hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
悪性リンパ腫を構成する炎症細胞の起源の解明

悪性リンパ腫の組織には、腫瘍細胞の他に様々な炎症性細胞が存在する。本研究では、腫瘍細胞と炎症細胞の起源が同一であることを証明した。具体的には、骨髄中で種々の血球やリンパ球に分化する能力のある造血前駆細胞の一つに遺伝子変異が生じて「がん準備状態」となり、そこから腫瘍細胞と炎症細胞が派生することを示した。炎症細胞が「がん準備状態」の細胞から派生することを、初めて証明した。悪性腫瘍は腫瘍細胞とこれをとりまく微小環境細胞から構成される。本研究では、T細胞性リンパ腫の標本から腫瘍細胞とその周辺の非腫瘍性炎症細胞とを1個ずつ補足して細胞種毎にDNAを調整し、腫瘍化したT細胞特異的な体細胞性変異と、非腫瘍性炎症細胞にも存在する体細胞性変異とを同定することを目的とした。まず、6例のT細胞性リンパ腫サンプルについて全エクソンシークエンスを行い、87のアミノ酸変化を伴う遺伝子変異を同定した。複数の検体でRHOA変異が認められたことから、多数例のT細胞リンパ腫でRHOA遺伝子を解析したところ、特に血管免疫芽球性T細胞性リンパ腫(angioimmunoblastic T-cell lymphoma, AITL)において非常に高頻度(70%)に変異が認められた(Nat Genet, 2014)。AITLは、血管と炎症細胞に富む難治性の末梢性T細胞性リンパ腫であり、腫瘍細胞は濾胞性ヘルパーT細胞の形質を示す。標本から腫瘍細胞および炎症性リンパ球をレーザーマイクロダイセクションで1個ずつ分取し1000個のプールからDNAを調整してシークエンスしたところ、RHOA変異は腫瘍性T細胞でのみ検出された。一方、TET2遺伝子やDNMT3A遺伝子の変化は、腫瘍細胞で予想通り検出された他、同一の体細胞性変異が非腫瘍性炎症細胞でも同定された。このことは、腫瘍性T細胞と微小環境を構成する炎症細胞とが同じクローンから派生することを意味し、がん微少環境を治療標的として理解する上でも重要な進歩になると期待される。悪性リンパ腫では、腫瘍細胞以外に種々の炎症細胞が腫瘍組織を構築している。炎症細胞の多くは造血幹細胞から派生するため、同じ造血幹細胞由来である腫瘍細胞とは、類似の起源を有することになる。本年は前年度までの研究から大幅に症例数を増やし、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫(AITL)の組織標本からレーザーマイクロダイセクションによって炎症細胞を分離し、DNAを調整してシークエンス解析を行った。また、前年までとは異なる抗体を用いた免疫染色によって細胞を分離し、確実にB細胞を分離した。その結果、腫瘍細胞と同一の遺伝子変異がB細胞にも同定されるケースが複数見出された。これらのケースでは、腫瘍化したT細胞と炎症細胞であるB細胞との共通の前駆細胞の段階で遺伝子変異を獲得してクローン性増殖をきたしたと考えられる。このクローン性細胞は前がん細胞とも考えられるが、この共通前駆細胞からT細胞性の腫瘍細胞と、非腫瘍細胞であるB細胞が派生し、このようなB細胞は腫瘍の微小環境細胞として腫瘍の成長に寄与している可能性が考えられる。血液内科血管免疫芽球性T細胞リンパ腫の標本から、レーザーマイクロダイセクション法によって腫瘍細胞とその周辺の非腫瘍性炎症細胞とを1個ずつ補足し、個々のケースで同定されている遺伝子変異の有無を、腫瘍細胞と非腫瘍性炎症細胞のそれぞれで確認することことができた。少数例での検討ではあるが、腫瘍化したT細胞と非腫瘍性炎症細胞とに共通の体細胞性変異が存在することを実証する、という当初の目標を、初年度である程度実現することができた。今年度行ったレーザーマイクロダイセクション法による細胞種毎の遺伝子変異解析を、さらに血管免疫芽球性T細胞リンパ腫(AITL)の症例数を増やして行うことにより、AITL腫瘍組織における炎症細胞の起源が、普遍的に腫瘍細胞と同一のクローンに求められるのかどうかを検討する。また、対象疾患をAITL以外の末梢性T細胞リンパ腫にも広げて解析する。
脳血流SPECTを用いた人工内耳の音刺激による賦活試験に関する研究

この2年間、人工内耳埋込み患者を対象に音刺激前後の脳血流SPECTを行い、聴覚認知の機序解明、人工内耳の客観的評価法の確立を目的とした.人工内耳埋込み後、音刺激下で脳血流SPECTを施行し、脳血流の増加する部位、範囲と程度を観察した.脳血流SPECTは、3検出器型SPECT装置PRISM3000と核医学データ処理装置ODYSSEYを使用した.対象となる人工内耳患者は、本人の同意を得た.まず人工内耳の電源を切った状態(無音)で、^<99m>Tcで標識したニ-ロライト(^<99m>Tc-ECD)370MBqを静注し20分間SPECTデータの収集を行い、引き続き人工内耳の電源を入れるとともに音を聞かせた状態で、倍量の^<99m>Tc-ECDを追加静注しSPECTデータの収集を行った.画像減算法により音刺激下の脳血流画像を再構成し、無音状態と音刺激下の局所脳血流分布の変化を見た.その再構成SPECT画像を8年度購入のパーソナルコンピュータに転送し、大脳内局所の脳血流分布の変化を定量的に評価した.合計で9例に施行し、賦活部位、範囲、程度の解析を行った.今回の研究で解明できたことを列挙すると、以下の4点である.1.SPECTを用いて聴覚刺激により賦活される脳の領域を見ることができる.2.人工内耳を介した聴覚刺激では特に一次聴覚野が賦活される.3.人工内耳による聴覚機能の評価の良かった例で、特に賦活される.4.左右では右装用例で左聴覚野の賦活が高頻度にみられ、聴覚機能の評価も良かった.脳血流SPECTが人工内耳の客観的評価法の一つとして有用であることが示唆され、今後、経過観察等データの蓄積によるさらなる研究が期待された.この2年間、人工内耳埋込み患者を対象に音刺激前後の脳血流SPECTを行い、聴覚認知の機序解明、人工内耳の客観的評価法の確立を目的とした.人工内耳埋込み後、音刺激下で脳血流SPECTを施行し、脳血流の増加する部位、範囲と程度を観察した.脳血流SPECTは、3検出器型SPECT装置PRISM3000と核医学データ処理装置ODYSSEYを使用した.対象となる人工内耳患者は、本人の同意を得た.まず人工内耳の電源を切った状態(無音)で、^<99m>Tcで標識したニ-ロライト(^<99m>Tc-ECD)370MBqを静注し20分間SPECTデータの収集を行い、引き続き人工内耳の電源を入れるとともに音を聞かせた状態で、倍量の^<99m>Tc-ECDを追加静注しSPECTデータの収集を行った.画像減算法により音刺激下の脳血流画像を再構成し、無音状態と音刺激下の局所脳血流分布の変化を見た.その再構成SPECT画像を8年度購入のパーソナルコンピュータに転送し、大脳内局所の脳血流分布の変化を定量的に評価した.合計で9例に施行し、賦活部位、範囲、程度の解析を行った.今回の研究で解明できたことを列挙すると、以下の4点である.1.SPECTを用いて聴覚刺激により賦活される脳の領域を見ることができる.2.人工内耳を介した聴覚刺激では特に一次聴覚野が賦活される.3.人工内耳による聴覚機能の評価の良かった例で、特に賦活される.4.左右では右装用例で左聴覚野の賦活が高頻度にみられ、聴覚機能の評価も良かった.脳血流SPECTが人工内耳の客観的評価法の一つとして有用であることが示唆され、今後、経過観察等データの蓄積によるさらなる研究が期待された.人工内耳埋込み患者を対象に音刺激前後の脳血流SPECTを行い、聴覚認知の機序解明、人工内耳の客観的評価法の確立を目的とした.人工内耳埋込み後、音刺激下で脳血流SPECTを施行し、脳血流の増加する部位、範囲と程度を観察した.脳血流SPECTは、現有設備である3検出器型SPECT装置PRISM3000と核医学データ処理装置ODYSSEYを使用した.対象となる人工内耳患者は、本人の同意を得た.実際には、まず人工内耳の電源を切った状態(無音)で、Tc-99mで標識したニ-ロライト(Tc-99m-ECD)370MBqを静注し20分間SPECTデータの収集を行い、引き続き人工内耳の電源を入れるとともに音を聞かせた状態で、倍量のTc-99m-ECDを追加静注しSPECTデータの収集を行った.画像減算法により音刺激下の脳血流画像を再構成し、無音状態と音刺激下の局所脳血流分布の変化を見た.その再構成

SPECT画像を8年度購入のパーソナルコンピュータに転送し、大脳内局所の脳血流分布の変化を定量的に評価した.今年度は4例に施行し、賦活部位、範囲、程度の解析を行い、側頭葉から上側頭回にかけての聴覚領の血流増加が確認できた.また、3次元表示により、賦活部位の把握が容易となった.次年度は症例数の増加と経時的な変化を見ることにより、詳細な検討を行い、脳血流SPECTが人工内耳の客観的評価法として有用かどうかの検証を予定している.昨年度に引き続き、人工内耳埋込み患者を対象に音刺激前後の脳血流SPECTを行い、聴覚認知の機序解明、人工内耳の客観的評価法の確立を目的とした.人工内耳埋込み後、音刺激下で脳血流SPECTを施行し、脳血流の増加する部位、範囲と程度を観察した.脳血流SPECTは、3検出器型SPECT装置PRISM3000と核医学データ処理装置ODYSSEYを使用した.対象となる人工内耳患者は、本人の同意を得た.まず人工内耳の電源を切った状態(無音)で、Tc-99mで標識したニ-ロライト(Tc-99m-ECD)370MBqを静注し20分間SPECTデータの収集を行い、引き続き人工内耳の電源を入れるとともに音を聞かせた状態で、倍量のTc-99m-ECDを追加静注しSPECTデータの収集を行った.画像減算法により音刺激化の脳血流画像を再構成し、無音状態と音刺激化の局所脳血流分布の変化を見た.その再構成SPECT画像を8年度購入のパーソナルコンピュータに転送し、大脳内局所の脳血流分布の変化を定量的に評価した.前年からの合計で9例に施行し、賦活部位、範囲、程度の解析を行い、側頭葉から上側頭回にかけての聴覚領の血流増加が確認できた.人工内耳を介した音刺激による聴覚領の賦活がSPECTによって検出できることが証明された.脳血流SPECTが人工内耳の客観的評価法の一つとして有用であることが示唆され、今後、経過観察等データの蓄積によるさらなる研究が期待された.
羊膜点眼による眼表面疾患の再生・治療

帝王切開により得られる胎盤組織から得られる羊膜は、現在では胎盤とともに出産後の排泄物として扱われている。羊膜は胎児外胚葉・中胚葉由来の組織で上皮と間葉系細胞より成り、胎児の保護と羊水の分泌を本来の目的としているが、増殖繊維の抑制、上皮層の進展促進、抗炎症、実質層の融解抑制、拒絶反応の抑制などの機序により、角膜および結膜を含む眼表面の再生医療の必要不可欠な治療手段となっている。眼表面に縫着された場合、残存する期間はせいぜい1週間であり、効果が十分でなかった場合には長期の入院の上、繰り返し手術を受ける必要がでてくる。羊膜の臨床応用には特殊な臨床手技が必要であり、全ての施設に於いて応用可能な治療法であるとはいいがたい。我々はどの医療施設に於いても容易に応用可能でまた持続投与が可能となる羊膜の抽出液を作成し、眼表面の再生医療に対する効果を検討する。羊膜抽出液点眼は手術・入院施設の必要のない治療法であり、手技の習得も必要のない治療法となると考えられる。またその簡便さから眼表面の再生治療などの重篤な疾患に対する治療のみならず、ドライアイや角膜上皮欠損などの比較的軽度な疾患に対しても羊膜治療を拡大できる可能性がある。これらは一次医療、地域医療においても先進の眼表面治療の適応を拡大し、より多くの患者がその恩恵に預かり、かつ結果的に医療費の削減にも貢献するものと考えている。産業廃棄物として破棄されていることが多い帝王切開後の羊膜を含んだ胎盤組織は、羊膜治療の裾野を広げることでより有効利用が図れることとなる。このことは医療技術の進歩に対する社会の参画を促すことになると期待できる。
電気式コーン貫入試験を用いた原位置地盤特性評価法について

電気式コーン貫入試験法は、軟弱地盤の現位置試験法の1つとして世界的に幅広く使用されている試験法である。本試験法の特徴は、試験機先端のコーン直上部に備えたセンサーにより得られる、コーン貫入抵抗、間隙水圧及びロッドと粘土との摩擦抵抗の3成分を活用すると原位置地盤の判別が効率よく行えることである。これまで、本研究代表者を中心にして電気式コーン貫入機構の解明がなされてきたので貫入試験データを用いて粘土地盤の非排水剪断強さ評価がかなり精度よく行えるようになってきた。しかし、依然、貫入試験データから推定される粘土地盤の剪断強さと室内試験により得られる剪断強さとの間には、地盤の種類にもよるがかなり差があることが明らかにされている。本研究は、有明粘土地盤において実施された電気式コーン貫入試験結果および土質試験結果をさらに集積すると共に、貫入試験結果より推定される粘土の剪断強さと対比する室内試験により得られる剪断強さとの相関を、試料採取時の攪乱の度合いの関数として整理することを検討したものである。まず、室内強度試験結果より得られる、供試体の攪乱の度合いを表す指標となる変形係数と電気式コーン貫入試験より得られる、粘土の密度の関数となる過剰間隙水圧をパラメーターとして用いて表される一次式を,攪乱を受けたと思われる粘土の剪断強さを取り除くための式(フィルター式と称す)として提案した。次いで、この提案式を用いて室内試験による剪断強さのうち攪乱の影響を受けたと思われるデータを除去したものと電気式コーン貫入試験結果から推定した剪断強さとの相関を検討した。この結果、両者の相関は大変よく,誤差は±20%以内におさまることが明らかになった。これにより、電気式コーン貫入試験結果を用いた精度の良い原位置地盤評価法が可能となった。電気式コーン貫入試験法は、最近良く用いられる現位置試験法の一種で、先端のコーン直上部に備えたセンサーにより得られる、コーン貫入抵抗、間隙水圧及びロッドと粘土との摩擦抵抗の3成分を用いて原位置地盤の判別を効率よく行おうとするものである。これまで電気式コーンの粘性土地盤への貫入機構は十分明らかにされていなかったため、本試験法の利用には限度があった。本研究では、まず、粘土地盤への電気式コーン貫入機構を、すべり線解法を用いて3次元的に解析した。解析では、土は完全塑性剛体とし、応力はMohr-Coulombの破壊包絡線及びHaar-von Karman条件を満足すると仮定した。コーン先端の周囲のすべり線場を、コーン先端角2α=60°に対し、3種類のコーン及びシャフト表面の摩擦係数(ζ)に対して解析した。ここで、ζは粘土の鋭敏比の関数でもある。コーン支持力係数(N_<cp>)はコーンやシャフトの表面の粗度及びコーンの相対貫入深さの関数として表した。電気式コーン係数N_<kt>の値は9.514.5の範囲で与えられたが、これらは多くの研究者が提案した値の範囲に含まれるものであった。つぎに、有明粘土地盤の6地点において実施された電気式コーン貫入試験結果を用いて地盤の原位置における物理的性質としての土の密度ρ_tや力学的性質としての非排水せん断強さs_uの推定への適用性について検討した。半解析的に導いたρ_t予測式は実測値とよい一致を示した。

s_uを推定するために用いられる電気式コーン係数N_<kt>はコーン表面の粗度や粘土の鋭敏比S_tの関数となるが、鋭敏性の高い粘土の場合N_<kt>=11を用いると電気式コーン貫入試験結果からs_uを推定できることが明らかとなった。電気式コーン貫入試験法は、最近良く用いられる現位置試験法の一種で、先端のコーン直上部に備えたセンサーにより得られる、コーン貫入抵抗、間隙水圧及びロッドと粘土との摩擦抵抗の3成分を用いて原位置地盤の判別を効率よく行おうとするものである。本研究では、先ず、粘土地盤への電気式コーン貫入機構を、すべり線解法を用いて3次元的に解析し、電気式コーン貫入抵抗と粘土の非排水せん断強さとの関係を粘土の鋭敏比の関数として表した。次に、有明粘土地盤の6地点において実施された電気式コーン貫入試験結果を用いて地盤の原位置における物理的性質としての土の密度ρ_tや力学的性質としての非排水せん断強さs_uの推定への適用性について検討した。半解析的に導いたρ_t焼予測式は実測値とよい一致を示した。s_uを推定するために用いられる電気式コーン係数N_<kt>はコーン表面の粗度や粘土の鋭敏比S_tの関数となるが、鋭敏性の高い粘土の場合N_<kt>=11を用いると電気式コーン貫入試験結果からS_uを推定できることが明らかとなった。最後に,変形係数(E_<50>)と過剰間隙水圧(u_d)をパラメーターとして表される一次式を,撹乱を受けたと思われるs_uの値を取り除くための簡単なフィルター式として提案している。提案式を用いて室内試験によるs_uのうち撹乱の影響を受けたと思われるデータを除去したものと電気式コーン貫入試験結果から上述のN_<kt>を用いて推定したs_uとの相関を検討した結果,両者の相関は大変よく,誤差は±20%程度であった。電気式コーン貫入試験法は、軟弱地盤の現位置試験法の1つとして世界的に幅広く使用されている試験法である。本試験法の特徴は、試験機先端のコーン直上部に備えたセンサーにより得られる、コーン貫入抵抗、間隙水圧及びロッドと粘土との摩擦抵抗の3成分を活用すると原位置地盤の判別が効率よく行えることである。これまで、本研究代表者を中心にして電気式コーン貫入機構の解明がなされてきたので貫入試験データを用いて粘土地盤の非排水勢断強さ評価がかなり精度よく行えるようになってきた。しかし、依然、貫入試験データから推定される粘土地盤の勇断強さと室内試験により得られる勇断強さとの問には、地盤の種類にもよるがかなり差があることが明らかにされている。本研究は、有明粘土地盤において実施された電気式コーン貫入試験結果および土質試験結果をさらに集積すると共に、貫入試験結果より推定される粘土の勢断強さと対比する室内試験により得られる勇断強さとの相関を、試料採取時の撹乱の度合いの関数として整理することを検討したものである。まず、室内強度試験結果より得られる、供試体の撹乱の度合いを表す指標となる変形係数と電気式コーン貫入試験より得られる、粘土の密度の関数となる過剰間隙水圧をパラメーターとして用いて表される一次式を,撹乱を受けたと思われる粘土の勇断強さを取り除くための式(フィルター式と称す)として提案した。次いで、この提案式を用いて室内試験による勇断強さのうち撹乱の影響を受けたと思われるデータを除去したものと電気式コーン貫入試験結果から推定した勇断強さとの相関を検討した。この結果、両者の相関は大変よく,誤差は±20%以内におさまることが明らかになった。これにより、電気式コーン貫入試験結果を用いた精度の良い原位置地盤評価法が可能となった。
水疱性類天疱瘡の病態解明と新規治療法の開発

水疱性類天疱瘡(Bullous pemphigoid;BP)の発症機序は自己抗体が結合した後から水疱形成に至る過程で、構造タンパク質-シグナル分子-サイトカイン/ケモカインの関与が想定される。今回我々はこの中のサイトカインに特に着目し病態の解明を試みた。まず水疱性類天疱瘡患者の血清および水疱液中で炎症性サイトカインの一つであるマクロファージ遊走阻止因子(Macrophage migration inhibitory factor;MIF)が増加し、それが病勢と関連することを見いだした。次にこのMIFが水疱性類天疱瘡の発症と関与するかするため、抗マウスBP180 NC16a抗体を作製し、この抗体をMIFトランスジェニックマウス、MIFノックアウトマウスに投与し水疱性類天疱瘡の発症について検討した。その結果MIFトランスジェニックマウスでは明らかな差がみられなかったが、MIFノックアウトマウスでは水疱の形成は減少していた。以上よりMIFは水疱性類天疱瘡の発症に関与している可能性が示唆された。水庖性類天庖瘡(Bullous pemphigoid; BP)は高齢者に好発する自己免疫性水庖症の一つである。本疾患は自己抗体が直接細胞の接着を阻害する天庖瘡群と異なり、自己抗体がBP180、特に細胞外ドメインに存在するNC16a領域に結合したあと、補体の活性化が生じ、遊走してきた多核白血球が産生する蛋白分解酵素により基底膜が分解されることにより水庖が形成される。しかしこれだけで本病態がすべて説明できるわけではない。自己抗体結合後に表皮角化細胞と浸潤細胞の間をつなぐ各種サイトカイン/ケモカインの作用の解析などは、新規治療の開発のためにも必要となるものと考えられる。本研究の目的は水庖性類天庖瘡の発症機序-特に自己抗体が結合した後から水庖形成に至る機序-を構造タンパク質、シグナル分子、サイトカイン/ケモカインの3点からのアプローチで解明することである。今回、炎症性サイトカインの1つである、マクロファージ遊走阻止因子(MIF)がBPの発症機序に重要であることが解明された(Asano Y, et al. JDermatol Sci, 2008)。即ち、BP患者の血清中のMIF値は健常者と比べて有意に高値を示すことが示された。さらに臨床症状の改善に伴い、血清MIF値も正常値近くまで低下することが解明された。BP皮膚病変部の組織を調べたところ、好酸球に強いMIFの発現が確認された。血中好酸球は病状の変化に変動することから、好酸球由来のMIFがBPの病態に重要であることが示唆された。今後、さらに水庖形成過程で重要な役割を担っていると推測される炎症性サイトカインをターゲットとして、水庖性類天庖瘡の新しい治療法の開発を試みる。水疱性類天疱瘡(Bullous pemphigoid ; BP)は高齢者に好発する自己免疫性水庖症の一つである。本研究の目的は水庖性類天疱瘡の発症機序ー特に自己抗体が結合した後から水疱形成に至る機序-を構造タンパク質、シグナル分子、サイトカイン/ケモカインの3点からのアプローチで解明することである。結果:今回、研究代表者等はマウスNC16a領域に一致するポリペプチドに対する精製ポリクローナル抗体を作製した。精製した抗体はマウス皮膚180kDaと150kDaにバンドがWestern blot法で確認された。またマウス皮膚を用いて、精製ポリクローナル抗体による蛍光免疫染色を施行したところ、C57BL/6マウスでは基底膜部に線状の沈着が確認されたが、BP180ノックアウトマウスの皮膚では基底膜への染色は認められなかった。

次に新生児マウス(生後24時間)に精製ポリクローナル抗体(5mg IgG/1匹)を投与したところ、投与24時間後の皮膚は容易に表皮がはがれることが確認された。投与24時間後の皮膚を蛍光抗体直説法にて観察すると、基底膜部にIgGの線状の沈着が確認された。今後炎症性サイトカインノックアウトマウスを用いた実験を行う予定である。水疱性類天疱瘡(Bullous pemphigoid;BP)は高齢者に好発する自己免疫性水疱症の一つである。本疾患は自己抗体がBP180のNC16a領域に結合したあと、補体の活性化が生じ、遊走してきた多核白血球が産生する蛋白分解酵素により基底膜が分解されることにより水疱が形成されう。しかし自己抗体結合後に表皮角化細胞と浸潤細胞の間をつなぐ各種サイトカイン/ケモカインの作用の解析などは十分なされておらず、この機序の解明は新規治療の開発のためにも必要となるものと考えられる。まず、我々は水疱性類天疱瘡患者の血清および水疱液中で炎症性サイトカインの一つであるマクロファージ遊走阻止因子(Macrophage migration inhibitory factor;MIF)が増加し、それが病勢と関連することを見いだした。このMIFが水疱性類天疱瘡の発症と関与するかを検証するため、我々が作製した抗マウスBP180 NC16a抗体をMIFトランスジェニックマウス、MIFノックアウトマウスに投与し水疱性類天疱瘡の発症について検討した。その結果MIFトランスジェニックマウスでは明らかな差がみられなかったが、MIFノックアウトマウスでは投与した抗体は表皮基底膜部に沈着したものの、臨床的、組織学的に水疱の形成がみられなかった。また組織学的に表皮下から真皮上層への好中球、リンパ球などの炎症細胞浸潤は抗体投与後の正常マウスと比較し著明に減少していた。以上よりMIFは水疱性類天疱瘡の発症病態形成、とくに好中球浸潤に関与している可能性が示唆された。それゆえ、MIFの制御は病態形成初期の好中球の遊走を阻害できる可能性があり、今後水疱性類天疱瘡の治療のターゲットとなりうる可能性が期待された。
ル-プ空間上の調和解析の総合的研究

本研究の目的は、ル-プ空間及びル-プ群に関する研究を、解析、代数、幾何の接点である調和解析という観点から行うことにあった。まだまだ満足できる水準に達していないが、いかに研究実績を述べる。1.基本となるル-プ空間上のドラ-ムコホモロジ-についてはかなりのことがわかった。ドラ-ム・ホッジのプララス作用素に対する調和形式の空間からドラ-ムコホモロジ-の空間への自然な写像が定義できそれが0、1次の場合は全単射であり、2次以上では全射であることを示すことができた。また余次元有限の微分形式やホッジの星型作用素も定義することができ、写像度定理も証明することができた。中間次元の微分形式を定義し、適当なラプラス作用素を定義することに関しても研究は現在進行している。ラプラス作用素のスペクトルについての研究は余り進まなかった。2.ル-プ群上ではドルボ-コホモロジ-が重要である。これについて、まずホッジ・小平の複素ラプラス作用素を定義することができた。次に問題になるのはコホモロジ-の消滅定理である。これに関しては擬凸領域を定義してその上でコホモロジ-が消滅していることを示すことが第一歩となるが、研究は現在進行中である。ル-プ群の1次のドルボ-コホモロジ-は消滅していると予想されているが、それを証明するまでにはいたらなかった。また表現論からの考察も十分な成果を得ていない。
口腔扁平上皮癌の細胞接着によるHippo経路活性化に着目した抗浸潤転移療法の確立

口腔扁平癌細胞培養時の細胞密度の低下に伴いE-cadherinのN-cadherinへの変換が起こることや、この接着因子の変換に伴い細胞の浸潤・転移に深く関わるHippo経路のシグナル調節分子YAP/TAZの活性が制御されることを見出しており、この"cadh erin switch"がHippo経路を負に調節することによりEMT誘導性転写因子の発現が誘導され、口腔扁平癌細胞の浸潤・転移を誘導するものと予測した。確認方法としてヒト口腔扁平上皮癌細胞として、HSC-4細胞を用いた。cadherin switchに関与する遺伝子とタンパク質はreal time qRT-PCRおよびウェスタンブロット法、蛍光免疫染色法により解析した。TGF-β1刺激で誘導される上皮間葉転換(EMT)において、N-cadherinの発現に関与する転写因子としてSox9を検出した。またSox9の遺伝子ノックダウンによりN-cadherinの発現が抑制されたことから、Sox9はN-cadherinの発現を正に制御することが示された。次に細胞密度変化に伴うSox9の発現変化を調べた結果、細胞密度の低下に伴いSox9発現の上昇が認められるとともに、蛍光免疫染色法によりSox9の核内移行が強く確認された。また、細胞密度低下に伴い、E-cadherinからN-cadherinへのcadherin switchが認められた。さらに、E-cadherin間の結合を阻害する中和抗体を投与したところ、N-cadherinの発現増大が認められた。以上より、Sox9は細胞密度低下に伴い核内移行と発現が上昇しEMTを誘導することが示された。2Sox9をHSC-4細胞でノックダウンすることによりHSC-4細胞のN-cadherinの発現が正に制御された。以上より、研究課題の進捗状況は概ね順調である。E-cadherinによる細胞接着が解除されるとHippo経路を介しYAPが活性化してEMTが誘導されることを予測しているが、この仮説を立証すべく、Hippo経路のシグナル伝達分子であるYAP/TAZの遺伝子ノックダウンにて、N-cadherinからE-cadherinへのcadherin swtchを検証する予定である。口腔外科学会への参加を予定していたが、日程的に参加ができなくなったため、その分の参加費および旅費の予算である。次年度での学会参加を予定しいる。
慢性心房細胞に対するMaze手術の有用性及び機序の解明と術式の確立に関する研究

1)Maze手術の改良の開発平成9・10年を通じ心房表面電位マッピング調査によって,心房内のfiring pointが肺静脈入口部付近に集中し,これによりAFの発生が強く示唆された。また一方で,僧帽弁輪への心房隔離線の作成が不完全となり,心房頻脈を合併することが,electro-anatomical mapping systemを用いた検索で明らかとなった。そこで,Maze手術の左房切開線を簡略化し,かつ心房頻拍を予防する目的で,肺静脈入口部を含む左房後壁の隔離のみとする改良法を平成11年度から施行した。その結果心房頻拍の発生率は23%から0%となった。しかし除細動効果については,今後の遠隔成績を待たなければならない。2)Maze手術の術後遠隔成績Maze手術を僧帽弁膜症と合併施行することの安全性と,その効果(除細動率75%)を明らかにし,洞調律回復が得られる指標として心電図上のf波高と心エコー図上の左房径が有用であることを示した。そしてMaze手術100例の術後平均44.6ヶ月の追跡では,実生存率87.8%(5年),NYHAクラス平均1.5±0.5と良好であった。しかし,Kaplan-Meier法による洞調律維持率は経年的に下降し,術後1年88.8%から術後5年64.8%と低下することが判った。このことは僧帽弁膜症に合併する心房細動のマクロリエントリー説,あるいはそれに基づくMaze手術の限界を示唆するもので,今後は心房細動の予防を含めた総合的な取り組みが必要である。1.Maze手術における切開線の簡略化術中心房表面マッピングを、24チャンネル同時に4回、計98ポイントにおいて行った。その結果、細動波がほとんど認められないものと、細動波に規則性がなくなりエントリ-回路が不明なものを除くと、心房細動(Af)のリエントリ-回路は、主として肺静脈入口部を中心に形成されていると考えられた。従って、特に僧帽弁疾患のように左房負荷がAfの成因となっている場合は、肺静脈入口部を含む左房後壁を隔離切開する改良法が簡便かつ効果的であると考え、現在この方法を用い検討中である。2.基礎心疾患手術時にMaze手術を付加することの安全性Maze手術の合併施行が、基礎心疾患の手術の危険因子となるかどうかを明らかにするため、同一疾患(僧帽弁閉鎖不全症;MR)に対する同一手術(弁形成術)において、Maze手術付加の有無による手術成績の差を検討した。すなわち、MR+Af群と洞調律のMR群の比較では、手術死亡あるいは病院死亡のいずれも、両群ともになく、合併症の発生頻度にも有意差は認められなかった。ただ体外循環時間と心停止時間は、Maze手術併用群において30分程度延長し、術中・術後の出血量と輸血量も多い傾向にあった。このことより、基礎心疾患の手術にMaze手術を付加することが、手術の危険因子とはならないと結論した。3.Maze手術の適応の検討Maze手術によって洞調律に回復する条件を検索するため、術後洞調律群とAf群における術前諸因子を比較分析した。両群間に有意差を認めたのは、心エコー図上の左房径と心電図上のf波高(V1)であった。理想的な洞調律への回復が期待できる術前の指標は、左房径が60mm以下で、f波高が0.1mV以上の症例と考えられた。Maze手術後の心房機能の評価慢性心房細動(af)に対するMaze術のゴールは、合併症としての血栓塞栓症の予防である。そのためには、術後洞調律(SR)に復した左房機能が、どの程度回復するかが重要である。

僧帽弁膜症に伴うafに対しMaze手術を加え、術後SRに復し、繰り返しUCG検査を行い得た35例について検討した。その結果、心房能動収縮機能は術後経時的に回復(left atrial active contraction fraction 14.3±9.4→20.3±7.7%,p<0.005)することが知られた。特に弁膜症の中でも、変性僧帽弁膜症における左房機能の回復が明らかであった。しかし、左房貯留能に関しては有意の改善が認められなかった。また、別の対象例で繰り返し行った心肺運動負荷試験、血中心房性Na利尿ペプチド(ANP)濃度測定、およびUCO検査では、術前に比し、術後急性期(約1ヶ月後)、さらに術後慢性期(36ヶ月後)にかけて、心房の諸機能の改善がみられた。即ち、嫌気性代謝閾値(ml/mim/kg)は12.1±1.8から14.4±3.4、15.1±1.8へ、最高酸素摂取量(ml/min/kg)は、17.1±3.1から18.7±3.7、20.6±3.6へと増加し、安静時ANP濃度(pg/ml)は114±64から43+21、22±15と低下し、術後左房能動駆出分画は0.11±0.06から0.21±0.04へと増加を示した。今後、これらの心房機能の回復が、手術後の患者の症状改善や生命予後、また血栓塞栓症発生率に、どの程度貢献するかを明らかにする必要がある。また現在進行中の、より簡便な改良手術についても、その成績を検討する予定である。1)Maze手術の改良法の開発平成9・10年度を通じ,心房表面電位マッピング検査によって,心房内のfiring pointが肺静脈入口部付近に集中し,これによるAFの発生が強く示唆された。また一方で,僧帽弁輪への心房隔離線の作成が不完全となり,心房頻拍を合併することが,electro-anatomical mapping systemを用いた検索で明らかとなった。そこで,Maze手術の左房切開線を簡略化し,かつ心房頻拍を予防する目的で,肺静脈入口部を含む左房後壁の隔離のみとする改良法を平成11年度から施行した。その結果心房頻拍の発生率は,23%から0%となった。しかし,除細動効果については,今後の遠隔成績を待たなければならない。2)Maze手術の樹都度遠隔成績Maze手術を,僧帽弁膜症と合併施行することの安全性と,その効果(除細動率75%)を明らかにし,洞調律回復が得られる指標として心電図上のf波高と心エコー図上の左房径が有用であることを示した。そしてMaze手術100例野術後平均44.6ヵ月の追跡では,実生存率87.8%(5年),NYHAクラス平均1.5±0.5と良好であった。しかし,Kaplan-Micicr法による洞調律維持率は経年的に下降し,術後1年88.8%から術後5年64.8%と低下することが判った。このことは僧帽弁膜症に合併する心房細動のマクロリエントリー説,あるいはそれに基づくMaze手術の限界を示唆するもので,今後は心房細動の予防を含めた総合的な取り組みが必要である。
疾患特異的iPS細胞を用いたQT延長症候群のメカニズムの解明と治療への応用

QT延長症候群7型(LQT-7)は、心電図のQT/QU時間延長、周期性四肢麻痺、骨格異常を三徴とした、心室性不整脈の原因となる疾患であり、KCNJ2遺伝子異常が原因である。遺伝子変異の異なるLQT-7患者3名より人工多能性幹(iPS)細胞を樹立し、分化心筋を解析した。単一細胞の活動電位解析では、活動電位持続時間と最大拡張期電位に有意差を認めなかったが、多電極アレイ解析では、LQT-7においてフレカイニドにより不規則な興奮が減少し、イソプロテレノールを投与しても異常な興奮が誘発されず、不整脈予防効果が推測された。本研究により疾患研究や薬剤効果の検討に疾患特異的iPS細胞研究の有用性が示唆された。QT延長症候群は心電図におけるQT時間の延長と心室頻拍を特徴とする突然死の原因となる遺伝性疾患である。我々のグループでは、20年以上前より不整脈患者の遺伝子解析・機能解析を施行しており、現在、全国の施設より1400家系、2400症例の家族性不整脈患者ゲノムDNAを集積し、遺伝子解析・病態解析を進めている。その中より、KCNJ2遺伝子異常が原因のQT延長症候群7型患者3名(KCNJ2-R218Q、R218W、R67W)を抽出し、血液を採取して、センダイウイルスを用いてそのT細胞から疾患特異的induced pluripotent stem cell (iPSC)を樹立した。そのiPS細胞を心筋細胞に分化誘導し、以下の解析を施行した。マルチ電極アレーディッシュを用いた細胞外からのフィールド電位の解析では、疾患特異的iPS細胞を心筋に分化誘導した細胞(iPSC-derived cardiomyocytes、iPSC-CM)よりにおいてコントロールよりも心電図のU波様波形、異所性興奮を高頻度に認めた。また、蛍光色素を用いたカルシウムトランジェント解析では、疾患特異的iPSC-CMにおいてコントロールと比較して有意に不規則なカルシウムリリースが増加していた。薬効評価のためフレカイニドを投与した結果、この不規則なカルシウムリリースは抑制されたため、患者の治療にフレカイニドが有効である可能性が示された(Kuroda Y,Yuasa S, Hattori T et.al第78回日本循環器学会学術集会2014)。パッチクランプ法による単一細胞の電気生理学的機能解析は解析中である。[イソプロテレノール負荷による多電極アレイ(multi-electrode array:MEA)を用いた検討]拍動する胚葉体にイソプロテレノールを投与し、MEAにて観察し、コントロールと疾患特異的iPS細胞由来心筋細胞と比較した。その結果、コントロールと比較して疾患特異的iPS細胞由来心筋細胞では有意な期外性収縮の増加を認めた。[モルモット心室筋細胞でのフレカイニドのNCXに対する効果の検討]MEA解析では、ピルジカイニドを投与してもコントロールと疾患特異的iPS細胞由来心筋細胞を比較しても有意差を認めなかったため、フレカイニドの効果はナトリウムチャネルブロックだけではないと考えられた。フレカイニドがNCXに影響していると推測し、モルモット心室筋細胞でフレカイニド投与前、投与後でNCX電流を比較した結果、フレカイニドによるNCX電流の増加を認めた。共同研究者により、昨年度の研究結果を含め、論文投稿中である。循環器内科学QT延長症候群患者3名より疾患特異的iPS細胞の樹立に成功し、心筋への分化誘導の手技が確立できている。その分化心筋細胞の疾患発症メカニズムを解明するため、分子生物学的機能解析(RNA解析)、電気生理学的機能解析(マルチ電極アレーディッシュを用いた細胞外からのフィールド電位、蛍光色素を用いたカルシウムトランジェント、パッチクランプ法による活動電位やイオン電流)を進めている。しかし、iPS細胞から心筋に分化誘導した細胞には、心室型、心房型、洞結節型といった多様なタイプの細胞が存在すること、成人心筋と比較して未分化であること、分化度が一定でないこと、細胞が脆弱のため解析が困難であることなど問題点があり、その解析は容易ではない。引き続き、QT延長症候群患者3名より樹立した疾患特異的iPS細胞を心筋に分化誘導した細胞の機能解析を行い、病体解明を進める。電気生理学的機能解析に関しては、細胞に低侵襲な穿孔パッチクランプ法を用いた方法で解析を行い、活動電位による細胞のタイプ別分類の基準を確立し、データを分析する。また、疾患モデルとしての有用性を確立した後には薬剤スクリーニングを行い、患者に適した治療薬の検討を目指す。
神経発生過程におけるＨｅｓ１遺伝子の発現振動の意義の解明

神経発生過程において、Hes1遺伝子は神経幹細胞の維持に重要な役割を担う。加えて、その発現は2-3時間の一定の周期で振動する。しかし、Hes1遺伝子の発現振動が神経分化にどのような役割をもつのかは未解明である。この問題を明らかにする手法として、Hes1遺伝子のイントロン配列を除去し、転写にかかる時間を短縮した。これによって、Hes1遺伝子の発現動態を振動発現から減衰振動に改変した。以上の手法により、発現振動が神経分化に与えている影響の解明を試みた。Hes1遺伝子のイントロン配列を除去したノックインマウス(Hes1イントロン欠損マウス)を新たに作製した。Hes1イントロン欠損マウスでは、野生型マウスに比べ体のサイズが小さくなる傾向が認められた。細胞分裂・細胞死について観察したところ、Hes1イントロン欠損マウスでは、細胞分裂の数が少なくなり、細胞死に至る細胞の数が多くなる傾向が認められた。これらのことが起因となり、体のサイズを縮小化させている可能性がある。Hes1イントロン欠損マウスの脳では、Hes5遺伝子の発現量が増加していた。神経発生過程において、Hes5遺伝子は、Hes1遺伝子と同等の機能を担い補償的に作用することが知られている。そこで、Hes5遺伝子の相補的影響を排除するため、Hes1イントロン欠損マウスとHes5欠損マウスを掛け合わせた二重変異マウスを作製し、神経分化過程を解析した。二重変異マウスの大脳皮質において、基底側面における細胞分裂の数が増加していた。この結果は、中間前駆細胞の数が増大したことが示唆される。それに応じ、二重変異マウスでは、大脳皮質の深層ニューロン、浅層ニューロンの層が肥大化した。この結果は、神経分化のタイミングが加速化していることが示唆できる。上記の結果より、Hes1遺伝子の発現振動自体が、神経幹細胞の増殖や神経分化のタイミングの制御に重要な機能を担っていることが明らかになった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。Hes1遺伝子の発現振動はHes1タンパク質が自身の転写を抑制するネガティブフィードバックにより調節される。また、Hes1の発現振動は微分方程式を用いた数理モデルで表され、この数理モデルから、転写・スプライシングに要する時間が安定した発現振動を維持する上で重要であると予測された。しかし、Hes1遺伝子の短周期的な発現振動が神経分化にどのような影響を与えるかは未解である。この問題を解決する手法として、Hes1遺伝子のイントロン配列を除去し、転写・スプライシングに要する時間を短縮することで、発現動態を改変を試みた。Hes1遺伝子のイントロン配列を除去したマウス(Hes1イントロン欠損型マウス)とHes1転写活性レポーターマウスを掛け合わせ、得られた胎児由来の神経前駆細胞を分散培養し、Hes1の発現動態を解析した。結果として、Hes1イントロン欠損型マウスでは野生型より短周期で振動が維持された。また、Hes1イントロン欠損型マウスは体の大きさが小さくなることが認められた。Hes1イントロン欠損型マウスの胎児脳において、Hes5の発現が上昇していた。神経発生過程において、Hes5はHes1と協調(補償)的に機能することが知られている。そこで、今後Hes1遺伝子のイントロン配列およびHes5遺伝子を同時に欠損したマウスを作出し、神経分化に与えている影響を解析する予定である。平成29年度は、Hes1遺伝子のイントロン配列を全て除去したノックインマウス(Hes1イントロン欠損型)の作製ならびに変異マウスにおけるHes1遺伝子の発現振動を解析することを目標とした。ノックインマウスの作製は完遂し、変異マウスにおいてHes1遺伝子の発現振動の短周期化を認めた。加えて、神経発生過程におけるHes1イントロン欠損型マウス脳の解析も進めており、おおむね順調に研究は進展していると考えられる。

そこで、Hes5遺伝子の相補的影響を排除するため、Hes1イントロン欠損マウスとHes5欠損マウスを掛け合わせた二重変異マウスを作製し、神経分化過程を解析した。二重変異マウスの大脳皮質において、基底側面における細胞分裂の数が増加していた。この結果は、中間前駆細胞の数が増大したことが示唆される。それに応じ、二重変異マウスでは、大脳皮質の深層ニューロン、浅層ニューロンの層が肥大化した。この結果は、神経分化のタイミングが加速化していることが示唆できる。上記の結果より、Hes1遺伝子の発現振動自体が、神経幹細胞の増殖や神経分化のタイミングの制御に重要な機能を担っていることが明らかになった。Hes1遺伝子のイントロン配列を削除することで、野生型に比べ転写・スプライシングに要する時間がどの程度早くなったのかを解析し、数理モデルと比較し議論する。Hes1遺伝子のイントロン配列およびHes5遺伝子を同時に欠損した二重変異マウスの脳を用い、神経分化・細胞増殖に着目した解析を進める。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
覚醒調節の分子機構に関する研究

ヒスタミンH_1受容体(H_1R)の遺伝子欠損(KO)マウスは、野生型マウスと同じ睡眠覚醒を示したが、ノンレム睡眠中の16秒以内の短期覚醒の回数と腹腔注射刺激後の入眠潜時が半減した。同様の変化は、野生型マウスへのH_1R拮抗薬(ピリラミン)投与により再現された。さらに、H_3R拮抗剤(シプロキシファン)投与は、野生型とH_1R-KOマウスの前頭葉におけるヒスタミン放出を同様に増大させ、野生型マウスの覚醒時間を延長したがH_1R-KOマウスの覚醒時間を変化させなかった。以上の結果は、H_1Rがノンレム睡眠から覚醒への変化に重要な役割を果たし、H_3R阻害剤の覚醒作用に不可欠であることを示している。前脳基底部クモ膜下腔へのアデノシンA_<2A>受容体(A_<2A>R)作動薬(CGS21680)の注入は、ラットの覚醒時間を短縮し前頭葉におけるヒスタミン放出を抑制した。A_<2A>R作動薬は麻酔下ラットの前頭葉と視索前野におけるヒスタミン放出を抑制し、結節乳頭核におけるGABA放出を増加させたが、前頭葉のGABA放出は変化させなかった。さらに、A_<2A>R作動薬による結節乳頭核のヒスタミン放出の抑制は、同部位へのGABA_A拮抗剤の投与により阻害された。これらの結果は、A_<2A>R作動薬がヒスタミン系覚醒中枢でのGABA放出に伴う活動抑制により覚醒を抑制することを示している。カフェインによる覚醒はアデノシン受容体に対する拮抗作用と考えられてきたが、脳内に存在するA_1とA_<2A>の2種類のアデノシン受容体のいずれが関与するのか不明であった。そこで、それぞれの受容体のKOマウスに対するカフェインの効果を調べた。その結果、カフェイン投与は、野生型マウスとA_1受容体KOマウスの覚醒を用量依存的に延長したが、A_<2A>R-KOマウスの睡眠覚醒に全く影響を与えなかった。従って、カフェインの覚醒反応はA_<2A>Rの拮抗作用によると考えられる。ヒスタミン神経系は、ヒスタミンH_1受容体(H_1R)を介して覚醒の維持に重要な役割を果たすと考えられている。そこで、覚醒調節におけるH_1Rの役割を明らかにするために、H_1R遺伝子欠損(KO)マウスにおけるヒスタミン神経系と睡眠覚醒調節の変化を調べた。生理的条件下において、KOマウスは野生型マウスと同じ睡眠覚醒周期を示したが、16秒以内のマイクロ覚醒の回数が減少し、ノンレム睡眠周期が延長した。H_3R拮抗剤シプロキシファンの投与は、野生型マウスとKOマウスの前頭葉におけるヒスタミン放出を同様に増大させ、野生型マウスの覚醒を増加させたがKOマウスの覚醒時間を変化させなかった。これらの結果は、H_1Rがノンレム睡眠から覚醒への変化に重要な役割を果たし、H_3R阻害剤の覚醒作用に不可欠であることを示している。一方、アデノシンA_<2A>受容体(A_<2A>R)はPGD_2誘発睡眠に重要な役割を担うが、A_<2A>

Rが仲介する睡眠の分子機構は明らかでない。そこで、A_<2A>R作動薬CGS21680の睡眠誘発とヒスタミンおよびGABAの放出に対する効果を調べた。非拘束ラットの前脳基底部クモ膜下腔へのCGS21680の注入は、睡眠誘発を引き起こし、前頭葉におけるヒスタミン放出を抑制した。そして、このヒスタミン遊離と睡眠誘発には負の相関が見られた。麻酔下のラットにおいて、CGS21680は前頭葉と視索前野におけるヒスタミン放出を抑制し、ヒスタミン系覚醒中枢である結節乳頭核におけるGABA放出を増加させたが、前頭葉のGABA放出は変化させなかった。さらに、CGS21680による結節乳頭核のヒスタミン放出の抑制は、同部位へのGABA_A拮抗剤の投与により阻害された。これらの結果は、覚醒中枢でのGABA放出の増大に伴うヒスタミン神経系の阻害により、A_<2A>R作動薬が睡眠を誘導することを示している。アデノシンはPGD_2と同様に内因性睡眠物質の有力な候補物質であり、カフェインの摂取による覚醒反応は、脳内のアデノシン受容体に対する拮抗作用によるものと考えられている。しかし、脳内に存在するA_1とA_<2A>の2種類のアデノシン受容体のいずれが、この覚醒作用に関与するのか不明であった。そこで、それぞれの受容体の遺伝子欠損(KO)マウスの睡眠覚醒に対するカフェインの効果を調べた。その結果、カフェインの投与は、野生型マウスとA_1受容体KOマウスの覚醒時間を用量依存的に延長したが、A_<2A>受容体KOマウスの睡眠覚醒に全く影響を与えなかった。従って、カフェインの覚醒反応はアデノシンA_<2A>受容体の拮抗作用によって引き起こされると考えられる。一方、脳内移行性の高いヒスタミンH_1受容体(H_1R)拮抗薬が催眠効果を示すことから、ヒスタミン神経系は覚醒の維持に重要な役割を果たすと考えられている。そこで、覚醒調節におけるH_1Rの役割を明らかにするために、H_1R-KOマウスにおける睡眠覚醒調節の変化を調べた。H_1R-KOマウスの生理的条件下におけるノンレム睡眠とレム睡眠の日内変動は野生型マウスと同じであったが、ノンレム睡眠中の16秒以内のマイクロ覚醒の回数と腹腔注射刺激後の入眠潜時が半減した。同様の変化は、野生型マウスへのH_1R拮抗薬(ピリラミン)の投与により再現された。さらに、H_3R拮抗剤シプロキシファンの投与は、野生型マウスとH_1R-KOマウスの脳内ヒスタミン放出を同様に増大させ、野生型マウスの覚醒を増加させたがH_1R-KOマウスの覚醒時間を全く変化させなかった。これらの結果は、H_1Rがノンレム睡眠から覚醒への変化に重要な役割を果たしヒスタミンの覚醒作用に不可欠であることを示している。
生体内で持続発現を可能にする新規レトロウイルスベクターの開発

1)マウスES細胞における抗サイレンシング効果の検討幹細胞を標的とした遺伝子治療への応用性を検討する目的で、マウスES細胞CCEにおけるウニArsインスレーターを有するベクターの抗サイレンシング効果を検討した.この試験においてArsインスレーターによる抗サイレンシング効果が認められたが、その効果はArsインスレーターの挿入方向に依存していた。2)インスレーター間の能力比較異なるインスレーター間の効果の相違を検討する目的で、ウニArs及びニワトリHS4インスレーターによる抗サイレンシング効果を比較した。いずれかのインスレーターを含むマウス白血病ウイルス由来ベクターを骨髄由来細胞HL60に導入して抗サイレンシング効果を検討したところ、いずれのインスレーターも抗サイレンシング効果を有しており、その活性は同程度であった。3)Arsがベクター内部のクロマチン構造に及ぼす影響Arsインスレーターによる抗サイレンシング効果の作用機序を明らかにする目的で、Arsインスレーターがベクター内部のクロマチン構造へ及ぼす影響を検討した。ヒストンH3のアセチル化をクロマチン免疫沈降法により測定し、クロマチンの活性化レベルの指標とした。内部プロモーターであるサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターにおいては、サイレンシングが回避されたベクターで高度なアセチル化が認められが、Arsインスレーターのアセチル化レベルは抗サイレンシング効果の有無とは相関しなかった。このことから、Arsインスレーターによる抗サイレンシング効果にはベクター内部のクロマチン構造の維持が関与している可能性が示唆された。ウニArsインスレーターを3'側long terminal repeat(LTR)U3領域に有するレンチウイルスベクターを構築した。内部のCMVプロモーターよりGFP・ハイグロマイシン耐性の融合遺伝子の発現をレポーターとして用いている。このウイルスをpackaging細胞で発現させレコンビナントウイルスを作成した後に様々な細胞への感染を行い感染細胞をハイグロマイシンで選択(4週間)後、感染細胞だけの存在を確認した後にハイグロマイシンを除去しGFPの減衰を経時的に測定した。ウニArsインスレーターは骨髄性白血病細胞株HL-60ではサイレンシングを抑制したが、肝細胞株Huh7、赤白血病細胞株K562などではサイレンシング抑制効果は認められなかった。HL-60で分化を誘導させたところGFPの抑制が生じ、分化によって起こるサイレンシングにはウニArsインスレーターは働かないことが明かとなった。またエンハンサー遮断効果を指標に単離したヒトゲノムDNA断片の抗サイレンシング効果を解析したが、細胞株で効果は認められなかった。以上の研究からインスレーターの抗サイレンシング効果は細胞種に依存し、分化によっても失われることが示され、今後の遺伝子治療のためには更に強力で分化に伴うサイレンシングにも抵抗性を示すインスレーターが必要であることが明かとなった。現在、新規インスレーターのスクリーニングを継続中である。
異物排出システム群の連携作動解析による多剤耐性緑膿菌感染症の新規化学療法の開発

緑膿菌による高齢者や免疫不全患者での重篤な難治感染症における抗菌薬耐性の軽減を目指し、異物排出に働くマルチコンポーネント型排出システムの機能および発現制御機構を解析し、下記の結果を得た。1.基質認識機構:基質認識の本体であることを明らかにしたRNDコンポーネント分子内の基質認識アミノ酸を解析したところ、E.coliのRNDであるAcrBのX-線結晶のポケット構造に相当する領域に基質認識に寄与するPheクラスター構造が存在することが分かった。2.抗菌薬耐性および病原性への関与:病原性に関与する代謝産物の細胞外輸送の可能性を調べた。MDCK細胞モノレイヤ透過実験系から、MexAB-OprM排出システムの欠損は細胞侵入性を失わせることが分かった。これは白血球減少マウスでの病原性の喪失と一致した。3.発現制御機構:緑膿菌シグマ因子σDとσSタンパク質を大量精製し、試験管内での転写系、DNA-タンパク質結合反応、in vivoプロモーター活性を測定することにより、現在ゲノム上で確認されている12種類の排出系遺伝子プロモーターのシグマ因子特異性の決定を行い、転写制御機構と転写制御機構全体像の解明を行っている。排出システム阻害薬のデザインを目指した基質認識の分子機構の解明と緑膿菌細胞での排出システムの発現と機能の解明の二面から研究を進めてきた結果、1)阻害薬のデザインのための分子構造に関する有用な情報を提供することができた。2)排出システムが病原因子の排出にも機能していることから、排出システムの機能の阻害は抗菌薬耐性の軽減のみならず、緑膿菌の病原性の低減にも繋がることが分かった。このように、多種の排出システムを秘めた緑膿菌で、排出システムの機能の網羅的な解明は本菌感染症の新規化学療法を開くものと期待される。