hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グラフェンにおけるナノエレクトロニクスとスピントロニクス

グラフェン及びグラフェン派生物質に付随する物理現象は,現在の物性物理で最も注目を集めている物の一つである.特に,グラフェンを一次元状に切り出したグラフェン・ナノリボンに関しては多くの研究がなされている.同様に重要な物質として,グラフェン・ナノディスクがある.これは閉じた境界を持つグラフェン派生物である.このナノディスクという新しい物理系の豊かな電磁的性質を明らかにし,バンド構造などの基礎的物性から,スピントロニクスなどの応用まで論じた.グラフェン及びグラフェン派生物質に付随する物理現象は,現在の物性物理で最も注目を集めている物の一つである.特に,グラフェンを一次元状に切り出したグラフェン・ナノリボンに関しては多くの研究がなされている.同様に重要な物質として,グラフェン・ナノディスクがある.これは閉じた境界を持つグラフェン派生物である.このナノディスクという新しい物理系の豊かな電磁的性質を明らかにし,バンド構造などの基礎的物性から,スピントロニクスなどの応用まで論じた.申請者はグランフェンを円盤状に切り出したグラフェン・ナノディスクという新しい物質群を提唱した.この中でも特に,ジグザグエッジを持つ三角グラフェン・ナノディスクにN重縮退した零エネルギー状態が存在する事を発見している.この零エネルギー状態に射影された相互作用を導出した.この系では交換相互作用がクーロン相互作用に匹敵する大きさであることを発見した.グラフェンナノディスクにリードをつけることにより,クーロン・ブロッケード現象をグリーン関数の運動方程式を用いて解析した.相互作用のないときはナノディスクの零エネルギー状態にはSU(N)対称性が存在する.しかし零エネルギー状態に射影された相互作用はSU(N)対象性を持たない.この為に特異なクーロンブロッケードが発生することを発見した.またグラフェン・ナノディスクのスピントロニクスヘの応用の可能性についても数々の提案を行った.グラフェンナノディスクの基底状態は強磁性である為,グラフ出ンナノディスクにリードを接合し,電流を流すとナノディスクのスピンと同じ向きの電子のみが通過できる.この結果グラフェンナノディスクはスピンフィルターとして働く事が確認出来た.またグラフェンナノディスクをスピンメモリーとして使えることも議論した.グラフェンナノディスクに不完全分極したスピン流を入力すると完全分極したスピン流が出力される.この性質を用いてスピンアンプリファイアーを作成できること提案した.これはノイズで分極が不完全になったスピン流をまた完全に戻すための装置として有力である.更にナノディスク2つを直列に並べることにより,スピンバルブ・スピントランジスターを作成できることも提案した.2つの速うサイズのナノディスクを接続することでズピンの回転速度の違いを用いてスピンダイオードを作成できることも提案した.申請者はグラフェンを円盤状に切り出したグラフェン・ナノディスクという新しい物質群を提唱した.この中でも特に、ジグザグエッジを持つ三角グラフェン・ナノディスクにN重縮退した零エネルギー状態が存在する事を発見している.この零エネルギー状態に射影された相互作用を導出した.この系にクーロン相互作用を導入し磁性を論じた.この系では交換相互作用がクーロン相互作用に匹敵する大きさであることを発見した.ナノディスクの基底状態はスピンがN/2の磁性を示す.交換相互作用は強いので、有限系であるにも係わらず,スピンは強磁性類似の性質(擬強磁性)をもつ.この擬強磁性は1スピンと強磁性の中間の性質を持っている.この擬強磁性の熱力学的性質を調べた.温度の関数として、比熱に鋭いピークが現れ、擬強磁性相と擬常磁性相の間の擬相転移が存在する事を発見した.ナノディスクにリードをつけた系はHeisenberg-Hubbard模型で記述されることを示した.トランスファーに関してSchrieffer-Wolff変換を用いて二次摂動を行うことにより多スピン近藤ハミルトニアンを導出した.またナノディスクの零エネルギー状態に対するトランスファーエネルギーやサイトエネルギーの乱雑さの影響を調べた.その結果零エネルギー状態はこの種の摂動に対してロバストであることを発見した.格子欠陥が存在する場合について零エネルギー状態の数がどう変化するかもLiebの定理と数値計算を用いることで解析した.格子欠陥の零エネルギー状態数に与える公式を提唱した.ナノディスクスピンが擬強磁性である性質を利用したスピントロニクスデバイスを提唱した.ナノディスクスピンは小さなサイズでもスピン緩和時間は長く情報を保持し易く、尚かつ外場や電流で容易に制御できるという良い性質を持っている.スピンスイッチ、スピンダイオード、スピンフィルター、スピンバルブ、スピントランジスタなどを提案した.
液相クロマトグラフィー質量分析法による微量糖脂質糖鎖分析法の開発研究

LC/MSを用いて粗精製糖脂質画分をon-lineで直接質量分析を行い、構成成分の構造を迅速に解析する方法を目指して研究を行った。LC/MSの分析性能を決定付ける要因の比重は、HPLCに関連する要因に大きく偏っている。とくに、糖脂質は親水性部分の糖鎖が同一でありながら疎水性部分の炭化水素鎖長が異なる分子種を同一の分子群として扱うのでそれぞれの分子種の挙動がHPLCの分離に大きく関わってくる。今回の研究ではHPLCの分離を最適化する条件の選択に多くの時間を割いた。HPLCカラムには疎水性部分の違いによる分離度が少ない順相系のシリカゲルカラムを用いた。ガングリオシドがアセトニトリルに溶けにくいことから、2-propanolと水の系を用いて分析を試みた。MSに対して問題を起こさない範囲のいろいろな添加剤を試してみたが、酢酸アンモニウムが良好な分離を示すことがわかった。しかし、この溶媒系ではガングリオシドの各ピークの幅は期待したほど狭くならなかった。一方、アセトニトリル-水の系はガングリオシドが溶けにくいという欠点はあるものの、ガングリオシドの各ピークの幅は満足できる程度に狭くなった。質量分析では内径1mmのHPLCカラムを用いた場合に100ngのガングリオシドでも十分な感度で検出できることがわかった。モノシアロガングリオシドは1価と2価イオン、ジシアロガングリオシドは2価イオン、トリシアロガングリオシドは2価と3価イオンが観測された。MS/MSによる多成分の構造解析の実現が今後の課題である。糖脂質の質量スペクトルは、高速原子衝撃質量分析法(FABMS)あるいは二次イオン質量分析法(SIMS)によって糖脂質の構造解析法としての有用性が確固たるものとなっている。しかしながら、これらの方法により分析する際には分析対象の糖脂質を単離精製しなければならない点が欠点であり、構造研究の大きな負担となっている。特に生理活性を持つ非常に微量な糖脂質を分析しようとすると、単離精製操作における糖脂質の損失が大きくなることから、単離精製することなく糖脂質の質量分析が行える方法の開発が待たれている。本研究では液体クロマトグラフィーを直結した質量分析計を用いて、この問題の解決を試みる。エレクトロスプレーイオン化法の負イオンモードは脱プロトン化分子だけが現れるので高感度分析に適していることがわかった。クロロホルムは糖脂質の順相系クロマトグラフィー溶媒としてよく用いられるが、含塩素系溶媒はグロー放電を引き起こす液滴中の電子を除去するので負イオンエレクトロスプレーが安定する。操作性と分析感度のバランスを考慮するとマイクロエレクトロスプレーが適しているようである。糖脂質は脂質の脂肪酸組成の違いによる複数の分子種からなるが、糖鎖構造が同じならば同一の糖脂質として扱われる。そのため、液体クロマトグラフィーで個々の分子種に分かれてしまうと解析が困難になるので、脂質の組成の影響が少なく糖鎖の構造を反映するクロマトグラフィーカラムを検索する作業を続けている。いくつかの候補が挙がっているが、さらに分析条件等の最適化を行う必要がある。ガンダリオシドがアセトニトリルに溶けにくいことから、2-propanolと水の系を用いて分析を試みた。

MSに対して問題を起こさない範囲のいろいろな添加剤を試してみたが、tetramethylammonium carbonateが良好な分離を示すことがわかった。しかし、この添加剤を用いて長時間分析を続けているとカラムが目詰まりを起こしてしまう問題が発生した。また、この溶媒系ではガンダリオシドの各ピークの幅は期待したほど狭くならなかった。一方、アセトニトリル-水の系はガングリオシドが溶けにくいという欠点はあるものの、ガンダリオシドの各ピークの幅は満足できる程度に狭くなった。質量分析では内径2mmのHPLCカラムを用いた場合に100ngのガングソオシドでも十分な感度で検出できることがわかった。モノシアロガングリオソドは1価と2価イオン、ジシアロガングリオシドは2価イオン、トリシアロガングリオシドは2価と3価イオンが観測された。MS/MSによる多成分の構造解析の実現が今後の課題である。
人間と動物の関係の多様性とその文学的表象の比較研究

2019年1月12日にセミナー「動物のまなざしのもとの文学」を一橋大学で開催した。司会を務めた研究代表者の鵜飼哲による本共同研究の全体的な方向づけに関する提言に続き、村上克尚(日本学術振興会)「喪の作業から共生へー津島佑子「真昼へ」におけるアイヌの自然観との共鳴」、呉世宗(琉球大学、研究分担者)「金石範作品における動物ー「鴉の死」を中心に」、中井亜佐子(一橋大学、言語社会研究科)「『ロビンソン・クルーソー』と『フォー』近代小説における労働、動物、言語」の三本の報告が行われた。このセミナーは「研究実施計画」において「日本語文学の領域で政治的もしくは宗教的コンテクストのもとに人間と動物の関係を主題化した作品に焦点を当て国内研究者を招聘してセミナーを開催する」と述べられていた計画に英語文学との比較論的次元を加えた形で成立した。村上報告では津島作品においてアイヌ民族の動物観への参照が他界した親族たちをいかに想起するかという問いと深く関連していることが明らかにされた。呉報告では金石範「鴉の死」に描かれる主人公による鴉の殺害が済州島4・3事件という歴史的状況に照らしてどのような暴力性を内包しているかが主要な分析の対象となった。また中井報告ではデフォー作品におけるロビンソンの労働の様態、動物に対する暴力と愛着がロックやマルクスを参照しつつ検討され、そのリライトであるクッツェー作品で女性の語り手が舌を奪われたフライデーと島の動物たちをどのような関心において接近させているかが論じられた。以上の報告はいずれも本共同研究の「研究の目的」において提示された方向性に沿って重要な貢献を行った。また研究代表者と研究分担者はそれぞれ調査旅行を行い各自の研究の進展に努めた。「研究計画」で「欧米において現在行われている動物に関する文学研究の現状を報告するとともにフランスから研究者を招聘して国際セミナーを開催する」と述べられていた計画が、被招聘者の事情によって2019年5月に延期されたため。前年度に計画が実現できなかった国際セミナーは2019年5月に「動物と文化の境界を通過するー宗教的信仰、政治、そして文学」というタイトルのもと、一橋大学で開催する準備を進めている。また2019年度内に「軍事的暴力と動物たち」(仮題)というセミナーを、韓国から研究者を招聘して琉球大学で開催する予定である。また第1回のセミナーの成果を大学の紀要などの媒体を通じて公表することも追求する。
バイオトランジスタによるタンパク質翻訳後修飾の電気的検出

分子認識による電荷密度変化を直接検出する「バイオトランジスタ」を用いて、タンパク質の翻訳後修飾を電気的に検出する手法を開発した。本手法は標識を用いないラベルフリー検出であり、分析時間の短縮・低コスト化・装置の小型化・高スループット化を実現し、翻訳後修飾のポイント・オブ・ケア診断を志向する。本成果は、ゲノム解析からエピゲノム調節・タンパク質翻訳・翻訳後修飾の解析に至るまで網羅的な生命情報をすべてトランジスタで評価するという統一されたプラットフォームの提供に繋がる。網羅的解析により偽陽性・偽陰性の問題を克服しつつ、医療インフラを必要としない分散化・ユビキタス化を標榜した次世代型医療に直結する。本研究では分子認識にともなう電荷密度変化を直接検出する「バイオトランジスタ」を用いて、生命現象に深く関わるタンパク質の翻訳後修飾を電気的に検出する手法を開発する。分子の電荷密度変化を直接測定することができる電位計測型バイオセンサーを用いて、翻訳後修飾によるタンパク質分子の電荷密度変化をラベルフリーで検出する新たな手法を開発した。バイオトランジスタと水晶発振振動子(QCM)センサーを統合し、「電荷」と「重量」という異なる物理パラメータを同時に検出することによって、遺伝子の転写調節を司るヒストンのアセチル化・メチル化をモデル系として、タンパク質翻訳後修飾の検出をおこなった。ヒストンのアセチル化はリジン残基の正電荷を奪い、DNAの転写を促す役割を担っており、転写異常は細胞のがん化と密接に関連している。まず、精製ヒストンプロとマーとアセチル化試薬(Sulfo-NHS)を用いてアセチル化度の異なるヒストンを作製した。次に、半導体バイオセンサーによる電位測定により、界面電位変化から吸着したヒストンにともなう界面電荷密度変化ΔQを求めた。水晶発振振動子(QCM)法により得られるヒストン吸着量を用いてヒストンの電荷/重量比を求め、質量分析あるいは蛍光ラベル測定から得られたヒストンのアセチル化度との比較をおこなった。その結果、ラベルフリー測定で求めた単位分子当たりの電荷密度がヒストンのアセチル化度に依存することが明らかとなった。本年度はヒストンのアセチル化度をモデルサンプルにおいて求めることには成功したが、実サンプルを用いた測定に手間取っている。その結果、当初予定のヒストンメチル化の実験には未着手である。本研究では、分子認識にともなう界面電荷密度変化を電気的に直接検出する「バイオトランジスタ」を用いて、生命現象に深くかかわるタンパク質の翻訳後修飾を非標識に検出する手法を開発する。セリン残基のリン酸化等、いくつかのタンパク質翻訳後修飾では、アミノ酸側鎖の電荷が変換される。このことに着目し、タンパク質分子の重さと電荷密度という異なる物理量を同時に検出するために、水晶発振振動子(QCM)とバイオトランジスタを統合した新たなバイオセンサーを開発することを目指した。遺伝子の転写調節を司るヒストンのメチル化およびアセチル化をモデル系として、タンパク質の翻訳後修飾の電気的検出をおこなった。ヒストンアセチル化はリジン残基の正電荷を奪い、クロマチン構造を弛緩させることによって、DNAの転写を促進させる役割を有している。翻訳後修飾による転写異常は組織の眼科と密接に関連しており重要な課題である。そこで、まずリコンビナントなヒストンプロトマー(H3、H4)を用いて、アセチル化試薬(SulfoーNHS)によるリジン残基のアセチル化をおこなった。また、タンパク質と試薬の混合比を調節することで、アセチル化度の異なるヒストンを作製した。次に、バイオトランジスタを用いて、ヒストン特異性DNAアプタマーを固定化した電極表面に対し、ヒストンを選択的に吸着させ、電位変化を計測した。また、同じ表面修飾を施したQCMセンサーチップを用いて、ヒストンの吸着した重量を求めた。そして、アセチル化度に対するヒストンの電荷/重量比を算出し、原理証明実験をおこなった。また、タンパク質分子の電荷と重量を同一の電極表面で同時に計測するバイオトランジスタ・表面プラズモン共鳴(SPR)一体型センサーを新たに開発した。これまで、モデルサンプルを用いたヒストンのアセチル化度の測定には成功したが、十サンプルによる測定が難航している。その結果、ヒストンメチル化度の実験には未着手である。分子認識にともなう電荷密度変化を直接検出する「バイオトランジスタ」を用いて、生命現象に深く関わるタンパク質の翻訳後修飾を電気的に検出する手法を開発した。本手法は蛍光標識や電気化学標識を用いないラベルフリー検出であり、分析時間の短縮・低コスト化・装置の小型化・高スループット化を実現し、翻訳後修飾のポイント・オブ・ケア診断を志向する。網羅的解析により偽陽性・偽陰性の問題を克服しつつ、可搬型デバイスを用いた医療インフラを必要としない分散化・ユビキタス化を標榜した次世代型医療に直結する挑戦的な研究課題である。本研究では、遺伝子の転写調節を担うヒストンのアセチル化をモデル系に、分子の電荷密度変化を直接測定することができる電位計測型バイオトランジスタと吸着質量を測定する水晶発振振動子(QCM)を併用し、「電荷」と「重量」という異なる物理パラメータを同時に検出することによって、翻訳後修飾によるタンパク質分子の電荷密度変化をラベルフリーで検出することに成功した。分子の電荷密度変化からタンパク質翻訳後修飾を検出するという試みは、従来のタンパク質翻訳後修飾の検出法である煩雑な「ELISAアッセイ」や大型装置を要する「質量分析」といった既存の分析化学とは一線を画するものであり、さらに、既存のバイオトランジスタの適用範囲を拡張させるものである。

今後、ゲノム・エピゲノム・プロテオームをバイオトランジスタという単一のプラットフォーム上で高速・安価に・その場で統合的に計測して、がんのポイント・オブ・ケア診断や早期診断など先進医療を提供する「医療革新」に繋がることが期待できる。分子認識による電荷密度変化を直接検出する「バイオトランジスタ」を用いて、タンパク質の翻訳後修飾を電気的に検出する手法を開発した。本手法は標識を用いないラベルフリー検出であり、分析時間の短縮・低コスト化・装置の小型化・高スループット化を実現し、翻訳後修飾のポイント・オブ・ケア診断を志向する。本成果は、ゲノム解析からエピゲノム調節・タンパク質翻訳・翻訳後修飾の解析に至るまで網羅的な生命情報をすべてトランジスタで評価するという統一されたプラットフォームの提供に繋がる。網羅的解析により偽陽性・偽陰性の問題を克服しつつ、医療インフラを必要としない分散化・ユビキタス化を標榜した次世代型医療に直結する。ヒストンのアセチル化に関する実験を実サンプルを用いておこなう。ヒストンのアセチル化を担うHATの阻害剤や、ヒストンディアセチラーゼ(HDAC)阻害剤をヒト株化細胞に作用させ、アセチル化の異なるヒストンを細胞から抽出・回収する。HAT阻害剤としては、Anacardic acidやCurcuminを検討しており、HDAC阻害剤としては、ApicidinやTrichostatin Aを用いる予定である。上記の方法によって、ヒストンの電荷/重量比を求め、実サンプルにおけるヒストンのアセチル化度を評価する。当初予定のヒストンメチル化の実験に取り組む。ヒストンのメチル化は電荷の変化をともなわない(-NH3-n+-Men、n=1-3)。そこで、メチル化のおこなわれていないリジン残基については化学的に電荷をラベルする手法を採用する。これは、以前、タンパク質の高感度電荷検出法として開発された手法であり(Goda, Anal. Chem. 2010, 82, 8946)、未修飾のリジン残基について選択的に負電荷へと電荷を変換する電荷ラベリング法である。アセチル化の実験と同様に、既存の方法との比較をおこない、メチル化度の定量的な検出をおこなう。アルツハイマー病のバイオマーカーであるリン酸化タウタンパク質の評価に関するモデル実験をおこなう。トレオニン181、セリン199、セリン202、トレオニン205等のリン酸化によってタンパク質に付与された負電荷を直接検出することを試みる。チューブリンやアプタマー(Krylov, FEBS Lett, 2005, 579, 1371;Kumar, BioNanoSci, 2012, 2, 83)などタウタンパク質と特異的に結合するリガンドを電極に修飾し、高感度測定をおこなう。ヒストンのアセチル化に関する測定を、実サンプルを用いて、引き続き検討する。
リポ酸転位反応の機構の解明

リポ酸はグリシン開裂酵素系のH蛋白およびピルビン酸、α-ケトグルタル酸、分枝鎖ケト酸脱水素酵素複合体のアシル転移酵素の補酵素である。我々はリポ酸を蛋白質に結合させる反応を触媒するリポ酸転移酵素をウシ肝から精製し、その性質を既に報告した。本研究ではウシおよびヒトリポ酸転移酵素のcDNAを得て以下の結果を得た。1)ウシリポ酸転移酵素のcDNAは1119bpのopen reading frameを含み、373アミノ酸残基から成る前駆体蛋白質をコードしていた。2)ヒトリポ酸転移酵素のcDNAも1119bpのopenreading frameを含み、前駆体は373アミノ酸残基から成る。ウシ酵素との比較から、前駆体は26アミノ酸残基から成るpresequenceを持つものと思われ、推定される成熟型酵素は347アミノ酸残基から成り、分子質量は39,539Daである。ヒトリポ酸転移酵素のアミノ酸配列はウシのそれと88%、大腸菌のlipoate-protein ligase Aのアミノ酸配列と31%の相同性を示した。3) Poly(A)^+RNAのNorthern解析により、ヒトリポ酸転移酵素のmRNAは1.5kbであった。mRNAの組織分布を検討したところ筋と心に多く認められ、リポ酸を結合している蛋白質の組織分布と一致した。4)ヒトリポ酸転移酵素の遺伝子は4個のexonと3個のintronから構成されており、大きさは約8kbであった。ヒトリポ酸転移酵素遺伝子は第二染色体のq11.2に存在することがFISH法で明らかとなった。リポ酸はグリシン開裂酵素系のH蛋白およびピルビン酸,α-ケトグルタル酸,分岐鎖ケト酸脱水素酵素複合体のアシルトランスフェラーゼの補酵素である。リポ酸を蛋白に結合させるリポ酸転移酵素はウシ肝臓から精製する過程でI型とII型のアイソフォームに分離される。両者のN末端アミノ酸配列はI型のN末端にAsnが付加されている以外はII型と同一であった。ウシとヒトのリポ酸転移酵素のcDNAをクローニングして以下の結果を得た。1)ウシのII型酵素のN末端領域アミノ酸配列を基に合成したヌクレオチドをプローブに用いて得たcDNAは1119base pairsのopenreading frameを含み、373アミノ酸より成る前駆体蛋白をコードしていた。成熟型蛋白は347アミノ酸より成り,分子量は38,903で肝臓から精製した酵素の分子量とよく一致した。ウシのリポ酸転移酵素を大腸菌中で発現させ,精製後ウサギに免疫してその抗体を得た。肝臓から精製したリポ酸転移酵素I型およびII型の抗体との反応性に差異はなく、NorhermおよびSouthern blot analysesの結果とも合わせて,I型とII型は同一遺伝子・転写産物からの生成物であり,前駆体蛋白がミトコンドリアに移入した後のプロセシングの違いによってI型とII型が生じたものと結論づけられた。2)ヒトのcDNAも同じく1119base pairsのopenreading frameを含み,373アミノ酸より成る前駆体蛋白をコードしていた。前駆体蛋白は27アミノ酸のmitochondrial presequenceと347アミノ酸の成熟型蛋白より成っていた。ヒトのリポ酸転移酵素のアミノ酸配列はウシのリポ酸転移酵素および大腸菌のlipoate-protein ligaseとそれぞれ88%および32%の相同性があった。現在,ヒトのリポ酸転移酵素の遺伝子の構造を解析中である。

またウシリポ酸転移酵素のcDNAを分離し、それをプローブとしてヒトリポ酸転移酵素のcDNAを得た。本年度はヒトリポ酸転移酵素およびその遺伝子について以下の結果を得た。1)ヒトリポ酸転移酵素前駆体は373アミノ酸残基から成り、ウシ酵素との比較から、26アミノ酸残基から成るpresequenceを持つものと思われる。推定される成熟型酵素は347アミノ酸残基から成り、分子質量は39,539Daである。ヒトリポ酸転移酵素のアミノ酸配列はウシのそれと88%、大腸菌のlipoate-protein ligase Aのアミノ酸配列と31%の相同性を示した。2) Poly(A)^+RNAのNorthen解析により、ヒトリポ酸転移酵素のmRNAは1.5kbであった。mRNAの組織分布を検討したところ筋と心に多く認められ、リポ酸を結合している蛋白質の組織分布と一致した。3)ヒトリポ酸転移酵素の遺伝子は4個のexonと3個のintronから構成されており、大きさは約8kbであった。ヒトリポ酸転移酵素遺伝子は第二染色体のqll.2に存在することがFISH法で明らかとなった。
大腸癌臨床サンプルからの再発細胞（スーパー癌幹細胞）の同定

大腸癌による死亡率は本邦トップ3に位置し、再発癌の治療は依然として困難である。転移・再発の原因としてLrg5やDclk1などの癌幹細胞の概念が注目されているが、大腸癌の多様性から考えれば、癌幹細胞の種類も複数存在し、症例ごとに個別の癌幹細胞が存在してもおかしくないと考え、本研究では患者さんの臨床検体から個々の症例で重要な働きをする癌幹細胞を同定することを目的とした。2018年には、10症例の大腸癌患者の手術切除組織よりヌードマウスの皮下にPDXを作成し、そのうち9例にマトリゲル上での細胞培養することに成功した。2年間で20例を予定しており、その約半数が1年間で達成できたので予定通りである。本研究の鍵は患者由来細胞の培養の成功率であったが、マウスを使うことで9割がin vitro培養にもっていけたことは大きな成果である。さらにスフェロイドを形成した腫瘍細胞を1個3個の単位でマウスに皮下移植し、腫瘍を形成させ、3例においてRNA sequenceを行った。またsphereをマウス皮下に移植して作成した腫瘍を細胞単位に分解して1例でsingle cell解析を行った。別の3例においては、二次元培養したすべての細胞に色素マーキングを施してからスフェロイドを作成すると、ほとんどの細胞は細胞分裂を繰り消した結果、色素を失うが、癌幹細胞はほとんど分裂をしないために色素が維持される。色素が維持された幹細胞性の高い細胞とマーキングが消えた分裂回数の多い分化した細胞のRNA sequenceを実行した。これまでに得られた結果からは、幹細胞性の高い集団や細胞を同定できていることが示されたため、個々の症例で働く個別の癌幹細胞の同定が達成される見込みである。今年度、1PDX(patient derived xenograft)の作成を10症例に行い、できたPDXを腫瘍細胞をバラバラに分離して、マトリゲル上で培養することに9例で成功した。23例において1-3個の少数のsphereをヌードマウス皮下に移植し、腫瘍を形成させ、bulkサンプルからRNA sequenceを行った。原発巣の遺伝子発現と比較すると、形成した腫瘍では一部の既知の幹細胞マーカー以外に複数の幹細胞マーカー候補遺伝子の発現が亢進していることが分かり、幹細胞性の高い腫瘍が形成されたことが示唆された。3色素で細胞マーキングを行った後にsingle cellからsphereを形成させることで、sphereの中で分裂回数の少ない幹細胞性の高い細胞のみをマーキングすることに成功した。そのうち3例において、マーキングされた幹細胞性の高い細胞とマーキングが消えた分裂回数の多い分化した細胞のRNA sequenceを行った。この系でもマーキングされた細胞において既知の幹細胞マーカーの発現と共に複数の幹細胞マーカー候補遺伝子の発現が亢進していた。4sphereをマウス皮下に移植して作成した腫瘍を細胞単位に解体し、single cell解析を行った。この結果から、遺伝子系譜図を作成し、幹細胞性の高い細胞集団とそれを構成する遺伝子群が明らかとなる。本研究の目的は、手術によって切除された大腸癌組織の中から、1個数個の細胞でマウスに腫瘍を形成する能力を有するスーパー癌幹細胞を同定し、その性質を解明することである。これまでに得られた結果から、症例ごとに異なる幹細胞性の高い集団や細胞を同定できていることが示されつつある。本研究では、上記の複数のアプローチを計画したが、そのいずれもが成功し、予想以上に順調に成果が得られている。癌幹細胞の性質は患者ごとに多様であると考えられるため、さらに10例程度症例を追加する予定である。並行して、既に培養している細胞を用いて、sphere単位での皮下移植による腫瘍形成、スーパー癌幹細胞のマーキング・その発現解析、幹細胞性の高い細胞からなる腫瘍のシングルセル解析を行う。また、スーパー癌幹細胞のマーキングにおいては、マーキングされた細胞が実際に幹細胞性の高い細胞であることを、造腫瘍性などを評価することによって証明する。最終的には得られた発現様式を様々な手法で解析することにより(例えばIPA解析やGO解析を補助として)、患者ごとに異なる未知の癌幹細胞マーカーの同定を行う。解析の結果、多くの症例で共通する未知の癌幹細胞マーカーの同定にも繋がる可能性も考えられる。

別の3例においては、二次元培養したすべての細胞に色素マーキングを施してからスフェロイドを作成すると、ほとんどの細胞は細胞分裂を繰り消した結果、色素を失うが、癌幹細胞はほとんど分裂をしないために色素が維持される。色素が維持された幹細胞性の高い細胞とマーキングが消えた分裂回数の多い分化した細胞のRNA sequenceを実行した。これまでに得られた結果からは、幹細胞性の高い集団や細胞を同定できていることが示されたため、個々の症例で働く個別の癌幹細胞の同定が達成される見込みである。今年度、1PDX(patient derived xenograft)の作成を10症例に行い、できたPDXを腫瘍細胞をバラバラに分離して、マトリゲル上で培養することに9例で成功した。23例において1-3個の少数のsphereをヌードマウス皮下に移植し、腫瘍を形成させ、bulkサンプルからRNA sequenceを行った。原発巣の遺伝子発現と比較すると、形成した腫瘍では一部の既知の幹細胞マーカー以外に複数の幹細胞マーカー候補遺伝子の発現が亢進していることが分かり、幹細胞性の高い腫瘍が形成されたことが示唆された。3色素で細胞マーキングを行った後にsingle cellからsphereを形成させることで、sphereの中で分裂回数の少ない幹細胞性の高い細胞のみをマーキングすることに成功した。そのうち3例において、マーキングされた幹細胞性の高い細胞とマーキングが消えた分裂回数の多い分化した細胞のRNA sequenceを行った。この系でもマーキングされた細胞において既知の幹細胞マーカーの発現と共に複数の幹細胞マーカー候補遺伝子の発現が亢進していた。4sphereをマウス皮下に移植して作成した腫瘍を細胞単位に解体し、single cell解析を行った。この結果から、遺伝子系譜図を作成し、幹細胞性の高い細胞集団とそれを構成する遺伝子群が明らかとなる。本研究の目的は、手術によって切除された大腸癌組織の中から、1個数個の細胞でマウスに腫瘍を形成する能力を有するスーパー癌幹細胞を同定し、その性質を解明することである。これまでに得られた結果から、症例ごとに異なる幹細胞性の高い集団や細胞を同定できていることが示されつつある。本研究では、上記の複数のアプローチを計画したが、そのいずれもが成功し、予想以上に順調に成果が得られている。癌幹細胞の性質は患者ごとに多様であると考えられるため、さらに10例程度症例を追加する予定である。並行して、既に培養している細胞を用いて、sphere単位での皮下移植による腫瘍形成、スーパー癌幹細胞のマーキング・その発現解析、幹細胞性の高い細胞からなる腫瘍のシングルセル解析を行う。また、スーパー癌幹細胞のマーキングにおいては、マーキングされた細胞が実際に幹細胞性の高い細胞であることを、造腫瘍性などを評価することによって証明する。最終的には得られた発現様式を様々な手法で解析することにより(例えばIPA解析やGO解析を補助として)、患者ごとに異なる未知の癌幹細胞マーカーの同定を行う。解析の結果、多くの症例で共通する未知の癌幹細胞マーカーの同定にも繋がる可能性も考えられる。
液体界面における球形微粒子の運動-ミクロスコピックな動的濡れの観点からの挙動解明

液体界面における球形微粒子の運動の決定に対する重要因子である凹凸面における接触線運動および過渡的な接触線・接触角挙動について分子動力学解析および可視化実験を行った.その結果,以下の知見を得た.ナノスケールの凹凸上における接触線の固着効果は凹凸の高さが流体間界面厚さに比べて小さいときには減じられることが明らかになった.また,ステップ状の接触線運動の速度変化時においては微視的(nmスケール)接触角でも過渡性が顕著に現れることがわかった.さらに,このような過渡性による影響は巨視的な体系(mmスケール)での実験においても観察された.液体界面における球形微粒子の運動の決定に対する重要因子である凹凸面における接触線運動および過渡的な接触線・接触角挙動について分子動力学解析および可視化実験を行った.その結果,以下の知見を得た.ナノスケールの凹凸上における接触線の固着効果は凹凸の高さが流体間界面厚さに比べて小さいときには減じられることが明らかになった.また,ステップ状の接触線運動の速度変化時においては微視的(nmスケール)接触角でも過渡性が顕著に現れることがわかった.さらに,このような過渡性による影響は巨視的な体系(mmスケール)での実験においても観察された.微粒子が着水する際には粒子表面のナノスケールの凹凸が粒子表面上の接触線の運動に極めて大きな影響を与える。本年度は、凹凸が接触線の運動および接触角挙動に与える影響について分子動力学を用いた解析を行うとともに、その際の挙動を支配する因子を明確にした。その結果、接触線の挙動は凹凸の高さに大きく依存することが明らかとなった。特に、流体間界面内に引き起こされる圧力の非等方性に起因する応力の非一様な分布が無視できない領域の厚さ(界面厚さ)と凹凸高さの相対的な大きさが重要な因子であることがわかった。すなわち、凹凸高さが界面厚さよりも大きい場合は接触線挙動はマクロ理論に従うが、凹凸高さが界面厚さと等しい、もしくはそれよりも小さい場合にはマクロ理論で予測される値からは外れ、凹凸がない場合の挙動(平板上における挙動)に近づくことがわかった。このような凹凸の高さに対する依存性を評価するため、前記の界面内応力分布を考慮したモデルを構築し、分子動力学計算の結果と比較したところ、両者の間にはよい一致が見られた。このモデルは、凹凸表面における接触線の運動を記述する際に用いることができるため、界面に衝突する粒子の運動を予測するためのモデルを構築する上で重要となる。また、グリセリンを用いた接触線近傍流れ場の可視化測定を行い、流体界面の汚れによるマランゴニカに対する粘性の影響およびこれまでに提案されている接触線近傍流れ場の線形予測モデルの適用性を検討した。測定には粒子画像流速測定法を用いた。その結果、流体粘度が大きい場合には粘性応力が卓越し、界面に汚染がある場合でも線形予測モデルが適用可能であることが明らかになった。微粒子が着水する際には粒子表面の接触線運動が粒子の運動に極めて大きな影響を与える.着水時には接触線速度は時間的に大きく変化するため,その過渡性に関する検討の必要性が高まっている.本年度は分子動力学を用いた微視的接触角に関する検討と,可視化実験による巨視的接触角における過渡性の影響についての検討を行った.分子動力学を用いた解析では,非混合二流体が互いに逆方向に動く平行平板間に挟まれた体系で行った.計算は予め平板が運動しない状態で平衡状態を維持し,その後に平板にステップ状の速度変化(0m/s→20m/s)を与えることで行った.その結果,平板が運動した直後の100psの間の接触角と接触線速度の関係は,定常時に得られる両者の関係から大きくずれることがわかった.このことは微視的接触角においても過渡性を考慮したモデル化が必要であることを示している.また,このような接触線速度の過渡的変化が接触角に与える影響について,巨視的な体系(ミリメータスケール)にて実験的に測定を行った.実験は鉛直に設置した直径2mmのガラス円柱を0.2mm/sの下降速度でエチレングリコールに浸入させ,その際のメニスカスの形成時における接触角および接触線速度の過渡変化を観察することで行った.接触線は円柱の着液後10ms程度の間に円柱表面を上昇し,定常に至った.その際の動的接触角と接触線移動速度の関係を調べた結果,特に着液直後については,接触角が接触線速度では一意に定まらない期間が見られた.この原因を明らかにするため,定常時における動的接触角と接触線速度の関係を用いて評価した接触角と,測定された接触角の偏差の時間変化を求めた.その結果,偏差の挙動は加速度の変動とほぼ同じものであることがわかった,このことは接触線の加速度が接触角に大きな影響を及ぼしていることを示している.
偏微分方程式の数値解析的研究

1.波の伝播を記述する、最も簡単な双曲型方程式である、伝播方程式を例に、それを近似する陰的差分スキ-ムを取りあげ、そこに含まれる2つのパラメ-タの最も適切な選び方についての数値解析的研究を行なった。差分スキ-ムの固有値分布を解析することにより、或る意味での最適スキ-ムを求めた。またその差分解の位相が波数に応じて遅れること(分散)、および振幅が減衰すること(散逸)も明らかにした。2.KーdV方程式を近似するZabuskyーKruskalスキ-ムによる差分解が、ある時間経過すると、急に不安定になる現象を調べ、丸め誤差の影影響、CFL比との関係を解析した。今後研究を進め、出来るだけ長時間安定に保つための汎用な方法を探る計画である。3.代用電荷法に基づく数値等角写像の研究を行ない、最適な電荷配置、領域の特異性の取り扱い方、誤差分布の特徴などについて、いくつかの知見を得、それを自動的電荷配置へ応用した。また積分方程式法との比較研究も行なった。4.理論的見地から、非包合的多重特性集合をもつ偏微分方程式の研究も行なった。解の接続、特異解の存在、零解の存在の観点から、それらが包合的多重特性集合をもつものとは全く違った性質を持つことを明らかにした。局所化の概念を用い、相関数の存在を示し、次に特性曲面にデ-タを与えて、解を一意に定めることが出来ることを示し、更にその解の存在域に関する精密な評価を与え、それらの応用として、複素および実領域での解の接続に関する結果を得た。
ラット顎下腺導管細胞におけるカルシウムシグナルのイメージング

唾液腺細胞の細胞内Ca^<2+>動態は、主に腺房細胞について調べられてきたが、導管細胞のCa^<2+>動態については十分に検討されていない。本研究では、ラット顎下線導管細胞と腺房細胞においてアゴニスト刺激を介した細胞内Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>] i)上昇反応に違いがあるか否か検討した。さらに導管細胞と腺房細胞の受容体mRNA発現量をRT-PCR法により解析した。Ca^<2+>イメージングシステムを用いた実験により、腺房細胞はタキキニン受容体およびムスカリン受容体刺激に対して高い反応性を持つことが明らかとなった。一方、導管細胞はα一アドレナリン受容体刺激に対して高い反応性を有していた。またイソプロテレノールを用いた実験により、導管細胞にβ-アドレナリン受容体を介した[Ca^<2+>]i上昇機構が存在する事が確かめられた。導管細胞と腺房細胞の受容体mRNA発現量を調べるためRT-PCRによる解析を試みた。実体顕微鏡下においてマイクロピペットを用いた分離法により導管細胞と腺房細胞を分離した。それぞれの細胞群からtotal RNAを用いて実験を行った。タキキニン受容体mRNAの発現は、腺房細胞に強い発現が観察されたが、導管細胞では極めて弱かった。またα_<1a>-アドレナリン受容体mRNAの発現は導管細胞に強い発現が観察された。一方、ムスカリン受容体サブタイプ(M_1、M_3およびM_5)のmRNA発現量には大きな差は認められなかった。またβ-受容体サブタイプ(β_1およびβ_2)のmRNA発現量にも大きな違いは認められなかった。本研究によって、導管細胞と腺房細胞では、受容体を介した[Ca^<2+>]i上昇反応に大きな違いがあることが明らかとなった。またサブスタンスPおよびエピネフリン刺激による[Ca^<2+>]i応答と受容体mRNA発現量はよく相関していた。一方、ムスカリン受容体刺激を介した[Ca^<2+>] i応答と受容体mRNA発現には相関は認められなかった。導管細胞と腺房細胞では、受容体発現量だけでなく受容体以後の情報伝達機構にも違いがある可能性が示唆された。唾液腺細胞における細胞内Ca^<2+>の動態については、主に腺房細胞について調べられてきたが、導管細胞のCa^<2+>動態については十分には検討されていない。本研究では、ラット顎下腺導管細胞と腺房細胞においてアゴニストによる細胞内Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]i)上昇反応に違いがあるか否かについて検証した。酵素処理により調製した顎下腺細胞にfura-2/AMを取り込ませ、アゴニスト刺激後の導管細胞と腺房細胞の[Ca^<2+>]i変化をCa^<2+>画像解析システムを用いて同時にモニターした。10nMサブスタンスP(SP)は腺房細胞の[Ca^<2+>]iを著明に上昇させたが、導管細胞の[Ca^<2+>]iにはほとんど影響を与えなかった。一方、カルバコール(CCh)およびエピネフリン(Epi)は導管細胞と腺房細胞の[Ca^<2+>]iを濃度依存的に上昇させた。[Ca^<2+>]i上昇の最大値を比較すると、CChによる[Ca^<2+>]i上昇は腺房細胞が導管細胞より高かったのに対し、Epiでは導管細胞が腺房細胞より約2倍高い[Ca<2+>]i上昇を示した。Epiによる[Ca^<2+>]i上昇がαおよびβ受容体のいずれの受容体を介する反応であるのかを調べるため、アンタゴニストを用いて検討した。フェントラミン前処置は、10μM Epiによる腺房細胞の[Ca^<2+>]i上昇を完全に抑制し、導管細胞の[Ca<2+>]i上昇を約65%抑制した。一方、プロプラノロール前処置は、腺房細胞の[Ca^<2+>]i上昇を全く抑制せず、導管細胞の[Ca<2+>]i上昇を約30%抑制した。導管細胞と腺房細胞では、受容体を介した[Ca<2+>]i上昇反応に違いがあることが確かめられた。腺房細胞はタキキニンおよびムスカリン受容体刺激に対し高い反応性を有していた。一方、導管細胞はαアドレナリン受容体刺激に対して高い反応性を持つことが明かとなった。唾液腺細胞の細胞内Ca^<2+>動態は、主に腺房細胞について調べられてきたが、導管紳胞のCa^<2+>動態については十分に検討されていない。本研究では、ラット顎下線導管細胞と腺房細胞においてアゴニスト刺激を介した細胞内Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]i)上昇反応に違いが有るのか否か検討するとともに、導管細胞と腺房細胞の受容体mRNA発現量を調べた。Ca^<2+>画像解析装置を用いた研究により、腺房細胞はタキキニン受容体およびムスカリン受容体刺激に対して高い反応性を持つことが明らかとなった。一方、導管細胞はαアドレナリン受容体刺激に対して高い反応性を有していた。またイソプロテレノールを用いた実験により、導管細胞にβアドレナリン受容体を介した[Ca^<2+>]i上昇機構が存在する事が確かめられた。

導管細胞と腺房細胞の受容体mRNA発現量を調べるためRT-PCRによる解析を試みた。導管細胞と腺房細胞を得るため、酵素処理によって得られた顎下線細胞群をパーコール遠心分離法により分離し、さらにマイクロピペットを用いて、導管細胞と腺房細胞を精製した。それぞれの細胞群からtotal RNAを用いて実験を行った。タキキニン受容体を特異的に認識するプライマーを用いてRT-PCRを行ったところ、腺房細胞に強いmRNA発現が観察されたが、導管細胞での発現は極めて弱かった。またαアドレナリン受容体mRNAの発現は導管細胞に強い発現が観察された。導管細胞と腺房細胞では、受容体を介した[Ca^<2+>]i上昇反応が大きく異なっていることが明らかとなった。またサブスタンスPおよびエピネフリン刺激による[Ca^<2+>]i反応と受容体mRNA発現量はよく相関していた。唾液腺細胞の細胞内Ca^<2+>動態は、主に腺房細胞について調べられてきたが、導管細胞のCa^<2+>動態については十分に検討されていない。本研究では、ラット顎下線導管細胞と腺房細胞においてアゴニスト刺激を介した細胞内Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>] i)上昇反応に違いがあるか否か検討した。さらに導管細胞と腺房細胞の受容体mRNA発現量をRT-PCR法により解析した。Ca^<2+>イメージングシステムを用いた実験により、腺房細胞はタキキニン受容体およびムスカリン受容体刺激に対して高い反応性を持つことが明らかとなった。一方、導管細胞はα一アドレナリン受容体刺激に対して高い反応性を有していた。またイソプロテレノールを用いた実験により、導管細胞にβ-アドレナリン受容体を介した[Ca^<2+>]i上昇機構が存在する事が確かめられた。実体顕微鏡下においてマイクロピペットを用いた分離法により導管細胞と腺房細胞を分離した。タキキニン受容体mRNAの発現は、腺房細胞に強い発現が観察されたが、導管細胞では極めて弱かった。またα_<1a>-アドレナリン受容体mRNAの発現は導管細胞に強い発現が観察された。一方、ムスカリン受容体サブタイプ(M_1、M_3およびM_5)のmRNA発現量には大きな差は認められなかった。またβ-受容体サブタイプ(β_1およびβ_2)のmRNA発現量にも大きな違いは認められなかった。本研究によって、導管細胞と腺房細胞では、受容体を介した[Ca^<2+>]i上昇反応に大きな違いがあることが明らかとなった。またサブスタンスPおよびエピネフリン刺激による[Ca^<2+>]i応答と受容体mRNA発現量はよく相関していた。一方、ムスカリン受容体刺激を介した[Ca^<2+>] i応答と受容体mRNA発現には相関は認められなかった。導管細胞と腺房細胞では、受容体発現量だけでなく受容体以後の情報伝達機構にも違いがある可能性が示唆された。
造血幹細胞に発現されている細胞表面機能分子の分子生物学的解析

1.マウスの骨髄中に存在する造血幹細胞に関しては、cーkit陽性分化抗原(Lin)陰性分画のうちScaー1陽性の細胞(cーkit^+Sca^-1+Lin^+細胞)に高濃度に未分化な造血幹細胞が含まれていることを明らかにした。一方で、cーkit^ーでCD4とGrー1抗原を弱く発現している細胞分画中に、CFUーC活性を持たないにもかかわらず長期間にわたって骨髄を維持できる細胞が存在することを示した。またヒト造血幹細胞についても、cーkit抗体で使えることができるようになったためCD34^+CD33^-cーkit^+の分画に最も未分化な造血幹細胞が含まれていることを明らかにすることができた。2.ヒトエリスロポエチン受容体をコードする遺伝子をクローニングし、3つの異なるタイプの受容体(EPORーF、EPORーF、EPORーS)の存在を明らかにした。EPORーTは細胞内実質部の大部分を欠損するエリスロポエチン受容体を、またEPORーSは可溶化型のエリスロポエチン受容体をコードする。EPORーFとEPORーTの発現は赤芽球系細胞の分化とともに変化し、T型からF型への移行が観察された。またF型T型ともにエリスロポエチント結合して細胞内に増殖シグナルを送ることができるが、T型を導入した細胞はF型よりもアポトーシスで死に易いことも明らかになった。以上より、エリスロポエチンによる赤芽球系細胞の分化と増殖にはEPORのaltetnative splicingを介した制御機構が存在することが強く示唆された。
DAP12のマクロファージにおける機能解析と新規会合分子の同定

DAP12は1998年Lanierらによって発表された新規NKレセプター会合分子である。我々はIL-2依存性CTLL-2とIL-2非依存性増殖を示す変異株との間のサブトラクションでITAMを含む膜蛋白を規定する新規遺伝子を単離していたがこのDAP12配列と同一であった。マウス各臓器におけるタンパクレベルでのDAP12の発現を検討したところ、腹腔マクロファージや、肺、骨髄等、マクロファージを多く含むような臓器にDAP12の強い発現が認められた。マウス骨髄球系細胞株であるM1細胞ではDAP12の発現がほとんど見られないが、LPS等の刺激によりマクロファージへ分化するとDAP12の発現が上昇する。そのためマクロファージへの分化の過程でDAP12のなんらかの関与があると考え、M1細胞にFLAG-DAP12を形質導入しM1細胞の変化を検討した。その結果、DAP12への刺激によりM1細胞のマクロファージ様細胞への劇的な形態変化と、CD86、Mac-1等、種々のマクロファージ表面抗原の発現が認められた。さらにこの時、免疫沈降による検討ではリン酸化DAP12と考えられる17KDaのリン酸化分子の発現が認められた。DAP12のITAM部分のチロシンをフェニルアラニンに変更した変異体ではこのリン酸化DAP12の発現は認められなかった。DAP12のリン酸化がマクロファージ分化への重要な役割を担っていることが示唆される。さらに、LPSを介したアポトーシスがこの変異体では抑制されることがわかった。LPSのレセプターとしてはCD14、Toll Like Receptorなどが報告されているがこれらの受容体シグナルとDAP12を介したシグナルのクロストークが予想される。現在、この変異体を使用しLPS刺激におけるDAP12ITAMモチーフを介したシグナル伝達について更に詳細な検討を加えているところである。DAP12の生体における発現を検討するためにGST-DAP12融合蛋白を作製し、これを用いて抗DAP12ポリクローナル抗体を得た。この抗体を用いてマウス各臓器におけるタンパクレベルでのDAP12の発現を検討したところ、腹腔マクロファージや、肺、骨髄等、マクロファージを多く含むような臓器にDAP12の強い発現が認められた。マウス骨髄球系細胞株であるM1細胞ではDAP12の発現がほとんど見られないが、LPS等の刺激によりマクロファージへの分化が見られるとDAP12の発現が上昇する。さらにこの時、免疫沈降による検討では17KDaのリン酸化分子の発現が認められた。この分子がDAP12自身がリン酸化されたものであるのか、新規リン酸化会合分子であるのかは不明であるが、DAP12のシグナルに重要であると考えられる。DAP12のITAM部分のチロシンをフェニルアラニンに変更した変異体ではこのリン酸化分子の発現は認められなかった。現在、この変異体を使用しマクロファージ分化におけるDAP12の役割とITAMモチーフを介したシグナル伝達について更に詳細な検討を加えているところである。

LPSのレセプターとしてはCD14、Toll Like Receptorなどが報告されているがこれらの受容体シグナルとDAP12を介したシグナルのクロストークが予想される。現在、この変異体を使用しLPS刺激におけるDAP12ITAMモチーフを介したシグナル伝達について更に詳細な検討を加えているところである。
高生体融合性一体型人工股関節用基盤材料の創出

本研究では、チタン(Ti)より優れた生体親和性を示すと共に、弾性率がTiより数GPa低いジルコニウム(Zr)に着目し、力学的特性のバランスに優れ高生体親和性を有する新規なベースバイオマテリアル(基盤生体材料)の創出を目的とした。その結果、20mass%Nbの含有量にて、Zr-Nb系合金のヤング率が最小値を示し、比較的良好な強度・延性バランスを示した。また、Zr-Nb系合金の骨融合性は、Nb含有量の増加(10mass%以上)により向上することが確認された。現在、硬組織代替インプラントでは、鉄(Fe)、コバルト(Co)およびチタン(Ti)を主成分とする金属製バイオマテリアルの応用が主流となっている。また、現在使用されている金属製バイオマテリアルのほとんどが構造用として既に応用されている材料を生体用として転用したものである。近年、上記材料により構成される硬組織(骨)代替インプラントを体内に埋入した場合、繰り返し負荷等による破断および骨と金属製バイオマテリアルとの弾性率の相違による骨吸収あるいは骨の薄化などの不具合が報告されており、最悪の場合、再手術を余儀なくされる。本研究では、Tiより優れた生体親和性を示すと共に、弾性率がTiより15GPa程度低いジルコニウム(Zr)に着目し、力学的特性のバランスに優れ高生体親和性を有する新規なベースバイオマテリアル(基盤生体材料)の創出を目的とした。Nb含有量が最も低いZr-5mass%Nb合金ではα+β相の混合組織を呈していたが、同含有量が10mass%以上の場合ではβ単相組織を呈していた。Nb含有量の増加に伴い、Zr-XNb合金の引張強さは線形的に増加したが、伸びは逆に低下する傾向を示した。この中で、Zr-20mass%Nb合金は、それぞれ約480MPaおよび約16%の引張強さおよび伸びを示し、他のZr-XNb合金と比較して良好な強度・延性バランスを示していた。同合金のヤング率は、他のZr-XNb合金と比較して最も低い値(約55GPa)を示していた。また、その疲労限は、約400MPaであった。この場合、既存の生体用チタン合金の引張強さおよび疲労限と比較してやや低い値であったが、溶体化時効処理などの熱処理による析出強化や他のβ安定化元素の添加による固溶強化等により、強度を改善することが可能であると考えられる。細胞毒性に関しては、全てのZr-XNb合金において、4日培養後の細胞数が2倍以上に増殖しており、Nb含有量の変化に対する細胞毒性の有意な差は認められなかった。硬組織(骨)代替インプラントを体内に埋入した場合、繰り返し負荷等による破断および骨と金属製バイオマテリアルとの弾性率の相違による骨吸収あるいは骨の薄化などの不具合が報告されており、最悪の場合、再手術を余儀なくされる。本研究では、Tiより優れた生体親和性を示すと共に、弾性率がTiより数GPa低いジルコニウム(Zr)に着目し、力学的特性のバランスに優れ高生体親和性を有する新規なベースバイオマテリアル(基盤生体材料)の創出を目的とした。Nb含有量の増加に伴い、Zr-XNb系合金の引張強さは線形的に増加したが、伸びは逆の傾向を示した。この中で、Zr-20mass%Nb合金は、それぞれ約480MPaおよび約16%の引張強さおよび伸びを示し、他のZr-XNb系合金と比較してやや良好な強度・延性バランスを示していた。同合金のヤング率は、他のZr-XNb系合金と比較して最も低い値(約58GPa)を示していた。細胞毒性に関しては、全てのZr-XNb系合金において、4日培養後の細胞数が2倍以上に増殖しており、Nb含有量の変化に対する細胞毒性の有意な差は認められなかった。日本白色家兎の大腿骨にZr-XNb系合金を埋め込んだ場合、Nb含有量の増加に伴い、骨融合性(異種材料と骨組織との化学的結合:オステオインテグレーション)が向上する。この場合、5から10mass%Nbの含有量を境に骨融合性が著しく変化していた。この結果より、合金化によって骨融合性を制御できる可能性が示唆された。