hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヘルペスウイルス感染細胞膜の動態に関する分子生物学的ならびに分子形態学的考察

単純ヘルペスウイルス(HSV)の感染によって細胞膜が新たな生物学的活性を発現することと関連して,2種の研究項目について考察した。(I)HSV感染細胞の表面膜に発現するFcレセプタ-により,感作ヒツジ赤血球が吸着(HAD)する現象について検討し、次の成果を得た。(1)感染後期の単層培養細胞で,gCの出現率からほぼ100%の感染が成立している条件においても,HADは7090%に止どまった。(2)同様感染細胞をペルオキシダ-ゼ-抗ペルオキシダ-ゼ・ウサギIgG抗体で処理したのち,金コロイド標識ヤギ抗ウサギIgG抗体で標識し,走査電顕で観察したところ,HAD陰性の感染細胞表面も標識され,感染細胞はすべてFcRを発現していることが示された。(3)感染細胞のHAD活性は,細胞表面上にmicrovilliが多数密生しており、しかもウイルス粒子数が比較的少ないか,あるいは認められない細胞において顕著に発現した。以上の事実から,HSV感染細胞によるHAD活性の発現には,FcRの表面膜上発現のほかに,microvilliが赤血球に密着するという,より生物学的機構の関与もまた重要であることが明らかとなった。(II)ヒトヘルペスウイルス6(HHVー6)感染細胞における膜系とウイルス粒子との相互関係,特に粒子の細胞内輸送機構を一層明確にするために,HHVー6感染細胞の電顕観察を継続実施し,以下の結果を得た。(1)細胞外のすべてのビリオンと,ほぼすべての細胞質内粒子は,明瞭なテグメント(tegument)を保有するが、核内粒子はこの構造を保有しない。したがって,HHVー6のテグメント獲得部位は細胞質である。すなわち,核から被膜,脱被膜を通じて細胞質に出た裸粒子が,この部で直ちにテグメントを獲得し,細胞質内の空胞膜部でエンベロ-プを被って成熟粒子となり,逆貧食過程の機構で空胞と共に運ばれて細胞表面に達し,空胞の開裂によって細胞外に放出される機構が確実となった。1.単純ヘルペスウイルス(HSV)感染細胞の表面膜に発現するFcレセプタ-(FcR)によって,感作ヒツジ赤血球が吸着(HAD)する現象について検討し,以下の結果を得た。(1),1段増殖実験下で,HADとgC抗原の発現を経時的に追跡したところ,螢光抗体法でgC抗原陽性細胞はほぼ100%に達するが,HAD陽性細胞は最高7090%に止どまった。またHAD陽性細胞の割合が,最高に達したのち一時的抑制期がみられ,その後再上昇するという興味ある新知見が得られた。(2),感染細胞をペルオキシダ-ゼー抗ウサギペルオキシダ-ゼ・ウサギIgG抗体とコロイド金標識ヤギ抗ウサギ抗体を用いて処理したのち,走査電顕で観察したところ,HAD陰性の感染細胞表面も標識され,感染細胞はすべてFcRを発現していることが示された。(3),ほぼすべての細胞の表面にFcRが分布している時期においても,顕著なHADを認める感染細胞は一部に止どまった。(4),感作赤血球が感染細胞表面上に固定される主たる様式は,赤血球が多数のmicrovilliによって絡まれて捕獲されることによることが示された。

(5),HAD活性は,microvilliが多数密生しており,しかもウイルス粒子数が比較的少ないか,認められない細胞表面において顕著に発現した。(6),細胞表面上に夥しい数のウイルスを保有する細胞では,HAD活性はむしろ微弱であった。以上の事実から,HSV感染細胞によるHAD活性の発現には,FcRの表面膜上発現のほかに,microvilliが赤血球に密着するというより生物学的機構の関与もまた重要であることが明らかとなった。2.感染細胞内におけるウイルス粒子の輸送の方向性の有無を検討するために,マウスサイトメガロウイルス感染マウス唾液腺を観察し,予備的実験としては,満足すべきであったが,ヒトヘルペスウイルス6感染細胞と共に次年度も継続して電顕学的検討を行う予定である。1.単純ヘルペスウイルス(HSV)感染細胞の表面膜に発現するFcレセプタ-(FcR)によって、感作ヒッジ赤血球が吸着(HAD)する現象について、昨年度の研究を継続した。とくにHAD陽性FL細胞のin situ固定標本を作製し、超薄切片法による観察を併行実施した。赤血球表面膜と接する部位の微細構造について検討した結果、細胞表面膜、microvilliならびにHSV粒子のエンベロ-プがこれに接着しており、これらの三者の表面のいずれにもFcRの発現のあることが推定された。走査電顕観察では、HAD現象の三次元構築に関するmicrovilliの関与の重要性を再確認した。2.ヒトヘルペスウイルス6(HHVー6)感染細胞における膜系とウイルス粒子との相互関係、とくに細胞内輪送機構を一層明確にするために、HHVー6感染細胞の超薄切片観察を継続し、以下の結果を得た。(1)細胞外のすべてのビリオンと、ほぼすべての細胞質内粒子は、明瞭なテグメント(tegument)構造を保有するが、核内粒子はこの構造を保有しない。したがって、HHVー6のテグメント獲得部位は、細胞質部と考えられる。すなわち、核から細胞質に出た裸粒子が直ちにテグメントを獲得し、細胞質内の空胞膜部でエンベロ-プを被り、逆貪食過程で細胞外に放出される構機が確実視されるに至った。(2)核内テグモソ-ムと呼ばれる領域で、テグメントを獲得するという学説があるが、この領域は細胞質部の核内への陥入した構造であり、上記(1)と本質的に同義であることが明らかとなった。(3)フ"コソ-ム内に存在するビリオンでは、テグメント構造が修飾を受けていることを示す興味ある知見が得られた。3.HSVー1の一段増殖実験下で、感染細胞におけるウイルス糖蛋白の出現動態について検討した。その結果、深山・-GCr株と+GC(LPV)株感染では、gB,gD共に感染4時間後から出現し始め、他方gCについては-GCr株でのみ、稍遅れて6時間後より出現を観察した。
親潮・混合水域における海水の沈降と中層水

中層循環は数十年の時間スケールの気候変動や海洋中の物質の循環に重要な働きする。しかし、北太平洋中層水の生成機構についても現在まで明らかにされていない。この問題を明らかにするため、中層水生成のキイエリアと考えられている親潮域・混合水域の海況を、既存の資料を中心に調べた、別に量的には少なくとも、親潮域・混合水域で津軽暖水系水が冬季の冷却によりかなりの高密度になり得ることが示される。近年、高精度のCTDが各機関に配備されるようになり、この海域での観測資料は質・量ともに急速に増大しつつあるが、CTD記録に現れるジグザクした形状を微細構造の活動度と捉え、それがその海域での水塊混合・変質の活質の活発さを与えるものと考えられることから、その地理的分布から生成域の特定を試みており、暖水塊やフロント付近の海況が重要な要因となることを確かめつつある。また、岩手県水産試験場の定期観測線の過去20年に渡る資料から、三陸沿岸で冬季にどれだけ重い水が生じるかを調べた。その結果は、北太平洋中層水に対応する水系の水が、高塩分の津軽暖水流の冬季の冷却でほぼ毎年生成されていることが示された。またその生成は、冷却の最も激しい2月ではなく、高塩の津軽暖水の滞留する1月に行われることを明らかにした。これはこの密度の水亜寒地帯海域で冬季にも水面近くでは見出せないとする今までの常識とは反する結果である。量的に単独に北太平洋の中層水の起源となり得るかは今後の研究に待つ必要があるが、この海域に流入して来るオホーツク起源の低塩の中層水との混合により中層水を作るのでありば十分な生成量を生み出すことは十分考えられる。少なくとも、キイエリアである混合水域の北部の中層の海洋構造を決定する上において津軽暖流水起源の高密度水は無視することの出来ないものであることは示し得た。
異なる気候帯に植栽されたチークの材質の変化と植栽適地の判定

これまでチーク(Tectona grandis)植林に不適とされてきた半島マレーシアにおいて植栽されたチークの個体サイズや材密度を調べた。これまでに報告されているタイのチーク人工林の結果と比較すると、今回の調査林分の平均胸高直径、平均樹高、優勢木の樹高は、タイの平均値に近い値であった。また、材密度もタイで報告されている範囲であった。このことから、植栽不適地とされてきたマレーシアでも、タイのチーク人工林と同程度の直径成長や樹高成長、材密度が期待できると考えられた。Perlis州にあるマレーシア森林研究所(FRIM)のMata Ayer研究ステーションを訪問し、敷地内に植栽されているチーク人工林内で調査をおこなえるか交渉をおこなった。話しあいの結果、同ステーション内での調査に関して問題ないという返事をいただいた。またステーション内の36年生チーク人工林において予備調査として、40m×40mの調査区を設定し、樹高、胸高直径を測定した。測定の結果、立木密度400本/ha、平均DBHは26.4 ±0.9 cm、平均樹高は21.3 ±0.6 cmであった。現在、タイでおこなっているチーク林の調査ではKanchanaburi県Tong Pha Phungの33年生のチーク林で平均DBHは31.3 ±5.2cm、平均樹高は22.6 ±2.1 cm、Uttradit県TongSen Khanの33年生のチーク林で平均DBHは15.1 ±3.1cm、平均樹高は12.9 ±1.5 cmであることから、マレーシアに植栽されたチークの成長は悪いとは言えないと考えられた。当初計画していた高速道路沿いのチーク植栽地での調査に関して交渉を続けたところ、新規に調査区を設定する許可は得られなかったが、既存の調査区であれば調査が可能という許可を得ることができた。また、FRIMの研究員との交渉の結果、Negri Sumbilan州内に個人所有のチーク人工林があり、調査が可能という情報を得ることができた。これまでの打ち合わせではマレーシア高速道路公団(PLUS)が管理する高速道路沿いのチーク植栽地での調査は可能であると言われてきたが、現地で交渉をした結果、PLUSに対して新規の調査区を申請することは難しい、という回答をうけた。そのため、これまで、PLUSの高速道路沿いのチーク植栽木の調査をしてきた、マレーシア森林研究所(Forest Research Institute Malaysia; FRIM)の研究員を紹介していただき、共同で既存の調査区内でおこなう分に関しては問題ないということになった。熱帯地域において広く植栽されているチーク(Tectona grandis)は、降雨に季節性の無い湿潤熱帯気候であるマレーシアでは一般的に植栽に適していないと言われている。本研究では半島マレーシアにおいて植栽されたチーク人工林で毎木調査をおこない、これまでにタイで報告されてきたほぼ同齢のチーク人工林研究の結果と比較し、タイのチーク人工林よりも成長が劣るか明らかにした。調査はマレーシア半島部のPerlis州(36年生)、Selangor州(14年生)、Negri Sembilan州(46年生)、Malacca州(18年生)、Johor州(18年生)の計5カ所のチーク人工林に調査区を設定し、調査区内のチークについて胸高直径(DBH)、樹高(H)を測定した。タイでおこなわれてきた研究と比較した結果、平均DBHは、ほぼ同齢のタイのチーク人工林の林分の値の範囲内で中程度の値であった。平均Hはタイの同齢林分よりも低い傾向を示したが、林冠の上層高(DTH)で比較した場合は平均DBHと同様に同齢のタイのチーク人工林の林分の値の範囲内で中程度の値であった。間伐により小径木が少ないタイのチーク人工林に対して、マレーシアの林分では間伐などがおこなわれていないため小径木の出現が多く、平均Hの値が低くなったが、林冠高で比較するとタイのチーク人工林の林冠高と変わらないという結果になった。このことから、植栽不適地とされているマレーシアにおいても、今回調査をおこなった5林分の成長はタイ国内のチーク人工林と同程度と考えられた。初年度は現地での交渉と調整に日程の多くを費やしたが、平成28年度までにマレーシア国内で計5カ所での調査を実施することができた。各調査地では調査区を設定し、毎木調査とサンプルの採集をすることができた。また、これまでの調査内容を学会で報告し、論文を一報発表することができ、概ね順調に進展している。材質が優れているチーク(Tectona grandis)は、雨期、乾期が明瞭な熱帯地域で植栽されているが、降雨に季節性の無い湿潤熱帯気候であるマレーシアでは一般的に植栽に適していないと言われてきたが実証データはほとんどなく、チークの成長を左右する環境因子も不明であった。本研究では、半島マレーシアにおいて様々な地域に試験的に植栽された1446年生のチークの個体サイズや材密度を自生地域であるタイの人工林と比較し、どの程度成長が異なるのか明らかにした。マレーシア半島部の6州の計6林分に調査区を設定し、毎木調査及び材の採取をおこなった。

植栽適地から不適地を含むタイのチーク人工林で得られた既報の結果と比較すると、今回の6林分の幹の平均胸高直径(DBH)、平均樹高、優勢木の樹高(上層樹高)は、タイの平均値に近い値であった。林冠を構成する個体の幹の形状比(樹高と胸高直径の比;H/DBH)を比較すると、タイよりもマレーシアの6林分は低く、樹高に対するDBHが高かった。タイでは林齢が増加するとH/DBH比が低くなった。タイではチークを高密度に植栽し、その後間伐をするので立木密度が減り空間があくためにH/DBH比が減ると考えられた。一方マレーシアでは調査区間でH/DBH比に有意差はなく、幼齢期から樹高に対するDBHが高いという、タイのチークとは異なる成長特性であった。材密度はタイで報告されている範囲にあり、林齢が高い林分ほどチークの材密度も高かった。以上の結果から、植栽不適地とされてきた半島マレーシアでも、本研究をおこなった林分に関してはタイのチーク人工林とH/DBH比を指標とした成長特性は異なるが、同程度の直径成長や樹高成長、材密度が期待できると考えられた。したがって、明確な乾季の有無はチークの成長には大きく影響せず、半島マレーシアがチークの植栽不適地であるとは言えないことが示唆された。これまでチーク(Tectona grandis)植林に不適とされてきた半島マレーシアにおいて植栽されたチークの個体サイズや材密度を調べた。これまでに報告されているタイのチーク人工林の結果と比較すると、今回の調査林分の平均胸高直径、平均樹高、優勢木の樹高は、タイの平均値に近い値であった。また、材密度もタイで報告されている範囲であった。このことから、植栽不適地とされてきたマレーシアでも、タイのチーク人工林と同程度の直径成長や樹高成長、材密度が期待できると考えられた。調査許可が得られたMata Ayer研究ステーション、PLUSが管理する高速道路沿いのチーク調査区において、毎木調査をおこない、成長量の追跡調査をおこなう。また、材のサンプルを採集し、材密度を調べる。調査区内の土壌を採取しカウンターパートに土壌分析を依頼する。半島マレーシア内での調査区を増やすとともに、これまでに採集したサンプルの分析を始める。今年度が最終年度であることから、共同研究者、現地カウンターパートととりまとめについて、今後の研究の発展について協議する。森林生態2015年10月頃に予定していたマレーシア調査が日程調整上、困難になったためとりやめた。11月から翌年3月まで日程調整をしたが、この期間中の渡航も難しく、結果的に分担者とともにそれぞれ1回分の渡航費、渡航先で使用する調査関係費が残った。平成28年度のマレーシアでの調査は、7月の出張の際にイスラム教の断食および断食明けの休みが重なり、希望通りの滞在日数がとれなかった。調査地への入林許可の関係から日程を変更することができず、短めの滞在となった。また、10月の予定していたマレーシアでの調査は、日本での業務とマレーシアのカウンターパートとの日程調整がつかず、年明けまで延期することとなった。平成28年度予定している回数よりも1回多く渡航し、合計3回渡航する。渡航予定は7月、10月、翌年2月とする。平成29年度は、イスラム教の断食および断食明けの休みが平成28年度よりも10日ほど前になるので、予定してる日程を組むことができる。また、既にマレーシアのカウンターパートにも日程の確認をとっており、希望通りの予定を組むことができている。また、平成28年度は日本で関わっているプロジェクトの最終年度であったことから海外出張に制限がかかったが、平成29年度では10月の海外調査も可能になる。
放射性炭素および分子レベル同位体解析を用いた、炭素循環と生態系構造の関係の解明

本研究においては、放射性炭素14の分析と、炭素・窒素安定同位体比およびアミノ酸窒素同位体比を用いて、集水域レベルの炭素循環と生態系構造の関係を研究した。△14C値の測定を行なうことによって、陸域由来の隔離された炭素と大気CO2起源の炭素が混合されて河川食物網に取り込まれていることが示された。その比率は河川内部生産と外部生産の比率に依存することが分かった。本年は、分析体制の確立を中心課題とした。まず、京都大学生態学研究センターに設置された安定同位体比質量分析計(GC/C/IRMS)を用いて、アミノ酸の窒素同位体比に関するオンライン測定法を確立し、土壌動物群集のアミノ酸同位体分析を行った。また、河川生態系のΔ^<14>C値を決める要因となる、河川の微細環境における礫上付着物(Epilithon)および粒状有機物(POM)のΔ^<14>C値を解析した。さらに、安定同位体比を測定するための有機物標準試料について、多くの国際標準物質と比較して値を決定した。続いて、京都大学にて準備されたグラファイト試料について、加速器質量分析(以下、AMS:国立環境研究所現有)による放射性炭素同位体の測定を実施した。測定に先立ち、AMSの高精度化、高感度化についての検討を実施した。高感度化のため、従来の加速電圧を4.6から4.8MVへの昇圧実験を行い、4.8MVでの定常運転が可能となった。また測定精度向上のため、ファラデーカップからの電流情報をイオン源へフィードバックさせ、グラファイト試料からのビーム引き出しを安定化させることに成功した。この結果、測定精度が大幅に向上した。陸上生態系構造、特に土壌分解系の時間軸を明らかにするため、北海道の冷温帯林、静岡の照葉樹林、沖縄の亜熱帯林から採集されたリター食ミミズ及び土壌食ミミズのΔ^<14>C値の測定を行った。^<14>C値から食物年齢(炭素が植物によって固定されミミズに利用されるまでの時間)を求めた結果、採集場所による有意な影響は見られず、リター食ミミズの食物年齢は約2年、土壌食ミミズの食物年齢は約10年であった。このことは、土壌動物が利用する炭素の循環速度が、冷温帯林から亜熱帯まで有意に違わないことを示唆している。平成23年度には、22年度に確立した放射性炭素14(14C)分析手法およびアミノ酸窒素同位体分析システム(GC/C/IRMS)を利用して、本格的な研究を進めた。陸域生態系研究としては、アミノ酸窒素同位体比分析を進めた結果、分解に伴う微生物の代謝によって従来からのアミノ酸栄養段階の計算とは異なる結果を生む可能性が示された。また、水域生態系研究としては琵琶湖集水域における河川生態系の炭素循環および食物網の研究を行った。生物群集の炭素・窒素安定同位体比を用いた食物網解析に加え、アミノ酸窒素同位体比を利用した栄養段階推定も開始した。その結果、河川生態系のように内部生産と外部生産の混合系では、アミノ酸窒素同位体比による栄養段階推定に注意を要することがわかった。また、森林より河川に流出する炭素画分(溶存無機炭素(DIC)・溶存有機炭素(DOC)・懸濁態有機炭素(POC))の放射性炭素14解析を開始した。その結果、流域の無機・有機炭素画分の14C値は母岩に影響されて大きく変動する部分と、母岩に関わらず集水域に影響されて変動する部分の混合によることがわかった。一方、水域生態系の窒素同位体比の変動要因として陸上生態系の消費者の現存量の影響を調べた。その結果、集水域中に大型草食上動物が多いほど、河川有機物の窒素同位体比が上昇することが明らかになった。また、森林生態系の遷移過程に伴う消費者群集の炭素窒素安定同位体の変動についての研究を行った。その結果、アリ群集の窒素同位体比が上昇する傾向があり、遷移が進むにつれて食物網構造に変化があることが示唆された。本年度の水域生態系研究としては琵琶湖集水域における河川生態系の炭素循環および食物網の研究を行った。アミノ酸窒素同位体比を利用した栄養段階推定を行なった結果、河川内部生産と外部生産の混合系である河川生態系では、アミノ酸窒素同位体比混合モデルの必要性が明らかになった。それを用いて、混合モデルが必要とされる場合での栄養段階推定手法を確立した。また、琵琶湖集水域河川の比較研究から、流域の無機・有機炭素画分の14C値は母岩に影響されて大きく変動する部分と、母岩に関わらず集水域に影響されて変動する部分の混合によることがわかった。これらをまとめて総説を執筆した(Ishikawa et al.印刷中)。土壌は生物圏で最も多くの炭素を貯蔵しており、温度上昇による土壌炭素の滞留時間の変化について近年多くの研究がなされている。しかし、土壌動物が餌として利用している有機物の滞留時間(食物年齢)についての知見は極めて乏しい。

本年度は、様々な気候帯から採集したミミズの放射性炭素同位体分析を行い、気候条件がミミズの利用する食物年齢に与える影響を調べた。その結果、ミミズの食物年齢は、食性(リター食や土壌食)ごとに有意に異なったが、気候条件による有意な差は見られず土壌食ミミズで約10年であった。このことは、ミミズが利用する土壌有機物の分解速度が、気温ではなく、土壌構造や植生によって決まっている可能性があることを示している。その他、放射性炭素14解析、バルク同位体比を用いた解析、アミノ酸同位体解析を用いた研究を行ない、標記課題に関連する複数の論文執筆を行なった。陸域生態解析および水域生態系解析の両方とも、試料採取および同位体比の精密分析を順調に進めている。3年間の研究計画上、2年目までの進行状況はおおむね計画通りといえる。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後の研究計画としては、24年度が最終年度となるために、成果を取りまとめ学会発表とともに学術論文の出版を中心課題とする。そのためには、未分析の試料の分析をまず最優先課題とし、続いて関連する研究者と効率的な議論を行い、精緻な解析および緻密な議論構築をする必要がある。
コレステロール生合成酵素系と先天異常

コレステロール生合成の後段階酵素の1つスクアレン・エポキシダーゼの遺伝子をクローニングし,ヒト遺伝子が第8染色体のテロメア近傍8q24.1に局在することを明らかにした。この部位はヒトの先天奇形で知られるLanger-Giedeon症候群の原因遺伝子が推定される部位と一致する。本症候群患者の遺伝子解析では未だスクアレン・エポキシダーゼが関わると同定された症例はなく現在も探索は進行中である。将来の遺伝子異常解析に備えるため,スクアレン・エポキシダーゼ酵素活性測定スクリーニングの簡便化,Biosensor開発の検討,遺伝子プロモーター領域の全塩基配列決定,転写開始点(ネズミ),ステロール応答領域の機能解析を行い,プロモーター領域ではSterol Regulatory Element(SRE)並びにNF-Y相同部位の存在を明らかにした。ノックアウトマウス以外に酸素欠損動物を作成する手段として,本酵素に対する阻害剤のスクリーニングを行い,緑茶から有効な阻害剤を見出した他,FAD,基質,阻害剤結合部位を測定した。ヒト本酵素の膜貫通部位は5個であることがPred.IIプログラムによるコンピュータ解析から想定され,生物種による相違を明らかにできた。スクアレン・エポキシダーゼ遺伝子異常は転写に関わるプロモーター領域の配列異常に基づく転写機能異常,遺伝子産物であるタンパク質のアミノ酸異常によるもの,酵素の代謝回転異常などの関与が推定されるが,解析のための基盤は整った。転写機構に関し胆汁酸をリガンドとするFXRの機能解析,オキシステロールをリガンドとするLXRsのスクアレン・エポキシダーゼ遺伝子のDown-regulationへの関与を明らかにした。ヒトの先天奇形で知られるLanger-Giedeon症候群の原因遺伝子と推定されるスクアレンエポキシダーゼ遺伝子の塩基配列を決定し、第8染色体局在を明らかにした。遺伝子産物をコードする配列からアミノ酸の一次構造を推定し、各種酵素の組み換え体を作成し活性ある酵素の精製を行った。遺伝子異常症例の異常部位解析に取り組むため、酵素遺伝子のプロモーター領域の機能解析としてヒト及びラットの構造を比較決定し、更に転写開始点を決定するとともに典型的なステロールレギュレトリーエレメント(SRE)を認めないSEプロモーターの機能構造を目下解析中である。また、アミノ酸の置換体を用い酵素タンパクの機能ドメインとして推定される1)FAD結合ドメイン、2)基質結合ドメイン(スクアレシ及び酵素)、3)膜結合ドメイン、4)NADPH-チトクロームP-450還元酵素相互作用ドメインの機能解析を展開中である。膜結合ドメインに関してはPred.llプログラムによるコンピュータ解析から数個の膜結合部位を推定し、動物種による相違を明らかにできた。Langer-Gedeon症候群の1症例(米国)をSE遺伝子を用い目下解析中である。SE遺伝子の異常を検索するためには、臨床症状の他検体でのSE酵素活性異常の検出が不可欠で、現在biosensorでの測定法を開発中である。SE遺伝子の異常は、転写に関わるプロモーター領域の配列異常に基づく転写機能異常、遺伝子産物であるタンパク質のアミノ酸異常に基づく活性機能の異常、酵素の代謝回転異常などが関与すると推定されるが、異常解析のために必要な基盤はほぼ備わった。転写調節機構に関し核内レセプターLXRの機能に必要なLXREの発現がSEの発現と逆相関にあること汲びオキシステロールがリガンドである可能性を明らかにした。コレステロール生合成の後段階酵素の1つスクアレン・工ポキシダーゼの遺伝子をクローニングし、ヒト遺伝子が第8染色体のテロメア近傍8q24.1に局在することを明らかにした。この部位はヒトの先天奇形で知られるLanger-Giedeon症候群の原因遺伝子が推定されている部位と一致する。将来の遺伝子異常解析に備えるため、スクアレン・エポキシダーゼ酵素活性測定スクリーニングの簡便化、Biosensor開発の検討、遺伝子プロモーター領域の全塩基配列決定、転写開始点(ネズミ)、ステロール応答領域の機能解析を行い、プロモーター領域ではSterol Regulatory Element(SRE)並びにNF-Y相同部位の存在を明らかにした。

ノックアウトマウス以外に酵素欠損動物を作成する手段として、本酵素に対する阻害剤のスクリーニングを行い、緑茶から有効な阻害剤を見出した他、FAD、基質、阻害剤結合部位を推定した。ヒト本酵素の膜貫通部位は5個あることがPred.IIプログラムによるコンピュータ解析から推定さ、れ、生物種による相違を明らかにできた。スクアレン・エポキシダーゼ遺伝子異常は転写に関わるプロモーター領域の配列異常に基づく転写機能異常、遺伝子産物であるタンパク質のアミノ酸異常によるもの、酵素の代謝回転異常などの関与が想定されるが、解析のための基盤は整った。転写機構に関し胆汁酸をリガンドとするFXRの機能解析、オキシステロールをリガンドとするLXRsのスクアレン・エポキシダーゼ遺伝子のDown-regulationへの関与を明らかにした。
α位にフッ素を持つビニルホスホニウム塩の合成とその合成化学的利用

1)α-フルオロビニルホスホニウム塩の合成ジフェニルホスフィドアニオンと入手容易は1,1-ジフルオロエチレンを-60°C-40°Cで反応させることで、望むホスフィンを82%収率で得た。対応するホスホニウム塩の合成はジフェニルヨードニウム塩と塩化銅(I)の存在下、140°Cで反応させることで対応するα-フルオロビニルトリフェニルホスホニウム塩が82%収率で得られることがわかった。このようにしてわずか二段階で目的とした含フッ素ビルディングブロックの合成に成功した。2)α-フルオロビニルトリフェニルホスホニウム塩の反応基本的反応性をみる目的でフルオロエチレン基を有するエーテルの合成を検討した。求核剤のナトリウムエトキシドをマイケル付加させて得られるイリドに種々のアルデヒド類をWitting反応させたところ、期待した反応が進行し目的化合物のモノフルオロビニルを有する種々のエーテルを高収率で得ることができた。3)含フッ素複素環化合物の合成分子内に水酸基とアルデヒド基両方を持つ化合物とα-フルオロビニルトリフェニルホスホニウム塩を反応させ一段階で含フッ素複素環化合物を得ることに成功した。反応の鍵はアルコキシドのカウンターカチオンにセシウムを用いることで、たとえばサリチルアルデヒドとの反応で3-フルオロ-2H-クロメンを34%の収率で得ることが出来た。得られた3-フルオロ-2H-クロメンはロジウム触媒を用いて対応する3-フルオロクロマンに導いた。4)モノフルオロアリルアルコールの合成求核剤を工夫してアリルアルコールのアルコキシドを用いることで得られたモノフルオロアリルアリルエーテルのフッ素の置換していないアリルエーテルの炭素-酸素結合を選択的に切断でき対応するモノフルオロアリルアルコールが高収率で得られることを見いだした。1) α-フルオロビニルホスホニウム塩の合成標的化合物の前駆体としてα-フルオロビニルジフェニホスフィンを選び合成を検討した。ジフェニルホスフィドアニオン(クロロジフェニルホスフィンと金属リチウムから合成)と入手容易な1,1-ジフルオロエチレンを-60°C-40°Cで反応させることで、望むホスフィンを82%収率で得た。対応するホスホニウム塩の合成はアルキル系およびアリール系の2種類の化合物を用いる4級化による方法を検討した。ヨードメタンとの反応は容易に進み対応するα-フルオロビニルジフェニルメチルホスホニウム塩を91%の収率で与えた。アリール化合物との反応は困難であった。反応条件を種々検討した結果、ジフェニルヨードニウム塩と塩化銅(I)の存在下、140°Cで反応させることで対応するα-フルオロビニルトリフェニルホスホニウム塩が82%収率で得られることがわかった。2) α-フルオロビニルトリフェニルホスホニウム塩の反応基本的反応性をみる目的でフルオロエチレン基を有するエーテルの合成を検討した。求核剤のナトリウムエトキシドをマイケル付加させて得られるイリドに種々のアルビデド類をWittig反応させたところ、期待した反応が進行し目的化合物のモノフルオロビニルを有する種々のエーテルを高収率で得ることができた。この結果からα-フルオロビニルトリフェニルホスホニウム塩は有機化合物中に容易にフルオロエチレン基を導入できる有用な化合物であることが明らかとなった。現在、フルオロエチレン基を有する複素化合物合成に着手し、適用範囲の拡大を行なっている。

1)含フッ素複素環化合物の合成分子内に水酸基とアルデヒド基両方を持つ化合物とα-フルオロビニルトリフェニルホスホニウム塩を反応させ一段階で含フッ素複素環化合物を得ることに成功した。反応の鍵はアルコキシドのカウンターカチオンにセシウムを用いることで、たとえばサリチルアルデヒドとの反応で3-フルオロ-2H-クロメンを34%の収率で得ることが出来た。しかしながらこの環化反応は対応する立体障害の大きいケトン基を持つ化合物には適応できなかった。また得られた3-フルオロ-2H-クロメンはロジウム触媒を用いてモノフルオロオレフィン部分のフッ素を失うことなく水素添加でき、対応する3-フルオロクロマンに導けることもわかった。2)モノフルオロアリルアミン誘導体の合成求核剤にフタルイミドを用いることでモノフルオロアリルアミン誘導体を得ることに成功した。生成物はGabriel反応のときと同様にヒドラジンで脱保護すればフリーのモノフルオロアリルアミンが得られるものと考えられる。3)モノフルオロアリルアルコールの合成すでにモノフルオロアリルエーテルが得られることを報告しているが、求核剤を工夫してアリルアルコールのアルコキシドを用いることで得られたモノフルオロアリルアリルエーテルのフッ素の置換していないアリルエーテルの炭素-酸素結合を選択的に切断でき対応するモノフルオロアリルアルコールが高収率で得られることを見いだした。現在、モノフルオロアリルアリルエーテルのE/Z選択的合成に取り組んでいる。
シグナリング及び非シグナリングに関わるホスホリパーゼA_2の生物薬学的研究

本研究では、哺乳動物に20種類以上存在するPLA_2の各分子種の機能を解明し、これを体系化することを目的としている。本年度は、前年度の研究の流れを更に発展させ、組織特異的に発現しているsPLA_2分子種の固有の機能について、トランスジェニック(Tg)およびノックアウト(KO)マウスを用いて検討を行った。1.sPLA_2-Xの生体内機能の解析:sPLA_2-X KO (X-KO)マウスでは野生型マウスと比較して末梢性痛覚刺応答が有意に低下することを見いだした。逆に、sPLA_2-X Tg (X-Tg)マウスは痛覚過敏を呈した。また、抗sPLA_2-X抗体による免疫組織化学染色において、野生型マウスの脊髄後根神経節および座骨神経に陽性所見が認められた。これらのことから、末梢神経線維に発現しているsPLA_2-Xが何らかの機構で神経応答を調節しているものと考えられた。2.sPLA_2-IIIの生体内機能の解析:sPLA_2-III Tg (III-Tg)マウスでは血漿リポ蛋白質の組成変化が起こり、HDLが減少し、変性LDLが生じていた。免疫組織化学染色の結果、sPLA_2-IIIはヒトおよびアポE欠損マウスの動脈硬化巣に発現していた。更に、III-Tgを高脂肪食負荷に処すると肥満を呈し、解剖学的には皮下脂肪の蓄積と脂肪肝が顕著であった。以上のことから、sPLA_2-IIIの過剰発現は生活習慣病様の症状を誘導するものと考えられた。またIII-Tgではアレルギー反応が充進し、さらに加齢に伴い脾臓肥大と皮膚炎を自然発症することも明らかとなった。これらの表現型の妥当性を検証するためにsPLA_2-III KOマウスの作製を試み、ごく最近ホモ欠損マウスを得ることに成功した。本研究では、sPLA2群の生体内機能を明らかにし、個々の酵素の機能的役割分担を確立することを目指している。本年度は新規PLA2群について、細胞に過剰発現させ、細胞機能の体系化を目指すと共に、sPLA2分子種について、特異抗体を用いて各酵素のヒト組織における発現分布の網羅的解析に着手した。(1)新規PLA2の細胞機能:III型sPLA2,IVC型cPLA2、VIB型iPLA2について、それぞれをHEK293細胞に過剰発現し、機能を調べた。(i)III型sPLA2の酵素ドメインは細胞の形質膜に作用し、X型sPLA2と同様の機構で未刺激細胞からアラキドン酸を遊離する。また、N末とC末に存在する本酵素固有の塩基性ドメインは本酵素がヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合するのを助け、結果としてIII型sPLA2はIIA型sPLA2同様にヘパラン依存的経路によってもアラキドン酸を遊離する。(ii)IVC型cPLA2はC末端のisoprenylationを介して小胞体膜に構成的に結合しており、刺激非依存的にアラキドン酸遊離を亢進し、炎症刺激下で更に亢進する。isoprenylation siteの変異導入すると、小胞体への局在ができなくなり、アラキドン酸遊離能が消失する。(iii)VIB型iPLA2は刺激非依存的な脂肪酸の非特異的遊離(膜脂質リモデリング)を著しく亢進し、炎症刺激下で更に亢進する。またVIA型iPLA2と異なり、VIB型iPLA2により遊離されたアラキドン酸は効率良くPGE2に変換される。

(2)sPLA2のヒト組織分布:免疫組織化額染色により、IIA, IID, IIE, IIF, V, X型sPLA2の慢性関節リウマチ、心筋梗塞、肺炎、C型肝炎、大腸癌、生殖器、等における発現を解析中である。本研究では、哺乳動物に20種類以上存在するPLA_2の各分子種の機能を解明し、これを体系化することを目的としている。本年度は特にsPLA_2分子種について、そのヒト病理組織での発現と、アラキドン酸代謝への関与について検討を行った。免疫組織化学染色の結果、ヒト肺炎ではsPLA_2-Vと-Xが広範に発現しており、アデノウイルス発現系によりヒト初代培養気管支上皮細胞、肺線維芽細胞に発現させるとアラキドン酸代謝が亢進した。ヒトリウマチ関節炎ではsPLA_2-IIA、-V、-Xが滑膜細胞に発現しており、培養滑膜細胞に対してアラキドン酸代謝を亢進した。癌組織では、癌のタイプに応じて異なるsPLA_2分子種が多様な発現様式を示し、このうち大腸癌細胞株に各種sPLA_2をレンチウイルス発現系を用いて導入した結果、全てのsPLA_2においてPGE_2産生の増強が認められた。心筋梗塞や肝硬変などの組織障害では、sPLA_2-IIAと-Vの発現が選択的に上昇していた。更に組織の枠を超えて普遍的に、sPLA_2-IIAは血管平滑筋に、sPLA_2-Vは間質線維化組織に、sPLA_2-Xは神経線維に発現していることが明らかとなり、各々が細胞特異的な機能への関与が予想された。また、sPLA_2群が高発現していることが知られている雄性生殖器についても検討を行い、精子形成細胞にsPLA_2-IID、-V、-Xが、Leydig細胞にsPLA_2-IIFと-Vが、Sertoli細胞にsPLA_2-IIEが、前立腺上皮細胞にsPLA_2-IIAが発現していることを見い出した。現在はこれらの知見を元に、臓器固有のsPLA_2の機能について、トランスジェニックあるいはノックアウトマウスを用いて解析を進めていく予定である。現在、sPLA_2-III,-V,-Xについてトランスジェニックマウスを、sPLA_2-Xについてノックアウトマウスを調整中である。本年度は特に組織特異的に発現しているsPLA_2分子種の固有の機能について検討を行った。1.sPLA_2-Xの神経機能:免疫組織化学染色の結果、sPLA_2-Xは末梢神経線維に特有に発現していた。培養神経細胞にsPLA_2-Xを過剰発現させると神経突起の伸張が促進され、この作用はsPLA_2-Xによるリゾホスファチジルコリンの産生に依存していた。また、sPLA_2-Xが組織レベルではzymogenの形で存在し、細胞から分泌された後にN末端が限定分解されて活性化されることを見いだした。2.sPLA_2-IIIと癌:免疫組織化学染色の結果、sPLA_2-IIIは癌細胞とその周辺の新生血管内皮細胞に発現していた。培養内皮細胞を炎症性サイトカインで刺激すると、sPLA_2-IIIの発現が誘導された。大腸癌細胞にsPLA_2-IIIを過剰発現させると、PGE_2産生の亢進に加えて細胞増殖が促進された。逆に、sPLA_2-IIIのsiRNAを本細胞に導入すると、細胞増殖に抑制傾向が見られた。3.sPLA_2-Vと肺サーファクタントの分解:免疫組織化学染色の結果、sPLA_2-Vは肺炎組織の気管支上皮細胞に発現していた。
環境汚染物質が炭酸カルシウム系文化財に及ぼす影響とその抑制に関する研究

漆喰や炭酸カルシウム顔料の保存、修復における材質同定方法として顕微鏡観察法を用いて、その原材料である貝殻や石灰岩がもつ特有の形態から、歴史資料に利用された原材料の識別を試みた。劣化している歴史資料を調査するにあたって、それが置かれている環境から受ける影響を調査する必要があることから、大気、環境汚染物質、防カビ・防虫剤に曝された時の炭酸カルシウムの形態および物性の変化を確認した。炭酸カルシウムの原材料にはカキ、ハマグリ、石灰岩の粉末を実験に用いたが、カキは他の貝殻よりも脆いため、環境の影響を受けやすいことが明らかになった。収蔵庫内揮発物質が炭酸力ルシウムの微細構造に与える影響を調査するため、環境調査を行った博物館において顔料の曝露試験を開始した。炭酸カルシウム(原材料;カキ、ハマグリ、石灰岩)、朱、鉛丹、ベンガラ、緑青(粒度は粗、細の2種類)、群青(粗、細)、鉛白、蜜陀僧の計12試料(10種類)を用いた。試験は2007年10月から開始し、1カ月後と3カ月後の色差測定を行なった。蜜陀僧の変色が認められ、これはプレ実験として行なった曝露試験と同様の結果であった。現在、曝露した試料の形態学的調査、機器分析等を行なっており、解析中である。変色が顕著に認められた蜜陀僧は歴史的に使用の履歴が定かではなく、ここでは研究対象としない。ただし、反応性が高い指示薬として有効であると考えられるので今後も曝露試験には用いるものとした。炭酸カルシウムの変化は光学調査では認められなかった。更に、ホルムアルデヒドや蟻酸、酢酸などの防カビ剤や収蔵庫内装材などからの影響を調査するため、高濃度環境での曝露試験を行った。環境抑制装置の対象として酢酸を取り上げその除去方法の検討を開始した。調査の結果、小規模な博物館などでは恒常的な最適環境を提供するには資金的、技術的にも負担が大きいことが判明した。特に展示ケースにおいて、貴重な資料は短期間(2週間から1ケ月ほど)しか展示環境に曝されないことがわかった。そこで、博物館などとの協議を重ね、簡易に迅速に短期間の環境改善が可能な装置に必要なファクターを抽出し、その開発を開始した。●環境抑制装置を製作した。簡易に対象汚染物質を除去する方法として、ケミカル除去シートとファンフィルタユニット(FFU)とを開発し、限られたスペース(企画展示用の大型展示ケース)で環境改善を試みた。その結果、展示ケースを使用する際にFFUで短時間に汚染物質の濃度レベルを下げることが可能で、その後は除去シートによって汚染物質を低濃度レベルで維持できることがわかった。これらは除去したい環境汚染物質によって仕様の変更が可能であるばかりか、その簡便な手法と即効性、安定性により、様々な規模かつ多様な材質を持つ収蔵施設、展示施設の環境改善に効果がある。想定される仕様モデルは次のようになる。1.環境状態が懸念される展示ケースを使用する際には、ファンフィルタユニットを用いての強制循環により汚染物質を低濃度まで下げ、その後展示中(低濃度期間中)は吊り下げるだけの除去シートで対応できる。吊り下げ式は特に火災や漏電などの危険性がなく、しかも本研究の成果から1年以上の効果の持続が期待できる。2.収蔵庫においては、特定の材質(例えば浮世絵や文書など)を主に保管する場合、その収蔵庫の内装材との相性から脅威となる物質を除去するケミカルフィルターの種類を選択し、収蔵庫を開閉したときにのみファンフィルタユニットを稼働させ短時間に汚染空気を清浄することが可能であろう。3.周辺とは隔離した環境で保管したい文化財をケミカル除去シートで包み対処することにより、空気環境を広空間で調整することなく、限られた空間のみの環境改善が可能である。●南鹿児島市から出土した炭酸カルシウム系材料の材料科学的調査を行った。
酵母プリオン系を用いたプリオン伝播の分子機構の解明

前年度までの研究によって、酵母プリオンSup35NMドメイン(Sup-NM)はアミロイド形成前に温度依存的にオリゴマーを形成し、それがアミロイド構造を決定する重要な要因であることを明らかにした。また、オリゴマー内にはアミロイドに存在しない非天然相互作用が含まれていることも発見した。本年度ではその研究を引き続いて行い、オリゴマーが直接のアミロイド形成の核とはならないことを単離したクロスリンクオリゴマーを用いて証明し、さらにオリゴマーがアミロイドの伸長には必要でないことをシーディング実験で明らかにしたことで、オリゴマーは凝集核形成の足場としての役割を持つことを示唆することができた。またオリゴマーを増減させる変異によって変化したアミロイドの構造がシーディングによってワイルドタイプSup-NMにも受け継がれることが分かった。そして、前年度までと今年度行ったオリゴマーとアミロイド構造の関係について論文にまとめ発表した。さらに本年度はオリゴマーの構造的解析をNMRを用いてさらに進めた。前年度までにSup-NMのNMRスペクトルが低温領域でのオリゴマー形成に伴って一部のピークが消失するなどの変化が見られることが分かっていたため、まずはモノマーSup-NMのNMRスペクトルの帰属を行い90%以上の残基を帰属することが出来た。そして、その帰属情報を用いてオリゴマー形成に伴うNMRスペクトルの変化を残基レベルで観察することができた。酵母プリオンSup35pは、温度の違いにより異なる構造を持つアミロイドを形成し、それらアミロイドは酵母に異なる表現型をもたらすことが知られている。この現象の機構解明のため、Sup35pのアミロイド形成前駆体について調べた。X線小角散乱及び分析用超遠心の測定から、アミロイド前駆状態ではモノマーとオリゴマーが平衡状態で存在し、低温ほどオリゴマーの比率が増すことを発見した。また、酵母に感染させたときの表現型はオリゴマー量と密接に関係しており、一定以上のオリゴマー存在下で形成されたアミロイドは、共通の表現型を示した。以前より、Sup35pのオリゴマーの存在の有無については議論の的であったが、そこに明白な答えをもたらす結果を得ることが出来た。次に、1アミノ酸置換Sup35pのオリゴマー量をX線小角散乱で測定することで、オリゴマー形成に重要な残基の特定を行った。結果、それはN末端から100残基程度の広範囲に分布しており、特にチロシン残基が重要であることが分かった。Sup35pのアミロイドではN末から40残基が重要であるという報告があり、その事からオリゴマーがアミロイドとは大きく異なる構造を持つことが分かる。さらに円二色性測定からはオリゴマーはモノマーの構造に近いことが示された。しかし、アミロイド特異的に結合する蛍光色素チオフラビンTと弱いながら結合することから、オリゴマーの一部にアミロイド様構造が含まれていると考えられる。さらに、Sup35pのオリゴマー形成を阻害もしくは促進する薬剤も発見しており、オリゴマーの有無による酵母の表現型の変化がより一般的に成立するということも分かった。また、この薬剤添加実験から、アミロイド構造と表現型に興味深い変化をもたらす薬剤も見つかっており、今後、より詳細なアミロイド形成機構解明へのアプローチの手助けとなると確信している。前年度の研究によって、酵母プリオンSup35NMドメイン(Sup-NM)はアミロイド形成前に温度依存的にオリゴマーを形成し、それがアミロイド構造を決定する重要な要因であることを明らかにした。今年度は更にオリゴマーの役割や構造について掘り進める研究を行った。まず、Sup-NMの詳細なアミロイド形成速度の測定では、オリゴマーの存在する低温領域では核形成に複数分子の衝突が必要であるが、オリゴマーの存在しない高温領域ではSup-NM一分子の構造変化により核形成がなされていることが示唆された。また、両者のアミロイドは核形成後にはモノマーの付加によって重合が進み、この段階になると周囲の温度の変化には全く影響を受けなかった。つまり核形成の条件が後のアミロイド構造や特性、さらには酵母の表現型を決定する最重要要因であるといえる。更に蛍光色素ピレンで修飾したSup-NMを用いて、オリゴマーのコアと成る部分の特定を行った。ピレン修飾部位が、分子間で10Å以下の距離に接近すると、ピレンダイマー(エクシマー)が形成され、特殊な蛍光が発せられる。このエクシマー蛍光はオリゴマーの存在する低温領域のみで観察でき、中でも80120番目の残基で最も高い値を示した。低温条件で出来るアミロイドは140番目の残基がコアになっていることが既に報告されており、オリゴマーはそれとは全く異なるコア領域を持っていることが示された。今年度の研究ではプリオン株や種の障壁の基盤となる多様凝集構造が出来る仕組みに迫ることが出来、今後の哺乳類のプリオン病やアミロイド病の理解の手助けとなる結果を得ることができた。また、多くのアミロイド病で問題視されているが、解析の進んでいないオリゴマー蛋白質の構造を一部解明出来たのは大きな前進であり、今後、より詳細な研究を進めていく。

本年度ではその研究を引き続いて行い、オリゴマーが直接のアミロイド形成の核とはならないことを単離したクロスリンクオリゴマーを用いて証明し、さらにオリゴマーがアミロイドの伸長には必要でないことをシーディング実験で明らかにしたことで、オリゴマーは凝集核形成の足場としての役割を持つことを示唆することができた。またオリゴマーを増減させる変異によって変化したアミロイドの構造がシーディングによってワイルドタイプSup-NMにも受け継がれることが分かった。そして、前年度までと今年度行ったオリゴマーとアミロイド構造の関係について論文にまとめ発表した。さらに本年度はオリゴマーの構造的解析をNMRを用いてさらに進めた。前年度までにSup-NMのNMRスペクトルが低温領域でのオリゴマー形成に伴って一部のピークが消失するなどの変化が見られることが分かっていたため、まずはモノマーSup-NMのNMRスペクトルの帰属を行い90%以上の残基を帰属することが出来た。そして、その帰属情報を用いてオリゴマー形成に伴うNMRスペクトルの変化を残基レベルで観察することができた。
植物内生放線菌を利用した耐病性植物の実用的作出技術の開発研究

本研究では、植物に内生する有用放線菌の探索を目的として、野外生育のシャクナゲ、カルミアからそれぞれ102菌株、90菌株の内生放線菌を分離した。シャクナゲ菌株のうち、Streptomyces galubusと同定されたR-5株でシャクナゲ組織培養苗を処理すると、苗に抵抗性が誘導され耐病性組織培養苗になることが明らかとなった。さらに、本菌株とは異なる未同定のR-52株が、組織培養苗の発根および支根の分裂を促進することを突き止めた。この性質は組織培養苗の活着を促進し、馴化効率を高める効果を期待できる。現在、両菌株を同時に組織培養苗に処理し、活着率が高く、しかも耐病性のシャクナゲ苗の作出を目指している。カルミア菌株のうちStreptomyces pandanusと同定されたAOK-30菌株を、組織培養苗が生育するフラスコに投入すると、同苗も耐病性になることを確認した。さらに、本菌株で処理した苗では、細胞浸透圧の上昇、細胞壁ヘミセルロース成分の増加、維管束周辺のリグニン化促進がおこり、結果的に苗が耐乾燥性がになることを実証した。馴化過程ではフラスコから取り出した組織培養苗をビニールトンネルなどの高湿状態で生育させるため、必然的に病害発生率が高くなるが、放線菌処理によって耐乾燥性となった苗は、通常のガラス室のベンチで馴化できることが明らかとなり、病害予防、省農薬、苗の徒長および軟弱化の防止に寄与する手法開発の目処がついた。
チオレドキシンペルオキシダーゼファミリーがマラリア原虫寄生適応に果たす役割の解明

チオレドキシンペルオキシダーゼファミリー(Prx)遺伝子を欠損するローデント(ネズミ)マラリア原虫の表現型を調べた。(1)肝臓型でのPrx発現について: qRT-PCRによる欠損原虫株でのmRNA相対定量から、肝臓型においてもPrx欠損による他Prx遺伝子の過剰発現(酸化ストレス応答)が示唆された。(2)肝臓型での発育障害について:培養細胞感染モデルを用いた解析から、2-Cys Prx遺伝子欠損原虫では、シゾントの小型化とメロゾイト数の減少が起きることが解った。(2)赤血球型の増殖障害について:マウス感染モデルを用いた解析から、1-Cys Prx遺伝子欠損原虫の赤血球型に増殖障害が観察された。(1)マラリア原虫肝内型における抗酸化酵素(1-Cys Prx、TPx-1およびTPx-2)の局在と発現プロファイルを野生株(WT)で観察した。Plasmodiumberghei感染蚊唾液腺から調整したスポロゾイトを、in vitroで培養したHepG2細胞へ接種した。接種後5時間後(5h)、17時間後(17h)、40時間後(40h)、50時間後(50h)に1-Cys Prx、TPx-1およびTPx-2の局在を各特異的抗体を用いて間接蛍光抗体法で観察した。また、各抗酸化酵素mRNA発現量をリアルタイムRT-PCRにて相対定量した。WTにおいて、TPx-1は細胞質に局在し、構成的な発現を示した。1-Cys Prxの発現も細胞質に局在し、その発現は40hから亢進し50hでピークとなった。一方TPx-2はミトコンドリアに局在し、その発現は17hから亢進し40hでピークとなった。(2)マラリア原虫蚊体内ステージにおける抗酸化酵素の発現プロファイルを野生株(WT)とPrx欠損株との間で比較した。Prx欠損株では幾つかの抗酸化酵素発現量がWTのそれと比較して有意に増加した。このことから、蚊体内発育型において酸化ストレス応答のメカニズムが存在することが示唆された。(3)過酸化水素反応分子プローブ(HyPer)のトランスジェニックP. bergheiANKA株を作製した。原虫各発育期で細胞内に派生する過酸化物の動態観察をおこなっている。1.ローデントマラリア原虫Plasmodium bergheiのチオレドキシンペルオキシダーゼー1(TPx-1)遺伝子欠損株について肝臓型での表現型を観察した。野生型株(WT)、TPx-1遺伝子欠損株(TPx-1 KO)スポロゾイトを、in vitroで培養したHepG2細胞へ接種して、5時間後、17時間後、40時間後および50時間後に、肝臓型原虫の発育状態を抗CSP(circumsporozoite protein)抗体と抗MSP (merozoite surface protein)-1抗体による蛍光染色で観察した。CSP抗体を用いた蛍光染色像から、TPx-1 KOでは肝臓型シゾント期以降で、原虫細胞の大きさがWTに比較して有意に小さいことが解った。また、MSP-1抗体を用いた蛍光染色像から、TPx-1 KOでもWTと同様にシソゴニーが進行するが、シゾント内に形成されるメロゾイトの数がWTと比較して有意に少ないことも解った。このことから、TPx-1 KOで観られた赤血球型出現の潜伏期遅延は、肝臓型シゾント期以降の発育障害によるメロゾイト数の減少によると考察された。2.1-Cys Prxを欠損するP. berghei(1-Cys Prx KO)について、赤血球型の表現型を観察した。1-Cys PrxKOおよびWT寄生赤血球をマウス腹腔内に接種し、その後の赤血球型原虫の増殖を観察した。WT原虫を接種したマウスの赤血球型原虫寄生率(PE)は接種後4日目で10%に到達し、その後も20%以上の高い値を継続した。WT原虫接種マウスは8割が死亡した。一方1-Cys Prx KO原虫接種マウスのPEは7日目まで1-5%にとどまり、その後20%に上昇するが、18日目には0.2%以下に低下した。同原虫接種マウスは全頭が生存した。形態的には、KO原虫で空胞を形成した原虫細胞が、WT原虫と比較して有意に多く認められた。1-Cys Prx KO原虫のPEが接種初期に低く抑えられる理由や、空胞形成の理由については、膜の過酸化脂質や細胞内の過酸化レベルを比較して、現在考察を進めているところである。