hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
酸化ストレス・病態マーカーとなる酸化リン脂質の高感度定量系の構築

動脈硬化症の発症要因である生体内の酸化LDLは、これまでその性状がほとんど分かっていなかった。本研究では、1LC-MS/MSを用いて酸化ホスファチジルコリン(PC)の高感度定量法を構築し、LDL酸化過程で生じる種々酸化PCやリゾPCを検出できるようにした。2陰イオン交換カラムとモノクローナル抗体を用いて、電気泳動度の増加、抗酸化PC抗体陽性を示すヒト血漿中の酸化LDLの分離に初めて成功した。酸化LDLは、全身性あるいは組織局所での酸化ストレスを評価するマーカーとなる可能性が期待できる。1酸化LDLは心血管疾患の発症要因であり、予後予測因子の可能性も期待されている。LDL酸化に伴う特徴的な脂質の変化を知るために、硫酸銅酸化したLDL中のリン脂質プロファイルを質量分析法で調べた。ヒトLDLを硫酸銅で酸化すると60分程度のラグタイムの後、急速にTBARS値の上昇、アガロース電気泳動度の増加が見られ、その後プラトーに達する。この時急速にPUFA含有PCが減少しlysoPCが増加した。PAF-AHを失活させたLDLでは、lysoPCの生成が著しく抑制された。蓄積が確かめられた主な酸化PC分子種、C34:2-PCやC36:2-PCのOH化体、あるいは9CHO-PCであり、いずれもリノール酸含有分子種に由来するものと考えられた。アラキドン酸、EPA、DHAを含有するPC分子種はほとんど消失していることから、これら二重結合の多い脂肪酸が酸化された場合には、さらに二次的な酸化産物にまで変換したり、あるいはPAF-AHで代謝されるなどで、迅速に失われるのではないかと考えられた。2ヒト血中酸化LDLの性状を知るため、HiTrapQカラムを用いて、LDLを分画した。吸着画分に酸化LDLが濃縮し、アガロースゲル電気泳動度の増加、抗酸化PC抗体反応性の上昇を確かめた。意外なことにリゾPC、酸化PCの蓄積は見られず、循環血中では、生成した酸化PCはlysoPCに代謝され、さらにリゾPCは容易に再アシル化、あるいは別のリポタンパク質や細胞膜に移動して、酸化LDL粒子上に蓄積し難いと考えられた。3歯肉溝滲出液中の酸化LDLについて調べるため、酸化LDLのELISA検出条件の改善した。予備検討から歯周病部位から採取した歯肉溝滲出液中に酸化LDLが多い可能性が指摘され、現在多数検体による検討と脂質プロファイル検討のための準備を進めている。LC-MS/MS装置(QTRAP5500)を用いて、酸化LDL中のリン脂質分子種を網羅的に解析した。主要なPCおよび酸化PCをMRM法で、別々に高感度かつ定量的に扱うことができ、硫酸銅によるLDL酸化過程の経時的な変化を分析した。ヒトLDLの酸化反応の進行には30-60分のラグタイムがあり、急激にPUFA含有PC分子種の消失とlysoPCの生成が認められた。lysoPCの生成は、PAF-AH阻害剤のpefablocによりほぼ完全に抑制されたことから、PAF-AHによる酸化PCの加水分解によって生成したものと考えられた。lysoPCの生成に先立って、長鎖型酸化PC分子種の一過的な生成が認められ、PCの酸化変性が、長鎖型酸化PC→開裂型酸化PC→lysoPCへと進行する様子が示された。ウサギLDLについても硫酸銅による酸化過程を調べたところ、ほぼ同様の経過をたどることが分かったが、面白いことにlysoPCの生成量がはるかに少なかった。動脈硬化の好発性との関連が考えられる。PAF-AH阻害剤存在下ではlysoPCの生成が抑制されるにも関わらず、開裂型酸化PCの蓄積はそれほど大きなものではなく、さらに異なる代謝産物に転換している可能性が考えられた。予備的な検討ながら、LDL中の生体内酸化LDLを抗酸化PC抗体で吸着・回収した画分について、含まれるPC分子種を調べてみた。硫酸銅処理で調製した酸化LDL中には著しいlysoPCの蓄積が認められたのに対し、生体内酸化LDL画分にはほとんどlysoPCが認められず、血中では生成したlysoPCが再アシル化するあるいは周囲の細胞などに移行してしまう可能性があると思われた。LDLの参加に伴って生じる酸化リン脂質は、様々なルートで代謝され多様性を増しているものと思われる。動脈硬化症の発症要因である酸化LDLは、全身性あるいは組織局所での酸化ストレス状態を評価マーカーとなる可能性がある。生体内の酸化LDLの性状はほとんど分かっておらず、分子レベルでの解析により、その特性を明らかにすることが必要である。本研究では、1LC-MS/MSを用いた酸化ホスファチジルコリン(PC)の高感度定量法を構築し、硫酸銅によるLDL酸化過程の経時的な変化を分析した。酸化変性の進行に伴い、急激なPUFA含有PC分子種の消失とリゾPCの生成を検出した。

さらに、このリゾPC生成がPAFアセチルヒドロラーゼ依存的であることを確認した。硫酸銅処理ウサギLDLでもほぼ同様の経過をたどることが分かったが、リゾPCの生成量はヒトLDLよりも少なく、ウサギでは動脈硬化がヒトよりも進展し難いこととの関連が考えられる。2陰イオン交換カラムとモノクローナル抗体による固相吸着によって、ヒト血漿中の酸化LDLを分離することに成功した。分離した画分のLDLは、陰性荷電の増加によりアガロースゲル電気泳動での移動度が増加した。また、抗酸化PC抗体によりウエスタンブロットで検出され、血漿中の酸化LDL様の性状を示すLDL粒子の存在が生化学的に立証できた。このヒト血漿中の酸化LDLのリン脂質分子種をLC-MS/MSを用いて分析したところ、銅酸化LDLとは異なり、ほとんどリゾPCの増加は認められず、生体内酸化LDLには銅酸化LDLとは大きな違いがあることを見出した。血漿中では、酸化LDL中に生じたリゾPCが速やかに再アシル化を受けて再びPC分子となるため、過剰な蓄積が起こり難い可能性が考えられた。生体内での酸化LDL中での脂質代謝の動きを明らかにするために、安定同位体標識脂質プローブの作製の準備を始めている。9CHO-PCのような比較的安定な酸化PC分子やアポBタンパク質の修飾構造も検出されており、酸化ストレスのマーカーとなる可能性について、多くのヒト血漿サンプルの分析例を集めて検証したい。生化学酸化LDL中の脂質プロファイルの検討が進み、主な酸化リン脂質分子種がいくつか特定できた。この成果については、平成25年度末に論文発表した。さらに、ヒト血漿中に存在する酸化LDL中の脂質プロファイルの特徴についても、予備的検討が進んでおり、現在検証中である。当初の予想とはやや違った結果であるが、生体内での酸化LDLの挙動をより明確化できる可能性があり、さらにもう一歩解析を進め研究を展開したい。平成24年度の主要な目標は、LC-MS/MSを用いた酸化ホスファチジルコリンの測定法を導入することである。昨年度は装置の使い方を練習し、予備的な検討をした段階であったが、この1年間で主要なホスファチジルコリン、酸化ホスファチジルコリンの分析パターンがほぼ分かってきて、MRM法による定量的な一斉分析をルーチンに行える体制が整いつつある。ホスファチジルコリンの酸化物の中には、微量の産物も多く、構造未知のものもあり、今後徐々に分析系を向上させていきたい。ヒト血漿中の酸化LDLの分離・回収については、今年度試みていた抗酸化PC抗体を用いた固相吸着法では、スケールアップがやや難しいこと、固相プレートのブロッキング条件がなかなか最適化できないことなどの問題点が生じ、少し異なる手法を試みながら、分離条件を改善する必要がある。これを含めて、酸化ホスファチジルコリン分析の応用を進めることが平成25年度、26年度の目標である。1血漿中の酸化LDLの脂質プロファイルが、硫酸銅処理で調製した酸化LDLと大きく異なっている可能性について、データの検証を行う。このことは、血漿中の酸化LDLの挙動の特徴を表している可能性があり、興味深い。lysoPCのリポタンパク粒子間の移動性についての検討から、脂質の代謝の速さについて明らかにすることも一つの展開である。
豪雪地帯の南限に位置する森林流域からの水・栄養塩流出－積雪・融雪期に着目して－

中国山地は、豪雪地帯に分類されるが、降雪期の平均気温が比較的高いため(-21°C程度)、将来の温暖化による水・栄養塩循環への影響が顕在化しやすいエリアとされる。このため中国山地の森林流域において、a)降雪ー流出の一連の実態を定量的に把握し、b)積雪・融雪期の栄養塩の生産過程や流出特性について評価することの意義は大きい。本研究では、鳥取大学・蒜山研究林を活用し、積雪・融雪期の水と栄養塩の流出について上述aとbの観点から明らかにする。これにより、中国山地での水源涵養機能の評価や今後の富栄養化対策に資する知見を得る。
臨床倫理コンサルテーション普及のための課題解決の確立

各医療機関における臨床倫理委員会および臨床倫理コンサルテーション活動を支援するための遠隔スーパーバイズのシステムを立ち上げるための、介入検証を実施した。当教室の臨床倫理に関するセミナーを受講したもののうち、実際に臨床倫理委員会もしくは臨床倫理コンサルテーションの活動を行なっている医療者を対象に、モニター参加者を募集した。結果、14施設がエントリーし、グループ(委員会)での参加が8施設、個人での登録が6施設であった。エントリー施設は、初回のスーパーバイズが、メールによるスーパーバイズ、ネット会議システムによるスーパーバイズに、それぞれ7施設づつに無作為に割り付けられた。施設は、エントリーされた施設は、6ヶ月間のモニター期間中、最低1ケース以上、メールおよびネット会議システムをそれぞれ利用してもらうこととした。利用者は、1回のみ利用した施設が3施設、2回利用した施設が5施設、3回利用した施設が2施設、登録したものの一度も利用しなかったのが4施設であった。最終的に、遠隔スーパーバイズ総利用件数は19件、うちメール10件、ネット会議システム9件の利用となった。各参加者には、利用前後にアンケート調査に解答してもらうこととし、スーパーバイザーはルーブリックによる評価を行ない、主観と客観的な面から、支援の効果を評価した。初期のリクルートでは参加施設が十分に集まらず、追加募集を行わなければならなかったことと、遠隔スーパーバイズの依頼も当初の期間では依頼が足りなかったために、期間を延長せざるを得なかったたため、これは、各医療機関で、臨床倫理委員会への依頼件数が年間数件程度あることから、モニター期間に適切な案件が発生しなかったことも原因と考えられる。次年度は、評価の結果を解析するとともに、解析結果をもとにシステムの改善を行い、恒常的な臨床倫理の支援システムのあり方を構築する予定である。また、臨床倫理コンサルテーションの参考資料の作成を行う予定である、実効性のある臨床倫理コンサルテーション: web会議システムなどを使用した遠隔での実践研修の確立するために、複数のweb会議システムの検証を行った。結果、その安定性などからZoomを使用することになった。また、臨床倫理コンサルテーション研修の方法を確立するため、web会議をシステムを使用するスーパーバイズ、電子メールを使用するスーパーバイズの二つの方法を導入し、比較検討することとした。参加者はこれまで、研究代表者の主催する臨床倫理セミナーの受講生をリストアップし、すでに臨床倫理コンサルテーション活動を行っているものを対象に応募メールを送付した。また臨床倫理コンサルテーションのスーパービジョンの効果を検証するための方法の選定を先行文献を中心に行い、カークパトリックモデルに基づくことを決定した。さらに臨床倫理コンサルテーションの質を評価するためのルーブリックの作成を行った。臨床倫理コンサルテーションの具体的な方法論の確立:比較考量の参考基準を作成するために、主要な原則・義務が衝突するような倫理的問題において、一般的な日本人がどのように考えているか、また医療者はどのように考えているかについて全国調査を行うことにより「蓋然性」のある方向性についての参考資料を作成する。本年度は、主要な倫理的問題を抽出するために、出版されている書籍からケースを抽出し、ケースに内容を分類する作業を行った。スーパービジョンの方式の決定に時間がかかったものの、H30年度の実施に向けての準備は整ったため、概ね当初の予定通りに進行している。臨床倫理コンサルテーションの具体的な方法論の確立に関して、「蓋然性」を中心とした参考資料を作成するための質問紙調査を順次進めていくと同時に、研修としての臨床倫理コンサルテーション・スーパービジョンを開始していく。また、臨床倫理コンサルテーションの参考資料の作成を行う予定である、蓋然性に関する質問紙調査が遅れていること、研究成果が遅れているため学会発表がなかったことにより旅費の使用が限定された。

また、遠隔スーパービジョンの使用するための必要機器の購入も次年度に持ち越しになったため、物品費の使用が行われなかった。最も研究費用を使用する、資料作成のための全国調査がまだ実施に至っていないため、次年度使用額が生じている
マウスモデルを用いたブラキシズム発症におけるアネキシンA5の機能解析

ブラキシズムは、何らかの原因で咀嚼筋が異常に緊張し、咀嚼、嚥下、発語などの機能的運動と無関係に歯を食いしばり、歯ぎしり、噛み合わせる習癖である。ブラキシズムは一般にストレスなど環境要因によっても増悪するが、その発症には遺伝的素因がより強いことが類推されながら、現在まで原因遺伝子はもとより、咀嚼調節異常発生の分子メカニズムについても十分に明らかでない。さらには、遺伝的にブラキシズムを高頻度で発現し有用な治療法を検証するための前臨床段階で利用できるようなモデル動物の報告は無かった。本研究によって、アネキシンA5(Anxa5)の機能欠損マウス(Anxa5-/-)がヒトのブラキシズムと類似した多くの表現型を示すことを見出した。Anxa5-/-マウスでの、Anxa5-lacZの解析からAnxa5が腱の骨付着部位、骨膜、歯根膜に高い発現を示すことを見出した。両アリルがAnxa5-lacZとなったAnxa5 KOマウスでは、腱の骨付着部位において特異的な骨の肥大化が認められた。とくに、顎顔面領域においては咬筋の下顎骨付着部で骨の肥大化が認められた。歯周組織においては、歯根膜腔拡大や歯根根尖部セメント質吸収などの炎症様像が認められた。さらに、臼歯を解析したところ咬合面の咬耗が認められ、また、口蓋骨における骨隆起が認められた。すなわち、Anxa5 KOマウスでは骨、歯、歯周組織においてヒトに現れる病態に類似した表現型を呈することを見出した。
学術研究支援のための超高速情報通信網の研究開発

大学構内に整備が完了しつつある学内LANには、百メガビット/秒の速度の伝送方式を採用しているが、今後の学術研究の基盤となる情報通信網の整備に当たっては、ス-パコンピュータに対する超高速なインタフェースや超高速画像処理装置等をも統一的に制御するネットワーク方式を開発し、これにより新たな学術情報ネットワークを実現することが要請されている。このために平成5年度に試作した超高速通信網を実現するATM(非同期伝送モード)装置を、昨年度に設置した155メガビット/秒の超高速回線に接続し、その超高速通信網制御の品質制御の実証評価を行った。具体的には、応用の要請に応えて品質制御を実現する基盤ソフトウェアの評価、動画像の高能率伝送を可能とする新たなプロトコル(ST2)の提案と評価、情報の伝送帯域を管理する試作装置の性能評価、低速の情報伝送に適合させた網資源管理方式の評価を順次実施し、範囲を拡大した実験網により総合的な実証を併せて行った。この成果は、平成7年11月に実施した国際シンポジウムで公開し評価を得ている。同時に、G7諸国で計画している国際テストベッドに於いて方式の提示を行い、次年度以降に普及を図るための準備を実施した。超高速通信網を活用する応用の開発では、電子図書館システムの開発に加えて、平成7年に米国で開催された国際会議にて分散協調の一つの実現であるネットワークベビ-を提案しており、更に画像の分散蓄積の効率化を図る方式の提案と実証を行い、上記のシンポジウムで公開している。一方、超高速通信網の即時的伝送特性を遠隔治療に活用する目的で、脳血管撮影を例として実現性を評価している。これらは、共同研究を実施するNTTの公開成果報告にても提示しており、評価が寄せられている。以上の成果の実用化の用意も進めている。
AML1/PEBP2αBプロトオンコジーンによる造血制御の分子メカニズム

ヒト急性白血病におけるもっとも高頻度の遺伝子異常の標的であり、かつ成体型造血成立において中心的役割を担う転写調節関連因子、AML1(PEBP2 αB)、による造血制御作用の分子メカニズムについて、マウス胚幹(ES)細胞のin vitro実験システムを用いて検討した。その結果、以下の諸点を明らかにした。1. AML1欠損ES細胞における造血障害がAML1b(PEBP2 αB1)cDNAのノックインアリルからの発現によってレスキューされることを見い出し、もって、AML1欠損マウスにおいて認められた造血障害が正しくAML1遺伝子活性のみの欠損にもとづいていることを証明した。2. AML1には多くのスプライス・バリアントの存在が知られているが、すくなくともそのAML1b(PEBP2αB1)アイソフォームは造血制御における生物活性を有していることを明らかにした。3.マウスAML1遺伝子座はゲノムインプリンティングによる制御を受けていないことを明らかにした。5.現在以下について検討を進めている。1)ノックインES細胞を用いたキメラマウス作成によってこのAML1の生物作用がin vivoでも認められるか否か検証する。2)AML1変異体cDNAをノックインさせることによってその変異の及ぼす生物作用を検討する。
アジア都市国家における「日本型授業研究・校内研修モデル」導入の可能性に関する研究

本研究により、シンガポールおよびインドネシア・バンドン市において「授業研究(Lesson Study)」による授業改善ならびに現職教員研修に着目した結果、1授業研究およびそれを支える校内研修体制において理論的研究が進展していること、2協同的教材研究の導入や児童の予想される反応を織り込んだ指導案開発など、「日本型授業研究モデル」が現地の教員高度化のニーズと合致した形で展開されていることが明らかとなった。本研究は,アジア諸国における「授業研究(Lesson Study)」による授業改善ならびに現職教員研修、とりわけ「校内現職研修」体制の整備に注目し、アジアにおける都市型国家および中核的都市において、1授業研究およびそれを支える校内研修体制がどのように整備されようとしているか、2それらの国・都市において、「個に照らした指導」を特徴にした「日本型授業研究モデル」の有効性の検証を目的としている。本年度の主な研究成果を研究実施計画書に照らして示せば,次の通りである。1本年度焦点化したシンガポールおよびバンドンの二都市で行われている校内研修体制の構築には、日本の授業研究の先例と経験が大きく寄与し、「日本型授業研究」がモデルとして機能していることが明らかになった。(論文・学会発表で報告)2インドネシア・バンドンにある小学校において「日本型授業研究」の特徴的な研究手法の一つである「授業記録」に基づく授業研究を行い、その効果について検討を行っている。その成果については、来年度の世界授業研究学会で発表する予定である。今年度は、計3回の研究会を行った。第1回は、9月に東海市教育研究所にて、本年度の研究計画および研究課題の再確認を行った。第2回は、10月に日本教育方法学会に併せて福井大学にて、各自の研究内容の交流及び12月のWALSに関わる打ち合わせを行った。第3回は、2月に名古屋大学にてインドネシアの授業研究について報告と意見交換を行った。最後に、研究実施に当たって得られた国際研究者交流の実績を記す。本年度の研究によって、アジア諸国の同世代の研究ネットワークを築き,深める手がかりが得られたことは、研究の土台をなす研究の実績である。具体的には、シンガポールEdmund LIM氏とインドネシア教育大学のTatang Sratno氏の名を挙げることができる。本研究は、アジア諸国における「授業研究(Lesson Study)」による授業改善ならびに現職教員研修、とりわけ「校内現職研修」体制の整備に着目し、アジアにおける都市型国家および諸都市において、(1)授業研究およびそれを支える校内研修体制がどのように整備されようとしているのか、(2)それらの国において「個に即した指導」を特徴にした「日本型授業研究モデル」の有効性の検証を目的としている。本年度の主な研究成果を研究実施計画に照らして示せば以下の通りである。(1)国内研究会において、シンガポールの教育状況に関するワークショップを実施した(日本教育方法学会第47回大会・秋田大学、「授業記録を活用した国際比較授業分析」2011年10月1-2日)(2)国際学会において、日本型授業研究モデルの主要な手法である授業分析に関するシンポジウムを行った。(World Association of Lesson Studies・11月27日)(3)「日本型モデル」となる授業の学習指導案を翻訳し、プレテストを実施した。(幸田町立坂崎小学校・第6学年理科「水のゆくえを探ろう(植物のからだのはたらき)」・2011年6月21日)(4)インドネシアにおける現地調査の実施・・・現地の小学校3校においてプレレクチャー、研究授業、事後調査を実施した。(ジャカルタ市およびバンドン市、2011年3月26日30日)今年度は計3回の研究会を行った。第1回研究会は、名古屋市において研究目的及び年度計画の確認を行った(名古屋市・7月2日)。第2回研究会は、教育方法学会のワークショップ実施後に行った(秋田市・10月2日)。第3回研究会を実施し、各自の研究の進展と調査結果の報告・調査予定事項の確認を行った(東海市・2012年1月9日)。共同研究及び単独研究の両面から、学会等での発表並びに論文等による成果が出始めていることによる。とりわけ、シンガポールおよびインドネシアとの共同研究に成果が得られたことが大きい。具体的には、研究代表である久野弘幸は、インドネシア教育大学スラトノ氏との連携により愛知教育大学生活科教育講座紀要『生活科・総合的学習研究』誌に「Lesson Study Development in Asian Countries」を執筆したこと、モハメド・アラニは、福井大学での教育方法学会において「授業逐語記録にもとづく比較授業分析ーシンガポールの授業と比較して日本の授業の特徴をさぐるー」を発表したこと、そして、田村知子は九州教育経営学会紀要において「カリキュラムマネジメントに関するミドルリーダー研修の開発と評価」をそれぞれまとめている。以上のことから、現在までの達成度を「おおむね順調に進展している」と判断した。現在までのところ、日本の学校における質問紙調査については、十分に進んでいないものの、海外における調査並びに日本型授業研究の報告については、予想以上の蓄積を行っていることによる。

今年度の前半については、研究代表者である久野弘幸が英国・ケンブリッジ大学にてアジアおよび世界の授業研究に関わる研究を行うことにより、本研究の中間的整理を行う。また、研究分担者であるモハメド・アラニと田村知子とともに、三人の研究チームで9月にスウェーデン・ヨーテボリで開催される国際授業研究学会(WALS)に参加し、共同研究の発表ならびに個人発表を行う予定である。これとは別に、6月のシンガポールにおける授業研究シンポジウム、7月の日本カリキュラム学会および10月の日本教育方法学会、九州教育経営学会などに研究成果報告の場を求め、積極的に研究成果の発信を行う。これらの成果および前年までの研究成果を集約し、12月から2月にかけて研究報告書をまとめ3年間の研究のまとめと課題の抽出を行う予定である。そのために、本年度についても、3回の研究会を予定しそれぞれの役割分担や執筆項目の確認、予算管理及び研究期間終了後を見越した継続的な研究計画の原案作成を行う予定である。最後に、長期的な研究推進の方策を述べておきたい。今次の3年間にわたる科学研究費補助金研究により、アジア諸国の大学や教育研究所などと同世代の研究ネットワークを築き,深める手がかりを得ることができた。今次の研究期間には、主に2つのアジア授業研究拠点都市とを結ぶことには成功したが、今後の研究の推進にあたっては、両国との関係をさらに深化しさせることはもちろん、東アジアの授業研究拠点都市(中国・上海、韓国・全州)との関係づくりを通して、アジアに生起している授業研究拠点都市における研究動向を明らかにすることが今後の研究課題として浮かび上がってきている。最終年次には、中長期的な研究の方策を立案することも課題としている。第1に、現在進捗が遅れている国内の学校に対する質問紙調査を実施する。質問紙調査の内容検討及び調査先の選定を行うことを重視する。第2に、現在取り組んでいる海外の学校における日本型授業研究の試行を充実させる。インドネシア・バンドン市にあるGagas-Seria校に焦点を当て、同校の授業研究への取り組みに日本型の視点を組み込み研究を進める。第3の点は、研究の発信である。国内外の学会・研究会に於いて、研究の成果を発信する。国内の学会は、7月の日本カリキュラム学会および10月の日本教育方法学会を想定している。また、海外の学会は、11月の国際授業研究学会を想定している。その他、海外からの招請講演などで、成果の一端を発信する。研究費の使用については、最終年次であることを踏まえ、おおよそ以下のように計画している。なお、予定していた一件の調査旅行が日程変更により実施困難になり、次年度に実施することにしたため一部残額が生じた。1日本カリキュラム学会・日本教育方法
動物の糞中エストロンスルフェイト濃度による妊娠診断技術の創設

家畜の妊娠診断において、材料採取が容易な糞や乳汁に注目し、それらに含有されるestrogen代謝産物であるestrone sulphateを測定し、早期の妊娠診断法を検討した。測定では、従来のRIA法に比べ、安全であるEIA法に注目し、測定系や確立を目指した。まず、96ウェルのマイクロプレートに抗原としてEstron-BSA Conjugateを吸着固相化させ、24時間後、マウスモノクローナル抗体(AgResearch,NZ)を第一抗体として加えた。その後、抗マウスIgG-HRPを第二抗体として添加後、発色基質を加え、プレートリーダーで吸光度を測定した。第一抗体の希釈率は、吸光度が0.51.0の範囲の中で、より高い感度を示した1/20,000倍を用いた。標準曲線では、抗原1μg/we11、第一抗体1/20,000倍、第二抗体1/1,000倍で良好な曲線が得られ、測定感度は5pg/wellであった。実際の糞サンプルの測定では、馬の糞1gを10mlのメタノールで撹拌し、その110μlの抽出液について、測定した。その結果、非妊娠馬および妊娠初期4ヵ月頃までは、50ng/g前後で、その後増加し、非妊娠馬と比べ有意に高い濃度を示した。エストロンスルフェートはウマの妊娠中期以降にみられる特徴的なエストロジェンで、妊娠のモニター等に用いられている。今回、生体に対し、非侵襲的な材料として糞サンプルを用い、放射性物質を使用しない酵素免疫学的測定法(EIA法)による糞中エストロンスルフェート濃度の測定を行った。方法として、マイクロプレートに抗原を吸着させ、マウスモノクローナル抗体を第一抗体として、抗マウスIgG-HRPを第二抗体として、測定した。その結果、抗原10μg/ml、第一抗体1/20,000、第二抗体1/1000で良好な標準曲線が得られ、測定感度は5pg/wellであった。非妊娠馬および妊娠初期4ヵ月頃までは、糞中エストロンスルフェートの濃度は50ng/g前後で、妊娠中期以降は100ng/gを超え、その後妊娠末期まで増加した。EIA法による糞中のエストロンスルフェート濃度の測定は、放牧馬などの妊娠のモニターに有用と思われる。測定では、従来のRIA法に比べ、安全であるEIA法に注目し、測定系の確立を目指した。標準曲線では、抗原1μg/eell、第一抗体1/20,000倍、第二抗体1/1,000倍で良好な曲線が得られ、測定感度は5pg/wellであった。今回、EIA法による高感度なestrone sulphateの測定系を確立し、糞や乳汁中のestronesulphateの測定が可能となった。
先史アンデス社会における文明の形成プロセスの解明

1.発掘データの分析と年代測定結果から、以下のようなクントゥル・ワシおよび関連地域の形成期編年を確立した。中期IIイドロ期(950-800BC.)、後期Iクントゥル・ワシ期(800-550BC.)、後期IIコパ期(550-250BC.)、末期ソテーラ期(250-50BC.)。2.クントゥル・ワシ神殿の発掘調査で作成した遺構図を整理して4時期9フェイズにまとめ、3次元復元図3Dモデルを作成、神殿建築変遷の様相をあきらかにした。3.クントゥル・ワシ神殿遺跡出土資料の整理・再検討を行った。(1)土器資料を全61タイプに分類、記述と写真・実測図からなる土器集成を完成させた。(2)石製品、骨・貝製品などの写真撮影、計測、原材料同定、タイプ分類を行い詳細な工芸品遺物リストを完成させた。(3)獣骨資料の動物考古学的分析を行い、形成期後期における家畜動物(ラクダ科)の導入や動物資源利用の実態をあきらかにした。4.クントゥル・ワシ神殿遺跡調査の全資料を電子ファイル化し体系的な整理を行って個別データの相互検索が可能な遺跡データベースを完成させた。また収納データの種類、内容の一覧、サンプルページ、公開可能な分析結果などを収めた開示版を作成した。5.関連する地域(ヘケテペケ流域地方、カハマルカ盆地、パコパンパ地域)で考古学調査を実施し、それぞれの地域における社会発展プロセスと相互関係を捉え、広域型神殿クントゥル・ワシが文明形成に果たした役割をあきらかにした。6.アンデスでは形成期に神殿を核とする社会統合がみられ、神殿が文明形成の起動力となっていた。本研究ではその到達点である広域型神殿クントゥル・ワシの実態を明らかにした。この広域型神殿は地域間の相互交流を促し、社会の流動性を高めたが、広い領域を統合する大規模社会は生み出さなかった。このような神殿社会はやがて崩壊するが、最初の国家社会出現までには数百年の断絶がある。神殿を中心としたアンデス独特の文明展開は国家社会の成立には直結しなかったのである。1.クントゥル・ワシ神殿遺跡のデータベースの基本設計現地クントゥル・ワシ遺跡において土器、石製品と獣骨資料の整理分析を進め、データ化の基礎作業に着手した。国内においては、埼玉大学21世紀総合研究機構棟の短期プロジェクト研究室に、クントゥル・ワシ遺跡に関連する写真、図面、文書等の資料を集約し、電子ファイへの入力作業に着手した。2.クントゥル・ワシ神殿遺跡の補充調査クントゥル・ワシ神殿の中央広場で全面発掘を行い、前800年から前250年、二時期五フェイズにおける床面の張り替え状況を確認、あらたに地下水路と床下に設けられた奉納用の埋納穴を発見した。3.カハマルカ盆地の一般調査山間盆地カハマルカの一般調査では、45遺跡において基本的なデータ収集を行った。また土器の材料となる粘土(カオリン)の採取場を確認、分析のためのサンプルを収集したほか、遺跡の建築材料となる石材の原産地同定を行うための地質データを収集した。さらに気候変動のデータを得るための花粉分析を実施すべく、サンプル収集が可能な場所の選定を行った。なお、当初予定していたパコパンパ神殿遺跡の予備調査は見合わせることとした。4.リモンカルロ神殿遺跡の発掘およびクピスニケ=ヘケテペケ河谷の一般調査

海岸地方のリモンカルロ神殿遺跡では、中央基壇および南基壇で集中的な発掘を行い、ラ・カレーラ期、リモンカルロ期(四フェイズ)の建築活動について詳細なデータを得た。またクピスニケ=ヘケテペケ河谷の一般調査を実施し、37遺跡において基本的なデータの収集を行った。1.クントゥル・ワシ神殿遺跡データベースの作成を進め、発掘調査のもっとも基本的な記録となる発掘日誌、土器台帳、遺物台帳、写真資料を電子ファイル化した。2.クントゥル・ワシ遺跡周辺の補充調査として19遺跡を踏査、そのうち8遺跡が関連遺跡であることを確認した。また現地クントゥル・ワシ遺跡博物館に保管してある出土遺物のうち、土器資料、石製品資料、および獣骨資料について整理・分析を行った。3.山地カハマルカ盆地の総合調査を実施、盆地の東部、東南部、南部を対象として121遺跡を踏査して盆地全域の遺跡分布パターンに関する基礎データの収集を完了した(踏査遺跡の総計は247進跡)。また、古気候復元を行なうため2カ所で花粉分析用のボーリング調査を行い、良好なサンプルを得た。4.ヘケテペケ川中流域ラス・ワカス神殿遺跡の発掘調査を行い、二つの建築フェイズを確認、幾つかの基壇・広場が改修・拡張されて一つの大きな神殿複合になっていくプロセスをあきらかにした。この時期がクントゥル・ワシ神殿遺跡では最下層のイドロ期にあたることもわかった。5.海岸地域リモンカルロ神殿遺跡の発掘調査を行い、中央に広場、その周囲に三基壇が配置されるU字型構造であることを確認した。また、この神殿は少なくとも三回にわたり大規模に改築されていたことがわかった。リモンカルロ神殿で活発な神殿建設が行われた時期は、ラス・ワカス神殿の第二フェイズに対応するが、出土遺物からは直接の相互関係は認められなかった。6.国際ラテンアメリカ・カリブ研究連盟第11回大会においてシンポジウム「クントゥル・ワシ:ペルー北部山地形成期における社会発展」を組織し、ペルーの研究者も招聘して、研究成果の発表と意見交換を行なった。1.クントゥル・ワシ神殿遺跡データベースの作成を進め、発掘資料に関する基本データの電子ファイル化を行った。また、現地クントゥル・ワシ博物館に保管してある石器、骨角器、獣骨資料の整理分析を行った。その過程でソーダライト製品の原産地がボリビア山地セロ・サポ鉱山であることが蛍光X線装置による化学分析の結果判明した。これは紀元前1千年紀の社会における遠距離交流を実証的に示す重要データである。また、出土獣骨の時期毎の出現比率分析によって野生動物(シカ)から家畜(ラクダ科動物)の利用へ移行する様相を実証的に把握できた。2.山地カハマルカ盆地で平成15年度までに実施した総合調査のとりまとめを行い、「カハマルカ盆地遺跡分布カタログ」を完成させた。これは247遺跡におよぶ学術調査結果の基礎データ集成として重要な意義がある。3.北部山地パコパンパ遺跡の踏査を実施し、想定される紀元前1千年紀のクントゥル・ワシ広域社会の外縁部でも、きわめて類比性が高い神殿が存在していたことを確認した。また、さらに北のポマワカ地域においてインガタンボ遺跡を踏査し関連する資料を得た。4.ヘケテペケ
Prose Brut写本とキャクストン版『イングランド年代記』との関係

これまでキャクストン版『イングランド年代記』に書誌学上もっとも近い写本とされてきた、大英図書館所蔵のBL Additional10099写本の大部分が、実際には印刷本からコピーされた写本と見られる有力な証左を得た。この研究は、カリフォルニア州サンマリノのハンティントン図書館所蔵のHM136写本が、キャクストン版の印刷用原稿である可能性を濃厚に示す証拠を写本上に示したDaniel Wakelinの発見に有力な理論的根拠を与えることになった。結論としてProse Brut研究において100年定説になっていたBL Additional10099写本の重要性は根底から覆り、HM136の重要性に新しいスポットが当たるようになった。キャクストン版Chronicles ofEnglandで使用されたと印刷用原稿にもっとも近い写本を特定するために、Lister Mathesonの分類に基づき、英語で書かれたProse Brutの主な写本80余りをピックアップした。その中の写本18について、アメリカカリフォルニア州ハンティントン図書館、イギリスグラスゴー大学図書館、オックスフォードボドリアン図書館、ロンドン大英図書館にて調査・研究した。特にアーサー王に関する記述部分についてのスポット・チェックを行った。平成21年度のもっとも大きな成果は、ケンブリッジ大学のダニエル・ウェイクリン博士から有益な知見を受けて、ハンティントン図書館所蔵のHM136にキャクストンが使用した印刷用原稿だと思われる印がついていることが確認できたこと、それによって同写本が印刷用原稿そのものに違いないという確信が得られたことである。(*)またこれまで写本から写本への転写と考えられていた写本も、印刷本から転写した写本だという新たな可能性が高まってきている。今までの研究でアーサー王の記述に関する成立年代の特定までにはいたっていないが、改めて「アーサー王の死』とProse Brutの記述を比較してみると、後者の記述年代成立がばら戦争の比較的後期に当たる可能性が確認できた。キャクストン版成立までのProse Brut写本の発展過程をさらに特定するために、引き続き60近い写本の調査・研究を予定している。(*)平成22年5.月13日現在、ウェイクリン博士は筆者による情報提供を元にHM136がキャクストンの印刷用原稿だと主張する新しい論文を執筆中であるという情報を得ているが、発刊雑誌・発行時期は共に未定である。具体的内容:(1)ケンブリッジ図書館での調査から、HM136の所有者であるJohn LecheがWilliam Caxtonと関係の深い人物である可能性が判明した。(2)英国の複数の図書館でHM136を含む合計8つのcontinuationを比較した結果、同様のcontinuationとは極めて違う性格を持っていることが明らかになった。HM136のそれは唯一系統発生としてよどみなくCaxton版につながる可能性を持っている。(3)Brut写本の基本形とでもいうべきDouce323写本は成立年代が1333年でこの系統でもっとも古いとされているが「6人の王の予言」の記述はこの写本が少なくとも1400年以降に成立したことを示唆している。意義と重要性:(1)と(2)はHM136がCaxton版の直接の底本であったことを濃厚に示唆している。Wakelin博士の2011年7月発行の論文と併せincunabulaの分野に重要な知見がもたらされることを確信している。(3)はこれまでBrut写本を分類してきたやり方に疑問を呈するもので、20世紀最大のBrut写本研究家Lister Mathesonの研究方法そのものの見直しを迫るものである。しかし重大な疑義を呈するものではあるが、どのように見直すべきかという新たな知見を生み出す段階にはいっていない。そのためにはなぜDouce323の前半部に1400年以後でなければ知りえない情報が含まれているのかという理由について新たな仮説を立てる必要があり、そのためにはさらに大規模なBrut写本調査が必要になる。2011年には、2つの面で重要な成果があった。以下に2点に要点を分けて記述する。(1)HM136とキャクストン版『イングランド年代記』の本文校訂をテキスト全体の20%について行なった。その結果を受けて、従来印刷用原稿にもっとも近いとされてきたBL Add 10099との本文校訂をさらに行なった。その結果、BL Add 10099はキャクストン版からの書写にすぎない証拠が散見され、逆にHM136はキャクストン版の印刷用原稿ではないとみられる証拠はほぼ皆無であった。ゆえに、これまでのLister Mathesonが唱えてきた仮説=「BL Add 1OO99はキャクストン版の印刷用原稿からの書写」は完全に覆ったといえる。また、HM136写本が印刷用原稿である証拠は、写本の書きこみ、そして本文からも確定的になったといえる。

これに関する論文はKyorin University Review24号に所収。(2)キャクストンが印刷したLe Morte Darthur(1485)のBook v書き換え問題と、『イングランド年代記』(1480)に重要な接点があることが明らかになった。今回研究者は『イングランド年代記』で史実の「予言」による後付け=権威づけが行われてきた事実を具体的に示した。(政治的な意図を持った統治者は、世論誘導のために歴史書の中に予言を巧みに織り込み、特定の政治的事件が昔から予言された「天からの意思」であるかのように装ってきた事実。)それを受けてキャクストンが印刷したLe Morte Darthurにも同種の権威づけが行われてきた可能性を示唆。具体的にはチューダー朝台頭時に、ヘンリー・チューダーに対して行われたアーサー王の生まれ変わりという権威づけである。この観点からBook vのテキストを改めて検討しなおすことは、本文校訂とはまた違った重要な価値を持つ。(これに関する論文はPoetica77号に掲載予定。)研究者は急逝したLister Mathesonの家族から、彼が死ぬまでBL Add 10099がCaxtonの印刷用原稿として機能したという仮説を保持していた情報を得た。つまり、Wakelinが2011年夏に提出した(Caxton版の印刷用原稿である可能性を濃厚に示す)HM 136上の証拠をMathesonはついに知らず、ゆえにFriedrich Brieが一世紀も前に立てた説に立脚し続けていたと判明したのである。こうした背景から研究者は4月に中尾祐治を訪問し、HM136上の言語的特徴について示唆を受けた。幾つかの表現において、HM136の言語の方がCaxton版よりも古いとする証拠が見られた。その上で8月にロンドンの大英図書館を訪問、綿密な語の単位でHM136のテクストをCaxton版、そして10099と比較した。その結果、、研究者が2004年に違いを明らかにしてあった10099の書き出し部分の2丁は、テクスト部分でも違いがあると判明。すなわち、書き出しの2丁が基にした原稿はCaxton版よりも前の写本で、MS Douce 323に近いテクストだが、HM136とは直接の関係はない。これは副次的に、ぶれの大きい10099のテクストにおいて、3丁以降がCaxton版に基づいているというこれまでの研究を際立たせる結果ともなった。研究者は上記について、12月中世英語英文学会で発表を行った。HM136がCaxton版の印刷原稿で、10099がお手本とする原稿を途中で差し替えた写本という事実もさりながら、10099はCaxton以前の写本であるというBrieの定説を覆した点は重要である。権威あるEETSの一冊として百年も君臨してきたProse Brut研究におけるひとつの前提が覆ったからだ。この内容はArturianaの論文にも盛り込み、海外の研究者への結果提示も行っている。
種子成熟と休眠に関わるアブシジン酸の生合成と作用機構の分子生物学的研究

植物ホルモンABAは、種子の成熟の成熟過程においてABAの量が増加し、種子の乾燥耐性獲得(休眠)に関与していることがこれまでの生理学的な研究により示されている。さらに、近年の分子遺伝学的研究よりABAの生合成系のネオザンチン開列酵素(NCED)をコードする遺伝子が単離されており、その酵素はABAの量を調節している律速酵素であることが示されている。我々は、ABA生合成の律速段階で働くNCED遺伝子を同定し、この遺伝子を詳細に解析する事を試みた。昨年度までに我々は、種子で発現しているネオザンチン開列酵素をコードする遺伝子AtNCED2遺伝子を同定し、この遺伝子が、種子の胚で発現することを明らかにした。そこで、本年度はこの遺伝子の破壊株の探索および解析を行った。AtNCED2遺伝子の破壊株についてはEckerらが作成しているSALK T-DNAタグラインの中に候補となる株が得られたので、その株を譲渡してもらい以後の解析に用いることにした。得られたAtNCED2破壊株を用いて種子の休眠の程度を調べた、その結果、野生株よりも若干休眠性が低下している結果が得られたが、これまでに知られているABA合成経路の酵素をコードする遺伝子の破壊株と比較すると明らかに休眠の程度が野生株に近い事が分かった。この事はAtNCED2破壊株として単離した破壊株が実際は破壊株ではないか、あるいは他の4つのNCED遺伝子が種子で発現している事が考えられた。そこで、種子でのNCEDの発現をノーザンブロット解析ではなく、RT-PCRで確認することにした。その結果、AtNCED2遺伝子以外にもAtNCED5,6,9の遺伝子についても発現が確認された。この結果はAtNCED2遺伝子の破壊株では休眠性に大きな影響を与えなかった結果と一致しており、種子ではいくつかのNCED遺伝子が発現することによりABAの量を調節して休眠性の程度を決定していることが示唆された。そこで我々は、ABA生合成の律速段階で働くNCED遺伝子を同定し、この遺伝子を詳細に解析する事を試みた。まず、アラビドプシスの全ゲノム配列から予想されるNCED遺伝子のDNA断片をPCRにより単離し種子の成熟過程で発現している遺伝子(AtNCED2)をノーザンブロットにより同定した。次に単離・同定したAtNCED2のプロモーター領域ATGコドンより上流約2kbpをPCRで単離し、その塩基配列の決定を行い、すでに決定されているゲノム配列と一致していることを確認した。このプロモーター領域と指標遺伝子GUS遺伝子の融合遺伝子AtNCED2::GUSを作製しアラビドプシスに遺伝子導入し、その植物体を用いてGUSの活性と染色部位の特定を試みた。その結果、開花後1114日目ごろにGUS活性が上昇しており、ノーザンブロット解析で得られた結果と一致していることが確認された。さらに莢および種子をGUS染色したところ、種子の胚でGUSによる染色が見られた。これらの結果は、ABAは種子成熟期に上昇するという結果と一致しており、AtNCED2遺伝子がこのABAの上昇に大きく関わっていると考えられた。さらに、これまで種子のABAが何処で合成されているか全く不明だったが、今回のこの結果より種子のABAは胚で合成されている可能性が示唆された。この結果はAtNCED

2遺伝子の破壊株では休眠性に大きな影響を与えなかった結果と一致しており、種子ではいくつかのNCED遺伝子が発現することによりABAの量を調節して休眠性の程度を決定していることが示唆された。
眼内炎症と化学伝達物質

眼内炎症の惹起には各種エンドトキシンを足掌に注射して眼に触れずに眼内炎症を起こした.その経時的変化を前房水中の蛋白量,細胞数測定で定量的,客観的に測定した.1.ラットにおいては前房内の蛋白及び細胞はほぼ時期を一つにしてやや蛋白の方が早く増え始め,注射後約3時間から4時間で最も強い反応を示し,それから後は徐々に減少して24時間後にはほぼ正常にかえった.それに反して家兎では蛋白の増加は34時間をピークに見られるが細胞増多はそれより更に遅れ,注射後6時間後から出始め24時間或いは48時間後が前房中に細胞が認められた.このように動物の種によって炎症の現われ方には違いがあることがわかった. 2.各時点での前房水中のアラキドン酸代謝物のRIA法による測定,プロスタグランディンA, B, E_2, F_2α,トロンボキサンB_2,プロスタグランディンI_2の代謝物である6-Keto, PGF_2α, LTB_4の測定を行なった.その結果種々のプロスタグランディンの増強は炎症の増加と共にやや上昇を見るが,顕著な上昇は見られず有意の差はなかったがその中にあってPGE_2はラットにあっては蛋白の動きとほぼ平行な増加減少の曲線を描いた.又, LTB_4ではラットにおいてはほぼPGE_2と同様の動きを示した.それに対し家兎では最初にPGE_2の増加が起こり,それに引き続いてLTB_4の増加が認められた.その曲線のズレは丁度前房水中の蛋白及び細胞の動きと一致しており蛋白の増加と共にPGE_2の増加現象があり,更に細胞の増加と共にLTB_4の増加が認められた.家兎においてはこのように炎症のパラメータである前房水蛋白と前房水中細胞数の出現の時間的な分離がされており,それに伴なって眼内化学伝達物質であるPGE_2, LTB_4の動きが一致しており興味ある結果を得た.眼内炎症の惹起には各種エンドトキシンを足掌に注射して眼に触れずに眼内炎症を起こした.その経時的変化を前房水中の蛋白量,細胞数測定で定量的,客観的に測定した.1.ラットにおいては前房内の蛋白及び細胞はほぼ時期を一つにしてやや蛋白の方が早く増え始め,注射後約3時間から4時間で最も強い反応を示し,それから後は徐々に減少して24時間後にはほぼ正常にかえった.それに反して家兎では蛋白の増加は34時間をピークに見られるが細胞増多はそれより更に遅れ,注射後6時間後から出始め24時間或いは48時間後が前房中に細胞が認められた.このように動物の種によって炎症の現われ方には違いがあることがわかった. 2.各時点での前房水中のアラキドン酸代謝物のRIA法による測定,プロスタグランディンA, B, E_2, F_2α,トロンボキサンB_2,プロスタグランディンI_2の代謝物である6-Keto, PGF_2α, LTB_4の測定を行なった.その結果種々のプロスタグランディンの増強は炎症の増加と共にやや上昇を見るが,顕著な上昇は見られず有意の差はなかったがその中にあってPGE_2はラットにあっては蛋白の動きとほぼ平行な増加減少の曲線を描いた.又, LTB_4ではラットにおいてはほぼPGE_2と同様の動きを示した.それに対し家兎では最初にPGE_2の増加が起こり,それに引き続いてLTB_4の増加が認められた.その曲線のズレは丁度前房水中の蛋白及び細胞の動きと一致しており蛋白の増加と共にPGE_2の増加現象があり,更に細胞の増加と共にLTB_4の増加が認められた.家兎においてはこのように炎症のパラメータである前房水蛋白と前房水中細胞数の出現の時間的な分離がされており,それに伴なって眼内化学伝達物質であるPGE_2, LTB_4の動きが一致しており興味ある結果を得た.
細胞死におけるリソゾームプロテアーゼの役割

本研究は、昨年度に引き続きPC12細胞のアポトーシス過程におけるリソゾームプ口テアーゼの機能解析を行った。PC12細胞は無血清培地で培養するとカスパーゼ-3が活性化され、アポトーシスで死滅する。昨年度はカテプシンB.Dおよびカスパーゼ-3の特異的阻害剤を用いた研究を行い、リソゾームカテプシン群で制御される細胞死の経路が存在し、その経路ではカテプシンDが細胞死惹起因子として働き、カテプシンBはその作用を制御することを示してきた。今年度は、同過程を形態学的に詳細に検討するために、電顕的検索と共にカテプシンBとDの抗体を用いて免疫組織化学的に検索した。その結果、1)電顕的に観察すると核クロマチンの凝集を呈する細胞は培養6時間後に初めてみられた。核の変化が認めらる以前の培養3時間後にオートファジー小体が細胞質に多くみられた。培養12時間から24時間と時間経過と共に細胞の縮小化と核クロマチンの凝集像を呈する細胞の数が増加した。これらの細胞の細胞質にもオートファジー小体/オートリソゾーム様構造物が数多くみられた。2)カテプシンBあるいはDの免疫染色とTUNEL反応の二重染色を行って観察したところ、培養開始3時間の時点からカテプシンB陽性顆粒は激減し、Dのそれは増加した。特に24時間後になるとTUNEL陽性の細胞には、カテプシンDが強陽性となり、Bはほとんど陰性を示した。以上の結果よりPC12細胞はカスパーゼの活性化により細胞死に陥る条件において、リソゾーム系ではカテプシンBとDの間でインバランスが生じること示唆された。また細胞死を惹起するリソゾームプ口テアーゼの基質を同定するために、現在、様々な条件下の細胞死の過程にあるPC12細胞からパーコール濃度勾配分画法を用いて採取されたリソゾーム分画を、ラット肝臓細胞から単離した核分画に添加し、アポトーシスが誘導されるか否かを検討している。本研究では、PC12細胞のアポトーシス過程におけるリソゾームプロテアーゼの機能解析を生化学的、免疫組織化学的手法を用いて行ってきた。PC12細胞を無血清培地で培養すると早期からカテプシンBの細胞内活性が上昇し、またautophagic vacuolesの増加がみられた。さらにアポトーシス関連のプロテアーゼであるcaspase3の活性化も同様にみられた。そこで、プロテアーゼの制御機構を検索するためにそれぞれのプロテアーゼの特異的阻害剤を用いた実験を行った。caspase3の特異的阻害剤であるAC-DEVD-CHOを添加した培地で同細胞を培養すると細胞はアポトーシスを回避し生存したが、同時にカテプシンBの特異的阻害剤であるCA074を添加して培養することによりアポトーシスで細胞が死滅した。また、CA074の代わりにカテプシンBのアンチセンスヌクレオチドを添加して培養しても同様な結果を得ることができた。さらに、アスパラギン酸プロテアーゼの阻害剤であるpepstatinAやカテプシンDのアンチセンスヌクレオチドを添加することによりアポトーシスを回避できた。上記の実験をラット後根神経節から採取した初代培養神経細胞を用いた場合も同様な結果を得ることができた。これらの結果より、アポトーシスにはリソゾームプロテアーゼによる独自の制御機構が存在すると考えられる。そして現在、リソゾームプロテアーゼによって活性化され細胞死を惹起する基質の検索に着手し、また他のプロテアーゼとのプロッセシングの関連性を検討している。また細胞死を惹起する

リソゾームプ口テアーゼの基質を同定するために、現在、様々な条件下の細胞死の過程にあるPC12細胞からパーコール濃度勾配分画法を用いて採取されたリソゾーム分画を、ラット肝臓細胞から単離した核分画に添加し、アポトーシスが誘導されるか否かを検討している。