hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
薬剤性腎障害発現における腎細胞分子機構の解明と腎保護薬に関する薬理学的研究

抗MRSA薬バンコマイシン(VCM)は、ブタ由来培養尿細管上皮細胞(LLC-PK1)に濃度および時間依存的なアポトーシスを引き起こし、その障害発現には、ミトコンドリア由来の活性酸素種(ROS)産生が関与することが明らかとなった。一方、VCMによってLLC-PK1細胞に引き起こされたミトコンドリア機能異常やアポトーシスは、脂溶性抗酸化薬ビタミンEならびにミトコンドリア標的抗酸化薬mitoTEMPOの処置によって有意に抑制された。加えて、VCMはJNKのリン酸化を亢進させ、VCMによる細胞障害に対してJNK阻害薬SP600125が有意な保護効果を示した。(研究目的)医薬品の使用により引き起こされる急性腎不全は薬剤性腎障害と呼ばれ、中でも抗がん薬や抗菌薬、非ステロイド性抗炎症薬やヨード造影剤等による腎障害は発現頻度が特に高い。しかしながら多くの薬剤では腎細胞や腎組織への直接的な薬理作用は想定外であり、腎障害の発現機序はほとんど明らかにされていない。本研究では、昨年度の研究において明らかになったバンコマイシンによる尿細管上皮細胞の障害発現機序についてさらなる解明を行うと共に、保護薬物の探索を行った。(研究方法)ブタ近位尿細管由来LLC-PK1細胞にバンコマイシン(4mM)を曝露して細胞障害を誘導し、TUNEL染色法を用いたフローサイトメトリー解析により評価した。各種タンパク質の発現評価は、特異的抗体を用いたWestern blot法により行った。ミトコンドリア機能評価は、ミトコンドリア膜感受性試薬JC-1を用いた。(研究成果)バンコマイシンによってLLC-PK1細胞に引き起こされたミトコンドリア機能異常やアポトーシスは、脂溶性抗酸化薬ビタミンEならびにミトコンドリア標的抗酸化薬mitoTEMPOの処置によって有意に抑制された。一方、バンコマイシンはJNKおよびERKのリン酸化を亢進させたが、p38 MAPKのリン酸化には影響しなかった。さらに、バンコマイシンによるLLC-PK1細胞障害に対してJNK阻害薬SP600125が有意な保護効果を示したことから、バンコマイシンによる尿細管上皮細胞障害の発現には活性酸素種と共にJNKが関与することが明らかとなった。(研究目的)医薬品の使用により引き起こされる急性腎不全は薬剤性腎障害と呼ばれ、中でも抗がん剤や抗菌薬、非ステロイド性抗炎症薬やヨード造影剤等による腎障害は発現頻度が特に高い。バンコマイシン等の抗菌薬では治療薬物モニタリング(TDM)による血中濃度管理により、腎障害発現の回避が図られているが、血中濃度管理そのものが困難なケースも多くあり、薬剤性腎障害に対する有効な対策法は確立していないのが現状である。本研究は、薬剤性腎障害発現における腎細胞分子機構を薬理学的手法により解明し、腎保護薬を見出すことを目的とした。(研究方法)ブタ近位尿細管由来LLC-PK1細胞に各種薬剤を曝露して細胞障害を誘導し、WST-8法ならびに乳酸脱水素酵素(LDH)漏出量測定により細胞生存率の変化を評価した。アポトーシスおよびネクローシスの判定には、propidium iodide (PI)染色法、annexinV染色法およびTUNEL染色法を用いて、フローサイトメーターにより解析した。活性酸素種(ROS)の評価には蛍光指示薬のDCF-DAやMitoSOXを用いた。(研究成果)抗MRSA薬バンコマイシンは、LLC-PK1細胞に濃度および時間依存的なアポトーシスを引き起こし、その障害発現には、ミトコンドリア呼吸鎖複合体Iの活性低下に基づく活性酸素種産生(ROS)が関与することが明らかとなった。一方、抗酸化剤ビタミンEを併用処置すると、ミトコンドリア由来のROS量が低下し、バンコマイシンによる腎細胞アポトーシスが有意に抑制されることが明らかとなった。本研究は、薬剤性腎障害発現における腎細胞分子機構を薬理学的手法により解明し、腎保護薬を見出すことを目的としているが、初年度においてはブタ近位尿細管由来LLC-PK1細胞を用いたin vitro評価モデルを作製し、同モデルを用いることで抗MRSA薬バンコマイシンによる腎細胞障害分子機構を明らかにすることに成功した。加えて、バンコマイシンによる腎細胞アポトーシスが、ミトコンドリア呼吸鎖複合体Iの活性低下や活性酸素種の上昇、さらにはミトコンドリア機能異常に起因するとの研究成果を基にして、抗酸化剤ビタミンEに着目して検討を進めた結果、ビタミンEの併用によりバンコマイシンによるミトコンドリア由来活性酸素種産生が低下し、腎細胞アポトーシスが抑制されることを見出した。

これまでに用いた手法や得られた成果の多くは、当初の研究計画において想定していたものであり、いずれも次年度における研究の基盤となるものである。したがって本研究は、おおむね順調に進展していることが考えられる。初年度の研究成果を基に薬剤性腎障害発現における細胞分子機構のさらなる解明を行うと共に、これまでに明らかとなった腎障害機序に基づき、腎障害を抑制可能な腎保護薬物の探索を行う。加えて、それらの有用性評価を行う。in vivoモデルでの腎障害の判定には、(1)血清クレアチニン値および血中尿素窒素(BUN)の変化、(2)腎尿細管細胞障害の指標である尿中N-アセチル-β-D-グルコサミニダーゼ(NAG)の変化、さらに(3)腎臓切片をPAS染色およびTUNEL染色した際の病理的所見を指標とする。一方、腎障害の発症機序には、腎細胞への直接的な障害作用の他に、ナトリウムやカリウムの欠乏および血管収縮による腎血流量の低下などの関与が考えられることから、化学療法剤投与による,血清中の電解質濃度変化および、血液中のエンドセリンや一酸化窒素、プロスタグランディン、アデノシンといった血管作用因子の動態変化について検討を行なうとともに、腎血流をモニターし、各薬剤処置による腎血流量の変化を検討する。上記までの検討により腎保護効果が認められた薬物については、保護薬物の副作用や、併用による各薬剤の主作用への影響を検討する。抗がん剤の抗腫瘍効果への影響は、担癌マウスの腫瘍体積への影響により評価する。該当なし
大脳新皮質の飛躍的なニューロン産生増加の基盤メカニズム

RP58は大脳新皮質に強く発現する転写抑制因子であり、その発現は、これまでの解析から細胞周期離脱、ニューロンの放射状移動、成熟、に必要であることを明らかにしてきた。とくに、細胞周期離脱に関しては、RP58欠損マウスにおいて、細胞周期離脱が阻害されている部位は、脳室帯の脳表面側であることを見いだした。そして、同じ部位でPax6陽性細胞が観察された。そこで、われわれは、この層が、霊長類を含む高等ほ乳類でみられるOSVZ(外側脳室下帯)に相当するものである可能性を考えた。OSVZは、Pax6陽性増殖層として知られ、浅層ニューロンの数を飛躍的に増加させる機能を有すると考えられる。そこで、この形成過程のメカニズム解明の糸口を得ることを目的として本課題に取り組んだ。RP58の欠損では出生直後に死亡するため、大脳皮質でのみRP58を欠損するマウスを作製するためにRP58floxマウスとEmxCreマウスを交配した。RP58KOマウス同様に、OSVZ様の構造が見られた。RP58が欠損していると、ニューロン移動や成熟も阻害されるので、それを補償するためにRP58欠損皮質に、ニューロンに分化運命が決まった時期に発現するNeuroDのプロモータの支配下でRP58を発現するプラスミドを子宮内エレクトロポレーション法を用いてE14で導入した。予想どおり、RP58を導入された細胞は脳表面に移動し、細胞塊を形成した。以上のことから、細胞周期を制御することにより、げっ歯類の脳から、霊長類型のニューロンを増加させた脳を形成させることの可能性が示されたと考える。例えば、RP58の発現が遅延することで、ニューロン増殖層の細胞周期離脱を阻害し、その結果OSVZが形成され、そして、その結果、多数のニューロンを生み出すことができる。26年度が最終年度であるため、記入しない。大脳皮質は高次脳機能の担い手であり、認知機能の構造的基盤である。げっ歯類から霊長類にかけて、大脳皮質のニューロン産生は著しく増加する。このニューロン産生の増加には、神経前駆細胞の分裂パターンが重要である。それでは、どのような分子メカニズムが、その分裂パターンを司っているのか?最近、我々は、その分裂パターンに決定的に重要な因子として転写抑制因子RP58を同定した。本研究では、RP58の機能解析を手がかりに、神経前駆細胞からニューロン産生の分子メカニズムを解析し、げっ歯類から霊長類への大脳皮質形成進化の解明のための知見を得ることを目指す。転写抑制因子RP58欠損マウスには霊長類を含む高等ほ乳類で特徴的な外側脳室下帯(OSVZ)様構造がみられたことから、RP58発現抑制がOSVZ形成を促している可能性がある。RP58はニューロンの移動や成熟に必須であるため、RP58欠損皮質ではOSVZが形成されても、成熟したニューロンができない。そこでRP58をタイミングよく補充することを試みた。ニューロンに決定後早い時期に発現することが知られているNeuroDのプロモーターの支配下にRP58を発現するプラスミドを子宮内電気穿孔法で導入した。このことで増殖したニューロンが脳表まで移動した。このことから、げっ歯類から霊長類の脳進化の過程で、RP58の関与するカスケードが関わる可能性が示された。また、RP58の発現パターンを調節することでOSVZ形成を促し、ニューロン数を増加させられることが明らかとなった。従って、本研究は、霊長類を含む高等ほ乳類で発達した大脳皮質の形成メカニズム解明の糸口となるとともに、マウスを用いてヒトの脳形成のメカニズムを解明するモデルとなることが期待される。

例えば、RP58の発現が遅延することで、ニューロン増殖層の細胞周期離脱を阻害し、その結果OSVZが形成され、そして、その結果、多数のニューロンを生み出すことができる。26年度が最終年度であるため、記入しない。マウスのRP58を大脳皮質で欠損させることで、OSVZ様構造が見られることを、明らかにしたてきたが、今回NeuroDプロモータの支配下でRP58を子宮内エレクトロポレーションで補充することでRP58を適切な時期に発現させることに成功した。一方、移動した子宮内エレクトロポレーションのため、大脳皮質の一部なので、個体レベルの機能的な解析が困難である。以上の理由で、本研究はおおむね順調に進展していると評価した。個体レベルでマウスに霊長類型の機能的なOSVZを形成させるためには、今後遺伝子改変マウスを用い、個体レベルでRP58を補充する系を作製することが必要である。
機能性ポリフェノールによる実験的コレステロール胆石の制御作用

マウスによるポリフェノールの実験的コレステロール胆石抑制作用について、昨年度までに種々のポリフェノール高含有食品についての実験と、各種ポリフェノールの構造と胆石抑制作用との関連についての実験を行った。これらの実験において、コレステロール胆石抑制作用が、ポリフェノールの構造によって異なるが、総じて認められることを見出した。さらに本年は、近年日本において都市部を中心に増加している黒色系胆石の実験的生成条件を検討し、コレステロール負荷条件で、ハムスターにおける黒色系胆石を高頻度に惹起させることに成功し、マウスにおける白色胆石と比較研究が可能となった。マウスにおけるよりもハムスターのほうが短期間に胆石形成が誘導されることも判明した。そこで、コーヒーとその含有ポリフェノールのクロロゲン酸、あるいはカフェインを添加して胆石形成への影響を調べた。その結果、対照群では100%、コーヒー群では20%、クロロゲン酸群では90%、カフェイン群では20%とマウスにおける実験結果とは若干異なった結果が得られた。血清脂質ではトリグリセリドのコーヒー群とクロロゲン酸群での有意な低下が認められた。白色系と黒色系との胆石の違いがなにに由来するかさらに今後の検討が望まれるが、同じ食事コレステロール由来であることは興味深い。また、ポリフェノールの影響が両胆石で異なる原因も今後機会があれば、さらに検討を加えたい。ポリフェノールのコレステロール胆石抑制作用を調べるためマウスを用いて、今年度はカレー粉中の黄色い香辛料であるクルクミン、コーヒー中の主成分であるカフェインやクロロゲン酸、また、ポリフェノールを数種類含んだ混合物である食品素材について検討した。クルクミンとクロロゲン酸は飼料に0.20.5%添加することによって胆石の形成を抑制した。カフェインにおいては胆石の形成が認められなかったものの、カフェインを摂食させたマウスの飼料摂取量及び体重の増加が著しく悪かったため、カフェインにコレステロール胆石抑制作用があるとは判断できなかった。ポリフェノールを含有する食品素材には、赤ワイン、緑茶、イチョウ葉、赤ブドウ葉、さとうきびの各抽出物について検討した。これらの素材はいずれもポリフェノールを1580%含有している。マウスの飼料に3%添加することによって、赤ワイン及び赤ブドウ葉抽出物が最も強いコレステロール胆石抑制効果を示し、次いでイチョウ葉抽出物が抑制した。さとうきび抽出物の抑制効果は最も弱かったが、これはポリフェノール含有量が15%と最も低いためであると思われた。緑茶抽出物はこれらの素材の中では最もポリフェノール含有量が高かったが、マウスの飼料摂取量と体重の増加が著しく悪く、これは緑茶抽出物中にカフェインを含有していることが原因であると考えられた。これら食品素材中には最低でも3種類以上、多いものでは10数種類のポリフェノール成分を含んでいることから、食品素材を用いてコレステロール胆石抑制実験をおこなえば最低でも15種類以上のポリフェノール成分が評価できたことになる。しかし、これらのポリフェノール成分には胆石形成に及ぼす効果があるものとないものが共存しており、今後はポリフェノール成分を系統的に分けて化学構造と胆石抑制効果との相関を検討する。マウスによるポリフェノールの実験的コレステロール胆石抑制作用について、昨年度までにカレー粉中の黄色い香辛料であるクルクミン、コーヒー中の主成分であるカフェインやクロロゲン酸、また、ポリフェノールを数種類含んだ混合物である食品素材について調べた。今年度はコーヒーおよび緑茶についてカフェイン含有の有無により胆石形成に違いがあるかを調べた。また、水酸基の結合部位の異なる3種のアントラキノン化合物とアントラキノン系食用色素のラック、コチニールについても検討した。コーヒーと緑茶は含有するポリフェノール量が異なるため、コーヒーは飼料中に3%、緑茶は1%添加することによって胆石の形成を調べた。コントロール群は90%以上の高い胆石形成率であった。コーヒー投与群では、カフェイン添加(+)で80%、カフェイン無添加(-)で100%、緑茶投与群では、カフェイン(+)で90%、カフェイン(-)で100%、胆石形成を抑制した。いずれの場合もカフェイン(+)に比べカフェイン(-)のほうが胆石形成抑制率はわずかに高かった。また、1,2,4-位に水酸基を有するプルプリン、1,4-位に水酸基を有するキニザリン、1,5位に水酸基を有するジヒドロキシアントラキノンとコチニール色素(カルミン酸)、ラック色素(ラッカイン酸)の5種類のアントラキノン類についてコレステロール胆石抑制作用を検討した。飼料中に各1%添加して胆石の形成を調べた結果、いずれの化合物も高い胆石形成抑制率を示した。中でもジヒドロキシアントラキノンは100%胆石の形成を抑制し、トリヒドロキシ体よりもジヒドロキシ体のアントラキノン類のほうがわずかに抑制効果が高いようであった。また配糖体のカルミン酸は抑制率が70%でこれらの化合物の中では最も効果が弱かった。自然界には様々な構造のポリフェノールがあり、その一端を今回明らかにした。更にポリフェノールの化学構造と胆石形成との相関について今後も詳細に検討する。

さらに本年は、近年日本において都市部を中心に増加している黒色系胆石の実験的生成条件を検討し、コレステロール負荷条件で、ハムスターにおける黒色系胆石を高頻度に惹起させることに成功し、マウスにおける白色胆石と比較研究が可能となった。マウスにおけるよりもハムスターのほうが短期間に胆石形成が誘導されることも判明した。そこで、コーヒーとその含有ポリフェノールのクロロゲン酸、あるいはカフェインを添加して胆石形成への影響を調べた。その結果、対照群では100%、コーヒー群では20%、クロロゲン酸群では90%、カフェイン群では20%とマウスにおける実験結果とは若干異なった結果が得られた。血清脂質ではトリグリセリドのコーヒー群とクロロゲン酸群での有意な低下が認められた。白色系と黒色系との胆石の違いがなにに由来するかさらに今後の検討が望まれるが、同じ食事コレステロール由来であることは興味深い。また、ポリフェノールの影響が両胆石で異なる原因も今後機会があれば、さらに検討を加えたい。
＜周縁＞からの東アジア国際秩序の探求―台湾・沖縄の間主観と国際関係史の視座

「周縁からの間主観性に基づく共生秩序」を検証するため、非政府主体の国際秩序観を調査研究対象に据える。とくに輿論と対話する言論人・知識人のへの聞取り調査を行う。周縁の言論人や知識人も公的な空間に向けて語る言葉の真意は別にもあり、その隠された真意こそが間主観を知るために有益な情報源となるからである。そこで公的記録の検証と聞き取り調査を軸として調査・研究を実施する。調査・研究の共有のためには、周縁地域にある大学の研究者同士が研究の中核となって、東アジアの日本研究者による『日本を外から理解するための事典』を間主観的認識のモデルとして刊行する。
第一原理格子ダイナミクスによるアパタイト型高速イオン伝導体の拡散機構解明

アパタイト型結晶構造を有するランタンシリケート(La10(SiO4)6O3)について、そのイオン伝導メカニズムを定量的に解明するため、第一原理計算を用いた理論解析を行った。まず格子間酸素イオンの最安定・準安定サイトを探索し、それらのサイト間を経由して伝導していくメカニズムを解析した。イオン伝導メカニズムとしては、格子間酸素イオンが格子間をすり抜ける格子間機構ではなく、酸素イオン同士の連動による準格子間機構がエネルギー的に安定であることがわかった。このようなイオン伝導機構は従来報告に無いメカニズムであり、アパタイト型酸素イオン伝導体の高速なイオン伝導を説明するものと考えられる。アパタイト型結晶構造を有するランタンシリケートについて、そのイオン伝導メカニズムを定量的に解明するため、第一原理計算を用いた理論解析を行った。まず格子間酸素イオンの最安定・準安定サイトを網羅的に探索したところ、アパタイト型構造のc軸に平行な酸素イオンカラム近傍に最安定となる格子間酸素イオンサイトが存在することがわかった。さらに0.1eV程度エネルギーが高い準安定格子間サイトがSiO4四面体近傍に存在していた。これらは従来の実験報告と一致した結果である。また格子間酸素イオンサイトを結ぶイオン伝導経路とそのポテンシャルエネルギー障壁をNudged Elastic Band法により調べた。アパタイト型結晶構造において、格子間酸素イオンが格子間をすり抜ける格子間機構を仮定した場合、エネルギー障壁が1 eVを超える結果となった。実験値(0.5-0.9eV)を念頭に置くと、格子間機構による拡散は困難であると考えられる。そこで、イオン半径の大きな酸素イオン同士の連動を考え、準格子間機構によるイオン伝導を検討したところ、格子間機構に較べ低いエネルギー障壁であることがわかった。この準格子間機構による酸素イオン伝導の様子は、別途行った高温での第一原理分子動力学計算でも確認することができた。このような酸素イオン伝導機構は従来報告に無いメカニズムであり、複雑な結晶構造を有するランタンシリケートやその類縁物質が示す高いイオン伝導度の起源であると考えられる。
ハイブリッド形成によりマルチ制御機能を持つインテリジェント核酸の創製

本研究では過剰発現している異常遺伝子に対しハイブリッドを形成し、その発現を調節するのと同時に、薬剤を放出することで標的蛋白の機能を制御するマルチ制御機能をもつインテリジェント核酸の開発を目的とした。すでに私は標的との2本鎖内で特異的に活性化されシチジンに対して選択的にクロスリンク反応する2-amino-6-vinyl purineを開発している。さらにこの反応中で反応性官能基のマスキング剤に使ったスルフィド基で結合した分子が放出されることを確認している。これらの一連の化学反応を利用し、遺伝子配列特異的な薬物放出システムへの展開を計画した。まずこれらのシステムが細胞内で機能することを確認するために標的遺伝子に対して、ハイブリッドを形成し、薬物が放出されるのを細胞外から検出する方法の検討を行った。平成17年度は脱離するマスキング剤に蛍光基を結合させ、脱離により蛍光が増強することで反応を検出する方法を検討した。しかし、この方法では脱離による蛍光の増強は観測されなかった。そこで平成17年度はFRET現象の利用を計画し、消光団としてダブシル基、蛍光団としてフルオレセインを持つダブル標識機能性オリゴDNAを合成した。これらのオリゴDNAは試験管内で標的位置にシトシンを含む相補的配列のオリゴDNAと混合したときのみ、選択的に消光剤の脱離に伴う蛍光の増強が観測された。さらにこれらの反応をモデル細胞である細胞抽出液中で行ったところ、同様に、標的選択的な蛍光の増大が観測された。またダブル標識機能性オリゴDNAは高いアンチセンス効果を示すこともわかった。これらの結果は、今回合成したダブル標識オリゴDNAを用いて、細胞内においてハイブリッド形成により選択的に進行する化学反応を、蛍光の増強により観測できると期待されるとともに、これらの化学反応が薬物放出システムとしても細胞内で機能する可能性を示したものであると考えている。本研究では過剰発現している異常遺伝子に対しハイブリッドを形成し、その発現を調節するのと同時に、薬剤を放出することで標的蛋白の機能を制御するマルチ制御機能をもつインテリジェント核酸の開発を目的としている。またスルフィド官能基でマスキングされたクロスリンク剤を持つオリゴDNAは天然型アンチセンスの効率を向上することがわかっており、細胞内でもスルフィド基の脱離及びクロスリンク反応が進行することが示唆されている。そこで本年度はまず、細胞内で効率よく脱離するスルフィド官能基の検索を行った。細胞内でスルフィド基の脱離を確認する方法としてFRET現象の利用を計画した。まず2つの蛍光団を持つ機能性オリゴDNAを合成し、スルフィド結合した蛍光団が遊離しFRETが解消し蛍光を示すことを指標に、標的遺伝子に対してハイブリッドを形成することで容易に遊離するスルフィド官能基の検索を行なった。その結果、消光剤としてダブシル基をスルフィド結合させた2-amino-6-alkyl purine誘導体を含むオリゴDNAの末端に、フルオレセインを導入したオリゴDNAが効率よくFRET現象を起こすことを見出した。さらにこのオリゴDNAを試験管内で標的位置にシトシンを含む配列のオリゴDNAと混合したときのみ、消光剤の脱離に伴う蛍光の増強が観測された。この結果は今回合成した標識オリゴDNAはハイブリッド形成により選択的に蛍光の増強を観測できると考えられ、細胞内での化学反応の追跡も可能であると期待される。

現在、モデル細胞系を用いてこれらの反応追跡を検討中であり、さらに細胞内への適用を目指して研究を展開中である。すでに私は標的との2本鎖内で特異的に活性化されシチジンに対して選択的にクロスリンク反応する2-amino-6-vinyl purineを開発している。さらにこの反応中で反応性官能基のマスキング剤に使ったスルフィド基で結合した分子が放出されることを確認している。本研究ではこの一連の反応を利用して、過剰発現している異常遺伝子に対しハイブリッドを形成し、その発現を調節するのと同時に、薬剤を放出することで標的蛋白の機能を制御するマルチ制御機能をもつインテリジェント核酸の開発を目的とした。まず、標的遺伝子に対して、ハイブリッドを形成し、薬物が放出されるのを細胞外から検出する方法の検討を行った。その方法としてFRET現象の利用を計画し、消光団としてダブシル基、蛍光団としてフルオレセインを持つダブル標識機能性オリゴDNAを合成した。このオリゴDNAは、フルオレセインのみを持つオリゴDNAに比べ蛍光強度が減少しており、効率よくFRET現象が起きていることがわかった。これらのオリゴDNAは試験管内で標的位置にシトシンを含む相補的配列のオリゴDNAと混合したときのみ、選択的に消光剤の脱離に伴う蛍光の増強が観測された。さらにこれらの反応をモデル細胞である細胞抽出液中で行ったところ、同様に、標的選択的な蛍光の増大が観測された。またダブル標識機能性オリゴDNAは高いアンチセンス効果を示すこともわかった。これらの結果は、今回合成したダブル標識オリゴDNを用いて、細胞内においてハイブリッド形成により選択的に進行する化学反応を、蛍光の増強により観測できると期待されるとともに、これらの化学反応が薬物放出システムとしても細胞内で機能する可能性を示したものであると考えている。
パレオアジアDBデータ時空間動態の可視化と文化多様性形成プロセスの推定

本申請課題の目的は、数理的な手法をもちいることで、パレオアジアDBの石器製作技術データの時空間動態を可視化し、データセットの様相を把握するとともに、その形成プロセスについても統計的・数理的に推定することである。多変量解析による情報の要約と、遺跡間の網羅的な比較を通じて、石器製作技術の地理的変異や、文化多様性の地域差を定量的に評価する。そうすることで、検討すべき仮説の提示を行い、その仮説の検証結果をさらにデータ解析に反映させる。これを繰り返すことで、プロジェクト全体のフィードバック関係を強化する。
歯周炎関連口腔細菌による炎症性シクロオキシゲナーゼ産生の解析

(2)COX-2 mRNAの検出:P.gingivalis、S.anginosusから得られたMFをPBMCあるいはヒト歯肉線維芽細胞(Gin-1)に加えて培養し、4時間後に細胞を集め、Acid guanidinium thiocyanate-phenolchloroform(AGPC)法で全RNAを抽出する。さらにこのRNAからcDNAを合成し、COX-2特異的プライマーを用いて、PCRを行い、アガロース電気泳動でCOX-2 mRNAを検出した。2.結果(1)P.gingivalis、S.anginosusの培養上清から得られたMFは、SDS-PAGEで34本のタンパクバンドにまで精製した。(2)PBMCあるいはGin-1にこれらMFを(12mug/ml)加えて培養すると、細胞内mRNAは対照(PBSコントロール)にくらべ、P.gingivalis、S.anginosusいずれのMFでも明らかにCOX-2 mRNAが増量していた。3.考察:以上の結果より、歯周炎関連細菌P.gingivalis、S.anginosusの培養上清にCOX-2を誘導する物質が存在し、歯周炎との関連が示唆された。
自発的磁場配向膜中生理活性ペプチドの高分解能構造解析法の開発

本研究では生理活性ペプチドの膜結合構造を明らかにするため、自発的磁場配向膜を用いた新しい方法の開発を目的として研究を進め、以下の成果を得た。1.これまで明らかにしてきた長楕円型小胞体を形成するメリチン-DMPC小胞体の膜分断における形態変化を微分干渉光学顕微鏡を用いて観測した。この結果、脂質二重膜は相転移点(Tm)以上の温度では、膜融合を繰り返し30μmにも達する巨大小胞体を形成することが判明した。2.メリチン-DMPC脂質二重膜は磁場の存在下では、長軸が短軸に比べて、4倍以上長い楕円小胞体を形成し、その長軸を磁場に平行に向けて自発的に磁場配向することが明らかになった。3.メリチンのカルボニル炭素を^<13>C同位体標識した試料を合成し、自発的磁場配向膜に組み込んだ。このカルボニル炭素の化学シフトテンソルを静止条件(磁場配向条件)、低速MAS条件、および高速MAS条件で測定した。この結果、カルボニル炭素の^<13>C等方化学シフト値から、メリチンは膜中でN端およびC端に渡ってα-ヘリックス構造をとっていることが判明した。4.磁場配向状態のメリチンの化学シフト値の解析から、メリチンのヘリックスはヘリックス軸から傾いた軸の回りで歳差運動をしており、その回転軸は膜面に垂直であることが判明した。従って、メリチンは膜結合状態で膜貫通ヘリックスを形成しており、N-端のヘリックスは膜の垂線から30°傾き、C-端のヘリックスは膜の垂線から10°傾いた状態で、その方向を絶えず変化させて膜中を2次元拡散しているメリチンの動的構造が明らかになった。
発達障害児の早期支援における子ども理解と家族支援のためのサービスモデルの開発

本研究では発達障害早期支援における初期アセスメト及び家族支援の方法を検討した。初期アセスメントに導入する「子ども理解シート」を作成し、専門機関に導入した結果、シートの導入が家族と支援者が共に子どもの発達や障害の理解を深めるツールとして有効であることが明らかになった。専門機関による家族支援を補完するサービスの開拓として大学研究室と専門機関との連携を実現させた子育てサロンを定期的に実施した。その結果、関係機関が相互補完的な役割を担いながら地域を基盤とした子育て支援システムに包含した発達障害早期支援モデル及び発達障害の診断前後に導入する家族支援に特化したサービスの具体的な方法を提案することができた。本研究は、発達障害児の早期介入の場である児童福祉施設等のサービスのあり方を検討することを目的としている。平成24年度は、早期診断に関する研修、視察調査をもとに、山口県内の児童福祉サービスを実施する事業所のスタッフと幼時期の発達障害の診断前後のサービスのあり方について抱えている課題を整理した。本研究のゴールである早期支援のサービスモデルの開発を目指しつつ、発達障害の診断前にある子どもの理解を家族と支援者が共有し、その後の具体的なサービスの提案、ツール(子ども理解を共有するためのプロフィールブック)の開発・試行導入・評価を行った。プロフィールブックを試行導入した児童福祉サービスを利用している発達障害の診断前の保護者を対象とした支援のあり方を検討し、試行事業としてグループカウンセリングを計2回実施した。参加者の語りの記録や感想から効果の検討を行った。また、平成22年度から実施している発達障害児を育てる母親を対象とした子育てサロンの運営を通して、関係機関との連携による早期支援におけるサービスモデルの開発のための、地域を基盤とした子育てサロン事業の意義を整理した。今年度の研究から得られた成果として、発達障害の診断前からの子どもと家族へのサービス内容及び家族と支援者が<子ども理解>を共有するためのツールの開発に至った。また、大学施設を利用した子育てサロン活動の実践的研究から、発達障害支援を包含した乳幼児期の子育て支援システムのあり方について考察を行うことができた。最終年度は、幼児期の発達障害の診断前後における母親支援のあり方を検討することを重点においた実践研究を継続しながら、開発したプロフィールブックを導入した早期支援サービスモデルの開発を行った。研究の社会への還元として、地域還元シンポジウム「発達障害の早期支援のあり方を考える発達支援の場における子どもと家族へのまなざし」を開催した。実践研究として1関係機関との連携を実現させた子育てサロンの実施・評価(ママかんフリーカフェ)2未診断の子どもを育てる母親が記述するプロフィールブックの開発・導入・評価(「プロフィールブックはじめのいっぽ」3診断前の母親を対象としたサロン活動の試行的実施・評価(アーリー・スタート・マザーズ・プログラム)の研究の成果をまとめた。その上で、発達障害の早期支援における「子ども理解」と「家族支援」を包含したサービスモデルの開発を行った。シンポジウム開催にあたっては、連携してきた関係機関(児童発達支援事業)の保育士や児童発達支援管理者との研究会を経て、その成果を報告した。研究成果についての客観的評価を得るために、発達障害支援の先駆的実践を展開している北海道おしまコロニーの児童発達支援事業の施設長に指導助言を得た。本研究は、発達障害児の早期介入の場である児童福祉施設等のサービスのあり方を検討することを目的とする。平成23年度は、国内外の文献レビューを行い、視察調査(国内3ヶ所、山口県内4ヵ所)を実施した。視察調査で得られた情報を整理し、今後の研究をすすめていく上での具体的な方向性を探った。また、これまで申請者が実施してきた発達障害児の早期発見・支援に関する研究の再整理・分析を行い課題の明確化を図り、調査研究の準備を行った。特に家族支援に関する課題を整理することができ、研究計画の見直しをすることができた。また、本研究の計画として、山口県内の発達障害児の支援に携わる支援者を対象とした研修会の企画・運営を行うこととしている。平成23年度は、視察調査の報告や発達障害の診断前後のサービスに関する課題を共有することを目的とし、本学地域交流スペースYuccaにて年3回、研究室にて年3回実施した。今年度の研究から得られた成果として、発達障害の診断前後の子どもと家族へのサービス内容の整理とサービス上の課題を明らかにできたことが挙げられる。また、発達障害の診断前後の支援が困難であり、そのサービスのあり方を検討することが求められることが明らかになった。本研究は、発達障害児の早期支援の場におけるサービス提供プロセスの整理を行い、サービスモデルの開発を行うことを到達点にしているが、そのサービス提供プロセスには、発達障害の診断前の子どもの発達アセスメントと家族支援の方法を検討することが求められる。

発達障害の早期支援におけるサービスモデルの開発として、発達障害の診断前後に特化した支援方法の検討、早期支援に活用するツールの開発、家族支援のモデル事業の評価をもとにした新たなサービスの提案ができた。平成24年度に実施予定であったツールの開発・導入、家族支援の方法論の検討等、研究目的を達成するための研究はおおむね進んでいる。平成23年度に実施予定であった全国の児童福祉施設及び事業所を対象とした調査は、児童福祉法の改正のために、施設名や事業内容の見直しの時期だったことを踏まえ、見送った。しかし、研究目的を達成するための研究はおおむね進んでいる。児童福祉サービスを実施する事業所のスタッフを対象とした研究会を実施し、今年度の研究の成果をもとに、実践的研究へと進め、発達障害の早期支援のサービスモデルの提案を行う。研究成果を広く公表するために、学会発表、論文作成、HP作成、報告パンフレットの作成を行う。平成26年2月に、研究成果の還元を目的としたシンポジウムを山口県立大学にて実施する。発達障害の診断前後のプロセスを含んだサービスモデルの開発に必要な情報を再整理し、研究をすすめる。また、発達障害の診断前後のサービスモデル事業の企画・運営、子ども理解シートの開発、家族支援ガイドライン作成のための研究を実施する。研究会の企画・運営、家族支援モデル事業運営に係る費用として、リムーブディスク、プリンターインク、用紙、ファイル等の消耗品を購入する。また、研究会の記録の整理、報告パンフレット作成補助としてアルバイト代金を計上する。報告パンフレットに係るデザイン料と印刷製本費、パンフレット等成果物の郵送代は、研究費から計上する。学会発表を行う際の旅費、シンポジウム運営にかかわる旅費(講師旅費)、シンポジウムの講演者への謝金を研究費から計上する。発達障害の診断に関する研修会参加費、調査(全国調査、ヒヤリング調査)に係る費用、発達障害子ども理解シート、家族支援ガイドライン作成のための研究会の企画・運営のための費用として研究費を充てる。
転写制御因子の多重修飾と機能調節ネットワークの解明

転写因子はさまざまな生体刺激に反応して,転写を活性化・抑制化することで標的遺伝子の発現を制御する.しかし,遺伝子発現の『ON』や『OFF』は,単純に転写因子自身の遺伝子発現の"all or nothing"の反応ではなく,タンパクとして既に"待機"している転写因子の活性調節が必須で,modificationによって精巧にチューニングされている.転写コファクターであるCBP/p300がヒストンアセチル基転移酵素(HAT)の活性を持つことが明らかにされたことがブレイクスルーとなり,クロマチンの基本構造を支えるヒストンのアセチル化をはじめとするリン酸化やメチル化の修飾によるリモデルリングが注目を集めている.一方,CBPと結合するE2F, MyoD, GATA-1,GATA-3,EKLF, HNF-4などの転写因子は,アセチル化でDNA結合活性と転写活性が増強される事が証明された.申請者らは,『フォークヘッド(FOXO)ファミリー転写因子・Foxo1がCBPと結合してアセチル化されることで,転写活性が抑制される』ことを発見し,【アセチル化=転写活性化】という定説を覆した.さらに申請者らの研究から,Foxo1はリン酸化と共役してユビキチン化される事が判明している(PNAS 100,11285-11290,2003).このように,Foxo1は《多重修飾》を受けるが,その生理機能は不明である.そこで,本研究は以下の4点に焦点を絞り,『転写制御因子の多重修飾と機能調節』の生物学的意義を明らかにすることを目的とした.(1)アセチル化による転写抑制機構の解明:(2)ユビキチン化による転写制御機構の解明:(3)多重修飾の共役リレー制御の解明:(4)修飾制御の個体機能の解明:本年度は,Foxo1のCBPによるアセチル化に対する逆反応を触媒する脱アセチル化酵素がSir2(silent information regulator 2)であることを明らかにした(PNAS 102,10042-10047,2004).Sir2はNADH依存的に脱アセチル化を触媒するが,Foxo1の脱アセチル化し,抑制活性を解除した.今後は,リン酸化と(脱)アセチル化との多重修飾の関係を明らかにしていく予定である.転写因子はさまざまな生体刺激に反応して,転写を活性化・抑制化することで標的遺伝子の発現を制御する.しかし,遺伝子発現の『ON』や『OFF』は,単純に転写因子自身の遺伝子発現の"all or nothing"の反応ではなく,タンパクとして既に"待機"している転写因子の活性調節が必須で,modificationによって精巧にチューニングされている.転写コファクターであるCBP/p300がヒストンアセチル基転移酵素(HAT)の活性を持つことが明らかにされたことがブレイクスルーとなり,クロマチンの基本構造を支えるヒストンのアセチル化をはじめとするリン酸化やメチル化の修飾によるリモデルリングが注目を集めている.一方,CBPと結合するE2F, MyoD, GATA-1,GATA-3,EKLF, HNF-4などの転写因子は,アセチル化でDNA結合活性と転写活性が増強される事が証明された.申請者らは,『フォークヘッド(FOXO)ファミリー転写因子・Foxo1がCBPと結合してアセチル化されることで,転写活性が抑制される』ことを発見し,【アセチル化=転写活性化】という定説を覆した.さらに申請者らの研究から,Foxo1はリン酸化と共役してユビキチン化される事が判明している(PNAS 100,11285-11290,2003).このように,Foxo1は《多重修飾》を受けるが,その生理機能は不明である.そこで,本研究は以下の4点に焦点を絞り,『転写制御因子の多重修飾と機能調節』の生物学的意義を明らかにすることを目的とした.(1)アセチル化による転写抑制機構の解明:(2)ユビキチン化による転写制御機構の解明:(3)多重修飾の共役リレー制御の解明:(4)修飾制御の個体機能の解明:本年度は,Foxo1のCBPによるアセチル化に対する逆反応を触媒する脱アセチル化酵素がSir2(silent information regulator 2)であることを明らかにした(PNAS 102,10042-10047,2004).Sir2はNADH依存的に脱アセチル化を触媒するが,Foxo1の脱アセチル化し,抑制活性を解除した.今後は,リン酸化と(脱)アセチル化との多重修飾の関係を明らかにしていく予定である.転写因子はさまざまな生体刺激に反応して,転写を活性化・抑制化することで標的遺伝子の発現を制御します.しかし,遺伝子発現の『ON』や『OFF』は,単純に転写因子自身の遺伝子発現の"all or nothing"の反応ではなく,タンパクとして既に"待機"している転写因子の活性調節が必須で,modificationによって精巧にチューニングされています.転写コファクターであるCBP/p300がヒストンアセチル基転移酵素(HAT)の活性を持つことが明らかにされたことがブレイクスルーとなり,クロマチンの基本構造を支えるヒストンのアセチル化をはじめとするリン酸化やメチル化の修飾によるリモデルリングが注目を集めています.一方,CBPと結合するE2F, MyoD, GATA-1,GATA-3,EKLF, HNF-4などの転写因子は,アセチル化でDNA結合活性と転写活性が増強される事が証明されました.

申請者らは,『フォークヘッド(FOXO)ファミリー転写因子・FKHRがCBPと、結合してアセチル化されることで,転写活性が抑制される』ことを発見し,【アセチル化=転写活性化】という定説を覆しました.さらに申請者らの研究から,FKHRはリン酸化と共役してユビキチン化される事が判明しています(未発表).このように,FKHRは《多重修飾》を受けますが),その生理機能は不明です.そこで,本研究は以下の4点に焦点を絞り,『転写制御因子の多重修飾と機能調節』の生物学的意義を明らかにすることを目的としました.(1)アセチル化による転写抑制機構の解明:(2)ユビキチン化による転写制御機構の解明:(3)多重修飾の共役リレー制御の解明:(4)修飾制御の個体機能の解明:本年度は,FKHRがプロテオソーム阻害剤MG132によって,HepG2における安定性が増強したことを明らかにした.さらに,インスリンによってユビキチン化が加速されることも明らかにした.今後は,ユビキチン化と転写活性化の関係を明らかにしていく予定である.転写因子はさまざまな生体刺激に反応して,転写を活性化・抑制化することで標的遺伝子の発現を制御する.しかし,遺伝子発現の『ON』や『OFF』は,単純に転写因子自身の遺伝子発現の"all or nothing"の反応ではなく,タンパクとして既に"待機"している転写因子の活性調節が必須で,modificationによって精巧にチューニングされている.転写コファクターであるCBP/p300がヒストンアセチル基転移酵素(HAT)の活性を持つことが明らかにされたことがブレイクスルーとなり,クロマチンの基本構造を支えるヒストンのアセチル化をはじめとするリン酸化やメチル化の修飾によるりモデルリングが注目を集めている.一方,CBPと結合するE2F, MyoD, GATA-1,GATA-3,EKLF, HNF-4などの転写因子は,アセチル化でDNA結合活性と転写活性が増強される事が証明された.申請者らは,『フォークヘッド(FOXO)ファミリー転写因子・Foxo1がCBPと結合してアセチル化されることで,転写活性が抑制される』ことを発見し,【アセチル化=転写活性化】という定説を覆した.さらに申請者らの研究から,Foxo1はリン酸化と共役してユビキチン化される事が判明している(未発表).このように,Foxo1は《多重修飾》を受けますが),その生理機能は不明である.そこで,本研究は以下の4点に焦点を絞り,『転写制御因子の多重修飾と機能調節』の生物学的意義を明らかにすることを目的とした.(1)アセチル化による転写抑制機構の解明:(2)ユビキチン化による転写制御機構の解明:(3)多重修飾の共役リレー制御の解明:(4)修飾制御の個体機能の解明:本年度は,プロテオソーム阻害剤MG132によるFoxo1タンパク質のHepG2における安定化は,ユビキチン依存的な分解を阻害することで増強されたことを明らかにした.さらに,インスリンによるユビキチン化の促進は,リン酸化依存的であり,且つ細胞質局在が重要であることが判明した.今後は,ユビキチン化とリン酸化・アセチル化との多重修飾の関係を明らかにしていく予定である.転写因子はさまざまな生体刺激に反応して,転写を活性化・抑制化することで標的遺伝子の発現を制御する.
肝細胞癌に対する肝移植療法の基礎的実験:分子標的治療を応用した肝癌再発抑制の研究

(1)ラット肝細胞癌株をラット肝臓に移植することで、自然経過では肺転移を来たし死亡するラット肝細胞癌モデルに対して肝移植を行い、術後FK506を1週間皮下投与すると、肝移植を行わない自然経過群と同様に肺転移を来し死亡することが確認され、ラット肝細胞癌肝移植モデルの確立ができた。(2)ラット肝細胞癌肝移植モデルに、FK506を1週間皮下投与し、Rock阻害剤投与群(経口で2週間投与)、非投与群に分けた所FK506単独投与群に比べRock阻害剤併用投与群で生存日数の有意な延長を認めた。FK506単独投与群で死亡時に転移を認めたのに対し、Rock阻害剤併用投与群では転移も認めず、肝細胞癌に対する肝移植でRock阻害剤が肝癌再発を抑制しうることをin vivoにおいて証明できた。(3)In vitroでの癌浸潤能の解析は、migration assayを行った。Rho kinase(Rock)のリガンドであるLPA投与で腫瘍細胞のmigration能の亢進、Rock阻害剤投与でmigration能の抑制を確認した。免疫抑制剤(FK506)の投与で、腫瘍細胞のmigration能がLPA同様に亢進し、FK506投与によって亢進したmigration能がRock阻害剤投与で抑制された。(4)Rock標的因子のミオシン軽鎖(MLC)のリン酸化レベルはFK506投与で増加し、Rock阻害剤併用投与で減少した。(3)(4)より免疫抑制剤が癌細胞のmigration能を亢進し、亢進したmigration能がRock阻害剤投与で抑制されることを証明した。(5)細胞増殖や分化に関与のRas/MAPキナーゼシグナル伝達系は、FK506およびRock阻害剤投与下にMTTアッセイで腫瘍細胞の増殖には影響を与えず、ウエスタンブロット法を用い、FK506投与およびRock阻害剤投与下にMAPキナーゼのリン酸化能も影響されなかった。ラット肝細胞癌株(使用腫瘍株:Morris hepatoma)をラット肝臓に移植することによって、自然経過で肺転移を来たし死亡するモデルを確立した。このラット肝細胞癌モデルに対して肝移植を行い、術後FK506を1週間皮下投与すると、肝移植を行わない自然経過群と同様に肺転移をきたして死亡することが確認された。これにより、ラット肝細胞癌に対する肝移植モデルの確立ができたといえる。このラット肝細胞癌肝移植モデルに対し、全例FK506を1週間皮下投与し、Rock阻害剤投与群、非投与群に分け、生存日数及び死亡時に転移巣を確認し転移数をカウントした。その結果、FK単独投与群に比べRock阻害剤投与群で生存日数の有意な延長を認めた。FK単独投与群で死亡時に転移を認めたのに対し、Rock阻害剤投与群では転移も認めていない。この結果により、肝細胞癌に対する肝移植においてRock阻害剤が肝癌再発を抑制しうることをin vivoにおいて証明できたといえる。Cell migration assayによる癌浸潤能の解析においては、Morris、NIH3T3細胞を使用した。Rho kinase (Rock)のリガンドであるLPA投与によりこれらの細胞のmigration能が亢進し、さらにRock阻害剤投与によりLPA投与で亢進したmigration能が抑制された。サイクロスポリン、FK506などの免疫抑制剤投与により、これらの細胞のmigration能がLPA同様に濃度依存性に亢進することが認められた。また、免疫抑制剤投与によって亢進したmigration能は、Rock阻害剤投与で抑制が認められた。

この結果により、免疫抑制剤が癌細胞のmigration能を亢進すること、さらにその亢進したmigration能がRock阻害剤投与により抑制されることを証明できたといえる。ラット肝細胞癌株(Morris hepatoma)をラット肝臓に移植することによって、自然経過で肺転移を来たし死亡するラット肝細胞癌モデルに対して肝移植を行い、術後FK506を1週間皮下投与すると、肝移植を行わない自然経過群と同様に肺転移をきたして死亡することが確認された。これにより、ラット肝細胞癌肝移植モデルの確立ができたといえる。このラット肝細胞癌肝移植モデルに対し、全例FK506を1週間皮下投与し、Rock阻害剤投与群(経口で2週間投与)、非投与群に分け、生存日数及び死亡時の転移巣を確認した。結果は、FK506単独投与群に比べRock阻害剤併用投与群で生存日数の有意な延長を認めた。また、FK506単独投与群で死亡時に転移を認めたのに対し、Rock阻害剤併用投与群では転移も認めなかった。この結果により、肝細胞癌に対する肝移植においてRock阻害剤が肝癌再発を抑制しうることをin vivoにおいて証明できたといえる。In vitroでの癌浸潤能の解析は、Morris、NIH3T3を使用し、migration assayを行った。Rho kinase(Rock)のリガンドであるLPA投与によるこれらの細胞のmigration能の亢進、Rock阻害剤投与によるmigration能の抑制を確認した。免疫抑制剤(FK506)の投与により、これらの細胞のmigration能がLPA同様に亢進し、FK506投与によって亢進したmigration能がRock阻害剤投与で抑制された。さらに、Morrisを用いてRockの標的因子であるミオシン軽鎖(MLC)のリン酸化レベルを解析した。FK506投与によりMLCのリン酸化レベルが増加し、Rock阻害剤併用投与によりそのリン酸化レベルが減少した。これらの結果により、免疫抑制剤が癌細胞のmigration能を亢進すること、さらにその亢進したmigration能がRock阻害剤投与により抑制されることを証明できたといえる。(1)ラット肝細胞癌株をラット肝臓に移植することで、自然経過では肺転移を来たし死亡するラット肝細胞癌モデルに対して肝移植を行い、術後FK506を1週間皮下投与すると、肝移植を行わない自然経過群と同様に肺転移を来し死亡することが確認され、ラット肝細胞癌肝移植モデルの確立ができた。(2)ラット肝細胞癌肝移植モデルに、FK506を1週間皮下投与し、Rock阻害剤投与群(経口で2週間投与)、非投与群に分けた所FK506単独投与群に比べRock阻害剤併用投与群で生存日数の有意な延長を認めた。FK506単独投与群で死亡時に転移を認めたのに対し、Rock阻害剤併用投与群では転移も認めず、肝細胞癌に対する肝移植でRock阻害剤が肝癌再発を抑制しうることをin vivoにおいて証明できた。(3)In vitroでの癌浸潤能の解析は、migration assayを行った。Rho kinase(Rock)のリガンドであるLPA投与で腫瘍細胞のmigration能の亢進、Rock阻害剤投与でmigration能の抑制を確認した。
タンパク質合成系への作用からみたN-アセチルシステインの抗精神病作用機序の解明

コカイン依存症動物モデルで予想される側坐核での細胞内システィンの欠乏からtRNAのチオール化抑制を予測し、それを触媒するMOCS3の発現量についてウエスタン法で検討したが、発現確認できなかった。またシスティンを合成の律速段階とするグルタチオンの量はコカインの影響を受けていなかった。メチオニンからのシスティン供給に関与する酵素についても活性をに有意な差を認めなかった。従って、慢性コカイン投与でシスチン-グルタミン酸交換体の機能障害が起きても、細胞内システィンの供給は代償されていると考えられた。一方、N-アセチルシスティンの急性投与は慢性コカイン動物でのシナプス構成タンパク質の分解を促進した。細胞内システィンの量は、内在性抗酸化ストレス分子のうち、脳内で最も大量に存在するグルタチオンの合成に関して律速段階となりうる。従って、システィン-グルタミン酸交換体(xCT)の機能異常は、脳内グルタチオンの代謝及び絶対量にも影響を与えうるので、抗酸化ストレスの見地からの動物の細胞レベル、行動レベルに対する影響の検討は非常に重要である。しかし、酸化ストレス、特に細胞死を誘導するには至らないマイルドなレベルのものが脳に与える影響については、胎生期や幼若期における検討を除くと、特に成熟脳機能に関する検討は極めて乏しかった。xCTの異常は依存症などの多くの精神疾患では、成熟脳で予想されているので、この検討は急務であった。そこで本研究グループは、薬理学的にマイルドな酸化ストレスを一過性に誘導するシステムを利用し、急性あるいは慢性にマイルドな酸化ストレス負荷をかけた時に成熟ラットの脳内及び学習や行動に与える影響について検証した。その結果、酸化ストレス負荷が統合失調症やうつ病のような特定の精神疾患モデルを模倣するわけではなく、ある側面では治療薬的な効果も有し、その効果発現の機序はおそらくはドパミン系を介した作用であることを明らかにし、以下の論文として発表した。初年度の検討の結果、慢性コカイン投与による側坐核でのシスティン-グルタミン酸交換体の機能障害は、同部のcysteine内容量に影響を与えておらず、それ以外の経路を介して代償されている可能性が強く示唆された。また、予想に反し細胞外cystathionine合成を触媒する酵素CBSは、コカイン投与群の側坐核で、対照群に比べ有意に低下していた。そこで2年度はCBSの活性制御に重要なglutathionylation化について免疫沈降法で対照群とコカイン群で比較を行ったが、いずれの群でもglutathionylation化したCBSは確認されなかった。以上の結果より、コカイン投与群側坐核におけるcysteine内容量は未知の代償機序によって制御され、タンパク質合成系に直接影響を与えている可能性は低いと考えられた。一方、タンパク質合成系と対応する関係にあるタンパク質分解系に関しては、我々の以前の検討から、コカイン投与群の側坐核で特異的に、細胞外cysteineを急速に補うN-acetyl-cystine(NAC)投与にて特に後シナプス膜分画に存在するタンパク質に特異的に誘導されるデータを得ていた。慢性コカイン投与やNACがユビキチン化促進やプロテオソーム活性に影響を与えないことが確認されたためオートファジー系の関与を疑い、同現象のマーカーであるLC3の発現量に関して検討したが、これも有意な結果は認めなかった。従ってオートファジー系の関与も否定された。初年度は、まずtRNAのチオール化を触媒するMOCS3について、生食投与群とコカイン慢性投与群の側坐核および背側線条体でウエスタン法によりタンパク質量を比較した。しかしいずれの領域においてもMOCS3の量には変化を認めなかった。また、細胞内システィンが減少した場合に予想されるグルタチオン量についても、両群間で有意な変化を認めなかった。これらの結果はコカイン慢性投与後の側坐核では、xCTの機能低下が存在するにも関わらず、以前から可能性として指摘されていたように、グルタミン酸との交換以外にもシスティン(あるいはシスチン)を細胞内に取り込むシステムが存在する可能性を示唆している。最近、xCTが細胞内のcystathionineと交換して細胞外のグルタミン酸を細胞内に取り込むことが明らかにされた(Kobayashi et al, JBC, 2015)。これによれば、細胞内のcystathionineが増加した場合、細胞外へのグルタミン酸放出は低下し、コカイン依存症用の表現系を呈することになる。細胞内cystathionineの合成は、メチオニンからGCLあるいはCBSという酵素の触媒で産生される。まずGCLについて発現量を検討したが、これまでの報告のようにGCLの発現は特異的抗体を用いても確認されなかった。これまでの報告から、グリア細胞内でcystathionineを合成する経路(transsulfuration経路)が、xCTの機能に影響を与えている可能性が示唆された。