hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
カーボンナノチューブの3次元細胞培養担体への応用

本年度の研究ではCNTコートスポンジに播種した初代培養骨芽細胞の3次元培養を行い,分化に対する影響を評価するとともに,ラット皮下および大腿骨に埋入し,その組織に対する適合性を検索した.その上で,ex vivoにおける骨形成を観察し骨芽細胞移植による骨再生への応用を検討した。また,CNTsによる表面処理を応用し,ポリ乳酸(PLLA)にCNTsをコートし,骨芽細胞様細胞を培養しその細胞培養特性を評価した.さらに,CNTsによる表面処理が未分化な骨髄間質細胞に与える影響を評価するためCNTコートしたディッシュ上で培養し,増殖と分化について検討した.1.カーボンナノチューブコートした3次元細胞培養担体の骨再生への応用CNTコートスポンジ上で培養したラット初代培養骨芽細胞(ROBs)は,短期間で分化することが明らかになった,また,CNTコートスポンジは,骨組織との適合性を有し,骨芽細胞移植への応用の可能性が示唆された.2.カーボンナノチューブコートしたポリ乳酸膜上での骨芽細胞様細胞の培養CNTコート後のPLLAは親水性が2倍以上に向上した.また,CNT表面処理により,培養初期においてPLLAへの細胞接着が向上することが明らかになった.3.多層カーボンナノチューブの骨髄間質細胞への影響ラット骨髄から採取した骨髄間質細胞(RBMSCs)およびROBsをCNTsをコートしたディッシュ上で培養したところ,.細胞の付着量および細胞増殖率,また各分化マーカーの発現については未処理のdishと比較して有意差は見られなかった.以上より,CNTsは,骨髄間質細胞と骨芽細胞の増殖および初期の分化には影響を与えないことが明らかになった.カーボンナノチューブ(CNTs)は炭素六員環がチューブ状に結合したものである.機械的特性や化学的安定性に優れ,生体適合性が高いことから生体材料への応用が期待されている.我々はこれまでに,CNTs特有の立体構造に着目し,3次元細胞培養担体の1つであるコラーゲンスポンジの表面をCNTsでコートしたCNTコートスポンジを開発した.本研究では,CNTコートスポンジの骨再生への応用の可能性を検討するため,1.CNTコートスポンジ内部への細胞接着機構の詳細な観察,2.初代骨芽細胞の分化への影響の評価,3.同スポンジに対する周囲組織の反応の観察を行った.その結果,培養3,7日後においてCNTコートスポンジ中心部に付着した細胞数は未処理のスポンジと比較して有意に高く,細胞播種直後においてはCNTコートスポンジに付着した細胞は早期に伸展することが明らかになった.また,ラット頭蓋冠より採取した初代骨芽細胞を培養したところ,CNTコートスポンジでは未処理のスポンジより短期間で分化することが明らかになった.周囲組織の反応については,皮下組織において,CNTコートスポンジ周囲の炎症反応は軽微であり,骨随腔内ではCNTsと直接接して骨形成が観察された.CNTコートスポンジ周囲の骨形成量は28,56日後において未処理のスポンジと比較して有意に高かった。さらに,初代培養骨芽細胞を1日培養した各スポンジを,ラット皮下に埋入したところ,28日後において,CNTコートスポンジのポアを埋めるように明瞭な骨形成が観察された.一方未処理のスポンジでは,骨形成の前にスポンジが押しつぶされ,骨形成はほとんど観察されなかった.以上より、CNTコートスポンジでは中心部にまで細胞が付着し,骨芽細胞の分化を促進する上,高い生体適合性を示し,骨再生への応用が期待できると考えられた.本年度の研究ではCNTコートスポンジに播種した初代培養骨芽細胞の3次元培養を行い,分化に対する影響を評価するとともに,ラット皮下および大腿骨に埋入し,その組織に対する適合性を検索した.その上で,ex vivoにおける骨形成を観察し骨芽細胞移植による骨再生への応用を検討した。また,CNTsによる表面処理を応用し,ポリ乳酸(PLLA)にCNTsをコートし,骨芽細胞様細胞を培養しその細胞培養特性を評価した.さらに,CNTsによる表面処理が未分化な骨髄間質細胞に与える影響を評価するためCNTコートしたディッシュ上で培養し,増殖と分化について検討した.1.カーボンナノチューブコートした3次元細胞培養担体の骨再生への応用CNTコートスポンジ上で培養したラット初代培養骨芽細胞(ROBs)は,短期間で分化することが明らかになった,また,CNTコートスポンジは,骨組織との適合性を有し,骨芽細胞移植への応用の可能性が示唆された.2.カーボンナノチューブコートしたポリ乳酸膜上での骨芽細胞様細胞の培養CNTコート後のPLLAは親水性が2倍以上に向上した.また,CNT表面処理により,培養初期においてPLLAへの細胞接着が向上することが明らかになった.3.多層カーボンナノチューブの骨髄間質細胞への影響ラット骨髄から採取した骨髄間質細胞(RBMSCs)およびROBsをCNTsをコートしたディッシュ上で培養したところ,.細胞の付着量および細胞増殖率,また各分化マーカーの発現については未処理のdishと比較して有意差は見られなかった.以上より,CNTsは,骨髄間質細胞と骨芽細胞の増殖および初期の分化には影響を与えないことが明らかになった.
環境化学物質による胎仔毒性・催奇形性の発現機序に関する基礎的研究

これまでに私はethylnitrosourea(ENU)はラット胎仔の中枢神経組織の神経幹細胞、生殖巣の始原生殖細胞、胎盤の栄養膜細胞などにアポトーシスおよび細胞周期停止を誘発し、その後、当該器官において奇形の発生が高率に認められること、および、その過程にはp53蛋白が重要な役割を果たしていることを示唆する結果を得ている。今年度は、ラット胎仔組織におけるENU誘発アポトーシスおよび細胞周期停止の発現機構および当該組織における奇形発生のメカニズムをより詳細に明らかにするために,DNAマイクロアレイ法を用いてENU投与後の胎仔中枢神経組織における遺伝子発現の変化を明らかにした。この結果ENUによるアポトーシスおよび細胞周期停止の発現に先立って多くのp53の転写標的遺伝子の発現が増加し、ENUによる胎仔中枢神経組織のアポトーシスおよび細胞周期停止の発現にはp53が重要な役割を果てしていることが再確認された。本研究の成果は現在投稿準備中である。さらに、ENUによる胎仔中枢神経組織のアポトーシスおよび細胞周期停止におけるp53の役割をより明確にするため、p53ノックアウトマウスを用いて実験を行った。その結果p53欠損マウスではENUによるアポトーシスおよび細胞周期停止の双方が全く誘発されなかった。従って、ENU誘発胎仔中枢神経組織のアポトーシスおよび細胞周期停止にはp53が必須であることが示された。また、本研究の成果は国際学術誌である「Cell Death and Differentiation」誌に投稿し、現在査読中である。これまでにEthylnitrosourea(ENU)はラット胎仔の中枢神経組織や胎盤などにアポトーシスおよび細胞周期停止を誘発し,その後,当該器官において奇形の発生が高率に認められること,および,ENU誘発アポトーシスおよび細胞周期停止にはp53蛋白が重要な役割を果たしていることを明らかにしている。今年度は,ENUによって誘発されたラット胎仔の生殖巣の始原生殖細胞におけるアポトーシス病変について検索した。ENUは始原生殖細胞にもアポトーシスを誘発し,さらに,その際にも胎仔組織や胎盤と同様にp53蛋白が重要な役割を果たしていることを明らかにした。また,本研究の結果を国際学術誌である「Experimental and Toxicologic Pathology」誌に投稿した。また,ラット胎仔中枢神経組織においてENUによってアポトーシスが誘導される際の細胞周期の変化について検索したところ,アポトーシス細胞の増加に先立ってS期の細胞が増加し,その後アポトーシス細胞が増加するに伴ってG2/M期の細胞が減少することが明らかになった。さらに,S期の細胞が増加する際にG1/S期移行を担う因子が活性化していないことおよびENUの投与により増加したS期の細胞はDNAの複製が遅延または停止していることも明らかにした。すなわち,本実験でみられたS期の細胞の増加はG1/S期移行が亢進したために起こったものではなく,S期にて細胞周期が遅延または停止したために起こったものであることが明らかとなった。以上より,ENUはS期の細胞のDNA複製を阻害し,その後G2期を向かえる前にアポトーシスを誘導しているのではないかと考え,さらなる検索を行っている。
平面と立体とを可逆変化する構造に基づいた腹腔鏡手術用臓器圧排器具の創製

腹腔鏡手術は開腹手術と比較して,手術創を微小にでき,出血や痛みを少なくできる低侵襲性の点において有利である.しかし腹腔鏡手術においては,治療部位に関係のない臓器を押しのける圧排操作が難しいという課題がある.本研究課題では,術野を狭めることなく,かつ容易に臓器を圧排できる,腹腔鏡手術用の臓器圧排器具を新規に提案する.提案する臓器圧排器具は,平面と立体とを可逆変化する構造に基づいて設計,開発する.平成30年度においては,腹腔鏡手術の中でも,鏡視手術の安全制を高め,かつ超音波画像の多角的利用を可能にする方法として提案されている,水中腹腔鏡手術に着目した.この手法は,生理食塩水を腹腔内にて持続灌流しながら治療を行う方式である.灌流によって腹腔内の生理的環境を保持できるため,炎症性反応の抑制や臓器の機能温存への効果が期待できる手法である.水中腹腔鏡手術では,生理食塩水によって臓器に浮力が働くため,臓器圧排に要する力,すなわち臓器圧排器具に求められる構造強度が,一般的な腹腔鏡手術よりも弱くなる.この点に着目し,本研究課題において,水中腹腔鏡手術用の臓器圧排器具の試作を行った.試作品の素材として今回は,透明かつ入手の容易性から,ポリエチレンナフタレートとポリエステルを採用した.素材の厚さとして0.100mm,0.125mm,0.188mmの3種類を選択した.素材と厚さの異なる6種類の試作品を量産して,その強度と臓器圧排器具としての有効性を評価した.その結果,今回採用した素材においては,素材の性質よりもその厚さの方が,臓器圧排器具の性能に大きく影響することが分かった.厚さ0.188mmの素材で構成した臓器圧排器具であれば,水中腹腔鏡手術において臓器圧排に必要となる力の指標である,4Nの外圧に十分耐えうることを実験的に確認できた.腹腔鏡手術は,腹部に数mm1cm程度の小さな穴を開け,その穴から筒状の内視鏡(腹腔鏡)や手術用の器具類を挿入して,腹腔内の組織に対して治療を行う方式である.開腹手術と比較して,手術創を微小にでき,出血や痛みを少なくできる低侵襲性の点において有利である.しかし腹腔鏡手術においては,治療部位に関係のない臓器を押しのける圧排操作が難しいという課題がある.本研究課題では,術野を狭めることなく,かつ容易に臓器を圧排できる,腹腔鏡手術用の臓器圧排器具を新規に提案する.提案する臓器圧排器具は,平面と立体とを可逆変化する構造に基づいて設計,開発する.平面と立体とを可逆変化する構造は,複数の展開図から構成される各平面を組み合わせることで実現できる.従来はすべて手作業にて構造を作製したため,展開図に基づいて素材を切断する際に多大な時間と労力を要していた.特に本研究では,紙だけでなくポリエチレンテレフタラート(PET)のような樹脂も素材の候補として検討している.PETをはじめとする樹脂素材は人の手による切断が容易でないものが多く,時間や労力の他に,怪我の危険性が高いことも課題であった.そこで平成28年度においては,作業の効率化,安全化を第一の課題と設定して,樹脂を切断可能なレーザ加工機を導入した.これにより,従来は臓器圧排器具一つを試作するために少なくとも1時間を要していた製作過程をわずか数分に短縮でき,大幅な効率化を実現できた.現在は試作型を量産しており,平成29年度においてその評価を実施予定である.先行研究において,中空円筒型の立体形状が適しているという知見を得ているため,中空円筒型をベースにして,素材の厚み,器具の大きさ,各底面の半径と円筒部の半径がそれぞれ臓器圧排時の圧排性能,強度にどのように影響するかを検証することが目的である.平成28年度においては,作業の効率化を目的として導入したレーザ加工機により,さまざまな素材,さまざまな仕様の臓器圧排器具を試作,量産した.現在,評価実験を継続して行っている段階であり,目に見える形での成果はまだ得られていないが,研究は概ね順調に進んでいるものと考えている.腹腔鏡手術は,腹部に数mm1cm程度の小さな穴を開け,その穴から筒状の内視鏡(腹腔鏡)や手術用の器具類を挿入して,腹腔内の組織に対して治療を行う方式である.開腹手術と比較して,手術創を微小にでき,出血や痛みを少なくできる低侵襲性の点において有利である.しかし腹腔鏡手術においては,治療部位に関係のない臓器を押しのける圧排操作が難しいという課題がある.本研究課題では,術野を狭めることなく,かつ容易に臓器を圧排できる,腹腔鏡手術用の臓器圧排器具を新規に提案する.提案する臓器圧排器具は,平面と立体とを可逆変化する構造に基づいて設計,開発する.平成28年度に導入したレーザ加工機により,臓器圧排器具の試作における効率が大幅に向上した.それに伴い,試作器具の量産が可能にあったため,素材や仕様の異なる試作器具の評価を平成29年度に実施した.レーザ加工機導入前は困難であった樹脂の切断も容易に可能になったため,透明かつ入手の容易性からポリエチレンテレフタラート(PET)にまず焦点を絞って試作器具の量産,評価を行った.その結果,臓器圧排性能は十分であることが確認できた.一方でPETは紙ほどしならないため,今後検討予定である,臓器圧排器具を丸めて巻き取ることが極めて困難であることが実験的にも明らかになった.

そこで,PET以外の透明樹脂,たとえばポリエチレンナフタレートも候補として評価,検討を進めた.並行して,将来的に「透明な紙」が素材として利用可能になることを想定して,耐水紙を用いた評価実験も実施した.平成29年度において,試作,量産した臓器圧排器具を評価し,目的とする臓器圧排器具として適した素材,仕様を選定する予定であったが,所望の性能を満たす素材の選定に難航している.臓器圧排器具の構造を改良することで前述の問題を解決できることを期待し,設計用の高性能PCを新たに導入した.また,新たな着想の芽を得るきっかけとするべく,情報収集のために研究会にも参加した.現在も引き続き,素材の選定,構造の改良と評価実験を行っている段階であり,目に見える形での成果は得られていない.腹腔鏡手術は開腹手術と比較して,手術創を微小にでき,出血や痛みを少なくできる低侵襲性の点において有利である.しかし腹腔鏡手術においては,治療部位に関係のない臓器を押しのける圧排操作が難しいという課題がある.本研究課題では,術野を狭めることなく,かつ容易に臓器を圧排できる,腹腔鏡手術用の臓器圧排器具を新規に提案する.提案する臓器圧排器具は,平面と立体とを可逆変化する構造に基づいて設計,開発する.平成30年度においては,腹腔鏡手術の中でも,鏡視手術の安全制を高め,かつ超音波画像の多角的利用を可能にする方法として提案されている,水中腹腔鏡手術に着目した.この手法は,生理食塩水を腹腔内にて持続灌流しながら治療を行う方式である.灌流によって腹腔内の生理的環境を保持できるため,炎症性反応の抑制や臓器の機能温存への効果が期待できる手法である.水中腹腔鏡手術では,生理食塩水によって臓器に浮力が働くため,臓器圧排に要する力,すなわち臓器圧排器具に求められる構造強度が,一般的な腹腔鏡手術よりも弱くなる.この点に着目し,本研究課題において,水中腹腔鏡手術用の臓器圧排器具の試作を行った.試作品の素材として今回は,透明かつ入手の容易性から,ポリエチレンナフタレートとポリエステルを採用した.素材の厚さとして0.100mm,0.125mm,0.188mmの3種類を選択した.素材と厚さの異なる6種類の試作品を量産して,その強度と臓器圧排器具としての有効性を評価した.その結果,今回採用した素材においては,素材の性質よりもその厚さの方が,臓器圧排器具の性能に大きく影響することが分かった.厚さ0.188mmの素材で構成した臓器圧排器具であれば,水中腹腔鏡手術において臓器圧排に必要となる力の指標である,4Nの外圧に十分耐えうることを実験的に確認できた.平成28年度において試作,量産した臓器圧排器具の評価を継続し,最終的に得られた知見から,目的とする臓器圧排器具として適した素材,仕様を選定する.並行して,構想段階にある臓器圧排器具の挿入・展開・摘出方法について,具体的な方策を絞り込む.すべてを同時に実現する器具をいきなり試作することは難しいと考えられるため,まずは各工程を独立に考えることとし,挿入・展開・摘出方法の評価と実現可能性について検証する.現時点ではおおむね以下のような方式を想定している.腹部に開けた穴.あるいはその穴に通した筒状の器具(トロッカ)の直径は数mm1cm程度である.
納豆中に含まれる抗う蝕性物質の同定と応用化

これまでに市販納豆の可溶性抽出液にう蝕原性Streptococcus mutansのバイオフィルム形成抑制効果を明らかにしている。36種市販納豆を対象として評価した結果、バイオフィルム抑制効果はプロテアーゼ活性と相関性が認められた。抑制因子を精製した結果、セリン型プロテアーゼであるナットウキナーゼの特徴と良く類似した。これはS. mutansのバイオフィルム形成に必須である非水溶性グルカン合成阻害が原因であることが明らかとなった。ナットウキナーゼは歯の脱灰の臨界pHである5.0付近においても比較的活性を維持しており、応用的にも利用可能であるものと期待された。これまでの結果より、納豆抽出液にう蝕原性Streptococcus mutansのバイオフィルム形成阻害効果を有することを明らかにしている。また、原料大豆には本活性は見られなかった。一方、納豆菌培養ろ液にはS.mutansのバイオフィルム抑制効果が認められたことから、当該物質は納豆菌の菌体外代謝産物であるものと推察されている。そこでH27年度の研究では、納豆菌の培養ろ液に焦点をあて、バイオフィルム抑制物質の探索を行った。スクロース分解酵素の標準品においてS. mutansバイオフィルム形成が著しく抑制されることが確認された。そこで納豆菌を低濃度のスクロースを含む液体培地にて培養した結果、ろ液中にスクラーゼ活性が確認され、また高いバイオフィルム抑制効果が確認された。このことから、納豆菌によるS. mutansのバイオフィルム形成阻害機構の1つはスクロースの競合阻害によるものと考えられた。一方、枯草菌においても納豆菌と同様、ろ液中にバイオフィルム形成抑制効果が認められたが、スクラーゼ活性は検出されなかった。よって納豆菌と枯草菌では、異なるメカニズムによりS.mutansのバイオフィルム形成阻害が生じているものと考えられた。枯草菌遺伝子ライブラリーを用いて、S.mutansバイオフィルム形成因子のスクリーニングを行ったところ、ヌクレアーゼに関する遺伝子変異株においてバイオフィルム形成抑制効果の消失が確認された。これまでにヌクレアーゼによる抑制効果に関する報告はなされていない。一般的にバイオフィルムは細胞だけではなく、菌体外多糖や菌体外DNAなどにより構成されるとされており、本研究結果は、菌対外DNAに影響を及ぼすことでバイオフィルム形成抑制につながるものと考えられた。H27年度の実施計画に示した枯草菌遺伝子変異株ライブラリーを用いた当該物質のスクリーニング、および納豆中の活性物質の特定に関して、いずれも計画通り本年度内に達成することができた。これら研究内容について、2016年3月に日本大学生物資源科学部にて開催された食品科学工学会関東支部会で発表を行い、申請者が主導的に指導する大学院生川崎幸正が発表奨励賞を受賞した。一方、当初枯草菌と納豆菌のバイオフィルム抑制メカニズムは類似のものであると考えていたが、本年度の研究結果より、異なるメカニズムが存在するものと考えられた。これらの点について、H28年度以降の課題としてあげられる。これまでに市販納豆中に含まれるう蝕原性バイオフィルム抑制因子は熱に対して感受性であることを明らかにしている。納豆は大豆を原料として納豆菌の菌体外酵素の働きにより作られる発酵食品であり、各種酵素が豊富に存在する。よって我々は納豆中の酵素に着目して解析を行った。36種類の市販納豆を対象として、プロテアーゼ活性とバイオフィルム形成抑制効果を調べた結果、比較的高い相関性が認められた(R2=0.82)。加えて、スクロース分解能を有するスクラーゼも強いバイオフィルム形成抑制効果を有することが明らかとなった。H27年度の解析により、納豆菌が生産するヌクレアーゼがバイオフィルム形成抑制効果を有することを明らかにしている。納豆菌が産生する複数の酵素がう蝕原性細菌に多面的に働くことで強いバイオフィルム形成阻害効果を発揮するものと推測された。他方、納豆抽出液には成熟したバイオフィルムへの分解効果は認められなかった。このことから、納豆抽出液はバイオフィルム形成の初期および中期において影響するものと考えられた。う蝕原性細菌のバイオフィルム形成において、菌体外の非水溶性グルカン合成が最重要因子である。納豆抽出液、および納豆由来プロテアーゼの添加により非水溶性グルカンの合成が阻害されることが定量試験、およびin situでの顕微鏡観察により確認された。納豆菌の代謝産物の中でジピコリン酸等の抗菌性物質の存在が報告されているが、納豆抽出液にはう蝕原性細菌S. mutansを含む口腔常在性の近縁種に対しての抗菌性は認められなかった。当初の実験計画通り、納豆抽出液中に含まれるバイオフィルム形成抑制因子を明らかにすることができた。またこれら解析にあたり、バイオフィルム形成促進因子の存在が見つかるなど、当初は予想していない興味深いデータも得られている。S. mutansが納豆抽出液存在下でどのような遺伝的応答を示すのかについて、すでに取り掛かっている段階であり、グルカン合成に関与する遺伝子に影響することが少しずつ明らかになってきた。この点については、H29年度に継続的に実施する予定である。また、納豆抽出液中に含まれるプロテアーゼ等の抑制因子の探索では、成分分析を含め現在実施しているところであり、概ね予定通り進んでいる。H29年度に実施予定の臨床応用を目指した基礎実験については、人工唾液とハイドロキシアパタイトディスクを用いた実験に取り掛かっており、この点については当初の予定より早く計画が進行中である。これら結果については複数の学会にて報告している。以上の理由より、これまでのところ実験計画はおおむね順調に進展していると判断された。

市販納豆の可溶性画分からう蝕原性細菌Streptococcus mutansバイオフィルム形成抑制因子の分離・精製を行った結果、セリン型プロテアーゼであるナットウキナーゼの特徴と類似した。Bacillus subtilis nattoのナットウキナーゼをコードするaprN遺伝子変異株を作成し、これを用いて納豆製造を行った。本変異株を用いて製造された納豆は糸引きが大幅に低下するなど、既知の報告とよく一致した。本納豆の可溶性画分には、S. mutansのバイオフィルム抑制効果が一部残存することが明らかとなった。このことから、ナットウキナーゼ以外のプロテアーゼが抑制に関与することが示唆された。S. mutansよりバイオフィルム形成に必須である非水溶性グルカン合成酵素を精製し、納豆由来プロテアーゼによる阻害活性を評価した。その結果、プロテアーゼは酵素活性を大幅に抑制することが明らかとなった。このことから、納豆によるバイオフィルム形成阻害は、グルカン合成酵素阻害によるものと考えられた。ナットウキナーゼの応用利用を目的として、口腔と類似環境下でのプロテアーゼ活性を評価した。ここでは比較対象としてセリン型、システイン型、金属型の各市販プロテアーゼ計20種類を用いた。ナットウキナーゼは、酸性条件、および唾液存在下においても比較的高いプロテアーゼ活性を維持することが明らかとなった。一方で、ナットウキナーゼは耐熱性に乏しく、60°C15分の加熱により90%程度活性が低下した。よって、実用化には熱処理を伴わない方法が必要であると考えられた。納豆由来プロテアーゼは歯のモデルであるハイドロキシアパタイトディスクを用いた場合においても十分なバイオフィルム形成抑制効果が認められた。以上の結果から、納豆由来プロテアーゼは抗う蝕材として実用可能性があるものと考えられた。これまでに市販納豆の可溶性抽出液にう蝕原性Streptococcus mutansのバイオフィルム形成抑制効果を明らかにしている。36種市販納豆を対象として評価した結果、バイオフィルム抑制効果はプロテアーゼ活性と相関性が認められた。抑制因子を精製した結果、セリン型プロテアーゼであるナットウキナーゼの特徴と良く類似した。これはS. mutansのバイオフィルム形成に必須である非水溶性グルカン合成阻害が原因であることが明らかとなった。ナットウキナーゼは歯の脱灰の臨界pHである5.0付近においても比較的活性を維持しており、応用的にも利用可能であるものと期待された。H28年度では研究計画で示した通り、S.mutans側の視点から抑制メカニズムについて検討を行う。具体的には細胞表層タンパク質の変化、また転写レベルでの影響評価について検討を行う予定でいる。また、H27年度の課題として挙げられた枯草菌と納豆菌での抑制メカニズムの際については、ゲノムレベルでの比較解析を予定している。
末梢血線維細胞の機能解析による気道リモデリングの評価法の確立

末梢血単核細胞から線維細胞を誘導するための培養至適切条件を確立し、得られた線維細胞を用いて気道リモデリングに関係する機能の解析を行った。線維細胞はシステイニルロイコトリエンのレセプターを発現しており、ロイコトリエンD4刺激は増殖には影響しないが、線維芽細胞への分化を抑制し、血管新生に関わる因子の産生を抑制することで、気道炎症に伴う組織修復過程に影響を与える可能性が示唆された。一方、IL-17刺激では細胞増殖は抑制されるが、CD40Lの刺激によるIL-6,VEGF産生を増強し、気道リモデリングを増悪させる可能性が考えられた。また線維細胞はCD4陽性T細胞を活性化し、活性化したT細胞とのCD40/CD40Lを介する相互作用によりIL-17、IL-6、VEFG産生増強することで気道リモデリングに関与することが示唆された。損傷組織の修復と線維化に関与する繊維細胞は、喘息の気道リモデリングにも関与していると推測されている。線維細胞の機能の制御機構は不明の点が多いことから気道リモデリングに作用する重要な因子の一つであるロイコトリエンD4(LTD4)が線維細胞の機能に与える影響について解析した。ヒト末梢血単核細胞をフィブロネクチンをコートしたプレートで培養し、浮遊細胞を除去した後、PDGF-BBを添加してさらに2週間培養し、線維細胞を分離回収する。回収した線維細胞をロイコトリエンD4存在下で培養し、mRNA発現、培養上清中のサイトカイン産生、細胞マーカーを測定した。その結果、線維細胞は構成的にCysLT1R,CysLT2RのmRNAを発現しているが、蛋白レベルではCysLT2Rを主に発現していた。1μMまでのLTD4は生細胞数に影響を与えなかったが、線維細胞の筋平滑筋への分化のマーカーであるα・smooth muscle actin、Calpaine、collagen Iの発現やVEGF、angiogenin、TGF-β1のmRNA発現、IL-6、TNF-α産生は、LTD4の濃度依存性に抑制された。しかし、活性化T細胞に発現されるCD40Lからの刺激の代わりに可溶性sCD40L刺激による線維細胞のIL-6、TNF-α産生にはLTD4は影響を与えなかった。LTD4は活性化T細胞による線維細胞の活性化を抑制しないが、非存在下では繊維芽細胞様形質の発現と増殖因子産生を抑制することで、気道炎症に伴う気道リモデリングの組織修復過程に影響を与える可能性が示唆された。線維細胞の機能とその制御機構は不明の点が多く、Th2サイトカインのIL-4、IL-13が増殖を促進することが知られているに過ぎない。近年、喘息の病型によってはIL-17が病態に関与していることが報告されている。そこで、IL-17が線維細胞機能に及ぼす影響を検討したところ、線維細胞の増殖はIL-17A、IL-17Eの濃度依存性に抑制されたが、IL-6産生はIL-17A単独刺激では弱いもののsCD40L刺激により著明に増加した。また、IL-17A存在下でsCD40Lにより誘導されるIL-6産生はIL-17Aの濃度依存性に著明に増加したが、IL-17EはIL-6産生に影響を与えなかった。一方、IL-10産生はIL-17A、IL-17Fのいずれによっても濃度依存性に抑制された。また、線維細胞のVEGFのmRNA発現はIL-17A、IL-17F存在下でsCD40L刺激が加わると増加し、コラーゲンIの発現はIL-17F存在下でsCD40L刺激が加わると増加した。線維細胞にも抗原提示能が存在することが知られており、アロのCD4陽性T細胞と線維細胞を共培養するとIL-17産生、VEGF、IL-6産生が増強した。線維細胞はTh2サイトカインの非存在下でも、CD4陽性T細胞との相互作用により、CD40/CD40Lの補助刺激とIL-17A,IL-17F産生を介して、気道リモデリングに関与する可能性が考えられた
アレルギー性気道炎症における2型システイニルロイコトリエン受容体の意義の解明

本年度はCysLT2R拮抗薬の、Th2細胞からのIL-5産生、モデルマウスにおける肺局所のTh2細胞ならびにILC2数、ならびにILC2細胞の活性化に及ぼす影響、およびILC2細胞上のCysLT1RならびにCysLT2Rの発現に及ぼす影響をそれぞれ検討した。(1)Th2細胞からのIL-5産生に及ぼす影響:Th2細胞は感作マウスへの最終ダニ抗原気管内投与24時間後、縦隔リンパ節から単細胞浮遊液を回収し、これを抗原刺激しIL-5産生を評価した。in vitro試験ならびにex vivo試験共に抗原刺激により顕著なIL-5産生が認められた。これに対し、CysLT2R拮抗薬はいずれの場合にもIL-5産生には影響を及ぼさなかった。(2)抗原刺激後の肺組織におけるTh2細胞/ILC2細胞の局在の確認と薬物の影響:最終抗原投与24時間後に還流肺から肺単細胞浮遊液を得た。両細胞共にそれぞれ細胞数および比率ともにダニ抗原投与群では増加が確認され、CysLT2R拮抗薬はいずれの細胞の細胞数および比率の増加を有意に抑制あるいは抑制する傾向を示した。(3)2型自然リンパ球(ILC2)の活性化に及ぼす影響: NaiveマウスにIL-33を反復気管内投与し、FACS Aria IIを用いてILC2を無菌的に単離し培養した。次いで、得られたILC2をCysLTsで刺激した際のIL-13産生量に及ぼす拮抗薬の影響を検討した。CysLTs刺激によりILC2細胞からはIL-13の産生が観察されたが、この産生はCysLT1R拮抗薬でのみ抑制された。また、ILC2上のCysLT1RならびにCysLT2Rの発現は同程度であった。いずれの実験も計画通り完了し、【研究実績の概要】で記したとおりの成果を得た。令和元年度はTh2細胞ならびにILC2細胞の局所集積あるいは免疫応答に重要な気道上皮細胞ならびに樹状細胞に及ぼすCysLTsの作用に焦点を絞り、下記のような実験を行う予定である。1)気道上皮細胞:Th2依存性ケモカイン産生の抑制(気道上皮細胞株上への両受容体の発現は免疫染色により確認済み)In vivo実験を模倣し、マウス気道上皮細胞株をIL-13存在下ダニ抗原で刺激する。この際、LTC4あるいはLTD4を添加し、CCL17 (TARC)あるいはCCL22 (MDC)のmRNA発現をreal-time PCRにて検討する(上昇が見られた場合には上清中のサイトカイン量をELISAにより定量する)。ケモカイン産生が見られた場合にはCysLT2RあるいはCysLT1R拮抗薬を添加し、その影響を検討する。2)樹状細胞:抗原捕捉ならびに抗原提示本年度はCysLT2R拮抗薬の、Th2細胞からのIL-5産生、モデルマウスにおける肺局所のTh2細胞ならびにILC2数、ならびにILC2細胞の活性化に及ぼす影響、およびILC2細胞上のCysLT1RならびにCysLT2Rの発現に及ぼす影響をそれぞれ検討した。

この際、LTC4あるいはLTD4を添加し、CCL17 (TARC)あるいはCCL22 (MDC)のmRNA発現をreal-time PCRにて検討する(上昇が見られた場合には上清中のサイトカイン量をELISAにより定量する)。ケモカイン産生が見られた場合にはCysLT2RあるいはCysLT1R拮抗薬を添加し、その影響を検討する。2)樹状細胞:抗原捕捉ならびに抗原提示昨年度は予想外に実験が順調に進み、当初、基礎検討を行う予定であった動物実験および試薬にかかる支出が減額となり、全体としては繰越金が生じた。本年度はこの資金を利用して、気道上皮細胞の培養において培地中で培養する実験系以外にair-liquid interface法と呼ばれる新たな培養系を確立し、実際に気道上皮細胞の先端部が空気に触れるような培養系と従来法との成績の差についても検討していく予定である。本実験系の導入にかかる費用として、今回生じた差額を使用していく予定である。具体的にはマウス気道から気道上皮細胞を採取し、一定期間、培地内で培養後、気液平衡が生ずる特殊培養ディッシュを用いて培養を行い、気液平衡の確認には経上皮抵抗値を測定する。抵抗値が上昇し、一定レベルを超えて維持された場合に上皮間バリアの形成が確立されたものとして実験に供する予定である。
NF-kB活性阻害剤の尿路上皮癌への抗癌剤としての応用

本研究において、これまでほとんど研究がなされていなかった進行性尿路上皮癌における転写因子NF-kBの役割と、新規NF-kB活性阻害剤DHMEQの作用、その阻害機構が解明された。これをもとに抗癌剤CPT-11によるNF-kB活性化をDHMEQにより抑制することにより、膀胱癌に対する抗腫瘍効果の増強が示された。DHMEQとCPT-11の併用は新規膀胱癌治療として期待できると考えられた。【目的】転写因子NF-κBは、免疫・炎症に深く関与するほか、アポトーシスを阻害する作用があることが知られている。このため、NF-κBを阻害する化合物は新しい抗癌剤として発展する可能性がある。DHMEQは抗生物質であるepoxyquinomicin Cの構造をもとに分子デザイン・合成された新規epoxydone化合物である。我々は本研究とは別に、DHMEQがホルモン抵抗性前立腺癌JCA-1細胞においてNF-κB活性を阻害し、in vitroおよびnude mouse xenograft modelにおいて抗腫瘍効果を示すこと、癌悪液質に対して抑制効果を有することを報告した。本研究では、各種サイトカイン産生ヒト尿路上皮癌細胞に対する、DHEMQによる、転写因子制御効果による癌細胞のサイトカイン産生抑制作用を検証し、癌に対する新規治療薬としての確立を目指すものである。具体的には、ヒト膀胱癌より樹立され、恒常的にNF-κBが活性化しているKU-19-19細胞を用いてDHMEQのNF-κB阻害効果を検討した。【方法および結果】DHMEQは20μg/mlでKU-19-19細胞の増殖を抑制し、細胞死を誘導した。さらに、xenograft modelにおいて抗腫瘍効果が示された。electrophoresis mobility shift assayを用いて検討したところ、DHMEQ10μg/ml処理後2-6時間でNF-κB活性が阻害された。GFP標識p65を用いた観察により、DHMEQはNF-κBの核移行を阻害していることが示された。DHMEQはIκBのリン酸化、分解には影響しなかった。【結論】以上より、DHMEQは、KU-19-19膀胱癌細胞において恒常的に活性化されたNF-κBを阻害する作用を持ち、分子標的治療薬となりうることが示された。【目的】転写因子NF-κBは、免疫・炎症に深く関与し、アポトーシスを阻害する作用も知られている。本研究初年度に、DHMEQが膀胱癌患者より樹立され、恒常的にNF-κBが活性化し、各種サイトカインを産生しているヒト尿路上皮癌細胞KU-19-19においてNF-κB活性を阻害することにより、in vitroおよびxenograft modelにおいて抗腫瘍効果を示すことを報告した。本年度においては、DHMEQによる、膀胱癌に対する新規治療薬としての位置づけを確立するため、抗癌剤CPT-11との併用による膀胱癌に対する殺細胞効果増強の検討を行った。【方法および結果】KU19-19細胞で、5μg/mL以上のDHMEQ単独、0.15ng/mL以上のSN38(CPT-llの代謝活性物)単独投与により濃度依存性に増殖抑制効果が認められた。無治療群と比較し、5μg/mLDHMEQ単独投与で18%、0.3ng/mL SN38単独投与で26%、両治療併用群で55%の細胞障害増強が示された。NF-κBはSN38単独投与で活性化されたが、DHMEQはこれを抑制した。さらにKU19-19マウス皮下腫瘍モデルを用し、て抗腫瘍効果を検討した。実験開始25日目におけるDHMEQ+CPT-11併用群の腫瘍体積(374±73cm^3)はDHMEQ単独群(1962±202cm^3)、CPT-11単独群(821±82cm^3)、無治療群(2675±238cm^3)と比較し有意に減少していた。併用治療群の組織内において有意なCD31、MMP-9の減少、アポトーシスの増加が認められた。【結論】以上より、DHMEQはCPT-llのNF-κB活性化を効率に抑制し、膀胱癌に対し抗腫瘍効果の増強を示した。DHMEQとCPT-llの併用は新規膀胱癌治療として期待できると考えられた。
「だけ」を含む否定文の獲得について

本研究の成果としては、まず「だけ」が主語もしくは目的語に付いた否定文に対して日本語児が大人と同様に別個の解釈を与えることができると言うことが明らかになり、幼児の日本語文法でも「階層的な」構造が形成されていることが示唆された。また、「だけ」が与格目的語に付いた否定文に対して日本語児が「だけ」が否定辞より広い作用域を取る解釈と狭い作用域を取る解釈のどちらも与えることができ、選好効果を示さなかったことからMusolino and Lidz(2006)の同形読み初期値(Isomorphism by Default)説というよりはHulsey et al.(2004)等の問答要件(Question Answer Requirement)説が支持されることを示した。L2日本語に関しては、日本語の主格目的格構文の獲得においてL1の効果が見られることが明らかになった。日本語は「pro肉だけを食べない」のように「だけ」が目的語に付いた場合(「肉だけではなく他のものも食べる」という)「ない」>「だけ」の読みが可能であるが、「和夫だけがpro食べない」のように「だけ」が主語に付いた場合には不可能となる。この違いは、否定辞が目的語はc統御するが主語はc統御しないことに因るもので、統語的制約が働いていると考えられている。子どもによる解釈もこの統語的制約に従ったものであれば、「ない」>「だけ」の読みを目的語+「だけ」の文で容認し、主語+「だけ」の文で却下するはずである。平成20年度はこの予測の検証を行った。19名(平均6才2ヶ月)の日本語児と20名の大人の日本語母語話者を対象に真理値判断法に基づく実験を試みた。分散分析の結果、「だけ」を含む否定文の解釈に際して子供も大人と同様統語的情報を用いていることが示唆された。先行研究では数量詞と否定辞が含まれる文、あるいはonly/[だけ]が含まれる文、の解釈を巡って盛んに議論がなされてきたが、「だけ」と否定辞が含まれる文に関しては先行研究がなく今回の実験で初めて子どもがどのような解釈を与えるのかが明らかになったことになる。また、今回の実験のように英語ではなく日本語で調べることにも大変重要な意義がある。英語と異なり日本語は主語も目的語も動詞に先行し、英語で問題となる語順の影響というものを排除できるからである。より確かな結論を得るためには今後引き続き実証的研究を重ねる必要があるであろう。「だけ」と否定辞が含まれる「和子だけにプリントを配っていない」のような二重目的語構文は曖昧であり、「和子だけではなく他の誰かにも配っている」という「だけ]の作用域が狭い読み(以下、狭い読み)と「配っていないのは和子だけ」という「だけ」の作用域が広い読み(以下、広い読み)の両方が可能である。平成21年度はこのような文に対して日本語児がどのような解釈を与えるのかを明らかにすることを目的とし、研究を行った。18名(平均5才4ヶ月)の日本語児と18名の大人の日本語母語話者を対象に真理値判断法に基づく実験を試みた。分散分析の結果、幼児の狭い読みと広い読みの平均容認度に有意差がなくどちらも容認していること、また幼児と大人との間にも有意差がないことが明らかになった。よって幼児は大人と同様に2通りの解釈が可能であることが示唆された。また狭い読みと広い読みそれぞれ偽となるような文脈で正しく排除できるのかという残りの問題についても調べた結果、どちらも容認度が低く、正しく排除していることが明らかになった。作用域を取る(scopal)要素が現れている否定文の解釈に関しては、Musolino and Liz(2006)のIsomorphism by Default説(ID説)とHulsey et al.(2004)等のQuestion Answer Requirement説(QAR説)が提唱されているが、英語児を対象にしたものが多く、日本語児を対象とした研究はまだ少ない。また、「だけ」のような焦点接辞が目的語位置に含まれている否定文についてもあまり調べられていない。本研究の実験結果はID説ではなくQAR説を支持するものであったが、日本語児を対象に焦点接辞が含まれている否定文について調べている点でも意義があると言えよう。1.目的語位置に「だけ」を含む否定文は2通りの解釈(「だけ」の作用域が否定辞より広い読みと狭い読み)が可能であるが、幼児が大人と同様にどちらの解釈も与えることができるのかについて21年度に調べた研究について日本言語学会で発表を行った。

実験の結果は大人と同様に幼児(18名、平均5歳3カ月)も上記の広い読みと狭い読みの両方を容認し(平均容認度はどちらも0.78)、Musohno and Lidz(2006)の同形読み初期値(Isomorphism by Default)説というよりはHulsey et al.(2004)等の問答要件(Question Answer Requirement)説に支持を与えるものであった。そもそも焦点助詞「だけ」が含まれる否定文について調べた研究はごく限られており、同じ幼「児が曖昧文の2つの解釈を同等に容認しているという報告もないことから、本研究により重要な知見が得られたことになる。2.「だけ」を含む否定文の解釈がL2日本語の主格目的語構文でどうなるかを調べる前段階として、L2日本語学習者による多重主語構文と主格目的語構文について調査を行った。母語が英語・中国語・韓国語のL2日本語学習者の発話コーパスを入手し、分析を行った。(i)両構文が母語に存在する韓国語母語話者は(他の言語母語話者と比べて)初級の段階から特に主格目的語の使用が豊富である、(ii)(中級でいったん母語の影響は見えなくなるが)上級で再度韓国語母語話者の主格目的語の使用頻度が他の言語母語話者と比べて高くなる。ただし、(iii)主格が標示されるべき非主語に対しての誤った格標示はごく限られたものであることが明らかになった。よってPrevost and White(2000)の表層的屈折欠如仮説(Missing Surface Inflection Hypothesis)と合致する興味深い結果を得たことになる。
摂食神経回路をモデルとした連合学習に伴うシナプス可塑性の単一細胞レベルでの解析

学習の神経基盤を理解するためには、まず学習による行動の変化をとらえ、その行動を制御する神経回路を同定し、その中で行動の変化を担う主要な箇所を同定した後に、学習の細胞メカニズムの解析へと進む必要がある(Tukahara et al., 1981)。本研究では、ショウジョウバエ摂食神経回路をモデルに、連合学習による動物行動の変化と、それを担うシナプスの可塑的変化を明確な因果関係のもとに対応付けて理解することを目指した。これまでに、新しい連合学習の実験系を開発し、学習前には応答を示さなかった条件刺激に対して、学習後には摂食神経回路の要に位置するFeeding neuronが活動し、吻伸展という摂食行動が起こるようになることを明らかにした。そこで最終年度は、学習後に観察される神経活動と動物行動の変化がFeeding neuronへと入力するシナプスの変化によって起きているのかを調べた。顕微鏡下で開頭した状態で545nmのレーザー光を、ハロロドプシン(eNpHR3.0)を発現させたFeedingneuronに照射した。条件刺激と無条件刺激の対呈示中にFeeding neuronの活動を抑制し、シナプスの強化を阻害すると、記憶形成が観察されなかった。その後、Feeding neuronへの光照射をせずに、同一個体を学習させたところ記憶形成が観察された。学習する能力はありながら、Feeding neuronの活動抑制によって、記憶形成が阻害されたと考えられる。さらに、対照実験として活動抑制のタイミングを条件刺激と無条件刺激の対呈示からずらした場合には、記憶形成が観察された。以上から、少なくとも部分的にはFeeding neuronへと入力するシナプスの強化によって記憶が形成されることが示唆された。学習の分子細胞メカニズムを単一細胞レベルで解明する道を拓く成果である。本研究の目的は、連合学習による分子・細胞レベルのミクロな変化と、行動レベルで観察されるマクロな脳機能の変化とを、単一細胞レベルの解像度で、明確な因果関係のもとに結びつけて理解することである。具体的には、キイロショジョウバエの摂食神経回路、特にその要に位置するFeeding neuronをモデルとし、神経活動やシナプス形態の変化と摂食行動の変化とを、同時にライブイメージングすることによって対応付ける。今年度はその第一歩として、ショウジョウバエを顕微鏡下で開頭した状態で記憶形成を観察することが可能な連合学習実験系を構築した。「つかんでいる棒をハエから離す」という条件刺激の直後に、無条件刺激としてショ糖溶液を与え、間隔をあけてこの操作をくり返すと、学習前は棒が離れても摂食行動を示さないのに対して、学習後には棒を離すだけで摂食行動が起こるようになった。実験の再現性を高めるために、棒を駆動するモーターを導入し、棒を動かすスピードを最適化した。また、無条件刺激として用いるショ糖溶液の濃度については、高すぎるとhabituationにより、学習効率が低下することがわかった。さらに、条件刺激と無条件刺激を提示する回数と間隔も複数のパターンを試し、長時間安定して記憶形成を観察できる実験条件を発見した。さらに、このとき同時にFeeding neuronの活動をCa2+イメージング法を用いて観察すると、学習前には応答を示さなかった条件刺激に対して、学習後には強く応答するようになることがわかった。Feeding neuronか、あるいは摂食神経回路内でより上流に位置するニューロンのシナプスが学習によって変化したのだと考えられる。今後は、記憶の保持や忘却過程においても解析を進めると共に、こうした神経活動と行動の変化を担う主要なシナプスの同定を試みる。神経活動を観察しながら、記憶を形成させる新しい学習実験パラダイムを構築することに成功し、連合学習に伴い摂食行動が変化するのと同時に、Feeding neuronの活動が変化することを明らかにすることができたため。本研究は、連合学習に伴う分子・細胞というミクロなレベルでのシナプスの可塑的変化と、マクロな脳機能の発露としての動物行動の変化を、同時観察によって結びつけ、単一細胞レベルの解像度で理解することを目的とする。学習の神経基盤を理解するためには、まず学習による行動の変化をとらえ、その行動を制御する神経回路を同定し、その中で行動の変化を主に担う箇所を同定した後に、学習の細胞メカニズムの解析へと進む必要がある(Tukahara et al., 1981)。これまでに、神経活動やシナプス形態のライブイメージングのために開頭したショウジョウバエに対して、古典的条件付けを行う新しい学習実験パラダイムの開発に成功し、学習によって摂食行動が変化するのに伴い、摂食神経回路の要に位置するFeeding neuronの活動が変化することを明らかにした。そこで、行動の変化を担う主要な可塑的変化がFeedingneuronでおこるのかを明らかにするために、本年度は光遺伝学的な手法を用いて、学習中にFeeding neuronの不活性化を行う実験系を構築した。具体的には、ハロロドプシン(eNpHR3.0)をFeeding neuron特異的に発現する系統を作出し、脳を露出させて光を照射した。まず脳全体に光を照射したところ、抑制効果が観られた光の強さでは、ハエが衰弱することが分かった。そこで、レーザー光をFeeding neuron周辺に限局して照射し、光の強さや照射時間を複数条件試した結果、照射中には顕著な摂食行動の抑制が観察される一方で、照射後は摂食行動に影響が観られない条件を見つけることができた。学習中に任意のタイミングで神経活動を操作することで、記憶の直接原因となるシナプスを同定する準備が整った。

また、生理食塩水の成分を見直した結果、開頭状態での学習実験をより安定して長時間行うことが可能となった。予定通りに、光遺伝学的な手法を用いて、学習中に任意のタイミングでFeeding neuronの活動を抑制する実験系を構築することができたため。脳への光照射によるダメージも最小限に抑える条件を見つけることができた。さらに、生理食塩水の成分を見直したところ、脳を露出させた状態でより安定して長時間の学習実験を行うことが可能となり、記憶が長期的に保持される分子細胞メカニズム解明にアプローチする道を拓くことができたため。学習の神経基盤を理解するためには、まず学習による行動の変化をとらえ、その行動を制御する神経回路を同定し、その中で行動の変化を担う主要な箇所を同定した後に、学習の細胞メカニズムの解析へと進む必要がある(Tukahara et al., 1981)。本研究では、ショウジョウバエ摂食神経回路をモデルに、連合学習による動物行動の変化と、それを担うシナプスの可塑的変化を明確な因果関係のもとに対応付けて理解することを目指した。これまでに、新しい連合学習の実験系を開発し、学習前には応答を示さなかった条件刺激に対して、学習後には摂食神経回路の要に位置するFeeding neuronが活動し、吻伸展という摂食行動が起こるようになることを明らかにした。そこで最終年度は、学習後に観察される神経活動と動物行動の変化がFeeding neuronへと入力するシナプスの変化によって起きているのかを調べた。顕微鏡下で開頭した状態で545nmのレーザー光を、ハロロドプシン(eNpHR3.0)を発現させたFeedingneuronに照射した。条件刺激と無条件刺激の対呈示中にFeeding neuronの活動を抑制し、シナプスの強化を阻害すると、記憶形成が観察されなかった。その後、Feeding neuronへの光照射をせずに、同一個体を学習させたところ記憶形成が観察された。学習する能力はありながら、Feeding neuronの活動抑制によって、記憶形成が阻害されたと考えられる。さらに、対照実験として活動抑制のタイミングを条件刺激と無条件刺激の対呈示からずらした場合には、記憶形成が観察された。以上から、少なくとも部分的にはFeeding neuronへと入力するシナプスの強化によって記憶が形成されることが示唆された。学習の分子細胞メカニズムを単一細胞レベルで解明する道を拓く成果である。今年度は短期記憶にしぼって神経活動と行動の同時観察を行ったので、長期記憶においても摂食行動の変化とFeeding neuronの活動の変化との対応関係を明らかにする。また、連合学習による神経活動ならびに摂食行動の変化の直接原因となる主要なシナプスを同定するために、チャネルロドプシンやハロロドプシンをFeeding neuron特異的に発現させるための系統を作出し、連合学習中にFeeding neuronの活動を操作する実験系を構築する。学習・記憶の分子細胞メカニズムを解明するために、学習による行動の変化を担うシナプスの同定を試みる。
住民投票の成立要件が有権者の投票行動に与える影響

市町村合併の是非を問う住民投票の多くで、その成立要件として、投票率が予め定められた水準(多くの場合50%)を超えなければならないというルールが設けられた。本研究の目的は、この成立要件が有権者の投票行動に与える影響を理論と実験により明らかにすることである。実験研究では、1セッション13人からなる住民投票実験を6セッション実施した。「投票前に見込まれる賛成派と反対派の人数比」と「最低投票率の水準」に応じて、どちらの派の有権者がどのくらい棄権するかを観察した。得られた結果は、各有権者は、多数派であることが見込まれる派に振り分けられた場合には最低投票率の水準にかかわらず投票する一方、少数派であることが見込まれる派に振り分けられた場合には、最低投票率が低ければ投票するが高いと棄権するというものであった。すなわち、最低投票率を高くしすぎると戦略的棄権が生じて不成立になりうることが確認された。今年度は理論研究を行い、その成果を論文Yoichi Hizen and Masafumi Shinmyo,"Imposing a Lower Bound on VoterTurnout,"HOPS Discussion Paper SeriesNo.6にまとめた。論文では、住民投票を(1)各有権者が賛成派と反対派のいずれかにランダムに振り分けられる、(2)各有権者は、他の有権者たちがどちらの派に属するかを知らないまま(ただし、各派に属する確率は知っている)、賛成に投票するか、反対に投票するか、棄権するかを選ぶ、(3)投票率が予め定められた水準を上回ったら住民投票は成立し、より多くの票を得た選択肢が選ばれる、という不完備情報静学ゲームで表現したうえで、成立要件の水準に応じて有権者たちの投票行動(ベイジアン・ナッシュ均衡)がいかに影響されるかを導出した。その結果、成立要件が課されない場合には賛成派は賛成に、反対派は反対に投票し、投票率100%が達成されるという極端な状況を考えても、成立要件が課されると複数均衡が発生し、その多くで、負けそうな派の有権者たちが住民投票の不成立を狙って戦略的に棄権することが示された。この結果は、これまで数値計算でしか証明されていなかったが、この論文では解析的に証明している。また、低投票率のため不成立となった住民投票の事例として、2005年1月に実施された石狩市の2村との合併の是非を問う住民投票に触れ、理論的帰結のインプリケーションを吟味している。