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チロシンキナーゼシグナリングの分子的基盤に関する研究

がん化の制御機構を分子レベルで明らかにするために、がん原遺伝子産物Srcチロシンキナーゼの制御に関わる膜アダプター蛋白質Cbp、および新たに見いだした後期エンドソームに局在するMEK1アダプター蛋白質p18の機能解析を行い以下の成果を得た。1)Cbpが活性化したSrcを膜ドメイン「ラフト」にリクルートすることによってがん化活性を抑制することを見いだし、Cbpががん抑制遺伝子として機能することを示した。2)p18がSrcによるがん化経路の必須の足場として機能することを明らかにし、p18-MEK1経路が主要ながん増殖シグナル経路となる可能性を示した。チロシンキナーゼ型がん原遺伝子産物であるSrc family kinases(SFK)は、がんの発症や悪性化との強い関連性が示唆されているが、それらの正常細胞における本質的作用や細胞がん化の分子機序に関しては未だに不明な点が多く残されている。また、がんの悪性化と関連するSFK制御系破綻の分子機序は全く不明である。そこで本研究では、SFKの機能および制御機構を分子構造レベルにまで掘り下げて徹底的に解明し、その成果に基づいて、SFKの関与するがんに対する新たな治療標的を開拓することを目指して以下の研究を行った。1)SFKの機能制御に関与するCskとCbpの複合体の構造解析を試みた。これまでに、NMR法により、CskSH2ドメインとCbpリン酸化部位との相互作用表面の同定に成功した。一方、SFK標的膜蛋白質SHPS-1の結晶構造解析を行い、そのリガンドCD-47との結合ドメインの結晶構造を明らかにした。2)SrcのトランスジェニックマウスおよびCskノックアウトマウスの解析を進め、SrcおよびCskがアクチンおよび中間径フィラメントの構築の制御に関与して細胞形態や性質の発現において中心的な役割を担うこと、また、MMP2/9などのプロテアーゼの発現誘導を介して細胞外環境の制御においても重要な役割を担うことをin vivoレベルで明らかにした。3)細胞膜ミクロドメイン「ラフト」におけるSFKの機能解析を行い、受容体エンドサイトーシスの制御における役割を明らかにし、また、その制御と関連する新たな標的蛋白質の同定に成功した。4)SrcおよびCskの本質的な機能を、線虫を用いて遺伝学的に解析し、細胞運動の方向性、極性の決定を司る細胞骨格系の制御においてSrcが必須の役割を担うことを明らかにした。チロシンキナーゼ型がん原遺伝子産物であるSrc family kinases (SFK)は、がんの発症や悪性化との強い関連性が示唆されているが、それらの正常細胞における本来の機能や細胞がん化の分子機序に関しては未だに不明な点が多く残されている。本研究では、SFKの機能および制御機構を分子構造レベルにまで掘り下げて徹底的に解明し、その成果に基にSFKの関与するがんに対する新たな治療標的を開拓することを目的として以下の研究を行った。1)SFKの制御因子Cskと相互作用する分子の網羅的な解析をLC-MS/MSを用いて行い。新たな結合分子としてZO-1,ZO-2,Talinを同定した。SFK標的膜蛋白質SHPS-1の結晶構造解析を行い、そのリガンドCD-47との結合ドメインがT細胞受容体などの抗原受容体と非常に良く似た構造をとること、およびリガンド結合に必要なアミノ酸残基を同定した。2)Srcのトランスジェニックマウスの解析より、Srcが微小管形成の制御に重要な役割を担うことを明らかにした。上皮組織特異的なCskノックアウトマウスの解析を進め、SrcおよびCskがアクチン骨格系の制御を介して細胞間相互作用の制御において中心的な役割を担うこと、また、炎症性サイトカインやMMP2/9などのプロテアーゼの発現誘導を介してがん悪性化と関連する細胞外環境の制御においても重要な役割を担うことを明らかにした。3)細胞膜ミクロドメイン「ラフト」におけるSFKの機能解析を行い、Srcによるトランスフォーメーションの制御にラフトタンパク質Cbpを介するSrcの細胞内局在の変化が重要な役割を担うことを明らかにした。チロシンキナーゼ型がん原遺伝子産物であるSrc family kinases(SFK)は、がんの発症や悪性化との強い関連性が示唆されているが、それらの正常細胞における本来の機能や細胞がん化の分子機序に関しては未だに不明な点が多く残されている。本研究では、SFKの機能および制御機構を分子構造レベルにまで掘り下げて徹底的に解明し、その成果を基にSFKの関与するがんに対する新たな治療標的を開拓することを目的として以下の研究を行った。

1)神経堤由来組織特異的なCskノックアウトマウスの解析を行い、CskによるSrcの制御系がアクチン骨格系の極性を維持することによって細胞遊走や細胞間相互作用の制御において必須の役割を担うことを明らかにした。2)Csk欠損細胞を用いることによって、正常型Srcによるトランスフォーメーション活性を評価する実験系を確立した。3)細胞膜ミクロドメイン「ラフト」におけるSFKの機能解析を行い、Srcによるトランスフォーメーションの制御にラフトタンパク質Cbpを介するSrcの細胞内局在の変化が重要な役割を担うことを明らかにした。4)SFKの制御因子Cskと相互作用する分子の網羅的な解析をLC-MS/MSを用いて行い。新たな結合分子としてZO-1,ZO-2を同定した。5)SFK標的膜蛋白質SHPS-1の結晶構造解析を行い、そのリガンドCD-47との結合ドメインがT細胞受容体などの抗原受容体と非常に良く似た構造をとること、およびリガンド結合に必要なアミノ酸残基を同定した。がん原遺伝子産物であるc-Srcチロシンキナーゼは、ヒトの様々な悪性化したがんにおいて発現上昇や活性化が認められることから、がん悪性化形質(浸潤・転移・血管新生など)の発現と強く関連することが古くから指摘されている。しかしながら、がんの進行に伴うc-Srcの活性化機構やがん形質の発現機構およびその制御機構に関しては未だに不明な点が多く残されている。本研究では、細胞膜ミクロドメイン「ラフト」に局在するアダプター蛋白質Cbp(Csk binding protein)によるc-Srcのがん化能抑制機構、および、後期エンドソームのラフトに局在する新規アダプター蛋白質p18を介するc-Srcによるがん悪性化機構の解析を行い以下の成果を得た。1)Cbpが活性化したc-Srcをラフトに捕捉することによってそのがん化活性を抑制することや、種々のヒトがん細胞でCbpの発現が低下していることを見いだし、Cbpががん抑制遺伝子として機能する可能性を示した。また、他のSrcファミリーキナーゼも同様のCbpによる制御を受けることや、コレステロールの賦与によってもがん形質が抑制されることから、ラフト自体ががん悪性化に対して抑制的に作用することを示した。2)Cbpの遺伝子発現がSrcのみならずRasによるがん化でも抑制されることや、ヒストンの脱アセチル化阻害剤などで発現抑制が解除されることなどが観察され、Cbpの発現がゲノムのエピジェネティックな変化により制御されることが明らかとなった。3)新たなラフトアダプター蛋白質p18のノックアウトマウスおよびp18欠損細胞の解析より、p18が後期エンドソームにMAPキナーゼ経路をアンカーすることによってエンドソーム系の恒常性の維持において必須の役割を担う分子であることを明らかにした。また、SrcおよびRasによるがん悪性化形質発現機構においてもp18を経由するMAPキナーゼ経路が重要な役割を担う可能性を示した。がん化の制御機構を分子レベルで明らかにするために、がん原遺伝子産物c-Srcチロシンキナーゼの制御に関わるラフト局在アダプター蛋白質Cbpおよび後期エンドソームに局在する新たなラフトアダプター蛋白質p18の機能解析を行い、以下の成果を得た。1) Cbpによるc-Srcの形質転換活性抑制の分子機序を解析し、Cbpおよびラフト自体がc-SrcのみならずSrc
中枢性浸透圧感知における新規TRPV1分子の機能解析

他研究室の報告で、マウス由来のTRPV1のN端を一部欠く変異体であるΔN-TRPV1をHEK293細胞に発現すると浸透圧応答を生じるという報告がなされた(Zaelzer et al., Cell Reports 2015)。この成果は浸透圧感知分子が何であるかだけでなく、全長TRPV1が視索上においてニューロンではなくグリアにのみ存在するという点でも本研究のin situ hybridizationや細胞生理学的解析の結果と大きく異なっている。本年度は、ラット視索上核ならびに背根神経節組織を用いてReal time RT-PCRを実施し、全長TRPV1とTRPV1_SONの発現量比較を行った。その結果、視索上核においても背根神経節においてもTRPV1_SONはTRPV1に比較して数オーダー発現量が少ないことが判明した。浸透圧感知機能を有していることが知られる脳室周囲器官(SFO)を単離し、浸透圧応答、Capsaisin応答、アンジオテンシンII(AII)応答をFura-2による細胞内Ca2+濃度変化を指標に解析した。SFOニューロンは浸透圧増加(+50 mOsm)およびCapsaisinに対してまったく応答しなかった。一方、AIIは50%以上のSFOニューロンで細胞内Ca2+濃度上昇を引き起こした。AIIは従来報告されていた最小有効濃度である1nMよりも遙かに低濃度である1pMで細胞内Ca2+濃度上昇を生じた。pMレベルのAIIによって生じるCa2+応答は繰りかえし細胞内Ca2+濃度が増加減少を繰りかえす、いわゆるCa2+オシレーションであった。約半数のSFOニューロンにおいては刺激がない状況下でも自発性にCa2+オシレーションが生じており、pMレベルのAIIを作用させることで濃度依存性にオシレーションの振幅と頻度の両者が増加することが判明した。TPRV1ならびに、本研究室で新たに発見したそのスプライスバリアントであるTRPV1の機能をHEK293細胞にそれぞれの分子を単独で発現、あるいは共発現させてパッチクランプ法および細胞内Ca2+濃度画像解析法にて解析した。共発現ベクターは2種の分子をGly20で構成されるリンカーで結合する構造を採用した。その結果、TRPV1発現細胞においてのみTRPV1アゴニストであるカプサイシンに応答がみれれた。さらにTRPV1発現細胞においては、マニトール50mMによる浸透圧増加刺激に対しても応答が観察された。しかし、TRPV1_SON発現細胞およびTRPV1とTRPV1_SONの共発現細胞では、カプサイシンに対しても浸透圧増加に対しても反応は観察されなかった。リンカーの妥当性と確認するために、TRPV1を同様のリンカーで結合したベクターも作成し、HEK293細胞に発現させてTRPV1単独発現細胞とカプサイシン応答性、浸透圧応答性を被核して差がないことを確認した。これらの結果は、TRPV1が浸透圧感知分子であること、およびTRPV1_SONはおそらくはDominant negative分子としてTRPV1の機能を抑制することを示唆している。一方、TPRV1単独発現細胞でのカプサイシン誘発電融と浸透圧増加によって誘発される電流の逆転電位はほぼ0mVで一致していたが、視索上核ニューロンにおいて観察されたカプサイシンあるいは浸透圧増加誘発電流の逆転電位(約-40 mV)とは大きく異なっており、中枢性浸透圧感知分子の分子実体がTRPV1単独でホモテトラマーを形成する分子では無いことも示唆している。加えて、TRPV1とTRPV1_SONのmRNAのラット脳における分布をin situ hybridization法を用いて解析する手法を確立し、浸透圧感知機能を有する中枢部位である視索上核(SON)と脳弓下器官(SFO)において両者のシグナルを得た。さらにSONでは腹側のバゾプレシンニューロン領域にシグナルが集結していた。中枢性浸透圧感知分子の分子実体解明のため、TRPV1とTRPV1_SONを単独あるいは共発現するベクターの作成に成功し、その機能を解析することができた。TRPV1分子には浸透圧増加に対して陽イオン電流を生じ、細胞内Ca2+濃度を増加させる機能があることが証明できた。一方、TRPV1_SONに関しては、単独では機能がなく、TRPV1と共発現するとその機能を抑制する可能性があることを解明できた。これらは中枢性浸透圧感知分子の実体解明について重要な手がかりを与えている。さらに、TRPV1ならびにTRPV1_SON分子の脳内分布を解析する手法が確立できたことは次年度以降の研究への重要なステップとなったと考えている。機能的ならびに形態的な解析が軌道にのった、という点において当初の計画通りの進行状況であると判断した。1昨年度に引き続き、TPRV1ならびに、TRPV1の機能をHEK293細胞に単独で発現させてパッチクランプ法および細胞内Ca2+濃度画像解析法にて解析した。TRPV1発現HEK293細胞におけるマニトール誘発電流とCapsaisin誘発電流は逆転電位がほぼ一致したものの、Capsaicin電流の速い脱感作がマニトール電流ではみられないことが判明した。一方、TRPV1_SON発現細胞およびTRPV1とTRPV1_SONの共発現細胞では、環境温度36度で行っても、カプサイシンに対しても浸透圧増加に対しても膜電流反応も細胞内Ca2+濃度変化も観察されなかった。2TRPV1とTRPV1_SONの発現がIn Situ Hybridization法で明らかになった脳弓下器官(SFO)と脳室上衣細胞において浸透圧感受性およびCapsaisin感受性を解析した。

単離SFOニューロンにおいて、50mMマニトール刺激、Capsaicin刺激により膜電流応答は観察されなかった。さらに細胞内Ca2+濃度にも影響がなかった。3ラット脳から単離した脳室上衣細胞で浸透圧反応、Capsaicin応答を観察したが、いずれの刺激にも応答は観察されなかった。4視索上核(SON)のTRPV1発現細胞の組織学同定をより詳細に行うために、TRPV1のN端認識交代と、グリアマーカーであるGFAPの交代を用いて二重染色を行った。バゾプレシンニューロンが多数存在することが知られるSONの腹側領域に、TRPV1の免疫陽性が確認されたが、それらTRPV1陽性ニューロンはGFAP免疫陽性は観察されなかった。GFAP陽性シグナルは上衣細胞ならびにSON内のアストロサイト様細胞に観察された。これらの結果は、TRPV1分子がバゾプレシンニューロンに局在しているという我々の以前の電気生理学的証拠を支持している。TRPV1ならびにTRPV1_SON発現HEK293細胞における解析により、浸透圧誘発性の応答とCapsaicin誘発応答に明瞭な差が見いだされたこと、さらにはNativeに浸透圧感知能をもつ視索上核ニューロンで観察される浸透圧誘発応答がそのいずれとも異なることから、浸透圧感知分子はTRPV1関連分子であるがTRPV1_SONではなく、TRPV1と他分子の複合体である可能性が示唆される。また、In situ hybridization法でTRPV1、TRPV1_SONの両者の発現が明らかとなった脳弓下器官ニューロンと脳室上衣細胞の両者でCapsaicin応答も浸透圧応答も観察されなかったことは、これらの分子が浸透圧感知以外の機能を持つ可能性を示唆している。TRPV1、TRPV1_SONに関して機能面のみならず脳内分布という観点において数多くの証拠が得られているという点で、当初の計画通りの進行状況であると判断した。他研究室の報告で、マウス由来のTRPV1のN端を一部欠く変異体であるΔN-TRPV1をHEK293細胞に発現すると浸透圧応答を生じるという報告がなされた(Zaelzer et al., Cell Reports 2015)。この成果は浸透圧感知分子が何であるかだけでなく、全長TRPV1が視索上においてニューロンではなくグリアにのみ存在するという点でも本研究のin situ hybridizationや細胞生理学的解析の結果と大きく異なっている。本年度は、ラット視索上核ならびに背根神経節組織を用いてReal time RT-PCRを実施し、全長TRPV1とTRPV1_SONの発現量比較を行った。その結果、視索上核においても背根神経節においてもTRPV1_SONはTRPV1に比較して数オーダー発現量が少ないことが判明した。
日本近縁ヒト集団間で異なる新規分散型繰り返し領域の探索とその集団の推定法の確立

本研究では、遺伝的に非常に近縁なヒト集団間の異質性を突然変異率の非常に高い分散型反復配列であるAlu配列の中で、より新規なファミリーであると考えられているAlu Yファミリーに着目し、日本近縁ヒト集団で異なる配列を、新規に見出すための第一段階であるトランスポゾンディスプレイ法を確立することができた。また、縦列反復配列であるSTRsでも100以上の座位を用いれば、日本人と朝鮮族との間でも、区別できる可能性があることがカテゴリー分析により示され、これらのデータから統計学的判別法を検討したところ、その判別分析によるベイズ因子から、約92%の日本人が、朝鮮族から容易に区別できることが判明した。初年度の本年度の計画としては、非連結・既収集試料を用いたゲノム解析研究として、名古屋大学医学部倫理委員会に申請し、承認を得る予定であったが、今回用いるトランスポゾンディスプレイ法の習得をし、本研究が実現可能であるかどうかを見極めてから、申請することとした。それで、最初に、ヒトAlu配列のうち、文献やNCBIなどのデータベースからこれまでにAlu配列であると考えられている部位の配列を検索した。検索されたAlu配列のコンセンサスな部分を、中でも比較的若い配列であるといわれているAluY配列のコンセンサスな部分を切断しない制限酵素としてMspIを選択した。制限酵素Msp Iを用いて、トランスポゾンディスプレイ法に従い、研究代表者らのDNA試料を断片化した。アダプター付加反応により、DNA断片の両端にアダプターを結合した。アダプタープライマー(AATAGGGCTCGAGCGGCと配列決定)及びAlu特異的プライマー(CACTGCAACCTGCGCCTCと配列決定)により1回目のPCR増幅を行った。入れ子になるアダプタープライマー(CGGCAGCTATTAATAGTACCと配列決定)及びAlu特異的プライマー(CACTGCAACCTGCGCCTC)により2回目のPCR増幅を行った。各増幅産物を1枚のポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、銀染色法によりバンドを検出した。本年度は、特異的プライマー及び1回目と2回目のアニーリング温度の検討を行った結果、おおよその条件が決定し、本目的のためのトランスポゾンディスプレイ法をほぼ確立することができた。これらの結果から、方法論としての技術が習得できたので、今後、非連結・匿名化した日本人及び韓国人のDNA試料を使用し、本法を応用するゲノム解析研究として、名古屋大学医学部倫理委員会に申請するための準備をした。2年度目の本年度は、計画の中で、初年度に、申請時に計画していた手法であるトランスポゾンディスプレイ法がほぼ確立したので、その手法を用いての非連結・既収集試料を用いたゲノム解析研究として、名古屋大学医学部倫理委員会に申請し、承認を得る予定であった。しかし、銀染色法の後、塩基配列を決定するよりも最終的な増幅産物を得る2回目のPCR増幅に使用するAlu特異的プライマー(CACTGCAACCTGCGCCTC)に蛍光(6-FAM)ラベルしてPCR増幅を行い、この増幅産物をGenetic Analyzer 3102によりキャピラリー電気泳動を行った方がより効率的に個人間・ヒト集団間の差異を検討することが容易であることがわかったので、この方法を用いてPCR条件の検討を行った。その結果、最終的なPCR増幅条件は、ほぼ確立できた。一方、本研究の当初の目的は、日本人や韓国人など遺伝的に非常に近縁なヒト集団間の異質性を突然変異率の非常に高い分散型の繰り返し配列(特にAlu配列)に着目して新たな配列を探索することがその一つであった。しかし、研究の途中で、我々が今までに保有している分散型ではないが、縦列反復配列である常染色体上のSTRsにおいても、100以上の座位を用いれば、その可能性があることがカテゴリー分析により示された。そこで、これらのデータを統計数理学研究所の間野修平准教授と共同して、その統計学的判別法を検討したところ、現在までの日本人5地域(160名)と朝鮮族(64名)のデータを利用した場合には、その判別分析によるベイズ因子から、日本人であることを示すのは、比較的容易であるが、朝鮮族であるということを決定するには、やや不確かさが残り、その原因として、データが、特に朝鮮族のデータが不足していることが示唆され、今後、より多くのデータを収集すれば、より正確な判別が可能であることがわかった。本研究では、トランスポゾンディスプレイ法を確立することが第一の目的である。申請時には、銀染色法の後、塩基配列を決定する方法がよいと考えていたが、前年度まで研究により、蛍光ラベルしてPCR増幅を行い、この増幅産物をGenetic Analyzer 310によりキャピラリー電気泳動を行った方がより効率的に個人間・ヒト集団間の差異を検討することができることがわかった。そこで、Alu配列の中で、より新規なファミリーであると考えられているAlu Yファミリーに着目し、そのファミリーの共通配列領域に存在する制限酵素Mse I切断部位を切断後、アダプター付加後、アダプター付加サイトをPCR増幅した。その結果、非常に均等なスメアの電気泳動像が得られたので、最終的に2回目のPCR増幅に蛍光色素(6-FAM)標識したAlu特異的プライマー(GACGGAGTCTCGCTCTG)を用いて増幅した。そのPCR産物を、キャピラリー電気泳動を行ったところ、様々な大きさのフラグメントを得ることができた。そこで、日本人数名のDNA試料に、この方法を応用したところ、共通のフラグメントばかりでなく、個人間で異なる大きさのフラグメントを得ることができたので、ヒトAlu Yに関するトランスポゾンディスプレイ法を確立することができた。

一方、本研究では、遺伝的に非常に近縁なヒト集団間の異質性を突然変異率の非常に高い分散型反復配列着目して、新たな配列を探索することがその目的の一つであった。しかし、縦列反復配列のSTRsでも100以上の座位を用いれば、その可能性があることがカテゴリー分析により示され、これらのデータから統計学的判別法を検討したところ、その判別分析によるベイズ因子から、約92%の日本人が、朝鮮族から容易に区別できることが判明した。その成果を、クラクフで開催された第26回国際法医遺伝学会等で発表し、論文としても掲載された。本研究では、遺伝的に非常に近縁なヒト集団間の異質性を突然変異率の非常に高い分散型反復配列であるAlu配列の中で、より新規なファミリーであると考えられているAlu Yファミリーに着目し、日本近縁ヒト集団で異なる配列を、新規に見出すための第一段階であるトランスポゾンディスプレイ法を確立することができた。また、縦列反復配列であるSTRsでも100以上の座位を用いれば、日本人と朝鮮族との間でも、区別できる可能性があることがカテゴリー分析により示され、これらのデータから統計学的判別法を検討したところ、その判別分析によるベイズ因子から、約92%の日本人が、朝鮮族から容易に区別できることが判明した。本年度までの計画では、当初予定していた分散型のAlu配列の解析に、トランスポゾンディスプレイ法と、ポリアクリルアミドゲル電気泳動ー銀染色法を組み合わせた方法より、より効率的な検出法である蛍光標識特異的プライマー法に変更に時間を費やしてしまった。その一方で、当初予定していなかった分散型繰り返し領域ではないが、縦列反復配列であるSTRsを100座位以上利用することにより、当初の大きな目的である、遺伝的に非常に近縁な日本人と韓国人を、カテゴリー分析や判別分析により、ある程度区別できる可能性が示唆されたことは、従来の認識を新たにした新しい知見も得ることができ、そのことは、本研究の目的から考えれば、研究自身が非常に進展したと考えられる。また、この2年間で解析技術も非常に進歩し、申請時における最新技術であった、トランスポゾンディスプレイ法とポリアクリルアミドゲル電気泳動ー銀染色法を組み合わせた方法の改良型である、蛍光標識特異的プライマー法による検出法がある程度確立できたことも大きな進展であると言える。さらに、このような検出の最新技術である、次世代シーケンサMiSeqなどによる方法も、非常に効率よく、個人ゲノム間の、あるいはヒト集団間の遺伝的相違を検出することができるので、残り1年間で、これらの方法を利用するで、当初予定していた新規の分散型繰り返し領域のAluを検出ことは、それほど困難なことではないと予想される。試料についても、協力者であるソウル国立大学医学部法医学教室の李崇徳教授に直接説明することで、研究の重要性、方法論も十分理解し、共同研究の了解を得たので、韓国人のDNA試料を必要量入手することが可能になった。このように、倫理委員会の申請が準備・提出段階まで来ているだけで、いまだ承認されていないように思われるが、順番はともかく、研究の全体としては、概ね順調に進展していると考えられる。
18世紀英国女性にみられる<弱者>との関係の文化史的研究-慈善と母子関係を中心に

本研究の目的は、18世紀の個人の出版されていないマニュスクリプトの資料を核にして、他に文学テキストや出版された歴史資料などを使って、18世紀イギリスの女性の文化的活動と自己認識を考察することであった。社会的大流行でもあり、文学上でも際立った特徴となった「感受性」`sensibility'の時代といわれる時期に、弱者に対する配慮がケアを与える側・与えられる側双方にとって、どのような意味をもったかという点に関し、1)慈善活動の場で2)母子の関係の上で、というしばしば女性の自己実現の場と位置付けられる分野について注目し、主に慈善についての考察を行った。研究期間中の2003年夏期休暇を利用して、大英図書館の資料を読むことができたことにより、慈善活動については、個人の慈善と組織的慈善の両方について研究を進めることができた。スペンサー伯爵夫人(Georgiana, Countess Spencer)の膨大な書簡・日記(未出版マニュスクリプト)の研究については、請願者個々人の事情を訴える手紙と文学的流行の間の関係をジャクソンの論文で示した。組織的慈善に関する文献では、18世紀半ばに設立された売春婦更生のための慈善施設(The Magdalen House/Hospital)に関わる出版物(出版されたもの以外は失われている)及びその設立に関わった人物の出版物を同じ滞在中に読み資料確認を行って、慈善の対象となった売春婦観の18世紀半ばから19世紀半ばにかけての変化をたどった。他に、18世紀から20世紀を概観しイギリスの出産時のケアの特徴を指摘する論文、湯治都市バースでの文学者の間のケアのネットワークについて考察した論文と、死期が迫っている夫のケアのあり方を分析した論文を書いた。1.Countess Spencerの慈善について。彼女とMary Jacksonという人物の関係について、「18世紀英国の慈善活動とケアについて」という題目で、学内の「生命ケアの比較文化論」研究会(6月20日)で発表した。そこでは、手紙という媒介を通じて、相互の会話を促す文学的文化的知識の共有を土台にして、慈愛と感受性を重視する杜会現象に支えられて、裕福な貴族女性と困窮する女性の個人的関係が成立していることを指摘した。このテーマで雑誌論文として発表する準備を進めている。2.慈善と売春婦について。18世紀半ばに、ロンドンで売春婦更正施設Magdalen House(Hopsital)が開設された。これに象徴されるように、売春婦は、ケアを与えられるべき対象となるのであるが、18世紀初めの性欲の化け物のような無法者や会話を楽しむ相手としての売春婦から、18世紀半ば以降の道徳と家庭の守護者としての女性像から取り残されて、人格を失って救われることのない売春婦へと変容していった。慈善施設関係の資料では、売春婦は杜会の腐敗の犠牲者であって、欠如を埋めて社会復帰を促すべき対象なのであるが、この施設が機能し始めるのと、売春婦たちの理想の女性像からの復帰不可能な脱落が明確化するのはほぼ同時期であるということになる。以上のような主旨で「18世紀の慈善と売春婦」の論文を「身体医文化論研究会」のワークショップ「腐敗と再生」(慶応義塾大学にて3月19日・20日開催予定)で発表する。第二のテーマとして予定していた妊娠・出産・育児については、15年度以降に持ち越すことになるが、慈善と売春婦の論文で、慈愛に満ちた道徳と家庭の守り手としての女性像に注目したので、そこから繋いでいく。15年度は夏に大英図書館にてCountess Spencerのまだ手をつけていない資料を読んでリサーチを進めるが、その他に、情報を補充して上記二つの論文を完成させる。平成15年度は、1)売春婦更生施設関連の研究と、2)個人の慈善、3)助産婦と母親の関係についての研究を進めた。

1)14年度末の3月末に口頭発表した「18世紀の慈善と売春婦」の論文について、論文集掲載に向けての準備を進めた。口頭発表時には、主に18世紀の分析であったが、夏期休暇中にロンドンでリサーチする機会をもつことができたので、マグダレン・ホスピタル関係の資料やチャペルで行われた説教を出版したものなど19世紀半ばまで広げて研究を進めることができた。18世紀から19世紀への変わり目に大きな変化が起こっていたので、このリサーチは非常に有益であった。18世紀半ばに慈善を立ち上げていった人々が主張した慈善を受ける側の人々像と、慈善活動が定着していった19世紀では、女性観の変化とともに売春婦観が変化していることが明らかになり、慈善を組織する側と慈善を受ける側の関係の変化も指摘した。2)Georgiana、Countess Spencerの慈善について、夏期休暇中のロンドンでのリサーチで足りないところを補い、論文として発表できるよう準備を進めている。3)妊娠・出産・育児について、18世紀の男助産婦の出現と流行による女性たちの行動パターンの変化と、現代に至るまでのイギリスの妊婦と助産婦・医師(地域と病院)の出産ケアチームとの関わりに関して、文学的な資料も(を)とりいれながら考察する論文を準備している。他に、18世紀の文学から集めた資料やスペンサー伯爵夫人の手稿資料の質的分析をすることができるように準備している。二つのテーマ:1)慈善、2)妊娠・出産・育児、子とのコミュニケーションについて、前年度の成果を引き継ぎ検討した。1.Georgiana, Countess Spencerの膨大な書簡・日記(未出版マニュスクリプト)を使って彼女が行っていた個人としては大規模な慈善事業をテーマにした論文を完成し、学術雑誌に9月に投稿した。採否の結果待ち。『静岡大学人文論集』の論文は、18世紀の湯治リゾート・バースでのケアの一例を論じたものである。『身体医文化論』の論文は、寄付により賄われた売春婦更生施設の方針と女性観・売春婦観について、18世紀半ばから19世紀におきた変化を論じた。2.18世紀にイギリスでは男助産婦(man-midwife)が流行し、出産の歴史のなかでも際立った現象として、出産が女性たちの集まりの中に囲まれた体験から階層により差異のある体験となった(富裕な女性たちの選択で男助産婦が流行った)と説明されている。妊娠・出産・育児についての富裕な女性の考え方を考察する論文を準備中である。他に、19世紀の日本の女医二人についてDictionary of Medical Biography(Greenwood)に執筆した。今年度は、研究補助のための謝金を使用しなかったのは、マイクロフィルムWomen and Medicine : Remedy Books 1533-1865(全35リールのうち12リールを購入した)を購入し、予算の都合上無理になったためである。この資料は、女性がつけていた家計簿や薬などのレシピ・ブックを集めたもので、一家のなかでのケアの担い手としての女性の研究に大いに役立つものと思われる。二つのテーマ:1)慈善、2)妊娠・出産・育児、子とのコミュニケーションについて、前年度までの成果を引き継ぎ研究を進めた。
グルタチオン放出を介したNLRP3インフラマソームの新規活性化機構の解明

インフラマソームは、感染や組織損傷、環境異物への暴露などにより活性化されるタンパク質複合体で、インターロイキン(IL)-1βやIL-18などの炎症性サイトカイン生成をもたらす重要な自然炎症応答を担っている。我々は内因性のインフラマソーム活性化因子であるアデノシン3リン酸(ATP)による刺激が、抗酸化ペプチドであるグルタチオン(GSH)の細胞外への放出を促進し、それによって、これまでに報告されたカリウム放出とは異なる新規な経路でインフラマソームの活性化に関わることを示す予備結果を得た。本研究ではGSH放出を介したインフラマソーム活性化の機序とその生理・病態生理の意義の解明を目指す。本年度は、(1)GSH放出によるインフラマソーム活性化の機序、および(2)GSH放出に対する阻害剤探索、を中心に解析をすすめた。NLRP3インフラマソームの活性化は、マウスJ774.1細胞を用い、大腸菌由来リポ多糖(LPS)とATPによる刺激によって活性化した。ATP刺激後の細胞内のグルタチオン含量を質量分析にて定量解析したところ、刺激後30分以内に90%以上の減少が見られた。このグルタチオンの減少は、ATP受容体であるP2X7受容体アンタゴニストにより阻害された。さたに細胞外に酸化型グルタチオン(GSSG)を添加すると、ATP刺激によるグルタチオン減少が有意に抑制された。このことから、P2X7受容体活性化がグルタチオン放出を制御し、さらにグルタチオン放出が細胞外GSSGによって競合的に阻害されることが示された。今後、グルタチオン輸送に関わる細胞膜タンパク質の探索を進める。インフラマソーム活性化の最初のセンシングにATP受容体であるP2X7受容体が関わることを明らかにできた。さらにグルタチオン放出が、細胞外に添加したGSSGによって阻害されることを見出し、今後、細胞膜を介したグルタチオン放出を探索する上で重要な知見を得ることができた。培養細胞で観察された現象が、マウス個体内で起こっているかどうかを動物実験により検証する。またグルタチオン放出を抑制することが、インフラマソームの活性化を抑制できるかどうかを、同じく培養細胞と動物実験により検証する。
大学生のチームワーク能力を向上させるトレーニングの有効性の多面的検証

申請者は、チームワーク能力の構成要素を踏まえ、大学生のチームワーク能力を向上させるトレーニングを開発した。そして、トレーニング実施条件は非実施条件に比べ、チームワーク能力の五つの構成要素を自己評定する相川他(2012)の尺度について、前後の時期での得点の上昇が大きかったことを示した(太幡, 2016)。また、トレーニング実施から約9か月経過した後にも、チームワーク能力の構成要素の多くの尺度について、トレーニング実施条件は非実施条件に比べ、時間経過後の得点の上昇が大きかったことを報告した(太幡, 2017)。本研究課題は、申請者が開発した大学生のチームワーク能力を向上させるトレーニングの有効性を多面的に示すことを目的としている。チームワーク能力は経済産業省が提唱する“社会人基礎力"に含まれる能力であるため、大学生のチームワーク能力をトレーニングにより向上させることができることを示すと、社会のニーズに適合した能力を有する学生を育成することに寄与する、社会的貢献性の高い知見を提供できると期待される。本研究課題への助成を受け、これまでに、以下の2点について検証した。(1)チームワーク能力が向上するプロセスを推定するため、チームワーク能力の構成要素の“コミュニケーション能力"の向上に伴って、他の構成要素も向上するか否かを検証した。(2)トレーニングによるスキルの変化と関連する要因を推定するため、感情的側面(トレーニングの楽しさ)、認知的側面(トレーニングの必要性)の評価、トレーニングの受講動機と、スキルの変化との関連を検証した。平成30年度の研究の推進方策としては、当初、(1)これまでの検証に関するデータの追加、(2)研究結果の公表を予定していた。しかし、平成30年度は、申請者が在外研究のため1年間、海外に滞在していたため、研究を計画通り遂行できなかった。したがって、研究期間の延長(1年間)を申請し、平成30年度の研究の推進方策として予定していたことを、平成31年度に行うこととする。なお、平成30年度の進捗状況を、2点に分けて説明する。(1)平成29年度に、申請者が担当する2年次のゼミナール形式の授業(前期、後期の2回担当、それぞれ受講生は15名ほど)にて、申請者が開発した大学生のチームワーク能力を向上させるトレーニングを実施し、トレーニングによるスキルの変化と関連する要因を推定するため、トレーニングの受講動機と、スキルの変化との関連を検証する研究を実施した。平成30年度に、得られたデータを分析した。得られた結果については、平成31年度の学会にて発表する。また、学術論文として公表する準備を進めている。(2)大学生のチームワーク能力を向上させるトレーニングに関するこれまでの研究成果を論文化し、平成30年度に、新たに1本の学術論文が公刊された。現在、本研究課題に関するこれまでの研究成果を学術論文として公表する準備を進めている。平成31年度の研究の推進方策としては、(1)これまでの検証に関するデータの追加、(2)研究結果の公表の2点を予定している。以下、具体的に示す。(1)これまでの検証に関するデータの追加:本研究課題のトレーニングは、申請者が担当する2年次のゼミナール形式の授業(前期、後期の2回担当、それぞれ受講生は15名ほど)で実施しているため、データ数が少ないと考えられる。また、当該授業を受講した学生の特徴が結果に反映されている可能性も考えられる。そこで、平成31年度も、平成28年度、平成29年度と同様の調査を実施し、これまでの研究と同様の結果がみられるか否かを確認する。(2)研究結果の公表:平成29年度に実施した研究の結果について、平成31年度の学会にて発表する。また、これまでの研究成果を学術論文にする準備を進める。その結果、トレーニング実施条件は非実施条件に比べ、チームワーク能力の五つの構成要素を自己評定する相川他(2012)の尺度について、前後の時期での得点の上昇が大きかったことを示した(太幡, 2016)。また、トレーニング実施から約9か月経過した後にも、チームワーク能力の構成要素の多くの尺度について、トレーニング実施条件は非実施条件に比べ、時間経過後の得点の上昇が大きかったことを報告した(太幡,印刷中)。本研究課題は、申請者が開発した大学生のチームワーク能力を向上させるトレーニングの有効性を多面的に示すため、(1)チームワーク能力が向上するプロセスを検証する、(2)トレーニングの有効性を、他者評定、行動指標といった客観的指標を用いて検証することを目的としている。平成28年度は、チームワーク能力が向上するプロセスを検証した。チームワーク能力の構成要素間の関連について、“コミュニケーション能力"がその他の能力の基盤となると仮定されている(相川他, 2012; Dickinson & McIntyre, 1997)。この仮定に基づき、トレーニングにおいて、チームワーク能力の構成要素の“コミュニケーション能力"の向上に伴って、他の構成要素も向上するか否かを検証した。平成28年度は、当初の予定通り、本申請課題の第一の目的である、申請者が開発したチームワーク能力が向上するプロセスを検証した。

申請者が担当する2年次のゼミナール形式の授業(前期、後期の2回担当、それぞれ受講生は15名ほど)にてトレーニングを実施し、上記の目的について検証する研究を実施した。トレーニング前(Time 1)、中(Time 2、“コミュニケーション能力"を高めるトレーニング終了後)、後(Time 3)の時期に、チームワーク能力の五つの構成要素を自己評定する相川他(2012)の尺度に回答するように求めた。分析では、主に、Time 2でのTime 1からの“コミュニケーション能力"の向上が、Time 3でのTime 2からのその他の能力の向上を予測するか否かを検討した。得られた結果は、本年度の学会にて発表し、学術雑誌に論文を投稿する予定である。また、申請者が開発したトレーニングは、大学3年生に有効であることは確認されているものの(太幡, 2016,印刷中)、本研究の対象となる大学2年生にも有効であるか否かは確認されていなかった。そこで、平成27年度に大学2年生を対象に同様のトレーニングを実施したデータを分析し、申請者が開発したトレーニングは大学2年生にも有効であることを確認した。この結果を論文にまとめ、公刊した(太幡, 2017)。申請者は、チームワーク能力の構成要素を踏まえ、大学生のチームワーク能力を向上させるトレーニングを開発した。その結果、トレーニング実施条件は非実施条件に比べ、チームワーク能力の五つの構成要素を自己評定する相川他(2012)の尺度について、前後の時期での得点の上昇が大きかったことを示した(太幡, 2016)。また、トレーニング実施から約9か月経過した後にも、チームワーク能力の構成要素の多くの尺度について、トレーニング実施条件は非実施条件に比べ、時間経過後の得点の上昇が大きかったことを報告した(太幡, 2017)。本研究課題は、申請者が開発した大学生のチームワーク能力を向上させるトレーニングの有効性を多面的に示すことを目的としている。チームワーク能力は経済産業省が提唱する“社会人基礎力"に含まれる能力であるため、大学生のチームワーク能力をトレーニングにより向上させることができることを示すと、社会のニーズに適合した能力を有する学生を育成することに寄与する、社会的貢献性の高い知見を提供できると期待される。平成29年度は、主に以下の2点について検証した。(1)平成28年度に引き続き、チームワーク能力が向上するプロセスを検証した。チームワーク能力の構成要素間の関連について、“コミュニケーション能力"がその他の能力の基盤となると仮定されている(相川他, 2012; Dickinson & McIntyre, 1997)。この仮定に基づき、トレーニングにおいて、チームワーク能力の構成要素の“コミュニケーション能力"の向上に伴って、他の構成要素も向上するか否かを検証した。(2)トレーニングによるスキルの変化と関連する要因について検証するため、感情的側面(トレーニングの楽しさ)、認知的側面(トレーニングの必要性)の評価と、スキルの変化との関連を検証した。平成29年度の進捗状況を、3点に分けて説明する。
溶媒が誘起するタンパク質の遅く大きな構造変化を記述する新規理論手法の開発

ある種のタンパク質は周囲の溶媒環境の変化に応じてその構造や機能を変化させる。このような、溶媒が引き起こすタンパク質の大規模な構造変化について、その基本的な仕組みについては未解明の部分が多い。生体分子を理論的に扱うための主な手法は分子動力学シミュレーションであるが、シミュレーションの時間スケール的制約及びイオンや小分子等の希薄な溶媒種の正確な挙動の予測が困難であることから通常のシミュレーションでは上記のような構造変化の取り扱いは難しいのが現状である。そこで本研究では、上記の二つの問題を同時に解決し、溶媒が誘起するタンパク質の遅く大きな構造変化を取り扱うことを可能にする新規理論手法の開発を行う。
幼若期ストレスの脳機能への影響と聴覚的環境エンリッチメントの予防効果に関する研究

生後29日齢または310日齢のラットを1日4時間母仔隔離し、聴覚エンリッチ群では隔離中4555dBの自然環境音を再生した。生後1ヶ月齢のホールボード試験において、コントロール群と隔離群に有意差は見られなかった。ガラス玉覆い隠し行動試験は不適であり、生後9日齢の血中コルチコステロンレベルおよび腹側海馬CA1のGABAb受容体mRNA発現レベルに有意差はなかった。一方、環境エンリッチ群で壁登り行動が有意に増加し、排尿回数は有意に減少した。母仔隔離で超音波発声(USV)が増加し、環境エンリッチで減少した。生後3・6ヶ月齢の居住者-侵入者試験でもUSVが増えたが、母仔隔離の影響はみられなかった。4月に研究機関を移動したことにより、防音環境下での母仔隔離実験と行動薬理実験を行う実験室の構築が必要となった。そこでまず、行動実験室となるスペースを確保し、必要となる機材・資材等を設置して、実験基盤の構築を行っている。これまでに、母仔隔離実験については、騒音レベルが40dB程度で温度管理もうまくできスムーズに行えるようになった。また、行動実験についても、着任校で使われずに眠っていた装置を再度組み立て、新たに構築した行動実験室内にて物理的には観察できるところまで来た。しかし、Windows2000上で起動する古い装置であり、かつ、測定方法が前任校の機器とは異なるため、機器・解析ソフトの理解に手間取っている。また、前任校では防音室内に行動観察のフィールドを設置し、防音室外にて動物の行動を測定・観察できたが、着任校には防音室がなく、狭い実験室内にフィールドを設置して実験者と同じ空間で観察することから、まだ前任校で行っていたようにうまく実験を行える状況には至っていない。現在、照明や音響、視覚的遮断、実験室内の匂い対策などを行うとともに、観測機器の習熟も行い、前任校での結果が再現できるように工夫している。超音波発声の記録については、母仔隔離用の小型防音庫内に特殊マイクを設置し、防音庫外のPCに接続して母仔隔離と同時に超音波発声が記録できるよう試行錯誤している。ドイツ製の機器で優れた特性を持つが、最新技術であり未経験の分野であるため、まだ装置を使い熟せていない。神経化学実験については、現在、生後2日目から9日目まで母仔隔離し10日目に海馬CA1領域を切り出した後、GABAB受容体発現量を測定しているが、年度当初に予定がなかった研究室の引っ越しがあり途中で中断している。まず、転任先での動物飼育・行動実験環境の整備を進めた。また、母仔隔離により不安レベルが低下することをオープンフィールド試験で以前見出していた。不安にも種類があるため、強迫性障害のモデルと考えられているガラス玉覆い隠し行動試験を用い、ベンゾジアゼピン系抗不安薬が効かないタイプの不安レベルに対する影響を観察した。しかし、実験に用いているウィスター系ラットにおいて、既報とは異なり、無処置動物でさえガラス玉に対して全く不安を示さなかった。同系ラットを用いた既報も参考にしながらガラス玉のサイズや色、床敷きの高さ、フィールドの明るさ等実験条件を変えて検討を重ねたが、改善されなかった。ICRマウスでは問題なく結果を得た経験もあり、手法に大きな欠陥はないはずであるが、無処置群でガラス玉を隠さない理由はわからなかった。そこで、続いてホールボード試験により不安レベルの解析を行った。その結果、統計解析中ではあるが、無処置群、母仔隔離群、聴覚エンリッチ環境内母仔隔離群の3群間に有意な差は見られない傾向にある。本試験に関して、無処置群でもフィールドの中心部を平気で横切る例が多くみられ、前任校でのオープンフィールド試験の結果と違いがみられた。前任校では床・壁とも黒色のフィールドであったのに対し、本学ではいずれも灰色である。この点が影響しているかもしれない。超音波発声を指標としたストレス度の測定は難航している。そこで、コルチコステロンレベルを生化学的に測定し、我々の条件下での母仔隔離によるストレス度測定を試みた。しかしながら、コルチコステロンレベルに違いは見られなかった。生後9日目のため、下大静脈から採血したが、その際、麻酔下でも大きなストレスがかかったものと思われる。また、海馬CA1領域のGABAb受容体のmRNA発現レベルを測定したところ、無処置群と母仔隔離群の間で有意な差はみられなかった。慢性ストレスに伴う情動性変化の検出に利用されるHole-board試験を用い、穴覗き込み行動、立ち上がり行動、壁立ち上がり行動、排尿、脱糞の5項目について正常飼育群と母仔隔離群で比較したところ、いずれの項目においても有意な差は認められなかった。また、母仔隔離時に45-55dBの自然環境音(雨音、小川のせせらぎ、虫の声など)を聴かせた聴覚エンリッチ群でも、穴覗き込み行動、立ち上がり行動、脱糞の3項目について正常飼育群との間に有意な差は認められなかった。しかしながら、壁立行動は聴覚エンリッチ群において有意に多く、逆に、排尿回数は聴覚エンリッチ群で有意に少なかった(ともにp<0.05)。また、排便回数も有意差は認められなかったものの大幅に低下していた。排尿回数と排便回数の低下は、ストレス(不安)の低下を示すものと考えられており、聴覚エンリッチメントの脳機能保護作用について今後解明する手がかりになるものと考えられる。

一方、壁立ち行動についてはこれまで注目されておらず、聴覚エンリッチメントの効果について現時点でその意味を考察することは難しい。今後、壁立ち行動が動物行動のどのような側面を表す指標であるかを明確にすることで、行動試験の幅が広がり、聴覚エンリッチメントの評価が進展するものと期待される。超音波発声については、まだ記録できていない。研究環境整備が進んでいないこと、学会支部事務局幹事となり支部大会の準備・開催に当初予定した以上の時間を要したこと、全学の初年次基礎教育および入学前教育に関する学内制度構築等を担当することとなり当初予定になかった時間を要したこと、実験担当者の減員が起きたこと、超音波発声記録装置およびソフトの習熟が遅れていること、熊本地震と父の逝去に伴う私事雑事で時間を取られていること等により、モデル動物の作成の後の実験が遅れている。超音波発声を指標として、生直後の母仔隔離が脳機能に与える影響を解析しようとしている。これまで継続してWistar rat kyudoを実験に用いてきたが、平成28年夏頃に供給元の九動で飼育場のトラブルが発生し、現在に至っても供給が再開されていない。このため、やむを得ず国内大手の実験動物供給元であるSLCよりWistar ratを入手することにした。しかしながら、これまで通り生後2日齢を入手すると多くがその後の数日間に食殺される事態となり、納入方法をいろいろと変えて対応したものの、生き残ったラットの体格や性格が九動のratと大きくことなることが判明した。このため、同じSLCが供給するWistar ST ratに代えて検討を行った。しかしながら、妊娠15日齢生後3日齢の間で納入時期を検討し、飼育方法も改善したが、いずれにおいても、Wistarの場合と同様食殺が多発し、生まれたラットがほぼ全滅することもあった。また、生き残っても、性格が九動のratとは異なっていた。ただ、Wistar STの方がWistarよりはまだWistar kyudoに近いと思われた。そこで、ST ratを用いることとし、超音波発声の記録を行っている。現在、音声の記録はできているが、20KHzを超える音声は殆ど記録できていない。記録できた場合も、その持続が極めて短く、これまで論文で発表されているスペクトルとは異なる。このため、ラットが発したものかもまだ不明である。また、超音波記録用マイクは、通常用途のマイクよりかなり高機能で、人音声用マイクで検討した際には防音されていると判定した防音庫内に、かなり外部の音が入っていることも判明した。このため、超音波発声記録用防音庫に外部音が入らないよう工夫を行っている段階でもある。今後、指標となる超音波発声が安定して記録され、解析できるよう引き続き努力する予定である。生後29日齢または310日齢のラットを1日4時間母仔隔離し、聴覚エンリッチ群では隔離中4555dBの自然環境音を再生した。生後1ヶ月齢のホールボード試験において、コントロール群と隔離群に有意差は見られなかった。ガラス玉覆い隠し行動試験は不適であり、生後9日齢の血中コルチコステロンレベルおよび腹側海馬CA1のGABAb受容体mRNA発現レベルに有意差はなかった。一方、環境エンリッチ群で壁登り行動が有意に増加し、排尿回数は有意に減少した。母仔隔離で超音波発声(USV)が増加し、環境エンリッチで減少した。