hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ナトリウム温度ライダーに応用するレーザ周波数の超精密制御方法の研究

この状態で、AOに印加する超音波の強度に対する変換効率を計測し、システム全体の光学効率からインジェクションに必要となるレーザパワーの見積を行った。また、波長計を用いてレーザ周波数を計測した。パルスレーザに対してインジェクションをかけ、波形をオシロスコープでモニターしながらAOの周波数を切替え、それぞれの周波数に応じてパルスレーザのインジェクションが正常にかかるかどうかを確認しながら、最適条件を設定した。この状態を確認した上、長時間観測により、システムの安定性の確認をした。また、得られたデータの解析結果からライダーシステムの動作を確認した。本研究は、ナトリウムライダーに用いる種レーザ(連続光レーザ)に関する周波数制御手法の研究であり、ライダー観測のコア技術の研究である。次の手法で種レーザの周波数制御をし、種から成長するパルスレーザの周波数を制御する(インジェクションシーディング技術)。種レーザ(1064/1319nm)の和周波で生成した589nm光を用いて、ドップラーフリー分光法により589nmのレーザ絶対周波数を特定の周波数にロックする。音響光学素子を用いてその波長からプラス/マイナスー定周波数だけ周波数シフトする技術を確立する。周波数シフト装置はライダーに組み込まれ、最終年度は観測データの取得をしながら調整を行ってきた。種レーザの1064/1319和周波による589nmコヒーレント光の生成は、生成に用いる結晶の前の和周波アライメントをより精密に行うことにより、文献値を2倍上回る出力が得られた。コヒーレント光をナトリウムセルに通し、ドップラーフリー分光による絶対周波数のモニターと、コヒーレント光の周波数ロッキングは数MHz以内の精度で達成できており、観測に必要な充分なレーザチューニング精度を達成した。ただし、加熱セルが原因でロッキングエラーが生じることがあるので、改善を要する。音響光学素子(AO)を用いたレーザ周波数の高速変換システムは、光軸に対するAO素子入射角度の最適化により、周波数変換効率を最も高めることができた。周波数切替を行ってもインジェクションの光路がかわらないように調整することで、基準周波数±630MHzの3周波数の切替を、電気的に1kHz以下の精度で行うことを確認し、観測を継続した。また、得られたデータのナトリウム密度解析を行い、論文にまとめた。
ライボザイムベクターによる血管新生抑制を利用した腫瘍増殖抑制に関する研究

腫瘍の増殖において血管新生が重要であることは広く知られている。この腫瘍の血管新生を抑制することは腫瘍増殖抑制を導き抗腫瘍療法に新たな道を供給する。この血管新生は促進因子と抑制因子の両方で制御されており、我々は血管新生抑制因子を強制発現し腫瘍の増殖抑制効果を証明してきた。今回はVascular endothelial growthfactor(VEGF)に着目しこのリガンドであるVEGF receptor(VEGF-R)をターゲットとして血管新生を抑制することを目標とし、その手段としてライボザイムを用いることとした。しかしながらこのVEGF-Rの発現を抑制するライボザイムを産生するベクター作成は困難を極め断念した。その代わりとなり得る候補としてRNA interference(RNAi)に注目した。これは数十塩基の二重鎖RNAでありながら強力なmRNA発現抑卸効果を有する。我々はVEGF-R mRNAの発現を抑制するRNAiをデザインした。このRNAiの候補はその構造から4種類が選ばれsilencer siRNAkitを用いてRNAiを作成しVEGF-Rを発現しているマウスのmicro vascularcell line(MS1-VEGF)に投与したところ一つの候補で60%のVEGF-R mRNA発現抑制効果を示した。この候補RNAiを発現するRNAiと同等に作用するヘアピン構造をもったRNA(分泌されると速やかにヘアピン部で折れ曲がり二重鎖のごとく働く)を発現するベクター(pSilencer-VEGF-R)を作成しその腫瘍増殖抑制効果を検討した。このpSilencer-VEGF-RをMS1-VEGFに形質導入したところVEGF-Rの発現は有意に(60%)抑制された。このベクターをマウスの転移性肺腫瘍モデルにin vivo形質導入を行ったが予想したほどの腫瘍抑制効果は認められなかった。本研究では(1)vascular endothelial growth factor(VEGF), basicfibroblast growthfactor(bFGF), epiderlual growth factor(EGF)等の血管新生因子をコードするmRNAを切離するライボザイムを発現するベクター及び(2)VEGF receptorのsolble receptor fragmentのFlk1やFlt1をコードするベクターを用いて腫瘍血管新生の完全制御を試みる。(1)ライボザイムは独特のハンマーヘッド構造をもちRNAのある特異配列(GUC)に結合し、強力にその部分でRNA基質を切離する能力をもつ。このライボザイムにより形質導入された細胞は強力にVEGF mRNAの発現がknock downされる。このVEGFmRNAのknock downに加え、(2)VEGF soluble receptor fragmentを過剰発現させVEGFとVEGF receptorとの結合もブロックし完全にVEGFを抑制する。発現プラスミドは非ウイルス性のliposamal vectorを用いて肺の内皮細胞及び早期の腫瘍結節に形質導入する。この形質導入を我々が確立してきたマウス転移性肺腫瘍モデルに適応し、その抗腫瘍効果を評価することが我々の研究の目標である。現段階ではVEGFmRNAを切離するライボザイムを作成中であるが、現在までにその有力な候補は得られていない。そのためにライボザイムのようにRNAを切離するRNA interferenceも候補として考慮中である。またVEGF receptorのFlk1やFlt1もこのライボザイムやRNA interferenceを用いて制御することも準備中である。現在までに公に発表した業績はない。また研究の主たる目的であったライボザイムベクターの作製にも成功していない。これは、ライボザイムベクターの設計に問題があったと考えられる。従って、ライボザイムベクターに替わり、血管新生を抑制するRNA interferenceを作製することでその代用とした。本研究では、血管新生抑制のターゲットをVEGF receptorに定め、Flk1およびFlt1を抑制するRNA interferenceをデザインした。

現在までに、マウスのVEGF recepteor-1 mRNAを抑制する4つの候補のsiRNAを作製した。それらは、遺伝子配列とGC比から選択された。VEGF R1及びR2が発現していることが周知であるマウスのMS1-VEGF細胞株に、これらの4種類の候補siRNAを投与し、48時間培養したところ、Mockに比べて最大で60%以上のVEGF R1mRNA発現抑制を認めた。このため、最も効果が期待できる候補siRNAと同様の配列をもつloop構造を持ったmRNAが発現できるpSilencer-VEGF R1を作製し、前述のMS1-VEGF細胞株に形質導入したところ、最大で60%以上のVEGF R1mRNA発現抑制を認めた。その結果、siRNAを用いた血管新生抑制を利用した腫瘍増殖抑制の可能性が、充分示唆された。
PPARα欠損マウスを用いた酸化型LDLの量的変動機構の解明と新規薬効物質の探索

新たに、PPARαノックアウトマウスに0.2%コレステロール食を8ヵ月間与え、高コレステロール血症、酸化型LDLの生成、血清・肝臓過酸化物量の増加、肝臓組織のアポトーシスを認めた。肝臓蛋白の発現変動解析から、肝細胞のコレステロール代謝能の低下と酸化ストレスの増大の要因と目される分子数種を特定した。先年度作成した病態マウスサンプルと併せて解析を行い、炎症性因子(NF-κB、TNFα等)、線維化因子(TGF-β1、TIMP-1等)、アポトーシス誘発因子(Bax、tBid等)の発現増加並びにストレス応答キナーゼ(PKC、PI3K等)の活性化を認め、病態マウスの表現型変化の解釈に有用な情報が得られた。新たなフェノール性食品素材としてブドウ外皮乾燥粉末の機能評価を行い、0.5%濃度でコレステロール負荷4ヵ月後から4ヵ月間併用飼育した。コレステロール単独飼育群と比較し、酸化型LDLと血清・肝臓過酸化物の低値を認めた。関連分子のmRNA・蛋白発現量解析結果から、肝臓のコレステロール蓄積量減少に伴い酸化ストレスが低下し細胞毒性が軽減されたものと推測された。さらに本年度は、これまでの研究成果を発展させる試みとして、PPARαヘテロマウスを作成し、同様の病態モデルの構築を行い、その条件をほぼ確定することができた。ヒト肝臓にPPARαは少量発現しているため、ヘテロマウスの解析はヒトへの外挿を考える上でさらに有用な情報をもたらすと期待される。また、PPARα活性化作用を有するポリフェノール類が最近報告され、薬効評価の面からも新たな展開が期待できる。本年度を通して、コレステロール・酸化ストレス・細胞毒性の関連についてさらに理解が深まり、新たな研究の方向が定まった。今後、発展型の研究を通して、コレステロール性障害の発生機構と治療・予防法に関して有益な情報を提案できるよう努めたい。PPARα欠損マウスに1%コレステロール含有粉末食を6ヵ月間与え、高コレステロール血症、酸化型LDLの生成、血中過酸化脂質修飾物(HNE修飾蛋白)の増加が確認された。肝臓では重度のコレステロール蓄積、過酸化物(HNE修飾蛋白、MDA、8-OHdG)の増加が認められ、コレステロールと過酸化物の量的相関が示唆された。肝臓蛋白の発現変動解析から、肝細胞のコレステロール合成・異化・運搬機能は著しく低下していることが見出された。またNADPHオキシダーゼの増加、カタラーゼ、SOD、グルタチオンペルオキシダーゼの減少が確認ざれ、酸化ストレス増加の要因と考えられた。肝組織には炎症、線維化、アポトーシスが認められ、コレステロールの過剰蓄積に伴う各種代謝障害、酸化ストレスの増加により細胞毒性が高まったものと推測された。フェノール性食品素材としてタマネギ外皮乾燥粉末を0.5%の濃度でコレステロール負荷4ヵ月目から3ヵ月間併用摂食させたところ、酸化型LDLと血・肝過酸化物の減少が確認された。肝臓の酸化ストレス関連酵素の発現量はほぼ正常のレベルであった。また血・肝コレステロール値も低下しており、肝臓細胞障害も緩和されていた。肝臓細胞のコレステロール蓄積量減少により、酸化ストレス並びに細胞毒性が軽減されたものと判断された。現在、その他のフェノール性物質の機能評価を行っている。本研究における低濃度コレステロール・長期摂食による病態モデルの構築は、ヒトの病態発症の条件に類似したものと考えられ、得られる成果はヒトのコレステロール性障害を理解する上で極めて重要な情報をもたらすものと期待される。本年度は、コレステロールによる肝臓細胞障害と酸化型LDL生成の関連について、ある程度理解が深まった。来年度は、本年度得られた成果をより発展させるよう努めたい。
散逸型方程式における特異非線形構造の解析

平成30年度は、非線形楕円型および特異拡散方程式、および関連する常微分方程式を中心に研究を進め、以下のような成果を得た。楕円型偏微分方程式については、非等方的Finslerノルムを含む種々のHardy型不等式及びKato不等式(トレースHardy不等式)、monomial weightを持つ対数型Sobolev不等式及び関連する変分問題に関連した方程式、divergence-freeまたはcurl-freeベクトル場に対するHardy-Leray不等式の最良定数について成果が得られた。また、変動指数をもつソボレフ埋め込みのコンパクト性、ソボレフ臨界指数に達する変動指数をもつ半線型放物型方程式の時間大域解の最大値ノルムの時間大域的有界性に関して大きな進展があった。熱方程式の解の対数凸性の精密化した凸性概念を導入し、熱方程式が保存する最も強い凸性の同定に成功した。ポテンシャル項付き半線形熱方程式の時間大域可解性に関する藤田指数の決定に関して成果が得られた。対数拡散方程式と反応項を結合した系に対し、進行波の存在と安定性に関する問題を解決した。このほか、放物型偏微分方程式については、単調成長を拘束条件に持つ勾配流の例として非斉次項付き拡散方程式に対応する問題の可解性や解の正則性・比較原理・長時間挙動を研究し、分数冪ラプラシアンの境界値問題に対する解の正則性理論や一般化された勾配流に対する変分原理について大きな進展があった。常微分方程式については、散逸型方程式の定常問題であるMoore-Nehari方程式の2点境界値問題について研究が進んだ。その問題の正値対称解から正値非対称解が分岐する現象を発見することができ、さらに分岐が起こる瞬間のパラメータの値を厳密に求めた。各課題について順調に研究が進展した。楕円型方程式については、Hardy不等式の一般化について大きな進展があった。放物型方程式については、特異拡散方程式系の解の正則性に関する問題を解決し、定性的挙動について研究が進んだ。常微分方程式についても境界値問題の解析に大きな進展があった。放物型偏微分方程式については、特異拡散項を含む方程式系の解の非一意存在に関する研究の完成を目指すとともに、反応項との相互作用による現象の記述と解析手法の確立を目指してさらに考察を進める。特に、対数拡散方程式の解の構造を線形拡散方程式との違いを意識して調べ、その解析手法の確立と新しい非線形構造の発見を目指す。また、Hardy型ポテンシャルを持つ放物型方程式における特異解の存在と構造の問題、非線形拡散方程式における動的特異点の存在とその性質の解明を図る。特に、きわめて遅い拡散を伴う方程式において、特性が凍結することにより生じる漸近的非対称解の存在とその形状についての研究を開始する。楕円型方程式については、特に多様体上の解の対称性とその破れの問題に対して分岐理論と変分法を用いて考察し、ユークリッド空間上の領域との違いを明らかにしていく。また、特異解の分類と漸近形状についてより詳細な性質を明らかにした、対応する放物型方程式のダイナミクスに与える影響について調べていく。関連する常微分方程式の境界値問題の重要性が増していることから、特に優線形の場合の解の構造を解析するための強力な手法の開発を目指す。また変分問題との関連についても考察を加える。このほか、これまでにやり残した研究について検討を進め、今後の研究の方向を明確にする。楕円型偏微分方程式については、一般有界領域上での臨界型Hardy不等式の最良定数の値及びその達成可能性と領域の幾何学的形状の関係、重み付き臨界型Hardy不等式の確立及びKolmogorov作用素を主部に持つ発展方程式の可解性への応用について成果を上げた。また1次元分数べきTrudinger-Moser不等式の全空間バージョンの確立とその最良定数の達成可能性・不可能性、Trudinger-Moser型不等式と関連する最大化問題の研究についても進展があった。放物型偏微分方程式については、非線形境界条件付き熱方程式の解の初期トレースの特徴付け及び解が存在するための初期関数の最も強い特異性の同定,ポテンシャル項付熱方程式の解の漸近解析, Finsler Laplace作用素とFinsler熱方程式について研究を行った.また、ポテンシャル項付藤田型方程式の時間大域可解性、非線形楕円型方程式の可解性等の研究も行った.このほか、高次元特異性を有する解の存在するための条件をかなり一般性のある枠組みで明らかにした。非線形発展方程式については、勾配構造を有する発展方程式を対象にWED汎関数を用いた変分的定式化を拡張し、時間大域的な理論を構築した。その他,解の単調性を拘束条件に持つ発展方程式を一般的な枠組みで扱い,それに適した解の概念を導入し,実際にその存在の証明や諸性質について議論した.そのほか、散逸型方程式の定常問題の1つである、一次元の(p,q)-ラプラス作用素をもつある2点境界値問題について、その問題に含まれるパラメータと正値解の個数の関係を完全に明らかにした。楕円型偏微分方程式に対して各種の不等式を確立し、解の構造の研究に応用した。放物型方程式については,非線形境界値問題の解の存在、特異解の構成について進展があった.より一般の発展方程式については変分的定式化についての拡張などについて成果をあげた。

楕円型偏微分方程式については、非等方的Finslerノルムを含む種々のHardy型不等式及びKato不等式(トレースHardy不等式)、monomial weightを持つ対数型Sobolev不等式及び関連する変分問題に関連した方程式、divergence-freeまたはcurl-freeベクトル場に対するHardy-Leray不等式の最良定数について成果が得られた。また、変動指数をもつソボレフ埋め込みのコンパクト性、ソボレフ臨界指数に達する変動指数をもつ半線型放物型方程式の時間大域解の最大値ノルムの時間大域的有界性に関して大きな進展があった。熱方程式の解の対数凸性の精密化した凸性概念を導入し、熱方程式が保存する最も強い凸性の同定に成功した。ポテンシャル項付き半線形熱方程式の時間大域可解性に関する藤田指数の決定に関して成果が得られた。対数拡散方程式と反応項を結合した系に対し、進行波の存在と安定性に関する問題を解決した。このほか、放物型偏微分方程式については、単調成長を拘束条件に持つ勾配流の例として非斉次項付き拡散方程式に対応する問題の可解性や解の正則性・比較原理・長時間挙動を研究し、分数冪ラプラシアンの境界値問題に対する解の正則性理論や一般化された勾配流に対する変分原理について大きな進展があった。常微分方程式については、散逸型方程式の定常問題であるMoore-Nehari方程式の2点境界値問題について研究が進んだ。その問題の正値対称解から正値非対称解が分岐する現象を発見することができ、さらに分岐が起こる瞬間のパラメータの値を厳密に求めた。各課題について順調に研究が進展した。楕円型方程式については、Hardy不等式の一般化について大きな進展があった。放物型方程式については、特異拡散方程式系の解の正則性に関する問題を解決し、定性的挙動について研究が進んだ。常微分方程式についても境界値問題の解析に大きな進展があった。今年度進展があった課題の完成を計るとともに、新たな方向の問題に取り組む予定である。特に、Hardy型ポテンシャルを持つ放物型方程式の解の構造、透過媒質方程式に対する特異性と非線形の相互作用、変分構造と特異非線形構造の関連について重点的に研究を進める予定である。放物型偏微分方程式については、特異拡散項を含む方程式系の解の非一意存在に関する研究の完成を目指すとともに、反応項との相互作用による現象の記述と解析手法の確立を目指してさらに考察を進める。特に、対数拡散方程式の解の構造を線形拡散方程式との違いを意識して調べ、その解析手法の確立と新しい非線形構造の発見を目指す。また、Hardy型ポテンシャルを持つ放物型方程式における特異解の存在と構造の問題、非線形拡散方程式における動的特異点の存在とその性質の解明を図る。特に、きわめて遅い拡散を伴う方程式において、特性が凍結することにより生じる漸近的非対称解の存在とその形状についての研究を開始する。楕円型方程式については、特に多様体上の解の対称性とその破れの問題に対して分岐理論と変分法を用いて考察し、ユークリッド空間上の領域との違いを明らかにしていく。また、特異解の分類と漸近形状についてより詳細な性質を明らかにした、対応する放物型方程式のダイナミクスに与える影響について調べていく。
強磁性膜による核偏極生成技術

原子核の(特に短寿命各)核スピン偏極生成技術は,原子核物理の実験研究に不可欠のみならず,他分野の物理研究にも極めて重要かつ有効な手段である.我々の研究室では以前から,偏極した短寿命ベータ放射性核に適用可能なNMR法を用いて,幅広い分野の実験物理の研究を続けてきた.これらの研究にベータ放射性核の核スピン偏極の生成は必須であり,今までは主として核反応の偏極現象を用いてきた.一方1974年より原子物理の分野において,加速されたイオン原子と固体とのビーム・ホイル相互作用を用いる新しい核偏極生成技術が研究されてきた.我々はいち早くこの技術に注目し,特に斜膜法による核偏極生成技術が高い一般汎用性と簡便性を持ち,短寿命核を用いる実験には極めて有効である事を実証した.そしてこの技術を我々のNMR法の新しい実験研究に導入し,より幅広い物理研究を発展させた.さらにこのビーム・ホイル法の新しい応用発展を目指して,強磁性薄膜の偏極電子捕獲による核偏極生成技術新技術開発の基礎研究を開始した.その第一段階として,蒸着膜表面のビーム・ホイル相互作用への影響の研究を行なった.強磁性薄膜の生成は一般的には困難であり蒸着法が最も実現性が高いが,これ用いるためには蒸着膜表面の微視的状態について正確に知る必要があった.このため,高分子薄膜マイラー(5000オングストローム厚)の表面上に極薄い金(10-100オングストローム厚)を蒸着し,この薄膜を用いた斜膜法で生成された短寿命ベータ放射性核の核偏極を測定することにより,その表面状態の微視的形状の種々の知見を得た.この測定に最適かつ収量の多い新しい装置(多重斜膜装置を付置した静伝型反跳核収集器とベータNMR測定装置)を製作し,多くの基礎データを収集し次の2段階への足掛りを築いた.原子核の(特に短寿命各)核スピン偏極生成技術は,原子核物理の実験研究に不可欠のみならず,他分野の物理研究にも極めて重要かつ有効な手段である.我々の研究室では以前から,偏極した短寿命ベータ放射性核に適用可能なNMR法を用いて,幅広い分野の実験物理の研究を続けてきた.これらの研究にベータ放射性核の核スピン偏極の生成は必須であり,今までは主として核反応の偏極現象を用いてきた.一方1974年より原子物理の分野において,加速されたイオン原子と固体とのビーム・ホイル相互作用を用いる新しい核偏極生成技術が研究されてきた.我々はいち早くこの技術に注目し,特に斜膜法による核偏極生成技術が高い一般汎用性と簡便性を持ち,短寿命核を用いる実験には極めて有効である事を実証した.そしてこの技術を我々のNMR法の新しい実験研究に導入し,より幅広い物理研究を発展させた.さらにこのビーム・ホイル法の新しい応用発展を目指して,強磁性薄膜の偏極電子捕獲による核偏極生成技術新技術開発の基礎研究を開始した.その第一段階として,蒸着膜表面のビーム・ホイル相互作用への影響の研究を行なった.強磁性薄膜の生成は一般的には困難であり蒸着法が最も実現性が高いが,これ用いるためには蒸着膜表面の微視的状態について正確に知る必要があった.このため,高分子薄膜マイラー(5000オングストローム厚)の表面上に極薄い金(10-100オングストローム厚)を蒸着し,この薄膜を用いた斜膜法で生成された短寿命ベータ放射性核の核偏極を測定することにより,その表面状態の微視的形状の種々の知見を得た.この測定に最適かつ収量の多い新しい装置(多重斜膜装置を付置した静伝型反跳核収集器とベータNMR測定装置)を製作し,多くの基礎データを収集し次の2段階への足掛りを築いた.
セロトニン症候群の脳内モノアミン、グルタミン酸代謝異常の解明とその治療法の開発

セロトニン(5-HT)症候群は主に抗うつ薬の投与中に発現する医原性の疾患である。本症候群の治療法はまだ確立されていず、またその病態生理も十分に解明されていない。そこで、われわれは5-HT症候群の致死性の動物モデル(clorgyline 2mg/kgと5-hydroxy-L-tryptophan(5-HTP)100mg/kgを投与)を用いて5-HT症候群に対する様々な薬剤の有効性を検討した。有効性の判定は、原因薬剤投与後出現する直腸温の上昇を前投与した薬剤が抑制するかどうかで調べた。その結果、5-HT_<2A>受容体遮断作用の強い薬剤、すなわちrisperidone, pipamperone, ketanserin, ritanserinなどが最も有効であった。純粋な5-HT_<1A>受容体遮断薬であるWAY100635は5-HT症候群に効果は示さなかった。5-HT受容体にする非特異的拮抗薬であるcyproheptadineは、その用量を多く投与すれば5-HT症候群による直腸温の上昇を抑制した。悪性症候群に使用されるdantroleneは直腸温の上昇をある程度抑制した。脳保護作用を有するベンゾジアゼピン系薬剤であるdiazepamやmemantineなどのNMDA受容体拮抗薬も動物モデルの直腸温の上昇を抑制した。次に、5-HT症候群の病態生理を調べるため、新たな動物モデルで、ラットの視床下部におけるドーパミン、セロトニン、グルタミン酸の濃度変化をmicrodialysis法により4時間まで調べた。その結果、tranylcypromineとfluoxetineによる5-HT症候群では、視床下部のドーパミンとセロトニンは約50倍と40倍に上昇した。一方、dorgylineと5-HTPによる5-HT症候群では視床下部のドーパミンとセロトニンは約10倍と150倍に上昇した。グルタミン酸は、ドーパミンの増加が多い前者の動物モデルで薬剤投与3時間以降約5倍まで上昇したが、セロトニンが著明に増加する後者の動物モデルではグルタミン酸の増加は認めなかった。以上の様に、5-HT症候群といっても原因薬剤によって脳内モノアミン代謝、グルタミン酸代謝が異なることが判明した、このように、さまざまな中枢神経系の関与がヒトの多彩な5-HT症候群の臨床症状の形成に関与することが示唆された。セロトニン(5-HT)症候群は抗うつ薬の投与中に発現する最も重篤な副作用である。Selective serotonin reuptake inhibitors(SSRIs)やmonoamine oxidase(MAO)阻害薬が原因となることが多く、これらの薬剤が広く使用されている欧米で注目されている。わが国でも、1999年にはじめて最初のSSRIが臨床に登場し、現在2種類のSSRIが使用されている。また、新しいMAO阻害薬であるmoclobemideの治験が終了し、臨床に登場する予定である。以上のようなわが国のうつ病治療の状況においては、5-HT症候群が増加する可能性が考えられる。しかし、5-HT症候群の治療に関しては確立されていない。

そこでわれわれは、5-HT症候群の動物モデルを用いて5-HT症候群に対する幾つかの薬剤の有効性を検討した。5-HT症候群の動物モデルは、clorgyline 2 mg/kgと5-hydroxy-L-tryptophan (5-HTP)100mg/kgをラットの腹腔内に同時投与することにより作成した。有効性の指標は、5-HT症候群による体温上昇を抑制するかどうかによった。次に、ドパミン作動薬であるbromocriptineが有効か検討した(吉野達規、西嶋康一、その他日本神経精神薬理学雑誌21:262,2001)。さらに、最近NMDA受容体遮断薬であるmemantineが5-HT症候群の動物モデルに対して有効であることを認め、近く発表の予定となっている(西嶋康一、その他.精神薬療基金研究年報34集(in press)2002)。セロトニン(5-HT)症候群は主に抗うつ薬の投与中に発現する医原性の疾患である。本症候群の治療法はまだ確立されていず、またその病態生理も十分に解明されていない。そこで、われわれは5-HT症候群の致死性の動物モデル(clorgyline 2mg/kgと5-hydroxy-L-tryptophan(5-HTP)100mg/kgを投与)を用いて5-HT症候群に対する様々な薬剤の有効性を検討した。有効性の判定は、原因薬剤投与後出現する直腸温の上昇を前投与した薬剤が抑制するかどうかで調べた。その結果、5-HT_<2A>受容体遮断作用の強い薬剤、すなわちrisperidone, pipamperone, ketanserin, ritanserinなどが最も有効であった。純粋な5-HT_<1A>受容体遮断薬であるWAY100635は5-HT症候群に効果は示さなかった。5-HT受容体にする非特異的拮抗薬であるcyproheptadineは、その用量を多く投与すれば5-HT症候群による直腸温の上昇を抑制した。悪性症候群に使用されるdantroleneは直腸温の上昇をある程度抑制した。脳保護作用を有するベンゾジァゼピン系薬剤であるdiazepamやmemantineなどのNMDA受容体拮抗薬も動物モデルの直腸温の上昇を抑制した。次に、5-HT症候群の病態生理を調べるため、新たな動物モデルで、ラットの視床下部におけるドーパミン、セロトニン、グルタミン酸の濃度変化をmicrodialysis法により4時間まで調べた。その結果、tranylcypromineとfluoxetineによる5-HT症候群では、視床、下部のドーパミンとセロトニンは約50倍と40倍に上昇した。一方、clorgylineと5-HTPによる5-HT症候群では視床下部のドーパミンとセロトニンは約10倍と150倍に上昇した。グルタミン酸は、ドーパミンの増加が多い前者の動物モデルで薬剤投与3時間以降約5倍まで上昇したが、セロトニンが、著明に増加する後者の動物モデルではグルタミン酸の増加は認めなかった。以上の様に、5-HT症候二群といっても原因薬剤によって脳内モノアミン代謝、グルタミン酸代謝が異なることが判明した。このように、さまざまな中枢神経系の関与がヒトの多彩な5-HT症候群の臨床症状の形成に関与することが示唆された。
看護学生へのたばこ教育プログラムの開発とその評価

研究背景わが国のたばこ対策が包括的に推進される中で、医療従事者の大多数を占める看護職こそ喫煙者に計り知れない影響を与えることができるとし看護職への期待は大きい。成人の喫煙行動に対する看護介入の有効性に関するシステマティックレビューでは1.41倍禁煙率が高まることが報告されている。しかしわが国の看護職による禁煙支援の実態調査では禁煙への話し合いをしている18.9%と十分に実施されていない。看護職による禁煙支援に関連する要因の先行研究では禁煙支援への態度、過去の禁煙支援方法に関する学習経験があるほど高まる自信が報告されているが、看護学部教育における必修科目での禁煙支援方法に関する教育の国際比較では米国45.5%、韓国41.9%、中国58.6%、フィリピン61.6%に比べ23.2%とかなり低い現状である。そこで本研究では看護学部生を対象に禁煙支援方法に関する教育プログラムを実施し、その有効性を検証した。研究方法・結果先行研究、実態調査、グループディスカッションから看護学生が禁煙支援に自信をもち喫煙の害や禁煙支援に関する知識を得て禁煙支援や模範的役割に積極的な態度をもつことを目的とした1回目(90分)「喫煙の健康への害と看護職の役割に関する講義とディスカッション」2回目(90分)「禁煙サポートの講義とペアロールプレイ」のプログラムを看護系大学2校2年生に実施し、2つの方法で有効性を検証した。1.介入群と非介入群にわけて無記名自記式質問紙による介入前後での変化を分析した結果、介入群において有意な知識や自信の有意な上昇がみられた。2.プログラムを受講した看護学生が大学生を対象にした禁煙支援と中学生を対象に防煙教育を実施し無記名自記式質問紙による介入前後での変化を分析した結果、大学生の禁煙への関心度および中学生の非喫煙継続への意思の有意な上昇がみられた。考察本プログラムにより害や支援法に関する知識、禁煙支援への自信が高まる効果は確認できたが、医療者としての役割意識や禁煙支援への積極性の効果は確認できなかった。先行研究で態度と喫煙行動の関連が指摘されており今回の対象者では喫煙率が低く介入前の得点が高く偏っていたことから、今後は対象者を増やし効果を検証することが必要である。研究背景喫煙を「ニコチン依存症」という病気として捉え、その治療を行うのは医療従事者の重要な責務である。特にヘルスケア提供者の大多数を占める看護職こそが喫煙の減少に計り知れない影響を与えることができると期待されている。先行研究では看護師による禁煙支援の有効性が示されており、禁煙支援の実践と、看護師の喫煙行動、模範的な役割意識、過去の禁煙支援に関する教育経験との関連が指摘されている。しかし国内の教育機関では防煙教育がほとんどで、禁煙支援方法に関する教育は少ない。そこで本研究では、将来看護師になる看護学生を対象に禁煙支援に関する教育プログラム(以下たばこ教育プログラム)を開発・実践し、その有効性を検証した。研究方法・結果・考察目的1:看護学生へのたばこ教育プログラムを開発・実施し、有効性を検証する看護学生が禁煙支援に意欲をもち、喫煙の害や禁煙支援に関する知識を得て、禁煙支援や模範的役割に積極的な態度をもつことを目的としたプログラムを開発し、看護系大学2年生を対象に実施した結果、有害性や禁煙支援方法に関する知識、禁煙支援への意欲、自信は有意に上昇した。目的2:たばこ教育プログラムを受講した看護学生が禁煙支援・防煙教育を実施し、有効性を検証するプログラムを受講した看護学生が、大学生を対象に禁煙への関心や非喫煙継続の意思を高めることを目的とした禁煙支援・防煙教育プログラムを開発・実施した結果、害に関する知識、禁煙への関心度、非喫煙継続意思は有意に上昇した。また中学生を対象に非喫煙意思を強めることを目的とした防煙教育プログラムを開発・実施し、非喫煙継続意思は有意に上昇した。今後の課題目的1:対象群を広げ、比較対照研究を行うことにより有効性を検証する目的2:病院に勤務する看護師の禁煙支援の実践と、過去のプログラム受講経験との関連を検討し有効性を評価する研究背景わが国のたばこ対策が包括的に推進される中で、医療従事者の大多数を占める看護職こそ喫煙者に計り知れない影響を与えることができるとし看護職への期待は大きい。

1.介入群と非介入群にわけて無記名自記式質問紙による介入前後での変化を分析した結果、介入群において有意な知識や自信の有意な上昇がみられた。2.プログラムを受講した看護学生が大学生を対象にした禁煙支援と中学生を対象に防煙教育を実施し無記名自記式質問紙による介入前後での変化を分析した結果、大学生の禁煙への関心度および中学生の非喫煙継続への意思の有意な上昇がみられた。考察本プログラムにより害や支援法に関する知識、禁煙支援への自信が高まる効果は確認できたが、医療者としての役割意識や禁煙支援への積極性の効果は確認できなかった。先行研究で態度と喫煙行動の関連が指摘されており今回の対象者では喫煙率が低く介入前の得点が高く偏っていたことから、今後は対象者を増やし効果を検証することが必要である。
人間性の探求―哲学的人間学の批判的検討を通じて

昨年度の研究対象の中心は、アーノルト・ゲーレンとエルンスト・カッシーラーであったが、本年度はその成果を基に倫理学年報(日本倫理学会)に、「アーノルト・ゲーレンの倫理学ーその問題と意義」という論文を発表した。そこでは、まずゲーレンの哲学的人間学の根本思想(彼が人間と他の動物の決定的な違いをどこに見ていたかということ)が明らかにされ、それに続いて、そうした思想に基づく彼の倫理学の骨子、諸問題ならびに意義が究明されている。また、「シュペングラーにおける(ドイツ)保守革命へのニーチェの影響ーニーチェ諸概念の政治的先鋭化」と題した、シュペングラー(の人間観・政治観・歴史観)におけるニーチェ哲学の影響を扱った論文も、ドイツのニーチェ研究書(Nietzsche-Lektueren)に発表した。この論考は直接に哲学的人間学に関わるものではないが、哲学的人間学派に影響を与えたニーチェの人間観と、哲学的人間学派に対峙したシュペングラーの人間観を(政治的観点から)捉えている点で、哲学的人間学理解に一つの貢献をなすものとなっている。以上に加えて、ヘルムート・プレスナーの哲学的人間学に関する研究を遂行し、その人間学の根幹をなす人間観(及び動物観)を探求した。また、そうしたプレスナーの人間観(及び動物観)が現代の生物学(就中、ダーウィン進化論)におけるそれといかなる点で決定的に異なっているかを検討し、その結果、プレスナー人間学に存する根本問題を見出した。この成果は、来年度に論文として発表することを予定している。昨年度の報告書で言及した理由により、マックス・シェーラーの哲学的人間学の詳細な検討は本研究の主要課題にとって必須ではないと判断し、(予定されていた)シェーラーに関する研究論文は取り止めることとした。その代わりとして、カッシーラーの哲学的人間学に纏わる研究論文の執筆を予定している。以上の変更点を除いては、哲学的人間学の批判的検討という課題に関してはー研究成果の発表を含めてー当初の計画通り順調に進行している。そうした批判的検討を通じて独自の人間理解に至ることも本研究の課題であるが、その為に必要とされる現代科学(主に生物学、人類学、神経科学、心理学等)の見識の拡大も順調に進められている。以上から総合的に判断して、本研究は順調に進展していると看做して良い。当初はウィーンにて研究滞在を行う予定であったが、受入教授が逝去された為、引き続き東京(東京大学)を拠点に研究を遂行する。プレスナー、カッシーラーの哲学的人間学に関する論文を仕上げた後は、そこで得られた知見を手掛かりに、また、これまで蓄積した現代科学の成果に関する知識を基に、哲学的人間学の根本問題に自分なりの答えを提示したいと考えている。つまり、人間とは何かー人間とその他の動物の決定的な違いとは何かーという問題に対して一つの仮説を提出したいと考えている。そうした成果の発表の場は現在検討中である。現代科学が提供する人間や動物に関する知見を基に、20世紀前半のドイツに起こった哲学的人間学(シェーラー、ゲーレン、プレスナー、カッシーラー等の人間観)を批判的に検討することで、人間性(動物界において、人間を真に人間足らしめているもの)とは何かという問題の解明に寄与することが、本研究の主要課題である。哲学的人間学に関しては、ゲーレンやプレスナーといった哲学者の研究も並行して行ったが、発表された成果はカッシーラーに関するものである。その一つにおいては、カッシーラーの倫理学及び文化哲学が、どのような人間理解を基盤にしているかを明らかにした。また一つでは、カッシーラーの反ダーウィン主義的(=有機論的)進化理解を詳述すると同時に、そうした理解が今日の視点から見てどのような問題を抱えているかを示した。また、他の研究者と共同で論文集を編集、刊行し、カッシーラーを中心とした文化哲学・社会哲学の可能性や問題点を様々な観点から提示した。現代の自然科学に関しては、人間に関する様々な科学を対象としたが、生物学(その中でも特に進化論)を中心として研究を遂行した。こうした研究を通じて得られた成果は、カッシーラーに関する上記の論文中に用いられた。また、歴史的視点からの進化論の研究も行い、その成果を日本倫理学会の大会において発表した。そこでは、ダーウィンが人間における道徳の発生起源をどこに見ていたのか、またその道徳の固有性をどのようなものと考えていたのかを明らかにした。哲学的人間学に関しては、順調に研究が進んでいる。既にカッシーラーに関する研究は殆ど完了し、ゲーレンやプレスナーに関する研究も滞りなく進行している。現代科学(主に生物学・進化論)の知見の獲得に関しては、まだ多くを望みたいところではあったが、書籍の読解や、ゼミ・講義などへの参加を通じて、予定していた最低限度の知見を得ることは出来た。こうして得られた成果を基に行われた論文発表や口頭発表は、発表場所に多少の変更こそあれ、内容に関しても数に関しても当初の計画通り遂行された。こうした当初の計画通りの発表に加えて、他の研究者と共同で一冊の論文集を編集、出版したことを考慮に入れれば、研究は当初の計画以上に進展していると言って良いであろう。

そこでは、まずゲーレンの哲学的人間学の根本思想(彼が人間と他の動物の決定的な違いをどこに見ていたかということ)が明らかにされ、それに続いて、そうした思想に基づく彼の倫理学の骨子、諸問題ならびに意義が究明されている。また、「シュペングラーにおける(ドイツ)保守革命へのニーチェの影響ーニーチェ諸概念の政治的先鋭化」と題した、シュペングラー(の人間観・政治観・歴史観)におけるニーチェ哲学の影響を扱った論文も、ドイツのニーチェ研究書(Nietzsche-Lektueren)に発表した。この論考は直接に哲学的人間学に関わるものではないが、哲学的人間学派に影響を与えたニーチェの人間観と、哲学的人間学派に対峙したシュペングラーの人間観を(政治的観点から)捉えている点で、哲学的人間学理解に一つの貢献をなすものとなっている。以上に加えて、ヘルムート・プレスナーの哲学的人間学に関する研究を遂行し、その人間学の根幹をなす人間観(及び動物観)を探求した。また、そうしたプレスナーの人間観(及び動物観)が現代の生物学(就中、ダーウィン進化論)におけるそれといかなる点で決定的に異なっているかを検討し、その結果、プレスナー人間学に存する根本問題を見出した。この成果は、来年度に論文として発表することを予定している。昨年度の報告書で言及した理由により、マックス・シェーラーの哲学的人間学の詳細な検討は本研究の主要課題にとって必須ではないと判断し、(予定されていた)シェーラーに関する研究論文は取り止めることとした。その代わりとして、カッシーラーの哲学的人間学に纏わる研究論文の執筆を予定している。以上の変更点を除いては、哲学的人間学の批判的検討という課題に関してはー研究成果の発表を含めてー当初の計画通り順調に進行している。そうした批判的検討を通じて独自の人間理解に至ることも本研究の課題であるが、その為に必要とされる現代科学(主に生物学、人類学、神経科学、心理学等)の見識の拡大も順調に進められている。以上から総合的に判断して、本研究は順調に進展していると看做して良い。哲学的人間学に関しては、ゲーレン及びプレスナーを研究の中心とする予定である。(シェーラーの研究に関しては、それをどこまで深く進めるか検討中である。というのも、その哲学的人間学は構想段階で終わっており、カッシーラー、ゲーレン、プレスナーの哲学的人間学に対する批判的考察だけで本研究の主要目的には十分であると見えて来た為である。)現代の自然科学に関しては、引き続き生物学(主に進化論)を中心としてその見識を拡げて行く予定である。当初はウィーンにて研究滞在を行う予定であったが、受入教授が逝去された為、引き続き東京(東京大学)を拠点に研究を遂行する。プレスナー、カッシーラーの哲学的人間学に関する論文を仕上げた後は、そこで得られた知見を手掛かりに、また、これまで蓄積した現代科学の成果に関する知識を基に、哲学的人間学の根本問題に自分なりの答えを提示したいと考えている。つまり、人間とは何かー人間とその他の動物の決定的な違いとは何かーという問題に対して一つの仮説を提出したいと考えている。そうした成果の発表の場は現在検討中である。
赤血球凝集と血流におよぼす強磁場の影響に関する研究

鉛直強磁場下で赤血球沈降係数が生理食塩水中でも血漿中でも促進される事が示された。生理食塩水中での磁場促進の原因は赤血球の異方性反磁性による配向により流体抵抗の減少に起因する事が判明した。一方、血漿中の磁場促進は、強磁場による赤血球凝集性の促進した結果である事が明らかとなったが、さらに、これがどの様な磁場効果に起因した現象かを調べた。原因となる複数の可能な因子のうち、常磁性相互作用の可能性から調べたヘモグロビン分子の磁気異方性と、膜物性の磁気異方性を定量的に調べたが、これらが主たる原因ではない事が判明した。残された因子のうち、細胞膜と血漿蛋白の相互作用の磁場効果の直接測定についてはかかる期間に完了しなかった。そこで、各因子の直接測定を諦め、定性的に主たる因子を同定する為、赤血球沈降係数の促進現象の観測をくり返した。そこで、次のような発見をした(米国Bioelectromagnetics誌に投稿中)。すなわち、1.細胞の形がほぼ球形でも凝集は起こる事、2.細胞の形が球形に近づくと強磁場による赤血球沈降係数の促進も凝集性の促進もなくなる事、である。1.はその形状から細胞間凝集面積の実質的減少が起こるが、赤血球膜の高い変形能により接触面積が有限のまま残る事を示す。2.は形状異方性がなくなり赤血球の磁場配向がなくなると、1.により凝集能があるにも関わらず、凝集能の磁場による促進は起こらない事を示す。以上から、磁場による凝集性の促進の原因となる主たる因子が、赤血球の磁場配向による細胞間凝集面積の実質的増加である事が判明した。しかし、残された因子、細胞膜と血漿蛋白の相互作用の磁場効果の存在そのものが否定されたわけではないので、今後はこの残された因子を調べる事を予定している。9年度は、研究目的に記したように、測定システムを構築する事に主眼を置いた。その結果,東京工業大学内の磁場発生装置の改良が進行したが、誘電測定が遅れている。これは異なる大学に実験装置を設置する難しさが、特に日本医科大学側に存在したことが大きな理由であった。遅れているうえ、得られる磁場も当初の計画よりもやや低いものになってしまう予定となったが、10年度にはより総合的な見地から研究を行える予定である。強磁場により赤血球の凝集が促進される事を顕微鏡下で観測し、赤血球沈降係数が増大する事がはっきり示された。細胞凝集の磁場効果は、少量でも常磁性を持つ細胞内ヘモグロビン分子の磁場異方性、細胞膜物性の磁場依存性(磁場異方性はすでに示されている)、血漿蛋白質の磁場異方性、および膜一血漿蛋白質間相互作用の磁場依存性に起因すると考えられる。9年度には、磁場中で核磁気共鳴測定を行い、赤血球内ヘモグロビンには分子運動に異方性は見いだされない事、および、細胞膜物性を反映する水透過係数には磁場効果は現れない事が判明した。よって、観測された細胞凝縮の磁場効果の原因は、細胞内と膜自身には無く、細胞膜と血漿蛋白質間の相互作用にある事が示唆された。今後は、細胞凝縮能増加をミクロな観点から観測する為、残った当初の予定である、誘電測定などを遂行すべく、測定電極と試料セルを完成させ、磁場依存測定を行う予定である。

試料に血液を用いると細胞配向等の凝集への影響があり実験系も複雑な為、今後は水自由表面の分子分散系などの、より単純な系における実験も予定している。強磁場による赤血球沈降係数の促進する直接の原因が、強磁場による赤血球凝集性の促進である事が、明らかとなった。さらに、この凝集性の促進の原因となる因子を調べる為、複数の可能な因子のうち、常磁性相互作用の可能性から調べたヘモグロビン分子の磁気異方性と、膜物性の磁気異方性を調べたが、これらが主たる原因ではない事が判明した。残された因子のうち、細胞膜と血漿蛋白の相互作用の磁場効果の直接測定についてはかかる期間に完了しなかった。無論の事、すでに知られている赤血球の磁場配向による、細胞間凝集接触面積の実質的増加も因子の1つである。研究期間もわずかなときに、複数の因子の解明が残ってしまったことになる。そこで、各因子の直接測定を諦め、本研究の目的を達成すべく、初心に立ち戻り、赤血球沈降係数の促進現象の観測をくり返した。そこで、次のような発見をした(米国Bioelectromagnetics誌に投稿中)。すなわち、1.細胞の形がほぼ球形でも凝集は起こる事、2.細胞の形が球形に近づくと強磁場による赤血球沈降係数の促進も凝集性の促進もなくなる事、である。1.はその形状から細胞間凝集面積の実質的減少が起こるが、赤血球膜の高い変形能により接触面積が有限のまま残る事を示す。2.は形状異方性がなくなり赤血球の磁場配向がなくなると、1.により凝集能があるにも関わらず、凝集能の磁場による促進は起こらない事を示す。以上から、磁場による凝集性の促進の原因となる主たる因子が、赤血球の磁場配向による細胞間凝集面積の実質的増加である事が判明した。しかし、残された因子、細胞膜と血漿蛋白の相互作用の磁場効果の存在そのものが否定されたわけではないので、今後はこの残された因子を調べる事を予定している。
バキュロウイルスによる宿主行動操作の神経基盤の解明

バキュロウイルスに感染したチョウ目昆虫の幼虫は異常な徘徊行動を呈する。この現象はウイルスによる利己的な宿主操作であると考えられているが、その詳細な分子・神経機構はほとんど解明されていない。本研究課題は、RNA-seq解析により同定した徘徊行動中の脳で発現量が上昇あるいは低下する遺伝子(Differentially Expressed Gene: DEG)に着目し、遺伝子組換えカイコおよびバキュロウイルスを用いてDEGおよびDEG発現ニューロンの詳細な機能解析を行うことで、宿主行動操作メカニズムの全容を解明することを目標とする。初年度であるH30年度は、実験材料である遺伝子組換えカイコおよびバキュロウイルスの作出に注力した。まず、使用するカイコ系統の行動観察における適性を調査したところ、N4系統は徘徊行動の観察が困難であったのに対し、w1-pnd系統や白c系統では徘徊行動を比較的長時間観察可能であることが明らかになった。一方、組換え体作出効率の点はw1-pnd系統よりN4系統の方が顕著に優れていたため、現在は組換え体の作出を基本的にN4系統で行い、作出した組換え個体と白c系統個体を戻し交配することで行動解析に用いる組換えカイコ系統を樹立中である。CRISPR/Cas9によるDEGノックアウトカイコや、Gal4/UASシステムによりDEGの過剰発現を行うことのできる組換えカイコを作出中であり、一部の系統については既に組換え体が得られている。また、DEGのノックダウン方法としてCas13dを新たに導入中である。一方、当初利用予定であったエンハンサートラップGal4系統が本実験の目的に足る発現パターンを示さないことが判明したため、現在TALーPITCh法により神経細胞特異的Gal4系統を作出中である。平成30年度は、遺伝子組換えカイコおよびウイルスの作出が主要な達成目標であったが、遺伝子組換えカイコの作出の進捗状況が想定よりもやや遅れている。第一の原因は、インジェクション用系統の変更である。概要でも述べたように、当初は予備実験により徘徊行動の観察に適したw1-pnd系統を用いて組換えカイコを作出を幾度も試みたが、この系統は最適なインジェクション条件を整えてもなお卵の孵化率が約5%程度と非常に低かったため、組換え体を得るのが非常に困難であることが判明した。一方、N4系統では3060%という高い孵化率を達成できたため、インジェクション用系統をN4に変更した。しかし、N4系統は徘徊行動の観察に適さないため、白c系統との戻し交配を行わなければならず、その点でも当初の予定より余計に時間がかかってしまうと予想される。第二の原因は、Gal4系統の新規作出が必要になった点である。当初はナショナルバイオリソースプロジェクトにより九州大学で管理されているエンハンサートラップGal4系統を用いて実験を進める予定であったが、実際に取り寄せて発現パターンを調査した結果、本研究の要求を満たさないことが判明した。そこで、本研究で用いるためのGal4系統を新規に作出するため、TAL-PITCh法により目的の発現パターンを示す遺伝子領域にGal4をノックインすることを試みている。一方、上述の問題点は既に解決済であることから、今後は平成30年度よりも効率的に組換え体を作出でき、それらを用いたDEGの機能解析に進む事ができると考えている。また、DEGのノックダウン手法として新たに導入したCas13dのノックダウン性能も評価中であり、今後有用なツールとして期待できる。初年度は主要な実験材料である遺伝子組換えカイコの系統樹立までは至らなかったものの、インジェクションにおける低孵化率の問題は解決したため、今後は各種組換えカイコ系統を最優先で作出し、それらを用いて各DEGおよびDEG発現ニューロンの詳細な性状解析を行う予定である。また、ウイルス感染脳のホールマウントin situハイブリダイゼーションにより各DEGの発現領域およびその時間的変化を調査する。また、別のアプローチとして、ウイルス感染脳を経時的にサンプリングし、抽出液のHPLC分析を行なうことで、徘徊行動の惹起にともなう生体アミン量の変化を定量する。変化が見られた生体アミンについては、免疫染色を行なうことで作動性ニューロンの分布を調べ、DEG発現ニューロンとの位置関係を明らかにする。また、生体アミン受容体のアゴニストやアンタゴニストを幼虫に注射し行動活性への影響を調査することで、行動操作における生体アミンの重要性を検証する。一方、組換え体作出効率の点はw

1-pnd系統よりN4系統の方が顕著に優れていたため、現在は組換え体の作出を基本的にN4系統で行い、作出した組換え個体と白c系統個体を戻し交配することで行動解析に用いる組換えカイコ系統を樹立中である。CRISPR/Cas9によるDEGノックアウトカイコや、Gal4/UASシステムによりDEGの過剰発現を行うことのできる組換えカイコを作出中であり、一部の系統については既に組換え体が得られている。また、DEGのノックダウン方法としてCas13dを新たに導入中である。一方、当初利用予定であったエンハンサートラップGal4系統が本実験の目的に足る発現パターンを示さないことが判明したため、現在TALーPITCh法により神経細胞特異的Gal4系統を作出中である。平成30年度は、遺伝子組換えカイコおよびウイルスの作出が主要な達成目標であったが、遺伝子組換えカイコの作出の進捗状況が想定よりもやや遅れている。第一の原因は、インジェクション用系統の変更である。概要でも述べたように、当初は予備実験により徘徊行動の観察に適したw1-pnd系統を用いて組換えカイコを作出を幾度も試みたが、この系統は最適なインジェクション条件を整えてもなお卵の孵化率が約5%程度と非常に低かったため、組換え体を得るのが非常に困難であることが判明した。一方、N4系統では3060%という高い孵化率を達成できたため、インジェクション用系統をN4に変更した。しかし、N4系統は徘徊行動の観察に適さないため、白c系統との戻し交配を行わなければならず、その点でも当初の予定より余計に時間がかかってしまうと予想される。第二の原因は、Gal4系統の新規作出が必要になった点である。当初はナショナルバイオリソースプロジェクトにより九州大学で管理されているエンハンサートラップGal4系統を用いて実験を進める予定であったが、実際に取り寄せて発現パターンを調査した結果、本研究の要求を満たさないことが判明した。そこで、本研究で用いるためのGal4系統を新規に作出するため、TAL-PITCh法により目的の発現パターンを示す遺伝子領域にGal4をノックインすることを試みている。一方、上述の問題点は既に解決済であることから、今後は平成30年度よりも効率的に組換え体を作出でき、それらを用いたDEGの機能解析に進む事ができると考えている。また、DEGのノックダウン手法として新たに導入したCas13dのノックダウン性能も評価中であり、今後有用なツールとして期待できる。初年度は主要な実験材料である遺伝子組換えカイコの系統樹立までは至らなかったものの、インジェクションにおける低孵化率の問題は解決したため、今後は各種組換えカイコ系統を最優先で作出し、それらを用いて各DEGおよびDEG発現ニューロンの詳細な性状解析を行う予定である。また、ウイルス感染脳のホールマウントin situハイブリダイゼーションにより各DEGの発現領域およびその時間的変化を調査する。また、別のアプローチとして、ウイルス感染脳を経時的にサンプリングし、抽出液のHPLC分析を行なうことで、徘徊行動の惹起にともなう生体アミン量の変化を定量する。