hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
免疫系細胞におけるプロスタサイクリン受容体の発現と機能

プロスタサイクリン(PGI_2)は、種々の刺激に応じて主に血管内皮細胞で産生される不安定なアラキドン酸代謝物であり、特異的な受容体を介して血小板凝集阻止作用及び血管平滑筋弛緩作用を示す。申請者らは、マウスならびにヒトのPGI_2容体cDNAを単離することによって本受容体の一次構造を明らかにし、これが7回膜貫通構造を有するG蛋白共役型の受容体であることを見いだした。本受容体はアデニル酸シクラーゼの活性化を引き起こし、胸腺、肺、心臓、脾臓に発現していることを明らかにした。これらのうち、胸腺や脾臓はこれまでその発現が全く知られていなかった部位であり、PGI_2と免疫細胞の機能との関連が初めて示唆された。本研究の目的は、PGI_2受容体の発現細胞を同定し、これら発現細胞におけるPGI_2の機能を解析することにより、免疫系をはじめとするPGI_2の新しい生理作用を分子レベルで明らかにすることである。そこで本年度は、受容体cDNAをプローブとしたIn Situ Hybridization法により、その詳細な発現部位を同定することを試みた。その結果、本受容体は、大動脈・環状動脈・肺動脈・脳動脈等の血管平滑筋において強い発現が見られたが、静脈系には発現は認められなかった。また、胸腺では髄質にのみ発現し、成熟した胸腺細胞に発現していることが判明した。さらに、脾臓においては、リンパ球、巨核球に発現していることが分かった。一方、本受容体は、後根神経節の約40%の神経細胞に強い発現が見られた。タキキニンを神経伝達物質とするニューロンとの対応を調べたところ、その約70%が本受容体を発現していたことから、本受容体が痛覚伝達と密接に関連していることが推察された。これらの成果より、本受容体は、従来考えられていた循環器系での作用のみならず、免疫系、神経系における作用を示唆するものである。本研究では、次に、これらの発現部位における生理機能を解明するために、受容体欠損マウスの作成を検討し、既にその作成に成功している。今後は、このマウスを有効に利用・解析することにより、上記のように同定された部位における本受容体の生理的意義を明らかにしていく予定である。
巨大都市の発達と生態系の遷移過程の解析

現在急激に進行している都市化は、大都市及び周辺の植生、動物相、土壌、水系など生態系に与えるインパクトがきわめて大きい。これに対処するためには、都市化を都市生態系の遷移の観点から研究することにより、都市化による都市生態系の構造と機能の変化の過程・方向を明かにし、都市圏における望ましい生態系のあり方を探ることが必要である。本年度は5回の研究検討会を開催し、都市生態系に関する既往の研究成果の収集し、主として生態学の立場から検討・整理すると共に、都市域における望ましい生態系像についての総合的討議も行った。これらの検討結果は、「人間環境系」研究報告集(G034ーN31ー15)として印刷発行した。また、研究分担者以外に5名の研究協力者も参加して、上記の目的を達成するために必要な研究課題の抽出、研究計画の策定、対象地・手法の検討などを行った結果、次年度からの研究分担課題として、次の4つを抽出した。1)大都市内陸後背地の景域構造の空間的・時系列的変化の把握2)都市圏植生の景域構造の動態把握と植生管理手法の検討3)都市生物相による環境変化の評価と環境計画への適用4)都市圏における水辺生態系の変化の診断と管理手法の検討今後の研究を通じて、(1)都市化が植生の組成、構造、動態に与えるインパクトを明かにし、都市における「グリーン・ミニマム」(量、存在形態、質)の提示など望ましい植生管理計画の構想の策定を目指す。(2)都市化による動物相の変化、行動や生態の特異性を明かにし、望ましい管理のあり方を提示すると共に、環境変化の指標生物種を選別し、これらり生物群によるモニタリングシステムの検討を行う。(3)水と陸と緑がワンセットとして存在する水辺生態系(河川敷、池沼)の回復・維持管理のための環境計画のあり方を提示する。
色素増感型二酸化チタン電極を用いた海洋微生物燃料電池の開発

本研究は、色素増感系薄膜電池を単体の太陽電池とするのではなく海洋微生物燃料電池のアノード電極として組込むことで可視光領域の光エネルギーを利用し、かつ従来のPtカソードをバイオフィルム電極に代替することで大幅な出力向上を見込む。色素増感型アノードを組込んだ電池モジュールの試作をして従来型のPtカソードセルの試作、電池構築とEISによる電池内部抵抗の測定と等価回路によるシミュレーションを行った。これにより、期間中、4件の国際会議発表、1件の国内特許出願、1件の国内特許取得の成果を上げている。本研究では、色素増感型太陽電池(DSC)の技術的進展と開発したスクリーン印刷技術を融合させ、本来は単体電池である同電池をTiO2光触媒アノードの非消耗電極として組み込むと共に、一方のカソード電極を海水中の微生物代謝活性を利用したバイオフィルム電極とすることで、ゼロソース・ゼロエミッション型の高出力微生物燃料電池を開発することを目的に実験を行っている。平成26年度としては、スクリーン印刷皮膜の安定的な成膜条件を検討した。スクリーン印刷法とディップコーティング法による色素増感型TiO2電極の作製を目標に、その基材への担持方法を検討して電極の実用試作を行った。増感剤としては可視光領域の吸収スペクトルに優れたN-719ルテニウム色素[RuL2(NCS)2]:2TBAを用い、アノード電極の積層印刷条件とディップコータを用いた増感剤の傾斜担持方法の検討を行った。その結果、スクリーン印刷におけるギャップとスキージ速度の最適条件を決定し、再現性に優れるTiO2皮膜の作成に成功した。また、Ru色素のTiO2皮膜への担持については、ディップコーターの導入を予定したが繰り返し試験が不可能な形式であったため、次年度繰越て改造を行い、最適ディップ条件の確定試験を行う予定である。持続的恒久的エネルギーの確保と環境保全を目的としたCO2排出量削減は重要な政策課題であり、世界各国で国を挙げての取り組みが行われている。微生物燃料電池(Microbial Fuel Cell, MFC)は水素燃料非使用型ながら酸化還元反応過程を伴う燃料電池(FC)として研究開発が進み、ピーク出力が従来のりん酸型を上回る形式も発表されている。本研究では、色素増感型太陽電池(DSC)の技術的進展と開発したスクリーン印刷技術を融合させ、本来は単体電池である同電池をTiO2光触媒アノードの非消電極として組み込むと共に、一方のカソード電極を海水中の微生物代謝活性を利用したバイオフィルム電極とすることで、ゼロソース・ゼロエミッション型の高出力微生物燃料電池を開発することを目的として研究を行っている。平成27年度は、二酸化チタン皮膜を積層させて二層化構造として半導体特性の異なる皮膜をヘテロジャンクションとして結合し、また、二層化二酸化チタン皮膜に焼きなまし熱処理を施すことで、単層皮膜に比較して光電位特性の向上ならびに光腐食に対する耐久性を改善することに成功した。この電極についてソーラーシミュレータにより模擬太陽光による光照射実験を開始した。電極全体に均質な波長分布をもつ光を照度分布の偏りなしに照射することで、電極の最大性能を発揮させることができた。これらの成果をもとに、今後はRu増感剤を用いた微生物電池の実用開発に取り組む。申請段階で導入を予定したソーラーシミュレータを予定通り稼働させた。分光光度計については、ソーラーシミュレータでの実験結果を検証後に、来年度で導入を行う。本研究は、DSCを単体の太陽電池とするのではなく、海洋微生物燃料電池(Marine Microbial Fuell Cell,MFC)のアノード電極として組込むことで可視光領域の光エネルギーを利用し、かつ従来のPtカソードを海水中のバイオフィルム電極に代替することで海洋微生物電池の大幅な出力向上を見込むことを目的とする。太陽電池においては変換効率の高い電池パネルの開発が進展しているが、中でも色素増感系薄膜電池(Dye-sensitized Solar Cell, DSC)光触媒を利用したものでは安定性や製造コストの面から最も着目されている次世代型の電池である。そこで本研究では、まず色素増感電極の微生物電池アノードとしての組込を検討した。アノードであるスクリーン印刷機と導入したディップコーターを用いて二酸化チタン皮膜を用いたDSCアノードの開発を行い、色素沈着分布の最適化と特性測定を行う。次に電極の表面解析を行うと共に、導入した分光放射計で自然光におけるスペクトル依存特性の把握、ならびに動的負荷による耐久性を測定して実用性を検討する。これをMFCアノードとして組込んだ電池モジュールの試作を検討する。以上の内容により、28年度には国際会議発表2件(Shin-chi Motoda,Sho tamura,Motoaki Morita:Abstract of 230th ECS, Hawaii 2016)ほか)を行った。来年度は、太陽光照射における分極特性ならびに長期発電特性の把握、耐久性評価、ならびに動的負荷特性を流動海水中で測定して実用性を検討すると共に、電極の交流インピーダンス特性、バイオフィルムカソードと組み合わせた電池の交流負荷特性を検討する。海洋環境と太陽光を利用したエネルギー発生システムとして微生物燃料電池(MFC)の1つであるバイオフィルムバッテリーの性能向上を目的に、研究室での従来の研究ではバイオフィルム付着による金属の電位貴化現象をカソード電極に利用し、光触媒効果による酸化チタン被覆金属の電位卑化現象をアノード電極に利用したMFCを検討して来た。本研究では、高い光触媒効果を有する二酸化チタン電極を開発するため、以下の方法で電極の皮膜形成方法の検討を目的として研究を行った。

まず、二酸化チタンの光触媒特性を向上させるために、Ru色素を担持した電極と酸素欠陥を制御した電極を作製した。作製した全ての電極を用いて光電位の計測を行った。同法による均一な皮膜は電極基材の腐食を抑制し二酸化チタン電極の光電位の安定性を向上させた。さらに、スクリーン印刷法を用いて作製した二酸化チタン電極は、1ヶ月間の流動海水環境での実験で腐食が発生しなかった。色素担持にはディップコーティング法と浸漬法の2種類の方法を検討し、両方法で色素を担持することができた。しかし、120分間の計測で色素の脱離が生じ、色素による光電位の向上は得られなかった。二層に積層した二酸化チタン皮膜の酸素欠陥を制御するには、二層目を焼成するときの温度を制御することが有効である。また、皮膜焼成後の熱処理は酸化チタン中の酸素欠陥量を表すO/Ti値に大きな変化は見られないものの光電位を卑化させた。このような結果から、Ru色素を担持するヒドロキシアパタイト中間層の効果について検証を行っている。本研究は、色素増感系薄膜電池を単体の太陽電池とするのではなく海洋微生物燃料電池のアノード電極として組込むことで可視光領域の光エネルギーを利用し、かつ従来のPtカソードをバイオフィルム電極に代替することで大幅な出力向上を見込む。色素増感型アノードを組込んだ電池モジュールの試作をして従来型のPtカソードセルの試作、電池構築とEISによる電池内部抵抗の測定と等価回路によるシミュレーションを行った。これにより、期間中、4件の国際会議発表、1件の国内特許出願、1件の国内特許取得の成果を上げている。申請時に導入検討したディップコーターが製造中止になり、年度途中の導入ができなかった。ソーラーシミュレータでの照射時間等の外部環境を系統的に変化させて分極挙動を調査する。さらに、バイオフィルムが付着して電位が貴化したステンレス電極(カソード)とTiO2光触媒電極(アノード)を接続して発化電の基礎特性を把握する。この状態で両電極を電気的に接続して、発生電力、発生酸化物量、反応温度、海水流量および通過有機物量を計測する。このようにして得られたデータを解析して電極近傍の電位分布、電流分布の流体シミュレーションにより適配列を決定する。このような方法で、カソード・アノードの電気化学的電極特性を調べ、DSCアノードとバイオフィルムカソードの組込下において半導体被膜と微生物被膜の相互作用による反応機構を構築・検証する。さらに、太陽光導光装置ならびに太陽電池評価システムを用いて、太陽電池DSC電極の特性評価を行うと共に、バイオフィルムカソードを組込み、MMFCとしての出力特性評価を行う。前者にはC-V(Cyclic vo ltammetory)測定を、後者にはI-V(Current voltage)測定を行えるシステムとする。C-V特性では、交流インピーダンスの測定結果から電池モジュールの等価回路推定を行い、電極によって生じる誘導成分や直列/並列抵抗性分の分離評価を実施して回路負荷特性を明らかにするとともに、測定データを発電シミュレーションに提供する。
ガンの転移・浸潤のインビボ分子イメージング法の開発

本研究の目的は、がんが転移・浸潤するときに細胞内で生じている分子事象、すなわち転移・浸潤に関与するシグナル伝達の亢進やタンパク質発現の増加をインビボで、かつそれぞれを区別してイメージングする手法を開発することである。E-カドヘリンの転写抑制因子であるSnailを細胞に導入することで細胞接着を阻害して転移を誘導することを計画し、まずはそのベクターを細胞内に有効に送達するための膜透過配列の検討を行った。細胞膜透過のためには正電荷を有することが重要であることから、蛍光タンパク質であるEGFPにリジンを9つ結合させたK9-EGFPを構築し、その膜透過能をFACSを用いて評価した。比較対照としては、既存の膜透過配列であるHIV Tatペプチド由来の配列を結合させたTat-EGFP、何も結合させていないEGFPを使用した。その結果、Tat-EGFP、K9-EGFPはEGFPに比べてそれぞれ4倍、8倍と高く細胞内に移行し、K9がTatよりも有用であることが明らかとなった。また本研究課題では、がんの転移・浸潤の際に細胞内で生じている複数の事象を、それぞれを区別して捉えることを目標としていることから、光と放射線を併用したイメージングの可能性について基礎検討を行った。HeLa細胞を移植したヌードマウスに対して、K9-EGFPを蛍光色素で標識したプローブあるいはI-123で標識したプローブを投与し、光イメージング装置とガンマカメラで撮像したところ、どちらのプローブも類似の体内動態を示し、腫瘍のイメージングが達成できた。今後、これらの成果をさらに発展させることで、がんの転移・浸潤に伴う分子事象のマルチモダリティイメージングが可能となると考えられる。具体的には、転移開始のキーステップであると考えられる細胞接着因子E-カドヘリンの発現消失を誘導し、その後に生じるβ-カテニンシグナル伝達経路の亢進や細胞増殖能の変化を、生物発光と放射線という異なるモダリティを組み合わせることにより、各過程を区別してイメージングを行うことを計画している。E-カドヘリンの発現消失を誘導するために、転写抑制因子であるSnailを細胞に導入することを計画し、当該年度はそれをコードするプラスミドを大腸菌に組み込んだ。β-カテニンシグナル伝達経路の亢進は、β-カテニン依存的にルシフェラーゼを発現するプラスミドpTOPFLASHを細胞に一過性に導入し、ルシフェラーゼアッセイを行うことで評価した。またウェスタンブロットにより、細胞質と核でのβ-カテニン発現の評価も合わせて行った。細胞増殖能は放射線を用いて評価することを計画し、汎用性の観点からSPECTの使用を考慮に入れ、核酸誘導体である[^<123>I]ITdUを選択した。当該年度は基礎検討に用いるため、半減期が長く取り扱いが容易な^<125>Iを用いて標識を行い、スズ前駆体に酸化剤としてヨウ素の存在下、^<125>Iを作用させることで、放射性化学的収率19%、放射性化学的純度97%で[^<125>I]ITdUを合成する方法を確立した。
電気生理学的手法による眼科用製剤併用時の有害事象低減を目的とした処方・製剤設計

臨床では複数の点眼薬を併用する場合が多いにも関わらず、点眼薬併用時の眼組織膜への障害性に関する系統的な研究は少なく、安全性についての合理的な情報はほとんどない。そのため、臨床における市販点眼薬使用時の角膜障害性を予測・評価することに加え、点眼薬併用時の眼組織への障害性を低減できる処方・製剤設計の検討は重要である。本研究では、ヒトの涙のターンオーバーを再現した系として、電気生理学的実験法を考案し、角膜電気抵抗値を指標として、臨床での点眼薬適用時の各種成分をスクリーニングした。臨床において、緑内障は、長期の点眼治療が必要となる場合が多く、安全に使用していくことは重要となる。そこで、本研究では、抗緑内障点眼薬を用いて、原因となる物質の同定やtight junctionを中心とした作用機構を調べた。その結果、保存剤であるベンザルコニウム塩酸塩(benzalkonium chloride;BAC)濃度が角膜電気抵抗値に大きく影響し、低濃度の場合には主成分の種類にも影響されることを明らかにした。また、2種類の抗緑内障点眼薬を併用する場合、点眼順序を考慮することで、角膜障害を低減できることが示唆された。さらに、角膜保護点眼薬(精製ヒアルロン酸ナトリウム点眼液、コンドロイチン硫酸エステルナトリウム点眼液)を先行して使用することで、抗緑内障点眼薬による角膜障害が改善できることが確認された。本研究は、臨床と基礎研究を結ぶリサーチであり、点眼剤を併用する場合、点眼順序や角膜保護点眼薬の併用が、有害事象低減に有用な処方・製剤設計に繋がることを示唆しており、今後より詳細な検討は必要ではあるものの、重要な知見を得ることができた。`臨床では複数の点眼薬を併用する場合が多いにも関わらず、点眼薬併用時の眼組織膜への障害性に関する系統的な研究は少なく、安全性についての合理的な情報はほとんどない。`
大気と北方森林生態系間におけるCO_2交換過程の解明,定量評価,およびモデル化

北海道苫小牧市のカラマツ林を対象とし,現地での連続観測およびデータの解析を行なった。20012003年の3年間の結果をまとめた結果,CO_2交換量の年積算値の平均(±標準偏差)は,純生態系生産量(NEP),総生態系生産量(GEP),生態系呼吸量(RE)でそれぞれ499±26,1595±65,1095±52gCm^<-2>y^<-1>と推定された。また,REがGEPに占める割合は6770%であった。このように,CO_2交換量の年積算値における年次差は比較的小さかったが,季節変化には大きな違いが認められた。特徴的なのは,2002年のGEPであった。この年は冬から春にかけて気温が高かったため,融雪と開葉が他の年より2週間ほど早く,光合成も早く始まった。しかし,2002年の夏期はP_<max>が小さく,PPFDも低かったため,GEPが他の年より小さくなった。結果として,成長期間が長いにもかかわらず,2002年のGEPは他の年より小さくなった。2002年におけるP_<max>低下の原因として,多雨による光合成酵素(Rubisco)の損失や早期の開葉による窒素利用効率の低下が考えられた。なお,2003年7月の気温は他の年より23°C低かったが,GEPが減少することはなかった。低温は大気飽差を低下させ,結果としてGEPを増大させた。成長期間の土壌水分は0.20.4m^3m^<-3>で推移したが,土壌水分の変化がGEPやREに大きな影響を与えることはなかった。カラマツ人工林は,北海道や世界の他の森林と比べて高い炭素固定能力を示した。これは,冷温・湿潤・多雨な気候により,カラマツの持つ高い生産能力が維持されるためであることが示唆された。本年度は,研究を開始したのが12月であり,実施期間がほとんどなかった。また冬季であったため,研究対象の落葉針葉樹(カラマツ)林に観測機器を設置するなどの作業は困難であった。したがって本年度は,来年度の雪解け後の本格的な現地実験に向けた観測システムの開発・整備と,これまで独自に観測および収集してきたデータの整理・解析を中心に研究を実施した。具体的には,1)カラマツ林(キャノピー)上でのCO_2フラックス観測データの解析と評価,2)カラマツ林の土壌CO_2濃度および土壌から放出されるCO_2量(土壌呼吸速度)の解析と評価,3)カラマツ林の微気象および土壌環境の解析と評価,4)カラマツ林の微気象データを利用したフラックス・フットプリント解析,を予備的に行った。また観測システムに関しては,1)林床でのCO_2,水蒸気,熱フラックスを長期連続観測(モニタリング)するためのシステムの開発,2)マスフローによる土壌からのCO_2放出過程に関係した大気圧の変動を観測するためのシステムの開発,3)森林内外での乱流輸送を詳細に観測するためのシステムの開発,を行っている。1)と2)のシステムに関しては,融雪後のなるべく早い時期に現地に設置し,46月のカラマツ(キャノピー植物)のフェノロジー変化(展葉)にともなうフラックスの変化を観測する予定である。現在までに得られた主な成果は,1)研究対象のカラマツ人工林の年間(2000年9月2001年8月)のCO_2固定量は18.4mol m^<-2>y^<-1>であった,2)拡散法を用いて観測した土壌呼吸速度は,2001年8月で0.40.6mol m^<-2>y^<-1>であった,などである。

成長期間の土壌水分は0.20.4m^3m^<-3>で推移したが,土壌水分の変化がGEPやREに大きな影響を与えることはなかった。カラマツ人工林は,北海道や世界の他の森林と比べて高い炭素固定能力を示した。これは,冷温・湿潤・多雨な気候により,カラマツの持つ高い生産能力が維持されるためであることが示唆された。カラマツ林を対象とし,現地観測およびデータ解析を行なった。本年度は,渦相関システムを林床に設置し,トランクスペースにおけるCO_2・エネルギーフラックスの連続観測を開始した。また,森林のエネルギー収支を詳細に解析するために,森林空間における貯熱変化量の観測と評価を行なった。さらに,大気-森林間のCO_2・エネルギー交換過程のモデル化のために,ビッグリーフモデルの適用を試みた。本年度に得られた主な成果は,以下の通りである。1)展葉初期には,林床に光がよく届き,低温で坪吸量が小さいため,林床植生の光合成が土壌呼吸量を上回り,昼間は林床がCO_2シンクとなった。一方,展葉の終わる6月初旬には昼間のCO_2交換量はほぼ0になり,7月下旬になると昼間でも正となった。これは林床の光強度が減少して林床植生の光合成が低下し,地温が上昇して土壌呼吸が上昇した結果である。2)繁茂期には貯熱変化項の中で土壌表層の貯熱変化が最も大きく,次いで幹の貯熱変化が大きかった。これらが貯熱変化項の8割以上を占めた。落葉期には,繁茂期に比べ貯熱変化項は全体的に増加した。これは落葉のため,日射が樹幹や土壌などに直達したためと考えられる。そのため,日中平均の純放射量に占める貯熱変化項の割合は,繁茂期から落葉期にかけて5.4%から7.8%に上昇した。貯熱変作量を考慮することでエネルギー収支が改善された。3)カラマツ林のCO_2・エネルギー交換過程を理解し,推定するためにビッグリーフモデルを適用した。その結果,顕熱フラックスは比較的精度良く推定できたが,潜熱フラックスは全体的に過小評価された。また正味CO_2交換量(NEE)は日中のモデルの再現性に問題が見られた。これらを改善するためには,遮断蒸発の影響をモデルに組み込むとともに,光強度と光合成の関係を再検討する必要がある。来年度は多層モデルを適用する予定である。北海道苫小牧市のカラマツ林を対象とし,現地での連続観測およびデータの解析を行なった。本年度は,1)渦相関法を用いたキャノピー上,およびトランクスペースでのCO_2およびエネルギーフラックス連続観測,2)土壌空気のCO_2濃度および土壌CO_2フラックス(土壌呼吸速度)連続観測,3)キャノピー層(高木の葉)と林床植生のCO_2交換量(光合成・呼吸)を分離評価,4)葉面積密度(LAD)を中心とした森林構造の空間分布の計測とパラメータ化,5)林床を中心とした森林内微気象および土壌環境の集中観測,6)フラックスの欠測値を補間方法の検討,を行った。得られた主な成果の概要は以下の通りである。1)キャノピーのCO_2吸収量のピークは6月、林床のCO_2放出のピークは8月だった。森林全体のNEEが見かけ上8月に大きく減少するのは林床からのCO_2の放出が大きくなることと、キャノピーのNEEが減少することが原因だった。8月から9月にかけてはキャノピーが吸収するCO_2の45割が林床から供給されていた。夜間は特に林床からの供給量が大きかった。2)観測されたCO_2・潜熱・顕熱フラックスデータセットを用いて,補間法の比較・検討を行った。使用した補間法はMDV法,Look up table法,ビッグリーフモデル,非線形回帰法(CO_2のみ)である。補間精度の評価には,人工的に欠測を設けその補間値と観測値の残差を使用した。その結果,CO_2フラックスについては非線形回帰法,潜熱・顕熱フラックスについてはLook up table法がそれぞれ適しているという結果が得られた。
動脈硬化および高血圧の進展に関与する遺伝子の分子疫学的研究

本研究では20代前半の男性に70名の時間断面調査も行っているB3ARの多型による脂肪分布の違いが示唆され、LPLと中性脂肪、カイロミクロンに関連が見られた。AGTと血圧には関連が見られなかった。第二回健康調査を行った化学繊維工業会加盟11社800名の工場従業員のうち生活習慣病関連遺伝子の遺伝子診断実施に同意したものは2社120名であった。第二回健康調査は昨年12月にデータの収集を終え、現在、解析中である。また、遺伝子診断の実施に同意した120名の従業員の遺伝子多型についても現在解析中である。さらに、新たに健常者をリクルートし遺伝的素因および生活習慣が生活習慣病の危険因子へ及ぼす影響について時間-断面調査を行った。男性70名の参加が得られたが、彼らについて7日間の自記式食事調査、飲酒、喫煙、習慣的に行っている運動などのライフスタイルの調査、血液検査、尿検査、血圧測定、体脂肪率測定、頸動,脈エコー検査を行った。血液検査では末梢血検査、脂質を中心とした血液生化学検査を行った。尿検査としてはナトリウムおよびカリウムの24時間排泄量を行った。このほか、酸化ストレス指標としての尿中および白血球中8-hydroxydeoxyguanosineの測定を行った。まず、遺伝的素因としてのbeta3-adrenergic receptor(以下、B3AR)のTrp64Arg多型およびエネルギーの出納と肥満に関する諸指標との関連が検討された。BMI、体脂肪率、ウエストヒップ比の値ではTrp/Trp群とTrp/Arg群との間に差は見られなかった。BMIで層別化したエネルギー摂取量/所要量比では、わずかながらTrp/Arg群で低値を示す傾向がみられたが有意ではなかった。なお、これらの対象者については現在以下の遺伝子多型を解析中である。angiotensinogen遺伝子G-6A多型、M235T多型、apolipopoprptein B遺伝子Xbal多型、signal peptide insetion/deletion多型、variablenumber of tandemrepeat多型、apolipoprotein Al遺伝子Mspl多型、apolipoprotein Cll遺伝子Sstl多型、lipoprotein lipase遺伝子Hindlll多型、S447X多型、cholesteryl ester transfer protein遺伝子1405V多型、paraoxyonase遺伝子L55M多型、A192B多型、metylene tetrahydroforate reductase遺伝子C677T多型。
資源量評価に向けた天然ガスハイドレート生成史の解明

水中の極微量メタノールの分析には,ガスクロマトグラフ質量分析計を用いたヘッドスペースガス分析が有効であった.放射線を受けた天然ガスハイドレートでは,メタノールに加え,ホルムアルデヒドが主に生成する.海底堆積物では,深度が深くなるにつれてメタノールやホルムアルデヒド濃度の増加が観測された.天然ガスハイドレートの生成史を議論する上で不可欠な,生成物の種類や生成効率,環境での存在度に関する情報を得ることができた.水中の極微量メタノールの分析には,ガスクロマトグラフ質量分析計を用いたヘッドスペースガス分析が有効であった.放射線を受けた天然ガスハイドレートでは,メタノールに加え,ホルムアルデヒドが主に生成する.海底堆積物では,深度が深くなるにつれてメタノールやホルムアルデヒド濃度の増加が観測された.天然ガスハイドレートの生成史を議論する上で不可欠な,生成物の種類や生成効率,環境での存在度に関する情報を得ることができた.当初の計画である「水中の極微量メタノールの計測システムの構築」に関する研究を,2種類の質量分析計を用いて行った.プロトン移動反応質量分析計を用いた研究では,この装置を開発しているインスブルック大学(オーストリア)に2ヶ月滞在し,溶液試料を直接注入し計測する手法の開発に従事した.水中の微量メタノールの計測は実現できたが,環境中のメタノールが大きく影響し,現在のシステムでは水中メタノールの検出限界は約10ppmwであることがわかった.本手法を用いて高感度検出を実現させるためには,環境に含まれるメタノールを減少させること,および酸素イオンの混入を減少させることが必須である.一方,ガスクロマトグラフ質量分析計を用いた研究では,ヘッドスペース法により実験をおこなった.水中の微量メタノールの計測に成功し,検出限界は0.1ppmwであることがわかった.よって,現状では後者の分析法が有望であることがわかり,装置を導入した.次に,このガスクロマトグラフ質量分析計を用い,メタンハイドレートにおいて放射線照射により生成するメタノール量の定量評価を行った.6kGyのγ線照射により2ppmmolのメタノール(メタン比)が生成することがわかった.天然試料ではメタノール量が数桁少ないと予想されるため,今後,より低濃度の試料でもメタノールを検出できるよう改善を行い,天然ガスハイドレートの生成年代の評価につながる研究を遂行していく計画である.本年度の「研究実施計画」における各項目別に研究実績の概要を記す.1.「水中の微量メタノール計測法の最適化」ガスクロマトグラフ質量分析計を用いた水中の微量メタノール計測法の最適化を行い,その再現性についても確認した.また,メタノールに加え,メタンハイドレートに含まれるホルムアルデヒドも年代推定の指標となりうることが新たに判明した.メタノールに比べホルムアルデヒドは誘導体を利用してガスクロマトグラフ質量分析計で検出できるため,高い信号ノイズ比で計測することができた.よって,本研究で開発している手法では,メタンハイドレートの生成年代が千年前後でもその年代を判別できるということがわかった.2.「天然ガスハイドレートの入手とそこに含まれるメタノール量の評価」日本海でのガスハイドレート調査に参加し,天然ガスハイドレートと堆積物,および堆積物に含まれる間隙水の採取に成功した.大学へ試料を持ち帰り分析したところ,天然ガスハイドレートの分解後の水からメタノールを検出することができた.また,間隙水に含まれるメタノールやホルムアルデヒドも検出でき,海底堆積物におけるそれらの動態をはじめて明らかにした.3.「自然放射線量率の評価と年代推定」日本海における調査から,天然ガスハイドレートの分布は層状や塊状と多様であることがわかった.天然ガスハイドレートにおける放射線量の評価には,3次元観察などによる形状の評価が必須であることが明らかとなった.
生合成工学を目指したポリケチド合成酵素の機能解析

放線菌から生産される抗寄生虫・抗昆虫活性を有するポリケチド化合物エバ-メクチンのアグリコン部分の生成はポリケチド合成酵素によって行われる。同生合成遺伝子群の解析の結果、エバ-メクチン-ポリケチド合成酵素はaveAIとaveAIIの2ケ所にコードされ、さらにそれらはI型ポリケチド合成酵素であることがが推察された。本研究ではエバ-メクチンアグリコン部分の生合成機構を明らかにすることを目的に、同アグリコン合成の初期段階の生合成遺伝子を含むaveAI領域の全塩基配列を決定し、その領域にコードされるポリケチド合成酵素を明らかにした。I型ポリケチド合成酵素はポリペプチド上に数種の機能ドメインが存在する多機能ポリペプチドであり、炭素鎖延長反応の回数分の縮合、およびそれに引き続くβ位炭素鎖修飾の機能ドメイン構造を有するため、極めて巨大なポリペプチドであり、その遺伝子領域も30kbpにもおよぶ。効率の良い塩基配列解析を行うため本研究では大腸菌のトランスポゾンを用いた方法を検討た。その結果、高GC含量を有する放線菌の遺伝子解析にも適用可能であることを見出した。aveAI領域の解析の結果、この領域には2つのORFが存在し、それぞれAveAI-PKS1(414kDa)とAveAI-PKS2(666kDa)のポリペプチドがコードされており、それぞれ2回、4回の炭素鎖伸長反応を触媒するものと思われる。さらにそれぞれのポリペプチド上の機能ドメインの配置はH_2N-AT-ACP-KS-AT-KR-ACP-KS-AT-DH-KR-ACP-COOHとH_2N-KS-AT-ACP-KS-AT-KR-ACP-KS-AT-KR-ACP-KS-AT-DH-KR-ACP-COOHであることが推定された。それぞれの機能ドメイン同士の保存性は非常に高いものの、ATドメインでは転移する基質によってそれぞれ相違が認められた。抗寄生虫・抗昆虫活性を有するエバ-メクチン生合成遺伝子群の内のポリケチド生成に関与する領域、特にポリケチド生成初発段階の解析を行い以下の結果を得た。エバ-メクチン生合成遺伝子群の発現は同遺伝子群の末端に位置する領域の遺伝子(aveR)産物によって正に調節されていることが明らかとなった。したがって、二つのポリケチド生合成段階の遺伝子領域(aveAI及びaveAII)の人為的な発現改変は、制御遺伝子aveRの発現あるいは制御遺伝子産物に支配されているこれらのポリケチド合成酵素遺伝子のプロモーターを改変することによって達成できるものと期待される。一方、ポリケチド生成に関与する遺伝子領域(aveAI及びaveAII)のうち、ポリケチド生成初発段階の遺伝子領域(aveAI)の塩基配列の決定を行っているが、同領域は35kbpにもおよぶため効率よい塩基配列決定方が望まれており、大腸菌のトランスポゾンを利用した新たな解析方法を検討し、極めて効率よく塩基配列を決定する系を構築することができた。現在までに得られた塩基配列の結果、5'末端にはacyltransferaseドメインと推察される領域が認められ、さらにその下流にacyl carrier protein,β-ketoacyl-ACP synthaseドメインと推察される配列が認められた。これらの結果はポリケチド合成酵素の初発領域であることを示唆するものである。また、エバ-メクチン生産菌の無細胞抽出液をSDSゲル電気泳動で解析したところ、およそ、450,540,610,700kDaの巨大ポリペプチドを検出した。

なおこれらの巨大ポリペプチドがポリケチド合成酵素であるか否かについては現在検討を行っているが、おそらくエバ-メクチン生合成遺伝子群のaveAIとaveAII遺伝子領域にはそれぞれ2種づつのポリケチド合成酵素がコードされているものと思われる。エバ-メクチン生合成遺伝子群のアグリコン形成に関与する遺伝子aveAIIは同遺伝子群の中央に位置しており、遺伝解析などからそれぞれはI型ポリケチド合成酵素をコードしていることが推察されていた。本研究ではエバ-メクチンアグリコン部分の生合成機構を明らかにすることを目的に、同アグリコン合成の初期段階生合成の遺伝子を含むと考えられるaveAI領域の全塩基配列を決定し、その領域にコードされているポリケチド合成酵素を明らかにした。35kbpにもおよぶ塩基配列決定を行うため、極めて効率の良いトランスポゾンγδを利用した方法を検討し、高GC含量を有する生産菌Streptomyces属の遺伝子解析にも適用可能であることを見出した。この方法で塩基配列を決定したところ、aveAI領域には2つのORFが存在し、それぞれAveAI-PKS1(414kDa)とAveAI-PKS2(666kDa)のポリペプチドがコードされていることを推定した。塩基配列から推定されたAveAI-PKS1及びAveAI-PKS2の機能ドメインを検索した結果、それぞれ2回、4回の縮合反応ドメインを有することが推察された。AveAI-PKS1及びPKS2のアミノ酸配列について詳細に分析した結果、それぞれのアシル基伸長過程の縮合反応(KS)ドメインは保存性が高いこと、また、KSとアシル基転移(AT)ドメイン間や、ATとケトン還元(KS)ドメインの間の長い結合領域で互いに極めて高い相同性を示すことが示唆された。一方、ATドメインは転移する基質(マロニル-CoAあるいはメチルマロニル-CoA)の相違によって差異が認められた。さらに、モノカルボン酸型のCoAエステルの転移を触媒する導入ドメインのATは他のジカルボン酸型のCoAエステルの転移を触媒するATとは違いが認められた。
iPS細胞注射による低侵襲脊椎固定術の開発

当研究は、骨形成を強く促進する骨形成タンパク-2産生遺伝子、及び、特定の薬剤投与により細胞死を起こす単純ヘルペスウイルス1型チミジンキナーゼ産生遺伝子を組み込んだ人工多能性幹細胞であるiPS細胞を作成することで、現在は高侵襲な手術でしかなしえない脊椎固定術を、細胞注射のみで行う事を目的とし、平成26年度より行われている研究である。3年間の研究期間内に、上記二種の遺伝子を細胞に送り込み取り込ませるベクターをいわれる塩基配列を構築し、マウス横紋筋由来細胞にて両タンパク質の発現を確認した。今後は、発現するタンパク質の量をさらに増加させる処置を加えた後に、iPS細胞へ導入する予定である。超高齢社会の到来により、脊椎手術は近年増加の一途を辿っているが、患者の早期社会復帰や医療費の削減に向け手術の低侵襲化が重要である。周辺器具の発達に伴い脊椎手術の低侵襲化は進んでいるが、脊椎固定術に必要な骨新生促進及び骨癒合促進に関しては、未だに骨盤などより採取された自家骨移植などが用いられており低侵襲化とはほど遠い現状である。また、ヒト人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell; iPS細胞)は2007年に山中らによって見出された細胞であり、さまざまな組織の細胞に分化する能力を有し患者本人の細胞から樹立可能である特徴を持つ。現在は本邦を中心に、遺伝疾患の基礎研究や治療薬の開発のみならず、再生医療や移植治療への応用が期待され臨床治験が始まろうとしている。しかし、iPS細胞の骨再生への応用の研究は世界的にみても報告が非常に少なく、iPS細胞の臨床への応用を進めているにあたり重要な課題と考える。当研究は、骨形成タンパク-2 (Bone Morphogenetic Protein-2; BMP-2)、及び、単純ヘルペスウイルス1型チミジンキナーゼ(HSV-TK)発現プラスミドベクターを導入したiPS細胞を作製し、同細胞の骨形成能、及び、ガンシクロビルの添加により発現ベクター導入細胞の細胞死を確認した後に、ラットを用いて細胞注射による脊椎固定術の検証を行うことを主目的とし、平成26年度より開始されている研究である。平成26年度の進捗状況としては、当学内における組み換えDNA実験計画など諸審査に対する承認を取得した後に、当教室で保有していたBMP-2発現ベクター、HSV-TK発現ベクターの増幅、制限酵素での切離、不純物の除去を行い、DNAの純度測定とシークエンスの確認まで完了している。また、ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)はさまざまな組織の細胞に分化する能力を有し患者本人の細胞から樹立可能である特徴を持ち、再生医療や移植治療への応用が期待され臨床治験が始まろうとしている。平成27年度の進捗状況としては、BMP-2遺伝子とHSV-TK遺伝子をIRESでつなぎ生合成開始に必要な遺伝配列を組み込んだプラスミドを作成し、GFP遺伝子を持つベクターにクローニングした。PromoterとしてはEF-1αを用いている。作成したベクターをマウス横紋筋由来細胞(C2C12細胞)にLipofection法を用いてトランスフェクションし、GFP陽性細胞を評価し導入率評価、BMP-2機能評価としてALP活性評価、HSV-TK評価としてガンシクロビル(GCV)との共培養による細胞数評価を行った。その結果、コントロールと比較した際のALP活性の上昇、GCVとの共培養での細胞数の有意な減少を認め、作成したプラスミドが両タンパク質を産生し機能していることを確認した。平成26年度は当施設で研究を開始するに当たって必要な種々の手続きにより時間を要したが、平成27年度は遺伝子の作成と産生されたタンパク機能評価までを完了しており概ね順調な進展と考えられる。BMP2の蛋白発現量に関して現在確認作業中であるが、発現量が少ない場合にはベクターの変更などを考える必要もあり遅れる可能性がある。また現段階ではC2C12での確認にとどまっておりiPS細胞での検討が出来ていないためやや遅れている。当研究は、骨形成タンパク-2 (Bone Morphogenetic Protein-2; BMP-2)、及び、単純ヘルペスウイルス1型チミジンキナーゼ(HSV-TK)発現プラスミドベクターを導入したiPS細胞を作製し、同細胞の骨形成能、及び、ガンシクロビル(GCV)の添加により発現ベクター導入細胞の細胞死を確認した後に、ラットを用いて細胞注射による脊椎固定術の検証を行うことを目的とし、平成26年度より開始されている研究である。平成27年度までに、BMP-2遺伝子とHSV-TK遺伝子をIRESでつないだプラスミドを作成、GFP遺伝子を持つベクターにクローニングしプラスミドベクターを作成した。

作成したプラスミドベクターを、マウス横紋筋由来細胞(C2C12細胞)にLipofection法にてトランスフェクションし機能評価を行った。導入効率は80%と高水準であり、GCV共培養による細胞死も安定して確認されたが、ALP活性で評価したBMP-2機能評価のみが不安定な結果である点が問題であった。平成28年度は、ベクターによりBMP-2が産生されているかを直接検証する目的で、ELISA法にてBMP-2の定量評価を行った。結果、ベクターを導入したC2C12細胞はBMP-2を産生(10ng/ml)しているが、C2C12の骨分化誘導を行う域値(50ng/ml)に達していないことが判明した。またBMP-2の検証作業と同時に、トランスフェクションに適したiPS細胞の分化ステージに関する検討を始めた。以上をまとめると、本研究期間中にBMP-2およびHSVーTKを発現する新たなプラスミドの作成に成功した。プラスミドの導入にて、GCV投与による細胞死、及び、BMP-2の発現は確認されたが、発現タンパクの濃度を高めることが課題と判明した。今後は、ウイルスベクターを用いた遺伝子導入を行う予定である。当研究は、骨形成を強く促進する骨形成タンパク-2産生遺伝子、及び、特定の薬剤投与により細胞死を起こす単純ヘルペスウイルス1型チミジンキナーゼ産生遺伝子を組み込んだ人工多能性幹細胞であるiPS細胞を作成することで、現在は高侵襲な手術でしかなしえない脊椎固定術を、細胞注射のみで行う事を目的とし、平成26年度より行われている研究である。3年間の研究期間内に、上記二種の遺伝子を細胞に送り込み取り込ませるベクターをいわれる塩基配列を構築し、マウス横紋筋由来細胞にて両タンパク質の発現を確認した。今後は、発現するタンパク質の量をさらに増加させる処置を加えた後に、iPS細胞へ導入する予定である。26年度末までにBMP-2発現遺伝子、HSV-TK発現遺伝子を1つのベクターに組み込み、まずはC2C12細胞に導入、ALP活性測定などの骨形成能評価、及びガンシクロビル添加による細胞死の評価までを終了する予定であった。しかし、当学内における組み換えDNA実験計画など諸審査に対する承認に時間を要し、研究の開始が遅れたため、現在はBMP-2発現ベクター、HSV-TK発現ベクターの作製、増幅、制限酵素での切離、得られた遺伝子の純度、及びDNAシークエンスの測定、評価までを完了している。現在はBMP-2の機能評価としてALP活性評価を行っているが、併せてBMP-2タンパクのELISAを行い定量評価を行う。十分なBMP-2の産生が確認されれば、in vivoでの評価としてC2C12細胞に作成したプラスミドをトランスフェクションにて導入し無胸腺ラットの横突起間に細胞を注射、4週間、8週間の時点で犠牲死させ単純X線にて骨新生の状態を確認する。さらに注射部分の脊椎を摘出しmicro CTを用いて新生骨の骨質評価を行う。その後組織標本を作成し、組織学的に新生骨を確認した上で注入細胞生存の有無や骨新生への寄与の割合などをμCTを用いて評価する。
学校組織の変容と教師役割の再構築

本研究は、諸外国から注目されてきた日本型学校=わが国の総合的・包括的教育が、近年の教育改革や学校機能縮小論の中で変容している実態を踏まえ、今後、学校や教師がどのような役割を果たすべきかを明らかにすることを目的としている。研究期間を通じて、(1)子どもの指導と学校役割に関する教師の意識、(2)学校・教師に対する制度改革の実態と、それへの教師の評価を明らかにする調査研究を行うとともに、学校・教師役割の再構築のためのモデルを模索するために、(3)問題状況に対応する欧米での試み=restorative justiceの教育への導入について資料を収集した。具体的には、(1)においては、アンケート調査『児童・生徒の諸問題に対処する学社連携に関する研究』を実施したほか、複数の県でインタビュー調査を、(2)については、全国の教育委員会に対して『教員評価政策に関するアンケート』を実施した。また、(3)については、平成17年3月にrestorative practiceの国際会議に出席し、また、平成18年2月にはイギリスで教育改革と教師の役割について、研究者と意見交流を行った。収集したデータを考察した結果、次のようなことが明らかになった。第一に、学校役割と教師役割について考察した結果、4類型が析出され、論点の整理を可能にした。第二に、その類型の中で、これまでに殆ど言及されていないタイプの学校・教師役割類型があることが示された。第三に、その類型は欧米でののSchool as a core social centerの試みをモデルとして、わが国でも展開可能なであることを示唆し、また、教師=対人専門職論への研究の可能性を指摘した。精緻化した分析はまだ途中であるが、以上の成果は科研費報告書にまとめられた。子どもの諸問題は、地域や家庭の変化を背景にし、複雑に絡み合って現出している。この点から考えると、学校教育の<肥大化>として批判の対象となってきた「日本型学校」は再評価されるべきである。一方、カウンセラー等専門家の配置に見られるような、多様な専門家の存在は、一人の子どもについての情報分散をもたらし、かえって指導困難を高めるという問題(教師と他専門家との分業と協働)を孕んでいることが指摘できる。本研究は上述したような状況を踏まえて、変容する社会における今後の学校の在り方を探り、学校と地域・家庭、関係諸機関との連携の検討を踏まえ、学校組織成員の誰がどのように、それを担うのか、その際の教師の役割は何か、という問題を考察することを目的としている。本年度計画・実施した調査研究のうち、「修復的司法」の取り組みについての情報収集(ミネアポリス教育委員会・コロラド州のスクールメディエーションセンターのフォローアップ調査、IIRP<International Institute of Restorative Practice>世界会議で新たに得られた資料)からは、いくつかの知見が見いだされた。(1)わが国のみならず多くの先進国で、家庭背景の多様化により、様々な問題が集中して現象する子どもが一定数存在しており、その対処が、学校や地域全体の共通課題となっていること(2)その対処法として、厳罰的指導に代わり修復的司法が有効であること、しかしながら、(3)修復的司法の実質的担い手となり、学校や教師を支援するような中間集団が、わが国では殆ど見られないという問題があること、などがそれである。またこれらを踏まえ、各機関・各専門家の<繋ぎ役>をどのようにして創出するかが、わが国の課題であることが明らかになった。本研究は、「教育問題」を超えて問題が集積する子どもの指導に、学校や教師がどのような役割を果たすべきかを明らかにしようとした『学校組織の変容と教師役割の再構築』の最終年度に当たる。

とりわけ、諸外国から注目されてきたわが国の総合的・包括的教育が、近年の教育改革や学校機能縮小論の中で変容してきている実態を踏まえ、今後の学校・教師のあり方を探ることを目的としていた。今年度は、(1)問題の集積する子どもの指導についての教師の意識を明らかにすること(2)学校・教師に対する制度改革の実態と、それに対する教師の認識の2点に焦点を当て、(1)(2)を並行しつつ研究を進めた。(1)においては、アンケート調査(『児童・生徒の諸問題に対処する学者連携に関する研究』)を実施し、またイギリスで、restorative justiceのフォローアップ調査を行った。(2)では、複数の県で教師インタビューを行い、それをもとに、教育委員会を対象とした『教員評価政策に関するアンケート』を実施した。(1)(2)とも現在まだ分析中で、最終結論を導くには至っていないが、現時点で以下のことが明らかになっている。第一に、「教育問題」の背後には、子どもの生活総体=家庭での問題が存在しており、教師の指導の領域を超えるものも多いが、欧米のrestorative justiceの取組みように、中間集団の存在・活動がないわが国では、教師は他専門諸機関との連携・協力に関して経験がなく、学校内での単独処理に終始していること。第二に、急激な教員改革が行われた地域では、教師のモチベーションが低下していること。以上の知見を、イギリスにおけるホリスティックな子どもへのかかわりを視野に入れたdemocratic professionの提起とあわせ、理論的には、専門職としての教師の「専門」内容の再検討と関連してまとめる予定である。
植物のアスコルビン酸酸化酵素のオーキシンによる発現調節と細胞伸長

アスコルビン酸酸化酵素(AAO)は、高等植物、特にカボチャやキュウリなどのウリ科植物に多く認められる銅酵素で、アスコルビン酸を分子状酸素を用いてモノデヒドロアスコルビン酸へと酸化する反応を触媒する。本酵素は、植物由来の酵素では数少ない有用酵素の一つであるが、植物における生理機能については、未だ不明である。そこで、本研究では、AAOの生理機能に着目した。タバコ懸濁培養細胞を、細胞分裂阻害剤を用いて同調化させ、さらには、ホルモン処理により細胞伸長のみを誘導させ、タバコ培養細胞の細胞分裂時と細胞伸長時におけるAAOの発現変動を調べた。その結果、同調化して活発に分裂しているタバコ培養細胞において、AAOの発現はM期からG1期への移行にともない減少した。一方、タバコ細胞の伸長培養時において、AAOの発現は、細胞の伸長が始まる直前に急激に増加した。また、AAOの発現は細胞分裂時より、細胞伸長時に高いことが示された。これらのことから、AAOは細胞伸長に関与している可能性が示された。さらに、タバコ培養細胞にカボチャのAAOcDNAを導入し、AAOを過剰発現した形質転換タバコ培養細胞を作成した。野生型タバコ培養細胞と形質転換タバコ培養細胞をそのまま伸長培養し、細胞の形態を観察した結果、両者の間に有意な相違は認められなかった。一方、野生型タバコ培養細胞と形質転換タバコ培養細胞を、それぞれプロトプラスト化し、伸長培養させた結果、形質転換タバコ培養細胞の方は培養1日以降から膨張し、培養3日目にはそのプロトプラストの直径は、野生型のものの約2.5倍となった。すなわち、AAOを過剰発現した形質転換タバコ培養細胞のプロトプラストは、伸長が始まる前に一過的に膨張することを見いだした。これらのことから、AAOが植物の細胞伸長に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。アスコルビン酸酸化酵素(AAO)はウリ科植物の果実組織中に多量に存在する。そこで、カボチャ果実の形成段階におけるAAOの発現を調べた。その結果、AAOは受粉後14日目まで高い発現が認められたが、その後急激な発現の低下が認められた。この発現変動は、転写レベルで調節されていることがわかった。カボチャ果実は受粉後14日目まで急激な成長を示すことから、AAOの発現は、カボチャ果実の成長と相関することが示唆された。AAO遺伝子の転写段階での発現調節を解析するために、カボチャのAAO遺伝子の5'上流域のプロモーター解析を行った。AAO遺伝子5'上流城-703の位置までを、レポーター遺伝子であるGUS遺伝子に連結し、カボチャ発芽種子中にパーティクルガン法を用いて導入した。この発芽種子中のGUS活性を調べた結果、高いGUS活性が認められた。この活性は、コントロールとしてカリフラワーモザイクウィルス35SプロモーターをGUS遺伝子に連結したものを導入した発芽種子中のGUS活性よりも高く、AAO遺伝子5'上流域中に、発芽種子での高発現に関わるシス因子が存在することが示唆された。さらに、AAO遺伝子5'上流域とGUS遺伝子の融合遺伝子を、オーキシンを含む培地と、含まない培地上でインキュベートしたカボチャ果実組織中に導入し、GUS遺伝子の発現を調べた。その結果、オーキシンを含む培地上でインキュベートした組織中に高いGUS活性が認められた。この活性は、AAO遺伝子5'上流域を-493の位置まで欠失させると低下することから、-493-703の約200bp中にオーキシン応答性のシス領域が存在することが明らかとなった。

アスコルビン酸酸化酵素(AAO)は、高等植物、特にカボチャやキュウリなどのウリ科植物に多く認められる銅酵素で、アスコルビン酸を分子状酸素を用いてモノデヒドロアスコルビン酸へと酸化する反応を触媒する。本酵素は、植物由来の酵素では数少ない有用酵素の一つであるが、植物における生理機能については、未だ不明である。そこで、本研究では、AAOの生理機能に着目した。タバコ懸濁培養細胞を、細胞分裂阻害剤を用いて同調化させ、さらには、ホルモン処理により細胞伸長のみを誘導させ、タバコ培養細胞の細胞分裂時と細胞伸長時におけるAAOの発現変動を調べた。その結果、同調化して活発に分裂しているタバコ培養細胞において、AAOの発現はM期からG1期への移行にともない減少した。一方、タバコ細胞の伸長培養時において、AAOの発現は、細胞の伸長が始まる直前に急激に増加した。また、AAOの発現は細胞分裂時より、細胞伸長時に高いことが示された。これらのことから、AAOは細胞伸長に関与している可能性が示された。さらに、タバコ培養細胞にカボチャのAAOcDNAを導入し、AAOを過剰発現した形質転換タバコ培養細胞を作成した。野生型タバコ培養細胞と形質転換タバコ培養細胞をそのまま伸長培養し、細胞の形態を観察した結果、両者の間に有意な相違は認められなかった。一方、野生型タバコ培養細胞と形質転換タバコ培養細胞を、それぞれプロトプラスト化し、伸長培養させた結果、形質転換タバコ培養細胞の方は培養1日以降から膨張し、培養3日目にはそのプロトプラストの直径は、野生型のものの約2.5倍となった。すなわち、AAOを過剰発現した形質転換タバコ培養細胞のプロトプラストは、伸長が始まる前に一過的に膨張することを見いだした。これらのことから、AAOが植物の細胞伸長に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。