hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非結核性抗酸菌に対する新たな検査法の開発と感染症例の検討

医療の進歩やAIDSの蔓延に伴う免疫不全患者の増加により非結核性抗酸菌感染症は増加している。しかし、生化学的な性状から抗酸菌の菌種を同定することは難しく、多くの症例は正しく診断、治療されていないものと考えられる。このような問題から遺伝子シークエンスを基にした細菌の同定法が報告され、研究室レベルで利用されてきた。しかし、どの遺伝子を解析すると良いのかを総合的に検討した報告はない。そこで本研究では菌種同定の"golden standard"となっている16S rRNA遺伝子に組み合わせて解析すべき遺伝子としてrpoB遺伝子の前半部分と後半部分、secA遺伝子の検討を行った。30種の標準菌株を用いた検討の結果、16S rRNA遺伝子の前半500bpとsecA遺伝子を組み合わせて解析する方法が最も診断率が高く、コストの上でも優れていることが明らかとなった。そこで、20012004年に福島県立医科大学附属病院臨床検査部で分離された非結核性抗酸菌214株をこの方法で解析した結果、1株を除いて全ての株を同定でき、世界で6例目のM.heckshornense肺炎例も診断できた。一方、結核菌群(Mycobacterium tuberculosis complex ; MTC)に分類される菌種は遺伝子のシークエンスがほとんど同じで、遺伝子シークエンスによっては菌種同定が出来ない。そこで、既に報告されている欠損遺伝子をPCRで解析し、菌種同定を行う方法を用いて症例の解析を行った。その結果、BCG接種50年後に皮膚結核症を発症した例、膀胱癌に対するBCG療法後にBCGによる脊椎カリエスを発症した症例を明らかに出来た。現在多くの検査室ではMTCの診断を行っていないが、本法の導入によって結核菌感染症と誤診されているBCGの感染症を正しく診断できるものと考えられた。抗酸菌感染症のおよそ20%は非結核性抗酸菌によるもので、新規患者発生数は増加傾向にあると言われている。しかし、その原因菌には38種もの菌が知られており、生化学的性状を基盤とした古典的同定法では菌種を確定することが困難な症例が多い。そこで、近年発達してきた16S ribosomal RNA(16S rRNA)遺伝子シークエンスによる菌種同定法を用い、福島県立医科大学での症例を確定診断し、それぞれの症例の臨床像を検討することを目的に本研究を進めている。2001年5月から2003年12月の期間に、福島県立医科大学臨床検査部で分離され、保存されていた非結核性抗酸菌224株の16S rRNA遺伝子をPCR-directed sequencing法で解析し、抗酸菌16S rRNA遺伝子のデーターバンクRIDOMと遺伝子データーバンクGeneBankで相同性検索を行った。その結果、223株(98.7%)の菌名を同定することが出来た。その中には、既存の検査法では同定不能な、世界で3例目の稀な感染症も含まれていた(Mycobacterium heckeshornense)。この方法が検査法として有用であることが明らかとなったので、福島県立医科大学附属病院での抗酸菌検査の体制を見直し、PCRで同定可能なM.tuberculosis、M.avium、M.intracellulale以外の抗酸菌は、全て本法で同定することとし、現在さらに多くの症例の解析を進めているところである。また、次のステップとして、培養せずに喀痰から直接菌のDNAを調整し、同定を行う検査法を開発中である。これによって、抗酸菌が顕微鏡下で観察される症例中、菌が培養で陰性となるおよそ20%の症例も原因菌の同定が可能になるものと期待される。

抗酸菌感染症のおよそ80%は結核菌群、20%は非結核性抗酸菌の感染症である。一般検査では結核菌群5種の菌種同定や、100種を越える非結核性抗酸菌種をすべて同定するのは不可能で、臨床の現場では診断に至っていない症例や、結核と診断されている症例の中にBCGの感染症例が多数潜んでいると考えられる。このような現状をふまえ、本研究では、これまで報告されている遺伝子やゲノムの解析に基づいた分子生物学的な抗酸菌同定法を比較検討し、最適と考えられる方法で多数の臨床例を解析した。結核菌群の確定診断にはParsonsらによって報告されたPCRによるdeletion領域の解析法が簡便・有効であることが確かめられ、本法を用いた。その結果、50年以上前に接種されたBCGが内因感染し、皮膚結核症を起こした症例や膀胱癌の治療に用いたBCGがおよそ2年後に脊椎カリエスを起こした症例を明らかにすることが出来た。膀胱癌に対し広くBCG療法が使われていることから、今後確実なBCGの同定が必要な症例は増加するものと考えられた。非結核性抗酸菌感染症については、2001年5月から2003年12月に福島県立医科大学附属病院臨床検査部で分離された226株全てを16s rRNA遺伝子のシークエンスから同定出来た。これまで報告されているrpoB遺伝子のシークエンスによる同定法と比較し、16s rRNA遺伝子シークエンスによる方法が有効であることを確認した。診断した症例中には、世界で4例目のM.heckeshornense、7例目のM.thermoresistibile、初めてのM.arupense感染症などが含まれる。以上の研究から抗酸菌の分子生物学的同定法は大変有用であり、本研究は規模を全国に拡大し、継続していく必要があると考えられた。
経皮的冠動脈形成術の中長期的治療成績に関与する因子の検討

我々のPCI(経皮的冠動脈形成術)に関するレジストリーであるFU-Registryは、我々福岡大学病院心臓血管内科学を中心とし、関連施設である福岡大学筑紫病院、福岡白十字病院と提携し、1症例あたり約700項目の詳細な情報を収集、整理、数値化している。このRegistryで、PCIに統計学的根拠を付加する事が可能であり、更なるPCIの臨床成績の改善に活かせると考えdataを日々蓄積している。H30年度は、dataの蓄積として、500症例を追加登録し、総登録症例数は3574となった。新たな関連病院として福岡大学西新病院との提携が決定した為、症例登録を行う為の準備を現在行っている。また3月の横浜で行われた日本循環器学会総会において当Registry研究から、2演題を登録し発表を行った。複数人でのdata登録を行っており、登録数が伸びている。また、SASsystemを使用した解析システムにも問題が無いため、複数の研究テーマを同時進行で行えている。H28年度に予定していた解析・データ収集システムの更新、動画サーバーの再構築が遅れ、新しいパソコン、サーバーの造築や記録媒体等の物品費がかからなかった事や、予定していた海外学会への参加がテロ等の政治的な影響で取りやめになった事が挙げられる。H29年度は、data収集システム、解析システム、動画サーバーの再構築を行った。その為、新規に複数の大容量記録媒体や、プリンター、Angio結果の動画を読み込む為のdevice等の物品費は必要であったが、昨年同様に経皮的冠動脈治療において注目度の高い欧州の国際学会は、H28年度の段階で演題登録が必要であり、政治的情勢が不安定であった為、見送った。旅費等が予定より少なかった事や、大容量記録媒体の補充でコアラボラトリーのメインパソコンにある程度の容量の余裕が生まれた為、パソコン自体を新規購入する必要が無くなった事等が予算変更に至った理由として挙げられる。(使用計画)今年は、解析システム、data収集システム、動画サーバー等に大幅な改善を加える必要が無いが、引き続き、Registryを維持していく上での諸経費、消耗品に関する雑費等が必要となる。また、上記の様に、今年は欧州動脈硬化学会に既に2演題の発表が決まっており、また、その他、TCT、SCAI等の国際学会にも演題登録を検討しており、日本循環器学会総会にも複数の演題を登録する。H30年度は研究成果の発表、報告を多く行う予定である。本年度は昨年予定していた学会参加に加え、複数の学会に参加、発表を予定している。また、物品費としては、心臓カテーテル検査の結果を動画として取り込みQCA解析を行うための動画サーバーが昨年より容量の限界を迎えつつある為、造築が早急に必要である。また動画に加えてレジストリー本体のdata量も膨大であり、各関連施設と当施設の解析者が収集したdataを保存し、コアラボである当院のメインコンピューターにスムーズに移行する為の比較的大きく安全な記録媒体がそれぞれに必要となってきた。クラウド管理に関しては、現在検討中であるが、data保存の安全性の問題があり、これをクリアするには費用に問題が生じる為、現行の人を介した記録媒体を使用したdataの受け渡しを継続する予定である。
水痘帯状疱疹ウイルスに対する免疫認識、免疫誘導過程における糖タンパクの特徴と役割

水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)の糖タンパクgB、gE : gI、gH : gLはウイルスの宿主細胞への吸着・侵入と細胞融合に重要であり、特にgH : gLはこの細胞融合を単独で誘導でき、免疫の標的としても重要である。しかしながら、gHではそのサイズの大きさ(118kDa)に関わらず、conformationalepitopeに対する抗体以外は検出されず、immunogenic linear epitopeが存在しないという特徴的な抗原性を有している。今回、この現象がgH : gLの立体構造に依存するのかどうかを明らかにし、gB、gE : gIと共に立体構造と免疫誘導との関連について検討した。昨年度までの検討により、gH : gLでマウスを免疫したところ抗体は検出されなかったが、変性したgH : gLで免疫したところ複数のlinear epitopeに対する抗gH抗体が誘導された。また、各糖タンパクの免疫誘導能を確認するためヒトにおける遅延型過敏反応を検討したところ、gH : gLはgB、gE : gI同様の強い免疫原性を有していた(Vaccine 2003)。VZVは免疫誘導過程初期の、接種局所でのサイトカイン誘導に、質的な影響を与えると考えられたため(J Gen Virol 2003)、本年度はこのこととgH : gLに対する抗体誘導の抑制との関連を検討した。非関連抗原であるHBs抗原を糖タンパクと混合接種したところ、いずれの糖タンパクと混合した場合もHBs抗原に対する遅延型過敏反応は認められなかった。また、免疫後の脾臓リンパ球を得て抗原刺激を行ったが、3種の糖タンパクの間にIFN-γ/IL-4誘導能の差は見られなかった。以上よりgH : gLに対する抗体誘導の制限はVZV糖タンパクによる免疫誘導時のサイトカイン環境に対する影響よりもむしろ、gH : gLは抗体認識を免れる立体構造を有しているためと考えられた(投稿予定)。水痘帯状庖疹ウイルス(VZV)の糖タンパクgB、gE:gI、gH:gLはウイルスの宿主細胞への吸着、侵入と細胞融合に重要であり、特にgH:gLはこの細胞融合を単独で誘導でき、免疫の標的としても重要である。しかしながら、gHではそのサイズの大きさ(118kDa)に関わらず、conformationalepitopeに対する抗体以外ほとんど、あるいは全く検出されず、immunogenic linear epitopeが存在しないという特徴的な抗原性を有している。今回、この現象がgH:gLの立体構造に依存するのかどうかを明らかにし、gB、gE:gIと共に立体構造の持つ抗原性の生物学的意義について検討している。まず、各糖タンパクの免疫誘導能を確認するためヒトにおける遅延型過敏反応を検討したところ、gH:gLはgB、gE:gI同様の強い免疫原性を有していた(Vaccine 2003)。ELISAを用いて定量的にconformational及びlinear epitopeに対する抗体産生量を検討したところ、gE:gIで免疫した場合にはconformational及びlinear epitopeの両方に対して抗体が誘導された。これに対し、gH:gLでは未変性抗原で免疫した場合には抗体が検出されなかったのに対し、変性抗原の免疫でlinear epitopeに対する抗体が誘導された。また、従来gH:gLに対する中和抗体は唯一のconformationalepitopeを認識するものしか検出することができなかったが、我々の検討でlinear epitopeも中和の標的となることが示唆された。そこでgHを6つの断片にして発現・精製したリコンビナントタンパクでモルモットを免疫したところ、抗gH抗体が誘導され、タンパクの立体構造が自然に近い状態と考えられる蛍光抗体法において、6つのうち少なくとも5つの領域に対する抗体がgHを認識した。そのうち2つの領域に中和抗体を誘導できた。現在これらの抗体の中和活性を詳細に検討中である。以上より、本来gH上に存在する中和の標的を含むlinear epitopeを認識する抗体誘導がgH:gLの立体構造により生体内で妨げられていると考えられた。

VZVは免疫誘導過程初期の、接種局所でのサイトカイン誘導に、質的な影響を与えると考えられたため(J Gen Virol 2003)、本年度はこのこととgH : gLに対する抗体誘導の抑制との関連を検討した。非関連抗原であるHBs抗原を糖タンパクと混合接種したところ、いずれの糖タンパクと混合した場合もHBs抗原に対する遅延型過敏反応は認められなかった。また、免疫後の脾臓リンパ球を得て抗原刺激を行ったが、3種の糖タンパクの間にIFN-γ/IL-4誘導能の差は見られなかった。以上よりgH : gLに対する抗体誘導の制限はVZV糖タンパクによる免疫誘導時のサイトカイン環境に対する影響よりもむしろ、gH : gLは抗体認識を免れる立体構造を有しているためと考えられた(投稿予定)。
マイクロマシンにおける微小エネルギ流入・流出現象の解明と集積機構の設計法

光ファイバと導波路の組立,しゅう動形磁気ディスクのトラッキング等の情報機器におけるしゅう動形位置決め機構のマイクロ化においては,一般に,摩擦力が精度低下の要因になる.特にマイクロ領域では,表面力である摩擦力が支配的になり,不感帯の増大やスティックスリップの発生により,位置決め精度はさらに低下する.しかしマイクロ領域の機械(マイクロメカジズム)では,センサの組み込みが難しく,また微小質量のため慣性力がほぼ0に等しい系を扱うことになる.このため,大きな摩擦力が働く柔軟体を,オープンループで位置決めする設計法の確立が必要となっている.本研究では,マイクロメカニズムの特徴である微小質量のしゅう動位置決め系として片持梁を対象にし,まず,固定端をステップ駆動した際に発生する不感帯とスヒックスリップの特性を明らかにした.この結果,スティックスリップの発生により,位置決め誤差やばらつきが,スティックスリップのタイミングに依存してしまうため,増大することがわかった.ついでこれに基づき,微小質量の地位決め系設計法の1つとして,スティックスリップが発生してもパ-プンループで位置決めできる設計法を確立した.この方法は,アクチュエータを位置決め系の固有周波数より高い周波数で振動させることで,微小質量の位置決めが可能であることを示している.これは,微小質量がスティックスリップを生じても,スリップ中の周期が位置決め系の固有周波数の約半分となるので,スリップ中に,アクチュエータを目標位置よりプラス側に移動することができ,微小質量は目標位置を超えないため,オープンループでの位置決めが可能となっている.さらに微小質量の典型例として光ファイバの位置決め系に適用し,使用可能であることを示した。マイクロマシンの運動解析研究の一環として,片持ち梁および曲がり梁における振動減衰特性を解析し,寸法微小化と減衰比の関係を明かにした.まず梁に加わる空気抵抗について,系を球の集合で近似する簡便な計算式を導出し,実験値との比較により適用限界を示した.つぎに,スクイズ力を無限小幅軸受により,内部摩擦を構造減衰により計算し,これらを組み合わせて全減衰力を得た.結果をシリコン片持ち梁,および,パ-マロイ片持ち梁と卍梁に適用し,マイクロ領域ではスクイズ力,空気抵抗,内部摩擦の順に減衰力が大きいことを示した.最後に本結果からステップ応答を簡便に計算する方法を示し,電磁駆動アクチュエータの残留振動を解析した.主な結論を以下に示す.(1)梁形状を相似形とすると,減衰比のうち,空気抵抗は長さの-0.5-1乗に,スクイズ力は-1乗に比例し,内部摩擦は寸法に依存しない.(2)シリコン片持ち梁では,マイクロからセンチ領域まで,スクイズ力,空気抵抗,内部摩擦の順に大きい.スクイズ力を無視したパ-マロイ片持ち梁および卍梁では,長さ100μm2mm以上では内部摩擦が,それ以下では空気抵抗が支配的である.(3)シリコン片持ち梁における1次共振の空気抵抗は,振動レイノルズ数が16570の範囲で実験値と計算値が一致する.また1辺300μmのパ-マロイ卍梁の1次と2次の空気抵抗の差も,実験値と計算値はほぼ一致する.振動を用いるメモリやセンサでは,梁の固有振動数以上でのサンプリングが不可能なため,高速化には,振動子のアレー化による並列処理が必要である.このため,これら機器の高速,高機能化には,アレー状マイクロ振動子のエネルギーに着目した運動特性の解明が必要となっている.本研究では、梁を球の連鎖で置き換える,Kokubunらのビーズモデルを発展させ,並列振動子における周囲流による振動連成を解明した.まず,球間の流れの連成を考慮した空気抵抗の計算式を導出して,これと梁の運動方程式を組み合わせ,梁の振動連成と減衰比を簡便に求める計算法を提案した.

次にシミュレーションにより,振動連成と梁寸法,梁間距離の関係を求めるとともに,実験により理論の妥当性を検証し,アレー状振動子を用いたアクチュエータなどの梁間隔における設計指針を示した.さらに,アクチュエータの微小化,集積化に伴う動力学的課題である連成振動のうち,支持点での連成に関して2本の梁を有する振動子のFEM解析をおこない,空気連成との関係を調べ,連成振動を支持部の弾性振動および空気流による連成の2つの要因で比較し,支持連成と空気連成の支配領域を明らかにし,連成振動を抑える設計指針を定量的に示した.さらに,マイクロ化に際する支持部の影響を考慮し,支持連成は減衰比に依存するが寸法に依存しないこと,及び空気連成は寸法に依存するため両者の大小関係は寸法に依存することを明らかにし,マイクロ振動子の材質に関しては,シリコンとパ-マロイとを比べるとパ-マロイの方が減衰比が大きいため連成が小さくなることを明らかにした.光ファイバと導波路の組立,しゅう動形磁気ディスクのトラッキング等の情報機器におけるしゅう動形位置決め機構のマイクロ化においては,一般的に,摩擦力が精度低下の要因になる.特にマイクロ領域では,表面力である摩擦力が支配的になり,不感帯の増大やスティックスリップの発生により,位置決め精度はさらに低下する.しかしマイクロ領域の機械(マイクロメカニズム)では,センサの組み込みが難しく,また微小質量のため慣性力がほぼ0に等しい系を扱うことになる.このため,大きな摩擦力が働く柔軟性を,オープンループで位置決めする設計法の確立が必要となっている.本研究では,マイクロメカニズムの特徴である微小質量のしゅう動位置決め系として,片持梁を対象にし,まず,固定端をステップ駆動した際に発生する不感帯とスティックスリップの特性を明らかにした.この結果,スティックスリップの発生により,位置決め誤差やばらつきが,スティックスリップのタイミングに依存してしまうため,増大することが分かった.ついでこれに基づき,微小質量の位置決め系設計法の1つとして,スティックスリップが発生してもオープンループで位置を決めてできる設計法を確立した.この方法は、アクチュエータを位置決め系の固有周波数より高い周波数で振動させることで,微小質量の位置決めが可能であることを示している.これは,微小質量がスティックスリップを生じても,スリップ中の周期が位置決め系の固有周波数の約半分となるので、スリップ中に,アクチュエータを目標位置よりプラス側に移動することができ,微小質量は目標位置を超えないため、オープンループでの位置決めが可能となっている.さらに微小質量の典型例として光ファイバの位置決め系に適用し,使用可能であることを示した.
モノクロナ-ル抗体,遺伝子を用いた耐性癌の基礎的な診断と治療に関する研究

(1)基礎的に抗P糖蛋白(Pーgp)抗体MRK16(鶴尾)の反応性とmdr1遺伝子のmRNA発現程度を培養細胞株で検討し,中等度以上のmRNA発現細胞株でMRK16陽性であった(下山)。(2)ヒト腫瘍nude mouse移植株47株のうち多剤耐性を示す33株中21株でRTーPCR法によりmdr1遺伝子の発現を認め,このうち8株が抗Pーgp抗体C219陽性であった。なおMRK16とC219による固型腫瘍材料の免疫染色至適条件が決定された(玉置)。(3)臨床材料につきmdr1遺伝子発現を6種類のamplimerを用いてRTーPCR法で検索し,amplimerは200300bp前後のものが感度が高く,少量の試料で解析可能であった(向山)。(4)白血病,悪性リンパ腫などの造血器腫瘍でのPーgpの関与はin vivoの耐性細胞株で確認された。in vivoの症例検索がなされ,128例の造血器腫瘍でMRK16 F(ab')_2抗体(鶴尾)を用いた間接法で11例陽性,直接法では3例(リンパ腫再発例)の化学療法不応例のみに陽性であった(上田)。また64例の各種白血病症例で同上抗体でのFACS解析陽性例は8例で,うち5例は単球性性格を示し,経過を追跡し得た治療抵抗性8例でmdr1遺伝子発現を経過中に認めたものはPh(+)ALL,MDS各1例で臨床上検出限界に問題が残った(白川)。(5)固型癌については,MRK16の肺癌培養細胞42株の検討では全例陰性であった(上田)が,C219の免疫染色で肺癌,転移性肺腫瘍76例中26例(24%)に陽性(広橋),大腸癌ではC219で高率(68%)に陽性(玉置),また大腸癌,未分化甲状腺癌,肝癌,胎盤など(菅原),乳癌,卵巣癌など(向山)でPTーPCR法によるmdr1mRNAの有意な発現があり,化学療法抵抗性と関連があった。(6)MRK16とMRK17はADCC誘導に際し,リンパ球はMRK16においてのみeffectorとして,単球は両抗体において働くことが判明した。またヒトマウスキメラ抗体の臨床応用への可能性が示唆された(曽根,鶴尾)。(7)MRK16とmagnetic particleをcouplingしたbeadsを用いるmagneticーaffinitycell sorting(MACS)法が開発され,Pーgp発現多剤耐性細胞の分離に成功した。
肝星細胞のエネルギー代謝に着目した肝硬変抑制法の開発

肝線維症は肝細胞損傷が原因で細胞外基質の過剰生産や分解低下により生じる。肝硬変における肝星細胞のエネルギー代謝に着目した基礎的研究を行うことで、星細胞の活性化制御による肝線維化改善、さらには肝硬変治療につながる新たな治療法開発を目的とした。エネルギー代謝に関与する遺伝子をノックダウンし、星細胞活性化に関わるかどうか評価を行ったところ、肝星細胞活性化と関係が深いことを見出した。またマイクロアレイのデータをIPAで解析を行い評価したところ、興味深いPathway解析の結果などが得られた。肝星細胞のエネルギー代謝に着目し関わる酵素に着目し遺伝子発現を制御することで肝星細胞の活性化の変化とメタボローム解析やエネルギー代謝、ミトコンドリア活性の変化に着目し評価を行うことを目標に研究を行った。肝星細胞由来の培養細胞であるLI90、HHstec細胞を用いて、活性化星細胞におけるエネルギー代謝に関わる遺伝子発現をsiRNAでノックダウンを行い変化を調べた。Alpha smooth muscle actinやmatrix metalloproteinaseなどいくつかの遺伝子発現をリアルタイムRT-PCRで解析評価を行い、アデニル酸キナーゼとクレアチンに着目することとした。アデニル酸キナーゼをノックダウンしたHHstec細胞をマイクロアレイで発現の評価を行い、いくつかの興味深い発現の変化を認めた。特に細胞内解毒に関わる遺伝子の発現上昇が認められたことから、なぜアデニル酸キナーゼのノックダウンを行うことでこのような遺伝子発現変化が起るか現在詳細な解析を行っているところである。平成27年度計画として次の3つの計画を挙げている。計画1:肝星細胞におけるエネルギー代謝に関わる酵素の解析計画1では肝星細胞由来の培養細胞であるLI90、HHSTECを用いてエネルギー代謝に関わるアデニル酸キナーゼ(AK)、クレアチンキナーゼ(CK)に関わる酵素に着目して解析を行った。計画2:遺伝子発現調節による肝星細胞の遺伝子発現および代謝の解析目的遺伝子のノックダウンした株のマイクロアレイ解析を行い遺伝子発現の網羅的解析を行った。計画3:遺伝子発現変化を行った細胞の解糖系代謝解析平成27年度は解糖フラックスの3つのパラメーターであるグルコース代謝(Glycolysis)、解糖能(Glycolytic Capacity)、解糖予備能(Glycolytic Reserve)を評価することはまだできていないが、この手技はこれまで確立しており28年度に行うことが可能と考えている。我々は世界に先駆けて肝硬変症に対する自己骨髄細胞投与療法(Autologous Bone Marrow Cell infusion, ABMi療法)を開発した。現在までに、山口大学、山形大学、国立国際医療研究センター、韓国延世大学と多施設臨床研究を行い、その有効性を報告してきた。平成25年6月には日本初の“先進医療B"に認められ、現在多施設臨床研究を推進している。生物の細胞内で各コンパートメントのATP濃度には違いがあり、ATP産生場所から消費場所へとエネルギーを転移することは重要である。エネルギー代謝の視点から、肝星細胞の活性化について研究を行ってきた。αSMAやコラーゲンの発現を指標とし、肝星細胞の活性化に関わるエネルギー代謝に関わるであろう遺伝子をノックダウンし、活性化に関わるかどうか評価を行ったところ、アデニル酸アイソザイムB(AKisoB)が肝星細胞活性化と関係が深いことを見出した。またマイクロアレイのデータをIPAで解析を行い評価したところ、AKisoBをノックダウンするとαSMAが2.7倍、Col1A1が2.1倍に増加することを確認した。さらにIPAを用いた解析を行い興味深いPathway解析の結果などが得られた。今後はアデニル酸キナーゼをノックダウンすることで起こる遺伝子発現の原因を調べるために、ノックダウン細胞の代謝解析をミトコンドリア代謝に着目して行う。代謝に関わる酵素の活性低下や薬剤投与の効果の評価にミトコンドリア活性を測定することは重要である。特に基礎代謝測定だけでは明らかにできない、ミトコンドリア機能評価における重要な4つの指標である基礎呼吸、ATP代謝回転、プロトンリーク、最大呼吸(予備呼吸能)を測定し細胞ストレスへの反応を評価する。またこれまでに得られたマイクロアレイのデータをより深く解析する予定である。特に細胞内解毒に関わる遺伝子の発現上昇についてそのメカニズム解析を行うことでアデニル酸キナーゼの機能を詳しく知ることができると考えられる。肝臓病学平成27年度に遺伝子発現変化を行った細胞の解糖系代謝解析、解糖フラックスの3つのパラメーターであるグルコース代謝(Glycolysis)、解糖能(Glycolytic Capacity)、解糖予備能(Glycolytic Reserve)を評価する予定であったが、その他の検討項目にかなり時間を要し、平成28年度に施行する予定に変更したため。

遺伝子発現変化を行った細胞の解糖系代謝解析、解糖フラックスの3つのパラメーターであるグルコース代謝(Glycolysis)、解糖能(Glycolytic Capacity)、解糖予備能(Glycolytic Reserve)に関する解析手技はこれまでに確立しており、平成28年度に行うことが十分可能と考えている。また、国際学会での研究成果の発表も複数回予定している。
Ｂａｅｙｅｒ－Ｖｉｌｌｉｇｅｒ酸化の新戦略・新方法論の開拓

超原子価臭素の極めて高い超脱離能を利用して、ジフルオロブロマンを用いたBaeyer-Villiger(BV)酸化の全く新しい方法論を提案することに成功した。本方法により、これまでは不可能であるとされていた脂肪族一級アルデヒドや芳香族アルデヒドのBV酸化が可能となった。また、超原子価臭素が引き起こすBV酸化が立体保持で進行することを証明すると共に、本BV酸化におけるアルキル基の転位が、アルキル基の電子供与能によって支配されることを明らかにした。同時に、芳香族アルデヒドを用いてその置換基効果を検討し、反応機構を明らかにした。更に、分子軌道計算を実施して、反応機構の検証を行った。1、三価の超原子価臭素反応剤の合成:三価の超原子価臭素化合物として、Frohn教授らと共に開発したジフルオロブロマンを使用した。BrF3にArSiMe3を作用させて臭素原子上での配位子交換を実施し、ジフルオロブロマンを大量に合成することに成功した。プロマンは室温でも一ヶ月以上保存可能であり、取り扱いが容易な化合物であるある。p-CF3基を水素に変えたジフルオロブロマンの合成も実施した。2、脂肪族一級アルデヒドのデカナールのBV酸化反応:デカナールにジフルオロブロマンを作用させると、フッ化アシルが73%の収率で生成した。反応系中で放出されたHFがアルデヒドに付加してα-フルオロヒドリンを生成した後、配位子交換によりアルコキシブロマンが生成し、最後に三価の臭素置換基の還元的脱離に伴ってα位水素が引き抜かれ、フッ化アシルが得られたと思われる。このフッ化アシルへの酸化反応において、更に反応系に水(2当量)を添加して反応を行うと、反応経路が劇的に変化し、BV酸化が主として進行した。即ち、ギ酸エステルが88%の収率で得られた。本反応は、脂肪族一級アルデヒドのBV酸化の世界で初めての反応例である。なお、m-CPBAによるデカナールの酸化では専らカルボン酸が生成し、BV酸化は全く進行しない。添加する水の量について詳細に検討した結果、2当量が最適であった。3、アルキル基の置換基効果の検討:BV酸化によるギ酸エステルの生成とβ脱離によるカルボン酸の生成比は、アルキル基の転位能が支配していると予測される。そこで、脂肪族アルデヒドのアルキル基をMe基から、Et,...n-nonyl基へと連続的に変化させ、ギ酸エステルとカルボン酸の生成比を求め、置換基効果を調べた。Winnikらはケトンの古典的BV酸化におけるアルキル基の転位能を数値化し、評価している。本研究で得られたアルキル基の相対的転位能はWinnikらの結果と良い一致を示した。2級アルキル基の転位能はかなり高くなることが知られており、2級アルデヒドのBV酸化についても調べた。芳香族アルデヒドのBaeyer-Villiger酸化反応におけるパラ位置換基の電子的効果:パラ位置換基の電子的効果については、二種類のベンズアルデヒドの競争反応を実施して相対反応速度を求め、p-Me, p-MeO, p-F, p-Cl, p-Br, p-CF3基の電子的効果をHammettの置換基定数との相関関係を解析して調べた。また、得られた反応定数値を古典的Baeyer-Villiger酸化反応と比較し、反応の律速段階についての知見を得た。即ち、本反応の律速段階はアリール基の1,2-転位であることが強く示唆された。本Baeyer-Villiger酸化が立体保持で進行することを証明:光学活性な2級アルデヒドを合成し、ジフルオロブロマンを用いたBaeyer-Villiger酸化を実施した。得られたギ酸エステルを炭酸塩と処理してアルコールに変換し、その絶対配置と光学純度を決定した。その結果、我々のBaeyer-Villiger酸化が立体保持で進行することが明らかとなった。分子軌道計算:分子軌道計算(DFT法及びMP2法)を実施して、反応機構の検証を行った。アセトアルデヒドのBaeyer-Villiger酸化におけるアルコキシブロマン中間体の構造計算を行った後、メチル基の転位と水素の転位を比較した。その結果、メチル基の転位が圧倒的に有利となることが判明した。この結果は、カルボン酸の生成が水素の1,2-転位を経由するルートで進行するのではなく、β脱離を経て進行していることを強く示唆している。これはアルデヒドの古典的Baeyer-Villiger酸化において、未だに残された未解決の課題(水素の1,2-転位かβ脱離)に対して、有力な考え方を提供するものである。

超原子価臭素の極めて高い超脱離能を利用して、ジフルオロブロマンを用いたBaeyer-Villiger(BV)酸化の全く新しい方法論を開発するのが本研究の目的であり、以下の研究を実施した。1)ケトンのBaeyer-Villiger酸化反応を開発することに成功:アルデヒドだけでなくケトンのBaeyer-Villiger酸化反応も進行することを、ジフルオロ-λ3-ブロマンとシクロヘキサノンとの反応を実施して、証明した。更に、2-メチルシクロヘキサノンとの反応では、古典的Baeyer-Villiger酸化反応と全く同様に、メチン基の転位がメチレン基の転位よりも圧倒的に優先することを確立した。メチン基の高い転位能を反映した結果である。2)芳香族アルデヒドのBaeyer-Villiger酸化反応を開発することに成功:ジフルオロ-λ3-ブロマンを用いると、芳香族アルデヒドのBaeyer-Villiger酸化反応も進行することが明らかになった。少量の水の存在下、ベンズアルデヒドにジフルオロ-λ3-ブロマンを塩化メチレン中0 °Cで作用させると、ギ酸エステルが選択的に生成した。安息香酸の生成は全く検出されなかった。本反応は、世界で初めてのベンズアルデヒドのBaeyer-Villiger酸化反応である。なお、ベンズアルデヒドの過安息香酸による古典的酸化反応では、安息香酸が専ら生成してしまい、そのBaeyer-Villiger酸化は全く進行しないことが報告されている。平成23年度の計画(1、三価の超原子価臭素反応剤の合成;2、脂肪族一級アルデヒドのデカナールのBaeyer-Villiger酸化反応;3、アルキル基の置換基効果の検討)に従って研究を実施したところ、これまでに前例の全くない脂肪族一級アルデヒドのデカナールのBaeyer-Villiger酸化反応の開発に成功するなど、予想以上の成果が得られた。Baeyer-Villiger酸化の新戦略を提案するための基礎作りができたと考えている。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度の研究実施計画(1、ケトンのBaeyer-Villiger酸化の開発;2、芳香族アルデヒドのBaeyer-Villiger酸化反応の開発)に従って研究を実施したところ、これまでに前例の全くない芳香族アルデヒドであるベンズアルデヒドのBaeyer-Villiger酸化反応を開発することに成功した。世界で初めての研究成果である。なお、芳香族アルデヒドのBaeyer-Villiger酸化におけるベンゼン環上の置換基効果(パラ位置換基の電子的効果とオルト位置換基の立体的影響)については現在検討中である。また、アルデヒドだけでなくケトンのBaeyer-Villiger酸化反応も進行することを明らかにした。以上のように、Baeyer-Villiger酸化の新戦略を提案する本研究は順調に進展している。今後はアルデヒドだけでなくケトンのBaeyer-Villiger酸化も進行することをシクロヘキサノンとの反応を実施して、証明する予定である。2-メチルシクロヘキサノンとの反応では、古典的Baeyer-Villiger酸化と同様に、メチン基の転位がメチレン基の転位よりも圧倒的に優先することを確認したい。
体性感覚情報の修飾変換をになう視床間結合の特性と可塑性

phospholipase Cβ(PLCβ4)は、IP3,DAGなどの重要な細胞内シグナルを産生し、シナプス機能や脳機能においても重要な役割を担っていると考えられているが、詳細は明らかでない。PLCβ4はマウス視床の唯一のアイソフォームであるので、視床VPLにおける体性感覚情報、とりわけ体性痛覚の情報処理に寄与するか否かを調べるため、PLCβ4の遺伝子欠損マウスを用いて、疼痛関連行動の解析を行った。ノックアウトマウスでは、炎症疼痛モデルのホルマリンテストを行ったところ、第一相の疼痛行動には差はないが、第二相の疼痛反応時間は野生体に比べて29.9±3.3%まで減少していた。さらに我々は、マウスでの脳室内投与法、視床内投与法を確立し、野生体にPLCまたその上流にグルタミン酸受容体1型(mGluR1)の阻害剤、拮抗薬を投与すると同様にホルマリンテストの第二相が減弱した。これらの結果から、視床mGluR1-PLCβ4のカスケードが炎症性疼痛の修飾に関わっていることが明らかになった。さらに、マウスの視床から細胞外記録を行い、疼痛時にPLCβが細胞の発火を調整する事により、痛みをコードしていることが明らかになった。末梢からの感覚情報は、主に視床の後腹側内側核群(VB)を経由して、大脳皮質4層に投射される。一方、大脳皮質の5-6層から視床VBへは、corticothalamicなシナプス結合を作り、VBの活動性を調節していると考えられている。近年の研究で、末梢レベル-脊髄レベルでの痛覚修飾の分子基盤は明らかになってきたが、視床より上位中枢では、ほとんど明らかになっていない。本年度はマウス視床で特異的に優位に発現している、ホスホリパーゼ(PLC)β4のノックアウトマウスにおいて、痛覚行動解析を行い、視床での痛みの修飾機構を検索した。ノックアウトマウスは、急性痛には影響はないが、炎症性疼痛は有意に減弱しており、野生体の視床内にPLCの阻害剤を局所投与しても同等の現象がおこることから、視床PLCβ4が炎症性疼痛情報の修飾に関わっており、またその上流にグルタミン酸受容体1型(mGluR1)が存在し、mGluR1-PLCβ4のカスケードが炎症性疼痛の修飾に関わっていることが明らかになった。マウス視床VBで代謝型グルタミン酸受容体1型(mGluR1)がrelayneuronのcorticothalamicシナプス後部に局在している(Xiao-Bo Liu et al.1998)ことから、炎症性疼痛ではこのシナプスの関与があると考えられる。従って、その生理的意義とそのシナプス特性を明らかにする目的で、Thalamo-cortical slice標本を作製し、視床の投射細胞より記録し、大脳皮質の刺激にたいする応答性(corticothalamic synapse)を観察、頻度特異性にmGluR1の関わりを調べている。
高純度ナノクラスターの新しい生成法の基礎的研究

この研究の基盤は,水溶液中の疎水性物質の希薄溶解度にあり,その熱力学的特性について理論的,実験的にも検討してきた.その希薄溶解度から発展できる新しい分離操作や乳化・結晶化現象を提案し,実証してきた.今年度の主な成果は,当初の目標であった疎水性物質(ラウリン酸)のナノサイズ結晶粒子の生成操作とそれらのAFMによる観察ができたことにある.以下に,その内容をまとめた.疎水性物質のラウリン酸は水溶液に対して極微量の溶解度をもつ.ただし,ラウリン酸の融点は40°Cであり,それ以上の温度では液体,それ以下の温度では結晶となる.水溶液中に溶解しているラウリン酸は極微量であるため,一般的な観察ではラウリン酸の液クラスタ,結晶核を観察できないが,熱力学的な解析により水溶液中でラウリン酸の結晶核の生成が裏付けられる.このような概念をもとにラウリン酸のナノサイズ結晶核の観察を試みた.まず,物理化学的に異なる性質を示すラウリン酸の水溶液中の液液相互溶解度と結晶溶解度を算出し,実験ではそれら2つの溶解度の水溶液を実現する.具体的には,液液飽和にある比較的高温の水溶液,それを冷却してできる結晶飽和にある低温の水溶液である.この2つの溶解度差よりラウリン酸はナノサイズ結晶粒子として水溶液中に出現,分散している.それらを採取し,AFMにより観察した結果,40-100nmサイズのラウリン酸結晶粒子を観察できた.水溶液中のエタノール溶媒の濃度,冷却温度の操作因子とナノサイズ結晶粒子の粒径の関係を考察したところ,冷却温度の増加,エタノール濃度の増加とともに粒径が大きくなることが分かった.さらに,液液相互溶解度と結晶溶解度からできる熱力学的溶解度の温度勾配で粒径を整理すれば,1つの関数に収束することが分かった.これは,Ostwald-Freundlichの関係式で表されることが示唆された.これにより,水溶液中で疎水性物質のナノサイズ結晶粒子の粒径制御の操作方法が確立できたことになる.これは大変大きな進歩である.(公表準備中)エタノール水溶液中の飽和脂肪酸混合物の希薄溶解度について検討した結果、液液相互溶解度と固体溶解度が同時に存在する可能性を見いたした。その事実を検証するため、3成分系、4成分系の液液相互溶解度および固体溶解度の測定し、熱力学関係式により計算した。そこで、これまでにない新しい晶析分離操作を発案し、実証した。次に、上記のような背景を基盤に、飽和脂肪酸混合物の希薄溶解度の特異性を利用することによって、高過飽和の溶液からナノクラスターを生成する方法を検討した。その結果、希薄溶液からの飽和脂肪酸の結晶化は、エマルションの中間生成物を経て、水溶液相から起こることを観察した。熱力学的見地から観察された現象の妥当性を証明した。一方、分子論的アプローチにおいては、Lennard-Jones流体の純粋系と2成分系の溶液の固液相転移をNPTアンサンブルMDにより観察した。その結果、異種分子間相互作用パラメータは、混合物の混和性を決定し、均一溶液、不均一溶液を再現できることがわかった。混和性の少ない溶液からの結晶化では、水溶液中の疎水性物質の結晶化をうまく再現できた。また、異種分子間相互作用パラメータが純物質に近づくにつれて溶液は均一系になり、一般的な溶媒からの溶質の結晶化も再現できた。現在、クラスタ、結晶核の新しい分類法の検討を進めており、また、実際にナノクラスターを生成させ、その評価を検討している。この研究の基盤は,水溶液中の疎水性物質の希薄溶解度にあり,その熱力学的特性について理論的,実験的にも検討してきた.その希薄溶解度から発展できる新しい分離操作や乳化・結晶化現象を提案し,実証してきた.今年度の主な成果は,当初の目標であった疎水性物質(ラウリン酸)のナノサイズ結晶粒子の生成操作とそれらのAFMによる観察ができたことにある.以下に,その内容をまとめた.疎水性物質のラウリン酸は水溶液に対して極微量の溶解度をもつ.ただし,ラウリン酸の融点は40°Cであり,それ以上の温度では液体,それ以下の温度では結晶となる.水溶液中に溶解しているラウリン酸は極微量であるため,一般的な観察ではラウリン酸の液クラスタ,結晶核を観察できないが,熱力学的な解析により水溶液中でラウリン酸の結晶核の生成が裏付けられる.このような概念をもとにラウリン酸のナノサイズ結晶核の観察を試みた.まず,物理化学的に異なる性質を示すラウリン酸の水溶液中の液液相互溶解度と結晶溶解度を算出し,実験ではそれら2つの溶解度の水溶液を実現する.具体的には,液液飽和にある比較的高温の水溶液,それを冷却してできる結晶飽和にある低温の水溶液である.この2つの溶解度差よりラウリン酸はナノサイズ結晶粒子として水溶液中に出現,分散している.それらを採取し,AFMにより観察した結果,40-100nmサイズのラウリン酸結晶粒子を観察できた.水溶液中のエタノール溶媒の濃度,冷却温度の操作因子とナノサイズ結晶粒子の粒径の関係を考察したところ,冷却温度の増加,エタノール濃度の増加とともに粒径が大きくなることが分かった.さらに,液液相互溶解度と結晶溶解度からできる熱力学的溶解度の温度勾配で粒径を整理すれば,1つの関数に収束することが分かった.これは,Ostwald-Freundlichの関係式で表されることが示唆された.
天然有機化合物の供給と創薬を指向した生物活性分子の合成研究

Cochlearol Bについては、A環ベンゼン環とC環シクロヘキサン環をカップリング後、酸化的にB環ジヒドロピラン環を閉環したのち、2+2反応によりE環シクロブタン環とD環シクロペンタン環を同時に形成するルートでの合成研究を実施している。昨年度は、酸化的B環ジヒドロピラン環閉環反応が収率良く進行したことを報告した。本年度は光照射下、2+2反応によるE環シクロブタン環とD環シクロペンタン環の構築に成功し、cochlearol Bのもつ5環性骨格を得ることができた。現在、残り3工程のC環上置換基の変換を実施するためのスケールアップ反応を実施中である。Cochlearol Bの全合成研究の合成計画としては、A環ベンゼン環とC環シクロヘキサン環を結合後、鍵工程であるB環ジヒドロピラン環の形成を、三級アルコールの、フェノールパラ位への酸化的付加環化反応により実施する予定である。検討の結果、A環へのヨウ化銅を用いたC環の導入、および官能基の変換は問題なく進行した。この後のB環炭素鎖ユニットの、C環2位への導入反応がうまく進行しなかったため、アセチル基導入後炭素鎖を付加させ、B環閉環反応前駆体の合成に成功した。Ganocin Aの全合成研究は、A環ベンゼン環とD環シクロペンタン環を連結後、分子内Diels-Alder反応によりB、C環を同時に構築し、最後にE環テトラヒドロフラン環を形成する計画である。鍵反応として、B、D環を同時構築する分子内Diels-Alder反応とE環テトラヒドロフラン環形成反応が挙げられるが、研究を開始したところ、A環とD環の、エーテル結合形成によるカップリング反応が進行しなかったため、直鎖状のD、E環ユニットの、A環とのカップリングを検討したところ、反応が効率良く進行することを見い出し、さらに、D環閉環反応の進行を確認した。Alstoscholarisine Aの全合成研究の計画では、D環テトラヒドロピラン環の構成ユニットを直鎖状態でインドール母核2位に導入後、分子内オキシマイケル反応によりテトラヒドロピラン環を構築する。引き続く立体選択的還元反応によって、オールシスの置換基をもつD環側鎖へ変換した後、還元的アミノ化反応により、C環およびE環を同時に形成する計画である。現在、インドール母核とのカップリングに用いるD環ユニットアルデヒド体の合成を検討しており、研究が遅延している。アルデヒドの前駆体であるオレフィンの合成まで終了しており、オレフィンのオゾン酸化によるアルデヒドへの変換を検討中である。Cochlearol Bの全合成研究では、B環2位へのアルキル鎖ユニットの導入反応について種々反応条件を検討したが、アルキルケトンへの付加反応は進行しなかった。このため、アシル基を導入した後、メチル基の導入を検討したところ、B環形成反応のための前駆体合成経路を開発することができた。この後の鍵反応である酸化的B環形成反応と2+2反応によるE環4員環の構築を含め、最短6工程で全合成が終了することから、研究助成期間中の完成は可能と考えているが、可能な限り進捗を急ぎたい。Ganocin Aの全合成研究では、当初D環形成後にA環とのカップリングを予定していたが、カップリング反応が進行しなかったため、閉環前の直鎖状化合物を用いてカップリングを検討したところ、収率良く反応が進行することを見い出した。さらに、この後に閉環を試みたところ、D環形成を確認することができた。現在、スケールアップ反応と閉環反応の収率改善を検討中である。Ganocin Aの全合成達成まで9工程あるものの、研究助成期間中の達成は可能と考えている。鍵反応である分子内Diels-Alder反応と、E環テトラヒドロフラン環の形成反応の検討を早急に実施したい。Alstoscholarisine A合成の達成度は、当初の期待を下回るものである。初年度のうちに、鍵反応であるオキシマイケル反応によるテトラヒドロピラン環形成反応を検討したかったが、アルデヒドパートの合成経路の開発に留まった。実験者の育成に時間がかかり、効率的に合成経路の検討を実施することができなかったことが主たる原因と考えている。しかしながら、現在スケールアップしてアルデヒドパートの追加合成およびオレフィン部のオゾン酸化によるアルデヒドへの変換を実施中であり、早急に進捗をはかりたい。Cochlearol Bの骨格合成は、A環ベンゼン環とC環シクロヘキサン環をカップリング後、酸化的にB環ジヒドロピラン環を閉環した後、2+2反応により4員環であるE環とD環シクロペンタン環を構築するものである。これまで、A環とC環のカップリングは良好に反応が進行した。次いで、小スケールでのB環閉環反応前駆体への変換には成功したものの低収率であったが、今回、反応条件の検討により収率を改善することができた。現在、スケールアップ反応を実施している。Ganocin Aの合成については、A環ベンゼン環に対しD環シクロペンタン環をエーテル結合で連結し、B、C環の一部となるユニットを導入後、分子内Diels-Alder反応によりB、C環を一挙に構築する計画を提案した。昨年は、D環ユニットとA環間のエーテル結合形成反応がうまく進行せず、より立体障害の小さい鎖状構造での連結に成功したことを報告した。今回、導入したD環鎖状ユニットの環化反応によるD環の構築を検討したが、反応成績体が非常に不安定で、その後の化学変換に耐えないことが判明したため、本合成経路での合成研究は中断することとした。

Alstoscholarisine Aの合成は、インドール環2位へD環の構成ユニットを導入後、テトラヒドロピラン環を形成した後、C、E環を構築する計画であった。これまでのところ、インドール環2位へのD環構成ユニットの導入に成功している。しかしながら、2016年の13工程でのラセミ体の全合成に引き続き、2017年には10工程での不斉全合成が報告されたことから、本天然物の合成経路の開発は、これ以上実施しないこととした。これに代えて、14員環構造をもつBoscartin Fの全合成を実施することとした。研究の結果、保護基を用いることなく、最長直線工程11工程で全合成を行うことができた。Cochlearol Bの合成の第1の問題点は、C環に対するB、D、E環を構成するユニットの、短行程での導入が低収率であることであった。ビニル基上のヨウ素の、ハロゲンーリチウム交換反応では、ベンジル位のリチオ化が優先したため、パラジウムを用いてアセチル基を導入した。次のアセチル基のプレニル化が現在までのところ低収率であり、反応条件の検討を行っている。次のメチル基の導入、ベンジル基の脱保護は、予備検討レベルながら中程度の収率で反応が進行することを確認した。Ganocin Aの合成研究は、A環ベンゼン環とD環シクロペンタン環の、エーテル結合による連結反応が進行しないため、鎖状のD環ユニットを導入後、D環を閉環する経路へ変更し、A環ーD環カップリング体を合成することができた。しかしながら、A環ーD環カップリング体は、その後の各種変換反応条件に対する安定性が低いことが判明し、当初のバックアッププランに従い、cochlearol Bの合成中間体を利用する合成経路を採用することとした。Alstoscholarisine Aについては、インドール環2位へのD環構築ユニットの導入に成功したものの、2016年に13工程でのラセミ全合成および2017年に11工程での不斉全合成が報告されたことから、本化合物に代えて、14員環炭素骨格をもつ大環状天然物であるBoscartin Fの全合成を実施することした。x-box結合タンパク質に対する作用が報告されている。検討した結果、短行程での不斉全合成を達成することができた。シャープレス不斉エポキシ化、立体選択的なヨードエーテル化反応によるテトラヒドロフラン環の構築、立体選択的なアルドール反応による水酸基立体制御とカップリング、閉環メタセシスによる14員環骨格の構築、立体選択的なエポキシ化反応等により不斉全合成を達成した。Cochlearol Bについては、A環ベンゼン環とC環シクロヘキサン環をカップリング後、酸化的にB環ジヒドロピラン環を閉環したのち、2+2反応によりE環シクロブタン環とD環シクロペンタン環を同時に形成するルートでの合成研究を実施している。昨年度は、酸化的B環ジヒドロピラン環閉環反応が収率良く進行したことを報告した。本年度は光照射下、2+2反応によるE環シクロブタン環とD環シクロペンタン環の構築に成功し、cochlearol Bのもつ5環性骨格を得ることができた。現在、残り3工程のC環上置換基の変換を実施するためのスケールアップ反応を実施中である。Cochlearol Bの全合成研究では、B環閉環反応前駆体までの合成経路の開発に成功したことから、スケールアップを実施している。
急性肺損傷における可溶性TNF-αの関与

本研究では、ラットに気管内エンドトキシン吸入刺激、気管内塩酸吸入刺激または人工呼吸器による伸展刺激を施行して肺損傷モデルを作り、この際の可溶性TNF-α濃度、および好中球数を測定し、肺損傷の指標としてBAL液中のアルブミン濃度、肺病理組織学的所見を検討し、肺損傷の病態におけるTNF-αの役割を検討する。さらに肺損傷の治療のターゲットとしてTNF-a converting enzyme(TACE)の阻害剤の有用性を評価する。すでに我々の実験において、以下を日本呼吸器学会において発表している。Sprague-Dawleyラット(体重300350g)にネンブタール麻酔下で気管切開し、尾静脈内にカテーテルを留置し、LPS(300μg/kg)気道内投与15分前にTACE阻害剤(10mg/kg)を静注した。さらにLPS気道内投与後1時間、2時間、3時間の時点でTACE阻害剤を追加静注した。LPS、TACE阻害薬の対照には同量の生食を用いた。4時間の観察後、左肺にてBALを行った。BAL液中の細胞数、可溶性TNF-α濃度、肺損傷の指標としてのBAL液中のアルブミン濃度を測定した。LPS気道内投与群(肺損傷モデル)においてBAL液中の可溶性TNF-α濃度、好中球数、アルブミン濃度は増加した。これらの指標はTACE阻害剤投与群において有意に低下した(p<0.05)。これより、可溶性TNF-αが気道内投与LPSによる急性肺損傷の発症病態に関与する可能性が示唆された。さらに肺損傷の治療のターゲットとしてTNF-αconverting enzyme(TACE)の阻害剤の有用性を評価する。Sprague-Dawleyラット(体重300350g)にネンブタール麻酔下で気管切開し、尾静脈内にカテーテルを留置し、LPS(300μg/kg)気道内投与15分前にTACE阻害剤(10mg/Kg)を静注した。これらの指標はTACE阻害剤投与群において有意に低下した(P<0.05)。本研究では、ラットに気管内エンドトキシン吸入刺激肺損傷モデルを作り、この際の可溶性TNF-α濃度、肺損傷の指標としてBAL液中のアルブミン濃度、およびBAL中の好中球数、サイトカインを測定し、肺病理組織学的所見を検討し、肺損傷の病態における可溶性および膜性のTNF-αの役割を検討する。すでに我々の実験において、ラットモデルでのLPS刺激肺損傷の実験でTACE阻害剤を用いて行い、肺損傷において増加したBAL液中の可溶性TNF-α濃度、好中球数、アルブミン濃度はTACE阻害剤投与群において有意に低下した(p<0.05)という結果を日本呼吸器学会において発表している。本実験では肺損傷の指標としての透過性の評価にヒトアルブミンをもちい、評価ができた。また、平成18年には肺胞マクロファージの培養実験においてもLPS刺激で培養上清中に増加したTNFαがTACE阻害剤によって有意に低下したという結果を日本呼吸器学会において発表する予定である。急性肺損傷のさいに増加するTNFαのひきおこす、炎症のカスケード、細胞間の接着解離による透過性の変化を研究し、肺損傷の治療のターゲットとしてTNF-αconverting enzyme (TACE)の阻害剤の有用性を評価する。

4時間の観察後、左肺にてBALを行った。BAL液中の細胞数、可溶性TNF-α濃度、肺損傷の指標としてのBAL液中のアルブミン濃度を測定した。LPS気道内投与群(肺損傷モデル)においてBAL液中の可溶性TNF-α濃度、好中球数、アルブミン濃度は増加した。これらの指標はTACE阻害剤投与群において有意に低下した(p<0.05)。これより、可溶性TNF-αが気道内投与LPSによる急性肺損傷の発症病態に関与する可能性が示唆された。