hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
色覚進化解明の試み:視細胞可視化ゼブラフィッシュによる視物質遺伝子発現制御の解析

ゼブラフィッシュ青タイプ視物質遺伝子(SWS2)が網膜Long Single Cone(LSC)に特異的に発現する為のゲノム上における発現制御領域を探索した。様々な長さのゲノム上流領域を蛍光タンパク質であるgreenfluorescent protein(GFP)レポーターにつないで受精卵に導入し、正負の制御領域を検討した。まず当該遺伝子がLSC特異的に発現するための制御領域が近傍の上流領域約300bp内に存在することを示唆する結果を得た。この領域を他のゼブラフィッシュ視物質遺伝子の上流に組み込んだヘテロコンストラクトを作製して同様にレポーターアッセイを行ったこところLSCに発現を誘導することができた。以上のことから、この約300bp内にLSC特異的に発現するための制御領域が存在していることを明らかにした。また、さらにこの過程で当該遺伝子を発現するLSCをGFPにより可視化したトランスジェニックブラフィッシュ(TransGenic ZebraFish:TGZF)を複数樹立した。このTGZFは網膜あるいは視細胞の発生研究に非常に有用であるため、既に国内外の研究者に提供し、共同研究を開始している。次に、当該遺伝子が網膜視細胞以外の組織において発現が抑制されるための制御領域を探索した。この結果、網膜short single coneで発現が抑制されるために必要な上流領域89bpを同定した。さらに網膜の双極細胞の抑制に関わるOTX結合配列、および脳の松果体光受容細胞での発現を抑制するための9bpから成る新規シスエレメントをそれぞれ同定した。ゼブラフィッシュを用いて視物質遺伝子の発現制御機構を明らかにすることを目的として、まず視物質遺伝子の時間的空間的発現パターンを詳細に調べた。ゼブラフィッシュは吸収光波長も発現量も異なる2種類の赤型視物質遺伝子と4種類の緑型視物質遺伝子を有するが、それらの網膜における時間空間的発現パターンは未知であったため、我々は胚と成魚に対してこれら重複遺伝子の発現パターンをin situ hybridizationによって調べた。その結果、赤型、緑型ともより短波長感受型の遺伝子から順に発現が開始され、成魚では網膜の中央背側領域と周縁部+腹側領域で発現する遺伝子のセットが異なることを明らかにした。ゼブラフイッシュは重複した視物質遺伝子が網膜でそれぞれ異なる時間空間的発現パターンを示すことにより、成長時期あるいは視野によって異なる色覚を有するように進化したことが示唆された(雑誌論文として発表)。次に、ゼブラフィッシュ青型視物質遺伝子(SWS2)のゲノム上における発現制御領域を探索した。様々なゲノム上流領域を蛍光タンパク質であるgreenfluorescentprotein(GFP)レポーターにつないで受精卵に導入し、正負の制御領域を検討したところ、当該遺伝子が特定の視細胞種類特異的に発現するための制御領域が遺伝子近傍領域の約200bp内に存在することを明らかにした。また当該遺伝子の転写活性化領域(エンハンサー)が上流領域に複数存在する可能性を示唆した。さらにこの過程で当該遺伝子を発現する特定の視細胞をGFPにより可視化したトランスジェニックブラフィッシュを樹立した。ゼブラフィッシュ青型視物質遺伝子(SWS2)が網膜Long Single Cone(LSC)に特異的に発現する為のゲノム上における発現制御領域を探索した。また、その他の上流領域にも当該遺伝子の転写活性化領域(エンハンサー)が複数存在する可能性があることを明らかにした。さらにこの過程で当該遺伝子を発現するLSCをGFPにより可視化したトランスジェニックブラックフィッシュ(TransGenic ZebraFish : TGZF)を複数樹立した。次に、当該遺伝子が網膜視細胞以外の組織において発現が抑制されるための制御領域を探索したところ、網膜の双極細胞および脳の松果体光受容細胞での発現を抑制するためのシスエレメントをそれぞれ同定した。

次に、当該遺伝子が網膜視細胞以外の組織において発現が抑制されるための制御領域を探索した。この結果、網膜short single coneで発現が抑制されるために必要な上流領域89bpを同定した。さらに網膜の双極細胞の抑制に関わるOTX結合配列、および脳の松果体光受容細胞での発現を抑制するための9bpから成る新規シスエレメントをそれぞれ同定した。
未知なる歯髄細胞の機能を解析し、新たな歯髄再生療法の臨床的展開を目指す。

歯髄細胞の多分化能を調べた結果以下の結論が得られた。1歯髄組織(歯の神経がある組織)に存在するいろいろな組織に分化する細胞を利用して、もう一度歯髄組織を再生する方法を見出した。2ヒトのES細胞から歯髄細胞を分化させ、これを歯髄の再生療法に応用する方法を確立した。3新たな歯髄保護(虫歯や歯周病で歯の神経が失われないように保護する方法)法のために、機能性ガラス(いろいろな活性物質を放出できる小さなガラスビーズ)や魚のコラーゲンを応用して象牙質形成(歯の大部分を構成する硬い組織)を促進させる方法を確立した。これらの結果は、歯の保存するために大切な歯髄保護と歯髄再生療法の発展に寄与するものである。平成25年度の研究計画に従い研究を遂行した結果、主に以下の三点について結果が得られた。1.歯髄の未分化間葉細胞から象牙芽細胞へと分化する過程で、重要な役割を果たす転写調節因子の中でも、wntシグナルが大きな役割を果たしていることが明確になった。このwntシグナルは象牙芽細胞の分化を抑制する方向で働くことがあり、これを抑制する因子であるectodinは象牙芽細胞で合成分泌されるタンパク質で、wntの発現と拮抗するように合成分泌されるnegative feed back機構芽存在することが分かった。象牙芽細胞は分化する過程でこのwnt発現とectodin発現を交互にコントロールすることによって細胞分化をコントロールしていることが分かった。2.歯髄以外の筋組織に存在する未分化幹細胞から象牙芽細胞を分化させるために、細胞接着因子であるintegrinの発現をコントロールすることにより、象牙芽細胞に分化させることが可能であることを突き止めた。さらにES細胞とiPS細胞から分化させた象牙芽細胞の増殖機能においてMMP-3が深く関与することが分かった。3.歯髄細胞をin vitroで象牙芽細胞に分化させるために、適切な足場(スキャフォールド)を検討したところ、コラーゲンゲルを用いた3次元培養法が単層2次元培養法に比較して分化が更新することが分かった。さらに酸素分圧の関係から3次元培養法では中心部分と周囲では細胞分化に違いが生じることが分かった。平成26年度の研究計画に従って研究を遂行した結果、以下の結果が得られた。1.象牙芽細胞の分化にはSOSTdc-1 (ectodin)が重要な役割を果たしていることが昨年度までの研究て明確になった。すなわち、wntシグナルは骨芽細胞にとっては分化促進作用を示すが、興味あることに象牙芽細胞ては逆に分化を抑制することが分かった。象牙芽細胞ではwntシグナルがRunx2を誘導して、DSPPの発現を抑制することで、分化を抑制する。従って、象牙芽細胞が分化するためにはwntシグナル(象牙芽細胞てはwnt10a)が細胞膜に存在する受容体に結合するのを抑制する必要がある。そしてそのwntシグナルの抑制を担っているのがectodinである。ectodinがwntシグナルを抑制しDSPの発現を促進することを確認するために、ectodinのsiRNAを用いてノックダウンした結果、培養歯髄細胞でRunx2の発現が促進され、DSPの発現がコントロールのほぼ30%に減少していた。これはectodinの発現が抑制され、wntシグナルが活性化してRunx2を通してDSPの発現が抑制されたことを示す。また、ectodinのノックダウンを行った細胞にタンパク質であるectodinを添加したところ、Runx2の発現が抑制されDSPの発現がコントロール群の細胞のおよそ80%まで回復した。これらの結果によりectodinは象牙芽細胞の分化にとって重要な因子であり、wntシグナルを通して象牙芽細胞の分化がコントロールされていることが明らかとなった。2.歯髄未分化細胞を3次元培養してマウスの生体に戻すことによって歯髄組織を再生させ、象牙質形成を可能にするspheroid培養システムを開発した。これは歯髄血管再生療法につながる結果である。本研究の最終業績の概要は次の三点に絞られた。1.歯髄組織に存在する幹細胞を利用した歯髄再生療法への基礎的な知見。2.歯髄再生療法へ応用するためのヒトのES細胞から歯髄幹細胞へ分化誘導させる方法の確立。3.新たな歯髄保護法のための生体活性ガラス(BAG)が有する象牙質形成能を確認した。以下にこれらの内容について述べる。1.ヒトおよびラットの歯髄組織から多分化能を有する未分化間葉細胞を分離法を確立し、それらの細胞におけるectodinの細胞機能に及ぼす影響を分子生物学的に調べた。その結果、ectodinはwnt10aを介してカノニカル経路に作用して象牙質形成をコントロールしていることが分かり、ectodinが歯髄再生療法に応用可能な因子であることを示した。また、これらの歯髄幹細胞を低接着性ディスクを用いたスフェロイド培養を行うことによって、より効率良く象牙質形成を誘導することができることを示した。さらに低出力レーザー照射を利用して象牙質形成をコントロールできる可能性を示した。2.ヒトのES細胞を培養しレチノイン酸の添加と3次元培養によってCD29,CD44,CD73およびCD90が陽性の血管新生と神経再生能を有する歯髄幹細胞を誘導できた。そして、これらの細胞がより象牙質形成を促進するscaffoldの開発のために魚コラーゲンを利用して安全性の高い担体を開発した。

3.生体親和性の優れた生体ガラスは骨形成促進作用があることから骨補填剤として使用されているが、ストロンチウムが硬組織形成に重要な役割を果たしていることがわかり、これを象牙質形成に応用するために、ラットの臼歯露髄面に応用したところ効率良くdentin bridgeの形成が見られ、生体ガラスが新たな覆髄剤になる可能性を示した。以上のように本研究では最大の目的であった歯髄再生療法の新たな臨床的な展開を行うための知識ならびに方法を示すことができた。歯髄細胞の多分化能を調べた結果以下の結論が得られた。1歯髄組織(歯の神経がある組織)に存在するいろいろな組織に分化する細胞を利用して、もう一度歯髄組織を再生する方法を見出した。2ヒトのES細胞から歯髄細胞を分化させ、これを歯髄の再生療法に応用する方法を確立した。3新たな歯髄保護(虫歯や歯周病で歯の神経が失われないように保護する方法)法のために、機能性ガラス(いろいろな活性物質を放出できる小さなガラスビーズ)や魚のコラーゲンを応用して象牙質形成(歯の大部分を構成する硬い組織)を促進させる方法を確立した。これらの結果は、歯の保存するために大切な歯髄保護と歯髄再生療法の発展に寄与するものである。本年度は象牙芽細胞の分化にとって重要な機能であるwntシグナルとそのアンタゴニストであるectodinの作用が明確のなったことは大きな進歩である。骨芽細胞では分化促進として知られているwntシグナルが象牙芽細胞では逆に分化抑制因子であることは、歯髄細胞を再生療法へ応用する重要な情報になる。さらに3次元培養でもspheroidを用いた培養法の完全な確立は歯髄組織の再生療法には必須であり、臨床応用に極めて有用な結果である。以上のことからこれまでの研究の目的達成度はおおむね順調と判断した。27年度が最終年度であるため、記入しない。保存治療学次年度は最終年度になるため、以下の4点について推進し、成果報告に重点を置く。1 wntシグナルとectodinのカスケードをさらに明確にする。特にRunx2との関係を明確にする。2 3次元培養(sheroid)を利用した歯髄血管再生療法の動物実験を行う。3 iPS細胞から象牙芽細胞を分化させ、wntシグナルの作用を歯髄細胞と比較検討する。4歯髄細胞の分化にとって最適なスキャホールドを完成させる。以上の4点を中心に研究を遂行し、各分担者間の連絡を密に取り成果報告を取りまとめ、学会発表と論文作成を行う。平成25年度の実験計画では(1)歯髄組織の分化機構の解明のために歯髄細胞特有の転写調節因子を調べる、(2)歯髄以外の組織からの象牙芽細胞の分化を誘導能の可能性を探る、(3)歯髄組織の生体移植のための適切な担体を検討する、の3点にポイント絞った内容であった。これらに対して(1)では歯髄細胞に特徴的であるwntシグナルとectodinの関係が分かった。(2)では筋肉組織から象牙芽を分化させることが可能であることが示唆されたことやES細胞やiPS細胞から象牙芽細胞を分化させることができること示された。(3)に対しては歯髄細胞の三元培養法が確立できた。以上の結果は当初の研究計画に従ったものでおおむね順調に進行していると考える。
ストレス誘発鎮痛の神経心理学的研究

ラットにストレス刺激を与えると一過性の鎮痛効果があらわれる.これをストレス誘発鎮痛と呼んでいる.中枢神経系の形態的,機能的可塑性と幼弱期にとくに富んでいる.もし,ストレス刺激をこの時期に与えるなら,永続性のある効果が期待されるのではないだろうか.この仮設検証のために一連の実験が行われた.1.ラット新生児期(021日令)に1日2回, 30分間の電撃を継続的に与える. 2.ラットの成熟を待って, 150日令に生物化学検査を行った.3.オピオイド受容体結合テストの結果によれば,オピオイド受容体数,親和性ともに実験群と続制群で差がなかった.4.行動テスト結果によれば, a.150日令の実験群はホットプレート法による痛み刺激に鈍感になっており,仮設が検証された.b.モルヒネに対する感受性が有意に強く,オピオイドの関与が示唆された.モルヒネ拮抗薬ナロキソンはストレス誘発鎮痛を有意に抑制した.c.モルヒネ依存ラットを作り,退薬時の攻撃行動を観察すると,実験群のラットの退薬症状は弱かった. 4.以上の結果から,新生児期に与えたストレスはラットのオピオイドシステムに変化を及ぼし,成熟したのちのラットに侵襲刺激に対して耐える効果をもたらした.この効果は受容体数,親和性に変化のないことから,シナプス前ではなく,シナプス後になんらかの効果をあたえたためと考えられる. 5.3年間の研究成果は学会発表2,雑誌論文3,単行本一章として公表された.ラットにストレス刺激を与えると一過性の鎮痛効果があらわれる.これをストレス誘発鎮痛と呼んでいる.中枢神経系の形態的,機能的可塑性と幼弱期にとくに富んでいる.もし,ストレス刺激をこの時期に与えるなら,永続性のある効果が期待されるのではないだろうか.この仮設検証のために一連の実験が行われた.1.ラット新生児期(021日令)に1日2回, 30分間の電撃を継続的に与える. 2.ラットの成熟を待って, 150日令に生物化学検査を行った.3.オピオイド受容体結合テストの結果によれば,オピオイド受容体数,親和性ともに実験群と続制群で差がなかった.4.行動テスト結果によれば, a.150日令の実験群はホットプレート法による痛み刺激に鈍感になっており,仮設が検証された.b.モルヒネに対する感受性が有意に強く,オピオイドの関与が示唆された.モルヒネ拮抗薬ナロキソンはストレス誘発鎮痛を有意に抑制した.c.モルヒネ依存ラットを作り,退薬時の攻撃行動を観察すると,実験群のラットの退薬症状は弱かった. 4.以上の結果から,新生児期に与えたストレスはラットのオピオイドシステムに変化を及ぼし,成熟したのちのラットに侵襲刺激に対して耐える効果をもたらした.この効果は受容体数,親和性に変化のないことから,シナプス前ではなく,シナプス後になんらかの効果をあたえたためと考えられる. 5.3年間の研究成果は学会発表2,雑誌論文3,単行本一章として公表された.動物に強いストレス性の有害刺激を与えると、後続の痛み刺激に対して一過性に鈍感になる。これはストレス誘発鎮痛と呼ばれ、内因性鎮痛物質(オピオイドペプチド)の関与が指適されている。申請者は自己刺激に関与する脳内に想定される報酬系(快情動を伝達する神経回路)に関して、従来、唱えられてきたカテコラミン仮説(カテコラミン、とくにドーパミンが報酬系に直接的に関与している説)を否定し、主役はオピオイドペプチドではないかと考えるに至り、快情動と不快情動に関する神経モデルを構築した。本研究の究極的目標はそのモデル検証であるが、その前段階としてストレス誘発鎮痛が取上げられた。近年の発生学的研究によれば、中枢神経系の形態的発達がなされる新生児期に慢性的ストレスを与えるとストレスを伝達する神経系の発達が促進されるという。研究室内で産生されたウィスター系アルビノラットを2群に分け、実験群には生後初日から離乳までの21日間、1日1時間の断続的電撃を与え、統制群には電撃を与えなかった。実験【I】:150日令のラットを熱板法により熱刺激(56°C58°C)に対する感受性を検討したところ、実験群のラットは統制群に較べ統計学的に有意に低かった。実験【II】モルヒネに対する感受性を両群のラットで検討したところ、実験群のラットは統制群の約2倍、感受性が高く、モルヒネの鎮痛効果が認められた。実験【III】.両群の脳内オピオイドペプチド含有量、オピオイド受容体濃度を測定したところ、両群に差は認められなかった。今年度は実験【I】,【II】の前年度結果の再確認に大くの作業が使われたが、その結果は、従来ストレス誘発鎮痛は一過性と考えられているが、本実験におけるようにストレスを与える時期を選ぶと永続性の鎮痛効果が惹起されることが明らかになった。しかし、生化学的定量結果(実験【III】)はわれわれの予測と一致するものではなかった。
巨大地震に対するＲＣパッシブ制振建物－地盤連成系の非線形最適制御設計法の開発

本研究では、鉄筋コンクリート造(RC)のパッシブ制振建物と地盤の連成系を対象とし、巨大地震に対する最適な制御設計手法について検討した。最終年度である平成30年度には、RC制振構造の上部構造と杭基礎の下部構造を一体としてモデル化したPenzien型モデルを用い、地震応答解析を行って最適ダンパー特性を分析した。また、基礎のスウェイ・ロッキング(SR)動を考慮した粘性系ダンパーを有する構造物の連成系モデルを対象とし、様々なパワースペクトル密度の地動入力特性に対する最適なダンパーの減衰性状を数値的に評価した。平成2830年度の研究期間全体を通しての研究成果について次に述べる。基礎下部にSR動を考慮した摩擦ダンパー付き制振構造の振動台実験を実施し、最適ダンパー特性を分析した。この結果、地盤条件、ダンパー支持材剛性、地震波入力レベル等の違いによって、地震応答を最小化する最適ダンパー耐力が変化することを実験的に示した。最適ダンパー値付近で基礎固定とSRの違いにより応答曲線に逆転が生じる場合があることが示され、その要因について考察を行った。SR地盤ばねー制振建物の多質点系モデル、およびPenzien型の多質点系モデルを用いた地震応答解析を行い、RC制振建物の最適ダンパー特性を解析的に検討し、振動台実験で得られた傾向と概ね同様の性状が得られることを示した。さらに、質点系のSR地盤ー制振構造連成系モデルを用い、様々な周波数入力特性に対する最適ダンパー減衰性状を伝達関数に基づいて理論的に分析し、時刻歴解析に依らずに最適ダンパー値を評価する手法について検討した。これらの検討を通して、構造物の特性と地盤の影響を同時に一括して考慮できる非線形最適制御設計法の構築に取り組んだ。平成28年度には主に、最適ダンパー特性の定量的評価を目的として、次の1、2を実施した。1.建物と地盤の動的相互作用(SSI)を考慮したパッシブ制振構造の振動台実験を実施し、得られた結果に基づいて最適ダンパー特性を分析した。振動台実験の試験体として、摩擦ダンパーを有するパッシブ制振構造とその下部に地盤のスウェイ・ロッキング(SR)挙動を模擬した機構を組み入れた連成系模型を使用した。試験体のばね材などの各部品を交換することでダンパー支持材剛性や地盤スウェイ剛性などを変化させ、さらに入力地震動の周波数特性や入力レベルを様々に変化させることで、多ケース・多変量の振動台実験を行った。この結果、地盤条件、ダンパー支持材剛性、地震波入力レベル、地震波周波数特性の違いにより、地震応答を最小化する最適ダンパー摩擦耐力が変化することを確認した。一般に耐震構造ではSSI効果によりSRを考慮した場合の地震応答は小さくなることが多いとされているが、本実験では複数の加振ケースにおいて最適ダンパー摩擦耐力付近でFIXと比べてSRの地震応答が大きくなる結果が得られた。2.振動台実験で用いたSR制振構造試験体を質点系モデルでモデル化し、スペクトル特性の異なる地震波入力による地震応答解析を行った。また、実大建物の設計例を参考にし、SR地盤-制振建物の多質点系モデルによる地震応答解析を行った。地震波のスペクトル特性、基礎の種類、主架構の特性を変化させた多ケースの解析の結果、最適ダンパー値付近でFIXとSRで最大応答が逆転する場合が少なからず起こることが示された。これらの検討により、制振構造の設計の際にSSIの影響を適切に考慮することの重要性が示された。平成28年度には、建物と地盤の動的相互作用(SSI)を考慮したパッシブ制振構造の振動台実験を実施し、その結果に基づいて最適ダンパー特性を分析した。また、振動台実験で用いたSR制振構造試験体を質点系でモデル化し、地震応答解析を実施した。さらに、実大スケール建物の設計例を参考にした制振建物-SR地盤の多質点系モデルによる地震応答解析を行い、最適ダンパー特性を分析した。当初計画で予定していた内容をほぼ実施できたことから、現在までの進捗状況は、おおむね順調に進展していると判断できる。パッシブ制振構造を対象とし、建物と地盤の動的相互作用の影響を考慮した最適ダンパー特性の定量的評価を目的として、平成29年度には主に次の内容を実施した。これまでに実施した摩擦ダンパーを有するパッシブ制振構造とその下部に地盤のスウェイ・ロッキング(SR)挙動を模擬した機構を組み入れた連成系模型に対する振動台実験から得られた結果に基づいて、最適ダンパー特性に関するより詳細な分析を行った。あわせて、追加の振動台実験を実施した。これらの実験結果から、最適ダンパー値付近で基礎固定(FIX)とSRの条件の違いにより地震時最大応答が逆転する現象(FIXとSRの応答逆転現象)が少なからず起こる場合があることを確認した。さらに、この要因について実験データに基づいて等価剛性、等価周期、等価粘性減衰定数、応答スペクトルによる考察を行った。また、中層、高層、超高層の計3タイプの鉄筋コンクリート造制振建物を想定した質点系スウェイ・ロッキング地盤ー制振構造連成系モデルを用いた地震応答解析を行い、最適ダンパー特性について分析した。その際、FIXとSRの応答逆転現象の程度を定量的・数値的に比較するための評価指標を提案するとともに、その評価指標を用いてFIXとSRの応答逆転現象に影響を及ぼすパラメターについて検討した。

さらに、質点系のスウェイ・ロッキング地盤ー制振構造連成系モデルの伝達関数に基づく分析を行い、時刻歴解析に依らない最適ダンパー設計手法について検討した。平成29年度には、建物と地盤の動的相互作用を考慮したパッシブ制振構造を対象とし、これまでに得られた振動台実験結果に基づいて最適ダンパー特性を分析するとともに、追加の実験を実施した。また、質点系のスウェイ・ロッキング地盤ー制振構造の連成系モデルを用いて、地震応答解析を行い最適ダンパー特性について評価するとともに、伝達関数に基づく最適ダンパー設計手法について検討した。当初計画から多少の変更は生じたものの、予定していた内容をほぼ実施できたことから、現在までの進捗状況としては、おおむね順調に進展していると判断できる。本研究では、鉄筋コンクリート造(RC)のパッシブ制振建物と地盤の連成系を対象とし、巨大地震に対する最適な制御設計手法について検討した。最終年度である平成30年度には、RC制振構造の上部構造と杭基礎の下部構造を一体としてモデル化したPenzien型モデルを用い、地震応答解析を行って最適ダンパー特性を分析した。また、基礎のスウェイ・ロッキング(SR)動を考慮した粘性系ダンパーを有する構造物の連成系モデルを対象とし、様々なパワースペクトル密度の地動入力特性に対する最適なダンパーの減衰性状を数値的に評価した。平成2830年度の研究期間全体を通しての研究成果について次に述べる。基礎下部にSR動を考慮した摩擦ダンパー付き制振構造の振動台実験を実施し、最適ダンパー特性を分析した。この結果、地盤条件、ダンパー支持材剛性、地震波入力レベル等の違いによって、地震応答を最小化する最適ダンパー耐力が変化することを実験的に示した。最適ダンパー値付近で基礎固定とSRの違いにより応答曲線に逆転が生じる場合があることが示され、その要因について考察を行った。SR地盤ばねー制振建物の多質点系モデル、およびPenzien型の多質点系モデルを用いた地震応答解析を行い、RC制振建物の最適ダンパー特性を解析的に検討し、振動台実験で得られた傾向と概ね同様の性状が得られることを示した。さらに、質点系のSR地盤ー制振構造連成系モデルを用い、様々な周波数入力特性に対する最適ダンパー減衰性状を伝達関数に基づいて理論的に分析し、時刻歴解析に依らずに最適ダンパー値を評価する手法について検討した。これらの検討を通して、構造物の特性と地盤の影響を同時に一括して考慮できる非線形最適制御設計法の構築に取り組んだ。基本的には当初計画にしたがって、今後の研究を推進する予定である。平成29年度には、非線形地震応答推定手法の構築を目的として、時刻歴解析に依らない簡便な非線形地震応答推定手法を提案するとともに、その妥当性を検証する予定である。平成30年度には、非線形最適制御設計法の開発を目的とし、制御理論に基づいて最小のダンパー量で地震応答を目標値以内に抑えることを可能にする制御設計手法を提案するとともに、その妥当性を検証する予定である。平成30年度には、基本的には当初計画にしたがって研究を推進する予定である。非線形パッシブ制振構造の地盤の影響を考慮した最適制御設計法の開発を目的とし、制御理論に基づいて最小のダンパー量で地震時応答を目標値以内に抑えることを可能にする最適ダンパー設計手法について検討するとともに、その妥当性を検証する予定である。
指数関数型ペトロフ・ガラーキン有限要素法による乱流解析及び統合ソフトウェアの開発

本研究では、これまで流れのモデルを対象に指数関数型ペトロフ・ガラーキン有限要素法を開発してきた。また、自由表面等を含むより複雑な流れの問題への適用を図るために、粒子法による数値解析も示してきた。その粒子法による圧力計算をする際に、有限要素法の定式化で用いられた重み関数のアイデアを粒子法シミュレーションに拡張し、圧力場に関する数値解の安定化を図った。その流れの可視化システム構築として、マーチングキューブ法を用いポリゴンデータに変換し、POV-Rayでレンダリングすることで流体をリアルに表現することを示した。また、GPUによる大規模な3次元複雑流れのシミュレーションの可能性を提示してきた。本研究では、研究の目的を達成するために、これまで流れのモデルを対象に指数関数型ペトロフ・ガラーキン有限要素法を開発してきた。そのアイデアは、有限要素法の定式化において指数関数型の重み関数を利用することにより圧力等の数値解の安定化を図っている点である。また、自由表面やマルチフィジックス等を含むより複雑な流れの問題への適用を図るために、粒子法による数値解析も示してきた。特に、その粒子法による圧力計算をする際に擬似的な数値解が得られることが知られているが、前述の指数関数型ペトロフ・ガラーキン有限要素法の定式化で用いられた重み関数のアイデアを粒子法シミュレーションに拡張し、圧力場に関する数値解の安定化が図られることを明らかにしてきた。その流れの可視化システム構築として、得られた数値データをCGのアルゴリズムの一つであるマーチングキューブ法によってポリゴンデータに変換し、流体の表面を作成した後、POV-Rayを用いてレンダリングすることで流体をよりリアルに表現することを提示してきた。以上の提案に関しては、CMESの論文(2012.4)で発表してきた。さらに、大規模な複雑流れの数値シミュレーションを実行するには、多大な時間を要するために、より高速で高機能なコンピュータ資源が必要であり、高性能なGPUコンピュータを利用した数値解析も行ってきた。その研究成果はCMESの論文(2012.12)で発表し、GPUによる大規模シミュレーションの可能性を提示してきた。また、関連する文献の調査並びに平成24年度に開催された幾つかの学会等(ICCES'12、2012年4月30日5月4日、ギリシャ;数理科学会第31回数理科学講演会、2012年8月25日、東京;ICCESMM2012、2012年9月2日6日、モンテネグロ)で研究発表あるいは参加し、研究の動向に関する情報収集も行ってきた。この研究課題では、これまで流れのモデルを対象に指数関数型ペトロフ・ガラーキン有限要素法を開発してきた。自由表面やマルチフィジックス等を含むより複雑な流れの問題への適用を図るために、粒子法による数値解析も示してきた。特に、その粒子法による圧力計算をする際に擬似的な数値解が得られることが知られているが、指数関数型ペトロフ・ガラーキン有限要素法の定式化で用いられた重み関数のアイデアを粒子法シミュレーションに拡張し、圧力場に関する数値解の安定化が図られることを明らかにしてきた。また、その流れの可視化システム構築として、マーチングキューブ法によってポリゴンデータに変換し、流体の表面を作成した後、POV-Rayを用いてレンダリングすることで流体をよりリアルに表現することを提示してきた。これらの提案に基づき大規模な3次元複雑流れの数値シミュレーションを実行するには、多大な計算時間を要するために、より高速で高機能なコンピュータ資源が必要であり、高性能なGPUコンピュータを利用した数値解析も行ってきた。その研究成果はCMESの論文(2013.10, vol.93, no.5 & 2013.12, vol.95, no.5)で発表し、GPUによる大規模シミュレーションの可能性を提示してきた。なお、関連する文献の調査並びに平成25年度に開催された幾つかの学会等(ICCES'13、2013年5月24日28日、米国;数理科学会第32回数理科学講演会、2013年8月27日、大阪)で研究発表し、研究の動向に関する情報収集も行ってきた。本研究では、研究の目的を達成するために、これまで流れの層流モデルを対象に開発してきた指数関数型ペトロフ・ガラーキン有限要素法に基づくLES乱流モデルの開発、及びその解析手法によるチャネル内流れや基本形状まわり流れの乱流解析を行い、実験値や他解法の結果との比較を通して提案手法の妥当性及び適用性を検討してきた。

さらに、流れの可視化システムを統合したソフトウェアの構築も図ることを目的として、市販のソフトウェア(ANSYS CFX/Fluent)の利用に関する準備及びその性能等を調べてきた。その流れの可視化システム構築の最初の段階として、得られた数値データをコンピュータグラフィックスのアルゴリズムの一つであるマーチングキューブ法によってポリゴンデータに変換し、流体の表面を作成した後、POV-Rayを用いてレンダリングすることで流体をよりリアルに表現することを提示してきた。また、関連する文献の調査並びに平成23年度に開催された幾つかの学会等(ICCES'11、2011年4月18日21日、中国(南京);日本機械学会第24回計算力学講演会、2011年10月8日10日、岡山;日本流体力学会第25回数値流体力学シンポジウム、2011年12月19日21日、大阪)で研究発表あるいは参加し、研究の動向に関する情報収集も行ってきた。本研究での提案手法に基づく複雑流れモデルの開発とその解析手法の妥当性及び適用性を確認でき、自由表面やマルチフィジックス等を含むより複雑な流れの問題への適用性も検討し、さらに、流れの可視化システムを構築するための方向性が概ね図られた。また、大規模な複雑流れの数値シミュレーションの実行に向けて、高性能なGPUコンピュータを利用した数値解析も行い、GPUによる大規模シミュレーションの可能性を明らかにしてきた。以上の研究成果は審査付き論文として発表した。提案手法に基づく複雑流れ(乱流)モデルの開発とその解析手法の妥当性及び適用性を確認でき、さらに、自由表面やマルチフィジックス等を含むより複雑な流れの問題への適用性も検討している。また、流れの可視化システムを構築するための方向性が概ね図られている。工学的観点から自由表面やマルチフィジックス等を含む3次元の複雑流れの数値シミュレーションを実行し、その計算結果の評価をすることは価値がある。その際、コンピュータでの処理には多大な計算時間及び記憶容量を要するために、さらに高速で高機能なコンピュータ資源が必要となる。今後、3次元の複雑流れの問題に関し、最新の高性能GPUコンピュータを利用した数値シミュレーションを行いたいと考えている。大規模な複雑流れの数値シミュレーションを実行するには、多大な時間を要するために、より高速で高機能なコンピュータ資源が必要であり、今後、高性能なGPUコンピュータ等を利用した数値解析を行いたいと考えている。必要とする研究経費の主要部分は、複雑流れの数値シミュレーションに関するプログラム開発及びソフトウェア構築のために利用する設備として、より高性能なコンピュータ購入費、得られた数値データを出力するプリンタ装置及び関連消耗品代である。また、研究の成果を発表するための旅費及び研究成果投稿料となっている。必要とする研究経費の主要部分は、乱流現象の数値シミュレーションに関するプログラム開発及び統合ソフトウェア構築のために利用する設備として、当該研究費と合わせてのより高性能なコンピュータ購入費、他解法との比較検討をするために購入する市販のソフトウェア費用、及び関連消耗品代である。
イタリア看護師の地域精神保健活動の実態-精神病院閉鎖に伴う看護師役割の変化-

本研究の目的はイタリアの精神病院の閉鎖に伴う看護師の地域精神保健活動の実態を明らかにすることである。当時イタリアのトリエステで改革に携わった看護師等にインタビューを行い内容の分析を行った。看護師達は改革に伴い、患者を地域に戻すために病院内から自分達も積極的に地域に出ていき、住民に理解を得るためのミーティングや訪問を頻回に行うなど、院内での看護にとどまらず生活者としての当事者を支えた。本研究の目的はイタリアの精神病院閉鎖に伴う看護師の地域精神保健活勤の実態を明らかにすることである。1978年にイタリアのトリエステで始まった精神疾療改革に携わった看護師3名に改革当時に看護師が何を行い,また自分達の役割が変化することに対してどのような思いを持っていてのか等インタビューを行った。さらに4つの精神保健センター,看護師との訪問同行などを通して,そこで働く看護師に現在の自分達の役割についてインタビューを行った。精神医療改革時,改革に賛同する看護師と反対する看護師とに分かれ,反対する看護師の多くはやめていった。しかし意志を持って集まってきた医師や,改革を進めようと残った看護師とが毎日ミーティングを開き話合いを行いながら,少しずつ入院患者を地域で暮らすことができるよう関わった。また地域の住民からの抵抗も多くみられたが,その都度医師と看護師がその場へ出向き,住民へ根気強く説明を行い,精神障害者がその地域で暮らし続けることができるよう働きかけた。そのような改革を経験した看護師は,あまりにも大きな変化にとまどいを感じていたが,病棟を閉鎖するのではなく,カギを開け,扉を開けることが治療的であることを自分自身が実感し,改革を推進しようと決めたという。しかし改革が進むにつれて,入院していた患者がみな地域に帰ってしまい,自分自身が人生をかけて改革を進めてきたにもかかわらず,自分の得割がたなくなってしまったような喪失感をもち,一時的に看護師をやめた看もいた。病院から患者が出ることに抵抗を示した医療従事者のほとんどが,自分たちの役割の変化にとまどったことと,さらには病院内で自今のもつ一定の権力を失うことを恐れたからだと話した。現在の看護師達は改革当時の教訓から,常に自分目身を振り返るように心がけていた。本研究の目的はイタリアの精神病院閉鎖に伴う看護師の地域精神保健活動の実態を明らかにすることである。昨年度はイタリアのトリエステで始まった精神医療改革に携わった看護師3名にインタビューを行ったが、今年度はさらに人数を増やして看護師4名に対して、改革当時に看護師が何を行い、また自分達の役割が変化することに対してどのような思いを持っていたのか等についてインタビューを行った。看護師の1名はギリシャからトリエステの改革にわざわざ賛同するためにやってきた者や、改革前からトリエステで看護師として務めていたが、特に改革に対して抵抗は感じずに、医師に言われたまま行ったという2名、若かったのでまずは時代の流れにのってみようと思ったという1名だった。今回インタビューを精神保健局に依頼した際に「改革について話したくない」と断った看護師もいたとの報告を受けたことからも、改革から20年以上経っているにも関わらず、未だに当時のことについて受け入れることができない、もしくは語ることを拒む状況にある人もいることがわかった。さらに今年度は改革を経験した精神科医師1名、当事者5名、精神障害者に関するボランティア活動を行っている市民1名にもインタビューを行った。改革当時と比較すれば、現在は精神障害者に関する偏見は少なくなっているように感じるが、公的な資金として精神障害者の地域での生活や文化的な活動に当てられる額が少ないことが課題であると話す人が多かった。また当事者と看護師の関わりについては、疾患に伴う問題のみならず、地域で精神障害者が自分らしい生活や自分の望む生活を営む上で就職、文化的活動等への関わりを積極的にもっていることがわかり、日本での地域精神保健活動への示唆が得られた。今年度は1978年にイタリアトリエステで始まった精神医療改革以前から精神病院に勤務し、実際に改革に携わった看護師5名のインタビュー資料をもとに、改革前の精神病院の実態、特に患者および看護師の日々の生活の実態を明らかにした。改革前の精神病院では、男性スタッフが男性患者、女性スタッフが女性患者を担当し、また病棟は興奮する患者、重症患者、不潔患者などに分けられ、患者70180人に看護師23人で担当するなど、劣悪な環境であった。患者は非人道的な扱いを受けている状況を知り、何とかしたいと看護師になった者がいる一方、何も分からずに看護師として勤めるなど、看護師の教育体制および無資格者による看護がなされていた。また医師や自分より年齢の高い者に言われるがままに活動する看護師もいたなど、病院には院長をはじめとする完全なヒエラルキーがあり、さらに法律によってっも看護師は病院の体制に影響を受け、患者に対する非人道的な扱いが横行していた。

看護師の多くがこのような体制を良しとみなしていなかったが、患者や上司に対する恐怖や不安から従わざるをえない状況であった。そのためバザリア医師の行った改革は、患者の解放のみならず、看護師たち自身を恐怖や不安、絶望から解放した。その後看護師は自分たちが解放されたことで、患者との関係性が大きく変化した。看護師は患者と「コミュニケーションをとる」「一人にしない」「関心を示す」「病院外との関わりがもてるようにする」など心がけ、患者を一人の人間としての尊厳の回復を目指した。また改革によって自分たちの患者に対する権限がなくなることを恐れ改革に反対していた看護師達は病院をやめ、バザリアの改革に賛同した看護師たちは毎日ミーティングやグループワークを開き、治療計画を皆でたてるなど、自由に意見を述べる時間を設け改革をすすめた。
トリチウム放射線のマウス受精卵への影響

マウス卵の試験管内受精、初期胚の培養およびその卵管への移植技術を使い、マウス受精卵のトリチウム放射線に対する感受性を、胞胚形成率、仔マウス産出率を指標に検討した。メスB6C3F1マウスを排卵誘発剤で処理し、採取した卵をICRオスマウスからの精子と6時間試験管内受精させた。第二極体放出によって確認した受精卵を集め培養を続け、受精開始7.5時間目より3時間HTO処理をした。この時期は受精卵の前核形成期にあたる。X線は受精開始8時間目に1回照射をした。処理卵はそのまま培養を続けるか、偽妊娠させたメスマウスの卵管に移植した。培養では、胞胚のハッチ数を調べ胞胚形成率とした。移植した卵は、出産前日にメスマウスを開腹し、生存胎児数、胎盤残遺数を調べ、それらの和より胎盤形成率を算出した。1.胞胚形成への影響:HTO処理は受精開始7.5時間目から3時間であるが、この時期のX線感受性は大きくかわる。この3時間のX線感受性の平均は受精開始8時間目のX線感受性とよく一致したので、X線照射は受精開始後8時間目に行ってHTOの結果と比較した。胞胚形成率でみた前核形成期の受精卵の感受性は、HTOとX線でよく一致し、LD(50)は約120radとなった。2.胎盤、胎児形成への影響:無処理の場合、移植受精卵の約50%が胎盤を形成し、約30%が生存胎児まで発生した。胎盤形成、胎児形成それぞれに対するHTOとX線の効果にはほとんど差がみとめられなかった。さらに、胎盤形成率でも胎児形成率でもLD(50)はおよそ40-50radで、胞胚形成率の約120radに比べかなり感受性が高かった。前核形成期での放射線損傷が、胞胚期以後、胎盤形成期までの発生段階でも影響をおよぼしているものと考えられるが、in vitroの卵操作によって放射線に対して弱くなる可能性もすてきれない。
ゼブラフィッシュを用いたMuRFの発現機構解析と筋萎縮治療薬の探索

筋特異的E3ユビキチンリガーゼであるMuRF-1の発現をコントロールする薬剤を見つけるため、ゼブラフィッシュmurf1プロモーター領域を明らかにし、その遺伝子配列を組み込んだEGFP発現ベクターを用いて、murf1トランスジェニックゼブラフィッシュを作製することに成功した。これらの個体を野生型と交配し次世代を作製、その個体群から、骨格筋、心筋特異的にEGFPシグナルが観察される個体、つまりEGFPシグナルにより間接的にmurf1の発現が観察される個体が得られた。これらを用いたmurf1発現制御物質のスクリーニングの結果、ゼブラフィッシュmurf1遺伝子発現を制御する複数の薬剤候補が得られた。今年度は、ゼブラフィッシュMuRF1の発現をコントロールする薬剤のスクリーニングに用いるトランスジェニックフィッシュを作製するため、(1)ゼブラフィッシュを用いたMuRF1プロモーター領域の特定、(2)マイクロインジェクションによるMuRF1トランスジェニックフィッシュの作成、を目的にプロジェクトを進めた。MuRF1翻訳開始コドンの上流領域の塩基配列をEGFPのベクターの配列に組み込みその発現を解析することで、MuRF1翻訳開始コドンの上流領域の塩基配列、約600塩基対がMuRF1プロモーター領域として、その発現制御に重要であることが明らかになった。このMuRF1プロモーター領域の配列をEGFPをコードする塩基配列の上流領域に組み込んだベクターを受精卵に注射することにより、ゼブラフィッシュのゲノムDNAにこれらが組み込まれたトランスジェニックゼブラフィッシュを作成することに成功した(F0)。受精卵に注射した個体のうち、約50%の個体でGFPシグナルが筋組織で観察され、これらの個体を第一世代(F0)として、成魚まで成長させ、野生型と交配し次世代(F1)を作成した。F1個体群からGFPシグナルを指標にGFP陽性な個体をスクリーニングした結果、骨格筋、心筋においてEGFPシグナルが観察される個体、つまりGFPシグナルにより間接的にMuRF1の発現が観察される個体が得られている(F1)。ゼブラフィッシュMuRF1翻訳開始コドンの上流領域、約600塩基対がMuRF1プロモーター領域として、その発現制御に重要であることが明らかになり、このMuRF1プロモーター領域をEGFPをコードする遺伝子配列の上流に組み込んだベクターを導入した個体を得ることができた。これらの変異体を第一世代(F0)として、次世代を作成し、骨格筋、心筋でEGFPのシグナルが観察されるトランスジェニックフィッシュが得られており(F1)、現在のところ計画通り達成されているが、そのトランスジェニックフィッシュの解析、そして薬剤スクリーニングを行うためには、さらに個体群を増やすことが必要なことから、やや計画からは遅れていると自己評価している。筋特異的E3ユビキチンリガーゼであるMuRF-1の発現をコントロールする薬剤のスクリーニングのため、ゼブラフィッシュのmurf1プロモーター領域を特定し、マイクロインジェクションによるトランスジェニックフィッシュの作製を行った。その結果、murf1遺伝子の翻訳開始コドンの上流領域、約600塩基対がmurf1プロモーター領域として、その発現制御に重要であることが明らかになった。その領域の配列を上流領域に組み込んだEGFP発現ベクターを用いてトランスジェニックゼブラフィッシュを作成することに成功した(F0)。これらの個体を成魚まで成長させ、野生型と交配し次世代(F1)を作成し、F1個体群からGFP陽性を示す個体をスクリーニングした結果、骨格筋、心筋特異的にGFPシグナルが観察される個体、つまりGFPシグナルにより間接的にmurf1の発現が観察される個体が得られた(F1)。これらのmurf1トランスジェニックフィッシュを用い、murf1の発現に影響を及ぼす薬剤を見いだすため、GFPシグナルを指標とした薬剤スクリーニングを行い複数の候補薬剤を得ることができている。骨格筋、心筋特異的にGFPのシグナルが観察されるトランスジェニックフィッシュが得られこのトランスジェニックフィッシュの系統を確立した(F1)。作製したmurf1トランスジェニックフィッシュを用いて、murf1の発現制御物質のスクリーニングを行った。1,250個の薬剤を含む薬剤ライブラリーを用いたスクリーニングの結果、ゼブラフィッシュmurf1遺伝子発現を制御する複数の薬剤が得られた。現在のところ計画通り達成されているが、得られた複数の薬剤の効果についてのさらなる確認実験を現在行っているため、やや計画からは遅れていると自己評価している。その結果、murf1遺伝子の翻訳開始コドンの上流領域の一部が、murf1プロモーター領域として、その発現制御に重要であることを明らかにした。さらに、その領域の配列を上流領域に組み込んだEGFP発現ベクターを用いて、ゼブラフィッシュmurf1トランスジェニックフィッシュを作製することに成功した(F0)。次に作製したmurf1トランスジェニックフィッシュを用いて、murf1の発現制御物質のスクリーニングを行った。1,250個の薬剤を含む薬剤ライブラリーを用いたスクリーニングの結果、ゼブラフィッシュmurf1遺伝子発現を制御する複数の薬剤候補が得られた。

得られた薬剤群が及ぼすmurf1の発現への効果を定量的PCR法で解析したところ、murf1トランスジェニックフィッシュを用いた結果と同様に、ゼブラフィッシュmurf1遺伝子発現を制御する効果があることが確認された。現在これらの薬剤を中心に産業財産権(特許申請)の出願の準備している。筋特異的E3ユビキチンリガーゼであるMuRF-1の発現をコントロールする薬剤を見つけるため、ゼブラフィッシュmurf1プロモーター領域を明らかにし、その遺伝子配列を組み込んだEGFP発現ベクターを用いて、murf1トランスジェニックゼブラフィッシュを作製することに成功した。これらの個体を野生型と交配し次世代を作製、その個体群から、骨格筋、心筋特異的にEGFPシグナルが観察される個体、つまりEGFPシグナルにより間接的にmurf1の発現が観察される個体が得られた。これらを用いたmurf1発現制御物質のスクリーニングの結果、ゼブラフィッシュmurf1遺伝子発現を制御する複数の薬剤候補が得られた。今年度は、昨年度作製したMuRF1トランスジェニックフィッシュを用いて、MuRF1の発現制御物質のスクリーニングについて行う。現在すでに1250個の薬剤を含む薬剤ライブラリーを入手しており、このライブラリーに含まれる薬剤に関してスクリーニングを行う。トランスジェニックフィッシュの成魚への成長後、個体数を増やし系統を確立する。系統確立後、トランスジェニックフィッシュの解析と薬剤ライブラリーのスクリーニングを行なう予定である。そのスクリーニングにより、MuRF1の発現制御する候補薬剤とその分子機序を明らかにし治療法開発に役立つ分子の新規発見をめざす。得られた薬剤群が及ぼすmurf1の発現への効果を定量的PCR、ウエスタンブロッティング解析法により、murf1トランスジェニックフィッシュを用いた結果と同様な結果が得られるかどうかを確認する。それらが確認された候補薬剤を用いて、筋萎縮を表すモデル動物を用いてその効果を評価していく。病態生理学昨年度は、国外で行われる国際学会への参加が無かったことと、いくつかの抗体購入を次年度行なうことにしたことが、次年度使用額を生じた理由である。次年度、得られた薬剤群が及ぼすmurf1の発現への効果を定量的PCR、ウエスタンブロッティング解析法により確認が必要であることと、国外で行われる学会への参加、国際誌への論文の投稿が、次年度使用額を生じた理由である。今年度、国外で行われる国際学会への参加と研究成果の発表のための参加登録費、旅費等へ使用することと、本研究課題を実施するために必要な抗体購入、抗体作製に使用することを予定している。使用計画としては、発現解析に用いる実験試薬の購入の他に、国外で行われる国際学会への参加費(参加登録費、旅費等)、国際学術誌への投稿料を予定している。
新しいシェーグレン症候群モデルマウスにおける唾液腺再生と唾液分泌能の再獲得

シェーグレン症候群モデルマウスにおける破壊された唾液腺の再生を目標とし、種々の臓器において自己複製能と多分化能を持つside population cells(SP細胞)を移入して唾液腺再生をめざしたが再生はできなかった。そのため胎仔マウスからの顎下腺器官培養条件を検討し、顎下腺器官培養や単一細胞化を行った顎下腺および周囲間葉組織から調整した細胞集合塊の培養系を確立した。さらにマウス腎被膜下に移植して、唾液腺組織の増殖も確認できた。これらの培養条件下でSP細胞と供培養でのSP細胞の変化を観察している。本研究ではシェーグレン症候群(SS)モデルマウスを用いて唾液腺の再生を試み、口腔乾燥症の治療法を確立することを目的としている。SLE自然発症マウスNZM 2328にマウスサイトメガロウイルスを感染させ、SSにきわめて類似した唾液腺炎を発症させ、このマウスに多分化能を持つ組織幹細胞であるside population cells(SP細胞)を移入して唾液腺の機能の再生を獲得することを試みている。21年度はNZM2328マウスをアメリカ、バージニア大学Fu教授から供与していただき交配を開始する予定であったが、供与が許可された後、実験施設への受け入れ申請をしたが、マウスの輸入となるためウイルス感染実験を行う予定であった実験施設に直接受け入れができず、途中受け入れ動物実験施設の確保ができず、交配を開始できなかった。ようやく途中受け入れ施設の確保ができることとなり、現在申請中である。そのため、他のマウスを使用してSP細胞の分離手技の確立を行ってきた。また、SP細胞の数代の継代はまだGFP遺伝子のトランスフェクションを行える段階までは至っていない。21年度はこのように実験のための準備段階の予備実験を続けており、これから本格的な実験となる。SLE自然発症マウスNZM2328にマウスサイトメガロウイルスを感染させ、SSにきわめて類似した唾液腺炎を発症させ、このマウスに多分化能を持つ組織幹細胞であるside population cells(SP細胞)を移入して唾液腺の機能の再生を獲得することを目標にしている。種々の臓器におけるSP細胞は組織幹細胞として細胞移入によって臓器の機能回復などに寄与することが報告されているが、唾液腺においては移入したSP細胞が唾液腺内で幹細胞として器官形成をせずに散在したままであるという報告も出てきた。そのため、以前同研究室で行った胎仔マウス顎下腺細胞から得た単一化細胞を培養して行った組織再構成の方法を用いてSP細胞の培養を行う予備実験を行っている。単一化細胞を安定させるマトリックスや増殖因子の条件を設定して細胞集合塊の器官培養の可否を再検討し、ヒト口唇小唾液腺から得られたSP細胞中に発現していると報告のあった前立腺の前駆/幹細胞マーカーと考えられているPSCA (prostate stem cell antigen)などの発現の有無を解析している。SP細胞からの器官培養が確立できない場合は、まず胎仔マウス顎下腺細胞から器官培養した組織をSSモデルマウスに移入して唾液腺の再生が見られるか、または新生唾液腺組織をどのように破壊しようとする病態が出現するかを検討していく。SLE自然発症マウスNZM2328にマウスサイトメガロウイルスを感染させSSにきわめて類似した唾液腺炎を発症させ、このマウスに多分化能を持つ組織幹細胞であるside population cells(SP細胞)を移入して唾液腺の機能の再生を獲得することを目標にしていた。種々の臓器におけるSP細胞は組織幹細胞として細胞移入によって臓器の機能回復などに寄与することが報告されているが、唾液腺においては移入したSP細胞が唾液腺内で幹細胞として器官形成をせずに散在したままであるという報告も出た。NZM2328マウスの生育状態が悪くSSモデルのinvivoでの移入実験ができなかったこともあり、以前同われわれの研究室で行った胎仔マウス顎下腺細胞から得た単一化細胞を培養して行った組織再構成の方法を用いてSP細胞の培養を行った。単一化細胞を安定させるマトリックスや増殖因子の条件を変えて細胞集合塊の器官培養を試みたが、器官培養には至らなかった。このため、現在はより確立されて多分化能を持つことがわかっている骨髄組織幹細胞、脂肪組織幹細胞を採取してこれをマウスに移入する実験へと方向を変換しその予備実験を行っている。
tRNAアンチコドン部位のコンホメーションの人工固定化およびその分子認識能

tRNAはアンチコドンループに鋭く曲がったいわゆる"Uターン"構造と呼ばれるベント構造が存在している。この特異な折れ曲がり構造はコドン-アンチコドンの分子認識機構にも関係する重要な構造的特徴である。今回我々は、このベント構造が実際にコドン認識に関与しているか検証する目的でこのUターン構造を化学的に固定したオリゴリボヌクレオチドを合成しその構造解析をおこなった。まず、すでに合成を完了し、リン酸ジエステル結合のバックボーン構造が^<31>PNMRによってベントしていると示唆された環状ウリジル酸2量体の分子力場計算によるシュミレーションをおこなった。その結果、真空中ではUターン構造に近い構造が最安定構造となったが、水中でのシュミレーションではUターン構造よりもUターン構造が開いたストレッチ構造の方がエネルギー的に安定であることがわかった。このストレッチ構造をとった場合バックボーンの折れ曲がり角度は約30°になった。このことは、この2量体が核酸を人為的に折れ曲げるための最小限のユニットになることも期待でき、核酸とタンパク質との相互作用の際最近報告されているベント核酸の人工的な合成に発展できるものと考えた。また、実際にこのユニットをRNA中に組み込まないと、Uターン構造をとるのかストレッチ構造をとるのか評価できないため、まずモデル化合物としてこのユニットの3'および5'末端にオリゴチミジル酸を付加したオリゴマーを合成することにした。その結果、固相合成法によって環状ウリジル酸を組み込んだ8量体と14量体のオリゴチミジル酸を合成することができた。これらのオリゴマーを^<31>PNMRとCD等の分光学的手法とゲル電気泳動やオリゴデオキシアデニル酸との熱融解曲線により解析したところ、オリゴマーに組み込まれてもリン酸ジエステル周りの折れ曲がりは同様に存在することがわかった。