hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
局所結晶方位解析による動的再結晶における新粒生成機構の解明

動的再結晶における新粒生成の機構を解明することを目的に、γ-TiAl、純ニッケル、純銅を対象に、高温単軸圧縮変形を温度、歪み速度ならびに歪み量を種々変えて行い、集合組織ならびに結晶粒界解析を行った。動的再結晶においては、新粒生成に先行して必ず結晶粒界が湾曲することに注目し、湾曲の程度と結晶粒界近傍の結晶方位分散の関係を調べた。その結果、湾曲が進行するほど結晶粒界近傍に形成されるサブグレイン間の方位差が大きいことを見出した。また、動的再結晶が生ずる変形条件の範囲内での高温、低歪み速度領域(いわゆる低Z条件)ではγ-TiAlには先鋭な集合組織が形成されるが、純ニッケルや純銅では集合組織はそれほど発達しないこと、低温、高歪み速度条件(いわゆる高Z条件)では集合組織の発達はきわめて弱いことを見出した。結晶粒界解析の結果、低Z条件で変形した純銅、純ニッケルには高い頻度で双晶が形成されていることが判明した。大角粒界の全長に占める双晶境界の割合は50%を越える場合も認められた。同じく低Z条件での変形であってもγ-TiAlには双晶はほとんど認められなかった。これらの事実から、低Z条件における新粒の主たる生成機構は歪み誘起粒界移動であると結論した。一方高Z条件では双晶の頻度はZ値が増加すると共に小さくなった。このことは、高Z条件における動的再結晶は、新粒が結晶粒界近傍の不均一変形領域から核生成・成長によって生まれることを示している。これらの成果は、動的再結晶を活用した熱間加工により、結晶粒径、双晶境界頻度ならびに集合組織の制御が可能であることを示唆している。純ニッケル、純銅、Al-3mass%Mg合金を対象に、いずれも広く変形温度、歪み速度、最終歪み量を変えて単軸圧縮試験を行い、変形特性、結晶粒組織観察ならびに結晶粒界解析を行った。純ニッケルならびに純銅では、動的再結晶が生ずる場合には、変形温度が低温になるほど、また歪み速度が高くなるほど、すなわち高Z変形条件で集合組織が発達した。高温、低歪み速度すなわち低Z変形条件では集合組織はほとんど形成されなかった。典型的な高Z条件と低Z条件で試料を作製して結晶粒界の解析を行ったところ、低Z条件では双晶境界の頻度が全大角粒界の50%以上にも達するのに対し、高Z条件では10%にも満たなかった。さらに高Z条件で変形した試料について、結晶粒界に沿った結晶方位の分布を調査したところ、同一結晶粒内に結晶方位差が15度を上回る領域が頻度高く存在していることが判明した。このことから、高Z変形条件では、動的再結晶初期に生ずる結晶粒界の湾曲によって結晶粒界近傍に結晶方位差の大きい下部組織が形成され、それが新粒生成をもたらすと考えた。この新粒は変形によってある量の結晶回転を変形の安定方位に向けて生じた後に再度新粒化する。この結晶回転によって集合組織が発達したのではないかと考えられる。一方低Z条件では、結晶粒界付近に結晶方位差の大きな領域が形成されず、歪み誘起粒界移動により新粒が生成される。新粒は変形の安定方位に向けた結晶回転の影響を受けるが、粒界移動の過程で双晶形成により結晶方位がランダム化するために集合組織が発達することはないと考えると変形条件による集合組織形成の変化は理解できることになる。歪み誘起粒界移動が困難と考えられるAl-3mass%Mg合金の動的再結晶では圧縮変形集合組織が発達したが、容易回復方位とされる(100)(圧縮面)も併行して成長した。これの形成機構については次年度の課題としたい。純ニッケル、純銅、Al-Mg合金、γ-TiAl

金属間化合物を対象に、いずれも広く変形温度、歪み速度、最終歪み量を変えて単軸圧縮試験を行い、変形挙動と結晶粒組織の調査、集合組織測定ならびに結晶粒界解析を実施して、様々な金属材料における動的再結晶下での新粒生成機構の解明をすすめた。金属間化合物では高温、低歪み速度条件、すなわちいわゆる低Z変形条件で先鋭な集合組織が形成された。純ニッケルならびに純銅では、動的再結晶が生ずる場合には、変形温度が低温になるほど、また歪み速度が高くなるほど、すなわち高Z変形条件で集合組織が発達した。低Z変形条件では集合組織はほとんど形成されなかった。典型的な高Z条件と低Z条件で試料を作製して結晶粒界の解析を行ったところ、低Z条件では双晶境界の頻度が全大角粒界の50%以上にも達するのに対し、高Z条件では10%にも満たなかった。これに対し、γ-TiAlでは低Z条件でも双晶の頻度は数%に過ぎなかった。このことから、高Z変形条件では、動的再結晶初期に生ずる結晶粒界の湾曲によって結晶粒界近傍に結晶方位差の大きい下部組織が形成され、それが新粒生成をもたらすと考えた。この新粒は変形によってある量の結晶回転を変形の安定方位に向けて生じた後に再度新粒化する。この結晶回転によって集合組織が発達したのではないかと考えられる。一方低Z変形条件では、結晶粒界付近に結晶方位差の大きな領域は形成されず、歪み誘起粒界移動により新粒が生成される。新粒は変形の安定方位に向けた結晶回転の影響を受け、双晶の形成頻度が少ない金属間化合物では先鋭な集合組織の発達をもたらす。これに対し銅やニッケルでは、粒界移動の過程で双晶形成により結晶方位がランダム化するために集合組織が発達することがなかったと考えられる。歪み誘起粒界移動が困難と考えられるAl-3mass%Mg合金の動的再結晶では、変形の初期には(011)繊維集合組織が発達するが歪みの増大とともに、(100)(圧縮面)が先鋭化した。この形成は、変形前に存在していた、(100)近傍方位の結晶粒が、変形の進行中も回復が容易なために周囲に存在する歪みの大きな結晶粒を消費して成長することによると考えられる。
花食者が創り出す花形質の性差と多様性

花と花食性および送粉性昆虫との相互作用の中で、花の雌雄差がどのようにして生み出されるのかを明らかにすることを目的に、雑居性雌雄異株植物ヒサカキを材料として研究を進めている。前年に続き、花の大きさ、花蜜の雌雄差と送粉者数について再解析を行い、(1)雄花は雌花より大きいこと、(2)花蜜糖度は雄花より雌花で高いこと、(3)雄花と雌花で送粉者数に有意な差は見られないこと、(4)雄では花弁の大きさが送粉者数と正の相関にあるが、雌ではそうでないこと、(5)雌では花蜜糖度が送粉者数と正の相関にあるが、雄ではそうでないこと、を明らかにした。これらの結果は、雄花では送粉者数を多く呼ぶための広告として、機能すると考えられている花弁が、雌花では送粉者を呼ぶための報酬として機能すると考えられる花蜜が、送粉者の誘引に寄与していることを示唆している。防御を含む複数の花形質の雌雄差や花食害に関わる測定、実験結果の再解析も前年に続き行った。その中で、花弁を除去しても花粉添加すれば結実率は低下しないが、花粉を添加しなければ、自然状態に比べ結実率が半分ほど低下することが明らかになった。このことは、ヒサカキでは、花弁の損傷が送粉者の誘引を低下させることを示唆している。また、ヒサカキ以外の植物、ミミュルスを材料に、花食者と送粉者の関係に焦点をあて研究も行った。この研究では、野外で花食害の頻度と送粉者の訪花に負の相関がみられることを明らかにした。そこで、この負の相関は、前述のヒサカキ同様花弁の損傷が送粉者の誘引を低下させたためではないかと考え、花弁を損傷させる実験を行ったが、この予測を支持する結果は得られなかった。野外観察及び実験結果を解析する中、野外で見られた花食害と送粉者の訪花頻度の負の相関は、送粉者が好む花の場所と、花食者が好む花の場所が異なることによりみられているのではないかと考えられた。27年度が最終年度であるため、記入しない。花と花食性および送粉性昆虫との相互作用の中で、花の雌雄差がどのよりにして生み出されるのかを明らかにすることを目的に、雑居性雌雄異株植物ヒサカキを材料に、研究を進めている。今年度は、ピサカキの花形質の雌雄差を明らかにするため、形態、花蜜に着目し、測定・分析を行った。その結果、雌花は雄花に比べ小さいものの、花蜜量が多く、花蜜糖度が高いことが明らかになった。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いた分析により、花蜜には、スクロース、グルコース、フルクトースの3成分が含まれ、スクロースとグルコースの含有量が雌花で高くなっていることが分かった。さらに、これら雌雄差のある形質が送粉者の誘因に与える効果を明らかにするため、野外観察を行った。その結果、花蜜量・糖度は訪花昆虫数と正の相関を示し、ヒサカキ雌個体では、花蜜量・糖度と種子生産量(結実率・発達種子率)に正の相関がみられた。一方、花の大きさと訪花昆虫数・種子生産量には有意な相関は見られなかった。また、花食害が繁殖成功に及ぼす影響を調べるため、雌花において、人工的に花食害に似せた傷をつけ、結実率を測定した。その結果、傷付けた花の結実率は低く、ほぼ結実には至らなかった。このことは、受粉前の花食害が、受粉を妨げ、雌花の繁殖成功を大きく低下させることを示している。ヒサカキの花食害は蕾の時期からみられ、受粉前の花食害が最も多く観察されることから、花食者の存在は雌ヒサカキの繁殖成功度に大きく関わっていると考えられる。花と花食性および送粉性昆虫との相互作用の中で、花の雌雄差がどのようにして生み出されるのかを明らかにすることを目的に、雑居性雌雄異株植物ヒサカキを材料として、研究を進めている。本年度は、前年に続き、ヒサカキの花形質の雌雄差を明らかにするため、形態、花蜜に着目するだけでなく、花の匂いにも着目し、研究を行った。その結果、花蜜量は同一個体内でも時間帯により大きく変化するものの、雄花は雌花より花蜜生産量が少ないこと、雄花は雌花より大きいことが再確認された。匂いについては、解析中であるが、匂いの強さは花数とは相関がなさそうなこと、雄花のほうが雌花より強い匂いを出している傾向があることが分かってきた。また、花の大きさと、花蜜の質は、送粉者の誘引に正の効果を持つことが、再解析の結果、明らかになった。この結果については、学会(Evolution2014, ESA 2014,進化学会2014)にて発表を行った。また、前述の花形質の雌雄差と合わせ執筆した論文原稿を再考しているところである。これまで花食者の調査に伴い、経年、花の蕾のサイズを計測してきた。しかし、この蕾サイズが、蕾期の葯/胚珠、花弁、ガクのどの器官のサイズと相関があるのか、また、開花後の花のサイズと相関があるのかは明らかになっていなかった。

そこで、蕾、花の形態計測を行い、形質間の相関の解析を行った。その結果、雌花では、蕾サイズと特定の蕾器官のサイズに相関は見られないものの、蕾が大きい花ほど、開花後の花も大きい傾向にあること、雄花では、蕾サイズはガクのサイズと相関はないが、花弁と葯のサイズと正の相関がみられること、雌花同様、大きい蕾ほど、開花後の花も大きい傾向にあることが明らかになった。また、花食者数と花食害の程度も継続調査しており、各花形質と花食害の程度の関係の解析も進めている。花と花食性および送粉性昆虫との相互作用の中で、花の雌雄差がどのようにして生み出されるのかを明らかにすることを目的に、雑居性雌雄異株植物ヒサカキを材料として研究を進めている。前年に続き、花の大きさ、花蜜の雌雄差と送粉者数について再解析を行い、(1)雄花は雌花より大きいこと、(2)花蜜糖度は雄花より雌花で高いこと、(3)雄花と雌花で送粉者数に有意な差は見られないこと、(4)雄では花弁の大きさが送粉者数と正の相関にあるが、雌ではそうでないこと、(5)雌では花蜜糖度が送粉者数と正の相関にあるが、雄ではそうでないこと、を明らかにした。これらの結果は、雄花では送粉者数を多く呼ぶための広告として、機能すると考えられている花弁が、雌花では送粉者を呼ぶための報酬として機能すると考えられる花蜜が、送粉者の誘引に寄与していることを示唆している。防御を含む複数の花形質の雌雄差や花食害に関わる測定、実験結果の再解析も前年に続き行った。その中で、花弁を除去しても花粉添加すれば結実率は低下しないが、花粉を添加しなければ、自然状態に比べ結実率が半分ほど低下することが明らかになった。このことは、ヒサカキでは、花弁の損傷が送粉者の誘引を低下させることを示唆している。また、ヒサカキ以外の植物、ミミュルスを材料に、花食者と送粉者の関係に焦点をあて研究も行った。この研究では、野外で花食害の頻度と送粉者の訪花に負の相関がみられることを明らかにした。そこで、この負の相関は、前述のヒサカキ同様花弁の損傷が送粉者の誘引を低下させたためではないかと考え、花弁を損傷させる実験を行ったが、この予測を支持する結果は得られなかった。野外観察及び実験結果を解析する中、野外で見られた花食害と送粉者の訪花頻度の負の相関は、送粉者が好む花の場所と、花食者が好む花の場所が異なることによりみられているのではないかと考えられた。本年度は昨年の調査をもとに解析を進め、学会発表と論文執筆に取り組んだ。また、花の匂い分析をはじめ様々な調査も行っている。その結果、雌雄ともに、蕾が大きい花ほど、開花後の花も大きい傾向があることなどが分かった。これまで、花食は蕾の時期に生じるため、花食者の資源に関して蕾のサイズに焦点を当ててきた。しかし、上記の結果は、蕾のサイズが花食者だけでなく、開花後の花のサイズと正の相関があることで、送粉者の誘引を促進している可能性を示唆している。現在、野外実験の結果に基づいて論文を作成中である。以上の進捗状況により、おおむね順調に進んでいると判断した。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題に関する主なデーターの収集はほぼ完了しているため、そのデータをもとに、今後解析を行っていく。また、その解析をもとに、追加実験などを行っていく。なるべく早く成果を公表できるよう、論文執筆や学会発表などに力を入れたい。当初の予定通り、花蜜量を含め、複数の雌雄差のある形質を明らかにし、その形質が送粉性昆虫の誘因に与える効果を明らかにした。また、花食性昆虫が雌植物の適応度に与える効果をも明らかにした。本年は研究の初年度であり、多くのデータを得ることが必要であったが、順調に調査が進んだと思われる。研究はほぼ順調に進んでおり、これまでに得られたデータを解析し、その成果を論文などで公表する。
「コミュニケーション」を基盤にした音楽学習の開発研究

音楽科の学習にコミュニケーション活動を導入するためのカリキュラムと学習指導法・教材について,小学校低学年に焦点を当てて実践的に開発すること,及び,その成果を学校教育教員養成課程の「音楽科教育法」に取り入れ,学校教員養成と学校教育現場の密接な連携のモデルを提示することを目的とする。初年度に,コミュニケーションの原点としての方言と民話に着目し,伝統的な音楽要素を用いたミュージカル製作,附属小学校で参加型・相互コミュニケーション型の上演を試みたことを受けて,本年度は,「音楽科教育法」における多種の創造的表現学習においては,グループ内でのコミュニケーションの様態に着目して分析し,活発なコミュニケーションが表現内容の深化に寄与することを明らかにした。音楽科の学習にコミュニケーション活動を導入するためのカリキュラムと指導学習法・教材について小学校低学年に焦点をあてて実践的に開発すること,及び,その成果を学校教育教員養成課程の「音楽科教育法」に取り入れ,学校教員養成と学校教育現場の密接な連携のモデルとして提示するために,本年度は以下の研究を行った。1.イギリス,アメリカ,ドイツにおけるコミュニケーション教材を分析し,非言語コミュニケーションにおける音楽的要素を抽出した。2.アメリカとドイツの音楽教材をコミュニケーション機能の視点から分析し,日本の音楽教材との比較を行った。3.コミュニケーションの原点としての方言と民話に着目し,伝統的な音楽要素を用いたミュージカルの製作を行った。製作を学校教員養成の授業の中で行い,附属小学校で参加型・相互コミュニケーシヨン型の上演を試みた。
ゲノムワイドな反復配列を利用した日本人と日本近隣ヒト集団との識別推定法の確立

本研究計画のうち、新規マーカーとしてターゲットとしている反復配列のうち分散型のAlu配列について、当初はレトロトランスポゾンディスプレイ法によってのみ、新規のAlu配列を、日本人と韓国人(韓族)において探索することを、生命倫理審査委員会に申請する予定をしていた。しかしながら、その後、東京大学人類遺伝学研究室では、日本人約400人及び韓国人約90人の全ゲノム塩基配列データから、日本人で約5000箇所と韓国人で約3000箇所のAlu挿入部位を検出し、その挿入箇所データの提供が可能であるとの情報を得た。これらの箇所は、in silico(コンピュータ解析のみ)のデータであるので、実際にどれくらい精度があるか評価する。もし、精度の高いデータであるならば、当初の予定した計画に、このデータを使用することが可能となり、このデータ使用を含めて生命倫理審査委員会へ申請した方が、より効率的・効果的であると考えた。そこで、日本人8名のDNA試料を用いて、予備的にその挿入箇所データの評価を行った。選出されたAluYa5及びAluYb8サブファミリーの各40部位のうち、挿入予想部位前後100 bpに特異的な配列が存在しなかった部位を除く、それぞれ37及び38部位について、プライマー設計が可能であった。そのうち、各35部位において、Alu配列の挿入が確認されたので、これらの挿入箇所データの精度は非常に高いと評価することができた。従って、日本人と韓族で比較する際に、このデータも利用することが可能であると判断されたので、このデータ解析も含めて生命倫理審査委員会に申請することとした。また、新規Alu探索法であるレトロトランスポゾンディスプレイ法を、承認後実験が行えるように、機器・試薬等の準備を行った。このように、当初の計画の内容を一部再々修正して、生命倫理審査委員会へ申請し、現在修正中である。平成29年度のSTR解析のための研究協力体制づくりに時間を要し、また、平成30年度は、日本人と韓国人の全ゲノム塩基配列データから、両ヒト集団を識別可能なAlu挿入箇所データを利用するか否かを検討したことにより、生命倫理審査委員会への申請が遅れているため、一見して非常に遅れているように感じられる。しかしながら、このデータ使用は、非常に信頼できるものであると実験的に評価したため、当初計画していた、分散型反復配列のAlu配列を新規に検出するための方法である、レトロトランスポゾンディスプレイ法により今後得られるデータに加えて、さらに効率的に日本人と韓国人とを識別できるAlu挿入箇所を選択することが可能になった。また、このデータを評価しながらも、実際に多検体からレトロトランスポゾンディスプレイ法を嫉視するための、デザインや機器・試薬等の購入の現実的な準備を整えた。さらに、約1000人の全ゲノム塩基配列データベースをもつ研究機関とも、多型的STRマーカーの選出及びマルチプレックス判定法の開発という点で、協力を続けており、今後この機関とも連携できる可能性が高くなった。。従って、全体的にみて、やや遅れていると考えるのが、妥当であると考える。効率的な研究方法の出現により、研究方法の変更やその研究体制の確立のために申請が遅れていた、名古屋大学医学部倫理審査委員会での承認を得る。日本人のDNA試料については、既に法医・生命倫理学研究室で保有している非連結匿名化試料のうち質の高いDNA試料を100検体選択する。韓国人(韓族)のDNA試料については、研究協力者のソウル国立大学に依頼して、ソウル在住の韓国人(韓族)の血液から抽出されたDNA試料の提供を受ける。分散型反復配列であるAlu配列に関しては、数例のDNA試料からレトロポゾンディスプレイ法を行い、塩基配列決定による特異的増幅の確認後、各個人特異的配列を付加したプライマーを用いて、日本人及び韓国人のDNA試料100検体について、レトロポゾンディスプレイ法を行う。次世代シーケンサMiSeqにより塩基配列を決定し、各個人のゲノム上でのAlu配列の挿入部位を決定する。また、東京大学人類遺伝学研究室より提供された、日本人及び韓国人の全ゲノム塩基配列解析データよりin silico解析で得られた、各集団におけるAlu挿入部位のデータを用いて、集団ごとにAlu挿入部位を比較して、個体特異的部位、各集団共通部位、各集団特異的部位を選択する。縦列反復配列のSTRsに関しては、同様に日本人及び韓国人のDNA試料を用いて、一方のプライマーに各個人特異的配列を付加したプライマーを、250座位の座位ごとに用意し、これらを混合後、PCR増幅を行い、次世代シーケンサMiSeqによる塩基配列決定解析を受託会社に委託する。各個人の塩基配列から得られた型判定結果から、集団遺伝学的解析を行い、両集団で異質性の高いSTR座位を選択後、判別可能なカテゴリー分析あるいは判別分析について検討する。できれば、東北大学のゲノムバンクと共同研究契約を締結後、それらのうち日本人で識別力の高いSTRs座位を選択する。

もし、精度の高いデータであるならば、当初の予定した計画に、このデータを使用することが可能となり、このデータ使用を含めて生命倫理審査委員会へ申請した方が、より効率的・効果的であると考えた。そこで、日本人8名のDNA試料を用いて、予備的にその挿入箇所データの評価を行った。選出されたAluYa5及びAluYb8サブファミリーの各40部位のうち、挿入予想部位前後100 bpに特異的な配列が存在しなかった部位を除く、それぞれ37及び38部位について、プライマー設計が可能であった。そのうち、各35部位において、Alu配列の挿入が確認されたので、これらの挿入箇所データの精度は非常に高いと評価することができた。従って、日本人と韓族で比較する際に、このデータも利用することが可能であると判断されたので、このデータ解析も含めて生命倫理審査委員会に申請することとした。また、新規Alu探索法であるレトロトランスポゾンディスプレイ法を、承認後実験が行えるように、機器・試薬等の準備を行った。このように、当初の計画の内容を一部再々修正して、生命倫理審査委員会へ申請し、現在修正中である。平成29年度のSTR解析のための研究協力体制づくりに時間を要し、また、平成30年度は、日本人と韓国人の全ゲノム塩基配列データから、両ヒト集団を識別可能なAlu挿入箇所データを利用するか否かを検討したことにより、生命倫理審査委員会への申請が遅れているため、一見して非常に遅れているように感じられる。しかしながら、このデータ使用は、非常に信頼できるものであると実験的に評価したため、当初計画していた、分散型反復配列のAlu配列を新規に検出するための方法である、レトロトランスポゾンディスプレイ法により今後得られるデータに加えて、さらに効率的に日本人と韓国人とを識別できるAlu挿入箇所を選択することが可能になった。また、このデータを評価しながらも、実際に多検体からレトロトランスポゾンディスプレイ法を嫉視するための、デザインや機器・試薬等の購入の現実的な準備を整えた。さらに、約1000人の全ゲノム塩基配列データベースをもつ研究機関とも、多型的STRマーカーの選出及びマルチプレックス判定法の開発という点で、協力を続けており、今後この機関とも連携できる可能性が高くなった。。従って、全体的にみて、やや遅れていると考えるのが、妥当であると考える。本研究計画のうち、STR多型解析について、当初の予定より研究協力体制を拡大した方がより効率的であることが判明した。しかし、その確立中に、STRデータ解析及び全ゲノム塩基配列データベースを扱う専門的知識を有する研究協力予定者が急遽日本国内の機関に異動することが判明し、STRデータ解析に前所属機関への参画ができなくなった。データ及びデータベースは、研究協力予定者の前所属機関に付随し、持ち出し不可のため、新たにその機関の膨大なデータを利用するために、新たに人材を確保し、研究協力体制の見直しをする必要が生じた。
単一心筋細胞を用いたNa/Ca交換機構の細胞内制御機構に関する研究

低Na^+溶液を急速に短期間灌流することによる一過性の[Ca^<2+>]i上昇(Na^+withdrawal Ca^<2+>transient:SWCT)は、Na_+/Ca^<2+>交換機構を介するreverse-modeによるCa^<2+>流入を反映する。代謝阻害時には、[Na^+]iは対照に比し増加したが、SWCTは抑制された。一方、washout時のSWCTは、対照および代謝阻害時に比べ増加した。これにより、代謝阻害時には、Na^+の電気化学的勾配は増大するが、Na_+/Ca^<2+>交換活性は抑制されるため、Ca^<2+>influxは減少することが示唆された。Na^+/Ca^<2+>交換機構の阻害薬KB-R7943は、定常状態での細胞収縮とCa^<2+>transientを変化させず、筋小胞体のCa貯蔵量、休止後の収縮とCa^<2+>transientの増大反応、活動電位を変化させなかった。一方、strophanthidinによりNa/KATPaseが抑制された状態ではKB-R7943は、陽性変力作用に影響を与えることなしに拡張期のCa^<2+>濃度を減少させ自発性Ca律動を抑制した。また、KB-R7943は、低酸素灌流後の再酸素化時の不整脈の発生頻度と収縮張力の回復を促進した。Na^+/Ca^<2+>交換機構を介するCa^<2+>流入は、正常の興奮-収縮連関や強心配糖体の陽性変力作用には重要な役割をもたないが、細胞内Na^+濃度が高い状態での催不整脈性のCa^<2+>過負荷に関与することが示唆された。モルモットの単一心室筋細胞をSBFI(40μM)とfluo-3(20μM)で同時負荷し、顕微蛍光法により[Na^+]iと[Ca^<2+>]iを同時に測定した。microinjectorを用いて低Na^+溶液を急速に短期間(10秒間)灌流することにより、一過性の[Ca^<2+>]i上昇(Na^+ withdrawal Ca^<2+>transient;SWCT)を測定して交換活性の指標とした。strophanthidin(1-100μM)により[Na^+]iとSWCTは共に増加し、SWCTの[Na^+]i依存性が示され、SWCTがNa^+/Ca^<2+>交換活性を反映することが示唆された。CCCP(5μM)とamytal(3.3mM)による酸化的燐酸化阻害およびそのwashoutを虚血/再灌流のモデルとし、代謝阻害とその解除時のNa^+/Ca^<2+>交換活性に及ぼす影響を検討した。これにより、代謝阻害時には、Na^+の電気化学的勾配は増大するが、Na^+/Ca^<2+>交換活性は抑制されるため、Ca^<2+>influxは減少することが示唆された。しかし、SWCTは、ryanodineやthapsygarginの存在下でその振幅が減少することから、Na^+/Ca^<2+>交換を介するCa^<2+>流入にtriggerされる筋小胞体からのCa^<2+>放出が関与することが示唆された。

今後、Ca^<2+> channel blockerとSRのblocker存在下での虚血/再灌流のモデルにおけるSWCTを検討する予定である。Na/Ca交換機構の再酸素化時における役割を、モルモット摘出乳頭筋においてNa/Ca交換機構のreverse modeの特異的阻害剤であるNO-7943を用いて検討した。1)NO-7943の低Na灌流時の拘縮に対する効果:低Na灌流によるNa/Ca交換機構のreverse modeに起因する拘縮は、対象群では、定常刺激時の収縮張力の55.6±10.7%であったが、NO-7943(10μM)は、低Na灌流による拘縮を22.6±7.5%に抑制した(mean±SE,n=6,p<0.05)。2)NO-7943の定常刺激時の細胞内電位と張力に対する効果:NO-7943は、定常刺激時の収縮張力(37.7±6.5 vs 37.4±8.1mg)、静止張力(73.4±3.5 vs 71.5±2.5mg)や活動電位の振幅(125±1 vs 123±3mV)、持続時間(140±8 vs 142±8mV)、立ち上がり速度(214±9 vs 210±9V/sec)、静止膜電位(-89±0.1 vs -89±0.6mV)に影響を与えなかった(n=4)。また、脱分極心筋のslow action potentialと収縮張力も変化させなかった(n=3)。3)Na/Ca交換機構の再酸素化時における役割:グルコースを含まない低酸素灌流液で60分間灌流後、酸素化した灌流液で乳頭筋を灌流した。再酸素化直後に、対照群では7例全例でCa過負荷による不整脈を認めたが、NO-7943の前投与により不整脈の発生は7例中4例に減少し、その持続時間も対象群の71±16.6秒に対し21.1±14.4秒に短縮した(p<0.05)。aftercontractionの振幅は、対照群では収縮張力の14.5±1.2%であったが、NO-7943により7.7%に減少した(p<0.05)。また、再酸素化30分後の収縮張力の回復も対照群の72.5±2.8%に比し、85.3+4.3%に改善した(p<0.05)。再灌流時の不整脈や収縮不全が、Na/Ca交換機構の活性化によりもたらされることが示唆された。reverse modeのNa/Ca交換機構の選択的阻害薬であるKB-R7943を用いて、Na/Ca交換機構を介するCa流人の役割をCa感受性指示薬indo-1を負荷したratの単離心筋細胞で検討した。KB-R7943は、定常状態での細胞収縮とCa transientを変化させなかった。また、KB-R7943は、筋小胞体のCa貯蔵量、休止後の収縮とCa transientの増大反応、活動電位の初期相を変化させなかった。strophanthidinによりNa/K ATPaseが抑制された状態では、KB-R7943は、陽性変力作用に影響を及ぼすことなしに拡張期のCa濃度を減少させ、自発性Ca律動を抑制した。Na/Ca交換機構を介するCa流入は、正常の興奮-収縮連関や強心配糖体の変力作用には重要な役割をもたないが、細胞内Na濃度が高い状態での催不整脈性のCa過負荷に関与することが示唆された。
希土類含有層状酸化物の静電自己組織的構築

金属酸化物ナノシートを用いて希土類イオンが層間にインターカレートした層状物質や希土類イオンが格子内に入ったナノシートを作製し、これらがナノシートのバンドギャップ光励起から希土類イオンへのエネルギー移動に基づいた強い発光を示すことを発見した。さらに層間の希土類イオンの場合、それが水和している水分子によって発光が促進されることの発見や希土類イオンのナノシート光電気化学的反応による発光の制御に成功した。本年度は、主にナノシートの中に含まれる希土類イオンの発光特性について、吸着状態、水分子の影響、層内希土類イオンの発光、電気化学発光特性など、様々な角度から検討し、ナノシートと希土類イオンとの相互作用を利用した発光の実学的側面についても検討した。特に顕著な成果についてまとめると以下のようになる。1、TiOやNbO系ナノシート表面にそれぞれEuやTbを吸着させるだけで、ナノシートからのバンドギャップ励起によるエネルギー移動が生じ、希土類イオンが強い発光を示すことが発見された。この発光には、水分子が大きく影響し、水分子がエネルギー移動を促進していることが明らかとなった。すなわちナノシート表面の吸着水分子と希土類イオンを水和している水分子の強い水素結合による。そのため、内部のペロブスカイト型ナノシートの希土類イオンの発光には水分子の影響は受けない。この希土類イオン吸着ナノシートをアルコールや他の遷移金属イオンを含む溶液に入れることで、発光が減少した。特に後者の場合には、生成したホールと電子が表面で光電気化学反応が生じるためである。溶液センサーとしての可能性が示された。2、層間に希土類イオンをインターカレートした層状物質を作製し、その発光特性を測定した。特にpH依存性に関してはEXAFSを駆使して層間水の状態を検討した。その結果、pHに依存して発光特性が変化するのは、層間の水分子の結合状態が変化し、それにより、エネルギー移動が変化し、発光の強度を変化させることが明らかとなった。また、水分子のphononの効果を調査するため、軽水と重水中での発光強度を比較した。特に重水中では軽水に比べて発光強度が増加し、水分子の振動が消光効果をもたらす一般的現象を確認した。結局、水分子は、消光効果も有しているが、それよりもさらにエネルギー移動促進効果が強く、発光は水分子の存在下で促進されるのである。化学
海藻起源リグニンの存在とその意義

褐藻、紅藻、緑藻、約30種を用いて、アルカリ加水分解法と熱化学分解法による分析を行った。前者ではリグニンフェノールが検出されなかったことから、海藻中リグニンフェノールはエステル結合ではなく、エーテル結合で架橋されていることがより確実になった。また、後者の方法において、いずれの海藻においてもp-クマル酸が多く検出されたことは、陸上植物と同様のリグニン合成系が存在している可能性があること、またシリンガ酸が最も多く検出された褐藻類のヒバマタ目・ホンダワラ科は、リグニン様構造を発達させている可能性がある。褐藻類15種、紅藻類12種、緑藻類5種の計32種類を用いて、まず海藻中にリグニン用構造の存在を確かめるために、TMAH(水酸化テトラメチルアンモニウム)熱化学分解法とアルカリ加水分解による分析を行った。前者はエステル結合とエーテル結合を加水分解可能であり、後者はエステル結合のみを加水分解する。アルカリ加水分解法では、いずれの海藻からも脂肪酸類、ステロール類が主要な生成物で、リグニンフェノールは検出されなかった。そのため、海藻中のリグニンフェノールはエステル結合ではなく、エーテル結合で架橋されていることがより確実になった。そこでTMAH熱化学分解法による分析結果を詳細に検討した。いずれの海藻においても、p-クマル酸が403-662μg/g(平均465±245μg/g)最も多く、ついでp-ヒドロキシアルデヒド、バニリン酸がそれぞれ201-245μg/g(平均211±79μg/g)、68-181μg/g(平均134±79μg/g)検出された。海藻に含まれるリグニンフェノールの総量は、1110±467μg/gで陸上植物のリグニンフェノール濃度と比べると1/20程度であることが明らかになった。また、褐藻類のヒバマタ目に属するヤバネモク科とホンダワラ科にはシリンガ酸が111-420μg/gと他の海藻(1.6-170μg/g)と比べて多く含まれていることが明らかになった。陸上植物ではp-クマリルアルコールやp-クマル酸が始めに合成される。海藻にp-クマル酸が多いことは、陸上植物と同様の合成系が存在している可能性がある。また、シリンガ酸はリグニンフェノールの合成系において、p-ヒドロキシ酸やバニリン酸より後に合成されること、また被子植物に多く存在し、裸子植物にはほとんどないことが知られていることから、褐藻類の中でもヒバマタ目は海藻類の中でもリグニン用構造を最も発達させている可能性がある。平成23年度は、まず海藻の試料採取を行い、さらにリグニンフェノールが広く海藻中に存在することの確認、またリグニン構造の有無を検証することであった。海藻の採取は伊豆半島真鶴岬などで実施し、緑藻、褐藻および紅藻を現在30種程度採取した。海藻の分析は、まずリグニンフェノールの存在を広く確認するために、TMAH-GC-MS法にて行った。その結果、陸上植物と比較して極めて興味深いことが何点か見いだされた。(1)量的には陸上植物と比較して千分の一のオーダーであること。(2)陸上植物ではリグニンを構成する主要なフェノールユニットとして、p-ヒドロキシ類(アルデヒド、ケトン、酸)、バニリル類(アルデヒド、ケトン、酸)、シリンギル類(アルデヒド、ケトン、酸)、シンナミル類(p-クマル酸、フェルラ酸)の9種あるが、海藻では緑藻、褐藻および紅藻のいずれにも見いだされたものは、p-ヒドロキシ類のアルデヒド、バニリル類の酸およびシンナミル類のp-クマル酸の3種だけであった。またそのほかに、p-ヒドロキシ類の酸が一部の海藻に、さらにシリンギル類の酸が褐藻類にのみ検出された。したがって、海藻中に見いだされるリグニンフェノールは、量的に極めて少なく、また構成するユニットも陸上植物と比べて単純であることが考えられ、陸上植物の幹を支えるような堅固な構造体を形成していない可能性が示唆された。これは水中では浮力が働くために堅固な構造体が不必要であることと関連しており、理にかなっている。海藻中にリグニンフェノールが存在することは、30種程度の海藻で確認した。本年度のもう一つの課題は、海藻中のリグニンフェノールが陸上植物と同様のリグニン構造をもっているかどうかを、溶媒抽出法、アルカリ加水分解法、熱化学分解法(TMAH法)の3種の抽出法にて確認することである。方法的には確立してきたが、海藻への応用は現在進めている。平成23年度は、まず海藻の試料採取を行い、さらにリグニンフェノールが広く海藻中に存在することの確認、またリグニン構造の有無を検証することを試みてきた。

平成24年度は海藻におけるリグニン構造の検証を継続するとともに、リグニンフェノールの炭素安定同位体比の測定を行い、海洋沿岸試料で検出されるリグニンフェノール化合物への海藻からの寄与の大きさを見積もる。試料の調整のために凍結乾燥機(80万円程度)の導入を計画していたが、他の研究費によりすでに購入した。ゆえに、「次年度使用額」の684,639円と平成24年度請求額の直接経費700,000円と合わせて、研究発表のための旅費(国内および国外)、分析試料の保存のための試料瓶、分析にかかわる消耗品(高純度ヘリウムガス、カラム、その他GC/MSおよびGC/C/IRMS分析のための消耗品)、分析補助者への謝金、印刷費に使用する予定である。
ノロウイルスに対する迅速診断法の開発

ノロウイルスは主に小児や高齢者の施設で集団感染を起こし、また食中毒も起こすことから、感染防止対策上迅速な診断が必要であるが、現行のPCR法では1日を要する。本研究では臨床現場において約10分で診断可能なイミュノクロマト法を開発することを目的とする。H19年度に多種のノロウイルスでも共通の抗原エピトープを有すると推定されるリコンビナントVp蛋白(rVp)の作製を行い、H20年度に完了し、これをウサギに免疫し抗体を得て、これを精製した。本年度はこの抗体を固相に結合させ、サンドイッチ法を用いて発光系による検出法を開発し、さらに感度を上げることに成功した。本方法のrVpに対する検出限界を検討し、0.1μg/mlまで検出可能であった。ノロウイルス陽性の便3検体に対して高いカウント数を示したが、非ノロウイルス下痢便でも、バックグラウンドに比較してやや高めのカウントを示した。この非特異的な発光反応を抑制するために、便の懸濁液を熱処理などの処理を行い、カウントが減少するか検討したが、応用可能な手段は認めることが不可能であった。現在さらに非特異的反応が生じない方法を発見すべく検討している。ノロウイルスはおもに小児や高齢者の施設で集団感染を起こし、また食中毒も起こすことから迅速な診断が必要であるが、現行のPCR法では1日を要する。本研究では現場で約10分で診断可能なイミュノクロマト法を開発することを目的とする。すなわち、ノロウイルスの種々の株の小カプシッド蛋白あるいはVpのアミノ酸配列の中で相同性の高い部位に対する抗体を多数作製し、より多くのウイルス株に反応する抗体を選択する。この抗体を用いて定法に従いイミュノクロマト法を作製し、臨床検体の吐物や便中のノロウイルスを検出することが可能であるか否かを検討することを目的とした。H19年度はまずリコンビナントVp蛋白の作製を目標とした。NV genotype GII.4陽性の糞便検体からRNAを抽出し、Vp蛋白遺伝子の全長をPCR法を用いて増幅し、PCRプロダクトはクローニングベクターpCR4-TOPO(invitrogen)に組み込んだ。塩基配列が正確であることを確認後、大腸菌をトランスフォームし、複数の大腸菌コロニーを得て、少量培養しVp蛋白の発現をSDS-PAGEにて確認した。当該蛋白が大腸菌体に産生されるため、大腸菌を大量培養後、菌体を破砕しアフィニティーカラムにてVp蛋白を精製した。純度の高いVp蛋白が約10mg精製された。H20年度は、このVp蛋白でマウスを免疫してポリクローナル抗体を得、この抗体を用いてイミュノクロマト法を作製していく予定である。ノロウイルスは主に小児や高齢者の施設で集団感染を起こし、また食中毒も起こすことから、迅速な診断が必要であるが、現行のPCR法では1日を要する。すなわち、ノロウイルスの種種の株の小カプシッド蛋白あるいはVpのアミノ酸配列の中で相同性の高い部位に対する抗体を多数作製し、より多くのウイルス株に反応する抗体を選択する。この抗体を用いて定法に従いイミュノクロマト法を作製し、臨床検体の嘔吐物や便中のノロウイルスを検出することが可能であるか否かを検討することを目的とした。H19年度にノロウイルスのリコンビナントVp蛋白(rVp)の作製を行い、H20年度に完了し、これをウサギに免疫して抗体を得て、これを精製した。さらにこの抗体を用いてイミュノクロマト法を作製した。本方法のrVpに対する検出限界を検討し、1μ1/mlまで検出可能であった。ノロウイルス陽性の便3検体に対する反応性を検討したところ、2検体で有意な高いカウント数を示し、1検体は軽度に高いカウントを示した。非ノロウイルス下痢便では2検体が低値で、1検体はやや高めのカウントであった。さらに本方法を改良するために、非ノロウイルス下痢便を用い、非特異的反応が生じない方法を検討している。
等脚甲殻類における「体性運動-心臓機能」促進性連関の中枢細胞機構

等脚甲殻類オオグソクムシの心臓拍動は、様々な動物運動時に促進される。この心拍促進は、心臓興奮(CA)ニューロン活動の活性化と心臓抑制(CI)ニューロン活動の抑制により引き起こされる。CIニューロン細胞体は胸部第1神経節(TG1)に、CAニューロン細胞体は、TG2およびTG3に存在する。両ニューロンから細胞内および細胞外誘導法によりニューロンの活動記録し以下のことを明かとした。1.歩脚や遊泳肢への自発的運動時にはCAニューロンインパルス頻度を増大させ、CIニューロンインパルス頻度を減少させた。2.胸部および腹部神経節の各神経節神経の求心性刺激は、CAニューロンにEPSPを、CIニューロンにIPSPを惹起した。3.歩脚および遊泳肢の人工的運動は、CAニューロンにEPSPを惹起した。4.腹髄下動脈潅流による薬物投与により、CAニューロンは、モノアミン類で興奮した。アセチルコリンの単独投与は、CAニューロンを興奮できなかったが、エゼリン前処理により、アセチルコリン投与はCAニューロンを興奮した。5.TG2およびTG3のツボクラリン潅流は、末梢神経の求心性刺激によるCA興奮を抑圧した。6.TG2およびTG3のクロルプロマジン潅流は、縦連合神経刺激によるCA興奮を抑圧した。これらの結果から、以下のことが推測された。動物運動時の心臓促進は、脳神経節およびTG1からCAニューロンを興奮させ、CIニューロンを抑制する回路(1)と末梢の機械自己受容器からCAニューロンを興奮させる回路(2)が関わっている。回路(1)には、ドーパミン作動性ニューロンが関わっている。一方、回路(2)は、コリン作動性ニューロンが関わっている。
枯草菌の緊縮転写制御ネットワークの先導的基盤研究とその活用

枯草菌の胞子形成のトリガー遺伝子kinB(並びにkinA)は緊縮状態に曝されると転写開始点(+1)のアデニンからの転写が活性化される、すなわち正の緊縮転写制御をうける。kinB転写は制御因子SinRの欠失で脱抑制される。また、SinRはkinBの正の緊縮転写制御にも関与していた。lacZ融合とEMSA解析により、kinBの転写抑制に関わるSinRの結合シス配列(-61/-57)を特定した。また、kinBの正の緊縮転写制御の関わるSinRの結合シス配列(-29/-8)をも明らかにした。さらに、SinRは、kinBのみならずkinA、ilvB、pycAの正の緊縮転写制御にも関与していた。枯草菌の胞子形成は細胞分化のモデルと考えられ、活発に研究が行われてきた。しかし、胞子形成開始に関わる代謝制御機作は未だに謎に満ちている。最近、本研究代表者は、胞子形成のトリガー遺伝子kinB(並びにkinA)は緊縮状態に曝されると転写開始点のアデニンからの転写が活性化される、すなわち正の緊縮転写制御をうけることを見出した。kinB遺伝子の転写制御に関わる因子をkinBのプロモーターとlacZとの融合系を用いて探索したところ、既知のCodY、AbrBやSpo0Aの欠損では影響を受けず、SinRの欠失で影響を受けることが分かった。欠失解析によりSinRの結合部位を探索すると、kinBの転写開始点(+1)の上流域(-65-55)に存在することが分かり、その部位とー45を中心とする部位に直接反複配列(TAAAGG)があることがあることが分かった。そこで-45GをAに置換したところSinRでの抑制が弱くなった。上流のTAAAGGを含む5塩基欠失とー45AのGへの置換はSinRによる転写抑制解除に相加的に働いていた。この胞子形成開始時のSinRによるkinBの抑制解除は、kinBの正の緊縮制御とは独立しているものであるが、胞子形成開始時にSinRが不活性化しkinBの転写が上がり、胞子形成を引き起こし易くしていると思われた。まだ現在のところ予備的結果であるが、SinRがkinBやilv-leuなどの正の緊縮転写制御の作動に関与するが、ptsGやpycAなどの負の緊縮転写制御には関与していないことが明らかになった。現在SinRの正の緊縮転写制御への関与の詳細を解析中である。また、転写開始点のプリン塩基種に依存した緊縮制御遺伝子の次世代シーケンサーを用いたトランスクリプトーム解析とオリゴキャッピング法により体系的に転写開始点の同定を進めたが、信頼できる結果を得るに至っていない。平成27年度の研究計画は、枯草菌の緊縮転写制御ネットワークの全体像を掴むことと、正の緊縮制御下にある胞子形成開始を担うkinAとkinBの転写制御の詳細を明らかにすることである。前者はDNAシーケンサーを用いた体系的な緊縮遺伝子の検索とその転写開始点の同定であるが、技術的な問題で信頼できる結果が得られなかった。しかしながら、胞子形成の一義的なトリガーであるkinB遺伝子の転写制御に関わる因子をkinBのプロモーターとlacZの融合系を用いて探索したところ、SinRの欠失がkinB発現に影響を与えることが分かった。さらにkinBプロモーター上流のSinRの結合配列を欠失解析により探索すると、直接反複配列(TAAAGG)が存在し、この反復配列の各々の欠損は相加的に抑制を解除した。この胞子形成開始時のSinRによるkinBの抑制解除は、kinBの正の緊縮制御とは独立したものだがkinBの転写制御の解明での大きな成果と言える。さらに、ごく最近の予備的な知見であるが、驚いたことにSinRがkinBやilv-leuなどの正の緊縮転写制御に関与しているが、ptsGやpycAなどの負の緊縮転写制御には関与していないことが明らかになった。この発見は、SinRが正の緊縮転写制御のどの過程に関与するかという、本研究課題の根源的問題を提示するものであり、その解決は枯草菌の緊縮制御機作の解明に大きなインパクトを与える。枯草菌の胞子形成は細胞分化のモデルと考えられ活発に研究が行われてきたが、胞子形成に関わる代謝制御機作は未だに未解決である。最近、本研究代表者は、胞子形成のトリガー遺伝子kinBは、緊縮状態に曝されると転写開始点のアデニンからの転写が活性化される、すなわち正の緊縮転写制御をうけることを見出した。そこで、kinB遺伝子の転写制御に関わる因子をkinBのプロモーターとlacZとの融合系を用いて探索したところ、バイオフィルム形成の制御因子であるSinRにより転写抑制されていることを明らかにした。lacZ融合による欠失・塩基置換解析と精製SinRを用いたEMSA解析により、kinBの転写抑制に関わるSinRの結合シス配列を特定した。それは、kinBのプロモーター上流域(-64から-36)に存在するタンデムリピート(各々のリーピートの下流域にSinRのコンセンサスを含む)であった。さらに、lacZ融合による塩基置換解析とEMSA解析により、その下流域(-34から-8)にkinBの正の緊縮転写制御に関わると思われる同様な構成のタンデムリピートを見出した。

また、kinBのSinRによる転写抑制は、SinRのアンタゴニストであるSinIの誘導により解除されるが、SinRに依存したkinBの正の緊縮転写制御へSinIの関与は認められなかった。これらの結果より、枯草菌の胞子形成は対数増殖後期におけるSinRのSinIによる阻害によるkinBの転写抑制の解除と緊縮状況下でのSinRの関与するkinBの正の緊縮転写制御の作動が協調して効率良い胞子形成を引き起こすと推察された。平成28年度の研究計画は、枯草菌の緊縮転写制御ネットワークの全体像を掴むことと、バイオフィルム形成の主たる制御因子であるSinRが関与する転写抑制と正の緊縮制御の下にある、胞子形成開始を担うkinBの転写制御機作の解明である。前者は技術的な問題で顕著な進展はなかったが,後者はkinBのプロモーターのlacZへの融合系を用いたプロモータ領域の塩基置換・欠失解析と精製SinRを用いたEMSA解析によるSinRの結合部位の特定に成功した。すなわち、kinBの転写抑制に関わるSinR結合シス配列はkinBの転写開始点の上流域(-64から-36)に存在するタンデムリピート(各々のリーピートの下流域にSinRのコンセンサスを含む)であり、その下流域(-34から-8)にkinBの正の緊縮転写制御に関わると思われる同様な構成のタンデムリピートを見出したことである。この研究成果は胞子形成とバイオフィルム形成さらに緊縮制御とを結節させる転写制御系の存在を示し、その枯草菌の生理学上の意義は極めて大きい。以上の研究結果を纏め,平成29年2月にJournal of Bacteriologyに投稿したが、修正(revision)を要求され、現在その対応に当たっている。また、SinRはkinBの正の緊縮転写制御のみならず, ilv-leu, pycAやkinAの正の緊縮転写制御にも関わるが、ptsGやpdhの負の緊縮転写制御には関わらないことを見出した。このことは、枯草菌の正の緊縮転写制御にSinRが普遍的に関わるということを示唆し、このSinRの関わる正の緊縮制御系の分子レベルでの解明は、枯草菌の転写制御研究に極めて大きなインパクトを与える。枯草菌の胞子形成は細胞分化のモデルと考えられ、活発に研究が行われてきた。しかし、胞子形成開始に関わる代謝制御は未だに謎に満ちている。本研究代表者は、胞子形成のトリガー遺伝子kinB(並びにkinA)は緊縮状態に曝されると転写開始点(+1)のアデニンからの転写が活性化される、すなわち正の緊縮転写制御をうけることを見出していた。kinB遺伝子の転写抑制に関わる因子をkinBのプロモーターとlacZとの融合系を用いて探索したところ、CodY、AbrBやSpo0Aの欠損では影響を受けず、バイオフィルム形成の制御因子であるSinRの欠失で脱抑制された。この脱抑制にはSinIが絡んでいた。また、予期せぬことに、SinRは、kinB、kinA、ilv-leu、pycA等の正の緊縮転写制御に関与するが、ptsG、pdhA等の負の緊縮転写制御には関与していないことが判明した。29年度には、lacZ融合による欠失・塩基置換解析及び欠失・塩基置換プローブを用いたEMSA解析により、kinBの転写抑制に関わるSinRの結合シス配列を特定した。それは一対の逆転SinR結合コンセンス配列(-61/-57)から成り立っていた。また、kinBの正の緊縮転写制御の関わるSinRの結合シス配列は、ー対の反復SinR結合コンセンサス配列(-29/-8)から成り立っていた。これらの配列はkinBプロモーターの“-35"と“-10"領域と部分的に重複していた。
メゾスケール3次元観察のための次世代電子線トモグラフィー法の開発

透過型電子顕微鏡法(TEM)と計算機トモグラフィ(CT)を組み合わせ、材料の内部構造をナノメートル(nm)スケールで3次元可視化できる電子線トモグラフィー法(Transmission Electron Microtomography, TEMT)に注目が集まっている。本研究の目的は、メゾスケール(nmとμmの間のスケール)の3次元観察が可能な"被写界深度が深い"光学系を備えた次世代のTEMTを開発することである。通常、TEMTでは試料(板状試料)を70°程度まで傾斜させ多数の透過像を撮影する。試料の傾斜に伴い、入射電子線に対する"実効的な"試料厚みは増加し、従って、本申請のように数μmの試料の3次元観察を可能とするためには、被写界深度の深い長焦点光学系を実現することが必須となる。本申請の全ての検討・開発項目は、いかにして被写界深度の深い明るい光学系を実現するか、という一点に集約されていると書いても過言ではない。3年の研究期間を通して、長焦点光学系を実現するための高コントラスト走査型ポールピースと高感度検出器などの開発を行い、これらを実際に電子顕微鏡に組み込んだ。また、試料内での電子の多重散乱による(=色収差による)像のボケを低減するために「磁場制御型Ωフィルター」も電子顕微鏡に組み込んだ。この新型電子顕微鏡において、被写界深度の実測(実測で数μmを実現)、長焦点光学系による走査電子ビームの収束角度の実測、走査系の動作プログラムの開発、明るい光学系の実現のためのレンズパラメーターの最適化、検出器の高感度化など様々な装置開発・改良を行い、上に述べた「被写界深度の深い明るい光学系」を実現した。さらに、この新型顕微鏡を用いて厚み数百nm数μmの複数の高分子試料の3次元観察を行ったところ、3次元画像の分解能は試料の厚みとともに劣化するものの、2μm程度の厚みの高分子試料の観察は可能であること、数nm程度の分解能を保った状態での3次元観察は0.5μm程度が限界であること、などの上重要な知見を得ることができた。高分子関連材料の多くはナノメートルからマイクロメートルに渡る広い空間スケールに階層を持つ複雑な3次元不均一構造を持つことが多い。新規高性能材料の開発のためには、この3次元階層構造を正確にキャラクタリゼーションする必要があり、そのための有力な方法として電子線トモグラフィー法がある。本研究では、これまで観察不可能であったメゾスケールの不均一構造を3次元的に可視化・解析することを可能とする新規の電子顕微鏡(加速電圧2ookV)を完成させ、高分子材料において12μmの厚みの試料を数数十nmの分解能で3次元観察できることを示した。本成果は、高分子だけでなく生物・物理など他分野にも大きな波及効果を持つと思われる。通常、TEMTでは試料(板状試料)を70゚程度まで傾斜させ多数の透過像を撮影する。試料の傾斜に伴い、入射電子線に対する"実効的な"試料厚みは増加し(傾斜角度60゚では実効的な試料厚みはオリジナルの2倍になる)、従って、本申請のように数μmの試料3次元観察を可能とするためには、被写界深度の深い長焦点光学系を実現することが必須となる。本申請の全ての検討・開発項目は、いかにして被写界深度の深い明るい光学系を実現するか、という一点に集約されていると言っても過言ではない。本年度は、長焦点光学系を実験するための重要要素である高コントラスト(HC)走査型ポールピースと高感度検出器などの開発を行った。この際、試料内での電子の多重散乱による電子ビームの拡散(ブロードニング)のために画像に"ボケ"が生じることが予想され、また、実験的にも確認された。試料の傾斜に伴い、入射電子線に対する"実効的な"試料厚みは増加し(傾斜角度60°では実効的な試料厚みはオリジナルの2倍になる)、従って、本申請のように数μmの試料の3次元観察を可能とするためには、被写界深度の深い長焦点光学系を実現することが必須となる。昨年度は、長焦点光学系を実験するための重要要素である高コントラスト(HC)走査型ポールピースと高感度検出器などの開発を行った。