hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
微生物の新しい機能開発のための基盤研究

本研究は、昭和62年度から平成元年度までの3年間行ってきた重点領域研究「微生物の新しい機能開発のための基盤研究」の研究成果を取りまとめるために行ったものである。すなわち、微生物が示す多様な機能を総合的に解析することを通じて生物そのもの統一的な認識に有意義な知見をもたらすとともにそれらの成果を基盤として新しい視点に立った工業的物質生産システムを確立するための研究を基礎的かつ体系的に推進した3年間の成果の取りまとめを行った。まず、本重点領域研究に研究分担者として加わった全班員58名に、3年間の研究成果の取りまとめを依頼し、それを総合して成果報告集を作成した。本報告書は総括班員及び研究班員に送付し、全体の成果の全容を理解してもらった。なお、本報告集は244ペ-ジに及ぶものである。また、本重点領域の活動の全般を総括した研究成果総括報告書も作成した。これは、研究目標と研究組織,研究成果のまとめ(総括班の活動,研究班の研究成果の概要)を記述したものである。一方,3年間の研究成果の取りまとめに基づいてこれを平成3年度成果刊行費一般学術図書として出版する方策について協議を重ねた。その結果,書名「微生物の機能開発ーバイオ研究の最前線ー」,出版社学会出版センタ-,ペ-ジ数360頁,判型B5判,定価13000円として出版することとし、その準備を進めた。全班員の研究成果を充分に検討し評価した結果、30人を選び、出版のための原稿の執筆を依頼し、平成3年度成果刊行費一般学術図書計画調査を提出した。さらに、集まった原稿について研究分担者が分担して内容,スタイルについて検討し、数度にわたり打ち合せを行い、出版準備を完了した。
領域分割法を用いた直接法の超並列計算アルゴリズムについての研究

半導体などの開発に必要なデバイスシミュレーション等では、大規模線形連立方程式の高速・高精度な解法が求められている。高速解法の一つとして並列計算手法が有効であることが近年報告されている。スーパーコンピュータなどの計算機を用いた場合にも内部処理的には並列化されているが、並列粒度が小さく逐次処理部に大きな影響を受けてしまい十分な効果を得ることは困難である。これに対して、本研究で用いる物理モデルを考慮に入れた領域分割法を用いた並列計算手法は、大きな並列粒度を得ることが可能であり、実際の並列計算機を用いた数値実験においても効果が得られている。従来は、半導体などの物理モデルを規則的に空間分割を行いこれに対する並列スケジュールを提案したが、任意形状のモデルに対しては対応できなかった。本年度の研究目的は、(1)任意形状の空間分割に対する並列スケジュールの拡張、(2)このときの計算精度の検討である。任意形状の分割スケジュールは、従来の分割スケジュールを拡張することで可能になると考え、分割数を変えずに分割する箇所を変更するスケジュールを提案した。分割箇所を変更することで各部分領域ごとに精度を変更することが可能になった。しかし、従来のスケジュールと同様に解析領域の精度を上げるために分割数を増加させた領域は他の領域に対して多くの時間を必要としている。しかし、実際の高並列計算機AP1000を使用して評価を行った結果は、従来の並列スケジュールと同様に有効であった。しかし、プロセッサと部分領域間のマッピングが十分でなく、計算を行わないプロセッサが生じて効率の問題が残っている。また超並列計算機の計算精度を検討するために、この並列計算機に適したアルゴリズムが必要になる。このアルゴリズムとして、巡回セールスマン問題に対する並列遺伝的アルゴリズムを提案した。
M2マクロファージを介した新規変形性膝関節症疼痛惹起機構の解明

OA患者の滑膜組織、OAモデルマウスを用いてM2マクロファージとOA疼痛との関連性を検討する(1、2)。M2サブタイプM2a, M2cによるOA疼痛惹起機構を明らかにする(3)。1全人工膝関節全置換術(TKA)時に採取したOA患者の滑膜組織を用いてM2マクロファージマーカーと疼痛との関連性を検討する。2薬剤誘発および自然発症OAマウス(STR/Ort)の関節内にM2マクロファージ除去剤を投与後、滑膜組織における種々の神経ペプチド発現レベルを検討する。3ゲノム編集により作製したM2a,M2c由来神経ペプチドノックアウトマウスを用いてM2由来神経ペプチドの疼痛への関与を検討する。
土壌過湿がダイズの光合成と窒素代謝に及ぼす影響

ダイズは,過湿条件におかれると地下部からの窒素供給が著しく制限されるために,体内窒素が不足して乾物生産ならびに子実収量の低下をきたすことを著者らは明らかにしているが,本研究では,近年広く試みられるようになってきた開花期以降の窒素追肥が湿害軽減に有効であるかどうかについて検討を行った.本研究は,圃場実験とポット実験から成り立っている.圃場実験では,湿害発生後の窒素追肥が子実収量に及ぼす影響について検討した.その結果,窒素追肥が子実収量の回復に有効であることがわかったので,そのメカニズムを明らかにするためにポット実験を行った.1.水田転換畑でダイズ品種タマホマレを栽培し,花芽分化期に畦間に58cmの深さに水を溜めて過湿処理を行った.過湿処理終了後,硫安を窒素成分で12gm^<ー2>追肥した。その結果,無過湿区では追肥をしても増収しなかったが,過湿区では追肥により1718%増収した.増収は,莢数の増加によってもたらされた.2.窒素追肥による莢数増加の原因について調べた.水田土壌を充填したポットにタマホマレを栽培し,花芽分化期に地下水化が57cmとなるようにポットを水槽につけた湿潤区,地上水位が23cmとなるようにした湛水区,ならびに適宜潅水した適湿区を設け,過湿処理終了後に硫安をポット当たり5g施用した.湿潤区と湛水区の非追肥区では,総節数と筋当たり莢数が減少した.その結果,総莢数が減少して子実収量が低下した.一方,湿潤区と湛水区の追肥区では,節当たり莢数が増加することによって総莢数の増大がもたらされ,子実収量が回復した.節当たり莢数の増加は,窒素追肥によって光合成速度が増大した結果と考えらた.ダイズは,過湿条件におかれると地下部からの窒素供給が著しく制限されるために,体内窒素が不足して乾物生産ならびに子実収量の低下をきたすことを著者らは明らかにしているが,本研究では,近年広く試みられるようになってきた開花期以降の窒素追肥が湿害軽減に有効であるかどうかについて検討を行った.本研究は,圃場実験とポット実験から成り立っている.圃場実験では,湿害発生後の窒素追肥が子実収量に及ぼす影響について検討した.その結果,窒素追肥が子実収量の回復に有効であることがわかったので,そのメカニズムを明らかにするためにポット実験を行った.1.水田転換畑でダイズ品種タマホマレを栽培し,花芽分化期に畦間に58cmの深さに水を溜めて過湿処理を行った.過湿処理終了後,硫安を窒素成分で12gm^<ー2>追肥した。その結果,無過湿区では追肥をしても増収しなかったが,過湿区では追肥により1718%増収した.増収は,莢数の増加によってもたらされた.2.窒素追肥による莢数増加の原因について調べた.水田土壌を充填したポットにタマホマレを栽培し,花芽分化期に地下水化が57cmとなるようにポットを水槽につけた湿潤区,地上水位が23cmとなるようにした湛水区,ならびに適宜潅水した適湿区を設け,過湿処理終了後に硫安をポット当たり5g施用した.湿潤区と湛水区の非追肥区では,総節数と筋当たり莢数が減少した.その結果,総莢数が減少して子実収量が低下した.一方,湿潤区と湛水区の追肥区では,節当たり莢数が増加することによって総莢数の増大がもたらされ,子実収量が回復した.節当たり莢数の増加は,窒素追肥によって光合成速度が増大した結果と考えらた.近年,水田転換畑におけるダイズの作付が増加してきたが,湿害が大きな問題として生起してきた。光合成は物質生産の基礎であるが,土壌の過湿が光合成に及ぼす影響についての研究はきわめて少ない。本研究においては、過湿条件下における光合成低下の原因について,窒素代謝(根による窒素吸収と根粒による窒素固定)との関連において究明するとともに,その対策についても検討した。そのために,まず花芽分化期に土壌の過湿処理を行い(地下水位を57cmとした湿潤区と地上水位23cmとした湛水区を設けた),葉位別に光合成速度ならびに窒素含有率を測定した。その結果,光合成速度ならびに窒素合有率に対する処理の影響は,処理別に比較すると湛水区の方が著しく,また葉位別に比較すると下位葉の方が著しかった。葉身窒素含有率と光合成速度とには高い正の相関関係が認められたが,これより過湿処理による光合成速度低下の主要な原因は,葉身窒素含有率の低下であると推察された。そこで,この対策として葉身窒素含有率の低下を補うために,過湿処理終了後に窒素追肥(硫安)を行った。その結果,両処理区とも根粒による窒素固定は著しく減少したが,根による窒素吸収が増加して総窒素同化量が増え,葉身窒素含有率も高まった。そのために光合成速度が高まり,個体当たりの光合成速度も高まって乾物生産が増大した。また,窒素追肥による葉身窒素含有率と光合成速度の上昇は,下位葉ほど顕著であった。

窒素追肥は子実収量の増加に対しても効果があった.すなわち,土壌過湿後に窒素追肥をすることにより,莢数が増加した結果子実収量は増えた。そして,莢数増加は落花・落莢の減少によってもたらされた。水田転換畑で栽培したダイズに土壌の過湿処理を行うと,乾物生産が減少して子実収量が低下することを著者らは明らかにしている。土壌過湿による乾物生産の減少は,光合成速度の低下に起因すると考えられるが,ダイズをはじめとして,土壌過湿が光合成速度に及ぼす影響について検討した報告例は少ない。ところで,作物の個体は葉齢の異なる種々の葉身で構成されているが,各葉身における光合成速度はその葉齢によって過湿障害の受け方が異なることが予想される。本研究では,ダイズ品種タマホマレを供試して,開花期と登熟期に土壌の過湿処理を行い,これが葉位別光合成速度に及ぼす影響について検討するとともに,圃場における土壌過湿による減収機構についても考察した。土壌の過湿処理は,地下水位を57cmに維持した湿潤区,地上水位を23cmとした湛水区を設け,7日間実施した。光合成速度は携帯用光合成蒸散測定装置を用いて,屋外で測定した。その結果,1.湛水区では,いずれの葉位においても生育段階にかかわりなく,光合成速度は顕著に低下した。2.湿潤区では生育段階により異なり,開花期ではいずれの葉位の光合成速度も顕著に低下したが,登熟期になると,葉齢の進んだ葉以外はあまり低下しなかった。3.過湿処理による光合成速度の低下は,開花期においては莢数の減少を,登熟期においては粒重の減少を引き起こし減収の原因になったものと考えられた。
スーパーコイル化因子の生体内における機能解析

ショウジョウバエのDNA超らせん化因子(SCF)は、トポイソメラーゼIIと協調してDNAに負の超らせんを導入するタンパク質である。DNAの超らせん構造は転写や複製に重要な役剤を担うと考えられているが、真の生物学的意義については未だ謎が多い。SCFの生体内における機能を明らかにするため、RNAiを利用した解析を行ったところ、SCFの発現量低下によりX連関遺伝子群の発現レベルが雄特異的に低下すること、そして雄特異的致死性を示すことを見出した。さらに、SCFと遺伝子量補正遺伝子群(MSL遺伝子群)とが、遺伝学的・生化学的な相互作用を示すことから、SCFが遺伝子量補正機構に関与していることが強く示唆された。ショウジョウバエでは、雄X染色体の転写量を倍加することにより遺伝子量補正が成されており、MSL遺伝子産物がクロマチンの活性化に必須であることから、SCFはMSL複合体による活性クロマチンの構築に重要な役割を果たすと考えられる。以上の成果をまとめ、現在論文を投稿中である。上記の結果に加え、腹部体節のアイデンティティーを支配するHox遺伝子、Abd-Bの変異体を用いた解析により、SCFがAbd-Bの発現制御に関与している事を示唆する結果を得た。さらに、Abd-Bの発現制御領域として同定されているFab-7エレメントを欠損した変異体を用いた解析から、SCFがFab-7を介したAbd-Bの発現制御に寄与している可能性を示した。Hox遺伝子群の発現制御に関しては、ポリコーム遺伝子群およびトリソラックス遺伝子群の解析を中心として、クロマチン構造変換/修飾による制御機構の存在が示されてきた。しかし、広範な非コード領域を含むクロマチンドメイン単位での制御を説明する上では未だ謎が多い。SCFがDNAのトポロジー変化を介してこのメカニズムに関与しているのではないかと考え、現在解析を進めている。DNAスーパーコイル化因子、SCFの生体内における機能を明らかにするため、RNAiを利用した解析を行ったところ、SCFの発現低下に伴って雄特異的致死性が観察された。ショウジョウバエの雄特異的致死に関する遺伝子群は既に数種報告されており、これらの遺伝子産物はMSL複合体を形成して遺伝子量補正に関与することが示されている。ショウジョウバエでは、X染色体上の遺伝子発現を倍加することにより、遺伝子量補正が成されている。この際、転写量の増大を担うクロマチン構造変換が重要であることが報告されているが、そのメカニズムは不明である。scfのRNAiが示す雄特異的致死性から、この超活性クロマチンの構築にSCFが関わるのではないかと考え、解析を進めている。まず、scf遺伝子座を含む領域を欠損した系統およびMSL複合体構成因子群の変異体等を用いた解析を行い、scfとmsl遺伝子群の間に遺伝学的相互作用があることを示唆した。また、初期胚核抽出液を用いた免疫沈降法により、SCF-TopoII複合体がMSL複合体と生体内で相互作用していることが示唆された。さらに、MSL複合体が関与して遺伝子量補正が成されていることが知られている数種類のX連関遺伝子群について、scfのRNAiによるそれらの転写活性への影響を解析した。リアルタイムRT-PCRを用いた解析の結果、これらの遺伝子はRNAiによってSCFが欠損した雄でのみ転写レベルが低下していた。以上の結果はSCFがMSL複合体を介した遺伝子量補正機構におけるhypertranscriptionに関与することを示唆している。また、ヒストンアセチル化酵素MOFの変異体およびSCF過剰発現系統等を用いた唾腺染色体の解析により、X染色体上におけるSCFの機能にはMOFによる高アセチル化状態が重要であることが示唆された。
新規希土類金属錯体の合成とその重合触媒への応用

1.新規モノCp型希土類金属錯体の合成とその重合触媒作用2つのCpアニオンを配位子とする希土類金属錯体は高いエチレン重合活性を有することが知られている。この2つのCp環の一つを他のモノアニオンで置き換えることを試みた。そのモノアニオンとしてアリルあるいはベンジル型のものを用いることとしたが、これらのモノアニオンはCp環に比べて立体的、電子的に中心金属の配位不飽和性を向上させると予想されるので、その結果としての高重合活性が期待できる。しかしCp環とアリル基、ベンジル基を結合させこれをジアニオンをして錯体の形成を試みたが、安定にこれらを単離することができなかった。そこでアリルアニオンよりも中心金属への供与電子数の多いプロパルギルアオン、およびベンジル基の芳香環に窒素原子を導入したピコリルアニオンを用いて錯体の安定化を試みた。期待どうりにこれらの配位子を有する新規希土類金属錯体を単結晶として単離することに成功した。そしてこれらの錯体を反応性の高いアルキル錯体へと誘導したところ、非常に高いエチレン重合活性を有する錯体が得られた。これらのCp-アリル、ベンジルを基本骨格とする新規希土類錯体に種々の化学的な修飾を施すことによって今後さらに高重合活性を有する錯体触媒の開発へと展開する予定である。2.2,6-ジアルコキシフェニル基(Ph^★)を配位子とする新規希土類錯体の合成ペンタメチルシクロペンタジエン(Cp^★)に代わる新規モノアニオン性の配位子として2,6-ジアルコキシフェニル基(Ph^★)を用いることを試みた。Ph^★はCp^★にくらべてやはり立体的、電子的に中心金属の配位不飽和性を向上させると予想される。現在Ph^★_3Sm、Ph^★_4SmLiといった錯体の合成に成功しており、今後Ph^★_2LnR型の希土類アルキル錯体の合成を目指す。
磁性を利用した遺残ガーゼ検知システムの構築と臨床応用

手術時、不注意によって、体腔内に残される遺残ガーゼは、今日、代表的な医療ミスのひとつである。その防止は、単純な数合わせだけでは不十分で、現在、バリウム糸を一本組み込んだ手術用ガーゼが市販されている。しかし、バリウム糸組み込みガーゼの検出には、レントゲン撮影を要するという欠点がある。我々は、手術終了時に、"より簡便かつ確実に遺残ガーゼを検出する"新しい方法の確立を目指し、磁性糸を組み込んだガーゼを作成し、磁性ディテクターとの組み合わせによる検出システムの開発研究を行った。(特開平10-277082)初年度は、コバルト系アモルファス金属繊維(ユニチカ社製作:構成元素CoFeSiB)のモノフィラメント糸(φ50μm)一本を織り込んだガーゼを作成し、"アモガーゼ"と命名した。試作したアモガーゼを用いた豚実験で、ディテクターを体表に接触させると、ガーゼは閉創後、遺残なく検出され、かつ、使用したハンドヘルディテクター(ユニチカ社製)はアモルファス金属糸のみに反応し、手術場の各種金属類には反応しないところから、その有用性は証明された。しかし一方でガーゼの形状に対応して、磁性糸の検出に限界が(3cm7cm)があることも明らかになった。(磁性を利用した遺残ガーゼの検知システムの構築第13回日本コンピュータ外科学会大会論文集31-32 2004)次年度は、引き続きアモガーゼを作成し、検出限界の距離延長につき検討した。2枚のボードが一組となった検出用ディテクター(AMOS専用検出器、株式会社リンテック)を用いた測定で、検出距離は30cm50cmと、約10倍と検出距離が延長され、一枚のボードをあらかじめ手術台へ敷きこむことにより、肥満症例においても確実な検出の可能性が示唆され、臨床応用への展望が開かれた。コバルト系アモルファス金属繊維(ユニチカ社製作:構成元素CoFeSiB)のモノフィラメント糸(φ50μm)一本を織り込んだガーゼ(以下アモガーゼ)を作成した。検知器としては昨年度購入した市販のハンドヘルドディテクタ(meto社製)を使用した。最初に手術台や各種の金属製鉗子類の存在下で本検知システムの有用性に関し、検証を行った。本検知システムはアモガーゼのみに反応し、他の金属製の手術用機材には一切反応しなかった。検知可能範囲の計測として、検知器とアモガーゼとの距離およびアモルファスガーゼの形状を変化させ感知限界を方眼紙上にプロットした。アモガーゼは4つ折りにした場合の感知距離が85mmであり、球状にした場合がもっとも感知距離が小さく25mmであり、形状によって感知距離に差が出ることが確認された。平面方向については、方眼紙上にアモガーゼを置き平行に移動させプロットした。結果として原点座標を中心とした傾いた2つの楕円形の範囲で検知距離が徐々に拡大していくことが確認された。有用性に関して、豚を使用した動物実験を行った。開腹下でさまざまな形状としたすべてのアモガーゼの検出に成功した。本検知システムは、検出性の簡便性や迅速性ならびに浸襲性の全ての面で従来のレントゲン糸に比べ優れていたが、検出可能距離にはアモルファス金属糸の形状に伴いある程度の限界があることも明らかとなった。そのために今後は検知範囲の領域の拡大のためのコイル形状の研究およびアモルファス磁気金属の織り込み法についての研究を行う予定である。
内臓感覚による情動形成における前頭前野・前帯状回の役割

ヒトの内臓感覚を作る脳部位はどこで、どのように制御されるのかを解決することが本研究の目的である。本研究では以下の仮説を検証した。仮説1:消化管の刺激位置により、内臓感覚を作る脳部位が異なる。仮説2:催眠暗示により前頭前野と前帯状回機能が変化し、内臓感覚が変化する。仮説3:感覚刺激による条件づけに関連する脳賦活様式はセロトニントランスポーター遺伝子多型(5-HTTLPR)の影響を受ける。対象は成人333名である。直腸(n=14)ならびに下行結腸(n=15)にバッグを挿入し、圧伸展刺激を加え,H2^<15>Oを静注し、positron emission tomography (PET)を行った。直腸刺激においては、更に鎮痛、中性、過痛の催眠暗示を与えた後に圧伸展刺激を加えた。得られた局所脳血流量(rCBF)のPET画像はSPM2で分析した。304名では採血して5-HTTLPRを分析し、I/I(n=10)、I/s(n=10)、s/s(n=10)各多型を抽出した。白色雑音を聴取させた直後は無刺激とし、高調音を聴取させた直後に左足背に電気刺激を加え、条件づけを行った。この間、脳のfunctional magnetic resonance imaging (fMRI)を施行し、得られた画像の遺伝子多型による反応差を分析した。下行結腸刺激は直腸刺激に比し二次感覚野、背外側前頭前野、内側前頭前野、前帯状回をより賦活化した(p<0.001)。鎮痛暗示下の直腸刺激は、中性暗示に比し、下部頭頂皮質、背外側前頭前野(右)、内側前頭前野、内側前頭皮質のrCBFを有意に増加させた(p<0.001)。条件刺激時の縁上回活動は有意に5-HTTLPR多型間で異なり(交互作用p=0.008)、I/I型はs/s型よりも有意に活動が高かった(p<0.05)。無害刺激時の眼窩前頭皮質(主効果p=0.001)、橋(交互作用p=0.008)活動に有意な5-HTTLPR多型差が見られ,I/I型に比し、s/s型が有意に眼窩前頭皮質活動は低く(p<0.05)、橋活動が高かった(p<0.05)。消化管の刺激位置により、脳賦活部位は異なっていた。催眠暗示により前頭前野と前帯状回機能が変化し、内臓感覚も修飾された。条件刺激と無害刺激時の縁上回、眼窩前頭皮質、橋の活動に5-HTTLPR多型差を認めた。条件刺激と無害刺激時の縁上回、眼窩前頭皮質、橋の活動に5-
MIMダイオードによる遠赤外光源の開発とその発生メカニズムの解明

MIMダイオードを用いた周波数可変遠赤外光の発生では、これまでは経験的に、2波混合ではW-Ni、3波混合ではW-Coダイオードがバイアス無しで用いられてきた。本研究では、色々な金属をダイオードのベースとしてテストした結果、3波混合では、バイアス無しの状態でW-FeダイオードがW-Coダイオードと同等以上の効率を持つことがわかった。次に、これらのダイオードにバイアスを印加した場合の遠赤外光強度の変化を調べた。W-Coを3波混合で使用した場合、W-Niを2波混合で使用した場合の何れの場合もバイアスを印加すると遠赤外光強度は減少した。これは、これまでの経験的なMIMダイオードの使用が妥当であったことを示す。しかし、2波混合に関しては、W-Fe,W-Coダイオードにバイアスを印加した方が、W-Niダイオードをバイアス無しで用いるよりも数倍大きなパワーが得られた。これは、今後、微弱な遷移の測定や非線形分光を行う上で有用である。トンネル電流による遠赤外光発生のメカニズムに単純なモデルを適用し、MIMダイオードの非線形効果を計算した。しかし、そのような計算では観測されたバイアス特性を説明することはできなかった。そこで、直流に対する電流-電圧特性を測定し、その結果から非線形効果の大きさを見積った。そして、赤外光の検出、遠赤外光の放射、バイアスに対する応答というMIMダイオードの3つのメカニズムに対し簡単な等価回路を適用して解析することにより実験結果を説明できた。また、より高い周波数領域で、MIMダイオードの特性を測定するため、^<13>CO_2レーザーの発振を試みた。初め、市販の^<13>CO_2レーザー混合ガスを用いたが、発振が10分程度で止まるという現象が起きた。これは、自前の混合ガスでも同様であった。我々の炭酸ガスレーザは、loss抑制のために鏡や回折格子がレーザー管内にあるため、通常のタイプよりも真空度が悪い。これが原因として考えられ、その点を改善してテストを継続中である。
自己反応性B細胞の分化・機能成熟制御システムの解明

本研究は、免疫抑制受容体PD-1を欠損させたマウスが発症する自己免疫疾患について、それらの発症機序を解析することにより、PD-1による自己反応性B細胞の制御機序、ひいては自己免疫疾患発症制御機構を解明することを目的としている。これまでに、BALB/c-PD-1欠損マウスにおける自己免疫性胃炎の発症には抗体のクラススイッチと親和性成熟が必須であるという結果を得ている。より重度の胃炎を発症するNOD.H2b-PD-1欠損マウスにおいてクラススイッチと親和性成熟の関与を検討したが、マウスの飼育環境が変化したためか、胃炎の発症頻度と重症度が大幅に低下しており、明確な結果が得られなかった。そこで、PD-1と協調的に自己免疫疾患の発症を制御することを近年見出したLAG-3について、LAG-3の機能を時間特異的に阻害する目的で抗マウスLAG-3モノクローナル抗体の作製を試みた。その結果、既に報告されているものよりもin vitroでの阻害活性が100倍以上高い抗体を得ることに成功した。胃炎モデルに加え、他のモデルを用いた解析を行った。腸管内に存在するCX3CR1強陽性のミエロイド系細胞が腸炎の発症を抑制すること、またこの細胞集団がPD-L1を強く発現しているもののPD-1シグナルは抑制機能には関与しないことを明らかとした。また、BALB/c-PD-1欠損マウスの胸腺を新生仔期に摘出することにより誘発される自己免疫性肝炎モデルの解析から、TNFを介したCCL20の肝臓における発現増強が、肝炎の発症に必須であることを明らかとした。さらに、抑制性Fc受容体FcγRIIBとPD-1の二重欠損マウスが間質性膀胱炎を自然発症すること及びTNFの発現が膀胱と胃において上昇していることを見出した。これらの結果から、PD-1欠損マウスが発症する自己免疫症状にはTNFが重要な役割を果たすことが示唆された。免疫抑制受容体PD-1を欠損させたマウスは、BALB/c系統において自己免疫性胃炎を自然発症するが、本胃炎の発症には、抗体遺伝子のクラススイッチ組換えと体細胞突然変異が必須であることを、これまでの研究において明らかとしている。本研究では、BALB/c-PD-1欠損マウスに発症する胃炎をより詳細に解析することにより、PD-1がどういった細胞のどういった機能を抑制することにより、自己反応性8細胞の分化、活性化、機能成熟等を制御し、自己免疫疾患の発症を抑制しているのかを明らかとすることを目的としている。平成22年度には、より重症の胃炎を自然発症するNOD.H2b-PD-1欠損マウスの脾臓細胞およびリンパ節細胞をミエローマ細胞と融合し、胃壁細胞特異的な自己抗体を産生するB細胞ハイブリドーマを3種類樹立することに成功した。今後、これらのハイブリドーマより自己抗体を大量に精製してマウスに投与し、自己免疫性胃炎の惹起を試みる予定である。また、NOD.H2b-PD-1欠損マウスと抗体遺伝子のクラススイッチ組換えと体細胞突然変異が全く起こらないAID欠損マウスとの交配実験を開始した。上記に加え、PD-1とは別の免疫抑制受容体であるLAG-3という分子が、PD-1と協調して自己免疫疾患の発症を制御していることを見出し、両分子による協調的な役割について解析した。その結果、PD-1とLAG-3が相加的にT細胞の抗原刺激による活性を抑制すること、また両分子を欠損する場合でも制御性T細胞の機能には大きな異常が認められないことを明らかとした。
土壌微生物の細胞形態変化による低濃度基質利用機構の解明

本課題では、硝化菌細胞凝集体は生育に不利な環境で生存能力が優れていることを示すことを目的とし、次の結果を得た。安定的に増殖するNitrosoglobus属のアンモニア酸化細菌凝集体には10%程度の従属栄養細菌が共存していた。Nitrosoglobus属新種の存在を明らかにし、それらが亜硝酸酸化菌・従属栄養細菌と細胞凝集体を形成し共存することを示した。酸性環境に適応したCOMAMMOX菌の存在を明らかにし、この菌は複数種の従属栄養菌と凝集体を形成していることを示した。これらの結果から硝化菌とある種の従属栄養菌は凝集体中で共存し劣悪な環境に適応していると考えられた。培養微生物の活性に比べ土壌中の微生物活性のエネルギー源や炭素源に対する基質親和性が高いことは古くから知られている。しかしこのギャップの原因は未だに不明である。特に硝化反応では、純粋培養の硝化菌に比べて土壌の硝化のアンモニアに対する親和性は高く、より低濃度のアンモニアを酸化する。我々は独自に分離した耐酸性アンモニア酸化細菌(TAO株)のゲノム情報と培養実験から、細胞凝集体が微生物の土壌における低濃度基質に適応した存在形態で、独自の基質取り込み機構を持つとの仮説を得た。本課題では、土壌中で硝化菌は細胞凝集体を形成し、純粋培養菌(単細胞遊離状態)よりも低濃度の基質(アンモニア=エネルギー源)を効率的に利用することを明らかにする。本年度は、土壌から直接生きたままの細胞凝集体をセルソーターで分取する方法を確立するために、TAO株をアンモニア濃度と培地pHを変えて培養して、様々な大きさの細胞凝集体を調製する方法について検討した。その結果、培養時間を長期するほど凝集体が成長し大きくなった。しかし培養のタイミングによっては凝集体を形成しないなど不安定な場合もあった。これらのことから、TAO株の情報だけでは、土壌からの硝化菌凝集体の分離に必要な情報が限定されると考え、TAO株と類似の酸性耐性型のアンモニア酸化細菌をTAO株を分離した地域とは地理的に異なる地域からの分離を試み、細胞凝集体を形成するアンモニア酸化細菌の分離に成功した。これらはいずれもγプロテオバクテリアに属すると推定された。本年は、目的とするアンモニア酸化細菌のマイクロコロニーをその形状情報に基づいてセルソーターで分離するために必要なマイクロコロニーの物理的性状に関する情報を得るために、我々が独自に分離した新属新種の耐酸性アンモニア酸化細菌(Candidatus Nitrosoglobus terrae TAO株)を様々な条件で培養し、細胞凝集体を形成させた。これは細胞凝集体の前方散乱光(大きさ)と側方散乱光(複雑さ)に関する情報を得てセルソーターで分離するためである。培地に緩衝液を入れpHを一定にすると細胞が単細胞状態に分散して凝集体を形成しなかったが、緩衝液を加えずに酸性化する過程で凝集体を形成した。このことからpHを変動させて様々な大きさの凝集体を得ることとした。しかし凝集体が単細胞化することなく凝集体として増殖するため、セルソーターで分別できる大きさよりさらに大きな凝集体となった。また植菌のタイミングによっては単細胞状態で増殖するなど凝集体を形成しないことがあった。このことは凝集体形成の発現に関する遺伝子レベルでのメカニズムの検討の必要と考えられた。一方、一菌株では情報が限定されるので、TAO株と類似の酸性耐性型のアンモニア酸化細菌を新たに3株分離した。以上により本年度は達成目標に届かなかったものの、γプロテオバクテリアに属する3株のアンモニア酸化細菌を分離し細胞凝集体の形成を確認するという成果を得た。以上を総合して計画通りの進捗と判断した。純粋培養の微生物に比べて土壌に存在する微生物のエネルギー源や炭素源に対する基質利用能力は高く、生存能力が優れていることは古くから知られている。しかし純粋培養と土壌中におけるこのギャップのメカニズムは不明である。特に硝化菌(アンモニア酸化細菌)は、純粋培養に比べて土壌の硝化反応におけるアンモニアに対する利用性は高く、より広範囲の濃度のアンモニアを酸化する。我々は独自に分離した耐酸性アンモニア酸化細菌(TAO株)のゲノム情報と培養実験から、細胞凝集体は微生物の土壌における広範囲の基質濃度に適応した存在形態で、独自の基質利用機構を持つとの仮説を得た。本課題では、土壌中で硝化菌は細胞凝集体を形成し、純粋培養に比べてより広範囲な環境条件で良好に生育する機構を検討する。本年度は、我々が独自に分離した凝集体を形成するTAO株と類似の酸性耐性型のアンモニア酸化細菌を分離した。得られた菌株の細胞凝集体をメタゲノム解析したところ、共通する硝化菌以外の菌株の存在が明らかになった。また耐酸性凝集体の一つはγープロテオバクテリアに属するアンモニア酸化細菌と耐酸性亜硝酸酸化細菌が共存し、この2株を中心に十数種の細菌から凝集体を形成していた。これらは広範囲のアンモニア濃度、pHあるいは抗生物質存在下でも生育した。一方、耐酸性完全硝化菌を中心とする複数種の細菌からなる細胞凝集体を得た。これらの細菌集団は安定的に維持された。このことから細胞凝集体は硝化菌を中心に形成された複数種の細菌から成り、これまで雑菌と思われていた細菌が硝化菌が安定的に生存する凝集体の形成に役立っており、土壌中の硝化菌の生存を支えていると推察された。

本課題では、硝化菌細胞凝集体は生育に不利な環境で生存能力が優れていることを示すことを目的とし、次の結果を得た。安定的に増殖するNitrosoglobus属のアンモニア酸化細菌凝集体には10%程度の従属栄養細菌が共存していた。Nitrosoglobus属新種の存在を明らかにし、それらが亜硝酸酸化菌・従属栄養細菌と細胞凝集体を形成し共存することを示した。酸性環境に適応したCOMAMMOX菌の存在を明らかにし、この菌は複数種の従属栄養菌と凝集体を形成していることを示した。これらの結果から硝化菌とある種の従属栄養菌は凝集体中で共存し劣悪な環境に適応していると考えられた。独自に分離したアンモニア酸化細菌を用いて、細胞凝集体の形成条件等を検討した。細胞凝集体の形成は条件によって異なることから、遺伝子レベルでの制御機構の存在が推定された。さらに正確な情報を得るために、凝集体を形成する耐酸性アンモニア酸化細菌を新たに3菌株分離した。新たな菌株の分離は当初計画にはなかったが、凝集体形成に関する情報を得るには1菌株では不足と考え実施した。これらの分離菌株のゲノム情報の比較により、単細胞状態と凝集体状態のアンモニアや酸性耐性のメカニズムを検討し、また凝集体の特性を明らかにする予定である。微生物生態学菌株の分離と培養実験などに時間を要したため、高額試薬の使用量や次世代シーケンサーの稼働回数が予定よりも少なかった。また途中から微生物の分離にも着手したため、遺伝子解析等が次年度にまたがることになった。以上によりの高額試薬の使用が次年度にずれ込んだ。このため平成28年度分の予算執行が予定より少なく次年度使用額が生じた。平成29年度は、環境DNAとRNAさらには分離菌ゲノム解析、トランスクリプトーム解析などを実施するため次世代シーケンサーを多数回稼働する。また分析壌サンプルが増え、これらからRNAやDNAの抽出するために高額試薬の使用が多くなる予定であり、これらにかかる経費を支出する。また一連の遺伝子解析作業では、熟練のテクニシャンを雇用し、効率的に実験を進めるために、賃金を支出する予定である。以上により適正な予算執行を計る。
ホヤ背索周囲に見出された神経分泌細胞群の研究

脊椎動物にのみ存在する腺性下垂体の系統的起源は、原索動物にまでさかのぼって何らかの姿がとらえられるとの推論から、神経複合体を中心に電顕による広範な検索を行い、背索に沿って散在する内分泌細胞群を発見した。これらの細胞は内分泌細胞である点から、下垂体細胞と相同である可能性が考えられた。当該研究はこれを探る目的で始められ、相同であることを示すいくつかの証拠を得た。それらは、(1)プロラクチン(PRL)陽性細胞の存在:いくつかのプロラクチン抗体のうち、両生類、特にウシガエルPRLに対する抗体に強く反応する一群の細胞がある。その陽性反応はそれらの細胞のもつ分泌顆粒によることが免疫電顕法により示された。ホヤ以外の無脊椎動物ではPRL陽性細胞の存在は知られていない。(2)生殖腺刺激ホルモン(GTH)陽性細胞の存在:いくつかの魚類のGTH-II型に対する抗体で濃染する細胞群がある。(3)副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)陽性細胞の存在:いくつかのACTHに対する抗体で染色される細胞群がある。ACTHと共通の前駆体(POMC)より生ずるbeta-エンドルフィンに対する抗体でも染色される。しかし、成長ホルモン(GH)と甲状腺刺激ホルモン(TSH)の存在を示唆する証拠は得られなかった。他の原索動物でも存在は知られていない。この他に下垂体と密着な関連をもつ生殖線刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)産生ニューロンが、ホヤでは神経節と背索周囲に局在し、背索周囲では隣接の内分泌細胞に突起を伸ばして接触している。これらは脊椎動物の視床下部-下垂体系に相当する構造と考えている。また、ホルモン物質の構造解明の有力な手段となるモノクローナル抗体を二種作製し、現在一種を用いて研究を継続中である。当該研究に関わる成果としては、学会発表7編、シンポジューム2編、国際会議1編、原著論文1編があり、さらに原著論文1編を作製中である。大型のアカボヤ約1000個体とマボヤ約250個体、合計で約半トンの材料を使用し、免疫組織化学用、電顕観察用、モノクローナル抗体作製用および化学分析用の試料を作成または採取し保存した。(1)免疫組織化学的方法の結果は、マボヤとアカボヤで反応結果に若干の違いがみられたため、マボヤを中心に反応を調べた。その結果、これまでに明らかにされているLHRH陽性細胞およびACTH陽性細胞に加え、PRL陽性細胞が神経節および背索に局在することを見出した。さらに、Met-enkephalin様物質およびβ-endorphin様物質をもった細胞が両者に局在することもほぼ明らかとなった。しかし、いずれの物質も我々の結果からは神経腺には存在しないと思われる。(2)電顕観察により、マボヤと同様、アカボヤの神経節および背索中に分泌顆粒をもつ細胞が多数みいだされた。(3)分泌顆粒中の物質を抽出するため、Potassiumを加えてexocytosisを促し、SDS-PAGEで展開したところ、コントロールにはない強いバンドが得られた。(4)アカボヤの神経腺と背索の複合体をホモジネートにしてBALB/cマウスを免疫し、神経腺上皮・背索本体・神経節全体を特異的に染色するモノクローナル抗体を得た。

また、背索に沿って散在する神経分泌細胞群を特異的に染色するモノクローナル抗体も得たが、細胞増殖能が弱く、残念ながら消失した。(5)化学分析用として約500個体分の神経節と神経腺・背索複合体を採取し保存した。今年度もアカボヤおよびマボヤを材料(合計で約500キログラム)とし、免疫組織化学用、電顕観察用、モノクローナル抗体作製用およびRNA抽出試料を作成または採取し、保存した。今年度の新たな成果として、(1)生殖腺刺激ホルモンIIβ型(GTH II β)またはそれに相当すると考えられるGTHに対する抗体で免疫染色される細胞もまた背索に沿って多数存在することが明らかとなった。これはまた、これまでに明らかにされている生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)様物質の存在と併せ、脊椎動物にみられる視床下部-下垂体-生殖腺系と同様の系が原索動物にも存在することを十分に予測させるものである。(2)ホヤの神経複合体におけるACTH様物質の存在については研究結果がまちまちであったが、合成ヤツメウナギACTH(1-16)に対する抗体を用いて免疫染色すると、やはり背索に沿って散在する細胞の一部が陽性反応を示した。高等脊椎動物ACTHに対する抗体では陰性なので、ホヤのACTHは下等脊椎動物型の分子構造をもつことが考えられた。(3)カエルのPRL抗体で免疫染色される細胞群が神経節および背索にあることはすでに報告したが、電顕レベルの免疫染色により、PRL様物質が径約100-250nmの電子密度の高い顆粒に含まれていることが判明し、PRL産生細胞が同定できた。(4)再度、アカボヤの背索をPotassium処理してexocytosisを促し、その濾液でBALB/Cマウスを免疫し、背索に沿って散在する細胞を特異的に染色するモノクローナル抗体を得た。抗体も十分に得られ、ハイブリドーマも保存し、ホルモン遺伝子のクローニングに見えた。(5)マボヤ神経複合体のアセトン抽出物をゲル電気泳動し、カエルPRL抗体で染色したところ、2-3本のバンドが得られた。以上の結果は、我々の仮説--背索に散在する細胞群は下垂体の系統的起源に関る細胞群である--を更に前進させるものである。今年度はマボヤおよびアカボヤの成体、合計約300キログラムを材料としてプロラクチンの単離同定用、モノクローナル抗体で染色される背索周囲細胞の顆粒内物質の同定用、および光顕・電顕レベルの免疫組織化学用の試料を作成した。さらに、背索に沿って散在する顆粒細胞群の個体発生学的起源を調べる目的でさまざまの大きさの幼若個体から神経複合体を採取した。本年度の成果として、(1)生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)産生ニューロンは細胞体が脳神経節および背索に無数に存在するが、前者からは体各部に長い突起が伸びている。ホヤの主要な神経伝達物質はアセチールコリンであることが知られているので、GnRHはco-transmitterまたはneuromodulatorとして機能していることが考えられる。後者は一般に短い突起を伸ばし、背索の顆粒細胞に接触している。こちらにはシナプス小胞は観られず、血洞中に位置しているので神経内分泌機能および旁分泌を行っていることが考えられる。また、GnRHは顆粒中に存在することが免疫電顕法により示された。(2)GnRH産生細胞とGTH(生殖腺刺激ホルモン)産生細胞とは異なる細胞であることが免疫二重染色により示された。
in vitro再構成系を用いた膜脂質選別輸送機構の解析

セラミド(Cer)は小胞体で合成された後、ゴルジ体へ輸送され、スフィンゴミエリン(SM)に変換される。我々は、チャイニーズハムスター卵巣由来CHO細胞を親株として、SM生産に欠損のある変異株(LY-A株)を得、この変異株の示すSM量低下が、小胞体-ゴルジ体間のATP依存性Cer輸送の欠損によることを見いだしていた。本課題期間中に、先ず、ATP依存性Cer輸送のin vitro再構成系を樹立した。すなわち、低張剥離処理により調製した膜開孔細胞において[^3H]Cerを合成させ、それに細胞質画分やATPを添加して37°Cで保温する。その時の[^3H]Cerから[^3H]SMへの変換は、無傷細胞で見られる変換の諸性質(変換効率、温度依存性、変異株のCer輸送欠損)を再現しており、小胞体-ゴルジ体間Cer輸送活性の指標となることを示した。一方で、化学合成した新規Cer構造類似体群のなかから、Cer-SM変換を阻害する化合物(HPA-12)を見いだし、本化合物が小胞体-ゴルジ体間Cer輸送過程を選択的に阻害することを明らかにした。そして、これら実験系を用いた解析から、「小胞体-ゴルジ体間Cer輸送の主経路はATPおよび細胞質依存性であり、Cer認識因子が関与している」ことを明らかにした。スフィンゴ脂質生合成の初発反応を担うセリンパルミトイル転移酵素(SPT)はLCB1,LCB2と名付けられた二つのサブユニットから成る。下肢の知覚神経退縮を伴う遺伝病の一つ・遺伝性知覚神経障害I型(HSN1)はLCB1遺伝子に特異的なミスセンス点突然変異を伴っていることが他の研究グループによって示された。我々は、(1)LCB2の安定維持にはLCB1との会合が必要であること、(2)HSN1型変異LCB1はLCB2と不活性型の複合体を形成することでSPT活性を抑制することを明らかにした。セラミド(Cer)は小胞体で合成された後、ゴルジ体へ輸送され、スフィンゴミエリン(SM)やグルコシルセラミドに変換される。我々は、チャイニーズハムスター卵巣由来CHO細胞を親株として、SM生産に欠損のある変異株(LY-A株)を得、この変異株の示すSM量低下が、小胞体-ゴルジ体間のATP依存性Cer輸送の欠損によることを見いだしている。今回、Cer輸送の詳細を明らかにする目的で、無傷細胞で観察されるATP依存性Cer輸送の性質を反映するin vitro再構成系の樹立を試みた。種々の条件を検討した結果、低張・剥離処理により調製した膜開孔細胞(semi-intact細胞)を低温で放射性スフィンゴシン標識して放射性Cerを蓄積させ、その後、37°Cでの放射性Cerから放射性SMへの変換を小胞体-ゴルジ体間輸送の指標とした場合にin vitro再構成系が構築できた。このin vitro再構成系において、CHO細胞野生株由来のsemi-intact細胞と細胞質画分を用いると、Cer→SM変換がみられ、ATP依存性を示した。LY-A株由来のsemi-intact細胞と細胞質画分の場合は野生型に比べCer→SM変換活性が低く、ATP依存性はみられなかった。以上は、無傷細胞における観察結果と一致する。

さらに、細胞質を相互に交換すると、LY-A semi-intact細胞ではATP依存性のCer→SM変換活性が野生型まで回復し、野生型semi-intact細胞ではLY-A株のレベルまで低下した。semi-intact細胞におけるSM合成酵素活性自体はATP、細胞質依存性を示さなかった。これらの結果から、小胞体-ゴルジ体間Cer輸送には細胞質因子が必要であること、LY-A細胞のCer→SM変換活性低下は細胞質因子の欠損によることが明かとなった。主要膜リン脂質の一種であるスフィンゴミエリン(SM)の生合成では、小胞体の細胞質表面で合成されたセラミドが、ゴルジ体の内側に移行してスフィンゴミエリン(SM)へと変換し、さらに細胞膜へと輸送される、報告者らは、昨年度までに、小胞体-ゴルジ体間セラミド輸送のin vitro再構成系を樹立している。セラミド輸送過程には、セラミドを認識する因子が関与しているという作業仮説を立て、本因子を競合阻害するようなセラミド構造類似体が存在する可能性を追求した。本年度は、化学合成した新規セラミド構造類似体群のなかから、セラミド-SM変換を阻害する化合物(HPA-12)を見いだし、本化合物が小胞体-ゴルジ体間セラミド輸送過程を選択的に阻害することを無傷細胞およびin vitro再構成系を用いた解析から明らかにした。この発見は、上述した作業仮説を支持する。なお、HPA-12は、細胞内スフィンゴ脂質輸送を選択的に阻害する初めての薬剤である。主要膜リン脂質の一種であるスフィンゴミエリン(SM)の生合成では、小胞体の細胞質表面で合成されたセラミドが、ゴルジ体の内側に移行してSMへと変換し、さらに細胞膜へと輸送される。セラミドの小胞体-ゴルジ体間輸送過程を阻害する新規化合物N-(3-Hydroxy-1-hydroxymethyl-3-phenylpropyl)dodecanamide(HPA-12)を昨年度までに見いだしており、本年度はHPA-12の様々な誘導体の活性を比較検討して、その構造活性相関を明らかにした(投稿中)。スフィンゴ脂質生合成の初発反応は、セリンパルミトイル転移酵素(SPT)によって触媒される。我々は、SPT活性の欠損した動物培養細胞変異株を分離・解析し,この酵素はLCB1,LCB2と名付けられた二つのサブユニットから成る複合体膜酵素であることを明らかにしてきた。最近、下肢の知覚神経が緩慢に退縮する常染色体優性遺伝病である遺伝性知覚神経障害I型(HSN1)はSPTLC1/LCB1遺伝子に特異的なミスセンス点突然変異を伴っていることが国外の複数の研究グループによって示された。本年度は、(1)LCB2の安定維持にはLCB1との会合が必要であること、(2)HSN1型変異LCB1はLCB2と不活性型の複合体を形成することでSPT活性を抑制することを明らかにした。
低線量放射線被ばく尿からのバイオマーカーの探索

放射線による生体影響は不明な点が多く残されています。我々はマウスを用いた放射線被曝による生体影響の観察から、被曝後に肝臓中で体内の鉄代謝に関わるHepcidinと構造の酷似したHepcidin-2が増加し、尿中に排出されることを29年度には報告しました。また、このHepcidin類は体内の鉄のバランスを保つホルモンであることから、30年度には鉄イオン濃度の変化の追試と共に、それに伴う蛋白質またはその代謝物の挙動の変化を解析しました。その分析の結果、被曝前の尿中鉄量の平均が51.1ppbであったのに対し、被曝24時間後の尿中鉄量の平均は100.1ppbであり。被曝によって尿中鉄量が約2倍に増加していることが分かりました。尿中の鉄量が大幅に増加していることから、体内鉄の挙動が明らかに変化していると判断し、生体内における鉄の挙動について調べました。すると鉄と過酸化水素によって生体に極めて有害な活性酸素種が生じること、これに対する防御機構が備わっていることが分かりました。その中で代表的なものとしてカタラーゼが挙げられます。カタラーゼは代謝の結果生じる過酸化水素を速やかに分解することでヒドロキシラジカルが生じることを防いでいます。また、尿中に炎症性物質が排出されていることから体内で炎症が起こり、過酸化水素が生産されるだけでなく、放射線により体内の遊離酸素がスーパーオキシドに、水分子がヒドロキシラジカルへ変化していると考えられます。つまり、被曝後に生体内では活性酸素種が増加していると予想されます。被曝して時間が経つに連れてcatalaseの量が減っていることが明らかになりました。蛋白質という指標だけではなく、低分子のは鉄代謝異常という点に積まれたことが今回の大きな進展である。低線量被曝により低酸素応答因子HIF-1a、Hepcidin、鉄イオン、60kDaHSPの挙動が変化することが分かりました。特に転写因子であるHIF-1aが様々な原因によって活性化することで嫌気性解糖系だけでなく造血の様な鉄の利用が亢進され、これを受けて鉄の貯蔵を亢進するHepcidinが活性化するなど、HIF-1a、ヘプシジン、鉄イオンは密接に関わっています。低線量被曝とこのサイクルの関係を明らかにすることが、低線量被曝の生体への影響の理解への切り口になるものと思います。この役者同士の関係性を明らかにすることが今年度の研究方針です。放射線による生体影響は不明な点が多く残されている。我々はマウスを用いた放射線被曝による生体影響の観察から、被曝後に肝臓中で体内の鉄代謝に関わるHepcidinと構造の酷似したHepcidin-2が増加し、尿中に排出されることを報告した。そこで、本研究では鉄代謝の変化とそれに伴う蛋白質またはその代謝物の挙動の変化を解析した。まず、尿中に排出される鉄量の変化に注目し、マウスを用いて4 Gy被曝前後の尿中鉄量の変化を黒鉛炉原子吸光光度法を用いて観察した。測定結果から、被爆後24時間から72時間において尿中鉄量が増加すること、特に24時間後から48時間後にかけて被曝前と比較して約2倍に増加することが明らかとなった。次いで、被爆後のマウス肝臓から蛋白質を抽出し質量分析を行ったところ、被曝後のマウス肝臓中から嫌気性解糖系に関わる酵素Triokinaseが検出された。このことから、被爆後に生体内で低酸素ストレスが進行していることが示唆された。そこで代表的な低酸素応答因子であり、低線量放射線被曝で活性化するHIF-1の変化をウエスタンブロッティングを用いて観察した。その結果、被曝直後に減少したHIF-1αの発現量が徐々に回復し、さらに24時間後から72時間後にかけてその量が増加することが明らかとなった。HIF-1αは赤血球の生産を亢進することから、放射線被曝は鉄代謝に影響していることが示唆される。さらに、尿中にその一端が現れることから、より簡便な放射線被曝の新規バイオマーカーとしての可能性が示唆された。鉄代謝を中心とした放射線被曝による生体応答解析として、新規なバイオマーカーを発見していること。

また、尿中に炎症性物質が排出されていることから体内で炎症が起こり、過酸化水素が生産されるだけでなく、放射線により体内の遊離酸素がスーパーオキシドに、水分子がヒドロキシラジカルへ変化していると考えられます。つまり、被曝後に生体内では活性酸素種が増加していると予想されます。被曝して時間が経つに連れてcatalaseの量が減っていることが明らかになりました。蛋白質という指標だけではなく、低分子のは鉄代謝異常という点に積まれたことが今回の大きな進展である。次いで、被爆後のマウス肝臓から蛋白質を抽出し質量分析を行ったところ、被曝後のマウス肝臓中から嫌気性解糖系に関わる酵素Triokinaseが検出された。このことから、被爆後に生体内で低酸素ストレスが進行していることが示唆された。そこで代表的な低酸素応答因子であり、低線量放射線被曝で活性化するHIF-1の変化をウエスタンブロッティングを用いて観察した。その結果、被曝直後に減少したHIF-1αの発現量が徐々に回復し、さらに24時間後から72時間後にかけてその量が増加することが明らかとなった。さらに、HIF-1α関連の蛋白質が新規バイオマーカーとしての可能性を今後、調べていく予定である。低線量被曝により低酸素応答因子HIF-1a、Hepcidin、鉄イオン、60kDaHSPの挙動が変化することが分かりました。特に転写因子であるHIF-1aが様々な原因によって活性化することで嫌気性解糖系だけでなく造血の様な鉄の利用が亢進され、これを受けて鉄の貯蔵を亢進するHepcidinが活性化するなど、HIF-1a、ヘプシジン、鉄イオンは密接に関わっています。低線量被曝とこのサイクルの関係を明らかにすることが、低線量被曝の生体への影響の理解への切り口になるものと思います。この役者同士の関係性を明らかにすることが今年度の研究方針です。
レーザー誘起蛍光法と相関法による速度および温度場の同時計測に関する開発研究

前年度までに開発された画像処理による温度と速度場の同時計測装置を用いて、現有の円管内温度成層流および新規構築された二次元衝突噴流系よどみ域における温度と速度を面的かつ時系列に計測し、得られたデータを前年度購入のエンジニアリング・ワークステーションを用いて新規購入のデータ処理・可視化ソフトウェアにより種々の方法で解析することで熱流動場における乱流混合および乱流伝熱機構を解明した。現有の円管内温度成層流系は円管直径60mmでああり、レイノルズ数7400、全域的リチャードソン数0および2.5の2条件で、十分下流の温度と速度を面的かつ時系列に計測した。一時刻で約1000点の瞬時速度・温度が時系列に1000時刻分得られ、それをエンジニアリング・ワークステーションに転送し、可視化ソフトウェアによって瞬時速度、温度、渦度の可視化および平均速度、平均温度、乱れ速度、乱れ温度、乱流熱流束、平均渦度および平均自乗渦度の算出を行った。平均温度・速度分布は従来の結果と合致し、また既存のLDVによる同時計測結果ともよく一致しており、前年度開発された本計測システムの信頼性が確認された。時系列渦度分布から、温度成層流には非成層時には見られない明確な秩序構造が存在することが明らかになった。これは浮力によって混合が抑制されるためと結論づけられた。新規構築された二次元衝突噴流系は水を作動流体とし、ノズル幅14.5mm、最大ノズル出口流速200mm/sの二次元噴流をステンレス箔ヒーターによって通電加熱された衝突板に噴射するものである。この衝突板よどみ線上から噴流上流へかけての流体側温度と速度を同時計測した。瞬時渦度分布およびその時系列分布を可視化した結果、よどみ線上には回転方向を異にした渦対構造が頻繁に発生し、これによって壁面近傍の高温流体が温度境界層外へ輸送されるため渦対の存在する部分で高い乱流熱流束が発生することが明らかになった。この渦対は噴流上流より流下し衝突面近傍で渦度を高める。さらに、平均自乗渦度の輸送方程式の各項の収支を求めることで平均流による渦度の増幅が大きな要因であることが判明した。温度計測で用いる蛍光剤を決定し、その蛍光発光特性および消光性等を調べ、蛍光剤の最適濃度と測定可能な温度範囲を明確にした。温度と発光強度の関係を示す関係式を求め、画像処理温度計測システムを構築した。温度計測の不確かさ解析を行い、熱電対との同時計測の結果がその不確かさ範囲内にあることを確認した。蛍光剤として、蛍光発光強度の温度依存性が高いローダミンBを選択した。これは、水溶液中の酸素や塩化物イオン等により消光作用を受け、時間経過にともなって発光強度が低下する。この影響は、溶媒(水道水)を一旦沸騰させることで抑えることが可能となった。蛍光強度は励起光、蛍光剤濃度等に比例するが、励起光の減衰も蛍光剤濃度に依存するため、蛍光強度を最大とする濃度を求めることができる。光線パスを10cmとすれば最適濃度は約1mg/lであった。