hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
活性酸素シグナルのユビキチン化を介した新たな制御システムとストレス応答機構の解明

本研究の目的は、活性酸素(ROS)の強度に応じて、我々が独自に同定したUSP9X、Roquin-2、TRIM48などのユビキチン化関連酵素群が、ASK1活性化のバランスを制御するメカニズムと、その制御を介して細胞死や免疫応答といった異なるストレス応答が適切に誘導される仕組みを分子レベルで解明し、ユビキチン化関連酵素を標的として、そのシステムの異常が原因となる免疫疾患や癌の新たな治療戦略開発に繋げることである。本年度は、CRISPR-Cas9システムによって作成したRoquin-2などの欠損細胞やコンディショナル遺伝子欠損マウスを用いて、特に、ASK1特異的なユビキチン化酵素であるRoquin-2と、ASK1活性化促進因子として働く、別なユビキチン化酵素TRIM48による、ROS依存的なASK1活性化のバランス制御機構について解析を加えた。解析の結果、Roquin-2欠損細胞では、TRIM48によるASK1のROS依存的なユビキチン化分解が抑制されていたことから、TRIM48によるASK1活性化に伴って、Roquin-2がASK1のユビキチン化分解を亢進させることが判明した。同時に、Roquin-2欠損細胞では、ROS依存的な細胞死に加えて、炎症性サイトカイン産生が減少していた。すなわち、Roquin-2は、ASK1をユビキチン化分解を促進することで、ROS依存的なASK1活性化を介した細胞死および免疫応答を抑制し、TRIM48との相互作用を通じて、細胞死や免疫シグナルのバランスを微調整して、適切なROSシグナル応答を誘導していることが明らかとなった。さらに、TRIM48の実際のユビキチン化分解の標的は、ROS応答性のASK1阻害分子であることも解明した。本結果は、上記のユビキチン化連酵素群が、ROSが関与する自己免疫疾患や癌などの治療標的となる可能性を示している。今後も、我々が独自に同定したUSP9X、Roquin-2、TRIM48といったユビキチン化関連酵素群が、どのようにして酸化ストレス応答キナーゼASK1の活性を厳密に制御しているのか、その仕組みについて詳細な分子レベルでの解析を進めたい。特に、ユビキチン化関連酵素群を介した活性酸素シグナルの微調整の仕組みと、その仕組みによる、適切な酸化ストレス応答の誘導メカニズムについて明らかにしたい。同時に、これらのユビキチン化関連酵素群が、ASK1活性化の活性酸素依存的なバランス制御にどのように関わるのか、また、このようなASK1依存的な酸化ストレス応答シグナルのバランス変化が免疫応答や細胞死に与える影響についても検討したい。さらに、これら活性酸素シグナル制御に関わるユビキチン化関連酵素が、実際に自己免疫疾患や癌などの治療標的としての妥当であるか否か、ノックアウト細胞あるいは遺伝子改変動物を用いて、細胞からの炎症性サイトカイン産生量や自己免疫疾患等の動物モデルなどで検証し、研究の推進を図りたい。28年度が最終年度であるため、記入しない。
脊髄披裂マウスを用いた二分脊椎の水頭症成因についての研究

脊髄披裂を伴う胎仔の長期生存例のモデルは以下の事由により達成されなかった。まず、正常例の胎仔では出生前に取り出されても他の母親により何ら問題もなく生存することは、すでに確立されている。しかし、披裂胎仔では胎生末期までの生存は確認されているが、胎生末期には進行したChiariII奇形が存在し、延髄の機能異常による呼吸障害のため出生後生存し得ないと考えられた。さらには、出生直後に後頭蓋窩を開放することを試みたが、未だ未成熟な胎仔のためその侵襲により生存し得なかった。そこでTNF(Tumor Necrosis Factor),FGF(Fibroblast Growth Factor)を用いて、脊髄披裂マウスがChiariII奇形を発現する前の妊娠日数12日の胎仔の脊髄中心管に全麻下で妊娠子宮より投与し、脊髄中心管の閉塞された胎仔のモデルを作成し、ChiariII奇形の発生を予防できるかを検討した。結果は、いずれのモデルも母体の生存にもかかわらず胎内死亡に至ってしまった。以上より、脊髄披裂に合併する水頭症の成因に関し、長期生存例の脳の形態学的検証ならびに、水頭症の発生には二分脊椎とこれに続発するChiariII奇形の関与が重要であるとする著者らの説を証明するには至らなかった。結局二分脊椎に伴う水頭症の成因は、胎生末期の脊髄披裂例のクモ膜の形成異常が関与している可能性があるという事実のみが検証できた。継代培養されたSpd carrierの雌と雄の交配により作成した各妊娠日数別胎仔の検討では、脊髄披裂の発生は約25%であり脊髄披裂例における脳傍矢状断切片では、妊娠日数13日より後頭蓋窩奇形を認める様になり妊娠末期ではその形態は顕著となりChiari II奇形様後頭蓋窩所見を呈することが確認された。そしてその再現性は100%であった。また、妊娠日数12日、18日正常マウスの後頭蓋窩ならびに頭蓋冠部のクモ模下腔の走査電顕所見では、正常胎仔脳のクモ膜下腔の妊娠時期に伴う発達が認められた。次に妊娠末期に取り出した胎仔の生存であるが、まず正常マウス妊娠日数18日を出生前に取り出し他のFoster motherにその飼育を委ねたところ、取り出した直後の胎仔の保温と乾燥に注意をしながら、Foster motherの胎仔と混合することで正常例ではほぼ問題なく生後発育が確認された。そして脊髄披裂例に対してはまず直接顕微鏡下に縫合を試みたが、欠損部が大きく縫合は不可能であった。続いて、フィブリングルーあるいは医療用アロンアルファーを用いて披裂部の修復を行ったが全く生着しなかった。そこで、正常例でのFoster motherによる飼育には問題ないことは確認されているので、今後は同じ妊娠日数18日の正常胎仔の皮膚を脊髄披裂部にフィブリングルーを用いるかあるいはナイロン糸にて縫合し、移植することを考慮している。脊髄披裂をともなう胎仔の妊娠中期ならびに後期の冠状断ならびに矢状断脳切片の電子顕微鏡学的検討では、妊娠12日目でクモ膜下腔は正常例で認められる層構造は呈していたものの、洞構造は認められなかった。さらに妊娠後期(妊娠18日)では脊髄披裂例においては、正常例におけるクモ膜の網目構造は存在せず、瘢痕組織様構造を呈しておりクモ膜ならびにクモ膜下腔系の形態異常は明らかであった。しかし、第四脳室出口孔(Luschka孔ならびにMagendie孔)の電子顕微鏡学的所見では正常例、脊髄披裂例の間で明らかなる差異は認められなかった。次いで脊髄披裂生後生存例の作成では、披裂例におけるChiari II奇形の存在による脳幹機能低下によると推測される出生後の呼吸障害のため、依然として長期生後生存例は確認されていない。そこで現在はChiari II奇形による延髄の形態異常にともなう

呼吸障害が、Chiari II奇形自体による延髄の機能異常による一次的な呼吸障害であるかどうかを、摘出脳幹の還流実験より電気生理学的に検討することを考慮中である。もし下垂した小脳扁桃による単純な延髄の圧迫による二次的な呼吸障害であるとすれば、出生直後に後頭蓋窩を開放することで呼吸障害を回避できる可能性があり、長期生後生存例も考えれるため現在検討中である。脊髄披裂を伴う胎仔の長期生存例のモデルは以下の事由により達成されなかった。まず、正常例の胎仔では出生前に取り出されても他の母親により何ら問題なく生存することは、すでに確立されている。しかし、披裂胎仔では胎生末期までの生存は確認されているが、胎生末期には進行したChiari II奇形が存在し、延髄の機能異常による呼吸障害のため出生後生存し得ないと考えられた。さらには、出生直後に後頭蓋窩を開放することを試みたが、未だ未成熟な胎仔のためその侵襲により生存し得なかった。そこでTNF(Tumor Necrosis Factor),FGF(Fibroblast Growth Factor)を用いて、脊髄披裂マウスがChiari II奇形を発現する前の妊娠日数12日の胎仔の脊髄中心管に全麻下で妊娠子宮より投与し、脊髄中心管の閉塞された胎仔のモデルを作成し、Chiari II奇形の発生を予防できるかを検討した。結果は、いずれのモデルも母体の生存にもかかわらず胎内死亡に至ってしまった。以上より、脊髄披裂に合併する水頭症の成因に関し、長期生存例の脳の形態学的検証ならびに、水頭症の発生には二分脊椎とこれに続発するChiari II奇形の関与が重要であるとする著者らの説を証明するには至らなかった。結局二分脊椎に伴う水頭症の成因は、胎生末期の脊髄披裂例のクモ膜の形成異常が関与している可能性があるという事実のみが検証できた。
精子形成過程における遺伝子発現調節機構

アフリカツメガエル(Xenopus laevis)成熟精子核の塩基性蛋白質はコアヒストンと6種の精子特異的蛋白質(SP16)からなり、後者はアミノ酸組成からプロタミンとは異なるタイプに属する。異なる分子種の精子核蛋白質(SBPs)が精子形成過程のいつ、どのような仕組みで一定量生産されるかを知るために、SP4とSP5のcDNAをもちいて、それらの遺伝子のゲノム上での在り方を調べ、次の結果を得た。(1)SPsのなかで最も量的に多いSP4の遺伝子は、ゲノム上で約20kbの領域に5ケがタンデムにならび、各遺伝子は1ケのイントロンをもつ。(2)各SP4遺伝子は5'上流域に典型的なTATAおよびCCAT配列、および3'下流域にポリAシグナルをもつ。(3)SP5遺伝子の5'上流域非翻訳領域の約400bpの範囲内に互いに85%の相同性をもつ塩基配列を含む領域が3ケ所存在する。(4)タンデムに並ぶSP4遺伝子のうち最も5'側に位置する遺伝子では1ケ所でGからTへの置換がおこり、そのためN末端から69番目のアミノ酸がAlaからSerへと置換すると推定される。(5)精子核塩基性蛋白質の逆層HPLCによる分画のひとつが、ペプチドマッピング、アミノ酸配列から確かにSP4遺伝子から予想される変異体であり、その量比はゲノム上でのSP4遺伝子の数を反映して、変異体/SP4が1/4であった。(6)SP5のcDNAを新たにクローニングし、その塩基配列から74ケのアミノ酸からなる一次構造を決定し、それがSP4と同じく第一精母細胞期に転写されることを明らかにした。(7)ゲノミックサザン解析からSP5遺伝子はゲノム当たり1ケであり、SP4とくらべると精子核あたりのmRNA量、蛋白量ともにSP5はSP4のそれの約1/5であった。(8)SP4とその変異体、およびSP5はいずれも同じ時期にゲノム当たりの遺伝子数を反映した量の転写翻訳をおこなっており、これらの遺伝子に共通する発現調節を担う候補としてSP4遺伝子の5'非翻訳領域の役割の解明が今後の課題である。(1)アフリカツメガエルのSP4 cDNAをプローブとしてゲノミックサザンハイブリダイゼーションを行なったところ、ゲノムDNA約25K塩基対の中に複数個のSP4遺伝子が並んで存在していることが示唆された。SP4遺伝子を含む12K塩基対のEco RI分解断片をクローニングしたところ、このDNA断片には3つのSP4遺伝子が約3K塩基対おきに並んでいた。このうち2つのSP4遺伝子とその5'上流域の塩基配列を明らかにしたところ、双方の5'上流域にTATA配列とCCAAT配列の逆配列であるATTGG配列が確認できた。これら2つの配列間での相同性を検索したところ、転写領域では95%の相同性であるほか、6'上流域にも400塩基対にわたり約90%もの相同性を示す領域が3ケ所存在していた。

5'上流域の相同性が高い領域と、既に明らかにされている魚類(マス)と哺乳類(マウス)のプロタミン遺伝子5'上流域の塩基配列とを比較したところ、3種間で共通する配列(AAAGAGGACCA)や、同じ転写時期を示すマスのプロタミンとSP4だけで共通する配列(ACACAGATCAC,GTTTTCT)を見出すことができた。これら共通配列が、組織特異的または時期特異的な転写調節に深く関わっていると予想される。(2)超音波処理したヒキガエル精子の上清液を出発点に、Q-セファローズによるイオン交換クロマトグラフィー、Superose 12HRによるゲル濾過および逆相カラムを用いたHPLCにより卵膜ライシンを精製した。この標品のアミノ酸配列をEdman法により調べようとしたところ、最初のN末端アミノ酸の分解が起こらず、このアミノ酸が化学修飾を受けて保護されていることが明らかになった。これと平行して、ライシン合成が活発に行われていると思われる精細胞のmRNAを用いてcDNAライブラリーを作製した。(1)アフリカツメガエルの精細胞から得たポリ(A)^+RNAを用いて、精子核塩基性蛋白質をコードする501塩基対からなるcDNAを新たに選別した。このcDNAは、その塩基配列をツメガエル精子核特異的塩基性蛋白質SP16のN-末端2345ケのアミノ酸配列と対応させて比較した結果から、SP5をコードするものであると結論された。塩基配列に基づいて、以前に明らかにしたSP4のそれと比較すると、SP5とSP4はコーデイング領域で互いに83.3%相同であり、SP5はSP4より4ケ少ない74ケのアミノ酸残基からなっているが、両者はアルギニン・ダイマーを7ケ、同テトラマーを1ケのみ持つなどヒストンとプロタミンの中間型の塩基性蛋白質であるという点で共通していた。ノザン解析の結果、SP5はSP4と同じく一次精母細胞期に転写され精細胞に到る過程でポリAの短縮が起こるが、一次精母細胞での細胞当たりのmRNA量はSP5がSP4のそれの1/5であった。遺伝子に関するこれらの解析及びアミノ酸配列の比較から、ツメガエルの精子核塩基性蛋白質の遺伝子はSP1,SP2/SP3,SP4,SP6/SP5の3タイプをコードするものから成り、前2グループについては翻訳後の修飾によりそれぞれが形成される、という可能性が示唆された。(2)ツメガエルSP4のcDNAをプローブとして、EcoRIおよびHindIIIで切断したゲノムDNAのサザン解析を行い、12kb,4kb,2kbの3つの断片にSP4遺伝子が存在することが明らかになった。制限酵素地図作成、遺伝子マッピングおよび一部の塩基配列決定等の結果を総合すると、12kb断片に3つ、4kbおよび2kb断片に各1つ、合計5つのSP4遺伝子が約20kbの領域にタンデムに並んでいると結論された。これらのSP4遺伝子はいずれも1ケのイントロンを持ち、そのうち2つの遺伝子について5'上流域の塩基配列を比較すると、約400bpにわたって85%以上の相同性を示す領域が3ケ所存在し、その配列は魚類や哺乳類のプロタミン遺伝子の5'上流域と共通性が高いことから、この領域が転写調節に深く関わっていると推定される。1.アフリカツメガエルの精子核塩基性蛋白質SP4のcDNAをプローブとして行ったゲノムDNAのサザン解析から、SP4遺伝子はゲノム上の約20kbにわたる領域にタンデムに5ケ並んでいることが前年度に示された。これらのうち、第24番目の3つの遺伝子をふくむ10,165塩基対のすべての配列をしらべた結果、(1)各遺伝子は互いに約3kb隔てて並ぶ、(2)5'上流域に典型的なTATAおよびCCAT配列、および3'下流域にポリAシグナルをそれぞれもつ、(3)5'上流域の約400kbにわたる範囲に85%以上の相同性をもつ領域が3ケ所存在すること、等が明らかになった。
通級指導教室における言語面の支援ニーズに対応した指導方法の体系化と教材の開発

東京都、神奈川県、千葉県の通級指導教室(学級)を対象にして指導方法の実態に関する調査の結果や海外の指導に関する文献等を踏まえて、学齢期における語彙領域の言語指導については以下の5つの指導方針が抽出できた:1.言葉について客観的に考えるメタ言語的活動、2.子供の言い誤りや言いよどみを捉えて語を教える、3.指導する語彙を選択して直接アプローチする、4.文字を使い知らない言葉を視覚化する、5.言葉を学ぶ方法を学ぶ。「慣用句・心的語彙」領域では、1.意味の手がかりから慣用句を想起する、2.架空の状況に応じた気持ちを言葉で表現する、3.特定の心的語彙に対応する場面を想起する、4.登場人物の心情を表す文章を読む、5.ゲーム等の中で気持ちを言葉で表現する等の指導方針が抽出された。言語表現に関する指導方法の回答を類型化からは、1経験や活動に基づき語る、2文法面または形式面で整った文や語りを産出する、3手がかりをもとにことばで表現する、4ことばの意味をことばで表現するメタ言語的活動、の4つの指導内容に整理された。言語理解にかかわる指導では、1やり取りのある文脈、設定された活動、言語的文脈の中でことばを聞いて理解する、2理解する方策を活用する、などが抽出された。コミュニケーションの改善を目指す指導においては、ロールプレイやSSTカード等の使用を通して特定の場面などを想定して適切なコミュニケーション行動を学ぶ活動、自由会話や好きな活動における自発的発話の導出とやり取りへの展開、状況に応じた発話の促しなどに整理された。文や文章の聴覚的理解、語彙知識、発話表現、柔軟性、リテラシーの5領域にわたる10の下位検査によるアセスメント(LCSA)から個人の発達的プロフィールを明らかにし、各児の課題に応じた指導法や教材を体系化し提案した。小学校の通級指導教室(学級)において言語面の支援を受ける児童の実態を明らかにするために、児童の主訴や認知・言語面の実態について情報収集を行った。言語面のアセスメント情報としては、LCSA(学齢版言語・コミュニケーション発達スケール)の結果を共通指標とした。14年生の76名について検討したところ、WISC-IIIまたはWISC-IV知能検査による全IQは平均91.2(SD12.3)であった。LCSAの10の下位検査の評価点をもとにクラスター分析を行ったところ、現時点では以下の6つのクラスターに集約された:A.「音読」のみに顕著な成績低下のある群;B.「語彙知識」に低下のある群;C.「言語指示理解」と「柔軟性」は比較的良好であるが「音読」「読解」「慣用句・心的語彙」に低下のある群;D.「聞き取り文脈理解」「慣用句」は比較的高いがその他は低水準である群;E.「音韻意識」「音読」「対人文脈」が比較的高い群;F.どの言語領域も低水準である群。これらは、語彙、文表現、音読といった各児童の困難領域と概ね対応し、下位検査間の個人内差は、児童ごとの発達的アンバランスさを明らかにすることが示された。言語により限局した苦手さを有する児童について検討するために、以下の3つの条件を加えたところ13名が抽出された:1非言語性知能の指標としてWISC-IIIの知覚統合群指数またはWISC-IVの知覚推理指標が90以上、2LCSA指数が80以下、3これらの非言語ー言語指数値間に15以上の乖離がある。LCSAのプロフィールは6つのクラスターのうち上記のC、D、E、Fに分散しており、成績が低下している領域に個人差が大きいことが示された。これらの結果から、言語に特に発達課題のある児童のプロフィールは多様であり、個人の実態に合せた指導目標と方法の設定が重要であることが示唆された。小学校の通級指導教室(学級)の協力を得て、通級による支援を受ける児童に関する情報が蓄積されつつある。また、得られたデータの整理・分析に加えて、海外での実践に関する情報の収集も進んでいる。通級指導教室(学級)における指導方法の実態を明らかにするため、通級指導の場を設置する東京都79校、神奈川県61校、千葉県167校の通級指導担当者を対象として質問紙調査を実施し、127校(41.4%)から回答を得た。質問紙は言語発達の遅れを主訴として指導を受ける児童について、児童の実態と具体的な指導方法に関する項目から成る。分析の結果、通級を利用する児童の半数以上が言語発達の遅れを有していることが明らかになった。語彙の習得に困難がある児童に対する指導方法は大きく分けて、語の想起と意味の言語化にかかわる活動、新しい語彙の習得、文脈における語の活用の3つに分けられた。ゲーム性のある活動を通した語彙の学習に加えて、文章や会話の文脈の活用、視覚的情報提示の活用を通して語彙習得を図っている実態が明らかになった。読み書き困難については、フラッシュカードを用いて文字や単語をスムーズに読むことを目標とする指導や、拍単位への分解や特殊拍に焦点を当てた音韻意識の指導などが中心であった。音読の改善を目指した指導では、文節等の区切り等に横線を引くなど読みやすくするための工夫を取り入れたり、語をまとまりとして把握する単語検索課題を行ったりする学級が多かった。

文章の読解の改善にあたっては、文章の長さや内容の複雑さを調整した教材を用いたり、絵や図などの視覚的な情報を手がかりとしたり、文章で使われる語彙の習得を並行する指導などが行われていた。漢字の読み書きの改善では、漢字を部首等に分けたカードを作り覚えたり、漢字の書き方を言語化して覚えたりする工夫や、タブレット端末の活用を挙げた回答もあった。指導方法は多様であるが、教室間格差が生じないように学校間で指導方法を共有し、担当者の異動があっても児童に継続的な支援を提供できるような指導体制の構築が求められる。小学校の通級指導教室・学級の協力を得て、通級による指導を受ける児童の実態および通級指導における指導方法について情報を蓄積することができた。得られたデータの整理・分析に加えて、海外での実践に関する情報の収集も進んでいる。昨年度実施した通級指導教室(学級)における指導方法の実態に関する調査の結果をさらに分析したところ、通級利用児の語彙に関しては、語彙が少ない(94.5%)、語彙を想起するのに時間がかかる(70.9%)、間違った語彙を使うことがある(51.2%)といった実態が明らかになった。言語表現に関しては、積極的に話すが何を言いたいのかが伝わりにくい(78.7%)、短く単純な文で話すため細かい内容が伝わらない(73.2%)、文法的に誤った表現になることがある(67.7%)という実態であった。調査結果や海外の指導に関する文献、学齢児の特性を踏まえて、学齢期における語彙領域の言語指導については以下の5つの指導方針が抽出できた:1.言葉について客観的に考えるメタ言語的活動(例:言葉の意味を別の言葉を使って表現する、似た意味の言葉を想起する、反対の意味の言葉を想起する)、2.子供の言い誤りや言いよどみを捉えて語を教える、3.指導する語彙を選択して直接アプローチする(例:時間や季節にかかわる言葉、位置を表す言葉、工作や調理にかかわる言葉など意味的関連性を基盤として指導する)、4.文字を使い知らない言葉を視覚化する、5.言葉を学ぶ方法を学ぶ(例:知らない言葉に線を引く習慣をつける、言葉の意味について質問する習慣をつける、言葉の意味を辞書で調べる習慣をつける)。「慣用句・心的語彙」領域では、1.意味の手がかりから慣用句を想起する、2.架空の状況に応じた気持ちを言葉で表現する、3.特定の心的語彙に対応する場面を想起する、4.登場人物の心情を表す文章を読む、5.ゲーム等の中で気持ちを言葉で表現する等の指導方針が抽出された。小学校の通教指導教室・学級の協力を得て、通級による指導を受ける児童の実態及び通級指導における指導方法についての情報を蓄積することができた。東京都、神奈川県、千葉県の通級指導教室(学級)を対象にして指導方法の実態に関する調査の結果や海外の指導に関する文献等を踏まえて、学齢期における語彙領域の言語指導については以下の5つの指導方針が抽出できた:1.言葉について客観的に考えるメタ言語的活動、2.子供の言い誤りや言いよどみを捉えて語を教える、3.指導する語彙を選択して直接アプローチする、4.文字を使い知らない言葉を視覚化する、5.言葉を学ぶ方法を学ぶ。
極性上皮細胞における微小管の編成機構とその役割

上皮細胞は、多くの臓器の主成分で、上(頂端面)、下(基底面)という極性をもつ。微小管細胞骨格が、頂端-基底軸に沿って配向する特徴的な編成を示すことが知られていたが、その仕組みは不明であった。微小管は、それ自身がプラス端・マイナス端という極性をもつ。本研究では、微小管マイナス端結合タンパク質CAMSAP3に着目し、マウス小腸と、培養上皮細胞を用いた解析を行った。その結果、CAMSAP3が頂端面に局在してマイナス端を繋ぎとめることで、上皮細胞に特徴的な微小管編成を可能にしていること、そのような微小管編成は、核やゴルジ体などの細胞内小器官が正しく配置されるために必須の働きを示すことが明らかになった。極性をもつ上皮細胞では、微小管は、表層面ー基底面に対して垂直方向に編成され、微小管の動的なプラス端が基底面に、より静的なマイナス端が表層面に向くと考えられている。この特徴的な微小管編成は、極性上皮細胞が生体内で正しく機能するために重要な役割を果たすと考えられているが、微小管編成形成のしくみとその役割については、未だ多くのことが明らかにされていない。本研究では、極性をもつ上皮細胞として腸の上皮細胞に着目し、極性上皮細胞における微小管マイナス端の制御機構と特徴的な微小管編成のしくみ、その生理的役割についての理解を深めることを目指す。非中心体微小管マイナス端に結合するNezha/CAMSAP3の役割とその機構について、Nezhaノックアウトマウスと、ヒト大腸癌由来Caco-2細胞の三次元培養系を用いた解析を行っている。平成25年度は、1.Nezhaノックアウトマウスの小腸上皮細胞における表現型の解析と、2.ヒト上皮由来Caco-2細胞の三次元培養系を用いた解析を併行して行い、それぞれの解析から以下の結果を得た。1 Nezhaは、細胞表層面の細胞膜直下(sub-apical region)に、微小管端と共に点状に局在した。Nezhaノックアウトマウスでは、細胞表層面直下に微小管端が認められず、表層に近い領域で微小管の配向が乱れる様子が観察された。このことから、極性上皮細胞における微小管の構築には、微小管マイナス端がNezha依存的に表層面の細胞膜直下に局在することが必須であると考えられた。2 Caco-2細胞を用いた三次元培養系において、NezhaのRNAiを行った結果、細胞の高さが低くなり、核の位置が表層面と近くなるという、小腸上皮細胞における表現型とよく似た表現型を示した。Nezhaの極性上皮細胞における役割の分子機構について、この系を用いての実験が可能であることが示唆された。極性をもつ上皮細胞の微小管は、頂端面ー基底面に対して垂直方向に編成され、一定の方向性をもって存在する。微小管のマイナス端は、非中心体微小管として頂端面に向き、プラス端は基底面に向くとされている。本研究では、この極性上皮細胞に特徴的な微小管編成のしくみとその役割を明らかにすることを目指して、非中心体微小管マイナス端に結合するCAMSAP3(Nezhaともよぶ)に着目し、CAMSAP3ノックアウトマウスと、ヒト大腸癌由来Caco-2細胞の三次元培養系を用いた解析を行っている。昨年度までの研究から、小腸上皮細胞における特徴的な微小管編成の構築には、頂端面の細胞膜直下に局在するCAMSAP3が、微小管マイナス端の局在を規定することが必須であることがわかった。また、三次元培養をおこなったCaco-2細胞は、小腸上皮細胞とよく似た表現型を示し、この系を用いての分子機構の解析実験が可能であることが示唆された。平成26年度は、1.CAMSAP3ノックアウトマウス小腸上皮細胞と、2. Caco-2細胞三次元培養系を用いた解析から、それぞれ以下の結果を得た。1細胞極性、細胞内小器官のマーカーとなるタンパク質の局在を調べた結果、CAMSAP3ノックアウトマウスでは、細胞膜の極性に乱れは観察されなかったが、細胞の高さが低くなり、核やゴルジ体等の細胞内小器官の配置が乱された。CAMSAP3によって配向される微小管は、細胞内小器官の配置に重要な役割を果たすことが明らかになった。2微小管動態のライブ観察をおこない、野生型では頂端面から基底面に向かって走る微小管が、CAMSAP3ノックダウン細胞では、基底面を含む様々な位置から細胞内をランダムに走る様子を観察した。CAMSAP3を異所局在させる実験により、CAMSAP3の局在が、微小管マイナス端の位置を決定するために、必要十分であることを示した。極性をもつ上皮細胞において、微小管は、頂端ー基底軸に沿って配列する特徴的な編成を示す。微小管のマイナス端は頂端面に向き、プラス端は基底面に向くとされている。本研究では、この上皮細胞に特徴的な微小管編成が形成されるしくみと、その役割を明らかにする目的で、非中心体微小管マイナス端に結合するCAMSAP3に着目し、CAMSAP3変異マウス小腸と、培養上皮細胞(Caco-2)を用いた解析を行っている。

昨年度までの研究から、小腸上皮細胞では、CAMSAP3が頂端面の細胞膜直下に局在して微小管マイナス端を繋ぎ止めることにより、頂端-基底軸に沿った配向を可能にしていること、この微小管編成は、細胞内小器官の正しい配置に必須であることが分かった。Caco-2細胞の三次元培養実験系からは、CAMSAP3の機能が破壊されると、細胞内で微小管の配向がランダムになること、CAMSAP3の局在が微小管マイナス端の位置を規定するために、必要十分であることが分かった。平成27年度は、CAMSAP3が頂端面に局在する機構を知るために、Caco-2細胞を用いた実験を行い、以下の結果を得た。さらに、本研究から得られた結果をまとめ、論文を作成した。1.頂端面のCAMSAP3の局在は、微小管とアクチン、双方に依存することが分かった。2.ドメイン解析の結果、CAMSAP3の頂端面への局在には、CAMSAP3の微小管結合領域である、CKKドメインと、プロリンリッチ領域の双方が必要であり、微小管に結合できないCAMSAP3は、細胞質中に散ることが分かった。3.Coiled-coil (CC1)ドメイン内に変異を導入したCAMSAP3は、微小管端に結合するが頂端面に局在できない。ことから、微小管マイナス端に結合したCAMSAP3がCC1ドメインを介して頂端面に局在する機構が示唆された。上皮細胞は、多くの臓器の主成分で、上(頂端面)、下(基底面)という極性をもつ。微小管細胞骨格が、頂端-基底軸に沿って配向する特徴的な編成を示すことが知られていたが、その仕組みは不明であった。微小管は、それ自身がプラス端・マイナス端という極性をもつ。本研究では、微小管マイナス端結合タンパク質CAMSAP3に着目し、マウス小腸と、培養上皮細胞を用いた解析を行った。その結果、CAMSAP3が頂端面に局在してマイナス端を繋ぎとめることで、上皮細胞に特徴的な微小管編成を可能にしていること、そのような微小管編成は、核やゴルジ体などの細胞内小器官が正しく配置されるために必須の働きを示すことが明らかになった。Caco-2細胞の三次元培養系を用いた解析が進行した。三次元培養系において、組織サンプルを用いた実験では不可能である、微小管動態のライブ観察をはじめとする、CAMSAP3/Nezhaの分子機構を解析する実験を遂行した。課題の成果を論文にまとめる作業を開始した。理研NEWS2016年5月号SCIENCE VIEW -上皮細胞の機能と形をつくる微小管の謎を解明-細胞生物学CAMSAP3が頂端面に局在するしくみについての研究をおこなう。研究成果を論文にまとめて公表する。本研究を通して、極性上皮細胞における微小管編成とそのしくみを興味深く学んだ。同じ腸細胞の微小管編成といっても、生体組織と培養細胞では、ある程度の相違があることもわかった。今後、より生体内に近い状態で、かつ、培養細胞系に近い技術・手法を使って実験できる、新しい、極性上皮細胞の微小管実験系についても考えてみたい。組織サンプルにおいては、これまで細胞内微小管を鮮明に観察することは困難であった。試料調整法に改良を加えることにより、小腸上皮細胞内の微小管について、より詳細な観察を行うことが可能となり、Nezha/CAMSAP3ノックアウトマウス小腸上皮で細胞内微小管に関する表現型が明らかになった。Caco-2細胞の三次元培養系においては、Nezha/CAMSAP3 RNAiで、生体内で観察されるのとよく似た表現型を示すことが確認できた。この系を用いて、分子レベルでの解析を進めることができると考えられる。継続しておこなっている実験に必要な物品の購入時期のずれにより、次年度使用額が生じた。小腸上皮細胞については、ひきつづき、細胞極性、膜輸送、
歯の移動により生じる歯根吸収に対するHSP72の影響と歯根吸収抑制剤の検討

本研究の目的は、矯正力が引き起こす歯根吸収に対するHSP72の影響の解明と、HSP72の選択的機能阻害分子であるPifthrin-μが歯根吸収の抑制剤になり得るか検討することである。平成30年度は、培養細胞を用いた研究(in vitro)を行う計画であったが、これまでの研究の流れから、令和元年度に予定していた実験動物を用いた研究(in vivo)を行った。12週齢Wistar系雄性ラット(n=40)の上顎第一臼歯をニッケルチタン製のクローズドコイルスプリングを用いて10gの力で近心方向に移動した。実験群には移動開始前日からHSP72の機能抑制分子であるPifithrin-μ(3mg/kg)を、対照群には偽薬を、実験期間中、隔日腹腔内に投与した。移動開始6時間(n=10)、24時間後(n=10)に過量の3種混合麻酔薬を投与して、実験動物の苦痛を軽減させて屠殺、還流固定を行い、上顎骨を採取した。その後脱灰、パラフィン包埋を行い、薄切切片を作製。その他の個体は、実験開始7日および14日に麻酔下で上顎歯列の印象採得を行い、石膏模型を作製した。その後、石膏模型はマイクロCT撮影を行った。実験開始21日後に過量な麻酔下のもと屠殺、還流固定を行い、上顎骨を採取した。採取した上顎骨のマイクロCT撮影を行い、脱灰、パラフィン包埋を行い、薄切切片を作製した。現在、得られたマイクロCT画像による歯の移動量や形態の評価を行っている。また、薄切切片を用い、組織学的検討および免疫組織学的検討を行っている。本年度は、in vitroの研究も同時に行う予定である。平成30年度途中で主任教授が他大学から着任し、医局運営や臨床、教育法の再構築に多くの時間が割かれ、本研究課題を推進する時間が十分に確保できなかったため。本研究の手技は確立されている。本年度以降は、計画通り推進する予定である。
脳γセクレターゼ活性の解析とその活性変化がアルツハイマー病発症に及ぼす意義

アミロイドβタンパク質(Aβ)の脳内蓄積はアルツハイマー病の発症を引き起こすが、孤発性アルツハイマー病ではAβが蓄積する原因は不明である。本研究では、その原因として脳γセクレターゼの活性変化を想定し、検証した。脳のγセクレターゼ活性の領域特異的、発達段階および加齢依存的な変化を調べ、活性量とAβの沈着、年齢、アルツハイマー病危険因子などとの関連性を検討した。その結果、脳γセクレターゼ活性の量的変化がAβの蓄積を生じるのではないらしいということが明らかになった。活性の質的変化については現在も解析中である。脳のγセクレターゼ活性の領域特異性と発達に伴う活性の変化について調べた。昨年度の研究で脳γセクレターゼ活性の測定方法の検討を行い、ラフト画分を用いてin vitro Aβ産生法により活性測定を行うことにしたが、その後、ミクロソーム画分由来のCHAPSO可溶性画分を酵素源とする方が本研究の目的に適合するらしいということが分かった。そこで、ここではCHAPSO可溶性画分を用いたin vitro Aβ産生法により脳γセクレターゼ活性の解析を行った。2ヶ月齢マウスの脳を、大脳皮質、海馬、間脳、脳幹、小脳に分け、各領域のγセクレターゼ活性を測定し比較検討した。脳のγセクレターゼ活性は大脳皮質で高い傾向を示したが、領域間における活性の差違は小さく有意差はなかった。次に、胎生期から6ヶ月齢までの種々の発達段階のマウスの大脳皮質のγセクレターゼ活性を測定した。その結果、胎生期の脳は非常に高いγセクレターゼ活性を呈し、生後徐々に活性が低下して、4週齢以降には低レベルでほぼ定常状態になることが分かった。各発達段階におけるγセクレターゼ複合体構成因子の発現量は活性変化のパターンとよく一致しており、γセクレターゼの量的変化が活性量を制御している可能性が示唆された。また、産生されるAβの分子種を調べると、Aβ40とAβ42/Aβ43の割合に年齢依存的な変化が見られた。以上のことから、γセクレターゼは胎児型酵素であり、胎児期のAβ産生に生理学的な重要性がある可能性が考えられる。また、年齢依存的に生じる活性の低下と修飾についてさらに十分な検討を行い、アルツハイマー病発症との関係を明らかにすることが重要である。本研究は、γセクレターゼによるアミロイドβタンパク質(Aβ)産生活性の変化が、孤発性アルツハイマー病の発症原因に寄与している可能性を検討する目的で、脳のγセクレターゼ活性を直接的に測定し、γセクレターゼの活性変化と孤発性アルツハイマー病の発症およびAβの脳内沈着との関係を明らかにする研究課題である。本年度は、その第1段階として脳におけるγセクレターゼ活性の測定方法を確立した。マウス脳よりミクロソーム画分を調製し、ここから得た1%CHAPSO可溶性画分、およびショ糖密度勾配遠心法によりさらに分画したラフト画分を用い、それぞれの画分に含まれるγセクレターゼ活性をin vitro Aβ産生法により比較検討した。また、γセクレターゼ複合体構成因子の分布を調べた。その結果、ラフト画分にはγセクレターゼ複合体が集積しており、高いγセクレターゼ活性を示すことが明らかになった。そこで次に、Aβ産生反応に伴って生じるペプチド産物をLC-MS/MS法により解析し、ラフト画分におけるAPPの膜内切断様式を検証した。その結果、ラフト画分においてもCHAPSO可溶性画分と同様、3残基毎の段階的な切断によりAβが産生されていることが明らかになった。以上の結果に基づき、次年度以降の研究では、ラフト画分を用いて脳のγセクレターゼ活性を測定することに決定した。本研究で確立した手法を用いて今後の研究課題を遂行することにより、アルツハイマー病の9割以上を占める孤発性アルツハイマー病の発症原因を解明できる可能性があり、成功すれば治療法の確立に繋がる重要な研究である。今年度はヒト脳のγセクレターゼ活性を解析し、アルツハイマー病発症に関わる様々な要因との関係について調べた。本研究では、アルツハイマー病病理であるAβの脳内沈着が起こる前からアルツハイマー病発症初期に至るまでの期間における脳内γセクレターゼ活性を調べて、その変化が発症および病理形成にどのように関与するか、あるいは関与しないかを明らかにすることを目的としている。Aβの脳内沈着はアルツハイマー病の発症より10から20年先行して起こると考えられている。そこで、40歳代から80歳代の正常人の脳、約60例を対象として、γセクレターゼ活性を解析した。脳は前頭葉皮質の一定領域を使用した。

γセクレターゼの活性は昨年度と同様に、CHAPSO可溶性画分を用いたin vitro再構成Aβ産生法により測定した。脳内Aβ蓄積量は、不溶性画分に存在するAβをELISA法で定量した。測定した脳γセクレターゼ活性を、アルツハイマー病危険因子であるアポリポタンパク質Eの遺伝子多型および年齢と比較検討した。その結果、いずれも相関関係が見られなかった。従って、脳γセクレターゼ活性はアポE遺伝子型による相違はないこと、また中年期から老年期の間では年齢依存的な変化を生じないことが分かった。脳γセクレターゼ活性は、全Aβの脳内蓄積量、Aβ42およびAβ40の蓄積量、Aβ42の全Aβに対する量比ともほとんど相関が見られず、Aβ各分子種および全Aβの脳内蓄積量には関係しないことが明らかになった。以上の結果から、脳γセクレターゼ活性の量的変化が、アルツハイマー病の発症や病理形成に関与する可能性は低いことが示唆された。しかしながら、産生されたAβの各分子種毎の定量において、最も重要な分子種であるAβ42の検出感度が低く定量に至らなかったため、γセクレターゼ活性の質的変化と疾患の関係については、今後さらに調べて行く必要がある。神経化学さらに詳細な研究を行うべき点もあるが、現在のところ、おおむね計画通りに研究が進行している。研究の進行はやや遅れ気味であったが、最終的には研究実施計画に従って本年度の研究目標を達成できており、ほぼ順調に研究を遂行できていると評価できる。今後、加齢が進行したマウス脳を用いて、老化に伴うγセクレターゼ活性の量的・質的変化を追跡する。また、アルツハイマー病患者脳と正常脳を用いてγセクレターゼ活性を測定し、疾患に特徴的な活性の変化を明らかにする。上述のように、ほぼ交付申請書に記載の研究実施計画通りに研究が進行しており、本年度の目標を達成することができているので、次年度以降も交付申請書に記載の研究計画に従って研究を遂行する予定である。次年度は、マウス脳を用いて、脳の各領域および年齢依存的なγセクレターゼ活性の変化について調べる計画である。次年度使用額が生じた理由は、これが平成26年3月31日の支出状況(3月31日に支払い終了のもの)を反映しているためであり、研究費はほぼ全額を本年度中(3月中)に使用している。上記の理由により次年度使用額は実際にはほとんど存在しない。在った場合には、実験のための消耗品の購入に充てる。研究費の次年度使用額は0ではないが、これは平成25年3月31日の支出状況(3月31日に支払い終了のもの)を反映しているためで、実際は、研究費のほぼ全額を本年度中(3月中)に使用済みである。従って、次年度以降の研究費については、交付申請書に記載した当初の計画通りに使用する予定である。
歯周炎におけるフォスフォリパーゼA_2の局在および意義に関する研究

プロスタグランジン,ロイコトリエンや血小板活性因子など炎症性メディエーター産生の律速酵素であるフォスフォリパーゼA_2(PLA_2)が歯周病患者の歯肉溝滲出液(GCF)中に認められるのか,また,この活性測定が歯周病患者の病態を反映しうる有効な方法になりうるか否かを追究した。PLA_2活性はフォスファチジルエタノールアミンのアラキドン酸を^<14>Cでラベルした基質を用い遊離した[^<14>C]-アラキドン酸の放射活性を測定することにより算出した。その結果,未治療患者のGCF中の約半分にPLA_2活性が検出された。このGCF中のPLA_2活性は同部位より抽出された歯肉組織中のものと高い正の相関関係が認められたが,一方,唾液中や血液中では活性が検出されなかった。また,GCF中の活性は歯周治療により著しく減少した。このように,GCF中のPLA_2は歯肉組織に由来しており,その程度は歯周病の病態に相関しているものと推察された。そこで,これらのPLA_2活性をdisease activityの指標であるといわれているプロービング時の出血(BOP)の有無で分類した。未治療患者のGCF中のPLA_2活性はBOP(+)のものがBOP(-)のものに比べて2.6倍と有意に高かった。また,BOP(+)であった部位で歯周治療後BOP(-)になった部位のPLA_2活性はほとんど検出できないレベルまで顕著に減少したのに対して,BOP(+)で治療後もBOP(+)のままであった部位のPLA_2活性には有意な減少が認められなかった。これらの結果は,GCF中のPLA_2活性測定が歯周病の状態を反映しており,将来disease activityを判定する指標の1つとして有効な方法になりうるものと考えられた。すでに我々は,ラット歯肉由来線維芽細胞培養系にインタ-ロイキンー1β(ILー1β)を添加することにより細胞内にホスホリパ-ゼA_2(PLA_2)が誘導され細胞外に分泌されることを明らかにしたが,平成3年度は,歯周炎の進行と組織の修復に関係が深いといわれている腫瘍壊死因子α(TNFーα)及び腫瘍化増殖因子β(TGFーβ)について歯肉線雑芽細胞のPLA_2活性への影響を検討した。その結果,TNFーαはILー1β同様に細胞内外のPLA_2活性を上昇させるとともに,ILー1βによるPLA_2誘導を相乗的に上昇させた。一方,TGFーβは単独では歯肉線維芽細胞のPLA_2活性に影響しないものの,ILー1β共存下ではILー1βによる細胞内外のPLA_2活性上昇を有意に減少することが明らかとなった。これらILー1β,TNFーα及びTGFβによるPLA_2活性への影響は,これらサイトカインの歯周病の進行と組織の修復における役割の一致するものであり,歯周炎において炎症性サイトカインは歯肉線維芽細胞に作用しそのPLA_2を促進することにより進行に関与しうることが示唆された。一般に,PLA_2は外分泌型の消化酵素として作用する膵臓型(I型)と,各種炎症反応により内分泌される非膵臓型(II型)が存在することがすでに知られているが,我々は大阪大学医学部分子生理化学教室(岡本光弘教授)より供与されたそれぞれの抗PLA_2抗体を用いて調べたところ,ILー1β及びTNFーαにより誘導された分泌型ホスホリパ-ゼA_2はII型に属することが判明した。以上の結果は,現在投稿中である。(FEBS LETTERS)

プロスタグランジン、ロイコトリエンをはじめとするエイコサノイド及び血小板活性化因子等の炎症性メディエーター産生の律連酵素であるホスホリパーゼA_2(PLA_2)は、一般に、外分泌型の消化酵素として作用する膵臓型(I型)と、各種炎症反応により内分泌される非膵臓型(II型)が存在することが知られている。本年度我々は、それぞれの抗PLA_2抗体を用いて以下の事を明らかにし発表した。(I)ラット歯肉線維芽細胞培養系においてインターロイキン1β(IL-1β)によりII型PLA_2が誘導、分泌した。(FEBS LETTERS)(2)同培養系で腫瘍壊死因子α(TNF2)はIL-1β同様にII型PLA_2を誘導、分泌した。このTNF2はIL-1βによる作用を相乗的に上昇させたが、腫瘍増殖因子βは逆に抑制した。(J.Periodontal Res.)以上のサイトカインによるII型PLA_2誘導の動態は歯周病発生と進行におけるものと一致していた。そこでII型PLA_2が臨床的に歯周病の進行に関与しているか否かを調べる目的で末治療患者の歯肉溝浸出液(GCF)及び歯肉組織をサンプルとして現在まで以下の結果を得ている。(1)末治療患者の約半分のGCF中にPLA_2活性が認められ、歯周治療により臨床的改善に相関して同活性も有意に減少した。(2)GCF中のPLA_2活性は同部より採取した歯肉組織中と相関した。(3)RIAにより歯肉組織中のPLA_2はII型PLA_2に属していた。以上の結果は現在投稿中である。また、本年度我々は共同研究者とともに開発したII型PLA_2のCDNAをプローブして次の事を計画実行中である。(1)ノーザン法による炎症及び非炎症歯肉組織中のMRNAの測点。(2)in situにおけるII型PLA_2の炎症歯肉組織中の局在。以上の事により更に歯周病発生及び進行における役割を明らかにする。アラキドン酸糸で産生の酵素であるフォスフォリパーゼA_2(PLA_2)が歯周病患者の歯肉溝滲出液(GCF)中に認められるのか、また、この活性が歯周病患者の病態を反映しているのか否かを追究した。活性測定はフォスファチジルエタノールアミンのアラキドン酸を^<14>Cでラベルした基質を用い遊離した[^<14>C]-アラキドン酸の放射活性を測定することにより算出した。その結果、未治療患者のGCF中の約半分にPLA_2活性が検出された。このGCF中のPLA_2活性は周部位より抽出された歯肉組織中のものと高い正の相関関係が認められたが、一方、唾液中や血液中では活性は検出されなかった。また、GCF中の活性は歯周治療により著しく減少した。このようにGCF中のPLA_2活性は歯肉組織に由来しており、その程度は歯周病の病態に相関しているものと推察された。そこでこれらのPLA_2活性をdisease activityの指標であるといわれているプロービング時の出血(BOP)の有無で分類した。未治療の患者のGCF中のPLA_2活性はBOP(+)のものがBOP(-)のものに比べて2.6倍と有意に高かった。また、BOP(+)であった部位で歯周治療後BOP(-)になった部位のPLA_2活性はほとんど検出できないレベルまで顕著に減少したのに対して、BOP(+)で治療後もBOP(+)のままであった部位のPLA_2活性には有意な減少が認められなかった。
南黄海における汚濁物質の輸送過程に関する研究

南黄海から東シナ海の中国沿岸域では工業化・都市化に伴って排出される汚濁物質の負荷が急激に増加している。北緯2930°、東経126.45130.00°の海域において、東京水産大學の研究練習船"神鷹丸"を用いて各汚濁物質の測定および海色リモートセンシングのための基礎的データを得た。1).定点における海洋環境の基礎データの収集a)オクトパスによる水温、塩分、蛍光強度、濁度、溶存酸素の観測b)透明度(セッキー板による)c)採水(クロロフィルa濃度、懸濁物質量、懸濁粒子、植物プランクトンの吸収係数、基礎生産力など)d)海中可視光の放射特性-直上、直下および各層の下方向分光放射照度と上方向放射輝度の測定2).表面要素モニター(航行中の表層水の水温、塩分、蛍光強度の測定)3).海水中のやハロカーボンの測定4).リモートセンシングデータからの南黄海の懸濁物質量およびクロロフィルa量の推定以上の調査研究を行った。本調査から、海水中のクロロフィルa濃度および濁度は明らかに大陸棚では高い傾向が認められ、1995年のデータと照らし合わせると、長江からの汚濁負荷が大きいことが推察された。さらに、1997年のハロカーボンの測定結果から大陸棚に近いほどブロモホルム、ブロモクロロメタンの濃度が増加していた。これは当海域の植物プランクトンによる富栄養化に起因していることが考えられた。
レーザー光による燃料噴霧直接点火手法の確立～プラズマからの火炎核形成機構の解明～

噴霧液滴を利用したレーザー光による点火手法では燃料濃度の濃い液滴周りで点火の契機となるプラズマが生成されるために,筒内の空気比が高い場合でも確実に点火ができると考えられる.しかし,プラズマから火炎核生成に至るプロセスは明らかになっていない.そこで本研究では,燃料噴霧を対象としμsオーダーの高速な現象である火炎核生成に対して高度光学計測と数値解析を適用し,噴霧液滴近傍における火炎核形成メカニズムを明らかにすることで,噴霧中におけるレーザー点火機構の解明を行うことを目的としている.2017年度においては,液滴周りの燃料蒸気濃度がプラズマの生成によって形成される高温領域および初期火炎核の形成に及ぼす影響を理解するために,蒸発量を変更した燃料噴霧へレーザー着火を着火および着火失敗に至る過程の調査を行った.その結果,蒸発量によって形成される高温領域および初期火炎核の形状が異なることがわかり,着火の成否への影響が確認できた.しかし,噴霧液滴周りの燃料蒸気に関してはその濃度の定量化ができておらず,2018年度に行う予定であった.しかし,装置や計測機器などの不具合もあり予定より進行が遅れ未だ定量化には至っていない.これに関しては2019年度に行う予定である.また数値解析に関しては,数値計算を行う環境は整えたが,まだコードの開発までには至っていない.燃料の蒸発量は噴霧流形成からテストセクションへの供給時間を変更することで変化させているが,この手法では定量性に欠ける.そこで,揮発させた燃料蒸気を用いて燃料液滴搬送気体の当量比を調整することで,噴霧液滴周辺の燃料蒸気濃度を変更することを予定していた.しかし,噴霧生成装置や点火装置(レーザー)などの不具合により当初の予定よりも開発がやや遅れている.2019年度前半に環境を確立し,当初の目的を達成することを目標としている.数値計算においては,コード開発までには至っていないが,開発環境の整備を行った.燃料液滴近傍の燃料濃度の定量性を確保するため,揮発させた燃料蒸気を用いて燃料液滴搬送気体の当量比を調整することで,噴霧液滴周辺の燃料蒸気濃度を変更する.また,アセトンLIFによる燃料蒸気の定量化を行う.2018年度ではエタノールを燃料として用いていたが,2019年度では揮発性の低いn-デカンを用いての調査も行う.数値解析では,2次元のプラズマ成長・緩和モデルを構築し液滴近傍の温度分布を取得し,点源爆発の理論より空間中にエネルギー(温度分布)が与えられた場合の場の速度や圧力,温度分布を得るコードを開発する.噴霧液滴を利用したレーザー光による点火手法では燃料濃度の濃い液滴周りで点火の契機となるプラズマが生成されるために,筒内の空気比が高い場合でも確実に点火ができると考えられる.しかし,プラズマから火炎核生成に至るプロセスは明らかになっていない.そこで本研究では,燃料噴霧を対象としμsオーダーの高速な現象である火炎核生成に対して高度光学計測と数値解析を適用し,噴霧液滴近傍における火炎核形成メカニズムを明らかにすることで,噴霧中におけるレーザー点火機構の解明を行うことを目的としている.当該年度においては,液滴周りの燃料蒸気濃度がプラズマの生成によって形成される高温領域および初期火炎核の形成に及ぼす影響を理解するために,蒸発量を変更した燃料噴霧へレーザー着火を着火および着火失敗に至る過程の調査を行った.その結果,蒸発量によって形成される高温領域および初期火炎核の形状が異なることがわかり,着火の成否への影響が確認できた.しかし,噴霧液滴周りの燃料蒸気に関してはその濃度の定量化ができておらず,次年度に行う予定である.また,数値計算に関しては開発環境の整備を行ったがプラズマの成長と緩和に関するモデル化には至っていない.こちらに関しても次年度に行う予定である.燃料の蒸発量は噴霧流形成からテストセクションへの供給時間を変更することで変化させているが,この手法では定量性に欠ける.そこで,揮発させた燃料蒸気を用いて燃料液滴搬送気体の当量比を調整することで,噴霧液滴周辺の燃料蒸気濃度を変更する.29年度ではエタノールを燃料として用いていたが,30年度では揮発性の低いn-デカンを用いての調査も行う.数値計算においては,コード開発までには至っていないが,開発環境の整備を行った.噴霧液滴を利用したレーザー光による点火手法では燃料濃度の濃い液滴周りで点火の契機となるプラズマが生成されるために,筒内の空気比が高い場合でも確実に点火ができると考えられる.しかし,プラズマから火炎核生成に至るプロセスは明らかになっていない.そこで本研究では,燃料噴霧を対象としμsオーダーの高速な現象である火炎核生成に対して高度光学計測と数値解析を適用し,噴霧液滴近傍における火炎核形成メカニズムを明らかにすることで,噴霧中におけるレーザー点火機構の解明を行うことを目的としている.2017年度においては,液滴周りの燃料蒸気濃度がプラズマの生成によって形成される高温領域および初期火炎核の形成に及ぼす影響を理解するために,蒸発量を変更した燃料噴霧へレーザー着火を着火および着火失敗に至る過程の調査を行った.その結果,蒸発量によって形成される高温領域および初期火炎核の形状が異なることがわかり,着火の成否への影響が確認できた.しかし,噴霧液滴周りの燃料蒸気に関してはその濃度の定量化ができておらず,2018年度に行う予定であった.しかし,装置や計測機器などの不具合もあり予定より進行が遅れ未だ定量化には至っていない.これに関しては2019年度に行う予定である.