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表面に不飽和窒素官能基を有する炭素体と金属の複合材の調製と機能

本研究は、不飽和窒素官能基を表面に多数有する炭素体の調製と、同炭素体に金属および金属錯体を高分散担持した複合材の調製を行ない、これらの機能を調べると同時に、機能発現機構解明を行なうことを目的として各種検討を行なった。不飽和窒素官能基を高濃度に含有する炭素体および繊維状炭素体の調製を検討した結果、ポリアクリロニトリルの選択的脱水素縮環反応と賦活度の調整ならびに各種活性炭、活性炭素繊維の硫酸或いはSO_2酸化とアンモニア処理の組み合わせにより、含有量をある程度制御した高濃度窒素官能基含有炭素体の調製が達成できることを見出した。殊に後者の方法は、前駆体となる炭素の種類に依らず適用可能な興味深い方法と言えよう。両者共、窒素官能基については熱安定性に秀れ、他の表面修飾法に無い特徴を有する炭素体を得る方法と考えられる。これらの炭素体は、適度の前処理或いは前処理無しで、秀れた排煙脱硫および排煙脱硝能を発現することを見出した。その性能は、従来の活性炭のそれをはるかに陵駕するものであり、今後の一層の展開が期待できる。一方、これら炭素体と金属の複合材については、非水溶媒を用いる含浸法により高分散が達成できることを明らかにした。Cu、Feについてはクロロホルム等により分散担持した複合体が、NO還元反応に秀れた性能を示す見通しを得ており、貴金属との複合体についても、芳香族化合物の選択水素化ならびに耐灰性の向上が達成できる見通しが得られ、引き続き検討を加えている。大環状金属錯体との複合体についても検討したが、予想した高性能を得るには到っていないものの、相互作用の向上法についての知見が得られ、今後の進展に希望をもてると確信している。1.本研究は、不飽和窒素官能基を表面に多数有する炭素体を調製し、金属および金属錯体を高分散担持させると同時に、窒素-金属間の化学的相互作用を利用して、新しい型の触媒、吸着剤、電極、電導材への応用を計画している。このような炭素体の調製の化学反応機構および窒素-金属結合の化学的相互作用ならびに機能発現の機構の解明も併せて目的としている。2.本年度は、不飽和窒素官能基を高濃度に含有する炭素体として、ポリアクリロニトリルの脱水素縮環反応により調製した高表面積繊維状炭素体(PAN-ACF)についてNOのN【H_3】による還元触媒機能を中心に検討を行なった。窒素含有量が214%の5種のPAN-ACFは、140°CでのNO-N【H_3】反応に対して、高窒素含有率程高い活性を示した。これらの場合、表面含窒素官能基はNO活性化に寄与することが示唆された。活性向上を図るため酸化鉄一酸化銅の2元酸化物の担持効果について調べた結果、窒素含有率が低いACFのNO還元活性は向上し、酸化物担持効果が認められたのに対して、同含有率が増加すると担持の効果はわずかしか認められなくなった。含窒素官能基と酸化物との相互作用については検討中である。PAN-ACF以外の含窒素化合物からの炭素体調製についても条件設定をほぼ終了している。高窒素含有率PAN-ACFにコバルトテトラフエニルポルフィリン(COTPP)を担持した複合材の触媒機能の検討に着手した。本系では、COTPPのNO活性化能の含窒素官能基との相互作用による向上と、ACFによるN【H_3】活性化との結合により低温での高活性を期待したが、現時点では充分な活性は得られていない。COTPPの担持率の調整も含め引き続き検討する計画である。尚、備品に申請した液体クロマト用ポンプならびにインテグレータは購入、設置を終わり、有効に使用している。

本年度は,前年度の研究成果に基づき,研究計画に従って以下の研究を行なった.I.不飽和窒素官能基を高濃度に含有する炭素体および繊維状炭素体の調製a)高表面積担体への含窒素有機化合物のCVD:高表面積SiO_2を担体としてビニルイミダゾール,アクリジンのCVDを検討した結果,いずれも含窒素炭素体を表面に形成させることができたが,重合触媒の同時供給が難しく重合度が低いためいずれも熱安定性に問題があることから, CVDよりむしろ液相重合ー沈着を利用する調製が望ましいことが示唆された.b)活性炭素繊維とアンモニアの反応:活性炭素繊維とアンモニアを400°C付近で反応させることにより同繊維の窒素含有量を増加できることを見出した.アンモニアとの反応に硫酸による賦活を組み合せることで更に窒素含有量を増加できることを明らかにした.このようにして得た活性炭素繊維とCoTPPとの複合により低温でのアンモニアによる排煙脱硝活性を賦与できる見通しを得た.II.同炭素体への金属の高分散担持法と機能の研究これ迄に得られた炭素体に貴金属およびFe,Cuの高分散担持を検討した.貴金属は塩化物のメタノール溶液を用いた含浸担持により良好な分散度が得られた.これに対してFe,Cuの担持は,層間化合物調製法である塩化物のクロロホルム溶液を用いる含浸担持がメタノールを用いる担持法に比べ高分散度を与えることを見出した.現在これらの触媒能について,通常の酸化物或は活性炭に担持した場合との特徴に違いを調べている.以上の結果から来年度は,活性炭素繊維とアンモニアとの反応により得た不飽和窒素官能基含有炭素体を用いた複合材を中心にそれらの機能を調べ,目標達成を目指す.本年度は、窒素官能基を表面に高濃度で含有する炭素体とポルフィリン等大環状配位子錯体複合材の調整を行ない、その吸着ならびに触媒機能について検討を行なった。炭素体としては各種PANーACFならびにアンモニアとの反応によって窒素濃度を高めたPANーACFを、大環状錯体としては、CoTPP(コバルトテトラフェニルポルフィリン)を用い、含浸法により複合体を調整した。これら炭素体とCoTPPとの相互作用は予想外に低く、炭素体の表面積、窒素含有量から予想される担持率は得られなかったが、ほぼ2ωt%のCoTPP担持物が調整できた。このような相互作用の要因として、同炭素体中の窒素は、多環芳各族中にピリジン環として主として存在し、π電子の非局存化による窒素原子の電子供与能が単環に比べ大きく低下していることが予想された。従って、イミダゾール、ピリジン等を炭素ー炭素結合で表面に固定化した炭素体が有望と考えられるので、その調整を検討している。シリカゲル上に固定化したイミダゾールについては既に報告しているが、これに比べ、疎水性が高く、吸着物質とのより高い相互作用が期待できよう。他の金属TPPについても検討したが、中心金属の二価を安定化することができないため、可溶性のフタロシアニンの合成と利用の検討を開始した。得られた複合体の酸素、一酸化炭素、一酸化窒素の吸着能は錯体単身に比べ、1.5倍程度であった。そこで、一酸化窒素のアンモニア、一酸化炭素による環元能を検討した結果、炭素体単独に比べ1.5倍程度の活性向上が認められた。上述の具夫による新しい型の炭素体ーフタロシアニン複合体の機能についても検討を進めており、更に大中な活性向上が期待できよう。尚、高分散金属複合体の電導性についても着手しているが、高濃度金属の分散と同時に、複合体の前処理が有効と考えられる。
音声辞書と言語音声データベースの作成研究

語の習得に妻子,文字資料と音声資料の双方が提示する方がその習得を容易にさせる事は自明と言ってて良いだろう.しかし,アジア・アフリカの小言語の学習では,音声資料のない言語がほとんどであり,また文字資料すらさえない言語も多い.この現状に対し,本研究は,単語を中心とした語と意味,その発音を習得を容易にする音の出る辞書(音声辞書,語彙集)をパソコンを用いて作成することであった.具体的には,ある単語(文字)をクリックするとその音声が聞こえ,またそのパソコン操作が極めて容易であるものを作成することであった.対象とした言語はアジア・アフリカの商業ベースには乗りにくい小言語である.また,各資料を統御するソフトウエアーは研究実施前に作成したものを必要に応じて随時改良した.これまでに実施した言語数は19言語(当初計画で4年間で18言語)であるが,パソコンの性能不足,台数不足,担当者の転勤等のため,現在実際に完成したもの,ほぼ作業が終了史研究期間内に完成見込みの言語は12言語である(11・研究発表参照).しかし残りの7言語も文字資料の入力は終了し,現在は音声の入力中であり近々完了の予定である.なお,各言語は約2000語程度の語数から成っているが,チベット語のように3000語を優に超えるものも出ている.研究の性質上,その成果は文字による論文等よりも,光磁器デスク(MO)とコンパクトディズク(CD)(現代北京口語のみ)を媒体として発表・公開する.また,現在ん音声辞書ははマッキントッシュ用に作成したものであるが,パソコンの機種を問わずに利用できるようにする研究,インターネット上で公開する研究も振興中である.これらの残された研究と作業は,本科学研究費補助金による研究が終了する本年度3月末以降も継続する予定である.また,その媒体の性質上,語彙の追加・削除等も容易であり,発表・公表後も必要に応じて随時行う予定である.語の習得に妻子,文字資料と音声資料の双方が提示する方がその習得を容易にさせる事は自明と言ってて良いだろう.しかし,アジア・アフリカの小言語の学習では,音声資料のない言語がほとんどであり,また文字資料すらさえない言語も多い.この現状に対し,本研究は,単語を中心とした語と意味,その発音を習得を容易にする音の出る辞書(音声辞書,語彙集)をパソコンを用いて作成することであった.具体的には,ある単語(文字)をクリックするとその音声が聞こえ,またそのパソコン操作が極めて容易であるものを作成することであった.対象とした言語はアジア・アフリカの商業ベースには乗りにくい小言語である.また,各資料を統御するソフトウエアーは研究実施前に作成したものを必要に応じて随時改良した.これまでに実施した言語数は19言語(当初計画で4年間で18言語)であるが,パソコンの性能不足,台数不足,担当者の転勤等のため,現在実際に完成したもの,ほぼ作業が終了史研究期間内に完成見込みの言語は12言語である(11・研究発表参照).しかし残りの7言語も文字資料の入力は終了し,現在は音声の入力中であり近々完了の予定である.なお,各言語は約2000語程度の語数から成っているが,チベット語のように3000語を優に超えるものも出ている.研究の性質上,その成果は文字による論文等よりも,光磁器デスク(MO)とコンパクトディズク(CD)(現代北京口語のみ)を媒体として発表・公開する.また,現在ん音声辞書ははマッキントッシュ用に作成したものであるが,パソコンの機種を問わずに利用できるようにする研究,インターネット上で公開する研究も振興中である.これらの残された研究と作業は,本科学研究費補助金による研究が終了する本年度3月末以降も継続する予定である.また,その媒体の性質上,語彙の追加・削除等も容易であり,発表・公表後も必要に応じて随時行う予定である.今年度は、音声辞書およびデーターベースの実際の作成に着手する以前に数回の研究会を行い、作成するシステムの全体に関する問題を討議した。その上で、使用するソフトウエアを確定し、制作するプログラムの使用を決定した。こうして作業環境を整えた後、ウォロフ語、ハヤ語(以上梶担当)、トルコ語(林担当)の音声データの入力を、インフォーマントの協力を得て行った。音声フォーマットの違い、データ容量の大きさ、文字データとの同期(特に検索やソーティングを適用する場合)、さらに、使いやすいインターフェイスなど、未解決の問題は残るが、データ入力自体は順調に進んだ。現在トルコ語をパイロット・ケースとして、上記の問題点を考慮しつつ、音声ファイルの編集を進めているなお、トルコ語音声辞書作成のために準備したデータは、入門書作成の際にも利用された。音声データの入力・編集とともに、アムハラ語、オロモ語(以下中野担当)、ベンガル語東ベンガル方言(奈良担当)、マ-ザンダラーン語サ-リ-方言およびワ-ザキ-方言(上岡担当)、エストニア語(松村担当)の言語資料(テクスト)を入力し、今後の音声辞書ならびに音声データーベース作成の準備作業を行った。本年度中でトルコ語音声辞書作成のための主な作業を終えることができたためトルコ語は本年度限りとし、その作成過程を参考にしつつ、来年度からは他の言語に重点を移していく予定である。今年度は、特に以下の3点について研究および作業を進めた。1.音声辞書・音声データベースの作成のためのスタックSES(ハイパーカード・プログラム)の試作・改良。2.音声辞書・音声データベースの作成のための音声および文字情報のコンピュータへの入力。3.音声辞書・音声データベースの作成の準備のための語彙データの入力およびその整理。

研究の過程で明らかになった問題点および来年度以降の課題として、特に以下の2点を指摘することができる。1.ハイパーカードおよびそのプログラム言語であるパイパート-クは、現在使用されているアプリケーションの中では、比較的多言語環境が整っているほうである。しかしながら、我々が扱おうとしている、いわゆる「特殊言語」の処理に完全には対応していない。また、一部の機能において、日本語処理の問題が未解決である。このため、現在の我々の音声辞書・音声データベース用スタックにおいても、特にアムハラ文字の表示の問題が解決されていない。2.音声データベースの基本的設計に関して、未だに合意が得られていない。現在は一応音声データに文字データを対応させ、その文字データをキ-として音声データを検索する方法により試作を行っている。試作された音声辞書の使い勝手を検討し、さらにデータベースの設計を改善していく必要がある。今年度は主として、サンダウェ語、ハヤ語、モン語、タイ語、シャン語、ビルマ語、中国語(北京語)、アムハラ語、テルグ語、現代ウィグル語、ハウサ語の文字データ入力と録音、そして一部、音声張り付けを行なった。これらは、すでに前年度から継続して行なっている作業である。各言語ごとの作業および研究の概要は以下の通りである。1)ビルマ語、シャン語、タイ語については、中国語と英語の対照語彙集としてまとめた。2)ハヤ語では、ブコバ方言の語彙集をほぼ完成させ、一部録音を行なった。3)現代ウィグル語では、すでに録音されていたウルムチ方言話者の音声データを、パソコンソフトSoudEditを用いて、データベース用に編集した。さらに、グルジア方言話者とカシュガル方言話者から新たに録音を行い、現在それらの資料を編集中である。4)ハウサ語では、データをインターネットのWWWに載せるために加工した。5)テルグ語は、ハイパーカードを用い音声データベース用スタックを作成した。6)モン語、クメール語については、辞書作成のためにデータの追加、訂正を行なった。7)サンダウェ語については、音声データをすでに入力されている文字データに張り付けを行なった。語の習得に際し,文字資料と音声資料の双方が提示する方がその習得を容易にさせる事は自明と言って良いだろう.しかし,アジア・アフリカの小言語の学習では,音声資料のない言語がほとんであり,また文字資料すらさえない言語も多い.この現状に対し,本研究は,単語を中心とした語と意味,その発音を習得を容易にする音の出る辞書(音声辞書,語彙集)をパソコンを用いて作成することであった.具体的には,ある単語(文字)をクリックするとその音声が聞こえ,またそのパソコン操作が極めて容易であるものを作成することであった.対象とした言語はアジア・アフリカの商業ベースには乗りにくい小言語である.また,各資料を統御するソフトウエアーは研究実施前に作成したものを必要に応じて随時改良した.これまでに実施した言語数は19言語(当初計画で4年間で18言語)であるが,パソコンの性能不足,台数不足,担当者の転勤等のため,現在実際に完成したもの,ほぼ作業が終了し研究期間内に完成見込みの言語は12言語である(11.研究発表参照).しかし残りの7言語も文字資料の入力は終了し,現在は音声の入力中であり近々完了の予定である.
分子マーカーで探る褐藻ホンダワラ属を例とした海藻類の分散能力の解明

海洋生物の地域集団間の遺伝的分化の程度には、分散能力の違いが大きな影響を及ぼすことが明らかになっているが、日本沿岸に生育する海藻類の分散能力については未だ不明な点が多い。本研究は、褐藻ホンダワラ属藻類を対象として、地域集団間及び集団内の遺伝的多様性の違いを基にそれぞれの種の分散能力や繁殖戦略を明らかにするとともに、種間の分散能力の違いを引き起こす要因を考察することを目的とする。具体的な研究項目は、1)対象とするホンダワラ属藻類の採集、2)ミトコンドリアゲノムの塩基配列をもとにした地域集団間の遺伝的多様性の解析、3)マイクロサテライトマーカーの開発及びそれらマーカーを利用した集団内の遺伝的多様性の解析、4)遺伝的多様性をもとにした分散能力や繁殖戦略の解明、及び種間の分散能力の違いをもたらす要因に関する考察,の4つである。平成30年度は、日本各地においてホンダワラ属藻類(タマハハキモク、ヒジキ、ヤツマタモク、マメタワラ、キレバモク、ヒイラギモクなど)を採集し、ミトコンドリアゲノムのcox3遺伝子領域及びnad3遺伝子から16S rRNA遺伝子の間の塩基配列を決定した。キレバモクについては、日本沿岸で10のハプロタイプが認められ、ヒイラギモクについては12のハプロタイプが認められた。また、ヒジキについては既に発表されているマイクロサテライトマーカーを試したものの良好な結果が得られなかったことから、次世代シークエンサーを用いたRNA-Seq解析を行い、得られた配列をもとにマイクロサテライトマーカーの開発を行った。これまでに5遺伝子座について多型が認められている。タマハハキモクとヒジキについては、nad3遺伝子から16S rRNA遺伝子の間の塩基配列を終え、cox3遺伝子領域の配列決定後に論文の投稿を予定している。また、その他のホンダワラ属藻類(ヤツマタモク、マメタワラ、キレバモク、ヒイラギモクなど)についても西日本を中心にサンプルを入手し、ミトコンドリアゲノム領域の塩基配列決定を進めている。また、ヒジキについてはマイクロサテライトマーカーの開発を進めており、既に5遺伝子座について有効な結果が得られている。従って本研究は順調に進展していると考えられる。タマハハキモクとヒジキのcox3遺伝子領域の配列決定を進め、投稿論文を作成する。また、平成30年度までにサンプルが得られていない地域を中心にサンプリングを行い、ミトコンドリアゲノム領域の塩基配列決定を進める。ヒジキについては、マイクロサテライトマーカーの開発を進めると共に、これまでに有効な結果が得られたマイクロサテライトマーカーを用いて、日本沿岸各地の集団の解析を進める。平成29年度は、日本各地においてホンダワラ属藻類(タマハハキモク、ヒジキ、ヤツマタモク、マメタワラ、キレバモク、ヒイラギモクなど)を採集し、ミトコンドリアゲノムのcox3遺伝子領域及びnad3遺伝子から16S rRNA遺伝子の間の塩基配列を決定した。ヒジキについては日本沿岸で遺伝的に異なる6から8のグループが認められた一方、タマハハキモクについては2つのグループしか認められなかった。また、タマハハキモクについては、次世代シークエンサーを用いたRNA-Seq解析を行い、得られた配列をもとにマイクロサテライトマーカーの開発を行った。これまでに16遺伝子座について多型が認められている。タマハハキモクとヒジキについては、日本沿岸における分布域を網羅する形でサンプリングの入手を終えている。また、タマハハキモクについてはマイクロサテライトマーカーの開発を進めており、既に16遺伝子座について有効な結果が得られている。

平成30年度は、日本各地においてホンダワラ属藻類(タマハハキモク、ヒジキ、ヤツマタモク、マメタワラ、キレバモク、ヒイラギモクなど)を採集し、ミトコンドリアゲノムのcox3遺伝子領域及びnad3遺伝子から16S rRNA遺伝子の間の塩基配列を決定した。キレバモクについては、日本沿岸で10のハプロタイプが認められ、ヒイラギモクについては12のハプロタイプが認められた。また、ヒジキについては既に発表されているマイクロサテライトマーカーを試したものの良好な結果が得られなかったことから、次世代シークエンサーを用いたRNA-Seq解析を行い、得られた配列をもとにマイクロサテライトマーカーの開発を行った。これまでに5遺伝子座について多型が認められている。タマハハキモクとヒジキについては、nad3遺伝子から16S rRNA遺伝子の間の塩基配列を終え、cox3遺伝子領域の配列決定後に論文の投稿を予定している。また、その他のホンダワラ属藻類(ヤツマタモク、マメタワラ、キレバモク、ヒイラギモクなど)についても西日本を中心にサンプルを入手し、ミトコンドリアゲノム領域の塩基配列決定を進めている。また、ヒジキについてはマイクロサテライトマーカーの開発を進めており、既に5遺伝子座について有効な結果が得られている。従って本研究は順調に進展していると考えられる。平成29年度までにサンプルが得られていない地域を中心にサンプリングを行い、ミトコンドリアゲノム領域の塩基配列決定を進める。また、タマハハキモクについては、これまでに有効な結果が得られた16のマイクロサテライトマーカーを用いて、日本沿岸各地の集団の解析を進める。タマハハキモクとヒジキのcox3遺伝子領域の配列決定を進め、投稿論文を作成する。また、平成30年度までにサンプルが得られていない地域を中心にサンプリングを行い、ミトコンドリアゲノム領域の塩基配列決定を進める。ヒジキについては、マイクロサテライトマーカーの開発を進めると共に、これまでに有効な結果が得られたマイクロサテライトマーカーを用いて、日本沿岸各地の集団の解析を進める。消耗品の納品が遅れ、31年度の研究費に少額の未使用額が生じたが、次年度に納入されるため、今年度行う予定の研究計画と併せて実施する。
生体臓器の細胞活性に対する非破壊「誘電」モニタリング法の開発

従来の生体標本を用いた組織診断には、主として形態学的アプローチが用いられているが、このような手法の場合、どうしても組織採取という侵襲を生体に加えなければならない。また、組織診断には時間を要し、繰り返し行うことの難しさなどの欠点がある。誘電スペクトル解析は、組織に微弱な交流電流を流し、周波数-電流-電圧関係を測定するというものであるため、この方法により非破壊的で実時間評価の可能な組織性状診断法となり得る。腹腔鏡下での肝組織診断への応用を想定し、生体位の肝臓を用いた実験を行った。動物の呼吸に伴う組織の動きに追随できる「位置サーボ追従型同軸プローブ」を自作し、温度コントロール(組織温)に注意して誘電測定すると、極めて再現性の良い誘電分散-誘電率が周波数により変わる現象-が得られた。さらに、組織構築を反映した誘電体モデルを考案し、理論解析から"生きている肝細胞"の電気的特性量の算出に成功し、理論的には、肝組織の線維化、浮腫等が充分診断可能であることを報告した。さらに、ラット大脳皮質下に微小針型プローブを挿入し、一過性の頸動脈閉塞による脳虚血が、脳組織の誘電分散にどのような影響を与えるかを評価した。一過性の脳虚血により、誘電減衰度や導電率が変化することがあきらかになった。以上のようなことから、生体臓器の細胞活性に対する非破壊「誘電」モニタリング法の開発は可能であると結論づけた。1.ラット摘出肝の保存状態のモニタリング(1)開放端同軸プローブを作製し,インピーダンス・アナライザと組み合わせて,低温保存液中における肝組織の誘電挙動の変化を長時間に亘り追跡することに成功した.(2)誘電分散曲線の経時的変化あらかじめ設定した時刻に自動的に計測し,データ取りこみを行うコンピュータ・アルゴリズムを作成した.(3)誘電的指標(緩和強度,特性周波数,パラメータα)から,低温保存に伴う肝細胞の膨化や細胞内外のイオン状態の経時変化に関する情報が得られた.2.各種臓器の異なる深さからの誘電的指標の検出肝・肺・脳組織の表面から1mmおよび2mmの2種類の深さまで選択的に計測できるプローブを用いたところ,組織構築の差異を忠実に反映する結果が得られた.3.肝・肺・脳・皮膚組織など多様な生体材料の誘電挙動を記述するのに有用な「新しい理論式」を提出した.従来の生体標本を用いた組織診断には、主として形態学的アプローチが用いられているが、このような手法の場合、どうしても組織採取という侵襲を生体に加えなければならない。
プレニル鎖の鎖延長反応と環化反応における基質一酵素間の精密構造認識と反応機構

1.ファルネシルニリン酸(FPP)合成酵素のアリルニリン酸部位に関する基質特異性をゲラニルニリン酸(GPP)のアナログ基質を用いて調べた。一級のcis二重結合をもつネリルニリン酸(NPP)とイソペンテニルニリン酸(IPP)を基質とした場合,trans,cis-FPPが生合成した(収率0.7%)が,その反応性はtrans二重結合をもつGPPの場合(収率83%)に比べて極めて低かった。三級のリナルニリン酸(LPP)とIPPからtrans,trans-FPPが収率4%で生成することが見出されたが,このFPPの生成はLPPの非酵素的異性化によって生成したGPPにIPPが酵素的に縮合したものであることが実証された。すなわち,FPP合成酵素は,SPPとIPPとの反応を触媒しないことが示された。従って,FPP合成酵素のアリルニリン酸部位に関する基質特異性は高いことが明らかとなった。2.ホウショウにおける(R)-(-)-リナロールの生合成機講をトレーサー実験により解明した。その結果,GPP合成酵素によってIPPとジメチルアリルニリン酸からGPPがまず生合成し,ついで,このGPPが酵素的に加水分解を受ける際に,立体特異的な異性化が同時に生起して(R)-(-)-リナロールを生合成していることがわかった。3.ハッカの酵素系によるリモネンヘの酸素官能基導入機構を(S)-(-)-[9-^3H]リモネンを用いたトレーサー実験により解明した。その結果,(S)-(-)-リモネンの1位二重結合が立体選択的に酸化されてtrans-リモネン-1,2-ウポキシドが生合成し,ついでこのエポキシドが酵素的に開裂して,(+)-trans-カルベオールを生合成することが実証された。
細胞の運命転換における選択的スプライシング制御機構の解析

本研究は、体細胞初期化過程における選択的スプライシングの制御機構を明らかにることを目的とする。本年度はまず、体細胞初期化における選択的スプライシングの変化とエピジェネティック修飾との関連を、報告されているChIP-seqのデータを用いて解析した。しかしながら、選択的スプライシングの変化と明らかな相関のあるエピジェネティック修飾を見つけることはできなかった。続いて、去年度確立したノックダウンスクリーニングの実験による解析をさらに推し進めた。siRNAを用いたノックダウンスクリーニングとハイスループットな定量的RT-PCR法を用いて体系的に解析を行った結果、多能性幹細胞において選択的スプライシングを制御するRNA結合タンパク質をコードする遺伝子を同定した。これらのRNA結合タンパク質についてshRNAを設計し、体細胞初期化過程におけるノックダウン実験を行った。多能性関連遺伝子の発現を指標に体細胞初期化効率を評価したところ、U2af1とSrsfという二つのRNA結合タンパク質の発現抑制により体細胞初期化効率が減少することが分かった。これらの結果は、体細胞初期化過程においてU2af1とSrsfによる選択的スプライシング制御が重要な役割を果たしていることを示唆する。次に、これらのRNA結合タンパク質が前駆体mRNAに直接結合してスプライシング制御を行っているのか、どういった遺伝子のスプライシングを制御しているのかを解析するためにCLIP法による実験系の確立を試みた。報告されている研究の中で使用されているCLIP法では放射性同位体を用いている。本研究では放射性同位体を用いない簡便な手法の確立を目指した。次世代シーケンサーや定量的RT-PCRを用いたRNA結合タンパク質に結合しているRNAの解析は今後の課題である。(抄録なし)近年、体細胞に少数の転写因子を強制発現させることにより、多能性幹細胞を人工的に誘導する方法が開発された。しかし、体細胞初期化現象の分子メカニズムはほとんど分かっていない。そこで、本研究は主に分子生物学や生化学的手法を用いて、体細胞初期化過程における選択的スプライシング制御機構を解明することを目的とする。これまでの私の研究で、次世代シーケンサーを用いた解析により体細胞初期化前後でスプライシングパターンが変化する数百の遺伝子を同定した。そこで本年度は、これらの遺伝子を元に体細胞初期化過程における選択的スプライシング制御の生理的意義の解明を試みた。まず、数十の遺伝子について、次世代シーケンサーによる解析結果を定量的PCR法によって検証した。その際、デジタルPCR法を用いた遺伝子発現の絶対定量法を確立した。これにより、より正確なスプライシングパターンの定量が可能になった。次に、体細胞初期化前後でスプライシングパターンが変化する遺伝子について、スプライシングバリアントごとに初期化因子とともに体細胞に共発現させ、体細胞初期化に対する効果を検討した。続いて、体細胞初期化過程における選択的スプラシイング制御の分子機構に迫るため、多能性幹細胞に特徴的な選択的スプライシングの制御を担っているRNA結合タンパク質をノックダウンスクリーニングにより探索した。その際、iPS細胞およびEs細胞におけるsiRNAの導入条件を最適化した。さらに、RNA結合タンパク質についてshRNAを設計し、体細胞初期化過程においてノックダウン実験を行い、体細胞初期化に与える効果を検討した。今後は、これらの実験によって得られた結果と合わせて、同定したRNA結合タンパク質がRNA分子に直接結合してスプライシングに関与しているのかどうかを、RNA-IPなどにより検討し、体細胞初期化過程の選択的スプライシング制御の分子メカニズムの解明を行う予定である。交付申請書「研究の目的」に記載したポイントのうち本年度において半数を達成できた。「本年度の研究実施計画」に記載した順とは前後したが、おおむね順調であると考える。本年度、おおむね順調に研究が進展した。今後も交付申請書の「研究の目的」にしたがって研究を進め完成させる。(抄録なし)
知的コンピュ-タによる化学生産バッチプラントの分散協調管理

高機能化学製品の革新的生産技術として注目されているパイプレスバッチプラントにおいて、レシピを用いた自律分散型運転管理システムの設計を提案し、アクタ-モデルおよび分散協調問題解決の手法を参考にして検討を加え、次のような結論を得た。1.製品の生産手順を記述したレシピを単位作業ユニット毎のサブレシピに分割して、作業手順という情報を分散させ、ハ-ドウェア(ユニット)とソフトウェア(サブレシピ)の一体化を計った。これによりパイプレスバッチプラントの各ユニットに自律性を持たせ、分散協調型の運転管理を可能にし、さらに、時間的・空間的にロ-カルなユニット間での調整および同期的動作によってプラント全体を健全に動作させる方法を示した。2.静的情報に基づくオリジナルレシピに準動的情報を加味してインスタンスレシピを生成し、さらに動的情報を用いてより具体的な動作状況を実現していく方法を取ることにより、機能的に不均質な化学プラントにおいて知識および意思決定の分散と集中のバランスをとることを可能にした。この結果、予期せぬ行動を起こさず安全である集中型の長所と、保守が容易で負荷が1箇所に集中しない分散型の利点を同時に実現することができた。3.契約ネットモデルに基づくメッセ-ジによる公募・入札・契約動作に時間の概念を導入し、ユニットの割当に際して予約動作を行うことにより、ロ-カルなスケジュ-リングを可能にした。4.代替ユニットの中から好適な契約ユニットを選択するための意思決定の方法として階層化意思決定法(AHP)を採用し、知的ユニット間の多目的、ゲ-ム的意思決定を動的に行うことにより、パイプレスバッチプラントの生産効率、頑健性、信頼性、柔軟性、適応性といった問題への対処の仕方を示した。高機能製品の多品種少量生産に柔軟に対処することを目指して設計されたパイプレスバッチプラントを活用するために、自律して知的動作を行うことのできる複数ユニットによる分散協調的な運転管理システムを構築することが要望された。本年度補助金で新しく購入したワ-クステ-ションを中核にして既存のコンピュ-タとの間にRSー232Cおよびイ-サネットによるネットワ-クを張り、人工知能言語PROLOGとC言語をUNIXマルチタスク環境でハイブリッドに利用し、分散協調型運転管理のシミュレ-ション実験を行う環境を整えることができた。自走式ロボット反応器、原料供給ステ-ション、加熱冷却ステ-ション、貯蔵ステ-ション、洗浄ステ-ション等をそれぞれ一つの分散した知的システムであると考え、機能性高分子のバッチ式生産例を念頭に置いて、各ユニットが互いにメッセ-ジ交換を行いながら協調的に運転管理を遂行していく様子をシミュミレ-ションするためのソフトウェアの開発を行った。その結果、分散協調型運転管理法が事象駆動的操作の管理に有効であり、故障に対するメインテナンス性を向上させ、また生産計画の短期的変動や操作実行時間の不安定性に十分に適応できるものであることが確認された。システムの構築に際して得られた結果として、分散協調問題解決(分散型人工知能)の手法の応用が有効であり、問題の水平・垂直分割に基づくタスク分配型の推論方式と契約ネットモデルを基本にしたメッセ-ジの通信方式とが、本研究に適切なものであることがわかった。以上の結果は、次年度において上記のシミュレ-タを更に充実させ、特にレシビの表現法や動作プランのための意思決定法を検討するための基礎的な知見になるものと考えられる。高機能化学製品の多品種少量生産に柔軟に対処するために設計されたパイプレスバッチプラントを活用するため、自律して知的動作を行う複数ユニットによる分散協調的な運転管理システムを構築することが要望されている。このような目標に耐える知的コンピュ-タシステムを開発し、それを基に自走式反応器や各機能ステ-ションの分散協調管理の仕方を探り、実際にシミュレ-ション実験することを目的とした。前年度補助金で購入したワ-

クステ-ションを中核にしてネットワ-ク環境を整えたのにひきつづき、今年度は複数の自走式反応器と複数の各機能ステ-ションの並列的運転を管理するため、各種の動作フロ-の例を想定し、その際に必要になる知識ベ-スを補充した。これらの知識ベ-スは今年度補助金で購入したハ-ドディスク装置に保存され、必要に応じてメッセ-ジ通信により起動される形に整理した。また、多目的生産を上記の分散協調管理方式で行うのに際し、適切なレシピの表現法を探索し、さらにレシピの実行にあたり、ユニット割り当てや動作開始時刻決定などのスケジュ-ルを好適に行っていくための意思決定方法について検討し、次のような結論を得た。1.静的情報に基づくオリジナルレシピに準動的情報を加味してインスタンスレシピを生成し、さらに動的情報を用いてより具体的な動作状況を実現していく方法を取ることにより、複雑な多目的化学プラントにおいて知識および意思決定の分散と集中のバランスをとることを可能にした。2.代替ユニットの中から好適な契約ユニットを選択するための意思決定の方法として階層化意思決定法(AHP)を採用し、知的ユニット間の多目的、ゲ-ム的意思決定を動的に行うことにより、パイプレスバッチプラントの生産効率、頑健性、信頼性、柔軟性、適応性といった問題への対処の仕方を示した。
磁気誘導・放出制御可能な薬剤封入磁気超微粒子-リポソーム複合体の作製

昨年度までの研究において、磁性細菌粒子及び抗癌剤cis-dichlorodiammine platinum(CDDP)を封入したリポソームを用いて、in vitroでの抗腫瘍作用およびin vivoでの外部磁場による薬剤の誘導・固定を確認し、人工の磁気微粒子に対する磁性細菌粒子の優位性を示してきた。さらに、より高度にキャラクタライズされた磁気超微粒子-リポソーム複合体として、磁性細菌由来の磁気微粒子の生成に関与するタンパク質MagAを発現させた大腸菌の逆転膜リポソーム内でのマグネタイト生成に関する研究について進めているが、その発現量が低いことが問題となってしいる。そこで本年度は、磁性細菌粒子上のタンパク質から、発現量が高いタンパク質を検索し、そのタンパク遺伝子を分離、解析した後に融合タンパクとしての利用の可能性について検討した。磁気微粒子の膜タンパクは、磁気微粒子より8M尿素溶液により変性させて抽出した。細胞膜についても同様の条件でサンプルを調整し、二次元電気泳動後、ゲルからタンパクをPVDF膜に転写し、クマシ-ブリリアントブルーにより染色した。磁性細菌の細胞膜及び磁気微粒子膜を二次元電気泳動を行った結果、細胞膜と磁気微粒子膜ではそのタンパク構成が非常に異なっており、また、磁気微粒子膜上に特徴的なタンパクを3スポット(Spot 1-3)確認することができた。磁気微粒子膜表面に特徴的な3スポットのタイパクについて、エドマン分解法によりN-末端アミノ酸シークエンスを行い、それぞれのタンパクのN-末端アミノ酸シークエンスを決定した。これらのシークエンスのうちの一つは磁性細菌MS-1株で報告がある磁気微粒子から分離されたタンパクと83%のホモロジーがあった。また、得られたN-末端アミノ酸シークエンスよりデザインしたプライマーによりPCRを行った結果、105bpの断片(mps-PCR1)が磁性細菌のゲノムから増幅された。
ウェルシュ菌における病原因子のグローバル制御機構の解析

申請時に提出した計画書の通りに実験を行ない、以下の結果を得たので報告する。1.ウェルシュ菌染色体ライブラリーの作製シャトルベクターpJIR418のHindIII切断部位へ、ウェルシュ菌strain13の染色体をHindIIIに部分分解した3-7kbの断片を挿入し、大腸菌へ形質転換して染色体ライブラリーを作製した。得られた大腸菌コロニーを集菌し、プラスミドDNAを大量調整して以下の実験に用いた。ライブラリーより96穴マイクロタイタ-プレートを用いてプラスミドを計1,200個調製し、フィルターメンブラン上へそれぞれをブロットして変性後、スクリーニングに用いた。2.ウェルシュ菌virR遺伝子により転写レベルで調節される遺伝子群の同定ウェルシュ菌strain 13とそのvirR遺伝子変異株TS133株より全RNAを調製し、それぞれをrandom primer、[α-^<32>P]dCTR、AMV reverse transcriptaseを用いてラベルした。前述のライブラリーをブロットしたフィルターに対してこれらのプローブをハイブリダイゼーションし、strain13とTS133のプローブでハイブリダイズした放射活性を比較し、明らかに活性の異なるクローンを選択した。計15個のクローンが選択され、そのうちstrain13の方が強いものが9個、TS133の方が強いものが6個であった。このことは、得られたクローンのうち9個がvirRによって正に調節され、残りの6個は負に調節される遺伝子を含んでいる可能性を示している。これらのクローンのプラスミドDNAを調べたところ、全て異なる長さのDNA断片を含んでおり、virRによって調節される複数の遺伝子群がクローニングされたと思われる。今後、これらのクローンについてさらなる解析を行っていきたい。
霊長類の音声知覚に関する研究

1.反応時間課題により、ニホンザル,チンパンジー,ヒトで種々の母音の知覚を検討した。後2者については聴感度を測定し、母音知覚との関わりを検討をした。その結果、ヒト以外のサルでは/i/と/u/、/e/と/o/の弁別がヒトに比べてよくないことが判明した。これには、ヒト以外のサルでは2.4KHzで聴感度が低下する(ヒトでは最も感度がよい周波数帯である)ことが関与すると考えられた。この結果から、ヒトは母音の第2ホルマントに鋭敏であるが、サル類ではその聴取が劣っていると考えられた。2.チンパンジーとヒトで子音(特に破裂子音)と母音(/a/)の音節の弁別を行なった。破裂子音は有声・無声,調音場所(3つ)の相違から6つに分類される。自然、合成の破裂子音の知覚を検討したところ、チンパンジー、ヒトともに有声・無声の弁別(例えば/pa/と/da/)は容易であったが、調音場所の相違(例えば/da/と/ba/)の弁別は、特にチンパンジーでは困難であった。この結果は、調音場所の相違が第2ホルマントの変移部の周波数変化によること、チンパンジーでは第2ホルマントの聴取がよくないことと整合する、と考えられた。3.カテゴルカルであると云われている破裂子音の知覚をヒト,チンパンジーで検討した。有声・無声の差はVOT(voice onset time)の値に依存し、調音場所の相違は、上記のように、第2ホルマントの変移部の周波数変化に依存する。そこでVOTと第2ホルマント変移部の周波数を段階的に変化させる合成破裂子音を作成し、カテゴリカルな知覚を検討した。その結果、チンパンジーもヒトとほぼ同じ境界効果を示し、破裂子音をカテゴリカルに知覚することが明らかになった。4.半球優位性については検討中である。これらの結果から、ヒトの音声言語の進化について考察を進めている。
生薬「蒲黄」による創傷治癒制御機構の解明及び組織再生の可能性の有無の検証

哺乳類の殆ど全ての臓器は,損傷を受けると再生できず,瘢痕を残して創傷治癒する。この部の機能は不可逆的に失われ,しかも臓器を再生させる有効な医薬も存在しない。歴史書「古事記」には,蒲の花粉を塗ると傷ついた皮膚が再生したという記載がある。それ以来,蒲の花粉の乾燥物「蒲黄」は,皮膚の創傷治癒の民間薬として使用され続けている。しかし蒲黄による皮膚の創傷治癒の促進作用に関する科学的検証は全く行われていない。以上から研究では,蒲黄の創傷治癒促進作用の存否の検証と,その分子機構に関して,以下の方法により検証する。1)蒲黄による細胞の挙動の変動の解析:蒲黄抽出液を真皮線維芽細胞に添加し,細胞の1遊走能,2接着能,3増殖能の変動を解析し,創傷治癒を促進するのか解析する。2)蒲黄により誘導される遺伝子の解析:蒲黄で真皮線維芽細胞を刺激し,細胞内で発現する全遺伝子の変動を網羅的に解析する。蒲黄で新たに発現が誘導される遺伝子の中から皮膚の創傷治癒を促進する遺伝子を,皮膚の再生マスター遺伝子の候補として同定する。3)マスター遺伝子の同定:マスター遺伝子の候補の発現ベクターを構築し,これをマウス生体皮膚の損傷部に導入する。どの遺伝子が創傷治癒を促進させるかを解析し,マスター遺伝子を同定する。4)蒲黄によるマスター遺伝子の発現制御の解析:遺伝子及び翻訳産物の発現変動を解析する。特に転写制御に関しては,応答配列とここに結合する転写因子を同定する。平成30年度は,最初に蒲黄による細胞の挙動の変動を解析した。蒲黄の抽出液を真皮線維芽細胞に添加して培養した。その結果,蒲黄は創傷治癒を反映する細胞の増殖能には影響しなかった。しかし細胞の遊走能と接着能を促進した。蒲黄は,創傷部への真皮線維芽細胞の移動と接着を促して肉芽組織の形成し,創傷治癒を促進する可能性が示唆され,古事記の記載に矛盾しないものであった。そこで次に,創傷治癒を制御する遺伝子及びタンパク質の蒲黄による発現変動を解析した。創傷治癒機構は,炎症期,増殖期,組織再構築期を経て,損傷部に肉芽組織が形成されて細胞外マトリックス成分で充填され,次いで上皮化が行われて完了する。そこで,これら各期に関わる遺伝子の蒲黄による発現変動を網羅的に解析した。その結果,多数のCCケモカイン,CXCケモカインの発現が著明に促進し,蒲黄は創傷治癒機構の初期段階である炎症期,増殖期に強く作用する可能性が考えられた。細胞の遊走・接着に関わる遺伝子の蒲黄による発現変動を解析した結果,インテグリン,FGF,VGEF,ラミニンの遺伝子の発現が促進していた。組織再構築期を制御する遺伝子を解析した結果,真皮コラーゲンの発現は著明に抑制され,以上から,蒲黄は,創傷治癒機構の炎症期,増殖期など初期から中期にかけて強く作用し,後半の組織再構築期には抑制的に作用している可能性が考えられた。最後に蒲黄により特異的に発現変動する遺伝子について網羅的に解析した。発現していた41345種類の遺伝子のうち,そのうち蒲黄により新たに発現する様になった注目すべき遺伝子2種類と発現が消失したもの1種類が検出された。平成30年度の解析によって見出された,蒲黄によって発現が促進・抑制する遺伝子,新たに発現する・発現が消失する多数の遺伝子の発現制御機構を展開する。その中から,皮膚の創傷治癒を促進する遺伝子,特に古事記の記載の通り皮膚の再生させるマスター遺伝子の候補を見出す。具体的には,各遺伝子の発現ベクターを構築してマウス生体皮膚の損傷部に導入し,実際に傷が跡形残さずに完全に再生できるか確認し,皮膚のマスター遺伝子を同定する。最終的には,蒲黄によるマスター遺伝子の発現制御の解析を進め,遺伝子及び翻訳産物の発現変動をリアルタイムPCRやウェスタンブロットで解析する。特に転写制御に関しては,応答配列とここに結合する転写因子をルシフェラーゼアッセイ法やゲルシフトアッセイ法等で同定する。

どの遺伝子が創傷治癒を促進させるかを解析し,マスター遺伝子を同定する。4)蒲黄によるマスター遺伝子の発現制御の解析:遺伝子及び翻訳産物の発現変動を解析する。特に転写制御に関しては,応答配列とここに結合する転写因子を同定する。平成30年度は,最初に蒲黄による細胞の挙動の変動を解析した。蒲黄の抽出液を真皮線維芽細胞に添加して培養した。その結果,蒲黄は創傷治癒を反映する細胞の増殖能には影響しなかった。しかし細胞の遊走能と接着能を促進した。蒲黄は,創傷部への真皮線維芽細胞の移動と接着を促して肉芽組織の形成し,創傷治癒を促進する可能性が示唆され,古事記の記載に矛盾しないものであった。そこで次に,創傷治癒を制御する遺伝子及びタンパク質の蒲黄による発現変動を解析した。創傷治癒機構は,炎症期,増殖期,組織再構築期を経て,損傷部に肉芽組織が形成されて細胞外マトリックス成分で充填され,次いで上皮化が行われて完了する。そこで,これら各期に関わる遺伝子の蒲黄による発現変動を網羅的に解析した。その結果,多数のCCケモカイン,CXCケモカインの発現が著明に促進し,蒲黄は創傷治癒機構の初期段階である炎症期,増殖期に強く作用する可能性が考えられた。細胞の遊走・接着に関わる遺伝子の蒲黄による発現変動を解析した結果,インテグリン,FGF,VGEF,ラミニンの遺伝子の発現が促進していた。組織再構築期を制御する遺伝子を解析した結果,真皮コラーゲンの発現は著明に抑制され,以上から,蒲黄は,創傷治癒機構の炎症期,増殖期など初期から中期にかけて強く作用し,後半の組織再構築期には抑制的に作用している可能性が考えられた。最後に蒲黄により特異的に発現変動する遺伝子について網羅的に解析した。発現していた41345種類の遺伝子のうち,そのうち蒲黄により新たに発現する様になった注目すべき遺伝子2種類と発現が消失したもの1種類が検出された。平成30年度の解析によって見出された,蒲黄によって発現が促進・抑制する遺伝子,新たに発現する・発現が消失する多数の遺伝子の発現制御機構を展開する。その中から,皮膚の創傷治癒を促進する遺伝子,特に古事記の記載の通り皮膚の再生させるマスター遺伝子の候補を見出す。具体的には,各遺伝子の発現ベクターを構築してマウス生体皮膚の損傷部に導入し,実際に傷が跡形残さずに完全に再生できるか確認し,皮膚のマスター遺伝子を同定する。最終的には,蒲黄によるマスター遺伝子の発現制御の解析を進め,遺伝子及び翻訳産物の発現変動をリアルタイムPCRやウェスタンブロットで解析する。特に転写制御に関しては,応答配列とここに結合する転写因子をルシフェラーゼアッセイ法やゲルシフトアッセイ法等で同定する。平成30年度には,蒲黄による創傷治癒関連遺伝子及びタンパク質の発現変動を解析した。その結果,解析用の試薬を多数購入したが,その際に,質的には同等であり,且つ,当初の予定よりも廉価な試薬が新たに見つかり,そのために未使用額(20円)が生じた。データを確実なものにするために,今後も同じ解析を繰り返し行う必要があるために,未使用額は次年度以降の経費に充てることにしたい。
カーボンナノチューブを用いた単一生体分子応答計測

本年度の目的は,プローブ型センサの開発であった.共振熱センサの一部を真空下に置き,周囲への熱損失と振動減衰を防止することで高感度化が可能であることをマイクロ流体チップ型の熱センサデバイスで既に実証した.マイクロ流体チップ型デバイスでは,マイクロ流路に細胞を流し,偶発的に捕捉された細胞の熱計測を行う.そのため,培養シャーレ上の特定の細胞の熱計測は非常に難しい.2次元空間上の特定の領域の熱計測に適した例として,走査型熱顕微鏡等に用いられるプローブ型熱センサが挙げられる従来のプローブ型センサで高感度計測を行うには,周囲への熱損失を避けるため真空環境が求められるしかし,液体の試料や液体環境を求められる試料の熱計測は,真空中では行うことはできない.上記原理をプローブ型センサに適応することで,従来とは異なり,真空下でなくとも高感度で液体環境を要する試料の熱を高感度で計測できるようになり,かつ,2次元空間上の特定の領域にアクセスできるようになる.本プローブ型センサは,ガラスで形成されたプローブ本体にSiが挟まれた構造(ガラス-Si-ガラス)を有している.プローブ本体の先端にSiの熱検知部が,本体内部のキャピラリー内にはSiの共振熱センサが設けられた.熱検知部-共振熱センサ間はSiを介して物理的熱的に接続されており,プローブ先端で検知された熱は熱センサに伝導され,そこで計測される.本年度は,基本的な微細加工技術を用いたプローブ型センサの作製,特性評価(共振熱センサの隔離性,共振周波数温度係数,周波数ゆらぎ)を行った.応用としての生体試料(グルコース)を含む液滴の熱計測により,本プローブセンサが原理的に大気環境下で高感度計測が可能であることを実験的に証明したと言える.単一のカーボンナノチューブ(CNT)をプローブ先端に接着できることも既に確認しており,CNTを用いた高感度プローブセンサの開発に大きく貢献した.本研究の目的はカーボンナノチューブ(CNT)を用いた高感度温度センシングシステムを構築し,単一生体分子の熱測定を行うことである.22年度の実施計画は,CNTの気中・液中での熱的性質を,定量的に評価することである.CNTに関する熱的特性に関する報告は数多く存在するが,それは真空中における結果である.生体分子を,活性を保ったまま測定するには,液中である必要がある.SOIウェハ上に,フォトレジストを用いたリソグラフィをはじめとするMEMS技術で作製したデバイスを用いて,気中・液中において実験・測定を行った.その結果,CNTの一方の末端をマイクロヒーターで熱した際,CNTの温度を1°C上昇させるのに必要な熱量は,液中,気中,真空中の順に大きいことがわかった.これは,CNTは軸方向に優れた熱伝導率を有するといわれているが,CNT表面を介して周辺環境に熱が逃げていることが推測できる.しかし,液中においても十分測定できるほどの温度変化が生じており,熱センサとしての応用が可能であることを示唆している.また,マイクロ流体チップとカンチレバー型センサを組み合わせた,液中における高感度熱測定システムの構築を行っている.外乱防止や溶液置換などの利点を持つ閉空間を有するマイクロ流体チップ内にマイクロ真空チャンバーを設け,そこに高分解能を有する接触センサであるカンチレバーの一方の端を,他方をマイクロ流路中に埋め込む.液中で検知された熱を,カンチレバーを介して真空中で測定することで,周囲への熱の逃げを減少することができる.現在まで,実際にデバイスを作製し,カンチレバーの一部が接している真空-液体の境界壁があっても,一方の端から他方へ熱が伝達されることを,カンチレバーの共振周波数変化を測定することで確認した.本研究の目的はカーボンナノチューブを用いた高感度温度センシングシステムを構築し,単一生体分子の熱測定を行うことである.23年度の実施計画は計測システムの構築とその評価,および褐色脂肪細胞を用いた実験である.振動型微小熱センサを,マイクロ流体チップを用いて局所的に真空下に置くことで,液中における熱損失と振動減衰を防ぐことができる.実際にデバイスを作製し,振動型熱センサを支持するマイクロ流体チップ内部の壁の厚さと伝熱効率の関係を評価した.壁の厚さが10μmの時,最大の効率55%を得た.さらにマイクロ流路に水を流入し,同様の評価を行ったところ,効率は48%であった.液中ではセンサ周辺に96%の熱が逃げることが理論的に明らかになっており,それと比較すると大幅に改善されている.さらに,熱センサのQ値を比較したところ,マイクロ流路に水を流入する前後で4000と変化がなかった.これは,水のリークがなく,感度も維持できることを示している.アラン偏差により振動型熱センサの周波数安定性を評価したところ,0.015 ppmであり,S/N比を基に熱分解能を計算すると5.2 pJとなった.このデバイスを用いて,単一の褐色脂肪細胞の熱計測を行った.マイクロ流路中にあるサンプルステージに細胞を一つ付着させ,薬剤刺激の有無による熱計測を行った.薬剤刺激前のバッファ液のみでも,'数分に一度パルスに近い発熱を観察した.薬剤刺激を行うと,バルクでの計測と同様に,緩やかに温度が上昇し,発熱が20分程度続いた.前者の反応はこれまで報告されたことがなく,不活性化した細胞ではいずれの発熱現象が確認できなかったことからも,何かしらの生体由来の反応と推測できるが,原因の断定には至っていない.

以上より,単一細胞熱計測用デバイスを作製し,実際に単一細胞を用いた実験により,バルク計測と同様の結果はもちろん,バルク計測では報告されていない現象の観察に成功した.本年度の目的は,プローブ型センサの開発であった.共振熱センサの一部を真空下に置き,周囲への熱損失と振動減衰を防止することで高感度化が可能であることをマイクロ流体チップ型の熱センサデバイスで既に実証した.マイクロ流体チップ型デバイスでは,マイクロ流路に細胞を流し,偶発的に捕捉された細胞の熱計測を行う.そのため,培養シャーレ上の特定の細胞の熱計測は非常に難しい.2次元空間上の特定の領域の熱計測に適した例として,走査型熱顕微鏡等に用いられるプローブ型熱センサが挙げられる従来のプローブ型センサで高感度計測を行うには,周囲への熱損失を避けるため真空環境が求められるしかし,液体の試料や液体環境を求められる試料の熱計測は,真空中では行うことはできない.上記原理をプローブ型センサに適応することで,従来とは異なり,真空下でなくとも高感度で液体環境を要する試料の熱を高感度で計測できるようになり,かつ,2次元空間上の特定の領域にアクセスできるようになる.本プローブ型センサは,ガラスで形成されたプローブ本体にSiが挟まれた構造(ガラス-Si-ガラス)を有している.プローブ本体の先端にSiの熱検知部が,本体内部のキャピラリー内にはSiの共振熱センサが設けられた.熱検知部-共振熱センサ間はSiを介して物理的熱的に接続されており,プローブ先端で検知された熱は熱センサに伝導され,そこで計測される.本年度は,基本的な微細加工技術を用いたプローブ型センサの作製,特性評価(共振熱センサの隔離性,共振周波数温度係数,周波数ゆらぎ)を行った.応用としての生体試料(グルコース)を含む液滴の熱計測により,本プローブセンサが原理的に大気環境下で高感度計測が可能であることを実験的に証明したと言える.単一のカーボンナノチューブ(CNT)をプローブ先端に接着できることも既に確認しており,CNTを用いた高感度プローブセンサの開発に大きく貢献した.コンセプトの変更があったにも関わらず,今年度の実施計画の根幹をなす褐色脂肪細胞の熱計測に成功した点および作製したデバイスの評価実験を通して課題が明らかになり,さらなる改善の余地と,その解決方法を見出すことができた点.単一細胞に比べ,単一生体分子の発熱量は大幅に低いことは容易に予想される.現在の問題はドリフト等のノイズと,細胞の発熱自体の周囲の水への拡散が問題となっている.前者に関して,現在は熱センサの振動検出にレーザードップラー振動計を用いているが,静電容量を用いた検出方法を用いることで解決を試みる.後者に関して,マイクロ流路に水があるために生じる問題なので,サンプルを液体に包みこみ,空気による断熱を行って,熱損失を軽減する対策を講じる.