hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
MASを用いた購買行動の分析と潜在的行動パターンの進化論的獲得に関する研究

平成19年度は,研究計画期間における最終年度にあたり,申請時に記載した研究計画に基づき,(1)初年度に設計したエージェントを用いてMASを構築し,(2)それにより得られた結果から購買者の潜在的行動パターンを進化論的に獲得する予定であった.(1)については,消費者の異質性の考慮が不可欠となる.これを実現するために,一般にマーケット・セグメンテーションでは,顧客を事前に与えられている変数群の類似度に基づいてクラス分けをする事前セグメンテーションと,観測変数が離散的分布をもった潜在変数と仮定し,その潜在変数の類似度に基づいて顧客をクラス分けするのが潜在クラスモデルを用いる手法がある.消費者の非計画購買にはこれら両方の性質を有するため,消費者の異質性を評価する新たな方法の確立が必要であることがわかった.(2)については,エージェントが移動した経路から進化論的に行動ルールを獲得するために強化学習を組み込んだモデルを構築した.ここでは,状態入力ベクトルの次元数の増加に伴う状態空間の増加の問題を回避するために,状態の粗視化方法を提案した.また,エージェントが学習を効率良く行える仕組みを導入することで,少ない実行回数の中で潜在的な行動パターンを進化的に獲得することが可能となった.平成19年度は,(2)が主な研究内容となったため,今年度中に予定していた仮想店舗を用いたシミュレーションを通して,より実用的なモデルの構築を実現するまでは至らなかった.今後,(1)の非計画購買に関する消費者の異質性の評価方法を確立し,消費者の行動を売り場状況要因と合わせてシミュレーション分析する予定である.研究計画期間の初年度である平成18年度は,消費者の非計画購買行動を分析するために,従来研究の結果を踏まえたアンケートの作成と,その規定要因の解明を行うためのエージェントの行動ルールの設計を行った.本研究において作成したアンケート調査は,心理プロセスに焦点を当てた研究と同様,幾つかの店舗属性が従属変数である非計画購買にどのような影響を与えているのかをコンジョイント分析を用いて検証するものである.さらに,自由記述による調査からテキストマイニングを用いることで,規定要因の絞込みを行うことができる.また,人間の購買行動を表現する方法としては,消費者が効用最大化に基づいて行動するロジットモデルを用いた.このモデルは,解析的表現が単純であることとパラメータ推定が頑健であることから,マーケティングだけでなく経済学や心理学でも応用されている.しかし,このモデルでは消費者の選好や反応などの消費者の異質性を表現することができない.この問題点を補うために,データから得られる分散を考慮したエージェントを設計した.また,消費者の効用を定量化する際に,プロスペクト理論を適用した.これにより,価格の変動と消費行動に関する人間の心理的な効用を定量化することが可能となった.研究計画期間の最終年度に当たる平成19年度においては,作成したアンケートを元に調査を行い,仮想店舗を用いたシミュレーションを通して,より実用的なモデルの構築を実現すべく研究を推進してゆく予定である.平成19年度は,研究計画期間における最終年度にあたり,申請時に記載した研究計画に基づき,(1)初年度に設計したエージェントを用いてMASを構築し,(2)それにより得られた結果から購買者の潜在的行動パターンを進化論的に獲得する予定であった.(1)については,消費者の異質性の考慮が不可欠となる.これを実現するために,一般にマーケット・セグメンテーションでは,顧客を事前に与えられている変数群の類似度に基づいてクラス分けをする事前セグメンテーションと,観測変数が離散的分布をもった潜在変数と仮定し,その潜在変数の類似度に基づいて顧客をクラス分けするのが潜在クラスモデルを用いる手法がある.消費者の非計画購買にはこれら両方の性質を有するため,消費者の異質性を評価する新たな方法の確立が必要であることがわかった.(2)については,エージェントが移動した経路から進化論的に行動ルールを獲得するために強化学習を組み込んだモデルを構築した.ここでは,状態入力ベクトルの次元数の増加に伴う状態空間の増加の問題を回避するために,状態の粗視化方法を提案した.また,エージェントが学習を効率良く行える仕組みを導入することで,少ない実行回数の中で潜在的な行動パターンを進化的に獲得することが可能となった.平成19年度は,(2)が主な研究内容となったため,今年度中に予定していた仮想店舗を用いたシミュレーションを通して,より実用的なモデルの構築を実現するまでは至らなかった.今後,(1)の非計画購買に関する消費者の異質性の評価方法を確立し,消費者の行動を売り場状況要因と合わせてシミュレーション分析する予定である.
事例とシナリオモデリングに基づく持続可能ビジネス設計・立案支援手法

本研究では様々な事業分野における持続可能ビジネス事例を収集し、その成功要因を分析・ルール化することで持続可能ビジネスの「パターン言語」を作成し、これとビジネスの外部環境を表現するステークホルダモデルやライフサイクルフローモデル等を組み合わせ、持続可能ビジネスを体系的に設計する方法および、その支援ソフトウェアの開発を行った。さらに、生分解性プラスティックの有効利用、小型家電リサイクルの2課題を対象に設計ワークショップを実施し、本手法を用いることで事業分野にとらわれずに様々な持続可能ビジネスアイデアを生成することが可能であることを確認した。国内を中心に持続可能ビジネスの事例収集・調査および文献調査を行い、持続可能ビジネス設計のための必要条件を通常のビジネス設計手法と比較して整理、類型化することを試みた。この結果、持続可能ビジネス設計には当該ビジネスに直接関与するステークホルダのみではなく、間接的に利益または被害を受ける他の関連ステークホルダを考慮にいれてビジネスモデルを設計すること、すなわち「外部性」を考慮したビジネスモデル設計を実施することが肝要であり、この点において通常のビジネス設計手法とは異なる設計支援手法が必要となることを明らかにした。例えば、持続可能ビジネスは利益のみではなく地球環境や人々の福祉などのトリプルボトムラインを実現することを目的とするので、環境的、社会的、ときには倫理的な側面を考慮したビジネス設計が必要となるし、また多世代間の公平性を担保することが必要となることから、通常のビジネスに比べて長期間にわたってビジネスシナリオを設計することも不可欠である。このように通常ビジネスに比べ、ビジネスの考察範囲を広げ、社会、環境的な様々な因果関係を考慮した上でビジネスシナリオを構築することが、持続可能ビジネス設計の特徴である。これを支援するためには、単なる持続可能ビジネスの成功事例の収集にとどまらず、これらの外部性のモデリング手法、外部性に起因する様々な問題やそれを解決する手法群と事例を関連付け、統合的に持続可能ビジネス設計を支援するシステムを開発することが必要となる。この目的のもと、(1)持続可能ビジネス設計課題において生じる外部性の列挙・分類、(2)各外部性を表現可能なモデリング手法(アスペクトモデル)の収集、(3)アスペクトモデルを統合的に用いた設計支援手法の開発作業を行った。以上に関連して国際誌2件(査読有)、国際会議4件の研究発表を行った。本研究の目的は、持続可能な社会に向けた動きを企業のビジネスモデルや、生活者のライフスタイルとして協調的に設計するための方法論および支援システムを構築することである。その方法として、様々な事業分野において共通して生起するエコビジネス構築の障害や、それらに共通する問題構造、解決方法を「パターン」として整理し、パターンおよびパターンの使い方を様々な関係者間で「言語」のように共有することで、エコビジネスを協調して設計できるようにする「パターン言語」という考え方を採用する。本年度は、文献調査、インタビュー調査を通じてエコビジネス事例を収集するとともに、パターン言語の要素となるパターンの収集、整理、類型化を行った。また、生分解性プラスティックを例題として、エコビジネス設計ワークショップを行い、エコビジネスにおけるアイデア生成プロセスを分析し、パターン言語を用いてエコビジネスを設計するための必要条件や、要求機能等を抽出し、手法開発のおおまかな指針を策定した(例えば、エコビジネスを因果モデル、ステークホルダモデル等の複数のモデルを用いて表現すること、トップダウンあるいはボトムアップ的に事象の因果ツリーを構築することでエコビジネスのアイデアを生成することなど)。さらに、エコビジネス設計支援手法の実地での適用を支援するため、東京都環境局と打ち合わせを行い、マイクロソフトアクセスを用いてエコビジネス事例データベースのα版を開発した。以上に関連して国際会議1件(査読あり)、国内会議3件の研究発表を行った。持続可能な社会に向けた動きを企業のビジネスモデルや生活者のライフスタイルとして協調的に設計するための方法論および支援システムの開発を目的とし、様々な事業分野における持続可能ビジネス事例を収集し、共通する課題と成功要因を分析・ルール化することで持続可能ビジネスの「パターン言語」を構築し、これと様々なモデル化手法を組み合わせて持続可能ビジネスを体系的に設計する手法およびシステムの開発を行った。平成24年度はパターン言語の要素となる国内の持続可能ビジネス事例を収集、分析、類型化し、平成25年度には「外部性の考慮」という観点から持続可能ビジネス設計条件を整理・分類し、それらを表現するために必要となる各種モデル化手法を適切に組み合わせて持続可能ビジネス設計を支援する手法を開発した。平成26年度においては小型家電リサイクルビジネスを例題として同手法を用いた設計ワークショップを実施し、各種モデル化手法およびアイデア生成手法の有効性とその適用有効範囲を明らかにした。本研究で用いたステークホルダネットワークモデル(SHモデル)、ロジックツリーモデル、因果ループ図等のモデルは、それぞれ持続可能ビジネスのアイデアを効果的に表現しうること、さらに複数のモデル表現を付き合わせることで有効なビジネスモデルを抜け・漏れなく生成可能であることがわかった。またパターン言語の考え方を用いた問題事象や解決策のパターンのネットワーク的表現がアイデア生成に有効であることを確かめた。一方で、複数アスペクトモデルの関連付け、矛盾、抜け・漏れの発見を人手で行っているため、ビジネスモデルが大規模化、詳細化するとともに、複数モデルの整合性管理が困難になることなどがわかった。

このような作業を計算機化することで、本手法をさらに有効なものにできると期待できる。最終年度は3件の査読付論文、6件の学会発表を行った。ライフサイクル設計持続可能ビジネスについての事例収集・分析結果をデータベース化し、さらに、事例に共通する問題構造・問題解決パターンの類型化を進め、これらを用いて持続可能ビジネス設計ワークショップを実施し、持続可能ビジネス設計の方法論の概略と、計算機等を用いて支援可能な技術要素の抽出を行った。研究の目的に照らし、概ね順調に進展していると考える。エコビジネス設計方法については、エコビジネスを表現する複数のモデルを開発したこと、ならびに、エコビジネス設計ワークショップを通じて、エコビジネス設計プロセスにシナリオモデリング手法がどのように対応付けられるかを明らかにできた点などから、手法そのものの大枠は固まりつつあると判断できる。地方自治体での活用を目指して、方法論の簡略化を当初は試みたが、当該自治体担当者との打ち合わせを通じて、簡略化よりもむしろ、方法論のより一層の充実と形式化が必要であるとの結論に達した。そこで、より包括的な事例分析、文献調査を実施し、その結果、様々な「外部性」を設計者、設計チームに体系的、包括的に提示することが持続可能ビジネスの設計に不可欠であることが明らかとなった。そこで、これまで収集した事例およびモデリング手法を外部性という観点から再整理し、持続可能ビジネス設計に必要十分なモデル要素、モデリング手法を明らかにするとともに、これらを統合化して活用するための方法論の構築を今年度試みる予定である。事例収集、分析を通じた「パターン」の整理・類型化と並行し、本年度までに策定した方針に基づき、エコビジネス設計方法を具体化・詳細化するとともに、これを支援する計算機システムの実装を部分的に開始する予定である。学会参加費等を各分担者が利用可能な他の予算から捻出することで、成果発表のための英文校正、論文投稿、学会参加費等を最終年度に多めに確保することを目指したため。特に国際会議への参加は渡航費が大きいので、最終年度に集中的に成果発表を行いたいと考えている。研究成果発表のための旅費、学会参加費、英文校正等に使用する予定である。事例ビジネス事例データベースサーバ
ヘテロポリ化合物の分子触媒機能の拡張

本研究は、ヘテロポリ化合物の分子レベルでの新規な触媒機能を開発することを目的とし、液相非極性反応媒体中におけるヘテロポリ酸の酸塩基触媒作用ならびに遷移金属の触媒作用におけるヘテロポリアニオンの修飾効果を検討したもので、得られた成果は以下のように要約できる。1.担持ヘテロポリ酸の液相非極性反応媒体中における酸塩基触媒作用【○!1】オレフィン、アルキルハライド、アシルハライド、カルボン酸無水物を用いる担持ヘテロポリ酸触媒による非極性媒体中での芳香族炭化水素のフリーデルークラフツ反応(アルキル化及びアシル化)において、シリカ担持ヘテロポリ酸は通常のプロトン酸には見られない高活性を示し、分解・溶出もなく、有効な固体酸触媒として機能することを見出した。【○!2】これらの触媒作用は非極性媒体中でルイス酸的機能を発現するヘテロポリ酸の新しい分子触媒機能を示唆するものである。2.ヘテロポリアニオンによる遷移金属錯体の修飾と触媒作用【○!1】8族遷移金属錯体(Rh,Pd)を触媒とする1ーオレフィンのヒドロホルミル化、1ーオレフィンのアルコキシカルボニル化等におけるヘテロポリアニオンの遷移金属修飾効果を検討した。Rhカチオン錯体による1ーオレフィンのヒドロホルミル化において、対アニオンとしてヘテロポリアニオンを用いた場合、反応が著しく加速された。Pd錯体による1ーオレフィンのメトキシカルボニル化ではモリブデートのような単純な酸素酸アニオンとは全く異なり、ヘテロポリアニオンのみが反応を加速し、かつ直鎖エステルの選択性を高める電子的・立体的修飾効果を見出した。【○!2】これらの修飾効果はRhやPdと強く相互作用するヘテロポリアニオンに特徴的な新しい分子触媒機能を示唆するものである。1.担持ヘテロポリ酸の液相非極性反応媒体中における酸塩基触媒作用(1)担持ヘテロポリ酸による非極性媒体中での芳香族炭化水素とハロゲン化アルキル及びオレフィンのFriedelーCrafts反応を検討した.(2)シリカ担持ヘテロポリ酸は,通常のプロトン酸触媒より,はるかに高活性であることを見出した.ハロゲン化アルキルをいる用いる反応において,とくにKeggin型モリブデン系ヘテロポリ酸を担持した固体酸が著しく高い触媒活性を示し,非極性媒体中ではヘテロポリ酸がルイス酸的機能を発現するという,ヘテロポリ酸の新しい分子触媒機能を見出した.(3)上記反応中,ヘテロポリ酸は分解しないことを赤外吸収スペクトルで確認するとともに,触媒の最適調整条件を確立した.2.ヘテロポリアニオンによる遷移金属錯体の修飾と触媒作用(1)8族遷移金属錯体(Rh,Pd)によるアルコールの酸化脱水素, 1ーオレフィンのヒドロホルミル化,水性ガスシフト条件下のオレフィンの水素化, 1ーオレフィンのアルコキシカルボニル化を検討した.(2)カチオン性Rh錯体による1ーオレフィンのヒドロホルミル化において,対アニオンとしてヘテロポリアニオンを用いた場合,反応が著しく加速され,ヘテロポリアニオンがRhの触媒機能を電子的に修飾することを見出した. (3)Pd錯体による1ーオレフィンのメトキシカルボニル化では,モリブデートのような単純な酸素酸アニオンとは全く異なり,ヘテロポリアニオンのみが反応を加速し,かつ直鎖エステルの選択性を高める電子的・立体的修飾効果を見出した.とくに,モリブデン系ヘテロポリアニオンは83%に及ぶ高い直鎖エステル選択性を示し,赤外吸収スペクトルの検討から,その修飾効果がPdと強く相互作用するヘテロポリアニオンに特徴的な新しい分子触媒機能に基づくものであることを指摘した.

1.担持ヘテロポリ酸の液相非極性反応媒体中における酸塩基触媒作用(1)担持ヘテロポリ酸による非極性媒体中での芳香族炭化水素とアシルハライドのFriedel-Crafts反応を検討した。(2)塩化ベンゾイルによるPーキシレンのアシル化において、シリカ担持モリブドリン酸触媒は高い活性を示すが、ヘテロポリ酸の溶出と分解が認められた。これに反し、シリカ担持タングストリン酸及びタングストケイ酸触媒は溶出・分解を伴うことなく高活性を持続した。通常のプロトン酸触媒にはこのようなFriedel-Crafts活性が認められず、Koggin型タングステン系ヘテロポリ酸特有の新しい分子触媒機能であることが明らかになった。(3)シリカ担持タングステン系ヘテロポリ酸はカルボン酸無水物によるアシル化に対しても有効に機能した。2.ヘテロポリアニオンによる遷移金属錯体の修飾と触媒作用(1)Pd錯体による1ーヘキセンのメトキシカルボニル化において、モリブデートのような単純な酸素酸アニオンとは全く異なり、ヘテロポリアニオンが反応を加速し直鎖エステルの選択性を高める電子的・立体的修飾機能を示すことを既に報告した。本年度は、最適合成条件について検討した。(2)Pd錯体ーヘテロポリ酸(PdCl_2(PPh_3)_2ーH_3PMo_<12>O_<40>)系について、CO圧力の影響と水の共存効果について検討した。反応速度はCO圧力に一次に比例した。水の共存は反応活性ならびに直鎖エステル選択性に大きく影響し、最適量は水/ヘテロポリアニオン(モル比)=20であった。
ボルナ病ウイルスの脳内持続感染機序の解明

平成15年度の研究では、BDV感染によりウイルス抗原がPML蛋白と結合することによりPML-NBを消失させ、細胞の増殖分化や遺伝子の転写などに影響をおよぼすことを明らかにした。このようにBDVは、PML-NBの抗ウイルス効果に対し抵抗性を獲得することにより持続感染を成立させている可能性が推察された。また、PMLはアポトーシスと密接に関連していることから、BDV持続感染には、アポトーシスに対する抵抗性の獲得もその機序の一因と予想される。そこで平成16年度は、BDV持続感染した細胞におけるアポトーシスに関連する遺伝子・蛋白の動態についてアポトーシス誘導因子を用いて以下の2点について調べた。1.アポトーシス誘導剤(Camptothecin; CPT)及びUV照射によるアポトーシス抵抗性BDV持続感染細胞では、CPT処理によるアポトーシス誘導に対し抵抗性を示した。このCPT処理したBDV持続感染細胞では、アポトーシス関連遺伝子であるCaspase 3及びBax遺伝子発現が抑制されていた。次に、UV照射によるアポトーシス抵抗性をBDV持続感染と非感染C6細胞で比較した。UV照射(50J)は、C6細胞に対しBax及びCaspase3両遺伝子発現を誘導したが、対照的に、持続感染細胞では、アポトーシス及びBax・Caspase3の遺伝子発現が抑制されていた。これらの結果から、BDVは、細胞に持続感染することによりアポトーシス或いは細胞障害性に対する抵抗性を細胞に付与することが明らかとなり、ウイルス由来の遺伝子あるいはタンパク質がCaspase3及びBax遺伝子の発現に影響をあたえている可能性が示唆された。これらの現象は、PML構造の変化に伴うアポトーシス関連遺伝子の転写機能障害に起因するのか、ウイルス由来の蛋白あるいは遺伝子産物が直接アポトーシス関連遺伝子・蛋白分子に影響を与えているかは、今後の詳細な検討が必要である。ボルナ病ウイルス(BDV)は、非細胞障害性の核内で複製する神経親和性のウイルスである。新生子ラットへの実験感染では、BDVは脳神経細胞に持続感染するが、その機序は不明である。本研究では、BDV感染による細胞の機能変化を明らかにする目的で、細胞増殖分化や遺伝子の転写などに重要な役割を担っている急性前骨髄球性白血病(PML)蛋白質に着目し、ウイルス感染による影響を種々検討した。PML蛋白質は、急性前骨髄球性白血病(PML)の研究から発見された核内に点状に存在する蛋白質でIFNにより産生誘導され、細胞増殖分化や遺伝子の転写などに重要な役割を担っていると同時に、インフルエンザやVSVなどに対し抗ウイルス効果を示すことがこれまで報告されている。そこでIFN及びそれにより誘導されるPML蛋白の抗BDV効果を検討した。BDV感染による核内のPML-NB (nuclear body)の構造変化及びIFNα/βの抗ウイルス効果をヒトグリオブラストーマ細胞株U373細胞及びVero細胞を用いて調べた。その結果、BDV持続感染細胞のPML-NBは、BDV抗原と供に核内に限局発現しPML-NBの点状構造が不明瞭あるいは消失することが明らかとなった。また、PML発現を誘導するIFNα/β処理により、BDV感染細胞のPML-NBの再構成が確認できたが、BDVの感染とその転写複製は抑制されなかった。さらに、IFN処理による、BDV遺伝子複製および転写への影響にPML分子が直接関与しているか否かを調べるためにVero細胞にPML遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターでPMLを過剰発現させBDV感染抵抗性を検討した結果、PML蛋白の細胞内過剰発現は、BDV遺伝子発現およびウイルス産生に影響しなかった。

以上の知見から、BDV感染によりウイルス抗原がPML蛋白と結合することによりPML-NBを消失させ、細胞の増殖分化や遺伝子の転写などに影響を与え、PML-NBの抗ウイルス効果に対し抵抗性を獲得することにより持続感染を成立させている可能性が推察された。今後の展開として、持続感染した個体の脳内でPML-NBがどのように発現しているか観察すると供に、アポトーシスに関連する遺伝子・蛋白の動態を調べる予定である。平成15年度の研究では、BDV感染によりウイルス抗原がPML蛋白と結合することによりPML-NBを消失させ、細胞の増殖分化や遺伝子の転写などに影響をおよぼすことを明らかにした。このようにBDVは、PML-NBの抗ウイルス効果に対し抵抗性を獲得することにより持続感染を成立させている可能性が推察された。また、PMLはアポトーシスと密接に関連していることから、BDV持続感染には、アポトーシスに対する抵抗性の獲得もその機序の一因と予想される。そこで平成16年度は、BDV持続感染した細胞におけるアポトーシスに関連する遺伝子・蛋白の動態についてアポトーシス誘導因子を用いて以下の2点について調べた。1.アポトーシス誘導剤(Camptothecin ; CPT)及びUV照射によるアポトーシス抵抗性BDV持続感染細胞では、CPT処理によるアポトーシス誘導に対し抵抗性を示した。このCPT処理したBDV持続感染細胞では、アポトーシス関連遺伝子であるCaspase 3及びBax遺伝子発現が抑制されていた。次に、UV照射によるアポトーシス抵抗性をBDV持続感染と非感染C6細胞で比較した。UV照射(50J)は、C6細胞に対しBax及びCaspase3両遺伝子発現を誘導したが、対照的に、持続感染細胞では、アポトーシス及びBax・Caspase3の遺伝子発現が抑制されていた。これらの結果から、BDVは、細胞に持続感染することによりアポトーシス或いは細胞障害性に対する抵抗性を細胞に付与することが明らかとなり、ウイルス由来の遺伝子あるいはタンパク質がCaspase 3及びBax遺伝子の発現に影響をあたえている可能性が示唆された。これらの現象は、PML構造の変化に伴うアポトーシス関連遺伝子の転写機能障害に起因するのか、ウイルス由来の蛋白あるいは遺伝子産物が直接アポトーシス関連遺伝子・蛋白分子に影響を与えているかは、今後の詳細な検討が必要である。
ファントム写像とSNT-同値

全てのnについて同じn-型をもつ空間のホモトピー型の分類についての研究を行ない次の成果を得た。ファントム写像f:ΩM^1(I,J)→S^3を使って無限次元空間の場合のキャンセル、非キャンセル現象を研究し種々の興味深い例を発見した。以上の研究成果をふまえ、無限次元空間の積分解、ウェッジ分解について、一般理論を創り、更にジーナスとの関連についても研究を展開して行く予定である。
構造生物学的着想に基づく昆虫グルタチオンS-転移酵素Noboの内在性基質の同定

(1)Nobo結晶中化合物の高精度質量分析:Noboのタンパク質結晶にショウジョウバエ抽出物をソーキングし、その後に結晶を取り出して破砕して、Nobo結晶中に挿入された化合物を抽出した。そして、四重極イオントラップ型質量分析装置を用いて、Nobo結晶に存在する低分子化合物の分子量を分析した。抽出物なしの陰性区画と比較して、抽出物存在時にのみ見られた化合物ピークは存在したものの、実験毎の変動が非常に激しく、真に有意とみなせるピークを得ることはできなかった。残念ながら、このアイデアによる内在性基質の質量同定は限界があると判断した。(2)内在性基質候補のケミカルバイオロジー的探索:上述のアプローチによる質量同定は不可能であったことから、逆にどのような化合物であれば基質結合ポケットに入り込めるのかを追究した。具体的には、Nobo酵素活性阻害化合物をまずハイスループットスクリーニングにより同定し、その後、化合物の構造特性を計算科学的に詳細に検討した。その結果、ステロイドを含む複数の化合物が基質結合ポケットに入り込むことを見出した。(3)内在性基質候補としてのステロイドとDmNobo結晶の複合体構造解析:Noboは昆虫ステロイドホルモン生合成制御因子であることを考えると、上述のスクリーニングで得られたステロイド化合物は内在性基質と近しい可能性が期待できた。そこで、同定されたステロイド化合物をショウジョウバエNobo結晶にソーキングさせ、X線回折測定により複合体構造を明らかにした。その結果、一部のステロイドはNoboの特定のアミノ酸残基と強固な水素結合を作ることを見出した。この結果から、同定したアミノ酸残基が今後の内在性基質同定においても重要な評価指標となることが期待される。当初計画において期待していた質量分析に基づく内在性基質の類推が頓挫したことは、残念なことだった。研究代表者としては、関連分野の専門家とも今後の研究の進捗について議論してきたが、現状の技術レベルでは大きな改善を見込むことは難しいと結論づけた。この結果を受けて、ハイスループットスクリーニングや計算科学的手法による内在性基質の同定を進めているものの、現状では当初期待よりも遅れているとの評価が妥当と考える。初年度において、代替手段として採用したハイスループットスクリーニングや計算科学的手法によって、ステロイド類がNoboタンパク質と非常に高い特異性を持って結合すること、そしてあるアミノ酸残基を介した結合がNoboの機能にとって重要であることを見出せたことは意義があると考えている。今後は、このアミノ酸残基に相互作用する化合物に注目し、かつ、昆虫に内在する物質をリストアップしながら、内在性基質候補の洗い出しを進めていく。本来、質量分析によって内在性化合物群の候補が同定された際には、それに該当する多種の化合物を取り揃え、生化学実験や結晶構造解析に用いる予定であった。しかし、質量分析の結果が芳しくなかったため、これらの計画を実施するに至らなかった。

2年次においては、ハイスループットスクリーニングと計算科学手法による別戦略によって化合物を新たに絞り込むともに、繰り越した予算を使用して候補化合物を利用した実験へと移行する計画である。
椎間板変性に対する薬物治療へのアプローチ

ヒト椎間板髄核細胞にmTOR、Raptor、RictorのsiRNAを導入すると、全群でオートファジー活性が増加した。一方、RaptorのsiRNA導入群は他群に比べアポトーシスおよびセネッセンスに関連する酵素の発現が抑制されていた。Raptorの選択的な機能抑制がオートファジーの誘導とアポトーシス・老化・基質分解の抑制を来たしていると考えられた。実際に臨床で使用可能なmTOR阻害薬を使用してヒト椎間板髄核細胞への影響を検討したところ、多くに椎間板保護作用を認めたが、特にテムシロリムスは他剤に比べて親水性が高く、臨床上の投与方法にも利点があるため椎間板変性治療薬としての有用性が期待できる。研究計画通り、ヒト椎間板髄核細胞株にmTOR・Raptor・Rictorに対するsiRNAをリポフェクション法で導入し、ウエスタンブロット(以下、WB)法で細胞自食作用(オートファジー)の活性に関係する各蛋白質の動向を検討した。さらにIL-1βによる細胞刺激下に、細胞死(アポトーシス)や細胞老化(セネッセンス)、細胞外基質分解に関係する遺伝子の評価を、TUNEL染色、WB法、定量PCRで検討した。結果であるが、導入した各siRNAが標的蛋白の発現を特異的に抑制することを確認した(mTOR 56%,Raptor 63%,Rictor 53%)。また、これらのsiRNA導入後には全群でp70/S6Kのリン酸化が減少し、さらにLC3とp62/SQSTM1で観察したオートファジー活性も全群で増加することが明らかとなった。一方、Aktのリン酸化はmTOR・RictorのsiRNA導入群で減少していて、mTORC2以下の遺伝子シグナルを広範に抑制することが示唆されたものの、RaptorのsiRNA導入群ではAktのリン酸化がむしろ増加していた。さらにIL-1βによる細胞刺激を加えると、RaptorのsiRNA導入群ではコントロール群を比べ、TUNEL陽性細胞の増加を有意に抑制するとともに、アポトーシスに関係するcleaved PARP、caspase-9、セネッセンスに関係するp16/INK4A、細胞外基質分解酵素であるMMP-2、-3、-13、ADAMTS-4の発現がいずれも抑制されていた。以上より、Raptorの機能抑制がAktを活性化させつつmTORC1のみを抑制することでオートファジーの誘導とアポトーシス・老化・基質分解の抑制を来たすことが示された。平成27年度の「研究計画・方法」の要点は、ヒト椎間板髄核細胞の不死化細胞株内に、オートファジーに必須の分子であるATG-5遺伝子や、オートファジーを抑制的に制御しているmTORおよびmTOR結合蛋白質であるRaptor・RictorのsiRNAを導入し、細胞刺激下に下流遺伝子の動向評価を詳細に行うというものであった。研究実績の概要に記載の通り、mTORおよびmTOR結合蛋白質のsiRNA導入実験において、今のところ当初の想定通りの結果が出ており、おおむね順調に進展していると考えている。前年度まではヒト椎間板髄核不死化細胞株にmTOR・Raptor・Rictorに対するsiRNAを導入し、ウエスタンブロット(WB)法で細胞内恒常性維持機構である細胞自食作用(オートファジー)の活性に関係する各蛋白質の動向を検討した。その結果、Raptorの機能抑制がmTORC1を抑制することで、オートファジー活性化と細胞アポトーシス・老化・基質分解の抑制を導くことが示された。本年度は実際のヒト椎間板組織を用いて椎間板とオートファジーの関係を証明すべく以下の実験を行った。ヒト椎間板髄核・線維輪組織より蛋白を抽出し、オートファジー必須因子ATG5、オートファジーマーカーLC3-IIと基質p62/SQSTM1の発現をWBで検討するとともに、ヒト椎間板髄核細胞へATG5のsiRNAを導入し、細胞生存率をCCK-8法で検討した。またIL-1β刺激による細胞アポトーシス・セネッセンスの誘導についても検討した。その結果、ヒト椎間板髄核細胞における経時的なLC3-IIの増大とp62/SQSTM1の減少、オートファジーの亢進を認めた。またATG5のRNA干渉により細胞生存率は有意に低下した。さらにATG5抑制群はIL-1β刺激下でアポトーシス促進因子であるBax、cleaved caspase-9、cleaved PARP、セネッセンスマーカーp16/INK4Aの増大と、抗アポトーシス因子Bcl-2の減少を示し、細胞アポトーシスとセネッセンスがともに亢進することが示された。これにより、これまで不明であったヒト椎間板細胞におけるオートファジーの関与が明らかとなった。さらに実際に臨床で使用可能なmTOR阻害薬であるラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、クルクミンを使用してヒト椎間板髄核細胞への影響を検討したところ、いずれの薬剤でもオートファジーの亢進、細胞アポトーシスの抑制が確認できた。平成28年度は以降は、計画ではラット尾椎の創外固定器型椎間板圧迫変性モデルにmTOR、Raptor・RictorのsiRNAの導入を行って形態学的・組織学的変化を評価するとともにとともに、摘出した尾椎椎間板髄核細胞から各種遺伝子の動向を評価することを予定していた。

しかしながら、まずは不死化細胞株ではない、実際の椎間板細胞を用いたIn vitroでの研究成果を固めるために、実際のヒト椎間板髄核細胞にオートファジー必須因子ATG5のsiRNAを導入して細胞生存率を検討するとともに、ATG5のsiRNAを導入下でのIL-1β刺激による細胞アポトーシス・セネッセンスの誘導の有無について評価した。その結果、ヒト椎間板髄核細胞において明らかなオートファジーの亢進を認め、またATG5のsiRNA干渉による抑制で細胞アポトーシス・セネッセンスの亢進ならび細胞生存率が有意に低下したため、今まで明らかでなかった椎間板髄核細胞でのオートファジーの関与がIn vitroにおいて明らかとなった。これらの結果から、In vivoの実験へ進む前に、実際に臨床現場で使用可能なmTOR阻害薬であるラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、クルクミンといった薬剤を使用してIn vitroでのヒト椎間板髄核細胞への影響を検討した。このことは当初の研究計画予定になかったことであったが、いずれの薬剤でも椎間板髄核細胞においてオートファジーの亢進、細胞アポトーシスの抑制が確認できた。In vivoの実験へ進む前段階で、実際の薬剤を用いて前向きな研究結果が得られたが、研究計画からはIn vivoの実験に進めていないことからやや遅れているとの自己評価である。本研究初年度は、ヒト椎間板髄核細胞株においてsiRNAを用いたRaptorの機能抑制を行うことでmTORC1の発現のみが選択的に抑制され、オートファジーの誘導および細胞アポトーシス・老化・基質分解が抑制されることを明らかにした。昨年度は実際のヒト椎間板細胞を用い、オートファジー必須因子であるATG5を抑制することで、IL-1β刺激下において細胞アポトーシスとセネッセンスがともに亢進することを明らかにした。最終年度である本年度は、これらの結果を踏まえ、実際に臨床で使用可能なmTORC1阻害薬であるラパマイシン(Rap)、テムシロリムス(Tem)、エベロリムス(Eve)、クルクミン(Cur)を使用してヒト椎間板髄核細胞への影響を詳細に検討した。腰椎変性疾患に対する後方侵入椎体間固定術で得られた椎間板髄核の初代培養細胞にRap,Tem,Eve,Curの4剤を加え、1CCK8による細胞生存率の評価、2Western Blotting(WB)によるmTOR経路で重要なmTOR,Akt,P70/S6Kの発現量とリン酸化を評価、3オートファジーの評価としてWBによるLC3およびp62/SQSTM1の発現量の評価、4さらにIL-1β刺激下での4剤投与において細胞アポトーシス(PARP、Cleaved PARP、Cleaved caspase-9の発現量)、細胞老化(セネッセンス:p16/INK4Aの発現量)、細胞外基質分解(MMP2,3,9,13,TIMP-1,TIMP-2の発現量)を評価した。その結果、Rap,Tem,Eveの3剤の投与によりmTORシグナル経路の抑制ならびにオートファジーとAktの発現亢進を認め、ヒト椎間板髄核細胞での強力な保護作用が示された。特にTemは他の2剤に比べて親水性が高く、臨床上の投与方法に利点があるため椎間板変性治療薬として有用ではないかと考えられた。ヒト椎間板髄核細胞にmTOR、Raptor、RictorのsiRNAを導入すると、全群でオートファジー活性が増加した。一方、RaptorのsiRNA導入群は他群に比べアポトーシスおよびセネッセンスに関連する酵素の発現が抑制されていた。
Lewy小体病発症におけるα-シヌクレインの役割

Lewy小体以外の異常蓄積物にα-synucleinが存在するかどうかを、多種類の変性疾患について検討し、多系統萎縮症(multiple system atrophy)の脳幹、小脳、基底核などの白質のオリゴデンドロサイトに出現するglialcytoplasmic inclusion(GCI)がα-synuclein陽性を示すことを見出した。presenilin 1,2,βAPPなどに変異を有するFAD脳においてα-synuclein陽性のLB及び関連病変の出現を検討した。約60%の症例で扁桃核及び近隣の側頭葉皮質にα-synuclein陽性のLB及びLewy neuriteの出現を認めた。家族性ADの原因遺伝子変異は、LBにおけるα-synuclein蓄積も促進する可能性があることを指摘した。各種培養細胞に野生型及びA53T変異α-synuclein cDNAを一過性もしくは恒常的に発現し、α-synucleinの局在、代謝、細胞形態・生存への影響を検討した。COS細胞の一過性発現系では、α-synucleinは細胞質及び一部核に局在した。Neuro2a,HEK293恒常発現細胞では主として細胞質に出現し、核も陽性を示した。ウェスタンブロットでは、大部分のα-synucleinは可溶性画分に回収され、18 kDaの1本のバンドを示した。これらの性質は変異の有無、C末端FLAG tagの有無により影響を受けなかった。2種類のα-synuclein特異モノクローナル抗体を用いたsandwich ELISAの樹立を試み、15 ng/ml以上の濃度域でα-synucleinを定量可能な系を確立した。
金属ポルフィリン錯体の電子構造制御による酸化活性種の作り分けと反応設計

ポルフィリン環の構造及び電子状態を制御する目的で、右に示す様なメソ位に種々の置換基を有するポルフィリン錯体(A)の合成を行なった。さらに過酸付加体の立体的構造と安定性を制御するために、種々の過酸および酸化剤を合成した。酸化剤と金属ポルフィリン錯体との反応は、-78°C前後の低温下で行ない、EPR,IR,UV-vis等のスペクトルの直接観測により反応の経時変化を追跡したところ、電子欠乏系では過酸付加体1が安定に生成することを明らかとした。そこで、高原子価オキソ鉄錯体との反応性に違いについて検討を加えた。その結果、オキソ鉄錯体では、基質に対する立体選択性がもっぱらポルフィリン環の構造に依存しているのに対し、過酸付加体1による酸化反応では、過酸及びポルフィリン環の両者の構造に大きく依存していることが明らかとなった。更に、光学活性な過酸の付加体を用いて、スルフィドの不斉酸化反応を検討したところ、小さい値ではあるが、生成物(スルフォキシド)への不斉誘導に成功した。さらに、高原子価オキソ鉄錯体と過酸付加体1は、ポルフィリン環の電子状態に摂動を加えること以外に、反応溶媒の極性を変えることでも可能であることが明らかとなった。一方、Coumpoun Iと同じ酸化状態にあるFe(III)ポルフィリンジカチオンの合成に初めて成功した。この錯体は、ペルオキシダーゼ反応における不安定中間体の可能性が指摘されており、その化学反応性を明らかとした。
前立腺癌の発生と再燃にかかわる新しい遺伝子の同定と診断への応用の研究

1.細胞の不死化と老化に関わるとされるテロメラーゼ遺伝子の発現は前立腺癌では癌特異的あり、その発現量は分化度が低いほど多く、再燃癌でも多い傾向にあった。2.Differential Display法を用いて前立腺癌における新しいアンロゲン依存性遺伝子を同定したが、そのなかでLiprin a-2遺伝子とNKX3.1like遺伝子は再燃癌の処性質に関係することが示唆された。3.Differential Display法にて、ヒト前立腺癌の癌特異的な遺伝子として、OSM-betaとnm55の2つの興味深い遺伝子を同定できた。4.再燃癌に認められる遺伝子変化の特徴としては、非再燃癌に比べて遺伝子変化を認める頻度が高く、多くは複数以上の遺伝子異常を認めることを明らかとしてきたが、今回、c-mycとAR遺伝子の遺伝子増幅は再燃癌で特に特徴的に認められることを明かとした。5.また、前立腺癌の組織学的多様性と再燃癌の関係に注目し、前立腺癌組織の中に、内分泌療法感受性から見てthe worst elementに相当する組織型が存在し、このelementの有無が予後に重要であり、再燃と極めて関係していることが示唆される結果を得た。今後このelementの遺伝子背景の分析が急がれる。本年度は1。同一患者の前立腺癌組織と正常前立腺組織2。ヒト前立腺癌細胞株LN-CaPにandrogenを添加と非添加状態よりmRNAを抽出しDifferential Display法をおこなった。その結果1。の検討により発現に違いがある4つのc-DNA fragment 2。の検討によりandrogenに反応し発現する10のc-DNA fragmentを分離する事ができた。Gene bankとのcomputer解析によりうち3つは既知の遺伝子の断片であり残りは未知の遺伝子の断片であった。未知の遺伝子については現在c-DNAライブラリーよりクローニングをおこなっつている。結果の一部は日本癌学会等で発表した。本研究はDifferential Display法をヒト前立腺癌の分析に応用し、ヒト前立腺癌の発生と進展やhormone依存性に関わる遣伝子を検索しその役割を明らかにすることを目的としている。前年度は1。ヒト前立腺癌細胞株LN-CaPにandrogenを添加と非添加状態よりm-RNAを抽出しDifferentialDisplay法をおこなった。その結果1。本年度はこれらの遺伝子断片と同様の方法で得た遺伝子断片につきc-DNAライブラリーよりクローニング,を行った。その結果機能がよくわからない配列をもつ遺伝子を得ており、これを用いて前立腺癌組織での発現を検討している。また前立腺癌におけるtelomerase活性の検討を行い癌にのみこの活性を認めることを確認し、この差についてhTRT遺伝子の発現と機能の面で検討をおこなっている。これらの成果は論文と癌学会や泌尿器科学会で報告した。本研究では,Differential Display法をヒト前立腺癌の分析に応用し,ヒト前立腺癌の発生と進展や,アンドロゲン依存性に関わる特異性の高い未知の遺伝子を検索し,その遺伝子情報と役割を明らかにする。そして,それらの新しい遺伝子による遺伝子診断や治療法の糸口をさぐることを目的とする。本年度の成果としてa.ひと前立腺癌細胞でアンドロゲン添加にて濃度依存性に発現量を増加させる遺伝子断片43個をクローニングし、塩基配列を決めその中から遺伝子バンクとのコンピュター探索により前立腺に関わることが予測される既知の遺伝子2個と未知の遺伝子3個を選び遺伝子全長のクローニングと塩基配列を決めた。そのうち1個は、個体の分化に関わる胎生の遺伝子NKX3.1様の遺伝子であり、現在この前立腺癌での発現状況をしらべている。また他の遺伝子のひと前立腺への関与を明らかにしている途中である。b.ひと前立腺癌におけるtelomerase活性の検討を行った。癌に特異的に活性が認められる事を確認し、さらに、1。ひと前立腺のbiopsy組織でこのtelomerase活性が測定可能であることを明らかとした。今後診断面に応用する方向をしめした。2。telomerase活性とhTRT
巨大ベシクル再構成膜法の確立とそれを用いたカルシウム輸送機構の研究

カルシウム・ポンプ並びにカルシウム・チャネル蛋白質を、電気生理学的手法が適用できる膜系である巨大ベシクルに再構成することを目的とした。初めに、脂質のみから成る巨大ベシクルの生成する条件を検討し、次いで、筋小胞体膜蛋白質を組み込んだ巨大ベシクルの調製法を開発した。1.種々のリン脂質から超音波処理によって小さな単層リポソーム(SUV)を調製し、これを凍結-融解処理して巨大ベシクルを得る条件を検討した。アゾレクチン(AL),卵黄ホスファチジルコリン,又はこれらに少量の酸性リン脂質(ホスファチジン酸(PA),又はホスファチジルセリン(PS))を加えた混合物からは、巨大単層ベシクル(GUV)の生成を位相差顕微鏡下に認めた。これに、微小電極を刺入し、膜の電気容量を測定して、単層膜であることを確認することができた。凍結-融解の際の塩濃度は、50-300mM Kclが適当で、0や1MではGUVは生じなかった。コレステロールを添加したものや、PS,PA,ホスファチジルイノシトール単独では巨大ベシクルは生じなかった。一方、ホスファチジルエタノールアミンを主成分とする脂質からは、高収率で巨大多重層ベシクルが生成した。2.筋小胞体膜ベシクルをアゾレクチンと共にデオキシコール酸で可溶化し、透析して、脂質置換SUVを調製した。これを凍結-融解したところ、脂質のみの場合と異なって、直径1μm程度のベシクルを生じるのみで、十分に巨大化しなかった。そこで、ベシクルを誘電泳動法により配列・接触させたところに、高電圧パルスを与える、いわゆる電場融合法を適用することによって、巨大ベシクル化した。3.以上より、膜蛋白質を巨大ベシクルに再構成する方法をほぼ確立できた。今後、この系を実際に用いて、電気生理学的測定法によりカルシウム輸送を測定する予定である。
浮体式洋上風力発電施設の動的応答と成立性評価に関する研究

浮体式基礎を利用した洋上風力発電施設の実現に向け、1)設計の基本ツールとなる、浮体基礎、係留系、タワー、風車を一体とした連成振動予測技術の開発、2)施工性がよく、大量生産時に大幅なコスト低減が見込める構造として、下部をプレキャストPCセグメント、上部を鋼製としたハイブリッドスパー構造を開発し、その1/10モデルによる実海域実験を実施、3)想定海域の設計波浪推算システムの開発、等を行った。浮体式基礎を利用した洋上風力発電施設の実現に向けて、(1)低コストな浮体式洋上風力発電施設の基本コンセプトの策定とその成立性の検討、(2)設計の基本ツールとなる、浮体基礎、係留系、タワー、ブレードを一体とした連成振動予測技術の開発、を研究目的とし、AFのサブテーマを設定し、研究協力者(戸田建設、富士重工業、新日鉄エンジニアリング、佐世保重工業)とも分担・連携しながら実施した。全体会合は6回実施した。A.プレキャストPCセグメント工法によるスパー型洋上風力発電用基盤浮体の開発:2MWプロトタイプの概念検討をおこない、概算コストの算出をおこなった。また、実機の1/22.5モデルに対する水槽実験を行った。B.合成繊維索と投げ込み式アンカーを用いた新形式係留法の検討:SPAR用合成繊維索、複合トート係留および最適チェーン係留の検討、サクション杭の貫入及び把駐力解析プログラムの開発、さらに損傷時係留解析を実施した。C.係留、浮体、タワー、ブレードを一体とした連成振動シミュレーションプログラムの開発:6自由度剛体としての運動方程式に基づく波浪応答解析プログラムを開発し、1/22.5モデルに対する水槽実験結果との比較をおこない、その精度の検証を行った。D.風と波を同時に受けるスパー型浮体の動揺解析に関する実験:風を定常力として与えた上で、波と風の入射角度をパラメータとした水槽実験を実施し、シミュレーションプログラムの検証データを取得した。E.風車の動揺制限値の把握・浮体動揺時の風車機械系、ブレード、タワーの疲労評価:浮体動揺実験および解析結果に基づき、タワーの疲労評価を実施した。F.実証実験サイト選定のための洋上風況と波浪の推算:実証実験サイトを選定した上で、洋上風況および波浪推算をおこない、50年再現期間に対する設計風速・波高を定めた。浮体式基礎を利用した洋上風力発電施設の実現に向けて、(1)低コストな浮体式洋上風力発電施設の基本コンセプトの策定とその成立性の検討、(2)設計の基本ツールとなる、浮体基礎、係留系、タワー、ブレードを一体とした連成振動予測技術の開発、を研究目的とし、AEのサブテーマを設定し、研究協力者(戸田建設、富士重工業、新日鉄エンジニアリング、佐世保重工業、双日九州)とも分担・連携しながら実施した。全体会合は4回実施した。A.想定実機の1/10モデルによる洋上実験の実施;ハイブリッドスパーの製作性や海域上での施工性も含めて実証するため,想定実機の1/10スケールモデルを用いた実海域実証実験を実施した.佐世保港の湾内、岸壁から30m沖合に、下部をプレキャストPCセグメント、上部を鋼製とするスパー型浮体、鋼製タワー、定格出力1kWの水平軸型風車および3本のアンカーチェーンと重力式アンカーを構成要素とする実証実機を設置し、約3週間にわたって自然外力下での浮体挙動等の計測を行った。本実験により、ハイブリッドスパーコンセプトの基本的な成立性を確認した。B.係留、浮体、タワー、ブレードを一体とした連成振動シミュレーションプログラムの開発;MATLABを用いた浮体動揺解析プログラムにより、上記Aの実験結果を再現し、プログラムの検証をおこなった。また、設計解析ツールとして、NREL/FASTプログラムに浮体動揺および係留解析プログラムを組み込むことで、連成振動解析プログラムの開発をおこなった。C.新形式係留法の検討;砂地盤用サクションアンカーの検討を実施した。D.洋上風況・波浪推算法の実測による検証と予測精度の向上;洋上での風況解析と波浪推算を実施し、想定海域における設計波高、設計風速を算出した。E.100kW級風車を搭載したスパー型基礎による実証実験計画の策定;同基本計画を策定した。浮体式基礎を利用した洋上風力発電施設の実現に向けて,(1)低コストな浮体式洋上風力発電施設の基本コンセプトの策定とその成立性の検討,(2)設計の基本ツールとなる,浮体基礎,係留系,タワー,ブレードを一体とした連成振動予測技術の開発,を研究目的とし、連携研究者(京都大・森信人,安田誠宏,海技研・井上俊司)および研究協力者(戸田建設,富士重工業,新日鉄エンジニアリング,佐世保重工業,双日九州,日本ヒューム,ジェイ・パワーシステムズ,ながさき地域政策研究所)とも分担・連携しながら実施した。特に、最終年度となる本年度は実海域実証実験実施のための基礎検討を以下のサブテーマに対して実施した。A.社会的制約条件の調査

漁業事業者の受容性調査景観に対する影響と地元住民および関連自治体の受容性調査その他法的規制に関する調査、等B.自然環境条件の調査気象再解析モデルによる設計風速の算定とその検証波浪シミュレーションによる設計波の算定とその検証、等C.浮体式洋上風力発電施設に作用する外力の算定と基本設計空力・流力・弾性・制御力一体解析モデルによる全体系応答予測と設計外力の評価簡易解析モデルによる強度評価と基本設計検討、等D.洋上施工の基礎検討洋上での浮体曳航・設置,タワー・風力発電機の取付施工に関する基礎検討E.実証実験計画の素案作成本基礎検討を通じて、2MWクラスのハイブリッドスパー型浮体式洋上風力発電施設の技術的成立性を確認した。
転写調節因子CREBの細胞内ソーティングとそのリン酸化制御

Western-blottingで通常CREBは約43kDの位置に検出されるが、同調を行ったものでは、これに加えてM期にのみ、これより泳動度の小さい(約45kD)バンドが認められた。オカダ酸処理によっても同様な結果が得られたことから、CREBのM期における変化にはリン酸化が関与していると思われた。in vitroでCREBのリン酸化を行ったところCREBの転写活性を制御するA-kinaseでは43kDのバンドのみであったのに対し、cdc2kinaseでは、M期同調およびオカダ酸処理と同様のシフトが認められた。以上の結果より、CREBはM期においてA-kinase以外の酵素によりリン酸化を受けることが判明し、その候補としてはcdc2 kinaseが挙げられた。cdc2 kinaseの活性は、細胞周期依存性に変化し、M期に最大となる。また、M期の細胞では分裂を行うために核膜が消失し、蛋白合成も基本的に停止するとされている。従って、M期におけるCREBのリン酸化は、その転写活性の制御の上で何らかの機能的役割を持っていると思われる。
呼吸中枢異常や概日リズム異常を呈する、転写因子MITF変異マウスの病態の解析

メラノサイトの分化には、転写因子であるMITFやSOX10、分泌タンパクendothelin 3とその受容体endothelin receptor type B(EDNRB)が必須である。これらの遺伝子変異マウスは、メラノサイトが欠損し白い体毛となる。まず我々はメラノサイトの新たな生理的役割を探索するために、Mitf遺伝子変異マウスであるMitf-black eyed white(bw)マウスの様々な生理機能を解析した。正常なマウスでは夜間に活発化した運動が夜間後期に減少するが、bwマウスでは夜間後期の運動の減少が認められなかった。また換気応答の解析の結果、bwマウスの安静覚醒時の呼吸数が正常なマウスに比べ少なく、低酸素及び高炭酸ガス刺激に対して過剰応答した。これらの症状から、bwマウスには概日リズムや呼吸調節の異常があると予想される。そこでbwマウスの病態の分子機序を解明するために、Wild typeとbwマウスの皮膚によるcDNA microarray法を行った。そして、新規メラノサイトマーカーとしてlipocalin-type Prostaglandin D synthase(L-PGDS)を同定した。L-PGDSの発現がMITFによって制御されることも示した。L-PGDSは睡眠の調節に関与しており、夜間運動亢進の原因である可能性がある。さらに我々は、SOX10がEDNRB遺伝子の転写を活性化することを明らかにした。さらに、EDNRBを発現しないHeLa細胞(子宮頸ガン)ではEDNRB遺伝子プロモーターがメチル化されており、一方メラノサイトではメチル化されていなかった。SOX10によるEDNRB遺伝子の転写活性化には、EDNRB遺伝子プロモーターの脱メチル化が必要であった。以上より、メラノサイトの新たな生理的役割や恒常性維持機構が示唆された。Mitf-black eyed white(Mi-bw)マウスは、メラノサイトの分化に必須な転写因子MITFの発現が著しく障害されているために、メラノサイトが欠損し白い体毛となる。我々はMITFやメラノサイトの新たな生理的役割を探索するためにMi-bwマウスの様々な生理機能を解析した。その結果、夜間運動の亢進や、低酸素刺激による過剰な換気応答を発見した。正常なマウスでは夜間(暗期)に活発化した運動が夜間後期に減少するが、Mi-bwマウスでは夜間後期の運動の減少が認められなかった。この症状から、Mi-bwマウスには何らかの概日リズムの異常があると予想される。またマウス用ボディープレスチモグラフにより、無麻酔・無拘束下でマウスの即時(刺激後20秒以内)換気応答の解析を行った結果、Mi-bwマウスの安静覚醒時の呼吸数が正常なマウスに比べ有意に少なく、低酸素および高炭酸ガス刺激に対して過剰応答した。これらの症状はMITFやメラノサイトの知見から予想しえない。上記症状が中枢神経に起因する可能性もある。さらに我々はMITFの標的遺伝子を網羅的に探索するために、Wild typeとMi-bwマウスの皮膚との間でcDNA microarray法を行った。その結果、メラノサイトを欠損したMi-bwの皮膚において発現が減少した多くの遺伝子が同定された。その中にはメラノサイトの新たな生理機能を伺わせる、予想外の遺伝子も存在した。例えばProstaglandin D2 synthase(brain-type)(PGDS)が同定された。PGDSは睡眠の調節に関与することが知られており、夜間運動の亢進の原因である可能性がある。我々はPGDSの発現がMITFによって制御される、新規メラノサイトマーカーであることを明らかにした。以上より、転写因子MITFやメラノサイトの新たな生理的役割が示唆された。