hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞内核外輸送阻害とエピジェネティクス制御を標的とした消化器癌分子治療の開発

難治性消化器癌に対する新たな治療を目指し、遺伝子の導入、転写、翻訳され機能するタンパクとして発現し、細胞内を輸送され、さらに分解されるという細胞内でのダイナミックな動きを制御することを目指し、遺伝子の発現を制御する酵素の阻害剤により遺伝子治療の効率を上げることを確認、新たな化合物の抗腫瘍効果も確認した。また、分子の細胞間輸送を制御することにより細胞死がより強く誘導可能であった。これらの化合物は橋渡し研究の重要なシーズの1つであり、分子治療の展開上で極めて有用である。遺伝子の導入、細胞内での遺伝子の発現、細胞内での分子移動の制御、遺伝子導入細胞による生体の応答を利用した新たな難治性消化器癌に対する新たな治療を目指している。これまでの単に遺伝子を導入する、単独の分子標的を目的とした薬剤のみでは、ヘテロジェナイティーという特徴をもつ難治性の消化器癌の性質からみるとその治療には限界がある。当研究では、遺伝子を導入する時点から、ピストンのアセチル化脱アセチル化、転写、翻訳され機能するタンパクとして発現し、細胞内を輸送され、さらに分解されるという細胞内でのダイナミックな動き、エピジェネティクスを制御することを目指している。今回、HDAC阻害剤を食道癌細胞に作用させることにより、遺伝子治療に用いるアデノウイルスベクターの細胞内導入に必要なコクサッキーアデノウイルスレセプターの発現が増強すること、それにより遺伝子導入高率が増加すること、実際の遺伝子治療に用いるp53遺伝子発現が増強することを確認、報告した。また、分子の細胞間輸送を制御することによる癌治療は新たな癌分子治療を考える上で極めて重要であり、レプトマイシンBを用いて核から細胞質への分子輸送を阻害することにより核内にp53分子が蓄積することが確認された。さらにp53分子より下流の分子の転写が増強していることも明らかになり、細胞死も誘導可能であった。これらの化合物はトランスレーショナルリサーチの重要なシーズの1つであり、分子治療を展開するうえで極めて有用である。今後、in vivo電気穿孔法を含めて速やかに臨床研究へ移行したいと考えている遺伝子の導入、細胞内での遺伝子の発現、細胞内での分子移動の制御、遺伝子導入細胞による生体の応答を利用した新たな難治性消化器癌に対する新たな治療を目指している。当研究では、遺伝子を導入する時点から、ヒストンのアセチル化脱アセチル化、転写、翻訳され機能するタンパクとして発現し、細胞内を輸送され、さらに分解されるという細胞内でのダイナミックな動き、エピジェネティクスを制御することを目指している。今回、食道癌細胞にヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を作用させることによって生じるアポトーシスの機序について不明であったが、新規ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤CHAP31が食道癌治療に有用であることを示し、そのアポトーシスの機序がFas-FasLによる外因性経路ではなく、ミトコンドリアを介した内因性経路によるものであることを明らか化にした。この経路ではBaxが関与しているがその上流のp53とは独立しており、ROSが関与していることも明らかにした。また、このCHAP31は新たながん治療として有用性が検証されつつある重粒子線との併用により、食道癌細胞においてCHAP31がDNA修復遺伝子の発現を抑制し、その抗腫瘍効果をin vitroならびにin vivoにおいて増強することを明らかにした。今回、食道癌細胞からエピジェネティクスの重要な役割を担うmicro RNAをアレイにより解析、食道癌細胞において抑制されているmiR-145,miR-133を見出した。これらのmiRNAを食道癌細胞に導入することにより細胞増殖と癌細胞として特徴的な性質である浸潤能が減弱することを確認した。これらのmiRNAがFSCNを標的としていることを確認しさらに直接同遺伝子の転写領域に作用することを確認した。これらのmiRNA導入により細胞内のFSCN発現が減弱することも確認できた。また、このFSCNをsiRNAによりノックダウンすることにより食道癌細胞の増殖能、浸潤能ともに減弱した。エピジェネティクスの重要な一員であるmiRNAが抑制的に働き癌遺伝子の発現を減弱させ、癌治療に有用であることが明らかとなった。
心臓逆リモデリングにおけるミトコンドリアダイナミクスの関与の解明

心不全後の心形態改善は逆リモデリングと称されるが、その細胞内分子機構にオートファジー性ミトコンドリア分解や、ミトコンドリア分裂融合が関わるとの仮説を立てた。網羅的解析を行った結果、新規ミトコンドリア分裂、マイトファジー誘導分子Bcl2-L-13を発見した。また逆リモデリングの評価システムを確立すると共に、逆リモデリングに関わると考えられるBcl2-L-13, Drp1, Rubiconの心筋細胞特異的遺伝子改変動物を作成し、病態モデルを用いた解析を行った。これまでの研究において、オートファジーと呼ばれる細胞内分解機構が心筋細胞内ミトコンドリアの形態維持および逆リモデリングに関わることを明らかにしてきた。種々の治療によって惹起される心臓逆リモデリングに関する分子機構について、ミトコンドリア形態変化に着目した研究を行った。本年度は逆リモデリングに関する機構解析を行うためのモデル樹立を行った。まずin vivoの評価系として、アンジオテンシンII持続投与後の心肥大退縮モデルならびに横行大動脈縮窄圧負荷心肥大手術後の圧負荷解除による心肥大退縮モデルを作成し、いずれにおいても心臓逆リモデリングが評価可能であることを確認し、モデル樹立に成功した。続いてin vitroの系としてフェニレフリン刺激による心筋細胞肥大後の、刺激除去による心筋細胞肥大退縮を評価するための適切な条件設定を実施し、評価系を確立した。また遺伝子改変マウスとして、オートファジー抑制因子であるRubiconの心筋細胞特異的欠損マウスを作成した。さらに心筋細胞特異的にミトコンドリア融合分裂に介入可能な遺伝子改変マウスの作出を行った。同時に、ミトコンドリア分解機構に関わる新規分子機構の解析を行い、酵母において見いだされたマイトファジー必須因子であるAtg32の機能的ホモログとしてBCL2L13を同定した。BCL2L13はミトコンドリア外膜上に発現しており、ミトコンドリアの分裂を誘導すると共に、マイトファジーレセプターとして機能することを明らかにした。心臓逆リモデリングを評価するために必要とされるin vivoならびにin vitroの系をそれぞれ樹立に成功しているとともに、遺伝子改変マウスの作出については予定よりも順調に進行している。しかしながらin vitroの評価系樹立開始が遅れたため、逆リモデリングにおける分子機構の網羅的解析の開始が遅れている。しかしながらマウスを用いる実験が予定よりも順調に進んでいることから、全体としてはおおむね順調に進展していると判断される。これまでの研究において、オートファジーと呼ばれる普遍的細胞内分解機構が心筋細胞内ミトコンドリアの恒常性を維持することで、圧負荷などのストレス適応や加齢性変化において心保護的に資することを明らかにしてきた。さらにAtg5依存性のオートファジーによる細胞内分解系は、心肥大以後の刺激除去に際しての肥大退縮に代表される逆リモデリングに関わることを明らかにしてきた。昨年度に確率した心肥大退縮モデルについて、オートファジー抑制因子Rubiconの心筋細胞特異的欠損マウスの評価を行った。本遺伝子改変マウスは圧負荷による有意な表現型を認めたため、その機構についての解析を開始している。またミトコンドリア分裂の必須因子であるDrp1の変異体を心筋細胞特異的に発現させる遺伝子改変マウスを作製した。その際に、一つは心筋細胞特異的プロモーターによる発現モデル、もう一系統としては薬剤誘導性(Tamoxifen)に後天的に心筋細胞特異的にDrp1変異体を発現させる遺伝子改変マウスの作出に成功した。現在これらのマウスを交配させ、リモデリングおよび逆リモデリングに与える影響の検討に入っている。さらに、ミトコンドリア特異的オートファジーであるマイトファジー必須因子の酵母Atg32について、我々がほ乳類の機能的ホモログとして同定したBCL2L13についても、Cre-loxPシステムによる心筋特異的欠損マウスを作製し、生理的条件下および血行動態ストレスによる応答に関しての解析を開始した。心臓逆リモデリングに関わる分子についての解析について、予定通りin vivo解析モデルに必要な遺伝子改変マウスの作出が完了し、それぞれの機能的評価が開始されている。一部については既に有意な表現型が得られており、その機構解析の段階に入った点からも、全体としてはおおむね順調に進展していると判断される。これまでの研究において、オートファジーと呼ばれる、酵母から哺乳類まで普遍的に保たれている細胞内分解機構が心筋細胞内ミトコンドリアの恒常性を維持することで、圧負荷などのストレス適応や加齢性変化において心保護的に資することを明らかにしてきた。本研究では、まず逆リモデリングに関する機構解析を行うためのモデル樹立を行った。in vivoの評価系として、アンジオテンシンII持続投与後の心肥大退縮モデルならびに横行大動脈縮窄圧負荷心肥大手術後の圧負荷解除による心肥大退縮モデルを作成し、いずれにおいても心臓逆リモデリングが評価可能であることを確認し、モデル樹立に成功した。オートファジー抑制因子Rubiconの心筋細胞特異的欠損マウスを作出解析した結果、野生型と比し血行動態ストレスによる有意な心臓表現型を認めた。同マウスでは、野生型と比しミトコンドリア形態の変化を見出した。またミトコンドリア分裂の必須因子であるDrp1の変異体を心筋細胞特異的に発現させる遺伝子改変マウスを作成・解析した。この目的に資する2系統のマウスを作出し、血行動態負荷によるリモデリングおよび逆リモデリングに与える影響の検討を行った。

さらに、ミトコンドリア特異的オートファジーであるマイトファジー必須因子の酵母Atg32のほ乳類機能的ホモログ候補として同定したFKBP8についても、Cre-loxPシステムによる心筋特異的欠損マウスを作製・解析し、ストレス応答において心臓保護的に機能していることを明らかにした。心不全後の心形態改善は逆リモデリングと称されるが、その細胞内分子機構にオートファジー性ミトコンドリア分解や、ミトコンドリア分裂融合が関わるとの仮説を立てた。網羅的解析を行った結果、新規ミトコンドリア分裂、マイトファジー誘導分子Bcl2-L-13を発見した。また逆リモデリングの評価システムを確立すると共に、逆リモデリングに関わると考えられるBcl2-L-13, Drp1, Rubiconの心筋細胞特異的遺伝子改変動物を作成し、病態モデルを用いた解析を行った。上記の通り、逆リモデリングのin vitroに関する実験にやや遅れが認められるが、遺伝子改変マウスを用いた研究遂行が予定よりも順調であることから、今後の全体の研究進行は順調であると考えられる。今後は本年度に確立した評価系を用い、ミトコンドリアダイナミクスが心臓逆リモデリングにおよぼす影響の検討を実施すると共に、逆リモデリングに関わる分子機構の探索を実施する。心臓肥大後の逆リモデリング過程に関する研究は予定通りの進行状況と考えられ、今後はそれぞれの遺伝子改変モデルにおける解析をさらに推進し、当初の目的達成に向けた研究を続行する。循環器内科心臓逆リモデリングに関わる分子機構の探索のために、siRNA購入を本年度中に行う予定であったが、本実験に用いる心臓逆リモデリングのin vitro評価系の確立に時間を要したため、種々のsiRNA購入が予定よりも遅れたためである。しかしながら心臓逆リモデリングのin vivo評価系の確立や、ミトコンドリア形態介入のための遺伝子改変マウスの作成やRubicon心筋特異的欠損マウスの作成評価は予定よりも順調に進んでおり、全体としての研究推進ならびに遂行には特に問題はないと考えられる。siRNA購入、ならびにsiRNAを用いたin vitro実験に用いる試薬や器具類購入に充てる予定であり、次年度の中で使用するものである。さらに予定よりも順調に進行しているin vivo実験や、マウスの維持管理費に充当することで研究計画の達成に用いる。
含水率を評価尺度とする建築物の防湿設計法に関する研究

含水率を評価尺度とする建築物の防湿設計法に関する研究において、大別、壁体内含水率予測法、室内湿度解析法、水分物性値の測定、推定法、予測用外界気象条件とそのモデル化について研究を行い、以下の成果を得た。1:松本は、(1)解析をおこなう場合の熱・水分移動の基礎式、境界条件について検討し、各種外界条件と適応すべき方程式を示すととも、解析に必要な物性値と測定上考慮すべき条件を明示した。(2)設計に有効に利用するために、上記の基礎方程式の線形化について検討し、擬線形化法による方法とそれによる線形化方程式を陽に示し、建築壁体におけるその適応範囲、有効性を示した。これにより、規準気象要素における解を求めておけば、他の場合の状態が、線形操作で容易に求められる。(3)HYGROSCOPIC近似の適応範囲、物性値との関係を数種の壁体について数値解析しその適応限界を示し、また高空隙率の断熱材内の対流の影響を数値解析に依って求め、通常条件では対流の影響を無視して良い事をを示した。(4)地盤、床下の湿気的性状の解析法を示し、常水面、降雨の影響の検討法、数値解析を行った。(5)結露、蒸発過程を含む水分移動過程に対する相似法則を導き、これを用いた縮小模型実験の実行、装置の信頼性、これによる壁体の評価の方法を示した。(6)鉾井とともに、数種の材料について水分伝導率の測定を行った。2:鉾井は、さらに、(1)外界気象要素を確率的観点から分析し、ARMA(日射)、ARMAX(気温)でそれを表現できる事を示した。(2)さらにそれを用いた室内湿度、熱負荷変動を確率過程として解析する方法について研究を行い、時変重み関数による分散解析法(気象モデル不要)、状態方程式による確率過程解析法を示し、室内湿度変動性状を明らかにした。3:森山は、地表被覆、含水率および人工排熱と微気象的周辺気温の関係を予測する方法について検討を行った。過大な防湿設計を避け合理的な壁体、室の防湿設計を行うには、前者に対して壁体内の含水率の時間経過の予測、後者に対しては壁体の水分特性、吸放湿性を考慮した室内湿度の予測が必要であり、一方これらの記述方程式は非線形であり、設計に用いるには、適切な近似化が必要である。上述の設計法確立に必要な問題に対して以下の結果を得た。1:松本は、(1)現象記述の簡単なHYGROSCOPIC領域とそれ以外とを区別する方法を示し線形化可能領域を明示し、それに基づき、室内湿度を年周解析し、容量一定化の可能なこと。(2)非HYGROSCOPICを含む一般的な系の擬線形化技法による線形近似法を示し、基準解を一つ求めておけば、上記の重畳和可能の線形解との和によって、壁体内含水率の非定常解は容易に得られ、含水率基準(水分ポテンシャル基準)の壁体設計ができること。(3)材料物性値の不明または測定困難な材料で構成される壁体の評価を行うための相似模型実験法、相似法則、時間短縮法(年周変化の短時間実験)を示し実験を行ってその妥当性を示した。上記(2)の結果を用いれば、数種の実験で、境界条件の変化した場合の解の予測が可能となる。

(4)地下室など地盤に接する空間の挙動解析を行うために、降雨のある場合の地盤内含水率変動の計算法を吟味し、地表境界条件は降雨時でも必ずしも第一種境界条件とはならず、第3種での判定が必要なこと、この場合、BEM法は非線形性大のため殆ど適応不可である。また床下空間の年周挙動解析も行った。2:鉾井は、(1)水分伝導率の測定法を検討し、木材について測定した。(2)気象条件の確率性状をARMAモデルで表現できることを示し、それを用いた室温湿度、熱負荷の確率過程解析法を示した。また、非線形要素である相対湿度の確率過程の解析の方法を提案し、室の温湿度性状を解析した。3:森山は、境界条件としての建物周辺の気象要素の特性を把握するための土地被覆のリモ-トセンシングによる同定法、周辺の物質(水分も含む)分布の予測法を示した。本年度は、計画通り前年に引き続き各研究課題を継続して研究した。得られた成果を以下に述べる。1:松本は、(1)熱・水分移動の基礎式、境界条件について改めて検討し、各種外界条件とそれに対応する方程式を示すとともに、異なった水分ポテンシャルを用いた各種モデル間の関係について検討した。また、水分伝導率の水分ポテンシャル依存性の吟味、物性測定上考慮すべき条件を明示した。(2)前年に引続き、擬線形化法による線形化方程式の近似の誤差について数値解析により検討し、水分伝導率の水分ポテンシャル依存性の程度と近似可能範囲の関係について検討した。前記ポテンシャル依存性が規準値の1/2の場合、適応可能範囲は2倍以上となる事が示された。(3)HYGROSCOPIC近似の適応範囲を数値解析により検討し、ALC壁体では、相対湿度95%まで近似可能な事を示した。また高空隙率の断熱材内の対流の影響を検討し、通常条件では対流の影響は無視し得る事を示した。(4)地盤を床下系に含めた床下湿度変動(年周)の解析プログラムの作成をおこない、砂質地盤の場合の常水面深さ、降雨を考慮した数値解析に着手した。(5)鉾井とともに、木材(米松)について水分伝導率の測定を行い、装置の精度、サンプリングの影響、さらに木材の異方性について検討した。2:鉾井は、(1)外界気象要素のモデル化において、これまでの季節別モデルの通年化の可能性の検討を行ったが、通年化は困難である事が示された。(2)トレンドの大きい中間期について、間欠空調下の室温、熱負荷の確率過程解析法を示した。3:森山は、気温予測の相関式を気象台デ-タの統計処理によって求めた。
地盤-抗-コンクリート構造物から成る全体系の地震応答解析手法の開発

本研究は,地盤-杭-構造物の地震応答性状を,模型供試体を用いて動的実験ならびに静的実験を行うことによって求め,その性状を実験および解析的に明らかにすることである.実験に用いた模型供試体は,RC杭が基盤に定着しているものと仮定し,一本の円形RC杭を模した供試体を作製し,RC杭の下端をコンクリートで固定し,これを剛性の高い壁面でできた土槽に入れ,地盤定数が既知の砂を土槽の上面まで入れた.次に,地震力を想定した水平荷重を杭先端に載荷する静的正負繰り返し載荷実験を行った.実験要因は,杭頭にかかる軸力,ロッキングに伴う変動軸力、杭頭拘束条件が及ぼす影響である.以下のことが結論として得られた.1)実験及び解析の結果,軸力が大きくなると共により大きな履歴ループを描き,零価減衰定数も大きくなる傾向が確認された,さらに最大耐力時からの耐力低下も,軸力が大きいケースでより顕著に見受けられた.2)典率最大点深さについては軸力による影響はほとんどみられず,杭体と地盤の相対剛性によって一義的に決まることが確認された.また,変動軸力が作用するケースは,最大及び最小の軸力が一定に作用する際の復元力特性に近い結果となり,軸力の変動幅が既知であれば,一定軸力作用時の挙動をもって代用できると考えられる.3)構造系全体の地震応答を計算により求めるために,3次元有限要素激より,地盤と杭との剥離を考慮した応答解析手法を開発した.これを用いた計算結果は実験結果を概ね精度よく表すことが可能であり,解析手法の有用性が示された.本研究は,地盤-杭-構造物の地震応答性状を,模型供試体を用いて動的実験ならびに静的実験を行うことによって求め,その性状を実験および解析的に明らかにすることである.実験に用いた模型供試体は,RC杭が基盤に定着しているものと仮定し,一本の円形RC杭を模した供試体を作製し,RC杭の下端をコンクリートで固定し,これを剛性の高い壁面でできた土槽に入れ,地盤定数が既知の砂を土槽の上面まで入れた.次に,地震力を想定した水平荷重を杭先端に載荷する静的正負繰り返し載荷実験を行った.実験要因は,杭頭にかかる軸力,ロッキングに伴う変動軸力、杭頭拘束条件が及ぼす影響である.以下のことが結論として得られた.1)実験及び解析の結果,軸力が大きくなると共により大きな履歴ループを描き,零価減衰定数も大きくなる傾向が確認された,さらに最大耐力時からの耐力低下も,軸力が大きいケースでより顕著に見受けられた.2)典率最大点深さについては軸力による影響はほとんどみられず,杭体と地盤の相対剛性によって一義的に決まることが確認された.また,変動軸力が作用するケースは,最大及び最小の軸力が一定に作用する際の復元力特性に近い結果となり,軸力の変動幅が既知であれば,一定軸力作用時の挙動をもって代用できると考えられる.3)構造系全体の地震応答を計算により求めるために,3次元有限要素激より,地盤と杭との剥離を考慮した応答解析手法を開発した.これを用いた計算結果は実験結果を概ね精度よく表すことが可能であり,解析手法の有用性が示された.本研究では,地盤-杭-構造物の動的実験ならびに仮動的実験を行い,その応答性状を明らかにするとともに,実験結果を踏まえて,構造系全体の地震応答解析手法を開発しようとするものである.本年度得られた成果は以下のようである.1)RC杭と地盤からなる模型供試体を作製し,動的載荷実験を行った.模型供試体は,RC杭が基盤に定着しているものと仮定し,一本の円形RC杭を模した供試体を作製し,RC杭の下端をコンクリートで固定し,これを剛性の高い壁面でできた土槽に入れ,地盤定数が既知の砂を土槽の上面まで入れた.次に,地震力を想定した水平荷重を杭先端に載荷する動的正負繰り返し実験を行った.その結果,実験に用いた載荷速度(20cm/s)では,静的実験結果と大きな違いは見られなかった.2)地盤-杭から成る構造系の地震応答解析を3次元弾塑性有限要素法により開発した.本解析プログラムは,地震力などを受ける鉄筋コンクリート構造物あるいは部材に適用するために開発されたもので,その精度は実験などにより既に確かめられている.しかし,地盤の地震応答性状あるいは地盤中における杭の動的応答性状についてはその適用性および精度は検証されておらず,ここでは,実験結果をフィードバックして,解析モデルを修正しつつ精度高いものに仕上げていった.その結果,地盤と杭の剥離現象をモデル化する必要があることが明らかとなり,これを解析プログラムに取り入れた.来年度は開発した解析プログラムを用いて,全体系構造物の地震応答性状を数値的に求める計画である.本研究は,地盤-杭-構造物の地震応答性状を,模型供試体を用いて動的実験ならびに静的実験を行うことによって求め,その性状を実験および解析的に明らかにすることである.実験に用いた模型供試体は,RC杭が基盤に定着しているものと仮定し,一本の円形RC杭を模した供試体を作製し,RC杭の下端をコンクリートで固定し,これを剛性の高い壁面でできた土槽に入れ,地盤定数が既知の砂を土槽の上面まで入れた.次に,地震力を想定した水平荷重を杭先端に載荷する静的正負繰り返し載荷実験を行った.

実験要因は,杭頭にかかる軸力,ロッキングに伴う変動軸力、杭頭拘束条件が及ぼす影響である.以下のことが結論として得られた.1)実験及び解析の結果,軸力が大きくなると共により大きな履歴ループを描き,等価減衰定数も大きくなる傾向が確認された,さらに最大耐力時からの耐力低下も,軸力が大きいケースでより顕著に見受けられた.2)曲率最大点深さについては軸力による影響はほとんどみられず,杭体と地盤の相対剛性によって一義的に決まることが確認された.また,変動軸力が作用するケースは,最大及び最小の軸力が一定に作用する際の復元力特性に近い結果となり,軸力の変動幅が既知であれば,一定軸力作用時の挙動をもって代用できると考えられる.3)構造系全体の地震応答を計算により求めるために,3次元有限要素法により,地盤と杭との剥離を考慮した応答解析手法を開発した.これを用いた計算結果は実験結果を概ね精度よく表すことが可能であり,解析手法の有用性が示された.
領域を超えた特性理解の発達

本研究では,人間の様々な特性に関する理解が,幼児期から児童期にかけてどのように発達的に変換するのかについて検討することを目的とした。身体的特性,心理的特性,社会的特性を取り上げ,これらの特性の変化可能性(現在のネガティブな特性を変えたいと思っている子どもが,大きくなったときに変えることができるか)を推論させる課題を用いて検討した。幼児,児童,大学生を対象に実験,調査を行った結果,幼児は現在の特性を重視するが,児童期半ばになると「意志・努力」を重視するようになり,さらに多様な要因を考慮するようになることが示された。産前産後の休暇および育児休業の取得(平成24年6月5日平成25年3月31日まで)のため,1年間補助事業を中断した。本研究の目的は,人間の様々な特性に関する理解が幼児期から児童期にかけて,どのように変化するのかについて検討し,領域を超えた認知的操作のモデルを構築することである。領域を超えた認知的操作を行うためには,メタ的に捉える能力が必要であると考え,そのような視点を持つことが発達し,可能となっていく幼児期・児童期の子どもを対象に,発達的変化のメカニズムを明らかにすること,また大人の特性理解や特性推論との比較検討を行うことを目的とした。今年度は,大学生を対象とした2つの調査研究を行った。まず,子どもが持っている現在の特性である内的要因と両親の持つ特性である外的要因が葛藤する場合,子どもの将来の特性を推測するときに,内的要因と外的要因のどちらの影響を重視するのかについて,身体的特性,社会的特性,心理的特性を対象に検討した。その結果,特性によって,重視される要因が異なること,また,例えば同じ身体的特性であっても,特性の内容によって異なる要因が重視されることが示された。次に,子どもが現在の特性を変化させたいと望む場合,それがどのくらい変容可能であるのかを問う調査を行った。ここで,将来の特性を推論する際に,ポジティブな情報とネガティブな情報を付与した場合,それらの情報の方向性が将来の特性の推論にどのような影響を与えるのかについても検討することを目的とした。情報の方向性を操作するため,調査対象者を2群に分け,異なる方向性の情報を付与した課題を用いた。この調査の結果は,現在分析中である。本研究の目的は,人間の生物学的特性と社会的特性に関する理解が幼児期から児童期にかけて,どのように変化するのかについて検討し,領域を超えた認知的操作のモデルを構築することである。領域を超えた認知的操作を行うためには,メタ的に捉える能力が必要であると考え,そのような視点を持つことが発達し,可能となっていく幼児期から児童期の子どもを対象に,発達的変化のメカニズムを明らかにすることを目的とした。そのために,統制可能性を操作し,生物学,社会的領域内で葛藤する特性をもつ人物像(例えば,現在の栄養状態と遺伝的な要因など)を用いた課題に対し,子どもたちがどのように統制可能性を考慮するようになるのか,複数の葛藤要因を考慮できるのか,それとも片方のみを重視するのかについて検討することとした。平成23年度の研究計画として,(1)横断的実験による検討,(2)縦断的観察による検討,の2つの研究を予定していた。(1)に関しては,幼児(年中児,年長児)および比較のための大学生を対象とした個別実験,調査を実施した。具体的には,生物学的特性,心理的特性,社会的特性が葛藤するような課題を用意し,将来の特性を推測させることで,それぞれに関する理解と領域間の関係に関する理解の発達的変化の検討を行った。得られた結果は,学会のポスター発表および学会のラウンドテーブルでの発表を行った。今後,さらに分析を進める予定である。また,(2)の縦断的な観察については,現在準備を進めているところである。また,研究で得られた成果については,本の分担執筆の中で紹介した。本研究の目的は,人間の様々な特性に関する理解が幼児期から児童期にかけてどのように変化するのかについて検討すること,また,それらに対する大人の理解との比較から,領域を超えた認知的操作のモデルを構築することである。領域を超えた認知的操作を行うためには,対象をメタ的に捉える能力が必要であると考え,そのような視点を持ち,操作することが発達し,可能となっていく主に幼児期後半から児童期の子ども達を対象に,発達的変化のメカニズムを明らかにすること,また大人の特性理解や特性推論との比較検討を行うことを目的とした。昨年度の大学生を対象とした調査結果の分析から,新たな調査研究が必要となったため,今年度は大学生を対象とした調査研究を行った。具体的には,現在持っているネガティブな特性を変えたいと思っている子どもが,大人になった時その特性を思うように変えられるかどうかについての推論を,身体的特性,心理的特性,社会的特性それぞれについて行うよう求めた。その際,1現在の特性のみを紹介する(情報なし)課題,2現在の特性と現在のポジティブな環境に関する情報を付与した課題,3現在の特性と同様環境もネガティブである情報を付与した課題の3種類の課題を用意した。その結果,1つの特性推論でも,与えられる情報の影響が異なること,特に付加情報を与えられない場合,本人の意思・努力に帰属する推論が多くみられることが明らかとなった。この結果をもとに,付加情報の影響についてさらなる検討を行う予定である。

領域を超えた認知的操作を行うためには,対象をメタ的に捉える能力が必要であると考え,そのような視点を持ち,操作することが発達的に可能となると考えられる児童期の子ども達を対象に,発達的変化のメカニズムを明らかにすること,また大人の特性理解や特性推論との比較検討を行うことを目的とした。これまで大学生を対象に行った調査では,現在持っているネガティブな特性を変えたいと思っている子どもが,大人になった時その特性を思うように変えられるかどうかについての推論を,身体的特性,心理的特性,社会的特性それぞれについて行うよう求めた。その際,1現在の特性のみを紹介する(情報なし)課題,2現在の特性と現在のポジティブな環境に関する情報を付与した課題,3現在の特性と同様環境もネガティブである情報を付与した課題の3種類の課題を用意した。その結果,1つの特性推論でも,与えられる情報の影響が異なること,特に付加情報を与えられない場合,本人の意思・努力に帰属する推論が多くみられることが明らかとなった。そこで,付加的報の影響についてさらに検討すること,児童期の発達的変化の検討から認知発達のメカニズムについてのモデルを構築するため,小学36年生を対象とした調査を行った。用いた課題は,上記の2,3の課題と同様,提示する子どもの特性にポジティブ情報およびネガティブ情報を付加したものであった。その結果,付加的な情報により,特性理解の推論の結果が異なること,また加齢とともに多様な原因帰属による推論が見られるようになるという発達的変化が明らかとなった。本研究では,人間の様々な特性に関する理解が,幼児期から児童期にかけてどのように発達的に変換するのかについて検討することを目的とした。身体的特性,心理的特性,社会的特性を取り上げ,これらの特性の変化可能性(現在のネガティブな特性を変えたいと思っている子どもが,大きくなったときに変えることができるか)を推論させる課題を用いて検討した。幼児,児童,大学生を対象に実験,調査を行った結果,幼児は現在の特性を重視するが,児童期半ばになると「意志・努力」を重視するようになり,さらに多様な要因を考慮するようになることが示された。これまで行った幼児を対象とした実験および,大学生を対象とした調査の結果をふまえ,26年度に幼児および児童を対象とした実験を行う予定であったが,大学生を対象とした調査の分析方針を変え,新たな調査が必要となった。そのため,計画を変更し,幼児・児童を対象とした実験研究は行わず,これまでのデータ分析と追加の調査研究を中心に進めたため,進展に遅れが生じた。教育心理学今年度は,これまで検討した調査課題を用いて,幼児・児童を対象とした複数の領域に関する特性理解の実験研究を行う予定である。その結果をまとめ,複数の領域に関する特性理解の発達モデルを構築することを目指す。産前産後の休暇および育児休業取得により,1年間補助事業を中断したため。幼児・児童を対象とした実験を行うことはできなかったが,大学生を対象とした複数の調査から,データを順調に収集し,研究の方向性を絞ることができた。また,幼児・児童を対象とする実験に備えることができた。24年度の研究計画として,生物学的特性と社会的な特性の理解の発達的変化の検討するため,
心筋I_KのP_<2Y>受容体による調節機序I_<K(ACh)>のDHP系薬剤による抑制機序

モルモット単離心筋にホールセルパッチクランプ法を適用して心室筋IKにおける細胞外ATPの作用について検討した。その結果、細胞外ATPはP2Y受容体および百日咳毒素非感受性G蛋白を介してIKを増大させた。細胞外ATPはisoprenaline(1μM)もしくはTPA(100nM)によるIKの増大反応に対して付加的に作用したため、PKAやPKCは関与していないと考えられた。H-7存在下でも反応が認められ、この点からもPKCの関与は否定的であった。次に、G蛋白の効果器としてPLCの関与を検討した。Neomycin 500μMのpreincubationでPLCを抑制するとα刺激であるフェニレフリンによるIKの増大反応は消失したがATPによるIKの増大反応には影響を与えなかった。このことは本反応にはPLCが関与していないことを示唆する。さらにATP-γSやokadaic acidを細胞内投与した場合、ATP wash時のIKの減衰過程は遅延した。この結果はリン酸化反応の関与を示唆する。IK増大反応はgenistein存在下では有意に抑制されたが、daidzeinではほとんど影響をうけなかった。さらにチロシン脱リン酸化阻害剤のdephostatinの細胞内投与によってATP wash時のIKの減衰過程は遅延した。これらの結果から、P2Y受容体刺激によるIKの増大反応におけるチロシンリン酸化機序の関与が示唆された。1)細胞外ATPによるI_Kの増大反応におけるチロシン燐酸化機序の関与を検討するために、チロシン燐酸化阻害剤であるgenisteinやその不活性アナログであるdaidzeinによる反応の修飾を検討したところ、daidzeinはATPによるI_Kの増加率に影響を与えなかったが、genisteinは有為に増加率を抑制した。さらにチロシン脱燐酸化阻害剤であるdephostatinを細胞に負荷したところ、細胞外ATPによるI_Kの増大反応は不可逆性を示した。これらの事より本反応におけるチロシン燐酸化機序の関与が示唆された。以上の結果は、心筋I_Kの調節に関与する新たな細胞内情報伝達機序を示唆しており、心筋細胞に存在する、P_<2Y^->受容体を介した心筋活動調節機構の解明に寄与するものと考えられる。2)nicardipineやnisoldipine、BAYK8644等のdihydropyridine(DHP)系薬剤のムスカリン性K電流(I_<K(ACh)>)に及ぼす効果をwhole-cell patch clamp法を用いて検討したところ、いずれの薬剤もI_<K(ACh)>に対して抑制性に作用した。各種薬剤によるI_<K(ACh)>の抑制率をさらに検討したところ、いずれの薬剤においてもACh投与によって活性化された電流およびGMP-PNPの細胞内負荷によって活性化された電流の両者に対する抑制率がほぼ等しいことが認められた。以上のことより、これらのDHP系薬剤によるI_<K(ACh)>の抑制反応はG_Kの活性化より下流のレベルで起こっていると考えられた。
品詞素性情報つき古典漢文コーパスの発展的応用

われわれは、MeCabを用いた古典漢文の形態素解析について、その実際的手法と実用性をこれまでに研究してきた。本研究においてわれわれは、これまでのわれわれの手法をさらに拡張し、地名、官職、人名など、漢文における固有表現抽出に挑戦した。本研究の成果として、われわれは、漢文における地名の自動抽出に成功し、官職に対しては、われわれの手法の有効性を呈示することができた。一方、人名に対しては、姓氏の自動抽出には成功したものの、名や諱に対しては有効な手法を構築するに至らなかった。各形態素用例と、それらの出現する文脈とを検討した結果、官職情報の抽出には、地名情報との共起関係を考慮する必要があり、同時に、品詞分類を多少チューニングする必要性が生じてきている。これらの検討結果を勘案し、当初の予定どおり2014年度は、地名情報の抽出をおこなうと同時に、共起関係を処理するためのクラスタリング手法の開発に挑む。品詞情報を付加したコーパス化をおこなう古典漢文テキストとして、『漢文大系』から「十八史略」を選び、地名情報抽出のための古典漢文コーパスと、来年度分を一部先取りして人名情報抽出のための古典漢文コーパスを作成した。さらに、この漢文コーパスを用いた形態素解析の結果を、地名情報の抽出という側面から検討した。これに合わせ、形態素解析に用いる古典漢文辞書に、地名を大量に追加するという手法を試し、非常に良好な結果を得た。この手法の有効性をさらに検討すべく、従来われわれが使用してきた古典漢文辞書と、今回あらたに作った古典漢文辞書、さらには、これらの古典漢文辞書からあえて全ての地名を取り除いた辞書を作成し、それらに応じてF値がどのように変化するかを検証した。結論から言えば、あらたに作った古典漢文辞書が地名抽出に際してもっともF値が高く、また、それは、地名用例以外に対して何ら悪影響を及ぼさないことが検証できた。研究状況に関しては、逐一「東アジア古典文献コーパスの応用研究」ページhttp://kanji.zinbun.kyoto-u.ac.jp/yasuoka/kyodokenkyu/において、WWW経由での公開をおこなっている。これに加え、検討結果の一部をCHISEの「古典中国語形態素用例」としてWWW公開すると同時に、研究全体の進行状況について国際シンポジウム「Digital Humanities 2014」および「じんもんこん2014」にて発表をおこなった。品詞情報を付加したコーパス化をおこなう古典漢文テキストとして、『漢文大系』から「十八史略」および「孟子」を選び、人名情報抽出のための古典漢文コーパスを作成した。この結果、姓氏の自動抽出については、地名と同様の手法で可能であるとの感触を得た。すなわち、形態素解析に用いる古典漢文辞書に、姓氏を大量に追加する手法によって、姓氏はほぼ全てを自動抽出できる。その一方で、名や諱については、自動抽出がかなり困難な例が多数みつかった。典型例が『十八史略』巻之二に登場する「李斯」である。巻之二には「斯」が16例出現するのだが、うち6例までは「李斯」という形で出現することから、これらについては「斯」が名を意味していることは容易に判定できる。一方、残る10例は「斯」が単独で現れるが、最初の9例が名で、最後の1例だけが代名詞、という非常に自動判定の難しい形になっていた。これを自動抽出するような手法は、残念ながら、研究期間中には開発することができなかった。なお、研究状況に関しては、http://kanji.zinbun.kyoto-u.ac.jp/yasuoka/kyodokenkyu/archive2016.htmlでWWW公開している。また、これまでの検討結果を合わせて、『東洋学へのコンピュータ利用』第27回研究セミナーで発表をおこなった。地名の抽出手法は、古典漢文辞書の見直しというかなり大胆な手法によって、思いのほか順調に開発が進んだ。これによって、来年度予定している人名の抽出手法についても、一定の目処が立っている。27年度が最終年度であるため、記入しない。人文情報学2015年度は、予定通り、人名に特化したキーワード抽出のためのクラスタリング手法の開発をおこない、3年間の研究の総仕上げとする。官職に関する共起確率は、動詞との関係はかならずしも高くなく、むしろ、地名との共起関係が高いことが明らかになった。これにより、官職のキーワード抽出のためのクラスタリング手法に、一定の目処が立った。2014年度は、予定通り、地名に特化した古典漢文コーパスの入力をおこない、同時にキーワード抽出のためのクラスタリング手法の開発をおこなう。
非単調アナログ神経回路モデルによる動的パターンの連想記憶

筆者が提案した非単調アナログ神経回路網は,従来の神経回路モデルにはない多くの優れた性質をもち,注目を集めている.本研究では,このモデルの動的パターンの記憶能力とその動作原理を明らかにすることを目的として,以下のような研究を行った.まず,従来のモデルが動的パターンをうまく記憶できない原因を,力学的な観点から検討した.その結果,従来のモデルは,本質的に孤立した点状のアトラクタしかもつことができず,動的パターンの記憶にはもともと適していないこと,複雑な学習則を用いてもこの問題は解決されないことが明らかになった.次いで,非単調アナログ神経回路網の力学的性質を,主に数値実験によって解析した結果,このモデルでは,線状ないし面状に広がるアトラクタ(の集合)が形成可能なことがわかった.これにより,動的パターンのような一次元構造をもつパターン群の記憶ができることの理論的裏付けが得られた.そこで,実際に動的パターンを記憶する二種類の方法について検討した.一つは,離散的なパターン系列の各パターン間を適度に補間した上で相関行列を求めるという,昨年度考案した方法である.これについて,十分な数値実験を行い,その有効性を確認した.もう一つは,連続的に変化するパターンを教師信号として入力しながら学習を行う方法であり,その具体的な方法を考案した.後者の方法は,教師パターンの変化速度も同時に学習されるなど,非常に興味深い性質を示したが,学習の詳しいメカニズム等は今後の課題である.筆者が提案した非単調アナログ神経回路網は,従来の神経回路モデルにはない多くの優れた性質をもち,注目を集めている.本研究では,このモデルの動的パターンの記憶能力とその動作原理を明らかにすることを目的として,以下のような研究を行った.まず,従来のモデルが動的パターンをうまく記憶できない原因を,力学的な観点から検討した.その結果,従来のモデルは,本質的に孤立した点状のアトラクタしかもつことができず,動的パターンの記憶にはもともと適していないこと,複雑な学習則を用いてもこの問題は解決されないことが明らかになった.次いで,非単調アナログ神経回路網の力学的性質を,主に数値実験によって解析した結果,このモデルでは,線状ないし面状に広がるアトラクタ(の集合)が形成可能なことがわかった.これにより,動的パターンのような一次元構造をもつパターン群の記憶ができることの理論的裏付けが得られた.そこで,実際に動的パターンを記憶する二種類の方法について検討した.一つは,離散的なパターン系列の各パターン間を適度に補間した上で相関行列を求めるという,昨年度考案した方法である.これについて,十分な数値実験を行い,その有効性を確認した.もう一つは,連続的に変化するパターンを教師信号として入力しながら学習を行う方法であり,その具体的な方法を考案した.後者の方法は,教師パターンの変化速度も同時に学習されるなど,非常に興味深い性質を示したが,学習の詳しいメカニズム等は今後の課題である.
鳥類の僧帽筋を支配する運動神経の発生機序の解明

「(1)dMNの発生におけるmicroRNA-9(miR-9)が果たす役割の解明」については、運動神経の発生に関与することが知られているmiR-9が、背側運動神経(dMN)の発生に関わっているか調べるために、miR-9の強制発現を行った。その結果、dMNの分化マーカーを示す細胞は観察されるものの、発生領域であるNkx2.2陽性領域から最終定着領域(運動神経核の背側)までの移動が阻害されていることが判った。細胞移動や突起伸展に関係するROBOファミリーの発現について検索したところ、ROBO1や2、またリガンドであるSLIT1, 2の発現には異常なかったが、ROBO3のみNkx2.2陽性領域に異所性の発現が認められた。正常個体での発生を調べたところ、ROBO3の発現が認められるのはdMNが移動を完了した後の時期であるのに対し、miR-9強制発現例では、dMNの移動以前にROBO3が発現していることが分かった。これらの結果はmiR-9はROBO3の発現を早発させることを示している。「(2)dMNおよび副神経運動神経(SAN-MN)の発生におけるHox分子の関与」については、頚髄に発現するHox分子のdMNおよびSAN-MNにおける局在について調べた。その結果、Hoxc5は頚髄の体性運動神経には発現されているものの、dMN/SAN-MNにおいては全く発現が認められなかった。一方、Hoxa5はdMN/SAN-MNで発現があり、その発現の吻側の境界はSAN-MNの吻側端と一致した。これらの結果は、dMN/SAN-MNの発生分化に対して特定のHoxの関与を示唆するものである。「(3)dMN/SAN-MNの軸索伸展メカニズム解明」について、2018年度はdMN/SAN-MNの軸索特異的なGFP発現系の開発を目指した。タイムラプスシステム技術は確立されたが、成果はまだ出ていない。(1)dMNの発生におけるmicroRNA-9(miR-9)が果たす役割の解明についておよび(2)dMNおよび副神経運動神経(SAN-MN)の発生におけるHox分子の関与は、当初の予定通り順調に進んでいるものの、(3)dMN/SAN-MNの軸索伸展メカニズム解明については、技術的な難度が高く成果が出ていないため。「(1)dMNの発生におけるmicroRNA-9(miR-9)が果たす役割の解明について」は、今後、ROBO3の発現とdMN移動の異常の因果関係について明らかにすることを目指す。このため、ROBO3そのものの異所性発現とdMNの背側への移動との関係について解析を進める予定としている。「(2)dMNおよび副神経運動神経(SAN-MN)の発生におけるHox分子の関与」については、今後強制発現や機能阻害実験を通じてその役割を明らかにしていく。「(3)dMN/SAN-MNの軸索伸展メカニズム解明について」は、Nkx2.2のプロモーター領域にGFP遺伝子を繋げたコンストラクトの導入発現の至適な条件を探っていくとともに、プロモーターに依らずに限局的な電気穿孔法の技術を試していくことで技術的な問題の解決を試みる。

「(1)dMNの発生におけるmicroRNA-9(miR-9)が果たす役割の解明について」は、今後、ROBO3の発現とdMN移動の異常の因果関係について明らかにすることを目指す。このため、ROBO3そのものの異所性発現とdMNの背側への移動との関係について解析を進める予定としている。「(2)dMNおよび副神経運動神経(SAN-MN)の発生におけるHox分子の関与」については、今後強制発現や機能阻害実験を通じてその役割を明らかにしていく。「(3)dMN/SAN-MNの軸索伸展メカニズム解明について」は、Nkx2.2のプロモーター領域にGFP遺伝子を繋げたコンストラクトの導入発現の至適な条件を探っていくとともに、プロモーターに依らずに限局的な電気穿孔法の技術を試していくことで技術的な問題の解決を試みる。
真核微生物Ｐ４５０の高機能化とタンパク質ライブラリの構築

白色腐朽担子菌および褐色腐朽担子菌に由来する304種類のシトクロムP450を用いて、大腸菌を宿主とする膜結合型P450の異種高発現技術を開発した。一連の研究において、P450の異種発現レベルを飛躍的に向上させるN末端配列が見出され、種々のP450をキメラ型酵素として高発現させることが可能になった。本研究において、60種類の真核微生物P450を大腸菌に高発現させたタンパク質ライブラリが完成した。また、麹菌に由来するP450を遺伝子工学的に機能強化して高いイソフラボン変換活性を実現し、生理活性物質生産に向けた有用P450の創出に成功した。1.真核微生物シトクロムP450の異種発現系構築木材不朽担子菌(Phanerochaete chrysosporium, Postia placenta)および麹菌(Aspergillus oryzae)に由来する425種類のP450遺伝子のN末端領域を改変して大腸菌異種発現ベクターを構築した。本年度は、担子菌に由来する304種類の異種発現に挑戦し、大腸菌細胞内に高発現する27種類の分子種を同定することに成功した。また、大腸菌細胞内に発現可能であった分子種のN末端領域を他の分子種と置換したところ、野生型配列では発現が困難であった分子種も効率良く異種発現させることが可能であった。本年度得られた成果は、多くの真核生物P450を大腸菌内で高発現させるための基盤技術として大きな意義を持つ。また、本研究により得られた成果は、動物・植物・微生物など多岐にわたるP450異種高発現を可能とし、様々な研究領域の活性化に繋がる。本研究の成果を基に機能解析・構造解析が促進されることも期待され、P450の配列-構造-機能の関係を深く理解することで、生物機能の高度理解と利用が可能になる。2.真核微生物シトクロムP450の機能強化麹菌(Aspergillus oryzae)に由来するP450の中からイソフラボンに活性を示す分子種を選抜し、遺伝子変異導入を施して機能改変酵素の創出を試みた。変異体を酵母に異種発現させて約1000種類の変異体を獲得し、フラボノイドに対する活性を網羅的に追跡したところ、天然型酵素とは異なる基質特異性を示す酵素が選抜された。本酵素は、高抗酸化活性を有するフラボノイド生産に向けた有用変異体であり、【研究-1】により得られた大腸菌異種発現技術を応用することで、安価な有用フラボノイド生産技術の開発にもつながると予想される。1.真核微生物シトクロムP450の異種発現系構築木材不朽担子菌(Phanerochaete chrysosporium, Postia placenta)に由来する305種類のP450のうち、担子菌に由来する27種類の分子種が大腸菌細胞内に高発現することが前年度までに明らかになった。本年度は、野生型配列では発現困難な278分子種の異種発現を達成することを目的として、大腸菌における発現が確認されているCYP5144C1およびCYP5139D7v1に由来するN末端配列とのキメラ体を作成して異種発現の可否を追跡した。網羅的検討の結果、CYP5144C1およびCYP5139D7v1との平易なキメラ化により、58種類のP450を高発現させることに成功した。本年度得られた成果を基に、動物・植物・微生物など多岐にわたるP450異種高発現が可能となり、基礎・応用研究の発展に繋がる。2.真核微生物シトクロムP450の機能解析大腸菌細胞内に異種高発現したP450の精製条件について検討を加え、膜結合型P450の可溶化に適した界面活性剤を見出した。本年度までに、10種類のP450をアフィニティークロマトグラフィーにより精製している。また、一部のP450についてはin vitroでの酵素反応にも精製しており、本成果を基に機能解析・構造解析が促進されることも期待される。3.真核微生物シトクロムP450の機能強化麹菌(Aspergillus oryzae)に由来するP450の中からイソフラボンに活性を示す分子種の機能改変を試みた。ランダムミューテーションにより変異を導入したP450を酵母に異種発現させたところ、酵母に由来する代謝物を基質として新規化合物を蓄積させる分子種が得られた。現在、新規化合物の構造決定を急ぐと共に、大腸菌異種発現技術を応用した希少天然物生産への可能性についても検討している。1.真核微生物シトクロムP450の異種発現

木材腐朽担子菌に由来する305種類のP450のうち、58種類の分子種が平易なN末端アミノ酸配列改変により大腸菌細胞内で高発現することを前年度までに明らかにした。本年度は、種々の真核生物P450の異種高発現を可能とするN末端アミノ酸配列の決定を目的として、100種類のP450-N末端配列を用いてキメラ体を作成し、網羅的に異種発現レベルを追跡した。検討の結果、少なくとも64種類のN末端配列が種々のP450を効果的に発現させうることが示された。さらに、麹菌Aspergillusoryzae由来のCYP620H9をモデルとした異種発現実験を行ったところ、100種類のP450-N末端配列のうち1種類だけがキメラ配列として利用可能であることが示された。本例が示すように、効果的なP450-N末端配列のスクリーニングにより種々のP450の異種発現が可能となる。2.真核生物シトクロムP450の機能強化麹菌に由来するイソフラボン水酸化酵素にランダム変異を導入して機能強化を目指した。一連の検討の結果、ゲニステイン水酸化活性が2倍に向上した変異体の獲得に成功した。ゲニステイン水酸化体は高い生理活性を示すことが知られており、P450反応を利用した産業応用に期待が持たれる。また、非天然アミノ酸の生産を可能とする変異体の獲得にも成功した。3.微生物ヘム合成経路の活性化と宿主利用前年度までに大腸菌を用いて種々の真核微生物P450の異種発現が可能となることを明らかにした。本年度は、異種発現レベルの向上を目指して、ヘム合成経路を活性化した大腸菌を創出して宿主利用を試みた。5ーアミノレブリン酸合成酵素を活性化することで、大腸菌におけるヘムタンパク質の異種発現レベルが向上することが示され、様々なP450の異種発現技術の向上に繋がると期待された。26年度が最終年度であるため、記入しない。生物工学26年度が最終年度であるため、記入しない。本プロジェクトの最終到達目標は、全ての真核微生物シトクロムP450を高発現するライブラリーを構築するとともに、機能強化P450を創出する点に有る。本年度は、異種発現を可能とする基礎的知見の獲得に成功しており、これらを活用することで研究目標に大きく近づくと考えている。また、P450機能改変も順調に進行しており、さらなる機能強化が期待される。発現系構築へ向けた研究計画として、ステップ1:木材腐朽担子菌および麹菌に由来する425種のP450の野生型配列を用いた発現追跡、ステップ2:発現に成功した分子種とのキメラ化による発現系の改良、ステップ3:異種発現を可能とする配列のデザイン、の三段階で達成する。既に、一斉スクリーニングは終了しており、現在は発現系の改良を試みている段階である。現在までに、異種発現に適したN末端アミノ酸配列を決定できたことに加え、酵素の精製に必要不可欠な可溶化条件の決定にも成功しており、実際に一部の酵素は精製として獲得することに成功している。精製酵素の獲得は、構造解析等への発展研究にも大きなアドバンテージとなる。次年度以降の応用研究に向けた基礎データは概ね揃っており、本年度終了時点での到達度は概ね順調と考えている。さらに、本研究の成果は、多種多様な生物のP450異種発現を可能とする普遍技術として大きな意義を持つ。本研究の成果を活用することで研究目標に大きく近づくとともに、多くの研究者に新しい異種発現技術の提案ができると考えている。また、P450機能強化も順調に進行している。