を事例として整理し、これらを統合した形態で、先駆企業のモデルを構築したいと考え、目下これを具体的に取りまとめつつある。またこのモデルの信頼性、妥当性について、さらに実証的研究を実施する。この研究実施について、両名はすでに具体的に計画しており、そのため、研究スケジュールを明治大学社会科学研究所研究費の助成を得て遂行する(平成元年4月3年3月まで)段取りになっている。以上先駆企業(Vanguard)は、企業経営において、重要な方向と機能を示すものと思われる。以上
ソノポレーション現象を応用した新たな肝癌治療の開発

造影超音波によるマイクロバブルのsonoporation(超音波穿孔)を応用した肝癌に対する抗癌剤の新たなdrug deliverysystemの開発を目的とした基礎研究をおこなった。In vitro解析では、培養肝癌細胞株の培養液中に超音波造影剤と蛍光色素を加えて、超音波照射後に蛍光顕微鏡観察をおこない、肝癌細胞内へのsonoporation効果による蛍光色素導入を確認した。In vivo解析では、培養膵癌細胞株皮下移植マウスやDEN誘発肝発癌マウスに造影超音波をおこない、sonoporation効果を解析するための至適条件を検討した。さらに、マウスに超音波造影剤と蛍光色素を投与後、自家蛍光内視鏡AFIを用いた蛍光腹腔鏡観察をおこない,超音波照射マウスにおいて肝臓内に蛍光色素が効果的に導入されていることを明らかにした。以上より、臨床用超音波診断装置や超音波造影剤を用いても肝臓においてsonoporation効果が認められ、肝癌に対する抗癌剤の新たなdrug deliverysystemの開発と臨床応用につながると考えられた。難治性進行肝癌に対しては抗癌剤による化学療法が行われているが、非腫瘍部への肝毒性の問題があり、標準的な治療法は未だ確立されておらず、新しい治療法の開発が急務である。近年、超音波の診断技術の進歩に伴い、侵襲性の少ない超音波の治療応用の試みがなされており、超音波照射によって細胞表面近くで気泡崩壊が起こると、細胞膜に一過性で可逆性の小孔が生じるsonoporation(超音波穿孔)という現象が報告され、さらに現在臨床で使用されている超音波造影剤のマイクロバブルの崩壊によってsonoporationの増強効果が認められることより、マイクロバブルによる新たなdrug deliverysystemが期待されている。そこで、超音波照射によるマイクロバブルのsonoporationを用いた、肝癌に対する抗癌剤の新たなdrug deliverysystemの開発を目的として研究をはじめた。平成18年度は、In vivo解析で、ラットに対して、抗癌剤とマイクロバブルの混合液を静脈投与後、超音波照射し、超音波照射部と非照射部における、肝組織内の抗癌剤濃度及ぴTunnel法によるアポトーシスを検討している。今後は肝癌自然発症モデルであるLEC (Long Evans Cinnamon)ラットの担癌ラットを用いて、抗癌剤とマイクロバブルの混合液を静脈投与後、超音波照射し、腫瘍内の抗癌剤濃度及び抗腫瘍効果を検討する予定である。そこで、超音波照射によるマイクロバブルのsonoporationを用いた、肝癌に対する抗癌剤の新たなdrug deliverysystemの開発を目的として研究を始めた。平成19年度は、培養癌細胞株皮下移植マウスを用い、至適超音波設定条件と超音波造影剤濃度を検討した。今後は肝癌自然発症モデルであるLEC(Long Evans Cinnamon)ラットの担癌ラットを用いて、抗癌剤とマイクロバブルの混合液を静脈投与後、超音波照射し、腫瘍内の抗癌剤濃度及び抗腫瘍効果を検討する予定である。難治性進行肝癌に対しては抗癌剤による化学療法がおこなわれているが、非腫瘍部への肝毒性の問題があり、標準的な治療法は未だ確立されておらず、新しい治療法の開発が急務である。近年、超音波の診断技術の進歩に伴い、侵襲性の少ない超音波の治療応用の試みがなされており、超音波照射によって細胞表面近くで気泡崩壊が起こると、細胞膜に一過性で可逆性の小孔が1生じるsonoporation(超音波穿孔)という現象が報告され、さらに現在臨床で使用されている超音波造影剤のマイクロバブルの崩壊によってsonoporationの増強効果が認められることより、マイクロバブルによる新たなdrug delively systemが期待されている。

そこで、超音波照射によるマイクロバブルのsonoporationを用いた、肝癌に対する抗癌剤の新たなdrug delively systemの開発を目的として研究をはじめた。これまでに、In vitro解析では、培養肝癌細胞株(HuH7等)を用い、培養液中に超音波造影剤(Sonazoid等)と蛍光色素(propidium iodide)を投与し、超音波を110秒照射し、sbnoporationの効率が良くなる至適条件(造影剤濃度や超音波照射条件など)を検討してきた。平成20年度は、In vivo解析として、培養膵癌細胞株皮下移植マウス、膵癌自然発症マウス、diethylnitrosmine(DEN)誘発肝発癌マウス等を用い、超音波造影剤を投与し、各腫瘍におけるsonoporation効果を検討するための、造影超音波による腫瘍血流イメージングの解析をおこなった。
ホヤ運動神経節におけるカルシウム振動と遊泳運動との関係解明

本研究では遊泳という広い生物種でみられる運動がどのように生じるかを神経発生学的に明らかにする。我々人を含む脊索動物門のモデル生物で、神経系の観察に適したカタユウレイボヤを用い、これまでの研究より遊泳の制御に関わると推察されるCa2+振動をする運動ニューロンについて、細胞系譜同定、振動を生じる機構の検証、交互な尾の運動に必要と考えられる抑制性介在ニューロンACINとの関係の検証などを通して、発生過程において神経系がどのように活動して、遊泳運動が可能となるのかを明らかにする。