hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
無血清培養系での遺伝性顎口腔疾患特異的i PS細胞を用いた発症機構解明と治療応用

本研究では顎口腔顔面領域に異常をきたす各種遺伝性疾患の発症メカニズムを明らかにし、診断・治療法を開発するため、フィーダーレス無血清培養系にて鎖骨頭蓋異形成症(CCD)、Noonan症候群、Neurofibromatosis typeI、基底細胞母斑症候群、Cowden症候群患者より各種疾患特異的iPS細胞を樹立し特性解析を行うと共に、NGSを用いた網羅的遺伝子解析にて新規変異を報告した。なかでもCCD-およびNoonan-iPS細胞では、軟骨分化誘導時に患者の病態を反映した成熟異常を認めたことから、本疾患特異的iPS細胞を用いて機能解析を行うことで、さらなる病態解明への有用性が示唆された。本研究では、遺伝性疾患患者由来細胞から無血清培地を用いてフィーダー細胞を使用せずiPS細胞を樹立・維持し、各疾患の詳細な発症メカニズムの解明および診断・治療法の開発を行うことを目的とし、以下のとおり実施した。1.インテグレーションフリー・フィーダー細胞フリー・無血清培養条件での疾患特異的ヒトiPS細胞誘導および幹細胞バンク化:センダイウイルスベクターを用い、顎口腔顔面領域に異常をきたす各種遺伝子疾患特異的iPS細胞を樹立した。なお、同ベクターは初期化遺伝子が同一ベクターに搭載されており、宿主細胞から排除可能であるため、ゲノムDNAへランダムな遺伝子挿入が起こらず、安全なヒトiPS細胞が樹立可能となった。現在、インテグレーションフリー・フィーダー細胞フリー・無血清培養条件にて、鎖骨頭蓋異形成症(CCD)、Turner症候群、Noonan症候群、ミトコンドリア病、Von Recklinghausen病、基底細胞母斑症候群、Cowden症候群の各患者より疾患特異的iPS細胞を樹立し凍結保存・細胞バンキングを行っている。2.無血清培養系に樹立した疾患特異的iPS細胞を用いた特性解析:本研究において無血清培地(hESF9)で樹立されたヒトiPS細胞の特性解析を行い、各遺伝子疾患特異的iPS細胞を用いて、特定の細胞系列に分化誘導し、疾患モデルを作製した。3.次世代シークエンサーを用いた疾患関連遺伝子解析:顎口腔顔面領域に異常をきたす各種遺伝子疾患のうち、原因遺伝子が明らかでないものにつき、次世代シークエンサーを用いて網羅的解析を行い、過去に報告のない新規変異を報告した。センダイウイルスを用いた無血清培養法を確立し、遺伝子疾患患者由来血液細胞から簡便にiPS細胞の樹立・維持が可能となった。また同培養方法を用いて、顎顔面領域に異常をきたす遺伝性疾患特異的iPS細胞を樹立し、GMP準拠施設内でのiPS細胞誘導および幹細胞バンク化をすすめている。特に鎖骨頭蓋異形成症、Noonan症候群、Cowden症候群、Von Recklinghausen病由来iPS細胞を用いて、それぞれ骨・軟骨細胞系統や神経系、上皮細胞系、神経系細胞へ分化誘導し、疾患モデルを作製し、責任遺伝子の発現や機能について解析中である。CRISPR/Cas9システムによる変異遺伝子修復を行い、無血清培養条件でのiPSCからの分化・発生機構などを検討し、各疾患の疾患発生メカニズムや分化細胞での発癌機構の解明を目指している。引き続き、センダイウイルスを用いた無血清培養法を用いて樹立した各種疾患特異的iPS細胞を用いた病態解明を行う。

1.樹立した複数例の鎖骨頭蓋異形成症(CCD)iPS細胞を用いて、遺伝子変異部位のゲノム編集をCRISPR/Cas9を用いて行い、変異部位の配列を正常化し、分化誘導時の特性解析について正常人由来iPS細胞との比較検討を行う。2.Cowden症候群iPS細胞を用い、変異Pten遺伝子を修復し正常株と比較する。また変異型における細胞増殖亢進やアポトーシス抵抗性、幹細胞の未分化性維持、セントロメアの不安定性、DNA修復異常等について正常型と比較し検討を行うとともに、癌化の分子メカニズムとの関連性についても詳細な解析を行う。口腔外科学平成28年3月までにCRISPR/Cas9を用いて疾患特異的iPS細胞の変異部位の配列遺伝子改変を作製していたが、樹立した各種疾患特異的iPS細胞において、全種類の疾患における改変iPS株は得られておらず一部疾患において苦渋しているため、本年度使用額に残額が生じ、次年度使用額が生じた。今後は次年度繰越額を用いてCRISPR/Cas9の再設計を実施し、各種疾患特異的iPS改変株の取得を目指す。それらの作製に係る物品および消耗品に繰越額を使用し、分化誘導実験等について検討する予定である。
金属タンパク質活性サイトモデル : ペプチド錯体の合成・構造・機能

本研究は、蛋白質中の金属イオン結合サイトに見られる基本的なアミノ酸配列に関して、ペプチドを配位子とする錯体化学の基礎をつくること、及び、人工の電子伝達蛋白質を合成すること、の2点を企図した。そのため、1)ジンクフィンガーモチーフZFの亜鉛サイトCys-X_n-Cys-Y/Zn^<2+>、及び、加水分解酵素の亜鉛サイトHis-X_n-His/Zn^<2+>のペプチドを配位子とする亜鉛・水銀錯体を合成、次いで、これら錯体の溶液のEXAFSとROESYデータをもとに分子軌道法・制限分子動力学計算・距離幾何学計算を行い、ペプチド錯体の構造を明らかにすることを計画した。又、2)ポルフィリンを鋳型に持つペプチドポルフィリンを合成し、その会合性を検討することを計画した。以下、達成した成果を列挙する。2) [(2)Hg]は極性溶媒中でBu^tS^-と反応して[(2)(Bu^tS)Hg]^-を生成する。本研究ではこの分子の骨格構造はZFやRubの局所配座と同じであることを明らかにした。3) Cys-X_2-Cys/Zn^<2+>とCys-X_2-Cys-A-B/Zn^<2+>を得るための有機合成と錯体合成を系統的に発展させ、[(2)Zn]及び[(1)Zn]を得た。これらは共にZnS_2O_24配位を基本とするが5配位の混入が有り得ることを実験的に見出した。又、置換反応を試みた。温度変化実験を含む精密EXAFS解析と配位結合に関する分子軌道法計算、及び、配位と配座の運動に関する分子動力学計算を行い、化合物はZnS_2O_2の4配位を基調とするが5配位幾何構造(tbp)も存在し、溶媒が周囲に多数存在する場合は5配位となる可能性が高いことを計算的に確認した。4)プロテアーゼ活性中心はHis^i-Glu^<i+1>-X_2-His^<i+4>/Zn^<2+>で表わされる。本研究は最小アミノ酸配列であるBoc-Glu-TI-His-OMeを選び亜鉛錯体の合成を行った。本系は溶液中で平衡系であるがROESY実験から平均値として_lH-_lH距離を求め、距離幾何学計算と制限分子動力学計算を遂行した。得られた幾つかの構造を平均化すると、加水分解酵素中のGlu-X_2-His/Zn^<2+>と極く近い構造となることを明らかにした。5)マルチヒスチジンペプチドをピケットフェンスとする人工蛋白質α_4-(PepA_<18>)_4-MTAPP:PepA=EEALEKHEKALEKHEKAGを設計・合成した。これをホストとしてプロトヘムをゲストに取り込み、ポルフィリン会合体を形成することに成功した。次いで、ヘリックス性と会合体分子量を検討し、α_4-(PepA_<18>)_4-ZnTAPPは二量体を形成すること、ヘミン共存下三量体へと変化することを明らかにした。本系は2種類の金属ポルフィリンからなる12のポルフィリンを含み、人工蛋白質で最大のポルフィリン集積を示した。

本研究は最小アミノ酸配列であるBoc-Glu-TI-His-OMeを選び亜鉛錯体の合成を行った。本系は溶液中で平衡系であるがROESY実験から平均値として_lH-_lH距離を求め、距離幾何学計算と制限分子動力学計算を遂行した。得られた幾つかの構造を平均化すると、加水分解酵素中のGlu-X_2-His/Zn^<2+>と極く近い構造となることを明らかにした。5)マルチヒスチジンペプチドをピケットフェンスとする人工蛋白質α_4-(PepA_<18>)_4-MTAPP:PepA=EEALEKHEKALEKHEKAGを設計・合成した。これをホストとしてプロトヘムをゲストに取り込み、ポルフィリン会合体を形成することに成功した。次いで、ヘリックス性と会合体分子量を検討し、α_4-(PepA_<18>)_4-ZnTAPPは二量体を形成すること、ヘミン共存下三量体へと変化することを明らかにした。本系は2種類の金属ポルフィリンからなる12のポルフィリンを含み、人工蛋白質で最大のポルフィリン集積を示した。2.Clu-Thr-Ile-His/Zn^<2+>,3:加水分解酵素特に亜鉛プロテアーゼの活性中心に対応してClu-Thr-Ile-HisのZn^<2+>錯体4を合成、単離精製した。錯体4についてX線散乱や赤外・ラマン測定,各種NMR測定を実施中。3.ヘリックスポルフィリン:αヘリックス1本鎖を有するα,α,α,α-のアトロープアイソマ-ポルフィリン約百mg準備し、ポリフィリン部位に亜鉛を導入した。メタルフリー、亜鉛錯体の何れの化合物も脱保護以後の精製はゲル濾過及び分取HPLCにより、また、キャラクタライゼーションは質量分析、NMR等で行った。UV-vis及びCDにより会合とヘリックス形成のpH依存性、等電点との関係、濃度依存性を克明に検討した。又、会合の無い条件でNMRを測定し、^<13>C,^1H共帰属を行った。両者とも、ROESYデータの測定に成功したので、距離幾何学及び制限分子動力学による構造解析を検討中である。他方,His部位への鉄イオン導入を検討中である。尚、ヘリックスポルフィリン系の電子移動反応を検討するため、ITO電極セルの作成と、ITOのシリルアミン及びピリジル酢酸による修飾を行った。標準としてCoTPPを選びピリジンと結合させ、XPS等により電極上での挙動を検討した。一方、プロテアーゼの多くがHis-Glu-X_2-His/Zn^<2+>型の活性中心を有し、何れもほぼ同じ折れ曲がり構造を持つ。本研究はこの事実をもとに、Boc-Glu-Thr-Ile-His-OMe,H_21,とBoc-His-Glu-Thr-Ile-His-OMe,H_22,を合成し、これらペプチドの亜鉛錯体、[(H1)Zn]・ClO_4,3,及び〔(H2)Zn〕・ClO_4,4,の合成を目指した。今まで、〔(H1)_2Zn〕;5,の単離,精製に成功した。又、H_21及びH_22をはじめとする各種のペプチドと、これらペプチドと亜鉛イオン共存系のポテンショメトリーを行い、各プロトンの解離平衡の様子を検討し、加水分解酵素のメカニズムに関する考察を進めた。最終年度は、蛋白質中の金属イオン結合サイトに見られる基本的なアミノ酸配列に関して、1)ジンクフィンガーモチーフZFの亜鉛サイトCys-X_n-Cys-Y/Zn^<2+>のペプチドモデル、及び、加水分解酵素の亜鉛サイトHis-X_n-His/Zn^<2+>のペプチドモデルの合成と、これら錯体の溶液のEXAFSやROESYデータをもとにした分子軌道法・制限分子動力学計算・距離幾何学計算を行い、ペプチド錯体の構造を明らかにした。又、2)ポルフィリンを鋳型に持つペプチドポルフィリンを合成し、その会合性を検討した。以下、達成した成果を列挙する。
学術情報の国際相互接続利用に関する実証研究

本研究は,学術情報センタ-が所有する学術研究に関するデ-タベ-スを,日本のみならず米国の研究者にも利用できるようにシステム開発を実施し,学術情報の国際的相互利用の基盤を形成することを目的とするものである.この背景には,学術情報センタ-と米国NSF(米国科学財団)との従来からの国際協力があり,NSFとの連携を深める中で日本の学術情報を米国に提供する具体的方策を検討し,その実現を評価する実証的研究を実施することは,今後の両国の学術情報の流通を促進する上で不可欠であるとする判断があった.このための実証的研究を実施するためには,3年からなる計画が必要とされた.平成元年度には,NSFと学術情報センタ-との間に国際通信回線を設け,学術情報センタ-が運用する学術情報ネットワ-クを米国に延長し,その稼働を開始した.又NSRには日本語処理を可能とするパ-ソナルコンピュ-タを設置し,これを介して学術情報センタ-のデ-タベ-スを検索することを可能にした.同時に,NSFが主導するCSNETとの接続を行い,電子メ-ルの国際交換のための研究開発を実施した.昭和64年度には,日本の統一図書目録等の作成に重要な役割を果たしているLC(米国議会図書館)にも回線を延長し,LCからの情報検索を可能にした.又世界的規模で運用されているネットワ-クであるBitnetとの接続のための研究開発を実施し,その相互接続を完了した.これにはジョ-ジワシントン大学の協力があり,共同研究の範囲も拡大している.同時に国内でもMHSによる電子メ-ルサ-ビスを,CSNET並びにBitnetに接続するための相互変換機能の開発が行われている.今年度は,本実証研究の最終年度として,従来の研究成果のとりまとめを行うとともに,将来の国際相互接続利用を展望した今後の相互利用の方策について検討を行った.第一は,第一年次(昭和63年度)に試行的運用を開始した米国研究者に対する情報検索サ-ビスを充実し,サ-ビスの普及を図った.即ち,従来の大学研究者だけでなく民間の研究機関の研究者に範囲を広げ,又提供情報の種類を増すことで,利用の量的並びに質的変化の傾向を分析した.この結果,約2倍の量的増大が達成されており,又従来は科学技術分野に利用が集中していたものが,人文社会分野にも利用の拡大が図られてきたことが明らかにされた.特に,文部省科学研究費補助金による研究成果の中に,米国研究者にとって関心の高い人文社会関係の研究が多いことが示されている.第二は,電子メ-ルを中心とするネットワ-ク応用の相互接続利用を拡大するために,国際通信回線の増強を図り,運用の高度化のための配慮を行った.即ち,従来は64kb/sの回線を使用していたが,これを56kb/sに増大し,個々のサ-ビスに使用する容量の拡大を図った.しかし米国では,一層のネットワ-ク高度化が計画されていおり,研究と教育を一体化したネットワ-ク構想が議論されている.又欧州でも,ネットワ-クの増強を計画する機関があり,この傾向は国際的なものとなってきている.この中で,将来のネットワ-クの動向につき検討を実施するために2名の研究者を米国から招き,具体的な検討を実施した.更に,米国の主要なネットワ-ク運用機関であるNASAとも検討を行い,学術情報センタ-が実施する将来のネットワ-ク事業に関して検討を深めた.以上に加えて,3月にはNSFにて最終の検討会を持ち,3年にわたる本実証研究のとりまとめを行った.3年にわたる本研究を要すれば,従来は米国との情報流通が米国から日本に対する一方向であると見做されていたものが,実証的研究による結果により,米国から日本に対しても広い研究分野の情報検索が起こっていることが明らかにされたことであろう.今後は,この情報流通を一層促進させるために,海外に提供できる情報を整備していくことが重要と考えられる.一方,ネットワ-クの国際相互接続にも顕著な成果があり,公式の協同推進体制ができたことは,将来の資産といえる.このような成果が得られたことで,本国際共同研究は当初の目標を達成したものと判断する.本研究は,学術情報センタ-が所有する学術研究に関するデ-タベ-スを,日本のみならず米国の研究者にも利用できるようにシステム開発を実施し,学術情報の国際的相互利用の基盤を形成することを目的とするものである.この背景には,学術情報センタ-と米国NSF(米国科学財団)との従来からの国際協力があり,NSFとの連携を深める中で日本の学術情報を米国に提供する具体的方策を検討し,その実現を評価する実証的研究を実施することは,今後の両国の学術情報の流通を促進する上で不可欠であるとする判断があった.このための実証的研究を実施するためには,3年からなる計画が必要とされた.平成元年度には,NSFと学術情報センタ-との間に国際通信回線を設け,学術情報センタ-が運用する学術情報ネットワ-クを米国に延長し,その稼働を開始した.又NSRには日本語処理を可能とするパ-

ソナルコンピュ-タを設置し,これを介して学術情報センタ-のデ-タベ-スを検索することを可能にした.同時に,NSFが主導するCSNETとの接続を行い,電子メ-ルの国際交換のための研究開発を実施した.昭和64年度には,日本の統一図書目録等の作成に重要な役割を果たしているLC(米国議会図書館)にも回線を延長し,LCからの情報検索を可能にした.又世界的規模で運用されているネットワ-クであるBitnetとの接続のための研究開発を実施し,その相互接続を完了した.これにはジョ-ジワシントン大学の協力があり,共同研究の範囲も拡大している.同時に国内でもMHSによる電子メ-ルサ-ビスを,CSNET並びにBitnetに接続するための相互変換機能の開発が行われている.今年度は,本実証研究の最終年度として,従来の研究成果のとりまとめを行うとともに,将来の国際相互接続利用を展望した今後の相互利用の方策について検討を行った.第一は,第一年次(昭和63年度)に試行的運用を開始した米国研究者に対する情報検索サ-ビスを充実し,サ-ビスの普及を図った.即ち,従来の大学研究者だけでなく民間の研究機関の研究者に範囲を広げ,又提供情報の種類を増すことで,利用の量的並びに質的変化の傾向を分析した.この結果,約2倍の量的増大が達成されており,又従来は科学技術分野に利用が集中していたものが,人文社会分野にも利用の拡大が図られてきたことが明らかにされた.特に,文部省科学研究費補助金による研究成果の中に,米国研究者にとって関心の高い人文社会関係の研究が多いことが示されている.第二は,電子メ-ルを中心とするネットワ-ク応用の相互接続利用を拡大するために,国際通信回線の増強を図り,運用の高度化のための配慮を行った.即ち,従来は64kb/sの回線を使用していたが,これを56kb/sに増大し,個々のサ-ビスに使用する容量の拡大を図った.しかし米国では,一層のネットワ-ク高度化が計画されていおり,研究と教育を一体化したネットワ-ク構想が議論されている.又欧州でも,ネットワ-クの増強を計画する機関があり,この傾向は国際的なものとなってきている.この中で,将来のネットワ-クの動向につき検討を実施するために2名の研究者を米国から招き,具体的な検討を実施した.更に,米国の主要なネットワ-ク運用機関であるNASAとも検討を行い,学術情報センタ-が実施する将来のネットワ-ク事業に関して検討を深めた.以上に加えて,3月にはNSFにて最終の検討会を持ち,3年にわたる本実証研究のとりまとめを行った.3年にわたる本研究を要すれば,従来は米国との情報流通が米国から日本に対する一方向であると見做されていたものが,実証的研究による結果により,米国から日本に対しても広い研究分野の情報検索が起こっていることが明らかにされたことであろう.今後は,この情報流通を一層促進させるために,海外に提供できる情報を整備していくことが重要と考えられる.一方,ネットワ-クの国際相互接続にも顕著な成果があり,公式の協同推進体制ができたことは,将来の資産といえる.このような成果が得られたことで,本国際共同研究は当初の目標を達成したものと判断する.
肝炎ウイルスに対するモノクローナル抗体が認識するエピトープと中和能の検討

細胞マイクロアレイシステムで得られた抗HBVモノクローナル抗体を用いて検討した。エピトープ解析では、HBV表面蛋白の細胞外ループ部が強い抗原性を持ち、HBV中和能に関連することを示した。抗体の組み合わせにより様々なgenotype、エスケープミュータントとして知られるG145Rに対してもHBV中和効果を示した。これらの知見は、今後ユニバーサルワクチネーションが検討されており、現行のワクチンで様々なgenotype、ミュータントを含めたHBV中和が可能であることを示す。また、モノクローナル抗体もしくはその組み合わせによる抗体療法の可能性も示唆する。本年度は細胞マイクロアレイシステムにより得られた30数種の抗HBVモノクローナル抗体を用いて、抗体の生理的活性の評価を行い、また、それぞれの抗体が認識するエピトープとHBV中和能につき検討した。その結果、HBVに対するモノクローナル抗体はさまざまな結合活性を示するのが混在していた。抗体のエピトープ部位として予想されたHBV表面蛋白抗原(Small-HBsAg)の細胞外部位(抗原決定基a)を立体構造を保つ形でペプチド断片化し、抗体の結合を検討したところ、モノクローナル抗体の多くがいずれかのペプチドを認識しており、特に細胞外のループ構造部を認識するものが多く認められた。次に、HBVの感染、抗体の中和効果をin vitroでHepaRG細胞を用いて検証した。HBV量を調節し、感染条件を検証した結果、2x10^4コピーのHBV感染をHBV-DNAまたはHBsAg定量、HBcコア抗原の免疫染色にて確認できた。これらの感染系を用いて30数種のモノクローナル抗体のHBV中和能を検討したところ、抗原決定基aのループ構造部を認識する抗体が他の部位を認識する抗体より高いHBV中和活性を示した。抗体のHBsAgへの親和性よりも、どこのエピトープを認識するがHBV中和能に関与が深いと思われた。これらの知見はHBワクチンにより誘導される抗体がHBsAgのどの部位を認識しているのかを示しており、HBワクチンによりHBV中和メカニズムを考える上でも興味深い知見と思われる、HBワクチンに応答しない症例も存在することが知られているが、そのような症例に対する対処として、HBsAgの細胞外ループ領域蛋白を追加免疫したり、細胞外ループ領域蛋白とアジュバンドを用いて免疫したりなどの方法が有効である可能性も示唆される。また、HBsAgの特定の部が強いHBV中和活性を示すことより、HBVの肝細胞への感染に同部位がなんらかの作用を果たしている可能性が考えられ、HBVの感染機序の解明や同部位を標的とした治療法の開発など今後につながる重要な知見であると思われる。本年度は細胞マイクロアレイシステムにより得られた30数種の抗HBVモノクローナル抗体の中から、異なるエピトープを認識し、in vitroでのHBV中和能の強いモノクローナル抗体を用いて検討をすすめた。モノクローナル抗体、もしくはその組み合わせによるHBV中和効果の増強作用、さらにはヒト肝細胞キメラマウスを用いたHBV中和能につき検討した。さらに、様々なgenotypeのHBVに対するモノクローナル抗体の中和作用につき検討した。前年度の結果から、HBV表面蛋白抗原(Small-HBsAg)の細胞外部位(抗原決定基a)のループ構造部が強い抗原性を持ち、第一ループ部の一部がHBV中和能に関連することが予想された。In vitro,in vivoのHBV中和実験では、エピトープの違うモノクローナル抗体の組み合わせにより、HBVの中和効果が増強することが判明した。さらに、HBVの中和効果の強いモノクロ抗体、もしくはその組み合わせにより、様々なgenotypeのHBVが中和可能であった。また、ワクチンエスケープミュータントとして知られるHBV G145Rに対してもHBV中和効果をモノクロ抗体が示すことを示した。これらの知見はHBワクチンにより誘導される抗体によるHBV中和が、異なるgenotypeにおいても有用であることを示唆し、またエスケープミュータントに対しても有効であることを示している。今後ユニバーサルワクチネーションが検討されており、現行のワクチンで様々なgenotypeのミュータントを含めたHBV中和が可能であることを示唆するものであり、臨床的にも意義ある研究成果であると思われる。また、モノクローナル抗体もしくはその組み合わせによる抗体療法の可能性も示唆するものである。
音鐘理論を応用した耳鳴検査装置の実用化

本研究の目的は、従来の固定周波数ピッチ・マッチ検査と連続周波数ピッチ・マッチ検査における両者の問題点を、我々が提案してきた音鐘理諭に基づく検査装置で解決し、また患者情報データベースと結ぶことによって、個々の患者に適した耳鳴検査が可能なシステムを開発することであった。計画では、臨床の場においてオンライン・リアルタイムで利用できるよう、検査装置をコンパクトに、しかも簡便に使用できる専用電子回路を製作し、またコンピュータと接続して診断ならびに患者情報のデータベースが構築できるシステム開発を目標に行った。研究の成果としては、患者の治療経過を考慮した検査や呈示音の操作がコンピュータの画面上で簡便に実施でき、しかも、検査時の記録や情報管理が極めて容易に行えるようになった。以下に具体的な成果を示す。1.開発したシステムは、ル-タ、サーバおよび耳鳴検査装置から成り、各装置はネットワークを介して結んだ。2.耳鳴検査装置は、専用の電子回路を設計・製作し、ノート型パーソナルコンピュータに内蔵した。3.検査・診断システムのソフトウェアに3種類の検査モードを設けた。(1)従来のピッチ・マッチ検査モード(2)過去の患者情報を参照して事前に検査手順を決め自動的に検査できるモード(3)データベースが自由に利用できるモード4.検査結果は、オンライン・リアルタイムで自動的に記録でき、患者情報データベースへの構築も可能になった。以上、本研究の目標はほぼ達成でき、得られた成果は学会などで発表した。本年度は、主に検査・診断システムにおけるハードウェアの設計・制作を中心に作業を進め、以下に示す成果を得た。1.設備備品類は、任意波形発生器、改造対象の耳鳴検査装置を購入した。2.購入した耳鳴検査装置の改造については、電子回路部の設計・制作を実施した。3.呈示音の操作は、これまで機械部のスイッチ切り換え操作によって行ってきた。しかし、検査・診断システムの操作全体からみると操作が複雑になり、操作に混乱を招く可能性が生じた。したがって、この問題を解決する方法として呈示音の操作を画面操作のみで処理できるよう検討中である。4.7音音階周波数のキャリブレーションを実施するため、任意波形発生器をコンピュータに接続し、データ収集ソフトウェアを開発中である。5.これまでの測定データを基にしたデータベースの構築については、処理フォーマットを設計した。6.検査方法、診断基準およびこれらの処理ソフトウェアについては開発中である。7.平成8年度購入予定の設備備品コンピュータに対してのソフトウェアの移植準備は進行中である。8.7音音階周波数を用いた検査方法は、自覚的耳鳴の治療効果を評価する上で有用な手段であることが臨床応用の結果より明らかになった。以上、本年度の目標はほぼ達成でき、得られた成果は日本聴覚医学会等で発表した。本年度は、主に検査・診断システムのハードウェアを完成させるとともに、ソフトウェアの移植ならびに開発を中心に作業を進め、以下に示す成果を得た。1.設備備品類は、耳鳴検査装置組み込み用データ処理装置を購入した。2.購入した耳鳴検査装置組み込み用データ処理装置は、インターフェース部にネットワークのための改良を加え、耳鳴検査装置と接続した。3.呈示音の操作は、これまで機構部のスイッチ切り換え操作によって行ってきた。したがって、この問題を解決する方法として呈示音の操作を、画面操作のみで処理できるよう検討した。その結果、耳鳴り検査装置のハードウェアならびにソフトウェアの改造を行い、呈示音の操作問題はほぼ解決できた。4.検査装置の7音音階周波数キャリブレーションは、任意波形発生器を用いて実施した。キャリブレーション結果および被験者による比較でも良好な結果であった。5.これまでの測定データを基にしたデータベースの構築については、処理フォーマットの設計ができ、患者情報の一部を構築した。7.臨床応用では、検査結果を整理してデータベース構築に用いるとともに、通常のピッチマッチ法に対する音階耳鳴検査の評価を行い、また簡易測定法の検討も行っている。

以上、本年度の目標はほぼ達成でき、得られた成果は聴覚医学会の国際会議等で発表した。本年度は、主に検査・診断システムのハードウェアならびにソフトウェアを完成させるとともに、これまでの研究成果をまとめ学会で発表した。また、研究期間が終了したので3年間の成果をとりまとめて研究成果報告書を作成した。実施して得られた成果を以下に示す。1.耳鳴検査装置のハードウェアの改良は、呈示音を発生させる電子回路を制御用コンピュータの機種に依存しない方法に変更してほぼ完成した。2.検査装置とデータ処理装置のネットワーク環境の整備は、耳鳴検査装置と患者情報データベースを構築したワークステーション(サーバ)とを、イーサネットを介して接続し、耳鳴検査装置から患者情報がアクセスできるシステムを構築した。3.データベースソフトウェアの改良は、サーバ側と耳鳴検査装置側の双方にインタフェースソフトウェアを作成した。4.患者情報データベースへのカルテ情報の入力は、登録者および耳鳴検査症例を追加した。また、耳鳴治療薬の臨床効果を評価する問診票の情報も追加した。5.検査・診断システムのソフトウェアの改良は、従来のピッチ・マッチ検査、過去の患者情報を参照して事前に検査手順を決めて実施する方法およびデータベースが自由に利用できる3種類の検査モードを設けた。また、検査結果がオンライン・リアルタイムで自動的に記録でき、患者情報データベースへの構築も可能になった。以上、本年度の目標はほぼ達成でき、得られた成果は日本聴覚医学会、日本ME学会およびAuris Nasus Larynx誌で発表した。
余剰濃縮汚泥の液化を伴う遺伝子組換え光合成細菌によるエチレンの生産技術の開発

本研究は、細菌Pseudomonassyringaeのエチレン生成酵素(efe)遺伝子を導入した組換え光合成細菌Rhodobacter sphaeroides IFO12203(pRKEFE1)を用いて、余剰汚泥を高温酸発酵やラジカル反応を利用して液化した液化余剰汚泥からエチレンを生成させることを目的としている。3年間で得られた結果は以下のように要約させる。1.余剰汚泥の高温酸発酵条件の決定。昨年度に続いて、余剰汚泥の高温酸発酵のVSS容積負荷量を種々変えた連続培養を実施し、液化に適した条件を求めた。その結果、VSS容積負荷14g/lで有機酸濃度7,000mg/l(酢酸800mg/l、プロピオン酸1,600mg/l)が最適であった。そのときのVSS消化率は43%であった。2.濃縮余剰汚泥のフェントン反応による液化。濃縮汚泥20mlに対して30%過酸化水素0.75ml(終濃度1.1%),2g/lFe^<2+>溶液0.75mlを添加し、25°C,180rpmで3日間反応した。その結果、MLVSS98%減少した。この条件をもとにスケールアップした3リットルではMLVSS66%減少にとどまった。3.高温酸発酵とフェントン反応で液化した余剰汚泥を用いた組み換え光合成細菌によるエチレン生産の培養工学的研究。培養条件は暗好気振とう培養、30°Cで行った。その結果、高温酸発酵液化余剰汚泥ではエチレンの生産が認められたが、フェントン反応を利用した液化余剰汚泥からはエチレンの生産が認められなかった。最高のエチレン生産速度は50nlエチレン/ml/hr/OD610で、以前、市販低級脂肪酸(酢酸、プロピオン酸、酪酸)混合液で得られた120nlエチレン/ml/hr/OD610の42%であった。本研究は、細菌Pseudomonas syringaeのエチレン生成酵素(efe)遺伝子を導入した組換え光合成細菌Rhodobacter sphaeroides IFO12203(pRKEFE1)を用いて、余剰汚泥を高温酸発酵やラジカル反応を利用して液化した液化余剰汚泥からエチレンを生成させることを目的としている。本研究は、エチレン生成酵素遺伝子を導入した組み換え光合成細菌を用いて、余剰汚泥を高温酸発酵させることにより得た液化余剰汚泥からエチレンを生成させることを目的としている。本年度得られた結果は以下のように要約される。(Rhodobacter sphaeroides IFO 12203)へE.coliS17を用いて接合伝達により導入した。ベクターとしてPRK415を用い、プロモーターとして、Pseudomonas syringaeのエチレン生成酵素のもの、大腸菌のlacのもの、Synechococcus sp.PCC7942の光化学系IIの水分解に関与するD1タンパク質の遺伝子(psbAI)のもの3つを用い、プラスミドpRKEFE1,pRKEFE2,pRKEFE3を構築した。これらのプラスミドの中で、エチレン生成活性が確認されたものはPseudomonassyringaeのエチレン生成酵素のプロモーターを用いたプラスミドpRKEFE1を持つ株のみであった。2.余剰汚泥の高温酸発酵はpH6.5に保って、負荷量を種々変えた連続培養で実施し、低級脂肪酸混液を得た。3.市販低級脂肪酸(酢酸、プロピオン酸、酪酸)単独、あるいはそれらの混合液を用い、組み換え光合成細菌を増殖させたところ、エチレン生成が認められ、その最大値として、120nlエチレン/ml/hr/OD610を得た。

[余剰汚泥の高温液化の検討]余剰汚泥の高温液化方法は実容積1.7リットルの撹拌型リアクターを用い、処理温度53°C、撹拌速度100rpmの条件で連続処理試験を行なった。汚泥供給量を段階的に上げることによりVSS容積負荷の検討を行なった。その結果、VSS容積負荷2g/l/dayでは生成有機酸濃度は約2,000mg/lであり、反応はガス化反応まで進んでいた。この時のVSS消化率及び供給VSS当たりのガス発生量はそれぞれ52%,215ml/gであり、バイオガス中のメタン含量は約58%であった。しかし、VSS容積負荷を5g/l/day以上にすると残存有機酸濃度は増加し、消化されたVSS当たりのメタン生成収率も240mlから155mlに低下した。VSS容積負荷8g/l/dayでは有機酸濃度は7,000mg/l(酢酸,800mg/l;プロピオン酸1,600mg/l)となり、生成ガス量も80ml/g of VSSと大幅に低下したが、メタン含量は51%であった。さらに、VSS容積負荷を12,14g/lと段階的に上げたが、有機酸濃度は一定しており、VSS消化率およびメタン生成収率もほぼ一定していた。[液化余剰汚泥を用いた組み換え光合成細菌によるエチレンの生産]上記の液化余剰汚泥を用いて、本来の目的である細菌のエチレン生成酵素遺伝子を組み換えた光合成細菌、Rhodobacter sphaeroides IFO12203(pRKEFE1)を培養した。培養条件は暗好気で30°Cで行なった。しかしながら、昨年行なった市販低級脂肪酸(酢酸、プロピオン酸、酪酸)で得られた増殖、エチレン生産は観察されなかった。この原因は現在のところ不明である。本研究は、細菌Pseudomonas syringaeのエチレン生成酵素(efe)遺伝子を導入した組み換え光合成細菌Rhodobacter sphaeroides IFO12203(pRKEFE1)を用いて、余剰汚泥を高温酸発酵やラジカル反応を利用して液化した液化余剰汚泥からエチレンを生成させることを目的としている。本年度得られた結果は以下のように要約される。1.余剰汚泥の高温酸発酵による液化最適条件の決定。昨年度に続いて、余剰汚泥の高温酸発酵のVSS容積負荷量を種々変えた連続培養を実施し、液化に適した最適条件を求めた。その結果、VSS容積負荷14g/l・d(滞留時間1.8日)が達成された。この時のVSS消化率は43%で、有機酸濃度7,000mg/l(酢酸、3,800mg/l、プロピオン酸、1,600mg/l)となり、生成メタン含量は51%であった。2.濃縮余剰汚泥のフェントン反応による液化。5,000mg/lに濃縮した濃縮汚泥20mlに対して30%過酸化水素0.75ml(終濃度1.1%)、2g/lのFeSO4溶液0.75mlを添加し、25°C,180rpmで3日間反応させた。その結果、20%の無機灰分を差し引くと、MLVSSは98.4%減少した。しかし、この条件をもとに5リットル容発酵槽(実容積3リットル)を用いてスケールアップしたが、MLVSSは66%の減少にとどまった。3.高温酸発酵とフェントン反応で液化した余剰汚泥を用いた組み換え光合成細菌によるエチレン生産の培養工学的研究。光合成細菌の培養条件は暗好気振とう培養、30°Cで行った。
エイズの細胞侵入蛋白を利用したガン細胞マスターシグナル分子の解明

本研究では細胞レベルでがん化に関与するタンパク質を同定するために、TATタンパク質を用いたタンパク質導入法とミトコンドリア活性測定による新しいスクリーニング法を確立した。この手法を用いてエストロゲン非依存性乳がん細胞MCF-7より分離した3つのPeak A、B、Cについてミトコンドリア活性の測定を行ったところ、Peak Cにおいてミトコンドリア活性の低下が確認された。質量分析計による解析の結果、Peak Cに含まれるタンパク質をHistone H4と同定した。Peak AおよびPeak Bについてはタンパク質精製の途中で活性が消失した。今後抽出タンパク量を増やし、感度を上げる必要がある。(細胞培養)モデル細胞として乳がん細胞株のMCF-7を用いる。MCF-7細胞をDMEM培地で大量培養し、合計20Lまで細胞を保存した。(培養細胞からの抽出)カラムの分離を蛋白の安定に与える影響を最小限にするためこれまでのカラム精製用蛋白質抽出のプロトコールに従って行う。0.1%のTriton-Xを含む緩衝液を加えた後、オルガネラに含まれる蛋白質もできるだけ多く回収するため、超音波破砕機で細胞を溶解する。その後、遠心分離を行い、上清の細胞可溶化液を回収した。(イオン交換カラムによる精製)蛋白質の分離が最も効果的に行えるようにpH、カラム流速、塩濃度を確立した条件設定で行う。つまりFPLC(Bio-CAD現有)に大量精製用の陰イオン交換カラムHi-Trap HQカラム(GEヘルスケア)を接続し、細胞可溶化蛋白を移動相で希釈した蛋白質溶液を移動相からカラムに注入した。できるだけ多くの蛋白質を吸着させるため、移動相はpH8.0に合わせ、すべての溶出液を2mlづつフラクションに分離した。(脱塩・濃縮)分離したフラクションを限外ろ過に通して溶液を交換し、脱塩した後、10倍濃縮した。濃縮サンプルを活性測定に用いた。(SDS-PAGEゲルでの分離)全てのフラクションをSDS-PAGEゲルで分離した後、CBB染色でタンパクを検出した。各フラクションで10以上のタンパクが分離され、十分に脱塩と濃縮は行われていることを確認した。(活性測定)濃縮したフラクションをHIVのTATタンパク質を用いてHCC38細胞にタンパク質導入を行った。導入し細胞で多くの細胞死が観察され、タンパク質導入の条件検討を行う必要がある。本研究の目的は、申請者らが開発した独自のシステムを駆使して1モデル細胞として乳ガン細胞のタンパク質を分離精製後、正常細胞に導入し、ガン化のマスターシグナル伝達分子を解明するシステムを確立する。2難治性乳がんの臨床分離細胞を用いて実際にガン化制御するマスター分子を同定する。3質量分析計を用いて同定されたシグナル分子の翻訳後修飾を解明し、ガン化のメカニズムを明らかにすることである。(実験の概要)目的1を達成するため、子宮頸がん細胞HeLaをDMEM培地で大量培養し、培養細胞を0.1%のTriton-Xを含む緩衝液を加えた後、超音波破砕機で細胞を溶解する。タンパク質をFPLC(Bio-CAD現有)に大量精製用の陰イオン交換カラムIon-Trap(GEヘルスケア)をアプライし、タンパク質分画を分離した。この分離タンパク質をこれまでに確立した手法に従い、正常子宮上皮細胞に導入したが、有意な表現型の変化は顕微鏡下では観察されなかった。このため、細胞の表現型の変化を高感度に観察できるシステムを確立するため、細胞ミトコンドリア膜電位の活性をハイスループットで測定できるシステムを検討している。また、同時に細胞数を検定できるように核染色試薬を自動分注装置で測定し、ミトコンドリア活性と同時測定するシステムを検討している。現在のこのシステムをINCELLアナライザーで高速蛍光画像を取得できるようになり、再度蛋白導入実験を再開する予定である。このことから、Histone H4がミトコンドリア活性を抑制する可能性が示唆された。今後はHistone H4がどのようにしてミトコンドリア活性を抑制するのか検討を行っていく。分離の途中でタンパク質の分解や脱リン酸化によって活性の消失が引き起こされた可能性がある。そのため、今後抽出タンパク量を増やし、感度を上げる必要がある。申請者らは、エイズウイルスの細胞侵入に関与するTATタンパク質を用いて高効率で培養細胞に活性化タンパク質を導入するシステムの開発に成功した。この活性型タンパク導入システムを用いてガン細胞の活性型タンパク質を正常の細胞に導入し、生理機能の変化を観察することで正常細胞がガン細胞へと変化する活性制御マスターシグナル伝達分子を明らかにする。

本研究の目的は、モデル細胞として乳ガン細胞のタンパク質を分離精製後、正常細胞に導入し、ガン化のマスターシグナル伝達分子を解明するシステムを確立すること、難治性乳ガンの臨床分離細胞を用いて実際にガン化制御するマスター分子を同定すること、質量分析計を用いて同定されたシグナル分子の翻訳後修飾を解明し、ガン化のメカニズムを明らかにすることである。本年は、臨床サンプルから転移や再発乳ガンのサンプルを用いて、これまでに確立した技術で培養細胞を調整する。つまり、コラゲナーゼB、DおよびプロテアーゼXIVを用いて細胞を分散し、コラーゲンコートしたシャーレで培養する。本年は研究成果を臨床に応用するために、正常細胞と乳ガン細胞が混在した乳ガン組織から、乳ガン細胞を分離する技術の開発を行った。乳ガンの手術直後に組織を分散し臨床分離株の条件検討を行った。市販のキットでは、いずれも正常細胞と乳ガン細胞は分離されず、分離されても多くの細胞が死滅していた。そこで、酵素による組織分散を行いながら細胞培養を行うことで細胞の生存率を向上させる条件を検討した。その結果、乳ガン細胞の回収率は10倍以上に増加し、乳ガンと正常細胞、それぞれの臨床分離細胞の取得に成功した。約20人から分離した乳ガンの臨床分離細胞の中でも増殖が異常に早く悪性度の高い細胞について標的遺伝子の解明を行う。本研究では細胞レベルでがん化に関与するタンパク質を同定するために、TATタンパク質を用いたタンパク質導入法とミトコンドリア活性測定による新しいスクリーニング法を確立した。この手法を用いてエストロゲン非依存性乳がん細胞MCF-7より分離した3つのPeak A、B、Cについてミトコンドリア活性の測定を行ったところ、Peak Cにおいてミトコンドリア活性の低下が確認された。質量分析計による解析の結果、Peak Cに含まれるタンパク質をHistone H4と同定した。Peak AおよびPeak Bについてはタンパク質精製の途中で活性が消失した。今後抽出タンパク量を増やし、感度を上げる必要がある。タンパクを同定する質量分析計がトラブルを起こし、修理する時間が必要であった。質量分析計だけでなく前処理HPLCのチューブの劣化も確認され、チューブの総交換を行い、再度解析を行った。このトラブルの過程で精製したタンパク質の多くが損失し、再度精製し直す必要が生じた。修理後、解析したタンパクは一部同定されたが、大量に存在するタンパクが同定されており、目的とするがん活性化因子であることを確認する必要がある。病態生理学質量分析計が安定している状況で、さらに大量のタンパクから精製をやり直す必要がある。このため、解析カラムの用量を増やすために従来のカラムをタンデムにつなぎ、精製を行う。さらに大量のタンパクを抽出し、活性を測定する。タンパク精製が不調の場合は、抗体アレイや次世代シークエンス解析を行うなど代替方法を検討する。細胞の活性を測定する機器が不調で修理を依頼していたが、修理に数ヶ月の時間がかかり、実験が中断してしまった。細胞活性の測定システムが十分に機能せず、測定ができなかった。
Ｆｌｏｅｒ理論、正則曲線の理論とｓｙｍｐｌｅｃｔｉｃ構造・接触構造の研究

symplectic構造は、古典力学におけるHamiltonの運動方程式の定式化などで重要な幾何構造である。近年は、symplectic構造そのものの幾何学的研究が進展し、ミラー対称性の数学的研究と相俟って多くの研究者が関心を持つ対象となっている。研究代表者は、symplectic幾何学で特に重要なFloer理論とその応用の研究を続けている。今研究計画においては、Floer理論をトーリック多様体とそのLagrangeトーラスファイバーに対して、具体的な研究をし、いくつもの興味ある結果を得た。深谷賢治氏、Yong-Geun Oh氏、太田啓史氏とで共同研究によるLagrange部分多様体のFloer理論を具体的な設定で詳細に調べるにとを中心に引き続き共同で研究を進めた。具体的には、コンパクトトーリック多様体の中に運動量写像のファイバーとして現れるLagrangeトーラスのFloer理論を、我々が一般論の中で定義したpotential functionのJacobi環を通して調べ、それをmirror対称性理論の中で理解することやsymplectic幾何の問題に応用するにとである。トーリック多様体がFano多様体となる場合には今年度中に出版された論文の中で確立されたが、Fano多様体とはならない場合のJacobi環の定義や扱いには精密な完備化が必要となる。また、我々は一般的な枠組みでFloer理論のbulk変形を考察していたが、この状況ではbulk変形を用いることでLagrange部分多様体のdisplaceabilityに関するよりよい結果を得ることができる。またbulk変形によりPotential functionのminiversal deformation familyが得られることもわかる。にれらについては既に投稿済みの論文と近い将来には公表できると思われる現在準備中の原稿とで論じた。このような研究は、トーリック多様体のトーラスファイバー以外の場合にも広げられる可能性があり、実際野原-西納-植田3氏によるトーリック退化のアイデアを用いた研究もある。そうした中で、我々も、面積の等しい2次元球面の直積として得られる4次元symplectic多様体の中のトーラスファイバーではないLagrangeトーラスの1径数族でdisplaceableでないものがあることを示した。これらの研究の他にAnti-symplectic involution and Floer cohomology,Anchored Lagrangian submanifolds and their Floer theoryも纏めた。前年度に引き続き、compact toric多様体のLagrangian torus fiberのFloer理論を中心に研究を進めた。昨年度出版された論文と現在校正中の論文とでは、Lagrange torus fiberのpotential関数の臨界点とFloer cohomologyの非自明性やそのsymplectic幾何への応用などが得られているが、さらに進めた視点からpotential関数のJacobi環と大量子cohomology環の同型、それらに導入されるpairingsの対応などについて250ページ程の論文にまとめた(深谷,Oh,太田との共著)また、この研究により、Hamilton微分同相群あるいはその普遍被覆が実数に値をとる本質的に異なる擬準同型の連続族をもつようなcompact toric多様体があることも分かった。この擬準同型についても論文を準備中である(深谷,Oh,太田との共著)。この他にも、面積の等しい2次元球面の直積はHamilton変形で自分自身と交差を外せないようなLagrangian torusの連続族を含むことを示した論文(深谷,Oh,太田との共著)や、2次元商特異点のリンクのsymplectic充填の分類に関する論文(Bhupalとの共著)を再検討し、加筆修正した。深谷,Oh,太田との共著の本のTheorem Jの証明に不備が見つかったため、symplectic cylinderの中のPolydiskのdisplacement energyの評価とともに論文(深谷,Oh,太田との共著)を準備中である。研究代表者小野は深谷賢治氏(京都大学)Yong-Geun Oh氏(Wisconsin大学Madison校)太田啓史氏(名古屋大学)とLagrange部分多様体のFloer理論の研究を続けている。今年度は、compact toric Kaehler多様体をA-model側、Lagrangeトーラスファイバーに付随したpotential関数の普遍開折をB-model側としたmirror対称性についての研究、Hamilton微分同相写像のスペクトル不変量及びHamilton微分同相写像群の研究を論文として纏めて投稿した。特に前者の研究では、compact toric Kaehler多様体の大量子コホモロジー環と、Lagrangeトーラスファイバーのpotential関数のJacobi環の間に環同型を然るべき正則曲線のmoduli空間を用いて構成し、さらにこの同型が両者のそれぞれに定義されるpairingを保つことを示した。この仕事に続き、compact toric Kaehler多様体の深谷圏の生成系についてM.Abouzaid氏と我々4人の共同研究を纏めている。Abouzaid氏は与えられた深谷圏のobjectsの集合が深谷圏を分裂生成するための十分条件を得ていた。前述の我々の研究では、potential関数の臨界点としてFloer cohomlogyの消えないLagrangeトーラスファイバーとbounding cochainsの組が対応する。

それらがAbouzaid氏の十分条件を満たすことがわかることから分裂生成系を得ることができるというのがその粗筋である。この研究は国内外の研究者の興味を引き、研究集会などで講演を行っている。2.コンパクトトーリック多様体のホモロジー的ミラー対称性予想に関する4人の論文Lagrangian Floer theory and mirror symmetry on compact toric manifoldsにあったいくつかの技術的な誤謬を修正した。この論文は平成25年度中に出版できる形になると考えている。他にもAnti-symplecticinvolution and Floer cohomologyの中のあるmoduli spaceの扱いかたを精密にし、出版可能な原稿にすべく努力をした。深谷氏、Oh氏、太田氏と小野によるcompact toric Kaehler多様体の運動量写像のファイバーとして現れるLagrangeトーラスに対してLagrange部分多様体のFloer理論を具体的に研究するプロジェクトは順調に進んでおり、今年度中にも200ページ超の論文にその成果をまとめ、投稿中である。関連したHamilton微分同相写像のスペクトル不変量とその応用についても論文をまとめた。これらの仕事に続くompact toric kaehler多様体の深谷圏の生成元に関するAbouzaid氏と我々4人の共同研究は、論文としてまとめるまでには至っていないが、それに向けた検討を続けている。25年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画にあるLagrange部分多様体に対するFloer理論の応用は、今までおおむね順調に進んでいる。今年度の始めに、倉西構造による仮想基本類/基本鎖の構成について質問を受けたのでそのために解説論文Technical details on Kuranishi structure and virtual fundamental chainを深谷氏、Oh氏、太田氏と共に準備した。倉西構造の理論を広く浸透させるために役立つと期待している。この仕事にかなりの時間を使ったが、今後の研究で必要に応じて引用できることから我々にとっても有用なものとなるであろう。toric多様体のホモロジー的ミラー対称性予想への応用を見込んだM. Abouzaid氏と我々4人の仕事に関する論文の草稿について検討した。この研究結果は既にN. Sheridan氏の研究などで使われ初めている。今年度の達成状況は以上の通りである。
新しい緑内障治療薬-Prostaglandins-開発に関する基礎的・臨床的研究

PGF_<2α>又はD_2はその刺激性のため臨床応用には難があった。一方、PG関連新規化合物であるUF-021点眼液は刺激性が少なく、且つ人眼眼圧下降作用を示すことより新しい緑内障治療薬として可能性がある。今回我々はUF-021を健常成人有志者に投与し、その房水動態及び血液房水柵透過性に及ぼす影響を調べ、その眼圧下降機序について検討した。健常成人有志者の片眼にUF-021点眼液0.12%を単回点眼し、他眼をcontrolとして房水蛋白濃度の変化をレ-ザ-フレアセルメ-タ-を用いて、また眼圧を圧平眼圧計を用いて経時的に測定した。その1週間後に同様に他眼をcontrolとして、フルオロフォトメトリ-を用い、点眼前後の房水流量の変化を経時的に測定した。更にその1週間後に他眼をcontrolとして点眼前、及び点眼4時間後にトノグラフィ-を施行し、房水流出率を測定した。測定した房水蛋白濃度及び房水流量より、血液房水柵透過性の指標として血漿中から房水への蛋白流入率(Kin)を算出した。UF-021点眼液は点眼3時間後から10時間後に渡り有意に眼圧を下降させた(最大1.6mmHg)が、房水蛋白濃度、Kin、房水流量、房水流出率についてはいかなる時点においてもcontrolとの間に有意差は認められなかった。UF-021点眼液は房水産生量、房水流出率を変化させずに眼圧を下降させることからuveoscleral outflowの増加、あるいは上強膜静脈圧の低下により眼圧下降をもたらすことが示唆された。UF-021は従来の眼圧下降薬とは異なった作用機序を有し、且つ血液房水柵透過性には影響を与えないため、新しい緑内障治療薬として有力である。実験対象動物として,猫は安定した供給が得られない事が判明したため家兎眼を用いて,PGF_<2α>及びPGD_2の,眼圧下降機作,BAB透過性に対する作用を比較検討した。1.房水流量の検討:フルオレセインを角膜内に投与するJones-MauriceのII法で行った。PGD_250μg点眼により,点眼側の房水流量は3.00±0.17μe/分(平均±SD,N=13)とコントロール側の3.58±0.22μe/分に比べて有意に低下した。2.Uveo-scleral flowの検討:Pedersonの方法により行った。PGF_<2α>(50μg)では,コントロール側0.15±0.02μe/分(N=7)に対べ0.21±0.03μl/分と有意に増加,これは従来の報告とよく一致した。一方PGD_2(50μg)点眼ではコントロール側の0.15±0.02μl/分(N=8)に対し,0.16±0.02μe/分と,全く変化がみられなかった。更に,Uveo-scleral flowを低下させる薬物ピロカルピン前処置のPGF_<2α>,PGD_2の眼圧下降効果に対する影響を検討した所,ピロカルピンによりPGF_<2α>の作用はブロックされたが,PGD_2のそれは影響をうけない事が分った。3.BAB透過性に対する影響:FITC-ウサギアルブミンを,静注し,その前房中濃度を測定する事により検討した。PGF_2は,BAB透過性を促進させたが,PGF_<2α>は,変化を与えないか,又は前房中FITCーアルブミン濃度を逆に低下させる事が分った。一方,フルオレセイン静注後の前房中フルオレセイン濃度は,PGD_2点眼側と,コントロール側で差をみなかった。4.眼圧下降効果:PGF_<2α>のPGD_2とも家兎眼眼圧を,容量依存性に下降させたが,外眼部刺激症状は,PGF_<2α>はPGD_2に比べ遙かに強かった。以上PGD_2の眼圧下降機作は,PGF_<2α>と全く違う事が分かった。更にプロスタグランディンの眼に対する作用は,一律でなく複雑な事が分かった。