hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
任意のコア構造を有するマルチコンポーネント金属ナノ粒子作製法の確立

二種類の異なる金属で構成される二元金属コアーシェル型ナノ粒子は、金属ナノ粒子の中でも特に触媒活性が高いことが知られている。液相中における金属イオンの還元によるナノ粒子作製は、コアおよびシェルとなる金属がイオン化傾向に依存しており、その順序を入れ替えた粒子を作製するには煩雑な操作を必要とするなど、ナノ粒子作製の自由度は低い。本研究では、液相中における金属イオン還元法とは異なる、気相合成法を用いて、イオン化傾向の影響を受けないコアーシェル型ナノ粒子の簡便な作製法を確立することを目的とした。本年度は作製したナノ粒子の構造の評価を行った。作製したナノ粒子中には2種類の金属が含まれており、また吸光度測定の結果から、コアーシェル型を有している可能性があることを示唆している結果が得られた。今年度は、これらの結果についての学会発表および論文執筆準備も同時に行った。また実験装置について、触媒活性が高く、より融点の高い金属を用いることが出来るよう装置改良も行った。具体的には、1500°C程度まで加熱可能な管状電気炉の中に通す管の変更を行った。これまでは石英管を用いていたが、実験を行っていくうちに、1100°Cを超えた実験条件で何度も使用していると少しずつ融解していくことがわかった。このことから、管状電気炉の中に通す管を石英管からムライト菅に変更し、それに伴う接続部品の変更等も行った。今後、改良した装置を用いて、さらに金属の種類を増やし、マルチな金属ナノ粒子作製へと研究を進めていきたい。液相における金属イオンの還元によるナノ粒子作製は、コアおよびシェルとなる金属がイオン化傾向に依存しており、その順序を入れ替えた粒子を作製するには煩雑な操作を必要とするなど、ナノ粒子作製の自由度は低い。また、報告例の少ない3種類以上の金属からなるナノ粒子の作製も併せて検討し、調製し易く活性の高い触媒の開発を試みた。本年度は、気相合成法によるコア-シェル型金属ナノ粒子の生成手法の確立に向けた合成条件の検討を中心に行った。特に、金属ごとの加熱温度、ガス流速の最適条件を検討し、粒子の粒径分布と単位時間・単位体積当たりの粒子生成数に関する知見を収集した。あわせて、生成ナノ粒子の捕集に関する検討を行った。AgおよびAuについて、それぞれの融点付近まで加熱することでナノ粒子が生成可能であることがわかった。また、装置内を流れるガス流量を調製することで、ナノ粒子の生成量および生成されるナノ粒子の大きさの制御が可能であることがわかった。気相中で生成したナノ粒子を液相中に捕集することを試みた。捕集に用いる溶液には、ナノ粒子の液相合成の際に一般的に用いられるポリビニルピロリドン(PVP)を用いることで、ナノ粒子が凝集することなく捕集可能であることを示した。PVPの濃度や分子量による捕集効率の違いは、今後検討する予定である。来年度は、得られた知見をもとに、液相合成では生成が難しい逆コアーシェル型ナノ粒子の生成および構造評価を行い、触媒活性を評価する。平成27年度は、以下の内容に関して検討を行った。おおむね順調に進んでいると思われる。(1)単一金属ナノ粒子の生成条件の最適化気相合成法を用いた金属ナノ粒子の生成、および気相生成金属ナノ粒子の液相捕集に関する条件検討を行った。金属は、触媒として一般的に用いられていることに加えて、融点が比較的低いという理由から、温度調整の容易なAgおよびAuを用いた。大気圧化において電気炉内に各金属を設置し、融点付近(Agの場合1000 °C、Auの場合1200 °C程度)まで加熱した。上流側から不活性ガスを流すことでナノ粒子の合成を行った。下流部位に携帯型凝縮粒子カウンター(CPC)を取り付け、生成したナノ粒子の粒子数のカウントを行った。CPC計測結果から、本手法によりナノ粒子が生成出来ていることを確認した。さらに、装置の下流部に電顕観察用グリッド設置のための部品を取り付け、グリッド上にナノ粒子を捕集した。捕集したグリッドについて透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて観察し、粒子の大きさおよび形状の解析を行った。これにより、生成したナノ粒子はAgナノ粒子およびAuナノ粒子共に歪んだ形状ではなく、ほぼ球形の粒子が生成されていることを確認した。(2)コアーシェル型金属ナノ粒子の作製最適化された単一金属ナノ粒子の生成条件を元に、これまでに触媒活性の報告がなされている逆コアーシェル型金属ナノ粒子である、AgコアーAuシェル複合ナノ粒子の生成を試みた。出口部分にCPCを取り付け、粒子生成を確認したところ、ナノ粒子が生成されていることを確認した。さらに、出口部分に顕微鏡観察用グリッド設置のための部品を取り付け、グリッド上に捕集した所、球状のナノ粒子が生成されていることが確認できた。

液相中における金属イオンの還元によるナノ粒子作製は、コアおよびシェルとなる金属がイオン化傾向に依存しており、その順序を入れ替えた粒子を作製するには煩雑な操作を必要とするなど、ナノ粒子作製の自由度は低い。本研究では、液相中における金属イオン還元法とは異なる、気相合成法を用いて、イオン化傾向の影響を受けないコアーシェル型ナノ粒子の簡便な作製法を確立することを目的とした。本年度は、昨年度得られた単一金属ナノ粒子の合成条件をもとに、実際に気相法を用いたコアーシェル型ナノ粒子の合成を試みた。生成したナノ粒子の構造解析は、透過型電子顕微鏡による形状観察およびEDS分析による元素の同定を行った。電気炉を2台連結させ、それぞれの電気炉に異なる金属を設置し融点付近まで加熱することでナノ粒子を生成した。本研究により、この手法を用いることで2種類の金属からなる複合ナノ粒子が合成可能であることを示した。また、連結した2台の電気炉のうち、上流側の電気炉に設置した金属と下流側の電気炉に設置した金属では、下流側に設置した金属がナノ粒子の核となる部分を構成しており、上流側に設置した金属は、ナノ粒子の周りに散在するような状態で存在することが明らかとなった。また、この傾向は金属の種類に依存しないという事も明らかとなった。生成したナノ粒子のコアーシェル構造の確認、および生成したナノ粒子の触媒活性評価については、来年度さらに詳細に評価を行う予定である。平成28年度は、以下の内容に関して検討を行った。全体としてはやや遅れ気味の進行ではあるが、着実に進んでいる。(1)コアーシェル型金属ナノ粒子の合成最適化された単一金属ナノ粒子の生成条件を元に、これまでに触媒活性の報告がなされている逆コアーシェル型金属ナノ粒子である、AgコアーAuシェル複合ナノ粒子の生成を試みた。電気炉を2つ連結させ、上流側の電気炉にはAg粒を設置し、下流側の電気炉にはAu粒を設置した。それぞれの電気炉にて各金属の融点付近まで加熱し、上流側から不活性ガス(N2ガス)を流すことでナノ粒子を生成した。装置の出口部分に顕微鏡観察用グリッド設置のための部品を取り付け、生成されたナノ粒子をグリッド上に捕集した。透過型電子顕微鏡を用いてグリッドを観察したところ、ナノ粒子の存在を確認することが出来た。また、EDS分析により、ナノ粒子中にAgおよびAuが含まれていることも確認出来た。(2)回収した金属ナノ粒子のプラズモン特性の評価水相に回収した金属ナノ粒子のプラズモン特性を紫外可視吸光光度計を用いて測定した。コアーシェル型ナノ粒子の吸収波長は、単一金属ナノ粒子とは異っていたことから、今回合成したコアーシェル型ナノ粒子は単一金属ナノ粒子と異なる性質を持つ粒子であることを示した。また、吸収波長からは光学特性だけでなく回収したナノ粒子の凝集状態を評価することができる。今回回収した金属ナノ粒子は、水相中において分散した状態で存在可能である事も確認した。また、粒径と最外金属の種類を揃えた、単一型、コアシェル型の光学特性を比較した。内部構造が異なる事で、プラズモン吸収波長が異なる事を明らかにした。二種類の異なる金属で構成される二元金属コア-シェル型ナノ粒子は、金属ナノ粒子の中でも特に触媒活性が高いことが知られている。
細胞内レドックス環境の変化とサイトカインストレス応答の相互作用の分子生物学的検討

高サイトカイン血症は、手術侵襲・重傷膵炎・外傷・熱傷・ショック敗血症などの様々な侵襲に対して引き起こされる過剰な生体反応の背景に存在する。神経・免疫・内分泌の連関が一連のストレス反応の基礎に存在すると考えられるが、それを担う細胞の反応をレドックスの観点から捉え、細胞内レドックスシグナルとリン酸化を中心とした従来のシグナル系のクロストークの重要性を明らかにすることを目的として、炎症性サイトカイン・感染などのストレスに対する生体応答における酸化・還元(レドックス)制御機構の解析を進めた。生体内のレドックス制御因子のひとつであるチオレドキシン(TRX)は、種々の酸化ストレスで誘導されることが知られているが、C型肝炎ウイルス感染症では血清TRX値がインターフェロン感受性とよく相関すること、さらにHIVウイルス感染症末期ではその予後判定にも有用であることを明らかにした。また熱傷後にもTRX誘導放出が見られることを明らかにした。一方、種々の酸化ストレス刺激によりTRXは細胞質から核内へ移行することが知られているが、TRXファミリーのひとつであるグルタレドキシンの核内移行は必ずしも認められないことを明らかにした。さらに核内においてTRXがNF-kBやp53などの転写因子のDNA結合活性を増強することを明らかにした。さらに内因性TRXの誘導剤としてテプレノン(geranylgeranylacetone,GGA)を同定した。従来抗潰瘍薬として臨床応用されているGGAは胃粘膜細胞をはじめ肝細胞、リンパ球にもTRXを誘導し、その分泌をも促進する作用を示した。GGAはエタノールなどによる細胞障害を軽減すること、さらにTRX単独の投与あるいは誘導によっても細胞障害軽減作用が認められることから、GGAの細胞保護作用の一部はTRXの誘導を介することが示唆された。以上より、ストレスに対する生体応答機構において、TRXをはじめとするレドックス制御因子によるレドックス制御機構の重要性の一端を明らかにした。手術侵襲・重傷膵炎・外傷・熱傷・ショック敗血症などの様々な侵襲に対して引き起こされる過剰な生体反応の背景には高サイトカイン血症が存在する。神経・免疫・内分泌の連関が一連のストレス反応の基礎に存在すると考えられるが、それを担う細胞の反応をレドックスの観点から捉え、レドックスシグナルとリン酸化を中心とした従来のシグナル系のクロストークの重要性を明らかにすることが本研究の目的である。来年度も実験計画にそって計画を継続する予定である。神経・免疫・内分泌の連関が一連のストレス反応の基礎に存在すると考えられるが、それを担う細胞の反応をレドックスの観点から捉え、細胞内レドックスシグナルとリン酸化を中心とした従来のシグナル系のクロストークの重要性を明らかにすることが本研究の目的であった。その結果以下の様な結果を得た。培養細胞株を用いた実験によりTRX系とGRX系は炎症性サイトカイン依存性の遺伝子発現調節において異なった役割を果たしている。この役割の差は、TRXとGRXの基質特異性または細胞内局在の差によるものと考えられた。またTRXとGRX系は、異なった種類の転写因子をそれぞれ独自に調節することが明らかになった。私たちはさらにこのようなレドックス制御は、炎症性サイトカインによる転写因子の活性化にとどまらず低酸素で活性化される転写因子、紫外線刺激により活性化される転写因子なども含めた幅広いストレス応答性の転写因子の調節に関わっていることも明らかにした。
DNA鎖の転写反応におけるねじれの伝搬と非平衡カイラルダイナミクス

本研究では,DNAおよびDNAとヒストンタンパクの複合体であるヌクレオソーム構造のねじれ(twist)変形に対する安定性と力学的応答を,連続体モデルにもとづく解析的・数値的アプローチによって調べた。我々の計算結果は,ヌクレオソームのカイラルフリップや準安定状態がRNAポリメラーゼによるトルクの導入によって力学的に引き起こされるという可能性を強く支持する。本研究の成果は,クロマチン構造の動的な構造安定性を理解するうえで重要な知見をもたらすと期待される。すべての生命にとってDNAの転写反応は最も基本的かつ重要な細胞内活動のひとつである。遺伝情報の転写はDNAとRNAポリメラーゼをはじめとする種々のタンパクとの複雑でダイナミックな相互作用からなり、RNAポリメラーゼIIは活発にDNAを引っ張り、ねじり、DNAのスーパーコイル形成や構造転移を誘起する。本研究では転写に際にDNAに導入されるtwistがどのように伝搬し、DNAのトポロジカルな変化やヌクレオソーム構造の不安定化を引き起こすかという問題をメカニクスの視点から理論的に考察する。初年度にあたる22年度はまず、semiflexible polymerの一端からトルクの形で導入されたtwistがどのように輸送されるのかという基礎的な問題を取り上げ、それを解析的および数値的に詳細に調べた。とりわけ、ねじれによって駆動されるフィラメントのbuckling現象に注目した。Microスケールのフィラメントの運動では、まわりの溶媒流体の粘性効果が支配的になるため、エネルギー散逸を最小にするような配置を実現しようとする。そのとき、twist-writhe転換という幾何学的な効果のためにフィラメントは特異な形状をとる(whirling)が、その現象のメカニズムをエネルギー的また幾何学的な視点から明らかにした。(この成果は23年度に論文として公表した。)さらに、別の基礎的側面を明らかにしておくため、熱平衡におけるゲノムスケールのDNAの構造についても実験グループと協同で考察を行った。基盤上にdepositeした環状のDNA鎖の形状の統計的性質を特徴づけるユニバーサルなスケーリング公式を導出し、それを実験結果と比較することで非常によい一致を得た。この成果は22年度に論文として発表している。DNAに書き込まれた遺伝情報を読み出し、タンパク質を合成するプロセスは、あらゆる生物にとってその生命活動を維持するためのもっとも基本的なプロセスである。このきわめて重要なプロセスの第の一段階が、RNAポリメラーゼによるDNA遺伝情報の読み出し(mRNAの合成)である。真核細胞では、RNAポリメラーゼがクロマチン構造中にタイトに折り畳まれたDNAの必要箇所にどのようにアクセスし、どのように読み出しとmRNAの合成反応を行っているのか、その全体像は未だに曖昧としている。転写反応の開始や制御には、DNAのスーパーコイリング転移やねじれの伝搬が深く関わっていることが示唆されている。本研究の目的は転写ダイナミクスの文脈において、まげとねじれと引っぱり弾性を持つフィラメント(semi-flexible polymer)におけるカイラルな力学的摂動、ねじれの効果を解析的および数値的なアプローチを組み合わせて明らかにすることである。本年度は昨年の成果に加えて、DNAの局所的なねじれに依存したポテンシャルを導入し、これを用いてDNAとヌクレオソームのモデル複合体を計算機上で作成することに成功した。さらにこれを用いてRNAポリメラーゼによって外部から加えられたトルクがどのようにこの複合体の安定性とダイナミクスを変化させるかを調べた。とくに十分に大きなトルクによって複合体のunwrappingがひと巻きずつステップワイスにおこり、さらにカイラリティの逆転した複合体が出現する。外部トルクに誘起されるカイラルフリップや準安定状態の可能性は近年の実験で示唆されていたが、初めてモデル計算によって示された。これらの成果はクロマチン構造のトルクに対する強いplasticityを裏付ける。上記成果のの部は今年度に出版済ろであるが、さらに詳細な結果も現在、発表の準備中である。RNAポリメラーゼの働きによってDNAには動的にねじれが導入され,DNAのスーパーコイリングやヌクレオソーム複合体のリモデリングを引き起こすことが、多くの実験結果から示唆されている。このような力学的なプロセスはまた転写反応の開始や制御,あるいはクロマチンレベルの巨視的な構造安定性にも関与していると考えられている。本研究課題はこの複雑な現象の素過程であるモデルヌクレオソーム複合体におけるねじれの動的効果を理論的に調べることであった。最終年度である本年度は、弾性フィラメントと球状のモデルヒストンからなるヌクレオソーム複合体のねじれのもとでの安定性を、理論的および数値的に調べた。まずゆらぎを無視するレベルで系の自由エネルギーを解析的に導出し,ねじれの大きさに応じてそのエネルギーランドスケープがどのように変化するかを調べた。その結果,ヌクレオソームの安定性を減じるようにねじれが加わる場合,ヒストンをおよそ2回巻きしているDNAは協同的に解離することが予測された。さらに23年度に構築したシミュレーションモデルを用いて,外部からのねじれによってヌクレオソーム構造がどのように動的に変化するかを調べた。

その結果,DNAはヒストンからステップワイズに解離することが示された。さらにねじれートルク曲線を測定し,それが特徴的なのこぎり型の応答を示すことを明らかにした。これらのふるまいは磁気ビーズを用いた生体一分子測定実験によって検証可能な予測である。以上の結果は,転写過程におけるヌクレオソームの動的な構造安定性を理解するうえで,重要な力学的知見をもたらす成果である。初年度にDNAのモデルであるsemi-flexible polymer中のねじれの伝搬に関する基礎的研究を遂行し、これを2年目にあたる今年度に出版することができた。さらに今年度は、シミュレーションによってモデルヌクレオソームを安定的に構成することに成功し、外部トルクによってunwrappingおよびreverse wrappingが引き起こされることも発見できた。ほぼ申請書に記載したタイムテーブル通りに成果が得られており、順調に進展していると考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度にシミュレーションから得られた新規な結果(上記の記述参照)の成果をさらに説得力のある形でまとめ論文として出版するには、より多くのパラメータに対するデータと理論的な考察が不可欠である。また今年度の研究から得られたreversed chhlalityをもつモデルヌクレオソームは、生物において示唆されているクロマチン構造のplasticityと直接的に関わっていることが強く期待されるが、そのバイオロジカルな意義をさらに明らかにするには生物サイドからのいっそうの考察も必要である。これらを最終年度に遂行していく計画である。
鼻腔原発リンパ腫における細胞間接着分子の発現の検討

カドヘリンは細胞間接着分子である。E(epithelial)-カドヘリンは上皮系の細胞上に発現している。上皮細胞以外ではランゲルハンス細胞とγδ型のT細胞受容体を有するTリンパ球の亜群に発現している。これらは、表皮内において扁平上皮細胞とE-カドヘリンを介して接着し、局所の免疫応答に関与していることが報告されている。一方、鼻腔原発リンパ腫においては、E-カドヘリンとの関係を検討した報告はない。本研究は、鼻腔原発リンパ腫においてE-カドヘリンの発現の有無について検討したものである。北里大学病院耳鼻咽喉科で治療した鼻腔原発リンパ腫症例について治療前に生検した組織をホルマリン固定・パラフィン包埋し切片を作製して免疫組織化学的検討を行った。一次抗体にはT細胞に対してCD3(1:1000、DAKO)、CD4(1:80、DAKO)、CD8(1:100、DAKO)、CD45RO(1:50、DAKO)、B細胞に対してCD20(1:50、DAKO)、E-カドヘリンに対してHECD-1(TAKARA)を用いた。一次抗体反応の前に0.01Mクエン酸buffer0.1%Tween20を用いてオートクレーブで10分間抗原の賦活化を行った。染色は高感度間接法であるEnvisionsystemを使用した。本研究では、オートクレイブと界面活性剤を用いることで、ホルマリン固定・パラフィン包埋切片でも安定してE-カドヘリンを検出することができた。結果が明確に出た症例数が8例と少なかったが、その2例にその発現を認めることができた。全症例でT細胞に対するいずれかの抗体で陽性であり、B細胞に対する抗体はいずれも陰性であった。我々が用いた方法によって、T細胞リンパ腫においてもE-カドヘリンが発現している症例があることを証明できた。これら症例におけるE-カドヘリンの機能に関しては、さらなる検討が必要である。上皮細胞以外でE-Cadherin(E-Cad)を発現している細胞はランゲルハンス細胞とγδ型のT細胞受容体を有するTリンパ球の亜群であり、表皮内では扁平上皮細胞とE-Cadを介して接着し、局所の免疫応答に関与していることが最近報告された。鼻腔原発リンパ腫は多くの場合γδ型のT細胞受容体を有しているが、これまでE-Cadとの相互関係を検討した報告はない。北里大学病院耳鼻咽喉科で治療した鼻腔原発リンパ腫のホルマリン固定・パラフィン包埋切片を用い、特異的抗体を用いて免疫組織化学的方法で検討した。これまで、細胞間接着分子の発現は主に凍結切片を用いて行われ、ホルマリン固定・パラフィン包埋切片での染色は困難であった。しかしながら、我々は、オートクレーブと界面活性剤を併用することにより、ホルマリン固定・パラフィン包埋切片でも安定してE-Cadを検出することができた。我々は鼻腔リンパ腫において6例中1例にE-Cadの発現を確認した。鼻腔原発リンパ腫において、E-Cadの発現と臨床経過との間に何らかの関連性のあることが予想される。しかし、症例数が少なくこれらの検討は難しい。鼻腔原発リンパ腫における特徴たとえば、上皮との親和性の検討やリンパ球のマーカー等を用いた二重染色法を用いることにより、腫瘍細胞におけるE-Cad発現細胞の割合、分布等を明らかにする。また、同方法を用いてE-Cad以外の細胞間接着分子(N-Cadherin,P-Cadherin)の検討もする。今後、症例数が増やして検討しこれら細胞間接着分子の発現と臨床経過や予後との関係を明らかにする。

我々が用いた方法によって、T細胞リンパ腫においてもE-カドヘリンが発現している症例があることを証明できた。これら症例におけるE-カドヘリンの機能に関しては、さらなる検討が必要である。
骨髄間質細胞から分化誘導した神経細胞の電気生理学的機能解析

マウス骨髄間質細胞に細胞成長因子を添加して神経細胞に分化誘導した。この神経細胞を神経細胞に特異的な分子マーカーであるNestin、Neurofilament、GFAP(Glial fibrillary acidic protein)の抗体を用いた免疫細胞化学法にて調べたところ、すべての抗体に対して細胞が染色され骨髄間質細胞が神経細胞に分化していることが確認された。その後、この分化誘導した神経細胞が神経細胞としての興奮機能を有しているか否かを細胞外電位を記録することにより電気生理学的に検討をおこなった。シャーレ上の神経細胞に3M KClで満たされたガラス管電極を刺入し細胞外電位を記録した。その結果、ほとんどの神経細胞から自発放電を記録することができた。さらに細胞に脱分極電流を流すと、ナトリウム電位に類似した波形が記録された。また、この状態において神経成長因子であるNGF(Nerve growth factor)を100ng/mlで添加し細胞外電位を観察した。シナプス形成のある細胞数の多い培養条件では、NGFを添加することにより1分以内に細胞外電位の振幅の増大がみられた。この増大は次第に大きくなり、3分後で最大となった。その後徐々に減弱し投与5分後には消失した。消失後、同濃度のNGFを追加しても同様の現象がみられたが、3回目以降の投与ではNGFによる効果はみられなかった。また。このNGFによる効果は、細胞間のシナス形成がほとんどない培養条件ではみられなかった。以上の結果から、骨髄間質細胞から分化誘導した神経細胞は電気生理学的に興奮機能を有しており、この細胞の興奮性にはナトリウムチャネルが関与していることが示唆された。また、NGFは一過性であるがこれら分化誘導した神経細胞の興奮機能およびシナプス伝達機能を増強することが示唆された。また。マウス骨髄間質細胞を細胞成長因子を用いて神経細胞に分化誘導した。神経細胞に特異的な分子マーカーであるNestin、Neurofilament、GFAP(Glial fibrillary acidic protein)に対する抗体を用いて免疫細胞化学法にて調べたところ、すべての抗体に対して細胞が染色され骨髄間質細胞が神経細胞に分化していることが確認された。その後、この分化誘導した神経細胞が神経細胞としての興奮機能を有しているか否かを細胞外電位を記録する電気生理学的検討をおこなった。シャーレ上の神経細胞に3M KCIで満たされたガラス管電極を刺入し細胞外電位を記録した。その結果、シャーレ内の細胞数が多く細胞同士のシナプス形成がなされている神経細胞からは細胞外電位を容易に記録することができた。しかし、シャーレ内の細胞数が少なく顕微鏡下で近接した細胞同士のシナプス形成ができていない神経細胞から自発放電を記録することは困難であった。さらに、この状態において神経成長因子であるNGF(Nerve growth factor)を100ng/mlで添加し細胞外電位を観察した。その結果、シナプス形成のない細胞数の少ない状態ではNGFを添加しても細胞外電位にほとんど変化はみられなかったが、シナプス形成のある細胞数の多い状態ではNGFを添加することにより約1分後に細胞外電位のburstがみられた。このburstは1分から2分間時持続しその後消失した。さらにNGFを追加しても同様の現象がみられた。以上の結果から、骨髄間質細胞から分化誘導した神経細胞は細胞間の神経ネットワークを形成することにより興奮機能を有し、NGFは一過性であるがこの興奮機能を増強することがわかった。細胞成長因子を添加してマウス骨髄間質細胞から神経細胞に分化誘導した後、この神経細胞の興奮性獲得を電気生理学的に検討をおこなった。細胞外電位を記録することにより検討をおこなった。

シャーレ上の神経細胞に3M KCIで満たされたガラス管電極を刺入し細胞外電位を記録した。ほとんどの神経細胞から自発放電を記録することができた。さらに細胞に脱分極電流を流すと、ナトリウム電位に類似した波形が記録された。このことから、細胞の興奮性にはナトリウムチャネルが関与していることが示唆された。また、神経成長因子であるNGF(Nerve growth factor)を100ng/mlで添加し細胞外電位を観察した。シナプス形成のある細胞数の多い培養条件では、NGFを添加することにより1分以内に細胞外電位の振幅の増大がみられた。この増大は次第に大きくなり、3分後で最大となった。その後徐々に減弱し投与5分後には消失した。消失後、同濃度のNGFを追加しても同様の現象がみられたが、3回目以降の投与ではNGFによる効果はみられなかった。また。このNGFによる効果は、細胞間のシナプス形成がほとんどない培養条件ではみられなかった。以上の結果から、骨髄間質細胞から分化誘導した神経細胞は電気生理学的に興奮性を有しており、ナトリウムチャネルが関与していることが示唆された。また、NGFは一過性であるがこれら分化誘導した神経細胞の興奮機能およびシナプス伝達機能を増強することが示唆された。今後、NGFによる作用がナトリウムチャネルを介したものか否かを、テトロドトキシン等による阻害作用をもちいて検討する予定である。
アルコ-ル性胃粘膜障害機序の究明、とくに胃主・壁細胞にホスホリパ-ゼ活性の役割

A.モルモット胃主細胞におけるエタノ-ルの作用ーエタノ-ルは胃主細胞障害をおこさない濃度範囲(300ー900mH)で主細胞からのペプシノ-ゲン放出反応を刺激しました。主細胞にFuraー2を負荷したのち、Fura2Ca^<2+>複合体の螢光を指標とした主細胞内Ca^<2+>濃度の変化を観察すると、cholecystokinin(CCK)刺激の場合とは異なりエタノ-ル300ー900mMは主細胞内Ca^<2+>濃度をなだらかに増加させました。エタノ-ル刺激主細胞内Ca^<2+>濃度の増加は細胞外液中のEGTAや、Ca^<2+>チャネル阻害剤のLa^<3+>により抑制されることから、CCK刺激主細胞内Ca^<2+>移動とはその由来が異なっていました。エタノ-ルは又^<45>Ca^<2+>で測定される主細胞内への初期Ca^<2+>流入率をCCKに比し著明に増加させました。エタノ-ルによって刺激される初期Ca^<2+>流入率の増加はLa^<3+>によって抑制されるが、ニフェジピンやベラパミルによっては抑制されませんでした。ヌエタノ-ル刺激ペプシノ-ゲン放出作用もLa^<3+>によって完全に抑制されましたが、ニフェジピンやベラパミルによっては抑制されませんでした。従ってエタノ-ルはLa^<3+>によって調節されるCa^<2+>チャネルを介して主細胞内へのCa^<2+>流入を刺激し、ペプシノ-ゲン放出を刺激するものと思われました。B.モルモット胃主細胞イノシト-ルリン脂質動態の解析ーエタノ-ルによる主細胞内へのCa^<2+>流入刺激作用がイノシト-ルリン脂質の代謝産物によって調節されているか否かを検討しました。〔^3H〕イノシト-ル標識主細胞においてCCKはイノシト-ルリン酸の集積を刺激しましたが、エタノ-ルには刺激効果はありませんでした。従ってエタノ-ルによるCa^<2+>流入刺激作用はイノシト-ルリン酸の集積を介するものではないことが示唆されました。
人工呼吸管理中にしゃべれる気管切開チューブの開発

昨年度の研究実績より直径3cm、厚み0.15mm、形状は円形であることが呼気時に最もカフが縮み、発声をできる可能性が高いこと判明した。そこで今年度はそのカフの形状とサイズにおいて至適なシリコン材質を検討した。シリコンの硬さをJIS K6301(A型)で20、40、60に調整、シリコンの伸び率をJIS K6301〔3号型〕で300、600、1000、1500%で調整した。すなわち3X4=12通りのカブを具備したボイストラックを作製した。試作したボイストラックをモデル肺と人工呼吸器の間にセットしたモデル気管に装着し基礎実験を行った。吸気時)にカフの隙間から空気漏れがなく、呼気時カフが充分に縮む、至適なカブの形状、サイズ、厚さ、を検討した。モデル肺のcomplianceは10ml/cmH_2Oから50ml/cmH_2Oの間で5ml/cmH_2Oずつ区切り、9段階のcomplianceで設定した。PEEPを0、3、5、7cmH_2Oの4段階に設定した。それぞれの肺のcompliance、PEEPの条件の組み合わせ、すなわち9x4=36通りの条件下で12種類のカフを有する気管切開チューブでモデル肺の人工呼吸を行った。集積したデータはモデル肺の換気量、吸気時に気管切開チューブとモデル気管の隙間から漏れる空気量(人工呼吸器の送気量-モデル肺の換気量)、呼気時に気管切開チューブとモデル気管の隙間から漏れる空気量(モデル肺の換気量-人工呼吸器に戻る空気の量)である。この実験より、カフの硬さはJIS K6301(A型)で40、カフの伸び率はJIS K6301(3号型)で600%において、吸気時の漏れが最も少なく〔5%以下〕、呼気時の漏れる空気量が40%と最も大きい結果を得た。すなわち、同条件のシリコン材質が最も有効換気が多く、最も大きな発声を可能とすることが判明した。シリコン製のカフを高研株式会社に依頼し、カフの直径2.5cm,3cm,3.5cm,4cmの4種類、カフの厚みを0.15mm,0.2mm,0.25mmの3種類、カフの形状を円形、楕円形、台形の3種類で、3×4×3=36種類のカフを具備したボイストラックを作製した。試作したボイストラックをモデル肺(MI Instruments; Grand Rapids, MI)と人工呼吸器の間にセットしたモデル気管に装着し基礎実験を行った。吸気時(人工呼吸器が空気を送り込む時)にカフの隙間から空気漏れがなく、呼気時カフが充分に縮む、至適なカフの形状、サイズ、厚さ、を検討した。モデル肺のcompliance(肺の硬さ)は10ml/cmH_2O(重傷肺の硬さ)から50ml/cmH_2O(正常肺の硬さ)の間で5ml/cmH_2Oずつ区切り、9段階のcomplianceで設定した。Positiveend expiratory pressure(PEEP)を0,3,5,7cmE20の4段階に設定した。それぞれの肺のcompliance、PEEPの条件の組み合わせ、すなわち9×4=36通りの条件下で36種類のカフを有する気管切開チューブでモデル肺の人工呼吸を行った。この実験より、カフの形状では円形、楕円形、台形型の間に吸気時に漏れる空気量は約10%で差はなかったが、呼気時に漏れる空気量は円形が40%、楕円形、台形型の25-30%より有意に多い結果を得た。すなわちカフの形状は円形であることが声を最も出せる可能性が高いことが判明した。

集積したデータはモデル肺の換気量、吸気時に気管切開チューブとモデル気管の隙間から漏れる空気量(人工呼吸器の送気量-モデル肺の換気量)、呼気時に気管切開チューブとモデル気管の隙間から漏れる空気量(モデル肺の換気量-人工呼吸器に戻る空気の量)である。この実験より、カフの硬さはJIS K6301(A型)で40、カフの伸び率はJIS K6301(3号型)で600%において、吸気時の漏れが最も少なく〔5%以下〕、呼気時の漏れる空気量が40%と最も大きい結果を得た。すなわち、同条件のシリコン材質が最も有効換気が多く、最も大きな発声を可能とすることが判明した。
新規アクチン細胞骨格制御因子TAB182を介したがん浸潤機構の解明とその制御

我々が同定し命名した新規タンキラーゼ結合蛋白質TAB182は細胞質に局在しcortical actin networkと共染色される。しかしながらその意義は不明である。本研究においてTAB182が細胞質においてF-actinと共局在すること、さらにアクチン細胞骨格の再構成を介して細胞の運動・浸潤能の制御に関与することを見いだした。本研究はポリ(ADPリボース)ポリメラーゼファミリーの一員であるタンキラーゼ新規結合蛋白質TAB182の破綻がどのようにがんの細胞運動・浸潤に関与するのか、またタンキラーゼによるTAB182の制御機構を明らかにすることを目的としている。TAB182の発現低下による細胞運動・浸潤の亢進HT1080細胞株を用いてアクチン細胞骨格上に局在するTAB182を枯渇させると、ROCK(Rhoキナーゼ)の活性化を介したアクチン細胞骨格の再編成が誘導され、細胞運動・浸潤能の亢進が観察された。一方、ROCK阻害剤を処理することによりそれらの現象が抑制できたことから、TAB182の枯渇はROCK経路の制御に関与することが考えられた。また、臨床がんとの関連を検討した結果、いくつかのがん種で正常組織に比べがん組織でTAB182の発現低下が観察された。これらのことから、TAB182の発現低下がある種のがんの進展に寄与していることが示唆された。タンキラーゼによるTAB182の制御タンキラーゼは細胞内で様々な部位に局在することから、核または細胞質にタンキラーゼを安定に発現するHT1080細胞株を樹立し検討した結果、細胞質にタンキラーゼを発現する細胞がポリ(ADPリボシル)化に依存してROCK経路の活性化を介したアクチン細胞骨格の再構成および細胞運動の亢進を引き起こすことを明らかにした。この時、TAB182自体の発現低下が観察されなかったことから、タンキラーゼによるTAB182のポリ(ADPリボシル)化の関与が示唆された。今回、TAB182がROCKの活性化を介した細胞運動・浸潤の制御に関与すること、さらにタンキラーゼの活性がTAB182の制御に関与している可能性を見いだした。これらの解明を行うことにより、TAB182やタンキラーゼを標的とした新たながん治療法の確立につながることが期待される。本研究はポリADP-リボースポリメラーゼ(PARP)ファミリーの一員であるタンキラーゼ1新規結合蛋白質TAB182の破綻がどのようにがんの細胞運動・浸潤に関与するのか、またタンキラーゼ1によるTAB182の制御機構を明らかにすることを目的としている。本年度は以下の結果を得た。TAB182の細胞内局在を詳細に検討した結果、アクチン細胞骨格上に局在することを見いだした。ヒト繊維肉腫HT1080細胞を含む複数のヒトがん細胞株を用いてTAB182に対する低分子干渉RNA(siRNA)を導入すると、アクチン細胞骨格の再構成に関与するシグナル伝達経路の活性化および細胞運動の亢進を引き起こした。そこで、同経路の活性化を特異的に阻害する薬剤を処理したところ、細胞骨格の再構成および細胞運動が抑制できたことから、TAB182の発現低下がアクチン細胞骨格の再構成を介した細胞運動亢進に寄与することが示唆された。さらに臨床がんとの関連を検討した結果、正常組織にくらべTAB182の発現低下をみとめるがん種を見いだした。次に、タンキラーゼ1によるTAB182の制御機構の検討を行った。タンキラーゼ1は細胞内で様々な部位に局在することから、核または細胞質にタンキラーゼ1を安定に発現するHT1080細胞株を樹立した。これらを用いてアクチン細胞骨格への影響を検討した結果、細胞質にタンキラーゼ1を発現する細胞がそのPARP活性に依存してアクチン細胞骨格の再構成および細胞運動の亢進を引き起こすことを見いだした。今回、TAB182がアクチン細胞骨格の再構成を介して細胞運動の制御に関与すること、タンキラーゼ1がTAB182の機能を制御している可能性を見いだした。これらの制御機構の解明を行うことにより、TAB182およびポリ(ADP-リボシル)化修飾シグナルを標的とした新たながん治療法の確立につながることが期待される。これまでのところ、概ね当初の予定通り研究が進んでいる。次年度も研究計画に沿って研究を継続する。当初の研究計画に沿った研究を行うが、次年度に行う予定であるTAB182ノックアウトマウス同士の交配による表現系の変化の解析は長期観察が必要であるため、場合によってはそれ以外の実験を優先する。当初の計画どおり研究費の大部分を消耗品費に使用する予定である。また研究成果の発表を行うための旅費、論文執筆に必要な謝金、論文出版費なども費用に計上している。
構音の視覚的フィードバック訓練に用いる人工口蓋床の開発と臨床連携システムの構築

構音障害の改善に難渋している症例に効果的な視覚的フィードバック訓練を均てん化するため、より安価で安定したエレクトロパラトグラフィ(EPG)の人工口蓋床を開発した。また、EPGの運用を拡大することを目的としたワークショップやシンポジウムを実施し、EPG研究会のウェブサイトを立ち上げて情報の共有を図った。今後、言語聴覚療法のみならず、歯科治療や音声学・言語学、音声情報処理分野にもEPGを活用し、学際的な研究を進める可能性が拡がった。構音障害に対する訓練法としては、従来聴覚刺激法や構音点位置付け法などが用いられてきたが、従来の訓練法で改善しにくい人や聴覚障害のある人に対して、エレクトロパラトグラフ(EPG)を用いた視覚的フィードバック訓練が効果的であることが分かってきた。EPGは微細な電極を埋め込んだ人工口蓋床を口蓋に装着して、発話時の舌と口蓋の接触を経時的に表示・測定する装置である。人工口蓋床の製作工程は、各々の上顎石膏模型を採取し、上顎歯列の頬舌・前後幅径を計測して解剖学的に定められた位置に62個の電極を手作業で配置するなど、技術と時間を要する。そこでEPGの臨床応用を拡大するために、次の2項目の目標を立てた。1.製作が簡便で信頼性が高く、より低価格なEPG人工口蓋床の開発2.EPGの臨床応用に関する多施設間連携システムの構築1.については、様々な年齢の口蓋の形態を分析し電極間の幅を計測した結果、2.07.0mmまでの12種類で対応できることがわかった。ベースプレートをバキュームフォームにし、手置き電極を12種類のフレキシブル基盤にする改良で、従来6時間以上かかっていた作成時間を3時間以内に短縮できた。今年度は、各電極からのエナメル線をEPGシステムに接続するマルチプレクサー(回線多重化装置)を、より簡便かつ確実に接合できるよう設計・開発を行う予定である。2.については、2010年3月に第1回EPGワークショップを開催して、EPGシステムの基本的な操作やEPGデータの収集方法について情報交換をおこなった。今年度は第2回EPGワークショップを計画し、施設間を電子ネットワークでリンクし、個人情報保護の観点も踏まえたEPGデータ送受信システムを立ち上げ、データベース構築のための準備を進める。1. EPG人工口蓋床の各電極からのエナメル線をWinEPGシステムに接続するマルチプレクサー(回線多重化装置)の改良、および様々な年齢の口蓋の形態に適応する12種類の電極幅のシートの開発をおこなった。こうした材料を提供することで、現在は国内では山本歯科医院でのみ作成しているEPG人工口蓋床を、他の歯科関連施設でも作成可能となり、汎用化が進むと考えられる。2.これまで英国から輸入していたEPG簡易トレーニング装置を国内で生産できるよう、浜松市のアスカプランニング株式会社と協同開発を行った。英国製のものはin situフィードバックのみだったが、今回開発した装置は記録・再生機能を搭載し、SDカードに記録したデータをコンピューターに移して解析することが可能となった。EPGを用いた構音の視覚的フィードバック訓練を導入する施設も増加しつつあり、データの解析および指導法に関する助言を依頼される機会が増加すると思われる。1.構音の視覚的フィードバック訓練で用いる日本語音のEPG目標パターンに関する検討:これまでは正常例5例の累積パターンを構音訓練の目標として用いてきたが、15例の累積に拡大し、信頼性を向上させた。また、口蓋の形態や歯列に異常がある口蓋裂術後症例のEPGパターンは正常例とは異なるのではないか、という疑問から、正常な構音を獲得している口蓋裂術後症例15例を対象として、日本語音の累積パターンを作成した。結果、舌の口蓋への接触範囲は広がるが基本的には正常例と同様なパターンを呈することが分かった。2.構音障害の評価の標準化に向けた検討:口蓋裂に伴う異常構音をEPGで分析し、海外における分類との整合性を検討し、2011年10月に第56回、日本音声言語医学会にて発表した。また2011年5月に開催された第35回日本口蓋裂学会においてシンポジウム「口蓋裂に伴う構音障害の評価と分類-共通理解に向けて-」を企画運営した。3.EPG研究会のwebページの立ち上げと活用:EPG研究会の広報サイトでEPGに関する情報の公開を進めた。また、SNSサイトでは登録者を対象として臨床データの分析・解説や、データの集積・活用を目指している。4.研究業績集の作成.:EPGに関する研究業績を冊子にまとめて、EPGに関心のある臨床家や研究者に紹介する。
健康の社会格差の視点を包含した社会的弱者に対する保健師活動支援方略の検討

自記式調査のデータ集計から、社会的弱者に対する健康認識と活動実態の現状と課題を明らかにした。調査票の有効回答数(率)は13,277(47.3%)で、健康格差という言葉の意味を知っていた者は約6割であったが、知識として健康の地域格差や個人の社会経済的背景による健康格差があることを約9割の者が理解していた。具体的な健康格差対策について分かる者は、約1割にとどまった。健康格差対策に関する政策や計画等について知っているものは、政策や計画等により約0.5割から約5割と限定的だった。日々の活動の中で健康格差を感じている者は約9割で、健康格差を縮小するための取り組みを必要だと感じ、また保健師はその担い手のひとりであると感じていた。日々の活動を行う際に、既存のデータを活用している者は約8割であった。社会背景ごとの健康指標の違いをデータ化している者は約2割と少ないものの、データ化している者はそれらを活用できている者が多かった。『社会的弱者の把握の機会』は、「各種相談時」や「訪問時」、「関係部署や関係機関との連携・調整時」、「各種事例検討会時」で有する者が多かった。実際に各機会で社会的弱者を把握しているかについては、「妊娠届出時」や「訪問時」、「乳幼児健診時」、「各種相談時」、「各種事例検討会時」などで約9割以上が、「住民の主体的活動の支援時」や「各種計画立案・評価時」では、約5割が意図的な把握を行っており、機会により差が見られた。社会的弱者の把握の機会に関わらず、対象者の経済状況や職業といった社会経済的背景を意識して把握している者が多かった。以上から、健康の社会格差の視点を包含した保健師の活動支援方略として、まずは、健康格差の理解が深まるように知識の伝達を行い、既に行っている保健活動と健康の社会格差を意識した活動がどのように関連しているかを伝えていくことが重要である。平成28年度は、貧困率・生活保護率の高い地域における、社会的弱者の健康実態に関する保健師の認識と社会的弱者に対する活動実態を実施した。方法は、貧困率・生活保護率の高い地域で活動を行なう保健師への半構成化質問紙を用いた面接調査である。調査の結果、9人から同意が得られた。テキストマイニングにより、原文文字数55,999、分かち書き数29,019、キーワード数5,293を得、以下のことが明らかとなった。1.保健師は日々の活動の中で`生活'を見る視点を持ち`相手の気持ち'により添うことが重要だと考えていた。2.社会的弱者の健康格差について知っていることとして、`お金'が最も多く挙げられた。この`お金'を第一キーワードとして「精密検査をうけない」「検診をうけない」「病院に行かない」など`健康'についてのつながりをとらえていた。また「孤立している」「知り合いがいない」などの`生活'をとらえていた。3.しかし、社会的弱者を明確に把握はしておらず、生活保護受給者と認識している者も多くいた。4.社会的弱者を意識した取り組みや活動は約半数が「ない」と回答した。5.社会的弱者への保健活動に対する思いは、`やっぱり'「難しい」、「健康に関して問題意識を持たない」、「関係部署との連携が必要」との意見が聞かれた。生活保護率や貧困率が高い地域で活動鶴保健師は、健康格差という言葉は知っているが、それが人々の暮らしの中で具体的にどの様なこととしておこっているのかは十分理解していなかった。また社会手弱者への健康格差の視点からの取り組みは少なかった。普段の活動の中での気づきを、より意識して取り組むことに向うための手立てが必要であることが示唆された。当初計画通り、面接調査の対象者を抽出できた。しかし、当初予定していた人数(約20名)より少なく9名からしか研究同意が得られなかった。これは対象市区の同意が得られなかったためであり、計画が当初計画通りに進まない時の対応として考えていた、「市区の同意が得られなかった際は、順次生活保護率が低い市区に依頼を行う」ことで対応した。具体的には、対象府県の平均生活保護率を下回る市区しか同意が得られなかった場合、対象人口を100万人口5万から10万人口、30万から50万人口へと広げることで対応し、市区より保健師の推薦がない場合や保健師の同意が一人も得られない場合も、上記同様に対象地区を広げて対応した。市区の同意を得るために依頼文書を出し、その結果を受け取るまでに約3週間を要した。このような市区が複数あり、結果的に同意が得られた者が少なく、また調査時期が予定よりも遅くなってしまった。しかし、同意が得られた者からは有意義な内容を聴取することが出来た。データの分析も研究者間で協働し予定時期に終えることが出来た。よって、おおむね順調に進展していると評価した。平成29年度は、前年度に実施した保健師面接調査より明らかになった社会的弱者の健康認識や活動実態を反映させた自記式調査票を作成した。具体的な質問項目は、基本属性(部署、役職、年齢、勤続年数、所属市町村の人口規模)、前年度調査より抽出した社会的弱者の健康認識、活動の必要性認識、実際の活動内容等、社会的弱者への支援に関する項目である。これらの項目を盛り込み、社会的弱者に対する全国市町村保健師の活動の実態把握を行うために悉皆調査を実施した。

対象は全国の市区町村・特別区である1,743施設に常勤職員として勤務する保健師28,067人である。調査票の回収(率)は14,328(51.0%)、無回答や対象外を除いた有効回答数(率)は13,277枚(47.3%)であった。次年度はこのデータの分析を行っていく。当初の計画通り、前年度調査の結果を受けて調査票の項目を検討し、作成できた。また、倫理委員会の承認も得て、自記式質問紙調査を実施できた。調査票の回収、データの入力も予定通り進んでおり、29年度末には全回収データの入力を終了した。回収率は約50%であり、予想回収率とした60%と近似していたことから、おおむね目標は達成できたと考える。自記式調査のデータ集計から、社会的弱者に対する健康認識と活動実態の現状と課題を明らかにした。調査票の有効回答数(率)は13,277(47.3%)で、健康格差という言葉の意味を知っていた者は約6割であったが、知識として健康の地域格差や個人の社会経済的背景による健康格差があることを約9割の者が理解していた。具体的な健康格差対策について分かる者は、約1割にとどまった。健康格差対策に関する政策や計画等について知っているものは、政策や計画等により約0.5割から約5割と限定的だった。日々の活動の中で健康格差を感じている者は約9割で、健康格差を縮小するための取り組みを必要だと感じ、また保健師はその担い手のひとりであると感じていた。日々の活動を行う際に、既存のデータを活用している者は約8割であった。社会背景ごとの健康指標の違いをデータ化している者は約2割と少ないものの、データ化している者はそれらを活用できている者が多かった。『社会的弱者の把握の機会』は、「各種相談時」や「訪問時」、「関係部署や関係機関との連携・調整時」、「各種事例検討会時」で有する者が多かった。実際に各機会で社会的弱者を把握しているかについては、「妊娠届出時」や「訪問時」、「乳幼児健診時」、「各種相談時」、「各種事例検討会時」などで約9割以上が、「住民の主体的活動の支援時」や「各種計画立案・評価時」では、約5割が意図的な把握を行っており、機会により差が見られた。社会的弱者の把握の機会に関わらず、対象者の経済状況や職業といった社会経済的背景を意識して把握している者が多かった。以上から、健康の社会格差の視点を包含した保健師の活動支援方略として、まずは、健康格差の理解が深まるように知識の伝達を行い、既に行っている保健活動と健康の社会格差を意識した活動がどのように関連しているかを伝えていくことが重要である。平成29年度は、保健師面接調査より明らかになった社会的弱者の健康認識や活動実態を反映させた自記式調査票を作成し、全国市区町村保健師への悉皆調査により社会的弱者に対する活動の実態把握を行う。そのために、4月から7月は全国市区町村保健師への自記式質問紙の検討を行う。7月の倫理委員会にて審査を受けその結果を基に秋ごろ(9月11月)に、社会的弱者に対する全国市区町村保健師への健康認識・活動実態悉皆調査を行う。計画当初は、全国の1,748市区町村(総務省,平成26年4月現在)に所属する保健師約27,000人を対象としていたが、データの入力作業(業者委託)の単価が高くなっており、3年間を予算と実現可能性を考慮し対象者を全国の1,748市区町村を対象とするものの市区町村の保健師数に応じた比例抽出とし、保健師約15,000人を対象とし実施する。