hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ベッセルビームを用いたレーザーアブレーションによるマイクロ3次元加工

本研究の目的はレーザー微細加工に「深い焦点深度」を有するベッセルビームを適用することにより,簡便なレーザー微細加工手法を開発することである.ベッセルビームによるレーザー加工では表面ダメージが生じ易いことが欠点として知られているが,加工雰囲気を真空にするなど試料表面の酸化を防ぐことにより加工ダメージを大幅に低減できることが分かった.またベッセルビームを発生させる際に用いるアクシコンレンズに要求される加工精度は照射するレーザー光の波長が短いほど,アクシコンレンズ頂角が小さいほど高くなることを数値解析により見出した.本研究の目的はレーザー微細加工に「深い焦点深度」を有するベッセルビームを適用することにより,簡便なレーザー微細加工手法を開発することである.ベッセルビームによるレーザー加工では表面ダメージが生じ易いことが欠点として知られているが,加工雰囲気を真空にするなど試料表面の酸化を防ぐことにより加工ダメージを大幅に低減できることが分かった.またベッセルビームを発生させる際に用いるアクシコンレンズに要求される加工精度は照射するレーザー光の波長が短いほど,アクシコンレンズ頂角が小さいほど高くなることを数値解析により見出した.ナノ秒パルスYAGレーザーを光源として、可視光(532nm)および紫外光(266nm)でのマイクロドリル加工を行った。紫外光で実験を行うために光学系の一部を紫外光用に変更し、金属材料に対しての加工を行った。その結果、紫外光での加工では副次ロブに起因する加エダメージ(多重リング構造)が目立つことが分かった。この原因としてアクシコンレンズにて発生させたベッセルビームのビーム形状が、適用されるレーザー光の波長によって異なっていると考察し、フレネル回折を基本とした数値解析を行った。アクシコンレンズの円錐対称軸と底面のなす角の角度ずれに着目し、解析を行った結果、1.波長が短くなるほど、角度ずれの許容値が小さくなる。2.半頂角が小さいほど,角度ずれの許容値が小さくなることが分かった。解析の結果、266nmのレーザー光を適用してベッセルビームを発生させる場合はアクシコンレンズに求められる工作精度が厳しくこともあり、DOEアクシコンの設計を行った。材質は石英とし、それぞれ半頂角80°,85°,88°のアクシコンレンズに対応する設計とした。金属・高分子材料に加え、セラミックス(窒化アルミナ)に対してのマイクロドリル加工を行った。金属材料に対する加工では酸化に起因する副次ロブによる加工ダメージが目立つ傾向であるが、セラミックスの酸化物は白色であることからも、加工ダメージ(特に着色)はそれほど目立たないことが分かった。また532nmのレーザー光で発生させたベッセルビームで、アスペクト比約5のマイクロサイズオーダーの穴を形成する事ができた。355nmの紫外光を用いたポリイミドへのマイクロドリルでは照射エネルギー密度を適切に選択することにより、副次ロブに起因する加工ダメージを低減できることが分かった。本年度は窒化アルミニウムやシリコンを中心にマイクロ溝加工を行った.窒化アルミニウムは極めて高い熱伝導率と電気絶縁性から電子材料として重要視されているが,脆性材料のため機械加工での微細加工は困難であり,レーザー加工の適用が期待される.いくつかの窒化アルミニウムのマイクロ溝加工に関する報告がされているものの,いずれも穴あけ加工を中心とした報告に一例として記載されているのみで詳細は報告されていない.本研究では,実際の加工で重要なパラメータとなる,波長や照射エネルギー密度,ライン移動速度,照射時間などを変化させた実験を行った。まず可視光(532mm)と紫外光(266mm)を用いた溝加工において,波長が加エダメージにおよぼす影響を検討した,その結果可視・紫外光ともにエネルギー密度が大きいほど,ステージの移動速度が大きいほど,試料表面のダメージが顕著になっている,また,エネルギー密度がほぼ等しい条件では,532nm波長と比較して移動速度が大きい場合でも266nm波長ではダメージが低減されていることが分かった,可視光による加工は,高エネルギー密度による試料材料の溶解,蒸発に起因し,試料表面では激しい熱衝撃が生じる,それに対し紫外光による加工は,光化学反応が関与するため熱による影響が低減され、表面ダメージの低減にっながると考えられる.移動速度を固定し,単位長さあたりのパルス数を変化させた際の溝深さを検討した結果,可視光では紫外光と比較して同一パルス数の照射による溝深さが大きくなっており,加工速度が大きくなっていることが分かった.しかしながら可視光では,照射パルス数が増加するに従い,溝深さが一定以上から進展しにくくなり加工速度が著しく低下した.一方,紫外光の場合は加工速度の低下は可視光の場合と比較して小さいことが分かった.
生物のかたちをつくるモルフォゲンの作用機構

Dppモルフォゲンの活性勾配はその受容体のレベルによって規定されている。受容体の発現を制御する新規遺伝子の機能解析を通して、コンパートメント形成とモルフォゲン勾配形成の共役機構を明らかにした。Dppモルフォゲン・シグナルは受容体Thickveins(Tkv)を介して核に伝えられる。Tkvの発現レベルは後部コンパートメントで高く、前部コンパートメントで低い。またDppを発現している細胞では最も低い発現レベルを示す。細胞が受容するDppシグナルを、細胞内伝達因子Madの活性化状態(リン酸化、pMad)を指標に可視化する方法を開発した。シグナルはDppを発現している細胞において非常に低く、後部コンパートメントにおける勾配は前部の勾配よりも急である。これはTKvの発現量で説明される。Tkvと相補的な発現パターンを示す新たな系統を同定し、master of thickveins(mtv)と名付けた。Mtvは1つのZincfinger構造を持つほかはきわだったモチーフを持たない。クローン解析の結果、mtvはTkvの発現を負に調節していることが解った。ヘッジホッグはDpp発現領域においてtkvの発現レベルを抑制している。また、後部コンパートメントで発現するenがtkvのレベルを調節している。2重変異クローンの解析から、これらの作用がmtvにより担われていることを明らかにした。Enはヘッジホッグを介てDppモルフォゲンの発現を誘導するばかりではなく、その受容体であるtkvの発現をも調節し、Dppシグナルの強度分布パターンを制御する。mtvはこの共役を維持するためにenおよびヘッジホッグからのシグナルを統合する因子として働く。さらにDppのターゲット遺伝子の発現を抑制している新規遺伝子brkを同定し、Dppはbrkの発現を抑制することによりターゲットの発現を調節していることを明らかにした。ショウジョウバエにおけるBMPのホモログであるDpp(Decapentaplegic)は様々な発生過程においてモルフォゲンとして機能し、形態形成における個々の細胞の位置価を設定する働きを持つと考えられている。このメカニズムを理解するためにDppにより発現が制御されるターゲットの探索を行ったところ相補的な発現パターンを示す2種の遺伝子、dad(daughters against dpp)とbrk(brinker)を得た。dadはSmadのC末側にあるMH2ドメインに相同性を持つ蛋白質をコードし、その発現はdppにより正に制御されている。一方、brkの発現はdppにより負に制御されている(dadとbrkは相補的な発現パターンを示す)。機能喪失および機能獲得変異の解析から、両者はDppのターゲット遺伝子の発現を負に制御していることが明らかとなった。DadはTGF-βファミリーの信号伝達を負に制御するSmad6,7と同様に、リセプターによるMadのりん酸化を阻害することによって、Dppシグナルを制御していると考えられる。brkがコードする蛋白質は既知のモチーフを持たないが、ショウジョウバエの転写因子Dsxに弱い相同性があることから転写因子として機能することが示唆される。DppはBrkの発現を抑えることによってターゲット遺伝子の発現を制御していると思われる。Brkが脊椎動物においても機能している可能性を調べるために、Xenopus初期胚における作用を検討した。BrkmRNAの注入によって胚の背側化が観察され、これはBMP-4による腹側化を抑制していることが示唆された。事実BrkとBMP-4mRNAの共注入により両者の効果が相殺されたことから、BrkはBMP-4の作用を特異的に阻害することが示された。BrkはDpp/BMPモルフオゲンの制御に普遍的に機能している可能性がある。ショウジョウバエの翅形成をモデルシステムとしてモルフォゲンが細胞の分化を制御する機構を理解することを目指している。

本年度はDppモルフォゲンの活性を可視化する手段を用い、細胞がどのようにモルフォゲン・シグナルを受け取り、遺伝子発現のout putに変換しているかを探ることを試みた。Dppモルフォゲン・シグナルは転写因子Madによって核に伝えられる。MadはDppレセプターであるThick veins (Tkv)によりリン酸化を受けることにより核に移行し、転写複合体を形成し、ターゲットの転写を制御していると考えられている。そこで、リン酸化Mad (p-Mad)に特異的な抗体を用いることによってMadの活性化を指標としたDppモルフォゲンの活性の分布をin vivoで視覚化した。翅成虫原基ににおけるp-Madの分布は複雑なパターンを示す;Dppを発現する細胞の付近で最大となる勾配を形成しているが、Dppを発現している細胞そのものにおいてはシグナルは非常に低下している。このp-Madシグナルの低下はヘッジホッグによる直接的な制御によることが明らかとなった。加えて、ヘッジホッグによるp-Madレベルの調節のターゲットが受容体tkvであることを明らかにした。さらにtkvの発現は、前部コンパートメントで低く、後部コンパートメントで高くなっている。このことは後部コンパートメントにおいてp-Madで表わされるDpp活性の勾配が、前部コンパートメントよりも急であることと良く一致する。すなわち、Tkv受容体の発現量が多いと、より多くのDpp分子が捕捉されるためにDppモルフォゲンの勾配は急になると考えられる。ヘッジホッグはDppモルフォゲンの発現を誘導するだけではなく、その活性の勾配の形成にも直接働いている。モルフォゲンが他のモルフォゲンの勾配の形成をもプログラムする巧妙なメカニズムが明らかになった。
人工原子を用いたアキシオン探索用光子検出器の開発

宇宙暗黒物質の正体とその性質については、現在の素粒子・宇宙物理学分野における重要な未解決問題の一つである。暗黒物質を構成すると考えられている素粒子の有力な候補の一つであるアキシオンは強い相互作用におけるCP問題に関連してその存在を予言されている。その質量は理論的には任意の値を取りうるが、様々な宇宙・天体物理学的な考察により、10^<-3>-10^<-6>eVの領域に絞られている。宇宙由来アキシオンの存在を検証する最も有力な実験的方法は強磁場中に置かれた共振空胴中でのアキシオン転換光子を検出するものであり、現在日本と米国の2つのグループがこの方法に基づき、質量10^<-4>-10^<-6>eVのアキシオンに対する理論的数密度限界までの感度を持った探索実験を行っている。しかしそれより重い領域、すなわちmeV程度の質量領域に対してはレーザーを用いた実験や太陽由来のアキシオン検出実験が提案され行われているが、十分な感度には至っていない。そこで、本研究では人工原子を用いて、この領域の質量を持った宇宙由来アキシオン探索用検出器の開発を目的としている。meVの質量領域での転換光子は遠赤外光に相当する。このような波長域に対して、人工原子の単電子トランジスター(SET)とよばれる作用を用いて単一光子の検出手段として利用できる。このアイディアに基づき実験の有効性を検証するため、今年度は昨年度に整備をした単一遠赤外光検出器の低温環境テストベンチを利用して冷却テスト実験を行い、温度制御装置等を含めた改良を進めた。現在は実際の試料を利用した実験についての準備を進めているところである。また、アキシオンの理論模型から予測される数密度に対して有効な感度が得られるか、実験データを利用して検討を進めている。素粒子・宇宙物理学の分野における最近の重要な問題の一つである宇宙暗黒物質の正体はいまだに明らかではないが、アキシオンは有力な候補の一つである。その質量は様々な宇宙・天体物理学的な考察により、10^<-3>-10^<-6>eVの領域に絞られている。その存在を検証するため、世界中でいくつかの実験・研究が行われているが、最も有力な実験的方法は強磁場中に置かれた共振空胴中でアキシオンをマイクロ波光子に転換し、その光子を検出するものである。現在、日本と米国の2つのグループがこの方法に基づき、質量10^<-4>-10^<-6>eVのアキシオンに対する理論的数密度限界までの感度を持った探索実験を行っている。しかし、上記の手法は共振空胴の物理的な大きさなどの制約により、それより重い領域、すなわちmeV程度の質量領域に対して適用することは困難であり、この様なアキシオンに対する探索手法は未だに決定的なものが存在していない。そこで、本研究では人工原子を用いて、この領域の質量を持ったアキシオン探索用検出器の開発を目的としている。meVの質量領域は波長域では遠赤外光に相当するがこのような波長域には今まで単一光子の検出手段が存在していなかった。最近、人工原子の単電子トランジスター(SET)とよばれる作用を利用すると非常に信号対雑音比の良い単一光子検出が可能であることが報告されている。これを利用し、小型の共振空洞と一体化された遠赤外光検出器を多数用意し強磁場中に設置することにより、比較的短時間で今までの実験(太陽アキシオンの観測など)よりも良い感度で探索実験を行えることが期待される。このアイディアに基づき実験の有効性を検証するため、今年度は単一遠赤外光検出器の低温環境テストベンチの整備、及び試料の作成を行った。
実験内分泌学的手法と形態学的解析法を活用した小胞体ストレスへの新たなアプローチ

粗面小胞体は膜蛋白や分泌蛋白合成の場となる細胞内膜系小器官であり、細胞の種類や機能状態に応じた多様な形態をとる。本研究では、特異的な調節因子により分泌蛋白の生合成・分泌が明快に制御されている下垂体前葉内分泌細胞に着目して、実験内分泌学的操作で生じる粗面小胞体の微細構造や小胞体ストレス応答に関連する機能分子局在の変化を解析した。既に平成22年度には、GnRH誘導体である酢酸リュープロレリンを持続的に投与したラットモデルで同剤の標的細胞である下垂体前葉のLH/FSH産生細胞の微細構造の変化を解析し、強いGnRH刺激が付加される初期には管状細網構造をとる特異な粗面小胞体塊が出現すること、および、その後受容体の不応化現象によって逆説的に性腺刺激ホルモン生合成が抑制される時期には内腔が狭小化した粗面小胞体が積層化することを明らかにした。この研究成果を踏まえて、平成23年度にはさらに、去勢手術によって長期的に刺激されたLH/FSH産生細胞の微細構造がリュープロレリンの作用を受けてどのように変化するか検討した。その結果、持続的な刺激によって巨大に拡張していた粗面小胞体内腔は、同剤の追加投与直後から著明に分葉化することが明らかになった。その後、粗面小胞体内腔は次第に狭小化し長期的には積層化したことから、性腺刺激ホルモンの生合成が極度に亢進し小胞体ストレスが負荷されていると考えられるLH/FSH産生細胞に対しても、リュープロレリン持続投与が抑制的に作用することが示された。このような粗面小胞体の微細構造の変化はまた、GnRH誘導体持続投与ラットモデルが小胞体ストレス応答や小胞体構造維持機構を解析する上で再現性の高い有用な解析系となる可能性を示唆している。以上の研究成果は、研究発表欄に記載した学会(日本解剖学会・第117回全国学術集会、2012年3月、甲府)のシンポジウムで報告した。粗面小胞体は様々な膜蛋白や分泌蛋白の合成を行う細胞内膜系小器官であり、生体では細胞の種類や機能状態に応じて多様な形態をとる。本研究では、分泌蛋白を大量に生合成し、かつその合成量や分泌量が特異的な調節因子により制御されているペプチド性内分泌細胞に着目して、実験内分泌学的操作で生じる粗面小胞体の微細構造や機能分子局在の変化を解析し、より生体に即した条件で小胞体ストレス応答機構の詳細の解明を試みている。平成22年度にはGnRH誘導体である酢酸リュープロレリンの持続的投与あるいは去勢術を施したラットモデルを作製し、免疫組織化学法および電子顕微鏡観察で解析した。その結果、両方のモデルで処置後初期に下垂体前葉のLH/FSH産生細胞におけるホルモン分泌・産生が刺激されて一過性に複雑に絡み合った網状の特殊な小胞体塊が出現し、分泌蛋白の生合成が急激に促進されると粗面小胞体の膜量が飛躍的に増加する応答が生じることが示唆された。しかし、その後分泌蛋白の生合成が持続的に亢進する去勢されたラットの同細胞では粗面小胞体の内腔が拡張・融合し、印環状の特徴的な洞様構造物が形成されるのに対し、分泌蛋白の生合成が持続的に抑制される酢酸リュープロレリン投与ラットの同細胞では粗面小胞体内腔は顕著に狭小化し層板状の構造を呈した。今後は、さらにこの対照的な変化を踏まえて上記の実験内分泌学的操作を組み合わせ、去勢手術によってペプチドホルモン生合成が促進され肥大化した粗面小胞体が、その後GnRH誘導体持続投与でホルモン生合成が抑制された場合に、どのような過程を経て縮小するかを検討する予定である。また、この解析と並行して、LH/FSH産生細胞以外の下垂体前葉の内分泌細胞に関しても、特異的な刺激後に粗面小胞体の微細構造や機能がどのように変化するか同様に解析し、細胞種による応答の差異を明らかにする計画である。

その後、粗面小胞体内腔は次第に狭小化し長期的には積層化したことから、性腺刺激ホルモンの生合成が極度に亢進し小胞体ストレスが負荷されていると考えられるLH/FSH産生細胞に対しても、リュープロレリン持続投与が抑制的に作用することが示された。このような粗面小胞体の微細構造の変化はまた、GnRH誘導体持続投与ラットモデルが小胞体ストレス応答や小胞体構造維持機構を解析する上で再現性の高い有用な解析系となる可能性を示唆している。以上の研究成果は、研究発表欄に記載した学会(日本解剖学会・第117回全国学術集会、2012年3月、甲府)のシンポジウムで報告した。
酵母を用いた微小管機能制御因子の網羅的遺伝子相互作用解析

本研究の目的は、真核生物の染色体分配を制御する因子の解析により、細胞がどのような機構で増殖、分化するかを分子レベルで解明することである。染色体分配の制御機構は非常に多くの遺伝子の関与の上に成り立っている。本研究では分裂期に機械的な因子として中心的役割を果たす微小管の関与する制御機構の解明に取り組んだ。微小管機能は分裂期だけに限定しても非常に多くの遺伝子が関与することがこれまでの研究から明らかにされてきた。そこで本研究ではとりわけ微小管を中心とした因子群が細胞周期に共役して染色体分配を制御する機構を分子レベルで解析することを試みた。本研究では微小管機能制御因子Dislの解析、ならびにランダムに分離された突然変異株ライブラリーを用いた微小管関連因子の変異の解析を行なった。Dislを用いた解析からはDis1とコンデンシンとの相互作用が見いだされ、染色体凝縮に微小官機能が関与している可能性を示唆している。また、DislとMCM複合体の相互作用は全く予期せぬ物であった。この相互作用が生物学的に意味のある物であれば、DNA複製開始機構と微小官機能の遺伝子同士のつながりという新たな局面が開けると期待される。突然変異珠ライブラリーの中には、上記の他にチューブリン遺伝子、ならびに関連遺伝子の変異が少なくとも4株見いだされた。見出された遺伝子はいずれも機能的に予想される結果であったが、これまでの報告と矛盾がない点、ならびにこれらの遺伝子の分子レベルのさらに詳細な機能解析を行なう際に良い材料となると期待される。今回用いた突然変異株群ライブラリーを用いた網羅的な解析は、予想される結果に加えて、全く予期しない結果も得られたことからアプローチとして非常に有効で、強力な方法であると考えられる。1000株からなる分裂酵母の高温感受性株ライブラリー中の変異株に対して、特定の遺伝子を形質転換により導入し、機能的に相互作用する遺伝子の網羅的な同定を開始した。用いた遺伝子はDis1ならびにMtc1である。これら両遺伝子は微小管結合活性を持ち、分裂酵母の微小管機能を制御する遺伝子である。Dis1は動原体微小管と動原体の結合に必須であり、その欠損は有糸分裂の停止を引き起こす。今回のスクリーニングによりDis1と機能的相互作用を示す因子として2つの細胞周期制御遺伝子を同定した。1つは染色体凝縮に必須なコンデンシンサブユニットCut14、もう1つはDNA複製開始に必要なMCMサブユニットMis5であった。Cut14については同じくコンデンシンサブユニットの一つであるCut3がDis1と機能的相互作用することが示されており、コンデンシンの関与する染色体凝縮とDis1の機能が深く関与する可能性がより確かなものになった。Mis5については予想しなかった結果であり、DNA複製の開始、とりわけ複製のライセンシング機構がどのようにDis1の機能と関わっているのか大変興味深い。微小管機能とDNA複製の制御機構の接点、あるいはDis1の新たな機能の解明が期待される。Mtc1についても同様にCut14,Mis5が同定されたため、これらの微小管機能制御因子とコンデンシン、あるいはMCM複合体との機能的連関は生物学的に意味のあるものと考えられる。またMtc1はDis1とアミノ酸レベルで高い相同性を示すことからほぼ同じ遺伝子群が同定されると予想されたが、Mtc1の場合にはその他にもMis4,Psm1(染色体の合着制御因子)、Apc10(ユビキチンリガーゼ複合体)、Cut1(セパレース)等の多くの有糸分裂制御因子とも機能的連関を示すことが示唆された。

昨年度に引き続き、1000株からなる分裂酵母の高温感受性株ライブラリー中の変異株に対して、特定の遺伝子を形質転換により導入し、機能的に相互作用する遺伝子の網羅的な同定ならびにその解析を継続した。解析の中心となる遺伝子はDis1ならびにMtc1である。これら両遺伝子は微小管結合活性を持ち、分裂酵母の微小管機能を制御する遺伝子である。とりわけDis1は動原体微小管と動原体の結合に必須であり、その欠損は有糸分裂の停止を引き起こす。昨年のスクリーニングによりDis1と機能的相互作用を示す因子として2つの細胞周期制御遺伝子を同定した。1つは染色体凝縮に必須なコンデンシンサブユニットCut14、もう1つはDNA複製開始に必要なMCMサブユニットMis5であった。Mtc1についても同様にCut14,Mis5が同定されたため、これらの微小管機能制御因子とコンデンシン、あるいはMCM複合体との機能的連関は生物学的に意味のあるものと考えられる。本年度Cut14について解析を進めた結果、少なくとも2種の遺伝的相互作用を示す遺伝子の存在が新たに確認され、現在原因遺伝子を特定するためサブクローン化を進めている。この候補となる遺伝子を含むDNA断片はいずれもCut14の温度感受性を抑圧し、さらにこのDNA断片上にはこれまでコンデンシンとの機能的連関が報告されている遺伝子が存在しないことから新規の相互作用が見いだされたと考えられる。これらの遺伝子はCut14のコンデンシンサブユニットにおける機能のみならず微小管機能とコンデンシンのつながりを解明する重要な情報をもたらすと期待される。昨年度に引き続き、約1000株からなる分裂酵母の高温感受性株ライブラリー中の変異株に対して、特定の遺伝子を形質転換により導入し、微小管に機能的に相互作用する遺伝子の網羅的な同定ならびにその解析を継続した。これまでDis1ならびにMtc1と機能的相互作用を示す因子として2つの細胞周期制御遺伝子を同定した。1つは染色体凝縮に必須なコンデンシンサブユニットCut14、もう1っはDNA複製開始に必要なMCMサブユニットMis5であった。Cut14について解析を進めた結果、遺伝子の特定にはいたらなかったものの、少なくとも2種の遺伝的相互作用を示す遺伝子の存在が新たに確認された。Dis1,Mtc1以外の微小管機能因子を探索するという視点から、高温感受性ライブラリーの網羅的クローニングの過程で、微小管の構成要素であるチューブリン遺伝子の変異が見つかり、そのサプレッサーとしてチューブリン特異的シャペロンであるSto1とAlp1が見いだされた。これらは細胞内で複合体を形成することが知られているが、以前の報告ではこれらのシャペロンはチューブリン遺伝子の変異表現型をさらに強めることが示されている。今回の結果ではチューブリン遺伝子の変異表現型を抑圧していることから、生化学的結果とよく一致する。表現型3者の機能的相互作用を示す点で興味深い突然変異と考えられる。
超高温・高密度プラズマ計測技術と爆縮の高効率化

核融合特別研究の10年のまとめとして、核融合臨界プラズマの診断にとって重要なイオン温度計測をはじめとする計測技術と爆縮の高効率化の基礎となる以下の研究行った。^3H_e中性子検出器でMCFプラズマの中性子スペクトルを計測し、イオン温度を決定するための応答関数の整備を行い、磁場のエネルギー分解能に及ぼす影響等を明らかにすると共に信号のパイルアップ補正法を研究した。ICF中性子スペクトル計測法として、CRー39飛跡検出器による方法と多数のシンチレーション中性子検出器を用い個々の中性子の飛行時間を計測してスペクトルを決定する方法について行い、これらの方法が有効であることを明らかにした。CW中性水素ビームプローブ法によりイオン温度の時間変化を決定する方法をCRFプラズマを用いて行い、その有効性を確認した。遠赤外イオントムソン散乱法をヘリオトロンプラズマに摘要した。H_eビームを用いたレーザー誘起蛍光法によりプラズマ中の電場を100V/cmの精度で計測する基礎実験を行いその有効性を確認した。固体撮像素子の14MeV中性子損傷について明らかにした。爆縮の高効率化にとって重要な基礎物理であるX線の放射輸送を取り扱う多次元コードの開発を行った。また放射輸送の基礎データの収集をKrFレーザー、YAGレーザーで行った。レーザーの代替エネルギードライバーである軽イオンビームの輝度向上にとって重要なイオンビームバンチングに関する研究を行い陽極後面よりプラズマを入射する半透過型のアクティブダイオードがビームバンチングに有効であることを見いだした。プラスチック燃料容器の水素透過性能を抑制する研究を行い、KrFレーザー照射により抑制できることを明らかにした。核スピン偏極燃料での核融合反応率の理論計算をDーT、DーD、Dー^3H_eについて行った。また反応率測定のための実験装置を建設した。
マルチモーダル情報環境下における利用者誤りからの回復技法に関する研究

本研究の目的は,次世代のユーザインタフェースに関する誤り回復技法を確立することである.次世代のインタフェースに対するインタラクションの仕方として固視と音声を使って日常生活と同様な自然なインタラクションを実現する研究を行った.問題は,入力された音声と固視情報についてのシステムの認識能力である.音声と固視が単独では,システムの認識誤りが多く発生するモダリティである.本研究の目的は,それら曖昧な2モダリティを組み合わせることによって,適切で頑健なインタラクションシステムを構築することにある.具体的な研究内容を以下に示す:(1)はじめに,認識誤りがよくおこる固視と音声の2モードをいかに組み合わせてシステム全体の誤り率を低下させインタラクションの効率を上げるかについて研究する.(2)2番目に,作成したマルチモーダル統合方法を分析評価するために,誤り処理についての新たな効率評価を提案する.この評価法により,本研究で提案するマルチモーダルシステムが最適である条件も発見することができる.(3)さらに,マルチモーダルの誤りの分類をすることから,それらの誤りを減少する方法を見つけることができた.マルチモーダルの誤りの分類をすることによって,誤りの自動修復システムを開発するひとつの方法を得ることができた.モダリティの統合の分析と評価実験から,本研究で提案した統合方法はシステムの認識誤りとタスク実行時間を大きく減少させ,さらに,各モード単独では得られない発話の簡略が可能となる.認識誤りを最小にして実行時間を減少させる,簡単な文法と視線操作領域のパラメータ値を見つけることができた.本研究の目的は,次世代のユーザインタフェースに関する誤り回復技法を確立することである.次世代のインタフェースに対するインタラクションの仕方として固視と音声を使って日常生活と同様な自然なインタラクションを実現する研究を行った.問題は,入力された音声と固視情報についてのシステムの認識能力である.音声と固視が単独では,システムの認識誤りが多く発生するモダリティである.本研究の目的は,それら曖昧な2モダリティを組み合わせることによって,適切で頑健なインタラクションシステムを構築することにある.具体的な研究内容を以下に示す:(1)はじめに,認識誤りがよくおこる固視と音声の2モードをいかに組み合わせてシステム全体の誤り率を低下させインタラクションの効率を上げるかについて研究する.(2)2番目に,作成したマルチモーダル統合方法を分析評価するために,誤り処理についての新たな効率評価を提案する.この評価法により,本研究で提案するマルチモーダルシステムが最適である条件も発見することができる.(3)さらに,マルチモーダルの誤りの分類をすることから,それらの誤りを減少する方法を見つけることができた.マルチモーダルの誤りの分類をすることによって,誤りの自動修復システムを開発するひとつの方法を得ることができた.モダリティの統合の分析と評価実験から,本研究で提案した統合方法はシステムの認識誤りとタスク実行時間を大きく減少させ,さらに,各モード単独では得られない発話の簡略が可能となる.認識誤りを最小にして実行時間を減少させる,簡単な文法と視線操作領域のパラメータ値を見つけることができた.本研究の目的は,次世代のユーザインタフェースに関する誤り回復技法を確立することである.次世代のインタフェースに対するインタラクションの仕方としては,PDA,ペン,音声,ジェスチャー,視線などマルチモーダル入力/出力を研究対象にする.成果1.誤りの視覚的探索による発見機構とツールの評価操作対象のオブジェクトごとに関連するコマンド履歴をもたせる機構,およびオブジェクト間に制約のある場合の履歴処理アルゴリズムを実現した.さらに,この考えをもとに,作業領域のスナップショット列からなるアニメーション機構をユーザインタフェース開発環境に付け加えて,スナップショット中のオブジェクトを選択することによって関連コマンドを利用者が検索できるインタフェースツールを作成した.さらこのツールの視覚的探索の実験課題についてユーザビリティ(評価)テストを行い,このツールの有効性および視覚的探索パターンタイプを見つけることができた.成果2.ネットワーク上の遠隔カメラ制御法と視覚的探索2-1.ズーム情報によりパン・チルト量を変化させる適応型カメラ制御法ズームイン・アウトで視界の動かしすぎや不足をなくするために,入力装置のズーム変位量に対しカメラのパン・チルト量を自動的に変化させる方法を実装および評価実験の結果,本手法の有効性が示された.なお,入力装置として,ジョイスティックのほうがボタン入力装置より有効なことを示した.2-2.両手操作による表示領域指定カメラ制御法予めカメラのズームやパン/チルト量を指定するカメラ制御に関して,画面上の指定領域にカメラを移動する方法を提案する.この方法の考え方は,ポインタで指定されたディスプレイ上の枠の位置にカメラを自動的に移動させる方法である.そのために,(1)ポインタ位置とカメラ進行方向,および(2)ポインタ間の距離とカメラ画角を比例近似させる.評価実験により,両手操作が片手操作に対して操作時間が短い仮説が有意であった.さらに伝送遅延のある場合,本手法が手動による操作より有効なことを示した.本研究の目的は炊世代のユーザインタフェースに関する誤り回復技法を確立することである.次世代のインタフェースに対するインタラクションの仕方としては,PDA,ペン,音声,ジェスチャー,視線などマルチモーダル入力/出力を研究対象にする.成果1.誤りの視覚的探索による発見機構とツールの評価操作対象のオブジェクトごとに関連するコマンド履歴をもたせる機構,およびオブジェクト間に制約のある場合の履歴処理アルゴリズムを実現した.さらに,この考えをもとに,作業領域のスナップショット列からなるアニメーション機構をユーザインタフェース開発環境に付け加えて,スナップショット中のオブジェクトを選択することによって関連コマンドを利用者が検索できるインタフェースツールを作成した.

さらこのツールの視覚的探索の実験課題についてユーザビリティ(評価)テストを行い,このツールの有効性および視覚的探索パターンタイプを見つけることができた.成果2.画像の2次元配置(サムネイル)で特定の画像を目で探す視覚探索におけるデータの記録方法を提案し,3種類の探索パターンを見つけることができた.成果3.Excelのような記入欄の指定とマウスカーソルの移動に人間の固視情報を利用するシステムを作成し,評価テストを行いその有効性を示した.成果4.仮想と実空間を混合した複合現実空間における新しいインタラクション方法として,頭部と体のひねり情報を取り入れたインタフェースを構築し,実験によりこのインタフェースの有効性を示した.本研究の目的は,次世代のユーザインタフェースに関する誤り回復技法を確立することである.次世代のインタフェースに対するインタラクションの仕方として固視と音声を使って日常生活と同様な自然なインタラクションを実現する研究を行った.問題は,入力された音声と固視情報についてのシステムの認識能力である.音声と固視が単独では,システムの認識誤りが多く発生するモダリティである.本研究の目的は,それら曖昧な2モダリティを組み合わせることによって,適切で頑健なインタラクションシステムを構築することにある.具体的な研究内容を以下に示す:(1)はじめに,認識誤りがよくおこる固視と音声の2モードをいかに組み合わせてシステム全体の誤り率を低下させインタラクションの効率を上げるかについて研究する.(2)2番目に,作成したマルチモーダル統合方法を分析評価するために,誤り処理についての新たな効率評価を提案する.この評価法により,本研究で提案するマルチモーダルシステムが最適である条件も発見することができる.(3)さらに,マルチモーダルの誤りの分類をすることから,それらの誤りを減少する方法を見つけることができた.マルチモーダルの誤りの分類をすることによって,誤りの自動修復システムを開発するひとつの方法を得ることができた.モダリティの統合の分析と評価実験から,本研究で提案した統合方法はシステムの認識誤りとタスク実行時間を大きく減少させ,さらに,各モード単独では得られない発話の簡略が可能となる.認識誤りを最小にして実行時間を減少させる,簡単な文法と視線操作領域のパラメータ値を見つけることができた.
高齢者の咬合・咀嚼と精神保健の相互連関に関するコホートスタディ

岩手県花巻市大迫に居住する65歳以上の高齢者において、現在歯数と認知機能低下との関連を縦断的に検討した。その結果,多数歯欠損者(現在歯数10歯未満)の4年後に認知機能低下を示すオッズ比は10歯以上の高齢者に対し、他の交絡因子と独立して有意に高値(オッズ比=3.3)を示した。また同じく55歳以上の大迫住民に対し、口腔関連QoLと抑うつ傾向発生との関連を検討したところ、口腔関連QoLの低下した者の4年後の抑うつ傾向発生のオッズ比は、口腔関連QoLの低下していない者に対し有意に高値(オッズ比=5.2)であった。本研究より口腔の健康維持が高齢者の良好な精神保健に寄与する可能性が示された。本研究は高齢者における咬合や欠損補綴状況、歯周状態および咀嚼・嚥下機能と、精神保健との相互の関連を明らかにすることを目的とした長期前向きコホート研究である。縦断研究に先立ち今年度は2005年度から2009年度に実施したベースライン調査の参加者563名のうち、データ欠損のない541名に対しベースライン時の抑うつ傾向と口腔保健指標との関連を横断的に検討した。抑うつ傾向の評価にはZung自己記入式うつ病スケール(Zung Self-rating depression scale: SDS)を用い、40点未満を正常、40点以上を抑うつ傾向ありと見做した。口腔保健指標には、現在歯数(20歯以上/20歯未満)、口腔関連QOL(Oral Impacts on Daily Performances)、歯科受診行動(1年以内の歯科受診の有無)を用いた。年齢、性、body mass index、既往歴、喫煙、飲酒、認知機能、学歴を調整した多重ロジスティック回帰分析の結果、口腔関連QOLの低下は他の因子と独立して有意に抑うつ傾向と関連していた。それに対し現在歯数、歯科受診行動と抑うつ傾向との関連は認められなかった。一方、コホートの拡大を図るべく今年度は新たに岩手県花巻市大迫の55歳以上の地域住民115人(男性44人、女性71人)に対し、心身機能の検査および歯科検診を実施し、得られたデータを集計した。検診に参加した115人のうち27人(男性13人、女性14人)は初めて受診であるためベースラインデータとして、残りの88人は過去に受診歴があるため追跡データとして新たにデータベースに加えられた。横断解析ながら口腔関連QOLと抑うつとの関連を明らかにした。また検診実施により着実にコホートの拡大が図られている。岩手県花巻市大迫町在住の55歳以上の住民に対し,ベースライン調査として口腔関連QOL (Oral impacts on daily performances: OIDP)と抑うつ傾向(Zung Self-rating depression scale: SDS)を調査し,さらにその4年後に同様の追跡調査を実施した.口腔関連QOLは10項目の質問からなるOIDPにおいて,1項目でも日常生活に支障がある場合をQOLの低下ありとした.抑うつはSDSが40点以上(80点満点)を抑うつありとした.ベースライン調査時に抑うつが無く,4年後の追跡調査を受診した296人を解析対象とした.追跡調査の結果,対象者のうち12人に抑うつの発生を認めた.抑うつ発生を認めた者は認めなかった者に比べ有意にベースライン調査時のSDSが高値で,口腔関連QOL低下の割合が高かった.多重ロジスティック回帰分析の結果,ベースライン調査時の口腔関連QOLの低下と4年後の抑うつ発生は,年齢,性,既往歴,BMI,喫煙,飲酒,認知機能,学歴,ベースライン調査時のSDS得点と独立して有意な関連を示した.一方,口腔保健の客観的指標である現在歯数と歯科受診行動は4年後の抑うつ発生との関連は認められなかった.口腔関連QOLの低下が4年後の抑うつ発生とも有意な関連を認めたことから,口腔関連QOLの低下が抑うつの危険因子あるいは予測因子である可能性が示された.また,これまで既に,主観的健康感の不良が抑うつの発生に関わることがメタ解析により示されているが,口腔の不健康感もまた,充実した食生活を損ねるだけでなくコミュニケーションや審美の問題を介して高齢者の精神的不活発に影響する可能性が示唆された.一方,今年度は新たに岩手県花巻市大迫の55歳以上の地域住民120人に対し,心身機能の検査と歯科検診を実施し,得られたデータを集計した.口腔関連QOLと抑うつとの関連が縦断的に示された.また検診実施によりコホートの拡大が確実に図られている.

本年度は一般高齢者を対象に客観的評価に基づく歯の欠損と4年間での認知機能低下との関連を縦断的に検討した.研究参加の同意を得た65歳以上の高齢者を対象にベースライン調査を行い,Mini-Mental State Examination(MMSE)での評価で認知機能低下を認めず(25点以上),4年後のフォローアップ調査に参加した140名(女性97名,平均年齢70.9±4.3歳)を解析対象とした.ベースライン調査時の現在歯数の中央値を閾値として,対象者を0ー9歯の多数歯欠損群と10歯以上の群に分け,フォローアップ調査時のMMSEスコアが24点以下を認知機能低下とした.フォローアップ調査時に認知機能低下を認めたのは27名(19%)であった.多重ロジスティック回帰分析の結果,交絡因子(年齢,性,高血圧,糖尿病,脳心血管疾患,高脂血症,BMI,学歴,喫煙,飲酒,ベースライン時のMMSEスコア)での補正後も10歯以上の群に対する多数歯欠損群における認知機能低下のオッズ比(95%信頼区間)は4.63(1.37ー18.9)と有意に高い値を示した.本研究から多数歯欠損が他の因子と独立した認知機能低下の危険因子,あるいは予測因子である可能性が示唆された.適切な保健行動による歯の喪失の防止や歯周炎のコントロールが将来の認知機能低下の防止に寄与する可能性が考えられる.また歯を失った高齢者に対しても,補綴装置による咀嚼機能の回復や適切な栄養指導の介入により,認知機能に対する負の影響を減らせるかもしれない.平成27年度から29年度の研究期間全体を通して,地域高齢者において口腔関連QOLの低下が4年後の抑うつ傾向発生と関連すること,および多数歯欠損が4年後の認知機能低下と関連することが明らかとなった.本研究より口腔の形態・機能の維持が高齢者の良好な精神保健に寄与する可能性が示された.岩手県花巻市大迫に居住する65歳以上の高齢者において、現在歯数と認知機能低下との関連を縦断的に検討した。その結果,多数歯欠損者(現在歯数10歯未満)の4年後に認知機能低下を示すオッズ比は10歯以上の高齢者に対し、他の交絡因子と独立して有意に高値(オッズ比=3.3)を示した。また同じく55歳以上の大迫住民に対し、口腔関連QoLと抑うつ傾向発生との関連を検討したところ、口腔関連QoLの低下した者の4年後の抑うつ傾向発生のオッズ比は、口腔関連QoLの低下していない者に対し有意に高値(オッズ比=5.2)であった。本研究より口腔の健康維持が高齢者の良好な精神保健に寄与する可能性が示された。研究計画に変更はなく引き続き新たな対象者のリクルートと調査を実施しコホートの拡大を図るとともに、これまでのデータベースを基に解析を進める。解析内容は1地域高齢者における認知機能低下および抑うつの発生および経時的変化の実態の把握、2認知機能低下・抑うつ傾向の発生および進行と口腔状態・機能との関連、3口腔状態・機能の変化と認知機能・抑うつ傾向との関連である。研究計画に変更はなく引き続き新たな対象者のリクルートと調査を実施しコホートの拡大を図るとともに、これまでのデータベースをもとに解析を進める。解析内容は1地域高齢者における認知機能低下の発生の実態の把握、2認知機能低下の発生と口腔状態・機能との関連、3口腔状態・機能の変化と認知機能との関連である。高齢者歯科学研究開始当初に予定していた検診実施および資料収集・整理にかかる人件費・謝金の支出がなかったため。成果発表のための英文校正が次年度にずれこんだため.次年度は調査項目として加える咀嚼能力検査のための検査キットのモデルチェンジに伴う新規購入と、老朽化に伴う交換が必要なオートクレーブおよび保守期限切れとなるパノラマエックス線撮影用のパーソナルコンピュータの入れ替えを予定している。また、その他の用途としては、大規模コホートデータの長期管理に必要な記憶媒体、解析用ソフトウェア、調査研究旅費、検診補助員等への謝金、印刷通信費、成果発表関連費である。これは調査地が遠隔地であること、調査事業にマンパワーを要すること、研究協力者への情報提供の必要性、大規模データの堅牢な管理の必要性を鑑み算出したもので、妥当な予算配分と考える。前年度に使用予定だった英文校正費に使用する.
推論主義と社会存在論の統合

本研究は「社会制度の構築において言語はいかなる役割を果たしているのか?」という問いに対して「社会存在論」と「推論主義」を統合した「推論主義的な社会存在論」によって答えることを目的とする。制度構築の場面では言語の機能のなかでも「推論」の重要性が明らかになるはずだが、これは言語の「表象」機能がもっぱら強調されてきた従来の社会存在論にはみられないものである。本研究からは付随的に「人は表象的なシンボルのみならず推論する能力を獲得してはじめて制度を構築できる」という自然科学的に検証可能な仮説が導けるため、進化生物学、霊長類学、発達心理学などの分野にも具体的なリサーチ・プロジェクトを提供しうる。
ヒストン修飾リーダー因子による正常及びがん幹細胞の分化多能性の維持機構の解明

本研究では、分化多能性に関わるヒストン修飾リーダーを同定する目的で、クロモドメインタンパク質Cdyl2の幹細胞における機能を解析した。ノックダウンES細胞および過剰発現ES細胞の解析から、Cdyl2は、マウスES細胞の未分化状態の維持に重要であることが示された。また、ChIP assayから、Cdyl2は分化関連遺伝子の転写開始点近傍に結合することがわかった。さらに、Cdyl2はEZH2と結合すること、H3K27me3を認識することが示された。よって、Cdyl2は、EZH2によりメチル化された分化関連遺伝子に結合し、それらの発現を抑制することでES細胞の未分化性を保っていると考えられる。ヒストン修飾を認識するタンパク質「リーダー」は、エピジェネティック情報を細胞の表現系へと変換する重要な因子である。本研究では、細胞の分化多能性に関わるリーダーを同定する目的で、クロモドメインタンパク質Cdyl2の正常マウス幹細胞およびがん幹細胞での機能解析を遂行している。1年目の本年度は、Cdyl2によるマウスES細胞の分化方向性への影響と発現変動遺伝子の同定を行った。Cdyl2欠損マウスES細胞は、未分化培養条件下においても、未分化コロニーを維持できない、未分化マーカーNanogの発現が低下する、分化マーカーFgf5, HoxA3の発現が上昇する、という表現系を呈し、外胚葉系への分化が誘導されていると考えられた。Cdyl2の下流遺伝子を同定する目的で、発現アレイを行ったところ、欠損ES細胞2株で共通して発現上昇している遺伝子が9遺伝子同定され、幹細胞性に関連するIgfbp3、細胞増殖抑制に働くSfrp1などが含まれていた。さらに、Cdyl2を通常よりも2倍程度発現させたマウスES細胞の作製に成功し、レチノイン酸添加による分化誘導実験を行った。コントロール細胞と比較して、未分化マーカーOct-4, Nanogの発現は高く保たれており、内胚葉分化マーカーGata4の発現が上昇していた。これらの結果から、Cdyl2はマウスES細胞の未分化状態の維持に重要であり、さらに、過剰発現により分化能を撹乱することを見いだした。また、免疫沈降-ウェスタンブロットにより、Cdyl2と結合する因子の候補として細胞増殖に関連するPcnaを同定した。今後は、正常マウス幹細胞で得られた結果を応用し、ヒトCDYL2のがん幹細胞における機能を解析する。本研究では、細胞の分化多能性に関わるリーダーを同定する目的で、クロモドメインタンパク質Cdyl2の正常マウス幹細胞およびがん幹細胞での機能解析を遂行した。最終年度である本年度では、Cdyl2のマウスES細胞の分化への影響をin vitroおよびin vivoで解析した。Cdyl2を通常の2倍発現させたマウスES細胞を作製し、未分化マーカーSox2が高く発現していること、また、レチノイン酸による分化誘導後も未分化マーカーOct-4, Nanogの発現が検出されることを見いだした。テラトーマ形成能試験から、コントロール細胞からのテラトーマは三胚葉由来の組織から成っていたが、Cdyl2過剰発現細胞を用いた場合は、ほとんど全てが外胚葉由来の組織であることがわかった。昨年度の成果と合わせると、Cdyl2はマウスES細胞の未分化状態の維持に重要であり、過剰発現により分化能を撹乱することを見いだした。さらに、ChIP assayを行ったところ、分化関連遺伝子の転写開始点近傍にCdyl2が結合することがわかった。免疫沈降-ウェスタンブロットにより、Cdyl2はヒストン修飾酵素EZH2と結合すること、H3K27me3を認識することが示された。一方、ヒトがん幹細胞におけるCDYL2の機能を明らかにする目的で、CDYL2ノックダウン細胞を樹立した。ノックダウンにより細胞増殖が若干抑制される傾向が観察されたが、がん幹細胞への影響は明らかではなかった。現在は、過剰発現細胞を樹立し、その解析を行っている。以上のことから、Cdyl2は、EZH2によってメチル化された分化関連遺伝子のクロマチンに結合し、それらの発現を抑制することで、ES細胞の未分化性を保っている可能性が示された。分子生物学申請時の計画通り、マウスES細胞におけるCdyl2の分化方向性への影響を明らかにし、下流遺伝子の候補を同定したため、おおむね順調に進展していると考えられる。平成25年度は、ヒトCDYL2のがん細胞における機能解析を目的とする。これまでに予備的データとして、一部のヒト乳がん細胞株および乳がん検体でCDYL2が高発現していることを見いだしている。そこで、がん幹細胞の分化
生物時計分子装置の作動原理解明

生物発光リズム自動測定装置と発光データ解析プログラムを開発した。藍色細菌において、以下の5点を解明した。1)時計タンパク質KaiCのN末端ドメインはKaiCの6量体化に関与し、C末端ドメインはKaiCのサブユニット間リン酸化に関与する。2)KaiCは極めて弱いATPase活性を持つ。この活性はKaiAによって促進され、リン酸化によって抑制される。N末端とC末端の各ドメインが共にATPase活性を持つ。野生型KaiCのATPase活性は温度補償されているが、リン酸化部位欠損変異によってこの温度補償性が失われる。3)KaiBの結晶構造を解明し、その構造に基づいて、時計発振に関与するサブ構造と機能残基を推定し、実験的に実証した。4)外部環境からの信号を生物時計に伝達するインプット経路に関与する時計関連タンパク質Pexの結晶構造を解明し、その構造に基づいてDNA結合に関与するアミノ酸残基を推定し、実験的に確認した(投稿中)。5)DNAミクロアレイ法によって、生物時計で制御された遺伝子群を網羅的に同定し、その発現パターンを解明した。クラミドモナスにおいて、葉緑体遺伝子の生物発光リズム系を開発し、多様なリズム変異体を多数分離して、時計遺伝子と時計関連遺伝子の網羅的クローニングに成功した。時計遺伝子は、高等植物の時計遺伝子と共通のモチーフを持つものとクラミドモナスに固有のものとが見つかった。シロイヌナズナにおいて、真の生物時計遺伝子PHYTOCLOCK 1のクローニングに成功した。藍色細菌の生物時計分子装置は3つの時計タンパク質KaiA、KaiB、KaiCから構成されている。我々は、生物時計を時計タンパク質から構成された精巧な分子装置と捉え、その会合、解離、状態変化が時計発振に深く関わっていると考えている。我々は耐熱タンパク質が利用できる別府温泉産の好熱性藍色細菌Thermosynechococcus elongatesで先ず遺伝子移入系を確立し、時計の運行を生物発光リズムとして捉えられる生物発光リズム系を開発し、さらに時計タンパク質と時計関連タンパク質の大腸菌における大量生産法と高度精製法を確立、これらタンパク質の生化学的・生物物理学的解析とX線結晶構造解析を進めてきた。これまでにKaiA(我々による)とKaiCの原子構造がX線結晶構造解析などにより解明されている。藍色細菌、クラミドモナス、シロイニナズナの生物時計分子装置の原子レベルでの解明に向けて、本年度は以下の研究を行った。藍色細菌:時計タンパク質Kaicは重複構造をとっており、それぞれ1セットのATPaseモチーフを持つN末端ドメインとC末端ドメインからなる。この2つのドメインの機能を明らかにするために、N末端ドメインタンパク質とC末端ドメインタンパク質をそれぞれ大腸菌で発現さて精製し、生化学的に解析した。Kaicの6量体形成活性は主にN末端ドメインに存在し、時計タンパク質KaiAとの結合活性とサブユニット間リン酸化活性はC末端ドメインにのみ存在した。C末端ドメインには弱い多量体形成活性も存在した。時計関連タンパク質Pexは生物時計への光入力に関与し、時計遺伝子kaiA語の発現を抑制するリプレッサーと考えられる。常温性糸状性藍色細菌Anabaena sp. strain PCC7120 (Anabaena)と常温性単細胞性藍色細菌Synechococcous sp. strain PCC7942 (Synechococcus)のPexをそれぞれ大腸菌で大量生産し、高度に精製して結晶化し、SPring-8でX線回折データを取得し、X線結晶構造解析を行い、結晶構造を解明した。原子構造からDNAとの結合に必要なアミノ酸残基を推定し、in vivoリズム解析とゲルシフトアッセイで実験的に確認した(名古屋大学理学研究科物質理学専攻神山勉教授との共同研究で未発表)。クラミドモナス:タギング法によって多種多様な生物発光リズム変異体を分離した。これらの変異体の原因遺伝子をPCR法によって同定し、遺伝子相補実験によって確認した。これまでに数個の時計遺伝子・時計関連遺伝子候補を見つけ、そのうちの1つに関して同定に成功した。

シロイヌナズナ:既存の時計遺伝子、時計関連遺伝子上に変異を持たない9つのリズム変異体を見つけた。現在、これらの変異体に関して、マップベースクローニング法によって原因遺伝子のクローニングを進めている。藍色細菌の生物時計分子装置は、主に3つの時計タンパク質KaiA、KaiB、KaiCから構成されており、これらの3つのタンパク質はATP存在下の試験管内で24時間周期の自律振動を生み出す。1)KaiCは重複構造をとっており、2つのATPaseモチーフを持っているが、そのATPase活性はこれまで検出できていなかった。今回その活性の検出に成功した。KaiCが極めて弱いATPase活性を持つこと、この活性がKaiAによって促進され、リン酸化によって抑制されること、N末端とC末端の各ドメインがATPase活性を持つこと、そして野生型KaiCのATPase活性は温度補償されているが、リン酸化部位欠損変異によって温度補償性が失われることを明らかにした。2)外部環境の変化を生物時計に伝達するインプット経路を担う時計関連タンパク質Pexの結晶構造を解明した。PexはPadRファミリーに属するwinged-helix proteinであり、原子構造に基づいてDNA結合に関与するアミノ酸残基を推定し、実験的に確認した(投稿中)。3)クラミドモナスにおいて、多様なリズム変異体を多数分離し、時計遺伝子と時計関連遺伝子の網羅的クローニングに成功した。時計遺伝子は、高等植物の時計遺伝子と共通のモチーフを持つものとクラミドモナスに固有のものが見つかつた。