hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
活褶曲と伏在断層の地震危険度評価に関する研究-信濃川中流域を例として

研究対象地域(5万分の1「長岡」図幅)の活構造を,以下に記すような室内作業および野外調査により解析した.まず縮尺2万分の1および1万分の1空中写真の判読により,活構造詳細図(縮尺2.5万分の1)を作成した.この作業により,従来報告されていなかった断層変位地形を数カ所で認定した.成果の一部は,国土地理院発行都市圏活断層図「長岡」図幅として,2001年度に公表する予定である.この判読図を基に,現地で約40日間の地形・地質調査を行った.活断層露頭や堆積物の撓み・急傾斜を多くの地点で確認した.また地形面の対比・編年のために,段丘礫層やそれを覆うローム層の観察・記載を進めた.また地形面の変形様式・量を正確に見積もるために,約30本の地形断面測量を行った.地下地質に関しては,室内においてガス坑井資料や反射法地震探査断面の解析を進めた.特に坑井資料が豊富な藤川-雲出地域・片貝地域については,坑井間の地層を詳細に対比し東西方向の地質断面図を作成することによって地層の変形構造を明らかにした.また長岡平野全域をカバーする地震探査断面を相互に対比することにより,広域的な地下地質のマッピングを進めた.これらの成果は,地球惑星科学関連学会2001年度合同大会において発表する予定である.このような信濃川中流域における調査と並行して,逆断層の地震危険度をより正確・簡便に評価する手法の確立を目的とした調査を,石川県邑知潟平野南縁断層(石動山断層)を対象に実施した.地層抜き取り装置を用いて地下地質試料を採取し,地層の対比や年代測定結果に基づいて,石動山断層の平均変位速度が従来地形学的に求められていた速度よりも2倍以上大きいことを明らかにした.この調査結果については「活断層研究」に公表した.研究対象地域(5万分の1「長岡」図幅)全域について,縮尺2万分の1空中写真の判読により,活構造詳細図(縮尺2.5万分の1)を作成した.この作業により,従来報告されていなかったごく新期の断層変位地形を数カ所で認定した.この判読図を基に,現地での約2週間の地形・地質調査を行い,活断層露頭や堆積物の撓み・急傾斜を多くの地点で確認した.また地形面の対比・編年のために,段丘礫層やそれを覆うローム層の観察・記載を進めると同時に,次年度に行う予定の地形断面測量の測線の設定を行った.室内においては,前年度に収集したガス抗井資料や反射法地震探査断面の解析を進めた.特に抗井資料が豊富な藤川-雲出地域・片貝地域については,抗井間の地層を詳細に対比し東西方向の地質断面図を数本作成することによって地層の変形構造を明らかにした.また長岡平野全域をカバーする地震探査断面を相互に対比することにより,広域的な地下地質のマッピングを進めている.このような信濃川中流域における調査と並行して,逆断層の地震危険度をより正確・簡便に評価する手法の確立を目的とした調査を試みた.調査対象地域には石川県邑知潟平野南縁断層(石動山断層)を選定し,最近開発された地層抜き取り装置を用いて地下地質試料を採取した.この調査によって,沖積層が地表の撓曲崖と調和的に変形しており,石動山断層の平均変位速度が従来地形学的に求められていた速度よりも2倍以上大きいことを明らかにした.この調査結果については現在学術誌に印刷中である.研究対象地域(5万分の1「長岡」図幅)の活構造を,以下に記すような室内作業および野外調査により解析した.まず縮尺2万分の1および1万分の1空中写真の判読により,活構造詳細図(縮尺2.5万分の1)を作成した.この作業により,従来報告されていなかった断層変位地形を数カ所で認定した.成果の一部は,国土地理院発行都市圏活断層図「長岡」図幅として,2001年度に公表する予定である.この判読図を基に,現地で約40日間の地形・地質調査を行った.活断層露頭や堆積物の撓み・急傾斜を多くの地点で確認した.また地形面の対比・編年のために,段丘礫層やそれを覆うローム層の観察・記載を進めた.また地形面の変形様式・量を正確に見積もるために,約30本の地形断面測量を行った.地下地質に関しては,室内においてガス坑井資料や反射法地震探査断面の解析を進めた.特に坑井資料が豊富な藤川-雲出地域・片貝地域については,坑井間の地層を詳細に対比し東西方向の地質断面図を作成することによって地層の変形構造を明らかにした.また長岡平野全域をカバーする地震探査断面を相互に対比することにより,広域的な地下地質のマッピングを進めた.これらの成果は,地球惑星科学関連学会2001年度合同大会において発表する予定である.このような信濃川中流域における調査と並行して,逆断層の地震危険度をより正確・簡便に評価する手法の確立を目的とした調査を,石川県邑知潟平野南縁断層(石動山断層)を対象に実施した.地層抜き取り装置を用いて地下地質試料を採取し,地層の対比や年代測定結果に基づいて,石動山断層の平均変位速度が従来地形学的に求められていた速度よりも2倍以上大きいことを明らかにした.この調査結果については「活断層研究」に公表した.
ドパミンD1およびD2受容体拮抗剤による肺癌治療に関する研究

統合失調症患者では肺癌罹患率が低いとの疫学調査より、今回、統合失調症の原因のひとつであるドパミンと肺癌について研究をおこなった。統合失調症モデルマウスを用いた。統合失調症モデルマウスであるドパミントランスポーター(DAT)欠損マウスにマウス肺腫瘍(Lewis Lung Carcinoma)を移植した。DAT欠損マウスは野生型に比較し、腫瘍増殖は有意差をもって抑制された。DAT欠損マウスでは血液中のドパミンが低下していた。しかし、野生型マウスにDAT阻害剤を投与しても、移植した腫瘍は増殖の抑制はされなかった。DAT欠損マウスは血清レベルでドパミン量が減少していた。さらにDAT欠損マウスでは末梢血管のドパミンレセプターD1が減少していた。ドパミンレセプターD1阻害剤を野生型マウスに投与すると移植した腫瘍は増殖の抑制はされた。さらにドパミンレセプターD1およびD2欠損マウスを用い腫瘍を移植し、観察した。これまでの報告とは異なり、D1欠損マウス、D2欠損マウスに移植した腫瘍は増殖抑制された。以上のことよりこれまでD2刺激が血管新生を阻害し腫瘍増殖を抑制するといわれていたが,in vivoではD1レセプターを阻害することによって血管新生を抑制し腫瘍増殖を抑えることが考えられた。そこでヒト血管内皮細胞(HUVEC)にてドパミンD1,およびD2阻害実験をおこなった。ドパミンの刺激にて血管新生因子であるVEGFレセプターがリン酸化されることを見いだし、さらにこれはD1レセプターを阻害することで抑制されることを明らかとなった。以上のことより、癌治療においてドパミンは腫瘍血管を促進する能力がありそれはD1刺激を介している。今後はD1阻害剤がヒトにおいて腫瘍増殖を抑制するかどうかを検討する必要がある。肺癌は日本において癌死で最も多い。癌研究は生物学的、心理学的、社会学的そして倫理学的な視点からの多面的なアプローチが必要である。肺癌の発症はタバコとの関連が証明されている。しかし、統合失調症患者においては、喫煙が多いのに関わらず、肺癌の発症が少ないと報告されている。統合失調症はドパミン分泌の異常が指摘されており、また、ドパミン受容体の異常やドパミン受容体の減少が指摘されている。ドパミン受容体は7回膜貫通のGタンパク質で魚類、爬虫類、鳥類においても存在し個体の神経制御に深く関わっている。今回、統合失調症のモデルマウスを用い、肺癌の進展について分子生物学的に研究をおこなった。統合失調症のモデルマウスであるドパミントランスポーター(DAT)欠損マウスに肺腫瘍(Lewis Lung carcinoma)を移植しそれを観察した。DAT欠損マウスは野生型マウスに比較し腫瘍増殖を抑制していた。しかし、野生型マウスにDAT阻害剤を投与しても、移植した腫瘍は増殖の抑制はかからなかった。さらにDAT欠損マウスではドパミンレセプターD1が減少していた。また、末梢血管にドパミン受容体D1,D2を確認したところ、RT-PCRにて存在を確認できた。そこで、さらにドパミンレセプターD1およびD2欠損マウスを用いドパミンシグナルと腫瘍増大について研究を進めている。これまでにドパミンが血管新生(VEGF受容体のリン酸化阻害)に関わっている可能性が示唆されているがシグナル伝達については十分なものではなくほかの経路についてタンパク質レベルで調べている。
血液凝固波形解析法を用いた凝固異常症の診断の確立

本研究の位置づけと応募者のこれまでの研究成果を踏まえた着想に至った経緯:凝固波形の解析は2013年にAPTTの凝固反応過程で生じる凝固波形から血友病の疾患において異常な波形が生じることが発見されたことでAPTTによる血友病の診断及びその重症判定が可能であることが示唆されて近年、注目されている検査法である。この波形解析法は患者血漿中にCaを一定量添加することによって得られる凝固反応の開始から最終産物であるフィブリンが形成されるまでの過程で得られる光の透過性量が変化することを利用して経時的変化量を描出したのが血液凝固波形とされている。この吸光度波形をさらに一定時間当たりの2点間を一次微分することで凝固の速度(1st)を導き出すことができる。得られた1stの凝固波形をさらに二次微分することで凝固の加速度(2st)を導き出すことができる。これらの波形の中にAtypical peakで示すような停滞した特徴的な波形異常と2stの最大ピークから最小ピークまでの時間が正常と比較して延長している症例がAPTTの延長例に多く認められた点に着目し研究を開始した。2015年度の研究で明らかにしたこと1、2と残された課題3: 1APTT延長症例の中で異常な波形パターン例を集積して凝固波形の統計解析を行い数値定量化して特定の鑑別点を見つけることができないか検討する課題の研究成果では異常な波形パターンであるAtypical peakを示す割合はLA陽性例患者88例では94.5%、凝固因子欠乏症43例では29.1%の割合で認められ、その他の正常20例、血友病A, Bなどの疾患10例、抗凝固療法中の患者33例では認められなかった。2波形異常のパターンを集積して1の解析を利用して他の凝固異常症での検証と疾患ごとに識別が可能かどうか証する課題の研究成果では2stの加速開始点から最大ピークまでの時間と最大ピーク(B)から最小ピークまでの時間(C)をもとにした(B/C ratio)を検討した。正常群から算出したカットオフ値(>2.10)をもとにするとLA陽性例患者例では57.8%、凝固因子欠乏症例では27.8%の割合で陽性となり、その他の血友病A, Bなどの疾患例、抗凝固療法中の患者例では全て陰性であった。そこでAtypical peakとB/C ratioの2つを指標として検証したところ、LA陽性例患者群では感度88.0%と検査精度の高い結果が得られた。平成28年度は残された課題である3の波形異常出現のメカニズム解明のためLAの責任抗体であるリン脂質抗体を用いて異常凝固波形機序を解明し凝固異常症への診断の基盤研究を完成させる。

平成28年度は残された課題である3の波形異常出現のメカニズム解明のためLAの責任抗体であるリン脂質抗体を用いて異常凝固波形機序を解明し凝固異常症への診断の基盤研究を完成させる。
エネルギー変換ユニットの活性を制御する動的構造変換

細菌べん毛モーターにおいてエネルギー変換を担う固定子PomA/PomB複合体は、回転子周囲の適切な場所に配置されて機能する。このとき、PomBのペリプラズム領域に構造変化が生じて固定され、同時にイオン透過能が活性化すると考えられている。本研究では精製固定子をリポソーム上に再構成し、蛍光プローブを用いて構造変化を検出することを目標とした。結果として構造変化検出には至らなかったが、固定子の大量精製を再現性良く行えるようになり、リポソームへの再構成条件を網羅的に検討できるようになった。またジスルフィド架橋実験により、構造変化部位をある程度特定することに成功した。細菌べん毛モーターにおいてエネルギー変換を担う固定子は、回転子周囲の適切な場所に十数個配置され機能する。ビブリオ菌のPomA/PomB固定子複合体は、モーターに集合するとPomBのペリプラズム領域に構造変化が生じて固定され、同時にイオン透過能が活性化すると考えられている。しかし本当に機能に必須な構造変化が生じているのかは不明である。本研究では、精製固定子をリポソーム上に再構成し、PomBの結晶構造から予測される構造変化部位に、局所環境変化により蛍光強度を変化させるプローブを導入して、構造変化の検出を試みることを最終目標に行ってきた。平成25年度は、前年度に改良したPomA/PomB固定子複合体の精製法により得た精製標品を用いて、リポソームへの再構成を試みた。今回は他の輸送体において成功例の多い、脂質と界面活性剤が混合したリポソームを用いる方法に着目した。この方法では、脂質混合リポソームの形成を溶液の吸光度により検出できるため、前年度に比べて定量性と再現性において向上が見られ、様々な界面活性剤を試すことによって、順方向に固定子が再構成されたプロテオリポソームを得ることが出来た。しかし残念ながら、この再構成リポソームを用いてもイオン透過活性の検出は出来なかった。従って、機能を保持した状態での再構成には成功していない。一方固定子の固定に伴うPomBのペリプラズム領域(PomBC)の構造変化については、この領域における詳細なジスルフィド架橋実験により検証を行い、PomBCの第1ヘリックスのN末端が構造変化を誘起する可能性を示唆する結果を得た。現在、固定子のリポソームへの再構成系の確立に全力を尽くしている。機能的再構成が可能になれば、ジスルフィド架橋実験で明らかになった情報をもとに、蛍光ラベルの導入と構造変化の検出に取り組む予定である。細菌べん毛モーターにおいて、エネルギー変換を担う固定子は回転子周囲の適切な場所に十数個配置され機能している。ビブリオ菌PomA/PomB固定子複合体は、モーターに集合するとPomBのペリプラズム領域に大きな構造変化を誘起して固定され、イオン透過能を活性化すると考えられている。本研究では、精製固定子をリポソーム上に再構成し、PomBの結晶構造から予測される構造変化部位に、局所環境変化により蛍光強度を変化させるプローブを導入して、構造変化の検出を試みることを目標にしている。本年度は、まずPomA/B複合体の大量発現および精製法の改良を行った。我々はこれまでpETベクターによる発現系を用いてPomA/B複合体を発現させていたが、思った以上に発現量が低く、精製標品の収量は低いままであった。試行錯誤の結果、コールドショックによる発現誘導が特徴のpColdベクターを用いた発現系で、顕著に発現量が向上することが分かった。加えてPomA/B複合体のカラムへの吸着やカラム洗浄の条件検討を行うことで、より純度の高い精製標品を短時間で得ることが出来るようになった。リポソームへの再構成も、バイオビーズによる界面活性剤除去の条件や凍結融解の回数などを検討することで、まだ収率は低いが、イオン透過能を保持した状態での再構成ができるようになった。さらに、大きな構造変化が予想されるPomBのペリプラズム領域(PEMドメイン)にジスルフィド架橋を導入したところ、固定子の機能(モーターの回転)が架橋に依存して阻害されることが明らかとなった。以上により、本研究の核となる、再構成固定子にプローブを導入して構造変化を検出する実験のために必要な準備を、本年度十分に行うことが出来たと考えている。本研究では、べん毛モーター固定子が回転子周囲に自己集合する際に誘起される、固定子ペリプラズム領域の構造変化の検出を目的としている。具体的には、固定子を精製し、結晶構造から予測される構造変化部位に、局所環境変化により蛍光強度を変化させるプローブを部位特異的に導入してリポソーム上に再構成する。

もしも構造変化が誘起されるならば、プローブの発する蛍光強度の変化で検出が可能と考えられる。本年度は、研究計画調書において初年度に計画していた、精製した固定子をリポソームへ再構成するところまでを目標に研究を進めた。PomA/B固定子複合体の精製と再構成は、以前に我々の研究室で成功しているが、精製中に複合体が解離するなど調製が困難で、変異体を多数解析することが出来ていない。そこで、まず大量発現系を見直し、pColdベクターを用いることで、誘導後に全細胞サンプルで明らかにバンドが確認できる程度まで発現量を上げることに成功した。さらに可溶化PomA/B複合体のカラム吸着および洗浄条件を再検討し、短時間で比較的純度の高い精製標品を得ることに成功した。リポソーム上への再構成はまだ確立できていないが、バイオビーズを用いた界面活性剤除去や、凍結融解によるリポソーム融合などの条件を検討し、PomA/B複合体を介したNaイオン透過能を何とか計測できるところまで到達している。一方で、大きな構造変化が予想されるPomBのPEMドメインにジスルフィド架橋を導入したところ、固定子の機能(モーターの回転)が架橋に依存して阻害されることを見いだした。このことから、機能に必須な構造変化が実際におきている可能性は高いと考えており、次年度計画している検出実験で、実際の構造変化を捉えることが出来るのではないかと期待している。以上、本年度に目標としていた、本実験のための準備は十分に行うことが出来たと考えている。次年度は、本研究の核となる「構造変化検出実験」を行う。まず本年度改良した発現・精製系を用いて得た精製固定子を、機能(イオン透過能)を保持したままリポソームに効率よく再構成できるよう、条件の検討を行う。機能の評価は、平行して行っているアイソトープを用いたNaイオン透過活性測定系を用いて行う。安定に再構成リポソームが得られるようになったら、蛍光プローブで部位特異的にラベルした精製固定子を再構成する。その後、研究計画調書に記載した通り、さまざまな条件下での蛍光強度変化を測定することにより、構造変化の検出を試みる。基本的には、当初の計画通りに研究を進める予定である。主に消耗品に経費を当てる。また、成果発表のために外国出張のための旅費を計上している。また、謝金には外国語雑誌への投稿にかかる英文校閲と掲載料を計上している。基本的に当初の研究計画調書通りに研究費を使用する予定である。
臨床応用に向けたラジオアイソトープ標識抗テネイシンC低分子化抗体の開発

ラジオアイソトープ(RI)による標識が可能な低分子を作製するため、モノクローナルマウス抗テネイシンC(TNC)抗体ハイブリドーマや抗TNC Fab抗体、精製TNCを作製した。抗TNC抗体(4F10TTと4C8MS)に由来する低分子化抗体としてscFvのC末端配列を改変してVH-linker-VL-Flag-Cys(Cysはメルカプト基を有する)とし、ハイブリドーマからRNAを抽出し、RT-PCR法によりH鎖およびL鎖のドメイン(VHとVL)の遺伝子をクローニングし、これらをoverlap extension PCRに付すことによりリンカー配列を介して連結し、scFv遺伝子を構築した。これを発現ベクターにサブクローニングしたのち大腸菌に導入して、可溶型scFvタンパク質を調製した。Biacoreによる解離定数(KD)測定から、scFv抗体の親和性は低下していないことが確認された。キレート(EMCS-Bz-EDTA)を作製し、scFvに付加し、インジウム-111を用い標識する手法を確立した。心筋梗塞モデルラット(MI)に、RI標識抗体を尾静注し、臓器分布を調べた。オートラジオグラムにて、心筋梗塞による心筋壊死部に一致してscFvの集積が認められることを立証した。別のMIにTNCの発現を免疫組織染色し、比較した。臨床応用に向け、RI標識Fab抗体を心筋梗塞モデルラットに尾静注し、SPECTを撮像した。2種類の抗TNC抗体の集積は、対照や非特異抗体に比べ、有意に高かった。抗TNC抗体の集積量が高いラットは、心臓超音波検査による心筋梗塞後の心拡大が大きかった。また、星細胞腫ヌードマウスを作製し、RI標識抗体が癌の生体イメージソングにも有効であることを示し、臨床応用の適応拡大の可能性を示唆した。RI標識抗テネイシンC抗体投与後の長期経過を観察し、安全性を確認した。特許出願予定である。特許出願予定である。樹立されたモノクローナルマウス抗テネイシンC(TNC)抗体ハイブリドーマや抗TNC Fab抗体、精製TNCを三重大学が作製、提供した。神戸薬科大学にて、抗TNC抗体4F10TTに由来するscFvのC末端配列を改変してVH-linker-VL-Flag-Cys(Cysはメルカプト基を有する)とし、ラジオアイソトープによる標識が可能な分子を作製した。ハイブリドーマからRNAを抽出し、RT-PCR法によりH鎖およびL鎖のドメイン(VHとVL)の遺伝子をクローニングし、これらをoverlap extension PCRに付すことによりリンカー配列を介して連結し、scFv遺伝子を構築した。ELISAで調べたところ、得られたscFvは1NCに対する結合特性を保持していた。また、メルカプト基が付加されていることを、マレイミド化ビオチン化との反応性を有することから確認した。放射線医学総合研究所(放医研)にてBiacoreを用いて、解離定数(K_D)を求めたところ、scFvでは4x10^<-8>Mとなり、これまで用いてきたFab抗体の7x10^<-8>Mに比べ同等か低値であった。新規分子抗体の親和性は低下していないと判断された。千葉大学では、キレート(EMCS-Bz-EDTA)を作製し、scFvに付加し、インジウム-111を用い標識した。放医研が作製した心筋梗塞モデルラットに、ラジオアイソトープ標識抗体を尾静注し、臓器分布を調べた。その結果、血液中の洗い出しは良好であるが、肝臓の集積は高まった。

心筋梗塞部は、非心筋梗塞部に比べ高い集積を認めた。オートラジオグラムと隣接切片の病理評価を行い、心筋梗塞による心筋壊死部に一致してscFvの集積が認められ、線維化も軽度確認された。樹立されたモノクローナルマウス抗テネイシンC(TNC)抗体ハイブリドーマや抗TNC Fab抗体、精製TNCを三重大学が作製、提供した。神戸薬科大学にて、抗テネイシンC(TNC)scFv抗体作製の第2候補である4C8MSタイプを用い、抗体のC末端配列を改変してVH-linker-VL-Flag-GGGGSC(Cはメルカプト基を有する)とし、ラジオアイソトープによる標識が可能な分子を作製した。ハイブリドーマから総RNAを抽出し、RT-PCR法によりH鎖およびL鎖のドメイン(VH, VL)の遺伝子をクローニングし、これらをoverlap extension PCRに付すことによりリンカー配列を介して連結し、scFv遺伝子を構築した。さらに適当な発現ベクターにサブクローニングしたのち大腸菌に導入して、可溶型scFvタンパク質を調整した。ScFv抗体の大量合成を目標として、TNC固定化カラムによる精製法を開発中である。千葉大学では、キレート(EMCS-Bz-EDTA)を作製し、scFvに付加し、インジウム-111で標識する手法を確立した。臨床実用化に向け、千葉大学と放射線医学総合研究所では、心筋梗塞モデルラットを作製し、ラジオアイソトープ標識Fab抗体を尾静注し、SPECTを撮像した。心臓超音波検査にて経過観察すると、心筋梗塞後の心拡大が大きいほうが、抗TNC抗体の集積量が高かった。また、星細胞腫ヌードマウスを作製し、ラジオアイソトープ標識抗体を尾静注した。臓器分布を調べ、SPECTを撮像し、癌の生体イメージングにも有効であることを確認した。モノクローナルマウス抗テネイシンC(TNC)抗体ハイブリドーマ抗TNC Fab抗体、精製TNCを三重学が作製、提供した。また、TNCの発現を免疫組織染色し、評価した。神戸薬科大学にて、抗TNC抗体4C8MSに由来するscFvのC末端配列を改変してVH-linker-VL-Flag-Cys(Cysはメルカプト基を有する)とし、ラジオアイソトープによる標識が可能な分子を作製した。ハイブリドーマからRNAを抽出し、RT-PCR法によりH鎖およびL鎖のドメイン(VHとVL)の遺伝子をクローニングし、これらをoverlap extension PCRに付すことによりリンカー配列を介して連結し、scFv遺伝子を構築する。これを発現ベクターにサブクローニングしたのち大腸菌に導入して、可溶型scFvタンパク質を調製する。大量合成した抗体を効率よく大量に取得するために、精製法を開発した。千葉大学と放医研ではインジウム-111を用い標識するキレート(EMCS-Bz-EDTA)を作製し、scFvに付加した。作製した心筋梗塞モデルラットに、ラジオアイソトープ標識抗体を尾静注し、臓器分布を調べた。オートラジオグラムと隣接切片の病理評価を行いながら評価を行いながら、心筋梗塞による心筋壊死部に一致してscFvの集積が認められることを立証した。さらに、4F10TTと4C8MS由来の抗TNC抗体の比較を行った。
生産性と光学特性に秀でたチューナブル波長選択フィルタチップの開発

次世代光アクセス網の高速大容量技術方式WDM-PONにおけるキーデバイス,チューナブル波長選択フィルタの開発を行った.光学薄膜を利用した2種類のフィルタ(温度制御型TO-BPF、電圧制御型EO-BPF)の作製技術とデバイス性能向上を進め,得られた成果は以下の9項目:1a-Si:D/SiOx TO-BPFによる生産性改善2TO-BPFの耐熱性改善3NIR波長域用ITiO透明ヒータ膜の実証4TO-BPFの小型化/薄型化による省電力化5省スペースTO-BPFモジュール試作; 6EO-BPF用PLZT用シード層兼透明電極の開発7EO-BPF構成要素の検討91キャビティ型EO-BPFの試作.(1)温度制御型チューナブルフィルタ■a-Si:D/SiO2多層膜チューナブルフィルタの高温時吸収損失増加を抑制することを目的に,多層膜の低屈折率層を(従来のSiO2から)SiNに変更し,高温時吸収損失の実証実験を行った。a-Si:D/SiO2とa-Si:D/SiNとの吸収損失に明確な違いが認められ,a-Si:D/SiNによる抑制効果を実証できた。■チューナブルフィルタチップの消費電力特性改善(初年度に実施)を推し進めるため,(i)局部薄型加工技術(初年度に開発)の改良,(ii)透明ヒータ膜材料の新規選定,に取り組んだ。(i)では,局部薄型加工した穴底面の形状および凸凹粗さを改善できた。(ii)では,Si半導体系と酸化物半導体系の薄膜を試作し,電気特性(抵抗率,電流印加発熱時の面内温度分布,発熱時の耐熱性)および光学特性(透明性)を実験的に評価した。試作薄膜は透明ヒータ膜としてまだ不十分な特性であり,次年度引き続き検討を続けたい。■フィルタ成膜技術改善の一項目として,成膜時間の短縮化(目標:従来の1/2以下)がある。フィルタの多キャビティ構造化,スペクトル形状改善,など将来の進展に寄与する。多層膜の低屈折率層を(従来のSiO2から)SiOxに変更して試作実験を行い,従来の1/31/4に短縮化できる可能性を見いだした。(2)電圧制御型チューナブルフィルタ■チューナブル波長選択フィルタの試作を行うべく、作製技術の検討に取り組んだ。スピンコート法および酸素雰囲気中での高速高温熱処理によって,Pt/STO結晶基板上に,ペロブスカイト型PLZT結晶薄膜を形成できた。■Pt薄膜をミラー兼電極とした簡易構造のフィルタ(構造:Pt/PLZT/Pt/STO基板)を試作し,電気光学効果の確認実験を行った。実験では熱光学効果の影響が大きく電気光学効果が隠れてしまったため後日改めて評価したい。(1)温度制御(TO)型チューナブルフィルタ■ダブルキャビティ型a-Si:D/SiOx BPFを作製し,箱形の透過スペクトル特性を実証した。成膜レートの早いSiOxを低屈折率層に採用して,多層膜フィルタの作製時間を従来の1/3にまで短縮できることを実証した。■温度制御型波長選択フィルタ用の透明ヒータ膜候補としてITO,ITiO,pc-Si:Bを作製条件を変えて作製し,近赤外波長帯における光吸収率,体積抵抗率を評価し,ITiO膜が唯一光吸収率3%以下かつ体積抵抗率10^-2Ω・cm以下の性能目標を満足することを明らかにした。ITiO膜について消費電力負荷試験を行い,膜厚300nmのITiO膜では消費電力0.8Wで抵抗率が安定であることを示した。ITiO膜がチューナブル波長選択フィルタ用の透明ヒータ膜材料に適することを実証した。■TOチューナブル波長フィルタの省電力化と応答向上を目的としてフィルタ付石英基板の局所薄型加工を行い,取扱い強度を保持したまま試料体積を従来比22%に減少させた。消費電力に対する温度増加率を34°C/0.1W(薄型加工前と比較して1.4倍)に改善できた。■チューナブルフィルタチップのファイバインライン集積を目的に,光学系を30mm角面積内に構築した。フィルタチップ150°C発熱時,インライン光学系への悪影響がないことを確認した。(2)電圧制御(EO)型チューナブルフィルタ■PLZTを用いたEOチューナブル波長フィルタの作製要素技術の開発に取り組んだ。1Pt(111)の良好な形成条件を見いだした。2Pt(111)を上部seed層に利用することで,格子不整合の下地層上にもPLZT(111)を優勢的に結晶成長することに成功した。3SiNx/SiO2多層膜ミラーの700°C耐熱性を実証した。次世代光アクセス網の高速大容量技術方式WDM-PONにおけるキーデバイス,チューナブル波長選択フィルタの開発を行った.光学薄膜を利用した2種類のフィルタ(温度制御型TO-BPF、電圧制御型EO-BPF)の作製技術とデバイス性能向上を進め,得られた成果は以下の9項目:1a-Si:D/SiOx TO-BPFによる生産性改善2TO-BPFの耐熱性改善3NIR波長域用ITiO透明ヒータ膜の実証4TO-BPFの小型化/薄型化による省電力化5省スペースTO-BPFモジュール試作; 6EO-BPF用PLZT用シード層兼透明電極の開発

7EO-BPF構成要素の検討91キャビティ型EO-BPFの試作.(1)温度制御型チューナブルフィルタ■チューナブル波長選択フィルタチップの応答特性と消費電力特性を改善するため、消費電力0.2W以下、応答速度改善1秒以下の目標を設定して研究に取り組んだ。■応答及消費電力特性を改善するためにフィルタチップ基板を薄型化したい。逆に基板強度を保持するために基板を薄型化できない。そこでフィルタチップ基板に新しく局部薄型加工することを試みた。(i)超音波ドリル、(ii)砥粒及び回転研磨冶具、(iii)化学エッチング、を併用して加工を行い、石英ガラス基板に井戸型の穴(直径1.5mm、残り厚0.005mm)を形成した。■続いて局部薄型加工を施したフィルタチップの特性評価実験を行った。応答速度及び消費電力のいずれも局部加工前と比べると約半分にまで改善できた。■応答速度は0.9秒(波長シフト+5nm時)となり、目標を達成した。■消費電力は0.87W(波長シフト+30nm時)となり、目標(0.2W以下)を達成するに至らなかった。目標未達成の原因はフィルタ加熱用ヒータ膜の形状にあると推測し、次年度にその解決を試みる。(2)電圧制御型チューナブルフィルタ■チューナブル波長選択フィルタの試作を行うべく、作製技術の検討に取り組んだ。まずスピンコート法と高温熱処理によって基板上にEO結晶薄膜を形成できるか確認するため、薄膜形成とXRD結晶分析を行ったが、結晶化を確認できなかった。続いて"高速"高温熱処理に変更して薄膜形成と結晶分析を行い、(目的のペロブスカイト型結晶でなく)パイロクロア型結晶の形成を確認した。■実験的検討を通じて、良質なEO結晶薄膜を形成するには作製条件の知見が必要なことが判明したので、以降「文献調査による検討」「良質なEO結晶薄膜の形成に必要な装置準備」を実施した。■次年度に実験的検討を引き続き行い、フィルタ試作を行いたい。■異なる2つの材料系を用いてTO-BPFを作製し,耐熱性(吸収率の温度依存性)を評価した.a-Si:D/SiNxでは熱処理温度450°Cまで吸収率は増加せず,a-Si:D/SiOxでは400°Cまで増加し450°Cで破壊した.SiNxによる高温時の吸収率増加の抑制を実証した.■TO-BPFを2mm角×0.05mm厚に小型薄型加工して消費電力効率を向上させた(0.30W/20nm).■ファイバコリメータ(市販品)とTO-BPFチップを組み合わせ省スペース(5cm長×2cm幅)モジュールを試作した.V溝加工アルミ板上に2つのコリメータを対向させて配置し(光軸ずれ0.2mm,結合効率12%)さらに光軸調整用に平行平板を傾けて挿入して結合効率を86%に改善した.■光学モニタ系に市販の帯域可変フィルタを導入し光源線幅1nmに拡げて可干渉性を抑えたが,光量安定性は改善されなかった.■TO-BPF成膜後のポストアニール前後の中心波長シフト量を調べ,350°C程度まで短波長側,それ以上で長波長側へのシフトを確認した.■コリメータ光学系と恒温/高温チャンバを組み合わせてTO-BPF中心波長温度係数(dλ/dT)評価系を構築し,150°C以上高温時にチャンバの振動が大きく光学系に伝わり,dλ/dT測定精度劣化の原因であることを突き止めた.
マルチリンガル（多言語話者）の熟達体験から捉える外国語の学びの質的分析

多言語を活用できるマルチリンガルの言語学習体験には、言語間の相互作用によることばへの気づきや学び方の学習といった外国語の深い学びに関わる重要な手掛かりが多く存在している。そこで本研究では、英語・日本語を含めたマルチリンガル環境(多言語活用環境)にある日本在住の幼児児童生徒及び家族を対象とし4年間に渡る縦断的な調査を通して体験の詳細な分析を行い、単なる英語の日常会話の学びにとどまらず、多言語活用、異文化理解、及びグローバルな市民性の育成を目指す外国語学習方略を構築し学習実践プログラムを提案する。
東京の土地変遷史研究ー寺院集合地域について

本研究の目的は、都市を「土地の集合体」としてとらえ、個々の土地の具体的変遷史としての都市研究を行なうことにあった。対象とするものとして寺院集合地域をとり上げ、基礎的情報の収集につとめた。考察の対象地域は、1上野公園(旧寛永寺境内),2浅草(旧浅草寺境内),3牛込市ヶ谷(横寺町,通寺町),4向丘(文京区)を念頭におき、必要に応じて谷中・麻布などその他の寺院集合地域を参照する形をとった。調査の形態は1.基礎的情報の収集,2.明暦大火後・幕末期・明治初期・市区改正後の、4期の後原図の作成,3.大正以降の寺院移転,消滅についての追跡調査を主眼としたが、中でも1および3が作業の中心となった。1については該当地域の調査・巡見にもとづいて,現状の構成要素(建築・塀・庭園・墓地など)を記録していった。この作業のなかで、檀家系列、旧藩関係の寺院および明治以降の有力商人と寺院の関係を中心としたデ-タ収集が行なわれた。その結果、寺院の性格が幕末から明治以降にかけてどのように変化したかを、檀家層から解明するという方法の端緒をつかむに至った。この作業を逆転させ、鍋島家、島津家等を中心にして、当主および家臣団の墓地の所在および寺院分布を調査し、大正期以降の寺院移転・消滅の追跡を行なうことが可能になった。東京における寺院の存在基盤と存在意義を、檀家層から捉え直すことが、近代における都市内寺院の動きを把握する上で有効なのである。
プロテインチップによる抗がん剤感受性マーカータンパク質の解析

癌の診断・治療において新しいバイオマーカーの発見は重要である。我々はこれまでに、肺、胃、大腸など8臓器由来39種のヒト培養癌細胞株からなる"癌細胞パネル"を樹立し、これら細胞株について薬剤感受性、遺伝子発現などを調べ、統合データベースを構築し、癌の分子薬理に関する有用情報獲得に用いてきた。本研究では、SELDIプロテインチップシステム(Ciphergen)により39種の癌細胞株における蛋白質発現プロフィルを調べ、新しいバイオマーカーの解析を行った。成果を以下に要約する。1.癌細胞パネルの蛋白質発現プロフィルの分析から、大腸癌株のみに11970Daの蛋白質が発現していることを見出し、これをProthymosin α(PT-α)と同定した。PT-αは、酸性核蛋白質で細胞増殖やアポトーシスへの関与が示唆されているが、その機能は不明である。2.抗PT-α抗体を作成し、免疫組織学的にその発現を臨床大腸癌材料で調べた。正常大腸粘膜より腺腫の方がPT-αを強く発現し、腺腫より癌組織の方がさらに強く発現していた。この観察は、PT-αが癌マーカー候補であることを初めて示すものである。今後、症例数を追加してPT-αの発現を癌組織と血中レベルで測定することによりPT-αが癌マーカーとなりうるかの検証へ、また、癌におけるその機能を解明し治療の分子標的となるかの検討へ発展させたい。3.抗癌剤感受性マーカー発見のため、抗癌剤により癌細胞内でおこる蛋白質発現変化を解析した。ヒト肺癌NCI-H226細胞に対するTaxol、Cisplatin、SN38など9種類の抗癌剤の影響を見た。様々な変化の中から、薬特異的に発現変化する蛋白質、すなわち抗癌剤感受性マーカー候補の検出に成功した。今後これらの同定を行い、その抗癌剤感受性マーカーとしての有用性検証ならびに機能解析研究に発展させたい。以上より、癌細胞パネルを利用したプロテインチップ解析は、癌マーカー、抗癌剤感受性マーカーなどのバイオマーカー発見の新しい方法論として有望である。今後、診断・治療の開発研究に活用したい。プロテインチップによる抗癌剤感受性マーカー蛋白質の解析抗癌剤処理により癌細胞内で起こる蛋白質発現変化の解析は、抗癌剤感受性診断のマーカーや治療効果判定のマーカー(サロゲートマーカー)の発見、ならびに新たな創薬ターゲットの発見に繋がると期待される。その解析に先立ち、癌細胞蛋白質をプロテインチップで分析するための至適条件を検討するため、様々な臓器由来の培養癌細胞の蛋白質発現解析をプロテインチップシステムにて行い、特定の臓器癌に発現している蛋白質を探索、同定した。大腸など8臓器、計39種のヒト培養癌細胞破砕液から高濃度ウレア溶液で蛋白質を抽出し、陰イオン交換チップに添加した。チップ表面に親和性のある蛋白質は時間飛行型質量分析計で検出した。各臓器の発現パターンを比べた結果、大腸癌由来細胞のみに11970Daの蛋白質が認められた。チップ上で決定された精製条件に従って精製し、ゲル内トリプシン消化により同定を試みたところ、目的蛋白質はProthymosin αであることがわかった。正常大腸粘膜にはその発現は見られなかった。Prothymosin αはそのmRNA発現レベルが細胞増殖に関与することが示唆されており、大腸癌においてもmRNAが高発現していることが報告されている。以上、プロテインチップシステムによってマーカー蛋白質候補を迅速に探索、同定できることがわかった。

これに基づき、抗癌剤処理により癌細胞内で起こる蛋白質発現変化の解析を開始した。抗癌剤Taxolで処理したヒト肺癌NCI-H226細胞など7種のヒト癌細胞から蛋白質を抽出、イオン交換チップに添加し、チップ表面に吸着した蛋白質を時間飛行型質量分析計で検出した。この方法で少なくとも100種類の蛋白質が検出された。発現パターンをTaxol未処理のコントロールと比較した結果、Taxol処理後複数の細胞株に共通して発現が上昇または低下する蛋白質が認められた。その同定を進めている。癌の診断・治療において新しいバイオマーカーの発見は重要である。我々はこれまでに、肺、胃、大腸など8臓器由来39種のヒト培養癌細胞株からなる"癌細胞パネル"を樹立し、これら細胞株について薬剤感受性、遺伝子発現などを調べ、統合データベースを構築し、癌の分子薬理に関する有用情報獲得に用いてきた。本研究では、SELDIプロテインチップシステム(Ciphergen)により39種の癌細胞株における蛋白質発現プロフィルを調べ、新しいバイオマーカーの解析を行った。成果を以下に要約する。1.癌細胞パネルの蛋白質発現プロフィルの分析から、大腸癌株のみに11970Daの蛋白質が発現していることを見出し、これをProthymosin α(PT-α)と同定した。PT-αは、酸性核蛋白質で細胞増殖やアポトーシスへの関与が示唆されているが、その機能は不明である。2.抗PT-α抗体を作成し、免疫組織学的にその発現を臨床大腸癌材料で調べた。正常大腸粘膜より腺腫の方がPT-αを強く発現し、腺腫より癌組織の方がさらに強く発現していた。この観察は、PT-αが癌マーカー候補であることを初めて示すものである。今後、症例数を追加してPT-αの発現を癌組織と血中レベルで測定することによりPT-αが癌マーカーとなりうるかの検証へ、また、癌におけるその機能を解明し治療の分子標的となるかの検討へ発展させたい。3.抗癌剤感受性マーカー発見のため、抗癌剤により癌細胞内でおこる蛋白質発現変化を解析した。ヒト肺癌NCI-H226細胞に対するTaxol、Cisplatin、SN38など9種類の抗癌剤の影響を見た。様々な変化の中から、薬特異的に発現変化する蛋白質、すなわち抗癌剤感受性マーカー候補の検出に成功した。今後これらの同定を行い、その抗癌剤感受性マーカーとしての有用性検証ならびに機能解析研究に発展させたい。以上より、癌細胞パネルを利用したプロテインチップ解析は、癌マーカー、抗癌剤感受性マーカーなどのバイオマーカー発見の新しい方法論として有望である。今後、診断・治療の開発研究に活用したい。
ＲＮＡ医薬を搭載した標的指向型多機能性エキソソームの開発

本研究では細胞から分泌される小胞であるエキソソームの体内動態制御法の開発を目的として、エキソソームの体内動態を解析した。マウスメラノーマ細胞株、B16BL6細胞をモデルのエキソソーム細胞として検討を行ったところ、静脈内に投与されたエキソソームは半減期2分という非常に短い時間で血中から速やかに消失することを見出した。主に肝臓・肺・脾臓に分布することも見出した。また、血中からのエキソソームの速やかな消失は、肝臓・脾臓に存在するマクロファージにより取り込まれるためであることを明らかとした。エキソソームはsmall interfering RNAを始めとした核酸医薬品の安全かつ効率のよいデリバリーキャリアとなりえることが期待されているが、その実現にはエキソソームの体内動態の解析が必要である。本研究ではエキソソームの体内動態解析の開発と評価を行った。前年度の検討において、エキソソーム体内動態の定量的な評価系の確立を目的として、レポータータンパク質Gaussia luciferase (gLuc)とエキソソーム移行性タンパク質lactadherinとの融合タンパク質gLuc-lactadherinをデザインし、その発現プラスミドDNAをエキソソームの産生細胞に遺伝子導入することで、エキソソームをgLuc-lactadherinで標識することに成功した。また、マウスを用いた検討から、gLuc-lactadherinで標識したマウスメラノーマB16-BL6細胞由来エキソソームは、静脈内投与後、約2分の消失半減期で全身循環から速やかに消失し、肝臓ならびに脾臓、肺に移行することを明らかにした。そこで本年度では、このエキソソームの血中からの速やかな消失の要因の解析を試みた。エキソソームのおもな消失機構として、エキソソームの細胞による取り込みが考えられた。そこで、静脈内投与したエキソソームの取り込み細胞について、リポソームなどの微粒子製剤の消失に関与するマクロファージに焦点を当てて検討した。蛍光標識したエキソソームを用いて検討を行った結果、投与されたエキソソームは肝臓・脾臓においてはマクロファージに、肺においては血管内皮細胞に取り込まれることを見出した。また、クロドロネート封入リポソームの投与により全身のマクロファージを除去したマウスにおいて、エキソソームの血中からの消失が著しく遅延することも見出した。以上の結果は、エキソソームの血中からの消失におけるマクロファージの重要性を示すものである。エキソソームは細胞から分泌される、粒子径30100nm程度の脂質膜から構成される膜小胞である。エキソソームはその中に内封された核酸やタンパク質を、エキソソームを取り込んだ細胞に送達することで細胞間情報伝達手段として働いていることから、small interfering RNAを始めとした核酸医薬品の安全かつ効率のよいデリバリーキャリアとなりえることが期待されている。エキソソームを用いたデリバリーシステムの開発にはその体内動態の解析と制御が必要であるが、体外から投与されたエキソソームの体内動態については不明な点が多く、その体内動態の解析方法も確立されていない。そこで本研究では、エキソソームを利用した核酸デリバリーシステムの開発を目的として、エキソソームの体内動態解析方法の開発を行った。エキソソーム移行性タンパク質であるlactadherinをレポータータンパク質であるGaussialuciferaseとの融合タンパク質(gLuc-lactadherin)とすることで、エキソソームレポータータンパク質とし、これを発現するプラスミドDNAを構築した。gLuc-lactadherin発現プラスミドDNAをマウス黒色細胞腫B16-BL6細胞にトランスフェクションした後、エキソソームを回収することで、gLuc-lactadherin標識エキソソームを調製可能であった。また、作製した標識エキソソームをマウスに静脈内投与した後、gLuc活性を指標に体内動態を解析したところ、エキソソームの血中半減期は1分程度と非常に短いこと、投与されたエキソソームは肝臓・脾臓・肺などの臓器に主に移行することが明らかとなった。これまでの検討において、エキソソームの体内動態を解析可能なシステムの開発に成功したことから、本研究はおおむね順調に進展しているものと考える。これまでに開発した体内動態解析方法は、遺伝子導入が可能な細胞に限られること、標識エキソソームが細胞に取り込まれた後に分解するとgLucの活性が消失するために、エキソソームの各臓器への蓄積を解析するには適さない、などの制限があることから、gLuc-lactadherinの組換えタンパク質の調整と、gLucのかわりに放射性同位体を用いる標識方法の開発を行う予定である。

体内動態解析方法の最適化を行った後、種々の細胞からエキソソームを回収した後に体内動態を解析し、治療に望ましい体内動態を有するエキソソームを産生する細胞の選別を行う予定である。該当なし
I型アレルギー効果相の特異的制御

1.抗原特異的IgEを持続的に産生するアレルギーのマウスモデルの作製と、このマウスにおけるアレルギー反応の解析抗DNP IgE産生ハイブリドーマを同系マウスの皮下に移植し、抗DNP IgE抗体を持続的に産生するマウスモデルを作製し、このマウスにアレルギー反応を反復惹起し、可溶化ヒトFcεRIα鎖(soluble α)による抑制効果を調べた。抗原の投与経路を変えることによって、皮膚炎、結膜炎、消火管アレルギーを惹起し、soluble αによるそれらのアレルギーの抑制効果を確認した。2.IgE結合を阻止する抗ヒトFcεRIα鎖抗体のヒト型化マウス抗ヒトFcεRIα鎖モノクローン抗体を樹立し、その中でIgE結合を阻害する抗体(CRA2)のヒト型化を行った。この抗体の認識するエピトープはC末端の免疫グロブリン相同ドメインに存在することを確認し、α鎖上のIgE結合部位がこのドメインにあることが推測された。この抗体のCDR(13)の遺伝子クローニングを行ない、ヒト型化フレームへのグラフティングを施行した。hu CRA2はヒトFcεRIを発現したトランスフェクタントやヒト好塩基球に結合し、IgE結合を阻害する。その効果はmo CRA2と同等である。一価にするためにFab断片を作製したが、このFabもIgE結合を阻害し、IgE-抗IgE抗体によるヒト好塩基球からのヒスタミン遊離を抑制した。in vivoの検定にはアカゲザルを用いたが、抗原性は殆んどなく、かつ感作したサルにおけるアレルギー性皮膚炎を効率よく制御した。さらにレセプターへの親和性を高め、有効な特異的抗アレルギー剤の開発へと結びつけたい。1.抗原特異的IgEを持続的に産生するマウスモデルの作製抗DNP IgE産生ハイブリドーマを同系マウスの皮下に移植し、抗DNP IgE抗体を持続的に産生するマウス(数10ng数μg/ml)を得た。ハイブリドーマ移植後1014日後に血清IgEはプラトーに達し、およそ68週は実験に耐える。2.アレルギー反応の反復惹起とsolubleαによるその抑制上記マウスの耳介皮膚に抗原を塗布すると、IgE特異的に耳介に腫脹を伴った皮膚炎繰り返し惹起できることを確認した。このマウスにリコンビナント可溶化FcεRIの鎖(solubleα)を投与(静注)しておくと、抗原の反復投与による繰り返す皮膚炎を阻止できることが明らかになった。さらに、抗原を点眼することによってこのマウスにアレルギー性結膜炎を惹起できるが、solubleαの点眼は、反復するアレルギー性結膜炎を抑制できた。さらに胃ゾンデを用いて抗原を十二指腸に投与すると、このマウスは下痢を来すが、それに加えて呼吸切迫、血圧低下などのアナフィラキシ-ショック症状を呈する。IgE特異的に消化管症状を始めて惹起できるモデルが確立したことになる。このマウスにsolubleαを静脈内投与しておくと、消化管症状、アナフィラキシ-ともに回避できることを証明した。3.抗ヒトFcεRIα鎖抗体のエピトープ解析とCDRの遺伝子クローニングマウス抗ヒトFcεRIα鎖モノクローン抗体を複数確立したが、この抗体はIgEと競合するグループと競合しないグループに分けられる。前者のエピトープはC末側の免疫グロブリン相同ドメインに存在し、後者のエピトープはN末側のドメインに存在することを確認した。IgEと競合する抗体をヒト型化するため、そのCDR (13)の遺伝子クローニングを完了し、ヒト型フレームへのグラフティングのための遺伝子構築を行なった。1.マウス抗ヒトFcεRIα鎖モノクロナール抗体(CRA2)の可変領域

cDNAのクローニングヒトIgEのヒトFcεRIα鎖への結合を強力に阻害する抗体(CRA2)を産生するハイブリドーマから、RT-PCRにより可変領域cDNAを合成、増幅し、配列を決定した。2.ヒト型化CRA2可変領域の設計Gen Bankデータベースより、CDR-graftingを行うのに最適と思われるヒトgermlineV、及びJ遺伝子を選択した。これらにコードされるFRとマウスCRA2抗体のCDRを組み合わせて、ヒト型化CRA2可変領域のアミノ酸配列を設計した。3.ヒト型化CRA2の発現H鎖及びL鎖のヒト型化可変領域遺伝子は、合成DNA断片をPCR法にて連結することにより構築した。これらをそれぞれ、ヒトIgG1定常領域遺伝子あるいはヒトK鎖定常領域遺伝子に連結し、発現ベクターを作製した。COS7細胞に遺伝子導入し、培養上清中の抗体活性を検討した。培養上清中にH鎖とL鎖の会合したヒト型化抗体が分泌されていることを、ELISAにて確認した。4.ヒト型化CRA2の機能、生物活性ヒト型化CRA2は、ヒトFcεRIαを発現させたCHO細胞への結合活性を有し、かつヒトIgEの結合を濃度依存的に阻害した。可溶化ヒトFcεRIα鎖を固相化したELISAにより、このヒト型化抗体の結合能を定量的に評価すると、元のマウスCRA2 moAbと同等の結合能を保持しており、ヒトIgEの結合もマウス抗体と同等に阻害することが明らかになった。ヒト型化抗体のFab断片は、抗IgE抗体による、ヒト末梢血好塩基球からのヒスタミン遊離を濃度依存的に抑制し、その活性は元のマウス抗体Fab断片より強力であった。このヒト型化抗体は、新規のIgE結合阻害剤として有望であることが確認された。昨年度までに作製したヒト型化CRA2抗体(Hu CRA2:ヒト型化した抗ヒトFcεRIα鎖抗体)を抗アレルギー剤として開発する前階段として、先ずHu CRA2・Fabの抗原性および抗アレルギー作用を霊長類を用いて検討した。各々2匹のニホンザルに5mg/kgのマウスCRA2・Fab(Mo CRA2・Fab)、またはHu CRA2・Fabを週1回、5週に亘って静脈内投与し、並行して血漿中の抗CRA2・Fab IgG抗体価をELISAにて測定した。ニホンザルにおいて、Hu CRA2・Fabに対する特異的IgG抗体は、コントロール(Mo CRA2・Fab)、に比して殆んど産生されず、ヒト型化により、CRA2・Fabの霊長類に対する抗原性が殆んど消失したことが明らかになった。したがって、ヒトに投与する場合の抗原性は殆んどないものと思われる。II.Hu CRA2・Fabの抗アレルギー作用:アカゲザルにおける検討アカゲザルをダニ抽出物とアラムで免疫し感作成立後、Hu CRA2・Fab 5mg/kgを5日/週で3週間に亘って筋肉内投与し、ダニ抽出物刺激による末梢血白血球からのヒスタミン遊離を調べた。Hu CRA2・Fabの投与期間中では、ヒスタミン遊離はほぼ100%抑制されており、このヒト型化抗体がin vivoにおいてアレルギー反応抑制効果を示すことが明らかになった。さらにダニ抗原の皮内投与による皮膚アレルギー反応に及ぼす効果を検討した。Hu CRA2・Fabを皮内投与した(抗原チャレンジの前日)部位では皮膚アレルギー反応(膨疹、出血)が濃度依存的に抑制され、即時型の皮膚アレルギー反応の抑制がサルの能動感作モデルで確認された。