hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本列島における完新世活断層の活動度評価に関する研究

フロントは従来考えられていた位置よりもさらに西に位置し,変位速度も従来の推定値よりかなり大きいことが分かった.この断層フロントを北へ追跡すると,野幌丘陵から樺戸山地西方沖を経て,天塩山地西縁の沖合いに延びることがわかった.天塩山地西縁で断層フロントが最も海岸に近づく部分では,海成段丘の高度が異常に高いことが分かった.この断層フロントの東側地下深部には,幅数十kmに達する大規模なデコルマンが存在する可能性がある.東日本に関しては,引き続き高精度マッピングを行うとともに,千屋断層帯をテストフィールドとして反射法地震探査による地下構造調査を実施した.その結果,千屋断層は地下約1kmで低角のデコルマンに移化すること,ずれの総量が2kmを越えること,の2点が分かった.また,千屋断層先端部で極浅層反射法探査と浅いボーリングを併用して,net-slip rateを決定する調査も行った.中部日本でも,糸魚川静岡構造線の北部,神城断層をテストフィールドとして同様の調査を行った.本研究は,日本列島に分布する主要な活断層について均質な尺度で活動度評価を行ない,日本列島の新しい地質時代のテクトニクスを定量的に吟味するうえで基礎となるデータを得ることを目的として行われた.平成7年度から平成9年度までの3年間に,全国の主要な活断層帯について,大縮尺空中写真の判読による詳細マッピングと断層にともなう地表変形の抽出を行った.その結果,従来の調査では見落とされていた完新世地形面の微弱な変形や伏在断層にともなう地表変形が発見され,断層帯のセグメンテーション問題やグル-ピング問題を解決するうえで重要な知見を得た.その成果の一部は,論文として学会誌に発表したほか,「1:25000都市圏活断層図」シリーズとして国土地理院から出版されている.さらに平成8年度と9年度の2年間においては,空中写真判読の成果に基づいて,いくつかの断層帯(糸魚川静岡断層帯,千屋断層帯,石狩低地帯東縁断層帯)で地形・地質調査,重力探査,反射法地震探査,ボーリング調査,地層抜き取り調査を実施した.正確なスリップ・レートを決定したり複雑な断層帯の主断層と副断層の関係を明確にするためには,断層帯の浅層地下構造を明らかにすることが不可欠である.そのために,これらの野外調査では,従来研究的な断層調査においては用いられることの少なかった浅層反射法地震探査を導入し,それと従来型の調査法を有機的に結合することによって,新たな活断層研究の手法を確立する端緒を開いたと評価される.
落屑症候群における落屑物質の成因に関するレクチンおよび免疫電顕組織化学的研究

これまで落屑物質の成因に関する研究のほとんどは,電子顕微鏡を用いた形態観察にのみ基づくものであった.本研究の目的は,落屑物質の成因と考えられている物質に対し,レクチン,免疫電顕および生化学的手法を用いて,形態および成分の両面から検討を行うことにより,落屑物質の成因を解明することである.本院における眼手術により得た線維柱帯組織,水晶体組織,皮膚組織,結膜組織を,直ちにロビクリルK4Mに低温包埋し,超薄切片を作製した後,18種類のレクチンで染色し,金コロイド標識を行った.各組織において,落屑物質,基底膜,毛様小帯,弾性線維,エラウニン線維,オキシタラン線維,エラストーシス,エラストジェネシス,膠原線維などの,線維性構造物についてのレクチン染色性を,電顕的に比較検討した.その結果,各構造物とも基本的には落屑物質と一致した染色性は示さなかったが,エラストーシスおよびエラストジェネシスは,超微形態,レクチン染色性が一様でなく,その中に形態および染色性が落屑物質にほぼ一致したものが存在した.従って落屑物質が,エラストーシスあるいはエラストジェネシスの中で産生される可能性が示唆された.これまで成因として,有力視されてきた基底膜については,形態学的には,基底膜から落屑物質が産生される様な所見が認められたものの,レクチン染色性がかなり異なっていた.同様に有力視されていた毛様小帯に関しては,染色性は類似していたが,形態学的な類似性に乏しかった.本手法は,親水性の包埋剤であるロビクリルK4Mによる低温包埋法とコロイド金電顕組織化学を用い,より生体に近い標本での優れた染色性が得られる上に,上記の様な微細な構造物の,形態と成分を同時に比較することが可能な手技である.現在さらに,新たに作成した抗体,および既知の細胞外基質に対する抗体を用い検討中である.これまで落屑物質の成因に関する研究のほとんどは,電子顕微鏡を用いた形態観察にのみ基づくものであった.本研究の目的は,落屑物質の成因と考えられている物質に対し,レクチン,免疫電顕および生化学的手法を用いて,形態および成分の両面から検討を行うことにより,落屑物質の成因を解明することである.本院における眼手術により得た線維柱帯組織,水晶体組織,皮膚組織,結膜組織を,直ちにロビクリルK4Mに低温包埋し,超薄切片を作製した後,18種類のレクチンで染色し,金コロイド標識を行った.各組織において,落屑物質,基底膜,毛様小帯,弾性線維,エラウニン線維,オキシタラン線維,エラストーシス,エラストジェネシス,膠原線維などの,線維性構造物についてのレクチン染色性を,電顕的に比較検討した.その結果,各構造物とも基本的には落屑物質と一致した染色性は示さなかったが,エラストーシスおよびエラストジェネシスは,超微形態,レクチン染色性が一様でなく,その中に形態および染色性が落屑物質にほぼ一致したものが存在した.従って落屑物質が,エラストーシスあるいはエラストジェネシスの中で産生される可能性が示唆された.これまで成因として,有力視されてきた基底膜については,形態学的には,基底膜から落屑物質が産生される様な所見が認められたものの,レクチン染色性がかなり異なっていた.同様に有力視されていた毛様小帯に関しては,染色性は類似していたが,形態学的な類似性に乏しかった.本手法は,親水性の包埋剤であるロビクリルK4Mによる低温包埋法とコロイド金電顕組織化学を用い,より生体に近い標本での優れた染色性が得られる上に,上記の様な微細な構造物の,形態と成分を同時に比較することが可能な手技である.現在さらに,新たに作成した抗体,および既知の細胞外基質に対する抗体を用い検討中である.
ウサギの脊髄局所冷却による脊髄保護効果とオートファジーの関連についての検討

本研究では、ウサギの脊髄虚血モデルおよび脊髄冷却モデルを用い、脊髄虚血後の運動神経再装備におけるオートファジーの関わりと、冷却による脊髄保護のメカニズムの一部を解明することを目指した。最終的に細胞死をきたす運動神経細胞内において、オートファジー関連タンパク質(Bcl-2、Beclin-1、GABARAP)が誘導されていることが証明された。また、一過性脊髄虚血により運動ニューロン内で誘導される遅発性運動神経細胞死において、オートファジーが関与していることが示唆された。生存する運動神経細胞内においては、オートファジーを抑制的に制御するBcl-2の発現増強が遷延することが証明された。脊髄虚血による対麻痺は、下行大動脈瘤や胸腹部大動脈瘤手術時の合併症として最大20%の頻度で認められ、術後の患者のQOLを考える上で非常に大きな問題となっている。これまでにも、脊髄保護目的に様々な薬物療法や低温療法、脊髄ドレナージ法が臨床応用されてきたが、いまだ確立された脊髄保護法はない。一方で、診断技術の進歩、高齢化の進行、活様式の欧米化等により、大動脈瘤の患者は確実に増加しており、手術成績向上のために、脊髄虚血による対麻痺の進展に関するするメカニズムの解明や、その予防法の確立に対する重要性は増している。過去の報告によるとウサギの一過性脊髄虚血モデルにおいて遅発性の運動神経細胞死が生じることが報告されている。この運動神経細胞死に関してはヒートショックプロテインや小胞体ストレス、オートファジー関連タンパク質の関与が示されている。本研究の目的は、前述のウサギの脊髄虚血モデルおよび脊髄冷却モデルを用い、脊髄虚血後の運動神経細胞死におけるオートファジー関連タンパク質の関わりと、冷却による脊髄保護のメカニズムの一部を解明することである。平成25年度は主に脊髄虚血モデルおよび脊髄冷却モデルからそれぞれ得られた試料を用いてwestern blot analysis及び免疫染色を行い、オートファジー関連蛋白の解析を行った。脊髄虚血による対麻痺は,下行大動脈瘤や胸腹部大動脈瘤手術時の合併症として最大20%の頻度で認められ,術後の患者のQOLを考える上で非常に大きな問題となっている.これまでにも,脊髄保護目的に,様々な薬物療法や低温療法,脊髄ドレナージ法が臨床応用されてきたが,いまだ確立された脊髄保護法はない.一方で,診断技術の進歩,高齢化の進行,生活様式の欧米化等により,大動脈瘤の患者は確実に増加しており,手術成績向上のために,脊髄虚血による対麻痺の進展に関するするメカニズムの解明や,その予防法の確立に対する重要性は増している.過去の報告によるとウサギの一過性脊髄虚血モデルにおいて遅発性の運動神経細胞死が生じることが報告されている。本研究の目的は,前述のウサギの脊髄虚血モデルおよび脊髄冷却モデルを用い,脊髄虚血後の運動神経細胞死におけるオートファジー関連タンパク質の関わりと,冷却による脊髄保護のメカニズムの一部を解明することである.平成24年度は主に脊髄虚血モデルおよび脊髄冷却モデルの作成を行った。Jhonson scoreによる後脚機能評価によれば脊髄冷却により対麻痺は良好に回避されることが改めて確認された。現時点では得られたsampleを用いてwestern blot analysis及び免疫染色を行い、Autophagy関連蛋白の解析を行っている。一方で、診断技術の進歩、高齢化の進行、活様式の欧米化等により、大動脈瘤の患者は確実に増加しており、手術成績向上のために、脊髄虚血による対麻痺の進展に関するメカニズムの解明や、その予防法の確立に対する重要性は増している。この運動神経細胞死に関してはヒートショックプロテインや小胞体ストレス、オートファジー関連タンパクの関与が示されている。本研究の目的は、前述のウサギの脊髄虚血モデルおよび脊髄冷却モデルを用い、脊髄虚血後の運動神経細胞死におけるオートファジー関連タンパク質の関わりと、冷却における脊髄保護のメカニズムの一部を解明することである。本研究では最終的に細胞死をきたす運動神経細胞内において、オートファジー関連タンパク質(Bcl-2, Beclin-1, GABARAP)が誘導されることが証明された。生存する運動神経細胞内においては、オートファジーを抑制的に制御するBcl-2の発言増強が遷延することが証明された。

医歯薬学当初はモデル作成にやや時間を要していたが、モデル数が予定数に達して以降はwestern blot analysisによる蛋白の解析及び免疫染色が順調に進めることができている。当施設のアニマルセンターにてウサギを飼育しているが、当科の使用できるケージ数が限られておりモデル作成にやや時間を要した。しかしながらモデル作製数は予定数に達し、蛋白の解析及び免疫染色も予定通り進めることができている。引き続きwestern blot analysisによる蛋白発現の解析や免疫染色(光学および蛍光)による評価を行っていく。Western blot analysisによる蛋白発言の解析を継続し、加えて免疫染色(光学および蛍光)による評価を行っていく。データが揃い次第、論文作製を行う。実験試薬や消耗品の購入および追加実験のためのウサギの購入、データ解析を行うテクニカルスタッフの人件費に充てる予定としている。
ラットにおける肺静脈心筋固有Cl-チャネルのクローニング

本研究ではラットの肺静脈からRT-PCR法により、Cl-チャネルのホモロジークローニングし、HEK293細胞にクローニングしたcDNAを遺伝子導入して、機能を確認した。クローニングの結果Cl-チャネルのポアドメインはClcn2であった。機能もClcn2由来の電流としてすでに知られているもので肺静脈のCl-電流とは異なっていた。免疫染色により肺静脈心筋におけるClcn2タンパクの膜発現を確認しており、肺静脈Cl-電流は、未知の調節タンパクにより制御されていることが示唆された。今後、プロテオミクスにより、この調節タンパクを網羅的に探索していく予定である。現在、慢性の不整脈で最も頻度が多い心房細動は、加齢と共に罹患者が増加し、80歳以上では人口の10%にのぼるという。心房細動では,心房収縮の欠如,不適切な心室拍数による心機能低下や胸部症状が出現しうるだけでなく、脳塞栓症のリスクが増大することから、その予防や治療が重要な臨床的課題となっている。心房細動を起こすのは、心房内を不規則に興奮が旋回するリエントリーと考えられているが、多くの心房細動は肺静脈を起源とした異常興奮が重要な役割を果たすことが示唆されている。申請者はこれまで、ラット肺静脈の心筋細胞において、心房や心室の筋肉細胞では観察されない特徴として、ノルアドレナリン負荷により容易に自動能を獲得することや、過分極活性型Cl電流が存在することなどを報告してきた。本研究の目的は、肺静脈心筋で観察されるCl電流の分子実態をクローニングし、蛋白構造を予測する事で、より具体的な治療標的とすることである。今年度は遺伝子導入装置を購入し、遺伝子工学的な実験手法を用いて、肺静脈から過分極活性型Clチャネルをクローニングした。今後、Clチャネルの物理生化学的な特徴を確認し、修飾蛋白の存在などを幅広く検証していく。今年度は遺伝子導入装置を購入し、遺伝子工学的な実験手法を用いて、肺静脈から過分極活性型Clチャネルを単離し、電気生理学的手法を用いて過分極活性型Cl電流を確認した。主要な目標だったイオンチャネルのクローニングはほぼ完了している。「研究目的」本研究の目的は肺静脈心筋に存在する過分極活性型Cl-チャネルをクローニングし、治療標的として、その分子実態の詳細を明らかにすることであった。肺静脈に存在する心筋細胞は、極めて頻度の高い心疾患である心房細動の発生起源であるとされている。申請者は、肺静脈で観察される新規クロライド(Cl-)電流を発見し、この電流が不整脈の発生を促していることを明らかにした。このCl-電流の分子実態を同定する事で、より実践的な治療標的とする狙いだった。「研究実施計画」本研究ではラットの肺静脈からRT-PCR法を使ってCl-チャネルをクローニングし、HEK293細胞に導入して機能を肺静脈のCl-電流と比較する計画だった。その結果、このCl-チャネルのポアドメインをクローニングし、Clcn2であると同定した。免疫染色で細胞レベルの発現も確認した。ところが、Clcn2単独の遺伝子導入だけでは肺静脈の過分極活性型電流を再現できず、Clcn2以外の要因を検討しなければならなくなった。文献的にも興奮性細胞では、Clcn2の機能的な膜発現にはβサブユニットが必要であるという報告があることから、プロテオミクスを利用した新規βサブユニットの探索の必要となった。申請者は本研究期間中に、プロテオミクス実験が可能な教室に所属教室を異動しており、新規βサブユニットの同定は今後行う予定である。以上に述べたように、当初の実験目的である遺伝子クローニングには成功したものの、最終目的としての治療標的としての分子実態同定にまでは至らず、Cl-チャネルをテーマとした論文発表はできなかった。今後、Clチャネルの物理化学的な特徴を確認するとともに、修飾蛋白の存在などを幅広く検証していく。肺静脈心筋細胞と他の心筋細胞の違いを分子レベルで明らかにし、国際誌に発表する事を目指す。28年度が最終年度であるため、記入しない。心筋細胞の細胞生理28年度が最終年度であるため、記入しない。
小・中学生の有酸素的作業能および運動能力の発達に関する追跡的研究

本研究は、幼児期から中学生期にかけての最大酸素摂取量および運動能力の発達の様子を、同一対象の追跡的測定によって縦断的に明らかにすることを目的として、1980年10月以来異なる対象群に対して継続実施してきた研究のうち1991年から1994年度について実施したものである。幼児期に活発な身体活動を行う指導が行われた三重県紀伊長島町立K幼稚園の卒園児で中学23年生に在籍した対象児を19911992年7月にかけて追跡測定した。このことにより、本研究期間内に男子78名、女子33名、昨年度までの測定結果を含めて男子107名、女子38名の10年間にわたる追跡測定結果が得られた(K群)。一方、幼児期に運動指導が行われることがなかった三重大学教育学部付属幼稚園の卒園児については、19911993年度にかけて、男子74名、女子61名の追跡測定を実施し、89年間の縦断的測定結果を得た(M群)。これらの縦断的測定結果を、個人値の個人値の推移としてとらえるのが、本研究の主な目的である。しかし、集団の平均値を示すと、次のようである。K群男子6歳1.0191/分(50.0ml/kg/分)、10歳1.6271/分(47.70ml/kg/分)、13歳2.401/分(54.52ml/kg/分)、14歳2.701/分(55.46ml/kg/分)、15歳2.811/分(54.17ml/kg/分)。これに対しM群男子では、6歳0.9441/分(44.36ml/kg/分)、10歳1.6141/分(49.43ml/kg/分)、11歳1.7431/分(48.67ml/kg/分)、12歳1.9601/分(47.46ml/kg/分)。女子の値については省略。このように、K群とM群には幼児期で体重あたり最大酸素摂取量に差がみられたが、10歳では両群で差が有意でなくなっている。PHV年齢をはさんで、最大酸素摂取量には急激な増大がみられた。本研究の目的は、幼児期から小・中学生期にかけての体力・運動能力の発達の様子を追跡的測定によって縦断的にとらえ,幼児期からの活発な身体運動の実施の影響を明らかにすることにある。測定は1980年から実施され,毎年新しい対象を増加させてきたが,1990年までに,中学3年生まで10年間の追跡測定を完了した生徒数60名を数えた。また,小学生についても4・5歳の幼児期から小学校5年生まで67年間の追跡測定結果を45名について得ている。今年度の研究は,昨年度までの測定対象をひき続き追跡してゆくことによって,測定例数を増加させることを主目的として実施した。三重県紀伊長島町立幼稚園,町立小学校を卆業し,今年度町立紀北中学校2,3年に在学する追跡測定対象者について,トレッドミルランニング法を用いて最大酸素摂取量の測定を実施した。対象のうち,追跡測定条件を満たしたものは、95名であり、910年間の追跡測定結果がさらに増加したことは大きな成果であった。

測定項目は、上記の他,形態計測22項目,皮脂厚,握力,背筋力,垂直とび,立位体前屈,立巾跳,立5段跳,シャトル走,自転車駆動アネロビックパワ-などである。小学生については、幼児期にあまり活発な身体運動が行われなかった三重大学附属幼稚園の卆園児で、三重大学附属小学校に在学している4,5,6年生135名について追跡測定を実施した。このことによって,幼児期から小学生期にかけての非常にきめ細かい縦断的測定結果が得られつつある。今年度の追跡測定研究を行うことによって,次のことがより明確になった。(1)思春期発育スパ-ト期以前では、最大酸素摂取量の発達がゆるやかであるが,発育スパ-ト期に発達が著しくなる。(2)中学3年生ではクラブ活動を引退する習慣があり,最大酸素摂取量の低下が生じている。本研究の目的は、幼児期から小・中学生期にかけての体力・運動能力の発達の様子を追跡的測定によって縦断的にとらえ、幼児期からの活発な身体運動の実施の影響を明らかにすることにある。測定は1980年から実施され、毎年新しい対象を増加させてきたが、1992年までに、中学3年生まで10年間の追跡測定を完了した生徒数は135名となった。また、小学生についても4・5歳の幼児期から小学校6年生まで78年間の追跡測定結果を97名について得ることができ、6年間の追跡測定結果も49名について得ている。今年度の研究は、できる限り多くの追跡測定結果を得ることに最大限の努力を行なった。三重県紀伊長島町立幼稚園、町立小学校を卆業し、今年度町立紀北中学校3年生となっている男子29名、女子18名についてトレッドミルランニング法を用いて10年目の最大酸素摂取量を測定した。男子の平均値は、2.81l/分、体重あたり量57.11ml/kg/分であり、女子の平均値は、2.31l/分、体重あたり量45.21ml/kg/分であった。これらの値は前年に比較し、男子で17.5%増(体重あたり量は13.5%増)、女子で15.5%(体重あたり量は3.4%増)となっている。小学生については、幼児期にあまり活発な身体活動が行われなかった三重大学附属幼稚園の卆園児で、三重大学附属小学校に在学している5・6年生85名について測定し、さらに三重大学附属中学校に進学した中学1年生40名について追跡測定を実施することができた。測定項目は、最大酸素摂取量の他、形態22項目、皮脂厚、背筋力、垂直跳、立位体前屈、立巾跳、立5段跳、シャトル走、自転車駆動アネロビックパワーなどである。今年度の測定結果にもとづいて、個人別の発達曲線を描き、発育発達の多様な側面をアプローチしてゆく作業をすすめている。本研究は、幼児期から中学生期にかけての最大酸素摂取量および運動能力の発達の様子を、同一対象の追跡的測定によって縦断的に明らかにすることを目的として1980年以来異なる対象群に対して継続実施してきた研究のうち平成5年度について実施したものである。幼児期には体育指導が行われていない三重大学教育学部附属幼稚園を卒園し、平成5年度に附属小学校に在籍し、15年生時に追跡測定を受けた6年生男女60名について追跡測定を実施した。また、附属中学校に進学した中学1年生と中学2年生男女120名についても追跡測定を実施した。測定項目は、形態計測(22項目)、握力、背筋力、垂直とび、立位体前屈、立幅跳、1歩助走幅とび、立ち5段とび、シャトル走、自転車駆動パワー、および最大酸素摂取量である。最大酸素摂取量は、小学生はダグラスバッグを用いたグラウンドランニング法、中学生は、トレッドミルランニング法によって測定した。
肝細胞障害の早期指標としてのグルタチオンS-トランスフェラーゼの評価

【臨床研究1】肝機能障害患者に対する低血圧麻酔が肝血流量および肝機能に及ぼす影響をGSTを用いて評価した。腰椎手術を受ける患者4名を対象とした。亜酸化窒素-酸素-イソフルランで麻酔を行い,トリメタファンあるいはプロスタグランジンE1を用いて平均血圧を5055mmHgに2時間維持した。手術開始時,低血圧麻酔終了時,終了1,2,3,4,6時間後に採血してGSTを測定した。GSTは酵素免疫測定法のキットを用いて測定した。その結果,肝機能障害患者に対する低血圧麻酔は,使用する降圧薬にかかわらず,平均血圧5055mmHgに2時間維持すると,一過性にGSTの上昇が認められた。この結果の一部については,第16回日本臨床麻酔学会総会(平成8年11月)で発表した(日本臨床麻酔学会誌,16(8),0-233,1996)。【臨床研究2】肝血流遮断後のGSTの変動を追跡し,現在使用されているAST,ALTと比較した。肝切除術を受ける患者で術中に完全肝血流遮断を行う12名を対象とした。胸部硬膜外麻酔併用の亜酸化窒素-酸素-イソフルランで麻酔を行い,低用量のドパミンを持続投与した。手術開始時,遮断解除直後,解除1,2,3,4,6時間後に採血してGSTを測定した。AST,ALTは術直後,術後1,2,3日目に測定した。その結果,遮断解除直後GSTは全例増加し,その後徐々に減少することが明らかになった。AST、ALTは術直後から徐々に増加し,術後1日目に最大になった。血流遮断時間とGST,AST,ALTは相関しなかった。GSTは,ほかの酵素に比べて,肝血流遮断による肝細胞障害に迅速に反応すると考えられた。この結果については,第43回日本麻酔学会総会(平成8年3月)で発表した(J.Anesth.,10(Suppl.),A227,1996)。
肝細胞癌における肝移植後の転移再発予測システムの確立

肝細胞癌に対する肝移植療法は、生体内の癌病巣とともに発癌の母地である肝硬変までも除去するという点で肝細胞癌の根本的な治療法となり得ると考えられるが、病期の進行した症例では移植後においても転移再発が認められる。一方、肝細胞癌においては特定の染色体領域の欠失や重複が高頻度に認められ、これらが癌の悪性化の主要な原因と考えられている。このことから、肝細胞癌の染色体異常に基づいた肝移植治療後の転移再発の予測式を確立することを目的として本研究を開始した。当院移植外科で肝移植治療を受ける肝細胞癌症例に対し、文書によりインフォームドコンセントを得た後、病理部に提出された肝組織の癌部及び非癌部を採取した。PCRプライマーは22の常染色体およびX染色体を網羅する400のマイクロサテライトに対応する市販のプライマーを用いた。アレリックインバランスの判定には癌細胞の2つのバンドのピーク面積比を非癌肝組織のピーク面積比で補正し0.70をカットオフ値とした。アレリックインバランスが認められたマイクロサテライトは更に正常型を示すマイクロサテライトを内部基準とした比較二重PCRを行い、染色体の欠失または重複を判定した。11例の検体を採取したが、うち4検体はDNA抽出が不良であり、さらに3検体はアレリックインバラスが検出されず腫瘍細胞が十分採取されていないと考えられた。残る4例については以下のような染色体異常が検出された。症例1,-1p,+1q,-4q,+5p,+6q,+7p,-7q,+8q,-9p,-10,-12p,-14q,-17,-19p;症例2,-1p,+1q,-4q,+6P,-6q,-16,+20;症例3,-1p,+3,+11,+12p,-14q,+16p,-16q,-18q,-21q;症例4,-1p,+1q,-2,+3,+4p,-4q,-8p,+8q,-11,-16。現在も解析を継続中であり、50症例が集積された時点で移植治療後の転帰を調査する事により、これら染色体異常に基づいた転移再発の予測式の構築を検討する予定である。従来より我々を含め複数の施設より肝細胞癌(肝癌)の転移に関する分子生物学的検討がなされ、染色体異常やそれらの蓄積が肝癌切除後の転移再発と関連するとの報告がみられる。近年、肝癌に対する肝移植療法が普及しつつあり、その治療成績向上のため、肝移植で得られたレシビエント肝での肝癌部、周辺非癌部の組織を採取し、全染色体に対して遺伝子増幅や欠失について包括的に解析し、肝移植後の再発との関連を明らかにし、移植後の再発予測システムを構築することとした。今年度は、これまで肝切除、剖検で得られた組織から得られたDMについて我々が開発した半定量マイクロサテライト解析を全染色体について行った。さらに癌部における各染色体における高頻度、重複、欠失の共通領域(shortest regeon of overlap)を求め、既知の癌遺伝子、癌抑制遺伝子との染色体上の位置関係と対比した。高頻度に重複が認められたのは、1q,8q,17qでその領域・頻度・既知遺伝子数はそれぞれD1S196-D1S238,1q24-q25,41/56,73%,6.5Mbp,23遺伝子(ABL2/ARG等),D8S1784-D8S514,8q22.3-q24.13,30/56,54%,16.3Mbp,28遺伝子(CML66,NOV等),17q25.3-qter,17/56,30%,2.6Mbp,41遺伝子(ASPSCRI等)。'一方、欠失に関しては、1p,4q,8p,13q,16q,17pでそれぞれ、D1S214-D1S450,1p36-22,21/56,38%,3.5Mbp,14遺伝子(DNB5等),D4S414,4q22.1,22/56,39%,6.3Mbp,22遺伝子(DRLM等),D8S550-D8S549,8p22-8p23.1,32/56,57%,5.2Mbp,9遺伝子(DLC1,N33等),D13S153,13q14.1,17/56,30%,5.2Mbp,26遺伝子(RB1,DLEU1/2等),D16S3091-qter,16q23.1-qter,19-56,34%,7.4Mbp,45遺伝子(CBFA2T3,CDH13等),D17S938-D17S1852,17p13.1-17p13.2、29/56,52%,3.4Mbp,59遺伝子(TP53等)であり、これらの既知、あるいは未知の遺伝子が肝発癌、進展、転移に深く関わっているものと考えられた。現在インフォームドコンセント作成、倫理委員会承認待ちの状態で、今後これらをふまえて肝移植例での検討をすすめる予定である。

肝細胞癌に対する肝移植療法は、生体内の癌病巣とともに発癌の母地である肝硬変までも除去するという点で肝細胞癌の根本的な治療法となり得ると考えられるが、病期の進行した症例では移植後においても転移再発が認められる。一方、肝細胞癌においては特定の染色体領域の欠失や重複が高頻度に認められ、これらが癌の悪性化の主要な原因と考えられている。このことから、肝細胞癌の染色体異常に基づいた肝移植治療後の転移再発の予測式を確立することを目的として本研究を開始した。当院移植外科で肝移植治療を受ける肝細胞癌症例に対し、文書によりインフォームドコンセントを得た後、病理部に提出された肝組織の癌部及び非癌部を採取した。PCRプライマーは22の常染色体およびX染色体を網羅する400のマイクロサテライトに対応する市販のプライマーを用いた。アレリックインバランスの判定には癌細胞の2つのバンドのピーク面積比を非癌肝組織のピーク面積比で補正し0.70をカットオフ値とした。アレリックインバランスが認められたマイクロサテライトは更に正常型を示すマイクロサテライトを内部基準とした比較二重PCRを行い、染色体の欠失または重複を判定した。11例の検体を採取したが、うち4検体はDNA抽出が不良であり、さらに3検体はアレリックインバラスが検出されず腫瘍細胞が十分採取されていないと考えられた。残る4例については以下のような染色体異常が検出された。症例1,-1p,+1q,-4q,+5p,+6q,+7p,-7q,+8q,-9p,-10,-12p,-14q,-17,-19p;症例2,-1p,+1q,-4q,+6P,-6q,-16,+20;症例3,-1p,+3,+11,+12p,-14q,+16p,-16q,-18q,-21q;症例4,-1p,+1q,-2,+3,+4p,-4q,-8p,+8q,-11,-16。現在も解析を継続中であり、50症例が集積された時点で移植治療後の転帰を調査する事により、これら染色体異常に基づいた転移再発の予測式の構築を検討する予定である。
生きた分子を見、操作する手法の開発

1.研究期間中に、蛍光色素1分子の水中での連続観察が可能になり、文字通り「生きた」分子を見ることができるようになったので、この手法の今後の発展、応用の可能性、さらに1分子操作など他の手法との組み合わせ、などを中心テーマとし、重点領域研究申請のための準備を行った。2.具体的には、班員間の協議(1分子観察を実現した慶應義塾大・木下および阪大・柳田らが中心)、ワークショップ(慶應義塾大)、班会議(新横浜)などを通じて重点領域の内容を練った。「生きた分子を見て操作する」という領域名で、木下が代表となって平成8年度発足重点領域研究を申請した。3.重点研究の内容としては、1分子観察・1分子操作を直接生かす応用として、蛋白質分子でできた「分子機械」の動作原理を解明すべきとの結論を得た。分子機械は確率的に動くため互いに同期させることができない。したがってその働きを理解するには1分子を相手にせざるを得ないのである。一方、よりチャレンジングな課題として、細胞内での1分子可視化・1分子操作を目指すことにした。細胞内での分子間相互作用、広い意味での「信号」の流れを解きほぐすのである。細胞内にごくわずかしか存在しない(極端には1コピー)分子をしっかりとらえていく。4.この分野の近未来を展望し、上記重点領域研究の方向付けをする目的で、International Discussion Meeting"Imaging and Manipulating Live Moleculesand Cells"を慶應義塾大学で開催した。5人の著名な外国人研究者を招き、走査針型顕微鏡や電子顕微鏡の第1人者も交えて、最新の研究発表に引き続き密度の高い討論を行った。新しい手法を、Toyに終わらせずToolとして用いて成果をあげるべきだとの発言があり、まさに上記重点領域申請の趣旨と合致していると、意を強くした。
骨髄細胞から肝細胞への分化を制御する遺伝子群の同定プロジェクト

我々は、自己骨髄細胞を用いた肝臓再生療法の臨床応用を進める基盤モデルとして骨髄細胞から肝細胞への分化評価モデル(GFP/CC14モデル)の開発し、骨髄細胞が持続的肝障害の肝硬変時に肝臓に遊走され肝細胞へ分化・増殖することを明らかにした(JB2003、特公2003-70377)。さらにこのモデルの解析を通じ、骨髄細胞移植により生存率の回復、また肝線維化の改善を発見した(Hepatology 2004,この発見はWiley社よりHepatology News Alert記事とし世界に発信された)。さらに骨髄細胞を用いた再生療法をより効率的に行うための骨髄細胞の肝細胞への分子制御機構を骨髄細胞の肝細胞への分化評価モデルGFP/CC14モデルの解析を通じて、骨髄由来細胞の肝細胞への分化過程に関与する遺伝子群を,DNA-ChipとMicroarray-Self Organization Map(SOM)解析を用い骨髄細胞の投与により誘導された遺伝子群の抽出を目指した。その結果、骨髄細胞の肝細胞への分化は初期には形態形成に関与するHOX,HLH型転写制御分子が関与し、後期においては肝細胞の代謝に関与する分子が誘導されていることが明らかになった(FEBS letters2004)。この結果は骨髄細胞の肝細胞への分化において、発生と同じ遺伝子群が関与することが明らかになった。生データはhttp://liver-roject.med.yamaguchi-u.ac.jp/researchのサイトでホームページにて公開している。)。肝幹細胞は肝細胞,胆管細胞,膵臓細胞,小腸細胞に分化する細胞群と考えられてきた。最近になり、骨髄中にも同様な幹細胞が存在することが証明された。我々は骨髄中に存在するこの多能性分化能を持つ幹細胞を使った再生療法を開発したいと考え基礎的検討を行ってきた。骨髄細胞を用いた肝臓再生療法の開発のため、骨髄細胞から肝細胞へのin vivo分化評価モデル(GFP/CCl4モデル)を開発した(特願2001-271240号、特公2003-70377,J.Biochem.134;551-558,2003)。このモデルにおいては持続肝障害下で骨髄細胞は肝芽細胞に分化転換し最後は肝細胞へと分化する。また新たに作成した胎児肝モノクローナル抗体Liv8抗体とGFP/CCl4モデルを使った解析により、骨髄中のLiv8陰性分画に肝臓再生に有用な細胞分画が存在することがほぼ明らかになった(BBRC23;313(4):1110-8,2004)。現在このLiv8抗体の認識する抗原の同定を目指した研究を行っている。この抗原が決定できれば、人骨髄細胞よりの効率的な肝幹細胞分離法の開発につながると考えられる。さらに、このモデルの解析の結果、持続炎症におけるシグナルは、骨髄細胞の肝細胞への分化に必須など、持続炎症下の微小環境"Niche"の問題が重要と考えられた。本年度の研究においては、GFP/CCl4モデルにおける遺伝子発現の変化について、DNA chipと複雑かつ膨大な多次元のデータを可視化することができるSelf Organization Map(SOM)を用いた統計解析を行うことで、その遺伝子群の変化の抽出、可視化を試みた。その結果、骨髄細胞の肝細胞への分化はドラマティックな遺伝子変化の中で進んでいることがあらためて明らかになった。さらに今回用いた新たな解析により、連動して変化する遺伝子群がクラスターとして抽出できた。今後はこれらに遺伝子についての解析を続ける。)。
軟骨組織のマイクロ・ナノ構造における軟骨細胞・周囲組織のメカニクス解明

変形性関節症等の発症の事前防止策の提案や再生軟骨の機能向上をめざして,軟骨細胞と細胞外マトリックスの相互関係に着目しながら軟骨組織としてのマクロレベルと細胞を対象としたミクロレベルについて各種実験と数値解析を実施した.まず,サブミクロンオーダの位置精度と歩行周期レベルの高速荷重パターンを再現しうる共焦点レーザ顕微鏡据付型マイクロ力学試験機を用いて,軟骨細胞の形態や分布を観察するとともに,生体内のダイナミックな力学環境を再現しながら軟骨試験片の圧縮試験を行った.一定変位試験において蛍光染色した軟骨細胞をマーカとすることにより局所的ひずみの部位依存・時間依存の挙動の観察を行った.固液二相性理論に基づく有限要素解析を行い,圧縮実験における平衡状態の局所ひずみから平衡弾性率の深さ方向分布を推定し,有限要素解析の物性値として与えることにより実験における試験片の変形挙動との対応を得ることができた。接触荷重については計算値が小さめになったために,弾性率の時間依存性を導入することにより実測値の時間変化との合致を得た.また,軟骨細胞-アガロース複合体の培養試験では,周期的圧縮刺激が剛性の向上をもたらすことを確認し,細胞外マトリックスの産生増加を分析により定量的に評価した.軟骨表面への関節液成分吸着膜形成については,高含水性人工軟骨PVA (ポリビニルアルコール)ハイドロゲルやラングミュア・ブロジェット膜形成ガラス板等の軟骨モデルにおける摩擦試験や観察により異種蛋白による低摩耗・低摩擦吸着膜の形成条件や膜構造を明確化できた.変形性関節症等の発症の事前防止策の提案や再生軟骨の機能向上をめざして,軟骨細胞と細胞外マトリックスの相互関係に着目しながら軟骨組織としてのマクロレベルと細胞を対象としたミクロレベルについて各種実験と数値解析を実施した.まず,サブミクロンオーダの位置精度と歩行周期レベルの高速荷重パターンを再現しうる共焦点レーザ顕微鏡据付型マイクロ力学試験機を用いて,軟骨細胞の形態や分布を観察するとともに,生体内のダイナミックな力学環境を再現しながら軟骨試験片の圧縮試験を行った.一定変位試験において蛍光染色した軟骨細胞をマーカとすることにより局所的ひずみの部位依存・時間依存の挙動の観察を行った.固液二相性理論に基づく有限要素解析を行い,圧縮実験における平衡状態の局所ひずみから平衡弾性率の深さ方向分布を推定し,有限要素解析の物性値として与えることにより実験における試験片の変形挙動との対応を得ることができた。接触荷重については計算値が小さめになったために,弾性率の時間依存性を導入することにより実測値の時間変化との合致を得た.また,軟骨細胞-アガロース複合体の培養試験では,周期的圧縮刺激が剛性の向上をもたらすことを確認し,細胞外マトリックスの産生増加を分析により定量的に評価した.軟骨表面への関節液成分吸着膜形成については,高含水性人工軟骨PVA (ポリビニルアルコール)ハイドロゲルやラングミュア・ブロジェット膜形成ガラス板等の軟骨モデルにおける摩擦試験や観察により異種蛋白による低摩耗・低摩擦吸着膜の形成条件や膜構造を明確化できた.変形性関節症等の発症の事前防止策の提案や再生軟骨の機能向上をめざして,軟骨細胞と細胞外マトリックスの相互関係に着目しながら軟骨組織としてのマクロレベルの解析と細胞を対象としたミクロレベルの解析とを対照実験とともに並行的に実施した.走査型共焦点レーザ顕微鏡蛍光計測により軟骨内部の軟骨細胞の3次元画像を再構成して,固液二相性理論に基づく有限要素解析を行った.とくに負荷後の軟骨内部液体の流動にともなう応力・ひずみ状態の経時的変化に着目した数値解析と蛍光可視化実測実験を行い,力学モデル化を提案し,非線形性を考慮しながら実態に迫りつつある.なお,軟骨の弾性率については,原子間力顕微鏡による押込み試験により,各種の軟骨試料について評価を行った.また,サブミクロンオーダの位置精度と歩行周期レベルの高速荷重パターンを再現しうる共焦点レーザ顕微鏡据付型マイクロ力学試験機を開発した.本試験機により,生体内のダイナミックな力学環境を再現しながら内部構造を同時観察をすることが可能となり,応力のひずみ速度依存性や経時的ひずみ挙動の観察が可能となった.新規購入したレーザ光ピンセットマニピュレーションシステムでは,細胞への力学的操作を試みている.また,軟骨細胞を3次元培養したアガロースゲル内に歩行時の下肢関節軟骨内部と同様の力学環境を再現するため,静水圧,せん断刺激,摩擦刺激などの力学刺激の手法を検討しつつある.軟骨細胞-アガロース複合体静置培養実験では,特定の細胞濃度条件下で剛性の向上が最大となる最適条件が得られた.そこでは,細胞外マトリックスのプロテオグリカンの産生を免疫染色により確認できた.本研究では,関節軟骨の比較対照試験として,高含水性人工軟骨PVA(ポリビニルアルコール)ハイドロゲルの試験も試みている.軟骨組織の修復・変性機構の実態解明をめざして,軟骨細胞と細胞外マトリックスの相互関係に着目しながら軟骨組織としてのマクロレベルの解析と細胞を対象としたミクロレベルの解析を対照実験とともに並行的に実施した.軟骨組織の圧縮試験では,サブミクロンオーダの位置精度を再現しうる共焦点レーザ顕微鏡据付型マイクロ力学試験機を開発し,軟骨細胞を蛍光染色することにより,局所的ひずみの経時的変化の3次元的可視化評価を可能とした.新鮮な豚関節軟骨の一定変位圧縮試験では,中間層では変位付与直後には過大なひずみ応答が生じ,応力緩和過程でひずみの回復が観察されたのに対して,表面層では,応力緩和にともない平衡状態ではひずみが過大化することを観察できた.

これらの経時的挙動については,固液二相理論に基づく有限要素解析で同様な挙動を確認するとともに,変形性関節症の進行に対応する軟骨表面の境界条件の影響を評価できた.レーザマイクロマニピュレーションシステムを用いてポリスチレンビーズを利用した軟骨細胞のトラップ操作を可能とした.また,単離軟骨細胞のマイクロ拘束治具を試作した.力学環境下における軟骨細胞代謝と軟骨組織のマイクロ・ナノ構造形成の解明に関しては,軟骨細胞・アガロース複合体の培養試験により,機械的剛性に関して最適細胞密度条件を見出し,静水圧負荷培養試験により細胞外基質の産生と関連して力学的刺激効果の有無を観測できた.また,ケラタン硫酸およびコラーゲンタイプIIの免疫染色蛍光観察により機械的剛性の変化が3次元的構造化の進行と対応することを確認できた.生体関節軟骨の対照材料としての高含水性人工軟骨PVA(ポリビニルアルコール)ハイドロゲルについては,蛋白質吸着膜のミクロな構造が摩擦摩耗挙動に影響を及ぼし,吸着膜の最適構造が存在することを原子間力顕微鏡観察や蛍光二重染色観察により確認できた.変形性関節症等の発症の事前防止策の提案や再生軟骨の機能向上をめざして,軟骨細胞と細胞外マトリックスの相互関係に着目しながら軟骨組織としてのマクロレベルの解析と細胞を対象としたミクロレベルの解析とを対照実験とともに並行的に実施した.走査型共焦点レーザ顕微鏡蛍光計測により軟骨内部の軟骨細胞の3次元形態と細胞骨格を観察した.とくに,最表層部では,細胞は偏平な形態を有すること,細胞の体積割合が大きいことを確認できた.また,サブミクロンオーダの位置精度と歩行周期レベルの高速荷重パターンを再現しうる共焦点レーザ顕微鏡据付型マイクロ力学試験機を用いて,生体内のダイナミックな力学環境を再現しながら,応力のひずみ速度依存性や経時的ひずみ挙動の観察を行った.固液二相性理論に基づく有限要素解析を行い,とくに負荷後の軟骨内部液体の流動にともなう応力・ひずみ状態の経時的変化に着目した数値解析により,表面の摩擦と透過性に関する境界条件が大きい影響を有することを示した.平衡状態の局所ひずみから平衡弾性率の非均一性を推定し,有限要素解析の物性値として与えることにより実験における試験片の変形挙動との対応を得ることができた。単離した軟骨細胞に対してピペット吸引試験を行い,力学的刺激に対する細胞骨格のマイクロフィラメントにおける応答を評価した.また,軟骨細胞を3次元培養したアガロースゲル内に歩行時の下肢関節軟骨内部と同様の力学環境を再現し,周期的圧縮荷重負荷の力学刺激を与えた培養実験では,特定の細胞濃度条件下で剛性の向上と細胞外マトリックスの産生増加を分析により確認できた.本研究では,関節軟骨の比較対照試験として,高含水性人工軟骨PVA(ポリビニルアルコール)ハイドロゲルの摩擦・摩耗への表面膜の影響を評価した.変形性関節症等の発症の事前防止策の提案や再生軟骨の機能向上をめざして,軟骨細胞と細胞外マトリックスの相互関係に着目しながら軟骨組織としてのマクロレベルと細胞を対象としたミクロレベルについて各種実験と数値解析を実施した.
CD8α陽性樹状細胞の活性化とTh1/Th2バランスの制御機構

CD8α陽性樹状細胞は、免疫監視と免疫寛容の両者のバランス制御において重要な役割を担っているとされている。本研究課題ではCD8α陽性樹状細胞活性化機構の一端を明らかにすることを目的に、CD8α陽性樹状細胞上のDNAM-1の機能を解析した。またこれに先立ち、DNAM-1のリガンド同定、DNAM-1のマウスホモログの同定等をおこなった。以下に本年度の研究実績を述べる。1,DNAM-1のリガンドがCD155(PVR)とCD112(PPR2)であることを同定した(Int.Immunol. 16:533-538,2004)。2,DNAM-1のマウスホモログを同定した(Biochem.Biophys.Res.Commun.,2005 in press)。4,DNAM-1の329番目のセリンのリン酸化がDNAM-1とlipid raftsの会合に必須であることを明らかにした。また、細胞内シグナルの伝達に重要であるDNAM-1の322番チロシン残基は、DNAM-1とlipid raftsの会合下においてのみリン酸化されることを示した(Int Immunol. 17:217-23.2005)。5,CD8α陽性樹状細胞上DNAM-1の機能解析(1)CD8α陽性樹状細胞上のDNAM-1を特異抗体で刺激すると、CD8α陽性樹状細胞上のCD80やCD86などのcostimulatory moleculeの発現が上昇した。(2)DNAM-1刺激によりCD8α陽性樹状細胞のIL-12の産生が亢進した。(4)以上の結果より、CD8α陽性樹状細胞上のDNAM-1を介して細胞内に伝達されたシグナルによりCD8α陽性樹状細胞が活性化することが示唆された。
新しい腫瘍集積性化合物を用いた中性子補足療法の実用化に関する研究

最終年度はこれまでに開発されたボロンボルフィリン化合物であるSTA-BX909を用いて9Lグリオザルコ-マ培養細胞系に対する熱および熱外中性子の放射線生物学的効果の検討を行った.これまでに使用された熱中性子に対し,熱外中性子はエネルギーも大きく,その放射線生物学的効果についても異なることが予想され,その臨床応用に向けて基礎的なデータを得ることをも目的とした.対象と方法1)細胞系:9Lグリオザルコ-マ細胞を25cm2のカルチャー容器でRPMI1640の培養液と7.5%fetal bovine serum,erythromycinを加えてCO2インキュベータ-にてsemiconfluentになるまで培養した.2)ボロン化合物:培養液内にSodium Borocaptate(BSH),あるいはSTA-BX909を10B濃度で30μg/mlになるように調整し,上記細胞にて24時間培養した.照射前8次間に培養液をボトルに充填して京大炉に搬送(10B濃度としては10倍希釈).対照としては通常の培養液のみでみたしたものを使用した.3)照射プロトコール:京都大学原子炉実験所の重水炉の連続運転中にレール搬送装置を用いて培養細胞を照射孔に送り込み,熱中性子モード(00-0011-F):15,30,45,60分,熱外中性子モード(C0-000-F):30,60,90,120分の照射を行った.5)細胞周期に関する評価:照射後の細胞を12,24,48,72,120時間後に浮遊細胞とし,ethanol固定し,chromomycinA3にてDNAを染色し,FACSort(波長420nm)で検出した.考察と結語1)新しいボロンポルフィリンSTA-BX909はIn vitro実験で高い生物学的致死効果を得た.2)熱外中性子と熱中性子の生物学的効果はボロン濃度が非存在の群でもっともその差が大きく,B(n,a)以外の要素が関与していると考えられた.3)細胞周期のおよぼす影響は熱外中性子と熱中性子の間で大きな差はみられず,むしろ線量依存性に細胞周期におよぼす影響の方が大きい.最終年度はこれまでに開発されたボロンボルフィリン化合物であるSTA-BX909を用いて9Lグリオザルコ-マ培養細胞系に対する熱および熱外中性子の放射線生物学的効果の検討を行った.これまでに使用された熱中性子に対し,熱外中性子はエネルギーも大きく,その放射線生物学的効果についても異なることが予想され,その臨床応用に向けて基礎的なデータを得ることをも目的とした.対象と方法1)細胞系:9Lグリオザルコ-マ細胞を25cm2のカルチャー容器でRPMI1640の培養液と7.5%fetal bovine serum,erythromycinを加えてCO2インキュベータ-にてsemiconfluentになるまで培養した.2)ボロン化合物:培養液内にSodium Borocaptate(BSH),あるいはSTA-BX909を10B濃度で30μg/mlになるように調整し,上記細胞にて24時間培養した.照射前8次間に培養液をボトルに充填して京大炉に搬送(10B濃度としては10倍希釈).対照としては通常の培養液のみでみたしたものを使用した.3)照射プロトコール:京都大学原子炉実験所の重水炉の連続運転中にレール搬送装置を用いて培養細胞を照射孔に送り込み,熱中性子モード(00-0011-F):15,30,45,60分,熱外中性子モード(C0-000-F):30,60,90,120分の照射を行った.5)細胞周期に関する評価:照射後の細胞を12,24,48,72,120時間後に浮遊細胞とし,ethanol固定し,chromomycinA3にてDNAを染色し,FACSort(波長420nm)で検出した.考察と結語1)新しいボロンポルフィリンSTA-BX909はIn vitro実験で高い生物学的致死効果を得た.2)熱外中性子と熱中性子の生物学的効果はボロン濃度が非存在の群でもっともその差が大きく,B(n,a)以外の要素が関与していると考えられた.3)細胞周期のおよぼす影響は熱外中性子と熱中性子の間で大きな差はみられず,むしろ線量依存性に細胞周期におよぼす影響の方が大きい.悪性脳腫瘍に対する中性子補捉療法の改善のポイントは化合物の開発にあるといわれており、我々は腫瘍集積性を有するポルフィリン化合物とボロンの化合物(STA-BX900)を作成し、従来用いられてきたSodium Borocaptate(BSH)と脳腫瘍、正常脳、腫瘍周囲、血液内のボロン濃度を比較検討した。結果としてはSTA-BX900はBSHに比して投与後の血液濃度はほぼ同様に減衰するのに対し、腫瘍内にはSTA-BX900の方が長時間選択的にとどまることが明かとなった。腫瘍/血液比を投与後24時間でみるとBSHが0.21と低いのに対し、STA-BX900は1.55と示し高値を示し、正常脳への放射線壊死をもたらす一因といわれている血管内皮への障害が軽減できる可能性が指摘された。

また、腫瘍周囲の浮腫の部位への薬剤の漏出も治療上問題となるが、腫瘍/腫瘍周囲脳比の検討では投与後24時間では両化合物ともに検出限界以下にであったが、投与後6時間の時点でBSHで1.97、STA-BX900は9.3とSTA-BX900で高い比率を示し、STA-BX900は脳腫瘍周囲の薬剤濃度が低く、腫瘍選択的な治療ができると考えられた。現在、STA-BX900をベースにして側鎖を変えることによりより腎排泄性の高い、安全性の高い薬剤を開発中であり、4種類の化合物を検討する予定である。また、一つの化合物に多数のボロンケージ(1ケージあたり12個のボロン)をつけることについても検討中である。In vivo系の照射実験についても京都大学原子炉を用いてSTA-BX900を投与後に照射実験を行い、コントロール群に比べて生存日数の長い傾向が見られ、組織学的にも特徴的な変化を得た。このpilot studyをもとに来年度に改良された化合物の基礎的検討を行ったのちに、治療実験を予定している。【目的】中性子捕捉療法の効率改善のための新しい化合物を開発するためにこれまでにも検討を行ってきたが、今回は以前に検討したSTA-BX900を改良したSTA-BX909,910についてその生体内動態を検討したので報告する。【方法】Fisher344ratをNembutal麻酔下に9L細胞を1x10^4cells/10μg深さ5mmにて前頭葉内に移植し、2週間後に薬剤投与を行った。薬剤はSTA-BX909,STA-BX910(n=4)を0.02mmol/kg投与し、投与後24時間後に安楽死させ、腫瘍、腫瘍周囲浮腫脳、正常脳、血液、腎臓、肝臓、脾臓、皮膚を採取し、ほう素濃度をプラズマ誘導結合原子分光分析装置(ICP-AES;Seiko SPS1200A)で定量した。【結果】薬剤投与後24時間において腫瘍内ホウ素濃度はSTA-BX909において3.48±2.48ppm,STA-BX910では0.065±0.13ppmとSTA-BX909において高い腫瘍集積性を示した。STA-BX909における腫瘍/血液比は24hoursにて15.3±9.39とばらつきが大きいものの高値を示した。【考察】STA-BX909はボロンケージ戸ポルフィリン環を結合するスペーサーにアミノグアニジンが用いられている。以前に検討したSTA-BX900(1)のデータでは24時間後の腫瘍/血液比1.55であり、STA-BX909では腫瘍へのより効率的な取り込みが示唆された。スペーサーの構造が腫瘍への取り込みや化合物の安定性に寄与していると考えられ、今後さらに検討を行う予定である。最終年度はこれまでに開発された新しいボロンポルフィリン化合物であるSTA-BX909を用いて9Lグリオザルコ-マ培養細胞系に対する熱および熱外中性子の放射線生物学的効果の検討を行った。これまでに使用された熱中性子に対し、熱外中性子はエネルギーも大きく、その放射線生物学的効果についても異なることが予想され、その臨床応用に向けて基礎的なデータを得ることをも目的とした。対象と方法1).細胞系:9Lグリオザルコ-マ細胞を25cm2のカルチャー容器でRPMI 1640の培養液と7.5%fetal bovine serum,erythromycinを加えてCO2インキュベータ-にてsemiconfluentになるまで培養した。2)ボロン化合物:培養液内にSodium Borocaptate(BSH)、あるいはSTA-BX909を10B濃度で30μg/mlになるように調整し、上記細胞にて24時間培養した。照射前8時間に培養液をボトルに充填して京大炉に搬送(10B濃度としては10倍希釈)。対照としては通常の培養液のみでみたしたものを使用した。3)照射