hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
家蚕の致死遺伝子と発生制御に関する研究

染色体上で致死遺伝子の近傍に存在する塩基配列は、致死遺伝子のクローン化をはじめとする分子レベルの解析の基礎となる。下記の方法でゲノムの解析を行った。1.第22連関群における形質地図と分子地図の重ね合わせ:RAPD連関地図とRFLP連関地図から形質地図の第22連関群に相当する連関群を同定し、交配実験によってそれら3者を統合して一本の地図とした。そこには致死遺伝子skuも含まれる。2.休眠ホルモン-PBAN遺伝子のマッピング:交配実験により、同遺伝子を第11連関群-2.5cMへマップした。3.形質地図と分子地図における連関群の対応付け:交配実験により、形質地図の第7連関群、第13連関群、第18連関群の三つに相当する連関群をRAPD地図の中から同定した。この中には、Obsなどの致死遺伝子が含まれる。4.染色体上の塩基配列の決定:正逆交雑で差異を示す伴性遺伝をするRAPDについて、塩性基配列の決定やコピー数の推定を行った。カイコの性染色体の塩基配列としては始めての報告である。5.第7染色体上の塩基配列の決定:形質地図の第7連関群の上のいくつかのRAPDについて塩基配列を決定した。6.アリルフォリン遺伝子の分子進化に関する理論的解析:同義置換と非同義置換を区別することで、系統進化におけるアリルフォリン遺伝子の挙動をより正確に把握できた。7.エリサンとサクサンのヘキサメリン遺伝子の転写制御:ヘキサメリン遺伝子の性特異的・発育段階特異的な発現が、いかなる機構で制御されるかをメソプレン投与などで解析した。8.産卵行動と寿命を制御する遺伝子:xu20系統に見られる産卵行動と寿命の異常が、第29RAPD連関群の上の因子で制御されることが明らかになった。9.カイコ核多角体病ウイルスの変異株の解析:不整形や立方体の多角体を作る変異株のポリヘドリン遺伝子を解析し、アミノ酸置換を解明した。(1)E系致死突然変異のモデイク解析:E^<NK>突然変異を遺伝的モザイク系統moに導入し,体の一部だけE^<NK>/E^<NK>となるようなモザイクを作成した。これらのモザイク個体の一部は孵化し,成虫はで生存した。E^<NK>/E^<NK>の細胞は腹部にあっても胸部として分化し,たとえば腹部成虫原基が成虫の過剰翅となった。E^<NK>遺伝子の発現はモザイクの境界で区別され,細胞ごとに自律的であった。(2)内分泌異常による致死突然変異NMG(光沢不眠蚕)の研究:種々に実験から,nmgホモ個体でも脳が前胸腺激ホルモン(PTTH)を合成しており,前胸線のエクジステロイド合成能がないためか,またはPTTHへの感受性がないためエクジステロイド欠損となることが解明された。(3)前胸腺刺激ホルモンと休眠ホルモン-PBAN遺伝子の連関分析:標記の二つの遺伝子は,家蚕の胚子発生や後胚子発を制御する重要な働きを担っている。既知の発育制御遺伝子とこれらホルモン遺伝子の関係を解明するために,ホルモン遺伝子の多型探索と連関分析を行った。その結果,両者には各々三つの複対立遺伝子が存在することが明らかになった。

さらに,前胸腺刺激ホルモン遺伝子は第22連関群の2.7の位置に,休眠ホルモン介PBAN遺伝子はおそらく第11連関群に,それぞれ座位することが判明した。4)家蚕ゲノムの連関地図作成:致死突然変異遺伝子をクローン化するために,ゲノマッピングを試みた。蚕品種「支108号」と「大造」の交雑F1とF2を作成してゲノムDNAを調製し,RAPD(Randomly-amplified polymorphic DNA)によるゲノムDNAの多型検出と,そのマッピングをおこなった。その結果,10数本の泳動帯が再現性,明瞭性にすぐれ,遺伝的に優性であったので,各泳動帯に関してF2の100個体を調査した。大部分の泳動帯は独立に遺伝したが一部は関連していた。1.休眠ホルモン-PBAN遺伝子の座位休眠ホルモン-PBAN遺伝子と既存の突然変異遺伝子の間の関係を究明する目的で,遺伝子の多型探索とマッピングをおこなった。1-1休眠ホルモン-PBAN遺伝子の多型性:休眠ホルモン遺伝子には,第4,第5イントロンの長さの多型で区別できる三つの対立遺伝子Dh^A,Dh^B,Dh^Cが存在していた。1-2遺伝子の座位決定:九州大学保存のw30系統(Dh^C)を用いた連関検索の結果,Dh遺伝子座が第11連関群のKおよびbp遺伝子と連関していた。三点実験の結果から,Dhの座位は第11連関群の-1.5と決定された。2.着色非休眠卵pnd,pnd-2遺伝子のモザイク解析2-1pndのモザイク:遺伝的モザイク系統moを用いてpndの細胞とpnd^+の細胞が混在する個体を作出し,その休眠性を調査した結果,モザイク個体のほとんどすべてが休眠個体となることを発見した。2-2pnd-2のモザイク:moを用いてpnd-2細胞とpnd-2^+細胞が混在する個体を作出した結果,その多くは胚発生の種々の段階で致死した。組織学的観察の結果,非同調的発生は認められなかった。3.体節分化に関わる致死遺伝子,優性短節油Obsの皮膚の性状Obsのクチクラタンパク質を分析したが,野生型との大きな差異はなかった。ObsとObs^+の細胞が混在するモザイクを作成したところ,背部正中線での不等縫合が観察され,Obs遺伝子が体節の性格に影響を与えていることが実証できた。4.致死遺伝子のポジショナルクローニングへ向けての基礎研究致死遺伝子のクローニングのために現在考えられるのはポジショナルクローニング法である。RAPDを利用したアプローチを試みた。320種類の10merプライマーを用いて支108号と大造の間のF2雑種101個体におけるRAPDを調査した。320のうち約半数が多型的な泳動帯を生じ、約180の多型泳動帯が見いだされた。F2における分離の結果からこれらの泳動帯に対応する座位の間の連関関係を調査し,RAPDのマップを作成した。今後,従来の突然変異連関地図とRAPD連関地図を対応させる研究を開始する。染色体上で致死遺伝子の近傍に存在する塩基配列は,致死遺伝子のクローン化をはじめとする分子レベルの解析の基礎となる。下記の方法でゲノムの解析を行った。1.第22連関群における形質地図と分子地図の重ね合わせ:RAPD連関地図とRFLP連関地図から形質地図の第22連関群に相当する連関群を同定し,交配実験によってそれら3者を統合して一本の地図とした。そこには致死遺伝子skuも含まれる。2.休眠ホルモン-PBAN遺伝子のマッピング:交配実験により,同遺伝子を第11連関群-2.5cMへマップした。
昆虫の成長におけるRasタンパク質の機能解明

始めはがん遺伝子産物として報告されたRasタンパク質は、一般細胞の分化や増殖に関わることが分かってきた。昆虫ではショウジョウバエで近年、脱皮ホルモン活性制御への関与から、体サイズ調節にも係わっていることが示唆されたので、器官ごとに分析可能な大型なカイコを用いて遺伝子解析を行った。哺乳動物ではH-, K-, N-Rasの三種が知られており、ショウジョウバエにおいても1,2,3の3つの遺伝子が存在する。そこで、それらの配列を元に縮重プライマを設計し、カイコcDNAライブラリからRasタンパク質をコードするcDNA断片を得、RACE法により全長をコードするcDNA3種を得た。予想されるアミノ酸配列から、カイコの1,2,3中の相同性よりも、カイコとショウジョウバエの1,2,3のそれぞれの間の相同性の方が高かった。しかし昆虫の1,2,3型と哺乳動物のN-, K-, N-間の相同性は低く、系統樹解析の結果、昆虫Rasのグループと哺乳動物のグループは別のクラスターであることが分かった。成長におけるmRNA発現変動は全てのRasで認められ、5齢後半から蛹期で高い発現が観察された。Ras3のみ胚期初期でも高く、Ras2は蛹期後半で特に高かった。4齢後期と5齢中期の発現量を主要器官別に比較したところ、いずれも前蛹期のマルピーギ管で高い発現が見られた。また、Rasタンパク質を蛍光タンパク質GFPと融合タンパク質として昆虫培養細胞に発現させたところ、GFPのみを発現させた場合には細胞内にほぼ全体的に存在していたのに対し、融合タンパク質では細胞膜に局在化することが分かった。さらにRasの脂質修飾を解析した結果、3種のRasはいずれもゲラニルゲラニル化されることが示唆された。昆虫ではショウジョウバエで近年、脱皮ホルモン活性制御への関与から、体サイズの調節にも係わっていることが示唆された。そこで、器官ごとに分析が可能な大型昆虫のカイコを用いて遺伝子の解析を行った。哺乳動物ではH-,K-,N-Rasの三種が知られており、ショウジョウバエにおいても1,2,3の3つの遺伝子が存在する。しかし昆虫の1,2,3型と哺乳動物のN-,K-,N-間の相同性は低く、系統樹を作成した場合、昆虫Rasのグループと哺乳動物のRasのグループは別のクラスターであることが分かった。成長におけるmRNA発現変動はRas1とRas3で認められ、胚期前半と幼虫期では血中エクダイソン濃度の高い各幼虫脱皮の前で高く、幼虫期よりも胚期の方で発現量が高かった。4齢後期と5齢中期の発現量を主要器官別に比較したところ、アラタ体、脳、マルピーギ管、精巣で終齢中期の方が高く、脂肪体は逆であった。タンパク質の機能発現のための修飾には、リン酸化や糖鎖修飾の他に脂質修飾がある。その一つとしてプレニル化が知られ、炭素鎖のユニット数の違いからファルネシル化とゲラニルゲラニル化の2種がある。シグナル伝達に関与するタンパク質の多くはプレニル化されており、Rasタンパク質のファルネシル化の重要性が良く知られている。

哺乳動物ではH-、N-、K-の3種のRasがあり、ファルネシル化等の脂質修飾を受けている。昨年クローニングされた3種のカイコRasについて、そのタンパク質のプレニル化について解析した。カイコRasは、プレニル化を指令するCAAXモチーフの配列パターンから、いずれもゲラニルゲラニル化されると推定された。そこでN末端にFlag-tagを導入したカイコRas cDNAを作製し、プレニル化の特異的阻害剤(FTI、GGTI)を用いて、昆虫細胞由来無細胞タンパク質合成系および、バキュロウイルス(カイコ核多角体ウイルス)発現系における代謝標識により、カイコRasのタンパク質プレニル化を検討した。その結果、3種のカイコRas(BmRas1、2、3)はいずれもゲラニルゲラニル化されることが確かめられた。また、Rasタンパク質を蛍光タンパク質GFPと融合タンパク質として昆虫培養細胞に発現させたところ、GFPのみを発現させた場合には細胞内にほぼ均一に存在していたのに対し、融合タンパク質では細胞膜に局在化することが分かった。
上皮組織の立体構築過程におけるHippoシグナル伝達系の役割

ピペット吸引法やレーザー切断法など組織・個体レベルでの物理的張力を計測する技術を駆使し、YAPが組織張力の原動力となるアクトミオシンの活性制御を司ることを突き止めた。また、単一細胞レベルでのタイムラプス解析から、YAP変異体では組織張力の異常により細胞積層が正常に進行せず、結果として神経管などの上皮組織が扁平化したと考えられた。さらに、YAPはアクトミオシンの活性制御を介してフィブロネクチンの重合化を引き起こし、眼のレンズと網膜の正常な組織配置に関与することも明らかとなった。これらメダカで見出されたYAPの新機能はヒトにおいても保存されていることがヒト培養細胞の3次元培養法により示された。器官サイズ制御シグナルHippo伝達系が上皮組織の立体構築を統御する分子メカニズムは未解明な点が多い。我々はこれまでにHippoシグナルの下流標的因子YAPのメダカ変異体を単離し、この変異体が神経管や網膜などの上皮組織の破綻という特徴的な表現型を呈することを明らかにしてきた。そこで本研究では、YAPによる上皮組織の立体構築機構およびその破綻による上皮形成異常の発症機序を明らかにすることを目的として研究を進めた。1.生きた個体全体の中で神経管腔組織の破綻を細胞張力の観点から検証するため、張力可視化用センサープローブ(VinTS)をメダカ胚に導入した。蛍光タイムラプス顕微鏡を用いて、メダカ胚における細胞間張力の組織分布をFRETの蛍光強度の変化として捉えられるか否かを検討した。これまでに期待したほどのFRET効率は得られていないが、リンカーの種類や長さの変更により様々な改良型張力センサー分子の作製を試み、FRET効率の最適化を培養細胞にて検討している(未発表)。2. Hippoシグナル伝達系による網膜の神経上皮組織の形成機構を明らかにするため、YAPの様々な機能ドメインに変異を施したmRNAを受精卵へ導入し、初期胚における表現型の詳細な解析を行なった。その結果、YAPのTEAD結合ドメイン、WWドメインならびに転写活性化ドメインが網膜上皮組織の形成過程に重要な役割を果たすことを見出した。また、YAPが網膜の転写因子Rx1との相互作用を通じて網膜組織形成に関与することを明らかにした[Asaoka et al. PLoSOne (in press)]。脊椎動物の体は複雑な三次元的形態をしており、組織や器官が正しく形作られ適切に配置されることにより初めて機能を発揮できる。こうした三次元的な形態形成の場には組織張力の制御が不可欠であるが、その詳細な分子機構については不明な点が多い。本研究において申請者らはhirame (hir)と命名したメダカ変異体の解析を行なった。hir変異体はその名の通りユニークな扁平の形態を示すが、これは器官サイズを制御するHippoシグナルの核内標的分子YAPの変異が原因であった。詳細な解析の結果、hir変異体はアクトミオシンを介した組織張力が低下したことにより、重力に耐えられなくなり組織の扁平をきたし配置も崩れることが判明した。さらにヒト培養細胞を用いた解析から、YAPの下流分子の一つとしてARHGAP18を同定した。以上の結果からYAPの三次元器官構築への関与が新たに明らかとなった[Nature (2015)]。今回の研究から、脊椎動物の器官が重力下で押しつぶされることなく三次元構造を構築する分子メカニズムの一端が明らかとなった。これは魚類からヒトに至るまで広く保存されたメカニズムである点は意義深い。現在、世界中でES細胞やiPS細胞を用いた器官作成に関する研究が盛んであるが、立体的で機能的な器官の構築は未だ困難な状況である。最近になって、試験管内でES細胞から網膜原基の眼杯組織を立体構築する画期的な自己組織化技術が報告されており、今回の研究成果をもとに今後YAPの組織張力制御を考慮した研究がさらに進めば、三次元構造を持った機能的な眼の開発に役立つことが期待される。上皮組織は多細胞生物を構成する器官の基盤的構造であり、その形状やサイズの適切な制御は機能的な器官の構築に極めて重要である。ここ数年の研究から、器官サイズ制御シグナルHippo伝達系が上皮組織の構造制御と密接に関連することが明らかとなってきたが、上皮組織の3次元構築を規定する分子メカニズムの詳細は未解明な点が多い。我々はこれまでにHippoシグナルの下流標的因子YAPのメダカ変異体hirameを単離し、このhirame変異体が神経管や血管等の上皮組織の構築と維持の不全という特徴的な表現型を呈することを見出した。Hippoシグナル伝達系は、隣接細胞間の接触情報に基づいて細胞増殖と細胞死の双方を制御することにより、組織や器官の形状やサイズを決定する新しいシグナル経路として近年注目を浴びている。しかしhirame変異体の特徴的な表現型は、組織を構築する個々の細胞の増殖や細胞死の観点だけからでは説明をつけることは難しい。そこで新たに細胞張力の観点からhirame変異体の表現型を精査した。具体的には、ピペット吸引法やレーザー切断法など組織・個体レベルでの物理的張力を計測する技術を駆使し、YAPが組織張力の原動力となるアクトミオシンの活性制御を司ることを突き止めた。単一細胞レベルでのタイムラプス解析から、hirame変異体では組織張力の異常により細胞積層が正常に進行せず、結果として神経管などの上皮組織が扁平化したと考えられた。

また、YAPはアクトミオシンの活性制御を介してフィブロネクチンの重合化を引き起こし、眼のレンズと網膜の正常な組織配置に関与することも明らかとなった。さらに、これらメダカで見出されたYAPの新機能はヒトにおいても保存されていることがヒト培養細胞の3次元培養法により示され、YAPがRhoGTPase活性化分子の発現を介してアクトミオシン活性を制御していることが判明した。ピペット吸引法やレーザー切断法など組織・個体レベルでの物理的張力を計測する技術を駆使し、YAPが組織張力の原動力となるアクトミオシンの活性制御を司ることを突き止めた。また、単一細胞レベルでのタイムラプス解析から、YAP変異体では組織張力の異常により細胞積層が正常に進行せず、結果として神経管などの上皮組織が扁平化したと考えられた。さらに、YAPはアクトミオシンの活性制御を介してフィブロネクチンの重合化を引き起こし、眼のレンズと網膜の正常な組織配置に関与することも明らかとなった。これらメダカで見出されたYAPの新機能はヒトにおいても保存されていることがヒト培養細胞の3次元培養法により示された。これまでに初期発生期のHippoシグナル伝達系が細胞張力制御に関与する可能性を見出しており、これらの研究成果を論文にまとめるに至った[Nature (2015)]。さらに詳細な解析を進めることにより、最終的にマクロスケールの上皮神経組織構築を個体レベルで理解できると考えている。発生生物学今後は細胞張力の可視化に向けた実験系の最適条件を決定し、hir変異体の神経上皮形成過程において細胞張力をリアルタイムに可視化し、Hippoシグナルの活性化の上皮組織形成における役割を明らかにする予定である。これまでに初期発生期のHippoシグナル伝達系が細胞張力制御に関与する可能性を見出しており、さらに詳細な解析を推進することにより最終的にマクロスケールの上皮神経組織構築を個体レベルで理解できると考えている。個体内での細胞内張力の解析にあたっては、現在までに一過的発現系において細胞間張力の組織分布をFRET法により検出するための実験系を立ち上げることができており、当初の研究目的はおおむね順調に進行していると考えている。今後は細胞内張力をFRETの蛍光強度の変化として捉えるための最適化条件を決定するため、改良型張力バイオセンサーをシステマティックに作製し培養細胞にて解析を継続する予定である。さらにYAP変異メダカの神経上皮形成過程において1細胞極性2細胞運動性ならびに3細胞張力をリアルタイムに可視化し、Hippoシグナル活性化の上皮組織形成における役割を明らかにする。
小児の注意欠陥多動性障害(ADHD)および学習障害に関与する環境および遺伝要因

本研究では、「注意欠陥多動障害」(ADHD)など小児の神経発達障害、行動異常の発症リスクを解明するため、特に内分泌かく乱物質からの影響が考えられる甲状腺機能との関連に焦点を当てて研究を行った。Wistarラットを用いた動物実験ではMethimazole投与の影響を検討した。オープン・フィールドを用いて活動量を検討した結果、暗期における活動量の低下が認められ、甲状腺ホルモン抑制による活動の明暗リズムの崩れが認められた。また、情動性の高まりが見られ、新奇刺激に対して馴化が生じにくく、馴化が生じた後では多動が認められた。オペラント課題による学習行動の検討では、オスでは学習の獲得過程で行動の時間どり抑制ができず、ひとたび反応すると、報酬に関わらず続けて反応を連発する行動が見られたが、メスでは認められなかった。脳神経発達期に甲状腺ホルモンを阻害されると多動性や行動抑制の障害(衝動性)といったADHDと類似した行動障害が生じると示唆された。DRLLによる学習への影響は、メスでは影響がなかったが、オスにおいて行動抑制ができないという反応抑制障害が認められた。疫学研究では小児神経専門医療機関に通院しているADHDを含めた発達障害児を対象とし、母親の妊娠時、及び児の新生児期の甲状腺機能検査、現在の甲状腺機能についての測定を行った。発達障害児と診断された3歳から17歳の児58名を対象とし、分娩年月日、性、分娩週数(±1週)をマッチさせた217名を対照群とした。その結果、新生児期のTSHは症例が2.6μU/ml(06.3)に対し、対照では、2.8μU/ml(011.2)、FT4では、症例が2.1ng/dl(1.23.7)に対して、対照は2.1(1.04.4)と有意な差が認められなかった。疫学研究では、妊婦甲状腺機能の検討が出来た症例が少なく、さらに、サンプルサイズを増やして検討を行う予定である。本研究では、「注意欠陥多動障害」(ADHD)など小児の神経発達障害、行動異常の発症リスクを解明するために、関与する環境・遺伝要因との関連を検討した。特に、内分泌攪乱化学物質が甲状腺への作用を介して神経発達に影響すると危倶されていることから、甲状腺機能との関連に焦点を当て、検討を行った。札幌市内の4つの小児神経専門医療機関に通院しているADHDを含めた発達障害児を対象とし、同意を得た後、母親の妊娠時、及び児の新生児期の甲状腺機能検査を検索し、同時に現在の甲状腺機能にっいての測定を行った。なお、札幌市では1986年より妊婦及び新生児の甲状腺マススクリーニングを行っている。本年度は、発達障害児と診断された7歳から17歳の児31名(男29名,女2名)を対象とし、分娩年月日、性、分娩週数(±1週)をマッチさせた200名を対照群として遊離型サイロキシン(FT4)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)の値を解析した。その結果、新生児期のTSHは症例が1.7μU/ml(0-6.3)に対し、対照では、2.7μU/ml(011.2)と症例で低値の傾向が見られた。FT4では、症例が1.9ng/dl(1.2-3.7)に対して、対照は2.1(1.0-4.4)と差が見られなかった。児の現在の甲状腺機能については、症例のみの検討になったが、異常は見られなかった。さらに、症例の母親の妊娠時マススクリーニングの結果について検索し得た8名については、甲状腺機能に異常はなく、抗甲状腺抗体陽性者もいなかった。一般的には、分娩ストレスにより、出生直後TSHは過剰分泌されるために漸減する。ADHDを含めた発達障害児のTSH低値が、代謝過程の未熟性を反映しているかを判断するためにも、今後さらに症例数を増やして検討していく必要があると思われる。

その結果、新生児期のTSHは症例が2.6μU/ml(06.3)に対し、対照では、2.8μU/ml(011.2)、FT4では、症例が2.1ng/dl(1.23.7)に対して、対照は2.1(1.04.4)と有意な差が認められなかった。疫学研究では、妊婦甲状腺機能の検討が出来た症例が少なく、さらに、サンプルサイズを増やして検討を行う予定である。
光学活性なサリドマイドイソスターの設計と合成および生物活性評価に関する研究

催奇形性のない安全なサリドマイドの開発を念頭に,新型サリドマイドの開発研究を開始した。サリドマイドには,不斉炭素原子が1つあるために,2つの光学異性体が存在する。一般にR体のサリドマイドが催眠鎮静作用を有するのに対し,S体のサリドマイドは催奇形性を有すると信じられている。従って,R体のサリドマイドを医薬品として使用すれば安全である。しかしながら,サリドマイドは生体内で容易にラセミ化してしまうため,光学活性体を使用しても,その効果は現れないと考えられている。そこで,ラセミ化を抑制し,かつサリドマイドの構造修飾を最小限に抑えた新型サリドマイドとして,3位に重水素を組み込んだ,デュウテリオサリドマイドを設計した。分子内に組み込まれた重水素原子は,同位体効果により効率的に分子のラセミ化を抑えると期待できる。合成法を種々検討した結果,標的化合物をアミノ酸であるオルニチンからわずか六工程で合成することに成功した。さらに,合成したデュウテリオサリドマイドを光学分割し,ラセミ化に対する安定性を測定した。その結果,サリドマイドに比べ五倍以上安定であることがわかった。また,光学活性サリドマイドの実用的合成法の開発に着手した。サリドマイドがラセミ体として使用されている主要因は,単にラセミ化しやすいことではなく,実用的な光学活性体の合成法が無いことにある。ラセミ化しやすさのため,光学活性体の合成には様々な工夫を必要とし,多工程を要するのが実情だ。そこで,実用的な合成法を検討した結果,オルニチンよりわずか3工程で光学活性サリドマイドの純品を得ることに成功した。この方法はカラムクロマトグラフィーによる精製を一切必要としないことから,実用的方法になると考えている。本法が実用化されれば,催奇形性が懸念されているS体でなく,より安全なR体のみを医薬品化できる可能性が高い。容易に購入でき,しかも副作用がない催眠鎮静薬として昭和33年に市場に登場したサリドマイド(1)はそのフレーズとは裏腹に,妊婦が服用すると奇形の子供が生まれるという痛ましい傷跡を残し,昭和37年に姿を消した.そのサリドマイドが今度はエイズ治療薬になる可能性が高いとして再びクローズアップされ,世界各国こぞってサリドマイドの研究を再開した.さて,サリドマイド(1)にはRおよびS体の光学異性体が存在し,R体は催眠鎮静作用を持つが,S体は催奇形性を有する.惨事の原因は,サリドマイドのラセミ体を薬剤として使用したためであると言われ続けてきた.しかし,サリドマイドが生体内ですみやかにラセミ化するということが最近になって報告され,1のエナンチオマー間での生物活性の差に疑問が投げかけられた.このような問題点に答えるべく,ラセミ化の少ないサリドマイドとして,光学活性3-デュウテリオサリドマイド(2)を設計し合成することとした.L-オルニチンをメチルエステルとし,塩基を用いて環化してピペリジン体3を得た.3をN-カルボエトキシフタルイミドでフタロイル化した後,アミド基をBocで保護しN-Boc-2-(2-oxo-piperidin-3-yl)-isoindole-1,3-dione4を得た.続いてLiHMDSでアニオンを形成し,重水を用いて反応をクエンチしN-Boc-3-deuterio-2-(2-oxo-piperidin-3-yl)-isoindole-1,3-dione5を得た.5をトリフルオロ酢酸で脱保護したのち,ルテニウム酸化により目的とする2の合成に成功した.次に.得られた2の緩衝液(37°C,pH7.4)中での安定性を調べた.その結果,2は1と同様に緩衝溶液中でゆっくりとラセミ化(この場合水素交換)するが,その速度は1に比べて5倍以上遅いことがわかった.催奇形性のない安全なサリドマイドの開発を念頭に,新型サリドマイドの開発研究を開始した。

サリドマイドがラセミ体として使用されている主要因は,単にラセミ化しやすいことではなく,実用的な光学活性体の合成法が無いことにある。ラセミ化しやすさのため,光学活性体の合成には様々な工夫を必要とし,多工程を要するのが実情だ。そこで,実用的な合成法を検討した結果,オルニチンよりわずか3工程で光学活性サリドマイドの純品を得ることに成功した。この方法はカラムクロマトグラフィーによる精製を一切必要としないことから,実用的方法になると考えている。本法が実用化されれば,催奇形性が懸念されているS体でなく,より安全なR体のみを医薬品化できる可能性が高い。
活動期トキソプラズマ感染症における新規血清学的診断法の開発

国内で実施不能であったトキソプラズマの血清学的検査、Sabin-Feldman Dye Test(SFDT)の再開を試み、また日本赤十字社が実施する献血血液の公募事業で譲渡された血漿検体をスクリーニングした結果、十分量のアクセサリーファクター(一部の健常者が保有している補体成分で、SFDTの実施に不可欠)が確保可能になり、多検体の処理が可能になった。SFDTの実装を基礎に、GFP発現タキゾイトを用いた改良SFDTを開発し検証した。具体的には1野生エゾジカ、2実験動物(マイクロミニピッグ)、3HIV感染患者の血清を対象とし、新検査法の特徴や感度・得意度を明らかにした。1研究期間中に確立した方法でSFDT・改良SFDTを実施し、野生エゾジカ80検体を評価した。新旧の検査結果は完全に一致し(定量結果は一部乖離あり)、改良SFDTの有用性が示された。同時に対象とした個体の約半数がトキソプラズマに感染しているという新たな知見を得て、これを報告した。2マイクロミニピッグ4頭を対象にブラディゾイト(緩徐分裂虫体)の経口感染実験を行い、6ヶ月間に渡り抗体推移を測定した。抗体が上昇しなかった1頭を除き、3頭で抗体価の上昇とその推移を観察できた。新旧の検査結果は概ね一致したが、期待していた抗体半減期については個体差が大きく、単回検査による活動期感染の判別は困難であるとの結果が得られた。3トキソプラズマ脳炎のリスク群であるHIV陽性者を対象に、疫学調査を実施した。研究には約400人のHIV陽性者が参加し、抗体保有率、感染に関連する因子を明らかにした。抗体保有率は8.3%と、国外の報告と比較すると低い傾向、既存の報告でリスクとされた、猫の飼育歴・調理不十分な食肉の摂取歴との関連はなかった。一方、北海道居住歴を有す群で有意に高い抗体保有率が認められ、新たな知見として報告する予定である。本研究の基礎となる、トキソプラズマ感染症の血清学的診断方法、Sabin-Feldman Dye Test(SFDT)の安定した実施にあたり、検査に必要な環境を整備した。具体的には、検査に必要なアクセサリーファクター(一定の条件を満たすトキソプラズマ未感染者血清・血漿)を十分量確保した。これには、日本赤十字社の事業「献血血液の研究開発等での使用に関する指針に基づく公募」を介して購入した血漿の、アクセサリーファクタースクリーニングを実施し、本研究に必要な検体量の確保に成功した。上記準備が整った上で、SFDTと新規検査Toxoplasma Killing Observation Test(TOKIOテスト)の比較を実施した。まず、オオシスト(緩徐分裂虫体)を接種したマイクロミニピッグ4頭を用いた感染実験を行い、感染から6ヶ月間にわたり血液検体の採取した。つづいて、得られた血清検体を用いて、抗トキソプラズマ抗体力価の推移をSFDTとTOKIOテスト双方で評価し、その結果を比較した。各個体での抗体推移は多様であったものの、SFDTとTOKIOテストの結果は概ね相関する結果が得られた。この動物実験における結果は、本研究におけるコンセプトの裏付けとなり、ヒトを対象とした同測定法を実施する上での基軸となった。日本人におけるトキソプラズマ感染の頻度とリスク因子の研究は、先天性トキソプラズマ症が問題となる女性を対象とした研究が多い。一方、トキソプラズマ感染が重症化する恐れのあるHIV感染者の疫学については情報が限られている。我々は東京慈恵会医科大学附属病院に通院するHIV患者400人を対象に、トキソプラズマの感染頻度を調べ、同時にリスク因子についてのアンケート調査を実施した。得られた検体と情報については現在解析中であり、今後TOKIOテストでの評価と比較を計画している。Sabin-Feldmandye test (SFDT)の安定した実施にあたり、アクセサリーファクターの確保は絶対的に必要な条件である。本研究以前のアクセサリーファクターは、先行臨床研究で得られた血清をスクリーニングし適合血清をアクセサリーファクターとして使用していた(東京慈恵会医科大学倫理委員会承認済み。研究番号27-024(7908))。しかし、被験検体数の増加に伴い十分なアクセサリーファクター量が確保できず、日本赤十字社から血漿の提供を受けた。新鮮凍結血漿のスクリーニング作業と、それを用いた検査再現性確認のため時間を要した。マイクロミニピッグを用いた感染実験では、感染から6ヶ月間の感染期間を設け、その間の抗体価の推移を評価したため、実験自体に時間を要した。6ヶ月間の期間設定の理油としては、先天性トキソプラズマ症における妊婦の血清評価を想定した。先天性トキソプラズマ症は妊娠中の初感染が契機となるため、診断には感染時期の特定が重要な情報となる。マイクロミニピッグとヒトを直接比較することはできないが、抗体の推移を評価することで、先天性トキソプラズマ症の診断への応用を期待し、6ヶ月間の経時的評価を実施した。HIV感染者を対象とした臨床研究では、400人の血清学的評価、アンケート調査の集計・解析にも時間を要した。特に、血清学的評価では、約400人分の血清に対しSFDTを実施する必要があり、その作業には相当の時間を要す見込みである。現時点では、抗トキソプラズマIgG陽性者におけるSFDTとTOKIOテストが実施済みであり、今後は抗トキソプラズマIgG陰性者の評価が必要である。

国内で実施不能であったトキソプラズマの血清学的検査、Sabin-Feldman Dye Test(SFDT)の再開を試み、また日本赤十字社が実施する献血血液の公募事業で譲渡された血漿検体をスクリーニングした結果、十分量のアクセサリーファクター(一部の健常者が保有している補体成分で、SFDTの実施に不可欠)が確保可能になり、多検体の処理が可能になった。SFDTの実装を基礎に、GFP発現タキゾイトを用いた改良SFDTを開発し検証した。具体的には1野生エゾジカ、2実験動物(マイクロミニピッグ)、3HIV感染患者の血清を対象とし、新検査法の特徴や感度・得意度を明らかにした。1研究期間中に確立した方法でSFDT・改良SFDTを実施し、野生エゾジカ80検体を評価した。新旧の検査結果は完全に一致し(定量結果は一部乖離あり)、改良SFDTの有用性が示された。同時に対象とした個体の約半数がトキソプラズマに感染しているという新たな知見を得て、これを報告した。2マイクロミニピッグ4頭を対象にブラディゾイト(緩徐分裂虫体)の経口感染実験を行い、6ヶ月間に渡り抗体推移を測定した。抗体が上昇しなかった1頭を除き、3頭で抗体価の上昇とその推移を観察できた。新旧の検査結果は概ね一致したが、期待していた抗体半減期については個体差が大きく、単回検査による活動期感染の判別は困難であるとの結果が得られた。3トキソプラズマ脳炎のリスク群であるHIV陽性者を対象に、疫学調査を実施した。研究には約400人のHIV陽性者が参加し、抗体保有率、感染に関連する因子を明らかにした。抗体保有率は8.3%と、国外の報告と比較すると低い傾向、既存の報告でリスクとされた、猫の飼育歴・調理不十分な食肉の摂取歴との関連はなかった。一方、北海道居住歴を有す群で有意に高い抗体保有率が認められ、新たな知見として報告する予定である。現時点では達成できていない、HIV感染者におけるSFDTとTOKIOテストの比較解析を予定している。結果が判明することで抗トキソプラズマIgG抗体(ELISA法)、SFDT、TOKIOテストの検査精度(感度・特異度)が明らかになる。また、SFDTでは従来のインタクトなタキゾイト(急速分裂虫体)を検査に使用するが、TOKIOテストでは代わりにGFP発現タキゾイトを用い、被験血清との反応後のGFP活性を評価する。そのメカニズムは依然不明であるが、その機序を解明することで新たな検査方法への応用が期待できる。具体的には、TOKIOテストに用いた虫体を反応前後で蛍光抗体染色し、共焦点顕微鏡でその構造を観察する。タキゾイト傷害能を有す抗体を含有する被験血清が、どのように虫体を障害するのか、構造的変化を観察する。今後はその知見から、より簡便で検査精度の高い検査方法を立案する。さらに新たな検査方法の候補として、ルシフェラーゼ発現タキゾイトを用いた、血清学的検査方法の開発を予定している。虫体が発現するルシフェラーゼ活性と被験検体との反応を、発光量の定量により測定する検査方法であり、SFDT、TOKIOテストと比較して、より簡便で定量的な検査方法となることが予想される。基礎実験と臨床研究に想定外の時間がかかり、想定していた研究の一部を実施するに至らず、次年度使用額が生じた。
金融取引のグローバル化とローカルな法的責任-モデル契約書による架橋の試み

1.この研究では(1)英米の基本判例と日本法の比較を行い(2)英国法および日本法に準拠する標準契約を比較し、次の3点を明らかにした。(1)日本のシンジケート・ローン実務はローカル化しており、グローバル取引に適合的とはいえない。(2)日本法における基本的義務の概念とそれらの相互関係は英米法ほど明らかではない。(3)日本法を準拠法とする契約には、グローバルな標準契約と同様にエージェントやアレンジャーの義務を排除する条項が含まれているが、(1)と(2)を架橋すべき契約書による規律も、グローバル取引に適合的なものとはなっていない。2.以上の成果に基づき、日本法を準拠法とする現行の標準契約書の条項について、グローバルな標準契約の観点から、改正提案を行った。この研究は、グローバル化したシンジケートローンとローカルな法的責任を架橋し、発行市場から流通市場までを適切に規律するために、あるべき契約書のモデルを提案することを目的とする。本研究は、グローバル化したシンジケート・ローンとローカルな法的責任を架橋し、発行市場から流通市場までを適切に規律するために、あるべき契約書のモデルを提案することを目的とする。(1)シンジケート・ローン研究会を組織し、年4回の研究会を開催した。(2)研究会の結果および各自の研究成果を共有するため、研究会ウェブページを開設した。メンバー専用ページには、研究会議事録および研究成果としての原稿を掲載した。(3)研究組織間の意思疎通を効率化するため、専用のメーリングアドレスを作成した。(4)研究会では、英米法系の国における次の事項に関する判例を検討し、日本との比較および日本法に対する示唆を汲み取りながら議論を行なった。(a)シンジケーション成立前の段階の問題としては、(1)インフォメーション・メモランダムの意味および(2)その他の不実表示など、(b)シンジケーション成立後のエージェントの義務の問題、(c)債務者の債務不履行に伴う問題として、(1)シンジケート団における少数派の保護および(2)リスケジュリング交渉におけるエージェントの責任、(d)資金の帰属形態に関する問題、最後に(e)貸主の地位の移転に関する問題。とりわけ、(a)(1)パーティシペーションについては、主幹事銀行は借主から返済を受け、それを参加銀行に交付するが、これを他者に属している金銭を代わりに受領し当該他者に交付すると解せば、信託と性質決定できるのではないかという点が指摘された。(5)研究分担者らは前記(4)の議論をもとに、各自7つの論点について原稿を作成した。これらの原稿は今年の夏をめどに公表予定である。1.シンジケート・ローン研究会を、年3回開催した。2.研究会の結果および各自の研究成果を共有するため、研究会ウェブページの充実化を図った。3.研究組織間の意思疎通を郊率化するため、専用のメーリングアドレスでのネット上で迅速な情報交換を試みた。4.研究会では、英米法系の国における次の事項に関する判例を検討し、日本との比較および日本法に対する示唆を汲み取りながら議論を行なった。(1)アレンジャー,エージェントの法的責任、(2)ローン・パーティシペーションに対する証券法の適用、(3)アレンジャーの情報提供責任と集団行動条項の有郊性(4)デフォルトした借り手への対応をめぐる貸し手間の利害調整(5)シンジケートローン債権者間の多数決問題(6)貸付人の地位の伊転に関する制限5.研究分担者らは前記4.の議論をもとに、各自7つの論点について原稿を作成し、研究成果として公表した。1.研究組織によるシンジケート・ローン研究会を4回開催し、研究会における検討結果および各自の研究成果をメンバー専用ページに掲載した。(13.備考欄にURLを記載)2.実務家を招き日本における実際の紛争例に含まれるシンジケートローン契約書についての情報提供を受け、これに基づいて法的および実務上の問題点を検討した。この契約はあるメガバンクをエージェントとし、地域の中小企業を借主とする者であったが、検討の結果本件で果たしてシンジケートローンが資金調達方法として必然であったのか、借主のために有効適切であったのかという問題が浮き彫りになった。

また、エージェントであるメガバンクとその他のシンジケートメンバーとの間で回収について平等的な取り扱いが意図されていたのかどうかが担保に関する条項からは契約上明らかではないという問題点も指摘された。(2)弁済関係(Articles 10-11)について相違点の分析を行った。4.海外調査として連携研究者(黄)の協力を得て、中国において次の調査研究を実施した。(1)シンジケートローンを含む中国ローン市場の法制調査(2)中国における債権譲渡の法制調査(3)中国におけるローン債権の流通の実態調査本研究は、グローバル化したシンジケート・ローンとローカルな法的責任を架橋し、発行市場から流通市場までを適切に規律するために、あるべき契約書のモデルを提案することを目的とする。1.研究組織によるシンジケート・ローン研究会を5回開催し、研究会における検討結果および各自の研究成果をメンバー専用ページに掲載した。(13.備考欄にURLを記載)2.海外より専門家を招きアジア太平洋地域におけるシンジケートローン契約書および英国のLMA標準契約書についての情報・資料提供を受け、これに基づいて法的および実務上の問題点を議論・検討した。LMAが香港に設立した「アジア太平洋地域委員会」(APLMA)が香港版を作成し、さらにシドニーに設立されたオーストラリア「支部」がオーストラリア版を作成したことが明らかになった。4.シローンに関する日本最初の公表裁判例(貸付人がアレンジャーを訴えた事案)について議論・検討を行った。アレンジャーに信認義務を認めなかった結論は妥当であるが、日本法上信認義務の具体的内容は明らかではないという理論的問題が残される。
クリプトスポリジウム症のヒト、イヌ、ネコ等の保有率の調査および臨床疫学的研究

Cry.症のヒト、イヌ、、ネコ等の保有率の調査及び臨床疫学的研究について、本邦における人畜共通感染症としてのイヌ、ネコ、フェレット等22種類のペットにおけるCry.の保有状況について糞便の蔗糖浮遊法により調査を行い、知見を得たので報告を行う。今回の調査に参加した獣医科医院数は22施設であり、動物種及び症例数/検体数は、ヒト11/13,ウシ61/61,イヌ180/185,ネコ86/90、ウサギ27/27、フェレット46/51、ハムスター18/20、プレリードッグ5/5、インコ4/5、マウス2/2、アライグマ1/1、イグアナ1/1、ウズラ5/5、ヒョウモンガメ1/1、ハト1/1、タヌキ5/5、ヒヨドリ3/3、ムクドリ3/3、ムササビ1/1、トリ1/1、チャボ1/1、ミーアキャット1/2、バーニーズ1/1計465/484であった。この中でCry.のオーシストが検出されたのは、イヌ1例(0.6%)、ウシ2例(3.3%)、フェレット3例(6.5%)であった。また、現在もフェレットの2例については経過観察中であり、オーシストの排出が継続している。この便の性状は健康便が多いことから、飼育環境中への拡散から感染が成立する可能性が高いと考えられ、重要な問題であると考えられた。また、1999年7月には日本小動物獣医師会の招請により、年次大会の教育講演として『Cry.の今日的な話題と検査法(実習)』を行った。蔗糖浮遊法による検査法の実習は和歌山、東京、千葉、新潟で行ない、他にも招請講演を10件程行い、実習・講演の効果を認めた。この実習結果から、Cry.のオーシストが極小であることにより、他の寄生虫の検査以上に、顕微鏡操作および'目合わせ'が重要であると考えられた。動物の飼育・生活環境、価値観の変化等の要因により、一時的な調査を行うのではなく、今後とも継続した調査を行う必要があると思われた。以上のことから、現在も経過観察を行っており、欧文ジャーナルへの投稿は本年後半になる予定である。Cry.症のヒト、イヌ、ネコ等の保有率の調査及び臨床疫学的研究の初年度として、本邦における人畜共通感染症としてのイヌ、ネコ、フェレット等10種類のペットにおけるCry.の保有状況について糞便の蔗糖浮遊法により調査を行い、知見を得たので報告を行う。今回の調査に参加した獣医科医院数は9施設であり、動物種および検体数は、イヌ37検体、ネコ25検体、兎2検体、ハムスター11検体、フェレット8検体、子牛3検体、ハト2検体、およびトリ、ムササビ、プレリードッグ各1検体、の10種類103検体であった。これら検体のうちCry.のオーシストが検出できたのは、イヌ1検体(2.7%)およびフェレット1検体(33.3%)のみであった。

しかし、現在のところ全国各地から研究協力を申し出ている獣医科医院があること、および蔗糖浮遊法によるオーシストの検出実習の希望が東京、和歌山、九州の研究グループから申し込みがきていること、さらに、本年7月31日の日本小動物獣医学会においてCry.オーシストの検出実習および講演の依頼がきており、今後の本研究の発展が想定される。現在までのところ、本研究の交付期間内に行うことの半分以上の成果および具体的予定が完了しているといえる。今後はさらなる検体数の増加と、ヒトの症例数の増加に努めることと、平成10年度に未完了の部分への成果を全力で上げる予定である。そのために、今回および今後の調査の結果を第73回日本感染症学会、日本臨床病理学会に発表を行い、かつJICに投稿する予定である。Cry.症のヒト、イヌ、、ネコ等の保有率の調査及び臨床疫学的研究について、本邦における人畜共通感染症としてのイヌ、ネコ、フェレット等19種類のペットにおけるCry.の保有状況について糞便の蔗糖浮遊法により調査を行い、知見を得たので報告を行う。今回の調査に参加した獣医科医院数は18施設であり、動物種及び症例数/検体数は、ヒト9/11,ウシ43/43,イヌ164/169,ネコ75/79,ウサギ25/25,フェレット14/19、葉ハムスター14/16,プレリードック5/5、インコ2/2、マウス2/2、アライグマ1/1、イグアナ1/1、ウズラ1/1、ヒョウモンガメラ1/1、ハト1/1、タヌキ3/3、ヒヨドリ3/3、ムクドリ3/3、ムササビ1/1、トリ1/1、計369/387であった。この中でCry.のオーシストが検出されたのは、ウし1例(2.3%)、イヌ1例(0.6%)、フェレット1例(7.1%)であった。この結果の一部は昨年の感染症学会において発表を行なった。さらに、症例数を加えた後に応分ジャーナルに投稿予定である。分離されたオーシストの継代は現在ウシからのものをおこなている。また、蔗糖浮遊法による検査法の実習を和歌山、東京の2箇所で、合計40人に実習を行ない、実習効果を認めた。さらに、この2月に千葉県、3月に東京の獣医師会で実習を行なう予定であり、その後に、学会発表を行ない、欧文ジャーナルに投稿予定である。
林木のプロトプラストの単離及び培養法に関する研究

我国の主要広葉樹であるカバノキ科およびブナ科の樹種についてプロトプラストの単離方法の開発を中心に行い培養方法についても検討した。その結果カバノキ科ではシラカンバ、ミズメ、オノオレカンバ等においてプロトプラストの単離が認められた。材料として主に培養植物の葉を用い葉肉細胞のプロトプラストを得た。単離条件の酵素組成はセルラーゼ“オノヅカ"RSあるいはR-10、ドリセラーゼ、ペクトリアーゼY-23等の組み合わせが有効であった。しかし、材料組織の状態により酵素液の浸透圧を調節する必要があった。ブナ科ではクヌギを材料に、培養シュート及び不定胚からのプロトプラストの単離を行った。いずれもプロトプラストの単離はセルラーゼ“オノヅカ"RS及びペクトリアーゼY-23を組み合わせた組成酵素液で可能であった。しかし、収量やその後の培養については、不定胚を材料とすることが有効と結論された。不定胚由来のプロトプラストからはカルス再生に成功した。ここで得られた知見を基に熱帯産アカシアであるアカシアマンギウムについてプロトプラストの単離実験を行った。その結果、シラカンバ、クヌギと同様の酵素組成をもってプロトプラストの単離が可能であることが明らかになった。以上の様に多くの樹種においてプロトプラストの単離法を明らかにするとともにその培養の可能性を示唆することが出来た。研究対象とした樹種のうち、クヌギについては、子葉由来の不定胚培養系を用いての、プロトプラストの単離法について検討した。その結果、酵素によるプロトプラストの単離は、不定胚発育の初期および中期が適しており、十分に生育し子葉内部にデンプンの蓄積がみられるようになった後期のものは、適当でないことが明らかになった。さらに、不定胚の得やすさなどを加味すると、実験には発育の中期にある不定胚が適当であるとの結論を得た。また、プロトプラストの単離のための、材料組織の処理方法、酵素処理の温度、時間等について検討し、最適な酵素処理方法について明らかにした。こうして得られたプロトプラストを、BAP(6ーベンジルアミノプリン)と2,4ーD(2,4ージクロロフェノキシ酢酸)をいくつかの濃度で組み合わせた改変MS培地中で培養したところ、連続した細胞分裂が誘導され、コロニ-およびマイクロカルスの形成が認められた。一方、シラカンバでは、従来から実験してきた試験管内に生育した幼植物体からのプロトプラストの単離では、供試材料の性質や供給や不安定であることから、サスペンションカルチャ-を供試材料に用いることとし、そのためのサスペンションカルチャ-を確立した。培養中のシラカンバの葉を2、4ーDを含むMS培地上で培養し、カルスを誘導した。このカルスを、2、4ーDとBAPを含むMS液体培地上で培養することにより、サスペンションカルチャ-を得た。このサスペンションカルチャ-は同じ培地に20ー30日間隔で継代培養することによって、安定的に維持することが可能であった。本研究は、林木のプロトプラストの単離法および単離されたプロトプラストの培養法を明らかにすることを目的としている。本年度は、昨年度までに明らかにされたシラカンバおよびクヌギのプロトプラスト単離法を用い、単離されたプロトプラストの培養法の開発について重点的に研究を行なった。その結果、クヌギ成熟胚から誘導された体細胞胚培養系を材料として単離されたプロトプラストを、硝酸アンモニウムを除いたMS培地中で培養し、徐々に浸透圧を低くすることによってコロニ-を得た。さらに、得られたコロニ-を回転培養することにより、カルスを誘導することが可能であることを明らかにした。

また、クヌギ体細胞胚に用いたプロトプラスト単離法が、同属のコナラの体細胞胚についても適用可能であり、分裂可能な活力に富むプロトプラストが単離できることを明らかにした。しかし、シラカンバ幼植物体の葉からの葉肉プロトプラストの単離では、単離されたプロトプラストが材料植物の生育状態によって単離後わずかの時間に破裂してしまう現象が見られた。これを解決するため、DTTの添加等について検討し有効な方法を明らかにした。それとともに、この手法をチョウセンヤマナラシの幼植物体の葉からのプロトプラスト単離への適用を検討し、有効であるとの結論を得た。今後は、再生したクヌギカルスから不定胚の誘導を行なうとともに、他樹種についてプロトプラスト培養実験を進める予定である。平成4年度は、平成3年度までの成果をふまえ、今後のプロトプラスト研究の発展の可能性を検討するため、他の日本産広葉樹についてプロトプラストの単離の可能性をチェックした。その結果、ケヤキ、オノオレカンバ等についても、これまでに明らかにした酵素組成が適用可能であり、今後これら樹種に関するプロトプラスト培養の可能性を指摘することが出来た。さらに、現在熱帯林造成において主要な造林樹種であるアカシアマンギウムについてもプロトプラスト単離の可能性を検討した。まず酵素組成について、クヌギ等に用いた組成をベースにセルラーゼ“オノヅカ"RS、ペクトリアーゼY-23、ドリセラーゼ等の量及び比を変えたいくつかについて検討し培養中のシュートの本葉からプロトプラストを単離するための、最適条件を明らかにした。次いで、プロトプラストの単離に用いる材料組織いついて調べた。培養植物の本葉、仮葉からのプロトプラストの収量を比較したところ、仮葉からは全くプロトプラストが得られなかった。また、発芽間もない芽生えからの単離では、子葉からもプロトプラストが得られ、このプロトプラストを培養した結果コロニー様のものの形成が認められた。更に胚軸由来のカルスからも高能率でプロトプラストが得られた。このように温帯性樹種において確立された方法が熱帯樹種にも適用可能であることが明らかにされ、今後研究が発展する可能性が示唆された。
縄文時代以降の森林植生復元と人間の木材利用史の研究2

1.青森県青森市の三内丸山遺跡及び富山県小矢部市の桜町追跡を中心に出土木材の樹種の調査を行った.その結果,三内丸山遺跡ではクリ材が構造材,器具材,燃料材など広汎に用いられていることが改めて確認された一方,主要な針葉樹材がアスナロ(ヒバ)であることが発見された.桜町遺跡では建築部材を中心にクリ材であることが確認され,その他の樹種の利用が極めて少ないことに特徴があることが明らかになってきている.いずれにしても未だ出土材の一部にしか調査が及んでいないので引き続き調査を行う.2.燃料材としてのクリ材の重要度を知るために,同じく縄文時代の遺跡において炭化材の樹種を調べる手はずを整えた.対象とした遺跡は北海道渡島半島南茅部町の大船C遺跡,三内丸山遺跡,青森県八戸市の是川遺跡,宮城県一迫町の山王囲遺跡などである.これらの遺跡では堆積物等の水洗・選別が順次行われており,それらが終了後試料の提供を受け,樹種の同定を行うことになっている.3.東北地方の縄文遺跡においてはクリ材の重要性は極めて明白であり,大量消費していることが経験的に知られている.上記の調査によりその消費量を定量化する試みを行っているのと同時に,それだけの消費をまかなうメカニズムの解明が必要である.そこで,青森県三戸郡田子町の雑木林に調査地を設けて群落学的調査を行った.これは,まず第一番目に,現在の雑木林にはどれだけのクリの現存量があるのかを把握し,それが,皆伐,クリだけの抜き伐り,クリを残した皆伐,等の施行の違いによって,クリ現存量がどう異なるのか,そしてそれらの施行によってクリの再生はどの様になるのかのデータを得るためのものである.これによって縄文時代の集落が必要としたクリを含んだ雑木林の面積を知ることができる.1.青森県青森市の三内丸山遺跡及び富山県小矢部市の桜町追跡を中心に出土木材の樹種の調査を行った.その結果,三内丸山遺跡ではクリ材が構造材,器具材,燃料材など広汎に用いられていることが改めて確認された一方,主要な針葉樹材がアスナロ(ヒバ)であることが発見された.桜町遺跡では建築部材を中心にクリ材であることが確認され,その他の樹種の利用が極めて少ないことに特徴があることが明らかになってきている.いずれにしても未だ出土材の一部にしか調査が及んでいないので引き続き調査を行う.2.燃料材としてのクリ材の重要度を知るために,同じく縄文時代の遺跡において炭化材の樹種を調べる手はずを整えた.対象とした遺跡は北海道渡島半島南茅部町の大船C遺跡,三内丸山遺跡,青森県八戸市の是川遺跡,宮城県一迫町の山王囲遺跡などである.これらの遺跡では堆積物等の水洗・選別が順次行われており,それらが終了後試料の提供を受け,樹種の同定を行うことになっている.3.東北地方の縄文遺跡においてはクリ材の重要性は極めて明白であり,大量消費していることが経験的に知られている.上記の調査によりその消費量を定量化する試みを行っているのと同時に,それだけの消費をまかなうメカニズムの解明が必要である.そこで,青森県三戸郡田子町の雑木林に調査地を設けて群落学的調査を行った.これは,まず第一番目に,現在の雑木林にはどれだけのクリの現存量があるのかを把握し,それが,皆伐,クリだけの抜き伐り,クリを残した皆伐,等の施行の違いによって,クリ現存量がどう異なるのか,そしてそれらの施行によってクリの再生はどの様になるのかのデータを得るためのものである.これによって縄文時代の集落が必要としたクリを含んだ雑木林の面積を知ることができる.