hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト視床腹中間核の電気刺激による病態解析

目的:ヒト視床腹中間核(Vim)の最外側部には,振戦に関連した特異なニューロン群が存在する。そこで振戦に対する選択的Vim核手術に際しVim最外側部で急性電気刺激を行い、振戦に対する効果を解析した。対象と方法:手に振戦のみられたパーキンソン病55例と本態性振戦9例について検討した.対側末梢の自然刺激(上下肢各関節の屈曲伸展)に反応するニューロンがとらえられた部位(A群:手関節の屈曲伸展による反応が得られた部位,B群:手関節以外の上肢関節の運動に対する反応が得られた部位,C群:下肢の運動に対する反応が得られた部位)で,1秒間の高頻度電気刺激(100Hz)を行い、振戦が停止する閾値や筋電図上の変化を観察した。A群については、7例で1020秒間の連続電気刺激を行った。結果:全刺激点のなかで振戦に影響を与えたのは153部位中95であり、その内訳はA群30、B群50、C群15であった。1秒間の高頻度電気刺激の結果は,A群では前腕伸筋群または屈筋群に筋電図上最も早い潜時で異常群化放電の振幅低下がみられ、拮抗筋には一時的な振幅増大と周波数の増加が認められた。B群では屈筋群伸筋群とも一時的な振幅増大と周波数増加に続いて振幅の低下が観察された。振戦を抑制する閾値電流は明らかにB群よりA群が低かった(0.08±0.05mA<0.180±0.130mA)。C群では電気刺激により振戦は増強した。連続電気刺激(A群7例)では、持続的に振戦を停止させ得る電流は,1秒間の刺激での閾値電流より高かった(0.12±0.06mA,N=11)。振戦を停止させ得る強さの電気刺激では随意運動は障害されなかった。電気刺激による固縮の改善は明かではなく、パルス刺激では連続刺激と同程度の振戦抑制は得られなかった。結論:前年度より対象の数を増やしたが、基本的には同じ結果が得られた。ヒト視床腹中間核(Vim)の最外側部の高頻度電気刺激では振戦の抑制効果はみられるが、固縮については著しい効果はないように思われた。難治性の手の振戦に対する定位脳手術(選択的視床腹中間核手術)を行ったパーキンソン病29例と本態性振戦7例について,微小電極を用いて脳深部電気活動記録と高頻度電気刺激による振戦への効果を検討した.対側末梢の自然刺激に反応するニューロンがとらえられた部位(A群:手関節の屈曲伸展による反応が得られた部位,B群:手関節以外の上肢関節の運動に対する反応が得られた部位,C群:下肢の運動に対する反応が得られた部位)で,1秒間の高頻度電気刺激(100Hz)を行い、刺激側と対側の前腕伸筋群、屈筋群の筋電図をモニターしながら,振戦が停止する閾値や筋電図上の変化を観察した。全刺激点のなかで振戦に影響を与えたのは86部位中60であり、その内訳はA群20(19人)、B群26(23人)、C群14(11人)であった。1秒間の高頻度電気刺激の結果は,A群では前腕伸筋群または屈筋群に筋電図上最も早い潜時で異常群化放電の振幅低下に続いてdesynchronizationがみられ、拮抗筋には一時的な振幅増大と周波数の増加が認められた。振戦を抑制する閾値電流は明らかにB群よりA群が低かった(0.098±0.064mA<0.165±0.118mA)。C群では電気刺激により振幅増大と周波数の増加のみが見られ振戦は増強した。標準アトラスのVim矢状断像にプロットすると、振戦が増強する部位(C群)は抑制される部位(A,B群)より背外側部に位置していた。今回の急性電気刺激の結果からは、手の振戦に最も関与している筋に対応する運動感覚性ニューロンの存在する部位での電気刺激が振戦の抑制に最も有効であり、その部位から背外側方向に離れるにつれ、手の振戦を増強する効果が強調されることが推定された。

結果:全刺激点のなかで振戦に影響を与えたのは153部位中95であり、その内訳はA群30、B群50、C群15であった。1秒間の高頻度電気刺激の結果は,A群では前腕伸筋群または屈筋群に筋電図上最も早い潜時で異常群化放電の振幅低下がみられ、拮抗筋には一時的な振幅増大と周波数の増加が認められた。B群では屈筋群伸筋群とも一時的な振幅増大と周波数増加に続いて振幅の低下が観察された。振戦を抑制する閾値電流は明らかにB群よりA群が低かった(0.08±0.05mA<0.180±0.130mA)。C群では電気刺激により振戦は増強した。連続電気刺激(A群7例)では、持続的に振戦を停止させ得る電流は,1秒間の刺激での閾値電流より高かった(0.12±0.06mA,N=11)。振戦を停止させ得る強さの電気刺激では随意運動は障害されなかった。電気刺激による固縮の改善は明かではなく、パルス刺激では連続刺激と同程度の振戦抑制は得られなかった。結論:前年度より対象の数を増やしたが、基本的には同じ結果が得られた。ヒト視床腹中間核(Vim)の最外側部の高頻度電気刺激では振戦の抑制効果はみられるが、固縮については著しい効果はないように思われた。
代数的暗号解読アルゴリズムに対して証明可能な安全性を実現する暗号設計法

本年度は前年度に引き続き代数的解読法の発展に関する研究を進めた。これまでに開発した方法は、1)上1段消去法、2)2段消去法、3)弱鍵利用法の3通りである。1)と2)に関しては14,15年度の国際学会で、3)に関しては16年7月の国際学会で発表を行った。これらの一般化した攻撃アルゴリズムをまとめ、その効果についてブロック暗号MISTY1とICEBERGに対する攻撃例で示した。攻撃実験には複数の計算機が必要になり、計算能力と設置場所の物理的制約からワークステーション1台(所属する機関が所有)、デスクトップ型コンピュータ1台(14年度購入)と高性能ノート型コンピュータ2台(15年度と16年度に購入)を連携して行った。実験の結果、MISTY1に対しては、既知の攻撃可能段数が5段であるのに対し、6段まで攻撃可能であることを示した。さらに、弱鍵が利用されている場合は従来の5段の攻撃に必要な計算量とほぼ同じ計算量で6段まで攻撃可能なことを明らかにした。本結果を論文としてまとめ、学会論文誌に投稿中である。ICEBERGは昨年開発された新しいブロック暗号である。これに対し代数的攻撃の強度評価、国際学会で発表を行った。共通鍵暗号方式にはブロック暗号とストリーム暗号がある。後者は擬似乱数生成器を用い、安全性はこれに依存する。擬似乱数生成器の評価は、出力される乱数列の統計評価が主であり、暗号学的な安全性は相関攻撃と線形複雑度の評価で行っている。ところが、最近提案されている擬似乱数生成器の構成法が多岐に渡るため、これらでの安全性評価が不能な場合がある。本研究では代数的攻撃の応用の一つとして、擬似乱数生成器の評価尺度を提案した。線形複雑度を算出するアルゴリズムと代数的攻撃における攻撃方程式を解くアルゴリズムの関係を明らかにし、線形複雑度よりも誤差の少ない評価値を見積もれることを示した。この結果、これまで不可能であった擬似乱数生成器の相互評価が可能になった。本研究結果は16年度旅費による国内学会で発表を行った。代数的暗号解読アルゴリズムに対して証明可能安全性を実現する暗号設計法に関する研究の準備段階として、代数的解読アルゴリズムの代表的手法である高階差分攻撃の拡張性を2つの側面から研究を実施した。1つ目は、暗号アルゴリズムに用いられる鍵スケジュールに注目した拡張法である。一般に暗号アルゴリズムはユーザが直接使用する秘密鍵から、暗号化の途中で中間変数として使用する拡大鍵を生成する。この拡大鍵が攻撃者に都合良く選ばれた場合、そうでない場合と比較すると格段に安全性が低下する。また、鍵スケジュールが弱いと、解読のための攻撃方程式中の鍵に関する項の代数次数が低くなり、より容易に方程式を求められる。このような視点から64ビットブロック暗号MISTY1に対して攻撃実験を行った。MISTY1は我が国の電子政府利用において推奨暗号アルゴリズムであるだけでなく、ヨーロッパにおける暗号評価プロジェクトにおいても、標準に採用された暗号アルゴリズムである。その結果、128[bit]の秘密鍵中32[bit]に条件を付けると、8段中6段まで攻撃が可能であることが分かった。この結果は、直接にMISTY1の安全性を脅かすものではないが、鍵スケジュールの設計が実装性能を重視した傾向にあることを明らかにした。2つ目は、途中出力の高階差分値を攻撃者に都合良く制御する方法である。MISTY1に適用した場合、FL関数の無い簡略版については、1段目の鍵32[bit]に対応する制御sub-blockを推定する上一段消去法を提案することにより8段中7段まで攻撃可能であることを示した。以上より、一般に代数的解読アルゴリズムに対する耐性は、暗号化関数の代数次数の高さで保証されると考えられているが、拡張法まで含めて考えると、これだけで評価するのは安直である。今後は、どのようなデザインが有効か、主に線形変換の効果について研究を進める予定である。昨年度に引き続き、代数的暗号解読アルゴリズムに対して証明可能安全性を実現する暗号設計法に関する研究の準備段階として、代数的解読アルゴリズムの代表的手法である高階差分攻撃の拡張性を2つの側面から研究を実施した。この研究内容は、昨年度から引き続き解析を進め、いくつかのMISTYに関する代数的性質を明らかにし国際学会に投稿中である。また、昨年行われたSCIS2003学会における本研究発表は今年度に論文賞を受賞した。MISTY1に適用した場合、FL関数の無い簡略版については、1段目の鍵

32[bit]に対応する制御sub-blockを推定する上一段消去法を提案することにより8段中7段まで攻撃可能であることを示した。以上より、一般に代数的解読アルゴリズムに対する耐性は、暗号化関数の代数次数の高さで保証されると考えられているが、拡張法まで含めて考えると、これだけで評価するのは安直である。これに関しては解法アルゴリズムの最適化に関する研究を進め、IEICEに採択された。本年度は昨年度の結果の解析を進め、理論的な探究を試み学術論文としてまとめることに集中した。来年度は、解析が進んでいる代数的解法の一つであるXSL攻撃の解析も進め、関数の設計に関する研究としてまとめる予定である。本年度は前年度に引き続き代数的解読法の発展に関する研究を進めた。これまでに開発した方法は、1)上1段消去法、2)2段消去法、3)弱鍵利用法の3通りである。1)と2)に関しては14,15年度の国際学会で、3)に関しては16年7月の国際学会で発表を行った。これらの一般化した攻撃アルゴリズムをまとめ、その効果についてブロック暗号MISTY1とICEBERGに対する攻撃例で示した。攻撃実験には複数の計算機が必要になり、計算能力と設置場所の物理的制約からワークステーション1台(所属する機関が所有)、デスクトップ型コンピュータ1台(14年度購入)と高性能ノート型コンピュータ2台(15年度と16年度に購入)を連携して行った。実験の結果、MISTY1に対しては、既知の攻撃可能段数が5段であるのに対し、6段まで攻撃可能であることを示した。さらに、弱鍵が利用されている場合は従来の5段の攻撃に必要な計算量とほぼ同じ計算量で6段まで攻撃可能なことを明らかにした。本結果を論文としてまとめ、学会論文誌に投稿中である。ICEBERGは昨年開発された新しいブロック暗号である。これに対し代数的攻撃の強度評価、国際学会で発表を行った。共通鍵暗号方式にはブロック暗号とストリーム暗号がある。後者は擬似乱数生成器を用い、安全性はこれに依存する。擬似乱数生成器の評価は、出力される乱数列の統計評価が主であり、暗号学的な安全性は相関攻撃と線形複雑度の評価で行っている。ところが、最近提案されている擬似乱数生成器の構成法が多岐に渡るため、これらでの安全性評価が不能な場合がある。本研究では代数的攻撃の応用の一つとして、擬似乱数生成器の評価尺度を提案した。線形複雑度を算出するアルゴリズムと代数的攻撃における攻撃方程式を解くアルゴリズムの関係を明らかにし、線形複雑度よりも誤差の少ない評価値を見積もれることを示した。この結果、これまで不可能であった擬似乱数生成器の相互評価が可能になった。本研究結果は16年度旅費による国内学会で発表を行った。
マイクロフローシステムの特徴を活かした保護基フリー合成法の開発

フローマイクロリアクターシステムの特長を活かし、高活性な有機金属種を鍵中間体とする一般性の高い保護基フリー合成法を開発することを目指し研究に取り組んだ。研究成果として、(1)バッチ型反応器では困難または実現困難または不可能な、シアノ基、ニトロ基、アルコキシカルボニル基、のような極めて反応性の高い求電子性官能基を有するアリールリチウム種の発生ならびに反応、(2)ミリ秒オーダーの精密滞留時間制御の特長を活かしたバッチ型反応器では反応制御が不可能なケトンカルボニル基を有するアリールリチウム種の発生ならびに反応、(3)複数の官能基を有する化合物としてMalachite green誘導体などの形式合成、に成功した。保護・脱保護を必要としない分子変換法は、アトムエコノミー、ステップエコノミーの高い環境にやさしく効率の高い合成法が構築できる。このような保護基フリーの合成反応の開発は有機合成上最も重要な課題の一つである。これまで保護基フリーの合成反応のための方法として、有機リチウム化合物や有機マグネシウム化合物のかわりに有機亜鉛化合物や有機ホウ素化合物といったより反応性の低い有機金属種を利用するなど、反応剤の活性を下げて、反応速度を落として官能基選択性を高めるというアプローチが主流であった。フローマイクロリアクターシステムの特長を活かした精密反応制御に基づいて、高活性な有機金属種を鍵中間体とする一般性の高い保護基フリー合成法を開発することを目指し研究に取り組んだ。様々な有機金属種の中で、最も反応制御が困難とされる活性の高い有機リチウム種の反応を中心に、シアノ基、ニトロ基、アルコキシカルボニル基、などの官能基を有する不安定なアリールリチウム種の発生ならびに反応の検討をフローマイクロリアクターシステムにより行い、精密温度制御ならびに超高速混合ならびにミリ秒オーダーの滞留時間制御を可能とするマイクロデバイスを開発することで、バッチ型反応器では困難または実現不可能とされるシアノ基、ニトロ基、アルコキシカルボニル基、のような極めて反応性の高い官能基を有するアリールリチウム種の発生ならびに反応を達成することができた。フローマイクロリアクターシステムの特長を活かし、官能基を有する不安定有機リチウム中間体を迅速に発生させ、その後、中間体が分解する前に複数の官能基有する求電子剤との選択的反応を連続的に行うことで、複数の官能基を有する分子の迅速合成を目指し研究に取り組んだ。フローマイクロリアクターシステムの精密温度制御ならびに超高速混合ならびにミリ秒オーダーの精密滞留時間制御能の特長を活かし、バッチ型反応器では反応制御が不可能な様々な求電子性官能基(シアノ基、ニトロ基、アルコキシカルボニル基)を有する不安定なアリールリチウム中間体の発生ならびに反応の精密制御を実現することで、複数の官能基を有する化合物としてMalachite green誘導体などの形式合成を達成した。さらに、ミリ秒オーダーの滞留時間制御を可能とするフローマイクロリアクターデバイスを用いることにより、アシル基のような極めて反応性の高い求電子性官能基を有するアリールリチウム種の発生ならびに反応も実現することが可能となった。
小学校における語彙・文法の定着を図るためのフィンランド型の言語活動の教材の開発

本研究で行うことは、小学校における語彙・文法の定着を図るためのフィンランド型の言語活動の教材の開発である。フィンランドの外国語教育は学校教育において多大な成果を上げており、その成功要因の一つに、教科書・ワークブックがあげられている。本研究ではフィンランドの小学校で使われている教科書・ワークブックでどのような語彙・文法に関する言語活動が、いつどれくらい提供されているのかを質的・量的に分析する。そして日本において、小学校英語化後を見据えて、今後小学校でも文法が教えられると仮定し、フィンランド型の言語活動のモデルを提示し、体系的・螺旋的な言語活動の教材の開発を行う。
ショウジョウバエとマウスで共通するNMDA受容体による睡眠制御機構の解明

ショウジョウバエの睡眠-覚醒を制御する中心複合体PB (protocerebral bridge)の神経回路について引き続き解析した。これまでの研究で、覚醒を促進するPB-FB-NOニューロン(PBから中心複合体の他の部位であるFBとNOに投射するニューロン)と、睡眠を促進するPB介在ニューロンを同定した。本年度はまず、これら2つのニューロンを活性化したハエの行動をビデオ観察し、赤外線を用いたDrosophila Activity Monitoring Systemで睡眠測定した場合と同様の結果が得られることを確認した。睡眠-覚醒制御に関わるPB-FB-NOニューロンとPB介在ニューロンは、どちらもコリン作動性ニューロンであることが示唆されていたが、これら2つのニューロンで小胞アセチルコリントランスポーター(VAChT)をノックダウンすると、睡眠量に有意な変化がみられた。昨年度の研究で、T1ドーパミンニューロンはD2受容体シグナルを介してPB介在ニューロンを抑制することで、覚醒を促進することが示唆された。そこで、PB介在ニューロンにCa2+センサーGCaMP6sを発現させたハエの摘出脳を用いて、PB介在ニューロンがドーパミンに反応するかどうかを調べた。ドーパミン投与によって、予想通りGCaMPシグナルの減少がみられたが、逆に一過的に増加する場合もあった。この反応性の違いについては、原因を調査中である。PBにはグルタミン酸作動性ニューロンも存在する。PB介在ニューロンでハエの睡眠-覚醒制御に関わるNMDA受容体やカルシニューリンをノックダウンしたところ、睡眠量は、カルシニューリンノックダウンでは有意に減少し、NMDA受容体ノックダウンでは減少傾向がみられ、PB介在ニューロンがグルタミン酸シグナルによっても調節され、睡眠-覚醒を制御する可能性が示された。本研究の目的は、ショウジョウバエとマウスで共通するNMDA型グルタミン酸受容体による睡眠-覚醒制御機構の解明である。睡眠-覚醒制御の分子機構を解明するためには、それに関わる神経回路の同定が重要である。本年度に行った研究により、睡眠-覚醒を制御する中心複合体PBの神経回路を構成するニューロンのうち、睡眠を促進するPB介在ニューロンが、ドーパミンシグナルに反応することをCa2+イメージング法により示すことができた。PBにはグルタミン酸作動性ニューロンが存在する。NMDA受容体の下流に位置し、ショウジョウバエの睡眠-覚醒制御に関わるカルシニューリンをPB介在ニューロンでノックダウンすると、睡眠量が有意に減少した。このことから、PB介在ニューロンがドーパミンシグナルだけでなくグルタミン酸シグナルによっても調節され、睡眠-覚醒を制御する可能性が示された。以上の結果が得られたことから、研究の達成度については、おおむね順調に進展していると評価した。覚醒を促進するPB-FB-NOニューロンと睡眠を促進するPB介在ニューロンの機能的なつながりを、Ca2+イメージング法により調べる。この実験に用いるショウジョウバエ系統を現在準備中である。経シナプス的にニューロン間の接続を標識できる技術trans-Tango (Talay et al., 2017)を利用し、PB介在ニューロンに投射するニューロンを網羅的に探索する。標識されたニューロンについて、抗VGlut抗体による免疫染色を行い、PB介在ニューロンに入力するグルタミン酸作動性ニューロンの同定を試みる。T1ドーパミンニューロンは、闘争の制御に関わることが報告されている(Alekseyenko et al., 2013)。そこで、睡眠-覚醒を制御するPB神経回路が闘争の制御にも関わるのかどうかについても調べる。ショウジョウバエの睡眠-覚醒制御に関わる中心複合体の神経回路について解析を行った。本年度は、まずGRASP (GFP reconstitution across synaptic partners)法を用いて、睡眠-覚醒制御に関わるPB-FB-NOニューロンとPB介在ニューロンの間のシナプス結合を検討したところ、PBにおいて再構成されたGFPシグナルが観察され、これら2つのニューロン間のシナプス結合が示唆された。PBにはT1とよばれるドーパミン(DA)ニューロンが投射することが知られている。T1 DAニューロン特異的に温度依存性イオンチャネルdTrpA1を発現させて活性化したところ、睡眠量が有意に減少した。また、GRASP法により睡眠-覚醒制御に関わるPB介在ニューロンとT1 DAニューロンとの間のシナプス結合が示唆された。PBにはドーパミンD2受容体Dop2Rが発現することが報告されており、PB介在ニューロンでDop2Rをノックダウンすると睡眠量が有意に増加した。以上の結果から、PB介在ニューロンは、睡眠を抑制するPB-FB-NOニューロンを抑制することで睡眠を促進し、T1 DAニューロンはD2受容体シグナルを介してPB介在ニューロンを抑制することで、結果的に睡眠を抑制することが示唆された。睡眠-覚醒制御の分子機構を解明するためには、それに関わる神経回路の同定が重要であるが、上述したように、本年度に行った研究により、睡眠-覚醒制御に関わる新たなPBの神経回路を示唆することができた。また、PBにはグルタミン酸作動性ニューロンの存在が示され、今回見出した神経回路に着目して睡眠-覚醒制御におけるNMDA受容体の機能解析ができる可能性が考えられた。

ショウジョウバエの睡眠-覚醒を制御する中心複合体PB (protocerebral bridge)の神経回路について引き続き解析した。これまでの研究で、覚醒を促進するPB-FB-NOニューロン(PBから中心複合体の他の部位であるFBとNOに投射するニューロン)と、睡眠を促進するPB介在ニューロンを同定した。本年度はまず、これら2つのニューロンを活性化したハエの行動をビデオ観察し、赤外線を用いたDrosophila Activity Monitoring Systemで睡眠測定した場合と同様の結果が得られることを確認した。睡眠-覚醒制御に関わるPB-FB-NOニューロンとPB介在ニューロンは、どちらもコリン作動性ニューロンであることが示唆されていたが、これら2つのニューロンで小胞アセチルコリントランスポーター(VAChT)をノックダウンすると、睡眠量に有意な変化がみられた。昨年度の研究で、T1ドーパミンニューロンはD2受容体シグナルを介してPB介在ニューロンを抑制することで、覚醒を促進することが示唆された。そこで、PB介在ニューロンにCa2+センサーGCaMP6sを発現させたハエの摘出脳を用いて、PB介在ニューロンがドーパミンに反応するかどうかを調べた。ドーパミン投与によって、予想通りGCaMPシグナルの減少がみられたが、逆に一過的に増加する場合もあった。この反応性の違いについては、原因を調査中である。PBにはグルタミン酸作動性ニューロンも存在する。PB介在ニューロンでハエの睡眠-覚醒制御に関わるNMDA受容体やカルシニューリンをノックダウンしたところ、睡眠量は、カルシニューリンノックダウンでは有意に減少し、NMDA受容体ノックダウンでは減少傾向がみられ、PB介在ニューロンがグルタミン酸シグナルによっても調節され、睡眠-覚醒を制御する可能性が示された。本研究の目的は、ショウジョウバエとマウスで共通するNMDA型グルタミン酸受容体による睡眠-覚醒制御機構の解明である。睡眠-覚醒制御の分子機構を解明するためには、それに関わる神経回路の同定が重要である。本年度に行った研究により、睡眠-覚醒を制御する中心複合体PBの神経回路を構成するニューロンのうち、睡眠を促進するPB介在ニューロンが、ドーパミンシグナルに反応することをCa2+イメージング法により示すことができた。PBにはグルタミン酸作動性ニューロンが存在する。NMDA受容体の下流に位置し、ショウジョウバエの睡眠-覚醒制御に関わるカルシニューリンをPB介在ニューロンでノックダウンすると、睡眠量が有意に減少した。このことから、PB介在ニューロンがドーパミンシグナルだけでなくグルタミン酸シグナルによっても調節され、睡眠-覚醒を制御する可能性が示された。以上の結果が得られたことから、研究の達成度については、おおむね順調に進展していると評価した。睡眠-覚醒制御に関わる中心複合体PBの神経回路については、それを構成するPB-FB-NOニューロン、PB介在ニューロン、T1ドーパミンニューロン間の機能的なつながりを、細胞内Ca2+やcAMPのイメージング手法を用いて調べる。
低分子G蛋白質Rap1シグナルによる造血細胞の分化制御と白血病化機構の解明

生体内での機能については解析するために、リンパ・造血系組織における低分子G蛋白Rap1に対する主たるGAPであるSPA-1の遺伝子破壊(SPA-1-/-)マウスは、これまでの解析から活性化型Rap1の蓄積により、(1)T細胞の機能不全に基づく免疫不全状態に陥ること、(2)多能性造血幹細胞を含む未分化造血細胞の増殖亢進が起こり、その後生後1年1年半でほぼ全例において慢性骨髄性白血病をはじめとする多彩な白血病を発症することが明らかとなっている。今回の研究からさらにSPA-1-/-マウスでは加齢に伴う腹腔B1細胞数の増加、二重鎖DNAや赤血球に対する自己反応性抗体の産生、さらには免疫複合体の腎糸球体沈着による糸球体腎炎といったヒト全身性エリマトーデス(SLE)モデルマウスであるNZBマウスに酷似した自己免疫疾患状態に陥ることが新たに確認された。SPA-1-/-マウス由来骨髄細胞より樹立したB1細胞株はIgMを分泌し、SCIDマウスに移入するとヒトB細胞性慢性リンパ性白血病(B-CLL)に酷似した病態を発症するが、SPA-1を戻し活性型Rap1消失させたB1細胞株ではIgM分泌が減少するとともに白血病原性が消失した。この分子機構を解析するために両者の間でDNAマイクロアレイ法による遺伝子発現パターン解析を行ったところ、前者においてB細胞特異的転写因子の補助因子であるOCA-B分子の発現が顕著に上昇していることが明らかとなった。このOCA-B発現上昇により免疫グロブリンk鎖の再編成に異常が生じるとともに軽鎖遺伝子編集による自己反応性B細胞の不活化機構が損なわれるため、自己反応性B細胞が選択をくぐり抜け成熟し、腹腔B1細胞へと分化することが、上記の自己免疫疾患発症につながっていることが明らかとなった。
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の無血清培養系の開発

骨髄には間葉系幹細胞が存在し、中、内、外胚葉の細胞といった胚を超えて分化能力を有することが報告されており、顎・口腔外科領域においては顎骨から容易に骨髄液採取が可能であり、顎骨骨髄由来幹細胞を用いた臨床応用が期待されている。本研究では安全性や培養細胞の機能を評価する方法を確立する為、組成の明らかな培地で長期間、間葉系幹細胞の未分化性・多分化能を維持可能な無血清培養系の確立を目指す。さらに確立した無血清培養条件下で、間葉形幹細胞の多分化能を解析する。ヒト骨髄由来初代培養間葉系幹細胞は増殖が有限であるため、樹立間葉系幹細胞株を用い、未分化性・多分化能を維持可能な無血清培養条件の確立を行った。本年度は間葉系幹細胞株の増殖に必要な因子を決定する。細胞は、ウイルスベクターにて遺伝子を導入し不死化された間葉系細胞株を用い、共同研究者らが開発したヒトES細胞用無血清培地hESF9を基礎として、種々の増殖因子を添加して、細胞増殖に必要な因子を同定した。細胞株:UE7T-13細胞(JCRB1154)を用い、FGF-2、TGF-β1、アスコルビン酸が間葉系幹細胞の細胞増殖に有用であることを確立した。さらに、未分化性の同定のため、ヒト間葉系幹細胞のマーカーと言われている遺伝子や蛋白などの発現を解析した。ヒト間葉系幹細胞の決定的な未分化マーカーは現在のところ同定されていないため、ヒトES細胞をはじめとする種々の幹で発現が確認されている未分化マーカーについても解析を行った。初年度に引き続き、樹立間葉系幹細胞株を用い、未分化性・多分化能を維持可能な無血清培養条件の確立を目指した。(1)間葉系幹細胞株の増殖に必要な因子を決定。細胞は、ウイルスベクターにて遺伝子を導入し不死化された間葉系細胞株:UE7T-13細胞(JCRB1154)を用いた(厚生省JCRB細胞バンク登録細胞)。また、共同研究者らが開発したヒトES細胞用無血清培地hESF9を基礎として、種々の増殖因子を添加して、細胞増殖に必要な因子の同定を目指した。これらの増殖因子を単独、あるいは組み合わせて添加して、細胞の形態ならびに細胞増殖に与える影響を検討した。(2)未分化性の同定。ヒト間葉系幹細胞のマーカーと言われている遺伝子や蛋白などの発現を解析した。(1)遺伝子発現についての解析MSCのマーカーと考えられているCD90、中胚葉系組織に分化能を示すMSCで発現されるCD105またヒトES細胞の未分化マーカーで間葉系肝細胞でも発現が認められているoct3/4の他、nanogやsox2等の発現を、RT-PCRを用いて解析した。(2)細胞表面抗原についての解析
DNA fingerprinting法を応用した新しい癌関連遺伝子クローニング法

本研究は、従来腫瘍の主に増殖能亢進という性格を利用して行われてきた腫瘍関連遺伝子の同定法を離れ、遺伝子の構造変化を逐一検出し発癌機構との関連を探る事により、新たな腫瘍関連遺伝子を同定することを目的として計画した。具体的には、腫瘍細胞DNAを、ゲノム内minisatellite sequenceに相補的な合成プローブでDNA fingerprintingの手法を用いて解析し、非腫瘍細胞を対象として腫瘍特異的異常バンドを検出する。次いで、この異常バンド相当部位のDNAを回収してクローニングし、腫瘍関連遺伝子としての性格を解析する事を計画した。まず、上記方法の手法的確率を目的として、培養細胞系を用いた実験をおこなった。ヒト白血病細胞株HL-60の亜株の一つに親株と異なりPMA分化耐性・放射線耐性を示す細胞株があるが、上記DNA fingerprinting法の解析で5.6kbの位置で親株と異なる異常バンドを検出した。-方、実際にヒトに発生した腫瘍を材料とした同方法の実用性を検討するために、剖検材料から得られたDNA材料を用いて上記DNA fingerpriting法を行い、やはり非腫瘍部と異なる異常バンドを検出した。次いで、異常バンド相当部位のクローニングを数度試みたが、ゲルから抽出されるDNA量が微量であり、ベクターとの結合、選択的DNAライブラリーの作製が困難であった。バンド相当部位はminisatellite sequenceを含んでおり、この性格を利用して、この配列に相補的なPrimerを用いたPCR法を利用することで、ゲルから抽出したDNA断片の増幅が可能と考えられる。この方針に基づき現在研究を進めている。
遷移金属/ルイス酸協奏触媒による不活性結合の新規変換反応

多くの有機分子は,その表面を炭素・水素結合(以下,C-H結合と表記)によって覆われている.そのためこれを活性化して直接変換する反応は,分子を事前に官能基化する必要がないため原子効率にきわめて優れており,有機合成反応として理想的である.そのような観点からC-H結合の直接変換反応の開発は,近年世界中で最も活発に研究されている研究領域の1つであり,不飽和化合物への付加反応や,有機ハロゲン化物や有機金属反応剤とのカップリング反応などが相次いで報告されている.しかしながら,それらのほとんどがルテニウム,ロジウム,パラジウム触媒を用いるもので,反応性の低いC-H結合を活性化するために100°C以上の比較的過酷な反応条件を必要とする.本研究では,基質の配位性元素にルイス酸触媒を作用させることによって従来不活性なC-H結合を活性化し,これを穏和な条件下,切断・変換する新しい遷移金属触媒反応の開発を行ってきた.昨年度までに開発したピリジンとホルムアミドのC-H結合活性化法から,2-ピリドンのカルボニル酸素がルイス酸触媒に配位しても,ピリジンの活性化と同様にピリジニウム種を生じ6位C-H結合をニッケル触媒によって活性化・変換できるのではないかと着想した.期待通り,NyAlMe_3触媒存在下,2-ピリドンやウラシルの6位選択的なアルケニル化反応が立体および位置選択的に進行することをみつけた.カルベン配位子を用いると,ビニルアレーンへの付加も進行して,対応する6-アルキル化体が得られた.多置換ピリドンは,天然物や医薬品など生理活性物質に多く見られる構造である.また,多置換ピリジンやピペリジンなどの含窒素六員環化合物の合成前駆体としても有用である.しかしながら,母体ピリドンに直接かつ位置選択的に有機基を導入する手法は,5位でいろいろな求電子剤と反応させるものに限られていた.したがって本反応は,2-ピリドンの6位に直接有機基を導入できるきわめてユニークな合成反応である.多くの有機分子は,その表面を炭素-水素結合(以下, C-H結合と表記)によって覆われている.そのためこれを活性化して直接変換する反応は,分子を事前に官能基化する必要がないため原子効率にきわめて優れており,有機合成反応として理想的である.そのような観点からC-H結合の直接変換反応の開発は,近年世界中で最も活発に研究されている研究領域の1つであり,不飽和化合物への付加反応や,有機ハロゲン化物や有機金属反応剤とのカップリング反応などが相次いで報告されている.しかしながら,それらのほとんどがルテニウム,ロジウム,パラジウム触媒を用いるもので,反応性の低いC-H結合を活性化するために100°C以上の比較的過酷な反応条件を必要とする.本研究では,基質の配位性元素にルイス酸触媒を作用させることによって従来不活性なC-H結合を活性化し,これを穏和な条件下,切断・変換する新しい遷移金属触媒反応の開発を行っている.本年度は,ホルムアミドのホルミルC-H結合をニッケル/ルイス酸協働触媒によって穏和な条件下活性化し,アルキンや1, 3-ジエンを挿入させるヒドロカルバモイル化反応を開発した.アルケンに対するヒドロカルバモイル化反応は,分子内反応が収率よく進行し,いろいろなラクタムが得られることを見つけた.ホルムアミドのカルボニル酸素がルイス酸に配位することによって形式的に正電荷を帯びた窒素のα位にあたるホルミルC-H結合の反応性が向上し,ニッケル(0)に容易に酸化的付加することによって反応が進行しているものと考えている.多くの有機分子は,その表面を炭素・水素結合(以下,C-H結合と表記)によって覆われている.そのためこれを活性化して直接変換する反応は,分子を事前に官能基化する必要がないため原子効率にきわめて優れており,有機合成反応として理想的である.そのような観点からC-H結合の直接変換反応の開発は,近年世界中で最も活発に研究されている研究領域の1つであり,不飽和化合物への付加反応や,有機ハロゲン化物や有機金属反応剤とのカップリング反応などが相次いで報告されている.しかしながら,それらのほとんどがルテニウム,ロジウム,パラジウム触媒を用いるもので,反応性の低いC-H結合を活性化するために100°C以上の比較的過酷な反応条件を必要とする.本研究では,基質の配位性元素にルイス酸触媒を作用させることによって従来不活性なC-H結合を活性化し,これを穏和な条件下,切断・変換する新しい遷移金属触媒反応の開発を行ってきた.昨年度までに開発したピリジンとホルムアミドのC-H結合活性化法から,2-ピリドンのカルボニル酸素がルイス酸触媒に配位しても,ピリジンの活性化と同様にピリジニウム種を生じ6位C-H結合をニッケル触媒によって活性化・変換できるのではないかと着想した.期待通り,NyAlMe_3触媒存在下,2-ピリドンやウラシルの6位選択的なアルケニル化反応が立体および位置選択的に進行することをみつけた.カルベン配位子を用いると,ビニルアレーンへの付加も進行して,対応する6-アルキル化体が得られた.多置換ピリドンは,天然物や医薬品など生理活性物質に多く見られる構造である.また,多置換ピリジンやピペリジンなどの含窒素六員環化合物の合成前駆体としても有用である.しかしながら,母体ピリドンに直接かつ位置選択的に有機基を導入する手法は,5位でいろいろな求電子剤と反応させるものに限られていた.したがって本反応は,2-ピリドンの6位に直接有機基を導入できるきわめてユニークな合成反応である.
液相焼結法を活用した高効率熱電変換材料の合成と高性能化

β-FeSi_2系熱電変換材料はメカニカルアロイング法を利用してSi+C同時添加を施すことにより,その熱電特性著しく向上することがこれまでの研究結果から分かっている.従来,これらの材料は加圧焼結法であるホットプレス法により作製されたが,将来実用化を考慮した場合,ホットプレス用による製造プロセスではコストが高くなることが問題となる.したがって,このホットプレス材と同等の性能を有するFeSi_2-SiC系熱電変換材料を低コストな常圧焼結法を用いて作製することが重要な課題となる.そこでSiC添加FeSi_2粉末にCuを添加し,液相焼結の利用を試み,常圧焼結にて作製したところ,Cu-Si液相の発生により液相焼結が発生し,常圧焼結によっても緻密な焼結体を作製できることが明らかになった.一方,ε-Fesi金属相の析出を引き起こし,SiC添加に起因する熱起電力向上効果および熱伝導率低減効果がCu添加により失われてしまうことが分かった.そこでε-FeSi金属相の析出を抑えるため,Siを過剰添加したところε-Fesi+Si→β-FeSi_2反応により、ε-Fesi金属相量の減少のみならず半導体β相量の増加を引き起こすことを突き止めた.その結果,熱起電力が大幅に向上し,また熱伝導率も効果的に減少してCu添加による性能劣化を完全に克服できることが分かった.これにより高性能を有するSiC微粒子分散およびCu複合添加β-FeSi_2熱電変換材料を低コストな常圧焼結により作製可能であることを明らかにした.その他,高性能化のため新しいドーピング材の探索を試みたところ,P添加がn型のドーピング材として有効であることを明らかにした.本年度では,β-FeSi_2を用いてメカニカルグラインディングあるいはメカニカルアロイング法によって得られた粉末を,実際に常圧焼結することを試みた.通常の常圧焼結のみでは1150°C付近での焼結後,試料がα相およびε相に分解してしまうので,その後800-900°Cでのおよそ100時間という長時間での熱処理によりβ相が生成される.本研究において焼結中,液相焼結による試料の緻密化を促進させるため,比較的低融点金属であるAlおよびCuを試料粉末に添加して常圧焼結を行った.Al添加試料では昇温中においてAl-Si共晶融液が生成し,液相焼結による緻密化が期待されたが,AlのFe-Si相への拡散がおこり,試料中に多量の空隙を生じて焼結体は膨張し,試料の緻密化には至らなかった.また,Al添加試料ではβ相が安定に存在する温度領域を狭める働きを有していることが明らかとなり,以上の結果からAlはβ-FeSi_2の液相焼結における添加剤としては不適であることが確認された.一方,Cuを添加した場合,昇温中約800°C付近からCu-Siの共晶融液を生じ,試料粉末の再配列が促進され,無添加試料に比較して緻密化が大きく促進された.さらに降温時において無添加試料には見られなかった急速なβ相化反応が観察され,従来必要であったβ相化のための長時間にわたる熱処理を必要とすることなく,焼結のみによってβ相が得られることが明らかとなった.また熱電特性はCu添加による著しい劣化は見られず従来のホットプレス材と同等の性能が得られた.一方,Zrドーピングにより特に弱点であった高温側での低い性能を著しく改善できることを明らかにした.β-FeSi_2系熱電変換材料はメカニカルアロイング法を利用してSi+C同時添加を施すことにより,その熱電特性著しく向上することがこれまでの研究結果から分かっている.従来,これらの材料は加圧焼結法であるホットプレス法により作製されたが,将来実用化を考慮した場合,ホットプレス用による製造プロセスではコストが高くなることが問題となる.したがって,このホットプレス材と同等の性能を有するFeSi_2-SiC系熱電変換材料を低コストな常圧焼結法を用いて作製することが重要な課題となる.そこでSiC添加FeSi_2粉末にCuを添加し,液相焼結の利用を試み,常圧焼結にて作製したところ,Cu-Si液相の発生により液相焼結が発生し,常圧焼結によっても緻密な焼結体を作製できることが明らかになった.一方,ε-Fesi金属相の析出を引き起こし,SiC添加に起因する熱起電力向上効果および熱伝導率低減効果がCu添加により失われてしまうことが分かった.そこでε-FeSi金属相の析出を抑えるため,Siを過剰添加したところε-Fesi+Si→β-FeSi_2反応により、ε-Fesi金属相量の減少のみならず半導体β相量の増加を引き起こすことを突き止めた.その結果,熱起電力が大幅に向上し,また熱伝導率も効果的に減少してCu添加による性能劣化を完全に克服できることが分かった.これにより高性能を有するSiC微粒子分散およびCu複合添加β-FeSi_2熱電変換材料を低コストな常圧焼結により作製可能であることを明らかにした.その他,高性能化のため新しいドーピング材の探索を試みたところ,P添加がn型のドーピング材として有効であることを明らかにした.
p53欠失マウスを用いた酸化的DNA損傷の関わる化学発がんプロモーター機序の解析

本研究は、マウス肝での造腫瘍性の知られるpentachlorophenol(PCP)における、このものの二段階発がん実験でのプロモーター作用の基礎と考えられる(1)酸化的DNA損傷、(2)アボトーシス、(3)細胞間連絡(GJIC)阻害の3つの現象の相互関連に注目して、その制御機構を明らかにすることを目的としている。ここでp53欠失マウスは、この実験で(1)DNA損傷の蓄積、(2)アポトーシスの抑制、(3)GJICの低下などが高度に増強されると予測され、この研究の目的を効果的に果たすものと考えられたので、本研究のツールとして導入した。本研究成果として、(1)p53欠失マウスに短期間PCPを投与した結果、肝の酸化的DNA損傷・細胞増殖作用の増強性は認められず、p53のPCPによる発がんプロモーター機序における役割は本研究においては明らかでなかった。一方、(2)培養細胞系において、PCPによるGJIC阻害作用ならびにアポトーシス阻害作用のあることを明らかとした。またGJIC阻害の初期過程でのMAPK(mitogen activated protein kinase)の活性化、抗酸化物質カテキンによるGJIC阻害の軽減効果を見い出し、GJIC阻害と酸化的ストレスとの関連性が示唆された。さらに(3)我々が改良したin vivoGJIC解析法により、PCP投与によるマウス肝のGJIC阻害作用が認められ、これまでの培養系での知見を支持する結果が得られた。以上の本研究から、PCPの発がんプロモーター機序には、p53の制御については明らかでないが、GJIC阻害ならびにアポトーシス阻害が相互に関連することが明らかとなり、またその阻害機序に酸化的ストレスの誘導によるシグナル伝達系の関与が推察された。本研究は肝発がん性のpentachlorophenol(PCP)のプロモーター機序における酸化的DNA損傷、アポトーシス及び細胞間連絡(GJIC)阻害の相互関連性について、それらの制御に関わると考えられるp53欠失系で検討することを目的としている。これについて本年度は、日本側で(1)p53欠失マウスへのPCP投与試験を実施し、また日本からミシガン州立大学(Dr.Trosko研究室)へ研究員を派遣し、(2)培養細胞系でのPCPによるGJIC阻害作用に関する実験を実施した。またDr.Troskoを日本に招聘し、共同研究成果の報告及び今後の計画について打ち合わせ会議を行った。本年度の実績としては、(1)p53欠失マウスへのPCP投与試験では、p53野生型(p53+/+)及び欠失型(p53+/-,p53-/-)マウスにPCP(0300ppm)を2週間混餌投与し、肝の酸化的DNA損傷および細胞増殖作用を解析した。その結果、野生型マウスでのPCP投与量依存的な肝での酸化的DNA損傷ならびに細胞増殖作用に対して、p53欠失による増強性は認められず、この原因について現在検討中である。(2)培養肝細胞でのPCP及びその代謝産物TCHQによるGJIC)阻害作用に関する実験の結果、PCPにGJIC阻害作用が認められ、これにはコネクシンのリン酸化状態及び細胞膜状での発現とは関連性がないが、コネクシン発現量の低下との関連が認められた。一方、TCHQには阻害作用が見られなかった。このことから、PCPの直接的なGJIC阻害作用が発がんプロモーターに深く関与していることが示唆された。本研究は、マウス肝での造腫瘍性の知られるpentachlorophenol(PCP)における、このものの二段階発がん実験でのプロモーター作用の基礎と考えられる(1)

酸化的DNA損傷、(2)アポトーシス、(3)細胞間連絡(GJIC)阻害の3つの現象の相互関連に注目して、その制御機構を明らかにすることを目的としている。ここでp53欠失マウスは、この実験で(1) DNA損傷の蓄積、(2)アポトーシスの抑制、(3) GJICの低下などが高度に増強されると予測され、この研究の目的を効果的に果たすものと考えられたので、本研究のツールとして導入した。昨年度のp53欠失マウスを用いた酸化的DNA損傷に関する実験に引き続き、本年度は、(1)培養細胞系でのアポトーシス阻害作用とGJIC阻害との関連、ならびにその機序における酸化的ストレスの関与について実施し、さらに(2)我々の改良したinvivo GJIC解析法を用いて、マウスへのPCP投与による肝GJIC阻害作用を検討した。その結果、(1) PCPにはアポトーシス阻害作用のあることが明らかとなり、これはGJIC阻害作用に伴って観察された。またGJIC阻害の初期過程に、MAPK(mitogenactivated protein kinase)の活性化が起こること、抗酸化成分カテキンによりGJIC阻害が軽減することを見い出し、酸化的ストレスとの関連を示唆する知見が得られた。(2)また、PCP投与によるマウス肝のGJIC阻害作用を認め、これまでの培養系での知見を支持する結果が得られた。以上のように本年度の研究により、PCPの発がんプロモーター機序には、GJIC阻害ならびにアポトーシス阻害が相互に関連することが明らかとなり、またその阻害機序に酸化的ストレスの誘導によるシグナル伝達系の関与が推察された。
ポリ-γ-グルタミン酸加水分解酵素の立体構造解析及び基質認識機構の解明

納豆菌(Bacillus subtilis (natto))を宿主とするバクテリオファージ(ΦNIT1)が生産する、納豆菌の生産するポリ-γ-グルタミン酸(poly-γ-glutamate ; PGA)を分解する酵素(PghP ; 25kDa)のX線結晶構造解析を行い、1.9A分解能で結晶構造を決定した。PghPは平行(R)シートを主体とする構造を有し、1分子に一つの亜鉛イオンを配位していた。全体構造の比較から、本酵素は亜鉛ペプチダーゼであるcarboxypeptidase Aと類似した構造をもつことが判明した。納豆菌が生産するポリ-γ-グルタミン酸(poly-g-glutamate;PGA)を加水分解する3つの酵素のうち、納豆菌を宿主とするバクテリオファージ(ΦNITl)由来の新規のPGA分解酵素(PghP;25kDa)について、酵素反応機構の解明を目的とし、X線結晶構造解析に向けた結晶化を行った。PghPは、まず、PEG600を沈殿剤として用いた条件で結晶が得られ、X線による回折像の取得にも成功した。PghPが新規構造を持つタンパク質であると考えられたため、Se-誘導体の結晶を作り異常分散法での位相決定を行うために、Se-誘導体タンパク質の調製を行った。Se-誘導体タンパク質は常法でNativeタンパク質と同様、高収率で発現され、活性を有する状態で調製されたものの、先に得られていた結晶化条件では結晶が得られなかった。そこで、Se-誘導体タンパク質で結晶化条件を再検討したところ、PEG300とPEG1000を沈殿化剤とする新たな結晶化条件を見いだすことに成功した。結晶はシッティングドロップ蒸気拡散法を用いて、沈殿剤溶液とタンパク質溶液を混合して沈殿剤に対して蒸気平衡状態にして約1週間で再現よく得ることができるようになった。Nativeのタンパク質を用いても同じ条件での結晶が得られている。X線回折像は実験室系のX線解析装置を用いて測定し、3Åに迫る分解能の反射を確認することができた。この結晶は空間群P3_121,あるいはP3_221に属し、a=b=85.8, c=86.6Åの格子定数をもつこと、また、単位結晶中に2分子のPghPが存在し、結晶の水分含量は38%程であることが明らかとなっている。放射光での異常分散データの取得によりPghPの結晶構造が決定される可能性が高まった。納豆菌が生産するポリ-γ-グルタミン酸(poly-g-glutamate; PGA)を加水分解する3つの酵素のうち、納豆菌を宿主とするバクテリオファージ(ΦNIT1)由来の新規のPGA分解酵素(PghP; 25kDa)について、酵素反応機構の解明を目的としX線結晶構造解析を行った。構造解析は、Se-誘導体を利用した単波長異常分散法(SAD)により行った。まずSe-誘導体結晶を作製し、高エネルギー加速器研究機構放射光施設ビームラインNW12でSe吸収端での異常分散項を含む2.6Å分解能X線回折データの取得を行った。プログラムsolveでSAD法による位相計算を行った後、初期位相から、構造モデルのトレースを行った。非対称単位結晶中の2分子の全体構造のトレースを行った後、1.8Å分解能nativeデータヘ構造の移設を行い、高分解能データを用いて、構造モデルの精密化を進めた。最終的に結晶学的R因子21.1%の構造モデルを取得することに成功した。PghPは逆平行βシートを主体とする構造を有し、非対称単位中の2分子が、それぞれのβシートをつなげるように二量体を形成していた。その両端の位置にそれぞれの分子が一つずつ亜鉛イオンを配役しており、そこが触媒部位であると推定できた。亜鉛イオンの結合部位は分子を2分する溝の中心にあり、溝の中にはグルタミン酸やアルギニンなど、触媒基や基質認識にかかわると考えられるアミノ酵が存在していた。本酵素はメタロプロテアーゼ様触媒機構を持つのではないかと考えられた。今後触媒反応機構を解明する上で基質複合体構造が必要になるが、数種類のDL-オリゴγ-グルタミン酸ペプチドを結晶にソーキングしてデータを取得したものの、ペプチドとの複合体との構造を得ることができなかった、引き続き共結晶化を利用した複合体の作製・解析を進めることが必要である。納豆菌が生産するポリーγーグルタミン酸(poly-g-glutamate ; PGA)を加水分解する3つの酵素のうち、納豆菌を宿主とするバクテリオファージ(ΦNITI)由来の新規のPGA分解酵素(PghP ; 25kDa)について、X線結晶構造解析を行い、単波長異常分散法(SAD)により構造決定を行った。

構造解析では、構造構築後に、電子密度の重なった部分が存在したためデータの双晶が疑われ、各種プログラムで検証した結果、本結晶は空間群P3_2であり、merohedral twinで、twin fractionが0.47であり、空間群P3_221は双晶化による見かけの空間群であることが示唆された。そこで空間群P3_221で処理したデータを使用し、非結晶学的対称の拘束を利用し、結晶学的R因子19.7%のモデルを得た後、データを空間群P3_2で再処理し、反射の分離を行い、結晶学的R因子が約28%のモデルを最終構造モデルとした。PghPは逆平行βシートを主体とする構造を有し、非対称単位中の2分子がそれぞれのβシートをつなげるように二量体を形成していた。その両端の位置にそれぞれの分子が一つずつ亜鉛イオンを配位しており、そこが触媒部位であると推定できた。本酵素は亜鉛ペプチダーゼであるcarboxypeptidase Aと類似した構造をもつことが判明した。数種類のDL-オリゴγ-グルタミン酸ペプチドとの複合体解析を試みたものの、複合体構造を得ることができなかったが、carboxypeptidase Aとの比較により本酵素の触媒反応機構を明らかにした。また、亜鉛イオン結合部位のある溝の中にはグルタミン酸やアルギニンなどがあり、これらが触媒基や基質認識にかかわるアミノ酸であると推定された。