hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
モノクローナル抗体を用いた活性化血小板の検出

血小板活性化を検出する目的で下記の実験を行った。1方法(1)血小板の活性化:昭和60年度の研究実績報告に記した方法にてα-トロンビン(Pr Finfni寄贈)処理により血小板を活性化した。(2)活性化血小板に対するモノクローナル抗体の作成。上記活性化血小板をマウスに静注役、さらにもう一回、1週間後にブースターを静注した。これらマウスの脾のリンパ球を分離、これを用いて、モノクロープル抗体を作製した。しかし、作製抗体はいづれも、活性化血小板と明らかな反応をせず、今回の検討では、活性化血小板に対する抗体は得られなかった。
断層ガウジの岩石磁気学的・構造地質的研究

断層ガウジ試料の磁気的な性質から,断層についての新しい情報を得ることを目的として研究を行った.その主な結果は以下である.1)帯磁率異方性を測定するための最も優れた装置であるGISCO社製のKappbridge KLY-3Sをセットアップし,その信頼度を確かめ,帯磁率異方性を表現するパラメータとして何がもっとも有効かを検討した.その結果,Pj(異方性度)とT(楕円体形状)の2つのパラメータを用いることで,異方性を合理的にパラメタライズできることを確認した.2)愛知県瀬戸市の猿投山北断層(活断層)を横切る東白坂トレンチで試料を採取し,自然残留磁化と帯磁率異方性を測定した.自然残留磁化からは断層の活動時期を示す有効な情報は得られなかった.帯磁率異方性については,断層面に接して採取された試料と,離れた試料では明らかな差があることが示された.前者では,帯磁率異方性楕円体は鉛筆状であり,最大軸が断層の走向方向に平行,最小軸がそれに直交したガードル分布をしている.一方,後者では堆積構造と思われるピザ状の帯磁率異方性を示した.帯磁率異方性楕円体の最大軸が断層の走向方向に平行になるのは,断層の横ずれ成分が卓越するためなのか,あるいは垂直成分によって磁性粒子がロール状に配列したためなのか,今後より詳しい検討を必要とするが,断層運動の方向に制約を与える情報として使うことが可能と考えられる.3)三重県鈴鹿郡加太で比較的大規模な断層ガウジの試料を採取した.加太川断層(仮称)の詳細は不明だが,約1mの厚さの細粒物質からなるガウジから試料を採取した.帯磁率異方性楕円体の形状はピザ状であり,その面は断層面にも地層面にも近いが,完全に平行ではない.そのため,帯磁率異方性が断層運動に起因しているのかどうか確実には判断できなかった.本研究の目的は,断層ガウジなどの断層運動に関係した岩石の,主に磁気的な性質に着目して解析し,そこから過去に働いた応力を復元するための手がかりを得ることである.なかでも,2階のテンソルである磁化率の異方性に注目している.その理由は,非破壊で迅速測定できる可能性が高いからである.一方,磁化率は複雑な物理量であり,磁性鉱物の種類,それらの量と粉径分布,常磁性・反磁性粒子の磁化率,測定方法や測定温度などに大きく依存する.そのため,実際の測定にあたっては,対象とする岩石毎に上に述べたような条件を1つずつ検討していく必要があり,測定のルーチンを確立するのに多くの基礎実験を必要としている.今年度は,現在世界でもっとも高感度でかつもっとも扱い易いと評価されているSpinnerKappaBridge KLY-3Sを購入して設置し,その測定方法をマスターし,さらにこれまで20以上も提案されてきた磁化率異方性を表現するパラメータを実際に計算して評価してみることを行った.補正予算であったため,装置の設置ができたのは1月末であったが,感度,安定性ともに申し分なく性能を発揮できるような設置場所を見つけることに成功した.また,我々が使用している試料容器と座標系に合わせた測定のルーチンもほぼ確立できた.各種パラメータについては,目下その意味を1つ1つ理解しながら,測定データの処理に適応してみているところである.試料は,京都市左京区の花折れ断層,瀬戸市の猿投山北断層の2箇所で採取した.磁化率異方性測定に適した試料の採取方法を探すために,後者の猿投山北断層では,いわゆる断層ガウジだけでなく,基盤岩,被覆層からも広範に採取し測定を行っているところである.断層ガウジ試料の磁気的な性質から,断層についての新しい情報を得ることを目的として研究を行った.その主な結果は以下である.1)帯磁率異方性を測定するための最も優れた装置であるGISCO社製のKappbridge KLY-3Sをセットアップし,その信頼度を確かめ,帯磁率異方性を表現するパラメータとして何がもっとも有効かを検討した.その結果,Pj(異方性度)とT(楕円体形状)の2つのパラメータを用いることで,異方性を合理的にパラメタライズできることを確認した.2)愛知県瀬戸市の猿投山北断層(活断層)を横切る東白坂トレンチで試料を採取し,自然残留磁化と帯磁率異方性を測定した.自然残留磁化からは断層の活動時期を示す有効な情報は得られなかった.帯磁率異方性については,断層面に接して採取された試料と,離れた試料では明らかな差があることが示された.前者では,帯磁率異方性楕円体は鉛筆状であり,最大軸が断層の走向方向に平行,最小軸がそれに直交したガードル分布をしている.一方,後者では堆積構造と思われるピザ状の帯磁率異方性を示した.帯磁率異方性楕円体の最大軸が断層の走向方向に平行になるのは,断層の横ずれ成分が卓越するためなのか,あるいは垂直成分によって磁性粒子がロール状に配列したためなのか,今後より詳しい検討を必要とするが,断層運動の方向に制約を与える情報として使うことが可能と考えられる.3)三重県鈴鹿郡加太で比較的大規模な断層ガウジの試料を採取した.

加太川断層(仮称)の詳細は不明だが,約1mの厚さの細粒物質からなるガウジから試料を採取した.帯磁率異方性楕円体の形状はピザ状であり,その面は断層面にも地層面にも近いが,完全に平行ではない.そのため,帯磁率異方性が断層運動に起因しているのかどうか確実には判断できなかった.この研究の目的は,断層ガウジの磁気的性質から,その断層の起こした変位や働いた応力方向を推定することである.特に通常の地質学的方法では,断層面を露出させて詳細な調査を行うことが困難な,新しい時代の地層やボーリングコアなどに将来は適応させるための基礎的な研究と位置付けている.平成8年度末にSpinner KappaBridge KLY-3Sを購入できたので,それ以降KLY-3Sの性能を見極めるためのさまざまテストと各種パラメータの意味を厳密に解釈することと,いくつかの典型的断層ガウジ試料の測定を続けている.愛知県瀬戸市の猿投山北断層の東白坂トレンチで200個の試料を得ることができたので,断層面からの距離,岩相の違いなどに注意しながら,KLY-3Sによる初磁化率異方性以外にも様々な岩石磁気学的なパラメータの測定をおこなった.この断層は砂礫層を主体とするため,残留磁化からは断層と関係がありそうなパラメータは得られなかった.初磁化率異方性はKmaxは地層面内に,Kminは地層面に垂直であり,それぞれ変形を忠実に表現していると考えられた(H9年秋,地球電磁気・地球惑星圏学会で発表).さらに変形の強い断層ガウジ試料を得るため,三重県鈴鹿山地山麓の加太層の断層露頭から試料を多数採取した.この試料についての実験は目下進行中であるが,予察的な結果としては,ガウジに浸透する水などによる化学変化の影響が大きく,期待するような情報が得られない可能性がある.変位の方向についての確実な情報があり,あまり風化しておらず,さらにできればシルトサイズの断層ガウジを見つけるのが予想していたより困難で,典型的なデータをまだそろえることができていない.しかし,試料の採取方法,測定のノウハウ,最も効率的な解析の方法などの基礎的な情報は十分に得ることができたので,引き続き様々の試料について適応していく計画である.
子宮頸癌の新たなバイオマーカーの検索ー測定系の確立と分子標的治 療への応用ー

子宮頸部扁平上皮癌組織で増加する蛋白であるHSP70に着目し研究を行った。(1)HSP70の蛋白発現は6種類の子宮頸癌細胞株全てで増加していた。(2) HSP70発現を抑制すると、抑制遊走能および浸潤能は有意に抑制され、また、シスプラチンによるアポトーシスの誘導は増加した。子宮頸癌におけるHSP70の発現抑制は癌の増殖、浸潤・転移に抑制的に作用するだけでなく、抗癌剤の作用を増強させることが示された。子宮頸部扁平上皮癌組織で増加する蛋白であるHSP70に着目し、研究を行った。(1)多数の臨床検体でHSP70の発現を確認するために、組織抽出液を用いた蛋白発現の検討で、HSP70の発現は癌で10例中8例、正常組織で10例中3例に比して高頻度であった。(2)細胞株では6種類の子宮頸癌細胞株では全てHSP70の発現は増加していた。(3)そのうちSiHa、SKGIIにsiRNAを導入しHSP70発現抑制株を作成した。1HSP70の発現抑制により増殖能は有意に抑制され、細胞周期はG2/M期に停止が認められた。なお、アポトーシスには有意差を認めなかった。2HSP70の発現抑制により遊走能は有意に抑制された。3HSP70の発現抑制により浸潤能は有意に抑制された。4HSP70の発現抑制によりシスプラチン添加で誘導されたアポトーシス細胞の割合は有意に増加した。まとめると、HSP70は初期子宮頸癌でも発現の増強が認められ、またHSP70の発現を抑制することにより、癌の増殖、浸潤・転移を抑制するだけでなく、シスプラチンのアポトーシス誘導作用を増強させることが示された。このことからHSP70は子宮頸部扁平上皮癌の分子マーカーになり得る可能性が示唆され、その発現抑制は従来の治療に加えた新規の癌分子標的治療としての抗腫瘍作用の増強が期待できると考えられた。扁平上皮癌で明らかに増加する蛋白として我々が同定した、Transgelin, Protein disufide-isomerase(PDI), HSP70, HSP27のうち、まずはHSP70に着目し、機能解析を行った。【方法】ヒト子宮頸癌細胞株( BOKU、ME-180、SiHa、SKG l、SKG ll、SKG llla )においてHSP70の発現をWestern blottingで確認した。SiHa、SKG llにおいてsiRNA法によりHSP70の発現を抑制したうえで、以下の具体的な機能について解析した。1.増殖能および細胞周期、アポトーシス、2.遊走能、3.浸潤能について検討した。さらにCDDP添加によるストレス下でのHSP70の役割を検討する目的で、4.アポトーシス細胞の割合を検討した。【成績】正常細胞であるケラチノサイトと比較し、すべての子宮頸癌細胞株でHSP70の発現は増加していた。機能解析の結果は、1. HSP70の発現抑制により増殖能は有意に抑制され、細胞周期はG2/M期に停止が認められた。2, 3. HSP70の発現抑制により遊走能および浸潤能は有意に抑制された。4. HSP70の発現抑制によりCDDP添加で誘導されたアポトーシス細胞の割合は有意に増加した。【結論】子宮頸癌におけるHSP70の発現抑制は癌の増殖、浸潤・転移に抑制的に作用するだけでなく、抗癌剤の作用を増強させることが示された。HSP70の発現抑制は従来の治療に加えた新規の癌分子標的治療としての抗腫瘍作用の増強が期待できると考えられた。HSP70の機能として子宮頸部扁平上皮癌細胞の遊走能や浸潤能が更新することは分かったが、その機序を解明するために、遊走、浸潤の重要な因子であるE-adherinあるいはMMPなどの分子に注目し、その変化を観察したが有意な結果は得られず、条件設定なども含めて時間を費やし、計画が順調に進まなかった主な要因である。子宮頸癌におけるHSP70蛋白の発現を調査し、予後との関連性を検討する。多数症例の病理組織標本を用いて、免疫組織学的染色を行い、細胞内局在と発現強度をもとにした染色パターンの決定とその発現態度を解析し、分類する。この発現パターン分類をもとにして骨盤リンパ節への転移や予後(無進行生存・全生存)との関連性について統計学的に解析する。さらに特に前癌状態である異形成から上皮内癌、浸潤癌と病変が連続性に病変が進行していることが明らかである標本を選択し、どの段階からHSP70発現が増加するか調べ、早期診断をするためのマーカーとなりうるか検討する。

上記の検討により、HSP70が癌発生初期のマーカーとなりうる可能性と、実際に予後との関連が見いだせれば、臨床応用を目指して、血液を利用したより簡易な測定系の確立を目指す。血液中のHSP70の発現の有無、量は不明であるために、予備実験として培養細胞の上清におけるHSP70の発現の有無、量を実験する。1. HSP70に特異的な抗体(市販されている)をマイクロプレート上にコートする。2. ELISAあるいはEIAの測定系によって血液中の目的蛋白量を測定する。また今年度の追加としてHSP70の癌細胞の浸潤転移に関わるメカニズムの解明を行う。HSPの培養細胞の実験が順調に行かず、多数症例での免疫組織染色実験が未施行であり、それに伴う抗体など購入していないことが未使用額が生じた理由である。今年度は免疫組織染色を施行予定であり、組織スライドの作成と抗体購入に費用がかかる。また今年度の追加としてHSP70の癌細胞の浸潤転移にメカニズムの解明のために、細胞培養関連試薬(培養液、血清、抗生剤、培養プレート、ピペット等)が必要となる。さらにはELISA、EIA免疫測定系確立のため抗体、プレートが主な物品費となると思われる。また研究成果を国際学会で発表する予定であるので、渡航費が必要となる。
高等植物における生殖機構の細胞・分子生物学的解析

高等植物の生殖機構について我が国及び諸外国における基礎及び応用研究の現状と動向を細胞・分子生物学的側面を中心に調査・検討した。その結果、生殖機構を(a)生殖生長への転換機構、(b)配偶子の分化制御、(c)受精及び胚の発生機構、(d)生殖過程における外来遺伝子の伝達に大別することができ、その各々において最近新たな展開が見られつつあることが判明した。生殖生長への転換においては、花芽分化誘導直後新たに出現するRNAや蛋白質が同定され、分子生物学的解析の基礎ができつつある。また、花芽分化や花芽の発達に関与する突然変異株の作出やそのような遺伝子の染色体上での位置等も同定されつつある。さらに、花芽分化を調節すると考えられる物質の同定も進められており、花成ホルモン研究は新たな段階に入りつつある。配偶子の分化制御については、雄性配偶子分化時に見られる減数分裂機構に関わる蛋白質が単離され、遺伝子の単離も行われており、その機能解明が待たれる。また、雄性不稔現象についても、その主原因がミトコンドリアにおける遺伝子の構造変化にあることが各種植物で明らかにされつつある。受精及び胚発生については、さまざまな研究が進められている。試験管内受精や胚・胚珠培養による新品種の育成は様々な植物で行われており、既に実用品種も作成されているが、雑種胚致死の原因については不明な点も多く、今後の発展のためにはさらに広範な研究が必要である。また、胚発生については試験管内で見られる不定胚形成を中心に解析が進められており、胚発生時に出現する蛋白質の同定や遺伝子の単離も行われている。しかし、体細胞が不定胚形成能を有する細胞へと変化する過程については研究が進められておらず、この点の解析が待たれる。トランスジェニック植物を用いた外来遺伝子の安定性に関する研究は未だ小規模なものであり、育種を前提とした大規模な実験が待たれる。
国際製品規格への対応と企業構造の変化―費用構造・生産性・マークアップへの影響

H30年度は、昨年度に引き続き、食品の安全性向上を目的とする残留農薬基準(Maximum Residue Limit, MRL)の影響の分析を行った。具体的には、昨年度行っていたBerry et al. (1995)に始まる離散選択モデルによる需要関数の推定をさらに精緻化させた。当該手法により、MRLの変化がどのように影響するのか、平均的な効果だけでなくその分布まで推定し、より現実的な需要の価格・MRL弾力性を求めることができた。これを用いて、近年の規制強化政策の評価を行うべく、当初予定していたマークアップではなく、MRLが変化した場合の政策シミュレーションを行った。以上を加えて、研究期間全体としては、製造業および農産業における具体的な国際製品規格および規制について、その影響を明らかにすることができた。RoHS指令およびREACH規則により、サプライチェーンで繋がっている企業は有意に費用を高めてしまう。一方で、対応ができた企業は規制を行っているEUに対する輸出を拡大することができ、需要拡大も果たせている。同様の影響が、食肉貿易における各国のMRLの影響を見た分析でも確認できている。さらに、上記の需要関数の推定により、需要の価格弾力性およびMRL弾力性を精緻に計測することが可能となった。これら国際製品規格や規制は、非関税障壁として日本および他国経済へ無視できない影響を与える。費用の上昇と需要の拡大という相反する影響を持っているところが政策評価の難しいところであるが、それらを切り分けて検証を行った点が、本研究の重要な点である。H28年度は、以降の研究の土台となる基礎調査として、関連文献の調査と、需要側から見た非関税障壁の影響分析を行った。1生産性測定についての関連文献の調査:今後行う必要があるのは、企業レベルの生産性の測定と、需要構造を分析する構造推定モデルの推定である。そこでH28年度は、生産性測定についての近年の研究の調査を行った。広く用いられているOlley and Pakes(1996)やLevinsohn and Petrin(2003)に加え、その発展形であるAckerberg et al.(2015)、それらの活用状況などを把握することができた。また、包絡分析法(DEA)や確率的フロンティアモデルなど、データの制約がある場合の対処としてモデル推定に頼らない他の手法の調査も進めた。2簡易的な手法による需要構造分析:Berry et al.(1995)に始まる構造推定アプローチは、需要構造の推定からマークアップ率などを計算するものである。H28年度はその前段階として、簡易的な手法により需要構造を把握するべく、Almost Ideal Demand System(AIDS)モデルを用いて複数財・市場・政策を対象に分析を行った。具体的には、これまでの研究で扱った鶏肉市場、生鮮野菜・果物市場の例としてオレンジ市場について分析を行い、他にもスマートフォン市場などの製造業のデータ整備を進めている。引き続き、AIDSモデルを用いて複数市場で構造を確認しながら対象とする市場を見極め、より柔軟な形で分析可能なBerry et al.(1995)タイプの推定に進む予定である。概ね順調に進展している。他研究者と共に分担で様々な市場に注目することで、多くの市場の特性や政策を調査することができた。H29年度は、非関税障壁の影響分析をより具体化・精緻化させて研究を進めた。対象とする国際製品規格は、環境保護を目的とした有害物質の含有規制であるRoHS指令と、食品の安全性向上を目的とする残留農薬基準の2つとした。RoHS指令については、併せて施行されたREACH規則とまとめて、費用構造と輸出行動への影響を分析し、その精緻化を行った。この成果については、同じ規制について複数の研究者が分析したのものをまとめた書籍として、当該年度に出版されている。RoHS指令については上記で一定の成果を収めたとして、当該年度は主に残留農薬基準(Maximum Residue Limit, MRL)の影響の分析を行った。昨年度までは、需要構造分析にAlmost Ideal Demand System(AIDS)モデルを用いていたが、対象品・国数に制約があり、信頼に足る結果を得ることができなかった。そこで当該年度は、当初予定されていた通り、Berry et al. (1995)に始まる離散選択モデルによる需要関数の推定に着手した。以前AIDSモデルで行っていた鶏肉市場について、国産・原産国別輸入鶏肉に細分化し、その価格やMRLの変動が需要に与える影響について、非常に柔軟かつ信頼性の高い形で推定を行うことができた。MRLの影響については、当初予定していた企業ミクロデータの入手が困難である(海外農家が対象となる)ため、当初予定を変更して、このまま集計レベルでのデータを用いて分析を行う。Berry et al. (1995)の手法は集計レベルデータから構造パラメータを推定することができる手法ではあるが、この点についてはそれに連なる研究手法を取り入れ、さらに精緻化していく予定である。当初は費用構造、生産性、(需要構造に基づく)マークアップ率への影響を見ることを想定していた。費用構造については昨年度と今年度に一定の成果をまとめている。同時に、需要構造の分析を行っていたが、データ構築や計量分析の実施に時間と労力がかかることと、海外農家のミクロレベルデータが入手不可能であることから、生産性の測定と影響分析については別の機会に回し、需要構造への影響に集中した。その結果、この点については当初予定よりも進捗しており、H30年度に予定していた、構造パラメータを分布状のものとして計算するモデルまで取り掛かることができている。

以上より、総合して概ね順調に進展していると判断する。H30年度は、昨年度に引き続き、食品の安全性向上を目的とする残留農薬基準(Maximum Residue Limit, MRL)の影響の分析を行った。具体的には、昨年度行っていたBerry et al. (1995)に始まる離散選択モデルによる需要関数の推定をさらに精緻化させた。当該手法により、MRLの変化がどのように影響するのか、平均的な効果だけでなくその分布まで推定し、より現実的な需要の価格・MRL弾力性を求めることができた。これを用いて、近年の規制強化政策の評価を行うべく、当初予定していたマークアップではなく、MRLが変化した場合の政策シミュレーションを行った。以上を加えて、研究期間全体としては、製造業および農産業における具体的な国際製品規格および規制について、その影響を明らかにすることができた。RoHS指令およびREACH規則により、サプライチェーンで繋がっている企業は有意に費用を高めてしまう。一方で、対応ができた企業は規制を行っているEUに対する輸出を拡大することができ、需要拡大も果たせている。同様の影響が、食肉貿易における各国のMRLの影響を見た分析でも確認できている。さらに、上記の需要関数の推定により、需要の価格弾力性およびMRL弾力性を精緻に計測することが可能となった。これら国際製品規格や規制は、非関税障壁として日本および他国経済へ無視できない影響を与える。費用の上昇と需要の拡大という相反する影響を持っているところが政策評価の難しいところであるが、それらを切り分けて検証を行った点が、本研究の重要な点である。本研究課題の課題として、貿易データを集計データとして用いる際の欠損値の問題がある。AIDSモデルも離散選択モデルも、需要をシェアとして捉え、価格による影響を分析するが、貿易データの場合は貿易実績のない月があり、その場合の価格の扱いに注意が必要である。一部の先行研究では前後のデータから補間を行うなどの処理をしているが、その是非やそれが不可能な場合の対処などを今後検討する必要がある。必要に応じて、トービットモデルのような形で貿易実績なしのサンプルを考慮する可能性もあるため、推定モデルの調査も併せて行う予定である。需要構造の精緻化と共に、その構造パラメータから供給側のマークアップ率の計算を行う必要がある。この点についてはある程度研究手法が確立されているが、想定する市場構造や、事前の需要構造の推定結果に左右されるため、この点を中心に今後進めていく予定である。また、昨年度までのAIDSモデルでも同様に存在していた、貿易実績のない月の欠損値の問題は依然として存在している。現時点では価格を別のデータから補間して分析しているが、サンプルセレクションモデルやトービットモデルのようなモデル側での対処方法の検討も含めて、引き続き調査を進めていく。熊本地震発生により、当初計画よりも物品費の支出が多く、旅費の支出が少なくなった。
歯の形成萌出に伴う感覚入力系の発育変化:免疫組織化学的研究

歯根膜は歯の支持固定装置として機能するのみならず、咀嚼の神経性調節に重要な役割を演じている。本研究では、哺乳動物が生後、吸啜から咀嚼へと機能変換を遂げる過程における、歯根膜神経支配の発育変化を明らかにする目的で、ラット切歯歯根膜に多数存在するルフィニ神経終末の生後発育について、PGP9.5(protein gene product 9.5)抗血清を用いた免疫組織化学にて検索した。動物は、生後1、4、および切歯萌出期(9日前後)、切歯咬合開始期(15日)、第一臼歯咬合期(25日)、機能咬合期(60日)のWistar系ラット上顎切歯部を用い、4%パラホルムアルデヒドにて灌流固定後、EDTAにて脱灰、厚さ20mumの矢状断凍結切片を作成した。免疫染色は抗ヒトPGP9.5抗体を用いてABC法にて行い、光学顕微鏡にて舌側歯根膜の観察を行った。PGPの免疫染色により、神経分布および神経終末の形態変化を詳細に観察することができた。PGP陽性神経は、生後1日ですでに舌側歯根膜相当部に観察されたが、その分布密度は低く、散在性で、明瞭な終末形成は認められなかった。生後4日になると舌側歯根膜にはalveolus-related part(AR)とtooth-related part(TR)の2層が明確に区別されるようになり、PGP陽性神経は成熟ラット同様、ARの領域に限局して認められた。また、その分布密度は増加し、一部で樹枝状の分枝が開始されており、中には末端が球状に膨隆した部分も観察された。さらに、樹枝状分枝の末端が棍棒状あるいは釣鐘状に膨隆した、ルフィニ神経終末様の形態は切歯萌出期になって始めて観察された。切歯咬合開始期では、典型的なルフィニ神経終末が急激に増加しつつあり、上下の第一臼歯が咬合を開始すると成熟ラット歯根膜と同様の分布密度、形態を呈するようになっていた。以上より、ルフィニ神経終末の最終分化には、歯の萌出・咬合による機能刺激が密接に関わっている可能性が示唆された。
半導体ナノ粒子複合構造における多励起子状態とエネルギー移動過程の研究

CdSナノ粒子とCdTeナノ粒子が単一界面で接合しているCdS/CdTeヘテロダイマーナノ粒子の超高速キャリアダイナミクスを研究した。この構造は伝導帯の底をCdS部に、価電子帯の頂上をCdTe部に持つType-II量子構造であり、光励起された励起子を電子と正孔とに空間的に分離できると予想される。このType-II構造における電荷分離状態は、非輻射オージェ再結合を抑制し光学利得の閾値を低減するなど、多励起子状態において新たな機能性を生じさせることが期待できる。特に実験で用いたヘテロダイマーナノ粒子は中心対称性の破れた特徴的な形状を持つため、非常に高効率な励起子の電荷分離が可能であると考えられ、Type-II構造における新たな多励起子現象を探索するのに適した構造である。この構造における電荷分離を確認するために、既存の単一波長でのみ測定可能であったポンプ・プローブ測定系をプローブ波長を掃引しながら自動測定できるように改良し、過渡吸収スペクトルを測定した。その結果、CdSよりもバンドギャップエネルギーの小さなCdTe部のみを選択的に励起した場合においても、CdS電子準位を光キャリアが占有したことによるブリーチング信号を観測することができた。また、CdTe電子準位のポピュレーションの減少と同期してCdS電子準位のポピュレーションが増加しており、これらの結果からCdTeからCdSへ約400fsで電荷移動することを明らかにした。さらには、多励起子状態においては電荷移動が促進されていることを観測した。過渡吸収ダイナミクスの励起強度依存性を詳細に分析した結果、多励起子状態においてはCdTeの高エネルギーの電子準位から緩和を経ずに直接電荷移動する過程が新たに生じることがわかった。本研究の結果は、ナノ粒子中に閉じ込められた電子間の衝突によって効率的な電荷分離が可能であることを示唆しており、多励起子を利用することによって光電変換効率を劇的に向上させる可能性を提示する応用上も重要な結果である。半導体ナノ粒子複合構造における多励起子状態のダイナミクスを、ポンプ・プローブ過渡吸収分光法と時間分解発光スペクトル分光法により研究した。既存の測定系を拡張し、可視から近赤外までの広い波長域において過渡吸収スペクトルを測定する実験系を構築し、研究に用いた。磁性イオンとしてMn^<2+>イオンをドープしたCdSナノ粒子において、励起子-磁性イオン間の相互作用に起因するMn^<2+>イオンへのエネルギー移動時間を調べた。そして多励起子状態のオージェ再結合とエネルギー移動とが共存する場合のキャリアダイナミクスを解明した。Mn^<2+>イオン濃度の異なる試料について比較することで、電子正孔対の支配的な再結合過程はキャリア密度に依存しており、低密度においてはMn^<2+>イオンへのエネルギー移動が、高密度においてはオージェ再結合が支配的になることを発見した。さらにこの結果に基づき、Mn^<2+>イオンからの発光強度の励起光強度依存性がオージェ再結合とエネルギー移動との単純な競合によって決定されていることを明らかにした。高効率な発光材料として期待されている発光中心ドープした半導体ナノ粒子においても、多励起子状態のダイナミクスが発光効率を決定する重要な要因であることを示した。さらに、十分にエネルギー移動速度が速い試料においてはオージェ再結合を抑制できる可能性があることを示した。また外部環境としての磁性ナノ粒子が半導体ナノ粒子の光学特性に与える影響を研究するために、半導体/強磁性体ナノ粒子複合薄膜を作製した。Ar/H_2ガス雰囲気中でアニーリングすることにより、粒子間相互作用を増強することに成功した。長さの異なるCdSeのナノロッドにおけるオージェ再結合速度を測定し、粒子表面の与える影響を研究した。オージェ再結合確率は、発光減衰寿命から見積もった正孔の表面欠陥準位へのトラップ確率と明確な比例関係にあることを見出した。

また、CdTe電子準位のポピュレーションの減少と同期してCdS電子準位のポピュレーションが増加しており、これらの結果からCdTeからCdSへ約400fsで電荷移動することを明らかにした。さらには、多励起子状態においては電荷移動が促進されていることを観測した。過渡吸収ダイナミクスの励起強度依存性を詳細に分析した結果、多励起子状態においてはCdTeの高エネルギーの電子準位から緩和を経ずに直接電荷移動する過程が新たに生じることがわかった。本研究の結果は、ナノ粒子中に閉じ込められた電子間の衝突によって効率的な電荷分離が可能であることを示唆しており、多励起子を利用することによって光電変換効率を劇的に向上させる可能性を提示する応用上も重要な結果である。
癌免疫療法に用いる治療用細胞のリアルタイム抗腫瘍活性評価システムの開発

活性化リンパ球では、random migration速度が、活性化前リンパ球より有意に亢進し、これが癌細胞障害活性に関与する可能性が見出された。phosphorylatedFTY720 (FTYP)を添加すると、活性化リンパ球のrandommigrtaion速度が有意に抑制され、それに伴い、癌細胞障害活性も有意に低下することが分かった。さらに免疫不全マウスを用いて、FTYP投与による腫瘍増殖抑制効果を確認した。これらの結果より、活性化リンパ球のrandom migration速度が癌細胞傷害活性のbiomarkerになることが示唆された。研究の目的は、細胞・免疫療法の標準化を目指して、ベッドサイドにおいて治療用細胞の抗腫瘍活性をリアルタイムに定量的に評価するシステムを開発することである。平成25年度の計画(定量的リアルタイム抗腫瘍活性評価カルテの症例への応用)に沿い、研究結果の概要を記載する。1)リンパ球機能評価システムの検証:患者末梢血単核球より誘導した細胞療法に使用する活性化リンパ球のmigration能力を従来の3マイクロメートルのフィルターを通過させ通過した細胞数を計測する方法と、リアルタイムにタイムラプス撮影を行い、migrationの速度を計測する方法の2通りで解析し、両者で殆ど同等の結果が得られることを確認し、リアルタイムのタイムラプス撮影によるリンパ球機能評価システムの妥当性を確認した。2)経時的リアルタイム抗腫瘍活性評価システムの検証:さらに、膵臓癌細胞を標的としたリンパ球の細胞障害活性を検討する実験では、WST-8を用いた従来の計測法と標的癌細胞を蛍光標識し、細胞障害活性を蛍光強度の減弱で評価するタイムラプス撮影による計測法とで、同等の結果が得られることを確認した。本実験の中で、活性化リンパ球に発現するsphingosine-1 phosphate receptor-1がrandom migration能に関与しており、アンタゴ二ストの投与によりrandom migration能が低下し、細胞障害活性が低下すること、即ち、活性化リンパ球のrandom migration能と細胞障害活性が相関する可能性を見出した。平成24年度の計画(治療用細胞の定量的リアルタイム抗腫瘍活性システムの確立)に沿って研究成果の概要を記載する。1)リンパ球機能評価システム作成:腫瘍細胞あるいはリンパ球を蛍光標識し、24時間撮影可能な蛍光顕微鏡に接続し、個々の細胞の運動能および傷害を径時的・定量的に測定するシステムを開発した。さらに、実際に、この動画のDVDを作成し、患者説明用資料(リアルタイムカルテ)として配布した。2)樹状細胞機能評価システム作成:上記と同様のシステムを用いて、樹状細胞のCTL誘導能を測定し、実際の治療患者の説明に利用するシステムを開発した。3)併用抗がん剤選択システム:上記システムを用いて、抗がん剤の選択および投与時期の決定に応用した。4)マウスによる検証:上述のように、マウスではなくインフォームドコンセント取得患者に対し、システムの解析結果を治療説明に使用し、治療の指針として利用した。臨床的な意義については今後の解析結果を待つ必要がある。本研究の中で、活性化リンパ球では、random migration速度が、活性化前リンパ球より有意に亢進し、これが癌細胞障害活性に関与する可能性が見出された。また、Random migration速度を制御する受容体であるSphingosine-1-phosphate receptor 1を阻害する因子phosphorylated FTY720 (FTYP)を添加すると、活性化リンパ球のrandom migrtaion速度が有意に抑制され、それに伴い、癌細胞障害活性も有意に低下することが分かった。現在、活性化リンパ球のrandom migration速度と、治療効果および患者予後との連関を解析中である(論文作成中)。腫瘍免疫学上述の通り、25年度は計画していた1)リンパ球機能評価システムの検証、および2)経時的リアルタイム抗腫瘍活性評価システムの検証、を行い、活性化リンパ球のrandom migration能と細胞障害活性が相関する可能性を見出すなど、「治療用細胞の定量的リアルタイム抗腫瘍活性評価カルテ作成」を実現するために有望な結果が得られた。研究実績の概要で記述したように、24年度の計画案は全て基本的には遂行できた。特に、24年度に開発した「治療用細胞の定量的リアルタイム抗腫瘍活性システム」を用いて、25年度に計画していた定量的リアルタイム抗腫瘍活性システムの症例への応用を前倒しで実行した。これにより、患者と共に動画を見ながら治療説明および治療法を選択する医師・患者共用の次世代のカルテ(リアルタイムカルテ)開発の可能性が示された。このシステムは、実際の治療法選択決定に有効であることを示す症例に遭遇した(論文作成中)。すなわち、26年度計画の一端を検証することができた。

26年度は、活性化リンパ球のrandom migration能と細胞障害活性との相関をマウスを用いた治療実験で確認すること、および、治療中の患者リンパ球(胸腹水、原発巣、転移巣より)を回収し、定量的リアルタイム抗腫瘍活性能評価法を用いて、臨床結果(腫瘍縮小、病勢コントロール、生存期間)との関連解析を実施する。上述のように、24年度中に25年度の計画の一部を前倒しで遂行することが可能となった。したがって、25年度は、124年度に開発した治療用細胞の定量的リアルタイム抗腫瘍活性システムの改良、および、動物での検証、225年度計画である本システムの患者治療への導入(治療説明、治療法決定)に焦点を当てて研究を進める。3加えて、当初の計画案にはなかった本システムの研究領域への応用(新規治療法開発、治療メカニズム解析)の可能性(ベッドサイド研究室)を検証する。さらに、426年度計画である本システムの臨床的意義の検証のための準備を整える。25年度は、マウスを用いた治療実験まで行う予定であったが、時間的制約のため、実施出来なかったため、この実験に必要な研究費を26年度に繰り越した。研究実績に記載したように、24年度中に本システムを用い動画を見ながら患者へのリアルタイムの治療経過説明が可能となった。したがって、本システムにより撮影された動画のDVDを作成し、患者へ提供するための費用として24年度費用の一部を25年度へ繰り越すことにした。
MEMS-CMOSイメージセンサ技術による非標識マルチモーダルバイオセンサ

本研究ではCMOSイメージセンサの各画素上に集積化したMEMSファブリペロー干渉計を用いて、タンパク質をはじめとする生体分子同士にはたらく分子間力をとらえることにより、標識を用いずに分子を検出し、さらに吸着分子の構造変化を捉えることが可能なマルチモーダルセンサの開発を行った。その成果として、従来よりも22倍ストレス感度が高い分子間力センサと100倍高感度なMEMS質量センサの作製に成功した。生体分子に働く分子間力と質量の同時検出を目的に、H26年度は分子間力を検出する光干渉型表面応力センサと、質量を定量するMEMS共振器の各要素技術を個別に開発を進めた。光干渉型センサは分子を吸着する可動膜上にハーフミラーとして銀を30 nm成膜することにより波長選択性を向上させ、分子間力の信号伝達効率にあたる透過スペクトルの勾配を4倍に向上させた。また、フォトダイオードを作製する基板濃度とn-wellの不純物濃度を調整して分光感度を3倍に向上することができた。このセンサ上に牛血清アルブミン抗体(anti-BSA)0.01 mg/mLを380 pL (3.8 pg)を滴下したところ、センサの中央付近が上に凸形に49.7 nm変化したことが観察された。したがって、サブピコグラムのタンパク質を検出できる能力があることが示唆された。また、タンパク質の液中でのセンシングのため、センサ上にマイクロ流路を一体化した。生理食塩水の送液中は一定電流が観測されたのに対し、anti-BSAを送液すると約250 secで6 nAの光電流変化の検出を確認した。圧力変化と逆方向の電流応答が取得できたことから、分子吸着に起因した光電流変化と考えられる。次に、吸着分子の質量の同時検出を達成するため、光干渉センサと構造的な干渉を起こさないよう、リング型PZT電極によるMEMS共振センサの試作を行った。レーザードップラ振動計を使用して共振振動を測定した結果より、共振周波数は536 kHz, Q値は108であった。さらに共振器のインピーダンス測定を行い、直列共振点が機械共振と一致する点に観測され、電気的に分子の質量検出が可能であることが示された。質量感度評価のため、ダイフラム上に10 pgのPt原子を堆積したときに、2 kHzの周波数シフトが測定され、質量感度5.22fg/Hzが得られた。光干渉型表面応力センサにおけるストレス感度向上を目指し、光干渉計の可動膜にエラストマ材料を適用することを検討した。エラストマ材の自立膜を形成し、ひずみ試験を行ったところ、38%以上の弾性変形領域を持つことが示され、この結果は論文投稿準備中である。また、プロトタイプに用いていたパリレンCに比べ100分の1のヤング率を示すエラストマシートを本センサへ適用すると、有限要素法を用いた解析より10倍程度のセンサ感度向上が期待できる。次に、生体分子に働く分子間力と質量の同時検出を目的に、交流信号の印加によって共振振動可能なグラフェンの自立構造を作製した。振動膜が薄膜かつ高いヤング率であるほど質量感度が向上するため、グラフェンは共振子として理想的な材料であると期待される。作製した自立構造を有するグラフェンは、キャビティ長1050 nm、キャビティ直径は最大8.5 umまでのサイズを実現した。この架橋グラフェン膜と基板とのギャップ間で光干渉特性が得られ、干渉波形は解析的なフィッティング波形と良い一致を示した。この架橋グラフェン上へπ結合を利用した架橋剤を介してアルブミン抗体を修飾させた時、キャビティの気密性は保持されていることを確認するとともに、干渉波形のシフトからギャップが200 nm増加していることを示唆する結果が得られた。これより架橋グラフェン上でのバイオセンシングの可能性を示すことができた。提案するセンサでは、分子の構造変化によるストレス変化を検出することが可能なため、カルシウムイオンの吸収に対して構造が変化するカルモジュリンをモデル生体分子として使用した。架橋剤同士の水素結合を防ぐためにトリフルオロ酢酸を添加して単分子層を形成し、その後カルモジュリンを修飾した結果、分子同士の凝集を防いでダイヤフラム上に分子層を形成できたことを確認した。MEMSセンサ上に吸着した分子の分子間力と質量を計測するセンサとして、光干渉計のストレス感度を向上する見通しを得ることができた。また、質量センサとしてはグラフェンの自立構造の形成に成功し、高感度に質量計測が可能なセンサの見通しが得られた。グラフェンの自立膜上には架橋剤を介して、タンパク質を吸着させたときの応答変化が確認できたため、次年度に生体分子計測を進めることができる。また、タンパク質の構造変化を観察するモデル分子としてカルモジュリンに着目し、ダイヤフラム上での修飾が確認できたことから、実際に生体分子の分子間力変化と質量測定を行う準備が整った。センサ可動膜上部・下部に金ハーフミラーを集積して信号変換効率(可動膜変形時の出力信号変化の比)の向上を実現するデバイスの製作を行った。分光測定の結果、従来構造と比較して6.6倍の信号変換効率を実現した。さらに、センサ上にアルブミン抗原10 ug/mLを滴下した時に抗原抗体反応のリアルタイム応答取得に成功した。次にセンサ感度の向上を目指し、エラストマー製の低ヤング率材料であるポリスチレンーポリブタジエンーポリスチレン(SBS)ナノシート(59 MPa)を用いて作製した光干渉計において、ストレス感度を評価した。

BSA抗体10 ug/mLの修飾時においてパリレンCを用いた従来構造のスペクトルシフト量は0.0625 nm/minであったが、SBSナノシートを用いた構造では1.41 nm/min程度のシフト量が得られ、約22倍ストレス感度の向上を実証した。さらに、受容体タンパク質の構造変化応答取得を目的に、カルモジュリンをセンサ上に修飾し、カルシウムイオンに対する応答の評価を行った。1 mMCaCl2に対して20 nm程度のレッドシフトが確認され、分子の構造変化を捉えたことを示唆する結果が得られた。吸着分子の質量・分子間力の同時測定のため、新規ドライ転写技術により単層グラフェンキャビティ封止構造を形成した。SEM観察、ラマンシフトによりキャビティ中が真空に封止された共振器が作製できた。圧力差によって0.05%の引張ひずみがグラフェン中に印加されていることが確認され、共振特性の向上が期待される。また、直径3045 umのグラフェン共振器において室温、高真空下で共振周波数0.741.36 MHz、Q値83391の範囲の共振ピークを観測することに成功した。この実測値から算出した質量検出限界は従来の高性能なシリコンNEMS共振器に対し、2桁程度向上できることが示唆された。本研究ではCMOSイメージセンサの各画素上に集積化したMEMSファブリペロー干渉計を用いて、タンパク質をはじめとする生体分子同士にはたらく分子間力をとらえることにより、標識を用いずに分子を検出し、さらに吸着分子の構造変化を捉えることが可能なマルチモーダルセンサの開発を行った。その成果として、従来よりも22倍ストレス感度が高い分子間力センサと100倍高感度なMEMS質量センサの作製に成功した。光干渉型表面応力センサは、分子間力の信号伝達効率にあたる透過スペクトルの勾配を4倍に向上させることができた。目標の伝達効率10倍を達成させるためには基板側にもハーフミラーを成膜することにより達成可能であるため、次年度以降にさらに特性の向上を目指す。インクジェット法により、センサ上に分子の滴下を行った実験では、滴下質量に比例した変形応答を取得することができた。従来はセンシングエリア上に吸着している分子の量と出力の関係を明らかにする報告はなかったため、今回用いた手法により吸着分子と分子間力の関係の調査を進める。液中での非標識タンパク質検出は、検出濃度と検査時間はトレードオフの関係にあるため、低濃度を測定するためには長時間の検査時間が必要になる。ベンチマークに設定しているピエゾ抵抗型の表面応力センサと比較すると、同じ検査時間で一桁濃度の低い溶液から出力応答を取得することができた。この測定に使用したデバイスは、工程の簡略化のためハーフミラーを含まないセンサを用いて取得したデータのため、さらに低濃度の溶液中からターゲットを検出できる可能性を示している。質量センサの課題では、光干渉型表面応力センサとの一体化を目的にリング型の圧電電極を新規に提案し、インピーダンス評価により電気的に共振周波数を検出可能であることを示した。この構造から、ダイアフラム上に吸着した生体分子の分子間力と質量を同時に電気信号として出力できる見通しを得ることができた。プロトタイプでは質量感度5.22
RAD54変異ニワトリBリンパ細胞株の、DNA複製中に起ったDNA損傷の解析

ゲノムDNA上に2本鎖切断が起こり、それが修復されないと真核細胞は死亡する。真核細胞は、組み扱え修復(相同組み換え)とend joiningという2種類のDNA2本鎖切断修復経路を待つ。これらの生化学反応に関わるタンパク群は、その1次構造が酵母からヒトに至るまで非常によく保存されている。組み換え修復に関わる遺伝子群をRAD52エピスタシスグループと呼び、10種類以上の遺伝子が酵母とヒトでそれぞれ知られている。RAD51は、このエビスタシスグループの一員であり、酵母のRad51欠損株は、増殖可能であるが、ゲノム上に2本鎖切断を誘導する電離放射線照射に対して著しく感受性がある我々は、高等真核細胞(ニワトリBリンパ細胞株、DT40)からRad51コンディショナルミユ-タント細胞を世界で初めて作成した(Sonoda et al,EMBO J.,Vol.17;598-608,1998)。このミユ-タントのRad51の発源を停止させると、少数のランダムな染色体断裂がM期で観察され、ほとんどの細胞は分裂後、死亡する。この結果は、高等真核細胞では増殖中に染色体断裂が起き、Rad51はその断裂を修復するのに必須の働きをしていることを示唆する。相同組み換え機構が、染色体の構造維持にかかわっているという我々の研究結果は、その異常が染色体構造を不安定にし、発ガンの原因になりうることを示唆する。
ＰＩＰｓシグナルにおけるホスファチジルイノシトール脂肪酸鎖の生物学的意義の解明

生体内のアラキドン酸の多くはリン脂質に結合した状態で存在している。ホスファチジルイノシトール(PI)は、主要なリン脂質の一つであり、その極性頭部がリン酸化されたホスホイノシタイド(PIPs)の形で細胞内シグナリング経路を制御している事が知られている。一方生体内におけるPIは脂肪酸鎖に特徴があり、アラキドン酸が結合しているものが圧倒的に多いことが知られている。当研究室ではPIにアラキドン酸を導入する酵素としてLPIAT1を同定している。私はPIの特徴的脂肪酸鎖の生体での意義を明らかにする事を目指した。これまでに線虫遺伝学を用いた解析からPIPsの一つであるPI3PシグナリングとPI中の脂肪酸鎖の関連を示している。また昨年度にコンディショナルLPIAT1欠損マウスを用いた成体におけるLPIAT1欠損マウスの解析を開始し、成体におけるLPIAT1欠損により、肝臓での異常な脂質蓄積が生じる脂肪肝を示すことを新たに見出した。本年度では、コンディショナルLPIAT1欠損マウスの脂肪肝に関する解析を進めた。肝細胞特異的LPIAT1欠損マウスの解析から、脂肪肝の表現型は肝細胞自律的であることが明らかになった。さらに肝細胞特異的欠損マウス及び肝細胞由来培養細胞を用いた解析から、LPIAT1の機能阻害により中性脂質の分解が低下することが明らかになった。さらにLPIAT1欠損マウス肝臓においてPI3Pシグナリングにより制御されるオートファジーの機能が低下していることが示唆された。現在LPIAT1欠損マウスにおいてPIPsシグナリングの低下によりオートファジー機能が低下し、その結果中性脂質が蓄積するという仮説を考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。アラキドン酸は哺乳動物の細胞中に存在する高度不飽和脂肪酸の一つであり、特に脳に多く存在することが知られている。これまでに栄養学的な研究からアラキドン酸が発達期の神経に重要であることや、アラキドン酸摂取による脳・神経機能の亢進作用が見られることが数多く報告されている。ホスファチジルイノシトール(PI)は、他のリン脂質と比較してアラキドン酸を多く含む分子種が大部分を占めることが知られている。またPIはその極性頭部がリン酸化されたホスホイノシタイド(PIPs)の形で細胞内シグナリング経路を制御していることが知られているが、そのPIPs代謝に脂肪酸鎖の影響が示唆されてきている。これまでにPIヘアラキドン酸を導入する酵素LPIAT1欠損マウスにおいて神経細胞移動の異常や細胞死が生じ、脳の形態異常を来すことを見出しており、PIあるいはPIPs中のアラキドン酸が脳の形態形成に重要な機能を果たしていることが明らかしてきた。しかしPI中の脂肪酸鎖がどのようにして個体の機能に影響を与えるのか、どのような分子がそのような現象に関わるのかほとんど明らかになっていない。本年度では、PI中のアラキドン酸がどのようにして生体機能に影響を与えるのかを明らかにすることを目的として研究を行った。当研究室では脂肪酸不飽和化酵素を欠損した高度不飽和脂肪酸(poly unsaturatedfatty acid, PUFA)を持たない線虫を樹立している。PUFAの機能を調べるためにPUFA欠乏線虫の解析を行ったところ、上皮系細胞の形態に異常が生じていることが明らかになった。さらに上皮組織におけるアクチンフィラメントの染色を行い観察したところ、その構造が乱れていた。LPIAT1欠損線虫を用いた解析から、これらの表現型はPIへPUFAが取り込まれることが重要であることを明らかにした。アラキドン酸は哺乳動物の細胞中に多く存在する高度不飽和脂肪酸の一つであり、その多くは生体内においてリン脂質に結合した状態で存在している。ホスファチジルイノシトール(PI)は、主要なリン脂質の一つであり、特徴的な脂肪酸組成を有している。すなわち、他のリン脂質が多様な脂肪酸鎖を結合しているのに対して、PIにはアラキドン酸が結合されているものが圧倒的に多いという特徴がある。またPIはその極性頭部がリン酸化されたホスホイノシタイド(PIPs)の形で細胞内シグナリング経路を制御している事が知られている。本研究ではPIの特徴的脂肪酸鎖がPIPsシグナリングにおいてどのような意義があるかを明らかにすることを目指している。これまで当研究室においてPIへアラキドン酸を導入する酵素としてLPIAT1を同定している。さらにこれまでの研究からLPIAT1欠損マウスにおいて神経細胞移動の異常や細胞死が生じ、脳の形態異常を来すことを見出しており、PIあるいはPIPs中のアラキドン酸が脳の形態形成に重要な機能を果たしていることが明らかしてきた。本年度では、研究計画に従いLPIAT1コンディショナル欠損マウスを用いた成体におけるLPIAT1欠損マウスの解析を開始した。その結果、LPIAT1欠損により、肝臓での異常な脂質蓄積が生じることを新たに見出した。これまでに報告からPIPsシグナリングと脂質代謝の関連が示唆されており、このシグナリングにおける脂肪酸鎖の寄与についてさらに検討を進めている。

一方生体内におけるPIは脂肪酸鎖に特徴があり、アラキドン酸が結合しているものが圧倒的に多いことが知られている。当研究室ではPIにアラキドン酸を導入する酵素としてLPIAT1を同定している。私はPIの特徴的脂肪酸鎖の生体での意義を明らかにする事を目指した。これまでに線虫遺伝学を用いた解析からPIPsの一つであるPI3PシグナリングとPI中の脂肪酸鎖の関連を示している。また昨年度にコンディショナルLPIAT1欠損マウスを用いた成体におけるLPIAT1欠損マウスの解析を開始し、成体におけるLPIAT1欠損により、肝臓での異常な脂質蓄積が生じる脂肪肝を示すことを新たに見出した。本年度では、コンディショナルLPIAT1欠損マウスの脂肪肝に関する解析を進めた。肝細胞特異的LPIAT1欠損マウスの解析から、脂肪肝の表現型は肝細胞自律的であることが明らかになった。さらに肝細胞特異的欠損マウス及び肝細胞由来培養細胞を用いた解析から、LPIAT1の機能阻害により中性脂質の分解が低下することが明らかになった。さらにLPIAT1欠損マウス肝臓においてPI3Pシグナリングにより制御されるオートファジーの機能が低下していることが示唆された。現在LPIAT1欠損マウスにおいてPIPsシグナリングの低下によりオートファジー機能が低下し、その結果中性脂質が蓄積するという仮説を考えている。研究計画に従いLPIAT1コンディショナル欠損マウスの解析を行い、新たな表現型を見出しており、分子機構の解析を進めていることからおおむね順調と言える。PIPsシグナリングとの関連については今後さらに詳細な解析を継続する。27年度が最終年度であるため、記入しない。引き続き、LPIAT1コンディショナル欠損マウスを行いたい。また培養細胞を用いた実験を行い、PIの脂肪酸鎖のPIPsシグナリングの作用のメカニズムの解明を目指したい。研究計画に従い、線虫や培養細胞を用いて解析を進め、線虫の上皮細胞の形態維持及び上皮における正常なアクチン骨格形成に、アラキドン酸等の高度不飽和脂肪酸がPIに取り込まれることが重要であることを見出した。このことは上皮細胞形態およびアクチン骨格形成におけるPI中のPUFAの意義を明らかにできたと考えられるため。引き続きPIPsシグナルにおけるホスファチジルイノシトールの脂肪酸鎖の意義およびその作用メカニズムを解明することを目指す。現在線虫で見出しているPIへのPUFA取り込み依存的なアクチン骨格の乱れが、どのようなPIPsの作用であるかを遺伝学的・生化学的解析から明らかにしたい。また現在コンディショナルLPIA1欠損マウスの解析も開始しており、その表現型の解析を通して成体における意義についても明らかにしていきたい。