hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨肉腫患者に使用したメソトレキセートの効果・副作用に影響する一塩基多型の検討

骨肉腫患者と健常人における葉酸代謝関連遺伝子であるRFC1とMTHFRの一塩基多型を検討し、日本人の骨肉腫患者ではRFC-1のallele80にAAを持つ群が有意に多いことを発見した。この一塩基多型が骨肉腫の発生に影響を及ぼす可能性が示唆された。また、メソトレキセートによる治療を受けた骨肉腫患者においてRFC1の一塩基多型とメソトレート投与後の肝機能障害、MTHFR allele677の一塩基多型と生命予後とに相関を認め、予後や副作用の予測に有用であると考えられた。当科で保存されていた骨肉腫患者93例のDNAに加え、患者群と性、年齢のマッチングを行った健常人ボランティア188例のDNAをコントロールとして使用した。PCR-RFLP法を用いてRFC 1 A80G,MTHFR C677T,MTHFR A1298CのSNPを検出した。Hardy-Weinberg平衡が保たれているかを検討したところ、MTHFR A1298Cについてはコントロール群で保たれていなかったため、この系でのSNPの検出に問題がある可能性があると判断し、今後の検討から除外した。骨肉腫患者におけるRFC1のSNP分布は健常人と比較して有意な差を認めたが、MTHFR C677Tについては差を認めなかった。これまでの結果から、日本人の骨肉腫患者ではRFC-1のposition80にallele AAを持つ群が有意に多いことから、RFC-1のこのSNPが骨肉腫の発生機序に何らかの影響を及ぼしていることが示唆された。骨肉腫の発生には様々な遺伝子の関与が報告されてきたが、SNPの報告はこれまでないため、骨肉腫の発生や進行に関する研究に新しい方向性を見いだせる可能性がある。今後、これらのSNPと臨床データ(メソトレキセート血中濃度、経時的な血液所見、組織学的効果判定、生命予後)との関連を調査し、RFC 1 A80G,MTHFR C677TのSNPによりメソトレキセートの臨床的な効果、副作用の予測が可能かを検討する予定である。MTXを用いたプロトコールで治療を受けた骨肉腫患者46人を対象にしてMTX投与後の血中濃度および副作用とSNPとの関連を検討した。また42人を対象に手術時の壊死率とSNPとの関速を検討した。肝機能障害grade3以上の出現頻度がRFC1の80alleleにAAを持つ群で有意に高かった(p=0.018)。MTX投与後の血中濃度、抗腫瘍効果とSNPの間に関連を認めなかった。肝機能障害はMTXの比較的多い副作用の一つであり、特定のSNPで肝機能障害の発生頻度が高かったことから、MTX投与時に肝機能障害の出現が予測しやすくなり、安全に投与するための指標となりえる。MTXを含むプロトコールで治療した骨肉腫患者46人における予後とSNPの関連について検討した。MTHFR677alleleにCCを持つ群で全生存率(p=0.0132)、無病生存率(p=0.0083)ともに有意に予後が悪い結果であった。RFCIついては予後の差を認めなかった。これまで骨肉腫の予後に関与するSNPの報告はなく、MTXを用いた治療における骨肉腫患者の予後を推測するのにMTHFR677alleleが有用である可能性が示唆された。RFCIは葉酸とMTXを細胞内へと輸送するトランスポーターで、この遺伝子のSNPが肝機能障害と関連を認めたことから、葉酸やMTXの細胞内への輸送が変化することにより肝障害が引き起こされる可能性が考えられた。またMTXは葉酸代謝阻害剤として抗腫瘍効果を発揮するため、葉酸代謝酵素であるMTHFRのSNPが予後と関連することも興味深い。MTHFRのallele677にCCを持つ腫瘍細胞では、MTXの効果が阻害する機序が働くのであれば、allele677を変更することで、効果を上げたり、耐性を回避したりすることができる可能性がある。今回の研究では術前化学療法後の組織学的効果とSNPとの関連には有意差を認めなかったが、これはMTX単剤でなく、シスプラチンやアドリアマイシンを併用した効果をみているからと考えられた。今後はこのSNPを治療前に検討することで、予後の悪い群のプロトコールを変更するなどのテーラーメイドへと応用が期待される。
現代女性の未婚・晩婚化とジェンダーのゆらぎに関する研究

男性同士の恋愛を描いたマンガや小説を愛好する女性たちがいる。恋愛における女性の存在を回避する彼女らは、自分の女性性や性役割について違和感を抱いているのではないか。腐女子を通して、現代の女性たちが感じている葛藤や抑圧を可視化することが本研究の目的である。20歳前後の女子大学生を対象に、好んで読む小説・マンガのジャンルによって3群に分け、ジェンダー・パーソナリティや性役割観について質問紙調査を行った。その結果、腐女子は伝統的な性役割を肯定する傾向が、腐女子でない女性よりも顕著に低かった。腐女子は、自身の女性性を受容している一方で、女性への通念的な性役割に対しては否定的であることが明らかとなった。いまや「クール・ジャパン」ともいわれ、国際的にも評価の高い日本のサブカルチャーであるが、そのひとつに、男性同士の恋愛を描く「ボーイズラブ(BL)」といわれるジャンルがある。特に、そのようなBL作品を愛好する女性たちは「腐女子(ふじょし)」とよばれ、そのありようへの関心が高まっている。しかし、腐女子は現代サブカルの一大ポピュレーションであるにもかかわらず、彼女たちの実態はあまり研究されてこなかった。最近になって、論考やエスノグラフィ調査、またテクスト分析などがいくつかあるものの、数量的データの収集による実証的な研究はまだなされていない。そこで本研究では、20歳前後の女子大学生を対象に、ジェンダー・パーソナリティと恋愛および母性観、共感性や他者意識、プライバシー志向性に関する質問紙調査をおこなった。対象者を、BLを好む「腐女子群」、恋愛ものを好む「恋愛群」、BLや恋愛もの以外のジャンルを好む「非恋愛群」に分類して分析をした。その結果、腐女子群は、自身のジェンダー・パーソナリティや共感性,他者への意識において、腐女子でない女性との違いはなかった。一方で、恋愛観については、恋愛ものを好む女性は恋愛を大切であり必要なもの、成長を促すものと考えている一方で、腐女子はあまりそう考えていないことが示唆された。さらに、腐女子は、社会的通念としての伝統的な母親役割を信じる傾向が、腐女子でない女性よりも顕著に低いことが明らかとなった。また、腐女子は恋愛ものを好む女性よりも、生活において個人の時間や趣味を重視していることが明らかとなった。本研究は、恋愛や性役割に対する考え方を通して、腐女子のジェンダー観を明らかにするとともに、これまで論考などで推察されるのみであった腐女子の心的傾向について、実証的なデータからの考察を可能にした。当初の計画にて予定していた質問紙尺度6種類が実施でき、かつその分析も順調に進んだ。現在はその結果をまとめた学術論文の執筆と、学会発表の準備を進めている。研究は順調に進展しているといえる。本研究で取り上げるBL(ボーイズラブの略称)を愛好する女性とは,男女ではなく男性同士の恋愛を描いた作品を好むいわゆる「腐女子」のことである。いまやBLや腐女子という用語や存在もある程度は認知されている一方で,腐女子に対する世間の反応は厳しいと腐女子自身が強く感じていたり,腐女子であることを後ろめたく思っていることが,彼女らのなかで話題となることは珍しくない。そこで本研究では,腐女子の自己認識と内的な規範を探るために,腐女子自身の腐女子に対する見解や腐女子が考える世間からの見られ方などが,どのような心理的背景によって構築されているのかということに焦点をあてて面接による調査を行った。(1)世間の腐女子に対する見解は厳しいものだと考える腐女子と,それほど厳しいものでもないと考える腐女子とで,それまでにBLや腐女子に対するネガティブな反応の経験の有無と,腐女子が考える腐女子に対する世間の見解の厳しさは概ね比例していた。また,腐女子だけでなく,BLに対するネガティブな反応の経験までもが「世間は腐女子を受け入れない」という考えにつながっていることが明らかになった。世間は腐女子を受け入れないと考える要因には,性的な話題であること,原作を改変する二次創作により著作権を侵害していること,趣味嗜好が一般とは異なっていること,という3つがあると考えられる。(2)腐女子に対し非常に否定的な考えを持つ群と,それほど否定的でない,もしくはポジティブな考えを持つ群が認められた。前者には,家族に腐女子だということを隠している,家族がオタクについて否定的など,家族が腐女子について許容的な雰囲気ではないケースが多かった。後者では,家族は腐女子であることを知っている,家族内に自分以外に腐女子がいるなど,家族が腐女子に許容的な雰囲気のケースが多く,いずれにおいても,家族の態度が強く影響していると考えられる。昨年度の質問紙調査の結果をもとに,より詳細な検討を行うための面接調査を実施できた。数的なデータによる実証研究だけでなく,個別のデータを活かした質的な研究をも行ったことで,研究課題へ多様なアプローチによる解明が可能になったといえる。研究結果の学会発表も複数おこない,研究だけでなくその結果の公表も順調に進展しているといえる。本研究では,男性同士の恋愛作品(BL)を愛好する女性たちが,異文化や他者への受容や同性愛に対する心理・行動的側面においてどのような特徴があるのかを質問紙調査を用いて検討した。<方法と手続き>女子大学生102名を対象とした。(1)異文化感受性発達尺度「受容」「行動適応」の2因子計20項目について7件法で回答を求めた。(2)ゲイ/レズビアンに対する態度尺度「心理的距離」「社会的認知」の2因子計15項目について4件法で回答を求めた。

(3)ふだんよく読む小説やマンガのジャンルについて回答を求めた。<結果と考察>BLをよく読む群(33名),恋愛作品を読まない群(33名),男女の恋愛作品を好む群(36名)の3群に分けて、ゲイとレズビアンに対する態度尺度の「心理的距離」について3要因分散分析を行ったところ,各群とゲイ/レズビアンに対する態度との交互作用が有意傾向となった。特に,恋愛群のレズビアンに対する心理的距離がゲイより有意に低いことがわかった。この結果から,男女の恋愛作品を愛好する人は恋愛における当事者意識が強いために,恋愛対象が同性である男性のみに向けられるゲイよりも,レズビアンから自身に恋愛感情を向けられるかもしれないという恐怖や不快感が心理的距離をとらせたと考えられる。一方で,「社会的認知」について各群およびゲイ/レズビアンの有意差はなかった。また,異文化感受性発達尺度の得点について2要因の分散分析を行ったところ,交互作用が有意となり,恋愛群・非恋愛群よりもBL群の方が異文化への受容性が高いことがわかった。腐女子自身は異性愛者である場合が多いにもかかわらず,同性愛者という自分と異なる価値観を持つ人々の物語を好んで読むことから,多様な価値観や考えについて接触する機会が多い。物語を通しておこる多様性への接触頻度の高さが,異文化に対する受容度を高めている一つの要因だと考えられる。男性同士の恋愛を描いたマンガや小説を愛好する女性たちがいる。恋愛における女性の存在を回避する彼女らは、自分の女性性や性役割について違和感を抱いているのではないか。腐女子を通して、現代の女性たちが感じている葛藤や抑圧を可視化することが本研究の目的である。20歳前後の女子大学生を対象に、好んで読む小説・マンガのジャンルによって3群に分け、ジェンダー・パーソナリティや性役割観について質問紙調査を行った。その結果、腐女子は伝統的な性役割を肯定する傾向が、腐女子でない女性よりも顕著に低かった。腐女子は、自身の女性性を受容している一方で、女性への通念的な性役割に対しては否定的であることが明らかとなった。平成27年度の調査結果をまとめて学術論文を執筆する。また、その成果を、学会で発表するための準備を進める。そして、前年度の調査によって明らかになったジェンダー観や性役割に基づいた潜在的な態度、偏見などについて、次の質問紙調査および分析を行う予定である。さらに、詳細な検討を行うためのエスノグラフィ調査を開始し、個別のケースについてデータの蓄積を進める。これまでの研究結果をまとめて学術論文を執筆する。また,その成果を学会で発表するための準備を進める。これまでの研究によって明らかになったジェンダー観や性役割観,自己認識や内的規範について,次の質問紙調査および分析をおこなう予定である。さらに,潜在的な偏見や多様性の受容に関する実験的検討も計画している。最終年度にあたるので,公開シンポジウム等での広く一般へ向けた成果公表も検討している。ジェンダー心理学当初の計画時に計上していた予算の執行が、初年度において低く押さえられているのは、予備的な分析という見地から現存の備品および人材を活用して研究を行ったためである。
In-vivo組織再構築による人工尿路臓器作成の試み

実験の概要現在腸管利用による尿路再建術が最も汎用されているが、その腸管上皮による粘液分泌また電解質吸収の欠点を有する。尿路の代用物としてより理想的なものを得るために種々の材料に尿路上皮を生着させる実験を行った。コラーゲンゲルを混じた3次元培養系において、膀胱のacellular matrix (BAM),手術に利用される吸収糸でできたVicryl mesh,および大網など尿路再建に利用可能な物質のうえに尿路上皮細胞を播種した。BAMおよびVicryl meshはよく上皮化できたが大網は最初上皮化できなかった。大網の表面を覆う中皮が尿路上皮細胞の生着を妨げていると思われた。培養系に脂肪細胞を混じて同じ生着実験を行い、同様な結果が得られたが、これに表皮成長因子を加えると上皮の重層化が観察された。したがって尿路代用物の上皮化には種々の因子が関与しているものと思われた。支持組織への尿路上皮生着の時間的要素を見るため、生着を培養皿への付着時間で検討すると、I時間内に尿路上皮細胞の約50%、6時間内に80%が培養皿に付着していた。大網をそのまま上皮化することができなかったため、大網を機械的もしくは化学的に処理した後、尿路上皮細胞を播種した。これら方法で大網を前処置することによって大網を上皮化することに成功した。科学的処理した後の大網上皮化実験では6-8層の良好な上皮化が得られた。今後、上記の上皮化した支持組織を生体内に植えて検討する予定である。平成12年度は、in vitroにおける各種器官の尿路上皮化作成の実験を行った。まず当初の予定通り、尿路上皮細胞の移植場所として各種器官の有用性を探る目的で、ブタの膀胱と尿管、小腸を摘出して、各々の臓器で粘膜上皮層を、機械的あるいは化学的に処理して剥離後、その小切片の上でブタから単離した移行上皮細胞を単層培養した。組織培養をした小切片を3日目、7日目にホルマリン固定をして、通常の組織学的検査を行った。結果として、予想していた移行上皮細胞が重層して極性配列を有してくる尿路上皮化現象は認められず、上皮細胞の生着が良好ではなかった。そこで予備実験として、通常の培養条件下でブタ膀胱移行上皮細胞の生着時間を検討した。移行上皮細胞を培養皿に播種後、生着率とその時間経過を調べた。結果は播種後1時間では約50%の生着率で、6時間を過ぎると安定して播種細胞数の80%が生着していた。また、組織切片上で尿路上皮細胞を膀胱粘膜に分化させることに成功していないので、粘膜固有層を人工的にin-vitroで再構築して、その上で尿路上皮細胞を培養した。ブタ膀胱と小腸を利用して、各々粘膜固有層から線維芽細胞を単離して、これをコラーゲンゲル内に包埋して、膀胱粘膜固有層と小腸粘膜固有層に見立てた。この上で尿路上皮細胞を単離培養し、培養後3日目、7日目で固定し、組織標本を作製した。ブタ膀胱からの線維芽細胞の採取は良好で、その粘膜固有層上の移行上皮細胞は尿路粘膜上皮化は培養7日目で完成した。しかし、小腸からの線維芽細胞の採取は不良であった。さらに、人工膀胱として、平滑筋層、粘膜固有層、粘膜層の三層配列を確立する目的で平滑筋細胞をコラーゲンゲルの中に包埋して、平滑筋細胞の有無による移行上皮細胞の尿路粘膜への分化に対する影響を調べている。いずれの培養条件も、まだ安定している結果が得られておらず、現在確立中である。

平成13年度は、in vitro上で人工膀胱を作成する実験を行った。尿路上皮細胞の移植場所どして各種器官の有用性を探る目的で、ブタの膀胱を摘出して、各々の臓器で粘膜上皮層を、機械的あるいは化学的に処理して剥離後、その小切片の上でブタから単離した移行上皮細胞を単層培養した。組織培養をした小切片を3日目、7日目にホルマリン固定をして、通常の組織学的検査を行った。結果として、予想していた移行上皮細胞が重層して極性配列を有してくる尿路上皮化現象は認められず、上皮細胞の生着が良好ではなかった。そこで予備実験として、通常の培養条件下でブタ膀胱移行上皮細胞の生着時間を検討した。移行上皮細胞を培養皿に播種後、生着率とその時間経過を調べた。結果は播種後1時間では約50%の生着率で、6時間を過ぎると安定して播種細胞数の80%が生着していた。また、組織切片上で尿路上皮細胞を膀胱粘膜に分化させることに成功していないので、粘膜固有層を人工的にin-vitroで再構築して、その上で尿路上皮細胞を培養した。ブタ膀胱と小腸を利用して、各々粘膜固有層から線維芽細胞を単離して、これをコラーゲンゲル内に包埋して、膀胱粘膜固有層と小腸粘膜固有層に見立てた。この上で尿路上皮細胞を単離培養し、培養後3日目、7日目で固定し、組織標本を作製した。ブタ膀胱からの線維芽細胞の採取は良好で、その粘膜固有層上の移行上皮細胞は尿路粘膜上皮化は培養7日目で完成した。しかし、小腸からの線維芽細胞の採取は不良であった。さらに、人工膀胱として、平滑筋層、粘膜固有層、粘膜層の三層配列を確立する目的で平滑筋細胞をコラーゲンゲルの中に包埋して、平滑筋細胞の有無による移行上皮細胞の尿路粘膜への分化に対する影響を調べている。いずれの培養条件も、まだ安定している結果が得られておらず、現在確立中である。【最終目標】本年度は研究の最終段階として、in vitro上で昨年度までに作成した人工膀胱をin vivoすなわち実験動物へ移植する実験を行った。【実験方法・経過】1.昨年度から引き続き、より生理的な平滑筋層、粘膜固有層、粘膜層の三層配列を有した人工膀胱を確立する目的で平滑筋細胞をコラーゲンゲルの中に包埋する実験を行ったが、平滑筋細胞の層培養は成功に至らなかった。そこで平滑筋層の替わりに脂肪層を用いることにして、成熟脂肪細胞をラットから分離培養してコラーゲン三次元再構築を行うと粘膜上皮細胞の分化がより良好となった。次にこの人工膀胱粘膜シートをラット膀胱に移植をこころみた。しかしこの人工膀胱は脆弱であり実用になりえないことが判明した。2.この脆弱性の問題を解決するためにラット膀胱を酵素処理で無細胞化(acellular matrix)し、これを「足場」とした人工膀胱シートを開発した。この足場に脂肪層、粘膜層を今までの方法同様に三次元的に再構築すると、今まで以上にtoughで分化したシートが形成された。移植方法は二つの方法で行った。1)人工膀胱シートを二つに折り大網内に移植する、2)人工膀胱シートで膀胱拡大術を行う。7日目14日目と経時的に代用膀胱の粘膜上皮の発育を組織学的に調べた。【結果】Recipient animalはヌードマウスを用いた方法は術後2-3日目に死亡したので、ラットに移植した。ラットに移植すると、尿瘻を認めないものは回復も良好であり、代用膀胱として機能したと考えられた。移植7日目で、組織学的検討を行うとは移行上皮層の発育が不良であった。これは移植時の操作により、粘膜上皮宗我剥離したためと考えられた。
レンチノロールを基にした分子間相互作用阻害剤の合理的デザイン

釣竿法を利用した標的タンパク質同定により生理活性物質レンチノロールの標的タンパク質S100タンパク質を決定した。本研究ではレンチノロールーS100タンパク質複合体の構造解析を行い、その構造情報を基にレンチノロールを分子設計して、標的タンパク質への特異性の向上を目指した。研究成果として、大量調整したS100タンパク質とレンチノロールの共結晶作製条件を見出した。複合体の構造解析によりレンチノロールの新たな薬効の発見が期待できる。本研究では、生理活性小分子化合物レンチノロールとアフィニティー精製により同定した3種類の標的タンパク質(S100A11、S100A13、S100A16)との複合体の三次元構造の決定を目指してきた。それぞれ3種の標的タンパク質は,大腸菌発現系を利用して大量調整した。タンパク質は,6Hisフュージョンタンパク質として発現しており,精製はニッケルカラムによるアフィニティー精製後,イオン交換クロマトグラフィー・ゲルろ過により行った。タンパク質の精製純度は,SDS-PAGE解析により95%以上であることを確認している。それらのリコンビナントタンパク質を利用してタンパク質結晶の作製を試みた。良質な共結晶を得るために、予めタンパク質結晶を作製後、レンチノロールをドープする方法を用いた。3種類の標的タンパク質はすべてX線結晶構造が明らかとなっているため、結晶化条件が分かっているが、報告通りの結晶化条件ではタンパク質結晶が得られなかった。そこで、これまでに報告のある条件に加え、1000種の結晶化剤(沈殿剤)から適切な結晶化条件のスクリーニングを行い、結晶形成初期に見られるタンパク質結晶のシードを得ることができた。今後、本結晶化条件をもとに最適な結晶化条件を見出し、良質のタンパク質結晶を作製する予定である。得られた共結晶を用いて最終目的であるレンチノロールー標的タンパク質複合体の共結晶の作製・X線立体構造解析を試みる。本研究目的は,生理活性物質レンチノロールと標的タンパク質S100タンパク質との複合体構造を解き,その構造情報を基に設計することで優れた生理活性を有する誘導体を作製することにあった.申請者はまず,X線結晶構造解析を行うために,光学活性中心を持つレンチノロールの光学異性体を作り分けた.本研究では,D-レンチノロール,L-レンチノロールのそれぞれを1g合成することに成功した.また,ヒスチジンのタグを持つS100タンパク質を大腸菌発現系により大量発現(40L分)し,ニッケルカラムによるアフィニティークロマトグラフィー・陽イオン交換クロマトグラフィー・ゲルろ過により純度95%以上に精製された200mgのS100タンパク質を調製した.得られたS100タンパク質とレンチノロールを混和することにより複合体を形成させた後,共結晶の作製を試みた.結晶化条件の検討は市販の結晶作製条件決定用のスクリーニング溶液(960種類)を利用した.スクリーニングの結果、いくつかの条件でタンパク質結晶のシードが観察された。今後、さらなる条件検討を行い共結晶の作製し,X線による結晶構造の解析を目指す。本年度は、X線結晶構造解析により、生理活性小分子化合物レンチノロールとアフィニティー精製により同定した3種類の標的タンパク質(S100A11、S100A13、S100A16)との複合体の構造決定を目指してきた。タンパク質結晶作製のための必要量の標的タンパク質を調製し、レンチノロールー標的タンパク質複合体の共結晶作製条件をスクリーニングした。しかしながら、結晶化条件のスクリーニング過程で共結晶作製には不都合な沈殿が生じてしまうことが明らかとなった。その理由として、共結晶作製中に標的タンパク質表面より遊離したレンチノロールが析出してしまうことが予想された。この問題を解決するために、現在、予めタンパク質結晶を作製後、レンチノロールをドープすることによる共結晶作製を試みている。3種類の標的タンパク質はすべてX線結晶構造が明らかとなっており、結晶化条件が分かっていることから、容易にタンパク質結晶が得られると考えられる。研究目的に利用している生理活性化合物のレンチノロールの水溶液溶解性が低いため、レンチノロールー標的タンパク質複合体の共結晶作製は極めて困難であった。しかしながら、タンパク質結晶を作製後、レンチノロールをドープすることによる共結晶作製法の選択が功を奏し、タンパク質結晶のシードを得るに至った。最終年度に目標を達成できる目処がたった。初年度では、研究目的に利用している生理活性化合物のレンチノロールの水溶液溶解性が低いため、通常のタンパク質結晶化条件で析出してしまうなど、レンチノロールー標的タンパク質複合体の共結晶作製に支障が出たが、タンパク質結晶を作製後、レンチノロールをドープすることによる共結晶作製を始動しており、初年度の研究進展に影響が出た問題の解決のための実験方針・手法が確立できている。本研究はタンパク質結晶構造解析の権威であるアメリカ・ヒューストンのQuiocho教授ラボと共同で研究を進めている。連携を取りながら効率的に研究を推進する。

3種類すべての標的タンパク質(S100A11, S100A13, S100A16)に対してタンパク質結晶化条件をスクリーニングした結果、S100A11, S100A13において良好な結晶シードが得られた。今後、これらの研究条件を最適化し、タンパク質結晶を作製後、レンチノロールをドープすることにより共結晶の作製を目指す。タンパク質結晶を作製後、レンチノロールをドープすることにより共結晶作製を試みている。3種類すべての標的タンパク質(S100A11, S100A13, S100A16)はX線結晶構造が明らかとなっており、その結晶化条件が分かっていることから、タンパク質結晶が容易に得られると考えられる。また、本研究はタンパク質結晶構造解析の権威であるアメリカ・ヒューストンのQuiocho教授ラボと共同で研究を進めており、連携を取りながら効率的に研究を推進する。タンパク質作製および精製に使用する試薬・器具類、タンパク質の結晶化に必要な試薬・器具類、およびレンチノロールの追加合成のために必要な試薬・器具類など、消耗品購入に利用する。
中央銀行のバランスシートの正常化に向けた国債管理に関する理論と実証分析

リーマン・ショック後,日本・米国および欧州の中央銀行で強化されてきた量的緩和政策・フォワード・ガイダンスは,想定していた程の効果を発揮しなかった.その後,日本銀行はマイナス金利政策,イールド・カーブ・コントロールの導入を進め,主として国債購入によるバランスシートの拡張を一貫して行なってきた.一方,米国連邦準備制度は2017年末から段階的にバランスシートの縮小を続けてきたが,景気後退の兆しが見え始めた2019年に入り,バランスシート規模の維持に政策転換を行なった.また,欧州中央銀行は2018年から資産買入れ額を段階的に減らし,資産買入れプログラムを終了させた.こうして拡大してきた中央銀行のバランスシートに関して,国債発行による財政赤字の中央銀行引き受けが金利上昇,インフレ高騰の副作用を起こすリスクはないとするModern Monetary Theory(MMT)が主張されるに到っている.MMTは,中央銀行が発行した準備を如何なる短期の政府債の購入に充てても,財政当局と中央銀行を統合した政府全体の資産構成に変化はなく,実体経済に及ぼす効果に違いはないとするWallaceのMM定理に基づく議論である.本研究は,MM定理が考慮していない現実的な側面をモデルに導入し,非伝統的金融政策からの出口後のニュー・ノーマルにおける新しい金融政策について理論的に明らかにした.具体的には,中央銀行が保有する国債を担保とするリバース・レポ取引の金利,銀行の超過準備への付利,それぞれを上限,下限とするコリドー型の金融政策を提言した.リーマン・ショック後,日本・米国および欧州の中央銀行で強化されてきた量的緩和政策・フォワード・ガイダンスは,想定していた程の効果を発揮しなかった.その後,日本銀行はマイナス金利政策,イールド・カーブ・コントロールの導入を進め,主として国債購入によるバランスシートの拡張を一貫して行なってきた.一方,米国連邦準備制度は2017年末から段階的にバランスシートの縮小を続けてきたが,景気後退の兆しが見え始めた2019年に入り,バランスシート規模の維持に政策転換を行なった.また,欧州中央銀行は2018年から資産買入れ額を段階的に減らし,資産買入れプログラムを終了させた.こうして拡大してきた中央銀行のバランスシートに関して,国債発行による財政赤字の中央銀行引き受けが金利上昇,インフレ高騰の副作用を起こすリスクはないとするModern Monetary Theory(MMT)が主張されるに到っている.MMTは,中央銀行が発行した準備を如何なる短期の政府債の購入に充てても,財政当局と中央銀行を統合した政府全体の資産構成に変化はなく,実体経済に及ぼす効果に違いはないとするWallaceのMM定理に基づく議論である.本研究は,MM定理が考慮していない現実的な側面をモデルに導入し,非伝統的金融政策からの出口後のニュー・ノーマルにおける新しい金融政策について理論的に明らかにした.具体的には,中央銀行が保有する国債を担保とするリバース・レポ取引の金利,銀行の超過準備への付利,それぞれを上限,下限とするコリドー型の金融政策を提言した.英文校正・ジャーナルへの投稿を行なわなかったため.
ダイナミック錯体の立体電子構造揺らぎの制御と機能創造

物質変換の過程と機能の発現は化合物の連続した"動的揺らぎ"によっておこり,化学物質の諸性質を制御するためにはその"連続した揺らぎ"を解明しなければならない。本企画研究により,幾何構造的/電子構造的に柔軟な化合物群に焦点をあて,その揺らぎの解明と制御に挑戦する研究グループを新たに構築した。本企画研究の全体会議および主要メンバーによる集まりを名古屋で持つとともに、関連する討論会(ヘテロ原子化学討論会、有機金属化学討論会、錯体化学討論会、有機化学反応討論会、等)での活動を通して、「動的錯体制御化学」の重要性と、今後の大いなる発展の可能性を確認した。その結果、「物質創造のための動的錯体制御化学」の13年度発足をめざした科学研究費補助金特定領域研究(A)を申請する運びとなった。この特定領域研究は「立体電子的に柔構造をとる化合物はいかに制御できるか?」を命題とし、物理有機化学と金属錯体化学の考え方を基本に据えつつ、従来の有機化学/無機化学の研究領域にまたがった新たな基礎研究分野となる、「動的錯体制御化学」の確立に挑む。その発展として、動的錯体制御にもとづく新規物質創造に資する新反応の開拓、複数の活性部位をもつ多中心反応場の設計と高度化、動きのともなった新型触媒反応場の創出とその制御、さらに、酵素機能を凌駕する動的錯体の創出などをめざす。これまでにない高度な化学機能を付与された複雑な分子性物質を新たに創造するためには、従来の有機/無機化学分野の垣根を取り払い,さらに高分子化学、生物有機化学、生物無機化学、触媒化学と密接な連携をとりながら広い領域から組織的に研究を行なうことが強く求められている。これが本特定領域研究において、柔軟で多様な動きを見せる高周期典型元素化合物や遷移金属化合物および有機金属化合物を主たる研究対象とした、新たな研究分野を推進する理由である。
お椀状π共役分子を用いた新規機能材料の開発

本研究はお椀状分子を用いてこれまで誰も開発に成功していない強誘電性カラムナー液晶の開発を大きな目標としていた。強誘電性カラムナー液晶はカラム1本1本がメモリーになるため超高密度メモリーへの応用が期待されている。また液晶であるがゆえに、溶液プロセスでのデバイス作成が可能となり製造コストを大きく下げることも期待できる。また無機系強誘電体と比べ、レアメタルを用いない点も魅力的である。当該年度においては、この目標を達成することに成功した。鍵となるコンセプトは、極性構造を安定化するための水素結合ネットワークのデザインである。これまで強誘電性カラムナー液晶が達成されて来なかったのは、液晶という動的な系において、極性構造を維持できなかったからである。双極子モーメントは打ち消し合いたがるからである。しかしながら、極性構造をただ安定化してやればいいというものでもない。なぜなら強誘電性とは、自発分極を保持し、かつその分極を電場によって反転することが出来なければならないからである。すなわち、極性構造を安定化させ過ぎると、今度は電場によって反転することが出来なくなる可能性があるからだ。実際に強誘電性を実現するために、水素結合の周りを少しずつ変化させた誘導体を多数合成し調べることで最終的に強誘電性の実現に至った。本年度はさらにその適用範囲を広げるため、ブロックコポリマーを利用した相分離構造を元に、極性構造の安定化を制御することを目指した。現在は、ブロックコポリマーを環状化することでその物性の変化を調べ、より小さな相分離構造を実現できることを明らかとした。お椀型のII共役分子を利用し、カラム軸方向に大きな自発分極を有するカラムナー液晶の創成を目指した。先行研究よりカラム間の分極の相互作用が、分極を打ち消し合うように強く働くことが懸念される。そこで、極性構造をより安定化させること(水素結合の導入)、カラム間の距離を大きくし極性を打ち消し合う力を弱めること(多数のアルキル鎖の導入)を期待した分子デザインを開発した。またお椀型構造は、扇状分子が集合することで超分子的に形成されるものを採用した。超分子的なお椀構造を利用することの利点としては、お椀構造の大きさ・深さ・極性の大きさ等を容易に調整することができることが挙げられる。そのようなコンセプトのもと合成した分子が、液晶相の発現と同時にカラム軸方向に自発分極が発現されることが明らかになり、世界で初めての例アメリカ化学会誌の速報に採択された。有機半導体としての応用が期待される、ディスコテイツクカラムナー液晶の配向を電場で自在に制御出来れば、応用的にも学術的にも極めて有用である。そこで、カラムの側鎖に極性基を導入することで、電場によって配向を制御できるディスコティックカラムナー液晶の開発を試みた。特に側鎖に導入することで、コアの分子に依存しない普遍的な分子デザインの開発を期待した。具体的には側鎖にベンゼン環と共役したアミド基を導入し、カラム軸方向に極性を保持するようにした。共役により水素結合の強さを弱め、得られる液晶ができるだけソフトになるように心がけた。そのような側鎖をトリフェニレン、オリゴチオフェン、テトラチアフルバレンなどのコアと組み合わせた。すると期待通りすべてのヘキサゴナルカラムナー液晶相を発現し、電場を印加すると電場の向きに平行になるようにカラムが配向した。さらに、電場を切ってもその配向が保持され、メモリー効果も確認された。これらの結果をまとめた論文を現在投稿中である。この水素結合を利用して極性構造を間接的に安定化させるというコンセプトはこれまでだれも提案・実現したことがなく、また強誘電性カラムナー液晶自体、20年以上提案され続けて来たものの誰も実現することが出来なかった。そのため、本研究成果はScience誌に採択された。また他にも水素結合を利用してディスコティックカラムナー液晶の配向を制御できる普遍的な分子デザインの開発にも成功し、その成果がAngewandte Chemie International Editionに採択された。

本研究はお椀状分子を用いてこれまで誰も開発に成功していない強誘電性カラムナー液晶の開発を大きな目標としていた。強誘電性カラムナー液晶はカラム1本1本がメモリーになるため超高密度メモリーへの応用が期待されている。また液晶であるがゆえに、溶液プロセスでのデバイス作成が可能となり製造コストを大きく下げることも期待できる。また無機系強誘電体と比べ、レアメタルを用いない点も魅力的である。当該年度においては、この目標を達成することに成功した。鍵となるコンセプトは、極性構造を安定化するための水素結合ネットワークのデザインである。これまで強誘電性カラムナー液晶が達成されて来なかったのは、液晶という動的な系において、極性構造を維持できなかったからである。双極子モーメントは打ち消し合いたがるからである。しかしながら、極性構造をただ安定化してやればいいというものでもない。なぜなら強誘電性とは、自発分極を保持し、かつその分極を電場によって反転することが出来なければならないからである。すなわち、極性構造を安定化させ過ぎると、今度は電場によって反転することが出来なくなる可能性があるからだ。実際に強誘電性を実現するために、水素結合の周りを少しずつ変化させた誘導体を多数合成し調べることで最終的に強誘電性の実現に至った。本年度はさらにその適用範囲を広げるため、ブロックコポリマーを利用した相分離構造を元に、極性構造の安定化を制御することを目指した。現在は、ブロックコポリマーを環状化することでその物性の変化を調べ、より小さな相分離構造を実現できることを明らかとした。当初の目的である、強誘電性カラムナー液晶の開発に世界で初めて成功した。研究提案段階とは用いている分子が異なるが、お椀状であることにはかわらず、コンセプトは維持されている。用いる分子を変えたのは、得られた実験結果を鑑みた結果、新しい分子の方が目的に適していると判断したからであり、ポジティブな変更と捉えている。開発に成功した強誘電性カラムナー液晶は、超高密度メモリーなどへの応用が期待される。そのためには現状より極性反転のスピードを早く、作動温度をより低く改良する必要がある。これらは、どちらも分子間の相互作用を下げてやることによって達成できると考えられ、アルキル鎖等を増やした分子の開発に取り組んでいる。
承認プロセスを視野に海外ネットワークを活用するバイオベンチャーの創薬支援の模索

研究代表者は2018年度は引き続きバイオベンチャーの支援を行った。特に高知大学発の新しいがん治療法の臨床試験の支援を行った。第1相臨床試験は2018年夏に無事に終了し、現在最も重要である第2相臨床試験の計画を行なっている。2018年度もこれまでに引き続き英国がん研究所と交渉を行なった。2019年2月にはロンドンで最終的な打ち合わせを行なった。日本のバイオベンチャーの海外ネットワーク構築を支援するためのトレーニングプログラムの開発を行うプロジェクトにも大きく関わり、2018年12月と2019年2月には有望と見なされる企業との打ち合わせを行ない、製薬企業との連携の可能性を探った。このプロジェクトでは、日本の経済産業省などの官公庁や国立研究開発法人日本医療研究開発機構のような公的機関との連携も進めている。2018年7月にはモンゴルを訪問し、同国における臨床試験実施の可能性を探り、保険制度との調整のための調査を実施した。研究成果としては、2本の論文があり、共に成果の臨床的応用を軸にした論文である。研究代表者は、2015年度は、海外ネットワークによる貢献の可能性が最も高いバイオベンチャーにつながる研究成果の特定を行い、この研究成果の支援を行った。具体的には、東京大学医科学研究所の清野宏氏と幸義和氏による肺炎球菌のワクチン開発に対して、海外ネットワークを構築する支援を行った。支援の形態は多岐に渡るが、特に海外の研究所との連携の可能性を探った。実際の支援活動として、米国ニューヨークでForrest氏と臨床試験に関する打ち合わせ(2015年5月、2016年1月)、ワシントン州のゲイツ財団支援下のPATH研究所訪問(2015年5月)、カリフォルニア州スタンフォード大学のBlaschke氏のラボ訪問(2015年7月)、シカゴでアラバマ大学のBriles氏と打ち合わせ(2015年7月)、英国リバプール熱帯医学研究所訪問(2015年11月)、カリフォルニア州サンフランシスコのバイオベンチャー企業訪問(2016年1月)、同州サンディエゴのバイオ製品ラボ訪問(2016年1月)などを行った。バイオベンチャー支援の最も重要な論点は経済支援であり、このために知的財産権の面でのサポートが重要である。代表者は清野氏、幸氏、Briles氏と共同で、特許の申請の準備を進めている。また、投資候補者と数十回に渡る打ち合わせを行った。資金調達と知的財産は密接な関係にあり、現時点では特許申請段階にあるため、資金調達も確定には至っていない。2015年度は、海外ネットワークによる貢献の可能性が最も高いバイオベンチャーにつながる研究成果の特定を行い、この研究成果の支援を行った。東京大学医科学研究所の清野宏氏と幸義和氏による肺炎球菌のワクチン開発に対して、海外ネットワークを構築する支援を行った。特に海外の研究所との連携の可能性を探るために、米国ニューヨークでForrest氏と臨床試験に関する打ち合わせ(2015年5月、2016年1月)、ワシントン州のゲイツ財団支援下のPATH研究所訪問(2015年5月)、カリフォルニア州スタンフォード大学のBlaschke氏のラボ訪問(2015年7月)、シカゴでアラバマ大学のBriles氏と打ち合わせ(2015年7月)、英国リバプール熱帯医学研究所訪問(2015年11月)、カリフォルニア州サンフランシスコのバイオベンチャー企業訪問(2016年1月)、同州サンディエゴのバイオ製品ラボ訪問(2016年1月)などを行った。このうち、臨床試験に関する進捗は、Forrest氏との打ち合わせとリバプール熱帯医学研究所との打ち合わせを通して、順調に進んでいる。資金調達に関してもほぼ順調に進んでいるが、確定してはいない。前述したように、資金調達と知的財産は密接な関係にあり、現時点では特許申請段階にあるため、資金調達が確定していないのは、想定内である。研究代表者は、2016年度は、大学発のバイオベンチャーの支援を行った。具体的には、東京大学医科学研究所の清野宏氏と幸義和氏による経鼻粘膜を通して投与する肺炎球菌のワクチンの開発を行うバイオベンチャーを立ち上げるために特許の申請を行い、海外ネットワークの構築、資金の調達のための支援を行った。2016年4月にアラバマ大学バーミンガム校Briles氏を訪問し、共同研究ならびにライセンスに関する打ち合わせを行った。10月にはワシントン州シアトルのInfectious Disease Research Institute (IDRI)のReed所長を訪問し、経鼻投与システムを他の疾病に対するワクチンの用いる可能性を探った。12月にはベンチャーキャピタルの支援を受け、実際に企業を立ち上げた。該当該当肺炎球菌ワクチンの中で一緒に使用される三つの抗原がマウスを肺炎球菌感染から保護することを示しました。私はこれらの抗原を主張する特許を書いてました。この特許出願は、十二月に米国特許庁に提出された。研究代表者は、この他に、高知大学のがん治療に用いる放射線の効果を増幅させる薬物投与の開発を行うバイオベンチャーの立ち上げに関わった。臨床試験を視野に入れ、英国の大学とのネットワークを構築するための支援を行った。2017年1月には、米国サンフランシスコで行われた国際会議に参加し、上記2社をはじめとするバイオベンチャーやその過程にある研究成果の海外ネットワークを構築するための支援を行った。2017年2月には、韓国ソウルで行われた国際会議に参加し、東京大学医科研におけるコメ型コレラワクチンや肺炎球菌の経鼻ワクチンの開発に貢献する海外ネットワーク構築を行った。ワクチン抗原を作製するプロセスは高価である。予算上の制約の下で製造に関するの問題を解決する必要がある。

しかし、国際的な共同研究や臨床試験の計画は継続しています。他のプロジェクトは計画通り進めています。研究代表者は、2017年度は2016年度に引き続き、大学発のバイオベンチャーの支援を行った。具体的に支援したバイオベンチャーは以下の2つケースである。1)東京大学医科学研究所の清野宏氏と幸清和氏による経鼻粘膜を通して投与する肺炎球菌ワクチンの開発を行うバイオベンチャーの国際展開を支援した。2)高知大学のがん治療に用いる放射線の効果を増幅させる薬物投与の開発を行うバイオベンチャーの臨床試験の支援を英国におけるネットワークを通じて支援した。この2企業のために、2018年1月に米国サンフランシスコで行われた国際会議に参加し、海外パートナーの候補を模索し、海外ネットワーク構築を支援した。3)日本発のバイオベンチャーの可能性としてセカンドオピニオンに関する医療サービスを提供する可能性を模索した。2017年10月には、ワシントンDC郊外の国立衛生研究所を訪問し、臨床試験における優先課題に関する情報を得、日本発のバイオベンチャーが米国において臨床試験に行う際の論点に関しての意見を交換した。バイオベンチャーが真の意味で成功するか否かは数年のスパンでは判断することができず、科研費のプロジェクトしては成功していると言える。研究代表者は2018年度は引き続きバイオベンチャーの支援を行った。特に高知大学発の新しいがん治療法の臨床試験の支援を行った。第1相臨床試験は2018年夏に無事に終了し、現在最も重要である第2相臨床試験の計画を行なっている。2018年度もこれまでに引き続き英国がん研究所と交渉を行なった。2019年2月にはロンドンで最終的な打ち合わせを行なった。日本のバイオベンチャーの海外ネットワーク構築を支援するためのトレーニングプログラムの開発を行うプロジェクトにも大きく関わり、2018年12月と2019年2月には有望と見なされる企業との打ち合わせを行ない、製薬企業との連携の可能性を探った。このプロジェクトでは、日本の経済産業省などの官公庁や国立研究開発法人日本医療研究開発機構のような公的機関との連携も進めている。2018年7月にはモンゴルを訪問し、同国における臨床試験実施の可能性を探り、保険制度との調整のための調査を実施した。研究成果としては、2本の論文があり、共に成果の臨床的応用を軸にした論文である。代表者は清野氏、幸氏、Briles氏と共同で、特許の申請の準備を進めている。申請の内容はほぼ固められているが、現在この出願に必要なデータを採集している段階であり、今後はこれを提出し、承認を待つことになる。知的財産による保護の見通しがついた段階で、会社を設立し、同時進行で資金調達を進める。特許の所有者は、東京大学及びアラバマ大学になるので、設立した会社にライセンス供与をすることになる。このような計画が進むことで、日本の大学からの研究成果を商業化するために、海外の研究所とのネットワークを構築することが有効であることを示す。
流体波動系における高次元カオスと乱流遷移の解明

本研究では、ポアズイユ流等のせん断流や外力を受けた水面波動の乱流・カオス状態への遷移を、幾何学的理論(カオス理論)、数値解析及び実験の各面から研究、比較検討した。前年構成したフーリエ・チェビシェフ展開による2次元流体方程式の数値シミュレーションのスペクトル法コードを用いて大型計算機により数値解析し、平面ボアズイユ流の乱流状態への分岐過程を、レイノルズ数と基本波数を変化させて調べた。詳細なカオス状態への分岐構造が得られた。弱非線形理論のモデルとなるStewartson-Stewart方程式の散逸項のない非線形シュレディンガー方程式のホモクリニック構造を詳細に調べ、周期外力によりホモクリニックカオスが現れる事が示された。また、256X256の乱流データから、渦度の分布が粘性効果の大きい壁付近では正規分布、全領域で指数分布であることが分かった。前年製作済みの水面波加振装置と、購入済みの可視化機材、画像処理ボード及び購入した画像処理ソフト(Cライブラリー)を用いて、パラメータ励起された水面波上の浮遊粒子の複雑な運動のデータを取り込み処理し、ブラウン運動との比較を行った。加振振幅をあるしきい値より上げると粒子の運動が活発になる事がわかった。作成済みの回転乱流装置内の多数の小泡の運動から、乱流場の速度分布を画像解析により計測し、乱流場中の速度分布の統計データを得た。速度場はガウス分布に、速度勾配は指数分布に近いことが確認された。
出芽酵母におけるGPIアンカータンパク質の品質管理機構に関する研究

出芽酵母においてGPIアンカータンパク質の小胞体からの輸送に重要な役割を果たす、セラミドの小胞輸送機構について解析を行った。その結果、セラミドもGPIアンカータンパク質同様にGap1pやalphafactorとは違う分泌小胞によって輸送されていることを明らかにした。さらにこの選別輸送はv-SNAREであるBos1pの変異株を用いることによって、破綻することが明らかとなった。昨年度、新規遺伝子PER1がGPIアンカー型タンパク質の脂質リモデリングに関与し、この破壊株ではGPIアンカー型タンパク質が脂質ラフトに濃縮されなくなることを明らかにしている。この経路において、出芽酵母GPIアンカーはさらにリモデリングされ、脂質部分がジアシルグリセロールからセラミドへ変換されることが知られている。この反応に直接関与する遺伝子としてCWH43を明らかにした。またミスフォールドモデルGPIアンカー型タンパク質Gas1^*pは小胞体関連分解を受ける際に、付加的にO-結合型マンノースが転移され、この付加的な反応がGas1^*pのプロテアソームでの分解に重要であることが明らかとなった。さらに動物細胞よりGPIアンカー型タンパク質の輸送に関与する変異株のスクリーニングを行い、GPIアンカー型タンパク質の輸送が特異的に遅延する変異株を単離した。この変異株より原因遺伝子の発現クローニングを行った結果、新規遺伝子を取得した。変異株はGPIアンカーの生合成およびタンパク質への転移は正常であるが、GPIアンカー型タンパク質が小胞体に蓄積しており、小胞体からゴルジ体への輸送が特異的に遅延していることが明らかとなった。今年度はグリコシルフォスファチジルイノシトール(GPI)アンカー型タンパク質の品質管理機構に重要な役割をしているBST1遺伝子(Fujita et al.(2006)Mol.Biol.Cell)をもとに出芽酵母において遺伝的相互作用の系統樹を用いて、新規遺伝子PER1を発見し、解析を行った。解析の結果、この遺伝子産物はGPIアンカー型タンパク質の脂質部分の改変(脂質リモデリング)に必要な新規な反応を行っていることがわかった。さらに、この脂質リモデリングにおいてGPIアンカー部分のsn-2と呼ばれる部分の脂肪酸を切断する酵素活性があることを突き止めた。通常、GPIアンカー型タンパク質は脂質ラフトと呼ばれる膜ドメインに濃縮され、機能を制御されることが明らかとなっているが、PER1遺伝子を破壊した細胞ではラフトへの濃縮が起こらなくなった。さらにPER1のヒトホモログ遺伝子PERLD1を酵母で発現させたところ、PER1破壊株の表現型を相補し、PER1の機能ホモログであることが明らかとなった。また大阪大学の木下研究室との共同研究を行い、PERLD1遺伝子は哺乳動物細胞においてもGPIアンカー型タンパク質の脂質リモデリングに必要であり、脂質ラフトへの濃縮に必須であることが明らかになった。これらの結果はFujitae et al.(2006)Mol.Biol.CellおよびMaeda et al.(2007)Mol.Biol.Cellとして報告した。今年度の9月30日よりGPIアンカー型タンパク質の生合成と輸送の分野において著名な研究者であるスイス連邦・ジュネーブ大学のHoward Riezman教授のもとに留学しており、GPIアンカー型タンパク質の安定性と輸送に非常に重要な役割をしているセラミドの輸送とGPIアンカー型タンパク質の関連について研究を行っている。
セルソーターを用いたクラミドモナス変異株の選抜系の開発

本研究の目的は,単細胞緑藻クラミドモナスの栄養欠乏ストレス順化能変異株を,セルソーターを用いて選抜する方法を開発することである。クラミドモナスは,リン酸欠乏条件下に置かれると,細胞表層にアルカリフォスファターゼを誘導する。木研究では,抗クラミドモナスアルカリフォスファターゼ抗体を作成し,細胞表層のフォスファターゼの有無を蛍光抗体法により標識することにより,リン酸栄養欠乏条件下でフォスファターゼの分泌の有無をセルソーターを利用して判別し,分泌誘導変異株を選抜するという系の開発を目標とした。なお,系の開発は,実験計画書に記載した通り,この系の他,硫酸欠乏によるアリルサルファターゼ誘導系,低CO_2によるカーボニックアンヒドラーゼの誘導系の利用も考慮した。まず,直ちに入手できる状態にある抗カーボニックアンヒドラーゼ抗体(楊らによりポリクロナール抗体として作成済み)を入手して調べたところ,この抗体は,特異怯が低く,実用にならないことか判明した。本研究室ではフォスファターゼ誘導能を欠くリン酸欠乏順化能変異株をすでに有しているため,これを対照実験や材料として使えるメリットがある。そこで研究対象をリン酸欠乏によるアルカリフォスファターゼ誘導系に絞ることにした。まず,抗体作成のため,リン酸欠乏ストレスをかけてアルカリフォスファターゼを誘導させたクラミドモナスより,この酵素を大量調製した。予想以上の収量を上げることに成功したので,当初予定したモノクロナール抗体ではなく,より安価に行えるポリクロナール抗体をウサギで委託作成した。得られた抗クラミドモナスアルカリフォスファターゼ抗体を一次抗体,FITC結合抗ウサギIgG抗体を二次抗体として,実際にクラミドモナスが蛍光抗体染色可能であることを蛍光顕微鏡で確認した。現在,セルソーターによる抗体標識細胞の選抜条件の検討を行っている。