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新規な機能性分子融合型2本鎖RNAの開発

標的遺伝子の発現を強く抑制することができるRNA干渉法は、がんなどの難治性疾患の治療法として期待されている。本研究では、RNA干渉効果の向上を期待し、機能性物質融合型2本鎖RNAを開発した。その結果、機能性物質融合型2本鎖RNAは、高い細胞導入性、分解酵素耐性、遺伝子発現抑制能を示した。また、機能性物質融合型siRNAをマウスの腫瘍内に投与した結果も優れたRNA干渉効果を示した。これらの機能性物質を融合した2本鎖RNAは、RNA干渉反応における問題点を一掃でき、今後の医療応用への可能性を大きく広げるものと期待される。本研究では、医薬への応用が期待されているRNA干渉法の問題点を克服出来る新規な機能性分子融合型RNA干渉分子の開発を行っている。平成21年度は機能性分子融合型2本鎖RNAの開発を行った。Dicerの基質となる27塩基長の2本鎖RNAに機能性分子を結合させるために、5'末端にアミノ基を付与したセンス鎖RNAおよび未修飾のアンチセンス鎖RNAをそれぞれカスタム合成した。センス鎖RNAにはアミノ基を介して様々な機能性分子を結合させた。機能性分子としては脂質(パルミチン酸、ラウリン酸)、ポリエチレングリコール(PEG)、芳香族化合物(フェニル基、ベンジル基)、ペプチド(HIV Rev NESペプチド、MAPKK NESペプチド)などである。RNAと上記機能性分子との縮合方法はN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)などの活性エステル化機能性分子とアミノ基との反応、又は、N-(4-Maleimidobutyryloxy)succinimide(GMBS)などの2価性リンカーを利用した縮合方法を利用し、目的の機能性分子融合型センス鎖RNAを高収率で得ることに成功した。このセンス鎖RNAはアンチセンス鎖RNAとの間で2本鎖RNAを形成させ、その特性を評価した。その結果、合成した機能性分子結合型2本鎖RNAはDicerにより21-nt siRNAヘプロセシングされていることが明らかとなった。このとき、機能性分子は2本鎖RNAから離脱していることも確認している。また、脂質やペプチドを結合させた2本鎖RNAは未修飾の2本鎖RNAに比べ優れた細胞導入性を示した。さらに、Luciferaseを標的としたRNA干渉効果を評価したところ未修飾の2本鎖RNAに比べ格段に優れた遺伝子発現抑制能を示した。今回開発した機能性分子融合型2本鎖はRNA干渉法の問題点を解決できる可能性があり、今後はin vivoでの評価を行う。標的遺伝子の発現を強く抑制することができるsiRNAは、がんなどの難治性疾患の治療法として期待されている。このsiRNAの医薬への応用には、ヌクレアーゼに対する分解耐性の獲得や細胞内導入性の向上、副作用の低減などを克服する必要がある。本研究では、これらの問題点を解決できる、機能性物質融合型siRNAを独自の手法で開発した。この機能性物質として、脂肪酸(パルミチン酸、ラウリン酸)、ペプチド(HIV Rev NESペプチド、MAPKK NESペプチド)、芳香族化合物(フェニル基、ベンジル基)、ポリエチレングリコールなどを選択した。その中でも特に、脂肪酸をsiRNA(21塩基長)に直接結合させた脂質修飾型SiRNAは、高い細胞導入性、分解酵素耐性、遺伝子発現抑制能を示した。また、27塩基長の2本鎖RNAに脂肪酸を結合させた脂質修飾型長鎖2本鎖RNAは、上記の脂質修飾型siRNAに比べ優れたRNA干渉効果を示した。さらに、非対称な2本鎖RNAとその脂質修飾型2本鎖RNAについても高いRNA干渉効果を保有することを見出した。次いで、これらの脂質修飾型2本鎖RNAを担がんマウスの腫瘍内に投与した結果、脂質修飾型2本鎖RNAは未修飾のsiRNAに比べ、優れたRNA干渉効果を示した。また、脂質修飾型2本鎖RNAと遺伝子導入剤の複合体をマウスの尾静脈より導入した結果、多くの2本鎖RNAが肝臓へデリバリーされていることが明らかとなった。
日米のローカル・ミニマム学力保障政策の比較研究

本研究は、日米の学力テスト体制の比較研究である。本研究では、2013年に全国の教育委員会に対して学力調査の実施状況に関するアンケート調査を実施し、分析した。また、2014年度には面接調査も実施し、分析した。本研究の成果は、市町村教育委員会で学力調査が実施される理由と背景、ならびに市町村における学力調査が地方版「学力調査体制」の確立であった点を解明したことである。アメリカにおいては、1990年代より学力テストが普及し、浸透しているので、これを分析した。本研究の目的は、日米両国の地方自治体におけるテスト政策の特色や問題点などの実態調査を行い、日米両国のテスト政策の類似性と差異性を解明することである。本研究の研究内容は、現在の日米における地方自体のテスト政策の実態調査を実施し、地方教育行政におけるガヴァナンスの変容も合わせて解明することである本年度の研究実績は、2012年に行った全国の市教育委員会に対するテスト政策に関するアンケート調査(回収率約60%)に加え、2013年には全国の都道府県・町村教育委員会へのアンケート調査(回収率約77%)を行ったことである。また、この全国の都道府県,及び市町村教育委員会において独自の学力テストを実施している自治体17(京都・大分・宮崎・青森・山形・福島・沖縄)に対してインタビュー調査を実施した。次に、こうした全国の都道府県・市町村教育委員会の独自の学力テストの実態を分析する作業を行い、氏岡真弓(朝日新聞編集委員)の講演「学力調査は、だれのもの?だれのために?」を開催し、日本の学力テスト実施の背景や経緯を分析した。同じく、日本教育学会第72回大会(2013年8月29日:一橋大学)において共同研究発表「わが国におけるローカル・ミニマム学力保障政策の研究」を、北野秋男「全国の市教育委員会による学力テストの実施状況テストの実施主体に焦点を当てて」日本教育行政学会第48回大会(2013年10月12日:京都大学)を行い、学力テスト導入の背景や経緯を分析した。一方、アメリカにおける地方自治体の学力テストの実施状況に関しては、現在調査段階であるが、アメリカのテスト政策に関する全米動向を分析し、地方自治体における「分散型リーダーシップに基づく教育ガバナンスの理論と実態、個別の「学校力」を高めるキャパシティ・ビルディングによる学校改善の理論と実態などを考察した。本研究における本年度の研究実績は、以下の点を挙げることができる。2012年度と13年度において行った全国の教育委員会(都道府県・市町村)に対するアンケート調査の回答をもとに、「独自の学力調査を実施している」という教育委員会を対象に面接調査を行った。面接調査を行った自治体は30(高知、愛媛、香川、群馬、栃木、茨城、神奈川、大阪、滋賀、岐阜、北海道)であり、学力調査体制の実態に関するインタビューを行った。こうしたアンケート調査と面接調査で得た情報をもとに、日本教育学会第69回大会「ラウンド・テーブル」(九州大学)において「全国の地方自治体の学力テスト政策の動向」と題して研究代表者の北野らが共同研究発表を企画・実施した。また、研究代表者・分担者・協力者が一堂に会して行う研究会も7月(東京)、12月(沼津)、2月(塩原)において実施したが、村山詩穂(佐賀大学)、山下晃一(神戸大学)などの専門家の講演も企画・実施した。アメリカのテスト政策の研究に関しては、北野が教育思想史学会第24回大会(慶応大学)で「学力テストの暴力性」と題して、アメリカの学力テストの歴史的展開を報告した。研究分担者の黒田はマサチューセッツ州ボストン市、石井はカリフォルニア州の学力政策の実態を現地調査した。2014年度においては、研究代表者・分担者は日本のテスト政策、ないしは関連する論文を19編、アメリカのテスト政策に関する論文を6編を学会紀要、大学紀要、書籍として刊行した。平成27(2015)年度の研究実績の概要は、以下の通りである。(1)第8回全体研究集会を日米合同で開催した(日本大学文理学部)。同研究会では、日米の学力テスト政策に関する7件の研究報告があった。全体討論においては日米の比較を行い、研究成果の総括を行った。(2)日本教育学会第74回大会(お茶の水女子大学)において北野秋男と小杉聡(神奈川県公立学校教員)が「共同研究報告」(題目:地方自治体における学力調査問題の内容構成学力調査問題に独自性・専門性はあるのか」を行った。本報告は、2013年から2015年にかけて地方教育委員会(都道府県・市町村)における学力調査体制の実態と課題を解明することを目的として実施したアンケート調査と面接調査の結果を踏まえて、地方教育委員会における学力調査(テスト)問題の内容構成を分析し、地方教育委員会が実施する学力調査(テスト)問題に独自性・専門性があるか否かを検討した。(3)3年間の研究活動の総括を行いつつ、その内容を記載した『日米のローカル・ミニマム学力保障政策の比較研究』(1190頁)と題する報告書を100部作成した。とりわけ、報告書には8本の個人研究論文を掲載し、3年間の研究成果の一端を紹介した。

本研究の成果は、市町村教育委員会で学力調査が実施される理由と背景、ならびに市町村における学力調査が地方版「学力調査体制」の確立であった点を解明したことである。アメリカにおいては、1990年代より学力テストが普及し、浸透しているので、これを分析した。本研究は、現在の日米における地方自治体の学力テスト政策の実態調査であり、学力テスト体制における構造の類似性と差異性を解明することであった。本年度は、研究代表者・分担者の研究活動は予想以上に成果が上がり、多くの学会発表、研究論文の執筆を行った。日本の学力テスト体制は、面接調査によって30の都道府県・市町村教育委員会に対するインタビューを行い、それぞれの自治体独自の学力テスト体制の構造的特色を解明した。特に、地方自治体における学力テスト体制はローカル性はなく、全国的には共通しているものの、一部自治体で独自路線を歩む自治体も確認した。アメリカの場合は、多くの州では新しいスタンダードである「共通コア・スタンダード(Common Core State Standards)」と新しい評価が導入され、批判的思考力を問う試験への移行も起きている。また、州統一テストの試験結果が学区や学校、そして生徒や教員評価にも甚大な影響を与えており、学区内においてもアカウンタビリティが厳しく問われているという実態も解明した。その一方で、学校の力(キャパシティ・ビルディング)を高め、学校内部における教員の協働が強く求められている状況も指摘される。日米のテスト政策の比較研究2015(平成27)年度は最終年度になるので、これまで行った日本の学力テスト体制に関するアンケート調査、面接調査をもとに構造的特色を解明する。その際には、各教育委員会が発行する学力テストの結果に関する分析報告書なども参考としながら、学力テスト、能力主義、教育格差などに関する各種の文献も参考とし、総合的な分析と解明を行う。アメリカに関しては、さらに州の学力テストの実態を学区や学校の対応も考慮しながら解明する。対象とする州は、マサチューセッツ州、ニューヨーク州、ワシントンDC、ケンタッキー州、イリノイ州、カリフォルニア州などである。その際には、テスト政策だけでなく、教育内容、教員政策、学校の統廃合、地方教育行政のガヴァナンスの変容、教育行財政などの諸改革などの分野も考慮に入れて解明を行う。最後に、日米の学力テスト体制の構造的類似性と差異性を解明し、これを共同研究の形で学会発表する予定である。また、年度内には、これまでの研究活動、研究成果の一部を報告書してまとめ、刊行する予定である。本研究は、現在の日米における地方自体のテスト政策の実態調査を実施し、地方教育行政におけるガヴァナンスの変容を解明することである。この研究課題からすると、本年度の研究成果は十分に達成されたと言える。特に、日本の地方自治体における学力テスト政策の全国的動向を解明できただけでなく、17の自治体にインタビュー調査を実施したことにより、より詳細に学力テストの実施状況が判明した。
子宮内膜の分化と細胞運動におけるヒストンアセチル化の役割の解明

ヒト子宮内膜組織は剥離再生を繰り返す中で、受精卵の着床に備えた周期的な分化過程をたどる。着床機能障害患者に対する新規治療法の開発を念頭に、着床における受精卵接着面を構成する子宮内膜腺上皮細胞の性ステロイドを用いない分化誘導の可否を検討した。子宮内膜腺上皮のモデルとして腺上皮由来の子宮内膜腺癌細胞株Ishikawaを用い、遺伝子転写制御を担うピストン脱アセチル化酵素の阻害剤(HDACI)添加による影響を解析し、性ステロイド添加で得られるものと同様あるいは促進的な以下の効果を明らかにした。1)分泌期特異的発現を示す蛋白glycodelinのglycodelin promoterを介した発現誘導(mRNA・蛋白両レベル)2)平坦化かつ伸展する細胞形態変化3)グリコゲン産生能の亢進4)個々の細胞としての運動能亢進5)集団(組織)としての細胞運動機能亢進4)5)はglycodelin遺伝子導入クローンでHDACI非添加でも効果を認め、さらに1)5)の全ての効果がsiRNAを用いたglycodelin gene silencingによって消失することをあわせて明らかにした。以上の結果は、HDACIが子宮内膜上皮の分化誘導剤として、内膜機能の障害・破綻に関連する内膜機能不全や内膜症に対しての新規治療薬となりうる可能性を示唆しており、その分子機序にglycodelinが大きく関与していることを示唆している。我々は遺伝子転写制御機構の一端を担うヒストンの可逆的アセチル化を制御するヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)に対して、阻害剤(HDACI)を添加する事で、性ステロイドによる子宮内膜間質細胞脱落膜化を促進することを明らかにした。本研究では着床時の受精卵初期接着面を構成する子宮内膜上皮細胞を標的とし、腺上皮由来の子宮内膜腺癌細胞株Ishikawaを用い、HDACIによる人為的分化制御の可否につき検討した。その結果、Ishikawaに一部のHDACIを添加する事で、性ステロイド非依存的に、分化後の分泌期特異的に発現するglycodelinをmRNA・蛋白の両レベルで発現誘導することに成功した。その誘導がglycodelin遺伝子の転写制御によることも併せて明らかにした。さらに、HDACI添加は性ステロイドの反応に近似した細胞形態学的分化、増殖機能制御、グリコゲン産生を誘導し、それら一連の変化がsiRNAを用いたglycodelin gene silencingによって消失することを見いだした(投稿中)。また、IshikawaへのHDACI添加は細胞浸潤機能にも影響を及ぼすことを明らかにした。すなわち、細胞浸潤アッセイ・創傷治癒アッセイにより、細胞の単独レベル・集団レベル双方での浸潤能がHDACIによって、性ステロイド由来と同等あるいは、より高レベルで促進された。この細胞浸潤誘導能もまた、gene silencingによりglycodelin発現と強い相関を示す事を明らかとした(投稿準備中)。生殖期におけるヒト子宮内膜組織は、受精卵の着床に対応すべく、剥離・分化・再生を反復する。前年度に引き続き、ヒト子宮内膜腺上皮細胞のモデルとして腺癌細胞株Ishikawaを用いて、近年抗がん剤としての臨床応用が間近であるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(HDACI)添加実験を行い、子宮内膜腺上皮細胞の分化誘導・運動機能制御・増殖機能制御につき、解析を加えた。その結果、以下の通り性ステロイドホルモン添加と同様の反応を示し、これまで子宮内膜機能破綻に関連する子宮内膜症や着床障害といった疾患群に対して、HDACIの性ホルモン製剤の代替となる新規治療法としての可能性を示唆した。

HDACIによる子宮内膜腺上皮細胞の分化誘導前年度までの細胞形態変化、グリコゲン産生能の上昇が子宮内膜分泌期特異的タンパク質グリコデリンの発現誘導を介して起こることを明らかにしたことに加え、これらの分化誘導は、性ステロイドホルモン受容体の動態には、なんら変化を与えないことを明らかにした。(Uchida et.al. Endocrinology, 2005)HDACIによる子宮内膜腺上皮細胞の運動機能制御細胞の個々の運動、集団としての運動の双方において、HDACIが運動促進にはたらくことを明らかとした。また、それらがグリコデリン発現誘導を挙動を一致させていることを、siRNAを用いたgene silencingとともに、恒久的にグリコデリンを発現するIshikawa遺伝子導入株を用いた解析から明らかにした。(投稿準備中)HDACIによる子宮内膜腺上皮細胞の増殖機能制御子宮内膜腺上皮細胞の増殖が性ステロイドホルモン同様、低濃度のHDACIによって促進することを明らかにするとともに、グリコデリンの発現量に応じて、正負対極の増殖機能制御がなされている可能性を明らかにしている。また、その正負相反する機能制御が細胞周期関連因子の発現変化あるいは、細胞死誘導による結果であることを明らかにしつつある。
ウズラ骨髄骨のエストロジェン反応性骨形成細胞の分離・培養に関する研究

骨髄骨は鳥類雌の特異組織で、産卵期になると骨髄腔に出現する。骨髄骨の形成はエストロジェンによって誘発され、成熟した雄鳥にエストロジェンを投与することによって人為的に骨髄骨を形成させることが可能である。この骨髄骨の形成過程において骨髄内に多数のアルカリファスファターゼ(ALP)陽性の骨形成系細胞が出現することが知られている。これらの骨形成系細胞はエストロジェンレセプターを有していることからエクストロジェンの支配を強く受けていることが示唆されている。本研究では、骨形成系細胞を分離・培養することを試みて、これらの細胞の増殖に対するエストロジェンの作用と骨形成能を調べた。エストロジェン処理を施した雄ウズラの大腿骨骨内膜表面および骨髄内から、酵素処理と培養皿に付着する性質を利用して骨形成系細胞を分離した。分離した細胞の60%は、ALP陽性の骨形成系細胞であった。これらの得られた細胞を、エストロジェンを10^<-9>、10^<-8>および10^<-7>M含むBGjb培地で144時間培養したところ、エストロジェン無添加の条件で培養した培地に比べ、エストロジェンを添加した培地では、エストロジェン濃度に依存してALP陽性細胞の割合が増加した。また、^3H-チミジン2μCi/mlを含む培地で1時間培養してオートラジオグラフィで観察したところ、エストロジェン濃度に依存して骨形成系細胞の^3H-チミジンの取り込みが促進された。さらに、抗エストロジェン剤であるタモキシフェンを含む培地で培養したところ、骨形成系細胞の増殖が抑えられた。以上のことから、エストロジェンは骨形成系細胞の増殖を刺激することが窺えた。一方、骨形成細胞は培養1週間後に単層状にconfluentに達し、培養2-3週間後に重層状に観察され、その周囲に基質形成がみられた。培養4週間後にvon kossa陽性のカルシウムが沈着したnoduleが観察され、骨形成系細胞は骨形成能を有していることが示唆された。
分子の動的挙動を活用した新規触媒的有機合成反応の開拓

本研究は、申請者が培ってきた触媒的不斉合成の化学を発展させ、可逆的に複数の構造をとる触媒、基質、あるいは反応剤を用い、従来なかった、あるいは困難であった分子変換反応の開拓を目指す。すなわち、1)機能が異なる二種類の触媒種が可逆的に存在するデュアルRu触媒を用いる連続不斉反応、2)エナンチオマー間に平衡のあるラセミα-置換エステルとラクトンの不斉水素化、3)可逆的に反応性の高いラクトン中間体を生じるラセミケトエステルとメソヒドロキシジエステルの不斉水素化、4)シアン化トリメチルシリルの窒素求核性と炭素求核性を制御した求核的アリル位およびベンジル位イソシアノ化、を課題とする。
還元性末端修飾型セルロースの自己組織化挙動制御と高次構造の構築

セルローストリアセテート(CTA)は、有機溶媒に優れた溶解性を示しかつ優れたフィルム形成能を有している。またナノレベルに分散した金粒子はそのサイズや配列に応じて異なる光学特性、電気特性、触媒活性を有することが知られている。チオールあるいはジスルフィド基を有する化合物は金の表面に結合し、分散剤として機能する。高分子はとくに安定な金ナノ粒子の分散保護剤や機能付与材料として有用である。本研究では、新たな高機能性セルロース材料の創製を目的として、CTAにより保護された金ナノ粒子を調製し、そのサイズや配列の制御を試みた。まず還元性末端位置特異的に金結合性のジスルフィド基を有するCTA誘導体(DPn=2,13,41)を調製した。この誘導体とテトラクロロ金酸を水素化ホウ素ナトリウムにより還元し、CTAが表面に自己組織化して結合した金ナノ粒子(CTAAu)を得た。CTAAuは金ナノ粒子が均一に分散したフィルムを形成していた。TEM観察の結果、金コアの直径は約8-13nmであり、CTAが金ナノ粒子の保護剤として有用であることがわかった。また金粒子間距離はCTA分子鎖長とよく一致した。つまり剛直なCTA鎖が金粒子のスペーサーとして機能していることが示され、金粒子の配列がCTAの一次構造で制御可能であることが見出された。また動的光散乱(DLS)測定の結果、金ナノ粒子はクロロホルム中でよく分散し、CTAが溶液中においても優れた金の分散剤となることが確認できた。本研究で調製したCTA金ナノ粒子は溶液中で安定に分散し、固体状態でも金の配列の制御されたフィルムを形成したことから、セルロースと金からなる新規の有機無機ハイブリッド材料としての可能性が示された。本研究の目的は、還元性末端架橋型セルロースの一次構造および自己組織化挙動の制御により、化合物の一次一高次構造相関に関する知見を得ること、さらにその高次構造構築法を確立することである。本年度は、「還元性末端の架橋により安定な高次構造を維持した、セルロースナノ粒子の調製、その溶液中における自己組織化挙動および高次構造解析を行う」ことをテーマとし、セルロース誘導体の還元性末端間の重合を試みた。まずセロビオースを用いたモデル反応により、還元性末端の反応性を確認した。セロビオースアセテートの還元性末端位置特異的重合性官能基メタクリロイル基を導入した新規のモノマーを調製した。計画に沿ってこのモノマーを原子移動ラジカル重合に供したところ、ほぼ単分散のポリマーが得られ、高度な規制重合に成功した。しかし、重合度が9-19にとどまり、高分子量のポリマーは得られなかった。そこでさらに高分子量のポリマーを得るために、AIBNを開始剤に用いたフリーラジカル重合に供したところ、分散が大きいものの、重合度が100-1600の範囲の高分子量ポリマーを得ることに成功した。さらにセロビオース部分の保護基であるアセチル基をDBUを用いて除去した。NMRスペクトルから、糖鎖部分がポリメタクリレート鎖から脱離せずに保持されていることを確認した。現在この方法をセルロース(DPn=13)に適用し、還元性末端の架橋について反応条件を検討している。今後、長鎖疎水基の長さ、セルロースの重合度により親水疎水バランスの異なる誘導体を調製し、得られた誘導体の自己組織化挙動や構造解析を行い、セルロース誘導体の高次構造構築指針を確立し、その機能性を検討する予定である。本研究の目的は、還元性末端架橋型セルロースの一次構造および自己組織化挙動の制御により、化合物の一次-高次構造相関に関する知見を得ること、さらにその高次構造構築法を確立することである。まずセルローストリアセテート(DPn=13)の還元性末端位置特異的にメタクリロイル基を導入し、マクロモノマーCTA13-MAを調製した。これを、AIBNを開始剤として単独重合に供したが、数平均重合度は1.35までしか増加しなかった。そこでCTA13-MAとメタクリル酸メチル(MMA)との共重合を行った。SEC-MALSおよびNMR測定の結果、共重合により得られたコポリマー1はPMMA鎖を主鎖、CTA鎖を側鎖に有する櫛型コポリマーであり、その絶対分子量はMw=63000、組成はDP(MMA)=414、DP(CTA13-MA)=3,86であると算出された。さらにDBUを用いてアセチル基の除去を行い、セルロースを側鎖に有する目的の櫛型コポリマー2を得た。DSC測定による熱分析の結果、コポリマー2はPMMA鎖由来のガラス転移点(Tg)(1245°C)のみを示し、これはPMMAホモポリマーのTg(120.4°C)よりも高かった。またセルロースは分解点(283.2°C)のみを有しTgを示さなかったことから、PMMA鎖とセルロース鎖が相分離し、セルロース鎖がPMMA鎖の運動性を減少させていることが示唆された。X線回折測定の結果、コポリマー2はPMMA由来の非晶の回折パターンを示した。これはセルロース側鎖の数の少なさに由来すると考えられる。今後、コポリマーの形態やセルロース鎖の配向状態について検討を続ける。

セルローストリアセテート(CTA)は、有機溶媒に優れた溶解性を示しかつ優れたフィルム形成能を有している。またナノレベルに分散した金粒子はそのサイズや配列に応じて異なる光学特性、電気特性、触媒活性を有することが知られている。チオールあるいはジスルフィド基を有する化合物は金の表面に結合し、分散剤として機能する。高分子はとくに安定な金ナノ粒子の分散保護剤や機能付与材料として有用である。本研究では、新たな高機能性セルロース材料の創製を目的として、CTAにより保護された金ナノ粒子を調製し、そのサイズや配列の制御を試みた。まず還元性末端位置特異的に金結合性のジスルフィド基を有するCTA誘導体(DPn=2,13,41)を調製した。この誘導体とテトラクロロ金酸を水素化ホウ素ナトリウムにより還元し、CTAが表面に自己組織化して結合した金ナノ粒子(CTAAu)を得た。CTAAuは金ナノ粒子が均一に分散したフィルムを形成していた。TEM観察の結果、金コアの直径は約8-13nmであり、CTAが金ナノ粒子の保護剤として有用であることがわかった。また金粒子間距離はCTA分子鎖長とよく一致した。つまり剛直なCTA鎖が金粒子のスペーサーとして機能していることが示され、金粒子の配列がCTAの一次構造で制御可能であることが見出された。また動的光散乱(DLS)測定の結果、金ナノ粒子はクロロホルム中でよく分散し、CTAが溶液中においても優れた金の分散剤となることが確認できた。本研究で調製したCTA金ナノ粒子は溶液中で安定に分散し、固体状態でも金の配列の制御されたフィルムを形成したことから、セルロースと金からなる新規の有機無機ハイブリッド材料としての可能性が示された。
象牙質石灰化にともなうリンタンパク質とコラーゲンとの結合形成

1.フォスフォフォリンとコラーゲンとの静電的親和性象牙質に特有のリンタンパク質であるフォスフォフォリンとコラーゲンとの試験管内での結合実験をおこなった.フォスフォフォリンはコラーゲン分子に対して有意の親和性を示した.高イオン強度では結合が阻害されるのでこの結合は静電的親和性によると考えられる.コラーゲンのCNBrペプチドを基質として結合実験をおこなったところ、フォスフォフォリンはα1CB6ペプチドに選択的親和性を示した.このペプチドはコラーゲン分子のC末端付近に相当する.2.フォスフォフォリン-コラーゲン結合物の分析フォスフォフォリン分子の一部は基質中に分秘された後、基質コラーゲンと強固に結合することが知られている.不溶性コラーゲンを分解可溶化することによってこのフォスフォフォリン-コラーゲン結合物を可溶化することができる.得られた結合物は多様な成分の混合物ではあるが、平均して残基数比でフォスフォフォリンとコラーゲンが3:2で結合したものであると考えられる.両者の間の結合は共有結合性の架橋である可能性が高い.抗α1CB6抗体による分析、およびペプチドのアミノ酸配列分析から、フォスフォフォリンはα1CB6ペプチドに結合していることが判明した.3.試験管内でのフォスフォフォリンとコラーゲンとの架橋形成生体内でおこるフォスフォフォリンとコラーゲンの架橋形成のモデル実験として両タンパク質を試験管内でインキュベートした.インキュベーション時間の経過とともに両タンパク質は強固に結合されていくことが観察された.架橋形成のpH依存性および阻害実験から、この架橋はフォスフォセリンのβ脱離反応によって形成されるリジノアラニン架橋である可能性が示唆された.1.フォスフォフォリンとコラーゲンとの静電的親和性象牙質に特有のリンタンパク質であるフォスフォフォリンとコラーゲンとの試験管内での結合実験をおこなった.フォスフォフォリンはコラーゲン分子に対して有意の親和性を示した.高イオン強度では結合が阻害されるのでこの結合は静電的親和性によると考えられる.コラーゲンのCNBrペプチドを基質として結合実験をおこなったところ、フォスフォフォリンはα1CB6ペプチドに選択的親和性を示した.このペプチドはコラーゲン分子のC末端付近に相当する.2.フォスフォフォリン-コラーゲン結合物の分析フォスフォフォリン分子の一部は基質中に分秘された後、基質コラーゲンと強固に結合することが知られている.不溶性コラーゲンを分解可溶化することによってこのフォスフォフォリン-コラーゲン結合物を可溶化することができる.得られた結合物は多様な成分の混合物ではあるが、平均して残基数比でフォスフォフォリンとコラーゲンが3:2で結合したものであると考えられる.両者の間の結合は共有結合性の架橋である可能性が高い.抗α1CB6抗体による分析、およびペプチドのアミノ酸配列分析から、フォスフォフォリンはα1CB6ペプチドに結合していることが判明した.3.試験管内でのフォスフォフォリンとコラーゲンとの架橋形成生体内でおこるフォスフォフォリンとコラーゲンの架橋形成のモデル実験として両タンパク質を試験管内でインキュベートした.インキュベーション時間の経過とともに両タンパク質は強固に結合されていくことが観察された.架橋形成のpH依存性および阻害実験から、この架橋はフォスフォセリンのβ脱離反応によって形成されるリジノアラニン架橋である可能性が示唆された.1.象牙質リンタンパク質とコラーゲンとの静電的親和性象牙質リンタンパク質をビオチンでラベルし、コラーゲン線維との親和性について検討した結果、両者の間に有意の親和性が認められた。結合定数は10^7M^<-1>程度であり、結合量は骨のプロテオグリカンや酸性糖タンパク質に比べて高値であった。変性コラーゲンを結合基質として用いた実験ではリンタンパク質は主としてコラーゲンのα1鎖に結合することが明らかになった。コラーゲンCNBrペプチドを結合基質として用いた実験では、主としてα1CB6、すなわちコラーゲン分子のC末端付近に相当するペプチドに対して親和性を持つことがわかった。未変性コラーゲン分子とリンタンパク質を試験管内で結合させ、架橋試薬で架橋してからCNBrで分解した実験でもリンタンパク質がα1CB6ペプチドに結合することが確認された。2.象牙質リンタンパク質ーコラーゲン結合物の分析象牙質不溶性コラーゲン基質をCNBrで分解可溶化し、そこから象牙質リンタンパク質ーコラーゲン結合物を分離した。この結合物がフォスフォフォリンを含むことはコラゲナーゼ消化物の分析およびリン酸含有量の分析によって確認した。この結合物のコラーゲン部分を分析するためにコラーゲンのCNBrペプチドに対する抗体と反応させたところ、α1CB6に対する抗体と反応することがわかった。また、この結合物をプロテアーゼ消化して得られたペプチドを電気泳動、高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、α1CB6由来のペプチドが含まれることが明らかになった。象牙質リンタンパク質は象牙芽細胞によって合成分泌された後、静電的親和性によってコラーゲンのα1CB6ペプチドすなわちC末端付近に結合し、生体内で長時間経過するうちに非酵素的反応によって両者の間に共有結合性の架橋が形成されると考えられる。

1.試験管内でのフォスフォフォリンとコラーゲンとの架橋形成前年度に象牙質のリンタンパク質であるフォスフォフォリンとコラーゲンとの間に静電的親和性が存在することを明らかにしたが、本年度はこれを発展させて、試験管内で両者の間に架橋を形成させることを試みた。材料としては、骨を脱灰後可溶性成分を抽出除去した残りの不溶性コラーゲンおよびビオチンラベルフォスフォフォリンを用いた。両者をさまざまな条件でインキュベートし、終了後不溶性コラーゲンを徹底的に洗浄した後、残った共有結合性結合物をアビジン-アルカリフォスファターゼで検出した。その結果、37°Cでインキュベートするとフォスフォフォリンは時間の経過とともに不溶性のコラーゲンに強固に結合されていくことが観察された。この結合は解離性溶媒を用いても解離されないので共有結合である可能性が強い。結合の本体を明らかにするために条件を変えて結合実験を行った。結合形成はインキュベーションの温度が高いほど、また、pHがアルカリ性であるほど高率に起こった。また、アミノ基を有するグリシンアミドが共存すると結合形成は阻害された。以上の結果より、この結合はフォスフォフォリンに豊富に存在するフォスフォセリンのβ脱離反応によって非酵素的に形成されるデヒドロアラニンとコラーゲンのリジンのε-アミノ基の間に形成されるリジノアラニン架橋によると推定される。実際に試験管内で形成された結合物中にリジノアラニンが検出された。2.フォスフォフォリンのコラーゲン分子上での結合部位のより詳細な分析象牙質不溶性基質より得られたフォスフォフォリン-コラーゲン結合物をプロテアーゼ消化して消化物を分析した結果、コラーゲンのC末端テロペプチド部分が結合に関与することを示唆する結果が得られた。しかし具体的な結合部位の同定には至っていない。
鞭毛運動機能の研究-微小操作法を用いた「9+2」構造の機能的意義の解明

「9+2」構造は、真核生物の鞭毛・繊毛全般に見られるconservativeな構造であるにもかかわらずその機能的意義は明らかではない。鞭毛や繊毛の運動は、周辺小管の滑り運動に基づくものであるが、多くの鞭詣では、この滑り運動から平面的な波が形成される。本研究では、ウニ精子の頭部に強制的に振動を加える実験を行い、その鞭毛波形および屈曲面の解析から、9+2構造における微小管滑り速度の制御および平面波形の機構を解明することを試みた。除膜後ATPで再活性化したウニ精子の頭部をガラス微小ビペットで吸引して保持し、そのピベットにさまざまな周波数で振動を加え、さらにさまざまな速度で振動の面を変化させた。この時の鞭毛運動の波形を記録・解析した。さまざまなATP濃度(10μM4mM)の溶液中で、振動の周波数を変えたときの鞭毛波形を解析し、その時の微小管滑り速度を鞭毛打頻度と屈曲角度との積の2倍として求めた結果、100μM以下では、滑り速度は鞭毛打頻度の減少とともに減少したが、100μM以上では、振動を与えないときの鞭毛打頻度より振動数が低いときには、振動数の減少とともに速度も減少するのに対し、振動数が振動前の鞭毛打頻度より高い場合には振動数を増しても滑り速度はほとんど一定であった。この結果は、鞭毛運動中の微小管滑り速度は、ATP濃度のみによって一義的に決定されないことを示す。また、高塩濃度処理により外腕を取り除き、内腕だけになった鞭毛について、1mM ATP溶液中で同様の実験を行い、滑り速度の変化を検討した結果、内腕のみによっても同様の結果が得られることがわかった。即ち、振動を与えないときの鞭毛打頻度により振動数が低いときには、振動数の減少とともに速度も減少するのに対し、振動数が振動前の鞭毛打頻度より高い場合には振動数を増しても滑り速度はほとんど一定であった。この結果は、内腕は基本的な鞭毛運動の性質を担っている可能性を示唆する。「9+2」構造は,真核生物の鞭毛・繊毛全般に見られるconservativeな構造であるにもかかわらずその機能的意義は明らかではない。鞭毛や繊毛の運動は,周辺小管の滑り運動に基づくものであるが,多くの鞭毛では,この滑り運動から平面的な波が形成される。本研究では,ウニ精子の頭部に強制的に加える実験を行い,その鞭毛波形および屈曲面の解析から,9+2構造における微小管滑り速度の制御および平面波形成の機構を解明することを試みた。除膜後ATPで再活性化したウニ精子の頭部をガラス微小ピペットで吸引して保持し,そのピペットにさまざまな周波数で振動を加え,さらにさまざまな速度で振動の面を変化させた。9+2構造における滑り運動の制御には,中心小管が関与している可能性がある。そこで中心小管に外部から力を加えた状態で,振動面を回転させる実験を試みたが,この時振動面の回転中に中心小管をおさえた針がはずれることがしばしば起こり,付着させる方法を改善する必要があることがわかった。今後鞭毛先端の保持の方法について検討を重ね,中心小管が屈曲面の回転に直接関与しているかを明らかにする。

一方,さまざまなATP濃度(10μM4mM)の溶液中で,振動の周波数を変えたときの鞭毛波形を解析し,その時の微小管滑り速度を鞭毛打頻度と屈曲角度との積の2倍として求めた結果,100μM以下では,滑り速度は鞭毛打頻度の減少とともに減少したが,100μM以上では,振動を与えないときの鞭毛打頻度より振動数が低いときには,振動数の減少とともに速度も減少するのに対し,振動数が振動前の鞭毛打頻度より高い場合には振動数を増しても滑り速度はほとんど一定であった。この結果は,鞭毛運動中の微小管滑り速度は,ATP濃度のみによって一義的に決定されないことを示す。「9+2」構造は,真核生物の鞭毛・繊毛全般に見られるconservativeな構造であるにもかかわらずその機能的意義は明らかではない。鞭毛や繊毛の運動は,周辺小管の滑り運動に基づくものであるが,多くの鞭毛では,この滑り運動から平面的な波が形成される。本研究では,ウニ精子の頭部に強制的に振動を加える実験を行い,その鞭毛波形および屈曲面の解析から,9+2構造における微小管滑り速度の制御および平面波形成の機構を解明することを試みた。除膜後ATPで再活性化したウニ精子の頭部をガラス微小ピペットで吸引して保持し,そのピペットにさまざまな周波数で振動を加え,さらにさまざまな速度で振動の面を変化させた.この時の鞭毛運動の波形を記録・解析した.高塩濃度処理により外腕を取り除き,内腕だけになった鞭毛について,1 mM ATP溶液中で実験を行い,振動の周波数を変えたときの鞭毛波形を解析し,その時の微小管滑り速度を鞭毛打頻度と屈曲角度との積の2倍として求めた.滑り速度の変化を検討した結果,内腕を除いた場合も除かない場合も振動を与えないときの鞭毛打頻度より振動数が低いときには,振動数の減少とともに速度も減少するのに対し,振動数が振動前の鞭毛打頻度より高い場合には振動数を増しても滑り速度はほとんど一定であった。また,内腕は基本的な鞭毛運動の性質を担っている可能性を示唆する.
古生代中期から中生代最前期の礁生態系の変遷様式-後生動物礁と微生物礁変遷の統合-

1.南中国揚子地塊南縁部に分布するペルム/トリアス系境界層ならびに最下部トリアス系(Hindeodus parvus帯)の堆積相・岩相・微生物相の検討を行なった.その結果,次のことが明らかとなった.(1)ペルム/トリアス系境界は,詳細な岩相ならびに微生物相の証拠から不整合関係で特徴づけられる.(2)最下部トリアス系はスロンボライトで特徴づけられる.スロンボライトは,微視的巨視的観点からそれぞれ特異な性質を有する.地域を問わず共通して,「中視的な組織」と「巨視的な構造」の多様性が認められる.(3)スロンボライトの形成開始ならびに形成休止様式にも共通性が認められる.これら1)ペルム/トリアス系接触様式,2)スロンボライトの組織や構造の多様性,3)スロンボライトの存在様式と,ペルム紀末の「後生動物礁生態系の崩壊」後の「海洋環境変動」との関連性が注目される.2.オーストラリアN.S.W.州に分布する下部デボン系後生動物-微生物礁の形成を,代表的な造礁後生動物である層孔虫が内外に創りだす微環境の「微生物岩による充填様式」という観点から解明した.絶えず更新される微空間は,「多様な微生物群集」や「微生物群の多様な成長様式」によって活用されている.3.古生代を代表する後生動物群である四射サンゴの成長可塑性の一端を,「無性生殖様式の規則性」と「成長様式の変異性」の観点から考察した.古生代中期から中生代最前期にかけての「礁生態系の実態」の解明には,時代ごとの後生動物と微生物の間の地球生物学上の「相互作用」ならびに「相互作用の時代変遷」を十分に考慮する必要がある.上記の研究の一部は,学術雑誌,ならびに日本地質学会・日本古生物学会などの場で発表された.1.南中国揚子地塊南縁部に分布するペルム/トリアス系境界層ならびに最下部トリアス系(Hindeodus parvus帯)の堆積相・岩相・微生物相の検討を行なった.その結果,次のことが明らかとなった.(1)ペルム/トリアス系境界は,詳細な岩相ならびに微生物相の証拠から不整合関係で特徴づけられる.(2)最下部トリアス系はスロンボライトで特徴づけられる.スロンボライトは,微視的巨視的観点からそれぞれ特異な性質を有する.地域を問わず共通して,「中視的な組織」と「巨視的な構造」の多様性が認められる.(3)スロンボライトの形成開始ならびに形成休止様式にも共通性が認められる.これら1)ペルム/トリアス系接触様式,2)スロンボライトの組織や構造の多様性,3)スロンボライトの存在様式と,ペルム紀末の「後生動物礁生態系の崩壊」後の「海洋環境変動」との関連性が注目される.2.オーストラリアN.S.W.州に分布する下部デボン系後生動物-微生物礁の形成を,代表的な造礁後生動物である層孔虫が内外に創りだす微環境の「微生物岩による充填様式」という観点から解明した.絶えず更新される微空間は,「多様な微生物群集」や「微生物群の多様な成長様式」によって活用されている.3.古生代を代表する後生動物群である四射サンゴの成長可塑性の一端を,「無性生殖様式の規則性」と「成長様式の変異性」の観点から考察した.古生代中期から中生代最前期にかけての「礁生態系の実態」の解明には,時代ごとの後生動物と微生物の間の地球生物学上の「相互作用」ならびに「相互作用の時代変遷」を十分に考慮する必要がある.上記の研究の一部は,学術雑誌,ならびに日本地質学会・日本古生物学会などの場で発表された.南中国貴州省に分布する上部ペルム系最下部トリアス系石灰岩の現地調査を行い,詳細な堆積相・岩相・微生物相の検討を行なった.その結果,次のことが明らかとなった.1.上部ペルム系に特徴的な石灰海綿礁の形成には,"Archaeolithoporella"や『セメント』が量的・質的に大きな役割を果たしている.とくに"Archaeolithoporella"は,大型石灰質生物の表面を被覆・連結し,礁構造をより強固にしている."Archaeolithoporella"は,形態や産状の点から,バイオマット起源である可能性が高い.2.最下部トリアス系には,局地的ながら『マイクロバイアライト』が特徴的に形成されている.その産状を丹念に検討すると,出現には,堆積学的な周期性との関連が認められる.その形成には,1)ペルム紀末の絶滅事変を引き起こし,その後一定の期間持続した『海洋環境の悪化』,2)古生代後期からトリアス紀にかけて持続した,『炭酸カルシウム濃度の過飽和状態』,3)『世界的な規模での海水準変動』と『地域的な堆積環境の変遷』が大きく関与している.3.光学・電子顕微鏡レベルの検討を通して,『マイクロバイアライトの組織』(とくにスロンボライトとストロマトライト)と『構成要素』(ペロイド状粒子,石灰微生物,球状粒子など)との成因的な関係が明らかとなった.4.検討地域の最下部トリアス系のスロンボライト中には,『ペロイド状粒子』が多産する.岩石記載学的な観点から,それらペロイド状粒子の『成因』の一つとして,『石灰微生物の関与』が強く示唆される.

1.南中国貴州省・広西壮族自治区に分布する,とくに下部トリアス系石灰岩の野外調査を行い,詳細な堆積相・岩相・微生物相の検討を行なった.その結果,次のことが明らかとなった.(1)揚子地塊南部地域の最下部トリアス系には,個々には局所的(側方に数km数十kmオーダー)ながら,全体としては広域的にスロンボライト礁が分布している.(2)スロンボライトの微視的巨視的観点からの記載を行い,後生動物礁の消滅に引き続く微生物礁の成因として,1)ペルム紀末の絶滅事変後,一定期間持続した海洋環境の悪化ならびに微生物(とくに球状)相の発達,2)特異的に継続した,炭酸カルシウム濃度の過飽和状態,3)世界的な規模での海水準変動と地域的な堆積環境の変遷などの相互関連性が考えられる.(3)クロッツとしての構成要素が,上方・側方に付加的に成長することによって,スロンボライトの組織が形成されている.球状微生物自体がペロイド状粒子の直接的な起源となる場合もある.2.オーストラリアN.S.W.州に分布する下部デボン系微生物礁の成因を,(1)後生動物礁の代表である層孔虫が創りだす微環境とマイクロバイアライト(とくにストロマトライト)組織の多様性との関連,(2)代表的なカルシマイクローブであるRothpletzellaの成長様式の可塑性の観点から議論した.3.中・古生代後生動物礁の代表的な形成者である,四射サンゴならびに六射サンゴの成長様式を,その最も重要な支配要因である無性増殖様式の観点から考察した.そこには,系統的・構造的な規則性が存在している.上記の研究の一部は,学術誌,ならびに昨年8月にオーストリア(グラーツ)で開催された第9回国際化石刺胞動物・海綿動物会議などの場で発表された.1.南中国揚子地塊南縁部に分布するペルム/トリアス系境界層ならびに最下部トリアス系(Hindeodus parvus帯)の堆積相・岩相・微生物相の検討を行なった.その結果,次のことが明らかとなった.(1)ペルム/トリアス系境界は,詳細な岩相ならびに微生物相の証拠から不整合関係で特徴づけられる.(2)最下部トリアス系はスロンボライトで特徴づけられる.スロンボライトは,微視的巨視的観点からそれぞれ特異な性質を有する.地域を問わず共通して,「中視的な組織」と「巨視的な構造」の多様性が認められる.(3)スロンボライトの形成開始ならびに形成休止様式にも共通性が認められる.これら1)ペルム/トリアス系接触様式,2)スロンボライトの組織や構造の多様性,3)スロンボライトの存在様式と,ペルム紀末の「礁生態系の崩壊」後の「海洋環境変動」との関連性が注目される.2.オーストラリアN.S.W.州に分布する下部デボン系微生物礁の形成を,代表的な造礁後生動物である層孔虫が内外に創りだす微環境の「微生物岩による充填様式」という観点から解明した.絶えず更新される微空間は,「多様な微生物群集」や「微生物群の多様な成長様式」によって活用されている.3.古生代を代表する後生動物群である四射サンゴの成長可塑性の一端を,「無性生殖様式の規則性」と「成長様式の変異性」の観点から考察した.古生代中期から中生代最前期にかけての「礁生態系の実態」の解明には,時代ごとの後生動物と微生物の間の「相互作用」ならびに「相互作用の時代変遷」を十分に考慮する必要がある.上記の研究の一部は,学術雑誌,ならびに日本地質学会・日本古生物学会などの場で発表された.
代数多様体の総合的研究

1.対称微分形式の研究代数多様体の双有理変換の研究には有理微分形式が大切である。今回は,多重の有理対称微分形式の研究を進めた。対称微分形式は対称微分と共に使われ,大切なのは関数の1次独立性が,対称微分を用いて定義されたWronskianにより,判定されることであり,1変数の時に知られた事実が,形式上は全く同様に多変数に一般化され,これらは多様体上で意味をもつ。従って,代数多様体の研究手段として新しい方法を与えることが期待される。今年度の具体的成果はGL,PGL,GO等に対応した不変微分形式を構成することであり,また,計算機を用いて具体的計算を行い,多変数のSchwarzianの形を決定した。これらの結果をICM90(8月),及び城崎の代数幾何学研究集会(11月)で発表した。2.Prologを用いた抽象的数学のモデルの作成を行い,教科書にまとめ朝倉書店から出版した。これの応用として,与えられた有限群の極小生成系を全て決定することが可能になった。3.代数多様体の研究の面では,2変数多項式の分類の研究をし,曲面の分類と類似した新しい結果をえた。これについては次年度に発展させ結果を公表したい。(以上飯高による)4.1990年12月18,19,20日に研究集会代数幾何学目白ー本郷セミナ-を開催し代数幾何の研究交流を行い報告書を出版した。これに本科学研究費補助金を一部使った。5.黒田成俊はスペクトル法による固有関数の近似計算,高速フ-リエ変換とシュレ-ディンガ-方程式に関する共鳴現象の利用についての結果をえて,論文に発表した。6.片瀬潔は3次元レンズ空間とそのeta不変数の研究をまとめて論文発表をした。
バイオフォトンで捉える木質生分解とスペクトル解析

木材腐朽菌は、自然界において、木質成分の主要な分解者である。特に難分解性のリグニンの分解機構は重要な課題である。これまでリグニン分解酵素、メディエーターによる研究、分解化合物の同定による研究が行われてきた。しかしながら、木材腐朽菌が木質成分を分解するアクティビティーをリアルタイムにモニタリングする手段は限られていた。本研究では分解時に生じる微弱なバイオフォトンを可視化、イメージングし、経時的に追跡した。また生分解時に生じる二次代謝産物について分光学的解析を行った。このように、本研究は木材腐朽菌による木質成分の分解機構を動的に捉える新しい展開につながった。バイオフォトン(生物フォトン)は生物活動に伴い生じる微弱な光であるが、その起源は十分に解明されていない。本研究では、木材腐朽菌がリグニン分解過程で生じる微弱な化学発光を捉えること試みた。バイオフォトンの検出には外部エネルギーによる励起は必要なく光電子増倍管(PMT)を用いて検出した。一定時間に生じるフォトンのカウントをイメージング法により観察することで、発光にある種のリズムと局在が生じていることを見出した。さらにリグニン分解過程で菌体外反応として生じると考えられる過酸化反応を可視化して捉えるため蛍光プローブアッセイをおこなった。その結果、フォトンの生成領域近傍で過酸化反応が活発に行われていることが示唆された。自然界では木材の分解は主に木材腐朽菌が担っている。木質の中でも、特に芳香族高分子であるリグニンの生分解については未解明の点が多い。バイオフォトンとは生物活動に伴い生じる微弱な光であり、検出には外部エネルギーによる励起は必要ない。この微弱な化学発光は光電子増倍管(PMT)を検出器としたフォトンカウンティング法によって捉えることができる。本研究では、ある種の木材腐朽性担子菌が木質分解時に相当量のバイオフォトンを発することを見出し、培養中に発生するバイオフォトンを経時的に観測し、発光パターンの観測と解析を行った。また、異なる腐朽菌の対峙培養を行った際のフォトンイメージングについても経時的な観測を行った。この方法により腐朽木材の化学組成分析とは異なり、木質生分解過程における時間的、空間的な情報の取得が期待される。経時的なフォトンイメージング測定の結果、木材腐朽の進行に伴って発光パターンと発光部位が変化すること、木材腐朽菌の種類により発光量が大きく異なることが分かった。さらに、蛍光プローブを用いた菌体外反応の可視化を行い、イメージングの結果と合わせて、解析を行った。また、本年度は化学発光だけでなく質量分析から分解反応を評価するため、木材からのリグニン断片の直接イオン化、検出法の検討を行った。その結果、複数のリグニンフラグメントイオンが観測された。今後、本手法を生分解処理後の木質試料にも適用し、フォトンイメージングの結果と合わせて解析を実施する予定である。研究装置の不調により、実施していた測定データの取得に遅れが生じた。一方で質量分析法を用いたリグニン分子の検出とマッピングの手法に目途がついた。この手法を元に生分解機構について多角的な解析を進める基盤を構築できたと考えている。本研究課題は、自然界における一次の木質分解者である木材腐朽菌のリグニン分解機構に関する基礎知見を、これまでほとんど試みられてこなかった手法により解析することを目的としている。バイオフォトンとは生物活動に伴い生じる微弱な光であるが、その起源は十分に解明されていない。最近、木材腐朽菌の一部が木質分解時に相当量のバイオフォトンを発することがわかってきている。そこで本研究では、木材腐朽菌を培養プレート上において木板とともに培養し経時的な変化をバイオフォトン検出によるフォトンイメージングにより取得した。この際、測定条件、温度調整などを行い安定した条件で観測を行ったが、温調により生じるアーティファクトの影響について今後検討が必要である。連続的な観測により腐朽過程に伴う腐朽菌のアクティビティをバイオフォトン検出によって可視化することができた。腐朽過程におけるバイオフォトンイメージングの連続的な取得を行う一方で、菌体外代謝物、木質構成成分の構造変化をLCーMS, NMRを用いて分析した。さらに、質量分析法によるマスイオン検出によるケミカルマッピングによる観測手法について条件検討を進め、リグニン分子のオリゴマー断片の検出に成功したことから、木質内分子の局在解析への展望が見えてきたと考えている。以上により、木質生分解反応における多面的な知見と鍵因子の探索ツールとしての有効性について検討を行った。温度制御時に生じるアーティファクトのバイオフォトン検出に対する影響については課題が残ったが、質量分析法を用いたマスイオン検出によるケミカルマッピングによる観測手法については実際にデータの取得まで進展した。難分解性の芳香族天然高分子であるリグニンの主要な分解者は木材腐朽菌である。これまでリグニン分解酵素や低分子化合物とリグニンモデル化合物あるいは抽出リグニンを用いたリグニン分解機構に関する研究が多く行われてきた。しかしながら、腐朽菌そのものの分解アクティビティーを可視化する手段がないため、微生物自体がどのようなタイミングで分解しているのかといった活動を直接観測することは困難であった。そこで本研究課題では、木質分解時に生じる微弱な化学発光を可視化、イメージングし、十分に解明されていないバイオフォトンを捉えること、またその分子種を質量分析法やNMR法によって解析することを目的とした。バイオフォトンイメージングでは2週間にわたる培養を連続的にバイオフォトンイメージングし、連続的な動画として取得することに成功した。