hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
土壌深部への放射性物質の効果的誘導と固定-廃棄土壌を伴わない放射線量低減技術-

東日本大震災時に発生した福島第一原子力発電所の事故によって,福島をはじめとして複数の地域に放射性物質が降下した.表土はぎや天地返しが除染として有効とされているが,廃棄土壌の扱いは社会問題になっている.そこでブルーベリー畑を対象として,人工マクロポアによって表層にある放射性セシウムをバイパス的に下方移動させて固定し,植物による吸収を回避することを試みた.結果として放射性セシウムを移動させるには,セシウムを溶出させて可動状態にするプロセス,人工マクロポアによる下方移動を促進させるプロセスが必要であるとわかった.さらにカリウムはセシウムの植物による吸収抑制になると考えられた.東日本大震災の際には原子力発電所の事故により東北地方を含む複数の県に放射性物質が降下した.表土はぎや天地返しが放射性物質の除去に有効とされるが,比較的広い低平地にしか適用できず,傾斜地や森林などは手つかずの状態である.本研究では,下方浸透促進に効果のあった人工マクロポアを使って表層に集積する放射性物質を下方移動させ,固定させることを試みた.さらに,根群域での吸収を防止するために根群域をバイパスする浸透の技術構築を行った.放射性物質のほとんどは表層に集積しているが,このうち有機物に吸着し土壌の鉱物に固定されず,交換態のままと考えられる放射性セシウムは表層の蓄積の20-30%を占めると言われている.これらは植物に吸収されやすく,また雨水によって洗い流されやすい.人工マクロポア技術によって下方浸透を促し,表層蓄積率の変化という指標で評価すると,約10%の変化が見られ,可動性の1/3-1/2を鉱物の多い土壌深部に誘導・固定することが出来た.室内実験では排水から放射性物質の検出は見られず,農作物からの吸収を軽減する技術として大きな成果が得られたと判断した.室内実験では今回新たに考案した表面被覆型人工マクロポア導入の効果を検討した.対照区では全ての排水が土壌全体から排水されるのに対し,マクロポア区では多くの排水がマクロポアを通じて排水されていた.初期の成果では,従来型でも表面被覆型でも同様の効果が見られることがわかった.人工マクロポアを用いた放射線量低減技術は,一般に行われている除染技術と比べ,大型機械や廃土処理が必要ないこと,不定形の場所や傾斜地にも適用できること,安価で容易に作成できることなどの利点がある.今回の実験では可動性の放射性物質の約半分を表層から減ずることができた.また,表面被覆型人工マクロポアは,根群域を回避しながら放射性物質を下方移動させ固定できる可能性がある.本研究では,低濃度汚染土壌を用いて,根群域の汚染回避技術を試みた.放射性物質量の低減対象にはブルーベリー畑を想定し,人工マクロポアを使って,交換態の放射性物質を根群域下に移動させ,鉱物に固定させることを考えた.通常のマクロポアでは下方浸透促進中に周囲の土壌に汚染物質を拡散させる可能性があるため,人工マクロポアを被覆し,根群域層で汚染物質が拡散しない工夫をした.ポット栽培を行いピート層の直上に汚染物質層5cmをつくり,マクロポアの有無の違いを作り,下方浸透に対する効果を検討した.肥料には,セシウムと交換する効果のある硫酸アンモニウム,植物によるセシウムの吸収抑制に効果のあるカリウムを施用した.また,最下層にはセシウムの吸着固定のために黒ぼく土を施用した.栽培後にカラムを分解すると,マクロポアがないものよりマクロポアがある方が,下層部での放射能検出が大きくなる傾向があった.また,アンモニウムを施すと特にマクロポア周辺部で著しい下方移動傾向が観察された.カリウム施用区でも,アンモニウムほどではないが,下方移動効果は見られた.両者とも根群域への拡散はないため,側方拡散を防ぎつつ,バイパス移動させていると考えた.一方で,ブルーベリーの葉からはアンモニウム施用区で放射能が検出され,カリウム施用区では検出されなかった.アンモニウムは土壌中における放射性物質の交換・移動の効果が大きいと思われるが植物に吸収されるリスクもあるとわかった.一方カリウムは植物への吸収抑制が働くことがわかった.なお,アンモニウムは最表層濃度が低下傾向にあり,植生を考えずに移動・固定させることだけが目的であれば有力な選択肢になりうると考えた.表面被覆型の人工マクロポアを使い,肥料を施用すると放射性物質の下方移動と根群域の汚染回避に一定の効果があった.果実の収穫を待ってさらに効果を検討する予定である.計画した実験を行い,放射性セシウムが異動しやすい条件,植物が吸収しやすい条件を明らかにしたため.また,根群域での拡散を防いでいるため,人工マクロポアの放射性物質のバイパス効果が明らかであり,当初目的を達成していると判断できるから.東日本大震災によって,福島第一原子力発電所で事故が発生し,放射性物質の漏出と拡散が起こった.事故から数年経った現在では,環境中に放出された放射性物質が土壌中を降下し,根から植物に吸収される事が危惧されている.土壌に降下した放射性セシウムは粘土鉱物に強く吸着されているが,有機物含量の多い土壌では,粘土鉱物を多く含む土壌に比べて放射性セシウムとの吸着が弱く,植物へ吸収されやすくなる懸念がある.根群域にある放射性セシウムは農作物に吸収される可能性があるため,もし,迅速に根群域を超えて下方に浸透させ,鉱物層に吸着させられるのであれば有利である.

そこで,本研究では有機質土壌であるピートモスを植栽とするブルーベリーを対象とし,人工マクロポアを使って表層に存在する放射性セシウムを根群域下まで輸送し,植物による吸収を回避する可能性を検証した.人工マクロポアの有無と硫酸アンモニウム,カリウムという施肥の違いを用意して,人工マクロポアによる放射性セシウムの根群域下への移動と鉱物層での固定を試みたところ,硫酸アンモニウムには土壌からセシウムを溶出させる効果があり,他方で植物への吸収を促進させてしまう課題があった.また,人工マクロポアは硫酸アンモニウムと組み合わせたときに下方浸透が促進されるとわかった.一方カリウムはもっぱら植物体への吸収抑制に効果を示した.すなわち,放射性セシウムの効果的な移動には,溶出・移動・吸収抑制という素過程が必要であることがわかり,研究の次の展開のための成果と課題が得られた.しかしながら,下方浸透距離についてはいまだ十分といえなかったため,今後は硫酸アンモニウムとカリウムの同時施用など組み合わせを考えたうえでの効果の検討を図りたい.東日本大震災時に発生した福島第一原子力発電所の事故によって,福島をはじめとして複数の地域に放射性物質が降下した.表土はぎや天地返しが除染として有効とされているが,廃棄土壌の扱いは社会問題になっている.そこでブルーベリー畑を対象として,人工マクロポアによって表層にある放射性セシウムをバイパス的に下方移動させて固定し,植物による吸収を回避することを試みた.結果として放射性セシウムを移動させるには,セシウムを溶出させて可動状態にするプロセス,人工マクロポアによる下方移動を促進させるプロセスが必要であるとわかった.さらにカリウムはセシウムの植物による吸収抑制になると考えられた.I.人工マクロポアを使った放射性物質の下方移動促進技術の開発では,人工マクロポアを放射性物質に汚染された圃場に施したところ,表層に集積する放射性物質のうち,2,30%にあたるとされている交換態セシウムの約半分を表層から減ずることができ,当初の目的を達成したから.また,土壌中での放射性物質の拡散を回避する「表面被覆型」人工マクロポアを作成すると室内実験の範囲ではあるが,カリウムの移動がマクロポアからのものが圧倒的に多く,土壌基質部分の移動を回避したことがわかったため.II.また,溶質移動のシミュレーションと構造の最適設計において,二次元浸透シミュレーションによって,表層土壌から根群域下まで効率よく放射性物質を移動させることのできる最適構造を設計し,上の実験を実施できたため当初の計画に従い,上記技術の成果を圃場レベルの実験に適用する.特に施肥の効果についてはアンモニウムとカリウムを適切に使うことで移動と吸着防止を同時に行える可能性が出てきたため,この効果について明らかにする予定である.土壌環境工学研究はほぼ計画通りに進行しているため,基本的にはこのまま研究を実施するつもりである.現地調査は継続し,年二回ほどの現地調査と試験を行う.一方で,より管理された状況下での実験を行うために,現地施設内に苗などを隔離した条件下でポット実験を行い,萌芽的成果を見つつ,環境中への拡散のリスクを軽減する形での研究を実施する計画である.圃場における効果を検討する実験が秋以降継続しており,効果的な解析と考察には年度を越え,植物体が成長してから調査・分析を実施する方が良いため,繰り越しを行った.研究は当初予定通り進んでおり,全体に支障はない.研究が計画よりは少し進んでおり,室内実験後にポット栽培をする計画が立っており,進行中である.
下垂体性腺刺激ホルモン産生細胞における蛋白分泌機構の雌雄差に関する研究

申請者はこれまでに、下垂体性腺刺激ホルモン産生細胞におけるクロモグラニンA(CgA)とセクレトグラニンII(SgII)の局在に注目し、同細胞の分泌機構について解析してきた。今回の研究課題では、CgAとSgIIの細胞内局在をもとに、同細胞の蛋白分泌装置の雌雄差について検討した。その結果、典型的な雄ラット性腺刺激ホルモン産生細胞では今までに報告してきたように、SgIIは小型分泌顆粒に、CgAは大型分泌顆粒にそれぞれ限局し、両蛋白は共存しない。これに対して、雌ラットの同細胞では、大部分の分泌顆粒は小型で、雄で頻繁に観察されるようなCgA単独陽性の大型(φ500nm以上)の分泌顆粒は認められず、一部のSgII陽性の小型分泌顆粒の周辺部にCgAが少量共存していた。そこで、このような分泌顆粒の雌雄差を決定しうる因子として性ステロイドホルモンの関与を考え、雌ラットにエストラジオール(E2)あるいはテストステロン(T)を持続的に投与し、同様の形態学的・免疫組織化学的解析を行った。その結果、E2投与群では小型の分泌顆粒のみが細胞内に蓄積されたのに対して、T投与群では小型の分泌顆粒に加えてCgA単独陽性の大型の分泌顆粒が出現し、雄ラットの典型的な性腺刺激ホルモン産生細胞様に変化した。以上の所見から、雄ラットの下垂体性腺刺激ホルモン産生細胞では、大きさも電子密度も異なる別々の分泌顆粒にCgAがSgIIが分別されて蓄積されるのに対して、雌では、CgAがSgIIと一緒に小型分泌顆粒に蓄積されることが明らかにされた。さらに、性ステロイド投与実験から、このような分泌装置の雌雄差の決定には、TおよびE2が重要な役割を果たしていると考えられた。以上の研究成果の一部は、第18回日本比較内分泌学会シンポジウム(1994年8月、前橋)および第100回解剖学会総会(1995年4月、東京)で報告した。
高機能性人工核酸ＢＮＡを用いたスプライシング制御に関する研究

本研究の目的は、各種架橋型人工核酸(BNA)を導入したSSOの最適な配列設計に関する知見を獲得する事である。本年度は主に以下2点の項目について、研究を実施した。1点目は、Duchenne型筋ジストロフィー(DMD)モデル細胞の構築である。これまで、BNA導入SSOの活性評価は、DMD遺伝子断片の強制発現系を利用し、mRNAレベルでのみ実施してきた。今後タンパク質レベルにおいても評価する事を見据え、DMDモデル細胞の構築に着手した。DMD遺伝子由来mRNA並びにジストロフィンタンパク質を発現する事が確認された筋組織由来培養細胞株のゲノムDNAをCRISPR/Cas9システムにより編集し、DMD患者の遺伝子変異型を模倣した。ゲノム編集済みの細胞を限界希釈法によってシングルセル化し、遺伝子変異株をDMDモデル細胞として樹立した。続いてDMDモデル細胞において、既に報告されているSSOの活性を確認する事ができるか確認した。リポフェクション法を用いて、SSOをトランスフェクションした所、期待通りジストロフィンタンパク質の回復を確認できた。今後細胞株を用いて、BNA導入SSOのタンパク質レベルの活性評価を実施する予定である。2点目は、LNA導入SSOの高次構造形成についての検証である。以前報告した論文において、LNA導入SSOの塩基長が増大する事に伴い、活性が低減する結果を得ていた。そこで、当該一本鎖SSOについて融解温度曲線実験を実施した所、シグモイドカーブを検出した。以上の結果は一本鎖SSOが分子間若しくは分子内の相互作用をしている可能性を示唆するものである。LNA以外のBNA類縁体についても、その対RNA結合能が非常に高いという特徴から、今後各種BNAをSSOへ適用する際には相互作用に留意する必要がある可能性を示す事ができた。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。本研究は当分野で合成に成功した各種架橋型人工核酸を導入したSSOの最適な配列設計を目的としている。本年度実施した研究内容は以下2点である。1点目は、蛍光を利用した評価系細胞株の構築と、これを用いたLNA導入SSOスクリーニングの実施である。また2点目は、新規架橋型人工核酸であるAmNA導入SSOに関するエキソンスキッピング活性の評価である。以下に順に示す。1.エキソンスキッピング活性を蛍光タンパク質の発現量により評価可能な系を構築すれば、一度に数多くのSSOについてその活性を解析する事が可能となる。そこで以下の安定発現細胞株を構築した。まずpcDNA5/FRTベクターに対して、EGFP及びTag-RFPをコードする遺伝子をそれぞれ組み、上流域にDMD遺伝子のエキソン51周辺領域を組み込んだ。以上よりDMD遺伝子エキソン51のスキッピングの有無を2色の蛍光タンパク質の発現量にて評価可能なプラスミドを構築した。構築したプラスミドはFlp-Inシステムを利用して、別途構築したTag-BFP安定発現Flp-In CHO細胞株のゲノムDNA配列中に導入した。構築した細胞株を用いてLNA導入SSOを用いたスクリーニングを実施した。結果、特にカクテル投与を実施した場合に、高効率でエキソンスキッピング活性を示す標的領域を複数確認できた。今後、既存の人工核酸からなるSSOと活性の比較を実施する予定である。2. AmNAは5員環アミド構造を有する架橋型人工核酸である。AmNA導入SSOを合成し、過去に構築した評価系細胞株にてエキソンスキッピング活性の評価を実施した。結果、AmNA導入SSOは、LNA導入SSOに比較して、エキソンスキッピング活性が向上する傾向にあることを見出した。今後は、AmNA導入SSOの最適な配列デザインを検討し活性向上のメカニズムを検証する予定である。計画に示したように構築した評価系細胞株を用いてスクリーニングを実施し、エキソンスキッピングを惹起可能なLNA導入SSOの標的配列を明らかにする事ができた。また新規架橋型人工核酸であるAmNAを導入したSSOについてin vitroにおいて検討を実施し、LNA導入SSOを上回る活性を示すことを明らかにする事ができた。

そこで、当該一本鎖SSOについて融解温度曲線実験を実施した所、シグモイドカーブを検出した。以上の結果は一本鎖SSOが分子間若しくは分子内の相互作用をしている可能性を示唆するものである。LNA以外のBNA類縁体についても、その対RNA結合能が非常に高いという特徴から、今後各種BNAをSSOへ適用する際には相互作用に留意する必要がある可能性を示す事ができた。これまでの研究により、LNA導入SSOの最適な配列設計に関する知見を一層明らかにする事ができた。今後は、LNA導入SSOの配列設計を検討する過程で明らかとなっている課題(塩基長の増大に伴うエキソンスキッピング活性の低下等)を念頭に、適宜用いる人工修飾核酸を変更しながら更なる配列設計の最適化を行う事とする。一方、構築した評価系を利用して新規架橋型人工核酸類を導入したSSOのエキソンスキッピング活性の検討を行う。これらの検討を通じて、高い活性を示した架橋型人工核酸類については、その活性向上のメカニズムについても順次検討を行う事としている。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
慢性炎症および鉄過剰で誘導される肝発がん機構の解明とその防御

C型肝炎ウイルス(HCV)の持続感染は、慢性肝炎、肝硬変および肝細胞癌(HCC)を引き起こすが、その肝発がん機序は不明である。臨床的には、C型肝炎からHCCを発生してくる症例は、慢性肝炎期に炎症が高度な例や肝線維化が進行した例が大半であることが報告されている。つまり、HCVの肝発がん過程に持続慢性炎症が関与する可能性が示唆される。一方近年、持続慢性炎症によって惹起される発癌過程には、細胞内で生じた活性酸素(reactive oxygen species ; ROS)による酸化的DNA損傷が関与する可能性が想定されているが、HCVによる肝発癌過程で、そのような機序が関与するかは不明である。本研究では、HCV肝炎・肝癌患者の生検肝組織を用いて、1)ゲノムDNAのXbaI消化断片から、抗8-OHdG抗体を用いて標的遺伝子群を免疫沈降させ、PCRで増幅した後DNA arrayで解析した(ChIP-chip解析)。2)患者末梢血リンパ球から高分子DNAを抽出し、8-OHdG損傷のDNA修復酵素であるOgg1およびMutyh遺伝子のSNPs解析を行った。その結果、1)C型慢性肝炎やHCCの複数の肝組織から抽出したDNAを用いたChIP解析から抗8-OHdG抗体で認識される共通の106遺伝子を同定した。2)健常人対照に比べHCC患者に有意に偏りがあるMutyh遺伝子のintron内のSNPを同定した。3)新規経口鉄キレート剤を肝鉄過剰によって肝炎・肝癌を自然発症するLong-Evans Cinnamon (LEC) ratに投与し、除鉄治療が肝炎の発症阻止に有効であることを確認した。
対馬国定公園における自然環境保全と野生生物保護に関する基礎的研究

朝鮮半島と日本列島の間を流れる対馬暖流の真ん中に位置する対馬国定公園は、日本と大陸を結ぶ架け橋として、動物地理学上、また人文地理学上重要な位置を占めている。しかしながら、これらを育んだ対馬の自然環境とその保全の現状は、その重要性を軽視した「場当たり」的な開発、あるいは保全策によって大きな混乱状態にある。本課題ではこのような現状に鑑み、対馬国定公園における環境保全を新しい生態学的視点から研究を行った。具体的には現状ですでに絶滅の危機に瀕し、「種の保存法」で真っ先に指定された「ツシマヤマネコ」をはじめ、対馬に同所的に生息する野生生物の保護に焦点をあて、生息地の生態系保全を網羅した長期的かつ有効な基礎資料を収集し、それによって人間活動もふくめた自然環境の保全を考察した。本年度に行われた調査とその結果は次の通りである。(1)対馬の生態系食物連鎖で最上位に位置する食肉獣3種(ツシマヤマネコ、ツシマテン、チョウセンイタチの生態、特に食性、行動圏、行動圏内の資源利用様式の解明(2)食肉獣の餌として重要な役割を果たしている小哺乳類について生息密度密度の季節変化と生息環境の評価(3)ツシマヤマネコの環境選択と人間活動による土地利用との関係を明かにした。(4)調査が難しくツシマヤマネコでは調査できなかった生態・行動についてノネコとイリオモテヤマネコについて行い、ツシマヤマネコと比較検討(5)報告書の印刷・配布朝鮮半島と日本列島の間を流れる対馬暖流の真ん中に位置する対馬国定公園は、日本と大陸を結ぶ架け橋として、動物地理学上、また人文地理学上重要な位置を占めている。(4)調査が難しくツシマヤマネコでは調査できなかった生態・行動についてノネコとイリオモテヤマネコについて行い、ツシマヤマネコと比較検討(5)報告書の印刷・配布本研究課題の目的は、動物地理学的に貴重な動植物が分布している対馬の自然環境保全と野生生物保護についての新しい技術の開発にある。具体的には生態系食物連鎖の最上位に位置する3種(ツシマヤマネコ、ツシマテン、チョウセンイタチ)に焦点をあて、人間活動も含めた自然環境の修復、維持管理の方策を考える。初年度である当該年度は、上記3種が共存する調査地をこれまでの資料と理地踏査によって決定した。まず調査地において3種の食性とその重複度を糞分析によって明らかにした。その結果、最も重複度の高い、keyとなる餌動物として森林性のノネズミの重要性が指摘された。そこで3種の生息環境の典型的な植生による分類を行い、各植生ごとの小哺乳類の生息密度の変化を知るための調査を開始した。3種の行動圏および生息地資源利用様式解析のためのテレメトリー調査も次年度以降継続する予定である。本研究課題の目的は、動物地理学的に貴重な動植物が分布している対馬の自然環境保全と野生生物保護についての新しい技術の開発にある。具体的には生態系食物連鎖の最上に位置する3種(ツシマヤマネコ、ツシマテン、チョウセンイタチ)に焦点をあて、人間活動も含めた自然環境の修復、維持管理の方策を考える。2年度目である当該年度は、前年度に決定した対馬北西部の志多留・田の浜地域で、捕獲し、発振機をつけたツシマヤマネコ1頭とツシマテン2頭の連続したラジオトラッキングを行ない、行動圏の資料収集を行なった。また、同じ調査地で前年度の食性調査で最も重要な餌となっていた、ノネズミについての個体群密度とその月変動の調査を方形区生け捕りワナ法で行なった。次年度はこれらの野外調査結果と対馬全島の人間活動の資料から課題についての取りまとめを行なう予定である。

本年度に行われた調査とその結果は次の通りである。(1)対馬の生態系食物連鎖で最上位に位置する食肉獣3種(ツシマヤマネコ、ツシマテン、チョウセンイタチの生態、特に食性、行動圏、行動圏内の資源利用様式の解明(2)食肉獣の餌として重要な役割を果たしている小哺乳類について生息密度、密度の季節変化と生息環境の評価(3)ツシマヤマネコの環境選択と人間活動による土地利用との関係を明かにした。(4)調査が難しくツシマヤマネコでは調査できなかった生態・行動についてノネコとイリオモテヤマネコについて行い、ツシマヤマネコと比較検討(5)報告書の印刷・配布
パターン認識受容体との相互作用理解に基づくステルス型siRNA医薬設計法の開発

本研究課題では、申請者が独自に設計したケミカルデバイスを利用してshort interfering RNA (siRNA)-パターン認識受容体間の相互作用を理解し、得られた情報を基に真に医薬応用可能なsiRNA医薬設計法を確立することを目的とした。これを実現するために、Br7C7AおよびBr3C3Aからなるケミカルデバイスならびにケミカルデバイス導入siRNAの合成を達成し、これらを用いた生化学的解析により、siRNAとRNA干渉関連タンパク質間の相互作用を解析することに成功した。本研究課題では、申請者が独自に設計したケミカルデバイスを利用してshort interfering RNA (siRNA)-パターン認識受容体間の相互作用を理解し、得られた情報を基にsiRNA医薬開発において予期せぬ副作用発現の原因となる自然免疫応答を回避可能なステルス型siRNA医薬設計法の開発を目的とする。平成27年度は、申請者が設計したケミカルデバイス(3dia-deAおよび7-dia-deA)の合成に取り組んだ。当初の計画に従い、7-deazaadenosineならびに3-deazaadenosine誘導体をもとに有機金属触媒反応によりトリフルオロアセチル基を導入し、これを足がかりとしたジアジリン基への変換を達成した。収率に改善の余地を残す工程を含むものの、得られたヌクレオシド体をホスホロアミダイト誘導体へと導くことで、ケミカルデバイス導入siRNAの合成を実施中である。当初計画した通りの合成ルートに従い、2種のケミカルデバイス(3dia-deAおよび7-dia-deA)を合成することが出来た。本化合物の合成には若干の時間を要したものの、プロトタイプであるBr型のケミカルデバイスを用いて、自然免疫応答誘導の評価系を構築することが出来た。したがって、siRNA中へのケミカルデバイスの導入が完了次第、迅速に活性評価を実施出来る状況にあり、以上のことから本研究課題は概ね順調に進展していると判断出来る。また、プロトタイプであるBr型のケミカルデバイスを用いて得られたデータについて、現在論文執筆中である。本研究課題では、設計したケミカルデバイスを利用してsiRNA-パターン認識受容体(PRR)間の相互作用を理解し、得られた情報を基にsiRNA医薬開発において予期せぬ副作用発現の原因となる自然免疫応答を回避可能なステルス型siRNA医薬設計法の開発を目的とする。平成29年度は、プロトタイプ型ケミカルデバイス(7Br-deAおよび3-Br-deA)導入siRNAを利用した自然免疫応答の発現解析と、新たに設計した標的補足型ケミカルデバイス(3dia-deAおよび7-dia-deA)の合成研究に取り組んだ。まず、二本鎖RNAを認識するPRRであるToll-like receptor 3 (TLR3)を強制発現させたHEK293細胞を用いてレポータージーンアッセイにより自然免疫応答の発現解析を行ったところ、siRNAセンス鎖5'末端付近に3-Br-deAを導入したsiRNA群において自然免疫応答が低減する傾向が観察された。すなわち、TLR3によるsiRNAの分子認識においては、siRNAセンス鎖5'末端部マイナーグルーブ側での相互作用が重要な役割を果たしていることが示唆された。一方、複数のPRRsを介した自然免疫応答を一括して評価可能なWhole Blood Assayを行った場合、TLR3の場合とは異なり、siRNAセンス鎖5'末端部に3-Br-deAを導入したsiRNA群において、自然免疫応答の増強が観察された。続いて、この違いがいずれのPPRとの相互作用によりもたらされたかを明らかとするため、標的タンパク質を補足可能なケミカルプローブ(3dia-deAおよび7-dia-deA)の合成に着手した。7-deazaadenosine誘導体とのクロスカップリング反応により、7-dia-deAの合成を達成しており、これを用いた標的PRRの補足実験を進行中である。平成27度に合成したケミカルデバイスをsiRNA中へ導入し、Whole Blood Assay (WBA)により自然免疫応答に与える影響を評価する。また、本検討において観察された自然免疫応答変化の一般性を評価するため、他のsiRNA配列の合成・評価を実施する。さらに、活性変化の鍵となったパターン認識受容体の同定のため、光照射による受容体補足ならびに相互作用アミノ酸残基の同定を試みる。上記の検討により得られた情報を基に、siRNA医薬開発において予期せぬ副作用発現の原因となる自然免疫応答を回避可能なステルス型siRNA医薬設計法の開発を実現する。28年度が最終年度であるため、記入しない。核酸創薬28年度が最終年度であるため、記入しない。
界面不安定性による多角形渦輪の形成メカニズム

本研究の目的は、渦輪の多角形への変形メカニズムの解明を通して粘性流体における非平衡界面の変形現象を理解することである。粘性流体中を沈降する液滴は沈降過程で渦輪に変形した後、自発的にいくつかの液滴に分裂する。この現象は100年以上前から知られているにもかかわらず、液滴の形状や沈降速度が時間とともに変化する非定常な系であることから、そのダイナミクスが十分に理解されているとは言えない。そこで、我々は液滴の分裂を促す渦輪の不安定性の研究を通して、そのダイナミクスを理解することを考えた。本年度は、液滴の分裂個数を決定する物理量を明らかにし、分裂個数に関するモード選択を表現する物理モデルを通して、その物理ダイナミクスに対する解釈を与えた。まず、実験で粘度や初期の液滴のサイズに対する分裂個数の変化を調べた。その結果、分裂個数は粘度増加と共に減少し、液滴サイズとともに増加する傾向があることが分かった。次に、実験結果から1渦輪の成長と2重力不安定性による界面不安性によって、渦輪の不安定化が起こり、液滴の分裂現象が起こると考えた。実験から得られたこの考察を元に現象論的モデルを提案し、無次元化することにより液滴サイズや粘度、密度差を含む無次元パラメータを導出した。得られた無次元パラメータを用いることによって、実験で測定された分裂個数を整理することができた。さらに、モデルから得られた無次元パラメータと分裂個数の関係は実験結果とよく一致していた。以上のことから、成長する渦輪の不安定化において、渦輪の成長と二流体の密度差による重力不安定性が支配的要因であること示した。本年度は、本研究課題の大きな目的の一つである沈降する渦輪の不安定化におけるモード選択ついて、実験と数値計算の両方からアプローチし、液滴の分裂個数を決定する物理機構に関する解釈を与えることができた。以上のことから、おおむね順調に進展していると判断した。本年度の研究を通して、沈降する渦輪の成長を理解することが本研究タイトルである"界面不安定性による多角形渦輪の形成メカニズム"の解明において重要であることが明確になった。そこで、今後は、渦輪の成長速度を決定する物理に着目し、研究を進めていく予定である。残額は、当初から計画していた国際会議旅費の一部を、他の資金からの援助を受けて支出したことにより生じた余剰であり、研究計画の未達による物ではない。
解答過程解析を教師データに用いた学習助言システムの開発に関する研究

Rule Space Method(RSM)は、習得単元に基づいた学習到達度を把握することを目的として教育評価の領域から提案された手法であり、学習支援・診断を実現する際の応用が期待されている。しかし、これを具体化させるための作業の一つである解答過程解析(Task Analysis)は、当該教科の専門家の知識や経験に依存する部分が多くRSMの運用上の大きな障害となっている。そこで、本研究ではニューラルネットワークモデル(NNM)の探索機能を援用して、RSMの解答過程解析作業に活用しRSMの適用範囲を広げ、学習支援の方策を探ることを検討した。また、実験データを用いてその実現可能性も評価した。試験を実施することによって、その時点での受験者の学習到達度を把握することができる。しかし、受験者の行動としては、ややもすると得点と言う「数値の大小」に関心が集中してしまい、次の学習ステップとして、どの単元を習得するのが「より効果的なのか」と言ったところに興味を持たれない場合が多い。これは、採点結果が数値でしか受験者にフィードバックされないことも一因であり、「得点」に加えて的確な「助言(アドバイス)」を付与することによって飛躍的に改善される。この状況を打開するには、正答した問題に注目するだけでなく、誤答した問題についてどの点の学習が滞っているかを分析・把握する(解答過程解析(Task Analysis))ことによって、受験者のつまずいている単元を特定することが可能となり、それを助言として提示することができるようになる。このような学習診断の技術の一つとして、申請者らはRule Space Method(以下RSMと略, Kikumi K. Tatsuoka(2009))に注目し、その技術的問題点を明確化すると共に実装可能性を探ることとした。研究実施初年度である本年度はRSMの仕組みを詳細に調べることに主眼を置いた。具体的には、RSMの基幹となっている技術を習得すると共にRSMの提案・開発者であるKikumi K. Tatsuokaらのグループを訪問し、助言システムを実現する際に考慮すべき点等の調査を行った。また、平行して問題分析を行うに当たっての問題点の洗い出しを行った。RSMの基幹となっている技術は、数学や認知心理学の領域を応用したものとなっているため、それらの理解を含めて研究を進行する必要があり理解に時間を要している。また、解答過程解析には特定教科の知識と学習単元を有機的に理解して進行する必要があるため、当初の計画よりやや遅れた進捗となっているのが現状である。研究実施2年度である本年度は正答・誤答に応じた解答パターンと測定データとをリンクさせ、未習得の単元を特定する処理系を作成すべく計算機への実装を試みた。また、RSMの提案・開発者であるKikumi K. Tatsuokaらのグループを訪問し、助言システムを実現する際に考慮すべき点等の調査を行った。また、これを実装したプログラムについても、近年注目されている機械学習の技術が応用できるのではないか気付き調査を開始したが、実現するところまでは至っていない。よって、当初の計画よりやや遅れた進捗となっているのが現状である。「得点」に加えて的確な「助言」を付与することによって試験の有用性が飛躍的に高まると期待できる。この目的のためには、各設問の解答過程を分析・把握する(Task Analysis)ことによって、各受験者のつまずいている単元を特定することが可能となり、それを助言として提示することができるようになる。このような学習診断の技術の一つとして、申請者らはRule Space Method(RSM, Kikumi K. Tatsuoka(2009))に注目し、その技術的問題点を明確化すると共に実装可能性を探ることとした。研究実施最終年度である本年度はこれまでの成果を踏まえて、受験者の回答パターンから各受験者の学習達成度を把握する方策に対して、最近注目されている機械学習の技術を導入すること模索し、その技術習得を目指した。

しかし、これを実装するための処理系を準備することに時間を要し、正答・誤答に応じた解答パターンから未習得の単元を特定する実験を行うことができなかった。これら一連の研究を通して、解決すべき課題の所在も判ってきたので、諸課題については今後も継続的に研究を遂行していく予定である。Rule Space Method(RSM)は、習得単元に基づいた学習到達度を把握することを目的として教育評価の領域から提案された手法であり、学習支援・診断を実現する際の応用が期待されている。しかし、これを具体化させるための作業の一つである解答過程解析(Task Analysis)は、当該教科の専門家の知識や経験に依存する部分が多くRSMの運用上の大きな障害となっている。そこで、本研究ではニューラルネットワークモデル(NNM)の探索機能を援用して、RSMの解答過程解析作業に活用しRSMの適用範囲を広げ、学習支援の方策を探ることを検討した。また、実験データを用いてその実現可能性も評価した。初年度の遅れを取り戻すべく、RSMの基幹技術の習得に注力すると共に、初年度に購入予定であったハードウエア・ソフトウエアを整備してその実装システムを試作するところまでを目指す。その過程において、申請者らがこれまで研究してきたニューラルネットワークモデル(以下NNMと略)の技術を援用して実現を試みる。また、これらの研究成果を国内外の学会で発表し、同じテーマを持った研究者と意見交換をすることを予定している。本年度の遅れを取り戻すべく、RSMの基幹技術の習得に注力すると共に、機械学習の関連分野の調査を並行して進め実装を試みる。教育工学初年度に購入を計画していた実装システム用のハードウエアとソフトウエアについて、研究の進捗状況を勘案して次年度に購入することに変更したため、その分の使用額が繰り越しとなっている。今年度使用額についてはほぼ予定通り執行したものの、前年度未使用分が玉突きの状態で次年度に繰り越してしまった格好になった。本研究申請時に計画した第2年度の経費を予定通り行うのは勿論であるが、前項で説明したように、初年度に購入予定であったハードウエアとソフトウエアを本年度に執行することにより、繰り越した経費も1年遅れで執行する予定である。本研究申請時に計画した第3年度の経費を予定通り行うのは勿論であるが、新しく研究が進行している機械学習の領域の調査も並行して進めて、本研究に即したシステムの実装に注力する予定である。
システムオンチップアーキテクチャによるA-NETマルチコンピュータの研究開発

研究成果としては、A-NETの核言語であるA-NETLの処理系を各種プラネットフォーム上に実装評価することを継続的に行なうとともに、以下の観点から新たな研究開発を行なった。(1)投機的マルチスレッド処理を行なうプロセッサ将来の汎用マイクロプロセッサアーキテクチャとして最も有望と考えられているマルチスッド処理方式のうち、特にプログラムの制御フローに沿った複数パス投機処理を行なうものに関して、単純なベンチマークプログラムを用いてのシミュレーション評価を継続して行なった。(2)各プロセッサ間を接続するネットワークルータ接続形態が2Dメッシュおよびトーラス型のネットワークにおいて部分的に適応制御を行なうデッドロック回復可能なルータをハードウェア記述言語で記述し、論理合成を行なった結果を用いたシミュレーションによるコストパフォーアンスの評価を継続して行なった。さらに、論理合成結果から得られるタイミングパラメータを反映したソフトウェア機能シミュレーションを併用することにより、ベンチマークプログラムを用いた評価を行なった。(3)システムオンチップ技術を用いた並列計算機システムシステムオンチップ化技術の発展に伴い、将来の並列計算機のノードプロセッサはシステムオンチップ化されていくものと考えられる。その際、並列計算機システム全体としての性能が最大になるノードプロセッサの構成に関する評価が必要となる。本年度は、1チップ上に集積可能なトランジスタをプロセッサコア、キャッシュ用SRAM、オンチップ主記憶DRAMのそれぞれへの割り当て率を変化させた場合の全体としての性能の変化を、シミュレーションにより初期的評価を行なった。(4)並列計算機の実用的な課題への応用設計した並列計算機を、静的タイミング解析の並列処理、オブジェクト指向データベースに対する並列ナビゲーション、マルチエージェントシステム、ITS等の実際的な課題に応用し、その有効性を確認した。今年度の研究成果として大きく分けて1.投機的マルチスレッド処理を行なうプロセッサ、2.各プロセッサ間を接続するネットワークルータ3.システムオンチッププロセッサを用いて並列計算機システムを構築する際の全体の構成、の3つが挙げられる。1.投機的マルチスレッド処理を行なうプロセッサプログラムの実行を高速に処理するために個々のプロセッサが高性能であることが必要条件である。そのために不可欠な高性能プロセッサを構築するための実行モデルとして複数パス実行によるマルチスレッド処理を投機的に行なうものの可能性を検討した。2.各プロセッサ間を接続するネットワークルータ並列計算機全体の全体の性能は個々のプロセッサ性能と同等にその間を接続するネットワーク性能によっても支配される。接続形態が2Dメッシュおよびトーラス型のネットワークにおいて部分的に適応制御を行なうデッドロック回復可能なルータをハードウェア記述言語で記述し、シミュレーションによりコストパフォーマンスの評価を行なった。3.並列計算機システム全体の構成計算機システムの全体構成はその性能に応じて最適な組み合わせが存在し、バランスのとれた構成を採ることでシステム本来の潜在的に内在する性能を発揮することが可能となる。(1)(2)によりプロセッサおよびネットワークルータのそれぞれの高性能化を進める一方でシステム全体としてとらえた場合にそれらをどう組み合わせれば全体性能が高くなるかの検討が必要である。そのためにシステムオンチッププロセッサを用いて並列計算機を構成する際に個々のノードプロセッサの性能を最大限に活かすのに最適な構成を評価するのに必要な項目は何であるかを検討した。今年度の研究成果として大きく分けて(1)投機的マルチスレッド処理を行なうプロセッサ、(2)各プロセッサ間を接続するネットワークルータ、(3)システムオンチッププロセッサを用いて並列計算機システムを構築する際の全体の構成、の3つが挙げられる。(1)投機的マルチスレッド処理を行なうプロセッサ将来の汎用マイクロプロセッサアーキテクチャとして最も有望と考えられているマルチスレッド処理方式のうち、特にプログラムの制御フローに沿った複数パス投機処理を行なうものに関して、単純なベンチマークプログラムを用いてシミュレーション評価を行なった。(2)各プロセッサ間を接続するネットワークルータ接続形態が2Dメッシュおよびトーラス型のネットワークにおいて部分的に適応制御を行なうデッドロック回復可能なルータをハードウェア記述言語で記述し、論理合成を行なった結果を用いたシミュレーションによるコストパフォーマンスの評価を継続して行なった。さらに、論理合成結果から得られるタイミングパラメータを反映したソフトウェア機能シミュレーションを併用することにより、より規模の大きいネットワークの場合での評価を行なった。

(3)システムオンチップ技術を用いた並列計算機システムシステムオンチップ化技術の発展に伴い、将来の並列計算機のノードプロセッサはシステムオンチップ化されていくものと考えられる。その際、並列計算機システム全体としての性能が最大になるノードプロセッサの構成に関する評価が必要となる。本年度は、1チップ上に集積可能なトランジスタをプロセッサコア、キャッシュ用SRAM、オンチップ主記憶DRAMのそれぞれへの割り当て率を変化させた場合の全体としての性能の変化をシミュレーションにより初期的評価を行なった。今年度の研究成果として大きく分けて(1)投機的マルチスレッド処理を行なうプロセッサ、(2)各プロセッサ間を接続するネットワークルータ、(3)システムオンチッププロセッサを用いて並列計算機システムを構築する際の全体の構成、の3つが挙げられる。(1)投機的マルチスレッド処理を行なうプロセッサ将来の汎用マイクロプロセッサアーキテクチャとして最も有望と考えられているマルチスッド処理方式のうち、特にプログラムの制御フローに沿った複数パス投機処理を行なうものに関して、単純なベンチマークプログラムを用いてのシミュレーション評価を継続して行なった。(2)各プロセッサ間を接続するネットワークルータ接続形態が2Dメッシュおよびトーラス型のネットワークにおいて部分的に適応制御を行なうデッドロック回復可能なルータをハードウェア記述言語で記述し、論理合成を行なった結果を用いたシミュレーションによるコストパフォーマンスの評価を継続して行なった。さらに、論理合成結果から得られるタイミングパラメータを反映したソフトウェア機能シミュレーションを併用することにより、ベンチマークプログラムを用いた評価を行なった。
腎癌の治療反応特異的な分子シグナル経路の同定とその臨床応用研究

腎癌の予後因子である高Ca血症およびその原因であるPTHLH遺伝子に着目して解析を行った。血清Ca値は初発時683例、再発時71例を集積した。腫瘍PTHLH発現は623例をリアルタイムPCRで検出した。高Ca血症およびPTHLH高発現は淡明細胞型のみにみられ、それ以外の組織型ではみられなかった。PTHLH高発現は淡明細胞腎癌の全生存の有意な予後不良因子であり、さらにstage IV進行例でも、MSKCC、NCCN等の予後因子を組み入れた多変量解析モデルにおいて、PTHLHが独立した予後因子であった。腫瘍PTHLH発現検出は、淡明細胞腎癌の診断・予後マーカーになりうると考えられた。DNAマイクロアレイの網羅的発現情報をもとに、腎癌病理組織型別また予後別の遺伝子発現変動の状態を調べた。その結果、サイトカイン治療時代だけではなく最近の分子標的治療を施行した場合でも腎癌の有意な予後因子となりうる高Ca血症の主要原因遺伝子であるPTHLH遺伝子発現に着目して解析を進めた。まず腎癌多数検体例(淡明細胞型:542例、非淡明細胞型:82例)よりRNAを抽出、ここからcDNAを調整した。引き続きリアルタイムPCR法によりPTHLHの発現量を測定した。その結果、腎癌組織型のうちの約80%を占める淡明細胞型の中に腫瘍PTHLHが特に高発現しているものが含まれており、それらの症例でのみ高Ca血症が起きていること、PTHLH高発現は単変量、多変量解析で予後不良因子であること、一方非淡明細胞型の乳頭状、嫌色素型、オンコサイトーマ、血管筋脂肪腫、集合管癌等ではいずれの症例でもPTHLH発現は明らかに低値であることが分かった。引き続き腎摘除術を行ったstage IVの進行性淡明細胞腎癌113例の群について、PTHLH発現と予後との関係をさらに調べた。その結果、これまで報告されているように、LDH、腫瘍grade、好中球等と共に、PTHLH発現がoverall survival(OS)の有意な予後因子であることが明らかとなった。またPTHLH発現はサイトカイン治療症例群、分子標的治療症例群に分けたサブグループ解析でも、予後因子となっていた。本研究では、腎癌の発生・増殖・進展経路また治療反応性や予後と関連する分子シグナル経路の解析、およびその経路内に存在する分子群に着目し、薬物治療効果の予測マーカーになりうる遺伝子(群)の同定を目指す。進行性、転移性腎癌では現在主に作用機序の異なる2種類の分子標的薬群、すなわち血管新生阻害薬(チロシンキナーゼ阻害薬)、と2mTOR阻害薬、が標準的に使用されている。1の薬物群にはソラフェニブ、スニチニブ、アキシチニブ等が属し、その作用標的としては、VEGFR1/R2/R3, PDGFRやさらにFLT3, KIT, RET, RAF等を含むシグナル経路を、また2にはエベロリムス、テムシロリムスが属しており、mTORC1を含む経路をそれぞれ作用標的としていることが分かっている。そこでこれらのシグナル経路に属する主な遺伝子について、まずDNAマイクロアレイの網羅的発現情報により各腎癌組織型別、予後別の発現変動の状態を調べた。また淡明細胞型以外の乳頭状腎癌など、比較的まれな組織亜型については、database上で公開されている発現情報をも活用した。その結果、まず1の経路に属し、しかもマイクロアレイデータで腎癌で発現変動がみられる解析候補遺伝子約30種類を粗選別した。また当科で実際に治療を行った患者の腫瘍検体はこれまでに約40例を集積しえたので、これらを用いて遺伝子発現解析に用いるRNA/cDNAを調整した。その結果、サイトカイン時代だけではなく最近の分子標的治療が行われた症例でも腎癌の有意な予後因子として広く認知されている高Ca血症およびその原因となるPTHLH遺伝子に着目して引き続き解析を行った。本年度は進行転移症例を中心に検体とこれらの臨床病理の詳細なデータについても集積し、より細かな解析を進めた。PTHLH遺伝子の定量的発現値の検出はこれまでと同様に、腎癌組織検体よりtotal RNAを抽出、cDNAを合成、プール化した後、リアルタイムPCR法により、ACTBを内在性コントロールとして測定した。

その結果、腎摘除術が行なわれたstage IVの進行性淡明細胞腎癌(n=113)の単変量予後解析では、LDH、Hgb、補正Ca値、KPS、好中球数、血小板数、腫瘍gradeとともに、PTHLH発現値が全生存(overall survival(OS))の有意な予後因子であることをみいだした。一方、転移臓器数(<1, 2<=)の因子についてはOS予後との有意な関連はみられなかった。さらにCox多変量解析では、PTHLH発現値、腫瘍gradeとともに、1)NCCNのrisk因子を含むモデル、2)HengらのDatabase Consortium modelの因子を含むモデル、さらに、3)これら全ての因子を含むモデル、について検討したが、いずれのモデルにおいても、PTHLH発現は独立した予後因子となっていた。さらに腫瘍gradeも同様に3つのモデルで予後因子となっていたが、一方補正Ca値はいずれのモデルでも予後との有意な関連は検出できなかった。以上より腫瘍PTHLH発現検出は、淡明細胞腎癌の進行転移症例においても有用な分子マーカー、予後因子になり得ると考えられた。泌尿器科学DNAマイクロアレイを用いた網羅的発現情報にもとづく粗選別の解析候補遺伝子の数、粗選別したマーカー候補と考えられる遺伝子の腎癌多検体でのリアルタイムPCRによる発現検証解析、また治療患者の腫瘍検体の当該年度での集積数はおおむね計画通りである。我々のDNAマイクロアレイを用いた網羅的発現情報、およびdatabase上で公開されている発現情報をもとにフィルタリングを行い粗選別した解析候補遺伝子の数はおおむね予測した程度に収まっている。また我々が実際に治療を施行した患者の腫瘍検体の当該年度での集積数、そこからの遺伝子発現解析に用いるRNA/cDNAの調整もおおむね計画通りである。引き続いて、粗選別された候補遺伝子のうち上位に位置し、また遺伝子アノテーションからも遺伝子マーカーの可能性が高いと想定される遺伝子から、腎癌多検体でのその発現状態をリアルタイムPCRで逐一確認、検証を進める。得られた遺伝子発現情報と臨床病理因子の情報、薬物治療反応性、予後情報との関連解析を進める。患者組織検体の集積も引き続き継続し、解析精度を上げていく予定である。調整した患者腫瘍組織検体のcDNAを用いて、候補遺伝子のうち上位と考えられるものから、その発現状態をリアルタイムPCR等で逐一確認を進める予定である。患者組織検体の集積も引き続き継続し、解析症例数を今後増やしていく予定である。当初の計画予定より効率的に実験を進めることができ、試薬や消耗品代を節約できたため。当初の計画に従い、候補遺伝子のリアルタイムPCR等による発現解析、患者組織検体の新たな集積、それらからのRNA/cDNAの調整等に使用する。また研究成果は適時、学会や研究会等で報告を行っていく予定である。該当なし
生体侵襲時におけるヘムオキシゲナーゼ-1を介する血栓形成制御機構め解明

【目的】ヘムオキシゲナーゼ(HO)はヘム分解の律速酵素であると同時に、細胞を酸化ストレスかによる傷害から守る細胞保護蛋白である。われわれが経験した世界第一例のHO-1欠損症患者は、持続する発熱、肝腫大、血管内皮傷害による溶血性貧血、DIC様の著明な凝固・線溶系の充進を認め、さらには単球系の機能異常も認めた。そこで、今回の研究は、HO-1が血栓形成阻害に果たす役割を末梢血単球、血管内皮細胞(HUVEC)を用いて、明らかにすることを目的とした。【方法】1)ヘミン単独刺激の影響:HUVECにHO-1誘導剤であるヘミン(100μM)を添加し、28時間培養後HO-1、組織因子(TF)、PAI-1、トロンボモジュリン(TM)の各mRNA量を測定した。2)TNF-α刺激に対するHO-1の効果:HUVECにヘミンを添加した群と添加しない群を作製し6時間培養後洗浄、その後さらにTNF-α(10ng/ml)を添加し0.53時間培養後、HO-1、TF、PAI-1、TMの各mRNA量を測定した。それぞれのmRNAは細胞からtotal RNAを抽出後、リアルタイムPCR法を用いて測定した。【結果】1)ヘミン単独刺激により、HO-1、TF、TM mRNA発現は増加し、PAI-1 mRNA発現は低下した。2)ヘミン刺激群では、非刺激群と比べてHO-1、TM mRNA発現は増加し、TF、PAI-1 mRNA発現は低下した。【考察】ヘミン刺激でHO-1を誘導した後、炎症性サイトカインであるTNF-α刺激を加えたところ、HO-1を誘導していない群に比べてTM mRNA発現は増加し、TF、PAI-1 mRNA発現は低下した。以上の結果より、炎症性ストレス下において血管内皮細胞でHO-1が高発現していると、TF、PAI-1 mRNAの発現が抑制され、またTM mRNAの発現も促進され、結果として血栓形成抑制作用を示す可能性が示唆された。ヘムオキシゲナーゼ(HO)はヘム分解の律速酵素であると同時に、細胞を酸化ストレスかによる傷害から守る細胞保護蛋白である。われわれが経験した世界第一例のHO-1欠損症患者は、持続する発熱、肝腫大、血管内皮傷害による溶血性貧血、DIC様の著明な凝固・線路系の亢進を認めた、さらには単球系の機能異常も認めた。そこで、今回の研究は、HO-1が、血栓形成阻害に果たす役割を末梢血単球、血管内皮細胞における凝固・線路系因子の産生調節を中心にin vivo及びin vitroにおいて明らかにすることを目的とした。1.Epstein-Barrウイルス形質変換B細胞株(lymphoblastic cell line, LCL)の樹立(谷内洋担当)正常対照ならびに、HO-1欠損患者の末梢血から分離した単核球より、LCLを樹立した。これらの細胞株は継代培養を繰り返すので、生体内における二次的な変化の影響を除外して評価することが可能である。2.種々のストレス刺激による患者・および正常対照LCLでのHO-1の発現と凝固因子の発現(森下担当)患者LCLにおける各濃度のヘミン添加によるHO-1産生を正常対照と比較したところ、HO-1 mRNAは正常対照では無添加でも既に微量ながらも発現を認め、ヘミン添加により、濃度依存性に増加した。

一方、患者LCLではHO-1の発現は刺激後も認めなかった。また、リポポリサッカライド(LPS)での刺激を検討したが、添加によりHO-1や組織因子(TF)の発現に変化を認めなかった。培養上清中のサイトカイン(IL-1、TNF-α)を測定したところ、サイトカインの上昇も認めず、LPS添加ではLCL細胞に刺激が加わらない可能性が示唆された。【目的】ヘムオキシゲナーゼ(HO)はヘム分解の律速酵素であると同時に,細胞を酸化ストレスかによる傷害から守る細胞保護蛋白である。われわれが経験した世界第一例のHO-1欠損症患者は,持続する発熱,肝腫大,血管内皮傷害による溶血性貧血,DIC様の著明な凝固、線溶系の亢進を認めた,さらには単球系の機能異常も認めた。そこで,今回の研究は,HO-1が血栓形成阻害に果たす役割を末梢血単球,血管内皮細胞(HUVEC)を用いて,明らかにすることを目的とした。【方法】1)ヘミン単独刺激の影響:HUVECにHO-1誘導剤であるヘミン(100μM)を添加し,28時間培養後HO-1,組織因子(TF),PAI-1,トロンボモジュリン(TM)の各mRNA量を測定した。2)TNF-α刺激に対するHO-1の効果:HUVECにヘミンを添加した群と添加しない群を作製し6時間培養後洗浄,その後さらにTNF-α(10ng/ml)を添加し0.53時間培養後,HO-1,TF,PAI-1,TMの各mRNA量を測定した。それぞれのmRNAは細胞からtotal RNAを抽出後,リアルタイムPCR法を用いて測定した。【結果】1)ヘミン単独刺激により,HO-1,TF,TM mRNA発現は増加し,PAI-1 mRNA発現は低下した。2)ヘミン刺激群では,非刺激群と比べてHO-1,TM mRNA発現は増加し,TF,PAI-1 mRNA発現は低下した。【考察】ヘミン刺激でHO-1を誘導した後,炎症性サイトカインであるTNF-α刺激を加えたところ,HO-1を誘導していない群に比べてTM mRNA発現は増加し,TF,PAI-1 mRNA発現は低下した。以上の結果より,炎症性ストレス下において血管内皮細胞でHO-1が高発現していると,TF,PAI-1 mRNAの発現が抑制され,またTM mRNAの発現も促進され,結果として血栓形成抑制作用を示す可能性が示唆された。