hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
環境化学物質の脳発達への影響：培養シナプス形成系と遺伝子発現解析による評価

子どもの脳の発達障害の一因として、環境化学物質の影響が懸念されている。本研究では、リスク評価が不十分な農薬ネオニコチノイドの低用量長期曝露の影響を、発達期のラット小脳神経細胞培養を用い、遺伝子発現の変化から発達神経毒性を調べた。ニコチン、ネオニコチノイド2種を低濃度で2週間曝露した小脳培養のmRNAをDNAマイクロアレイで解析し統計処理した結果、複数の遺伝子で1.5倍以上の有意な発現変動を確認した。3種の処理で共通に変動した遺伝子には、シナプス形成に重要なカルシウムチャネルやG蛋白質共役受容体などが含まれており、ネオニコチノイドはニコチン同様に子どもの脳発達に悪影響を及ぼす可能性が確認された。今年度も、ネオニコチノイド系農薬イミダクロプリド、アセタミプリドについて研究を進めた。ネオニコチノイドは近年使用量が急増している農薬で、ニコチン類似構造をもち、昆虫選択毒性が高くヒトには安全性が高いと宣伝されているが、ヒトへの影響、中でも子どもの脳発達への影響が懸念されている。ネオニコチノイドは神経伝達物質アセチルコリンの受容体の一種、ニコチン性受容体にアゴニスト作用をもつ。ニコチン性受容体はヒトでは末梢神経、自律神経で主要であるだけでなく中枢神経でも重要で、さらに免疫系など非神経組織でも多様な生理機能をもっている。脳の発達過程でもニコチン性受容体が成体よりも多く発現して、正常なシナプス・神経回路形成に関与していることが分かっている。これまでに我々は、ラット小脳培養系を用いて、ネオニコチノイドの作用をニコチンと比較して調べたところ、ネオニコチノイド2種がこれまで報告されている結合実験の結果よりも、よりニコチンに近い反応性を示した。ニコチンが子どもの発達に悪影響を及ぼすことが確認されていることから、ネオニコチノイドがヒトの脳発達へ悪影響を及ぼすことが示唆され、その結果を2012年PlosOneに発表した。今年度の研究は、昨年に続きネオニコチノイドの脳発達への影響を、DNAマイクロアレイを用いた系で検討を進めた。複数腹のラット新生仔の小脳培養を用意し、ネオニコチノイドとニコチンを添加して培養し、シナプス形成期にmRNAを抽出して、DNAマイクロアレイにて網羅的に遺伝子発現を解析し、統計処理を行ったところ、神経回路形成に関わる多数の遺伝子発現に有意な変化が確認された。変動した遺伝子のうち、脳発達に重要と考えられる遺伝子について、リアルタイムPCRで確認を進めており、現在のところ多くの遺伝子がDNAマイクロアレイとリアルタイムPCRで共に発現変動が確認されている。今年度は、研究実績のあるネオニコチノイド系農薬イミダクロプリド、アセタミプリドについて主に研究を進めた。ネオニコチノイドは昆虫選択毒性が高く、ヒトには安全性が高いと宣伝され使用量が急増しているが、一方で哺乳類やヒトへの影響が懸念されている。ネオニコチノイドはニコチンと似た構造を持ち、神経伝達物質アセチルコリンの受容体の一種、ニコチン性受容体にアゴニスト作用をもつ。ニコチン性受容体はヒトでは末梢神経だけでなく中枢神経でも重要で、さらに免疫系など非神経組織でも生理機能をもっている。また脳の発達過程でもニコチン性受容体は多量に発現して、正常な神経回路形成に関与していることも分かっている。これまでに我々は、ラット小脳培養系を用いて、ネオニコチノイド系農薬の作用をニコチンと比較して調べたところ、ネオニコチノイド2種がニコチン同様に1μM以上で興奮性カルシウム流入を起こし、その反応が特異的アンタゴニストにより阻害されることを見出した。このネオニコチノイドの作用はニコチンに比べると多少低いものの、これまで報告されている結合実験の結果よりも、よりニコチンに近い反応性を示した。以上より、ネオニコチノイドはヒトの発達期の脳へニコチン様の悪影響を及ぼすことが示唆され、その結果を2012年PlosOne、欧州神経科学学会で発表した。今年度はラット新生仔の小脳、胎仔の海馬、大脳皮質の培養神経細胞にこれらのネオニコチノイドとニコチンを添加して培養し、シナプス形成期にmRNAを抽出して、DNAマイクロアレイにて網羅的に遺伝子発現を解析したところ、神経回路形成に関わる多数の遺伝子発現に変化が確認された。この結果を2012年環境ホルモン学会で発表した。今年度も、ネオニコチノイド系農薬イミダクロプリド、アセタミプリドの発達神経毒性について研究を進めた。ネオニコチノイドは害虫に選択毒性が高いとされ、世界中で多用されてきたが、ハチなど昆虫からトリに至るまで多くの生命や生態系に有害であることが明らかとなり、欧米では規制強化が進んでいる。ネオニコチノイドの標的であるニコチン性アセチルコリン受容体は、リガンドのアセチルコリンと共に、単細胞生物から高等動物に至るまで重要な情報伝達系を担っており、リガンド結合部位は特に類似性が高いため、害虫以外に悪影響を持つ可能性が高い。さらにネオニコチノイドはヒトを含む哺乳類への影響、特に子どもの脳発達への影響が懸念されている。ニコチン性受容体はヒトでは末梢神経、自律神経で主要であるだけでなく中枢神経でも重要で、その上免疫系など非神経組織でも多様な生理機能をもっている。脳の発達過程でもニコチン性受容体が成体よりも高発現し、正常なシナプス・神経回路形成に関与している。

これまでに我々は、ラット小脳培養を用いて、ネオニコチノイドの作用をニコチンと比較して調べ、ネオニコチノイド2種がこれまで報告されている結果よりも、よりニコチンに近い反応を示すことを明らかにした。ニコチンが子どもの発達への有害性が確認されていることから、ネオニコチノイドがヒトの脳発達へ悪影響を及ぼすことが示唆された。本研究では、ネオニコチノイドの脳発達への影響を、DNAマイクロアレイを用いて検討を進めた。ラット新生仔の小脳培養に、ネオニコチノイドを添加して培養し、シナプス形成期にmRNAを抽出して、DNAマイクロアレイにて網羅的に遺伝子発現を解析したところ、神経回路形成に関わる重要な遺伝子発現に有意な変動が確認された。変動した遺伝子のうち、重要なものについて、リアルタイムPCRで調べたところ、多くの遺伝子で発現変動が確認された。最終年度、ネオニコチノイド(ネオニコ)系農薬イミダクロプリド、アセタミプリドの発達神経毒性について、これまでの研究結果を再考し必要な実験を行い、論文にまとめて国際誌に投稿中である。ネオニコは害虫に選択毒性が高いとされ、世界中で多用されてきたが、ハチなど益虫などにも有害であることが明らかとなり、欧米では規制強化が進んでいる。ネオニコの標的であるニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)は、リガンドのアセチルコリンと共に、単細胞生物から高等動物に至るまで重要な情報伝達系を担っており、リガンド結合部位は特に類似性が高いため、害虫以外に悪影響を持つ可能性がある。nAChRはヒトでは末梢・自律神経で主要であるだけでなく中枢神経でも重要で、その上、脳の発達過程でもnAChRが成体よりも高発現し、正常なシナプス・神経回路形成に関与している。そのためネオニコはヒトの子どもの脳発達への影響が懸念されている。これまで我々は、ラット新生仔小脳培養を用いて、ネオニコの作用をニコチンと比較して調べ、ネオニコ2種がこれまで報告されている結果よりも、よりニコチンに近い反応を示すことを明らかにした。本研究では、ネオニコの脳発達への影響を、遺伝子発現に着目して研究を進めた。ラット新生仔の小脳培養に、ニコチン、ネオニコを1μM添加して約2週間培養し、シナプス形成期にmRNAを抽出して、DNAマイクロアレイにて網羅的に遺伝子発現を解析した。6回のアレイの結果を統計解析したところ、1.5倍以上有意に発現変動する遺伝子がニコチン、ネオニコで各々数十見つかった。そのうち約20の遺伝子についてリアルタイムPCRで発現変動を確認した。ニコチン、ネオニコで共通に変動する9つの遺伝子には、脳発達に重要なカルシウムチャネルやG蛋白共役受容体が含まれていた。ネオニコはニコチン同様に哺乳類の脳発達に悪影響を及ぼす可能性がある。子どもの脳の発達障害の一因として、環境化学物質の影響が懸念されている。本研究では、リスク評価が不十分な農薬ネオニコチノイドの低用量長期曝露の影響を、発達期のラット小脳神経細胞培養を用い、遺伝子発現の変化から発達神経毒性を調べた。ニコチン、ネオニコチノイド2種を低濃度で2週間曝露した小脳培養のmRNAをDNAマイクロアレイで解析し統計処理した結果、複数の遺伝子で1.5倍以上の有意な発現変動を確認した。3種の処理で共通に変動した遺伝子には、シナプス形成に重要なカルシウムチャネルやG蛋白質共役受容体などが含まれており、ネオニコチノイドはニコチン同様に子どもの脳発達に悪影響を及ぼす可能性が確認された。
日本企業における人事管理の公正性に関する理論的実証的研究

本研究の目的は,近年の日本企業の人事処遇制度の実態を把握し,特に従業員の知覚する公正感に資する人事制度について検討することであった。具体的には,企業の人事管理における公正性の位置づけ,そして,従業員の公正感の規定因の解明である。研究の結果,人事制度の運用要因(正社員転換の難易度,処遇の比較対象)と,組織行動要因(時間展望志向,倫理的リーダーシップ)により,従業員の公正感が変化することが明らかになった。本研究の目的は,近年の日本企業の人事処遇制度の実態を把握し,特に従業員の知覚する公正感に資する人事処遇制度について検討することである。その検証を行う上で初年度である平成27年度は,既存研究の理論や枠組みにおいて,企業内の従業員が公正についてどのように捉えるかといった課題を中心に,仮説構築や調査実施のための文献研究に注力した。また,日本企業における人事管理の公正の実態を把握するために,複数企業の人事担当者にインタビューを実施し,企業における公正の捉え方や人事上の課題等について聴取を行った。そのほかには,次年度以降の実証調査に向けての分析フレームワークの構築と,いくつかの企業におけるインタビュー及び質問紙調査についての実施準備も行われた。既に質問紙調査の設計は済んでおり,インタビューについても依頼済みで今後具体的な日程調整等が進むものと見込まれる。また,これとは別に,上記文献研究の成果と,それをもとに過去に実施済みの質問紙調査の再分析を行い,その結果を論文として執筆済みであり,ディスカッションペーパー及び公刊論文としている。公刊論文においては,公正や人事管理に関する文献を中心にレビューし,既存研究における公正概念の意義と課題について,実証研究に向けたいくつかの視点を提供した。ディスカッションペーパーにおいては,別の調査で実施済みの質問紙調査のデータを再分析し,従業員の公正感の規定因としての人事管理方針などに着目し,この影響が雇用形態(正社員・非正社員)によって変容する可能性等が示唆される結果を得て,原初的なモデルを提示した。また,そうした理論的検討を基に執筆した論文を,査読付き雑誌へ投稿済みである。本研究の進捗については概ね当初の計画通りに進んでいると考えられる。当初の計画において初年度は日本企業における人的資源管理に関する諸研究や公正公平に関する先行研究の分析が予定されており,これらは概ね計画通り実施されている。一部にまだ検討が不十分な研究領域もあるものの,次年度以降のインタビュー,質問紙調査を行うにあたって必要な文献研究は実施済みであり,実施にあたり特段の問題はない。また,質問紙調査については既に質問項目が確定しており,インタビュー調査の計画も対象者などの詳細が検討されており,調査の準備状況は初年度の計画に比して進捗状況は良好であると考えられる。その検証を行う上で2年目である平成28年度は,既存研究の理論や枠組みにおいて,組織内の構成員が公正についてどのように捉えるかといった課題ならびに,その人事管理の方法に関する文献研究及び実態把握を中心に注力した。28年度に引き続き,日本企業における人事管理の公正の実態を把握するために,昨年度実施した複数企業の人事担当者にインタビューをもとに,企業における公正の捉え方や現状の課題等についての分析フレームワークの構築を行い,いくつかの企業における質問紙調査の準備及び実施も一部で行われた。上記文献研究の成果と,それをもとに過去に実施済みの質問紙調査の再分析を行い,その結果を論文として執筆済みであり,ディスカッションペーパー及び公刊論文,学会での口頭発表といった成果を出しつつある。公刊論文においては,公正や人事管理に関する文献を中心にレビューし,既存研究における公正概念の意義と課題について,働き方の観点から実証研究を行った。ディスカッションペーパーにおいては,質問紙調査のデータを再分析し,従業員の公正感の規定因としての人事管理として正社員登用制度などに着目し,この影響が雇用形態(正社員・非正社員)によって変容する可能性等が示唆される結果を得て,理論的なモデルを提示している。こうした研究成果をもとに昨年度投稿した査読付き雑誌へ論文について,査読者のコメントに対応し再投稿を行う等,引き続き研究成果を外部に発信するための執筆・発表等を行っている。当初の計画において28年度は仮説の構築およびアンケート調査の設計,実施を計画する予定であったが,これらは概ね計画通りに進展している。一部にまだ検討が不十分な分析手法やフレームワークもあるものの,最終年度として学術的な成果を発信するにあたって必要な文献研究は実施済みであり,分析に用いるデータ等についても,一部ではすでに実施済みのものもあるなど,特段の問題はない。追加的に行う予定の質問紙調査については既に質問項目が確定しており,計画に比して進捗状況は良好であると考えられる。具体的には,企業の人事管理における処遇の公正性はどのように位置づけられ,どのように扱われてきたのか。あるいは,実際の従業員が処遇の公正性をどのようなものと捉えているのか。本研究ではこれらの課題について,明らかにすることを目的としてきた。最終年度の平成29年度は,当初の予定通り,先行文献の渉猟をもとに質問項目を作成し,正社員を対象とした質問紙調査の実施とその分析結果をまとめ,論文や学会報告を通じて研究成果の発表が行われた。

研究の結果,時間展望志向,倫理的リーダーシップ,そして処遇の比較対象といった要因により従業員の公正感が影響され,更にそうした関係は例えば正規非正規といった雇用形態によっても変容しうることが明らかにされた。本研究では特に分配的公正理論の視点から人々の公正感の下位概念を規定し,マネジメントの観点から公正感を取り扱ってきた。その中で,特に上司部下間の関係性が停滞している際には,上司による倫理的な行動が公正感を高めることから,処遇に不公平感が蔓延している際の直属上司の行動が重要となる。個人の志向としては,過去を肯定しつつ未来をもしっかりと見据えるような時間展望を持つ従業員ほど,現在の処遇に公正性を知覚する傾向がある。以上のような分析結果から,目先の処遇に囚われず,長期的な視野から前向きな展望を持てるよう涵養するような人事処遇制度や,直属上司による人材育成に展開されていくことが,従業員の公正性の観点からは求められることが示唆されている。本研究の目的は,近年の日本企業の人事処遇制度の実態を把握し,特に従業員の知覚する公正感に資する人事制度について検討することであった。具体的には,企業の人事管理における公正性の位置づけ,そして,従業員の公正感の規定因の解明である。研究の結果,人事制度の運用要因(正社員転換の難易度,処遇の比較対象)と,組織行動要因(時間展望志向,倫理的リーダーシップ)により,従業員の公正感が変化することが明らかになった。平成28年度においては,当初の研究計画のとおり,インタビュー調査と質問紙調査が実施される予定である。インタビュー調査に関しては既に初年度に調査の打診と内諾を得ており,今後具体的にその調査設計が,企業の人事担当者との打ち合わせを通じて確定する見込みである。質問紙調査に関しても,別の企業において既に先方との打ち合わせで質問項目の絞り込みの計画にあり,平成28年度中に実施される確度は高いものと推定される。研究成果に関連しては,既に学会報告での予定があるほか,学術雑誌への投稿が既になされており,これらの成果がある程度期待されるほか,上記調査結果の分析を通じた研究成果も適宜発表・執筆される見込みである。それ以外にも追加的に必要となる最新の学術的知見を得るために,各種学会への参加や発表等も予定される。平成29年度においては,当初の研究計画のとおり,質問紙調査の実施及び分析と研究成果の発表がなされる予定である。質問紙調査に関しては,前年度までに一部実施済みであり,追加的に行う調査についても当初の計画通りである。研究成果に関連しては,既に学会報告での予定があるほか,学術雑誌への投稿が既になされており,更に別の論文も現在執筆,投稿予定である。一部は修正後再査読という査読結果も返ってきているが,今後これらの成果がある程度期待されるほか,上記調査結果の分析を通じた研究成果も適宜発表・執筆される見込みである。
幼児の体力・運動能力の発達を促す新しいジャンプ運動プログラムの開発

幼児期の体力・運動能力は、その後の運動発達や健康増進の基礎になるため、積極的に高めていく必要がある。本研究では、基礎的な運動能力である跳躍能力、疾走能力および調整力を効果的に発達させるための方策として、幼児期のリバウンド型ジャンプの発達過程およびその特性に基づく運動プログラムを開発する。その過程では、PDCAサイクルを利用することで各年齢・発達段階に合わせたより効果的な運動内容への改良を検討していく。そして、科学的なエビデンスとPDCAサイクルによって得られた実践知に基づく、より効果的な幼児の体力・運動能力の発達を促す新しいジャンプ運動プログラムを開発する。
唾液腺腫瘍細胞の増殖に影響を与える細胞周期制御因子と基質成分の解析

唾液腺腫瘍の増殖に関わる細胞周期制御因子の異常と細胞外基質成分、アポトーシス関連タンパクの発現を中心に検討し、以下の結果を得た。1.腺様嚢胞癌(ACC)において、cyclin D1,cyclin dependent kinase inhibitor(p27,p21,p16),Rb,p53の異常について検討し、ACCではp27の発現低下が腫瘍細胞の増殖促進に強く関わっていることが示された。また、p27タンパクの発現低下が予後判定因子として有用であることも明らかとなった。さらに、培養細胞を用いた検討により、p27タンパクの発現低下は、proteasomeを介した分解の亢進に基づくことが明らかとなり、分解を抑制することによる新しい治療法の可能性が示唆された。2.唾液腺腫瘍ではbcl-2とbaxが種々の程度に発現されていたが、細胞増殖活性の低い腺房細胞癌では相対的にbcl-2が強く発現され、腫瘍細胞のアポトーシスが抑制されていることが明らかとなった。一方、細胞増殖活性の高い低分化な腫瘍では、逆にbaxが強く発現され、細胞分裂による増殖の促進とアポトーシスによる細胞の消失の両者が同時に起こっている可能性が示唆された。3.多形性腺腫では、各種glycosaminoglycanが腫瘍細胞によって産生されており、特にheparan sulfateは、細胞外基質には存在せず、より分化の高い腫瘍細胞の核に局在していたことから、細胞増殖の抑制と分化の促進に働いている可能性が示された。Proteoglycanのなかでは、aggrecanとbiglycanが上皮細胞間や特異的な基質成分中に存在し、腫瘍性筋上皮細胞による産生が示唆された。免疫電顕により、各種glycosaminoglycanとaggrecanの腫瘍性筋上皮細胞による産生と分泌が明らかとなった。唾液腺腫瘍細胞の増殖活性の促進に影響を与えると考えられる細胞周期制御因子の異常および間質成分、腫瘍細胞のアポトーシス抵抗性について、主に臨床材料を用いて検討し、以下の知見を得た。1.悪性唾液腺腫瘍のなかで発生頻度の高い腺様嚢胞癌を対象に、cyclin/cyclin dependent kinase(CDK)複合体の阻害タンパクであるp27の発現と臨床態度との関係を調べた結果、p27の発現が減弱消失している症例は有意に高頻度に転移を起こし、予後不良であることが明らかとなった。一方、同じくcyclin/CDK複合体阻害タンパクであるp21の発現はほとんどの症例で保たれており、腺様嚢胞癌では、p21の増殖促進・転移への関与は少ないものとみなされた。2.唾液腺炎ならびに各種唾液腺腫瘍におけるアポトーシス関連タンパク(bcl-2,bax)の発現を調べた結果、唾液腺炎では腺房細胞でbaxの発現が上昇し、アポトーシスに対する感受性が高まっていることが示唆された。一方、唾液腺腫瘍での両タンパクの発現は様々で、多形性腺腫、基底細胞腺腫や腺様嚢胞癌ではしばしば腺腔形成細胞にbaxの、外層細胞にbcl-2の明瞭な発現が観察されたのに対して、腺房細胞癌では腫瘍細胞全体がbcl-2をbaxよりも強く発現し、アポトーシス抵抗性であることが示唆された。また、粘表皮癌では分化の程度により発現の違いが観察され、高分化型では両タンパクともに強く発現されていたが、低分化型ではbaxの発現がより強く、細胞増殖活性とアポトーシス感受性との間に関連のあることが考えられた。

3.多形性腺腫で細胞外マトリックスであるグリコサミノグリカンの発現と局在を調べた結果、軟骨様域や上皮域に核にヘパラン硫酸の局在を示すものがあり、それらは増殖活性が低く、より分化の進んだ細胞であることが示唆された。唾液腺腫瘍細胞の増殖活性の促進に影響を与えると考えられる細胞周期制御因子の異常および間質成分の局在について臨床材料ならびに細胞株を用いて検討し、以下の知見を得た。1.前年度、臨床材料を用いて腺様嚢胞癌(ACC)ではcyclin/cyclin dependent kinase(CDK)複合体の阻害タンパクであるp27の発現低下が転移巣の形成と予後不良に関係することを報告したが、今年度はACC培養細胞株(ACCh,ACC3)を用い、p27の発現低下のメカニズムについて検討を加えた。その結果、mRNAレベルではいずれの細胞株でも明瞭な発現が認められるもののタンパク量には大きな違いがみられ、プロテアソームを介した分解課程の促進が発現低下に大きく関わっていることが明らかとなった。2.同じくcyclin/CDK複合体の阻害タンパクであるp16は、良性悪性問わず明瞭な発現が認められ、唾液腺腫瘍細胞の増殖促進への関与は低いことが示された。3.前年度、多形性腫瘍を対象に光顕レベルで細胞外マトリックスであるグリコサミノグリカン(GAG)の発現と局在を調べたのに引続き、今年度は電顕免疫組織化学的にGAGとプロテオグリカンの一種であるアグリカンの細胞内局在を観察した。その結果、これらはnon-luminal cellの細胞内空砲に認められ、一部はGolgi complexに由来していた。一方、ヒアルロン酸は細胞膜内面に局在していた。以上の結果は、GAGやアグリカンは腫瘍細胞、特に腫瘍性筋上皮細胞によって産生されていることを直接的に証明するもので、それらが腫瘍細胞の分化・増殖に影響を与えているが示唆された。
アポトーシスを誘導する細胞表面抗原:Fasのリガンド遺伝子のクローニング

FasはTNF受容体と類似のI型膜貫通蛋白質で、特異抗体との反応により細胞死(アポトーシス)を誘導する。本研究では、Fasを受容体とする細胞死誘導因子(Fasリガンド;以下FasL)の同定とその遺伝子の単離を目指し、以下の成果を得た。1.マウスFasの細胞外部分とヒトIgGlのFc部分からなる可溶性キメラ蛋白を調製し、これを用いてCTLハイブリドーマPC60-d10S(以下d10S)細胞上のFasLを同定した。2.d10Sのサブラインより、細胞死誘導活性をもつFasLを分子量40kDの膜糖蛋白質として精制した。3.d10SサブラインのcDNAライブラリーよりラットFasL cDNAを単離し、FasLがTNFファミリーに属するII型膜蛋白質であることを示した。4.このcDNAをプローブとして、ヒト及びマウスFasL染色体遺伝子を単離した。さらにヒト末梢血リンパ球及びマウス脾細胞のConAブラストのmRNAよりリバースPCR法でcDNAを作製した。5.ヒト及びマウスFasL遺伝子は、いずれも第1染色体の相同領域存在することを示した。6.この領域にはマウスgla突然変異がマップされていたが、野性型及びglaマウス由来のFasLcDNAを比較し、glaはFaSL遺伝子の点変異による機能欠損型突然変異であることを示した。我々は以前、lprマウスがFas遺伝子の突然変異体であることを示したが、両突然変異でT細胞の発生異常によるリンパ腫と自己免疫疾患を引き起こすことから、FasLは自己反応性T細胞の除去の過程で重要な働きをしていると考えられる。7.マウスFasL mRNAは、臓器ではリンパ系器官(胸腺、脾臓、リンパ節)及び肺、小腸、精巣で、また長期継代培養細胞株ではT細胞系統の細胞で特異的に発現することを示した。8.ヒトまたはマウスのFasLを発現させた細胞は、ヒトまたはマウスのFasを発現させた細胞を同等に傷害した。すなわち、ヒト、マウス間で、Fas/FasL相互作用に種特異性が存在しないことを示した。Fas抗原はTumor Necrosis Factor(TNF)リセプター、Nerve Growth Factor(NGF)リセプターと類似の細胞膜貫通タンパク質で、特異抗体との反応により発現している細胞自身にアポトーシスを誘導する。我々はFas抗原をリセプターとする未同定のリガンドが存在すると考え、Fasリガンドの同定と、その遺伝子の単離を試みた。1)まず、マウスFas抗原の細胞外部とヒトIgG1のFc部分からなる可溶性のキメラ蛋白(mFas-Fc)をコードするキメラ遺伝子を作製、発現させ、mFas-Fcを大量調製した。2)Fas抗原を発現する細胞のみを特異的に傷害するCTLハイブリドーマ(ラットxマウス)PC60-d10S(以下d10S)において、mFas-Fcがd10SのFas抗原依存性細胞傷害活性を特異的に阻害すること、mFas-Fcがd10Sに特異的に結合することをフローサイトメトリーを用いて示し、d10SがFasリガンドを発現していることを明らかにした。

3)フローサイトメトリーを用いて、mFas-Fcにより強く染色される細胞を繰り返しソーティングすることにより、Fasリガンドを強く発現するサブラインを樹立した。4)このd10Sサブラインの膜画分を1%NP-40で可溶化し、その遠心上清よりmFas-FcカラムとConcanavalin Aagarose beadsを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより分子量40kDの糖タンパク質(gp40)を精製した。5)この精製gp40はそれ単独で、Fas抗原を発現する細胞に対し特異的に細胞死を誘導し、機能的なFasリガンドであることを明かにした。さらに、6)d10SサブラインよりcDNA libraryを作製し、COS細胞に発現させ、mFas-Fcを用いたパニング法によりFasリガンドcDNAの単離に成功した。このFasリガンドcDNAはラット由来のものであった。7)単離されたラットFasリガンドcDNAは、278アミノ酸からなり、TNF/NGFファミリーに属するタイプII膜蛋白質をコードしていた。8)ノーザンブロット法により、精巣及び活性化された脾細胞と胸腺細胞でFasリガンドmRNAが発現していることを見いだした。FasはTNF受容体と類似のI型膜貫通蛋白質で、特異抗体との反応により細胞死(アポトーシス)を誘導する。本研究では、Fasを受容体とする細胞死誘導因子(Fasリガンド;以下FasL)の同定とその遺伝子の単離を目指した。平成5年度には、CTLハイブリドーマ(ラットxマウス)PC60-d10S細胞がFasLを発見していることを明らかにし、さらにラットFasL cDNAを単離し、FasLがTNFに類似のII型膜貫通蛋白であることを明らかにした。本年度は以下の成果を得た。1.ラットFasL cDNAをプローブとして用いてヒト及びマウスFasL染色体遺伝子を単離し、いずれも全長約8kb、4個のエクソンからなることを明らかにした。さらにヒト末梢血リンパ球あるいはマウス脾細胞のConAブラストのmRNAよりリバースPCR法でcDNAを作製した。2.ヒト及びマウスFasL遺伝子は、いずれも第1染色体の互いに相当する領域に存在することを明らかにした。3.この領域にはgld突然変異がマップされていたが、野生型及びgldマウス由来のFasL cDNAを比較し、gldはFasL遺伝子の点変異による機能欠損突然変異であることを明らかにした。我々は以前、lprマウスがFas遺伝子の突然変異体であることを明らかにしたが、両突然変異でT細胞の発生異常によるリンパ腫と自己免疫疾患を引き起こすことから、FasLは自己反応性T細胞の除去の過程で重要な働きをしていると考えられる。4.マウスFasL mRNAは、臓器ではリンパ系器官(胸腺、脾臓、リンパ節)及び肺、小腸、精巣で、また長期継代培養細胞株ではT細胞系統の細胞で特異的に発現することを明らかにした。5.ヒトまたはマウスのFasLを発現させた細胞は、ヒトまたはマウスのFasを発現させた細胞を同等に傷害した。すなわち、ヒト、マウス間で、Fas/Fasリガンド相互作用に種特異性が存在しないことが明らかになった。
肝臓―膵β細胞間神経ネットワークの生理的意義の解明

アセチルコリンや複数の迷走神経由来神経ペプチドを単離膵島に同時に作用させることで膵β細胞増殖が亢進することを見出した。この際に膵β細胞においてFoxM1経路が活性化していることを発見した。さらにこれらの変化は、遺伝子導入による肝臓ERK経路活性化によって肝臓ー膵β細胞間神経ネットワークを"ON"にした場合、あるいは神経ネットワークが活性化している肥満モデルマウスの膵島においても認められた。本研究では研究代表者が明らかにした肝臓ー膵β細胞間神経ネットワークにおいて、膵迷走神経シグナルから膵β細胞増殖にいたる細胞内シグナル伝達経路を明らかにすることを目的とした。研究代表者はすでにアセチルコリンを含む迷走神経由来因子を作用させることにより膵β細胞増殖が亢進することを見出している。これらの迷走神経由来因子を作用させた単離膵島では、細胞増殖において重要な働きを有する細胞周期関連の遺伝子の発現が有意に増加し、BrdU陽性を示す増殖細胞が増加した。さらにこの現象はマウスin vivoにおいて臓器間神経ネットワークにより膵β細胞が増殖する際にも認められる。本研究では迷走神経由来因子のうち、アセチルコリンに着目して検討を進めた。アセチルコリンは膵β細胞においてムスカリン3(M3)受容体を介してインスリン分泌を亢進することが知られている。そこで、アセチルコリンによる膵β細胞増殖におけるM3受容体の関与を検討するために、M3受容体ノックアウトマウスにおいて臓器間神経ネットワークを"ON"にした際の膵β細胞増殖効果を検討した。その結果、M3受容体ノックアウトマウスでは臓器間神経ネットワークによる膵β細胞増殖が起こりにくい傾向があることが明らかになった。さらにM3受容体ノックアウトマウスから単離した膵島にアセチルコリンを含む迷走神経由来因子を作用させたところ、細胞増殖において重要な働きを有する細胞周期関連遺伝子の発現上昇やBrdU陽性細胞の増加が有意に抑制されることが明らかになった。今後さらに、臓器間神経ネットワークを"ON"にした際にin vivoにおいて膵β細胞に対する迷走神経由来因子の作用が増加しているのかを検討する予定である。本研究の目的は肝臓ー膵β細胞間神経ネットワークにおいて、迷走神経シグナルから膵β細胞増殖にいたる細胞内シグナル伝達経路を明らかにすることである。研究代表者はすでに、アセチルコリンを含む迷走神経由来因子を単離膵島に作用させることで膵β細胞増殖が亢進することを見出している。この際に膵β細胞内で起こる遺伝子発現変化を網羅的に解析した結果、細胞増殖に重要と考えられている転写因子と細胞周期関連の遺伝子が大きく変化していることを発見した。さらにこれらの変化はマウスin vivoにおいて臓器間神経ネットワークを活性化して膵β細胞が増殖する際にも認められた。そこでこの転写因子の膵β細胞特異的ノックアウトマウスを作成して検討を行ったところ、これらのマウスでは臓器間神経ネットワークを"ON"にした際の膵β細胞増殖が著明に抑制されることが明らかになった。この神経ネットワークは肥満の際に活性化することから、このノックアウトマウスに高脂肪食を負荷して肥満にした際の代償性の膵β細胞増殖を検討したところ有意に抑制された。これらの結果から迷走神経由来因子は膵β細胞に作用してこの転写因子依存性に膵β細胞増殖を亢進することが示された。肥満状態での、肝臓ー膵β細胞間神経ネットワークにおける迷走神経由来因子による膵β細胞増殖機構が明らかになりつつあることから、当初の予定通りに研究が進展しているものと考える。本研究の目的は肝臓ー膵β細胞間神経ネットワークにおいて、どのような迷走神経因子が作用して膵β細胞増殖を起こすのか、またそれらの因子がどのような膵β細胞内シグナルを介して細胞増殖を起こすのか、を明らかにすることである。研究代表者はこれまでの研究によって単離膵島を用いてどのような迷走神経由来因子が膵島細胞増殖を起こすのかを解析するシステムを確立し、その結果、アセチルコリンや複数の迷走神経由来神経ペプチドを単離膵島に同時に作用させることで膵β細胞増殖が亢進することを見出した。この際に膵β細胞内で起こる遺伝子発現変化を網羅的に解析した結果、細胞増殖において重要な役割を担うFoxM1経路が活性化していることを発見した。さらにこれらの変化は、遺伝子導入によって肝臓ー膵β細胞間神経ネットワークを活性化した場合、あるいは神経ネットワークが活性化している肥満モデルマウスの膵島においても認められた。現在どのような迷走神経由来因子の組み合わせが効率的に膵β細胞増殖を起こすのかを検討する解析を進めている。これらの結果から肥満などで肝臓ー膵β細胞神経ネットワークが活性化した状態では、迷走神経を介してアセチルコリンや神経ペプチドが膵β細胞に作用してFoxM1経路を活性化している可能性が示唆された。これらの結果をもとに現在膵β細胞特異的FoxM1ノックアウトマウスの作成を行っており、一部のマウスを使用した解析も開始している。迷走神経由来因子による膵β細胞増殖作用において少なくとも一部はアセチルコリンによるM3受容体を介した効果が関与していることが明らかになったことから当初の予定通りに研究が進展しているものと考える。

現在同定した転写因子の膵β細胞特異的ノックアウトマウスの単離膵島にアセチルコリンを含む迷走神経由来因子を作用させた際の膵β細胞増殖を検討している。これらが抑制されていれば、迷走神経由来因子による膵β細胞増殖がこの転写因子依存性であることを直接的に証明することができる。また臓器間神経ネットワークがin vivoにおいて"ON"になっている際に、実際に迷走神経由来因子の作用が起こっているのかを検討するために、コリン受容体や迷走神経由来ペプチドの阻害薬を投与し、これらの作用を阻害したマウスで臓器間神経ネットワークを活性化した際に膵β細胞増殖がどのように変化するかを検討する予定である。また、妊娠中、膵部分切除後、新生児期、あるいは膵管結紮や薬理学的手法による膵傷害後、などの膵β細胞増殖が亢進する状態、あるいは反対に老化などの膵β細胞増殖が低下する状態における肝臓ー膵β細胞間神経ネットワークの関与を検討することで、この神経ネットワークの生理的な意義を明らかにすることを計画している。代謝学今後臓器間神経ネットワークを"ON"にした際にin vivoにおいて膵β細胞に対する迷走神経由来因子の作用が増加しているのかを検討する予定である。また、妊娠中、膵部分切除後、新生児期、あるいは薬理学的な膵傷害後などの膵β細胞増殖が亢進する状態、反対に廊下などの膵β細胞増殖が低下する状態における膵臓ー膵β細胞間神経ネットワークの関与を検討することで、この神経ネットワークの生理的な意義を明らかにするための検討を開始する予定である。
最先端分子細胞テクノロジーの応用による呼吸器疾患病態解明と治療開発

<転写ネットワークの解明>申請者らは世界に先駆けてTAZ欠損マウスを作成し、ホモ欠損マウスが肺気腫を呈することを報告した。さらに、共同研究先であるスウェーデン・ウプサラ大学にて外科切除を受けた非小細胞肺癌患者196例のトランスクリプトーム、345例の組織アレイ、ゲノム情報を統合的に解析し、TAZの肺癌促進作用を明らかにした。また肺上皮細胞において、炎症性サイトカインのTNF-αやLIGHTが、TGF-βによるEMT誘導を促進させることを示した。さらにTGF-βとTNF-αによる協調的な細胞内シグナル伝達機構を解明し、下流の標的遺伝子やマイクロRNAの網羅的な発現解析を行った。さらにヒト肺癌組織から初代培養線維芽細胞を樹立し、肺癌細胞との三次元共培養を行い、肺癌CAFの癌促進作用を明らかにした。またレンチウイルスによるノックダウンシステムを活用して、TGF-βが肺線維芽細胞の増殖・収縮や肺癌細胞との相互作用に与える影響を検証した。TTF-1は肺の器官形成において必須のマスター転写因子であり、TTF-1欠損マウスは肺形成不全により生直後に呼吸不全死となる。申請者らは肺癌細胞において、TTF-1がTGF-βによるEMT誘導を抑制することを見出した。さらにゲノムワイドChIP-Seqを行い、TTF-1とSmad3の結合を介した新規の転写調節機構を明らかにした。また、MACSによる細胞分離を活用し、マウス肺からのII型肺胞上皮細胞の単離法を確立した。これに2層培養法を適用することで、細胞極性及び細胞接着が維持された培養条件での細胞応答を観察することが可能になった。さらに気管支上皮細胞を気層・液層界面培養法(ALI: air-liquid interface)により線毛上皮細胞に分化誘導することに成功した。本研究では上述のような知見・経験・技術をさらに発展させ、Hippo-TAZ/YAP経路やTGF-β-Smad経路、TTF-1を含む転写因子ネットワークが、肺の器官形成や疾患病態に及ぼす影響を統合的に解析している。研究成果も出つつあるため、上記のように判断した。Bioinformaticsによって、転写ネットワークという視点からHippo-TAZ/YAP経路・TGF-βシグナルと主要な転写因子群との相互作用を解析する。さらに炎症・生体防御関連因子としての脂質性メディエーターに着目し、難治性肺疾患の病態解明および治療標的の同定を目指す。具体的には、Conditional knockoutマウスの発生学的解析、遺伝子改変マウスを活用した呼吸器疾患モデルによって個体レベルで解析する。またマウス胎仔肺のexplant cultureやマウス由来の肺上皮細胞(気管支上皮細胞・II型肺胞上皮細胞)の初代培養・特殊培養(2層培養・ALI)を行う。さらに、ゲノムワイドな網羅的解析(ChIP-seqやRNA-seq)、公共データベースを利用したBioinformatics解析も行う。COPD、ARDS、特発性間質性肺炎、難治性気管支喘息、新興呼吸器感染症(新型インフルエンザ等)などは、炎症関連機序を主体とする病態であり、その難治性・致死性や高い発症頻度から、社会的にも極めて重大な疾患群である。例えば、喫緊の対策課題であるインフルエンザの主要死因は、難治性呼吸不全・ARDSである。これらの炎症性肺疾患の病態機序・治療標的は未だに不明であり、新治療法の開発が急務とされている。また、本邦での肺癌患者数は年間10万人を超え、7万人以上が死亡している。肺癌細胞の悪性化の過程において、上皮細胞が間葉系細胞の形質を獲得する上皮間葉転換(EMT)が重要であり、癌細胞と癌間質との相互作用、特にCAF(cancer-associated fibroblast)の働きにより浸潤・転移といった癌進展が促進される。肺の器官形成(branching morphogenesis・肺胞形成)、肺リモデリング(気腫化・線維化)、癌進展(EMT・癌-間質相互作用)など一見して異なる生命現象は、細胞レベルでは上皮間葉相互作用という共通したメカニズムが介在しており、分子レベルで類似した制御機構が関与する。転写コアクチベーターTAZ/YAPは、Hippo経路の実行因子として機能し、転写因子TEADsと結合して転写制御に関わる。この数年でTAZ/YAPの多彩な機能(幹細胞の多能性維持や分化制御・器官形成・臓器サイズ調節・腫瘍形成)が解明されつつある。TGF-βはSmad3を介した細胞内シグナル伝達を行う。幹細胞の多能性維持、細胞の増殖・分化を制御し、様々な臓器の器官形成に関わる。またEMTを誘導する最も強力な因子であり癌細胞の浸潤・転移能を亢進させる。さらにTGF-βは細胞外基質やプロテアーゼの産生を通じて肺リモデリングや癌間質の形成に関与する。今年度は、上記のテーマを中心に研究を進めた。発生工学、細胞培養技術、次世代シーケンサー解析などの進歩により、器官形成、ストレス応答、細胞の増殖・分化と組織の再生や、これらの制御系の破綻がもたらす疾患病態が解明されつつある。本研究ではこれらの最先端技術を活用し、呼吸器官の形態形成や恒常性維持機構を解明し、ARDS・肺線維症・肺癌などの呼吸器疾患の病態理解を深め、治療法開発への糸口を探ることを目的としており、成果が得られつつある。LPCAT1はII型肺胞上皮細胞に強く発現している酵素であり、サーファクタント産生に深く関わるほか、強力な生理活性物質PAFを生成する作用がある。

しかし疾患病態における役割は殆ど不明である。申請者らはLPCAT1 knockoutマウスの導入を進めており、上述のような呼吸器疾患モデルにおいてLPCAT1の役割を解析し、さらにTAZ/YAPやTGF-βとの関連も検討しつつある。肺サーファクタントの約80%はリン脂質であり、surfactant protein C(SPC)などの蛋白と複合体を形成している。サーファクタント脂質の生成におけるLPCAT1の機能解析のため、knockoutマウスの肺胞洗浄液の脂質組成を質量分析計により測定し、II型肺胞上皮細胞の機能も調べた。肺の器官形成に必須の転写因子TTF-1は、TAZと協調して、SPCの発現を促進させる。このような転写制御において、Smad3はTAZに対して拮抗的に作用する可能性が指摘されているが、詳細なメカニズムは不明である。TAZ/YAP Conditional knockoutマウスや初代培養細胞の解析を通じて、TAZ/YAP・TGF-β・TTF-1による、SPCなどサーファクタント蛋白の発現制御機構を探究した。生成されたサーファクタントは細胞内のlamellar bodyに蓄積され、分泌刺激に応じて肺胞腔に放出されるが、その分泌調節メカニズムは殆ど分かっていない。膵β細胞からのインスリン分泌において、低分子量GTPaseのRab27a/bが主要な調節因子であるが、II型肺胞上皮細胞にも強く発現しているとの報告がある。今年度は、II型肺胞上皮細胞におけるRab27a/bのサーファクタント分泌調節機構を検討した。本研究で主に解析する遺伝子改変マウスは、TAZ flox及びYAP floxマウスであり、既に個体化の準備を進めている。肺胞成熟期など発生の後期段階や、成体マウスにおける呼吸器疾患モデルなどで、肺胞上皮細胞でのTAZ/YAPの機能解析が可能になると見込んでいる。概ね、順調に研究が進展している。<転写ネットワークの解明>申請者らは世界に先駆けてTAZ欠損マウスを作成し、ホモ欠損マウスが肺気腫を呈することを報告した。さらに、共同研究先であるスウェーデン・ウプサラ大学にて外科切除を受けた非小細胞肺癌患者196例のトランスクリプトーム、345例の組織アレイ、ゲノム情報を統合的に解析し、TAZの肺癌促進作用を明らかにした。また肺上皮細胞において、炎症性サイトカインのTNF-αやLIGHTが、TGF-βによるEMT誘導を促進させることを示した。さらにTGF-βとTNF-αによる協調的な細胞内シグナル伝達機構を解明し、下流の標的遺伝子やマイクロRNAの網羅的な発現解析を行った。さらにヒト肺癌組織から初代培養線維芽細胞を樹立し、肺癌細胞との三次元共培養を行い、肺癌CAFの癌促進作用を明らかにした。またレンチウイルスによるノックダウンシステムを活用して、TGF-βが肺線維芽細胞の増殖・収縮や肺癌細胞との相互作用に与える影響を検証した。TTF-1は肺の器官形成において必須のマスター転写因子であり、TTF-1欠損マウスは肺形成不全により生直後に呼吸不全死となる。申請者らは肺癌細胞において、TTF-1がTGF-βによるEMT誘導を抑制することを見出した。
口腔常在カンジダは腸管においてカンジダ特異的Tregを誘導するか

口腔カンジダ症の原因病原体のCandida albicansが、なぜ口腔内に常在できるのか不明である。我々は、C. albicansの経口摂取がそれに対する経口免疫寛容が誘導するからではないかと考えた。経口免疫寛容とは、食物に免疫反応が起こらないのと同様に、口から摂取された異物に対して免疫反応が起こらないシステムのことである。そこで、経口的にC. albicansを若いマウスや高齢のマウス、TLR2遺伝子欠損マウスに摂取させたがC. albicans特異的血中抗体に対する免疫抑制を誘導せず、TLR2の有無もC. albicansに特異的な抗体産生誘導には影響しないとわかった。口腔カンジダ症は、加齢に伴い検出率が上昇する口腔常在性の真菌であるCandida albicansが原因となることが知られている。しかしながらなぜC. albicansが常在できるのかは不明のままである。我々は、口腔のC.albicansが唾液や食べ物とともに飲み込まれることでC. albicansに対する経口免疫寛容が誘導されているのではないかと考えている。すなわち、C. albicansを経口摂取することで免疫抑制性のT細胞(制御性T細胞、Treg)が誘導されており、加齢によりC. albicans特異的Tregの割合や機能に変化が生じているのではないかと考えた。まず最初に、マウスを用いてC. albicansの経口摂取がC. albicansに対する特異抗体の誘導にどのような影響を与えるかを調べることにした。具体的には、マウスに経口的に生きたC. albicansあるいは生理食塩水を摂取させた後、フロイントの不完全アジュバントとともにC. albicansをマウスの背部皮下に免疫した。この免疫を3回行い、免疫終了まで経時的に血液ならびに唾液中を採取し、それらに含まれるC. albicansに対する特異的なIgG、IgM、IgAなどの抗体価の変化をELISA法で調べる予定である。現在、マウスの免疫と血液・唾液の採取を行っているところであり、これらの実験を、若いマウス(8週齢)と加齢マウス(4550週齢)を用いて行うことで、C. albicans特異的な抗体の誘導に及ぼす加齢の影響を明らかにできる。抗体誘導に及ぼす影響を明らかにした後に、マウスの腸管におけるTregの解析を行う。口腔カンジダ症は、口腔常在性であり加齢にともない検出率が上昇するCandida albicansが主たる要因となることが知られている。しかしながらC. albicansがなぜ口腔内に常在できるのかは依然として不明である。我々は、C. albicansが口腔内に常在できるのは経口免疫寛容が誘導されていることによるのではないかと考えた。すなわち、C. albicansが食物や唾液とともに経口的に摂取されることにより、腸管などにおいてC. albicansに特異的な免疫抑制性のT細胞(制御性T細胞、Treg)が誘導され、それによりC. albicansが口腔に定着できるのではないかということである。また、加齢によりC. albicansの検出率が上昇するのは、このC. albicans特異的なTregの数、あるいは割合が増加するのではないかと考えた。我々は、まずC. albicansの経口摂取による特異的な免疫抑制の状態を確認するために、C. albicansをマウスに経口的に摂取させ、その後C. albicansを皮下に接種することで特異的抗体の誘導に及ぼす影響を調べた。用いたのは若いあるいは高齢の野生型(WT)ならびにToll-like receptor 2欠損(TLR2KO)C57BL/6マウスである。その結果、WTならびにTLR2KOマウスで大きな違いはなく、若いマウスよりも高齢のマウスにおいて、C. albicansの経口摂取によりC. albicans特異的IgGが有意に強く誘導された。これは経口摂取が、皮下免疫による抗体誘導に対しては抑制的に作用しないということを示している。今後は糞便中のIgAならびに血清中のIgEについても調べ、さらに腸管におけるTregについても調べ、C. albicansの経口摂取が免疫系に及ぼす影響を確認する。ゾンデを使用することでマウスに安定的にC. albicansを経口投与することが可能になった。これにより、マウスへの免疫後の血清中、糞便中ならびに唾液中のC. albicans特異的抗体を測定することが可能となった。実際にマウスに10日間C. albicansを経口摂取させ、その後1週間に一度、計3回にわたり皮下にC. albicansを接種することで抗体産生を誘導し、C. albicansに対する抗体価測定も行った。また、マウスの腸管粘膜固有層における免疫系細胞も、各酵素による処理、特にDNaseによる処理時にその濃度を上げることなどにより安定して得られるようになったため、粘膜固有層のTregの分析も可能である。既述のように、マウスにC. albicansを経口投与し、その後皮下免疫を行い血中の特異的IgGを測定したところ、予想に反して高齢マウスにおいて強い抗体価の上昇が見られ、現時点では予想と異なる結果となっている。しかしながら、この実験において、経口投与の期間ならびにC. albicansの免疫部位の変更など改良の余地があるため、それによりまた異なった結果が得られる可能性があると考えている。

現在の実験において技術的には問題がなく、細かな改良をすることで信頼に足るデータが得られると思われ、これから先の実験を行うための準備も進んでいるので、おおむね順調に進展していると考えている。口腔カンジダ症は口腔常在性の真菌であるCandida albicansが主たる要因となる日和見感染症である。C. albicansは、加齢に伴い口腔からの検出率が上昇するが、なぜ口腔内に常在できるのかは依然として不明のままである。我々は、C. albicansが口腔に常在できるのは、C. albicansに対する経口免疫寛容が誘導されているからなのではないかと考えた。つまり食物とともに経口的にC. albicansが摂取されるとC. albicansに対して特異的な制御性T細胞が誘導されるのではないかと考えたのである。経口的に摂取されたC. albicansより特異的な免疫抑制状態にあるか確認するために、マウスへのC. albicansの経口投与がC. albicansに対する特異的な抗体産生誘導に及ぼす影響を調べた。用いたマウスは、C57BL/6の野生型ならびにTLR2ノックアウトの若いマウスと高齢マウスである。これらのマウスにC. albicansをあらかじめ経口投与してからC. albicansを免疫した場合と、経口投与をせずに免疫した場合とで、C. albicans特異的血中IgG、IgM、IgEならびに糞便中IgAの比較をした。抗体価の測定にはELISA法を用いた。その結果、高齢マウスの場合においてC. albicansを経口摂取した場合でも、若いマウスと比較して特異的な抗体誘導が減弱することはなかった。また、C. albicansの認識において重要な役割を果たすことが知られているTLR2のノックアウトマウスにおいても、野生型のマウスと変わらない傾向を示したことから、今回の研究で用いた条件下においては、C. albicansの経口投与が特異的な免疫抑制を誘導することはなく、TLR2もC. albicansに特異的な抗体産生誘導には影響しないとわかった。口腔カンジダ症の原因病原体のCandida albicansが、なぜ口腔内に常在できるのか不明である。我々は、C. albicansの経口摂取がそれに対する経口免疫寛容が誘導するからではないかと考えた。経口免疫寛容とは、食物に免疫反応が起こらないのと同様に、口から摂取された異物に対して免疫反応が起こらないシステムのことである。そこで、経口的にC. albicansを若いマウスや高齢のマウス、TLR2遺伝子欠損マウスに摂取させたがC. albicans特異的血中抗体に対する免疫抑制を誘導せず、TLR2の有無もC. albicansに特異的な抗体産生誘導には影響しないとわかった。マウスにおけるC. albicansに対する経口免疫寛容を調べるにあたり、まずC. albicansの経口摂取がC. albicans免疫による抗体産生誘導に及ぼす影響を確認するべきであると考えた。我々はすでにマウスの免疫を開始しており、血液だけでなく唾液の採取も行っているため、分泌型の特異的なIgAも調べられる。唾液の採取は、副交感神経末梢を興奮させる作用を持つ塩酸ピロカルピンを利用して可能となった。
小児期発症のインスリン非依存型糖尿病患児の遺伝子異常の検討

平成4年度および平成5年度に診断した耐糖能異常16名および若年発症インスリン非依存型糖尿病(NIDDM)患者30名を対象に末梢血よりDNAを抽出し、遺伝子異常の解析ならびにインスリン分泌能と感受性の検討を行い以下の結果を得た。1.インスリンレセプター遺伝子の検討PCR-SSCP法にて異常を検討したが、今回の検討では異常のある患者は認めなかった。2.ミトコンドリア遺伝子の検討上記の患者の内、家庭歴に糖尿病を認める患者を対象にミトコンドリア遺伝子のうち、tRNA-Leu(3243)領域の検討を行ったが、異常は見いだせなかった。3.インスリン遺伝子の検討糖負荷試験でインスリン/Cペプチドのモル比の異常を認め、インスリンの構造異常が疑われた症例は認めなかった。4.小児期発症のNIDDMの遺伝子異常の頻度上記13の結果より、若年発症のNIDDMであっても遺伝子異常が原因となっている症例は少ないと考えられた。5.小児期発症NIDDMのインスリン分泌能、インスリン感受性の検討遺伝子異常を認めないNIDDM患者のうち、肥満を認めない患者について糖尿病状態の時期と糖尿病状態を脱し、薬物不要で代謝異常が検査上、認めなくなった時期でのインスリン分泌能、感受性を検討した。食後2時間の血中Cペプチドは糖尿病状態を脱した後は全例ほぼ正常の値を示し、インスリン分泌不全の状態ではないと考えられた。一方、グルコースクランプ法でのインスリン感受性の検討では糖尿病状態を脱した時期では糖尿病状態の時期よりは改善が認められたものの、正常に比べて1/21/3程度の値であった。このことより小児期発症のNIDDMの原因はインスリン感受性の低下によるところが大きいと考えられた。今後はインスリンレセプター後の異常の解析について研究を進めたい。