hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
低酸素応答装置による免疫細胞機能調節機構の解明と新規抗炎症療法の開発

免疫系細胞機能制御におけるHIF-1およびHIF-1-IPAS相互作用をはじめとする低酸素シグナルの役割を明確にするとともに、低酸素応答装置を標的とする新たな抗炎症療法、免疫制御法開発の基盤を確立することを目的として展開された。HIF-1α発現が、細胞環境の酸素濃度のみならず、糖濃度やサイトカインなどによって制御されていることを解明した。また、HIF-1経路の抑制により、動物モデルにおける自己免疫性関節炎が改善することを明らかにし、低酸素シグナルをターゲットとする抗炎症療法の有用である可能性を示した。炎症や免疫応答の制御において、組織局所の酸素分圧の役割が注目されている。申請者は、活性化リンパ球やマクロファージの機能制御に、低酸素応答性転写因子(HIF)が密接に関与する事を見いだし、HIFを標的とした抗炎症療法の開発を目指してきた。薬剤によるHIF発現制御に加え、内因性HF機能抑制分子IPASを用いたHIF機能抑制の炎症細胞機能制御、炎症性血管新生制御における有用性を明確にしつつある。最近、申請者は、IPAS遺伝子のプロモーター構造、IPAS mRNAスプライシング制御機構を明らかにし、人為的IPAS発現制御/HIF機能抑制法の開発の突破口を見いだした。本研究は、免疫系細胞機能制御におけるHIF-1およびHIF-1-IPAs相互作用をはじめとする低酸素シグナルの役割を明確にするとともに、低酸素応答装置を標的とする新たな抗炎症療法、免疫制御法開発の基盤を確立することを目的として展開された。平成20年度は以下の成果が得られた。1)免疫細胞におけるHIF-1α発現制御機構の解析本研究では、免疫細胞におけるHIF-1α発現制御の分子機構の解明をめざした。(1)免疫細胞におけるHIF-1α遺伝子、蛋白発現とその制御機構の解析:単球系細胞におけるHIF-1α蛋白質の発現にはマクロファージへの分化課程が密接に関わる事を明らかにした。(2)疾患モデル動物におけるHIF-1α発現の解析:コラーゲン誘発関節炎モデルにおいてHIF-1発現の増強を認めた2)免疫細胞におけるHIF-1αシステムの人為的調節と疾患治療の試み(1)抗HIF-1分子IPAsの発現誘導によるHIF-1機能抑制法の確立:IPAS高発現マウスにおいてはコラーゲン誘導関節炎の重症度、発症頻度いずれも抑制された。薬剤によるHIF発現制御に加え、内因性HIF機能抑制分子IPASを用いたHIF機能抑制の炎症細胞機能制御、炎症性血管新生制御における有用性を明確にしつつある。本研究は、免疫系細胞機能制御におけるHIF-1およびHIF-1-IPAS相互作用をはじめとする低酸素シグナルの役割を明確にするとともに、低酸素応答装置を標的とする新たな抗炎症療法、免疫制御法開発の基盤を確立することを目的として展開された。平成21年度は以下の成果が得られた。(1)免疫細胞におけるHIF-1α遺伝子、蛋白発現とその制御機構の解析:単球系細胞におけるHIF-1α蛋白質の発現には、糖濃度など低酸素以外の細胞外刺激が重要な役割を果たしていた。グルコース応答性転写因子ChREBPはHIF-1aのmRNAを誘導し、HIF-1α発現制御に関わっていた。2)免疫細胞におけるHIF-1αシステムの人為的調節と疾患治療の試み(1)ChREBP発現抑制細胞ではHIF-1標的遺伝子の発現が抑制された。

本研究は、免疫系細胞機能制御におけるHIF-1およびHIF-1-IPAS相互作用をはじめとする低酸素シグナルの役割を明確にするとともに、低酸素応答装置を標的とする新たな抗炎症療法、免疫制御法開発の基盤を確立することを目的として展開された。平成22年度は以下の成果が得られた。1)免疫細胞におけるHIF-1α発現制御機構の解析本研究では、免疫細胞におけるHIF-1α発現制御の分子機構の解明をめざした。(1)正常酸素濃度下におけるHIF-1α遺伝子、蛋白発現とその制御機構の解析:正常酸素濃度下のHIF-1α蛋白質の発現には、インスリンなど低酸素以外の細胞外刺激が重要な役割を果たしていた。アディポカインはインスリンと共同してHIF-1朕発現制御に関わっていた。2)免疫細胞におけるHIF-1αシステムの人為的調節と疾患治療の試み(1)グルコース応答性転写因子を標的とし、HIF-1標的遺伝子の発現を広く抑制するSiRNAシステムを構築した。
顆粒膜細胞におけるmicroRNA発現量を用いた、新規良好胚選択法の開発

わが国における体外受精時の単一胚移植の推進は、多胎予防に大きく貢献している。単一胚移植の成績を向上させるためには、良好胚をいかに正確に選択するかということが最も重要であるが、現行の形態学的分類に基づいて選択された良好胚の着床率は3割程度であり満足のいくものとは言えず、さらに精度の高い選択法の開発が必須である。卵子は卵胞内において顆粒膜細胞に内包されており、顆粒膜細胞は体外受精時に容易にかつ卵子そのものに侵襲を与えずに採取することが可能であるため、卵子の状態を知るマーカーとしての有用性が注目されている。本研究においては、顆粒膜細胞におけるhas-mir-451発現量が採取時卵子の成熟度を反映しているという既報に基づき、has-mir-451発現量が卵子のその後の受精能、受精後の胚発生能とも関連しするのではないかという仮説のもとこれを検証した。体外受精のうち顕微授精を施行した患者より、卵子周囲の顆粒膜細胞(卵丘細胞)を、卵子毎に回収した。採卵18時間後の受精確認時に、受精成立群(F)と受精非成立群(U)とに分類した。F群に関し、採卵後3日目、5日目に形態学的分類(各々Veeck分類、Gardner分類)により良好胚(G)群と非良好胚(N)群とに選別した。G群とU+N群において、卵丘細胞におけるhas-mir-451発現量を比較したところ、G群においてU+N群より発現がやや高い傾向にあったが、有意差には至らなかった。有意差に至らなかった原因として、検体数が少ないため十分なパワーがなかったこと、あるいは、has-mir-451発現量は採卵時卵子の成熟度は反映してもその後の発生能とは関連しない可能性の両方が考えられた。検体数を増やし検討を重ね、G群、U+N群で優位に発現量に差を認めるということであれば、今後、従来の形態学的分類とhas-mir-451発現量とを組み合わせることにより、より高い精度で良好胚を選別することができるか否か臨床的検討へと進みたいと考えている。
硼化物高温強磁性体の基礎物性解明と熱電材料への応用研究

本研究課題が対象とした「高温強磁性物質」はCa_xLa_<1-x>B_6である。アメリカとスイスの著名な研究グループによるこの異常な強磁性の発見が1999年Nature誌上に発表されて以来、世界的な反響が巻き起こり、日本においても幾つかのグループが鎬を削って研究を進めてきた。我々もその強磁性発現のメカニズムを探るべく試料育成とその分析、磁化の測定を組み合わせてこの1年の間精力的に実験を行ってきた。しかし、我々がごく最近行き着いた結論は、上記高温強磁性はCaB_6に固有の本質的なものではなく、鉄に起因した不純物効果によるものである。物理学上、極めて残念な結果である。いますこし詳しく述べれば、適当な試料育成条件を選ぶことにより、Laをドープしなくても(即ちCaB_6において)同じ強磁性転移温度を持つ強磁性状態を作り出すことができる。この試料を適当な濃度の酸に浸すことにより、強磁性が消失することを発見した。この酸をプラズマ発光分光装置で分析を行ったところ鉄が検出され、この鉄の濃度と減少した強磁性磁化の大きさの相関を調べたところ、これら2つの物理量に強い相関があることを見出した。これにより、われわれは上記の結論に至った。この結果は、2002年3月に開催予定の日本物理学会年次大会で発表・報告する予定である。また、英文の論文も現在準備中である。しかし、熱電材料としてのCaB_6の可能性がこれによって否定されたわけではない。実際、数百度程度の高温領域で大きな熱起電力を有していることに変わりはない。従って、次年度以降は、むしろ応用材料としての可能性を追求していきたい。
糖・脂質代謝のリプログラミングによる抗肥満効果

糖・脂質代謝に関与する一連の酵素群の発現調節を担っている転写因子ChREBPは、肥満等を伴うメタボリックシンドロームの成因となる重要な因子であることが分かりつつある。我々は、ChREBPの欠損マウスを保有しており、従来より本マウスの解析を進めており、表現型として肝臓や脂肪組織において糖・脂質代謝の低下を認め、さらには高炭水化物食の負荷でも体重増加を認めないことなどを明らかとしてきた。本研究では、この体重増加を認めない原因を追究し、ChREBPの欠損あるいは活性化阻害が示す抗肥満効果のメカニズムを解明するとともに、ChREBP阻害剤の開発へと発展させようとするものである。高炭水化物食として高ショ糖食を与えたところ体重増加が野生型マウスと比べて少ないことから、小腸からの糖分吸収に阻害がかかっていると予想した。そこで単糖の吸収の役割を果たすグルコーストランスポーターの発現量を確認したところ、特にフルクトースの選択的に吸収するGlut5の発現がKOマウスで著しく低下していることを突き止めた。Glut5はフルクトースの濃度に応じて誘導されるわけだが、そもそも二糖類であるショ糖が単糖であるグルコースとフルクトースへと消化されていないと考えた。そこで消化酵素であるスクラーゼの発現量を検討した結果、やはり予想通りKOマウスでスクラーゼの発現量の低下を認め、酵素活性も低下していた。以上のことから、ChREBP KOマウスでは小腸においてスクラーゼの酵素活性が低下することでショ糖の消化が抑制され、その結果としてGlut5の誘導も低下しフルクトース自体の吸収に阻害がかかることで体重が増加しないことが判明した。体重増加が認められない主な原因が、小腸におけるスクロースの発現量低下と、Glut5の発現量低下であり、その結果としてショ糖およびフルクトースの吸収に阻害がかかり、たとえショ糖食を与えても体重が増加しないことが分かった。以上の理由から、おおむね順調に進展していると考える。今後の予定としては、スクロースおよびGlut5の発現調節をChREBPが直接行っているのか否かをin vivoの条件で検討を行う必要がある。そのために、スクロースおよびGlut5の発現調節に関わるプロモーター領域を含む遺伝子配列を導入したレポータージーンを構築し、転写活性などを細胞レベルで検討する予定である。またChREBP遺伝子のノックアウト細胞やノックイン細胞を作製し、スクロースやGlut5の発現量などを解析することでも確認する予定である。予定通り助成金を使用したが、どうしても端数が生じてしまった。次年度の使用計画として、遺伝子工学の為の試薬類、細胞培養関連の培地や試薬類、その他プラスチック類など消耗品の購入を予定している。
LSCF-GDCコンポジット空気極の性能向上メカニズムの解明

本研究は,混合導電体であるLSCFにイオン導電体のGDCを混合したSOFC空気極の性能向上メカニズムを明らかにすることを目的として実施した.LSCF-GDC粉末の混合比を変化させた空気極を作製し,その過電圧特性,および収束イオンビーム操作型顕微鏡(FIB-SEM)による3次元構造解析を行い,三相界面長,屈曲度ファクター,比表面積,粒径分布等の電極性能を特徴付ける構造パラメータを取得した.さらに,格子ボルツマン法による分極シミュレーションを実施し,その分極特性を予測した.その結果,LSCF-GDCコンポジット電極では,三相界面反応の局所活性を考慮しないと,実験結果を再現できないことを示した.混合導電性酸化物であるLSCFおよびLSCに対して,高いイオン伝導性を示す酸化物であるGDCを混ぜた場合の電極性能評価および電極構造解析を行うためのセル作成を試みた.5グラムのGDC粉体をペレット作成型に封入し,ハンドプレスを用いて60MPaで30分圧縮し,その後冷間等方圧加圧法(CIP)を用いて200MPaで30分さらに圧縮した.これを型から取り出し,空気雰囲気の電気炉内で1550°Cにて5時間焼成した.本GDCペレット上に微細凹凸を設けるための型を以下の手順で作製した.Si基板上にスピンコート法を用いてSU-8 3025の塗布を行い,ホットプレート上で95°C,10分間のソフトベークを行った.このSU-8 3025上にフォトマスクを重ねてマスクアライナーES410を用いてUV光を照射し,ホットプレート上で95°C,10分間の露光後ベークを行った.その後,プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテートに浸漬させて現像を行った.最後に,電気炉で200°Cで30分間のハードベークを行い,凹凸構造のマスターとなる金型を作成した.続いて,UV硬化樹脂SU-8 3025をPETフィルムとマスター金型の間に挟み,0.5 MPaの圧力を5分間保持して転写を行った.その後,UV光を照射量3000 mJ/cm2で照射することにより樹脂を硬化させた.次に樹脂の強度を高めるために,ホットプレート上で95°C,10分間のベークを行った.最後に転写されたUV硬化樹脂のパターンをマスター金型から離型し,SU-8樹脂のレプリカ金型を作製した.このレプリカ金型を用いて,GDC電解質ペレットに微細な凹凸を形成することを試みたが,割れが発生したため,繰り越しを行った.プレス圧力およびその時間の調整を行ったところ,H28年度初頭に割れのないペレットを作成することが可能となった.プレス圧力および時間を調整することで,割れのないGDC電解質ペレットの作成に成功した.繰り越しは行ったものの,十分に挽回可能であり,おおむね順調に進展していると考えている.混合導電性酸化物であるLSCFおよびLSCに対して,高いイオン伝導性を示す酸化物であるGDCを混ぜた場合の性能評価および電極構造解析を行った.異なる体積分率のLSCF-GDCおよびLSC-GDCコンポジット電極を作製し,性能評価を行った結果,過電圧および分極抵抗はLSCF-GDCとLSC-GDCのいずれの場合でも,体積分率が30:70,vol. %で最も低くなること,つまり最も性能が高くなるということが明らかになった.FIB-SEMを用いて電極の微細構造を再構築し,微細構造構造パラメータを算出した.表面反応に寄与するLSCFあるいはLSCの表面積は30:70,vol. %の体積分率では減少することから,LSCFーGDCおよびLSCーGDCコンポジット電極は表面反応に加えて,三相界面反応の両反応が性能に寄与することが考えられる.GDC電解質表面に微細な凹凸を設けた場合の効果について,格子ボルツマン法による数値シミュレーションコードを作成した.本ツールを用いることで混合伝導性酸化物とイオン伝導性酸化物コンポジット電極構造の系統的なパラメータサーベイ評価が可能になった.混合伝導性酸化物を用いた場合でも三相界面を増加させること,そして反応有効厚みを増加させることが性能向上には有効であるということを確認した.一方,GDC電解質上への微細凹凸加工についても,モールド作成条件を系統的に評価した.今後,電解質上に設ける凹凸形状や,充填する粒子径や体積分率等を系統的に変化させたパラメータサーベイイを実施する.混合伝導性酸化物とイオン伝導性酸化物コンポジット電極の実験及び数値計算を実施しており,反応機構の解明が進んできている.また,それを用いた数値実験により混合伝導性酸化物とイオン伝導性酸化物コンポジット電極の系統的なパラメータサーベイ評価が可能になりつつある.一方,GDC電解質上への微細凹凸加工についても,モールド作成条件を系統的に評価しており,着実に凹凸のピッチや高さをコントロールできるようになってきた.以上からおおむね順調に進展していると考えている.本研究は,混合導電体であるLSCFにイオン導電体のGDCを混合した際の,有効イオン導電率が向上する効果と,GDC-LSCF-空隙間の三相界面反応による寄与を定量的に区別して評価することで,その性能向上メカニズムを明らかにすることを目的として実施したものである.LSCF-GDC粉末の体積混合比を変化させたSOFC空気極を実際に作製し,その過電圧特性,および収束イオンビーム操作型顕微鏡(FIB-SEM)による3次元構造解析を行い,三相界面長,屈曲度ファクター,比表面積,粒径分布等の電極性能を特徴付ける構造パラメータを取得した.

さらに,表面反応,三相界面反応,有効イオン伝導パスを考慮した格子ボルツマン法による分極シミュレーションを実施し,LSCF-GDCコンポジット電極の分極特性を予測した.その結果,LSCF-GDCコンポジット電極では,三相界面反応の局所活性を考慮しないと,実験結果を再現できないことを示した.また,LSCF-GDCの混合割合だけでなく,電解質表面に微細凹凸を設けることで,有効イオン導電率を系統的に変化させた電極を作製するために,大面積の電解質表面に10ミクロンオーダーの微細凹凸を作製する名のインプリントリソグラフィー技術を開発した.光硬化樹脂とGDC粉末を混合し,電解質上に転写した後,高温で焼成することで,世界に先駆けて10ミクロンオーダーの凹凸を実現することに成功した.本研究は,混合導電体であるLSCFにイオン導電体のGDCを混合したSOFC空気極の性能向上メカニズムを明らかにすることを目的として実施した.LSCF-GDC粉末の混合比を変化させた空気極を作製し,その過電圧特性,および収束イオンビーム操作型顕微鏡(FIB-SEM)による3次元構造解析を行い,三相界面長,屈曲度ファクター,比表面積,粒径分布等の電極性能を特徴付ける構造パラメータを取得した.さらに,格子ボルツマン法による分極シミュレーションを実施し,その分極特性を予測した.その結果,LSCF-GDCコンポジット電極では,三相界面反応の局所活性を考慮しないと,実験結果を再現できないことを示した.今後凹凸の形状のピッチや高さの最適化を行うが,粉末の重点条件および転写条件の調整等を行う予定である.混合伝導性酸化物とイオン伝導性酸化物コンポジット化することが,実際に高性能化への効果が高いことが実証できた.今後は,長期安定性の評価を実施するとともに,数値計算から得られた情報をもとに,電解質上に設ける微細凹凸の最適化や粒子径の最適化を行う予定である.29年度が最終年度であるため、記入しない。熱工学29年度が最終年度であるため、記入しない。
亜鉛欠乏症のTh2リンパ球－M2マクロファージ経路を介した炎症反応増強の機序解明

【目的】必須微量元素である亜鉛が不足すると、免疫機能が低下し、炎症反応を生じることが報告されている。しかし、その機序については解明されていない。本研究では、亜鉛欠乏ラットを作製し、免疫機能の中枢である脾臓のヘルパーTリンパ球(Th1およびTh2)とマクロファージサブタイプ(M1およびM2)の分化誘導への影響について検討した。さらに、IL-4の腹腔内投与あるいは亜鉛補充を行い、亜鉛欠乏による炎症反応を抑制できるか検討した。【方法】SDラット(5週令:雄)に亜鉛欠乏食(亜鉛無添加)または亜鉛標準食(0.01%亜鉛含有)を毎日17gずつ6週間与えた。さらに亜鉛欠乏食のうち、一つの群には、IL-4の腹腔内投与(100ng/rat/週3回)を行い、もう一つの群には、亜鉛標準食を4週間与え亜鉛を補充した。【結果】亜鉛欠乏群で、1M2マクロファージ、IL-4/IL-13陽性細胞数の減少、2IL-1βおよびMIP-1αのmRNA発現の増加、3GATA-3のタンパク量の減少を有意に認めた。亜鉛欠乏/IL-4腹腔内投与群と亜鉛補充群で、1M2マクロファージ、IL-4 /IL-13陽性細胞の減少の抑制、2IL-1βとMIP-1αのmRNA発現の増加の抑制、3亜鉛補充群でGATA-3のタンパク量の増加を有意に認めた。【考察】亜鉛欠乏による炎症反応には、Th2リンパ球ーM2マクロファージ経路が関与することが明きらかになった。そして、この炎症反応はIL-4投与または亜鉛補充により抑制できることが示された。進捗状況として「亜鉛欠乏症のTh2リンパ球ーM2マクロファージ経路を介した炎症反応増強の機序解明」は、亜鉛欠乏ラットの脾臓を用いて研究する内容であった。研究成果の一部は1月に英語論文として受理されている。そこで、現在は亜鉛欠乏の炎症反応の機序についてマクロファージやTリンパ球以外の免疫担当細胞の関与について研究を進めている。さらに、末梢血や胸腺などの免疫担当細胞が関与する臓器と炎症反応についても検討を進めている。亜鉛欠乏の炎症反応について、明きからとなった「抗炎症型Th2リンパ球ーM2マクロファージ経路の低下」以外の他の要因も炎症反応の増悪に関与しているかどうかを追求する必要がある。そこで、急性炎症の指標である好中球について着目する。脾臓及び末梢血の好中球やその遊走因子であるケモカインを測定することで、亜鉛欠乏の炎症反応に関与しているかどうかを明らかにする。さらにIL-4の投与や亜鉛補充を施すことで、炎症反応を抑制/回復させることができるかどうかについても検討する。

研究計画の「亜鉛欠乏症のTh2リンパ球ーM2マクロファージ経路を介した炎症反応増強の機序解明」の一部は測定が終了した。故に予定よりも動物実験の回数が減り、使用する動物飼育費や特殊飼料費への使用額が少なかったことが理由である。次年度は、測定を実施できていない項目や他の臓器(胸腺や末梢血)を検討するため動物実験の回数や特殊飼料の発注数を増やす予定である。
高分子ゲル表面簡易観察技術の開発

大学等の研究機関において、近年、学生実験等の工学教育現場にて最新技術の導入が進んでいる。しかし、近年様々な新規材料(特に高強度高分子ゲル)が開発されており、最新設備を用いた分析技術や加工法にて分析・加工をすることが困難な事態が生じている。申請者は、研究教育支援の立場より、日々試行錯誤を繰り返し分析・加工を行っているが、ラボベースで簡易的かつ有効な、大気雰囲気下と真空中における表面観察・分析技術を開発し、研究教育への支援技術確立を目的とした。本研究では、1一般的な光学顕微鏡を用いて大気中での高分子ゲル表面観察観察と、2汎用SEMを用いての真空中における高分子ゲル表面分析を可能にした。1大気中での高分子ゲル表面観察を一般的な光学顕微鏡での観察では、親水性・疎水性表面処理を施したナノパーティクルを表面に付着させることにより摩擦・摩耗痕の観察が可能となった。また、2を実現するために、紫外線硬化剤の塗布により薄膜状の保護表面を形成することで汎用のSEMを用いて、真空中における摩擦・摩耗痕等の高分子ゲル表面分析が可能となった。はじめに、親水性、疎水性ナノパーティクル、紫外線硬化剤の選定し、購入後に高分子ゲルに対しての揮発性等を、デシケータ内や真空乾燥機等を用いて評価し、その後、光学顕微鏡・SEMを用いてナノパーティクル、紫外線硬化剤を決定した。次に、表面簡易観察技術の評価として、各ナノパーティクル、紫外線硬化剤にて作製した高分子ゲル表面を相対評価した。評価方法は、画像解析による塗布表面の面積率、3次元レーザー顕微鏡による線粗さ、面粗さを用いた。また、データを基に本学機械システム工学分野の教員に評価いただいた。
明らかな骨量増加を呈するTmem161a遺伝子欠損マウスの機能解析

我々は、骨粗鬆症などのロコモティブシンドロームの病因・病態解明のために、『可変型遺伝子トラップ法』により樹立した変異マウス系統を用いて、骨軟骨代謝に関与する新規遺伝子探索の効率的なスクリーニングを実施している。我々はそれらトラップクローンデータをデータベース『EGTC』(http://egtc.jp)に公開し、骨軟骨代謝に異常をきたす疾患モデルマウスライブラリーを構築中である。現在このEGTCデータベースに登録したクローンから、特に骨軟骨にトラップした遺伝子の発現のみられるクローンを選別し、その遺伝子欠損マウスを作製して骨軟骨表現型および遺伝子機能を解析している。そのライブラリーマウスの中で、Tmem161a (Transmembrane 161a)遺伝子欠損マウスは、骨軟骨スクリーニングにおいて、マイクロCTおよび骨形態計測では明らかな骨量増加を認め、骨力学試験では骨強度増大、そして病理組織では骨軟骨組織異常を示す骨表現型を呈していた。しかしながら、これまでin vivoでの骨代謝における機能について報告例はない。現在我々はTmem161a遺伝子欠損トラップマウスを用いて、将来の骨粗鬆症治療への可能性を見据えて、Tmem161a遺伝子の骨代謝を中心とした詳細な機能解析を遂行している。昨年度の結果より、Tmem161aは骨代謝において重要な機能を担っている可能性が高いと報告した。今年度は昨年度に引き続きTmem161a欠損トラップマウス解析を施行し、2次スクリーニング(マイクロCT、骨形態計測、骨力学試験、病理組織解析)を個体数や計測時期を増やして解析を行った。さらに骨代謝関連遺伝子群のリアルタイムPCR、アリザリンレッド・トルイジンブルー等骨組織染色各種、透過型電子顕微鏡解析や、in vitroにおける初代骨芽細胞培養実験等も実施した。現在我々はTmem161a遺伝子トラップクローンからホモ・ヘテロ接合体マウスを作製し、骨軟骨表現型を解析している。昨年度は、Tmem161a欠損トラップマウスにおけるvector insertion point解析、ゲノム構造解析、導入遺伝子の組織発現(X-gal染色)解析、マウス個体の遺伝子型解析、出生率、体重、生存日数調査、大腿骨のマイクロCT解析の結果から、Tmem161aは骨代謝において重要な機能を担っている可能性が高いと報告した。Tmem161a欠損トラップマウス表現型解析における結果は、ホモマウスはμCTにて著明な骨量増加を認め、骨形態計測では骨塩量、皮質骨厚や海綿骨厚、骨梁数が有意に増加し、骨力学試験でも有意に骨強度(最大点試験力・応力、破断点試験力・応力)の増大を認めた。リアルタイムPCRではBMP4やRunx2の発現が有意に高値であった。脛骨のアリザリンレッド染色では1次海綿骨骨梁の石灰化亢進を認め、トルイジンブルー染色では肥大軟骨細胞層の配列異常を認めた。透過型電子顕微鏡解析では、骨芽細胞の形態異常を認めた。初代骨芽細胞培養ではRunx2やOsterixの発現亢進を認め、ALP染色やアリザリンレッド染色では石灰化の亢進を認めた。今回のTmem161a欠損マウスの解析により、Tmem161aは骨芽細胞の機能発現に重要な機能を担っている可能性が高いと考えられた。Tmem161aは酸化ストレスに関与するタンパクのひとつであり(Montesano, 2006)、骨代謝障害の要因は酸化ストレスの亢進も関与することから、骨代謝においても重要な遺伝子である可能性が考えられる。しかしながら今回の研究対象であるTmem161aの骨代謝における機能は未だ不明で、さらにノックアウトマウスを用いたin vivoでの報告は無く、これまで骨組織、骨代謝に言及した報告は皆無である。また、我々のTmem161aトラップマウスに特徴的なことは、ホモマウスはnullで、短命ではなく生後一定期間生育可能であり、かつ明らかに骨形成能が亢進している。また出産も可能である。このためin vivoでホモマウスの実験が可能であるというメリットがある。したがって、今後もTmem161a遺伝子欠損トラップマウスを用いて、その骨代謝における機能を解析して行く計画である。既にTmem161a欠損トラップマウスは骨軟骨1次スクリーニング(EST profile、X-gal染色)、2次スクリーニング(マイクロCT、骨形態計測、骨力学試験、病理組織解析)、さらには初代骨芽細胞培養で骨表現型異常を呈していた為、Tmem161aは骨代謝において重要な機能を担っている可能性が高いと考えられる。今後は上記と共に更にTmem161aトラップマウスのin vitroにおけるMC3T3細胞を用いたRNAi解析、CRISPR/Cas9ノックアウト解析、酸化ストレス・小胞体ストレス負荷による細胞ストレス応答実験等を進めて行く計画である。本研究によりTmem161aの骨代謝における機能を解明できると考えられる。さらに我々が作製したTmem161a欠損マウスは、バイオリソースとして骨粗鬆症治療薬開発などの様々な研究分野での有効活用が期待できる。

我々は、骨粗鬆症などのロコモティブシンドロームの病因・病態解明のために、『可変型遺伝子トラップ法』により樹立した変異マウス系統を用いて、骨軟骨代謝に関与する新規遺伝子探索の効率的なスクリーニングを実施している。我々はそれらトラップクローンデータをデータベース『EGTC』(Database for the Exchangeable Gene Trap Clones, http://egtc.jp)に公開し、骨軟骨代謝に異常をきたす疾患モデルマウスライブラリーを構築中である。現在このEGTCデータベースに登録したクローンから、特に骨軟骨にトラップした遺伝子の発現のみられるクローンを選別し、その遺伝子欠損マウスを作製して骨軟骨表現型および遺伝子機能を解析している。そのライブラリーマウスの中で、Tmem161a (Transmembrane 161a)遺伝子欠損マウスは、骨軟骨スクリーニングにおいて、マイクロCTおよび骨形態計測では明らかな骨量増加を認め、骨力学試験では骨強度増大、そして病理組織では骨軟骨組織異常を示す骨表現型を呈していた。Tmem161aは酸化ストレスに関与するタンパク(Montesano, 2006)で、骨代謝障害の要因は酸化ストレスの亢進も関与することから、骨代謝においても重要な遺伝子である可能性が考えられるが、これまでin vivoでの骨代謝における機能について報告例はない。これまでの1次・2次スクリーニングの結果より、Tmem161aは骨代謝において重要な機能を担っている可能性が高いと考えられる。現在我々は可変型遺伝子トラップ法で作製したTmem161a遺伝子欠損トラップマウスを用いて、Tmem161a遺伝子の骨代謝を中心とした詳細な機能解析を遂行している。現在我々は『可変型遺伝子トラップ法』によって樹立されたトラップクローンを用いて、骨軟骨代謝に関与する新規遺伝子群の効率的なスクリーニングによる骨軟骨疾患モデルマウスライブラリー構築に取り組んでいる。今回、前述のEGTCデータベースを用いてそのライブラリーマウスの骨/骨髄組織に発現する遺伝子を検索したところ、Tmem161a遺伝子でESTプロファイルが高スコア(Tmem161a:153:bone 146, bone marrow 7)を示した為、Tmem161a遺伝子トラップクローンからホモ・ヘテロ接合体マウスを作製し、骨軟骨表現型をスクリーニングしている。Tmem161a遺伝子は8番染色体に存在し、8つの膜貫通ドメインから成り、主に細胞膜に発現が認められる。我々の作製したTmem161a欠損トラップマウスにおいて、Tmem161a遺伝子のvector insertion pointは5`RACE法、インバースPCR法で解析を行い、第1イントロンであることを確認した。また、Trap vectorはゲノム上の1か所のみに挿入されていることをサザンブロッティング法にて確認した。遺伝子型を解析しえた個体の出生数は野生型:322、ヘテロ型:677、ホモ型:264(出生率は1:2.10:0.82)であった。Tmem161aホモマウスは短命ではなく、出産も可能であった。ヘテロマウスを用いた導入遺伝子の発現解析(X-gal染色)から、Tmem161aは骨端線周囲海綿骨や大腿骨頭軟骨が染色され、骨組織を含む多くの組織に発現していた。
複合キラル超分子を用いる光不斉創成

本研究では、無機から有機、生体系に至る多様なキラル超分子系のキラルナノ空間の物性、ゲスト親和性、キラル反応場としての特性を究明し、それを利用した新たな複合キラルホスト系を構築し、複合超分子光不斉創成反応系を開発するとともに、その多次元制御法を確立した。これにより、より高度な制御と幅広い系への展開が可能になり、当初計画を上回る高い光学収率(最高99%)を達成した。さらに、97報におよぶ学術論文のみならず、この分野初の成書ならびに総説を刊行することにより「複合キラル超分子を用いる光不斉創成」という新規な複合的学術領域を確立し、広く世界に発信することにより当該分野の研究の活性化に貢献した。不斉合成は現在最も活発な研究が行われている分野の一つであるが、本研究では複合キラル超分子を用いる光不斉創成について研究を行い、今年度は次に述べる新規かつ重要な成果を得た。1)超分子ホストであるキューカービチュリルと抗原抗体反応をはるかに凌駕する高い結合定数を与えるゲストを見いだし、その原因を理論計算を用いて解明した。2)ホスト・ゲスト間の電荷移動錯体の吸収波長を選択励起することにより、通常の励起錯体経由とは得られる光学活性体のジアステレオマー過剰率が逆の温度依存性を示すことを見いだし、新たな制御方法となることを明らかにした。3)メソポーラスシリカ表面にシクロデキストリンを化学結合により導入した有機・無機複合超分子系を初めて構築し、生成物分布ならびに光学収率を精密に制御することに成功した。4)触媒的にターンオーバー可能な修飾シクロデキストリンを用いたキラル超分子光環化付加反応を、光増感系を用いずに初めてデザインし、光学収率と化学収率の両立を達成した。5)シクロデキストリンに光増感剤を導入した複合キラルホストを用いた芳香族アルケンへの水とメタノールの競争的不斉極性付加反応において、温度と溶媒組成により、生成物比ならびに光学収率を精密に制御することに成功した。6)アミノプロリノールとベンズアミドを結合した水素結合性キラルテンプレートを用いた不斉光環化付加反応において、高い光学収率を達成するとともに、エナンチオマー過剰率を決定する要因を完全に解明することにより、さらに高効率・高光学収率な反応系の設計指針を得た。7)ヒト血清アルブミンを生体系超分子キラルホストとする不斉光環化付加反応において80%を超える不斉収率を達成するとともに、その光物理的、光化学的挙動についても解明した。他の複合超分子系についても多くの興味深い基礎的知見を得たので、それを基盤として、来年度の研究を展開する。光による不斉合成は本研究者らが先導する新しい研究分野の一つであるが、本研究では複合キラル超分子を用いる光不斉創成について研究を行い、今年度は次に述べる新規かつ重要な成果を得た。(1)最強の生体系超分子アビジン・ビオチン錯体を凌駕するホスト・ゲスト系として、キューカービチュリルとビシクロ[2.2.2]オクタンあるいはアダマンタン系ゲストを新たに見いだした。(2)血清アルブミンだけでなく分子シャペロンタンパク質であるプレフォルディンを用いた新規生体超分子光化学反応系を開拓した。これは、変異株を用いる系に発展させる上で重要である。(3)修飾シクロデキストリンを用いたアントラセンカルボン酸の不斉光二量化反応において、生成物の光学収率を制御する因子を解明し、今後の飛躍的な光学収率向上への重要な指針を得た。(4)キラルイオン性液体を用いる初めての超分子不斉光化学反応を行い、40%の光学収率を達成した。今後、水素結合性テンプレートとしての活用が期待できる。(5) FRETを用いる新規な超分子不斉光化学反応を提案し、それが有効に機能することを立証した。(6)従来の単一のキラルホストではなく、2種類のキラル超分子を用いる超分子光化学反応系を考案し、今後、他の鎖状や環状のキラル足場の利用への基盤となる重要な成果を得た。なお、本研究代表者は、この分野に関する貢献を認められ、本年6月にドイツのAlexander von Humboldt財団からフンボルト賞(Humboldt Research Award)を受賞することが内定している。光による不斉合成は本研究者らが先導する新しい研究分野の一つであるが、本研究では複合キラル超分子を用いる光不斉創成について研究を行い、今年度は次に述べる重要かつ有望な成果を得た。(1)アビジン・ビオチン錯体を凌駕する最強の人工超分子系を新たに見いだすとともに、計算化学によりその原因を究明し、下記項目(3)の成果を得ることを可能にした。

(2)キラルなパラシクロファンを用いる1,5-シクロオクタジエンの光増感不斉異性化反応で従来の光学収率を大きく上回る87%の光学収率を得たことにより、水素結合などの強い分子間相互作用のないゲスト分子の不斉光化学反応に適用可能な有効な戦略を見いだした。(3)α-シクロデキストリンをキラル足場とし、γ-シクロデキストリンあるいはキューカービチュリルを束縛ホストとする複合超分子系を構築することにより、究極的とも言える化学収率98%、光学収率99%を同時に達成し、複合キラル超分子の有効性を立証するとともに、今後の幅広い展開が可能になった。(4)光化学の特徴を活かした励起波長による新たな立体化学制御の可能性見いだした。なお、本研究代表者はこの分野に関する貢献が認められ、2011年6月にベルリン(シャルロッテンブルク宮殿)においてフンボルト賞(Humboldt Research Award)を授与された。過去4年間にわたる研究で得た知見を統合し、より高度な制御と、より幅広い系への展開を目的に研究を行い、当初目標を上回る成果を得るとともに、最終的に「複合キラル超分子を用いる光不斉創成」を新規な複合的学術領域として確立、発信することができた。本年度の主要な成果としては、1)光不斉合成において、複数の外部環境因子を用いてより精緻で高度な多次元的な制御法を確立した。具体的には、環状オリゴ糖やキラル足場とする系を複合的に制御することにより、光不斉合成では初めてとなる化学収率96%、光学収率99%を与える系を見いだし、当初の目標を十二分に達成した。骨格がより柔軟で一見立体制御が難しいと考えられるキラル足場系では、励起状態寿命の短さが高選択性をあたえる主要要因であることを明らかにした。この新規反応制御法を基盤に、より単純な単糖や環状ジオールを足場とした系でも上記と同程度に高い光学収率が得られることを見いだし、その適用範囲を拡張した。2)キラルテンプレートを用いる系では、より困難ではあるが単一のキラル生成物が得られる交差光二量化系にも研究を展開し、本法の適用限界をさらに拡げた。3)生体超分子系では、すでに90%を超える光学収率が得られることを見いだしていたが、タンパクが触媒的に繰り返し利用可能であることを明らかにするとともに、時間分解蛍光異方性解消という新手法を用いて、その高い光学収率が得られる原因をも解明した。さらに、望みのものだけを作れるテーラー・メイドの抗体触媒的な手法を超分子光不斉反応系に取り入れ、自在に光不斉反応場を構築する新手法を開拓した。4)5年間にわたる研究成果は英国化学会発行のChemical Society Reviews誌にSupramolecular Photochirogenesisと題する総説として取りまとめ、広く世界に発信した。光による不斉合成は本研究者らが先導する新しい研究分野の一つであるが、本研究では複合キラル超分子を用いる光不斉創成について研究を行い、今年度は次に述べる重要かつ有望な成果を得た。(1)従来未知であったアントラセンカルボン酸およびアントラセンジカルボン酸の不斉光二量化反応で生成するキラル二量体3種の絶対配置を、現時点で最高精度の理論化学計算RI-CC2法を用いて計算した理論円二色スペクトルと実測スペクトルを比較することにより、明確に決定できた。(2)キラルなドナー・アクセプター系の立体特異的な光環化反応と光転位反応の選択性を基底状態ならびに励起状態コンフォマーの分布を制御することにより、高いレベルで制御できることを明らかにした。
界面協奏効果を機軸とする革新的金属複合ナノ粒子触媒の開発

研究代表者は、これまでナノ粒子を金属酸化物とを複合化したハイブリッドナノ粒子触媒を基盤とした固体触媒の設計を行い、液相での環境調和性の高い触媒反応系の開発を一貫して行っている。昨年度、本研究の課題であった、夢の反応“温和な条件でのアミドの還元反応"を白金とバナジウム酸化物を複合したハイブリッドナノ粒子触媒を開発知ることで、世界で初めて達成し、当初の計画以上の研究進展があった。温和な条件下でのアミドの還元反応は、2005年、アメリカ化学会のグリーンケミストリー会議(Roundtable of the ACS Green Chemistry Institute)にて、次世代の環境調和型医薬製造プロセスの開発に向けた12の革新的な重要研究課題の1つに挙げられていた。水素によるアミドの還元は、反応後に無害な水のみを副生し最も環境調和性が高いことから、およそ100年前からその触媒開発が検討されてきた。しかし、アミドは最も難還元性のカルボン酸誘導体であり、その還元には非常に高い水素圧と高温を必要とし、理想とされる温和な条件(水素圧:30気圧以下、反応温度:70oC以下)でアミドを還元できる触媒はこれまで開発されていなかった。本年度は、昨年度開発した触媒を超える新しい触媒開発を検討したところ、ロジウムとモリブデンからなる合金ナノ粒子が、白金ーバナジウム触媒の18倍以上の高い活性を示し、世界で初めて、常温・常圧でアミドを還元することに成功した。また、種々の分光学的分析から、反応中にロジウムとモリブデンの合金が形成され、それぞれがアミドの水素化とアミドの活性化を担うことが示された。本年度は、昨年度開発した触媒を超える新しい触媒開発を検討したところ、ロジウムとモリブデンからなる合金ナノ粒子が、白金ーバナジウム触媒の18倍以上の高井活性を示し、世界で初めて、常温・常圧でアミドを還元することに成功したため、研究は当初の計画以上に進展している。本研究は、申請時の課題をすでに達成し、当初の計画以上に進展している。本年度は、昨年度まで用いていた貴金属ナノ粒子から非貴金属触媒に展開し、非貴金属触媒を用いて、高難度なアミドの還元反応を温和な条件で達成することを試みる。環境汚染や資源の枯渇など環境・エネルギー問題が深刻化する今、化学産業では環境に負荷をかけず望みのものを生み出す「高性能触媒」の開発が強く求められている。本年度の研究では、金属ナノ粒子と無機酸化物を複合化するとその界面で新規な触媒機能が発現することに着目し、独自の手法で開発した複合ナノ粒子触媒が、有害物質を排出せずに省エネかつ安全に様々な物質を目標物質へと選択的に変換できることを見出した。特に、白金ナノ粒子とバナジウム酸化物を複合化した粒子径2ナノメートルの超微粒子触媒を開発し、温和な条件で難還元性の化合物「アミド」の還元に世界で初めて成功した。また、様々なアミドから高選択的にアミンを合成することができることを明らかにした。さらに、反応後の触媒は反応液からろ過により容易に回収でき、繰り返し使用できる。

種々の実験結果から、バナジウム酸化物がアミドを活性化し、隣接する白金が活性化されたアミドを高効率に水素化することを明らかにした。本反応では無害な水のみが副生し、アミドを還元して得られるアミンは汎用性が高く、医薬品・農薬・染料・ポリマー等様々な用途に使われる。従来、アミドの還元反応には爆発性のある還元剤を用い、反応後に金属廃棄物が大量に排出する問題があった。また、水素ガスによる還元反応では、高温・高圧が必要であり、理想とされる温和な条件(水素圧:30気圧以下、反応温度:70度以下)でアミドを還元する触媒はこれまで開発されていなかった。本申請課題であった、夢の反応“温和な条件下におけるアミドの還元反応"を促進する触媒の開発に世界で初めて達成し、論文としてまとめた。また、新聞にも掲載された。さらにここから得た知見を基により高活性な触媒の設計指針を得ることができたため。本研究は、申請時の課題をすでに達成し、当初の計画以上に進展している。本年度は、昨年度まで用いていた貴金属ナノ粒子から非貴金属触媒に展開し、非貴金属触媒を用いて、高難度なアミドの還元反応を温和な条件で達成することを試みる。本申請課題であった、夢の反応“温和な条件下におけるアミドの還元反応"を促進する触媒の開発に世界で初めて達成し、さらに得られた知見を基により高活性な触媒の設計指針を得ることができた。今後は、その設計指針に基づき触媒の合成・反応評価を試みる。
藻類・植物に共通のリン酸化酵素が制御する窒素欠乏応答性脂質蓄積機構の解明

栄養素が枯渇すると微細藻類はトリアシルグリセロール(TAG)を蓄積する。DYRK型タンパク質リン酸化酵素TAR1は緑藻クラミドモナスにおいて炭素代謝を調節することを既に報告した。tar1-1変異体は光独立栄養かつN欠乏条件において野生型(WT)細胞と比較して、高いレベルの細胞生存率および過酸化水素の生成を維持した。配偶子形成での交配効率および主要調節因子のmRNA存在量はtar1-1の方がWTよりも低かった。さらにtar1-1はWTと比較して高いレベルのTAGおよびデンプンを蓄積した。さらに426のTAR1依存性リン酸化タンパク質を同定し、N同化および炭素代謝に関連するタンパク質を見出した。緑藻クラミドモナスのC/Nバランス応答制御因子であるタンパク質リン酸化酵素TAR1のリン酸化標的となるタンパク質を探索するため、大腸菌で発現させたTAR1タンパク質を用いて、クラミドモナス野生型細胞より抽出し脱リン酸化処理した全タンパク質に対してin vitroリン酸化反応を行った。これをリン酸化プロテオミクス解析に供することで、TAR1によってリン酸化されたペプチドを計785個同定した。さらに、TAR1によるin vivoでのリン酸化制御を受ける基質タンパク質を絞り込むため、tar1-1変異体と野生型細胞を窒素欠乏下で培養した細胞から経時的にタンパク質を抽出し、野生型では窒素欠乏に応答してリン酸化が亢進するが、tar1-1変異体では亢進しないリン酸化ペプチドを200個見出した。そのようなペプチドの中から、in vitroでもin vivoでも共通してTAR1制御下にあるリン酸化ペプチドを選抜した。これらのペプチドの中にTAR1の直接のリン酸化標的が含まれる可能性が高い。候補ペプチドには窒素欠乏応答性の転写因子やタンパク質リン酸化酵素、タンパク質脱リン酸化酵素等の修飾酵素、タンパク質分解に関わるユビキチン-プロテアソーム分解系の因子などtar1-1変異体の表現型と関連が推定されるタンパク質のペプチドが含まれていた。既に各標的候補をコードする遺伝子の挿入変異体をクラミドモナス株配布機関より取り寄せているので、今後これらの変異体の解析から、TAR1がタンパク質リン酸化を介して制御するC/Nストレス応答機構の詳細な分子機構を明らかにする。リン酸化プロテオーム解析については既に論文投稿中である。本研究の達成目標として、1.リン酸化プロテオーム解析によるTAR1のリン酸化標的タンパク質の候補を取得、2.それらの候補タンパク質について挿入変異体の解析からTAR1との機能の関連性を明らかにし、TAR1の下流で機能する因子を同定、3.TAR1のシロイヌナズナオーソログであるAtYAK1の変異体の機能解析により、植物の多細胞化や陸上化といった進化の過程でTAR1の機能がどのように変遷し、また保存されているかを解明する、という3つの大目標を設定した。このうち、1についてはリン酸化プロテオーム解析の実施により標的タンパク質を取得することができた。また2についても候補遺伝子のクラミドモナス挿入変異体を取得することが出来、次年度にそれらの解析を行う見通しが付いている。さらに3についてはシロイヌナズナ変異体の解析からクラミドモナスTAR1のオーソログであるAtYAK1がTAR1と同様に、C/Nストレスに応答して炭素(糖)代謝の制御機構において機能することを示唆する結果を得た。これはTAR1の機能が進化的に保存されていることを示唆している。このように当初研究計画が順調に推移し、次年度の研究計画にスムースに移行している。緑藻クラミドモナスのC/Nバランス応答制御因子であるDYRK型タンパク質リン酸化酵素TAR1について、そのリン酸化標的となるタンパク質を探索するため、in vitroおよびin vivoでのリン酸化プロテオーム解析をおこなった。その結果標的候補として200個のリン酸化ペプチドを見出した。この結果を論文としてまとめPlant Journal誌に投稿し、現在under rivisionである。また標的候補をコードする遺伝子の中から、TAR1の下流で発現変動する遺伝子群を制御すると予想される転写調節因子や、TAR1によるリン酸化によって活性が制御される可能性のあるタンパク質リン酸化酵素の遺伝子について、それぞれ挿入変異株をタグDNA挿入変異体プールより単離した。得られた変異体について表現型解析を行った結果、1個の転写因子様遺伝子と1個のタンパク質リン酸化酵素遺伝子の挿入変異株において、C/Nストレス条件(光独立栄養5%CO2通気かつ窒素欠乏条件)での表現型が、ステイグリーン(クロロフィル高残存生)かつ高TAG蓄積を示し、tar1-1変異体と似た表現型を示すことがわかった。これらの因子はTAR1によるタンパク質リン酸化制御を介して、TAR1の下流でクラミドモナスのC/Nストレスに対する応答制御を担う新奇因子である可能性が考えられた。今後、これらの変異体について目的遺伝子へのタグDNAの挿入と表現型が連鎖すること、野生型配列の挿入によって変異表現型が相補するかを調べることで、TAR1の下流因子であることを検証する。本研究の達成目標として、1.リン酸化プロテオーム解析によるTAR1のリン酸化標的タンパク質の候補の探索、2.得られた候補タンパク質について挿入変異体の単離と表現型解析、3.TAR1の陸上植物でのオーソログの機能を明らかにする、という3つの大目標を設定している。このうち、1.についてはリン酸化プロテオームを共同研究によって実施し、成果を論文にまとめ投稿した。現在revision中である。2については標的候補のうち幾つかについて挿入変異体を単離し、機能解析を行った。

そのうち転写因子様の遺伝子とタンパク質リン酸化酵素をコードする遺伝子の挿入変異体がtar1-1と似たステイグリーンかつ脂質高蓄積の表現型を示すことがわかったので、さらに詳細な表現型の解析と遺伝子への挿入と変異表現型の相関を調べている。クラミドモナスの脂質蓄積異常変異体tar1の解析から、タンパク質リン酸化酵素TAR1がC/Nストレス条件において、光合成活性を抑制し酢酸吸収を促進することで脂質・デンプン蓄積を制御することを示した。さらにTAR1は細胞分裂や細胞サイズの調節、接合にも関与することがわかった。TAR1のリン酸化標的を明らかにするため、リン酸化プロテオーム解析を行い、tar1変異体で特異的にリン酸化が亢進するタンパク質と脱リン酸化が亢進するタンパク質を明らかにした。さらにRNAseq解析により、TAR1の下流で発現制御を受ける遺伝子を明らかにした。これらの結果を論文化し投稿したところ、審査の結果、リン酸化プロテオームおよびRNAseqにおける統計処理についての改善を求められた。そこで、リン酸化プロテオームおよびRNAseqの両解析における統計処理方法の修正、他のグループが既に報告した野生型クラミドモナスのN欠乏下でのリン酸化プロテオーム結果との比較解析などのデータを追加し、投稿論文の修正をほぼ完了した。栄養素が枯渇すると微細藻類はトリアシルグリセロール(TAG)を蓄積する。DYRK型タンパク質リン酸化酵素TAR1は緑藻クラミドモナスにおいて炭素代謝を調節することを既に報告した。tar1-1変異体は光独立栄養かつN欠乏条件において野生型(WT)細胞と比較して、高いレベルの細胞生存率および過酸化水素の生成を維持した。配偶子形成での交配効率および主要調節因子のmRNA存在量はtar1-1の方がWTよりも低かった。さらにtar1-1はWTと比較して高いレベルのTAGおよびデンプンを蓄積した。さらに426のTAR1依存性リン酸化タンパク質を同定し、N同化および炭素代謝に関連するタンパク質を見出した。TAR1のリン酸化標的候補タンパク質の機能を明らかにするために、それらをコードする遺伝子の挿入変異体の表現型を調べ、tar1-1変異体の表現型と比較検証する。現在、リン酸化プロテオームによりTAR1特異的なリン酸化制御を受けることが見出され、かつC/Nバランス応答との関連が示唆される9遺伝子の変異体を取得している。これらの変異体に対し、TAR1によるリン酸化部位と想定されるアミノ酸残基を置換した変異型タンパク質を発現させることで、TAR1が触媒すると考えられるリン酸化が変異体表現型に及ぼす影響を検証する。これらの解析によって、TAR1がタンパク質リン酸化を介して制御するC/Nストレス応答機構の詳細な分子機構を明らかにする。