hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
嫌気環境に生育する真核微生物の多様性の解明

真核微生物の中には、嫌気・微好気環境への適応の結果、酸素呼吸能をもつ典型的なミトコンドリアを2次的に失い、縮退型のミトコンドリア(Mitochondrion Related Organelles, MROs)を保持するに至った生物が存在し、それらは真核生物の系統樹上に散在している。しかし、その多様性の実態については未解明な点が多い。本研究では、国内外の嫌気・微好気水圏環境のサンプルから嫌気的培養によって単離したさまざまな培養株に関して、その微細構造や系統的位置の解析を行うとともに、トランスクリプトームデータに基づくMRO機能の推定などを行い、そのような生物の多様性の一端を明らかにした。真核生物の中には、嫌気適応や寄生適応によって典型的なミトコンドリア(mt)を二次的に失った生物群が存在し、系統樹上に散在している。これらの生物は機能が縮退したmtと考えられるミトコンドリア関連オルガネラ(MRO)をもっている。典型的mtからMROへの縮退的進化の変遷を辿ることは、真核系統に普遍的に存在するmtの真の機能を明らかにする上で重要であるが、それらの機能の詳細や普遍性・多様性に関する知見は極めて乏しい。本研究ではこれまで我々のグループが進めてきた、典型的なmtをもたない鞭毛虫からなるフォルニカータ生物群の進化と多様性、mt関連オルガネラの研究成果を基盤に、研究対象を真核生物全体に拡張した研究を行なうこととした。H27年度はこれまで調査対象地としてきて実績のあるパラオ共和国の海水湖の嫌気環境調査を行い、多数の嫌気性真核生物候補を株化した。これらからDNAを抽出し、SSUrRNA遺伝子を単離して配列を決定し、分子系統解析を行った。大多数については系統的位置が既知の生物の近縁種として位置づけられた。一方、既存の系統群に明確に位置付けられない、すなわち、深い分岐を示す可能性のある複数の株が存在することが明らかとなった。中でも、嫌気性で典型的なmtをもたない生物のみから構成されるフォルニカータ生物群やパラバサリア生物群の分岐の近傍に位置付けられるPAP020株は、今後mtからMROへの退行進化を研究する上で重要な手がかりを与える生物となる可能性が高いと考えられた。研究代表者がH27年12月に病気入院したため、H27年度に行う予定であったマレーシアの嫌気水圏環境調査を実施できず、マレーシア調査をH28年度に延期した。そのため、嫌気真核微生物の候補を多数株化するという、研究の初期段階の部分に多少の遅れを生じている。本研究ではこれまで我々のグループが進めてきた、典型的なmtをもたない鞭毛虫からなるフォルニカータ生物群の進化と多様性、mt関連オルガネラの研究成果を基盤に、研究対象を真核生物全体に拡張した研究を行なっている。H28年度にはH27年度に行ったパラオ海水湖の調査の再調査を行うとともに、H27年度に実施予定で実施することができなかったマレーシアの嫌気水圏環境の調査を行った。クアラルンプール郊外のPOME池の嫌気環境に生育する真核微生物の単離を目的としてサンプリングした。パラオ、マレーシアそれぞれのサンプルから、20種類程度の嫌気性真核生物候補株を単離することに成功した。これらからDNAを抽出し、SSUrRNA遺伝子を単離して配列を決定し、分子系統解析を行ったところ、メタモナス生物群の新奇生物種と考えられるもの、ディスコバ生物群内に位置付けられ分岐が古い可能性が示唆されるものなど興味深い分離株を得ることができた。マレーシアのPOME池に関して嫌気真核微生物に焦点をあてた調査はこれまで行われておらず、その多様性の一端を明らかにするためのサンプルを得た意義は大きい。パラオ海水湖のサンプルからも多くの嫌気真核微生物候補が得られており、進捗状況は順調である。嫌気性真核生物の真の多様性を探るために、パラオ共和国の海水湖、マレーシアのPOM池などの嫌気水圏環境の調査を行い、複数の新奇嫌気・微好気性真核微生物の候補を単離し、培養株を樹立した。前年度までに単離・株化した生物を含め、SSUrRNAによる系統解析で既知の真核生物の系統と明確な近縁性を示さないものについて、RNAを抽出し次世代シーケンサーを用いてトランスクリプトームデータを得た。これらをもとに多数の系統マーカー遺伝子からなる連結データを作成しファイロジェノミクス解析を行ったところ、フォルニカータ生物群の系統樹の基部から分岐する新奇生物、ヘテロロボサ生物群の新奇生物、ユーグレノゾア生物群の系統樹の基部から分岐する新奇生物などについて、それらの系統的位置づけを明確にすることができた。

さらに、前2者については、典型的なミトコンドリアを失い縮退型のミトコンドリア(Mitochondrion Related Organelles, MROs)をもつに至った生物である可能性が強く示唆されたたため、トランスクリプトームデータをもとに、MROの機能推定を行い、近縁生物種のMROの機能と比較することにより、嫌気・微好気適応に伴うミトコンドリア/MROの縮退進化の一端を明らかにした。一方、マレーシアおよび日本各地にて採集した陸生節足動物から、消化管に生息する嫌気性真核生物であるグレガリナ様寄生虫を単離し、トランスクリプトーム解析のデータをもとに、複数遺伝子連結分子系統解析を行いグレガリナ類の系統進化に関する知見を得るとともに、色素体様オルガネラで機能していると考えられる遺伝子を同定した。真核微生物の中には、嫌気・微好気環境への適応の結果、酸素呼吸能をもつ典型的なミトコンドリアを2次的に失い、縮退型のミトコンドリア(Mitochondrion Related Organelles, MROs)を保持するに至った生物が存在し、それらは真核生物の系統樹上に散在している。しかし、その多様性の実態については未解明な点が多い。本研究では、国内外の嫌気・微好気水圏環境のサンプルから嫌気的培養によって単離したさまざまな培養株に関して、その微細構造や系統的位置の解析を行うとともに、トランスクリプトームデータに基づくMRO機能の推定などを行い、そのような生物の多様性の一端を明らかにした。H28年度には、パラオの再調査を行うとともに、マレーシアのクアラルンプール周辺のPOME池を対象にした調査を行う。POME池は嫌気的であり、これまで真核微生物の調査があまり行われていないため新奇性の高い生物の発見に繋がる可能性がある。H27年度、H28年度に得られた株のうち、SSUrRNA遺伝子の分子系統解析の結果に基づき、その系統位置が興味深いと考えられる23分離株に関してRNAseq解析を行い、網羅的な発現遺伝子の配列データを得る。それらから系統マーカーとなる遺伝子配列を収集し、巨大アライメントによる大規模分子系統解析を行って、各分離株の系統的位置を推測する。29年度が最終年度であるため、記入しない。分子進化学29年度が最終年度であるため、記入しない。
ヒトiPS細胞の骨分化誘導条件の検討とその単離およびin vivoでの有効性

ヒトiPS細胞を骨芽細胞へ分化させる過程においてFGF-2、IGF-1、TGF-β1を培地に添加することにより高効率にアルカリホスファターゼ(ALP)陽性細胞を増加させることが可能であり、このALP陽性細胞のみをFACSにて分離し培養することで効率よく骨芽細胞への分化を誘導できることを見出した。さらに、これを長期培養するとにより骨細胞マーカー遺伝子発現やRANKL、SOSTといった骨細胞マーカータンパク質の発現が増加することを見出した。このことより、ヒトiPS細胞から簡単な操作で骨細胞様細胞にまで分化可能であることが示された。申請者らは、“TGF-β1がIGF-1の骨芽細胞前駆細胞内発現をポジティブ制御し、互いに骨芽細胞の分化を協調的に促進する"という機構を発見し骨に共存する意義を明確にした。この成果をさらに再生医療への実現に応用することが本研究の目的である。平成25年度は、1.ヒトiPS細胞から骨系細胞への効率的な分化誘導法の確立、2.分化誘導したヒトiPS細胞からの未分化細胞の除去および、純粋で安全な骨系細胞の回収、を実施した。ヒトiPS細胞からEBを形成し、単一細胞にしたのち骨芽細胞誘導培地(OBM;アスコルビン酸、β-グリセロリン酸、デキサメタゾンを含む)にて接着培養を行った。このとき、OBMにFGF2、TGF-β1、IGF-1を添加するともっとも効率よくアルカリホスファターゼ陽性細胞が増加し、FACSを用いた分離が可能であった。加えて、未分化iPS細胞と上皮細胞が発現しているE-カドヘリンを発現しない細胞集団を分離・回収することが出来た。さらに、このアルカリホスファターゼ陽性細胞を培養していくとDMP1、FGF23、RANKL、SOSTといった骨細胞マーカーの発現が増加した。このことは、FGF2、TGF-β1、IGF-1存在下で増加したアルカリホスファターゼ陽性細胞は骨細胞まで分化可能な細胞集団であるということを示唆している。間葉系幹細胞はこれを得るためには患者自身への侵襲が大きく、また、細胞の質は患者の年齢等によって異なる。ES細胞は倫理的な問題から臨床応用は難しい。一方でiPS細胞は、患者への侵襲も少なく、ES細胞のように増殖能は高いが倫理的な問題はない。今回得られた結果より、骨欠損を伴う疾患への治療に役立つことが考えられる。申請者は“TGF-β1がIGF-1の骨芽細胞前駆細胞内発現をポジティブ制御し、互いに骨芽細胞の分化を協調的に促進する"という機構を発見し骨に共存する意義を明確にした。この成果をさらに再生医療への実現に応用することが本研究の目的であった。本研究では、ヒトiPS細胞から骨芽細胞へ分化誘導する効率的な方法を検討し、FGF-2、IGF-1、そしてTGF-β1を添加し培養することで高効率にアルカリホスファターゼ(ALP)陽性の骨芽細胞前駆細胞が得られることを発見した。具体的には、ヒトiPS細胞を6日間浮遊培養することにより胚様体を形成する。つづいて、胚様体をシングルセルに単離し接着培養する。この際、上記三種類のサイトカインを骨芽細胞誘導培地(アスコルビン酸、βグリセロリン酸含有)に添加し14日間培養する。この細胞をFACSを用いて解析すると非添加群と比較してALP陽性細胞は著しく増加していた。さらに、このALP陽性細胞は骨芽細胞誘導培地にて培養し続けると骨細胞にまで分化可能であることを示した( PLoS ONE 2014, 9(6): e99534)。骨細胞は、高齢化に伴い増加する骨粗鬆症やその他の骨組織の疾患に対する治療材料としても注目されているが、骨基質に埋め込まれた細胞で単離が難しくその分化メカニズムには不明な点が多い。しかし、今回申請者が行った研究によりiPS細胞から骨細胞まで分化可能であり、骨細胞の機能解析あるいは分化メカニズム解析に役立つことが示された。生化学ヒトiPS細胞からEB形成を経てアルカリホスファターゼ陽性、E-カドヘリン陰性の骨芽細胞様細胞を分離回収することに成功した。また、このアルカリホスファターゼ陽性細胞を効率良く得る条件としてFGF2、TGF-β1、IGF-1という3つのサイトカインを組み合わせて培養することを見出した。さらに、このアルカリホスファターゼ陽性細胞を培養し続けると各種骨細胞マーカー陽性で、かつ細胞突起を多数もった骨細胞様細胞にまで分化することがわかった。これらのことから、研究目的であるヒトiPS細胞から骨系細胞への分化誘導と分離回収はおおむね順調に進展していると考えられる。今後は、より臨床応用可能な細胞を得るために前年度で得られた結果を発展させていく予定である。

具体的には、ヒトiPS細胞から得られたアルカリホスファターゼ陽性細胞から分化する骨細胞は一部分であるため、この骨細胞を純化するためにRANKLといった骨細胞マーカーでのFACS分離を試みる。このとき、骨細胞まで培養を続けた細胞は単一細胞にまで分離しづらいため、様々な細胞解離方法を試みる必要がある。さらに、分離した骨細胞をアテロコラーゲンやPuramatrixといった足場に包埋し、マウスあるいはラットに移植し骨形成能を評価する。残額が少額であり物品費等の消耗品の購入に充てられなかったため。翌年度分として請求した助成金と合わせて、主に物品費等の消耗品の購入に使用予定である。
ヒト神経可塑性の新展開：バイオマーカー・薬効機序・新増強法―個別最適治療の開発へ

刺激部位のモデルによる検討:人での脳刺激がどのような神経細胞を刺激しているのかは、可塑性誘導機序を考える上でも、今後の治療応用を考える上でも重要な問題である。そこで、工学系の研究者と共同で、刺激部位の推定をモデルで行い、Brain stimulation誌、Phys Med Biol誌、Biomedical Physics & Engineering Express誌に発表した。従来の刺激電流の大きさに関する考察に加えて、刺激される神経細胞もモデル化することで、実験結果を説明できる知見を得た。また、小脳刺激をしているとされていたコイルの位置で、小脳にどれだけの電流が誘導されているかをモデル化した。PASプロトコールのタスクへの影響:PAS刺激法は、MEPに長期効果を及ぼす事は証明されていたが、運動タスクに長期効果を誘導するかは知られていなかった。今回、この研究で、PASが運動学週に影響する事を示した。Brain Stimulation誌に発表した。聴覚情報と視覚情報の幻覚に関する研究:有名なマガーク効果という視覚聴覚幻覚に関して、刺激を行い、この幻覚に関する機序を解析した。Journal of Neuroscience誌に発表した。Caffeineの運動野可塑性に対する影響:QPSによるヒト運動野可塑性誘導に対するcaffeineの影響を正常被検者で検討した。A2Aに対する薬物がパーキンソン病の治療薬として用いられていて、カフェインが同様な効果を有することが判明した。コーヒーを多く摂取するヒトにパーキンソン病が発症しにくいと言う事実を説明できるかもしれない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。バイオマーカー研究:バイオマーカーの研究では、パーキンソン病、アルツハイマー病などで、軽度な症状の時からのバイオマーカーとなるような結果を得ている。脊髄での可塑性の誘導:脳幹刺激と末梢神経刺激をあるタイミングで与えることにより、皮質脊髄路と前核細胞の間のシナプスにspike timing dependentな可塑性を誘導できると言う実験結果が集まり始めている。軸索可塑性誘導研究:シナプス可塑性と軸索可塑性が相補的に働くと言う結果が出て来ている。正常値と年齢の影響では、一年目ですでに論文が一つ印刷され、もう一つの論文が印刷中となったことは、予定より進展していると言える。軸索可塑性誘導、脊髄可塑性誘導、バイオマーカー研究、paired associative QPS (PAS-QPS)と言う新しい刺激法の開発と、他の研究プロジェクトも順調に進んでいる。そこで、工学系の研究者と共同で、刺激部位の推定をモデルで行った。Brain stimulation誌に発表した。一次運動野内の方向の違う介在ニューロンを方向により刺激仕分けていると考えれた。どのシナプスに可塑性を誘導しているかを推定し、治療応用に生かす予定である。反復磁気刺激全体のまとめと安全性の検討:人での脳刺激が安全なのか、今後どのように研究・診療で使用していくかのガイドラインのようなものを、国際的な仲間と作成し、雑誌に発表した。Clinical neurophysiologyに2編、発表した。刺激パルス波形の効果への影響:磁気刺激パルスを変更できるcTMS装置を用いて、刺激パルス波形により、どのように効果が変わるかを検討した。バイオマーカー研究:バイオマーカーの研究では、ALSにおいて、運動野でなく、感覚野の機能異常が早期から見られ、これが治療のバイオマーカとなる可能性をClinical neurophysiologyに報告した。脊髄での可塑性の誘導:脳幹刺激と末梢神経刺激をあるタイミングで与えることにより、皮質脊髄路と前核細胞の間のシナプスにspike timing dependentな可塑性を誘導できると言う実験結果がほぼ整った。PAS-QPS (Paired associative QPS):末梢神経刺激と大脳皮質刺激を組み合わせることにより、協力に可塑性を誘導できる。この方法を我々が開発したQPSへ応用して、強力な可塑性を誘導できることが判明した。一部は予定以上に進展していて、一部は遅れ気味なところもある。刺激部位のモデルによる検討、反復磁気刺激全体のまとめと安全性の検討、刺激パルス波形の効果への影響:などは当初の予定になかったものであり、予想以上の進展と考える。バイオマーカー研究は、ALSにおいて、感覚野の2発刺激による機能解析がバイオマーカーの候補になるという、新しい成果がでたことは、予想以上の結果である。ただし、可塑性の検討がバイオマーカーになるという従来の予定については、少し遅れている。

今回、この研究で、PASが運動学週に影響する事を示した。Brain Stimulation誌に発表した。聴覚情報と視覚情報の幻覚に関する研究:有名なマガーク効果という視覚聴覚幻覚に関して、刺激を行い、この幻覚に関する機序を解析した。Journal of Neuroscience誌に発表した。Caffeineの運動野可塑性に対する影響:QPSによるヒト運動野可塑性誘導に対するcaffeineの影響を正常被検者で検討した。A2Aに対する薬物がパーキンソン病の治療薬として用いられていて、カフェインが同様な効果を有することが判明した。コーヒーを多く摂取するヒトにパーキンソン病が発症しにくいと言う事実を説明できるかもしれない。正常値と年齢の影響:すでに一定の結果を得たが、今後更に細かい年齢での可塑性について研究を進める。バイオマーカー研究:パーキンソン病、アルツハイマー病などでの研究を進めるとともに、てんかん、PSP等での検討も始める予定である。脊髄での可塑性の誘導:正常者での結果は、ほぼ終了したので、今後論文作成に取りかかるとともに、治療応用の可能性を探る。軸索可塑性誘導研究:現在の研究を継続する。PAS-QPS研究:可塑性誘導を増強させる新しい刺激法で、二つの刺激を組み合わせる方法を開発している。この研究を進める。薬物影響研究:抗パーキンソン病薬であるA2A受容体阻害薬の可塑性への影響について、研究を始める予定である。この研究を進める。このまま研究を継続する。薬物影響研究:抗パーキンソン病薬であるA2A受容体阻害薬の可塑性への影響について、研究を開始した。さらに、抗てんかん薬についても、解析を進める。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
酸化物トランジスタの電界誘起金属相

タンタル(Ta)酸化物の単結晶基板上に電界効果トランジスタ(FET)構造を作製し、表面に誘起される二次元的なキャリアの物性を調べた。電子層の磁気抵抗を2K程度の低温で測定した結果、電子の反局在効果という現象を観測した。反局在効果を詳細に解析したところ、従来の半導体の系と比較してスピンの回転長が数10nmと顕著に短いことがわかった。強いスピン軌道相互作用下におけるスピンと電場の相互作用を理解するうえで興味深い成果であると考えられる。酸化物表面に電界誘起の擬二次元電子状態を作製し、その物性を評価することが本研究の主目的である。今年度はペロブスカイト型酸化物であるKTa03からなるトランジスタを作製し、室温から2Kまでのトランジスタ動作をはじめて観測した。表面に誘起された電子相は低温で500cm2/Vs程度の移動度を示し、酸化物からなるトランジスタとしては非常に高移動度である。この新規の擬二次元電子相の磁気抵抗を調べたところ、弱磁場の領域で顕著な正の磁気抵抗を観測した。これは、磁気抵抗の大きさや形状などから、通常負の磁気抵抗を示す弱局在現象が、スピン軌道相互作用の効果でその符号を反転したものと考えられる。さらに、この正の磁気抵抗の大きさはゲート電界で制御できることが分かった。このことはスピン軌道相互作用がゲートで制御できることを示しており、KTa03はスピンを電場で制御するスピントロニクス材料としての可能性を持つことが分かった。酸化物からなる界面に電界効果によってキャリアを導入し、界面金属状態での物性、特に磁性と伝導との相関現象を明らかにすることを目的とした。その結果、初年度の後半に、KTaO_3の界面において電界誘起金属相の実現に成功した。低温(2K)において磁気抵抗を詳細に評価した結果、電子の「反局在効果」と呼ばれる現象を酸化物系においてはじめて発見した。これは電子の波としての性質が干渉効果を引き起こす現象であるが、特に電子のスピンがある一定の距離の間で回転すると反局在効果として現れる。この実験から、電子の位相緩和長、スピン回転長という長さスケールを酸化物界面においてはじめて測定することに成功した。ペロプスカイト系酸化物界面ではこれまで素子作製の難しさからドハース振動が二次元電子系では観測されておらず、電子の量子性を直接に反映した物理量を測定した例がなかった。今回、反局在という量子効果を通じてそれに成功したことは酸化物界面における物理を明確にするうえで大きな意義があると考えている。
中国近世期「陰符経」諸注の総合的研究

中国の近世、特に宋、金の『陰符経』諸注釈の内容を分析することで、近世中国思想史が受容した『陰符経』注釈の実態、『陰符経』諸注釈の相互関係と撰述時期、金末及び元初に北方中国で誕生した全真教への影響、南宋・朱熹の『朱子語類』に見られる道家文献としての『陰符經』理解の実態等に就いて、文献実証的に明らかにした。・現存する唐から清代の『黄帝陰符經』各テクストを調べ、300字本と400字本それぞれの「校本」を作成した。・早稲田大学等に文献調査に出かけた。・日本道教学会第64大会(於早稲田大学2013.11.09)に於いて「北宋に於ける『陰符經』の受容について」と題して口頭発表を行った。・上記発表の成果は、平成26年度6月刊行の『東方宗教』に掲載(印刷中)。・『陰符經』正文(300字本、400字本)の「校本」作成完了。・『陰符經』諸注「解題」の作成完了・南宋・夏元鼎『陰符經注』について論文執筆。・金代・唐淳『陰符經注』について口頭発表。・金代・唐淳『陰符經注』について論文執筆。・金代・劉処玄『陰符經注』について口頭発表。・唐宋の中国思想史に於ける『陰符經』の受容状況を、唐宋の思想・文学・歴史文献を資料として網羅的に調査し、当時の士大夫が『陰符經』を『道徳經』と同程度に重要な文献として受容していたことを確認した。同時に、唐末北宋の間の『陰符經』注釈は内丹的立場からの注釈ではなく、『道徳經』と同様にある種の原理的思想を提供する文献と見做した上で撰述されたものであり、それが内丹文献として認識され、内丹的注釈が撰述されるのは南宋に入ってからであることも確認した。このことにより、従来、『陰符經』及びその注釈を無条件に錬丹文献と見做してきた通説を修正することが出来た。併せて、唐宋の『陰符經』諸注の解題を作成し、唐宋の『陰符經』諸注に基づいた「校本『陰符經』」のテクストを作成した。・『陰符經』注釈に係る個別問題を、(1)「北宋に於ける『陰符經』の受容について」、(2)「唐淳『黄帝陰符經注』的思想與其道教思想上的意義」、(3)「夏元鼎『悟眞篇講義』的思想及其在道教思想上的意義」、(4)「劉處玄『黄帝陰符經注』について」、(5)「夏元鼎『黄帝陰符經講義』について」として、学会等で報告した。・個別問題について、(1)「宋代に於ける『陰符經』の受容について」、(2)「唐淳『黄帝陰符經注』の思想と道教思想史上の位置」、(3)「夏元鼎思想研究之一ー『悟眞篇講義』を中心にー」、(4)「『元陽子』小考」、(5)「『安樂法』」小考」等の論文を刊行した。・以上の論考に未発表論考を加えた報告書『中国近世期『陰符經』諸注の総合的研究』をまとめた。・「校本」「解題」の編集は修了し、個別研究の口頭発表と論文執筆も計画通りである。中国三教思想交渉史・最終年度内に個別論文を数編発表し、年度内に報告書としてまとめる予定である。・初年度に予定されていた「校本」の作成は終了し、本研究の全体に関する見通しに就いては、日本道教学会第64大会で口頭発表をし好評を得た。その成果は、H26年度6月中に学科誌で発表される。・次の展開としての金代・唐淳の思想については粗方の整理がすみ、H26年度5月の上海での国際学会での発表が決定している。・更に、南宋・夏元鼎の思想に就いて現在まとめており、H26年度11月の中国での国際学会、及び国内の研究会で報告の予定である。・H26年度に予定されていた学会等での報告がH27年度にずれ込んだ。・必要資料の中国からの購入がH26年度内に間に合わなかった。・上記上海での口頭報告結果は、勤務先の紀要に論文として発表の予定(投稿予告済)・11月の中国での報告、及び国内での報告も勤務先の紀要等の場で発表の予定。・国内研究機関所蔵の資料調査を継続して行い、「校本」の精度を高める。・H27年度内の国内外学会報告での旅費。

・論文執筆に必要な資料の購入。・報告書の印刷。・「校本」作成、及び関連論文執筆のための資料調査と資料収集費。・国内外の学会及び研究会での報告のための旅費。・本年度中に資料調査及び収集を完成させる予定。・5月(上海)、11月(江西)の二度の中国学会での報告を予定。
線虫C.elegans卵受精時のCa^<2+>-Signalingの機構の解析

種々の動物卵が受精するとき、細胞内カルシウムイオン濃度の一過性上昇(Ca^<2+>-transient)がおきることが知られている。精子がいかにしてこのような変化を引き起こすかについて、色々な手段で追求されているが未だに明らかにされていない部分が多い。本研究においては遺伝学的手段と分子生物的手段の利用が可能な線虫を用いてこの課題を追求した。本年度は前年度の結果をさらに確実なものにするため1.卵母細胞にDNA感受性の蛍光色素を負荷しておき、貯精嚢通過後の卵に精子のものと思われる核が進入している事を観察し、確かに受精していることを確認した。2.3種の突然変異種における、Ca^<2+>-transientの観察を繰り返し行い、野生種のそれと差のないことを確認した。3.itr-1遺伝子の一部をcodeする二本鎖RNAを、岡山大学香川研究室の協力のもとに合成し、卵巣多核体に注入した。行動などより判断しRNAiに成功していると思われるが、Ca^<2+>-transientには大きな変化は認められなかった。理由は分からないが、unc-68遺伝子に対するRNAiには成功しなかった。以上に結果より(1)このCa^<2+>-transientの発生に、IP_3RおよびRyRは関与していないか、あるいは(2)両者がともに正常のときのみCa^<2+>-transientを発生すると考えられる。種々の動物の卵は受精初期に卵内カルシウムイオン濃度([Ca^<2+>]_i)が一過性に増大(Ca-transient)する。この増大は細胞内小器官の小胞体の蓄積されていたカルシウムが細胞内に遊離することによると考えられている。小胞体にはIP_3レセプター・チャネル(IP_3R)およびリアノジンレセプター・チャネル(RyR)の二種類のカルシウムチャンネルが存在すると考えられているが、受精時のCa-transientへの寄与については議論がある。我々は本研究において、線虫C.elegansの受精時のCa-transientへ両チャネルが寄与しているかどうかを明らかにしようとする。本年度は:(1)野生株の雌雄同体において、卵母細胞が貯精嚢に進入した時点から[Ca^<2+>]_iが上昇し12分間持続した後減少することを確認した。このようなCa-transientは自家受精時のみならず、他家受精時においても観察された。(2)IP_3Rに変異のあるitr-1株の成虫の自家受精時においても野生株のそれと同様にCa-transientが起こることを確認した。(3)RyRに変異のあるunc-68(kh30)および(e540)株の自家受精時にもCa-transientが起こることを確認した。(4)IP_3RおよびRyRの発現を抑制するためRNA interferenceをおこなうべく、pat-10をもちいて、positive control実験を行った。
衛星塔載電力ケーブルの絶縁劣化評価手法の開発

2003年のADEOS2の全損事故原因は、電力ケーブル間のアーク放電による全ケーブルの焼損である。太陽電池から衛星本体までの送電ケーブルが宇宙空間に曝露されると、デブリ等の衝突により被膜に傷がつく。傷周辺部でプラズマ帯電による微小な放電が発生すると、太陽電池回路の電力が放電エネルギーを供給する直流アーク放電に至り、最悪の場合はアークが他のケーブルに飛び火して全損に至る。本研究では、宇宙空間に曝露された電力ケーブルの絶縁性能の劣化が、宇宙環境下での材料劣化の進行と共にどの程度進むのかについて基礎研究を行った。熱・真空・微小粒子衝突・放射線といった環境劣化因子に晒されたケーブルを用い、宇宙プラズマ環境を模擬した真空チャンバー内で隣接するケーブル間の絶縁耐圧及びケーブル・宇宙機表面導電性部材(CFRP等)間の絶縁耐圧を測定した。その際、繰り返しの微小放電によるアークトラッキングの形成と進行が絶縁耐圧(持続放電の発生電圧)低下にどう影響を及ぼすかを評価した。ケーブル絶縁評価試験装置を構築し、様々な宇宙環境要因にケーブルを曝して被覆を劣化させて、ケーブル間に繰り返しの微小放電と瞬間的短絡を起こさせた。繰り返しの過程の中で、in-situで微小電流計等を使って、10^<15>Ω程度の高抵抗から持続放電に至るまでの、累積放電回数や累積放電エネルギーに対するケーブル間抵抗の変化を測定し、絶縁耐圧を評価した。その結果、ケーブル間の線間抵抗は放電によって形成されるアークトラッキングの形成と進行と共に低下した。また絶縁被覆の劣化により放電の継続時間が変化する傾向が認められた。また線間電圧および電流の上昇と共に放電の継続時間も長くなる傾向が認められた。さらに恒久的持続放電の閾値を明らかにした。本研究では、宇宙空間に露出された宇宙用電力ケーブルの絶縁性能が、宇宙環境下での材料劣化の進行と同時にどの程度進むのかについて基礎研究を行う。熱サイクル・紫外線・微粒子衝突・原子状酸素といった環境劣化因子に晒された電力ケーブルを用い、宇宙プラズマ環境を模擬した真空チャンバー内で隣接するケーブル間の絶縁耐圧及びケーブル・宇宙機表面導電性部材(CFRP等)間の絶縁耐圧を測定する。その際、繰り返しの微小放電によるアークトラッキングの形成と進行が絶縁耐圧(持続放電の発生電圧)低下にどう影響を及ぼすかを評価する。今年度は、宇宙環境要因によるケーブルの劣化によって引き起こされる絶縁耐圧の低下を未劣化、および熱劣化ケーブルに対して評価した。熱劣化条件は260°Cで72時間、真空加熱した。真空度は15 torrであり、この加熱条件はみどり2号の環境で軌道上7ヶ月相当である。本研究では(1)隣接するケーブル間の絶縁耐圧、および(2)繰り返しの微小放電によるアークトラッキング(炭化導電路)の形成と進行が絶縁耐圧(持続放電の発生電圧)低下に与える影響、について評価した。使用した電力ケーブルは通常、人工衛星に使用しているものと同一のスペック55電線を使用し、ひび割れを模擬した傷を人工的に施し、試験を行った。ひび割れたケーブル同士が密着していない場合と密着している場合とで、ケーブル被覆材の熱劣化の影響を明らかにした。その結果、ひび割れたケーブル同士が密着していない場合では、ケーブルの熱劣化は持続放電を抑制し、逆にひび割れたケーブル同士が密着している場合では、ケーブルの熱劣化は持続放電を助長する傾向があることが分かった。どちらが実際の宇宙環境におけるケーブルの状態をよりよく模擬するのか、検討する必要がある。
近代化にともなう農村人口様式の変化に関する社会学的研究

1.6つの農村地域における農村人口様式の戦後の変貌過程の解明、および、将来におけるその変化を予測するための基礎資料として、昭和30年代から現在に至る間の地域人口、人口動態、農家戸数、農業人口、および農業経営に関する統計資料や、職場・部落での保管資料の転写・収集を、それぞれの地域の予備調査の段階で行なった。2.上記の予備調査にもとづき、新潟県東頚域郡松之山町水梨、中尾の両部落(計80戸)、酒田市中平田地区の熊野田、本川の両部落(計45戸)、群馬県佐波部東村西小保方部落(43戸)、山梨県南巨摩郡早川町草塩、京ケ島の両部落(60戸)につき、昭和30年から現在までの間の世帯員の移動(出生・死亡・転出・転入)、現住世帯員の就業状況、および、農業経営や部落生活の現状と将来に関する予測などに関し、意向調査をもふくめた面接調査を、昭和63年8月から11月の間に、学生補助査を調査員として実施した。さらに、2月および3月はじめにそれらの補足調査を行った。3.上記面接調査と竝行して、松之山町、早川町および山形県最上郡眞室町については、昭和35年以降の部落別戸数・人口や農家離村・留村廃農戸数を農業センサス資料にもとづき把握し、戸数減のいちじるしい部落をえらんで、部落長などから離廃農に至る個別事情や転出先、離廃農後の仕事や生活状況に関する聞き取り調査を実施した。またこれと対照する意味合いにおいて、戸数減少の比較的少ない東村や酒田市に関してキ同様の総計把握を行ない、比較資料とした。4.上記の諸調査の調査結果の整理術様の第一段階として、調査地域の統計資料の整理・製表、面接調査結果の点検・符号づけ・転写、離農世帯の聞き取り票の符号づけを学生補助員を雇用して実施し、基礎的作業をほぼ完了した。
実技教育に特化したオープンソースLMSにおける時系列解析に関する研究

研究計画に基づき、システムの構築、教材の作製を行い、実技教育を行う授業において2年間のデータをサーバに蓄積し、時系列分析を行った。これらの内容を論文(投稿中を含む)にまとめ、国内外の学会、研究会で報告した。その結果オープンソースLMSを大規模実習室に導入することでコストを軽減できるほか、柔軟な進捗分析を行うことができ、教育支援システムとして有効であることが確認された。東北学院大学工学部電子工学科では平成19年度から2年生に対し、従来のグループ式実験を改め、学生の実験技術の向上を目指し、個別ブース式による個人実験方式を導入した。この方式では個々人が各々のペースで実験を行うため、指導員がすべての学生のペースに合わせて説明や指導を行うことが困難であるため、教育支援システムとしてオープンソースソフトウエアによるサーバ・クライアント型のラーニングマネージメントシステム(LMS)を構築した。実施された実習は前期後期それぞれ15回、各180分であり、それぞれ100名程度の学生が受講している。サーバから配信される実験指導書やwebテストは学生の理解と進行を補助するように構成されており、各回30ページ、全イラスト数は1000を超える。各学生が現在どの段階の実験を行っているかはサーバのログを時系列解析し、グラフ化することで指導者に明確に伝えることができる。この実験ではオシロスコープやファンクションジェネレータなど、この分野で基本となる実験装置を本質的に理解・習熟し、ここの基礎力を養い、専門への興味と理解を促すことに大変効果があることは学生や教員へのアンケートから明確になってきており、指導を補助するシステムが安定して動作し、柔軟な分析を行いうることが重要な課題である。平成20年度では19年度に加えて3年生100名も実験を行うこととなっており、19年度に構築したシステムによってさらなるデータの蓄積と、より詳細な分析が可能になると期待している。これらの成果は平成19年度に学会等で報告済みである。本研究では大学などにおける多人数を対象とした電子回路作成などの実技も含む、組込みソフトウエア開発教育に特化した教育指導支援システムの開発を行った。この教育支援システムは、100名を超える多人数の学習者を少人数の指導者で教育する際に教育効果を向上させるもので、ウェブ型実験手順書とエディタやコンパイラの操作記録・ログ等をサーバにおいてリアルタイム解析し、指導者に逐次フィードバックする機能を持つ。東北学院大学工学部電子工学科では平成18年度から19年度にかけて、同学科2,3年生を対象に「電子工学実験」を実施した。この学生実験は前期15回、後期15回、各回90分x2行われ、それぞれ100名程度の学生が受講している。この学生実験では当該システムによるウェブ型手順書を採用し、実証分析を行った。学生達が閲覧したウェブ内の移動の様子を独自のプログラムによって時系列に解析した結果をチャート化することで各閲覧ページの内容がどのような相関を持つかを可視化することに成功した。これをもちいることにより閲覧者のアクセスパターンから、閲覧者が迷いや停滞の状態にいることを検出することが容易になり、指導効率を向上させることが可能であると考えられる。また、文字を含まない画像のみのスライド群による実験手順書の各ページ間を閲覧者がどのように移動しているかを直感的に捕らえることができ、それによって各ページ間の関連性の程度を把握できることから、教材を改善すべき箇所を明確に見出すことが可能である。
大脳皮質における層特異的な回路形成の分子機構

大脳皮質は特徴的な6層の細胞層から構成され、その層構造に基づいて神経回路が構築されている。同じ層にはサイズや形態が似た細胞が集合し、それらは神経結合においても同じ特徴を有する。このような層特異性は大脳だけではなく、他の神経系においても広く見られることから、中枢神経系の機能構築、それに基づく回路形成の一つの原則となっていると考えられる。これまでの発生学的な研究や申請者らのin vitro標本を用いた研究から、各々の層の細胞は特定の入出力回路を形成するための標的認識機構を有することが明らかになっている(Yamamoto et al.,1989,1992,1995)。さらに、この標的認識機構は大脳皮質に層特異的に発現する分子によって制御されることが明らかになってきた(Yamamoto et al.,1997,2000a,2000b ; Takemoto et al.,2002 ; Yamamoto 2002)。しかしながら、その分子機構については依然不明な点が多い。本研究においては発生期大脳皮質において層特異的に発現する遺伝子を得て、神経回路形成との関連性を明らかにすることを目指した。そのために、層を切り分けて微量なRNAを抽出し、サブトラクションライブラリーの作製、スクリーニングを行った。その結果、4層と5層それぞれに特異的に発現する転写調節因子や細胞表面分子を得ることに成功した。また、モノクローナル抗体法を用いて、皮質神経回路形成に関与する分子として接着因子cadherinファミリーに属する分子が層特異的に発現することを見出した。加えて、これら層特異的に発現する分子の作用について検討を加え、大脳皮質の回路形成に層特異的分子が果す役割を明らかにした。これまでの網羅的な遺伝子探索(サブトラクション法、DNAアレイ法)によって得た大脳皮質層特異的に発現する細胞表面分子や細胞外分子(Zhong et al.,2004,in press)の視床軸索に対する役割を解析するために、皮質内の空間的分布と同スケールで分子を塗布する新たなin vitro解析法の開発を行った。そのために、リソグラフの鋳型を軸索成長のためのメンブレン上に積層し、その上からタンパク質溶液を押し出すことで、タンパク質を帯状にプリントする手法を手掛けた。その幅は生体内の軸索束の幅に則して100-50μmとした。実際に、プリントされたタンパク質が機能することをテストするためには、コラーゲン及びラミニンを用いて、後根神経節細胞又は大脳皮質組織片を培養し神経突起の伸長を観察した。また、メンブレンの材質としては、ニトロセルロース、親水化ポリ四フッ化ビニリデン(PVDF)、非親水化PVDF、ポリ四フッ化エチレン(PTFE)、ポリLリジン(PLL)をコートしたPTFE、ポリカーボネイト(PC)などを用いた。その結果、いずれのメンブレンにおいてもコラーゲンは限局してプリントされたが、突起伸展の選択性は材質によって異なり、特に親水化PVDF及びPTFEで高い選択性を示した。ラミニンをプリントした場合には、突起伸展の選択性はいずれもコラーゲン塗布に比べて同等か低かったが、ラミニン溶液中に増粘剤として10%ポリエチレングリコール(PEG)を加えプリントした場合、プリントの限局度、突起伸展の選択性が向上した。以上の結果から、培養メンブレンの材質やタンパク質に添加する増粘剤を選ぶことでタンパク質を空間的に限定した領域にプリントすることが可能であり、そのメンブレン上で末梢神経系や中枢神経系の軸索成長をシミュレーションする展望が見出された。大脳皮質は6層からなる細胞構築を持ち、神経回路はこの層構造に基づいて形成される。

本研究では、その回路形成を担う分子を同定し、その形態的あるいは機能的意義を解析することを目指した。層特異的な遺伝子探索を行うためには、生後7日目ラットより5層特異的なcDNAライブラリーを作製し、differential screening、in situ hybridization法によって5層細胞に特異的に発現する遺伝子を得た。大脳皮質第5層cDNAから第4層cDNAをサブトラクションすることによって得られたクローンNo.262は、層形成の完了した生後7日目のラット脳切片上で大脳皮質第5層の一部の錐体細胞にのみ発現することがわかった。このクローンは塩基配列解析の結果、Etsファミリーに属するER81のラットホモログであることが判明した。まず、ER81の5層での局在に領野特性があるかどうかを調べたところ、領野による多少の発現量の差は見られるものの、皮質全体に発現が見られた。また、発生期の発現の解析からER81の発現は第5層細胞の誕生から成熟までの挙動と一致していた。次に、ER81発現細胞と回路形成との関連性を調べるために、上丘や対側大脳に投射する細胞の位置との比較を行ったところ、上丘や脊髄へ投射しているニューロンはER81を発現するのに対して、皮質対側へ投射しているニューロンの一部がER81を発現することがわかった。本研究の結果、大脳皮質第5層に特異的に発現する遺伝子が得られ、ER81のラットホモログであったことや発現解析より大脳皮質第5層への分化の関与が示唆された。また回路形成との関連性では上丘へ投射するニューロン群との分布で直接的な一致はなく、皮質全体に分布する対側大脳への投射ニューロン群のうちの第5層内のニューロンに関わる可能性が示唆された。大脳皮質は特有の細胞構築を持ち、神経回路はこの層構造に基づいて形成される。本研究では、この層特異的な回路形成を担う分子機構を明らかにすることを目指し、層特異的に発現する分子を同定しその機能的意義を解析することを目指した。これまでに層特異的な遺伝子探索を行うための方法として、(1)サブトラクションcDNAライブラリーからの探索による解析と(2)モノクローナル抗体法を用いる探索法を並行して進めてきた。その結果、次のような成果を得た。(1)遺伝子探索の結果、転写調節因子ER81が5層神経細胞に特異的に発現することが判明した。ER81の役割を調べるために、逆行性標識法と免疫組織化学的手法を組み合わせて投射パターンとの相関を調べたところ、上丘や脊髄へ投射しているニューロンはすべてER81を発現するのに対して、皮質対側へ投射しているニューロンの一部がER81を発現することがわかった。また、ER81の5層細胞での特異的な発現様式が系統発生学的な観点から保存されたものである可能性を検討するために、マカクザルにおいてmRNAの発現を調べたところ、サルにおいても5層での局在性が見出された。以上のことから、ER81は種を越えて哺乳類大脳皮質において一部の5層細胞に発現し、細胞分化に関与していることが示唆された。(2)モノクローナル抗体法によるスクリーニングによって、皮質深層の細胞がT-cadherinを特異的に発現することを示したが、さらにその機能的な役割を調べるために、RNAi法により内在的なT-cadの発現を抑制する、あるいは本来発現しない表層細胞への過剰発現による効果を調べた。
細胞接着因子発現制御による膵臓癌肝転移防止の実験的検討

雄性balb/cマウスを全身麻酔下に開腹し,膵体尾部を切除した.除終了後門脈内にmitomicine(1mg/kg)の投与を行ったものと投与を行わなかった2群について(投与群,膵切群),経時的に肝組織を採取しホモジネートし,上清を採取した.上清中のTNFα,ILlβとIL6の濃度をELISA法で測定した.両群ともTNFαとIL1βは有意な変動を示さず,両群間にも有意差はなかった.IL6(pg/mg protein)は膵切群・投与群とも,術直後0.68±0.27,0.43±0.20から術後30分に11.5±3.2,8.17±0.60へと有意に増加し,それぞれ24時間,12時間にも有意に上昇していた.両群間に有意差はないが,各時点とも常に膵切群が高値を示した.凍結肝組織よりacid-guanidine-phenol-chloroform法でtotalRNAを抽出した.マウスのE-selectin遺伝子配列より,オリゴプライマ-を作成し,reverse transcriptase-polymerase chain reaction法(RT-PCR)を行った後更にPCR反応を施行し,E-selectin遺伝子の発現の有無を検索した.internal controlとしてGAPDHの発現をm-RNA採取およびRT-PCR反応の成否の指標とした.両群の切除後1,3,6,12,24時間後の肝組織では,GAPDHは何れの検体についても発現が認められ,m-RNA採取およびRT-PCR反応は問題なく施行出来た.一方,両群ともE-selectinに対するRT-nested PCRでは,今回の検討した時間内で特異的なバンドは全く認められず,本実験系でのE-selectinの発現はないものと判断された.雄性balb/cマウスを全身麻酔下に開腹し,膵体尾部を切除した.除終了後門脈内にmitomicine(1mg/kg)の投与を行ったものと投与を行わなかった2群について(投与群,膵切群),経時的に肝組織を採取しホモジネートし,上清を採取した.上清中のTNFα,ILlβとIL6の濃度をELISA法で測定した.両群ともTNFαとIL1βは有意な変動を示さず,両群間にも有意差はなかった.IL6(pg/mg protein)は膵切群・投与群とも,術直後0.68±0.27,0.43±0.20から術後30分に11.5±3.2,8.17±0.60へと有意に増加し,それぞれ24時間,12時間にも有意に上昇していた.両群間に有意差はないが,各時点とも常に膵切群が高値を示した.凍結肝組織よりacid-guanidine-phenol-chloroform法でtotalRNAを抽出した.マウスのE-selectin遺伝子配列より,オリゴプライマ-を作成し,reverse transcriptase-polymerase chain reaction法(RT-PCR)を行った後更にPCR反応を施行し,E-selectin遺伝子の発現の有無を検索した.internal controlとしてGAPDHの発現をm-RNA採取およびRT-PCR反応の成否の指標とした.両群の切除後1,3,6,12,24時間後の肝組織では,GAPDHは何れの検体についても発現が認められ,m-RNA採取およびRT-PCR反応は問題なく施行出来た.一方,両群ともE-selectinに対するRT-nested PCRでは,今回の検討した時間内で特異的なバンドは全く認められず,本実験系でのE-selectinの発現はないものと判断された.1.膵切除後の肝組織中サイトカイン濃度の変動凍結肝組織よりAGPC法でRNAを抽出した.分光光度計での計測では,純度の高いRNAが得られた.マウスのE-selectin遺伝子配列より,F1:5'-AATGCCTCGCGCTTTCTCTC-3',R1:5'-AGTCTTTGGTTCGTTGGATGTAA-3',F2:5'-AGAGAGCACAGCTTGGTACTA-3',R2:5'-CACCTGGAGCCCAGTTCTGAGC-3'と設定し,オリゴプライマーを作成した.今後,肝組織より得られたRNAを資料とし,RT-PCR法でE-selectin mRNAの発現を検討する予定である.1.膵切除後門脈内mitomicine C投与による肝組織中サイトカイン濃度の変動雄性balb/cマウスを全身麻酔下に開腹し,膵体尾部を切除した.切除後門脈内に,mitomicine C(1mg/kg)の投与を行った後,経時的に肝組織を採取しホモジネートし,上清を採取した.上清中のTNFα,IL1βとIL6の濃度をELISA法で測定した.TNFαとIL1βは有意な変動を示さなかった.IL6(pg/mg protein)は術直後0.43±0.20から術後30分に8.17±0.60ヘと有意に増加し,12時間にも有意に上昇していた.両群の切除後1,3,6,12,24時間後の肝組織では,GAPDHは何れの検体についても発現が認められ,m-RNA採取およびRT-PCR反応は問題なく施行出来た.一方,両群ともE-selectinに対するRT-nestedPCRでは,今回の検討した時間内で特異的なバンドは全く認められず,本実験系でのE-selectinの発現はないものと判断された.
キラル3,3’-二置換ビナフチルジスルホン酸を用いる高活性有機分子触媒の精密設計

C2対称性をもつシンプルで安価なキラルビナフチル化合物は、配位子や有機分子触媒として多くの不斉触媒反応で用いられてきた汎用性のある不斉源である。特に、有機分子触媒におけるブレンステッド酸性の強さは触媒活性を特徴づける大きな要因であることから、研究代表者はキラルビナフチルジスルホン酸(BINSA)に着目している。これまでに、初めてのキラルBINSAの不斉合成とそれらを用いる不斉触媒反応の開発を重ねてきた。本研究では、これまでの研究開発を基盤として、合成が困難であったキラル3,3'-ジアリールビナフチルジスルホン酸を創製し、それらを高活性不斉触媒とする新たな触媒反応開発が研究目的である。特に、3,3'位へのアリール基導入により、立体及び電子的効果で従来よりも多様性のある精密触媒設計が可能となる。具体的には(1)3,3'-Ar2-BINSAによるシンプルな精密触媒設計、(2)キラル3,3'-Ar2-BINSAアンモニウム塩触媒の精密設計、(3)自己組織型キラル3,3'-Ar2-BINSAの精密触媒設計を行い、独創的な不斉有機触媒反応へと展開した。27年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、キラル3,3'-Ar2-BINSAの効率的合成と不斉触媒反応の開発を行った。一般にキラルビナフチル化合物の3,3'位への置換基導入は、立体的及び電子的効果の及ぼす影響が大きいため、触媒設計の常套手段となっている。特にアリール基は精密設計が容易であり、優れた置換基導入効果を発揮する。ところが、これまでキラルBINSAへの3,3'位へのアリール基の導入の一般性のある合成法は存在しなかった。研究代表者は、ごく最近、立体障害が小さい既知のキラルスルホンイミドを出発物質として、数種類のキラル3,3'-Ar2-BINSAの合成に成功している。本研究では、この合成技術を基に、不斉触媒反応開発に必要な様々なキラル3,3'-Ar2-BINSAの効率的合成を行なった。全8段階からなる合成のうち、鍵反応は選択的還元によるスルフィン酸合成・スルホン酸への収束的酸化の連続する2段階であり、収率向上の検討が必要であった。さらに、従来のキラルブレンステッド酸では反応進行が困難な強酸性を必要とする不斉触媒反応を重点的に開発した。特に、N-Bocイミンに対する不斉付加環化反応による新規光学活性カルバミン酸エステル合成法を開発した。キラル3,3'-Ar2-BINSAを用いることでN-Bocイミンへの多点配位とともに、反応の駆動源である強酸性条件でのt-Bu基の脱離を伴う環形成を促進させたことが鍵である。高収率、高ジアステレオ、高エナンチオ選択的に対応する生成物がえられた。今年度の成果を踏まえて、キラルキャビティーを有する金属イオン集積型BINSA触媒の開発を行う。

研究代表者は、これまでの研究でLi(I)などのアルカリ金属イオンまたはMg(II)などのアルカリ土類金属イオンを用いて自己組織化した高活性触媒の創製に成功している。複雑な高分子量の単一分子触媒を作るのとは対照的に、シンプルなキラル小分子をin situで巧みに集積することで、高次機能を有する分子錯体触媒が一挙に構築できる。こうした超分子触媒の設計技術を基に、本研究では、典型金属イオンを用いて集積型キラル3,3'-Ar2-BINSAを創製する。例えば、強酸性かつ高次機能が必要な従来達成されていない基質を組み合わせた不斉Friedel-Crafts反応などを開発する。キラルブレンステッド酸有機分子触媒として機能できるテーラーメイドのキラルキャビティーを構築し、X線結晶構造解析で新規触媒構造も解明する。27年度が最終年度であるため、記入しない。
閉経後骨粗鬆症の臨床・実験的研究

閉経の骨に与える影響を調べるためにビーグル犬を用いた動物モデルを作成し組織形態計測学的に観察した。ヒトでの組織形態学的変化を解明するために動物実験モデルを作成することを目的とした本研究では,当初の研究予定を終了してほぼ目的を達成することができた。結果1)ビーグル犬での卵巣摘出実験によれば、卵摘後の骨動態は当施設で得たヒトの閉経後の骨変化と本質的には同一であるようにおもわれたが、卵摘直後に骨芽細胞機能、とくに基質の産生障害が起きる時期が在ることが示された。ヒトにおける骨組織形態計測の結果では,閉経周辺期の骨芽細胞機能の障害は基質の産生のみならず石灰化においても認められた。このような変化は女性のみに認められ男性には認められなかった。2)本モデルにおいて閉経後は石灰化や基質産生に障害は認められず,閉経周辺期よりも青年期に近い状態であった。したがって骨量の減少は閉経周辺期に多く閉経後は安定していると考えられ,人での骨組織形態計測によっても同じ結果が得られた。3)骨粗鬆症の患者群では,男性は極めて小数であることや初発症状は閉経周辺期に出現すること,治療によっても骨量の増加はほとんど見られないことなどから,発症原因は閉経周辺期前の骨量の多少,閉経周辺期の骨芽細胞機能障害による骨減少,閉経後の骨芽細胞の機能回復の障害などが考えられる。4)骨粗鬆症では骨皮質が菲薄化し,骨強度が減少して骨折を生じることが知られている。ビーグル犬の肋骨を用いた実験ではオステオン単位で骨基質の産生が低下し,皮質骨から粗な海綿骨へと変化して粗鬆化が生じるというメカニズムが判明した。1)雌ビ-グル犬の卵巣摘出と経時的骨塩定量実験全24頭のビ-グル犬の内,既に約半数の卵巣摘出を行い現在飼育中である。既に標本作製済みの検体に対して,現在デ-タ解析中である。2)人腸骨の組識形態計測主にテトラサイクリン標識率について検討を加えた。健常女性では30才付近から標識率の低下が見られ,50才から60才で急速に20才代と同様のレベルまで戻った。一方男性ではこの様な年齢による変化は見られなかった。このことは加齢によって一様に骨芽細胞の機能に変化が生じるのではなく閉経等の内部ホルモン環境の変動によって細胞機能の変化が生じ,しかもその変化は可逆的であることが判明した。男性には見られない変化であり,閉経と密接に関連しているので,その原因としては女性ホルモンの分泌の低下すなわち閉経によって骨芽細胞の低下が生じ,後に女性ホルモンの欠如状態でも細胞機能が維持できるように変化するものと考えられる。詳細については,1992年4月に開かれる第11回国際カルシウムホルモン学会議(ICCRH:フロ-レンス,イタリア)で発表予定である。ビ-グル犬で摘出標本については現在結果の解析中である。骨粗鬆症患者の骨塩の経時的変化については5年以上経過例について症例数の蓄積が10例を越えたので,次回の骨形態計測学会等で発表を予定している。閉経の骨に与える影響を閉経後骨粗鬆症の動物モデルより組織計測学的に解明し、ヒトでの組織形態学的変化を解明することを目的とした本研究では以下の研究予定を終了してほぼ当初の目的を達成することができた。1)両側卵巣摘出による雌ビーグル犬の閉経後骨粗鬆症モデルの作製と腸骨および肋骨の採取、2)実験モデルとヒトの骨組織形態計測、3)single photon absorptiometryによる骨密度の測定結果1)