hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞膜足場形成の多次元複合体の構造生物学

本年度は,Tiam1/STEFとCD44, PAR3, JIP2との複合体の調製と基礎実験わ重点的に推進した.CD44の細胞質ドメインとPAR3の結合領域は、大腸菌でGST-融合タンパク質として調製して,プルダウンアッセイやBIAcoreを用いた結合実験により結合に必要な最小領域を決定した.その結果,酸性残基に富む領域が結合部位と判明した.アミノ酸配列の特徴から,CD44やephrin B1,1,3あるいはNMDA受容体等のmotif-I, PAR3やJIP2等のmotif-IIとの分類した.前年度に構造決定したTiam1/STEFのPHCCExドメインには塩基性残基が密集した溝がある.これらを含んだ保存された塩基性残基(ArgとLys)にAla変異を導入して,CD44, PAR3, JIP2との結合への影響を調べた.その結果,結合部位をCCサブドメインとExサブドメインからなる塩基性の溝と同定した.motif-Iとmotif-IIの両者ともこの溝に結合することもわかった.更に,上記の相互作用が細胞レベルでも重要であるかどうかを,変異Tiam1を用いて解析した.その結果,結合部位での変異が細胞膜の葉状仮足の誘導へ大きく影響することがわかり,細胞レベルでも上記の相互作用が重要であることが証明できた.以上のデータをまとめて,EMBO Journalに論文発表した.また,これと平行して,植物ホルモン受容体の構造研究を推進して,ジベレリン受容体によるジベレリン認識と標的タンパク質認識に関しての構造的知見を更に深めるために,合成アゴニストとの相互作用の解析を行った.ERMタンパク質によるCD43やCD44の認識については、N-末端のFERMドメインとの複合体結晶の構造解析に成功して,変異実験などの機能解析データや超遠心解析などの物性データとともに,それぞれ論文発表した.また,Racに特異的GEFであり,癌細胞の浸潤・転移にかかわる医学的に重要なTiamlとSTEFについては,結晶構造の決定に成功した.これで,in vitroならびだin vivo機能解析が三次元構造に基づいてできるようになった.今後,変異実験などの解析データを集積して,論文としてまとめる目処が立った.一方,植物シグナル伝達の研究では,成長等を制御する重要な植物ホルモンであるジベレリンの受容体GID1と生物活性のあるジベレリンGA3やGA4,ならびにGID1の標的タンパク質であるDELLAタンパク質の一つ,GAIとの三者複合体の結晶化に成功して,その三次元構造をX線結晶解析法で決定した.この解析により,受容体GID1がジベレリン分子を深い結合ポケットに取り込んで,ファンデルワールス相互作用・水素結合・塩橋を通して認識する詳細を解明した.また,ジベレリンの結合によって誘起された結合ポケットの蓋にあたるα-らせんの束が,標的タンパク質GAIのDELLAドメインを特異的に認識することを明らかにした.これらの発見は,英国科学雑誌Natureに発表したが,化学生物学の国際科学雑誌Nature Chemical Biologyや,米国化学会の機関誌Chemical and Engineering News (C&EN)で記事として取り上げられるとともに,C&ENの2008年度の化学領域における10大ニュースの一つに選ばれるなど,国際的に大きな反響と高い評価が与えられた.本年度は,Tiam1/STEFとCD44, PAR3, JIP2との複合体の調製と基礎実験わ重点的に推進した.CD44の細胞質ドメインとPAR3の結合領域は、大腸菌でGST-融合タンパク質として調製して,プルダウンアッセイやBIAcoreを用いた結合実験により結合に必要な最小領域を決定した.その結果,酸性残基に富む領域が結合部位と判明した.アミノ酸配列の特徴から,CD44やephrin B1,1,3あるいはNMDA受容体等のmotif-I, PAR3やJIP2等のmotif-IIとの分類した.前年度に構造決定したTiam1/STEFのPHCCExドメインには塩基性残基が密集した溝がある.これらを含んだ保存された塩基性残基(ArgとLys)にAla変異を導入して,CD44, PAR3, JIP2との結合への影響を調べた.その結果,結合部位をCCサブドメインとExサブドメインからなる塩基性の溝と同定した.motif-Iとmotif-IIの両者ともこの溝に結合することもわかった.更に,上記の相互作用が細胞レベルでも重要であるかどうかを,変異Tiam1を用いて解析した.その結果,結合部位での変異が細胞膜の葉状仮足の誘導へ大きく影響することがわかり,細胞レベルでも上記の相互作用が重要であることが証明できた.以上のデータをまとめて,EMBO Journalに論文発表した.また,これと平行して,植物ホルモン受容体の構造研究を推進して,ジベレリン受容体によるジベレリン認識と標的タンパク質認識に関しての構造的知見を更に深めるために,合成アゴニストとの相互作用の解析を行った.
糖質コルチコイドによる視床下部室傍核のCR下遺伝子発現抑制の作用機序の解明

急性拘束ストレス後の室傍核のCR下遺伝子発現に対する糖質コルチコイドの作用について.原癌遺伝子のc-fosの発現を神経細胞の活動性の指標として、CRFヘラロ核RNAの発現をCRF遺伝子の指標として、in sith hybidization法を用いて解析した。急性拘束ストレス開始後30分で室傍核のc-fos mRNA,CRFhnRNAは著名に増加したが、この増加はデキサンサゾン2mg/kgの前投与で有意に抑制され.副腎摘除により増強された。一方CRAmRNAレベルも同様にデキサンサゾンの前投与で抑制され.副腎摘除で増加した。従ってグルココルチコイドは室傍核の神経活動およびCRF遺伝子転写活性いずれも抑制することが明らかとなった。又.拘束ストレス後c-fosmRNAは室傍核以外にも海馬のCA1-3ニューロンで発現が認められたがこの発現量はデキサンサゾンの前投与により室傍核とは逆に増加した。海馬のc-fos発現が強い程、室傍核のc-fosの発現は抑制されており、室傍核と海馬のc-fosmRNAのレベルは有意な負の相関がみられた。従って海馬は特にストレス後のグリココルチコイドの負のフィードバックに関与し.室傍核ハ抑制的に作用していることが示唆された。
プログラム可能な自己組織化成長プロセスを用いた革新的機能を有する集積体の創製

核酸高分子による自己組織化原理に従って構造間結合のオン・オフをあらかじめプログラム可能なDNAプログラミングの手法とコロイド結晶成長理論に基づいて、革新的機能を有する新機能性薄膜を大面積、無欠陥に形成するプロセスを構築した。具体的には、電荷を有する基板上において荷電粒子(コロイド粒子、DNA集積体など)が対イオンを介して相互作用することによって、大面積かつ無欠陥の集積構造を発現することをはじめて明らかにした。さらにこの集積原理は、DNA構造体を用いたフォトニック結晶およびメタマテリアルとして知られる新奇な物性を発現する回路素子の成膜技術に応用できることを示した。「結晶成長論に基づく集積体の欠陥率の低減及び大面積化」に関しては、結晶成長論的アプローチにより、DNA格子の自己組織化の最適条件をわりだし、格子の完全性及び欠陥の発生メカニズムを明らかにした。その結果、一般の結晶成長と同様に、DNA格子の形成においても、過冷却度に起因するカイネティクス効果が重要であることが分かった。この知見は、従来、DNAプログラミングにおいては、経験的に知られてはいたが、定量的なデータをもとに、格子不完全性があらわれるメカニズムを解明したのは、今回が初めてであり、本申請提案におけるDNAコンピュータと結晶成長という異分野を結び付けるという構想が正しいことを裏付ける強い知見となった。「フォトニック結晶のためのコロイド結晶構造の制御」に関しては、コロイド粒子の重力沈降過程において、これまで見出されたことのない気相、液相、結晶相が同時に共存する新奇な粒子の集積(相分離)現象が見出された。この集積は、従来の集積条件と比べて少ない粒子密度、濃い塩濃度のもとでも発現した。このような現象はこれまで報告がなく、新たなフォトニック結晶の製膜プロセスとして極めて有望である。また、コロイド粒子の基板固定化に向けて、2次元テンプレートの作製を行った。今後、粒子の基板固定化技術の確立に向けて取り組む予定である。「メタマテリアルのための金属リング構造の作製」に関しては、従来のDNAタイルと比べて構造が単純であり、低コストが実現できるDNAモチーフ(特許出願中)を用いて、これを基板上にて高い歩留りで、高品質に自己組織化する製膜プロセスを見出した。本モチーフは、これまで溶液中で得られた集積体は、完全性に乏しく、また格子形成の歩留りが低かったが、本研究により、その完全性を各段に向上することが可能となった。これら異分野の研究活動を効率的に運営することを目的として、ナノデバイス研究会を開催(年度内3回)し、研究者間のシナジー効果がえられるよう工夫した。「結晶成長論に基づく集積体の欠陥率の低減及び大面積化」に関しては、DNAナノ構造の墓板上成長について、一価および二価の溶液イオン濃度および基板材質を変化させて表面電荷密度を測定し、DNAナノ構造の成長状態と比較した結果,弱い表面電荷密度帯で成長が起こることを明らかにした。引き続き、基板との相互作用力を制御し、成長体の欠陥を抑制するための知見として、共存イオンの効果のモデル化を検討する。「フォトニック結晶のためのコロイド結晶構造の制御」に関しては、本研究において、昨年度新たに見出した、これまで知られていないコロイド粒子による気相、液相、結晶相への相分離現象についてさらに詳細な実験を進め、粒子密度および塩濃度をそれぞれ横軸および縦軸とする相図を作成した。この結果、コロイド相分離には、臨界点と三重点が存在することが初めて明らかとなった。また、結晶相が安定に存在する領域が確定したことによって、結晶性制御の条件を明らかにできたことから、フォトニック結晶、メタマテリアルの製膜プロセスとして極めて有望であることが分かった。また、コロイド粒子の基板固定化する方法として、2次元テンプレートを用いることによって、粒子を基板に安定に固定化することが可能となった。「メタマテリアルのための金属リング構造の作製」に関しては、DNA格子を金属化する方法として、金属粒子固定用アンカーを有する三点分岐型DNAモチーフの設計と作製を行った。モチーフへのアンカー導入は、正常なモチーフの形成を阻害する効果が強いことが分かったため、さらに阻害効果を抑制するモチーフ設計を進める。これら異分野の研究活動を効率的に運営することを目的として、ナノデバイス研究会を開催(年度内4回)し、研究者間のシナジー効果がえられるよう工夫した。「結晶成長論に基づく集積体の欠陥率の低減及び大面積化」に関しては、「基板上成長法」と呼ばれる構造形成法を提案し,これを利用した完全性の高い二次元DNAパターンを実現した。基板上成長法とは,DNAナノ構造を基板に弱く吸着させた状態で構造形成を行う手法であり、基板との間にマグネシウムイオンなどの多価イオンを介してDNAを吸着させる方法である。具体的には、T-motifと呼ぶ成長単位をマイカ基板上にて自己集積させ、実験したすべての集積パターンにおいて、それぞれ溶液中より大面積で高い完成率の構造を得た。

「フォトニック結晶のためのコロイド結晶構造の制御」に関しては、本研究において新たに見出したコロイド粒子による気相、液相、結晶相への相分離現象について相図を作成することに成功した。これによって、結晶相が安定に存在する条件が明らかとなり、結晶性制御に向けた機構の解明および重力場あるいは電場の外場制御による結晶構造制御技術の確立に向けた端緒が開かれた。「メタマテリアルのための金属リング構造の作製」に関しては、固定用DNAアンカーを有するDNA格子(昨年度実施)に、高密度に金属粒子を配置するためのDNA被覆粒子の開発を行った。従来の方法では金属粒子を密に配置することが困難であったが、金属粒子のサイズに対してDNA被覆密度を適切に制御することによって、理論上全ての近接する格子点に粒子を配置できることが分かった。今後は、本研究によって開発したアンカー付DNA格子に相補的DNAを被覆した金属粒子を高密度に配置して金属リング構造の作製を行う予定である。
運動疲労の脳磁図研究

本研究の目的は、運動疲労の神経基盤を統合的に解明することである。動的で相互依存的な側面を持つ運動疲労の中枢神経系制御機構に対して、脳磁図装置を用いて詳細に検討することで、運動疲労の神経機構を統合的に解明した。健常者を対象として各種評価を実施し、運動疲労時における抑制・促進システムの相互作用について検討し、その神経学的基盤を明らかにした。また、健常者および慢性疲労者を対象として各種評価を実施し、慢性疲労の、運動疲労に対する影響を検討し、その神経学的基盤を明らかにした。これらの成果は、疲労の神経機構を統合的に解明する上で、非常に意義深いものであると考えられる。平成2325年度基盤研究(B)「運動疲労時における中枢制御機構の統合的解明」において、抑制システム、促進システム、疲労感などの運動疲労関連因子の神経基盤を個々に明らかにした。本研究ではさらに進めて、動的で相互依存的な側面を持つ運動疲労の中枢神経系制御機構に対して、脳磁図装置(160チャンネルを有する横河電機製MEG vision)を用いて詳細に検討することで、運動疲労の神経機構を統合的に解明する。本年度は、健常者を対象として、運動疲労時における抑制・促進システムの相互作用について検討し、その神経学的基盤を明らかにした。本研究では、健常被験者に対して、運動による疲労困憊状態を想起させた上で、抑制システムを賦活させるセッション、促進システムを賦活させるセッション、コントロールセッションを3試験区クロスオーバーデザインで実施した。なお、研究の遂行に当たっては、被験者のプライバシーに十分配慮し、大阪市立大学倫理委員会の承認の後、被験者の同意を得たうえで実施した。周波数解析を用いて、抑制システムの脳活動を評価したところ、右前頭前野において、α周波数帯域(8-13 Hz)事象関連同期が認められた。一方では、促進システムの脳活動を評価したところ、右前頭前野において、α周波数帯域事象関連脱同期が認められた。これらの結果は、右前頭前野の活動を抑制することで抑制システムが活性化され、一方では、右前頭前野の活動を亢進することで促進システムが活性化することを示唆している。本研究により、これまで別々に同定されていた抑制システムと促進システムの神経基盤を、動的・相互依存的に解明された。これらの成果は、運動疲労の神経機構を統合的に解明する上で、非常に意義深いものであると考えられる。本研究ではさらに進めて、動的で相互依存的な側面を持つ運動疲労の中枢神経系制御機構に対して、脳磁図装置を用いて詳細に検討することで、運動疲労の神経機構を統合的に解明する。本年度は、健常者を対象として、精神的疲労を想起した状態での運動疲労の抑制・促進システムの相互作用について検討し、その神経学的基盤を明らかにした。健常被験者に対して、精神的疲労負荷による疲労困憊状態を想起させた上で、抑制システムを賦活させるセッション、促進システムを賦活させるセッション、およびコントロールセッションを3試験区クロスオーバーデザインで実施した。周波数解析を用いて、抑制システムおよび促進システムの脳活動を評価したところ、運動疲労を想起した状態では前頭前野においてα周波数帯域事象関連同期および脱同期を、それぞれ認めたが、精神的疲労を想起した状態でも同様に、α周波数帯域事象関連同期・脱同期が認められた。本研究により、これまで別々に同定されていた抑制システムと促進システムの神経基盤、さらには、運動疲労と精神的疲労の神経基盤を、動的・相互依存的に解明された。これらの成果は、運動疲労のみならず、精神的疲労の神経機構を統合的に解明する上で、非常に意義深いものであると考えられる。本研究では、健常被験者に対して、精神的疲労負荷による疲労困憊状態を想起させた上で、抑制システムを賦活させるセッション、促進システムを賦活させるセッション、およびコントロールセッションを3試験区クロスオーバーデザインで実施した。本研究によって、これまで別々に同定されていた抑制システムと促進システムの神経基盤、さらには、運動疲労と精神的疲労の神経基盤を、動的・相互依存的に解明され、当初の計画どおりに順調に研究が進捗していると考えられる。我々のこれまでの脳磁図を用いた疲労研究より、慢性疲労の神経機構を明らかにしてきた。しかしながら慢性疲労の運動疲労に対する影響の解明までには至っていない。本年度研究では、慢性疲労者および健常被験者を対象として、運動による疲労困憊状態を想起させる実験を行い、慢性疲労の、運動疲労に対する影響を検討し、その神経学的基盤を明らかにした。運動疲労課題である、PC画面上に出現する「運動による疲労困憊状態の画像」の凝視→

「最大の力でのハンドグリップ」の想起を150回程度、参加者に実施させる。運動負荷課題前後で、脳磁図検査を実施し、慢性疲労の運動疲労に対する影響について検討したところ、ブロードマン18野において、θ周波数帯域(4-8 Hz)象関連同期減少が認められた。本研究により、これまで急性疲労のみの明らかにされていた神経基盤を、慢性疲労においても動的・相互依存的にその神経基盤が解明された。これらの成果は、疲労の神経機構を統合的に解明する上で、非常に意義深いものであると考えられる。本研究の目的は、運動疲労の神経基盤を統合的に解明することである。動的で相互依存的な側面を持つ運動疲労の中枢神経系制御機構に対して、脳磁図装置を用いて詳細に検討することで、運動疲労の神経機構を統合的に解明した。健常者を対象として各種評価を実施し、運動疲労時における抑制・促進システムの相互作用について検討し、その神経学的基盤を明らかにした。また、健常者および慢性疲労者を対象として各種評価を実施し、慢性疲労の、運動疲労に対する影響を検討し、その神経学的基盤を明らかにした。本研究では、健常被験者に対して、運動による疲労困憊状態を想起させた上で、抑制システムを賦活させるセッション、促進システムを賦活させるセッション、コントロールセッションを3試験区クロスオーバーデザインで実施した。本研究により、これまで別々に同定されていた抑制システムと促進システムの神経基盤を、動的・相互依存的に解明することに成功し、当初の計画どうりに進展していると考えられる。我々のこれまでの脳磁図を用いた疲労研究より、慢性疲労の神経機構を明らかにしてきた。しかしながら慢性疲労の運動疲労に対する影響の解明までには至っていない。本研究では、慢性疲労者および健常被験者を対象として、運動による疲労困憊状態を想起させる実験を行い、慢性疲労の、運動疲労に対する影響を検討し、その神経学的基盤を明らかにする。健常者および慢性疲労者を対象としたデザインで試験を実施する。運動疲労課題である、PC画面上に出現する「運動による疲労困憊状態の画像」の凝視→「最大の力でのハンドグリップ」の想起を150回程度、参加者に実施させる。運動負荷課題前後で、脳磁図検査を実施し、慢性疲労の運動疲労に対する影響について検討する。平成26年度および27年度と同様、本研究実施体制の構築に必要な人材(研究協力者)として、大阪市立大学大学院・医学研究科・病院講師の石井聡と、同特任助教の山野恵美が挙げられる。28年度が最終年度であるため、記入しない。脳科学我々のこれまでの脳磁図を用いた運動疲労研究から、中枢神経系が疲労した状態において、運動疲労時、促進システムの神経基盤を構成する前帯状回の活動が特異的に減少することを明らかにしてきた。しかしながら、時空間的関係性を有する形での統合的理解までには至っていない。
縞状鉄鉱床の安定同位体層序の確立

明瞭な縞状構造を有する堆積物の中で、化学的沈殿物とされるものには縞状鉄鉱層(BIF)、層状マンガン鉱層、シリカシンターなどがある。これらは海洋底あるいは地表で、海水や熱水溶液に溶けていたシリカ、鉄、マンガン等の溶解度が下がることによって沈殿し生成された。これら縞状堆積物の成因を明らかにするために、酸素、炭素および硫黄の安定同位体の縞単位での変動を解明する研究を行った。1.オーストラリア、ハマスレ-地域のブロックマン鉄鉱層についてCO2レーザープローブを使って石英の酸素同位体比がサブミリメートル単位でどのように変動するかを求めた。BIFは従来、同位体的に均質であるとされてきたが、δ18O=16.0-23.0の変化を示している。このような変動はBIFの生成が海洋底熱水活動と密接に関連していたことを示唆する。2.同上地域マラマンバ鉄鉱層の頁岩の有機炭素および炭酸塩の炭素同位体比を求めた。有機炭素はδ13C=-41.0--37.1と低い値を示し、当時の海洋底ではメタン生成バクテリアの活動が活発であったことを示す。炭酸塩の炭素同位体比も低いことから、当時の海洋の溶存炭酸はδ13C=-12程度で、現在の海洋とは異なる炭素の循環系が存在していたことが示唆される。3.北海道北の王鉱床周辺に分布するシリカシンターおよび岩手県野田玉川層状マンガン鉱物の酸素同位体比を分析し、これらの生成に関与した熱水の起源に関する考察を行った。縞状鉄鉱床(BIF)の生成メカニズムを解明するために、以下の3地域の試料について、主に安定同位体比の微小領域での変動を明らかにする研究を行った。オーストラリア・ハマスレ-地域のブロックマン層中のBIFにつき、石英の酸素同位体比を測定した。BIF薄片に蓚酸処理を行い、鉄酸化鉱物を除き石英のみとした後、CO_2レーザーを使用して試料中の200μm程度の領域毎に酸素同位体比の変動を調べた。3cm程度の岩片でδ18O(VSMOW)値が1925‰と6‰の変動を示す。また個々のマイクロバンド中では石英のδ18Oは比較的均質であった。このような大きな同位体比の変動は、BIF中の縞構造は季節変動により生成されたとする従来の考えでは説明できない。同上地域、マラマンバBIF中に狭在する頁岩中の微小領域からNd-YAGレーザー法により、有機物中の炭素を抽出し、δ13C値として-37-24‰の値を得た。これらの有機物は熟成を受けていることを考慮すると、堆積時の同位体比は-41-37‰であったと有機物のH/C比から推定される。このような低いδ13C値は当時の海洋でメタン発生型バクテリアの活動が活発であったことを示唆する。カナダ、ミチピコテン地域のヘレン層中の菱鉄鉱質BIFの鉱物学的記載と一部炭素および酸素同位体比の測定を行った。同位体比の変動は少なく、BIFの生成には熱水活動が関与していたことを示唆する。明瞭な縞状構造を有する堆積物の中で、化学的沈殿物とされる物には縞状鉄鉱層(BIF)、層状マンガン鉱層、シリカシンター等がある。これらは海洋底あるいは地表で海水や熱水溶液に溶けていた鉄、マンガン、シリカなどの溶解度が下がることにより沈殿して生成された。これらの縞状堆積物の成因を明らかにするために酸素、炭素および硫黄の安定同位体の縞単位での変動を解明する研究を行った。本年度はとくにオーストラリア・ハマスレ-地域のBIFに研究の重点を置いた。

BIFはチャートと鉄酸化物層が、mmから数cmの互層を成す堆積岩である。この試料の石英につき(鉄酸化物層にも少量の石英が含まれる)、CO_2レーザープローブを用いた五弗化臭素法により1mm以下の単位で詳細な酸素同位体の分析を行った。石英のδ^<18>O_<SMOW>値は、16-23%の変化を示し、数cmの範囲でも緩やかなトレンドを示しながら変動している。互いに隣接する鉄酸化物縞中の石英の方がチャート中の石英よりδ^<18>Oが大きくなる傾向が認められる。従来のバルク試料を用いた研究からは、BIFの酸素同位体変動幅は<2%で同位体的には均質であるとされてきたが、本研究による微小分析によりこの考えが誤りであることが解った。微細な単位での鉄酸化物層とチャート層の互層は、季節変化を示すと考える研究者が多いが、今回のデータはこの説を支持しない。δ^<18>Oの7%にも及ぶ変化は、浅海の静的な環境下でBIFが生成したとするこれまでの定説では説明できず、BIFの生成には海洋底の熱水活動が密接に関っていたことを示唆する。
口腔がんに対する腫瘍免疫を惹起できる新しい腫瘍溶解アデノウイルスの開発

腫瘍溶解ウイルス療法とは、がん細胞のみに感染するよう遺伝子を改変し、最終的にはがん細胞を死滅させる治療法である。今後、外科的切除、化学療法、放射線治療などと同様にがん治療法の選択肢の一つとなることが期待される。本研究は腫瘍溶解アデノウイルスにGM-CSFの遺伝子を挿入したウイルスの開発を目的とする。GM-CSFには免疫細胞の一種である樹状細胞を活性化する作用がある。GM-CSFが挿入された腫瘍溶解ウイルスはがん細胞を死滅させ、さらに発現したGM-CSFによって活性化された樹状細胞がT細胞を活性化し、がんに対して免疫を得ることが期待される。
ポリフェノール由来超強力接着剤の接着機構解明

本研究では我々が創製した工業用接着剤に勝る接着強度を持つ植物由来接着剤の接着機構の解明、及び等接着剤の医療分野への応用を目標とした。原子間力顕微鏡(AFM)を用いたカテコール基をもつ接着分子やその類似分子の単分子接着力測定、量子科学計算による接着シミュレーション、歯髄細胞を用いた等接着剤の細胞毒性試験を行った。その結果、本接着剤の接着分子であるカテコール基と被着材表面にある酸素原子の原子間距離は通常の水素結合よりも3/4程度であることと細胞毒性が全くないことがわかった。従って本接着剤の接着分子は通常の水素結合とは異なる挙動を示し、医療用接着剤としての応用が可能であるということを明らかにした。本研究では我々が創製したエポキシ樹脂に匹敵する接着強度をもつ植物由来接着剤の接着機構解明し,その創製物が医療分野へ応用可能かどうかを探ることを目的としている。まず,原子間力顕微鏡(AFM)を用いたカテコール基をもつ接着分子やその類似分子の単分子接着力測定を行った。次にそれらを接着性分子として用いて創製した接着剤高分子を歯髄細胞を用いた細胞毒性試験(MTT試験)を行った。AFMを用いた単分子接着力測定の結果は,芳香環上の水酸基が増えるにつれ接着力が増加し、2つの水酸基の位置関係についてはオルト位(カテコール基)の分子の接着強度が一番強いことが明らかとなった。また量子科学計算による接着シミュレーションでは、カテコール基の酸素原子と被着材(Siの1,1,1面の部分参加)表面の酸素原子の間の距離が通常の水素結合の約3/4と通常よりも結合距離が近いことが予想された。そして歯髄細胞を用いた当接着剤の細胞毒性試験では、市販の歯科用接着剤を含む培地で培養した歯髄細胞が24時間で生細胞がほぼいなくなったのに対し、当接着剤同条件下で培養72時間が経っても何ら細胞毒性が無いことが確認できた。以上の結果から芳香環上の水酸基の数・位置と接着力との関係、カテコール基の水素結合は通常の水素結合とは異なること、また細胞毒性が全くなかったことから医療用接着剤として応用が可能だということを明らかにすることができた。本研究の中核をなすAFM測定では、グラフト化の過程が最も重要である。H.24年度に行った実験概要を以下に説明する。まず、Si3N4カンチレバーをUVオゾン洗浄装置で処理し、表面にOH基を導入する。窒素雰囲気化でアミノ基を持つシランカップリング剤を用い、カンチレバーにアミノ基を導入する。その後、PEGの方末端のアミノ基が保護されたグラフト鎖を導入する。その後、保護基を外し、カルボキシル基を有する接着分子であるカフェ酸とアミノ基を反応させ、末端に接着性官能基を持つ、グラフトカンチレバーを得た。次にこのカンチレバーを用いて、カフェ酸の単分子接合力の測定をガラス基板を相手として水中で行った。具体的にはAFMのフォースカーブモードで、1カンチレバーを徐々に基板に近づけ、2基板やカテコール分子にカンチレバーが触れるとカンチレバーが撓み出し、斥力を検出する。3適当に押し込んだところで、今度は逆にカンチレバーを引き離す方向へ動かす。撓みが無くなったところでファンデルワールス引力が小さく検出され、すぐに検出力は0に戻る。4カテコール基が基板表面にナノ接合し、グラフト鎖が伸び始め、引き離しがグラフト鎖長に達したところで伸びきり、引力が最大値を示し単分子接合力が測定される。5接着がはずれ、カンチレバーの検出力は再び0に戻る。その結果、カフェ酸とガラスの相互作用力は300pNから700pNである事が分かった。これは通常の水素結合よりも10倍程度強く、共有結合の10分1程度である。本研究の最大の課題であった、カンチレバーに接着性官能基をグラフト修飾する事に成功し、原子間力顕微鏡のフォースカーブモードで接着分子の単分子ナノ接合力の測定に成功している。また、その値が強結合型の水素結合に匹敵する値である。この値は、事前に行った量子科学シミュレーション結果が示唆していた、強結合型の水素結合力を裏付ける実験的な値と合致しているためである。当初計画通り、引き続き様々な接着性天然分子を用いて、種々の基板へのナノ単分子接合力を測定してゆき、ポリフェノール由来の接着剤の接着機構解明に注力して行く。研究代表者は、平成24年度中に異動となり新しく研究室を立ち上げる事となった。約3カ月の間、研究室立ち上げに時間を割く事になり、その間研究遂行が滞ったので予定していた研究経費を繰り越す事となった。
圧電アクチュエータ用超高倍率変位拡大機構による多自由度位置姿勢制御の研究

本研究では,弾性ヒンジを用いた圧電アクチュエータ用の変位拡大機構について研究し,小型で,高い拡大率を有する高精度な位置決め機構を実現することを目的としている.まず始めに新しい1自由度変位拡大機構を提案し,その特性を検討した.1自由度機構については,弾性ヒンジ部とリンク部の形状などを如何にすれば高拡大率が得られるかを主として有限要素法による計算によって明らかにし,機構を実際に試作して,機構の静特性,動特性を実験的に調査した.機構の設計では,ヒンジ形状,リンク形状,設定位置,材質等に対する系統的なデータをFEM解析により調査し,複数の弾性ヒンジ同士の相対的位置関係を適切に決定した.また,圧電アクチュエータを用いた1自由度差動型変位拡大機構の簡易拡大率計算法について検討した.差動型変位拡大機構を剛体要素と弾性ヒンジ要素の連結構造体として取り扱い,伝達マトリックス法を用いて変位拡大率を計算した.有限要素法解析による高位近似解と比較検討し,充分に実施利用可能な精度を得,機構の変位拡大率の簡易設計法を確立させた.さらに,3自由度機構を設計製作した場合の特性について3次元有限要素法解析により推定した.提案した3自由度機構は,試作した1自由度機構を3個使用し,テーブルを平面内3自由度(すなわち水平2方向の並進2自由度と垂直軸まわりの回転動作1自由度)で動作させる機構である.解析モデルではテーブルと各1自由度機構とは弾性ヒンジにより連結するものとし,静特性,動特性を調査した.その結果,1自由度機構単体の時に比較して,変位拡大率が3割程度低下すること,2方向の並進運動の間では駆動したい方向に対して4%程度の干渉移動量が生じること,回転動作に対してはほとんど干渉が生じないことなどを明らかにした.本研究では,弾性ヒンジを用いた圧電アクチュエータ用の変位拡大機構について研究し,小型で,高い拡大率を有する高精度な位置決め機構を実現することを目的としている.まず始めに新しい1自由度変位拡大機構を提案し,その特性を検討した.1自由度機構については,弾性ヒンジ部とリンク部の形状などを如何にすれば高拡大率が得られるかを主として有限要素法による計算によって明らかにし,機構を実際に試作して,機構の静特性,動特性を実験的に調査した.機構の設計では,ヒンジ形状,リンク形状,設定位置,材質等に対する系統的なデータをFEM解析により調査し,複数の弾性ヒンジ同士の相対的位置関係を適切に決定した.また,圧電アクチュエータを用いた1自由度差動型変位拡大機構の簡易拡大率計算法について検討した.差動型変位拡大機構を剛体要素と弾性ヒンジ要素の連結構造体として取り扱い,伝達マトリックス法を用いて変位拡大率を計算した.有限要素法解析による高位近似解と比較検討し,充分に実施利用可能な精度を得,機構の変位拡大率の簡易設計法を確立させた.さらに,3自由度機構を設計製作した場合の特性について3次元有限要素法解析により推定した.提案した3自由度機構は,試作した1自由度機構を3個使用し,テーブルを平面内3自由度(すなわち水平2方向の並進2自由度と垂直軸まわりの回転動作1自由度)で動作させる機構である.解析モデルではテーブルと各1自由度機構とは弾性ヒンジにより連結するものとし,静特性,動特性を調査した.その結果,1自由度機構単体の時に比較して,変位拡大率が3割程度低下すること,2方向の並進運動の間では駆動したい方向に対して4%程度の干渉移動量が生じること,回転動作に対してはほとんど干渉が生じないことなどを明らかにした.本研究では,弾性ヒンジを用いた圧電アクチュエータ用の変位拡大機構について研究し,小型で,高い拡大率を有する高精度な位置決め機構を実現することを目的としている.最終的には多自由度位置決め機構の実現を目指しているが,まずは多自由度機構を構成するための新しい1自由度変位拡大機構を提案して特性を検討した.拡大機構の形状や弾性ヒンジ部とリンク部の形状などを如何にすれば高拡大率が得られるかを,主として有限要素法による計算によって明らかにした.さらに,計算機シミュレーションと実験によって機構の運動を詳細に調査して静的・動的特性を明らかにした.具体的な手法としては,まず,新規機構試作のため,主としてFEM解析を行い,ヒンジ形状,リンク形状,設定位置,材質等に対する系統的なデータを蓄積し,高拡大率を得るための1自由度機構の構造設計を行った.その結果,複数の弾性ヒンジ同士の相対的位置関係を適切に決定すれば,変形時にヒンジ内に生じる内部応力を低減させ,大きな出力変位量が得られることを明らかにした.逆に,各弾性ヒンジの配置と形状が適切でなければ,希望する変位拡大率が得られないことも示された.さらに,FEM解析により得られた設計に基づき,1自由度で駆動するための実験を試作し,機会の静特性,動特性を実験的に調査した.その結果,アクチュエータからの変位入力が11μmに対して出力変位が約350μmが得られ,約32倍の高拡大率が得られた.これはFEM解析で予想した結果にほぼ一致しており,設計の有効性を確認できた.本機構の寸法を大きくすればさらに大きな拡大率を得ることができるが,コンパクトな寸法で高い拡大率を実現させることができた.本研究では,弾性ヒンジを用いた圧電アクチュエータ用の変位拡大機構について研究し,小型で,高い拡大率を有する高精度な位置決め機構を実現することを目的としている.前年度までに新しい1自由度変位拡大機構を提案して特性を検討してきた.

1自由度機構については,弾性ヒンジ部とリンク部の形状などを如何にすれば高拡大率が得られるかを主として有限要素法による計算によって明らかにし,機構を実際に試作して,機構の静特性,動特性を実験的に調査した.機構の設計では,ヒンジ形状,リンク形状,設定位置,材質等に対する系統的なデータをFEM解析により調査し,複数の弾性ヒンジ同士の相対的位置関係を適切に決定した.その結果,アクチュエータからの変位入力が約11μmに対して出力変位が約350μmが得られ,約32倍の高拡大率が得られた.次に,3自由度機構を構成した場合の動作について調査した.3自由度化した場合の機構モデルを考案し,FEM解析により,平面内3自由度,すなわち水平2方向の並進動作,垂直軸まわりの回転動作について調査した.その結果,1自由度機構単体の時に比較して,変位拡大率が低下すること,駆動したい方向に対して,その他の方向に6%程度の干渉移動量が生じることなどを明らかにした.さらに,比較的高い駆動力が要求される場合の1自由度の変位拡大機構についても考察し,FEMを利用したシミュレーションを実施し,性能を調査した.本研究では,弾性ヒンジを用いた圧電アクチュエータ用の変位拡大機構について研究し,小型で,高い拡大率を有する高精度な位置決め機構を実現することを目的としている.前年度まで新しい1自由度変位拡大機構を提案して特性を検討してきた.1自由度機構については,弾性ヒンジ部とリンク部の形状などを如何にすれば高拡大率が得られるかを主として有限要素法による計算によって明らかにし,機構を実際に試作して,機構の静特性,動特性を実験的に調査した.機構の設計では,ヒンジ形状,リンク形状,設定位置,材質等に対する系統的なデータをFEM解析により調査し,複数の弾性ヒンジ同士の相対的位置関係を適切に決定した.また,圧電アクチュェータを用いた1自由度差動型変位拡大機構の簡易拡大率計算法について検討した.差動型変位拡大機構を剛体要素と弾性ヒンジ要素の連結構造体として取り扱い,伝達マトリックス法を用いて変位拡大率を計算した.有限要素法解析による高位近似解と比較検討し,充分に実施利用可能な精度を得,機構の変位拡大率の簡易設計法を確率させた.さらに,3自由度機構を設計製作した場合の特性について3次元有限要素法解析により推定した.提案した3自由度機構は,試作した1自由度機構を3個使用し,テーブルを平面内3自由度(すなわち水平2方向の並進2自由度と垂直軸まわりの回転動作1自由度)で動作させる機構である.解析モデルではテーブルと各1自由度機構とは弾性ヒンジにより連結するものとし,静特性,動特性を調査した.その結果,1自由度機構単体の時に比較して,変位拡大率が3割程度低下すること,2方向の並進運動の間では駆動したい方向に対して4%程度の干渉移動量が生じること,回転動作に対してはほとんど干渉が生じないことなどを明らかにした.
接着分子ネクチンとカドヘリンの連結機構とがんの浸潤・転移

上皮細胞の細胞間接着装置はカドヘリン依存性のアドヘレンスジャンクション(AJ)とクローディン依存性のタイトジャンクション(TJ)で構成されている。私どもの研究室では、AJにおいて接着分子ネクチンと、それをアクチン細胞骨格系に連結する蛋白質アファディンからる細胞間接着機構を見出している。ネクチン-アファディン系とカドヘリンカテニン系は間接的に連結し、協調的にAJの形成を制御している。そこで、生体内での両接着系の接着制御機構を明らかにし、これらが細胞のがん化にどのように関与するかを解析した。本年度の研究において、両接着系が共に存在している皮膚の表皮について以下の結果を得た。1.表皮において、ネクチン-1は有棘層および果粒層に発現を認めた。ネクチン-2は果粒層にのみ発現を認めた。E-カドヘリンは基底層、有棘層、果粒層の細胞間接着部位に発現を認めたのに対し、P-カドヘリンは基底層にのみに発現を認めた。またケラチノサイトの初代培養においても細胞間接着形成初期に両接着系が接着部位に濃縮していることが明らかとなった。2.ネクチン-1の表皮における役割を明らかにするために、ネクチン-1のノックアウトマウスを作製した。ノックアウトマウスでは皮膚の発達において胎生期から表皮の形成異常が認められた。またケラチノサイトの初代培養においても接着形成初期の形態異常が認められた。3.皮膚がんの初期病変において、カドヘリン-カテニン系においては異常が認められなかったのに対し、ネクチン-1の発現の低下が認められた。従って、ネクチンによる接着の破綻が、がん化に関与していることが明らかとなった。以上のように、これらの結果から本研究の目的はほぼ達せられたと考えられる。上皮細胞の細胞間接着装置は主としてカドヘリン依存性アドヘレンスジャンクション(AJ)とクローディン依存性タイトジャンクションより構成されている。私共の研究室では、接着分子ネクチンと、それをアクチン細胞骨格に連結する蛋白質アファディンから成り、AJに局在する細胞間接着機構を見出している。ネクチン-アファディン系とカドヘリン-カテニン糸は間接的結合を介して連結し、協調的にAJの形成を制御しており、両接着系の連結分子はがんの浸潤・転移遺伝子の候補と考えられる。そこでネクチン-アファディン系とカドヘリン-カテニン系の連結機構を明らかにし、これに関わる分子ががん細胞の浸潤・転移能を亢進させているかを解析する。本年度の研究において、まずは、両接着系が共に局在する組織をマウス胎仔を用いて調べ、以下の結果を得た。1.発生初期では、ネクチンおよびアファディンは原始線条や神経ひだの外胚葉および内胚葉上皮に濃縮が見られ、さらに神経上皮や体節などの上皮に発現を認めた。カドヘリン-カテニン系は主に細胞-細胞間に線状に分布するが、ネクチン-アファディン系はその頭頂側で点状にカドヘリン-カテニン系と共局した。2.発生中期では、主に感覚器系(内耳の蝸牛、眼の神経網膜・網膜色素など)の上皮に発現が認められた。同種細胞間接着を主とするカドヘリン系に対し、これらの組織ではネクチン系の異種細胞間接着の存在が示唆された。3.発生後期では、皮膚・毛・口腔を形成する重層扁平上皮にネクチン-1および-2の発現を認めた。近年、ネクチンと相同性の高いヒト遺伝子の変異による疾患(マルガリータ島症候群)では外胚葉形成不全(特に表皮の異常)を主とした発生異常が報告され、マウスネクチン-1の発現パターンはこれらと一致した。ゆえにネクチン-1は表皮を構成するケラチノサイト細胞において細胞接着・運動・増殖に関与していると考えられる。
現代日本における階層意識と格差の連関変動過程の実証枠組み構築

年度当初の計画に従い、この先5年間の研究を遂行すべく、研究代表者である大阪大学・人間科学研究科・准教授吉川徹と、研究分担者である東北大学・文学研究科・准教授浜田宏、統計数理研究所・データ科学研究系・准教授前田忠彦の3名により、入念な研究計画の打ち合わせを行なった。ここでは、事務補佐員および研究員の雇用による研究計画全体の統括、実験設備の設置、大規模調査の実施などの細かいスケジュールを決定した。続いて、分担者の所属先である東北大学と統計数理研究所に研究経費を配分する手続きを進めた。加えて、研究代表者である吉川徹は慶応義塾大学・文学研究科鹿又伸夫教授、早稲田大学・文学研究科・木村好美准教授との共同研究論文作成のための打ち合わせを行った。これは7月の研究会、12月の共著論文の執筆の道筋をつけるものとなった。この間に大阪大学では特任研究員および事務補佐員の採用の手続きを進め、人間科学研究科社会環境学講座内に階層意識研究拠点を立ち上げた。本年度の研究計画においては、2010年に収集した「格差と社会意識についての全国調査」の回収データを整理し、分析可能な状態に整形して、研究メンバーに配布し、基礎分析を行うことが予定されていた。そのため調査データのチェック作業などの活動に入ろうとしたところ、5月31日に科学研究費補助金基盤研究(S)「現代日本における階層意識と格差の連関変動過程の実証的解明」(23223002研究代表者:吉川徹)の交付内定の連絡があり、本研究を廃止することとなった。実質的にはこの2ヶ月という期間には研究実績を出すことはできていないが、上記の活動により、年度途中から開始された基盤研究(S)の研究をきわめてスムーズに開始することができた。
糖尿病による動脈硬化亢進機構と運動効果：マクロファージのインスリンシグナルの役割

平成30年度は、マクロファージ(MΦ)のインスリン受容体シグナル伝達系と脂質代謝調節機構のクロストークを明らかにするため、成熟期雄性C57BL/6Jマウスから採取した腹腔滲出性MΦ(peritoneal exudate MΦ:PEMΦ)および腹腔常在性MΦ(peritoneal resident MΦ:PRMΦ)を用いて、酸化低密度リポタンパク質(oxidized low-density lipoprotein:ox-LDL)取込みによる細胞内脂肪滴の形成、および各種の脂質合成調節酵素と脂質取込み受容体の発現レベルに対するインスリンの影響を検討した。まず、PEMΦは、15 nMの生理的濃度のインスリンに反応して、Aktのリン酸化が引き起こされた。しかし、PEMΦを終濃度50 μg/mLのox-LDLを含む培地で24時間培養しても、脂肪滴の形成そのものが認められなかった。一方、PRMΦも、15 nMの生理的濃度のインスリンに反応して、Aktのリン酸化が引き起こされた。遊離脂肪酸と遊離コレステロールの各合成酵素の発現をそれぞれ調節しているsterol regulatory element-bindingtranscription factorのアイソフォーム1と2、および脂質取込み受容体のCD36のmRNAレベルは、インスリン刺激による有意な変化を示さなかった。Aktによるリン酸化を受けることで活性化し、脂質のde novo合成を触媒するATP citrate lyaseのリン酸化レベルは、インスリン刺激で増加したが、ox-LDL取込みによる脂肪滴の形成に明らかな差は認められなかった。以上の結果から、PEMΦはインスリン刺激に応答するが、ox-LDL取込みによる脂肪滴の形成そのものが起こらない一方、PRMΦもインスリン刺激に応答するが、ox-LDL取込みによる脂肪滴の形成には影響がないことが示唆された。平成30年度に得られた結果から、PEMΦはインスリン刺激に応答するが、ox-LDL取込みによる脂肪滴の形成そのものが起こらない一方、PRMΦもインスリン刺激に応答するが、ox-LDL取込みによる脂肪滴の形成には影響がないことが示唆された。今後、MΦのインスリン受容体シグナル伝達系と脂質代謝調節機構のクロストークを明らかにするため、インスリン刺激、ox-LDL取込み、脂肪滴を検出するためのプローブ等の実験条件を改善して、さらに検討を行う必要がある。そのため、本研究は、現時点において「やや遅れている」と判断した。令和元年度は、MΦのインスリン受容体シグナル伝達系と脂質代謝調節機構のクロストークを明らかにするため、インスリン刺激、ox-LDL取込み、脂肪滴を検出するためのプローブ等の実験条件を改善して、さらに検討を継続する。その結果として、MΦではクロストークが認められなかった場合、MΦの前駆細胞である単球を用いて同様の解析を行う予定である。

平成30年度は、脂質合成調節酵素と脂質取込み受容体のmRNAレベルを分析した結果、インスリン刺激による有意な変化が認められなかった。そのため、抗体試薬の購入を控えたことが、次年度使用額が生じた主な理由である。その研究費は、引き続き各種のプローブや抗体の購入のために使用する予定である。
骨髄ニッチにおける造血前駆細胞の動態と増殖のクロストーク分子機構

骨髄微小環境を形成するニッチ細胞及び細胞外マトリックス群の本態、これらと造血幹細胞及び前駆細胞との相互作用の分子機構については未だ十分に明らかにされていない。リンパ球前駆細胞や造血幹細胞の著しい増幅がみられる抑制性アダプター蛋白質Lnkの遺伝子欠損マウスを起点とし、ニッチ細胞及び細胞外マトリックス群と造血幹細胞及び前駆細胞群の相互作用、制御シグナル分子機構について解析した。本年度は、遺伝子発現変化の影響が極めて少ない血小板を用い、細胞外基質からのシグナル受容におけるLnkの作用点を解明した。Lnk欠損マウスでは血小板が著増するものの血栓症はみられない。巨核球に発現するLnk蛋白質が成熟血小板でも保持されることから血小板の機能解析を行った。Lnk欠損マウスでは一旦止血した後に再出血を呈するマウスが多いことがわかった。骨髄移植後の回復期にあるマウスを用いてほぼ血小板数が揃った状態で検討したところ、Lnk欠損血小板を持つマウスでは出血時間が延長した。共焦点顕微鏡を用いた高速ビデオ撮影による生体イメージングにより、血管内皮障害による血栓形成における血小板二次凝集や血栓の安定化にLnkが必要であることがわかった。Lnk欠損血小板は、正常血小板がフィブリノーゲン上で起こすラミリポディア形成を示さず、フィロポディア優位な形態を示すことがわかった。αIIbβ3インテグリン活性化依存的にLnkがFynをリクルートしインテグリンβ鎖リン酸化に必要であることを明らかにした。この新規インテグリン制御系は細胞外環境による細胞応答制御への理解を深めるもので、また心血管障害の治療標的となる可能性を示したものとして期待される。長管骨を骨端部、移行部、骨幹部に分けそれぞれから骨髄細胞を回収し、造血幹細胞が濃縮されているCD34-cKit+Scal+Lin-分画やCD150+CD41-CD48-分画の割合を解析した。造血幹細胞分画の割合は、野生型マウスではこれまでの報告の通り移行部で最も高かったが、Lnk欠損マウスでは骨幹部にも多く含まれ、移行部と骨幹部での差が少なく骨髄内全域で増加していることがわかった。トロンボポイエチン(TPO)刺激時にインテグリンリガンドであるVCAMの共刺激を加えると、野生型細胞ではStat5のリン酸化が低下する一方でErkl/2及びp38がより強く活性化した。Lnk欠損巨核球ではいずれの活性化もTPO単独刺激と比し変化なかった。形態をみると、BSA上では野生型及びLnk欠損細胞ともに類似した血小板産生形態変化を示した。VCAM上では野生型細胞が大きく伸展し辺縁から分岐に富む血小板前駆体を形成したのに対し、Lnk欠損細胞は辺縁のみならず細胞体からも突出する分岐の少ない血小板前駆体を形成した。LnkはTPOシグナルに作用し巨核球成熟を抑制しているだけでなく、インテグリンからのクロストークシグナルによる血小板放出制御機構にも関与していることが示唆された。
微生物酵素機能電極に基礎を置く各種センサー及びリアクターの開発

シュウドモナスフルオレセンスTN5菌体をメディエーターを練りこんだカーボンペースト電極上に固定した微生物固定酵素機能電極は、微生物の資化因子であるニコチン酸に応答を示す。これは、メディエーターを介した菌体内酵素と電極間の電子移動が行われていることを意味する。使用するメディエーターとして、幾つかのベンゾキノン誘導体について比較検討した結果、2、6メチル置換ベンゾキノンが有効であることがわかった。しかし、限界電流値は、ベンゾキノンに比較しておよそ1.2倍程度であり、置換による顕著な効果はみられなかった。そこで、メディエーターには安価なベンゾキノンを用いることとし、カーボンペーストに練り込む量ならびに固定する菌体の必要量を見積もった。これらの値は用いる電極の形状や面積等に依存するが、本研究に用いた電極(幾何面積0.09cm^2)において、メディエーター含有量は3%(w/w)以上であればよく、菌体は60μg以上(乾燥重量)固定すればよいことがわかった。以下に、バッチセル方式にて、本電極の応答時間、選択性、最適温度、最適pH、安定性の評価を行った結果について簡単に報告する。1)応答時間と測定範囲:80秒程度(但し、電極の安定化等にかかる時間を含めると1行程あたり20分程度)、2)選択性:ニコチン酸に極めてよい選択性をもつ。(グルコース、エタノール、リンゴ酸、ニコチン酸類似化合物等に応答を示さない)3)最適温度:40°C(但し、45°Cにおいて失活)4)最適pH:pH8(但し、pH4以下、pH9以上において失活)5)2週間程度本電極は長期安定性の面で問題が残るが、選択性に優れており、分析時間も比較的短時間で済むという利点がある。今後は、本電極のフローシステムへの適用を考えたい。
シェーグレン症候群におけるHTLV-Iの作用点と分子機序を解明する多角的研究

HTLV-Iキャリアと抗HTLV-I抗体陰性シェーグレン症候群(SS)間では血清学的な差異は無いが、HAMに合併したSS(HAM-SS)では抗Ro/SS-A抗体頻度が有意に少ない。SSの自己抗体産生機序のひとつに異所性二次濾胞の存在が知られ、濾胞内の濾胞性樹状細胞(follicular dendritic cell: FDC)が産生するCXCL13がB細胞のホーミングに重要である。HAM-SSでは、この二次濾胞とFDCが欠如することを私たちは報告しているが、高親和性B細胞の欠如が部分的な自己抗体産生低下につながっている可能性がある。当院の倫理委員会の承認を得て当院耳鼻咽喉科より供与された扁桃腺組織よりFDC細胞株樹立を試みている。現在扁桃組織10検体以上について、FDC樹立を試みており、このうち数株においては、線維芽細胞様の接着細胞増殖を確認している。これらについて、CD14, CD21,CD23,CD54などの細胞表面マーカーや細胞質内のBAFF発現についてフローサイトメトリー法により確認を行っているところである。FDC細胞株が得られたらHTLV-I感染細胞株との混合培養を行い、FDC細胞株の形態変化およびB細胞のホーミングに必要なCXCL13やBAFF濃度の変化をELISA法にて観察する。これらの検討からFDC数が減少あるいはCXCL13濃度が低下することが証明できれば、HTLV-I感染による自己抗体産生抑制に言及可能となると考えられる。予定通りに研究が進まない点としては、扁桃組織が得られる時期に偏りがあることが一点である。また、コラゲナーゼ処理ではFDC細胞株が得られず、原著論文著者に問い合わせを行いトリプシン・EDTA処理を行ってもいるが、未だ樹立できていない。また、口腔内からの摘出のためコンタミが多いのも樹立が遅れている理由のひとつである。また、培養day2のFDC様細胞の免疫染色では、CD14, CD23,BAFFに加えて、CD40、ICAM-1、VCAM-1発現がみられている。これらの検討からFDC数が減少あるいはCXCL13濃度が低下することが証明できれば、HTLV-I感染による自己抗体産生抑制に言及可能となる。また、唾液腺組織を用いた検討では、HAMを合併したSSでは浸潤単核球にHTLV-I tax遺伝子発現が優位であり、導管上皮細胞には、taxおよびHTLV-I bZIP factor (HBZ)両者の発現があることが示された。また、抗HTLV-I抗体陽性無症候性キャリアに合併したSSでは、浸潤単核球・導管両者とも、HBZ優位の発現があることが示された。自然免疫に関連して、TLR7-9の唾液腺組織浸潤単核球・導管上皮細胞での確認とTLR7下流シグナル(MyD88、TRAF6およびIRF-7)の確認を行い、培養唾液腺上皮細胞と末梢血形質細胞様樹状細胞におけるI型IFN産生についても検討を進めている。現在、FDCを示唆する接着細胞は数検体で確認しており、これらの表面マーカー確認に時間を要している。さらに、検討する表面マーカーについて追加で採用すべき2つのマーカー(抗Fibroblast/FDC抗体)があり、これらも併せて検討する必要性が生じた。扁桃組織を入手するための連絡を緊密に行う。また、扁桃組織処理を複数の方法で行い、感染症対策も抗真菌剤での洗浄を行うなどより厳密な方法で行う。また培養液についてもOptiMEMのみでなく、問い合わせて提案のあったDMEM培養液使用も考慮する。現在、10株以上の扁桃についてFDC樹立を検討中である。現在、20株以上の扁桃についてFDC樹立を検討中である。

共培養については、FDCへのHTLV-I感染やアポトーシスの有無の確認、FDCからのCXCL13やBAFF産生への影響をみる予定である。表面マーカーでのFDC樹立が確認でき次第、HTLV-I感染細胞株および対照のJurkat細胞との共培養実験に移る。FDC株樹立に関しては、少なくとも3株以上の樹立を目指したい。一方末梢血および扁桃組織由来のB細胞をsCD40L、IL-4、IL-10で刺激した際のIgG産生とHTLV-I感染細胞株との共培養後のIgG産生量変化確認予定である。最終的にSS患者末梢血由来のB細胞を同様に刺激した際の抗Ro/SS-A抗体産生とこれに対するHTLV-I感染細胞株の影響まで確認する方針である。