hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アントラセン類の1,8,9-位を中心とした第16族元素間非結合相互作用の解明

本研究は、1-(アリールセラニル)ナフタレンの8-位の水素をハロゲン(G=Br,Cl,(F))に置換した場合に、G, Se, C_iの3原子が直線状に並列し、その原動力が、n(X)---σ*(Se-C)の非対称なX---Se-C型の3中心4電子結合(3c-4e)の相互作用による安定化効果であることを見出したことに立脚している。そこで本研究では、上記の成果を発展させ、研究対象をナフタレン環からアントラセンおよびアントラキノン環に発展させて5原子直線状の相互作用(5c-6e)に起因する構造と結合様式を解明した。具体的には、(1)1,8-ビス(アリールセラニル)アントラキノン(1,8-(p-YC_6H_4Se) C_<14>H_6O_2:1(Y=H,Cl,Me))および9-メトキシ-1,8-ビス(アリールセラニル)アントラセン(9-MeO-1,8-(p-YC_6H_4Se) C_<14>H_7:2(Y=H,Cl,Me))を合成した。(2)1および2のX線構造解析法によりその構造を決定し、C_i-Se---O---Se-C_iの5原子がそれぞれアントラキノン環およびアントラセン環と同一平面上で直線状に並列することを明らかにした。(3)非経験的分子軌道計算によって、このC_i-Se---O---Se-C_i原子直線状並列が、5c-6e型の非結合相互作用による安定化に起因することを明らかにした。また(4)1,2における5c-6eの寄与を再確認するために、9-位の原子が水素である化合物1,8-ビス(アリールセラニル)アントラセン(1,8-(p-YC_6H_4Se) C_<14>H_8:3(Y=H,Cl,Me))を合成し、X線構造解析法によりその構造を決定して、C_i-Se---H---Se-C_iの5原子が直線状には並列しないことを確認した。さらに、(5)1,2および3の硫黄誘導体を合成し、同様の検討を行ない、硫黄誘導体もセレン誘導体と同じ結果を与えることを実証した。本プロジェクトは化合物の微細構造の決定や高機能性の発現に大きく寄与する弱い相互作用の解明を目指し、アントラセンの1,8,9-位を中心として、第16族元素間の非結合相互作用について研究を行った。なお弱い相互作用の解明は、分析機器の検出限界への挑戦という側面をもつため、計算科学の手法を駆使して研究を進めた。非結合相互作用を経由した5c-6e系の構築を目指して、1,8-ビス(フェニルセラニル)アントラキノン(1a)および9-メトキシ-1,8-ビス(フェニルセラニル)アントラセン(2a)を合成し、X線結晶構造解析を行った。その結果、1aおよび2aの5個のC-Se...O...Se-C原子は、直線状に並列し、5c-6eを形成していると期待できる結果を得た。一方、1,8-ビス(フェニルセラニル)アントラセン(3a)の場合,には、C-Se...H...Se-C原子による直線状並列はみられず、有効な非結合相互作用は確認できなかった。フェニル基のパラ位に塩素を導入した化合物1b、2bについても同様の結果が得られた。1aおよび2aにおけるセレンと酸素の非結合距離は、両原子のvan der Waals半径の和(3.40Å)よりも約0.7Å短いため、両原子上の軌道間にはかなり有効な重なりが生じるものと期待された。そこで1aおよび2aにおけるC-Se...O...Se-C 5c-6eの性質在究明するため、1a、2aおよび3aについて非経験的分子軌道計算を行った。その結果、このC-Se...O...Se-C5原子直線状並列は、中央の酸素原子から両端のセレン原子方向に本がるP-性の非共有電子対(n_p(O))と両端の2個のσ^*(Se-C)との相互作用の結果であることが明らかとなった。すなわち、これらの系で見出された5c-6eは、2個のn_p(O)→σ^*(Se-C)非結合性3c-4eが中央のn_p(O)を直線状に共有した結合であることを明らかにした。具体的には、(1)1,8-ビス(アリールセラニル)アントラキノン(1,8-(p-YC_6H_4Se) C_<14>H_6O_2:1(Y=H,Cl,Me))

および9-メトキシ-1,8-ビス(アリールセラニル)アントラセン(9-MeO-1,8-(p-YC_6H_4Se) C_<14>H_7:2(Y=H,Cl,Me))を合成した。(2)1および2のX線構造解析法によりその構造を決定し、C_i-Se---O---Se-C_iの5原子がそれぞれアントラキノン環およびアントラセン環と同一平面上で直線状に並列することを明らかにした。(3)非経験的分子軌道計算によって、このC_i-Se---O---Se-C_i原子直線状並列が、5c-6e型の非結合相互作用による安定化に起因することを明らかにした。また(4)1,2における5c-6eの寄与を再確認するために、9-位の原子が水素である化合物1,8-ビス(アリールセラニル)アントラセン(1,8-(p-YC_6H_4Se) C_<14>H_8:3(Y=H,Cl,Me))を合成し、X線構造解析法によりその構造を決定して、C_i-Se---H---Se-C_iの5原子が直線状には並列しないことを確認した。さらに、(5)1,2および3の硫黄誘導体を合成し、同様の検討を行ない、硫黄誘導体もセレン誘導体と同じ結果を与えることを実証した。
分子認識・強相関薄膜法による生体機能薄膜の構築と誘電異方性解析

分子を組織化して薄膜にする技術が進む一方で,薄膜の構造とその物理的物性を分光学的に明らかにする手法は意外に進んでいない。本研究課題では,生体薄膜などの高度な分子構造と機能をもつ有機超薄膜を,赤外分光法で解析するための手段の開発に着手し,ソフトマテリアルの化学を界面化学と分析化学の両面から推進した。新しい研究の軸として,ケモメトリックスとしても知られる多変量解析の考え方を,全く新しい概念に変えてスペクトル解析に導入した。ひとつは,主成分分析法(PCA)アルゴリズムを詳しく検討した結果,複数のスペクトルから微量化学種の純スペクトルが抽出できることがわかった。これにより,固液界面の界面水が,バルクの水とは異なる化学構造をとっていることを,世界ではじめて赤外スペクトルを通じて明らかにすることができた。また,界面水と考えられる領域が,数Å程度であることも固有値解析から明らかにできた。この例の示すように,従来の"濃度検量"という強い呪縛から離れた,新しい多変量解析に利用法を示し,日本分光学会の論文賞,ならびに日本分析化学会の奨励賞の受賞につながった。他方,多変量解析のもつ強い線形性に着目し,物理計測の線形性と非線形性とを強力に区別する実験を考えた。薄膜解析に広く用いられる透過分光法を,この考え方に基づいて定式化した結果,本来計測が不可能な"縦波光による面外モード測定"が理論的に可能であることが示唆された。その後,回帰行列の理論的構築に成功し,非金属表面での面外モードスペクトルの測定に世界で始めて成功し,国内外の多くの学会から招待講演を受けた。この手法は多角入射分解分光法(MAIRS)と命名されており,厚みのわからない高分子材料や生体薄膜の分子配向解析に使えることが予想されており,現在,装置開発も含めて研究を進めている。生体薄膜や細胞一層レベルの薄膜の構造と物性を分光学的に詳しく調べることは,生物学的にもまた分光分析化学的にも大きな挑戦課題である。本研究では,これまで構造異方性の解析の難しかった要因を,入射光電場と官能基の遷移モーメントの相互作用だけに着目してきたことにあると考え,従来の考え方とはまったく異なる解析法を考案した。従来の光学定数に代わる概念として,Kimらの振動子モデルによる誘電関数を利用し,膜面内と面外の両方の関数をこれで表現することを考えた。そして,薄膜を非金属基板上で異なる二つ以上の入射角で反射法によりスペクトル測定し,その複数のスペクトルを同時に説明しうる関数になるよう,パラメータの最適化を行う方法とした。これにより,従来わからなかったα-炭素の配向角など,詳細な分子情報が得られるようになった。一方,分子認識を積極的に使った薄膜の作成も行った。これは,蛋白の一種であるヒスチジンの金属イオン認識機構を真似た人工的な薄膜を,コンビナトリアル表面化学と言うコンセプトで実現させることを狙ったものである。三種の鎖長の異なるアミド結合を持つ分子を合成し,その混合膜が金属イオンをどのように認識するかを調べた。その結果,Zn^<2+>とCu^<2+>を明確に識別できることがわかった。この際の分子配向変化を,赤外分光法で詳細に明らかにすることにも成功し,擬似生体分子の開発に新たな道を与えることができた。また,主成分分析法をスペクトル解析に新しく導入し,空間分解能を超えた新しい分析手法の開発も行い,固液界面の水の特異的構造をはじめて振動スペクトルで捉えることに成功した。これらの成果はJ. Phys. Chem. Bに2報,Chem. Eur. Jに1報公表した。これ以外にも,時間分解スペクトルに含まれる化学信号と他の要因とを識別する新たな分析手法の開発にも成功し,これは現在Appl. Spectrosc.に印刷中である。これらの成果に対し,日本分光学会論文賞と日本分析化学会奨励賞を受賞することができた。

その後,回帰行列の理論的構築に成功し,非金属表面での面外モードスペクトルの測定に世界で始めて成功し,国内外の多くの学会から招待講演を受けた。この手法は多角入射分解分光法(MAIRS)と命名されており,厚みのわからない高分子材料や生体薄膜の分子配向解析に使えることが予想されており,現在,装置開発も含めて研究を進めている。
高温・高圧下での斜長石の変形実験：下部地殻レオロジーに与える水の影響

下部地殻において水は塑性変形を促進させることで岩石を軟化させ,上部地殻の断層へ応力集中を引き起こし,地震発生の引き金となる.従って下部地殻の力学特性を決定することが重要であるが,下部地殻に相当する高温・高圧条件で,水が岩石の強度にどの程度影響を与えるか定量的にはよく分かっていない.また,変形する岩石内部を水がどのように拡散するのかよく分かっていない.上述の問題を解決するために下部地殻の主要構成鉱物である斜長石の変形実験を行った.実験にはGriggs型固体圧式変形試験機を用いるが,このタイプの試験機は力学データの精度が低いため,力学データにはKido et al. (2016)による差応力測定値の補正則を適用した.実験試料には人工的に合成された斜長石の多結晶焼結体を用いた.封圧を変化させて強度に対する水のフュガシティの効果を調べた.また,水を浸透させるための保持時間と変形時間を変え,水の拡散に与える変形の影響を評価した.実験後の回収試料については,偏光顕微鏡及び電子顕微鏡を用いて組織観察を行ったほか,赤外分光光度計により含水量を測定した.水を加えた試料は加えていないものに比べて著しい強度低下を示し,また,強度は含水量の増加と共に低下する傾向があった.同様の焼結体試料に対して低圧条件で実験を行った先行研究(Rybacki and Dresen, 2000など)が提案した構成則からの外挿値と比べ,高圧条件での強度は低いものであり,高圧条件において岩石の塑性変形を促進する水の効果が大きいことが明らかになった.また,変形時間の異なる試料の含水量測定の結果から,岩石内部の水の拡散が変形によって促進されている可能性が示唆された.下部地殻において,岩石の変形が水の浸透を促進し岩石の弱化の原因となり,歪局所化をもたらす可能性が示された.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。下部地殻領域では流体(水)が岩石の変形や破壊といったレオロジー特性に対して重要な影響を及ぼすことが知られている.本研究では,東北大学所有の固体圧試験機とガス圧試験機という2台の試験機を相補的に用いた実験的研究によって,下部地殻を構成する岩石のレオロジーに対して,高温・高圧の水が与える影響の詳細な理解を目指す.初年度にあたる平成28年度は中部下部地殻に相当する温度と圧力を発生させることのできるGriggs型固体圧式変形試験機を用いて人工斜長石多結晶体の変形実験を行った.実験は下部地殻に相当する封圧0.81.4 GPa,温度900 °Cで行った.実験前に試料の重さに対して0.5%の水を加え,高温・高圧下で軸圧縮変形を与え,差応力と歪を測定した.また,目標の温度・圧力を発生させた後に保持時間と変形時間を変えることで水が試料内部に浸透する時間を変化させ,変形特性と水の浸透時間との関係を調べた.実験の結果,強度は水の浸透時間が長くなるほど低下する傾向がみられた.最も長い時間水を浸透させた試料は他のものに比べて著しく低い強度を示した.実験後のいくつかの試料に関して薄片を作成し,偏光顕微鏡,走査型電子顕微鏡で微細組織観察を行った.そのうちの一試料についてフーリエ変換型赤外分光計を用いて試料中の含水量分布を測定した.最も時間をかけて水を浸透させた試料は,試料の内部においてほぼ均質な含水量分布を示した.本研究の差応力測定結果と低圧(0.5 GPa)の実験から求められた既存の構成則から予測される強度とを比較した.実験結果はいずれの構成則より低い強度を示しており,水のフュガシティの効果による弱化の程度が低圧の実験からの予測より大きいことを示唆する.今後は微細構造観察と含水量測定を進め,斜長石の強度と水の効果について定量的な検討を行う予定である.初年度に当たる平成28年度は,斜長石のレオロジーにおける水の効果を定量化するために,Griggs型固体圧式変形試験機を用いて下部地殻条件で人工斜長石多結晶体の変形実験を行った.封圧を0.81.4 GPaと変えて行った実験の結果を,同様の試料に対する低封圧(0.4 GPa)の実験を行った先行研究と比較した.どの封圧においても先行研究からの予測値よりも低い強度を示したことから,下部地殻に相当する高圧下では水の効果による弱化の程度が大きいことが示された.以上の研究成果は国内学会及び国際学会で発表した.また,結果をまとめた論文を国際学術雑誌に投稿準備中である.

本年度は,昨年度に引き続き東北大学所有のGriggs型固体圧変形試験機を用いて,下部地殻の主要構成鉱物である斜長石の含水下での高温・高圧変形実験を行った.試料の斜長石は天然のものではなく人工的に合成された多結晶焼結体を用いた.実験後の回収試料については薄片を作成し,偏光顕微鏡及び電子顕微鏡で組織観察を行ったほか,赤外分光法により含水量の測定を行った.本年度までの実験結果を取りまとめ,以下のことが示された.含水条件での強度は,非含水条件での強度に比べて著しい低下を示し,また含水量の増加と共に低下する傾向があった.同様の斜長石焼結体に対して低封圧(< 0.5 GPa)の実験を行った先行研究による予測値と比べ,本実験(0.8 1.4 GPa)で得られた強度はいずれの封圧においても低いものであり,高封圧での斜長石の強度を低下させる水の効果が低封圧からの予測よりも大きくなることが明確に示された.先行研究では封圧とともに強度が上昇する構成則と,強度が封圧に依存しない構成則が提案されているが,本実験の結果は後者の構成則を支持するものであった.水の拡散と変形の関係を調べるために,変形開始前の保持時間と変形時間を変えて実験を行った.その結果,含水量は保持時間にはあまり依存せず,変形時間の長い試料の含水量が多くなる傾向があり,水の浸透が変形によって促進されている可能性が示唆された.上記の研究成果について日本地質学会やアメリカ地球物理連合大会といった国内外の学会にて発表した.また国際誌に論文を投稿するために準備中である.当初の計画では,今年度においてガス圧式変形試験機を使用して高温・高圧下で斜長石の変形実験を行う予定であったが,封圧下での目標温度への昇温が達成できず,使用を見送った.しかしながら,固体圧試験機を用いた実験から,水を含んだ斜長石の強度が低封圧での変形実験から求められた従来の構成則から予測される値よりも明確に低いことから,水を含んだ下部地殻の強度が従来の想定よりも低くなることを示すことができた.また,変形時間と含水量及び強度の関係からは,変形に伴う水の拡散と強度の低下を確認することができた.下部地殻において水は塑性変形を促進させることで岩石を軟化させ,上部地殻の断層へ応力集中を引き起こし,地震発生の引き金となる.従って下部地殻の力学特性を決定することが重要であるが,下部地殻に相当する高温・高圧条件で,水が岩石の強度にどの程度影響を与えるか定量的にはよく分かっていない.また,変形する岩石内部を水がどのように拡散するのかよく分かっていない.上述の問題を解決するために下部地殻の主要構成鉱物である斜長石の変形実験を行った.実験にはGriggs型固体圧式変形試験機を用いるが,このタイプの試験機は力学データの精度が低いため,力学データにはKido et al. (2016)による差応力測定値の補正則を適用した.実験試料には人工的に合成された斜長石の多結晶焼結体を用いた.封圧を変化させて強度に対する水のフュガシティの効果を調べた.また,水を浸透させるための保持時間と変形時間を変え,水の拡散に与える変形の影響を評価した.実験後の回収試料については,偏光顕微鏡及び電子顕微鏡を用いて組織観察を行ったほか,赤外分光光度計により含水量を測定した.水を加えた試料は加えていないものに比べて著しい強度低下を示し,また,強度は含水量の増加と共に低下する傾向があった.同様の焼結体試料に対して低圧条件で実験を行った先行研究(Rybacki and Dresen, 2000など)が提案した構成則からの外挿値と比べ,高圧条件での強度は低いものであり,高圧条件において岩石の塑性変形を促進する水の効果が大きいことが明らかになった.また,変形時間の異なる試料の含水量測定の結果から,岩石内部の水の拡散が変形によって促進されている可能性が示唆された.下部地殻において,岩石の変形が水の浸透を促進し岩石の弱化の原因となり,歪局所化をもたらす可能性が示された.含水変形実験試料の微細構造観察,含水量測定から,変形メカニズムの推定と水の濃度の分布と変形の不均質性について議論を行う.封圧の異なるデータを増やして水のフュガシティが斜長石の変形特性に与える影響に関して定量的な評価を進める予定である.
擬縮重多電子系の理論の深化と実在系への展開

擬縮重多電子系である金属ナノクラスター、多核遷移金属錯体、ナノサイズ分子スピン系は、特異な機能が発現する非常に興味深い物質系である。これらのメゾスコピック系を理論的に扱うには、現状ではシングルデターミナントで記述されるスピン対称性が破れた(BS)の分子軌道法を用いて取り扱う方法が現在もっとも有効であると考えられる。しかしながら、これらの手法では高スピン状態からのspin contaminationにより、それらの構造、反応の活性化エネルギーなどの評価に重大な影響を与えることが知られている。以前からの我々のグループの研究で、近似的にスピン射影したBS法が、非常に実用的な方法であることを明らかにしてきた。そこで、上述の大規模系に対して、近似スピン射影BS法を用いることにより、基底状態の構造、エネルギー準位、スピン間相互作用に対して近似スピン射影を用いることによりspincontaminationの効果を除去し、これらのメゾスコピックサイズの小分子ともバルクとも異なる擬縮重多電子系の物性を理論的に評価する。このモデル系としてoxyHc等を検討した。この系の高スピン状態におけるCu(II)のスピン密度は0_2^<2->に非局在化し0_2^<2->がラジカル性を帯び電子状d態は極めて不安定である。このためBS法による最適化構造は高スピン状態と低スピン状態にかなりの違いが見られた。つまりスピン密度分布の不安定な高スピン状態が混入している系では、構造が大きな影響を受ける。低スピン状態の構造もこの影響を受けたがAPOPT法を用いることで磁気的相互作用に関わるCu-02-Cu部に大きな改善が見られた。これらの結果は、Cu-02-Cu部分のわずかな変化に対して磁気的相互作用はかなり敏感であり∠Cu-0-CuとJ値にはよい相関があるという実験結果と矛盾しないことが明らかになった。
細胞の増殖・分化における核内構造体の形成機構と機能の解析

核膜孔タンパク質がかかわる核内構造体形成機序の解明核膜孔タンパク質RanBP2によるタンパク質SUMO化修飾が、複数の核内構造体の形成に関与する分子機序を解析した。また、細胞の分化、発生、がん化に関わる遺伝子について、RNAのプロセッシングを含めた発現様式に関わる機序を調べた。細胞周期に依存した抑制クロマチンの構築と次世代への継承発生において各細胞系譜が固有の遺伝子発現様式を獲得、維持することは重要で、ポリコームグループタンパク質によるヒストンH3K27トリメチル修飾を介した遺伝子の抑制が役割を果たす。ポリコーム抑制複合体(PRC)が相互作用する抑制クロマチンの構築と、次世代細胞へ継承にPRC因子が関わる機序と、その欠失により細胞周期の制御への異常を見いだした。核内構造を基盤とした遣伝子発現制御機構マウスES細胞の神経分化過程における、細胞核とクロマチンのダイナミックな変動を見いだした。分化とともに特異的に抑制されるOct3/4-MHC遺伝子座のヒストン修飾、DNAメチル化などの解析により、細胞の未分化性の維持や細胞系譜の決定に核内構造体によるエピジェネティックな制御が役割を果たしている可能性を見いだした。1.細胞核内構造体におけるタンパク質SUMO化修飾の役割解析ユビキチン様ファミリータンパク質SUMOは、様々な因子を修飾し、被修飾タンパク質の細胞内局在やタンパク質の持つ活性等を変換する。SUMO E3活性を持つ、核膜孔タンパク質RanBP2のノックダウンにより、核スペックル形成が不全となる事象について解析した。核スペックルに関連する機能である転写とRNAスプライシングについてそれぞれ、RT-PCRにより解析した。2.マウスES細胞の分化過程における核内構造と遺伝子発現制御機構細胞の分化過程では、遺伝子発現プロファイルの変化を通して、幹細胞および前駆細胞が特定の系譜の細胞に変化する。細胞分化とともに選択的に抑制されるOtc3/4遺伝子座に着目して、マウスES細胞→神経前駆細胞→ニューロンに高度に均一に神経細胞へ分化する系を用いて、分化に伴う遺伝子の発現制御に細胞核内構造、クロマチン、DNAメチル化がいかに関与するかを調べた。免疫FISH法により、分化前ではPMLボデイーの近傍で活発に転写されていたOct3/4遺伝子が、分化とともに距離を離しながら抑制されていることを見いだした。また、クロマチンIPにより、神経前駆細胞ではOct3/4遺伝子の転写は抑制され、ヒストンH3K4の脱メチル化、H3K27のトリメチル化が昂進され、ニューロンではさらに加えてCpGメチル化がOct3/4遺伝子座のプロモーター部位に集中して起きることを見いだした。よって、マウスES細胞の神経分化段階における遺伝子発現制御とクロマチン修飾、そして核内構造で構成されるエピジェネティック制御機構が時空間的に協同することを明らにした。
高密度・低温の誘導結合プラズマを利用した大面積平面型無水銀光源の開発とモデリング

初年度には、通常の水銀蛍光ランプ用に構築した衝突輻射モデルを無電極高周波放電のプラズマへの適用の可能性を探るために、アメリカのオスラム社の商用無電極蛍光ランプを例にとって、検証を行った。その結果、電子エネルギー分布の計算を正確に行えば、精度が向上するであろうことが判明した。また、誘導結合放電(ICP)実験系の構築も行った。第2年度の本年度は、無水銀光源における水銀代替物質として有望なキセノンの放電モデルの構築に主に取り組んだ。キセノンは、電流密度の上昇による陽光柱の収縮が他の希ガスや水銀に比べて生じやすいという特性がある。キセノン、アルゴン、ネオンを使ってICP放電管を試作し、点灯試験を行ったところ、通常の放電管と同じく、キセノンではプラズマ(陽光柱)が収縮しやすい、という蛍光が見られた。そこで、キセノンの放電において陽光柱が収縮する物理機構の解明も目的として、キセノンの低圧放電プラズマの収縮についてのコンピュータシミュレーションを行った。その結果、キセノン陽光柱の収縮は、電流密度の上昇に伴ない生じる中心部での電子温度の上昇がキセノンイオンと電子の体積再結合のレートを下げ、見かけの拡散レートが負になる点が生じて、陽光柱の拡散が抑制されるために、収縮が生じることが明らかになった。このコンピュータシミュレーションの結果から、陽光柱の収縮を避けるためには、中心部でのガス温度の上昇を抑えること、そして、電子温度が必要以上に上昇させないこと、により中心部分でも十分な再結合が生じ、見かけの拡散レートが負になることを防いで陽光柱の収縮を回避できると期待できるので、来年度は、ICP放電において、アンテナ配置やRF電力のパルス化などにより、電子温度とガス温度を必要以上に上昇させない条件を明らかにし、平面型のICP光源の開発を行う必要がある。初年度の計画は、1)これまでに受け入れ研究者と特別研究員でこれまでに共同して開発してきた光・プラズマモデルを誘導結合プラズマに適用すること、2)ICPプラズマの生成のための電源回路の構築、3)ICPプラズマの分光測定系の構築である。プラズマモデルのICPプラズマへの適応については、アメリカのオスラム社(日本では三菱オスラム社)の開発したICP水銀蛍光ランプに関してモデリングを行った。このランプに関しては2001年の国際会議でプラズマパラメータと発光特性の計測結果が発表されており、我々の計算結果と比較検討した結果、定性的にはすべてのパラメータが一致するが、定量的には合わないものも多いことがわかった。この原因としては、ランプ内のプラズマを軸方向には一様と仮定したことと、径方向の電子密度分布をBessel関数と仮定したことによると考えられる。そのため次年度はモデリングの対象としたICP蛍光ランプを調達して実際に電子密度や準安定原子密度の径方向分布を測定し、その結果をモデルにフィードバックすること、径方向の分布を考慮したモデルの構築を目指す。またモデルについては既に定常計算だけでなく時間変化についてもモデリングできるようになっているため、実験に先立って、RFやVHFのパルス駆動の数値実験が可能な状態にある。その為、次年度には、第三年度に実験を予定しているパルス駆動放電に先駆けて、最適パラメータをシミュレーションにより予測することを計画している。ICP回路の構築は既に済ませており、テスト用の放電管においてICP放電が可能であることを確認しているので、次年度は当初の計画どおり、封入ガスやアンテナの最適化を行う。分光計測系についても既に構築を済ませており、次年度より、計画どおりにICPプラズマの光放射特性を測定できる状態にある。
水資源開発と環境問題におけるコンフリクト・マネジメントに関する研究

本年度は3篇の論文がJournalに掲載され、3編の審査付論文を発表し、学会発表として講演集に1編、京都大学防災研究所の研究紀要として1編の論文が収録された。また、地域学会の年次大会と、京都大学防災研究所の研究発表講演会において発表を行った。地域学会における発表内容は改めて論文として投稿し、現在査読中である。さらに、本年度は学位論文を「水資源開発における社会的コンフリクトマネジメント」という研究課題で執筆し、11月に申請、1月に公聴会を終え、2005年3月23日付で学位を授与された。また、申請者が昨年度研究交流のため滞在し、受け入れ教官となって頂いたカナダ・ウォータールー大学System Design EngineeringのKeith W.Hipel教授が平成16年11月平成16年12月まで京都大学防災研究所に客員教授として来日しておられたため、この間に取り組み中である共著論文の執筆を進めた。本論文は、平成17年10月にアメリカのハワイで行われるIEEE International Conference on Systems, Man and Cyberneticsで発表するために投稿中である。本年度はこれまで構築してきたコンフリクト現象分析のための数学モデルを、第3者機関の介入によるコンフリクトマネジメントという視点から体系化し、水資源開発における社会的コンフリクトマネジメントとしての方法論を構築した。この研究内容は学位論文にまとめられている。また、図書として平成17年度中に取りまとめ、平成17年度、もしくは平成18年度に出版予定である。本年度はこれまで構築してきた開発と環境のコンフリクトを分析するための数学モデルを、コンフリクト・マネジメントという枠組みで構成・位置付けするために、コンフリクトへの第三者機関の介入と調整という視点からのコンセプト作りを行った。地域学会で発表した論文とIDRMはこれに関するものである。この成果は来年度に発表予定である。また、ケーススタディとして分析対象としたインド-バングラデシュ間のガンジス河水利用をめぐるコンフリクトの背景についての資料収集や調査も、モデル構築と並行して行った。
コモンマーモセット受精卵へのアデノ随伴ウイルスベクターによる遺伝子導入法の開発

本研究は霊長類において標的遺伝子座を任意に改変する技術の開発を進めた。結果は以下の通りである。1) AAV2Repタンパク質を発現するrAAV5を作製し、rAAV2ベクターゲノムの安定導入効率が上がることを確認した。2)単独でNicking活性を持つTALEを発現するAAVベクタープラスミドを構築した。3) CRISPR/Cas9を搭載するAAVベクタープラスミドで標的遺伝子座に挿入/欠失変異を誘導出来、また、rAAVにパッケージング可能な事を確認した。4) 9型のAAVベクターがマーモセット受精卵に対し十分な感染能力を有し、特に内部細胞塊において導入遺伝子の強い発現が見られる事を確認した。本研究ではアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いてコモンマーモセットの受精卵ゲノム上のAdeno-associated virus integration site 1(AAVS1)領域に限定された効率的な遺伝子導入方法を開発する。そのためは1コモンマーモセットのAAVS1領域の同定2AAVS1領域へ目的遺伝子を挿入するためのAAVベクターの構築3AAVベクターのコモンマーモセット受精卵への感染条件の検索が必要である。当該年度はその中でAAVベクターの構築およびその機能確認について重点的に実施した。昨年度に構築した、2型AAVのRepタンパク質を発現する5型AAVベクタープラスミドを用いてAAVベクター(rAAV5-hA2R68)を作製した。同時に、本AAVベクターの機能評価を目的として、CMVプロモーター下にGFPおよびblasticidin耐性遺伝子を発現する2型AAVベクタープラスミドを用いて1型AAVカプシドにシュードタイプ化したAAVベクター(rAAV1-CEIB)、およびコモンマーモセットの腎臓に由来する初代培養細胞にSV40 Large T抗原を導入して不死化細胞(CJKT細胞)を作製した。CJKT細胞にrAAV5-hA2R68およびrAAV1-CEIBを共感染させたところ、およそ0.1%の割合でGFP発現を発現し、かつblasticidinに耐性のコロニーが得られたため、これらの細胞のクローン化を実施中である。本研究では経済的・倫理的に多数の検討を行う事が難しい霊長類においても確実に効率良くゲノム上の安全な領域に限定して目的とする遺伝子を挿入するために、AAVベクター(rAAV)を用いたコモンマーモセット受精卵への遺伝子導入方法の開発を行っている。昨年度まで野生型アデノ随伴ウイルスが持つ能力によりrAAVゲノムをマーモセットゲノムへ挿入する方法を開発してきた。一方で、今年度初頭より細菌の獲得免疫システムの応用による哺乳動物受精卵ゲノムの直接的な内在遺伝子破壊/外来遺伝子挿入法が報告されている。本システムの場合、ゲノム上のターゲット領域の変更が容易であり、また、内在遺伝子破壊/外来遺伝子挿入/遺伝子発現阻害の全てに対応出来るため、非常に有用である。そこで当該年度は、本システムに必要なコンポーネントを全て搭載し、発現可能なrAAVベクタープラスミドを構築した。本プラスミドにより293細胞ゲノムに挿入/欠失変異が誘導出来、また、実際にrAAVにパッケージング可能であることを確認している。今後、本rAAVを用いる事で、受精卵へのより簡便な遺伝子改変が期待出来る。そのためは(1)コモンマーモセットのAAVS1領域の同定(2)AAVS1領域へ目的遺伝子を挿入するためのAAVベクターの構築(3)AAVベクターのコモンマーモセット受精卵への感染条件の検索が必要である。当該年度はその中でも(1)および(2)について重点的に検討した。ヒトのAAVS1領域については19番染色体(19q13.4 qtr)に存在することが知られている。コモンマーモセットにおいては、ヒトAAVS1と相同性が高く、その上流および下流に存在する遺伝子も一致している領域がコモンマーモセット22番染色体上の45.95-8Mb付近に認められたが、この領域の1.6Kbが未解読であった。この領域をシークエンス解析したところ、AAVゲノムの挿入に必須なRep binding site (RBS)およびTerminal resolution site(TRS)の配列が存在することが確認された。すなわち、マーモセットにおいて、Repタンパクを用いてAAVベクターゲノムをコモンマーモセットのゲノムに挿入する事が可能であると判断された。一方、AAVベクターによるホストゲノムへのAAVS1領域に限定された導入遺伝子の挿入には野生型のAAVが持つRepタンパク質を作用させる必要がある。

そのため、2型のAAVベクターゲノムを対象のゲノムに挿入する能力を持つ2型AAVのRepタンパク質を発現する5型AAVベクタープラスミドを構築した。これにより、目的とする2型AAVベクターゲノムのみを宿主細胞のゲノムに挿入する事が可能になった。本研究では経済的・倫理的に多数の検討を行う事が難しい霊長類においても確実に効率良くゲノム上の安全な領域に限定して目的とする遺伝子を挿入するために、AAVベクターを用いたコモンマーモセット受精卵への遺伝子導入方法の開発を行っている。本法は野生型アデノ随伴ウイルス(AAV)が持つRepタンパク質を作用させ、Repを欠損するAAVベクターゲノムを、対象であるコモンマーモセットのゲノムに挿入させる。当該年度はコモンマーモセットのAAVS1領域に特異的にベクターゲノムを挿入するために必要なAAVベクターを作製した。本AAVベクターのおおよその特性を把握するにあたり、コモンマーモセット由来不死化細胞株のAAVS1領域に対するAAVベクターゲノムの挿入を試みた。通常よりも遥かに高い確立で導入遺伝子を安定に発現するコロニーが得られており、能動的なAAVベクターゲノムの挿入が起きていると予想される。今後、実際のAAVベクターゲノムの挿入様式の解析を行うとともに、挿入効率を改善する事で、今後受精卵への応用が期待出来る。そのためには野生型AAVが挿入されることが知られるAdeno-associated virus integration site 1(AAVS1)領域がコモンマーモセットに保存されているかどうかを確認する必要があった。解析の結果、マーモセットにおいてもAAVS1領域はよく保存されており、開発中の技術が実現可能であることが示唆された。また、目的とする任意のAAVベクターゲノムを挿入する為には、これとは別にRepタンパク質を発現し、かつそれ自体は対象のゲノムに挿入されないベクターを構築することが必要である。この補助ベクターについてもベクタープラスミドの構築は完了しており、実際の導入条件の検討を開始できる。本研究ではAAVベクターを用いたコモンマーモセット受精卵への遺伝子導入方法の開発を行っている。現在までに、マーモセットにおいてもAAVS1領域がよく保存されていることを確認している。
イソフラボン・ポリアミン誘導体が持つヘム分解調節作用の機能性食品・医薬品への応用

ヘム代謝系・鉄代謝系は、ヘム分解酵素・ヘムオキシゲナーゼ(HO)を中心に、生体防御や生体調節に重要な役割を果たしている。代表者らは、ヘムによるHO-1の発現誘導メカニズムを解明し、種々の物質などによるヘム分解系調節と、ヘム代謝と鉄代謝の関連を見出してきた。本研究では、食品成分を中心とした種々の物質によるヘム代謝系・鉄代謝系の調節メカニズムの解明と、医薬品などへの応用可能性を探った。その結果、ヘム代謝や鉄代謝を調節する化合物群が、原虫の増殖を抑制することを見出した。これは、感染症とヘム代謝系・鉄代謝系の関連についての基盤的な新知見であり、治療応用の可能性を示した成果である。ヘム分解酵素ヘムオキシゲナーゼ(HO)には、誘導型のHO-1と構成型のHO-2の2つのアイソザイムがあり,ヘム分解によって一酸化炭素(CO),鉄,ビリベルジンを生じ,生じたビリベルジンは速やかに抗酸化物質ビリルビンに変換される。HO-1の誘導は重要な生体防御反応であり,また,HO-2により生じるCOは低酸素応答を担っている。ヘム(鉄)は鉄補充,イソフラボンは女性ホルモン補充の目的で広く摂取されており,これら食品成分の安全性と有効性の正確な評価に加えて,食品成分によるヘム分解系調節の応用が期待されている。ヒト由来の培養細胞を用いて,イソフラボン,ポリアミン,オリゴ糖などの食品成分や低酸素によるHOの発現調節を検討したところ,イソフラボン誘導体のいくつかはHO-1を抑制し,ポリアミンは強くHO-1を誘導し,オリゴ糖はHO-1をわずかに誘導する傾向を示した。長時間の低酸素は,HO-1およびHO-2の発現を抑制するが,ポリアミンは低酸素下でもHO-1を誘導した。すなわち,ポリアミンは低酸素によるHO-1抑制に拮抗できることが明らかになった。HOの誘導は,酸化的ストレスに対する生体防御能力・細胞保護作用の増強などによって,種々の疾患の予防や治療に有効であることが示唆されている。一方,HOの抑制や阻害,遺伝子多型による低誘導は,癌抑制やマラリア重症化のリスク低減につながることが示唆されている。今後は,食品成分を中心としたHOの発現調節物質の作用機序も考慮しながら,物質群の組み合わせ等でHOの発現(誘導や抑制)を精密に制御する条件・方法を探っていきたい。ヘム鉄は、ヘムオキシゲナーゼ(HO)により分解されて、抗酸化物質ビリルビンや血管調節物質COなどを生じる。HOの誘導性アイソザイムであるHO-1は、酸化的ストレスなど種々の刺激で誘導される生体防御タンパク質であるとともに、ヘム鉄代謝系は鉄代謝系とも密接に関連している。HOの発現を調節するイソフラボン、ポリアミン、ヘム鉄などの食品成分や、HO阻害物質である金属ポルフィリン誘導体、鉄や鉄キレート剤などの鉄代謝を調節する物質などによって、ヘム代謝系を修飾することにより、疾患の治療や予防への応用可能性を検討した。抗原虫作用の評価として、ヒト回盲腺癌由来のHCT-8細胞にクリプトスポリジウム原虫を感染させ、これらの化合物が感染原虫の増殖を抑制するかどうかを調べた。その結果、鉄キレート剤であるデフェロキサミン、鉄塩、ヘム(鉄)、HO阻害剤であるスズポルフィリン化合物が、明らかに感染原虫の増殖を抑制した(小川ら、原虫感染症の治療又は予防薬.特願2008-175517)。クリプトスポリジウム感染症は、激しい下痢を引き起こす疾患で、先進国でもかなりの罹患者数が報告されている。著効を示す治療薬が存在しないため、免疫不全患者では治療が困難で、死亡する例も少なくない。従って、今回発見した鉄代謝やヘム鉄代謝を調節する化合物(群)の抗クリプトスポリジウム活性は、クリプトスポリジウム感染症治療薬・予防薬としての応用が期待される。また今回得た知見は、ヘム代謝や鉄代謝を軸とするヒトと病原微生物の相互作用についての基礎医学・基礎薬学・食品科学研究における新たな視点を提供する成果である。
悪性腫瘍における新規増殖因子ＯＧＦＯＤ１の制がん分子機序の解明

近年、OGFOD1はリボソームタンパク質のプロリン残基を水酸化する機能をもつことが報告されたが、その機能本態および癌での役割はいまだ解明されていない。私たちは、多系統の腫瘍細胞株においてOGFOD1が核に局在すること、また患者病理標本での発現解析により食道扁平上皮癌を含む多種類のがん組織でOGFOD1が高発現していることを認めた。また食道扁平上皮癌細胞におけるOGFOD1 knockdownではp21cip1の低下と細胞周期の停止が認められ、CDK阻害剤によりOGFOD1の発現低下および細胞増殖の抑制が観察された。これらの結果はOGFOD1が食道癌の増殖に必須な分子であることを示唆する。私たちはOGFOD1が、実際に多種類のヒト固形癌や脳腫瘍、血液腫瘍などのヒト悪性腫瘍細胞および病理組織に豊富かつユビキタスに発現していることを見出し、興味深いことに、これらの発現腫瘍細胞ではOGFOD1という単一の遺伝子の消長が腫瘍の増殖に大きな影響を与えることが準備研究から判明した。本申請では、OGFOD1遺伝子の発現量の正負の調節によりヒト悪性腫瘍において細胞死が惹起される分子機序を明らかにし、かつその知見に基づきOGFOD1をキー分子として利用した新たな制がん技術展開のための基盤構築にチャレンジすることを目的とする。現在までに、OGFOD1発現の増減によりp21分子の発現が変化する可能性を示唆するデーターを得た。今度、具体的なメカニズムを明らかにし、悪性腫瘍の制御基盤を確立する。近年注目を浴びているプロリン水酸化酵素のファミリー分子の一員として新たに同定されたOGFOD1の機能本態は依然として未知である。われわれはOGFOD1が、実際に多種類のヒト固形癌や脳腫瘍、血液腫瘍などのヒト悪性腫瘍細胞および病理組織に豊富かつユビキタスに発現していることを見出している。興味深いことに、これらの発現腫瘍細胞ではOGFOD1という単一の遺伝子の消長が腫瘍の増殖に大きな影響を与えることが準備研究から判明した。初年度はOGFOD1による抗腫瘍効果の網羅的解析と患者腫瘍組織を用いた免疫組織化学によるOGFOD1の発現の特徴を解析した。組織アレイを用いた解析により食道扁平上皮癌、咽頭・喉頭がん、肺扁平上皮癌などに高い発現を認め、これらの癌細胞株でのOGFOD1 knockdownは細胞増殖抑制を示した。一方、膵臓癌組織でのOGFOD1発現は低く、膵臓癌細胞株でのOGFOD1 knockdownは細胞増殖に影響を与えないが、OGFOD1の過剰発現により増殖抑制が生じることを見出した。以上のことにより腫瘍によりOGFOD1の役割が異なることが考えられる。OGFOD1はリボソームタンパク質のプロリン残基を水酸化する機能をもつことが報告されたが、その機能本態および癌での役割はいまだ解明されていない。私たちは、発生母地の異なる多系統の腫瘍細胞株においてOGFOD1発現量の増減いずれかの方向へのシフトが劇的な細胞死を誘導すること、かつ細胞死誘導が増強によるか抑制によるかが癌腫で分かれるという特徴を見出している。そこで本研究では、OGFOD1遺伝子の発現量の正負の調節によりヒト悪性腫瘍において細胞死が惹起される分子機序を明らかにすることを目的とする。患者腫瘍組織を用いた免疫組織化学により、OGFOD1は扁平上皮癌での高発現が認められとくに食道癌での発現が高いことから食道癌細胞株を用いてOGFOD1の発現および機能解析を行った。OGFOD1発現の抑制は、細胞周期の停止(G1停止)と増殖抑制を招くとともにがん抑制遺伝子であるp21Cip1遺伝子の上昇を誘導した。また、食道癌以外のいくつかのがん細胞株でも同様の現象が認められる。一方で、血清飢餓状態やCDK阻害剤による細胞培養ではOGFOD1の発現が低下すること判明した。このようにOGFOD1発現調節は細胞周期に依存し、また細胞周期を制御する機能を持つことが推察され癌の増殖に必須な分子であると考えられる。現在、食道癌を中心にOGFOD1の分子機序の解明に取り組んでいるもののin vivo解析およびOGFOD1をベースとする制がんペプチドの開発には至っていない。癌の種類によるOGFOD1の二面性の機能を具体的に明らかにし、今後のin vivo解析につなげたいと考えている。

分子生物学各種悪性腫瘍において、OGFOD1発現の強弱がp21分子の発現と相関している可能性があることを示唆するデーターを得ており、次のステップへの大きな足掛かりになったと考えられる。初年度はがん組織でのOGFOD1発現の特徴を解析することを目的としており、組織アレイや細胞株を用いた解析により癌の種類により異なる発現パターンを見出しおり、次のステップのための大きな知見が得られたと考えられる。分子間の相互作用や活性等を含めたメカニズムの解析、in vivoでの抗腫瘍効果の検討を行い、各種悪性腫瘍を制御できる技術応用への展開を目指す。今後は、OGFOD1発現制御に対し細胞死誘導に相反的反応を示す腫瘍細胞株をペアとして用いてOGFOD1結合分子を質量分析により同定・比較し、その分子機序を明確にしていく。また、制がん標的分子候補として、OGFOD1阻害ペプチドの開発や治療型組換えウイルスなどの応用による標的ツールの試作と担がんモデルマウスでの抗腫瘍効果の検討を行う。OGFOD1の作用点を明らかにするために、質量分析による解析および生化学的解析に重点を置いて使用する。とくに、質量分析はOGFOD1結合タンパク質の探索研究を遂行するために必須であり、その解析費用を最重視する。
Site Divination Practices in Premodern East Asia

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、視点を朝鮮半島に移し、当地での敷地選定と四神の出現についての研究を行う予定である。まず、敷地選定について書かれたもので、どの文献が朝鮮半島に伝えたのかを解明する。続いて、それらの文献がどのように変化、変容していったのかを調査する。この調査の出発点は、ホンキー・ユン(Hong-key Yoon)氏の2冊の著作、Geomantic Relationships between Culture and Nature in Korea(『風水の視点から見る朝鮮における文化と自然の関連性』、1976年)とThe Culture of Feng Shui in Korea(『朝鮮の風水文化』、2006年)に定めている。二人の韓国風水の専門家である、ニュージーランド・オークランド大学のホンキー・ユン教授とインシル・チョー・ユン(Inshil Choe Yoon)博士と、集中的にやりとりをする予定である。古代朝鮮の風水に関する一次資料と二次資料を追加購入し、韓国の研究者と図書館にコンタクトを試みる。(例えば、『山林經濟』の写本がある国立ソウル大学等。)本年末には、風水の国際シンポジウムを計画している。そして、そのシンポジウムでの記録を、東アジアにおける敷地選定の特別刊行物として、もしくは書籍として発行を目指す。次に、今まで自身が行った日本における敷地選定の研究結果を、最古の一次資料をはじめとして再調査し、(朝鮮の研究と)平行して徐々に前進させる予定である。年度末には、AASアジア研究協会年次総会(2017年3月16-19日トロントに於いて開催)にて、自身の研究発表を行う予定にしている。
血管新生と免疫寛容を標的とした新しい卵巣癌治療法の開発に関する基礎研究

・VASHファミリーの中で、VASH1は強制発現によりVEGFのみならずPDGFなど他の血管新生因子を産生する卵巣がんの血管新生、腫瘍増殖、腹膜播種を抑制し、宿主の生存期間を延長させることが示された。一方、VASH2はsiRNAやモノクローナル抗体を用いた阻害により、卵巣がんの血管新生、腫瘍増殖を抑制可能だった。・HGFのアンタゴニストであるNK4は免疫抑制因子IDOの産生阻害を介して、卵巣がんの免疫寛容を低下させ、腫瘍増殖を抑制した。その機序として、HGF受容体であるc-Metとその下流のシグナル経路のうち、PI3K-AKT経路が関与することが明らかになった。バソヒビン1を搭載した2型アデノ随伴ウイルスベクターを作成し、スモールスケールで調整したベクターをHEK293細胞に感染させたところ、抗バソヒビン1を用いたウエスタンブロットにより、細胞内および培養上清中へのバソヒビン1発現が確認できた。また、バソヒビン1が分泌された培養上清が、VEGFによって刺激されたヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖を抑制することを確認した。現在、動物実験に向けて大量調製を進めている。様々な婦人科悪性腫瘍のパラフィン包埋組織切片を対象に、抗バソヒビン2抗体を用いた免疫染色によりバソヒビン2の発現を検討している。様々な悪性腫瘍組織でバソヒビン2の発現が確認された。現在、臨床病理学的因子との関係を解析中である。また、様々な婦人科悪性腫瘍細胞株のバソヒビン2発現を定量的RT-PCR法で測定したところ、多くの細胞株で発現が認められた。特に子宮頸がん細胞株群において他の発がん因子と関連する傾向がみられたことから、さらなる解析を行っている。バソヒビン1強制発現細胞のIDO発現を検討したところ、これまで報告のない傾向がみられたため、再現性を検証中である。NK活性を持つ白血病細胞株(NK92、KHYG-1)に、HGF/NK4発現ベクターをリポフェクション法やエレクトロポレーション法を用いて遺伝子導入を試みているが、現時点で安定的導入株は得られていない。今後は他の遺伝子導入法を試みる予定である。・血管新生調節因子であるVasohibin-1(VASH1)遺伝子を強制発現させた卵巣がん細胞は、コントロールに比べて細胞増殖に差はみられなかった。一方、この細胞を用いたマウス動物モデルにおいて、血管新生、腫瘍増殖、腹膜播種が抑制され、生存期間の延長がみられた(Takahashi Y, Saga Y, et al. Int J Oncol 47:2057-2063,2015)。・抗VASH2モノクローナル抗体を作成した。この抗体を腹腔内に投与したところ、卵巣がんモデルマウスの血管新生、腫瘍増殖が抑制された(投稿中)。・HGFのアンタゴニストであるNK4は、免疫抑制因子IDOの産生抑制を介して卵巣がん細胞の免疫寛容を低下させ、マウス動物モデルにおいて腫瘍増殖を抑制した。その機序として、HGFの受容体であるc-Met、さらにはその下流のシグナル伝達経路の中で、PI3K-AKT経路が関与していることを明らかにした(Wang D, Saga Y et. al. Int J Oncol 43:2303-2309,2016)。婦人科腫瘍バソヒビン1搭載2型アデノ随伴ウイルスベクターの作成、および婦人科悪性腫瘍を対象とした抗バソヒビン2抗体を用いた免疫染色による検討、は予定通り遂行できている。IDOを標的とした分子標的免疫療法に関する研究は、既存の分子標的薬剤ではなく、これまで報告のみられない因子が有効である可能性を示唆する実験結果が得られ、さらなる発展が期待できる。一方、IDOを標的としたHGF/NK4による強化型ナチュラルキラー細胞療法の基礎検討は、安定的強制発現株の樹立に成功しておらず、新たな遺伝子導入法の検討を要する。バソヒビン1搭載ウイルスベクターによる血管新生抑制遺伝子治療およびバソヒビン2を標的とした血管新生抑制分子標的治療に関する検討は順調であり、このまま予定通り遂行する。IDOを標的とした既存の分子標的薬剤による分子標的免疫療法については、新たな因子との関連について検討を進める。IDOを標的としたHGF/NK4による強化型ナチュラルキラー細胞療法に関しては、他の遺伝子導入法を試みる。今年度は動物実験の実施がなく、in vitro実験中心のため、すでに購入済みの消耗品で研究遂行が可能であったため。次年度は高価な免疫不全動物を用いた実験が中心となるため、予算を全て執行する予定である。
高度耐塩性菌由来の遺伝子による塩耐性植物の分子育種

タイの塩土から分離した高度耐塩性細菌、Halomonas elongataは食塩濃度25%でも旺盛に生育し、アミノ酸誘導体であるエクトインを適合溶質として高濃度蓄積し、浸透圧を保っている。エクトインはaspartate β-semialdehydeからectA,ectB,ectC遺伝子がコードする3酵素により合成される。そこで遺伝子導入によりエクトインを蓄積する耐塩性植物の分子育種を目的とする。昨年度にCaMV35Sプロモーター支配下に置いたectA,ectB,ectC3遺伝子をタンデムに並べ、Km^rとHyg^r遺伝子を両端に置いたベクターを構築しタバコに導入した。カナマイシシとハイグロマイシン耐性で選抜した再生タバコ植物体を約20個体について、遺伝子導入を確認した。ノザン解析により3遺伝子が発現している個体を選び、耐塩性試験を行ったが、耐塩性は僅かしか上昇していなかった。しかし、野生型タバコが増殖できない600mMマンニトール存在下でも遺伝子導入タバコは旺盛な生育を示し、浸透圧耐性上昇が確認された。これは耐塩性賦与には浸透圧と有害なNa^+イオンの両者を分けて考慮しなければならないことを示唆する。そこで、植物のNa^+,K^+イオン輸送体の遺伝子をクローニングした。一つはコムギから得られた高親和性Na^+,K^+イオン輸送タンパク質のイネホモログのcDNAを得た。もう一つは酵母でNa^+イオン排出作用が知られているATPase遺伝子であるENA1導入タバコ培養細胞は野生型細胞が生育できないNa^+イオンのアナログであるLi^+イオン、120mM存在下でも生育した。今後、エクトイン蓄積、Na^+イオン取り込み、排出系を総合的に操作すれば実用耐塩性植物の育種が可能であるとの示唆を得た。タイ東北部の塩土から分離した高度耐塩性細菌、Halomonas elongataは食塩を最適濃度3%含む培地で最大増殖速度を示し、食塩濃度25%でも旺盛に生育する。その要因は高塩濃度下ではアミノ酸誘導体であるエクトイン(1,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarboxylic acid)を細胞内に高濃度に蓄積し、浸透圧を保っていることにある。エクトインを培地に添加すると大腸菌、枯草菌の増殖が高塩濃度でも可能になった。エクトインはaspartate β-semialdehydeからdiaminobutylate、N-acetyl-diaminobutylateを経て3段階の酵素反応で生合成される。H.elongataのゲノムライブラリーから得られた約4kbpのDNA断片の塩基配列から3酵素の遺伝子(反応順にectA,ectB,ectCと命名)はオペロンを成していることが解った。このオペロンを導入した大腸菌は耐塩性が上昇した。そこで本研究ではこれら3遺伝子を利用した耐塩性植物の分子育種を開始した。ectA,ectB,ectC遺伝子をそれぞれCaMV35Sプロモーター支配下に置き、3者を連結しカナマイシン耐性遺伝子とハイグロマイシン耐性遺伝子で挟んだバイナリーベクターを構築した。タバコでの3遺伝子の発現を確認するために、タバコ培養細胞(Nicotiana tabacum cv.BY2)に導入した。両薬剤存在下で選抜した独立したカルス10クローンを選びPCRでect遺伝子の存在を確認後、ノザン解析を行った結果、発現が確認された。CaMV35Sプロモーターを4つ使用しているが懸念されたジーンサイレンシングは起こっていないと思われた。そこでこれら3遺伝子をタバコ植物対に導入した。サザン解析で3遺伝子が存在する再生タバコを6個体得た。第2世代について、遺伝子発現、エクトイン蓄積、耐塩性を調べる予定である。