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円形脱毛症の病態形成におけるＴＣＲＶδ１＋γδＴ細胞の新規の役割

円形脱毛症は、自己免疫疾患であり、細胞障害性T細胞が病態形成に関与する。本研究では新たに、円形脱毛症患者の病変部毛包におけるγδT細胞(Vδ1T細胞)の増加と、末梢血液中におけるVδ1T細胞の各種発現の変化(分化段階の進行・皮膚遊走性マーカーであるCXCR3とCXCR4の発現増強・細胞障害と活性化マーカーであるCD107aの増強・免疫寛容減弱を示唆するPD-1の発現低下)が健常者と比べて明らかとなった。これらの成果は、円形脱毛症において、γδT細胞はVδ1T細胞特異的に活性化し、免疫寛容を回避している可能性を示唆する。ヒトγδT細胞は主にT cell receptor (TCR)Vδ1+γδT細胞(Vδ1T細胞)とTCRVδ2+γδT細胞(Vδ2T細胞)に分けられる。前年度に円形脱毛症の病変部毛包へVδ1T細胞は浸潤し、Vδ2T細胞は浸潤しないことを明らかにした。このことから円形脱毛症の病変部では、Vδ1T細胞の特異的活性化が生じている可能性を考えた。続いて末梢血液中においてもVδ1T細胞得意的活性化が生じているかどうか、解析した。正常者と比較して、円形脱毛症患者の末梢血Vδ1T細胞は細胞数が増加し、活性化マーカーであるCD25とCD69の発現が増強していた。一方、Vδ2T細胞の細胞数増加やCD25とCD69の発現増強は認められなかった。円形脱毛症患者の末梢血液ではVδ1T細胞の特異的活性化機序が働いていることが示された。ケモカインレセプターCXCR3のリガンドであるCXCL10が円形脱毛症の病変部毛包で発現することが報告されている。そこで、末梢血Vδ1T細胞上のCXCR3が毛包行性に関与する可能性を考えた。健常者の末梢血Vδ1T細胞はCXCR3の発現は低かったのに対して、円形脱毛症患者の末梢血Vδ1T細胞ではCXCR3の発現が増強していた。一方、Vδ2T細胞ではCXCR3の発現の増強していなかった。また、Vδ1T細胞は細胞障害性分子の脱顆粒を示すCD107aの発現が増強していた。すなわち、円形脱毛症において、末梢血γδT細胞はVδ1T細胞特異的に活性化し、CXCR3を介して毛包周囲へ浸潤し、毛包を障害することで脱毛をきたす可能性が示唆され、末梢血Vδ1T細胞を特異的に活性化する機序の解明は円形脱毛症の病態メカニズムの構築と新たな治療ターゲットにつながる重要な成果であると考えられる。今年度、円形脱毛症の病変部γδT細胞だけでなく、末梢血γδT細胞においてもVδ1T細胞の増加が認められ、末梢血Vδ1T細胞はCD25、CD69、CXCR3とCD107aの発現が増強していることから、γδT細胞は病変部の毛包周囲だけではなく、末梢血液中においてもVδ1T細胞特異的に活性化しているという新たな事実を発見することができた。この成果は、今後、末梢血Vδ1T細胞を特異的に活性化する機序の解明が、将来的な円形脱毛症の治療法の確立につながる事を示す重要なものである。ヒトγδT細胞は、主にT cell receptor (TCR)Vδ1+γδT細胞(Vδ1T細胞)とTCRVδ2+γδT細胞(Vδ2T細胞)に分けられるが、申請者らは、円形脱毛症の病変部毛包へVδ1T細胞のみが特異的に浸潤していることを明らかにしており、このことから円形脱毛症の病変部では、Vδ1T細胞の特異的活性化が、円形脱毛症の病態を解明する上で重要であると考えて本研究を行った。前年度は、末梢血液中におけるVδ1T細胞得の細胞表面マーカーを解析した。健常者と比較して、円形脱毛症患者の末梢血Vδ1T細胞は活性化マーカーであるCD25とCD69の発現が増強し、ケモカインレセプターであるCXCR3や、細胞障害性分子の脱顆粒を示すCD107aの発現が増強していた。続いて、ケモカインレセプターCXCR4のリガンドであるCXCL12がストレスを受けた毛包で発現することを確認しており、末梢血Vδ1T細胞上のCXCR4が毛包行性に関与する可能性を考えた。健常者に対して、円形脱毛症患者の末梢血Vδ1T細胞ではCXCR4の発現が増強し、治療後にその発現が減弱していたが、CXCR3においては治療前後に発現の変化は認められなかった。また、Vδ1T細胞では免疫チェックポイント分子であるPD-1の発現が減弱しており、治療後も低い発現状態を維持していた。また、in vitroの実験で、IL-7,IL-15により、Vδ1T細胞のCD107aの発現は増強した。すなわち、円形脱毛症において、自己反応性が増強した末梢血γδT細胞はVδ1T細胞

特異的に活性化し、CXCR3とCXCR4を介して毛包周囲へ浸潤し、毛包を障害することで脱毛をきたす可能性が示唆され、末梢血Vδ1T細胞を特異的に活性化する機序の解明は円形脱毛症の病態メカニズムの構築と新たな治療ターゲットにつながる重要な成果であると考えられる。円形脱毛症は、自己免疫疾患であり、細胞障害性T細胞が病態形成に関与する。本研究では新たに、円形脱毛症患者の病変部毛包におけるγδT細胞(Vδ1T細胞)の増加と、末梢血液中におけるVδ1T細胞の各種発現の変化(分化段階の進行・皮膚遊走性マーカーであるCXCR3とCXCR4の発現増強・細胞障害と活性化マーカーであるCD107aの増強・免疫寛容減弱を示唆するPD-1の発現低下)が健常者と比べて明らかとなった。これらの成果は、円形脱毛症において、γδT細胞はVδ1T細胞特異的に活性化し、免疫寛容を回避している可能性を示唆する。皮膚免疫、脱毛症
ヒストン脱アセチル化酵素阻害による新しい癌治療の開発

1.脱アセチル化酵素阻害剤のより特異的試薬の開発脱アセチル化酵素阻害剤は、それが持つアセチル化リジンと類似した構造により、脱アセチル化酵素と結合し、その機能阻害を起こしている。そこで、アセチル化リジンを含んだp53ペプチドを作製し、競合阻害を起こさせ、ストレス刺激に対する反応性を検索した。現在までのところ、明らかな期待している生物活性を認めていないため、さらに異なったペプチドを作製するべきと判断した。(安達)2.新規脱アセチル化酵素阻害剤によるアポトーシス誘導能・シグナル伝達系への影響の解析新規脱アセチル化酵素阻害FK228(Depsipeptide)によって、アポトーシス誘導能やシグナル伝達系への影響をさらに詳細に調べた。この結果、画期的な抗癌作用を期待しうる生物活性を見出している。現在、論文作製中、特許申請準備中である。今後、これらの効果の分子機序につき、さらに詳細な解析を必要とする。(今井)3.レポーター遺伝子発現系を用いたHAT過剰発現による転写活性への影響アセチル化酵素であるp300,CBP cDNAを遺伝子導入後の転写活性への影響をルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いて調べた。その結果、p300とCBP cDNAにおいて特にAP-1転写活性を高める作用が強いことが明らかになった。ターゲット遺伝子群のパターンの差異などについて詳細に検討してゆく必要があることがわかった。(安達)1.脱アセチル化酵素阻害剤のより特異的試薬の開発脱アセチル化酵素阻害剤は、それが持つアセチル化リジンと類似した構造により、脱アセチル化酵素と結合し、その機能阻害を起こしている。(安達)1.レポーター遺伝子発現系を用いたヒストン脱アセチル化酵素阻害剤による転写活性への影響と選択性の評価これまでの研究成果から、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は転写活性のレベルでシグナル遮断をおこしていることが想像される。ルシフェラーゼレポーター遺伝子は、エピゾーマルDNAとして存在することからヒストンによる制御を受けていないことから、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤添加時における、この転写機能に与えるアセチル化の影響を調べた。その結果、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現系全般に抑制的に働くことが判明した。すなわち、転写活性化機構においてはアセチル化が負に作用していることが示唆された。(安達)2.レポーター遺伝子発現系を用いたHAT過剰発現による転写活性への影響ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の多彩な作用を考慮して、アセチル化のみを高めることによるコントロール実験も同時に行った。すなわち脱アセチル化酵素HDAC及びアセチル化酵素であるp300,HAT cDNAを遺伝子導入後の転写活性への影響をルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いて調べた。その結果、p300とHAT cDNAにおいて転写活性を高める遺伝子群が異なることが判明した。一方HDACについては顕著な効果を認めなかった。今後、p300とHATの作用機転の差違、ターゲット遺伝子群のパターンの差異などについて詳細に検討してゆく必要があることがわかった。(今井)1.脱アセチル化酵素阻害剤のより特異的試薬の開発脱アセチル化酵素阻害剤は、それが持つアセチル化リジンと類似した構造により、脱アセチル化酵素と結合し、その機能阻害を起こしている。
タンパク質分子の固体表面への吸着機構解明と分子構造識別

特定の条件で処理したサファイア表面には疎水ドメインと親水ドメインが共存する。この相分離表面を用いて、タンパク質分子と固体表面の相互作用の解明を図った。まず、疎水ドメインと親水ドメインの液中での性質を明らかにするため、走査プローブ顕微鏡を用いてポリスチレン等のコロイドプローブとドメイン表面との吸着力を測定し、液中においても明瞭な化学状態の差が保存されていることを確認した。次いで、異なる電荷をもつタンパク質の吸着を系統的に調べ、選択吸着の第一の要因は静電相互作用にあることを明らかにした。さらに、吸着したのちは静電相互作用だけでなく、非可逆的な疎水性相互作用もかかわることを示唆する結果を得た。固体表面と生体分子の界面の制御は、新しい固体/生体融合デバイスの開拓、抗原抗体反応の検出や生体内デバイスにおける非特異吸着の抑制などにおいて重要な課題である。本研究では、原子構造と化学状態を制御したサファイア表面が、タンパク質分子の構造に依存した特異な吸着特性を示すことを出発点とし、固体/生体界面の吸着機構解明、固体表面による生体分子選別技術の開拓、さらには微量タンパク質の固体基板上への濃縮技術の可能性検証を目的とした。生体/固体界面制御の第一歩として、サファイアでは疎水領域と親水領域の共存が一般的に発現することを見出した。ついで、非特異吸着と脱離の機構解明に着目して、サファイア表面におけるタンパク質の特徴的な吸着特性の解明を進めた。タンパク質として細胞の固体表面への接着に関わるフィブロネクチンを用い、サファイア基板への吸着と脱離の過程を観察した。フィブロネクチンの帯電が弱いpH条件では、フィブロネクチン分子はサファイア基板に形成した特定のドメインに優先的に吸着をするが、そのドメイン以外への非特異吸着も見られる。溶液のpHを変化させ、フィブロネクチンの帯電を強めると、非特異吸着したフィブロネクチンは減少する。すなわち、フィブロネクチン間の静電的な反発を強くすることで、非特異吸着を抑制することができる。この結果は非特異吸着の抑制の手段として利用でき、細胞の培養や成長のコントロールへの応用が期待される。さらに、産業的に重要なSi表面でのタンパク質分子の選択的吸着技術を確立するため、原子間力顕微鏡によるSi表面の局所酸化領域の化学状態制御を試みた。その結果、化学状態の異なるSi酸化膜をパターンニングできることを明らかにした。固体と生体分子の界面制御は、抗原抗体反応を検出するバイオセンサや体内へのインプラントにおける非特異吸着の抑制などにおいて重要である。本研究では、原子構造と化学状態を制御した酸化物表面がタンパク質分子の種類に依存した特異な吸着特性を示すことを出発点とし、固体/生体界面の吸着機構解明を目的とした。上記目的のため、まず酸化物の代表としてサファイア表面の構造と化学状態を制御し、疎水領域と親水領域の共存の機構を明らかにした。さらに、チタン酸化物表面においても、疎水ドメインと親水ドメインが共存することを見出した。サファイア表面におけるタンパク質の特徴的な吸着特性については、タンパク質分子の固体表面へのアプローチと吸着後の挙動に分離して機構解明を進めた。構造的には類似しているが電荷の異なる数種類のタンパク質を用意し、吸着パターンを比較した。その結果、タンパク質分子が基板に到達するかどうかは分子のもつ電荷が主要な役割を果たしていることを明らかにした。一方、脱離においては、吸着後の変成が主要な役割をもつことが示唆された。固体と細胞との界面は、基板に支持された脂質二重膜によって模擬できる。相分離サファイア表面を用い、脂質二重膜のパターン制御を行った。脂質分子の長さ、電荷、およびコレステロールとの結合の異なる様々な脂質分子を用意し、ベシクル融合法によって脂質二重膜を形成した。コレステロールの添加量を制御し、生細胞において細胞機能を発現しているラフト構造の固体表面における形成制御を行った。その結果、固体表面の化学状態ドメインに応じて様々なラフト構造が現れることを見出し、固体に支持された脂質二重膜において人工ラフトを実現できることを示した。本研究の目的は、固体表面の原子構造制御と化学状態制御に基づき、タンパク質分子の選択的吸着、すなわちタンパク質分子の選別機能を有する固体表面を創製することである。タンパク質分子の構造的特徴を識別する表面を用い、新原理に基づくタンパク質検出チップを開発する。また、固体表面へのタンパク質分子の吸着機構に新しいモデルを提出し、バイオデバイスで大きな問題となっている非特異吸着抑制の基本原理を提示する。以上の目的に沿って、ドメイン構造を有するサファイア表面におけるタンパク質選択吸着の機構解明を行った。実験では、電荷状態の異なるタンパク質を用意し、溶液のpHを変化させて吸着と脱離を観察した。その結果、選択性を生じる第一の原因は電荷による相互作用であることを明らかにした。しかし一方、脱離に関してはpH変化だけでは説明できないことも明らかとなった。

すなわち、吸着はタンパク質分子のアプローチの過程であるので静電相互作用が主として関わるが、吸着した後の脱離は、疎水性相互作用なども関わり、この効果はタンパク質の種類に依存するため、単純な電荷効果では説明できないことが明らかとなった。また、これらの吸着現象の基礎となるサファイア基板上のドメインの性質を走査プローブ顕微鏡を用いて液中で評価する手法を開拓し、液中での表面化学状態を極めて選択性良く観察できることを明らかにした。サファイアからさらに一歩進めて完全な一次元物質であるグラフェンをサファイア基板に貼り合わせ、グラフェンのタンパク質吸着がグラフェン界面によって制御可能なことを示した。
高等植物のDNAメチル化による遺伝子発現の制御機構

本研究の目的は、高等植物におけるDNAメチル化の動態と遺伝子発現の制御機構を解明するために、DNAメチル化が花色遺伝子の制御に関与すると思われるアサガオの「刷毛目絞」模様形成の分子機構を明らかにすることである。ソライロアサガオ(Ipomoea tricolor)の「刷毛目絞(pearly-v)」遺伝子座は、色素生合成系のDFR-B遺伝子のプロモーター領域に、遺伝子の発現抑制と相関してDNAメチル化が高頻度かつランダムに変化する配列が存在する。まず本年度は、この配列とDFR-B以外の色素生合成系遺伝子のプロモーター配列を比較検討することで、保存された6塩基の配列を見出した。この配列は他の植物の色素生合成系遺伝子にも存在することから転写因子の結合部位である可能性が高く、この配列に結合する転写活性化因子はDNAメチル化により結合阻害を受けると同時に、DNAメチル化を阻害することで模様形成に重要な役割を担うと予測される。そこでDFR-B遺伝子を転写活性化する転写因子が実際に相互作用することを試験管内で確認することを試みたが、技術的な困難により確認には至らなかった。一方、生体内での相互作用を確認するために、形質転換によって転写因子の欠損変異株が存在するアサガオ(I.nil)への刷毛目絞遺伝子座の導入を試みた。これまでに独立な複数の形質転換体を得ており、茎の着色形質から刷毛目絞遺伝子座の導入に成功したと思われる。これらの形質転換体を解析することで、転写因子と模様との関連を解明できるであろう。また、アサガオの「刷毛目絞(duskish)」遺伝子座におけるDNAメチル化の解析からは、ソライロアサガオの刷毛目絞とは異なる遺伝子発現制御の関与が示唆され、一見すると同じ花の模様が異なるメカニズムにより形成されることが明らかになりつつある。本研究は、高等植物におけるDNAメチル化の動態と遺伝子発現の制御機構の解明を目的として、DNAメチル化が花色遺伝子の制御に関与すると思われるアサガオの「刷毛目絞」模様形成機構の解明を行う。これまでに、ソライロアサガオの「刷毛目絞(pearly-v)」遺伝子座において、遺伝子の発現抑制と相関してDNAメチル化が高頻度かつランダムに変化する性質(可変性)を持つ配列(可変領域)を見いだしている。本年度はpearly-v系統を、花色遺伝子のDFR-Bにローリングサークル型トランスポゾンが挿入したpearly-s系統と交配する相補実験から、pearly-vはDFR-B遺伝子の変異であることを確認した。さらに、DNAメチル化を制御する要因を解明するため、要因の候補であるDFR-B遺伝子の転写活性化因子の解析を行った。DFR-B遺伝子のプロモータ配列に、直接あるいは間接的に結合して転写を活性化するbHLH型転写因子をコードするIVS遺伝子の突然変異体と交配してF2植物を得た。ivs変異体は花色が薄くなる表現型を示し、IVSタンパク質はDFR-B遺伝子の可変領域においてDNAメチル化を阻害することが予想される。しかし、pearly-vとivsの二重突然変異体は、両者の変異形質を足し合わせた表現型、すなわち薄色の絞模様の花を咲かせた。これは、IVSタンパク質は可変領域のDNAメチル化を制御しないことを示唆する。現在、DFR-B遺伝子のプロモータ配列に直接結合して転写を活性化する、MYB型転写因子とDNAメチル化の関連をin vitroで解析する準備を進めている。また、アサガオの「刷毛目絞(duskish)」についても、sodium bisulfiteシーケンスを行い、遺伝子発現の抑制と相関するDNAメチル化の特定を試みている。
発酵食品に含まれる血液関連生理活性物質の探索と健康・機能性食品の開発

本研究では日常の食生活から血栓症の予防を目的として、種々の微生物が関与する発酵食品、特に魚を原料とする水産発酵食品に着目し、血栓を溶解する線溶酵素および血栓の形成を抑制する血液凝固抑制物質(抗トロンビン活性物質)などの血液関連生理活性物質について検討することを目的とした。平成14年度は、鮎うるかやこのわたに、カツオキナーゼの存在がすでに明らかになっている酒盗に匹敵する活性を有する線溶酵素や抗トロンビン活性物質の存在を認め、さらにアユをはじめとする5種類の淡水魚、アジをはじめとする8種類の海水魚のほとんどすべての胃や腸にこれらの血液関連生理活性物質の存在を示唆した。以上の結果から平成15年度はさらにその詳細について検討した。1.鮎うるかから各種培地を用いて微生物の分離を試みた結果、ペプトン・ブイヨン培地、マルツエキス培地を用いた好気培養より、嫌気条件下でのBL寒天培地での生育が大変良かった。2.1より分離した微生物を肉エキス(カツオ)-グルコース培地で培養したところ、10%NaClの存在下でも生育が顕著であり、耐塩性のあることがわかった。しかし、10日間の培養では菌体外における血液関連生理活性物質の存在は認められなかった。3.鮎うるかから10mMリン酸緩衝液(pH7.0)でホモジナイズし調製した粗酵素液を硫安分画し、さらにBio-Gel P-100を用いたゲルカラムクロマトグラフィー(1.0×30cm)で分離した。そのうち、線溶活性を示すフラクションを集めSDS-PAGEを行ったところ、約10kDaの比較的低分子の酵素であることがわかった。またこれらのフラクションには抗トロンビン活性も認められた。4.鮎の腸を3と同様に精製を行ったところ、鮎うるかの線溶酵素とほとんど近い分子量を持つ物質であることがわかった。本研究では、日常の食生活から血栓症の予防を目的として、種々の微生物が用いられている発酵食品、特に魚を原料とする水産発酵食品から心筋梗塞や血栓症などの原因となる血栓の形成を抑制する血液凝固抑制物質(抗トロンビン活性物質)および血栓を溶解する線溶酵素などの血液関連生理活性物質を生産する微生物の検索を試みた。1.水産発酵食品である鮎うるか、このわた、めふん、カツオキナーゼの存在が明らかになっている酒盗について、線溶酵素活性および抗トロンビン活性の測定を行った。その結果、線溶酵素については酒盗に匹敵する活性が鮎うるかとこのわたにみられ、抗トロンビン活性についても同様に、鮎うるか、このわた、酒盗で顕著であった。2.血液関連生理活性物質を有する発酵食品の原料となる食品について、線溶酵素活性および抗トロンビン活性を測定した。淡水魚としてアマゴ、アユ(半天然)、アユ(養殖)、イワナ、ニジマスを、海水魚としてアジ、イシモチ、カツオ、サバ、サンマ、タチウオ、ツバス、イカを用い、各組織における酵素活性を調べた。その結果、線溶酵素活性は、淡水魚では胃、腸においてみられ、肝臓や筋肉には全くみられなかった。海水魚でもほとんどのもので、同様の結果が得られた。抗トロンビン活性についても、ほとんどの淡水魚、海水魚で胃と腸に顕著にみられた。3.線溶酵素活性および抗トロンビン活性が顕著に見られた鮎うるかについて、ペプトン・ブイヨン培地(細菌用)、マルツエキス培地(酵母・カビ用)を用いて数種の微生物を分離した。これらを同液体培地で旋回培養し、菌体内および菌体外の酵素活性を調べた結果、全くその活性はみられなかった。平成15年度はこれら微生物の培養条件を変えてさらに活性の有無を調べ、活性がみられた場合は、それが鮎うるかのものと同一であるか、さらには原料となるアユの胃腸内の酵素との違いも検討したい。
酸化ストレスセンサーDJ-1を分子標的とした神経変性疾患治療薬の創製

パーキンソン病・アルツハイマー病・認知症などの神経変性疾患の最大のリスクファクターは老化です。現在、日本は超少子・高齢化社会になりつつあります。そして、若者の労働力不足、医療費経済、神経変性疾患の重篤患者に対する介護は深刻な社会問題となっています。このため、健康で、介護が必要でなく、労働力として期待される高齢者の生長・育養が必須の課題です。本研究により、酸化ストレスセンサーのDJ-1およびその結合化合物はパーキンソン病、認知症などの神経変性疾患の治療薬のシードとして有用であることを明らかにしました。つまり、1)高齢者で発症する神経変性疾患の患者の数を減らす、あるいは発症を遅らせる(予防)薬、2)発症しても症状が進行しないようにする(進行遅延)薬などの新規治療戦略や治療薬の開発が望まれています。本年度は、DJ-1タンパク質がヒト骨髄幹細胞に比較的豊富に存在することを見出しました。そして、ヒト骨髄幹細胞をロテノン長期投与により作成したパーキンソン病モデルマウスに移植すると黒質線条体系のドパミン神経の再生が起こることを明らかにしました。in silicoバーチャルスクリーニングにより見出したCompounds-A, -B, -23を6-hydroxydopamine (6-OHDA)を用いて作成したパーキンソン病モデルラットの黒質へのマイクロインジェクションにより、ドパミン神経細胞死が抑制される傾向にあることを見出しました。現在、ロテノンを用いて作成したパーキンソン病モデルマウスを用いて保護作用を示すかどうか検討中です。このように、次年度以降の研究に大変役に立つ意義深い研究成果を得ることができました。このため、健康で、介護が必要でなく、労働力として期待される高齢者の生長・育養が必須の課題で、新規治療戦略や治療薬の開発が望まれています。本年度は、DJ-1ノックアウト(DJ1-KO)マウスを用い解析しました。マウス黒質線条体系におけるドパミン神経細胞数ならびにドパミン神経線維密度は、DJ-1遺伝子をノックアウト(消失)させても、著しい変化ならびに行動異常も認められませんでした。このDJ1-KOマウスにドパミン神経毒MPTPを30mg/kg、4日間、腹腔内投与することにより、パーキンソン病モデルマウスを作製した。ヒトDJ-1リコンビナントタンパク質のX線構造を用い、市販されている約250万個の化合物からin silicoバーチャルスクリーニングによりDJ-1結合化合物として見出したcompound-23をDJ1-KOマウスへのMPTP投与1時間前にcompound-23の03mg/kg腹腔内投与し、薬理学的行動変化、黒質線条体系のドパミン神経系のパラメーターについて解析した。MPTPの連続投与により、正常マウスおよびDJ1-KOマウスの線条体のドパミン量・ドパミン神経線維密度および黒質のドパミン神経細胞数は有意に減少し、運動機能も低下した。Compound-23の腹腔内投与により、これらのドパミン神経障害は有意に改善された。現在、家族性アルツハイマー病から見出されたアミロイドβ、プレセニリン1遺伝子の変異遺伝子を導入したマウスを用いて検討中です。このように次年度以降の研究に大変役に立つ意義深い研究成果を得ることができました。つまり、1、高齢者で発症する神経変性疾患の患者の数を減らす、あるいは発症を遅らせる(予防)薬、2、発症しても症状が進行しないようにする(進行遅延)薬などの新規治療戦略や治療薬の開発が望まれています。本年度は昨年に引き続き、DJ-1ノックアウト(DJ1-KO)マウスを用い解析しました。このDJ1-KOマウスにドパミン神経毒MPTPを30mg/kg、4日間、腹腔内投与することにより、パーキンソン病モデルマウスを作製し、in silicoバーチャルスクリーニングによりDJ-1結合化合物として見出したcompound-23をDJ1-KOマウスへのMPTP投与1時間前にcompound-23の03mg/kg腹腔内投与し、薬理学的行動変化、黒質線条体系のドパミン神経系のパラメーターについて解析した。MPTPの連続投与により、黒質のドパミン神経細胞数は有意に減少し、運動機能も低下した。さらに、Compound-23の腹腔内投与により、これらのドパミン神経障害は有意に改善された。

また、創薬研究として、プレシナプスのα4-ニコチン受容体刺激により、ドパミン放出が促進され、神経保護作用に関与することが示唆された。このように、最終年度において、創薬のシードがいくつか見出し、意義深い研究成果を得ることができました。パーキンソン病・アルツハイマー病・認知症などの神経変性疾患の最大のリスクファクターは老化です。現在、日本は超少子・高齢化社会になりつつあります。そして、若者の労働力不足、医療費経済、神経変性疾患の重篤患者に対する介護は深刻な社会問題となっています。このため、健康で、介護が必要でなく、労働力として期待される高齢者の生長・育養が必須の課題です。本研究により、酸化ストレスセンサーのDJ-1およびその結合化合物はパーキンソン病、認知症などの神経変性疾患の治療薬のシードとして有用であることを明らかにしました。本年度は、パーキンソン病モデル動物のDJ-1ノックアウト(DJ1-KO)マウスを用い解析しました。市販されている約250万個の化合物からin silicoバーチャルスクリーニングによりDJ-1結合化合物として見出したcompound-23をDJ1-KOマウスへのMPTP投与1時間前にcompound-23の腹腔内投与により、DJ1-KOマウスのドパミン神経障害は有意に改善された。このように次年度以降の研究に大変役に立つ意義深い研究成果を得ることができました。神経薬理学平成26年度に得られたこれらの研究成果を基に、平成27年度は、ロテノンの長期投与(56日間)により作成するパーキンソン病モデルマウスにおいて、DJ-1結合化合物の末梢投与(腹腔内投与など)による作用についても解析します。さらに、アルツハイマー病モデル動物の変異遺伝子導入マウスにおけるDJ-1結合化合物の作用について実験する予定です。DJ-1タンパク質がヒト骨髄幹細胞に比較的豊富に存在することを見出し、パーキンソン病モデルマウスへの移植によりドパミン神経の再生が起こるという新知見が得られました。これにより、DJ-1タンパク質が神経保護のみならず神経再生にも関与する可能性が示唆されます。このため、in silicoバーチャルスクリーニングによりDJ-1結合化合物として見出していますCompounds-A, -B, -23の有効性が期待できます。現在、パーキンソン病モデルラットの黒質へのこれらの化合物のマイクロインジェクションにより、ドパミン神経細胞死が抑制される傾向があることを見出しております。このように、順調に研究成果が得られつつあります。平成25年度に得られた研究成果を基に、平成26年度は、引き続き6-OHDAを用いて作成するパーキンソン病モデルラットの黒質マイクロインジェクションによる作用について実験します。さらに、ロテノンの長期投与(56日間)により作成するパーキンソン病モデルマウスにおいて、DJ-1結合化合物の末梢投与(腹腔内投与など)による作用についても解析します。平成25年度から持ち越す研究費はありません。平成26年度の研究費は、神経変性疾患モデル動物の作成、行動薬理学的、神経化学的、組織化学的解析のための研究試薬などの消耗品を購入する。また、論文発表のための英文校正費、成果発表のための旅費にも充てる予定です。
中国環太行山脈地区の新石器時代末期から初期王朝期における文化移行過程に関する研究

本年度は研究成果の総括を考慮しつつ、これまでの不足を補う調査・研究を進めた。現地調査は、河南省の鶴壁市劉荘遺跡と新郷市、焦作市で資料調査を行った。特に劉荘遺跡ではこれまでの土器分類に基づく編年案について、鬲の長頸と短頸の違いが土器系統と時期差のどちらに起因するのかについて確認を行った。これまで時期差と想定していたが、河北省邯鄲でも同様の現象がみられ、それを論じた河北省文物研究所の張暁崢氏と面会し、意見交換を行った。本研究の中心は、環太行山脈地区における新石器時代の諸文化がいかにして初期王朝期へと移行し、古典籍中の夏王朝とどのような関係にあったかを復元することにある。特に後の殷文化へ繋がる下七垣文化の成立には晋中の影響が強く、一方で短頸鬲など逆方向の影響も存在すると考えた。ただし下七垣文化の土器組成からみれば、在地の龍山文化に由来する器種も一定数が存在し、先学が指摘する晋中からの集団的なヒトの移住は想定し難いと考えた。また、劉荘遺跡では次第に階層格差が広がる傾向を示す一方、突出した規模の墓の不在など社会的に未熟な部分を残す。集団構造についても二つの出自を同じくする集団から集落が構成されたと想定でき、相互補完的な関係のもとで社会のバランスを保つ比較的平等な様相を想定できる。また、二里頭文化内で社会階層と結び付く酒器が下七垣文化では社会階層と結びつかず、二里頭文化と異なる階層表示システムが存在したと考えた。しかし下七垣文化に後続する二里岡期には社会階層の複雑化に伴い二里頭文化の酒器や青銅製作技術を導入し、階層表示の複雑化を図る。この急速な社会の複雑化と二里頭文化の衰退、下七垣文化の拡大は連動しており、背景には王朝交代に関係する両文化の摩擦を伴う接触があったのだろう。以上は、本年度の活動およびこれまでの研究成果を本年度の研究において再構成した内容である。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、主に先商文化の研究史の整理と問題点の抽出および土器データベースの作成、二里頭文化の土器編年の確認作業を行った。当初の計画では、初年度に山西省の東下馮文化の土器データベースを作成し、それをもとに土器の分類を行い、編年を作成する予定であった。しかし、『鶴壁劉荘』、『輝県孫村』、『安陽鄣鄧』など2012年度後半以降に河北省や河南省北部に分布する先商文化の重要な報告書が立て続けに刊行されたことが分かり、まず先商文化の土器の分析から行うことにした。その結果、先商文化の土器に関する研究史は1編年に関する研究、2地域性に関する研究、3起源に関する研究の3つの柱に分けることができるとした。特に、1と2についてはいまだ学界の統一的な見解が形成されていない。また、3については先商文化が山西省中部に起源するとする見方が支持されているが、土器様式全体を比較すると、一概にそうとは言えない事実があることを明らかにした。データベースの構築については、資料の劇的な増加もあり、現在も入力作業中であるが、出土遺跡・遺構・報告時期・器種・胎土・色調・文様・サイズを主な入力項目とし、図版のデジタル化などはすでに済ませている。二里頭文化の土器編年については、すでに豊富な研究史があり、これらを参考にしながら改めて編年の確認を行った。基本的には従来の4期編年で大きな問題はないと考えるが、新砦期については地域性と考え、一部で洛陽盆地周辺の王湾三期文化や二里頭文化と時間的に併行し、山東などに由来する新砦期に見られる要素の影響を受けた洛陽盆地に二里頭文化が成立したと考えた。以上の研究内容を現地で確認するために、河南省および広東省を中心とした地域で、計2回の現地調査へ赴き、資料の実見を行った。平成25年度の調査内容な以上の通りである。平成26年度は主に、先商文化とされる下七垣文化の編年について整理し、さらにその社会構造を明らかにするため、河南省鶴壁市の劉荘遺跡で検出された墓の分析を行った。具体的な研究内容および調査内容は以下の通りである。下七垣文化の編年については、層位的根拠を持ちつつ土器が報告されている章鄧遺跡、葛家荘遺跡、宋窯遺跡および劉荘遺跡から考えた。そして、結果的に土器型式の組み合わせの変化を指標として、下七垣文化を3時期に区分した。また、9月には、この土器分類の蓋然性を確認するために、河南省および河北省に赴き、下七垣文化に属する土器の実見調査を行うとともに、劉荘遺跡の踏査を行い、周辺の地理環境などについても認識を深めることができた。年代研究のほか、下七垣文化の社会構造について墓の分析から検討した。特に2012年に報告書が刊行された劉荘遺跡では、338基の墓を含む墓地全体が報告され、下七垣文化の社会構造を検討する格好の資料となっている。多くの墓からは副葬品として鬲、豆、盆が出土しており、これらの型式をもとに墓地を3時期に区分した。また各時期に沿って墓の分布を確認すると一定の方向に沿った分布の拡大が看取でき、墓地が二つの集団から構成されていることが分かった。

さらに、これら2集団には明らかな階層上位墓が存在しており、集団間の関係についても東側の集団がより優位な状況であることを明らかにした。興味深い点としては、非日常的な副葬品が必ずしも階層上位墓に伴わず、階層表示の要素になっていない点を挙げることができた。以上のように、平成26年度は二里頭文化併行期の環太行山脈地区東側の下七垣文化における年代観を整理し、さらにその社会構造までも明らかにすることができた。これは、最終年度の研究に向けた、大きな研究の進展であった。本年度は研究成果の総括を考慮しつつ、これまでの不足を補う調査・研究を進めた。現地調査は、河南省の鶴壁市劉荘遺跡と新郷市、焦作市で資料調査を行った。特に劉荘遺跡ではこれまでの土器分類に基づく編年案について、鬲の長頸と短頸の違いが土器系統と時期差のどちらに起因するのかについて確認を行った。これまで時期差と想定していたが、河北省邯鄲でも同様の現象がみられ、それを論じた河北省文物研究所の張暁崢氏と面会し、意見交換を行った。本研究の中心は、環太行山脈地区における新石器時代の諸文化がいかにして初期王朝期へと移行し、古典籍中の夏王朝とどのような関係にあったかを復元することにある。特に後の殷文化へ繋がる下七垣文化の成立には晋中の影響が強く、一方で短頸鬲など逆方向の影響も存在すると考えた。ただし下七垣文化の土器組成からみれば、在地の龍山文化に由来する器種も一定数が存在し、先学が指摘する晋中からの集団的なヒトの移住は想定し難いと考えた。また、劉荘遺跡では次第に階層格差が広がる傾向を示す一方、突出した規模の墓の不在など社会的に未熟な部分を残す。集団構造についても二つの出自を同じくする集団から集落が構成されたと想定でき、相互補完的な関係のもとで社会のバランスを保つ比較的平等な様相を想定できる。また、二里頭文化内で社会階層と結び付く酒器が下七垣文化では社会階層と結びつかず、二里頭文化と異なる階層表示システムが存在したと考えた。しかし下七垣文化に後続する二里岡期には社会階層の複雑化に伴い二里頭文化の酒器や青銅製作技術を導入し、階層表示の複雑化を図る。この急速な社会の複雑化と二里頭文化の衰退、下七垣文化の拡大は連動しており、背景には王朝交代に関係する両文化の摩擦を伴う接触があったのだろう。以上は、本年度の活動およびこれまでの研究成果を本年度の研究において再構成した内容である。当初の計画は環太行山脈地区の東西の先商文化および東下馮文化について、2年目までに土器の基礎的な整理を行うことになっていた。すでに先商文化としての下七垣文化については、ほぼ作業が終わっている。また、東下馮文化についてもデータベースを構築し、さらに3月には山西省侯馬市および太原市において、山西省文物考古研究所の協力のもと、資料調査を行っている。下七垣文化および東下馮文化と併せて検討すべき二里頭文化についても、2014年度に新報告が刊行されたため、詳細な年代観を把握することができた。これらの点については、おおむね研究計画に基づいて順調に進展したと自己評価することができる。その他、本研究課題を進める過程で分析を行った下七垣文化の墓については、10月に北京の中国社会科学院考古研究所で開催された学会で発表する機会を得ることができ、成果の公表という意味では有意義であった。この点も、一つの収穫として評価することができる。ただし、本来ならば東下馮文化の年代観の確定まで2年目で進めておきたかったが、下七垣文化の分析に当初の計画を超えて時間を割いたため、終わらせることができなかった。この点が課題として残ってしまった。
新規に合成されたPrおよびSm化合物の軟X線光電子分光による電子状態の解明

本年度は計画の最終年度であり,H18年度に実施したSmOs_4Sb_<12>の硬X線光電子分光に続き,以下に述べる実験を行うとともに,Pr,NdおよびSmを充填したスクッテルダイトに対するバルク電子状態についてまとめた.実施した実験は,(1)軟X線光電子分光によるSmOs_4Sb_<12>のフェルミ準位近傍の電子状態の温度変化,(2)硬X線光電子分光によるPrRu_4P_<12>における金属絶縁体転移に伴う価電子帯電子状態変化の観測,(3)軟X線光電子分光によるNdOs_4Sb_<12>の価電子および内殻電子状態の観測,(4)硬X線光電子分光によるPrFe_4P_<12>の電子状態の温度変化である.本研究計画当初は,軟X線を用いた光電子分光のみを計画していたが,よりバルク電子状態に敏感な硬X線による光電子分光が利用可能になり,希土類3d内殻を中心によりバルク敏感な光電子スペクトルを得ることに成功した.特に,PrRu_4P_<12>におけるT=60Kでの金属絶縁体転移に関して,硬X線光電子分光とクラスターモデル計算の結果から伝導電子と4f電子との間の強い混成が転移に寄与している一方で,この混成が金属相から絶縁体相への変化に対しては鈍感である(安定している)ことを見いだした.またPrFe_4P_<12>との比較を通して,この系で見られる異常物性が充填スクッテルダイトの特異な結晶構造に由来していることを明らかにした.H18-19年度の研究から,希土類充填スクッテルダイトにおける結晶構造と異常物性の密接な関わりをSmとPrの両方の系において確認した.上記のような研究結果に対して,第15回真空紫外分光国際会議(VUVXV)において発表すると共に,論文4報にまとめた.本年度は,大型放射光施設SPring-8において純良単結晶の育成に成功したSm充填スクッテルダイトおよびPr充填スクッテルダイトの硬X線光電子分光を実施した.このなかで,軟X線光吸収分光からバルクにおいてサマリウムが価数揺動状態であることが確認されていたSmOs_4Sb_<12>において,硬X線を用いた高精度でのSm3d内殻光電子分光およびそのスペクトルの温度依存性を測定し,この価数揺動状態を再度検証すると共に,T=20-100Kの低温領域においてSm2価成分が3価に対して増大する重い電子的振る舞いを観測することに成功した.また,実験において得られたSm3d内殻光電子分光スペクトルおよび軟X線光吸収スペクトルに対して,配置問相互作用を取り入れたクラスターモデル計算を実施し,両スペクトルの形状を理論計算により再現することが可能であることを示すとともに,原因が不明であった価数揺動状態と重い電子状態の共存のメカニズムを明らかにした.その詳細としては,SmOs_4Sb_<12>の中に存在する12個のアンチモン原子からなる1nm程度の大きさのカゴとそこに内包されている希土類イオンの種(サマリウム)がこの共存を実現する上で重要であり,イオン半径が大きくなることを許すカゴの十分な大きさ(価数揺動状態の必要条件)とアンチモンの5p電子軌道とサマリウムの4f電子軌道の混成が小さくなるカゴの大きさ(重い電子状態の必要条件)の2つの条件をアンチモン原子のカゴが満たしていることによって,この共存が実現していることを明らかにした.上記のような研究結果に対して,電子構造と分光の国際会議(ICESS10)と磁性国際会議(ICM2006)において発表すると共に,論文5報(国際会議報2報を含む)にまとめた.本年度は計画の最終年度であり,H18年度に実施したSmOs_4Sb_<12>の硬X線光電子分光に続き,以下に述べる実験を行うとともに,Pr,NdおよびSmを充填したスクッテルダイトに対するバルク電子状態についてまとめた.実施した実験は,(1)軟X線光電子分光によるSmOs_4Sb_<12>のフェルミ準位近傍の電子状態の温度変化,(2)硬X線光電子分光によるPrRu_4P_<12>における金属絶縁体転移に伴う価電子帯電子状態変化の観測,(3)軟X線光電子分光によるNdOs_4Sb_<12>の価電子および内殻電子状態の観測,(4)硬X線光電子分光によるPrFe_4P_<12>の電子状態の温度変化である.本研究計画当初は,軟X線を用いた光電子分光のみを計画していたが,よりバルク電子状態に敏感な硬X線による光電子分光が利用可能になり,希土類3d内殻を中心によりバルク敏感な光電子スペクトルを得ることに成功した.特に,PrRu_4P_<12>における

T=60Kでの金属絶縁体転移に関して,硬X線光電子分光とクラスターモデル計算の結果から伝導電子と4f電子との間の強い混成が転移に寄与している一方で,この混成が金属相から絶縁体相への変化に対しては鈍感である(安定している)ことを見いだした.またPrFe_4P_<12>との比較を通して,この系で見られる異常物性が充填スクッテルダイトの特異な結晶構造に由来していることを明らかにした.H18-19年度の研究から,希土類充填スクッテルダイトにおける結晶構造と異常物性の密接な関わりをSmとPrの両方の系において確認した.上記のような研究結果に対して,第15回真空紫外分光国際会議(VUVXV)において発表すると共に,論文4報にまとめた.
超短パルスを用いた原子・分子の量子状態の制御〜アト、フェムト秒物理の開拓

近年の高次高調波発生やX線自由電子レーザー技術の発展により軟X線領域の高強度レーザーの実用化が期待されている。これらによってもたらされる時間・空間の分解能は新しい研究領域を拓くと言われている。そこで本研究ではX線波長域の高強度レーザーを原子に照射することによって誘起されるフェムト秒スケールの電子ダイナミクスを研究し、今まで知られていない新奇な知見を得ることを目的とした。今年度は水素原子陰イオンの三次元一電子模型に高強度真空紫外レーザーパルスを照射し、光電子スペクトルを計算した。レーザーピーク強度を十分高くすると、光電子スペクトルの多光子吸収ピーク中に振動構造が表れた。この振動構造は解析によってレーザーパルスによって作られる二つの光電子波束対の干渉効果であることが示された。この干渉構造はレーザーのパラメータに強く依存しており、振動構造を観測することによって、レーザーパルスのプロファイルを同定できる可能性を示した。Kramers-Henneberger frameとSiegert擬状態法を組み合わせ、強レーザー場による一次元原子模型の超閾イオン化スペクトルを精密に数値計算する手法を開発した。Kramers-Henneberger frameでは、レーザー場の効果は原子ポテンシャルに組み込まれたレーザー場中の自由電子の古典軌道によって表される。よって古典軌道の振幅をカバーする大きさの箱を用意すればレーザー場の効果を完全に取り込むことができる。また、外向き波境界条件を満たすSiegert擬状態で波束を展開することにより、境界からの非物理的な反射を除去する。よって、これらの手法を組み合わせることで超閾イオン化スペクトルを精密に計算することが可能になった。続いて開発した手法を用いて数値計算を行った。一次元の水素原子陰イオンの模型に高強度真空紫外レーザー光(λ=145nm, I=8.8×10^<15>W/cm^2)を照射し、超閾イオン化スペクトルを計算したところ、多光子吸収ピーク中に振動構造がみえた。結果を高周波Floquet理論を用いて解析し、この振動構造がレーザー光によって生成される同じエネルギーをもった光電子波東間の干渉効果であることを明らかにした。
UDP-グルクロン酸転移酵素のエピジェネティック制御の解明

第II相薬物代謝酵素であるUDP-グルクロン酸転移酵素(UGT)はヒトでは19分子種が同定されており、それぞれが組織特異的な発現分布を示す。例えば、UGT1A1は肝と小腸に発現し、腎臓に発現しない。また、UGT1A10は小腸に発現し、肝に発現しない。本年度はUGT1A1とUGT1A10の組織特異的な発現の制御にエピジェネティック機構が関わる可能性を明らかにすることを目的とした。ヒト腎においてUGT1A1遺伝子プロモーターは高メチル化状態(83%)であり、AcH3修飾および転写因子HNF1αのリクルートが認められなかった。一方、肝においては低メチル化状態(37%)にあり、AcH3修飾およびHNF1αのリクルートが認められた。従って、腎におけるUGT1A1の発現抑制にはこれらの機構が寄与するものと考えられた。ヒト小腸上皮においてUGT1A10遺伝子プローターは低メチル化状態(11%)であり、肝においては高メチル化状態(89%)にあった。この領域をルシフェラーゼ発現プラスミドに組み込み、レポーター活性を調べたところ、非メチル化プラスミドにおいてはHNF1αとCdx2の過剰発現による転写活性化が認められたが、メチル化プラスミドでは転写活性化は認められなかった。従って、DNAのメチル化がUGT1A10の発現を抑制していることが示された。大腸癌由来LS180と肝癌由来HuH-7細胞におけるUGT1A10のDNAメチル化状態を調べたところ、それぞれ19%と89%であった。このメチル化状態を反映し、LS180細胞におけるUGT1A10mRNA発現量はHuH-7と比べて有意に高値であった。DNAメチル化阻害剤5-Aza-dCを処置したところ、HuH-7細胞においてはUGT1A10発現量の上昇が認められ、HNF1αとCdx2の過剰発現によりさらなる発現量の上昇が認められた。HNF1αとCdx2の過剰発現のみではUGT1A10発現量の上昇が認められなかったことから、5-Aza-dCによる脱メチル化により、UGT1A10遺伝子プロモーターへHNF1αとCdx2の結合が可能となり、UGT1A10発現量の上昇に繋がったと考えられた。以上、DNAメチル化を中心とするエピジェネティック機構がUGTの組織特異的発現を制御していることを明らかにした。(抄録なし)第II相薬物代謝酵素であるUDP-グルクロン酸転移酵素(UGT)はヒトでは19分子種が同定されており、それぞれが組織特異的な発現分布を示す。(抄録なし)
Cyclic AMP および関連酵素の局材とその機能的意義の解明

初年度は、cAMPの分解酵素、ホスホジエステラーゼ(PDE)の各アイソザイムの選択的阻害薬を用いて、これら薬物の1)心筋に対する直接作用、2)β-受容体刺激増強作用を機能およびcAMP代謝を検討することにより、PDEの局在と機能的意義について検討した。本年度は、交感神経刺激薬イソプロテレノール(ISP)、非選択的PDE阻害薬IBMX、プロプラノロール(Prop)を用いて、細胞内cAMPの代謝、局在、および機能的意義について検討した。(方法):実験にはラット単離心筋細胞およびラット摘出心室筋細胞を用いた。細胞内cAMPの蓄積を高めるためISPおよびIBMXを用いた。cAMPの合成を抑制する目的でpropranololを用いた。(結果):ISPによるcAMPの増加の程度は、IBMXによるそれに比べ少ないにも拘らず、収縮張力はIBMXよりずっと大きかった。またISPとIBMXの組み合わせにより細胞内cAMPは著明に増加した。しかし、その時の収縮張力の増大はISP単独時とかわらなかった。IBMX+ISPにより著明に増加した細胞内cAMPはPropにより著明に低下した。本結果は、細胞内におけるcAMPの増加は心機能に必ずしも反映されないことを支持すると同時に、増加したcAMPがPDE阻害下にも拘らずPropにより何故急激に、しかも著明に低下するかという疑問が新たに生じてきた。本年度の目標であった単一細胞内cAMPの定量、カルシウム濃度測定および収縮張力測定については現在方法を確立すべく検討中である。今後はこれらの方法を駆使して、さらに細胞内cAMPの機能的意義および代謝制御機構について解明すべく努力する予定である。心筋において、4つのホスホジエステラ-ゼ(PDE)のうち、筋小胞体に局在するPDE(PDE III)活性阻害が強心効果に密接に関連していることが提唱され、現在PDE IIIの選択的阻害薬がジギタリスに代わりうる新しい強心薬として盛んに開発されている。しかしながら我々は、従来同一と考えられていたPDE阻害薬の(1)心筋に対する直接作用と(2)βー受容体刺激増強効果との間には解離現象があることを見いたした(Katano and Endoh,BBRC,1990)。そこで本年度は、これの点をさらに明らかにするために、PDEの各アイソザイムの選択的および非選択的阻害薬を用いて(1)と(2)に対する作用を、細胞内cAMPレベルとの関連において解析した。方法:実験には、ラットおよびPDEアイソザイムの細胞内分布がヒトに似ていると考えられているウサギ心室筋を用いた。PDEの非選択的阻害薬としてIBMX、PDE IIIの選択的な阻害薬としてMilrinone(Mil),Yー20487(Y),PDE IVの選択的阻害薬としてRo20ー1724とRolipremを用いた。結果:(ラット)IBMXはそれ自体で強心効果を発揮すると同時に著明なβー刺激増強効果を示した。MilとYは、共に弱いながらも細胞内cAMPレベルを上昇し、強心解果を示した。ところが、βー刺激増強効果は両薬物で異なり、Milは殆ど増強効果を示さなかったが、Yではβー刺激によるcAMP蓄績増強効果がIBMXよりずっと弱いにもかかわらず、βー刺激による強心作用をIBMXと同程度増強した。両PDE IV阻害薬は、それ自体では心筋に殆ど作用を示さなかったが、βー刺激増強効果を示した。(ウサギ)PDE IVの阻害薬は(1)と(2)作用を殆ど示さなかった。一方、MilもYも(1)と(2)作用を発揮したが、βー刺激増強効果はMilでは弱く、YはIBMXと同程度の明かな増強効果を示した。現在、さらに心機能と細胞内cAMPの局在との関連を明らかにすべく、新しい手法を用いて研究を進めているところである。

細胞内におけるcAMPの増加が心機能に必ずしも反映されないことから、cAMPおよび関連酵素の細胞内コンパートメント説が提唱された。しかしながら、その実態は明かでない。そこで、申請者はcAMPおよび関連酵素の細胞内局在とそれらの機能的意義の解明を目的に検討を加え、以下のような結果を得た。(方法)実験にはcAMPの合成促進薬として、isoproterenol(ISP)を、cAMPの蓄積をもたらす目的でホスホジエステラーゼ(PDE)の各アイソザイムのうち、2つのType III選択的阻害薬、2つのType IVの選択的阻害薬および非選択的阻害薬IBMXを用いた。ラットおよびウサギの摘出心室筋標本を用い心機能を、cAMP定量実験にはラット単離心室筋細胞を用いた。(結果)ISPによるcAMPの増加の程度は、IBMXのそれに比べ少ないにも拘らず、収縮張力はずっと大きかった。またISPとIBMXの組み合わせにより細胞内cAMPは著明に増加したが、その時の収縮張力の増大はISP単独時と変わらなかった。本結果は細胞内におけるcAMPの増加は心機能に必ずしも反映されないことを支持する。次に各PDE阻害薬を用いて、心筋に対する1)直接作用と2)β-刺激増強効果を細胞内cAMP蓄積との観点から検討した。その結果、非選択的阻害薬による1)と2)に対する効果はよく相関た。しかし、PDE IIIに阻害薬の間でも1)と2)に対する効果が異なった。PDE IVの阻害薬はともに心筋直接にはcAMP蓄積も強心作用も示さなかったにも拘らず、IspによるcAMPの蓄積作用を著明に増強した。このことはPDEにも局在があり、それぞれが異なった機能的役割を果たしていることを示唆している。本申請期間中の目標であった単一細胞内cAMP定量、Ca濃度測定、収縮張力測定については現在方法を確立すべく検討中であるので、今後はこれらの手法を駆使して、さらに詳細に検討を加える予定である。