hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規二重運動負荷刺激法の開発と誘発されるマイオカインの作用機序解明とその利用検討

行い、自然光下で標本を観察し一次パラメーターを測定した後、それをもとに二次パラメーターの算出し骨形態計測解析を行った。その結果、骨量や類骨量、骨吸収面や静止面などの解析から卵巣摘出マウスに刺激を行った群は行わなかった群に対して活発な骨代謝が行われていることが明らかになった。また、骨芽細胞数や破骨細胞数などからまだ、代謝途中であるとも考えられる。また、刺激装置による物理的な直接刺激だけではなく、骨格筋の収縮弛緩により誘発されていると考えられる肥大した骨格筋由来のサイトカイン(マイオカイン)について解析を行った。中でもインターロイキン(IL)-6とIL-8は骨形態計測の結果同様に活発な代謝が行われていることが示唆された。特にIL-15は、刺激を行った群は行わなかった群に対して大腿四頭筋、下腿三頭筋からの分泌が増加していた。最終年度となりヒトを対象とした研究を行った。基礎研究で得られた刺激条件をそのままヒトへ応用する予定であったが、その設定は予想以上に困難となった。振盪刺激としてshaking board (OG技研)に下腿および大腿部に部分振動装置を取り付け、刺激を行った。3か月間可能な限り実施し骨密度の測定を行ったが明らかな変化は得られなかった。しかし、刺激後1時間後の唾液中のIL-15の発現は増加していた。転倒による骨折は日常生活活動に大きな影響をもたらす。また、関節炎も老化に伴う疾患の1つで、予防や治療を積極的に行っていく必要がある。本研究は骨密度低下モデルマウスを用い新規二重運動負荷刺激法を用いてその症状緩和について検討を行った。その結果、閉経後の骨密度代謝は活発に行われていることが推察でき、運動刺激と休息を十分にとることが骨密度低下の症状緩和につながるのではないかと推察された。また、関節炎モデルマウスを用いた実験からは、運動後に骨格筋から抗炎症性作用マイオカインの発現量が増加し、炎症性作マイオカインの発現量が抑制された。それにより関節炎の発症の遅延化と症状進行の遅延化が推察された。振盪刺激に振動刺激を加えた動物用ダブルメカニカルストレス装置を作成し(特注:日伸理科)、その相乗効果について骨密度が低下する卵巣摘出マウス(閉経後モデル)用いた基礎実験を行い筋および骨についての解析を行った。その結果、刺激を行ったマウスでは、体幹につながる下半身の筋と大腿および下腿の筋肥大、大腿骨の骨密度の急激な低下を緩和することが明らかとなった。また、それだけではなく今回、注目する運動刺激により骨格筋から発現分泌されるマイオカインであるインターロイキン(IL)-15が、大腿四頭筋と下腿三頭筋からの刺激有群で発現増加が確認できた(p<0.05)。しかし、サイトカインや成長因子など含むメンブレンアレイ(RayBiotech, Inc.)を用いた網羅的解析を行ったが、その測定方法では感度の問題が生じ明確な結果を得ることができなった。一方で採取した筋から抽出液を作成し、骨細胞と破骨細胞に添加する細胞培養実験系の方が進行している。また、その筋抽出液をAlzetカプセル(半透膜による持続投与:DURECTTM)に入れ、マウス皮下に埋め込み、Parabiosis的効果を検証することを計画していたが、筋溶液がスムーズにカプセルから長期投与できない問題が生じた。
ヒト脳の形態形成から行動生成に至る発達のダイナミクス

ヒト胚子・胎児のMR画像、CT画像、連続組織切片等を用い、コンピュータ上で再構成を行い、脳・感覚器・血管系・頭蓋骨の形態形成を発生段階ごとに3次元可視化、定量化を行ってきた。特に、本年度は、胚子期の脳の連続組織切片データの分析より、脳のサブプレート層の発達が側頭部から拡がることを明らかにした。また、複雑な構造を持つ中顔面骨格の発達が、幾何学的形態計測手法により定量化された。さらに、頭蓋骨の各骨要素に分離した再構成により、各脳部位の成長速度に応じて頭蓋骨が部位特異的に発達することを示唆する証拠を得た。早産児で撮像されたMRI構造画像より白質・灰白質表面(脳表)・頭表を再構成し、fNIRS計測部位と脳部位との対応を明らかにした。また、早産児のfNIRS計測により、自発活動の脳領域間に位相差が認められた。新生児・乳児で計測したfNIRS信号の分析を行い、音声刺激時の前頭葉と他の領域との間の動的機能結合が発達とともに広がっていくことや、自発活動の位相が主要な脳溝の腹側から背側へと遅れることを見つけた。さらに、乳児において、動睡眠から静睡眠へと状態の変化に伴い、fNIRS信号が空間的に同期したパターンから非同期のパターンへ変化するとともに、特徴的な脳波パターンの変化と対応づけられることが明らかになった。脳の代謝・自発活動・組織の力学特性等に焦点を当て、脳の形態形成、回路形成、機能発現の機構を包括的に理解するための理論的な取り組みを行なってきた。本年度は、脳の皺形成に焦点を当てた物理的変形モデルを構築し、皮質の組織の成長率の高い部位に脳溝が形成されることを明らかにした。また、皮質表面上での神経活動の伝搬過程を理論的に解析し、進行波の方向は皮質の曲面の最短経路に一致することを理論的に予測した。さらに、自発活動が皮質の成長の促進作用を通じて脳溝形成に影響を及ぼしうることを理論的に考察した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。ヒトの胚子・胎児から新生児・乳児に至る脳の構造と機能の発達について、イメージング・行動・理論モデルの研究を推進するとともに、それらを統合した新たな枠組みを作るための基盤作りを行った。具体的には、以下のような取り組みを行い、成果を得た。(1)胎児標本のMRI構造画像・拡散テンソル画像の撮像を行い、白質線維の発達過程の可視化を目指した検討を行った。胚子・胎児のMRI構造画像より、脳形態形成、特に脳溝の形成に着目した解析を進めた。(2)睡眠中の乳児においてNIRSを用いて計測した脳血液動態のデータ解析を行ったところ、酸素化ヘモグロビンと脱酸素化ヘモグロビンの変動の位相差が、新生児と3ヶ月児の間で同位相から逆位相へと顕著な変化を示すことを発見した。さらに、NICUで治療が必要な早産児を対象とした計測を行い、同様な位相差の変化があることを見いだした。病的児を対象とした計測も実施した。(3)乳児のNIRSによる刺激応答や機能的ネットワークの計測では、成人に比べて頭部表面の血液動態の影響が少ないことを明らかにした。また、生後23ヶ月児を対象とし、睡眠時の脳の自発活動にともなう脳血液動態を広範な脳領域をカバーする94チャンネルNIRSで計測するとともに、脳波を同時に取得した。その結果、静睡眠では脳領域間で非同期、動睡眠では同期した変動パターンが見られることがわかった。これは、乳児における睡眠状態に応じた脳の機能的ネットワークの顕著な動的変化を初めて明らかにした点で、重要な発見である。(4)脳の構造および機能発達の理論構築を目指し、新生児期の脳の構造・機能イメージングデータに対応付けが可能な神経場モデルの構築を進めた。また、胎児期の皮質の折り畳みの理解のため、細胞の増殖と組織の弾性を考慮した座屈のモデルについて検討を行った。ヒトの胚子・胎児から新生児・乳児に至る脳の構造と機能の発達について、昨年度に引き続きイメージング・行動・理論モデルの研究を推進するとともに、新たな課題も加えた。(1)胚子・胎児標本のMRI画像、DTI画像、CT画像、組織切片等を用いて、脳および頭部の3次元形状の発達を明らかにするためのデータを蓄積し、幾何形状の解析を引き続き行った。胎児標本において頭蓋骨の発生について分析を開始した。(2)新生児・乳児の脳血流動態についてNIRSを用いた計測を行い、酸素化および脱酸素化ヘモグロビンの変化の位相差の発達を調べ、在胎32週未満の早産児は満期以前にはすでに満期産児より発達が進行しているが、その後の進行が遅いことが明らかになった。また、脳血管系および酸素代謝系の動力学モデルを構築し、ヘモグロビンの変化の位相差の機序について検討を行った。(3)睡眠中の乳児の睡眠中の乳児聴覚刺激を与えた時の応答について、振幅応答と、位相反応曲線による位相応答を分析し、領域による応答の違いを見いだした。睡眠時の自発活動を2ヶ月児で計測し、動睡眠・静睡眠に応じた自発活動の位相ダイナミクスは3ヶ月児と類似していることを明らかにした。また、睡眠時の脳波に性差がある可能性を示すデータを得た。(4)皮質に対応する

2次元の神経場に、白質線維に対応する長距離結合を導入し、孤立波が離れた場所に伝播し維持されることを見いだした。また、皮質の折り畳み構造に対応する曲率を持つ2次元の反応拡散系として、フィッツフュー南雲モデルを用いた進行波の特徴を分析した。本研究は、ヒトの脳の発達に関して、胚子・胎児、新生児・病的児、乳児、理論モデルの4つの領域にまたがる課題を含んでいるが、それぞれの領域を主な専門とする研究代表者および研究分担者・連携研究者が、これまでの実績や専門性を発展させた形で本研究課題に取り組むことで、すでにいくつかの重要な成果を得ている。また、研究代表者らは、研究分担者や連携研究者とのさらに密な協力体制を構築するために、双方にとって新規な対象・方法論・考え方を習得しながら、時間をかけた議論を繰り返し、今後の研究において、新たな枠組みを構築して推進するための基盤作りに取り組んだ。ヒトの胚子・胎児から新生児・乳児に至る脳の構造と機能の発達について、引き続きイメージング・行動・理論モデルの研究を推進した。具体的には、以下のような取り組みを行い、成果を得た。(1)代表的な標本のMR顕微鏡で撮像された画像より、終脳・間脳・中脳・橋・小脳・延髄の領域分割を試みた。その結果、解剖学的なランドマークに基づいた境界設定を行うことが可能となり、カーネギー発生段階ごとに19のヒト脳3Dモデルを作成することができた。また、胎児期の16-40週齢における脳溝の発達を定量化した。胎児標本のCT画像約30個体の頭蓋骨のセグメンテーションを行った。(2)脳血流動態についてfNIRSを用いた計測を、NICUに在院中の満期産児・後期早産児・前期早産児に加え、満期産児で在院歴のない2-6ヶ月齢児で実施した。酸素化および脱酸素化ヘモグロビンの変化の位相差をhPodと名づけこの指標によって脳の発達を鋭敏に捉えられることを発見した。(3)睡眠中の23ヶ月児でfNIRSデータの分析より、機能的ネットワークが、動睡眠・静睡眠の違いに応じて変化することが明らかになったため、さらに、fNIRSと脳波や他の生体信号の同時計測を開始した。また、3ヶ月児に音声を提示しながらfNIRS計測をすると、自発活動と同様に左半球の下前頭回がハブ性を示すことを見出した。(4)発達期の脳の自発活動と代謝の変動に関するモデルの構築を行なった。また、胎児期の脳の形態形成の機構を調べるため、連続体力学に基づき成長する板の理論を検討し、大脳皮質の二次元断面に対応する数値計算模型を構成した。さらに、神経場のモデルの情報処理能力の性質とその空間変形や長距離ネットワークによる効果を検討した。本研究は、ヒトの脳の発達に関して、胚子・胎児、新生児・病的児、乳児、理論モデルの4つの領域にまたがる課題を含んでいる。それぞれの領域での研究が進展するとともに、密な協力・連携の実施による、重要な成果も得られている。新生児・病的児の研究では、脳の発達を鋭敏に示す新たな指標を発見し、インパクトの高い報告を行なった。ヒトの胚子・胎児・新生児・乳児の脳の構造と機能の発達について、イメージング・行動・理論モデルの研究を推進した。(1)胎児期MRIデータを用いて、手動及び半手動抽出による脳の3次元モデルの作成が可能になり、脳実質・脳室・神経核の形態形成についての定量的解析を行った。また、μCT画像を用いて、骨化済頭部骨格の三次元再構築を行い、MRIデータとμCTデータの統合を検討した。
核酸医薬の経鼻投与型ワクチンアジュバントへの応用

本研究は免疫アジュバントとして期待されるCpG-oligo-deoxynucleotide(CpG-ODN)の粘膜免疫アジュバントとしての有用性を検討したものであり, CpG-ODNとリポソーム複合体は安全で有用な粘膜ワクチンアジュバントとして期待できることを明らかとした.また,抗原特異的IgAの誘導にIL-6が重要なサイトカインとして機能しており,その産生にキャリアーとして用いたリポソームの構成脂質の一つであるDC-Cholが深くかかわっていることを明らかとした.本研究は免疫アジュバントとして期待されるCpG-oligo-deoxynucleotide(CpG-ODN)の粘膜免疫アジュバントとしての有用性を検討したものであり, CpG-ODNとリポソーム複合体は安全で有用な粘膜ワクチンアジュバントとして期待できることを明らかとした.また,抗原特異的IgAの誘導にIL-6が重要なサイトカインとして機能しており,その産生にキャリアーとして用いたリポソームの構成脂質の一つであるDC-Cholが深くかかわっていることを明らかとした.核酸医薬として期待されるCpG-ODNはマクロファージや樹状細胞から強力にIL-12を産生誘導すること,またIL-12が粘膜免疫のアジュバントとして有用であることが報告されていることから,CpG-ODNを粘膜免疫アジュバントに応用することを企図した.脂質組成の異なる2種類の正電荷リポソームにモデル抗原であるOVAとCpG-ODNを封入し,マウス鼻腔に投与し,鼻咽頭関連リンパ組織(NALT)におけるIL-12mRNAおよび粘膜免疫活性化の指標である抗原特異的IgAレベルを測定したところ,DOTAP/cholesterolからなるリポソームを用いた場合,NALTにおける有意に高いL-12発現と鼻腔洗浄液中へのIgAの分泌が観察された.一方,DOTAP/DC-cholesterolを脂質組成とするリポソームを用いた場合,有意に高いIgA産生は観察されたものの,IL-12の発現は低値であり,粘膜免疫賦活化へのIL-12の関与が疑問視された.粘膜でのTGF-βは,IgAへの抗体クラススイッチに関与し,一方,IL-6は,B細胞の形質細胞への分化・増殖に関与していることが報告されている.そこで,リポソームに封入したCpG-ODN投与後のNALT単核球細胞回収上清中における両サイトカインレベルを測定したところ,いずれのリポソーム投与群で有意に高いIL-6の産生が認められた.これらの知見から,CpG-DOTAP/cholやCpG-DOTAP/DC-cholに封入したCpG-ODNの鼻腔内投与による粘膜免疫の賦活化にIL-12の関与は低く,IL-6産生の増強が,IgA産生の誘導に深く関わっていることが示唆された.免疫増強作用を有するCpG-ODNをDOTAPおよびcholesterol (Chol)またはその誘導体であるDC-cholesterol (DC-Chol)を構成脂質とする正電荷リポソームおよびモデル抗原であるOVAとともにマウスに経鼻投与することにより,粘膜免疫系のみならず全身免疫系のいずれもが賦活化されることを明らかとし, CpG-ODNの新たなアジュバントとしての可能性を示した.さらに,二種の正電荷リポソーム(CpG-DOTAP/CholおよびCpG-DOTAP/DC-Chol)投与群において,後者を用いることによりIgA, IgG産生が増強することを明らかとした.当該年度OVAとCpG-リポソームの経鼻投与による粘膜免疫応答の誘導の詳細な機構や,脂質組成の違いによる粘膜免疫賦活化の差異について検討を加え,以下の点を明らかにした.1. CpG-DOTAP/DC-chol投与群ではCpG-ODNはTh1優位な全身免疫応答やCTLの賦活化に必要なアジュバントであるが,粘膜免疫の賦活化には必ずしも必要ではなかった.2.CpG-DOTAP/DC-chol投与群のnasal passageにおいて著しいIL-6の産生誘導が観察され,さらに抗IL-6 receptor抗体の前投与によりIgA産生が顕著に抑制されたことから, CpG-DOTAP/DC-chol投与による粘膜免疫の賦活化にIL-6の関与を明らかとした.3.粘膜免疫の賦活化にリポソーム構成脂質中のDC-Cholが深く関わることを明らかとした.4.CpG-DOTAP/DC-cholは動物実験で用いられる強力な粘膜免疫賦活剤であるコレラトキシンと同等のIgA誘導能を示した.以上,当該年度得られた結果も含め,本プロジェクトで得られた知見を投稿論文として現在纏めている.
in vivoモデルのmiRNA発現解析に基づく前立腺癌浸潤機序の解明

前立腺癌の局所における浸潤機構解明を目的とし、ヒト前立腺癌細胞株であるLNCaP,PC-3およびDU145を用いて、マウスin vivoモデルを作成した。すなはち、各前立腺癌細胞株をMatrigelと混和し1 x 107個の細胞をnude mouseの背部皮下に移植、皮下腫瘍径が10mmの時点で腫瘍を周囲組織と一塊に摘除し、組織は無固定にてOCT compoundに包埋し、凍結保存した。厚さ10μmの連続切片を20枚作成し、後固定後にHE染色にてinvasive frontと非浸潤部分、および正常腺組織を同定した。また、他の連続切片をトルイジンブルー染色し、前立腺癌が周囲組織に浸潤した先端部分であるinvasivefrontと腫瘍の中心部で壊死像を認めない非浸潤部部を同定した。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションによってinvasive frontと非浸潤部分の選択的な切り出しを12例試行し、microRNA抽出キット(miRNeasy mini kit(Qiagen社)を用いてRNAを抽出した。RNAのQualityが解析に適していることを確認し、現在、microRNA解析を行う前段階にある。前立腺癌細胞LNCaP, PC-3およびDU145を用いたヌードマウス前立腺癌in vivoモデル組織像の解析の結果、PC-3が最も再現性の高い浸潤傾向を認めた。PC-3前立腺癌モデルにおいて1)癌が周囲組織に浸潤した先端部分であるinvasive frontと2)腫瘍の中心部で壊死像を認めない非浸潤部を同定し免疫染色を行った結果、Invasive frontではリン酸化E-cadherinおよびβ-cateninの発現低下を認めた一方で、リン酸化Akt, MMP7および9の発現が亢進していた。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションによってinvasive frontと非浸潤部分の選択的な切り出しを行い、microRNA (miRNA)の抽出とマイクロアレイを行いmiRNA発現パターンの解析により浸潤に関与するmiRNAの同定を試みた。個体間に若干の発現パターンの差が見られたが、invasive frontと非浸潤部分において有意に発現が異なるmiRNAを複数同定した。今後機能解析により同定したmiRNAと癌細胞逡巡との関わりを明らかにする必要がある。医歯薬学当初の予定通り、マウス前立腺癌モデルの作成と、組織の摘出を終了している。また、RNA抽出も進行しており、Qualityに問題がないことが確認できれば、今後解析に移行可能と考えられる。抽出したRNAのQualityを確認した後にmicro RNAの解析を行っていく。実験がおおむね順調に進んだことで、当初予定していた抗体や試薬が少なくて済んだため。学会発表を予定しているため国内出張費にあてる。
メタボリックシンドロームにおける腎障害進展のメカニズムの解明

Na利尿ペプチドの受容体であるGC-A遺伝子欠損マウス(GC-AKO)の高脂肪食負荷において野生型(WT)の高脂肪食負荷に比し有意な糸球体の腫大と糸球体基底膜の肥厚、上皮細胞足突起の癒合が認められた。また糸球体上皮細胞特異的分子であるnephrinの発現低下を認めた。これらの結果から内因性のNa利尿ペプチド系が細胞周期抑制分子の亢進による糸球体上皮細胞障害に対し保護的に働くことにより、メタボリックシンドローム関連腎障害に保護的に働いている可能性が示唆された。内因性ナトリウム利尿ペプチド系の肥満・メタボリックシンドローム関連腎障害における役割をナトリウム利尿ペプチドの受容体であるguanylyl cyclase-coupled receptor(GCA)の遺伝子欠損マウス(GCAKO)を用いて明らかにするため8週齢のGCAKO及びその対照マウス(WT)に高脂肪食(HF)による肥満モデルを作成し,8週後の尿アルブミン排泄,腎組織像を検討した。高脂肪食負荷後8週において,HF群はKO,WTとも通常食群(C群)に比し有意な体重増加を認めた。8週後においてHF-WT群はC-WT群に比し尿アルブミンの増加が認められなかったが,HF-KO群ではC-KOに比し有意な尿アルブミンの増加を認めた。腎組織はHF-WT群ではC-WT群と光顕上明らかな差は認めなかったが,HF-KO群では糸球体の明らかな腫大を認めた。しかし,メサンギウム基質の増加にはHF-WT群とHF-KO群で明らかな差は認めなかった。また電顕上HF-KO群ではfoot processの癒合,糸球体基底膜の肥厚が認められたが,HF-WT群ではそれらの変化は軽度であった。WT-1陽性細胞数による糸球体上皮細胞数の定量を行ったが,HF-KO群とHF-WT群間に差は認めなかった。しかしHF-KO群はHF-WT群に比しslit diaphragm関連蛋白であるnephrin遺伝子発現の低下を認めた。また一方糸球体硬化に重要なtransforming growthfactor-βや糖尿病性腎症の進展に重要とされるvascular endothelial growthfactorの遺伝子発現には両群で差を認めなかった。これらの結果からメタボリックシンドローム関連腎障害において糸球体上皮細胞障害が引き起こされ,GCAを介した作用がこれに防御的に作用している可能性が示唆された。内因性Na利尿ペプチド系がメタボリックシンドローム関連腎障害進展に及ぼす効果を明らかにするためにAtrial natriureticpeptide, Brain natriuretic peptideの受容体であるguanylyl cyclase A (GC-A)遺伝子欠損マウスの高脂肪食負荷モデルを用いて検討した。高脂肪食負荷4週後より正脂肪食群に比し、WT、GC-A KOとも明らかな体重の増加を認めた。高脂肪食負荷後8週でGC-A KOでは対照マウス(WT)に比し、有意な尿アルブミン排泄の増加を認め、光顕像(PAS染色)では明らかな糸球体の肥大を認めた。また電子顕微鏡による解析でも糸球体基底膜の肥厚、上皮細胞足突起の癒合が認められた。このようにGC-A KOでは高脂肪食負荷において糸球体上皮細胞障害が増悪することが明らかになった。定量的PCRにて糸球体上皮細胞特異的分子であるnephrinの発現低下を認めた。また免疫染色による検討において細胞周期調節蛋白で細胞周期抑制に働き、糖尿病性腎症の糸球体上皮細胞障害に関与していることが報告されているp27, p57の発現が高脂肪食負荷GC-A KOでWTに比し発現が亢進していた。一方糖尿病性腎症の進展に強く関与していることが報告されているVascular endothelial growthfactorやTransforming growthfactor-βの遺伝子発現や炎症関連の分子であるMonocyte chemoattractant protein-1蛋白の発現は高脂肪食モデルにおいてWTとGC-A KOで有意な差を認めなかった。
黒ボク土における腐植のアルミニウム制御物質としての機能

黒ボク土のアルミニウム(Al)-腐植複合体(Alと有機物の結びついた物質)が,土壌の性質や植物生育に及ぼす影響を調べた。Al-腐植複合体は,その大部分は安定で土壌有機炭素の蓄積に大きく寄与していることが確認された。黒ボク土のAl溶解性(溶けやすさ)を決定づけているのは腐植とアロフェン質鉱物であり,前者のAlの給源はAl-腐植複合体の一部であった。植物の生育に悪影響を及ぼす毒性Alの由来はAl-腐植複合体であることが強く示唆された。(1)黒ボク土のアルミニウム(Al)溶解性をAl-腐植複合体に注目して総括し,その黒ボク土生成との関係を明らかにする.(2)黒ボク土の植物に毒性を及ぼすAlを制御する物質を特定する(3)黒ボク土の有機炭素蓄積要因を化学的,微生物学的に解明する黒ボク土のアルミニウム(Al)-腐植複合体(Alと有機物の結びついた物質)が,土壌の性質や植物生育に及ぼす影響を調べた。自然状態および酸性化したアロフェン質黒ボク土(合計10土壌試料)のアルミニウム(Al)の存在状態(塩化カリウム,塩化銅,ピロリン酸塩,酸性シュウ酸塩溶液可溶のAl濃度)とAl溶解性(0.01M塩化カルシウム溶液中での平衡実験)を,非アロフェン質黒ボク土と比較して検討した.その結果,自然のアロフェン質土壌のA1溶解性はイモゴライトやギブサイトの溶解性にほぼ等しかったが,酸性化した土壌の溶解性は両鉱物に対して未飽和であった,このようなA1溶解性は非アロフェン質土壌の溶解性に似ており,腐植がAl溶解をコントロールしているとみられた.アロフェン質と非アロフェン質土壌から抽出した腐植と塩化アルミニウム溶液からAl-腐植複合体を合成した.この人工Al-腐植複合体の植物根への毒性と,その毒性に及ぼすアロフェン質鉱物共存の影響を調べた.どちらの人工A1-腐植複合体もオオムギとゴボウ根にA1毒性を示した.アロフェン質鉱物を添加することによって,その毒性は添加割合に応じて緩和された.以上の結果は次のように解釈された. Al-腐植複合体は潜在的に植物毒性をもっており,そのため非アロフェン質土壌では容易にAl毒性を示す.アロフェン質土壌はAl-腐植複合体を持つものの,アロフェン質鉱物がその毒性を打ち消している,しかし強い酸性化を受けるとアロフェン質土壌でもAl-腐植複合体の毒性が発現してくる.Alが微生物活性に及ぼす影響をみるため,非アロフェン質黒ボク土について石灰処理を行い,土壌窒素の無機化速度,および硝化速度を測定した.処理により無機化・硝化速度とも違いが認められ,土壌微生物の生態に大きく影響していると考えられた.また,処理土壌から全DNAを抽出し,メタゲノムを解析して細菌類と真菌類の群集構造を解析中である.これまでの研究で,黒ボク土のアルミニウム(Al)毒性あるいは可給性には腐植複合体Alが大きく関与しているとみられた.本年度は,Al感受性作物(ゴボウ,オオムギ)を用いて,非アロフェン質黒ボク土の未耕地2点(東北大学複合生態フィールドセンター(川渡)),自然状態に近いアロフェン質黒ボク土2点(盛岡,つくば),酸性化したアロフェン質黒ボク土3点(宇都宮,十和田)のAl毒性をみた.また,これらの土壌にAl集積植物であるソバを生育させ,Al吸収量を分析した.その結果,Al感受性植物への毒性は非アロフェン質土壌だけではなく酸性化したアロフェン質土壌でもみられ,これらの土壌ではソバによるAl吸収量も多くなっていた.酸性化したアロフェン質土壌でのAl溶解性は,非アロフェン質土壌と同様に,腐植複合体Alに制御されており,Al毒性が発現するとみられた.毒性Alの指標として用いられている1M塩化カリウム抽出Al(KCl-Al)は永久荷電に吸着されているAlを抽出すると言われている(いわゆる,交換性Al).永久荷電量を測定してKCl-Al量と比較した.また,データベースを用いてKCl-AlとpH(KCl)の関係を調べた.その結果,KCl-Alは腐植複合体Alも評価し,抽出時のpHに依存するため,必ずしも交換性Alを測定するものではないことが示された.非アロフェン質黒ボク土(川渡土壌)およびアロフェン質黒ボク土(盛岡土壌)の活性Alの状態を変化させ,それが腐植の安定性や窒素動態に及ぼす影響について化学分析と微生物群集解析(PCR-DGGE法)で調べた.すなわち,無処理,石灰処理,石こう処理等の土壌について,有機窒素の窒素無機化と硝酸化成をみるための培養実験を行い,培養前後の土壌からDNAを抽出した.石灰処理は窒素動態に大きく影響したが,石こう処理はほとんど影響を与えなかった.

微生物群集解析の結果,CaCO_3処理でその多様性が増加することがわかった.低pHと可溶性Alが土壌中の微生物活性を抑制し,Al-腐植複合体の大部分が化学的・生化学的にきわめて安定であることが,黒ボク土が多量の有機物を蓄積する要因であると考えられる.そこで,pHの変化とAlの化学形態の変化が有機物の安定性と土壌微生物に与える影響を土壌中の窒素代謝と炭酸ガス放出量から調べた.非アロフェン質黒ボク土(向山Al層,向山3A3層),アロフェン質黒ボク土(宇都宮A層)の3試料を用いて,炭酸カルシウム(炭カル)添加(pHを上げ,可溶性Alを減少させる),リン酸添加(pHを上げず,可溶性Alを減少させる),硫酸添加(pHを下げ,可溶性Alを増加させる)の3つの化学処理を行い,これらが有機物の無機化(土壌呼吸量・窒素無機化量)に及ぼす影響をみた.また,土壌からDNAを抽出し,細菌の16SrDNAのPCR-DGGE解析を行った.炭カル処理によりどの土壌でも呼吸量は増加した。これはpHの上昇とAl毒性の減少のためとみられたが,初期に発生する炭カル由来のCO_2の影響も考えられた.炭カル処理により窒素無機化量は増加しなかったが,向山Alでは無処理より低かった.これは窒素の有機化のためとみられた.リン酸処理によりいずれの土壌でも呼吸量,窒素無機化量が増加した.これはリン酸添加によるAl毒性の減少に加えて,水溶性有機物が増加して微生物活性が上昇したためと考えられた.硫酸処理により向山Alでは呼吸や硝化が低下したが,他の2土壌では変化がなかった.3土壌試料間の比較では,向山3A3の呼吸量,窒素無機化量は他の土壌に比べて低かった.これは埋没腐植層である向山3A3は腐植がAl-腐植複合体として安定に存在し,易分解性有機物が少ないためと考えられた,PCR-DGGE法による細菌の群集解析の結果,リン酸処理と硫酸処理によって微生物相が顕著に変化することがわかった.黒ボク土が多量の有機炭素を蓄積している要因のひとつに,有機炭素がアルミニウム(Al)-腐植複合体としてきわめて安定な状態で存在していることがあげられる。また,Al腐植複合体の一部は不安定であり,土壌溶液中や交換態のAlイオンと平衡しているとみられ,低pHとAl毒性は土壌微生物活性を抑制する可能性があると考えられた。そこで本研究では,有機炭素含量やAl-腐植複合体含量の異なる土壌試料の土壌呼吸量を調べた。また,土壌pHやAl形態の変化が炭酸ガス放出量に及ぼす影響をみた。東北大学フィールド教育研究センター内の農耕地および森林から32点の黒ボク土A層試料を採取し,実験室でのインキュベーションでの土壌呼吸量を調べ,有機炭素の存在状態との関連をみた。その結果,有機炭素のうち非腐植物質(ピロリン酸ナトリウムで抽出されない)の割合が多いほど土壌呼吸量が多いことが確かめられた。土壌を種々の中和資材(CaCO_3,Ca(OH)_2,NaOH,KOH)で中和後に呼吸量を測定したところ,殆どの土壌で,無処理<NaOH処理≒KOH処理<Ca(OH)_2処理≦CaCO_3処理の順となった。Ca資材処理により水溶性有機物の増加がみられた。これらのことより,中和によるプロトンやAlイオンの微生物活性阻害要因の緩和が作用していることに加え,Caイオンによる腐植の易分解化がおこることも示唆された。Tohoku University Andosol Databaseから293点のA層のデータを抽出し,有機炭素蓄積に及ぼす,土壌pH,交換性Al,腐植複合体(ピロリン酸塩抽出)AlとFeの影響を統計的に解析した(パス解析)。
周期植物の進化史の解明

周期生物とは2年以上の決まった周期で集団が一斉に繁殖を行ない、死んでしまう生物である。本研究課題では、6年周期で一斉開花・枯死するコダチスズムシソウを材料に、周期植物の進化史を解明することを目的として、理論研究と実証研究を平行して行うことにより、研究を進めた。理論研究として、コダチスズムシソウの周期的一斉開花の進化要因を理論的に検証した。一斉開花の進化要因として有力とされる捕食者飽和説、受粉効率説に加え、新たに提唱した「近縁種との繁殖干渉仮説」について、数理モデルを作成し、シミュレーションを行った。その結果、一斉開花の同調性の進化には捕食者飽和説、受粉効率説の両方が貢献しうる一方で、同調性の獲得よりも広範な条件で同調性が維持されることが示唆された。さらに、繁殖干渉が存在する場合には、コダチスズムシソウが6年開花型に進化することで近縁種と共存可能になった可能性が示唆された。実証研究として、野外調査、遺伝的な解析を行った。沖縄県での野外調査を7回、台湾での野外調査を2回行い、生活史の観察、訪花昆虫調査、種子食害率調査、遺伝的解析用サンプルの採集などを行った。これまでの生活史の観察から、沖縄本島のコダチスズムシソウとは異なり、八重山諸島では一斉開花せず、開花後にほとんどの個体が枯死するが少数の個体は生存していた。さらに、台湾では一斉開花せず、多くの個体が開花後も生存したことから、種内でも地域間で生活史に多型が存在することが明らかとなった。また、これまでの野外調査からの予測通り、20152016年の冬にコダチスズムシソウの一斉開花が観察され、コダチスズムシソウと近縁種オキナワスズムシソウの繁殖干渉の有無を検証した。遺伝的な解析では、RAD-seqを行い、集団間、ブルード間に加え、地域間(沖縄本島、八重山諸島、台湾)の遺伝的な分化を検証した。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、キツネノマゴ科のイセハナビ属の周期的一斉開花一回繁殖型植物(周期植物)の進化史を解明することを目的に、実証研究と理論・数理研究を平行して行った。まず実証研究として、野外調査は、沖縄本島で4回、八重山諸島で3回、台湾で2回、それぞれ行った。その結果、沖縄本島では一斉開花が見られるものの、他地域では毎年多くの個体が開花し、一斉開花は見られないことが明らかとなり、生活史に多型が存在していることが明らかとなった。遺伝的な解析では、コダチスズムシソウとその近縁種について分子系統解析を行い、コダチの周期的一斉開花は沖縄本島において、比較的最近に進化したことが明らかとなった。この結果は、周期的一斉開花一回繁殖型が比較的短期間で進化しうることを示した重要な発見である。続いて、コダチスズムシソウの集団間、ブルード(開花年の異なる集団)間の遺伝的な分化を明らかにするため、次世代シークエンサーを用いたRAD-seqによる集団遺伝学的な解析を行った。現在、数百個体について解析中である。さらに、生理メカニズムの検証のため、挿し木で増やした個体を用いて、対照群、高温恒明条件、低温恒明条件、恒明下で高温と低温を3ヶ月ごとに繰り返す操作群の4条件で栽培し、開花までの期間がどのように変化するか観察している。理論・数理研究として、一般的な一斉開花の進化要因として有力な捕食者飽和説と受粉効率説が、コダチスズムシソウの一斉開花の進化における重要性を明らかにするために、シミュレーション解析を行った。その結果、一斉開花の同調性の進化には両方の仮説が貢献しうることが明らかとなった一方で、同調性の維持には、受粉効率説よりも捕食者飽食説の方が重要であり、同調性を獲得するよりも広範な条件で同調性を維持できることが示唆された。本研究では、6年周期で一斉開花・枯死するコダチスズムシソウを材料に、周期的一斉開花一回繁殖型植物(周期植物)の進化史を解明することを目的として、理論・数理研究と実証研究を平行して行うことにより、研究を進めている。理論・数理研究として、コダチスズムシソウの周期的一斉開花の進化要因を理論的に検証した。その結果、一斉開花の同調性の進化には捕食者飽和説、受粉効率説の両方が貢献しうることが明らかとなった。さらに、繁殖干渉が存在する場合には、コダチスズムシソウが6年開花型に進化することでオキナワスズムシソウと共存することができることが明らかとなった。次に実証研究として、野外調査、遺伝的な解析を行った。沖縄本島および八重山諸島での野外調査は7月、1月、3月の3回、台湾での野外調査は4月、11月の2回、それぞれ行った。野外調査では、生活史の観察、種子食害率の測定、遺伝的解析用サンプルの採集を行った。コダチスズムシソウの生活史の観察の結果とこれまでの野外調査の結果を合わせると、沖縄本島では6年周期で一斉開花・枯死する一方で、八重山諸島では一斉開花が起きず、開花後も少数の個体は生存し翌年も再び開花していた。さらに、台湾では一斉開花が起きず、開花後も多くの個体が生存し翌年も再び開花することが明らかとなってきた。

遺伝的な解析では、まずコダチスズムシソウとその近縁種について分子系統解析を行った結果、コダチの周期的一斉開花は沖縄本島において、比較的最近に進化したことが明らかとなった。さらに、集団遺伝学的な解析については、次世代シークエンサーによるRAD-seqを行った。現在、コダチスズムシソウの集団間、ブルード(開花年の異なる集団)間、地域間(沖縄本島、八重山諸島、台湾)の遺伝的な分化を明らかにすることで、周期的一斉開花一回繁殖型の進化機構の解明を目指している。周期生物とは2年以上の決まった周期で集団が一斉に繁殖を行ない、死んでしまう生物である。本研究課題では、6年周期で一斉開花・枯死するコダチスズムシソウを材料に、周期植物の進化史を解明することを目的として、理論研究と実証研究を平行して行うことにより、研究を進めた。理論研究として、コダチスズムシソウの周期的一斉開花の進化要因を理論的に検証した。一斉開花の進化要因として有力とされる捕食者飽和説、受粉効率説に加え、新たに提唱した「近縁種との繁殖干渉仮説」について、数理モデルを作成し、シミュレーションを行った。その結果、一斉開花の同調性の進化には捕食者飽和説、受粉効率説の両方が貢献しうる一方で、同調性の獲得よりも広範な条件で同調性が維持されることが示唆された。さらに、繁殖干渉が存在する場合には、コダチスズムシソウが6年開花型に進化することで近縁種と共存可能になった可能性が示唆された。実証研究として、野外調査、遺伝的な解析を行った。沖縄県での野外調査を7回、台湾での野外調査を2回行い、生活史の観察、訪花昆虫調査、種子食害率調査、遺伝的解析用サンプルの採集などを行った。これまでの生活史の観察から、沖縄本島のコダチスズムシソウとは異なり、八重山諸島では一斉開花せず、開花後にほとんどの個体が枯死するが少数の個体は生存していた。さらに、台湾では一斉開花せず、多くの個体が開花後も生存したことから、種内でも地域間で生活史に多型が存在することが明らかとなった。また、これまでの野外調査からの予測通り、20152016年の冬にコダチスズムシソウの一斉開花が観察され、コダチスズムシソウと近縁種オキナワスズムシソウの繁殖干渉の有無を検証した。遺伝的な解析では、RAD-seqを行い、集団間、ブルード間に加え、地域間(沖縄本島、八重山諸島、台湾)の遺伝的な分化を検証した。フィールド調査、遺伝解析、数理研究のそれぞれに進展が見られた。フィールド調査では、翌年の一斉開花現象に向けて、植食性昆虫との相互作用に新たに着目した観察・実験を開始した。遺伝解析では、次世代シークエンサーを活用したRAD-seqを行い、得られたデータのバイオインフォマティクス的な解析を新たに開始した。数理解析では、繁殖干渉という現象に着目し、周期植物の進化に繁殖干渉がどのような影響を与えたか、検証を行った。以上のように、創意工夫により、研究を押し進めた。27年度が最終年度であるため、記入しない。数理解析については、これまでのシミュレーション解析の結果をまとめ、投稿論文を作成する。フィールド調査については、これまでの琉球列島および台湾での調査を継続して行う。特に今年度はコダチスズムシソウの一斉開花年にあたるため、琉球大学の辻和希教授との共同研究として綿密な調査を行う予定である。遺伝解析については、RAD-seqから得られたデータについてバイオインフォマティクス的な解析を行う予定である。現在、コダチスズムシソウとその近縁種についての分子系統解析の結果については、投稿論文を作成中である。
施設および在宅の看護・介護環境整備のための臭気除去システムの開発

臭気によるストレスのない快適な看護・介護環境を創出するため、介護者へのアンケート調査により、施設と比較し在宅における特有のにおいについて明らかにし、適切な臭気対策を検討する基礎データを収集した。また、在宅介護を行っている住宅の玄関、居間、高齢者の寝室において通常時のにおいのレベルを測定し、在宅介護環境のにおいの実態を把握した。さらに、おむつ交換時の臭気の拡散防止対策を検討し、看護・介護環境における臭気対策手法を整理した。本研究の目的の一つである在宅療養における臭気対策について、臭気によるストレスのない快適な看護・介護環境を創出するため、これまで行ってきた施設とは異なる在宅療養における特有のにおいについて明らかにし、適切な臭気対策を検討する基礎データを収集した。在宅介護を行っている介護者に住宅計画、設備、環境に関するアンケート調査を実施し、介護環境におけるにおいに関する意識、在宅における臭気の問題点、臭気に影響する主要因を検討した。(1)介護者と介護を担当していない同居家族の、同居家族に要介護者が居る場合の住環境に対する意識、生活環境要素の中のにおいの位置づけを比較検討した。(2)要介護者がいない場合と要介護者と同居している場合において、身近なにおい意識、自宅のにおい意識を比較検討した。(3)施設、病院での調査結果と比較し、在宅の場合の介護環境のにおいの問題点を検討した。(4)要介護度と介護環境のにおい問題の関係を検討した。(5)住宅の概要と介護環境のにおい問題の関係を検討した。(6)在宅介護において実施されている消臭対策を探り、その効果を把握し課題を見出した。臭気対策の基本となる発生源管理の観点から、医療施設において汚物廃棄容器から漏れ出る臭気の汚物処理室への環境影響を検討した。また、汚物廃棄容器からの漏えい臭対策として、消臭カバーについて現場のスタッフによる感覚評価をもとにその消臭効果を検討した。感覚評価は、パネル選定試験である嗅覚テストに合格した12名により実施した。医療施設において、排泄物臭以外の臭気問題も存在するため、緩和ケア病棟における喫煙環境に関する調査を実施し、たばこ臭に対する意識、対策の必要性について検討した。本研究では、住宅と施設の介護環境のにおいの低減を目的としている。まず、在宅介護環境における臭気をについて詳細を把握するため、在宅療養をおこなっている住宅の玄関、居間、高齢者の寝室のにおいのレベルを測定し、実態を把握した。これまでに一般住宅約60件のにおいのレベルについては既に把握していることから、これらの結果を比較することにより在宅療養を行う住宅の臭気特性を検討した。また、介護環境のにおいのレベルに影響する要因を探るため、介護者へ、住まい方、介護の内容、問題点、におい意識などに関するヒアリング調査を実施し、測定したにおいのレベルと対応させ、においのレベルに影響する要因に関して検討を行った。その結果、今回調査した住宅では、一般住宅より、においに対する意識が高く、換気、消脱臭対策を頻繁に行っているため、においのレベルは一般住宅よりも低い傾向にあった。ヒアリング調査の結果から、要介護者がおむつを使用している住宅で、使用済みおむつの保管時のにおいについて問題意識が高いことが分かった。施設では汚物処理室が設置されており、使用済みおむつの保管について、大きな問題にはならなかったが、住宅の場合には、スペースの問題から、要介護者がおむつを使用している場合には、においの問題が挙げられた。次に、施設の介護環境の臭気に関しては、おむつ交換時のにおいのレベルが上昇することから、ベッド周辺の臭気低減除去対策を検討する必要がある。そこで、おむつ交換前後のにおいのレベル、臭気成分を分析するとともに、においの拡散状況をにおいセンサーを用いて検討した。また、ベッド周辺に適した空気清浄機を使用した場合のにおいのレベルの測定を行った。その結果、おむつ交換時に、ベッド周辺において空気清浄機を使用することで、居室全体の臭気濃度、臭気強度、快・不快度の低減が図れた。介護者のにおいの評価と介護環境の臭気濃度とを比較検討したところ、「高齢者の部屋」の臭気濃度の平均値は21であった。寝たきりで要介護5の常時おむつを使用している高齢者の寝室より、同じ要介護5でトイレを使用している高齢者の寝室の方が高いケースがあった。臭気濃度21以上の6件のうち、ポータブルが1件、おむつが1件の他は基本的にトイレを使用しており、排泄の自立度と寝室の臭気濃度との関連性は低かった。また、排泄物の臭気レベルが「強い」と評価された5件の寝室の平均値は23であったが、「弱い」場合(6件)の平均値は27であり、介護者のにおい意識と実際のにおいのレベルとは必ずしも一致しなかった。これは、おむつ交時や使用済みおむつ保管容器の蓋を開けた瞬間といった介護者が最もにおいを強く感じる時に、測定ができていない可能性がある。在宅では、大型の空気清浄機を設置することが難しい面もあるため、開発中の消臭機能を有するマスクによる対策を検討した。介護者にマスクを着用してもらい、消臭効果について回答を求めた。

消臭効果を実感した場面では、「おむつ交換時」が最も多く、回答の得られた133名のうち半数以上が回答した。消臭機能を有するマスクによって、ある程度の消臭効果は期待できると考えられるが、反面「付け心地が不快」が60%に上り、改良する必要がある。今後、においの変動を連続モニターできるセンサ等を用いて、においが高濃度になる時期のにおいのレベルと成分等の特性を測定し、各場面に適した対策を検討する必要がある。臭気濃度は低いにも関わらずヒアリング時に寝室のにおいの問題を訴えていた人は、「寝室の掃除をさせてもらえない」など高齢者に対し不満を抱いている場合があり、介護者と高齢者との人間関係の善し悪しが、においの意識に影響を与えることもあると考えられるため、客観的なデータに基づくきめ細かな対応が必要である。目的として揚げた4点(A在宅療養におけるにおいの実態把握、B排泄物臭ほかの臭気特性の把握、C施設における脱臭システムの確立、D在宅における臭気対策の提案)のうち、2点(AとC)は達成し、3点目(B)と4点目(D)は5割程度達成した。最終年度に、3点目、4点目についてさらに検討を行い、研究結果をまとめる予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。施設における介護環境の排泄物臭ほかの臭気特性の把握については、療養病棟をもつ病院の協力を得て、実施する。また、在宅における臭気対策の提案については、これまでに実施したアンケート調査、ヒアリング調査を詳細に検討し、具体策をまとめる。
精神疾患における多種類微量元素のNMDA受容体調節機構に対する影響

統合失調症・大うつ病などを含む精神疾患では、NMDA型グルタミン酸(NMDA)受容体の機能変化が起きていると推測されている。様々な微量元素が直接的・間接的にNMDA受容体を調節することが報告されているが、精神疾患において微量元素が変化しているのか否か、それに伴いNMDA受容体機能に変化が起きるのかについては未だに明らかになっていない。本研究では、(1)精神疾患患者の脳脊髄液(CSF)および血漿中微量元素濃度の変化、およびそれらとD-セリンの関連、(2)微量元素のNMDA受容体発現量・機能、神経伝達物質への影響、を明らかにすることで微量元素によるNMDA受容体機能の調節機構を解明し、精神疾患の機序解明、新規治療薬の開発に貢献することを目的とする。まず始めに、年齢平均値と性別比が一致した統合失調症患者52名、大うつ病患者53名、双極性障害患者44名および健常者51名の血漿中微量元素(ナトリウム、マグネシウム、リン、カリウム、カルシウム、鉄、銅、亜鉛、リチウム、水銀)濃度を、誘導結合プラズマ分析装置により測定した。その結果、統合失調症患者では血漿中のリン濃度が有意に減少していることが明らかとなった。また、血漿中カルシウム濃度と統合失調症の陰性症状の重症度とは有意な正の相関があることが示唆された。一方、大うつ病患者では、血漿中カルシウム量の有意な減少が認められた。カルシウム濃度とうつ病症状の重症度との間に有意な相関関係は認められなかった。しかしながら、抗うつ薬の等価換算値であるイミプラミン換算値と血漿中リン濃度は有意な相関を示した。その他の血漿中元素に関しては、有意な差や関連は認められなかった。回収済みの検体から、症状重症度や服薬情報を精査し、統合失調症患者52名、大うつ病患者53名、双極性障害患者44名および健常者51名を選定した。これらのサンプルを用いて、誘導結合プラズマ分析装置(ICP-MS)により血漿中微量元素の測定を行った。また、こうした測定結果をSPSSで解析し、疾患との関連を見いだしつつある。しかしながら、血漿および脳脊髄液検体の選定、分注に時間を要しICP-MSでの測定までに時間を要してしまったため、やや遅れていると考えられる。今後は、血漿のみならず脳脊髄液における微量元素の測定を行う予定である。昨年度測定した微量元素がNMDA受容体にどのように影響するのか、実際にNMDA受容体や精神疾患に関連するモノアミン系への影響はあるのか否か、臨床検体および動物実験を用いて明らかとしていく。血漿や脳脊髄液の検体分注や検体選定に時間がかかったため、ICP-MSでの測定までに時間を要した。今後、SPSSを新たに購入し、統計解析速度を上げるとともに、臨床検体での結果に基づき、動物実験を行う予定である。
高血糖が吸入麻酔薬およびGLP-1受容体の心筋保護相互作用に及ぼす影響

In Vitro低酸素再灌流実験にて細胞の生存率を割り出した。GLP-1群、吸入麻酔薬イソフルラン刺激を与えたプレコンディショニング群の生存率がコントロール群に比較して高かった。In vivo虚血再灌流実験にて心筋梗塞サイズを測定した。コントロール群に比べGLP-1、イソフルラン刺激群の心筋梗塞サイズが縮小していた。次に、グルコースを静注することで高血糖マウスモデルを作成し、上記の実験を行い心筋梗塞サイズを比較検討すると、GLP-1・APCの刺激を行った群においては心筋保護作用が棄却された。これらのことより、GLP-1やAPCの心筋保護作用は血糖に影響を受けることが明らかとなった。マウスの摘出心をランゲンドルフ酵素法にて潅流、得られた遊離心室筋細胞をラミニンを用いてディッシュに接着させる。通常培養液(グルコース濃度5.5 mmol/L)を「グルコースなし」のものに置き換え、特殊チャンバーを用い、1時間低酸素状況(95%N2, 5%CO2)に暴露することで心室筋細胞に虚血状態をつくりだす。その後1時間通常の培養状態に戻すことで再潅流状態とした。細胞をトリパンブルー染色することで死亡細胞と正常細胞を区別し、生存率を割り出した。GLP-1を前投与したGLP-1群、吸入麻酔薬イソフルラン(1.0 minimum alveolar concentration [MAC])にて30分間APC刺激を与えたAPCによるプレコンディショニング群の生存率がコントロール群に比較して高かった。マウスを人工呼吸下に開胸、血行動態を測定しながら、GLP-1・APC刺激を行った。その後、心臓冠動脈を30分間閉塞し、2時間の再潅流を行う。再び冠動脈を閉塞、EvansBlueを注入し心臓を取り出す。心臓をスライスし、再染色後心筋梗塞サイズを測定すると両群の心筋梗塞サイズが、コントロール群に比較して減少していた。交付申請書に記載した「研究実施計画」通りに進捗しているため。つまり、GLP-1を前投与したGLP-1群、吸入麻酔薬イソフルラン(1.0 minimum alveolar concentration [MAC])にて30分間APC刺激を与えたAPCによるプレコンディショニング群の生存率がコントロール群に比較して高かった。また、心筋梗塞サイズを測定すると両群の心筋梗塞サイズが、コントロール群に比較して減少していた。マウスを人工呼吸下に開胸、血行動態を測定しながら、GLP-1・APC (イソフルラン1.0 MAC30分間)刺激を行う。その後、心臓冠動脈を30分間閉塞し、2時間の再灌流を行った。再び冠動脈を閉塞、Evans Blueを注入し心臓を取り出した。心臓をスライスし、再染色後心筋梗塞サイズを測定すると両群の心筋梗塞サイズが、コントロール群(プレコンディショニング刺激を何も加えていない虚血再灌流のみのマウス)に比べ縮小していた。次に、グルコースを静注することで高血糖マウスモデルを作成し、上記の各群に対してin vivoマウス虚血再灌流実験を行い、心筋梗塞サイズを比較検討すると、コントロール群においては心筋梗塞サイズに変化はなかったが、GLP-1・APCのプレコンディショニングを行った群においては心筋保護作用が棄却された。In vitro実験では、遊離心室筋細胞を用い低酸素実験を行った。方法は、通常培養液(グルコース濃度5.5 mmol/L)を「グルコースなし」のものに置き換え、特殊チャンバーを用い、1時間低酸素状況(95%N2, 5%CO2)に暴露することで心室筋細胞に虚血状態をつくりだし、その後1時間通常の培養状態に戻すことで再灌流状態とすることができる。細胞をトリパンブルー染色することで死亡細胞と正常細胞を区別し、生存率を割り出す。GLP-1およびイソフルランにてプレコンディショニングを行うと心筋保護作用を有し、細胞の生存率を上げた。しかしながら、高グルコース濃度培養液に一旦インキュベートすると、これらの作用は棄却された。これらのin vivoおよびin vitro実験から、高血糖は吸入麻酔薬やGLP-1によるプレコンディショニング作用に影響し、心筋保護作用を増悪させる可能性が示唆された。つまり、GLP-1やイソフルランによるプレコンディショニング心筋保護作用が、高血糖の状況に置かれることによって棄却されたため。また、この作用がin vivo実験とin vitro実験ともに確認された。Glucagon-Like Peptide (GLP-1)は小腸のL細胞から分泌されるペプチドでブドウ糖濃度依存性にインスリンの分泌を亢進させる働きがあり、新しい糖尿病治療薬として注目を浴びている。近年の研究によるとGLP-1受容体は心筋細胞にも分布していることが報告された。しかし、吸入麻酔薬による心筋保護作用(APC)がGLP-1受容体を介する経路によって相互作用を持つかどうかは明らかではない。また、近年、APCおよびGLP-1による心筋保護作用が、肥満や血糖値によって影響されることもわかってきた。これらのことから、APCやGLP-1は高血糖などの体内状態により動態・作用の変化が起こる可能性が示唆される。そこで、本年度は高血糖マウスモデルにおいてこれらの心筋保護作用がどのように影響を受けるかについて調査した。グルコースを静注することで高血糖マウスモデルを作成し、各群に対してin vivoマウス虚血再灌流実験を行い、心筋梗塞サイズを比較検討した。