hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Trypanosoma congolenseの細胞接着分子の同定と立体構造解析

本研究は、家畜のアフリカトリパノソーマ症の主要な病原体であるTrypanosoma congolenseのエピマスティゴート型および血流型虫体の、ツエツエバエまたは宿主の組織への細胞接着に関係する分子の同定を目的とし、その候補となる原虫タンパク質の分子生物学的および生化学的手法による分離と、質量分析による同定を試みた。その結果、エピマスティゴート型虫体からは生物機能未知の細胞表面タンパク質が、血流型虫体からはシアル酸と親和性をもつ未同定のタンパク質が得られた。本研究の目的は、Trypanosoma congolenseのベクター体内型ステージであるエピマスティゴート型虫体がツエツエバエの下咽頭に、宿主体内型ステージである血流型虫体が血管の内皮細胞に接着する際の接着分子を同定し、その立体構造を決定することである。当該年度は、研究遂行に必須な原虫細胞の調整と接着分子候補の探索とを以下の通り実施した。昆虫型培養用培地を用いてプロサイクリック型虫体を27°Cで培養し、培養フラスコ底面に接着して増殖するエピマスティゴート型ステージへの細胞分化を誘導した。エピマスティゴート型の安定した増殖を確認した後に、その培養上清中に出現するメタサイクリック型虫体を、陰イオン交換カラムを用いて分離した。これを血流型培養用培地に懸濁し、33°Cで培養することで血流型への分化を誘導した。エピマスティゴート型については細胞表面に発現する分子をCell Surface Protein Isolation Kit (Thermo Scientific社製)を用いてビオチン標識し、細胞を溶解した後にアビジン結合アガロースビーズを用いて分離した。また、血流型虫体の接着分子は、シアル酸に親和性を持つことが知られていたため、虫体のライセートからシアル酸に親和性を持つ原虫分子を、フェチュイン結合アガロースを用いて分離した。これらをSDS-PAGEで展開した後、全てのバンドを切り出した。これらを接着分子の候補とし、トリプシンによるゲル内消化後、質量分析により部分アミノ酸配列を決定し、これを基にデータベースから遺伝子の配列情報を得た。宿主・ベクター組織への接着は、原虫の分化や増殖に関係する重要な生物現象である。今後、当該年度の成果を基に原虫の接着分子を同定できれば、細胞接着の分子メカニズム解明につながり、原虫と宿主・ベクターとの相互作用について新たな知見を加えることが期待できる。Trypanosoma congolenseは、エピマスティゴート型虫体がツエツエバエの下咽頭に、血流型虫体が宿主血管の内皮細胞に接着する。本研究は、この細胞接着に関わる原虫分子を同定し、接着の分子メカニズムを解明することを目的とし、接着分子の分離と質量分析による同定を試みた。両ステージ虫体の細胞表面蛋白質をビオチン標識し、アビジンカラムを用いて分離した。これを電気泳動した後、各バンドに対して質量分析を実施した。血流型で分離された蛋白質は、VSG (variant surface glycoprotein)と考えられる未同定の蛋白質と、グライコソームへの局在が予想される解糖系の酵素群であり、接着分子の候補を絞り込むには至らなかった。一方、エピマスティゴート型では、解糖系酵素のほかにCESP (congolense epimastigote-specific protein)やMSP (major surface protease)といった機能未知の表面蛋白質が分離された。エピマスティゴート型虫体の接着分子は、虫体を界面活性剤や高塩濃度の緩衝液で段階的に処理することで精製できることが報告されていたが、研究期間中には再現することができなかった。一方、血流型虫体の接着分子は、シアル酸に親和性を持つことが知られていた。そこで、シアル酸に親和性を持つ原虫分子を、フェチュイン結合アガロースのカラムを用いて分離し、電気泳動したところ、濃縮された単一のバンドが得られた。その質量分析の結果、機能未知の原虫蛋白質が同定された。原虫と宿主・ベクターとの相互作用の分子レベルでの解明は、原虫の寄生戦略を理解する上で重要であり、今後も本研究で同定された蛋白質の機能解析を継続して実施していくとともに、次世代シークエンサーによるトランスクリプトーム解析の実施等も視野に入れ、研究を遂行していく予定である。分子寄生虫学本研究課題の遂行には、全体を通してTrypanosoma congolenseの全発育ステージ(プロサイクリック型、エピマスティゴート型、メタサイクリック型、血流型)のin vitro培養系が必要不可欠であるが、これまでに、それぞれのin vitro至適培養条件下で増殖する各ステージ虫体の調整に成功するとともに、これらを安定に維持している。

そして、当該年度はこの培養虫体を材料として、研究計画に従ってエピマスティゴート型および血流型虫体の接着分子の探索を実施し、それぞれについて候補となる蛋白質の分離から、質量分析によるその部分アミノ酸配列情報の取得、ゲノムまたはESTデータベースを効果的に活用した遺伝子配列情報の取得まで、概ね計画通りに実施することができた。ただし、年度途中の研究代表者の所属研究機関(北海道大学から東京慈恵会医科大学へ)の異動に伴い、予定していた一部の実験(生化学的手法を用いたエピマスティゴート型虫体の接着分子の分離と質量分析による同定)を実施することができなかった。しかしながら、これまでの研究の準備状況および実施状況から、質量分析(ペプチドマスフィンガープリンティング法またはde novoシーケンス解析)による部分アミノ酸配列情報の取得と、その後のデータベースを活用した原虫遺伝子検索までを円滑に実施できる実験系が確立できており、これについても今後直ちに実施できる状態にあるといえるため、ほぼ問題ないと考えている。また、今後は当該年度に得られた接着分子候補群の発現パターン、局在、生物機能などに関する解析を中心に実施していく予定であるが、上述の全発育ステージin vitro培養系を用いることで、これらの解析に用いる原虫細胞を安定して供給できる状態にあり、その円滑な遂行が期待できる。フラスコ底面上のエピマスティゴート型虫体を界面活性剤や高塩濃度の緩衝液で処理することで、接着分子以外を段階的に除去できることが報告されている。この方法を踏襲し、エピマスティゴート型虫体の接着分子候補を分離し、質量分析により部分アミノ酸配列を決定後、データベースから遺伝子配列情報を検索する。これと前年度に得られたエピマスティゴート型と血流型の接着分子の候補遺伝子群をクローニングし、大腸菌発現系を用いて組換え蛋白質として発現した後に、マウスに免疫して抗血清を作製する。これを用いたウエスタンブロット法による発現パターン解析並びに間接蛍光抗体法及び免疫電子顕微鏡法による局在解析を行う。エピマスティゴート型、血流型虫体はともに鞭毛で接着するため、解析の結果、鞭毛の表面に局在する蛋白質を接着分子の最終候補とする。これらがエピマスティゴート型および血流型の細胞接着に関与するか否かを、テトラサイクリン誘導性RNA干渉実験系を用いて検証する。ノックダウンにより、エピマスティゴート型では培養フラスコのプラスチック底面とツエツエバエの下咽頭への、血流型では初代培養ウシ血管内皮細胞への細胞接着が阻害されるか否かを評価し、原虫の細胞接着分子を決定する。その後、構造解析に用いるための組換え蛋白質を発現し、FPLCを用いたサイズ排除ならびに陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製する。この組換え蛋白質は、SDS-PAGEにより精製度を確認した後に、単結晶を作製し、X線回析装置(Rigaku R-AXIS IV++、Rigaku社製)を用いて構造解析を実施する。得られたデータを基にして、解析プログラムARP/wARPとCOOTを用いてモデル構築を行った後に、REFMACを用いて精密化する。免疫電子顕微鏡法と結晶構造解析は研究協力者との共同研究を予定しており、連絡を密にとりながら実施していく。研究代表者が当該年度中に所属研究機関を異動したことにより、交付申請時に計画していた実験の一部(in vitro培養下のエピマスティゴート型虫体の接着分子の生化学的手法を用いた分離と質量分析による同定)を年度内に遂行することができなかった。
歯周疾患の予防と治療;粘膜ワクチン療法に関する基礎研究と薬物開発への応用

成人性歯周炎はPorphyromonas gingivalis(Pg)の患部への定着および炎症性サイトカイン誘導能を持つ線毛やエンドトキシン(LPS)の作用、同菌が産生する組織障害性のプロテアーゼにより惹起されることが明らかになりつつあるが、同症の予防・治療には有力な手段がなく、現在、根本的な予防法および治療法の開発が切望されている。本研究では、Pgの菌体表層抗原であると共に病原因子でもある線毛を免疫抗原として、Pgに対する強力な免疫抗体を誘導する粘膜適用型ワクチン開発に関する基礎的研究を行った結果、申請者らは以下に示す成果を得た。1.Pg線毛およびPg線毛/rCTBワクチンをマウス鼻粘膜に投与すると、血清IgG/IgA、鼻粘膜および唾液に分泌されるIgA抗体価が顕著に上昇した。RCTB存在下において、唾液、鼻腔および肺洗浄液の抗Pg線毛分泌型IgA抗体産生を有意に誘導する線毛の最少有効量は、0.5μgであった。また、抗体産生の時間経過を検討した結果、抗原(Pg線毛0.5μg/rCTB10μg)の4回投与(0,14,21,28日目)において、血清IgG抗体価は12日目から屠殺日35日目まで上昇を続けた。粘膜免疫により誘導された血清IgGサブクラスはIgG1>IgG2b>IgG2aの順に高い抗体価が認められた。また、唾液中の分泌型IgA抗体価は18日目から上昇し、その抗体価はアジュバントの存在により有意に上昇した。2.線毛/rCTB抗原の安全性評価ならびに免疫応答を病理・免疫組織学的に検討した。Pg線毛(5μg)/rCTB(10μg)投与群の鼻粘膜組織に軽度の炎症細胞浸潤が認められたが、肥満細胞は観察されなかった。また、同実験群ではNALTの腫大が観察され、リンパ濾胞の形成も認められると共に、鼻粘膜固有層にIgA陽性形質細胞が観察された。これらの所見は、線毛抗原の経鼻免疫による局所並びに全身性免疫応答免疫応答は、NALTを介して誘導されていることが明らかになった。今後、Pg生菌感染による歯槽骨の吸収を指標とした歯周病モデル動物を開発し、線毛ワクチンによる歯周病予防効果を評価する予定である。成人性歯周炎はPorphyromonas gingivalis(Pg)の菌体表層病原因子である定着および炎症性サイトカイン誘導能を持つ線毛、莢膜およびエンドトキシン(LPS)の作用により惹起されると考えられている。しかし、現在のところ同症の治療には有力な手段がなく、根本的な治療方法の開発が切望されている。本研究は、Pgの各表層抗原に注目し、そのエピトープ構造を解明した後、天然由来菌体表層成分をリコンビナントコレラトキシンBサブユニット(rCTB)とコンジュゲートした免疫プローブを調製し、Pgに対する強力な免疫抗体を誘導する粘膜結合型新型薬剤の開発を目的とする。

Pg線毛/rCTB免疫プローブをマウス鼻粘膜に免疫すると、血清中に高い線毛特異的IgG・IgA抗体価の誘導と共に唾液IgA抗体価の誘導が有意に増強された。本菌のLPSは歯周疾患に特有の歯槽骨吸収活性を持つことから、無毒化LPSをワクチン抗原とし、LPS抗体を誘導することは、歯周病の治療にも応用できる。現在までに、無毒化LPSの調製と抗原性の有無の検討が終了しておる。即ち、弱ヒドラジン処理により調製したrCTBとの単純コンジュゲート用無毒化LPSは、リムルス活性やサイトカイン産生誘導能など、全ての内毒素活性を示さないことをすでに明らかにしている。同無毒化LPSの血清学的抗原性を検討した結果、intact LPSとほぼ同等の抗原性を保持していることが認められた。一方、rCTBとの化学結合型コンジュゲート用無毒化LPSの抗原性保持率はintact LPSの60%程度であった。また、化学結合型コンジュゲート用無毒化LPS分子中におけるSPDP残基の存在はNMR解析により確認することができた。今後、無毒化LPS/rCTB単純および化学結合型コンジュゲートの免疫応答性に関して検討する。Porphyromonas gingivalis(Pg)が誘因となる成人性歯周炎は、本菌が産生する組織障害性のプロテアーゼや患部への定着および炎症性サイトカイン誘導能を持つ線毛やエンドトキシン(LPS)の作用により惹起されると考えられている。しかし、同症の予防治療には現在有力な手段がない。申請者らは、Pgの病原因子でもあるPg線毛を免疫抗原とし、アジュバントとしてリコンビナントコレラトキシンBサブユニット(rCTB)を併用して経鼻的にマウスに投与することにより、Pg線毛に対する全身性IgG,IgA抗体および分泌型IgA抗体を強力に誘導できることを明らかにした。本年度は、線毛/rCTB抗原の安全性評価ならびに免疫応答を病理・免疫組織学的に行った。Pg線毛(5μg)/rCTB(10μg)投与群の鼻粘膜組織に軽度の炎症細胞浸潤が認められたが、他の実験群に著しい病的変化は全く認められなかった。同実験群の鼻粘膜に肥満細胞は観察されなかった。また、対照群と比較して、実験群ではNALTの腫大が観察され、リンパ濾胞の形成も認められると共に、実行組織である鼻粘膜組織にIgA陽性形質細胞が観察された。線毛抗原の経鼻投与による局所並びに全身性免疫応答免疫応答は、NALTを介して誘導されていることが明らかになった。一方、肺所見では、Pg線毛(5μg)/rCTB(10μg)共投与群の気管支周囲に炎症性細胞浸潤が比較的強く認められた。これは、経鼻に抗原を滴下投与する際の、肺への誤飲が原因と思われる。さらに、無毒化LPS/rCTBワクチンの抗体誘導能を検討した結果、弱ヒドラジン処理によりエンドトキシン活性を除去したPg-LPS(500μg)/rCTB(10μg)および弱ヒドラジン処理LPSを更に化学修飾してrCTBとSPDPにより架橋した無毒化LPS/rCTBコンジュゲート投与群を経鼻免疫しても、いずれの免疫群においても血清IgG抗体価の誘導は認められなかった。今後、Pg生菌感染による歯槽骨の吸収を指標とした歯周病モデル動物を開発し、線毛ワクチンによる歯周病予防効果を評価する予定である。
自己組織化を利用する新たな機能性ナノ複合材料の構築

本研究の目的は、自己組織化を利用する手法により、温和な環境下で機能性の新規無機/有機複合材料を作製することである。生体では有機高分子の働きにより、無機物の形成が温和な環境で制御され、複雑な構造を持つ骨や貝殻が作られている。これらは形状が制御された無機ナノ結晶やナノ粒子と高分子の複合体であり、階層的な規則構造とナノレベルでの無機/有機複合化により、材料としての優れた特性を示す。本研究では有機高分子を固体基板や添加物として利用することで無機結晶や無機ナノ粒子の自己組織化を制御し、これまで作製できなかった高次の秩序構造を合成する。同時に多様な無機物や有機物に展開し、より高機能な材料を創成することを実験計画の具体的な目標とする。平成21年度の研究においては、新たな所属研究室において、シリカ粒子の集合構造に関する研究を行った。両親媒性ブロックコポリマーを利用し、液相中において自発的に一次元状に連結したシリカナノ粒子の集合体を作製した。また、これまでの炭酸カルシウムの研究で培った無機物とポリマーの相互作用とに関する知見を基に実験系を構築し、ポリマーの構造が、シリカ粒子の集合状態に与える影響を調べた。そして、ポリマーを利用して、基板上における粒子の凝集状態の制御も行った。以上の成果について学会発表を行った。また、前年度まで取り組んできた、高分子マトリクスと水溶性添加物の共同効果を利用して結晶成長を制御する研究についても、総説を含む論文を執筆し、招待公演を含む学会発表を行った。生体は有機高分子を利用して、炭酸カルシウムなどの結晶化を温和な環境で巧みに制御し、骨や貝殻を作り出している。これらは形状・配向の制御された無機ナノ結晶と高分子の複合体であり、精緻な階層構造とナノレベルでの無機/有機複合化により、材料としての優れた特性を示す。本研究では有機高分子の基板と水溶性高分子添加物を用いて炭酸カルシウム結晶の自己組織化を制御することで、これまで作製できなかった高次の秩序構造を合成する。平成20年度の研究においては、ポリビニルアルコール、およびその誘導体をマトリクスに用いて炭酸カルシウムの結晶成長を行い、さまざまな秩序構造をもつ炭酸カルシウム薄膜を作製した。同時に、マトリクスにおける高分子鎖の架橋度や、高分子の配向か結晶の規則構造や多形に与える影響を調べた。さらに、架橋度をフォトパターニングによって制御したマトリクスを作製し、炭酸カルシウムの結晶成長に用いた。これにより、階層的な構造を持つ炭酸カルシウム薄膜結晶を、自己組織化プロセスを利用して作製することに成功した。以上の成果について学会発表を行い、ポスター章を受賞するなど高い評価を得た。さらに、架橋度の影響および立体的な規則構造を持つ炭酸カルシウム結晶の作製について、論文を発表した。また、高分子マトリクスと水溶性添加物の共同効果を利用して結晶成長を制御する手法を、炭酸カルシウム以外の無機物に対して応用する結晶成長実験を行った。機能性セラミックスの構造を制御し、高機能材料を開発するための基礎的な知見を得た。
骨・ミネラル代謝、およびその破綻による疾患における線維芽細胞増殖因子23の関与

血中リン濃度の異常は、くる病/骨軟化症や異所性石灰化の原因となる。従って生体には、リン濃度を一定の範囲に維持する機構が備わっているものと考えられる。線維芽細胞増殖因子23(FGF23)は、血中リン濃度を低下させるように作用する液性因子である。本研究では、FGF23の作用にKlothoが必要であること、FGF23作用障害により高リン血症性疾患が惹起されることなどから、FGF23が血中リン濃度を調節するホルモンであることが明らかとなった。線維芽細胞増殖因子(fibroblast growth factor : FGF)23は、いくつかの低リン血症性疾患の発症に重要な役割を果たす因子として同定された。FGF23は、腎近位尿細管におけるリン再吸収を抑制すると共に、血中1,25-水酸化ビタミンD濃度を低下させ、腸管リン吸収を低下させることにより、低リン血症を惹起する。実際腫瘍性骨軟化症などの低リン血症性疾患では、血中FGF23が高値を示し、過剰なFGF23活性により低リン血症が惹起されることが明らかにされていた。一方腎尿細管リン再吸収亢進による高リン血症を特徴とする疾患が、家族性高リン血症性腫瘍状石灰化症である。我々は、腫瘍状石灰化症の原因の一つとしてFGF23遺伝子異常が存在すること、FGF23蛋白が不活性なフラグメントへ分解されることによるFGF23活性障害が、この腫瘍状石灰化症の原因であることを明らかにした。一方腫瘍状石灰化症の原因としては、FGF23遺伝子異常に加え、蛋白の糖化に関与するGALNT73遺伝子異常が報告されていた。そこでFGF23蛋白とGALNT3蛋白の関連を検討し、GALNT3作用によるFGF23蛋白の糖化により、FGF23蛋白の分解が抑制されることを明らかにした。従って過剰なFGF23作用とは逆に、FGF23作用不全により、高リン血症を特徴とする疾患が惹起されることが明らかとなった。このことは、FGF23ノックアウトマウスが高リン血症を示すことと合わせ、FGF23が生理的なリン調節因子であることを示している。一方高リン血症を示すことが明らかにされていた動物モデルに、Klothoマウスがある。本マウスは、従来老化モデルマウスと考えられていたが、FGF23ノックアウトマウスと非常に類似した表現型を示す。そこでKlothoとFGF23との関連を検討し、KlothoがFGF受容体と結合することにより、FGF23特異的な受容体を形成することが明らかとなった。この成績は、FGF23作用の腎臓特異性を説明するものであると共に、FGFファミリーメンバーの新たな作用様式を示すものである。線維芽細胞増殖因子(fibroblast growth factor:FGF)23は,骨により産生され,腎臓に作用することにより血中リン濃度を低下させる液性因子である。このFGF23作用障害により,高リン血症を特徴とする腫瘍状石灰沈着症が惹起されることが明らかにされたことから,FGF23は生理的ホルモンと考えられる。腫瘍状石灰沈着症の原因遺伝子の一つとして,0型糖鎖付加に関与するGALNT3遺伝子が同定された。そこで本研究では,FGF23蛋白と0型糖鎖付加の関係を検討した。変異FGF23蛋白の検討などにより,FGF23蛋白には3ケ所のO型糖鎖付加部位が存在することが明らかとなった。またこれら3種類の糖鎖は,まず始めに^<200>Thr,次に^<171>Thr,最後に^<178>Thrへと順次付加されていくこと,^<171>Thrに糖鎖付加を受けたFGF23蛋白は,ほぼすべて速やかに^<178>Thrへも糖鎖付加を受けることが明らかとなった。一方既に一部のFGF23蛋白は,^<179>Argと^<180>Serの間で切断されること,この切断を受ける前の全長FGF23は活性を有するのに対し,切断された後のN端やC端フラグメントには,活性は認められないことが報告されていた。今回の検討により,3種類の糖鎖付加を受けたFGF23蛋白はこの分解を受けないのに対し,より少ない糖鎖を持つFGF23蛋白は切断されることが明らかとなった。従って,切断部位近傍の^<178>Thrへの糖鎖付加は,FGF23蛋白の分解を抑制するように作用すること,従ってFGF23蛋白のO型糖鎖付加による翻訳後修飾は,FGF23活性調節機構の一つであることが明らかとなった。線維芽細胞増殖因子(fibroblast growth factor:FGF)23は、骨により産生され、腎臓に作用することにより血中リンや1,25-水酸化ビタミンD濃度を低下させる液性因子である。

FGF23は、Klotho-FGF受容体1c複合体に結合することにより、その作用を発揮することが示されている。一部のFGF23蛋白は、179Argと180Serの間でsubtilisin様蛋白分解酵素により切断される。この切断部位のN端に、FGF23は他のFGFファミリーメンバーとの相同性を示すFGF相同領域を有している。一方FGF23のどの領域が、Klotho-FGF受容体1cとの結合に必要であるのかは明らかではなかった。そこでFGF23蛋白に対する複数の抗体を用い、FGF23とKlothoやFGF受容体1cとの関係を検討した。その結果、FGF23は、FGF相同領域を用いてFGF受容体1cと、また切断部位C端側の部位を用いてKlothoと結合することが示唆された。従ってFGF23の作用には、全長の蛋白が必要と考えられた。このFGF23蛋白の切断は、切断部位近傍の178Thrへの糖鎖付加により阻害されることが明らかにされている。FGF23蛋白は、この178Thrに加え、171Thr、および200Thrにも0型糖鎖付加を受ける。そこでこれらの糖鎖付加部位のThrを他のアミノ酸に置換した変異蛋白を用い、これらの糖鎖の意義を検討した。その結果、178Thrが糖化されるためには200Thrへの糖鎖付加が必須であることが明らかとなった。また200Thrへの糖鎖付加は、subtilisin様蛋白分解酵素以外のプロテア-ゼに対する抵抗性を惹起することが示唆された。
アルコールによる心筋障害におけるHippo経路の役割

過度の飲酒は、心筋を障害し心収縮能を低下させることが知られているが、その分子機序の詳細は未だ不明である。これまでに、エタノールによる心筋細胞障害に関わる新規分子機構として、Hippo-YAPシグナルが破綻することを明らかにした。本研究で、恒常的活性化型YAPの過剰発現やアクチン線維の脱重合阻害剤投与によってエタノールによる細胞死が抑制されたことから、エタノールによるアクチン細胞骨格の破綻とYAPの機能阻害がアルコールによる心筋細胞障害に関わる重要な因子であることが示唆された。過剰な飲酒は、心筋を障害し心収縮能を低下させることが知られている。アルコールによる心筋障害は、エタノールや代謝産物であるアセトアルデヒドが心筋細胞を直接障害するとされるが、その機序はいまだ不明な点が多い。我々は、自発的収縮能を維持したマウス心房由来のHL-1細胞を用いて、エタノールが心筋細胞に及ぼす影響について検討した。エタノールを曝露したHL-1細胞では、エタノール濃度依存的にアポトーシスが誘導されることを確認した。また、心筋細胞間の接着装置であるギャップジャンクション、アドヘレンスジャンクション、デスモソームの破綻による細胞間情報伝達の障害、アクチンやビメンチンなどの細胞骨格の変性が起きていることを明らかにした。近年、がん抑制シグナルとして同定されたHippo経路は、細胞間接着などの物理環境を感知して細胞増殖や細胞死を制御していることが知られている。我々は、エタノールを曝露したHL-1細胞においてHippo経路が抑制され、標的である転写調節因子YAPのリン酸化が減少している事を見出した。Hippo経路の活性化剤投与によってエタノール誘導のアポトーシスが増加したことから、エタノールはアポトーシスを誘導する一方、Hippo経路を抑制することで再生応答を促し心臓の恒常性を維持していると考えられた。しかし、YAPの核移行が阻害されていることが観察され、心筋細胞の再増殖には至らなかった。以上のことから、エタノールによる心筋障害の機序について、細胞間接着や細胞骨格の破綻、Hippo-YAP経路の機能障害が関与することが明らかとなった。これら心筋細胞障害に対する内在性アセトアルデヒドの関与について、アルデヒド脱水素酵素ALDH2の阻害剤や活性化剤を用いて検討したが影響は見られず、エタノールの直接作用によるものであることが確認された。アルコールによる心筋障害の機序にHippo-YAP経路が関与することを明らかにし、その内容を雑誌に掲載することが出来た(Noritake et al., PLoS One 2015)。急性的・慢性的なアルコールの過剰摂取は心筋障害を引き起こすことが知られているが、その分子機序は未解明な部分が多い。本研究では、培養心筋細胞HL-1細胞を用いてアルコールによる心筋細胞障害機序の詳細を明らかにすることを目的とした。これまでに、エタノールがアポトーシス型細胞死を誘導すること、細胞間接着(ギャップジャンクション・デスモソーム・アドヘレンスジャンクション)や細胞骨格を傷害すること、またエタノールによる心筋細胞障害に関わる新規分子機構として、細胞増殖や細胞死を制御するHippo-YAP経路を破綻させることを明らかにしている。今回、エタノールを曝露したHL-1細胞では、Hippoシグナルの標的となる転写共役因子YAPの核移行が障害され、YAPの標的遺伝子である細胞増殖・生存に重要なCTGFのmRNA及びタンパク質発現量がエタノール曝露後時間依存的に減少することが示された。エタノールによる細胞死に対するYAPの影響を調べるため、HL-1細胞に恒常的活性化型YAPを発現させた結果、エタノールによるアポトーシスが抑制されることが示された。YAPはHippoシグナル非依存的に、アクチン細胞骨格の動態変化に応じて核移行が調節されていることが報告されている。そこで、エタノールによるアクチン細胞骨格の破綻と細胞死との関係を調べるため、アクチン線維の脱重合阻害剤によってアクチン細胞骨格の再構築を促した結果、エタノールによるアポトーシスが有意に抑制された。これらのことから、エタノールによるアクチン細胞骨格の破綻とYAPの機能阻害がアルコールによる心筋細胞障害に関わる重要な因子であることが明らかとなった。Hippo経路がRASやRhoなどの細胞内シグナル経路により制御されることや、またYAPの活性化は細胞の代謝状態によっても制御されている事が明らかになってきている。そこで、HL-1細胞または初代培養細胞を用いてマイクロアレイ解析やメタボローム解析などを行い、エタノールによるHippo-YAP経路の障害機構を明らかにする。28年度が最終年度であるため、記入しない。法医学28年度が最終年度であるため、記入しない。
惑星形成過程の実験的再現

代表者らは、地球中心核の主成分である溶融鉄への水素溶解度および炭素溶解度と、FeHおよびFe_3Cの融点を東工大およびSPRING-8放射光に設置されたマルチアンビル装置を用い世界で初めて超高圧下で測定することに成功した。その結果、水素および炭素が地球の核に多量に存在した場合、外核の温度は従来の予想4000Kより最大1500K低下する可能性があることが分かった。本科研費に基づく研究成果はHiranoほか(2006)、Sakamaki,Takahashiほか(2009)、Nakajima,Takahashiほか(2009)など合計6編の国際誌論文として発表した。我々は十分に制御された高温高圧実験と化学分析を武器に、惑星初期分化過程を実験的に再現し、46億年から40億年にいたる地球初期進化を『フォワード問題』として検討する。本研究の重要な柱のひとつである高温高圧下でのマントルの流動変形特性を解明するため、本科学研究費を用いて、東京工業大学のキュービックマルチアンビルプレスを改造し、超高圧変形実験装置を作成した。超高圧変形実験装置は2段式マルチアンビルに上下の可動ラムを加えて、15GPa以上の圧力において様々な変形速度での岩石流動実験を可能とした。2006年12月末にガイドブロックの改造が終了し、2007年3月までに各種の動作テストが終了した。下部マントルに相当する25GPa 1600°Cでの定量的な岩石の流動特性試験が可能であることが確認できた。高橋らは既存のマルチアンビル装置を用いて地球中心核の主成分である溶融鉄への水素溶解度および炭素溶解度と、鉄水素合金FeHおよびFe3Cの融点をSPRING-8放射光を用いて世界で始めての超高圧下で測定することに成功した。FeHおよびFe3C融点のクラペイロン勾配は、Fe、FeS, FeOに比べてはるかに少なく、水素および炭素が地球の核に多量に存在した場合、外核の温度は従来の予想4000Kより最大1000K減少することが可能である。これらの研究成果は2007年5月の第7回HPMPS国際会議iにおいて発表する。関根と高橋は共同して衝撃圧縮実験を行い、静的な高温高圧条件での金属メルトとシリケイトメルトの軽元素分配と衝撃圧縮時の元素分配にどのような違いが有るかを検討に着手した。予察的な実験から、N, S, Oについては異常は見られなかったが、Cについては衝撃圧縮時に効果的に鉄メルトへの吸収が起こることがわかった。高橋らは、マルチアンビル装置を用いて地球中心核の主成分である溶融鉄への水素溶解度および炭素溶解度と、鉄水素合金FeHおよびFe3Cの融点をSPRING-8放射光を用いて世界で始めての超高圧下で測定することに成功した。FeHおよびFe3C融点のクラペイロン勾配は、Fe、FeS,FeOに比べてはるかに少なく、水素および炭素が地球の核に多量に存在した場合、外核の温度は従来の予想4000Kより最大1000K減少することが可能である。これらの研究成果は2007年5月の第7回HPMPS国際会議において発表し、Sakamaki他(2008)、Nakajima他(2008)の2編の論文がPhys.Earth Planet Inter誌に印刷中である。関根と高橋は共同して衝撃圧縮実験を行い、静的な高温高圧条件での金属メルトとシリケイトメルトの軽元素分配と衝撃圧縮時の元素分配にどのような違いが有るかを検討した。衝撃圧縮時の短い加熱時間内では、C、N,S,Oなどの軽元素が効果的に鉄メルトへの吸収が起こることは無いことがが明らかになった。ただし、岩石中に分散した金属メルトは衝撃圧縮時の短時間でも急速に粒成長する条件があることが明らかになった。粒成長の起きる条件についてさらに検討中である。西原らは、高温高圧下でのマントルの流動変形特性を解明するため、東京工業大学に超高圧岩石変形実験装置をKAT-Dを作成し、下部マントルに相当する25GPa 1600°Cでの定量的な岩石の流動特性試験を行いつつある。平成19年度は下部マントル構成物質のひとつである(MgFe)0の粒成長実験を行った。高橋は大学院生の中島と共同して、地球形成過程における未分化コンドライト物質の化学分化過程を高温高圧実験に基づいて研究し、これまで未解明であったFe-C系の相平衡と融点の圧力依存性をSpring-8放射光でのX線その場観察実験により世界で始めて明らかにした(Nakajimaほか2009)。さらに、地球の内核の主要構成物質である候補としてFe3CおよびFe7C3状態方程式をマルチアンビルおよび単結晶ダイヤモンドアンビルを用いて世界で始めて明らかにした。

これらの結果は複数の論文として出版準備中である。関根と高橋は共同して衝撃圧縮実験を行い(Sekine他2008)、静的な高温高圧条件での金属メルトとシリケイトメルトの軽元素分配と衝撃圧縮時の元素分配の違いを解明した。岩石中に分散した金属メルトは衝撃圧縮時の短時間でも急速に粒成長する条件があることが明らかになり地球型惑星成長のごく初期にパラサイト隕石に代表される金属鉄に濃集した物質が大小の衝撃融解でできたことが示された(Takahashiほか2009AGU講演)。粒成長の起きる条件についてさらに検討中である。
ICTを用いた英語協働学習のタスクと評価のための指標開発と展開

今年度は、ICTを用いた協働学習について行った研究を国内・国際学会にて発表することに加え、研究成果を踏まえたワークショップを実施することで、多くの外国語教育関係者に対してICT利用協働学習の意義と課題を提示することができた。1つはGoogleドキュメントを用いた協働ライティングを行う過程で、学習者の意識がどのように変化するか、また協働学習がうまくいったグループとそうでないグループの違いを量的、質的分析を混合して検証した。その結果、協働学習を通して自分の書いた文章が他の人に見られ、評価されることについての抵抗感が減ることが分かり、今後のICT利用協働ライティングにおける活動の可能性を示した。また協働学習に肯定的に取り組めたグループは,授業を通じて抵抗感が減少し,気づきや校正を通じて言語への意識が高まる傾向が見られた一方、取り組みに否定的であったグループは,ブレインストーミングまたは協働学習の作業の段階で学習が終了する傾向が見られた。この結果から、協働学習の意義に対する肯定的な説明を行った上で実践を開始する必要があり、他の人の文章を見ることを通して気づきを促し、校正させる必要があると主張した。この結果は次年度以降の実践研究に大きな示唆となった。2つ目はオンライン協働学習環境を創出するために、LINEグループ内にて自動翻訳チャットボットを介した対話活動を実施し、その効果と参加者の態度の変化を検証した。自動翻訳ボットを使うことにより、グループ内で書かれた日本語が全て自動的に英語に即時翻訳されるため、内容を理解した英語にふれることができた。3週間後のライティング活動の結果、翻訳された英語表現を用いていることが確認された。さらに協働学習に対する肯定的な認識も促進されることとなった。この結果は協働学習の効果を検証するポイントを特定する上で大きな示唆を持つものとなった。研究初年度であるにもかかわらず、すでに複数の研究を実施し、その成果を国内外の学会で発表し、論文を公刊することができた。これらの研究を通して、本研究を実施する以前に持っていたICT協働学習の意義が再確認できただけでなく、学習がうまくいくグループとそうでないグループの差がそれぞれの学習プロセスの観察を通して明らかになったため、次年度以降の研究に新しい知見を加え、より内容のある研究を次年度以降に実施できると考えている。更にそれらの研究成果を踏まえてICT協働学習についてのワークショップを実施し、ICT利用協働学習の意義と可能性を伝えることができた。発表した学会は国内外とも規模の大きい学会主催のものであったため、それぞれの発表に多くの参加者を集めることができ、研究内容をより多くの方に伝えることができた。すでに何人かの方から興味を持って頂いており、本研究の規模拡大のきっかけを作ることができた。また、研究発表を行ったところ以外の学会に参加することができた。様々な研究発表に触れ、最新の研究成果と我々の研究の今後の転換について知見を得ることができた。例えばアジアではコンピュータを備えた(CALL)教室の設置が難しいため、学生が自身のデバイスを用いて(BYOD)学習するための方策が必要であり、モバイル機器を用いた協働学習の方策と評価方法についてさらなる実践と研究を勧めていく必要があることを認識した。このように、研究初年度であるにもかかわらず、共同研究者・研究協力者とともに複数の研究を行い、その成果を国内での発表、及び論文という形公表できたという点で本研究は順調に進んでいると判断してよいと考える。上述の通り、本研究は順調に進んでいると思われるが、今後のさらなる研究の発展に向けて留意しておく点がある。1つは最新研究のレビューである。本来初年度は、ICT利用協働外国語学習の文献レビューを行い、実践手法及び評価方法を把握することが主たる目的であった。しかしICT利用協働学習の新たな方策を探る研究が先に動き出してしまったため、文献研究がやや疎かになってしまったところがある。そこで次年度はこれまで実施してきた研究をさらに進め、国内外での学会発表及び論文執筆を行っていくことと並行して、先行研究調査をより緻密に行っていく。このことを通して現在進行中の研究の位置付けが明確になり、発表や論文の下支えとなる理論的考察が強固なものになると予想される。このためには今年度に引き続き、国内外の学会に参加して最新研究を調査する必要があると同時に、共同研究者が一同に介してそれぞれ調査してきた先行研究を突き合わせて議論する場を設ける必予定である。まとめるならば、研究計画の1年目と2年目に実施する計画が逆になってしまったところがあるものの、それらは最終年度のICT協働外国語学習の実践・評価の指標づくり向かって行われているため、引き続き研究を進めていく所存である。

また協働学習に肯定的に取り組めたグループは,授業を通じて抵抗感が減少し,気づきや校正を通じて言語への意識が高まる傾向が見られた一方、取り組みに否定的であったグループは,ブレインストーミングまたは協働学習の作業の段階で学習が終了する傾向が見られた。この結果から、協働学習の意義に対する肯定的な説明を行った上で実践を開始する必要があり、他の人の文章を見ることを通して気づきを促し、校正させる必要があると主張した。この結果は次年度以降の実践研究に大きな示唆となった。2つ目はオンライン協働学習環境を創出するために、LINEグループ内にて自動翻訳チャットボットを介した対話活動を実施し、その効果と参加者の態度の変化を検証した。自動翻訳ボットを使うことにより、グループ内で書かれた日本語が全て自動的に英語に即時翻訳されるため、内容を理解した英語にふれることができた。3週間後のライティング活動の結果、翻訳された英語表現を用いていることが確認された。さらに協働学習に対する肯定的な認識も促進されることとなった。この結果は協働学習の効果を検証するポイントを特定する上で大きな示唆を持つものとなった。研究初年度であるにもかかわらず、すでに複数の研究を実施し、その成果を国内外の学会で発表し、論文を公刊することができた。これらの研究を通して、本研究を実施する以前に持っていたICT協働学習の意義が再確認できただけでなく、学習がうまくいくグループとそうでないグループの差がそれぞれの学習プロセスの観察を通して明らかになったため、次年度以降の研究に新しい知見を加え、より内容のある研究を次年度以降に実施できると考えている。更にそれらの研究成果を踏まえてICT協働学習についてのワークショップを実施し、ICT利用協働学習の意義と可能性を伝えることができた。発表した学会は国内外とも規模の大きい学会主催のものであったため、それぞれの発表に多くの参加者を集めることができ、研究内容をより多くの方に伝えることができた。すでに何人かの方から興味を持って頂いており、本研究の規模拡大のきっかけを作ることができた。また、研究発表を行ったところ以外の学会に参加することができた。様々な研究発表に触れ、最新の研究成果と我々の研究の今後の転換について知見を得ることができた。例えばアジアではコンピュータを備えた(CALL)教室の設置が難しいため、学生が自身のデバイスを用いて(BYOD)学習するための方策が必要であり、モバイル機器を用いた協働学習の方策と評価方法についてさらなる実践と研究を勧めていく必要があることを認識した。このように、研究初年度であるにもかかわらず、共同研究者・研究協力者とともに複数の研究を行い、その成果を国内での発表、及び論文という形公表できたという点で本研究は順調に進んでいると判断してよいと考える。上述の通り、本研究は順調に進んでいると思われるが、今後のさらなる研究の発展に向けて留意しておく点がある。1つは最新研究のレビューである。本来初年度は、ICT利用協働外国語学習の文献レビューを行い、実践手法及び評価方法を把握することが主たる目的であった。しかしICT利用協働学習の新たな方策を探る研究が先に動き出してしまったため、文献研究がやや疎かになってしまったところがある。
準安定超伝導粒界の実験的モデルの研究

本研究では,エネルギー散逸がある時の超伝導体の結晶粒界を取りあげ,その電子構造の特異性は成膜プロセス時における挙動を明らかにし,電気的特性への影響を明らかにするために制御可能な粒界を持つ実験的モデルにより特性を解明することを試みた.実験的モデルとしてS-N-S二次元接合集合体,ニオブ酸化物超微粒子集合体とLa-Sr-Cu-O酸化物超伝導体を用いた.1.S-N-S二次元接合集合体:粒界部に導入した不均一なグラニュラー構造のために電子系が局在化し抵抗が,常伝導抵抗より温度の減少につれて増加する現象が見出された.超伝導粒子間のジョゼフソン効果の結果,抵抗の温度依存性に周期的な段階状の抵抗変化が見出された.2.ニオブ酸化物超微粒子集合体: 0.3torr以上のアルゴン圧力の下で得られた平均粒径250Aの準安定酸化物超微粒子の酸化機構を電気抵抗により研究するためのモデルを提案した.10^<-e>から数torrの範囲の酸素分圧に対して実験し,酸化物成長率と酸素分圧の関係から微細な準安定構造を持つ実質によると思われる変化を見出した.3.La-Sr-Cu-O系超伝導体における電圧揺らぎと相転移の電流依存性:粒界部の抵抗は半導体的温度依存性を示し,電流に依存する2本のピーク状の抵抗異常が観測された.低温側のピークは35K付近に存在し高温側のピークは電流に強く依存して,室温まで観測できた.ピークの間の領域は等比級数を形成する離散的値よりなっていた.ピークのR-T特性は急激に立ち上り,電子系の一次の相転移が共存することを暗示している.結晶内の多様な血管はキャリア密度を支配し,電流依存性は粒界部の電子が電界の影響を受けキャリヤ数が制御されたものと考えられる.離散的電圧群は系の状態が三個の力学系よりなることを示している.本研究では,エネルギー散逸がある時の超伝導体の結晶粒界を取りあげ,その電子構造の特異性は成膜プロセス時における挙動を明らかにし,電気的特性への影響を明らかにするために制御可能な粒界を持つ実験的モデルにより特性を解明することを試みた.実験的モデルとしてS-N-S二次元接合集合体,ニオブ酸化物超微粒子集合体とLa-Sr-Cu-O酸化物超伝導体を用いた.1.S-N-S二次元接合集合体:粒界部に導入した不均一なグラニュラー構造のために電子系が局在化し抵抗が,常伝導抵抗より温度の減少につれて増加する現象が見出された.超伝導粒子間のジョゼフソン効果の結果,抵抗の温度依存性に周期的な段階状の抵抗変化が見出された.2.ニオブ酸化物超微粒子集合体: 0.3torr以上のアルゴン圧力の下で得られた平均粒径250Aの準安定酸化物超微粒子の酸化機構を電気抵抗により研究するためのモデルを提案した.10^<-e>から数torrの範囲の酸素分圧に対して実験し,酸化物成長率と酸素分圧の関係から微細な準安定構造を持つ実質によると思われる変化を見出した.3.La-Sr-Cu-O系超伝導体における電圧揺らぎと相転移の電流依存性:粒界部の抵抗は半導体的温度依存性を示し,電流に依存する2本のピーク状の抵抗異常が観測された.低温側のピークは35K付近に存在し高温側のピークは電流に強く依存して,室温まで観測できた.ピークの間の領域は等比級数を形成する離散的値よりなっていた.ピークのR-T特性は急激に立ち上り,電子系の一次の相転移が共存することを暗示している.結晶内の多様な血管はキャリア密度を支配し,電流依存性は粒界部の電子が電界の影響を受けキャリヤ数が制御されたものと考えられる.離散的電圧群は系の状態が三個の力学系よりなることを示している.61年度は準安定超伝導体粒界のモデルとしてS-N-S接合集合体とNb系超微粒子集合体について実験した。その結果以下のことが明らかになった。1,S-N-Sタイプでは、粒界抵抗と形而学的特徴が明らかにされ、Tc以下の特性が粒界の抵抗に依存していることが実験的に明らかになった。粒界部は多くの超伝導ループが形成されている領域が存在しこの部分がピニングセンターとなっている。また、R-T特性において生じた周期的抵抗の減少は、ループ構造制御が不十分なため構造との関係はまだ立証していない。2,Nb系超微粒子集合体は新しいスパッタイオン装置の完成により以下の事実が明らかになった。(1)スパッタ現象の圧力依存性より気相中における粒子生成には臨界的圧力が存在することが明らかとなった。(2)粒子は正,負イオンよりなっているが負イオンが多く、粒子サイズは平均250【A!°】であった。(3)Nb粒子集合体抵抗の温度依存性測定より、粒界部の抵抗は、サーマルサイクルにより増加する場合と減少する場合があり、金属的伝導を示すものは超伝導転移温度以下で著しい起電圧を発生する。この超電圧は特定の分布を持ち超伝導と関係していると考えられる。3,最近の新超伝導物質発見に関連してLa-Sr-Cu-O系超伝導体を合成し、14【C!°】で超伝導状態にあることを確認した。超伝導は粒界に存在しネガタイプのジョゼフソン接合集合体となっている。
PETプローブのチェレンコフ光を利用した光イメージングと光治療法への技術展開

PETでは、シグナル部位としてポジトロン放出核種を用いる。PETでは低分子量のプローブの作成が可能であるため、脳の分子イメージングが容易である。一方、光イメージングは簡便であるが、蛍光分子の分子量が大きいため脳機能イメージングは難しい。そこで、PETイメージングプローブが放出するチェレンコフ光を利用することで、これまで不可能と考えられていた脳機能の光イメージングが可能になると考え検討を行った。この結果、チェレンコフ光イメージングによる[18F]FDGを用いた脳糖代謝測定、[11C]raclopride, [11C]b-CFTを用いた脳受容体・トランスポータイメージングに成功した。PETは、脳機能を評価するのに適した分子イメージング法であるが、PET装置の普及率は低く、どの施設でも基礎研究に利用できる方法とは言えない。一方、光イメージングは汎用性が高く、薬剤開発など基礎研究の分野において広く利用されているが、血液脳関門を通過する低分子量の光プローブを作成することは困難であり、脳機能の評価は難しい。そこで、まず、PETプローブから放出されるチェレンコフ光を利用した、脳糖代謝・脳酸素代謝量イメージングを試みることとした。平成25年度は、脳機能の光イメージングについて検討した。まず、ファントムを用いチェレンコフ光の感度、波長、透過性などについて検討を行ったのち、チェレンコフ光による脳イメージングが可能であるか検討を行うため、[18F]FDGによる脳糖代謝イメージングを行った。この際、脳への[18F]FDGの取り込み量は血糖値に依存するため、絶食時間を変えることにより、血糖値を様々に変化させたddYマウスを用い、さらに、定量性についての検討をガンマカウンタにて測定した放射能の結果と比較検討した。この結果、剃毛することで、定量性を保ってチェレンコフ光により脳糖代謝を測定することができることが判った。次に、[15O]O2, [15O]CO2ガスによる脳酸素代謝測定について検討を行った。光イメージング装置の麻酔ラインに[15O]O2, [15O]CO2ガスを導入し、放射性ガス吸入システムを構築した。次に、マウスにマスクを装着し、麻酔ガスとともに[15O]O2または[15O]CO2ガスを吸入させた。この結果、脳への取り込みを画像化することに成功した。しかしながら、ガスラインからの放射能が高く、この放射線がCCDカメラに直接影響を及ぼし雑音が高くなること、また、カメラ破損の頻度が高くなることが判った。従って本検討については、遮蔽などが今後の検討課題となることが判った。そこで、まず、PETプローブから放出されるチェレンコフ光を利用した、脳イメージングを試みることとした。平成26年度は、脳の受容体機能を光イメージングにて評価できるかについて検討をした。すなわち、ドパミンD2受容体のイメージング剤である[11C]racloprideおよびドパミントランスポーターイメージング剤である[11C]beta-CFTを用いたチェレンコフ光イメージングを試みた。前年度までの検討より、マウスの頭髪を剃毛する必要性が示唆されていたため、頭髪を剃毛したマウスを用いて検討を行った。非侵襲性を確保するため頭皮はそのままにした。[11C]raclopride 7.4 MBgをマウス尾静脈から投与後、8分毎2分間隔にて光イメージング装置にて撮像した。さらに受容体への特異的結合を観察するため、ハロペリドールの負荷試験も行った。[11C]beta-CFTについては、1.85 MBqを投与後同様に撮像した。この結果、[11C]racloprideにおいて、D2受容体が多く存在する線条体での特異結合を見ることができた。[11C]beta-CFTについては脳への取り込み率が[11C]racloprideより高いため、より明確な画像を得ることができた。平成26年度までに、PET薬剤を用いたチェレンコフ光による光分子イメージングに成功した。そこで、平成27年度は本技術を癌へ展開することとした。まず、各種濃度の光感受性化合物IR700と[18F]FDG溶液を用意し、これらを混合することにより18Fからのチェレンコフ光ではなく、チェレンコフ光により励起されたIR700の波長の蛍光を捉えることができるか検討を行った。この結果、IR700の吸収帯が無い領域(545 nm)では[18F]FDGから放出されるチェレンコフ光はIR700の添加により減光することは無かった。一方、IR700の吸収帯はあるがIR700の蛍光波長(700 nm)からは外れる領域(612 nm)にて観察すると、IR700添加によるチェレンコフ光の減光が観察された。さらに、チェレンコフ光の波長からは外れるがIR700の蛍光がみられる領域(732 nm)にて観察すると、IR700を添加することで光が増強した。

これはすなわち、[18F]FDGによるチェレンコフ光がIR700に吸収されIR700が励起し蛍光を発したことを示すものである。そこで次に、チェレンコフ光を利用してがん細胞を殺傷できるか検討を行った。培養細胞にIR700標識抗体を結合させた後[18F]FDGを取り込ませ、LIVE/DEAD染色を行った。この結果、IR700と[18F]FDGを両方作用させることで、死細胞の数がやや増えていることを確認した。しかしながら、この細胞数の差は有意ではなく、また、長時間多くの放射能の[18F]FDGを作用させる必要があった。さらに、Annexin V, PI染色を施した細胞をフローサイトメトリーにより解析したが、非処理群と有意な差を認めることはできなかった。別の検討により、IR700による細胞死は細胞膜傷害によるものである可能性が示されてきたことから、細胞質内に取り込まれる[18F]FDGではなく、膜へ結合するPET薬剤の必要性が考えられ、今後、さらに検討を進める予定である。PETでは、シグナル部位としてポジトロン放出核種を用いる。PETでは低分子量のプローブの作成が可能であるため、脳の分子イメージングが容易である。一方、光イメージングは簡便であるが、蛍光分子の分子量が大きいため脳機能イメージングは難しい。そこで、PETイメージングプローブが放出するチェレンコフ光を利用することで、これまで不可能と考えられていた脳機能の光イメージングが可能になると考え検討を行った。この結果、チェレンコフ光イメージングによる[18F]FDGを用いた脳糖代謝測定、[11C]raclopride, [11C]b-CFTを用いた脳受容体・トランスポータイメージングに成功した。当初予定どおり、PETプローブが放出するチェレンコフ光を利用した脳のチェレンコフ光イメージングに成功した。特に、ダイナミック画像収集をすることにより、脳の受容体密度の測定、定量化の可能性を示唆することができた。分子イメージング平成27年度以降は、これまでの結果をもとに、PITと[18F]FDGによる癌の超特異的治療についての検討を進める。すなわち、癌へ集積した[18F]FDGから放出されるチェレンコフ光により、光応答性分子プローブの光励起を行う。これにより、さらなる特異性の向上と深部癌の治療を目指す。まず、培養腫瘍細胞を利用し、IR700結合抗体を細胞に取り込ませた後、[18F]FDGを加え、本方法による腫瘍細胞殺傷効果について、FACSなどを利用した検討を進めていく。さらに、担癌マウスを用いて、インビボでの検討を行う。この際、PITのメカニズムを明らかにすることで、より効果的な治療法の開拓を目指す。特に糖代謝イメージングについては、マウス頭部を無処置・剃毛処置・皮膚切開し、また、撮像後に脳を摘出し、様々な条件にてガンマカウンタでの放射能の測定値と比較検討を行うことで、定量性について一貫した結果を得ることができた。剃毛のみにより良好な定量性を示したことは、非侵襲的な測定が可能であることを示しており、PET装置に比較するとかなり一般に普及している光イメージング装置にて、PETイメージング剤を用いた脳機能の測定が可能であることを示すことができた。
新規細胞系樹立による放射線DNA損傷修復シグナルと突然変異の関係解明

本研究課題では、遺伝子ノックアウトや遺伝子導入といった手法を用いて新たな高感度突然変異検出系を樹立することと、放射線による遺伝子突然変異誘発におけるDNA損傷修復機構あるいは修復に関わるタンパク質の役割と相互作用を解明することを目的としている。特に、クラシカルな2つのDNA二重鎖切断(DSB)修復系路である、相同組換え(HR)と非相同末端結合を中心に、放射線被ばくによって引き起こされたDSBの修復過程と突然変異や遺伝的不安定性の誘導とを直接的に関連づけて解析可能にすることを主眼としている。具体的には、時間と部位を制御してゲノムDNAにDNA二重鎖切断が導入でき、その修復効率や精度の解析から突然変異誘発までを1つの細胞で解析できる、全く新たな視点に立った独自の細胞系を目指す。これまでの研究で、部位特異的DSB導入が制御可能な新規のHRレポーターアッセイ細胞系(未発表)を樹立しているが、これに加えて、時間・部位特異的DSB導入による新規の突然変異実験系を樹立し、細胞周期進行などに伴うDSB修復機構の変化から、突然変異の頻度やスペクトルまでを包括的に解析することに取り組んでいる。東日本大震災によって研究室が大きな被害を受け、かなりの細胞株とプラスミド等を失い、結果的に本年度の研究は後退してしまったが、部位特異的切断導入ベクターを構築・改造するための準備を整えることはできたこと(震災後もベクターは維持できている)、および、細胞周期を同調した細胞内で実際にDSBが導入されている細胞周期が狙ったタイミングに合致しているのかを確認できたことは、今後の研究の進展につながる成果である。