hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アフリカ睡眠病の治療に直結した新規キナーゼＡＫＢ１４－３－３－１分子の解析

Tb14-3-3結合タンパク質のプロテオミクスアプローチにより新規リン酸化酵素AKB1を同定した。AKB1はTb14-3-3中の両親媒溝構造を介して、直接且つ特異的にTb14-3-3と結合する。またAKB1の基質認識に重要なアミノ酸モチーフを同定し、細胞内AKB1の酵素活性をリン酸化モチーフ抗体を用いて測定した。AKB1の大部分は細胞骨格に分布しており、またAKB1の基質も同様に界面活性剤不溶性画分に存在した。AKB1の蛋白リン酸化酵素活性は細胞分裂に重要であった。以上の結果はTb14-3-3-AKB1複合体が細胞骨格結合タンパク質のリン酸化を介して細胞分裂を制御する可能性を示唆している。Tb14-3-3とAKB14-3-3-1の結合の生理的意義の解明Trypanosoma brucei14-3-3(Tb14-3-3)結合タンパクAssociated kinase of T. brucei14-3-3-1(AKB1)は、細胞分裂を制御する蛋白リン酸化酵素である。これまでの研究で、基質となるpeptide motifを同定し、in vivoでのAKB1による基質のリン酸化を判定するのにヒトAKT-substrate antibody(Cell signaling社)を利用できる可能性を示してきた。そこで我々はTetracycline-inducible Tb14-3-3過剰発現細胞,およびノックダウン細胞にAKB1 overexpression vectorをtransfectionした原虫株を樹立し, in vivoでのAKB1による蛋白リン酸化におけるTb14-3-3の役割を調べた。その結果、Tb14-3-3のoverexpressionにより顕著なAKB1によるリン酸化bandの増強を認めた。また、1)AKB1のTb14-3-3に結合しないC-terminal deletion mutantの過剰発現がAKB1によるリン酸化をwild typeの過剰発現より増強する、2)in vitroでのpeptideをsubstrateとして用いた系ではTb14-3-3をAKB1に加えてもリン酸化の増強は認められない。この2点を考慮すると、AKB1のC-terminal portionがin vivo substrateへのaccessibilityの負の制御を行っており、C-terminal portionにTb14-3-3が結合することにより、AKB1のsubstratesへのaccessibilityが向上したものと推測される。AKB1のin vivoでの活性をよりよく反映するのは、去年報告したAKT substrate motif抗体よりもAMPK substrate抗体であることが判明した。V5タグを付加したTb14-3-3とAKB1を共にoverexpressionした細胞、およびV5タグを付加したTb14-3-3をoverexpressionし,かつAKB1をknockdownした細胞をV5-Tag抗体で免疫沈降した。Input, Bound(Immunoprecipitated), UnboundにわけてAMPKsubstrate motif抗体でWBすると、AKB1でリン酸化されたほとんどの蛋白はTb14-3-3に結合した状態で存在することが判明した。AKB1又はTb14-3-3をknockdownあるいはoverexpressionするとcytokinesisの異常がおこりmultinucleated細胞が生じるが、このdetergent solubleなAKB1 Tb14-3-3 complexの量あるいは質的変化がそのような変化を起こしているのかもしれない。Inhibitorに関してはPrem. Reddyの研究室でscreeningをおこなうも、nanomolar orderで効くAKB1 inhibitorは得ることができなかった。ところが100mMのHEPESおよびPIPES bufferがAKB1の活性を完全に抑制することが判明し、そのPiperazine ringが活性を抑制することを見いだした。今後、Piperzaine ringをたくさん持つ化合物をscreeningする予定である。初年度、大腸菌にてAKB14-3-3-1のkinase活性のあるrecombinant蛋白を発現、精製に成功し、基質モチーフの同定に成功したことを以下に報告する。AKB14-3-3-1 (以下AKB1と略する)の基質の解明: AKB1のキナーゼ活性のあるrecombinant蛋白を大腸菌に発現させて、8090%の純度で精製したものを用いてin vitroでのリン酸化モチーフの解明にもちいた。PepTag PKC substrate (Promega)はAKB1の基質になるが、PKA substrate(Promega)はAKB1の基質とはならないことが、明らかになった。そこでGlutathione-S transferease (GST) fusion蛋白を発現させるvectorを用いGST-PKCsubstrateを大腸菌に発現、精製し、上記で用いたAKB1とATPの存在下で37°Cで反応させた。反応をSDS-PAGEにアプライし、ヒトAKT motif認識抗体でWBすると、リン酸化されたbandが検出された。

次に、GST-PKC substrateのAKB1によりリン酸化されるSer残基の-3, -5番目に変異を加えたGST-ペプチドを同様に作成し、in vitroのリン酸化反応は同様に行い、Phos-tag(Nard)を用いたGel-shift assayによりリン酸化されるGST-peptideを検出した。その結果、AKB1のリン酸化モチーフは、リン酸化されるSから-3がArgあるいはLys, -5が疎水性アミノ酸残基であることが重要であることが判明した。(理由)AKB14-3-3-1のdeletion mutantを作成しTb14-3-3に結合しないmutantおよびkinase-dead mutantを発現させたT. bruceiとwild type AKB14-3-3-1を発現させたT. bruceiと,形態およびgrowthを比較する。これに関しては、AKB14-3-3-1のkinase活性が存在する野生型AKB14-3-3-1をT. bruceiに過剰発現させると細胞分裂異常がおこるが、Kinase dead変異体を発現させても細胞分裂は正常に遂行されることが判明した。Tb14-3-3過剰発現あるいはKnockdownさせたT. bruceiにこれらAKB14-3-3-1 mutantを過剰発現させるT. bruceiを作成し、AKB14-3-3-1の基質のリン酸化をモニターする。これに関しては、上記研究実績の概要でのべている。以上2点より目標は達したと考えられる。報告したAKB14-3-3-1の基質motif決定した以外に、1)In vivoのリン酸化が市販のAKT-substrate抗体で検出されること。2)一般に使われるKinase Buffer中にAKB14-3-3-1のインヒビターが存在することが判明し、さらに、この物質を基本構造にもつ物資がインヒビターの候補になることが判明した。さらに3) ribosome蛋白も基質となることが判明した。これらのことにより、十分目標は達したと考えられる。最終目標であるAKB14-3-3-1のkinase活性をターゲットとしたインヒビターのscreening大腸菌発現vector pGEX4T2 (GST-tag),あるいはpET47b (His-tag)にAKB14-3-3-1の全長あるいはtruncated cDNAをsubcloningし、低温18oCにてIPTG-inductionをかけ、その後、affinity精製を試みる。
中国古代における 家族と「移動」の多角的研究─静態的家族観からの脱却をめざして─

今年度は湖南省文物考古研究所・里耶秦簡博物館において簿籍を中心とした里耶秦簡、および関連遺跡の調査を実施し、調査結果を取りまとめた。合わせて、里耶秦簡の出土地である遷陵県城址、秦のゲン陵県所在地であるゲン陵古窯城址を踏査した。また、長沙簡牘博物館でも走馬楼漢簡・走馬楼呉簡を調査し、今後の比較材料とした。調査および研究の成果は以下のとおり。1.里耶秦簡家族名簿(戸籍様簡)について、書式の特徴や作成・使用過程をしめす痕跡を発見した。現時点で調査データは整理済みであるが、【現在までの進捗状況】に記入した理由により、公表はひかえている。公表可能となれば、考察結果とともに発表する予定である。2.里耶秦簡にみる漆の調達と利用を題材に、秦代の県機構における手工業の重要性や原料としての漆の広範囲の移動を明らかにした。この研究には里耶秦簡博物館での調査による作成過程についての知見が、簿籍を作成した遷陵県での漆関係業務の復元に役立った。3.走馬楼呉簡吏民簿を実見調査し、簿籍の編綴痕や作成・使用状況の有無を確認したり、釈字を検討したりした。また、今回調査した走馬楼漢簡・走馬楼呉簡は竹簡が大部分であるが、里耶秦簡や居延漢簡にはみられない長大な竹簡を実見し、現地の研究者から作成官署や用途により竹簡の素材が異なることを教示された。2019年度に調査する居延漢簡・肩水金関漢簡にも内地からもたらされたと考えられる竹簡が含まれており、簿籍への竹簡利用方法の共通点・相違点を考える材料をえた。4.遷陵県城址、ゲン陵古窯城址の実見により、両城址がいずれも河川に面して築かれており、河川が主要な移動手段であり、酉水・ゲン水が当時の交通の大動脈であることを確認した。今回の簡牘調査では里耶秦簡の家族名簿について、これまで指摘されてこなかった作成過程をしめす特徴を発見することができた。しかし、里耶秦簡の大部分を所蔵する湖南省文物考古研究所の意向で、里耶秦簡報告書の当該部分が出版されるまで調査結果の公表を控えることとした。現在、調査時のデータは整理済みのため、里耶秦簡報告書出版後すぐに発表するつもりでいる。また、漆の調達と利用についての研究は、簿籍の作成過程に着目する点で本研究が基礎とする簿籍(家族名簿・移動者名簿)の集成、復元にも役立つものである。来年度も簿籍集成・復元のための基礎研究は継続するつもりだが、集成・復元結果をもとにした「家族と移動」についての具体的な研究が後半2カ年の課題となる。1.2019年夏に甘粛省文物考古研究所で居延漢簡・肩水金関漢簡など西北出土漢簡中の家族名簿・移動者名簿・通行証の調査を実施し、名簿の集成に必要なデータをとる。2.西北出土漢簡交通・通関制度にかかわる漢簡も調査対象とし、関係官署の実務を考える手がかりとする。調査結果をもとにして、漢代の交通・通関制度を復元する。3.西北出土漢簡の家族名簿・移動者名簿から漢代の内地と西北地区とを往来する人々の属性や目的を明らかにする。4.2018年度簡牘調査における疑問点について、再度、湖南省文物研究所・長沙簡牘博物館で確認する。今年度は台北中央研究院歴史語言研究所蔵居延漢簡の実見調査、および岳麓秦簡や里耶秦簡を用いての中国古代における未成年の空間的・社会的移動の研究を重点的に行った。(1)台北中央研究院所蔵居延漢簡の実見調査(平成30年3月)調査に当たっては、事前に木簡の法量や図版を精査し、図版から読み取れる木簡の特徴と釈文を入力した調査票を作成し、実見調査の成果を最大限に出せるよう工夫した。調査の成果としては、文書や帳簿を作成する際に使用する木材の種類(木質)や木取りを、提出先や用途によって選択する傾向を見出すことができた。こうした知見が、ただちに名簿や帳簿、関連文書の集成・復元に結びつくわけではないが、文書作成の現場の明文化されていないものを含む「規範」を知ることは集成・復元の基礎として必要だと認識した。(2)秦簡を用いての空間的・社会的移動についての研究岳麓秦簡や里耶秦簡を用いて、秦における奉公を目的とした世帯間移動や、官署の下役としての社会的属性の移動の研究を行った。具体的には、秦において「隷」と呼ばれる人々の身分的属性を明らかにし、「隷」として生家以外の世帯に住み込む者が一定程度いることを論証した。また、「小史」と呼ばれる官職が未成年の就く官府の下役であることを確認した。こうした「隷」や「小史」となるのは、10代の少年・少女であり、秦人は人生の早い段階で空間的な移動や、社会的属性の変化を経験していることが判明した。中国古代史研究では社会的流動性の研究蓄積が多くはないため、このような個別研究を積み重ねたうえで、当該社会のより広範囲で長期的な流動性を考える必要性を感じた。

実見調査参加者の予定の調整がつかなかったため、居延漢簡の実見調査を平成29年8月から30年3月に延期した。その分、事前に行う調査予定簡の選定と、漢簡のデータを書き込んでおく調査票の準備を丁寧に行うことができ、調査自体はスムースに運び、調査結果の整理もしやすくなった。居延漢簡調査にかわり、秦簡を用いての空間的・社会的移動の研究を先行したため、次年度に予定していた成果の公表が前倒しとなった。こうした予定変更がうまくできたため、おおむね順調に進展していると評価している。今年度は湖南省文物考古研究所・里耶秦簡博物館において簿籍を中心とした里耶秦簡、および関連遺跡の調査を実施し、調査結果を取りまとめた。合わせて、里耶秦簡の出土地である遷陵県城址、秦のゲン陵県所在地であるゲン陵古窯城址を踏査した。また、長沙簡牘博物館でも走馬楼漢簡・走馬楼呉簡を調査し、今後の比較材料とした。調査および研究の成果は以下のとおり。1.里耶秦簡家族名簿(戸籍様簡)について、書式の特徴や作成・使用過程をしめす痕跡を発見した。現時点で調査データは整理済みであるが、【現在までの進捗状況】に記入した理由により、公表はひかえている。公表可能となれば、考察結果とともに発表する予定である。2.里耶秦簡にみる漆の調達と利用を題材に、秦代の県機構における手工業の重要性や原料としての漆の広範囲の移動を明らかにした。この研究には里耶秦簡博物館での調査による作成過程についての知見が、簿籍を作成した遷陵県での漆関係業務の復元に役立った。3.走馬楼呉簡吏民簿を実見調査し、簿籍の編綴痕や作成・使用状況の有無を確認したり、釈字を検討したりした。また、今回調査した走馬楼漢簡・走馬楼呉簡は竹簡が大部分であるが、里耶秦簡や居延漢簡にはみられない長大な竹簡を実見し、現地の研究者から作成官署や用途により竹簡の素材が異なることを教示された。2019年度に調査する居延漢簡・肩水金関漢簡にも内地からもたらされたと考えられる竹簡が含まれており、簿籍への竹簡利用方法の共通点・相違点を考える材料をえた。4.遷陵県城址、ゲン陵古窯城址の実見により、両城址がいずれも河川に面して築かれており、河川が主要な移動手段であり、酉水・ゲン水が当時の交通の大動脈であることを確認した。今回の簡牘調査では里耶秦簡の家族名簿について、これまで指摘されてこなかった作成過程をしめす特徴を発見することができた。しかし、里耶秦簡の大部分を所蔵する湖南省文物考古研究所の意向で、里耶秦簡報告書の当該部分が出版されるまで調査結果の公表を控えることとした。現在、調査時のデータは整理済みのため、里耶秦簡報告書出版後すぐに発表するつもりでいる。また、漆の調達と利用についての研究は、簿籍の作成過程に着目する点で本研究が基礎とする簿籍(家族名簿・移動者名簿)の集成、復元にも役立つものである。来年度も簿籍集成・復元のための基礎研究は継続するつもりだが、集成・復元結果をもとにした「家族と移動」についての具体的な研究が後半2カ年の課題となる。(1)居延漢簡・肩水金関漢簡による旅行者のプロフィール研究居延漢簡・肩水金関漢簡に残る通行証や移動者名簿を利用して、旅行者の構成員の年齢・爵位などをデータ化する。ここでいう旅行者とは主に商用旅行者や官吏などと、旅行者のグループに奉公人として従う者を指す。このデータ化によって、世帯内非血縁者の多寡や性格、個人が広域の移動を経験するタイミングを理解することができる。(2)里耶秦簡による家族・世帯間移動の研究公表の遅れている里耶秦簡であるが、まもなく未公表簡を収録した報告が出版されるといわれる。出版され次第、家族・世帯にかかわる名簿や文書を抽出・整理し、家族・世帯間の人の移動、世帯構成員の地域を越えた移動の諸相を研究する。(3)里耶秦簡・走馬楼漢簡の実見、および里耶秦簡出土地調査今年
条里地割の施工単位・基準と立地条件に関する歴史地理学的研究

研究対象地域は,主に滋賀県の湖東平野および安曇川下流域平野,京都府亀岡盆地,大阪平野南部,濃尾平野,讃岐平野,関東平野,であった.研究の方法は, (1)主に1万分ノ1空中写真に写された条里地割1町方格遺構をトレースし,阡線・陥線が同一プランに乗らないもの,方位を異にする部分などを,分布の公狭にかかわらずすべて識別し,地形(立地条件)とのかかわりにおいて条理施工単元をとらえる一般手法を確立すること,(2)主に5000分ノ1, 2500分ノ1の大縮尺図上で,条理地割1町方格遺構=「坪」区画遺構をトレースし,各「坪」の辺長計測データをパソコンに入力し,立体地図作成プログラムを改良しながら,「坪」辺長の数値を「高さ」として表現する一種のブロックダイアグラムを多数作成し,そのパターンを読むこと.(3)近世絵図に描かれた条理1町方格遺構を分析すること,などであった.上記方法の(1), (3)は伝統的な手法であり, (2)が,特にわれわれの開発した新しい手法であり,研究の重点も,この手法で作成したブロックダイアグラムとその基礎となった計測データの,一般的な活用有効性の検計に向けられた.結果は,例えば(1)106.5m111.5mの標準「坪」辺長は,おおむね40%前後で,辺長頻度分布はバラツキが大きいと一般的に伝える.(2)南北方向の坪辺長に比し,東西方向の坪辺長が長いものが多いといった種類の一般傾向の存在を把握しやすい.(3)一定の広さごとにパターンの違いを見せるケースが多く,郡界線とのかかわりや,郷ないしそれ以下の条理施工単元の存在を窺い知らせてくれることが稀でない,など,単に条理研究にとどまらず,今後の歴史地理研究一般の新しい展開を促す数多くの情報の発信源となるものとして,われわれの開発したブロックダイアグラムは有効なものと判断できるようになった.研究対象地域は,主に滋賀県の湖東平野および安曇川下流域平野,京都府亀岡盆地,大阪平野南部,濃尾平野,讃岐平野,関東平野,であった.研究の方法は, (1)主に1万分ノ1空中写真に写された条里地割1町方格遺構をトレースし,阡線・陥線が同一プランに乗らないもの,方位を異にする部分などを,分布の公狭にかかわらずすべて識別し,地形(立地条件)とのかかわりにおいて条理施工単元をとらえる一般手法を確立すること,(2)主に5000分ノ1, 2500分ノ1の大縮尺図上で,条理地割1町方格遺構=「坪」区画遺構をトレースし,各「坪」の辺長計測データをパソコンに入力し,立体地図作成プログラムを改良しながら,「坪」辺長の数値を「高さ」として表現する一種のブロックダイアグラムを多数作成し,そのパターンを読むこと.(3)近世絵図に描かれた条理1町方格遺構を分析すること,などであった.上記方法の(1), (3)は伝統的な手法であり, (2)が,特にわれわれの開発した新しい手法であり,研究の重点も,この手法で作成したブロックダイアグラムとその基礎となった計測データの,一般的な活用有効性の検計に向けられた.結果は,例えば(1)106.5m111.5mの標準「坪」辺長は,おおむね40%前後で,辺長頻度分布はバラツキが大きいと一般的に伝える.(2)南北方向の坪辺長に比し,東西方向の坪辺長が長いものが多いといった種類の一般傾向の存在を把握しやすい.(3)一定の広さごとにパターンの違いを見せるケースが多く,郡界線とのかかわりや,郷ないしそれ以下の条理施工単元の存在を窺い知らせてくれることが稀でない,など,単に条理研究にとどまらず,今後の歴史地理研究一般の新しい展開を促す数多くの情報の発信源となるものとして,われわれの開発したブロックダイアグラムは有効なものと判断できるようになった.本年度は、滋賀県・京都府・大阪府・香川県・群馬県等の各平野部の条里地割分布地の大縮尺図ならびにそれらの一部地区の空中写真を入手し、また研究代表者および研究分担者がそれぞれ東京都・神奈川県・香川県・愛知県・奈良県・京都府の各地に出張して現地資料を収集し、同時に現地調査を行った。一方、これらの大縮尺図・空中写真入手地域および現地調査実施地域については、既往の条里地割に関する研究・データの整理をも進めた。入手した大縮尺図や空中写真によって条里地割を詳細に検討した結果、方位や方格網のずれなどによる様々な齟齬を介在した小条里地割区とでも表現し得る単位が、従来指摘されていた以上に広い範囲に分布することが確認された。また、それを統一的・計量的に把握する方法としては、大縮尺図上において条里地割の方格網のサイズを一つ一つ計測し、その数置を電算機に打ち込み、立体地図作成プログラムによって立体地図化するのが有効であることが判明した。本年度はまず、滋賀県湖東平野の主要地域について、条里地割の形態・サイズの立体地図を作成したが、次年度においては、事例をさらに増加させる予定である。条里地割の方位やその基準などについては、京都府亀岡盆地・大阪村和泉地方・香川県などにおいて,分析作業・現地調査を進めたが、これについては次年度にさらに継続して行なう必要がある。

ところで、現在の地表にみられる条里地割は、必ずしも古代(あるいは中世)の施工時点のものではなく、様々の改変を経ていると考えられるが、そのプロセスにおいては、中・近世における条理地割の認識が重要な関与をしたとみられる。この点についても事例分析を進め、本報告書11欄記載欄の論文としてその成果を発表した。
練りきり（和菓子）の色彩が食嗜好・食行動に及ぼす影響ー発達段階に応じた食育実践ー

食における色の効果を大切にしてきた我が国には,和菓子という伝統的な菓子がある。和菓子には,季節や行事により種類・色・形・材料などが使い分けられるなど,他国の菓子には見られない特徴を持つ。一方,現代においては,食における色彩は軽視される傾向にある。また,和菓子の喫食頻度は減少傾向にあり,食文化の継承という面において懸念すべき状況にある。本研究では,色の美しさが特徴であり,色の配色や形の変化により季節感や造形美を表現できる練りきりに着目し,その食嗜好と色嗜好について,園児・児童・成人を対象とした調査を行った。これにより,成長に伴う食嗜好や色嗜好の変化,および食行動への影響を検討した。おいしさは、味、香りなどの化学的要因、および、食感などの物理的要因により決定される。中でも、視覚はおいしさを左右する大きな要因の一つである。日本料理においては、色彩が鮮明で美しいことが大切にされるが、見た目の美しさは素材の天然色を生かす調理法、盛り付け方など、視覚上の演出方法によるところが大きい。食における色の効果を大切にしてきた我が国には、和菓子という伝統的な菓子がある。和菓子は、1種類・色・形・材料など多様である、2季節や行事により用途が異なる、3製法が多く、テクスチャーが多様である、4カロリーが低い、5卵や小麦粉に起因する食物アレルギーの心配が少ないなど、他国の菓子には見られない優れた特徴を持ち、我が国の重要な食文化の一つとなっている。一方、現代社会においては、加工品の普及により、簡便性、合理性、利便性が重視され、食における色彩は軽視される傾向にある。また、食生活の洋風化により、和菓子の喫食頻度は減少傾向にあり、食文化の継承という面において懸念すべき状況にある。本研究室では、和菓子の中でも色の美しさが特徴であり、色の配色や形の変化により季節感や造形美を表現できる練りきりに着目し、研究を進めており、いくつかの知見を得ている。和菓子の色が食嗜好や食行動に与える影響については本研究室以外では全く研究が行われておらず、新規性のある研究といえる。加えて、健全な食嗜好・食行動・食習慣の形成や食文化の継承には幼少の頃から体系的に食教育を行う必要があるが、実践例の報告はほとんどないのが現状であり、本研究は食文化の継承という面からも貢献できる。本年度は、練りきりに対する食嗜好性と食行動について、中学生と大学生を対象に検討を行った。また、練りきりの色彩構成と味覚との関連から、中学生を対象とした調査および実践研究を行った。視覚はおいしさを感じる上で大きな役割を果たしている。和菓子には、1季節や行事により種類・色・形・材料などが使い分けられる、2形や色、テクスチャーが多様である、3カロリーが低い、4卵や小麦粉に起因する食物アレルギーの心配が少ないなど、他国の菓子には見られない優れた特徴を持つ。加えて、健全な食嗜好・食行動・食習慣の形成や食文化の継承には幼少の頃から体系的に食教育を行なう必要があるが、実践例の報告はほとんどないのが現状であり、本研究は食文化の継承という面からも貢献できる。本年度では、練りきりの色彩構成と味覚との関連から、大学生を対象とした調査および実践研究を行なった。特に練りきりの色彩構成(色相,明度,彩度)が甘味感受性に及ぼす影響に着目し、男女間における食嗜好や色嗜好の変化を追究した。食文化の継承・発展の面で期待できる伝統文化の一つとして,和菓子が挙げられる。和菓子は長い歴史の中で多様な製菓材料・製菓技術を総合させて完成されたもので,日本人独特の情感や季節感を盛り込み,菓銘をもった,世界に例のない精巧な菓子である。しかし,食生活の洋風化により,和菓子の喫食頻度は,特に若い世代において減少傾向にある。また,地方都市においては,人口減少と高齢化に伴い,和菓子の需要は縮小傾向にあるなど,食文化継承の面で懸念すべき状況にある。

本研究室においては,和菓子の嗜好性や学習状況について研究を行っている。その中で,大学生における和菓子の嗜好性は低くないものの喫食経験が少ないこと,また,幼児を対象にした調査より,年少の段階から和菓子に触れることにより,和菓子の嗜好性が高まるという結果が得られている。しかし,幼稚園児から大学生に至るまでの成長過程における和菓子の嗜好性や意識に関しては不明な点が多い。そこで,本研究では,まず,中学生を対象として和菓子に対する嗜好性や喫食頻度について検討した。中学生を対象とした理由として,まず,中学生の生活のあり方が幼児や大学生とは異なることが挙げられる。発達段階にある中学生および高等学校生の和菓子に対する意識や実態を把握するとともに,先に行った大学生の結果と比較することで,異なる年代間の共通点や相違点を見出すことができる。これにより,成長段階に合わせた食文化の教育の在り方を探り,文化・伝統継承に関する食育教材開発の一助とした。食品学これまで詳細に調査されてこなかった我が国の食文化の一つである、和菓子の色彩構成と味覚との関係について、食嗜好性とも関連させて検討した。練りきりについては、茶席で用いられる和菓子であり、その色彩構成により季節感などを繊細に表現することが知られているが、練りきりの色彩構成が味覚に与える影響については調査されておらず、新規性のある調査といえる。これまで詳細に調査されてこなかった我が国の食文化の一つである、和菓子の色彩構成と味覚との関係について、食嗜好性とも関連させて検討した。平成24、25年度に得られた研究結果をもとに、配色構成と甘味感受性の関係、性別の相違などについて検討していく。これにより、各世代にあった食育教材の開発が可能となるだけでなく、近年、軽視されている食における色の効果についても再認識する一助となると思われる。各校種・学年における食育教材の作成を試みる。平成24年度に得られた研究結果をもとに、さらに世代による相違について検討していく。各校種・学年における食育教材を作成し、実践・評価を行なっていく。該当なし
血中HDLレベルを規定するCausal SNPの探索とその機能解析

米国で広く行われているDTC遺伝学的検査(Direct-to-Consumer Genetic Testing)が近年、日本国内においても開始され、ゲノムワイド関連解析(GWAS)によって得られた知見に基づいて消費者が自身のゲノムを検査できるようになった。現在までに、どのlead SNP(ゲノム上で目印となる一塩基多型)がどのような疾患や形質と関連しているかという情報は国内外で蓄積されてきたが、「この塩基の置換が原因である」といった真に機能を有するcausal SNPの情報はまだ充分ではない。今後、より正確な情報を消費者に届けるためには、causal SNPの探索とその機能解析が必要になる。一方、理化学研究所が主宰する国際研究コンソーシアム「FANTOM」の第5期の成果が発表され、GWASによって見出されたlead SNPがエンハンサーやプロモーターに位置していることが明らかになった。これらの遺伝子制御部位にcausal SNPが位置することで疾患や形質がもたらされるメカニズムを解明することは、生命現象の解明という点からも重要である。本研究では、善玉コレステロールとして知られるHDLコレステロールを血液中で輸送している「高密度リポタンパク質(HDL)」に着目し、その主要構成タンパク質であるアポリポタンパク質A-I(apoAI)を対象とした。まず、apoAI遺伝子のプロモーターに位置するSNPの中から、転写活性に影響を与えるcausal SNPを見出した。そして、転写因子だけをゲノムワイドに網羅した発現ライブラリー「Transcription Factor Expression Library」を独自に構築し、発現クローニングを行った。その結果、見出されたcausal SNPが位置するDNAエレメントに結合する転写因子を同定した。その後、同定した転写因子の機能解析を進めた。まず、apoAI遺伝子のプロモーターに位置するSNPの中から、転写活性に影響を与えるcausal SNPの探索を試みた。次にTFEL scan法を用いて、見出されたcausal SNPが位置するDNAエレメントに結合する転写因子の同定を進めた。apoAI遺伝子のプロモーターに位置するSNPの中から、転写活性に影響を与えるcausal SNPを見出した。そして、転写因子だけをゲノムワイドに網羅した発現ライブラリー「Transcription Factor Expression Library(TFEL)」を独自に構築し、発現クローニングを行った(TFEL scan法)。同定した転写因子の機能解析を進める。実験の進捗状況により、物品の調達が遅れたため。可及的すみやかに実験計画を進め、使用予定の物品の調達を行う。
薬用資源植物を素材とした記憶と痛みを制御する天然分子の探索と創薬研究への展開

がん性疼痛に有効な新規鎮痛剤の探索研究を行い、強力なオピオイド性鎮痛作用を有し、代謝安定性が向上した誘導体を創製した。非オピオイド性鎮痛作用を有するC5-nor stemmadenine型インドールアルカロイド類の効率的合成法を確立した。痛み受容に関与するTRPM8の強力なアンタゴニストであるIboga型アルカロイド類を見出した。認知症改善作用のあるアセチルコリンエステラーゼ阻害剤の探索として、リコポジウム属植物より新規アルカロイド類を見出した。また、リコポジウムアルカロイド類の不斉全合成を達成した。薬用資源植物の成分探索により、脳機能、特に「痛み」と「記憶」の制御に関与する天然リガンドを見いだし、これらシード分子の化学合成および医薬化学研究を実施することで、新規な「鎮痛剤」および「認知症改善薬」開発のための先導化合物の創出を目的に研究を行った。以下が実績である。鎮痛性アルカロイドMGM-9の代謝安定性の改善を目的として、2位が炭素-炭素結合、7位が炭素-酸素結合で架橋した2位、7位sp3炭素の誘導体MGM-29、MGM-30を合成した。その安定性はMGM-9と比較して著しく高く、MGM-9のヘミアミナール構造の2位架橋部位を炭素原子に置き換えることで代謝安定性が向上したことが明らかとなった。7-Hydroxymitragynineをシード分子とした構造活性相関研究により新規鎮痛性アルカロイドMGM-15、MGM-16を創製した。これら化合物のin vivoマウスにおける抗侵害作用は、morphineと比べ、皮下投与ではMGM-15は15倍、MGM-16は71倍、また、経口投与では、MGM-15は50倍、MGM-16は240倍の強力な抗侵害作用を示した。さらに神経障害性疼痛下でのMGM-16の作用は、μ、δ受容体を同程度介したものであることが明らかとなった。カンナビノイド受容体アンタゴニスト活性を有するイボガ型アルカロイド類の全合成研究を行い、新規イボガ型アルカロイドの合成を達成した。VoacangineのTRP受容体に対する活性評価を行い、本化合物がTRPV1並びにTRPM8アンタゴニストであり、さらにTRPM8受容体に対しては化学アゴニスト選択的阻害作用を示すことが明らかとなった。アセチルコリンエステラーゼ阻害剤探索のため、タイ産Lycopodium nummularifoliumの成分探索を行い、新規アルカロイド7種を含む計15種のアルカロイドを単離した。オピオイド性鎮痛作用を有するMGM-9の代謝安定性の改善を目的とした誘導体合成と活性評価を行った。MGM-9の不安定なヘミアミナール構造の2位架橋部位を炭素原子に置き換えたことにより代謝安定性が向上したMGM-29、MGM-30について、マウスを用いたin vivoでの活性評価を行った。その結果、いずれの化合物も用量依存的に鎮痛作用を示し、とくに、MGM-30の鎮痛作用が強力で、作用持続時間が長いことが明らかとなった。また、鎮痛性インドールアルカロイドMitragynine誘導体の体内動態解明のためのSPECT用プローブの合成を検討した。カンナビノイド受容体、あるいはTRPチャネルに対するアンタゴニスト活性を有するイボガ型アルカロイド類(3,6-Oxidovoacangineなど)の不斉全合成を検討した。TRPチャネル阻害作用についてVoacangine並びに関連化合物の構造活性相関研究を行った。その結果、CatharanthineとDihydrocatharanthineが強力なTRPM8アンタゴニストであり、化学アゴニスト選択的TRPM8阻害作用には、イボガ型アルカロイドVoacangineと同じ絶対配置のイソキヌクリジン環の構造が重要であることが示唆された。アセチルコリンエステラーゼ阻害剤探索のため、タイ産Lycopodium carinatumの成分探索を行い、24種のアルカロイドを単離した。また、大量供給法の確立を目指してリコポジウムアルカロイドの不斉全合成を検討し、Flabellidine、Lycodine、Lycoposerramine-Rの不斉全合成を達成した。保有のアルカロイド類を用いてNMDA受容体チャネルブロッカーのスクリーニングを行った。コプシアアルカロイド類、シニクイチアルカロイド類、ストリクタミン類、サルパギン型アルカロイド類の全合成研究を実施し、新規コプシアアルカロイドKopsiyunnanine E、サルパギン型アルカロイド18-Hydroxygardnerineの不斉全合成を達成した。C5-nor stemmadenine型インドールアルカロイドであるConolidineの全合成研究を行った。Conolidineは非オピオイド性新規鎮痛薬のシード化合物と報告されているが、その詳細な作用機序は解明されていなかった。そこで、作用機序解明の為の分子プローブ合成を指向し、Conolidine及びその類縁体2種の合成を行った。鍵反応であるシリルエノールエーテルを用いた金触媒環化反応の詳細な検討を行う事で、副生成物の構造並びに幾何異性体の特異な反応性を見出し、目的化合物の収率を92%まで改善した。同化合物を用いて、Conolidineを含む3つの天然物の全合成を達成し、論文として発表した。カンナビノイド受容体、あるいはTRPチャネルに対するアンタゴニスト活性を有するイボガ型アルカロイド類(voacangineなど)の不斉全合成を検討した。現在までに、本アルカロイドの中心骨格であるイソキヌクリジン環の構築に成功した。アセチルコリンエステラーゼ阻害剤探索のため、タイ産Lycopodium carinatumの成分探索を行い、新規5種を含む26種のアルカロイドを単離した。

既知アルカロイドの内、Lycocarinatine Aとして報告された化合物の化学構造を訂正するに至った。これらの成果を論文として纏め投稿、受理された(日本薬学会誌)。また、大量供給法の確立を目指してリコポジウムアルカロイド類(Lycopoclavamine A)の不斉全合成を検討した。Lycoposerramine-Rの不斉全合成を達成し論文として発表した。コプシアアルカロイド類、シニクイチアルカロイド類、ストリクタミン類、サルパギン型アルカロイド類、ヒガンバナ科アルカロイドの全合成研究を実施し、新規コプシアアルカロイドKopsiyunnanine K、かご型構造を有するサルパギン型アルカロイドKoumineの不斉全合成を達成した。後者の結果は論文として投稿し受理された(アメリカ化学会誌)。がん性疼痛に有効な新規鎮痛剤の探索研究を行い、強力なオピオイド性鎮痛作用を有し、代謝安定性が向上した誘導体を創製した。非オピオイド性鎮痛作用を有するC5-nor stemmadenine型インドールアルカロイド類の効率的合成法を確立した。痛み受容に関与するTRPM8の強力なアンタゴニストであるIboga型アルカロイド類を見出した。認知症改善作用のあるアセチルコリンエステラーゼ阻害剤の探索として、リコポジウム属植物より新規アルカロイド類を見出した。また、リコポジウムアルカロイド類の不斉全合成を達成した。代謝安定性が向上し、鎮痛作用が強力かつ作用持続時間が長い、創薬開発候補化合物MGM-30を創出し、この成果について特許申請を行うことができた。Voacangine類の化学アゴニスト選択的TRPM8阻害に重要な構造を明らかとし、論文として公表できた。リコポジウムアルカロイド(Flabellidine、Lycodine、Lycoposerramine-R)、並びに新規コプシアアルカロイド(Kopsiyunnanine E)の不斉全合成を達成し、論文として公表できた。27年度が最終年度であるため、記入しない。天然資源系薬学(1)平成26年度に得られた結果を基にして、オビオイド受容体アゴニスト(7-Hydroxymitragynine)に関して引き続き機能評価と構造最適化を繰り返し創薬開発候補化合物の取得を目指す。また、mitragynine誘導体の体内動態解明のための分子イメージング(SPECT)用プローブの合成を検討する。(2)カンナビノイド受容体リガンドに関する研究では、引き続き、イボガ型インドールアルカロイドである3,6-Oxidovoacangineの不斉全合成によるサンプル供給を目指す。(3) TRPリガンドに関しては、ボアカンジン類の不斉全合成による評価用サンプル合成、ボアカンジンの化学修飾による誘導体合成を行い、構造活性相関研究を深める。(4)アセチルコリンエステラーゼ阻害剤に関する研究では、引き続き、リコポジウム植物
中世聖人伝の形成と展開についての研究（『増賀上人行業記』の注釈的研究のために）

中世における聖人伝の特質を明らかにする試みとして、中古の遁世者増賀(9131003)が、中古・中世でどのように理想化されたかを中心に研究を進めた。その方法としては、聖人が移住した多武峯・談山神社(奈良県桜井市)周辺に残る文化財の調査・分析、および、信仰儀礼のフィールドワークを主として行い、聖人が信仰対象としてどのように位置づけられていたかを考察した。資料分析の成果としては、聖人の臨終を書き留めた「道義記」(宮内庁書陵部蔵『春夜神記』所収)記録者僧道義を考える一端として、『大鏡』に言及されている藤原兼家四男道義との関連性を考慮しつつ、道義評の「よのしれもの」の語について分析した。その結果、道義が「しれもの」とされたのは先天的な障害者の意味ではなく、出自に関連する語であり、出生のありかたが貴族社会に受け入れられなかったであろうとの結論を得た。したがって、僧道義と藤原道義が同一人物という仮説も考え得るようである。また、文化財調査の結果、聖人にかかわる肖像画2点(奈良国立博物館寄託本、法隆寺蔵本)・絵巻2種(「多武峯縁起絵巻」、「増賀上人行業記」)・講式2種(「談山権現講私記」、「南山講式」)の存在が確認された。講式を含む聖人関係の資料は今後翻刻紹介する予定である。
オートファジー関連遺伝子の発現制御に関する研究

オートファジーは飢餓時における不要タンパクのバルク分解・リサイクルシステムとしての役割に加え、癌をはじめとする様々な疾患の病態に関与することが知られている。本研究では、オートファジーに関与するMAP1LC3遺伝子ファミリーに着目し、ヒト子宮頸がん細胞株におけるエピジェネティック制御が発現に及ぼす影響の一端を解明した。また、小胞体ストレスに関与する転写因子CHOPに着目し、ULK1およびULK2遺伝子プロモーター内のCHOP応答配列を解析した。本研究では、転写因子やエピジェネティクスによるオートファジー関連遺伝子(以下、ATG遺伝子)の発現制御機構の解明を目指した。本年度は、ATG遺伝子の発現制御に関与する転写因子の同定を目指し、小胞体ストレス応答に関わる転写因子の中でもアポトーシス誘導能を有することが知られているCHOPに着目した。具体的には、21種類のヒトATG遺伝子プロモーターのルシフェラーゼ・レポーターの活性を指標として、CHOPがいかなるATG遺伝子の発現を制御するのかHeLa細胞で解析した。結果、CHOPによって直接制御されることが報告されているATG5、GABARAPおよびATG10を含む11種類のルシフェラーゼ・レポーターについて3倍以上のルシフェラーゼ活性上昇を確認した。以上より、小胞体ストレス応答に関わるCHOPは、多くのATG遺伝子の発現制御に関与する可能性が得られた。ヒトATG遺伝子プロモーターのルシフェラーゼ・レポーターの活性を指標として、小胞体ストレス応答に関わるCHOPが、多くのATG遺伝子の発現制御に関与する可能性を得た。また、HeLa細胞において、MAP1LC3ファミリーがエピジェネティックな発現制御を受けている可能性を得た。本研究では、オートファジー関連遺伝子(以下、ATG遺伝子)の発現制御機構の解明を目指した。まず、小胞体ストレス応答に関わる転写因子の中でもアポトーシス誘導能を有することが知られているCHOPにより、ULK1およびULK2遺伝子プロモーターがいかなる発現制御を受けるか、ルシフェラーゼ・レポーターの活性を指標として、HeLa細胞で解析した。結果、ULK1では13 bp、ULK2では53 bpにまでCHOP応答配列を限局化することに成功した。次いで、MAP1LC3遺伝子ファミリー(MAP1LC3A、MAP1LC3BおよびMAP1LC3C)のエピジェネティックな発現制御機構の解明に取り組んだ。まず、HeLa細胞へ5-Aza-2'-deoxycytidine(以下5-aza-CdR)を投与し、定量的リアルタイムRT-PCRを実施した。結果、MAP1LC3C mRNAは経時的な発現増加を示した。次いで、バイサルファイトシーケンシングにより、HeLa細胞におけるCpG配列シトシンのメチル化を確認した。結果、MAP1LC3C遺伝子の転写開始点を+1とした際、-592から-388 bp領域内の7ヶ所のメチル化率は89.9%であり、+423から+785 bp領域内の13ヶ所のメチル化率は35.9%だった。一方、5-aza-CdR投与したCa Ski細胞では、MAP1LC3CよりMAP1LC3A mRNA量がより顕著に増加したので、MAP1LC3A遺伝子のメチル化状態をCa Ski細胞で解析した。バイサルファイトシーケンシングの結果、-419から+14の領域におけるCpG配列シトシンのメチル化率は約99%であった。最後に、DNAメチル化に加え、ヒストンアセチル化の影響も解析した。まず、5-aza-CdRとヒストン脱アセチル化酵素阻害剤をHeLa細胞に連続投与しMAP1LC3C mRNAを検出した。結果、SplitomicinはトリコスタチンA同様、約10倍程度、MS-275は約80倍MAP1LC3C mRNAを増加させた。さらにMS-275投与の結果、経時的なパンクタ数の増加を確認し、ウェスタンブロッティングによる解析では、MAP1LC3タンパクのフォームIおよびIIの増加を確認した。ヒトATG遺伝子の多くがCHOPによる転写制御を受ける可能性が得られ、特に小胞体ストレス下でのオートファジー誘導の分子機構の一端として、CHOPによるULK1およびULK2の転写制御の可能性が得られた。また、HeLa細胞において、MAP1LC3C遺伝子はDNAメチル化に加えヒストン脱アセチル化によるエピジェネティックな発現抑制下にある可能性が得られた。MAP1LC3C遺伝子の転写開始点(+1)を含む領域(-903から+17)をpGL3-Basicに挿入し、HeLa細胞にトランスフェクション後、ルシフェラーゼ活性値を測定した。結果、pGL3-Basicに対して約3倍強のルシフェラーゼ活性の上昇を示した。次に、-903から+17領域をpCpGL3-Basicに挿入しCpG Methyltransferase M.SssIによりメチル化した。ルシフェラーゼアッセイの結果、メチル化前後でpCpGL3 -903/+17のルシフェラーゼ活性に顕著な変化を認めなかった。以上より、-903から+17領域に含まれるCpGのメチル化は、MAP1LC3C遺伝子の転写に影響を及ぼすとは考えにくい。次に、9種類のヒト子宮頸がん細胞株(SKG-I、SKG-II、SKG-IIIa、BOKU、HCA-1、HCSC-1、Ca Ski、ME-180およびHeLa)にMS-275または5-aza-CdRを処理し、定量的リアルタイムRT-PCRを実施した。結果、MS-275処理時にはME-180を除くすべての細胞株で、いずれかのMAP1LC3遺伝子の発現量増加を確認した。

また5-aza-CdR処理時には、BOKUおよびHCSC-1を除くすべての細胞株で、いずれかのMAP1LC3遺伝子の発現量増加を確認した。次いで、ウェスタンブロッティングの結果、MS-275処理時にはMAP1LC3AおよびMAP1LC3Bタンパクの発現量増加は5種類の細胞株で確認できた。一方、5-aza-CdR処理時にはMAP1LC3AおよびMAP1LC3Bタンパクの発現量増加は、それぞれ4および3種類の細胞株で確認できた。オートファジーは飢餓時における不要タンパクのバルク分解・リサイクルシステムとしての役割に加え、癌をはじめとする様々な疾患の病態に関与することが知られている。本研究では、オートファジーに関与するMAP1LC3遺伝子ファミリーに着目し、ヒト子宮頸がん細胞株におけるエピジェネティック制御が発現に及ぼす影響の一端を解明した。また、小胞体ストレスに関与する転写因子CHOPに着目し、ULK1およびULK2遺伝子プロモーター内のCHOP応答配列を解析した。CHOPタンパク質一過性発現時に最も大きなルシフェラーゼ活性の上昇を示したULK1プロモーター・ルシフェラーゼレポーターについて、CHOPに応答する配列の限局化を目指す。また、ULK1に次いで大きなルシフェラーゼ活性の上昇を示したULK2プロモーター・ルシフェラーゼレポーターについても、CHOPに応答する配列の限局化を目指す。一方、ATG遺伝子のエピジェネティックな発現制御の解明については、HeLa細胞以外のヒト子宮頸がん細胞株において、MAP1LC3ファミリーのエピジェネティックな発現制御が普遍的に見られるのか否か解明を目指す。本年度の成果を受け、MAP1LC3遺伝子の発現制御に関わる領域を詳細に解析する。具体的には、CpG配列シトシンにメチル基を導入し、ルシフェラーゼ・レポーター活性を指標としてDNAメチル化がMAP1LC3遺伝子の発現に及ぼす影響を解析する。また、MAP1LC3遺伝子ファミリーのエピジェネティックな発現制御をHeLa細胞などのヒト子宮頸がん細胞株に加えて、複数のがん細胞株で網羅的に解析する。具体的には、定量的リアルタイムRT-PCRでmRNAの発現変化を解析すると同時に、ウェスタンブロッティングでタンパクの検出も試みる。以上より、MAP1LC3遺伝子ファミリーのエピジェネティックな発現制御とオートファジーとの関係、ならびにがん発症との関係解明を目指す。細胞生物学
関節リウマチにおけるMDM2の役割

関節リウマチは自己免疫性の慢性炎症により多関節が罹患し骨や関節の破壊を生じる疾患である。最近の治療ではTNFαやIL-1βをターゲットとした生物製剤が使用でき、治療内容も大きく変化した。しかし、まだ病態が不明で、新しい治療薬が望まれている。以前、我々はリウマチ性滑膜線維芽細胞(RASF)ではHDAC1の活性がTNFαと正の相関をすることを報告。今回我々はHDAC1と複合体を作っていると想定されているMDM2に注目した。実験では、RASFにてTNFα等のサイトカイン刺激下でMDM2阻害剤を使用。蛋白レベルではp53の発現が上昇し、アポトーシスの誘導を示し新しいRAの治療薬となる可能性を考えた。本年度はヒト滑膜組織とリウマチ由来滑膜線維芽細胞におけるMDM2発現を確認する。リウマチ由来滑膜線維芽細胞にてTNFα+IL-6の刺激やMDM2拮抗薬であるnutlin3の投与有無によって3群に分け、蛋白抽出を行い、核内蛋白についてウエスタンブロット法でMDM2、p53、HDAC1の発現について確認した。p53については6時間、12時間後、24時間後に検出したところ上昇を認めた。しかし、MDM2については蛋白の問題か、ブロットが不明瞭であったため今後も抗体の種類や蛋白の内容など検討中である。また検体数も限られているため、今後n数を増やして検討をさらに行う予定である。また、リウマチ由来滑膜線維芽細胞に対してTNFα+IL-6刺激とnutlin-3投与を行ったところ、HE染色にて細胞数の減少と細胞の形状が変化していることを確認した。あわせて、TUNEL染色やヘキスト染色にて細胞核のDNA凝縮を認め、細胞の変形がアポトーシスによるものであることが推定された。またCASPASE3/7の活性では、TNFα+IL-6刺激にnutlin-3投与をしたものが上昇を認め、刺激なくnutlin3を投与したものでは活性の変化を認めなかった。以上より、活性が上昇しなかったことは比較的正常な(炎症を起こしていない)滑膜細胞においては、nutlin3の影響が少ないことが推察され、オフターゲット効果を確認できた。本年度はヒト滑膜組織からリウマチ由来滑膜線維芽細胞を培養し、MTSアッセイをおこなった。Nutlin3刺激群,TNFα・IL-1β刺激有無などにより3群にわけコントロールと比較した。MTSアッセイでは培養細胞の生存率や増殖率を確認するが、炎症性サイトカイン刺激のみでは増殖し、Nutlin3を加えると増殖が抑えられた。またNultlin3のみでは特に細胞の生存に影響を認められなかった。今後さらn数を増やして検討を行う予定である。関節リウマチは罹患患者は人口の約1%弱であるが、慢性の病態であり一旦罹患すると生涯にわたり医療を必要とする。発症年齢は30代から50代であり依然、病態が不明ではあるが近年は治療のパラダイムシフトにより、TNFαやIL-6などのサイトカインをターゲットとした注射剤を中心とした生物製剤が台頭し、古典的DMARDでは得られなかった寛解となる患者も認められているが再発する場合も多い。問題点として、効果があるのは7割程度に限定され、薬価も非常に高価である。個人の負担だけではなく日本の医療費全体の問題となっている。今回、本研究では関節リウマチの病態を掘り下げ、エピジェネティック変化について、特にMDM2が果たす役割について注目した。以前報告した研究ではHDAC1とTNFαが正の相関を認めることを示した事から着想した。HDAC1がMDM2、p53と複合体を形成し相互調整をおこなっている可能性を考慮し、関節リウマチにおけるMDM2の役割について検討した。関節リウマチ患者の手術時の滑膜組織からリウマチ線維芽細胞を培養しTNFなどの刺激を加えMDM2阻害剤の有無について検討した。蛋白を抽出しMDM2阻害剤の投与群ではp53の発現が上昇しHDAC1も影響を受けた。次にTNFαやIL-1βの刺激により線維芽細胞が増殖し続ける原因として、アポトーシスに影響している可能性を考慮した。MTSアッセイを行い、サイトカインで刺激した後にMDM2阻害剤を使用した群と使用していない群では有意ではないが差を認めリウマチ線維芽細胞においてもアポトーシスに傾く傾向が判明。関節リウマチでは滑膜細胞が増殖し続けることが病因であり、MDM2の関与が考えられた。MDM2阻害剤はすでに海外では血液腫瘍など他の疾患で使用可能な薬剤であり、関節リウマチへの臨床応用が望まれる。健康上の問題や研究施設の引越し等あり、達成が困難であった。また検体取得も十分に出来ていないため、検体獲得をしていきたい。リウマチ膠原病内科

積極的に整形外科医師と連絡をとり、検体がでることを確認したい。リウマチ滑膜組織の検体取得が難しく、滑膜組織での実験が十分にできていない。今年度は検体の獲得に努めたい。健康上の問題や研究室の引越し等あり、研究計画通りに進めることが困難であったため金額の差が生じた。繰越にて対応する。積極的に整形外科の医師と連絡をとり、検体がでることを確認していきたい。滑膜組織を使用した蛋白発現や染色、RNA検出などを随時行う。まだn数がいずれも十分でないため、繰り返し条件を考慮して再実験をおこなう。滑膜組織での実験が十分に進まなかったため、金額の差が生じた。繰越にて対応する。滑膜組織を使用した蛋白発現や染色、RNA検出など随時行う。またMDM2抗体について十分に検討できていないため、抗体やその他の条件を変更して、再実験を行う。