hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
悪性胸膜中皮腫と反応性中皮細胞でのアンチエイジングKotho遺伝子の役割

本研究は、未だ満足の行く治療成績を得られていない悪性胸膜中皮腫の診断精度の向上を目的としている。現在、反応性中皮と悪性胸膜中皮腫の鑑別のための確たる免疫組織学的診断マーカーが存在しないため、反応性中皮と悪性胸膜中皮腫の鑑別を簡便かつ、迅速にできるようにすることが急務である。そこで中皮細胞の悪性度に「不老・不死化」に関与するアンチエイジング遺伝子Klotho発現がどのように関与し、癌の浸潤、転移(EMT)にどのように影響を与えるか分子生物学的に検討する。今回の研究結果より、Klotho蛋白が消失することにより、悪性中皮中皮腫と反応性中皮細胞の鑑別診断補助になり得る可能性が示唆された。現在、確たる免疫組織学的診断マーカーが存在しない反応性中皮と悪性胸膜中皮腫の鑑別を簡便かつ、迅速にできるようにすることにある。これらを検討することにより、治療に有効な診断法を確立し、コスト削減・診断の簡便化・迅速性の図り、“難治性である悪性胸膜中皮腫の個別化治療"の確立のために診断方法の開発・基礎的検討を行う。そこで、本研究では、中皮細胞の「悪性化」と「浸潤」におけるアンチエイジング遺伝子Klothoとの関係に注目し、上皮間葉転換(EMT)という現象にアンチエイジング遺伝子Klothoが関与していると仮定した。すなわち、応募者は悪性胸膜中皮腫の浸潤・転移能の獲得には、アンチエイジング遺伝子の喪失が関与していると推測した。そこで診断技術の向上とともにまた、中皮腫細胞に「アンチエイジング機能」を復活させ、「正常の細胞機能・遺伝子修復機能」を再獲得させることが、悪性胸膜中皮腫治療の向上に寄与する考え、本研究を計画する。また、プロテオーム解析をすることにより、より洗練された診断・治療の補助に成り得るかを検討する。方法は、免疫組織学的染色抗(Klotho抗体)により、Klothoの発現を反応性中皮と中皮腫細胞を染色し、発現の有無をスコアリングすること、過去に研究された中皮腫と反応性中皮の鑑別のためのマーカーと比較し、Klothoの感度・特異度の優劣性を検討し検討すること、そして、プロテオーム解析することにより、Klotho遺伝子、また、新たな鑑別に有用と思われる蛋白・遺伝子変異を比較検討するである。本年度は、中皮細胞の「悪性化」と「浸潤」におけるアンチエイジング遺伝子Klothoとの関係に注目し、上皮間葉転換(EMT)という現象にアンチエイジング遺伝子Klothoが関与していると仮定し、悪性胸膜中皮腫の浸潤・転移能の獲得には、アンチエイジング遺伝子の喪失が関与していると推測した。そこで診断技術の向上とともにまた、中皮腫細胞に「アンチエイジング機能」を復活させ、「正常の細胞機能・遺伝子修復機能」を再獲得させることが、悪性胸膜中皮腫治療の向上に寄与する考え、本研究を開始した。東京医科大学病院の倫理委員会に当研究をするにあたり、審査後、研究開始となった。まず、臨床情報の収集し、悪性胸膜中皮腫50例と反応性中皮の存在する症例50例を抽出した。次に本研究の材料となり得る検体であるかの検討(生検材料だけの微小病理検体でないか、ホルマリン標本の有無の検討をした結果、30例づつを抽出することとなった。抽出した検体を予定通り、免疫組織学的染色(Klotho)を施行し、染色状態の両者間の違いを調べ、蛋白発現の分布を同定し、臨床情報をマスクされた病理医がスコアリング中である。本研究では、未だ満足のいく治療成績を得られていない悪性胸膜中皮腫の診断制度を向上することを目的としている。現在、診断方法として、唯一、確率されている方法が組織・細胞診断における免疫組織学的染色とされる。しかし、確たる免疫組織学的染色診断マーカーが存在しない反応性中皮細胞と悪性胸膜中皮腫の鑑別は困難なことが多い。反応性中皮はいわゆる良性反応であり、悪性胸膜中皮腫とは治療方法が全く異なる。一方、悪性胸膜中皮腫は予後が著しく悪く、早期の診断、治療が望まれる。そこで鑑別診断を簡便にかつ、迅速にできれば大いに有用である。これらを検討することにより、治療に有効な診断法を確立し、診断簡便化、迅速性を図り、かつ、コスト削減し、難治性である悪性胸膜中皮腫の個別化治療の確立のために診断方法の開発・基礎的研究を行う。本研究では中皮細胞の「悪性化」と「浸潤」におけるアンチエイジング遺伝子Klothoとの関係に注目し、上皮簡葉転換(EMT)という現象にアンチエイジング遺伝子Klothoが関与していると仮定した。すなわり、悪性胸膜中皮腫の浸潤・転移能の獲得には、Klothoの喪失が関与していると推測した。そこで診断技術の向上とともにまた、中皮細胞にアンチエイジング機能を復活させ、正常の細胞機能

・遺伝子修復機能を再獲得させることが、悪性胸膜中皮腫治療の向上に寄与すると考え、本方法は、免疫組織学的染色(Klotho抗体)により、Klothoの発現の有無をスコアリングし、また、プロテオーム解析することにより、Klotho遺伝子、また、新たな鑑別に有用と思われる蛋白・遺伝子変異を比較検討することである。本年度は、昨年度まで終了した免疫組織学的染色の結果を臨床情報と合わせて、評価し、並びに昨年度に終了したプロテオーム抽出し、得られた蛋白情報を検討する。悪性胸膜中皮腫(MPM)47検体、反応性中皮(RM)42検体を対象とし、免疫組織学的検査(IHC)を用いたKlotho蛋白の発現について、検討した。MPM検体の内訳は生検と手術検体のホルマリン固定標本を用い、RM検体は自然気胸に伴うBullaの切除標本47例を用い、破裂Bullaの修復過程、反応で増加した胸膜上の中皮細胞の観察が容易な標本を抽出した。結果はMPMで0 (negative)が7例、1+ (weak)が37例、2+(moderate)が3例で3+(strong)は0例であった。RMでは0が0例、1+が34例、2+が8例で3+は0例であった。解析するとRMは全例陽性を示していた。一方、MPMは7例にタンパク発現の消失を認めた。以上より、Klotho蛋白の発現消失は悪性所見の証明となりえる可能性が示唆された。Klotho蛋白の陰性化することを目的としたスクリーニング検査とすると感度14.9%ながらも特異度は100%で陽性的中率も100%,陰性的中率は51.2%であった。MPMのKlotho蛋白発現には明らかにRMに比べ、減少傾向を認め、Klotho蛋白ががんの浸潤に関わる最近の知見と矛盾ない結果であった。完全消失にならなかった理由に検体が手術標本と生検標本が混在していたため、MPMのstaging(進行度)にも差があったためと推測される。今回の研究結果より、Klotho蛋白の消失にすることにより、悪性中皮細胞の診断補助になり得る可能性が示唆された。この結果を2018年10月の欧州腫瘍外科学会での発表準備中である。これらの結果を踏まえ、MPM手術例5例とRM5例を抽出し、未知なる消失、出現蛋白の同定のため、プロテオーム解析を施行した。現在、結果解析中で2018年度中に解析結果が待たれているところであり、結果判明次第、学会発表、論文作成予定である。本研究は、未だ満足の行く治療成績を得られていない悪性胸膜中皮腫の診断精度の向上を目的としている。現在、反応性中皮と悪性胸膜中皮腫の鑑別のための確たる免疫組織学的診断マーカーが存在しないため、反応性中皮と悪性胸膜中皮腫の鑑別を簡便かつ、迅速にできるようにすることが急務である。そこで中皮細胞の悪性度に「不老・不死化」に関与するアンチエイジング遺伝子Klotho発現がどのように関与し、癌の浸潤、転移(EMT)にどのように影響を与えるか分子生物学的に検討する。今回の研究結果より、Klotho蛋白が消失することにより、悪性中皮中皮腫と反応性中皮細胞の鑑別診断補助になり得る可能性が示唆された。本年度は、終了している免疫組織学的染色の評価を行い、小括することである。また、時間と技術が要するプロテオーム解析を前倒しで2年次より開始することである。実験結果で得られた情報を臨床情報と合わせて、評価し、研究結果を論文化・学会発表を予定することである。呼吸器外科プロテオーム解析に支出が大きくなることが予測されたため、プロテオーム解析に研究費を集中させるためである。
光活性化に基づく新規スーパー有機ドナー試薬の開発と触媒化

本研究では,ベンズイミダゾリン(BIH)に光捕集部位として縮合芳香環(Ar)を置換したBIH-Arおよびヒドロキシアリール基を置換したBIH-ArOHの特異な酸化反応性を生かしたメタルフリー還元法の新展開を目指して,可視光で駆動する新規光試薬および光触媒の開発研究を実施している。本年度は,前年度課題の継続発展と新規課題に取り組み以下の成果を得た。まず,光活性化ナフトール置換BIH(BIH-NapOH)による種々のスルホンアミドの脱スルホニル化を達成した。光誘起によるBIH部位からNapOH部位へのプロトン移動(光誘起分子内プロトン移動)を経て生じるナフトキシド励起状態による基質還元の新機構を提出した。また,BIH-Arによるブロモカルボニル化合物の還元において,空気下光照射なしでα-酸素化が進行することを見出した。一方,より低反応性のα-スルホニル置換カルボニル化合物が基質の場合は,光活性化BIH-NapOHによりα-酸素化が可能であることを明らかにした。前年度に見出したBIH-NapOHの酸化体(BI+-NapO-)ベタイン光触媒と種々のヒドリド還元剤(水素化ホウ素ナトリウム,ピコリンボラン)が協働する新規光触媒法の適用基質の拡張を達成した。加えて,新たなベタイン光触媒としてフェノキシド置換体(BI+-PhO-)とナフトキシド置換ベンゾチアゾリウム(BT+-NapO-)を合成してその触媒活性度をBI+-NapO-と比較評価した。さらに,アミノアレーン置換ベンズイミダゾリン(BIH-ArNR2)の光還元試薬としての性能と酸化体(BI+-ArNR2)の光触媒能の調査を開始した。今後は,上記3タイプの還元酸化(レドックス)対(BIH-ArとBI+-Ar,BIH-ArOHとBI+-ArO-,BIH-ArNR2とBI+-ArNR)を用いる電子移動反応系の構築を推進して行く。近年,メタルフリー(希少高価な遷移金属非使用)反応手法が有機合成化学分野でも重要視され,多彩な分子設計が可能な有機試薬・触媒に注目が集まっている。酸化還元は最も基本的な化学反応であり,高い電子および水素供与性を有する有機分子は還元試薬として働くことが期待される。ベンズイミダゾリン(BIH)は,酸化還元補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型(NADH)と類似の酸化反応特性を有する人工の電子および水素供与体である。本研究では,BIHに光捕集部位として縮合芳香環(Ar)を置換した誘導体(Ar-BIH)の特異な酸化反応性を利用したメタルフリー還元法の新展開を目指して,可視光で駆動する新規Ar-BIH試薬および触媒の開発に取り組む。これまでに,Ar部位にHO基を導入した誘導体(HOAr-BIH)では塩基の添加により水素イオンが脱離した構造(-OAr-BIH)を生じて電子供与性が格段に向上することを見出していた。H28年度は,ナフトール置換BIH(HONaph-BIH)に焦点を絞って多様な基質の還元に適用して本手法の汎用性の拡張を図った。その結果,家電用の白色LEDを光源とした温和な条件で,有機合成上有用なスルホンアミドの新規光脱保護法の開発に成功した。また, HONaph-BIHの酸化生成物は双性イオン構造(-ONaph-BI+)を有する分子内塩であるが,これまでにこの物質が光触媒として働く可能性を示唆する現象を見出していた。H28年度は,その光触媒条件をヨードベンゼンの還元で生じるアリールラジカルの分子内アルケン付加反応に適用して,高いドナー性(ルイス塩基性)を有する溶媒が反応を顕著に加速するという特異な溶媒効果を発見した。さらに,HONaph-BIHの部分構造であるナフトールとBIHの二分子恊働系が光還元試薬として有効に働くことを初めて明らかにした。H28年度の研究室人員(大学院修士学生1名,学部4年生2名)を踏まえて,当初計画を見直して対象をナフトール置換BIH(HONaph-BIH)に絞って研究を進めた。そして,「HONaph-BIHの光活性化と塩基活性化の適用条件および基質の拡張」については,当初予想を上回る成果をあげた。また,当初はH29年度の本格実施を予定していた「-ONaph-BI+の光触媒活性の確認と反応条件の検討」について前倒しで取り組みを始め,-ONaph-BI+の光触媒能を確認し,かつ新知見を得ることに成功した。さらに,新規課題である「HONahとBIH分子間恊働系の開発とHONaph-BIH(分子内系)との比較評価」を検討して,分子間協働系が光還元反応を駆動するという新知見を得た。その一方で,研究室人員不足のため「HOAr部位の分子設計による新規HOAr-BIHの検討」には至らなかった。以上の状況を総合的に評価した結果,(2)と判断した。酸化還元は基本的な化学反応過程であり,高い電子・水素供与性を有する有機分子は有効な還元試薬として働くことが期待される。ベンズイミダゾリン(BIH)は,酸化還元補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型(NADH)と類似の酸化反応特性を有する人工の電子・水素供与体である。したがって,BIHと酸化体

BI+は,NADHとNDA+と類似の還元・酸化対(レドックスペア)とみなせる。一方,ヒドロキシ基を有するHOR-BIHは有機合成で汎用されるHantzschジドロピリジンと同様の二水素供与体と見なせるが,HOR-BIHと-OR-BI+がブレンステッド酸と共役塩基部位を有する点は,Hantzschジドロピリジンとピリジンとは際立った違いである。特に,Hantzschピリジンは安定中性分子であるが,-OR-BI+はルイス酸・塩基性と電子受容・供与性を併せ持つ特異な分子である。以上の背景を踏まえて,BIHおよびHOR-BIHのユニークな特性を生かした電子移動過程を基軸とする有機レドックス化学の創成を目指す基礎および応用研究を推進している。本研究では,BIHに光捕集部位として縮合芳香環(Ar)を置換したAr-BIHおよびヒドロキシ基を置換したHOAr-BIHの特異な酸化反応特性を生かしたメタルフリー還元法の新展開を目指して,可視光で駆動する新規光試薬および光触媒の開発研究を計画・実行している。H29年度は,前年度課題の継続発展と新規課題に取り組み,光活性化ナフトール置換体(HONap-BIH)による還元反応の適用基質の拡張を達成した。また,新たなベタイン(-OR-BI+)光触媒の開発と新規触媒サイクル構築法の開発に成功した。H29年度の研究室人員(大学院修士学生1名,学部4年生4名)を踏まえて,当初研究計画を絞りこみ,可視光活性化HOAr-BIHによる光還元反応とベタイン(-OAr-BI+)光触媒反応を中心に研究を進め,以下の成果を得た。(1)可視光活性化ナフトール置換体(HONap-BIH)によるαケトスルホンの脱スルホニル化を達成した。また,フェノール置換体(HOPh-BIH)のHO位置異性体の光還元試薬活性序列o-体>p-体>m-体を見出した。(2)BIHと酸素分子協働反応系の開拓を目指して,HONap-BIHとαケトスルホンの光反応を空気下で行い,脱スルホニル化を伴うα酸素化を観測した。次に,αブロモケトンをPh-BIHと室温空気下で反応させると光照射なしでも良好な収率でαヒドロキシケトンへ変換できることを見出した。さらに,加熱条件でAr-BIHによるN-トシルベンズアミドの脱スルホニル化も達成した。(3)ナフトキシドベタイン(-ONap-BI+)の特異な溶媒効果に対して,溶媒のルイス酸性と塩基性をアクセプター数とドナー数で評価して,溶媒とベタインの-ONap部位(ルイス塩基)とBI+部位(ルイス酸)の選択的相互作用による光触媒活性の制御という新たな作業仮説を提案した。さらに,フェノキシドベタイン(-OPh-BI+)も光触媒能を有することを見出した。この中で,光触媒サイクル構築法として通常の電子移動に基づく手法(電子移動法)に加えて,ベタインのヒドリド化により強力電子ドナーの-OAr-BIHを系内発生させる新手法(ヒドリド法)の開発に成功した。(4)-ONap-BI+は溶液中で無蛍光であったが,固体状態で発光することを発見した(蛍光量子収率20%)。上記(2)と(4)は当初計画にない新展開である。以上の状況を総合的に評価して,(1)と判断した。本研究では,ベンズイミダゾリン(BIH)に光捕集部位として縮合芳香環(Ar)を置換したBIH-Arおよびヒドロキシアリール基を置換したBIH-ArOHの特異な酸化反応性を生かしたメタルフリー還元法の新展開を目指して,可視光で駆動する新規光試薬および光触媒の開発研究を実施している。
血糖と血圧を調節する新規生理活性物質ヘパトニンの生理機能の解析

本研究において、私達が脂肪細胞分化とともに発現し分泌される新規生理活性物質ヘパトニンが生体においては主に肝臓で産生分泌され、遺伝子組み換え産物をマウスに投与すると血糖および血圧低下作用があることを明らかにしてきた。ヘパトニンは肝臓に特異的に発現し、その血中濃度は摂食によって低下し高脂肪食を負荷すると上昇する。分子量は約5kDで血中では主にダイマーとして存在している。このヘパトニンの意義を明らかにするために、今回ノックアウトマウスの作製に成功し解析を行っている。ヘパトニンノックアウトマウスは成長、発育は正常だが、腹腔内グルコース負荷試験において高血糖を示す。その機序としてヘパトニンはアミノ酸の一次配列の構造がセリンプロテナーゼ阻害剤との相同性を持っていることから、内因性のセリンプロテナーゼを阻害することによってその作用を発揮している可能性がある。私達は現在2つのセリンプロテナーゼの可能性について検討している。ひとつはDPPVI(Dipeptidyl peptidase IV, CD26)である。DPPVIはインスリン分泌を調節するインクレチン分解酵素で、次世代の糖尿病治療薬として大きな注目を集めている。もうひとつはキマーゼでいずれも血糖および血圧の制御において重要な役割を果たしていることがすでに報告されており、現在in vitroにおいてヘパトニンとこれらの酵素活性に対する影響や相互作用を解析している。同様にホルモン、サイトカインの生理作用を明らかにする研究を進めており、これまでにGHの標的遺伝子としてミトコンドリア関連遺伝子およびミネラルコルチコイド受容体を同定した(BBRC 2006)。さらにサイトカインシグナルおよび新規生理活性ペプチドの調節機序、作用について研究を行ってきた(JBC2006, Regulatory peptide 2006)。臨床研究においては、NASHを呈した成人GH分泌不全症のが6ヶ月のGH治療によってNASHが劇的に改善したことを報告した(Gastroenterology in press)。その他、成人汎下垂体機能低下症における治療と心血管病変の関係について(Endocrine J in press)、内分泌腫瘍のあらたな病態についての報告を行った(Endocrine J 2006, Internal Med 2006)。私達は新規生理活性物質を同定するプロジェクトでは培養脂肪、肝、筋肉細胞に様々な代謝および分化刺激を行い、変動する遺伝子をデイファレンシャルデイスプレー,cDNA microarrayを用いて同定し、バイオインフォマテイックスを活用したin silico解析にてシグナルペプチドを持った分子を抽出した。スクリーニングした約26000遺伝子の内、変動を示したのが2625遺伝子、その中で428遺伝子が未知で、シグナルペプチドを持ったものが14分子あった。最終的に、代謝関連組織特異的発現を示し、実際に分泌される未知の蛋白を9つ同定した。その中で、遺伝子組み換えをマウスに投与すると、血糖低下および血圧低下作用を示すことが判明した分子がヘパトニンである。肝臓に特異的に発現し分泌されることからヘパトニンと命名した。ヘパトニンは肝臓に特異的に発現し、特異的抗体を用いたイミュノブロッテイングで解析すると、その血中濃度は摂食によって低下し高脂肪食を負荷すると上昇する。遺伝子組み換え産物をバキュロウイルスの系で産生し、マウスに経静脈投与するとグルコース負荷において有意(40%以上)の血糖低下を認める。また同時に20-30mmHgの血圧低下を認める。私たちはヘパトニンの生理的意義を明らかにする目的で実験を進め、ノックアウトマウスを作製することに成功した。その他、成人汎下垂体機能低下
統合平均方程式に基づく混相乱流における非相似輸送機構の研究

流体の中に多数の固体粒子が分散した流れは工業装置や自然界あるいは生体内に幅広く観察され、ほとんどは乱流の状態にある。これを分散性混相乱流という。この流動を統一的に扱う数値シミュレーション手法が確立されれば、現象の解明にとどまらず、優れた輸送機能を有する媒体の開発、装置の設計、現象の制御にも強力な手段となる。本研究は、分散粒子と乱流に対してそれぞれ発展してきた理論的な扱い(数理モデル)を統合できる体積平均方程式系を確立し、例えば(流体だけでは相反する)抵抗低減と伝熱促進を両立させる混相乱流輸送現象を新規に見出し、そのメカニズムを解明することにより、提案する手法の有用性を検証する試みである。
腰椎黄色靭帯肥厚メカニズムの解明

靭帯肥厚と線維増殖性疾患(FPD)の類似性について検討した。黄色靭帯の特殊染色に加え、I型&III型コラーゲン、アルファ平滑筋アクチン(αSMA)の免疫染色を行った。結果、黄色靱帯の背側の弾性線維は肥厚靱帯ではまばらとなり瘢痕組織に置換され、さらに瘢痕に一致しType I & IIIコラーゲンが見られた。αSMA陽性細胞も多くみられ靭帯肥厚はFPDであることを支持する所見であった。瘢痕部に一致して、悪玉架橋のペントシジンの発現が観察された。方法:腰部脊柱管狭窄症により後方除圧手術をうけた症例の黄色靱帯を用いた。年齢は56-71歳であり、男性4例、女性1例であった。摘出黄色靱帯を矢状断面で、正中よりやや外側で切開し、その矢状断面を染色した。染色方法としては、瘢痕すなわち線維化を検討する目的でMasson Trichlome(MT)およびAzan(AZ)染色を、弾性線維を検討する目的でElastica van Gieson(EVG)染色を行った。免疫染色として、type Iおよびtype IIIコラーゲン、アルファ平滑筋アクチン(SMA)の発現部位を調査した。結果:黄色靱帯は基本のマトリックスは弾性線維であるため、EVG染色では全体が強染色される。しかしながら肥厚靱帯ではまばらに染色されない部分が目立ってくる。特に、背側ではその傾向は顕著であり、弾性線維が消失する部分が見られる。その部分をAZ染色とMT染色で確認すると、青色に強染色されるため瘢痕組織となっていることが分かる。硬膜側にも、瘢痕化は見られるが、背側に比べその範囲は少なく、ほぼ正常に近い弾性線維で占められる。いずれの検体でも背側での瘢痕形成が著しい。Fibrotic scoreでみると、硬膜側平均1.9に対し背側平均3.8と、背側に強い線維化・瘢痕形成を認めた。硬膜側ではType I&IIIを発現する部分は少なく限られている。一方背側の瘢痕部分は、一致するようにType Iコラーゲン免疫染色により陽性に染色されていた。しかしながらType IIIコラーゲンの発現は強く、Type Iコラーゲン陽性部位に加え、瘢痕形成が少ない部位にも発現しており、背側では広範囲に発現が認められた。また瘢痕層にはSMA陽性細胞もみられた。考察とまとめ:腰部脊柱管狭窄症患者の肥厚黄色靱帯の背側部分では強い瘢痕形成を認めた。免疫染色結果から、肥厚性瘢痕と類似の病態が存在することを示している。昨年度、黄色靭帯肥厚が肥厚性瘢痕との類似性について、免疫染色的評価を中心に行った。結果として黄色靭帯肥厚は、肥厚性瘢痕に類似した線維増殖性組織変化が主体であることを示した。本年度は、肥厚が高齢者に限局し、若年者には少ないことに着目した。靭帯の伸長性が加齢とともに低下することが易損傷性をもたらし、結果として、瘢痕形成となるとの仮説を立てた。黄色靭帯には、弾性線維と膠原線維がある。膠原線維は加齢により線維間を連結する架橋に変化が生じ、弾性性が落ちるといわれている。そこで、加齢性架橋(悪玉クロスリンク)の代表であるペントシジンの生成について免疫染色を使用して評価した。高齢者から得られた肥厚靭帯6検体と若年2検体の染色性を比較検討した。若年者のヘルニア手術中から得られた薄い黄色靭帯にもペントシジンの染色性は確認されたが、部分的であった。一方、高齢者の肥厚黄色靭帯には瘢痕組織の増生が確認された。とくに瘢痕形成は、靭帯の背面に顕著であった。ペントシジンの染色状況を見てみると、全体に染色されていたが、線維化、瘢痕化の強い背面部分では、染色度は強かった。以上より、高齢化に伴い、靭帯のマトリックスの一成分であるコラーゲンには、悪玉架橋といわれるペントシジンが生成されることが示唆された。この悪玉架橋により靭帯の伸縮性が低下し、易損傷性となる。損傷靭帯の修復過程において瘢痕が形成され、その蓄積により黄色靭帯には肥厚がもたらされることが強く示唆された。研究1:肥厚靭帯の病態として線維増殖性疾患( FPD)を提唱する報告は他に例がない。我々は、靭帯肥厚とFPDの類似性について検討した。腰部脊柱管狭窄症の後方除圧手術で摘出した黄色靱帯を矢状断面で、正中よりやや外側で切開し、その矢状断面を染色した。

瘢痕すなわち線維化を検討する目的でMasson Trichlome (MT)を、弾性線維を検討する目的でElastica van Gieson (EVG)染色を行った。FPDの類似性の解析として、I型コラーゲン、III型コラーゲン、アルファ平滑筋アクチン(αSMA)の免疫染色を行った。黄色靱帯の基本マトリックスである弾性線維は肥厚靱帯ではまばらに染色されない部分が目立っていた。特に、背側ではその傾向は顕著であり、弾性線維が消失する部分が見られる。その部分はMT染色で瘢痕組織であることが分かる。硬膜側にも瘢痕化は見られるがほぼ正常に近い。免疫染色では、硬膜側ではType I&IIIコラーゲンを発現する部分は少なく限られている。一方背側では瘢痕部分に一致するようにType Iコラーゲンが陽性に染色されていた。しかしながらType IIIコラーゲンの発現はさらに強く、Type Iコラーゲン陽性部位に加え、瘢痕形成が少ない部位にも発現していた。また、αSMAも背側に強く発現していた。以上より、黄色靭帯肥厚の原因として、靭帯背側における、肥厚性瘢痕や皮膚ケロイドのような線維増殖性の関与が示された。研究2:年齢による靭帯の弾性性劣化の検討。靭帯内のもう一つのマトリクスタンパクは、1型コラーゲンである。コラーゲンのクロスリンク解析に、加齢に伴い増加するといわれる悪玉架橋のペントシジンを免疫染色で検討した。Type Iコラーゲンの多く存在する瘢痕部に一致して、ペントシジンの発現が観察された。平成24年度に遺伝子解析を行うことで、当初の予定が遂行可能である。24年度が最終年度であるため、記入しない。靭帯の瘢痕化、悪玉架橋の分布状況を鑑み、靭帯の背側と腹側に生じる遺伝子発現の差異を検討することが、肥厚メカニズムの根底の解明に近づくことが明らかとなった。以上より、本年は、靭帯の背側と腹側の遺伝子発現の差異をマイクロアレイを用い、網羅的に解析する。興味ある遺伝子に関しては、その組織上発現分布をin situ hybridizationを用い、また、タンパク生成は免疫染色を用い評価する。
ゲル化窒化法による複金属酸窒化物系高温超伝導体の創出

岩塩型の窒化ニオブが、超伝導体(Tc=17K)であることに着目した。ニオブと異種金属陽イオンが均一に混合したアモルファス酸化物の混合物および複金属酸化物をアンモニア雰囲気中で焼成し、以下の新しい酸窒化物および窒化物超伝導体を発見した。(1)岩塩型(Nb_<0.95>Mg_<0.05>)(N_<0.92>O_<0.08>),(Nb_<0.89>Al_<0.11>)(N_<0.84>O_<0.16>),(Nb_<0.87>Si_<0.09>□_<0.04>)(N_<0.87>O_<0.13>)、(2)LiTa_3N_4型(Li_<0.88>□_<0.12>)Nb_3(N_<0.87>O_<0.13>)_4、(3)岩塩型(Nb_<0.5>Ti_<0.5>)N板状晶岩塩型の窒化ニオブが、超伝導体(Tc=17K)であることに着目した。(1)岩塩型(Nb_<0.95>Mg_<0.05>)(N_<0.92>O_<0.08>),(Nb_<0.89>Al_<0.11>)(N_<0.84>O_<0.16>),(Nb_<0.87>Si_<0.09>□_<0.04>)(N_<0.87>O_<0.13>)、(2)LiTa_3N_4型(Li_<0.88>□_<0.12>)Nb_3(N_<0.87>O_<0.13>)_4、(3)岩塩型(Nb_<0.5>Ti_<0.5>)N板状晶我々が開発したゲル化窒化法を用いると、従来の固相からの合成では不可能であった様々な新しい化学組成の金属酸窒化物の合成や形態制御が可能になり、物質科学の新しい領域を拓きつつある。本研究では性質の異なる複数種類の金属イオンを組み合わせることにより、高温超伝導などの新たな機能性をもつ複金属酸窒化物の創出を目指す。本年度は下記の3点について検討した。1)ゲル化窒化合成したNb-Al系酸窒化物はNb_<0.89>Al_<0.11>O_<0.32>N_<1.16>の化学組成をもち、Nb_4N_5型の結晶構造をもつ(Nb_<0.60>Al_<0.08>□_<0.32>)(O_<0.21>N_<0.79>)と記述できた。1,500°Cでアニールすると、岩塩型の(Nb_<0.89>Al_<0.11>)(O_<0.16>N_<0.84>)となり、Tc=17K、体積分率91%の新規超伝導体であった。2)FeAs系酸化物において超伝導が現れるところから、Asと同族のNに着目しペロブスカイト型LaFeO_3およびCaFeO_<2.5>をアンモニア窒化した。前者は600°C、後者は455°C付近からLa_2O_3およびCaOと窒化鉄の混合物にそれぞれ変化始めた。3)大きな誘電率が温度に依らず観察されると報告のあったSrTaO_2Nについて、室温での中性子線回折測定を行った。リートベルト解析するとI4/mnmの4aサイトを占有する酸化物/窒化物イオンの異方性温度因子がxy平面内で大きく変位した。8hサイトは酸化物イオンによる占有率が0.77,窒化物イオンが0.23であるところから、3(Ta-O),(Ta-N)結合でTaO_3Nからなるxy平面が構成されて局所的なひずみが生じ、これが分極を誘起すると考えられた。金属酸化物として均一に混合した原料をアンモニア窒化するゲル化窒化法などの合成法によって、従来の固相混合物からの合成では不可能であった新しい化学組成の金属酸窒化物や窒化物の合成や形態制御が可能になる。本年度は下記の2項目を明らかにした。(1)Nb-Al系のゲル化窒化生成物(Nb_<0.60>Al_<0.08>□_<0.32>)(N_<0.79>O_<0.21>)はTc=7K、さらにそれをアンモニア気流中1200°Cで焼成するとTc=17.3Kの超伝導体であった。これを受けて今年度には、Alの代わりにMgおよびSiがNbとともに共存する酸窒化物を得た。

アンモニア気流中1200°Cでの焼成物は、それぞれ(Nb_<0.95>Mg_<0.05>)(N_<0.92>O_<0.08>)および(Nb_<0.87>Si_<0.09>□_<0.04>)(N_<0.87>O_<0.13>)と表わされる岩塩型結晶構造を持ち、Tc=17.6Kおよび16.2Kの新超伝導体であった。Si系の生成物について中性子線回折法で結晶構造を精密化すると、Si位置の変位パラメータが大きく、正規位置の6配位から4配位位置に向けてやや変位していると考えられた。この結晶構造の乱れが、超伝導転移温度の低下につながった可能性がある。(2)層状化合物KTiNbO_5を酸処理して得たHTiNbO_5にプロピルアミンをインタカレーションしたのちアンモニア窒化すると、TiO_2-Nb_2O_5混合粉を原料とした場合よりも容易に(Nb_<0.5>Ti_<0.5>)Nが生成した。その結晶構造は2次元的には岩塩型に類似しているものの、原料酸化物が層状構造をもったことに由来して積層欠陥を多く含むと考えられた。1000°C以上でアンモニア窒化すると、Tc=15Kのバルク超伝導体であった。複数種類の金属塩を溶液中で均一混合したのち低温焼成したアモルファス酸化物や、複金属酸窒化物を原料としてアンモニア窒化すると、様々な新しい金属酸窒化物の創製や形態制御が可能となることを示してきた。本年度はさらに新たな知見として下記の2項目を明らかにした。(1)前年度に見出したNb系ゲル化窒化生成物(Nb_<0.89>Al_<0.11>)(N_<0.84>O_<0.16>)、(Nb_<0.95>Mg_<0.05>)(N_<0.92>O_<0.08>)および(Nb_<0.87>Si_<0.09>□_<0.04>) (N_<0.87>O_<0.13>)は、いずれもバルク超伝導体であり転移温度Tcは17K程度であった。これらのうちでSi系の酸窒化物は陽イオン欠損が関係した超伝導フラックスのピン止めの効果と思われる大きな磁気ヒステリシスを示し、5Kで約2.5×10^4A/cm^2の臨界電流値が見積もられた。またSi系の比熱測定ではTcに大きな不連続が観測され、電子相関が極めて強いことが明らかになった。さらにTc以下の温度域にも小さなギャップが観測され、新たなマルチギャップ超伝導体である可能性が見え始めている。(2)LiNb_3O_8を800°Cでアンモニア窒化して岩塩型(Li_<0.20>Nb_<0.71>□_<0.09>)(N_<0.78>O_<0.22>)、1000°Cでは窒化および陽イオンの秩序化が進行して層状構造を持つ六方晶(Li_<0.88>□_<0.12>)Nb_<3.0> (N_<0.87>O_<0.13>)_4を得た。後者は2.7以下で超伝導性を示す可能性が明らかになった。
病棟看護師が認識している統合失調症患者への退院支援の困難さの分析

本研究では、病棟看護師が長期入院をしている統合失調症患者の退院援助を提供することに何らかの困難を感じている事例を分析し、その上で、退院を促進するための看護について考察していくことを目的とした。結果、【家族と信頼関係を構築することが難しい】【患者への退院支援の介入のタイミングがわからない】【退院計画を医療チーム内で共有できず、介入方法がわからない】の3つのカテゴリーが抽出された。この研究の目的は、長期入院となっている統合失調症患者に対する退院支援について、病棟看護師がどのような困難さを感じているのかを明らかにし、長期入院となっている統合失調症患者への退院促進のための看護援助を考察することである。今年度は、長期入院者への退院援助に関する先行研究やそのための援助、自立支援法との関連性について文献検討を行った。長期入院者への退院援助は事例研究がほとんどであり、病棟看護師が抱える困難さについての研究は見当たらなかった。自立支援法に関する研究については、施行されてからの経過が短いため、解説が多く、法導入後に長期入院者への退院援助にどのような変化があったのか分析した研究は見当たらなかった。長期入院患者への退院援助には、地域でどのような援助が必要なのかを入院中から考えていくことが必要であり、地域の社会資源を利用することが必須である。よって、自立支援法について病棟看護師が理解した上で、患者の生活能力・障害に応じた退院援助が必要であると考えられた。また、今年度は、インタビューガイドを洗練するためのインタビュー予備調査を行った。慢性期閉鎖病棟に勤務する5名の看護師からインタビューの承諾があり、インタビューガイドをもとにインタビューを行った。その結果、インタビューの中で必ず語られたことは、患者の家族への援助の困難さであった。インタビューガイドでは、長期入院となっている理由を質問することにしていたが、その中で、家族の退院に対する思いやその背景についてもインタビューガイドに含める必要があることがわかった。今後は、予備インタビューをさらに分析し、インタビューガイドを洗練させること、また他の病院でのインタビューを行い、傾向の違い等も分析していく予定である。この研究の目的は、長期入院となっている統合失調症患者に対する退院支援について、病棟看講師がどのような困難さを感じているのかを明らかにし、長期入院となっている統合失調症患者への退院促進のための看護援助を考察することである。今年度は、昨年度に引き続き、インタビュー調査を行い、そのインタビューデータを質的に分析し、病棟看護師が抱えている困難さについてさらに分析を行った。その結果、病棟看護師は、慢性期の統合失調症患者自身の病状の変化をとらえにくく、ホスピタリズム化している患者にどのようなタイミングで退院への動機付けを高めていけばよいのかがわかりにくいこと;家族が高齢化しているため、家族の協力が得られにくいこと;不安やストレスへのコーピングスキルが未熟であり、その習得に時間がかかってしまうこと;退院後の支援体制をどのように構築したらよいのかがわからないこと等が挙げられた。また、いくつかの学術集会に参加し、精神障害者に対するリハビリテーションにおける病棟看護師の役割についての研究発表を聞く機会を得た。研究発表では、「退院支援において重要なことは看護師だけで展開するのではなく、精神保健福祉士や医師とともに協働して取り組む姿勢が前提にあるが、連携をしていく上での困難があるとの発表がなされ、インタビューの視点として、他職種との連携に関する項目も必要であると考えられた。来年度はさらにインタビューを行い、分析を深めていくとともに、カテゴリー化を行い、長期入院となっている統合失調症愚者を受け持っている病棟看護師が抱えている困難感を整理し、今後の看護への示唆を考察していく予定である。今年度は、慢性期病棟に勤務していない看護師(急性期病棟、訪問看護)へのインタビューも実施した。急性期病棟の看護師へのインタビューでは、「急性期病状が落ち着くまでの期間が長くても、病状が安定した後は患者も退院に目を向けることができる。また、病状が悪い時期に、共に歩んでいく中で患者との信頼関係を構築できる」と述べており、慢性期病棟の看護師とは違った観点で退院支援の難しさを語っていた。訪問看護師は、「退院支援において重要なことは病棟看護師だけで展開するのではなく、訪問看護師と連携をしていくことが必要ではあるが、現在の診療報酬制度では現実的には難しい」という連携の困難を語っていた。これらの結果を前年度までのインタビュー結果と比較分析した。慢性期病棟に長期入院をしている退院困難患者に対して病棟看護師が抱いている困難は、1.病状や生活パターンが固定化(ホスピタリズム化)している患者への動機付けや生活スキル向上のための援助、2.家族を含めだ退院後の支援体制を整えるための地域連携であることが明らかになった。

慢性期患者の退院促進のためには、慢性期病棟に勤務する看護師をスーパーバイズすることのできるディスチャージナースや専門看護師の活用、退院促進のベースとなる患者の退院への動機付けを高めるための援助技術、リハビリテーションに関する更なる研究が必要であることなどが示唆された。
含硫黄原子団の電子伝導に関する研究

金属-硫黄結合に係わる電子は非局在化し、これが電子伝導に特異な機能を発現することから、この特性を生かした機能性材料開発のための基礎的情報を得るための研究を行った.即ち、二核錯体の中心金属部分を測定機に接続するための端末、架橋部分を電子伝達のワイヤーと考え、一方の中心金属へ電子を出入りさせた場合、他方の金属がどの程度その事実を感知することが出来るかを調べることによって、架橋部分の電子伝達性の程度を評価しようとする試みである.本年度は2種類のモデル化合物の系統的創製方法を開発し、それらの電極反応を明らかにしたので報告する.1.[Ru(β-dik)_2(acac)]とSCl_2またはS_2Cl_2とを反応させることにより、ルテニウムトリスβ-ジケトン錯体中の1個のβ-ジケトンのγ位炭素を硫黄原子団で架橋した新規二核錯体[(β-dik)_2Ru(acac-S_n-acac)Ru(β-dik)_2](n=1-3)の系統的合成方法を確立した.2.[Ru(β-dik)_2(AN)_2](AN:アセトニトリル)とS_2Cl_2との反応により、ルテニウム金属を直接硫黄原子で架橋した新規二核[(β-dik)_2Ru)_2-μ(S_2)_2]および三核錯体[(β-dik)_2Ru(_3-μ(S_2)_2)]の系統的合成方法を確立した.3.新規に創製した二核錯体はそれぞれRu^<II>-Ru^<III>およびRu^<III>-Ru^<IV>の混合原子価状態の安定度を示す均化定数(K_c)は、同じ錯体部位をアルキンやアルケンで結合した同様な二核錯体に比べて増大した.硫黄原子団が電子伝導に特異な機能を持つことから、この特性を生かした機能性材料開発のための基礎的情報を得るための研究として、先ずモデル化合物の創製を行った.即ち、二核錯体の中心金属部分を測定機に接続するための端末、架橋部分を電子伝達のワイヤーと考え、一方の中心金属へ電子を出入りさせた場合、他方の金属がどの程度その事実を感知することが出来るかを調べることによって、架橋部分の電子伝達性の程度を評価しようとする試みである.本年度はそのモデル化合物の創製と生成機構について、下記に述べる1、2の成果が得られたので報告する.1ルテニウムトリスβ-ジケトン錯体中の1個のβ-ジケトンのγ位炭素を硫黄原子団で架橋した下記に示す新規二核錯体の系統的合成方法を開発・確立した.2硫黄原子団導入に伴う反応の機構を解明した。金属-硫黄結合に係わる電子は非局在化し、これが電子伝導に特異な機能を発現することから、この特性を生かした機能性材料開発のための基礎的情報を得るための研究を行った.即ち、二核錯体の中心金属部分を測定機に接続するための端末、架橋部分を電子伝達のワイヤーと考え、一方の中心金属へ電子を出入りさせた場合、他方の金属がどの程度その事実を感知することが出来るかを調べることによって、架橋部分の電子伝達性の程度を評価しようとする試みである.本年度は2種類のモデル化合物の系統的創製方法を開発し、それらの電極反応を明らかにしたので報告する.1.[Ru(β-dik)_2(acac)]とSCl_2またはS_2Cl_2とを反応させることにより、ルテニウムトリスβ-ジケトン錯体中の1個のβ-ジケトンのγ位炭素を硫黄原子団で架橋した新規二核錯体[(β-dik)_2Ru(acac-S_n-acac)Ru(β-dik)_2](n=1-3)の系統的合成方法を確立した.2.[Ru(β-dik)_2(AN)_2](AN:アセトニトリル)とS_2Cl_2との反応により、ルテニウム金属を直接硫黄原子で架橋した新規二核[(β-dik)_2Ru)_2-μ(S_2)_2]および三核錯体[(β-dik)_2Ru(_3-μ(S_2)_2)]の系統的合成方法を確立した.3.新規に創製した二核錯体はそれぞれRu^<II>-Ru^<III>およびRu^<III>-Ru^<IV>の混合原子価状態の安定度を示す均化定数(K_c)は、同じ錯体部位をアルキンやアルケンで結合した同様な二核錯体に比べて増大した.
血管新生を標的とする新規抗がんリード化合物の創製

近年、がんの進行に血管新生が密接に関与していることが明らかになり、がん化学療法の新たなターゲットとして注目を集めている。申請者の研究室では、インドネシア産海綿より単離したbastadin類が、in vitroおよびin vivoで強力な血管新生阻害作用を有することを明らかにしているが、その詳細な作用機序は不明のままである。本研究では、このbastadin類をシーズとして、合成化学的手法による新たな抗がんリード化合物の創製を目指しており、本年度はbastadin類の作用機序の解明を目的に、標的タンパクを探索するためのプローブ分子の設計・合成について検討した。前年度までの構造活性相関研究で、オキシム基は活性発現に必須であることを確認しているので、活性に影響が少ないと考えられる部位に、標的タンパクの精製及び検出に必要な補助基を導入したプローブ分子を設計した。検討の結果、bastadin6のフェノール部位に、リンカーを介してビオチンを導入することで、作用機序の解析に有用なツールとなるプローブ分子の合成に成功した。また、光照射により標的タンパクと共有結合を形成させることができるアジド基を導入したフォトアフィニティープローブの合成についても検討し、bastadin6が有するプロモ基を位置選択的にアジド基へと変換する方法を見いだすことに成功した近年、がんの進行に血管新生が密接に関与していることが明らかになり、がん化学療法の新たなターゲットとして注目を集めている。申請者の研究室では、インドネシア産海綿より単離したbastadin類が、in vitroおよびin vivoで強力な血管新生阻害作用を有することを明らかにしている。本研究では、このbastadin類をシーズとして、合成化学的手法による新たな抗がんリード化合物の創製を目指しており、本年度はbastadin 6の各種アナログを合成して、詳細な構造活性相関を検討することで、活性発現に必要な構造単位を明らかにすることを目的に研究を行った。まず、bastadin 6の効率的な合成法の開発を目指して検討を行い、フェノール類の新規酸化的カップリング反応を鍵工程とする、短工程、高収率での全合成を達成した(Tetrahedron,2005,61,7211)。そこで本合成法を用いて、bastadin 6の各種類縁体を合成し、構造活性相関を検討することとし、bastadin類の特徴的な構造であるオキシム基およびBr基に着目した構造変換を行い、得られた類縁体について活性評価を行った。まず、オキシム基を種々改変した類縁体では活性が大きく減弱したことから、オキシム基が活性発現に重要な役割を担っていることが明らかになった。また、bastadin 6には6つのBr基が存在するが、このBr基の数が活性発現に密接に関わっているというデータが得られた。これらの知見をもとに、化合物の水溶性の向上を目指してBr基の一部を極性官能基へ置換した類縁体の合成に成功した。また、それらの活性評価から、各種置換基の導入が活性発現に及ぼす影響に関する知見を得ることができた。また、光照射により標的タンパクと共有結合を形成させることができるアジド基を導入したフォトアフィニティープローブの合成についても検討し、bastadin6が有するプロモ基を位置選択的にアジド基へと変換する方法を見いだすことに成功した
潰瘍性大腸炎の腸粘膜内血管内皮細胞によるスーパーオキサイド産生の意義に関する研究

正常および潰瘍性大腸炎大腸粘膜の生検材料を試料とし、free radicalを産生する血管内皮細胞の性状に関して免疫組織科学的に若干の知見を得た。方法は、大腸粘膜生検材料に、1mg/mlのnitroblue tetrazolium(NBT)を含有するEagle's minimum essential medium 0.3mlを添加して2時間の器官培養を行う。培養後試料を固定し、OCTコンパウンドにて包埋し凍結切片を作成する。得られた切片に対して1次抗体として抗E-selectin、抗ICAM1、抗CD31、抗VCAM-1抗体を用い、酵素抗体免疫組織染色法により血管内皮細胞に発現している接着分子とNBT還元能の関連に関して検討した。炎症性腸粘膜において、VCAM-1は固有層に発現を認めなかった。組織学的炎症度との関連については、E-selectinのみが有意な関連を示した。NBT還元能を有する血管内皮細胞にはICAM-1およびCD31が陽性であった。E-selectinに関しては、NBT還元能を有する毛細血管ではE-selectinは陰性であり、比較的大きな血管において陽性であった。以上の結果に関してはScandinavian Journal of Gastroenterologyに掲載予定である。
試験管内における体細胞からの全能性誘導

iPS技術の確立によって、体細胞から多能性状態を誘導することが可能となった。しかし、ES/iPS細胞は栄養膜系列や原始内胚葉系列を生じることが出来ず、個体を作製するためには宿主となる初期胚を用いる必要がある。我々は初期胚を用いずに幹細胞のみで全能性の上位概念、即ち胚発生能を再構築可能とするべく研究を実施した。研究期間内には、研究に用いる幹細胞の性質を改良し、FGF依存的に維持され、キメラ貢献能、生殖細胞寄与能を保持する新たな多能性幹細胞(中間多能性幹細胞, INTPSCs)を報告した。また化学的に定義された培養条件で栄養膜幹細胞を樹立、維持することに成功し報告を行った。マウスES/iPS細胞は、胚盤胞に移植をすれば、個体を構成する全ての細胞に分化できるが、ES/iPS細胞のみから個体を発生させた報告はこれまでにない。一方、受精卵は単一の細胞でありながら個体発生能をもつ。本研究においては、1)試験管内における卵母細胞の作製、2)新規栄養膜幹細胞とES/iPS細胞の凝集による胚の再構成、の2つの戦略により、試験管内で細胞から個体を発生させる技術を確立すること、即ち全能性を試験管内で人為的に誘導することを可能とし、その系を用い個体発生能の論理を解明することを目的としている。本年度は、体細胞より簡便に多能性幹細胞を誘導し、キメラ貢献能、生殖細胞系列寄与能を評価可能とする系を開発し、査読付き学術誌に発表した(Tsukiyama et al.PLOS One 9,e92973(2014)(責任著者))。本報告はマウス-ラット異種キメラ個体内で機能的なラット精子を形成させた最初の報告でもある。またLIFを用いること無くキメラ貢献能、生殖細胞寄与能を有する新規多能性幹細胞株の樹立を試み、エピブラスト幹細胞培養培地を改変することによっても、これら多能性の上位指標を満たせることを示した(Tsukiyama et al PLOSONE 9, e95329(2014)(責任著者))。また化学的定義培養条件下での新規栄養膜幹細胞株の樹立・維持法を確立し、特許の申請を行った(発明者)。更に本成果は査読付き学術誌に投稿中である(Ohinata et al (筆頭責任著者))。唯一受精卵が有する厳密なる全能性、即ち胚発生能を支持する機構を解明し、試験管内で再構成することを最終の目的として研究を行った。マウスES細胞は胚盤胞に移植をすれば個体を構成する全ての細胞に分化できるが、ES細胞のみから個体を発生させた報告はこれまでにない。一方、受精卵は単一の細胞でありながら全能性をもつ。発生初期において受精卵は卵割を繰り返し、最初に栄養膜外胚葉(TE)系列と内部細胞塊(ICM)系列への細胞運命の分岐が起きる。これまでにTE系列からはTS細胞、ICM系列からはES細胞が樹立されている。ES細胞のみでは個体が発生しない合理的な理由として、ES細胞からはTE系列細胞が生じないことが挙げられる。とは言え、既存のTS細胞とES細胞の凝集によって胚の再構成に成功した報告もこれまでにない。ES細胞とTS細胞の混合による初期胚の再構築が実現しない一つの原因として、現存するTS細胞が初期胚のTEの性質を模倣できていないことが考えられる。本年度は増殖因子と低分子化合物の添加によって、より未分化な性質を示す新規TS細胞を樹立・維持することに成功し、報告した(Ohinata et al, PLOSONE (2014)。ES細胞とTS細胞の混合による初期胚の再構築が実現しないもう一つの原因として、それらの単純な混合によっては初期胚様の立体構造を形成できないことも考えられる。本年度は新規TS細胞を無血清浮遊条件において培養することで、高効率にTE様の構造を誘導できることにも成功しており、現在報告に向けて準備中である。現在それらにES細胞を注入し人工胚盤胞を作製する研究を進めている。今後はES細胞およびTS細胞の質、初期胚様立体構造形成法のを行い、全能性の理論を解明すると共に幹細胞からの個体形成技術を確立するべく研究を進めたい。初期胚盤胞は内部細胞塊と栄養膜外胚葉から成り、これら細胞の協奏によって胚全能性が支持されている。これまでに内部細胞塊からはES細胞が、栄養膜外胚葉からはTS細胞が樹立されているが、TS細胞の培養条件は最初の報告以来、殆ど改良がなされておらず、高い質と未分化安定性を支持し得る新規TS細胞培養条件の同定が望まれた。研究代表者は平成26年度までにTS細胞を血清やフィーダー細胞を用いない、化学的定義条件下(N2B27/Neurobasal/DMEMF12/FGF2/Activin A/XAV939/Y27632on fibronectin, FAXY)で樹立、維持することに成功し報告したが、平成27年度はこれらTS細胞と従来培養条件下で共存する多様な形態を示すTS細胞コロニーについて分子生物学的性質を明らかにするべく、理化学研究所筑波研究所の小倉淳郎室長の研究グループと共同研究を実施し、従来TS細胞培養条件下で見られるドーム型の形態を示すコロニーがElf5を高発現しており、幹細胞の自己複製を主に支持していること、FAXY TS細胞はこれと良く似た分子生物学的性質を示すことを明らかにした(Motomura K et al, Biol Reprod, in press)。