hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
メタボロミクスによる音響外傷性難聴の病態解明と新たな治療法の開発

今回用いたメタボロミクス解析という手法により、内耳リンパ液内の代謝産物を網羅的に初めて測定することができた。これらの代謝産物は、遺伝子やタンパク質と異なり、種特異性が無い点が特長である。そのため音響などの難聴モデル動物を作成して、内耳における代謝の変化を観察することは、ヒトでの難聴発生メカニズムや、治療法開発に直接繋がることが期待される。具体的には今回の手法を応用して、難聴モデル動物の内耳リンパ液内で増加している代謝物の経路をブロック、あるいは減少している物質を補充するといった方法で、難聴メカニズムの解明や治療法開発を目指して今後は研究を進めていきたいと考えている。Gas-chromatography/ mass-spectrometry(GC/MS)を用いてモルモットの内耳リンパ液のメタボローム解析を行った。また、強大音を負荷した直後の内耳リンパ液との比較も行った。その結果、29種類の代謝産物が同定され、うち6種類の代謝産物において強大音負荷後の内耳リンパ液で著明に変化がみられた。モルモット(ハートレー系、オス、8週齢:250-300g)を用いた。まずモルモットを深麻酔下に断頭し、蝸牛を摘出した。その際に同時に血液も採取した。次に顕微鏡下に正円窓・卵円窓からマイクロピペットを用いて、内耳リンパ液を採取した(1匹2耳より約5-10μl)。採取した内耳リンパ液および血漿から水溶性代謝物を抽出し、フリーズドライ、誘導体化の過程を経て、最後にガスクロマトグラフィー質量分析(GCMS-QP2010)にて代謝物を測定した。得られたデータは主成分分析にて内耳リンパ液に特異的な代謝物を検討した。主成分の分析の結果から内耳リンパ液に特異的な代謝物が合計29種検出された。このうち、アスコルビン酸やイノシトールなど血漿中と比較してリンパ液中に有意に多く認める代謝産物が同定された。次にモルモットに4kHz、120dB SPLのオクターブバンドノイズを2時間加えることにより一過性の聴覚閾値上昇モデルを作成した。聴力はABRで測定した。音響暴露直後と24時間後の各タイムポイントで内耳リンパ液を採取し、質量分析にて代謝物を測定した。結果、アスパラギン酸、グルタミン、乳酸、グルクロン酸、ガラクトサミン、リンゴ酸の合計6種の代謝産物において有意に変化がみられた。その際、同時に血液も採取した。採取した内耳リンパ液および血漿から水溶性代謝物を抽出し、フリーズドライ、誘導体化の過程を経て、最後にガスクロマトグラフィー質量分析計(GCMS-QP2010)にて代謝物を測定した。主成分分析の結果から、内耳リンパ液に特異的な代謝物が合計34種検出された。また、内耳リンパ液と血漿代謝物組成を主成分分析による多変量解析で比較すると両者の組成は有意に異なるという結果を得た。特にアスコルビン酸やイノシトールなど計12種の代謝物については有意に両者間で濃度差が見られた。アスコルビン酸にはフリーラジカルスカベンジャーとして音響外傷に対する内耳保護効果があることが報告されており、内耳リンパ液の代謝物として興味深い結果が得られた。次に、モルモットに126dB SPLのオクターブバンドノイズを5時間加えることにより、永続的聴覚閾値上昇モデルを作成した。音響暴露直後と24時間後の各タイムポイントで内耳リンパ液を採取し、質量分析計にて代謝物を測定した。今後音響を暴露しない群と比較して変動があった代謝物について調べる予定である。Gas-chromatography/ mass-spectrometry(GC/MS)を用いてモルモットの内耳リンパ液のメタボローム解析を行い、血漿との比較を行った。また、強大音を負荷した直後と24時間後の内耳リンパ液における代謝産物の変化も検討した。その結果内耳リンパ液から77種類の代謝産物が同定され、うち15種類の代謝産物の量は内耳リンパ液と血漿の間に有意な差がみられた。また10種類の代謝産物は、音響負荷により内耳リンパ液内で有意に変化がみられた。モルモット(ハートレー系、オス:250-300g)を用いた。

次に顕微鏡下に正円窓・卵円窓からマイクロピペットを用いて、内耳リンパ液を採取した(1匹2耳より約5-10μl)。採取した内耳リンパ液および血漿から水溶性代謝物を抽出し、フリーズドライ、誘導体化の過程を経て、最後にガスクロマトグラフィー質量分析装置(GCMS-QP2010)にて代謝物を測定した。得られたデータは主成分分析にて内耳リンパ液に特異的な代謝物を検討した。主成分の分析の結果から内耳リンパ液中に水溶性代謝物が合計77種検出された。このうち、アスコルビン酸やイノシトールなど血漿中と比較してリンパ液中に有意に多く認める代謝産物や、バリンやリン酸など血漿中よりリンパ液中に有意に少ない物質もみられた。次にモルモットに4kHz、126dB SPLのオクターブバンドノイズを2時間加えることにより不可逆的な難聴モデルを作成した。音響暴露直後と24時間後の各タイムポイントで内耳リンパ液を採取し、質量分析装置にて代謝物を測定した。結果グリセロールなどの合計10種の代謝産物において、血漿と比べて有意に音響負荷による変化がみられた。耳科学当初の予定通り、内耳リンパ液中と血漿中の代謝物の比較や強大音負荷後の内耳リンパ液中の代謝物の変化を測定することにより内耳リンパ液に特異的な代謝物や音響外傷に関与する代謝物を検出することが出来た。今年度は内耳リンパ液の採取手技を確立し、ガスクロマトグラフィー質量分析計を用いてモルモット内耳リンパ液の代謝物を網羅的に解析し、血漿から得られた代謝物と比較した。また、障害モデル(強大音響負荷モデル)での内耳リンパ液の代謝物組成の測定も行っており、以上のことからおおむね順調に進展していると考える。この手法を用いることで、直接内耳リンパ液内での代謝物の変化を調べ、統計学的に検討することが可能になると考える。また音響外傷モデル動物における、内耳障害後のリンパ液中の代謝物の変化を探ることによりMetabolic pathwayから内耳障害におけるメカニズム解明につながるのではないかと考えている。さらに治療薬開発への応用も可能と考える。今後は障害モデルから得られた内耳リンパ液の代謝物とコントロール群(音響暴露しない群)との比較、検討を行うことにより、内耳障害のさらなるメカニズムの解明および治療薬への開発に繋げたいと考えている。次年度も動物購入代、飼育代、抗体・試薬各種、生化学(免疫染色等)関連消耗品を主体に本研究をすすめる予定である。また、成果をとりまとめるにあたっては国内外の学会発表や海外英文誌への投稿などを積極的に行う予定であり、その際の旅費、謝金、学会参加費に使用する予定である。
人工複合糖質プローブの創製と高次生命機能の制御

糖鎖の中でも特に多彩な生理機能を発現するシアル酸含有スフィンゴ糖脂質ガングリオシドの実践的大量合成法を開発し、800種に及ぶ人工複合糖質プローブの創出に成功しました。この成果は、インフルエンザや細菌毒素の感染、免疫応答、がん、炎症、自己免疫性神経疾患などの病態の理解に世界的な貢献をしました。現在、薬の開発や細胞生物学への先端的応用研究が進行しています。(1)新戦略による新規B-シリーズガングリオシド分子プローブの創製と機能解明:B系列ガングリオシドの中で最も複雑な構造を有するGQ1bに焦点を絞り、糖鎖骨格内に二分子存在するジシアリルガラクトースを鍵化合物に設定し、効率的なGQ1b糖鎖の構築を試みた。その結果、従来法と比較して、立体選択性、収率ともに向上が見られ、非還元末端側七糖の効率的合成法の確立に成功した。またGT1b七糖分子プローブを用いて、シアル酸認識レクチンSiglec-7の結晶化に成功した。(2)ラクト系ガングリオシド及びムチンプローブの創製と機能解明:ラクト系ガングリオシドには、セレクチンリガンドとして知られるシアリルLe^xやガン関連抗原としてのシアリルLe^aなど、免疫、炎症、がんなどの高次生命機能に関わる分子が数多く含まれている。今回、シアリルLe^x含有ムチン型糖鎖プローブのデザインと合成、6-0-スルホシアリルパラグロボシド、ラクタム化シアル酸含有シアリルLe^xネオグリコリピドの合成に成功し、G159モノクローナル抗体との反応性を明らかにした。合成シアリルLe^x、シアリルLe^a及びジシアリルLe^a関連分子プローブにより作出されたモノクローナル抗体は、糖鎖抗原の生体内分布を明らかにするとともに、機能制御の可能性を示した。(3)自己免疫性神経疾患の発症機序解明のための分子プローブの創製:ギランバレー症候群(GBS)発症機序解明ための分子プローブとして、ガングリオシドGM1糖鎖-KLH複合体、及び、C.jejuniリポ多糖の合成を試みた。その結果、GM1エピトープを含む七糖構造の構築に成功した。(1)新戦略による新規B-シリーズガングリオシド分子プローブの創製と機能解明:前年度にひきつづき、B系列ガングリオシドの中で最も複雑な構造を有するGQ1bに焦点を絞り、糖鎖骨格内に二分子存在するジシアリルガラクトースを鍵化合物に設定し、効率的なGQ1b糖鎖の構築を試みた。その結果、ガングリオシドGQ1b八糖(保護体)の全合成に成功した。またGT1b七糖分子プローブを用いて、シアル酸認識レクチンSiglec-7の結晶化に成功するとともに、X線解析により動的結合機序を明らかにした(JBC,397,271-278,2006)。(2)自己免疫性神経疾患の発症機序解明のための分子プローブの創製:前年度にひきつづき、ギランバレー症候群(GBS)発症機序解明ための分子プローブとして、ガングリオシドGM1糖鎖-KLH複合体の合成を試みた。その結果、GM1エピトープ四糖を含むKLH複合体の構築に成功した。現在このGM1エピトープ-KLH複合体を用いてGBS発症試験を行っている。(3)セレクチン及びシグレックを標的とした糖鎖プローブの創製と機能解明:我々はシアリル6-スルホルイスXがHEV細胞における重要なL-セレクチンリガンドであることを明らかにしてきた。今回、末梢リンパ球におけるシアリル6-スルホルイスX糖鎖抗原の分布を調査したところ、ヘルパー・メモリーT及びNK細胞のサブセットに発現されていた。これらのT細胞サブセットは、皮膚ホーミング型であり、シアリル6-スルホルイスXの生合成に必須である6-スルホトランスフェラーゼ(HEC-GlcNAc6ST)とフコシルトランスフェラーゼ(Fuc-Tvll)を顕著に発現していた(Blood,107,3197-3204,2006)。一方、シグレック用プローブとして合成したジシアリルルイスAをリガンドとして、シグレック-7との共結晶の作製に成功し、その3D構造を解析した(Biochemical J.,397,271-278,2006)。(1)新戦略による新規B-シリーズガングリオシド分子プローブの創製:前年度において、b-シリーズガングリオシドGQ1bの非還元末端側七糖の効率的新規合成法の確立に成功した。今年度は、このGQ1b七糖エピトープの大量合成を行い、これをドナーとして、新たに開発したグルコシルセラミドアクセプターとの縮合を検討した。その結果、良好な収率でGQ1b八糖糖鎖を有する天然型ガングリオシドGQ1bの新規全合成を達成した。この研究成果は、今後、細胞生物学的機能を解明する上できわめて重要な意義を有するものである。

(2)セレクチン及びシグレックに関係する新規糖鎖リガンドのデザインと合成:インフルエンザヘマグルチニンが認識するシアロ糖鎖は、セレクチン及びシグレックが認識する糖鎖と重なっている。感染と自然免疫、ならびに白血球遊走に関係するシアル酸含有糖鎖や新規シアル酸誘導体をデザイン、合成してそのリガンド特異性を明らかにした。またリソゾームシアリダーゼ(NEU1)の選択的阻害剤を開発した。(3)自己免疫性神経疾患の発症機序解明のための分子プローブの創製:ガングリオ系a-シリーズガングリオシドGM3,GM2及びGM1糖鎖エピトープの新規効率的合成法を開発することにより自己免疫疾患関連人工複合糖質プローブの創製に成功した。今後大量合成を行うことによりギランバレー症候群(GBS)の発症機構解明が期待される重要な成果である。(1)人工ガングリオシド分子プローブ創製のための革新的合成技術の開発:ガングリオシドの合成で問題となる脂質導入の非効率性を解消するために、高反応性ユニット環状グルコシルセラミドを開発し、新しい効率的なガングリオシド合成法を確立した(Carbohydr. Res.,343,2729-2734,2008)。また、糖鎖-タンパク質相互作用を解析するための糖鎖アレー、抗糖鎖抗体作成用の免疫原性糖鎖複合体、糖加水分解酵素の基質特異性解明および酵素探索のための蛍光化糖鎖など種々の糖鎖プローブを合成し、GBS発症機序の解明などに応用した(Glycoconjugate J., 25, 269-278 & 545-553, 2008)。(2)新戦略による新規b-シリーズガングリオシド分子プローブの創製と高次生命機能の制御:ガングリオシドGT1b糖鎖プローブとボツリヌス毒素の複合体形成によるX-線結晶構造解析を行い、分子レベルでの毒素感染機序の解明に成功した(PLoS Pathogens,4,1-10,2008)。また人工ガングリオシドGQ1bの大量合成と分子プローブ化に成功(J. Org. Chem., in press)し、神経細胞の分化誘導実験に着手している。(3)セレクチン及びシグレックを標的とした新規糖鎖リガンドのデザインと合成、及び機能解析:B細胞に特異的なシアル酸結合性イムノグロブリン様レクチン(シグレック)であるCD22(シグレック-2)のリガンド構造要求性の解明に取り組み、天然リガンドを凌ぐ高親和性リガンドの開発に成功した(J.Med.Chem.,51,6665-6681,2008)。一方、内在性リガンドであるシアリルα2,3/α2,6 6-スルホルイスX及びLacNAcの合成を触媒する酵素遺伝子の転写調節機構を明らかにした(J.Biol.Chem.,283,34563-34570,2008)。(1)高反応性ユニット環状グルコシルセラミド法を応用して、自己免疫性神経疾患関連ガングリオシドGalNAcGD1a、及び新規インフルエンザ受容体ジシアリル分岐六糖性ガングリオシドの世界初全合成に成功した。また神経突起伸展活性を有する棘皮動物由来ガングリオシドHLG-2の合成に世界で初めて成功した。(2)シアル酸と硫酸基を共に含有するユニークな糖鎖に対する抗体を樹立し、シアル酸と硫酸基を有する糖鎖のセレクチン分子への結合能やシグレック分子への結合のこれらの抗体を用いた解析法を樹立した(Biochimie, 91 : 423-433, 2009)。さらにこれらの糖鎖の検出を、卵巣癌に応用した(Glycoconj. J., 26 : 923-928, 2009)。
電子弾性散乱による短寿命不安定核の電荷密度分布測定

本研究は、天然には存在しない短寿命で崩壊する不安定核の内部構造を、原子核内部構造の最も強力な研究手法である電子散乱により解明を目指すものである。不安定核構造の解明は、原子核物理学にとってはもちろんの事、宇宙での元素合成過程研究にも必須であるが、電子散乱による研究はあまりに困難であるため今までは不可能と考えられてきた。私達は、この壁を打ち破る短寿命不安定核の電子散乱による研究を可能にする革新的な実験技術、SCRIT法、を発明し、世界初の不安定核専用電子散乱施設を建設し研究を進めた。平成22年度に実施した研究及びその成果を記す。当該年度は最終目標到達に向けて2つの研究を実施した。平成23年度以降に建設予定の分析電磁石の検討及び詳細設計、そしてプロトタイプ型の検出器系を用いSCRIT法による標的生成の最適化にむけた実験である。1.本研究での弾性散乱電子検出では、長い(40cm)標的領域で弾性散乱される電子を広い散乱角度を一度に覆い測定する必要がある。この条件を満たす分析電磁石系を検討した。検討した磁極形状を基に、3次元磁場計算コードを用いて磁場分布計算を行った。電子蓄積リング中の周回電子ビームに与える影響を最小にするため、磁極やフィールドクランプの最適化を行いほぼ磁石の最終案を作り上げた。計算された磁場分布を用いて詳細なシミュレーションを行っている。2.本研究のため理化学研究所・RIビームファクトリー内に設置された電子蓄積リングのコミッショニングを行い、予定通り300MeVの電子ビームが数百mA蓄積できることを確認した。引き続き到達ルミノシティー測定及びその時の捕獲イオン数測定のため、安定核(Csイオン)を用いた散乱電子測定に向けた準備を進めた。当初22年度中の研究実施を目標としていたが、加速器トラブルによる遅延及び3月上旬の東日本大震災による活動停止などで年度内の実施は出来なかった。平成23年度に関東地区の電力制限がされ加速器健全性が確認された後、研究活動を再開、2.の到達ルミノシティー測定のための標的の捕獲条件最適化を行った。そして本加速器施設で初めての弾性散乱事象を確認した。世界初の電子弾性散乱による短寿命不安定核研究に向けて、平成23年度は次に示す2点の研究を行った。1)散乱電子測定系の検討並びに建設2)安定な原子核を利用したSCRIT装置での到達ルミノシティーの測定並びに高度化1)本散乱電子測定系に要求される運動量分解能はΔp/p0.1%、一度に覆う散乱角度範囲はΔθ=30度である。さらに、SCRIT装置で捕獲される標的は電子ビーム軸上に40cm程度広がることも考慮する必要があり、これらの条件を満たす散乱電子測定系の設計並びに建設を行った。本測定系は、大型の分析電磁石と軌跡測定のためのドリフトチェンバーで構成される。電磁石は磁極ギャップ29cm、磁極幅140 cmで最大磁場0.8 T(テスラ)、のウインドウフレーム型のダイポール電磁石を採用した。設置位置を最適化することで、散乱角度範囲3060°を覆い、全立体角100 msrを実現する。3次元の詳細な磁場計算を行い、電子蓄積リング内の周回電子ビームへの影響を最小限とする電磁石系を建設した。建設後、詳細な磁場測定を行い要求性能が満たされていることを確認した。2)平成23年度は、新設したSCRIT装置付きの電子加速器で電子散乱実験に必要なルミノシティー、10**27 /cm2/s、を達成するための開発研究を行った。到達ルミノシティーを測定するため、標的には安定核を使用した。安定核は、電荷分布密度が既知、即ち電子弾性散乱断面積が既知であるので、弾性散乱事象測定によりルミノシティーを決定出来るのである。加速器運転条件の最適化などの結果、10**7ヶの標的原子核捕獲で目標の10**27 /cm2/sが達成出来ることを確認した。この研究により、新たに建設した電子散乱施設で短寿命不安定核の電子散乱実験が可能であることを証明した。これらのデータはすでに論文で発表済みである。世界初の電子弾性散乱実験による短寿命不安定核研究に向けて平成24年度は以下の研究開発を実施した。1)散乱電子測定系の建設並びにテスト、2)ウラン光核分裂反応を利用した短寿命不安定核生成・分離装置(ISOL)の建設と不安定核生成、3)SCRIT装置への不安定核イオンビーム輸送ラインの建設、4)安定核を使ったSCRIT装置全体の総合テスト、である。1)散乱電子測定系は、大型電磁石と大型ドリフトチェンバー、そしてデータ読み出し系で構成される。平成23年度完成予定だった電磁石は東日本大震災のため同年科研費を繰越し平成24年度内に完成、ドリフトチェンバーは平成24年度完成、そして仕様を大幅変更したデータ読み出し系は平成24年度科研費を繰越し平成25年度1月に完成した。電磁石については80万点に及ぶ詳細な磁場測定を行い、データ解析の結果研究に必要な3次元磁場分布を決定した。2)日本初のウラン光核分裂反応を利用した短寿命不安定核生成・分離装置を完成し、電子ビーム照射により研究対象である寿命40秒の2重魔法核、132Sn、を生成、分離、輸送そして同定に成功した。3)短寿命不安定核生成・分離装置で生成した不安定核をイオンビームの形で電子散乱実験を実施するSCRIT装置まで高効率で輸送するイオンビーム輸送ラインを建設し輸送性能試験を行った。

4)上記生成・分離装置より安定Xeガスを導入、イオン化の後質量分析したXeイオンビームをイオンビーム輸送系を通じて輸送し、SCRIT装置で捕獲、そして電子散乱実験を実施した。これは建設が終了した世界初の不安定核専用の電子散乱実験施設の総合運転テストである。安定核は弾性散乱断面積が既知であり散乱電子測定より到達ルミノシティーを決定することができる。実験の結果、要求ルミノシティーである1e27 /cm2/sに近い4e26/cm2/sを達成することができた。世界初の電子弾性散乱実験による短寿命不安定核研究にむけて、平成25年度は1)加速器運転時に発生する電子ビーム加速用RF起源のノイズに強い新方式のドリフトチェンバー多チャンネル信号処理系の完成、2)同処理系を含む新設大型ドリフトチェンバーの性能評価、3)同ドリフトチェンバー、大型ウインドーフレーム型双極子電磁石及び大型トリガー用電子検出器からなる散乱電子測定系の組立と励磁テスト、並びに励磁時の電子蓄積リング内の周回電子ビーム軌道への影響調査と対策、4)イオン捕獲効率改善の必要性が明らかになったSCRIT装置の電極構造の再製作と取り付け、高真空再立ち上げのための長期間に渡る加速器の焼きだし(ベーキング)と枯らし運転、などを実施した。1000チャンネルを越える信号を処理する多チャンネル信号処理系は、ドリフトチェンバーに直付けされ電子回路ボード上でドリフト時間までデジタル処理をするタイプに変更したため、従来の回路で見られた電子ビーム加速用RF源からのノイズ問題は解決することができた。宇宙線を利用し本ドリフトチェンバー系の性能評価を行い、使用ガスの選定を含むドリフトチャンバー系の基礎的なパラメータの決定を行った。大型プラスチックシンチレータを使ったトリガー用電子検出器を建設し、上記ドリフトチェンバーとともに電磁石に設置、大立体角・高運動量分解能を有する散乱電子測定系を完成させた。その後、電磁石を励磁し検出器への影響と電子蓄積リング内の周回電子ビーム軌道に対する影響を測定、計算による予想通り深刻な影響はなく補正可能範囲であることを確認した。また以前の安定Xeガスイオンを用いた捕獲実験で明らかになったいくつかの問題を解決するため、外部入射イオン捕獲のためのSCRIT電極の再検討を行い、イオン捕獲効率やバックグランド軽減のための大幅な変更を加えた新SCRIT電極系を設計、製作した。世界初の不安定核の電子弾性散乱実施に向け、電磁石スペクトロメータ測定系のアクセプタンスの正確な評価を行った。そして安定核である132Xeの弾性散乱から、初めてこの原子核の電荷分布を決定した。現在、論文執筆中である。原子核の電荷分布は電子弾性散乱断面積の角度分布を精度良く測定する決定出来る。そのためには、測定系のアクセプタンスの角度依存性の完全な理解が不可欠である。そこで、平成27年度は、電荷分布既知の原子核を標的とした測定からアクセプタンス評価を行い、その後安定核だが電荷分布未知の原子核の弾性散乱実験を行った。まずは、電荷分布既知のタングステン。極細ワイヤー標的を準備し、タングステンからの弾性散乱断面積を測定し、既知の電荷分布を再現できるかを検証した。極細ワイヤー点状標的に対するアクセプタンスは、ほぼシミュレーションで再現できることが分かり、断面積絶対値や角度分布
金属触媒によるアルキニル化合物の新規閉環反応の創出

酸素が連結したアルキニル基とパラジウム触媒との相互作用により,基質内のいろいろな位置の安定な炭素ー水素結合を活性化し,反応利用することに成功した.アリール位やビニル位,ベンジル位の炭素ー水素結合の活性化に成功し,つづくアルキニル基への挿入による分子内環化,またはいろいろな不飽和結合化合物との環化反応を達成し,多様な含酸素環状化合物が構築できた.反応の機構の詳細も合わせて検討し,通常のアルキニル基を炭素ー水素結合の活性化に利用するための有益な情報を得た.今年度は交付申請書に記載したとおり、有機分子の中でも反応性に乏しい炭素ー水素結合を金属触媒と不飽和結合との協働作用により活性化し、炭素ー炭素不飽和結合への付加により新たな炭素ー水素,炭素ー炭素結合を形成する反応を研究した。結果の例を以下に記す。アルキニルアリールエーテルのアルキノキシ基へのパラジウム錯体の求核攻撃を利用して炭素ー水素結合を活性化し、アレンとの付加環化反応により2,3位に共役エキソメチレン部を有するクロマン類が合成できることを見つけた。用いるアレンの置換基を工夫することにより、反応の位置選択性を制御できるので、望みの位置にいろいろな置換基を有する環状化合物が得られる。生成物内の2,3位に共役エキソメチレン部を利用することにより、続く分子変換が容易に行える。アルキニルアリールエーテルとノルボルネンとの付加環化反応が進行し、オルト位炭素ー水素結合活性化を伴い6員環化合物ベンゾピラン類が生成することを見つけた。ゼロ価パラジウム錯体と還元剤の金属亜鉛を触媒利用することが重要である。金属亜鉛は、反応途中でパラジウムが不活性化した際に、活性な0価パラジウム錯体に再生させるために加えている。この反応において、パラジウム触媒を工夫すると、オルト位だけでなく、メタ位も切断できるという予期せぬ結果を得た。アルキニル-オルトトリルエーテルのベンジル炭素ー水素結合を選択的に活性化し、アルキノキシ基へ分子内でシス付加させることにより、2,3-ジヒドロベンゾフランを収率よく合成することに成功した。この時、オルトメチル基の反対側のアリール炭素ー水素結合は切断されない。この生成物はいろいろなカルボニル化合物はアゾ化合物とエン反応にワンポットで用いることができ、高度に官能基化されたベンゾフラン類を一挙にできる。今年度は交付申請書に記載したとおり、有機分子内の安定結合、炭素ー水素結合を金属触媒と不飽和結合配向基により活性化し、新たに炭素ー炭素結合を形成する反応を開発した。アルキニル炭素上にかさ高いトリイソプロピルシリル(TIPS)基を有するアルキニルアリールエーテルといろいろなイソシアナートを酢酸パラジウム、トリシクロヘキシルホスフィン配位子、添加剤に酢酸亜鉛を用いて反応させると、アルキニルアリールエーテルのオルト位炭素ー水素結合を選択的に活性化し、イソシアナートへの位置選択的挿入、つづく分子内挿入反応により、固体生成物のベンゾオキサジノン類を得た。本生成物に365 nmの波長のUVを照射すると、固体状態でのみ良好な蛍光発光を示し、生成物内の置換基を工夫することにより、青色から緑色の光を調整することができる。生成物の環状骨格内に電子不足のエテニルアミド部を有することと、分子間相互作用を抑制するかさ高いTIPS基の存在が顕著な固体発光を促していると理解している。ケイ素イソシアナートだけでなくケテンも反応に用いることができ、対応する1-クロマ-3-ノン類を得ることにも成功した。アルキノキシ基を2位に有するビアリールを酢酸パラジウム、トリシクロヘキシルホスフィン配位子を用いて反応させると、2'位、すなわちアルキノキシ基からシグマ位の炭素ー水素結合を活性化し、アルキノキシ基が分子内挿入した生成物、ジベンゾピラン類が収率よく得られた。本生成物を臭化水素で処理し、つづくブチルリチウムなどの有機金属反応剤を付加させることにより、π電子共役系高分子のモノマーとして知られる6,6-二置換ベンゾピラン類に収率よく変換できた。本反応は含酸素縮合芳香族炭化水素の合成に利用でき、実際にアルキノキシ基を二つ有するターフェニルから、縮合5環化合物へと収率よく変換できる。今年度は交付申請書に記載したとおり,金属触媒と不飽和結合配向基によりビニル炭素ー水素結合の活性化,およびアルキノキシ基(-OC≡C-)以外の不飽和結合基を用いる炭素ー水素活性化について検討した.合わせてこれまでの研究を引き続き推進した.結果の例を以下に記す.オルト位にアリル基(-CH2CH=CH2)を有するアルキニルアリールエーテルを酢酸パラジウム,トリシクロヘキシルホスフィンを触媒量用いてトルエン中で加熱すると,アリル基の内側の炭素ー水素結合が選択的に活性化され,アルキノキシ基へ分子内付加,すなわちヒドロビニル化が進行した生成物,2,3-ビスメチレンクロマンが収率よく得られた.アリル基を1-メチルエテニル基(CH(Me)=CH2)に替えると末端炭素ー水素結合の活性化が進行した.いずれもアルキノキシ基からデルタ位の炭

素ー水素結合を活性化していることがわかる.前者の反応,アルキニル-2-アリルアリールエーテルの分子内ヒドロビニル化の際,電子不足アルケンを加えて行うと,付加の後Diels-Alder反応が連続して進行し,縮合環状化合物を一挙に合成できる.アルキノキシ基以外の不飽和結合官能基を炭素ー水素結合活性化に利用する研究を進めている.これに着手するに当たり,アルキノキシ基とパラジウム触媒による炭素ー水素結合活性化,続くアルキンまたノルボルネンとの反応の詳細を検討し,本手法による炭素ー水素結合活性化に関する知見を得ることに成功した.この結果を利用することにより,いろいろな不飽和結合官能基を用いる炭素ー水素結合活性化の研究を進め,これまでにシリルアルキニル基を用いることに成功している.研究実績の概要のとおり,研究実施計画に記載した内容は順調に達成していて,期間内に計画を達成できると考えている.あわせてアルキノキシ基を用いる研究により,不飽和結合基を,いかにして遷移金属触媒を用いた炭素-水素結合の反応利用に結びつけられるのか,という基本的な情報を得ることにも成功したと考えている.この成果は,以降に予定している研究のみならず,金属錯体と不飽和結合基との相互作用における新たな可能性を示しているといえる.今年度は交付申請書に記載したとおり,アルキニルエーテル基以外の不飽和結合基を配向基に利用する,金属触媒による炭素ー水素結合の活性化,アルキニルエーテルを配位子に利用する異なる炭素ー水素結合の活性化について検討した.合わせてこれまでの研究を引き続き推進した.結果の例を以下に記す.アルキニルエーテル基以外の不飽和結合官能基を配向基に利用する研究をこれまで行ってきた.初めに申請書に記載した,アミノアルキニル基やビニルエーテル基,チオアルキニル基など全てを集中的に検討したが,いずれも配向基として満足に機能しなかった.官能基自体の安定性およびかさ高いかつ特殊な構造が触媒の接近を妨げたことが要因と考えられた.この結果を受けて,複雑かつ不安定な構造を避けつつ,アルキニルエーテル基と同様の効果を発現する簡単な不飽和結合官能基をさらに探索したところ,適切な炭素官能基を有するアルキニル基を用いると配向基として機能することを突き止めた.この方法を利用することにより,いろいろな官能基を有する芳香族化合物を簡便に構築できる.アルキニルエーテル基を配位子に利用する研究を進めてきた.これを達成するため,アルキニルエーテル内の炭素水素結合を活性化せずに異なる化合物の炭素ー水素結合を選択的に活性化する方法を探索した.具体的には,これまで活性化してきたオルト位炭素ー水素結合への金属錯体の接近を抑制し,かつ安定性を高めるかさ高い炭素官能基を有するいろいろなアリールアルキニルエーテルを設計し,検討した.その結果,期待どおり分子内の炭素ー水素結合活性化を抑制できるアルキニルエーテルを発見し,異なる化合物の炭素ー水素結合活性化に成功した.酸素が連結したアルキニル基とパラジウム触媒との相互作用により,基質内のいろいろな位置の安定な炭素ー水素結合を活性化し,反応利用することに成功した.アリール位やビニル位,ベンジル位の炭素ー水素結合の活性化に成功し,つづくアルキニル基への挿入による分子内環化,またはいろいろな不飽和結合化合物との環化反応を達成し,多様な含酸素環状化合物が構築できた.反応の機構の詳細も合わせて検討し,通常のアルキニル基を炭素ー水素結合の活性化に利用するための有益な情報を得た.研究実績の概要のとおり、研究実施計画に記載した内容は順調に達成している。合わせて、アルキニルエーテルとイソシアナートとの反応生成物が、当初は予期できなかった、固体状態で顕著な固体発光を示すことがわかり、固体発光材料の合成の新たな指針を提供することに成功した。
新規ミトコンドリアタンパクの機能解析と心不全治療への応用

心不全にて発現減少し、未だ機能未知の新規ミトコンドリアタンパク質:9030617O03Rikの機能解析を行った。本タンパク質は心臓・肝臓・腎臓に多く発現していた。アミノ酸配列の検討により、本タンパク質がアミノ酸の光学異性体であるD-アミノ酸代謝に関与している可能性を見出した。新たに本タンパク質のノックアウトマウスを作成し、その心臓における全遊離アミノ酸解析を実施したところ、D-グルタミン酸が有意に増加していることを確認した。更に酵素活性検討からD-グルタミン酸シクラーゼ活性を有することを見出した。今後D-アミノ酸代謝を介した心不全治療応用を目指す。心不全患者の数は高齢化に伴い増え続けており、既存の薬剤治療を上回る積極的治療法が求められている。これまでに心不全の進展にミトコンドリア障害や細胞死が大きく関与していると我々のグループを含め報告されている。本研究では心不全で発現が変化する、未だ機能未知の新規ミトコンドリアタンパク質Xの機能を解析を行っている。その発現機構を制御することで心不全に対する新たな治療法の発見につながるのではないかと考えられる。現在までの検討により、この分子Xは種を超えて保存されており、臓器別発現では心臓・腎臓に多く発現し、心臓においても心筋細胞に優位な発現を認めた。現在までに心臓特異的にタンパクXが過剰発現するトランスジェニックニック(TG)マウスを作製している。このTGマウスはTAC(横行大動脈縮窄術)による圧負荷に対して抵抗性を示しており、タンパク質Xが保護的効果を有しているものと考えている。その機序に関し現在までにアミノ酸代謝に関与していることが判明している。アミノ酸代謝の変化の心不全発症への関与し関し研究し、心不全治療への応用を目的とする。本研究では心不全状態で発現が変化する新規ミトコンドリアタンパク質Xの機能解析を行い心不全治療への応用を目的とした。タンパク質Xのアミノ酸配列からの検討によりアミノ酸の光学異性体であるD-アミノ酸代謝に関与している可能性を見出した。そこで新たにノックアウトマウスを作成し心臓組織での全遊離アミノ酸解析を実施したところ、特定のD-アミノ酸が有意にノックアウトマウスで増加していた。このD-アミノ酸が哺乳類の組織で確認されたことはこれまでになく新規性の高い結果を得た。引き続き本タンパク質の酵素活性検討を行ったところ、D-アミノ酸シクラーゼ活性を有していることが確認できた。これまでにも哺乳類において本酵素活性を検討した報告は存在するものの酵素が同定・精製されたことはなく、本研究により初めて存在が証明された。これらの結果は心不全の病態にアミノ酸代謝が関与していることを強く示唆する結果と考えている。元来、哺乳類の生体内にはL-アミノ酸のみが存在すると考えられてきたが、近年の測定技術の開発・進歩により様々なD-アミノ酸が哺乳類の組織中に存在し生理活性を有することが報告されている。しかし心臓におけるD-アミノ酸の存在・生理活性に関する検討・報告は未だなされていない。D-アミノ酸シクラーゼである新規ミトコンドリアタンパク質XによるD-アミノ酸代謝への介入が新たな心不全治療のターゲットとなる可能性を有していると考え引き続き研究を進めていく。in vivoモデルとして研究中の新規ミトコンドリアタンパク質Xの心臓特異的トランスジェニック(TG)マウスおよび全身ノックアウトマウスを作製しており、その表現型評価を行っている。これらにTAC(横行大動脈縮窄術)による圧負荷を行い、心不全関連分子を変動評価を行い、タンパク質Xが圧負荷刺激に抵抗性を有することを見出しており、その作用機序を検討中である。また、発現調整による代謝への影響としてタンパク質Xがアミノ酸代謝へ関与していることを新たに見出した。さらにタンパク質Xが胎生14.5頃より発現してくることも新たに判明した。27年度が最終年度であるため、記入しない。循環器内科学不全心におけるアミノ酸代謝の関与は全く新たな知見であり、今後タンパク質Xの反応生成物や酵素活性を定量するための定量法を検討中であり、アミノ酸代謝による心不全への治療応用を検討していく。
WISC-IVを用いた治療的介入：親との協働モデルの構築及びマニュアルの開発

本研究は,臨床現場で広く使用されているWISC-IVについて,そのフィードバック・セッション自体を治療的なものとするための新たな協働モデル(Collaborative WISC-IVFeedback with Parents: CFP)を提示し,マニュアルの作成及び導入の試みを行うことを目指している。2年目となる本年度はまず,昨年度行った心理士による知能検査・発達検査の実施状況についての質問紙調査の分析を行った。200名の回答を分析した結果,施行する知能検査・発達検査は,ウェクスラー式が95.5%と最も多く,新版K式(48.0%),ビネー式知能検査(17.0%)と続いた(多重回答)。また,自由記述の分析の結果,心理士が検査のフィードバックで重要視していることとして,5つのカテゴリー「今後の生活に役立つ方針を示す」「わかりやすい伝え方」「現状の困りごとへの支援」「被検者の自己理解の促進」「肯定的側面への言及」があることが明らかになった。これらによって,本研究の目的であるWISC-IVのフィードバックの協働モデルとそのためのマニュアルを提示することが,多くの心理士の業務に資することが確認された。またCFPの基本的な考え方が多くの心理士の方向性と一致することも明らかになった。これらをふまえマニュアル作成時には,フィードバックの中で上記の5項目をいかに具現化するかを丁寧に記述することが重要であろう事が示唆された。また,本年度後期からは,European Center for Therapeutic Assessmentにて研修を行う機会を得た。本研究のフィードバックは日本の現状を踏まえ主に保護者を対象としているが,検査を受ける子どもに対しての検査実施前後の声かけや振り返りの重要性について再確認し,マニュアルに反映するための方策について議論を続けている。昨年度に実施した心理士による知能検査・発達検査の実施状況についての質問紙の結果の分析が完了した。また,European Center for Therapeutic Assessmentにて,CFPモデルの精緻化についての議論も続けている。当初の計画におけるマニュアル試案の作成については,今後行う予定である。まずは,European Center for Therapeutic Assessmentにて,CFPモデルの精緻化についての議論を深める。これと並行してマニュアル試案を作成し,後期からは作成したマニュアル試案に基づく他の心理士によるCFPの試行を行う予定である。今年度はまず,研究協力者の協力を得て,これまで筆者が行ってきたCFPの見直しを行い,広く心理士が使用できるマニュアルを作成するために必要な要素の抽出を行った。ここにおいて,現在多くの心理士が行っているWISC-IVの実施状況が不明であることが指摘された。文献調査の結果,心理士養成段階での心理検査の教育状況については先行研究があるものの,臨床現場である各機関でのWISC-IVや心理検査全般の実施の具体についての詳細な研究は見当たらないことが明らかとなった。そのため,今年度はまず,現在のWISC-IVの実施状況についての質問紙調査を行うこととした。質問紙の作成を経て,近畿圏の2府4県の心理士が勤務する機関に質問紙を送付し,200部の回答を得た。現在分析中であるが,初心者から中堅・ベテランまで幅広い層が回答しており,WISC-IVの実施状況の一端を明らかにするデータになると考えられる。この一方で,効果的なマニュアル作成のために,研究代表者は米国にて協働的/治療的アセスメントの研究者らと意見交換を行った。そこでは,フィードバックを行う対象(親/本人)についての文化的な背景や配慮事項,WISC-IVが認知機能を測る検査であることによる特徴の明確化について議論が行われ,日本でWISC-IVのフィードバックを行う際に考慮が必要な事柄が明らかにされた。これまで行われてきたCFPを精査する過程で,心理士の行うWISC-IVの実施状況を明らかにする必要が指摘されたため,当初の計画に加えて質問紙調査を行った。そのため当初のCFPの評定については,完了するに至っていない。

これらをふまえマニュアル作成時には,フィードバックの中で上記の5項目をいかに具現化するかを丁寧に記述することが重要であろう事が示唆された。また,本年度後期からは,European Center for Therapeutic Assessmentにて研修を行う機会を得た。本研究のフィードバックは日本の現状を踏まえ主に保護者を対象としているが,検査を受ける子どもに対しての検査実施前後の声かけや振り返りの重要性について再確認し,マニュアルに反映するための方策について議論を続けている。昨年度に実施した心理士による知能検査・発達検査の実施状況についての質問紙の結果の分析が完了した。また,European Center for Therapeutic Assessmentにて,CFPモデルの精緻化についての議論も続けている。当初の計画におけるマニュアル試案の作成については,今後行う予定である。まずは本年度行った質問紙調査の結果の分析を行うことを最優先とし,CFPのマニュアル作成のための基礎資料とすることが肝要と考える。これと並行して,これまで行ったCFPについての評定を進めていく予定である。まずは,European Center for Therapeutic Assessmentにて,CFPモデルの精緻化についての議論を深める。これと並行してマニュアル試案を作成し,後期からは作成したマニュアル試案に基づく他の心理士によるCFPの試行を行う予定である。アメリカのCenter for Therapeutic Assessmentへの旅費を計上していたが,European Center for Therapeutic Assessmentへの海外研修の機会を得たため,今年度はこの分の支出がなかった。次年度,さらにEuropean Center for Therapeutic Assessmentにて議論を続けるために支出が必要になると考えられる。またマニュアルの策定と他の心理士による試行の準備のために,支出を必要とする。
分子認識応答過程のピコ秒〜ミリ秒ダイナミクス

分子認識に基づいた目的成分の高感度・高選択的な分析は医療分析や生体関連物質の分析、自動分析などに関連して、今後、益々その重要性を増すものと考えられる。更なる研究の発展には、新たな分子認識系の設計が必要であるとともに、分子認識に共役する信号発生・伝達機構の解明が重要となる。本研究においては、水素結合やクラウンエーテルによる分子・イオン認識系と光・電気化学的に活性なサイトを有する分子群を合成するとともに、その分子認識応答のダイナミクスを明らかにすることを目的とした。1)カリックスアレーンを対イオンとして持つRu(II)錯体の合成とイオン認識:カリックスアレーンテトラスルホン酸を対イオンとして有するRu(II)を単離するとともに、その結晶構造を明らかにした。また、この錯体がナトリウムイオンやマグネシウムイオンを選択的に認識し、その応答を発光強度・寿命により検知できることを示した。2)ケンプ酸型素子の合成と分子認識:水素結合により生体関連物質を認識する芳香族炭化水素を有するケンプ酸誘導体を合成し、これに基づきアデニン誘導体の認識をスペクトル的に検知可能であることを示した。3)芳香環を有するバルビツール誘導体の合成と分子認識:カルバゾール環などを有するバルビツール誘導体を合成し、そのアミンの分子認識を検討したところ、THFやアセトニトリル中において分子認識を吸収スペクトルから検知できることを確認した。以上のように、いずれの系においてもイオン・分子認識を分光化学的に検知できることを確認した。1)クラウンエーテル環を有するRu(II)錯体の合成とイオン認識:ナトリウムイオンを選択的に認識し、その応答を発光強度・寿命により検知できることを示した。2)分子関節型素子の合成と分子認識:ナフタレン環と水素結合により生体関連物質を認識するジアミノピリジン部位と、それを蛍光検出することのできるナフタレン環を同時に有する分子関節型化合物を合成した。クロロフォルムにおいて分子関節化合物はチミン誘導体を極めて効率良く認識することを、同化合物の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトル変化から確認できた。3)芳香環を有するバルビツール誘導体の合成と分子認識:ピレン、アントラセン環などを有するバルビツール誘導体を合成し、そのアミンの分子認識を検討したところ、THF中において分子認識を吸収スペクトルから検知できることを確認した。以上のように、いずれの系においてもイオン・分子認識を分光化学的に検知できるとを確認したため、次年度においては、目的とする認識デイナミクスを詳細に検討する。また、これらの化合物は電気化学的にも活性であるため、認識機構を電気化学的にも明らかにする予定である。

2)ケンプ酸型素子の合成と分子認識:水素結合により生体関連物質を認識する芳香族炭化水素を有するケンプ酸誘導体を合成し、これに基づきアデニン誘導体の認識をスペクトル的に検知可能であることを示した。3)芳香環を有するバルビツール誘導体の合成と分子認識:カルバゾール環などを有するバルビツール誘導体を合成し、そのアミンの分子認識を検討したところ、THFやアセトニトリル中において分子認識を吸収スペクトルから検知できることを確認した。以上のように、いずれの系においてもイオン・分子認識を分光化学的に検知できることを確認した。
Identification of Genes Controlling Treg Development by Combining the CRISPR-Cas9 System and Bone Marrow Chimeric Mouse Model

制御性T細胞(Treg)は免疫応答の抑制的制御に枢要な細胞群である。その発生、機能の分子基盤の解明により、自己免疫疾患の発症機構のさらなる理解が予想されます。筆者らはTregの分化早期段階のMbd3欠損により、Treg前駆細胞およびTregが減少、それに従って、マウスの多臓器における自己免疫疾患の発症を確認した。そこで、Mbd3がTregの分化制御により、自己寛容の樹立に関する肝要な役割を果たしていることを明らかにした。今回の研究により、自己免疫疾患発症の分子また細胞基盤につきまして、新たな知見を得られた。免疫学制御性T細胞エピジェネティクス
古地球磁場強度の統計モデルー強度実験の信頼性問題を考慮したデータベースについて

1.東北地方の蔵王火山と相馬市付近にて、それぞれ第四紀の火山岩と白亜紀の石灰岩の試料採集のための調査旅行を実施した。前者は以前に行なった古地磁気学研究のうち松山逆磁極期中の正磁極期への逆転途中の地球磁場の詳しい様子を探るためであり、後者は白亜紀の時代における地磁気の変動を調ベるためだある。2.採集した岩石試料については超伝導磁力計やスピナー磁力計を使用しての古地磁気方向の測行を行なった。また交流消磁法により十分に初生磁化成分が求められないものは、昨年度完成した高温連続測定装置を使用して高温で連続した熱消磁を行なった。その結果蔵王の火山岩からはハラミヨ期に関わる磁場逆転の詳細が解明された。また相馬層の石灰岩からは、古地磁気変動は白亜紀ではブリュンヌ期よりも小さいことや、この石灰岩は現在と同じ緯度で生成されたものであり、外来の地穀ブロックではないことも確認できた。3.上記の調査や実験と平行して古地球磁強度のデータベースを作成した。熱残留磁化起源の火山岩から得られた3万前よりも古い時代の出版されたすベてのデータをインプットした。データベースの項目は単に年代と古地球磁場強度のみではなく、サイトID、年代決定法の種類、データの誤差、実験試料の数、古地磁気方向のデータ等、データの信頼性を評価するのに役立つ項目も導入した。このデータベースから必要に応じてデータを抽出し、種々の解析を行なった。重要な成果としては、中生代には地磁気ダイナモの長周期変化が存在したこと、地磁気双極子モーメントはガウス分布ではなく対数正規分布であること、等が判明した。4.先カンブリア時代の古地球磁場強度が非常に不足していることが明らかになったので、今後は高温連続測定による古地球磁場強度実験を意欲的に行ない、全地球史ぶの地磁気変動の解明に発展させる。
高度尿道下裂に対する体内各種器官を用いた尿道形成術の実験的研究

尿道下裂は尿道口が陰茎の先端に開口せず,陰茎の途中あるいは陰嚢,会陰の高さに開口している先天性の疾患である。昨年までわれわれは,ラビットの陰茎を用いて,尿道およびそれを取りまく尿道海綿体を切除し尿道下裂状態を作成した。つづいて膀胱粘膜を採取し,マイクロサージェリーのテクニックを利用し,チューブ状になるように極細の吸収系で縫合し,欠損尿道に移植したが,生着には至らなかった。さらに尿管や腹膜についてもフリーグラフトにして欠損尿道部に移植し,新尿道の生着状況を観察したが,移植尿道の生着したラビットを作成することができなかった。本年も追試験を繰り返したが,同様の結果を繰り返した。そこで,実験方法の転換を余儀なくされ,以下の3点について軌道修正して実験を行っている。(1)実験動物をラビットからラットに変更した。(2)チューブ形成を行わず,onlay(上蓋)スタイルとして尿道を形成した。(3)移植組織を有茎組織弁として血行を維持するようにした。現在尿道下裂状態形成術を終了し,尿道移植手術を終え,その生着の成否について観察中である。生着が得られたら,移植尿道の形態,機能などについて明らかにする予定である。現在尿道の欠損した男児,すなわち尿道下裂に関して,動物実験モデルは確立をされていない。そこでわれわれは,ラビットの陰茎を用い,尿道下裂状態を作成した。その際,尿道およびその周囲の尿道海綿体のみを摘除し,その支持組織となる皮下組織はできる限り,温存するよう努めた。次に,同ラビットを開腹し,膀胱前腔を明らかにした後,膀胱粘膜を採取した。この際この移殖すべき膀胱組織をできる限り尿道と同様の状態とするため,漿膜,筋層は,マイクロサージャリーのテクニックを応用し,一枚ずつ剥離して除去した。このグラフトをク-ロバイクリル系にて,縫合してチューブ状として,尿道欠損部分に補填した。これを皮下組織で被覆し,さらに皮膚を縫合して,尿道欠損部への膀胱粘膜移殖を終了した。その後,インドインクを動脈内注入し,移殖した膀胱粘膜を摘出し,組織内へのインクの移行を光顕レベルで調べた。これによりインクは,周囲尿道組織と同様に移殖組織へも流入することが判明し,周囲組織からの血行あるいは尿道断端からの血行が推測された。移殖長期間後のものに関しては,手術成功が不可欠であるが,尿の流れる管腔であるため困難であり現在マイクロサージャリーを応用し,追試実験を行っている。ラビットの陰茎を用いて,尿道およびそれを取りまく尿道海綿体を切除し尿道下裂状態を作成した。つづいて膀胱粘膜を採取し,マイクロサージェリーのテクニックを利用し,チューブ状になるように極細の吸収糸で縫合し,欠損尿道に移植した。また,膀胱と同様の移行上皮組織である尿管,腹膜についても,これをそのまま尿道欠損部に移植し縫合した。ただラビットの陰茎には新尿道を被覆するのに十分な皮下組織は得られなかった。なか新尿道内には3Fの尿管カテーテルを挿入し,術後の尿の排泄はこのステント内を経由させた。術後数日でこのステントを抜去し,尿道の生着状況を観察したが,移植尿道の生着したラビットを作成することができなかった。他臓器を採取して移植した尿道組織の生着は得られず,壊死状態であった。移植尿道への血行が十分得られていないことが示唆された。同時期に,膀胱粘膜を用いた尿道形成術を離知性の尿道下裂の2例に臨床応用した。患者は7歳と15歳の男児で,両症例とも過去数回以上の尿道形成術を受けていたが,いずれも成功しておらず,外陰部にはすでに尿道の作成に用いる皮膚の余裕はなくなっていた。両症例とも皮膚の瘢痕化は著明で,皮下組織も豊富ではなかった。術後,7歳児の新尿道は生着せず,移植した膀胱粘膜は強度の萎縮に陥っていた。15歳児には皮下組織の代わりとして,血流の豊富な精巣鞘膜を膀胱粘膜で作成した新尿道と皮膚との間に補填したころ,尿道の末端部分で虚血による狭窄が認められたものの,新尿道の生着が得られた。

(2)チューブ形成を行わず,onlay(上蓋)スタイルとして尿道を形成した。(3)移植組織を有茎組織弁として血行を維持するようにした。現在尿道下裂状態形成術を終了し,尿道移植手術を終え,その生着の成否について観察中である。生着が得られたら,移植尿道の形態,機能などについて明らかにする予定である。
ＰＲＦによる創傷治癒促進効果の機序解明と効果的組織工学的応用法の開発

1)血管新生・誘導の検討:血管新生の促進作用を検証するため、PRFを圧延・トリミング後各実験に用いた。in vitroではヒト血管内皮細胞を用いたscratch assayを行い、PRFの増殖因子が内皮細胞の増殖・遊走を促進することが認められた。in vivoでは鶏胚漿尿膜を用いたCAM assayにより、PRF周囲への既存血管の誘導と新生血管の形成が認められ、血管数は有意に増加した。また、漿尿膜の組織学的評価では著しい細胞浸潤とコラーゲンの沈着が認められた。以上より、PRFには血管新生促進効果が認められる。2)血小板の局在の観察と増殖因子・サイトカインの検出と定量: PRFは部位により血小板の局在が異なり、特に血球層に隣接する分画に血小板が多いことをSEMによって明らかにした。抗体アレイにより、PRFには高濃度の増殖因子が含まれることを確認した。3)細胞増殖に及ぼす影響の検討: In vitroにおいて、PRF上にヒト培養骨膜シートを培養し、骨膜細胞の増殖・分化を組織学的に評価した。骨膜組織片とPRFの界面部で細胞密度が高く、一部の細胞はPRF内に浸潤しており、アルカリフォスファターゼ活性陽性を呈した。ヌードマウスの頭蓋骨に直径4 mmの骨欠損を形成し骨膜シートーPRF複合体を移植した場合、顕著なコラーゲン沈着と、骨新生の有意な増加がみられた。骨膜片周囲の組織ではαSMA陽性の血管数とTRAP陽性細胞の増加が認められ、骨リモデリング活性が上昇しているものと考えられた。以上より、骨膜シートとPRFの複合化は、フィブリンゲルに増殖遊走した細胞にPRFの増殖因子が作用し、骨芽細胞への分化を促進することで、骨再生を促進することが示唆された。臨床的には、組織再生療法への有用な生体移植材料として応用されることが期待される。1)血管新生・誘導の検討血管新生の促進作用を検証するため、PRFを圧延・トリミング後各実験に用いた。in vivoでは鶏胚漿尿膜を用いたCAM assayにより、PRF周囲への既存血管の誘導と新生血管の形成が認められ、血管数はコントロール群と比較して有意に増加した。2)増殖因子・サイトカインの検出と定量抗体アレイにより、PRFには血清と比較し高濃度の増殖因子が存在することが認められた。また、PRFは部位により血小板の局在が異なることをSEMによって明らかにした。3)細胞増殖に及ぼす影響の検討In vitroでPRF上にヒト培養骨膜シートを移植し、増殖・分化について評価した。免疫組織化学的評価では、骨膜片とPRFの界面で非常に細胞密度が高く、一部の細胞はPRF内に浸潤しており、それらの細胞はアルカリホスファターゼ活性陽性を呈した。一方、RT-PCRによる骨分化マーカー(ALP,COL1,RUNX2,オステオポンチン,オステオカルシン)に上昇はみとめられなかった。加えて、in vivoにおいてPRFが骨膜シートに与える影響について、ヌードマウス背部皮下に骨膜シートとPRFを同時に移植することで、コントロールと比較し、骨膜片周囲に顕著なコラーゲン沈着をみとめた。さらに、頭蓋骨に形成した骨欠損部に移植することで、30日後の有意な新生骨の形成をみとめた。また、局所的に破骨細胞マーカーであるTRAP活性が上昇しており、骨リモデリングの促進が予想された。以上より、PRFの増殖因子、そしてスキャホールドとしての機能が組織再生を促進することが示唆された。