hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
酸化チタン担持触媒による可視光駆動型環境浄化プロセスの研究

船舶に用いられる防汚塗料は、付着生物に対する毒性を有する防汚成分を塗料中に配合させ、塗膜表面からこれらの防汚成分が溶出することで汚損を防止する。防汚成分の中で、高い防汚活性を示す有機スズ化合物(OTCs)や重金属化合物が広く用いられてきたが、それらの生物への毒性が高いこと、中でもOTCsの問題が近年明らかとなり、世界的にも船舶塗料への使用が禁止となりつつある。しかしながら、環境中に残留した有機スズ化合物による海洋環境は、依然として続いており、OTCsの除去・分解に関する研究が、各国において精力的に行われている。OTCsの分解では、環境中において紫外線による分解が知られている。しかしながら、OTCsの分解反応は長い時間を必要とし、さらにその分解副生成物である、二置換スズ化合物および一置換スズ化合物は依然として環境毒性を有している。そこで、本研究では、酸化チタンをシリカゲルに担持させた触媒を用いた環境浄化プロセス装置を作成し、光触媒によるOTCs分解実験の検討を行った。標的のOTCsとして、トリブチルスズ(TBT)およびトリフェニルスズ(TPT)が調査された。超純水にOTCsを溶解させ、所定の濃度に調製したOTCs溶液を装置に流し、所定の期間UV照射した。GC/MS-SIM分析を行うため、サンプリング溶液に塩化ナトリウム飽和溶液、酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)を添加し、Et_4BNaによりエチル誘導体化を行った後、n-hexで抽出し硫酸ナトリウムで脱水した。OTCsのサロゲートおよびそれぞれの内部標準化合物(テトラブチルスズ、テトラフェニルスズ)により、OTCsの分解評価はGC/MS-SIMモニターイオンにより定量した。光照射に対する装置内OTCsの濃度の経時変化は、TBTの場合照射時間とともにTBT濃度は減少し、反応開始から24時間でほぼ定常となった。さらに反応開始から72時間では、TBTは90%消失した濃度に低下した。TBTの分解に伴うDBTおよびMBTの生成は、GC/MS-SIMモニターイオンから追跡したが確認できなかった。一方TPTでは、光照射160時間で分解反応を確認したが、槽内にTPTの残留が確認できた。半経験的分子軌道計算(Semi-empirical MOPAC)を用いてラジカル中間体の生成熱について計算した結果、OHラジカルより攻撃を受けたTBTおよびTPTから発生するラジカルの安定性によって、光触媒分解反応を決定することがわかった。H17年度の研究目標は、以下の通りである。1.光触媒(酸化チタン担持)の基礎データの収集および装置への最適化検討2.検討した光触媒を用いた環境浄化プロセス装置の設計および製作3.反応基質となる有機スズ化合物(OTCs)およびその類縁対の光物性データ取得に必要な分析装置の導入および分析方法の検討1.では、触媒の検討を行った。気相反応に使われる触媒は、粉体が主流であり適当な固体表面に担持した触媒は液層では使われない。しかしながら文献調査および多方面の技術者との討議の結果、球状のシリカゲルに酸化チタンを担持した光触媒を見出すことができた。粉体とは異なり触媒の最適化が容易である。それは、触媒の比表面積を増やすために、シリカゲルの細孔を増加させることができるためである。2.では、装置の設計・細かな詰めを行い、様々な試験によるマイナートラブルを克服した後、目的の装置が得られた。3.では、OTCsの化学物質濃度の経時変化を測定するために、UV-vis(紫外可視分光分析)を選択しUVデータを測定した。また、OTCsの分解評価は、ガスクロマトグラフ質量分析法(GC/MS)を用いるが、分析導入にはOTCsの誘導体化が必要であることがわかった。従来の誘導体化法は、Grignard試薬によるプロピル化が用いられているが、試薬調製および反応条件等複雑であり誘導体化が簡便ではない。そこで、GC/MSによる簡便な誘導体化法を検討した結果、Et_4BNa(テトラエチルホウ酸ナトリウム)によるエチル化法を見出した。今後は、引き続き防汚物質のOTCsの光触媒分解反応を調べ、さらに類似化合物の無害化処理技術の検討を継続する。さらに、反応光源について近紫外領域(ブラックライト)検討後、可視光(太陽光)を用いて検討を行うことを予定している。

標的のOTCsとして、トリブチルスズ(TBT)およびトリフェニルスズ(TPT)が調査された。超純水にOTCsを溶解させ、所定の濃度に調製したOTCs溶液を装置に流し、所定の期間UV照射した。GC/MS-SIM分析を行うため、サンプリング溶液に塩化ナトリウム飽和溶液、酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)を添加し、Et_4BNaによりエチル誘導体化を行った後、n-hexで抽出し硫酸ナトリウムで脱水した。OTCsのサロゲートおよびそれぞれの内部標準化合物(テトラブチルスズ、テトラフェニルスズ)により、OTCsの分解評価はGC/MS-SIMモニターイオンにより定量した。光照射に対する装置内OTCsの濃度の経時変化は、TBTの場合照射時間とともにTBT濃度は減少し、反応開始から24時間でほぼ定常となった。さらに反応開始から72時間では、TBTは90%消失した濃度に低下した。TBTの分解に伴うDBTおよびMBTの生成は、GC/MS-SIMモニターイオンから追跡したが確認できなかった。一方TPTでは、光照射160時間で分解反応を確認したが、槽内にTPTの残留が確認できた。半経験的分子軌道計算(Semi-empirical MOPAC)を用いてラジカル中間体の生成熱について計算した結果、OHラジカルより攻撃を受けたTBTおよびTPTから発生するラジカルの安定性によって、光触媒分解反応を決定することがわかった。
理工系留学生のための基礎科学教材の開発と利用に関する研究

<研究目的>1.予備教育機関に在籍する理工系留学生を対象に専門分野の考え方や基礎知識とその知識を支える日本語の体系的学習を可能にする基礎科学教材を開発することである。本研究では、既に本研究代表者を中心に開発し、使用している現行の科学教材を、日本語学習の視点から改良を加え、新たな基礎科学教材を目指す。具体的には、『留学生のための基礎科学入門【改訂版】』を開発する。2.新たな基礎科学教材の開発にあたって、以下の基礎研究を行う。1)語彙調査を行い、現行の基礎科学教材の言語的特徴(語彙・文型・漢字語彙など)を明らかにする。2)「基礎科学」の授業分析を行い、授業インタラクションの特徴や、受講生の言語習得の実態を明らかにする。3)受講生を対象としたアンケート・インタビュー調査を行い、学習方法や授業・教材の改善点を明らかにする。3.開発した教材を試用し、授業分析やアンケート調査に基づき、教材の改良を行い、よりよい学習支援につながる方法を提案する。<研究報告>1.上記2に挙げた基礎研究の研究結果に基づき、日本語初級後半レベルの理工系留学生を対象に、上記1で目標に掲げた『留学生のための基礎科学入門【改訂版】』を開発し、発行した。2.個々の研究課題に付いては、学会や論集等に発表してきた。3.上記3については、2008年6月より実施予定である。共同研究者の工藤講師が産休のため、前半は道脇のみで科学的な内容について、授業の中で問題点を拾い出した。平成18年1月に工藤講師が復帰してから言語分析等を集中的に進めた結果、次のように研究が進んだ。1.「基礎科学」の授業で使用している教材「基礎科学入門」に対して科学的な立場から問題点を指摘したが、今後の教材としての検討はまだ行っていない。2.「言語分析」は、授業で使用している「基礎科学入門」を以下の項目について、すべて計画通り作業が進み、次の段階での基礎資料として準備ができた。2-1語彙分析:1)品詞別高頻度語彙の難易度判定、2)日本語教科書との照らし合わせ、3)専門語彙の選定、4)自他動詞の抽出2-2文型分析:1)文型の機能分類、2)高頻度文型の難易度判定、3)日本語教科書との照らし合わせ2-3漢字分析:1)高頻度漢字の難易度判定、2)日本語教科書との照らし合わせ2-4談話機能分析:1)談話レベルの展開パターン化3.「基礎科学」の授業分析は、次のような研究段階にある。3-1授業インタラクション分析:基礎科学の授業のデータ収集は、工藤講師が産休のため平成18年度に行う。しかし、科研費申請前の準備段階でのデータはすでに収集済である。3-2学習上の問題点分析:1)インタビュー結果の分析(前年度分)は、研究予備段階でのデータの分析は終了した。2)アンケート調査(今年度生+卒業生)は、今年度生に対してアンケートを実施し現在分析中である。前年度分は、発送の準備中である。3)物理実験レポート・試験の分析は、今年度分の物理実験レポートのコピーを作成し、分析の準備をしているところであり、今後継続して進めていく予定である。4.学習内容の体系化および系列化は、以下の項目について、4月以降集中的に進めていく予定である。4-1学習項目の選定:1)語彙選定、2)文型選定、3)談話展開パターン選定4-2学習項目の系列化(以上)1.平成17年度に行った基礎研究、語彙や使用されている動詞の用法等の分析に基づき、平成18年度は理工系専門科目「基礎科学」の教材における言語的特徴や授業における言語活動及び言語習得の実体等を分析した。これらの結果に基づき、「基礎科学」教材の学習項目について、日本語の視点と理工系の視点から検討し、学習内容の体系化を進めた。

2.平成17年度に行った「基礎科学」の漢字語彙の分析をさらに進め、「基礎科学」の学習に効果的と思われる、学習漢字90字および漢宇語彙82語を選定した。これに基づき、「基礎科学」の漢字補助教材を開発中である。3.平成18年度の授業分析を日本語教育専門の立場からインタラクション面での問題点を明らかにした。これについて、基礎科学教育の学習活動との調整を図り、授業改善のプランを練った。4.平成18年度実施した「基礎科学」の授業アンケートを分析した。その結果、学生にとって必要なことと、指導上もとめていることや学生に与えているもののずれが確認された。それらの結果を考慮し、学生にとってさらに使いやすい補助教材(「漢字教材」「基礎科学の表現」など)の開発を進めている。また、新年度は、これら「漢字教材」や「基礎科学の表現」などの補助教材を用いて授業ができるよう、授業の準備を進めている。5.既存の基礎科学教材を改訂するために、当研究担当者等の専門以外の部分については、留学生日本語教育センターにおけるその分野の非常勤教員に依頼し、修正原稿を作成した。研究目的は、予備教育機関に在籍する理工系留学生を対象に専門分野の考え方や基礎知識及び日本語の体系的学習を可能にする基礎科学教材を開発することである。本研究では、既に本研究代表者を中心に開発し、現在使用している科学教材を、日本語学習の視点から改良を加え、新たな基礎科学教材を目指す。具体的な教材としては、『留学生のための基礎科学入門』を開発することであり、また、理工系専門分野の教材における、言語的特徴・言語活動及び言語習得の実体ならびに留学生が抱える問題点などの研究課題を明らかにするとともに、開発した教材を試用し、授業分析やアンケート調査等を基に教材の改良を行い、よりよい学習支援につながる方法を提案する。今年度は、理工系専門分野の教材における言語的特徴・言語活動及び言語習得の実体ならびに留学生が抱える問題点など、過去2年間の基礎研究の結果に基づき、開発した教材を試用し、授業分析やアンケート調査等による教材の改良を行い、当センターにおける教育を総合的に考慮した教授法を提案した。これらの研究結果を精査して、日本語初級後半レベルの理工系留学生を対象に、専門分野の考え方や基礎知識及び日本語の体系的学習を可能にする基礎科学の新たな教材として『留学生のための基礎科学入門』を開発し、発行した。個々の研究課題に付いては、学会や論集等に発表してきた。
変形性膝関節症に対するmiR-218関節内投与における軟骨細胞への機能解析

変形性膝関節症(osteoarthritis of the knee:以下OA)は軟骨変性により高齢者の生活の質を低下させ、健康寿命を脅かす代表的な疾患である。高齢化社会を迎えた現在、その罹患率は高齢化に伴い今後さらなる増加が見込まれている。予防や発症・進行の抑制が重要である。現行の治療としてはNSAIDsや非麻薬性鎮痛薬による症候改善薬や疾患修飾性OA薬があるがOAの発症や進行を抑制できる薬は現在のところない。近年、microRNA (miRNA)がOAの発症・進行に関与していると報告が散見されるようになり、様々な疾患においてその発現状態の変異が報告されており、診断マーカーや治療標的として非常に着目されている。OAにおいても、軟骨変性・炎症の程度により特徴的な発現パターンが観察され、診断や予後因子、さらには新規治療薬として研究が開始されている。miRNAは一つで複数の遺伝子発現を同時に標的とするため、破綻した生体ネットワーク全体を正常化することが期待できる。miRNAの中で、我々はOAに対する治療効果が期待できる分子としてmiR-218に着目した。我々は骨肉腫細胞株においてその発現が低下していることを確認した。さらにmiR-218の標的遺伝子にはruntrelatedtranscription factor (RUNX)、survivin、MMP-2・9等があり、OAとの関連が予想される遺伝子が複数含まれることを確認した。さらに骨肉腫細胞株MG63にmiR-218を過剰発現させるとRUNX2、survivinが遺伝子レベルと蛋白レベル両方で抑制されることを確認した。そこで本研究では今後、OAの進行、予防並びに改善のために軟骨細胞にmiR-218の過剰発現ならびに発現抑制しRUNX2を制御することでOAにおける作用機序を明らかにする。軟骨組織におけるmiR-218とRUNX2・survivinの発現量を確認するためには軟骨細胞からの十分なRNAの抽出が必要である。現在、軟骨組織採取は人工膝関節置換術の際にでる関節軟骨もしくは大腿骨頚部骨折後の骨頭よりの軟骨を採取しており順調に集まってきている。しかし、もともとこれらの軟骨組織には軟骨細胞の量が少ない。Trizol法により軟骨細胞を抽出しているが実験に使えるだけの遺伝子量ではない。そのため抽出方法を修正しながら行っている。そのため本研究はやや遅れている。現在ヒト由来の軟骨細胞株からの解析は終了した。さらにATDC5は軟骨分化の全分化段階を解析できる細胞株である。インスリン存在下にて培養すると初期軟骨細胞へと分化し、さらに培養を続けると後期軟骨分化を経て軟骨肥大細胞に分化する。このATDC5株を用いて軟骨分化誘導おけるmiR-218とRUNX2・survivinの発現量の変化を評価する。また、miR-218を遺伝子導入することによる変化量をRT-PCR,Western blotで評価していく予定である。組織よりの遺伝子抽出はTripsinにて溶解し単細胞を単離し培養する方法に変更を検討している。培養後にmiR-218の発現量を検討していく予定である。予防や発症・進行の抑制が重要であるが、発症病態は複雑なため根治的な治療法は開発されていない。本研究ではmicroRNAに注目しOAの進行、予防並びに改善のためにmiR-218を関節内に投与しRUNX2を制御することでOAにおける作用機序を明らかにすることで臨床応用につなげることを目的としている。そのため動物実験をする前に軟骨細胞レベルでの作用機序を解明する必要がある。

そこで本研究では軟骨形成におけるmiR-218とRUNX2・survivinの発現量の変化を確認するためには軟骨細胞株が必要であると考える。本研究に必要な資材、試薬はそろっていたが軟骨細胞株および軟骨細胞培養液を購入したが納期まで大幅に時間を要してしまった。そのため細胞培養を含めた実験を進めることができずにいた。また、臨床検体におけるmiR-218とRUNX2・survivinの発現量を評価するために変形性関節症群のサンプルと正常軟骨のサンプルは収集している。変形性膝関節症(osteoarthritis of the knee:以下OA)は軟骨変性により高齢者の生活の質を低下させ、健康寿命を脅かす代表的な疾患である。高齢化社会を迎えた現在、その罹患率は高齢化に伴い今後さらなる増加が見込まれている。予防や発症・進行の抑制が重要である。現行の治療としてはNSAIDsや非麻薬性鎮痛薬による症候改善薬や疾患修飾性OA薬があるがOAの発症や進行を抑制できる薬は現在のところない。近年、microRNA (miRNA)がOAの発症・進行に関与していると報告が散見されるようになり、様々な疾患においてその発現状態の変異が報告されており、診断マーカーや治療標的として非常に着目されている。OAにおいても、軟骨変性・炎症の程度により特徴的な発現パターンが観察され、診断や予後因子、さらには新規治療薬として研究が開始されている。miRNAは一つで複数の遺伝子発現を同時に標的とするため、破綻した生体ネットワーク全体を正常化することが期待できる。miRNAの中で、我々はOAに対する治療効果が期待できる分子としてmiR-218に着目した。我々は骨肉腫細胞株においてその発現が低下していることを確認した。さらにmiR-218の標的遺伝子にはruntrelatedtranscription factor (RUNX)、survivin、MMP-2・9等があり、OAとの関連が予想される遺伝子が複数含まれることを確認した。さらに骨肉腫細胞株MG63にmiR-218を過剰発現させるとRUNX2、survivinが遺伝子レベルと蛋白レベル両方で抑制されることを確認した。そこで本研究では今後、OAの進行、予防並びに改善のために軟骨細胞にmiR-218の過剰発現ならびに発現抑制しRUNX2を制御することでOAにおける作用機序を明らかにする。軟骨組織におけるmiR-218とRUNX2・survivinの発現量を確認するためには軟骨細胞からの十分なRNAの抽出が必要である。現在、軟骨組織採取は人工膝関節置換術の際にでる関節軟骨もしくは大腿骨頚部骨折後の骨頭よりの軟骨を採取しており順調に集まってきている。しかし、もともとこれらの軟骨組織には軟骨細胞の量が少ない。Trizol法により軟骨細胞を抽出しているが実験に使えるだけの遺伝子量ではない。
ゴルジ機能の体細胞遺伝変異と低比重リポ蛋白質(LDL)受容体の構造変化

チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が単離した, Na/Kイオノホア抗生物質モネンシンに対する耐性株Mon^r-31は,インスリンやウィルスに対する応答が異なっていることを報告した.本研究では,低比重リポ蛋白(LDL)に対する受容応答を, Mon^r-31とCHOに於て対比させた. Mon^r-31ではLDLに対する受容体活性がCHOの1/31/4に低下していたので, LDLレセプターの構造をその抗体を用いて解析することにした.その結果,1.^<125>I-LDLの結合活性を調べたところレセプター数はCHOとMon^r-31では差がないが,親和性が変化している.2.Mon^r-31のレセプターはCHOに較べて分子量が減少している.3.ヒトLDLレセプターのcDNAを導入したところ,そのレセプターの分子量もMon^r-31で減少している.4.LDLレセプターのN-糖鎖構造は, CHOとMon^r-31間で著明な変化がみられなかった.5.LDLレセプターのO-糖鎖をO-グリカナーゼ処理することによってCHOとMon^r-31間の分子量の差が消失した.6.この分子量の両細胞株間の差は,未成熟型では見られず,成熟型のLDLレセプターにおいてのみ観察された.以上の実験結果より, Mon^r-31においては, LDLレセプターが合成され,そのあとゴルジ装置で成熟する過程において変化を受けることが示唆された.現在,この変化したO-糖鎖構造を詳細に解析するとともに,細胞融合によって相補性グループを決定しつつある.チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が単離した, Na/Kイオノホア抗生物質モネンシンに対する耐性株Mon^r-31は,インスリンやウィルスに対する応答が異なっていることを報告した.本研究では,低比重リポ蛋白(LDL)に対する受容応答を, Mon^r-31とCHOに於て対比させた. Mon^r-31ではLDLに対する受容体活性がCHOの1/31/4に低下していたので, LDLレセプターの構造をその抗体を用いて解析することにした.その結果,1.^<125>I-LDLの結合活性を調べたところレセプター数はCHOとMon^r-31では差がないが,親和性が変化している.2.Mon^r-31のレセプターはCHOに較べて分子量が減少している.3.ヒトLDLレセプターのcDNAを導入したところ,そのレセプターの分子量もMon^r-31で減少している.4.LDLレセプターのN-糖鎖構造は, CHOとMon^r-31間で著明な変化がみられなかった.5.LDLレセプターのO-糖鎖をO-グリカナーゼ処理することによってCHOとMon^r-31間の分子量の差が消失した.6.この分子量の両細胞株間の差は,未成熟型では見られず,成熟型のLDLレセプターにおいてのみ観察された.以上の実験結果より, Mon^r-31においては, LDLレセプターが合成され,そのあとゴルジ装置で成熟する過程において変化を受けることが示唆された.現在,この変化したO-糖鎖構造を詳細に解析するとともに,細胞融合によって相補性グループを決定しつつある.
胎児胚体外組織-卵黄嚢からの新規組織幹細胞の樹立と応用

本研究課題は、1)マウス卵黄嚢(YS)幹細胞が各個体から100%精製可能な培養条件の検討、2)マウスYS幹細胞の特性解析-特に分化能と分化誘導条件、3)マウスYS幹細胞の特性解析-遺伝子発現プロブァイルとエピジェネティクス、4)ヒトYS幹細胞が各個人から100%精製可能な培養条件の検討、5)ヒトYS幹細胞の特性解析-特に分化能と分化誘導条件、6)ヒトYS幹細胞の特性解析-特に遺伝子発現プロファイルとエピジェネティクス、の解明を目的とした研究である。その結果、1)出生時に不用となる胚体外組織のYSおよび尿膜(AM)細胞からの組織幹細胞の樹立に成功した、2)YS幹細胞の妊娠中期の胚体外組織への移植によりキメラAM形成に成功した、3)YSおよびAM細胞では、細胞増殖因子であるKlf4やc-Myc遺伝子が常時発現していた。以上の結果から、YSおよびAM細胞は再プログラム化に感受性が高く人工多能性幹(iPS)細胞を効率よく樹立できるのではないかと仮定し、YSおよびAM細胞からのiPs細胞の樹立と効率の解析を行った。その結果、1)マウスYsおよびAM細胞からiPS細胞樹立に成功した、2)樹立頻度は高く、成体体細胞からの10倍以上であった、3)マウスiPS細胞は生殖系列キメラ形成能があり幹細胞品質が確認された、4)ヒトAM細胞からも高い頻度でips細胞が樹立された、5)ヒトiPS細胞の多分化能が奇形腫(テラトーマ)形成能から示された。ヒトおよびマウスAM細胞のiPS細胞化高感受性は、Klf4やc-Mycに加えて、内在的なRonin等の未分化関連遺伝子の発現に起因すると考えられt。出生児に廃棄される胚体外組織であるが、個人の組織幹細胞やiPS細胞の細胞源として貴重な医療資材である事を示した。この成果は、Genes to Cells (2009)に発表した。1.マウス新生児卵黄嚢(YS幹細胞)および尿膜(AM幹細胞)の幹細胞を濃縮した。E18.5胎児の帝王切開時に回収された、卵黄嚢および尿膜細胞をコラーゲン分解酵素処理後に培養した。複数種の細胞が出現し、繊維芽細胞様細胞の上に、接着性の弱い幹細胞が出現し増殖した。卵黄嚢および尿膜細胞で同様に得られたYSおよびAM幹細胞は150日以上の長期培養が可能であった。2.マウスYSおよびAM幹細胞の成長因子等の添加因子を含めて培養条件の最適化を検討した。YSおよびAM幹細胞株をbFGF、LIF存在有無の組み合わせにより、細胞増殖を基準に培養条件の最適化を行った。3.マウスYSおよびAM幹細胞の多分化能を培養条件下または生体内で検討した。樹立されたYSおよびAM幹細胞株のいくつかは、129/Rosa26トランスジェニックマウス由来のため、X-gal染色により青く染め出される。これらの細胞をE13.5日齢胚の尿水中に注入し、E18.5齢胚卵黄嚢および尿膜のX-gal染色により解析した。幹細胞の卵黄嚢細胞の正常発生への寄与能が明らかになった。培養条件下では分化誘導により神経細胞への分化が確認され、培養皿の中で神経ネットワーク状の高次構造を形成し、分化能が確認された。免疫抑制マウスの皮下にYSおよびAM幹細胞を注入し、8週後に摘出解析したが、テラトーマの形成は確認できなかった。4.マウスYSおよびAM幹細胞の凍結保存の最適化条件を検討した。
難治性不整脈症候群におけるゲノム上の非翻訳領域の役割と機序の解明

Brugada症候群、特発性心室細動、QT延長症候群等の致死性不整脈の多くは、心筋に発現するイオンチャネルやその共役タンパクの遺伝子のタンパク翻訳領域やその近傍に位置するイントロン内の変異を原因とすることが知られている。そのため、不整脈症候群の症例に対し、通常行われている遺伝子解析はタンパク翻訳領域を対象とすることが多い。しかしながら、これらの遺伝子のタンパク翻訳領域に変異が同定されないことも多い。我々は、Brugada症候群、特発性心室細動、洞不全症候群、心房細動、早期再分極症候群等の不整脈症例に対し、心筋の主要なナトリウムチャネルのαサブユニットをコードするSCN5A遺伝子のプロモーター領域、転写因子結合領域のシークエンシングを行い、数種類のrare variantを同定した。これらのうち数種類のvariantの機能解析を行い、いずれのvariantも野生型に比し機能低下を引き起こすことを報告した。次世代シークエンスの手法を用いて、不整脈や心筋症等の原因遺伝子のタンパク翻訳領域および心筋の主要なイオンチャネル(ナトリウムチャネル、カリウムチャネル)の非翻訳領域の解析を同時に行うことのできるアッセイを作成し、不整脈症候群の症例に対し遺伝子解析を行った。タンパク翻訳領域にアミノ酸置換を伴う変異が同定された症例を除外し、各々のイオンチャネルのプロモーター領域に同定された変異について機能解析を施行した。現在までに解明されている致死性不整脈症候群の原因の多くは、心筋に発現しているイオンチャネルやその関連蛋白のアミノ酸置換を伴う遺伝子変異であり、ほとんどは蛋白の翻訳領域に存在している。しかし、蛋白翻訳領域はゲノム全体の1%程度を占めるに過ぎず、また、近年、転写はされるが蛋白に翻訳はされない非コードRNAにも蛋白の翻訳を調節する働きがあることが明らかにされてきた。不整脈症候群において、非翻訳領域の変異が疾患の原因であるとの報告は現在までない。我々は既に、洞不全症候群、心臓伝導障害、Brugada症候群、心房細動、早期再分極症候群、特発性心室細動等種々の不整脈症候群において、心筋に豊富に発現しているナトリウムチャネルの遺伝子であるSCN5Aプロモーター領域、転写因子結合部位のシークエンシングを行い、いくつかのrare variantを同定している。これらは不整脈のないコントロール群では同定されておらず、また、rare variantの頻度はコントロール群に比べ不整脈症例で有意に高かった。また、これらのrare variantのうちのいくつかについて、レポーターアッセイを用いてプロモーター活性をwild typeと比較したが、いずれのvariantにおいてもその活性は低下しており、ナトリウムチャネルの発現を減少させることが考えられた。非翻訳領域の変異が不整脈発症に重要な役割を果たすと考えられ、現在は次世代シークエンスの手法を用いた広範囲のイオンチャネルの非翻訳領域のシークエンシングを行っている。全ゲノムあるいは全エクソンを対象とした次世代シークエンスでは、疾患の原因である遺伝子変異の他に、疾患とは無関係の多数の変異が同定される。このことから、我々は心筋に発現するイオンチャネルやその機能修飾蛋白、それらの転写因子や転写調節因子に焦点を当てた独自の次世代シークエンスのアッセイを構築し、遺伝子検索を行ってきた。ここに、さらに種々の不整脈の原因遺伝子であるナトリウムチャネルやカリウムチャネルの非翻訳領域を含めた新たなアッセイを構築し、集積した140例ほどの不整脈症候群や不整脈を伴う重症心筋症の症例のサンプル調整が終了している。致死性不整脈症候群の原因の多くは心筋に発現するイオンチャネルやその関連タンパクのアミノ酸置換を伴う遺伝子変異であることが知られている。これまで報告されている遺伝子変異は、アミノ酸に翻訳される領域あるいはその近傍に位置するイントロン内の変異がほとんどである。蛋白の翻訳領域は全ゲノムの1%程度に過ぎず、また、転写はされるものの蛋白に翻訳されない非コードRNAにも蛋白の翻訳を調節する働きをするものがあることが知られている。現在、不整脈症候群に対して行われている遺伝子検査の多くは、蛋白翻訳領域のみを検索の対象としており、非翻訳領域を対象とした報告は多くない。我々は、心房細動、Brugada症候群、洞不全症候群、早期再分極症候群、特発性心室細動等の不整脈症例において、心筋のナトリウムチャネルのαサブユニットをコードしているSCN5A遺伝子のプロモーター領域、転写因子結合領域のシークエンシングを行い、数種類のrare variantを同定している。これらのrare variantはコントロール症例では同定されておらず、また、コントロールに比較してrare variantの頻度は不整脈症例で有意に高かった。これらのvariantのうちいくつかでプロモーター活性を測定したところ、いずれのvariantもwild typeに比べ活性が低下していた。これらの結果から、非翻訳領域の変異が不整脈発症に重要な役割を果たすと考えられる。現在、次世代シークエンスの手法を用いて、種々の不整脈の原因遺伝子である主要なイオンチャネルの非翻訳領域のシークエンシングを行っている。翻訳領域にアミノ酸置換を来す変異を有しない症例において、非翻訳領域のvariantを検索している。全ゲノムあるいは全エクソンを対象とした次世代シークエンスでは、対象とする疾患と無関係のvariantも多数同定される。このことから、我々は心筋に発現するイオンチャネルやその関連タンパク、心筋の分化に関連する転写因子や転写調節因子、マイクロRNA等に的を絞った次世代シークエンスのアッセイを構築した。このアッセイに、種々の不整脈症候群に共通する主要な原因遺伝子であるナトリウムチャネルやカリウムチャネルの非翻訳領域を含めた新たなアッセイを構築した。すでに140例あまりの不整脈症候群症例および重症心筋症症例においてシークエンシングを施行している。

翻訳領域の遺伝子変異の確認を行い、アミノ酸の置換等を引き起こす変異が同定されない症例において、非翻訳領域のvariantを同定していく。QT延長症候群、Brugada症候群等の致死性不整脈の多くは、心筋に発現するイオンチャネルやその共役タンパクの遺伝子のタンパク翻訳領域やその近傍に位置するイントロン内の変異を原因とすることが知られている。タンパク翻訳領域は全ゲノムの1%程度に過ぎない。近年の報告では、転写はされるが蛋白に翻訳されない非コードRNAにもタンパクの翻訳を調節する機能があるとされている。不整脈症候群の症例に対し、通常行われている遺伝子解析は、タンパク翻訳領域を対象とすることが多い。しかし、これらの遺伝子のタンパク翻訳領域に変異が同定されないことも多い。我々は、Brugada症候群、特発性心室細動、洞不全症候群、心房細動、早期再分極症候群等の不整脈症例に対し、心筋の主要なナトリウムチャネルのαサブユニットをコードするSCN5A遺伝子のプロモーター領域、転写因子結合領域のシークエンシングを行い、数種類のrare variantを同定した。これらのうち数種類のvariantの機能解析を行い、いずれのvariantも野生型に比し機能低下を引き起こすことを報告した。次世代シークエンスの手法を用いて、不整脈や心筋症等の原因遺伝子のタンパク翻訳領域および心筋の主要なイオンチャネル(ナトリウムチャネル、カリウムチャネル)の非翻訳領域の解析を同時に行うことのできるアッセイを作成し、不整脈症候群の症例に対し遺伝子解析を行っている。これらの遺伝子のタンパク翻訳領域に変異が同定されない症例に対して、イオンチャネルの非翻訳領域のrare variantの同定を行い、プロモーター活性の測定を行う。タンパク翻訳領域に同定されたrare variantの機能変化については、SIFTやPolyPhen-2等を用いて機能予測を行っているが、さらに新たな文献等も参照し、実際に疾患の原因となるかどうかを予測し、症例の除外を行っている。この作業に予想外の時間を要している。Brugada症候群、特発性心室細動、QT延長症候群等の致死性不整脈の多くは、心筋に発現するイオンチャネルやその共役タンパクの遺伝子のタンパク翻訳領域やその近傍に位置するイントロン内の変異を原因とすることが知られている。そのため、不整脈症候群の症例に対し、通常行われている遺伝子解析はタンパク翻訳領域を対象とすることが多い。しかしながら、これらの遺伝子のタンパク翻訳領域に変異が同定されないことも多い。
泡沫向流クロマトグラフィーの実用化に関する研究

泡沫向流クロマトグラフィー(Foam countercurrent chromatography:Foam CCC)は,水と窒素ガスのみで向流を行わせ,生成する泡沫によって化合物を分離させる手法である.本手法は非常に穏やかな条件下で化合物の分離・精製を行なうことができ,なおかつ生成する泡沫中に目的成分を濃縮することができる.そこで著者らは不安定で微量な天然有機化合物の濃縮・分離に有効ではないかと考え,その実用化を目的とし基礎実験を実施した.1)どのような物理化学的性質を有した化合物がFoam CCCへ適用できるかの判定基準の検討.試料が生成する泡沫の物理化学的性質を表わす指標として泡沫形成性,泡沫安定性を測定し,Foam CCCへの適用性を検討したところ,試料の泡沫形成性が1以上,泡沫安定性が250分以上であるならば安定したFoam CCCによる濃縮が行なえることが判明した.2)泡沫形成能の満たない試料を適用するための手法の検討.界面活性剤と有機溶媒を添加する方法を試み,その挙動を考察した結果,界面活性剤の添加により,Foam CCCを適用することのできなかった試料も安定して泡沫を溶出させ,成分の濃縮を行なうことができた.また有機溶媒を添加する方法も泡沫形成性を増大させることができ,後述するリサイクル法の際に有効な手段であることが判明した.3)天然有機化合物の成分分離を目的とした試料導入法の改良.従来の成分分離法の欠点を改良したリサイクル法を考案し,大量の溶液中の起泡性試料の濃縮と分離が同時に行なえるようになった.ペプチド系抗生物質バシトラシン,有毒ラン藻および生薬セネガ末抽出物に適用したところ,目的成分が泡沫分画中に選択的に分離・濃縮されていることが判明した.本手法は泡沫安定性が低い試料に対しても適用できるため,天然有機化合物の分離・濃縮に幅広く応用できるものと考えられる.泡沫向流クロマトグラフィー(Foam countercurrent chromatography:Foam CCC)は,水と窒素ガスのみで向流を行わせ,生成する泡沫によって化合物を分離させる手法である.本手法は非常に穏やかな条件下で化合物の分離・精製を行なうことができ,なおかつ生成する泡沫中に目的成分を濃縮することができる.そこで著者らは不安定で微量な天然有機化合物の濃縮・分離に有効ではないかと考え,その実用化を目的とし基礎実験を実施した.1)どのような物理化学的性質を有した化合物がFoam CCCへ適用できるかの判定基準の検討.試料が生成する泡沫の物理化学的性質を表わす指標として泡沫形成性,泡沫安定性を測定し,Foam CCCへの適用性を検討したところ,試料の泡沫形成性が1以上,泡沫安定性が250分以上であるならば安定したFoam CCCによる濃縮が行なえることが判明した.2)泡沫形成能の満たない試料を適用するための手法の検討.界面活性剤と有機溶媒を添加する方法を試み,その挙動を考察した結果,界面活性剤の添加により,Foam CCCを適用することのできなかった試料も安定して泡沫を溶出させ,成分の濃縮を行なうことができた.また有機溶媒を添加する方法も泡沫形成性を増大させることができ,後述するリサイクル法の際に有効な手段であることが判明した.3)天然有機化合物の成分分離を目的とした試料導入法の改良.従来の成分分離法の欠点を改良したリサイクル法を考案し,大量の溶液中の起泡性試料の濃縮と分離が同時に行なえるようになった.ペプチド系抗生物質バシトラシン,有毒ラン藻および生薬セネガ末抽出物に適用したところ,目的成分が泡沫分画中に選択的に分離・濃縮されていることが判明した.本手法は泡沫安定性が低い試料に対しても適用できるため,天然有機化合物の分離・濃縮に幅広く応用できるものと考えられる.1泡沫向流クロマトグラフィ-の試料濃縮特性の解明モデル化合物としてバシトラシン、クチナシ黄、アシッドレッドおよびロ-ズベンガルを使用して、有栓メスシリンダ-中で各種の試料濃度の水溶液を振盪し、メスシリンダ-内で生成した泡末と水溶液の容積比および泡沫の消失時間を、それぞれ泡沫形成性および安定性を表すパラメ-タ-とした。これらのパラメ-タ-と泡沫向流クロマトグラフィ-の結果を比較したところ、泡沫形成性としては泡沫/水溶液の容積比が1前後、泡沫安定性としては消失時間250分以上を有する試料が泡沫向流クロマトグラフィ-に適用可能であることが判明した。さらに、メスシリンダ-内で生成した泡沫中の試料濃縮率は泡沫向流クロマトグラフィ-における濃縮率と十分な相関性があることが認められた。2泡沫向流クロマトグラフィ-の分離特性の解明1と同様のモデル化合物を用いて検討を行ったところ、泡沫形成性が大きくそして安定性の長い化合物が泡沫向流クロマトグラフィ-により分離される傾向が認められたが、詳細に付いては現在検討中である。3泡沫向流クロマトグラフィ-と小型泡沫分離器の相関性の検討内径1.5cm、長さ30cmのガラス管を用いて小型泡沫分離器を作製し、1と同様のモデル化合物を使用して泡沫向流クロマトグラフィ-との相関性を検討したところ、濃縮特性において十分な相関性が認められた。

4藍藻の生産する有毒成分の単離精製への応用上記1から3の研究結果を踏まえて最適化した分離条件により藍藻の水抽出物の泡沫向流クロマトグラフィ-を実施したところ、通常のHPLC条件では検出不可能な低極性成分が得られた。1泡沫向流クロマトグラフィーの分離特性の解明モデル化合物としてバシトラシンおよびクチナシ黄を使用して、種々の条件下で泡沫向流クロマトグラフィーを実施したところ、極性の低い成分が完全に泡沫と溶液に分離される条件が存在することを見いだした。現在、詳細については検討中である。2泡沫向流クロマトグラフィーと小型泡沫分離器の相関性の検討内径1.5cm、長さ30cmのガラス管を用いて小型泡沫分離器を作製し、1と同様のモデル化合物を使用して泡沫向流クロマトグラフィーとの相関性を検討した。小型泡沫分離器中の液層の厚さを2cmに、窒素ガスの流速を20ml/minに設定したときに発生する泡沫の高さと泡沫向流クロマトグラフィーにおける濃縮効率を比較したところ、泡沫が25cmとなるような試料溶液が最も効率の良い結果を与えることが判明した。3藍藻の生産する有毒成分の単離精製への応用藍藻の水抽出物の泡沫向流クロマトグラフィーを実施したところ、溶血性を有すると考えられる微量成分が特異的に泡沫中に濃縮されたが、詳細については現在検討中である。4界面活性剤を用いた泡沫向流クロマトグラフィーの分離および濃縮特性の解明モデル化合物としてバシトラシンを使用し、イオン性あるいは非イオン性界面活性剤を用いた泡沫向流クロマトグラフィーを実施した。泡沫向流クロマトグラフィーを適用できないような低濃度においても、イオン性界面活性剤を用いることにより効率的な試料の濃縮が認められた。詳細については、現在検討中である。泡沫向流クロマトグラフイー(Foam countercurrent chromatography;Foam CCC)は,水と窒素ガスのみで向流を行わせ,生成する泡沫によって化合物を分離させる手法である.本手法は非常に穏やかな条件下で化合物の分離・精製を行なうことができ,なおかつ生成する泡沫中に目的成分を濃縮することができる.そこで著者らは不安定で微量な天然有機化合物の濃縮・分離に有効ではないかと考え,その実用化を目的とし基礎実験を実施した.1)どのような物理化学的性質を有した化合物がFoamCCCへ適用できるかの判定基準の検討.試料が生成する泡沫の物理化学的性質を表わす指標として泡沫形成性,泡沫安定性を測定し,FoamCCCへの適用性を検討したところ,試料の泡沫形成性が1以上,泡沫安定性が250分以上であるならば安定したFoamCCCによる濃縮が行なえることが判明した.2)泡沫形成能の満たない試料を適用するための手法の検討.界面活性剤と有機溶媒を添加する方法を試み,その挙動を考察した結果,界面活性剤の添加により,FoamCCCを適用することのできなかった試料も安定して泡沫を溶出させ,成分の濃縮を行なうことができた.また有機溶媒を添加する方法も泡沫形成性を増大させることができ,後述するリサイクル法の際に有効な手段であることが判明した.3)天然有機化合物の成分分離を目的とした試料導入法の改良.従来の成分分離法の欠点を改良したリサイクル法を考案し,大量の溶液中の起泡性試料の濃縮と分離が同時に行なえるようになった.
C型肝炎難治例の薬剤耐性変異及びウイルス排除後肝発癌に関連する遺伝要因の解明

1つ目の課題である、ソホスブビル/レディパスビル(SOF/LDV)治療不成功例における耐性変異の検討についての検討。SOF/LDV治療不成功例におけるDAA再治療については、グレカプレビル/ピブレンタスビル(GLE/PIB)投与症例において、現在実臨床で全国多施設で治療成績データを収集中である。NS5B領域の207T+218S+316N変異株を有する症例のレプリコン解析ではSOF耐性を認めなかったが、NS5A領域のLDV耐性を有する症例でも実臨床ではGLE/PIBの治療効果は良好である。2つ目の課題である、ウイルス排除後の肝発癌検討について、昨年度から引き続きSVR症例のゲノムを全国多施設から収集中である。我々はIFNベース治療でSVR後発癌に寄与する因子としてTLL1 (rs8099917)遺伝子多型を報告したが、IFNフリーDAA治療でSVR24を達成した約1100例においてTLL1遺伝子多型の解析を行った。DAA治療前、ウイルス学的著効(SVR24)時点における臨床データと遺伝的要因を合わせて検討すると、DAA治療終了後1年以降の初発肝癌の検討では、SVR24時点におけるAFP、Fib4、TLL1 AT+TT群がSVR後初発肝癌の有意なリスク因子であった。またTLL1 (rs8099917) AT+TT群ではAA群に比べ優位に累積発癌率が高かった。さらにFib4、AFP、TLL1を組み合わせることで、発癌高リスク群を効率に囲い込みが可能と思われた。この結果については、JDDW2018、AASLD2018での報告を行った。またJ Gastroenterol. 2019Apr;54(4):339-346.に論文報告した。1つ目の課題である、SOF/LDV治療不成功例における耐性変異の検討について、DAA治療不成功例における実臨床での再治療成績については2019年5月の日本肝臓学会総会で発表を予定している。また2つ目の課題であるSVR後発癌に寄与する因子の検討についても順調にゲノム収集が進んでいる。TLL1遺伝子多型について、IFNフリーDAA治療でSVR24を達成した約1100例においてTLL1遺伝子多型の解析を行った。DAA治療終了後1年以降の初発肝癌の検討では、TLL1 (rs8099917) AA群ではAT+TT群に比べ優位に累積発癌率が高く、2018JDDWで報告するとともに、J Gastroenterol. 2019 Apr;54(4):339-346.に論文報告した。SOF/LDV治療不成功例における耐性変異の検討について。SOF/LDV治療不成功例は実臨床では2017年に使用可能となったグレカプレビル/ピブレンタスビル療法がおこなわれることが多いが、この治療不成功例のウイルス学的検討などを行い、HCV患者の効率的な治療法選択に役立てることを目標とする。DAA治療症例におけるウイルス排除(SVR)後肝発癌に関わる検討では、IFN治療によるSVR後発癌と同様にTLL1遺伝子多型の関連を認めた。DAA治療後も肝予備能が悪化する症例があり、今後はそれらの遺伝的要因を臨床データと合わせて解析予定で、SVR後に肝発癌や肝予備能低下する恐れのある症例の囲い込みについて検討する予定である。またさらに得られた知見を日本肝臓学会、日本消化器病学会、アメリカ肝臓学会(AASLD)、アジア肝臓学会(APASL)などでの報告を目指している。1つ目の課題である、SOF/LDV治療不成功例における耐性変異の検討についての検討。ウイルス再燃時の患者血清から、HCV-RNAを抽出し、相補的DNA (cDNA)作成。このcDNAを鋳型としてNS5B領域のPCRを行い、ダイレクトシークエンス法にて塩基配列を決定し、NS5B A207T/A218S/C316Nの塩基配列を有するPCR産物と治療成功例のNS5B A207/A218/C316の塩基配列を有するPCR産物をBglIIで処理してLigation、大腸菌を形質転換させてそれぞれのクローンを10コロニーほどピックアップ、ミニプレップ後で増幅後、プラスミド精製。その後このNS5Bの配列をBglII fragmentをCon1レプリコンに挿入した。Huh7細胞をG418存在下に3週間培養し、NS5B A207T/A218S/C316Nの塩基配列とNS5B A207/A218/C316の塩基配列を有するレプリコンRNAを複製した。変異株は野生株と同程度にSOFによる複製能低下を認め、またSOFのEC50は野生株305.6nM、変異株181.3nMと変異株は野生株と同程度であった。2つ目の課題である、ウイルス排除後の肝発癌検討について、現在順調にSVR症例のゲノムを全国多施設から収集しており、現在約1700例収集している。我々はIFNベース治療でSVR後発癌に寄与する因子としてTLL1 (rs8099917)遺伝子多型を報告したが、約1100例においてTLL1遺伝子多型の解析を行った。ウイルス排除後観察期間

中央値が93週(約2年)と短いため、累積発癌率には現在有意差は認めないものの、TLL1 (rs8099917) AA群ではAT+TT群に比べ治療前、治療後とも血小板が高くFib4が低値、また治療前M2BPGiが高値であり、AT+TT群は線維化進行例が有意に多かった。1つ目の課題である、SOF/LDV治療不成功例における耐性変異の検討について、NS5B変異株のレプリコン解析が終了した。治療不成功例の患者血清から抽出したHCV-RNAで多く認めた207T+218S+316N変異変異株のレプリコン解析を行った。SOFにより207T+218S+316N変異変異株は野生株と同様に複製は低下し、またEC50も同程度であり、207T+218S+316N変異変異株はSOF耐性に否定的であった。この結果については、JDDW2017で発表をおこなった。またDAA治療不成功例におけるNS5A変異、NS5B薬剤耐性変異に関して、日本肝臓学会総会、抗ウイル療法学会総会にて発表を行った。また2つ目の課題であるSVR後発癌に寄与する因子の検討についても順調にゲノム収集が進んでいる。現在1700例ほどのゲノム検体を収集している。また臨床データの収集にも取り組んでいる。今後はさらにゲノム収集症例数を増やして、臨床データと合わせて、IFNベース治療でSVR後発癌に寄与することが報告されたTLL1遺伝子多型について、DAA治療例におけるTLL1遺伝子多型と発癌率や治療後の肝線維化改善率など検討を予定している。1つ目の課題である、ソホスブビル/レディパスビル(SOF/LDV)治療不成功例における耐性変異の検討についての検討。SOF/LDV治療不成功例におけるDAA再治療については、グレカプレビル/ピブレンタスビル(GLE/PIB)投与症例において、現在実臨床で全国多施設で治療成績データを収集中である。NS5B領域の207T+218S+316N変異株を有する症例のレプリコン解析ではSOF耐性を認めなかったが、NS5A領域のLDV耐性を有する症例でも実臨床ではGLE/PIBの治療効果は良好である。2つ目の課題である、ウイルス排除後の肝発癌検討について、昨年度から引き続きSVR症例のゲノムを全国多施設から収集中である。我々はIFNベース治療でSVR後発癌に寄与する因子としてTLL1 (rs8099917)遺伝子多型を報告したが、IFNフリーDAA治療でSVR24を達成した約1100例においてTLL1遺伝子多型の解析を行った。DAA治療前、ウイルス学的著効(SVR24)時点における臨床データと遺伝的要因を合わせて検討すると、DAA治療終了後1年以降の初発肝癌の検討では、SVR24時点におけるAFP、Fib4、TLL1 AT+TT群がSVR後初発肝癌の有意なリスク因子であった。またTLL1 (rs8099917) AT+TT群ではAA群に比べ優位に累積発癌率が高かった。さらにFib4、AFP、TLL1を組み合わせることで、発癌高リスク群を効率に囲い込みが可能と思われた。この結果については、JDDW2018、AASLD2018での報告を行った。またJ Gastroenterol. 2019Apr;54(4):339-346.に論文報告した。1つ目の課題である、SOF/LDV治療不成功例における耐性変異の検討について、DAA治療不成功例における実臨床での再治療成績については2019年5月の日本肝臓学会総会で発表を予定している。TLL1遺伝子多型について、IFNフリーDAA治療でSVR24を達成した約1100例においてTLL1遺伝子多型の解析を行った。
実験的高血圧症における中枢性カテコーラミンの研究

腎血管性高血圧を片側腎動脈にクリップをかけることによりラットに作製した。高血圧の急性期には視床下部のノルエピネフリン含量は低下していたが、橋部のそれは正常レベルを示した。高血圧の慢性期(腎動脈狭窄作製13週以降)には、上記の部位におけるノルエピネフリン、ドーパミン含量に高血圧ラットと正常血圧ラットに有意差はなかった。高血圧慢性期に腸間膜動脈、精巣動脈、大動脈、心臓の血管収縮タンパク質の代謝を検索した。ラットに0.4μC/gの^3H-プロリンを投与し、上記の動脈中のコラージェン、非コラージェン蛋白質、エラスチンへの^3H-プロリンの取り込みを測定すると、高血圧の慢性期動物の腸間膜動脈、精巣動脈の非コラージェン蛋白質、コラージェンへの^3H-プロリンの取り込みが、正常血圧ラットのそれに比し、著しく亢進しており、血圧と取り込みとの間に正の相関も観察された。フェノキシベンザミンを投与すると、高血圧動物の血圧は下降し、腸間膜動脈、精巣動脈の非コラージェン蛋白質、コラージェンへの^3H-プロリンの取り込みは減少した。したがって二腎性高血圧の急性期には視床下部のノルエピネフリンの含量の低下が、レニン・アンジオテンシンの亢進とともに昇圧に強く関与している事が推測された。同じタイプの高血圧でも慢性期には上記の血管作動性物質はあまり高血圧の維持に関与せず、むしろ比較的小さな動脈の非コラージェン蛋白質、コラージェンの代謝が亢進して血管抵抗を高め、高血圧を保つのに関与していると推測された。
徐放化増殖因子による改良骨再生法の開発と再生骨組織(結晶配向性)の評価

申請者は、ウサギ長管骨の骨欠損モデルなどの動物実験を中心として、細胞増殖因子製剤の徐放および細胞分化制御因子(遺伝子)の制御(siRNA核酸)徐放製剤の開発・改良を進めてきた。とくに、骨の新生・増殖を顕著に促進させることが明らかとなっている増殖因子(BMP2)を主体としたゼラチンハイドロゲルによる徐放システムに関して、再生皮質骨に対する生体アパタイト配向生や骨密度を中心とするボーンクオリティ評価を行った。これは、微小領域X線回析装置やpQCT,microCTなどの計測機器による客観的数値化によるクオリティ評価であり、臨床応用を前提とするモノである。その結果、骨再生能力(速度や形態)は対照群との比較において著しく改善が認められるが、再生骨の真の強度を反映する長軸方向のハイドロキシアパタイト結晶配向性に着目すると、従来の骨再生の指標であった骨密度計測(BMD)の快復期間より、治癒期間の後期になって配向性回復がおこることが明らかとなった。つまり、これは、臨床的強度の回復が、見かけより遅れることを示唆するものであり、顎骨再建、とくに、インプラント埋入・上部構造再建時期の決定に関しては、結晶配向性を指標とした、骨再生評価系が必須であるといえる。よって、臨床的に有用な評価系構築の主体として、本実験で使用した微小領域X解回析装置の有効利用と更なる改善を進めてきた。また同時に、今後の老齢化社会社会を見据えて、老齢者の骨質変化に関して、分子生物学的メカニズムとハイドロキシアパタイト結晶配向性の相関・制御機構の解析にも着手している。特に、単独遺伝子による結晶配向性の制御は、今後の老齢者の骨質改善や骨再生に必須の基礎生物学的研究であることから、エイジングの代表的制御因子の一つである、KLOTHOに着目し、ノックアウトマウスの大腿骨の骨質解析を行い、骨密度・結晶配向性ともに著しい低下を示すデータを得た(論文発表in press)。今後、その他の制御因子の解析を追加して結晶配向性の制御メカニズムを解明し、骨再生等の治療へ生かす研究が必要になっていくと思われる。申請者は、ウサギ長管骨の骨欠損モデルなどの動物実験を中心として、細胞増殖因子製剤の徐放および細胞分化制御因子(遺伝子)の制御(siRNA核酸)徐放製剤の開発・改良を進めてきたが、システムの更なる改良点が明らかとなった。具体的には、まず、従来から胸骨再生や歯槽骨再生補助として臨床治験が進められている(京都大学医学部付属病院および大阪大学歯学部付属病院)bHLHを主体としたゼラチンハイドロゲルによる徐放システムに関して、再生皮質骨を中心とする生体アパタイト配向生や骨密度を中心とするボーンクオリティ評価を行った。これは、微小領域X線回折装置やpQCT, DEXA, microCTなどの計測機器による客観的数値化によるクオリティー評価であり、臨床応用を前提とするモノである。その結果、骨再生能力(速度や形態)に関して改善が必要と判断されたため(詳細データ省略)、引き続き、BMP2などの強力な骨誘導物質の導入や、骨形成を左右するosteoblast, osteoclastの機能制御遺伝子群(カルシウムシグナル伝達遺伝子)の導入と解析を進行中である。また、ハイドロキシアパタイト結晶の配向性を測定する方法を簡便化に関し、従来より微小な骨サンプルで対応可能であり、なおかつ、十数ミクロン単位での結晶構造(配向性)の解析が可能である、X解回折装置の開発が可能となった。これをうけて、より単純化した解析方法を検討していく予定である。また、臨床応用を視野に入れ、工学研究者などの専門家以外(具体的には、医療従事者、検査技師など)が操作可能で、非浸襲的検査法の開発が重要であるとの観点から、試料となる骨の正確な裁断などの手間が不必要で骨表面からの簡便な解析が可能なX解回折装置を企業と共同開発中である。

特に、単独遺伝子による結晶配向性の制御は、今後の老齢者の骨質改善や骨再生に必須の基礎生物学的研究であることから、エイジングの代表的制御因子の一つである、KLOTHOに着目し、ノックアウトマウスの大腿骨の骨質解析を行い、骨密度・結晶配向性ともに著しい低下を示すデータを得た(論文発表in press)。今後、その他の制御因子の解析を追加して結晶配向性の制御メカニズムを解明し、骨再生等の治療へ生かす研究が必要になっていくと思われる。