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1940年代中華圏における文学の複数性-地域・メディア・制度の視角から

日中戦争(1937-1945)と国共内戦(1945-1949)を背景とする1940年代の、いわゆる中華圏(中国語圏)の諸地域における文学的営為、つまり小説や散文、演劇や映画、またそれらを規定し支える文学の場としての制度や人間関係を対象として、それらの時代的特微を、新たに、1940年代における「地域」・「メディア」・「制度」という三っのテーマにおいて、従来とは異なる多眼的な視点から、複数の「関係性」として捉えなおした。日中戦争と国共内戦を背景とする1940年代の中華圏の諸地域における小説や散文、演劇や映画、またそれらを規定し支える文学の場としての制度や人間関係を対象として、従来とは異なる視点から時代的特徴を以下の三つのテーマにおいて捉える本研究の、平成20年度の成果は以下のようであった。1.1940年代文学研究に関連する基礎文献の収集と解読(文献の整理と目録作成を含む)『民国珍稀期刊』(北京・全国図書館文献縮微複製中心刊行)のうち、特に本研究にかかわりの深い重要文献である『文芸先鋒』(1942.10.10-1948.10?)〔マイクロフィルム〕を選び、今後議論を展開する素地となる資料を利用しやすい形に整える作業を行った。具体的にはこの雑誌を用いた「共通文献解読」として研究集会を3度開き、雑誌そのものの成り立ちや時代状況及び文学的意味について基礎的な行った上で、第1巻第1期および第2期の内容について具に検討を加えた。2.共同研究参加者相互の情報交換と研究報告「地域」分科会(宇野木洋、星名宏修、松浦恆雄)は、中華圏文学の複数並立性といったような状況を地域という観点から明らかにする基礎的な作業を行った。「メディア」分科会(西村正男、三須祐介)は、活字化された文学と、文字化されない文学を相対化して見つめることによって、文学の商品化とそれをめぐる文学の変容とを解読する作業を行った。「制度」分科会(今泉秀人、濱田麻矢、福家道信、大東和重)は、移動し伝播し流通し変化する文学テクストと、受容者としての読者の諸相に着目し、文学制度に対するアプローチを行った。日中戦争と国共内戦を背景とする1940年代の中華圏の諸地域における小説や散文、演劇や映画、またそれらを規定し支える文学の場としての制度や人間関係を対象として、従来とは異なる視点から時代的特徴を以下の三つのテーマにおいて捉える本研究の、平成21年度の成果は以下のようであった。1. 1940年代文学研究に関連する基礎文献の収集と解読(文献の整理と目録作成を含む)『民国珍稀期刊』(北京・全国図書館文献縮微複製中心刊行)のうち、特に本研究にかかわりの深い重要文献である『文芸先鋒』(1942.10.10-1948.10?)〔マイクロフィルム〕を選び、今後議論を展開する素地となる資料を利用しやすい形に整える作業を本年度も昨年度に引き続き行った。2.共同研究参加者相互の情報交換と研究報告「地域」分科会(宇野木洋、星名宏修、松浦恆雄)は、中華圏文学の複数並立性といったような状況を地域という観点から明らかにする基礎的な作業を、特に今年度は個別的なテーマを深化させる方法で行った。「メディア」分科会(西村正男、三須祐介)は、活字化された文学と、文字化されない文学を相対化して見つめることによって、文学の商品化とそれをめぐる文学の変容とを解読する作業を、今年度は特にいくつかの具体的な事例提示する方法を強調して行った。「制度」分科会(今泉秀人、濱田麻矢、福家道信、大東和重)は、移動し伝播し流通し変化する文学テクストと、受容者としての読者の諸相に着目し、文学制度に対するアプローチを、それぞれの研究対象に特化する方向で行った。日中戦争と国共内戦を背景とする1940年代の中華圏の諸地域における小説や散文、演劇や映画、またそれらを規定し支える文学の場としての制度や人間関係を対象として、従来とは異なる視点から時代的特徴を以下の三つのテーマにおいて捉える本研究の、最終年度(平成22年度)の成果は以下のようであった。2.共同研究参加者相互の情報交換と研究報告-三年間の総括的報告会

「地域」分科会(宇野木洋、星名宏修、松浦恒雄)は、中華圏文学の複数並立性といったような状況を地域という観点から明らかにする基礎的な作業を、「メディア」分科会(西村正男、藤野真子)は、活字化された文学と、文字化されない文学を相対化して見つめることによって、文学の商品化とそれをめぐる文学の変容とを解読する作業を、「制度」分科会(今泉秀人、濱田麻矢、福家道信、大東和重)は、移動し伝播し流通し変化する文学テクストと、受容者としての読者の諸相に着目し、文学制度に対するアプローチを、それぞれ行い、8月31日中国文芸研究会夏合宿の場において、包括的な報告会を行った。(報告者は、今泉、宇野木、松浦、藤野、西村、大東の6名であった)
抗癌剤感受性増強と副作用軽減を同時に実現する遺伝子治療システムの開発

癌に対する遺伝子治療の最も重要な点は癌細胞特異的に遺伝子導入を実現させるか又は発現させることである。本研究ではP53を転写因子として捉え、P53の変異細胞においてのみ自殺遺伝子を発現させるシステムの確立を目的とした。HSV-tkプロモータのエソハンサーをP53binding sequenceに組み替えたプロモータをもつCre発現プラスミドベクターを作成、さらにCre-loxpシステムを組み合わせたHSV-tkgene発現ベクターを作成した。この両者をCo-transfectionすることにより、P53異常な細胞に特異的にガンシクロビルによる細胞障害を誘導することが可能であった。
酸化ストレスによる情報伝達変化と神経細胞傷害の分子構構

プロテインキナーゼC(PKC)は、イノシトール燐脂質情報伝達系のkey enzymeであり、種々のlipid mediatorの中でもジアシルグリセロール(DAG)によって活性化されることにより様々な細胞応答に重要な役割を果たしている。我々はDAGが過酸化されることによりnative DAGの約3倍のPKC活性化作用を持つ強力な活性化物質に変質することを証明し、機能性脂質(DAG)の過酸化によるPKC過剰活性化と蛋白リン酸化反応の異常亢進による病変発生の可能性を示した。また、過酸化DAGがPKCδおよびα分子種を特異的に強く活性化することを明らかにし、更にPKCδおよびα分子種を過剰発現させた初代培養神経細胞に過酸化DAGを作用させた結果、δ分子種を高発現する細胞でのみ過酸化DAGによる神経細胞傷害が認められ、過酸化DAGによる傷害機構においてPKCδ分子種が特に重要であることが推測された。本研究は、過酸化DAGが特定のアイソザイム(δ)の活性化を介して病変を引き起こすことを、in vitro無細胞系、神経培養細胞系および実際の脳組織、細胞内において厳密に検証し、また、その分子機構を精査することを目的とした。2002年度は、過酸化DAG投与モデル作成のための基礎的な実験を行った。ウイスター系雄ラットを用い大脳・線状体領域に一定量の薬剤を投与するモデル系を完成させた。また、過酸化DAGの分子種特異的活性化機構を、Biacore(生体分子間相互作用を計測する装置)を用い検討を行った。その結果、過酸化DAGはnative DAGに比較してPKC分子との結合速度が速く、解離速度が低いことが明らかとなった。2003年度には、実際の脳組織に過酸化DAGを投与したモデル動物の解析を行った結果、顕著な神経細胞傷害が認められた。また、グルタチオンペルオキシダーゼ活性を有する薬剤であるebselenは過酸化DAGによる傷害作用を有意に抑制した。更にセレン添加および欠乏条件下で過酸化DAGの作用を検討したところ、セレン欠乏条件下でのみ神経細胞傷害が誘導された。以上の実験結果から、酸化ストレスにより発生することが予想される過酸化DAGが、脳組織神経細胞の傷害・細胞死において重要な役割を果たしていることが強く示唆された。更にその防御因子としてのグルタチオンペルオキシダーゼおよびebselenが有効であることが判明した。我々はDAGが過酸化されることによりnative DAGの約3倍のPKC活性化作用を持つ強力な活性化物質に変質することを証明し、機能性脂質(DAG)の過酸化によるPKC過剰活性化と蛋白リン酸化反応の異常亢進による病変発生の可能性を示唆してきた。

本研究は、過酸化DAGが特定のアイソザイム(δ)の活性化を介して病変を引き起こすことを、in vitro無細胞系および培養神経細胞系とは異なる環境下にある実際の脳組織、細胞内において厳密に検証し、また、その分子機構を精査することを目的とした。2002年度は、過酸化DAG投与モデル作成のための基礎的な実験を行った。ウイスター系雄ラットを用い大脳・線状体領域に一定量の薬剤を投与することに成功した。また、過酸化DAGの分子種特異的活性化機構を、Biacore(生体分子間相互作用を計測する装置)を用い検討を行った。その結果、過酸化DAGはnative DAGに比較してPKC分子との結合速度が速く、解離速度が低いことが明らかとなった。プロテインキナ-ゼC(PKC)は、イノシトール燐脂質情報伝達系のkey enzymeであり、種々のlipid mediatorの中でもジアシルグリセロール(DAG)によって活性化されることにより様々な細胞応答に重要な役割を果たしている。我々はDAGが過酸化されることにより強力な活性化物質に変質することを証明した。本研究では、過酸化DAGが特定のアイソザイムの活性化を介して病変を引き起こすことを、アデノウイルスベクターを用いたPKCαおよびδ高発現細胞を用いて検討した。その結果、過酸化DAGは、PKCδを過剰発現させた初代培養神経細胞においてMAPキナーゼカスケードの異常活性化を誘導し神経細胞傷害を引き起こすことが明らかとなった。また、過酸化水素、t-BHPなどの単なる過酸化物は傷害作用を示さず、脂溶性情報伝達物質の酸化物が特に強い傷害作用を有することが判明した。一方、PKCαあるいはPKCδkinase negative(kinase活性を持たないmutant δ分子)を高発現した初代培養神経細胞では、過酸化DAGによる神経細胞傷害は全く認められなかった。これらの結果から、過酸化DAGはPKCδ過剰活性化→MAP kinaseカスケード異常活性化を介して神経細胞傷害を引き起こすと考えられた。また、BIAcore装置を用いた検討により、過酸化DAGの強いPKC活性化作用はPKC分子と高い親和性を有するためであることが明らかとなった。更に、グルタチオンペルオキシダーゼ活性を有する薬剤であるebselenは過酸化DAGによる傷害作用を有意に抑制した。また、セレン添加および欠乏条件下で過酸化DAGの作用を検討したところ、セレン欠乏条件下でのみ神経細胞傷害が誘導された。
交通インフラの整備が郊外化をもたらすメカニズムの提案と検証

本研究の目的は、交通インフラの整備が人口や雇用の分布に与える影響を理論と実証の両面から分析することである。特に、渋滞などの混雑が消費者の居住地と職場を選択する行動に与える影響を理論モデルにより分析する。さらに、その理論モデルの妥当性を実際のデータから検証する。
メタン湧水場の地下断面を復元する～化学合成群集が指標する湧水のさまざまな活動様式

北海道の始新統幌内層および中新統望来層を対象に,シロウリガイ類化石を産出するメタン湧水性石灰岩体の規模,形状,岩石学的な特徴,内部組織,化石産状について調査し,当時の深海のメタン湧水場における地下断面を復元した.その結果,幌内層の湧水は高間隙水圧による破砕流動を伴い垂直な脈に集中するのに対し,望来層の湧水は破砕流動を伴わない拡散的な滲み出しであることが明らかとなった.またシロウリガイ類が湧水活動のさまざまな様式に対して広範な適応性を有していることも示された.この湧水利用についての適応性はシロウリガイ類の高い移動能力と関係しており,新生代以降に爆発的な繁栄を遂げた重要な背景と考えられる.北海道の中新統望来層に関して,昨年度予備調査を行った海崖露頭にて,懸垂下降による調査を行い,崖上部に露出する湧水性石灰岩体の規模,形状,岩相および内部構造,化石産状について記載を行った.この海崖では,層厚20m以上にもわたる硬軟泥岩互層が露出しており,メタン湧水の地下構造およびその活動履歴を追跡できる.調査の結果,以下の事実が確認された.1.湧水性石灰岩体は層理面に挟在するレンズ状の形態をなしている.2.石灰岩体内部には石灰化の続成作用による収縮裂開や破断が認められるが,周囲の泥岩には流動や破砕を示す組織は存在しない.これらのことから,望来層の湧水は,高間隙水圧による地下破壊的な性質ではなく,広い範囲に拡散する滲みだし的な性質であったことが判明した.また,化石密集層の形状や化石産状(合弁率や埋積姿勢等)を詳細に調査した結果,シロウリガイ類のコロニーが原地でそのまま乱泥流によって埋積され化石化したことも判明した.望来層の化学合成群集は活発な移動能力を有するシロウリガイ類で優占されるが,その化石群集の分類構成は,湧水経路が不安定であることだけでなく,乱泥流のような急速な埋積撹乱が頻繁に起きていることにも規制されることが示唆された.以上のように,湧水性化学合成群集の群集構成は,湧水の挙動性質だけでなく,生息場における堆積様式にもコントロールされている可能性がある.このことを確認するために,相模湾初島沖における現生シロウリガイ類コロニーの連続ビデオ画像の解析も行い,乱泥流による埋積時の活発なシロウリガイ類の行動様式を明らかにした.これらの成果については学会発表を行った.シロウリガイ類化石群集を産するメタン湧水性石灰質岩の形状と内部構造との対応を以下のように明らかにした.北海道の中新統望来層の石灰質岩は,シルト岩の硬軟互層中に挟在するレンズ状の形態を呈する.多数の岩石試料から研磨断面および岩石薄片を作成し,岩石組織や鉱物組成から岩相型を識別した結果,1)ほとんどは泥質なドロマイト岩からなること,2)それらのドロマイト岩は径1cm弱の泥質小塊が癒着して構成されるが,小塊同士の間隙はしばしば炭酸塩鉱物によって充填されていること;3)異常高間隙水圧による地下での破砕・流動組織はほとんど認められないことが明らかになった.これらから,その湧水活動は,泥小塊の間隙から広範囲ににじみ出す静的な状態であったことが示された.また,ブロックサンプルについて,シロウリガイ類の合弁率や埋没姿勢,堆積構造を検討し,原地性のコロニーが粘性度の高い重力流堆積物によって急速埋積されたことを明らかにした.一方,北海道の始新統幌内層は,直径12mの不規則塊状岩体が層理面を越えて積み上がる形状をなす.岩石組織を検討した結果,1)ほとんどが異常高間隙水圧による地下での破砕・流動組織を示すこと,2)化学合成二枚貝の化石はその近傍にしか分布しないことが明らかになり,その湧水は局所集中的な活動であったことが示された.以上のように,シロウリガイ類は様々なタイプの湧水に適応しているといえる.昨年度までに行った初島沖総合観測ステーションの連続静止画像の解析結果も考え合わせると,シロウリガイ類の活発な移動能力が変動帯の不安定な湧水場への進出を可能にしたものと考えられる.シロウリガイ類のみで優占される化石湧水サイトは,急速埋積作用による物理的な撹乱をしばしば伴うような,経路不安定な湧水活動を指標している可能性がある.これら成果については,本年6月の日本古生物学会で発表予定である.北海道の始新統幌内層および中新統望来層を対象に,シロウリガイ類化石を産出するメタン湧水性石灰岩体の規模,形状,岩石学的な特徴,内部組織,化石産状について調査し,当時の深海のメタン湧水場における地下断面を復元した.その結果,幌内層の湧水は高間隙水圧による破砕流動を伴い垂直な脈に集中するのに対し,望来層の湧水は破砕流動を伴わない拡散的な滲み出しであることが明らかとなった.またシロウリガイ類が湧水活動のさまざまな様式に対して広範な適応性を有していることも示された.この湧水利用についての適応性はシロウリガイ類の高い移動能力と関係しており,新生代以降に爆発的な繁栄を遂げた重要な背景と考えられる.地層断面をもとに湧水場の地下構造を復元すること,また湧水特性と化学合成

生物群集の構成との対応関係を明らかにすることを目的に,北海道の始新統幌内層および中新統望来層にて現地調査を行った.幌内層では,露頭面における岩相変化や化石の分布について詳細なスケッチを作成し,シロウリガイ類等で構成される化学合成群集は,幅数m以内の局所的な場所に長期にわたって継続していたこと,また地下の泥質堆積物が断続的に水圧破砕を受けており,そのような不安定な湧水経路を初期のシロウリガイ類が利用していたことを確認できた.また中新統望来層に関しては,海崖露頭の予備調査を行った結果,シロウリガイ類を産する石灰岩体近傍に面なし断層様の構造が認められ,断層面にそって一部石灰岩が形成されていることが判明し,次年度以降に詳細な露頭スケッチを作成する候補セクションを選定できた.以上のような泥質堆積物中におけるメタン湧水石灰岩は,石灰化した巣穴が顕著に発達する砂質シルト相(茨木県の中新統九面層,沖縄県の鮮新ー更新統新里層)とは異なり,水圧破砕を伴う局所的な発達で特徴づけられる.泥質堆積物中の石灰岩体は,高知県の白亜系中村層や長野県の中新統別所層の例のように直径20 m以上にもなるが,岩相およびその分布パタンを比較した結果,水圧破砕を局所的に伴う点では共通しており,局所的に発達した石灰岩が多数近接して発達し,見かけ上,巨大な石灰岩となったこと,湧水経路は地下の石灰化に伴い閉塞と移動を繰り返したことが明らかにされた.この成果については学会発表を行った.なお,このような泥質堆積物中のうつろい安い湧水場でのシロウリガイ類の行動を明らかにし化石産状と比較するため,相模湾初島沖における現生シロウリガイ類コロニーの連続ビデオ画像の解析,ならびに無人潜水調査船を用いた人口埋積実験も行い,その試行についても学会発表を行った.北海道の中新統望来層の海崖露頭について,詳細な露頭スケッチと化石産状の観察のため,当初は足場建設を行う予定であったが,地盤の不安定さ等の理由から,崖上からの懸垂下降調査に切り替えて調査を行った.結果として,広範囲に崖上部を調査することができ,複数の岩体について内部構造およびその周辺の露頭スケッチや,化石産状の観察・撮影,分析用の岩石サンプルの採集まで予定以上の基礎データを得ることができた.その結果,湧水の挙動およびシロウリガイ類コロニーの埋積プロセスについて,広範囲に拡散する滲みだし的湧水が乱泥流によって断続的に中断されるというモデルをたてることができた.一部のデータは,本年2月の古生物学会で予察的な報告を行ったが,より詳細な報告を本年5月の地球惑星科学連合大会で発表予定である.また,湧水の挙動変化や乱泥流の埋積作用に対するシロウリガイ類の反応を確認するためには,現在の化学合成生物群集についての基礎データを収集・整理する必要があるが,昨年度来すすめてきた,初島沖総合観測ステーションの連続静止画像の解析がほぼ終了した.これまで知られていなかったシロウリガイ類の移動方法や速度が解析できた.
MR拡散強調画像と血管新生因子・遺伝子解析による肺良悪性病変の悪性度の研究

拡散強調画像がPET-CTよりリンパ節転移の正診率が優れているのは、拡散強調画像がPET-CTのそれより、より小さなリンパ節内転移病変を検出できるためであった。肺腫瘤陰影の診断能は、拡散強調画像がPET-CTより、感度は有意に良好で、正診率は良好な傾向があった。肺癌の再発転移病変の検出能は、拡散強調画像がCTより有意に良好で、PET-CTのそれより良好な傾向であった。拡散強調画像による縦隔腫瘍の良悪の鑑別診断は、PET-CTと比較し良好な傾向があった。肺門縦隔リンパ節に多発FDGの集積を認める症例では、拡散強調画像の特異度・正診率は、PET-CTのそれに比較し有意に良好であった。これまでの研究で、肺癌の診断およびリンパ節の転移の評価に拡散強調画像が有益なことが判明している。今年度は、術前因子によるEGFR遺伝子変異の予測、肺の良悪性腫瘤陰影の拡散強調画像による評価、拡散強調画像による肺癌例の再発転移巣の検出能、多発肺門縦隔リンパ節FDG陽性例に対する拡散強調画像の有用性、肺癌例に対する全身性拡散強調画像の有効性等を検討してきた。最終年度(平成27年度)には、MR拡散強調画像の有効性をさらに拡大して検討した。縦隔腫瘍16例、良性縦隔疾患12例の計28例について、拡散強調画像とPET-CTを比較検討した。ADCの至適カットオフ値2.21×10-3mm2/sec、SUVmaxの至適カットオフ値2.93を用いると、悪性縦隔腫瘍に対する拡散強調画像の感度(100%)は、PET-CTの93.8%に比較し、良好な傾向があった。良性縦隔腫瘍および病変に対する拡散強調画像の特異度は、PET-CTのそれ(66.7%)に比較し、良好な傾向があった。縦隔腫瘍および縦隔疾患の対する拡散強調画像の正診率(92.9%)は、PET-CTのそれ(82.1%)に比較し、良好な傾向を認めた。拡散強調画像による縦隔腫瘍の良悪の鑑別診断は、PET-CTのそれと比較し良好な傾向があったが有意とはいえなかった(Usuda K, etal. Asian Pac J Cancer Prev.16: 6469-6475, 2015)。研究期間全体を通じて実施した研究の成果について胸部疾患について、幅広くMR拡散強調画像の有効性を検討した。拡散強調画像がPET-CTよりリンパ節転移の正診率が優れている理由として、調画像が描出できるリンパ節内転移病変の大きさが、PET-CTのそれより有意に小さいことが判明し報告した(Usuda K, etal.Ann Surg Oncol 20; 1676-1683: 2013.)。MR拡散強調画像は、肺の腫瘤陰影の評価、肺癌の再発転移の検出、縦隔腫瘍および縦隔病変の評価において、PET-CTのそれと比較し、同等かそれ以上であった。胸部外科科研費による研究費により、これまで4論文がインパクトファクターのある一流医学誌に掲載されている。また研究内容は、2回の国際学会、8回の国内学会で発表されている。病理学的検討も、現在進行している。現在研究を進めている拡散強調画像による肺の良悪性を含めた腫瘤陰影の評価、拡散強調画像による肺癌例の再発転移の検出能、多発肺門縦隔リンパ節FDG陽性例に対する拡散強調画像の有用性、肺癌例に対する全身性拡散強調画像の有効性について、さらに症例を増やし、国際医学誌に投稿する。
疾患胚特有の生理機能変動計測による異常成長診断システムの開発と臨床応用

本テーマの核心をなす学術的な問いは■DNA解析に現れない胎児期疾患に特有な循環動態系の生理パラメータはどのようなパターンか?どうすればそれらを計測し,明らかにできるのか?■正常・疾患特有データからリアルタイムで胎児期の疾患を予測できないか?という2点である.究極の目標は「胎児期の疾患予知システム」の開発である.このための基礎として,胎児モデルとして母体の影響をダイレクトに受けないニワトリ胚を用いて,特にヒトにおける妊娠2ヶ月以内,すなわち,異常が最も起きやすい時期に相当する胚形成期の胚の生理機能データ収集と疾患特有の現象を明らかにする.本テーマの核心をなす学術的な問いは■DNA解析に現れない胎児期疾患に特有な循環動態系の生理パラメータはどのようなパターンか?どうすればそれらを計測し,明らかにできるのか?■正常・疾患特有データからリアルタイムで胎児期の疾患を予測できないか?という2点である.究極の目標は「胎児期の疾患予知システム」の開発である.このための基礎として,胎児モデルとして母体の影響をダイレクトに受けないニワトリ胚を用いて,特にヒトにおける妊娠2ヶ月以内,すなわち,異常が最も起きやすい時期に相当する胚形成期の胚の生理機能データ収集と疾患特有の現象を明らかにする.
ピロリ菌体膜蛋白による血小板活性化とマクロファージの免疫応答に関する解析

ピロリ菌感染は免疫性血小板減少症(ITP)に関与し、我々はこれまでにピロリ菌外膜蛋白(Hp-OMP)、血小板および抗Hp-OMP抗体からなる免疫複合体が、ピロリ菌関連ITPに関与している可能性を報告している。本研究では、免疫複合体の貪食細胞への食作用の観察およびELISAによるHp-OMP抗体の検出を試みた。ITP患者をピロリ菌陰性群(Hp-N)、ピロリ菌陽性で除菌成功(CR)群または除菌失敗(NR)群に分類し、Hp-OMPに対する抗体の反応性を解析した。抗Hp-OMP抗体は、Hp-Nよりも感染群で有意に高く、NRよりCRでより高値を示す傾向が認められた。免疫複合体の貪食は確認できなかった。平成26年度は臨床分離株におけるHelicobacter pylori菌体膜蛋白(Hp-OMP)保有率の調査および動物実験を用いたHp-OMPに対する反応性の検討を実施する計画のもと実験を行ってきた。臨床分離株におけるHp-OMPの保有率に関しては100株程度の臨床分離株のHp-OMP遺伝子をPCR法によって解析を行ったが、ほとんどの株においてHp-OMP遺伝子を有する事が判明した。このことから、H. pylori関連特発性血小板減少性紫斑病(以下H. pylori関連cITP)における血小板減少機序において、本疾患に特有なH. pyloriが関連しているというよりも、ほとんどのH. pylori株が有するHp-OMPが感染時に生体内(血管内)に侵入し、かつHp-OMPに対する抗体産生が患者免疫応答によって異なる事が示唆される。動物実験を用いたHp-OMPに対する反応性に関しては、スナネズミへのH. pyloriの感染および定着が確認されたがマウス血液中(血小板および脾臓)Hp-OMPの検出を種々の方法によって行ったが今のところ検出に至っていない。感染期間の長短やマウスの免疫状態等種々の条件設定が必要かと思われる。また、最近の論文ではマウスにおいては、H. pylori感染によって血液関連疾患が惹起されないという報告もあり、これらの報告も加味した上で検討を行っている。測定条件を設定したのち、種々の患者血清を用いて血清中に存在するHp-OMP抗体を測定した結果、H.pylori感染患者ではHp-OMPに対する抗体は検出されなかったが、H. pylori関連血小板減少性紫斑病患者の血清では多くの患者でHp-OMP抗体が陽性であった。Hp-OMP-血小板複合体のマクロファージの貪食機構の解明には届いていないが、ELISA法の確立および血小板活性化機構の解明に着手しておりおおむね順調に進展していると評価した。Helicobacter pyloriは、免疫性血小板減少症(ITP)や冠動脈疾患等の消化管外疾患への関与が示唆されている。特にH.pylori関連ITP患者では、H. pylori除菌による血小板数の回復症例が多数報告されているにもかかわらず、発症メカニズムには不明な点が多い。これまでに、H. pylori関連ITPの発症においてH .pylori菌体膜蛋白(Hp-OMP)が血小板に結合し複合体を形成し、さらにこの複合体に抗Hp-OMP抗体が結合することにより形成された血小板-Hp-OMP-抗Hp-OMP抗体の免疫複合体による血小板破壊がH. pylori関連ITP発症に関与しているものと考え検討を行ってきた。各群のin-house Hp-OMP ELISAによる血清抗Hp-OMP抗体のOD値は、それぞれHp-N群:0.43±0.05、CR群:0.65±0.04およびNR群:0.60±0.04であった。Hp-N群に対しH. pylori感染群(CR群およびNR群)は有意に高値を示し、特にCR群でより高値の傾向を示した。これらの結果から、H. pylori関連ITP患者ではHp-OMPを始めとするH.pylori蛋白と血小板の直接的な結合に加え、抗体が結合した複合体が最終的にマクロファージに貪食されることにより血小板減少を引き起こす可能性が示唆された。研究実績にも記載した通り、動物実験におけるモデルが作成できないこともありやや遅れていると評価した。再度条件を変更した上で動物実験を試みる予定であるが、ヒトと動物における根本的な免疫応答の違いによる可能性も充分考えられることから、結果によってはin vitroにおける反応(マクロファージのセルラインを用いた貪食実験)を先行して行いたいと考えている。

Hp-OMPによる血小板活性化を観察する目的として、ヒト血小板多血漿(PRP)にHp-OMPの刺激を加え、血小板が活性化するか否かを検討している。血小板活性化によりP-selectinが発現することから、OMPで刺激した血小板のP-selectin発現をウエスタンブロットにて解析を行う。さらに、活性化した血小板の食細胞への食作用を解析する。感染症学平成27年度はHp-OMPの血小板凝集および血小板結合部位同定の目的で、血小板凝集に関連する因子(フォン・ヴィルブランド因子等)の抗体を用いて免疫学的に解析を行う予定である。また、前年度に引き続き動物実験でのH. pylori関連cITPモデル(動物生体内からのHp-OMPの証明を含む)を試みたいと考えている。また、マクロファージのセルラインを用いた抗Hp-OMP抗体-Hp-OMP-血小板複合体のマクロファージへの取り込み(貪食)に関するin vitroの実験を行い、これまにHp関連cITP発症の仮説としてきた免疫複合体関連説の確証を試みたいと考えている。抗体購入を予定していたが、次年度で当該実験を行う事になったため。平成26年度に計画していた動物実験の解析に遅れが生じたたため、これらに係る研究を次年度に行うことになったため。血小板活性化に関する抗体の購入に使用する。当初計画を立てた事項に加え、平成26年度に行う予定であった実験動物に関する研究を進めたいと考えている。
移植後慢性拒絶反応の病態の解析について

長期生着移植片の喪失の最大の原因は慢性拒絶反応である。現在までに、この慢性拒絶反応の発達には、アロ抗原特異的な因子とアロ抗原非特異的な因子が関与しており、ラット腎移植モデルにおいては、移植後16週目頃よりマクロファージが特異的に移植片内に集積し、移植片の長期間にわたる崩壊や、マウス心移植のモデルでは、初期のIFN-γの活性化やそれにともなう血管内皮細胞の接着分子(ICAM-1,VCAM-1)の発現などが、その病変の成立に強く関与していることなどを報告してきた。当該研究初年度には、マウス心移植の系においてノックアウトマウスを用いて、他のサイトカインネットワークの関与について検討したところ、TNF-α、IL-4は慢性拒絶反応の成立には、必ずしも必須の因子ではないことが判明した。さらにそのメカニズムとしては、TNF-α、IL-4は、T細胞と血管内皮細胞との拒絶反応初期の段階での、種々の内皮細胞上に発現する接着分子(ICAM-1,VCAM-1)ゃMHCのclassllの発現には特に関与しないことに起因していることも明らかになった。2年目には、ラット肝移植モデルに本研究を展開し、現在までにDA-WSの系において移植後、免疫抑制剤を少量、短期間(10日間)投与した場合には約12から16週めには移植肝に線維化が出現し、胆管や肝動脈に狭小化が出現することが明らかになった。以上より、肝移植片における慢性拒絶反応の解析へと発展できる可能性を確立した。近年の免疫抑制療法の開発にともない、急性拒絶反応については回避できるようになってきたが、長期移植片の生着成績についてはこの10年間大きな変化をみていない。この長期生着移植片の喪失の最大の原因は慢性拒絶反応である。我々は現在までに、この慢性拒絶反応の発達には、アロ抗原特異的因子とアロ抗原非特異的な因子が関与しており、ラット腎移植モデルにおいては、移植後16週目頃よりマクロファージが特異的に移植片内に集積し、以後、移植片が長期間にわたって崩壊していくとことや、マウス心移植のモデルでは、初期のIFN-gの活性化やそれにともなう血管内皮細胞の接着分子(ICAM-1、VCAM-1)の発現などが、その病変の成立に強く関与していることなどを報告してきた。本年度には、マウス心移植の系においてノックアウトマウスを用いて、他のサイトカインネットワークの関与について検討したところ、この慢性拒絶反応の成立には、IFN-g以外では、TNF-a、IL-4は必ずしも必要な因子ではないことが判明した。また、さらにTNF-a、IL-4については、T細胞と血管内皮細胞との初期の相互作用の中で、種々の内皮細胞上に発現する接着分子(ICAM-1、VCAM-1)やMHCのclassIIの発現には特に関与していないことも明らかになった。一方、この慢性拒絶反応については、ラット肝移植モデルにおいても実験を進めており、DA-WSの系において、移植後一定期間のみ、免疫抑制剤を少量、短期間(10日間)投与した場合には約12から16週めには移植肝に線維化が出現し、胆管や肝動脈に狭小化が出現することがわかった。今後は、肝移植片における慢性拒絶反応の解析へと発展できる可能性がと思われる。
ホロニック生産システムのモデル化とシミュレーションに関する研究

本研究の成果をまとめると,以下のようになる.(1)ホロニック生産システムの基本構成を検討し,論理的な構成要素からなるシステムの基本構成を提案し,その運用方法,特にスケジューリングにおける生産設備の選択または割り当て方法について調査と分析を行った.(2)機械加工を対象とする生産システムにおける自律的構成要素を検討し,オブジェクト指向の考え方に基づいてモデル化を行い,ホロニック生産システムにおける生産プロセスのシミュレーションを行うためのシステムを開発した.(3)オブジェクト指向のシミュレーションシステムを用いて,自律型構成要素がリアルタイムに生産スケジュールを決定しながら生産プロセスを実行していくプロセスのシミュレーションを行った.(4)階層分散型生産システムのスケジュール間の整合性を保持しながら,短い時間でリスケジューリングを行うことができるコンカレント・アプローチを提案した.(5)オブジェクト指向言語Smalltalkを用いて,リスケジューリングシステムのプロトタイプを作成した.このシステムを3階層のリスケジューリング問題に適用した.(6)加工フィーチャの持つ形状創成機能の情報に基づいて,その加工を実現することができる加工設備を選択し,加工時間を推定する手法を提案した.(7)加工フィーチャの加工順序および加工設備のシーケンスを決定するために,遺伝的アルゴリズム(GA)および動的計画法(DP)を組み合わせた手法を提案した.この手法を用いることで,段取り時間を含む加工時間を小さくする適切な加工順序および加工設備のシーケンスを決定することができる.(8)具体的な機械部品のプロダクトモデルを対象にケーススタディを行った結果,加工フィーチャとそれを創成することができる加工設備の組合せに基づいて,適切な加工順序と加工設備のシーケンスを自動的に求めることができた.これにより,ホロニック生産システムにおける工作物ホロンの工程設計機能を実現することができた.本研究の成果をまとめると,以下のようになる.(1)ホロニック生産システムの基本構成を検討し,論理的な構成要素からなるシステムの基本構成を提案し,その運用方法,特にスケジューリングにおける生産設備の選択または割り当て方法について調査と分析を行った.(2)機械加工を対象とする生産システムにおける自律的構成要素を検討し,オブジェクト指向の考え方に基づいてモデル化を行い,ホロニック生産システムにおける生産プロセスのシミュレーションを行うためのシステムを開発した.(3)オブジェクト指向のシミュレーションシステムを用いて,自律型構成要素がリアルタイムに生産スケジュールを決定しながら生産プロセスを実行していくプロセスのシミュレーションを行った.(4)階層分散型生産システムのスケジュール間の整合性を保持しながら,短い時間でリスケジューリングを行うことができるコンカレント・アプローチを提案した.(5)オブジェクト指向言語Smalltalkを用いて,リスケジューリングシステムのプロトタイプを作成した.このシステムを3階層のリスケジューリング問題に適用した.(6)加工フィーチャの持つ形状創成機能の情報に基づいて,その加工を実現することができる加工設備を選択し,加工時間を推定する手法を提案した.(7)加工フィーチャの加工順序および加工設備のシーケンスを決定するために,遺伝的アルゴリズム(GA)および動的計画法(DP)を組み合わせた手法を提案した.この手法を用いることで,段取り時間を含む加工時間を小さくする適切な加工順序および加工設備のシーケンスを決定することができる.(8)具体的な機械部品のプロダクトモデルを対象にケーススタディを行った結果,加工フィーチャとそれを創成することができる加工設備の組合せに基づいて,適切な加工順序と加工設備のシーケンスを自動的に求めることができた.これにより,ホロニック生産システムにおける工作物ホロンの工程設計機能を実現することができた.平成11年度における研究成果をまとめると,以下のようになる.(1)ホロニック生産システムにおける自律協調アーキテクチャホロニック生産システムにおける管理および制御の基本構成要素となる自律型生産設備および自律型ワークの意思決定構造とその協調機構を分析し,生産システムの管理と制御の新しいアーキテクチャを検討した.特に,生産対象であるワークを自律化した場合について,自律型生産設備と自律型ワークの意思決定および協調によりホロニック生産システムの管理と制御を行う手法を明確にした.(2)自律要素の機能分析自律型生産設備および自律型ワークの意思決定機能,協調機能および生産機能を分析,整理した.すなわち,生産対象のオーダが与えられた場合に,その生産計画の策定および生産スケジュールの決定を行い,そのスケジュールに沿って生産プロセスを管理,制御するための自律機能および協調機能の分析を行った.また,生産設備の故障や特急オーダの入力などの外乱が生じた場合の生産設備とワークの意思決定および協調により,リアルタイムで生産スケジュールの修正と実行を行う手法を開発した.(3)自律要素のモデルテンプレートの開発(杉村,谷水)(2)の分析結果に基づいて,自律型生産設備および自律型ワークのモデルを作成している.特に,オブジェクト指向の考え方に基づいて,モデルのデータおよび処理機能を分類,整理し,オブジェクトモデルを開発した.平成12年度は,以下の項目について研究を行った.(1)ホロニック・リアルタイムスケジューリングシステムの開発ホロニック生産システムにおける生産管理および制御の基本となるリアルタイムスケジューリングシステムの開発を行った.特に,ディシジョンルールを用いて,生産設備ホロおよび工作物ホロンが自律的にリアルタイムにスケジュールを決定し,加工を実行していくシステムのシミュレーションを行った.また,スケジューリングの最適化を目的として,生産工場あるいはショップのホロンが,その構成要素である生産設備のスケジューリングを行うシステム構成について検討した.(2)ホロニック生産管理および制御方法論の開発リアルタイムスケジューリングを基本とするホロニック生産システムにおける生産管理および制御の方法論を検討した.

特に,生産設備の故障あるいは特急オーダの入力などの予期できない外乱が生じた場合の管理および制御の方法論について検討した.また,よりフレキシブルな制御方法論の開発を目的として,工作物ホロンが自身の工程計画を設計する手法を提案した.この手法を用いることで,工作物ホロンは,生産設備の加工スケジュールを考慮した上で,自身の加工手順および生産設備のシーケンスなどの工程を設計することができる.(3)ホロニック生産システムの実用化の可能性の検討上記(1)および(2)の結果に基づいて,自律分散型のスケジューリング,管理および制御システムのプロトタイプをシミュレーションシステムに実装し,その実現可能性を検討した.その結果,以下のことが明らかとなった.・本研究で開発したシミュレーションシステムを用いて,ホロニック生産システムのスケジューリングプロセスおよび加工プロセスのシミュレーションを行うことができる.・本研究で提案したリアルタイムスケジューリング手法を用いることで,工作物ホロンおよび生産設備ホロンのスケジュールをリアルタイムに決定し,加工プロセスの実行を行うことができる.・工作物ホロンに工程設計機能を持たせることで,生産スケジュールを考慮した生産設備のシーケンスを求めることができる.
強酸耐性植物根圏の共生微生物でイネを守る ～ その強さの秘密を解き明かせ

pH 4.5以下の酸性土壌では、アルミニウムが土壌から溶け出す事により、植物とその根圏微生物に深刻な影響が起こる。酸性土壌でのアルミニウムの毒性機構や耐性機構についての情報は少ない。本課題では、問題土壌の多くを占める「酸性土壌」での農業へ適用可能な植物生育促進に使用する微生物として、酸性硫酸塩(ASS)適応植物に共生する有用微生物群をモデルとして用い、ASS適応遺伝子・タンパク質群の選抜と機能解明、根圏微生物の生存と定着・耐性に関与する多糖など金属イオン吸着物質の機能と構造解析などを行った。アルミニウム等の金属イオン耐性、低pH耐性、不溶性リン酸塩可溶化、バイオフィルム形成に関与する新規ASS適応機構を見出すために、今年度は、1.トランスポゾン導入変異株を用いた各種培養条件でのASS適応遺伝子破壊株の選抜を行った。次に、アルミニウム共存下、非共存下など各培養条件での網羅的タンパク質解析を行う予定であったが、実験機器の都合上次年度に予定していた2.多糖など金属イオン吸着物質の機能と構造解析を前倒しで実施した。トランスポゾン導入変異株を用いたASS適応遺伝子群の探索トランスポソン(EZ-Tn5)を用いてランダム遺伝子ノックアウトライブラリーとして2000以上株の変異株を取得してある。野生株で示されたアルミニウムなどの金属イオン耐性、低pH耐性、リン酸可溶化能などの形質を失う変異株、または形質が強化される変異株などを培地での生育を指標に、24ウェルや96ウェルマイクロプレートを用いた培養法で多検体スクリーニングを行った。その結果、200株以上の野生株と生育の異なる変異株を選抜した。現在は、選抜した変異株のトランスポゾン導入部位を決定し、ASS適応関連遺伝子群の候補を選抜している。多糖など金属イオン吸着物質の機能と構造解析本年度はまずCA42株の細胞外多糖を用い、ASSで問題となるその他の金属イオン(鉄、マンガン、ニッケル、カドミウム、銅、亜鉛やその他陽イオン)と細胞外多糖を反応させ、その後ICP発光分析装置を用いてこれら金属イオンの吸着性について検討した。その結果、CA42株の細胞外多糖は特にアルミニウムを吸着し、最大で0.17 μmol/mgの吸着を示し、その他の酸性硫酸塩土壌で問題になる金属(銅、鉄、ニッケル、亜鉛、マンガン)についても吸着が見られた。人口増加に伴う食糧増産の必要性が世界的命題となっているなかで、本課題では、耕作に適さない「問題土壌」の多くを占める酸性土壌へ適用可能な植物生育促進法のモデル微生物として、酸性硫酸塩(ASS)適応植物・微生物共生体から得た有用微生物群を用い、ASS適応遺伝子・タンパク質群の選抜と機能解明、根圏微生物の生存と定着・耐性に関与する多糖など金属イオン吸着物質の機能と構造解析などを目的にしている。昨年度は、CA42株の細胞外多糖がアルミニウムを最大で0.17 μmol/mgの吸着を示し、その他の酸性硫酸塩土壌で問題になる金属(銅、鉄、ニッケル、亜鉛、マンガン)についても吸着が見られたことを確認した。これを受けて今年度は、この多糖について機能と構造の検討を行なった。CA42-多糖について、HPLC分析などによりグルコースのホモポリマーと考えられ、NMR分析、メチル化分析の結合様式の解析の結果を考慮して多糖の構造を決定した。その結果が図5である。CA42-多糖は主鎖にα1-4結合を持ち、グルコース残基約10個毎にα1-4,1-6結合を持つグルコースが存在し、1-6結合からα1-4結合を繰り返すグリコーゲンを生産していると判明した。また、側鎖の鎖長の検討を行った結果、2糖、3糖、4糖を側鎖に持つと考えられる。また、CA42-多糖、グリコーゲン、でんぷんはAl3+除去能を示し、これらの多糖に共通する1-6結合の分岐がAl3+除去に必要なのではないかと考え、プルラナーゼ処理を行った各多糖のAl3+除去能を調べた結果、1-6結合が重要であると判明した。人口増加に伴う食糧増産の必要性が世界的命題となっているなかで、本課題では、耕作に適さない「問題土壌」の多くを占める酸性土壌へ適用可能な植物生育促進法のモデル微生物として、酸性硫酸塩(ASS)適応植物・微生物共生体から得た有用微生物群を用い、1ASS適応遺伝子・タンパク質群の選抜と機能解明、2根圏微生物の生存と定着・耐性に関与する多糖など金属イオン吸着物質の機能と構造解析などを目的にしている。これまでに、ASS適応微生物群から、既報を大きく上回る濃度のアルミニウムや重金属を含む酸性培地(pH 3)で良好な生育を示す菌株を選抜し、新種Acidocella aluminiidurans AL46株として報告している。このAL46株と、イネの根周囲に著量の金属吸着性バイオフィルムを形成するCA42株のドラフトゲノム配列を次世代シークエンサーにより決定した。これらの情報を元に、アルミニウム存在下、非存在下で培養したAL46株の細胞を回収後、タンパク質を抽出し、SDS-PAGEでの分離後にトリプシン消化してLC/MS/MS分析することで、網羅的に蛋白質を同定・定量するショットガンプロテオームを行った。その結果、アルミニウム(0 mM, 25 mM, 50 mM)の存在下で発現するタンパク質を複数回の分析を行うことで再現性よく解析できることを確認した。現在、アルミニウム耐性や不溶性リン酸可溶化に関与するタンパク質の候補を選抜し、それぞれのタンパク質の発現量を解析している。

さらにこれらタンパク質に関する周辺遺伝子の遺伝子破壊および遺伝子相補実験を行い、機能遺伝子の同定を行う。また、多糖など金属イオン吸着物質の機能と構造解析については、CA42株やAL46株以外の菌株についても、アルミニウムの吸着、有用機能について認められたため、これらの微生物の生産する多糖についても進めている。pH 4.5以下の酸性土壌では、アルミニウムが土壌から溶け出す事により、植物とその根圏微生物に深刻な影響が起こる。酸性土壌でのアルミニウムの毒性機構や耐性機構についての情報は少ない。本課題では、問題土壌の多くを占める「酸性土壌」での農業へ適用可能な植物生育促進に使用する微生物として、酸性硫酸塩(ASS)適応植物に共生する有用微生物群をモデルとして用い、ASS適応遺伝子・タンパク質群の選抜と機能解明、根圏微生物の生存と定着・耐性に関与する多糖など金属イオン吸着物質の機能と構造解析などを行った。アルミニウムなど、酸性土壌で問題となる金属イオンを吸着する細胞外多糖について、構造と機能の相関について明らかとなりつつある。また、プロテオーム解析については、分析機器が最新のものが導入されたため、現在分析中である。環境微生物学多糖など金属イオン吸着物質の機能と構造解析については、CA42株やAL46株以外の菌株についても、アルミニウムの吸着、有用機能について認められたため、これらの微生物の生産する多糖についても進める予定である。これらの菌株は、酸性土壌修復へ適用する場合に求められると考えられる、pH上昇能、金属耐性能、リン酸塩可溶化能などの機能ももっている。これらの機能は、今後本菌株を植生の回復による酸性土壌環境修復に応用するに当たり、重要な機能であると考えられる。今後はこれらの機能がどのような機構に依っているか検討を進め、応用方法を検討していく必要がある。さらに、これら微生物のいくつかは分類学的に新規な生物である可能性が高まったため、新種の細菌として国際誌に報告を進める予定である。トランスポゾン導入変異株の変異部位同定方法として、既報の方法を試みたが、効率が悪いため、現在別の方法を試みている。また、プロテオーム解析については、分析機器(LC/MS/MS)の都合上、分析が遅れている。これについては次年度以降に分析する予定である。当初の予定と異なり、プロテオーム解析に精度の高い最新機種を使用できたため、当初の予定より分析回数を少なくする事ができたので結果として使用料金が安く済んだ。また、次年度にこれまでに得られた成果を論文として報告する予定であり、余剰分を英文校閲料として使用したいため。トランスポゾン導入変異株の変異部位同定方法を変更し、これまでに選抜した変異株の遺伝子変異部位の特徴を明らかにする。また、プロテオーム解析については、分析機器(LC/MS/MS)の都合上、分析が遅れているたが、次年度以降に分析する予定である。また、多糖など金属イオン吸着物質の機能と構造解析については、AL46株についても進める予定である。今年度は成果を論文として複数の国際誌に投稿を予定しており、より原稿を良くするためにも次年度使用額分も用いて英文校閲を行う予定である。
腎細胞癌に対する免疫療法の分子機構:標的分子としてのエリスロポエチン

腎摘出術により採取した腎細胞癌25例について、そのmRNAレベルでのEPOの発現を調べると、25例中9例(36%)においてEPOの発現が認められ、さらにそのうち培養可能であった17例中5例(30%)において培養上清中にEPOの産生が認められた。上記症例について、EPOの発現、産生の有無におけるLAK細胞の感受性の違いを比較すると、EPOを発現、産生している腎細胞癌は、そうでないものに比べ、LAK細胞に高い感受性を示した。この事より、EPOの発現が標的分子として認識されている可能性が示唆された。さらに、EPOを発現、産生していない細胞にEPOの遺伝子を導入し、EPOを発現させることにより免疫担当細胞の感受性を高めることができればEPOが標的分子として認識されている可能性をより証明できると考え、EPOの発現、産生していないKRC1(腎細胞癌細胞株)、KUR11(腎細胞癌初代培養)、COS7、にEPOの遺伝子を導入し、stableにEPOを産生する系を樹立した。そしてEPOを発現させることによりLAK細胞や、TILの感受性を増加させることができた。これらの実験より、腎細胞癌上のEPOの発現が、免疫担当細胞の標的分子と成り得る可能性が示唆された。以上の研究結果は、第83回日本泌尿器科学会総会、第54回日本癌学会総会、第47回西日本泌尿器科学会総会シンポジウムにおいて発表した。
炎症惹起時の角膜幹細胞への影響―神経栄養因子を介在し、炎症から防御する可能性―

炎症細胞浸潤を誘導するためにまずマウス角膜に11-0ナイロン縫合糸を2針設置した。角膜stem/progenitor細胞と角膜三叉神経を経時的に定性・定量解析したところ著しく減少していた。それゆえにニッチェ(niche)を構成している角膜stem/progenitor細胞また角膜三叉神経が維持されるためには炎症因子が重要な役割を担っていると考察された。本研究では角膜幹細胞が生体内で生存、機能していくにあたり、炎症は重要な阻害因子であるという仮説の下、マウス角膜炎症モデルを用いてそのメカニズムを詳細に解明していくことが目標であると考えている。マウス角膜炎症モデルを用いた幹細胞の機能解析として、角膜にナイロン糸を縫合し炎症を惹起させ、術後経時的に角膜を採取し、フローサイトメトリー、免疫組織化学、Real-time PCR等の手法を用いて幹細胞の定量・機能解析を試みた。具体的な手法としてはC57BL/6マウス角膜に11-0ナイロンを3針通糸し角膜内に炎症を惹起させ、術後7、14日目に角膜を採取した。コントロールには通糸をしない正常角膜を用いた。また、角膜内の炎症が沈静化した後の幹細胞の変化を検討するために、11-0ナイロン糸を通糸し、7日後に抜糸、抜糸後7日目の角膜の幹細胞の変化も調査した。これら採取した角膜を用いて幹細胞の蛋白定量のために、フローサイトメトリーによるSP(Side population)の測定を行った。角膜幹細胞測定の方法として、各群の角膜(各n=6)をコラゲナーゼ処理し、角膜細胞を単一化させ、その細胞を、Hoechst33342で染色し、side populationをフローサイトメーターにて解析した。一部の角膜は、上皮と実質をEDTA処理にて分離し、上皮細胞のみを染色した。また、炎症細胞を除くためにCD45を同時染色し、CD45(-)細胞のSPの割合も検討した。術後7日目、14日目とも正常角膜のSide populationに比べ約80%と著しく減少していることが示唆された。本研究では角膜幹細胞が生体内で生存、機能していく上で、炎症は重要な阻害因子であるという仮説の下、マウス角膜炎症モデルを用いてそのメカニズムを詳細に解明していくことを目的としている。マウス角膜炎症モデルを用いた幹細胞の機能解析として、角膜にナイロン糸を縫合し炎症を惹起させ、術後経時的に角膜を採取し、フローサイトメトリー、免疫組織化学、Real-time PCRの手法を用いて幹細胞の定量・機能解析を行う。詳細な研究方法としては、C57BL/6マウス角膜に11-0ナイロンを3針通糸し角膜内に炎症を惹起させ、術後7、14日目に角膜を採取する。また角膜内の炎症が沈静化した後の幹細胞の変化を検討するために、11-0ナイロン糸を通糸し、7日後に抜糸、抜糸後7日目の角膜も比較のために同時に検討した。まず角膜炎症モデルマウスにおける角膜三叉神経をβIII-tubulinにて免疫染色を行った結果、正常眼と比較して特にsub-basal nerveの層の神経密度が減少し、また形状においても屈曲・途絶の著しい減少が観察された。更に角膜幹細胞の測定としては、角膜(各n=6)をコラゲナーゼ処理し、角膜細胞を単一化させ、その単一化した細胞を、Hoechst33342で染色し、side populationをフローサイトメーターにて解析した。術後7,14日目とも正常角膜のside populationに比べて約80%と著しく減少している結果が得られた。本研究では角膜幹細胞が生体内で生存、機能していくにあたり、炎症は重要な阻害因子であるという仮説の下、マウス角膜炎症モデルを用いてそのメカニズムを詳細に解明していくことを研究目標とした。マウス角膜炎症モデルを用いた幹細胞の機能解析として、角膜にナイロン糸を縫合し炎症をまず惹起させ、術後経時的に角膜を採取し、幹細胞の定量・機能解析を試みることとし、炎症を介しての角膜三叉神経への影響・関連性も同時に調査することである。2014年度に、炎症惹起時またその後の状況における幹細胞の蛋白定性・定量分析を行い、その結果を踏まえて炎症が角膜三叉神経と角膜stem/progenitor細胞の両方に影響することを国内外学会において発表する予定であったが、定性分析の結果、特に免疫染色において鮮明な結果を提出できず、再度至適条件を模索している。またフローサイトメトリーによる角膜縫合糸設置後、抜糸後の安定した定量条件の見直しを行っているため、計画を変更し他の角膜幹細胞マーカーの解析を行うこととしたためやや達成度が遅れている。