hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自律神経活動に着目したコンディショニングが筋損傷・筋痛に及ぼす影響

本年度の研究は、交代浴処置が運動後の筋損傷および筋痛に与える影響を自律神経活動および酸化ストレス応答の観点から明らかにして、コンディショニング方法の確立とその効果のメカニズムを明らかにすることを目的として行った。健康な一般成人男女10名が本研究に参加し、1処置なし条件または2交代浴条件(45°Cで4分+10°Cで1分を4セット)に分けられた。交代浴は、温浴4分(約44°C)×冷浴1分(約10°C)を4セット行った。全被験者は、筋損傷・筋痛を誘導するため、上腕屈筋群に対する最大伸張性運動を(角速度30deg/s、10回×3セット)を行った。被験者は、最大伸張性運動の前および直後、1、2、4日後に、自律神経活動、主観的筋痛の程度、上腕周径囲、肘関節可動域、最大等尺性筋力、血中のCK活性、酸化ストレスおよび抗酸化力の測定を受け、筋損傷・筋痛に対する処置の効果を観察した。その結果、自律神経活動において、トータルパワーは、前値と比較して両条件とも有意に低下して回復し、4日後で処置なし条件と比較して交代浴条件で高い傾向にあったが、交感神経および副交感神経活動に差は認められなかった。酸化ストレスには処置条件による差は認められなかったが、抗酸化力は交代浴条件で有意に高かった。上腕周径囲は交代浴条件で低値傾向にあったが、統計的な差は認められず、その他の筋痛、関節可動域、筋力および血中CK活性には、本研究で用いた処置の効果は認められなかった。本研究で用いた交代浴による処置は、自律神経活動を高め、抗酸化力が増加する可能性があり、抗酸化力の増加に伴い運動後に生じる筋損傷の回復は、程度はわずかであるが促進させる、または悪化を抑制させる可能性が示唆された。また女性被験者では性周期によって処置の効果が異なる可能性が推察された。本申請研究は、自律神経活動との関わりに着目して、冷却/温熱処置を用いたコンディショニング方法の確立とその効果のメカニズムを明らかにするという特色を持つ。本年度は、ホメオスタシスの維持に貢献している自律神経活動(交感神経・副交感神経活動)に影響を与えると考えられる温冷浴および交代浴刺激が、自律神経系に及ぼす影響を明らかにすることであった。一般成人男性の被験者7名が本研究に参加した。被験者は、非利き腕の上腕二頭筋筋腹までを20分間浴槽に浸水した。温冷浴の条件は、15/20/25/30/35/40/45°Cおよび交替浴(45°Cを4分および10°Cを1分を4セット)の8条件であった。処置の影響を観察するため、皮膚温、深部温、自律神経活動および酸化ストレスマーカーが処置の前後および処置後30分で測定された。その結果、表面温度および深部温度は、30°C以下の処置は、処置後30分まで低値を示し、40°C以上の処置では処置後30分まで上昇したままであった。35°Cおよび交代浴では、処置後30分で初期値に戻った。自律神経活動において、45°Cおよび交替浴後に交感神経および副交感神経活動は高値を示した。また、自律神経活動のトータルパワーにおいては交互作用が認められ、15°Cおよび交代浴の処置で有意に上昇した。酸化ストレス度および抗酸化力は、処置による変化が認められなかった。初期の皮膚温との温度差が大きい処置は、自律神経活動を高める可能性があり、特に15°Cおよび交代浴においては、自律神経活動のレベルを上昇させる可能性が示唆された。実験の設備や場所の選定および予備実験による方法論の確定まで時間がかかった。そのため実験Iの温冷浴を用いた自律神経活動に対するコンディショニングの研究において、数名の被験者の測定が一部残っている。しかしながら、5月中旬には終了する予定である。本年度における申請研究は、ホメオスタシスの維持に貢献している自律神経活動との関わりに着目して、冷却/温熱処置を用いた筋損傷・筋痛時の温冷浴および交代浴処置が、筋損傷および筋痛のマーカーに与える影響とともに、自律神経活動および酸化ストレス応答を明らかにすることで、コンディショニング方法の確立とその効果のメカニズムを明らかにするという特色を持つ。本年度は、前年度の研究に対して追加実験を行った。その結果、上肢への処置において、交代浴による処置は、皮膚温・深部温を維持するが、交感・副交感神経両方の活動が高まる可能性が示唆された。また、本年度は、予定している研究の予備実験として、1名に対してアームカールを用いて上腕二頭筋の伸張性収縮を行い、筋痛を誘発させた。その後にその後45度にて20分間の温浴処置を行った。その結果、酸化ストレスマーカーである大きな変化が認められていなかったが、抗酸化ストレスマーカーBAPの値が低値を示した。また、自律神経活動は、処置直後に交感神経活動が低下し、副交感神経活動は増加し、処置30分後では、処置前に戻る傾向にはあったが、処置直後と同じ傾向であった。本年度では他の条件を行っていないが、運動による筋損傷・筋痛にともない、酸化・抗酸化ストレスおよび自律神経活動が変化する可能性を確認することができた。最終年度では条件を変え、被験者数を増やし、効果的な処置を明らかにしていく予定である。

研究(ii)として、筋損傷・筋痛の自律神経活動を明らかにすることを目的として研究を進める予定であったが、予備研究のみに終わっているため。本年度の研究は、交代浴処置が運動後の筋損傷および筋痛に与える影響を自律神経活動および酸化ストレス応答の観点から明らかにして、コンディショニング方法の確立とその効果のメカニズムを明らかにすることを目的として行った。健康な一般成人男女10名が本研究に参加し、1処置なし条件または2交代浴条件(45°Cで4分+10°Cで1分を4セット)に分けられた。交代浴は、温浴4分(約44°C)×冷浴1分(約10°C)を4セット行った。全被験者は、筋損傷・筋痛を誘導するため、上腕屈筋群に対する最大伸張性運動を(角速度30deg/s、10回×3セット)を行った。被験者は、最大伸張性運動の前および直後、1、2、4日後に、自律神経活動、主観的筋痛の程度、上腕周径囲、肘関節可動域、最大等尺性筋力、血中のCK活性、酸化ストレスおよび抗酸化力の測定を受け、筋損傷・筋痛に対する処置の効果を観察した。その結果、自律神経活動において、トータルパワーは、前値と比較して両条件とも有意に低下して回復し、4日後で処置なし条件と比較して交代浴条件で高い傾向にあったが、交感神経および副交感神経活動に差は認められなかった。酸化ストレスには処置条件による差は認められなかったが、抗酸化力は交代浴条件で有意に高かった。上腕周径囲は交代浴条件で低値傾向にあったが、統計的な差は認められず、その他の筋痛、関節可動域、筋力および血中CK活性には、本研究で用いた処置の効果は認められなかった。本研究で用いた交代浴による処置は、自律神経活動を高め、抗酸化力が増加する可能性があり、抗酸化力の増加に伴い運動後に生じる筋損傷の回復は、程度はわずかであるが促進させる、または悪化を抑制させる可能性が示唆された。また女性被験者では性周期によって処置の効果が異なる可能性が推察された。研究(ii)として筋損傷・筋痛時の自律神経活動を明らかにすることを目的として研究を進める。健康な一般成人男性10名程度に対して、筋損傷・筋痛を誘導するため、上腕屈筋群に対する最大伸張性運動を行う。被験者は、最大伸張性運動の前および後1,3,7日後に、自律神経活動、主観的筋痛の程度、上腕周径囲、肘関節可動域、最大等尺性筋力および最大等速性筋力の測定を受ける。当初の計画では、次に自律神経活動と繰り返し効果との関係性を明らかにする予定であったが、計画を変更して、筋損傷・筋痛に対する温冷浴の処置およびその自律神経活動に与える影響を明らかにする。研究(ii)の運動による筋損傷・筋痛時の自律神経活動を考慮して、研究(i)にて明らかにした交感神経活動が変化した処置および副交感神経活動が変化した処置を基にして次の研究を行う。健康な一般成人男性20名程度に対して、筋損傷・筋痛を誘導するため、上腕屈筋群に対する最大伸張性運動をを行う。被験者は、研究(ii)と同様の測定項目および温/冷浴を1、3、5日目に行う予定である。最終年度では、研究(i)にて明らかにした交感神経活動が変化した処置および副交感神経活動が変化した処置を基にして次の研究を行う。研究(i)では、上肢への処置において、交代浴による処置は、皮膚温・深部温を維持するが、交感・副交感神経両方の活動が高まる可能性が示唆された。そこで、最終年度は、研究iiおよびiiiを同時に行い、筋損傷・筋痛の自律神経活動を明らかにするとともに、運動後の筋損傷・筋痛時に自律神経活動に影響を与えた交代浴の処置を行うことで、効果的なコンディショニング方法の効果とそのメカニズムを明らかにするために、以下の実験を行う。
がん微小環境を制御する低分子プローブの開発

平成23年度の解析からがん細胞と間質細胞との相互作用を制御すると予想される低分子化合物としてMEK inhibitor Iと我々が天然より見出したNBRI16716Aが候補となった。そこで、これら低分子化合物ががん微小環境を制御する低分子プローブとして有用であることを評価するために、それらの作用機構を解析した。平成23年度の解析からMEK inhihibitor Iは、胃がんと間質の相互作用を制御することが分かり、さらにその作用機構の解析から胃間質細胞がIL-6を分泌し胃癌細胞はこのIL-6を利用して、生存および増殖していることが明らかとなった。胃間質細胞は胃がん細胞の増殖を正にも負にも制御することが分かっているので、平成24年度では、胃間質細胞による胃がん細胞の増殖抑制のメカニズムに焦点をあてて検討した。その結果、MEK inhihibitor Iの作用機構の解析から胃間質細胞が胃がん細胞の増殖を抑制する因子を分泌することが明らかとなった(特許出願中)。この増殖抑制因子はMEK inhibitor Iで胃間質細胞を処理することによってその分泌が上昇することが分かった。一方、平成23年度の解析から、NBRI16716Aを処理した前立腺および肺の間質細胞の培養上清中に前立腺がんおよび肺がん細胞の増殖を抑制する活性を見出した。現在活性本体を精製し、同定を試みている。24年度が最終年度であるため、記入しない。ヒトがん細胞と繊維芽様の間質細胞の共培養実験系を用いて、がん細胞と間質細胞との相互作用を制御すると予想される低分子化合物を見出し、その作用機構の解析から相互作用の解明を目指し検討を行った。その結果、2つの低分子化合物ががん微小環境を制御する低分子プローブとして有用であることが示唆された。一つはMEK inhihibitor Iであり、胃がんと間質の相互作用の研究へと利用することができた。胃がん細胞の増殖が胃の間質細胞によって正にも負にも制御されることを我々は見出していたが、MEK inhibitor Iを用いた解析から、胃の間質細胞による正の制御、すなわち胃がん細胞の増殖促進作用には間質細胞が分泌するサイトカインIL-6が関与し、また胃がん細胞はPGE2やTNF-alphaを分泌することで間質細胞からのIL-6の分泌を促進することが分かった。もう一つの低分子プローブは我々がスクリーニングによってカビの培養液から発見した新規化合物NBRI16716Aである。肺がん、胃がん、大腸がん、膵がん、乳がん、前立腺がんと各臓器由来の間質細胞との共培養系を用いた解析から、NBRI16716Aは前立腺がんと肺がんのある細胞株の増殖をがん細胞のみの培養に比べて間質細胞と共培養した時の増殖を強く阻害することが分かった。この時、NBRI16716Aを処理した間質細胞の培養上清によってもNBRI16716Aのがん細胞増殖阻害活性が増強されることから、間質細胞からの液性因子が関与している可能性が示唆された。初年度の研究から少なくとも2つの低分子化合物ががん微小環境を制御する低分子プローブとして有用であることが示唆された。また、1つの低分子化合物を用いた解析から、胃がんと間質の相互作用の実態の解明へと繋がる知見が得られた点は極めて重要である。胃がんと間質の相互作用の解明については、間質細胞による胃がん細胞の負の制御、すなわち増殖抑制作用という大変興味深い現象の解明に向けて、引き続き低分子プローブを用いた解析を続ける。また、もう一つの低分子化合物についてはその作用機構の解析を進め、がん-間質相互作用の解明の一助とするとともに低分子プローブとしての有用性を見極める。一方で新たな低分子プローブの探索も続けて行く。
高齢者における客観的および主観的「孤立」の実態と健康面への影響に関する研究

本研究の目的は,「社会的孤立」を客観的な状態と主観的な感覚の2軸で捉え,社会的孤立の実態を明らかにすることであった。孤立状態は,同居者以外との接触頻度より測定し,対面的および非対面的接触の頻度を併せても週1回に満たない場合を「孤立」と定義した。孤立感は,孤立していると感じることがあるか尋ねた。結果,孤立と判断された約30%のうちの7割もが孤立感を抱いてないことが分かった。縦断的分析の結果からは,孤立感の有無にかかわらず客観的な孤立の有無が,4年後の生活能低下に影響を及ぼすこと,精神的健康面では,孤立していないにもかかわらず孤立感があることが,将来の精神的健康状態に影響を及ぼすことが示唆された。本研究の目的は,社会的孤立を客観的な「孤立状態」と主観的な「孤立感」の2側面から捉えた上で,社会的孤立の特徴と関連要因ならびに社会的孤立状態が高齢者の健康面に及ぼす影響を検討し,社会的孤立の実態を明らかにすることである。申請者らは,平成20年度に埼玉県和光市と協働し,65才以上の地域住民を対象に「シニア世代の安全・安心な暮らしに関する調査」(社会的孤立の実態把握を目的とした調査)を実施し,平成22年に追跡調査を実施した(第1回追跡調査: n=2275,有効票回収率78.3%)。本研究では,同じ2年間隔となる平成24年(本年度)に第2回追跡調査を実施する予定でこれまで同市と協議を重ねてきた。その結果,当初の予定は若干変更され,本年度は第2回追跡調査も兼ね,65歳以上の要介護4・5と施設入居者を除く全住民11,172名に対して,2012年10月11月に郵送式調査を実施することになった(他の研究補助金取得による調査規模拡大)。このように,追跡調査のみ実施する計画が,より大規模な調査へと発展した経緯はあるが,本研究目的である第2回追跡調査の実施概要については以下の通りであった。第2回目追跡調査では,第1回追跡調査の対象者のうち,平成24年度7月1日時点で死亡および転出,施設入所の状況が把握された者を除く2112人を追跡対象とした。結果,1806人(85.5%)より回答を得ることができた。本研究の目的は,社会的孤立を客観的な「孤立状態」と主観的な「孤立感」の2側面から捉えた上で,社会的孤立の特徴と関連要因ならびに社会的孤立状態が高齢者の健康面に及ぼす影響を検討し,社会的孤立の実態を明らかにすることであった。これまで申請者らの孤立研究班は,埼玉県W市と協働して65才以上の地域住民を対象にした調査を2回実施してきた。平成20年度にベースライン調査を,平成22年度に第1回追跡調査を実施した。本研究では,同じ2年間隔となる平成24年度に第2回追跡調査を実施し,既存データと併せて縦断的分析することとした。平成23年度は,次年度に実施する調査の質問項目検討することを目的とし,既存データの分析および2つの予備調査を実施した。平成24年度は,上記の既存データ分析と予備調査から示唆されたことを踏まえて第2回追跡調査を実施し,平成25年度は,縦断的分析を行うためのデータセットを作成した。また,平成24年度調査の一部をまとめた結果報告資料を作成し,住民へのフィードバック方法を同市役所職員と協議した。結果,市役所や同市の公共施設等の窓口に陳列することに決定し,より広範囲の住民に調査を実施したことおよびその結果を報告することができる形となった。本研究成果は現時点では,主に学会で発表している段階にある。平成24年度は,孤立および孤立感が高齢者の健康に及ぼす影響を検討し,日本公衆衛生学会にて発表した。縦断的分析の結果からは「孤立していない+孤立感なし」状態と比べた場合「孤立している+孤立感なし」状態は、4年後の高次生活機能の低下と関連する可能性が示された。精神的健康面では,客観的な孤立状態よりもむしろ「孤立感あり」状態が,4年後の抑うつ症状出現の予測因子となり得ることが示唆された。研究助成の期間終了後も本研究成果の論文化に向け,さらに詳細に分析を進めていく予定である。

申請者らは,平成20年度に埼玉県和光市と協働し65才以上の地域住民を対象とした質問紙調査を実施し,2年後に追跡調査を実施した。その2年後にあたる平成24年度に2回目の追跡調査を実施することを目指し,本年度は調査の実施可能性について同市と協議した。2回目追跡調査も同市と協同実施することが決定し,調査準備および体制を整えてきた。その他,本年度は既存データの分析と2つの予備調査を実施した。予備調査の目的は,来年度調査に向けた基礎資料(質問項目検討)を得ることであった。1つ目の予備調査では,孤立予防関連の取組みを実施担当している東京都某市の職員を対象にヒアリング調査を行った。結果,孤立しがちな者に共通する特徴が把握されたほか,人的な社会資源の豊富さが孤立状態の高低に関連することが示唆された。2つ目の予備調査では,東京都某区において実施した独居高齢者調査の未回答者のうち,85歳以上であった者(他にも基準設定)21名を対象に訪問調査を行った。訪問は,当該地域の地域包括支援センター職員に同行する形式で実施した。結果,実際には同居者がいるケースが多く,身体的理由により移動能力が制限されている者も数名しか確認されなかった。本調査においては「孤立死」リスクの高い者は把握されなかったが,日中独居や二世帯住宅といった生活環境の中に「孤立感リスク」が潜在する可能性もうかがえた。以上,社会的孤立の実態を把握していく上では,社会資源の測定方法を検討することや日中独居や二世帯住宅といった生活状況も考慮にいれる必要があることが示唆され,来年度はこれらの結果も踏まえて追跡調査を実施する。本研究の目的は,社会的孤立を客観的な「孤立状態」と,主観的な「孤立感」の2側面から捉えた上で,社会的孤立の特徴と関連要因の検討,ならびに社会的孤立が身体的,精神的,主観的健康度に及ぼす影響を検討し,社会的孤立の実態を明らかにすることである。本年度は追跡調査の実施を計画していた年であったため,本研究にとっての最重要年度であった。昨年度から和光市と協議を重ねてきたこともあり,(調査規模に若干の変更があったものの)2回目追跡調査は市と協同して問題なく実施・遂行することができた。上記の調査実施と並行し,本年度は平成20年度のベースライン調査以降から本調査実施までの期間の死亡者に関する死因情報を,厚生労働省に死亡統計の二次利用申請を提出し,許可を得ることで入手する予定であった。しかし,この点は進められなかったため,次年度に行なうこととした。死因情報の把握が予定通りに進まなかったとはいえ,本年度は調査を実施する計画が予定通りに進んだため,本研究の現在までの達成度はおおむね順調に進んでいるといえる。本研究目的達成に向けた本年度の主要な目標は,平成24度度に調査を実施出来るよう体制を整えて調査準備を進めることであった。この目標は達成され,これまでと同様に,市と協同して調査を実施することが決定した。現在,調査に向けた準備を進めており,本年度の主目標は達成されたといえる。また,来年度の調査に含める質問項目を検討するために予備調査を実施することも本年度の計画・目標として設定していた。本研究開始当初は,居場所づくり活動利用者や見守り活動利用者など,孤立予防関連の事業に参加する高齢者へのインタビュー調査を予定していた。当初予定していた対象ではなかったが,本年度は,2つ実施することができた。
環境にやさしい生分解性殺菌農薬α-ホモポリリジンの新規培養生産システムの構築

○研究目的非天然由来であるが生分解性のα-ホモポリL-リジン(αPLL)は30mer程度以上で殺菌能を有することが報告されており,組換え微生物を用いて大量生産が期待できる。本研究では,生分解性殺菌剤としてのαPLLの発現株の樹立とその生産を目的として,イオン交換樹脂を充填したバイオリアクターによるαPLLの分泌生産と分離を同時に行う新規生産システムの開発を行う。○研究方法リジンのコドンはAAAまたはAAGであるため,単純塩基配列となる長鎖αPLLのcDNAを人工合成することは難しい。そこで合成可能な短鎖cDNAを試験管内で連結する方法をデザインし,得られた連結体をベクターに挿入して微生物を形質転換することにより安定的なαPLL分泌生産株を得る。一方,陽イオン交換樹脂の流動層を有し,菌体外に分泌されたαPLLの吸着分離を可能にするエアリフト型バイオリアクターを作成すると共に,流動層形成に及ぼす操作条件を調べる。○研究成果長鎖αPLL生産後のキモトリプシン分解によって一度に大量の35mer αPLLを得ることを企図して, 35mer αPLL cDNAの繰り返し連結が可能で連結点にはフェニルアラニンのコドンが生じるようなDNAカセットをデザインして合成委託した。これを用いて実験を行い,計画どおりフェニルアラニンのコドンを介して35mer αPLLのcDNAを繰り返し伸長できることをDNAシーケシングにより確認した。また,大腸菌ならびにBrevibacillusを形質転換してαPLLの発現を調べたところ,発現量は低かった。これは,コドンAAAの割合が高いことが原因であり, AAGの割合を増やす必要があると考えられた。一方,陽イオン交換樹脂の流動層形成に及ぼすバイオリアクターの形状および通気速度の影響について検討した。その結果,イオン交換樹脂充填カラムを培養塔の外に設置した外部循環型のバイオリアクターがαPLLの分泌生産と分離を同時に行うのに適している事がわかった。
マウス生活史を通してのX染色体不活性化-再活性化サイクルの解明

哺乳類雌において、X染色体は不活性化・再活性化を繰り返すことが知られている。本研究ではXist RNAの発現/局在の変化やDNAメチル化パターンを解析することで、将来の胚本体となるエピブラストにおける"再"不活性化のタイミングを明らかにし、さらに始原生殖細胞における再活性化に伴う不活性X染色体連鎖遺伝子のプロモーター領域のDNAメチル化パターンの変化を解明した。X染色体不活性化は哺乳類におけるエピジェネティック制御の代表的な現象として知られており、細胞の分化/脱分化に連動して発生過程を通じて不活性化/再活性化サイクルを繰り返すことが分かってきた。本研究の目的は、不活性化/再活性化が起こるその瞬間をとらえ、その時に一体どのようなエピジェネティックな現象を伴い染色体レベルでの遺伝子発現制御がなされているのかを明らかにすることにある。卵割期にはすべての割球の父親由来X染色体が不活性化し、その後胚盤胞期の内部細胞塊において一旦再活性化することが知られているが、そのタイミングと生物学的現象との関連性は分かっていなかった。初期胚での解析を行ったところどうやら胚盤胞期胚がまさに着床するそのタイミングで再活性化が起こるらしいことが分かってきた。これは、「着床」という哺乳類を特徴付ける重要なイベントとX染色体の活性変化が極めて密接にリンクしている可能性を示唆する結果である。次のステップとして着床後のエピブラストにおける「再不活性化」のタイミングと初期発生における生物学的イベントとの関連性を明らかにする計画である。また、始原生殖細胞が出現するタイミングで不活性X染色体の再活性化が起こるが、bisulfite sequencingによるX連鎖遺伝子のDNAメチル化解析を行ったところ、「遺伝子発現レベルでの不活性X染色体の再活性化」と「X連鎖遺伝子のDNA脱メチル化」の間に密接な関連があることを示唆する結果が得られた。今のところ始原生殖細胞における再活性化がまさに起こる瞬間はまだ捉えられておらず、各種マーカーの発現を指標に再活性化の瞬間を突き止め、再活性化とDNA脱メチル化との関連性を明らかにする計画である。一方、体細胞核移植によるクローン動物作出効率の低さの原因が不活性化異常によるということが最近明らかにされつつある。効率の低さを克服するために行った不活性化制御遺伝子Xistの着床前期におけるノックダウン実験では期待通りクローン作出効率の劇的な改善がみられた。その際のXist RNAの発現状況を詳細に調べたところ、着床前期と着床後期におけるXist RNAの発現制御機構が異なることを示唆する結果が得られた。この結果は実用的なクローン動物作出法の開発に向けた基盤技術の創出というだけではなく、長年不明だった不活性化制御機購を解明するための新たな切り口での研究につながる重要な成果であると考えられる。
臨床応用に向けた3次元培養細胞移植による成長軟骨帯再生

長管骨の長軸方向への成長を司る成長軟骨帯は損傷すると、損傷部に骨性架橋が形成され変形や脚長差の原因となる。現在、変形予防のために骨性架橋を切除し自家脂肪組織やbone waxを移植する手術方法が一般的であるが、成長軟骨帯の再生は起こらず広範囲成長軟骨帯損傷例では変形が残存する。現在までに成長軟骨帯再生のためにウサギ成長軟骨帯損傷モデルを用いて滑膜由来間葉系幹細胞や自家軟骨細胞移植が行われており、一部で成長軟骨帯の再生を認めたと報告されているものの安定した成績とは言い難い。本研究ではウサギ滑膜由来間葉系幹細胞をハイドロゲル内で三次元培養後に軟骨分化誘導し、ウサギ成長軟骨帯損傷モデルの損傷部に移植することでこれまでより安定した成長軟骨帯再生を目指した研究を行う。また、動物由来成分を含まない培養液・軟骨分化培地を使用することで、小児における細胞移植の臨床応用への礎になると考えている。2018年においては、幼若ウサギの膝滑膜より間葉系幹細胞を採取しprimary cultureを行った。細胞の分離、培養については動物由来成分を含まない試薬、培地を用いた培養では細胞増殖に時間を要し、まずは従来の血清を使用した系での移植実験を行った。継代し増殖した細胞をハイドロゲルやArgimatrixを用いて3次元培養を行った。幼若ウサギに成長軟骨損傷モデルを作成し、3次元培養を行ったハイドロゲルやArgimatrixを移植し、損傷のみで移植を行わなかったもの(コントロール群と経過での内反変形の度合いや骨性架橋について比較観察を行った。コントロール群に対し、移植群においては損傷後経過での骨性架橋の内反変形においても改善傾向であったが経過での移植組織の吸収と一部の繊維性組織への置換を認めた。動物由来成分のない培地では培養細胞の増殖速度が通常の血清使用の培地に比べ遅く細胞採取から移植までの時間を要したため。使用する培養液をほかのものに変えて増殖速度の改善が得られるかを検討する。血清を使用した系にて3次元培養を行う上でハイドロゲルとAgrimatrixのどちらが移植後の骨性架橋の予防、成長軟骨帯の再生に有利かを検討動し、動物由来成分を含まない試薬・培地を用いた系のものと従来の血清を使用した系のものの比較を行う。採取した細胞を動物由来組織を含まない培地で培養したが増殖が遅く、移植手術の回数がすくなかったため。本年度も引き続き、細胞培養後移植実験を継続する予定である。
メラノーマ患者末梢血中の腫瘍循環細胞における遺伝子発現の解析

本研究では,メラノーマにおけるCTCが転移に関わっているかどうかを検証するために,患者血液からCTCを分離し,どのような分子を発現しているか調べた.その結果、HMW-MAA抗体とB7-H3抗体で標識することにより,セルソーターでCTCを単離する患者血液中に存在するCTCを単一細胞レベルで遺伝子解析することができた.本研究により,腫瘍循環細胞の単離と解析が,治療のモニタリングに役立つ可能性を示した.いっぽうRNA発現解析には,技術的な課題があることが分かった.その要因として,CTC単離からRNA抽出までの過程で,迅速性が必要であることが示唆された.【本年度の研究計画】メラノーマ患者の循環腫瘍細胞(以下,CTC)を分離するための条件を定める.【研究実施状況】1. CTC検出条件の設定:メラノーマの細胞表面に発現するタンパク質HMW-MAAとB7-H3に対するそれぞれの抗体をカクテルとし,蛍光標識した2次抗体をもちいて,培養メラノーマ細胞を染色したのち,細胞分析装置FACS Aria IIIにて細胞を分析,CTCと思われる集団を探索した.白血球細胞を鑑別するための標識として,白血球マーカーの抗体カクテルLineage 1をもちいた.これら2種類の蛍光で2次元展開により解析したところ,HMW-MAA,B7-H3強陽性で,CD45陰性の小さな細胞集団をCTCと想定し分取した.さらに,この分画をメラノサイトの分化マーカーであるgp100とMART1により染色を行った.2. CTCの分離とmRNA発現解析:メラノーマ患者からのCTC同定と分取:2名の患者および1名の健常人コントロールの末梢血から単核球分画を分離し,上記の染色ののち,設定した条件をもちいてFACS Aria IIIにより解析した.CTCと思われる集団を同定したのち,96穴の丸底プレートに細胞を1個ずつ,5個ずつ,20個,100個の単位で分取した.これらから,核酸抽出キットをもちいてDNAとRNAを抽出した.RNAからcDNAを合成し,gp100,TRP1,およびKU-MEL-1のquantitative PCRを行った.その結果,患者1のCTCのsingle cellにおいてKU-MEL-1の発現が確認された.患者2からは,いずれのマーカーも発現が認められなかった.2人の患者の白血球の分画から採取した細胞と健常人から採取した細胞には発現を認めなかった.Gp100とTRP1については特異的な発現を確認できなかった.おそらく発現量が少ないと考えられた.培養メラノーマ細胞と2名のメラノーマ患者,健常人からの末梢血単核球を用いて,CTCを同定する条件を設定し,CTCであることをある程度確認できた.これは、当初の計画どおりである。発現量が高いメラノーマのマーカーが必要と思われ,ひきつづき探索を行う.本研究では,メラノーマにおけるCTCが転移に関わっているかどうかを検証するために,患者血液からCTCを分離し,どのような分子を発現しているか調べた.その結果、HMW-MAA抗体とB7-H3抗体で標識することにより,セルソーターでCTCを単離する患者血液中に存在するCTCを単一細胞レベルで遺伝子解析することができた.本研究により,腫瘍循環細胞の単離と解析が,治療のモニタリングに役立つ可能性を示した.いっぽうRNA発現解析には,技術的な課題があることが分かった.その要因として,CTC単離からRNA抽出までの過程で,迅速性が必要であることが示唆された.【本年度の研究計画】メラノーマ患者の循環腫瘍細胞(以下,CTC)を分離し,メラノーマに多くみられるBRAF遺伝子変異を解析する.治療の前後での変化を調べる.【研究実施状況】1CTCの分離:間欠的露光部に発生した進行期メラノーマ患者1名から採取した血液をBDバキュテイナ採血管を用いて単核球を分離した.1回につき4mL,治療経過中の2回のタイムポイントについて解析した.メラノーマが発現するタンパク質に対する抗体で標識された細胞をCTCとして合計38個の細胞を単離した.2CTCの遺伝子解析:単離したCTCから個々にDNAを抽出した.DNAを用いて,BRAF V600領域を含むプライマーでサイクルシーケンスを施行した.38個中BRAFV600Kを2個検出した.内訳は,分子標的阻害薬治療前2個,治療後0個であった.3CTCのmRNA解析: 10個の細胞から抽出したRNAはRT反応によりcDNAを合成して,mRNA発現に用いた.Digital droplet PCR法(以下,ddPCR)を用いて,mRNAの発現を調べた.10個のCTCのtotal RNAからcDNAを合成し,GAPDHとtyrosinaseのddPCRを行った.GAPDHは10個中2個のみがシグナルが得られたが,他の8個は検出感度以下であった.RNAの質的な問題やcDNA合成過程の問題と考えられた.よって,mRNAについては評価不能であった.【達成できたことと今後の課題】患者血液中に存在するCTCを単一細胞レベルで遺伝子解析することができた.本研究により,腫瘍循環細胞の単離と解析が,治療のモニタリングに役立つ可能性を示した.いっぽうRNA発現解析には,技術的な課題があることが分かった.CTC単離からRNA抽出までの過程で,迅速性が必要であることが示唆された.

1さらに数名のメラノーマ患者の血液細胞を解析する予定である.分離したCTCがメラノーマ細胞であることの確認の精度を上げることが必要と思われ,そのために他のメラノーママーカーとRNA抽出キットを試す予定である.2次年度には,分取したCTCの核酸を用いてマイクロアレイ発現解析を行う予定である.PCRを確実に行うために,10個100個程度の細胞集団として取り扱うことも検討している.コントロールとして同一患者の白血球細胞を用いる予定である.CTCに特異的な分子については個別にRT-PCRを行って,詳細な解析を進める.メラノーマの増殖に重要なMAPK経路分子や,転移に関わる可能性のある上皮間葉転換の分子には特に注目して解析を行いたい.皮膚科本年度は核酸抽出数が予定より少なかったため,試薬の使用量が予定より少なかった.旅費の使用が予定よりも少なかった.次年度使用額は,H28年度請求額と合わせて,以下のとおり使用する.今年度に加えて更に数名のメラノーマの血液を取り扱う予定であり,今年度よりも多めに試薬および消耗品を購入する予定である.マイクロアレイも行う.研究発表や論文作成のためにも使用する予定である.
交流送配電線からの極低周波電磁界が誘起する人体モデル内部の誘導電流の定量化

水平・垂直の2次元磁界による楕円体状生体モデル内部誘導電流密度の計算結果から、(1)外部磁界成分間の位相差が0あるいは180°の場合には、各磁界成分による誘導電流成分間の打ち消しによって常に電流密度が0となる場所が現れる、(2)同じ平面内でも合成誘導電流密度分布は強度比と位相差の関係によって異なる、ことなどを示した。さらに、磁界の2成分と電界が同一方向の場合と直交している場合の合成誘導電流密度分布を計算した結果から、直交している電界と磁界は合成誘導電流密度に及ぼす影響が大きく、位相差によって合成誘導電流密度分布は大きく変化することがわかった。大地の影響を考慮し、電界および2次元磁界中に位置する回転楕円体状の生体モデル内部の合成誘導電流密度を解析した。非接地状態では、外部垂直磁界は外部電界に比較して、無視できる程度の電流しか誘導していないが、外部水平磁界による誘導電流の密度は、外部電界によるものと比較しうる程度の値となる場合があることがわかった。接地状態では、モデル下部において電界による誘導電流の密度は急激に増加するが、磁界による誘導電流密度は減少するため、低い位置ほど電界による成分が支配的となる。しかし、モデルが大地から徐々に離れて非接地状態に近づくにつれ、外部水平磁界が合成誘導電流密度に影響を及ぼす割合が増えることを確認した。さらに、実際の超高圧送電線下の地表面近傍で現れる磁界を外部磁界とし、回転楕円体モデル内に誘導される電流の密度分布を解析した。その結果から、超高圧送電線下の地表面近傍の磁界環境では、送電線下の位置(磁界の強度比と位相差の関係)よモデル内部の計算位置の関係が合成誘導電流密度に大きな影響を及ぼすことを示した。送配電線から発生する電界および磁界の強度・位相を考慮し、これらの電界・磁界が送配電線下周辺に位置する人体モデル(均一媒質)内部に誘導する電流の密度を解析するために、まず単位量の極低周波電界および磁界が楕円体状人体モデルに印加された場合のモデル内部の誘導電流密度を解析し、以下の成果を得た。1.送配電線を直線導体として模擬する場合、電線周辺の磁界環境は水平・垂直の2次元磁界と考えられる。そこで、2次元磁界による合成誘導電流密度に対して水平磁界および垂直磁界が及ぼす影響を解析し、以下の特性が得られた。(1)長軸1.7m、短軸0.25mの回転楕円体モデルにおいて、水平磁界が垂直磁界に対して最大値で約2倍の誘導電流密度を発生させ、合成誘導電流密度におよぼす影響が大きい。(2)楕円体状人体モデルの胴回りが等しいとして決定した回転楕円体と偏平楕円体モデルを比較したところモデル形状の違いによって、偏平楕円体モデル内部の方が大きな誘導電流密度を発生する。(3)モデル内部において水平・垂直磁界の位相差が合成誘導電流密度におよぼす影響は、それぞれの外部磁界による誘導電流密度の大きさの差が小さい場所ほど大きくなる。2.送電線下地表面近傍の広い範囲で存在する垂直電界(lkV/m)と2次元磁界(1μT)が人体モデルに同時に印加された場合、モデル内部の位置によって異なるが最大値に着目すると、電界による誘導電流密度が圧倒的に大きくなることがわかった。しかし、電界は遮へい等により低減されやすいため、容易に磁界による誘導電流密度と影響をおよぼし合うことが考えられる。また、垂直電界と水平磁界による誘導電流の合成には位相差が大きな影響をおよぼす場合があることもわかった。
大域的構造抽出と相互作用確率モデルによるタンパク質機能予測法

タンパク質の部分構造であるドメインに注目し一つの生物種におけるタンパク質全体についてドメイン構成の進化的側面から解析を行った.そのためにこれまで開発してきたドメイン集合の族に対する文法に基づく圧縮手法を修正し,ドメインのタンパク質内での順序の付いた列の集合に対する文法を新しく定義した.文法規則としては進化の過程における突然変異および遺伝子重複を仮定し,遺伝子が複製される際にはドメインが挿入または削除されるとした.ドメインの順序を考える上では,複製元のタンパク質のドメイン列から複製後のドメイン列への変換を考え,ドメインの挿入によるレーベンシュタイン距離に基づいたコストを定義した.一つの生物種に含まれるタンパク質全体を構成するすべての生成規則の中から最小コストの文法を見つける問題は最小全域木問題に帰着され大域最適解を多項式時間で見つけることができる.ヒトを含む7つの生物種にそれぞれ適用したところ,出芽酵母等においては圧縮率がドメインの順序の有無でほとんど違いが見られなかった一方,ヒト等では数%異なり,生物種を増やした追加実験が必要である.またタンパク質とRNAの相互作用におけるアミノ酸残基と塩基との間の相互作用の予測精度の改善に関して,多重配列アラインメントから得られる相互情報量等を入力とし正規化線形関数を活性化関数とした5層のニューラルネットワークを提案した.この他に遺伝子発現プロファイルとタンパク質相互作用ネットワークから畳み込みニューラルネットワークを利用して肺がんを予測する手法などを開発した.タンパク質相互作用の予測精度の改善が本研究課題の目的の一つであり,人工知能分野で利用されているニューラルネットワークを活用することで,タンパク質とRNAとの間の残基塩基相互作用を予測する手法の精度改善を達成した.またタンパク質のドメイン構成の進化解析についてはより多くの生物種に対して提案手法を適用し追加実験を行う必要がある.さらに閉路を含むグラフに対する圧縮手法の開発では実データへの適用による提案手法の有効性の検証が必要である.本研究課題において開発した技術の有効性の検証および追加実験を実施し学術誌論文としてまとめる.閉路を含むグラフに対する圧縮手法では理論的に導出した文法圧縮手法を実装し実データに適用する.またタンパク質のドメイン構成の進化解析については十分な数の生物種に対してドメインの配置を考慮した場合とそうでない場合に文法圧縮を適用しタンパク質のドメイン構成の獲得過程を比較解析する.本研究課題の主要な目的の一つであるタンパク質間の相互作用に対する予測手法の開発を,病原体のタンパク質と宿主のタンパク質との相互作用に限定して行った.病原体と宿主間において相互作用するタンパク質を同定することで,病原体感染のメカニズム解明および感染症の新たな治療法発見の手がかりとする.宿主内におけるタンパク質間相互作用ネットワークのあるノード周辺の局所的なグラフ構造に基づいた特徴量およびアミノ酸配列に基づいた特徴量から機械学習手法を適用した.分類器としてSGDおよびSCWを組み合わせた.4種の病原体,B. anthracis, F. tularensis, S. typhi, Y. pestisとヒトとの間のタンパク質の対に適用し10分割交差検証を行った結果,提案手法が既存手法に比べてF値が上回った.さらにネットワークの局所構造が予測の精度向上に寄与することを確認した.タンパク質アミノ酸残基とRNA塩基との間の相互作用予測についてこれまでに開発してきた相互情報量を入力とする条件付き確率場による予測手法の改良を検討した.SMM (Support Matrix Machine), OS-ELM等の機械学習手法を応用したが従来手法と同程度の予測精度となり有意な精度向上には至らなかった.今後の課題として入力となる特徴量の改良等を検討する.前年度に開発したレーベンシュタイン距離の下で中央文字列および中心文字列の厳密解を求める整数計画法の高速化を行った.レーベンシュタイン距離は三角不等式を満たすことが知られており,入力文字列と中央文字列あるいは中心文字列との間の三角不等式を制約条件として元の整数計画問題へ追加した.文字列の集合上のいくつかの確率分布に対する計算機実験の結果は計算時間が約10分の1となることを示した.この他にDicerのRNA切断部位予測手法の開発等を行った.タンパク質相互作用の予測精度を向上させることを本研究課題の目的の一つとしており,当該年度においては,宿主病原体における異なる生物種間でのタンパク質相互作用の精度向上を達成した.タンパク質アミノ酸残基とRNA塩基との間の相互作用予測については,既存の機械学習手法を適用しただけでは有意な精度向上に至らず,相互作用確率モデルおよび特徴量の検討が必要である.本研究課題の目的の一つであるタンパク質の機能予測手法の開発を促進させるために,タンパク質とRNAとの間の相互作用における条件付き確率場によるタンパク質残基とRNA塩基との間の相互作用確率モデルの改良を行った.アミノ酸残基と塩基との間の相互作用が,隣り合う残基と塩基の相互作用と依存関係があるモデルにおいて,先行研究ではそれぞれの相互作用の有無を特徴ベクトルとしていたところをイジングモデルに似たポテンシャル関数を導入した.先行研究と同じデータセットを用いた検証によって改良モデルは平均AUCを向上させることを確認した.また条件付き確率場の入力として,アミノ酸配列,塩基配列それぞれの多重配列アラインメントから計算した相互情報量を用いていたが,代わりにEkebergらが開発したplmDCAを用いることでさらに予測精度を向上させることを確認した.細胞内の生体分子間の相互作用ネットワークの構造やタンパク質立体構造を解析するための文法圧縮手法を提案した.これまでの研究では,木構造と見做せる糖鎖などの構造に対して文法圧縮を行うことで構造の解析を行ってきたが,遺伝子制御ネットワークなどの閉路をもったグラフには適用できなかった.一般化series-parallelグラフは木構造の他,外平面グラフ,series-

parallelグラフを含むグラフであり,このグラフに対する文法圧縮手法を開発することで,より複雑なネットワーク構造を解析できるようになる.当該年度においては整数線形計画問題への定式化の方策を提案した.この他にタンパク質二量体予測手法にペアワイズカーネルを組み合わせることによる予測手法の改良などを行った.タンパク質の機能予測が本研究課題の目的の一つであり,当該年度においてはそのためにタンパク質とRNAの間の相互作用モデルの改良を行い予測精度の向上を達成した.またタンパク質の立体構造をグラフで表現したときの構造を解析するために,一般化series-parallelグラフに対する分割型文法に基づく圧縮手法を整数線形計画問題に定式化することで提案した.タンパク質の部分構造であるドメインに注目し一つの生物種におけるタンパク質全体についてドメイン構成の進化的側面から解析を行った.そのためにこれまで開発してきたドメイン集合の族に対する文法に基づく圧縮手法を修正し,ドメインのタンパク質内での順序の付いた列の集合に対する文法を新しく定義した.文法規則としては進化の過程における突然変異および遺伝子重複を仮定し,遺伝子が複製される際にはドメインが挿入または削除されるとした.ドメインの順序を考える上では,複製元のタンパク質のドメイン列から複製後のドメイン列への変換を考え,ドメインの挿入によるレーベンシュタイン距離に基づいたコストを定義した.一つの生物種に含まれるタンパク質全体を構成するすべての生成規則の中から最小コストの文法を見つける問題は最小全域木問題に帰着され大域最適解を多項式時間で見つけることができる.ヒトを含む7つの生物種にそれぞれ適用したところ,出芽酵母等においては圧縮率がドメインの順序の有無でほとんど違いが見られなかった一方,ヒト等では数%異なり,生物種を増やした追加実験が必要である.またタンパク質とRNAの相互作用におけるアミノ酸残基と塩基との間の相互作用の予測精度の改善に関して,多重配列アラインメントから得られる相互情報量等を入力とし正規化線形関数を活性化関数とした5層のニューラルネットワークを提案した.この他に遺伝子発現プロファイルとタンパク質相互作用ネットワークから畳み込みニューラルネットワークを利用して肺がんを予測する手法などを開発した.タンパク質相互作用の予測精度の改善が本研究課題の目的の一つであり,人工知能分野で利用されているニューラルネットワークを活用することで,タンパク質とRNAとの間の残基塩基相互作用を予測する手法の精度改善を達成した.またタンパク質のドメイン構成の進化解析についてはより多くの生物種に対して提案手法を適用し追加実験を行う必要がある.さらに閉路を含むグラフに対する圧縮手法の開発では実データへの適用による提案手法の有効性の検証が必要である.
弾性波による岩盤内亀裂の高精度イメージング法の開発

本年度の研究実績の概要は以下の通りである.・Staggered gridを用いた弾性波動方程式の有限差分法(FDM)のプログラムに、新たに「変位不連続境界条件」を導入し、亀裂を含む岩盤内の弾性波伝播をシミュレーションするプログラムを作成した。・フルウェーブ・インバージョンのプログラムに震源波形のインバージョン解析を行うプログラムを新たに追加した。さらに、実際のクロスホールデータに対してフルウェーブ・インバージョン解析を適用した。データ前処理の手法を確立し、速度構造および震源波形の逐次インバージョンにより詳細な速度構造分布を求めた。・弾性波動方程式に基づくフルウェーブ・インバージョンのプログラムを実用化し、新たにP波およびS波の挙動を解析に用いることができるようにした。・弾性波伝播時間分布から地質構造をイメージングする弾性波トモグラフィ解析において、Fresnel体積の概念を用いた新たな解析方法を開発した。波動の周波数を物理的に考慮した解析が可能になるとともに、従来計算機の制約のため実現が困難であった3次元解析が可能になった。本年度の研究実績の概要は以下の通りである.●新規設備として導入したDATデータレコーダの性能測定および校正を行い、当初予定したモデル実験のみならず、現場実験においても高周波数の波動を観測しうることを確認した。●Stagged gridを用いた弾性波動方程式の有限差分法(FDM)のプログラムに、新たに「変泣不連続境界条件」を導入し、亀裂を含む岩盤内の弾性波伝播をシミュレーションするプログラムを作成した。プログラムの検証および計算精度の検討を引続き行っている。●フルウェーブ・インバージョンのプログラムに震源波形のインバージョン解析を行うプログラムを新たに追加したことによって、解析精度の向上を可能にした。●弾性波動方程式に基づくフルウェーブ・インバージョンのプログラムを実用化し、新たにP波およびS波の挙動を解析に用いることができるようにした。●弾性波伝播時間分布から地質構造をイメージングする弾性波トモグラフィ解析において、Fresnel体積の概念を用いた新たな解析方法を開発し、従来計算機の制約のため実現が困難であった3次元解析が可能になった。
内膜輸送系を介したγセクレターゼ基質特異的制御機構の解析

アルツハイマー病(AD)患者脳に蓄積するアミロイドβ(Aβ)蛋白質を産生する責任酵素であるγセクレターゼは、ADの根本的治療法のターゲットとして注目されている。しかしその単純な阻害はNotchなどのシグナルの阻害による副作用を誘発する。我々はショウジョウバエ細胞を用い、Notch、Aβ産生を特異的に制御する遺伝子をRNAi法によるスクリーニングをおこない、候補遺伝子について個々に解析を進めた。本研究成果は副作用のないAD治療薬の開発・および生体内シグナルの重要な因子であるNotchの制御機構の解析に道筋をつける研究であると考えている。アミロイドβ蛋白(Aβ)はアルツハイマー病(AD)患者脳内に蓄積する老人斑の主要構成成分であり、Aβの産生を担う酵素γセクレターゼは、AD予防・治療薬の開発において、重要な創薬ターゲットとなると考えられる。しかしγセクレターゼはAβ前駆体タンパク質(APP)を切断するとともに、Notchタンパク質も切断する。Notchの切断は多様な組織の分化・生存を制御することが報告されており、単純なγセクレターゼの阻害は重篤な副作用を誘発する。そのためγセクレターゼをターゲットとしたAD創薬には、APPとNotchの切断活性の分子機構を解明が重要である。これまでに我々はショウジョウバエ培養細胞を使ったRNAiによる遺伝子ノックダウンにより、ゲノムワイドなスクリーニングを行い、γセクレターゼの活性を制御する18個の遺伝子候補(gamma secretase modulator: GAMMO)を同定していた。本年度は特にNotchの切断を特異的に制御し、種間で保存性の高いGAMMO3に注目して詳細に検討した。GAMMO3は4回膜貫通タンパク質であり、その酵母ホモログはER-Golgi間輸送において可溶性タンパク質の選別輸送に関与していることが報告されている。我々はショウジョウバエGAMMO3のRNAiにより、Notchタンパク質の形質膜への輸送が不全になるなど、GAMMO3がNotchの選別輸送に関与していることを明らかにした。現在GAMMO3が実際にin vivoでのNotch切断を制御しているか、GAMMO3ノックアウトショウジョウバエ・線虫を作成して解析を行っている。またAD創薬ターゲットの同定を目指して、APPやγセクレターゼの細胞内輸送を制御する因子の探索も同時に行っており、GAMMO3関連因子や他の候補因子について解析を行っている。これまでに我々はショウジョウバエ培養細胞を使ったRNAiによる遺伝子ノックダウンにより、ゲノムワイドなスクリーニングを行い、γセクレターゼの活性を制御する18個の遺伝子(GAMma-secretase MOdubtor : GAMMO)を同定していた。本年度は特に種間で保存性の高いGAMMO3(Surf4)およびGAMMO5(TMEM202)に注目して詳細に検討した。我々はショウジョウバエGAMMO3のRNAiLにより、Notchタンパク質の形質膜への輸送が不全になるなど、GAMMO3がNotchの選別輸送に関与していることを明らかにした。一方GAMMO5は膜タンパク質であること以外の性質は不明であったが、我々の研究から、そのノックダウンにより小胞体(ER)の形態が大きく変化することが示され、ERの形態維持に寄与していることが明らかになった。以上より、ERからGolgiへの輸送によってγセクレターゼの基質特異性が決定している可能性が示唆された。
Glyoxalase1遺伝子多型に基づく統合失調症の病態解明と新規治療薬の創出

近年、毒性の強いメチルグリオキサールの解毒酵素であるGlyoxalase1と統合失調症の関連が報告された。研究代表者らのこれまでの検討でGlyoxalase1のプロモーター領域内のホモポリマー配列に少なくとも8種類の新規遺伝子多型を見出した。ホモポリマー遺伝子多型による転写調節の違いを解析した結果、他のホモポリマー遺伝子多型に比べて著しく高い転写活性を持つホモポリマー遺伝子多型を見出した。そこで研究代表者らは、このGlyoxalase1ホモポリマー当該遺伝子多型と統合失調症の発症・進展の関連について検討を行った。統合失調症患者80検体、健常者50検体を用いてホモポリマー当該遺伝子多型解析を行った結果、統合失調症患者の検体から遺伝子変異を見出した。これまで研究代表者らは、1型糖尿病患者(75症例)の検体を用いたホモポリマー当該遺伝子多型の解析を行ってきたが、このような遺伝子変異は見出していない。さらに、この遺伝子変異はGlyoxalase1の転写活性に影響を及ぼすこともこれまでの解析より明らかである。この遺伝子変異は統合失調症特異的なものと考えられ、この遺伝子変異に着目し解析を行うことで、これまでにない新たな視点から統合失調症の病態形成メカニズムを明らかにできると考える。今後は、このホモポリマー当該遺伝子多型の遺伝子変異と統合失調症の進展・重症度についての検討を行う予定である。また、原子間力顕微鏡(AFM)を用いてクロマチン構造変換とGlyoxalase1転写発現調節機構の可視化についての検討を行う予定である。統合失調症患者検体を用いてホモポリマー当該遺伝子多型解析を行った結果、ホモポリマー配列に新たな遺伝子変異を見出した。さらに、この遺伝子変異は、研究代表者らが注目しているホモポリマー遺伝子多型の転写活性に影響を与えることも発見した。以上より、研究の進歩状況はおおむね順調と判断した。今後も計画通りに研究を進め統合失調症の病態形成メカニズムの解明と新たな治療薬の開発を目指したい。今後は、統合失調症特異的であるホモポリマー当該遺伝子多型の遺伝子変異に注目し、統合失調症の進展・重症度との関連についての検討を行う予定である。さらに、新たに見出された遺伝子変異がホモポリマー遺伝子多型の転写活性にどのような影響を及ぼすのかをAFMを用いて明らかにすることも目指す。統合失調症のこれまで不明であった病態形成の分子メカニズムをGlyoxalase1遺伝子多型に着目した新たな視点から解明できると考えられる。また、本研究ではホモポリマー遺伝子多型による転写発現調節という新しい分子基盤に基づいた精神疾患治療薬の開発を目指す。