hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ダウン症患者における睡眠呼吸障害の実態調査と有効な看護介入の確立

ダウン症者における先天性心疾患と睡眠時無呼吸症候群との関連についての報告、ダウン症者特有の睡眠体位と睡眠時無呼吸症候群との関連とについての報告と睡眠時無呼吸症候群の簡易検査装置のパルスオキシメトリーを用いて検討したダウン症者特有の睡眠体位と睡眠時無呼吸症候群との関連についての報告を国際誌へ投稿し全て受理されている。いずれの論文もダウン症者における睡眠時無呼吸症候群は、非常に高率であることと睡眠時無呼吸症候群の危険因子に関して報告している。また、ダウン症者の睡眠時無呼吸症候群に関する国際調査を行うべく、スコットランドのチームと研究基盤を作り、研究を行った。この国際研究を実施するに当たって、双方のチームの立案段階でのデーターベースの作成やデータの解析を行った。最終的に我々は、成人のダウン症者のデータをスコットランド人・日本人合わせて約800名収集できた。以上の研究の内容をスコットランドのチームと共同して論文化しており、近日中に国際誌に投稿する予定である。今後は、さらに精度の高い検査法で疫学調査を行いより確立したデーターベースの作成を行う予定である。睡眠時無呼吸症候群は、心血管病、注意欠陥多動性障害、学習障害との関連が示唆されている。このことから、本研究は、睡眠時無呼吸症候群の早期発見・早期治療へと繋げることが出来る内容となっているため、ダウン症者のQOLや予後の改善に大きく貢献出来るものだと考える。また、調査範囲を国際研究へ広げたことから日本だけでは無くヨーロッパの国々にも貢献出来る研究に発展したと考えている。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、ダウン症者の睡眠時無呼吸症候群に関する基礎情報の確立として1,222人のアンケートデータを詳細に且つ多岐にわたり検討した。その結果、1先天性心疾患を合併しているダウン症者の睡眠時無呼吸の症状と先天性心疾患の重症度による影響については、先天性心疾患を持つものは睡眠中の呼吸停止(この場合は、心機能低下によって引き起こされる中枢性睡眠時無呼吸の可能性)が多くなることが示された。そのなかでも特に先天性心疾患の重症度が高いファロー四徴症を持つダウン症者が睡眠中の呼吸停止の合併率が高かった。このことから、ダウン症者において先天性心疾患を合併している者、特に重症度が高い者については、睡眠時無呼吸の症状を注意深く観察し早期発見・早期介入する必要があることが示された。2ダウン症者で特異的に観察される睡眠時無呼吸症候群の防御姿勢と考えられる睡眠体位と睡眠時無呼吸の症状との関連については、ダウン症者に特異的に観察される睡眠体位または座位で寝ているダウン症者は、いびきと睡眠中の呼吸停止の頻度が高かった。このことから、療育者や看護職者はこのような睡眠体位を発見した場合はダウン症者に対し精密検査を行い、早期介入をする必要が明らかとなった。3鼻炎・花粉症が及ぼす睡眠時無呼吸の症状への影響については、鼻炎や花粉症をもつダウン症者は、有意に睡眠時無呼吸の症状の発生率が高くなることが明らかになった。この研究により、従来の睡眠時無呼吸に対する介入に加えて、耳鼻科的な方面からの介入も必要な事が示唆された。また、看護職者は、睡眠時無吸症候群の早期発見のために鼻炎や花粉症をもつダウン症者の療育者に対して睡眠時無呼吸症候群を合併する確率が高くなるといった情報提供を行うことが大切なことが示された。上記したものに加えて、他にも多くのダウン症者の睡眠時無呼吸症候群に関するリスク因子を見いだした。本年度は、ダウン症者における睡眠時無呼吸症候群のリスク因子に関する基礎情報の確立としてアンケートベースで詳細に検討を行った。

その結果、数多くの今まで報告されていないリスク因子が明らかとなり、リスク因子に基づいてダウン症者の睡眠時無呼吸症候群の有無の可能性を評価することで早期発見の可能性が見いだせたことは評価できる。以上のことから当初の進展目標を達成出来たのではないかと思われる。これまでの調査は、主観的なデータのアンケートを基として研究を進めていったが、さらに確立したものにするために客観的なデータを使ってこれまで明らかにしてきたことを調査する必要がある。今後は、パルスオキシメーターなど簡易装置を使って調査をしていく予定である。また、国際的なダウン症者の睡眠時無呼吸症候群の基礎情報の確立のために同じ研究を行っているスコットランド(英国)のチームと情報の共有をするために調整をしている。上記に加えて、これまでの知見を論文にまとめ国際学術誌に投稿するために、論文の執筆を行う。
糖ペプチド型シュガーボールの精密合成と分子触媒・分子認識機能開発

研究計画に従って、各種の糖ペプチド型シュガーボールを新たに合成し、カプセル化や分子認識など、バイオ素材としての機能評価を実施した。1.糖ペプチド型シュガーボールの精密合成法の確立末端に1級アミノ基を有するポリ(アミドアミン)デンドリマーやポリ(トリメチレンイミン)デンドリマーと糖誘導体置換L-セリンN-カルボキシ無水物(NCA)との反応により、規制された構造からなる糖ペプチド型シュガーボールを精密に合成する方法を確立した。この方法により、グルコース、ガラクトース、およびN-アセチルグルコサミン単位を表層に有する第8世代までの糖ペプチド型シュガーボールを合成した。2.放射成長重合(RGP)における重合加速効果の解析デンドリマーを開始剤に用いた糖置換NCAのリビング開環重合を、電導度測定による速度論的解析により詳細に調べた。成長速度定数に及ぼす溶媒、温度、アルキル置換基の効果や開始基をもたないデンドリマーの添加効果などを克明に調べ、低分子開始剤に比べてデンドリマー開始剤を用いたときにみられる著しい加速現象が、デンドリマー表面層へのNCAの濃縮効果と放射成長に基づく衝突確率の増大に由来することを明らかにした。3.糖ペプチド型シュガーボールのバイオ素材としての機能評価糖ペプチド型シュガーボールの内部空孔への8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸ナトリウム(ANS)など低分子化合物のカプセル化を検討した。第8世代のポリ(アミドアミン)デンドリマーを用い、糖置換NCAとの反応をジメチルスルホキシド中で行うことにより、カプセル化能を大幅に向上させることができた。また各種レクチンを用いた赤血球凝集阻害試験により、糖ペプチド型シュガーボールが高い認識能を有することを実証した。下記の各項目について意義ある進展をみた。(A)糖ペプチド型シュガ-ボールの精密合成法の確立糖ペプチド型シュガ-ボールの精密構築として、生体適合性に優れたポリ(アミドアミン)デンドリマ-を開始剤とするグルコースおよびN-アセチル-D-グルコサミン誘導体置換セリンN-カルボキシ無水物(NCA)のリビング開環重合を行い、糖ペプチド放射状鎖をもつ星型デンドリマ-を合成した。(B)放射成長重合(RGP)における重合加速効果の解析ポリ(アミドアミン)デンドリマ-を開始剤とするグルコース誘導体置換NCAの重合を重水素化クロロホルム中で行い、^1H NMRを用いた直接測定により開始反応ならびに成長反応速度を観測した。開始反応速度定数は成長反応速度定数と比較して10^4倍以上大きく、放射成長鎖の鎖長が揃う条件を充たしていた。n-ヘキシルアミン開始剤の線状成長系と比較すると、デンドリマ-開始剤系の成長反応はデンドリマ-近傍で明らかに速いことが判明した。すなわち、第5世代デンドリマ-の表面近傍10Åおよび16Å以内の領域は、直鎖状成長と比較してそれぞれ30倍および20倍以上の加速反応場であることがわかった。第6世代デンドリマ-では70倍以上の加速を認めた。(C)糖ペプチド型シュガ-ボールののバイオ新素材としての機能評価小麦胚芽(WGA)レクチンを用いた赤血球凝集阻害試験により、糖ペプチド型シュガ-ボール(N-アセチル-D-グルコサミン型)の分子認識機能の世代依存性を調べた結果、糖ペプチド鎖の重合度が平均3.5以下の第3世代から第6世代デンドリマ-の間では第4世代が最も高い分子認識能を示すことが分かった。プラスミドから調製した分子量が明確なDNAと糖ペプチド型シュガ-ボールとのコンプレックス形成を電気泳動および濁度測定により確認することができた。

以下の各種の糖ペプチド型シュガーボールを新規に合成し、細胞認識機能などの機能評価を計画に従って遂行し、糖ペプチド型シュガーボールが優れた機能をもつことを明らかにした。(A)糖ペプチド型シュガーボールの精密合成法の確立ポリ(トリメチレンイミン)デンドリマーを用いたアミノ酸N-カルボキシ無水物(NCA)の開環重合により、目的のシュガーボールが構造が規制されたデンドリマー・リビング重合体複合体として合成できることを示した。ポリ(アミドアミン)デンドリマーを用いて、グルコースおよびN-アセチル-D-グルコサミン誘導体置換セリンNCAのリビング開環重合を検討し、糖ペプチド型シュガーボールを合成した。(B)放射成長重合(RGP)における重合加速効果の解析球状分子開始剤系を用いた糖置換NCAのリビング開環重合において確認された加速現象が、普遍的に他の球状開始剤系およびモノマー系でも起こりうる新現象であるかを明らかにするための手順として、ポリ(トリメチレンイミン)デンドリマーを用いた速度論的解析を^1H NMRを用いた直接測定により行なった。また、サルコシンNCAモノマーの重合を行い、糖部分の影響の有無を調べた。興味深いことに、この加速現象は糖には影響されず、普遍性が認められた。シュガーボールの研究をもとに、他の触媒開発などの糸口となる有用な知見が得られた。(C)ペプチド型シュガーボールのバイオ新素材としての機能評価糖ペプチド型シュガーボールの骨格のポリ(アミドアミン)デンドリマーの形態を原子間力顕微鏡で直接観察した。雲母表面上では表面力が働き偏球状構造をとることが判明した。8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸マグネシウム(ANS)およびクマシブリリアントブルーなどの低分子蛍光物質の糖ペプチド型シュガーボールへのカプセル化を行った。糖置換NCA重合前後で低分子の添加を検討した。糖を置換した後では、低分子化合物をカプセル内に入れることはできなかったが、低分子化合物存在下で糖を導入することによりカプセル化が達成できた。糖ペプチド型シュガーボールのカプセルは外殻の糖ペプチド層により内容物をブロックしていることが分かった。本年度も以下の三つの課題について引き続き研究を行った。1)糖ペプチド型シュガーボールの精密合成法の確立D-ガラクトースおよびN-アセチル-D-グルコサミンを表層に有する、それぞれ第8世代までの糖ペプチド型シュガーボールを、ポリ(アミドミン)デンドリマーの末端アミノ基と対応する糖誘導体置換L-セリンNCAとをクロロホルム中低温で反応させることによって合成した。2)放射成長重合(RGP)における重合加速効果の解析アミノ末端デンドリマーを開始剤として用いた糖誘導体置換L-セリンNCAの開環重合で見られた加速現象の要因を解明するために、サルコシンおよびその類縁体のNCAの重合を種々の条件下で研究した。速度論的な解析結果から、加速現象は、主としてデンドリマー表層における単量体の濃縮効果と放射成長による衝突確率の増大に起因することを明らかにした。3)糖ペプチド型シュガーボールのバイオ新素材としての機能評価8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸ナトリウム(ANS)をゲスト分子に用いて、ポリ(アミドアミン)
単一細胞・ゲノムアレイによるエピゲノム解析

本研究の目的は、単一細胞由来のゲノムDNAの化学修飾を一括計測可能な分析手法・材料、デバイスを提案し、細胞集団内のエピジェネティックな揺らぎを明らかにすると共にメチル化異常を有する単一細胞検知を目指すことである。細胞から抽出したゲノムDNAのアレイ化からシトシンのメチル化とヒドロキシメチル化の免疫化学的計測までをすべて室温、中性溶液で行うことでインタクトなゲノムDNAの情報を得る。これによりクローニングすることなく、個々の細胞のメチル化情報を数千数万細胞単位で一括計測することが可能になる。平成30年度では、リンカー修飾基板を作製し、抽出したゲノムDNAを滴下するだけでゲノムDNAアレイとなる条件を確認した。その後、抗DNA抗体位や抗メチルシトシン抗体によるメチル化計測を行い、単一ゲノムでのメチル化解析を行った。ゲノムDNAの検出に関して、先ずはゲノム全長が均一で明らかなλDNAをモデル試料として用い、DAPIなどの蛍光染色や蛍光色素を標識した抗メチルシトシン抗体、さらには抗メチルシトシン抗体での多重染色を行い、落射型正立蛍光顕微鏡観察により、単一ゲノムDNAが捕捉される条件を求めた。その結果、金基板上に単一ゲノムDNAごとに捕捉されることを確認することができ、さらに抗メチルシトシン抗体で染色することによって単一ゲノムでのメチル/非メチルゲノムを見分けることに成功した。本結果は、単一細胞由来のゲノムDNAの化学修飾を一括計測可能な分析手法として重要な基盤技術となる。計画書通りに推移しているため単一ゲノムごとに、規則正しいアレイ状に固定化することにより、より簡便に解析できるようになる。実施計画書に従い、アレイ化金基板を作製することで。より高度な解析を行う予定。ゲノムDNAを基板上へ効率的に捕捉するために、片側にナイトロジェンマスタードを持ち、もう片側に基板結合部位(環状ジスルフィド、ビオチン)を有するリンカー分子を合成した。ナイトロジェンマスタードは、第二次世界大戦時に開発された抗がん剤の主要骨格であり、グアニン塩基の7位の窒素に結合し、二本鎖DNAを架橋する性質をもつ。まず、オリゴDNAとリンカー分子を中性溶液中で混合し、変性ポリアクリルアミド電気泳動で評価した結果、95%以上の二本鎖DNAがリンカー分子に架橋されたことを確認した。次に、表面プラズモン共鳴測定装置(Biacore)を用いて架橋オリゴDNAの固定化を行った結果、架橋オリゴDNAを速やか基板上へ固定化することに成功した。さらに、メチル化率の異なるオリゴDNAを固定化し、抗メチルシトシン抗体を送液したところ、固定化DNAのメチル化率に比例して抗体の結合量が増加することを明らかにした。同様の実験をゲノムDNAの一種であるλDNAを用いて行った結果、リンカー分子による架橋・送液によるDNAの固定化・抗体によるメチルシトシンの検出が可能であることを実証した。また、30年度実施予定のマイクロアレイ基板に対するDNA固定化の予備検討として、マイクロプレート基板表面でのDNAの固定化を検討した。アビジン-ビオチン結合を介してあらかじめリンカーを固相化したプレート表面にDNAを加えた結果、DNAが十分に固定化されることを確認した。さらに、プレート表面に固定化したDNAのメチルシトシンを抗体によって検出可能であることを明らかにした。リンカー分子の合成と評価を行い、目的としていたDNAの基板への捕捉およびメチルシトシンの計測を実現でき、一連の成果を論文で発表するに至った。また、プレート上でのDNAの固定化にも成功し、次年度以降の計画をスムーズに進められると考えている。計画書通りに推移しているため次年度は、ゲノムDNAのメチル化率の評価を重点的に行う。異なる組織から抽出したゲノムDNA中のメチル化率を評価し、組織ごとに差が生じることを確認する。またプレート上により効果的にDNAを固定化すべく、構造が異なるリンカー分子の開発を進める。単一ゲノムごとに、規則正しいアレイ状に固定化することにより、より簡便に解析できるようになる。
大腸癌のゲノム進化モデルに基づく新たな分子治療標的遺伝子の同定とその機能解析

本邦において各々の癌症例におけるPrecision medicine(精密医療)の実践のためにゲノム医療が実用化されてきている。大腸がん進化におけるゲノム変化を明らかにすることがゲノム医療の有効な実践に必須と考える。我々はこれまでヒト大腸がん組織を用いて包括的なゲノム解析を行い、大腸がんの進化モデルを提唱してきた(PLoS Genet 2016, Nat Commun 2018)。上記のゲノム解析により、大腸癌に広く存在する発癌関連ゲノム変化(Founder遺伝子の変異)として、7番、13番染色体のコピー数の増幅を見い出した(PLoS Genet 2016, Nat Commun 2018)。これらの染色体に、大腸癌の発癌や進展に関与するがん遺伝子が存在することが強く示唆されるため本研究では、内包されるがん遺伝子を同定してきた(PSPH: Anticancer Res 2017, 5MP1:eBioMedicine最終年度では上記研究の総括および引き続き新規がん遺伝子の同定と機能解析を行った。また現在これらの遺伝子を標的とした治療薬(化合物)の同定とその機能解析を行っている。当研究室の研究により明らかにした大腸がん進化モデル(ProsGenetics 2016)により、7番染色体、13番染色体の増幅が大腸がんの早期に共通して生じることが明らかになったため、これらに内包されるがん遺伝子を大腸がん臨床検体および実験により同定している。現在までに7番染色体に3つ、13番染色体に1つがん遺伝子候補を同定した。それらの機能解析を進めつつ新たながん遺伝子を検索している。現在のところがん遺伝子候補として4つ同定し、学会報告を複数行っている。一つについては最近論文報告を行った(Anticancer Res 2017)当研究室の研究により明らかにした大腸がん進化モデル(ProsGenetics 2016)により、7番染色体、13番染色体の増幅が大腸がんの早期に共通して生じることが明らかになった。これらの遺伝子変化は大腸がんに共通して存在することを示しており、それらを治療標的にすることは治療抵抗性の原因と考えられている腫瘍内不均一性に影響されない有効な治療法になりえることが期待される。現在これらに内包されるがん遺伝子を大腸がん臨床検体および実験により同定し、機能解析を行っている。現在までに7番染色体に4つ、13番染色体に2つがん遺伝子候補を同定した。そのうちの1つであるPSPHに関しては論文報告を行った(Anticancer Res 2017)。残りの5つに関しても現在論文作成中である。現在のところがん遺伝子候補として6つ同定し、学会報告を複数行っている。一つについては論文報告を行った(Anticancer Res 2017)。他の5つに関してもおおむね実験が終了し、現在論文作成中である。引き続き新規がん遺伝子の同定を試みる。また同定したがん遺伝子は機能解析および化合物スクリーニングを行う。また同定したがん遺伝子に関しては、それを抑制する化合物のスクリーニングをさらに進め有効な化合物の同定を試みる。その化合物のヒトでの有効性を確認する臨床試験を行うことを最終目標としている。次年度実験で利用したい。来年度の研究消耗品として使用予定次年度、実験消耗品として利用予定。
ケミカルツールを駆使したミトコンドリア機能制御因子の探索

酸化ストレスによるミトコンドリア機能異常は、運動機能低下や加齢性疾患、生活習慣病など多くの疾病と深く関連しており、ミトコンドリア内での抗酸化機序解明が健康長寿研究に占める重要性は高い。その中で近年、CARS2タンパク質の関わる強力な抗酸化機序が発見されたが、それがミトコンドリア機能制御にどう関連しているかは明らかにされていない。そこで本申請課題では、機能性分子化学の発想に基づくケミカルツールの開発という独自のアプローチによる課題解決を目標とし、新しい視点からのバイオマーカー探索や創薬研究への貢献を目指したCARS2関連代謝経路の解明に挑む。
基質認識特性に立脚した新規アミラーゼ阻害剤の分子設計

膵α-アミラーゼの阻害は肥満、糖尿病抑制に効果的である。しかし、この酵素はグルコースの連鎖を基質として認識するという特性から、親和性の高い低分子阻害剤がほとんど知られていない。本研究では、α-アミラーゼの基質認識特異性を積極的に利用した分子を阻害剤として設計、合成して新たな低分子α-アミラーゼ阻害剤をつくりだした。さらに、今後の阻害剤設計に有用なα-アミラーゼの基質認識特性についても明らかとした。消化管α-アミラーゼの阻害は肥満、糖尿病抑制に効果的である。実用的な低分子阻害剤が知られていないα-アミラーゼについて、酵素の独特の基質認識機構、すなわちα-アミラーゼが触媒部位であるグルコシド結合だけではなく、そこから上流部と下流部に連なるグルコースの連鎖を認識するサブサイト部位をもっていることに着目し、酵素阻害につながる反応部位と基質認識を向上させるサブサイト結合部位の両方を適当なリンカーで結んだ分子を設計し、活性評価を行った。まずα-アミラーゼの触媒活性阻害ユニットとして、既存のグルコシダーゼ阻害剤デオキシノジリマイシン(D)をもち、その上流側にリンカー(L)を介してサブサイト認識グルコース(G)を配したGLD型分子として、L部にC6,C9,C12,C15の炭化水素鎖をもつ各化合物を合成した。カップリングに用いる4位のみ遊離OHをもつD保護体はグルコースから既報の改良によって11段階総収率3%で合成することができた。GL部は各鎖長のω-ヨードアルコールを常法のα-グルコシル化反応によってG保護体に結合し、ヨードアルキルグルコシド保護体とした。GL保護体のリンカー末端とD保護体4位のカップリングは、立体障害のために反応性が低く種々条件検討を必要としたが、最終的にTHF中NaHによるエーテル形成条件によっておだやかに進行することがわかった。最後にすべての保護基を除去して目的のGLDを得ることができた。合成した各鎖長のリンカー部をもつGLD化合物について、酵素源に市販のブタ膵臓アミラーゼ、基質にジニトロフェニルマルトオリゴ糖を用いた阻害活性試験を行った結果、すべての化合物に中程度の活性(1mMで13-35%)が見られ、なかでもC12リンカー体が最大の活性を示すことがわかった。リンカー鎖長による活性の差異は、触媒部位と認識サブサイトとの距離の適否によるものと考えられた。実用的な低分子阻害剤が知られていないα-アミラーゼについて、酵素の独特の基質認識機構、すなわちα-アミラーゼが触媒部位であるグルコシド結合だけではなく、そこから上流部と下流部に連なるグルコースの連鎖を認識するサブサイト部位をもっていることに着目し、酵素阻害につながる反応部位と基質認識を向上させるサブサイト結合部位の両方を適当なリンカーで結んだ分子を合成し、活性評価を行った。また、コンピュータを用いた計算化学的手法により、最適構造分子の設計をあわせて行った。まずα-アミラーゼの触媒活性阻害ユニットとして、既存のグルコシダーゼ阻害剤デオキシノジリマイシン(D)をもち、その上流側にリンカー(L)を介してサブサイト認識グルコース(G)を配したGLD型分子として、L部にこれまで(C6-12)より長いC15および短いC4,C5の炭化水素鎖をもつ各化合物を、前年度確立した方法により合成した。合成した各鎖長のリンカー部をもつ化合物について、酵素源に市販のブタ膵臓アミラーゼ、基質にジニトロフェニルマルトオリゴ糖を用いた阻害活性試験を行った結果、C15,C4,C5ともこれまでの鎖長の化合物より活性が低下し、最適鎖長はC12であることがわかった。この結果は、分子計算による酵素タンパク質への最適合分子構造とは一致しなかった。また、より近傍の-3サブサイトへの親和性を狙ったC4,C5がほとんど活性を示さなかったことから、単にサブサイト(G)と活性部位(D)の距離だけではなく、L部の剛直性や疎水性など他の要因を慎重に考慮する必要があることがわかった。消化管α-アミラーゼの阻害は肥満、糖尿病抑制に効果的であるが、酵素がグルコースの連鎖を基質として認識するという特性から、親和性の高い低分子阻害剤がほとんど知られていない。そこで、このα-アミラーゼの基質認識特異性を積極的に利用し、触媒部位阻害ユニットと離れたグルコース認識部位(サブサイト)をリンカーで結んだ分子を設計、合成したところ、リンカー長を適度(Cl2炭素鎖)にとればアミラーゼ阻害物質として成り立つことを前年度までに確かめた。本年度は、α-アミラーゼの触媒部位近傍のアミノ酸残基について詳細に検討した結果、上流側サブサイトには疎水性領域があり、グルコース以外の疎水性分子が認識される可能性が考えられた。

そこで分子計算結果も考慮して、触媒部位阻害ユニットであるデオキシノジリマイシン(D)から上流側にC4リンカーを介して末端に疎水性のベンゼン環をもつ安息香酸エステルを配したところ、弱いながらα-アミラーゼ阻害活性がみられることを見出した。構造活性相関についての知見を得るためにパラ位に電子求引性のフッ素および電子供与性のヒドロキシ基が結合した置換安息香酸エステルを合成したところ、いずれも無置換体よりも活性が低下した。また、下流側サブサイト部位には塩基性アミノ酸残基があることから、相互作用しうる酸性官能基をリンカー末端にもつ分子としてDの下流側にC8リンカーを介してカルボキシ基をもつ分子を合成したが、酵素阻害活性はみられなかった。以上の研究結果より、触媒部位結合ユニットの上流側に適当な長さのリンカーを介してサブサイトに認識されるグルコースあるいは疎水性構造単位を結合させた分子は、α-アミラーゼに基質類似物質として認識され、阻害活性を示すことが明らかになった。
1次感覚ニューロンにおけるb系列ガングリオシドの機能的役割

ニューロパチーにより運動失調をきたしうる。感覚性運動失調型のニューロパチーではIgG抗GD1b抗体やb系列ガングリオシドに対するIgM抗体が、小脳性運動失調型のニューロパチーではIgG抗GQ1b抗体が検出されることがある。本研究では、作業仮説「b系列ガングリオシドが固有感覚を司る1次感覚ニューロンの機能維持に重要な役割を演じている」を検証するため、GD1b、GQ1bを含むb系列ガングリオシドを発現していないマウスの解析を始めた。GD3合成酵素をノックアウトしたF4マウスとC57BL6を戻し交配し、F8世代のマウスを得た。固有感覚を司るIa群線維の起始細胞は脊髄神経節に存在し、筋紡錘の錘内筋から筋肉情報(入力)を受け脊髄後根を経由し、脊髄前角に伝達している。前角のγ-運動ニューロンがこれらの情報を受けて、錘内筋に指令を出している。GD3合成酵素ノックアウトマウスと、その同腹の野生型マウスにおいて、後根神経節におけるパルブアルブミン(深部感覚をつかさどる大型ニューロンのマーカー)、イソレクチンB4(小型ニューロンのマーカー)を用いて免疫組織化学を行い、大型・小型ニューロンの局在をすでに確認した。今後これらで染色される単位面積当たりの神経細胞数を計測する。ノックアウトマウスにおいてパルブアルブミンで染色される細胞数が少なく、イソレクチンB4で染色される細胞数は不変であるという結果が期待される。各種抗ガングリオシド抗体と末梢神経障害との相関が臨床的に示されているだけでなく、GM1、GD1bを感作することによりモデル動物が樹立されている。しかしながら、抗ガングリオシド抗体の作用機序は明らかでない。本研究ではラット脊髄後根神経節(DRG)ニューロン初代培養系において、抗ガングリオシド抗体神経障害の発症機構を検討している。まず、ラットDRGニューロンにおけるガングリオシド発現の割合を免疫組織化学を用いて検討した。各種ガングリオシドの大型ニューロン、小型ニューロンの比率(%)は、GM1(大型ニューロン48%、小型ニューロン24%)、GD1a(72%、19%)、GD1b(63%、19%)、GQ1b(59%、21%)であった。次に、ラットDRGニューロンを初代培養し、b系列ガングリオシドに対するIgM抗体を有する感覚性運動失調型ニューロパチー、IgG抗GQ1b抗体陽性のフィッシャー症候群、IgG抗GM1もしくは抗GD1a抗体陽性のギラン・バレー症候群GBS、正常対照、疾患対照として筋萎縮性側索硬化症、重症筋無力症の血清を非働化し、最適条件で添加した後の細胞死率を求めた。この結果、対照血清では細胞死は惹起されなかったが、抗ガングリオシド抗体陽性の各種疾患患者血清では、高率に細胞死が惹起された。抗GD1b抗体による初代培養細胞死の検討でも濃度依存的に細胞死が惹起され、カスパーゼ系によるアポトーシスのシグナル誘導を確認した。抗ガングリオシド抗体陽性の各種疾患では抗ガングリオシド抗体がDRGニューロンに発現しているガングリオシドに結合し、アポトーシスのシグナルを誘導し、細胞死が惹起されることを確認した。
水溶性高分子への吸着固定化による酵素の安定化・活性化と膜型酵素反応器への応用

1.水浴性高分子への吸着固定化による酵素の安定化と反応速度の促進(1)グルコース脱水素酵素(GDH)をポリエチレンイミン(PEI)やDEAE-デキストランなどの水溶性カチオン性高分子に吸着固定化すると、GDHの熱安定性が著しく向上することを見出した。(2)PEIの添加により、補酵素NAD(P)^+の低濃度領域でNAD(P)^+の還元速度が促進された。反応速度解析より、この促進効果は、PEIを介してGDHの反応部位近傍に補酵素が静電相互作用で濃縮されたことによると推論した。(3)GDHと乳酸脱水素酵素(LDH)との共役酵素系によるフェニルピルビン酸の回分式還元反応において、PEIの添加は低補酵素濃度域で反応速度を促進し、補酵素サイクル数の向上に有用である。(4)アルコール脱水素酵素(ADH)へのPEIの添加は、NAD^+からNADHへの還元反応の平衡をNADH生成側にシフトさせ、LDH/ADH共役酵素反応系における反応率の向上に顕著な効果があった。2.膜型酵素反応器の性能に対する水溶性高分子添加効果中空糸膜型酵素反応器を用いたLDH/GDH共役酵素系によるフェニルピルビン酸の連続還元反応において、PEIの添加はフェニルピルビン酸の反応率の向上に有効であった。3.プラズマグラフト重合法による膜型酵素反応器用多孔質荷電膜の作製補酵素を膜内に保持するために、プラズマグラフト重合法によりポリエチレン多孔質模にアクリル酸をグラフトし、酵素と反対の電荷をもつ多孔質膜を作製した。グラフト量、膜厚、イオン交換容量に対する重合条件の影響を検討するとともに、膜の濾過特性の測定を行った。1.膜型酵素反応器を用いる乳酸脱水素酵素(LDH)とグルコース脱水素酵素(GDH)の共役反応に対するポリエチレンイミン(PEI)添加効果小型中空糸限外ろ過膜モジュールのシェル側にLDHとGDH(PEI添加または無添加)の溶液を循環させ,同じシェル側にフェニルピルビン酸(PP),グルコース(Glc),NADH溶液を連続的に供給する濾過方式によるPPからフェニル乳酸(PL)への連続生産を行った.PEI添加により反応率は著しく向上し,膜反応器における本酵素系でのPEI添加効果の有用性が確認された.2.アルコール脱水素酵素(ADH)の反応特性に対するPEI添加効果pH7前後でのADH反応において,NADからNADHへの再生の反応率は,PEIの添加により著しく増加した.これは,ADH-PEI複合体近傍から静電相互作用によりプロトンが排除されてADH反応の平衡がNADH生成側へシフトしたためと推論した.よって,PEI添加はADHを用いるNADH再生に有用であることが判明した.3.LDH,ADH共役反応に対するPEI添加効果LDH,ADH共役反応において,NADHの濃度が低いとき,PEI無添加ではPPからPLへの反応は途中で停止した.しかし,PEI添加により反応は完全に進行し,反応速度も著しく増加した.PEI添加は,速度促進,補酵素のリサイクル数の向上のみならず,補酵素の安定化にも寄与すると推論した.4.低温プラズマを用いる高分子膜への酵素の固定化低温プラズマを用いる固定化酵素膜の作製の基礎として,プラズマによる高分子膜へのグラフト重合実験を行い,グラフト率に対するプラズマ出力,照射時間,アクリル系モノマーの種類,濃度,グラフト重合時間などの影響を実験的に検討した.1.各種カチオン性水溶性高分子添加によるグルコース脱水素酵素(GDH)の安定化と反応挙動の変化これまでに用いてきた

ポリエチレンイミン(PEI),DEAEデキストラン(DEAE-D)は分岐を有する高分子であるが,今回直鎖状の高分子としてポリビニルアミン(PVAm)およびポリアリルアミン(PAA)を用い,GDHの安定化に対するこれらの添加効果を検討した.その結果,安定化効果としては,PEI>PAA>PVAm〓DEAE-Dであり,GDHはPEIの安定化に最も有効であった.2.吸着による酵素の活性およびコンフォメーション変化構造がよく解明されているリゾチームをシリカ微粒子に吸着させたところ活性がかなり低下した.微粒子に吸着されたリゾチームのCDスペクトルによれば二次構造にはほとんど変化がなかったが,蛍光スペクトルより活性部位がより疎水性雰囲気にあることが示され,微小な構造変化が活性の変化を引き起こしたことが示唆された.この結果は,GDH反応のVmaxがPEIなどの添加により変化しないことと対比された.3.プラズマグラフト重合による多孔質荷電膜の作製プラズマグラフト重合法によりポリエチレン多孔質膜にアクリル酸をグラフトし,高い負電荷密度を有する多孔質膜を作製した.この膜は十分な耐圧性があったものの,酵素膜反応器(限外濾過装置)にやや問題があり,負電荷を有する酵素や補酵素をこの膜が静電反発により阻止するかどうかに関する明確な結論は得られなかった.
情報伝達因子NF-kB変異コンジェニックラットの作製とその分子病理学的解析

我々は肝炎・肝癌の自然発症モデルであるLECラットにおいて遺伝的な転写因子異常を見い出した。このラットにはNF-kBシステムに異常があり、この異常を引き起こす遺伝子を同定することを第一目的とした。そしてこの異常遺伝子を同定した後、そのコンジェニックラットを作製することを次の目的として実験を行った。LECラットでは細胞型グルタチオンペルオキシダーゼ(GPx1)活性ならびにmRNA発現が、先天的に肝特異的に低下していることが知られている。そこでLEC肝でのGPx1活性低下の機序を解析した。LEC肝由来細胞株(93C13細胞)と対照LEA肝由来細胞株(93A16細胞)を用いてプロモーターのルシフェラーゼアッセイを行った。抗癌剤エトポシドでp53を誘導すると、p21(WAF1/CLAP1)遺伝子プロモーターは両細胞共に著しい活性化を受けたが、GPx1プロモーターは93A16細胞のみで活性化を受け、93C13細胞は無反応であった。同様の現象はNF-κB結合配列をもつエンハンサー用ベクターを導入し、TNF-α刺激を行った時にも認められた。これらの結果から、93C13細胞ではp53およびNF-κBと協調する因子が不足していることが予測された。そこでGPx1プロモーターの各種欠失変異体を作製してルシフェラーゼアッセイを行なったがルシフェラーゼ活性を低下させる特定の領域は存在しなかった。また93C13細胞における転写活性は常に93A16細胞における転写活性より低く、いずれの欠失変異体でもその比は同じであった。これらの結果から、LECラット肝由来細胞においては、グルタチオンペルオキシダーゼの発現低下は特異的転写因子の差ではなく、基本転写因子を含む転写複合体に異常があるためエンハンサー効果が発揮されないことに因ると考えられた。この基本転写因子の異常がLRCラットにおける多彩な異常所見の原因と考えられる。LECラットと正常対照LEAラット肝の性質を反映していると考えられる93C13細胞(LECラット肝由来)と93A16細胞(LEAラット肝由来)を用いて、グルタチオンペルオキシダーゼ(GPx1)プロモーター活性の測定を行った。これらの細胞に抗癌剤エトポシドでp53を誘導してp21(WAF1/Clip1)遺伝子のプロモーターを持つPG13 pyLucでルシフェラーゼ・アッセイを行った実験では、両細胞株ともp21の転写活性が上昇した。これに対し、GPx1プロモーターはエトポシドにより93A16細胞は活性上昇を示したが、93C13細胞は無反応であった。同様に、NF-κB結合配列を持つエンハンサー活性用ベクターでルシフェラーゼアッセイを行うと、93A16細胞ではTNF-αによりルシフェラーゼ活性の上昇が認められたが、93C13細胞ではほとんどルシフェラーゼ活性は上昇しなかった。これらの結果から、LEC由来の93C13細胞ではGPx1プロモーターがp53やNF-κBに反応するための因子が不足していることが予測された。そこでGPx1プロモーターの各種deletion mutantを作製してルシフェラーゼアッセイを行うと、ルシフェラーゼ活性はGP1配列を欠損させても低下しなかった。また93C13細胞における転写活性は常に93A16細胞における転写活性より低く、いずれのdeletion mutantでもその比は同じであった。

以上より、LECラット由来肝細胞においては、GPx1の発現低下は特異的転写因子の差ではなく、基本転写因子を含む転写複合体に異常があるためp53やNF-κBのエンハンサー効果が発揮されないことに因ると考えられた。我々は肝炎・肝癌の自然発症モデルであるLECラットにおいて遺伝的な転写因子異常を見い出した。このラットにはNF-kBシステムに異常があり、この異常を引き起こす遺伝子を同定することを第一目的とした。そしてこの異常遺伝子を同定した後、そのコンジェニックラットを作製することを次の目的として実験を行った。LECラットでは細胞型グルタチオンペルオキシダーゼ(GPx1)活性ならびにmRNA発現が、先天的に肝特異的に低下していることが知られている。そこでLEC肝でのGPx1活性低下の機序を解析した。LEC肝由来細胞株(93C13細胞)と対照LEA肝由来細胞株(93A16細胞)を用いてプロモーターのルシフェラーゼアッセイを行った。抗癌剤エトポシドでp53を誘導すると、p21(WAF1/CIAP1)遺伝子プロモーターは両細胞共に著しい活性化を受けたが、GPx1プロモーターは93A16細胞のみで活性化を受け、93C13細胞は無反応であった。同様の現象はNF-kB結合配列をもつエンハンサー用ベクターを導入し、TNF-α刺激を行った時にも認められた。これらの結果から、93C13細胞ではp53およびNF-kBと協調する因子が不足していることが予測された。そこでGPx1プロモーターの各種欠失変異体を作製してルシフェラーゼアッセイを行ったがルシフェラーゼ活性を低下させる特定の領域は存在しなかった。また93C13細胞における転写活性は常に93A16細胞における転写活性より低く、いずれの欠失変異体でもその比は同じであった。これらの結果から、LECラット肝由来細胞においては、グルタチオンペルオキシダーゼの発現低下は特異的転写因子の差ではなく、基本転写因子を含む転写複合体に異常があるためエンハンサー効果が発揮されないことに因ると考えられた。この基本転写因子の異常がLECラットにおける多彩な異常所見の原因と考えられる。
肝代謝調節におけるkupffer細胞の役割に関する研究

平成3年度はラット肝還流系において、肝神経を刺激するとKupffer細胞から受容体を介してプロスタグランディン(PGs)が放出され、肝実質細胞に作用してグリコーゲン分解を促進することを明かにした。一方、ラットを寒冷暴露すると交感神経が活性化するとともに、肝臓からのグルコース供給の増加が要求される時、神経-Kupffer細胞の応答が減弱する結果を得た。平成4年度は応答の減弱は神経刺激時のnorepinephrine遊離の減少ではなく、PGs産生の減少に因ることをあきらかにした。Kupffer細胞に特異的に貧食されるzymosanのグリコーゲン分解効果は寒冷暴露により増加した。この増加は貧食能の増加ではなく、PGs産生の増加に求められた。従って、寒冷暴露による神経刺激効果の減弱はnorepinephrineに対するKupffer細胞の応答ね減弱に求め得た。Zymosan(酵母の膜標本)はkupffer細胞に特異的に貧食され、生理活性物質を放出されることが知られている。Zymosanを煮沸することにより、2成分(遠心上清と沈査)に分離しうる。平成5年度は上清と沈査のkupffer細胞刺激により放出するアラキドン酸代謝産物の同定を行い、平成4年度に得られた肝交感神経刺激時に得られた代謝産物と比較検討した。研究の目的は生体防御と肝障害性に関連するKupffer細胞の機能は主としてin vitroにおいて解析されてきているが肝という臓器組織構造の中で,kupffer細胞,実質細胞,神経とがどのような関わりを持ちながら物質代謝に機能を発揮していくのかを明らかにすることである。平成3年度はラット肝潅流系において,肝神経を刺激するとkupffer細胞からαー受容体を介してプロスタグランデイン(PGs)が放出され,肝実質細胞に作用してグリコーゲン分解を促進することを明らかにした。一方,ラットを寒冷暴露すると交感神経が活性化するとともに,肝臓からのグルコ-ス供給の増加が要求される時神経ーkupffer細胞の応答が減弱する結果をえた。その応答の減弱は刺激時のnorepinephrine遊離の減少ではなく,PGs産生の減少に因ることを明かにした。一方,kupffer細胞に特異的に貧食されるzymosanのグリコ-ゲン分解の効果は寒冷暴露により増加した。この増加は貧食能の増加ではなく,PGs産生の増加に求められた。従って寒冷暴露による神経刺激の効果の減弱はnorepinephrineに対するkupffer細胞の応答の減弱に求め得ることを明かにした。研究成果は神経ーkupffer細胞ー実質細胞の相互関係は動物の飼育環境に影響されることが示唆された。これらの成績は肝代謝調節に於けるkupffer細胞の役割の重要性を認識させる。Zymosan(酵母の膜標本)はKupffer細胞に特異的に貧食され、アラキドン酸代謝産物が放出されることが報告されている。平成4年度に肝神経-Kupffer細胞の相互関係の寒冷暴露による減弱の機構を解明するため、肝神経刺激とzymosanの作用を比較検討した。ラットを寒冷暴露すると交感神経が活性化するとともに、肝臓からのグルコース供給の増加が要求される時神経-Kupffer細胞の応答が減弱する結果をえた。その応答の減弱は刺激時のnorepinephrine遊離の減少ではなく、PGs産生の減少に困ることを明かにした。一方、kupffer細胞に特異的に貧食されるzymosanのグリコーゲン分解の効果は寒冷暴露により増加した。従って、寒冷暴露による神経刺激の効果の減弱はnorepinephrineに対するkupffer細胞の応答の減弱に求め得ることを明かにした。研究成果は神経-kupffer細胞-実質細胞の相互関係は動物の飼育環境に影響されることが示唆された。

Zymosanを煮沸することにより、2成分(遠心上清と沈査)に分離すると上清は受容体を介して、沈査は貧食を介してアラキドン酸代謝産物を放出するので、平成5年度は上清と沈査の刺激により放出されるアラキドン酸代謝産物の同定を行い、神経による産物と比較する。Zymosan(酵母の膜標本)はKupffer細胞に特異的に貧食され、生理活性物質を放出されることが知られている。Zymosanを煮沸することにより、2成分(遠心上清と沈査)に分離しうる。平成5年度は上清と沈査のKupffer細胞刺激により放出するアラキドン酸代謝産物の同定を行い、平成4年度に得られた肝交感神経刺激時に得られた代謝産物と比較検討した。遠心上清にはmannoseを含有しKupffer細胞のmannose受容体に結合、アラキドン酸を遊離するが、アラキドン酸はlipooxygenaseの反応を介してロイコトリエンのみを産生することを明らかにした。このロイコトリエンは内皮細胞に作用し、循環障害を引き起こすし、実質細胞への酸素供給の抑制をもたらす。結果として、細胞障害をもたらす。一方、Kupffer細胞による沈査の貧食はアラキドン酸を遊離するが、アラキドン酸はcyclooxygenaseの反応を介してプロスタグランジンを産生し、実質細胞の糖代謝を刺激することを明らかにした。沈査の成績は神経刺激時の結果と一致する。これらの成績はKupffer細胞のアラキドン酸代謝は刺激の種類により異なることを示唆する。今後、肝臓の病態生理や物質代謝の調節機序を理解するためにはKupffer細胞のアラキドン酸代謝の調節機序の理解が重要な課題である。
中世イタリアの聖堂壁画における聖ペテロ伝の研究

本研究は、ヴァティカノ旧サン・ピエトロ大聖堂を飾ったペテロ伝サイクルについて考察すると共に、中世イタリアのモニュメンタル絵画に与えたその影響を検討するものである。ヴァチカノの旧大聖堂は16世紀から17世紀にかけて、新聖堂建立のために解体されたが、かつての大聖堂にはペテロ伝諸場面を表わした絵画サイクルが三つ存在した。すなわち、翼廊、ヨハネス七世礼拝堂、アトリウムの三箇所である。このうち、後二者については年代(8世紀および13世紀)のみならず、17世紀の模写素描によって構図さえ知られるが、これに対して、翼廊のペテロ伝サイクルについては、実体が不明である。そもそも、初期キリスト教時代のものなのか、初期中世のものなのか、両説とも可能である。しかし、前者のほうが有力であろう。上記三つのサイクルの相互関係については、ヨハネス7世礼拝堂のモザイク7場面にせよ、アトリウムのフレスコ30場面にせよ、結局のところ、翼廊に配された、より大規模な壁画サイクルの縮小版と考えられる。旧サン・ピエトロ大聖堂の失われた三つのペテロ伝サイクルに間接的もしくは直接的につながる後世のモニュメンタル絵画の遺例として、ミュステールのザンクト・ヨーハン修道院聖堂(9世紀および12世紀)、トゥスカーニアのサン・ピエトロ聖堂(11世紀)、モンレアーレ大聖堂およびパレルモの宮廷礼拝堂(12世紀)、アッシージのサン・フランチェスコ聖堂上堂(13世紀)、ピサ近郊のサン・ピエロ・ア・グラード聖堂(1300年頃)が挙げられる。これらの作例は、いずれも、プロトタイプとしての旧サン・ピエトロ大聖堂のペテロ伝サイクルの個々の場面を復元するのに重要な役目を果たす。ペテロ伝サイクルで飾られた中世イタリアの教会堂といえば、現存する主要作例として、ピサ近隣のサン・ピエロ・ア・グラード、トゥスカーニアのサン・ピエトロ、アッシージのサン・フランチェスコ上堂、パレルモのカペラ・パラティーナ、モンレアーレ大聖堂が挙げられる。これらのうち、アッシージとモンレアーレのサイクルは、注目すべきことに翼廊もしくはこれに属する空間に配されているが、これは決して偶然の一致ではない。ここに古いプロトタイプ、すなわち、旧サン・ピエトロ翼廊のペテロ伝サイクルの影響を想定すてきである。上記の5つの作例は図像学的に見れば、結局、一つの共通のプロトタイプに遡る可能性が高い。そして、このプロトタイプの最古の痕跡は、近世の模写(J・グリマルディ)によって伝えられる、ヨハネス7世のオラトリウムのモザイク(8世紀)に認められる。ここでは、ペテロ伝サイクルの各場面が描かれた壁面は、上下に重ねられた複数のゾーンに区分されているが、このような平坦な壁面を多層に構成するシステムそのものはー別の図像ではあるがーローマではヴィア・ラータのサンタマリア(8世紀)やサンタ・プラセーデ(9世紀)の壁面にも見出される。このタイプの源泉を求めるならば、これも、近世の改築によって失われたサン・ピエトロ翼廊のモザイクに遡る(ストックホルムにある16世紀の素描参照)。しかも、この翼廊モザイクの主題は、グリマルディ(16世紀)が記しているように、まさにペテロ伝であった。問題は、その製作年代である。これについては、従来、4世紀と7世紀の二つの節が提唱されてきたが、後者の節が妥当と考えられる。巨大な翼廊の壁面に多場面多層構想のペテロ伝サイクルを配するタイプを4世紀に求めることは難しく、また、ペテロ伝という図像選択そのものも7世紀の歴史的背景(旧サン・ピエトロのアプシス外枠の銘文参照)の中で理解すべきである。ヴィティカノの旧サン・ピエトロ大聖堂翼廊を飾っていた聖ペテロ伝のモザイクは、西洋美術のペテロ図像のサイクルの中で最古かつ最重要な作例である。

近世の新聖堂建設のために破壊され失われた,このペテロ伝サイクルが後続の中世ペテロ伝サイクルに影響を及ぼしたことは疑いない。これらはプロトタイプとして旧サン・ピエトロ大聖堂翼廊サイクルを復元するために大きな役割を果たす。本年度においては、それらの諸作例の作品研究を行った。先ず、旧サン・ピエトロ大聖堂翼廊のペテロ伝サイクルの影響としてもっとも早い作例と考えられる、同じ聖堂内の教皇ヨハネス7世礼拝堂のモザイク(8世紀)を近世の模写素描によって各ペテロ伝場面の図像を分析し、次に、このサイクルと、アルプス地方ミュステールのザンクト・ヨーハン修道院聖堂北アプシスの壁画サイクル(9世紀及び12世紀)との比較を行い、両者の共通点を検討した。続いて、トゥスカーニアのサン・ピエトロ聖堂交差部アーチ南壁上部の壁画(11世紀)およびシチリア島モンレアーレ大聖堂南アプシス部(ペテロ礼拝堂)のモザイク並びにパレルモのカペラ・パラティーナ(両者とも12世紀)のモザイク・サイクルと取り上げ、それらもローマのペテロ伝図像の影響下にあることを具体的に指摘した。旧サン・ピエトロ大聖堂には、翼廊及びヨハネス7世礼拝堂以外に、もう一つのペテロ伝サイクルが存在した。アトリウムの壁画(13世紀)である。近世の模写素描によって知られるこのポルティコのサイクルは、ナルテックスの全面外側及び内側に配されていたとみられ、おそらく古いペテロ伝サイクルと接点をもつと推定される。ポルティコのペテロ伝サイクルは、アッシージのサン・フランチェスコ上堂南翼廊壁画(13世紀)に影響を与え、さらに1300年頃、ピサ近隣のサン・ピエロ・ア・グラード聖堂身廊壁画において大々的にコピーされた。この最後の作例が、現在ペテロ伝サイクルの中で最大規模のものである。
刷り込み記憶の分子基盤の解明

生体の発達初期において、外界から刺激が与えられた際、その効果が最も良く現れる時期は臨界期と呼ばれる。カモの雛が孵化した直後の臨界期に、初めて見た動く物体を親と記憶し追従するようになる刷り込みは有名であるが、その分子メカニズムは未解明である。我々は長年、マウスを用いて嗅覚系の研究を行ってきた。その過程で、生後一週間の臨界期にマウス新生仔の鼻腔を塞ぎ嗅覚入力を遮断すると、その後閉塞を解除しても嗅覚能力が低下し、社会行動に異常が現れる事を見出した。一方、臨界期に特定の匂いを提示した所、この個体は成体になった後もその匂いに愛着を示すようになった。そこで本研究では、臨界期に脳内で何が起きているのか、嗅覚神経回路形成を中心にその分子基盤を明らかにする事を目指した。まず、臨界期に特定の匂いを嗅がせ、Sema7Aシグナルによるシナプス形成を積極的に促進した場合、何が起こるかについて解析を行った。その結果、嗅がせた匂いに反応する嗅細胞と僧房細胞間のシナプス形成が増強され、検出感度も上昇していた。また驚いたことに、嗅がせる匂いの質感が先天的に中性や忌避性であっても、臨界期に嗅がせて刷り込むことで、成長後のマウスはその匂いに対して誘引性の行動をとるようになることを見出した。そこで、匂い刷り込みによって特異的に活性化されるようになる脳領野がないかを、嗅皮質、扁桃体、海馬など脳全体に渡って、神経活動依存的に発現するEgr1を指標に免疫染色を行った。その結果、臨界期に嗅がせて刷り込んだ場合にのみ、その匂いで扁桃体内側前部が活性化され、誘引行動を誘導することが明らかとなった。更に、この刷り込み記憶の誘引的な価値付けに、臨界期に脳内での発現濃度が上昇するオキシトシンの関与が疑われたので、オキシトシン分泌異常マウス(CD38 KO)を調べたところ、匂い刷り込みによる誘引的価値付けがなされないことを見出した。研究は概ね順調に進み、計画していた以上に実験を行うことができた。しかし、研究成果を論文としてまとめるに当たり、査読者からの指摘で追加実験を行う必要が生じ、研究期間を延長するに至った。研究成果をまとめ、論文を現在投稿中である。その論文中で、嗅覚刷り込み記憶に誘引的質感を付与する機構を明らかにするために、オキシトシン分泌異常マウス(CD38 KOマウス)を用いて解析していたが、査読者らからの指摘を受け、オキシトシンKOマウスを用いて実験をやり直す必要が生じた。従って、補助事業期間を一年延長して追加実験を行い、研究成果を論文として完成させると共に、学会でも積極的に発信していく。我々は長年、マウスを用いて嗅覚系の研究を行って来た。一方、臨界期に特定の匂いを提示したところ、この個体は成体になった後もその匂いに愛着を示すようになった。まず、生後一週間という臨界期に、マウス鼻腔閉塞により嗅覚入力を遮断した場合、嗅細胞軸索と僧房細胞樹状突起間のシナプス形成がどのような影響を受けるかを調べた。具体的には、特定の糸球体に着目し、嗅細胞軸索と僧房細胞樹状突起間のシナプス形成の度合いを、嗅球切片上でシナプスマーカー分子に対する免疫染色を行うことにより解析した。その結果、臨界期に嗅覚入力を遮断すると、このシナプス形成はずっと未熟なまま留まることを見出した。続いて、シナプス形成に関与する分子の同定と解析を行った。神経活動依存的に嗅細胞の軸索末端で発現しシナプス形成に関わる分子を探索し、Sema7Aに辿り着いた。また、Sema7AのリガンドPlxnC1が、僧房細胞の樹状突起に生後一週間限定で発現することも見出した。さらにSema7A及びPlxnC1欠損マウスをそれぞれ解析した結果、Sema7A- PlxnC1シグナルが嗅細胞と僧房細胞間のシナプス形成促進に必須であることが明らかになった。予備実験の蓄積が十分であったため、大きなトラブルに見舞われることなく、予想以上に順調に、計画した実験が進んでいる。