hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大量輸血後の非A非B型肝炎の長期追跡研究

某大学医学部1外科・2外科.及びその関連施設で、昭和20年昭和45年の間に胃・十二指腸良性疾患のために手術・輸血を受けた患者4,289例の診療録を閲覧した。その診療録から氏名、性、生年月日、現住所、本籍地、原疾患、手術術式、手術年月日、輸血量、飲酒歴、喫煙歴等の情報について採録した。これらの症例の個人識別情報、現住所、本籍地等の情報を用い、当該役所に住民票・戸籍抄本等を照合して生死を確認した。さらに死亡例については死亡診断書を入手した。次に原因別観察死亡数を集計し、一般人口の原因別死亡率を研究対象集団の人口に掛け合わせて期待死亡数を求め、標準化死亡比(観察死亡数と期待死亡数の比)を計算し、リスクの高まりの有無を検討した。未だフォロ-アップが完了しないので、ここに予備的結果を示す。まず肝がん死亡(男)は胃切除の際に輸血を受けた群に高く、そのリスクは輸血量(ユニット数)に比例して高まっていた。これは輸血を介して感染したHCV関連の肝がんが発生したものであることが示唆された。なお輸血から肝がん死亡までの期間は平均21年であった。ところで、北欧諸国では残胃初発がんのリスクがBーII法に高く、そのリスクは術後期間に比例して高まることが報告されているが、私どもの研究ではそのような傾向を見いだしえなかった。今後は現在急速に進歩しつつあるHCV関連マ-カ-を用いて、C型肝炎から肝硬変・肝がんの自然史の研究、肝がんの早期発見・早期治療などが重要な研究テ-マとなろう。現在、本研究の展開としてC型肝炎と肝硬変・肝がんとの関連についての疫学的研究を行っている。北九州の4医療機関で昭和55年までに、心臓疾患に対する外科的治療を受けた患者の診療録を閲覧して必要事項(後述)を入手した。これまで収集した施設別・調査期間別症例数は、それぞれ九州大学病院(1962年80年)690例、九州厚生年金病院(196180年)346例、小倉記念病院(197380年)673例、久留米大学病院(195760、63、6770、7478年)559例の計2,268例である。以上の4施設のうち九州厚生年金病院では、心臓外科開設以降1980年までの当該全症例について、小倉記念病院では診療録が保管されていた1973年以降1980年までの当該全症例を採録した。九州大学病院では1961年以前の分が未採録である。久留米大学では診療録保管の関係から採録期間がまちまちであるが、今後1980年以前の当該全症例の採録を予定している。個々の症例について、その診療録から氏名、性、生年月日、現住所、本籍地、原疾患、手術内容、麻酔薬、輸血量(成分別に)、人工心肺、輸血後肝炎、既往歴(特に肝疾患について)、家族歴、飲酒歴、喫煙歴、職業歴、HBVマーカー、術前術後の肝機能などの情報について入手した。採録した症例の個人識別情報、現住所、本籍地などの情報を用い、該当役所に住民票、戸籍抄本等を照会し、生死の確認を行っている。死亡した症例については、該当の法務局より死亡届・死亡診断書の入手の準備をあわせて行っている。

今後の計画は、入手した情報をコード化し、パンチして、コンピュータに入力し、コンピュータを使い、B型、非A非B型別に分け、輸血から肝硬変、肝がんまでの潜伏期の計算、原因別観察死亡数の集計、一般人口の原因別死亡率を対象人口にかけあわせて期待死亡数を求める。標準化死亡比(観察死亡数/期待死亡数)を求め、リスクの高まりの有無を検討する。輸血量とそのリスクの間の量・反応関係の有無を調べる。輸血を介して感染する肝炎ウィルス(HBV、NANB-HV[HCV]等)から慢性肝炎・肝硬変・肝がんへの自然史の研究、当該疾病のリスクの評価、環境中の関連要因・プロモ-タ-の究明等を目的する。[対象と方法及び結果]1.当初実施した心疾病による手術の際に輸血を受けた患者の長期追跡研究では、心疾病による致命率が高いこと、観察期間が短いこと等により、proportionate mortality analysisによる予備的解析では、研究対象群に肝硬変・肝がんのリスクの高まりを観察することはできなかった。2.残胃初発がんのリスクの検証と輸血後肝炎の自然史等の究明のために、胃切除の際に輸血を受けた患者の長期追跡研究を行っている。献血制度が施行される昭和30年代後半以前に、九州大学病院と関連医療施設で胃切除の際に輸血を受けた患者について、個人識別情報、手術年月日、手術術式、輸血量、喫煙、飲酒量等の情報を入手している。これまでに約2,000例の症例を収集し、一部生死の確認と死亡診断書の照会、入手を行った。3.HCV抗体陽性者の長期追跡研究を行うために、HCV抗体陽性献血者のリストの整備等を検討している。この研究は世界的にもまだ実施されてないオリジナルな研究テ-マである。4.献血者集団における昭和52年から63年までのHBsAgの年次推移を観察して、性差(男>女)、年齢による影響、誕生コホ-トの影響、HBVキャリアへの告知の影響等を明らかにした。5.献血者集団におけるHBVとHTLV-1の重複感染の研究も行っている。【目的】輸血を介して感染する肝炎ウィルス(HBV、HCV等)から慢性肝炎・肝硬変・肝がんへの自然史の研究、当該疾病のリスクの評価、環境中の関連要因・プロモ-タ-の究明、肝硬変・肝がんの1次予防・2次予防の可能性の研究等を目的する。【対象と方法及び結果】1.輸血後肝炎の自然史の研究と残胃初発がんのリスクの再検証のために、胃切除の際に輸血を受けた患者の長期追跡研究を行っている。献血制度が開始された昭和30年代後半以前に、九州大学病院と関連医療施設で胃切除の際に輸血を受けた患者について、個人識別情報、手術年月日、手術術式、輸血量、喫煙、飲酒量等の情報を入手した。これまでに約3,800例の症例を収集し、生死の確認と死亡診断書の照会・入手を行った。現在結果の集計を行っている。2.その他の関連研究として、(1).献血者集団における昭和52年から63年までのHBsAgの年次推移を観察して、性差(男>女)、HBVキャリアであることにセレクションと年齢別陽性率への影響、誕生コホ-トの影響、HBVキャリアへの告知の影響等を明らかにした。(2).献血者集団におけるHBVとHTLVー1の重複感染の研究も行った。
冥王代プレ生命システムの実験室内再現

人工の脂質膜であるNanodiscを用いたRibosome Displayの確立に取り組んだ。ribosomeから提示されたペプチド鎖が、脂質との親和性によって選抜されることを示すために、7回膜貫通型タンパク質bacteriorhodopsin(bR)と、FtsZ interacting protein A(ZipA)の一回膜貫通ドメインを膜タンパク質のモデル分子として使用した。可溶性のタンパク質(DHFR)と、各モデル分子を系中に共存させたときに、サイクル数の増加に伴ってモデル分子の遺伝子が濃縮されることが示された。このことにより膜タンパク質のibosome Displayによる選抜が可能であり、また脂質としてNanodiscを用いることが有効であることが示されたため、この手法を用いて、ランダムな10アミノ酸のペプチドをコードするDNAライブラリーを構築した後、PURE systemで翻訳し、Nanodiscとの親和性を有する翻訳複合体の選抜を行った。1サイクル後のmRNAの配列解析の結果、コドンの出現確率に対するアミノ酸の出現頻度において、イソロイシンの相対頻度が顕著に上昇し、グリシンの相対頻度が顕著に減少した。このサイクルを繰り返すことによって、原始膜タンパク質の配列に迫ることができるものと期待できる。大腸菌の細胞分裂の根幹を担う3つのタンパク質を、人工膜小胞中でPURE systemを用いてde novoに合成することに成功した。FtsZは、脂質膜にアンカリングされたZipAと結合、重合し、脂質膜の変形を惹起した。このリポソームは分裂する人工細胞の開発につながるものと期待できる。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の基盤は、海の出現の前の原始地球上で生命の基本となる高分子(タンパク質、核酸、脂質)は、すでに準備されていたとする仮説である。これらの高分子は、地球の冷却により出現した海の中で水に溶解すると同時に、再編成が生じハイパーサイクル的ネットワーク形成が生まれたと考えられる。こうした生命につながるプロセスと、実験室内で再現することを目指す。例えば、脂質による疑似細胞様の構造を持つリポソームを融合、分裂を惹起するタンパク質をリポソームディスプレイ法によりde novoで合成することを目指す。平成27年度は具体的に以下の研究を行った。Nanodiscを用いるRibosome Displayの確立人工の脂質膜であるNanodisc(ND)を用いたRibosome Displayの確立に取り組んだ。脂質膜に対して大きな親和性をもつことが知られる膜タンパク質bacteriorhodopsin(bR)をモデル分子として、三者複合体とNDとの複合体を回収することを試みた。結果、発現したbRの全量に対して34%の複合体を回収することができた。さらに、得られたmRNAを逆転写、PCRした産物に遺伝子変異が入らない条件を確立した。10アミノ酸ペプチドの選抜ランダムな10アミノ酸のペプチドをコードするDNAライブラリーを構築した後、PURE systemで翻訳し、NDとの親和性を有する翻訳複合体の選抜を行った。複合体のmRNAの配列解析の結果、選抜のサイクルを経るごとにイソロイシンとアルギニンの比率が単調に増加し、システインが単調に減少した。しかしながら、配列解析したサンプル数は数十であり、選抜が有効であったかどうかについて結論がだせない。非特異的吸着物の洗浄条件の最適化など、さらなる条件検討が必要であると考えている。ナノディスクに吸着されるペプチドの選抜に成功しており、実験系の基盤は形成されたと考えられる。平成28年度はこの選抜を多数のライブラリーで行うことで原始タンパク質の配列にたどり着けるものと期待される。平成28年度は以下の二点にフォーカスして研究を進める。二つのモデルタンパク質による実験系のデモンストレーション脂質との親和性によって選抜がなされることを示すために、bRと疎水性の低いタンパクを系中に共存させ、サイクル数の増加に伴うbRの濃縮を示す。

選抜されたペプチドー脂質間の相互作用の検出選抜されたペプチドが実際に脂質膜に挿入または付着することを示すために、C末端側にGFPなどの蛍光分子を連結させたタンパク質をリポソーム中で発現させ、膜局在性を確認する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
Eddy Accumulation法による水田からのメタン放出速度の計測

地表からのガスフラックスを微気象学的に精度良く測定する方法を確立するため、理論的に提唱されているEddy Accumulation法の実用化を検討した。定速Eddy Accumulation法の理論によれば、風の垂直成分(標準偏差σw)によって上下方向に運ばれる空気中のガス濃度をCup,CdnとするとガスフラックスはF=bσw(Cup-Cdn)となる。ただし、bは実験定数である。本研究では、こうした理論的要請に合致するよう、風の鉛直成分の向き別に空気をサンプリングする、高速自動サンプリング装置を試作した。また、数種類の植生下での実験定数bの検討と本測定法の精度検定を踏まえ、試作した装置により水田からのメタンフラックスを測定した。実験定数bは、20mを越す林の上部ではσw=0.3以上にならないと収束傾向が見られないが、潅木林や水田のような背の低い植生上では、b=0.53の一定値を取ると見做せた。また、この値を用いてEddy Accumulation法により潅木林と水田で顕熱フラックスを求め、Eddy Correlation法、熱収支法による値と比較したところ、充分な精度での測定が可能であることが分かった。水田におけるメタンフラックスは朝方から徐々に増加し、日没になると減少するという変化を示し、平均30mg/m2/hr程度の妥当と考えられる測定値が得られた。しかし、フラックスがさらに小さいと予想される場所での測定値は、かなりばらつきも大きく、精度を上げるためには、サンプリングしたガス濃度の測定精度をさらに向上させることが課題として残された。本研究は.精度の高い微気象学的フラックス測定法のひとつとして提案されているEddy Accumulation法の実用化を検討し、同法を用いて水田あるいは湿地林からのメタンフラックスを測定しようとするものである。本年度は主に同法を実用化する上で不可欠となる定圧がスサンプラ-とコントロ-ラの開発に主眼を置き、以下に箇条書きで述べるような成果が得られた。1.開発されたシステムは.超音波風速計により求められた風の垂直上下方向によって弁を開閉するコントロ-ラ-部,弁の開閉に応じて定圧で上下方向の風を別々にサンプリングする定圧ガスサンプラ-部とに大別される.サンプラ部は一定時間ごとに自動的に切り換わり.12ペア-24本の空気をサンプリングでき.しかもDC12Vの電源のみで駆動可能なため.電源の無い圃場等でも容易に使用し得る。本システムは国内・タイ国等の水田・湿地林において長期間・安定して使用できることが確認された。2.Eddy Accumulation法の精度検定を顕熱フラックス測定によっておこなった。Eddy Accumulation法による顕熱フラックスはEddy Corrーelation法やBowen法による測定値と良好な一致を示した。3.タイの水田で測定したメタンフラックスは日変化を示し.日平均で30mg/m^2/hr程度の値をとることがわかった。定速Eddy Accumulation法の理論によれば、風の垂直成分(標準偏差iw)によって上下方向に運ばれる空気中のガス濃度をCup,CdnとするとガスフラックスはF=biw(Cup-Cdn)となる。ただしbは実験定数である。

実験定数bは、20mを越す林の上部ではiw=0.3以上にならないと収束傾向が見られないが、灌木林や水田のような背の低い植生上では、b=0.53の一定値を取ると見做せた。また、この値を用いてEddy Accumulation法により灌木林と水田で顕熱フラックスを求め、Eddy Correlation法,熱収支法による値と比較したところ、充分な精度での測定が可能であることが分かった。水田におけるメタンフラックスは朝方から徐々に増加し、日没になると減少するという変化を示し、平均30mg/m2/hr程度の妥当と考えられる測定値が得られた。しかし、フラックスがさらに小さいと予想される場所での測定値は、かなりばらつきも大きく、精度を上げるためには、サンプリングしたガス濃度の測定精度をさらに向上させることが課題として残された。
iPS細胞由来膵島細胞による血管化膵島の開発

膵島移植は、ドナーの膵ランゲルハンス島を移植することによって生理的な血糖コントロールを提供するための、重症糖尿病に対する細胞治療法である。膵島移植をはじめとする移植療法は以前よりドナー不足の課題が指摘されてきたが、2010年の改正臓器移植法の施行により従前に比べドナーは増加し、膵島移植においてもドナー提供情報は少しずつ増加している。その一方、移植療法はドナーありきであり、待機患者がいつこの治療法の恩恵を受けれらるかは全く不透明である。よってヒト膵臓に依存しない、常時提供することが可能な新たなドナー源を確立することが要求されている。その有力な候補としてiPS細胞が挙げられる。現時点では、膵島に匹敵する機能を持つ細胞を作成する段階までには至っていないものの、iPS細胞からインスリン、グルカゴンといった内分泌ホルモンを発現する膵島細胞を作成する手法は確立されつつある(Nakashima R, et al. Genes Cells. 2015)。また、移植された膵島の多くは脱落するため、その多くを生着させることが治療成功の鍵となる。膵島が脱落する理由の一つは虚血であり、移植早期の血流回復が膵島の生着に大きく貢献することは我々のこれまでの検討で明らかになっている(Tsuchiya H, et al. Plos One. 2015)。本研究は血管を付帯させた膵島を開発すること、さらにiPS細胞由来の膵島細胞に血管を付帯させたいわゆる血管化膵島を開発することを目的とする。最終年度に当たる今年度は昨年度作成した血管化膵島を糖尿病マウスの腹腔内に移植し、血糖値の推移を評価した。一部のマウスに血糖値の正常化が認められた。また、iPS細胞由来膵島細胞を同様に糖尿病マウスの腎皮膜下に移植し、血糖値の降下作用を確認できた。今年度はマウス膵臓から膵島を分離抽出し、これにマウス線維芽細胞、マウス皮膚微小血管内皮細胞とを共培養することでマウス由来の血管化膵島の作成が可能であるか検討した。ここまでに膵島表面に血管の形成が認められることを確認した。膵島表面への血管付帯までは成功した。作成条件の検討、機能評価については今後進めていく予定である。最終年度に当たる今年度は昨年度作成した血管化

膵島を糖尿病マウスの腹腔内に移植し、血糖値の推移を評価した。一部のマウスに血糖値の正常化が認められた。また、iPS細胞由来膵島細胞を同様に糖尿病マウスの腎皮膜下に移植し、血糖値の降下作用を確認できた。血管化膵島の作成法を確立し、その機能をグルコース負荷、糖尿病動物への移植実験等により評価していく。また、本研究は糖尿病における虚血脚の再血管化による血流回復にも応用できると考えられ、その方面に関しても動物モデルなどを使用して研究を進めていく予定である。
口腔癌における腫関瘍連抗原発現の解析と臨床応用に関する研究

Fluorescence in situ hybridization(FISH)法により、口腔腫瘍細胞において17番染色体の数的異常が、悪性腫瘍において正常細胞や良性腫瘍細胞よりも多くみられることを報告した。増殖細胞核抗原(PCNA)は、悪性腫瘍や悪性化の可能性のある前癌病変において高率に免疫組識学的に検出され、口腔扁平上皮癌の癌化学療法前後では、化学療法後に一般的にPCNA陽性率は低下する。癌化学療法の組識学的効果を推測する指標としての臨床応用が示唆された。c-erbB-2癌遺伝子産物は、悪性唾液腺腫瘍においてまれに検出されが、この抗原の有無と唾液腺腫瘍の悪性度や予後との関連については、症例数が少なく結論的なことは言えなかった。e-erbB-2癌遺伝子産物は、扁平上皮癌では検出されず、多形成腺腫において高率に検出された。正常唾液腺では、導管上皮細胞に検出され、侵潤性に増殖した唾液腺腫瘍細胞に高率に検出された。DNAaneuploidyは、悪性腫瘍にかぎらず、良性病変においても検出されるが、DNAindexは、悪性腫瘍の方が高い傾向がみられた。KM-93抗原は、唾液腺腫瘍患者で高値を示すことから唾液腺腫瘍の血清診断への臨床応用が示唆された。正常唾液腺では、KM-93抗原は導管上皮細胞に検出され、Whartin腫瘍では2層性の腺管様構造の腫瘍細胞の内側層に検出されることから、この腫瘍細胞は導管由来であると示唆された。当科入院中の扁平上皮癌患者および唾液腺腫瘍患者の血清中における抗ヒト肺腺癌抗体KM93反応抗原量を測定したところ、唾液腺腫瘍患者において、統計的に有意に高値を示すことが明らかとなり、唾液腺腫瘍の血清腫瘍マ-カ-としての有用性を報告した。当科で治療した多数例の扁平上皮癌および唾液腺腫瘍のフォルマリン固定パラフィン切片で、ポリクロナ-ル抗ヒトcーerbBー2抗体を用いて免疫組織化学的に染色した。その反応性並びに抗原の存在様式から推察すると、cーerbBー2遺伝子産物は、口腔外科領域の扁平上皮癌では、免疫組織化学的には存在しないことが推察された.次に唾液腺腫瘍では、悪性腫瘍だけでなく良性腫瘍や正常唾液腺にも反応した。正常組織では唾液腺導管上皮細胞に強い反応性を示した。良性の多形性腺腫では、その細胞質と反応し、実質性の増殖を示す腫瘍部分よりも散在性に増殖している腫瘍細胞に反応していた。悪性腫瘍では、腺様嚢胞癌の中でも分化度の高いとされる腺管形成型に反応し、2層腺管構造の管腔側細胞層に強く反応した。粘表皮癌では、高分化型のグル-プI型で反応した。しかし、唾液腺癌では反応せず、腺房細胞由来とされる明細胞癌や腺房細胞癌では反応しなかった。以上のことから、唾液腺腫瘍では、cーenbBー2遺伝子産物は、唾液腺腫瘍の悪性度とは関連しておらず,むしろ、唾液腺態管上皮由来の腫瘍に反応しており、しかも、分化度が高いとされる腫瘍に多く検出されることから、唾液腺導管細胞もしくは滝液腺導管由来細胞の分化に関連していることが示唆された。ヒト肺癌関連抗原であるKMー93の血清抗原値が唾液腺腫瘍患者において、高値を示すことを報告した。癌遺伝子産物関連抗原cーerbBー2の免疫組織染色を口腔腫瘍で行なったところ、扁平上皮癌で検出されず、唾液腺腫瘍で高率に検出されるが、従来の報告に反して悪性腫瘍に特異的に検出されず、導管上皮由来の腫瘍細胞に高率に検出されることを報告した。増殖細胞核抗原(PCNA)の免疫組織染色陽性率は、口腔扁平上皮癌において腫瘍の分化度や異型度と関連することを報告した。

PCNA陽性率は、前癌病変よりも癌において高率となり、癌診断に有用であることを報告した。染色体特異的DNAプロ-ブを用いて17番染色体のfluorescence in situ hybridization(FISH)法を行ない、口腔悪性腫瘍において17番染色体の3倍体以上の数的増加がみられることを報告した。疣贅状癌において、フロ-サイトメトリ-によるDNA aneuploidyのみられない場合でも、FISH法による17番染色体aneuploidyはみられ、こうした染色体異常の検出にFISH法は有用であることを報告した。PCNA陽性率は、癌化学療法が奏効した症例では治療後に低下することから、治療効果を組織的判定にする際に有用であるという内容を既に学会報告し、海外誌へ投稿中である。PCNA陽性率は、従来のKiー67やBrdUよりも簡便であるが、同一の腫瘍でそれらを比較すると、PCNA陽性細胞は、従来言われているようなG1後期からS早期の細胞に検出されるのではなく、cell cycleの広い範囲の細胞に検出されている可能性があるという内容を学会報告し、投稿している。Fluorescence in situ hybridization(FISH)法により、口腔腫瘍細胞において17番染色体の数的異常が、悪性腫瘍において正常細胞や良性腫瘍細胞よりも多くみられることを報告した。増殖細胞核抗原(PCNA)は、悪性腫瘍や悪性化の可能性のある前癌病変において高率に免疫組織学的に検出され、口腔扁平上皮癌の癌化学療法前後では、化学療法後に一般的にPCNA陽性率は低下する。癌化学療法の組織学的効果を推測する指標としての臨床応用が示唆された。c-erbB-2癌遺伝子産物は、悪性唾液腺腫瘍においてまれに検出されが、この抗原の有無と唾液腺腫瘍の悪性度や予後との関連については、症例数が少なく結論的なことは言えなかった。DNAaneuploidyは、悪性腫瘍にかぎらず、良性病変においても検出されるが、DNAindexは、悪性腫瘍の方が高い傾向がみられた。
知識の動的合成による熟練技能の創発に関する研究

人間作業者による熟練技能の工学モデルの開発として,とくに雑多な対象のなかから的確に意味ある情報のみを選別し抽出できる環境認識と概念生成の能力,さまざまな形態の知識の動的合成と学習,さらにはその効率的な運用に関わる部分の実現,の諸側面に対して焦点をあて以下のような研究を行なった.1)進化型計算によるユーザ挙動の観察に基づく概念の洗練化ユーザの挙動を観察するなかから人間の認識やシステムの状態に適合した形での情報の選別や発見を行なう動的概念形成システムを提案を行なった.さらに,実環境として、プラントオペレーション環境を取り上げ,この動的概念形成手法を使った知的支援について検討を行なった.2)進化型学習手法を用いた環境とのインタラクションによる自律移動ロボットの注視点形成と行動獲得創発的な行動形成の機構を実現するための予備段階として,環境の側が行為者に対して行為の可能性についての予見的情報を提供するような特徴を自律移動ロボットにとっての注視点として定義し,この獲得が行為実行の効率性と正確性を保証するという普遍的な拘束条件下に進行する過程を進化型計算を用いて実装した.3)遺伝アルゴリズムを用いた異種知識源の融合による創発的信号解釈創発的な信号解釈の試みとして,地質探査のためのリモートセンシングの一つである地震探査による速度スペクトラムデータの速度解析作業をとりあげ,上述のようなデータに対する意味づけの冗長さを階層的クラスタリングの手法の適用により,また複数知識情報源の融合を遺伝的アルゴリズム(GA)により実現を試みた.4)階層型状態分類概念に基づく自律移動体の強化学習自律移動ロボットの学習として,先験的な概念知識を保持しつつ,環境との相互作用の経験の蓄積に基づいた行動知識の獲得とを融合したロボットの行動形成のためのハイブリッド学習法を,本研究では“概念依存型強化学習"として提唱し,これにより従来の盲目的な試行錯誤の繰り返しからの強化学習の学習効率・信頼性の問題が克服できることを示した.人間作業者による熟練技能の工学モデルの開発として,とくに雑多な対象のなかから的確に意味ある情報のみを選別し抽出できる環境認識と概念生成の能力,さまざまな形態の知識の動的合成と学習,さらにはその効率的な運用に関わる部分の実現,の諸側面に対して焦点をあて以下のような研究を行なった.1)進化型計算によるユーザ挙動の観察に基づく概念の洗練化ユーザの挙動を観察するなかから人間の認識やシステムの状態に適合した形での情報の選別や発見を行なう動的概念形成システムを提案を行なった.さらに,実環境として、プラントオペレーション環境を取り上げ,この動的概念形成手法を使った知的支援について検討を行なった.2)進化型学習手法を用いた環境とのインタラクションによる自律移動ロボットの注視点形成と行動獲得創発的な行動形成の機構を実現するための予備段階として,環境の側が行為者に対して行為の可能性についての予見的情報を提供するような特徴を自律移動ロボットにとっての注視点として定義し,この獲得が行為実行の効率性と正確性を保証するという普遍的な拘束条件下に進行する過程を進化型計算を用いて実装した.3)遺伝アルゴリズムを用いた異種知識源の融合による創発的信号解釈創発的な信号解釈の試みとして,地質探査のためのリモートセンシングの一つである地震探査による速度スペクトラムデータの速度解析作業をとりあげ,上述のようなデータに対する意味づけの冗長さを階層的クラスタリングの手法の適用により,また複数知識情報源の融合を遺伝的アルゴリズム(GA)により実現を試みた.4)階層型状態分類概念に基づく自律移動体の強化学習自律移動ロボットの学習として,先験的な概念知識を保持しつつ,環境との相互作用の経験の蓄積に基づいた行動知識の獲得とを融合したロボットの行動形成のためのハイブリッド学習法を,本研究では“概念依存型強化学習"として提唱し,これにより従来の盲目的な試行錯誤の繰り返しからの強化学習の学習効率・信頼性の問題が克服できることを示した.
インフルエンザ重症化における誤嚥性肺炎の作用機序の解明とその予防法の開発

肺炎の原因菌である肺炎球菌の感染防御法を探索した。肺炎球菌の莢膜タンパクであるrPsPAを抗原に、プラスミドRANTESをマウス(C57BL/6)に舌下から投与したところ、抗原特異的な抗体価の誘導が血液、鼻腔洗浄液及び肺洗浄液で認められた。また脾臓、鼻腔粘膜などでは抗原特異的抗体産生細胞の増加も認められた。免疫されたマウスに対して肺炎球菌(50%致死量)を投与したところ、そのどれも生存した。リンパ組織のFACS像から、PGLNにおいてCCR5+樹上細胞が有意に増加しており、これらの免疫反応に重要な役割を果たしていることが示唆される。肺炎の主要な起因菌である肺炎球菌の粘膜ワクチンの評価を行った。抗原としてPneumococcal surface protein A (PspA)を用いた。PspAは全ての肺炎球菌表層に存在するコリン結合タンパク質である。粘膜ワクチンとしてpCCL5 cDNAを使用した・C57BL/6マウスにPspAとpCCL5 cDNAを周毎に4回舌下投与したところ、血清、肺洗浄液(LWs)、鼻腔洗浄液(NWs)において抗原特異的な抗体価の上昇が見られた。また膣洗浄液(VWs)およぎ糞便(FEx)からも同様の結果が得られた。また脾臓、鼻腔粘膜(NPs)、頚部リンパ節(CLNs)および腺周囲リンパ組織(PGLNs)において抗原特異的抗体産生細胞の上昇を確認した。最終免疫から1週間後、肺炎球菌WU-2株を鼻腔投与し48時間後のLWs、NWsおよび血液を用いてCFU assayを行った。pCCR5 cDNA投与群はコントロール群(pORF)と比較して著しい抑制効果を示した。引き続き、舌下腺(SLGs)、顎下腺(SMGs)、CLNs、PGLNsおよび脾臓の樹上細胞をフローサイトメトリー(flow cytometry)で分析したところ、PGLNsにおいて、CCR5+樹状細胞の増加が認められた。これらのことから舌下免疫は舌下組織のCCR5+樹上細胞を活性化させることで、PspA特異的な分泌型抗体価を上昇させ肺炎球菌の感染を減少させることが示唆された。肺炎モデルの構築、またその免疫系を判ずるにあたって非感染マウスにおける気道免疫防御系(BALT)及び鼻腔免疫防御系(NALT)のプロファイリングを行った。また誤嚥性肺炎に口腔細菌が強く関与することから舌下腺(SLGs)、顎下腺(SMGs)、腺周囲リンパ組織(PGLNs)および頚部リンパ節(CLNs)も評価した。C57BL/6マウスに対して、OVAを抗原、アジュバントとしてFlt3リガンド発現アデノウイルスを用いて1週間ごと4回舌下免疫を行った。最終免疫から1週間後に抗原特異的な抗体反応をELISA法で調べたところ、唾液や血液で確認することが出来た。フローサイトメーターではPGLNsにIgA(+)B細胞の増加を確認することが出来た。このIgA(+)B細胞のmRNAはスイッチングに関与するAIDなどの増加がみられた。またPGLNsでは樹上細胞、T細胞及びB細胞の増加が見られた。ELISPOT法ではSMGsよりSLGsにおいてIgA抗体産生細胞を確認することが出来た。このことは舌下免疫がSLGsに樹状細胞、T細胞及びB細胞の集積を誘導し、引き続いて抗原特異的な分泌型IgA抗体産生細胞を誘導することを示唆している。肺炎球菌、成人における重症肺炎球菌感染症の原因の役7割を占めるという報告がある。この肺炎球菌は93種類の血清型を有することが知られているが、これら全ての肺炎球菌が保有するPneumococcal surface protein A(PspA)を抗原とし、粘膜アジュバントとしてRANTESの遺伝子配列を組み込んだプラスミドDNA(pRANTES)を使用した。コントロール群としてRANTESの配列を組み込んでいないプラスミド(pORF)を用いた。1)68週齢のC57BL/6マウスにこれらを1週間ごと計4回舌下免疫したところ、実験群はコントロール群と比較して抗原特異的な抗体価の上昇が血清、鼻腔洗浄液、肺洗浄液で確認出来た。また脾臓、NPs、PGLNsにおける抗体産生細胞の増加も確認出来た。2)脾臓、頚部リンパ節、PGLNsのCD4+T細胞の抗原特異的サイトカイン発現を調べたところ、PGLNsではコントロール群と比較してIL-4、IFN-gおよびIL-17の発現誘導が確認出来た。

3)脾臓、頚部リンパ節、PGLNsにおけるCD11c+樹上細胞のプロファイルを調べたところ、PGLNsにおいてCCR5+樹上細胞の発現がコントロール群と比較して優位に増加していた。4)免疫後のマウスに対して、LD50に相当するS. pneumoniae W50を経鼻投与した。2日後に、肺、鼻腔洗浄液、血液をCFUアッセイに供与したところ、実験分はコントロール群と比較して優位にCFU数を減少させた。予防歯科学誤嚥性肺炎時におけるマウスの状態、及び誤嚥性肺炎とインフルエンザ感染を同時に起こしている状態を今後考察するにあたって、主要な肺炎起因菌を使用したマウスモデルの評価は非常に重要である。本年はその評価を行うことが出来たと考えられ、現在までの達成度は「おおむね順調に進展している。」と区分できる。誤嚥性肺炎時におけるマウスの状態、及び誤嚥性肺炎とインフルエンザ感染を同時に起こしている状態を今後考察するにあたって、健康時における気道免疫防御系(BALT)及び鼻腔免疫防御系(NALT)のプロファイリングは非常に重要である。」と区分できる。誤嚥性肺炎モデルを構築する。またその評価は気道免疫防御系(BALT)及び鼻腔免疫防御系(NALT)を中心に評価する。具体的には口腔細菌及び肺炎球菌を同時に用いた混合感染モデルを予定している。具体的には口腔細菌を用いた感染、及び肺炎球菌を用いた感染、その両方を感染させたモデルを考えている。予定していたよりはるかに少ないマウスで実験結果を得ることが出来たから。混合感染モデルの予備実験としてマウスを多く購入することで対応する。研究を進めていく上で必要な研究費を執行したため当初の見込み額と執行額は異なったが、研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め、当初予定通りの計画を進めていく。具体的にはマウスモデル構築のためにマウスの購入、感染に用いる菌体の培養・調整のために培地、培養チューブの購入、免疫系の評価のために、抗体の購入を予定している。
沖縄における米軍基地周辺地域の社会経済指標に関する実証研究

1990年2010年の国勢調査のデータを整備し、市町村別のシングルマザー人口の統計を整備した。また、世帯数のうえでシングルマザー世帯をとらえることと同時に、市町村にいる子どもの中のどれだけの割合がシングルマザーに育てられているか、という指標も作成した。そしてこのことを地図上に表示し、シングルマザーの比率に地域差が大きいことを確認した。さらに、市町村に米軍基地(陸軍・海軍・海兵隊・空軍別に)・自衛隊基地(陸上・海上・航空別に)が存在しているかどうかのデータを整備した。これにより、軍事基地のある市町村でシングルマザーが多いのかどうか、また、基地の属性の影響はどれだけか、を検証することが可能になった。この結果、シングルマザーの比率は、沖縄の米軍基地のある市町村で高いこと、自衛隊基地のある市町村ではシングルマザー比率は基地のない市町村よりも若干だけ高いことがわかった。また、1990年と2010年を比較すると、1990年には沖縄の米軍基地の影響は大きかったが、この20年の間に基地のない市町村でシングルマザーがより大幅に増えた結果、基地の影響は近年になるほど小幅になっていることがわかった。しかし、日本の国勢調査では、外国軍隊に属する世帯員がいる世帯は、調査対象から外れている。なので、米軍人が所属する世帯は調査されておらず、米軍人が所属する世帯の子どもは、市町村に居住する子どもの数に含まれないことになる。このことが、子どもに占めるシングルマザーに育てられている子どもの割合の数値にどのような影響を与えうるか、とりわけ、米軍基地の影響を過大に推計する可能性がないかどうか、検討が必要である。市町村合併を考慮したデータ整備に時間がかかった。また、国勢調査は米軍人を含む世帯を調査していないことにかかわる補正をしなくてはならない可能性を当初明確に認識していなかったので、その補正方法を考慮する必要が生じた。また、2018年度には研究代表者が所属する部局の副研究院長を務めており、研究時間を取るのに若干苦労した部分があった。得られた成果を、研究論文にまとめる。また、研究報告を行ない、フィードバックを得て、研究の深化と改善に役立てる。軍事基地周辺地域とそれ以外の地域の社会経済指標を考察するにあたり、本研究では、子どものいる世帯の中でのシングルマザー世帯の割合(以下、シングルマザー世帯割合)に注目した。2010年国勢調査の市町村レベルのデータの集計により、この割合が市町村間でどのように異なるのかをみたところ、沖縄県においては米軍基地の近隣の市町村において、この割合が高くなっていることが確認された。このことが時系列でどう変化したのかを調べるために、1980年の国勢調査のデータを、2010年の市町村の境界に集計し直す作業を行った(2000年代には多くの市町村合併があり、1980年と2010年の市町村別の統計数値を比較するには、合併前時点である1980年のデータを、合併後の市町村の境界に合わせて集計し直す必要がある)。1980年国勢調査の集計からも、沖縄県においては米軍基地の近隣の市町村でシングルマザー世帯割合が高いことが確認された。そして、基地周辺でこの割合が高い傾向は、1980年のほうが2010年よりも顕著である。この主な理由は、1980年から2010年の間に、基地周辺以外の市町村においてシングルマザー世帯割合が上昇したからである。比較の対象となる日本全体の傾向としては、(1)シングルマザー世帯割合は大都市部で低い、(2)地方部ではシングルマザー世帯割合が高い地域とそうでない地域がある、(3)シングルマザー世帯割合は、1980年から2010年までの間に上昇してきている、の3点が確認できた。市町村合併の以前のデータを、合併後の市町村の境界にあわせて集計する作業について、当初予想したよりも定型化されたプログラム等が存在していなかったため、その作業が遅れている。

市町村合併を考慮したデータ整備に時間がかかった。また、国勢調査は米軍人を含む世帯を調査していないことにかかわる補正をしなくてはならない可能性を当初明確に認識していなかったので、その補正方法を考慮する必要が生じた。また、2018年度には研究代表者が所属する部局の副研究院長を務めており、研究時間を取るのに若干苦労した部分があった。基地周辺においてのシングルマザーの増え方はその他の地域と比較して高いのか低いのか、を明らかにする。さらに、シングルマザーの属性を、マイクロデータ等を利用して明らかにする。シングルマザーに育てられている子どもが増えていることは統計からわかっているが、シングルマザーやその世帯の属性がそれとともにどう変化しているのかは、必ずしもはっきりわかっていないので、その点を統計から明らかにする。今後は、1990年、2000年のデータを整備し、特にこの増加が大きかった時期があるのかどうか、そしてなぜその時期に一部の地域においてシングルマザー比率が上昇したのか、等の特徴を明らかにする。そして、沖縄の米軍基地周辺地域のシングルマザー世帯割合が、そのような全体の傾向の変化と比較してどう異なっているのかを検証する。得られた成果を、研究論文にまとめる。また、研究報告を行ない、フィードバックを得て、研究の深化と改善に役立てる。国勢調査のオーダーメイド集計を行なうことを予定していたが、集計様式の調整に時間がかかり、また年度末近くにはオーダーメイド集計を受け付けていない期間があったこともあり、29年度中にオーダーメイド集計を発注することができなかった。研究が遅れた部分があったので、研究期間の延長を申請した。研究の進行に伴って必要になってくる旅費や英文校閲等の費用を支出しなかったために、次年度使用額が生じている。2019年度はこれまでの研究成果をまとめ、発信していく計画であるので、次年度使用額もそのために支出する予定である。
ナノレーザー蒸散加工の完全焼結ジルコニアセラミックブロックからの高精度修復物作製

5軸加工技術を適用したレーザー装置を組み立て、適合の良いクラウンが作製できた。さらに、クラウンの歯頸部の真円度も測定し、レーザー加工は円を正確に作製するのに、優位な方法であることが明確になった。実際に直ぐに臨床応用できるデータを得た。以上の結果を、国際歯科材料会議2016(インドネシア)口頭発表、第71回日本歯科理工学会(2018年:大阪)でポスター発表した。さらに、2017年12月に論文をDMJ(Master Journal List掲載誌)に投稿し、2018年4月にアクセプトまでに至った。オールセラミックスクラウンのコーピング材である高強度セラミックブロック(イットリア安定化ジルコニアセラミックス)から、高出力レーザーによる新しい切削加工法を開発することが目的である。現在、半焼結ブロックからバーによる切削後、再び焼結する方法が普及している。半焼結ブロックからCAD/CAMによる切削加工前に、再焼結による大きな2030%収縮(20%)を補正しなければならないので、歯科用CAD/CAMが必須な機器となっている。しかし、再焼結により精確な修復物の作製は不可能である(技工士によって調整されて、臨床で応用されている)。そこで、完全焼結ジルコニアセラミックブロックから、高出力レーザーの蒸散による切削加工で、高精度のジルコニアセラミックコーピング作製の方法を開発する。今年度は:a)完全焼結ジルコニアセラミックブロックにおける切削に適当な高出力レーザーの照射条件:完全焼結体のY-TZPブロックに、フェムトレーザー、ピコレーザー、ナノレーザーをブロックに照射した。適当照射条件(加工深度が深い)が明確になった。b)レーザー照射による熱影響層の確認:完全焼結ジルコニアセラミックスに高出力レーザーを照射した痕の直下の熱影響層の状態を確認することにより、レーザーの熱による変性が小さいことが分かった。c)5軸加工技術の導入(平成28年度を予定):レーザーと5軸の作業台を設置することにより、クラウンの内部をレーザーで加工することができた。完全焼結ジルコニアブロックから、高出レーザー作製したクラウン(CAM用ソフトで、セメント層を0mmに設定)と金型の垂直的間隙は0.49%となり、僅かに収縮した。標準偏差が0.11と大きく、レーザーで切削加工して作製したクラウンの個体差は大きかった(繰り返し6回)。レーザー装置の購入が早く、設置がスムーズに出来たこと。さらに、5軸の作業台を流用できたことが大きな理由である。また、同時に進めている研究で、ISO TC 106 SC9/WG5(機械加工物)のCDを作成していて、修復物の精度を金型を用いて測定を経験しているからと考える。13軸でのレーザー加工従来の3軸の作業台を用いて、完全焼結体のジルコニアブロックから高出力レーザーで、切削加工した。これをテーパー10°を付与した金型(原寸)を用いて、クラウンの加工精度を測定した結果、0.49%(標準偏差0.11)小さくなった。この原因は奥行きをレーザーにより加工が困難であったからで、さらに5軸の作業台の必要性が明確になった。2半焼結のジルコニアセラミックブロックを焼成することによる“ゆがみ"頬側の厚さを一定(0.5mm)にして、舌側の厚さを0.5,1.0,1.5mmの3種類に変化させた半焼結のジルコニアブロックからクラウンをCAD/CAMにより作製した。これらを金型(20%拡大)で加工精度を評価した。また、これらを焼成する時間を通常(6時間)とその約1/3とした急速の2種類で完全焼結したクラウン試料を作製し、同様に金型(原寸)を用いて、クラウンの加工精度を評価した。さらに、完全焼結体クラウンの歯頚部の正円度を測定した。実験の結果、急速に焼成した完全焼結体クラウンは舌側の厚さが増すにしたがい、寸法精度が悪くなった。原因は、舌側の厚みが異なることによりクラウン内部に“ゆがみ"が生じたからである。同様に、通常時間で焼成しても20%と大きな焼成収縮の為、頬側と舌側の厚さが異なると、本焼結したクラウン内部に“ひずみ"が発生していることが分かった。すなわち、従来の半焼結ブロックから切削加工後、焼成すると“ゆがみ"が生じるので、完全焼結のジルコニアセラミックブロックをレーザーで加工することにより、精度の高いクラウンを作製することができ、患者さんに良い補綴物を提供できることが分かった。完全焼結体のジルコニアセラミックブロックから高出力レーザーでクラウンを加工する利点を、1)3軸でのレーザー加工と2半焼結のジルコニアセラミックブロックを焼成することによる“ゆがみ"の実験の結果から明確にした。5軸の作業台を設置中で、来年度に向けての実験の準備をしている。本研究の目的は、完全焼結ジルコニアセラミックブロックから、高出力レーザーの蒸散による切削加工で、高精度のジルコニアセラミッククラウン作製の方法を開発することである。現在、半焼結ブロック(100HV)から切削後、再び焼結(1300HV)しているので、半焼結ブロックを本焼結するときに生ずる大きな2030%焼成収縮により、ひずみが生じ、このひずみの出現部位を予想できない。よって、現状の作製方法で作製したクラウンの精度は悪い。よって、完全焼結ブロックから、高出力レーザーによる加工したクラウンは精度が高いと考えた。

平成27,28年度において、レーザーのジルコニアセラミックスに最適な照射条件を決め、3軸加工技術のレーザー装置を組み立て、完全焼結体の高強度セラミックスからクラウンを作製した。しかし、Z方向の切削に不足が生じ、作製したクラウンと支台歯との間隙が大きく、適合の悪いクラウンであった。平成30年度は、5軸加工技術のレーザー装置を組み立て、適合の良いクラウンが作製できた。さらに、クラウンの歯頸部の真円度も測定し、レーザー加工は円を正確に作製するのに、優位な方法であることが明確になった。また、レーザー照射痕(表面変え200μm以内)の物理的、機械的性質が、従来の電気炉による焼成したジルコニアセラミックスのそれらとは差がなかった。実際に直ぐに臨床応用できるデータを得た。以上の結果を、国際歯科材料会議2016(インドネシア)口頭発表、第71回日本歯科理工学会(2018年:大阪)でポスター発表した。さらに、2017年12月に論文をDMJ(Master Journal List掲載誌)に投稿し、2018年4月にアクセプトまでに至った。5軸加工技術を適用したレーザー装置を組み立て、適合の良いクラウンが作製できた。クラウンの精度の実験の結果、完全焼結ジルコニアブロックから、高出レーザー作製したクラウン(CAM用ソフトで、セメント層を0mmに設定)と金型の垂直的間隙は0.49%となり、僅かに収縮した。よって、CAMソフトのプログラムを修正して、金型による測定で、精度が0%になるようにする。標準偏差が0.11と大きく、レーザーで切削加工して作製したクラウンの個体差は大きかったので、レーザー切削加工が安定するようように、照射雰囲気や照射条件を調整する。さらに、5軸の作業台を用いた、クラウンの外形を加工するCAMソフトを開発する。5軸の作業台を用いて、完全焼結体のジルコニアセラミックブロックから高出力レーザーで精度の高いクラウンを作製する実験を行う。さらに、レーザーで切削加工時に加工状態を測定し、もし加工不足があった場合に再レーザー加工のシステムの構築も考えている。補綴・理工系歯学物品は発注したが、事務における検品が3月末日までにできなかった。既に、4月に検品は終了している。
チベット政策からみた清帝国の多面的政治関係に関する研究―雍正・乾隆年間を中心に

チベット政策からみた清帝国の多面的な政治関係に関する研究の一環として、『チベット内戦と清朝の対応』『清朝軍のチベット駐留を巡る清朝の対応』という二つの論文をまとめた。それから中国で清代乾隆年間、清・チベット関係を知る上で重要な満州語の史料集が出版されたため、その史料集の内容を分析し、『清代軍機処満文熬茶档について』という史料紹介を行い、掲載した。従来の研究では、雍正・乾隆前期(ジュンガル滅亡まで)のチベット政策に対し、具体的な検討が行われていなかったため、清朝のチベット政策の全体図の中で個別の政策を位置付ける試みはなかった。今回の研究結果を通し、雍正・乾隆初期までの清朝のチベット政策は連続的を持つものであることが判明したのである。具体的にいうと、雍正・乾隆初期における清朝の対チベット政策は、ジュンガルに対抗して「ゲルク派の振興(ダライラマ七世護持)とチベット安定」の名分を確保し、ダライラマ七世との協力関係を維持することを目標としたものであり、強引な軍事干渉がチベット側の疑惑や反感を通じてダライラマ七世のジュンガル接近を招くことのないよう、清朝は極めて慎重な態度を取った。一方、清朝のチベット支配の実務者として知られてきた「駐蔵大臣」はこの時期まで臨時的な措置として運用され、チベット内政には直接介入することが禁止されており、現地での交渉役が期待された。清朝がチベット政策を実現する上で、多面的な政治関係を構築し、政策の方針の転換が頻繁に行われていたのは、ダライラマ七世を中心とするチベット政治体制を改変せず、チベットの安定を保持するという清朝支配のあり方によるもので、18世紀前半、清朝の対チベット支配の大きな特徴であるといえる。二回にわたって中国北京にある資料館に行き、資料調査を行いました。この資料は全て満洲語で書かれたとう案史料で、はじめて使用される資料であります。調査終了後は、日本に戻り、資料整理と翻訳の作業を行いました。これにより、新しい論文を作成するための基礎研究が完了しました。一方、申請時のテーマと関連してチベット内戦に介入する際の清朝の政治的手法を明らかにした論文を「史學雑誌」に投稿しまして今年に掲載になる予定であります。台湾で開かれた国際学会に参加しました。そこでは、チベットだけではなく、多様な分野の発表が行われ、更に外国の研究者との交流を通して、より大きな視点でチベット問題を研究する研究手法を得ることができました。日本では近世史研究会において清帝国の多面的な政治関係を検討する上で欠かせない清帝国の境界画定とチベットという題目で論文発表を行っており、内容の修正を行い、今後、投稿を予定しています。
ディーゼル排ガスにより次世代の神経幹細胞に生じる機能障害とＤＮＡメチル化異常

本研究では、胎仔期のディーゼル排ガス(DE)曝露により神経幹細胞に生じるDNAメチル化状態の変化と遺伝的・機能的異常の検討を行った。胎仔期にDEを曝露した新生仔マウスの神経幹細胞から得たゲノムDNAについてメチル化状態の解析を行った。その結果、ゲノム全体にわたるメチル化状態の変動が認められた。また、多くの遺伝子(mRNA)の発現変動が認められ、神経細胞への分化に対する影響が推測された。実際に神経細胞の分化マーカーの発現量に低下が認められた。以上より、胎仔期のDE曝露が神経幹細胞のDNAメチル化状態に影響を及ぼし、mRNA発現が変動することで神経細胞への分化に影響を及ぼすことが示唆された。我々はこれまでに、胎仔期にディーゼル排ガス(DE)の曝露を受けたマウスの脳におけるDNAメチル化状態を網羅的に解析し、DE胎仔期曝露によってDNAメチル化パターンの形成が大きく乱されることを明らかとした。本研究では、脳神経系の発達の要である神経幹細胞を対象とし、DEあるいは排ガス中の粒子状成分によりもたらされるDNAメチル化の変化と神経幹細胞の遺伝的・機能的異常との関連を明らかとすることを目的としている。前年度までに、DEを曝露した妊娠マウスから生まれた新生仔(1日齢)の脳から神経幹細胞を得た。得られた神経幹細胞からゲノムDNAおよびmRNA・microRNAを含むtotal RNAを抽出・精製した。得られたゲノムDNAからメチル化DNA免疫沈降法を用いてメチル化DNAを特異的に回収し、得られたメチル化DNAについてマイクロアレイ(タイリングアレイ)を用いてDNAメチル化状態の網羅的解析を行った。その結果、雄性産仔・雌性産仔ともにゲノム全体にわたってメチル化状態が変動する領域が認められた。続いて、mRNAレベルでの発現変動についてマイクロアレイを用いて解析を行ったところ、多くの遺伝子が発現変動することが示された。発現変動が認められた遺伝子についてGene Ontologyを用いて機能グループ解析を行ったところ、神経方向への分化に関与する遺伝子に発現変動が多いことが示唆された。実際に、定量的RT-PCRを用いて神経細胞の分化マーカーの発現量を調べたところ、発現量の低下が認められた。以上より、胎仔期のDE曝露が仔の神経幹細胞から神経細胞への分化に影響を及ぼすと推測された。また、発現変動した遺伝子の一部では、DNAメチル化の変化も認められていることから、mRNA発現変動にDNAメチル化が関与している可能性が考えられた。我々はこれまでに、胎仔期にディーゼル排ガス(DE)の曝露を受けたマウスのDNAメチル化状態を網羅的に解析し、DE胎仔期曝露によってDNAメチル化パターンの形成が大きく乱されることを明らかとした。本研究では、脳神経系の発達の要である神経幹細胞を対象とし、DEあるいは排ガス中のナノサイズの粒子によりもたらされるDNAメチル化の変化と神経幹細胞の遺伝的・機能的異常との関連を明らかとすることを目的としている。妊娠マウスにDEを曝露した後、新生仔(1日齢)から脳を採取し、神経幹細胞培養用の培地を用いて培養を行った。神経幹細胞マーカーに対する免疫染色を行い、得られた細胞中に占める神経幹細胞の割合を調べたところ、90%以上の細胞に神経幹細胞マーカーの発現が認められた。また、得られた神経幹細胞に対し、血清を用いて分化誘導したところ、神経細胞、グリア細胞等のマーカーの発現量が上昇し、多分化能を有していることが確認できた。以上から、解析に十分な純度の神経幹細胞が得られたと考えられる。得られた神経幹細胞からゲノムDNAおよびmRNA、microRNAを含むtotal RNAを抽出・精製した。ゲノムDNAを用いてY染色体上のSRY遺伝子に対するPCRを行うことで、得られた神経幹細胞の雌雄を判定した。仔に生じる影響を雌雄間で比較するため、性別ごとにサンプルをプールし、解析に供することとした。ゲノムDNAから、メチル化DNA免疫沈降法を用いてメチル化DNAを特異的に回収し、得られたメチル化DNAの増幅およびマイクロアレイを用いたDNAメチル化状態の網羅的解析を進めているところである。また、得られたtotal RNAについては、マイクロアレイを用いてmRNA発現およびmicroRNA発現の解析を行う予定である。本研究では、脳神経系の発達の要である神経幹細胞を対象とし、妊娠期のディーゼル排ガス(DE)により産仔の脳に生じるDNAメチル化の変化と神経幹細胞の遺伝的・機能的異常との関連について検討を行った。DEを曝露した妊娠マウスから生まれた新生仔から神経幹細胞を得た。得られた神経幹細胞のゲノムDNAについてメチル化DNA免疫沈降法およびタイリングアレイを用いてDNAメチル化状態の網羅的解析を行った結果、ゲノム全体にわたるメチル化状態の変動する領域が認められた。