hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
重粒子線治療における低エネルギー光子を用いた体内照射深度モニタリング手法の開発

照射イオンの体内到達深さのリアルタイムモニターは治療の信頼性の向上に繋がる重要な技術である。本研究では、発生量の大きな低エネルギー光子により到達深さの推定が可能となる技術の開発を目指す。研究代表者は、まず、粒子線入射時に発生する低エネルギー領域の放射線についてのモンテカルロシミュレーションを実施し、照射体から放出される粒子として二次電子制動輻射が支配的であることを示した。この結果を基にリアルタイムモニター装置を検討した上で実験を実施し、装置の構成要素であるシンチレーション結晶の厚さの最適化により、散乱光子によるバックグラウンド事象を削減することが手法の実現に不可欠であることを示した。照射イオンの体内深部位置のリアルタイムモニター技術は、照射位置のずれを治療中に修正することを可能とし、治療の信頼性を向上する。しかし、従来の陽電子消滅ガンマ線測定によるモニター手法はガンマ線の発生量が少なくリアルタイムモニターとしての利用は困難であった。そこで本研究では、発生量の大きな低エネルギー光子を測定することにより飛程位置の推定が可能となる技術を開発し、リアルタイムモニターの実現を目指す。平成25年度に粒子線入射時に発生する低エネルギー領域の放射線の種類、エネルギー、放出量等を正確に把握するための検討を、シミュレーション及び実験的手法を用いて行い、平成26年度にリアルタイムモニター装置のプロトタイプ機の設計及び性能試験を行う計画である。平成25年度はシミュレーションスタディを進展させた。シミュレーション空間に水ファントムを設置して、コリメータ及び位置敏感型検出器を配置した状態で、粒子線(炭素線及び陽子線)入射に付随して放出される光子の発生機構をついて詳しく調べた。その結果、低エネルギーの二次電子の発生が低エネルギー光子の発生量に大きく影響していることが分かった。しかし、二次電子発生に付随する光子を精度よくシミュレーションするには計算時間が当初の予測より大幅に長くなることが判明した。これに対応するため、現在用いている計算機よりも大幅に高速な大型計算機を利用したシミュレーションの準備を進めている。照射イオンの体内到達深さのリアルタイムモニターは、照射中にその深さを検知することで、治療の信頼性の向上につながる。しかし、従来の陽電子消滅ガンマ線による手法はガンマ線発生量が極端に少なく、リアルタイムでのモニターは困難であった。本研究では、発生量の大きな低エネルギー光子(約65 keV)により到達深さの推定が可能となる技術の開発を目指す。前年度は、粒子線入射時に発生する低エネルギー領域の放射線の種類、エネルギー、放出量等を正確に把握できるシミュレーション環境を構築した。今年度は、まず、上記の環境を用いて実際にシミュレーションを実施し、イオン照射時に検出器に到達する粒子が、二次電子制動輻射を主成分とする光子及び中性子であり、それ以外の粒子は無視できることを示した。さらに、この結果を基に、ピンホールコリメータと位置敏感型のシンチレーション検出器とを組み合わせた光子検出による到達深さリアルタイムモニター装置を設計、試作し、実際に試験を実施した。その結果、観測光子数に深さ方向の依存性が現れず、現状の試作機での到達深さのモニターが困難であることがわかった。この現象をシミュレーションするためには莫大な計算量が必要となるため、大型計算機を用いて計算を実施した。その結果、装置の構成要素のシンチレーション結晶で生じる散乱光子によるバックグラウンド事象内に、制動輻射の信号が埋もれてしまい、到達深さ決定精度が悪化していることが分かった。そこで、再度結晶の材質及び形状の最適化を目的としたシミュレーションを実施した結果、結晶部分を厚さ1 mm程度のガドリニウムアルミニウムガリウムガーネット結晶に交換することで到達深さを精度よく計測可能となる装置を制作可能であることを示し、これによって本研究の目的をほぼ達成できることを示した。放射線検出技術実験の実行に必要なシミュレーションスタディと、これに伴う実験機材の設計、製作準備が若干遅れている。まず、モンテカルロシミュレーションを原子力機構の大型計算機で実施し計算時間を大幅に短縮する。これにより、低エネルギー光子スペクトル及び発生強度の位置依存性を精度良く計算した上で、この結果を基に照射実験の実験セットアップを決定し、実験を遂行する。これらシミュレーション及び実験による考察で、低エネルギー領域の放射線の種類、エネルギー、放出量等を正確に把握し、最終年度である26年度にリアルタイムモニター装置のプロトタイプ機の設計及び性能評価を行うことで、本研究の目標を達成する。シミュレーションスタディに十分に時間を掛ける必要があり、これにより、物品等の購入を次年度に繰越す必要が生じた。今年度予定していた実験機材の購入に使用する。
宗祇の両吟連歌作品におけるコミュニケーション概念の基礎構築

本年度は、昨年度に収集・分析した宗祇が一座する五つの両吟連歌作品(両吟とは、二人で詠む連歌のこと)をもう一度読み直し、両吟独自の特性を考えることが目標である。最初に、それらに一座した連衆(参加者)の経歴を調査した。一座する宗祇の相手は、以下の五名である。(1)堀江賢重(文明4年10月6日賦山何連歌)、(2)紀元盛(文明6年1月5日賦何木連歌)、(3)宗伊(文明14年2月5日賦何路連歌)、(4)宗長(長享2年1月1日賦何木連歌)、(5)宗元(長享3年5月11日賦何路連歌)。まず、(3)宗伊は年の近い先輩連歌師で、(4)宗長は弟子に当たる。(1)賢重は遠江国の国人、(2)元盛は地下歌人。(5)宗元は未詳であるが、宗祇の山口来訪中に巻かれた作品であるから、山口在住の僧侶であろう。次に、連衆の知識の程度をはかるため、踏まえられている古典的典拠を調査した。五作品中に引用されたのは、古今集、源氏物語、伊勢物語等、当時の基本的な文学的素養に含まれるものばかりであった。一方、句の表現においては、見慣れない語句を用いた句、及び奇矯な表現は見られず、正統的な正風連歌といってよい。これらの特徴から、以下の点が推論できる。まず、内容面からは、両吟連歌は、不特定多数への公開を前提にした作品ではないだろう。公開し、世間に自らの作品の質を問うことが前提であれば、より新鮮で、意欲的な句作りがなされたはずである。作品が、古典的なありふれた表現により構築されている点は、当座性に重点がおかれていたことを示している。これは連衆からも裏付けられる。(1)・(5)のような地方在住の好士は、来訪した宗祇を歓待し、学問の先達として尊敬の意を込めて連歌の一座を依頼したのだろう。また、(3)・(4)のような連歌師は、互いの実力を高め合う訓練のための作品を結びたかったのではないか。(2)も歌人という経歴から、恐らくは練習のためと推測される。宗祇の両吟連歌は、特に連衆同士の交誼を深めることに役割を大きく果たした文学形式であった。本年度は、まず宗祇の両吟作品の収集を開始した。『連歌総目録』により、両吟作品の五作品の現存が知られる。いずれも原本・マイクロフィルムによる閲覧が可能であり、5月には収集が完了した。6月以降は各作品の基本的な分析作業に入った。連歌新式に照らしてその適合の度合いを調査すると同時に、先行用例の和歌・連歌をふまえ句意を確認した。現存五作品のうち、「湯山両吟」と通称される、宗祇とその師匠・兄弟子である宗伊による連歌を中心に据え、他の四作品との差異を考察した。「湯山両吟」には宗祇の自注が付されており、作句意図を探る手がかりになる。「湯山両吟」の前半は穏当な進行だが、後半に入ってすぐ、三折表の五四句「夜寒の宿のいねがての空」(宗祗)は問題のある句である。それは打越(二句前)の五二句「幾夕露の野を枯らすらむ」(宗祗)にも含まれる時分の素材(「夜寒」)を詠んでいるからである。連歌新式では、時分の素材は二句の間隔が再使用の条件となっている。この場合、五三句と五四句では時分を詠んではならない。宗祗と宗伊が交代に句を詠じていく作品の特性上、五二句・五四句とも宗祗の句であるが、宗祗は何故このような明確な違反を犯す必要があったのか。この疑問を出発点として、同時期の百韻一五作品との比較を通して、宗祗が宗伊に「月」を詠ませるためにあえて違反を犯した、という結論に至った。「月」は連歌にとって最も重要な景物である。「月」を詠むことは名誉に類する。宗祗は複雑なルール(連歌新式)の適用による困難な状況の中で、「月」を師匠である宗伊に譲るために、自らは違反を犯す汚れ役を買って出たのである。一つの連歌作品を詳細に分析し、作品論として構成する論文は、既存の研究では試みられなかった。私は上記の論を「湯山両吟論-連歌作品論の試み-」と題して、2007年11月に口頭発表する機会を得た。現在それを基に論文を執筆中である(近日中に雑誌「国語国文」に投稿予定)。(1)堀江賢

重(文明4年10月6日賦山何連歌)、(2)紀元盛(文明6年1月5日賦何木連歌)、(3)宗伊(文明14年2月5日賦何路連歌)、(4)宗長(長享2年1月1日賦何木連歌)、(5)宗元(長享3年5月11日賦何路連歌)。まず、(3)宗伊は年の近い先輩連歌師で、(4)宗長は弟子に当たる。(1)賢重は遠江国の国人、(2)元盛は地下歌人。(5)宗元は未詳であるが、宗祇の山口来訪中に巻かれた作品であるから、山口在住の僧侶であろう。次に、連衆の知識の程度をはかるため、踏まえられている古典的典拠を調査した。五作品中に引用されたのは、古今集、源氏物語、伊勢物語等、当時の基本的な文学的素養に含まれるものばかりであった。一方、句の表現においては、見慣れない語句を用いた句、及び奇矯な表現は見られず、正統的な正風連歌といってよい。これらの特徴から、以下の点が推論できる。まず、内容面からは、両吟連歌は、不特定多数への公開を前提にした作品ではないだろう。公開し、世間に自らの作品の質を問うことが前提であれば、より新鮮で、意欲的な句作りがなされたはずである。作品が、古典的なありふれた表現により構築されている点は、当座性に重点がおかれていたことを示している。これは連衆からも裏付けられる。(1)・(5)のような地方在住の好士は、来訪した宗祇を歓待し、学問の先達として尊敬の意を込めて連歌の一座を依頼したのだろう。また、(3)・(4)のような連歌師は、互いの実力を高め合う訓練のための作品を結びたかったのではないか。(2)も歌人という経歴から、恐らくは練習のためと推測される。宗祇の両吟連歌は、特に連衆同士の交誼を深めることに役割を大きく果たした文学形式であった。
超急速熱処理における非接触温度測定と不純物の短時間活性化に関する研究

熱プラズマジェット(TPJ)照射中のシリコンウエハ表面温度を非接触測定しつつヒ素(As)およびホウ素(B)の活性化と極浅接合形成を試みた。Bは処理温度の上昇とともに活性化率は上昇し、1400K以上で低いシート抵抗値に飽和するのに対して、Asは1000K程度の低温でも高効率活性化し、処理温度だけでなく高い加熱・冷却速度が重要な処理条件であることが明らかになった。接合深さ11.9nm、シート抵抗1095Ωの極浅接合の形成に成功した。IT社会を支える超々大規模集積回路(ULSI)の構成素子である金属-酸化膜-半導体電界効果トランジスタ(MOSFET)、あるいはディスプレイの駆動素子である薄膜トランジスタ(TFT)の高性能化を実現するため、ミリ秒時間の超急速熱処理(URTA)技術を用いて不純物活性化をおこなう技術が精力的に研究されている。本研究ではミリ秒時間分解能を有する非接触温度測定技術を開発し、不純物拡散制御やURTAプロセスのその場モニタリングへの適用を目的とする。本年度の研究成果として、1.波長1.51μmのレーザー光を用いることでSiウエハの非接触温度測定が可能であることを世界で初めて実証した。2.ミリ秒URTA中のSiウエハ表面温度を理想的には±1Kの精度で測定可能であることを明らかにし、本研究の非接触温度測定技術が極めて高精度であることが分かった。3.URTAにより高ドープアモルファスSiを固相結晶化することによって、熱平衡固溶限を超えるキャリア密度を達成可能であり、高効率不純物活性化に有効であることを実証した。4.前記不純物活性化技術をTFT作製工程へ適用したところ電界効果移動度67cm^2V^<-1>S^<-1>の優れた電気特性が得られ、半導体素子作製工程へ導入可能であることを実証した。以上の成果により、本研究の非接触温度測定技術が将来の産業応用に対しても極めて高い可能性を有していることが明らかになった。2年目である来年度は測定温度精度の検証と、不純物活性化に重要な熱処理条件の明確化に取り組む。本年度はミリ秒時間分解非接触温度測定技術を駆使し、熱プラズマジェット照射時のSiウエハ表面温度を精密制御しつつ不純物を高効率に活性化することを目的として研究を推進した。従来の熱プラズマジェットのパワー密度はガラス等の加熱には十分であるものの、熱伝導率が2桁も大きいSiウエハ表面を十分に加熱するには更なる高パワー化が不可欠であることが明らかになった。以下に研究成果を列記する。・DCアーク放電をおこなう陽極-陰極間ギャップ(ES)を従来の1mmから3mmへと拡大すると、ジュール加熱により熱プラズマの温度が15000Kから23000Kへと上昇し、これによって熱処理時のパワー密度を3倍の33kW/cm^2へと格段に増加できることが明らかになった。・この結果、従来200K程度しか加熱できなかったSiウエハ表面を600K以上昇温可能となり、熱プラズマジェットをSiウエハの不純物活性化に適用可能となった。この高パワー密度熱プラズマジェットを用いて極浅接合形成実験を実施した結果、・Asをイオン注入したSiウエハをミリ秒熱処理したところ、到達温度1000K以上で低シート抵抗を達成する高効率不純物活性化に成功した。・Asクラスターイオン注入した試料を熱処理し、接合深さ11.9nm、シート抵抗1095Ωの極浅接合形成に成功した。・Bクラスターイオン注入した試料でも、接合深さ21.8nm、シート抵抗392Ωを達成した本年度は、AsおよびBのクラスターイオンを注入したシリコンウエハ表面へ熱プラズマジェット照射ミリ秒熱処理をおこない、処理温度だけでなく、加熱・冷却の速度が不純物活性化に与える影響について詳細な実験的検討を行った。その結果、以下のことが明らかになった。・Asは1000K以上で高効率活性化するのに対して、Bで同等の活性化率を得るためには1400K以上の熱処理温度が必要である・B注入試料は1400Kまでの処理温度の上昇に伴って単調にシート抵抗が低下するのに対して、As注入試料は1000K以上の処理温度であってもシート抵抗値に大きなばらつきが生じる・As注入試料のシート抵抗がばらつく理由を明らかにするために、1000K前後の処理温度で加熱冷却速度を0.3から1.0X10^5K/sに増加させる実験をおこなった。その結果、シート抵抗は3400Ωから250Ωへと大幅に低減可能であることが明らかになった。すなわち、処理温度だけでなく、高い急速加熱・冷却速度がAs活性化における重要なパラメータであることが明らかになった。

・熱プラズマジェットを高密度化することによって、従来のミリ秒からマイクロ秒へと熱処理時間を短くすることによって、注入不純物(As)のクラスタリングの抑制と活性化率向上の可能性があることを実験的に明らかにした以上、急速熱処理による不純物活性化において重要な熱処理条件に関して、実験的事実に基づく知見を得ることができた。
サンドイッチ型N-アルキル金属ポルフィリンの集積化と光誘起電子移動

生体系における電子伝達系では電子供与体(ドナー)と電子受容体(アクセプター)とが互いに相手を立体化学的に認識しながら有効な電子移動が行われていると考えられる。本研究ではπ電子系の電子移動反応ではドナーとアクセプターの軌道の位相が一致しない配向ではたとえ近距離でも電子移動反応速度が遅くなるという考えに基づいて、N-アルキルポルフィリンの面上に電子授受可能な置換基を垂直方向に配列させた複合体を用いて光電子移動反応速度を制御するモデル系の構築を目指した。また、この考えを生体系に適用するためヘム蛋白質に金属錯体を集積させた複合体の構築も試みた。(1)ビオローゲンが結合したN-アルキルポルフィリンおよび二量体とその金属錯体を合成し、それらの蛍光挙動および光誘起電子移動反応を検討した。その結果、ポルフィリンおよび金属ポルフィリン励起一重項および三重項はともにビオローゲンにより電子移動消光を受けるが、金属イオンの有効電荷が大きくなるにつれて蛍光強度が増加し、蛍光寿命が長くなることがわかった。これは、金属イオンの挿入によりビオローゲンがポルフィリンに対して立ち上がるようになり電子供与体であるポルフィリン面と電子受容体であるビオローゲン平面がより垂直配向をとるようになり、電子移動反応速度が減少するためであると考えられる。(2)サンドイッチ型金属ポルフィリンを構築し、その蛍光特性を検討した。また、ビオローゲンで架橋したN-アルキルポルフィリンニ量体のサンドイッチ型金属ポルフィリンを合成した。(3)金属キレート試薬としてジエチレントリアミン五酢酸イオン(DTPA)を蛋白質表面に存在するリシン残基に化学修飾したミオグロビン(metMb(DTPA)_n)を構築し、そのキレート部分にCo(III)イオンを導入することを試みた。組成の確認はMALDI-TOF MSとFeおよびCoの原子吸光分析により行った。
光による細胞機能制御による新規細胞療法の開発

本研究は細胞内の分子機能・細胞内環境を制御する新しいシステムを構築し、「移植細胞の保存時の生存能の維持と向上」、そして「移植後の細胞生存率の向上と機能維持」を目指すことを目的とした。細胞内分子機能を制御するために、光感受性タンパク質を利用して、機能制御を行うべくデザインしたプローブを作製した。これをもちいて細胞内分子の活性化制御を試みた結果、光による細胞内分子の活性化制御に成功し、さらに外的ストレスに対する細胞傷害抑制効果を確認することができた。本研究成果は今後新しい疾患治療技術として、細胞移植などの分野おいて重要な役割を果たすことが期待される。本年度は、細胞生存に重要なAkt分子の機能を光により制御するためのプローブのデザインと作製および細胞レベルでの機能解析、および同分子機能を細胞内でモニタリングするためのプローブのデザインと作製を主に進めた。1. Akt分子機能の制御プローブは、植物由来の青色光感受性タンパク質を利用してデザインし、作製した。これは、プローブ導入細胞に青色光を当てることにより、光感受性蛋白質の特性を利用して目的分子を活性化させる仕組みである。プローブ作製後、細胞内にこれらプローブを発現させて、実際にAkt分子が活性化されるかどうかを検討した。プローブ導入細胞に光刺激したところ、細胞内のプローブタンパクは、確かに光依存性の局在変化を示し(蛍光タグよる観察)、また、光によって外因性Akt自身のリン酸化(活性化)を確認することができた。さらに、この活性化は、光刺激の条件により活性の程度、持続時間等が変化する可能性が示された。また、本プローブは同時に2つのプローブをバランスよく導入する必要があるが、両者を同等に細胞に導入する方法については課題が挙げられる。2. Akt分子機能を細胞内でモニタリングするためのプローブ開発も行った。このプローブは、我々が独自に開発した分割ルシフェラーゼ再構成を利用した技術を基盤として設計し、作製した。初年度は、プロトタイプの作製に成功した。これを細胞内に導入し発現させた後にAkt活性化刺激に対するプローブの反応を検討した。細胞実験では、刺激に対する十分な反応性と特異性が得られなかったため、プローブのデザイン段階に戻り、構造の再検討を行っている。初年度は、光生物学の知識・技術を医学研究に応用し、細胞内分子機能・環境を制御しするためのプローブ作製に関する基礎技術の研究開発を行い、細胞実験によりそれらプローブの機能評価を行った。本研究は移植細胞内の分子機能・細胞内環境を制御し、「移植細胞保存時の生存能の維持と向上」、「移植後の細胞生存率の向上と機能維持」を目指すものである。本年度は、昨年度から引き続き細胞生存に重要なAkt分子をターゲットとして設定し、Akt分子制御およびモニタリングプローブそれぞれの感受性・特異性の向上を試み、さらに細胞内での機能性も検討した。1.Akt分子機能の制御プローブ:植物由来の青色光感受性タンパク質を利用してデザイン・作製され、青色光照射により分子機能を活性化させる仕組みである。本プローブは同時に2つのプローブをバランスよく導入する必要があり、これらを同等に細胞に導入する方法が昨年度からの課題となっていた。この課題を解決するために、両プローブが共に細胞内で発現する安定発現細胞株の作製を試みた。まずプローブの耐性遺伝子を変更する必要があり、異なったベクターへ遺伝子の入れ替えを行った。これを用いて安定発現株候補の細胞株(肝細胞株)を複数作製した。候補細胞株をもちいて、各プローブの導入状態および、青色光刺激によるAktの活性化を検討し、もっとも反応性のよい細胞株を選出した。さらにこの細胞株による検討で、光刺激の時間と強度がAkt活性化に大きく影響することが判明した。2.Akt分子機能を細胞内でモニタリングするためのプローブ:初年度作製したプロトタイププローブは刺激に対する反応性が不十分であった。そのため、プローブのデザイン段階に立ち戻り、再検討を行った。DNA断片結合部位のスペーサーの調整、プローブの細胞膜への親和性向上のための修飾などの改良を加え、細胞ライセートをもちいたワンポイントアッセイにおいてプローブの活性化をある程度検出することができた。しかし、刺激直後に誘導されるAkt活性化を、生きた細胞に導入したプローブで検出するための解析方法に課題が残された。本年度は昨年度から引き続きプローブの完成を目指した検討と細胞内でのプローブの機能性確認のための解析を進められ、研究の確実な進捗と成果が得られた。各プローブ共に昨年度の研究結果により、その構造などに改良が必要であることが課題とされていたが、それぞれ考察を元に、まず細胞への遺伝子導入方法の再検討と(それに伴う)プローブの改良を進めた。この検討により、バランス良い遺伝子導入が可能となり、細胞内にて期待したプローブ機能を得ることが可能となった。改変したプローブの導入により再検討を行った結果、昨年度考察されたプローブの活性化条件をさらに詳細に検討することができた。これらの成果を元に、次年度、さらに詳細な細胞内シグナルの解析および細胞傷害性に対する検討へ段階を進めることが可能となった。他方プローブについても、前述のとおり、構造(デザイン)の再検討を行い、細胞レベルでの機能解析まで段階を進めることができた。この段階で、生細胞内で本プローブの活性化を確認するための解析方法を再検討する必要が生じた。これは、プローブ自体の非特異的な反応が、ターゲット分子の活性化シグナルと重なっている可能性が一因であると考えている。

当初の計画では想定していなかった問題ではあるが、プローブの構造と機能性を解析するために解決が必須なステップである、新たな課題として次年度以降追加して検討を進める。以上の理由から、本年度の研究の進捗状況はおおむね計画通り進展していると評価した。本研究は移植細胞内の分子機能・細胞内環境を制御することで「移植細胞保存時の生存能の維持と向上」、「移植後の細胞生存率の向上と機能維持」を目指すものである。最終年度である本年度は、主に「細胞生存に重要なAkt分子の機能を光により制御するためのプローブ」の細胞内における生理機能への影響の検討、および同分子機能を「モニタリングするためのプローブ」の条件検討を進めた。1.Akt分子機能の制御プローブ:前年度までに本プローブの基本的な機能検討・細胞への導入方法改善の検討を行い、候補として残った本プローブの安定発現細胞株を作出した。同細胞株におけるプローブを青色光照射し、外的ストレスに曝した際の生理状態を検討した。細胞を軽度の栄養飢餓培地および酸化的ストレス刺激状態でそれぞれ培養したところ、青色光非照射群では継時的に細胞傷害が引き起こされたが、光照射群ではその傷害は抑制された。またこの傷害抑制効果は、青色光の照射条件が影響することもわかった。同細胞株の細胞内分子シグナルについても、青色光照射後、確かにAkt下流分子が活性化していることが確認できた。2.Akt分子機能をモニタリングするためのプローブ:これまで本プローブのデザイン・作製、改良を進めた結果、生きた細胞内でプローブシグナルを検知する方法が課題となっていた。これを解決するためにいくつかの方法を検討し、生細胞のまま、刺激直後のシグナル比較的効率良く検出する方法を見出した。また、プローブ評価の結果、各デザインによりプローブ活性化度合が異なることも明らかとなった。今後さらに感度の高いプローブを検討する必要がある。本研究では、細胞内の分子機能を光で制御し、それをモニタリングすることが可能な一連のプローブを開発・検討し、その機能性評価を遂行することができた。この研究成果は光をもちいた新たな細胞療法への足掛かりになると考えられる。本研究は細胞内の分子機能・細胞内環境を制御する新しいシステムを構築し、「移植細胞の保存時の生存能の維持と向上」、そして「移植後の細胞生存率の向上と機能維持」を目指すことを目的とした。細胞内分子機能を制御するために、光感受性タンパク質を利用して、機能制御を行うべくデザインしたプローブを作製した。これをもちいて細胞内分子の活性化制御を試みた結果、光による細胞内分子の活性化制御に成功し、さらに外的ストレスに対する細胞傷害抑制効果を確認することができた。本研究成果は今後新しい疾患治療技術として、細胞移植などの分野おいて重要な役割を果たすことが期待される。本年度は、研究の目的に挙げた計画に対しておおむね基づいて研究を進めることができた。本研究の主軸となる各種プローブの作製に関しては、計画した構造(デザイン)を基にして、いくつかのタイプを本年度内に作製することができた。
イギリス自然神学詩の研究

本年度は、自然神学詩や18世紀の詩およびロマン主義詩全般によく見られる「呼びかけ」(Vocative)について研究をした。詩においては通例、呼びかけの語(Vocative)は、呼びかける対象物を出現せしめる。ところが、ロマン派の詩においては、かならずしも対象物を出現せしめるだけではない。ロマン派を代表する(1)Wordsworth,"There wasa Boy"、(2)Shelley,"Ode to the West Wind"、(3)Keats,"Ode on a Grecian Urn"、(4)Lord Byron,"The Colosseumepisode"from the Canto IV of Childe Harold's Pilgrimageのなかに現れる(広義の)詩人の自画像と解される詩行を見ると、それらがそれぞれの詩人独自の詩論の特徴を反映しながらも、全体として、共通するロマン主義的特質を表していることがわかる。その特徴とは、呼びかけの語によって対象物が顕れると同時に、そこに呼びかける主体または詩人が理想とする自画像もまた顕れてくるということである。これは、18世紀詩からロマン主義の詩へ変化してゆく際の非常に重量な特徴である。ロマン派における自我意識の拡大を如実に反映しているからである。これが、4年間におよぶ自然神学詩をはじめとした18世紀詩からロマン主義の詩へ移行する家庭をたどった本研究の結論である。平成14年度は、18世紀の代表的な自然神学詩James Thomson, The Seasonsを精読した。通常、この作品の定本とされているのは、作者Thomson生存中の最後の版本である1746年版なのだが、ThomsonのパトロンであるLyttelton男爵が編集した死後出版の版本の幾つかにおいては、大幅な改筆がなされ、またはなされようとしていて、それらの箇所は、おおむね汎神論的要素が濃厚にでている部分であることが判明した。また、Joseph Warton, William WordsworthらのThomson評価を精読し、彼らは、もっぱら叙景詩としてのThe Seasonsを評価、もっと突っ込んで言えば、ロマン主義的要素の先駆けとしての評価を下していることが判明した。また、学術誌『学燈』に「イギリス自然神学詩について」と題した小論を寄せ、「自然神学詩」を「詩人が、創造主により創造された全宇宙を総覧し、そのなかの秩序や調和、また背後の創造の御業を讃える詩」と定義した。しかしこのように定義した場合、18世紀詩の殆どがその範疇に入ってしまいそうだが、それには、以下のような限界を設けた。すなわち、William Cowper, The Task (1785)などは、自然描写から宗教的瞑想へと進んでゆく部分よりは、はるかに清新な自然描写の方が優れていて、時にその自然描写には、神の束縛から自由になった喜びさえ感じられる、という点に鑑み、自然神学詩とは見なさない。これらの研究で、かねがね出版予定であった『地誌から抒情へ-ロマン主義の淵源をたどる』(明星大学出版)の刊行に向けてさらに一歩前進したことになる。平成15年度はかねがね出版予定であった『地誌から叙情へ』を刊行した。笠原は本書全体の企画・編集と、序章、第4・5章の執筆を行なった。扱った詩人・作品は章ごとに以下の通りである。序章(笠原執筆)/ジョン・デナム『クーパーの丘』(2章)/アレグザンダー・ポープ『ウィンザーの森』(3章)ジェイムズ・トムソン『四季』(4章、笠原執筆)/ジョン・ダイアー『ローマの廃墟』(5章、笠原執筆)/トマス・グレイ「田舎の墓地で詠んだ挽歌」(6章)/ジェイムズ・ビーティ『吟遊詩人』(7章)/ウィリアム・クーパー『課題』(8章)/ウィリアム・L・ボールズ『十四のソネット』(9章)/シャーロット・スミス『ビーチー岬』(10章)/叙情する風景(11章)/ワーズワスと自然科学(12章)/想像の風景(13章)/エイブラムズとイギリス・ロマン派の叙情詩の系譜(14章)

第一部は、ジョンソン博士が地誌詩の嚆矢として位置づけたデナム、ポープをはじめ18世紀前半のトムソンを取り上げ、第一義的に政治詩・農耕詩・自然神学詩である作品において、地誌的テーマが芽生えてくる跡を検証する。第二部は、18世紀中期のダイアーとグレイにおける地誌的テーマに関連して、そこから叙情性が生じてくる過程を見る。第三部は、18世紀から19世紀にかけてのビーティ、クーパー、ボールズ、スミスの作品のなかに、叙情的要素がロマン的自我として結晶化してゆく跡を追う。批評の部と称する第四部は、盛期ロマン派の作品に適宜言及しつつ、地誌的テーマから叙情性が生じてくる過程や関連テーマを扱った20世紀後半の主要論文を概観する。盛期ロマン派に至って、風景が内面化する、または逆に言えば、自我意識が外界と融合することになるのだが、そのことが孕む諸問題(とりわけ言語上の問題)を多角的に考察していくことになる。昨年度は『地誌から叙情へ』を刊行したのに引き続き、本年度は、その改訂をおこなった。具体的にはページ割は変えずに誤記の訂正をほどこした。かつて申請者はバイロンにおける廃墟の取り扱いを論じたときに、バイロンにおける地誌的要素について触れたことがある。本年度は、このテーマの延長として、バイロン『コリントの包囲』に注をつけ、翻訳をした。この作品は、コリントという実在の地名と、そこに繰り広げられた歴史上の実話をもとにしつつ、そこに、虚構として恋物語をかぶせたもので、実話の上に虚構をのせるその方法は、上記の地誌から叙情へというテーマと軌を一にすることは論をまたないが、本研究のテーマである自然神学詩の変貌を見るうえで大変参考になった。以下、簡潔に梗概を示す。ヴェネチア支配下のコリントに対し、オスマントルコ軍が攻撃をしかける場面から始まる。ここまでは史実である。その後につづくAlpとFrancescaの恋が虚構である。そのトルコ軍の先鋒を務めるのが、背教者Alp。彼は嘗て、とある乙女を恋するも、その父親の反対で結ばれず、以後、祖国と十字を棄て、新月旗を掲げて復讐を挑まんと、今コリント包囲の陣頭に立っている。そして、奇しくも嘗てのAlpの恋人Francescaの父Minottiがコリント市総督兼防衛軍大将として、攻め来るオスマン軍を迎え撃とうとしている。攻撃を明日に控えた満月の夜、Alpは一人、海辺の陣営を出て、過去のこと、現在のことどもに思いを馳せる。浜は、風もなく静か。Alpは、野犬が戦死者の残骸を食い荒らしている様、禿鷹が軍馬の死骸を啄ばんでいる様などを見ながら、廃墟となった神殿に来る。その列柱の基石に腰をおろしているところへFrancescaの亡霊が登場し、Alpに改悛をせまる。なお、本研究は、何れ出版予定のバイロン作・笠原順路訳『バイロン詩集』(岩波文庫)に採録予定である。本年度は、自然神学詩や18世紀の詩およびロマン主義詩全般によく見られる「呼びかけ」(Vocative)について研究をした。詩においては通例、呼びかけの語(Vocative)は、呼びかける対象物を出現せしめる。
多臓器ＤＮＡマイクロアレイデータの相関分析による低体温症における臓器間関連検索

法医診断に有用な低体温症マーカーの検出を目的として、マウス低体温症モデルを導入し、肝臓、肺のトランスクリプトーム解析をDNAマイクロアレイを用いて行い、候補遺伝子を抽出するとともに、発現機序の考察を行った。さらに平成24、25年度に施行した副腎、心臓、腎臓のDNAマイクロアレイデータを加え、副腎、心臓、腎臓、肝臓、肺の大容量遺伝子発現データを対応分析し、低体温症における臓器間の関連を考察した。[目的・方法]低体温症バイオマーカーの検索と同定、診断法の構築を目的として、低体温症例について左心室心筋、肝臓、肺の網羅的遺伝子発現解析を行った。具体的にはマウス低体温症モデルを導入し、左心室心筋、肝臓、肺のトランスクリプトーム解析をDNA microarray法を用いて行った。また左心室心筋に関しては、定量PCR法を用いて遺伝子発現の再現性確認を行った。[結果]心臓)有意差を持って発現変動していた遺伝子は3438個であり、1704個は有意に発現が上昇しており、1734個は有意に発現が減少していた。具体的には、最も発現が上昇していた遺伝子はgranzyme Aで、最も発現が減少していた遺伝子はsolute carrierfamily 41, member 3であった。さらに遺伝子セット解析を行ったところ、有意に変動している遺伝子セットが79個が確認され、57個は有意に発現が上昇しており、22個は有意に発現が減少していた。またgranzyme A関連のパスウエイが低体温症の発症に関与していることが示唆された。Gene functional category analysisにおいては、発現上昇遺伝子、発現減少遺伝子とも最も発現していたカテゴリーはbiological processにおいてはcellular process、molecular functionにおいてはbinding、cellular componentにおいてはcell、cell partであった。肝臓、肺)DNA microarray実験を行い、データは回収した。具体的なデータ解析を遂行中である。[目的・方法]低体温症バイオマーカーの検索と同定、診断法の構築、全身反応の解析を目的とする。具体的には低体温症例について諸臓器の網羅的遺伝子発現解析を行い、各臓器ごとに低体温症マーカーを抽出する。また各臓器の網羅的遺伝子発現データを相関分析で統合することにより、低体温症における諸臓器の関連を解析し、低体温症の全身反応を明らかにする。これまでにマウス低体温症モデルを導入し、左心室心筋、腎臓、肝臓、肺臓のトランスクリプトーム解析をDNAmicroarray法を用いて行った。また左心室心筋に関しては定量PCR法を用いて遺伝子発現の再現性確認を行うと共に、免疫染色を施行し鑑定法の構築を試みた。[結果]左心室心筋では有意差を持って発現変動していた遺伝子は3438個であり、1704個は有意に発現が上昇しており、1734個は有意に発現が減少していた。免疫染色ではgranzyme Aの弱陽性像を認めた。腎臓、肝臓、肺臓に関してはDNA microarrayデータ解析は、ほぼ完了しており、定量PCR法を用いた遺伝子発現の再現性確認を行っている。低体温症における副腎のDNA microarrayデータは本研究課題施行前に得られており、これと本研究により得られる心臓、腎臓、肝臓、肺のDNA microarrayデータを統合し、2015年末までに低体温症における諸臓器の関連を解析し、低体温症の全身反応を明らかにする予定であった。本解析には相関分析を導入し、全身反応の解析を進めているが、相関分析が難解な理論に基づいており、進捗は若干、遅れている。[目的]法医解剖での低体温症診断は特異的な剖検所見を欠くことから、実際には除外診断となっている。本研究では法医実務への応用に向け、低体温症バイオマーカーの検索、診断法の構築を目的とする。さらに各臓器の遺伝子発現データを相関分析で統合し、低体温症の全身反応を明らかにする。[方法]マウス低体温症モデルを導入し、低体温症バイオマーカーの検索に向け副腎、左心室心筋、腎臓、肝臓、肺のトランスクリプトーム解析をDNAmicroarray法で行う。さらに定量PCR法を用い遺伝子発現の再現性確認を行う。また再現性が確認できた遺伝子に関しては、免疫染色を施行し鑑定法の構築を試みる。一方、低体温症の全身反応を明らかにする観点から副腎、左心室心筋、腎臓、肝臓、肺のDNAmicroarrayデータに相関分析を適用する。[結果]平成27年度までに副腎、腎臓の低体温症マーカー検索は完了したことから、平成28年度は左心室心筋、肝臓、肺の低体温症マーカー検索を中心に行った。左心室心筋でDNAmicroarray法で発現変動していた遺伝子は3438個であり、1704個は有意に発現が上昇し、1734個は有意に発現が減少していた。最も発現が上昇していた遺伝子はgranzyme Aで、最も発現が減少していた遺伝子はsolute carrierfamily 41, member 3であった。これら遺伝子を含む発現上昇上位3遺伝子、発現減少上位3遺伝子の再現性を定量PCR法で確認した。また免疫染色でgranzyme Aの弱陽性像を認めた。

一方、肝臓、肺のDNA microarrayデータからは、特に肺において好中球に関連する遺伝子が変動することを示唆するデータを得ており、これら遺伝子を含め、定量PCR法を用いた遺伝子発現の再現性確認を行っている。法医診断に有用な低体温症マーカーの検出を目的として、マウス低体温症モデルを導入し、肝臓、肺のトランスクリプトーム解析をDNAマイクロアレイを用いて行い、候補遺伝子を抽出するとともに、発現機序の考察を行った。さらに平成24、25年度に施行した副腎、心臓、腎臓のDNAマイクロアレイデータを加え、副腎、心臓、腎臓、肝臓、肺の大容量遺伝子発現データを対応分析し、低体温症における臓器間の関連を考察した。平成27年度以降は相関分析を用い、マウス低体温症の副腎、心臓、腎臓、肝臓、肺について各臓器間の関連性の解析を行い、低体温症病態の考察を行う予定である。この解析の元データとなるマウス低体温症における副腎、心臓、腎臓、肝臓、肺の遺伝子(約20万遺伝子)の発現動態データを平成26年度までに揃えることができた。腎臓、肝臓、肺に関しては定量PCR法を用いて低体温症における遺伝子発現の再現性確認を行うと共に、免疫染色を施行し鑑定法の構築を試みる。さらに副腎、心臓、腎臓、肝臓、肺のDNA microarrayデータを相関分析を用いて統合し、低体温症における諸臓器の関連を解析し、低体温症の全身反応を明らかにする。法医学1)平成26年度は肝臓、肺のDNA microarray解析を行ったが、これらの再現性を定量PCR法を用いて確認する。2)相関分析を用い、マウス低体温症の副腎、心臓、腎臓、肝臓、肺について各臓器間の関連性の解析を行い、低体温症病態の考察を行う。相関分析に700,000円程度を要する予定であったが、解析が遅れたため、支払いが発生せず、翌年度に繰り越しとなった。平成27年度施行予定の相関解析に費用を要するため、平成26年度の若干の研究費を平成27年度に持ち越した。平成28年度は相関分析を進める予定で、本解析を中心に、また定量PCR法、免疫染色法にも繰り越し予算を使用する。平成27年度施行予定の相関解析の費用に加える。
抗体を利用した生体内遺伝子ターゲッティング法の開発と癌遺伝子治療への応用

1.イムノジーンの作製本研究で用いたモノクローナル抗体B4G7は、ヒトEGFレセプター(EGFR)を認識し、EGFRとともにエンドサイトーシスされる。チオエーテル結合で架橋した抗体/ポリリジン複合体「イムノポーター」は、ジスルフィド結合による複合体よりも安定で、高い遺伝子導入効率が得られた。また、イムノジーン法において、抗体・ポリリジン・DNAの量比を至適範囲に保つことが重要であった。2.イムノジーンによる遺伝子導入遺伝子導入効率の指標として、β-Gal遺伝子を運ぶイムノジーンを作製し、EGFRを過剰産生するA431細胞の培養液に添加した。5日以上にわたりX-gal染色される発現細胞数の上昇がみられた。またクロロキンで細胞を処理するとイムノジーン法による遺伝子導入効率が上昇した。さらに、毒性はないがエンドソームから細胞質への移行能は保持した変異型ジフテリア毒素を共存させて作製したイムノジーン・ジフテリア毒素複合体を用いると飛躍的な遺伝子導入効率の上昇が観察された。したがって、イムノジーンがエンドサイトーシス系を介し遺伝子を導入すること、また、リソソーム活性および細胞質への移行の制御が、遺伝子導入効率の上昇に重要であることが示唆された。3.イムノジーンの癌治療への応用の試みヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ(TK)遺伝子を発現するプラスミドを運ぶイムノジーンを作製し、EGFRを過剰産生する扁平上皮癌細胞(A431およびNA)培養に添加後、ガンシクロビルで処理した。イムノジーンを添加した細胞では、ガンシクロビル依存的な殺細胞効果が観察された。本イムノジーン法は生体内の特定細胞へのターゲッティングが可能な遺伝子導入法で将来の遺伝子治療には不可欠の技術である。組織特異的なプロモーターの利用などとあわせて生体系での効果を評価するために担癌マウスでの実験を進めている。
組換え遺伝子導入シュワン細胞を用いた脳内白質の再生の試み

白質損傷後の脳機能再生を図るため、遺伝子導入したシュワン細胞を脳内移植し、脳機能変化をみることを本研究の主眼として始めた。本年度は白質損傷モデルとして、脳梁損傷モデル、凍結損傷による脳梁機能障害モデル、虚血性脳梁損傷モデルを用いて上記試みの準備研究を進めた。まずラット凍結脳損傷モデルを用い、白質オリゴデンドロサイト活性の指標として、MSP遺伝子と蛋白の発現を検討した。MSP(Myelencephalon-specific protease)は新規のセリンプロテアーゼで、白質のオリゴデンドロサイト、ミクログリア、神経細胞に多く存在し、ミエリンの代謝に関与することが知られている。その結果、凍結損傷後1-3日して損傷直下の白質にMSPmRNAと蛋白陽性のオリゴデンドロサイトが出現し、浮腫の進展に応じて、損傷遠隔部位の白質まで、陽性細胞が出現することを確かめた。また、mRNAと蛋白の発現は同時に並行して変化することも確かめられた。ついでラット脳虚血モデルを用いて、MSPの発現を検討すると、虚血周囲の白質に虐血後1-3日して発現することが認められた。これらの所見から、各種の白質損傷モデルでは損傷に応じてオリゴデンドロサイトの活性化がおこり、これが損傷後のミエリン修復に関与することが明らかとなった。同時にbrain derivedneurotrophic factor (BDNF)およびinterferon gammaを組み込んだレトロウィルスベクターを作成し、それを用いてWisterラットから採取したシュワン細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入されたシュワン細胞をジェネシチン(G418)でセレクションをかけながら、シングルコロニーを採取してシングルクローンとした。そうして得られた遺伝子組み換えシュワン細胞のシングルクローンのうち、増殖などに問題の無かったものを選択して増殖させ、移植の準備段階は整えることができた。研究期間は終了してしまったが、次の段階として作成した遺伝子組み換えシュワン細胞をラット脳梁損傷モデルに移植するなど、今後も研究を継続していく予定である。MSP(Myelencephalon-specific proteaseは新規のセリンプロテアーゼで、白質のオリゴデンドロサイト、ミクログリア、神経細胞に多く存在し、ミエリンの代謝に関与することが知られている。その結果、凍結損傷後1-3日して損傷直下の白質にMSP mRNAと蛋白陽性のオリゴデンドロサイトが出現し、浮腫の進展に応じて、損傷遠隔部位の白質まで、陽性細胞が出現することを確かめた。ついでラット脳虚血モデルを用いて、MSPの発現を検討すると、虚血周囲の白質に虚血後1-3日して発現することが認められた。次年度はこの変化をシュワン細胞の移植が修飾できるか検討する予定である。
テロメアDNAを標的とした新規癌治療薬の開発

テロメラーゼはテロメア反復配列(TTAGGG)を染色体末端に伸長させる酵素であり、癌細胞型の80%以上で過剰発現を認めるため、抗癌剤の新たな標的として期待される。本研究では、テロメア反復配列が細胞内で4本鎖構造を形成することに着目し、4本鎖DNA構造への特異性を向上させた新規化合物について、複数の口腔癌由来細胞株および正常細胞に対する影響を比較検討した。口腔癌由来の細胞株に対して、テロメアを標的とした性質の異なる種々の化合物を作用させた。テロメラーゼの遺伝子発現や活性と比較的相関の認められた化合物2種に焦点を当てて実験を進めた。RT-PCR及びリアルタイムPCRによって解析した各細胞のhTERT発現量とTRAP法によるテロメラーゼ活性、細胞増殖抑制効果の程度はおおよそ相関関係にあった。ヒト正常角化上皮細胞やマウス骨髄細胞と癌細胞に対する各化合物の細胞増殖抑制効果を比較すると、濃度作用曲線で大きな差を認め、癌細胞に対して高い効果を有していた。ヌードマウスにおける異所性腫瘍形成は想定よりも形成効率が低く、適切な細胞株の選定や接種方法の検討を続けている。臓器の摘出と切片作成・組織染色等の手技は概ね確立した。テロメアDNA配列を標的とした新規化合物は、正常細胞と比較して癌由来の細胞株に対して強い増殖抑制効果を示した。その効果は各細胞株のテロメラーゼ発現量と相関関係にあった。ヌードマウスの異所性腫瘍形成のモデルを用いる実験は、腫瘍形成効率や化合物の安定性に関する予備実験を開始したところである。実験計画に沿った進捗状況であり、期待された実験結果を得ている。培養細胞を用いる実験では良好な結果が得られているので、ヌードマウスを用いた実験系の条件検討などを進め、個体レベルで化合物の抗腫瘍効果や有害作用などを検討する。前年度に引き続き、テロメアDNA配列を標的とした化合物の抗癌作用の解析に関する研究を進めていくため。
骨髄造血微小環境の直接利用と選択的細胞増幅を組み合わせた慢性肉芽腫症遺伝子治療

造血幹細胞遺伝子治療の効果を改善するため、X連鎖型慢性肉芽腫症(X-CGD)をモデル疾患として、選択的増幅遺伝子(SAG)の改良を行った。SAGは、造血因子受容体とエリスロポエチンEpoにより活性化されて増殖シグナルを発する融合蛋白質をコードする人工遺伝子で、臨床応用を念頭に全てのコンポーネントをヒト化した。コロニーアッセイにて細胞増幅機能を確認した改良型SAGをX-CGD骨髄細胞に導入して同系マウスに移植後、Epoを投与して遺伝子導入細胞の体内増幅が可能か検討した。末梢血中の機能回復顆粒球の割合は、第1クールの刺激にて1.0±0.1%から3.9±0.8%(P=0.006)、第2クールの刺激にては1.5±1.1%から3.2±2.2%(P=0.065)へと上昇し、Epo反応型SAGによって、X-CGDマウスの治療効果が増強しうることが示された。現在、サルを用いた前臨床研究の準備を進めている。細胞輸注の前処置による副作用低減と遺伝子導入細胞の生着促進のため、骨髄内移植法の効果を検討した。X-CGDマウスに低線量(4Gy)のガンマ線を照射後、野生型マウスの骨髄細胞を通常の静注法と骨髄内注入法にて移植し、活性酸素産生能を比較した。10^6個以上の細胞を移植した場合は両者ともに正常細胞が生着したが、それ未満の場合は骨髄内移植法で移植した場合のみ治療域の正常細胞が長期間生着した。骨髄の造血微小環境を形成する間質細胞は間葉系幹細胞(MSC)から分化したものであり、造血幹細胞の生着を促進するとして注目されている。そこで、MSC分化の分子機構1や造血幹細胞との相互作用を解析した。マウス間質細胞10T1/2親株に比べ、造血支持能を有する亜株はSteel factor・CXCL12・Ang-1など造血に関わる液性因子を高発現しており、その発現量が、骨髄球系細胞が分泌するサイトカイン刺激によりさらに増加するとともに、共培養した造血前駆細胞のcobblestone areaおよび造血コロニーの形成が促進された。以上から、MSCの同時移植が遺伝子導入細胞の生着促進に有用であることを示している。1.慢性肉芽腫症(CGD)治療用遺伝子高発現ベクターの選定:これまで実際の臨床でCGD遺伝子治療に用いられたベクターとしてMFG(米国)とSFF(ドイツ)があり、共同研究者である韓国のKim教授らはMTを用いる計画である。そこでこれらのベクターにX連鎖型CGD(X-CGD)の治療用遺伝子(gp91遺伝子)を搭載し、テスト細胞に感染させてgp91の発現を個々の細胞レベルで測定したところ、これら3者によるgp91発現量はほぼ同等であった。MTは野生型レトロウイルスの蛋白コード領域を全て除去しているため、相同組み換えによって複製可能型ウイルスが出現する可能性が最も小さく、安全性が高い。また組み込み可能な遺伝子サイズが最も大きく、治療用遺伝子と細胞増幅用遺伝子を搭載する必要がある本課題に適したプラットフォームだと判定した。

2.完全ヒト化型選択的増幅遺伝子の構築:ヒトエリスロポエチン受容体(EpoR)の細胞外領域とヒト顆粒球コロニー刺激因子受容体(GcR)細胞内部分のキメラ受容体を数種、接合部分をずらしながら作製し、エリスロポエチンに反応して発する増殖シグナルを比較した。いずれのキメラ受容体も、野生型EpoRと比肩する増殖シグナルを伝えた。3.造血幹細胞の骨髄腔内移植(iBMT)と経静脈的移植(IV-BMT)の比較:出来るだけ副作用を低減しつつ輸注した遺伝子導入細胞の生着を促進するため、非骨髄破壊的前処置下でのiBMT法の効果を検討した。X-CGDマウスに低線量(4Gy)のガンマ線を照射後、野生型マウスから採取した骨髄細胞を3x10^5個から1x10^7個まで数を変えながらiBMTとIV-BMTにて移植し、活性酸素産生能を比較した。両者とも10^6個以上の移植にては正常細胞が生着したが、それ未満の場合はiBMT法で移植した場合のみ治療域の正常細胞が長期間生着した。造血幹細胞遺伝子治療の効果を改善することを目的に、X連鎖型慢性肉芽腫症(X-CGD)を対象疾患として、遺伝子導入細胞増幅システム(選択的増幅遺伝子;SAG)の改良を行った。SAGは薬剤反応性に細胞増殖シグナルを発するキメラ分子をコードする人工遺伝子であるが、今年度は第二世代であるエリスロポエチン(Epo)反応型分子を、X-CGD治療の標的となる骨髄球系細胞に合わせて改変した。すなわち、キメラ分子を構成するエリスロポエチン受容体(EpoR)細胞外-膜貫通部分と顆粒球コロニー刺激因子受容体(GcR)細胞内部分をすべてヒト化した。次いで、それらの接続部分の違いが造血前駆細胞増幅効果に及ぼす影響を詳細に検討するため、両者の接合部を少しずつずらして多数作製した。これらSAGとX-CGD治療用遺伝子(gp91遺伝子)を、レトロウイルスベクターにてX-CGDマウス骨髄に導入し、顆粒球系造血前駆細胞の増幅効果を比較した。いずれのEpoR-GcR型SAGも、Epo刺激下でほぼ同等の造血コロニー誘導能を示し、その約85%が活性酸素産生能を有する顆粒球コロニーだった。そこで、最も多数のコロニーを生ぜしめたSAGを選び、X-CGD骨髄細胞に導入して同系マウスに移植後、Epoを投与して遺伝子導入細胞の体内増幅が可能か検討した。末梢血中の機能回復顆粒球の割合は、第1クールの刺激にて1.0±0.1%から3.9±0.8%(P=0.006)、第2クールの刺激にては1.5±1.1%から3.2±2.2%(P=0.065)へとそれぞれ上昇した。以上の実験により、Epo反応型SAGによって、X-CGDマウスの治療効果が増強しうることが示された。今年度検討したベクターをサル等の大型動物を用いた前臨床研究に供し、単独で、あるいは間葉系幹細胞の共移植や骨髄内移植と組み合わせた場合の細胞増幅効果を解析する。造血幹細胞遺伝子治療の成績向上をめざし、遺伝子導入細胞の生着を促進し、さらに増幅するための方策を検討した。前者については、近年、間葉系幹細胞(MSC)同時移植の生着促進作用が注目されている。骨髄の造血微小環境を形成する間質細胞は、骨細胞・軟骨細胞・筋細胞・脂肪細胞・繊維芽細胞などに分化する能力をもつ間葉系幹細胞(MSC)から分化したものである。そこで、MSC分化の分子機構や造血幹細胞との相互作用の解析を行った。マウス間質細胞10T1/2親株と、造血支持能を有する10T1/2亜株が発現する分子の差異を調べた。親株に比べて亜株はSteel factor・CXCL12・Ang-1など造血に関わる液性因子を高発現しており、その発現量は、骨髄球系細胞が分泌するサイトカイン刺激によりさらに増加した。
細胞融合による細胞質DNAの再編成とその育種学的利用に関する基礎的研究

1.ダイコンとキャベツの細胞融合により育成された細胞質雄性不稔植物のミトコンドリアDNAの解析ダイコンとキャベツの細胞融合により作出された細胞質雄性不稔植物と、融合に用いた両親から全DNAを抽出し、数種類の適当な制限酵素で切断したのちアガロースゲル電気泳動し、ミトコンドリアDNA上の遺伝子をプローブにしてサザンハイブリダイゼイションを行うことにより、それぞれのミトコンドリアDNAの制限酵素切断パターンを比較解析した。その結果、5種類の遺伝子(atpA,atp6,coxII,26S,18S)について細胞質雄性不稔植物のミトコンドリアDNAの制限酵素切断パターンは両親のものと異なり、DNAが再編成されていることが示唆された。2.細胞質雄性不稔植物のミトコンドリアDNA上の遺伝子発現の解析ダイコン、キャベツ及び細胞質雄性不稔植物から全RNAを抽出し、1で変異の見られたミトコンドリアDNA上の遺伝子をプローブに用いてノーザンハイブリダイゼイションを行い、各遺伝子の転写物の大きさを比較解析した。その結果、26S rDNA,atpA,coxIIでは転写物の大きさに差異は見られなかった。またatp6遺伝子は発現量が低く、検出できなかった。今後、遺伝子発現に変異の見られた遺伝子について、ダイコン、キャベツ、細胞質雄性不稔植物それぞれからクローニングし塩基配列を決定して比較することにより、DNAの再編成と遺伝子発現の変異との関連を解析する。3.細胞質雄性不稔植物の葉緑体DNAに見られた変異の解析1と同様にしてダイコン、キャベツ及び細胞質雄性不稔植物から全DNAを抽出し、葉緑体DNAのプロープを用いてサザンハイブリダイゼイションを行った結果、細胞質雄性不稔植物の葉緑体DNA上のrps16遺伝子付近にバンドパターンの変異が見られた。このバンドパターンは両親にみられないバンドパターンだったので、細胞融合により両親の葉緑体DNAが再編成した可能性が考えられる。今後、この変異の見られた領域をクローニングし塩基配列を決定して両親の塩基配列と比較することにより、どのような変異が起こったのかを詳細に解析する。