hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
矯正的歯の移動における歯根膜特異遺伝子の同定

6週令ラットの上下顎切歯より歯根膜を,大腿骨より骨膜を剥離しoutgrowth法により初代培養細胞を調整した。両細胞から調整したtotal RNAの逆転写物に対して、differential display PCRを行った。8種類のプライマーの組み合わせによる反応産物を展開し,再度増幅可能であったクローン11種の塩基配列を決定した。このうちひとつのクローンは細胞骨格蛋白質遺伝子であり,その他10クローンは既知の遺伝子および既存のsequence tagとの有意な相同性はみられなかった。次に未知の遺伝子断片3種よりprimerを設計し、RT-PCR法により歯根膜、骨膜細胞間でのmRNA発現の差異を検討した。その結果両細胞間でmRNAの発現量の明らかな差がみられなかった。2.歯根膜細胞の発現する骨関連蛋白質の遺伝子について歯根膜細胞から調整したtotal RNAの逆転写物をもとに,既知の骨関連蛋白質遺伝子の発現をRTR-PCR法Northern blot法により検討した。歯根膜細胞は培養初期より,osteopontin,osteonectin,bone sialoprotein遺伝子を発現しており,培養期間により顕著な変動はみられなかった。Alkaline phosphatase遺伝子は培養期間につれて発現が増強され,また骨系細胞の分化を促進すると考えられているdexamethasoneの添加により著しく発現を増強した。これらの結果より歯根膜細胞が遺伝子の発現において骨系の細胞と類似したパターンを示すことが明らかとなった。1.ラット歯根膜細胞、骨膜細胞の調整と性状6週令ラットの上下顎切歯および大腿骨より歯根膜、骨膜を剥離しoutgrowth法により細胞を調整した。歯根膜細胞は敷石状の形態、骨膜細胞は紡錐状の形態であった。それぞれのprimary cultureの細胞からtotalRNAを抽出し、逆転写反応を行った。両細胞ともRT-PCR法によりAlkaline phosphatase遺伝子の発現がみられた。2. Differential display PCR法による発現遺伝子のdisplayと特異遺伝子の検索歯根膜、骨膜細胞から調整したtotal RNAの逆転写物に対して、differential display PCRを行った。展開した遺伝子断片のうち歯根膜細胞に特異的にみられるバンドを切りだし、再度PCR反応にて増幅した。8種類のプライマーの組み合わせによる反応を行い、増幅可能であったクローンをプラスミドベクターに組み込んだ。そのうち最終的に11クローンのsequenceが解読可能であった。これらの遺伝子断片のsequenceについてGenBank/EMBL/DDBJデータベースに対して相同性の検索を行った。このうちひとつのクローンをのぞいて、既知の遺伝子および既存のsequence tagとの有意な相同性はみられなかった。既知の遺伝子は細胞骨格に関係する構造蛋白質であった。本年度の実験によっては、歯根膜細胞に特異的に発現する遺伝子はいまだ得られていない。
シリカ種上でのアルカンの低温ラジカル酸化反応

申請者らは珪酸エチル(TEOS)蒸気を気相中に導入することにより(in-situ調製)、反応器中で調整された固体シリカ種が400°C以下の比較的低温でn-ブタン酸化反応に活性を示すことを見いだした(A.Satsuma et al.,Chem.Lett.,1997,1051)。通常は不活性とされているシリカ種上で、反応性に乏しい低級アルカンが酸化されるという現象は科学的、工学的な見地から極めて興味深い。本研究ではこの現象に対して、(1)現象論の整理と、(2)低温でのラジカル的酸化反応機構の解明、という2つの観点から研究を進めた。その結果、(1)については以下が明らかになった。(1)本反応系は通常の触媒反応とは異なる特異的な温度依存性と生成物分布を示す、(2)通常の触媒反応では得られないフラン類が生成する、(3)本反応系では気相のラジカルが関与する、(4)シリカ種は反応間壁にdepositし触媒として作用している。また、反応機構を明らかにするため、in-situ調製条件の影響、ラジカルトラップ剤(NO)の導入等によりシリカ種の作用機構について検討を行った。その結果、(5)シリカ表面の水酸基サイトが活性サイトである、(6)活性サイトは気相ラジカルのinitiatorとして働き反応が開始される、(4)シリカ表面の活性サイト上で生成したブチルラジカルが気相中のラジカル連鎖反応により反応が進行する、ことが解明された。最終的な成果として、シリカ触媒上でのブタン反応機構を提案した。申請者らは珪酸エチル(TEOS)蒸気を気相中に導入することにより(in-situ調製)、反応器中で調製された固体シリカ種が400°C以下の比較的低温でn-ブタン酸化反応に活性を示すことを見いだした。本研究では(1)シリカの触媒としての利用の可能性と、(2)低温でのラジカル的酸化反応機構の解明、という2つの観点から研究を進めた。本反応系は全く新規な触媒系であるため、平成10年度は現象論の整理として、(1)反応条件の影響と、(2)シリカ種調製条件の影響、について検討した。(1)反応条件の影響:ブタン酸化活性は反応温度に対して山形の特異的な挙動を示した。また、全温度域にわたってアルデヒド、ブテン、CO、CO_2が多く生成した。この2つの挙動はcool flameと言われる現象と類似であることが示された。本反応系は気相のラジカルが関与し、シリカ種は気相ラジカルのinitiatorとして働いていることが示唆された。(2)シリカ種調製条件の影響:シリカ種の調製に種々のガスを用いた。ブタンと酸素が共存する場合にのみ、酸化反応が進行した。これはシリカ種調製にはブタン酸化生成物が関与することを示唆している。水蒸気とTEOSを同時導入したところ、先のin-situ調製の場合と同様な現象が見られた。TEOSの加水分解により生成したシリカ、かつ表面が高度に水和された状態が不可欠であることが示唆された。平成11年度は本年度の知見を元に反応機構について検討する予定である。
骨芽細胞の分化調節機構を基盤として新しい骨再生療法を開発する

A)間葉系幹細胞の性状の解析及び分離・移植法の確立・ヒト過誤腫よりSV40LargeT抗原導入により単一細胞に由来し、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨格筋、平滑筋への分化能を保持する細胞株CloneKを樹立した(Cell Tissue Res 317:237-246,2004)・ヒト軟骨肉腫から樹立した細胞株USACは軟骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞への分化能を保持しており、この細胞がヒト間葉系細胞の分化過程の解析に有用なことを報告した(BONE 34:648-655,2004)。B)骨芽細胞の分化を調節する転写因子群の機能の解析・骨格形成で重要な役割を担うMsx2はBMP-2の骨芽細胞の分化を促進し、脂肪細胞の分化を抑制することを明らかにした(Mol Cell Biol. 25:1971-1979,2005)。C)解析結果を臨床応用するための基礎研究・GFPトランスジェニックマウスから採取した細胞を野生型の骨欠損部に移植する実験系を確立し、生体内で移植細胞の運命を追跡できる実験系を確立した。また、BMP-2を過剰発現した皮膚線維芽細胞の移植が骨再生に有用なことを明らかにした(Bone 32:502-512,2003、BONE 34:993-1003,2004)。今年度は次の3点について研究を行い、以下の結果を得た。1.骨芽細胞の分化過程におけるCbfa1の役割の解析頭蓋冠由来のCbfa1欠損細胞はBMP-2非添加の状態ではノーザンブロット法でオステオカルシンmRNAの発現は検出できす、RT-PCR法で弱い発現が確認できた。一方、同細胞にBMP-2(500ng/ml)を添加すると48時間以内にノーザンブロット法でオステオカルシンmRNAの発現が誘導され、RT-PCR法でもオステオカルシンmRNAの発現上昇が確認できた。この結果は、BMP-2に応答するCbfa1以外の転写因子がオステオカルシンの発現調節に関与していることを示しているので、来年度はこの因子の同定を試みる。2.マウス骨再生モデルの作成本研究では歯科用エンジンを用いて直径2mmの円形の骨欠損を作成し、骨再生過程を解析した。この骨欠損モデルは特殊な固定装置等を必要とせずに、骨再生が再現性よく観察できることが形態学的解析で明らかとなった。また、本モデルでは骨欠損作成後3日目で骨再生部にアルカリフォスファターゼ陽性細胞とBrduを取込む細胞が増加することが明らかとなった。3.担体/BMP-2/細胞複合体の移植実験担体/骨芽細胞様細胞複合体を骨欠損部に移植すると担体のみの移植に比べて骨再生が促進された。また、担体/BMP-2を移植すると骨再生が著明に促進された。担体/BMP-2/細胞複合体の移植は、担体/BMP-2の移植より骨再生を促進する傾向が見られたが、有意な差ではなかった。しかし、BMP-2の添加量が少ない場合には、担体/BMP-2/細胞複合体の移植は、担体/BMP-2の移植より有意に骨再生を促進した。1.骨芽細胞の分化調節機構の解析1)骨芽細胞の分化を調節する転写因子の解析山口らがすでに樹立したCbfa1欠損細胞株にアデノウイルを用いてBMP-2遺伝子過剰発現させると骨芽細胞の分化が誘導されることを明らかにした。現在,早期に変動する遺伝子群をcDNAチップを用いて解析中である。2)間葉系幹細胞の性状の解析と同定ヒト過誤腫から骨芽細胞,軟骨細胞,脂肪細胞,筋肉への分化能を保持する細胞を分離しSV40 T antigenの導入により,不死化細胞株を樹立した。この細胞株を用いてヒト間葉系幹細胞の性状を解析中である。II.骨再生の分子メカニズムの解析マウス正常大腿骨骨幹部に直径2.2mmの円形骨欠損を作製し,その修復過程を解析した結果,3-4日目に間葉系幹細胞が出現すると考えられた,そのため,現在,骨欠前と骨欠損作製5日目の間で発現量が変動している遺伝子をcDNAチップで解析中である。III.骨再生療法の開発マウス頭頂骨に円形骨欠損を作製し,同部に担体と細胞の複合体を移植し,骨再生に及す効果を解析した。その結果,アデノウイルを用いてBMP-2を過剰発現させた皮膚線維芽細胞を移植すると骨再生が促進されることが明らかとなった。IV.カエル骨格形成の解析カエル,ニホントカゲ,マウスなどの長管骨の形成過程を組織学的に解析した。その結果,カエルにおける骨代謝回転はマウスに比べると非常に遅く,カエルにおいては,マウスのように骨組織がカルシウムの貯蔵庫としての機能を有しておらず,爬虫類になってから骨組織がカルシウムの貯蔵庫として機能することが示唆された。今年度は次の3点について研究を行った。I.骨芽細胞の分化調節機構の解析1)骨芽細胞の分化を調節する転写因子の解析Cbfa1欠損細胞株における骨芽細胞の分化調節機構を解析。

この細胞株をスキッドマウスに移植して,In vivoにおける分化能を解析中である。II.骨再生の分子メカニズムの解析マウス正常大腿骨骨幹部に直径2.2mmの円形骨欠損を作製し,その修復過程を解析した結果,3-4日目に間葉系幹細胞が出現すると考えられた,そのため,現在,骨欠前と骨欠損作製5日目の間で発現量が変動している遺伝子をcDNAチップで解析した。その結果を基盤として,骨再生5日目で発現が上昇する遺伝子40を選択し,骨再生過程における各遺伝子の発現パターンをin situハイブリダイゼーション法で解析し,興味ある遺伝子8個に絞り,詳細な解析を進めている。III.骨再生療法の開発マウス頭頂骨に円形骨欠損を作製し,同部に担体と細胞の複合体を移植し,骨再生に及す効果を解析した。その結果,アデノウイルを用いてBMP-2を過剰発現させた皮膚線維芽細胞を移植すると骨再生が促進されるが,Cbfa1を過剰発現した線維芽細胞の移植では骨再生が誘導されないことを明らかにした。1)骨再生の分子メカニズムの解明マウス正常大腿骨骨幹部に直径1.2mmの円形骨欠損を作製し,骨欠損前と骨欠損作製後5日目及び10日目で発現量が変動している遺伝子をcDNAチップで解析した。その結果、骨再生前と比較して骨再生5日目で顕著な発現上昇を示した遺伝子が約270個みられ、その中から約40個の遺伝子を選択し、骨再生過程におけるそれらの遺伝子璽発現パターンをRT-PCR,NorthernブロットおよびIn situハイビリダイゼーションで再検証した。これらの結果に基づき、骨で興味ある発現パターンを示した12個の遺伝子を選択し、さらに詳細に解析した結果、骨再生過程で重要な役割を担うと考えられる遺伝子が同定できた。2)細胞移植法を利用した新しい骨再生療法の開発新生仔マウスから分離培養した皮膚線維芽細胞にアデノウイルスベクターを用いてLacZ,BMP-2または,Runx2遺伝子を導入し,in vitroにおける骨芽細胞への分化能を解析した。次に,これらの遺伝子を導入した皮膚線維芽細胞を成長マウスの頭頂骨に作成した直径4mmの骨欠損部に移植し,骨再生に及ぼす効果を経時的に解析した。また,GFP Tgマウスから採取した皮膚線維芽細胞を移植することにより生体内での挙動を追跡した。BMP-2またはRunx2遺伝子を導入した皮膚線維芽細胞は骨芽細胞への分化が示された。BMP-2を過剰発現した皮膚線維芽細胞を骨欠損部に移植すると2週後より明らかな骨再生が誘導されたが,Runx2,LacZを過剰発現させた皮膚線維芽細胞の移植では骨再生が誘導されなかった。さらに,GFP Tgマウスより採取した皮膚線維芽細胞にBMP-2遺伝子を導入して野生型マウスの骨欠損部に移植する実験より,移植した皮膚線維芽細胞が生体内で骨芽細胞・骨細胞へ分化することも明らかとなった。A)間葉系幹細胞の性状の解析及び分離・移植法の確立・ヒト過誤腫よりSV40LargeT抗原導入により単一細胞に由来し、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨格筋、平滑筋への分化能を保持する細胞株CloneKを樹立した(Cell Tissue Res 317:237-246,2004)・ヒト軟骨肉腫から樹立した細胞株USACは軟骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞への分化能を保持しており、この細胞がヒト間葉系細胞の分化過程の解析に有用なことを報告した(BONE 34:648-655,2004)。
ルチル型二酸化チタン表面の超親水化反応に伴う表面構造変化の研究

ルチル型TiO2(110)表面における紫外線誘起超親水化反応中に表面構造がどのように変化するか調べた。新しく開発した表面X線回折迅速測定法を用いることで、反応中にTiO2表面自身の構造が変化するという直接的な証拠を初めて示すことができた。また、構造解析によって、疎水性表面では水分子が表面上に周期配列しているが、超親水性表面では表面に酸素欠陥ができて表面粗さが増大し、水分子の周期配列構造も解消されることが分かった。このことから、紫外線を照射した乱れのある表面では、表面格子からの束縛に強くとらわれずに水素結合ネットワークを作ることができ、親水性が達成されるというモデルを提案することができた。表面X線回折法を用いて、紫外線照射によるルチル型二酸化チタン(110)表面の濡れ性変化における、1紫外線照射前(疎水性表面)の表面構造解析、2紫外線照射後(超親水性表面)の表面構造解析、3紫外線照射中におけるX線結晶トランケーションロッドの時分割測定を行った。1と2は単色X線を用いた従来法を用い、3は申請者等が開発した波長分散法を用いた。構造解析の結果、疎水性表面においては、再表面に水分子層(1分子層)が周期配列していることが分かった。この構造は水中において提案されている構造と一致しており、大気中においても、水分子が1層だけ化学吸着していることが分かった。一方、超親水性表面においては表面粗さが増加し、水分子層の周期配列が解消されていることが分かった。時分割測定によってこの変化が100秒程度の時間スケールで起こることが分かった。この時間スケールは二酸化チタン表面が超親水化する時間スケールと同じであり、濡れ性変化によって表面構造が原子スケールで変化する様子を初めて観測することができた。この構造変化は雰囲気中に活性酸素があるときには起こらなかった。上記の結果から、以下のモデルを提案した。紫外線照射によって表面に酸素欠陥ができ、それを埋めるように水分子が化学吸着する。疎水性表面においては水分子は二酸化チタン表面と整合するように周期的に吸着するため、水分子間で水素結合を作ることができないが、超親水性表面では酸素欠陥があるため、水素結合ネットワークをつくりながら不規則に吸着することができる。これにより水分子の密度が大きくなり表面が親水化する。この結果は第27回日本放射光学会(2014年1月)において口頭発表した。平成24年度は、紫外光照射によるルチル型TiO2(110)表面超親水化反応に伴う表面構造変化の研究を行った。表面構造変化の観測には、我々が開発してきた波長分散集束X線ビームを利用したX線結晶トランケーションロッド同時測定法を用いた。これによって、光学系や試料を一切動かすことなく、広いq範囲の結晶トランケーションロッド散乱分布を同時測定することが可能になり、反応中の表面構造変化をその場観察することに成功した。測定では、表面敏感性を高め、かつ基板からのバックグラウンドを低減するために、波長分散X線ビームの高エネルギー成分に対して全反射臨界角になるように試料の入射角を設定した。紫外光を照射しながら、チタン原子配列からの寄与がなく、酸素原子配列のみが寄与する結晶トランケーションロッド散乱プロファイルの強度変化をその場観察したところ、明瞭な時間変化が見られた。強度プロファイルの変化は一様ではなく、これは表面の酸素原子配列が変化することを示しており、超親水化反応に関する新しい重要な知見を得ることができた。この結果を、日本物理学会2012年秋季大会及び、2013年物構研サイエンスフェスタにて発表した。上記の測定は、既存のゴニオメーターを用いて行ったが、測定精度と測定効率を向上させるために、サークル型回転ステージの設計製作を行った。これを既存のゴニオメーターに取り付けることで、4軸回折計として用いることができ、より精密で高効率な表面X線回折実験を行うことが可能になった。また、本測定系を用いることで、X線反射率測定の迅速測定が可能であることを示すことができたため、投稿論文にまとめ、掲載受理された。平成24年度は、まずサークル型回転ステージを設計製作し、これを用いた表面X線回折実験によって、ルチル型TiO2(110)表面構造解析を行う予定であったが、製作に時間がかかることが判明したため、先に次年度に行う予定であった表面構造の時間変化測定を行った。研究実績の概要欄にあるように、時間変化測定では重要な知見を得ることができ、また、サークル型回転ステージも年度内に製作することができた。このため、実験計画の前後はあったが、研究自体はおおむね順調に進んでいる。

平成24年度に製作したサークル型回転ステージを搭載した4軸回折計を用いた表面X線回折実験を行い、ルチル型TiO2(110)表面構造解析を行い、原子レベルの構造情報を得る。この情報をもとに、紫外光照射による表面構造変化の時間変化測定をさらに詳しく調べ、超親水化反応と表面構造の関係を明らかにする。表面X線回折実験用の消耗品(光学系に用いるポリクロメーター結晶や試料結晶)と、研究発表のための旅費に用いる。
生命系のホメオスタシスを構築するトランスファロームのシステム生物学

生命システムは、呼吸循環系と代謝系を中心に、熱と物質の移動を極めて精密かつ緻密に制御し、深部温度を一定に保つことができ、さらに広範囲な分子量にわたる物質の移動を制御することによって、エネルギ代謝を行い、生命活動の原動力になっている。従って、生命システムは熱と物質移動の宝庫とも言うべきものであるが、従来は局所的な熱と物質移動の取り扱いがされているだけで、生命システム全体で、熱と物質移動現象が、生命システムの動的恒常性であるホメオスタシスを実現しているかが不明であった。生命システムの熱と物質移動現象は、生命活動に直接関わっているため、生命システム全体の熱と物質移動が明らかになることによって、医学における診断・治療や薬物輸送の薬理効果が明らかになり、革新的な医学が出現する可能性がある。生命システムにおける熱と物質移動の総体を、ここでトランスファロームと名づけ、これまでのシステム生物学では重点的に取り上げられていなかった熱と物質移動のダイナミクスをトランスファロームで明らかにすることを目標としている。そこで、まず本企画調査では、生命システムにおける熱と物質移動現象に関して、移動現象論、医学生物学および薬理学の立場から調査・討論を行い、トランスファロームのシステム生物学を確立するための研究計画をたてた。具体的には、5回の研究会(シンポジウムを2回)、幹事会を2回開催し、研究計画の独自性、ニーズ、特徴、社会への波及効果などを中心に議論を行った。その結果、十分に特定研究のテーマとして相応しいという結論に達し、今後特定研究の具体的な申請の手続きを行うこととした。
脳生理学的知見を取り入れた芸術教育における感性育成プログラムの開発

芸術教育における感性の育成について脳生理学的な知見を取り入れ,実験的な手法を含めての検討を行なった。本研究では,感性反応を脳における快感反応と捉え,感性の育成に関わる具体的な場面を実験的に設定し,NIRS(Near Infra- Red Spectroscopy)を用いて大脳皮質のoxy-Hb(酸素化ヘモグロビン)の変化量を計測した。一例として,音楽聴取の場面で心が動く瞬間のoxy-Hbの変化に注目した実験では,側頭連合野のoxy-Hbが増加するという傾向をとらえた。絵画の鑑賞場面におけるバックで流れる音楽の有無など,芸術教科間の枠を超えての感性の育成の可能性についても検討を行なった。芸術教育における感性の育成に関わる評価の場面で,これまでは言語的表出を含む心理学的指標が用いられることが多かったが,本研究では,感性の育成について,脳生理学の知見を加えて検討している。科学的な根拠をもって感性を育成するプログラムを検討することが本研究の目的である。学校音楽教育の目標には,感性を育てるという内容が含まれているが,音楽を鑑賞したり演奏したりする場面で心が動かなければ,感性の育成につながることはないだろう。音楽で心が動かすことが,感性の育成の第一歩となるのではないかと考え,平成27年度の研究では,心が動く,という現象を脳血流の変化としてとらえる実験を行った。たとえば,音楽を聴いて心が安らぐ,気持ちが高揚する,ゾクゾクするなど,音楽は人間の心に何らかの影響を与えるものである。そこで,ある一曲の音楽を聴いて心が動く瞬間に注目し,そのときに大脳皮質の脳血流はどのように変化するのかについて検討した。実験では,通常の授業の環境下に近い状態での実験を行うために,NIRS(Near Infra- Red Spectroscopy)を用いた実験を行った。NIRSは,脳内のヘモグロビン濃度の変化をリアルタイムに計測することができる装置である。本研究では計48chで計測することができる日立メディコの光トポグラフィ装置ETG-4000を用いた。被験者は20代の女性とし,前頭部,右側頭部,左側頭部の3部位を計測し比較検討を行った。実験の対象曲として,1曲の中で,楽器編成が変わる,調性が変わる,強弱が変わるなど,楽曲の中で顕著な変化があるものを取り上げた。その結果,曲調が変わる場面や楽曲の頂点で脳血流が変化するという現象をとらえることができた。具体的には,側頭部のoxy-Hbの増加を確認することができ,音楽を聴いて心が動くときには側頭連合野が重要な役割を果たしている可能性を指摘した。感性の育成の第一歩として,心が動くという瞬間に注目し,そのときの脳血流の特徴をとらえる実験など順調に行うことができた。特に,音楽鑑賞時における心が動く瞬間について,NIRSを用いた実験結果をもとに具体的に検討を行うことができた。近年,感性について脳科学から検討し,感性反応を脳の快感反応としてとらえようとする動きがある。本研究では,この点に注目し,快感反応を脳血流の変化としてとらえることができないか検討している。平成27年度の研究では,心が動く,という現象に注目した。平成28年度は,音楽鑑賞や絵画鑑賞の場面で,どのような条件を設定したら,心が動きやすいのかについて検討を行った。具体的には,音楽鑑賞の場面で,同じ楽曲を鑑賞するときの条件を変えることによる大脳皮質の脳血流への影響(自由に鑑賞,音楽の雰囲気を感じ取りながらの鑑賞,音楽の特徴をとらえながらの鑑賞という3つの条件の比較),絵画を鑑賞する場面(複数の絵画を次々に提示)で,音楽を流しているときと音楽を流さないときの比較,書道の場面で,音楽を流しているときと音楽を流さないときの比較などの実験を行った。実験は,通常の授業の環境下に近い状態での実験を行うために,NIRS(Near Infra- Red Spectroscopy)を用いた実験を行った。NIRSは大脳皮質のヘモグロビン濃度の変化をリアルタイムに計測することができる装置である。被験者は大学生とし,前頭部,右側頭部,左側頭部の3部位を計測し比較検討を行った。その結果は次の通りである(一部のみ)。音楽鑑賞の場面で,3つの条件を比較した実験では,自由に鑑賞したときが一番心地よく聴くことができたという被験者の事例では,自由に鑑賞しているときは前頭部の前頭前野およびその近傍の血流の賦活が下がるという特徴がみられた。絵画を鑑賞する場面で,音楽を流した方が心地よかったという被験者の事例では,音楽が流れていると複数の絵画に連続性を感じるようになり,心地よいという心理的な変容があることについて指摘した。本研究では,外界からの刺激に対して,心が動くという現象がなければ,感性を育成することはできないと考え,心の動きを脳血流の変化でとらえることができないか検討している。平成29年度は,音楽鑑賞,絵画鑑賞,詩の鑑賞に注目し,その三者を独立して鑑賞するときと,音楽と絵画の鑑賞を重ねたとき,音楽と詩の鑑賞を重ねたときの違いがあるかどうかについて,NIRS(Near Infra- Red Spectroscopy)を用いた実験を行った。本研究では日立メディコの光トポグラフィ装置ETG-4000を主として用いた。

被験者は大学生とし,前頭部,右側頭部,左側頭部の3部位を計測し比較検討を行った。その結果,被験者によって差が見られたが,音楽を重ねることによる心理的な変化を質問紙調査で確認し,脳血流では側頭部のoxy-Hbの変化としてとらえることができた。他にもピアノの音色の違いが脳内に及ぼす影響などについても検討した。人間には,視覚,聴覚,触覚,味覚,嗅覚という五感がある。感性は,視覚,聴覚,触覚など複数の感覚モダリティが同時に進行するようなマルチモーダルな多次元構造にその形成基盤があるという。芸術教育においても,複数の感覚モダリティを意識しての感性の育成という視点をもつことが大切となるだろう。外界の刺激に対する脳内での情報処理システムとして,無意識的で直感的,自動的なシステム1と,意識的で論理的,制御的なシステム2があるという。脳生理学的にも外界からの刺激に対して,高次脳機能を司る大脳皮質連合野における情報処理を経て情動機能を司る大脳辺縁系の偏桃体へ流れるルートと,大脳皮質を経由しない直接ルートがある。子供たちの感性を育成するとき,このどちらかのルートに偏りすぎるのではなく,直感的な情報処理と論理的な情報処理のバランスを考えていくことも大切な視点となる。芸術教育における感性の育成について脳生理学的な知見を取り入れ,実験的な手法を含めての検討を行なった。本研究では,感性反応を脳における快感反応と捉え,感性の育成に関わる具体的な場面を実験的に設定し,NIRS(Near Infra- Red Spectroscopy)を用いて大脳皮質のoxy-Hb(酸素化ヘモグロビン)の変化量を計測した。一例として,音楽聴取の場面で心が動く瞬間のoxy-Hbの変化に注目した実験では,側頭連合野のoxy-Hbが増加するという傾向をとらえた。絵画の鑑賞場面におけるバックで流れる音楽の有無など,芸術教科間の枠を超えての感性の育成の可能性についても検討を行なった。心が動く瞬間について,音楽を中心とした実験を行うことができたが,さらに,美術の分野,書道の分野においても,同様の実験も進めていく予定である。また,それぞれの分野における感性の育成のための具体的なプログラムの考案および,そのプログラムの検証時実験に入る予定である。引続き,音楽,美術,書道の各教科における感性を育成(心を動かすという視点から)するためのプログラムの検討し,その効果があるかどうか,NIRSを用いての脳生理学的計測と,質問紙調査等による心理学的な調査を実験的に行う予定である。また,教科を横断しての感性に育成に関わるプログラムの検討も行いたいと考えている。29年度が最終年度であるため、記入しない。音楽教育29年度が最終年度であるため、記入しない。
肝癌腫瘍マーカーPIVKA-IIの産生機序の解明

肝癌腫瘍マーカーPIVKA-IIは、肝癌が積極的に産生するのではなく、epithelial mesenchymal transition(EMT)の過程においてアクチン線維が断裂することにより脂溶性ビタミンであるビタミンKの取り込みが不良となり(アクチンは脂質を細胞に取り込む際のclathrin-mediated endocytosisに重要な働きをする)、プロトロンビン前駆体から活性型プロトロンビンへの変換が不良となるため、PIVKA-IIが産生されることを証明した。また、EMTの強力な誘因因子である虚血にても肝癌はPIVKA-IIを産生するphenotypeに変化することも証明した。腫瘍の急激な増大あるいは抗癌剤治療・肝動脈塞栓術など虚血と栄養障害を来す病態の場合は、さらなるphenotypeの変化が起こりmammaliantarget of rapamycin(mTOR)pathwayを介して肝特異的蛋白産生が低下する。その場合、PIVKA-IIの産生は逆に減少あるいは消失することになることを証明した。これらのことより、PIVKA-IIは単なる肝癌腫瘍マーカーではなく、肝癌のphenotypeを示すマーカーとして臨床的に有用であると論じた。(2)それらの細胞がEMTをおこしているかの確認としてwestern blottingおよび蛍光免疫染色を行ったところ、両細胞はTPAおよびTGF-bにてE-cadherinの発現低下を認め、さらにE-cadherinの発現が低下した細胞がPIVKA-IIを産生していた。(3)臨床上、血清PIVKA-II値が高値を示す肝癌患者に対しビタミンK2製剤を投与すると血清PIVKA-IIの値が低下することから肝癌はPIVKA-IIを積極的に産生しているのではなくビタミンKの機能的取り込み障害により産生されるとの仮説を立てた。標識ビタミンKは市販されていないので(脂溶性であるビタミンKはLDL receptorを介して肝に取り込まれることから)標識LDLを用いて取り込み実験を行った。TPAまたはTGF-β処理肝細胞株は標識LDLの取り込みが低下しており、取り込みが低下した細胞でPIVKA-IIの産生を認めた。(4)さらに脂質の取り込みにはclathrin-mediated endocytosis (CME)が重要であるがCMEにおいてアクチンが重要である。そこでアクチンを処理前後で調べると処理細胞ではアクチンのrearrangementが起こり、その細胞でPIVKA-IIの産生を認めた。これらの結果からEMT時におけるactin rearrangementによりCMEが障害される結果、PIVKA-IIが産生されると考えられた。(1)肝癌細胞株(HepG2, PLC/PRF/5)を化学的にepithelialmesenchymal transition(EMT)を誘導することによって、PIVKA-IIを産生するphenotypeに変化することを証明した。そのPIVKA-II産生の機序としてphenotypic changeによってアクチン線維の断裂が起こりアクチンの働きが必要とされるビタミンKの取り込みが低下することを蛍光免疫染色、Western blottingにより証明した。さらにアクチン重合阻害剤の投与によりPIVKA-II産生が誘導されることを確認した。さらに臨床検体でもEMTが誘導された肝細胞癌にてPIVKA-IIが産生されていることを免疫化学染色で確認した。(2)これらの結果からEMT時におけるactin rearrangementによりビタミンKの肝癌細胞内への取り込みが障害された結果、PIVKA-IIは産生されると考えられた。(3)肝細胞癌は、腫瘍増大に伴い容易に低酸素状態に曝されると考えられるため、低酸素下に肝癌細胞株を培養するとEMTが誘導され、PIVKA-IIが産生された。低酸素下における肝細胞癌によるPIVKA-II産生機序も化学的にEMTを誘導した場合と同様であった。さらに臨床的に肝動脈塞栓療法のように肝細胞癌が低酸素かつ低栄養に曝された場合を想定し、同条件下で肝細胞癌株を培養するとPIVKA-II産生は逆に低下した。その機序として癌は生存に不利な条件下では蛋白合成を低下させることが原因と考えられた。肝癌細胞を化学的、または虚血刺激(一般にEMTを誘導するとの報告がある)によりepithelial mesenchymal transition (EMT)を誘導すると細胞内のアクチン線維の重合障害がおこり、アクチンが重要な働きをするclathrin-mediated endocytosisが障害される。

そのために肝癌細胞がEMTを起こすと細胞内にビタミンKを取り込めなくなり、PIVKA-IIを産生する。さらにEMTが進行すると上皮性細胞は間葉性の性質を持つようになり上皮性としての性質を失う。その過程において肝癌細胞が持つアルブミン産生能も低下もしくは廃絶することになる。本年度の研究はこのことを証明するために虚血および低栄養下で肝癌細胞株を培養した。予想どおり同条件下では蛋白合成能は低下すること、およびPIVKA-IIの産生が低下あるいは消失することを証明した。また、同機序にはmammalian target of rapamycin (mTOR)を介していることも証明した。さらに肝癌手術切除標本を用いて間葉性細胞に発現するvimentinと尿素サイクル酵素であるHep Par1、PIVKA-II、リン酸化mTORを連続切片にて染色したところ、vimentin陽性肝癌細胞では、Hep Par 1、PIVKA-IIは染色されず、さらにリン酸化mTORも染色不良であった。このことはin vitroの実験に合致する。今回の検討により肝癌細胞は生育環境が不良な状態ではEMTを起こし、その過程においてアクチンの断裂が起こりビタミンKの取り込みが不良となることからPIVKA-IIを産生するphenotypeに変化する。さらに生育に不利な条件下では、蛋白合成機能も低下する結果、PIVKA-IIも産生出来なくなる。このようにPIVKA-IIは単なる腫瘍マーカーであるばかりでなく腫瘍のEMTマーカーとしても臨床的に有用と考えられた。
ハプトグロビン特異的DNAの多型性.検出とその法医学的応用およびHp^o型との関連

(4)non-RI検出法本probeを用い、Behringerのanti-digによる、P発色検出法と、Amershamのluminol反応検出の2法が良い成績を示した。特異性・コストは前者が時間的には後者が優れていた。(5)Hp^o型ヒト血清3,800検体についてsingle immuno difusionとPAGEでHpが検出不能(従来Hp^o型としていた)の16例について、Hp probeと前記8種の制限酵素で検討した。1例を除いた全てで正常検体と同様に判定が可能であった。例外の1例はいずれの酵素を用いても反応せず、遺伝子欠損が考えられた。(6)今後の展開(2)については、タンパクレベルでのvariantとDNAの相関について更に検討と進めたい。については、Hp遺伝子欠損は未だ報告がなく、家族調査、クロモゾ-ムでの欠損、DNAレベルでの欠損の場所・長さの検討などを計画している。
漢帝国における武器生産と手工業の展開に関する考古学的研究

本研究の目的は、矢を機械的に発射する射撃具として開発された「弩」の分析を通じて、漢帝国の形成や発展に深く関わった武器生産や官営手工業の実態を解明することである。弩弓に装着された「骨簽(こっせん)」と矢の発射装置である青銅製の「弩機」に刻まれた銘文内容の分析や、製品規格の統一化に関する検証を通じて、漢帝国の中央政府が整備した厳格な武器生産・管理制度の存在を証明した。また、当時武器や器物生産を担った官営工房「工官」の組織体制が複雑化していく過程についても明らかにした。本研究の目的は、矢を機械的に発射する射撃具として開発された「弩」の分析を通じて、漢帝国の形成や発展に深く関わった武器生産や官営手工業の実態を解明することにある。研究代表者が目的を達成するために取り組む調査研究は、以下の4点にまとめられる。1、資料調査を実施して基礎データの蓄積をはかり、矢の発射装置である青銅製「弩機」の規格の統一化について検証する。2、弩を構成する弩機と「骨簽(こっせん)」に刻まれた銘文の内容を整理し、弩の製作に関わった官営工房「工官」の組織体制の実態とその変遷を明らかにする。3、「居延漢簡」等の簡牘に見える弩や工官に関する記述を抽出し、弩の銘文内容と比較する。4、弩とは異なる工官で製作された「漆器」の銘文と比較し、弩の生産組織の実態を相対化させる。本年度は2、3、4の課題に取り組んだ。課題2については、弩機に刻まれた銘文を集成するため、台湾の故宮博物院国書文献館に出張した。国書文献館では、研究代表者がこれまで国内で入手することができなかった文献を中心に閲覧し、必要な箇所を複写した。3については、台湾の中央研究院が公開する漢籍や出土簡牘のデータベースを利用し、弩や工官名が記された箇所を抽出・整理した。また、中央研究院歴史語言研究所の歴史文物陳列館にも赴き、研究所が所蔵する簡牘や銘文が刻記された弩矢などを見学した。4については、モンゴル科学アカデミー考古学研究所およびモンゴル国立博物館において、漆器の観察・記録作業を行った。また、紀年銘漆器の集成も行い、分布状況や銘文の内容について整理した。なお、これまでの研究成果については学会発表(第9回東京大学駒場キャンパス技術発表会、日本中国考古学会2013年度大会)、雑誌論文(『環日本海研究年報』第23号)などを通じて発信した。目的を達成するために取り組む調査研究は、以下の4点にまとめられる。1)資料調査を実施して基礎データの蓄積をはかり、矢の発射装置である「弩機」の規格の統一化について検証する。2)弩を構成する弩機と「骨簽(こっせん)」に刻記された銘文の内容を整理し、弩の製作に関わった官営工房「工官」の組織体制の実態と変遷を明らかにする。3)「居延漢簡」等の簡牘に見える弩や工官に関する記述を抽出し、弩の銘文内容と比較する。4)弩とは異なる工官で製作された「漆器」の銘文と比較し、弩の生産組織の実態を相対化させる。初年度は主として1)の課題に取り組んだ。漢代の武器生産や手工業に関わる資料を広く収集するとともに、国内外の研究機関において資料調査を実施した。東京大学駒場博物館では、朝鮮半島の伝楽浪郡出土とされる弩の実見・記録を行った。財団法人東洋文庫では、「梅原末治考古資料」の目録をもとに、楽浪郡の漢墓から出土した弩および青銅鏃の図面・写真・調査記録などを収集した。また、モンゴルでは科学アカデミー考古研究所が所蔵する漢代の弩機、鏃の調査を実施した。考古研究所では紀年や製作者名が刻まれた漆器も実見し、4)の課題に関わる予備的成果を得ることができた。これまでの研究成果については、2013年3月8日北京大学中国古代史研究中心の学術講座において、「関于漢長安城出土的骨簽与弩機考察」として発表した。あわせて中国の研究者と意見交換を行い、工官や器物生産に関わる問題について新たな知見を得た。2、弩を構成する弩機と骨簽(こっせん)に刻まれた銘文の内容を整理し、弩の製作に関わった官営工房「工官」の組織体制の実態とその変遷を明らかにする。平成26年度は主に2と4の課題に取り組んだ。

課題2については、台湾の故宮博物院図書文献館等に出張し、銘文の刻まれた弩機の拓本等を収録した文献を閲覧、複写した。さらに、漢帝国における武器生産体制の特徴を明確にするため、漢代以前(戦国時代から秦代)、漢代以降(魏晋時代)の銘文武器に関する文献についても収集を行った。課題4については、モンゴル科学アカデミー考古学研究所の協力を得て、近年新たに発掘された紀年銘漆器の観察・記録作業を行った。また、これまで集成した紀年銘漆器の銘文を整理し、弩機と骨簽の銘文と比較するためのデータを整えた。なお、これまでの研究成果については2015年3月10日の香港中文大学での招待講演において、「漢代武器生産的相関問題(漢代の武器生産に関する一考察)」として発表した。あわせて、香港の研究者と意見交換を行い、漢代の手工業に関わる問題について新たな知見を得たほか、中国・香港での研究成果の公開方法に関して助言をいただいた。本研究の目的は、矢を機械的に発射する射撃具として開発された「弩」の分析を通じて、漢帝国の形成や発展に深く関わった武器生産や官営手工業の実態を解明することにある。研究代表者が目的を達成するために取り組んだ課題は、以下の4点にまとめられる。1、資料調査を実施して基礎データの蓄積をはかり、矢の発射装置である青銅製「弩機」の規格の統一化について検証する。2、弩を構成する弩機と骨簽(こっせん)に刻まれた銘文の内容を整理し、弩の製作に関わった官営工房「工官」の組織体制の実態とその変遷を明らかにする。3、「居延漢簡」等の簡牘に見える弩や工官に関する記述を抽出し、弩の銘文内容と比較する。4、弩とは異なる工官で製作されていた「漆器」の銘文と比較し、弩の生産組織の実態を相対化させる。研究最終年度にあたる平成27年度は、前年度までの資料調査や文献収集によって得られたデータを整理・統合し、研究の取りまとめを行った。これまでの研究成果については、2015年10月16日中国人民大学で開催された国際学会において「漢代官営漆器生産的相関問題-以蒙古国諾音烏拉墓葬出土漆器為中心-(漢代官営漆器生産に関する一考察-モンゴル国ノイン・ウラ遺跡出土漆器を中心として-)」として報告したほか、2016年2月27日石川県立歴史博物館の北アジア調査研究報告会では「北東アジアの複合弓-モンゴル匈奴墓出土資料を中心として-」として発表した。今後は学会発表の内容等をもとに、中国語および英語による論文の執筆・投稿を予定している。本研究の目的は、矢を機械的に発射する射撃具として開発された「弩」の分析を通じて、漢帝国の形成や発展に深く関わった武器生産や官営手工業の実態を解明することである。弩弓に装着された「骨簽(こっせん)」と矢の発射装置である青銅製の「弩機」に刻まれた銘文内容の分析や、製品規格の統一化に関する検証を通じて、漢帝国の中央政府が整備した厳格な武器生産・管理制度の存在を証明した。また、当時武器や器物生産を担った官営工房「工官」の組織体制が複雑化していく過程についても明らかにした。本年度は主に、国内外の研究機関での資料調査のほか、これまでに収集した資料の整理・比較検討を行った。台湾とモンゴルでは当初の予想よりも多くの資料が見つかり、本研究の目的である漢帝国の手工業組織の実態解明に関わる重要な情報を入手することができた。また、これまでの研究成果については、香港中文大学での招待講演等を通じて発信し、一定の評価を得ることができた。よって現在までのところ、研究代表者の研究はおおむね順調に進展していると言える。人文学本研究の期間は、平成24年度27年度である。次年度が本研究の最終年度にあたることから、これまでの資料調査や文献収集等によって得られたデータを統合し、本研究の目的である漢帝国における武器・器物生産や官営手工業の実態解明を目指す。
イヌのアトピー性皮膚炎に対するイヌキメラ抗IgE抗体を用いた新規治療法の開発

イヌのアトピー性皮膚炎に対する新規治療法を開発する目的としてイヌIgEと肥満細胞の結合を阻害する抗イヌIgE抗体の作製を試みた。イヌIgEの肥満細胞結合部位の遺伝子組み換え体を免疫源として10クローンのモノクローナル抗体を作製した。これらの抗体は肥満細胞とIgEの結合およびアレルゲン介在性の脱顆粒を阻止できなかった。平成20年度に得られた研究成果は以下の通りである。1.マウス由来抗イヌIgE抗体の作製:イヌIgE CH3領域のリコンビナント蛋白を免疫原としてモノクローナル抗体を作製したところ、それぞれ反応性の異なる抗イヌIgEモノクローナル抗体を10クローン得ることができた。これらすべての抗体はイヌIgE産生ハイブリドーマから得られたIgEに対して交差性を示した。2.作製した抗イヌIgE抗体のエピトープマッピング:イヌIgE CH3領域を網羅する、それぞれ15残基からなるオーバーラッピングペプチドを合成し、作製した抗イヌIgEモノクローナル抗体のエピトープを決定した。その結果、CH3領域のうちIgE受容体との結合に重要と考えられている領域をエピトープとするモノクローナル抗体が3クローン含まれていることが明らかとなった。3.カセットベクターの作製:正常イヌ由来脾臓cDNAライブラリーより、PCRによってIgGの重鎖および軽鎖の定常領域をクローニングし、それぞれをIRES(Internal Ribosome Entry Site)により二つの遺伝子を同時に同程度発現できる哺乳類発現ベクターpCAGS-neo-IRESに組み込み、イヌキメラ抗体発現用カセットベクターを作製した。4.抗体スクリーニング系の確立:作製した抗体のIgE結合阻止能評価のためのスクリーニング系の確立をイヌ肥満細胞腫由来の株化細胞を用いて試みたが、未だ確立に至っていない。次年度は由来の異なる株化細胞を用いて評価系を確立する予定である。平成21年度に得られた研究成果は以下の通りである。1.抗体スクリーニング系の確立:作製した抗体のIgE結合阻止能評価のためのスクリーニング系をイヌ肥満細胞腫由来の株化細胞を用いて確立した。2.イヌIgEとFceRIの結合阻害能の評価:ハウスダストマイト抗原によって感作させたイヌより得たIgEを高濃度に含む血清を用いて、昨年度に作製したモノクローナル抗体によるIgE-FceRI結合阻害能を評価した。その結果、評価した4クローンのマウス由来抗イヌIgEモノクローナル抗体は、いかなる抗体濃度(5,10,20,40,80,100mg/ml)においてもイヌ血清中に含まれるIgEとFceR Iの結合を阻害することができなかった。3.イヌIgEとマウス由来抗イヌIgEモノクローナル抗体結合能の評価:イヌIgEとFceRIの結合を阻害できなかった原因を明らかにするため、イヌIgEに対するモノクローナル抗体の結合の有無について再検証した。その結果、モノクローナル抗体はイヌIgEと複合体を形成しながらFceRIに結合していることが明らかとなった。4.イヌのキメラ抗体発現系の確立:イヌkappa軽鎖またはlamda鎖の定常部領域およびイヌ重鎖IgG-A、IgG-BまたはIgG-Cの定常部領域のそれぞれの組み合わせをIRES(internal ribosomal entry site)の上流および下流に挿入した哺乳類発現ベクター(CAT7neoベクター)を構築し、これらのベクターが293T細胞において抗体発現することを確認した。平成22年度に得られた研究結果は以下の通りである。1.新規マウス由来抗イヌIgE抗体の作製:これまでと同様な方法を用いて、新規のモノクローナル抗体を2クローン(CCH3-4、CCH3-15)作製し、肥満細胞に対するイヌIgEの結合阻害能を評価した。その結果、これらの抗体はいかなる濃度においてもイヌIgEと肥満細胞の結合を阻害しないことが明らかとなった。2.ラット由来抗イヌIgE抗体の作製:イヌIgEのCH3領域のリコンビナント蛋白または同領域をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクター(pCAGGS)を用いてラットを免疫し、4クローン(CCH3-21、CCH3-22、X-1、X-2)のモノクローナル抗体を作製した。これらのモノクローナル抗体によるイヌIgEと肥満細胞の結合阻害能を評価したが、いかなる濃度においても有意な阻害効果は認められなかった。3.肥満細胞における脱顆粒抑制効果の評価:昨年度に作製した抗イヌIgEモノクローナル抗体のうちイヌIgEおよびFceRIと複合体を形成したクローン(CCH3-5)を用いて、肥満細胞の脱顆粒抑制効果を評価した。モノクローナル抗体-Derf2特異的IgE複合体またはDerf2特異的IgEの存在下で肥満細胞を12時間培養した後、遺伝子組み換え型Derf2を添加し脱顆粒を誘起した。脱顆粒はβ-hexosaminidase assayによって定量化したが、モノクローナル抗体-Derf2特異的IgE複合体による有意な阻害効果は認められなかった。
アセチルコリンニコチンα7受容体をターゲットとした新規潰瘍性大腸炎治療薬の検討

潰瘍性大腸炎(UC)は活動期と緩解期を繰り返す難治性の病気であり、特定疾患に指定されている。また、現在の治療薬では根治は難しく、新規治療薬の開発が望まれている。一方、マクロファージに存在するアセチルコリンニコチンα7受容体(α7nAChR)の刺激を介した抗炎症作用機序(Nature,2003)が発見され、α7nAChR作動薬は新しいタイプのUC治療薬になると考えられるが、詳細な検討は行われていない。そこで本研究では、既に安全性が確認されている既存薬に着目し、新規UC治療薬の探索を行った。文献調査より、抗悪性腫瘍薬使用時に用いる制吐剤であるトロピセトロンにα7nAChR刺激作用があることが報告されていた(Bioorg.Med.Chem.Lett.,2001)。そこで我々は、UCの代表的な実験動物モデルであるデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)腸炎モデルを用いてトロピセトロンの腸炎抑制効果を検討した。5週齢の雄性マウスに5%DSSを7日間自由飲水させることによりDSS腸炎が惹起され、下痢・血便のスコアの上昇、大腸の長さの短縮、ミエロペルオキシダーゼ活性の増加が起こった。我々は、同時にトロピセトロン0.5-2mg/kgを1日1回腹腔内投与することにより、これら全ての指標が抑制されることを見出した。また、H&E染色により組織学的に腸炎抑制効果を確認したところ、トロピセトロンの投与によりDSS腸炎で起こる腸粘膜の傷害は軽減されていた。これらのことから、トロピセトロンの新規UC治療薬としての可能性が示唆された。臨床では様々なUC治療薬が使用されるが、ステロイド剤による糖尿病や骨粗鬆症、インフリキシマブのinfusion reactionなど副作用の観点からも様々な問題が残されている。このような背景からも本研究が安全性の高い新規UC治療薬開発の一助となることを期待している。
深海底熱水活動域が育む微生物共生系：第三の分子生物学で紐解く生物間相互作用

本研究の目的は、深海底熱水活動域において共生関係にある化学合成微生物ー大型生物間の相互作用を、世界で初めて第三の分子生物学(=グライコミクス)の観点から解明することにある。具体的には、微生物の『糖鎖と修飾タンパク質の組み合わせが、特定生物間の共生を成立させる分子基盤である』という独自の仮説を検証するため、申請者が深海微生物に見いだしてきた(1)特異糖鎖の生合成経路(糖鎖関連遺伝子の発現様式・破壊実験・酵素化学的性状)、(2)糖鎖修飾タンパク質の機能・修飾様式(糖タンパク質のプロテオーム)を、細胞外共生系および細胞内共生系のそれぞれにおいて解析する。本研究は深海底における異種生物間の分子的コミュニケーション手段の研究を通じて、人類に蔓延する病原性微生物の誕生過程の解明、さらには共生(感染)メカニズムを標的とした革新的治療法の開発に益することを目指している。平成30年度は、深海底熱水活動域に固有の化学合成微生物群が有する糖鎖関連遺伝子群の機能解析を進めた。具体的には、これまで申請者らが実施した調査航海において、インド洋中央海嶺等から採取した巻貝を主要な解析対象とし(特にアルビンガイと呼ばれる巻貝。本共生系では、既に主要共生微生物系統群に近縁な微生物の分離培養・性状決定・ゲノム解析に成功しているためである)、共生微生物と分離培養株を比較しながら、主に(a)メタゲノム解析による糖鎖関連遺伝子群の同定、(b)糖鎖関連酵素の発現・精製、(c)糖鎖関連酵素の性状解析を実施した。(b)において、大腸菌の形質転換および発現誘導・精製が想定より困難であったが、これまでに当面の性状解析に足る量の糖鎖関連酵素群を取得することに成功している。なお、以上に関連する成果の一部は複数の学会や国際誌等で報告した。生態学的に重要かつ産業的応用へのポテンシャルも高い新規糖鎖関連酵素群を取得することに成功し、性状を解析している。これらは今後種々の解析において基盤的役割を果たすとともに、当初想定していなかった新しい研究展開を可能とするものである。本年度は、前年度解析した細胞内共生系(インド洋の熱水活動域等から採取したアルビンガイと呼ばれる巻貝を対象とする。本共生系では、既にイプシロンプロテオバクテリアと呼ばれる主要共生微生物系統群に近縁な微生物の分離培養・性状決定・全ゲノム解析に成功しているためである)を主要な解析対象とする。本細胞内共生系を対象として、以下1および2を実施し、糖鎖修飾タンパク質の機能解明を目指す。1.糖鎖修飾タンパク質の機能・局在性の同定化学合成共生微生物において糖鎖修飾をうけているタンパク質の機能を網羅的に同定するため、試料から分画・調整した細胞内共生微生物および近縁の培養株からタンパク質を調整する。調整したタンパク質をそのまま用いるグライコプロテオーム解析が困難な場合は、必要に応じて2次元電気泳動で個々のタンパク質を分離する。シッフ反応により全糖鎖を染色し、各スポットをペプチドマスフィンガープリンティング(PMF)法に供する(機能・局在性の同定に必要なゲノム情報はこれまでの研究で取得することに成功している)。近縁病原菌であるCampylobacterでは同様の手法により、多数の糖タンパク質が既に同定されているため、本解析で得られる結果と比較することが可能である。2.タンパク質の糖鎖修飾部位の同定2-a.糖鎖修飾部位の決定: 1.で調整した糖鎖修飾タンパク質における糖鎖修飾部位(どのアミノ酸に結合しているか、また特定のアミノ酸配列があるか)を、必要に応じて安定同位体による標識技術(IGOT法)により決定する。2-b.個別タンパク質の糖鎖の構造解析: 2-a.において各タンパク質から切り出した糖鎖を精製・ラベル化し、CE-MS等の質量分析器を用いて構造解析する。なお糖鎖の切り出しにはヒドラジン分解法を用い、プロナーゼ分解法等も併用する。平成28年度は、深海底熱水活動域に固有の化学合成微生物群が有する糖鎖関連遺伝子群の機能解析を進めた。平成27年度に実施した調査航海において、中部沖縄トラフに位置する深海底熱水活動域(水深は約1000m、噴出熱水の最高温度は311度)から採取し飼育中の甲殻類(ゴエモンコシオリエビと呼ばれる。腹部剛毛に莫大な付着共生微生物を有する)を主要な解析対象とし、主に(a)メタゲノム解析による糖鎖関連遺伝子群の同定、(b)糖鎖関連酵素の発現・精製、(c)糖鎖関連酵素の性状解析を実施した。