hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
事業モデルに適合した非株式会社型ストラクチャーの法制度設計に関する研究

事業を行うにあたって、パートナーシップやLP、LLPそれにLLCなどの非株式会社型のストラクチャーが広く用いられている。米国ではLPとLLCが株式会社以上に活用されており、その持分を証券取引所に上場するものもある。株式会社と比較して、定款自治あるいは契約自由の原則が法制度上ならびに利用者から広く認識されていることが特徴的であり、信認義務が排除されることも認められている。そこでは株式会社法制では認められていた出資者の保護のあり方が問題となっている。わが国と英国では米国ほどの活用事例は乏しく、英国ではプライベートカンパニー法制が、わが国では柔軟すぎる会社法制が利用されているというのが実態である。平成26年度においては、わが国における非株式会社型ストラクチャーの実態を調査するとともに、文献ベースにて米国と英国の制度について資料収集とその分析を行った。わが国においては、投資ファンドのような特定の目的のために非株式会社型のストラクチャーを用いることが多く、節税目的と法人格の有無がその利用の動機となっており、小規模事業の促進には至っていないことが確認できた。また、株式会社に代替するスキームとしては魅力が乏しいことも確認でき、特に会社法により創設されたLLCの利用に関しては、その法制度を有用なものとしなければ独自性が薄いとの仮説を立てるに至っており、これについては今後、立証を進めていきたい。また、米国においては特にエネルギー関連の事業を中心にLPやLLCが用いられており、そこでは持分を上場しているMLPや公開LLCが数多く存在している。これらは実態が上場株式会社であるにも関わらず、約款により経営陣の責任は極めて制限されている。この点について特にデラウェア州の判例についての研究成果を公表したほか、重要判例であるNorton v. K-Sea Transportation Partners, L.P., 67 A.3d 354 (2013)を研究し、約款による責任制限が広範に認められていることを確認した。これは平成26年8月の神戸大学商事法研究会下関合宿において報告し、その内容を公表することにしているが、出版社の都合により平成27年8月に公表される予定となった。さらに英国においては、文献収集が未だ十分ではないものの、監査法人等の専門家法人を中心にしてLPが用いられていることが確認された。加えて、英国のパートナーシップ法理が米国のLP、LLCの経営者責任(信認義務)の源流であることから、より一層、信任義務について研究を深める必要性を確認した。平成27年度においては、わが国と米国における非株式会社型ストラクチャーについての研究を文献を中心にして前年度より継続・深化させたほか、特に英国に調査・資料収集に行くことにより、現地調査を行ったことが成果である。具体的には以下の通りである1わが国では株式会社以外のスキームにて事業を行う場合に、投資ファンド等の一定事業について合同会社や匿名組合の利用がみられるものの、米国のような税制の特典がないことから株式会社ほど利用は進んでいないことが確認された。2米国については、特にデラウェア州においてLPとLLCについて基本契約にて信認義務の排除がなされた場合に、株式会社の株主と比較してその保護が十分であるか否かか論争になっており、この点についてデラウェア州最高裁判所判例であるGerber v. Enterprise Holdings, LLC, 67 A.3d 400 (Del. 2013)について判例研究をするとともに、信認義務の排除に関する分析の視点につき論考をまとめた。これらについては出版社との関係から28年度に公表されることになっている。3英国においてはLSE(London School of Economics)とオックスフォード大学にて、とりわけpartnershipとLPについての資料を収集したほか、登記所においていわゆるわが国の閉鎖会社に相当するprivate companyの活動実態を調査したり、BIS(Department for Business, Innovation and Skills)等の政府機関の公式文書や統計を調査・収集した。これらは現在精力的に考察・まとめを行っている。平成27年度の研究計画は、主としてわが国における非株式会社型ストラクチャーの事業実態の調査と文献ベースにおけるわが国と米国の制度の把握とともに英国における実態調査と資料収集であった。1わが国については2006年の会社法改正後に合同会社制度が導入されたものの、株式会社に変わるストラクチャーとしての優位性は特に税制の点から見られず、小規模事業や投資ファンドとしての利用にとどまっていることが理解された。2米国については特にデラウェア州のLP・LLCについて研究を進めた。持分を公開しているMLPや公開LLCについては大規模公開株式会社とストラクチャーにおいて大きな相違がないにも関わらず、契約自由の原則を理由に信認義務を放棄することができるとされ、持分権者の保護が株式会社の株主に比して劣位に置かれることの必然性に疑問がわき、とりわけこの点について、文献や判例を調査・検討した。制度や判例の流れを論考としてまとめたほか、デラウェア州最高裁判所のGerber v. Enterprise Holdings, LLC, 67 A.3d 400 (Del. 2013)について詳細に検討し、判例評釈を発表するとともに、公表原稿を作成した。いずれも出版社との関係から平成28年度に公表される予定である。3英国については平成27年度に現地における調査・資料収集を行った。これによりわが国では収集できない資料や論考を入手し、現在、検討を行っているところであるが、英国はわが国の制度に類似すると言ってよく、米国のようにLPやLLCが株式会社に代替してはいない。その代わり、小規模事業についてはprivate companyがその役割を果たしている。

また、partnershipについては1890年法と1907年法が、LPについては1907年法が基本法のままであり、それぞれが株式会社的なスキームではなく、伝統に根ざした組合であることが理解された。平成28年度においては、非株式会社型ストラクチャーに関して、1平成26年度から継続しているわが国の法制度や実務ニーズの研究の深化、2平成27年度における英国での資料収集・実態調査の結果の分析やまとめに加えて、3米国での実態調査と法制度の分析を行った。これら13については具体的に以下の通りである。1わが国における非株式会社型スキームの利用は、徐々にではあるが合同会社の利用が増加している。とはいえ、米国のような税法上のメリットや責任限定がなく、利用そのものについては積極的な動きはない。他方で、米国の信認義務排除の考え方について、ようやくわが国の複数の研究者も紹介し始めており、わが国の法制への当てはめが積極的に議論され始めている。また、米国のようにエネルギー関連に限定してLLCなどを活用する方法もわが国の特区制度を利用すれば考えられなくもなく、方法について検討中である。2英国での調査・文献の分析と整理を行った。英国の状況は米国よりもむしろわが国に近く、LLPの利用が専門家組織にほぼ限定されていることや、private companyの法制度の利用の方がLLP等を利用するよりもメリットが大きいことが理解できた。3米国については、平成28年9月にニューヨークのFordham University等にて文献収集・実地調査を行った。そこでは特に同大学のBrent J. Horton准教授の協力を得るとともに、同氏と議論を行い、LLCやLPの隆盛について理解を深めた。とりわけ、信認義務を契約によって排除できるという点で、持分を公開しているMLPなどでは株式会社に比べて持分権者の保護が十分ではなく、どのように保護すべきかが喫緊の課題となっていることが理解できた。平成28年度の研究計画は、非株式会社型ストラクチャーの法整備に関して、平成26年からの継続として、文献ベースにて日米英それぞれの制度を比較検討するとともに、特に米国に関して実地調査と文献・資料を収集することであった。日英に関するこれまでの進捗状況は、日・英ともに非株式会社型ストラクチャーの顕著な利用がみられず、その理由として、税制面で投資家に有利になっていないことと、ストラクチャーの選択として小規模株式会社のルールが浸透していることを確認したが、他方で、米国のLPやLLCの利用が特定の産業分野で利用しようとする動きがあることも確認した。また、わが国でも最近になって米国の制度を紹介する流れから制度論を展開する論説が散見されるようになり、そのような議論が盛んになってきている。
DNA診断を用いた早期胚性判定法の性差分析への応用

マウス早期胚磁気における性差を解析するために、PCR法を用いて雌雄診断法について開発を行った。対象遺伝子としてY染色体に特異的なSry遺伝子を選び、404bpの断片を増幅するためのprimerを合成した。正常雄マウスの肝臓より精製したgenemicDNAを用いてPCRによる遺伝子増幅の条件を検討した。増幅された標的配列の検出は3%agarose gelによる電気泳同とEtBrによる染色により行った。上記のprimerにより、30cycle2回のdualPCRを行ったところ、10pgの精製DNAで検出可能であった。これはほぼ2細胞に含まれるDNA量と同等である。この条件を用いて、実際にマウス早期胚について標的配列の検出を試みた。早期短時間交配にて得られた妊娠マウスより、交配後72時間後に子宮潅流により桑実胚から胚盤胞期の胚を回収し、Hanks′液により3回洗浄後、直接胚を反応液のはいったPCR tubeに移し、熱変性の後、30cycle2回のdualPCRを行った。その結果、桑実胚、胚盤胞いずれの初期胚からも標的配列が増幅され、freshな細胞を用いてのマウス早期胚性別診断が可能となった。さらに、より定量的な性差分析にこの方法を応用するために、スライドグラス上に展開したマウス初期胚の染色体標本を用いた性別診断法を現在開発中である。グラス上に固定された細胞数を算定し、同一標本よりDNAを回収し、PCRにより性別診断を行うことにより、より定量的に性差を解析できると考えられる。染色体標本中のDNAは、標本作成時に用いられる酢酸により脱プリン化され、短い断片となっていることが予想されるため、より短い領域を増幅するためのprimerを現在設計しており、また、効率のよいDNAの回収、精製法を検討中である。
エイズ脳症の動物モデルの作製

結果:1、増殖能(doubling time)は、HIV感染細胞株とその非感染親細胞株とで有意な変化は認められなかった。2、貧食能を持つ細胞の数および1細胞あたりの食べ込み粒子数はともに感染細胞株で減少しており、貧食能の低下が認められた。3、表面抗原の変化(1)HLA-DRの表出の低下が、感染細胞株で認められた。(2)CD11bの表出の増加が、感染細胞株U937/HIVでのみ認められた。(3)VLA-4の表出は、感染細胞株とその非感染親細胞株とでほとんど変化なかった。4、TNF-αは、感染細胞において転写活性の増加を認めたが、培養上清中のタンパク量には有意な変化は認められなかった。5、New born-ICRマウスの脳内に感染細胞を接種すると、両側大脳半球に広範なグリオーシスを生じさせることができたが、非感染親細胞株を接種した場合にも同様な病変を認めた。PCRでは接種後3週間まで脳内からHIV遺伝子を検出することができた。さらに、接種後3カ月まで経過を観察したが、臨床的に異常なく、脳内HIV遺伝子、血中抗HIV抗体は陰性であった。これらの実験より、感染T細胞だけでなく、感染マクロファージも、HIVの感染に伴う免疫不全に関与していることが示唆された。
極早期緑内障の網膜神経線維層欠損と網膜内層の進行様式と乳頭出血の関係の解明

【研究目的】Preperimetric glaucoma(PPG)において、スペクトラルドメインOCT(SD-OCT)の黄斑部解析とHumphrey視野10-2(HFA10-2)を2年以上経過観察を行った症例において、構造と機能の進行速度および互いの相関を検討し、極早期緑内障の構造と機能の進行について、関連因子を検討する。【研究方法】当科でPPGと診断され、網膜神経線維層欠損(RNFLD)が上下のいずれかに存在し、2年以上経過観察可能で、RS-3000(NIDEK)で9×9mmの黄斑マップ(512×128)でSSI6以上の画像が5回以上、信頼性のあるHFA10-2を5回以上測定できた21例24眼(男性6例、女性15例、平均年齢57.1±10歳)。等価球面度数-6.0D未満、眼軸長26mm以上、内眼手術既往、緑内障以外の眼疾患、視神経視路疾患の例は対象から除外した。SD-OCTはG chartの各8セクター{内周(直径1.53.0mm),外周(直径3.06.0mm)各4象限}および上下で網膜神経線維層+網膜神経節細胞層+内網状層(GCC)の厚みを、HFA10-2はOCTに対応させ、4分割および上下について各々進行速度をトレンド解析し、対応するGCCとHFA10-2の進行速度の相関を用いて進行に関連する因子を検討した。【研究成果】下側にRNFLDが存在する(下側RNFLD)群は上側にRNFLDが存在する(上側RNFLD)群と比較して、RS-3000の外周下耳側と下方のGCCが有意に進行が速かった(p=0.016、0.013)。HFA10-2では、下側RNFLD群が上側RNFLD群と比較して、上下半視野ともに進行が速かった(p=0.0020.032)。乳頭出血(DH)の有無別では、DH+群のほうがDH-群に比べて、上半視野の進行が速く(p=0.030)、RS-3000の外周下耳側のGCCの進行が速かった(p=0.034)。PPGにおいて下側RNFLD群は上側RNFLD群と比較して、DH+群はDH-群と比較して、黄斑部の構造と機能の進行が速い。
スピンモデルに付随するアソシエーションスキームのT-module構造

Jaeger-Nomuraによれば、spin modelは、必ずself-dual association schemeの上に構成される。しかしながら、いかなるself-dual association scheme上にspin modelが存在するかは未解決の問題である。この問題に対してassociation schemeのT-module構造が重要な役割を果たすことは疑いを入れない。なぜならspin modelの最も重要な性質であるstar-triangle relationは、T-algebraを通して最も自然な形で記述できるからである。本研究においては、代表的なself-dual association schemeとしてclassical parametersを持つものとcyclotomic schemeとをとりあげ、T-module構造を調べた。classical parametersを持つものは、endpoint1のnonthin T-moduleがladder basisという極めて良い性質を持ち、cyclotomic schemeのT-module構造は、Jacobi sumに関する極めて興味深い関係式に帰着される。これらの結果を1996年5月上海における組合わせ論の国際会議において、1996年12月RIMSにおけるT-algebraのworkshopにおいて発表した。1996年12月のRIMSにおけるT-algebraのworkshopは私がorganiseしたものであるが、T-algebraの創始者であるTerwilligerを招聘し、彼のschoolの最近の研究の進み具合、特に(classical parametersを持つassociation schemeを含むところの)P-and Q-polynomial schemeについて、最近の研究の進み具合を話してもらったのは、有意義であった。我々の研究と併せて、Lie型の有限群の表現との類似点、相違点が明らかになりつつある。
日本海側に見られる暖流系漂着物の北海道と本州との比較

目的:2005年から2008年、北海道の日本海沿岸では秋季に暖流系漂着物(温帯熱帯海域や沿岸に生息する生物等)が多く見られた。その代表であるアオイガイの石狩湾における大量漂着の大きな要因は高い海面水温と北西季節風だが、この関係は本州九州の日本海側でも成り立つのか。その解明を本研究の目的とした。手法:石狩湾中央部の砂浜を定期的に踏査し、特徴的な漂着物の数量と年間の変動を記録した。同時に気象・海況観測を実施した。アオイガイの漂着状況を北海道と本州九州とで比較するため、下北(津軽海峡)、新潟、福岡の3地域で、漂着が予想される12月1月、砂浜の踏査と現地の水族館関係者や漂着物研究者からの聞き取り調査を実施した。成果:石狩湾のアオイガイ漂着はすでに2008年には減少の傾向を見せていたが、2009年は一層減少した。2000年代後半に見られた大量漂着現象は34年間で終息したことが確認された。一方、12月初旬の下北では長さ約5kmの砂浜の2日間の踏査で、100個体近い大量のアオイガイ漂着を確認した。それに対して12月中旬の新潟と1月中旬の福岡では同様の調査で数個体しか見られなかった。過去5年間の調査結果から、石狩湾でアオイガイ漂着がもっとも増加するのは海面水温が1516度の時だとわかったが、今回調査を実施した地域・時期の水温がこの範囲内だったのは下北だけで、新潟と福岡ではこの範囲から外れていた。このことから、アオイガイ漂着の水温条件は地域を問わないことが明らかになった。また、下北、新潟、福岡での過去のアオイガイ大量漂着は1960年代と1980年代に多かったが、2000年代後半は3地域では漂着は目立って多くはない。北海道で見られた大量漂着は津軽海峡以北に限定された現象であったことが明らかになった。
放射化学的手法による塩素原子と有機化合物および有機金属化合物の気相反応の研究

本研究を行うために必要な施設・設備は大きく分類して次の3部分である。1・試料調製のための真空ライン設備。2・^<38>Cl原子生成する熱中性子照射のための原子炉施設。3・気相反応により生成した^<38>Cl-標識化合物を分離・測定するためのラジオガスクロマトグラフの設備。1・本年度は、新たに真空ラインを製作した。真空ラインの全体の大きさは150cm×120cmであり、気体のリザーバーを2個、試料気体の導入と取り出しのための口を各々2個取り付けた。真空排気設備としては、スクロール型真空ポンプと油拡散ポンプの両者を設置した。圧力計は水銀マノメータとピラニー計を設置したが、将来的にはさらに電離真空計、静電容量型圧力計を取り付けたいと計画している。製作した真空ライン系のテストでは真空到達度は本研究にとって満足のいくものであった。2・本年度は熱中性子照射後の測定系であるラジオガスクロマトグラフが、後述するように、完成していないので、本研究の実験のための熱中性子照射は行えなかった。熱中性子照射は立教大学原子力研究所の原子炉施設を用いて行う予定であるが、本年度は当該研究所を2回訪問し(訪問の目的は他にもあったが)、本研究のために当該研究所の施設・設備を視察した。3・ラジオガスクロマトグラフは、ガスクロマトグラフの分離系と標識生成物の放射能測定系の2部分からなる。本年度は、新たに前者の部分であるガスクロマトグラフを設置し、調整を行った。このガスクロマトグラフを用い、本研究に関連するいくつかの化合物について分離条件(分離温度と保持時間の関係など)を調べた。放射能測定系については、高圧電源、ビン電源、比例計数管用前置増幅器を購入した。これらを用いて現在ラジオガスクロマトグラフの製作を進行中である。本研究に関連した総説を本年度出版したので裏面に示した。
昆虫の生体防御における外骨格の役割

昆虫の外骨格が傷を受け、その場所にバクテリアが存在すると傷害部位のしたにある表皮細胞が抗菌ペプチドを合成することを我々は既に報告している(Brey et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90,6275-6279)。また、我々は昆虫のクチクルにも血液と同じようなフェノールオキシダーゼ前駆体カスケードが存在することを観察している(Ashida and Brey.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92,10698-10702)。このように昆虫のクチクルは生態防御に重要な役割を担っていると考えられているメカニズムを備えていることが本研究により明らかになった。このクチクルの生体防御機構をよりよく理解するためにクチクルのフェノールオキシダーゼ前駆体(proPO)カスケードについて研究した。その結果、以下に記す事柄が明らかになった。1)フェノールオキシダーゼ前駆体は分子量約80、000のサブユニットから構成されるヘテロダイマーである。2)フェノールオキシダーゼ前駆体はN末端から50残基と51残基の間のペプチド結合が切断されて活性化する。3)フェノールオキシダーゼ前駆体は今まで知られていたどのフェノールオキシダーゼとも異なり、節足動物のヘモシアニンと相同なタンパクである。4)フェノールオキシダーゼ前駆体血球細胞で合成され、クチクルに移送され、今までクチクルでは観察されていなかったような規則的な局在を示す。5)クチクルのフェノールオキシダーゼ前駆体は血液のものと逆相HPLCで異なる挙動をしめすので血液から移送される際、何らかの修飾を受けている可能性がある。外皮(integument)のクチクル部分に傷を与え、そこに細菌細胞壁成分[リポポリサッカライド(LPS)あるいはペプチドグリカン(PG)]を塗布すると、傷害部の下にある表皮細胞がセクロピンを合成する。このLPSあるいはPGが表皮細胞にどのようなシグナルを与えているのかを明らかにしようとするのが本研究課題の主要テーマの一つである。本年度はこのテーマについて研究するため予備実験を行った。クチクルは、表皮細胞が分泌した、いわば死んだ部分と看なされている。その死んだ部分に与えられたLPSあるいはPGは巨大分子なので直接表皮細胞表面に到達できないと考えられる。クチクルで存在が証明されてるPG認識タンパク(PGRP)あるいは未同定のLPS認識タンパク(LPSRG)がPGあるいはLPSと特異的に結合し、その結果引起された何らかの化学反産物が、表皮細胞にセクロピン合成開始のシグナルを与えているかもしれないという作業仮説をたてた。この作業仮説中の"何らかの化学反応"として、フェノール酸化酵素前駆体活性化系(proPOカスケード)の活性化を考えた。血液のproPOカスケードと類似のカスケードがクチクルに存在することを我々は証明している。血液のproPOカスケードはPGとカビの細胞壁成分であるβ-1,3-グルカン(βG)によって活性化される。作業仮説を検証するために、まずPGRPのポリクローナル抗体によりPGRPとPGの結合が抑制される条件下で傷害を与えたクチクルにPGを塗布する実験を計画した。この実験が初期の目的通りの成果を上げるためには、実験に使う試薬に混入してくるLPSがどの程度実験結果に影響を与えるかを知らなければならない。無菌的に飼育した家蚕幼虫のクチクルに無菌的に傷を与え、そこにLPSを塗布して表皮細胞にセクロピンを合成させる。そのとき、どの程度のLPSが傷害部位にあれば表皮細胞がセクロピンを合成するか調べた。必要なLPS量は数ピコグラム/50ml/傷害部位であった。この量は通常の試薬に混入しているLPS濃度であり、外皮はLPSに対して高い感度を持つことが明らかになった。

また作業仮説を証明する実験計画の見直しをせまるものであった。1)クチクルに外傷を与えてそこにバクテリアを塗布したときにクチクルに現れる抗菌活性(セクロピン)誘導の機構2)クチクルにおけるフェノール酸化酵素前駆体カスケード活性化機構の究明とさらにこの機構と抗菌活性(セクロピン)誘導の関係、の2点について研究を進めるのが本研究課題の目的である。本年度は2)のうちのフェノール酸化酵素前駆体カスケード活性化機構に焦点を絞って研究をおこなった。五令家蚕幼虫クチクルをp-アミヂノフェニルメタンサルフォニルフルオライドとEDTAを含むアセテート緩衝液pH5.2で抽出すると、フェノール酸化酵素前駆体カスケードは活性化されずに抽出できた。この抽出液をCM-トヨ-パールカラムにかけフェノール酸化酵素前駆体から前駆体活性化カスケードを分離することができた。フェノール酸化酵素前駆体はDEAE-ト-ヨ-パールカラム、ハイドロキシアパタイトカラム、プレパックドMono-Qカラム、プレパックドハイドロキシアパタイトカラムなどのカラムクロマトグラフィーで精製することができた。精製標品はカラムクロマトグラフィーでの挙動から血液のフェノール酸化酵素前駆体と異なることが示された。しかし、この差が一次構造の差によるものなのか否かは明らかでない。クチクルの前駆体活性化カスケードはin vitroでCa++により活性化された。クチクル抽出液にはフェノール酸化酵素前駆体、フェノール酸化酵素前駆体を活性化する酵素の前駆体(proPPAE)、proPPAEを活性化する因子が存在することが確認された。クチクルでのフェノール酸化酵素前駆体の活性化にこれら三つの因子以外の因子が関与しているか否かは明らかでない。したがって、Ca++の作用点は不明である。本年度の研究で昆虫クチクルにフェノール酸化酵素前駆体とそれを活性化するカスケードが存在することが初めて証明され、1966年のLai-Fookの研究以来の昆虫生理学上の謎が一つ明らかにされた。昆虫の外骨格が傷を受け、その場所にバクテリアが存在すると傷害部位のしたにある表皮細胞が抗菌ペプチドを合成することを我々は既に報告している(Brey et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 6275-6279)。また、我々は昆虫のクチクルにも血液と同じようなフェノールオキシダーゼ前駆体カスケードが存在すること観察している(Ashida and Brey. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92, 10698-10702)。このように昆虫のクチクルは生態防御に重要な役割を担っていいると考えられているメカニズムを備えている。このクチクルの生体防御機構をよりよく理解するために本年度はクチクルのフェノールオキシダーゼ前駆体(proPO)カスケード構成要素の内、特にフェノールオキシダーゼ前駆体活性化酵素(PPAE)前駆体(proPPAE)のcDNAクローニングとクチクルフェノールオキシダーゼ前駆体が何処で合成されるかについて研究を行った。
シスタチオニンγ-シンターゼ遺伝子の新生ポリペプチドによる翻訳伸長停止機構の研究

シロイヌナズナ・シスタチオニンγ-シンターゼ(CGS1)mRNAを翻訳中のリボソームが,S-アデノシルメチオニン(SAM)に応答して一時停止(翻訳アレスト)する機構の解析をおこなった.H21年度の研究で,SAMに応答して,リボソーム出口トンネル内でCGS1新生ペプチドが収縮構造をとることが翻訳アレストに重要であることを示した.出口トンネルはリボソーム大サブユニットを貫通する構造であり,翻訳伸長中である新生ペプチドの通り道である.出口トンネル内には狭窄部位が存在し,リボソームタンパク質L4とL17がこれを構成している.L4やL17は原核生物において,新生ペプチドによる翻訳制御に関与することが報告されており,収縮したCGS1新生ペプチドがL4やL17と相互作用して翻訳アレストに関与する可能性が考えられた.そこで,これらのうちL4に変異を導入することで上記の可能性を調べた.変異は,狭窄部位を構成するループ構造の頂点であるArg-77をAla置換したもの((1)),ループ構造を小さく削ったもの((2)),および大きく削ったもの((3)),の3種類を導入した.これの変異を導入した形質転換シロイヌナズナのうち,(2)の変異を持つ系統において,SAMに応答したCGS1の制御が弱まることが分かった.共同研究者による解析から,L4と共に狭窄部位を構成するL17もCGS1制御へ関与することが示唆されており,本研究によって,真核生物においても狭窄部位が翻訳アレストに重要な役割を果たしていることが考えられた.1.MTO1ペプチドの作用機構の解明:MTO1ペプチド中にUVクロスリンク能を持つアジドチロシンを導入して,MTO1ペプチドと相互作用する因子を解析した.その結果,MTO1ペプチドが約20kDaの因子と相互作用することが明らかとなった.この因子を同定することで,MTO1ペプチドの作用機構の解明に向けて大きく前進すると期待されるので,これは重要な成果である.2.S-アデノシルメチオニン(SAM)の作用機構の解明:SAMと相互作用する因子をUVクロスリンク法を用いて解析するために,自ら[^<35>S]SAMを調製する必要があった.そこで,高熱耐性菌のSAM合成酵素を大腸菌に発現させて,これを用いることにした.これまでに,大腸菌でのSAM合成酵素の大量発現に成功した.したがって,[^<35>S]SAMを調製する準備が整ったので,来年度には[^<35>S]SAMを用いてSAMと相互作用する因子を解析する.SAMと相互作用する因子が明らかとなれば,翻訳アレスト機構の解明に大きく貢献することができる.3.リボソームタンパク質L4(RPL4)の翻訳アレストへの関与の検証:CGS1遺伝子における翻訳アレストへのRPL4の関与を解析するために,変異型RPL4を持つ形質転換シロイヌナズナを作出した.この形質転換体でのCGS1遺伝子の翻訳アレストの解析にはまだ至っていないが,今後の解析により翻訳アレストへのRPL4の関与を解明できると考えている.以上,CGS1遺伝子の翻訳アレストに重要な因子である,MTO1ペプチドとSAMの作用機構の解明につながる成果を今年度は主にあげることができた.1.MTO1ペプチドの作用機構の解明:CGS1遺伝子の翻訳アレストのキーファクターであるMTO1ペプチドをPEG-maleimideで標識する手法を用いて,リボソーム出口トンネル内でMTO1ペプチドが二次構造を取るかどうかを解析した.出口トンネル内でMTO1ペプチドが二次構造を取っていた場合はPEG-maleimideで標識されにくく,一方,二次構造を取っていない場合は標識されやすくなるという原理を利用して解析した.その結果,MTO1ペプチドが出口トンネル内でSAMに応答して二次構造をとることが,翻訳停止に重要であるとの示唆を得た.これはMTO1ペプチドの作用機構解明にとって重要な成果であり,さらにはCGS1翻訳アレスト機構の解明に向けて大きな前進をもたらした.2.リボソームタンパク質L4(RPL4)の翻訳アレストへの関与の検証:RPL4がCGS1遺伝子における翻訳アレストに関わるのかどうか解析するために,変異型RPL4を持つ形質転換シロイヌナズナを作出した.3種類の変異型RPL4を持つ形質転換シロイヌナズナを作出して,そのうち1種類については,CGS1遺伝子の発現制御が弱まっていることを示唆する結果を得た.残り2種類については現在解析を進めており,RPL4が翻訳アレストに関与するかどうか,来年度には結論を出せる準備が整った.以上,CGS1遺伝子の翻訳アレスト機構解明に繋がる2つの大きな成果を今年度あげることができた.現在,MTO1ペプチドが翻訳アレスト時に二次構造を取るという成果については,原著論文にて発表準備を進めている.シロイヌナズナ・シスタチオニンγ-シンターゼ(CGS1)mRNAを翻訳中のリボソームが,S-アデノシルメチオニン(SAM)に応答して一時停止(翻訳アレスト)する機構の解析をおこなった.H21年度の研究で,SAMに応答して,リボソーム出口トンネル内でCGS1新生ペプチドが収縮構造をとることが翻訳アレストに重要であることを示した.出口トンネルはリボソーム大サブユニットを貫通する構造であり,翻訳伸長中である新生ペプチドの通り道である.

出口トンネル内には狭窄部位が存在し,リボソームタンパク質L4とL17がこれを構成している.L4やL17は原核生物において,新生ペプチドによる翻訳制御に関与することが報告されており,収縮したCGS1新生ペプチドがL4やL17と相互作用して翻訳アレストに関与する可能性が考えられた.そこで,これらのうちL4に変異を導入することで上記の可能性を調べた.変異は,狭窄部位を構成するループ構造の頂点であるArg-77をAla置換したもの((1)),ループ構造を小さく削ったもの((2)),および大きく削ったもの((3)),の3種類を導入した.これの変異を導入した形質転換シロイヌナズナのうち,(2)の変異を持つ系統において,SAMに応答したCGS1の制御が弱まることが分かった.共同研究者による解析から,L4と共に狭窄部位を構成するL17もCGS1制御へ関与することが示唆されており,本研究によって,真核生物においても狭窄部位が翻訳アレストに重要な役割を果たしていることが考えられた.
トリチウム増殖材料中でのトリチウム移行素過程とその体系化に関する研究

今年度は、チタン酸リチウムにおける照射欠陥消滅速度及び拡散トリチウムの捕捉速度を明らかにした。さらに、前年度に明らかになったチタン酸リチウムにおけるトリチウムの拡散速度、捕捉サイトと捕脱捕捉速度を基に、計算コードを作成しトリチウム移行モデルを確立した。また、トリチウム移行モデルと実際の実験で得られたトリチウム放出挙動を比較し、モデルの妥当性を検証した。最終的に構築されたトリチウム移行モデルを用い、中性子照射下でのLi_2TiO_3からのトリチウム放出挙動の概算を行った。ここで、ブランケットシステムのような中性子照射環境下ではLi_2TiO_3の温度は高温になることが予想される。中性子照射を開始するとトリチウムの放出速度は増加し、定常状態に到達した。特に中性子フラックスが変化するとトリチウム放出挙動は大幅に変化した。中性子フラックスが増加すると試料内部の欠陥密度が増加し、拡散しているトリチウムの再捕捉が進行しトリチウム放出速度が減少すると考えられた。照射を止めると欠陥生成と消滅のバランスが崩れ、再捕捉率が大幅に減少するためトリチウム放出速度は一旦増加し、拡散速度に従って滞留トリチウムが放出することが分かった。このように本研究で確立されたトリチウム移行モデルは実機環境における中性子照射下でのトリチウム回収研究に適応することが可能であり、本研究の意義や核融合炉開発への貢献は大きいと考えられた。本研究計画は今年度で終了である。今年度はチタン酸リチウム構造の乱れがトリチウム移行過程に及ぼす影響を明らかにするため、中性子照射フルエンスを4桁変化させたチタン酸リチウムを用意し、He雰囲気下でトリチウム放出実験を行った。特に本研究の低中性子フルエンスである、3.3×10^<15>n cm^<-2>照射試料ではトリチウム放出ピークは570K付近に出現した。このピークの帰属は、中性子フルエンス3.3×10^<15>n cm^<-2>照射試料の試料に対し、等温加熱実験を行うことで明らかにした。等温加熱下でのトリチウム放出速度はFickの拡散方程式の厳密解と良く一致し、570Kでのトリチウム放出がチタン酸リチウム中の拡散過程が律速段階となった放出であることが示された。チタン酸リチウムにおけるトリチウムの拡散係数及び拡散エネルギーはそれぞれ6.0×10^<-7>m^2s^<-1>、1.1eVと算出された。一方、中性子フルエンスの高い試料ではトリチウムの放出は高温領域にシフトした。この結果から、チタン酸リチウム構造の乱れに伴い、安定なトリチウム捕捉サイトが形成することが示唆された。次にこの安定なトリチウム捕捉サイトの帰属を試みた。本研究での最も高い中性子フルエンスである2.2×10^<19>n cm^<-2>照射した試料では殆ど全てのトリチウムが高温領域で放出した。また、トリチウムの放出率の拡散方程式の厳密解を用いての再現は出来なかった。次に捕捉サイトからの脱捕捉過程を一次反応として一次反応律速モデルを用いて解析を行った。各温度における脱捕捉速度定数から、トリチウムの脱捕捉の活性化エネルギーは1.2eVと見積られた。特にLiOHでは生成したトリチウムが水酸基(O-T結合)を形成することが考えられたため、1.2eVのエネルギーは水酸基の熱分解エネルギーに相当すると考えられた。以上の結果から、照射によりチタン酸リチウム中に照射欠陥などが蓄積することにより、水酸基の形成が起こりやすくなることが分かった。照射欠陥の蓄積や、中性子との反応によるリチウムの燃焼などにより、酸素原子の周りのリチウム密度が下がり、水酸基の形成が起こりやすくなると考えられた。チタン酸リチウムにおけるトリチウム放出の律速段階の同定だけでなく、各トリチウム移行素過程を速度論的に解明することで、チタン酸リチウム中のトリチウム挙動の理解が大幅に進んだ。また、リチウム添加した材料や、リチウムの不足した材料、金属コーティングした試料への調製や中性子照射なども順次行っており、H25年度への実験準備も確実に行っている。

さらに、研究で得られた成果を積極的に発表し論文にまとめており、チタン酸リチウム関連の論文も2報投稿(1報は発行済み、1報は受理済)し、さらに1報は執筆中である。また、国際協力研究で得られた成果も、海外の研究者と議論しながら論文にまとめ、発表している。今年度は昨年度中性子照射した材料の実験を進め、得られたLi_2TiO_3での基礎的物理定数を、素過程モデルにインプットし、実験データの再現、または実験データとの差異から他の素過程の可能性を探る。一方、先進的な材料における実験も並行して進めるが、Li_2TiO_3で得られた知見をベースとして解析を行う予定である。最終的にトリチウム増殖材でのトリチウム移行過程の定量的なモデル化を達成することを目標とする。本研究計画は今年度で終了である。
共生窒素固定に関わるABCトランスポータLjPDRの輸送機能と根粒形成の制御

LjPDR(=LjABCG1)はG-サブファミリーに属するフルサイズのABC蛋白質で、従前はPDRと呼ばれていたグループに属する構成員である。この遺伝子は、ミヤコグサの根のみで発現しており、根粒形成によって強く誘導されることが明らかになっている。その発現部位をPromoter::GUS植物を作成し、切片を調製して調べた所、若い根のプライモディア、根端、若い根の中心柱で発現していること、根粒形成によって、その維管束部分から若い根粒にかけての維管束組織の周りで強く発現することが明らかとなった。このトランスポータの発現は、根粒が成熟すると発現は消失することから、根粒の機能維持というより根粒組織を形成の段階で重要な役割を果たしているトランスポータであろうことが次第に分かってきた。なお局在膜は、ペプチド抗体を用いたウエスタン法で、細胞膜であることも示した。輸送活性をアッセイするために、出芽酵母、バキュロウイルス(昆虫培養細胞Sf9)の系でこの膜蛋白質を発現させることを試みたが、いずれに計においても蛋白質として発現することが認められていない。現在は植物細胞であるタバコBY-2の培養細胞をホストとしてこのミヤコグサのABCトランスポータが発現できないか試している所である。LjABCG1遺伝子の植物における機能を知るため、RNAiによる発現抑制植物を多数作成し、その表現型を調べた結果、根粒の数には直接の影響は現在の所認められていないが、根の伸長あるいは発達に本遺伝子が深く関わっていることを示唆するデータを得た。陸上生態系の窒素の8090%は生物学的窒素固定に由来し、特にマメ科植物と根粒菌の窒素循環に対する貢献は大きい。共生系の確立には種特異的な相互認識が必要で、初期にはフラボノイドがシグナル分子として使われるなど、物質輸送が極めて重要な役割を果たしている。本研究では、マメ科のモデル植物ミヤコグサを用い、植物-微生物共生系確立に寄与する植物輸送体の解析を目的とする。特に、オートレギュレーションと呼ばれる地上部を介した長距離シグナルは、過剰に根粒が根に着生するのを防ぎ、大気から固定した窒素代謝物を得る代わりに炭素源である光合成産物を根粒菌に受け渡すCとNのパラレルな供給が、適度なバランスを持って行われている。我々がミヤコグサのアレイ解析データから着目したATP結合カセット(ABC)トランスポータLjPDR1は根で特異的に発現する遺伝子で、根粒形成時ならびにオートレギュレーションをミミックするジャスモン酸にも鋭く応答し、これらで特異的に発現誘導される。LjPDR1の発現組織と細胞タイプ特異性を突き止め、遺伝子発現の改変株での根粒形成能を比較し、このABC蛋白質が根粒の数の制御にどのような機構で関与するかを解明することを目的とした。H20年度はLjPDR1の発現組織特異性を厳密に明らかにするため、自らのプロモータでドライブしたGUSコンストラクトを用いて調べた所、本遺伝子は若い根の中心柱と根端で強く発現していること、また、生長中の根粒で発現が高いことが認められた。ペプチド抗体とショ糖密度勾配遠心法を用いてLjPDR1の局在膜を調べた所、細胞膜であることを明らかにした。次いでRNAiでLjPDR1の発現を低下させたミヤコグサを作成し、発現をノックダウンしたクローンを10ライン以上作成したが、20%程度の発現が残っており、根粒数に対する影響は認められなかった。
影響関数法による3次元き裂部材の健全性評価に関する研究

単位分布力の重ね合わせに基づく影響関数法の手法を開発し,この手法により,熱応力場,残留応力場,あるいは切欠き裂の複雑な応力場等における3次元表面き裂の応力拡大系数(K値)が容易に,しかも精度良く評価できることを示した.本手法によれば単位分布力に対するK値の影響係数K_<ij>を予め求めておくことが必要で,これは一連の3次元有限要素解析を伴う膨大な作業となる.研究代表者はこれまでの研究において1.平板中の半楕円表面き裂2.平板中の4分の1楕円表面き裂に対して, K_<ij>のデータを作成したが,本研究においてはさらに,3.丸棒中の半楕円表面き裂4.パイプの軸方向内面半楕円表面き裂に対して,一連の3次元有限要素解析を行い, K_<ij>のデータを充実させた.これらのK_<ij>のデータを用いると,熱応力場,残留応力場あるいは切欠き底の応力場等の複雑な応力場における表面き裂の応力拡大係数が簡単な重ね合わせのアルゴリズムにより求められることを示し,具体的な応用例を示した.さらに,これらK_<ij>のデータをデータベースとしてパソコンのフロッピディスクに収め,ユーザーはき裂のない部材の応力分布とき裂形状の入力だけで,極めて容易にK値が求められるパソコンによるK値評価システムの開発を行った.また,疲労き裂伝播に関するパリス則の積分に際して上記システムを組み込むことにより,複雑な応力場での疲労き裂伝播寿命の評価が簡単に行えることを示すとともに,モンテカルロシミュレーションにより表面き裂部材の信頼性評価が可能なことを示した.単位分布力の重ね合わせに基づく影響関数法の手法を開発し,この手法により,熱応力場,残留応力場,あるいは切欠き裂の複雑な応力場等における3次元表面き裂の応力拡大系数(K値)が容易に,しかも精度良く評価できることを示した.本手法によれば単位分布力に対するK値の影響係数K_<ij>を予め求めておくことが必要で,これは一連の3次元有限要素解析を伴う膨大な作業となる.研究代表者はこれまでの研究において1.平板中の半楕円表面き裂2.平板中の4分の1楕円表面き裂に対して, K_<ij>のデータを作成したが,本研究においてはさらに,3.丸棒中の半楕円表面き裂4.パイプの軸方向内面半楕円表面き裂に対して,一連の3次元有限要素解析を行い, K_<ij>のデータを充実させた.これらのK_<ij>のデータを用いると,熱応力場,残留応力場あるいは切欠き底の応力場等の複雑な応力場における表面き裂の応力拡大係数が簡単な重ね合わせのアルゴリズムにより求められることを示し,具体的な応用例を示した.さらに,これらK_<ij>のデータをデータベースとしてパソコンのフロッピディスクに収め,ユーザーはき裂のない部材の応力分布とき裂形状の入力だけで,極めて容易にK値が求められるパソコンによるK値評価システムの開発を行った.また,疲労き裂伝播に関するパリス則の積分に際して上記システムを組み込むことにより,複雑な応力場での疲労き裂伝播寿命の評価が簡単に行えることを示すとともに,モンテカルロシミュレーションにより表面き裂部材の信頼性評価が可能なことを示した.単位分布力の重ね合わせに基づく影響関数法の手法を開発し、この手法により、熱応力場、残留応力場、あるいは切欠き裂の複雑な応力場等における3次元表面き裂の応力拡大係数(K値)が容易に、しかも精度良く評価できることを示した。本手法によれば単位分布力に対するK値の影響係数Kijを予め求めておくことが必要で、これは一連の3次元有限要素解析を伴う膨大な作業となる。研究代表者はこれまでの研究において1.平板中の半楕円表面き裂2.平板中の4分の1楕円表面き裂に対して、Kijのデータを作成したが、本研究においてはさらに、3.丸棒中の半楕円表面き裂4.パイプの軸方向内面半楕円表面き裂に対して、一連の3次元有限要素解析を行い、Kijのデータを充実させた。これらのKijのデータを用いると、複雑な応力場における表面き裂の応力拡大係数が簡単な重ね合わせのアルゴリズムにより求められることを示し、具体的な応用例を示しした。さらに、これらKijのデータをデータベースとしてパソコンのフロッピディスクに収め、ユーザーはき裂のない部材の応力分布とき裂形状の入力だけで、極めて容易にK値が求められるパソコンによるK値評価システムの開発を行った。また、疲労き裂伝播に関するパリス則の積分に際して上記システムを組み込むことにより、複雑な応力場での疲労き裂伝播寿命の評価が簡単に行えることを示した。次年度はさらに、確率破壊力学の手法を組み合わせて表面き裂部材の信頼性評価へと発展させていく予定である。
もやもや病類縁頭蓋内血管狭窄の網羅的遺伝子解析による発現機序の同定

RNF213は、もやもや病の原因遺伝子と明らかになった一方、もやもや病類似血管狭窄疾患におけるRNF213の意義は不明である。また、RNF213は日本人の2%に見られるが、血管狭窄発現因子は明らかになっていない。我々は、自己免疫疾患におけるもやもや病類似血管狭窄の病態を報告し、次世代シークエンサーやDNAアレイ遺伝子解析による病因解析を行ってきた。これらの研究成果から、真のもやもや病と、もやもや病類似血管狭窄の遺伝子変異発現の相違に着目する必要性を見出した。脳神経外科臨床医グループは、研究対象として、頭蓋内内動脈系狭窄性所見と内頸動脈瘤が確認された日本医科大学病院と共同研究施設での対象症例が140例ほどとなった。これらの臨床情報(原発疾患、発症年齢、身体所見、画像評価、検査所見等)リストを作成し、該当患者の登録を行なう。比較するコントロール集団として既知内頸動脈瘤の患者を対象とし、これについても臨床情報の収集を行なう。遺伝子情報の取得に関する説明文書は当院倫理委員会の審議を得、患者個々人から同意を得、血液を検体とすして採取を開始した。検体は連結可能匿名化し、ゲノムDNAを抽出することも開始している。遺伝学解析グループは、得られた遺伝子は、頻度の高いRNF213遺伝子のp.R4859Kを来す遺伝子多型(c.14576G>A)について、多人数を迅速に遺伝子多型の分類ができるよう高感度融解曲線法を基盤とした解析系を構築する。続いて、RNF213は5,256アミノ酸、69エクソンからなる巨大遺伝子であり、RNF213遺伝子69エクソン全体で遺伝子変異をスクリーニングできる解析系を高感度融解曲線法を基盤とし開発すべく準備を開始した。最終的には、遺伝子多型解析でリスク型(GA, AA)でない方に対しては、RNF213遺伝子全体エクソンでの遺伝子解析を行いたいと考えている。研究対象とした、MRA, 3次元CT血管撮影、脳血管撮影を基にした頭蓋内内動脈系狭窄性所見と内頸動脈脳動脈瘤の遺伝子情報が140例ほど集積している。該当患者の登録が行われ、臨床情報(原発疾患、発症年齢、身体所見、画像評価、検査所見等)リストを作成した。これらの段階と症例数は当初の予定を超えた症例数で進捗している。比較するコントロール集団として既知内頸動脈瘤の患者を対象としているが、これも同様に集積している。献体のゲノムDNAを抽出も一部で終了している。このような状況から概ね順調に進捗していると判断した。また、研究初年度であり、学術的価値から見た進捗状況に特記事項はない。予想される今後の研究課題としては、当初の予定を超えた症例数を集積することを目論んでおり、継続研究における倫理審査の追加、臨床データ解析の分類が挙げられる。平成31年度中に、研究継続に関する倫理審査を追加したい。また追加の症例群としては50例程度を想定しているが、時間、予算の制約もあるため、脳動脈瘤の発生部位、類もやもや病を基準に症例を限定する。

比較するコントロール集団として既知内頸動脈瘤の患者を対象としているが、これも同様に集積している。献体のゲノムDNAを抽出も一部で終了している。このような状況から概ね順調に進捗していると判断した。また、研究初年度であり、学術的価値から見た進捗状況に特記事項はない。予想される今後の研究課題としては、当初の予定を超えた症例数を集積することを目論んでおり、継続研究における倫理審査の追加、臨床データ解析の分類が挙げられる。平成31年度中に、研究継続に関する倫理審査を追加したい。また追加の症例群としては50例程度を想定しているが、時間、予算の制約もあるため、脳動脈瘤の発生部位、類もやもや病を基準に症例を限定する。該当なし
アルコール依存症の成因に関する分子生態遺伝学的研究

アルコール依存症の発症および進展にはさまざまな生体要因に加え、ライフスタイルや心理的・社会的因子などが関与する多因子病である。しかしながら過去20年におよぶ研究から遺伝的要因が強い疾患であることも判明している。我々は依存症に対する遺伝的脆弱性に関わる候補遺伝子として幾つかのものを分析した。そのうちアルコール依存症と健常対照者との間で有意差が検出された遺伝子の多型性変異はCholecystokinin(CCK)geneのpromoter領域のSp1 bindingcis-elementの-45C→Tの変異のほか、mitochondria DNAのATPase領域のへテロプラスミーおよびALDH2 promoter領域のMAZ binding cis-elementの-357G→Aの変異であった。しかしながらCCK-AおよびCCK-B受容体、Serotonin-1A受容体については新たな多型性変異が見い出されたが、アルコール依存症との相関はなかった。一方、CCK geneの変異型はアルコール離脱症状のうち個人差が顕著な「振戦譫妄」を呈した患者群では健常群より有意に高い頻度で検出された。この原因は変異型をもつ個体の末梢血のCCKペプチドは正常型よりも低いことと関連することが、Radioimmunoassayの結果から判明した。更に三次元人格分類票(TPQ)による調査データはCCK geneの変異型をもつ個体は損傷回避性の気質傾向が強く、とりわけ予期懸念や易疲労性が強いことも関連していた。このことはアルコール依存の背景に不安やストレスからの逃避があることを示唆している。Cholecystokinin(CCK)は8アミノ酸からなるペプチドホルモンで、prepro CCKがendopeptidaseによりプロセッシングを受け生成されたものである。CCKは主として消化管(小腸,胆嚢)のほか、中枢および末梢の神経系に存在する。消化管においては膵酵素の放出や胆嚢の収縮に関与し、中枢神経系においては不安や食欲の機能に重要な役割を演じる一方、ドーパミンと相互作用する。我々は一般集団を対象にprepro CCK promoter gene領域の解析を行った結果、Splが結合するcis-elemintの変異型とCloningerの人格類型のHarm avoidance(HA)の低得点グループとが相関することを示唆するデータを得ている。またHAはタイプ2のアルコール依存とも相関することが報告されていることもあり、本研究ではこの変異型をマーカーとしてアルコール依存症に関する対照研究を行った。あらかじめ検査の目的を説明し、同意の得てある男性アルコール症患者80人および健常人男性100名の末梢血からDNAを抽出した。PCR法によりCCKのpromoter領域225bpを増幅し、SSCP法により変異型のスクリーニングを行った。変異型を示したものは、PCR-direct sequencing法により塩基置換部位を確認した。更にallele specific primer PCR(ASP-PCR)法によって再確認した。promoter領域内のcis-element GGGCGGはtrans-acting factor Splの結合部位であるが、このCがTに塩基置換している変異が、ヘテロあるいはホモ接合型で多型として検出された。C/Tの置換を検出しうるprimerを作り、ASP-PCR法で両集団をスクリーニングした結果、一般集団ではCC型63%,CT型34%,TT型3%であったのに対し、アルコール依存症群ではCC型27%,CT型48%,TT型25%で、両群の間で表現型および遺伝子頻度ともに有意差が検出された(p<0.01)。また一般集団を対象にTPQテストとCCK geneのC/T多型との相関を調べたところ、HA低得点グループとCCK-T型との相関を示唆するデータが得られた。アルコール離脱症状を示した患者のうち振戦譫妄ではCC:36.5%,CT:59.6%,TT:3.9%となり、一般健常人のCC:33.8%,CT38.0%,TT:8.2%と比較しT遺伝子をもつ固体が有意に高い頻度を示した(x^2=4.91,p<0.03)。

CC型とCT,CT型とで抹消血中CCK peptide濃度を測定した結果、男性群ではCC型(19.9±6.9),CT型(11.1±5.5),TT型(9.1±9.7)となり、女性群ではCC型(16.1±12.1),CT型(15.1±13.3),TT型(14.6±8.0)となり、男性群ではCC型はCT,TT型より有意に高い値を示した。(p<0.001)。アルコールの長期乱用により発症する離脱症状には個人差が存在することが、従来知られてきたが、その遺伝的背景のひとつとしてCCK geneのpromoter領域の多型が関与することが推測される。アルコール離脱症状を類型別にみた場合、振戦譫妄はCCK geneのC-45Tの多型のうち、T型変異を含む遺伝子型がhigh riskの候補のひとつとなることが示唆された。またこの生理的背景にはCCK peptideの産生量が遺伝子型と関連している可能性もある。本年度はALDH2 promoter領域中に、強力な転写活性を示すMAZが結合するcis-elementに新たな多型性変異を見い出したので、健常人とアルコール性肝障害との対照研究を行った。アルコール性肝障害の診断基準に基づき診断された男性患者40名(肝線維症、肝硬変、肝炎)および健常者66名の血液から抽出したDNA試料を用いた。ALDH2geneの5′末端上流は約600bpの塩基配列がHsu et al.(1988)により報告されている。この領域を約300bpずつ上流と下流に分け、PCR増幅したものをDNA Sequencer(ALFexpress,Pharmacia)によりSSCP分析した。検出された変異型はすべてGenetic analyzer(ABI,310)にて塩基配列を決定した。健常者集団では-375G→Aの置換が多型として検出されたほか、稀な変異として-530C→Tが検出された。このほかHsu et al.の報告と異なる配列として-539G→Tの置換および-345Cと-346Cの間のG insertionが全例に見い出された。遺伝子頻度は健常群ではGG:39(59.1%),GA:22(33.3%),AA:5(7.6%)であるのに対し、アルコール性肝障害ではGG:7(17.5%),GA:32(80,0%),AA:1(2.5%)となり、アルコール性肝障害においてはA型変異が有意に高かった(X^2=6.78,p<0.001)。この-375G→A変異はSp1より更に強力な転写活性をもつMAZが結合するcis-element中に生じた塩基配列(GGGGAGG→GGGAAGG)であるので、転写活性に何らかの影響を及ぼし、ひいてはALDH2活性の低下につながる可能性がある。