hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
地域経済の自立に向けた産業・企業振興に関する研究

5.地域経済活性化の1施策として注目されているべンチャー支援については,当該地域の出身者のいわゆるUターン技術者にターゲットを絞った支援システムの構築が効果的である。本研究プロジェクトは包括的な視点から地域の産業・企業の現状と問題点を解明し、地域経済の発展に必要な政策を検討することを目的として研究した。具体的な研究課題は(1)地域産業構造のマクロ分析,(2)企業行動分析,(3)政策立案プロセス分析から構成される。このうち(2)および(3)では,地域企業の市場行動と営業体制について,北海道を対象として実態把握し、さらに,こうした市場行動に関わって国や地方自治体が行っている経済活性化の施策について政策効果を把握し、企業行動要因との関連性を分析した。主要な成果は次の通りである。1.新規顧客の比重が低い企業,換言すればリピートオーダー比率の高い企業ほど,官公庁の需要に依存する程度が強く,こうした企業は市場行動面で問題を多く抱えている。2.地域外市場への進出はこうした企業にとって有効な戦略方向である。ただし,地域外市場進出に不向きな業種も存在する(金融・保険,不動産,電力ガス等)。しかし,建設業も含めて地域外進出は可能であり,その成功事例も認められる。3.地域外市場進出に失敗するのは次のような場合である。(1)旧態依然とした,地域固有の慣習や閉鎖性に依存している。(2)他力本願的な道外進出である。(3)営業部門の協力体制や販路開拓の積極さがない。(4)顧客市場とのコミュニケーション・パス(顧客対応・苦情処理部門など)が十分でない。(5)道外の優良な流通業者と連携できない。4.地域外市場への進出の成功要件として次の5項目を指摘できる。(1)戦略を明確にすること,(2)組織全体への戦略の浸透,(3)営業部門における営業のプロ意識の醸成,(4)顧客情報の開示,(5)新商品アイデアの創出に対する積極さ。
ゲノムワイド解析から同定した新規高血圧遺伝子：ATP2B1,LPIN1の機能解析

ATP2B1遺伝子の血管平滑筋、血管内皮、遠位尿細管、全身ヘテロの臓器特異的ノックアウトマウスの解析および、期間内に血管平滑筋特異的遺伝子過剰発現マウスの作成に成功し、現在、機能解析を進めている。LPIN1遺伝子に関しては、その発現に日内変動があることが示されており,期間内に血圧概実リズム制御へ果たすLPIN1の役割を解明し,新たな高血圧発症の機序の一部を解明した。現在、これまでの結果で論文投稿準備中である。上記が本研究の期間内のまとめである。今回の科研費で全世界的にも確認されてきた高血圧関連遺伝子(ATP2B1,LPIN1)の機能を解明し、血圧上昇のメカニズムを明らかにして、臨床への応用を目指している。以下の2つを研究のテーマとした。ATP2B1遺伝子の全身ヘテロノックアウトマウス、及び遠位尿細管集合管特異的ノックアウトマウスを作製し、機能解析を行うLPIN1遺伝子の昇圧メカニズムの同定(1)ATP2B1遺伝子の全身のヘテロノックアウトマウスは、通常状態においてコントロール群と比較して血圧が上昇していることが示され、そのメカニズムの一部にNOの産生障害が関連している事が示唆された。また、カルシウムホメオスタシスを担う遠位尿細管でのATP2B1遺伝子ノックアウトマウスの解析では、血圧への関与は少なく,カルシウム排泄・尿濃縮の調整に関与する可能性が示唆された。平成25年度では特に(1)の成果の一部として2014年Journal of Hypertensionに報告した。(2)LIPIN1欠損マウス(fld/fld)と野生型(WT)および表現型が同一であるヘテロノックアウトマウス(fld/+)をコントロール群とし血圧およびホルモン採血や尿中カテコラミンを比較検討した。血圧はテイルカフ法(12-16週令)では、fld/fldマウスでfld/+マウスと比べて血圧の上昇を認め、脈拍は高い傾向を認めた。Radiotelemetry法(20週令)ではfld/fldマウスは血圧上昇傾向を呈した。また、通常食において、fld/fldマウスでは尿中ノルアドレナリンの有意な上昇を認めた。平成25年度はLPIN1遺伝子は交感神経活性を介し、高血圧の発症に関連する可能性を示した。現在、ATP2B1遺伝子に関して、(1)血管平滑筋(2)全身ヘテロ(3)血管内皮細胞(4)遠位尿細管の4系統のノックアウトマウスを作成し機能解析を行っている。(1)降圧薬への応答性の違いを、テレメトリー法で測定している。Ca拮抗薬、α遮断薬、β遮断薬、ARB、利尿薬を投与し、応答性が異なれば、テーラーメイド医療への応用が期待できる。(2)通常状態においてコントロール群と比較して血圧が上昇していることが示され、そのメカニズムの一部にNOの産生障害が関連している事が示唆された。このことをJournal of hypertension 2014Jul;32(7):1415-23に報告した。(3)(4)は、血圧とCa代謝(骨、血中・尿中Ca)の関連を解析し、現在投稿中である。また、ヒトにおける降圧薬へのATP2B1遺伝子のSNPsによる応答性の違いを投稿準備中である。さらに、血管平滑筋細胞で同遺伝子の過剰発現マウスを作成し、現在G2世代、4ラインの系統を維持できるようになった。今後、発現量のチェックと機能解析を行っていき、どのような表現型のマウスになるか確認する。LPIN1遺伝子に関して、ノックアウトマウスにテレメトリー法による血圧測定を行った。血圧高値を確認した。現在、ヒトSNPとの関連及び、マウスでの血圧測定の結果を投稿準備中である。同時に、血圧高値の原因をホルモン採血や行動解析等行っている。「ゲノムワイド解析から同定した新規高血圧遺伝子:ATP2B1,LPIN1の機能解析」を近年の継続的テーマとして取り組んできた。ATP2B1遺伝子に関しては、全身ヘテロノックアウトマウスの血圧上昇及びそのメカニズムについて、2014年のJournal of Hypertension誌に報告した。(Fujiwara A, et al. J Hypertens. 2014 Jul; 32(7): 1415-23)その後、現在、遠位尿細管特異的ノックアウトマウスに関して、投稿準備中である。新たな研究として、ATP2B1遺伝子とCAVI検査との関連を開始した。約1000例を目標にサンプリング開始したが、現在1300検体採取し1000検体分をDNAに抽出し、今後SNPタイピング予定である。そして、学会発表及び論文発表をする予定である。現在、これまでの結果で論文投稿準備中であり、さらに,時間という新たな視点から高血圧の発症および進展機序を明らかにすることにより,治療開発を目指す.上記が本研究の期間内のまとめである。

ATP2B1遺伝子の血管平滑筋、血管内皮、遠位尿細管、全身ヘテロの臓器特異的ノックアウトマウスの解析および、期間内に血管平滑筋特異的遺伝子過剰発現マウスの作成に成功し、現在、機能解析を進めている。LPIN1遺伝子に関しては、その発現に日内変動があることが示されており,期間内に血圧概実リズム制御へ果たすLPIN1の役割を解明し,新たな高血圧発症の機序の一部を解明した。現在、これまでの結果で論文投稿準備中である。上記が本研究の期間内のまとめである。上記、研究実績概要で述べたとおり、組織特異的ノックアウトマウスの機能解析は進行し、報告してきた。さらに、本年度作成した平滑筋特異的トランジェニックマウスの作成に成功し4系統のライン作成ができた。来年度はトランスジェニックマウスの機能解析を予定している。またヒトサンプルについても、準備ができている。そのほか、論文報告・学会発表も予定通り行え、おおむね順調である。27年度が最終年度であるため、記入しない。高血圧ATP2B1遺伝子と薬剤応答性のマウス・ヒトにおける検討。また、CAVI(Cardio Ankle Vascular Index)との関連をヒト集団を用いて検討し、同遺伝子の動脈硬化性病変へ与える影響を検討する。LPIN1遺伝子に関しては、アディポサイトカインやサーカディアンリズムとの関連が示唆される実験結果を得ており、それらを詳細に検討していく。前者はテーラーメード医療、後者は新規パスウェイの解明を目指す。それぞれの遺伝子欠損マウスの飼育、解析が順調に行えている。従来より成功していたATP2B1遺伝子の血管内皮特異的ノックアウトマウス、血管平滑筋特異的ノックアウトマウスも解析に十分な飼育ができており、さらなる機能解析が期待できる。および、LPIN1遺伝子の解析も平成26年度にその一部を報告できる目処がたっている。平成25年度は全身ヘテロノックアウトマウスの解析でATP2B1とNOの産生が生体内で関連していることを示した。しかしながら,ATP2B1とeNOSの相互作用はよくわかっていない.そのため,血管内皮特異的ATP2B1KOマウスを用いて,その血圧変化やメカニズムについてのさらなる研究を行っていく。遠位尿細管集合管特異的ノックアウトマウス、集合管特異的ノックアウトマウスをつかった研究では、カルシウム排泄のポンプ機能解明をおこなっていく。また、ATP2B1遺伝子は細胞内から細胞外へカルシウムイオンを排泄するPMCA1という蛋白をコードする遺伝子であるので、Ca拮抗薬を含む降圧薬への反応性に違いがあるかをヒト検体及び、血管平滑筋マウスにおいて解析を予定している。ATP2B1遺伝子の遺伝的バリエーションの情報を得ることは,患者の個人差に配慮したテーラーメード医療の応用が期待できる。さらにノックアウトマウスだけでなく、組織特異的過剰発現マウスを作成を予定している。LPIN1遺伝子は従来はインスリン抵抗性による動脈硬化に関連するものであると推測していたが、平成25年度の結果では、交感神経活性を介した反応も高血圧の発症に関与している可能性が示唆された。
専門職基準に基づく校長の養成・採用・研修プログラムの開発に関する実証的研究

(1)諸外国における校長の養成・研修システムと専門職基準について調査を行い、その制度と実態を明らかにした。(2)日本教育経営学会が作成した校長の専門職基準に照らして、わが国の教育委員会等における管理職研修の内容を調査し、その特色や改善点を明らかにし、教育委員会と共同で管理職研修プログラムを開発した。(3)大学院における管理職養成・研修プログラムの教授法開発に関して調査を行った。(4)校長の専門職基準に関する解説書を作成した。初年度にあたる平成22年度には、まず、6月に、日本教育経営学会において、フォーラム「校長の専門職基準-校長の養成・研修にどう生かすか-」を開催し、研究を進める上での示唆を得た。その後、メンバーによる研究会を開いて調査計画を立案し、校長の専門職基準及び学校管理職研修についての、国内及び外国の調査を実施した。まず、国内調査については、全国の都道府県及び政令市すべての教育センターに対してアンケート調査を実施した。その結果、全国の管理職養成の実施態と課題が明らかになった。また、それらと日本教育経営学会が作成した校長の専門職基準との対応関係も明らかになった。さらに、それらの中から15のセンターを取り上げ、訪問調査によって、より深くその実態を調査した。外国調査については、アメリカ、イギリス、中国の校長の専門職基準について調査を行った。各国の学校管理職の状況と改革動向、および、校長の専門職基準の内容と活用実態が明らかになった。平成23年度は、まず、6月に、前年度に実施した学校管理職研修及び校長の専門職基準に関する国内外調査の概要を日本教育経営学会大会で報告した。その後、研究メンバーが分担して、2009年に日本教育経営学会が作成した「校長の専門職基準」について、その一部修正版、英訳版、解説書、の三つを作成した。また、前年度の調査の補充調査も実施した。前年度は、東日本大震災のため、中間報告書を出せなかったため、前年度と本年度の2年間の研究成果を合わせて、中間報告書(本体、別冊)を3月末にとりまとめた。中間報告書の本体は、『専門職基準に基づく校長の養成・採用・研修プログラムの開発に関する実証的研究(その1)』と題するもので、内容構成は、以下のようになっている:第I部我が国における学校管理職養成・研修の実態と校長の専門職基準、第II部諸外国における校長の専門職基準と管理職養成改革の動向、第III部日本教育経営学会による校長の専門職基準(2009年版)の一部修正案、第IV部日本教育経営学会による校長の専門職基準(2009年版)の英訳試案、第V部校長の専門職基準解説書。さらに、別冊として、『「校長の専門職基準」準拠ケースメソッド事例集』をまとめた。これは、参加型の管理職養成・研修プログラムとして注目されている「ケースメソッド」を実施するためのケースを、校長の専門職基準に対応させて開発したものである。専門職基準に対応させたケースメソッドのプログラム開発は、我が国においては初めての試みである。本研究は、日本教育経営学会が作成した「校長の専門職基準」に基づき、専門職としての校長にふさわしい養成・採用・研修プログラムを開発するための基礎的調査とプログラム開発を行うことが目的であった。3年間の研究の結果、第一に、現在、教育委員会等で行われている管理職研修と専門職基準との内容的な照応を行い、現在の管理職研修を専門職基準の視点でその実態を明らかにすることができた。第二に、諸外国の校長の養成・研修と専門職基準の実態を明らかにすることができた。特に、アメリカ、イギリス、オーストラリア、カナダ、中国、韓国について明らかにし、我が国の専門職基準の内容や役割を検討・普及させるための視点を得ることができた。第三に、校長の専門職基準に準拠したケースメソッド事例集を作成したことである。管理職研修において使用できるような事例を作成したが、その基礎に、専門職基準を置いており、このような試みは本邦初である。第四に、専門職基準の解説書を作成したことである。専門職基準そのものは、非常にシンプルに書かれているため、その具体的な内容や、事例等、より詳しい解説書が必要とされていた。大学院や教育委員会で、管理職の養成・研修プログラムを作成するために利用できるものである。第五に、教育委員会との連携の下に、校長の専門職基準をベースにした教育委員会における管理職研修プログラムの開発を実際に行ったことである。こうした試みも、我が国では初めての試みであった。以上のように、本科研では多くの成果を生み出すことができたが、こうした成果は、3冊の研究成果報告書と、日本教育経営学会大会における3回のフォーラムで発表した。3月末にこの2年間の調査研究成果をとりまとめることができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度である本年度においては、校長の専門職基準に対応した管理職(校長、教頭、教務主任等)養成・研修プログラムの開発を予定している。さらに、校長の専門職基準の今後の在り方について、最終提言を行う予定である。
転写因子Fra1による骨硬化症の発症時期同定

2量体の転写因子AP-1のサブユニットのひとつであるFra1を、体中の細胞で高発現するトランスジェニック(Tg)マウスは、著明な骨量増加を示す。すなわち、Fra1は重要な骨形成促進因子として知られている。この骨硬化症の発症時期を解明するため、昨年度は、麻酔下で実験小動物を撮影可能なX線CT装置LaTheta(Aloka)を利用し、経時的に脛骨骨密度を測定した。平成18年度は、その過程で明らかになった、3つの知見を掘り下げて解析した。1.高解像度のマイクロCTによる解析:LaThetaの空間分解能は、60マイクロメータが限界であった。そこで、GE社のeXploreLocus(解像度27マイクロメータ)および、コムスキャンテクノ社のScanXmate(解像度5マイクロメータ)を用いて、生体ではなく摘出骨による解析を行った。その結果、生後一ヶ月後から組織学的に認められた骨量の増加は、骨形成のと共に、胎児期からすでに始まっていることが示された。2.高解像度のCT解析により、皮質骨内の血管孔と思われる管腔構造の走行異常が見出された。この血管走行異常が骨に特異的か否かを明らかにするために、網膜の血管走行を解析したところ、Fra1 Tgマウスでは、網膜の血管走行にも異常が認められた。その理由はいまのところ分かっていない。3.骨量増加が初期から起こることがわかったので、骨折治癒過程が促進しているかどうかを検討した。脛骨の横骨折モデルの解析から、予想に反して仮骨形成が遅延していることがわかり、また、炎症反応の低下が認められた。骨折後の炎症反応が、治癒過程の惹起に必要であることが示唆された。転写因子AP-1に属するFra1はトランスジェニック(Tg)マウスが著明な骨量増加を示すことから、Fra1は重要な骨形成促進因子として知られている。この骨硬化症の発症時期を解明するため、麻酔下で実験小動物を撮影可能なX線CT装置LaTheta(Aloka)を利用し、経時的に脛骨骨密度を測定した。生後3日齢から9週齢までのFra1 Tgマウス(n=15)ならびに野生型マウス(n=15)の脛骨を麻酔下で週2回、3週間にわたり測定した。骨密度による成長曲線を作成したところ、雌雄の差なく生後4週よりFra1 Tgマウスの骨密度増加は著明となった。次にLaThetaの測定結果を検証すべく、他機種のマイクロCTにより摘出骨による骨密度評価をおこなったところ、Fra1 Tgマウスの皮質骨は厚くなっているものの、皮質骨密度の増加は見られず、皮質骨内に管腔構造が多数見られた。これら管腔は血管孔と思われ、その本数や、方向性を解析したところ、野生型の脛骨骨幹部では骨髄から骨外膜へ貫通する方向のものが多く、一方Fra1 Tgマウスの皮質骨内血管は骨軸と平行に走っていた。野生型でも骨幹端部では血管が骨軸と平行に走っている傾向があることから、Fra1 Tgマウスの皮質骨は骨幹部も骨幹端に似た構造を持っていることが明らかとなった。この血管走行の差異は、骨硬化症による骨量増加により誘導された2次的な変化か、または成長にともなう血管自体の異常かは現段階では明らかでない。そこで平成18年度に骨以外での組織中の血管構造の解析をおこなう予定である。また、皮質骨内血管の走行異常が骨髄の持つ造血能にいかに影響するかを骨髄細胞の解析をすすめる予定である。
乾燥地農業地域における砂丘地の水循環と水資源評価

乾燥地灌漑農地の塩類地、砂丘地、草原など土地利用型の分布を標高、勾配、標高差などの地形的特徴量から推定する方法を示し、塩類地面積の経年変化を推定するとともに、砂丘と湖が隣接して立地することを統計的に示した。部分地域ブロックごとに流入と流出量の差である水収支を求めると、水収支の多いところで、砂地率や塩類地化率が大きいことが分かった.砂丘の中腹部、斜面下端、周辺地における地下水位の連続観測結果からその変動は灌漑による年間変動、降雨に伴う変動、蒸発散に伴う日変動から構成され、砂丘中腹部が灌漑水を貯留し、周辺地へ供給する役割を果たしていることが明らかになった。平成26年度は以下の3項目を目標に研究を進めた。(1)内蒙古河套灌区を対象に、砂丘とその周辺地域の水循環構造を明らかにし、砂丘の地下水涵養機能を定量的に評価する。(2)砂丘地・湖の空間的分布の特徴と地形特性の関係を把握する。(3)衛星画像を利用して地域の蒸発量分布を計算し、地域を水資源涵養型と水資源消費型に分級してマッピングする。(1)の目標を達成するために、河套灌区西部、抗錦后旗に試験地砂丘を設定した。砂丘中腹、砂丘下部、砂丘隣接塩害地に地下水位・塩分濃度観測ロガー、土壌水分量・土壌塩分濃度・地温測定器を設置して連続観測し、地下水の動態の把握を試みた。その結果、地下水位は砂丘から周辺塩害地に向かって低下していることから砂丘から周辺に向かって流れていることが分かった。また、降雨イベント時の地下水位変化の関係から、砂丘に降った降雨が砂丘の浅層地下水を涵養していることが分かった。引き続き観測を続け、涵養量を定量的に推定する方法を明らかにしたい。(2)の目標に関しては、灌区全体に渡ってその平均的地形傾斜を表現する基準面を設定し、それからの標高偏差と各種土地利用の関係を検討した。その結果、基準面と比べ水面(湖)は最も低い位置にあり、ついで塩害地がやや低い位置に、農地と砂地は相対的に高い位置に分布するなど、微起伏と土地利用との関連性が明らかになった。(3)については、灌区を排水ブロックに分割しMODIS画像から計算した蒸発量と降水量、灌漑水量、排水量を用い、ブロックごとの水収支を算定した。その結果から、砂地は塩害地よりも(降水量ー蒸発量)の値が大きく涵養的であること、灌区西部では水収支が充足傾向にあり、塩害地面積率が高い灌区東部では不足する傾向にあることが分かった。H27年度は、以下の目標のもと、研究を進めた。(2)砂丘における蒸発抑制機構を明らかにする。(3)砂丘地・湖の空間的分布の特徴と地形的特徴を把握する。(4)衛星画像を利用した地域蒸発量計算モデルを適用し、水収支から水資源涵養量を評価し、水資源涵養量で地域を分級してマッピングする。上記(1)の目標を達成するために、河套灌区西部、抗錦后旗に2カ所の試験地砂丘を設定し、砂丘中腹、砂丘下部、砂丘隣接塩害地で地下水位、土壌水分量、地温を連続観測し、地下水の動態の把握を試みた。比産出率を用いて地下水位変化から地下水涵養量を求めたところ、対象砂丘は年間470mmの地下水涵養量をもつものと推定された。(2)に関しては、温度水分拡散係数をカラム実験で測定し、地温度勾配による水分フラックスを求めたところ、砂丘地では下向きフラックスが生じ、蒸発を抑制していることが分かった。(3)について、1990、2000、2014年の衛星画像を用い、1土地利用の経年変化、2土地利用の形成要因、3土地利用を変化させた要因を分析した。その結果、塩害草地が減少し、農地が面積が増大していること、湖水は農地と比べ標高差が低い窪地に形成され、塩害地は用水路からの距離の大きい位置に形成されること、農地から塩害地・塩害草地への変化は傾斜、曲率、排水路からの距離が大きい所で生じることが分かった。(4)に関しては、水収支(=地下水涵養量)=降水量+用水量ー(排水量+蒸発量)を説明変数として農地から土地利用変化をロジット回帰分析したところ、地下水涵養量の少ない農地で、塩害裸地、塩害草地への変化が生じることが分かった。(理由)新たな調査対象砂丘を1カ所加えて、砂丘地における地下水位観測を拡大して行っているが、沙壕渠試験場の協力を得て順調にデータが蓄積できている。また、砂丘地の地温勾配が蒸発抑制機構として働いている事実も確認できた。ただし2014年度に砂丘地に設置した土壌水分計が故障し、データが取得できない問題が生じている。本研究の主要な目的は以下の通りである。(1)地形・地理空間情報による塩分集積立地要因の分析と砂丘地・湖の立地特徴の分析。(2)衛星画像から蒸発量分布を計算し、地域ブロックごとに砂丘地による地下水涵養量を推定する。

(3)内蒙古河套灌区を対象に、地下水の動態に関する現地調査を行い、砂丘とその周辺地域の水循環構造を明らかにし、砂丘の地下水涵養機能を定量的に評価する。(1)の目的を達成するために、衛星画像、地形情報データを収集するとともに、灌漑区全体をカバーするように設定した移動経路周辺での写真撮影で土地利用の現状、土壌採取により塩分集積状況を把握した。土地利用8種(塩害草地,宅地,宅地土,水面,農地,塩害地,砂地)を,標高,標高差,傾斜,曲率,累積流量,用水路距離,排水路距離の計7変数としたNested Logitモデルで適合できることを示した。砂地ポリゴンの重心から7種の土地利用の出現する距離と方位角を分析した。砂地と湖の集塊的立地を確認した。(2)については、各ブロックおよび画素単位の水収支を各種土地利用面積率を説明変数とする重回帰分析を行って、灌区全体の広域水収支マップを作成し、砂丘の地下水涵養量を推定した。(3)については、過去2年間行ってきた2か所の砂丘地における地下水位の連続観測を継続するとともに、現地の土を用いて降雨浸潤試験、蒸発試験、温度勾配下での土壌水分移動実験を行い、基盤土である沖積土と比較して砂丘砂の水分移動特性の特徴を解明した。地下水位の変動は1年間を通じた長期的変動、2降雨イベントに伴う変動、3蒸発散に伴う日変動、から合成されていることが分かった。帯水層の比産出率を室内実験で決定し、砂丘中腹、砂丘下端、砂丘に隣接する塩害地における地下水涵養量と蒸発散量を計算した。それらを互いに比較し、砂丘が地下水を涵養する機能を有することを実証した。乾燥地灌漑農地の塩類地、砂丘地、草原など土地利用型の分布を標高、勾配、標高差などの地形的特徴量から推定する方法を示し、塩類地面積の経年変化を推定するとともに、砂丘と湖が隣接して立地することを統計的に示した。部分地域ブロックごとに流入と流出量の差である水収支を求めると、水収支の多いところで、砂地率や塩類地化率が大きいことが分かった.砂丘の中腹部、斜面下端、周辺地における地下水位の連続観測結果からその変動は灌漑による年間変動、降雨に伴う変動、蒸発散に伴う日変動から構成され、砂丘中腹部が灌漑水を貯留し、周辺地へ供給する役割を果たしていることが明らかになった。(1)対象である内蒙古、河套灌区での現地調査に当たり、中国側カウンターパートとして内蒙古農業大学、および沙壕渠試験場との間に研究組織が確立し、調査内容について同意が得られた。(2)地下水観測孔の設置など、現地調査が予定通り進み、データが持続的・定期的に得られている。(3)これまでに得られたデータを用いて中間的な結果を学会で発表するため投稿を行っている。(1)平成26年度、27年度に設置した2つの砂丘において、それぞれ砂丘斜面、砂丘下端、周辺塩害地の3点で地下水位観測を継続する。加えて内蒙古農業大学の協力を得て砂丘地下水位の既往データの収集に努める。これらのデータから砂丘地下水の移動方向の傾向を推定する。(2)灌漑期間中の降水量データを収集し、蒸発量推定モデルから推定した蒸発量、取水量・排水量を水収支式に組み込んで、それぞれの砂丘の地下水涵養水量を評価する。(3)砂丘地およびその周辺地から採集した土壌を用いて、温度勾配下の水移動実験を行い、沙丘地の蒸発抑制機構の特徴を明らかにする。(4)平成26年度に得た気象観測データ、地温データおよび衛星画像データを用いて、ピクセルごとに蒸発量を推定し、涵養・消費水量を地域全体でマッピングする。(5)平成27年度に得られたデータを整理、検討し、成果を学会で発表する。28年度が最終年度であるため、記入しない。農業土木学(1)平成26年度に得られたデータを整理、検討し、成果を学会で発表する。(2)前年度に設置した地点で地下水位観測を継続する。
幽門腺型粘液の糖鎖αGlcNAcの発現低下とがんの悪性化の分子機構の解明

本研究では、胃、膵臓、子宮頸部のがん病変、前がん病変におけるαGlcNAcの発現低下について、予後を含めた悪性度の関係まで調べ、対象臓器も肺、胆道などに広げて検討することを1つの目的とする。がん由来の培養細胞株を用いて、αGlcNAcの発現に呼応する細胞機能の変化と、関連する遺伝子発現やリン酸化の変化を調べ、αGlcNAcががんの悪性化を抑制する分子生物学的な機序を明らかにし、αGlcNAcの発現変化を基盤とした、新たな治療標的の知見を得ることが2つ目の目的である。本研究で、がんの悪性化に関わる糖鎖修飾の変化が臓器横断的に理解されれば、糖鎖修飾を鍵にした新たながんの治療標的の研究の基盤になる。
ウシの成長に伴う脂肪前駆細胞増殖分化活性の変動の関する研究

1.肉牛の脂肪前駆細胞および脂肪細胞が動物の成長あるいは肥育によって量的にどのように変化していくか調べるため、黒毛和種において摂取試料とさまざまな月例および部位における脂肪組織のcellularityとの関係について検討した。結果、東低の磁気および部位の脂肪細胞の大きさは摂取試料の影響を受けることが示された。2.ウシの筋肉から筋衛星細胞を単離・培養し、培養液にtransdifferentiationを引き起こす可能性のある強力な脂肪細胞分化誘導物質であるチアゾリジンジオンを添加しても筋分化に影響を及ぼさず、また脂肪細胞分化を誘導しなかった。ことからラットで認められている筋芽細胞から脂肪細胞へのtransdifferentiationはウシでは生じない可能性が示唆された。3.ホルモンや微量栄養素がウシ脂肪細胞分化に及ぼす影響について検討した。チアゾリジンジオン等のPPARγリガンドは脂肪細胞分化を促進し、ビタミンAは抑制、ビタミンCは促進することが確認できた。またインスリン様作用、増強作用を示す亜鉛は脂肪細胞分か促進作用を示すことが解かり、その作用の一部は一酸化窒素(NO)産生抑制を介していることが示唆された。さらにこのNO自身の脂肪細胞分かへの影響について検討した。筋肉および脂肪細胞において誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)および上皮型一酸化窒素合成酵素(eNOS)の発現を確認し、NO供与体であるNOC18は脂肪細胞分化を抑制し、NOS阻害剤であるL-NAMEは促進することが示された。これらの結果から、細胞により産生されるNOは脂肪細胞分化を抑制することが明らかとなった。黒毛和種去勢牛30頭を育成期粗飼料多給/肥育期粗飼料多給(I)区、育成期粗飼料多給/肥育期濃厚飼料多給(II)区、育成期濃厚肥料多給/肥育期粗飼料多給(III)区、育成期濃厚飼料多給/肥育期濃厚飼料多給(IV)区育成期著しい濃厚飼料多給/肥育期濃厚飼料多給(V)区に割り当てた。供試牛を各区3頭ずつ14、26ヶ月齢でと殺し、腎臓周囲脂肪、皮下脂肪、最長筋内脂肪組織を採取した。これらをオスミウム固定後にコールターカウンターを用いて、脂肪細胞の細胞径を測定した。腎臓周囲脂肪組織において14ヶ月齢の脂肪細胞径はV区と比較し、他の区で小さくなった。一方、26ヶ月齢では全ての区で細胞径の減少が認められ、いずれの区間においても差が認められなくなった。皮下脂肪組織の細胞径は14ヶ月齢では給与飼料の影響を受けなかった。一方、III区では26ヶ月齢では細胞径が減少する傾向が認められ、V区と比較し明らかに小さかった。筋肉内脂肪組織の細胞径は14ヶ月齢では給与飼料の影響が認められなかった。I、IV、V区は14ヶ月齢時と26ヶ月齢時で細胞径に明らかな差は認められなかったが、II、III区では減少傾向を示した。その結果、II、III区の細胞径はI区と比較し小さかった。以上の結果から、特定の時期および部位の脂肪細胞の大きさは摂取飼料の影響を受けることが示された。強力な脂肪細胞分化誘導物質であるチアゾリジンジオンをウシ筋衛星細胞の培地に添加しても、筋分化に影響を及ぼさず、また脂肪細胞化を誘導しなかった。ラットで認められている筋芽細胞から脂肪細胞へのtransdifferentiationはウシでは生じない可能性が示唆された。亜鉛はインスリン様作用やインスリン増強機能を有し、3T3-L1細胞において脂肪細胞分化を促進することを報告したが、ウシはインスリンに対する感受性が低く、亜鉛がウシの脂肪細胞分化に効果があるかどうかは不明である。そこで、ウシ脂肪前駆細胞の初代培養系を用いて、亜鉛が脂肪細胞分化に及ぼす影響について検討した。また、亜鉛は一酸化窒素合成酵素(NOS)活性を抑制することが知られており、亜鉛がNO産生に及ぼす影響、およびNOが脂肪細胞分化に及ぼす影響についても併せて検討した。

肥育牛の筋間脂肪組織からコラゲナーゼ消化により脂肪前駆細胞を含む間質脈間系細胞群を調整し、これを播種しコンフルエントまで培養した後、第一実験ではインスリンを含む5%FBS含有DMEM/Ham'sF12培地と含まない培地の両方に塩化亜鉛を0から100μMの濃度で添加し、14日間培養した。また第二実験ではNOS阻害剤であるL-NAMEを0μMから500μMの濃度あるいはNO供与体であるNOC18を0から100μMの濃度を含む培地に置換し、14日間培養した。いずれの実験でも脂肪細胞分化の生化学的な指標であるGPDH活性および細胞中トリアシルグリセライド(TG)含量を測定した。また、培地中NO濃度をNO_2+NO_3濃度をグリース法により測定することで推定した。結果、インスリンの有無に関係なく、亜鉛の添加によりGPDH活性および細胞中TG含量は濃度依存的に上昇し、また、NO産生は濃度依存的に抑制された。さらにL-NAME添加によりNO産生は阻害され、GPDH活性および細胞中TG含量は上昇し、NOC18添加によりGPDH活性および細胞中TG含量は有意に減少した。このことから、亜鉛による脂肪細胞分化促進作用の一部はNO産生抑制を介していることが示唆された。ウシの初代脂肪前駆細胞培養系ではNOS阻害剤により分化が促進されたことから、NOが脂肪細胞分化に影響を及ぼすことが示唆された。また近年、ヒトやラットの脂肪組織においてNOSの存在が明らかとなり、産生されたNOにより脂質代謝が調節されている可能性が示唆されている。ウシの脂肪組織においても、脂肪組織から産生されるNOがパラクリン的に脂肪前駆細胞分化に影響を及ぼしている可能性が考えられる。そこでまずウシの脂肪組織におけるNOSの発現を検討した。肥育牛の筋間脂肪組織から脂肪前駆細胞を含む間質脈管系細胞群を調整し、iNOSタンパクの発現を確認した。さらに黒毛和牛の筋肉組織、脂肪組織、間質脈管系細胞いずれの部位においてもiNOS遺伝子発現が確認できた。これにより、脂肪組織から産生されるNOがパラクリン的に脂肪細胞分化に影響を及ぼす可能性が示唆された。また脂肪前駆細胞株である3T3-L1細胞を用いて、NOが脂肪細胞分化に及ぼす影響とそのメカニズムを検討した。3T3-L1細胞を分化誘導すると同時に培地にNO供与体であるNOC18、グアニル酸シクラーゼの特異的阻害剤であるODQ、膜透過性のcGMPアナログである8-bromo cGMPを添加し培養した。結果、NOC18は濃度依存的に脂肪細胞分化を抑制したが、ODQの添加はNOC18による脂肪細胞分化抑制効果を妨げなかった。さらに、8-bromo cGMPは脂肪細胞分化に影響を及ぼさなかった。このことから、NOは脂肪細胞分化を抑制するが、この現象にはNOによるcGMPの上昇は関与しないことが示唆された。またNOC18添加の際PPARγ2タンパク発現量に変化は見られなかったが、脂肪細胞分化の後期マーカーでありPPARγに直接反応することが知られているaP-2遺伝子の発現量はNOC18の濃度依存的に抑制された。このことから、NOは脂肪細胞分化の過程においてPPARγの下流に影響を及ぼしていると考えられる。
新しい、ケトン体を用いた、気絶心筋時の心筋保護法

1.ラット摘出心をワーキングハート法で灌流し、灌流液遮断による10分間の全虚血と30分間の再灌流を行った。通常の灌流液を用いるK(-)群、5mMケトン体を虚血前より添加するK(+)群、さらに虚血を作成せず還流したContro群の3群を作成し、循環動態指標及び細胞内代謝産物を測定した。2.循環動態指標:虚血再灌流後の左室dp/dt、心拍出量、心仕事量、心筋仕事効率はK(+)群が有意に早い回復過程を示た。3.細胞内代謝産物濃度:4.細胞内エネルギー動態:(1)細胞質△GATPHdrolyssエネルギーは、C群56.4Kl/mol、K(+)群58.2Kl/mol、K(-)群56.0Kl/molとK(+)群が他の3群と比較して有意な高値を示した。(2)ミトコンドリアNAD/NADH電位はC群280.8mV、K(+)群297.1mV,K(-)群291.1mVとK(+)群が他の2群と比較して有意な高値を示した。(3)以上より算出した、ミトコンドリア電子伝達鎖電位はC群11.4mV、K(+)群5.4mV、K(-)群1.1mV、とK(-)群及びK(+)で有意な低下が示された。結語1.ケトン体は循環動態における虚血再灌流障害の影響を軽減した。2.ケトン体群ではミトコンドリア酸化還元電位の増大、細胞P動員エネルギーの上昇が示された。3.ケトン体は、虚血再灌流時の基質となり、虚血心筋保護作用を有すると考えられた。1ラット摘出心をワーキングハート法で灌流し、灌流液遮断による10分間の全虚血と30分間の再灌流を行なった。通常の灌流液を用いるK(-)群、5mMケトン体(D-β-hydroxybutyrate 4mM+acetoacetate 1mM)を虚血前より添加するK1群および虚血後より添加するK2群、さらに虚血を作成せず貫流したControl群の4群を作成し、循環動態指標および細胞内代謝産物を測定した。2循環動態指標:虚血再灌流後の左室dp/dt、心拍出量、心仕事量、心筋仕事効率はK1群が有意に早い回復過程を示た。3細胞内代謝産物濃度:(3)細胞内3-Phosphoglycerate濃度もK(-)群が有意な低値を示した。細胞内DHAPおよびGlutamate濃度はK1群が他の2群よりも有意な高値を示した。現在、生命活動の基本エネルギー:細胞質△GATPHydrolysisエネルギー、ミトコンドリアredox stateすなわちNAD/NADH比およびその電位差、ミトコンドリア呼吸鎖エネルギーを計測中である。平成10年度、11年度は、このミトコンドリア膜ポテンシャルの変化および心仕事効率の変化を、各群における気絶心筋時の循環動態と対比することによって、ケトン体が遷延する気絶心筋の発生を抑えるために貢献するか否かを、ミトコンドリアエネルギー代謝効率の側面から評価する予定である。1.ラット摘出心をワーキングハート法で灌流し、灌流液遮断による10分間の全虚血と30分間の再灌流を行なった。

通常の灌流液を用いるK(-)群、5mMケトン体(D-β-hydroxybutyrate4mM+acetoacetate1mM)を虚血前より添加するK1群および虚血後より添加するK2群、さらに虚血を作成せず灌流したControl群の4群を作成し、循環動態指標および細胞内代謝産物を測定した。2.循環動態指標:虚血再灌流後の左室dP/dt、心拍出量、心仕事量、心筋仕事効率はK1群が有意に早い回復過程を示た。3.細胞内代謝産物濃度:現在、ミトコンドリアredox stateすなわちNAD/NADH比およびその電位差、ミトコンドリア呼吸鎖エネルギーを計測中である。平成11年度は、このミトコンドリア膜ポテンシャルの変化および心仕事効率の変化を、各群における気絶心筋時の循環動態と対比することによって、ケトン体が遷延する気絶心筋の発生を抑えるために貢献するか否かを、ミトコンドリアエネルギー代謝効率の側面から評価する予定である。1.ラット摘出心をワーキングハート法で灌流し、灌流液遮断による10分間の全虚血と30分間の再灌流を行なった。通常の灌流液を用いるK(-)群、5mMケトン体を虚血前より添加するK(+)群、さらに虚血を作成せずControl群の3群を作成し、循環動態指標および細胞内代謝産物を測定した。2.循環動態指標:虚血再灌流後の左室dP/dt、心拍出量、心仕事量、心筋仕事効率はK(+)群が有意に回復過程を示た。3.細胞内代謝産物濃度:4.細胞内エネルギー動態:(1)細胞質ΔGATPHydrolysisエネルギーは、C群56.4KJ/mol、K(+)群58.2KJ/mol、K(-)群56.0KJ/molとK(+)群が他の3群と比較して有意な高値を示した。(2)ミトコンドリアNAD/NADH電位はC群280.8mV、K(+)群297.1mV、K(-)群291.1mVとK(+)群が他の2群と比較して有意な高値を示した。(3)以上より算出した、ミトコンドリア電子伝達鎖電位はC群11.4mV、K(+)群5.4mV、K(-)群1.1mV、とK(-)群およびK(+)で有意な低下が示された。結語1.ケトン体は心循環動態における虚血再灌流障害の影響を軽減した。2.ケトン体群では、ミトコンドリアNADH酸化還元電位の増大、ΔGATPからみた動員エネルギーの上昇が示された。3.ケトン体は、虚血再灌流時の基質となり、虚血心筋保護作用を有すると考えられた。
歯周疾患患者における免疫応答の解析(歯周病巣における活性化リンパ球機能について)

ヒト歯周炎にはlgGを保有するB細胞系リンパ球の著しい浸潤増生と、T細胞の局在が認められる。我々はhelper/inducerT細胞(T4陽性細胞)とsuppressor/cytotoxicT細胞(T8陽性細胞)の局在を証明し、また歯肉組織より抽出した歯肉リンパ球を利用してこれらT細胞サブポピュレーションにおけるlaの発現率を検討した。その結果、laの発現頻度は同程度であったことから、歯周病巣でT細胞の免疫調節機能が作動している可能性が推定された。他方、B細胞系リンパ球の増加の一因は歯周ポケットに生息する細菌の示す多クローン性B細胞活性化反応(PBA)による可能性がある。そこで、歯周病関連菌の一つであるActinomyces viscosus T14Vの示すPBAを検討し、これはT細胞、マクロファージ非依存性であること、さらにlgGの産生は表面lgG陽性B細胞(免疫記憶細胞)に依存し、表面1gG陰性B細胞には依存せず、いわゆるクラススイッチを誘導するものではないことを明らかにした。またこのPBAはT細胞により修飾され、この場合は著しいlgGの産生が増大することを明らかにした。この機構はPBAで活性化されて、B細胞表面上に発現した多数のla抗原をhelper/inducerサブポピュレーシュン(L3T4陽性細胞)に属するT細胞が認識して刺激され、何らかの因子を産生して、既に非特異的に活性化されているB細胞をlgGの産生へと分化誘導するという新しい事実を明きらかにした。一方、成人型歯周炎患者では末梢血Tリンパ球のサブポピュレーションの比率(T4/T8)は健康人の場合と変わらないが、歯周病巣では患者末梢血と比較して大きく変動した。また、若い成人で重度な歯周炎患者のなかには末梢血リンパ球の自己リンパ球混合培養反応の低下する場合がみられた。今後、このような免疫異常が存在することと、歯周病巣局所での免疫調節という概念とを合わせて歯周病巣の形成機構を検討して行きたい。1)重度な成人型歯周炎患者においては、末梢血リンパ球を無刺激のまま7日間培養すると健常者の場合に比べTリンパ球のIa抗原の発現頻度が低く、Tリンパ球の自己認識系が健常者とは異なることが明らかとなった。そこで、自己リンパ球混合培養反応(AMLR)を行いTリンパ球の増殖反応を患者及び健常者で検討した結果、健常者では自己の非Tリンパ球を認識したTリンパ球の増殖が認められるが歯周炎患者では、検討した患者の約半数においてTリンパ球の増殖が低下、ないしは認められなかった。この結果は歯周炎患者の末梢血リンパ球中のTリンパ球、あるいは非Tリンパ球に、健常者と比較して機能的な差異の存在する可能性を示唆するものである。2)歯周炎病巣に特徴的な病像であるIgG産生形質細胞の著しい浸潤増殖をもたらす一因として、口腔内細菌に起因する多クローン性B細胞活性化(PBA)の関与が考えられている。我々はこれまでに、その病像の成立機序にin vivoである抗原に感作されてIgG産生を拘束されるようになったIgG記憶B細胞が関与し、歯周炎局所で口腔内細菌由来のPBA作用によりT細胞及びマクロファージ非依存性に増殖分化する可能性を示唆する結果を報告した。

今回はさらに、歯周炎病巣に活性化されたT細胞も存在するという我々の研究報告をふまえPBAのT細胞による調節の有無について、マウスの系で検討を行った。その結果、IgGの産生はT細胞依存性に増強され、マイトゲン活性化T細胞上清でもこの増強効果が認められた。さらに、老齢マウスの場合に、T細胞依存性IgG産生の増強効果が著明であった。このことは加齢に伴いB細胞もしくはT細胞に免疫学的機能変化が生じ、たとえT細胞非依存性のPBAでもT細胞の共存下でB系細胞に影響を及ぼしIgG産生が優位となることを示唆し、歯周病変がこの様な機構で形成される可能性が考えられる。
木材乾燥中の4次元的な細胞形状変化の可視化による収縮異方性の解明

木材を乾燥させる際に生じる割れの発生挙動をアーティファクトの影響なく、細胞レベルで経時的に可視化する方法を開発するために、木材の含水率に左右されずに観察可能な共焦点レーザー顕微鏡(CLSM)の利点に着目し、木材ブロック試料を設置する雰囲気の環境制御法を確立することで、乾燥に伴う木材細胞の3次元的な形状変化をリアルタイムで可視化する方法を検討した。17年度の研究成果は以下の通りである。乾燥中の4次元的な割れ発生挙動の可視化CLSM下において,木材ブロックに割れを発生させるための環境制御法を検討し,割れの発生に成功した。これにより,アーティファクトの影響なく,割れ発生挙動を細胞レベルで,かつ経時的に可視化することが可能になった。この手法を使って得られた成果は次の通りである。まず、放射組織に沿って割れが進行する場合,割れは晩材部で発生することが明らかになった。次に,発生した割れは髄側,樹皮側の両方向へ進行するが,早材部で止まることを明らかにした。割れの進行とともに割れ幅は増大するが,乾燥終了前に減少し,発生した割れのうち,肉眼では観察できないレベルの割れが存在することが明らかになった。以上の割れ発生挙動については経時的な動画としてビジュアル化した。また,割れの深さ方向を解析したところ,晩材部で最も深く,年輪界を超える場合は急激に浅くなり,髄側への進行の場合は徐々に浅くなる傾向を明らかにした。木材を乾燥させる際に生じる割れの発生挙動をアーティファクトの影響なく、細胞レベルで経時的に可視化する方法を開発するために、木材の含水率に左右されずに観察可能な共焦点レーザー顕微鏡(CLSM)の利点に着目し、木材ブロック試料を設置する雰囲気の環境制御法を確立することで、脱湿および吸湿過程に伴う木材細胞の3次元的な形状変化をリアルタイムで可視化する方法を検討した。16年度の研究成果は以下の通りである。1.環境制御下での細胞形状の経時変化観察法の確立木材ブロック試料の観察環境を制御するため、分流式精密湿度供給装置を導入し、試料室の温度および湿度の精密な制御を可能にした。アーティファクトの影響を限りなく小さくするために、木材ブロック試料をそのまま観察する方法を採用したが、木材表面と内部で含水率勾配が生じるために得られる画像の箇所の含水率と木材ブロック全体の含水率が異なる。この問題を解決するために、脱湿過程を通して木材ブロック全体の均一な含水率を実現させるための最適な脱湿速度を検討し、飽湿状態から気乾状態までの環境制御スケジュールを確立した。2.横断面(X-Y平面)における細胞形状の経時変化の可視化1で述べた実験系を使って、まず、横断面(X-Y平面)において、脱湿に伴う収縮挙動の可視化を検討した。その結果、繊維飽和点以下において、含水率の低下に伴う細胞形状の変化をリアルタイムに捉えることが可能になった。
腫瘍細胞膜上分子会合体情報を用いた分子標的薬併用効果の検討

申請者らは、腫瘍細胞において特定の細胞膜上分子(増殖因子受容体等)が会合体を形成する現象について、申請者らが開発したEMARS法およびプロテオーム技術を用いて研究を進めてきた。これら分子会合体はシグナル伝達経路等を介して腫瘍細胞形質の発現に関与していると考えられ、創薬ターゲットとしての有用性が期待された。この「2分子会合体情報」を用いた分子標的薬の選択法は全く新奇の方法であり、悪性腫瘍の治療薬剤の選択に有用であると考えられる。本年度は、以下の2つについて研究を実施した。1)前年度に引き続き、2分子会合体に対する機能阻害薬剤および抗体を利用し、in vitro細胞増殖阻害実験を実施した。阻害剤単剤では効果がない場合も、2分子会合体情報を基に併用処理すると効果を示す薬剤があることが分かった。これは、薬剤開発において、有効性がなかった薬剤を併用し、リバイバル薬剤として使用できる可能性を示す結果であり、今後の展開が期待される。また、ある種の2分子会合体情報を基に選択した抗体同士の組み合わせ処理により、細胞増殖に変動がある可能性が認められたため、抗体をクロスリンクする方法で細胞増殖阻害に有効であるか検討した。2)がん細胞から放出される細胞膜断片が血液中に存在している可能性を検討した結果、マウス肺がんモデル血清中に肺がん細胞から分泌されたextracellular vesicleが検出された。そのextracellular vesicle上の2分子会合体をEMARS反応を用いて探索した結果、いくつかの特異的候補会合体を挙げることができた。申請者らは、腫瘍細胞において特定の細胞膜上分子(増殖因子受容体等)が会合体を形成する現象について、新規で実用的な細胞膜上分子会合体解析法であるEnzyme-Mediated Activation of Radical Sources(EMARS)(Kotani N. et al. Proc Natl Acad Sci U S A)を利用して研究を進めてきた。これら分子会合体はシグナル伝達経路等を介して腫瘍細胞形質の発現に関与していると考えられ、創薬ターゲットとしての有用性が期待される。本年度は、EMARS反応を用いて、肺がんモデルマウスであるEML4-ALKマウスの肺から癌組織を採取して樹立した初代培養腫瘍細胞及びヒト培養腫瘍細胞のLK-2細胞における分子会合体を解析・同定した。その結果、各細胞において、細胞接着に寄与するCHL1分子と会合する分子群として数種類の分子を同定し、選択した(分子名は特許申請の関係から省略)。興味深い事に、マウス細胞およびLK-2細胞に関して、共通の会合体が少なくとも1種類確認された。それぞれの分子会合体を構成する各分子に対する分子標的薬剤(阻害剤等)を選択した。それらの阻害剤を当該腫瘍細胞に併用処理し、単剤処理の場合よりも相乗的に腫瘍縮退効果がある薬剤の組み合わせがあるかのアッセイを行うための実験系を構築した。現在、96wellプレートに細胞を播種し、各薬剤処理後の細胞増殖アッセイを行っている。当初計画の分子会合体の同定については概ねうまくいっているから。細胞増殖アッセイ系を確立し、まずin vitro系で併用効果のある薬剤を探索したい。分子会合体同定において、数種類の会合体候補を同定したものの、そのconfirmationや阻害剤選定が時間の関係で遅れたため上記confirmationおよび阻害剤選定と購入を次年度に行う際に使用する予定である。
アミロイド核の出現に先立つタンパク質初期集合および秩序化プロセスの解明

アミロイド線維の核形成反応は、アミロイドーシスや神経変性疾患などアミロイド線維の沈着を伴う一連の疾病群の発症に深く関与すると考えられている。この反応は多くの場合線維形成反応全体の律速となっているが、一旦核が形成するとアミロイド線維は自己触媒的に成長、増殖し発病に至る。そこで本研究では、アミロイド線維形成反応の核形成段階のなかで、伝播性をもつ核が形成する際にどのようなタンパク質分子の会合が進行し秩序構造を形成するのかについてのメカニズムを明らかにすることを目的としている。H28年度は、インスリン配列由来のアミロイド性ペプチド断片について、線維前駆中間体が明確に蓄積するアミロイド線維形成経路を明らかにした。そこでH29年度は本経路についてCDとDLSを用いた時分割的な構造変化の観察を実施し、線維前駆中間体が構造発達するプロセスの解明を試みた。その結果、線維前駆中間体は2種類存在すること、さらに超音波パルスを活用することで2番目に生成する中間体のみが核を生成できる構造であることを見つけた。さらに上述の線維前駆中間体の持つ特性を明らかにするため、領域内での共同研究により固体NMRや小角X線散乱を用いた詳細な構造解析を開始した。また、連携研究者である山本直樹博士の協力によりテラヘルツ分光法を用いた水和水の解析を試み、モノマー体、線維前駆中間体、アミロイド線維の解析を実施した。その結果、わずかであるが各構造状態により水和構造が異なるという結果が得られ、アミロイド線維形成に伴い水和状態が変化する可能性が示唆された。29年度が最終年度であるため、記入しない。そこで本研究では、アミロイド線維形成反応の核形成段階のなかで、伝播性をもつ核が形成する際にどのようなタンパク質分子の会合が進行し秩序構造を形成するのかについてのメカニズムを明らかにすることを目的とする。H26-27年度の研究では、インスリンアミロイド線維が形成する途中で過渡的に生成する線維前駆中間体を捕捉し、これが会合して成熟したアミロイド線維構造へと変化する様子を追跡した。これを踏まえてH28年度は、インスリン配列由来のアミロイド性ペプチド断片を主要な研究題材とし、線維前駆中間体を経由する反応経路の探索を行った。その結果、アミロイド線維形成初期段階に線維前駆中間体が明確に蓄積する反応経路を見つけることができ、CDやDLSなどの解析を通して、線維前駆中間体が段階的に構造発達する様子を確認した。また、連携研究者である山本直樹博士の協力によってテラヘルツ分光法を用いたアミロイド線維形成過程における水和状態の変化追跡のための初期検討にも着手し、インスリンについてネイティブ構造とアミロイド線維構造状態における水和の特性の観察を試みた。線維前駆中間体を経由した新たなアミロイド線維形成反応の発見により、アミロイド核の生成に伴うタンパク質の集合の様子を時系列で追跡する研究へと発展させる段階に到達できた。今後の解析により、アミロイド線維構造が形成されるまでについてより一般的なメカニズムに迫りたいと考えている。さらに、テラヘルツ分光法の結果より水和状態の変化を追跡できる可能性が期待されるので、タンパク質、水両分子の視点から線維形成機構を総合的に理解できることが期待される。今後は、インスリン由来ペプチド断片の線維前駆中間体を経由した反応経路の時分割測定をX線溶液散乱をはじめとしたいくつかの解析を複合的に組み合わせることで実施する。これにより線維前駆中間体が形成するまでの様子、さらに中間体が構造発達し核を生成する様子を時系列で明らかにする。並行して、ほかのタンパク質についても線維前駆中間体種の捕捉も試みる。

インスリン由来ペプチド断片が形成する線維前駆中間体については、準安定構造として捕捉が比較的容易であるだけでなく、超音波パルスを利用することにより核構造へと転移できそうなので、この性質を利用して線維前駆中間体から核への構造転移を選択的に観測し、どのような構造転移を遂げることで線維前駆中間体から核構造が生成するかを明らかにする。さらにインスリンについては、ネイティブ状態とアミロイド線維の間に水和状態の差が見られた場合には引き続き核形成相の最中に水和状態の変化を観測できるか否かを検討する予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。