hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ドライアイスを使用しない霧箱による放射線飛跡の視覚化

中学校「理科」の新学習指導要領に,放射線が約40年ぶりに記述されたにもかかわらず,教育現場で自由に利用できる放射線教育用の教材は,少ないのが現状である。身近な材料で製作できる霧箱も,放射線の飛跡を観察する際には,ドライアイスなどの冷却材が必要となり,学校現場において,必ずしも使い勝手の良い教材ではない。本研究では,教育現場の教員が継続的にかつ柔軟に利用できる放射線教育用教材の開発を実施した。中学校の新学習指導要領「理科」には,放射線に関する記述が約40年ぶりに復活し,放射線教育に対するニーズが高まっている。しかしながら,放射線の測定には専用の検出器が必要となり,教育現場において自由に利用できる環境は整っていない。放射線の飛跡を観察できる霧箱は,身近な材料で作製できる唯一の教材ではあるが,観察時にドライアイスを必要とする不便さがある。本研究では,教育現場の教員が,継続的にかつ柔軟に使用できる新しい放射線教育用教材として,放射線の飛跡を視覚的に確認できるドライアイスを使用しない霧箱を開発してきた。平成21年度は,放射線のエネルギーを吸収させた蛍光体の発光について検討を行った。粉末状蛍光体(銀活性化硫化亜鉛)と放射性同位元素を含む試料(例えば,微量のトリウムを含浸させたマントル)を混合させると,放射線作用による発光現象を暗室において観察でき,新しい教育用教材としての有効性が確認した。しかしながら,その蛍光体からの発光量は微弱なもので,学校の実験室環境では,放射線飛跡の観察は極めて困難であることが判明した。今年度は,超音波振動子が作り出す霧を気化させることで,過飽和状態の領域をつくりだし,放射線の飛跡に伴うイオン化によって,再度,霧化させる条件を見出す。また,ドライアイスの代わりに,市販の冷却ガスやペルチェ素子を用いることで,霧化に必要な急激な温度勾配を生成し,放射線飛跡の観察を試みる。これらの研究項目を実施することで,教育現場の教員が継続的にかつ柔軟に使用できる霧箱を開発し,放射線教育用教材としての有用性を確認し,研究課題を終了する。中学校「理科」の新学習指導要領に,放射線が約40年ぶりに明記されたにもかかわらず,教育現場で自由に利用できる教材は,少ないのが現状である。身近な材料で製作できる霧箱も,放射線の飛跡を観察する際には,冷却材(例えばドライアイス)が必要となり,カリキュラムや学校行事が過密化する教育現場において,必ずしも使い勝手の良い教材とは言えない。蛍光体(銀活性化硫化亜鉛)と放射線との相互作用に着目し,放射線飛跡の可視化を試みたが,発光量が極めて微弱であるため,飛跡を観察することはできなかった。しかし,放射性同位元素を含む試料(微量のトリウムを含浸させたマントル)と粉末状の蛍光体を混合したものを暗室で観察すると,放射線による点状の発光が確認でき,教材としての有効性を見出せた。従来の霧箱については,スターリング冷凍機による冷却を試み,箱内に過飽和状態の領域を生成することで,放射線の飛跡を観察することができた。身近な材料による製作法も報告されているスターリング冷凍機は,熱分野の学習用教材としても活用できるものであり,より安価な教材製作も可能と思われる。従来と全く異なる手法として,超音波振動子によりエタノール-水混合溶液を霧化させ,放射線飛跡の可視化を試みたが,観察するには至らなかった。超音波霧化のメカニズムは,未だ明らかにされていない現象ではあるが,超音波により発生した液滴中のエタノールが濃縮化されているとの報告もあり,今後,霧化の条件を精査することで,放射線飛跡の可視化が期待される。
体内時計が喘息の病態に果たす役割

本研究の目的は、体内時計がアレルギー性喘息の発症または症状発現に果たす役割を解明し、体内時計制御による気管支喘息の予防/治療へのまったく新しいアプローチを提唱することである。異なった感作の時刻で、野生型マウスと時計遺伝子Clock変異マウスを用いてアレルギー性喘息モデル作製した結果、野生型マウスで見られる重症度の違いが時計遺伝子Clock変異マウスでは消失することを見出した。加えて、野生型マウス由来培養樹状細胞(BMDC)におけるToll-like receptor(TLR)4の発現が体内時計によって制御されることを見出した。これらの結果から、アレルギー性喘息発症に体内時計の関与が認められ、それは樹状細胞の体内時計に制御されるTLR4の発現変動に依存している可能性が示唆された。本研究の目的は、免疫担当細胞(マスト細胞など)における「体内時計」が気管支喘息の病態形成に果たす役割について解明し、免疫担当細胞の「体内時計」制御による気管支喘息の予防/治療への新しいアプローチを提唱することである。前年度の研究結果から、マスト細胞の「体内時計」が喘息の症状発現の日内変動に関与する可能性が示唆されている。しかしながら、今年度に野生型マウスと時計遺伝子Clock変異マウスを用いて、AM10:00(朝)とPM10:00(夜)にLPSと卵白アルブミン(OVA)投与によって喘息発症を誘導(感作)したを行った結果、野生型マウスでは感作の時間によって症状の重症度に違いがあり、時計遺伝子Clock変異マウスではどの時間に感作しても同様な症状であることが分かった。この結果から、喘息発症にも「体内時計」が関与することが分かり、その詳細を解析した。アレルゲン感作に最も関与する免疫担当細胞は樹状細胞である。そこで、野生型マウスの骨髄由来培養樹状細胞(BMDC)を用いて、「体内時計」を持つか否かについて検討した。その結果、時計遺伝子が概日性をもって発現していることが確認された。加えて、病原体の特徴的な成分(LPSなど)に対するサイトカイン産生反応、それらの成分を認識する受容体(TLR4)の発現に概日性があることが確認でき、これらの周期性は時計遺伝子Clock変異マウス由来のBMDCでは消失していた。これらの結果から、喘息発症にも「体内時計」が関与していることが分かり、それは樹状細胞の「体内時計」に制御されるTLR4の発現変動に依存している可能性が示唆された。本研究の成果は、樹状細胞の「体内時計」制御による気管支喘息の予防/治療へのまったく新しいアプローチにつながる可能性があることが示唆された。本研究の目的は、マスト細胞における「体内時計」が喘息の病態形成に果たす役割について解明し、マスト細胞の「体内時計」制御による喘息の予防/治療への新しいアプローチを提唱するである。我々は既に野生型マウス由来培養マスト細胞(BMMC)において、時計遺伝子が24時間周期性(概日性)を持って発現し、時計システムを有していることを見出している。そこで野生型マウス由来、主要な時計遺伝子の一つであるClock遺伝子を変異させたマウス由来BMMCを作成し、IgEによる脱顆粒反応に24時間周期性の変動が認められるか否かについて検討した。その結果、野生型マウス由来BMMCでは脱顆粒反応に24時間周期性が確認でき、Clock変異マウス由来BMMCではその周期性が減弱または無くなることが確認できた。また、脱顆粒反応を行った時間に野生型、Clock変異マウス由来BMMCからmRNAを回収し、real-time PCRを用いて解析した結果、IgEのレセプターであるFcεRのalpha鎖、beta鎖の発現にも周期性があり、脱顆粒反応と関係している可能性を示唆する結果を得ている。加えて、野生型、Clock変異マウス由来BMMCをマスト細胞欠損マウス(W/Wvマウス)の皮下に移入し、野生型マスト細胞をもつマウス、Clock遺伝子変異マスト細胞をもつマウス(マスト細胞に"時計遺伝子"機能がないマウス)の作成に成功した。そのマウスを用いて、生体内における脱顆粒反応に周期性があるか否かを解析した結果、野生型マスト細胞を移入したマウスではPM10:00(げっ歯類における朝)に強く、AM10:00(げっ歯類における夜)に弱いという周期性が確認でき、Clock遺伝子変異マスト細胞を移入したマウスではその周期が消失していた。これらの結果は「体内時計」とアレルギー疾患(喘息)が強く関連していること示唆してる。マスト細胞における概日リズム性の機能については、脱顆粒反応に周期性があることが分かり、その周期が時計遺伝子Clockの変異によって消失することが確認できている。さらにIgEのレセプターであるFcεRのalpha鎖、beta鎖の発現にも周期性があり、これらの発現も時計遺伝子Clock変異によって消失することも確認できた。

これらの結果から、マスト細胞における概日リズム性機能の一つは脱顆粒反応であり、その周期性は時計遺伝子に依存してることが分かった。さらに、予備で行ったマスト細胞欠損マウスの皮下に野生型、時計遺伝子Clock変異マウスから作成したマスト細胞を移入した実験では、生体内においてもマスト細胞の脱顆粒反応に周期性があり、Clock変異によってその周期が消失することが確認できている。これらのことから、マスト細胞における概日リズム性の機能は完全でないが特定できており、その機能を制御する分子・遺伝子も特定できている。さらに、喘息モデルで作成を試みる時計遺伝子変異マスト細胞移入マウスの作成も達成できており、時計遺伝子変異による喘息病態形成に影響があることも予想できる。以上の理由からおおむね順調に進展していると考えられる。1.マスト細胞における概日リズム性の機能の同定これまでにマスト細胞の体内時計の概日性に伴い、脱顆粒反応も概日性を持つことが視されている。しかし、完全にどの分子または遺伝子がまでは同定できていないのでさらに詳細を追及する。2.マスト細胞選択的に「時計遺伝子」が欠如したマウスを用いた喘息モデルの作成と解析時計遺伝子群において中心的な役割を果しているPer2遺伝子の欠損マウス、またはClock遺伝子の欠損マウスが既に樹立されており、概日リズムの乱れが観察されている。これらのマウスの骨髄細胞をIL-3/SCFの条件下で培養しBMMCを得たあと、マスト細胞欠損マウス(W/Wvマウス)に移入し、Per2またはClock遺伝子欠損マスト細胞をもつマウス(マスト細胞に"時計遺伝子"機能がないマウス)を作成する。同時に、野生型マウス由来のBMMCをW/Wvマウスに移入したコントロールマウスを樹立する。その後、これらのマウスに対して卵白アルブミン(OVA)及びLPSの同時吸入による感作後、OVAを吸入チャレンジすることによって既報のように喘息モデルを作成し(J Exp Med 196:1645,2002)、肺における好酸球浸潤、気管支肺胞洗浄液中のTh2タイプサイトカイン濃度(IL-4,IL-5, IL-13など)、上皮細胞由来のTSLP、IL-33の発現、血清中のIgE濃度、脾臓T細胞のOVA刺激に対するサイトカイン産生(IL-4, IL-13, IFN-gなど)について検討し、マスト細胞における時計遺伝子欠如が喘息反応に与える影響について解析する。また、OVAチャレンジの時間を日中と夜間の2パターンで行い、抗原(アレルゲン)がチャレンジされる時間によって喘息反応の強さに違いが認められるか否かについてもコントロール及びマスト細胞Per2またはClock遺伝子欠損マウスにおいて検討する。1.実験用試薬・器具類購入費:マスト細胞培養用試薬、時計遺伝子の発現検討や脱顆粒反応の検出用試薬などは本実験に必須である。(70万円)2.実験用動物(マウス)購入費:本研究はマウスを用いた個体レベルの実験であり本費用は必須である。(70万円)(野生型マウス約200匹/年および肥満細胞欠損マウス約50匹/年)3.旅費(10万円):日本アレルギー学会、日本免疫学会参加費用。
グリコサミノグリカンを用いた歯髄・根尖歯周組織の局所的・連続的再生療法の検討

本研究では,歯髄・根尖歯周組織の局所的・連続的再生療法を確立するため,基礎研究としてFGF2徐放性ゼラチン粒子やヒアルロン酸スポンジによる新生象牙質形成誘導,象牙芽細胞様細胞の熱耐性・炎症応答・BMP2-Smadシグナル伝達経路,およびBMP2誘導性骨芽細胞分化への半導体レーザーの影響を解析するとともに,臨床における歯髄・根尖病変組織の採取方法樹立の基盤となる顕微鏡下治療技術を確立した.本研究では,歯髄・根尖歯周組織の局所的・連続的再生療法を確立するため,基礎研究としてFGF2徐放性ゼラチン粒子やヒアルロン酸スポンジによる新生象牙質形成誘導,象牙芽細胞様細胞の熱耐性・炎症応答・BMP2-Smadシグナル伝達経路,およびBMP2誘導性骨芽細胞分化への半導体レーザーの影響を解析するとともに,臨床における歯髄・根尖病変組織の採取方法樹立の基盤となる顕微鏡下治療技術を確立した.本研究の最終目的は歯髄・根尖歯周組織に各種グリコサミノグリカン(GAG)を応用し象牙質-歯髄複合体及び根尖歯周組織の局所的・連続的再生療法を確立にある.これまでに私達は,歯髄創傷治癒過程での歯髄アポトーシスと修復象牙質形成の相互作用や歯髄細胞回復能への各種刺激の影響について明らかにしてきた.またgelatinhydrogelからのFGF-2徐放による象牙質欠損部への新生象牙質形成誘導や象牙芽細胞様歯髄細胞株の樹立等,歯髄再生に必須の研究成果を挙げてきた.本年度の研究結果は2点に大別される.第1点は,これまでの成果を発展させ,細菌性リボ多糖(LPS)刺激に対し樹立象牙芽細胞様細胞が炎症応答を示すことおよびオゾン水によりLPS刺激が抑制されること(Noguchi et al., J Endod, 2009in press),また,gelatin hydrogelから徐放されるFGF-2量を制御することで象牙質欠損部に増殖した歯髄組織最表層にdentin bridgeを誘導できることを明らかにした(Ishimatsu et al., J Endod,2009 in press).さらに,GAGの1つであるピアルロン酸による神経細胞分化(突起伸長)抑制メカニズムをPCI2細胞を用いたin vitro実験系で明らかにするとともに,再生医療用スキャフォールドとしてのピアルロン酸スポンジの有用性を明らかにするためin vitro, in vivo実験系でコラーゲンスポンジと比較し細胞付着あるいは炎症応答におけるピアルロン酸スポンジの有用性を明らかにした.両成果は現在投稿中である.第2点は,本研究費の購入備品であるマイクロスコープを用い,将来的に実施する傷害を受けた歯髄あるいは根尖病変組織の採取方法確立に向けて,顕微鏡下での治療器具の検討等を実施した.今後は器具改良と組織採取・保存について検討予定である.本研究の最終目的は歯髄・根尖歯周組織に各種グリコサミノグリカン(GAG)を応用し象牙質-歯髄複合体及び根尖歯周組織の局所的・連続的再生療法を確立にある.これまでに私達は,歯髄創傷治癒過程での歯髄アポトーシスと修復象牙質形成の相互作用,歯髄細胞回復能への各種刺激の影響,およびオゾン水による象牙芽細胞様細胞に対する細菌性リポ多糖(LPS)刺激の抑制ついて明らかにしてきた.またgelatin hydrogelからのFGF-2徐放による象牙質欠損部への新生象牙質形成誘導や象牙芽細胞様歯髄細胞株の樹立等,歯髄再生に必須の研究成果を挙げてきた.本年度の研究結果は2点に大別される.第1点は,GAGの1つであるヒアルロン酸からなる再生医療用スキャフォールドとしてのヒアルロン酸スポンジの有用性を明らかにするためin vitro, in vivo実験系でコラーゲンスポンジと比較し細胞付着あるいは炎症応答におけるヒアルロン酸スポンジの有用性を明らかにした(Inuyama et al., J Biomed Mater Res B).さらに,GAGの1つであるヒアルロン酸による神経細胞分化(突起伸長)抑制メカニズムをPC12細胞を用いたin vitro実験系で明らかにした(Washio et al., Exp Cell Res).第2点は,本研究費の購入備品であるマイクロスコープを用い,将来的に実施する傷害を受けた歯髄あるいは根尖病変組織の採取方法確立に向けて,顕微鏡下での治療技術開発と治療器具の検討を実施した.

今後はさらに器具改良と組織採取・保存について検討するとともに臨床治験を実施する環境を整えていく予定である.本研究の最終目的は歯髄・根尖歯周組織に各種グリコサミノグリカン(GAG)を応用し象牙質-歯髄複合体及び根尖歯周組織の局所的・連続的再生療法を確立にある.これまでに私達は,歯髄創傷治癒過程での歯髄アポトーシスと修復象牙質形成の相互作用,歯髄細胞回復能への各種刺激の影響,およびオゾン水による象牙芽細胞様細胞に対する細菌性リポ多糖(LPS)刺激の抑制ついて明らかにしてきた.またgelatin hydrogelからのFGF-2徐放による象牙質欠損部への新生象牙質形成誘導や象牙芽細胞様歯髄細胞株の樹立等,歯髄再生に必須の研究成果を挙げてきた.本年度の研究結果は2点に大別される.第1点はin vitro実験系において,栄養条件の異なる環境下における象牙芽細胞様細胞に熱刺激を加えることで象牙芽細胞様細胞は熱耐性,炎症応答を示すこと(Morotomi et al., J Endod), BMP-2刺激により骨芽細胞に分化するC2C12細胞を用い,半導体レーザー照射により骨芽細胞分化が促進されること(Hirata et al., J Cell Biochem),および象牙芽細胞様細胞にBMP-2を加えることでSmadシグナル伝達経路が活性化しDSPおよびDMP1発現に影響を与えること(投稿中)を明らかにしたことである。第2点は臨床において,本研究費の購入備品であるマイクロスコープを用い,将来的に実施する傷害を受けた歯髄あるいは根尖病変組織の採取方法確立に向けて,顕微鏡下での治療技術の検討を実施したことである.今後は組織採取・保存と臨床治験を実施する環境を整えていく予定である.
パーキンソン病の環境的並びに遺伝的因子の解明

パーキンソン病は加齢、環境因子、遺伝的素因の3つの要因による多因子遺伝性の中脳黒質細胞の変性疾患である。これらの3要因の検索のために、医療機関を外来通院中の患者64名の同意を得て、末梢血液を採取しDNAを抽出した。これや患者集団の遺伝的変異を正常健康者集団におけるそれらと比較するために、医学部学生にも同意を得て彼らの採血も行った。そこで、外来物質の解毒作用を有するシトクロームP450デブリソキン/スパルテイン遺伝子のDNA変異を検索した所、日本人集団における新しい酵素機能欠損を伴うDNA変異を同定した。このDNA変異は白人集団では同定されず、東洋人に特有の変異と思われた。パーキンソン患者46名におけるこのDNA変異の頻度は健康者集団における頻度と有意な相違は見られず、疾患との相関はみられなかった。ドーパミン転移酵素の変異を検出するために、PCRによる40塩基の反復配列回数の個体差の検出を試みた所、正常日本人集団において7、9、10、11回と反復回数の異なる遺伝子型が同定された。これらの変異はメンデルの共優性遺伝性を示した。パーキンソン病患者集団における遺伝子変異の頻度は正常者集団と有意な差がみられなかった。さらに、加齢と共に遺伝子頻度の減少するアポプロテインE(ApoE)の4型遺伝子頻度をパーキンソン患者集団において検索した結果、正常若年者に比べて2倍の頻度で検出され、パーキンソン患者において有意に高かった。
CD271陽性がん幹細胞標的治療法の確立

申請者らはこれまで、下咽頭がんが腫瘍形成するためにはCD271(神経成長因子受容体)の働きが必須であり、CD271陽性がん細胞によってCD271陰性がん細胞を含むヘテロな腫瘍組織が構築されることを明らかにしてきた。したがって、CD271の機能を阻害することができれば、腫瘍全体を縮小へ向かわせることが可能であると考えられる。
疼痛緩和に対する貼付用剤(リドカインテープ)の評価方法と臨床効果に関する研究

静脈穿刺時の疼痛緩和効果を目的として開発された60%リドカインテープ(ペンレス^<【○!R】>)の有用性について検討した。《研究1》健康成人を対象とし、前腕部屈側に貼付したテープの種類および貼付時間によりリドカインテープ30分、60分および90分間貼付群、プラシボテープ30分および60分間貼付群の5群に分類した。テープ貼付側と非貼付側への静脈穿刺の痛みをVisual Analogue Scale(VAS)を用いて、被験者自身に評価させるとともにその有効性、副作用についても調査した。〈結果〉1.リドカインテープ60分および90分間貼付群はリドカインテープ30分間貼付群、プラシボテープ貼付側に比較して有意に疼痛を緩和した(p<0.01)。2.リドカインテープ60分および90分間貼付群では被験者自身による有効性の評価も高かった。3.副作用の発現率は各群30%前後であったが、その症状はすべて一過性の発赤、掻痒感の局所的なものであり、症状の持続や全身的な症状を呈したものは認められなかった。《研究2》リドカインテープ貼付による影響、特に血管拡張作用を観察するため、健康成人を対象とし、リドカインテープ30分、60分および90分間貼付群とプラシボテープ60分間貼付群のテープ除去後の平均皮膚温を医用サーモグラィ装置を用いて観察した。〈結果〉1.リドカインの血管拡張に基づく皮膚血流量の増加からのテープ貼付部皮膚温の上昇は認められなかった。2.テープ剥離の物理的刺激またはテープ基剤の影響によると思われる0.40.5°Cの低温を示したが、貼付部周囲皮膚温に比較し有意な温度変化ではなかった。今後、サーモグラフィとともに非侵襲型ドップラー血流計による皮膚血流量の測定を加える必要がある。以上のことから、60%リドカインテープの6090分間の貼付は静脈穿刺時の疼痛緩和に有用である。
古代中近東世界における王の宗教的役割：紀元前２千年紀ヒッタイトの王権観を中心に

本研究の目的は、紀元前2千年紀後半のアナトリアに栄えたヒッタイト王国における、神々と人間の仲介者としての王の宗教的役割に焦点を当て、ヒッタイト独自の王権観を解明し、それを古代オリエント諸地域に見られる君主像と比較することである。本研究では、在位中の王がどのように神々の「神命」を受け取り、それを人々へ伝えたのか(研究1)、そして死した王がどのように神格化され、いかに「神命」と王位が後継者へ受け継がれたのか(研究2)という、王の生前と死後に着目する二方向からのアプローチを試みる。平成30年度は主に研究1を実施した。研究1の目的は、王と王妃による祈りの文書の言及される「神命」とは神々が人間に求めた信仰方法を意味していた点を確認し、神々の祭儀の内容にかんする個別の「神命」は占いによって言語化されるものであったことを明らかにすることである。前期には、王家の祈りの文書の読解と該当箇所の日本語翻訳を行い、神々から王への「神命」の内容について整理した。その成果は平成31年3月のアッシリア学研究会で発表した。また、平成30年7月には、ヘルシンキで開催された国際聖書文学学会に参加し、“Divine Embodiment of Territorial Boundaries of the Hittite Kingdom"という題目で口頭発表を行い、ヒッタイト王国の王権観と領土との関連性について報告した。その中では、神殿建設の際の儀礼を記録した『王国と神々の法』等に見える王権観について論じた。当初の予定通り、平成30年度は、本研究を始めるにあたっての基礎的な研究として、ヒッタイト王と神々の関係に着目した王権観についての研究を行った。次年度以降についても当初の計画に沿って研究を遂行する。次年度は、前期に引き続き研究1を実施し、後期に研究2に着手する。前期には、国家祭儀を記録した文書の中に規定される王の儀礼行為が、昨年度に整理した「神命」の内容と一致するか否かを確認する。なお、これらの文書については日本語への翻訳を行う。この作業にあたっては、夏期にドイツ・マインツで行われている祭儀文書コーパスにかんするプロジェクトを視察する。また、科研費若手研究Bにおける課題において撮影・収集したトルコのレリーフと碑文史料を用い、上記の研究における理解を補完する。
新規放射線増感剤による悪性神経内分泌腫瘍に対する内照射療法の効果増強

ヒト神経芽細胞腫(SK-N-SH)腹腔内播種モデルに対する^<131>I標識metaiodobenzylguanidine投与では、腹腔内投与の方が、静脈内投与よりも腫瘍集積は良好であった。腹腔内播種モデルマウスに対する^<131>I標識metaiodobenzylguanidineによる実験的内照射療法では、静脈投与群と未治療群で平均生存期間に有意差は認められなかったが、腹腔内投与群で有意に牛存期間の延長が認められた。本年度は、本研究の主目的であるsulfoquinovosylacylglycerolによる^<131>I標識metaiodobenzylguanidine内照射療法効果増強確認のための基礎的データ収集を行った。ヒト神経芽細胞腫(SK-N-SH)皮下担癌ヌードマウスモデルおよび腹腔内播種モデルにおいて、^<131>I標識metaiodobenzylguanidineの腫瘍集積性を検討した。静脈内投与6時間後における皮下腫瘍集積は1.40%ID/gであった。一方、静脈内投与における腹腔内腫瘍への集積は、3時間後1.22%ID/g、6時間後1.99%ID/gと皮下担癌腫瘍と同様であったのに対し、腹腔内に^<131>I標識metaiodobenzylguanidineを投与した場合には、投与2時間後35.9%ID/g、6時間後15.5%ID/gと非常に良好な腫瘍集積を示した。同一投与量における腹腔内播種腫瘍線量をMIRD法で推定したところ、静脈内投与では450cGy、腹腔内投与では4140cGyと腹腔内投与で充分な線量を確保できると同時に、主要臓器における治療効果比に約4-14倍の差が認められ、抗腫瘍効果と毒性の両面において、腹腔内投与の優位性が明らかであった。従来から、放射能標識抗体では指摘されていたことであるが、抗体が分子量15万と大きなタンパクであるのに対し^<131>I標識metaiodobenzylguanidineは300弱の小分子であるため体腔内から循環系への吸収がより迅速に生じる可能性があり、^<131>I標識metaiodobenzylguanidine体腔内投与の意義は従来検討されていなかった。今回の結果から、体腔内に播種した状態では、静脈内全身投与よりも、体腔内投与が望ましいことがわかる。また、内照射療法に用いることができる可能性のある候補分子の多くが^<131>I標識metaiodobenzylguanidine同様の小分子であるため、他の内照射用製剤でも体腔内投与が有効に機能するであろうことを示唆する。さらに、本研究の主題であるSulfoquinovosylacylglycerolも小分子であり、Sulfoquinovosylacylglycerolと^<131>I標識metaiodobenzylguanidineの双方を体腔内投与することによる利益をも意味するものであると考える。昨年度の検討から、^<131>I標識metaiodobenzylguanidineのような小分子化合物においても、体腔内に播種した状況における内照射療法は静脈内投与による全身投与よりも体腔内投与による局所への投与が望ましいであろうことが示された。本年度は、ヒト神経芽細胞腫(SK-N-SH)腹腔内播種モデルにおいて^<131>I標識metaiodobenzylguanidineによる実験的内照射療法を行った。^<131>I標識metaiodobenzylguanidineを一匹当たり9.25-74MBqの範囲で段階的に静脈内投与量を増加し、末梢血血小板数で毒性を評価したところ、投与量依存性に血小板減少が認められたが、どの群においても投与8-9週後に投与前の値まで回復した。4×10^6の細胞を腹腔内投与し、2週後に55.5MBqの^<131>I標識metaiodobenzylguanidineを静脈投与した群、腹腔内投与した群、未治療群で生存期間を比較した。静脈投与群の平均生存期間は、60.6±2.8日と、未治療群59.3±3.9日と比べ全く差が認められなかった。一方、腹腔内投与群では、94.7±17.5日と有意(p<0.02)に生存期間延長が認められた。体重減少で毒性を評価したところ、静脈内投与と腹腔内投与で差は認められなかった。以上の結果から、経時的体内動態観察結果・生体内線量分布観察結果から予測されたように、腹腔内播種神経芽細胞腫に対しては、腹腔内局所^<131>I標識metaiodobenzylguanidine投与による内照射療法の利益が大きいものと考えられた。なお、本研究課題のsulfoquinovosylacylglycerolは動物実験実施に必要な量が確保できなかったため、その内照射療法併用時の有効性を検証できなかったが、分子量約300の小分子量化合物である^<131>

I標識metaiodobenzylguanidineが体腔内投与で望ましい挙動を示したことにより、同様に小分子量化合物であるsulfoquinovosylacylglycerolの同時体腔内投与の方向性を示すことができたと考える。
高強度、高延性をもつTi、Zr、Hf、Nb、Ta基ナノ準結晶合金の創製

高いガラス形成能をもつジルコニウム基四元合金に対して、従来ガラス形成能を低くするため添加元素として用いられなかったパラジウム、金、白金などの元素を意図的に微少添加するにより、ナノメートルサイズの正20面体準結晶が生成することを見出した。また、組成の異なるジルコニウム合金系では、ジルコニウム-アルミニウム-ニッケル-銅ガラス合金に対して、バナジウム、ニオブ、タンタルの添加により、正20面体準結晶が生成することを明らかにした。さらに、ジルコニウム70原子パーセント-パラジウム30原子パーセントおよびジルコニウム80原子パーセント-白金20原子パーセントの二元系ジルコニウム合金においても液体急冷による得た試料の初相として20ナノメートル以下の正20面体準結晶が析出することを明らかにした。その他の合金系としては、急速凝固により得たハフニウム-貴金属-遷移金属-アルミニウム合金が正20面体もしくは立方体からなる準結晶を生成することを明らかにした。チタン基においても、チタン-ニッケル-ジルコニウム-イットリウム合金で、液体急冷法を用いることにより準結晶相が得られることを明らかにした。これら一連の研究から、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、ニオブ、タンタルを構成元素とする準結晶材料の創製の基礎を築いた。これらの準結晶生成に関して、熱力学を基礎とする理論的なアプローチをおこない、キャビテイー生成エンタルピーと結晶化温度との相関を半経験的な統計解析から導出した。これにより、多元系金属ガラスの結晶化温度の算出に成功した。この計算モデルを拡張することにより、今後、準結晶創製のための新しい知見が導き出されるものと考えられる。ジルコニウム-アルミニウム-ニッケル-銅ガラス合金にニオブ、タンタル、バナジウムを添加することにより正二十面体準結晶相が生成することを明らかにした。液体急冷した金属ガラスを熱分析することにより、この正二十面体準結晶相は明瞭なガラス遷移の後の二段結晶プロセスにおける第一相として生成することを明らかにした。結晶化開始温度は、ニオブを含む合金で705K、タンタルを含む合金で710K、バナジウムを含む合金で702Kである。ニオブ、タンタル、バナジウムおよび貴金属元素の添加により、ジルコニウム-アルミニウム-ニッケル-銅ガラス合金でナノスケールサイズの正二十面体準結晶相が生成する理由は、準結晶相の析出のための核生成頻度の増加およびジルコニウム-アルミニウム-ニッケル-銅ガラス合金の中に短範囲規則が存在するためである。また、単ロール液体急冷法により、ハフニウム-ニッケル-銅-チタン系で金属ガラスが生成することを見出すとともに、この金属ガラスの熱分析結果から、二段の結晶化ピークの低温側の結晶化ピークが準結晶相の析出に対応することを明らかにした。生成する正二十面体準結晶相のサイズは20から40ナノメートルである。等温焼鈍により正二十面体準結晶層は安定層へと相変態することから正二十面体準結晶相は準安定相であることを明らかにした。さらに、液体急冷したジルコニウム-パラジウム二元系合金で初相として準結晶が生成し、そのサイズは十ナノメートル以下で均一分散して生成することを見出すとともに、ニッケルの添加によりこの二元系準結晶相が安定化することを見出した。これらの金属ガラスに見られる正二十面体準結晶相の析出は、構成元素の化学的な類似性により説明することが可能である。
タンパク質プロファイリングによるコンブの環境ストレスマーカーの探索

Saccharinajaponicaの生育状況に違いが見られた水温と栄養塩濃度によるストレスによって発現量が変化するタンパク質の数と量を比較した。その結果、高水温で発現量が増加する47つと、温度上昇に伴い減少する7つのスポットが検出された。また、貧栄養環境で増加するスポットも少数見つかった。泳動像を比較した結果、これらのいくつかは高温環境で増加する既知のタンパク質に一致すると考えられ、環境ストレスマーカーとしての利用が期待される。本申請課題は、北海道南西部沿岸に生育するマコンブSaccharina japonicaについてプロテオーム解析を行い、探索された環境ストレスタンパク質をバイオマーカーとして各地のコンブ藻場の健全性を診断するための手法を確立するものである。本年度は、先ず、北海道の南西部日本海沿岸から津軽海峡沿岸にかけてマコンブ群落の衰退・消失が進行している現状をふまえ、(1)健全性が損なわれているコンブ藻場(小樽市忍路湾周辺)、(2)健全性が損なわれつつあるコンブ藻場(函館市住吉漁港周辺)、(3)健全性が保たれているコンブ藻場(函館市臼尻漁港周辺)を選定し、各藻場について、夏季(予備調査)、秋季および冬季に生育環境を調査した。その結果、コンブ藻場の健全性は各種栄養塩濃度(NO2+NO3、NO2、PO4、NH4)や塩分濃度との間に目立った相関は見られず、現場の海水温に関係があることが示された。また、各地域において採集・凍結保存された胞子体について、エタノール/フェノール法でタンパク質を抽出し、一次元・二次元電気泳動で展開したところ、再現性のある泳動スポットが得られた。更に、これらスポットについて分光分析を行い、また、既存の暖海性カジメの分析データと照らし合わせてプロファイリングを行った結果、高水温期に発現量が上昇するバナジウム依存性ブロモペルオキシターゼ(vBPO)活性を示す複数のスポットなどが特定できた。今後、現在進行中の培養実験によりそれぞれのタンパク質発現量増加のための環境因子を特定することにより、目的とするバイオマーカーの検出が期待できる。本年度は、前年度に引き続き3カ月毎に函館市臼尻町(健全域)、函館市住吉町(衰退域)、小樽市忍路町(磯焼域)の沿岸において、栄養塩(硝酸態窒素,亜硝酸態窒素,アンモニア態窒素,リン酸態リン),水温,塩分等の測定を行った。4回の調査の結果、忍路における2地点では、春季に他の調査域より塩濃度の低下(およそ28PSU)が確認されたが、今年3月の調査ではいずれの地点においても塩濃度が28-29PSUであったため、一時的な塩濃度の低下はコンブの生育に大きく影響しないことが推察された。また、新たに測定項目を設け調査を行っているが、pHや濁度(忍路は海水中の砂の流動のため高い調査地点によって高い値を示した)等にも大きな違いは認められなかった。一方、栄養塩と水温については、試験区ごとに差異が検出され、これらが藻場衰退の主要因となっていることが示唆された。また、各地域において採集・凍結保存された胞子体について、前年度に続いて抽出タンパク質の一次元・二次元電気泳動を行い、高水温期に発現量が著しく増加するハロペルオキシターゼ活性や光合成、ATP合成などに関わるタンパクスポットをおよそ40程度特定した。現在、衰退域において採取した成熟胞子体から遊走子を単離し、培養して育てた胞子体について、水温ストレスおよび栄養塩ストレスを与える実験を進めており、その発現タンパク質データをこれまで得られた天然藻体のデータと照らし合わせることにより目的とするバイオマーカーの検出が期待できる。Saccharina japonicaの野生株と培養株を用いて、環境条件依存性のタンパク質の探索を行った。野生株は、藻場の衰退が報告されていない地域、藻場の衰退が進行していると考えられる地域、磯焼けが報告される地域から採集するとともに、藻場の衰退に関わる環境要因の調査を行った。環境調査の結果、各地域の環境水のpH、塩分、溶存酸素量には有意な差が認められなかった。しかし、健全域に対して、衰退域と磯焼け域の水温は年間を通じて1-3°Cほど高かった。また、各種栄養塩濃度は、各地点で大きな差異が認められたが、その優位性は海水の採水時期によって変わり、一定の傾向は見られなかった。地点間で差異が認められ水温と栄養塩濃度が本種の生育に影響を及ぼすことが推察されたため、これらの環境条件の変化に伴って発現量が変化するタンパク質の探索を行った。衰退域の個体について、生育に適した条件で中間育成して実験に供した。短期間のストレス(高温・貧栄養)を与えた胞子体からタンパク質を抽出し、アクリルアミドゲル二次元電気泳動によって、タンパク質を分画した。

温度試験区全体で、1633のスポットが得られた。水温の上昇に伴って増加した、あるいは20°C,25°C,30°Cの高水温環境でのみ発現するスポットが220検出された。その中で、特に発現量が多い29のスポットについては、その種類や機能については今後の研究課題である。一方、いずれの条件においても発現しているスポットが、120見つかっている。これらは、培養条件に応じた変化が認められなかったが、概して発現量が高く、重要な機能を持ったものであることが示唆された。通常の培養液の2-4倍量の栄養塩を添加して培養した個体については、特異的なスポットが検出されなかったが、貧栄養の試験区ではいくつかの特異的なスポットが検出されており、環境ストレスを検出するマーカーとして期待される。培養藻体のタンパク質解析に用いるための胞子体の培養に時間を要しているため、その部分の解析では予定よりも遅れているが、環境調査および天然藻体のタンパク質解析、DNAマーカーの検出手法の確立は予定通りあるいは予定以上に進行しており、全体としてはおおむね順調に進展していると考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでは天然藻体の環境調査および、タンパク解析を中心に進めてきたが今後は培養藻体のタンパク質解析を積極的に進め、得られた双方のデータを照らし合わせてバイオマーカーとして有用なタンパクスポットを特定する予定である。現在、培養実験に使用する胞子体の培養を進めているが、水産試験場の大型水槽を利用し、実験の効率化を図っている。
菌糸成長の細胞極性に微小管配向はどのように関わっているか

二形性を有し、日和見感染にも関わる酵母Candida albicansを材料に、その形態形成における微小管の役割を解析するため、分泌オルガネラの細胞内分布と細胞骨格の関係について調べた。分泌阻害剤brefeldin A処理により菌体内部にゴルジ体様構造が蓄積することをすでに報告したが、その局在を微小管の阻害剤が著しく乱すことを新たに報告した。酵母の分泌に重要な細胞骨格要素としてアクチンが有名であるが、このゴルジ体様構造の局在にはアクチンは関与していないことも併せて示した。さらに微小管形成の制御について洞察を深めるため、制御因子の一つとして知られるγチューブリン遺伝子をこの材料から単離し、その機能、構造の解析を開始した。方法として、近縁であり、かつ遺伝子解析が容易なパン酵母S.cerevisiaeを用いた。γチューブリンは普遍性の高いタンパクであるが、C.albicansのγチューブリン様遺伝子は他の生物のそれと相同性が極めて低い.ことをすでに昨年度明らかにしている。C.albicansγチューブリン様遺伝子を多量発現させたところ、パン酵母自身のγチューブリンを相捕することが分かった。また緑色蛍光タンパク(GFP)との融合遺伝子は、パン酵母の微小管形成中心に局在した。C.albicansのγチューブリン様遺伝子はパン酵母のそれとも相同性が極めて低く、それでもなお局在し、相捕する能力があったことは、チューブリン研究において極めて意外な結果であった。現在これらの結果を受け、共通性を突き詰めることでγチューブリンの基本的構造が見い出せるのではないかと考え、検討を進めている。他方、C.albicansγチューブリンに置き変えられたγチューブリンを持つパン酵母は、いくつかの微小管阻害剤に異なる感受性を示した。違いの原因遺伝子がγチューブリン遺伝子であることから、これまで知られていない阻害剤の標的として、応用的観点からも今後検討すべき結果を得た。先端成長は様々な細胞形態形成の内でも最も基本的な形式の一つである。本研究では、二形性酵母Candida albicansの先端成長を対象に、先端成長における細胞極性と細胞骨格要素、特に微小管との関わりについて調べた。分泌オルガネラの局在を細胞極性の指標に、微小管破壊剤の細胞極性に対する影響を調べたところ、微小管破壊剤は成長先端近くのゴルジ体様構造の集合を解消し、それらを細胞全体に分散させる効果があった。この結果は、微小管が細胞全体での極性に関与している可能性を示している。他の主要な細胞骨格要素アクチンは、局所的な分泌極性に関与していると思われる結果も得られ、カビの先端成長において各細胞骨格要素に機能的な分業があると推察された。さらに、菌糸中の微小管自身の極性を検討するため、微小管形成中心物質であるガンマチューブリンをC.albicansにおいて探索し、その細胞内局在を調べた。PCRを利用し、C.albicansガンマチューブリン遺伝子を見い出した。そのガンマチューブリン遺伝子とGFP(Green Fluorescence Protein)の融合遺伝子を作製し、細胞内で発現させた場合の融合タンパク質局在を調べたところ、この遺伝子の産物はSPBに局在し、他には特定の局在を示さなかった。このことから、このカビの菌糸中に延びる微小管は、菌糸先端をマイナス端とした微小管であることが示唆された。今回見つけたC.albicansガンマチューブリン遺伝子は、近縁種と考えられる酵母Saccharomyces cerevisiaeとも著しく異なっており、本研究により酵母類におけるガンマチューブリン遺伝子の進化の多様性が明らかになった。違いの原因
減数分裂におけるイネ異種ゲノム間の染色体認識機構の研究

野生イネは、イネが栽培化過程で失った多数の遺伝子を保存する貴重な遺伝資源である。その中には、病気や害虫に対する抵抗性など、農業上有用な遺伝子も多数含まれるが、それらを従来の交雑育種法により栽培イネに導入するのは非常に難しい。最大の原因は、両親のゲノム構造が分化過程で多様化し、雑種第一代の減数分裂異常により種子不稔が生じ、種間での遺伝子交換が制限されるためである。本研究の目的は、雑種第一代植物の減数分裂細胞で、染色体認識などに関わる遺伝子を突き止め、その機能を解析することである。将来的には、ゲノム編集技術などにより当該遺伝子機能を改変し、野生イネの有用遺伝子の育種利用を促進できると考えている。
アンチセンオリゴを用いたDuchenne型筋ジストロフィー治療への試み-revertant fiberの発現機序を応用して-

1.イントロン配列の決定とアンチセンスオリゴの作製mdxではエクソン23にpoint mutationが存在しこれがstop codonとなりジストロフィンが欠損している。そこでエクソン23をskipするsplicingを作らせるためのアンチセンスオリゴを決めるためエクソン23の配列をプライマーとして利用するreverse PCR法を用いイントロン23の配列を決定した。既知のアンチセンスオリゴはエクソン23へのスプライシングのacceptor siteを隠すように設計した。2. mdx筋培養系の作製とアンチセンスオリゴ処理増殖能の高い胎児筋を取りだし、grouth mediumでconfluentになるまで培養し分化誘填導の際のdexamethazoneとアンチセンスオリゴで処理した。3.培養系でのジストロフィン陽性細胞の確認ジストロフィン免疫組織化学染色による蛋白質の確認とRT-PCR法によるスプライシングの変化の確認を組み合わせて確認することにした。N末端からC末端までの異なるドメインを認識する4種類の抗ジストロフィン抗体を用いた免疫組織化学染色を行い陽性細胞の頻度からアンチセンスオリゴの効率の評価を試みたが、ジストロフン発現時期のmyotubeになると細胞が剥がれ生存が困難になり十分量の細胞が得られなかった。方法の検討が必要となり現在mdxマウスを用いたin vivoでの実験系で検討中である。
分子認識機能界面とセンシング

本研究では、新しいセンシング機能界面の創製を目指して、1)制御無機・有機複合化界面の創製、2)酵素モデル構造性金属錯体等を用いた生体機能界面の構築、3)無機固体界面を用いたガスセンサ機能界面の構築、などの研究を進め、以下のような研究成果を得た。1.制御無機・有機複合化界面での分子認識機能の発現に関して、シトクロムcの電気化学応答に対する明確な界面構造依存性を2-、4-ピリジンチオール(2-PySH、4-PySH)、2-ピリミジンチオール(2-PymSH)等を用いて示し、その界面構造や吸着分子のピリジン窒素のpKaは変化などをSTM測定および表面赤外分光測定から明らかにした。4-PySHの金(100)面上での吸着構造やアントラキノン部位を持つアルキルチオールの金電極上へ吸着挙動を明らかにした。2.生体機能界面の創製と応用において、ヘムエリトリン酵素機能を有する多電子移動型のルテニウムニ核錯体の電極上への固定化に成功し、その特性を明らかにした。また、2-PymSH修飾金電極上では銅タンパク質であるアズリンの速い電子移動反応を観測した。電気化学顕微鏡を用いて単一細胞および細胞膜の機能を明らかにすると共に自己集合的に電極上にパターニングした酵素等のイメージングに成功した。3.高選択制・無機固体型センサ機能界面の創製に関して、半導体型ガスセンサの高感度化のため酸化スズゾル粒子の分散性を制御してメソポア構造の制御によりセンサ感度を一桁向上できた。また、100ppmレベルの二酸化炭素測定用の高耐湿性・低温動作機能を持つ固体電解質型ガスセンサを開発し選択性発現のための界面構造を明らかにすると共に高機能化のメカニズムを示した。これらの研究は、いずれも新しい機能材料・機能素子創出の基礎の確立に大きく寄与する世界をリードする研究である。本研究では、新しいセンシング機能界面の創製を目指して、1)制御無機・有機複合化界面、2)生体機能界面、3)センサ機能界面などの構築と、4)機能界面創製のための新規な手法の開発などに関する研究を進め、以下のような研究成果を得た。1)単結晶電極/チオール系分子による金属・有機分子超薄膜複合化界面の創製と電気化学法による構造規制界面の加工に関する研究から、電極の単結晶化度や平滑性によってアルカンチオールの電極面上での表面分子集合体構造が明確に異なること、さらに、チオール分子の修飾挙動は修飾剤中の硫化物イオンの存在によって極めて複雑な挙動を示すことを明らかにした。また、走査型電気化学顕微鏡を用いた酵素分子を固定化した分子認識機能界面の局所微細構造のパタ-ニング解析手法を開発した。2)酵素機能を有する多電子移動型の酵素モデル構造性遷移金属錯体を電極上に固定化することに成功し、溶液中とは異なった性質の発現を達成した。また、シトクロムc分子をプローブとしたプロモーター修飾界面を高い分解能で構造解析に成功し、加えて、半人工改変金属タンパク質の一部の機能解析が達成された。3)高選択性・無機固体型センサ機能界面として、高純度な半導体型ガスセンサのための新しい水熱処理法を開発した。また、二酸化炭素検出用の高機能固体電解質ガスセンサを開発し界面機能を明らかにした。これらの研究によって、これまで原子・分子レベルで界面を制御することの重要性は認識されていながら、必ずしも十分な取り組みがなされていなかった機能界面の構造制御によって、高度な分子認識センサ素子の開発のための人工的界面の創製・加工・制御がこれまでとは質的に異なるレベルで可能であることが示された。本研究では、新しいセンシング機能界面の創製を一目指して、1)制御無機・有機複合化界面の創製、2)酵素モデル構造性金属錯体等を用いた生体機能界面の構築、3)無機固体界面を用いたガスセンサ機能界面の構築、などの研究を進め、以下のような研究成果を得た。1.制御無機・有機複合化界面での分子認識機能の発現に関して、チオール系分子による機能界面の例として、シトクロムcの電極反応に対する明確な界面構造依存性を明らかにした。また、電極表面の修飾分子の構造を高解像度のSTM測定結果や表面赤外分光測定から分子レベルで明らかにした。さらに、チオール分子による機能界面形成時に硫化物イオンが極微量存在するだけで修飾電極表面は複雑になることを明らかにするとともに、修飾界面の構造を予測するための判断基準を提唱した。2.生体機能界面の創製と応用において、酵素(ヘムエリトリン)機能を有する多電子移動型構造を持った鉄二核錯体の電極上への固定化に成功し、従来不可能であった水溶液中での測定を可能とし、物理化学的に特徴ある性質を明らかにした。また、人工生体機能プロモーター及び関連分子の修飾電極界面の分子レベルでの高分解能構造解析にも成功した。さらに、単一細胞レベルではじめて細胞膜の分子及びイオン透過挙動を電気化学的に解析が可能であることも実証された。3.高選択制・無機固体型センサ機能界面の創製に関して、半導体型ガスセンサの高感度化のための新しい水熱処理法の開発、すなわち、酸化スズゾル粒子の分散性を制御してメソポア構造の制御によりセンサ感度を一桁向上できた。また、100ppmレベルの二酸化炭素測定用の高耐湿性・低温動作機能を持つ固体電解質型ガスセンサを開発し、選択性発現のための界面構造を明らかにした。これらの研究は、いずれも新しい機能材料・機能素子創出の基礎の確立に大きく寄与するものである。

本研究では、新しいセンシング機能界面の創製を目指して、1)制御無機・有機複合化界面の創製、2)酵素モデル構造性金属錯体等を用いた生体機能界面の構築、3)無機固体界面を用いたガスセンサ機能界面の構築、などの研究を進め、以下のような研究成果を得た。1.制御無機・有機複合化界面での分子認識機能の発現に関して、シトクロムcの電気化学応答に対する明確な界面構造依存性を2-、4-ピリジンチオール(2-PySH、4-PySH)、2-ピリミジンチオール(2-PymSH)等を用いて示し、その界面構造や吸着分子のピリジン窒素のpKaは変化などをSTM測定および表面赤外分光測定から明らかにした。4-PySHの金(100)面上での吸着構造やアントラキノン部位を持つアルキルチオールの金電極上へ吸着挙動を明らかにした。2.生体機能界面の創製と応用において、ヘムエリトリン酵素機能を有する多電子移動型のルテニウムニ核錯体の電極上への固定化に成功し、その特性を明らかにした。また、2-PymSH修飾金電極上では銅タンパク質であるアズリンの速い電子移動反応を観測した。電気化学顕微鏡を用いて単一細胞および細胞膜の機能を明らかにすると共に自己集合的に電極上にパターニングした酵素等のイメージングに成功した。3.高選択制・無機固体型センサ機能界面の創製に関して、半導体型ガスセンサの高感度化のため酸化スズゾル粒子の分散性を制御してメソポア構造の制御によりセンサ感度を一桁向上できた。また、100ppmレベルの二酸化炭素測定用の高耐湿性・低温動作機能を持つ固体電解質型ガスセンサを開発し選択性発現のための界面構造を明らかにすると共に高機能化のメカニズムを示した。これらの研究は、いずれも新しい機能材料・機能素子創出の基礎の確立に大きく寄与する世界をリードする研究である。
異種間4倍体補完法を利用した多能性幹細胞からの個体作製法の確立

本研究課題において、我々はマウスとラットという異なる種の間で、それぞれラットES/iPS細胞由来の細胞からなる胎児をマウス体内で、あるいはマウスES/iPS細胞由来の細胞からなる胎児をラット体内で、作製することに成功した。両者とも出産までには至らなかったが、このような異種の個体内でES/iPS細胞由来の個体を発生させる技術は、種の違いによりどのような発生の違いがあるかを解析するために利用可能なだけでなく、たとえば絶滅が危惧されている動物からiPS細胞を樹立し、別の個体の体内で育て、生ませるというような、種の保存にも用いることのできる技術への第一歩となりうると思われる。申請者はマウス、ラットそれぞれに由来する多能性幹細胞を互いの胚盤胞に注入したとき、マウス-ラット異種間キメラを作製できることを見出した。そこで本研究ではその知見をさらに深め、マウス-ラット間における異種間4倍体補完法により、異種の胚体外組織を利用して完全に多能性幹細胞由来の組織からなる個体を作製することを目的とした。まずはじめの段階として、4倍体補完法により異種の多能性幹細胞由来の胚が発生段階のどのステージまで発生可能かを明らかにするため、ラット多能性幹細胞をマウス4倍体胚に、マウス多能性幹細胞をラット4倍体胚に注入し、仮親子宮へ移植した後、胎児期での解析を行った。その結果、少なくともラット多能性幹細胞由来の胎児は胎生9.5日目程度、マウス多能性幹細胞由来の胎児は胎生14.5日目程度までは異種の環境下においても発生可能であることが明らかになった。フローサイトメーターやPCRを用いた解析により、それらの胚が完全に注入された多能性幹細胞由来の個体であることが明らかにされ、また組織学的な解析において形態的にも3胚葉由来の組織を有したほぼ正常な胚であることが判った。このように異種個体内で多能性幹細胞由来の胚発生が可能であれば、受精卵および胚の採取が困難で、発生学的な解析が困難な動物種を汎用な実験動物の体内を用いて容易に解析できることが可能となり、今年度の研究実績による成果はその最初の一歩となり得る。個体のサイズに関しては大きさだけを見るとラット多能性幹細胞由来のものであればラット胚、マウス多能性幹細胞由来のものであればマウス胚の大きさに近いが、発生学的特徴を元にした詳細な解析が今後必要であると思われる。また両者ともに胎生中期以降の発生は認められなかったことから、次年度はそのステージを乗り越え発生するために何が必要か明らかにしたい。研究計画の初年度は計画の基盤である技術の確立に注力し、特にラットにおける4倍体補完法を確立させ、一方で予備データとしてラットiPS細胞をマウス4倍体に注入した際、胚発生の中期(E9.5)への発生が確認できた。そこで最終年度である今年度は(1)個体サイズや組織の正常性の評価および(2)胚発生の停止が認められた場合、その原因を明らかにするという目標を達成すべく研究を進めてきた。(1)について得られた胚の正常性を判断するために形態的特徴や免疫染色法を用いた各組織の機能マーカーの発現を見たところ、前年度に見られたE9.5のラットiPS細胞由来の胚では正常胚とほぼ変わらない結果が得られた。一方で、発生を継時的に追ったところ、E10.5以降では発生時の退行が認められ、その後、出生可能な胚は得られなかった。また逆の実験、すなわちマウスiPS細胞をラットの4倍体胚に注入するという実験においても、同様に発生中期(E13.5)程度での発生の停止が認められた。そこで(2)として掲げた原因究明のため、これらの原因のひとつとして多能性幹細胞の質について検証した。ラットでは生殖系列にも効率に寄与が可能で、新規に同定したラットのRosa26遺伝子座の制御化で安定してtdTomatoを発現するES細胞を、またマウスについても、129sv系統とC57BL6系統のF1由来の同種間で4倍体補完由来の個体を生み出せる質の高いES細胞をそれぞれ用いた。しかしながら結果は同様で、いずれも胚発生の中期での発生停止が見られた。特にラットにおいては同種間でも4倍体補完により個体作製に至らなかったため、今まで樹立してきたラットES細胞の遺伝子プロファイルをマイクロアレイ法により解析したが、今のところ株間で機能と関連する遺伝子の同定には至っておらず、今後さらなる解析が必要である。以上より、マウス-ラットを用いた異種間4倍体補完法により多能性幹細胞を胚発生中期まで発生させることに成功したが、一方で生存可能な個体作出には至らず、今後さらなる研究が必要であると思われる。