hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯・歯周組織再生促進薬の開発

本研究では,ポリリン酸による歯と歯周組織の再生促進作用を検討し,新薬の開発に寄与することを目的とした研究を行い、ポリリン酸により,(1)In vitroでの検討での基質石灰化および骨形成マーカー遺伝子の発現の促進と,アルカリホスファターゼ活性の誘導,(2)ビーグル犬を用いたIn vivoでの検討での骨再生誘導,(3)臨床実験での歯周疾患の症状の改善と,歯槽骨の形成が認められた.以上より、ポリリン酸は骨形成を促進し,また歯・歯周組織再生促進薬としての効果が期待できることが示唆された.本研究では,ポリリン酸による歯と歯周組織の再生促進作用を検討し,新薬の開発に寄与することを目的とした研究を行い、ポリリン酸により,(1)In vitroでの検討での基質石灰化および骨形成マーカー遺伝子の発現の促進と,アルカリホスファターゼ活性の誘導,(2)ビーグル犬を用いたIn vivoでの検討での骨再生誘導,(3)臨床実験での歯周疾患の症状の改善と,歯槽骨の形成が認められた.以上より、ポリリン酸は骨形成を促進し,また歯・歯周組織再生促進薬としての効果が期待できることが示唆された.ポリリン酸による歯・歯周組織再生促進メカニズムを明らかにすることを目的とし,本年度は,ポリリン酸の骨芽細胞と破骨細胞への作用およびポリリン応答遺伝子の解明に用いる細胞の選択と処理条件の決定を行った.Balb/cマウスより採取した頭蓋冠骨芽細胞を採取し分割ポリリン酸を02mM(添加可能な濃度)で添加し,細胞増殖(MTSおよびMTT assay)能を検討した。さらに前駆細胞の成熟細胞への分化についてosteocalcin(OC), alkaline phosphatase(ALP), Type I collagen, receptor activator of NF-κB(RANKL)の発現を検討し、アリザリンレッド染色を用いて石灰化物形成能を検討した.破骨細胞は,骨髄細胞と頭蓋冠骨芽細胞の共存培養系で象牙質片上の吸収窩形成実験(pit formation assay)を行った。また、研究条件を検討するために、カルシウムチャネルのひとつであるATP-bindingcassette transporterのmultidrugresistance gene 1の遺伝子発現を骨芽細胞と破骨細胞で検討した.その結果、破骨細胞は、コラーゲンゲル上から播種した時点からアポトーシスが生じる可能性があること、さらに、骨芽細胞前駆細胞はポリリン酸によって成熟骨芽細胞に分化する傾向がみられるとともに、アポトーシスによって選択されている可能性が考えられた。以上の結果から、骨芽細胞および破骨細胞に対するポリリン酸の作用を検討する場合には、アポトーシス関連遺伝子を含むDNAマイクロアレイを行う必要性が示唆された。今後はDNAアレイを行いポリリン酸による遺伝子の挙動を検討する予定である。ポリリン酸による歯・歯周組織再生促進メカニズムを明らかにすることを目的とし、ポリリン酸の骨芽細胞,破骨細胞、歯髄細胞、歯根膜細胞への作用の検討と発現型DNAマイクロアレイを用いた遺伝子発現の解析を行った。ヒトおよびBalb/cマウスより採取した組織より各細胞を組織培養したところ、組織周囲から細胞のoutgrowthがみられ、これらの細胞を分化誘導培地でさらに培養した。分割ポリリン酸を02mMで添加し、細胞増殖(MTSおよびMTT assay)を検討したところ、1mMポリリン酸が最も細胞増殖率が高かった。成熟細胞への分化では、骨芽細胞は,0.1mMデキサメタゾン,0.05mMアスコルビン酸,10mMβ-グリセロフォスフェイトを含むMSC培地を用いて培養したところ、骨芽細胞は、osteocalcin(OC)、alkaline phosphatase(ALP)、Type I collagen, receptor activator of NF-κB(RANKL)の発現が亢進した。また、アリザリンレッド染色を施行したところ、石灰化物が同定された。破骨細胞を骨髄細胞と頭蓋骨骨芽細胞の共存培養系で誘導し活性型vitamin D3、Prostaglandin E2などの骨吸収因子を添加して培養し、さらにポリリン酸を添加して培養したところ、象牙質片上の吸収窩形成実験(pit formation)が減少した。歯髄細胞においても0.1mMデキサメタゾン、0.05mMアスコルビン酸、10mMβ-グリセロフォスフェイトを添加してDMEM培地を用いて培養すると石灰化物の形成がみられた。歯根膜細胞ではType I collagenのmRNAの発現が亢進した。ポリリン酸の存在によるこれら遺伝子の挙動をDNAマイクロアレイを用いて検討したところ、細胞増殖シグナルの変動が明らかとなった。これらの結果は、ポリリン酸が細胞増殖と分化に影響を与えることを示しており、新たな歯周組織再生促進薬としての可能性を示唆している。ポリリン酸の骨芽細胞、歯根膜細胞、軟骨前駆細胞を用いたin vitro実験系、ビーグル犬を用いたin vivo実験系を用いた石灰化、骨形成誘導能の検討を行った。骨芽細胞における石灰化促進作用は以前にも報告したが、本年は内軟骨性骨化モデルを研究の対象に加え、ポリリン酸の石灰化機構への関わりをより深く調べ、骨再生への応用の可能性を検討した。その結果、以下の点について明らかとされた。1)ポリリン酸により,In vitroでの骨芽細胞前駆細胞を用いた検討では,基質石灰化が促進する。2)ポリリン酸は,骨芽細胞前駆細胞の骨形成マーカー遺伝子の発現を促進し,アルカリホスファターゼ活性を亢進させる.

3)ポリリン酸により,アルカリホスファターゼの他,ポリリン酸をリン酸,リン酸オリゴマーに分解するポリホスファターゼ活性が誘導される.3)ビーグル犬を用いたIn vivoでの検討では,ポリリン酸により,臼歯部に人為的に作成した骨欠損における骨再生が誘導された.また、臨床実験では,ポリリン酸を定期的に歯周ポケットに局所投与した患者において,歯周疾患の症状の改善と,歯槽骨の形成が認められたことから、この結果を論文にまとめ、雑誌掲載に至った。
公共サービス供給における市民セクターとの協力に関する研究

本研究者は目韓地方政府の公共サービス供給における生産性測定に関する理論的基礎、すなわち理論の背景、概念、類型を考察し、日韓両国で試行されている公共サービスの類型と特徴を調べており、公共サービスの提供における市民セクターとの協力に成功している地方政府の生産性を他の地方政府と計量的に分析するため、計量分析モデルを作っている。採用期間中、受入研究者及び学生たちと共に毎週定期的なディスカッションに参加しているし、関連カンファレンスに参加して研究に有用な情報と助言を受けた。また、本研究のフレームワークの確立のため、ガバナンスに関する文献及び計量分析に関する文献を分析したし、関連資料の収集のために官庁及びNPOを訪問した。採用期間中の耕究実績としては地方政府の生産性分析に関する理論と実際応用の整理した著書を出版して(地方政府生産性測定の理論と実際(共著)、2003。ソウル:集文堂)、フレームワークになるガバナンスの埋論に関する著書も一冊今年出版予定である。(行政学研究入門(共著)、2004。ソウル:大栄文化社。)専門学術誌に発表した論文としては、地方政府のサービス提供の比較分析の'英米の住宅政策に関する歴史制度主義的アプローチ'、市民セクターとの協力のよる生産の'公共サービス生産の新しい可能性:NGOを中心に'などがあり、それからいくつかの論文('日本の特殊法人改革に関する研究''新公共管理論と地方経営など)が載せられる予定である。この研究は公共サービスの提供においてNPOなどの市民セクターによる公共サービス供給、いわゆる市民セクターの協力に関する研究である。公共サービスの生産者がもはや政府に限られるのではなく、住民または住民組織の持っている提供者としての役割を再認識する点から出発している。まだ研究を始めて3ヶ月くらいなので、本研究の最初の段階として、文献研究を通して日本と韓国で部分的に行われている公共サービス供給における市民セクターとの協力に関する理論的基礎、すなわち登場背景、概念、類型を考察している。また、日韓両国で試行されている公共サービスの市民セクターとの協力の事例を通じて、地方政府の効率向上のための代案としての可能性を模索している。今まで、公共サービス供給における市民セクターとの協力については、その効果性を実証的に検証した研究がまだ十分に展開されていない。公共サービス供給を政府自身が独占的に行う場合と、市民セクターとの協力を図る場合のどちらが効率性が高いのか、市民セクターとの協力が地方政府の公共サービス供給に与える生産性上の影響はどのくらいのか、また地方政府と市民セクターとの協力体制に影響を受ける主要変数等を考察している。ソウル:大栄文化社。
知識工学を用いた書道・CAIシステムに関する基礎的研究

本研究では書家と同等の指導能力を有した書道CAIシステムの構築を目的とし、以下に述べる成果を得た。1.教材知識の記述書道CAIシステムにおいて、学習者の文字の問題点を正しく指摘するためには、美しく整った文字を書くための規則(書写規則)をシステムが蓄えている必要がある。本研究ではこの書写規則を記述するために、規則を構成する要素を抽出しその要素を組み合わせて規則を記述する手法を提案した。書家が学習者の文字を添削,指導の過程を観察すると、添削理由を説明するために用いる言葉に、複数文字について適応する表現要素が存在することが判明した。本研究ではこの要素を書写プリミティブと呼ぶ。本提案手法はこのプリミティブの組み合わせで書写規則を表現する。2.学習者モデルおよび指導戦略書写規則と学習者の文字から得られた規則を比較すると、学習者が知っている規則は、(1)手本文字にも学習者の文字にも存在する規則で学習者が正しく理解していると考えられる規則、(2)書写規則として存在しないが学習者の文字に存在する規則、(3)書写規則として存在するが学習者の文字には存在しない規則である。学習者モデルは(1)(3)の規則の集合関係で表す。効率のよい指導を行うためには、全ての規則を一度に学習するのではなく一部の規則に集中して訓練を行うのが良いとされている。本研究では、練習目標の設定,目標に沿った添削指導といった効率的な指導を行う指導戦略を先に述ベた学習モデルを用いて生成する手法を提案した。提案手法はまず学習者モデルより学習すベき書写規則、または誤っているために矯正すべき規則の集合を抽出し、教育的な観点から優先順位の高い規則を練習目標として設定する。さらにその練習目標を達成するために適切な練習文字を提示,添削し、教育を行う。本研究はコンピュ-タを用いた書写教育の機械化を目的としたもので、本年度の主たる研究成果を以下に要約する。1.書写ル-ルの定量化文字を美しく書くために必要な決まり(書写ル-ル)の中で非常に抽象的なル-ルについて定量化を行った。その結果文字の大きさに関する決まりは2次元での分散にあたる広がり量に視覚的補正を行った特徴量(改良型広がり量)および複雑度の特徴量に関係があることが分かった。これら特徴量を用いて文字の大きさを計算機を用いて正規化したところ、書家2名による主観評価の結果89.7%、84.0%と本手法が非常に有効であることが確認できた。さらに字行バランスをとる(文字を蛇行させずに真っ直ぐ並べる)決まりについては、従来文字の重心を用いるのが良いとされていた。しかし主観量は人の視覚系の影響を受けているとの観点から人の視覚モデル(側抑制モデル)を用いた手法を提案した。主観評価実験の結果81%の有効性を確認できた。2.毛筆文字添削システムの開発書写CAIを開発するためには、書道テキストに書かれた知識以外に書家が経験的に有している知識も必要となる。しかし、この様な知識は書家が悪い文字を添削しているときに無意識に用いられるため、書家にインタビュ-を行っても知識の抽出は困難である。したがって本研究では、書家に文字の修正を行ってもらいその修正動作の履歴から書家の持つ経験的な書写知識の抽出支援を行うことを目指し、毛筆文字添削システムの開発を行った。本システムの特徴は書家の添削過程をモデル化しており、書家の次の添削動作を予測しながら添削メニュ-を表示する。そのため書家の思考を中断させずに円滑な添削動作が可能となる。

また本システムは書写CAIにおいて学習者が書写規則を学習したかどうかの確認のための悪い文字に対する添削実習にも用いることができる。本研究では書家と同等の指導能力を有した書道CAIシステムの構築を目的とし、本年度は以下に述べる成果を得た。<1.教材知識の記述>___ー書道CAIシステムにおいて、学習法の文字の問題点を正しく指摘するためには、美しく整った文字を書くための規則(書写規則)をシステムが蓄えている必要がある。本研究ではこの書写規則を記述するために、規則を構成する要素を抽出しその要素を組み合わせて規則を記述する手法を提案した。本研究ではこの要素を書写プリミティブと呼ぶ。このプリミティブにはストロ-ク間の関係で角度,位置,長さ,間隔,接続関係,曲がりの6種類を用いる。<2.学習者モデルおよび指導戦略>___ー学習モデルは学習者の理解の状態を表し、システムが助言を与えたり、次の課題を与える戦略を生成するときに用いられる。書写規則と学習者の文字から得られた規則を比較すると、(1)手本文字にも学習者の文字にも存在する規則で学習者が正しく理解していると考えられる規則、(2)書写規則として存在しないが学習者の文字に存在する規則、(3)書写規則として存在するが学習者の文字には存在しない規則である。学習者モデルは(1)(3)の規則の集合関係で表す。効率よい指導を行うためには、全ての規則を一度に学習するのではなく一部の規則に集中して訓練を行うのが良いとされている。本研究では、練習目標の設定,目標に沿った添削指導といった効率的な指導を行う指導戦略を先に述べた学習モデルを用いて生成する手法を提案した。
二酸化炭素のカルベン活性種を経由する触媒的固定化

金属触媒存在下、ジシランと二酸化炭素からのカルベン様活性種の創製について検討した。まず、ジシランのケイ素ーケイ素結合の切断が可能な金属のスクリーニングを検討した結果、Pd, Pt, Cuなどが適していることを見出した。続く二酸化炭素との反応による金屬カルベノイド生成に対して、配位子も含めた検討を行ったところ、カルベン配位子を有する触媒が適していることが判明した。実際に、スチレンとの反応において二酸化炭素を補足した化合物を得ることができた。昨年度に引き続き、目的とするカルベン様活性種の創製について、ケイ素ーケイ素結合切断に続く、二酸化炭素の挿入、転位を経て形成されるという反応設計に基づいて検討した。ケイ素ーケイ素結合の切断およびジシロキシカルベノイドの形成が可能な金属のスクリーニングを行った。その結果、予測したとおりに、Pd, Pt, Cuなどの金属がケイ素ーケイ素結合切断に適していることを見出した。これらの金属を中心に配位子も含めた検討を行ったところ、配位子としては、ケイ素の転位段階の生起のし易さとカルベン錯体が適しており、種々条件を精査したところ、昨年より効率が向上し、二酸化炭素を補足した化合物を得ることができた。ジシランはできるだけ汎用性の高いものとして鎖状を使用したいが、ケイ素ーケイ素結合切断を司る金属種によって使い分けが必要となる。Pdを適用する場合は環状の歪んだジシラン、Ptの場合は鎖状ジシランが適していることが判明した。カルベノイド錯体の単離に挑戦したが、かなり活性な錯体であり、その単離および結晶化には至らなかった。そこで、反応の系内で調製し、代表的なアルケンであるスチレンと反応させたところ、少量のシクロプロパン誘導体が生成していることを見出した。二酸化炭素の状態について最適条件を調べた。その結果、常圧で目的の反応が進行することが分かったが、効率がよくなかったので、圧力をかけたところ、その効率は倍増した金属触媒存在下、ジシランと二酸化炭素からのカルベン様活性種の創製について検討した。目的とするカルベン様活性種の創製は、ケイ素ーケイ素結合切断に続く、二酸化炭素の挿入、転位を経て形成されるという反応設計に基づいて検討した。これらの金属を中心に配位子も含めた検討を行ったところ、配位子としては、ケイ素の転位段階の生起のし易さとカルベン錯体が適しており、少量ではあるが二酸化炭素を補足した化合物を得ることができた。いずれにしてもカルベン錯体の金属の違いによる反応性に帰結されるので、それぞれフィードバックしながら基質と金属の選定を今後検討する必要がある。カルベノイド錯体の単離に挑戦したが、かなり活性な錯体であり、その単離および結晶化には現在のところ至っていない。今後グローブボックス等を駆使して、単結晶を作成し、X線結晶構造解析を検討する。常圧で目的の反応が進行することが分かったが、非常に効率がよくないので、今後圧力の効果を検討する。錯体の反応挙動について調べた。アルケン、ケトン、アルデヒドあるいはイミン等との反応を検討し、小員環合成を試みたが、未だ目的物質は得られていない。二酸化炭素を固定化してカルベンの発生の証拠をつかんではいないが、カルベン様に作用した反応生成物を少量ではあるが、得ることに成功している。この基礎的な知見は、今後の研究に大いに役立つ。触媒のスクリーニング法や配位子の選択法の迅速化を図り、研究を進展させる。以上の成果は、本研究の糸口をつかんだにすぎないが、かなりチャレンジングな研究課題であることから、自己的には満足している結果である。目的のカルベン様活性種の創製は、金属によるケイ素ーケイ素結合切断に続く、二酸化炭素の挿入、転位を経て形成されるという反応設計に基づいている。金属錯体の設計として、中心金属(Pd, Pt, Cuなど)とNHC配位子をさらに精査し、カルベノイド発生に必要なジシランの骨格との相関を明らかにする。カルベノイド生成を確認後、アルケン、ケトン、イミンあるいはヘテロ原子のα位やベンジル位との反応を検討し、付加価値の高い小員環化合物やCH活性化による炭素ー炭素結合形成反応に展開する。最終的には反応の触媒化を目指し、金属触媒の配位子を光学活なものを使用することによって、不斉合成をめざす。前年度の遅れを取り戻すべく、迅速な最適条件の探索を行い、効率的なカルベンの発生法を検討する。

前年度で得た知見を基盤とし、本系を触媒反応へと展開する。本反応は基本的に触媒化が可能である。そこで効率的な触媒反応サイクルの構築を行うとともに、様々な基質(アルケン、カルボニル化合物、イミンなどの不飽和化合物)へと応用し本反応の一般性を図る。また、前年度に得た最適配位子(P系、N系あるいはそれらの混合系)のキラル修飾を行い、本系を不斉合成へと展開する。例えば、反応基質としてカルボニル化合物を用いることにより不斉エポキシ化を、イミンを選択することにより、光学活性なアジリジンを合成する。さらに、このようにして得られたアジリジンに対してフッ化物イオンを作用せせることにより、光学活性名なアミノ酸へと誘導する。
母体の高血糖に起因する新生子のインスリン抵抗性発現をラクトフェリンで改善する

幼児期のインスリン抵抗性には母体の影響が大きく関与しており、妊娠期に肥満かつ高血糖の母体は出生した新生児のインスリン抵抗性発現の危険因子になることが報告されている。本研究ではラクトフェリン(bLF)がインクレチン分泌を介してインスリン放出を促進し、インスリン抵抗性の改善効果が期待できることに着目し、母ラットの妊娠期から新生子が成熟するまで高スクロース高コレステロール食を給餌することで、インスリン抵抗性モデルラットを作成し、ラクトフェリンによる改善効果の解析を試みた。【実験1】妊娠11日齢母ラットを高脂肪食(Fat:20.7%、スクロース:20.1%)給餌群(HF群)とコントロール食(Fat:1.9%、スクロース:16.4%)給餌群(Cont群)に分け、それらの子ラット(雌雄)にも離乳後に母親と同様の食餌を与えた後、生後7週齢でブドウ糖(2g/kg)経口耐糖能試験(OGTT)を行った。【実験2】別の妊娠ラットを用い、上記の2群に加えて、妊娠期から授乳期はCont食を給餌し、離乳後の子ラットにHF食を給餌(離乳後HF群)して、生後10週齢でOGTTを実施した。実験1の7週齢で実施したOGTTでは、雌では群間に差がないものの、雄ではHF群で血糖値の下降は遅延傾向にあった。また、肝臓重量はCont群で有意に重く、精巣周囲脂肪重量はHF群で有意に増加していた。これよりHF食の影響は雄において顕著に表れやすいと考えられた。実験2における離乳後HF群の体重はCont群と同様に推移したのに対し、HF群では55日齢以降に有意な増加を示した。10週齢で実施したOGTTでは、HF群と離乳後HF群の血糖曲線は類似していたが、離乳後HF群のグルコース投与後60分においてCont群に比較して有意な増加を認めた。妊娠期から母ラットに高脂肪食を給餌するケースと離乳後から高脂肪食を給餌して比較したところ、離乳後妊HF群の体重増加はCont群と同様であったことから、妊娠期から授乳期に母ラットが高脂肪食を摂取すると、子ラットの脂肪蓄積量が増加することが確認された。耐糖能試験ではHF群と離乳後HFはともにCont群よりも高血糖であり、一部で離乳後HF群の方が有意な高血糖を示したことから、妊娠期から授乳期の母ラットの高脂肪食摂取は子ラットの血糖調節機構に何らかの影響を及ぼすことが示唆された。以上より、当初の目的である子ラットの高血糖モデル作成がほぼ確立できたと判断した。初年度において確立した高血糖モデルラットから採取した膵臓、白色脂肪、褐色脂肪、肝臓、骨格筋等の組織について遺伝子発現解析を行い、インスリン受容体、GLUT4等の発現状況を検証することで、モデル動物の病態を詳細に把握する予定である。また、確立した10週齢の高血糖モデルラットにラクトフェリンを投与することで、高血糖改善効果の有無を検証する。さらに、高脂肪食を妊娠期から給餌して得られた新生子ラットに対し、生後5日から21日までラクトフェリンまたは生理食塩水を1日1回経口投与し、新生子期のラクトフェリン投与が成熟後の高血糖改善に寄与するか否かを検証する予定である。併せて、各種臓器の遺伝子発現解析を進め、ラクトフェリンの作用機序の解明を目指す。

妊娠期から母ラットに高脂肪食を給餌するケースと離乳後から高脂肪食を給餌して比較したところ、離乳後妊HF群の体重増加はCont群と同様であったことから、妊娠期から授乳期に母ラットが高脂肪食を摂取すると、子ラットの脂肪蓄積量が増加することが確認された。耐糖能試験ではHF群と離乳後HFはともにCont群よりも高血糖であり、一部で離乳後HF群の方が有意な高血糖を示したことから、妊娠期から授乳期の母ラットの高脂肪食摂取は子ラットの血糖調節機構に何らかの影響を及ぼすことが示唆された。以上より、当初の目的である子ラットの高血糖モデル作成がほぼ確立できたと判断した。初年度において確立した高血糖モデルラットから採取した膵臓、白色脂肪、褐色脂肪、肝臓、骨格筋等の組織について遺伝子発現解析を行い、インスリン受容体、GLUT4等の発現状況を検証することで、モデル動物の病態を詳細に把握する予定である。また、確立した10週齢の高血糖モデルラットにラクトフェリンを投与することで、高血糖改善効果の有無を検証する。さらに、高脂肪食を妊娠期から給餌して得られた新生子ラットに対し、生後5日から21日までラクトフェリンまたは生理食塩水を1日1回経口投与し、新生子期のラクトフェリン投与が成熟後の高血糖改善に寄与するか否かを検証する予定である。併せて、各種臓器の遺伝子発現解析を進め、ラクトフェリンの作用機序の解明を目指す。
眼球運動障害患者に対する視能訓練方法の開発

眼球運動を本研究費で購入したCCDカメラによりコンピュータに取り込み,画面上で任意の時間における眼球の位置,速度が数字としてでるようにソフトを改変した.輻輳不全患者が視能訓練によりどのように両眼視機能上あるいは眼球運動機能上の改善効果を得るか検討した.AC/A比は調節機能と輻輳機能の連関状態を示す指標だが,訓練前にAC/A比が正常であった患者ではわずかに増大するだけであったが,低値であった患者は増大(正常化)傾向が明らかであった.また訓練により輻輳近点は短く(正常化)なり,融像幅も増大(正常化)した.これらは輻輳不全にたいする視能訓練の有効性を示すデータと考えられた.しかし,自覚症状の上では複視や霧視を解消しやすくはなかったがそれを持続することはまだ不十分だと感じる患者もみられ訓練方法などを再検討する必要があると考えられる.輻輳機能と衝動性眼球運動との関連に関しては,輻輳振幅の増大と衝動性眼球運動の振幅量に比例関係になく,直接の連関は証明できなかった.今回は純粋な輻輳運動を要求する形の視標刺激に対して生じた眼球運動を検討対象としたのだが,衝動性眼球運動と輻輳運動を同時に要求するような刺激を検討して実験してみたいと考えている.外眼筋手術前後での眼球運動の変化についてはまだ症例数が少なく分析途中である.眼球運動を本研究費で購入したCCDカメラによりコンピュータに取り込み,画面上で任意の時間における眼球の位置,速度が数字としてでるようにソフトを改変した.輻輳不全患者が視能訓練によりどのように両眼視機能上あるいは眼球運動機能上の改善効果を得るか検討した.AC/A比は調節機能と輻輳機能の連関状態を示す指標だが,訓練前にAC/A比が正常であった患者ではわずかに増大するだけであったが,低値であった患者は増大(正常化)傾向が明らかであった.また訓練により輻輳近点は短く(正常化)なり,融像幅も増大(正常化)した.これらは輻輳不全にたいする視能訓練の有効性を示すデータと考えられた.しかし,自覚症状の上では複視や霧視を解消しやすくはなかったがそれを持続することはまだ不十分だと感じる患者もみられ訓練方法などを再検討する必要があると考えられる.輻輳機能と衝動性眼球運動との関連に関しては,輻輳振幅の増大と衝動性眼球運動の振幅量に比例関係になく,直接の連関は証明できなかった.今回は純粋な輻輳運動を要求する形の視標刺激に対して生じた眼球運動を検討対象としたのだが,衝動性眼球運動と輻輳運動を同時に要求するような刺激を検討して実験してみたいと考えている.外眼筋手術前後での眼球運動の変化についてはまだ症例数が少なく分析途中である.
認知症概念の変容・浸透が支援実践に及ぼす効果に関する社会学的研究

本年度は、昨年度に引き続き、近年の認知症概念の変化のあり様の一端について探求していくためにレビー小体型認知症をめぐる当事者、家族、支援者の活動に関してフィールドワークに基づくデータ収集を中心に研究を行った。2016年度より看護学研究者と共同で開始してきたレビー小体型認知症サポートネットワーク兵庫の活動を継続して行い、特に今年度は、レビー小体型認知症の本人と家族の講演とその準備としての訪問インタビューを行なった。このサポートネットワークの活動は、レビー小体型認知症の介護者や当事者、その支援に関するものたちが集まる会であり、今年度も3回の定例会を開催した。会において参加者に対する情報提供や参加者同士の話し合いの機会を設けるなどのサポート活動を行いながら、参加者への調査票調査のデータや公開の医師等の講演会における質疑応答のやり取りのデータを収集するというアクションリサーチを行ってきた。このフィールドで得たデータについて、2018年度は保健医療社会学会大会、家族問題研究学会シンポジウムで報告し、参加者から有益なアドバイスをもらった。これらの報告を元にして、論文を執筆し、2019年7月頃に刊行予定である。もう一つの課題である認知症概念の医療・介護領域外への拡張については、認知症当事者勉強会という、認知症に関する当事者を中心とした実践を推し進めるメンバーたちの勉強会で研究報告をしながら情報収集を行なっていった。また、日本保健医療社会学会で保健医療社会学と地域に関するシンポジウムでコメンテーターを務め、そこでの議論を踏まえて論文を執筆し、発表をした。さらに、現在の認知症をめぐる新しい実践の展開を踏まえて、以前に収集していたNHKの認知症に関するドキュメンタリー番組の記録に関するデータを再分析して、英語論文を執筆した。レビー小体型認知症に関するデータ収集は昨年度に引き続き進めることができたが、認知症をめぐる新しい諸実践に関しては、国内外で注目する活動が展開しているのに比して、十分にフィールドにアクセスしきれていない。海外での報告等も含めて、進展が遅れている。レビー小体型認知症サポートネットワークを中心とした調査を継続していくとともに、国際的な認知症研究の文脈に関する情報をより収集し、日本における動きを位置付けていくことを試みたい。具体的には、イギリスを中心とした認知症フレンドリーコミュニティ形成の運動や、シティズンシップ・アプローチの動向を追うとともに、そうした動きに示唆を受けた認知症の社会学研究の文献を収集し、キャッチアップにつとめる。また、国内の認知症の当事者を中心とした、新しい認知症をめぐる動きに関する調査をより積極的に進めていく。本年度は、本研究でまず捉えるべき課題である、近年の認知症概念の変化のあり様の一端について探求していくためにレビー小体型認知症をめぐる当事者、家族、支援者の活動に関してフィールドワークに基づくデータ収集を中心に研究を行った。具体的には、2016年度より看護学研究者と共同で開始してきたレビー小体型認知症サポートネットワーク兵庫の活動を本年度も継続して行った。このサポートネットワークの活動は、レビー小体型認知症の介護者や当事者、その支援に関するものたちが集まる会であり、年に4回の定例会を開催した。会において参加者に対する情報提供や参加者同士の話し合いの機会を設けるなどのサポート活動を行いながら、参加者への調査票調査のデータや公開の後援会における質疑応答のやり取りのデータを収集するというアクションリサーチを行ってきた。以上のフィールドで得たデータを、看護系の学会で協力研究者と共同で発表を行い、2018年度には社会学系の学会で報告をしていく予定である。また、2017年は多くの認知症の当事者が著作を出版した年であったが、2010年代の当事者による著作を含めて、それらの著作を収集し、その内容や出版の背景の変遷について分析を行った。その分析の一端を、書評論文という形でまとめ発表した。以上のようにレビー小体型認知症に焦点化した認知症概念の変化に関する研究は進めてきたが、もう一つの課題である認知症概念の医療・介護領域外への拡張については進められておらず、次年度以降の課題となってくる。研究の一つの柱であるレビー小体型認知症に関して、データ収集やそのデータの分析がスムーズに進んだ。また、認知症の当事者の動きが2017年度にはいっそう盛んになったが、そうした動きについて、2000年代以降の当事者による本を収集して、一定程度整理することができた。

もう一つの課題である認知症概念の医療・介護領域外への拡張については、認知症当事者勉強会という、認知症に関する当事者を中心とした実践を推し進めるメンバーたちの勉強会で研究報告をしながら情報収集を行なっていった。また、日本保健医療社会学会で保健医療社会学と地域に関するシンポジウムでコメンテーターを務め、そこでの議論を踏まえて論文を執筆し、発表をした。さらに、現在の認知症をめぐる新しい実践の展開を踏まえて、以前に収集していたNHKの認知症に関するドキュメンタリー番組の記録に関するデータを再分析して、英語論文を執筆した。レビー小体型認知症に関するデータ収集は昨年度に引き続き進めることができたが、認知症をめぐる新しい諸実践に関しては、国内外で注目する活動が展開しているのに比して、十分にフィールドにアクセスしきれていない。海外での報告等も含めて、進展が遅れている。まず、これまで進めてきたレビー小体型認知症サポートネットワークにおけるデータ収集を継続するとともに、そこへの参加者に対するインタビュー調査などを企画していく予定である。他方で、十分に進められていない、認知症概念の医療・介護領域外への拡張については、まだ調査を開始できていないので、これまでつながりを作ってきた団体や新たな団体にアクセスして、少しずつ進めていく。レビー小体型認知症サポートネットワークを中心とした調査を継続していくとともに、国際的な認知症研究の文脈に関する情報をより収集し、日本における動きを位置付けていくことを試みたい。具体的には、イギリスを中心とした認知症フレンドリーコミュニティ形成の運動や、シティズンシップ・アプローチの動向を追うとともに、そうした動きに示唆を受けた認知症の社会学研究の文献を収集し、キャッチアップにつとめる。また、国内の認知症の当事者を中心とした、新しい認知症をめぐる動きに関する調査をより積極的に進めていく。レビー小体型認知症サポートネットワーク兵庫でのアクションリサーチに用いる予定だった交通費や会場費がそれ程かからなかった。また、認知症概念の医療・介護を超えた拡張を考えていくための、もう一つのフィールドでの調査が今年度は実施できなかったため、来年度に繰り越した。国際学会での報告や調査などが十分に進展しなかったため、予定していた旅費による支出が少なかったため。
有機酸とホスファターゼの分泌機能増強による土壌未利用リン吸収能の向上

枯渇しつつあるリン酸質肥料は使用量の節約が望まれている。一方で、耕地土壌中ではリンが難利用性の形で蓄積されている。一部の植物は有機酸やホスファターゼを分泌することによって難利用性リン利用能を高めている。そこで、機能を理解し、活用する目的で本研究を実施した。難利用性リン利用能の高い植物において新たに有機酸トランスポーターを単離した。また、有機酸トランスポーターが根からの有機酸分泌に大きく貢献することを示した。また、酸性ホスファターゼや有機酸トランスポーターの発現量の増強により難利用性リンが可溶化し、植物による利用性が向上されることが示唆された。リン酸質肥料の原料であるリン鉱石資源は涸渇に瀕している。その一方で、多くの耕地土壌には難溶性リンや有機態リンの形で未利用のリンが多く蓄積している。これらの土壌未利用リンの吸収能を向上することができれば、リン酸質肥料の使用量の削減が可能となると考えられる。本研究は、未利用リンの吸収能力のうち、有機酸トランスポーターと酸性ホスファターゼの能力を活用することにより、植物による土壌未利用リンの吸収能を向上することを目的とする。具体的には、根分泌性酸性ホスファターゼの機能および有機酸分泌に関わるトランスポーターの機能の活用を試み、これらの根分泌物質と根圏微生物の間の相互作用の評価を行う。今年度は、シロイヌナズナより単離したリン欠乏誘導型有機酸トランスポーターのうち、リンゴ酸トランスポーターAtALMT3およびクエン酸トランスポーターAtMATE-PI1のプロモーター::GUS発現系統を確立し、発現部位局在性を確認したところ、いずれにおいても根端上部の有機酸分泌の高い領域において強い発現が見られた。AtALMT3のアミノ酸配列をもとに、有機酸分泌能の高いシロバナルーピンのオーソログLaALMT-PI1の完全長cDNAを単離した。そのアミノ酸配列から、LaALMT-PI1は細胞膜に局在するリンゴ酸トランスポーターであることが示唆された。また、クラスター根を形成し、低リン条件下でもよく生育する木本植物Hakea laurinaからクラスター根特異的に発現する酸性ホスファターゼHISAP1の完全長cDNAを単離し、そのアミノ酸配列から、HISAP1は分泌型タンパク質であることが示唆された。さらに、来年度以降の解析対象である有機酸トランスポーターと酸性ホスファターゼの単独および多重過剰発現系統の作出に着手した。土壌未利用リンの吸収能を向上することができれば、リン酸質肥料の使用量の削減が可能となることが期待される。今年度は、以下の成果を得た。まず、有機酸トランスポーターの単離、解析においては、これまでに分析したシロイヌナズナ、シロバナルーピンに加え、低リン条件下でよく生育する木本植物ハケアからクエン酸トランスポーターと考えられるHlMATE-PI1の単離に成功した。この遺伝子は、ハケアにおいて最もクエン酸分泌量の多い成熟クラスター根で最も発現量が多いことが示された。次に、昨年度までに単離した有機酸トランスポーター候補遺伝子と分泌性酸性ホスファターゼ遺伝子LASAP2について、単独または多重の形質転換系統の育成を進め、次年度に栽培試験を行うめどをつけた。また、標準リン条件、リン欠乏条件で栽培したシロバナルーピンの根での遺伝子発現および根分泌物と根の抽出物に含まれる代謝産物について、RNA seqによるトランスクリプトーム解析およびCE-MSを用いたメタボローム解析を行った。その結果、リン欠乏条件で膨大な量の有機酸分泌が増える他にアミノ酸など複数の化合物が多く分泌されることが明らかとなった。シロバナルーピン根圏で見られる特異的な微生物群集構造の変化には、基質としての有機酸分泌だけでなく、これらの分泌物質が影響を及ぼしている可能性が示唆された。カヤツリグサ科植物において、ダウシフォーム根を多く形成する個体の根圏での難利用性リンの有効利用が行われていることを見いだした。

今年度は、シロイヌナズナより単離したリンゴ酸トランスポーターAtALMT3のT-DNA挿入変異株にAtALMT3のcDNAを組み込んだところ、そのリンゴ酸分泌能が復帰したことから、AtALMT3がリン欠乏時のリンゴ酸分泌を担うことを裏付けた。有機酸分泌能の高いシロバナルーピン根のクエン酸分泌を担う候補遺伝子としてLaMATE-PI1を単離した。昨年度単離したLaALMT-PI1と合わせて発現量を調査したところ、LaALMT-PI1はリンゴ酸分泌能の高い若いクラスター根で、LaMATE-PI1はクエン酸分泌能の高い成熟したクラスター根で発現量が多いことが示された。クラスター根圏から単離したフィチン酸分解細菌の性質を調査したところ、若いクラスター根でリンゴ酸、成熟したクラスター根でクエン酸を資化する細菌の割合がそれぞれ高く、フィチン酸の可給化には有機酸の分泌に伴って変化する細菌群集が強い影響を及ぼすことが示唆された。低リン条件下でよく生育する木本植物ハケアが形成したクラスター根の根分泌物を分析したところ、多量のリンゴ酸、クエン酸が多く含まれた。この植物からAtALMT3のオーソログと考えられるHlALMT-PI1の単離に成功した。日本に自生するカヤツリグサ科植物が低リン土壌条件でクラスター根と似た役割を果たすダウシフォーム根を形成することを見いだした。土壌未利用リンの吸収能を向上することができれば、リン酸質肥料の使用量の削減が可能となることが期待される。本研究は、未利用リンの吸収能力のうち、有機酸トランスポーターと酸性ホスファターゼの能力を活用することにより、植物による土壌未利用リンの吸収能を向上することを目的とする。具体的には、根分泌性酸性ホスファターゼの機能および有機酸分泌に関わるトランスポーターの機能の活用を試み、これらの根分泌物質と根圏微生物の間の相互作用の評価を行う。今年度は、以下の成果を得た。シロバナルーピン由来クエン酸トランスポーター候補遺伝子LaMATE-PI1の発現はリン欠乏で形成されたクラスター根に特異的である一方で、リンゴ酸トランスポーター候補遺伝子LaALMT-PI1はリン欠乏だけではなくアルミニウムによっても発現が誘導されることが示された。LaMATE-PI1をリン欠乏誘導型酸性ホスファターゼLASAP2のプロモーター制御下で発現するシロイヌナズナコンストラクト(LpMA系統)、LaMATE-PI1とLASAP2を同時に発現するコンストラクト(LpLAMA系統)、LASAP2のみを発現するコンストラクト(LpLA系統)を用いて土耕栽培を行った。その結果、可給態リンが少ない条件下で野生株よりも全ての組換え系統で生育、リン吸収の向上が示唆された。一方、有機酸分泌と酸性ホスファターゼ分泌の両方の効果が期待されるLpLAMA系統ではLpMA系統と同程度の生育であり、相乗的な効果は観察されなかった。日本に唯一生息するヤマモガシ科植物であるヤマモガシの根がクラスター根を形成していることを発見した。また、このクラスター根は極めて高い酸性ホスファターゼと有機酸分泌能を有していることを見出した。
アディポネクチンとアディポネクチン遺 `子多型が胎児発育に及ぼす影響に関する研究

正常新生児を対象として、臍帯血アディポネクチン(ApN)濃度とApN遺伝子多型を測定し、臍帯血ApNが出生体重SDスコアと有意な関係を示すことを報告した。rs266729は出生体重SDスコアで補正をした後も臍帯血ApNと有意な関係を認めたが、出生体重SDスコアとは臍帯血ApNで補正後は関連を認めなかった。以上から、ApN遺伝子多型の出生体重への影響はApN濃度を介していることが示唆された。1.早産児におけるAdiponectin(ApN)とインスリン感受性との関連に関する検討筑波大学附属病院の倫理委員会の審査後に検体の登録を開始した。現在までに早産appropriate-for-gestational age(AGA)児90例(目標100例)、早産mall-for-gestational age(SGA)児40例(目標100例)のインフォームドコンセントを得ることができ、現在も登録作業を行っている。また登録症例に関しては適宜ApNなどの測定を行い、中間的な結果として早産児においてApNは、出生後体重増加に伴って修正1か月までは増加し正の相関をみとめるがそれ以降は低下すること、修正12か月のApNは修正1か月以降のApNに依存することを発見し、第54回未熟児新生児学会で報告した。また早産SGA児において、修正満期までに体重がCatch upした群とCatch upしていない群においてApNは出生時に有意差はないが、修正満期時には有意にCatch upした群がApN高値であり、早産AGA児群と比較しても高値であることが明らかとなり、今後報告する予定である。2.正常日本人におけるApN遺伝子多型の頻度に関する検討筑波大学人間総合科学研究科の倫理委員会の審査後に登録を開始した。現在までに200例ほどの正常妊婦からのインフォームドコンセントを得ることができ、現在も登録作業を行っている。インフォームドコンセントを得られた臍帯血は適宜、ApN遺伝子多型の検索を行っており、今後臍帯血ApNの測定を行っていく予定である。現在までに早産appropriate-for-gestational age(AGA)児100例、早産mall-for-gestational age(SGA)児60例のインフォームドコンセントを得ることができ、現在フォローアップ中である。。また登録症例に関しては適宜ApNなどの測定を行い、中間的な結果として早産SGA児において、修正満期までに体重がCatch upした群とCatch upしていない群においてApNは出生時に有意差はないが、修正満期時には有意にCatch upした群がApN高値であり、早産AGA児群と比較しても高値であることが明らかとなり、第113回日本小児科学会学術集会で前記内容を発表した。また早産児において修正満期までの体重増加が、修正満期までApNの増加と関連しているということも明らかになり、こちらは今後学術誌に掲載される予定である。現在目標症例である760例の正常新生児からのインフォームドコンセントを得ることができ、現在ApN遺伝子多型の検索とApN血中濃度を測定中である。中間的な結果としては、ApN遺伝子多型により体内のApNの分泌が増加し、出生体重に影響を与えるということが明らかになり、今後学会で報告予定である。対象:筑波大学附属病院で出生した正常新生児526例を対象とし、臍帯血アディポネクチン濃度とアディポネクチン遺伝子多型を測定した。結果:臍帯血ApNは在胎週数(r=0.14)、出生体重(r=0.23)、出生体重SDスコア(r=0.21)、出生身長(r=0.13)、ponderal index(r=0.15)と有意な相関を認めた。ApN遺伝子多型と出生体重SDスコアとの検討では5'near領域のrs266729のGアリルを持つ群で、有意に出生体重SDスコアが重かったが(CC: -0.06±0.75 versusCG: 0.20±0.64versusGG: 0.07±0.78)、臍帯血ApNで補正後には有意ではなかった。多型とApNの関係は、SDスコアと同じようにrs266729のGアリルを持つ群で有意に臍帯血ApNが高値で(CC: 34.1±20.2 versusCG: 44.3±26.1versusGG:54.1±36.7μg/ml)、出生体重SDスコアで補正後も有意であった。考察:

今回の報告はアジア人新生児で大規模にApN遺伝子多型と出生体重SDスコア・臍帯血ApNの関係を検討した初めての報告である。新生児におけるApN遺伝子多型と臍帯血ApNの検討は、Rothenbacherらによるドイツ人新生児の報告だけである。その報告では、rs17300539・rs266729・rs1501299の3つの多型を検討し、我々の報告と同じようにrs266729の多型においてGアリルを持つ群が、持たない群より臍帯血ApNが高値であると報告しているが、出生体重との検討は行ってない。ApN遺伝子多型と出生体重の検討は、ブラジル人での報告だけである。その報告では、rs17300539のAアリルがlarge-for-gestationa1-age児の増加に関係していると報告しているが、出生時のApNは測定していない。今回の検討でrs266729と出生体重SDスコアに有意な関係を認めたが、臍帯血ApNで補正を行うと有意ではなかったことから、rs266729はApN濃度を介して出生体重SDスコアに影響を与えていることが示唆された。結論:アジア人で初めて臍帯血ApNが出生体重SDスコアと有意な関係を示すことを報告した。rs266729は出生体重SDスコアで補正をした後も臍帯血ApNと有意な関係を認めたが、出生体重SDスコアとは臍帯血ApNで補正後は関連を認めなかった。以上から、ApN遺伝子多型の出生体重への影響はApN濃度を介していることが示唆された。
中性子解析によるＡＴＰ結合タンパク質の水和構造とそのダイナミクス

ATP結合タンパク質のATP結合前後における水和水の配向変化をX線および中性子回折法により原子レベルで観察し、ATPエネルギー変換を“負エントロピー"を産み出す構造変化の切り口から解明することを目的とする。ATP結合タンパク質として、ATP類似物質結合により10数個の水和水構造変化を起こすタンパク質DAPK(Death-associated protein kinase)を取り上げた。DAPKは合成DNAを用いて大腸菌で発現させ、イオン交換樹脂・ゲル濾過カラムクロマトグラフィー精製を行い、75mgの試料を取得した。結晶化剤PEG1000,硫酸アンモニウム、硫酸リチウムで結晶析出することが判明し、DAPK結晶成長相図を作成し、それをもとに結晶育成を行い、最大0.032mm3の結晶を得ることが出来た。それをX線結晶解析実験に用い、DAPK単独およびATP類似物質を結合させた状態でのリガンド結合部位のフーリエ図を解析し、リガンド結合部位付近の水分子数がそれぞれ23個,24個と求められた。中性子回折実験用大型単結晶(1 mm3以上の結晶は現時点では得られず、中性子回折実験は未だ出来ていない。DAPKにATPアナログ分子が結合するとき発生する熱を等温滴定熱量測定装置で行い、結合定数(Kd / M:5.41×10-7)、反応の結合比(n:1)、エンタルピー変化(ΔH / kJmol-1 :-57.3±0.4)、およびエントロピー変化(ΔS0 / JK-1mol-1:-72±1)をそれぞれ取得した。24年度が最終年度であるため、記入しない。目的:中性子回折法は水和水の配向を観察出来るユニークな実験手段である。ATP結合タンパク質のATP結合前後における水和水の配向変化を中性子回折法により原子レベルで観察し、ATPエネルギー変換を"負エントロピー"を産み出す構造変化の切り口から解明することを目的とする。ATP結合タンパク質として、ATP結合による水和水構造の特徴を考慮して、DAPKタンパク質を選択し、中性子回折実験を行い、ATP結合前後における水和水の配向の自由度の変化を決定し、エントロピー変化を求める。並行してDAPK-ATP結合の熱測定を行い、それにより得られるエントロピー変化と比較し、"負エントロピー"の起源を議論する。試料調整:DAPKリン酸化領域(285アミノ酸残基)の合成DNAを用いて大腸菌で発現を試み成功した。イオン交換樹脂・ゲル濾過カラムクロマトグラフィー精製を行い、75mgの試料を取得した。結晶育成:結晶化剤PEG1000,硫酸アンモニウム、硫酸リチウムで容易に結晶析出することが判明した。硫酸リチウムを用い、DAPK結晶成長相図を作成した。これをもとに結晶育成を行い、現在最大0.032mm^3の結晶を得ている。X線結晶構造解析:KEK PF-ARNE3AでATPアナログ非結合型および結合型のX線回折実験を実施した。DAPKに結合しているATPアナログ物質は10個以上のオーダーした水分子と水和構造を形成しており、さらにその水分子を介して多くの水分子やアミノ酸側鎖と水素結合を形成していた。しかし、AMP-PNPやATP-γSのγ-リン酸基はディスオーダーしている。以上からATPアナログとしてはADPを用いるのが得策であることが判明した。更に,マグネシウムを加えるとoverallの温度因子が小さくなるので、マグネシウムイオンがADPの静的構造を安定化していることが判明した。H23.3.11震災により、実験室の装備機器のいくつかが破損し、それの修理や更新に時間がかかった。また、J-PARC設置の中性子回折装置も被害を受け、それの復興等に時間を要した。H23.3.11震災復興も殆ど完了したので、計画通りの方策で研究推進する。

昨年度の後半に取得したDAPKタンパク質を用い、ATPアナログ結合による熱測定を開始する。また、中性子回折実験用大型単結晶育成実験に取りかかり、大型単結晶が得られた段階で最終目標の中性子回折実験を遂行する。
グロビン遺伝子群を含む広範囲遺伝子欠失によるサラセミア症の解明

昨年度に引き続き、未知の広範囲遺伝子欠失領域を決定する遺伝子技術の開発を行ってきた。この新たな方法は、Real-Time PCRと新たに開発・命名したJunction PCRを用い、mega base単位の遺伝子欠失でさえも正確に欠失断端を決定することが可能である。Genome projectによりヒトgenome data公開されている現在、この手法でかなり容易に決定することが可能になった。最も早い場合では、Real-Time PCRにより大まかな一方の欠失領域が決定できれば1週間で正確な欠失断端を決定することができる。しかし、Real-Time PCRによる遺伝子定量が難しい場合(α-globing gene等)や、欠失断端付近に高度な繰り返し配列がある場合には決定できないこともあるというこの方法の問題点もみつかった。この問題を解決するべく検討中をおこなった。その対策の1つとしてprobeを用いたReal-Time PCRによる定量を試みた。その結果、一般的な定量PCRでうまくいかない場合、probeを用いたReal-Time PCRによる定量はうまくいかないことが判明した。また、多種類のPCR primerを設計しReal-Time PCRの厳密な条件決めを行った。これにより、かなりの精度で定量PCRが可能になったが、完全に解決はできなかった。また昨年同様、この方法の有用性を示す広範囲遺伝子欠失型非αサラセミアの解析を続けてきた。我々の研究室に全国および海外から多数の血色素異常症の遺伝子分析依頼がある検体はの中で、約20家系の広範囲遺伝子欠失型非αサラセミアの診断を、この技術を用いて解析を行った。δβサラセミア1種類・6家系(27kb欠失)、βサラセミア1家系(116kb欠失)、βグロビン遺伝子は存在するがLCR(Locus control region)を含む上流の欠失による、εγδβサラセミア3家系(39kb,46kb,118kb欠失)、βグロビン遺伝子群が完全に欠失しているεγδβサラセミア2家系(1.41Mb,1.4Mb欠失)、欠失と逆方向挿入によるδβサラセミア1家系を診断することが出来た。最後の症例を除けば、全て新規の欠失であることがわかった。また、いずれの症例も相同組み換えによる欠失ではなく、その欠失断端付近にはおもしろい配列が存在する症例もあった。今後の課題となる。未知の広範囲遺伝子欠失領域が決定できる新しい遺伝子技術(クローニングを用いない)の開発を行った。この新たな方法は、Real-Tlme PCRと新たに開発・命名したJunction PCRを用い、mega base単位の遺伝子欠失でさえも正確な欠失断端の決定が可能である。Genome projectによりヒトgenome data公開されている現在では、クローニングやサザンプロット解析では決定できなかった欠失さえも容易に決定できるようになった。早い場合では、Real Time PCRにより大まかな一方の欠失領域が決定できれば1週間で正確な欠失断端を決定することができる。この方法の有用性を示すdataは広範囲遺伝子欠失型非αサラセミアの解析である。我々の研究室には全国および海外から多数の血色素異常症の遺伝子分析依頼がある。多くの検体はSSCP等の遺伝子技術により,簡易に遺伝子診断が可能である。しかし、約20家系の広範囲遺伝子欠失型非αサラセミアの遺伝子診断は手付かずの状態であった。この技術を用いて解析を行ったところ、δβサラセミア1種類・6家系(27kb欠失)、βサラセミア1家系(116kb欠失)、βグロビン遺伝子は存在するがLCR(Locus control region)を含む上流の欠失によるεγδβサラセミア3家系(39kb,46kb,118kb欠失)を診断することが出来た。現在、残りの家系についても解析中である。しかし、この方法の問題点もみつかったもReal-Time PCRによる遺伝子定量が難しい場合(α-globin gene等)や、欠失断端付近に高度な繰り返し配列がある場合には決定できないこともある。現在、この問題を解決する新たなテクニックを検討中である。今後、決定できていない広範囲遺伝子欠失型非αサラセミアおよびαサラセミアの欠失領域の決定を進める予定である。これにより申請書に記載した広範囲遺伝子欠失によるサラセミア症の解明をしていきたい。

これにより、かなりの精度で定量PCRが可能になったが、完全に解決はできなかった。また昨年同様、この方法の有用性を示す広範囲遺伝子欠失型非αサラセミアの解析を続けてきた。我々の研究室に全国および海外から多数の血色素異常症の遺伝子分析依頼がある検体はの中で、約20家系の広範囲遺伝子欠失型非αサラセミアの診断を、この技術を用いて解析を行った。δβサラセミア1種類・6家系(27kb欠失)、βサラセミア1家系(116kb欠失)、βグロビン遺伝子は存在するがLCR(Locus control region)を含む上流の欠失による、εγδβサラセミア3家系(39kb,46kb,118kb欠失)、βグロビン遺伝子群が完全に欠失しているεγδβサラセミア2家系(1.41Mb,1.4Mb欠失)、欠失と逆方向挿入によるδβサラセミア1家系を診断することが出来た。最後の症例を除けば、全て新規の欠失であることがわかった。また、いずれの症例も相同組み換えによる欠失ではなく、その欠失断端付近にはおもしろい配列が存在する症例もあった。今後の課題となる。