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ファジィ最適制御による建築構造物の知的アクティブ制御に関する実験的研究

本研究は、筆者らが提案している知的ファジィ最適アクティブ制御システムを、実験システムに導入し、居住性,安全性,経済性等の建築構造物が有する特性を考慮した最適化を可能とし、地震動入力予測,構造物の同定をリアルタイムに行う知的アクティブ制御実験システム構築を目的とする。ここで用いる知的ファジィ最適アクティブ制御法は、1)制御に関する目的関数と制約条件は、ファジィ集合の帰属度関数で表現される、2)地震動入力予測と構造同定(構造同定)をリアルタイムに行なう。3)ファジィ最大化決定により最適制御変数を決定する、等の特徴を有する。供試体は、1質点系構造物とし、入力低減方式により制御力を構造物に導入する。制御力はAMD方式で導入し、AMDはDCサーボモーターで駆動される。実験システムは、3台のパーソナルコンピュータを同期させ、相互に連携させたもので、1)振動台の駆動と供体応答の観測,2)最適制御変数の決定、3)AMDの駆動をそれぞれ分担して行う。これら3台のコンピュータは、第一コンピュータのAD変換に用いるタイマーに同期して駆動される。この実験システムを用いた知的ファジィ最適制御実験を行った。実験は、入力波とその振幅,応答変位と制御力に対して設定する帰属度関数を変化させて実施した。その結果、入力波が定常的な場合では制御効果が見られるが、入力される波がランダムになるにつれて制御が不安定になる傾向が見られた。一方、シミュレーション結果では、設定した帰属度関数に応じた制御結果が得られている。以上の結果より、本研究で提案している知的ファジィ最適アクティブ制御実験システムの構築に関する基礎的な知見が得られた。本研究で構築した制御実験システムでは、その設定で、いくつかの問題点も明らかとなり、今後さらに改良を行っていくことにより、より有効な制御実験システムが構築できるものと考える。本年度は、まず、ファジイ最適アクティブ制御実験を行う際に必要となる基礎的な技術を確立することを目的として、以下基礎的実験とAMD方式の制御デバイスの基本設計を、神戸大学と建設省建築研究所が協力して行った。まず、初年度導入した振動台について、既存のパーソナルコンピュータと初年度に導入したA/D,D/A変換ボードとそのコントロールソフトを用いて、導入した振動台を用いた実地震波加振の制御方法とそのシステムの構築を行った。さらに、このシステムを用いた振動台自体の振動実験を行い、動的計測機器を用いて、振動台の振動特性の動的な同定を行った。次に、1,2層の実験用供試体を作成し、供試体と振動台の動的振動特性の同定を行うための予備実験を行った。次に、制御方法として採用するAMD方式の制御デバイスの基本設計については、ディジタルシミュレーションによる検討を行い、付加質量,制御方式の検討を行い、制御デバイスの基本性能を決定し、サーボモータを用いたAMD装置の試作と、振動特性の検討を、初年度に購入する計測機器を用いて行った。さらに、試作したAMD装置と振動供試体を用いた基礎的実験を行い、次年度以降で実施する本格的実験に必要となる基礎的データの収集を行った。初年度では、振動台の納入が遅れたが、実施震波を再現するための振動台のディジタル制御システムの構築と、AMD装置の試作、および、AMD装置を用いた供試体の制御実験を行い、次年度以降で行う、種々の制御実験で必要となる基礎的なデータを収集することができた。この中で、供試体,AMD装置ともに小型であるため、その作成精度や計測精度が制御に及ぼす影響について考慮する必要があり、これらの点を、次年度以降さらに検討する必要がある。

本年度は、昨年度実施した供試体、AMD装置の基礎的データを基に、ファジィ最適アクティブ制御実験を行う際に必要となる基礎的技術を確立することを目的として、以下の基礎的検討を、神戸大学と建設省建築研究所が協力して実施した。まず、1層供試体について非制御実験を実施し、ディジタルシミュレーション結果との比較を行った。この結果、本システムで用いている振動台は、規模が小さいため、供試体の重量が重くなるにつれて、供試体の振動整性状が振動台に波及し、1質点系構造の場合でも、全体として2質点系としたシミュレーションが必要となることが明らかとなった。さらに、制御を実施した場合でも同様の効果により、実験で得られた結果から制御効果を分離することが困難で、本システムで非制御実験を実施できるシステムの構築が必要となった。また、昨年度AMD装置として導入したアクチュエータは、制御通信プロトコルの制約から、0.2秒程度に一回の制御力しか投入できず、また、制御力を加速度として投入する形式ののため、大きい制御効果が期待できない。このため、AMD装置に関しても、作動間隔を高速にする改良が必要となった。ファジイ最適制御のシステムソフトに関しては、3台のコンピュータを並列的に作動させるシステムは完成してるが、ソフト的制約から、3台目のコンピュータとの通信速度が低下しており、制御効果が小さくなる可能性があり、この点の改良が必要となっている。以上の観点から、現在、導入した振動台、AMD(アクチュエータ)と構築したシステムソフトの改良を実施し、現有の設備で最大の効率を得ることが可能な制御アルゴリズムの検討を実施している。この検討を早急に実施し、最終年度では、本格的制御実験を実施する予定である。本年度は、最終年度として、昨年度の問題点であった、AMD装置への指定伝達速度を向上させるため、アクチュエータを駆動するDCサーボモータのコントローラの改良を行った。その結果、AMD装置の駆動時間は0.5msec間隔となり、AMD装置から供試体へ有効に制御力を作用させることが可能となった。このシステムを、昨年度までで構築していたファジイ最適アクティブ制御実験システムに組み込み、実験システムの再構成を行った。システムの再構成を行ったため、本年度では、1質点系構造物を対象とした基本的実験を実施し、まず、構築した実験システムの有効性を確認するための実験を実施した。その結果、構築した実験手法で、模型供試体に対するアクティブ制御実験が可能であることを確認した。さらに、提案しているファジイ最適制御システムの有効性を検討するための実験とシミュレーションを実施した。ここでは、地振動入力予測法としては条件付きファジイ集合ルールを、構造同定手法としては区分線形応答方程式を用いた。その結果、構築した実験システムでは、振動台に入力する波形のランダムさが小さい場合では、提案しているファジイ最適制御システムで構造物のアクティブ制御を実行できることを確認した。しかし、振動台に入力波形のランダムさが大きい場合では、アクティブ制御の効果があまり見られない場合もあった。この点に関しては、システム作動のタイミングの取り方等の調整が必要であると考えており、今後改良を行う必要がある。
有機高分子薄膜の活性反応界面のナノ構造と電荷偏析イメージング

本研究は、高分子系有機薄膜太陽電池の性能を左右する反応活性界面におけるナノ構造変化を放射光の高輝度X線を用いて直接評価するためのX線散乱実験法を構築し、電荷が偏析する界面形状と光電変換特性との相関性を分子レベルで解明することを目的とする。平成24年度は、ポリアルキルチオフェン(P3AT)とフラーレン誘導体(PCBM)のブレンド系で、P3ATやPCBMの側鎖アルキル鎖長とP3HTの結晶構造・結晶化度との相関性を検討した。P3AT:PCBMブレンド溶液を用いてシリコン基板上にスピンコート法で数百nmの厚みの薄膜を成膜した。ブレンド薄膜の膜厚はサーフコーダーで評価した。この薄膜は、P3ATとPCBMが相分離した構造を有することが報告されている。P3AT:PCBMブレンド薄膜に対するすれすれ入射X線散乱(Grazing-incidence X-ray scattering : GIXS)測定は、大型放射光施設SPring-8の構造生物学Iビームラン((独)理化学研究所、BL45XU)で行った。P3ATのアルキル鎖長が6から12に増加すると、P3AT結晶からの100反射が低角側にシフトし、P3ATのedge-on結晶の面間隔d(100)が長くなることがわかった。蒸気圧の異なる溶媒に対するP3AT:PCBM薄膜の結晶化挙動とモルホロジーの違いについても検討も行った。(「スピンコート製膜過程におけるP3AT:PCBMブレンドの結晶化挙動」、第61回高分子討論会、2012/9/20、名古屋大学)放射光を利用したGIXSと電流-電圧(I-V)特性との同時計測用試料であるP3AT:PCBMブレンド薄膜に関する検討を進める一方で、同時計測システムを構築のための試料周辺装置の構築を行った。試料周辺装置はまだ準備段階にあるが、来年度に実験できるようにする予定である。高分子系有機薄膜太陽電池の研究開発で用いられているポリ(3-ヘキシルチオフェン):フラーレン誘導体(P3HT:FD)ブレンドのスピンコート成膜過程における薄膜結晶化/相分離挙動を放射光の高輝度X線を用いた微小角入射X線散乱(Grazing-Incidence X-ray Scattering: GIXS)時間分解測定で追跡した。P3HT:PCBM(1:1, w/w)ブレンドのクロロホルム溶液およびクロロベンゼン溶液を用いてシリコン基板上に成膜し、赤外線サーモカメラによる試料の熱画像測定を行うことにより、溶媒の蒸発挙動を間接的に評価した。その結果、蒸気圧の高いクロロホルム溶液を用いた方がP3HTの結晶化が速く、蒸気圧の低いクロロベンゼン溶液を用いた方が結晶の配向性が高いことが判った。P3HTの主鎖が基板に平行なedge-on型配向結晶が優先的に生成していたことから、遠心力により結晶化過程でP3HTの主鎖が動径方向に高配向したものと考えられる。また、ブレンドとP3HTホモポリマーの結晶化速度を比較した結果、ブレンドの方が大きいことが明らかになった。P3HTとPCBMの相分離がP3HTの結晶化を促進した可能性がある。放射光を利用したGIXSのその場測定で太陽電池の動作環境下での構造変化を評価するための試料周辺装置を整備したが、SPring-8で実験するまでには至っていないため、今後も継続して取り組む予定である。本研究は、電子のプローブである放射光の高輝度X線を用いて、有機薄膜太陽電池の性能を左右する反応活性界面におけるナノ構造変化を可視化するための散乱実験法を構築し、電荷が偏析する界面トポグラフィーと光電変換特性との相関性を分子レベルで解明することを目的とする。平成23年度は、以下の事柄を実施した。(1)有機高分子モデル薄膜試料の製膜と静的構造評価本研究の予備実験として、現在高分子系太陽電池開発で注目されているフラーレン系高分子(アクセプター(A)分子)とポリアルキルチオフェン(ドナー(D)高分子)をブレンドした薄膜の静的構造を微小角入射小角・広角X線散乱(GISWAXS)測定により評価した。電流-電圧(I-V)特性評価で相対的に性能の良い薄膜と悪い薄膜のナノ構造を比較評価したところ、界面形状を反映する角度領域で散乱強度プロファイルに違いが見られることが明らかになった。(2)放射光GISWAXSと電流-電圧(I-V)特性との同時計測システムの設計放射光実験を行う前に実験室(ラボ)で試料の電流-電圧(I-V)特性評価を行う必要がある。そのため、試料周辺はヘリウム雰囲気下での実験室(ラボ)での測定を想定して設計し、試料台を製作した。本年度までに高分子系太陽電池材料の構造の特徴を把握し、成膜方法や成膜に用いる溶媒との相溶性に関して理解を深めることができた。実験に必要な試料周辺装置も揃い、試験的実験を行う前の段階である。これらのことから、本研究はまだ目立った成果はないがおおむね順調に進展していると考えている。研究実績の概要に示した通り、交付申請書で計画していた(1)有機高分子モデル薄膜試料の製膜と静的構造評価(2)放射光GISWAXSと電流-電圧(I-V)特性との同時計測システムの設計を実施することができたため、本研究はおおむね順調に進んでいると考えている。

平成25年度は、ポリアルキルチオフェン(P3AT)とフラーレン誘導体(PCBM)のブレンド系薄膜を用いて、放射光を利用したGIXSと電流-電圧(I-V)特性との同時計を行う予定である。薄膜はスピンコート法によりITO基板上に成膜する。実験は、大型放射光施設SPring-8の構造生物学Iビームラン((独)理化学研究所、BL45XU)で行う予定である。疑似太陽光を照射しながら試料からのGIXS測定を行い、光電変換時に分子凝集状態に変化があるかどうかについて検討し、研究成果としてまとめる予定である。電変換反応過程における活性界面ナノ構造をその場で評価するために、放射光GISWAXS・電流-電圧(I-V)特性同時計測システムを構築する。・高分子系太陽電池薄膜のバルクヘテロジャンクション型相分離構造のA-D界面の構造評価・解析法を検討する。すでに(平成23年度に)その手始めとなる静的実験を実施しているが、今後はそれをさらに発展させて、様々な化学構造の側鎖や製膜方法を変えて製膜したフラーレン系高分子(アクセプター(A)分子)とポリアルキルチオフェン(ドナー(D)高分子)のブレンド薄膜のナノ構造をGISWAXS法により詳細に検討する。・光電エネルギー変換過程における有機(有機高分子)薄膜の結晶構造、ドメイン構造および界面構造をμビームGISWAXS計測で評価し、異種分子の接合領域である活性反応界面の構造変化をその場観察する。該当なし次年度へ持ち越した研究費(15,657円)は、平成23年3月29日平成24年4月5日の米国出張における平成24年4月1日以降の旅費の一部として使用する。平成24年度の研究費(直接経費500,000円)は、試薬、電子・電気部品、金属加工部品、コンピュータ関係の消耗品、国内出張旅費、SPring-8消耗品に使用する予定である。
並列アルゴリズムに関する基礎的研究

本研究について,研究実施計画に基づき今年度はつぎのテ-マについて研究を行った。1.全域通信除去に関する研究(1)任意近傍をもつ2次元シストリック配列上で,全域通信を実時間で除去できるための条件について研究を行った。その結果,2次元の任意の方向に信号が伝わる2方向システムは,いずれも全域通信除去可能であることが分かった。1方向システムでは必ずしも除去できないことを示した。(2)この種のグロ-バルバスは,網目結合計算機のようなア-キテクチュアに適した高速化手法であることが明かとなった。3.ログ深さ(log depth)をもつ並列回路網による並列アルゴリズムの構成(1)けた上げ先見加算器のようなlog深さをもつ専用回路網の高速化アルゴリズムを示した。(2)ログ深さを実現する汎用並列計算機として知られるハイパ-キュ-ブ結合計算機において,多項式の乗算等のアルゴリズムを示した。この場合,各デ-タの同期をとりながら,いかにして転送するかが問題となる。このことはハイパ-キュ-ブ上に並列アルゴリズムを作成する上で最も本質的な部分となる。(3)巡回セ-ルスマン問題のようなうまい符号化の存在するNP問題に対して,遺伝アルゴリズムのような新しい数理工学的手法の有効性(元の問題の計算時間を対数をとる程度に時間を圧縮していると考えられる)を実験的に示した。このうち3.の問題については,今後さらにそれぞれの回路網の有効性について検討が必要である。本研究について,研究実施計画に基づき初年度はつぎのテ-マについて研究を行った。1.全域通信除去に関する研究(1)任意近傍をもつ1次元シストリック配列上で,全域通信を実時間で除去できるための条件について研究を行った。その結果,1次元の任意の方向に信号が伝わる2方向システムは,いずれも全域通信除去可能であることが分かった。この結果については現在投稿中である。(2)1次元において,1つの方向にしか信号の伝わらない1方向システムについては,全域通信をもつ場合ともたない場合とでは能力に差があることが分かった。このことについては,投稿予定である。2.局所計算可能条件を与える研究(1)この第一ステップとして高速加算アルゴリズムである「桁上げ先見加算器」について検討を加え,学会誌に新しい手法を発表した。これは,従来のアルゴリズムに比べて,2030%高速化できる。1.に関する多次元の結果や,2.の局所計算可能な条件を見つける問題については現在考慮中であり,結果が得られしだい学会等で発表していきたいと考えている。
乳幼児期における他者の指さしの理解と語用論的推論の発達

語用論的推論能力の発達の様相を明らかにするため、他者の指さしを文脈に基づいて理解する能力の発達について幼児を対象とした一連の実験を実施した。一連の実験では、二人の人物の指さしによるコミュニケーション場面を記録した映像刺激を用い、文脈手がかりを体系的に操作することで、幼児における他者の指さしに対する語用論的推論の特徴と発達について検討した。結果、文脈手がかりが乏しい場合、幼児は、他者の指さしを真正な情報の伝達を意図したものと解釈する強固なバイアスを示した。一方、文脈手がかりが豊富な場合、複数の文脈手がかりを組み合わせて、適切に伝達意図を推論できることが示された。本研究の目的は,他者の指さしによる伝達行為を文脈に基づいて理解する能力の発達過程の検討を通じて,語用論的推論能力の早期発達の様相を明らかにすることであった。1年目は,幼児における指さし解釈のバイアスについて検討することを目的とし,先行研究(Palmquist et al., 2012)の先行研究を発展させ,他者の指さしの意図を推測するための文脈手がかりの種類,量をコントロールした実験を実施した。実験では3,4歳児に対して,2人の大人が「ボール探しゲーム」を行う映像を呈示し,その中で行われる指さしを用いたコミュニケーションについて,2人の指さしの意図(ボールの在処を尋ねる質問の指さしと,質問を受けて正しいボールの在処を教える教示の指さし)を推測できるかどうかを調べた。結果,文脈手がかりが指さしのタイミングのズレのみの条件では,多くの対象児は指さしの意図を推測することができず,時間的に先行する指さしを一貫して信頼する傾向がみられた。一方,指さしのタイミングのズレに加えて,確信度の強弱を示唆する文脈手がかり(声のトーン、ジェスチャー)を加えた条件では,ほとんどの対象児が指さしの意図を適切に推測することができた。これらの結果から,(1)幼児は文脈情報から指さしの意図を推測できるが,その能力は発展途上で,文脈情報が乏しい場合には推測が困難であること,(2)指さしが常に正しい知識に基いて行われると解釈するバイアスがあることが示唆された。これらの成果については既に国内学会で発表し,国際学会でも発表を採択されている。また,初年度の成果をまとめた論文を国際誌に投稿すべく執筆作業を進めている。十分な数の対象児を確保することに時間がかかり,計画していた実験の一部を遂行できなかった。また,不測の要因により,海外での発表機会を逃すなど,成果発表についても計画からの遅れが生じた。一方で,2年目に計画している実験の準備を前倒しで開始するなど,計画の完遂に向けた対策を講じた。先行研究(Palmquist et al., 2012)の方法を発展させ,他者の指さしの意図を推測するための文脈手がかりの種類,量を要因した一連の実験を実施した。一連の実験では,2人の大人が物を探す際に指さしを用いるコミュニケーション場面の映像を用いた。物体の所在に知識を持っている大人と,その物体の所在を知らない大人の指さしの信頼性を判断させる実験では,指さしの時間的順序,指さしに伴う発話の文法的特徴(確信度を表す終助詞の有無,種類),発話のトーン,指さしと共起するジェスチャーの有無,種類を系統的に操作することで,2人の指さしの意図(物の在処を尋ねる質問の指さしと,正しい物の在処を教える教示の指さし)の明白さが異なる多種の映像を作成した。実験の結果,3,4歳児とも,文脈手がかりが豊富で,指さしの意図が明白な場合には,知識を有する他者の指さしをより信頼するという判断を一貫して行うことができた。文脈手がかりが十分でない場合,知識の有無に基づく判断ができる幼児の割合は大幅に減少し,多くの幼児の判断は,指さしの時間的順序に大きく影響されることが明らかになった。2人の指さしが同時に行われた場合は,幼児の信頼性判断はランダムになり,2人の指さしに時間的ずれがある場合は,時間的に先行する指さしを一貫して信頼する傾向を示した。これら結果から,(1)幼児は指さしが常に正しい知識に基いて行われた「真正な情報」の提供行為であると解釈するバイアスがあること,(2)このバイアスは,意図を示す文脈情報が顕著かつ豊富な場合には克服可能であるが,文脈情報が乏しい場合には特定の手がかりに頼ったシンプルな方略によって場面を解釈することが示唆された。

初年次に計画した実験の遅滞については,初年次に構築した園との関係を活用するとともに,新たなフィールドの開拓を進めており,指さしとリーチングにおける解釈の差を検討する実験など未実施の実験を速やかに遂行する予定である。また並行して,平成29年度の当初計画通り,対象物に対する接近可能性を操作した一連の指さし解釈実験を行う。その際,語用論的推論能力の発達の萌芽を捉えるため,1,2歳児を対象とした実験を優先的に実施する予定である。発達心理学実験実施の遅れと,不測の要因による国際学会参加のキャンセルなどにより生じた。実験のペースアップ,およびより積極的な成果発表のためにかかる経費として使用する。
広エネルギー帯多成分宇宙プラズマの計測手法確立と相互作用解明を目指す発展的研究

宇宙空間プラズマ現象解明の鍵となる中・高エネルギーセンサーの開発のため、イオン・電子ビームライン(イオン・電子源、粒子質量分析部、ビームエクスパンダー、ターンテーブル)の設計・製作・組上を行い、8-200keVのイオン・電子ビームラインを完成させた。このビームラインを用いて50mm×50mmの広範囲に渡って一様なイオンビームを確認した。イオン種は、H+、He+、N+、He^<2+>、N^<2+>等を選択可能である。将来の衛星計画への必要性が高まりつつある半導体検出器に対して、信号読み出し回路装置と上述のビームラインを用いて性能較正実験を実施した。また、今後頻繁になるプラズマ粒子分析器の複数同時並行開発に対応するため、簡易なビームラインも新規に構築した。ジオスペースにおける中エネルギーイオン分析器の実験室モデル(静電分析器、質量分析器、および片面シリコンストリップ半導体検出器)を開発し、室内実験によって設計通りの性能を確かめた。また、中間エネルギー電子計測のため、放射線での高エネルギー粒子による雑音を除去する手法を考案し、モデルを用いた計算によって十分な効果を確かめた。内部磁気圏に捕捉された中エネルギー帯(1-100 keV)のイオンは、地球近傍に集積してリングカレントを作るだけではなく、余剰電流としての沿磁力線電流が電離圏磁気圏の電場ポテンシャルの配位を本質的に大きく変えることを、衛星観測、地上レーダー観測、シミュレーションを組み合わせて明らかにした。また、リングカレントの中心付近において、中エネルギー帯(1-100 keV)と高エネルギー帯(100 keV以上)のイオンが磁場を介して強く結合していることや、磁気嵐時に太陽風と地球に起源を持つ酸素イオンが大量に流入することなど、エネルギー階層間結合と領域間結合が宇宙空間の粒子環境を理解する上で重要であることを示した。・本研究で試作される粒子観測器の性能・較正試験を行う為、最高150keVのイオン、及び50keVの電子のビームラインを構築する必要があり、イオン・電子源と真空チャンバーとを結合するドリフトチューブ部の設計・製作・整備を行った。ビーム特性取得用として、2次元位置検出用MCPを用いたデータ取得・解析・表示システムを構築した。・従来に無い高い時間分解能で数eV数10keVの荷電粒子の検出が可能な新しい検出器の開発に着手した。非常に小型で高性能のアナログASICチップ(荷電アンプとカウンタを含む)を検出器上に直接実装する予定であるが、本年度は実装方法を試験する為の評価チップを購入し、良好な試験結果を得た。・従来のSSDでは測定が出来なかった30keV以下の粒子を測定可能とする為、片面ストリップSi検出器の開発を行い、不感層を出来る限り薄くした。また、S/N向上を目的に1信号ライン当たりの検出器静電容量を下げる為にストリップ構造を採用し、非常に高いエネルギー分解能を得た。更に、従来の1/2000以下の大きさで32chの信号処理系を含む専用のアナログ信号処理LSIを開発し、LSI単体でのノイズレベルで1keV以下を実現した。・10200keV程度までのエネルギー帯域用の粒子観測器を数値計算によって設計した。これは、従来の静電分析手法を、より高エネルギー側に応用したもので、エネルギー分解能を損なわない分析器が現実的な大きさで製作出来る見通しとなった。・AKEBONO及びCRRES衛星の高エネルギー粒子観測データを用いて、極軌道とGTO軌道における磁気嵐及びサブストーム時における放射線帯電子の比較研究を行った。

更に、地球磁気圏尾部プラズマシート境界層での低周波波動とイオンビームの関係を統計的に調べた結果、イオン加速メカニズムへの粒子波動相互作用の寄与の可能性が示唆された。中間エネルギーイオン分析器を構成する静電分析部の製作・試験と、質量分析部の設計を行った。静電分析部試験として、イオンビームを入射させ、その検出特性と設計時の数値シミュレーションとの比較、装置内部の黒色塗装による紫外線除去性能の確認、等を行い、テストモデルが設計通りの粒子計測性能を持つ事、紫外線除去の性能が十分である事、が判った。質量分析部については、計算機シミュレーション等によって極板形状・位置の最適化設計を行った。イオンビームラインの設計構築を行い、イオン源、イオン質量分析部、ビームエクスパンダーを設計・製作・組上を行った。極域電離圏・磁気圏結合による内部磁気圏イオンの運動論的シミュレーションを実行し、磁気嵐時に特徴的な対流電場、粒子、沿磁力線電流の分布を算出し、観測とよく一致することを示した。特に内部磁気圏に蓄積されたイオンが作る沿磁力線電流の効果が極域電離圏に対して極めて顕著であることが分かった。統計的観測結果による電離圏イオンの宇宙空間への流出モデルと、イオンの3次元軌道追跡シミュレーションを開発し、位相空間写像法を用い、水素・酸素イオンに代表される電離圏イオンの最終輸送到達地でのイオン量を5次元の位相空間の関数で求め、流出したイオンの約半数はリングカレント域に流入すること、磁気圏磁場が双極子型に近いほど、再び地球へ戻るイオンの量が増えることなどを明らかにした。これらは、極域電離圏を起源とするイオンの磁気圏への供給問題や、固有磁場を持つ地球型惑星の大気の進化を考える上で重要である。磁気圏界面付近の多衛星データの解析により、高緯度における磁気再結合および、低緯度境界層における流体不安定による磁気圏へのプラズマ輸送の効果を調べた。また、低高度衛星と赤道面衛星の高エネルギー粒子データを用いて、内部磁気圏での中から高エネルギー帯の粒子フラックスについて比較を行った。今後の宇宙空間におけるプラズマ加速現象解明のための鍵となる中エネルギーセンサーの開発に先立ち、8-140keVのイオン・電子ビームラインを完成させた、このビームラインを用いて50mmx50mmの広範囲に渡って一様なイオンビームを確認した°イオン種は、H+、He+、N+、He^<2+>、N^<2+>、等を選択可能である。この結果の一部は2006年9月に行われた地球電磁気・地球惑星圏学会講演会にて口頭発表された。中エネルギー帯(10-200keV)のイオン計測に向け、静電分析部及び質量分析部の開発を行った。静電分析器に関しては、エネルギー分析部の耐圧試験を行い最大電圧(±5kV)を印加した際でも放電が発生せず、エネルギー分析が可能であることを確認した。また、静電分析器の原理や試験結果をまとめて、Review of Scientific Instruments誌に投稿し、2006年12月に掲載・出版された。更に、質量分析部テストモデルの製作と室内実験を行い、地球磁気圏イオン分析に十分な質量分解能があることを確認した。また、2006年7月にシンガポールで開催されたAOGS annual meeting 2006に参加し、中間エネルギーイオン質量分析器に関する口頭発表を行った。
ヒト全身性疼痛疾患モデルにおける脂質制御マシナリーの解明

本研究では、神経障害性やストレス性疾患を含む上位脳が深く関わる全身性疼痛について、申請者が見出した神経障害性疼痛誘発因子リゾホスファチジン酸(LPA)合成の観点から、その責任性を網羅的かつ体系的に解析し、慢性疼痛の創薬およびバイオマーカー探索を目指す。これまでにPhostag技術を用いた新規のTOF-MS法により、バイオマーカー候補となりうるLPA分子種の同定に成功しているが、今年度は本技術を用いたLPA合成の分子メカニズム解析において、初期でのLPA産生には、cPLA2とiPLA2活性化により誘発されることを見出し、さらにこの合成酵素の上流には神経障害によって遊離されるサブスタンスPとグルタミン酸の相乗的な疼痛刺激が引き金となることを明らかにした。また、興味深いことに18:1-LPAを脊髄クモ膜下腔内に投与すると、LPA自身の産生を増強することを明らかにしており、このメカニズムにおいてはミクログリアの活性化の関与を見出している。一方、LPAの責任合成酵素の一つであるcPLA2の活性化型(リン酸化cPLA2)は主に神経で観察されるが、このcPLA2の活性化およびLPA産生は、ミクログリアの阻害剤で抑制されることから、神経障害時に産生されるLPAはミクログリアに存在するLPA受容体に作用し、協調的な制御機構を介して神経でLPA産生を増強しているものと推定される。また申請者は、これらのLPA誘発性LPA産生増幅機構を手がかりに、慢性疼痛を治癒へと導く分子基盤を明らかにしており、既に関連する複数の標的については、公的化合物ライブラリーを用いて慢性疼痛の新規治療薬開発を目指したLPA創薬スクリーニングを実施している。一方で、神経障害性疼痛モデルに加えて、脳梗塞やリウマチなどにおいてもLPA合成の関与を証明しており、LPA創薬は新規の慢性疼痛治療薬となりうることが期待される。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、線維筋痛症を含む上位脳が深く関わる全身性疼痛について、申請者が見出した神経障害性疼痛誘発因子リゾホスファチジン酸(LPA)合成の観点から、その責任領域、責任分子を網羅的かつ体系的に解析し、慢性痛の創薬およびバイオマーカー探索を目指す。今年度は、左足の末梢神経障害が反対側の痛み(ミラーイメージペイン)を含む全身性の疼痛を誘発することを明らかにし、本モデルを用いて、LPA責任脳領域を明らかにした。具体的には、質量顕微鏡を用いて前駆体LPCの可視化を行い、神経障害後に視床特異的に増加することを見出した。更に、マトリックスを使用しない新規のTOF-MS法により、LPCの定量に成功し、LPAについては、Phostag技術を用いて定量的に視床に上昇することを証明した。さらに、本モデルにおいて、責任脳領域にLPA1およびLPA3受容体に対するsiRNAを導入することにより、慢性疼痛の消失を確認している。一方、脂質関連遺伝子群の発現変調機構に関しては、末梢神経障害疼痛の責任領域である脊髄およびDRGで行い、LPA合成に関与する受容体や複数のLPA合成に関連する酵素のアイソフォームの長期にわたる発現上昇を見出した。また、LPA3受容体については、障害誘発性のLPA産生に関与することを明らかにしており、LPA3受容体阻害剤スクリーニング系を構築し、東京大学化合物ライブラリーを利用して既にスクリーニングを始めている。バイオマーカーの観点からでは、MALDI-TOF-MSの結果から16:0、18:0、18:1-LPAが増加しており、特に18:1-LPAは機能的な慢性疼痛のバイオマーカーになることが期待できる。以上の結果は、LPA標的が現在慢性痛治療に求められている原因治療および早期診断において新規性の治療薬およびバイオマーカーとなりうることが期待できる。

一方で、神経障害性疼痛モデルに加えて、脳梗塞やリウマチなどにおいてもLPA合成の関与を証明しており、LPA創薬は新規の慢性疼痛治療薬となりうることが期待される。24年度が最終年度であるため、記入しない。全身性疼痛疾患モデルとして従来我々が作成した線維筋痛症モデルに加えて、左足の末梢神経障害モデルが全身性疼痛を誘発することを明らかにした。このモデルを用いて、当初の目的であるLPA受容体が機能する責任脳領域の同定に成功している。また、脂質関連遺伝子群の変調に関しては、末梢神経障害時での脊髄レベルでのLPA産生機構を基にLPA合成の関連遺伝子を網羅的に解析することにより、複数のLPA合成酵素の発現上昇を見出している。特にLPA_3受容体に関しては、LPAの産生に関与していることを明らかにしており、東京大学化合物ライブラリーを利用して、新規のLPA_3アンタゴニストの創薬スクリーニングを既に開始している。全身性疼痛疾患は、その原因により責任脳領域が異なることが予想されるので、今後神経障害に加えて、炎症性、筋痛性、精神ストレス性線維筋痛症やリウマチを含むモデルごとのLPA駆動責任領域を明らかにしていく。また、LPA関連遺伝子群の変調に関しては、今年度長期的に発現変化が観察された遺伝子について、ヒストンアセチル化およびDNAメチル化などエピジェネティクス機構の観点からその制御機構を明らかにする。さらに、創薬の観点からは、新規LPA_3アンタゴニスト探索として、東京大学化合物ライブラリーに加えて、海洋微生物ライブラリーおよび漢方薬ライブラリーなどオリジナルのライブラリーを利用したスクリーニング、さらにin silico解析から予想される市販の化合物を入手し、ヒット化合物を見いだす。また、バイオマーカー探索には、18:1-LPAに加えて、LPA合成・作用・分解の観点からさらに新規のバイオマーカーを探索する。
分子シャペロンを利用したダイナミック機能材料の創製

大腸菌由来のシャペロニンGroELのシステインをすべてアラニンに変換し、さらに入り口付近の231番目の残基としてシステインを導入した変異体を作成した。この変異体に対し、マレイミド部位を有するアゾベンゼンカルボン酸を反応させ、231番目の残基上にアゾベンゼンカルボン酸を導入した。この化学修飾シャペロニンに対し、酸変性させた緑色蛍光タンパク質(GFP)を加えたところ、GFPの自発的リフォールディングに由来する蛍光がほとんど観測されなかったことから、変性体が化学修飾シャペロニンに取り込まれることが分かった。次に、得られたシャペロニン/変性GFP複合体にアデノシン三リン酸(ATP)を加えたところ、取り込まれた変性GFPが速やかに放出され、自発的リフォールディングによる蛍光が観測された。ここで、アゾベンゼン部位がトランス体の場合、放出速度が遅くなり、アゾベンゼン部位がシス体の場合、シス体と比べ放出速度3倍ほど速くなった。また、この放出速度は、紫外光・可視光を交互に照射することにより可逆的にスイッチできることが分かった。また、カルボン酸末端部にアラニン、ロイシンなどのアミノ酸部位を導入したところ、かさ高いアミノ酸を導入した場合、酸変性GFPの取り込み効率の低下、ならびにATP添加による速い放出が観測された。一方、チロシンを導入したところ、変性GFPの取りこみ効率は維持された一方、ATPを添加した場合に、放出速度が著しく低下することが分かった。このように、立体的要因に加え極性などによって放出速度が大きく影響を受けることが分かった。大腸菌由来のシャペロニンGroELの空孔部のみにシステインを導入した変異体に対し、マレイミド部位を有するアゾベンゼン誘導体を加え、空孔入り口部をアゾベンゼンで修飾した。紫外可視吸収スペクトルおよびBradford Assayにより定量したところ、シャペロニンあたりおよそ10個のアゾベンゼンが導入されていることが分かった。また、紫外可視光の選択的な照射により、アゾベンゼン部位を可逆的に異性化させることができることが分かった。この修飾変異体に対し、中性バッファ水溶液中で酸変性させた緑色蛍光タンパク(GFP)を加えたところ、これが速やかに空孔に取り込まれ、自発的リフォールディングが抑えられることが分かった。この状態に紫外光および可視光を照射したところ、ほとんど放出は見られなかった。一方、変性GFPを取り込んだ修飾変異体にATPを加えると、取り込まれた変性GFPの放出が起こった。この放出の過程で紫外光および可視光照射によりアゾベンゼン部位を異性化させたところ、紫外光照射によりトランス体からシス体に異性化させた場合には、放出速度が大きく上昇するのに対し、可視光照射によりシス体からトランス体に異性化させた場合には放出速度が大きく低下することが分かった。これらの結果をまとめると、取り込まれた変性GFPが最も速やかに放出されるのはATP存在下、紫外光照射によりアゾベンゼン部位をシス体へと異性化させた場合であり、一種のAND論理回路的な応答を示すことが分かった。大腸菌由来のシャペロニンGroELは、サブユニットの14量体からなる直径14.5nm、高さ14.5nmほどの大きさの円筒形のタンパク質であり、内部に直径4.5nmほどの円筒状の空孔を有する。細胞内では、ATPをエネルギー源として、空孔内部に変性タンパク質を取り込み、そのリフォールディングを助けることが知られている。その機構は詳細に検討されており、GroELにATPを添加すると、その空孔上部が開くような形で形状が変化し、取り込んだ変性タンパク質を放出することが分かっている。このような機械的な動きを起こす部位に、さらに光応答性の部位を導入することで、本来ATPで駆動するシャペロニンの機能を光で制御できるのではないかと考えた。具体的には、空孔部にシステインを導入した変異体を調製し、このシステインをスピロピラン部位を有するマレイミド誘導体で修飾することにより、GroELの空孔付近に光応答性のスピロピラン部位を導入することに成功した。

得られた修飾GroELに対し、ゲストとして酸変性緑色蛍光タンパク質(GFP)を加えたところ、非修飾の変異体と同様に、GroEL内に取り込まれることが分かった。スピロピラン部位は、紫外光/可視光照射により可逆的に異性化するため、その照射波長、ATPの有無に応じて合計4つの状態を作り出すことができる。それぞれの状態での変性GFPのリフォールディング挙動を検討したところ,GroESおよびATPの存在下、紫外光照射によりスピロピラン部位をメロシアニン型にした場合にのみ、変性GFPのリフォールディングが起こることが分かった。また、この挙動は紫外光、可視光照射により可逆的にスイッチできることがわかった。
界面構造解析・制御による薄膜成長プロセスの動的キャラクタリゼーション

X線光電子回折(XPED)法により、表面化学反応・成長プロセス前後の原子構造の変化を精密に決定し、さらにその途中の動的過程をXPEDの時間分解測定によってリアルタイムで解析する実験的方法の確立が目的である。XPED法の元素識別性を利用し、表面変性エピタキシーや表面合金化など、最表面原子だけでなくナノメーターオーダーの深さまでの原子が関与するためにSTMなどでは完全には解析できない系を測定・解析することを目指して、以下の研究を行った。初年度は精密かつ時間分解測定のために試料精密回転・温度可変マニピュレーターを改良した。次年度はこれらを実効的に使用するためにトランスファーロッドなどを組み込み、液体窒素温度から1000°Cまでの温度範囲のMBE作製-XPED測定が可能な装置の作製を行った。この装置の予備テストを行ったが、残念ながら時間的理由により実試料での温度変化測定までは至らなかった。2.光電子ホログラフィー理論の精密化温度変化による表面プロセス解析法として、得られたXPEDパターンを有効に解析するために新原理に基づく差分光電子ホログラフィーやtensor XPEDの手法を提案し、この手法の基礎的検討を実際の系を仮定して行った。3.表面合金化プロセスの検討Ge(111)上にCuを吸着させた不整合構造をつくり、Cu原子の構造を調べた。加熱により形成したCuとGeと合金相についてRHEED、XPEDでの測定および詳細な解析を行った。リアルタイム測定は時間的な理由から達成できなかったが、上記新手法と併せてこれらの系での解析手法を確立した。4.XPED測定の高速化の検討従来の測定をより高速化するために、2次元同時検出による測定の高速化の理論的・実験的研究や、新しいタイプの電子レンズに対する理論的検討を行い、リアルタイム測定への装置的検討を行った。X線光電子回折(XPED)法により、表面上での化学反応・成長プロセス前後の原子構造の変化を精密に決定し、さらにその途中の動的過程をXPEDの時間分解測定によってリアルタイムで解析する実験的方法を確立することが本研究の目的である。XPED法の元素識別性を利用して、表面変性エピタキシーや表面合金化など、最表面原子だけでなくナノメーターオーダーの深さまでの原子が関与するためにSTMなどでは完全には解析できない系を測定・解析することを目指して、本年度は以下の研究を行った。1.温度可変XPED装置の立ち上げ既存のマニピュレーター先端に本年度購入した試料回転・加熱用ホルダーを組み込み、液体窒素温度から1000°C程度までの温度範囲でのXPED測定を可能とする装置系の立ち上げを行った。同時にチタンサブリメーションポンプやロータリーポンプなどにより真空系のさらなる強化を行い、高温実験時の真空悪化を防ぐ工夫をした。2. XPED理論の精密化温度変化による表面プロセス解析の基礎として、XPEDにおける熱振動効果のより正確な定式化を行っている。また同時に、tensor LEEDの手法を応用して、XPEDパターンから複雑な構造を導きだすために、tensor XPEDの手法を提案し、この手法に対する基礎的な検討を行った。3.表面合金化プロセスの予備検討Ge(111)上にCuを吸着させた不整合構造をつくり、Cu原子の構造との関係を調べた。加熱により形成したCuとGeと合金相についてRHEED、XPEDでの予備測定を行い、次年度でのリアルタイム測定のための試料側からの予備検討を行った。4. XPED測定の高速化の検討従来の測定をより高速化するために、2次元同時検出による測定の高速化の理論的・実験的研究や、新しいタイプの電子レンズに対する理論的検討を行い、リアルタイム測定への装置側からの予備検討を行った。

X線光電子回折(XPED)法により、表面上での化学反応・成長プロセス前後の原子構造の変化を精密に決定し、さらにその途中の動的過程をXPEDの時間分解測定によってリアルタイムで解析する実験的方法を確立することが本研究の目的である。XPED法の元素識別性を利用して、表面変性エピタキシーや表面合金化など、最表面原子だけでなくナノメーターオーダーの深さまでの原子が関与するためにSTMなどでは完全には解析できない系を測定・解析することを目指して、本年度は以下の研究を行った。昨年改良した試料精密回転・温度可変マニピュレーターを実効的に使用するために本年度購入したトランスファーロッドなどを組み込み、液体窒素温度から1000°C程度までの温度範囲でのMBE作製-XPED測定を可能とする装置の作製を行った。この装置の予備テストを行なったが、残念ながら時間的理由により実試料での温度変化測定までは至らなかった。2.光電子ホログラフィー理論の精密化温度変化による表面プロセス解析の次段階として、得られたXPEDパターンを有効に解析するために新しい原理に基づく差分光電子ホログラフィーの手法を提案し、この手法に対する基礎的な検討を行った。3.表面合金化プロセスの検討Ge(111)上にCuを吸着させた不整合構造をつくり、Cu原子の構造との関係を調べた。加熱により形成したCuとGeと合金相についてRHEED、XPEDでの測定および詳細な解析を行なったものの、リアルタイム測定は時間的な理由から達成できなかった。しかしながら上記の新手法と併せてこれらの系での解析手法を確立した。4.XPED測定の高速化の検討従来の測定をより高速化するために、2次元同時検出による測定の高速化の理論的・実験的研究や、新しいタイプの電子レンズに対する理論的検討を行い、リアルタイム測定への装置的検討を行った。
高分子単結晶の真の結晶構造の解明への挑戦

我々の身の回りで使用されている高分子材料は、軽量で、しなやかな性質を有しているため、様々な用途で用いられており、近年では軽量であることを活かして、自動車や航空機のボディーやガラスなどの代替材料としても広く使用されている。高分子材料は結晶性高分子と非晶性高分子に分類され、結晶性高分子は、硬さや柔さなどの指標である弾性率や気体透過性などの観点から、非晶性高分子では得られない様々な性質を有している。結晶性高分子の結晶形態の一つとして、希薄溶液から形成される単結晶がある。これまで、この単結晶の結晶構造に関して、乾燥状態の試料について評価されてきたが、溶液中のそれは異なる可能性があり、真の情報を得られていない可能性がある。このような背景をもとに、本研究では、溶液中および乾燥後の高密度ポリエチレン単結晶の結晶構造をX線回折法に基づき評価し、その相違を明らかにすることを目的とする。ポリエチレンをp-キシレンに溶解した後、所定の結晶化温度まで温度ジャンプして降下することで等温結晶化を行った。ポリエチレン単結晶の生成は、原子間力顕微鏡により確認した。得られたポリエチレン単結晶溶液の溶媒を一部除去して濃縮することで、広角X線回折用試料とした。参照用試料として、ろ過により乾燥したポリエチレン単結晶マットも調製した。q = 550 nm-1の領域で、両試料のWAXD測定を行った。得られたプロファイルを比較すると、乾燥に伴い、一部の結晶面の回折ピークが広角側にシフトすることが明らかになった。これより、乾燥過程でポリエチレン単結晶の結晶格子間隔は小さくなることが明らかとなった。これは、単結晶が溶液中で形成していた中空ピラミッドが平面状へ変形することと相関があると考えられる。高分子材料は、金属材料や無機材料では有しえない、軽量でしなやかな性質を有しているため、自動車や航空機のボディーやガラスなどの代替が広く進められている。構造と物性の関係を解明することで、高分子材料の物性の改良が進められているが、溶液中で調製される高分子単結晶の結晶構造が乾燥後の試料でしか評価された例がないなど、構造評価に関して未解明な点が多く残されている。本研究では、放射光X線広角回折(WAXD)法および小角散乱(SAXS)法を駆使して、溶液中の高分子単結晶の結晶構造解析に挑戦する。溶液中および乾燥後の試料の結果を比較することで、真の高分子単結晶の結晶構造を解明する。平成29年度は、種々の条件でポリエチレン単結晶の調製し、放射光X線回折測定を行った。分子量20,00050,000、分子量分布1.22.2のポリエチレンを0.0050.01 wt%の濃度でp-キシレンに溶解し、結晶化温度6080°Cの条件でポリエチレン単結晶の調製を試みた。得られた結晶の形態を評価するため、シリコンウエハー上に溶液を滴下、乾燥し、原子間力顕微鏡により観察した。一部単結晶の形成が確認されたが、樹脂状の結晶の生成も確認された。この結晶浮遊溶液をデカンテーションおよび減圧下で60°Cで保持することで濃縮し、放射光WAXD測定を行った。その結果、ポリチレンに特徴的な斜方晶の(110)、(200)の回折ピークが確認された。しかしながら、結晶構造を解析できる程度の精度高い実験結果を得ることはできなかった。これは、濃縮が十分でなく、溶液中に存在する結晶の存在量が低かったためと推測され、平成30年度は十分に濃縮した試料で測定を行う。これまでにポリエチレン単結晶を調製し、溶液中で放射光WAXD測定を実施可能であることを明らかにした。今後は、単結晶を破壊することなく、溶媒を留去して十分な濃縮を達成する必要がある。放射光WAXDおよびSAXS測定を実施する状況も整っており、適切なサンプル調製が達成されれば、目標の達成は可能であると期待している。

これより、乾燥過程でポリエチレン単結晶の結晶格子間隔は小さくなることが明らかとなった。これは、単結晶が溶液中で形成していた中空ピラミッドが平面状へ変形することと相関があると考えられる。平成30年度は、当初の計画通り、種々の条件で調製した溶液中に存在する単結晶の結晶格子の評価を行う。これに加えて、乾燥後および乾燥過程の結晶格子の評価も行う。さらに、高速度偏光カメラおよび偏光顕微鏡観察を、溶液中、乾燥後および乾燥過程において行い、WAXD測定およびSAXS測定を総合的に考察して、乾燥過程の中空ピラミッドの崩壊メカニズムの解明を試みる。
肝細胞癌発生環境へのチトクロームP450酵素群およびアラキドン酸代謝酵素の関与

肝細胞癌の外科的切除は根治性において他の治療法を凌駕すると思われるが、これを阻む大きな要因として残肝再発並びに肝細胞癌の多中心性発生の問題がある。肝細胞癌は通常慢性肝炎、肝硬変を発生母地とし、外的因子による持続的炎症がその発癌に関与すると考えられている。これら肝細胞癌発生環境を評価することにより新たな治療戦略を見い出すのが本研究の最終目標であるが、2年間の研究により以下の結果が得られている。<方法・測定項目><結果>1)COX-2免疫染色では、非癌肝組織における陽性率は、肝細胞癌症例で正常肝に較べ有意に高く線維化の程度に従いその陽性率も増加した。3)臨床病理組織学的に肝細胞癌症例を多中心性肝細胞癌群とその他の群に分けて検討したところ、COX-2と各CYP isoformとの共発現率は多中心性肝細胞癌群で高い傾向を示した。4)さらには単位蛋白量あたりのMDA量も有意に多中心性肝細胞癌群で高かった。5)8-OHdGの発現ではcontrol<非癌部<癌部の順に高くなる傾向がみられ、非癌部での発現はcontrol<HBV<HCVの順に高くなる傾向がみられた。肝細胞癌は通常B型、C型肝炎を主因とする慢性肝炎、肝硬変を発生母地とし、外的因子による持続的炎症がその発癌に関与すると考えられている。これら肝細胞癌発生環境因子を探る目的の本研究のうち本年度の予定の研究計画で以下の結果が得られている。<臨床病理学的検討>1)COX-2免疫染色では、非癌肝組織における陽性率は、肝細胞癌症例で正常肝に較べ有意に高く線維化の程度に従いその陽性率も増加した。これら研究成果の一部は第56回日本消化器外科学会総会などで発表した。
microRNAの画期的な迅速、高感度検出法の開発

本提案ではPCRを基盤とした簡便、高感度なmiRNA検出法の開発を主目的とし、HP-PCR法を使ったmiRNA検出法を開発する。この方法を実用的な技術に仕上げするために、下記3つの目標を設定した。1) RT-HP-PCR法を使ったmiRNA検出法の構築、2) DNAプローブを用いた蛍光増大型HP-PCR法(Hpro-PCR法)とmiRNA検出法の開発、3)新規蛍光分子の開発によるHP-PCR法、Hpro-PCR法の高性能化。本年度は主に3)新規蛍光分子の開発によるHP-PCR法、Hpro-PCR法の高性能化をおこなった。28年度に我々が開発したHP-PCR法を使ってmiRNAの検出を行なうと、miRNAが検出可能であることが確認できた。また蛍光増大型のHpro-PCR法も、miRNAの検出に応用できるのでないかと考え、HPro-PCR法はDNAの特殊構造を構築できるヘアピン型DNAプローブを設計し、PCRのプライマーの5'末端にそのプローブと相補的なDNAタグをつけ、PCR前にはそのヘアピン型プローブが開いた形になっている。PCRが進行するに従い、DNAプローブはタグは配列から剥がされ、剥がされたタグは自発的にヘアピン構造をとる。DNAの特殊構造に特異的に水素結合する蛍光分子DANPがそのヘアピンに結合すると蛍光が発せられ、PCRの進行がモニタリングできる。実際にOne-step RT-PCRキットを使って逆転写からPCRまでを連続して行うと蛍光強度変化が観測され、この方法で簡単にmiRNAの検出ができることが示唆された。また、プライマーのタグは、プライマーとテンプレートがアニーリングされるときにも大きく寄与しており、タグがない場合はPCRが進行しないことが明らかとなった。本提案では、PCRを基盤とした簡便、高感度なmiRNA検出法の開発を主目的とし、HP-PCR法を使ったmiRNA検出法を開発する。このmiRNAの検出には、我々が開発したHP-PCR法が応用できるのではないかと考えた。HP-PCR法は、PCRのプライマーの5'末端をDNAで修飾し、DNAの二次構造に特異的に水素結合する蛍光分子DANPを使ってプライマーを蛍光ラベル化する。PCRが進行するとへアピン構造が開いてDANPが遊離し、蛍光が減少するという蛍光を使ったPCRモニタリング法である。この方法の場合、現在主に行われているTaqman probeを用いた場合と異なり、共有結合で蛍光分子をDNAに結合させる必要がない。つまり、蛍光分子、プライマー、miRNAを混合すると簡単にmiRNAの検出ができる利点がある。実際にOne-step RT-PCRキットを使って逆転写からPCRまでを連続して行うと、DNAプライマー部分がmiRNAに結合して逆転写が進行すると同時に、蛍光強度変化が観測され、この方法で簡単にmiRNAの検出ができることが示唆された。さらにヘアピンプローブPCR法(Hpro-PCR法)を使っても逆転写が効率的に進み、mIRNAの検出が可能であることがわかった。現在、miRNA検出用のプライマーの設計はほぼできている。あとはヘアピンプライマーPCR(HP-PCR),ヘアピンプローブPCR(Hpro-PCR)法用のプライマーで、タグ部分の関与によって目的外の増幅が起きなければ、使える技術として発表できるところまで来ている.本提案では、PCRを基盤とした簡便、高感度なmiRNA検出法の開発を主目的とし、HP-PCR法を使ったmiRNA検出法を開発する。本年度は主に2) DNAプローブを用いた蛍光増大型HP-PCR法(Hpro-PCR法)とmiRNA検出法の開発を行なった。前年度、我々が開発したHP-PCR法を使ってmiRNAの検出を行なうと、miRNAが検出可能であることが確認できた。そこで、蛍光増大型のHpro-PCR法もまた、miRNAの検出に応用できるのでないかと考えた。HPro-PCR法は、DNAの特殊構造を構築できるヘアピン型DNAプローブを設計し、PCRのプライマーの5'末端にそのプローブと相補的なDNAタグをつけ、PCR前にはそのヘアピン型プローブが開いた形になっている。現在、miRNA検出用のプライマーの設計はほぼ完了している。また、miRNAとなる前のpre-miRNAとmiRNAの検出を区別することが可能か否かを検討したいところ、プライマー部分が短いものであれば、miRNAのみの検出が可能であることが明らかとなった。現在実サンプル(血清)使い効率的に検出が可能かどうかを検討している。