hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗癌剤感受性評価におけるアポトーシス画像化の有用性に関する研究

(1)正常BALB/cマウスに抗マウスFasモノクローナル抗体(10・g/マウス)を投与し、2.5時間後に^<99m>Tc-HYNIC-AnnexinV(HAV)(100・Ci/マウス)を投与し、さらに1時間後にガンマカメラ撮像を行なった結果、抗Fas抗体投与群の肝臓における%IDは、抗Fas抗体無投与群の約4倍であり、ガンマカメラにおいても明らかな肝臓集積を示した。一方、抗Fas抗体投与群において、^<99m>Tc-HAVの腎集積は相対的に減少し、対照群の約1/3倍であった。(2)マウス胸腺細胞のDEX誘発アポトーシスにおいて、^<99m>Tc-HAVによるアポトーシス検出能を検討した結果、viability低下やDNA ladder形成から判断して、DEX投与群ではアポトーシスが起こっているにも関わらず、^<99m>Tc-HAVの%IDは非常に低かった。したがって、DEX誘発胸腺細胞アポトーシスのような軽度のアポトーシスに関しては、^<99m>Tc-HAVによるイメージングはできないことが分かった。(3)VDSの抗腫瘍効果を調べる目的で、VDSを腹腔内投与し、投与時および各時間点において予測腫瘍重量をノギスを用いて測定し、抑制率を求めた結果、対照(Saline投与群)では、投与後12時問以降腫瘍重量が増加するのに対し、VDS投与群では72時間まではほぼ一定であり、その後増加傾向を示した。腫瘍細胞DNAの電気泳動では、VDS投与群の12、24および48時間点の腫瘍からladder patternが観察されたが、対照群ではいずれの時間点においても観察されなかった。TUNEL法によって、VDS投与後24および48時間の腫瘍アポトーシスの出現を検討した結果、24時間点では約5%、48時間点では約30%のTUNEL陽性細胞が検出された。(1)vindesine(VDS)投与後の至適撮像時間を調べるため、ヌードマウス皮下に移植したHL-60初代培養モデルを用いて、VDS(3mg/kg)の投与時および各時間点において予測腫瘍重量(mg)を測定し、抑制率IRを求めた結果、VDSは投与後24-72時間で、効率的にアポトーシスを誘導することが示唆された。電気泳動およびTUNEL法の結果から、VDSによる最も効率的なアポトーシス誘導時間は、投与後48時間と判断した。(2)^<99m>Tc-HYNIC-Annexin V(HAV)によりVDSの抗腫瘍効果を評価できるか否かを調べるため、VDS投与後48時間に^<99m>Tc-HAVを投与し、1時間点においてガンマカメラでの撮像を行い、1.5時間点において解剖およびガンマ線量測定を行った結果、VDS投与群と非投与群共に腫瘍組織への^<99m>Tc-HAVの集積はほとんど見られなかった。(3)投与された^<99m>Tc-HAVのほとんどがFirst Passで腎臓および肝臓に集積するため、腫瘍組織に充分量の^<99m>Tc-HAVが到達できず集積しない可能性があるため、^<99m>Tc-HAVを長時間循環させ、腫瘍組織により多く輸送できる腎肝血流遮断マウスを作製し、saline投与群とVDS投与群における^<99m>Tc-HAVの腫瘍集積について検討した。IRと腫瘍組織での%ID/gとの間には相関関係の傾向が認められ、IRの増加に伴って%ID/gも増加する傾向を示した。(1)正常BALB/c

マウスに抗マウスFasモノクローナル抗体(10・g/マウス)を投与し、2.5時間後に^<99m>Tc-HYNIC-Annexin V(HAV)(100・Ci/マウス)を投与し、さらに1時間後にガンマカメラ撮像を行なった結果、抗Fas抗体投与群の肝臓における%IDは、抗Fas抗体無投与群の約4倍であり、ガンマカメラにおいても明らかな肝臓集積を示した。一方、抗Fas抗体投与群において、^<99m>Tc-HAVの腎集積は相対的に減少し、対照群の約1/3倍であった。(2)マウス胸腺細胞のDEX誘発アポトーシスにおいて、^<99m>Tc-HAVによるアポトーシス検出能を検討した結果、viability低下やDNA ladder形成から判断して、DEX投与群ではアポトーシスが起こっているにも関わらず、^<99m>Tc-HAVの%IDは非常に低かった。したがって、DEX誘発胸腺細胞アポトーシスのような軽度のアポトーシスに関しては、^<99m>Tc-HAVによるイメージングはできないことが分かった。(3)VDSの抗腫瘍効果を調べる目的で、VDSを腹腔内投与し、投与時および各時間点において予測腫瘍重量をノギスを用いて測定し、抑制率を求めた結果、対照(Saline投与群)では、投与後12時間以降腫瘍重量が増加するのに対し、VDS投与群では72時間まではほぼ一定であり、その後増加傾向を示した。腫瘍細胞DNAの電気泳動では、VDS投与群の12、24および48時間点の腫瘍からladder patternが観察されたが、対照群ではいずれの時間点においても観察されなかった。TUNEL法によって、VDS投与後24および48時間の腫瘍アポトーシスの出現を検討した結果、24時間点では約5%、48時間点では約30%のTUNEL陽性細胞が検出された。
トポロジカル手法による理論分散計算の統一理論の構築

今年度は,直観主義様相論理に基づくプログラムを中心に研究を行った.当初予定していた組み合わせ幾何を直接扱うアプローチは数学的な困難さが回避できないことがわかった.一方で,直観主義様相論理を経由して組み合わせ幾何を扱うアプローチが有効であることがわかったのでそちらに基づいて研究を行った.大きな成果が得られたものから順に述べる.まず,直観主義様相論理の意味論を古典的なKripkeモデルではなくより現代的な圏論的モデルによって与える研究をおこなった.この研究によって,直観主義様相論理が圏論で用いられる豊穣圏という概念と密接に関連していることがわかった.次に,圏論的モデルを検討することによって得られた知見をもとに,直観主義様相論理の証明論にかんする研究を行った.この研究によって双文脈流とFitch流と呼ばれる直観主義様相論理の二つの証明体系が圏論的には随伴によって説明できることがわかった.それらと平行して外部の研究者と新しいプログラミングパラダイムについての共同研究を行った.この研究では探索問題を解くプログラムを簡潔に記述するための手法を提案した.申請者は特にプログラミング言語の理論に関する知見を生かして提案手法の数学的基礎づけを担当した.先立つ直観主義様相論理の研究では直観主義のボックス様相のみを扱ってきたので,その双対である直観主義ダイヤモンド様相についての研究を行った.この研究により直観主義ダイヤモンド様相と次数付き代数的効果が密接な関係にあることがわかった.また,量子計算に関連して,分布モナドの変種の研究を行った.この研究では,量子通信プロトコルの検証のためのモナドを定義し,その性質を調べた.また,ゲーデル論理と呼ばれる中間論理に対応するプログラミング言語の研究を行った.この研究では証明論的な議論によって並列・平行計算の基礎となる抽象的な言語の構文を作成した.当初予定していたアプローチを修正する必要はあったものの,修正後の研究ではインパクトのある成果が得られている.一方で,本来の目標である分散計算に関連した成果は限定的なものにとどまっている.アプローチの修正によって得られた成果を再検討し分散計算に適用することが今後の重要な課題である.以上を総合して,着実に研究成果が積み重なっておりおおまかには順調に発展していると考える.引き続き,直観主義様相論理を通して分散計算のための基礎理論の構築を目指す.直観主義様相論理の研究をさらに進めて,意味論の解明に努める.特に,現在までに中間的な成果が出ているが論文化できていない,直観主義ダイヤモンド様相と次数付き代数的効果の対応,量子通信プロトコルの検証のためのモナド,ゲーデル論理に基づく平行プログラミング言語の研究を進める.今年度は,直観主義様相論理に基づくプログラムを中心に研究を行った.当初予定していた組み合わせ幾何を直接扱うアプローチは数学的な困難さが回避できないことがわかった.一方で,直観主義様相論理を経由して組み合わせ幾何を扱うアプローチが有効であることがわかったのでそちらに基づいて研究を行った.大きな成果が得られたものから順に述べる.まず,直観主義様相論理の意味論を古典的なKripkeモデルではなくより現代的な圏論的モデルによって与える研究をおこなった.この研究によって,直観主義様相論理が圏論で用いられる豊穣圏という概念と密接に関連していることがわかった.次に,圏論的モデルを検討することによって得られた知見をもとに,直観主義様相論理の証明論にかんする研究を行った.この研究によって双文脈流とFitch流と呼ばれる直観主義様相論理の二つの証明体系が圏論的には随伴によって説明できることがわかった.それらと平行して外部の研究者と新しいプログラミングパラダイムについての共同研究を行った.この研究では探索問題を解くプログラムを簡潔に記述するための手法を提案した.申請者は特にプログラミング言語の理論に関する知見を生かして提案手法の数学的基礎づけを担当した.先立つ直観主義様相論理の研究では直観主義のボックス様相のみを扱ってきたので,その双対である直観主義ダイヤモンド様相についての研究を行った.この研究により直観主義ダイヤモンド様相と次数付き代数的効果が密接な関係にあることがわかった.また,量子計算に関連して,分布モナドの変種の研究を行った.この研究では,量子通信プロトコルの検証のためのモナドを定義し,その性質を調べた.また,ゲーデル論理と呼ばれる中間論理に対応するプログラミング言語の研究を行った.この研究では証明論的な議論によって並列・平行計算の基礎となる抽象的な言語の構文を作成した.当初予定していたアプローチを修正する必要はあったものの,修正後の研究ではインパクトのある成果が得られている.一方で,本来の目標である分散計算に関連した成果は限定的なものにとどまっている.アプローチの修正によって得られた成果を再検討し分散計算に適用することが今後の重要な課題である.以上を総合して,着実に研究成果が積み重なっておりおおまかには順調に発展していると考える.引き続き,直観主義様相論理を通して分散計算のための基礎理論の構築を目指す.直観主義様相論理の研究をさらに進めて,意味論の解明に努める.特に,現在までに中間的な成果が出ているが論文化できていない,直観主義ダイヤモンド様相と次数付き代数的効果の対応,量子通信プロトコルの検証のためのモナド,ゲーデル論理に基づく平行プログラミング言語の研究を進める.
動きを制限した多糖類の構造および包接活性の制御

D-Glucoseが互いにα(1→4)結合で68残基連なって環状になった化合物群は“シクロデキストリン"と呼ばれ,その中空に他分子を取り込むという活性(いわゆる包接活性)を持つことが知られている.NMR等の解析から,シクロデキストリンに含まれるD-Glucose残基はいずれもエネルギー的に安定な^4C_1配座を取り,分子全体としてはきれいなC_<68>対称性が保たれていることが明らかとなっている.本研究では,シクロデキストリンのD-Glucose残基の一部を3,6-anhydro-D-glucoseに変換することにより,分子中に強制的に^1C_4配座を持つ残基を導入し,その立体構造や包接活性の変化を解析した.1.高分解能NMRを用いた解析により,α-cyclodextrin (D-Glucoseが6残基)中の3残基を3,6-anhydro-D-glucoseに変換しても,変換されずに残ったD-glucose残基の配座は^4C_1のまま保たれていることを明らかにした.分子中に非対称に3,6-anhydro残基を導入することが可能となった.2.この修飾したシクロデキストリンをキャピラリー電気泳動のキャリアーとして用いた結果,mono(3,6-anhydro)-α-cyclodextrinの包接活性はもとのα-cyclodextrinよりも弱くなってしまうことが判明し,そのため,当初期待された光学分離能がmono(3,6-anhydro)-α-cyclodextrinには見られなかった.これは環構造のひずみからキャビティー(中空)の大きさが小さくなり,他分子を受容できなくなってしまったためと思われる.現在,より大きな中空構造を持つβ-cyclodextrin(7残基)およびγ-cyclodextrin(8残基)に3,6-anhydro-D-glucoseを導入した誘導体を調製中である.D-Glucoseが互いにα(1→4)結合で68残基連なって環状になった化合物群は“シクロデキストリン"と呼ばれ,その中空に他分子を取り込むという活性(いわゆる包接活性)を持つことが知られている.NMR等の解析から,シクロデキストリンに含まれるD-Glucose残基はいずれもエネルギー的に安定な^4C_1配座を取り,分子全体としてはきれいなC_<68>対称性が保たれていることが明らかとなっている.本研究では,シクロデキストリンのD-Glucose残基の一部を3,6-anhydro-D-glucoseに変換することにより,分子中に強制的に^1C_4配座を持つ残基を導入し,その立体構造や包接活性の変化を解析した.1.高分解能NMRを用いた解析により,α-cyclodextrin (D-Glucoseが6残基)中の3残基を3,6-anhydro-D-glucoseに変換しても,変換されずに残ったD-glucose残基の配座は^4C_1のまま保たれていることを明らかにした.分子中に非対称に3,6-anhydro残基を導入することが可能となった.2.この修飾したシクロデキストリンをキャピラリー電気泳動のキャリアーとして用いた結果,mono(3,6-anhydro)-α-cyclodextrinの包接活性はもとのα-cyclodextrinよりも弱くなってしまうことが判明し,そのため,当初期待された光学分離能がmono(3,6-anhydro)-α-cyclodextrinには見られなかった.これは環構造のひずみからキャビティー(中空)の大きさが小さくなり,他分子を受容できなくなってしまったためと思われる.現在,より大きな中空構造を持つβ-cyclodextrin(7残基)およびγ-cyclodextrin(8残基)に3,6-anhydro-D-glucoseを導入した誘導体を調製中である.
自己免疫性肝炎診断のための抗ヒトP450自己抗体測定法の開発に関する研究

抗肝腎ミクロソーム抗体1(LKM1)の抗原であるチトクロームP450 IID6のより特異的で高感度な方法としてラジオリガンドアッセイ法もちいた測定を行った。この方法は、プラスミドに組み込まれたヒトチトクロームP450 IID6遺伝子をT7ファージのRNAポリメラーゼと網状赤血球抽出液を用いた無細胞蛋白翻訳系で^<35>S-メチオニンラベルしたP450 IID6を合成して抗原として用いるもので、3次元構造の比較的保たれた形で純度の高い抗原を得られる利点がある。AIHスコアが10以上の自己免疫性肝炎28例中強陽性2(7%)、弱陽性13(46%)と高率であった。確認のための吸収試験では弱陽性例でも半数で50%以上の吸収が確認され、P450 IID6と反応する抗体が弱いながら存在することが示唆された。一方最近、ELISA法によるP450 IID6抗体の測定法がキット化されたので、その方法についても検討したが、この方法によると陽性は、上記の強陽性例のみであった。このように、残りの非吸収例の検討の問題は残るものの、ラジオリガンドアッセイ法によれば、日本人の自己免疫性肝炎において従来いわれていたようにはP450抗体保有率は低くないものと考えられた。また、肝臓関連抗原としてヒト肝型アルギナーゼに対する抗体が動物実験において肝障害性を持つという報告があるので、自己免疫性肝炎においてヒト肝型アルギナーゼに対する自己抗体の有無を調べた。ヒトリコンビナント肝型アルギナーゼは京大・池本博士らに提供を受け、これを抗原とする自己抗体測定法をELISA法によって確立した。自己免疫性肝炎(definite 11、Probable31)患者血清について測定したところ、それぞれ2例(18.2%)、10例(32.3%)が陽性であった。抗肝型アルギナーゼ抗体価は、抗P450抗体やその他の自己免疫性肝炎関連抗体価(抗核抗体、抗平滑筋抗体等)との関連を示さなかった。抗P450 IID6抗体、抗肝型アルギナーゼ抗体とも自己免疫性肝炎をそれだけで診断するには不十分であったが、従来いわれていた自己抗体よりは高率に見出されることがわかった。抗肝腎ミクロソーム抗体1(LKM1)の抗原であるチトクロームP450 IID6のより特異的で高感度な自己抗体の測定法の開発を試みているが、前回の研究(奨励A-09772066)に引き続き、ラジオリガンドアッセイ法を主体とした測定を行った。この方法は、プラスミドに組み込まれたヒトチトクロームP450 IID6遺伝子をT7ファージのRNAポリメタ-ゼと網状赤血球抽出液を用いた無細胞蛋白翻訳系で^<35>S-メチオニンラベルしたP450 IID6を合成して抗原として用いるもので、3次元構造の比較的保たれた形で純度の高い抗原を得られる利点がある。前回の研究では、AIHスコアが10以上の自己免疫性肝炎28例中強陽性2、弱陽性13と高率であったが、弱陽性例のほとんどで呼吸実験が陰性で非特異反応の可能性が考えられると報告したが、今回の実験では、呼吸操作の検討の結果、弱陽性例でも半数で50%以上の呼吸が確認され、P450 IID6と反応する抗体が弱いながら存在することが示唆された。ラジオリガンドアッセイ法では、抗原の純度は高いが量は少量しか得られず、したがって、吸収用の抗原に他の方法で得たものを使わざるをえないため前回の研究ではうまく行かなかったものと考える。

ヒトリコンビナント肝型アルギナーゼは京大・池本博士らに提供を受け、これを抗原とする自己抗体測定法をELISA法によって確立した。自己免疫性肝炎(definite 11、Probable31)患者血清について測定したところ、それぞれ2例(18.2%)、10例(32.3%)が陽性であった。抗肝型アルギナーゼ抗体価は、抗P450抗体やその他の自己免疫性肝炎関連抗体価(抗核抗体、抗平滑筋抗体等)との関連を示さなかった。抗P450 IID6抗体、抗肝型アルギナーゼ抗体とも自己免疫性肝炎をそれだけで診断するには不十分であったが、従来いわれていた自己抗体よりは高率に見出されることがわかった。
カエルの視覚性行動における視蓋-イスミ核間相互結合の機能的役割

イスミ核は同側視蓋投射を受け,同側及び対側視蓋に投射する。イスミ核の機能を明らかにするために,イスミ核を電気刺激にたいする視蓋の電場電位を記録し,イスミ核から視蓋への投射を電流源密度解析法によって調べた。対側イスミ核から視蓋への投射第8層で最大となるSink1,視蓋表面で最大となるSink2,第6層で最大となる潜持の長いSink3が出現した。これらに対するSourceの位置を考慮すると,Sink1をもたらす視蓋細胞は,第6層に細胞体を持ち第8層で単シナプス性のシナプスを,Sink2を生じる視蓋細胞は細胞体を視蓋の第8層付近に持ち,視蓋表面で単シナプス性の入力を受ける。Sink3を生ずる細胞は細胞体を第6層付近に持ち、樹状突起を第8層当たりまで伸ばして多シナプス性の入力を受けていると考えられる。同側イスミ核から視蓋への投射第8層及びG層で最大となるSink1,第6層で最大となる比較的持続時間の長いSink2が現れた。これらのSourceの位置から判断すると,Sink1を生じる視蓋神経細胞は細胞体を第6層に持ち,第8層付近でイスミ核からの単シナプス性入力を受ける。Sink2を生じる視蓋神経細胞は第9層下部まで細胞体を伸ばし,第6層にある細胞体近傍で多シナプス性入力を受けている。イスミ核からの入力と,R3/R4網膜神経節細胞からの直接入力は,同じ視蓋神経細胞である可能性が高い。本研究では、イスミ核から視蓋への投射様式を電流密度解析法によって調べることを目的とした。イスミ核は中脳被蓋の後方に位置している。最初に、視策を刺激してフィールドポテンシャルを記録し、イスミ核の位置を確かめた。つぎに、刺激電極をイスミ核に刺し、電気刺激による視蓋のフィールドポテンシャルを深さ800μmまで20μmごとに記録した。各深さにおいて10回の応答を記録し加算平均をとった。応答はPCMデータレコーダに記録し、AD変換の後UNIXに転送し、CSD解析プログラムによってデプスプロファイルを作成した。刺激後最初に出現するのは、深さ320360μmで潜時約5ms、持続時間約5msのsinkである。このsinkは、イスミ核から視蓋への興奮性の入力がこの場所に局在していることを示している。続いて、深さ340440μm付近で潜時18msのsinkが出現した。このsinkは先に出現したものに比べて約35msという非常に長い持続時間を持っていた。また、最初のsinkに対するsourceは深さ160260μmおよび深さ460540μm付近で出現し、2番目のsinkに対するsourceは深さ140320μmおよび深さ520580μm付近で出現した。以上の結果から、イスミ核から視蓋への興奮性入力はR3とR4の有随視神経線維投射部位と一致することがわかった。すなわち、網膜とイスミ核からの投射は視蓋ニューロンの同じ部位に結合していることが示唆される。また、sourceの分析より、イスミ核からの入力を受ける視蓋細胞の細胞体は第6層にあり、樹状突起を視蓋表面まで伸ばしていることがわかった。昨年度は,同側のイスミ核から視蓋への投射の解析を行ったが,今年度は,対側イスミ核から視蓋への投射も含めて実験を行い,加算平均によって結果の再現性を確認した。対側イスミ核から視蓋への投射第8層で最大となるSink1,視蓋表面で最大となるSink2,第6層で最大となる潜時の長いSink3が出現した。

これらに対するSourceの位置を考慮すると,Sink1をもたらす視蓋細胞は,第6層に細胞体を持ち第8層で単シナプス性のシナプスを,Sink2を生じる視蓋細胞は細胞体を視蓋の第8層付近に持ち,視蓋表面で単シナプス性の入力を受ける。Sink3を生じる細胞は細胞体を第6層付近に持ち,樹状突起を第8層あたりまで伸ばして多シナプス性の入力を受けていると考えられる。同側イスミ核から視蓋への投射第8層及びG層で最大となるSink1が出現し,それに続いて第6層でピークとなる比較的持続時間の長いSink2が現れた。これらのSourceの位置から判断すると,Sink1を生じる視蓋神経細胞は細胞体を第6層にもち,第8層付近でイスミ核からの単シナプス性入力を受ける。Sink2を生じる視蓋神経細胞は第9層下部まで細胞体を伸ばし,第6層にある細胞体近傍で多シナプス性入力を受けている。イスミ核からの入力と,R3/R4網膜神経節細胞からの直接入力は,同じ視蓋神経細胞である可能性が高い。
喫煙の肺胞マクロファージと癌肺転移に及ぼす影響の遺伝子レベルでの評価

自動喫煙装置を用いてマウスにタール15.2mg,ニコチン1.5mgのタバコを1日、20本、10日間、連続して喫煙させた後、気管支肺胞洗浄により、肺胞マクロファージを採取し、肺胞マクロファージの細胞形態的変化、肺胞マクロファージ機能として、抗原提示機能をMHCの異なるマウスの脾臓リンパ球混合試験により解析し、脾臓リンパ球のConA及びLPS反応に対する影響、細胞表面抗原の発現、貪食機能、活性酸素産生機能、サイトカインmRNA遺伝子レベルの発現、p53癌抑制遺伝子への影響、肺組織のDNA遺伝子レベルへの影響及び癌細胞の肺転移とICAM-1の発現への影響を非喫煙マウス群と比較検討した。タバコ(タール15.2mg,ニコチン1.5mg)喫煙により、肺胞マクロファージは、非喫煙に比べて、喫煙により大型化し、細胞内部に空胞変性が認められ、Dot plot解析により、FSCとSSC値の増加が認められ、喫煙により細胞内部構造の複雑化が認められた。また、細胞内の自動蛍光の強度が喫煙により強まることが認められた。さらに、肺胞マクロファージの細胞表面抗原である、Mac-1,B7-1,ClassII抗原の発現が抑制され、IL-1β、TNF-αのmRNA発現も抑制された。これらの成績から、喫煙による肺胞マクロファージの抗原提示機能への影響について検討を加えると共に、ConA,LPS反応への影響についても検討した。肺胞マクロファージの抗原提示機能は、非喫煙群に比べて、喫煙群の肺胞マクロファージ添加により、リンパ球の増殖反応は抑制され、喫煙により肺胞マクロファージの抗原提示機能が影響を受けていることが認められた。また、ConA及びLPS反応に対しても、非喫煙群の肺胞マクロファージ添加に比べ、喫煙群の肺胞マクロファージ添加により、ConA及びLPS反応の抑制が認められた。肺胞マクロファージの抗原提示機能、リンパ球のConA及びLPS反応に対する肺胞マクロファージ機能が喫煙により抑制・低下することが認められた。その抑制機構について解明するため、喫煙による肺胞マクロファージの活性酸素産生への影響と遺伝子への影響について検討した。活性酸素産生機能はHE,DCFHを用いて反応後、FACSにより解析した。肺胞マクロファージのO_2^-産生は、非喫煙群に比べて、喫煙群の肺胞マクロファージで増強されていることが認められたが、H_2O_2産生に関しては、両者間で変化が認められず、肺胞マクロファージの活性酸素産生の種類により、喫煙による影響が異なることが解明された。この成績から、喫煙による肺胞マクロファージの抗原提示機能、リンパ球のConA及びLPS反応に対する肺胞マクロファージ機能の抑制に、喫煙により産生増加されたO_2^-により、肺胞マクロファージ機能が傷害された結果、これらの反応の抑制が引き起こされた可能性が示唆された。喫煙により肺胞マクロファージからのO2の産生増強が認められたことから、このO2により肺組織への遺伝子への影響を8-OHdGを指標に検討したところ、喫煙群の肺組織のDNA中の8-OHdG量が増加していたことから、喫煙により肺組織の遺伝子の損傷が引き起こされていることが示唆され、今後、更に喫煙による個々の細胞の遺伝子DNA損傷についての詳細な検討が必要である。また、発癌と関係している、癌抑制遺伝子p53のmRNA発現が、喫煙により低下していたことから、喫煙による発癌過程に、DNA損傷とp53の発現低下が関与している可能性が考えられ、喫煙は遺伝子レベルに対しても影響を及ぼしていることが認められた。癌細胞の肺転移に対する喫煙の影響は、癌細胞の肺転移による平均生存日数が、喫煙により短縮する傾向が認められ、喫煙による肺転移が促進され、その原因の一つに喫煙により肺の毛細血管の内皮に接着分子のICAM-1の発現増強が引き起こされることによる可能性が示唆された。

肺胞マクロファージの抗原提示機能は、非喫煙群に比べて、喫煙群の肺胞マクロファージ添加により、リンパ球の増殖反応は抑制され、喫煙により肺胞マクロファージの抗原提示機能が影響を受けていることが認められた。また、ConA及びLPS反応に対しても、非喫煙群の肺胞マクロファージ添加に比べ、喫煙群の肺胞マクロファージ添加により、ConA及びLPS反応の抑制が認められた。肺胞マクロファージの抗原提示機能、リンパ球のConA及びLPS反応に対する肺胞マクロファージ機能が喫煙により抑制・低下することが認められた。その抑制機構について解明するため、喫煙による肺胞マクロファージの活性酸素産生への影響と遺伝子への影響について検討した。活性酸素産生機能はHE,DCFHを用いて反応後、FACSにより解析した。肺胞マクロファージのO_2^-産生は、非喫煙群に比べて、喫煙群の肺胞マクロファージで増強されていることが認められたが、H_2O_2産生に関しては、両者間で変化が認められず、肺胞マクロファージの活性酸素産生の種類により、喫煙による影響が異なることが解明された。この成績から、喫煙による肺胞マクロファージの抗原提示機能、リンパ球のConA及びLPS反応に対する肺胞マクロファージ機能の抑制に、喫煙により産生増加されたO_2^-により、肺胞マクロファージ機能が傷害された結果、これらの反応の抑制が引き起こされた可能性が示唆された。喫煙により肺胞マクロファージからのO2の産生増強が認められたことから、このO2により肺組織への遺伝子への影響を8-OHdGを指標に検討したところ、喫煙群の肺組織のDNA中の8-OHdG量が増加していたことから、喫煙により肺組織の遺伝子の損傷が引き起こされていることが示唆され、今後、更に喫煙による個々の細胞の遺伝子DNA損傷についての詳細な検討が必要である。また、発癌と関係している、癌抑制遺伝子p53のmRNA発現が、喫煙により低下していたことから、喫煙による発癌過程に、DNA損傷とp53の発現低下が関与している可能性が考えられ、喫煙は遺伝子レベルに対しても影響を及ぼしていることが認められた。癌細胞の肺転移に対する喫煙の影響は、癌細胞の肺転移による平均生存日数が、喫煙により短縮する傾向が認められ、喫煙による肺転移が促進され、その原因の一つに喫煙により肺の毛細血管の内皮に接着分子のICAM-1の発現増強が引き起こされることによる可能性が示唆された。喫煙の肺胞マクロファージに及ぼす影響について、気管支肺胞洗浄(Bronchoalveolar lavage:BAL)により得られた肺胞マクロファージを用いて、細胞数、細胞表面抗原及びサイトカイン遺伝子発現を検討し、さらに、マウスLewis Lung Carcinoma(LL/2)腫瘍を用いて、喫煙のLL/2腫瘍細胞の肺転移への影響についても実験医学的に検討した。喫煙は、マウスにタバコ(Coresta monitor No.2:タール15.2mg,タール1.5mg/本)を20本/回/日、連続して10回、自動喫煙装置(HamburgII)を用いて喫煙させた。喫煙後、BALにより細胞を回収し肺胞マクロファージを分離後、FACSにより細胞表面抗原を解析し、サイトカイン遺伝子の発現をRT-PCRにより解析し、非喫煙群と比較検討した。肺胞マクロファージ数は、非喫煙群に比較して、喫煙群で増加が認められた。肺胞マクロアファージの細胞表面抗原については、Mac-1抗原陽性細胞比率は、非喫煙群に比較して有意な減少が認められ、B7、classII抗原についても、喫煙群で有意な減少が認められた。肺胞マクロファージのサイトカン
新しい骨軟部組織損傷モデルの妥当性の評価及び、外傷後臓器障害発生機序の検討

近年、軟部組織の炎症性サイトカインの貯蔵庫としての役割や、脂肪細胞の免疫応答反応としての役割等が報告されている。このことは、骨・軟部組織損傷が、外傷後に起こる全身性炎症の誘因として極めて重要であることに矛盾はないであろう。臨床においても、ほぼ全ての外傷症例は、程度の差はあるものの、骨・軟部組織損傷を合併しており、外傷後の全身炎症反応、それに引き続く臓器傷害発生メカニズムを解明することは非常に重要であろう。我々が従来使用していた動物骨軟部組織損傷モデルを改良した。その新しいモデルの骨軟部組織損傷実験における妥当性を評価し、外傷後臓器障害発生メカニズムの更なる解明を行う。
肝炎におけるγδーTリンパ球局在の意義

肝炎の病態の中で重要な役割を示すpiecemeal necrosis部分では、肝炎ウイルスが認められないにもかかわらず強い肝細胞障害像が認められる。このメカニズムに自己応答性のリンパ球の関与を推定し肝炎の発生機序について検討した。自己応答性のクロ-ンとしては肝臓などで胸腺外分化するTリンパ球を考え、ウイルスに感染した肝細胞を監視、排除しているものと推測した。手術時や肝生検材料についてγδ細胞を認識するモノクロ-ナル抗体を用いて免疫組織化学方法で肝臓局所の免疫反応を観察した。健常なヒト肝臓においては、類洞壁に沿ってγδ細胞が散在性に認められ、その特性を二重免疫組織化学法により検索するとγδ細胞はCD3^+4^ー8^ーであることが判明した。電顕による観察では長円形の大型リンパ球を示し、類洞内皮細胞に多数の突起で付着していた。豊かな細胞質を有し、通常は顆粒を持っいなかったが、ごく稀に細胞質内顆粒を認めた。この肝臓のリンパ球を分離し、ILー2刺激下で培養すると多数の細胞質内顆粒を認め、電顕的にLGLの形態を示し、活性化したものではNK様の細胞機能が推測された。B型肝炎ではspotty necrosis部にCD8陽性リンパ球に混じってγδ細胞が多数認められ異常自己の肝細胞障害に関与していると推測された。グリソン鞘周囲のpiecemeal necrosis部でもγδ細胞が確認されたが、このリンパ球はインタ-フェロン投与により著明に増加し、中止すると再び元の数に戻った。これらのγδ細胞は末梢血液やリンパ節で見られるものと同様小型形態を示し、spotty necrosis部の肝細胞障害巣とは異なり、末梢血液から由来する可能性が示唆されたがこれからの課題である。このリンパ球集簇には接着分子が関与するものと推測し研究を継続している。類洞以外の肝細胞膜に発現したICAMやグリソン鞘血管のELAMがγδ細胞の集簇に関与している可能性が示唆された。γ^δーTリンパ球が、肝臓類洞に散在性に存在していることを、ヒト肝臓の手術材料を用いた免疫組織化学的方法で確認し報告してきた。酵素抗体法を用いた通常の免疫組織化学方法とビオチン化した抗体による螢光抗体疫組織化学法を重ね合せた二重免疫組織化学法を開発し、同一リンパ球上の重複した表面のマ-カ-の検索が可能となった。この方法を用いたリンパ球の表面マ-カ-検索では、γ^δーリンパ球は、CD3^+4^-8^-で、いわゆるダブルネカティブTリンパ球であることが分かった。γ^δーTリンパ球の免疫電顕による観察では、細胞表面に多数の細胞突起を持ち、肝類洞内皮細胞に付着していた。通常、γ^δーTリンパ球の細胞質内には顆粒をほとんど認めなかった。しかし、肝臓リンパ球を分離し、ILー2刺激下で培養すると多数のアズ-ル顆粒が出現した。これらは、電顕的にlarge granular lymphocyteの形態を示し、NK細胞としての機能が推測された。更に、我々はこれまでに肝炎の肝細胞障害巣に多数のリンパ球に混じってγ^δーTリンパ球が存在することを認めてきた。生検した肝臓の検索では、本年度はB型肝炎に焦点を絞って研究した。

B型肝炎の初期には、散在性に肝細胞障害像が見られる時に最っとも多数のリンパ球浸潤が見られ、その中にはCD8陽性のTリンパ球とγ^δーTリンパ球が確認された。さらに肝硬変症に移行し再生結節部ではほとんどγ^δーTリンパ球は認められず、ウイルスに感染した肝細胞をγ^δーTリンパ球が攻撃しているものと推測された。肝類洞にγδーTリンパ球が散在性に認められ,その役割が注目されている。この細胞が肝炎でどの様に関与しているかを肝生検材料を用いて免疫組織化学的に調べた。B型肝炎の肝細胞障害部,特にspotty necrosis部にリンパ球の集簇が見られ,それらの多くはCD8陽性リンパ球やγδーリンパ球であることを確認した。更にplecemeal necrosis部についても引きつづき検討した。炎症反応のないグリリン鞘には通常γδリンパ球は存在しないが,慢性肝炎になると多数のリンパ球が浸潤し,リンパ濾胞を形成することもあることは周知のことで,特にC型肝炎で目立っていた。このリンパ球はCD8陽性リンパ球の他にも各種のリンパ球が認められた。γδリンパ球も症例間に数の差は見られるが,常に認められた。このリンパ球は同一患者の経過を追った肝生検材料の検索ではインタ-フェロン投与により著明に増加し,中止するとほぼ元の数に減少した。ウィルスに感染した肝細胞がいかなる機序でリンパ球に攻撃されるかについて糖鎖の発現を中心に検討してきた。ELAMのリガンドであるsLe^xで代表される様にリンパ球接着因子が糖鎖構造を有することが知られ,肝臓におけるICAM,ELAMを検索してきたが,肝類洞壁には常時ICAMを発現し,ELAMはグリリン鞘以外には認められず,これらからの細胞障害機序の説明は困難と考えられた。γδーリンパ球は,通常細胞質内に顆粒をもたず,いわゆるLGLとは形態学的に異っていた。しかし,ヒト肝臓から分離採取したリンパ球をILー2を添加し短期培養すると細胞質内に多数のdense granuleが出現した。すなわち,γδーリンパ球は状況によりLGL型ISK細胞に変換しうることを証明した。
DNA合成および低酸素イメージングにテクスチャ解析を応用した脳腫瘍の病態評価研究

脳腫瘍にPET分子イメージングを応用し、腫瘍組織の増殖能と低酸素環境を評価する。新たな画像バイオマーカーとしてテクスチャ解析を計画し、腫瘍の形状や内部の特徴量といった性状を数値化する。脳腫瘍のPET検査で腫瘍増殖能と低酸素環境の病態評価を行い、従来の半定量的指標とテクスチャ解析指標を併用することで、予後予測、遺伝子変異予測、治療薬の反応性などの判断の向上ができるか否かを明らかにする。
エニオン凝縮と作用素環

物質のトポロジカル相の間のgappeddomainwallというものが物性物理で研究されているが,その数学的定義を与え,2015年のLan, Wang, Wenの予想は正しくないことを示した.フル共形場理論のカップリング行列について,モジュラー不変性が成り立つのは表現論が自明な時である.2つの局所共形ネットが同じ場合,カップリング行列をかけた時の分解規則はフュージョンルールとして知られている.この「テンソル積」とその直和分解の構成を,二つの局所共形ネットが同じとは限らない場合に一般化した.これはgappeddomainwallの合成にあたるものとなっている.二つのトポロジカル相の間のgappeddomain wallの数学的構造について研究した.トポロジカル相はモジュラーテンソル圏で記述されるため,まずモジュラーテンソル圏二つの上のFrobenius代数でしかるべき条件を満たすものとしてgappeddomainwallの数学的定義を与えた.次に三つのモジュラーテンソル圏の間に二つのFrobenius代数があるとき,その間の相対テンソル積の概念を与えた.もともと局所的かつLagrangeanなFrobenius代数二つから相対テンソル積を作ったときは,既約分解によって局所的かつLagrangeanなものができることを証明した.この場合はモジュラー不変性が満たされている.2次元のヘテロティックなフル共形場理論も同じ数学的構造で記述できるため,この場合は二つのヘテロティックなフル共形場理論の相対テンソル積の定義もこれで与えられたことになっている.三つのモジュラーテンソル圏がすべて同じ場合には,これはモジュラー不変量の間のフュージョンルールを与えることになっている.このようなフュージョンルールについてはこれまでも研究されてきたが,こらまではカイラル共形場のアルファ・インダクションから生じるフル共形場理論の構成を経由して,間接的な定義しか与えられていなかった.今回はこのフュージョンルールのより直接的な定義を与えたことになっている.期待通りに進展している.物質のトポロジカル相の間のgappeddomainwallというものが物性物理で研究されているが,その数学的定義を与え,それが存在するための十分条件についての2015年のLan, Wang, Wenの予想は正しくないことを反例を挙げて示した.完全有理的な局所共形ネット2つからできるフル共形場理論のカップリング行列について,モジュラー不変性が成り立つのはフル共形場理論の表現論が自明な時であり,またその時に限ることが知られている.一方2つの局所共形ネットが同じものである場合,モジュラー不変行列を二つかけてもモジュラー不変性が保たれることは自明であり,その分解規則はモジュラー不変行列のフュージョンルールとして知られている.これについては,Evans-Pinto, Fuchs-Runkel-Schweigertの研究があり,フル共形場理論と,カイラル共形場理論の局所的とは限らない延長の関係に基づき,Q-systemのbraidedproductとしての解釈が知られている.この「テンソル積」とその直和分解の構成を,二つの局所共形ネットが同じとは限らない場合に一般化した.また物質のトポロジカル相の文脈では,これはgapped domainwallの合成にあたるものとなっている.物質のトポロジカル相の間のgappeddomainwallというものが物性物理で研究されているが,その数学的定義を与え,2015年のLan, Wang, Wenの予想は正しくないことを示した.フル共形場理論のカップリング行列について,モジュラー不変性が成り立つのは表現論が自明な時である.2つの局所共形ネットが同じ場合,カップリング行列をかけた時の分解規則はフュージョンルールとして知られている.この「テンソル積」とその直和分解の構成を,二つの局所共形ネットが同じとは限らない場合に一般化した.これはgappeddomainwallの合成にあたるものとなっている.予定通りに推進しようとしている.作用素環論旅費の実費が見込みを下回ったため小額の差額が発生した.次年度の旅費として使用する予定である.
神経生理指標を用いた発達障害児の早期兆候に関する研究

【研究目的】自閉スペクトラム症(Autism Spectrum Disorders: ASD)などの神経発達症は,睡眠障害を併存することが多く,神経の発達と関連している可能性がある.睡眠障害が神経発達症の早期兆候をとらえる上で重要な指標になりうるか検討することを目的とした.【結果】2016年9月から2019年2月に1.5歳健診を受けた611名のうち426名(M:F=204:222, 18.1±1.1ヶ月)から回答を得た(有効回答率:69.7%)・M-CHAT 3/23項目以上のASD特性有群は50名,3/23未満のASD特性無群は350名であった.睡眠習慣に関しては,昼寝回数/週(ASD特性有群v.s. ASD特性無群:6.5±1.3 v.s. 6.8±0.7, p=0.047)以外は,有意差は認めなかった.睡眠の問題に関しては,睡眠時間の変動がASD特性有群で有意に大きく(χ2=16.518, df=1, p<.001),寝相の悪さが有意に少なかった(χ2=5.771, df=1, p=0.018).【考察】ASD特性を有する乳幼児と有しない乳幼児では,睡眠習慣に差がなかった.しかし,ASDの特性を有する児は睡眠時間の変動が有意に大きく,睡眠覚醒リズムの構築の困難さが示唆され,臨床感と合致する所見であった.睡眠覚醒リズムが幼少期より構築しにくい場合,神経発達症の可能性を考慮することの重要性が示された.1.5歳健診データとして500名を予定していたが,まだ達成できていないため,延長申請を行っている.3歳時健診にて,Autism Screening Questionnaire (ASQ)を用いてスクリーニングを試みたが,十分に特性を反映できていない可能性があり,問診票の変更を検討中である.データの更なる蓄積を行い,1.5歳児の睡眠状況が,早期兆候としての指標になりうるか更なる検討を実施する.3歳時健診については,問診票の差し替えを視野に入れて検討中である.注意欠如・多動症や自閉スペクトラム症などの発達障害の早期兆候をとらえるために非侵襲的な指標が求められているが,十分な取り組みはなされていない.我々は,発達障害の早期兆候として,睡眠指標に着目した.平成28年度は,乳幼児の睡眠習慣および発達との関連を明らかにすることを目的とした.2016年9月から2017年2月までの間に,愛媛県東温市の1.5歳および3歳健診を受けた乳幼児およびその保護者を対象として,睡眠状況に関する問診票(CASC)および自閉スペクトラム症のスクリーニング法(1.5歳:M-CHAT,3歳:ASQ)を配布し,集計・解析を行った.対象者は,1.5歳健診者が,89名(母親記入:87名,父親記入2名),3歳健診者が63名(母親記入:62名,父親記入1名)およびその保護者であった(回収率73.1%).1.5歳児において,M-CHATがカットオフ値以上であったのは12名(13.4%)であり,3歳児においてASQがカットオフ値以上であったのは4名(7.9%)であった.また.1.5歳児は,M-CAHT得点が高いほど(自閉傾向が強い),平日および休日の入床時刻が遅かった.3歳児はASQ得点が高いほど(自閉傾向が強い),平日起床時刻が遅かった.また,3歳児では自閉傾向が高いほど,平日および休日のインターネット使用時間が長かった.本研究では,自閉傾向と総睡眠時間との関連は認めなかったが,入床時刻や起床時刻など睡眠-覚醒リズムが関連する可能性が示された.また,インターネット使用は睡眠環境に影響を及ぼすことから,発達障害への早期介入するポイントとして留意する必要がある.愛媛県東温市の健診にあわせて,データを確実に蓄積できており,現段階では想定外の問題はみられない.「研究の目的」平成29年度の研究では,乳幼児の生活様式による睡眠状況とメディア使用の違いに関する検討を行うことを目的とした.「研究実施計画」平成28,29年度に,愛媛県東温市の1.5歳および3歳児健診時に睡眠状況,メディア使用に関する問診票および自閉スペクトラム症のスクリーニング問診票(M-CHAT)の配布した.平成29年度は,保護者記入式の問診票から得られた指標を用いて,睡眠状況,メディア使用と生活様式(日中自宅で過ごす,保育園への通所,幼稚園への通園)との関連について解析した.対象は,1.5歳児183名(男児93名,女児90名)と3歳児215名(男児104名,女児111名)であった.結果,1.5歳児は日中自宅で過ごしている場合も,保育園で過ごしている場合も,総睡眠時間およびメディア使用の実態に有意な差は認めなかった.一方,3歳児は,総睡眠時間に有差はなかったが,幼稚園に通う幼児は,最もメディアの使用度が高かった.特に,携帯用ゲーム,据え置きゲームの使用頻度が高かった.生活様式にあわせたメディア使用の実態について報告した.乳幼児の生活状況にあわせたメディア使用への介入が必要である.今後は,自閉症の特性とメディア使用の関連についても検討する予定である.

平成28年度より,1.5歳時・3歳時健診を実施した児童を対象に,調査を継続している.1歳半児健診:総290名(男子134名,女子156名),3歳児健診:総268名(男子132名,女子136名)であり,順調に回収できている.現在解析をすすめている.健診者のうち,診断・介入が必要と思われる乳幼児を愛媛大学医学部附属病院の子どものこころセンターおよび睡眠医療センターへの受診をすすめる予定であったが,地域の見守りや助言に留まり,受診希望者の収集には至らない事例が多い.引き続き,発達障害および睡眠障害患者群を続きリクルートする.臨床評価および終夜ポリグラフィ検査指標との関連を抽出する.【研究目的】自閉スペクトラム症(Autism Spectrum Disorders: ASD)などの神経発達症は,睡眠障害を併存することが多く,神経の発達と関連している可能性がある.睡眠障害が神経発達症の早期兆候をとらえる上で重要な指標になりうるか検討することを目的とした.【結果】2016年9月から2019年2月に1.5歳健診を受けた611名のうち426名(M:F=204:222, 18.1±1.1ヶ月)から回答を得た(有効回答率:69.7%)・M-CHAT 3/23項目以上のASD特性有群は50名,3/23未満のASD特性無群は350名であった.睡眠習慣に関しては,昼寝回数/週(ASD特性有群v.s. ASD特性無群:6.5±1.3 v.s. 6.8±0.7, p=0.047)以外は,有意差は認めなかった.睡眠の問題に関しては,睡眠時間の変動がASD特性有群で有意に大きく(χ2=16.518, df=1, p<.001),寝相の悪さが有意に少なかった(χ2=5.771, df=1, p=0.018).【考察】ASD特性を有する乳幼児と有しない乳幼児では,睡眠習慣に差がなかった.しかし,ASDの特性を有する児は睡眠時間の変動が有意に大きく,睡眠覚醒リズムの構築の困難さが示唆され,臨床感と合致する所見であった.睡眠覚醒リズムが幼少期より構築しにくい場合,神経発達症の可能性を考慮することの重要性が示された.1.5歳健診データとして500名を予定していたが,まだ達成できていないため,延長申請を行っている.3歳時健診にて,Autism Screening Questionnaire (ASQ)を用いてスクリーニングを試みたが,十分に特性を反映できていない可能性があり,問診票の変更を検討中である.平成29年度も,引き続きデータを蓄積する予定である.また.本横断調査の未分析部分(保護者と子どもの睡眠習慣や情報機器使用の種類や使用状況の関連,発達に影響を与える因子,睡眠習慣・睡眠問題の関連に関する記述統計的特徴の検討など)を行い,今後の調査の項目を精選する.加えて,今年度は,アクチグラフなどの客観的データも導入して,問診票における指標と生理指標の関連を明らかにする予定である.平成30年度も引き続きデータを蓄積する.平成30年度は,平成28年度に1.5歳児健診を実施した児童の3歳児健診となるため,同一児童の経年変化について検討を予定している.昨年に引き続き,睡眠状況,メディア使用と自閉症の症状程度の関連についてさらに解析をすすめる.また,愛媛大学にて平成29年度に実施した自閉症検査セット(ADOS-2)を用いて自閉スペクトラム症を更に精密に診断する.発達検査と睡眠検査を実施して,問診票における指標と生理指標の関連を明らかにする.
細胞増殖に関わるPKC分子種の同定とその作用機序の解析

細胞内情報伝達系において重要なSer/Thrリン酸化酵素であるプロテインキナーゼC(PKC)は、多数の関連分子からなる遺伝子ファミリーを形成している。PKCは細胞の増殖や分化の制御に関わっていることが示唆されているが、その作用は細胞によって異なる。これは細胞毎に発現しているPKC分子種の種類が異なり分子種により生理機能が異なることに起因すると思われる。G0期のラット繊維芽細胞3Y1に増殖刺激を施すと、内在性PKC分子種のうちδとεが強く活性化されるがαの活性化は検出できないことを申請者はこれまでに報告している。そこで本年度は3Y1細胞の増殖に関わるPKC分子種を同定し、その作用機序を明らかにすることを目的とし、PKCα、δ、εの高発現株を作製し増殖刺激に対する応答を解析した。即ち、PKCδ及びεの発現ベクターとネオマイシン耐性遺伝子を3Y1に導入後ネオマイシン培地で選択し、各PKC発現株を単離した。各クローンのPKC発現量は特異抗体を用いたウェスタンブロッテイング及び細胞の[^3H]PDBu結合能の測定により求めた。次に、血清飢餓により静止期に同調したPKC高発現株をTPAや血清、EGF、LPA等で刺激し、[^3H]Thymidineの取り込みを測定することにより誘導されたDNA合成量を求めた。全てのδ高発現株は内存性のδに比べ発現量が究めて低く、顕著な効果が見られなかった。しかしベクターのみを導入したコントロール株に比べ、ε高発現株ではEGF刺激に対する応答性が若干上昇していた。そこで、より高発現の効果を検討するためにtransientな発現系でDNA合成能の解析を行う系を確立した。即ち、PKCとマーカー遺伝子(CAT)を細胞に導入しマーカーに対する抗体で細胞染色によりPKCを発現した細胞を同定し、同時に細胞にBrdUを取り込ませ抗BrdU抗体による二重染色でDNA合成の有無を判定するものである。これを用い、現在εの効果について検討中である。
低酸素性の呼吸抑制に関連する脳幹ニュ-ロンの解析

本研究により以下の新知見を得た。1.頚動脈洞神経と頚部迷走神経を切断することによって、末梢化学受容器からの求心性入力を除去したネコで実験を行った。なお、人工呼吸により、動脈血の酸素分圧と炭酸ガス分圧が正常範囲内になるように換気量を調整した。呼吸中枢からの出力として横隔神経活動をモニタ-した。このような条件下で、中枢性の低酸素負荷を与える目的で、一側椎骨動脈に挿入したカテ-テルから、窒素ガスで飽和した(無酸素)生食を注入すると、呼吸抑制と血圧上昇が誘発された。この反応は注入後、直ちに出現することから、椎骨動脈の還流域である下部脳幹に、呼吸抑制を誘発する構造があると考えられた。更に、中脳レベルで除脳した動物でも、同様の反応が出ることから、低酸素性の呼吸抑制は橋・延髄の領域で発生することが明らかとなった。2.上記の低酸素負荷に応答する神経を延髄領域で探索した。候補となる神経は延髄網様体の持続性に発射(呼吸性リズムを持たない)ものである。この領域には、呼吸との関連で、いわゆる中枢性化学受容器の存在が知られているので、はじめに、この点を検討した。窒素の代わりに、炭酸ガスで飽和した生食を椎骨動脈から注入すると、呼吸の亢進がおこるが、それと完全に対応する時間経過で活動亢進する神経が同定され、それらは中枢化学受容器の構造に関連するものと考えられた。一方、低酸素負荷で反応する神経も、延髄網様体で発見されたが、それらの分布は、中枢性化学受容器に関連するの神経よりも、吻側延髄にあり、比較的腹外側に多いことが明らかとなった。平成元年度の研究では、以下の実績が得られた。1.中脳レベルで除脳した、自発呼吸下のネコで、椎骨動脈カテ-テルからN_2飽和生理食塩水を微量注入して、一過性の低酸素負荷を与えると直ちに呼吸抑制が誘発された。一方、CO_2で飽和した生食を同量注入すると、逆に呼吸は明確な興奮反応(中枢化学受容器刺激効果)を示した。これらの結果は、橋・延髄に低酸素で呼吸を抑制する構造があることを示すものと解釈されるが、本デ-タはJ.Autonomic Nervous Systemに発表された。2.上記の負荷で反応するニュ-ロンを延髄腹側の網様体を中心に探索した結果、N_2注入負荷(低酸素負荷のみ)には、興奮性反応をするが、CO_2注入負荷には反応しないものが見出され、中枢性の低酸素のみに応答するニュ-ロンが存在することが確かめられた。この結果は、日本生理学会に発表した。3.多連微小ガラス電極を用いて、呼吸性ニュ-ロンを細胞外記録しつつ、その近傍にセロトニン、ノルアドレナリンをピコ・ポンプを用いて微量圧注入する実験にて、興味深い新知見が得られた。呼気性ニュ-ロンにはセロトニンで興奮するものと、抑制するものがあり、その違いは呼気性ニュ-ロンの発射パタ-ンに基づき、漸減型は興奮で、漸増型は抑制であった。この結果は日本神経科学集会に発表した。漸減型発射の呼気性ニュ-ロンは迷走神経(反回神経)を介して上気道開大筋(内喉頭筋の後筋)を支配している可能性が示唆されたので、現在、逆行性刺激法と組織学的検索法を利用してこの点を検討中である。1.頚動脈洞神経と頚部迷走神経を切断することによって、末梢化学受容器からの求心性入力を除去したネコで実験を行なった。

呼吸中枢からの出力として横隔神経活動をモニタ-した。このような条件下で、中枢性の低酸素負荷を与える目的で、一側椎骨動脈に挿入したカテ-テルから、窒素ガスで飽和した(無酸素)生食を注入すると、呼吸抑制と血圧上昇が誘発された。この反応は注入後、直ちに出現することから、椎骨動脈の還流域である下部脳幹に、呼吸抑制を誘発する構造があると考えられた。更に、中脳レベルで除脳した動物でも、同様の反応が出ることから、低酸素性の呼吸抑制は橋・延髄の領域で発生することが明らかとなった。2.上記の低酸素負荷に応答する神経を延髄領域で探索した。候補となる神経は延髄網様体の持続性に発射(呼吸性リズムを持たない)ものである。この領域には、呼吸との関連で、いわゆる中枢性化学受容器の存在が知られているので、はじめに、この点を検討した。窒素の代わりに、炭酸ガスで飽和した生食を椎骨動脈から注入すると、呼吸の亢進がおこるが、それと完全に対応する時間経過で活動亢進する神経が同定され、それらは中枢化学受容器の構造に関連するものと考えられた。一方、低酸素負荷で反応する神経も、延髄網様体で発見されたが、それらの分布は、中枢性化学受容器に関連するの神経よりも、吻側延髄にあり、比較的腹外側に多いことが明らかとなった。