hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イヌｉＰＳ細胞を用いた血小板減少症の治療に向けた応用的基盤技術の開発

今後、得られた細胞を詳細に解析し、研究発表する予定である。今年度は、得られたイヌiPS細胞の血小板への効率的な分化誘導に当たり、その性状を調べた結果、本細胞は無血清・無フィーダー細胞培地で長期継代培養可能なことに加え、新規のイヌiPS細胞であることを見出した。また、本細胞を血小板へ分化誘導することはできなかったが、低分子阻害剤を用いることで、イヌで初めて、多分化能を持つ胚体外内胚葉細胞(XEN細胞)様細胞の作製に成功したことから、今後この細胞を血小板へ分化誘導することによって、研究計画船体がが飛躍的に進む可能性が示唆された。今年度は、昨年度に作製したイヌ人工誘導胚体外内胚葉細胞様株(iXEN細胞様株)を用い血小板への分化誘導を行うに当たり、その性状をさらに解析した結果、本細胞は骨髄ストロマ細胞であるOP9細胞と共培養することで、肝細胞特異的なマーカーであるアルブミンとCYP3A4遺伝子を発現する肝細胞や、毛細胆管膜マーカーであるMRP2タンパクを発現する胆管上皮細胞に分化することを見出した。これまで、他種動物においてもXEN細胞の肝細胞への分化能については報告がなく、本知見はXEN細胞の新たな可能性を提示するものである。また、本細胞株を間葉系幹細胞(MSC)培地にて分化誘導したところ、脊髄損傷や自己免疫疾患の治療に応用されるMSCと同様の表面抗原を発現するイヌMSC様細胞が得られた。次に、イヌiXEN細胞の臨床応用に向けて、遺伝子組換えの無いイヌiXEN細胞を目指し、細胞質内で遺伝子を複製することができるセンダイウイルスベクター(SeVdp)を用いてイヌiXEN細胞の作製を試みたところ、イヌiXEN細胞様細胞が得られ、本細胞はSeVdpの発現が消失していた。また、本細胞はXEN細胞マーカーを発現し、肝細胞および胆管上皮細胞への分化能を有していたことから、遺伝子組換えの無いイヌiXEN細胞様細胞の作製に成功した。以上のことから、今年度は、イヌiXEN細胞様株が成熟肝細胞および胆管上皮細胞への分化能を有していることを明らかにし、さらに臨床応用に適した遺伝子組換えの無いイヌiXEN細胞様細胞を樹立した。本研究により得られた成果は、これまで培養維持可能な幹細胞が存在しないことにより停滞していた獣医再生医療を飛躍的に進めると考えられ、今後、血小板を含めた他胚葉への分化や、本細胞を用いたヒト疾患モデルの作製など発展が期待される。今年度は、研究全体の進展にかかわる重要な実験である、高品質なイヌiPS細胞の作製を試みた。ここでいう高品質なiPS細胞とは、具体的には、単一細胞で継代でき、安定的に長期培養可能な性質を持ったiPS細胞である。その結果、単一細胞で継代でき、長期継代可能なイヌiPS細胞の作製に成功したことから、今年度の研究目的は達成されたと考えられ、研究はおおむね順調に進展している。本研究課題の次年度以降の推進対策として、引き続き高い多分化能を持つイヌiPS細胞の作製を行うとともに、得られたイヌXEN様細胞を用いて、血小板への分化誘導を行う。また、血小板への分化過程におけるC-MYC遺伝子の発現量を測定することで、C-MYC遺伝子の分化効率に及ぼす影響を解明する。次に、導入遺伝子の発現強度を操作できる薬物誘導性C-MYCベクターをイヌXENおよびiPS細胞に導入し、導入C-MYC遺伝子の発現量を上昇させることで、効率的な血小板への分化誘導を行う。この方法で効率的に血小板を得られない場合は、血小板の凝集機能を活性化するメタロプロテアーゼ阻害剤を培地に添加し、機能的な血小板の作製効率の改善を行う予定である。
原子層制御エピタクシによるダイヤモンドヘテロ薄膜とそのデバイスの研究

ダイヤモンドヘテロエピタクシでは、基板(Si)とダイヤモンド薄膜の界面を良好な状態に保つ必要がある。この良好な界面状態を形成するために、水素終端したSi基板の真空アニール(800°C)を試みた。基板表面に付着したカーボン種と基板Siが反応して、SiCが形成さる(RHEED,LEEDにより確認)。このSiCは安定かつダイヤモンド成長の下地面として、有効に作用した。ダイヤモンド成長は、このSiC/Si基板に対し、負バイアス処理を施し、核形成密度の増加させ、その後、CO/H_2系により、実際にダイヤモンド成長を行った。以上の簡便なプロセスにより、ダイヤモンドはSiに対し、大きな格子不整合を持つにもかかわらず、良好な面内配向を有した結晶成長を示した。このことは、ダイヤモンドのヘテロエピタクシに関しての課題である、Si上に直接成長するのか、あるいはSiCを介して成長するのか、という疑問に対して、SiC層を介して成長することを示す有力な証拠である。また、これらの処理は、装置の都合により現在は大気曝露の工程を経るが、装置の改良で、容易にinsitu処理が可能であり、今後は、装置の改良を行う。一方、ダイヤモンドMOSFETの試作において、酵素freeのプロセスを実現できる材料としてCaFを絶縁膜に用いた。その結果、素子の構造がドレイン-ソース間距離が30μmと長いにもかかわらず、デプリーションモードでの動作において、相互コンダクタンスが25μS/mmを得た。この値はMOSFETとしては、大きな値である。その動作特性において、浅い準位が界面近傍に形成されている可能性が見出された。この準位について、ドレイン-ソース間の電流の温度依存性から検討を加えている。さらに、p-i-p構造を用いることでカソードルミネセンスを電界変調が実現できそうな予備実験結果を得た。この結果についてはさらに詳細な実験を行う必要がある。
接合金物を用いた木造軸組工法の耐震性向上に関する実験的研究

本年度は、昨年に引き続き改良型接合金具を用いた接合部の性能実験を行うと共に、昨年度実施した実験結果を踏まえて更なる改良を加えた柱-梁接合部のモーメント抵抗試験を実施した。さらにはそれらの改良型接合金具を用いて作製された門型架構について水平加力試験を実施した。以下にそれらの実験の結果を概説する。1.改良型接合金具の性能評価改良型接合金具を用いて作製された柱-梁接合部のせん断試験及び柱脚接合部の引抜き試験を実施した。いずれの接合部についても、一般的な在来工法の接合部をはるかに上回る耐力が得られた。柱-梁接合部のせん断試験では、梁を受ける金具あごの部分への梁のめり込みにより破壊が緩やかに進行したが、最終的に金具の変形はわずかであった。柱脚接合部の引抜き試験では、土台を介した金具の接合方法と、基礎に直結する接合方法を試験したが、基礎に直結した方が、土台を介した場合よりおよそ1.5倍高い耐力が得られた。また、基礎に直結した場合は、柱の木材の損傷はほとんど無く、金具の変形により高い靭性が得られることが明らかになった。2.改良型柱-梁接合部のモーメント抵抗性試験昨年度の実験結果で問題となった金具にかかる部分の梁の割裂を抑制するために、梁の端部をアラミド繊維シートにより補強した。この接合部について再度モーメント抵抗試験を実施した結果、耐力は1.3倍程度上昇し、回転角が1/10radに達するまでに割列が生じたものは、3体中1体のみであった。3.改良型接合金具を用いた門型架構の水平加力試験改良型接合金具により柱-梁接合部、柱脚接合部を構成した実大門型架構を作製し、水平加力実験によりそのフレームの基本的性能を把握することとした。試験体は、住宅の間口1間の架構を想定し高さ2,605mm、幅1,820mm(部材の芯々距離)の1層1スパンの門型架構を作製した。実験の結果、比較的高い初期剛性が得られ、塑生域に入ってからも緩やかな耐力上昇を示し、破壊までの靭性に優れた変形性能が得られた。木造住宅の構造設計で適用されている壁倍率による評価を行った結果、本架構の壁倍率はおよそ0.4倍程度であった。したがって、耐力壁なしで構造を成立することは困難であるものの、軸組架構自体にもある程度の耐震性を期待できることが明らかになった。本年度は、在来工法接合金物を用いた水平加力試験を行い、接合部のモーメント抵抗性能等の力学的特性についての予備実験を試みた。予備実験では、従来の木造軸組工法に基づいた仕口加工と呼ばれる大入れ、ほぞ穴などで柱と胴差し桁などを接合し、帯金物・羽子板ボルトで固定した柱-梁部材の試験体1組と、実際に建築現場で使用されている市販の接合金物を用いた柱-梁部試験体2組の合計3組の試験体をそれぞれ使用する釘の長さ(50mm・90mm)を変えて行った。実験方法としては梁の自由端を油圧ジャッキにより加力し、加力サイクルは正負繰り返しの水平交番載荷とした。この予備実験の詳しい解析は現在作業をすすめている途中であるが、実験から得られた荷重-変形曲線より、市販のボックス型接合金物では、各試験体において釘の長さによる影響は少ない結果となった。接合部の破壊に至る観察からは、梁の金具かかり部分の割裂、剥離や、金具あごかかり部分からの柱割裂がみられた。また在来工法型の試験体でも釘の長さによる違いは見られず、最終加力の状態は、ほぞからの抜け出し、梁のめり込みなどが確認できた。この予備実験において市販のボックス型金物では靭性の面で問題があることが明らかになった。平成12年度の実験予定では、接合金物のせん断試験・引抜き試験等も行う予定であったが本研究が追加採択ということで、実験にとりかかったのが10月後半であったため、予定よりも実験が遅れている状態である。今後は、予備実験で得られた接合部の破壊状況を考慮しながら、部分的に接合金物の改良を試みそれらの性能比較を行う予定である。

2.改良型柱-梁接合部のモーメント抵抗性試験昨年度の実験結果で問題となった金具にかかる部分の梁の割裂を抑制するために、梁の端部をアラミド繊維シートにより補強した。この接合部について再度モーメント抵抗試験を実施した結果、耐力は1.3倍程度上昇し、回転角が1/10radに達するまでに割列が生じたものは、3体中1体のみであった。3.改良型接合金具を用いた門型架構の水平加力試験改良型接合金具により柱-梁接合部、柱脚接合部を構成した実大門型架構を作製し、水平加力実験によりそのフレームの基本的性能を把握することとした。試験体は、住宅の間口1間の架構を想定し高さ2,605mm、幅1,820mm(部材の芯々距離)の1層1スパンの門型架構を作製した。実験の結果、比較的高い初期剛性が得られ、塑生域に入ってからも緩やかな耐力上昇を示し、破壊までの靭性に優れた変形性能が得られた。木造住宅の構造設計で適用されている壁倍率による評価を行った結果、本架構の壁倍率はおよそ0.4倍程度であった。したがって、耐力壁なしで構造を成立することは困難であるものの、軸組架構自体にもある程度の耐震性を期待できることが明らかになった。
近藤半導体イッテルビウム十二ホウ化物の強滋場誘起磁気秩序と金属非金属転移

前年度に引き続き、立方晶近藤半導体YbB_12の約200いとう大きさのエネルギーギャップが100T近くまでの強磁場下の等温磁場印加遍程においてどのような応答を示すかを調べ、エネルギーギャップ形成め機構を構った。このため準定常磁場を発生できる物性研のロングパルスマグネット(パルス幅36mxec,最大磁場58T)と希釈冷凍機を用いて、本年度は磁気抵抗測定実験を行った。また、Lu置換合金(Lu1%、5%)の磁化過程を測定し、Lu置換によりYbB_12での50T近膀の転移磁場変化を調べた。(1)磁気抵抗:近藤半導体YbB_12の単結晶の縦磁気抵抗測定を、[100],[110],[111]の3方向について行った。温度は0.1Kから1Kまで0.1K刻みで測定。転移磁場は[100]で47T,[110],[111]で54Tで、1.3Kの値と変わらない。磁場依存性は全体として負の磁場抵抗を示す。金属へ転移後はいずれも電気抵抗はほぼ磁場依存性を示さず、一定に近い。(2)磁気振動:0.1K-1Kまで20T以上は周期的な磁気抵抗振動が顕著に現れた。その磁場間隔は[100]で7T,「110]で8T、[111]では明確な振動は見られず、振幅と磁場間隔に大きな異方性が見つかった。この振動が磁気励起子によるものか今後調べていく。(3)Lu置換合金の磁化:転移後の磁化の伸びは鈍いが、振る舞いは基本的にYbB_12と同じ。また以前から指摘されていたIn-Gap状態の磁化成分が置換とともに増大してくることも見出した。2年間でYbB_12の磁化と磁気抵抗の準等温過程を確定することが出来、1次転移も明確になつた。飽和磁化までの磁化過程は次年度立ち上がる100Tマグネットを用いて、引き続き研究を進め、エネルギーギャップ形成機構を明らかにする。本年度は立方晶近藤半導体YbB_<12>の約200Kという大きさのエネルギーギャップが等温磁場印加過程においてどのような応答を示すが、準定常磁場を発生できる新しく開発された物性研のロングパルスマグネット(パルス幅30msec,最大磁場60T)を用いて磁化測定(70Tマグネットも使用)、磁気抵抗測定実験を行った。50T近傍での1次転移後強磁場誘起相の状態を明らかにすることを目指した。(1)結晶育成:浮遊帯域溶融法にて近藤半導体YbB_<12>の単結晶を育成。磁気異方性を調べるため、[100],[110],[111]の3方向の試料を準備した。(2)磁気抵抗:最大磁場60T。電流方向と磁場の方向が一致する縦磁気抵抗測定で、[100],[110],[111]の3方向について行った。温度は1.3K,4.2K,7K,10K,20K,40K,80K。転移磁場は以前報告した値と変わらず、[100]で47T,[110],[111]で54Tであった。転移後はいずれも電気抵抗はほぼ磁場依存性を示さず、一定に近い振る舞いであった。(3)磁化測定:1.3Kと4.2Kで等温磁化過程を測定した。理論で予想していた転移前の磁気異方性は殆ど示さず、磁気異方性はないといえる。金属非金属転移後の磁化の伸び方は、比較的スムーズで、強磁性や反強磁性というよりは、常磁性のKondo格子状態のものであった。小さなエネルギーギャップがつぶれたときに、常磁性のフェルミ液体的状態に移行したと考えられる。さらにショートパルスも併用して、70Tまでの磁化をかけたときにどこまで磁化が伸びるかも調べ、少なくとも[111]では最大磁化は最大1ボーア磁子を越えた。(4)さらに希土類のホウ化物の磁場応答の参照のため、重希土類の4ホウ化物(希土類R=Tb,Tm,Er)の磁気相図を明らかにした。R=Tbの場合、Yで置換した合金系で磁化がどのように磁場に対し変化するか、磁化プラトーがどうなるかをあわせて調べた。このようなデータの結果を踏まえ、最終年度となる来年度はより強い磁場とLu置換によるエネルギーギャップの変化に対する等温磁場応答を明らかにするため、さらに実験データを積み重ね、強磁場誘起金属非金属転移後のYbB_<12>の基底状態について、さらに検討を進めたい。

また、Lu置換合金(Lu1%、5%)の磁化過程を測定し、Lu置換によりYbB_12での50T近膀の転移磁場変化を調べた。(1)磁気抵抗:近藤半導体YbB_12の単結晶の縦磁気抵抗測定を、[100],[110],[111]の3方向について行った。温度は0.1Kから1Kまで0.1K刻みで測定。転移磁場は[100]で47T,[110],[111]で54Tで、1.3Kの値と変わらない。磁場依存性は全体として負の磁場抵抗を示す。金属へ転移後はいずれも電気抵抗はほぼ磁場依存性を示さず、一定に近い。(2)磁気振動:0.1K-1Kまで20T以上は周期的な磁気抵抗振動が顕著に現れた。その磁場間隔は[100]で7T,「110]で8T、[111]では明確な振動は見られず、振幅と磁場間隔に大きな異方性が見つかった。この振動が磁気励起子によるものか今後調べていく。(3)Lu置換合金の磁化:転移後の磁化の伸びは鈍いが、振る舞いは基本的にYbB_12と同じ。また以前から指摘されていたIn-Gap状態の磁化成分が置換とともに増大してくることも見出した。2年間でYbB_12の磁化と磁気抵抗の準等温過程を確定することが出来、1次転移も明確になつた。飽和磁化までの磁化過程は次年度立ち上がる100Tマグネットを用いて、引き続き研究を進め、エネルギーギャップ形成機構を明らかにする。
歯肉上皮細胞におけるトロンボモジュリンの機能とその意義

トロンボモジュリン(TM)は,これまで内皮細胞の膜表面に存在する糖蛋白で,機能的には,トロンビンと複合体を形成することにより,血液の流れを円滑にするため,抗凝固的に働いている。そのトロンボモジュリンが,血管を全く欠く表皮にもあることが,最近,発見されているが、表皮におけるトロンボモジュリンの機能については,いまだわかっていない。そこで,ヒト上皮細胞と内皮細胞を歯肉,臍帯からそれぞれ分離培養し,トロンボモジュリンの分子量,抗原量,活性能,遺伝子発現量を両細胞で比較検討を行なった。分子量においては,還元下70.5kDと66.5kDで内皮細胞のトロンボモジュリンより小さいバンドが観察された。これは,TM構造の糖鎖部分が少ないためと考えられる。また,歯肉上皮細胞でのTMmRNAの発現が観察され,それは,内皮細胞のそれより強いものであった。確かに内皮細胞由来のTMが歯肉上皮においても発現されていることが判明した。そこで,上皮のTMにおいても,内皮と同じ機能があるのかをprotein C活性化能測定法(鈴木ら)に基づき検討した。上皮においても,TM活性能を有しており,それは内皮に比べ50%以下であった。抗原量においては,上皮の方が内皮に比べ,多かった。本研究の結果より,トロンボモジュリンは,歯肉上皮細胞で,確実に発現がみられ,上皮におけるprotein C活性化能もみられた。このことにより,上皮内でのトロンビンとの関わりがあることが示唆された。したがって,上皮の創傷治癒に関与している可能性もある。今後、さらなるトロンボモジュリンの機能を検討し,歯周疾患にどのように関わっているのかを解明していく予定である。
骨細胞におけるメカニカルストレス応答因子の探索による骨萎縮治療の基盤研究

不動化マウスモデルの骨細胞を用いた網羅的遺伝子解析の結果、坐骨神経切除による後肢不動モデルの骨細胞においてBK(Big Potassium)チャネル遺伝子の発現が変動していることを見出した。RT-PCRの結果から、骨細胞にはKCNMB1, 2, 4のサブユニットが発現していることが明らかとなった。Col1a1-mRFP1; CaK-GFP Tgダブルヘミマウスを作成し、現在、BKチャネルオープナー化合物およびブロッカー化合物を注射投与し、共焦点レーザー顕微鏡を用いてin vivoにおける骨芽細胞および破骨細胞の細胞動態のライブイメージングを実施している。平成23年度のGeneChipによる網羅的遺伝子解析の結果、坐骨神経切除による後肢不動モデルの骨細胞においてBK(Big Potassium)チャネルの構成分子遺伝子の発現が大きく変動していることを見出した。BKチャネルはカルシウム活性化カリウムチャネルサブファミリーの一つで、脱分極とそれに伴う細胞内カルシウムイオン上昇に応答して開口し、膜電位の再分極相や後過分極あるいは静止膜電位の過分極を引き起こす。BKチャネルは4量体構造で、全身の組織に広く分布しているKCNMA1(αサブユニット)と組織分布が特異的でBKチャネルの機能調整をおこなうKCNMB1-4(βサブユニット)で構成されている。BKチャネルは神経・心筋・血管平滑筋・腺組織などに高発現しており、それぞれの組織で重要な機能を担っている。しかし、骨細胞で機能は全くの未知である。骨量維持に重要な女性ホルモンであるエストラジオールがβサブユニットに作用してBKチャネルの開口作用を示すことからもBKチャネルの骨細胞での重要な機能が示唆される。骨細胞のRNAを用いたRT-PCRの結果から、骨細胞にはKCNMB1, 2, 4のサブユニットが発現していることが明らかとなった。Col1a1-mRFP1 TgとカテプシンK遺伝子座にgreenfluorescent protein遺伝子ノックインし破骨細胞を緑色蛍光で標識した遺伝子改変マウス(CaK-GFP KI)は作製が終了し、Col1a1-mRFP1 Tgとのダブルヘミマウスを作成した。現在、BKチャネルオープナー化合物およびブロッカー化合物をこのダブルヘミマウスの頭蓋骨骨膜下に注射投与し、共焦点レーザー顕微鏡を用いてin vivoにおける骨芽細胞および破骨細胞の細胞動態をライブイメージングを実施している。我が国の高齢化社会の到来によって様々な疾患による骨脆弱性を起因とした易骨折性とその後の運動能力の低下は社会的に大きな問題となっている。現在までに数種類の骨粗鬆症薬が開発されているが、骨量の回復は決して十分なものではなく、特に骨皮質の永続的回復に効果が期待できる薬剤はほとんどない。その理由の一つとして、骨細胞ー骨芽細胞ー破骨細胞による局所微小環境におけるメカニカルストレスー骨形成ー骨吸収の分子メカニズムが解明されていないことがあげられる。本研究では、遺伝子改変マウスを用いて、生後、骨皮質に存在する骨細胞がメカニカルストレスに応答し、骨髄腔内の骨芽細胞および破骨細胞にシグナル伝達する分子メカニズムを解明し、骨粗鬆症および廃用性骨萎縮に対する組織再生医工学的および新規創薬の開発につなげることを目的とする。骨特異的I型コラーゲンプロモーターを用いて骨細胞および骨芽細胞にRed fluorescent protein遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを作製した。左坐骨神経を切除し後肢不動モデルを作製し、術後1週および3週で左大腿骨を摘出し、マイクロCTにて廃用性骨萎縮が発症していることを確認した。骨皮質のみの大腿骨は乳鉢で十分に粉砕し、トリプシンおよびコラゲナーゼで骨基質を十分に消化除去し、骨細胞を単離した。骨細胞は赤色蛍光で標識されており、単離された細胞をFACSにて骨細胞のみとする。不動化モデルの骨細胞およびsham手術の骨細胞それぞれよりmRNAを抽出し、Alligent社マウスGeneChipを用いて網羅的遺伝子解析を行い、それぞれの骨細胞における遺伝子発現プロファイルを作製した。現在、術後1週目および3週目において、不動化モデル骨細胞において3倍以上の遺伝子発現上昇または低下を認める分泌タンパク質のリストを作製し、病態に関与していると思われる遺伝子群を検討している。骨軟骨細胞を蛍光標識した遺伝子改変マウスを用いて骨軟骨の分子生物学的解析を遂行するため、近年、骨特異的I型コラーゲンプロモーターを用いて骨細胞および骨芽細胞にRed fluorescent protein遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを作製した(Col1a1-mRFP1 Tg)。この遺伝子改変マウスとFACS sortingを用いて骨細胞を単離することができる。10週齡の雄トランスジェニックマウスの左坐骨神経を切除し後肢不動モデルを作製する。対象はsham手術とする。術後1週および3週で左大腿骨を摘出し、マイクロCTにて廃用性骨萎縮が発症していることを確認した。次に、生理食塩水で骨髄腔を十分に洗浄し、Cワイヤーで骨髄組織を除去、骨皮質のみとする。

骨皮質のみの大腿骨は乳鉢で十分に粉砕し、トリプシンおよびコラゲナーゼで骨基質を十分に消化除去し、骨細胞を単離する。骨細胞は赤色蛍光で標識されており、単離された細胞をFACSにて骨細胞のみとする。不動化モデルの骨細胞およびsham手術の骨細胞それぞれよりmRNAを抽出し、Alligent社マウスGeneChipを用いて網羅的遺伝子解析を行い、それぞれの骨細胞における遺伝子発現プロファイルを作製した。現在、術後1週目および3週目において、不動化モデル骨細胞で3倍以上の遺伝子発現上昇または低下を認める分泌タンパク質のリストを作製し、病態に関与していると思われる遺伝子群を検討している。平成23年度で不動化マウスモデルの骨細胞で発現が低下している分泌タンパク質で、既に組み換えタンパク質が購入できるものに関しては購入し、市販されていないものに関しては大腸菌による発現システムを用いて作製する。6xHisタグを付加した分泌タンパク質遺伝子の発現ベクターを大腸菌に発現させ、IPTG誘導でタンパク質を発現させる。NiアフィニティーカラムでHisタグ付加組み換えタンパク質を精製し、濃度を100ug-1mg/mlに調整しておく。次に、Col1a1-mRFP1 TgとカテプシンK遺伝子座にgreenfluorescent protein遺伝子ノックインし破骨細胞を緑色蛍光で標識した遺伝子改変マウス(CaK-GFP KI;現在作成中)を交配し、ダブルヘミマウスを作成する。このマウスは骨細胞/骨芽細胞が赤色蛍光を、破骨細胞が緑色蛍光で標識されている。このダブルヘミマウスの頭蓋骨骨膜下に組み換えタンパク質を注射投与する。二光子励起顕微鏡を用いてin vivoにおける骨芽細胞および破骨細胞の組み換えタンパク質投与部への細胞動態をライブイメージングし、骨芽細胞の細胞誘導および活性増強を有する分泌タンパク質を同定する。さらに、得られた結果を取りまとめて、成果の発表を行う。平成24年度研究費は、遺伝子改変マウスの飼育管理料、組み換えタンパク質作製などの分子生物学的・生化学的手法のための一般消耗品購入費用に使用する予定である。
視床下部室傍核のα1アドレノセプター賦活による副腎髄質系賦活機構の解析

ストレス応答の重要な脳部位の一つである視床下部室傍核の興奮性アミノ酸NMDA刺激によるプロスタノイド、特にトロンボキサンA2産生が副腎髄質からのカテコールアミン分泌に関与することを薬理学的に解析した。室傍核のNMDA刺激による室傍核のノルアドレナリン遊離および血中カテコールアミン(ノルアドレナリンおよびアドレナリン)増加が、当該部位に局所投与したトロンボキサン受容体遮断薬によって抑制された。以上の成績から、室傍核に投射するノルアドレナリン神経系およびα1アドレノセプターの副腎髄質からのカテコールアミン分泌における重要な役割が示唆された。1.ウレタン麻酔したラット視床下部室傍核にダイアリシスプローブ介して投与した1mMNMDAによる室傍核のノルアドレナリン(NA)遊離増加および血中カテコールアミン(ノルアドレナリンおよびアドレナリン)増加は、(1)0.1mM MK801(NMDA受容体遮断薬)(2)0.25mM heat(α1受容体遮断薬)(3)25μM U-73122(PLC阻害薬)(4)1.4mM RHC-80267(Diacyl glycerol lipase阻害薬)(5)2.5mM S-145(トロンボキサンA2受容体遮断薬)をマイクロダイアリシスプローブを介してNMDAと同時に投与することによっていずれの場合も抑制されたが、(6)25μM U-73343(U-73122の不活性体)によっては抑制されなかった(投稿準備中)。2.そこでさらにα1アドレノセプター刺激薬フェニレフリン(0.3,1mM)あるいはPLCの刺激薬m3M3FBS(0.1mM)を室傍核にダイアリシスプローブ介して直接投与したところ、室傍核のノルアドレナリン(NA)遊離および血中カテコールアミンがいずれも増加したが、0.1mM03M3FBS(m3M3FBSの不活性体)投与は影響しなかった(日本薬理学会、2009年3月)。3.ごく最近Felderらが、麻酔ラットの室傍核にフェニレフリンを微量注入すると、心拍数および腎交感神経活動を増加させると報告した(2008)。従って今回得られた実験成績(1および2)は、高血圧症などストレスに起因する生活習慣病の病態生理解明に新たな視点を提供しうるという点で意義があり、これら疾患に対する新たな治療薬開発のための標的を考案する上で重要性が高いと考えられる。[1](1)ウレタン麻酔したラットの脳室内に投与したNMDAによる血中カテコールアミン増加が、選択的アドレナリンα_1受容体遮断薬(HEAT)、PLC阻害薬(U-46619)、DGリパーゼ阻害薬(RHC-80267)、MGリパーゼ阻害薬(URB602)の脳室内前処置によっていずれも抑制ないし消失した。(2)視床下部室傍核にダイアリシスプローブ介して投与した1mMNMDAによる室傍核のノルアドレナリン(NA)遊離増加および血中カテコールアミン(ノルアドレナリンおよびアドレナリン)増加がトロンボキサンA2受容体遮断薬(s-145)によって消失した。(1)、(2)の内容をまとめて投稿中(minor revision)。[2]α1アドレノセプター刺激薬フェニレフリン(0.3,1mM)あるいはPLC刺激薬m3M3FBS(0.1mM)の室傍核への直接投与は、室傍核ノルアドレナリン(NA)遊離および血中カテコールアミンのいずれも増加させたが、0.1mM o3M3FBS(m3M3FBSの不活性体)投与は影響しなかった(投稿準備中)。[3][1]および[2]から室傍核におけるα_1アドレノセプター賦活に関連した一連のシグナル伝達系が副腎髄質系賦活に重要な役割を果たしていることが示唆された。このシグナルカスケード系の異常または破綻が、副腎髄質系出力の過剰亢進をきたし、その結果ストレス関連疾患の基盤となる生物学的脆弱性が醸成され、最終的に疾患の発症に至るのではないかと推測される。得られた成績は、うつ病・不安障害・自律神経機能障害などストレスに起因する様々な病態の発症機序の解明に新たな視点を提供しうるという点で意義があり、新たな治療薬開発のための標的を考案する上で重要性が高いと考えられる。[1](1)ウレタン麻酔したラットの脳室内もしくは視床下部室傍核(PVN)に局所投与したNMDAによる血中ノルアドレナリン、およびアドレナリン増加の薬理学的解析から、PVNに存在するα1アドレノセプター受容体下流のPLC-DG(ジアシルグリセロー)lipase-MG(モノアイルグリセロール)

lipase経路から生じるトロンボキサンA2が、PVNに投射するノルアドレナリン神経系終末に作用して、ノルアドレナリン遊離を亢進し、その結果、副腎髄質からの血中カテコールアミン遊離が促進されることを証明した(Eur.J.Pharmacol.,640,55-62,2010).(2)さらに拘束ストレス負荷ラットの形態学的解析から、脊髄中間外側核(IML)に注入した逆行性色素(Fluoro Gold)で標識されるPVNニューロンにおいて、(a)拘束ストレスがCOX1、COX2、iNOSの発現を増加させること、(b)COX1、COX2、iNOS阻害薬の腹腔内投与が拘束ストレスによるFos発現を減弱させることを証明した(Neuroscience,170,773-781,2010)。[2]拘束ストレス負荷したラットの血中カテコールアミン増加が、(a)PPAR gamma agonist (rosiglitazone,PGJ2)の腹腔内投与により抑制され、逆に、PPAR gamma antagonist(GW9662)の腹腔内投与によってさらに増強されること、(b)拘束ストレスが経時的にPPAR gammaの核内移行を引き起こすことを報告した(Neuro 2010,神戸)。麻酔ラットおよび覚醒ラットの実験から得られた成績は、うつ病・不安障害・自律神経機能障害などストレスに起因する様々な病態の発症機序の解明に新たな視点を提供しうるという点で意義があり、新たな治療薬開発のための標的を考案する上で重要性が高いと考えられる。
焦点調節画像を用いた新規大腸腫瘍診断の解析と治療への応用

増加する大腸癌の診療において、大腸内視鏡は必要不可欠である。適切な診断と最適な治療方法を決定するために、狭帯域光観察(NBI)やpit pattern診断を高い正診率で行うことが重要であるが、主観に頼らざるを得ない内視鏡診断においては、診断能にバラツキが生じてしまう。本研究では、内視鏡画面全体に焦点の最適化を行った焦点調節画像を作成し、その特殊画像を用いることにより大腸腫瘍の診断能の向上を図る。また焦点調節画像を統合することにより、腫瘍の2Dマッピングや3D画像構築を行い内視鏡治療に活用することで治療成績の向上を図る。
毒素原性大腸菌耐熱性下剤毒素の受容体の構造と機能

STh受容体の精製とSTh受容体遺伝子のexpression cloningを行った。(1)STh受容体の精製:300匹のラットの小腸上皮細胞から刷子縁細胞膜を調製し、0.1%LubrolPXでSTh受容体を可溶化した。この粗STh受容体を濃縮後、Sephacryl Sー300 HRカラムクロマトを行った結果、分子量200kDaを示す画分にフォトアフィニテイラベリングでSThと結合する3種類の蛋白を検出した。還元状態でのSDSーpolyacrylamide電気泳動(SDSーPAGE)では、これら3種の蛋白の分子量は53kDa、70kDa、77kDaであった。かかるST受容体の分子量の相違は、STh受容体がいくつかのサブユニットから構成されていることを示唆していた。そこで、SDSーPAGEの泳動条件を変えてST受容体のサブユニット構造を証明した。すなわち、STh受容体をSDS存在下で加熱処理もしくは還元剤処理した後に、受容体蛋白の電気泳動位置の変化を解析し、70kDaの蛋白2分子からなるSTRー200Aおよび53kDaと77kDaの蛋白それぞれ1分子からなるSTRー200Bの分子形態を明らかにした。次に、Sephacryl Sー300カラムクロマトで得たSTh受容体画分をCon A Sepharoseカラムクロマト、さらにSTをリガンドとするアフィニティコロマトグラフィによって70kDa,77kDa,53kDaの蛋白をそれぞれ精製することに成功した。現在これらの蛋白の一次構造を解析中である。(2)ラット腸管上皮細胞よりpoly(A)mRNAを調製した。これをもとにcDNAを合成してpCDM8ベクタ-にインサ-トし、Cos7細胞でのST受容体のexpresioncloningを進めている。昨年11月、GarbersらによってST受容体遺伝子のクロ-ニングの報告がなされた。この報告ではST受容体は121kDaの単一ポリペプチドである。しかし、我々の成績では、ST受容体は2量体の分子構造であり、ふたつの成績にはST受容体の分子構造に大きな相違がある。我々のNorthern Analysisの結果は、複数の受容体の存在を示唆したmRNAを検出した。
乳児期のコミュニケーションおよび異感性間協応の発達としての顔の動きの模倣の研究

池上(1988)は1か月児と4か月児の4種の顔刺激(正顔、目顔、乱顔、輪郭顔)に対する模倣反応と共に注視反応をも測度として、視覚-触運動感性間協応が早期は一体的な非感覚様相的知覚から、発達と共に独立した感性間の統合へと結ばれていくことを示した。同時に、1か月児を対象に、舌出しという動きを持つ顔刺激と、舌が最長の状態で止まったままの静止顔刺激に対する反応を比較した結果、動作条件においては「人の顔」に対する模倣、微笑、目と目の絆などの反応が現れやすかったが、静止条件では「明暗の複雑性」に対する視覚的探索活動がなされることが示唆された。それでは模倣は、神経系の成熟によるのかまたは生後の経験によるのか。従来、早産児は満期産児より視覚的再認課題では、熟知化過程で注視と注視の間によく休むので、長い学習時間を要し、また新奇性を弁別しにくい。通様相転移課題では転移を示しにくく、新奇対象に対する視覚的探索と手操作の発達が遅く、探索のストラテジーが未熟である。他方山下によれば、幾何図形記憶課題で、早産児は生活令では満期産児に劣るが、修正令に換算して比較すると遂行が近似した。また高橋によれば自発的微笑は早産児では満期産児よりはるかにおおい頻度で現われるが、受胎後40週には両者とも同じ頻度になった。池上(1985)は満期産健常児と退院後の早産児を、生活週令または修正週令を同等にして模倣の生起を比較した結果、両ケースにおいて満期産児が初期から「人らしい」顔図版を選好して模倣するのに対して、早産児は「明暗の複雑性」を表す乱顔に対しても模倣を生じやすく、パターンが異なった。今年度は未熟児センターを退院間近い早産児を対象に静止または舌出しの動きの有る4種の顔図版に対する予備調査を行なった。その結果まず、過去の研究で取り扱った満期産健常児、早産児のO.B.と比較して非常にデータが得られにくかった。被験児の状態は変わりやすく、目覚めから泣き、眠りに移行しやすかった。目覚めているときは刺激への定位が見られた。全体として模倣的な舌出しは少なく、反応パターンも異なり、舌出しは乱顔と輪郭顔に現われた(図1)。図版に対する反応は得られにくいものの、実験者自らが被験児を抱き対面して実物の顔で舌出しを行なった場合は、模倣反応の舌出しが得られた。注視行動については乱顔と目顔、正顔が同等に注目される傾向があり、特に動作条件で著しかった。動作条件の方が静止条件より注視をひきつけた。目がよく注視され、動作条件では舌が注視された(図2)。来年度さらなるデータの集積と分析が待たれる。
椎体骨骨梁の三次元構造の解析による骨粗鬆症診断法

CT及びMRI臨床三次元画像のフラクタル次元測定法のプログラムの精度を検討する目的で、三次元フラクタル集合(カントール集合及びブラウン運動集合)のコンピューター構成画像のフラクタル次元測定値とlacunarityとの相関を調べた。3D空間を整数値のX,Y,Z座標の格子点からなるf(X,Y,Z)=1 or 0のデジタル空間として扱い、3D画像は値1の格子点で形成する。lacunarity,Λは三次元構造の粗密性を表示するパラメータであり、Λ=(n_dila)/(n^*27)により定義した。nは原画像での値1の格子点の数であり、n_dilaは3x3x3の要素により原画像に膨張画像処理を施した、膨張画像の値1の格子点の数である。次の結果を得た。Λ値はフラクタル次元の理論値が大きくなると小さくなる。すなはち1<Λ<1/27。同じフラクタル次元の理論値を持つ画像間ではΛ値が大きいときフラクタル次元の測定値は小さくなり、理論値から10%以上の偏差を示す例がある。ブラウン運動集合の画像では理論値の次元が2.7を越えると共にΛ値の減少の度合いが鈍り、フラクタル次元の測定値は理論値から離れる。この結果から、フラクタル次元の測定の精度には限界があることが確認された。したがって、椎体骨骨梁の三次元構造の数値解析において、一般的に述べられているフラクタル次元単独による骨症症の診断法においては、限界があり、画像のフラクタル性を表現するにはフラクタル次元と共にΛ値を併記することが必要であることが結論できる。次の結果を得た。本研究の目的は三次元CT撮影法及び三次元MRI撮影法に基ずく椎体骨画像から、骨梁構造を解析するシステムを整備することである。本年度の研究成果は、下記の三点である。1.CGソフトウエア導入による三次元CT及びMRI画像の可視化システムの構築可視化システムは対照とする三次元構造体についてのイメージを構成し、数値解析の結果を予測する上で必須である。2.理論値のフラクタル次元をもつ三次元像の作成本研究は三次元構造体の解析法の一つとしてフラクタル次元の測定を採用する。同測定法の計算時間及び精度を検討する目的で、理論値のフラクタル次元をもつ基準構造体を作成した。フラクタル次元2.0000のSierpinski Sponge、2.7269のMenger Sponge,及び2.22.8の3D Random FractalSpongeである。これらの構造体を1.の可視化システムにより確認した。3.三次元構造体のフラクタル次元測定プログラム医療画像のメモリ量が大きいことから、三次元構造体としてのデータ量全てをコンピューターのメモリ上で処理すると、一症例について数時間の計算時間を要する。各スライスの二次元画像ファイルをハードデイスクのメモリに格納し、最大20枚の画像ファイルをハードデイスクからコンピューターのメモリ上に転送することにより計算処理を行なうプログラムを作成した。計算時間は、3分程度にまで削減できた。本プログラムを2.の基準構造体に適用し、測定精度を検討した。Sierpinski Spongeで1.9903、Menger Spongeで2.7439を得た。いづれも理論値から1%以内の偏りであり、満足すべき精度である。しかし、3D Random Fractal Spongeでは、理論値2.60の場合、最も偏りの大きい2.75の値を得た。この結果は、3D Random Fractal Sponge作成のプログラムが不十分であることに起因すると考えられる。1)三次元画像データのフラクタル次元解析法により計算したフラクタル次元測定値の意義を調べた。

すなわちフラクタル次元の理論値が与えられたフラクタル画像について本解析法により求めた次元値の理論値からの偏位は、フラクタル画像のテクスチャーを表示するLacunarity、Lに依存することを確認した。本研究では、L=n_dila/n^*27と定義した。ここで、nは原画像のボクセル数、n_dilaは原画像の三次元膨脹画像処理(dilatioa)により得られる膨脹画像のボクセル数である。三次元膨脹画像処理の構造要素は3x3x3の立方体を採用したので孤立した単一のボクセルはボクセル数27の立方体に膨脹する。フラクタル画像は1/r=3とする三次元カントール集合(N=220、フラクタル次元Dim=logN/logr)により構成した。LはNと共に単調に減少する。同一のNについて比較するときLの大きいカントール集合ではフラクタル次元の測定値は理論値よりも小さい。逆にLの小さいカントール集合ではフラクタル次元の測定値は理論値よりも大きい。この相関はfractional Brownian motion(フラクタル次元の理論値が与えられている)の画像についても成立する。本研究は標準画像(フラクタル次元の理論値が既知)によりフラクタル次元解析法を検討するとき、測定値の理論値との一致の程度と共に、その偏位の様相をも調べることを指示する。さらに臨床画像のフラクタル性を表示する上、でフラクタル次元と共にLacunarity,Lの二つの値を併せて記述することが必要であることを結論する。2)臨床CTスライス画像を本研究のフラクタル次元解析システムのファイルフォーマットに変換し、正常成人女子の椎体骨骨梁の骨密度に対応するCT値で二値化し三次元骨梁構造体像を構成した。三次元骨梁構造体像を可視化した。同構造体内に関心部位を設定しフラクタル次元を測定するプログラム群を作成した。昨年度に、臨床CTスライス画像を本研究のフラクタル次元解析システムのファイルフォーマットに変換し、椎体骨骨梁の骨密度に対応するCT値で二値化した三次元骨梁構造体像を構成するプログラム及び同構造体内に関心部位を設定しフラクタル次元を測定するプログラム群を作成した。本年度は、これらプログラム群の有効性を検討した。KY座標をスライス面とするピクセル間隔の実寸を100μm、スライス厚すなわちZ座標間隔の実寸を1mmとする原画像ファイルからZ座標間隔の実寸を100μmとする内挿画像ファイル(100×100×100μmボクセル画像)を作成した。この内挿3D椎体骨骨梁構造ファイルのテクスチャーのフラクタル次元を求めたところ、測定値は予測値よりも大きい結果を得た。さらに、内挿スライス面での2D画像のテクスチャーを画像表示し、視覚的に調べた。これらの内挿スライス面には、同スライス面を計算した基になった原画像ファイルの二スライス面のいずれのテクスチャーよりも微細な構造が現出するアーチファクトが認められた。本施設現有のCT撮影装置では100×100×100μmボクセルサイズでの3D構造体のフラクタル次元の測定は不可能と判明した。原画像3Dファイルのスライス面に直交するZ軸方向でのテクスチャーを調べることは不可能であることから、2D画像のテクスチャーのフラクタル次元の測定値を平均した値を以て臨床3D構造体のテクスチャーを表示することにした。
自由行動下マウスを用いた海馬神経新生現象への統合的アプローチ

当該年度の研究では、難治性うつ病の治療薬として近年注目を集めているケタミンによる成体海馬神経新生の制御機序について、免疫組織学的実験、行動薬理学的実験、生化学的実験を組み合わせる集学的な検討を行った。オプティカルダイセクター解析では、マウス海馬歯状回の神経前駆細胞と新生ニューロンの分布密度がケタミンの一回投与によって有意に増加することが明らかになった。また、ケタミンの新生ニューロン産生促進作用には、海馬の長軸に沿った差異が存在し、認知や学習に関わる背側海馬に比較して、気分や情動に関わる腹側海馬の方が強い傾向が認められた。新生ニューロンの樹状突起の三次元再構築では、ケタミンの新生ニューロンの成熟促進作用は腹側海馬のみで認められた。T迷路試験では、ケタミンによる認知機能の改善は認められなかったが、強制水泳試験では、ケタミンによって抑うつ関連行動の減少が認められた。ウエスタンブロットでは、コントロールマウスにおけるNMDA型グルタミン酸受容体GluN2Bサブユニットの発現が背側海馬に比較して腹側海馬の方が高いのに対して、GluN1サブユニットの発現には背側海馬と腹側海馬で差異は認められなかった。ケタミンの抗うつ作用に関連している可能性が指摘されている脳由来神経栄養因子(BDNF)、AMPA型グルタミン酸受容体GluA1サブユニット、リン酸化哺乳類ラパマイシン標的タンパク質(p-mTOR)の発現レベルは、コントロールマウスでは差異は認められなかった。しかしながら、ケタミンによるBDNF、GluA1、p-mTORの発現上昇は、背側海馬に比較して腹側海馬の方が有意に高かった。一連の結果は、ケタミンの抗うつ作用の薬理学的基盤は腹側海馬における神経新生の促進作用にあり、NMDA型グルタミン酸受容体GluN2Bサブユニットを介するものである可能性を示唆している。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。当該年度の研究では、海馬の神経新生現象の制御機序の解析を進めた。先行研究によって、新生ニューロンの産生や成熟は、炎症性サイトカインやホルモンの影響を受けており、加齢に伴って減少することが報告されているが、その制御機序については不明な点も多い。このため我々は、初老期メスマウス(10カ月齢)に大豆イソフラボンの一種であるダイゼイン(30mg/kg)を28日間連続で腹腔内投与し、海馬の新生神経新生現象の作用について、免疫組織化学的な検討を行った。実験には7種類の神経新生現象関連分子マーカーを使用し、認知や記憶を担う背側海馬と、情動を担う腹側海馬の比較・検討を行った。ステレオロジー定量解析の結果、神経幹細胞や前期一過性増幅前駆細胞の空間分布密度は、ダイゼイン投与によって変化しないことが明らかになった。一方で、後期一過性増幅前駆細胞や神経前駆細胞、幼若顆粒細胞の空間分布密度はダイゼイン投与によって有意に増加した。また、分裂細胞の空間分布密度がダイゼイン投与によって増加したのに対して、アポトーシス細胞に変化は認められなかった。これらから、ダイゼインは初老期メスマウスの海馬において、神経新生現象の後期の細胞の分裂を促進し、密度を増加させる可能性が示唆された。次に我々は、ダイゼインのシナプス形成に対する作用について、形態学的な検討を行った。新生顆粒細胞の樹状突起を三次元トレーシングした結果、分枝の数や樹状突起の全長の進展が認められた。また、背側海馬と腹側海馬に対するダイゼインの作用を比較した結果、新生顆粒細胞の密度増加効果、樹状突起の分岐の数、二次・三次突起の長さの増加効果などはいずれも背側海馬の方が大きいこと明らかになった。これらの結果は、ダイゼインが初老期メスマウスの海馬神経新生現象を時期・部位特異的に増強する作用を示すものである。海馬神経新生の新たな制御機序についての研究が進展しており、おおむね順調に進行している。結果の一部については、平成28年度日本農芸化学学会の大会シンポジウムで発表し、現在国際誌に投稿備中である。また、自由行動下マウス海馬からの記録についても実験を進めており、ウィルストレーサーによる予備的なデータの取得に成功している。先行研究によって、成体海馬における新生顆粒細胞の産生や成熟は、炎症性サイトカインやホルモンの影響を受けており、加齢に伴って減少することが報告されているが、その制御機序については不明な点も多い。このため当該年度の研究では、腸内細菌叢の加齢変化に着目し、海馬の神経新生現象に与える影響について検討を進めた。若年マウス(2ヵ月齢)と初老期マウス(12ヵ月齢)にそれぞれ、ラクトバチルス・アシドフィルスを28日間投与し、海馬の新生神経新生現象の変化について、免疫組織化学的な検討を行った。ステレオロジー定量解析の結果、ラクトバチルス・アシドフィルスの投与によって、成体海馬神経新生現象は初老期マウスで変化する一方で、若年マウスでは有意な変化は認められないことを見出した。

具体的には、ラクトバチルス・アシドフィルスを投与された初老期マウスでは、分裂期の細胞や後期一過性増幅前駆細胞、神経前駆細胞、幼若顆粒細胞の空間分布密度が有意に増加していた。また、新生顆粒細胞の樹状突起を三次元トレーシングした結果、分枝の数が増加し、全長が伸展していることが示された。これらから、ラクトバチルス・アシドフィルスによる腸内細菌叢の改変は、初老期マウスの海馬において、神経新生現象の後期のプロセスを促進する可能性が示唆された。全般的に、促進効果は背側海馬の方が腹側海馬よりも強い傾向も認められた。予備的ではあるが、細菌の中間代謝産物である短鎖脂肪酸を28日間投与した初老期マウスでも同様の結果を得た。これらの結果は、ラクトバチルス・アシドフィルスによる腸内細菌叢の改変が、中間代謝産物を介して初老期マウスの海馬神経新生現象を時期・領域特異的に増強する可能性を示唆している。成体海馬神経新生の新たな制御機序についての研究が進展しており、おおむね順調に進行している。研究の一部の成果については、2016年度にNeuropharmacology誌に発表した。現在は、ラクトバチルス・アシドフィルスによる腸内細菌叢の変化に関する糞便解析や、腸内細菌叢と成体海馬神経新生をリンクする分子の検討を進めている。また、自由行動下マウスを用いた実験や、ウィルストレーサーによる標識についても予備的な検討が進んでいる。当該年度の研究では、海馬歯状回に発現している細胞外マトリックスの一種であるコンドロイチン硫酸に着目し、組織化学的・行動学的な解析を行った。実験には、chondroitinase ABC (chABC)によるコンドロイチン硫酸の分解、コンドロイチン硫酸のHPLCによる定量、行動実験、コンドロイチン硫酸合成酵素の一部を欠損させたT1KOマウスなどを組み合わせて、集学的な検討を行った。海馬歯状回にchABCを局所注入すると、レクチン染色によるコンドロイチン硫酸の染色性が消失し、神経前駆細胞の数や新生顆粒細胞、分裂期の細胞の数が減少する一方で、神経幹細胞の数やアストロサイトの数に変化はなかった。新生顆粒細胞の三次元再構築を行った結果、樹状突起の伸長や、分岐がchABC処理によって減少していることが示された。Western blottingでは、chABCの局所注入を行った海馬歯状回ではWnt-3の発現量に変化はないが、β-cateninの発現が減少していた。新規物体認知試験では、chABC処理によって記憶保持が低下することが示された。HPLCによる解析では、豊かな環境(enriched environment, EE)で飼育されたマウスにおいて海馬歯状回のコンドロイチン硫酸(CS-4)の発現量が増加し、拘束ストレスを与えたマウスではCS-4の発現量が減少していることが明らかになった。コンドロイチン硫酸合成酵素の一部を欠損したマウス(T1KOマウス)では、海馬歯状回におけるコンドロイチン硫酸の染色性が低下し、EEによる神経新生の促進効果が抑制されていた。これらの結果は、海馬歯状回の細胞外マトリックスを構成しているコンドロイチン硫酸は成体海馬神経新生の制御因子であり、EEやストレスによる成体海馬神経新生の促進や抑制に関わっていることを示唆している。研究の一部の成果については、既に論文に投稿し、掲載に向けて改定中である。また、自由行動下マウスを用いた実験や、ウィルストレーサーによる標識についても検討が進んでいる。