hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
先物金利情報に着目した日本の金融政策の企業別・産業別への影響に関する実証研究

より具体的には,量的緩和政策を実施している時期において,予測されていた金融政策に関連した変数が,市場金利に対して有意な影響を与えていたことを確認した。ただし,為替レートや株式収益率への影響は限定的であったことも同時に確認した。これらの成果は,論文としてまとめ,学術誌に投稿している。特に,最終年度は,産業別の株価指数に着目し,産業の違いによって金融政策の効果が異なる可能性があることを確認した。この研究は,「産業別の金融政策効果について」としてまとめた。2014年8月には,法政大学と京都産業大学で「第4回マクロ政策分析研究会」を共催し,金融政策にとどまらず広くマクロ経済政策に関連した論文を多くの研究者に報告してもらうと同時に,研究代表者も上記の論文を報告した。経済政策Tomorrow Nextを利用した論文については,2013年度以降の効果を踏まえた上で投稿すること画策しており,現時点ではまだ学会発表にとどまっているが,分析自体は9割は終えている。また,関連する研究については,学会報告並びに研究会での報告等は既に終えており,最終年に内容をまとめる作業をする段階にある。その意味で,概ね順調に進捗していると考えている。平成24年度における研究計画のうち,「先物データを利用した金融政策変数の作成」,「金利に関する日次データの整理」,「企業レベルの財務諸表に関連するデータの整理」,「産業別の株式データの整理」等,データの入手/整理に関する作業は概ね終了している。さらに,マクロレベルの株式データ,債券市場のデータ(LIBOR)などへの影響についての分析についても終えてる。2013年4月以降可能な限り長期間のデータを含むサンプルを用いた金融政策の影響を考察した上で論文を完成させ,投稿する。同時に,Caballeo, Hoshi and Kashyap(2006)で提唱されている「ゾンビ企業」を考慮した金融政策の影響について時系列/パネル分析を行い論文にまとめる。最後に,家計の所得階層別消費データと金融政策の影響について,より深い考察をした上で学会誌への投稿を行う。また,複数の学会での報告を予定している。まず,ある程度の分析が終わっている「Tomorrow Nextを用いた金融政策の分析」について,英文にした上で,海外の学術誌への投稿を行う。次に,Caballero, Hoshi, and Kashyap(2006)で提唱された「ゾンビ企業」について,現時点で収集してる企業レベルの財務データを用いて計算し,産業ごとにゾンビ企業の比率について計算を行う,など企業レベルの財務データ/産業レベルの株価データ等を用いた分析を行うことで,産業ごとの特性等について着目出来る分析を行う。その上で,本研究で作成している「金融政策変数」を用いることで,どのような企業/産業が,金融政策に影響を受けやすいのか,またそれらの企業/産業に共通する財務的な特徴は何か,といった分析を時系列分析/パネル分析を用いて行っていく。本研究の最終年では,海外を含む複数の学会で,研究の成果を報告すべく,上述の研究に関する結果についてまとめていく。
異種皮膚による自家皮膚の表皮形成促進効果に関する実験的研究

目的:異種皮膚を全層皮膚欠損創に適応した場合に、異種皮膚の存在が自家皮膚の表皮形成能にどのような影響を及ぼすかを検索した。実験材料及び方法:実験1;一般のマウスに比べて創収縮の影響少ないtight skin mouseを用いて、異種皮膚を自家皮膚と混合植皮した場合の創面の経時的変化を観察した。実験2;ハートレー系モルモットを用い、自家異種混合植皮の混合比を変えた場合の創面の状態と創面積の経時的変化を対照群と比較した。実験3;異種皮膚の脱落後の創面の状態と自家表皮形成について、同種植皮を行なった場合と肉眼的、組織学的に比較検討した結果及び知見:実験1では、創閉鎖時の創面積は対照群である自家植皮のみ行なった群と有意差は認められなかった。また異種皮膚脱落後の創面には異種真皮膠原線維の残存が確認された。実験2では、混合比をかえることにより異種植皮片の面積の広い部分では創閉鎖の遅れが認められた。また異種皮膚を適応することにより創収縮は抑制されるものの、明かな表皮形成の促進は認められなかった。実験3では、同種植皮の場合には真皮膠原線維が比較的その構造を保った状態で長期間残存し、その上に自家表皮形成の進行が認められた。異種植皮脱落後の創面においても真皮膠原線維の残存が確認されたが、同種植皮の場合に比べて早期に肉芽内に吸収され、また自家表皮形成が明らかに進行している所見は得られなかった。以上の実験結果及び文献的考察より残存真皮膠原線維が自家表皮形成の足場として重要な役割を果たしており、異種皮膚移植を適応した場合に明かな自家表皮形成促進効果が認められないのは、この真皮膠原線維の効果が維持されないためと考えられた。したがって異種自家混合植皮を臨床的に深達性熱傷の治療に用いる場合には個々の異種皮膚の大きさは同種自家混合植皮の場合ほどには大きくできないものと思われた。〔目的〕異種皮膚移植の拒絶および脱落の形態学的,組織学的変化を観察し,異種皮膚移植においても同種皮膚移植の場合と同様に拒絶脱落後に残存する組織成分の一部が自家皮膚よりの表皮形成に有利に働くか否か,また移植された異種皮膚組織の存在自体が創に対してどのような影響を及ぼすかなどを知る目的で実験を行った.〔方法〕異種皮膚脱落後の自家表皮の進展状態を観察するために,実験動物としては一般のmouseに比べて創収縮の起こりにくいtight skin mouseを用いた.背部にヒト分層皮膚と自家皮膚との混合植皮群と自家植皮群とを作成し,創の収縮状態および異種移植片の脱落後の形態学的,組織学的変化を経時的に観察した.〔結果と考察〕異種植皮片は10日前後で脱落するが脱落後も肉眼的に白色の真皮成分が存在するのが観察された.また組織学的にも膠原腺維を主体とする新皮成分の一部は残存し,同種植皮の場合にみられるのと同様に自家皮膚よりの表皮がその上に這い出している所見が得られた.しかし異種植皮脱落後の場合は同種植皮の場合に比較して自家表皮の進展が遅く,残存する真皮成分も大部分は異種植皮片脱落後,比較的早期に肉芽内に吸収されてゆくような所見を得た.また異種混合植皮後の創全体の拘縮状態を対称群と比較してみると創閉鎖時点に於いて両者の間に有意差を見出せなかった.

これらのことから,同種植皮の際に表皮形成促進の足場となると考えられる残存する真皮成分は,異種植皮の場合にも表皮形成促進の重要な役割を果たしていると考えられるが,同種植皮の場合程安定したものではないと推測される.この点については現在観察中の異種混合植皮,同種混合植皮群の実験結果ともあわせて総合的に判断したい.異種皮膚を全層皮膚欠損創に適応した場合に、異種皮膚の存在が自家皮膚の表皮形成能にどのうよな影響を及ぼすかを検索した。Materiais and Methods:Experiment1;一般のマウスに比べて創収縮の影響の少ないtight skin mouseを用いて、異種皮膚を自家皮膚と混合植皮し、創面の経時的変化を観察した。Experiment2;ハートレー系モルモットを用い、自家異種混合植皮の混合比を変え、創面の状態と創面積の経時的変化を対照群と比較した。Experiment3;異種皮膚の脱落後の創面の状態と自家表皮形成について、同種植皮の場合と肉眼的、組織学的に比較検討した。Resuits and Discussion:実験1では、創閉鎖時の創面積は対照群である自家植皮のみ行なった群と有意差は認められなかった。また異種皮膚脱落後の創面には異種真皮膠原線維の残存が確認された。実験2では、混合比をかえることにより異種植皮片の面積の広い部分では創閉鎖の遅れが認められた。また異種皮膚を適応することにより創収縮は抑制されるものの、明かな表皮形成の促進は認められなかった。実験3では、同種植皮の場合には真皮膠原線維が比較的その構造を保った状態で長期間残存し、その上に自家表皮形成の進行が認められた。異種植皮脱落後にも真皮膠原線維の残存が確認されたが、早期に肉芽内に吸収され、自家表皮形成が明らかに進行している所見は得られなかった。以上の実験結果及び文献的考察より残存真皮膠原線維が自家表皮形成の足場として重要な役割を果たしており、異種皮膚移植を適応した場合に明かな自家表皮形成促進効果が認められないのは、この真皮膠原線維の効果が維持されないためと考えた。したがって異種自家混合植皮を臨床的に深達性熱傷の治療に用いる場合には、個々の異種皮膚の大きさは同種自家混合植皮の場合ほどには大きくできないものと思われた。
概日時計調節化合物の新規標的探索法の開発と周期・位相制御機構の解明

生物は昼夜の環境変化への適応に概日時計を利用しており、様々な生理機能は概日時計に制御され約1日周期で活性が変動する。また概日時計は光により時計の時刻(位相)を調節できる。現在、周期が約1日になる仕組みや位相調節の機構についてはほとんど明らかになっていない。これまでに周期や位相を変化させる化合物が数多く得られており、これらが細胞内のどのタンパク質を標的として効果を示すのかが解明されれば、問題解決の手がかりになると期待される。本研究では、現行の手法の弱点をふまえた新たな手法を開発し化合物の標的同定に利用するとともに、得られた結果を数理生物学の専門家と共同で解析し、周期や位相の調節機構を理解する。
イガイ類接着タンパク質遺伝子構造全容解明

海産および淡水産のイガイ類接着タンパク質遺伝子の解析として、(i)cDNAライブラリーを構築し、次いで、(ii)翻訳後修飾様式・頻度解析の手段を確立し接着機構の解明を試みた。淡水性のイガイ類および水生昆虫のシルクーセメントタンパク質遺伝子に関する(ii)の課題においても多くの成果が得られた。接着タンパク質遺伝子の網羅的解析を行う研究対象は、海水環境および淡水環境による差異を明らかにすることで、生存戦略の違いを解明し工学研究に繋げたいと考えている。海産無脊椎動物の内、特に淡水性付着性二枚貝であるイガイ類に所属する生物の内、カワヒバリガイ(学名Limnoperna fortunei)を研究対象に選択した。カワヒバリガイの足組織に含まれる接着物質生合成器官であるフェノール腺を採集し、全mRNAを抽出後、cDNAライブラリを構築した。カワヒバリガイ足組織特的cDNAライブラリーからクローン190種以上を選別し、塩基配列解析を行ったところ、海産大型イガイ類の接着物質原料となるタンパク質と高い相同性を持つものをスクリーニングすることに成功した。また、イガイ本体と接着性繊維をつなぎ止めている糸状部分を構成するコラーゲン様タンパク質、また、イガイ類接着物質を凝集固化する役割を持つ酸化酵素であるポリフェノールオキシダーゼと見られる遺伝子も発見することができた。以上の結果から、淡水産イガイ類では、主に、タンパク質分子の等電点が海産イガイよりも中性付近であることが明らかになり、基本的な凝集機構のひとつ物理凝集過程の側面において、淡水環境に適応した分子構造を待つことが示唆された。さらに、幼虫絹糸腺のcDNAライブラリをスクリーニングし、当該付着性繊維タンパク質に含まれるホスホアミノ酸がpSerであることを明らかにした。さらに、およそ300アミノ酸残基の長周期構造を持つタンパク質の遺伝子クローニング手法を有効に行うための分析法についても検討を行った。これらの知見は、海産イガイ類接着タンパク質遺伝子のcDNAライブラリ作成および翻訳後修飾様式同定のための基礎研究手法となる。上記の成果により、ミドリイガイ接着タンパク質遺伝子を含むcDNAライブラリー作成、および、翻訳後修飾様式・頻度解析のための手法をほぼ確立することができ、海産および淡水産イガイ類の両方に適用可能な分析手段を得ることができた。のこれらの知見は、海産イガイ類接着タンパク質遺伝子のcDNAライブラリ作成および翻訳後修飾様式同定のための基礎研究手法となる。海産無脊椎動物の内、特に大型の付着性二枚貝であるイガイ類に所属する生物の内、ミドリイガイ(学名Perna viridis)を研究対象に選択した。ミドリイガイの足組織に含まれる接着物質生合成器官であるフェノール腺を採集した。イガイ類接着物質は翻訳後修飾されたアミノ酸を典型的に含み、多くの場合、3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン(DOPA)およびO-ホスホセリン(pSer)であることが知られている。ミドリイガイフェノール腺内から8種類のDOPA含有タンパク質を同定した。これらのタンパク質をPerna viridis foot proteins (Pvfps)と命名した。8種の内、最高分子量を持つタンパク質Pvfp-1のN末端アミノ酸配列分析を行った結果、N末端15残基以内に修飾アミノ酸が含まれることが明らかになった。現時点では未だ不明であるが、これらの修飾アミノ酸は、ある種の配糖体であるか、もしくは、pSerであると考えられる。pSerであった場合、これを自動分析する手段を申請者らの装置に最適化する必要が生じる。

このため、淡水産付着生物の1種、ヒゲナガカワトビケラ(学名Stenopsyche marmorata)の幼虫の付着性繊維タンパク質を試料として用い、ホスホアミノ酸自動分析の手法を開発した。さらに、幼虫絹糸腺のcDNAライブラリをスクリーニングし、当該付着性繊維タンパク質に含まれるホスホアミノ酸がpSerであることを明らかにした。さらに、およそ300アミノ酸残基の長周期構造を持つタンパク質の遺伝子クローニング手法を有効に行うための分析法についても検討を行った。上記の成果により、ミドリイガイ接着物質のcDNAライブラリー作成、および、翻訳後修飾様式・頻度解析手法をほぼ確立することができ、海産および淡水産イガイ類の両方に適用可能な分析手段を得た。研究推進に関する当初計画では、海産および淡水産のイガイ類接着タンパク質室遺伝子の網羅的解析の最初の段階として、(i) cDNAライブラリーを構築し、次いで、(ii)翻訳後修飾様式・頻度解析の手段を確立し接着機構を解明する予定であった。平成24年度の研究進捗では、淡水性のイガイ類および水生昆虫のシルクーセメントタンパク質遺伝子に関する(ii)の課題においてより多くの成果が得られている。接着タンパク質遺伝子の網羅的解析を行う研究対象は、イガイ類が持つ種々の生存戦略に含まれる接着機構の中では、海水環境および淡水環境による差異を明らかにすることで、酸化酵素が媒介する基本経路に加え、アミノ酸組成変化にともなう等電点の差異を含め、接着過程全体をとおした生存戦略の違いを解明し、工学研究に繋げたいと考えている。平成24年度の成果により、クローニング対象の種類について、海産ではミドリイガイ(学名Perna viridis)および淡水産ではカワヒバリガイ(学名Limnoperna fortunei)、および、水生昆虫(Stenopsyche maarmorata)シルクタンパク質の3種に拡張することができた。平成23年度の研究進捗では、(ii)の課題においてより多くの成果が得られている。接着タンパク質遺伝子の網羅的解析を行う研究対象は、イガイ類が持つ種々の生存戦略に含まれる接着機構のなかで、特に例外的なものは望ましくない。従って、イガイ同族の中で、極端に異なる翻訳後修飾様式を持つ種を(ii)の成果により迅速に除外することができるようになったと判断している。平成23年度の成果により、クローニング対象の種類について、海産ではミドリイガイ(学名Perna viridis)および淡水産ではカワヒバリガイ(学名Limnoperna fortunei)の2種に限定することができた。平成25年度では、最初に、達成度記載の研究課題(i)ミドリイガイおよびカワヒバリガイの足組織
肥大心に特異的に発現する遺伝子のSubtraction法による単離とその機能解析

平成10年度は以下の実験を行った。(1)サブトラクションにて約50個の遺伝子が得られた。このうち20個の遺伝子をプローブとして正常心筋および肥大心筋由来のmRNAのノーザンブロット解析を行った。ノーザンブロット法により肥大心筋にて発現亢進を認めたクローン14個が得られた。(2)そのうち8個の遺伝子配列を決定した。平均の遺伝子長は約550bpであった。Gene Bankdatabaseを用いた遺伝子配列のホモロジー解析では、ミオシン重鎖遺伝子などいずれも既知の遺伝子であった。(3)現在残りのクローンをプローブとしてノーザンブロット解析および遺伝子配列の決定を行っている。平成9年度は以下の実験を行った。(1)腹部大動脈狭窄およびSham Operationを施行し、前者において頚動脈圧が上昇していることを確認の上、それぞれの群の心臓の単離をおこなった。(2)両群の心臓よりポリトロンを用いて、acid-guanidium phenol chloroforrm extraction法にてtotal RNAを得た。オリゴdTビーズを用いてpoly(A)+RNAを精製したのち、逆転写酵素を用いてcDNAを作製しPolymerase chain reaction法にて増幅した。(3)大動脈狭窄群のcDNAの3`末端を保護した後Sham Operation群のcDNAと混合し、ハイブリダイゼーションさせた。そしてExnonuxlease IIIおよびVIIにて消化をしたのち残ったcDNAを再びpolymerase chain reaction法にて増幅した。この操作を4回繰り返した。(4)残ったcDNAをプラスミドDNAに組み込んだ。(5)現在得られたcDNAの一部の塩基配列を決定中である。現在のところ肥大心筋に特異的に発現する新たな遺伝子が単離できたかどうかは明らかでない。
家族性ALSに関する分子遺伝学的研究

今日までその原因が充分には明らかにされていない進行性難治性筋疾患である筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、主として運転ニューロンの選択的細胞死を惹起して筋萎縮をもたらし、その予後が極めて不良でありながら有効な治療法は未だ確立していない。ALS発症者の5-10%は遺伝性で(FALS)、1993年には細胞質内の活性酸素消去機構であるCu/ZnSOD (superoxide dismutase)遺伝子に点突然変異が見い出されてきて、これが一部のFALSの原因遺伝子であることが強く推定されるに至った。平成7および8年度の本研究により日本人の家系を用いた予備的な研究によって2家系のCu/ZnSOD遺伝子に、これまで検討された150以上の白人家系でも見られていない症状の進行が極めて遅いなどの際立った臨床的特徴を持った新しい遺伝子変異(点突然変異)を見い出して報告した(H46R変異)。さらに、もう5家系においても、白人家系にはまだ報告のないCu/ZnSOD遺伝子の5つの異なった異常を見い出した。異なった遺伝子変異は、それぞれに特徴的な臨床所見を示しており遺伝子変異と臨床的特徴の関連が注目される。さらにCu/ZnSOD遺伝子変異による蛋白チロシン残基のニトロ化が運動ニューロン死のメカニズムに深く関与していることを証明し本病の原因解明の足掛りとなり、2年間にわたる本研究の当初目的は達成できたものと考えられる。筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、今日までその原因が充分には明らかにされていない進行性難治性筋疾患で、主として運動ニューロンの選択的細胞死を惹起して筋萎縮をもたらし、その予後が極めて不良でありながら有効な治療法は未だ確立していない。平成7年度までの本研究により、東北大学神経内科でフォローしている家族性ALSの10家系のうち7家系にSOD1遺伝子の6つの異なった点突然変異が発見された。これは実に家族性ALS家系の60-70%に相当するわけで、白人で報告された14-20%とは大きく異なるものである。このことは家族性ALSの主たる原因が、白人ではSOD1遺伝子以外の他の遺伝子ということになるのに対して、日本人では主たる原因がSOD1遺伝子異常であるということを突き止めたことになる。このように、平成7年度までの研究により、新しい遺伝子変異の発見に加えて、人種間での家族性ALSの主原因の相違についても明らかにすることができ、当初の目的は達成できたものと考えられる。進行性難治性筋疾患である筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、今日までその原因が充分には明らかにされていないが、主として運動ニューロンの選択的細胞死を惹起して筋萎縮をもちらし、その予後が極めて不良でありながら有効な治療法は未だ確立していない。平成8年度の本研究により日本人の家系を用いた予備的な研究によって2家系のCu/ZnSOD遺伝子に、これまで検討された150以上の白人家系でも見られていない症状の進行が極めて遅いなどの際立った臨床的特徴を持った新しい遺伝子変異(点突然変異)を見い出して報告した(H46R変異)。さらにCu/ZnSOD遺伝子変異による蛋白チロシン残基のニトロ化が運動ニューロン死のメカニズムに深く関与していることを証明し本病の原因解明の足掛りとなり、本年度の当初目的は達成できたものと考えられる。
閉鎖性水域における広域的漁業管理組織の成立と発展に関する研究

本研究は沿岸海域でも,多種多様な漁業が狭い漁場で入り会って営まれ,過去から現在に至るまで数多くの漁場紛争を経験してきた日本を代表する閉鎖性水域である瀬戸内海に焦点を当てて,漁業者による自主的な漁業管理組織の広域的ネットワーク化の現状と課題,さらにはそのための合意形成がどのようにされているのか,それが永続性を持つにはどのような条件が必要なのかについて,瀬戸内海の西部海域を事例に考察したものである。課題接近のために,以下の視点から分析を試みた。第1に瀬戸内海機船船曳網漁業並びに小型機船底曳網漁業の自主管理規制の実態について言及し,漁業管理の地域的な広がりと,その到達レベルを明らかにしようとした。第2に自主管理がうまく行っているところとそうでないところとの差異は一体どこに原因があるのかを,両漁業を取り巻く経営環境と漁業管理組織設立にいたる経緯に留意しつつ究明した。以上の点をふまえて,第3に広域的漁業管理制度を構築するにあたっての障害は一体どこにあるのか,解決すべき課題は何であるのか,そして漁業管理組織の広がりとその機能強化に資源回復計画がどの程度効力を発揮しているのかを解明した。本研究から導き出される広域的な漁業管理組織成立の要諦は,第1に漁業管理の実働部隊を育成するために,地区単位で青壮年部の組織化と彼らに対する資金・技術面での支援を行い活動の活性化を促すこと,第2に漁業管理主体の結成と機能的な組織作りのために,地域横断的な協議会組織の結成と漁業管理実施に向けた啓発活動,仲間作りを兼ねたリーダー研修会の開催等が必要であり,第3に漁業管理の必要性を漁業者に納得してもらえるよう試験機関の協力を得て将来の見込み利益を数値で提示することが肝要である。最後に,包括的資源回復計画は広域的な漁業管理制度の枠組み作りの契機にはなっても,既存の漁業管理制度の行き詰まりを打開する切り札とはなり得ていない。
若年性歯周炎患者の疾患感受性を規定するA.a外膜蛋白のT細胞エピトープの同定

本研究課題は,早期発症型歯周炎(EOP)患者の疾患感受性を規定する抗原分子をアミノ酸レベルで同定するために,1)Omp34を認識するEOP患者末梢血由来ヘルパーT細胞株を樹立し,2)そのT細胞株のOmp34上におけるT細胞認識部位を同定することによって,歯周病に対する診断および免疫療法の基礎を築くことを目的とする。昨年度までに,Omp34の全アミノ酸配列を網羅するオーバーラップペプチドを作成した。また,A.actinomycetemcomitansに対して高いIgG血清抗体価を示すEOP患者1名の末梢血単核球から,Omp34を特異的に認識するヘルパーT細胞株を樹立した。本年度は,1)作成したOmp34のオーバーラップペプチドにおいて,被験患者のT細胞株が認識するペプチドを特定し,2)既報のHLAのアミノ酸結合モチーフと照らし合わせることを行なった。その結果,以下の成果を得た。1)32種類のオーバーラップペプチドのうち,T細胞株が認識するペプヂドを4種類特定した。それは,Omp34を構成する325残基のアミノ酸において,121残基目,161180残基目,171190残基目および241260残基目に位置するペプチドであったが,これら4種類のペプチドには,Y-X-X-X-X-(A or G)-X-X-Aという共通な配列が存在した。2)この配列は,被験患者が有するHLA-II alleleの一方であるDRB1^*0101のモチーフに相似することが判明し,Y, A or G,およびAをアンカー残基として結合し得ることが推測された。これらの結果は,患者集団におけるOmp34に対するT細胞応答性を規定するT細胞エピトープを同定することを可能とし,歯周病の免疫病理的な診断およびペプチド免疫療法に発展させる基礎を確立することにおいて貢献するものである。Actinobacillus actinomycetemcommians (A.a)におけるOmpAファミリー外膜蛋白は,Opm34と名づけられ,EOP患者の血清IgG抗体によって高頻度に認識される。本研究課題はEOP患者の疾患感受性を規定する抗原分子をアミノ酸レベルで同定することを目的に,1)Omp34を認識するEOP患者末梢血由来ヘルパーT細胞株を樹立し,2)そのT細胞株のOmp34上におけるT細胞認識部位を各個体間で比較し,患者に共通するT細胞エピトープを同定することによって,歯周病に対する診断および免疫療法の基礎を築くこととした。本年度は,1)Omp34の全アミノ酸配列を網羅するオーバーラップペプチドを作成すること,2)A.aに対して高いIgG血清抗体価を示す被験者となるEOP患者の選定を行なうこと,および3)Omp34を特異的に認識するT細胞株をEOP患者から樹立することを行なった。1)Omp34は325残基のアミノ酸から構成されているため,32種類の1521アミノ酸からなり1011残基オーバーラップするペプチドを設計した。ペプチドは,F-moc法で合成した後,逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製し,マス・スペクトロメトリーを用いることによって,その精度を確認した。2)A.aに対して高いIgG血清抗体価を示す被験者となるEOP患者1名を選定した。同被験者のHLA-II alleleは,DRB1^*0101-DQB1^*0501/DRB1^*1302-DQB1^*0604であった。3)同被験者の末梢血単核球から,Omp34を特異的に認識するT細胞株を樹立することができた。以上,本年度の成果を踏まえ,次年度は1)被験者数を増やすこと,および2)T細胞株のOmp34上におけるT細胞認識部位を同定することを行なうことを計画している。

これらの結果は,患者集団におけるOmp34に対するT細胞応答性を規定するT細胞エピトープを同定することを可能とし,歯周病の免疫病理的な診断およびペプチド免疫療法に発展させる基礎を確立することにおいて貢献するものである。
炎症性肺疾患に対する温度応答DDSの基盤技術に関する研究（国際共同研究強化）

今年度は、研究先で学んだリポソーム吸入剤に関する研究内容および知識を活かし、特殊なリポソーム吸入剤について基礎的な研究を行った。まず、はじめに多胞性リポソームとして知られるDepofoamを吸入剤として応用することを目指した。Depofoamは現在、注射剤として市販されている製剤であり、多胞性で数十マイクロメートルほどの巨大な粒子である。このため、吸入剤として応用するためには、サイズを小さくする必要がある。我々は、シラスポーラスガラス膜を用いて、ネブライザーで吸入できる程度の大きさに粒子径を調整することにより、Mini-Depofoamを作製した。調製方法を検討することにより、Mini-depofoamの粒子径に変化がみられることを確認した。また、Depofoamで見られた小胞構造はサイズを小さくしたMini-Depofoamにおいても確認され、多胞性を維持していることを確認した。また、吸入剤の薬物として抗結核薬であるリファンピシンを選択し、リファンピシンをリポソーム内に導入する方法として、リファンピシンを包接したシクロデキストリンを用いることにより、リポソーム内にリファンピシンを効率的に導入できることを見出した。また、研究先で学んだ吸入デバイスに関する知識や現在のニーズを踏まえ、3Dプリンターを用いた研究についても、継続して行っている。子供用の吸入デバイスやより肺組織の深部にまで届くようなユニークな吸入デバイスのデザインを3Dプリンターで制作することが可能であると考えている。3Dプリンターを用いて患者に応じた粉末吸入剤の調製を試みたが、粘度制御や造形が非常に困難であり、また凍結乾燥した吸入剤においても分散性で課題が残った。このため、吸入剤に有用な知見を広げるため、他の粉末からなる剤形(錠剤)の基礎研究も合わせて行った。また、肺気管支構造に合わせたインプラントを造形した。内定年度:2015本研究の目的は、個別化医療に向けた、機能性リポソーム製剤の吸入剤に関する研究を行うことである。今後、PM2.5などの大気汚染、高齢者化により、重篤な肺疾患にかかる患者数は急激に増加していくことが想定され、効果的な吸入剤の開発が求められている。生体適合性の高いリン脂質を構成成分とするリポソームは、ドラッグキャリアとして様々な研究が行われており、幾つかの疾患に対して注射剤としてリポソーム製剤が製品化されている。しかし、リポソームの吸入剤について、製品化されているものはない。本研究は、主にリポソームなどの機能性ナノ粒子の調製において、比較的粒度分布の狭い、均一なナノ粒子を作ることができるナノ粒子製造装置を用いて、リポソームの調製を行った。粒子作成装置のパラメータ(流速、脂質濃度、有機溶媒)を変更させることにより、リポソームの粒子径を制御できることを見出した。その後、リポソーム溶液をスプレードライヤーにより噴霧乾燥し、リポソームを含有する賦形剤マイクロ粒子(通称:ナノコンポジット粒子)の調製を行った。スプレードライヤーの条件(スプレー温度、賦形剤の種類、賦形剤/リポソーム比率)を変化させ、ナノコンポジット粒子を調製した。その後、ナノコンポジット粒子粉末に水を添加し、リポソームが、完全な形で再構成されるか、確認を行った。その結果、賦形剤および、スプレードライの温度が大きく影響し、いくつかの組み合わせにおいて、スプレードライ前後において、リポソームの粒子径、粒度分布がほとんど変化しない至適なスプレードライ条件を見出した。以上の結果から、以下のことが考察される。調製した吸入剤を実際に人に投与した場合、ナノコンポジット粒子が、肺に沈着し、その後、水分で溶解して露出したリポソームが完全な状態で存在する可能性が高いことが期待できる。スプレードライヤーを用いた機能性吸入剤(リポソームなどのナノ粒子を含む、ナノコンポジット粒子からなる吸入剤)の開発において重要なことは、スプレードライ操作において、リポソームを噴霧乾燥しても、リポソームが完全な形で存在することであると言える。この点において、今年度、海外共同研究先で時間をかけて行った、スプレードライヤーによる条件検討で得られた結果は、意味のあるものであると思われる。滞在期間が、限られていたため、当初予定した、検討項目をすべて行うに至ってはいない。また、日本に帰国してから行った方が、実験計画内容十分に検討できる項目があるということも明らかになった。このため、帰国後再検討し、作成したサンプルを、海外共同研究先で再分析するといった方法が、研究の効率化の面においてよいかもしれないと考えている。今年度は、リポソーム吸入剤の個別化医療を行っていく上で重要となる、高齢者の吸入剤に関する体内動態について焦点をあてて調査を行った。呼吸器疾患の多くは、時間をかけて高齢になって発症するものが多く、高齢者に吸入剤を投与することが多い。近年、PM2.5などの大気汚染が人口が増加する地域で深刻になっていることから、重篤な肺疾患が懸念されており、吸入剤の市場拡大も想定されている。高齢者は、生理機能の低下(呼吸機能の低下、肝臓・腎臓機能の低下など)、併存疾患、多剤服用による薬物相互作用など様々な要因が体内動態に影響を与えることから、薬物動態を予測することが困難にさせている。調査の結果、吸入剤の体内動態のデータは(日本だと添付文書やインタビューフォームが相当する)、健常な若者を対象に行った結果であるものがほとんどであるため、高齢者の体内動態に関する情報はほとんど知られていないことが明らかとなった。

次に、調査を進めて各疾患に対する高齢者の情報について体系的に習得することを試みた。調査の結果、例えば、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、パーキンソン病などの疾患は、高齢になってから発症するため、一部の臨床試験により、年齢差における比較が行われていることが明らかとなった。一部の研究では、高齢者では吸入剤投与後のAUCが高くなっており、この原因としては、肺からのクリアランスや肝臓・腎臓機能が影響している可能性が示唆された。その一方で、比較的健常な高齢者においては、年齢における体内動態の差は少ないと考えられる。また、国際共同研究者と打ち合わせを行い、特殊な薬物放出を行うことのできるリポソーム吸入剤や、薬物をリポソーム内に封入するための方法についてディスカッションを行い、複数の検討を行った。前年度に予定したリポソーム吸入剤に関する開発をある程度実行することができた。さらに調査を行い、高齢者に対する吸入剤に関して有用な情報を得られることができたため、概ね順調に進展していると考えた。リポソーム吸入剤に関する有意義なディスカッションを行うことができた。したがって、海外渡航をすることに大きな意義があったと考えている。今年度は、研究先で学んだリポソーム吸入剤に関する研究内容および知識を活かし、特殊なリポソーム吸入剤について基礎的な研究を行った。まず、はじめに多胞性リポソームとして知られるDepofoamを吸入剤として応用することを目指した。Depofoamは現在、注射剤として市販されている製剤であり、多胞性で数十マイクロメートルほどの巨大な粒子である。このため、吸入剤として応用するためには、サイズを小さくする必要がある。我々は、シラスポーラスガラス膜を用いて、ネブライザーで吸入できる程度の大きさに粒子径を調整することにより、Mini-Depofoamを作製した。調製方法を検討することにより、Mini-depofoamの粒子径に変化がみられることを確認した。また、Depofoamで見られた小胞構造はサイズを小さくしたMini-Depofoamにおいても確認され、多胞性を維持していることを確認した。また、吸入剤の薬物として抗結核薬であるリファンピシンを選択し、リファンピシンをリポソーム内に導入する方法として、リファンピシンを包接したシクロデキストリンを用いることにより、リポソーム内にリファンピシンを効率的に導入できることを見出した。また、研究先で学んだ吸入デバイスに関する知識や現在のニーズを踏まえ、3Dプリンターを用いた研究についても、継続して行っている。子供用の吸入デバイスやより肺組織の深部にまで届くようなユニークな吸入デバイスのデザインを3Dプリンターで制作することが可能であると考えている。3Dプリンターを用いて患者に応じた粉末吸入剤の調製を試みたが、粘度制御や造形が非常に困難であり、また凍結乾燥した吸入剤においても分散性で課題が残った。このため、吸入剤に有用な知見を広げるため、他の粉末からなる剤形(錠剤)の基礎研究も合わせて行った。また、肺気管支構造に合わせたインプラントを造形した。重篤な肺疾患(COPD・肺がん)について患う割合は、高齢者の割合が多くなっている。
口腔粘膜上皮の癌化の各段階におけるp53statusのDNA解析

目的正常口腔粘膜上皮-上皮異形成-扁平上皮癌の各段階におけるp53遺伝子変異の有無を調査することが研究目的である.対象・方法正常口腔粘膜上皮9例,上皮異形成36例,扁平上皮癌25例のホルマリン固定パラフィン標本から,p53遺伝子変異(exon57)をダイレクトシーケンスを用いて検出した.結果p53Exon5-7の変異頻度は正常で0.5カ所/exon,上皮異形成で0.61カ所/exon,扁平上皮癌で0.62カ所/exonで各群間に有意差を認めなかった.しかしながら,上皮異形成・扁平上皮癌での変異部位はコドン180,220,221,248に集中し,正常組織での変異部位は前記4カ所に集中する傾向は認められなかった.すなわち,p53遺伝子変異の頻度は正常口腔粘膜上皮,上皮異形成,扁平上皮癌ともあまりかわらなかったが,変異部位は上皮異形成と扁平上皮癌は同じパターンで,正常口腔粘膜上皮とは明らかに異なっていた.考察今回,正常組織では特定のコドンに集中することなく散発的にp53遺伝子変異がみられ,一方,上皮異形成と扁平上皮癌では特定のコドンに変異が集中していた.このことから,ある頻度でp53遺伝子変異が散発的に生じ,そのうち特定部位の変異が生じた場合に組織学的に上皮異形成と変化する.さらに,p53遺伝子の異常が加わると扁平上皮癌となると考えられる.これは,大腸がんでいわれているtwo hit theoryが口腔扁平上皮癌でも当てはまることを示唆していると考えられる.まとめ口腔粘膜上皮の癌化過程において,前癌病変の上皮異形成の段階で癌と同じ部位にp53変異がみられた.正常口腔粘膜上皮-上皮異形成-扁平上皮癌におけるp53の遺伝子変異の有無を調査することが研究目的である。平成14年度は、正常粘膜上皮症例2例、上皮異形成症例2例、扁平上皮癌症例2例のホルマリン固定パラフィン標本を用いて条件設定のための予備実験を行った。予備実験の結果、p53のPCR産物が得られれexon5からexon8までのダイレクトシークエンスを行ったところ、6例中1例のexon5に変異がみられた。このことから、ホルマリン固定パラフィンブロックからのp53ダイレクトシークエンスが可能であることが確認できた。本実験として、免疫組織化学的p53標識率、アポトーシスインデックス既知の症例を約100例、今回の手法を用いてp53ダイレクトシークエンスを行うことにより、以下の仮説を検証することが可能となった。すなわち、前癌病変ではp53が機能し細胞にかかるストレスを、アポトーシスを誘導して処理しており、p53が変異しアポトーシスで処理できなくなったため癌となる、との仮説である。総括。研究者は正常上皮12例、上皮異形成69例、扁平上皮癌35例の免疫組織化学的p53標識率とアポトーシスインデックスのデータを有しており、平成14年度行った研究結果から、同症例のp53ダイレクトシークエンスを行うことが可能となった。これにより、口腔扁平上皮から上皮異形成、扁平上皮癌へと進行する癌化過程でのp53stalusの解析が可能となった。正常口腔粘膜上皮-上皮異形成-扁平上皮癌におけるp53の遺伝子変異の有無を調査することが研究目的である。予備実験の結果、P53のPCR産物が得られexon5からexon8までのダイレクトシークエンスを行ったところ、6例中1例のrxon5に変異がみられた。平成15年度は,正常上皮,上皮異形成,扁平上皮癌の計77例を対象にp53ダイレクトシークエンスを行った.現在,結果を解析中であるが上皮異形成,扁平上皮癌において多くのp53遺伝子変異が認められている.今後,データの解析を進め,前癌病変ではp53が機能し,細胞にかかるストレスをアポトーシス誘導して処理し、p53が変異しアポトーシスで処理できなくなったため癌となる、との仮説を検証する。総括。研究者は正常上皮、上皮異形成、扁平上皮癌の77例の免疫組織化学的p53標識率とアポトーシスインデックスのデータを有しており、平成15年度行ったp53ダイレクトシークエンスにより、口腔扁平上皮から上皮異形成、扁平上皮癌へと進行する癌化過程でのp53statusの解析が可能となった。目的正常口腔粘膜上皮-上皮異形成-扁平上皮癌の各段階におけるp53遺伝子変異の有無を調査することが研究目的である.対象・方法正常口腔粘膜上皮9例,上皮異形成36例,扁平上皮癌25例のホルマリン固定パラフィン標本から,p53遺伝子変異(exon57)をダイレクトシーケンスを用いて検出した.結果p53Exon5-7の変異頻度は正常で0.5カ所/exon,上皮異形成で0.61カ所/exon,扁平上皮癌で0.62

カ所/exonで各群間に有意差を認めなかった.しかしながら,上皮異形成・扁平上皮癌での変異部位はコドン180,220,221,248に集中し,正常組織での変異部位は前記4カ所に集中する傾向は認められなかった.すなわち,p53遺伝子変異の頻度は正常口腔粘膜上皮,上皮異形成,扁平上皮癌ともあまりかわらなかったが,変異部位は上皮異形成と扁平上皮癌は同じパターンで,正常口腔粘膜上皮とは明らかに異なっていた.考察今回,正常組織では特定のコドンに集中することなく散発的にp53遺伝子変異がみられ,一方,上皮異形成と扁平上皮癌では特定のコドンに変異が集中していた.このことから,ある頻度でp53遺伝子変異が散発的に生じ,そのうち特定部位の変異が生じた場合に組織学的に上皮異形成と変化する.さらに,p53遺伝子の異常が加わると扁平上皮癌となると考えられる.これは,大腸がんでいわれているtwo hit theoryが口腔扁平上皮癌でも当てはまることを示唆していると考えられる.まとめ口腔粘膜上皮の癌化過程において,前癌病変の上皮異形成の段階で癌と同じ部位にp53変異がみられた.
吻側腹外側延髓は迷走神経性心臓抑制機構を抑制するか

クロラロースウレタン麻酔ラットを用い、延髄レベルにおける交感神経系ニューロン群による迷走神経性心臓抑制機構に対する抑制性影響の有無について、次の実験を行った。迷走神経性心臓抑制の示標には、大動脈神経の電気刺激による圧受容器反射性徐脈(BVB)を用いた。1.吻側延髄腹外側野(RVLM)の交感神経促進系基幹ニューロン群の細胞体を、興奮性アミノ酸DL-ホモシステイン酸(DLH、0.3M、40nl)の微量圧注入で化学刺激した。著明な昇圧とともに、迷走神経性心臓抑制機能の示標としての圧受容器反射性迷走神経性徐脈(BVB)は著明に抑制された。2.RVLMには抑制性の呼吸ニューロン群が存在するが、横隔神経の放電は抑制されているにも関わらず、BVBの抑制は見られた。3.RVLMは、圧受容器入力により尾側腹外側延髄CVLMを介するGABA入力によりtonicな抑制を受けている。この事実を利用し、RVLMに対しGABA拮抗剤ビククリンを微量圧注入(1mg/ml、80nl)し、脱抑制により興奮させた。この結果、昇圧とともに、BVBが著明に抑制されることを確認した。4.BVBの抑制は、頚髄上端の離断、中脳離断後でも観察された。5.以上の結果より、RVLMの交感神経促進系基幹ニューロン群が、延髄レベルにおいて、迷走神経性心臓抑制ニューロンを抑制する事実を確認した。
微生物群集機能を利用したラン藻由来有毒物質の処理手法の確立

本研究では、世界的に水環境中で問題になっているラン藻由来有毒物質に対して高効率処理技術を確立するために、強力な肝臓毒であるmicrocystinの特異的分解菌の生物膜(バイオフィルム)処理への応用を検討するとともに生物膜処理を導入した浄水場における生物膜の微生物群集構造解析を行った。microcystin類は浄水処理における塩素処理過程でその毒性が顕著に減少することが知られているが、反応に伴うトリハロメタン前駆物質の増加や塩素反応量を超えるmicrocystinの発生が懸念されている。そのため、安全な水域環境を確保する上でmicrocystinの処理技術の開発は世界的にも焦眉の課題となっている。そこで、平成16年度はすでに単離されているNovosphingobium sp.と採取ポイントが異なる中国のサンプルを用いて、スクリーニング培地のpHを9.5に固定して探索を行った。その結果、高活性のmicrocystin分解能を有する耐アルカリ性菌Sphingopyxis sp.C-1株の単離に成功した。さらに、平成17から18年度はmicrocystin分解菌Sphingopyxis sp.C-1株の特性解析を進め、microcystin分解酵素が膜タンパク質であることを見出した。また、生物膜処理への応用において、スライドガラスと形状の異なるPVC製担体への付着性を評価し、C-1株の両担体への良好な付着が確認された。さらに、ハニカム構造のPVC製担体に付着させたC-1株を用いてmicrocystin分解試験を行った結果、1細胞当たりのmicrocystin分解速度が懸濁系よりも顕著に高くなることが明らかとなった。一方、浄水場の生物膜においてmicrocystin分解に重要な役割を果たすと考えられるmicrocystin分解酵素をコードする遺伝子mlr4を検出することに成功した。本研究では、世界的に水環境中で問題になっているラン藻由来有毒物質に対して高効率処理技術を確立するために、強力な肝臓毒であるmicrocystinをモデル物質として本年度は新規microcystin分解菌、特に好アルカリ性分解菌の探索を行った。現在までにmicrocystin分解菌は世界的にも3種しか報告されておらず、新たなmicrocystin分解菌の発見は焦眉の課題となっている。さらに、本研究の前段において茨城県霞ヶ浦より単離されたNovosphingobium sp.を含め、そのほとんどが中性付近に高い活性を示すことが分かっている。しかしながら、実際にアオコが発生している水域由来の細菌群集のmicrocystin分解能はアルカリ領域においても中性付近のものと同程度であることから、アルカリ性において活性の高いバクテリアの存在が考えられる。また、アオコが発生している時期には水域のpHが10を超えることもあるため、安定したmicrocystin分解能を有した処理システム構築のためには好アルカリ性microcystin分解菌の単離が必須である。そこで本年度は、すでに単離されているNovosphingobium sp.と採取ポイントが異なる中国貴州省紅楓湖のサンプルを用いて、スクリーニング培地のpHを9.5に固定して探索を行った。その結果、高活性のmicrocystin分解能を有するmicrocystin分解菌の単離に成功した。本分解菌(C-1株)は黄色のコロニーを形成するグラム陰性の桿菌で、16SrRNA配列の解析によりのSphingopyxis sp.に分類されることが分かった。茨城県霞ヶ浦より単離された分解菌Novosphingobium sp.(MD-1株)と分解活性について比較検討を行った結果、C-1株はアルカリ性において増殖するにもかかわらず、どちらの菌もmicrocystin分解活性はpH中性付近で最大となることが見出された。

本研究では、世界的に水環境中で問題になっているラン藻由来有毒物質に対して高効率処理技術を確立するために、強力な肝臓毒であるmicrocystinをモデル物質として本年度は新規microcystin分解菌の特性解析および分解菌を用いた生物膜の構築を行った。昨年度は、すでに単離されているMD-1株と採取ポイントが異なる中国貴州省紅楓湖のサンプルを用いて、スクリーニング培地のpHを9.5に固定してmicrocystin分解菌の探索を行った結果、高活性のmicrocystin分解能を有する分解菌の単離に成功した。分解菌C-1株は黄色のコロニーを形成するグラム陰性の桿菌であるとともに16S rDNA配列の解析によりSphingopyxis sp.に分類された。さらに、MD-1株と分解活性について比較検討を行った結果、両菌株ともmicrocystin分解活性はpH中性付近で最大となることが見出されたが、この事象を解明するためには、更なる特性解析や遺伝子レベルでの解析が必要不可欠である。そこで、増殖に及ぼす初期pHの影響を解析した結果、C-1株はpH11においても良好な増殖を示したが、pH7が好適pHであった。このことは、C-1株がアルカリ耐性菌であることを示している。アルカリ耐性菌は、Na^+/H^+アンチポーターにより細胞内のpHを安定させており、microcystin分解活性がpH中性で最大になるのはmicrocystin分解酵素の至適pH依存していることが示唆された。実際に、microcystin分解酵素をコードする遺伝子mlrAおよびその周辺配列を解析した結果、C-1株より既往の報告と相同の遺伝子クラスターを見出した。一方、生物膜の形成およびその処理能力を解析するためにリアクターを設計した。遺伝子レベルでの詳細な解析を行うために、容積は230mLとし、上向流型で連続培養可能な装置をポリカーボネート樹脂により作成した。本研究では、世界的に水環境中で問題になっているラン藻由来有毒物質に対して高効率処理技術を確立するために、強力な肝臓毒であるmicrocystinをモデル物質として本年度は前年度までに単離したmicrocystin分解菌の生物膜(バイオフィルム)処理への応用を検討するとともに生物膜処理を導入した浄水場における生物膜の微生物群集構造解析を行った。microcystin類は浄水処理における塩素処理過程でその毒性が顕著に減少することが知られているが、反応に伴うトリハロメタン前駆物質の増加や塩素反応量を超えるmicrocystinの発生が懸念されている。そのため、安全な水域環境を確保する上でmicrocystinの処理技術の開発は世界的にも焦眉の課題となっている。そこで本年度は、前年度に引き続き耐アルカリ性microcystin分解菌Sphingopyxis sp.C-1株の特性解析を進め、microcystin分解酵素が膜タンパク質であることを見出した。
マスト細胞の組織浸潤におけるプロテイン・フォスファターゼ2Aの役割

マスト細胞は骨髄で最終分化を終えぬまま末梢血中移動し、末梢組織において血管外へ浸潤し最終分化を行う。マスト細胞は全身の皮膚や消化管、腹腔内などに生理的に存在するが、血管内に存在するマスト細胞前駆細胞が末梢組織内へ浸潤する機構についてはよくわかっていない。MITF遺伝子のプロモーター領域に挿入されたトランスジーンをホモに持つtg/tgマウスでは皮膚以外の全組織でマスト細胞が欠損する。ところが、このマウスの骨髄細胞や脾臓細胞をインターロイキン3存在下で培養すると、野生型マウスの場合と同じように培養マスト細胞(CMC)を得ることが出来る。従って、tg/tgマウスではマスト細胞の前駆細胞は存在するが、その細胞が組織へ浸潤することが出来ない可能性、更にはMITFが転写活性化を行う遺伝子の中にマスト細胞の組織浸潤に関与する分子が含まれている可能性が考えられる。tg/tgマウスの腹腔内におけるマスト細胞欠損について調べるため、CMCをtg/tgマウスの腹腔内に注射した。野生型マウス由来のCMC(+/+-CMC)は腹腔内で生存し続けたが、tg/tgマウス由来CMC(tg/tg-CMC)は死滅した。この現象はin vitroでも再現され、+/+-CMCは線維芽細胞との共生培養において線維芽細胞に接着し増殖したが、tg/tg-CMCは接着せず死滅し、tg/tg-CMCの接着能の欠陥が明らかになった。次にtg/tg-CMCにおいて発現が著しく低下し、かつ接着に関与する可能性がある遺伝子の単離をサブトラクション法により試みた。出来上がったライブラリーから600クローンを単離し、その中にSgIGSF (Spermatogenic Immunoglobulin Superfamily)をコードするクローンを見つけた。SgIGSFは細胞外に3つの免疫グロブリン様構造を持つ接着分子である。tg/tg-CMCにSgIGSFを遺伝子導入すると、線維芽細胞への接着能が正常化した。以上の結果より、SgIGSFはマスト細胞が線維芽細胞に接着する時に使われる接着分子で、その転写障害がMITF変異マウスにおける腹腔マスト細胞欠損の一因である可能性が考えられた。プロテイン・フォスファータゼ2A(PP2A)B56γ制御サブユニットのN末欠失アイソフォーム(異変γ1)の単離:(1)高転移性マウス・メラノーマBL6細胞では、PP2A B56γ制御サブユニット遺伝子においてレトロウイルスポゾンがイントロンに挿入し、そのアリルからは新たなスプライシングによってレトロウイルスポゾンの一部が融合したmRNAが転写された。このmRNAはN末の65アミノ酸残基を欠失するPP2A)B56γ制御サブユニットのN末欠失型アイソフォーム(変異γ1)がコードされていた。(2)PP2Aホロ酵素は構造・触媒サブユニットの2量体コアに制御サブユニットが結合したヘテロ3量体である。in vitroでの再構築系によるフォスファターゼ・アッセイの結果、変異γ1は正常型アイソフォーム(B56γ1)を含むPP2Aホロ酵素の脱リン酸化活性に対する阻害因子であった。変異γ1の細胞内局在:(1)作製した抗体による免疫細胞化学の結果、PP2A B56γ制御

サブユニットの細胞質内における主たる局在部位はゴルジ体であることがわかった。(2)エピトープ・タグした蛋白の免疫細胞化学の結果、変異γ1は主として小胞体とゴルジ体の間(ERGIC)の小胞に局在するとともに、ゴルジ58Kやp115分子の局在を変化させた。即ち、両分子の局在はゴルジ体主体からERGIC主体へと変化した。変異γ1による細胞内小胞輸送の加速化:(1)温度感受性変異型ウイルス蛋白質ts045VSVGは温度依存性に細胞内で小胞体→ゴルジ体→細胞膜へと小胞輸送される。この蛋白に自家蛍光物質GFPを融合させ生細胞内における局在を可視化した培養系を用いて、変異γ1の細胞内小胞輸送系における影響を調べた。小胞体に蓄積したts045 VSVGが細胞膜に到達するのに要する時間は変異γ1発現細胞において有意に短縮していた。マスト細胞は骨髄で最終分化を終えぬまま末梢血中移動し、末梢組織において血管外へ浸潤し最終分化を行う。マスト細胞は全身の皮膚や消化管、腹腔内などに生理的に存在するが、血管内に存在するマスト細胞前駆細胞が末梢組織内へ浸潤する機構についてはよくわかっていない。MITF遺伝子のプロモーター領域に挿入されたトランスジーンをホモに持つtg/tgマウスでは皮膚以外の全組織でマスト細胞が欠損する。ところが、このマウスの骨髄細胞や脾臓細胞をインターロイキン3存在下で培養すると、野生型マウスの場合と同じように培養マスト細胞(CMC)を得ることが出来る。従って、tg/tgマウスではマスト細胞の前駆細胞は存在するが、その細胞が組織へ浸潤することが出来ない可能性、更にはMITFが転写活性化を行う遺伝子の中にマスト細胞の組織浸潤に関与する分子が含まれている可能性が考えられる。tg/tgマウスの腹腔内におけるマスト細胞欠損について調べるため、CMCをtg/tgマウスの腹腔内に注射した。野生型マウス由来のCMC(+/+-CMC)は腹腔内で生存し続けたが、tg/tgマウス由来CMC(tg/tg-CMC)は死滅した。この現象はin vitroでも再現され、+/+-CMCは線維芽細胞との共生培養において線維芽細胞に接着し増殖したが、tg/tg-CMCは接着せず死滅し、tg/tg-CMCの接着能の欠陥が明らかになった。次にtg/tg-CMCにおいて発現が著しく低下し、かつ接着に関与する可能性がある遺伝子の単離を試みた。サブトラクション法に工夫を凝らし、出来上がったライブラリーから600クローンを単離し、その中にSgIGSF(Spermatpgenic Immunoglobulin Superfamily)をコードするクローンを見つけた。SgIGSFは細胞外に3つの免疫グロブリン様構造を持つ接着分子である。tg/tg-CMCにSgIGSFを遺伝子導入すると、線維芽細胞への接着能が正常化し、腹腔内での生存能も回復した。以上の結果より、SgIGSFはマスト細胞が線維芽細胞に接着する時に使われる接着分子で、マスト細胞の腹腔内における生存に寄与する分子であることが明らかとなり、その転写障害がMITF変異マウスにおける腹腔マスト細胞欠損の一因であると考えられた。