hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
キメラ抗原レセプターを遺伝子導入したリンパ球細胞の作成方法の至適化

CD19を標的としたキメラ抗原レセプター(CD19CAR)遺伝子導入T細胞の作成方法の至適化を行った。同種の細胞を用いた系における改良として、ウイルス特異的T細胞において効率よくCD19CARを遺伝子導入した細胞を作成する方法について検討した。培養系の検討としてサイトカインの至適組み合わせについて検討した。その結果、IL-2とIL-21の組み合わせが最適であった。また自家の細胞を用いた系における改良として、drug-inducible systemを用いて、CD19CARの発現をコントロールするシステムの開発を行い、発現をコントロールできることを示した。1.同種の細胞を用いた系における改良:(1)日本人に頻度の高いHLAに提示されるCMV/EBVエピトープの同定とそれらを用いたBi-specific T細胞の作成を引き続き行った。CMV特異的T細胞に比べてEBV特異的T細胞は増幅しづらいことが分かった。CMV特異的細胞は増幅しやすいものの、CMV陽性ドナーの割合は日本人の60%程度とそれほど高くないため、新たなエピトープの同定あるいは新たな培養方法の樹立が必要であると考えられた。そのため、CMVの代表的な抗原であるIE-1およびpp65抗原を人工抗原提示細胞としてすでに有用性が示されつつあるK562細胞にHLAを遺伝子導入したものに、さらに遺伝子導入を行い、これを用いてCMV陽性ドナー末梢血を刺激し、ウイルス特異的T細胞を誘導することを試みた。予想に反して非特異的な反応が強く出現し、特異性の高いウイルス特異的なTリンパ球ラインは作成できなかった。(2) IL-15およびIL-21を用いたBi-specific T細胞の培養条件の至適化:IL-2に加えてIL-15およびIL-21を加えた培養系でBi-specific T細胞の培養を行い、IL-2+IL-21の培養系において有意に高い遺伝子導入効率を得ている。2.自家の細胞を用いた系における改良:我々の用いてきたChimeric antigen receptor (CAR)の細胞内ドメインはCD28のものを用いているが、近年臨床的有用性が報告されている4-1BBやCD27を用いて更なるシグナル伝達の効率化を検討した。これまでのCD28細胞内ドメインに替えて、4-1BBやCD27の細胞内ドメインを合成し、4-1BBやCD27の細胞内ドメインを持つウイルスベクターを作成した。これらのCARによるシグナル伝達・サイトカイン放出・抗原特異的刺激後の分裂を今後比較検討する。1.同種の細胞を用いた系における改良:(ア)日本人に頻度の高いHLAに拘束されるCMV/EBVエピトープの同定とそれらを用いたBi-specific T細胞の作成を行った。CMV特異的T細胞に比べてEBV特異的T細胞は増幅しづらいことがわかった。CMV特異的細胞は増幅しやすいものの、CMV陽性ドナーの割合は日本人の60%程度とそれほど高くないため、新たなエピトープの同定が必要であると考えられた。EBVは日本人のほぼ100%が陽性であるが、前駆細胞の割合に比べて、培養中の増幅が不良であった。培養方法の更なる工夫が必要であると考えられた。(イ)IL-15およびIL-21を用いたBi-specific T細胞の培養条件の至適化;IL-2に加えてIL-15およびIL-21を加えた培養系でBi-specific T細胞の培養を行い、IL-2+IL-21の培養系において有意に高い遺伝子導入効率を得た。これらのCARによるシグナル伝達をより容易に比較・定量するために、細胞を用いたアッセイを構築しようとしている。これはT細胞の腫瘍細胞株にCARとreportervectorを遺伝子導入し、これをCARの標的抗原で刺激することによってCARを介して伝達するシグナルを定量使用とする試みである。現在reporter vectorを遺伝子導入し、次にCARを遺伝子導入する。1.同種の細胞を用いた系における改良CMV pp65/IE-1抗原に対するoverlappingpeptideを用いて検討を行ったが、ひとつひとつのpeptideに対する反応は弱かった。良好な反応を得るため、あらかじめdominantな反応を惹起するようなpeptideを選択して実験を行った。培養系の検討としてIL-2/IL-15/IL-21などのサイトカインの至適組み合わせについて検討した。その結果IL-2/IL-21の組み合わせが良好であった。

2.自家の細胞を用いた系における改良手持ちのCD19-CARの細胞内ドメインの至適化とその評価:評価にあたって刺激後のCAR-T細胞の分泌するInterferon-gamma/Interleukin-2などを測定した。細胞内シグナルを細胞レベルで見るにあたって細胞内リン酸化タンパクの染色を行った。3.CD19CAR発現の薬剤によるコントロール薬剤を用いて自由にCD19CARの発現をコントロールするため、tet-on systemを用いて検討を行った。ドキシサイクリンを投与することによってCD19CARの発現をコントロールすることが出来た。発現のkineticsについて、SUPT1に遺伝子導入して検討した。また、発現したCD19CARが機能的な分子であるのかどうか、細胞傷害活性・サイトカイン産生能・刺激後の分裂能などについてさらにこのシステムの検討を進める必要があると考えられた。遺伝子導入T細胞療法学1.同種の細胞を用いた系における改良(ア)日本人に多いHLA型とそのCMV・EBV特異的エヒピトープを認識するT細胞に対してCD19-CARを遺伝子導入し、Bi-specific T細胞を樹立できるかを検討する。:実績欄に示したように、HLAを遺伝子導入したK562細胞を人工抗原提示細胞として用いる系に、さらにCMV抗原を遺伝子導入することによって効率よくCMV特異的T細胞ラインを作成できるのではないかと考え、試みたがうまく行かなかった。人工抗原提示細胞は、T細胞を刺激する前に固定した方が良いとする報告に基づいてこれも試みたが、特に固定前と固定後で抗原特異的T細胞の誘導効率は変わらなかった。これらによって進捗はやや遅れている。現在特異的細胞をより効率よく増幅するため、overlapping peptideを用いた培養系について検討している。(イ)培養方法の改良。:これについてはおおむね予定通り進捗している。2.自家の細胞を用いた系における改良(ア)新規抗原に対するCARの作成;現在ひとつの新規抗原に対するCARの作成を進めている。同時にCD19-CARの細胞内ドメインの至適化を行っている。手持ちのCD19-CARの細胞内ドメインの至適化とその評価を行い、平行して新規抗原に対するCARの作成を進めている。1.同種の細胞を用いた系における改良(ア)日本人に多いHLA型とそのCMV・EBV特異的エピトープを認識するT細胞に対してCD19-CARを遺伝子導入し、Bi-specific T細胞を樹立できるかを検討する。:これについては進捗は予定通りである。結果の欄に示したようにCMV特異的T細胞においてもEBV特異的T細胞においてもさらなる工夫が必要である。現在特異的細胞をより効率よく増幅するための培養系について検討している。:これについてもおおむね予定通り進捗している。2.自家の細胞を用いた系における改良(ア)CARの細胞外ドメインのヒト化。
グルココルチコイドによる成長ホルモン遺伝子転写活性化の分子機構-グルココルチコイドにより誘導され、成長ホルモン遺伝子の転写を活性化する核内因子の同定-

胎生下垂体における成長ホルモン(GH)細胞の機能的成熟、すなわちGHやGHRH-受容体(GH放出ホルモン受容体)の発現開始の引き金となっているのがグルココルチコイドであるということを我々は様々な実験系で示してきた。しかし、GHRH-受容体の発現にはグルココルチコイド受容体が直接転写因子として機能していることがわかっているものの、GH発現誘導に関してはグルココルチコイドの作用を仲介する物質の存在が想定され、この分子の同定と作用機序の解明が問題であった。本研究ではグルココルチコイドの作用仲介物質としてのC/EBPδの機能を調べた。ラットGHプロモーター(翻訳開始点の上流約1700塩基)はMtT/S細胞においてルシフェラーゼを発現させ、この発現量はC/EBPδを共発現させることにより約3倍に上昇した。プロモーターを300塩基に短縮してもC/EBPδの活性は変化なかったので、C/EBPδの結合部位は翻訳開始点の上流300塩基までの領域にあると推定された。C/EBPαはδと同様GHプロモーターの活性を上昇させたが、その作用はδよりも弱かった。またβはプロモーター活性を低下させた。また、C/EBPδの作用は下垂体特異的転写因子であるpit-1の存在を必要としなかった。このような結果はGH遺伝子の転写調節にC/EBPδが関わっていること、さらにC/EBPδはGHプロモーターの翻訳開始点の上流300塩基までの領域に結合し、pit-1とは独立したメカニズムによりラットGH遺伝子の転写を調節していることが考えられる。これに対してヒトGH遺伝子のプロモーター活性(翻訳開始点の上流1600塩基)に対してC/EBPδは転写促進効果を示さなかった。ヒトではC/EBPδの結合部位がさらに上流に存在するか、或いはC/EBPδはヒトのGH遺伝子転写には関与しないのかもしれない。(注)pit-1に関しては、平成14年度科学研究費補助金実績報告書に記載の結果と異なる結果がその後の実験により得られたのでこれを本報告書に記載した。本研究においてこのグルココルチコイドの作用仲介物質としてのC/EBPδの機能を調べた。C/EBPδはラット下垂体では胎生15日に既に発現しており、発現量はGH産生の始まる胎生19日以降増加した。GH産生腫瘍細胞であるMtT/S細胞でもC/EBPδの発現は見られるので、胎仔下垂体で認められたC/EBPδの発現は少なくとも一部はGH細胞におけるものと思われる。またこの細胞株においてC/EBPδの発現量はグルココルチコイド処理により増加した。MtT/S細胞は成熟型のGH細胞であるが、幼若なGH細胞に相当すると思われるMtT/E細胞ではC/EBPδの発現は非常に低レベルであった。すなわち、C/EBPδの発現はGH産生能に比例するように思われる。

Cos細胞を用いた一過性の発現実験系でC/EBPδはGHプロモーターの活性を上昇させることが明らかとなった。C/EBPデルタと近縁の分子であるC/EBPαもGHプロモーター活性を上昇させたが、活性はδのほうが強力であった。C/EBPβはプロモーター活性を低下させた。これらのデータは、総合するとC/EBPδがグルココルチコイドの作用仲介物質であることを強く支持しているが、直接的な証明にはなっていない。次年度ではこの点を中心に検討を加えたいと考えている。前年度の実験から、胎生下垂体においてグルココルチコイドが成長ホルモン(GH)発現のスイッチを入れる際そのグルココルチコイドの作用仲介物質として働く分子がC/EBPδであろうということがある程度実証された。本年度はC/EBPδのGH遺伝子の転写を促進するメカニズムの解明をラットばかりでなくヒトのGH遺伝子についても検討を行った。産生細胞であるcos7細胞を用いて測定した。C/EBPδ、C/EBPαはラット下垂体のcDNAからRT-PCR法により得、これをCMVプロモーターを含む発現ベクターpcDNA4に挿入し発現プラスミドを作製した。C/EBPβは理研DNAバンクより購入した。ラットGHプロモーター(翻訳開始点の上流約1700塩基)はMtT/S細胞においてルシフェラーゼを発現させ、この発現量はC/EBPδを共発現させることにより約3倍に上昇した。プロモーターを300塩基に短縮してもC/EBPδの活性は変化なかったので、C/EBPδのGHプロモーター上の結合部位は翻訳開始点の上流300塩基までの領域にあると推定された。C/EBPαはδと同様GHプロモーターの活性を上昇させたが、その作用はδよりも弱かった。またβはプロモーター活性を低下させた。Cos7細胞を用いた結果から、C/EBPδの作用は下垂体特異的転写因子であるpit-1の存在が必須であることがわかった。このような結果はGH遺伝子の転写調節にC/EBPδが関わっていること、さらにC/EBPδはGHプロモーターの翻訳開始点の上流300塩基までの領域に結合し、pit-1との直接或いは間接的な相互作用の結果ラットGH遺伝子の転写を調節していることが考えられる。これに対してヒトGH遺伝子のプロモーター活性(翻訳開始点の蒸留1600塩基)はに対してC/EBPδは転写促進効果を示さなかった。ヒトではC/EBPδの結合部位がさらに上流に存在するか、或いはC/EBPδはヒトのGH遺伝子転写には関与しないのかもしれない。
動的外乱を受ける構造物の脆性連鎖破壊に関する研究

1995年兵庫県南部地震において,衝撃的破壊と言われる構造物の被害が発生した。これは,地震動のごく初期の短時間に構造物が一瞬にして破壊したと言われる現象である。建築構造物では,多層ラーメン構造の中間階がペシャンコニ潰れた被害が,この例として話題になった。本研究は,この衝撃的破壊問題を数値解析的に研究したものである。衝撃的破壊の動力学的メカニズムを解明し,その対策を立案することを目的とした研究である。2年間の研究を通して,次の成果が得られた。1)多層骨組の柱が弾塑性履歴後に脆性破壊するという特徴を持つ場合,地震の途中で一つの柱が破壊するとその層の残りの柱が次々に連鎖破壊する。この連鎖破壊は瞬時に起こり,一瞬にして建物が層崩壊する。これは,兵庫県南部地震におけるコンクリート系建物の中間層の衝撃的破壊を数値的に再現したものである。2)この連鎖破壊の現象は,一般の柱と梁で構成される多層ラーメン構造でも起こる。例えば,梁が脆性破壊する場合,ある層の梁がすべて連鎖的に破壊する。これは,梁降伏型で設計された鉄骨系建物が兵庫県南部地震で梁端破壊を起こした被害を再現したものである。3)脆性連鎖破壊を防止するための設計方法を提案した。具体的には,耐力の割増,変形能力の割増,脆性破壊のばらつき制御によって脆性連鎖破壊が防止できることを示した。また,必要な設計式を提案した。非線形構造解析に適したワークステーションを導入した.構造部材の脆性破壊を考慮した地震応答解析プログラムを独自に開発した.これをワークステーションにインストールして,膨大な数値シミュレーションを実施した.この数値的な研究により,次の知見が得られた.ある構造部材が脆性破壊すると,その部材を含む階において残りの部材が次々と連鎖的に破壊するという今まで知られていなかった特異な動的現象を再現することができた.この現象は,兵庫県南部地震において衝撃的破壊と言われている建物の被害そのものであることが明かとなった.さらに,この連鎖崩壊を防止するため,耐震設計上配慮すべき事項を設計式により提案した.これは,従来の耐震設計基準における必要設計耐力と必要塑性変形能力に付する割り増し率の形で表現されている.この数値シミュレーションを実際に構造模型で再現する実験システムを完成させた.これは,アクチュエーターを組み込んだ振動実験装置である.試運転により,地震動を再現できること,構造模型の変位応答および加速度応答が必要な精度で検出できることを確認した.この実験システムと数値シミュレーションシステムを組み合わせることにより,構造物が脆性破壊した直後の動的な釣合および変位条件に関する精密な構成式を確立することが出来る.1995年兵庫県南部地震において,衝撃的破壊と言われる構造物の被害が発生した。建築構造物では,多層ラーメン構造の中間階がぺしゃんこに潰れた被害が,この例として話題になった。

3)脆性連鎖破壊を防止するための設計方法を提案した。具体的には,耐力の割増,変形能力の割増,脆性破壊のばらつき制御によって脆性連鎖破壊が防止できることを示した。また,必要な設計式を提案した。
先天性プロトロンビン欠乏症(異常症)における異常プロトロンビン遺伝子の解析とその蛋白発現

Prothrombinは、VitamineKの存在下に肝臓で合成される一本鎖糖蛋白質で、種々の生理的条件下で活性化されてthrombinとなり、血液凝固を中心に種々の生理機能を果たしている。当教室において外来経過観察している先天性prothrombin欠乏症(異常症)一家系につき遺伝子異常の解析を行ってきた。昨年より患者より抽出した患者genomicDNAより、PCR-SSCP法を用いて13個のexon及びExon-intron boaderを13 pairのprimerを用いてscreeningしたが、異常を示唆するShift bandを認めなかった。このため、SSCPの条件を見直し、すべてのPCR領域が250bp前後になるように新たに20 pairのprimerを準備し同様の手法にてscreeningを行ったが、やはり異常を示唆するShift bandを認めなかった。以上のことより、screening法に問題があるのか、あるいはprothronbinの発現を制御しているpromoter領域に異常があるのか、この問題をclearするために新たな実験を計画し、現在まで行ってきた。一つは、患者genomicDNAより、PCR-Direct Sequenceによりprothrombinのcoding領域とpromoter領域をfull-sequenceすることである。7個のexonまで解析が終了しているが異常を見いだしていない。もう一つは、promoter領域の解析である。正常人のprothronbinのpromoter(-1423+115)領域をPCRで増幅し、pGL3-Luciferase-vectorにcloningしたところである。今後、ヒト肝細胞由来HepG2細胞にtransfectionしpromoter活性を測定しうる実験系を構築し、患者由来のpromoterと比較検討し、患者の遺伝子解析を終了したい。Prothrombinは、VitamineKの存在下に肝臓で合成されるMW.72Kの一本鎖糖蛋白質で、生理的条件下で活性化されてthrombinとなり、血液凝固を中心に種々の生理機能を果たしている。Prothrombin遺伝子は第11染色体上の11p11q12に存在し、この遺伝子の異常により稀な出血性疾患である先天性prothrombin欠乏症(異常症)が発症する。当教室において外来経過観察している先天性prothrombin欠乏症(異常症)1家系について遺伝子異常の解析を試みている。現在まで、PCR-SSCP法を用いて13個のexonおよびexon-intron boaderを13pairのprimerを用いてscreeningしたが、異常を示唆するshift bandを見つけることができなかった。この理由として、SSCPの条件の問題とscreeningした領域に変異が存在しない可能性が考えられる。SSCPの条件に関して、泳動温度等を含めた泳動条件の再検討およびfull-sequenceを考慮中である。また、screeningを行った領域に変異が存在しない場合は、promoter領域の異常を考えpromoter領域の解析を計画中である。当教室において外来経過観察している先天性prothrombin欠乏症(異常症)-家系につき遺伝子異常の解析を行ってきた。咋年より患者より抽出した患者genomicDNAより、PCR-SSCP法を用いて13個のexon及びExon-intron boaderを13 pairのprimerを用いてscreeningしたが、異常を示唆するShift bandを認めなかった。

一つは、患者genomicDNAより、PCR-Direct Sequenceによりprothrombinのcoding領域とPromoter領域をfull-sequenceすることである。7個のexonまで解析が終了しているが異常を見いだしていない。もう一つは、promoter領域の解析である。正常人のprothronbinのpromoter(-1423+115)領域をPCRで増幅し、pGL3-Luciferase-vectorにcloningしたところである。今後、ヒト肝細胞由来HepG2細胞にtransfectionしpromoter活性を測定しうる実験系を構築し、患者由来のpromoterと比較検討し、患者の遺伝子解析を終了したい。
３次元培養系による精細管構造の再構築メカニズム

我々は、樹立したマウス精巣の再凝集培養系を用いて、精巣形成に関わるシグナリング因子、間細胞の役割等について、Live imaging等を活用しながら解析した。その結果、CD34+細胞、p75+細胞、筋様細胞は内側から外側にかけて重層構造を形成して間組織を再構築すること、精細管様構造の再構築に間細胞が必要であること、ALK5i(ALK5阻害剤)は間細胞の増殖や細胞運動を阻害すること、純化したCD34+細胞を培養するとp75+細胞を経て筋様細胞へ分化することを示した。これらの結果は、間組織と精細管様構造の再構築にCD34+細胞とALK5シグナリングが重要であることを示唆する。哺乳類の精巣は、チューブ状の精細管とその外側の間組織から成る。我々は生後マウス精巣を解離・再凝集させ、コラーゲン内3次元培養系に、KSR (KnockOut Serum Replacement)を添加することにより、ほぼ完全な精巣再構築に成功したので、このユニークな培養系を用いて、KSRによる精細管の形成機構について解析することを目的とする。再構築中の過程を細胞が生きたまま観察するために、セルトリ細胞のみにGFPを発現するSox9-EGFPトランスジェニックマウス由来の精巣再凝集体を培養し、CV-1000を用いて観察した。その結果、KSRがある場合、凝集塊中の最初の直径3050umのセルトリ細胞凝集体が1週間後には300400umと拡大した。興味深いことに、小さな凝集塊はお互いに近づき合体してサイズが拡大した。また、TGFβ系の受容体の1種であるAlk5の阻害剤(Alk5i)を加えると、最終的なセルトリ細胞凝集体のサイズも小さくなるとともに、小さな凝集塊の動きや合体も不活発であった。Desert hedgehogの阻害剤であるcyclopamineを加えてもほとんど影響は見られなかった。このように、KSRはAlk5を介してセルトリ細胞の運動や形態形成を促進することが示唆された。理研CDBとの共同研究により、再凝集培養3日目や5日目のRNA sampleの解析を行った。その結果、細胞接着関連遺伝子や増殖因子関連遺伝子等について±KSRで差が見られる遺伝子がいくつか検出された。そのうち興味深いいくつかの遺伝子についてRT-PCRを行い、±KSRで差があることを確認した。Live imagingによる再凝集培養の観察とRNA sequencingによる解析がおおむね計画通り進行しているから。我々は、生後610日目マウス精巣を解離・再凝集させ、コラーゲン内3次元培養系に、KSR (KnockOut Serum Replacement)を添加することにより、ほぼ完全な精巣再構築に成功した。このユニークな培養系を用いて、KSRによる精巣索・精細管構造の再構築機構について解析することを目的とする。1)RNA sequencing解析:RNA sequencing解析によって±KSRで差が見られた遺伝子のいくつかについて、定量PCRや免疫染色によって発現を確認した(PDGF受容体等)。筋様細胞に発現が報告されているPDGF受容体の阻害剤であるTyrphostinをcontrol (-KSR)に加えると、培養3日目に形成されるはずの索様構造の形成を阻害する一方、KSR添加培地に加えてもほとんど影響は見られなかった。2)Live imaging等による再凝集培養の観察:再構築中の過程を細胞が生きたまま観察するために、セルトリ細胞のみにGFPを発現するSox9-GFPトランスジェニックマウス由来の精巣再凝集体を培養し、CV-1000を用いて蛍光と光顕の両方で観察した。その結果、KSRがある場合、凝集塊中から細長い細胞が遊出し、動き回るのが観察された。興味深いことに、細長い細胞はいくつか連結し、小さな凝集体を大きな凝集体へ引っ張り込む様子が見られた。また、TGFb系の受容体の一種であるAlk5の阻害剤(Alk5i)を加えると、細長い細胞の数や動きが少なかった。3)精細管様構造形成における間質細胞の役割:精巣再凝集培養における精細管様構造形成に対する間質細胞の役割を調べるため、間質の細胞をできるだけ除いて再凝集培養を行った結果、小さな凝集体の動きや合体も不活発であった。Live imagingによる再凝集培養の観察においては、CV-1000を用いて蛍光と光顕の両方で観察した結果、セルトリ細胞以外の細胞の動きも観察され、新しいことが分かりつつある。また、精巣再凝集培養における精細管様構造形成に対する間質細胞の役割も明らかになりつつあるため。哺乳類の精巣は、生殖細胞と体細胞から成るチューブ状の精細管とその外側の間組織から成るが、その形成機構には未だ不明な点が多い。我々は生後マウス精巣を解離・再凝集させ、コラーゲン内3次元培養系にKSR (KnockOut Serum Replacement)を添加することにより確立した精巣再構築系を用いて、精細管の形成機構について、解析することを目的とした。

間質や精細管辺縁に存在するCD34+細胞, p75+細胞,筋様細胞の再構築に於ける挙動を調べたところ、当初別々の固まりを形成していたが、3日目には3種の細胞群がお互いに混ざり合い、外側から筋様細胞、p75+細胞、CD34+細胞と3層を形成し、一部の細胞は2種類の抗原を同時発現することが観察された。また、p75+細胞、CD34+細胞は3日目にピークを持つ増殖活性を示した。これらの結果は、CD34+細胞->p75+細胞->筋様細胞と増殖しつつ分化して行くことを示唆する。また、間質を除去した実験から、管状構造の再構築にはCD34+細胞群が芯となってp75+細胞と筋様細胞を供給し、その周りにセルトリ細胞を配列させることが必要であることを示唆する。CD34+細胞からp75+細胞を経てa-SMA+筋様細胞へと分化するかどうかを調べるために、CD34抗体を用いた磁気分離法によってCD34細胞を純化し、collagenコートしたカバーグラス上で培養した。その結果、KSRのみの培養では3日でCD34+細胞からp75+細胞、筋様細胞へと分化したが、Alk5iを加えるとCD34+細胞からp75+細胞、筋様細胞への分化を阻害した。これらの結果は、CD34+細胞からp75+細胞、p75+細胞から筋様細胞へと分化すること、その分化をAlk5iが直接阻害することを証明した。我々は、樹立したマウス精巣の再凝集培養系を用いて、精巣形成に関わるシグナリング因子、間細胞の役割等について、Live imaging等を活用しながら解析した。その結果、CD34+細胞、p75+細胞、筋様細胞は内側から外側にかけて重層構造を形成して間組織を再構築すること、精細管様構造の再構築に間細胞が必要であること、ALK5i(ALK5阻害剤)は間細胞の増殖や細胞運動を阻害すること、純化したCD34+細胞を培養するとp75+細胞を経て筋様細胞へ分化することを示した。これらの結果は、間組織と精細管様構造の再構築にCD34+細胞とALK5シグナリングが重要であることを示唆する。1.個々のセルトリ細胞の動きの観察:再凝集培養における個々のセルトリ細胞の動きを観察する。その際、KSRの有無やAlk5i,cyclopamine等の影響についても調べる。2.精巣再凝集培養におけるセルトリ細胞以外の細胞の役割:精巣再凝集培養における精細管様構造形成に対する間質の細胞の役割を調べるため、間質の細胞を除いてセルトリ細胞と生殖細胞だけの再凝集培養を行い、精細管様構造が形成されるかどうかを調べる。3.KSRによって発現が上昇、下降する遺伝子についての解析:RNAsequence解析によって±KSRで差が確認された遺伝子のいくつかについて、免疫染色によってその産物(タンパク質)の発現を確認する。また、recombinantタンパク質や阻害剤等を加えて再凝集培養における精細管様構造形成に対する効果を調べる。精巣再凝集培養における精細管様構造形成において、間質細胞のうちどの細胞が重要な働きをしているのかを調べたい。間質細胞のみの長期培養について、いろいろな培養系や培地を試みたい。生殖内分泌学新しい大学に移籍したてで一緒に研究する大学院生等がいないため研究補助員を雇うつもりでいたが、ふさわしい人が見つからなかったため、研究費を翌年に繰り越すことにした。有能な研究補助員がいれば雇用することを考えていたが、なかなかふさわしい人が見つからなかったため、次年度へ繰り越すことにした。ふさわしい人が見つかれば、研究補助員として雇用したいと考えている。
高ＣＯ２順化に必須の、糖アルデヒド・毒性化合物による細胞障害防御機構の全容解明

我々は、植物糖代謝(光合成および呼吸)過程において、副産物として生成する糖由来の毒性アルドケト化合物(ジカルボニル)による細胞障害(植物糖尿病)の発症メカニズムおよび解毒メカニズムの全容解明を目的に研究を行っている。本年度は、以下のことを明らかにした。高等植物での葉緑体局在グリオキサラーゼの発見と機能解析ジカルボニル解毒の全容を明らかにするために、AKRと比較し、MG解毒に特化しているグリオキサラーゼ(GLO)の存在とその生理機能解明を試みた。その結果、シロイヌナズナゲノムに、GLO1とGLO2遺伝子を見出した。GLO1の細胞内局在解析を行ったところ、葉緑体に存在していた。さらに、その遺伝子産物は、これまで報告されているヒト型GLO1の触媒能力に匹敵した。現在、シロイヌナズナで、GLO1が欠損した変異株の生理解析を野生型と比較することにより行っている。高等植物シロイヌナズナ生葉でのジカルボニル生成とそのメカニズムの解明MGは、解糖系でのtriose phosphate isomerase (TPI)反応の副産物で生成する。我々は、葉緑体カルビン回路で機能するTPIもまたMGを生成する可能性があると考え、光合成条件下でのMG生成を検証した。その結果、葉緑体への光照射のみではMGは生成しなかったが、光合成条件かMGの生成が認められた。また、生葉でも、光に存して、また高CO2条件で光合成が促進されると、MGの生成が顕著に増加した。さらに、MG以外のジカルボニル生成の増加も認められた。これらの結果は、植物における光合成の営みは、ジカルボニル生成が不可避であることを示す。25年度が最終年度であるため、記入しない。我々は、植物糖代謝(光合成および呼吸)過程において、副産物として生成する毒性アルドケト化合物(糖アルデヒド)による細胞障害(植物糖尿病)の発症メカニズムおよび解毒メカニズムの全容解明を目的に研究を行っている。(1)高等植物での糖アルデヒド(メチルグリオキサールMG)解毒機構の解明:シロイヌナズナで、NADPHを電子供与体としてMGを還元無毒化する酵素aldo-keto reductase (AKR)ファミリーの全酵素の酵素学的特徴を明らかにし、MG還元に特異性が高いAKRを新たに見出した。さらに、これら酵素が、脂質アルデヒドにより酸化修飾を受け、失活することを明らかにした。つまり、細胞名でアルデヒドによりダメージを被るタンパク質を新たに見いだした。(2)高等植物でのAKR機能解析:上述したAKRの生理的役割を明らかにするために、AKRを欠損したシロイヌナズナタグラインのスクリーニングを行い、候補ラインを取得した。これらラインでの生葉におけるAKR活性の低下を確認した。(3)ランソウでの糖アルデヒド(メチルグリオキサールMG)解毒機構の解明:我々は、高等植物葉緑体の祖先生物と考えられているランソウにおいて、糖アルデヒド解毒メカニズムの検証を行った。その結果、ランソウにおいても、AKR活性を見出すとともにAKR遺伝子の同定を行った。現在、その生理的役割を細胞レベルで明らかにするためにAKR欠損ラン藻の作出を行っている。(4)高等植物での脂質アルデヒド(アクロレイン)解毒機構の解明:植物は、この脂質アルデヒドの中でもっとも反応性が高いアクロレインをNADPHを用いて無毒化する酵素AORをもつ。高CO2環境下で細胞内に糖が高蓄積する状況でのAORの生理的役割を解明するためにAOR欠損シロイヌナズナを作出し、その解析に取り組んだ。研究実績で述べた課題について、以下達成度を記す。(1)高等植物での糖アルデヒド(メチルグリオキサールMG)

解毒機構の解明:本年度、AKRファミリーの全容解明を来ないそれぞれの酵素の特質を明らかにした。しかしながら、細胞レベルでの、局在性、発現制御など、解明すべき課題(生理学的)は残る。(2)高等植物でのAKR機能解析:AKRファミリーのそれぞれの酵素を欠失したシロイヌナズナ・タグラインを入手した段階である。AKRの生理学的役割解明のためには、これらタグラインの詳細な解析が不可欠である。(3)ランソウでの糖アルデヒド(メチルグリオキサールMG)解毒機構の解明:作出したAKR欠損ラン藻の生理・生化学・分子生物学的解析を行う必要がある。(4)高等植物での脂質アルデヒド(アクロレイン)解毒機構の解明:作出したAOR欠損シロイヌナズナの生理・生化学・分子生物学的解析を行う必要がある。最終年度に当たる平成25年度は、これまでと同様に以下の項目の課題遂行に取り組む。(1)高等植物での糖アルデヒド(メチルグリオキサールMG)解毒機構の解明:MGおよび他の糖アルデヒド無毒化に関わるデヒドロゲナーゼ遺伝子の候補を、新たにデータベース上で見いだしている。本年度は、これら候補遺伝子の取得および遺伝子産物の酵素学的解析を行い、AKRとのアルデヒド無毒化の比較解析を行う。(2)高等植物でのAKR機能解析:取得したシロイヌナズナ・タグラインを用いて、高CO2環境下でのアルデヒドによる細胞障害の評価、光合成・呼吸さらに成長への影響評価を行う。予備的解析では、AKRファミリーの1つが欠損したタグラインでは、高CO2環境下での生育が大きく抑制されることを見出している。このタグラインを中心に、生化学・生理学・分子生物学的解析を推進する。(3)ランソウでの糖アルデヒド(メチルグリオキサールMG)解毒機構の解明:AKR欠損ラン藻を用いて、ランソウでのアルデヒド代謝の全容解明を行うべく、様々な環境にランソウを暴露し、アルヒデヒドによるタンパク修飾、遺伝子発現の確認を行う。さらに、光合成・呼吸名だ尾の生理学的要素へのAKRの関わりを探索していく。(4)高等植物での脂質アルデヒド(アクロレイン)解毒機構の解明:AOR欠損シロイヌナズナは、光合成が促進する強光環境下、光合成能および呼吸能の低下が生じる。本年度は、強光環境下での糖アルデヒドおよび脂質アルデヒドの相関解析を行い、光合成による細胞障害発生させる化合物の同定を試みる。さらに、高CO2かでのAOR欠損シロイヌナズナの成長解析・生理学的解析を行い、脂質アルデヒドによる細胞障害と高CO2の因果関係を明らかにする。25年度が最終年度であるため、記入しない。
機械意匠設計のための細分割曲面モデリング手法に関する研究

製品機能が成熟化するなかで、より意匠性が高く、高品質な製品デザインへの要求が高まっている。細分割曲面は、近年注目されているモデリング技術で、多面体を連続的に分割してゆくことによって、その極限において滑らかな曲面を生成する手法である。これを機械意匠の分野で適用するためには大きな課題がいくつかある。その最も重要なものは、デザイナが意匠曲面を定義する方法や手順が、細分割曲面モデリングでは実現されていない、ということである。本研究の目的は、機械意匠設計に適した細分割曲面モデリングの手法について研究を行った。本研究では、デザイナのためのモデリング機能として次の二つを主に考えている。(1)スキニング:断面線とそれが空間で動く軌道を与えて曲面を生成する。(2)内挿:境界曲線を与えて、内部の曲面を生成する。まずスキニング(断面線とそれが空間で動く軌道を与えて曲面を生成する)手法に注目し、そのための基礎理論とアルゴリズムを開発した。外部仕様的には、従来のパラメトリック曲面のスキングを踏襲した。今年度は、このスキニングを更に改良する。スキニングではいくつかの設計自由度があるため、これをどのように設定するかについて検討し、その設計方法を研究した。また、特徴線を与えて内部を内挿する方法についても研究を行った。これは、従来は境界曲線が与えられた場合には可能であったが、ここでは任意位相の境界曲線を考え、それに対して面分を同定し、曲面を生成する方式を考えた。これらに対する細分割曲面生成アルゴリズムを開発し、パーソナルコンピュータによって試作システムを作成し、様々な条件で曲面を生成することによって、手法の評価を行った。その結果、任意位相に対する有効性は確認できたものの、境界曲線のパタンによっては、曲面が必ずしもデザイナの意図した形にならない場合があり、細分割スキームの拡張の必要性が今後の課題として与えられた。細分割曲面は、近年注目されているモデリング技術で、多面体を連続的に分割してゆくことよって、その極限において滑らかな曲面を生成する手法である。細分割曲面のモデリング能力は非常に高く、これを機械意匠の分野で適用することを研究の目的としている。そのため機械意匠設計に適した細分割曲面モデリングの手法を開発することにある。本年度は、スキニング(断面線とそれが空間で動く軌道を与えて曲面を生成する)手法に注目し、そのための基礎理論とアルゴリズムを開発した。まず、補間すべき断面線と起動曲線から仮想的にスキング面を定義した。これは各断面線をスィープした曲面を独立に創成し、それらの面の重みつき平均として生成するものである。これをリファレンスの曲面として、この面にフィットするようにした細分割曲面を生成した。ここで、この細分割曲面の初期多角形の位相を決めることが重要な問題となるが、そのために幾つかの手法を試した。一つはできるだけ滑らかで凹凸の少ない曲面を生成するためのもので、格子状の配列をもつものとした。もう一つは、断面線間の対応付けを行うことによって、曲面の中に特異点を配置するものである。これによって従来のパラメトリック曲面ではできなかったような曲面が溶け込むようなスキングを実現できた。今後手法の洗練化を行うとともに、他の曲面生成手法にも適用する計画である。

その最も重要なものは、デザイナが意匠曲面を定義する方法や手順が、細分割曲面モデリングでは実現されていない、ということである。本研究の目的は、機械意匠設計に適した細分割曲面モデリングの手法について研究を行った。本研究では、デザイナのためのモデリング機能として次の二つを主に考えている。(1)スキニング:断面線とそれが空間で動く軌道を与えて曲面を生成する。(2)内挿:境界曲線を与えて、内部の曲面を生成する。まずスキニング(断面線とそれが空間で動く軌道を与えて曲面を生成する)手法に注目し、そのための基礎理論とアルゴリズムを開発した。外部仕様的には、従来のパラメトリック曲面のスキングを踏襲した。今年度は、このスキニングを更に改良する。スキニングではいくつかの設計自由度があるため、これをどのように設定するかについて検討し、その設計方法を研究した。また、特徴線を与えて内部を内挿する方法についても研究を行った。これは、従来は境界曲線が与えられた場合には可能であったが、ここでは任意位相の境界曲線を考え、それに対して面分を同定し、曲面を生成する方式を考えた。これらに対する細分割曲面生成アルゴリズムを開発し、パーソナルコンピュータによって試作システムを作成し、様々な条件で曲面を生成することによって、手法の評価を行った。その結果、任意位相に対する有効性は確認できたものの、境界曲線のパタンによっては、曲面が必ずしもデザイナの意図した形にならない場合があり、細分割スキームの拡張の必要性が今後の課題として与えられた。
口腔顔面部神経障害性疼痛の発症機序の解明とその治療法の確立

本研究では神経障害性疼痛の発症機序を中枢神経系におけるグリア細胞の作用を時系列的に解明し、その発症機序に神経栄養因子がどのように関係しているかを明らかにすることを目指した。グリア細胞の活動は慢性痛形成前に活発化し、慢性痛形成後には活性が減弱することが予想された。また、神経栄養因子の産生の促進は、熱刺激に対する反応潜時には影響しなかったが、慢性疼痛に伴ううつ様症状は軽減させることが予想された。本研究では、本研究では、神経障害性疼痛の発症機序を、脊髄後角から皮質・中脳脊髄路、大脳辺縁系に至る神経系におけるグリア細胞の相互作用を時系列的に解明し、その発症機序にBDNFがどのように関係しているかを、下歯槽神経障害モデルおよび薬剤による慢性疼痛発症モデルを使用して明らかにすることを目的としているが、現在、安定した動物モデルの確立に取り組んでいる。また、一方で先行研究が多くある坐骨神経結紮モデルを使用して基盤となる研究に取り組んでいる。現在までの坐骨神経結紮モデルを使用した動物モデルでは、ノルアドレナリン、セロトニンの再取り込みを阻害薬のイミプラミンを腹腔内投与により、坐骨神経結紮後の熱刺激に対する反応潜時には影響せず、強制水泳試験における不動時間(うつ様症状)の延長を軽減した。この効果は、選択的セロトニン神経毒の5,7-ジヒドロキシトリプタミン、anti-BDNF抗体で拮抗された。また、組織標本による評価では、イミプラミンの投与により、pERK1/2の活性化、pCREBの不活性化、5-HT/BDNF含量およびBDNFmRNAの低下を抑止した。これらのことから、イミプラミンは、5-HT含有神経の活性化とBDNF産生の促進を引き起こし、うつ様症状を軽減すると予想される。一方、イミプラミンはBDNF産生を促進するが、熱刺激に対する反応潜時には影響しなかった。この点については、今後、イミプラミンの投与量の変更による考察が必要であろうと考える。今後は、動物モデルの早期の安定化を目指し、グリア細胞の活性抑制剤の投与により、マイクログリアの働きの急性痛から慢性痛にいたるまでの経時的変化の評価を行う予定である。本研究では、神経障害性疼痛の発症機序を、脊髄後角から皮質・中脳脊髄路、大脳辺縁系に至る神経系におけるグリア細胞の相互作用を時系列的に解明することを目的としている。動物モデルによる実験系では、計画ではラット下歯槽神経を結紮する下歯槽神経障害モデルおよび側脳室および脊髄くも膜下腔内への薬剤投与による慢性疼痛発症モデルを使用する予定であったが、安定した動物モデルが得られていない。一方で、急性痛から慢性痛に至る過程を観察できるcarrageenanの筋肉内投与による動物モデルを使用して基盤となる研究に取り組んでいる。現在、3%carrageenanをラット咬筋に注入して慢性疼痛発症モデルを作成している。このモデルを観察したところ、carrageenan投与48時間までは急性痛が発症し、その後投与後2週間ぐらいまでが移行期、投与後2週間で慢性痛が発症することがわかってきた。また、発症した慢性痛はcarrageenan投与後約6週間で症状が消失するようである。このモデルを使用して、急性痛から慢性痛にいたるまでのマイクログリアの働きの経時的変化の評価をマイクログリアの活性抑制剤(ミノサイクリン塩酸塩)を投与することで行っている。マイクログリアの活性抑制剤の投与により、急性痛発症の抑制は起こらないが、慢性痛発症は抑制されることが確認され。今後、マイクログリアの活性抑制剤の投与時期を変えることで、急性痛から慢性痛に至る過程のどの時期のマイクログリア活性を抑制することが慢性痛発症の抑制に効果的かを観察するとともに、慢性痛発症の抑制には何が関係しているのかを探索していく予定である。実験計画で使用予定であった動物モデルの安定化が得られず、基盤的な研究をするためにcarrageenan注入による別の慢性疼痛発症モデルを取り入れたため。本研究では、神経障害性疼痛の発症機序を、脊髄後角から皮質・中脳脊髄路、大脳辺縁系に至る神経系におけるグリア細胞の作用を時系列的に解明することを目的としている。本研究計画における動物モデルによる実験計画では、ラット下歯槽神経を結紮する下歯槽神経障害モデルおよび側脳室、脊髄くも膜下腔内への薬剤投与による慢性疼痛発症モデルを使用する予定であったが、研究期間中に安定した動物モデルを得ることができなかったため、急性痛から慢性痛に至る過程を観察することが可能なcarrageenannの咬筋内投与による動物モデルを使用して、基盤となる研究に取り組んだ。Carrageenannの咬筋内投与による動物モデルでは、carrageenannの咬筋内投与後約24時間まで急性痛が発症し、投与後約2週間で慢性痛に移行し、その後投与後4週間まで慢性痛が継続することが確認された。このモデルを使用して,急性痛から慢性痛に課程でのマイクログリアの作用の評価をマイクログリア活性抑制剤であるミノサイクリン塩酸塩の投与を行うことで行った。マイクログリア活性抑制剤投与を急性痛発症前(carrageenannの咬筋内投与直前)から行った群では、急性痛の発症を抑制することはなかったが、慢性痛の発症は抑制されることが確認された。また、マイクログリア活性抑制剤投与を慢性痛発症後(carrageenannの咬筋内投与2週間後)から行った群では慢性痛発症は抑制されないことが確認された。

これらのことから、急性痛発症の時期においてマイクログリアが慢性痛の形成に関与していることが予想され、慢性痛の発症を予防するには、できるだけ早い時期にマイクログリアの活動を抑制することが重要だと考えられる。本研究では神経障害性疼痛の発症機序を中枢神経系におけるグリア細胞の作用を時系列的に解明し、その発症機序に神経栄養因子がどのように関係しているかを明らかにすることを目指した。グリア細胞の活動は慢性痛形成前に活発化し、慢性痛形成後には活性が減弱することが予想された。また、神経栄養因子の産生の促進は、熱刺激に対する反応潜時には影響しなかったが、慢性疼痛に伴ううつ様症状は軽減させることが予想された。研究計画で予定していた、動物モデルの安定化が得られていない。また、今年度、九州歯科大学から広島大学に異動したため、申請書作成時に想定していた研究環境と異なる部分があり、研究開始の準備に時間を要したため。引き続き、実験計画で使用予定であった動物モデルの安定化を目指すと同時にcarrageenan注入による慢性疼痛発症モデルを使用して、慢性痛発症とマイクログリア活性の関係について探索して行く。歯科麻酔学現在、研究のための準備はほぼ整っており、動物疼痛モデルの安定化を早期に目指す予定である。動物モデルの安定化を得た後に、グリア細胞の活性抑制剤の投与により、マイクログリアの働きの経時的変化の評価を行う予定である。当初の実験計画で使用予定であった動物モデルが安定せず、実験の遂行に遅れが生じているため。九州歯科大学から広島大学に異動したため、申請書作成時に想定していた研究環境と異なる部分があり、研究開始の準備に時間を要し、予定していた実験装置の購入が遅れたため。引き続き、実験計画で使用予定であった動物モデルの安定化を目指すと同時にcarrageenan注入による慢性疼痛発症モデルを使用して、慢性痛発症とマイクログリア活性の関係について探索して行く予定であり、薬品、試薬の購入で使用する予定である。また、熱刺激装置の購入の検討を行っている。ラット用電子痛覚測定装置及び、実験に使用する薬品の購入。
結び目と3次元多様体の同変不変量

結び目と3次元多様体の不変量について研究した。筆者はベッチ数が1の3次元多様体の量子不変量の摂動展開を計算し、これを摂動的不変量として定式化した。さらに、この摂動的不変量を導出するようなLMO不変量(普遍摂動的不変量)の精密化をこのクラスの3次元多様体にたいして構成した。これらの不変量は同変不変量の観点から定式化されたもので、従来知られている不変量よりもはるかに強力な不変量である。結び目と3次元多様体の不変量について研究をおこなった。筆者はfirst Betti数が1の3次元多様体の量子不変量の摂動展開を計算し、これを摂動的不変量として定式化した。さらに、この摂動的不変量を導出するようなLMO不変量(普遍摂動的不変量)のrefinementをこのクラスの3次元多様体にたいして構成した。従来の定義によるLMO不変量はfirst Betti数が大きくなるにつれて急激に弱くなることが知られているが、本研究で筆者が構成したLMO不変量のrefinementはこのクラスの3次元多様体にたいしても非常に強力な不変量である。とくに、このrefinementの2ループの部分から「2ループ多項式」という2変数多項式不変量を定式化することができ、これはCasson-Walker-Lescop不変量のrefinementになっている。これらの研究成果について、筆者は、2007年6月に北京の国際会議で基調講演をし、2007年12月に京都の国際会議で基調講演をした。筆者は、本研究の研究分担者の葉廣和夫氏と共同で低次元トポロジーセミナーを開催した。今年度の講演者は、渡辺忠之氏、石井敦氏、Ybav Rieck氏であった。これらのセミナーは申請者や研究分担者との共同研究をすすめるにあたって、また、大学院生等の若手研究者との研究交流の面からも、大変有益であった。これらの研究成果について、筆者は論文を執筆した。また、これらの研究成果について、筆者は、2008年4月にデンマークの国際研究集会で招待講演をし、2008年8月にトポロジーシンポジウム(金沢)で招待講演をした。また、これらの研究成果と関連して、筆者は3次元多様体の不変量について著書(共著、「幾何学百科」第2巻第4章、朝倉書店)の執筆をはじめた(2010年刊行予定)。筆者は、本研究の連携研究者の葉廣和夫氏と共同で低次元トポロジーセミナーを開催した。今年度の講演者は、John Morgan氏、Gwenael Massuyeau氏、Jean-Baptiste Meilhan氏であった。これらのセミナーは申請者や連携研究者との共同研究をすすめるにあたって、また、大学院生等の若手研究者との研究交流の面からも、大変有益であった。
薬用植物の二次代謝物生合成遺伝子の単離とトランスジェニック植物への導入及び発現

βー置換アラニン類生合成遺伝子のクロ-ニングとエンジニアリング薬用植物における二次代謝を分子レベルで人為的に制御するためには,生合成遺伝子のクロ-ニングおよび発現制御の分子レベルでの理解が不可欠である.そこで植物二次代謝の代表的な系である非タンパク性βー置換アラニン類生合成の分子生物学的研究を進めている.これらのアミノ酸はOーacetylserineを基質としてシステイン合成酵素(CSase)のisozymeにより生合成される(10).そこで,ホウレンソウよりCSaseを単一に精製し,ペプチド分解したフラグメントのアミノ酸配列を決定した.得られたアミノ酸配列をもとに合成DNAプロ-ブによって,ホウレンソウ緑葉から構築したcDNAライブラリ-をスクリ-ニングし約1.3kbのインサ-トをもつcDNAクロ-ンを単離した.全塩基配列の決定の結果cDNAクロ-ンは325アミノ酸残基をコ-ドしていることが示され,ピリドキサ-ルリン酸を補酵素とする活性中心部位が予想された.今後,タンパク質工学的手法による反応機構の解明,遺伝子発現の分子機構,トランスジェニック植物での高発現および生合成遺伝子の分子進化などについて検討する予定である.まとめ薬用植物における遺伝子操作はここで述べたように既にいくつか成功している.今後さらにより精密な分子育種を考えたとき,二次代謝遺伝子発現の細胞および分子のレベルでのより深い理解が不可欠であると考えられる.今後ますますこの方法の研究の進展が期待される.βー置換アラニン類生合成遺伝子のクロ-ニングとエンジニアリング薬用植物における二次代謝を分子レベルで人為的に制御するためには,生合成遺伝子のクロ-ニングおよび発現制御の分子レベルでの理解が不可欠である.そこで植物二次代謝の代表的な系である非タンパク性βー置換アラニン類生合成の分子生物学的研究を進めている.これらのアミノ酸はOーacetylserineを基質としてシステイン合成酵素(CSase)のisozymeにより生合成される(10).そこで,ホウレンソウよりCSaseを単一に精製し,ペプチド分解したフラグメントのアミノ酸配列を決定した.得られたアミノ酸配列をもとに合成DNAプロ-ブによって,ホウレンソウ緑葉から構築したcDNAライブラリ-をスクリ-ニングし約1.3kbのインサ-トをもつcDNAクロ-ンを単離した.全塩基配列の決定の結果cDNAクロ-ンは325アミノ酸残基をコ-ドしていることが示され,ピリドキサ-ルリン酸を補酵素とする活性中心部位が予想された.今後,タンパク質工学的手法による反応機構の解明,遺伝子発現の分子機構,トランスジェニック植物での高発現および生合成遺伝子の分子進化などについて検討する予定である.まとめ薬用植物における遺伝子操作はここで述べたように既にいくつか成功している.今後さらにより精密な分子育種を考えたとき,二次代謝遺伝子発現の細胞および分子のレベルでのより深い理解が不可欠であると考えられる.今後ますますこの方法の研究の進展が期待される.高等植物二次代謝の制御機構を分子レベルで理解するためには,二次代謝産物の生合成酵素遺伝子のクロ-ニングと植物へ再導入する実験が不可欠である.本研究担当者は植物二次代謝のモデル系として,非タンパク性βー置換アラニン類生合成の鍵酵素であるcysteine合成酵素(CSーase)についてその発現制御のDNAレベルでの解明を目的として,本酵素の内部アミノ酸配列の決定を行いcDNAクロ-ニングを進めている.ホウレンソウ(Spinacia oleracea)の新鮮葉には,二種類のCSaseA,Bが存在する.これらは,それぞれ可溶性画分およびクロロプラストに存在している.そこでCSase A,BそれぞれSDSーPAGE上均一なバンドにまで精製したが両isoenzymeともNー末端が保護されており,直接アミノ酸配列を決定できなかった.そこで,V8プロテア-ゼにより分解されたフラグメントのNー末端のアミノ酸配列を気相シ-クエンサ-によって決定した.現在までにCSase Aの4つのフラグメントのシ-クエンスを部分的に決定した.その結果,2つのフラグメントについてサルモネラ菌,大腸菌のCSaseと最大72%のホモロジ-のある領域を同定できた.現在アミノ酸配列から予想される合成オリゴヌクレオチドを用いて,PCR法等によりcDNAのクロ-ニングを進めている.また,マメ科植物に特有なキノリチジンアルカロイドの代謝酵素の活性を無細胞系で確認し,現在本酵素活性の精製を検討している.[目的]高等植物二次代謝の制御機構を分子レベルで理解するためには,二次代謝産物の生合成酵素遺伝子のクロ-ニングと植物へ再導入する実験が不可欠である.今回演者らは植物二次代謝の代表的な系である非タンパク性βー置換アラニン類生合成の鍵酵素システイン合成酵素(CSase)のcDNAクロ-ンをホウレンソウから単離し全塩基配列を決定した.[方法,結果]ホウレンソウ(Spinacia oleracea)の新鮮葉には,二種類のCSaseA,Bが存在する.そこで精製したCSaseAの4個のV8プロテア-ゼ分解フラグメントのアミノ酸配列を決定し,これを基にイノシンを含む合成DNAプロ-ブV812(50mer)とV822(56mer)を作製した.ホウレンソウ緑葉よりλgt10を用いて作製したcDNAライブラリ-をスクリ-ニングし,200,000クロ-ンから19個のポジティブなクロ-ンを単離した.サブクロ-ニングの後,約1.3kbのインサ-トを持つ2個のクロ-ンの全塩基配列を決定した.cDNAクロ-ンは325アミノ酸残基をコ-ドしていることが示され,ピリドキサ-ルリン酸を補酵素とする活性中心部位が予想された.

また,大腸菌,サルモネラ菌のシステイン合成酵素遺伝子と約50%,ラット肝臓のヘムタンパクHー450と約40%のアミノ酸配列のホモロジ-が認められた.現在,異種生物での発現などを検討している.