hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨髄由来サプレッサー細胞による免疫調節機構の解明と癌治療への応用

骨髄由来サプレッサー細胞(MSDC)は癌の増殖に伴って誘導される、未分化な細胞集団であり、炎症を抑える因子として注目されている。しかし、その性状は明らかにされていなかった。本研究において、申請者は癌の増殖によって誘導されるMDSCが、炎症抑制物質であるプロスタグランジンD2(PGD2)を産生することで、癌の増殖や転移を制御する働きを持つことをマウスモデルを用いて証明した。骨髄由来サプレッサー細胞(MSDC)は癌の増殖に伴って誘導される、未分化な細胞集団であり、炎症を“抑える"因子として注目されている。しかし、その性状は明らかにされていない。申請者は癌の増殖によって誘導されるMDSCが、炎症性脂質メデイエーター(ILM)を産生することで、癌の悪性度を制御しているという知見を得た。本研究では“ILMシグナルを軸としたMDSCsの免疫調節機構を解明し、癌の増殖や転移の抑制に応用する基盤技術の創出を目指すこと"を目的に、平成25年度は以下の項目について研究を行った。1ILM産生MDSCの特定と癌に与える影響の検討:MDSCには単球系と顆粒球系の2つが存在する。本項目ではまずILM KOマウス用いて、MDSCから産生されるILMがa)癌の増殖・転移と薬物感受性、b)原発・転移の両巣における免疫反応に与える影響を解析した。2癌原発巣においてはILMを発現する単球系MDSCが多く浸潤すること、この欠損が血管新生を促進して癌の増殖を加速させることを明らかにした。3癌の転移巣において顆粒球系MDSCが多く浸潤しており、この細胞がILMを発現していること、それを欠損すると癌の転移が抑えられることが分かった。申請者は癌の増殖によって誘導されるMDSCが、炎症性脂質メデイエーターを産生することで、癌の悪性度を制御しているという知見を得た。がん研究は、この脂質メディエーターシグナルを軸としたMDSCsの免疫調節機構を解明し、癌の増殖や転移の抑制に応用する基盤技術の創出を目指すことを目的に遂行している。平成25年度までに、がん原発巣と転移巣におけるMDSCの増加や、表面抗原解析、さらにはそこから産生させる脂質ががんの悪性度に与える影響の評価を行ってきた。平成26年度は以下の項目について研究を行った。1産生MDSCの特定と癌に与える影響の検討:脂質産生酵素の遺伝子欠損マウスや、細胞特異的遺伝子欠損マウスを用いることで、MDSCから産生される生理活性脂質が、がんの増殖を抑制するとともに、転移を促進する知見を得ることができた。さらには薬物感受性をも変化させることを示唆する知見を得ることに成功した。2各巣においてMDSC由来の脂質が、病巣におけるサイトカイン産生やNO産生に影響をあたえることで、がんの微小環境における炎症反応を制御することを明らかにした。MDSC由来の生理活性脂質が、がんの増殖や転移に影響をあたえているという当初の仮説とその機構解明を進めることができている。それに加えて、H25年に確立した新しいがんの標識方法を用いて、H26年度には予測していなかった実験データをさらに得ることにも成功した。本研究では“PGD2シグナルを軸としたMDSCの免疫調節機構を解明し、癌の増殖や転移の抑制に応用する基盤技術の創出"を目指す。平成27年度は以下の項目について研究を行った。1PGD2産生MDSCが癌に与える影響の検討:MDSCから産生されるPGD2が癌の微小環境における炎症反応を制御することを遺伝子欠損マウスを用いて証明した。また、PGD2の有無が抗がん剤感受性にも影響を及ぼすことを明らかにした。2MDSCから産生されるPGD2が癌の増殖を抑制する機構の解明:増殖するがん組織には、単球系のMDSCの浸潤が多く観察されることを明らかにした。3MDSCから産生されるPGD2が癌の転移に与える影響の解明:転移刺激に反応して組織にMDSCの浸潤が観察されることや、浸潤してきたMDSCからPGD2の産生が観察されることを確認した。4バイオインフォマティクスを用いたMDSCサブタイプの新規分類と性状予測:癌の原発巣と転移巣から単離したMDSCを対象に、プロテオーム解析を進め、表面抗原解析や産生脂質の解析を行った。進捗状況を各項目別にみると。1PGD2産生MDSCが癌に与える影響の検討、2MDSCから産生されるPGD2が癌の増殖を抑制する機構の解明、4バイオインフォマティクスを用いたMDSCサブタイプの新規分類と性状予測それぞれの項目についてはほぼすべての実験を遂行することができ、有益な成果を得らることができた。。3MDSCから産生されるPGD2が癌の転移に与える影響の解明については、実験は遂行できたものの、癌原発巣と転移巣での有意な差を見出すにはまだ至っておらず当初の仮説とは若干違った成果を得るに至った状況にある。今後実験手法を変更するなどして新たな成果を得ていきたい。骨髄由来免疫抑制細胞(MDSC)は、組織の慢性炎症に伴う発がんや増殖、転移を含む炎症刺激に反応して骨髄より誘導される未成熟な免疫細胞の集団であり、炎症を"抑える"免疫細胞群として注目されている。しかし、その性状については不明な点も多い。

申請者はこのMDSCが炎症抑制性の脂質メディエーターとして知られる、プロスタグランジンD2を多く産生していることを予備知見として見出した。そこで、本提案ではMDSCがマウスの癌移植モデルの増殖や転移に与える影響について、特にPGD2の産生とその作用に注目して解明することを目的とした。最終年度となる平成29年度において、申請者は、1マウスの移植肺癌と皮膚癌モデルを用いて、MDSCが産生するPGD2が癌の増殖を抑える働きをもつこと、2その機構として、PGD2は癌の中の血管の透過性や新生を強力に抑える働きを持つことをまず証明した。さらに、3マウスの肺癌と皮膚癌の転移モデルを用いて、MDSCが産生するPGD2が、癌の転移をも制御する働きをもつこと、その作用はPGD2受容体の1つであるDPを介していることを証明した。4その詳細な機構としてPGD2がMDSC自身のサイトカイン産生やケモカイン産生を調節する働きをもつことも明らかにし、5この受容体刺激がマウスにおける癌転移を有意におさえることを発見した。これらの成果は、将来の癌の増殖、転移の治療法開発に大きく寄与する可能性がある。これらの成果は学会発表と論文発表という形で公表した。骨髄由来サプレッサー細胞(MSDC)は癌の増殖に伴って誘導される、未分化な細胞集団であり、炎症を抑える因子として注目されている。しかし、その性状は明らかにされていなかった。本研究において、申請者は癌の増殖によって誘導されるMDSCが、炎症抑制物質であるプロスタグランジンD2(PGD2)を産生することで、癌の増殖や転移を制御する働きを持つことをマウスモデルを用いて証明した。ILMがMDSCの生理活性を制御することで癌の増殖や転移に影響をあたえているという当初の仮説をサポートするデータを得ることができた。それに加えて、新しい癌の標識方法の確立に成功することができ、予定していなかった新たな証拠となる実験データを得ることにも成功した。今後生理活性脂質がMDSCの生理活性や分化をどのように制御しているのか、受容体シグナルを中心とした機構を明らかにするとともに、がんの増殖や転移の治療への応用を見据えた実験を進めていく。本研究では“PGD2シグナルを軸としたMDSCの免疫調節機構を解明し、がんの増殖や転移の抑制に応用する基盤技術の創出を目指すこと"を目的に、今後以下の項目について研究を行う。1これまでにMDSCから産生されるPGD2ががんの微小環境の炎症に影響を与え、発がんやがんの増殖、転移の効率を変化させることを明らかにしてきた。今後は、これらががんの薬剤感受性に与える影響の評価とその機構解明を行っていく。2単球系のMDSC由来のPGD2ががんの血管透過性や新生に影響を与えることを明らかにしてきた。今後この影響を仲介する受容体シグナルを明らかにするとともに、その治療応用に挑戦する。3顆粒球系MDSC由来のPGD2ががん転移に影響を与えることを明らかにしている。今後、受容体シグナルを含めた機構解明を行い、治療応用に挑戦する。4がん増殖原発巣や転移巣、薬剤耐性がんから単離したMDSCの生理活性がなぜ変化するかについての解明を行っていく。平成28年度は本研究の最終年度であるため、各項目についてまとめ、報告していく。28年度が最終年度であるため、記入しない。
コケ窒素同位体を用いた東京西部における大気窒素沈着状況の把握

脱窒菌法を用いた新たな植物窒素生理特性測定としての体内硝酸同位体比測定について測定法の開発を行った。植物の乾燥処理、その後の抽出などについての検討を行い、高温での乾燥及び凍結乾燥では、硝酸の安定同位体比が変化することを突き止め、最適温度環境についての検討を終了した。実際の野外サンプル(コケ)について測定を行い、コケ体内中の硝酸態窒素が、予想されるインプット硝酸(降水、排ガス、土壌など)と良い一致を見せていることを明らかにした。この結果について論文をまとめ、Environmental Pollusion誌に掲載された。また、木本植物体中の硝酸についても測定を行い、植物体内のどの部位で硝酸還元が生じるかが、種によって大きく異なることを明らかにした。これについても論文としてまとめ、Biogeochemistry誌に掲載された。コケを用いた硝酸吸収実験についても論文化を進めることができ、2012年5月現在で再投稿を終えたところである。しかし、査読コメントでも指摘されたとおり、実験条件が少なすぎるという点が同位体分別の包括的な理解には未だ問題であり、今後の研究の中でより現場のコケの窒素吸収環境に即した実験系を組むことが、課題として残された。また、コケの窒素安定同位体比の解析に、コケ硝酸同位体比の情報が、硝酸吸収能のパラメーターとして役立つことがわかり、これについても、国際学会誌に論文を投稿している。2009年11月に来日後、微量安定同位体比測定の記述を修得し、現在、コケの安定同位体位比測定法について検討を開始した。コケに含まれる微量の硝酸は、降水硝酸の同位体シグナルを保存していると考えられるが、どのように抽出するべきかという方法論、さらには体内での同化によってどのような同位体分別が生じるかといった生理特性については全くわかっていない。そこで、現在、園芸用に栽培されたコケをモデルケースとして、乾燥方法、週出方法についての検討を行っている。コケの硝酸還元能力は極めて高く、凍結乾燥させた試料では、硝酸抽出中に体内に保存されていた硝酸が還元され、低い濃度、高い同位体比を示してしまうことが判明した。現在、恒温で硝酸還元活性を止めた上で、有機物の阻害などの影響を受けずに硝酸同位体比測定が可能であるか、最適プロトコルを探索中である。コケの硝酸吸収能力とその同位体分別の関係を明らかにすることがコケ同位体比を降水の指標として利用する際には必要であり、現在、室内培養実験を行い、コケの硝酸吸収速度の大小と、その時に発揮される同位体分別について明らかにしようと試みている。窒素と酸素の分別の比は、0.5から1とこれまで植物プランクトンで報告されている値に近く、硝酸同化における同位体分別については、同様なメカニズムで制御されていることが示唆された。現在、更に実験を進め、この窒素酸素比が安定であるのか、さらには他の種類のコケでも同様なのかについて議論を行う予定である。脱窒菌法を用いた新たな植物窒素生理特性測定としての体内硝酸同位体比測定について測定法の開発を行っている。現在までのところ、植物の乾燥処理、その後の抽出などについての検討を行い、高温での乾燥及び凍結乾燥では、硝酸の安定同位体比が変化することを突き止め、最適温度環境についての検討を終了した。この結果について論文をまとめ、国際学会誌に投稿したが却下され、現在異なる国際学会誌に投稿中である。これについても現在論文としてまとめており、5月に国際学会誌に投稿予定である。コケを用いた硝酸吸収実験についても論文化を進めているものの、より詳細かつ慎重な実験設定が必要であるとの指摘を国際学会での発表時にうけたため、コケを使った硝酸吸収実験を再度行い、1年目に得られた結果をあわせ、植物による硝酸吸収における同位体分別について定式化を行う予定である。また、硝酸だけでなく硝酸還元で生じる亜硝酸についても同位体比測定を行い、より詳細な同位体分別についての議論を展開できるようにすることを予定している。

また、コケの窒素安定同位体比の解析に、コケ硝酸同位体比の情報が、硝酸吸収能のパラメーターとして役立つことがわかり、これについても、国際学会誌に論文を投稿している。
抗りん酸化チロシン抗体によるヒト癌細胞内の標的蛋白の総合的分析と癌診断への応用

1.放射性ヨード標識による燐酸化チロシン含有蛋白(PTYR蛋白)の検出。ヒト癌試料中のPTYR蛋白検出のため本法を開発した。本法は細胞培養が不要であり、また、燐酸の代謝回転に関係なく検出可能であるので、従来法では検出されるいPTYR蛋白の検出に成功している。2.ヒト癌におけるPTYR蛋白の分析。(1)蛍光抗体法-PTYRに対する単クロン抗体を用いて、各種ヒト白血病細胞、および各種固形癌細胞におけるPTYR蛋白の局在を調べた。全例の悪性腫瘍細胞の細胞質と核小体に有意な蛍光像を認めたが、正常な細胞は殆んど陰性であった。特に重要な発見は、完全寛解の白血病患者の骨髄中に陽性細胞を認めたことで、その臨床的な意義を明らかにする必要がある。(2)放射性ヨード標識によるPTYR蛋白の検出。手術摘出による各種癌組織とその癌の周囲の正常組織におけるPTYR蛋白を調べ、28種のPTYR蛋白を検出した。さらに【V_8】プロチアーゼでの限定分解で36KPTYR蛋白がある種の癌では正常のものと異なっている可能性を認めた。(3)ヒト白血病細胞K562と、成人T細胞白血病由来の各種細胞株の細胞表面のRTYR蛋白を検出する方法を開発し、前者では45K436K、後者では64Kなどの特異的な表面PTYR蛋白を同定した。PTYR基が細胞表面の外部に存在することは新らしい発見で、その機能、意義が今後の興味ある問題である。
豚コロナウイルスの病原性発現への宿主プロテアーゼの関与

腸管病原性の豚伝染性胃腸炎ウイルス(TGEV)の欠損変異ウイルスである豚呼吸器コロナウイルス(PRCV)は呼吸器親和性で非病原性である。この病原性の相違は標的細胞でのプロテアーゼ依存性増殖能差の可能性について検討した。腸管及び肺由来プロテアーゼは両ウイルスの培養細胞での増殖に影響を及ぼさなかった。どの場合にも、TGEVはPEDVと比較して、100倍以上高い増殖を示した。増殖差に自然免疫が関与しているかを、インターフェロン感受性及び耐性細胞を用いて検討したが、その関与は認められなかった。今後、両ウイルスの病原性に欠損部位が関与しているのかを組み換えウイルスを用いて解析する必要がある。豚伝染性胃腸炎ウイルス(TGEV)と豚呼吸器コロナウイルス(PRCV)は、相同性が高く、同じ受容体、アミノペプチダーゼN(APN)を利用して細胞に感染するが、TGEVは腸管感染し下痢の原因となり、一方PRCVは腸管には親和性を示すことなく、呼吸器系で軽微な感染を引き起こす。また、両ウイルスの受容体結合蛋白であるS蛋白には相違があるが、受容体結合部は保存され、受容体の違いによる組織親和性の違いは説明できない。本研究では、両ウイルスの組織親和性の違いは、ウイルス感染が活性化されるプロテアーゼの相違により決定されるのではないかと考え研究を開始した。本年度は両ウイルス感染細胞を様々なプロテアーゼ(トリプシン、キモトリプシン、サーモリジン、エラスターゼなど)で処理することにより、感染増強があるかを細胞に対する多核巨細胞形成で比較した。いずれのプロテアーゼ処理によっても、両ウイルス感染細胞では巨細胞が形成されることはなく、感染増強はないと考えられた。SARSコロナウイルスでは感染細胞を上記のプロテアーゼの処理により、巨細胞形成と感染増強が認められている。また、MERSコロナウイルスもSARSと同様プロテアーゼによる感染増強が認められている。本研究で検討した豚のコロナウイルスはSARSウイルスなどとは異なる機構で感染が活性化されることが示唆された。豚コロナウイルスである豚伝染性胃腸炎ウイルス(TGEV)は消化器官に親和性、病原性を示し、TGEVからの変異で出現したと考えられる豚呼吸器コロナウイルス(PRCV)は、腸管病原性がなく、むしろ呼吸器に親和性を示し、弱い呼吸器疾患を引き起こすことが報告されている。TGEVと比べPRCVのスパイク(S)遺伝子は大きな欠損があり、その欠損が組織親和性、病原性の相違ではないかと考えられている。即ち、TGEVのS蛋白は腸管内酵素により活性化され、感染性や組織障害性が上昇するが、一方PRCVのS蛋白はそのような性質を欠損する可能性がある。我々はこの仮説を検証するため、昨年はトリプシン、キモトリプシンなど消化器に存在するプロテアーゼによるウイルスの感染増強を比較したが、両ウイルス間で差異は認められなかった。本年は、消化管の主なプロテアーゼであるパンクレアチンの両ウイルスに対する増殖性増強及び感受性差異について検討した。その結果、両ウイルスともパクレアチン存在下でのウイルス増殖は殆ど増強されることはなく、また、抑制されることはなかった。一方、様々な濃度のパンクレアチン処理によるウイルス感染性の低下も両ウイルスで差異がなく、パンクレアチンによる不活化が病原性発現の原因となる可能性もないと思われた。本年度行ったパンクレアチンと昨年度行ったトリプシン等を実験結果から、TGEVの腸管親和性とPRCVの呼吸器親和性は、腸管に存在するプロテアーゼによって決定されているものではないことが示唆された。PRCVはTGEVと比較して、培養細胞に対する細胞毒性が有為に低く、動物でも違う組織親和性を示すのではなく、単に培養細胞と同様の現象がおこっているだけなのかもしれない。このことは、動物を用いて初めて検証できることであり、今後の課題である。豚コロナウイルスの豚伝染性胃腸炎ウイルス(TGEV)と豚呼吸器コロナウイルス(PRCV)は相同性が高く、TGEVは急性の胃腸炎を引き起こし、高い病原性を示すが、PRCVは、非常に微弱な呼吸器症状を起こすに止まる。我々は、この病原性の相違は、両ウイルスの標的臓器での増殖の差によるものではないかと考え、どのようにして増殖差が起こるのかを検討した。SARSでは、肺のエラスターゼがウイルス増殖を亢進させ、病原性の上昇にも関与することが報告されており、昨年度までTGEVとPRCVの場合にも、CPK細胞を用い宿主プロエアーゼがウイルス増殖に関与している可能性について検討したが、プロテアーゼの効果は認められなかった。CPK細胞での増殖は、一貫してTGEVがPRCVと比べ、100倍ほど高かった。そこで、両ウイルスの増殖には、インターフェロン(IFN)などの自然免疫が関与している可能性を考え、ウイルス感染によりIFNを産生するHeLa細胞とIFN欠損のVero細胞を用いて両ウイルス受容体の豚アミノペプチダーゼN(pAPN)の恒常発現細胞を樹立し、両ウイルスに対する感受性を比較測定した。その結果、いずれの細胞でもTGEVがPRCVより高い増殖性を示し、その差はCPK細胞と比べより大きかった。以上の結果から、両ウイルスの病原性や臓器特異性は宿主プロテアーゼやIFNの影響より、ウイルス自身が持つ増殖性能力による可能性が高いことが推測された。TGEVと比べPRCVにはスパイク遺伝子、ORF3遺伝子に欠損があり、これらの欠損がウイルスの増殖性に大きく関与している可能性が考えられる。

腸管病原性の豚伝染性胃腸炎ウイルス(TGEV)の欠損変異ウイルスである豚呼吸器コロナウイルス(PRCV)は呼吸器親和性で非病原性である。この病原性の相違は標的細胞でのプロテアーゼ依存性増殖能差の可能性について検討した。腸管及び肺由来プロテアーゼは両ウイルスの培養細胞での増殖に影響を及ぼさなかった。どの場合にも、TGEVはPEDVと比較して、100倍以上高い増殖を示した。増殖差に自然免疫が関与しているかを、インターフェロン感受性及び耐性細胞を用いて検討したが、その関与は認められなかった。今後、両ウイルスの病原性に欠損部位が関与しているのかを組み換えウイルスを用いて解析する必要がある。引き続き他のプロテアーゼによる両ウイルスの活性化を検討するとともに、当初、予測していたのとは全く別の機構により、TGEVとPRCVの病原性が決まっている可能性も考えられ、別の角度からの解析も必要となる。ウイルス感染学腸管および呼吸器系で生理活性を示す他のプロテアーゼによる両ウイルスの活性化を見ると共に、TGEVとPRCVの組織親和性と病原性の違いは、単にTGEVの遺伝子欠損や変異によりPRCVが病原性を失った可能性を検討するためには、動物実験が必要であり、既に報告されている両ウイルスの受容体である豚アミノペプチダーゼNを発現するトランスジェニックマウスを用いて解析する必要がある。平成25年度に行った実験では、豚コロナウイルスのPEDVとPRCVの組織親和性及び病原性の相違が、当初予測したプロテアーゼによることを証明することはできなかった。SARSやMERSコロナウイルスでは細胞侵入機構や病原性がプロテアーゼにより大きな影響を受けることが報告されている。特に、膜結合型プロテアーゼTMPRSS2による両ウイルスの感染増強や細胞膜からの直接侵入は、このプロテアーゼが病原性発言に大きく関与していることを示唆するデータである。豚コロナウイルス感染でも同様のプロテアーゼが病原性に大きく関与している可能性がある。次年度の物品費として使用する。SARS及びMERSコロナウイルス感染では、膜結合性プロテアーゼTMPRSS2が感染増強を示すことが知られている。豚コロナウイルス受容体APN発現細胞を用いて、TMPRSS2を恒常的に発現する培養細胞を樹立し、この培養細胞に豚コロナウイルスを感染させ、増殖増強に違いがあるのか否かを観察したい。平成27年の物品費の一部として使用する。平成26年度に新実験室が取得できるので、冷凍庫、遠心機などの備品を購入するため新実験室が9月に取得できる予定なので、その後上記備品を購入予定
膀胱癌進展の分子機構におけるAurora‐Aの役割の解明および新規治療の開発

Aurora-Aは細胞分裂期に発現し、中心体の成熟・分離、双極性紡錘体の形成、G2期からM期への進入、染色体の赤道面への整列など、分裂期の中心体機能を司っているキナーゼである。さらにAurora-Aの過剰発現と癌化との関連性が明らかになりつつあり、Aurora-Aは癌遺伝子としての機能を有する可能性が強く示唆されてきた。我々が作製したAurora-Aに対するsiRNA(Aurora-A/siRNA)を含むプラスミドをヒト膀胱癌細胞株にリポフェクトアミン法にてトランスフェクションを行い、それぞれについてAurora-A/siRNAプラスミド導入細胞株とcontrol/siRNAプラスミド導入細胞株を樹立した。なお、膀胱癌細胞株としては、我々の予備実験でAurora-A高発現株であることが確認されたKoTCC-1を用いた。プラスミド導入の有無は細胞よりRNA及び蛋白を抽出し、real time RT-PCR法とWestern Blotting法にて確認した。樹立されたAurora-A/siRNA及びcontrol/siRNAプラスミド導入細胞株を同条件下で培養し、経時的な細胞増殖能をMTT assayにより比較検討した結果、いずれの膀胱癌細胞株においてもScramble/siRNAプラスミド導入細胞株に比してAurora-A/siRNA導入細胞株で有意に細胞増殖が抑制された。また、各種治療刺激に対するAurora-A/siRNA及びcontrol/siRNAプラスミド導入細胞株の感受性の違いをMTT assayを用いて評価したところ、Aurora-A/siRNA導入細胞株ではcontrol/siRNAプラスミド導入細胞株に比してdocetaxelおよびsunitinibに対する感受性が亢進した。siRNAを用いたAurora-A発現抑制は膀胱癌に対して有効な治療法となる可能性が示唆された。siRNAの臨床応用においては、現在、生体内での標的細胞へのデリバリーが問題となっているが、膀胱内注入療法が標準的な治療法である表在性膀胱癌においては、比較的容易に標的細胞に導入可能なことが期待され、docetaxelやsunitinibとの併用療法の効果も期待される。我々が作製したAurora-Aに対するciRNA(Aurora-A/siRNA)を含むプラスミドをヒト膀胱癌細胞株にリポフェクトアミン法にてトランスフェクションを行い、それぞれについてAurora-A/siRNAプラスミド導入細胞株とScramble/siRNAプラスミド導入細胞株を樹立した。なお、膀胱癌細胞株としては、我々の予備実験でAurora-A高発現株であることが確認されたUMUC3及びKoTCC-1をそれぞれ用いた。樹立されたAurora-A/siRNA及びScramble/siRNAプラスミド導入細胞株を同条件下で培養し、経時的な細胞増殖

能をMTT assayにより比較検討した結果、いずれの膀胱癌細胞株においてもScrambie/siRNAプラスミド導入細胞株に比してAurora-A/siRNA導入細胞株で有意に細胞増殖が抑制された。現在in vivoにおいても増殖能を比較検討中である。また、各種治療刺激に対するAurora-A/siRNA及びScramble/siRNAプラスミド導入細胞株の感受性の違いをMTT assayを用いて評価したところ、Aurora-A/siRNA導入細胞株ではScramble/siRNAプラスミド導入細胞株に比してDocetaxelに対する感受性が亢進した。現在、細胞周期およびアポトーシス誘導関連のシグナル伝達経路におけるAurora-A発現阻害の意義を検索するために、細胞周期およびアポトーシス関連蛋白の発現変化をWestern blottingにて検討中である。また、併用する治療刺激の種類により上述の各種効果に違いが生じるのか、あるいは治療の種類とは無関係にアポトーシス誘導刺激に対して普遍的に認められる効果であるのかを併せて評価する。Aurora-Aは細胞分裂期に発現し、分裂期の中心体機能を司っているキナーゼである。さらにAurora-Aの過剰発現と癌化との関連性が明らかになりつつあり、Aurora-Aは癌遺伝子としての機能を有する可能性が強く示唆されてきた。我々が作製したAurora-Aに対するshRNA (Aurora-A/shRNA)を含むプラスミドベクターをヒト膀胱癌細胞株にトランスフェクションを行い、Aurora-A/shRNAプラスミド導入細胞株とScramble/shRNAプラスミド導入細胞株を樹立した。なお、膀胱癌細胞株としては、我々の予備実験でAurora-A高発現株であることが確認されたKoTCC-1を用いた。プラスミド導入の有無は細胞よりRNA及び蛋白を抽出し、real time RT-PCR法とWestern Blotting法にて確認した。樹立されたAurora-A/shRNA及びScramble/shRNAプラスミド導入細胞株を同条件下で培養し細胞増殖能をMTT assayにより比較検討した結果、Scramble/shRNAプラスミド導入細胞株に比してAurora-A/shRNA導入細胞株で有意に細胞増殖が抑制された。また、各種治療刺激に対するAurora-A/shRNA及びScramble/shRNAプラスミド導入細胞株の感受性の違いをMTT assayを用いて評価したところ、Aurora-A/shRNA導入細胞株ではScramble/shRNAプラスミド導入細胞株に比してdocetaxelおよびgemcitabineに対する感受性が亢進した。
不安定腰椎の動態特性に関する研究-生体力学的、病理学的検討-

本研究の目的は、正常腰椎における矢状面動態をシネラジオグラフィーを用いて連続的に検討し、その動態特性を明らかにし、それをもとに種々の脊椎疾患における異常動態を解明することにあった。平成8年度は、まず正常腰椎における矢状面動態の特性をシネラジオグラフィーを用いて検討した。その結果、脊椎に奇形等の異常がなく腰椎の既往のない正常腰椎では、前屈時には上位レベルから下位レベルに運動開始が波及していく位相差が存在すること、そして、運動開始時刻から一定時刻が経過した時点で各椎間運動が終了する割合は一定であることが明らかとなった。一方、腰椎分離すべり症、腰椎変性すべり症などの不安定腰椎では、正常腰椎での動態パターンとは異なり、分離椎間やすべり椎間で最も早期に椎間運動が開始し、その後に他の椎間運動が開始した。さらに、分離椎間やすべり椎間では早い時期のその椎間運動の大半を終了していた。以上の内容は、平成8年10月第11回日本整形外科学会基礎学術集会ならびに日本機械学会総会で報告した。次に、正常腰椎の動態を更に詳細に検討するため、前屈動作および後屈動作という異なる体幹動作で、椎幹運動の位相差の変化や各椎体の軌跡がどのように異なるかを比較検討した。その結果、後屈動作では前屈動作と全く逆の位相、即ち下位椎間から運動を開始し上位椎間の運動はそれに引き続いて起こった。また、各椎体運動の軌跡はL2/3、L3/4、L4/5椎間では前屈運動・後屈運動でほぼ同一の軌跡となり、この関係は各椎間で傾きは異なるもののすべて一次式で近似することができた。この成果は、平成8年11月第23回日本臨床バイオメカニクス学会ならびに平成9年11月第11回北海道整形外科基礎研究会で報告した。現在は、生体力学的指標の一つであるNeutral Zoneの概念を利用し、脊椎不安定性の定性的・定量的評価法の確立のため、さまざまな数学的パラメーターを算出し、簡便かつ合理的な手法の確立に全力をあげている。
栄養処理による食肉呈味低下モデル家畜を用いた食肉の呈味形成要因の研究

栄養処理による食肉呈味低下モデル家畜を用い、食肉の呈味形成要因の検討を行った。このモデル食肉は、対照群に比較し有意に呈味が異なることを確認し、平成11年度において剪断力価及び破断強度、pHは対照群と差がないことを明らかとしている。そこで呈味変動の主要因を明らかとするためにアミノ酸及び核酸関連物質を検討し、10日間の栄養処理により遊離グルタミン酸(Glu)は35%、イノシン酸は12%、各々有意に変動し、他のアミノ酸及び核酸関連物質においてはヒスチジン及びアルギニンのみが変動を示した。化学分析値や官能評価結果の解析から、呈味の変動は主として栄養処理による食肉のGlu量の変動に由来することを明らかとした。また栄養処理による同成分の変動は若齢ほど顕著であり、前述の49日齢で35%に対し、14日齢では41%であった。次にGluの変動要因を食餌成分、つまりタンパク質、代謝エネルギー量及び他成分から検討した結果、食餌の代謝エネルギー量によりGlu濃度が調節されることを明らかとした。そこで筋肉での一連のグルタミン酸代謝関連酵素を検討し、Glutaminase活性が飼料のエネルギー量に影響され、Glu量が調節される可能性が示唆された。これらの成果については、Animal Science Journal誌への掲載が決定されたほか、第21回World Poultry Congress(WPC:Montreal)、日本畜産学会大会及び家禽学会大会にて7回の研究発表を行った。WPCでは、Meat Quality部門の報告演題から選抜され、ワークショップにおいて研究報告を行った。栄養処埋による食肉呈味低下モデル家畜を用い、食肉の呈味形成要因の検討を行っている。このモデル食肉は、対照群に比較し有意に呈味が異なることを明らかとしている。その主要因を明らかとするため、アミノ酸及び核酸関連物質に注目したが、10日間の栄養処理により遊離グルタミン酸〈Glu)は35%、イノシン酸は12%、各々有意に変動し、他のアミノ酸、核酸関連物質においてはヒスチジン及びアルギニンが変動を示した。解析の結果、呈味の変動は主として栄養処理による食肉のGlu量の変動に由来することを明らかとした。同成分の変動は若齢ほど顕著であり、前記が49日齢であることに対し、28日齢ではGluが54%の変動を示すことを明らかとした。またモデル肉のGluの変動要因を明らかとするため、食餌成分、つまり蛋白質、代謝エネルギー量及び他成分の検討を行った結果、食餌の代謝エネルギー量がGlu濃度を調節することを明らかとした。このことから糖代謝との関連について検討を進めている。一方、栄養処理による食肉の呈味変動に対する熟成の影響を検討し、熟成による影響は見られず、栄養処理は主として生体に対して影響することを明らかとした。またモデル家畜の食肉の物性の検討を進めた結果、剪断力価及び破断強度への影響は認められなかった。他の項目については、現在、検討を行っている。これらの成果については、日本畜産学会大会及び家禽学会大会にて3回の研究発表を行った。
鉱山資料から見た朱銀朱産地推定のための基礎的研究

古代人の精神生活にとって重要な役割を果たした水銀朱が、どこで採取された原料に基づくものなのかについては、それが天然のものであったか否かを含めてほとんど研究されていないのが現状であった。そこで我々は、遺跡から発見される水銀朱の産地を特定することを目的として研究を実施した。試料先ず、この目的を達成するための基礎研究として、地質調査所が日本各地の水銀鉱床から採取した辰砂鉱石678点について、分析化学的な特徴、鉱物学的な特徴を明らかにすることを主眼として研究を進めた。さらに遺跡から発見された朱として、弥生時代中期から古墳時代中期(A.D.1世紀から5世紀)に至る墳墓から発見された朱について研究を進めた。測定辰砂を粉末にして重量を計測し、王水に溶かして分析試料とした。ICP-AES(島津製作所)を用いて微量元素分析を実施した。結果当初、均一な結晶を形作る辰砂には微量元素の違いはないと思われていたが、実際には辰砂に含まれる微量元素の種類は、鉱山によって類似する傾向を示した。そこで、西日本の主要鉱山である三重県丹生、奈良県大和水銀(宇陀)、徳島県水井、東日本の主要鉱山である北海道イトムカについて、辰砂に含まれる微粒元素を比較した。その結果、各鉱山の辰砂に含まれる微量元素の違いを明らかにすることができた。本年度は遺跡から発見される水銀朱の産地を特定するための基礎研究として、以下のような目標を設定して研究を進めた。(1)日本各地の水銀鉱床から採取した辰砂の分析化学的な特徴や鉱物学的な特徴を明らかにする。(2)弥生時代・古墳時代の主要遺跡から出土した朱の分析化学的な特徴を明らかにする。(3)微量元素分析、同位体分析など、産地推定のための有効な分析方法を検討する。(4)辰砂鉱石から朱を集積する過程における微量元素の変化をつかむ。(5)遺跡から出土した朱の用途を明確につかむ。(6)産地の朱鉱石と遺跡出土の朱の特徴を比較検討する。これまでに、以下のような成果を得た。(1)北海道、三重県、奈良県、大阪府、和歌山県、岡山県、徳島県、愛媛県、高知県、大分県の水銀鉱床から採取した辰砂鉱石について、ICP-AESを用いた微量元素分析を実施した。(2)ホケノ山古墳、黒塚古墳、天神山古墳、富雌丸山古墳、小泉大塚古墳、五条猫塚、鴨都波1号墳、島の山古墳、藤ノ木古墳など、奈良県下の主要古墳から出土した朱についてICP-AESを用いた元素分析を実施した。(3)デジタル顕微鏡による不純物鉱物の特定、EPMAによる不純物鉱物の元素分析、ICP-AESを用いた微量元素分析、硫黄同位体比・鉛同位対比の測定を行った。(4)朱を集積する過程における微量元素の変化について、ICP-AESによる微量元素分析を実施した。(5)鴨都波1号墳、黒塚古墳、藤ノ木古墳から出土した朱の用途を明確につかむための調査を実施した。(6)産地の朱鉱石と遺跡出土の朱の特徴を比較検討した。たとえば、奈良県の辰砂鉱石は、他地域の試料よりも銅(Cu)、亜鉛(Zn)、砒素(As)、カドミウム(Cd)、アンチモン(Sb)、鉛(Pb)が多く含まれる傾向が明らかに認められた。さらに、奈良県で採取した辰砂鉱石を宇陀地域とそれ以外で比較した場合、砒素、アンチモン、カドミウムは宇陀地方から採取した試料に高い値を示した。また、三重県で採取し辰砂鉱石には砒素(As)が多量に含まれる傾向にあることが判明した。前年度に実施した朱鉱石の産地の違いを基礎資料として、近畿地方、北九州地方の弥生時代から古墳時代はじめ(2世紀後半4世紀初め)から発見された水銀朱を含めて比較検討した。役割分担は以下の通りである。今津節生研究の総括、走査電顕-EPMAによる朱鉱石表面の元素分布の測定遺跡から出土した水銀朱の収集(特に近畿地方を中心とする古墳出土水銀朱)

安田博幸遺跡から出土した水銀朱の収集南武志分析化学的な総括、ICP-AESとICP-MSを用いた元素量の測定豊遙秋水銀鉱石に含まれる微量鉱物の検討富田克敏朱鉱石の結晶構造と微量元素の検討本田光子遺跡から出土した水銀朱の収集(九州地方を中心とする弥生時代の水銀朱)さらに、水銀朱の構成元素であるイオウの同位体比の分析を実施した。また、貴酬省を中心とする中国の主な朱鉱石のイオウ同位対比を調査した。その結果、中国産と日本産のイオウ同位体比には明確な違いのあることが判明した。また、日本産の水銀朱のイオウ同位体比にも、一定の傾向で同位対比が変化することが判明した。また、『朱が語る山陰・大和を結ぶ古代史』と題して、近畿大学豊岡短期大学公開シンポジウムを実施した。
株主総会における議決権行使と会計情報および会計行動との関係

本研究の目的は、株主総会における株主の議決権行使に対して会計情報が果たす機能、および会計情報を利用した株主による議決権行使が対象企業の経営行動に与える影響を明らかにすることである。具体的には、以下の3つを分析課題として設定している。第1に、株主提案が日本企業の利益調整行動に与える影響である。第2に、株主総会開催日前における印象操作を目的とした経営者による利益調整行動である。第3に、議決権行使時における会計情報の利用とそれに伴う企業行動の変化である。
NKT細胞抗原受容体Vα14遺伝子再構成のメカニズムとNKT細胞前駆細胞の分化

昨年度までに得られたNKG2I(本年度よりJ-03をあらたにこのように命名した)ノックアウト/GFPノックインマウス及び抗NKG2Iモノクローナル抗体を用いて、新規NKレセプターNKG2Iの機能について詳細な解析を行った。Flow cytometryによる解析から、NKG2IはNK細胞の約80%に発現しており、thymus Vα14 NKT細胞の約20%に発現していたが、末梢においてはVα14 NKT細胞上の発現は消失していた。またT細胞には発現は見られなかった。免疫沈降の結果からNKG2IはS-S結合によりダイマーを形成していることが明らかとなった。IL-2あるいはIL-12存在下にてNK細胞表面上のNKG2IをクロスリンクすることによりIFNγ産生が誘導された。一方、抗NKG2I抗体はB6のNK細胞のBALB/c Con A blastに対する細胞障害活性を抑制し、放射線照射したB6 mouseに移植したBALB/c骨髄細胞の生着を促進した。NKG2I KOマウスにおいてはNK細胞、NKT細胞の数その他に著明な変化は認められず、これらの細胞の分化に必須な分子ではないと考えられた。NKG2I KOマウスのNK cellによるallogenic Con Ablastに対する細胞障害活性はwild typeマウスと比較して著しく低く、放射線照射したmouseに移植したBALB/c骨髄細胞の生着が著しく促進した。
眼創傷治癒におけるＴＧＦ‐βとインテグリンの相互作用の役割解明とその応用

インテグリンα11(ITGA11)は線維芽細胞上のコラーゲンレセプターであり、線維化に関与すると推測されるが、その機能についてはよくわかっていない。昨年度までに、ITGA11の細胞内ドメインと相互作用するタンパク質としてcalcium and integrin binding protein 1(CIB1)を同定していた。当該年度においてITGA11とCIB1を恒常的に発現する安定発現細胞を確立した。臓器の線維化は、コラーゲンをはじめとする細胞外マトリックス(ECM)が過剰に沈着し、臓器の機能障害をきたす病態である。plasminはfibrinを分解して血栓溶解作用を示すが、それ以外にECMを構成するフィブロネクチンやプロテオグリカンを分解する機能をもつ。その活性はセリンプロテアーゼインヒビター(セルピン)のひとつであるα2-antiplasmin(AP)によって抑制される。APが組織線維化にどのように関与するのかを明らかにするために、APと相互作用するタンパク質を探索した。APをbaitタンパク質として、肺線維芽細胞cDNA libraryに対して酵母two-hybrid法によるスクリーニングを行った。その結果、マトリックスメタロプロテイナーゼ2 (MMP-2)がpreyタンパク質の候補として同定された。APとMMP-2の結合は免疫沈降法によって確認された。2種類のセルピン(APおよびα1-proteinase inhibitor (PI))に対するMMP-2の作用を検討したところ、MMP-2はAPをランダムに切断しPIを限定分解した。また、bleomycin処理して生じたマウス肺線維化組織ではmyofibroblastによるAPの発現が亢進していた。以上の結果から、MMP-2はAPを分解することにより組織線維化抑制に関与する可能性があることが示唆された。眼創傷治癒におけるTGF-βとインテグリンの相互作用について解析するための基礎的研究を行った。線維化組織は筋線維芽細胞の過剰な存在によって特徴づけられる。これまでの研究からインテグリンを介する細胞外マトリックスと細胞骨格の相互作用が筋線維芽細胞の分化を促進することが明らかにされつつある。インテグリンα11(ITGA11)は線維芽細胞上のコラーゲンレセプターであり、創傷治癒・線維化に関わっていると推測されるが、その機能については不明な点が多い。線維化を促進する中心的役割を担うTGF-βで角膜線維芽細胞を刺激すると筋線維芽細胞様に形態が変化し、α-smooth muscle actin、fibronectin、ITGA11の発現が亢進することを見出した。ITGA11と結合する候補タンパク質としてcalcium and integrin binding protein 1 (CIB1)が同定されたので、ITGA11およびCIB1の線維芽細胞への影響を明らかにするために、ITGA11およびCIB1発現ベクターを構築し、線維芽細胞へトランスフェクションし安定発現細胞を確立した。それらの安定発現細胞はTGF-βに対する感受性が亢進した。これらのことから、ITGA11およびCIB1は臓器線維化治療の標的タンパク質となりうることが示唆された。それゆえ、筋線維芽細胞の分化を誘導する因子を理解することは過剰な結合組織増生を防ぐために重要である。インテグリンα11(ITGA11)は線維芽細胞上のコラーゲンレセプターであり、線維化に関わっていると推測されるが、その機能については不明な点が多い。線維化を促進する中心的役割を担うTGF-βで角膜線維芽細胞を刺激するとITGA11の発現が亢進することを見出した。ITGA11の細胞内ドメインをコードするcDNAを線維芽細胞cDNAライブラリーより、PCR法にてクローニングした。そのcDNAをbaitとして酵母two-hybrid法により、線維芽細胞cDNAライブラリーをスクリーニングし、ITGA11と結合する候補タンパク質としてcalcium and integrin binding protein 1 (CIB1)が同定された。ITGA11およびCIB1の線維芽細胞への影響を明らかにするために、ITGA11およびCIB1発現ベクターを構築し、線維芽細胞へトランスフェクションし安定発現細胞を確立しようと試みた。肺癌細胞株A549とPC9の培養上清が肺線維芽細胞MRC-5の活性化を抑制することを見出し、その抑制する物質は5'-deoxy-5'-methylthioadenosine (MTA)であることを同定した。MTAはTGF-βが誘導するmitogen-activated protein kinaseの活性化を抑制することにより筋線維芽細胞活性化を抑制した。24年度研究実施計画において予定していた通り、ITGA11およびITGA11の細胞内ドメインと相互作用するタンパク質であるCIB1を恒常的に発現する安定発現細胞の確立には成功した。同じく計画通りに、線維化にかかわるタンパク質であるα2-antiplasminをbaitとして酵母two-hybrid法を行い、マトリックスメタロプロテイナーゼ2 (MMP-2)をpreyタンパク質の候補として同定した。さらに、bleomycin処理して生じたマウス肺線維化組織ではmyofibroblastによるAPの発現が亢進することを見出した。しかし、それらのタンパク質を高発現させた場合、線維化に及ぼす影響についての十分な検討はできていない。

23年度研究実施計画において予定していた通り、TGF-βで角膜線維芽細胞を刺激した場合のインテグリン発現解析、ITGA11の細胞内ドメインをbaitとしての酵母two-hybrid法によるタンパク質スクリーニング、およびITGA11の細胞内ドメインと相互作用するタンパク質遺伝子のクローニングなどの実験は成功した。また、線維化にかかわる可能性のある各種タンパク質(ITGA11, CIB1、decorin、CTGF)発現ベクターの構築も予定通り遂行できた。しかし、その発現ベクターを線維芽細胞にトランスフェクションして安定発現細胞を確立しようと種々の条件を検討して試みているが、いまだ確立できていない。線維化にかかわる可能性のある各種タンパク質を恒常的に発現する安定発現細胞が確立できたので、それらの高発現するようになったタンパク質によって細胞が形態学的および生化学的にどのような影響を受けるかを解析する。具体的には、線維芽細胞の活性化の指標であるα-smooth muscle actin、細胞外マトリックスのひとつであるフィブロネクチンなどの発現、TGF-βシグナリングを担う細胞内タンパク質のひとつであるSmad3のリン酸化状態などを検討する。また、α2-antiplasminと相互作用するタンパク質の探索も引き続き進めてゆく。線維化にかかわる可能性のある各種タンパク質を恒常的に発現する安定発現細胞を確立するために、トランスフェクション試薬、細胞の培養条件などをさらに検討してみる。安定発現細胞が確立されれば、ITGA11, CIB1を高発現させた場合、細胞が形態学的および生化学的にどのような影響を受けるか解析する。具体的には、線維芽細胞の活性化の指標であるα-smooth muscle actinや細胞外マトリックスのひとつであるフィブロネクチンなどの発現、TGF-βシグナリングを担う細胞内タンパク質のひとつであるSmad3のリン酸化状態などを検討する。また、インテグリンに限定せず、線維化にかかわるタンパク質と相互作用するタンパク質のスクリーニングも引き続き行う。次年度使用額が7,101円生じた。これは当該年度の直接経費1,206,285円の約0.6%に相当する金額である。平成25年2月末の時点では、すでに当該年度に予定していた物品は購入済みであり、この金額(7,101円)で購入可能で、かつ早急に必要な物品はなかった。交付される科学研究費をできる限り有効に活用するためには、翌年度に繰り越し翌年度分の研究費と合わせて使用するのが妥当であると考えた。当該年度と同じように、翌年度も直接経費は実験試薬・消耗品をはじめとする物品の購入に充てる予定である。次年度使用額が6,285円生じた。これは当該年度の直接経費総額1,800,000円の約0.3%に相当する金額である。
熱可塑性CFRPの接合成形による高強度大型構造部材の作成法

本研究は熱可塑性CFRPを対象として高い継手効率を持つ接合構造を解明し,これを利用して部品を連結することで長尺閉断面ビームなどを成形する手法を確立することを目的としている.最終年度は以下の2つの課題に取組んだ.1.閉断面ビームの長手方向の連結前年度に製作した閉断面ビーム2本を長手方向に連結することを試み,プレスを用いて部分加熱圧着することで長尺閉断面ビーム(長さ452mm,高さ106mm,幅106mm,板厚3mm)を製作することができた.本研究で発案した接合成形法により,長尺閉断面部材をプレスで成形できることを示した.熱可塑性CFRPの接合では溶融部を加圧しながら冷やすことが高い強度を得る上で重要であるが,本研究で設計製作した金型は,油圧を用いた内圧装置とプレスのスライドに取り付ける外圧装置からなり,それぞれに加熱加圧冷却機能を統合したものとし,接合部の両面から加熱加圧冷却を1工程で完結する構造とした.本研究では2本のビームを連結したが,内圧装置はプレスのスライドとは独立して閉断面ビームの内部に設置できるので,より多くのビームの連結にも対応することができる.2.繊維の座屈を防ぐ方法の解明前年度明らかになった強度上の問題は,部分加熱圧着では加熱領域(接合しようとする領域)と非加熱領域との境界で引張破断し,その強度が周囲より低いことであった.破断部は繊維が座屈しており,これは溶融樹脂が接合時の圧力で押し出され,固体状態の樹脂にぶつかるためと考えた.そこで加熱領域の周囲の温度条件と加圧条件の効果を検証したが,強度の改善は限定的であった.この問題の解明にはより広範囲の要因探索や詳細な組織観察など引き続きの調査が求められる.平成28年度は,接合部をもつ短冊状の試験体を成形し,さまざまな接合構造を作成するとともに接合構造と接合強度との関係を研究した.接合部のない熱可塑性CFRPシートと同等の引張および曲げ強度となる接合構造を解明した.さらに閉断面ビームを成形するための部品であるU字ビームの成形を試み,所望の接合構造をもつU字ビームを成形することができた.まず基本的な接合構造としてはめ込み接合と階段接合とを作成し,強度を評価した.はめ込み接合とは,積層したシートの端部を層ごとにずらして凸状にしたものと凹状にしたものとを互いにはめ込んで加熱圧着したものを指し,接合面積が大きい.階段接合とはシートの端部が階段状になったものである.これらの強度を比較すると,引張強度ははめ込み接合で520MPa,階段接合で460MPa,曲げ強度ははめ込み接合で480MPa,階段接合で500MPaであった.はめこみ接合の接合面積は階段接合の2倍であるが強度の違いは小さい.階段接合においてシートを上からみたときの切り口の角度を45度とした場合,引張強度が520MPa,曲げ強度が550MPaとなり,接合部のないシートと同等の強度となった.このことから,接合部をある断面でみたときに繊維が連続している層が多いほど接合強度が高くなることがわかった.つぎに,端部に階段接合構造をもつU字ビームの成形を試みた.これはのちに閉断面ビームを接合成形するときの部品となるものである.平板状のシートを曲げたあとで各層の端部が3mmずつずれた階段構造を成形する必要があるが,曲げによる各層の周長差を考慮したシート寸法設計法を考案した.厚さ0.2mmの熱可塑性CFRPシートを15枚重ね,成形中に重ねたシートがずれないようクリップで固定した状態で加熱,プレス成形し,狙い通りの階段接合構造をもつU字ビームを成形することができた.平成28年度の計画では,U字ビームどうしを接合成形して閉断面ビームを作成するとしていたが,実際にはU字ビームの成形までにとどまっており,計画に対してやや遅れている.密閉金型を用いた接合構造と強度との関係の研究において,まず接合部のない連続したシートの成形で高い強度が得られる温度圧力条件を探索したが,その条件を見いだすのに時間がかかった.密閉金型そのものの変更の必要があり,途中で新たに製作しなおした.U字ビームの成形の金型製作にあたり,加工上の問題があり設計変更を行った.また試験体の強度評価では強度のばらつきがあり,接合構造ごとに繰り返し実験を行ったため評価に時間を要した.接合部の強度が接合部のないシートと同等とすることが目標であり,さまざまな接合構造を検討した結果,これは達成した.平板状のシートからU字ビームに成形する場合,シートが曲げられた上で目的の接合構造とする必要があるが,これはシート寸法設計法の解明や成形時の工夫により,当初想定していたよりも高い精度で成形することができた.要素技術の研究開発の進捗は良好であり,次のステップである閉断面ビームを成形するための金型設計は完了しているため,本年度の遅れは十分挽回できるものと考えている.1.U字ビームの成形精度の向上:成形したU字ビームどうしを接合するためには,成形後のU字ビームの両端に各層の端部が3mmずつずれた階段継手を実現することがまず重要であるが,正確にその階段継手を形成するため以下の改善を実施した.(1)積層したシートの中央部(曲げ変形を受けない領域)をあらかじめプレスで加熱圧着する.(2)金型に離型剤を塗布する.

(3)プレス成形前の加熱の際,階段継手領域を除いた部分加熱とする.これらの工夫により,U字ビーム成形中の各層の相対的なずれと金型に対するシート全体のずれを防止し,継手部の繊維の乱れを抑制し,より精度の高い継手構造を持つU字ビーム(長さ244mm,幅106mm,継手を含む高さ68mm,板厚3mm)を成形することができた.これにより成形したU字ビームどうしのはめあわせが容易になった.2.接合金型の設計製作:成形後のU字ビームどうしを接合して閉断面ビームを成形するための金型(接合金型と呼ぶ)と,その閉断面ビームを長手方向に接合する金型(連結金型と呼ぶ)を設計製作した.いずれもプレス機を用いて閉断面ビームの成形とそれらの連結を可能にするものである.3.接合による閉断面ビームの成形:接合金型を用いて継手部のみを部分加熱圧着することでU字ビームどうしを接合し,閉断面ビーム(長さ244mm,幅106mm,高さ106mm,板厚3mm)を製作するができた.接合部の表面は平滑で,内部組織の観察からはボイドなどの欠陥は見当たらず,密な組織の継手を実現できていることを確かめた.接合過程で成形品がずれないように,仮固定治具やガイドを設け,金型の改善も行った.4.接合部の強度評価:接合部の曲げ強度は615MPaで,基礎実験において密閉金型で製作した階段継手の曲げ強度と同等であることを確かめた.引張試験ではすべての試験片が継手以外の部分で破断した.その強度は325MPaであるので,継手部は少なくともそれ以上の引張強度を有すると考えられる.順調に進展していると判断した第一の理由は,閉断面ビームの成形に成功したことが挙げられる.成功に至った要因として,U字ビーム自体の成形精度を向上したことがある.昨年度成形したU字ビームは,当初の想定を上回る結果ではあったものの,金型に対するシートのずれや継手部の繊維の乱れなどの問題があり,これらをはめあわせることが困難であった.今年度はまずこれらの問題の解決を図り,概要で述べたとおりの工夫を試み,U字ビームの成形精度の向上を達成し,これらのはめあわせを容易にした.このような技術的発展があり,接合そのものを成功させることができた.第二の理由は,閉断面ビームの継手部において,高い接合強度を実現したことである.これは,精度の高い継手部どうしをはめあわせたことで,繊維の隙間のすくない密な継手構造を実現できたためである.一方で部分加熱圧着による課題も明らかになった.すべての引張試験片が継手部より外側で破断し,その強度は325MPaであり元のシートの強度に対して低い.破断した位置は,接合金型の加熱板が接触する領域との境界線であり,その内部組織を観察すると,階段継手に直行する繊維(引張方向の繊維)が局所的に座屈していることがわかった.部分加熱圧着では,圧力によって流動する溶融樹脂が周囲の固体状態の樹脂にぶつかり,それにともない繊維が座屈すると考えられる.これは部分加熱圧着における一般的な問題であるので,これの解決は重要課題である.