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p波超伝導体における半整数磁束量子状態の観察

カイラルp波対称性を持つことが強く示唆されているSr_2RuO_4などの新奇超伝導体を用いて、半整数磁束量子の存在を確認するために、微小単結晶からの素子作成プロセスの構築と、作成されたマイクロデバイスの輸送特性の評価を行った。素子プロセスに関しては研磨プロセス、FIB加工を用いることにより、1μm程度の素子の作成に成功した。作成されたSROの弱結合型接合の輸送特性は、異常なヒステリシス構造を有するスイッチング特性を示し、この起源は印加電流とカイラルドメイン構造、エッジチャンネルとの相互作用の存在を示唆しているものと解釈された。さらに弱結合を2個含む超伝導ループ構造を作成し、SQUIDとしての動作の検証を行った。SQUIDの臨界電流値はヒステリシスの無いI-V特性を示したが、外部印加電流に対して周期的な臨界電流の変調構造は観測されず、外部印加電圧に応答していないという結果になった。これは弱結合における臨界電流値が磁束の量子化条件に対応しておらず、エッジ状態やカイラルドメインの影響を含めた解釈が必要で有ることが示唆される。Sr2RuO4(SRO)はカイラルp波超伝導体の可能性が強く示唆されており、その超伝導状態には従来から広く研究されてきた金属超伝導体や銅酸化物超伝導体とは全く異なる輸送特性が期待される。一方SROの超伝導は不純物散乱に対してきわめて弱く、ごく微量の欠陥や不純物により容易に超伝導性が失われることが知られている。そのため現在まで超伝導臨界温度を有するSROを薄膜作成技術により作成した例はなく、そのマイクロデバイス作成はきわめて難しいと考えられている。我々は単結晶よりSROをマイクロデバイス化する技術を確立し、SRO中にトラップされた半整数磁束量子状態をSQUIDにより観測し、将来的にトポロジカル量子ビットの実現可能性を切り開くための研究を行っている。今年度はSROの微小結晶の輸送特性が、超伝導ネットワークと思われる内部構造を有しており、その輸送特性を詳細に観察した結果、カイラリティに起因すると考えられる異常なヒステリシスの存在を確認し、その運動のモデル化を行った(Phys.Rev.Lett誌に発表)。またC軸方向にのみ電流輸送が許されるマイクロブリッジを作成し、ジョセフソン接合としての特性を確認した。その磁場特性は磁場とともに一様に臨界電流が抑制される応答であり、期待された磁場振動成分の観測はできなかった。SQUIDに関しては作成には成功したが、熱破壊により試料自体が壊れ、磁場特性の成功にはいたらかなった。一方理論的にはカイラルp波超伝導体内の状態密度の計算を行い、奇周波数超伝導成分と磁束量子のコア伏態との関連を明らかにした(Phys.Rev.Lett誌に発表)。トポロジカル量子計算(QC)に関する実験的な基礎を確立することを目的として、非アーベル統計に従うと期待される半整数磁束量子を、ルテニウム系酸化物超伝導体Sr_2RuO_4(以下SROと略す)超伝導体において観測する試みを行った。SROはカイラル内部自由度を有する超伝導として、半整数磁束量子の存在が許されるということは理論的には予言されているが、実験的な確認は現在までになされていない。整数磁束量子に対して、半整数状態が安定化される条件は磁束進入長の2-3倍程度と予測され、1ミクロン程度サイズのブリッジ加工が必要と見積もられる。FZ法により作成された単結晶からab面内、c軸方向いずれの方位に対しても微細素子が作成できる技術を構築し、輸送特性を測定した。その結果c軸方向では大きなヒステリシスループを有するI-V特性を観察し、Nbなどの従来型超伝導と類似のスイッチング特性を観察した。一方面内ではジョセフソンスイッチングとは別の起源を有すると考えられるヒステリシスループを観察し、その起源はカイラルドメインと関連するものと考えられる。超伝導ループ内の2カ所に弱結合を有するDC-SQUIDの輸送特性の測定に関しては、非常にランダムなスイッチングと、規則的ではあるが磁場応答の無いスイッチングの2種類の応答を観察した。磁場応答が無いことより期待されたDC-SQUIDとしての動作はしていないと考えられ、現在その理由を明らかにすべく、追加工デバイスの作成を行っている。

SROの内部自由度と連動し、臨界電流が単純なジョセフソン効果ではなく、dベクトルや1ベクトルの連動した複雑なメカニズムに依存してる可能性を明らかにすべく、回転磁場を応用した測定を計画している。Sr2RuO4 (SRO)はカイラルp波対称性を有するペアポテンシャルを有しており、多自由度を有するトポロジカル超伝導体の一つと考えられている。この超伝導体には、コンベンショナルな磁束量子の半分の磁束量しか磁束を内包しない、半整数磁束量子の存在が許されるということは理論的には予言されているが、実験的な検証は行われていなかった。最近カンチレバーを用いた帯磁率測定において、半整数の可能性が示唆する結果が報告されたが、超伝導磁束量子干渉素子(SQUID)形状による検証の実験は行われていない。本研究においては、SRO単体を用いた素子作成技術を確立し、SRO単体による超伝導ループ内の磁束状態をSQUIDの臨界電流の外部印加磁場の関するとして計測することにより、半整数磁束量子の形成を検証することを目指して実験を進めた。まず現在までにSRO単体を用いたジョセフソン素子の作成は報告例が無く、そのため、京都大学前野研究室から提供を受けたSRO単結晶を、研磨プロセスにより薄片化し、基板に固定後に収束イオンビーム(FIB)プロセスを用いて微細加工することにより、弱結合型のジョセフソン接合を作成した。作成されたジョセフソン接合の輸送特性は、異常なヒステリシス構造を有するスイッチング特性を示し、この起源は印加電流とカイラルドメイン構造、エッジチャンネルとの相互作用の存在を示唆しているものと解釈された。さらに弱結合を2個含む超伝導ループ構造を作成し、SQUIDとしての動作の検証を行った。SQUIDの臨界電流値はヒステリシスの無いI-V特性を示したが、外部印加電流に対して周期的な臨界電流の変調構造は観測されず、外部印加電圧に応答していないという結果になった。これは弱結合における臨界電流値が磁束の量子化条件に対応しておらず、エッジ状態やカイラルドメインの影響を含めた解釈が必要で有ることが示唆される。今後さらにSQUIDの作成および測定を進める必要がある。
病理組織解析と質量分析の統合による冠動脈硬化性プラーク破綻の機序解明

本研究では、病理組織解析および質量分析を統合させた「イメージング質量分析法」によってヒト冠動脈組織の解析を行い、冠動脈硬化性プラークの破綻に関与する超微量物質を直接可視化・同定することを第一の目標とする。さらに、得られた知見をもとに血液中の新規バイオマーカー探索を行うことを目指す。
高性能オレフィン重合・二量化分子触媒の活性種・中間体の革新的構造解析新手法の開発

本国際共同研究は、オレフィンの精密重合や選択的二・三量化を効率よく進行させる触媒反応溶液中における分子触媒活性種の構造解析である。具体的には、専門・研究分野の異なる若手の(計算科学や物理学、固体無機化学の)研究分担者や海外の第一線で活躍する物理学者と連携し、欧州放射光施設での触媒溶液のX線吸収分光測定に取り組み、海外の共同研究者が開発した解析手法に基づくXANES(X線吸収端近傍構造)やEXAFS(広域X線吸収微細構造)スペクトル解析を通じて、今迄成功例のない、反応溶液中の触媒活性種の電子状態・構造の解明を目的としている。この研究成果を基盤に、革新的な高性能分子触媒の創製を指向している。
腎細胞癌における癌転移抑制遺伝子nm23の検討

目的)外科的に得られた腎細胞癌組織を用いて免疫組織化学的にnm23蛋白、p53蛋白、bcl-2蛋白の発現を検討し、これらとPCNA発現、核DNA量の変化および組織学的所見ならびに予後と比較した。結果)nm23蛋白、p53蛋白は癌組織の異型度が増加するにつれてその発現も増加したが、bcl-2蛋白に関しては明らかな傾向は認められなかった。nm23蛋白とPCNA発現、p53蛋白とPCNA発現の間には有意な正の相関を認め、またp53蛋白とbcl-2蛋白との間には負の相関を認めたがnm23蛋白とbcl-2蛋白の間には有意な関係を認めなかった。一方、p53蛋白は核DNA量の増加に伴い増加傾向を示したが、nm23蛋白と核DNA量との間には一定の傾向は認められなかった。予後との関連を検討すると単変量解析で生存率と有意な関連を認めたのは組織学的異型度、T分類、N分類、nm23蛋白量、p53蛋白量、PCNA発現率、2cDI、5cERであったが、多変量解析を行うとT分類、N分類、5cERおよびnm23蛋白量が有意な予後関連因子であった。しかしながら、nm23蛋白とNおよびM分類との間には明らかな関連性を認めなかった。結論)癌転移抑制遺伝子であるnm23の免疫組織化学的検討では、腎細胞癌におけるnm23の本来の機能は明らかではなく、むしろ増殖関連因子の一つである可能性が示唆された。
新しい緑内障視野進行判定アルゴリズムの開発およびその検証

客観的かつ統計学的に十分な妥当性を持つ緑内障の視野障害進行判定法を新たに開発し、従来報告されている判定法と実際の臨床データを用いた比較検討を行った。まず始めに従来報告されている判定法の妥当性を以下のように検討した。1039例の緑内障性視野データを用いて作成した視野クラスター分割法を元に、一つ以上のクラスターで有意な変化がある、相関の強い2つ以上、3つ以上、4つ以上などの条件を変えた視野進行判定法を案出し、その感度・特異度を算出した。感度・特異度を算出するに当たっては開放隅角緑内障303例303眼のハンフリー自動視野計C30-2プログラムによる2ケ月以内に測定した信頼度の高い2回繰り返し測定データを元に作成した視野変動のないsimulationデータを4000例と臨床的に確実に視野障害進行が認められた94例105眼の経時観察データ(平均追跡期間7.5年)を用いた。比較検討する判定方法としてはMean Deviation(MD)slopeによる判定、個々のTotal Deviation(TD)変化による判定、個々のTD slopeによる判定(progressor法)、隣接2点のTD変化による判定、Advanced Glaucoma Intervention Studyで用いられた方法(AGIS法)などを対象とした。その結果、従来の方法ではMD slopeを用いた方法が最も良好な感度・特異度を示したが、相関の強い2つ以上のクラスターまたは3つ以上のクラスターに変化を認めた時を視野変化ありとする判定法が、さらに優っていた。また前者よりも後者がより良好な結果を示した。したがって、3つ以上のクラスターに変化を認めた時を視野変化があったとする定義を用いることにより、今後緑内障性視野変化をより鋭敏かつ確実に捉えることが出来、今後の臨床および臨床研究に対して非常に有用な結果が得られたと考えられる。緑内障の視野障害進行判定法を開発するに当たって、まず従来報告されている判定法の妥当性を検討した。開放隅角緑内障303例303眼のハンフリー自動視野計C30-2プログラムによる2ヶ月以内に測定した信頼度の高い2回繰り返し測定データを元に、視野変動のないsimulationデータを4000例作成し、また、臨床的に確実に視野障害進行が認められた94例105眼の経時観察データ(平均追跡期間7.5年)と合わせ、従来の方法の検出率、誤判定率を検討した。判定方法としてはMean Deviation(MD)slopeによる判定、個々のTotal Deviation(TD)変化による判定、個々のTD slopeによる判定(progressor法)、隣接2点のTD変化による判定、Advanced Glaucoma Intervention Studyで用いられた方法(AGIS法)などを使用し、ROC曲線を作成することにより比較した。Simulationデータによる解析の結果、個々のTDに基づいた判定は検出力は比較的高いものの特異度が低く、過去に報告された方法のα値(第1種の過誤を犯す確率)は0.20.9と高かった。AGIS法の検出力・α値はそれぞれ0.467および0.0014であった。経時データによる解析でも同様な結果が得られ、ROC曲線による検討ではα値を0.1としたときのMD slope値による方法が検出力0.73と最も良好であった。以上より視野障害進行の判定は方法によって異なり、特にTDを用いた方法ではα値が高く出る傾向があるため、改善の余地があることが明らかとなった。以上の検討と同時に1039例の視野データを用いて作成した視野クラスター分割法を元に、新しい視野障害進行判定法の案出を行った。
内殻励起がもたらす分子の動的運動と緩和過程に関する理論的研究

近年のシンクロトロン放射光測定技術の発展による内殻励起状態での分子の動的運動という新しい概念理解のために、本研究は、内殻電子励起が及ぼす分子の動力学的運動を取り扱う理論と計算手法を構築し、実験事実との検証と共に新しい概念理解への理論的データを提供することを目的としている。本年度は、第一原理分子動力学法(AIMD)とウェーブレット変換(WT)による時間周波数解析法をBF_3分子の内殻励起初期ダイナミクスの詳細な解析に適用した。AIMD計算より、(a)30fs以内、(b)50fs以内、の2つの時間スケールの構造変化を見出した。WT解析から内殻励起に伴う時間スケールの違いは、(a)F-B-F非対称変角とB-F対称伸縮振動の同調運動、(b)F-B-F非対称変角運動、であると結論付けた。また、1粒子、2粒子Green関数(GF)法よる内殻励起状態を取り扱う方法論の検討を行った。自己エネルギー部分に対して、Coulombポテンシャルに動的スクリーニング効果を考慮したGW近似を採用し、参照配置としてHartree-Fock(HF)法、Kohn-Sham(KS)法を用いて検討した。1粒子GF法から内殻軌道に関する緩和効果の取り込みが重要であることを示し、2粒子GF法から内殻励起エネルギーを算出した。実験値との比較では、HF参照では2.2eV、KS参照では3.4eVの誤差となった。同様な1電子励起状態法である時間依存HF法と時間依存密度汎関数理論(BLYP汎関数の場合)と比較して、それぞれ約11eV、16eV(BLYP汎関数の場合)の改善が見られた。更なる高精度化のためには、GW近似より高次の自己エネルギー近似を用いることで達成され、Green関数法の有用性に期待できることを示した。当該研究課題の成果について国内発表3件(国際学会1件、口頭発表1件)行った。近年のシンクロトロン放射光測定技術の発展による内殻励起状態での分子の動的運動という新しい概念理解のために、本研究は、内殻電子励起が及ぼす分子の動力学的運動を取り扱う理論と計算手法を構築し、実験事実との検証と共に新しい械念理解への理論的データを提供することを目的としている。本年度は、内殻励起初期ダイナミクスの理解を目的とした。これは脱励起後の分子の断片化・イオン化反応の理解に重要となってくる。まず、電子励起状態と分子運動を取り扱う、分子軌道(MO)法を用いた第一原理分子動力学法(ab initio MD)の開発を行った。基底状態から内殻励起状態への連続的なMD計算を実行可能とすることにより、内殻励起ダイナミクスのシミュレーションを可能とした。次に、内殻励起ダイナミクスを取り扱う非平衡状態ダイナミクスを解析する手法としてウェーブレット変換を用いた新規解析手法を確立し、そのプログラム作成を行った。詳細な実験報告と理論解析がなされているBF_3分子に適用した。本研究によるab initio MD計算では、内殻励起によりB原子が面外方向へ移動し、平面から4面体への構造変化の結果を得た。この構造変化は、数10フェムト秒以内という時間スケールで達成され、内殻励起による超高速分子変形が起こりえる事を示した。本研究による新規解析手法であるウェーブレット変換による時間-周波数解析から、内殻励起後100フェムト秒内に内殻励起平衡構造C_<3v>のA_1対称変角振動に対応する振動モードを見出した。これは、内殻励起寿命内の非定常運動モードの観測という新たな知見として実験的観点からも重要なものであると考えられる。更に500cm^<-1>付近の非対称変角振動が内殻励起前後にほぼ連続的に観測され、BF_3内殻励起ダイナミクスではモード間エネルギー移動に重要であると考えられる。当該研究課題の成果について、国内発表1件を行った。これまで分子軌道法を用いた第一原理分子動力学法、ダイナミクス解析手法としてウェーブレット変換を利用した時間周波数解析法を開発し、内殻励起初期ダイナミクスの全体像理解を行ってきた。内殻励起状態は1電子励起配置間相互作用(CIS)法を用いてきたが、その精度に疑問が残っていた。本年度は、内殻励起状態を取り扱う方法論の検討を行った。本研究では内殻励起状態を取り扱う理論として、CIS法、時間依存Hartree-Fock(TDHF)法や時間依存密度汎関数理論(TDDFT)に着目してきた。これらの手法による内殻励起エネルギーは、いくつかの小分子における検討では数十eVの誤差があることが分かった。CIS法、TDHF法では過大評価、TDDFT法では過小評価であった。TDDFT法の場合は、交換-相関汎関数による依存性が大きく、HF交換を含むhybrid型ではエネルギー計算値の過小評価を抑える傾向があることが分かった。これらを踏まえ、HF法、DFT法の両方に改善の見込める1体、2体Green関数法による内殻励起状態を取り扱う理論的手法を検討し、そのプログラムの開発を行った。

自己エネルギー部分について、2次近似(GF2)と動的遮蔽効果考慮した近似(GW2)を行い、1体Green関数法により準粒子エネルギーを算出、その後2体Green関数法(BSE)により内殻励起エネルギーを算出した。小さい基底関数によるH_2O分子のテスト計算では、CIS(TDHF)法で14eV程度の誤差が、GW2-BSE法では、11.5eV程度の誤差となり、その有用性に期待できることを示した。当該研究課題の成果について国内発表2件行った。近年のシンクロトロン放射光測定技術の発展による内殻励起状態での分子の動的運動という新しい概念理解のために、本研究は、内殻電子励起が及ぼす分子の動力学的運動を取り扱う理論と計算手法を構築し、実験事実との検証と共に新しい概念理解への理論的データを提供することを目的としている。本年度は、第一原理分子動力学法(AIMD)とウェーブレット変換(WT)による時間周波数解析法をBF_3分子の内殻励起初期ダイナミクスの詳細な解析に適用した。AIMD計算より、(a)30fs以内、(b)50fs以内、の2つの時間スケールの構造変化を見出した。WT解析から内殻励起に伴う時間スケールの違いは、(a)F-B-F非対称変角とB-F対称伸縮振動の同調運動、(b)F-B-F非対称変角運動、であると結論付けた。また、1粒子、2粒子Green関数(GF)法よる内殻励起状態を取り扱う方法論の検討を行った。自己エネルギー部分に対して、Coulombポテンシャルに動的スクリーニング効果を考慮したGW近似を採用し、参照配置としてHartree-Fock(HF)法、Kohn-Sham(KS)法を用いて検討した。1粒子GF法から内殻軌道に関する緩和効果の取り込みが重要であることを示し、2粒子GF法から内殻励起エネルギーを算出した。実験値との比較では、HF参照では2.2eV、KS参照では3.4eVの誤差となった。同様な1電子励起状態法である時間依存HF法と時間依存密度汎関数理論(BLYP汎関数の場合)と比較して、それぞれ約11eV、16eV(BLYP汎関数の場合)の改善が見られた。更なる高精度化のためには、GW近似より高次の自己エネルギー近似を用いることで達成され、Green関数法の有用性に期待できることを示した。当該研究課題の成果について国内発表3件(国際学会1件、口頭発表1件)行った。
ラットモデルにおけるマスト細胞の新しい脱顆粒機構の解析とヒトマスト細胞への応用

LPS活性化マクロファージのhistaminereleasing factor(HRF)がラット腹腔内マスト細胞の緩徐な脱顆粒を誘導することを昨年明らかし、引き続きHRFの同定検索を行った。活性化マクロファージが窒素酸化物を放出することは周知のことであり、PFA310NO(東京化成工業社製)を用いて培養上清内の窒素酸化物(NO)を定量した。活性化マクロファージ群とcontrol群の間に統計学的な有意差は無く、量的及び半減期からNOはマスト細胞の緩徐な脱顆粒に直接関与しないと考えられた。次に活性化マクロファージ培養上清をaffi-gel blue gel(Bio Rad社)でアルブミンを除去し、ハイドロキシアパタイトカラムとゲルろ過カラムを組み合わせてHPLCで部分精製した。HRFは分子量100kDaのピークに強い活性を示した。以上の結果よりHRFはNOではなく熱安定な高分子プロテアーゼ物質と考えられた。次に対照としたI型アレルギー反応においてマスト細胞特異的抗体(抗MASA抗体)を用いてMASA発現を検討した。IgE抗体の結合したラット腹腔マスト細胞を抗原(DNP-As)で刺激するとMASAが発現した。そこでヒトマスト細胞株(HMC-1)を用いてサイトカインによるMASA発現を検討した。IL-6(50ng/ml)、SCF(50ng/ml)、IL-4(10ng/ml)、TGF-β(10ng/ml)、TNF-α(20ng/ml)でHMC1を刺激し5日間培養した。TGF-βで刺激したHMC-1がmRNA及びタンパクレベルでMASAを発現し、活性化マクロファージ由来のTGF-βがマスト細胞の活性化を誘導することを示唆した。よって本実験は活性化マクロファージとマスト細胞のcell-cell interactionが急性と慢性炎症の両者に関与することを示した。敗血症の原因であるエンドトキシン(LPS)1mg/ratをラット腹腔内に投与すると24時間でresident腹腔マクロファージが活性化像を呈し、24時間まで急激に細胞数が減少しその後増加した。一方、マスト細胞は48時間で著しく減少し、腹腔内ヒスタミン量も漸減した。この緩徐なマスト細胞の脱顆粒機構に活性化マクロファージの関与が示唆された。次にin vitroにおいてrat腹腔マクロファージを接着法で純度90%以上に分離し50μg/ml LPSで刺激して24時間後の培養上清を採取した。生物活性を長期維持する為に3T3 fibroblastとco-cultureした精製マスト細胞に活性化マクロファージ上清を添加して1、7時間後にfresh mediumに交換して48時間インキュベートしたものと48時間反応させたものを比較すると、48時間反応させた細胞に脱顆粒とヒスタミン遊離が認められた。更に活性化マクロファージが分泌するhistamine releasing factor(HRF)のcharacterizationを行なった。この脱顆粒反応は抗TNFα抗体、56°C30分間の熱処理では阻害されず、100°C30分間の熱処理、SBTI、cycloheximideで阻害された。以上の結果から緩徐な脱顆粒反応を起こすHRFは従来のTNFα、C3a、C5aとは異なる熱安定なプロテアーゼ様物質と考えられた。現在HPLCを用いたHRFの物質の同定とmacrophageから分泌されるNOの測定を検討している。
ヘム欠乏により惹起される糖代謝異常の分子メカニズムの解明

重要な生体分子であるヘム量を調節している、5-アミノレブリン酸合成酵素(ALAS)の遺伝子破壊マウスが糖尿病であることを発見し、このマウスの解析から、細胞内のヘムが欠乏すると、グリコーゲンの合成が異常になるため、糖尿病になることが判った。また、この異常はALASによって合成される5-アミノレブリン酸の投与により改善され、5-アミノレブリン酸が糖尿病薬として働くのはグリコーゲンの合成を促進しているためであることを明らかにした。。ALAS1+/-マウスに対する経口耐糖能試験(OGTT)およびインスリン負荷試験(ITT)により、耐糖能異常およびインスリン抵抗性が生後15週前後から惹起されることを明らかとした。なお、OGTTにおける、ALAS1+/-マウスでの血清インスリンレベルは野生型と同等であることがわかり、ALAS1+/-マウスでのインスリン分泌に異常が無いことが示唆された。ALA経口投与実験から、ALAS1+/-で認められた耐糖能異常およびインスリン抵抗性は、1週間の5-アミノレブリン酸(ALA)の経口投与により野生型レベルまで改善されることを確認した。また、ALAS1+/-マウスに対して、ALAと同時にクエン酸第一鉄を投与した場合は、ALAと鉄との相乗的な、耐糖能異常への治療効果は認められなかった。一方、ALAの耐糖能異常に対する治療効果は、投与後1週間の通常飼育後には、ALAS1+/-マウスに耐糖能異常が観察されるようになることから、可逆的であることが示唆された。これらの結果から、ALAS1+/-マウスでの耐糖能異常およびインスリン抵抗性はALA欠乏によって惹起されることが示唆され、持続的な耐糖能異常の改善には持続的なALAの投与が必要であることが示唆された。骨格筋において、インスリン依存的にグルコース取込を担うGlut4の発現解析を行ったところ、OGTTにおいて、グルコース投与後のGlut4のタンパクレベルは野生型と大差ないものの、形質膜への局在が認められる筋線維の割合が野生型と比較して、有意にやや減少していることが分かった。さらに、蛍光グルコース誘導体である2-NBDGを用いて、グルコース負荷後の、グルコースの取込を評価したところ、野生型と比較して、半減していることが明らかとなった。以上の結果から、ALAS1+/-マウスの骨格筋でのインスリン依存的グルコース取込に異常があることが示唆されたが、Glut4が関与しているかは不明である。ALAS1遺伝子破壊マウスヘテロ接合体(HT)が、15週齢以降のHTで、骨格筋での糖の取込異常が原因と推測される耐糖能異常・インスリン抵抗性を示すことを25年度に明らかにした。この異常はALA経口投与により改善することも明らかにした。26年度では、HTでの糖代謝異常に対する肝での糖新生の影響を検証した。絶食時血糖に有意な差はなく、OGTT時の血清グルカゴン量はHTが野生型と比較して有意に減少し、糖新生を律速するG6Pase mRNAレベルも減少していることから、肝臓での糖新生の異常亢進が原因で、HTで認められるインスリン抵抗性が起こる可能性が低いことがわかった。HT骨格筋でのインスリンシグナル分子の解析を行ったところ、Glut4と同様に野生型と顕著な違いを見出すことは出来なかったため、HTではインスリンシグナルはほぼ正常であることが示唆された。また、電子顕微鏡解析から、HT骨格筋でミトコンドリアに形態異常が観察され、HT骨格筋でのミトコンドリアDNAレベルの低下、ミトコンドリア形成調節の中心分子であるPGC1a mRNAレベルの低下を認めた。さらに、トレッドミル試験によるHTの運動耐性が低下を観察したことから、HTでは筋肉の機能低下を伴うミトコンドリア異常があることがわかった。なお、糖代謝異常を示さない15週齢以前の幼若なHTではミトコンドリア異常は認められなかった。HTでのミトコンドリア異常・運動耐性低下は、インスリン抵抗性と異なり、1週間のALA経口投与では改善されなかった。この結果から、骨格筋でのミトコンドリア異常がインスリン抵抗性をもたらす、必要十分な原因ではないことが明らかとなったことから、27年度では、さらにインスリン抵抗性をもたらす分子メカニズムの解明を進める。5-アミノレブリン酸はヘム生合成系の最初の生合成前駆体であり、ALAの合成により細胞内のヘム量がコントロールされている。非組織特異型ALA合成酵素遺伝子であるALAS1遺伝子破壊マウス(HT)における、ALA依存的な耐糖能異常(IGT)・インスリン抵抗性(IR)の発症機序について、解析を行い、HTの骨格筋では、インスリン依存的なde novoグリコーゲン合成、および、グリコーゲン合成を制御するグリコーゲンシンターゼ(GS)に対する、グルコース6ーリン酸(G6P)によるアロステリックな活性化が障害されていることを見出し、HTでは、G6Pによる、GSに対するアロステリック活性化が障害され、インスリンにより惹起されるde novoグリコーゲン合成が不全となるため、個体での血糖処理能が低下して、IGT/IRとなることを示した。また、ALAS1ノックダウンC2C12筋芽細胞を作製し、HTと同様のグリコーゲン合成異常を認め、さらに、ヘム生合成阻害剤スクシニルアセトン処理実験からALA合成失調は最終的にヘム合成失調を来し、これによりcell-autonomousにグリコーゲン合成異常が起こることを明らかとした。

本研究により、ヘムによる、グリコーゲン合成を介した、予想外の糖代謝調節機構が存在し、その異常がIGT/IRをもたらすことを明らかとした。一般に、二型糖尿病などに認められるグリコーゲン合成異常はインスリンシグナル異常の結果と考えられており、本研究により、グリコーゲン合成自体の異常が、IGT/IRをもたらしうることが明らかとなり、糖尿病発症における新規の分子機序を発見した。加えて、コホート研究により報告されている、ALAによる糖尿病治療の分子基盤が本研究により解明されたことで、今後の糖尿病薬としてのALAの利用が広がることが期待される。研究成果は現在、投稿中である。重要な生体分子であるヘム量を調節している、5-アミノレブリン酸合成酵素(ALAS)の遺伝子破壊マウスが糖尿病であることを発見し、このマウスの解析から、細胞内のヘムが欠乏すると、グリコーゲンの合成が異常になるため、糖尿病になることが判った。また、この異常はALASによって合成される5-アミノレブリン酸の投与により改善され、5-アミノレブリン酸が糖尿病薬として働くのはグリコーゲンの合成を促進しているためであることを明らかにした。。ALAS1遺伝子破壊マウスヘテロ接合体(HT)において、当初、見出した耐糖能異常、インスリン抵抗性に加え、電子顕微鏡解析の結果から、予想していなかった、骨格筋でのミトコンドリア異常を見出し、HTの糖代謝異常の発症に関わる可能性のある新たな異常を発見することが出来た。2型糖尿病患者の多くに、ミトコンドリア異常が認められ、インスリン抵抗性をもたらす、有力な原因の1つと考えらえており、HTでのインスリン抵抗性をもたらす原因の解明に近付くことが出来た。しかし、ALA投与実験などの解析の結果から、HT骨格筋でのミトコンドリア異常がインスリン抵抗性をもたらす必要十分な原因ではないことが分かったため、今後、さらにインスリン抵抗性を惹起する分子メカニズムの解明を進める必要がある。また、26年度に、培養細胞モデルとして、筋肉系培養細胞株C2C12を用いて、ALAS1ノックダウン株を樹立した。今後、この培養細胞モデルを用いて、より詳細な分子生物学的解析を進めることが可能となっている。分子生物学ALAS1遺伝子破壊マウスヘテロ接合体(HT)におけるインスリン抵抗性惹起のメカニズムは糖尿病病態をもたらす、新しい、重要な糖代謝制御機構の解明に繋がる可能性があると、考えており、今後もインスリン抵抗性惹起の分子機構の解明を進める。新たに、見出したHTでの骨格筋ミトコンドリア異常はALAS1欠損により起こる重要な異常であると考えらえるが、インスリン抵抗性惹起の必要十分な異常でないことが判明したため、インスリン抵抗性が糖代謝制御のどの過程の異常と関連しているかをさらに追及する。特にインスリンシグナル分子の異常が見いだされなかったことから、HTでの糖代謝制御でのいずれの過程に異常が認められるかを慎重に検討する予定である。また、26年度に、培養細胞モデルとして確立した、筋肉系培養細胞株C2C12ALAS1ノックダウン株を利用して、分子生物学的解析を進める予定である。現在までに、ALAS1+/-マウスの糖代謝に関する基本的な表現型解析が終了しており、ALAS1+/-
アフリカの農村資源管理と国家―ガーナとルワンダの比較研究

近年アフリカ諸国では、新自由主義的経済政策、人口増加、気候変動等の影響から、土地や水など農村における資源制約が強まり、その利用や分配(広義の「管理」)が政治問題化している。従来アフリカ農村の資源管理は伝統的権威に委任される傾向にあったが、国家の関与が強まり、国家と社会がせめぎ合う場となっている。本研究の目的は、農村資源管理の比較を通じて、アフリカにおける国家社会関係変容の方向性を探ることにある。現地研究者との密接な協力に基づいて、ガーナとルワンダという対照的な統治システムを持つ国の農村資源管理を比較分析する。それにより実践的な政策課題に答えつつ、国家社会関係の再編、変容の方向性を明らかにする。
発電する窓ガラス：ナノ粒子塗布による完全透明p-n接合デバイスのオンデマンド製造

透明導電性金属酸化物(TCO)は,可視光領域での透明性と導電性を併せ持つ材料である.その製造法として近年,インク塗布法が注目されている.しかしながら,その開発の中心はn-型TCOである.一方,p-n接合を鍵とする熱電変換材料や太陽電池分野において,p-型TCOに注目が集まりつつある.そこで本研究は,世界に先駆けてp-型TCOナノ粒子の厳密サイズ・形態制御液相合成法を開拓し,低抵抗かつ高透明性を両立するp-型TCOナノインクを調製する.また,代表者の高品位n-型TCOナノインクと組み合わせることにより,インク塗布プロセスにおいて透明導電性p-n接合型の“発電する窓ガラス"を試作する.透明導電性金属酸化物(TCO)は,可視光領域での透明性と導電性を併せ持つ材料である.その製造法として近年,インク塗布法が注目されている.しかしながら,その開発の中心はn-型TCOである.一方,p-n接合を鍵とする熱電変換材料や太陽電池分野において,p-型TCOに注目が集まりつつある.そこで本研究は,世界に先駆けてp-型TCOナノ粒子の厳密サイズ・形態制御液相合成法を開拓し,低抵抗かつ高透明性を両立するp-型TCOナノインクを調製する.また,代表者の高品位n-型TCOナノインクと組み合わせることにより,インク塗布プロセスにおいて透明導電性p-n接合型の“発電する窓ガラス"を試作する.
直交磁心型移相器の開発と電力潮流制御への応用に関する研究

平成16年度においては,まず前年度のシミュレーションによる検討により,動作確認を行った直交磁心型移相器システムの設計と製作を行った。1.5k VA級の直交磁心型三相可変インダクタについては,昨年度既に製作を行っている。本年度は,移相器システムを構成する上で重要な装置である,母線電圧に対して90度位相差を有する電圧を得るための調整変圧器と,機器設置点の線路電圧の位相を制御する直列変圧器の設計・製作を行った。設計製作を行った上記の直交磁心型可変インダクタ,変圧器,並びに制御用直流電源,三相交流電源を用いて直交磁心型移相器システムの構築を行った。次いで,構築した実験システムを用いて電力潮流制御実験を行った。動作原理上,潮流の向きを制御すること不可能であるが,本装置は潮流の大きさを線形かつ連続的に制御可能であることが明らかになった。なお,可制御範囲は50W800Wで有り,直交磁心型三相可変インダクタの容量1.5k VAの半分程度であった。今後は,システムの最適化について更に検討を進める必要がある。出力電流波形についてもほぼ正弦波の出力が得られた。今回実験を行った範囲では,全制御範囲で実効的な電流歪み率が3%以下になり,高調波フィルタ無しで系統との連系が可能であることが示された。以上により,直交磁心型移相器の開発と電力潮流制御に関する研究は,ほぼ所期の目的を達成できたものと考えられる。本年度は,まず移送器として用いる楔形ギャップ付き直交磁心の設計を行った。設計には,既に筆者らが提案している磁気回路法に基づいたリラクタンス・ネットワーク解析を用いた。この解析により,楔形ギャップの寸法によって機器の特性が大きく変化することがわかった。特に制御特性と電流歪み特性については,ギャップを大きくすると主巻線電流歪みは低減されるが制御特性が劣化し,逆にギャップを小さくすると制御特性は良くなるが電流歪みが強くなるため,両者はトレードオフの関係にあることがわかった。従って,用途に応じて適切なギャップ寸法を選定する必要あるが、研究代表者が提案している解析手法を用いれば,上記の特性が精度良く算定できるため磁心の設計に有用であると考えられる。次いで,上記の解析手法を用いて1.5kVAクラスの直交磁心型三相可変インダクタの試作を行った。この三相可変インダクタを用いた基礎実験により,所望の制御特性と,ほぼ良好な電流波形が得ることができた。次いで,移送器の基礎設計を行った。移送器は,直交磁心の他に,系統と90度位相の異なる電圧を得るための並列変圧器と,その電圧を系統に印加し,線路電圧の位相を変化させる直列変圧器で構成される。従って,変圧器の容量の選定や,システム全体のバランスも重要であるが,ここでは汎用の回路シミュレータであるSPICEを用いて,適切な容量の選定を行った。また,設計した移送器システムの動作をSPICE上で確かめた。その結果,電力潮流の制御が可能であることを確かめた。
多機能センシングナノビーズを用いた乳がん手術の開発

がん診断・治療において最適な粒径の薬剤は受動的に腫瘍に取り込まれる。我々は、移植乳がんに対し各種サイズの取り込みを画像計測した。その結果、粒径200nmの粒子は腫瘍血管外に漏出せず、20,40,100nmの粒子が腫瘍間質に漏出することを明らかにした。また蛍光量子ドットによる鏡視下センチネルリンパ節検出を試み、センチネルリンパ節の転移開始場所を精細に特定できた。抗腫瘍抗体結合量子ドットにより病巣可視化が可能であり、精細外科手術の実現に向けた基礎を築くことができた。本研究では多種の機能を持つナノ粒子を用いることで超精細な乳がん手術を可能とする新しい技術の開発を目指す。がん病巣に対してはがん特異的抗体、ならびにセンチネルリンパ節検出に最適な粒径を持つナノ粒子を作成する。さらに、比較的長時間標的に留まる蛍光、X線、MRIに利用可能な多機能造影剤を開発する。そして、単一造影剤による術前のX線CT、MRIによるがん病巣検査、術中の精密な病変の蛍光検出技術ならびに蛍光センチネルリンパ節生検法も合わせて確立する。本年度はがん病巣に到達した後のナノ粒子の動態を明らかにするため、腫瘍間質におけるナノ粒子の動態を粒子径20nm,40nm,100nm毎に腫瘍血管付近、腫瘍間質、細胞間においてそれぞれ検討し、それぞれの場所におけるリンパ流と拡散の影響の相違を初めて明らかにした。その中で粒径20nmの粒子はいずれの場所でもリンパ流に乗って移動するが、100nmの粒子は腫瘍間質、細胞間ではリンパ流の影響はほとんど受けず、ほぼ拡散運動を示した。この結果によりセンシングナノビーズの薬物動態(DDS)を決める上で重要な知見を得ることができた。また、X線造影剤として作製したシリカコーティングヨウ化銀ビーズを用い、腫瘍造影並びに体内動態の解明に成功した。これにより、ナノ粒子のコーティング毎の体内動態を明らかにする手法が確立できた。以上のように多機能センシングビーズの開発、特にその安全性、有効性の確立に向けて着実に進捗している。がん病巣に対しては特異的抗体を作成し、センチネルリンパ節検出に関しては最適な粒径を持ち、かつ比較的長時間標的に留まる蛍光、X線、MRIに利用可能な多機能造影剤を開発する。本年度は腫瘍病巣の精密診断に必要な、がん細胞1個レベルでの検出を可能にするべく研究を進めた。また生体内で蛍光ナノ粒子を用いるためには蛍光粒子の安定化が必要であり、安定な材料でコーティングする技術は必須である。そのため蛍光ナノ粒子のシリカコーティングの最適条件の決定とこれを用いてラットでのセンチネルリンパ節検出を試みた。この中でシリカコーティングに最適なtetraethylorthosilicate(シリカ源)濃度を決定することに成功した。また同ナノ粒子を用いた動物実験から、シリカコーティングによるセンチネルリンパ節造影実験において、造影持続時間を従来の蛍光ナノ粒子に比べて1時間以上延長することに成功した。また大型動物をモデルとして鏡視下に蛍光ナノ粒子を用いたセンチネルリンパ節の検出に成功した。シリカコーティングをはじめとするコーティング技術は安全性の確保やナノ粒子の医療応用のキーテクノロジーの一つになると考えられる。また既にHER2タンパク発現腫瘍移植マウスではその中で量子ドット抗体結合物を1粒子レベルで検出することが可能となり、更に抗体結合細胞の転移における動態を生体内で観察することに成功した。本研究は多機能センシングビーズの開発、細胞一個レベルの検出技術の確立、安全性、有効性の確立に向けて着実に成果をあげている。我々は機能性ナノ粒子を用いた新しい計測技術を開発し、乳がんの外科治療への応用を検討している。乳がんの外科治療においては病巣のマーキングとセンチネルリンパ節生検が主な応用として考えられる。またがん病巣への取り込みには能動的取り込みと受動的取り込みが考えられる。能動的取り込みとして、最適な粒径を与えることで取り込みが期待できる、enhanced permeability and retention (EPR)効果、能動的取り込みとして、trastuzumab等を利用した抗腫瘍抗体結合マーカーの利用が挙げられる。今回、腫瘍への最適な取り込みサイズに関し、我々は20、40、100、200nmの各種サイズの取り込み効果を検証するため移植乳がん腫瘍内動態を、超高精度1粒子蛍光計測システムを用いて計測した。その結果、粒径200nmの粒子は血管外に漏出せず、20,40,100nmの粒子が腫瘍間質に漏出することが明らかになった。また、腫瘍間質においても、血管近傍と細胞間とでは粒径によって動態が大きく異なることを明らかにした。

(Breast Cancer Res.2009)この結果はがん手術のみならず、抗がん剤の動態、薬剤耐性のメカニズム解明および解決、生体内での様々な分子動態、メカニズムの解明にもつながるものと期待される。更に蛍光を発する量子ドットを用いて鏡視下でのセンチネルリンパ節蛍光検出を試み、ナノ粒子は長時間にわたってセンチネルリンパ節、特にリンパ管流入部に滞留することを示した。これによりセンチネルリンパ節の転移を起こし得る場所を精細に特定できることがわかった。更にリンパ節内のリンパ球に対する抗体を用いて特定の細胞を標識できることを示した。(Nanotechnology, in press)以上により、この手法は病巣検出においても有効であり、将来乳がんの外科手術において、EPR効果にtrastuzumab等による能動的腫瘍検出能を組み合わせた病巣の可視化による精細な外科手術の実現が期待される。
制御性T細胞レパートリーと抗原特異性の解析

本研究では制御性T細胞(Treg)分化と機能発現に関わる抗原特異性とTCRレパトワを解明することを目的とし、Treg由来核移植ES細胞クローン1D2から樹立した1D2-TCRβマウスを用いて以下の研究を行った。(1)Treg由来TCRの特異性の解析:1D2クローンがTreg由来であることを証明してその特異性を明らかにするためにRAG欠損マウスの骨髄細胞に1D2 αβTCRを発現させるレトロウィルスを感染させ、これを放射線照射したRAG欠損マウスに移入してTreg分化を解析した。その結果、この1D2 αβTCRを発現する細胞から確かにFoxp3+ T細胞が分化することを見出し、このクローンがTreg由来であることを明らかにした。(2)Tregおよびaborted TregのTCRレパトワ解析:最近我々は、Treg分化の過程で一部のFoxp3+ T細胞がFoxp3発現を失ってヘルパーT細胞へと分化する可塑性を示すステージがあることを見出し、このような細胞をaborted Tregと名付けた。Tregとaborted Tregの関係、そしてそれらの特異性を明らかにするために、1D2-TCRβマウスにFoxp3^<EGFPCre>, ROSA26^<RFP>, TCRCα+/-allelesを交配により導入し、ここからTreg(EGFP+), aborted Treg (EGFP-RFP+), non-Treg (EGFP-RFP-)を単離してVαレパトワを解析した。その結果、これらのレパトワは多少の重なりはあるものの全体として異なっており、ある特定の特異性を持ったFoxp3^+ T細胞のみがTreg分化においてabortされることを見出した。平成20年度は、制御性T細胞(Treg)由来核移植ES細胞1D2クローンから得られた機能的TCRβ遺伝子を持ったマウス系統1D2βを樹立し、制御性T細胞の分化・機能を解析するためにFoxp3-hCD2レポーターマウス、Foxp3変異scurfyマウスと交配し、またTCRβ鎖を固定したときのTCRα鎖レパトワを解析するためにTCRCα+/-背景のマウスを作製した。まずTreg分化を解析した結果、1D2βマウスではほぼ全てのT細胞が1D2β鎖(Vβ4)を発現するが、野生型と比較してFoxp3^+CD4^+T細胞の発生・分化にはほとんど影響が見られなかった。しかしながら、この1D2βマウスにscurfy変異を導入したとき、発症する自己免疫疾患の臓器特異性に変化が見られ、皮膚炎は軽減する一方で、通常のscurfyマウスでは認められない大腸炎を発症した。この結果から、Treg由来TCRβ鎖により、T細胞の抗原特異性に大きなインパクトが与えられることが明らかとなり、1D2 TCRが腸管由来の抗原を認識することが示唆された。これまで1D2由来の機能的TCRα遺伝子を受け継いだマウス系統をgermline伝達によって樹立することができなかったが、Treg分化と機能におけるTCR特異性を明らかにするためには1D2αβ両方をモノクローナルに発現させることが必須である。この目的のため、1D2α鎖をレトロウィルスによる強制発現あるいはトランスジェネシスにより発現させる方法をとることとした。そして1D2αcDNAをRT-PCRによりクローニングし発現ベクターを構築した。これまでにTreg由来核移植ES細胞クローン1D2から機能的TCRβ遺伝子を受け継いだマウス系統1D2βを樹立した。本年度はこのマウスを利用して以下の研究を進めた。(1)Treg由来TCRの特異性の解析:1D2クローンがTreg由来であることを証明するためにFoxp3^<hCD2>.1D2β.TCRCα^<+/->マウスからFoxp3^+およびFoxp3^-CD4^+T細胞を単離してTCRαレパトワを解析した。その結果、1D2αclonotypeがVα4.3/Jα44を発現するTregのうち約95%、non-Tregにおいては約60%を占めたことから、1D2αb TCRは主に(排他的ではないものの)Treg分化を誘導することが示唆された。また、1D2αb TCRを個体レベルで再構成するためにCD4^+CD8^+細胞以降の胸腺内分化段階で1D2αを発現するトランスジェニックマウスの作製を進めた。(2)Tregおよびex-TreのTCRレパトワ:最近我々は、Tregはヘテロな集団であり、多くは安定にFoxp3を発現するコミットされた集団であるが、一部はFoxp3を不安定に発現しヘルパーT細胞へ分化転換する能力を保持した可塑的な集団であることを明らかにした。TregにおけるFoxp3発現の維持におけるTCR特異性の役割を明らかにするために、Foxp3^<hCD2>.1D2β.TCRCα^<+/->マウスからFoxp3^+T細胞をT細胞欠損マウスに移入し、Foxp3発現を維持するTregと失ったex-Tregを単離してそのVα2レパトワを比較した。予備実験の結果、両者に見出される配列は異なっており、さらに後者の方が前者と比較して多様性が低かった。従って、ある特定の抗原特異性を持ったTregのみが分化の可塑性を示すことが示唆された。

本研究では制御性T細胞(Treg)分化と機能発現に関わる抗原特異性とTCRレパトワを解明することを目的とし、Treg由来核移植ES細胞クローン1D2から樹立した1D2-TCRβマウスを用いて以下の研究を行った。(1)Treg由来TCRの特異性の解析:1D2クローンがTreg由来であることを証明してその特異性を明らかにするためにRAG欠損マウスの骨髄細胞に1D2 αβTCRを発現させるレトロウィルスを感染させ、これを放射線照射したRAG欠損マウスに移入してTreg分化を解析した。その結果、この1D2 αβTCRを発現する細胞から確かにFoxp3+ T細胞が分化することを見出し、このクローンがTreg由来であることを明らかにした。(2)Tregおよびaborted TregのTCRレパトワ解析:最近我々は、Treg分化の過程で一部のFoxp3+ T細胞がFoxp3発現を失ってヘルパーT細胞へと分化する可塑性を示すステージがあることを見出し、このような細胞をaborted Tregと名付けた。Tregとaborted Tregの関係、そしてそれらの特異性を明らかにするために、1D2-TCRβマウスにFoxp3^<EGFPCre>, ROSA26^<RFP>, TCRCα+/-allelesを交配により導入し、ここからTreg(EGFP+), aborted Treg (EGFP-RFP+), non-Treg (EGFP-RFP-)を単離してVαレパトワを解析した。その結果、これらのレパトワは多少の重なりはあるものの全体として異なっており、ある特定の特異性を持ったFoxp3^+ T細胞のみがTreg分化においてabortされることを見出した。
卵巣機能の局所調節に関する内分泌・免疫学的研究

近年、卵巣機能の調節において、下垂体性ゴナドトロピンの作用を修飾する性ステロイド、細胞増殖因子や、サイトカインなどの卵巣内局所調節因子の存在が注目を集めている。本研究では内分泌因子・免疫因子も含めた卵巣内局所調節機構の統括的概念の構築を目指し、実験系としてブタ顆粒膜細胞単層培養系、およびヒト黄体化細胞培養系を用い、さらに幼弱マウスの排卵誘発系、ブタ、及びヒト莢膜細胞の単層培養系を新たに樹立した。その結果ブタ顆粒膜細胞系において、サイトカインをはじめとするペプタイド因子を局所において分解代謝しうるアミノペプチダーゼ活性が、ブタ顆粒膜培養細胞の細胞表面に存在していることが見い出された。さらにアミノペプチダーゼのインヒビターであるベスタチンの添加によりブタ顆粒膜細胞の黄体化が促進されることが明らかとなった。幼弱マウス排卵誘発系においても、ベスタチン投与で排卵が促進され、細胞膜表面ペプチダーゼが卵胞発育の調節因子として生理学的に重要であることが示唆された。またヒト黄体細胞において、別の細胞膜表面ペプチダーゼであるジペプチヂルペプチダーゼIVが排卵後の黄体化に伴い発現することが明らかとなり、その発現はヒト黄体化顆粒膜細胞培養系を用いて、フローサイトメトリー法で分析したところインターロイキン1、及び腫瘍壊死因子によって増強された。我々は末梢血リンパ球との共培養でヒト黄体化顆粒膜細胞のプロゲステロン産生が刺激されることを以前に報告しているが、今回新たにTリンパ球の細胞接着関連分子であるHLA-DR抗原およびLFA-3が黄体化に伴いヒト顆粒膜黄体細胞にも発現してくる分化抗原であることが明らかとなった。フローサイトメトリー法での分析の結果、これら分化抗原の発現もサイトカインで制御されており、排卵後の黄体形成期においても内分泌系のみならず免疫系も含めた調節機構の存在が強く示唆された。本研究の目的は、卵巣機能における種々の卵巣内局所調節因子の働きに注目し、それらを因子間のネットワーク形成という観点より、詳細に検討する事である。調節因子としては性ステロイド、サイトカイン、成長因子、細胞膜表面ペプチダーゼなどに注目し、実験系としては幼弱マウスの排卵誘発系、ブタ顆粒膜細胞単層培養系、およびヒト黄体化細胞培養系を用いた。ブタ顆粒膜細胞系ではすでにインターロイキン1、腫瘍壊死因子、インターフェロンなどのサイトカインが顆粒膜細胞の増殖、ステロイドホルモン産生能に影響をあたえることを明らかにし報告している。本研究ではそれらに加え、TGF-βおよびアンドロゲンレセプター拮抗剤であるフルタミドが、LH刺激によるブタ顆粒膜細胞の黄体化を抑制すること、またペプチダーゼのインヒビターであるベスタチンが黄体化を促進することなどを明らかとした。幼弱マウスを用いた排卵誘発系においても、フルタミド、及び抗インターロイキン1抗体投与で排卵が抑制され、またベスタチン投与で排卵が促進されることが明らかとなり、上記の調節因子が生理学的に重要であることが示唆された。更にヒト黄体細胞において、ジペプチヂルペプチダーゼIVに引き続いて、HLA-DR抗原も黄体化に伴う分化抗原であることが明らかとなり、免疫系も含めた調節機構の存在が示唆された。これら分化抗原の発現機構をヒト黄体化顆粒膜細胞培養系を用いて、フローサイトメトリー法で分析したところサイトカインで発現が制御されていることが、明らかとなった。

次年度は以上の知見をもとに各因子間の相互作用に重点をおき更に検討を進める。本研究は、卵巣機能における種々の卵巣内局所調節因子の働きに注目し、それらを因子間のネットワーク形成という観点より、とくに免疫系の関与に注目して詳細に検討する事を目的とした。ブタ顆粒膜細胞系ではすでにサイトカインが顆粒膜細胞の増殖、ステロイドホルモン産生能に影響をあたえることを明らかにし報告しているが、本研究ではそれらに加え、ブタ顆粒膜細胞の細胞表面にアミノペプチダーゼ活性が存在していることを証明し、アミノペプチダーゼのインヒビターであるベスタチンの添加によりブタ顆粒膜細胞の黄体化が促進されることなどを明らかとした。幼弱マウスを用いた排卵誘発系においても、ベスタチン投与で排卵が促進されることが明らかとなり、細胞膜表面ペプチダーゼが調節因子として生理学的に重要であることが示唆された。更にヒト黄体細胞において、別の細胞膜表面ペプチダーゼであるジペプチヂルペプチダーゼIVが排卵後の黄体化に伴い発現することが明らかとなり、その発現はヒト黄体化顆粒膜細胞培養系を用いて、フローサイトメトリー法で分析したところインターロイキン1、及び腫瘍壊死因子によって増強された。また以前末梢血リンパ球との共培養でヒト黄体化顆粒膜細胞のプロゲステロン産生が刺激されることを報告しているが、今回新たにTリンパ球の細胞接着関連分子であるHLA-DR抗原およびLFA-3が黄体化に伴いヒト顆粒膜黄体細胞に発現してくる分化抗原であることが明らかとなった。フローサイトメトリー法で分析の結果、これら分化抗原の発現もサイトカインで制御されていることが明らかとなった。以上の結果より、排卵後の黄体形成期においても内分泌系のみならず免疫系も含めた調節機構の存在が強く示唆された。