hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
電解反応によるアルキンのラジカルカチオンＤｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ反応の開発

モデル反応を設定し、条件検討を通して最適条件を見つけ、さらにアルキンの汎用性の検討も行った。これにより、これまで未開拓であった部分の知見を得ることができ、期待通り研究が進展した。これまでの成果については、国際的に高く評価されている学術雑誌に発表した。また、上記の研究成果については新たに学術雑誌への投稿を目標に、研究を進めている。今後は、芳香環と共役していないアルキンを用いることなどを含め、アルキンの汎用性の広さを検討する。さらにジエンの汎用性を検討したいと考えている。さらに、ジエンとしてビフェニルを用いる検討も行っていきたい。ビフェニルをジエンとして用いることで、フェナントレン骨格の構築にチャレンジするつもりである。フェナントレン骨格は多くの天然物に含めれており、有用な骨格である。しかし、ビフェニルとアルキンから直接Diels-alder反応のような環化反応は報告例がない。用いる基質の電子の状態などを考えながら、この反応に挑戦したいと考えている。
超小型振動子を実現する圧電体全体共振制御技術の開発

本研究では、直方体形状の圧電体の全体共振に対して、無数に存在する振動モードの中から特定の振動モードを選択的に励起・検出することのできる手法の開発に取り組んだ。平板アンテナによる無電極振動励起・検出システムと振動解析プログラムを作成し、金属薄膜の成膜と圧電体形状が振動モードの選択的励起に与える影響を評価した。結果として、縦波平面波の振動モードに似た特定の振動モードのみを強く励起・検出できる圧電体形状があることが分かった。本研究では、直方体形状の圧電体の全体共振に対して、特定の振動モードを選択して励起することのできる、振動モード制御技術を開発することを目的としている。最初に、直方体形状の圧電体に対して一様な電場を印加することのできる対向平板アンテナを自作し、直方体形状の水晶振動子に対して電極を取り付けることなく共振を励起・検出できることを確認した。この振動子に対して、Cu薄膜を成膜し、金属薄膜の有無によって励起される振動モードが変化する様子を観測した。結果として、全ての面に成膜した場合はアンテナによって振動が励起されないこと、成膜する面を変えると励起される振動モードが変化することが確認された。この結果を理論的に解析するために、圧電体が共振する時の振動変位分布と電気分極分布を解析するプログラムを作成し、金属薄膜が振動に及ぼす影響を評価したところ、アンテナによって印加される電場分布が金属薄膜によって変化し、共振によって圧電体内部で発生する電気分極の分布と一致する時にその振動モードが強く励起されることが分かった。単純なパターンの薄膜を成膜した場合も、実験と解析で同様の傾向が見られた。さらに、薄膜を成膜しながら圧電体の共振計測を行ったところ、薄膜の膜厚が特定に膜厚にあると振動振幅が急激に低下する現象が見られた。このことは、薄膜の膜厚も振動制御のパラメータになり得ることを示唆している。前年度に自作した振動解析プログラムを用いて、圧電体の形状を変えながら共振解析を行ったところ、特定の形状の時にある振動モードが強く励起されることが分かった。その振動モードの変位分布や共振周波数の形状依存性を解析したところ、板厚共振に近い振動モードであることが分かった。一般に板厚共振は面内方向の寸法に対して厚さ方向の寸法が十分に小さい場合に観測される振動モードだが、ここでは面内方向と厚さ方向の寸法が同程度あるにも関わらず、このような振動モードが観測された。さらに、この振動モードは他のモードに比べてアンテナによる送受信効率が高く、このモードのみを選択的に送受信できることも分かった。そこで、実際にこの形状の水晶直方体を作成して実測したところ、解析結果と同様に、板厚共振に準ずる振動モードを選択的に送受信することができた。これらの結果より、平板形状ではなくとも、面内方向の寸法を適切に設計することで板厚共振に準ずる振動モードを選択的に送受信できることが分かった。このようなモード選択手法がどのような材料に対して適用可能かを検証するために、アルミニウムなどいくつかの材料に対して同様の解析を行った。その結果、形状調整による振動モードの選択手法は、弾性対称性の低い材料で顕著に表れることが分かった。当初の計画通りに研究が遂行されている。ナノメカニクス当初の計画通り、初年度に引き続き薄膜の成膜パターンを変えながら振動実験を行い、成膜パターンと振動モードの関係を系統的にデータ収集する。また、形状の異なる振動子に対しても同様の実験を行い、解析結果との比較を通して、振動モード選択手法を確立する。資料代などのその他の経費が当初の計画よりも少なかったことが、次年度使用額が生じた主な理由である。繰越金は主に物品費に割り当て、当初計画していたセンサ材料等の物品購入に充てる。
操作・モデリングから迫る精神病態シナプスパソロジーの多階層理解

DISC1コンディショナルノックダウンマウスを神経発達後期から成体期にかけてin vivo2光子励起イメージングを行い、実際に脳内で生じているスパイン動態を可視化・定量した。はじめに、in vitro/in vivoホールセル記録、Ca2+イメージング、シングルスパイン・MNI-グルタミン酸アンケージング法などの基本手技を完全に確立させた。マウス前頭野を標的として子宮内穿孔法で大脳皮質II/III層の錐体細胞に各種遺伝子を導入し、生後60日のマウスより前頭前野(PL領域)を含む冠状断急性スライスを作成し、グルタミン酸アンケージング法による単一スパイン刺激を行い、EPSCをホールセルパッチクランプ法により記録し、病態関連スパインのNMDA-EPSC/AMPA-EPSC比を求めた。これらのデータは、分担・田中が前頭前野神経回路モデリングを行っている。またGCaMP6もしくはCal-520などを用いたCa2+イメージングとホールセル記録を併用し、病的なスパインを有する樹状突起における樹状突起イベントと発動電位の発生に関しても定量的なデータを採取した。病的スパインは活動電位の発生に非線形な効果を持つことが明らかになった。また病的スパインの発生が有意に多いDISC1コンデショナルノックアウトマウスの行動解析を行い、オープンフィールド、プレパルス抑制、T-maze、Y-maze、高架式十時迷路、新規物体認識テストなどの必要なデータを採取した。行動解析を行ったマウス脳は保存し、スパイン情報と行動とにどのような関連があるかを、組織学的に検証した。以上の結果より、DISC1コンディショナルノックダウンで生じる病的スパインの電気生理学的特性とそれと関連する行動異常が明らかになりつつある。当初の予定だった行動解析は全て終了し、電気生理およびカルシウムイメージングを用いた多階層イメージング・レコーディングも予想以上の進捗であり、研究の方向性が見えたため。(1)病的スパインのAMPA-EPSC/NMDA-EPSCのデータ採取を完了し、このデータを基にした回路シミュレーションを進める。(2)DISC1 cKDでは作業記憶障害がみられるため、この細胞・回路基盤を検証する。そのための手がかりとして、課題遂行中の前頭野のオシレーションを計測することと考えており、この実験系の確立に取り掛かる。
高LET重イオン線によるアポトーシス誘導およびシグナル伝達の検討

X線照射と重イオンビーム照射後の細胞生残率の比較細胞はヒト肺癌由来の細胞株であるA549を用いた(p53 statusは野生型)。X線照射は群馬大学大学院のMBR-1505(140 kVp、92.89cGy/分、日立社製)、重イオン照射は原子力機構TIARAの深度制御種子照射装置(220 MeV ^<12>C^<5+>、108 keV/μm)細胞局部照射装置にて行い、照射後の細胞生存率はコロニー形成法で検討した。^<12>C^<5+>の細胞生残曲線は直線的であったが、X線および^<12>C^<5+>のDO(37%生存線量)/D10(1O%生存線量)はそれぞれ1.59 Gy/4.00 Gy、1.23 Gy/2.39Gyであった。マイクロビーム照射によるバイスタンダー効果に関する検討コンフルエントな状態の細胞のうち選択的に1つの細胞にのみイオンを照射した際の細胞生存率は非照射細胞とほぼ同様であった。照射細胞数をディッシュ内の5-25個、また各細胞への照射イオン数を5-10個とすると照射していない細胞の生存率に比較し統計学的に有意に低下した(9-15%の低下)。バイスタンダー効果に対するギャップ結合の関与低密度に細胞を培養し、細胞間のコンタクトをなくした状態でディッシュ内の細胞を選択的に照射したときの細胞生残率は非照射の細胞と同様であった。コンフルエントに培養した細胞にギャップ結合の促進剤(8-Br-cAMP:シグマ社製:照射の48時間前に添加し1mMに調節)を接触させ照射した場合、細胞生残率は照射のみの細胞に比較し低下したが統計学的に有意な差とはならなかった。また、ギャップ結合の阻害剤(Lindane:シグマ社製:照射の2時間前に添加し0.1mMに調節)を添加すると細胞生残率は照射のみの細胞よりも有意に高く、非照射の細胞とほぼ同等であった考察本実験ではディッシュ全体の細胞のうち0.001-0.005%という極少数の細胞を重イオンビームで照射した時、ディッシュ全体の細胞生存率が有意に低下する結果が得られたが、細胞間のコンタクトをなくした状態で照射するとこの現象は認められなかった。またギャップ結合阻害剤を細胞に接触させることにより照射後の細胞生残率低下は抑制された。これらより重イオン照射による細胞死に照射細胞から非照射細胞へのバイスタンダー効果が関わっており、また、そのシグナル伝達経路にギャップ結合が深く関与していることが示唆された。本結果は現在国際英文雑誌に投稿準備中である。重イオン照射による高い殺細胞効果の機序や,照射細胞から非照射細胞へのシグナル伝達により誘発される,いわゆるバイスタンダー効果の分子機構は十分に解明されていない.本研究では,ヒト固形癌細胞株において重イオンビーム照射後のバイスタンダー効果を中心に,重イオンビーム照射による細胞死の機序を検討した.細胞は高密度に培養したヒト非小細胞肺癌由来細胞株であるA549を用いた.X線照射は群馬大学大学院のMBR-1505(日立社製,150kVp,92.89cGy/分),重イオン照射は日本原子力研究所高崎研究所TIARAの深度制御種子照射装置(ブロードビーム)および細胞局部照射装置(マイクロビーム)にておこなった.照射後の細胞生残率はコロニー形成法により検討した.X線照射による,D_0/D_<10>は1.59Gy/4.00Gyであったが,ブロードビームを用いた実験から,^<12>C^<5+>(LET=108keV/μm)のD_0/D_<10>は1.23Gy/2.39Gyであった.マイクロビームを用いた実験で選択的にディッシュ内にある約5×10^5細胞中の1つの細胞にのみ照射した際の細胞生残率は非照射細胞とほぼ同様であった.しかし,ディッシュ内の5細胞あるいは25細胞に対し,^<12>C^<5+>イオン(LET=103keV/μm)をマイクロビームでそれぞれ5個あるいは10個ずつ照射すると細胞全体の生残率が非照射細胞に比較し10-15%低下した(p<0.05).この結果から重イオン照射による高い殺細胞効果と細胞死のメカニズムへのバイスタンダー効果の関与が示唆された.現在論文執筆中であるが,今後さらに今回認められた細胞死のバックグラウンドについて,細胞間橋を介した細胞同士のコミュニケーションやNOなどの細胞間の伝達物質の存在について検討予定である.X線照射と重イオンビーム照射後の細胞生残率の比較細胞はヒト肺癌由来の細胞株であるA549を用いた(p53 statusは野生型)。

マイクロビーム照射によるバイスタンダー効果に関する検討コンフルエントな状態の細胞のうち選択的に1つの細胞にのみイオンを照射した際の細胞生存率は非照射細胞とほぼ同様であった。照射細胞数をディッシュ内の5-25個、また各細胞への照射イオン数を5-10個とすると照射していない細胞の生存率に比較し統計学的に有意に低下した(9-15%の低下)。バイスタンダー効果に対するギャップ結合の関与低密度に細胞を培養し、細胞間のコンタクトをなくした状態でディッシュ内の細胞を選択的に照射したときの細胞生残率は非照射の細胞と同様であった。コンフルエントに培養した細胞にギャップ結合の促進剤(8-Br-cAMP:シグマ社製:照射の48時間前に添加し1mMに調節)を接触させ照射した場合、細胞生残率は照射のみの細胞に比較し低下したが統計学的に有意な差とはならなかった。また、ギャップ結合の阻害剤(Lindane:シグマ社製:照射の2時間前に添加し0.1mMに調節)を添加すると細胞生残率は照射のみの細胞よりも有意に高く、非照射の細胞とほぼ同等であった考察本実験ではディッシュ全体の細胞のうち0.001-0.005%という極少数の細胞を重イオンビームで照射した時、ディッシュ全体の細胞生存率が有意に低下する結果が得られたが、細胞間のコンタクトをなくした状態で照射するとこの現象は認められなかった。またギャップ結合阻害剤を細胞に接触させることにより照射後の細胞生残率低下は抑制された。これらより重イオン照射による細胞死に照射細胞から非照射細胞へのバイスタンダー効果が関わっており、また、そのシグナル伝達経路にギャップ結合が深く関与していることが示唆された。本結果は現在国際英文雑誌に投稿準備中である。
生理活性ペプチドの多角的かつ系統的検索とそれらが作動する未知の生体機序の解明

未知の生理活性ペプチドの検索とそれらが作動する生体機序の解明を目指し、本年度は下記の成果を得た。1.未知のペプチドの検索:ブタ脳抽出物よりヒヨコ直腸弛緩活性を指標として未知ペプチドの検索を行った結果、22残基のペプチドを単離した。構造決定の結果、本ペプチドはANP、BNPに類似した利尿ペプチドであることが判明し、C型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)と命名した。CNPは生体内では中枢神経系に局在するとともに、薬理活性的にもANP、BNPとは大きく異なり、CNP特異的受容体の存在、神経系での作用が示唆された。2.ナトリウム利尿ペプチド・ファミリ-:循環系におけるANP、BNPの生理的役割を探るため、種々の生理的条件、病態モデル、疾患例につきANP、BNPのペプチド、mRNA量の測定を行った。その結果、BNPはANPと異なる生合成、貯蔵、分泌機序を取り、緊急時にはBNPの生合成、分泌が著しく亢進し、ANPだけでは不足する循環系におけるナトリウム利尿ペプチドの調節機能を維持しているものと考えられた。3.生殖内分泌におけるインヒビン、アクチビン:ヒトインヒビンの高感度RIAシステムを確立し、妊娠中に血中インヒビン値が高値を示すことを明らかにした。これは胎盤のインヒビン産生を示し、生殖内分泌に新しい見地を開いた。一方アクチビンに卵成熟促進活性のあることを示し、卵巣におけるアクチビン役割を明確にした。4.ペプチドホルモンのプロセシング酵素:哺乳類プロセシング酵素のモデル系としてラット肝臓におけるプロアルブミンーアルブミン変換酵素の研究を行った。肝ゴルジ画分の可溶化物を出発材料とし、活性測定法を改良して精製を進めた結果、我々の構造決定した酵母KEX2プロテア-ゼと類似した酵素の存在が明らかとなった。本酵素は不安定で精製が非常に困難であるが、現在種々の改良を行いつつ最終精製を目指している。生理活性ペプチドの多角的かつ系統的検索とそれらが作動する未知の生体機序の解明を目指し,生化学的研究を行い下記のような成果を得た.1)ブタ脳より,心房性Na利尿ペプチド(ANP)免疫活性物質を単離,構造決定し,ブタ脳内ANPはα-ANP〔4-28〕とα-ANP〔5-28〕であることを明らかにした.また,ヒヨコ直腸弛緩を指標として,ブタ脳内より, ANPとは異なる26個のアミノ酸よりなる新しいNa利尿ペプチド(Brain Natruretic Poptile BNP)を単離し,その構造決定をした.2)ビテロゲニン遺伝子の発現調節因子の候補であるVS蛋白質の染色体DNAを含む組み換え(入VS6)を単離し,その構造決定中である.また,ラットのガン細胞に特異的なクロマチン蛋白質(38k)を精製し,それと強く結合しTATAbox構造を含む約1.3kbのDNA断片をクローニングした.これを用いたノーザン分析で一本のポジティブバンドを得た.3)視床下部、下垂体、性腺系に作用する新しい生理活性ペプチド検索のため、卵巣グラニュ-ロ-サ細胞、精巣セロトリ細胞、下垂体前葉細胞のみいよ培養系を確立した。卵巣グラニュ-ロ-サ細胞系ではLHリセプタD2産-、FSHリセプタ-、E_2生、プロゲステロン産生を指標にした活性測定系を開発し、ウシ卵胞液中に存在するパラクリンまたはオ-トクリン物質の検索中である。4)カエル体皮に存在する二種類のペプチドC末端アミド化酵素のcDNAクローニングを行い,その一次構造を決定した.また,塩基性ジペプチド結合切断酵素であり,酵母のαファクターのプロセシングに関与すると思われるKEX2プロテアーゼについても,遺伝子構造解析によりその一次構造を決定した.生理活性ペプチドの多角的かつ系統的検索とそれらが作動する未知の生体機序の解明を目指した本研究において、下記のような成果を得た。1)体液量および血圧調節に関与するNa利尿ペプチドにはANP-BNPファミリーの存在することを明らかにした。脳内ではBNP-26およびBNP-32として、心房ではBNP-106の大分子型として存在することを証明し、それらの全構造を決定した。また、BNP前駆体(131残基)のcPNA解析を完了し、BNPの生合成経路が、ANPと類似したパターンを示すことを証明した。2)ビテロゲニン遺伝子と強く結合する非ヒストンクロマチン蛋白質(VS蛋白質)の全構造決定のため、その染色体DNAの単離同定を行った。N-末端から一部アミノ酸配列を決定し、49個の合成ヌクレオチドを用いて、ニワトリの染色体DNAライブラリーから36個のポジティブなクローンを単離した。これらのインサートの解析の結果、その中の1つ(λVS6)の中にVS蛋白質のアミノ酸配列に相当する塩基配列が含まれていた。3)塩基性アミノ酸対(X-Y)プロセシング酵素系を解明するため、α接合因子およびキラートキシンを産生する酵母のプロセシング酵素について検討し、KEX2プロテアーゼのDNA配列を決定した。KEX2遺伝子は814アミノ酸残基をコードし、そのN末端部にサブチリシン様構造を有することを明らかにした。KEX2遺伝子を導入したKex2変異株の模画分より部分精製したKEX2プロテアーゼはX-Yに高い特異性を示した。

4)インヒビンβA鎖ダイマーがラット卵巣顆粒膜細胞でFSHリセプターを誘導することを明らかにし、さらにインヒビンβA鎖ダイマーのリセプターもまた顆粒膜細胞に存在していることを証明した。recombinantヒトインヒビンおよびβA鎖ダイマーを作製し、その作用を検討した。βA鎖ダイマーは、天然にはその存在は証明されていないが、recombinant βA鎖ダイマーも、ラット下垂体細胞からのFSH分泌を促進することを示した。未知の生理活性ペプチドの検索とそれらが作動する生体機序の解明を目指し、本年度は下記の成果を得た。1)Na利尿ペプチド・ファミリー研究:昨年度、われわれは、ブタ脳および心房中にANPと異なる新しいNa利尿ペプチド(BNP)が存在することを報告した。本年度、ブタBNPのcDNAプローブを用いて、ヒトおよびラットBNP各前駆体をコードするcDNAのクローニングおよびそれらの塩基配列を決定した。これらの結果に基づき、ANP-BNPファミリーがヒトやラットにも広く存在することを証明し、血圧および体液容量調節がANP-BNP系により、神経系ならびに内分泌系を通して制御される可能性を示した。またBNPのアミノ酸配列には、動物種差が著しくANPと極めて対照的であり、またBNP-mRNAの3′ー非翻訳領域にみられるAT-richシーケンスの存在は、BNPの発現調節がANPのそれと異なることを示している。2)生殖内分泌におけるインヒビンおよびアクチビンの役割:今年度は主にそれらの局所作用について検討した結果、アクチビンは卵巣に直接作用し、FSH、LHの作用を増強するとともに、卵に対しても、その成熟を促進することを明らかにした。一方、インヒビンの卵巣における直接作用はほとんど認められず、両ホルモンの相違が明らかになった。3)ペプチド性ホルモンのプロセシング酵素の研究:昨年度構造決定したKEX2遺伝子を酵母に導入して得られたKEX2プロテアーゼは、Lys-Arg、Arg-Arg、Pro-Argに極めて特異的で、α因子やキラートキシンのプロセシングに直接関与していると考えられた。ホ乳類プロセシング酵素研究のため、プロアルブミンーアルブミン変換をモデル系としてラット肝ゴルジ画分を検索した結果、酵母KEX2プロテアーゼと類似した酵素の存在が示唆されたため、現在その精製を実施している。1.未知のペプチドの検索:ブタ脳抽出物よりヒヨコ直腸弛緩活性を指標として未知ペプチドの検索を行った結果、22残基のペプチドを単離した。構造決定の結果、本ペプチドはANP、BNPに類似した利尿ペプチドであることが判明し、C型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)と命名した。CNPは生体内では中枢神経系に局在するとともに、薬理活性的にもANP、BNPとは大きく異なり、CNP特異的受容体の存在、神経系での作用が示唆された。2.ナトリウム利尿ペプチド・ファミリ-:循環系におけるANP、BNPの生理的役割を探るため、種々の生理的条件、病態モデル、疾患例につきANP、BNPのペプチド、mRNA量の測定を行った。その結果、BNPはANPと異なる生合成、貯蔵、分泌機序を取り、緊急時にはBNPの生合成、分泌が著しく亢進し、ANPだけでは不足する循環系におけるナトリウム利尿ペプチドの調節機能を維持しているものと考えられた。3.生殖内分泌におけるインヒビン、アクチビン:ヒトインヒビンの高感度RIAシステムを確立し、妊娠中に血中インヒビン値が高値を示すことを明らかにした。
障壁画の画題・表現・機能-会所から城郭へ-

15世紀から16世紀にかけての障壁画のうち、継続して調査をしている韃靼人図について、その受容のあり方を考察した。とくに、従来韃靼人図との関係を指摘されている文姫帰漢図だけではなく、台北故宮博物院所蔵の観猟図などの巻物形式の絵画が日本に伝来して、わが国の韃靼人図成立に大きく関与した可能性が高いことを、故宮博物院における作品調査のうえで確認をした。21年度にはもと障壁画であり、現在は他の形式に改変されている作品として、山梨県久遠寺書院障壁画、名古屋市総見寺所蔵花鳥図4幅、名古屋市興正寺所蔵の花鳥図屏風および唐人物図屏風、京都市無鄰庵内洋館二階貼付絵の調査をおこない、興正寺蔵の屏風については、22年4月に報告をおこない、無鄰庵貼付絵については22年5月に報告をおこなった。他の絵画についても、適宜発表する予定である。また、関連作品として、長野県田中本家博物館所蔵花鳥図屏風、島根県手銭記念館所蔵花鳥図屏風、帝鑑図屏風などの調査をおこなった。興正寺の花鳥図屏風は江戸時代前期、17世紀後半の京狩野様式を示す作品で、現在二曲一双の形式であるが、もともとは幅140cmほどの襖四面分であり、この大きさの襖は16世紀から17世紀の禅宗寺院の障壁画が該当する。さらに、同寺所蔵の唐人物図は、花鳥図と様式的に同一筆者と考えられ、現在六曲一双の形式であるが、もともとはやはり、140cm幅の襖四面分であることがわかった。この唐人物図の画面の一部には一連の襖絵の他の部分から移植された箇所があり、それを考え合わせると、制作当初の図柄をある程度復元することが可能である。興正寺には、この作品の伝来に関する史料が残っていないが、現存の花鳥図と唐人物図が隣り合う部屋の襖絵であり、表裏の関係にあったと推測することが可能である。京都市無鄰庵内洋館二階貼付絵は、桜に孔雀図、鶴図、松図、柳に鷺図という、もともとは別の部屋を構成していたと考えられる四種の絵画からなるが、いずれも、当初の建物の様相はとどめていない。しかし、このなかでもっとも保存状態が良好で画面の大きい桜に孔雀図を見ると、制作年代は17世紀中頃の狩野派系の作品であることがわかり、襖の引手跡が見られないことから、床貼付絵などの形式であったことが調査の結果判明した。本年度は、昨年度までに調査をおこなった一連の韃靼人図の体系化についての研究発表をおこなった(5月15日、意匠学会)。発表内容については、平成23年2月に意匠学会に投稿、査読を経て、23年7月刊行の『デザイン理論』77号に掲載が決まっている。また、昨年度調査をおこなった久遠寺障壁画、名古屋市総見寺花鳥図(もと障壁画)、愛知県正宗寺所蔵花鳥図(もと障壁画)、名古屋市興正寺所蔵屏風(もと障壁画)などについての調査結果は、『愛知県史文化財編』執筆にあたり参考とし、また、名古屋市文化財指定の報告書として提出した。これら「元障壁画」の調査は、これまでは体系的になされていなかったため、基本データの呈示から作業を始めた。また、22年4月には、京都市無隣庵の壁画を、23年2月には宇和島市立伊達博物館において、やはり元障壁画である「唐人物図」「花鳥図」の調査をおこなった。無隣庵障壁画に関しては報告書を作成した。さらに、田中本家博物館所蔵「花鳥図」について論文を執筆した。本申請課題「障壁画の画題・表現・機能-会所から城郭へ-」は、わが国の15世紀から16世紀にかけての障壁画の実態把握を目指した研究である。障壁画は、建築と一体になり人びとの生活空間を形成するものだが、本研究では、とくに、15世紀における室町将軍邸における会所と16世紀から17世紀にかけての城郭に焦点をあてて、それぞれの建築空間のなかで、どのような画題が選択され、それがどのようにと表現され、見る/見せる人にとってどのような意味をもったのかの解明を目指した。建物と一体になって障壁画が現存する例は、15世紀は言うまでもなく、16世紀においても非常に少ない。本研究では、現在、屏風形式に改装されているものの、制作当初は襖絵であったことのわかる例をできるだけ多く調査することとした。具体的には、久遠寺障壁画、名古屋市総見寺花鳥図、愛知県正宗寺所蔵花鳥図、名古屋市興正寺所蔵花鳥図および唐人物図、宇和島伊達博物館蔵唐人物図、ボストン美術館蔵韃靼人朝貢図などであり、これらの作品調査により、16世紀の障壁画の様相についての検討をおこなった。

また、その作業と並行して、九州国立博物館蔵韃靼人図と新出のサントリー美術館蔵韃靼人図とが、本来、一連の障壁画であったことを考察し、論文にまとめている。また、15世紀において独立した建物として成立をした会所に注目をして、ここでの障壁画の実態と機能について考察した。会所における障壁画は、唐物とは異なりそれ自体が直接的な価値をもつものではなく、それに似せたもの、つまり「擬似唐物」として装飾的機能をもっていた。このような「擬似唐物」としての障壁画の展開を、韃靼人図を通して考察し、同様に論文にまとめている。
虚血心筋細胞死と新しい心筋保護薬

1.虚血再灌流細胞死であるTunelアポトーシス細胞(apo)はLangendorff心の灌流液のglucoseと酸素との両方を減少させると急激なATP、pHの低下を伴いミトコンドリア(Mit)機能の低下を示し、認められた(Tong et al.,2001)。2.Mit膜電位に関与しCa流入を伴うapoを生じ、Na-H交換阻害薬(NHEI)がこの作用を抑制した。NHEIが心筋障害に有効との成績が得られ、構造中に塩素Cl(CL)とフッ素F(FL)をもち90%以上のLVDP回復を示す2つの化合物が合成された。活性酸素消去能を持つFLの方が、apo生成阻止作用はCLに比べ大きかった。活性酸素消去能を持たないCLは長時間の虚血再潅流ではFLよりも高いLVDPの回復を示した(Eur.J.Pharmacol.in press 2004)。3.また、5HT_<2A>拮抗薬(Mol.Cell.Biochem.投稿中)および新たに合成された5HT_<1A>拮抗薬も抗虚血作用を示し、活性酸素消去、apo細胞、関係するCaspase3の生成阻止を示した(第77回薬理年会発表)。4.酒類に含まれる環状ジペプチドも高い抗虚血作用を示し、MitへのCa^<2+>の取り込みの抑制、活性酸素消去、apo細胞、関係するCaspase3の生成阻止を示した(第77回薬理年会発表)。これらのことから、虚血再灌流障害はMitのPTPを生じチトクロームCが放出され、アポトーシス細胞の発生に関与するcaspace3を活性化する経路の関与が考えられる。1.Mit膜電位に関与しCa流入を伴うapoを生じ、Na-H交換阻害薬(NHEI)がこの作用を抑制,保護を示すことが報告された。NHEIが心筋障害に有効との成績が得られ、構造中にCI(CL)とF(FL)をもち90%以上のLVDP回復を示す2つの化合物が合成された。活性酸素消去能、apo生成阻止作用はFLの方が大きかった(薬理年会発表予定)。2.新たに合成され抗虚血作用を示す5HT_<1A>拮抗薬も活性酸素消去、apo細胞、関係するCaspase3の生成阻止を示した(発表予定)。3.活性酸素消去能はin vitroのX-typeESRで測定されたがin vivoの活性酸素・NOなどの変動を測定することができるNitroxyl-Probe(Cxp-AM)を合成し、心臓に負荷しL-TypeESRにより経時変化を測定する事ができた。糖の除去と窒素に変換すると、CxpのESRシグナルは一過性に増大し、減少した。酸素に戻すと更に減少した後、虚血前のレベルに回復した。X-typeで活性酸素消去する化合物はLVDPの回復と共にシグナルの変化は示されなかった。これは再酸素化により活性酸素が増大したと思われる(発表予定)。MitにeNOSが存在し,再灌流時に発生し,膜を破壊する・O_2^-消去のためにNOSが活性化されNO・を発生し,MitへのCa流入を阻害する.再灌流の際にNO・が・O_2^-,H^+,O_2とどの様に関与し,収縮回復に重要である自由エネルギー(ATP/ADP・Pi),Ca流入に関与するporeとの関係などがapo産生と心筋保護と直結するか更に検討している。3.また、5HT_<2A>拮抗薬(Mol Cell Biochem投稿中)および新たに合成された5HT_<1A>拮抗薬も抗虚血作用を示し、活性酸素消去、apo細胞、関係するcaspase3の生成阻止を示した(第77回薬理年会発表)。4.酒類に含まれる環状ジペプチドも高い抗虚血作用を示し、MitへのCa^<2+>の取り込みの抑制、活性酸素消去、apo細胞、関係するcaspase3の生成阻止を示した(第77回薬理年会発表)。
教師と教育実習生の授業設計過程の比較分析による支援システムの開発

教師と教育実習生に対する授業設計を支援する情報システムの開発のために,授業設計の手がかりと先行実践から得られる知と情報の活用について調査研究を行った。その結果,次の授業設計の手がかりに関する知見と支援システム開発のための示唆を得た.(1)授業設計の手がかりについては、(1)教科書の指導書,(2)授業の構成,(3)反応・応答,(4)(教師の)働きかけ,(5)板書,(6)指導教官・同僚の授業,(7)レディネス,(8)具体例の活用,(9)教材研究,(10)教科書,(11)先行実践の指導案,(12)学習活動,(13)シミュレーションの因子を抽出し、教師の授業設計の思考過程を分析・検討した.教師は教職経験に応じて多くの手がかりを活用し,授業設計手がかり因子のほぼすべてを用いる豊かな授業づくりを行うようになり、教育実習生,新任教師にはこの活動が乏しいことが明らかにされた.(2)教師が授業設計をするときに子どもが教材を理解する認知過程を共有することが有効であることを示した.授業設計は、「情報収集,教材の表象(具体化),授業過程の構成・検討」の3つの階層にわたる活動である.教師は「教材研究→学習活動→働きかけ→反応・応答」の流れで教材の表象を図り,働きかけ・授業過程を構成する仮説生成を行う.そこで,「教材研究,働きかけ,授業過程の構成」に関連して子どもの教材を理解する認知過程を共有するための教師への情報の支援が求められる.(3)授業設計を行うときに、先行実践の授業記録から教授方略・意図の構造を分析・抽出する活動と先行実践から得られる知を活用する再設計redesignが有効である.先行実践から授業設計の手がかりを抽出するために,先行実践における授業の遷移過程における教師の内面的な知見(実践の知)の抽出とそれらの知見を抽出する手続きを定式化をするため、先行実践に関する情報の量と質を充実させる必要がある.教師と教育実習生に対する授業設計を支援する情報システムの開発のために,授業設計の手がかりと先行実践から得られる知と情報の活用について調査研究を行った。その結果,次の授業設計の手がかりに関する知見と支援システム開発のための示唆を得た.(1)授業設計の手がかりについては、(1)教科書の指導書,(2)授業の構成,(3)反応・応答,(4)(教師の)働きかけ,(5)板書,(6)指導教官・同僚の授業,(7)レディネス,(8)具体例の活用,(9)教材研究,(10)教科書,(11)先行実践の指導案,(12)学習活動,(13)シミュレーションの因子を抽出し、教師の授業設計の思考過程を分析・検討した.教師は教職経験に応じて多くの手がかりを活用し,授業設計手がかり因子のほぼすべてを用いる豊かな授業づくりを行うようになり、教育実習生,新任教師にはこの活動が乏しいことが明らかにされた.(2)教師が授業設計をするときに子どもが教材を理解する認知過程を共有することが有効であることを示した.授業設計は、「情報収集,教材の表象(具体化),授業過程の構成・検討」の3つの階層にわたる活動である.教師は「教材研究→学習活動→働きかけ→反応・応答」の流れで教材の表象を図り,働きかけ・授業過程を構成する仮説生成を行う.そこで,「教材研究,働きかけ,授業過程の構成」に関連して子どもの教材を理解する認知過程を共有するための教師への情報の支援が求められる.(3)授業設計を行うときに、先行実践の授業記録から教授方略・意図の構造を分析・抽出する活動と先行実践から得られる知を活用する再設計redesignが有効である.先行実践から授業設計の手がかりを抽出するために,先行実践における授業の遷移過程における教師の内面的な知見(実践の知)の抽出とそれらの知見を抽出する手続きを定式化をするため、先行実践に関する情報の量と質を充実させる必要がある.1.授業設計過程のデータ収集授業設計過程を独話法で記録してもらうため、教師や教育実習生に対して貸し出すICレコーダを準備した.また,これとは別に教育実習を終了した実習生と教師に13の思考要素に影響を及ぼす先行の思考要素について一対比較法で評価してもらうアンケートを作成した.2.授業設計過程のデータの比較分析教師と教育実習生の授業設計過程の比較分析をするため、独話法により得られたデータをプロトコル分析により,どのような思考要素を用いているか,順序性と重要度,先行する思考要素の影響度から授業設計過程の構造の分析を試みた.同様に,アンケート調査により得られたデータから教師と教育実習生で思考要素と有意味な先行の思考要素間の対を求め,その思考要素間の対を元にISM法によって授業設計過程の構造の比較分析を試みた.3.システムの設計と利用法の開発それぞれの思考の段階で教師が必要とする資料を分析し,どこまでの資料を収集してシステムに登録するかを検討した.また、資料を公開する範囲を検討し、システムの運用計画を開発するのを試みた.既に作成されている光ファイリング装置に登録された学習指導案のデータベースと中型電算機に登録されたテスト項目のデータベースをシステムに移植するが、これらの資料の利用法について検討した.特に,ADF付のスキャナを新しく指導案のデータを登録するために導入した.1.授業設計過程のデータ収集大学の授業で,学生に授業設計を演習課題として課し,そこでの学生と実地指導講師の発話内容をICレコーダに記録し,プロトコルに起こした.

2.授業設計過程のデータの比較分析演習場面の発話データはプロトコル分析により,どのような思考要素を用いているか,順序性と重要度,先行する思考要素の影響度から授業設計過程の構造を明らかにすることを目標に,教師と教育実習生の授業設計過程の比較分析を進めている.同様に,アンケート調査により教師と教育実習生で思考要素と有意味な先行の思考要素間の対を求め,その思考要素間の対を元にISM法によって授業設計過程の構造をそれぞれに求め,授業設計過程の比較分析を行っている.3.システムの設計と利用法の開発それぞれの思考の段階で教師が必要とする資料を分析し,どこまでの資料を収集してシステムに登録するかを検討し、また、資料を公開する範囲を検討し、システムの運用計画を作成しているところである.既に作成されている光ファイリング装置に登録された学習指導案のデータベースと中型電算機に登録されたテスト項目のデータベースをシステムに移植を完了し、これらの資料の利用法について検討しているところである.特に,ADF(オートドキュメントフィーダ)付のスキャナは新しく指導案のデータを登録するために有用であった.教師と教育実習生に対する授業設計を支援する情報システムの開発のために,授業設計の手がかりと先行実践から得られる知と情報の活用について調査研究を行った。その結果,次の授業設計の手がかりに関する知見と支援システム開発のための示唆を得た.(1)授業設計の手がかりについては、(1)教科書の指導書,(2)授業の構成,(3)反応・応答,(4)(教師の)働きかけ,(5)板書,(6)指導教官・同僚の授業,(7)レディネス,(8)具体例の活用,(9)教材研究,(10)教科書,(11)先行実践の指導案,(12)学習活動,(13)シミュレーションの因子を抽出し、教師の授業設計の思考過程を分析・検討した.教師は教職経験に応じて多くの手がかりを活用し,授業設計手がかり因子のほぼすべてを用いる豊かな授業づくりを行うようになり、教育実習生,新任教師にはこの活動が乏しいことが明らかにされた.(2)教師が授業設計をするときに子どもが教材を理解する認知過程を共有することが有効であることを示した.授業設計は、「情報収集,教材の表象(具体化),授業過程の構成・検討」の3つの階層にわたる活動である.教師は「教材研究→学習活動→働きかけ→反応・応答」の流れで教材の表象を図り,働きかけ・授業過程を構成する仮説生成を行う,そこで,「教材研究,働きかけ,授業過程の構成」に関連して子どもの教材を理解する認知過程を共有するための教師への情報の支援が求められる.(3)授業設計を行うときに、先行実践の授業記録から教授方略・意図の構造を分析・抽出する活動と先行実践から得られる知を活用する再設計redesignが有効である.先行実践から授業設計の手がかりを抽出するために,先行実践における授業の遷移過程における教師の内面的な知見(実践の知)の抽出とそれらの知見を抽出する手続きを定式化をするため、先行実践に関する情報の量と質を充実させる必要がある.
高齢者の転倒事故を未然防止する安全福祉ロボットの開発

研究2年目である本年度は,昨年同様,高齢者を見守り体の状態を把握し,必要ならばその人の状態や体格に合わせて手助けすることで高齢者を転倒事故から守るためのロボット要素技術の開発を目指した.具体的には,ロボットが人の情報を獲得できるよう,「高フレームレートイメージセンサモジュール開発」のテーマを遂行し成果をあげた.画像情報を用いた高齢者の転倒前検出では,ビデオフレーム周期である33[msec]が制約条件になる.このような背景から,近年,高フレームレートで取得可能なビジョンシステムの開発が活気付いている.しかし現在販売されているものの多くは必要以上に高解像度であって価格も高く,必ずしも利用目的に見合ったものではないものが少なくない.本研究では,高速性のみに焦点を絞り,秒間200フレーム以上の画像取得が実現できる試作モジュールを作成した.イメージセンサは三菱製のCMOSイメージセンサM64285を採用した.このセンサは画素:32×32,最大フレームレート:364フレーム/秒のモノクロイメージセンサである.開発したモジュールの構成を述べる.イメージセンサから出力されるアナログ画像データはADコンバータに,トリガはCPLDのタイミング制御ブロックに同期をとるため入力される.タイミング制御ブロックからはADコンバータのタイミングトリガを出力し,AD変換の出力安定時間をみてラッチをかけ,変換した8ビット分のデータを保持させる.保持されたデータは基準クロックと位相をずらした画素トリガに同期させながらセレクタによって下位ビットから1ビットずつ出力されている.試作したイメージセンサモジュールにより1秒間に獲得できた画像データは,364フレーム分であり,すべて完全な画像であった.昨年度は200フレーム前後であったが,モジュールとPCのデータ転送をUSB1.1よりUSB2.0に変更したことにより改善した.今後の課題は,ノイズ対策と光学系の選定・製作である.研究1年目である本年度は,高齢者を見守り体の状態を把握し,必要ならばその人の状態や体格に合わせて手助けすることで高齢者を転倒事故から守るためのロボット要素技術の開発を目指した.具体的には,ロボットが「人の情報を獲得す」「人の状態を把握する」ことができるよう,下記のテーマに着手し成果をあげた.【人の情報を獲得する】・高フレームレート・ビジョンセンサユニットロボットに搭載可能な小型サイズでありながら高フレームレートで画像を獲得し処理するユニットを製作した.画像記録部,変換部,転送部をCPLDやFPGAを用いて独自に回路設計することで,秒間320フレームの画像データを獲得することに成功した.【人の状態を把握する】・歩行動作のゼロモーメントポイント(ZMP)解析とリハビリテーション支援ロボットの歩行概念であるZMPを用いて歩行動作を解析した.さらに転倒予防を目的とした計測システムを開発した.今回試作したシステムは,すべてのユニットを靴底に収めており,実験により歩行時の足圧と足の振りが屋内外を問わず計測できることを実証した.・ロボットが人に与える危険性の評価ロボット設計・制御と接触時の人のダメージを関連付け定量的に算出することで,ロボットの危険性を統一評価した.今回は衝撃力を規範量と定め,多リンクマニピュレータの安全接近動作の方針を見出した.シミュレーションによる検証を行い,その有効性を確認した.研究2年目である本年度は,昨年同様,高齢者を見守り体の状態を把握し,必要ならばその人の状態や体格に合わせて手助けすることで高齢者を転倒事故から守るためのロボット要素技術の開発を目指した.具体的には,ロボットが人の情報を獲得できるよう,「高フレームレートイメージセンサモジュール開発」のテーマを遂行し成果をあげた.画像情報を用いた高齢者の転倒前検出では,ビデオフレーム周期である33[msec]が制約条件になる.このような背景から,近年,高フレームレートで取得可能なビジョンシステムの開発が活気付いている.しかし現在販売されているものの多くは必要以上に高解像度であって価格も高く,必ずしも利用目的に見合ったものではないものが少なくない.本研究では,高速性のみに焦点を絞り,秒間200フレーム以上の画像取得が実現できる試作モジュールを作成した.イメージセンサは三菱製のCMOSイメージセンサM64285を採用した.このセンサは画素:32×32,最大フレームレート:364フレーム/秒のモノクロイメージセンサである.開発したモジュールの構成を述べる.イメージセンサから出力されるアナログ画像データはADコンバータに,トリガはCPLDのタイミング制御ブロックに同期をとるため入力される.タイミング制御ブロックからはADコンバータのタイミングトリガを出力し,AD変換の出力安定時間をみてラッチをかけ,変換した8ビット分のデータを保持させる.保持されたデータは基準クロックと位相をずらした画素トリガに同期させながらセレクタによって下位ビットから1ビットずつ出力されている.試作したイメージセンサモジュールにより1秒間に獲得できた画像データは,364フレーム分であり,すべて完全な画像であった.昨年度は200フレーム前後であったが,モジュールとPCのデータ転送をUSB1.1よりUSB2.0に変更したことにより改善した.今後の課題は,ノイズ対策と光学系の選定・製作である.
ファイル名/ディレクトリ名を秘匿可能なクラウド向けファイル共有システムの研究開発

クラウド上のオンラインストレージを安全に利用するために,暗号文ポリシー属性ベース暗号を利用してクライアント側でアクセス制御付きの暗号化を行うシステムを研究開発した.本研究では,従来の方式で考慮されていなかったファイル名/ディレクトリ名の情報も秘匿可能とし,なおかつ高速に動作する方式を検討した.さらにプロトタイプを作成して性能評価を行い,提案方式が実用的な時間で実行可能であることを確かめている.クラウド上のオンラインストレージを安全に利用するために,暗号文ポリシー属性ベース暗号を利用してクライアント側でアクセス制御付きの暗号化を行うシステムを研究開発した.本研究では,従来の方式で考慮されていなかったファイル名/ディレクトリ名の情報も秘匿可能とし,なおかつ高速に動作する方式を検討した.さらにプロトタイプを作成して性能評価を行い,提案方式が実用的な時間で実行可能であることを確かめている.クラウド上のストレージでグループ間でファイルを安全に共有するために,暗号文ポリシー属性ベース暗号を用いてクライアントでアクセス制御機能付きの暗号化を行うシステムが提案されている.しかしながら,従来の方式はファイル本体の暗号化のみ考慮されており,ファイル名/ディレクトリ名などコンテンツの内容が含まれ得る情報は対象になっていなかった.本研究ではファイル名/ディレクトリ名を秘匿可能で高速に動作する方式について研究・開発することを目的とする.本年度は以下のとおり実施した.研究代表者は,これまでにファイル名/ディレクトリ名を秘匿可能なシステムについて検討をしており,基本的な操作のプロトコルを与えている.この成果をもとに,方式およびシステムの詳細設計,プロトタイプ実装,構築した検証環境における性能評価を行い,その結果の一部はジャーナル論文誌に採録されている.上記の基本システムに対して必要な機能について検討を行っている.具体的には,複数の組織(鍵発行センター)が連携してシステムを運用する際の課題と解決策,提案方式の特性を利用してユーザの鍵を失効させる方式について検討している.これらの内容については各分野の専門家と議論を行っており,内容が整理でき次第学会で発表する予定である.提案方式の内部で使っている暗号技術について新しい方式の検討および安全性評価を実施している.具体的にはXORから構成される秘密分散法とストリーム暗号を利用してクラウド上で効果的にファイルを秘匿・保存する方式の開発やストリーム暗号方式の利用シーンに依存した安全性の評価などを行っている.これらの成果は,国内・国際会議で発表し,一部の結果はジャーナル論文誌に採録されている.平成25年度に引き続き,秘密分散法を利用してファイルを分散保存する方式について検討を進めた.XORに基づく秘密分散法とストリーム暗号を利用して,モバイル環境などネットワーク資源が乏しい場合に有効な方式を検討し,鍵配布など具体的な処理手順について提案・評価した.この方式は本課題で取り組んでいる暗号文ポリシー属性ベース暗号を用いたファイル共有サービスの冗長性及び機密性を強化できる.なお,本研究成果は国際会議ADMNET 2014で発表している.さらに,上記の方式で利用するストリーム暗号について利用シーンを考慮した安全性について詳細に評価した.具体的にはRC4暗号をブロードキャストセッティングと呼ばれる同じ平文を何度も暗号化して送信するような場合の安全性について解析し,新たな脆弱性を発見している.本研究成果は国内学会での発表をし,一部の結果についてはジャーナル論文誌に採録されている.その他,属性ベース暗号のユーザ鍵の失効および暗号文の更新方法についてAsiacrypt 2013でLeeらによって提案された方法について調査した.また,鍵発行センターの管理母体が異なるユーザ間でも提案システムを利用できる方法について検討を行っている.しかしながら,これらについては研究課題の期間内に十分な検討ができておらず,研究成果を得られていない状況である.今後,継続して検討を進め,成果が得られれば学会発表等で報告する予定である.情報セキュリティ研究実施計画における本年度の実施項目について概ね計画通り実施し,成果をあげることができた.当初の研究実施計画に沿って,本年度検討した秘密分散法も考慮して保存するファイルの冗長化手法について検討する.また,提案方式の特性を利用してユーザの鍵を失効させる方式の提案・評価,複数の鍵発行センターが連携したシステムを構築し運用実験を通して課題の抽出および解決策を考案を行う予定である.本年度に構築した提案システムの検証環境において,ネットワークを柔軟に変更できるようにネットワークスイッチを追加で購入しようとして予算を残していたが,年度末に多忙になり作業が困難であることがわかったため年度内の購入を取りやめ,次年度に購入することにした.予定していたネットワークスイッチの購入費用に充てる.なお,必要な能力を再度見積もり,必要な機器の購入に予算が不足している場合は2014年度予算の一部と合わせて購入する予定である.
中枢神経系原発悪性リンパ腫の診断・治療に関するバイオマーカーの探索

中枢神経系原発悪性リンパ腫(PCNSL)は難治性の悪性脳腫瘍である。診断には生検による病理診断が必須で、低侵襲で診断可能な分子マーカーは存在しない。標準治療は大量メトトレキサート(HD-MTX)療法基盤化学療法と全脳照射であるが、高齢者は照射により高次脳機能障害をきたしやすく、化学療法単独療法が試みられているが未だ満足のいく治療成績は得られていない。本研究では血清でPCNSLの診断を可能にする特異的分子マーカー及び高齢者PCNSL治療に重要なHD-MTX基盤化学療法の感受性と予後に関わる分子マーカーを探索し、PCNSLの新たな診断法・治療法の開発に向けて基盤的研究を行うことを目的とする。
蛍光相関分光法による転写因子ＦＭＢＰ－１高速ＤＮＡ認識動態の多成分同時定量解析

引き続き、「生細胞内で発現された転写因子の段階的なDNA認識動態について、それらの拡散動態が生じるために必要な外的・内的環境条件を決定付けること」を目的とし、研究を進めた。1.FMBP-1の超解像観察:前年度までの蛍光相関分光法(FCS)による解析から、細胞核内のFMBP-1の複数の拡散動態は、クロモソーマルDNAとの相互作用を反映すると示唆された。本年度は超解像顕微鏡によるさらなる解析を行った。蛍光標識を施したヒストン蛋白質H2BをEGFP-FMBP-1融合蛋白質と同時にHeLa細胞に発現させ、SIM顕微鏡を用いて観察した結果、野生型のFMBP-1とH2Bで明らかな共局在が見られた一方、DNA結合能欠損変異体FMBP-1とH2Bの分布が重ならないことが明示された。このことから、FMBP-1の相互作用相手が核内クロモソーマルDNAであることが確かめられた。2.FCCSによる解離定数(Kd)の導出:前年度の研究で、細胞溶解産物(ライセート)中での蛍光相互相関分光法(FCCS)測定によってFMBP-1とDNAプローブの相互作用が定量可能なことが示された。本年度はこの研究をさらに進め、多種類のFMBP-1変異体とDNAプローブを組み合わせて滴定実験を行い、Kdを算出した。野生型FMBP-1と認識配列DNAプローブ間のKdは数百nMと算出された一方、DNA結合ドメイン欠損変異体では有意な相互作用は見られず、少なくとも10 μM以上の高いKdが推定された。これらの実験の結果から、FMBP-1のDNA結合能の配列特異性が初めて定量的に示された。3.海外研究所における短期訪問研究:本年度はスウェーデン・カロリンスカ研究所に短期滞在し、同所にて開発中の多点同時FCS解析装置によるFMBP-1の拡散動態観察を試みた。現地の研究員と協力して実験系を立ち上げ、多くの測定データを得ることができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。「生細胞内で発現された転写因子の段階的なDNA認識動態について、各段階の動態の拡散特性を定量化し、それらの拡散動態が生じるために必要な外的・内的環境条件を決定づけること」を目的とし、北海道大学細胞機能科学研究室のご協力の下、以下の実験を行った。(1)カイコ絹糸腺組織でのin situ-FCS解析の完了:カイコ由来転写因子FMBP-1のin situにおける動態解析のため、カイコ5齢幼虫の後部絹糸腺内において、パーティグルガン法でEGFP-FMBP-1蛋白質の一過的導入・発現を行い、蛍光相関分光法(FCS)を用いて解析した。その結果、野生型のEGFP-FMBP-1は申請書に記載したHeLa細胞における解析結果と同様、4つの拡散動態を示すことが明らかになった。さらに比較のため、DNA結合能を欠損させた変異体を導入・発現させた細胞においても解析を行った結果、こちらもHeLa細胞での観察と同様の結果を示した。これらの結果から、in situ環境においてもFMBP-1が段階的DNA動態を示すことが明らかになった。(2)細胞ライセートFCCS解析:生細胞内FCS解析によって明らかとなったEGFP-FMBP-1の細胞核内動態の特性をより詳細に検討するために、EGFP-FMBP-1発現細胞を界面活性剤Triton X-100で溶解処理し、認識配列・ランダム配列DNAプローブを添加した状態で蛍光相互相関分光法(FCCS)による測定を行った。その結果、相互作用の強度を示すRelative Cross Amplitude (RCA)値は、認識配列DNAプローブに対してのみコントロール(EGFP単独発現細胞のライセート中で測定)よりも有意に高い値を示した。今後はDNA分子濃度によるDNA相互作用の変化を定量化するため、Kdの算出を試み、さらに核内動態再現のための条件検討を進める予定である。(3)論文投稿: HeLa細胞、カイコ後部絹糸腺細胞におけるFCS解析について論文を執筆し、海外学術誌に投稿した。2015年4月現在、レビュワーによる審査中である。本年度はこの研究をさらに進め、多種類のFMBP-

1変異体とDNAプローブを組み合わせて滴定実験を行い、Kdを算出した。野生型FMBP-1と認識配列DNAプローブ間のKdは数百nMと算出された一方、DNA結合ドメイン欠損変異体では有意な相互作用は見られず、少なくとも10 μM以上の高いKdが推定された。これらの実験の結果から、FMBP-1のDNA結合能の配列特異性が初めて定量的に示された。3.海外研究所における短期訪問研究:本年度はスウェーデン・カロリンスカ研究所に短期滞在し、同所にて開発中の多点同時FCS解析装置によるFMBP-1の拡散動態観察を試みた。現地の研究員と協力して実験系を立ち上げ、多くの測定データを得ることができた。今年度に計画していた、ライセートFCCS実験系の確立は計画どおり達成できた。また、予定していた論文投稿にも踏み切り、現在審査中ではあるが計画当初の予定通りに進展している。27年度が最終年度であるため、記入しない。現在のところ、大きな問題点は生じていない。そのため、当初の計画に沿って研究を遂行する予定である。前年度に得られた研究結果については、次年度の早い時期に論文投稿すべく、現在執筆中である。また、次年度にはスウェーデン・カロリンスカ研究所において、先端的な蛍光顕微鏡技術を用いてより詳細な解析を行う計画である。