hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
「集団」状況の知覚が個人の認知・判断変容に及ぼす影響―リスク・物質・表情認知―

本研究の目的は、集団状況がリスクテイク判断や、物質量の認知、表情認知についての影響を調べるものである。当該年度は物質量の認知について実験をおこなった。集団場面と個人場面では物質量の認知に関しては明らかな違いはみられなかった。また、これまでの研究成果について、第59回日本社会心理学会、作業療法神経科学研究会第4回学術集会、Society for Personality and Social PsychologyおよびRIKEN summer program、にて発表をおこなった。全体的な結果を総括すると、当初集団の影響を想定していたが、本研究成果によって、即時で作られた実験場面での集団の効果よりも、自己に深く関わる他者の影響が個人の判断に影響を及ぼすことが明らかとなった。さらに、リスクテイク判断については、特定の他者と親密な関係を持つ人ほど、報酬獲得に際しリスキーな選択肢をとることが示された。また、相互協調的自己観の影響は見られず、自己拡張理論に基づいたInclusion of Other in the Self (IOS) Scaleにおいてのみ個人の判断に影響していた。これらの結果から、Mere belonging(他者の存在によりパフォーマンスや動機づけが高まる)といったポジティブな影響は、集団カテゴリといった認知プロセスではなく個人と特定の他者や集団のコミュニティとの情緒的な繋がりがその背景にあると示唆された。具体的内容本研究の目的は、集団状況におけるリスク判断および重量や表情の認知変容について明らかにすることである。平成27年度は、リスク判断を取り上げ、2つの実験をおこなった。第一実験では、実験室に4名から5名の参加者に来てもらい、集団らしさ(凝集性)を高めた上で、リスク判断課題をおこなってもらった。集団らしさは、全員一致の揃いの羽織を着用し、また討論を全員でおこなうという手続きにより操作された。リスク判断課題は、「当たれば賞金がもらえる10種類のくじ(当たる確率は低いが、賞金額は高いリスキーなくじから、当たる確率は高いが賞金額は低いコーシャスなくじまで10の選択肢がある)」、「はずれを引くと罰金を払わねばならない10種類のくじ(はずれをひく確率は低いが、罰金額は高いリスキーなものから、当たる確率は高いが賞金額は低いコーシャスなものまで10の選択肢がある)」を選ぶ2種類を設定した。第二実験では、15名程度の大集団を対象とした。集団らしさを高める方法としては、揃いのレイ(首飾り)をつけてもらう手続きをとった。討論などはおこなわなかった。第一実験および第二実験において、個人でリスク判断をおこなう状況下での選択肢との比較がなされた。実験によるデータ収集を2回おこなうことにより、信頼性の高いデータを得ることができたと考えられる。本研究により、個人の認知が集団状況においてどのように変化するか、そのプロセスが示唆された。計画どおり、リスク判断に関する研究を進めることができたため、概ね順調との評価とした。また複数実験を重ねることで、第一実験のデータの信憑性を高めることができた。集団らしさの操作に関しては、さらに改良する必要があったので平成28年度中の研究課題としたい。本年度は、昨年度おこなったリスク課題(報酬と罰、それぞれにおいて、獲得・損失の高いものから低いものについての選択を、集団状況及び個人状況でおこなう)、について追加実験をおこなった。併せて、昨年度実施された3つの実験についてのデータ分析、および各実験結果の解釈について、他大学の研究協力者も交えて検討した。そこでは、本研究では集団状況における認知・行動変容を対象としているが、集団状況で喚起される心理状態は、友人や家族、恋人といった親密な関係における心理状態と同一なものか否かを考慮する必要性が指摘された。また、本研究の理論的基盤である、集団状況における認知的枠組みの変容に関わる実験研究について国内研究会、海外学会で発表、情報収集、論文執筆をおこなった。研究成果発表を通して、集団が個人にとっての意義が文化によって異なる可能性が考えられた。また、この点を含め、前年度おこなわれた実験結果を踏まえ、さらに新たな実験条件(完全に個人単独で実験室でリスク課題の選択をする)を設定した追加実験をおこなうこととした。この実験では、1.これまで実施された環境とは違い、単独状況であること、2.その参加者にとって集団がどのような意味をもっているか、例えば集団主義か否か、についてを考慮することとした。これまで個人条件では、周囲に人がいるものの、相互作用をしない状況を設定し、集団条件では相互作用をし、おそろいのユニフォームを着るという状況を設定していた。1に関しては、実験室に単独で来てもらい、回答することで、集団条件との差別化を図ることが狙いである。この条件設定によるデータ収集を、次年度もおこなう予定である。当初の予定通り、初年度はリスク判断課題についてデータ収集を実施した。そして続いて今年度は、研究内容や、昨年度の研究成果について、国内研究会で発表をおこなうことができた。また、本研究の理論的基盤である関連研究とその成果について、海外学会での発表を行い、本課題研究についての情報収集、他の研究者との意見交換の機会を得た。それにより、実験設定の発展だけでなく、データの理論的解釈を進めることが可能となった。研究協力者の意見を取り入れることで、今後の研究の発展が見込まれた。物質認知に関するデータを収集することはできなかったが、実験場所を確保し、実施の準備自体は行えたため、おおむね順調に進展していると判断する。本年度は、昨年度得られたリスク認知に関する成果の信頼性を高めるため、さらに追加実験を実施した。

併せて、昨年度得られた成果を、日本社会心理学会にて発表をおこなった。海外学会Society for Personality and Social Psychologyにも参加し、研究成果を論文にて発表する際の情報収集もおこなった。表情認知については、実験ではなく調査での実施とした。これまで実施してきた実験結果から、リスク認知に関しては、実験的に作られた集団状況だけでなく、日常的な対人関係も視野にいれた研究が有益であることが示唆された。そのことから、調査法を用いて、親密な他者との関係性とリスク認知との関連をさらに調べることが重要であると考えられた。Prospect theoryで報酬と損失の非対称性について明らかにされているが、本研究で明らかとなった成果にも、報酬と損失で影響の違いがみられた。次年度に研究成果を発表予定である。また、これまでの研究では、リスクテイク判断について、「ゲーム大会で賞金が当たり、その賞金の金額を決めるくじをひく」「ゲーム大会で罰金を支払わねばならないことになり、その罰金額を決めるくじをひく」といった場面想定をしてもらった上での判断指標としていたが、より自分自身の利益に関連するような実際の選択場面を実験にて設定する可能性も考えられる。申請時の計画通り、リスク認知から研究をスタートしたため、相対的に他の2変数より進行している状況である。表情認知と物質量認知に関しては研究手法の変更はあったものの、研究開始の時期を考慮すると遅れているともいえないため、おおむね順調との評価とした。本研究の目的は、集団状況がリスクテイク判断や、物質量の認知、表情認知についての影響を調べるものである。当該年度は物質量の認知について実験をおこなった。集団場面と個人場面では物質量の認知に関しては明らかな違いはみられなかった。また、これまでの研究成果について、第59回日本社会心理学会、作業療法神経科学研究会第4回学術集会、Society for Personality and Social PsychologyおよびRIKEN summer program、にて発表をおこなった。全体的な結果を総括すると、当初集団の影響を想定していたが、本研究成果によって、即時で作られた実験場面での集団の効果よりも、自己に深く関わる他者の影響が個人の判断に影響を及ぼすことが明らかとなった。さらに、リスクテイク判断については、特定の他者と親密な関係を持つ人ほど、報酬獲得に際しリスキーな選択肢をとることが示された。また、相互協調的自己観の影響は見られず、自己拡張理論に基づいたInclusion of Other in the Self (IOS) Scaleにおいてのみ個人の判断に影響していた。
カルシウムイオン輸送と共役ネットワーク

本研究の目的は,Ca^<2+>イオンを中心とした輸送系タンパク質群の構造とその共役ネットワークを酵母(Saccharomyces cerevisiae)を用いて明らかにすることである.前年度までに,酵母の性フェロモンによって誘導されるCa^<2+>の流入に欠損をもつ突然変異株mid1およびCa^<2+>の受容に欠損をもつと考えられる突然変異株mid2の解析を行い,MID1遺伝子産物(Mid1p)は種々のイオンチャンネルの膜貫通ドメインと相同な領域をもつこと,およひMID2遺伝子産物(Mid2p)は動物のalpha-ラクトアルブミンのCa^<2+>結合領域と相同な領域をもつことを明らかにしている.本年度は,Mid1pの細胞内局在部位と機能ドメインの同定,およびMid2pのCa^<2+>結合能の研究を行った.その結果,Mid1pは形質膜に貫通して存在すること,およびMid1pのC-末端ドメインは栄養増殖には必要ないが,性フェロモンの作用を受けたときのCa^<2+>流入に重要であることを明らかにした.Mid1pは既知のイオンチャネルと相同性はないが,唯一その膜貫通ドメインが他のイオンチャンネルの膜貫通ドメインと相同であることから,Mid1pは形質膜上でCa^<2+>チャネルの構成成分またはレギュレータとしてはたらくものと考えられる.Mid2pは大腸菌で大量生産し,部分精製し,^<45>Ca^<2+>を結合することを示した.前年度に,Mid2p遺伝子は多コピーでも低コピーでもmid1変異を抑圧できるが,MID1遺伝子はたとえ多コピーでもmid2変異を抑圧できないことを示している.したがって,Mid2pはMid1pによって流入したCa^<2+>を受け取る機能を果たしていると考えられる.本研究の目的は,Ca^<2+>イオンを中心とした輸送系タンパク質群の構造とその共役ネットワークを酵母(Saccharomyces cerevisiae)を用いて明らかにすることである.前年度までに,酵母の性フェロモンによって誘導されるCa^<2+>の流入に欠損をもつ突然変異株mid1およびCa^<2+>の受容に欠損をもつと考えられる突然変異株mid2の解析を行い,MID1遺伝子産物(Mid1p)は種々のイオンチャンネルの膜貫通ドメインと相同な領域をもつこと,およひMID2遺伝子産物(Mid2p)は動物のalpha-ラクトアルブミンのCa^<2+>結合領域と相同な領域をもつことを明らかにしている.本年度は,Mid1pの細胞内局在部位と機能ドメインの同定,およびMid2pのCa^<2+>結合能の研究を行った.その結果,Mid1pは形質膜に貫通して存在すること,およびMid1pのC-末端ドメインは栄養増殖には必要ないが,性フェロモンの作用を受けたときのCa^<2+>流入に重要であることを明らかにした.Mid1pは既知のイオンチャネルと相同性はないが,唯一その膜貫通ドメインが他のイオンチャンネルの膜貫通ドメインと相同であることから,Mid1pは形質膜上でCa^<2+>チャネルの構成成分またはレギュレータとしてはたらくものと考えられる.Mid2pは大腸菌で大量生産し,部分精製し,^<45>Ca^<2+>を結合することを示した.前年度に,Mid2p遺伝子は多コピーでも低コピーでもmid1変異を抑圧できるが,MID1遺伝子はたとえ多コピーでもmid2変異を抑圧できないことを示している.したがって,Mid2pはMid1pによって流入したCa^<2+>を受け取る機能を果たしていると考えられる.
天敵カブリダニの長期低温保存による生物的防除への効率的利用

天敵資材を有効に利用するためには、生産過程における増殖方法の開発だけでなく、生産された天敵資材をより有効に利用現場(農業生産現場)まで運搬する事が求められる。運搬過程の天敵死亡率が高ければ、増殖効率がいくら高くても実用価値は低減される。本研究の究極的な目的は、重要害虫であるハダニ類の有力天敵であるミヤコカブリダニとチリカブリダニを材料として、その運搬を低温下で行う事により(餌も必要無くなり)死亡率を抑えて、利用効率を上げるための技術を開発するものである。その基礎的資料として、ミヤコカブリダニの各種低温条件・湿度・餌条件下での生存と増殖のパフォーマンスを実験条件下で観察した。その結果、5-10°C、100%湿度の条件で雌成虫は長期生存(2ヶ月以上)し、その後の産卵にも影響が認められなかった。また、餌質を向上させる(休眠型のハダニ雌成虫を貯蔵前に供試)事によって、この耐性はより向上し、80%のカブリダニ雌成虫が2ヶ月半以上の生存率であった。一方、チリカブリダニでも5°C下で6週間の貯蔵が可能で、貯蔵後の悪影響(生存や産卵)もなかった。長期貯蔵期間中のカブリダニは、低温と低湿度(体水分のロス)によって大きな傷害を受けるが、同時に餌不足による飢餓にもさらされる。しかし、この栄養不足は貯蔵前の餌種(栄養も含めて)の工夫によって改良の可能性が考えられた。そこで、貯蔵前に種々の餌種を与える事による貯蔵中・貯蔵後のミヤコカブリダニのパフォーマンスを観察した結果、脂質と炭水化物を多く含む餌種を事前摂食した雌成虫は、生存率や産卵率が高いことが分かった。これらの結果は、今後の天敵資材の利用形態の改良に結びつく知見であり、現場における今後の天敵利用技術に活かすことが出来る。26年度が最終年度であるため、記入しない。天敵資材として既に市販もされているミヤコカブリダニの、販売目的で輸送する際におけるロスを最小限に抑えるための研究を進めた。低温で輸送すると、輸送対象の雌成虫の死亡率が低減され、常温に復帰後の産卵率の低減も見られない事は既知でもあったが、これに加えて低温高湿条件を確保するとその後のパフォーマンスは更に向上した。さらに、実験的に低温高湿に移す前の栄養条件を変えるため、休眠ハダニ、非休眠ハダニ、ナシ花粉をそれぞれ与えたミヤコカブリダニ雌成虫を低温高湿で75日間した後、雌成虫の生存率、産卵能力、子孫の生存率を観察した。その結果、休眠ハダニを食した後に低温高湿を経験した区で最もよい雌成虫のパフォーマンスが得られた。今後の天敵資材利用に有用な情報が得られた。さらに、本種の低温に対する生理生態的反応を詳しく観察するため、種々の前処理の後に雌成虫を-10°C環境下に2時間隔離して生存率などを解析した。常温から低温に急に移した場合に比べて、まず5°Cに1時間入れて慣らし、その後に低温に移すと生存率は2%以下から75%まで改善された。この処理に加えて、異なる温度の順化や、各発育ステージでの生存率なども観察した。これらの結果は、天敵資材として異なる環境に突然移される本種の利用の際に有用な情報であると思われた。これらの結果も含めて、H25年度には4報の学術論文(全て国際誌)と3回の学会発表(1つは国際会議)として情報公開がなされた。研究の進展のみでなく、学術誌や学会発表

(国際会議も含めて)も数量ともに充実した実績を残せた。現段階で特段の支障は起こってない。研究設備もほぼ整備され、研究環境には不備は生じてない。今後の研究方向は、ここまでに得られた生態的情報を物質レベルで検証する研究に方向性を進めている。
奥行き知覚・面知覚の座の解明:側頭葉経路の役割

網膜像のずれ(両眼視差)から、われわれは「輪郭や面の奥行き」と「物体の面構造」を知ることができる。われわれは最近、形・色・模様を処理している側頭葉経路の下側頭葉皮質(IT野)やその前段であるV4野の多くの細胞が両眼視差に感受性を持つことを見出した。本研究では、側頭葉経路の両眼視差感受性細胞が果たす機能をあきらかにする目的で細かい奥行きを弁別する課題遂行中のサルのIT野単一細胞の示す反応を解析し、奥行き弁別閾値近辺における神経細胞の反応の変動とサルが示す奥行き判断の変動の間の相関を送信者特性解析法(SOC解析)を用いて解析した。この相関値はchoice probablity(CP)と呼ばれ、CP=1は細胞活動から100%の確率で動物の弁別行動(本研究の場合、眼球を右または左に動かすことで、視覚対象が奥に見えたか手前に見えたかをサルが答える)を予測できることを示し、CP=0.5はそのような予測がまったくたたないことを意味する。IT野細胞の中にはCP=0.8を越す細胞があり、0.5から有意に異なるCPを示す細胞は半数以上を占めた。検査した細胞集団全体(61個)の平均値は0.56であった。この値は小さいものではなく、たとえば、MT野の細胞が視覚対象運動弁別課題において示す値に匹敵している。以上の結果は、IT野細胞が、視覚対象物の奥行き方向の精細な位置づけに関わっていることを示唆している。MishkinとUngerleider(1982)が頭頂葉経路が視覚対象の位置を、側頭葉経路が視覚対象の同定を担うと唱えた大脳皮質の機能構成に関する2分法は、最も厳密な意味においては、成立していないことを本研究の結果は示している。
森林における細根現存量とその回転速度についての研究

森林生態系の養分循環の機構解明において、地下部での細根の現存量、成長量、枯死量などからの細根動態の重要性が指摘されている。本研究は、ヒノキ人工林における細根動態の解明を目的として行われた。野外研究は40年生のヒノキ人工林において行われた。調査地において3年間にわたり細根の現存量の測定を行った。研究期間の3年間に以下の項目を検討し、最終年度に調査結果のまとめを行い、ヒノキ人工林での細根動態の様式を明らかにした。1.細根測定の方法論の検討地下部分の細根を定量的に推定するための方法論の検討を行った。細根は、土壌の表層に分布しており、地点間での分布は比較的均一であった。この結果をもとにして、調査地内から断面積25cm^2で深さ24cmの土壌コアーを採集し、洗い流し方により細根の現存量を測定した。この結果は、今吉、武田、岩坪(1991)年に示した。2.細根の現存量の季節変化ヒノキ人工林において、細根の現存量の変化を3年間にわたり測定した。細根の現存量は、季節的な変化、年次的な変化を示した。2年間での細根現存量の測定値から、現存量の平均は3.9トン/haと推定された。3.細根の回転速度の推定細根は、地上部の葉のように成長の様式を観察できないので、間接的な方法により細根の回転速度を推定した。細根の回転速度は、現存量、枯死量、生長量から推定できる。細根の枯死量は、リターバックに細根をいれて時間に伴う重量から推定した。以上の野外でのヒノキ細根の現存量、分解量測定の結果をもとにして、ヒノキ細根の純生産量、土壌への細根有機物量の供給量、細根の回転速度を推定した。森林生態系における細根の現存量の測定するための調査区を,京都市の比叡山ヒノキ40年生の人工林に設定した.1991年4月から毎月,調査区から土壌ホ-フ-を用いて土壌を採集し,実験室において水洗法により細根(1mm以下;1mm以上)を選別した,現在までに,7ケ月にわたる細根の現存量の季節変化を調査した。これまでの調査結果から,次の結果が得られた.1〕ヒノキの細根は、直径により1mm以下の微細根と1mm以上の細根に区別される.細根のうち重量で1mm以下の微細根の占める割合は、6070%であった.また各々のサイズの細根の現存量は,0.831.3t/na,(細根1mm以上),23t/na(1mm以下の細根)と推定された。2〕土壌における細根の垂直分布を検討した.これまでの調査で,細根の現存量は,土壌とともに減少し,表層から10cmの深さに80%近くの細根が分布していた。ヒノキ細根の分布様式から,ヒノキが土壌表層の土壌養分を利用していることが示唆される.3〕ヒノキの根もとからの距離と細根の現存量の変化を検討した結果,細根は、土壌において水平的に比較的均一に分布することがわかった.現在,ヒノキ人工林における細根調査を継続して行っている.今年度の調査の開始前に、過去に同じ調査地で測定したヒノキ細根の季節変化についての結果をまとめて報告した.細根の現存量とともに,現在,リタ-バッグ法により細根の分解速度を測定している.

1.京都市近郊のスギ,ヒノキ人工林に細根調査のプロットを設定し、1991年4月1993年3月まで、約2年間にわたり細根の現存量の測定を行ってきた。毎月、調査地において土壌ボーラーを用いて土壌を採集し、土壌中の細根を水洗法によりとり出した。細根は、直経別に区別し、微細根と細根にわけて各々の重量を風乾後に測定した。2.ヒノキ人工林での細根の現存量は、2年間を通して一定であり、細根の大部分は、地表05cmの表層に分布していた。3、ヒノキ人工林にリターバックを設置し、細根の分解速度を調ベた。4.ヒノキ天然生林に1992年3月、調査プロットを設定し、土壌中における細根の微細分布を新しく考察した土壌断面法を用いて調査した。ヒノキ天然生林では、細根は土壌堆積腐植層に分布しており、特に上層に多く分布していた。現存量は7.1A/haであった。新しく考察した土壌断面法により、土壌堆積腐植層における細根の分布様式と細根の生死の判別を明にした。土壌において細根は、形態をもとにして1)、新しい細根,2)枯死した細根3)枯死し分解した細根に区別できた。この方法を用いて、細根の生死の割合を推定することができた。今後、この方法を用いて細根の季節変化から、細根の出生死亡を推定することの可能性が示された。本年度は、1992年度から1994年度までの野外調査結果の解析を行った。1.現存量の推定:2年間の細根の現存量の季節変化の結果から、年平均の細根現存量、細根の生産の季節変化、細根の枯死の季節変化を明らかにした。ヒノキ細根の現存量は、明瞭な季節変化を示さないこと、年間での現存量の安定性が明らかとなった。2.細根の枯死分解速度の測定:野外での細根の枯死、分解の速度をリタバック方法を用いて推定した。2年間の分解実験から分解速度は1年目に高く、分解に伴い低下することが明らかとなった。3.細根の養分含有量の季節変化:細根の現存量測定結果と細根の養分分析から、細根の養分物質の現存量を測定した。養分物質として、窒素、リン、カリ、マグンシュム、カルシュムを測定した。4.細根の分解にともなう養分量の変化:分解に伴っての細根の炭素、窒素、リン、カリ、マグネシュウム、カルシュムの現存量の変化を測定した。窒素では、窒素の不動化、動化時期が明らかにされた。以上のこれまでの2年間の野外での細根現存量と養分分析の結果をもとにしてヒノキ人工林における細根動態にともなっての養分物質、有機物、炭素の動態を解析し、報告書として総括した。
ベンガル・デルタの農林生態系アリ群集：インドと東南アジアのアマルガム解明

本研究は、バングラデシュでの農林生態系のアリ相の解明を目的とし、特にツムギアリの系統生物地理について重点的に研究を行った。ツムギアリは熱帯アジアからオーストラリア北部にかけ分布し、本研究以前にはミトコンドリアDNAから7グループに区別され、バングラデシュからは東南アジア型個体群のみが知られていた。本研究ではバングラデシュ全域の64県中47県より90コロニー以上を解析し、その結果バングラデシュの個体群は、西部ではインド型、東部では東南アジア型が優勢で、中央部で混成することが明らかになった。このことは寒冷期に南方に避難した個体群がその終了により北進し、ベンガルデルタで再び会合したためと思われる。本研究はバングラデシュでの農林生態系のアリ相およびツムギアリを対象とする系統生物地理の解明を目的とし、南アジアにおけるアリ類の群集生態学および進化生物学的な知見の進展に貢献するものである。2014度はバングラデシュでの農林生態系モニタリング調査地の選定とツムギアリ(Oecophylla smaragdina)のサンプリングおよびDNA分析を計画した。特に本年度はツムギアリの系統生物地理を明らかにすることに焦点をあてて、2014年11月に中央部(ダッカ管区)と東部(シレット管区など)を調査した。予備調査として2014年3月に実施した西部(クルナ管区とラジュシャヒ管区)からのサンプルとあわせ、6管区(Division)、20県(District)、36郡(ウポジラ)からの39コロニーについてミトコンドリアDNAのCOIとCytbを解析した。西部、およびダッカ管区の一部についての分析結果から、これらの地域のツムギアリはすべてインド型個体群であることがわかった。従来バングラデシュの個体群は東南アジア型として報告されており、この発見はこれまでの記録とは一致しない。しかし、2014年11月の調査によるサンプルでは、北東部のシレット管区や南東部のコックスバザールの個体群は東南アジア型であり、中央部ダッカ管区では、インド型と東南アジア型が混在することを見出した。つまりバングラデシュでは、西部はインド型、東部は東南アジア型、中央部では両者が混在していることが明らかとなった。以上より当初に仮説の一つとして予想していた両タイプのガンジス川境界説およびジャムナ川境界説は成立しないこととなるが、メグナ川流域についてはなお詳しい調査が必要である。なお、西部のクルナ、ラジュシャヒ、およびダッカ管区の一部についての分析結果は、2014年9月の日本昆虫学会第74回大会で口頭にて発表した。ベンガル・デルタは大部分が農耕地で、河川の氾濫による冠水の影響をうける低平地である。また一方で、生物地理学上インド亜区とインドシナ亜区の要素が混成している地域といわれる。本研究は、バングラデシュでの農林生態系のアリ相およびツムギアリを対象とする系統生物地理の解明を目的とし、南アジアにおけるアリ類の群集生態学および進化生物学的な知見の進展に貢献するものである。これまでに、熱帯アジアからオーストラリア北部にかけて広く分布するツムギアリに注目し、そのmtDNAのCOIとチトクロームbから区別される東南アジア型個体群とインド型個体群の混成状況の解明を中心に進めてきた。平成27年度までにバングラデシュの33県(District)より70コロニーをサンプリングした。系統分析やネットワーク分析などにより、バングラデシュではインド型と東南アジア型の2タイプが見られること、西部ではインド型個体群が優勢であること、東部では東南アジア型個体群が優勢であること、中央部では両者が混成することを明らかにした。さらにmtDNAにもとづく系統樹での分岐年代推定を行ったところ、バングラデシュに分布するツムギアリでのインド型と東南アジア型の分化は550万年前、インド型内では220万年前、東南アジア型内では130万年前に多様化したと推定された。これらの多様化はバングラデシュ内で生じたというよりも、より南方のレフュージアで分化したものが最終氷期以降の温暖化に伴いバングラデシュへと分布を広げたものと推定される。なお、あわせて熱帯アジアに広く分布するツムギアリ属の分類学的な整理もおこない、南アジアと東南アジアでの構成種の要素を明らかにした。バングラデシュでは、政情不安や「イスラム国」の活動などにより、渡航の制限、もしくは渡航は可能ではあるものの、地方での調査の制限などの状況にある。そのため、本研究の共同研究者による現地調査はほとんどできなかった。しかしながら、その代替的方法として、同国より留学生として研究代表者の緒方の下で博士課程に在籍中の大学院生が渡航し調査を実施した。大学院生とはいえ、現地を熟知していることもあって、サンプリングは順調にすすめることができた。この成果に基づき、バングラデシュにおけるツムギアリのミトコンドリアレベルでのインド型/東南アジア型の分布状況がおおむね明かとなった。ツムギアリは樹上営巣性のアリで、熱帯アジアからオーストラリア北部にかけて広く分布する。これまで、そのmtDNAのCOIとチトクロームbから区別される東南アジア型個体群とインド型個体群の混成状況の解明を中心に進めてきた。2016年度はバングラデシュの中央北部のマイメンシン地域のサンプリングを行い、それまでのデータと合わせて総計で37の県(District)より82コロニーを解析した。

バングラデシュのツムギアリ個体群はミトコンドリアから2つのタイプ、インド型と東南アジア型に区分され、西部ではインド型個体群が、東部では東南アジア型個体群がそれぞれ優勢であることを明らかにしているが、両者は明確な境界線によって区分されているのではなく、中央部では混成する。このことから、バングラデシュでは、インド型と東南アジア型の交雑が行われていると推定される。また、2016年度は核DNAによる解析も行った。従来の研究から核DNAはsmaragdina Aとsmaragdina Bが区別されており、smaragdinaAタイプはインドシナ半島を中心に分布する個体群に見られる。分析の結果、バングラデシュ東部のモロビバザールとフェニのサンプルで、ミトコンドリアでは東南アジア型を示すものの核ではインド等に見られるsmaragdinaBタイプを示すという事例が見つかった。このことは、インド型と東南アジア型の交雑を示唆している。そこで交雑をより詳しく解析するためにマイクロサテライトを用いた分析にも着手した。2016年7月にダッカで深刻なテロ事件が発生し日本人が被害者となった。この後、外務省からはバングラデシュへの渡航の制限が出されており、共同研究者らによる現地調査はほとんどできなかった。しかしながら、同国より留学生として研究代表者の緒方の下で博士課程に在籍中の大学院生に調査を依頼し、マイメイシンでのサンプリングはすすめることができた。これまでのサンプルによるDNA分析は順調に推移している。また、2016年9月には米国フロリダで開催されて国際昆虫学会で、これまでの研究成果の一部をポスターとして発表したが、本研究に関心をよせる海外の研究者と協議することができた。現在、成果の一部は国際誌に投稿中。本研究は、バングラデシュでの農林生態系のアリ相およびツムギアリを対象とする系統生物地理の解明を目的とし、南アジアにおけるアリ類の群集生態学および進化生物学的な研究の進展に寄与するものである。ツムギアリは樹上営巣性のアリで、熱帯アジアからオーストラリア北部にかけて広く分布する。これまで、mtDNAのCOIとチトクロームbから区別されるインド型個体群と東南アジア型個体群とのバングラデシュにおける分布状況の解明を中心に進めてきた。2017年度はバングラデシュの北部のラングプール地域のサンプリングを行い、それまでのデータと合わせて同国全域にわたる47県(District)より総計で90コロニー以上を解析した。その結果、バングラデシュのツムギアリ個体群は、西部ではインド型が、東部では東南アジア型がそれぞれ優勢であることが明確に示された。両者は明確な境界線によって区分されているのではなく、バングラデシュ中央部では混成する。そこで、インド型と東南アジア型の交雑の有無を解析するためにマイクロサテライトを用いた解析を試みたが、本研究期間内に有用なマーカーは見出すことはできていない。ただし、核DNAのLWRhのハプロタイプによる解析からは、バングラデシュ東部のサンプルの中に、ミトコンドリアでは東南アジア型を示し核ではインド等に見られるタイプを示すという事例が見つかった。
microRNAから見た早期大腸癌におけるリンパ節転移に関わる分子基盤の研究

粘膜下層浸潤癌(SM癌)では、約10%にリンパ節転移がみられ、所属リンパ節郭清を伴う外科手術が必要となる。我々は、これまでにSM癌のリンパ節転移に関与する組織形態学的特徴を研究してきた経験から、様々な癌のバイオマーカーとなり得ることが期待されているmiRNAに注目した。本研究では、miR-31, miR-21, miR-200c, miR-143について、SM癌を対象としてその発現と形態学的特徴を解析した。miR-31, miR21は非腫瘍と比較して腫瘍において発現レベルが亢進していることが明らかとなった。miR-31は大腸発癌早期に癌化に関わっている可能性がある。本研究は、早期大腸癌(大腸SM癌)における浸潤・転移に関与するmiRNAの発現解析を行い、その分子病理学的特性を明らかにすることを目的としている。今年度は、大腸SM癌の病理組織標本(HE標本)50例をレビューし、形態学的な特徴を検討した。腫瘍の大きさ、発育様式、組織型、浸潤部の粘膜筋板状態、深達度、浸潤距離、脈管侵襲、簇出、腫瘍間質の線維化、浸潤先進部のリンパ球浸潤の程度、リンパ節転移の有無などを観察し、これらの結果からSM癌の病理組織学的なデータベースを作成した。さらに、大腸SM癌50例を対象として、病理組織切片から、非腫瘍部、腫瘍部を取り分け、miRNAを抽出した。浸潤・転移に関与すると考えられるmiRNA (miR-31, miR-21, miR-200family,miR-143)の発現を定量的RT-PCR法により評価たところ、miR-31およびmiR-21は、腫瘍において有意に発現レベルが上昇していることを明らかになった。本邦では、大腸癌が死因の上位を占め、大腸癌に対する最適な治療法を確立することが重要な課題となっている。現在、進行大腸癌に対する主たる治療法は手術療法および術後補助化学療法であり、粘膜内癌に対する治療法は内視鏡的切除術である。その間の深達度に位置する粘膜下層浸潤癌(SM癌)では、約10%にリンパ節転移がみられ、所属リンパ節郭清を伴う外科手術が必要となるが、90%の症例は内視鏡的切除術による根治が期待される。我々は、大腸SM癌の手術材料322例の病理標本を臨床病理学的に検討し、粘膜筋板完全破壊型の浸潤や簇出に着目した新しいリンパ節転移予測診断基準を提案した(Tateishi et al. Mod Pathol 2010)。さらに、分子病理学的な研究としてmicroRNA発現の解析に着目した。大腸SM癌の腫瘍部、非腫瘍部のパラフィン切片からmicroRNAを抽出し、定量的RT-PCR法により発現レベルを評価した。腫瘍化、浸潤、転移に関与することが報告されているmiR-31, miR-21, miR-200c, miR-143について検討し、miR-31, miR-21が腫瘍において発現が高いことを明らかにした。miR-31については、microdissection法により、非腫瘍、腺腫、癌に分けて検討し、腺腫の段階でmiR-31発現レベルが上昇し、SM浸潤する癌はさらに発現が高くなっていることが判明した。以上より、miR-31は大腸癌の腫瘍発生およびその進展に関わる因子と考えられることを報告した(Tateishi et al. Pathol Int 2015)。microRNA抽出の困難症例が多く、予定よりも検討できた症例数が少ない。固定標本の状態により、遺伝子の変性が強いものが混在していると考えられるが、条件検討を進めてきた。更に症例を追加して検討する予定である。病理学昨年度の結果に、さらに症例を追加し、子病理学的、組織形態学的特徴とmiRNA発現の相関を解析する。その結果から、高悪性度な大腸SM癌に特徴的な発現を示すmiRNAを明らかにする。当該研究室で以前に購入していた試薬で実験材料の多くをまかなうことができたため。RNA抽出キット、リアルタイムPCRで使用するプライマー・試薬、ISHのプローブなどを購入する。
ミトコンドリア病治療への基礎的及び臨床的研究

1.microplatereader(MPR)を用いた酵素活性測定法は少量の検体量、大量の検体処理等の利点がありミトコンドリア機能検査への応用が期待される。(1)筋組織から分離精製したミトコンドリアからMPRを用いて電子伝達系複合体II-IIIに続きI、IV測定法を開発した。(2)血液より分離した血小板からMPRを用い、複合体II-III、IVの測定法を開発した。MELASにおいて、卒中様症状出現時、complex IV低下を認め、DCA治療により改善と認めた。2.ミトコンドリア病患者、健常者から血小板、白血球を分離精製し液体窒素保存し約500検体を蓄積した。また、細胞培養におけるミトコンドリア活性化の検討を目指し、ミトコンドリア病患者の繊維芽細胞培養を、蓄積している。また、ρ^o細胞を用いた9176変異のcell lineを確立した。4.ミトコンドリア脳筋症へのクレアチン経口投与を臨床的に検討しMELAS患者に有効な結果を得た。3.PCRを用いてミトコンドリアDNA(mtDNA)のpoint mutation、deletationを検討を目指し、np3243,8344,8356,9176変異の同定をした。MELASの血小板mtDMAを検討し、卒中様症状時と回復期で3243変異率に変化がないことを確認した。現在、正常対象の酵素活性を測定し再現性を検討している。複合体I測定法は検討中である。又、ミトコンドリア脳筋症での複合体各酵素活性を測定中である。(3)MPRを用いて血清free,total carnitine(Car)および血小板free Car測定法を開発した。Car欠損症の症例にL-Carを急性期、回復期に点滴静注投与し、急性期には血小板free Carの上昇が認められずcarnitine transporterの障害が示唆された。Reye-like症候群の急性期にも血小板free Carは低下しておりcarnitine transporterの障害が示唆された。今後、ミトコンドリア障害の症例のCar測定法を行う予定である。ミトコンドリア病患者、健常者から血小板、白血球を分離精製し液体窒素保存し約200検体を蓄積している。更に蓄積予定である。また、細胞培養におけるミトコンドリア活性化の検討を目指し、ミトコンドリア病患者の繊維芽細胞培養を蓄積している。今後、ミトコンドリア活性化の検討のため、培養細胞におけるミトコンドリア機能評価をNMR specrometer、ミトコンドリア電子伝達系酵素、およびCar測定など用いて確立する予定である。1. microplatereader(MPR)を用いた酵素活性測定法は少量の検体量、大量の検体処理等の利点がありミトコンドリア機能検査への応用が期待される。

2.ミトコンドリア病患者、健常者から血小板、白血球を分離精製し液体窒素保存し約400検体を蓄積している。更に蓄積予定である。また、細胞培養におけるミトコンドリア活性化の検討を目指し、ミトコンドリア病患者の繊維芽細胞培養を蓄積している。今後、ミトコンドリア活性化の検討のため、培養細胞におけるミトコンドリア機能評価をミトフンドリア電子伝達系酵素、およびCar測定など用いて確立する予定である。1.microplatereader(MPR)を用いた酵素活性測定法は少量の検体量、大量の検体処理等の利点がありミトコンドリア機能検査への応用が期待される。(1)筋組織から分離精製したミトコンドリアからMPRを用いて電子伝達系複合体II-IIIに続きI、IV測定法を開発した。(2)血液より分離した血小板からMPRを用い、複合体II-III、IVの測定法を開発した。MELASにおいて、卒中様症状出現時、comploex IV低下を認め、DCA治療により改善と認めた。2.ミトコンドリア病患者、健常者から血小板、白血球を分離精製し液体窒素保存し約500検体を蓄積している。更に蓄積予定である。また、ρ°細胞を用いた9176変異のcell lineを確立しつつある。3.PCRを用いてミトコンドリアDNA(mtDNA)のpoint mutation、deletationを検討を目指し、本年度は、np3243,8344,8356,8993変異の同定を修得した。MELASの血小板mtDMAを検討し、卒中様症状時と回復期で3243変異率に変化がないことを確認した。更に蓄積予定である。
歯エナメル質生体EPR被曝線量測定装置の開発

1測定環境からのノイズを軽減するために電磁波シールド、低雑音電源を追加した。夏の環境でも安定した連続測定・動作ができるようにブリッジの冷却能力の向上を図った。アンプ増幅段の容量の増加は計画中であるが、冷却用にファンを追加し、稼働時の温度を下げることができた。2紫外線による信号形成:280nm未満の波長のUV-Cでは比較的高率にEPR信号が形成されるが、UVA (400ー315nm)、UVB(315-280nm)でも、長時間照射によりL-bandでも検出できる信号が確認された。太陽光を受ける前歯で計測する本装置では補正が必要になる可能性も示唆された。3改良EPR装置の評価:2018年10月頃より制御用PCの動作安定性が低下し、測定が不可能になったが、ソフトウエアーやPCメインプログラムを、共同研究機関であるダートマス大学に協力を依頼し改良を行った。さらに電源部の交換を実施し安定した制御PCの動作ができるようになった。ノイズ遮断電源トランスの効果を確認したが、予測されていた程度の改善は認められなかった。供給電源自体の状況を今後分析する予定である。4実際の被曝では種々のエネルギーの異なる線源が存在する。そこでエネルギーの異なる線源(60COγ線、X線(60kV,250kv),中性子線)を、抜去歯(智歯)に段階的に照射し、EPR測定を実施した。広島大学原爆放射線医学研究所において、ガンマセルを使用させていただき、標準γ線照射標本作製および放射線線量率がEPR信号に与える影響の評価を行った。現在5Gy照射を833mG/minのものと30mG/minで実施しL-bandでは信号強度に有意な差がないことを確認した。上述の通り、2018年10月頃より、EPR計測装置の制御用PCの動作が不調になり、回復にかなりの時間を要した。そのため当初予定していた、γ線の多段階追加照射による線源別信号強度比較分析が予定より遅れた。しかし、制御用プログラムの更新やPC自体の改良を行うことができ、最終的に安定した計測が実施できるようになった。PC動作用の高精度電源への交換は安定作動への効果が高かった。供給電源の改良による最終的なSN向上は、予測していた効果が得られなかった。ノイズ遮断トランスの効果が不十分であるのかあるいは供給電源自体の質に問題があるのか今後の検討を要する。当初の計画に則って実験を進める計画である。特に線源別のEPR信号強度の違いや既存信号評価は重要な課題であるため、重点的に実施する予定である。X-bandでの評価についてはいろいろ報告もあるがL-bandでの線量評価に関わる基礎データは少なくさらに追加していく必要がある。改良を加えた装置を用いて、実際に生体計測を実施し、最終的な計測精度の向上を図る計画である。X-

bandでの評価についてはいろいろ報告もあるがL-bandでの線量評価に関わる基礎データは少なくさらに追加していく必要がある。改良を加えた装置を用いて、実際に生体計測を実施し、最終的な計測精度の向上を図る計画である。国内学会・国際学会での発表をおこなわなかったこと、また計測装置の増幅アンプの更新を2019年度に行うようになったことで次年度使用額が生じた。次年度の後半あるいは2020年度にEPR国際学会が開催される予定であるのでその際に使用する計画である。
大強度電子ビーム集束用スーパートロン(バルク高温超伝導体レンズ)の基礎的開発

本研究は二つの研究から成る。。第一に、日本原子力研究所(以下原研)の大強度電子ビーム源(1 MeV、3 KA、100 ns)をビスマス系スーパートロン(内径20mm、長さ50mm、臨界温度103K)へ入射して、電子ビームの集束状況を実験的に調べたこと、第二に、山梨大学の電子ビーム源(340keV、1kA、10ns)によってスーパートロンの動作機構を明らかにして、スーパートロンの最適設計基準を示したこと、さらに、これらの結果より原研における実験結果を説明できたことである。原研の実験では、誘導加速器型電子ビーム源の出口に、カプトン箔によって真空分離したスーパートロンを設置した。スーパートロンはネオンガス(0.1 Torrの桁)中に置いて電子ビームの空間電荷中和を図り、スーパートロンのレンズ効果を発現し易くした。スーパートロンの下流において電子流を検出したところ、明白な集束効果が認められなかった。山梨大学の電子ビーム源による実験では、電子ビームの自己磁場がスーパートロン壁中へ低拡散速度(10^4m/s)で侵入し、その反作用によって磁場がスーパートロン内に閉じ込められることが明らかになった。そして、電子ビームがスーパートロンへ入射する角度を大きくすると集束されないことも軌道シミュレーションより分かった。このことから、原研における実験では電子ビームがカプトン箔によって散乱され、軌道がスーパートロン軸からそれたために、集束効果が明白に認められなかったと思われる。今後は、電子ビーム源とスーパートロンの分離を箔によってではなく差動排気によって実現し、電子ビームの軌道を乱さない実験が必要である。。高温超伝導体の応用として、我々は荷電粒子ビーム集束用レンズ(スーパートロン)を提案・開発してきた。その原理は、荷電粒子ビームのθ方向の自己磁場を超伝導体のマイスナー効果により円筒超伝導体内部に閉じ込めて、圧縮された自己磁場の力でビーム自身を絞るという簡単なものである。本研究(平成68年度)は、日本原子力研究所と協力して、山梨大学の電子ビーム源(340keV、10ns、2kA)では実験できない領域(原研の電子ビーム源:1MeV,3kA,100ns)における、スーパートロンの性能・動作を確認して、スーパートロンの設計・実用化の基礎データを集積することが目的である。初年度である本年度は2回の共同実験を行った。実験回数を更に重ねたく考えたが、原研における新設備の設置計画・工事と山梨大学の日程計画の不都合により、次年度に繰り越すことになった。本年度の実験内容は、粉体プレス形ビスマス系レンズ(内径20mm、長さ50mm)を誘導加速器出口に設置して、電子ビームのガイド磁場(2kG)、液体窒素冷却、空間電荷中和用ネオンガス導入(0.02-2Torr)、電子ビームの加速電圧(120-560keV)の効果・影響を大略調べた。本実験では、スーパートロンの入・出口に真空分離用のカプトン箔を設置した影響と電子ビーム検出用ロゴスキーコイルの出力に寄生振動が認められた。次回の実験ではこれらの影響を分離・除去して、山梨大学における実験結果との連続性を求める計画である。高温超伝導の発見直後より、我々は荷電粒子ビーム用レンズ(スーパートロン)を提案・開発してきた。スーパートロンは、超伝導体のマイスナー効果によって、ビームの自己磁場を超伝導体円筒内へ閉じ込めて、その圧縮された磁場によってビームを細径化する。この動作原理(作業仮説)を解明するために、本研究では(1)日本原子力研究所との共同研究として、単発パルス電子ビーム(加速電圧330-560keV、100ns)をスーパートロンへ入射して、スーパートロンを通過する電子ビーム特性を観測した。さらに、

(2)山梨大学の電子ビーム源(340keV、1KA、10ns)を用いて、スーパートロン壁(超伝導体壁)へ侵入し透過する磁場を観測し、スーパートロンの動作解明に迫った。そして、動作の実態をかなり知ることができた。(1)スーパートロンは、電子ビームの空間電荷効果を中和しないと有効動作しない。そこで、ビスマス系粉体プレス形スーパートロン(内径20mm、長さ55mm、厚さ1.5mm)を、カプトン箔によって電子ビーム源の真空空間から分離したうえで、スーパートロンの空間へネオンガス(0.06-10Torr)を導入した。誘導加速器からの入射電子ビームの加速電圧およびネオンガス圧の関数として、スーパートロン上流(300-1500A)・下流(7-70A)のビ^ム電流値を観測した。その結果、加速電圧、ネオンガス圧のいずれにも、意味のある依存性が認められなかった。その原因として、カプトン箔による電子ビームの散乱が考えられる。(2)スーパートロンの超伝導体壁を拡散・透過する磁場を測定したところ、超伝導状態の壁を10^4m/sの速度で拡散することが判明した。この遅い粘性的拡散速度の反作用として、ビームはスーパートロン内へ閉じ込められると推定される。本研究は二つの研究から成る。第一に、日本原子力研究所(以下原研)の大強度電子ビーム源(1Mev、3KA、100ns)をビスマス系スーパートロン(内径20mm、長さ50mm、臨界温度103K)へ入射して、電子ビームの集束状況を実験的に調べたこと、第二に、山梨大学に設置してある電子ビーム源(340keV、1kA、10ns)によってスーパートロンの動作機構を明らかにすると共に、スーパートロンの最適設計の基準を示したこと、さらに、これらの結果より原研における実験結果を説明できたことである。原研の実験では、誘導加速器型電子ビーム源の下流に、カプトン箔によって真空分離した後にスーパートロンを設置した。スーパートロンはネオンガス(0.1Torrの桁)中に設置して電子ビームの空間電荷の中和を図り、スーパートロンによるレンズ効果を発現し易くした。スーパートロンの下流において電子流を検出したところ、明白な集束効果が認められなかった。山梨大学の電子ビーム源による実験では、電子ビームの自己磁場がスーパートロン壁中へ低拡散速度(10^4m/s)で侵入し、その反作用力によって磁場がスーパートロン内に閉じ込められることが明らかに成った。そして、電子ビームがスーパートロンへ入射する角度が大きくなると集束されないことも軌道シミュレーションより分かった。このことから、原研における実験では電子ビームが分離用箔によって散乱され、入射軌道がスーパートロン軸からそれたために、集束効果が明白に認められなかったと思われる。今後は、電子ビーム源とスーパートロンの分離を箔によってではなく差動排気によって実現し、電子ビームの軌道を乱さない実験が必要である。
フラボノイド類の乳がん転移予防効果を最大限に活かすには？

転移とは、がん細胞がリンパ液や血液の流れに乗って別の臓器に移動し、そこで定着・成長することをいい、乳がんにおいては、検査では見つからない程度のごく小さな転移が比較的早期から起こっているとされている。この“見えない転移"を予防することが、天然由来の機能性化合物、フラボノイド類によって、どこまで可能になるかを解明することを主な目的とし、化学的または食事的予防効果の相反する視点から研究を実施する。それぞれの研究から得られた結果を総合的に解析し、フラボノイド類の生理活性を最大現に発揮するために必要な条件ならびに化学構造について科学的知見を提示する。
真核生物リボソ-ム遺伝子の発現制御機構

本年度はリボソ-ムRNA遺伝子の基本的転写因子の一つと考えられるUBF(upstream binding factor)のcDNAをマウス脳cDNAライブラリ-からクロ-ン化することに成功した。つづいてその遺伝子をもクロ-ン化した。その結果マウスのUBFは一つの遺伝子を持っているが、19個のエキソンによってコ-ドされ、第7番目のエキソンのオ-ルタ-ナティヴ・スプライシングによって89Kdと84Kdの2種のmUBFを作っていることが初めて明らかとなった。これら2種類のUBFの生理的意義は現在検討中である。mUBFはそのN端側に非ヒストンタンパク質の一つであるHMG1やHMG2にみられる配列(約80アミノ酸)が4回繰返しており(HMGboxー14)、84KdUBFで失なわれる部分はboxー2の中程の37アミノ酸であることもわかった。mUBFのC端側にはβタ-ンの部分とそれに続く酸性アミノ酸に富む酸性尾部(acidic tail)があり、これがトランス作用に働いているものと考えられる。現在、遺伝子工学的手法を用いてHMGーboxや酸性尾部の変異体を作ってその機能を検討中である。一方、リボソ-ム遺伝子を転写するRNAポリメラ-ゼIの修飾による調節を検討するため、その主要なサブユニットのクロ-ニングを目指して精製を進めている。現在、200Kd,120Kd,および56Kdの3つのサブユニットが純化され,アミノ酸部分配列を決定中である。今年度は(1)TFIDの精製、(2)細胞増殖におけるrDNA転写および(3)rDNA上流領域のエンハンサー様活性の検索、の3つの方向に研究を進めた。1.TFIDの精製。従来の方法では回収率が悪く精製の目途は立たなかったが、D Nase Iフットプリント法の確立に伴ない、rDNAプロモーター自身を用いたDNA配列特異的アフィニティークロマトグラフィーによって精製する道が開けた。部分精製されたタンパク質の一つは65,000他は40,000の分子量を示した。一方、部分精製したTFIDをUVcross-linking法でその存在を確認した。2.細胞増殖とrDNA転写。細胞増殖とrDNA合成との関係を調べるためHeLa細胞を血清で処理し細胞増殖を開始させる時に、rDNA転写がどのように変化するかを検討した。血清刺激後rDNAの転写は若干低下はするが約23倍の高値が継続することがわかった。次いで、分離核を用いた、nuclear run-onアッセイによっても殆んど同様の結果を得た。現在、これをin vitroの系で再現すべく実験を重ねている。3.rDNA上流領域のエンハンサー様活性の検索。rDNAの上流域のエンハンサー様エレメントを検索するため5側の逐次欠失変異体を作り、in vivoおよびin vitroの系でこれらの転写活性を測定した。その結果、-5kb近傍の1546pの中に活性を数倍に高める領域があることを見出した。この配列に結合する蛋白性因子を検索中である。今年度は(1)TFIDの更なる精製、(2)ヒトおよびマウスのrDNAプロモ-タ-の内部構造と種特異性の2つの方向に主として研究を進めた。1.TFIDの精製。マウス腹水肝癌MH134からホスホセルロ-スカラム、DEAEセルロ-スカラム、次いでマウスrDNAコアプロモ-タ-配列によるアフィニティクロマトグラフィ-を用いてTFIDの精製を試み50万倍以上の濃縮に成功したが、全量はアミノ酸配列の決定には不十分であった。現在の所十分な量をとるには10kg以上の細胞を必要とすると計算される。2.ヒトおよびマウスのrDNAプロモ-タ-の内部構造と種特異性。ヒトとマウスが互いに種特異性を示すrDNA中の領域をキメラ遺伝子を作って検討した。既にマウス細胞抽出液でヒトrDNAは転写出来ないが、そのコアプロモ-タ-中の-32から-14までをマウスの配列に押えると、マウスの野生型rDNAの約90%の効率で転写される(既報、文献1)ことを見ていたので、今回はヒトHeLa細胞に抽出液を用いてヒト・マウスキメラによってヒト特異的転写に必要な領域を決定した。その結果、マウスと異なりこの範囲は-43から+17迄と極めて広いことがわかった。更にその理由を調べると5′側では-43の塩基対が重要であり、3′では+17と+1の2塩基対がヒト特異的転写に重要であった。それにより内部の構造をマウスと比較しつつ変化して更に詳しく調べることにより哺乳動物のrDNAコアプロモ-タ-は3つの進化的に保存された配列(DCS:distal conserved sequence,PCS:proximal conserved sequenceおよびSCS:start siteconserved sequence)が保存されていない配列と交互に並んだモザイク状の構造を持っており、保存されていない配列の中にも比較的少数の転写に重要な塩基対がある他、保存された配列の中の異なる塩基対を保存された配列間の距離も種特異的な転写に重要な役割を果していることが明らかとなった。

その結果マウスのUBFは一つの遺伝子を持っているが、19個のエキソンによってコ-ドされ、第7番目のエキソンのオ-ルタ-ナティヴ・スプライシングによって89Kdと84Kdの2種のmUBFを作っていることが初めて明らかとなった。これら2種類のUBFの生理的意義は現在検討中である。mUBFはそのN端側に非ヒストンタンパク質の一つであるHMG1やHMG2にみられる配列(約80アミノ酸)が4回繰返しており(HMGboxー14)、84KdUBFで失なわれる部分はboxー2の中程の37アミノ酸であることもわかった。mUBFのC端側にはβタ-ンの部分とそれに続く酸性アミノ酸に富む酸性尾部(acidic tail)があり、これがトランス作用に働いているものと考えられる。現在、遺伝子工学的手法を用いてHMGーboxや酸性尾部の変異体を作ってその機能を検討中である。一方、リボソ-ム遺伝子を転写するRNAポリメラ-ゼIの修飾による調節を検討するため、その主要なサブユニットのクロ-ニングを目指して精製を進めている。現在、200Kd,120Kd,および56Kdの3つのサブユニットが純化され,アミノ酸部分配列を決定中である。