hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
固形癌の早期局在診断に有用な膜タンパク質のプロテオーム解析

大腸癌バイオマーカータンパク質の同定を目的として、大腸癌患者組織から調製した膜画分の大規模な網羅的定量解析とその検証をおこなった。同定された5566種類のタンパク質の中で、5287個が遺伝子オントロジー解析により注釈付けされ、3087個は膜に局在することが推定された。また、TMHMM解析により、1567個のタンパク質は膜貫通ドメインを有する膜タンパク質であることが推定された。同定タンパク質には、ポリープと癌組織、または転移のない癌組織と転移のある癌組織間で発現量に有意な差のあるタンパク質が、100種類以上含まれていた。そうしたバイオマーカー候補タンパク質の中の105個について、SRM法を用いて検証した結果、78個は、SRM法でも癌の悪性化に伴う有意な発現変化が確認された。2つの候補タンパク質protein-Xと-Yについては、ウェスタンブロット法や免疫組織染色法を用いた検証もおこなった。さらに14種類の癌組織を含む組織アレイ解析により、protein-Xと-Yは、大腸癌だけでなく、胃癌や乳癌、前立腺癌でも高発現していることが示されたことから、大腸癌だけでなく、他の癌においても有用なバイオマーカーとなる可能性が示唆された。癌の早期発見や局在診断に非常に有効な指標となるバイオマーカーは未だ明らかにされていない。本研究は、大腸癌組織から調製した膜タンパク質画分について、プロテオームの手法を用いた網羅的な解析をおこない、有用な大腸癌バイオマーカーを明らかにすることを目的としておこなった。ヒト大腸癌組織およびポリープをホモジュナイザーで破砕し、低速遠心により核や未破砕の細胞を除いた後、超高速遠心で可溶性画分を除き、膜画分を調製した。膜画分は、デオキシコール酸やラウロイルサルコシン酸を含む溶液で可溶化し、トリプシン消化後、酢酸エチルを加え、酸性条件にすることで界面活性剤を除いた。脱塩精製後得られたペプチドサンプルは、iTRAQ試薬で同位体標識ラベル後、カラム操作により分画し、液体クロマトグラフィー質量分析装置でタンパク質の同定と定量をおこなった。同定されたタンパク質の中で、癌の悪性化に伴う発現量の変化が示唆されたタンパク質について、抗体を用いたウェスタンブロット法や免疫組織染色法による検証をおこなった。その結果、5000を越えるタンパク質を同定し、同定タンパク質の約50%が膜に、約15%が表層膜に局在し、約30%が膜貫通ドメインを持つことが予測された。定量解析により、癌の進行に従って、有意に発現量が変化する膜タンパク質が多数見出された。その中には癌の進行との関与が既に報告されているインテグリンα5などが含まれており、さらに多検体のサンプルを用いた検証を進めている。効果的な癌治療のために、早期診断や予後診断、局在診断をおこなうためのバイオマーカーの開発が求められている。我々は、大腸癌組織から調製した膜タンパク質画分について、プロテオームの手法を用いて網羅的に解析することにより、有用な大腸癌の新規バイオマーカーを見出すことを目的として本研究をおこなった。ヒト大腸癌患者組織(良性腫瘍および癌組織)から調製した膜画分の網羅的な定量解析の結果、5000を越えるタンパク質を同定した。同定タンパク質の中から、良性腫瘍と癌組織、または、転移ありと転移なしの癌組織を比較して、有意に発現量の違いがみられた膜タンパク質や細胞外タンパク質を見い出し、大腸癌バイオマーカー候補タンパク質として検証をおこなった。100個を越える候補タンパク質の中の36個について、selected reaction monitoring(SRM)法を用いて検証した。この検証法により、抗体を用いずに、多くの標的タンパク質を同時に検討することができ、網羅的な定量解析やウェスタンブロットの結果とほぼ相関することが示された。SRM測定の結果、既に大腸癌での発現変化が報告されているタンパク質に加え、これまでに報告のない新規のバイオマーカー候補タンパク質が大腸癌の悪性化に伴って発現変化していることが示された。さらに、幾つかの候補タンパク質については、ウェスタンブロットや免疫組織染色法を用いた検証もおこない、良性腫瘍に比べ、癌組織で発現が増加し、非癌部に比べて癌部で高発現していることが示された。

癌の早期診断や予後診断、局在診断に有用なバイオマーカーの開発が求められている。我々は、大腸癌の新たなバイオマーカー候補タンパク質を同定することを目的として、プロテオミクス技術と組織アレイ解析法を用いて、大規模な網羅的な定量解析とその検証をおこなった。本研究では、大腸癌患者組織および良性腫瘍から膜タンパク質画分を調製し、iTRAQ試薬を用いた同位体標識後、質量分析器を用いて網羅的な定量解析をおこなった。その結果、5566種類のタンパク質が同定され、その中の1567種類のタンパク質は膜貫通ドメインを持つことが推定された。また、Gene Ontology解析の結果、その中の3087種類はmembrane、652種類はextra cellularに局在するタンパク質であることが推定された。同定タンパク質の中で、良性腫瘍と癌組織、又は転移なしと転移ありの癌組織間で有意に発現量の変化したタンパク質をバイオマーカー候補として、selected reaction monitoring (SRM)法を用いて検証した。候補タンパク質の中の105種類についてSRM測定をおこなった結果、78種類のタンパク質で有意な発現変化がみられた。さらに幾つかの候補タンパク質については、ウェスタンブロット法や免疫組織染色法での検証もおこなった。その中の2つの候補タンパク質は、良性腫瘍に比べ、癌組織で発現が増加し、非癌部に比べて癌部で高発現していることが示された。また、50または100検体、14種類の癌組織を含む組織アレイ解析では、大腸癌での高発現が確認されただけでなく、乳癌や胃癌でも高発現していることが示された。これらの結果から、2つの候補タンパク質が、大腸癌だけでなく、他の癌においても有用なバイオマーカーとなる可能性が示唆された。多数のバイオマーカー候補となるタンパク質を同定し、その検証をおこない、大腸癌バイオマーカーとして有望なタンパク質を複数見い出すことができたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。さらに多くのバイオマーカー候補タンパク質の検証作業をおこなう。また、血清サンプルでの候補タンパク質の検出と定量についても検討する。
がん遺伝子が誘導する複製ストレス応答におけるY-familyポリメラーゼの役割

活性化がん遺伝子によるDNA複製の異常は二重鎖切断を生じ、その修復エラーは遺伝子の欠損・増幅・再構成などの原因となる。このゲノム不安定性は腫瘍の悪性化を促進する主要な原動力となる。なかでも、複製起点の活性化亢進にともなうDNAの過剰複製(再複製)は、主要な異常複製として、その原因や細胞の応答機構について詳細な研究が行われているが、この異常な複製に関与するDNAポリメラーゼについてはほとんど判明していない。今回私たちは、Yファミリー・ポリメラーゼ(Y-Pol)が、このDNA複製に関与する可能性を検討し、忠実度の高い通常の複製ポリメラーゼ(Polε、Polδ)との役割分担についても解析を行った。Y-Polは忠実度の低いDNA複製酵素であり、損傷乗越えDNA合成への関与はよく知られているが、その他の高次構造を取るDNAの複製への関与が最近注目されている。私達は、まず、ヒト細胞U2OSにおいてgemininをノックダウンし、G2期に停止しつつDNA合成を持続する再複製モデル系を用いて解析を行った。本モデル系において、Y-PolメンバーであるPolη, Polκ, Polι, REV1は、いずれも特異的に再複製細胞でDNA複製フォーカスに局在した。さらに、内因性Y-Pol各メンバーのノックダウンは、再複製によるDNA量の増加を同程度に抑制した。Polηドミナント・ネガティブ変異体の過剰発現がDNA再複製を抑制したことから、この作用はY-Polの酵素作用によると考えられる。興味深いことに、Y-Polメンバーと複製ポリメラーゼは異なるDNA鎖の合成に関与することが示唆された。U2OS細胞にがん遺伝子サイクリンEを過剰発現すると再複製が誘導される。この実験系においても、Polη, Polκが関与する結果を得た。以上の結果は、活性化がん遺伝子が引き起こすDNA再複製にPolηをはじめとするY-Polが関与することが強く示唆される。今回の結果は、がんゲノムの不安定性の分子機構を理解する上で新しい知見を提供する。26年度が最終年度であるため、記入しない。活性化がん遺伝子による異常なDNA複製は、発がん過程を促進するゲノム不安定性の主な原因として注目を集めている。特にDNA再複製は二重鎖切断を生じ、ゲノムの欠損、増幅、再構成などを引き起こすと考えられるが、これに関与するDNAポリメラーゼについては、ほとんど判明していない。私たちは、Yファミリー・ポリメラーゼ(Y-Pol)の関与を示唆する予備的知見を得て、その機構や意義について解析を行った。私達はヒト細胞にがん遺伝子サイクリンEを過剰発現によるDNA再複製にともない複製フォーカスにY-PolのひとつであるPol-etaが動員されることを見出した。そこで、ヒト細胞U2OSにおいてgemininをノックダウンし、G2期停止からDNA再複製による高倍数体が出現するモデル系を用いて、DNA再複製している細胞に特異的に複製フォーカスへのPol-etaの動員が見られ、RNAiによるPol-etaの発現抑制が、再複製におけるDNA合成速度を有意に抑制することを見いだした。これらの結果は、DNA再複製にPol-etaが関与することを示唆する。また、私達はcyclin EによるDNA再複製がPol-eta発現抑制によって低下することも証明した。これらの結果は、活性化がん遺伝子が引き起こすDNA再複製にPol-etaが関与することを示唆し、がんゲノムの不安定性の分子機構を理解する上で新しい知見を提供する。さらに、私たちは発がん遺伝子c-mycによるDNA複製異常へのPol-etaの関与、Pol-eta以外のY-Polも発がん遺伝子によるDNA複製に関与する知見を得て、これらについて研究を進めている。

今回の結果は、がんゲノムの不安定性の分子機構を理解する上で新しい知見を提供する。26年度が最終年度であるため、記入しない。DNA複製開始制御因子であるgemininの発現抑制や、発がん遺伝子cyclin Eによって誘導されるDNA再複製にYファミリー・ポリメラーゼのひとつPol-etaが関与することを示唆する結果を得た。また、その分子機構に、一本鎖DNAの増加がRad18を活性化を介して起こるPCNAのモノユビキチン化が重要な役割を果たすことを明らかにした。その他の発がん遺伝子c-mycが引き起こすDNA複製異常にも、Pol-etaが関与することを示唆する結果を得ている。また、Pol-eta以外のYファミリー・ポリメラーゼも関与することを示唆する予備的知見を得ている。c-mycによるDNA複製にPol-etaが関与することを証明し、その分子機構を明らかにする。また、Pol-eta以外のYファミリー・ポリメラーゼの役割を明らかにする。DNA複製のepigeneticなメカニズムによる制御機構が明らかになりつつある。そこで、これらに関与する因子がYファミリー・ポリメラーゼの制御に与える影響をスクリーニングする。
抗膜蛋白質抗体の親和性成熟系の構築

今年度は、より確実に親和性成熟を実現するために、増殖とは逆の細胞死シグナルを伝達する受容体Fasを利用した競合選択系も開発した。この系では、抗原-Fas融合蛋白質と、抗原特異的抗体クローンを用いたAP20187依存的二量体化抗体を細胞に遺伝子導入して共発現させる。得られた細胞に、使った抗体クローンの抗原親和性に影響する部分の配列をランダム化した抗体ライブラリーを遊離の状態でさらに共発現させる。この細胞にAP20187を添加して培養すると、抗原-Fas融合蛋白質が活性化されて細胞は死滅するが、抗体ライブラリーの中に、元の抗体クローンより親和性の高い抗体があれば、その抗体は二量体化抗体よりも優先的に抗原に結合するので、抗原-Fas融合蛋白質の二量体化を阻害し、細胞死を阻害して生存する。生存した細胞から抗原への親和性が上昇した抗体遺伝子を得ることができる。本系を実証するために、抗原としてErbB2、元となる抗体クローンとして抗ErbB2 scFvであるML3-9を用いてライブラリースクリーニング実験を行った。その結果、生存した細胞群が得られた。この細胞群から得られたscFvクローンについて、動物細胞発現系でscFvタンパクを発現・精製し、表面プラズモン共鳴法により抗原親和性を測定した結果、ML3-9よりも解離が起きにくく高い親和性で結合するscFvクローンが複数得られた。これらのscFvクローンのエピトープを水素-重水素交換質量分析法により検証した結果、いずれも元クローンML3-9のエピトープと同一であることが分かった。以上より、本法では特定のエピトープに結合する抗体の親和性成熟が可能であることが示された。膜蛋白質は医療における重要なターゲットであり、膜蛋白質抗原に対する高特異性・高親和性抗体を迅速、簡便かつ確実に取得する系の開発が必要とされている。そこで本研究では、動物細胞膜上に提示させた標的膜蛋白質抗原と結合する特異的抗体をin vitroで迅速・簡便に選択でき、さらに抗原に対してより高親和性の抗体を簡便に得るための技術開発に挑戦する。具体的には、標的膜蛋白質抗原と、二量体形成により増殖シグナルを伝達する受容体を連結した融合蛋白質を細胞表面に発現させる。この細胞に二量体化抗体ライブラリーを発現させると、抗原特異的抗体は、その分泌元の細胞表面の抗原-受容体融合蛋白質に優先的に結合して増殖シグナルを伝達する。従って、細胞増殖を指標として簡便に抗原特異的抗体遺伝子を発現する細胞を選択できる。このとき、抗体の二量体化を小分子リガンド依存的に制御する仕組みを導入し、リガンド濃度を変化させることで、より高い親和性の抗体を得る手法を開発する。本年度は、標的膜蛋白質抗原としてErbB2、二量体形成により増殖シグナルを伝達する受容体としてIL-6受容体のシグナル伝達サブユニットgp130を用いて抗原側の融合蛋白質を構築した。一方、二量体化抗体側は、既知の抗ErbB2一本鎖抗体クローンと小分子リガンドAP20187依存的に二量体を形成するFKBP(F36V変異体)を用いて融合蛋白質を構築した。構築した融合蛋白質遺伝子をそれぞれ別の抗生物質耐性マーカーを持つレトロウイルスベクターに組み込み、Ba/F3細胞に導入した。抗生物質選択後の細胞に対してウエスタンブロッティングを行った結果、双方の融合蛋白質の発現が確認できた。増殖アッセイを行った結果、リガンドAP20187依存的に細胞が増殖することが確認できた。従って、本系によって抗膜蛋白質抗体の結合性を評価できることが示された。本年度は増殖誘導型の抗原/受容体融合蛋白質とリガンド依存性二量体化抗体の構築と、細胞増殖をリードアウトとする結合性評価系の検証が目標であった。実際に膜蛋白質ErbB2とそれに対する抗体クローンを用いて実験した結果、リガンド依存的な細胞増殖活性が見られたことから、おおむね順調に進展している。

これらのscFvクローンのエピトープを水素-重水素交換質量分析法により検証した結果、いずれも元クローンML3-9のエピトープと同一であることが分かった。以上より、本法では特定のエピトープに結合する抗体の親和性成熟が可能であることが示された。本系をベースにして抗体ライブラリースクリーニングを行い、抗膜蛋白質抗体の親和性成熟を実現できるかを検証する。また、増殖シグナル伝達型受容体の代わりに死シグナル伝達型受容体を用い、既存の抗体クローンを用いた二量体化抗体と競合させて親和性成熟抗体を得る系も開発する。研究の進捗状況から、研究に必要な物品が次年度に生じることが予想されたため、次年度使用額が生じた。主に物品費、旅費に支出する予定である。
吸入麻酔薬と抗癌剤の併用療法の可能性を探る

急性骨髄性白血病などの難治性を示すがんは、その存在が推測されている「がん幹細胞」によって治療困難性を高めるという仮説がある。抗がん剤は細胞周期の分裂期やDNA合成期に作用し細胞死を誘導する。しかし「がん幹細胞」はこうした細胞周期から離れ休眠状態の静止期に留まるため、抗がん剤が作用せず、がんの再発の素因となりその難治性を高めていることが推察されている。そこで本研究は一部のがん細胞が汎用されている吸入麻酔薬セボフルランの暴露により一時的に細胞周期を早めることに着目し、細胞周期から外れ休眠状態となった難治性のがんに対して、吸入麻酔薬セボフルランによる細胞周期の活性化を促し抗がん剤の治療効率を高めることができるかどうかを検討する挑戦的課題である。2018年度のこれまでに研究代表者はセボフルラン暴露を受けた一部のヒトがん細胞株が吸入麻酔薬暴露の細胞増殖能を有意に高めることを見出した。さらにこれらの増殖が細胞周期の活性化によって生じたものかどうかを確認するためにBrdU取り込み後の免疫染色を行い細胞周期内のDNA合成期が増加することを確認した。またこうした吸入麻酔薬暴露後の増殖能の亢進は、免疫不全マウスの皮下においても再現することを同定した。そこでこのような現象が他のがん細胞株にも生じるかどうかの検討を進め、複数のがん細胞株で同様の結果を得られたことから、さらに抗がん剤の種類を加え検討を進めている。上記の成果の一部を国内および国外でポスター発表した。癌幹細胞などの難治性固形癌は細胞周期の静止期に留まり各種抗癌剤に抵抗性を示し、治療抵抗性を示すことが明らかになっている。一方当研究室ではこれまでに一般的な吸入麻酔薬であるセボフルランが一部のヒト癌培養細胞株の増殖を促し、特に細胞周期中のDNA合成期であるS期を一時的に増加させることを明らかにした。そこで本研究では難治性癌に対する治療法の提案を目標とし、普及しているセボフルランを用いた抗がん剤との併用効果の有無を明らかにすることを目的としている。具体的には細胞周期のDNA合成S期に効果的に働く抗癌剤の効果を、一般的な吸入麻酔薬であるセボフルランが改善できるかどうか明らかにする。これまでに本研究では吸入麻酔薬セボフルランの暴露が、大腸癌細胞株の細胞周期のDNA合成S期を増加させることをBrdU取り込み量から明らかにした。さらに複数の抗がん剤を添加し、その死細胞数を血球計算版カウント法により計測し、また死細胞解析としてフローサイトメトリーを用いて前アポトーシス割合などを定量している。また細胞毒性については細胞内のLDH量を計測し比色法を利用して定量を行っている。またアポトーシスを生じる際に発現する死細胞関連タンパク質についても、ウェスタンブロッティングにより生化学的な検討を行っている。現在まで取り組んだ複数の抗がん剤については残念ながら、吸入麻酔薬セボフルランにより効果的な細胞死増加効果は見いだせていない。吸入麻酔薬セボフルランに暴露された大腸癌細胞株を用い、各種抗癌剤による細胞増殖率を計測している。麻酔薬がミトコンドリア呼吸鎖に働くといわれており、従来の比色法では生存率の判定手法にばらつきがあるため、より適した生存率及び致死率の判定法を比較検討している。しかし予測に反して細胞の死亡率が下がらないため、より致死性の高い条件や抗癌剤種を比較検討している。一方、S期判定にはBrdU染色による解析を実施しておりこちらは予測通りの結果を得ている。実験回数を増やしデータを増加させることが課題となっている。急性骨髄性白血病などに存在が推測されているがん幹細胞などの難治性の固形がんは、細胞周期のうち細胞分裂もDNA合成も行わない静止期に留まることにより、多くの種抗がん剤に抵抗性を示しその難治性を高めていると推測されている。申請者らはこれまでに吸入麻酔薬の暴露を受けた一部のヒトがん細胞株が、DNA合成期であるS期を一時的に増加し細胞周期を早めることをこれまでに見出したことから、本研究はこのヒトがん細胞株を用いて吸入麻酔薬と抗がん剤を併用し、抗がん効果を改善する新たな治療法の開発が可能かどうかを検討した萌芽的研究である。これまでに申請者らは臨床に一般的に用いられている全身麻酔薬セボフルランの暴露によって一部のヒトがん細胞株は、細胞周期のDNA合成期(S期)に移行する細胞割合を高め細胞周期を早めることをBrdUパルス法とフローサイトメトリー解析によって明らかにした。さらにこの麻酔薬暴露によりDNA合成期を増加した細胞株を用いて、麻酔薬暴露直後のトランスクリプトーム解析を実施した。その結果、細胞周期を制御する一部の細胞周期チェックポイント遺伝子が麻酔薬暴露直後に異常低発現することを見出した。さらに麻酔薬暴露によって増殖を高める一部のヒトがん細胞株に、暴露と同時に白金製剤または代謝阻害阻害剤をそれぞれ添加し細胞死数の変化の解析を行った。現在までに予測に反して、抗がん剤と麻酔薬の両添加による濃度依存的な変化を得られず今年度の課題となっている。本研究ではセボフルラン暴露を受けた一部の細胞株が細胞周期のDNA合成期に遷移し細胞周期を早めたことから、この現象を利用し抗癌剤作用への感受性を高めることが可能かどうかを検討する課題である。しかし現在までに予測に反して抗がん剤と麻酔薬の両添加による濃度依存的、または時間依存的な細胞死数の変化を得られていないため、進捗に遅れが生じている。

急性骨髄性白血病などの難治性を示すがんはその存在が推測されている「がん幹細胞」によって治療困難性を高めているという仮説がある。具体的には「がん幹細胞」は他の増殖の盛んながん細胞と異なり、抗がん剤の作用する場である、細胞周期の分裂期やDNA合成期に移行せず休眠状した静止期に留まるため細胞死に至らず生存を続ける。その結果がんの再発の原因となり、高い難治性の原因の一つになっていると推測されている。本研究は一部のがん細胞が吸入麻酔薬の暴露により一時的に細胞周期を早めることに着目し、細胞周期から外れ休眠状態となった難治性のがんに対して、吸入麻酔薬による細胞周期の活性化を促し抗がん剤の治療効率を高めることができるかどうかを検討する挑戦的課題である。これまでに申請者らはセボフルラン暴露を受けた一部のヒトがん細胞株は吸入麻酔薬暴露の細胞増殖能を有意に高めることを見出した。さらにこれらの増殖が細胞周期の活性化によって生じたものかどうかを確認するためにBrdU取り込み後の免疫染色を行い、DNA合成期が増加することを確認した。またこうした吸入麻酔薬暴露後の増殖能の亢進は、免疫不全マウスの皮下においても再現することを確認した。さらに申請者らは抗がん剤のうちDNAと結合してDNAの2重鎖切断を誘導しアポトーシスをもたらす白金製剤と、チミジン合成を阻害して代謝拮抗を行うフルオロウラシルを用いセボフルラン暴露の有無が細胞死数に変化を与えるかどうかを検討した。その結果予測に反してセボフルラン暴露後のがん細胞はこれらの抗がん剤に対する細胞死抵抗性を高めてしまうことを見出した。そこでこのような現象が他の麻酔薬暴露後に増殖を確認している細胞株にも生じるかどうかの検討を進めている。本研究の挑戦的課題に対してまず吸入麻酔薬のひとつであるセボフルランの暴露によって細胞周期を加速し、増殖を促すがん細胞を探索した。その結果申請者らは本年度までに、9種類の様々なヒトがん細胞株のうち2つの大腸がん細胞株、2つの肺がん細胞株、1つの乳がん細胞株で増殖効果を示すことを明らかにした。さらにこれらのセボフルラン暴露後の増殖効果は創傷治癒実験、ボイデンチャンバー実験、軟寒天培地を用いたフォーカス増殖能などを用いてその増殖能について繰り返し確認した。またそのうちの大腸がん細胞株についてはこの増殖効果が免疫不全マウスの皮下でも再現できることを見出した。そこで吸入麻酔薬と抗がん剤との同時添加が有効な細胞死増加につながるかを確かめるため、これらの細胞株の一部に対して一般的な抗がん剤である白金製剤シスプラチンやフルオロウラシルを同時添加した。しかし予測に反し吸入麻酔薬は抗がん剤単独で添加するよりもむしろ細胞死を減少させてしまうことが明らかとなり、追加実験が必要となったため。急性骨髄性白血病などの難治性を示すがんは、その存在が推測されている「がん幹細胞」によって治療困難性を高めるという仮説がある。抗がん剤は細胞周期の分裂期やDNA合成期に作用し細胞死を誘導する。しかし「がん幹細胞」はこうした細胞周期から離れ休眠状態の静止期に留まるため、抗がん剤が作用せず、がんの再発の素因となりその難治性を高めていることが推察されている。
cardiac growth factorsおよびchalonesの研究

Cardiacgrowthfactor,I.P.8.3.分子量43KDの分画は、心臓負荷(Goldblattラット高血圧)を始めてから、56週後にピ-クに達し、その後暫時減少していくことが明らかとなった。I.P.8.3の分画を高速液体クロマトグラフィ-と等電点電気泳動法との組み合わせにより、主として分子量43KDと、その前後の分子量をもつ6つの亜分画に分離し得た。これらの分画は非常に微量であるため、現在大量のサンプルより抽出を行っており、一定量得られた段階で鶏胚培養心臓に対する肥大増殖促進作用について検索する。一方I.P.8.3分画が増加する時点(上述)になると正常心には存在する。P.I.7.07.1の分画が減少し、8.3分画が消失し始めるとき、再びI.P.7.1分画が増加してくることが経時的研究により認め得た。次に心肥大の促進にAngiotensin IIがどのように関与しているかについて、培養鶏胚心臓細胞を用い検討した。まず心筋細胞にはAngiotensin Iは全く作用せず、Angiotensin IIは心筋細胞大促進する作用をもつ。このことは、心臓細胞にはACE活性が認められないことを示す。Angiotensin IIより心筋細胞のDNAの合成はS、G_2およびM Phaseにおいて増加している。一方ACE Inhibitorであるcaptoprilを各種培養細胞に投与すると、細胞の種類によりその抑制作用は異なるが、特に著しいのは、fibroblastに対する抑制作用である。しかしこの抑制作用は、培養液よりcaptoprilをwash outすることにより消失することから、captoprilによるACE阻害は可逆性のあるものと考えられた。一方、肥大心でI.P. 8.3,分子量43KDの分画が増加してくると、正常ラット心に存在するI.P. 7.1の分画が減少してくる。この分画を鶏卵胚心臓培養細胞に対し、75μg/mlでは影響がなかった。150μg/mlでは約30%、300μg/ml濃度では約80%の増殖抑制作用を認めた。これは前年度の樹立細胞株H9C2,CHL,F6に対してのみでなく、ビ-トしている心筋細胞に対しても増殖抑制作用を示した。次いでこのI.P. 7.1の分画を更に分子量別に分離すべく努力しているが、今日までのところ大きく分けて6分画を得るところまでに至った。これら分画の量は、非常に微量のため、現在どの分画に抑制作用があるのが未検索である。現在充分量の蛋白量を得るべく努めている。Cardiac growthfactor,I.P.8.3.分子量43KDの分画は、心臓負荷(Goldblattラット高血圧)を始めてから、56週後にピ-クに達し、その後暫時減少していくことが明らかとなった。
光と物質の相互作用を用いたミクロの世界の探究法と教材開発

ここでは、最初に本研究の目的について簡単に述べ、そのあと現在までの研究実績の概要について述べる。本研究の目的は、「物質」と「光」の相互作用を用いてミクロの世界を探究して解明する教材を開発し提供することにより、理科教育の振興を図ることである。具体的には次の4つのことを目的としている。1分光法を用いて、マイクロ波と分子構造の関係や、赤外線と温室効果ガスの関係や、可視光・紫外線と原子・分子の関係を解説する教材の開発を行う。2光の干渉を用いたシャボン玉やセッケン膜の膜厚測定の教材化に関する研究を行う。3光のハンカチなどによる回折を用いてX線回折の原理を説明する教材を製作する。4作成した教材を地域社会へ向けた自然科学の啓蒙活動の中で公開し、理科教育の振興を図る。続いて、現在までの研究実績の概要について述べる。1液体のマイクロ波分光に関しては、マイクロ波の吸収の有無を音でも確認できるように改良して大教室での演示実験が可能になった。振動スペクトルに関しては、近赤外領域の検出器の選定を行った。可視光・紫外線領域での原子や分子の分光については、現有のマルチチャンネル分光器を用いて、原子の発光や色素の吸収を演示実験の教材として提供することができた。2シャボン玉やセッケン膜の膜厚測定の教材化については、廉価版の測定装置に関する論文を発表した。3X線回折の原理を説明する教材の製作に関しては、メッシュの細かい金網や、レプリカの回折シートを回折素材にした教材を製作した。また、結晶格子の描画に関連して、エッシャー風タイリング図形の描き方に関するアイデアを思い付いた。4地域社会へ向けた自然科学の啓蒙活動については、「チルドレンズミュージアム」で幼児や小・中学生や保護者を対象に体験学習を行い、理科教育の振興を図った。分光法を用いた原子・分子の性質を解明する教材の開発においては、液体のマイクロ波分光、近赤外分光、及び紫外・可視分光について検討した。液体のマイクロ波分光に関しては、マイクロ波の吸収の有無を音でも確認できるように改良して大教室での演示実験を可能にした。また、実験内容を録画することで映像教材も作成した。振動分光に関しては、近赤外領域の検出器の選定を行った。紫外・可視領域での原子や分子の分光については、現有のマルチチャンネル分光器を用いて、水素、ヘリウム、酸素などの原子の発光や色付きセロファンや葉緑素の吸収を演示実験の教材として提供することができた。シャボン玉やセッケン膜の膜厚測定の教材化については、シャボン玉の透過光の干渉スペクトルが廉価版の測定装置で観測できることを論文にして報告した。また、測定光源のシャボン玉の膜への影響を調べるために、水の赤外分光を行った。測定結果は、反射光の干渉スペクトルを精度良く行うためには水の吸収に対する対策が必要であることを示した。X線回折の原理を説明する教材の製作に関しては、プリンタの印字出力の制御により微細な回折格子を描画するためのプログラムソフトについての論文を発表した。また、メッシュの細かい金網や、レプリカの回折シートを回折素材にしてアクリル板に挟むことにより、より、鮮明で、回折の仕組みを理解しやすい教材を製作して、自然科学教室で公開した。一方、パソコンで結晶格子を描画している中で、エッシャー風タイリング図形の描き方に関するアイデアを思い付いた。この描き方を小中学校の数学や美術関係の教材提案する方法についても検討中である。地域社会へ向けた自然科学の啓蒙活動については、「チルドレンズミュージアム」で幼児や小・中学生や保護者を対象に体験学習を行い、理科教育の振興を図った。次年度は、平成30年度までに得られた結果を基にして、次に示す内容の研究を行う。液体のマイクロ波分光に関しては、教材として市販されている電波実験器の発振器を使って本研究と同様の実験ができるかをテストする。振動スペクトルに関しては、選定を行った近赤外領域の検出器を用いて分子の振動運動のシグナルが観測できるかどうかをテストし、結果を表示するための回路を設計する。一方、可視光・紫外領域の分光では、複数のマルチチャンネル分光器を用いた光の吸収と放出に関する教材を作成する。シャボン玉の干渉の教材化に関して、反射光の干渉スペクトルの測定について2つのことを検討する。1つ目は、廉価版の分光器の感度が悪いために反射光の干渉スペクトルの測定ができなかったので、これを解決する新しい測定法を検討する。2つ目は、シャボン玉の膜厚測定の安定化を実現するために、シャボン玉に含まれる水による赤外線吸収の影響を最小限にするための方法を検討する。X線回折の原理を説明する教材の製作に関しては、これまでの研究で美しい回折像が得られるようになったが、作成した教材を自然科学教室で公開して更なる改良を加える。また、次年度は、回折格子を回転させるシステムを作成することにより、結晶粉末のX線回折像を再現する教材を作成する。一方、結晶格子の描画中に思い付いたエッシャー風タイリング図形の描き方に関するアイデアについては、論文作成のための準備を進める。また、この図形の描き方を小中学校の数学や美術関係の教材として提供する方法についても検討する。次年度に作成した教材は、地域社会へ向けた自然科学の啓蒙活動の中で公開する。具体的には、現在行っている「西新チルドレンズミュージアム」などの自然科学教室での演示実験や実習指導の中で公開し、参加者に実体験をしてもらう。

これと並行して、本研究の成果を論文として発表する。ここでは、最初に本研究の目的について簡単に述べ、そのあと研究実績の概要について述べる。本研究の目的は、物質と光の相互作用を用いてミクロの世界を探究して物質の性質を解明する教材を開発し、理科教育の振興を図ることである。具体的には次の4つのことを目的としている。1分光法を用いて、原子・分子の性質を解明する教材を開発する。2光の干渉を用いたシャボン玉やセッケン膜の膜厚測定の教材化に関する研究を行う。3光のハンカチなどによる回折を用いてX線回折の原理を説明する教材を製作する。4本研究で製作した教材を地域社会へ向けた自然科学の啓蒙活動の中で公開し、理科教育の振興を図る。続いて、現在までの研究実績の概要について述べる。1分光法を用いた教材の開発においては、現有のマイクロ波発振器と検出器を用いて10 GHz帯で作動する液体用のマイクロ波分光器を製作した。この装置を用いて、極性分子と無極性分子を区別することができた。2シャボン玉やセッケン膜の膜厚測定の教材化については、廉価版の測定装置の開発を進めている。具体的には、従来50万円かかっていた干渉スペクトルの光学系を懐中電灯で代用する方法を開発した。現在、5万円の分光器を用いて干渉スペクトルが測定できるかについて、継続して実験している。3X線回折の原理を説明する教材の製作では、2種類の布を用意して、布越しに豆電球の光を見るときに目視される回折パターンから、結晶配列の大きさと回折像の関係が類推できるような教材のプロトタイプを製作した。また、プリンタの印字出力をドット単位で制御して布の代用品になる格子を描画するプログラムソフトも開発中である。4地域社会へ向けた自然科学の啓蒙活動については、「チルドレンズミュージアム」で幼児や小・中学生や保護者を対象に体験学習を行い、理科教育の振興を図った。分光法を用いて原子・分子の性質を解明する教材に関しては、現有のマイクロ波発振器と検出器を用いて10 GHz帯で作動する液体用のマイクロ波分光器を製作した。現在、廉価版の装置を製作するための検討を行っている。続いて、教材用の振動スペクトルの測定装置を製作するために、近赤外分光器を購入したが、現在、動作テスト中である。光源の赤外発光ダイオードと測定対象の分子の選定に関しては、水分子を中心に教材作りを行うことを決定した。一方、可視光・紫外線領域での原子・分子の分光については、現有のマルチチャンネル分光器を用いて、原子の発光を演示実験の教材として提供することができた。シャボン玉やセッケン膜の膜厚測定の教材化については、廉価版の測定装置の開発を進めている。現在、5万円の分光器を用いて干渉スペクトルが測定できるか、実験中である。近赤外分光器を用いて干渉スペクトルを測定することに関しては、検討中である。今後、測定光源から出る赤外線のシャボン玉の膜への影響も調べる予定である。
スライスパッチ法を用いた網膜アマクリン細胞の研究

網膜アマクリン細胞は内網状層に存在する介在ニューロンで、神経節細胞の応答形成に重要な役割を果たしていると考えられている。大多数は抑制性ニューロンであるが、興奮性ニューロンや少数のアミン含有性ニューロンも存在する。アマクリン細胞については技術的な理由から、膜の性質や、シナプス入出力に関する詳細な研究が進んでおらず、視神経の光応答や受容野の形成にアマクリン細胞がどのように寄与しているのかが明らかになっていない。本研究では、網膜のスライス標本を用い、アマクリン細胞を直視下で同程しつつ電位依存性膜電流や伝達物質に対する応答を解析し、アマクリン細胞の特性と、網膜における役割を明らかにすることを目的とした。アマクリン細胞は網膜内顆粒層の最内側に存在する。キンギョから摘出した網膜をミリポア濾紙の上に張り付け、濾紙ごと剃刀の刃で150200μmの厚さにスライスした。スライスを潅流液中で水浸レンズを用いて観察し直視下で0.5%のルシファイェロ-を詰めたパッチ電極でスライス標本中のアマクリン細胞を記録した。ルシファイェロ-によって染色された形態から、記録したアマクリン細胞をON型、OFF型、ON-OFF型に分類することが出来た。これらのアマクリン細胞が持つ電圧依存性膜電流をwhole cellクランプ法で解析したところ、ほとんど全ての細胞に2種類のカリウム電流(I_AI_<K(V)>)、カルシウム電流が記録された。ナトリウム電流はON型、OFF型では大部分の細胞に見られたが、ON-OFF型細胞ではその一部にしか観察できなかった。また、10-40%の細胞でGABAによる自発性シナプス電流が観察された。本研究では、網膜のスライス標本を用い、アマクリン細胞を直視下で同定しつつ電位依存性膜電流や伝達物質に対する応答を解析し、アマクリン細胞の特性と、網膜における役割を明らかにすることを目的とした。キンギョから摘出した網膜をミリポア濾紙の上に張り付け、濾紙ごと剃刀の歯で150200μmの厚さにスライスした。スライスを灌流液中で水浸レンズを用いて観察し直視下で0.5%のルシファイェロ-を詰めたパッチ電極でスライス標本中のアマクリン細胞を記録した。

アマクリン細胞は形態が神経節細胞に類似しているため単離後の同定が困難なこと、伝達物質が多彩なため、薬理学的実験をしてもその標的の同定が困難なため、膜の性質や、シナプス入出力に関する詳細な研究が進んでおらず、視神経の光応答や受容野の形成にアマクリン細胞がどのように寄与しているのかが明らかになっていない。本研究ではこれらの疑問に答えるため、網膜のスライス標本でシナプス連絡を保ったアマクリン細胞を直視下で同定しつつ電位依存性膜電流や伝達物質に対する応答を解析した。キンギョ網膜からスライス標本を作製し、直視下で内網状層の遠位側にある丸い細胞体にギガシールを得てホールセル記録を行った。細胞内染色法によって記録後これがアマクリン細胞であることを認識した。アマクリン細胞からは脱分極時に大きな外向きK電流が観察されたが、過分極ではほとんど電流は活性化されなかった。電位依存性のナトリウム電流は一部の細胞のみで観察された。10-40%の細胞で自発性シナプス電流が観察された。この電流はビキュクリンによってブロックされた。また、逆転電位は0mV付近であった(細胞内外の塩素イオン濃度は等濃度)。これらの性質から、この自発性電流はGABAによるものであると考えられた。残された問題としては、(1)この電流の持続時間などの動態の膜電位依存性や薬物による修飾、(2)GABA受容体のタイプ、(3)GABA放出へのCaチャネルの関与、(4)GABAトランスポータによるGABA取り込み、さらに(5)アマクリン細胞間、あるいはアマクリン細胞と双極細胞、神経節細胞との伝達特性などを明らかにしなければならない。
汎関数解析学とファインマン経路積分の数学的研究

ファインマン経路積分の研究を行うについて、私はファインマンが最初にこの概念を思いついた際に用いたいわゆる有限次元近似法をとった。任意の経路を時間区間を分割し、分割に応じて、折れ線で近似することによって、経路積分の近似をつくる。そして、有限次元の積分で、停留位相法を使い、その後で時間の分割の幅を無限に小さくした極限を考えるのである。この極限移行の際に、私が嘗て得た大次元空間の停留位相法の結果を用いて、有限次元の場合にた量が収束することを保障する。平成21年度は(1)有限次元の積分で成り立つ部分積分の公式を研究した。(2)汎関数として、経路の汎関数ではなく、曲面の汎関数め場合の研究。に力を入れた。結果については(1)の研究は部分的には満足できる結果を得たが、(2)の研究は、成功していない。に力を入れた。
潰瘍性大腸炎の薬物治療抵抗性を予知する生検診断基準-多施設前向き研究-

生検後2年以内に手術が必要になる潰瘍性大腸炎患者(UC-S)と薬物治療のみで経過する患者(UC-M)を生検で鑑別する本診断基準は,同時に進めてきたretrospective studyによって単純化され,暗算でも使用できる診断基準となっている(Scand J Gastroenterol 2003 ; 38 : 594-8)。今回のprospective studyの目的は,この単純化診断基準の感度・特異度を正確に算出して,臨床応用できる「潰瘍性大腸炎の治療指針案」を作成することである。研究計画の前半部分に当たる初年度(平成14年度)と本年度(平成15年度)では,潰瘍性大腸炎症例の収集と診断基準を用いたカテゴリー診断を行った。本学を含めて研究参加を承諾している施設から送付された生検標本は約400例である。すでに切除標本の病理組織診断からUC-Sであることが確認された症例も多数あるが,その他の症例では今後の2年間で,潰瘍性大腸炎であるか否かの確認と,潰瘍性大腸炎であれば更にUC-SであるかUC-Mであるかを明らかにすることが必須の作業となる。そのためには,症例ごとの臨床経過・内視鏡所見・病理組織学的所見などについての詳細な検討が必要となる。なお,申請時の研究計画には平成16年度以降の症例収集について言及しなかったが,より多くのデータに基づいて正確な診断精度を算出するための症例収集と病理診断は継続していく予定である。1症例の収集研究の初年度に当たる平成14年度の研究計画は,生検後2年以内に手術が必要になる潰瘍性大腸炎患者と薬物治療のみで経過する患者を収集することである。現在まで,本学を含めて研究参加を承諾している施設から送付された生検標本は150例で,すべてについてH-E標本を作製している。症例毎の薬物治療抵抗性である確率は計算済みであるが,データの解析の前に,潰瘍性大腸炎であるか否かの精査と本疾患である場合は経過中に手術されたか否かの確認作業が不可欠である。個々の症例の経過観察は2年以上を予定している。平成15年度以降も引き続き症例の収集を継続するとともに,上記の精査と確認をしていく。2単純化診断基準の作成本診断基準はLogistic回帰分析を用いて作成されたもので,対数計算を含めた煩雑な計算が要求される。診断基準を一般化するためには,暗算で使用できるように単純化する必要がある。我々は平成14年度にこの単純化診断基準を完成し,既に最終診断と臨床経過が確定した症例を用いたretrospective studyによって,診断基準の有用性を示すことができた(Scand J Gastroenterol 2003,in press)。したがって,今回のprospective studyでは単純化診断基準の感度・特異度を正確に算出して,臨床応用できる治療指針案を作成することを目標とする。
骨折テーラーメイド予防のために大規模コホートで遺伝ー生活習慣相互作用を解明する

1996年実施の1579歳の女性住民を対象とした大規模な無作為抽出標本調査(骨粗鬆症予防のための疫学調査:JPOS study)から、1999、2002年に追跡調査が行われた約1500人を対象とした。各調査より、腰椎・大腿骨・橈尺骨の骨密度、体格、筋力、運動習慣、労働強度、飲酒、喫煙、第二次性徴、月経・妊娠・出産や婦人科既往歴、食事習慣、カルシウム摂取量、血液・尿中の骨代謝指標、骨量や生活習慣の変化、骨折の発生についてのデータを得た。1. 2006年に満10年の追跡調査を実施し、受診者1040人ついて以下の解析を行った。・調査時現在50歳以上の720人につきHologic社QDR4500Aにて胸腰椎測面のデジタル画像を撮影し、半自動morphometryにより椎体骨折を診断した。・症候的骨折(Clinical fracture)「痛みを伴い、医療機関でレントゲン撮影を受けて医師によって診断された骨折」を問診で把握し、確定した。・二重エネルギーX線吸収法による第24腰椎正面、大腿骨近位部、橈尺骨遠位部の骨密度を解析し、10年間の追跡期間中の変化を把握した。2.遺伝子多型は、対象者のゲノムDNAよりPCR-RFLP法および対立遺伝子識別アッセイ法で同定した。現在までに、VDR、TGF-β1、OC、MTHFR、CYP19、CYP1A1、COMT、PPARγ、RUNX2、HSD17β、BMP2遺伝子の多型を同定し、追跡調査結果も合わせて骨密度・骨折との関連を解析中である。3.骨髄間葉系幹細胞とセラミック材料を組み合わせた再生骨構築の基礎的研究において、培養再生骨の定量的評価のターゲットとして遺伝子多型に関連する低分子蛋白質オステオカルシン(OC)に焦点をあて、骨代謝領域のトランスレーショナルリサーチには欠かせないラットOCに特異性の高いモノクロナール抗体を作製して製品化した。1996年実施の1579歳の女性住民を対象とした大規模な無作為抽出標本調査(骨粗髪症予防のための疫学調査:JPOS study)から、1999、2002年に追跡調査が行われた約1500人を対象とした。2006年には、満10年の追跡調査を実施した。1.1996年のBaseline調査受診者から死亡や転居を除く1515人を対象に、満10年の追跡調査を実施したところ、受診者は1040人、受診率68.6%であった。骨密度の測定および骨折の発生、体格、ライフスタイルの調査を実施し、調査項目のデータベース化が完了した。平成19年度は骨折解析、保存血を使った骨代謝マーカー検査を完了し、遺伝子解析結果との比較解析を実施する。

現在までに、VDR、TGF-β1、MTHFR、CYP19、CYP1A1、COMTなどに加え、PPARγ、RUNX2、HSD17β遺伝子の多型を同定した。引き続き、平成19年度はBMP2、CYP1A2、LRP5遺伝子などの多型の同定とともに、追跡調査結果も合わせて骨密度・骨折との関連を解析する。3.同定した遺伝子については、順次解析を実施中であるが、ほとんどの遺伝子頻度は、先行研究と有意差はなかった。TGF-β1遺伝子の多型と、小児期の運動や牛乳摂取などとは、骨密度への相互作用を持つことがわかり、その結果を国際学会で発表した。また、PPARγの多型と、大腿骨や橈骨の骨密度には関連が見られ、他の生活習慣との相互作用を検討中である。1996年実施の1579歳の女性住民を対象とした大規模な無作為抽出標本調査(骨粗鬆症予防のための疫学調査:JPOS study)から、1999、2002年に追跡調査が行われた約1500人を対象とした。各調査より、腰椎・大腿骨・橈尺骨の骨密度、体格、筋力、運動習慣、労働強度、飲酒、喫煙、第二次性徴、月経・妊娠・出産や婦人科既往歴、食事習慣、カルシウム摂取量、血液・尿中の骨代謝指標、骨量や生活習慣の変化、骨折の発生についてのデータを得た。1.2006年に満10年の追跡調査を実施し、受診者1040人ついて以下の解析を行った。・調査時現在50歳以上の720人につきHologic社QDR4500Aにて胸腰椎側面のデジタル画像を撮影し、半自動morphometryにより椎体骨折を診断した。・症候的骨折(Clinical fracture)「痛みを伴い、医療機関でレントゲン撮影を受けて医師によって診断された骨折」を問診で把握し、確定した。・二重エネルギーX線吸収法による第24腰椎正面、大腿骨近位部、橈尺骨遠位部の骨密度を解析し、10年間の追跡期間中の変化を把握した。3.骨髄間葉系幹細胞とセラミック材料を組み合わせた再生骨構築の基礎的研究において、培養再生骨の定量的評価のターゲットとして遺伝子多型に関連する低分子蛋白質オステオカルシン(OC)に焦点をあて、骨代謝領域のトランスレーショナルリサーチには欠かせないラットOCに特異性の高いモノクロナール抗体を作製して製品化した。
イヌ神経伝達物質関連遺伝子の多型解析と、有用犬選別への応用性の検討

本研究では,ヒトで行動特性との関連が報告された脳内物質関連遺伝子多型をイヌで解析し,イヌの行動特性の遺伝的背景を探ることを目的としている。本年度は,昨年報告したドーパミン受容体D4(DRD4)遺伝子のエキソン3領域に加え,新たに多型が見出されたエキソン1,イントロン2領域を,有用犬候補のラプラドールレトリーバー(麻薬探知犬86頭,盲導犬86頭)で解析した。訓練の合否,および麻薬探知犬は7項目,盲導犬は15項目の行動特性の5段階評価値と,遺伝子型との関連性を解析した。麻薬探知犬は,「集中力」,「ダミー(タオルに麻薬臭をつけた訓練具)欲」,「活発性」が高い個体が有意に合格しやすい傾向にあった。エキソン3の短い対立遺伝子435を持つ個体は「他犬への攻撃性」と「人懐こさ」が強く,エキソン1の長い対立遺伝子L,またはイントロン2の短い対立遺伝子Pを持つ個体は「服従性」が弱い傾向にあったが,訓練年度により,結果に違いがあった。合否と遺伝子型の関連は見いだされなかった。盲導犬は,行動特性評価のうち,「興奮性」が低く,「集中力」が高い個体は合格しやすい傾向にあった。エキソン3の長い対立遺伝子447aを持つ個体は「食物に対する過度の執着」が弱かった。エキソン1の短い対立遺伝子3を持つ個体は,他犬,動物,食物,臭いに対する「過度の執着」,「興奮性」が低く,「服従性」が高く,盲導犬としての適性を多く備えていた。イントロン2の長い対立遺伝子Qを持つ個体は,エキソン1と関連が見られた行動特性に加え,「攻撃性」が低く,「集中力」が高く,盲導犬としての適性を多く備えていた。合格個体や繁殖個体は不合格個体と比較してエキソン1の対立遺伝子Sまたはイントロン2の対立遺伝子Qを高頻度に持っていたが,有意差を検出するには至らなかった。以上から,同一犬種内で,遺伝子型が行動特性の個体差に影響している可能性が示唆された。DRD4受容体遺伝子の3箇所の多型はそれぞれ異なる行動傾向に影響を与えていた。特にエキソン1の対立遺伝子S,イントロン2の対立遺伝子Qを持つと,「過度の執着」が弱いなど,多数の行動特性において高得点を示したことから,これらの対立遺伝子を指標として適性個体を選別できる可能性が示唆された。本年度は,ドーパミンD4受容体遺伝子に関して犬種内,犬種間の比較を行った。ドーパミンD4受容体対立遺伝子頻度の犬種差:犬種あたり4個体以上の遺伝子型データが得られた,31犬種,計860頭について,対立遺伝子頻度に基づく主成分分析を行った。9種類の対立遺伝子が識別され,447a, 447b, 435, 498の頻度分布が犬種差に寄与していることが示された。原産地により対立遺伝子の頻度分布に差異があり,アジア原産の犬種は447bを,ヨーロッパ原産の品種は447aを高頻度に保有していた。Hartらによる犬種の行動特性評価にもとづき,13の行動特性スコアと対立遺伝子頻度との相関を求めた。498と「他犬への攻撃性(r=+0.595, P<0.001)」や「反抗性(r=+0.544, P<0.01)」といった"攻撃性"に分類される行動特性との関連が強く示唆された。この498を高頻度に保有するグループには,高い攻撃性を求められる狩猟犬・番犬の用途で作出された犬種が多く含まれており,攻撃性の低いことが要求される牧羊犬,回収犬は含まれていなかった。同一犬種内での遺伝子型と行動特性の関連性:麻薬探知犬(ラブラドールレトリバー)63個体の遺伝子型を調べ,合否,訓練成績,行動特性評価との関連を解析した。特定の対立遺伝子と「臆病」「他犬への攻撃性」「人懐こさ」との関連が見いだされた。食肉目各種における遺伝子塩基配列の比較:イヌの反復配列多型の起源を明らかにするため,食肉目各種(オオカミ,タヌキ,クマ,アライグマ,ネコ)の相同領域の塩基配列を比較した。イヌ科のオオカミ,タヌキでは反復領域が見いだされた。一方,イヌ科以外の動物では反復構造は認められなかった。エキソン3の短い対立

遺伝子435を持つ個体は「他犬への攻撃性」と「人懐こさ」が強く,エキソン1の長い対立遺伝子L,またはイントロン2の短い対立遺伝子Pを持つ個体は「服従性」が弱い傾向にあったが,訓練年度により,結果に違いがあった。合否と遺伝子型の関連は見いだされなかった。盲導犬は,行動特性評価のうち,「興奮性」が低く,「集中力」が高い個体は合格しやすい傾向にあった。エキソン3の長い対立遺伝子447aを持つ個体は「食物に対する過度の執着」が弱かった。エキソン1の短い対立遺伝子3を持つ個体は,他犬,動物,食物,臭いに対する「過度の執着」,「興奮性」が低く,「服従性」が高く,盲導犬としての適性を多く備えていた。イントロン2の長い対立遺伝子Qを持つ個体は,エキソン1と関連が見られた行動特性に加え,「攻撃性」が低く,「集中力」が高く,盲導犬としての適性を多く備えていた。合格個体や繁殖個体は不合格個体と比較してエキソン1の対立遺伝子Sまたはイントロン2の対立遺伝子Qを高頻度に持っていたが,有意差を検出するには至らなかった。以上から,同一犬種内で,遺伝子型が行動特性の個体差に影響している可能性が示唆された。DRD4受容体遺伝子の3箇所の多型はそれぞれ異なる行動傾向に影響を与えていた。特にエキソン1の対立遺伝子S,イントロン2の対立遺伝子Qを持つと,「過度の執着」が弱いなど,多数の行動特性において高得点を示したことから,これらの対立遺伝子を指標として適性個体を選別できる可能性が示唆された。
高分子ミセル型抗がん剤のがんへのタ-ゲッティング

(1)様々な組成の高分子ミセルドラッグの合成:抗ガン剤アドリアマイシン(ADR)を担持するブロックコポリマ-構成成分であるポリエチレングリコ-ル鎖(PEG)とポリアスパラギン酸鎖P(Asp)の分子量をそれぞれ4種類用いて、種々の組成のブロックコポリマ-を合成した。分子量はPEGが1,000、2,000、5,000、12,000、P(Asp)が約1,000、2,000、4,000、8,000である。これらのブロックコポリマ-についてADRの導入反応を行ったところ、目的のADRーブロックコポリマ-の複合体(PEGーP(Asp(ADR)))の水溶性は、ブロックコポリマ-の組成に依存することがわかり、同一の反応条件ではPEGの含量が多いものの方が水溶性に富んでいることがわかった。反応条件を変えることで様々な組成の水溶性の(PEGーP(Asp(ADR)))を得ることができた。これらの複合体は疎水性のADRを多量に含んでいるにもかかわらず、優れた水溶性を示し、濃縮操作を行っても沈澱を生じることがなかった。(2)放射性同位元素で標識した高分子ミセルドラッグの合成:(1)で合成したPEGーP(Asp(ADR))にDM下中で^<14>Cーラベルしたベンジルアミンを水溶性カルボジイミドにより導入を行い、約60%という高導入率で高分子ミセルを形成する複合体のポリアスパラギン酸部分に共有結合で^<14>Cラベルをすることに成功した。(3)体内動態測定法の確立:(2)で得た^<14>Cラベル複合体を用いてddyマウスでの静脈内投与後の体内分布測定手法を確立した。(4)正常マウスでの体内動態測定:(3)の手法により、静脈投与後1時間、4時間、24時間の血中濃度および主要臓器分布を4つの組成について調べたところ、大きな組成依存性が見られ、PEG分子量12,000、P(Asp)分子量2,100のもので、血中半減期が6時間程度と非常に安定な血中循環を見いだした。