hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯周病と生活習慣病の双方向性発症機序の解明

歯周病の発症および進展における免疫担当細胞の活性化と、それら細胞と血管内皮細胞との接着機構の一部を解明した。歯周病と虚血性心疾患および糖尿病や骨粗鬆症などの全身性疾患との双方向性発症関係を臨床医学的に検討した。歯周病有所見者は男性に多く、高年齢、高血圧、肥満および血清尿酸、γGTP、中性脂肪、低比重コレステロール値/高比重コレステロール値比、血清アディポネクチン濃度の高値に有意の相関が見られた。(1)歯周病の発症・進展機序の解明のため、炎症病変におけるNK細胞の浸潤機構を検討した。NK細胞はCXCL12刺激によりI型コラーゲンを浸潤し、この浸潤にはα2-IntegrinおよびMMP-1のNK細胞膜上の凝集と、MMP依存性のコラーゲン分解能が関与する可能性を示唆する結果を得た。(2)歯周病における骨組織吸収機序の解明のため、RAW264細胞の破骨細胞への分化機構を検討した。RNKL刺激による破骨細胞の分化にはp38MAPKを介してMMP-9の発現が関与することが示唆された。また、一酸化窒素(NO)が破骨細胞の分化を促進することを解明し、その機序として、p38の活性化およびERKの阻害が関与することを示唆する結果を得た。(3)歯周病の重症度と虚血性心疾患との双方向性発症関係を検討するため、動脈硬化の危険因子と歯周状態との関連を、平成19年度大阪歯科大学教職員健康診断の検診結果を用いて検討した。検診受診者のうち,同意が得られた40歳以上の者209名(男性151名,女性58名)を対象者とした。CPI最大値が0の正常者群(n=57)と0以外の有所見者群(n=152)を比較すると、有所見者は男性に多く、年齢、血圧、体重、尿酸、γGTP、TG、LDL-C/HDL-C比が有所見者群で有意に高かった。一方、BMI、高感度CRPおよび糖尿病関連の因子などには両群間で有意差が認められなかった。またELISA法で測定した血清アディポネクチン濃度は、女性の有所見者群で総量および高分子量分画が有意に高値であった。また、対象者の歯周状態は、加齢や性差のほかγGTPおよび脂質データとの相関も見られた。(1)歯周病の重症度と虚血性心疾患との双方向性発症関係を検討するため、動脈硬化の危険因子と歯周状態との関連を、平成19年度および平成20年度大阪歯科大学教職員健康診断の検診結果を用いて検討した。CPI最大値がOの正常者群(n=57)とO以外の有所見者群(n=152)を比較すると、有所見者は男性に多く、年齢、血圧、体重、尿酸、γGTP、TG、LDL-C/HDL-C比が有所見者群で有意に高かった。一方、我々の検討では、pro-inflammatory risk markerとして多々報告されている高感度CRPには両群間に有意差が見られず、またBMIや糖尿病関連因子(FBS、Hb_<AIC>、IRI)にも有意差を認めなかった。(2)歯周病の発症・進展機序の解明のため、炎症病変におけるNK細胞の浸潤機構を検討した。(3)歯周病における骨組織吸収機序の解明のため、RAW264細胞の破骨細胞への分化機構を検討した。
ブドウ糖とサイトカインが血管壁平滑筋細胞の増殖とアポトーシスに及ぼす効果-TNF,IL-1,PDGF,IFNとTGF-β-

【目的】T細胞から分泌されるinterferon(INF)-γや、マクロファージ由来のinterleukin(IL)-1β、tumor necrosis factor(TNF)-αは、動脈硬化症の発症・進展に関係の深いサイトカインで,これらのサイトカインと高血糖が血管壁SM細胞のアポトーシス誘導に及ぼすを効果を検討するために以下の実験を行った。【方法】雄性家兎の胸部大動脈中膜平滑筋(SM)細胞を(A)G5.5mMDMEMと、(B)G55mMDMEMの2群に分け、(1)IL-1β(100U/mL)、(2)TNF-α(400U/mL)、(3)IFN-γ(400U/mL)を各単独、あるいは併用して添加、さらに一定時間培養した。その後、TUNEL法でDNA断片化を検出、アポトーシスを証明し、陽性細胞の割合を算出した。【結果】1)培養液のG濃度の効果;(A)、(B)条件下でTUNEL法陽性率は、孵置時間72時間後でそれぞれ数%程度で、両群間に有意差を認めなかった。2)培養液のサイトカインの効果;(A)に(1)、(2)、(3)を各単独で添加しても、TUNEL法陽性率は、孵置時間72時間後で有意に変化しなかった。(1)+(2)、(2)+(3)、(1)+(3)あるいは(1)+(2)+(3)併用では、有意に増加し(それぞれp<0.05)、増加率は(1)+(2)+(3)が最大であった。(B)条件下で(1)、(2)、(3)を同様に添加しても、TUNEL法陽性率は、(A)と有意に変化しなかった。SM細胞での(1)、(2)、(3)のアポトーシス誘導は、高G濃度下で培養しても増加しない。【考察並びに結語】アポトーシスが動脈硬化病変の退縮に責献しているとすれば、高血糖状態で進行した動脈硬化病変をサイトカインによるアポトーシスの誘導によって十分退縮させることができず、糖尿病患者の動脈硬化が激しいことの原因になっているかも知れない。1.血管壁平滑筋細胞の増殖におよぼすグルコース、インスリンの効果;家兎の胸部大動脈平滑筋細胞を培養し、5.5mmol/L高濃度グルコース存在下でのインスリン増殖能におよぼす効果を、細胞数算定、^3H-チミジン取り込みを指標に検討した。高濃度のグルコースは、平滑筋細胞の増殖に有意な影響を示さなかった。インスリンは、平滑筋細胞の細胞数、^3H-チミジン取り込みを濃度依存性に増加させた。しかし、グルコース高濃度下でインスリンを作用させても、グルコース5.5mmol/L時と増殖能は変わらなかった。平成10年度は、平滑筋細胞の増殖能におよぼすグルコース、TNF、IL-1、PDGF、IFN-α、β、γ、TGF-βの各単独、ならびに相加・相乗作用を検討したい。2.血管壁平滑筋細胞のアポトーシス誘導におよぼすグルコース、インスリンの効果;家兎の胸部大動脈平滑筋細胞を培養し、正常高濃度グルコース存在下でのアポトーシスの誘導におよぼすインスリン効果を、DNA蛍光染色所見とTUNEL法を用いた共焦点レーザー顕微鏡観察所見をもとに検討した。グルコース単独では、5.530mmol/Lにおいても平滑筋細胞のアポトーシスの誘導に有意な影響を示さなかった。また、インスリンは、高濃度でもアポトーシスの誘導を増加させなかった。しかし、高濃度のグルコース存在下でのインスリンは、アポトーシスの誘導を増加させた。平成10年度は、各種グルコース濃度下での平滑筋細胞のアポトーシス誘導におよぼすTNF、IL-1、PDGF、IFN-α、βとγ、TGF-βの各単独、ならびに相加・相乗作用を検討したい。また、フローサイトメトリー(FACScan)を用いたアポトーシス関連細胞膜表面抗原、細胞膜表面糖鎖の解析、ならびにDNAアガロースゲル電気泳動法によるアポトーシスの定量的解析を行いたい。2)培養液のサイトカインの効果;(A)に(1)、(2)、

(3)を各単独で添加しても、TUNEL法陽性率は、孵置時間72時間後で有意に変化しなかった。(1)+(2)、(2)+(3)、(1)+(3)あるいは(1)+(2)+(3)併用では、有意に増加し(それぞれp<0.05)、増加率は(1)+(2)+(3)が最大であった。(B)条件下で(1)、(2)、(3)を同様に添加しても、TUNEL法陽性率は、(A)と有意に変化しなかった。SM細胞での(1)、(2)、(3)のアポトーシス誘導は、高G濃度下で培養しても増加しない。【考察並びに結語】アポトーシスが動脈硬化病変の退縮に責献しているとすれば、高血糖状態で進行した動脈硬化病変をサイトカインによるアポトーシスの誘導によって十分退縮させることができず、糖尿病患者の動脈硬化が激しいことの原因になっているかも知れない。1.血管壁平滑筋細胞のアポトーシスの誘導におよぼすブドウ糖の効果;家兎の胸部大動脈平滑筋細胞を培養し、正常高濃度ブドウ糖のアポトーシスの誘導におよぼす効果を、DNA蛍光染色所見とTUNEL法を用いた共焦点レーザー顕微鏡観察所見をもとに検討した。ブドウ糖は、5.530mmol/L、7日間の培養において平滑筋細胞のアポトーシスの誘導に有意な影響を示さなかった。2.血管壁平滑筋細胞のアポトーシスの誘導におよぼすサイト力インの効果;家兎の胸部大動脈平滑筋細胞を培養し、TNF-α(400U/ml)、IL-1β(100U/ml)、IFN-γ(400U/ml)のアポトーシスの誘導におよぼす効果を、DNA蛍光染色所見とTUNEL法を用いた共焦点レーザー顕微鏡観察所見をもとに検討した。TNF-α、IL-1β、IFN-γは、各単独では7日間の培養において平滑筋細胞のアポトーシスの誘導を増加させなかった。3.平成11年度は、各種ブドウ糖濃度下での平滑筋細胞のアポトーシス誘導におよぼすTNF-α、IL-1β、PDGF、IFN-γ、TGF-βの各単独、ならびに相加・相乗作用を検討したい。また、フローサイトメトリー(FACScan)を用いたアポトーシス関連細胞膜表面抗原、細胞膜表面糖鎖の解析、ならびにDNAアガロースゲル電気泳動法によるアポトーシスの定量的解析を行いたい。【目的】マクロファージ由来の(1)interleukin(IL)-1β,(2)tumor necrosis factor(TNF)-αや,T細胞から分泌される(3)interferon(INF)-γは,動脈硬化症の発症・進展に関係の深いサイトカイン(C)と考えられ,これらが,血管壁平滑筋(SM)細胞のアポトーシス(A)の誘導を通じて,動脈硬化病変の進行,退縮に関与している可能性が示唆されている.糖尿病患者の動脈硬化症は,健常者に比較しより早期から高頻度に発症し進展も著しく,この原因として,血管壁構成細胞のAとの関連が考えられる.そこで,我々は,これらのCと高血糖が血管壁SM細胞のA誘導に及ぼすを効果を検討ずるために以下の実験を行った.【方法】家兎大動脈SM細胞をG5.5mMDMEM(A)と,G55mM(B)の2群で,(1)100U/mL,(2)400U/mL,(3)400U/mLを各単独,あるいは併用して添加,72時間培養,その後TUNEL法等でAの検出と定量化を行った.【結果】1)Cの効果;TUNEL法陽性率は,(A),(B)両群間に有意差を認めず,2)Cの効果;(A)に(1),(2),(3)を各単独で添加してもTUNEL法陽性率は,有意に変せず.(1)+(2),(2)+(3),(1)+(3),(1)+(2)+(3)併用では,有意に増加したが,(B)でも同様結果.【考察】
アミノ末端プロセシングによる蛋白質寿命の制御

個々の蛋白質の細胞内寿命にその蛋白質のN末端アミノ酸が重要な役割を担っているという実験事実がある。本研究では,この事実に鑑み,まずパン酵母のイソ-ノ-シトクロムCをモデル蛋白質として、そのN末端近傍領域を遺伝子工学的手法により変換した種々の変異体を作成し,N末端プロセシングの一般則を明らかにしさらにそれに作用する酵素群についての検討を行った。初年度においては,まずパン酵母イソ-ノ-シトクロムCの開始メチオニン(Met^i)に続くアミノ酸を遺伝子工学的手法を用い他の19種のアミノ酸に変異体におけるN末端アミノ酸を分析し,プロセシングの様式について推定した。変異体の作成は,イソ-ノ-シトクロムC遺伝子のN末端から3残基目のアミノ酸に対するコドンが終止コドン(UAA)に変わったため本蛋白質を欠損しているパン酵母菌株を用い,そのスフェロプラスト体に適当にデザインした鎖長2025のオリゴヌクレオチドをかえ,部位特異的変換とシトクロムCの複帰をハイブリダイズ法によりin vivoで行う方法を用いた。また変異体シトクロムCのN末端分析は,これを直接気相型アミノ酸配列自動分析装置を用いて行うと共にHPLCーペプチドマップにより定量的に解析した。この結果,開始メチオニンに続くアミノ酸が,グリシン,アラニン,シスチン,セリン,トレオニン,プロリン,バリンなどその側鎖の回転半径が1.29AGGOHH以下の場合,開始メチオニンの脱離が起り,それ以上の回転半径を持つアミノ酸が続く場合,開始メチオニンが保持されることがわかった。さらに,保持される開始メチオニンの次のアミノ酸がアスパラギン酸,グルタミン酸の場合,このメチオニンはアセチル化され,また,開始メチオニンが脱離した後の新しいN末端アミノ酸としてグリシン,セリン,アラニンなどが現われる場合も,N末端近傍での構造によっては,これらのアミノ酸もアセチル化されることがわかった。以上の結果から,N末端プロセシングには少くとも3種類の酵素;N末端開始メチオニンの離脱に作用するメチオニンアミノペプチダ-ゼ(MAP),N末端アミノ酸のアセチル化に作用するNーアセチルトランスフェラ-ゼ(NAT)ー基質特異性によってグリシン,アラニン,セリンなどに作用するNAT1とメチオニンに作用するNAT2があるーの存在が示唆された。そこで23年度においては,これら3種の酵素をパン酵母より単離,精製することを試みた。NAT1については,既にパン酵母の変異体よりその遺伝子構造が明らかにされていたので,この遺伝子をプラスミドに導入した菌株を用い,またNAT2およびMAPについては,主なプロテア-ゼを欠損しているパン酵母変異体菌株を用いた。この結果,未だいづれの酵素も完全な精製品を得るには至ってはいないが,NAT1については,分子量約9万の同一サブユニット2個よりなる蛋白質,NAT2については,分子量約65,000の蛋白質であること,またMAPについては,分子量約35,000の金属酵素であることなどがわかった。今後はさらにこれら3酵素についてその精製と構造に決定を行う予定である。このほか,最終年度においては,N末端アセチル基の生理的役割を明らかにする一端の研究として,N末端アセチル基の除去に作用する2つの酵素;Nーアシルアミノ酸遊離酵素(AARE)とアシルアミノアシラ-ゼ(ACY);についての研究も行い,アシルアミノ酸遊離酵素のCDNAの塩基配列,一次構造の決定と活性セリン残基の同定,アシルアミノアシラ-ゼのcDNAの塩基配列の決定を行った。今後は,これら5種の酵素についてそれぞれの役割をNー末端プロセシングを基盤として研究していく予定である。

以上の結果から,N末端プロセシングには少くとも3種類の酵素;N末端開始メチオニンの離脱に作用するメチオニンアミノペプチダ-ゼ(MAP),N末端アミノ酸のアセチル化に作用するNーアセチルトランスフェラ-ゼ(NAT)ー基質特異性によってグリシン,アラニン,セリンなどに作用するNAT1とメチオニンに作用するNAT2があるーの存在が示唆された。そこで23年度においては,これら3種の酵素をパン酵母より単離,精製することを試みた。NAT1については,既にパン酵母の変異体よりその遺伝子構造が明らかにされていたので,この遺伝子をプラスミドに導入した菌株を用い,またNAT2およびMAPについては,主なプロテア-ゼを欠損しているパン酵母変異体菌株を用いた。この結果,未だいづれの酵素も完全な精製品を得るには至ってはいないが,NAT1については,分子量約9万の同一サブユニット2個よりなる蛋白質,NAT2については,分子量約65,000の蛋白質であること,またMAPについては,分子量約35,000の金属酵素であることなどがわかった。今後はさらにこれら3酵素についてその精製と構造に決定を行う予定である。このほか,最終年度においては,N末端アセチル基の生理的役割を明らかにする一端の研究として,N末端アセチル基の除去に作用する2つの酵素;Nーアシルアミノ酸遊離酵素(AARE)とアシルアミノアシラ-ゼ(ACY);についての研究も行い,アシルアミノ酸遊離酵素のCDNAの塩基配列,一次構造の決定と活性セリン残基の同定,アシルアミノアシラ-ゼのcDNAの塩基配列の決定を行った。今後は,これら5種の酵素についてそれぞれの役割をNー末端プロセシングを基盤として研究していく予定である。
泌尿器科における抗菌素材(ゼオミックス)の臨床応用

現在ゼオミックス尿道バルンカテーテルを開発中である。ゼオミックスをa;カテーテルの素材に練り混む方法、b:カテーテルにコーティングする方法、の2種に分けて行った。カテーテル素材はシリコン・天然ゴムを選択し、各々の方法で行ったが、いずれの素材にもコーティング法(方法b)は接着できない、温度変化で剥がれてしまうなどの問題があり不可能であった。方法aでは天然ゴムには均等に練込むことができず、シリコン(付加型シリコーンの一般押し出しグレードで一般医療用に汎用されているもの。)にのみ可能であった。よって素材はシリコンとし、練込み法を採用した。ゼオミック濃度が1wt%と3wt%の2種類のゼオミックシリコンを開発した。銀イオンはその素材の性質上黒褐色を呈するためにゼオミックシリコンも同様の色となり、患者や医療関係者に不快感を与えると考え、熱処理を施しクリーム色に変色させた。カテーテルのバルン部分は、素材を薄くしなければならずかつ膨張・収縮に耐えられる強度が必要とされるために難航している。シリコンのみの内層とゼオミックを練込んだ外層の2層構造を検討中である。カテーテル開発中に協議検討した結果、バルンカテーテルのみでは逆行性尿路感染を完全に防ぐことは不可能だと思われた。なぜならカテーテルに接続する集尿バッグで菌が繁殖し、膀胱へ逆行する可能性があるからである。そこで集尿バッグの内側にも抗菌性をもたせることで菌繁殖を抑制することができるのでは考えた。しかしゼオミックは接触した菌しか抗菌効果がなく、バッグに蓄尿された尿にいかにゼオミックを接触させるかを検討し、バッグ内ににゼオミックをコーティングした不織布をいれることで、尿への接触面積を拡大することとした。よって今後はこのカテーテルとバッグをセットにした抗菌導尿システムとして開発していく予定である。
トレーサー解析による土壌およびイネ体内の放射性セシウムの動態解明と移行抑制の検証

本研究では、Cs-129を用いた「土壌からイネの玄米に到る放射性セシウムの詳細動態解明と移行抑制法の検証」を目的として、イネの生育段階別での放射性Cs吸収速度論解析と放射性Cs接触部位からのCsの移行について検討した。平成24年度においては、1)安定同位体Csを用いたイネのCs集積および吸収抑制に関する研究および2)Cs-129を用いたポジトロンイメージング解析を実施した。イネ品種は国内で生産されている代表的なジャポニカ種であるコシヒカリを用いた。1)安定同位体Csを用いたイネのCs集積および吸収抑制に関する研究水耕栽培したコシヒカリの安定同位体Cs経根吸収において、(1)播種後2週間の幼植物および出穂期個体へのCs処理、(2)異なるCs濃度(010μM)処理による根のCs吸収速度論解析および(3)カリウム添加(018mM)による吸収抑制効果の検討を行った。(1)から(3)の処理を行ったイネの部位別サンプル(葉身、葉鞘、基部、根)は酸分解およびCs濃度分析を行った。得られた分析結果はCs-129による動態解析における重要な基本情報になると考えられた。2)Cs-129を用いたポジトロンイメージング解析水耕栽培したコシヒカリ幼植物にCs-129を投与し、コシヒカリ体内のCs-129動態解析を行い、コシヒカリ根への集積が確認された。Cs-129の製造において、KIから生成されるCs-129の量が極めて少なく、また、溶液中に含まれる多量のKはコシヒカリのCs吸収を抑制する可能性が示唆された。製造したCs-129については分子認識ゲルを用いて溶液中のKと分離し、Cs-129イメージング精度の向上を検討した。Cs-129イメージングの確立により、これまで明らかとなっていなかったイネ体内の詳細なCs動態解析が可能になると考えられた。
ギャンブル行動の抑制につながる臨床心理学的研究：システム開発とログデータ解析から

ギャンブル渇望への対処に特化したEcological Momentary Interventionによる治療アプリケーション(Mobile version of the Gambling craving coping Application)を開発し、ギャンブル行動の抑制に対する効果を検討することを目的とする。そして、本研究で開発したアプリケーションに蓄積された膨大なデータを用いて、ギャンブル行動の抑制につながる心理学的要因を解明する。
脈管系におけるナノ粒子の動態解析および新規のナノ粒子生体内安全性評価法の確立

【摘出脈管内腔へのナノ粒子の灌流システム・動態イメージング解析システムの確立】これまで構築してきた1)リンパ管の自発性収縮に伴う径変動や振幅・頻度を経時的に長時間追尾し計測し記録する実験システム、2)内腔に流れるナノ粒子を高感度高FRハイスピードカメラで可視化し動態を解析する摘出リンパ管灌流システム、3)灌流後のリンパ管組織切片を作製しリンパ組織に与える影響を組織学的に評価する実験系を総合して用い、ナノバイオマテリアルの生体内安全性を評価するシステムを最終的に確立した。【脈管生体反応の解析】1ナノ粒子のリンパ管内移動に関するイメージングおよびその評価:前年度に引き続き粒子状CNH、繊維状CNTに加えて、カーボン以外の物質としてAgナノ粒子を比較に用いて解析を行った。3種のナノ粒子の分散状態のサイズ・電荷・構造等の評価を行い、溶液種・超音波出力・濃度等の好分散条件を決定できた。リンパ管内灌流させた3種のナノ粒子の動態をハイスピードカメラで撮影し各種粒子の動きを可視化することに成功した。2リンパ管自発性収縮に与える影響:前年度までに構築してきた摘出リンパ管の自発性収縮に与える影響を薬理学的に評価する方法を用いて、3種のナノ粒子が管に到達直後自発性収縮や直径、動きを変化させる影響の違いを捉えることができた。【脈管細胞レベルでの影響の組織化学的解析】3リンパ管内壁との相互作用の評価:これまで確立してきた灌流後のリンパ管を組織化学的に評価する方法を用いて、さらに電子顕微鏡学的にリンパ管内皮細胞内への粒子接着および取り込みを詳細に明らかにすることができた。In vivoリンパ微小循環流量定量およびイメージング法の確立に関しての研究は、成果をまとめ学会発表および論文投稿しアクセプトされた。さらに現在、当研究課題の最終成果を論文発表準備しており投稿前の段階である。関節内に造影剤を注入すると所属リンパ節に移動することが明らかになり、関節内のCNTが他臓器に移動する場合はリンパ系を介すると考えられた。このためリンパ管内のCNTの移動様式を調べる実験系を構築する作業を開始した。【リンパ管の生組織摘出法の手技確立】リンパ管の解剖学的選定は、膝関節の位置を考慮し下肢からのリンパ流が集合する腸骨リンパ節集合リンパ管にした。ラットからリンパ管組織を摘出する手技確立を行い、直径約100200 μm、長さ約12 mmのリンパ管を摘出し両端をガラスピペットにカニュレーションし縫合糸で固定、臓器槽チャンバー内にセットする方法を確立した。【摘出リンパ管の自発性収縮の保持条件の探索】摘出リンパ管特有の生体反応である自発性収縮を起こす実験条件を検討した。摘出リンパ管をカニュレーションした臓器槽チャンバー内にポンプで灌流液を注入し対側から吸引することで灌流させた。灌流液はリンパ系の低酸素分圧とpH7.4、温度38°Cを保ったCaイオン含有のKrebs緩衝液で、5 mL/minの速度でリンパ管外腔に灌流した。摘出リンパ管には内圧として6 cmH2O静水圧と張力を負荷させることにより連続的自発性収縮を惹起できることが分かった。リンパ管内の流れは2 mmH2Oの微小な静水圧差を用いることにより生体に近い流れ速度を作ることが可能と分かった。【リンパ球の流れを捉えるイメージングシステムの確立】リンパ管内の流れの確認には、25 μmのリンパ球を用いた。ラットから摘出した腸骨リンパ節を磨り潰し被膜から回収した細胞をCFSE蛍光色素で染色して行った。これらの動きをモニタリングする機械をセットアップし摘出リンパ管内腔を流れる蛍光リンパ球の流れ方を捉えることができた。リンパ管自発性収縮に伴う直径変化や振幅・頻度を経時的に追尾し計測するシステムも構築した。このin vitro摘出組織系を用いた手技と実験システムの構築により、今後様々なナノ粒子・マイクロ粒子の脈管内送達イメージングが期待できると共に、バイオマテリアルが脈管系の生体反応・組織・細胞レベルにおいてどのような影響を及ぼすか解明する新規の生体内安全性評価法を確立することができた。【摘出脈管内腔へのナノ粒子の灌流システム・動態イメージング解析システムの確立】リンパ管の自発性収縮に伴う径変動や振幅・頻度を経時的に追尾し計測するとともに、内腔に流れるナノ粒子を可視化し動態を解析する摘出リンパ管灌流システムと実験系を構築した。リンパ管径の計測はモニター上のリンパ管の壁のコントラストを感知しアナログ信号により行い長時間PCで観測できるシステムを作製した。灌流ナノ粒子のイメージングには、高感度高FRハイスピードカメラを顕微鏡に設置し管腔を流れるナノオーダーの粒子が観測できるシステムを構築した。【ナノ粒子灌流時の脈管生体反応の解析】【粒子灌流後の脈管細胞レベルでの影響の解析】1カーボン粒子のリンパ管内移動に関するイメージングおよびその評価:粒子状CNHを用いてCNH分散状態のサイズ・電荷・構造等の評価を行い、溶液種・超音波出力・濃度等の好分散条件を決定できた。リンパ管内を灌流させたCNHの動態は、ハイスピードカメラで撮影し種々のリンパ管構造毎の粒子の動きを可視化することに成功した。またソフトウェアを用い撮影動画の粒子を追尾し流れを解析した。2標本の生組織としての評価:摘出リンパ管が自発性収縮を維持する条件下で生理活性物質により収縮・弛緩反応を薬理学的に調べ平滑筋およびリンパ管内皮細胞の健在を確認できる方法を確立した。

3リンパ管自発性収縮に与える影響:管内を灌流させたCNHやCNTが管に到達直後自発性収縮や直径、動きが変化する様々な現象を捉えた。4リンパ管内壁との相互作用の評価:灌流後のリンパ管組織切片を作製する方法を確立し、リンパ管弁やリンパ管内皮細胞へのナノ粒子接着を明らかにした。これらの上記の成果は複数の学会にて報告を行った。生体リンパ微小循環のリンパ流量定量およびイメージング法の確立に関しての研究は、成果をまとめ学会発表および論文投稿しアクセプトされた。このin vitro摘出組織系を用いた手技と実験システムの構築により、今後様々なナノ粒子・マイクロ粒子の脈管内送達イメージングが期待できると共に、バイオマテリアルが脈管系の生体反応・組織・細胞レベルにおいてどのような影響を及ぼすか解明する新規の生体内安全性評価法を予定通り確立することができた。現在種々のナノ粒子を脈管内に流し試験しているところであるが、用いる材料毎の正確な灌流分散状態がポイントであり、粒子濃度や粒子数、速度、粘度など脈管に灌流する最適条件を検討している。In vivoにおけるリンパ循環研究においてリンパ流イメージングと流量測定法が確立でき、腸間膜リンパ管・乳び・胸管を介したリンパ微小循環から大循環へのリンパ流の可視化を可能にし、そのイメージング手法と評価の成果を論文投稿およびアクセプトできた。またin vivoリンパ管カニュレーション法によりリンパ液組成成分や細胞成分の評価が可能となり、in vitro摘出リンパ管系の実験システムを用いた灌流ナノ粒子の動態を明らかにする研究に大いに役立てられる。そのため当初の計画以上に進展している。生体内でのリンパ微小循環に関する研究成果が早く出たため論文投稿に至った。また研究成果の学会発表を複数回行った。また複数同時に実験を行うための実験器材を準備し、この研究の実験を更に早く数多く進める計画を立てている。また学会主催の流体力学の研修に行きナノ粒子の動態を理解評価し動態解析ソフトウェアを活用する予定である。【摘出脈管内腔へのナノ粒子の灌流システム・動態イメージング解析システムの確立】これまで構築してきた1)リンパ管の自発性収縮に伴う径変動や振幅・頻度を経時的に長時間追尾し計測し記録する実験システム、2)内腔に流れるナノ粒子を高感度高FRハイスピードカメラで可視化し動態を解析する摘出リンパ管灌流システム、3)灌流後のリンパ管組織切片を作製しリンパ組織に与える影響を組織学的に評価する実験系を総合して用い、ナノバイオマテリアルの生体内安全性を評価するシステムを最終的に確立した。【脈管生体反応の解析】1ナノ粒子のリンパ管内移動に関するイメージングおよびその評価:前年度に引き続き粒子状CNH、繊維状CNTに加えて、カーボン以外の物質としてAgナノ粒子を比較に用いて解析を行った。3種のナノ粒子の分散状態のサイズ・電荷・構造等の評価を行い、溶液種・超音波出力・濃度等の好分散条件を決定できた。リンパ管内灌流させた3種のナノ粒子の動態をハイスピードカメラで撮影し各種粒子の動きを可視化することに成功した。
血清中mRNAを用いた新規高感度病態診断法のプライマリーケアへの導入

癌細胞検出プロジェクトでは、共同研究施設からの肝がん検体が500例になり、臨床経過や現行の腫瘍マーカーとの比較でhTERT mRNAが新規の腫瘍マーカーとして応用可能であることを見出した。また6mm大の腫瘍を検出できることも見出し、Hepatologyに投稿中である。その他、甲状腺がん検体は伊藤病院から100検体を突破し、hTERT定量値は臨床応用可能とみて継続している。四国がんセンターと京都府立医科大学との共同研究により、膵がんにも応用可能か否か、PETによる画像診断との比較を検討した。100検体の検討では癌治療学会で有用性を発表した。炎症疾患早期診断プロジェクトでは、劇症肝炎とARDSに関して行った。劇症肝炎ではTGF-αmRNAが重症肝炎の時点で高値であれば回復でき、低値であれば肝移植になる可能性が高いことを学会発表した。ARDSでは、VWF、PBEF1, PDGFAが予後評価に有用であることを証明した。肺癌に対するNKT細胞免疫治療効果判定を、治療の前後で経時的に採血しhTERT mRNAとEGFR mRNAを測定している。理化学研究所及び千葉大学での倫理審査を受け承認後、100例以上の検体を検討した。現在NKT細胞の効果判定の解析を行っている。定量測定の最適化を図り、2つを過去の定量測定値と比較検討した。逆転写酵素反応の前に、高次構造をとる加熱過程を導入することで、定量測定が安定することを見出し、特許申請した。コニカミノルタテクノロジーセンターと共に、プライマリーケア導入が可能な試薬を完成させ、機器開発を開始している。機器開発費を得るため、機会がある毎に助成金申請を行っている。血液中のRNAの形態や安定なRNA抽出法の技術的向上を目指して継続している。本研究は、患者の血清中から疾病の原因遺伝子の活動性を、mRNAを指標として高感度に検出して行う病態診断法に関わるものである。本年度の検討として、以下の項目を行った。1.各種病態に即した検出方法の標準化:1)試薬開発を完成(キット化)し、各探索領域で本方法を臨床的に適応可能にする条件を標準化している。2)癌や炎症性疾患を対象とした臨床データを更に蓄積し、各病態に応じたPCR用のプライマーを作製している。(インテックW&G社が担当し、研究支援大学から検体を受けている)3)一回の定量測定で複数個の遺伝子の発現定量を可能にする癌、組織、病態特異的なチップの作製に着手している。(プライマーセットがすべて最適化された後にチップを作製)4)遺伝子医薬の翫判定・効果判定についても検討する。(理研及び千葉大学と肺癌に関して共同研究を開始)2.機器、カラムの開発:1)血清中細胞成分除去用の遠心分離器の開発。(並木精密宝飾社担当)2)高収量にRNAを得るための、DNase処理を必要としないDNAとRNA分離法の確立。(並木社が担当)3)病態の質的診断を可能にする網羅的プライマーチップと定量機器の開発。(コニカミノルタ社がICAN法を基に開発中。)臨床データの蓄積は、肺癌、膵癌、食道癌、胃癌、甲状腺癌、婦人科領域癌で行い、遺伝子マーカーとしてhTERT, survivin, EGFR, VEGF, CCNE1などを検討した。炎症性疾患に関しては、劇症肝炎とショック肺(ARDS)で行い、マーカーとしてTGF-α, VWF, c-metを検討した。生活習慣病に関しては、共同研究企業コスミック社の協力の下、インスリン抵抗性を、RBP4, adiponectinで検討した。最終的な目標はプライマリーケアへの導入である。

この1年間で各病態に関する高感度検出法として遺伝子の選択は順調に行え、機器の作製に応じて他の条件のすべてを最適化する環境を整えた。実用化は十分可能な見通しをもって、各企業も開発を行っている。迅速測定機器としての簡易化、自動化の実現が可能になると考える。1)癌細胞検出プロジェクトでは、共同研究施設からの肝がん検体が500例になり、臨床経過や現行の腫瘍マーカーとの比較でhTERT mRNAが新規の腫瘍マーカーとして応用可能であることを見出した。また6mm大の腫瘍を検出できることも見出し、Hepatologyに投稿中である。その他、甲状腺がん検体は伊藤病院から100検体を突破し、hTERT定量値は臨床応用可能とみて継続している。四国がんセンターと京都府立医科大学との共同研究により、膵がんに応用可能かを検討している。現時点で、100検体の検討で、有用性が強く予想されるため、そのデータを今秋の癌治療学会で発表するため抄録準備中である。2)炎症疾患早期診断プロジェクトでは、劇症肝炎とARDSに関して行っており、劇症肝炎ではTGF-αmRNAが重症肝炎の時点で高値であれば回復でき、低値であれば肝移植になる可能性が高いことを学会発表した。ARDSでは、検体を採取中である。3)肺癌に対するNKT細胞免疫治療効果判定を、治療の前後で経時的に採血しhTERT mRNAとEGFR mRNAを測定している。理化学研究所及び千葉大学での倫理審査を終え、今年中に100例以上の検体を検討できる予定である。4)定量測定の最適化を図り、100以上のプライマーセットをインテックW&G社の協力で選び、その内の2つを過去の定量測定値と比較検討した。逆転写酵素反応の前に、高次構造をとる加熱過程を導入することで、定量測定が安定することを見出し、特許申請した。5)コニカミノルタテクノロジーセンターがPCT出願を援助して下さり、プライマリーケアが可能な試薬製造と機器開発を開始した。開発費を得るため、顕在化ステージに申請を終えたところである。血液中のRNAの形態や安定なRNA抽出法の実際を実施している。四国がんセンターと京都府立医科大学との共同研究により、膵がんにも応用可能か否か、PETによる画像診断との比較を検討した。100検体の検討で癌治療学会で有用性を発表した。2)炎症疾患早期診断プロジェクトでは、劇症肝炎とARDSに関して行った。劇症肝炎ではTGF-αmRNAが重症肝炎の時点で高値であれば回復でき、低値であれば肝移植になる可能性が高いことを学会発表した。ARDSでは、VWF、PBEF1,PDGFAが予後評価に有用であることを証明した。
高抵抗材料を用いたナノ放電加工の実現に関する研究

本研究では,微細放電加工において工具電極に高抵抗材料を用いることで,単位加工量である放電痕を微小化し,放電加工の微細化の限界を更新することを目的としている.シリコン工具電極の抵抗率が増加するに従い,放電電流ピーク値が減少し,パルス幅が長くなったため,放電痕を小さくすることができた.その結果,シリコンを工具電極として用いることで,銅電極を使用した場合よりも小さい,最小直径0.7マイクロメーターの微細軸加工に成功した.本研究では,放電加工の微細化の限界を更新し,これまで不可能であったナノ放電加工(加工寸法:数百nm)を実現することを目的とする.放電加工は微細加工のための有力な加工法であるが,従来の技術で加工可能な最小寸法は1μm程度であった.これは,浮遊容量から供給される電流が単位加工量である放電痕の微小化に限界をもたらすためである.そこで本研究では,電極材料として高抵抗材料を用い,浮遊容量から流れる電流を極限まで低減することで放電痕の微小化を試みた.まず,高抵抗材料を電極に用いた場合の放電回路の等価回路解析を行い,高抵抗材料が放電エネルギーの減少に与える効果を理論的に検討した.その結果,電極の抵抗値が増加するほど,放電電流のピーク値が減少し,放電エネルギーも減少することがわかった.そこで,実際に電極として高抵抗材料であるシリコンを用いて放電加工を行い,放電電流を測定した結果,解析結果と同様に電流ピーク値が減少し,放電エネルギーも減少することがわかった.また,放電痕径を測定した結果,高抵抗材料の抵抗率が大きくなるほど放電痕径が小さくなるという結果が得られた.これは,放電エネルギーが減少することに加え,電流のピーク値が小さくなったことで,アーク柱から工作物へ流入する熱流束が減少したためと考えられる.また,シリコンを工具電極としてステンレス鋼に加工を行った結果,放電痕が微小なため,従来のタングステンを電極として用いた場合よりも良好な加工面粗さが得られた.さらに,シリコンを工具電極として超硬材料の微細軸加工を行った結果,直径0.7μmの微細軸の加工に成功した.高抵抗材料である単結晶シリコンを用い,抵抗率を大きくすることで放電痕径を小さくできることを実証した.一方で,これまではn型の半導体シリコンを用いていたが,半導体キャリアの違いが放電電流にどう影響するのかは明らかにできておらず,この検討が必要である.等価回路解析による理論的な検討は目標通りに行えている.また,次年度に実施を予定していた微細軸の加工にも既に着手することができ,直径0.7μmの微細軸を加工することに成功した.しかし,目標としている0.5μm以下の微細軸加工は未だに行えていない.本研究では,微細放電加工において工具電極に高抵抗電極を用いることで,単位加工量である放電痕を微小化し,放電加工の微細化の限界を更新することを目的としている.従来の微細放電加工では,浮遊容量から供給される電流が放電痕の微小化に限界をもたらすため,加工可能な最小寸法は1μm程度であった.そこで本研究では,電極材料として高抵抗材料を用いることで,浮遊容量から流れる電流を低減し,これによる放電痕の微小化を試みた.まず,高抵抗材料を電極に用いた場合の放電回路の等価回路解析を行い,高抵抗材料が放電エネルギーの減少に与える効果を理論的に検討した.その結果,電極の抵抗値が増加するほど,放電電流のピーク値が減少してパルス幅が伸び,放電エネルギーは減少することがわかった.そこで,高抵抗材料であるシリコンをブロック状の工具電極として用い,微細軸加工を行った.そして,微細軸加工時の放電電流および軸上の放電痕直径を調査した.その結果,工具電極抵抗率が増加するに従い,放電電流ピーク値は減少し,パルス幅は長くなった.また,軸上の放電痕直径も小さくなった.この理由として,工具電極の抵抗により浮遊容量から流れ込む電流が制限されたためと考えられる.さらに,シリコンを工具電極として用い,微細軸作成の成功確率と最小軸直径を調査し,従来の銅ブロック電極を工具電極として用いる場合と比較した.銅を工具電極とした場合,直径1.5μm以下の微細軸加工の成功確率は30%未満であった.また,銅を用いて得られた微細軸の最小直径は0.9μmであった.一方で,シリコンを工具電極として用いた場合,微細軸加工の成功確率は直径1.5μm以下の微細軸加工で40%であり,銅電極を使用した場合より高い確率となった.また,シリコンを工具電極として用いることで,銅電極を使用した場合よりも小さい,最小直径0.7μmの微細軸加工に成功した.本研究では,微細放電加工において工具電極に高抵抗材料を用いることで,単位加工量である放電痕を微小化し,放電加工の微細化の限界を更新することを目的としている.シリコン工具電極の抵抗率が増加するに従い,放電電流ピーク値が減少し,パルス幅が長くなったため,放電痕を小さくすることができた.その結果,シリコンを工具電極として用いることで,銅電極を使用した場合よりも小さい,最小直径0.7マイクロメーターの微細軸加工に成功した.目標としている0.5μm以下の微細軸加工の実現のため,更に抵抗率の大きいシリコンを電極として用い,放電痕の微小化を図る.また,半導体キャリアの違いが放電電流に与える影響を調査し,放電痕の微小化に最適なシリコンの種類を明らかにする.

さらに,低電圧の交流高周波電源を用いることによっても放電エネルギーを微小化し,高抵抗材料と合わせて用いることで,さらなる放電痕の微小化を図る.これらの方法により直径0.5μm以下の微細軸加工の実現し,製作した微細軸を工具電極として用いることで,直径1μm以下の穴加工の実現を目指す.生産工学・加工学
アミノトランスフェラーゼを指標としたC_4植物ミトコンドリア機能分化の解析

本研究で得られた知見と成果は以下に記す通りである。1.NAD-リンゴ酸型C_4植物シコクビエ(Eleusine coracana)葉組織に存在する3種のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AspAT1,2,3)のうち、AspAT1は葉肉細胞の細胞基質に、AspAT2は葉肉細胞および維管束鞘細胞のパーオキシゾームと目されるオルガネラ画分に、またAspAT3は維管束鞘細胞のミトコンドリアに局在することが明らかになった。また、これらアイソザイムを精製し、基質に対するkm値を決定するとともにAspAT1をAspAT3は電気泳動的にも反応至適pHにもまた免疫化学的にも識別し得ることが判明した。2.緑化過程におけるシコクビエ葉のAspATの発現を解析し、その結果に基づき抽出したmRNAを用い、ラムダgt11の系によりcDNAライブラリーを作製した。このライブラリーからグリーンパニック(Panicum maximum、NAD-リンゴ酸型C_4植物)葉肉細胞酵素由来の特異抗体を調製し、これを用いた免疫選抜によりAspAT1に対応すると目される全鎖長のcDNAをクローニングし、その塩基配列ならびにそれがコードするアミノ酸配列を決定した。さらにこのcDNAをプローブとし、プラークハイブリダイゼションを行ないこのcDNAとは構造が異なる3個の陽性クローンが得られた。これらのcDNAの塩基配列については現在解析が進行中である。
エキシマ照射した強誘電性薄膜の低温作製と評価

チタン酸ビスマスは希土類元素(La, Pr, Nd, Sm等)で一部置換することにより、強誘電性が飛躍的に向上することが報告されており、強誘電体不揮発性メモリへ応用するのに非常に優れた強誘電体材料の1つといえる。しかしながら、600°C以下の低温作製膜において良好な強誘電性が得られたという報告は少ない。そこで本研究では、化学溶液法を用いて希土類元素ドープチタン酸ビスマス強誘電体薄膜を低温作製し、その薄膜の結晶性、微構造おび強誘電性の評価を行った。各金属有機化合物原料の配位を溶液中で制御することにより、均一かつ安定な希土類元素ドープチタン酸ビスマス前駆体溶液を調製することができた。結晶構造中のBiサイトヘドープするのに最も効果的な希土類元素はNdであり、焼成温度700°Cで作製したBNT薄膜は良好な強誘電性を示した。その残留分極値(P_r)と抗電界(E_c)は、それぞれ22μC/cm^2と70kV/cmとなった。また、BNT薄膜におけるNd-ドープ量の最適な組成はBi_<3.35>Nd_<0.75>Ti_3O_<12>であることが分かった。BNT前駆体膜は比較的低温である600°Cの熱処理により結晶化した。その薄膜は比較的良好な強誘電性を示し、残留分極値(P_r)と抗電界(E_c)はそれぞれ7μC/cm^2と88kV/cmとなった。さらなる低温合成を目指して、エキシマUVランプ照射プロセスを採用した結果、前駆体膜中の残留有機基の除去および微構造の改善に有効であり、焼成温度550°Cの低温で作製したBNT薄膜においても良好な強誘電性を示した。また、エキシマUV照射BNT薄膜のリーク電流特性は、印加電圧3V程度まで10^<-6>A/cm^2以下のリーク電流密度であり、比較的に良好なリーク電流特性が得られた。以上のことから、本研究の薄膜合成技術が半導体メモリ分野に適用できると期待できる。近年、Bi_4Ti_3O_<12>(BIT)系強誘電体薄膜は、希土類元素(La,Pr,Nd,Sm,Gdなど)を添加することにより、強誘電特性が飛躍的に向上することが知られ、特に、不揮発性メモリへの応用が期待されている。しかし、Si半導体との整合性から600°C以下での低温作製が要求されている。本研究では、LaドープBiT【(Bi,La)_4Ti_3O_<12> : BLT】薄膜を、精密な組成制御が容易な化学溶液法を用いて、低温化プロセス(UVプロセシング、シード層の導入など)の確立および低温作製した薄膜の強誘電特性評価に関する研究を行った。その結果、BLT前駆体膜へのエキシマUVランプ照射は、BLT薄膜作製の低温化に有効であった。UVランプを照射したBLT薄膜はUV未照射膜に比べ、焼成温度550°Cと低温で結晶化した。

さらに、BLT薄膜の強誘電特性は、UVランプ照射により著しく改善され、焼成温度550°C作製BLT薄膜において、残留分極値、P_r=4.4μC/cm^2、抗電界、E_c=72kV/cmであった。以上の結果から、BLT前駆体薄膜へのエキシマUVランプ照射は、BLTの低温化、および強誘電特性の向上に有効であることがわかった。これより、エキシマUVランプ照射のプロセスは{化学溶液法により合成されたBIT系の低温化、強誘電特性の向上に有効であると同時に、FRAMへの応用に期待できるものと考えられる。チタン酸ビスマス強誘電体薄膜は、結晶構造中のBiサイトを希土類元素で一部置換することにより強誘電性が飛躍的に向上することが報告されており、不揮発性メモリへ応用するのに非常に優れた材料といえる。しかしながら、これらの材料を実際のメモリデバイスへ応用するには、比較的低温域(約600°-Cあるいはそれ以下)での薄膜化が可能であり、かつ強誘電特性が劣化しないことなどが望まれる。そこで本研究では、精密な組成制御が可能な化学溶液法を用いて希土類元素ドープチタン酸ビスマス強誘電体薄膜を合成し、低温作製膜において良好な強誘電性を得ることを目的とした。その結果、焼成温度700°-Cで作製したNd-ドープチタン酸ビスマス(BNT)薄膜において強誘電性が飛躍的に向上し、残留分極値(P_r)と抗電界(E_c)はそれぞれ、22μC/cm^2と.70kV/cmと非常に優れた値を示した。また、NdイオンがBIT結晶構造中のBiイオンを完全に置換していることがラマンスペクトルより確認された。さらに、BNT前駆体膜にエキシマUVランプを照射するプロセスを導入し、焼成温度550°-Cで作製したBNT薄膜において良好な強誘電性を示す薄膜の作製に成功し、その残留分極値(P_r)と抗電界(E_c)はそれぞれ、13μC/cm^2と88kV/cmであった。このことより前駆体膜へのエキシマUVランプ照射が、BNT薄膜の低温結晶化、微構造の改善および強誘電性の向上に有効であることを見いだした。以上のことから、エキシマUVランプ照射プロセスは、不揮発性メモリの応用に期待できると考えられる。
大スケールジェットにおける物理過程と相互作用の理論的研究

一層近似のもとでは大スケールジェットのX線放射機構は、FRI型のジェットではシンクロトロン放射、FRII型のジェットでは逆コンプトンで解釈するのが適切である。しかし、バルク運動の大きなローレンツ因子や弱い磁場強度など定量的な問題には内部構造の影響が無視できないことがわかった。Cen Aについて詳しい検討を行い、大スケールジェットではジェット表層部分と周囲との相互作用での粒子加速が大きな役割を果たすことを明らかにした。また、1959+650で観測されたTeVガンマ線のorphan flareについてジェット表層での反射モデルを提案した。これも表層部分での粒子加速が非一様であることを示唆している。また、関連する物理的過程として以下の研究を進めた。1.内部衝撃波の力学構造を考えると、ジェットには観測される相対論的電子の質量密度の千倍程度の質量密度の物質が存在していることを明らかにした。2.偏波観測やジェットの見かけの構造に対する相対論的ビーミング効果について解明し、観測の解釈に対する注意を喚起した。3.コンプトン散乱におけるクライン仁科効果が電子スペクトルを大きく変形し、輻射強度の強い減少をもたらさない場合もあることを指摘した。4.電子陽電子対ビームの形成と不安定性の物理機構を議論した。約20個程度の大スケールジェットの多周波観測のデータをもとに、そのX線放射機構を検討した。一般的にいってFRI型のジェットではシンクロトロン放射、FRII型のジェットでは逆コンプトンで解釈するのが適切であるという暫定的結論を得た。さらにFRII型の場合、種光子としてはシンクロトロン光子よりも宇宙背景放射と考える方が適切である。この場合大スケールジェットも大きなローレンツ因子をもって強い相対論的ビーミング効果を示していることになる。また、磁場はかなり弱くなる。この結果の及ぼすさまざまな理論的意味について検討を開始している。関連する物理的過程として以下の研究を進めた。3.コンプトン散乱におけるクライン仁科効果が輻射強度の強い減少をもたらさない場合もあることを指摘した。4.電子陽電子対と陽子からなるプラズマのビーム不安定性について検討した。多くの大スケールジェットのX線放射機構は、FRI型のジェットではシンクロトロン放射、FRII型のジェットでは逆コンプトンで解釈される。さらにFRII型の場合、種光子としてはシンクロトロン光子よりも宇宙背景放射と考えられる。しかしながら、この結果は一層近似の枠内では定性的には正しいが、詳しく検討すると内部構造の影響が無視できないことがわかってきた。本年度はCen Aについて詳しい検討を行い、大スケールジェットではジェット表層部分と周囲との相互作用での粒子加速が大きな役割を果たすことを明らかにした。1.輻射スペクトルから得られる物理状態と内部衝撃波の力学構造とをあわせて考えることにより、ジェットには観測される相対論的電子の質量密度の千倍程度の質量密度の物質が存在していることを明らかにした。2.偏波観測やジェットの見かけの構造に対する相対論的ビーミング効果についてさらに検討を進めた。3.遠方のブレーザーからのTeVガンマ線の検出を使って宇宙赤外線背景放射強度に強い制限を与えた。
細胞内シグナル伝達からみたA型肝炎ウイルス非構造蛋白の機能的意義

A型肝炎ウイルス感染は未だに重要な社会問題である。このウイルス感染症は明らかなCytopathic Effectを示さず、現在までに宿主細胞内輸送系および合成系に影響を及ぼすとの報告はない。近年B型およびC型肝炎ウイルス感染症では、それぞれHBx蛋白、HCVコア蛋白により、宿主細胞内シグナル伝達系に重大な影響を及ぼすことが報告されている。そこで我々はA型肝炎ウイルス蛋白の宿主細胞内シグナル伝達系に対する影響を検討するため、9つのA型肝炎ウィルス蛋白を発現するプラスミド(FLAG-HAV VP2、VP3、VP1-2A、2B、2C、3A、3BC、3C、3D)を作成した。これらを用いて以下に記す5つの代表的な細胞内シグナル伝達系に対する影響を検討した。ルシフェラーゼアッセイは少なくとも3回行った。ウイルス蛋白がコントロールに比して2倍以上活性化した場合を有意と定義すると、HAV-VP3蛋白はSRE関連シグナル伝達経路を2.2±0.3倍活性化した。しかし、CRE-(1.1±0.1)、SRF-(1.6±0.2)、AP-1-(1.1±0.1)、およびNF-KB-(0.7±0.1)関連シグナル伝達経路には影響がみられなかった。その他の蛋白はCRE-、SRF-、AP-1-、NF-KB-、およびNF-KB-関連シグナル伝達経路に明らかな影響を与えなかった。この結果、HAV-VP3蛋白が細胞増殖分化に重要なSRE関連シグナル伝達経路を活性化している可能性が示唆された。A型肝炎ウイルス(HAV)は約7500塩基のRNAウイルスであり、5^ ́非翻訳領域、構造蛋白領域、非構造蛋白領域、3^ ́非翻訳領域より構成される。HAVの非構造蛋白の機能的意義については不明の点が多いが、弱毒化ウイルスでは非構造蛋白領域に特定の変異がみられ、ウイルス増殖機構の上で、またホスト細胞の生命維持に重要な影響を与えると考えられる。我々はまず劇症肝炎および急性肝炎由来のHAVの全塩基配列を決定し、その異同の有無について検討した。さらに急性肝炎由来のA型肝炎ウイルスのVP1-2A、VP2、VP3、2A、2BC、2C、3A、3B、3C、3D領域蛋白をflag抗原シグナルと共に発現するベクターを作製した。これらの発現ベクターを各種細胞に導入し、それぞれの蛋白発現がなされていることを抗flag抗体を用いWestern blot法にて確認した。またこれらの発現ベクターを細胞のアポトーシスや分化・増殖にかかわるNF-κB結合配列、Serum responsive element(SRE)結合配列、AP-1結合配列など各種結合配列の下流にルシフェラーゼをもつreporter plasmidとcotransfectionし、これらの各種ウイルス蛋白がアポトーシスや細胞の分化・増殖にかかわるシグナル伝達系にどのような影響を及ぼすかについて検討した。今後、各種変異を導入した蛋白発現ベクターを作製し、またこれら構造蛋白・非構造蛋白を組み合わせて細胞に導入することで、それぞれの蛋白の機能についてさらに解析する予定である。そこで我々はA型肝炎ウイルス蛋白の宿主細胞内シグナル伝達系に対する影響を検討するため、9つのA型肝炎ウイルス蛋白を発現するプラスミド(FLAG-HAV VP2、VP3、VP1-2A、2B、2C、3A、3BC、3C、3D)を作成した。

しかし、CRE-(1.1±0.1)、SRF-(1.6±0.2)、AP-1-(1.1±0.1)、およびNF-KB-(0.7±0.1)関連シグナル伝達経路には影響がみられなかった。その他の蛋白はCRE-、SRF-、AP-1-、NF-KB-、およびNF-KB-関連シグナル伝達経路に明らかな影響を与えなかった。この結果、HAV-VP3蛋白が細胞増殖分化に重要なSRE関連シグナル伝達経路を活性化している可能性が示唆された。
siRNAの機能制御によるコンディショナル RNAi

RNA interference (RNAi、RNA干渉)は、21-23塩基の短い2本鎖RNA、small interfering RNAs (siRNA)、を介して起こる、配列特異的遺伝子発現サイレンシングの強力な手法である。本研究では、ケージド化合物の化学とRNAiを組み合わせて、光照射によって標的遺伝子の発現をコンディショナルに抑制する手法の開発を目指した。RNAiを光制御する方法として、siRNAの1本鎖への解離を光制御することを考え、3種類の光解離性クロスリンカー(1-3)を合成した。合成した光解離性クロスリンカーと混合することでsiRNAがクロスリンクされ、一本鎖への解離が阻害されること、および光照射によって再び元のsiRNAが生成することを電気泳動等により確認した。続いて、HeLa細胞に一過的に発現したGFPの蛍光強度を指標にして、GFPを標的にしたsiRNAによるRNAiの効果を定量した。その結果、siRNA (GFP)を加えた細胞ではGFPの発現が約90%抑制されたのに対し、Cross-linker 3(3)と反応させたsiRNAを細胞に導入した場合はRNAi誘導能が20%程度に低下すること、また、導入後の細胞にUV光を照射することにより、GFPの発現を効果的に抑制することを確認した。さらに、内因性遺伝子であるLamin B1をターゲットとするsiRNAのクロスリンクにも成功し、合成したケージドsiRNA (lamin B1)を導入した細胞にUV光を照射することによりsiRNAがほぼ完全にもとの機能を取り戻し、細胞内のLamin B1の発現が完全に抑制されていることを、ウェスタンブロットにより確認した。