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フィリピンおよびインドネシアにおける日本の占領政策・統治実態の比較研究-史料探索と聞き取り調査を中心として-

平成12年度は3年間におよぶ研究期間の最終年度にあたる。フィリピン班の寺田は第2年度にひきつづき米国の国立公文書館、議会図書館をはじめとする文書館において関係史料、コレクションの調査にあたった。池端はフィリピンおよびシンガポールにおいて華人関係の文書の調査にあたり、高橋はフィリピンの国立公文書館、アテネオ・デ・マニラ大学アメリカン・ヒストリカル・コレクション等において第二次大戦期のフィリピン側指導者に関する史料を収集した。インドネシア班の内海はオーストラリア国立文書館、戦争博物館等においてインドネシアで抑留された敵性民間人に関する史料調査をおこない、原はインドネシアにおいてキリスト教関係の文書の収集を進めた。小座野はインドネシアにおいて第二次大戦下の村落社会の変容を具体的に把握するために、フィールドワークを実施した。一方、ストポは日本において史料調査に従事した。こうした研究活動の成果は現在、論文として準備されつつあり、『上智アジア学』9号(2001年、上智大学アジア文化研究所)に特集号として掲載、公刊される予定である。また、今回の研究、とくに史料調査と聞き取り調査より得られた史料等を利用した研究成果は学会、シンポジウム、研究会等における口頭発表の形で徐々に公表されつつある。全体として、これまでの研究で欠けていた部分、日本による統治実態のなかでも宗教関係者、敵性民間人の処遇、華人の動向、フィリピンで日本が組織した翼賛団体の活動、村落における社会変容等について新しい事実を発掘することができた。本研究は、第2次世界大戦下のフィリピンとインドネシアにおける日本の統治政策・統治実態を、史料調査と関係者に対する聞き取り調査によって、明らかにすることを目的とし、平成10年度より3年間の計画で実施中である。初年度にあたる平成10年度には、フィリピンとインドネシアにおいて当初の研究計画にもとづいて調査を行った。フィリピンについては、研究代表者の寺田勇文および研究分担者の池端雪浦、Ricardo T.Jose(フィリピン大学歴史学科、現地参加)の3名が、マニラ、セブ等において各種文書館(国立文書館、国立図書館、ホセ・P・ラウレル記念財団図書館、マニラ大司教館付属文書館、フィリピン大学図書館所蔵日本占領期コレクション、アネテオ・デ・マニラ大学フィリピニアナ・コレクション等)で史料調査を行ったほか、関係者の聞き取りを実施した。インドネシアについては、研究分担者の内海愛子、原誠、小座野八光、前川佳遠理、Soetopo Soetanto(インドネシア大学日本研究センター、現地参加)の4名がジャカルタ、ジョクジャカルタ、ビアク、アンボン、バンジャルマシン、ボンチアナク、プラマン等において史料調査と聞き取りを実施した。今年度発掘した史料のなかにはこれまでの研究では利用されておらず、資料的価値の高いものも多く含まれている。また、とくにインドネシアでは首都のジャカルタやジョクジャカルタ以外に、カリマンタンや東インドネシアの島々において聞き取り調査を進めることができた。発堀した史料については現在各自が目録を作成中、聞き取り調査については録音テープからの筆耕作業を行っている。平成11年度は本研究の第2年度目にあたる。フィリピン班のうち3名(寺田勇文、池端雪浦、高橋久志)は、フィリピンの元宗主国である米国において史料調査および関係者の聞き取り調査を行った。史料調査の主たる場所はハワイ大学ハミルトン図書館フィリピン・コレクション、国立公文書館、スタンフォード大学フーバー研究所等であり、とくにワシントンDCの国立公文書館においては、第2次世界大戦期の米戦略事務局(OSS)文書群、国務省文書を集中的に探索した。その結果、これまでほとんど知られることのなかった日本占領期フィリピンにおける日本の対比住民動員政策およびそれに関する米国側の評価にかかわる一次史料を入手することができた。これらの文書は、現在、他の文書、一次史料、聞き取り調査の結果と対照させながら検討中である。また、インドネシア班のうち4名(内海愛子、原誠、小座野八光、前川佳遠理)は、インドネシアの元宗主国であるオランダにおいて史料収集を行い、未刊行一次史料を多数入手することができた他、オランダ側の研究者と意見交換を行った。オランダにおける史料調査の主な場所は、戦争資料館(アムステルダム)、陸海軍資料館、公文書館(ハーグ)等である。

また、フィリピンのRicardo T.Joseはマニラで、インドネシアのSoetopo Soetantoはジャカルタで史料収集を継続した。来年度には全員が集まり、東京でコロキウムを開催し、研究成果の相互確認を行うとともに、成果の最終的な公刊の準備を進める予定である。平成12年度は、本研究の最終年度(第3年度)にあたる。フィリピン班のうち、研究代表者の寺田勇文は昨年度にひきつづいて、キリスト教関係の宣撫工作活動の全体像を探るため、米国(主として国立公文書館)においてOSS(米国戦略事務局)および国務省関連文書の探索を行った。池端雪浦はフィリピンおよびシンガポールで日本占領下フィリピンにおける華人社会の動向について史料を発掘し、高橋久志はフィリピンにおける抗日運動および対日協力者問題に関してフィリピン国立文書館、アネテオ・デ・マニラ大学図書館American Historical Collection等で史料調査を行った。インドネシア班のうち、内海愛子は敵性国民間人の状況を把握するために、オーストラリアの国立公文書館、戦争資料館等で史料調査を行った他、関係者の聞き取りを実施した。原誠はインドネシアのジャカルタ神学大学他のキリスト教関係機関で史料探索と聞き取りを行い、小座野八光はインドネシア中部ジャワ州プマラン地方において住民動員の実態に関する聞き取りを実施、前川佳遠理はジャカルタのインドネシア元兵補協会関係者を中心とする聞き取りに従事した。海外共同研究者のリカルド・ホセ(フィリピン大学)はフィリピンにおいて、ストポ・スタント(インドネシア大学)は日本で史料調査と関係者の聞き取りを進めた。以上の調査により、日本の占領統治政策には地域により異なる部分があり、今回発掘された一次史料や聞き取り調査の結果をもとに、そうした細部を含めて全体像を検討することが重要であることが理解された。
常染色体劣性遺伝性痙性対麻痺の原因遺伝子の同定に基づく病態解明研究

常染色体劣性遺伝と考えられる遺伝性痙性対麻痺症例16例についてエクソーム解析を行った。SPG11に加え、SPG15など稀な病型を見出した。網膜色素変性症を伴う遺伝性痙性対麻痺3症例からは共通する遺伝子にそれぞれホモ接合性の変異を認め、さらに症例を増やして病原性について検討する必要があると考えられた。エクソーム解析のパイプラインが確立され、エクソーム解析を行う準備が完成した。また、常染色体劣性遺伝の原因遺伝子を同定するにあたり、ホモ接合もしくは複合ヘテロ接合となる遺伝子をピックアップすることが可能となり、エクソーム解析から原因遺伝子の候補となる遺伝子を見出すことができるようになった。また、実際のエクソーム解析を行ったデータから、既知ではあるが原因遺伝子を同定することができ、エクソーム解析は遺伝子同定に非常に有用であると考えられた。具体的には、AgilentのSureSelect V5+UTRでエクソン領域のキャプチャーを行い、HiSeq2500を用いて101塩基ペアエンド法で塩基配列解析を行った。得られたデータについては、参照配列にアラインメントを行い、変異の抽出を行った。16例の解析より、SPG11に加え、SPG15など稀な病型を見出すことができた。網膜色素変性症を伴う遺伝性痙性対麻痺3症例からは、エクソームデータを用いた連鎖解析を行い、一つの染色体上の高いLODスコアを示す領域があることが判明し、その中に存在するある遺伝子にそれぞれ別々のホモ接合性の変異を認めた。本遺伝子については、さらに症例を増やして解析を行い、病原性について検討するとともに、臨床的なスペクトラムについて検討する必要があると考えられた。サンプル調整を行い、次世代シーケンサーを用いた解析方法を確立させていたものの、実際の塩基配列解析には至らなかったため。25年度が最終年度であるため、記入しない。今後実際に塩基配列解析を行い、新規原因遺伝子の同定を目指す。原因遺伝子が同定されれば、その機能解析を行い、遺伝性痙性対麻痺の病態解明を目指す。
導電性粒子の異常再飛散現象の制御を利用した電気集塵

電気集塵は低圧力損失でナノサイズの粒子を捕集することが可能であり、従来の機械式フィルタに対して大きなアドバンテージを有している。しかしながら、導電性微粒子の再飛散によって捕集効率が低下する問題がある。本研究では電気集塵装置内における導電性粒子の異常再飛散の素過程を解明し、もって粒子の凝集状態を抑制・制御する手法を見出すことを目指す。
酸化的ストレスを介した遺伝子発現再活性化による糖尿病骨合併症発症機構の解析

糖尿病性骨合併症発症機構を解明するために、特に酸化的ストレスに注目し、マウス骨髄間質細胞株を用いてin vitroでの検討を行った。酸化的ストレスは、secretedFrizzled-related protein 4 (sFRP-4)に加えて、破骨細胞分化因子(RANKL)の発現増強、逆にRANKL阻害因子のOsteoprotegerin (OPG)発現を減少させた。またWnt/β-catenin系シグナルの一部を抑制した。sFRP-4に着目したところ、本遺伝子プロモータ領域TATA-box近傍のCpGアイランドでは、定常状態で高頻度のシトシンメチル化が観察され、メチル化シトシン結合蛋白(MeCP2)を介する転写抑制機構が推察された。一方、酸化的ストレス環境下では、このCpG配列のグアニン8位に水酸化が起きた場合、MeCP2結合に干渉して、TATA-box結合蛋白(TBP)とTATA-boxとの結合の促進が観察され、酸化的ストレスによるsFRP-4遺伝子発現再活性化機構を明らかにした。またin vitroの観察では、薬剤性に糖尿病を誘発した野生型マウスの大腿骨などで、骨梁減少が観察された。独自に開発したsFRP-4欠損マウスは、自然経過での加齢による骨量減少に抵抗性であった。急激な酸化的ストレスはRANKLを介する急激な骨吸収を促進し、加齢などの緩やかな酸化的ストレス下では、sFRP-4がWnt/β-catenin系を介する骨代謝回転を抑制することで、骨減少症ひいては骨粗鬆症を招来することが示唆された。本年度には、研究目的に挙げた項目(1)(3)のうちで、特に(1)について研究を行った。1. Memthylglyoxal(MG)投与による酸化的ストレス下での遺伝子発現変動の網羅的解析;マウス骨髄間質細胞株ST2に対し、24時間の100μMのMG投与による酸化的ストレスを短期的に加え回収したmRNAの発現を網羅的に解析したところ、31,769遺伝子のうち、354遺伝子が2倍以上の発現増加を示し、121遺伝子が0.5倍以上の発現低下を示した。予備検討結果と同様にsecreted Frizzled-related protein 4(sFRP-4)遺伝子を含む、多くのWnt/β-cateninシグナル関連遺伝子に優位な発現変動を認めた。2.酸化的ストレスにより発現回復を示すsFRP-4を含む遺伝子プロモータ領域の構造解析;マウスsFRP-4遺伝子プロモータ領域には転写開始部位上流37塩基あたりにTATA-boxを認め、その上流5塩基の部位に2つ連続するCpGを認めた。また、ST2細胞から回収したgenomic DNAを用いたsodium bisulfate mapping法では、独立した12株での検討では特にTATA-box直上のこの2連続するCpGのメチル化は高頻度(20/24)であり、steady-stateでのsFRP-4遺伝子発現を抑制する機構の一つとして、このTATA-box直上CpGメチル化の重要性が示唆された。以上の成果を、国内外の学会に於いて発表した。なお、実験器具、実験系に関して、最適な実験系を整備することが出来た。本年度には、研究目的に挙げた項目(1)(3)のうちで、主に(2)について研究を進めた。Memthylglyoxal (MG)のマウス腹腔内投与を行う前に、まず、streptozotocin (STZ)投与による糖尿病発症マウスを作成し糖尿病による酸化的ストレスを加えたマウス個体での骨の検討を行った。このマウスから長管骨(大腿骨および脛骨)を採取し、組織形態学的に観察を行ったところ、同週齢の正常個体に比較して、一次海綿骨骨梁短縮・減少が観察された。

また、パラフィン切片での免疫組織化学的なsecreted Frizzled-related protein 4 (sFRP-4)の発現を検索したところ、骨皮質内膜での骨芽細胞細胞質に陽性シグナルの増加を認めた。今後、酸化的ストレスマーカーである8-OHdGに対する免疫組織化学的検索を行う予定である。この他、研究目的で挙げた項目(1)の追加検討として、MG投与下に培養した、マウス骨髄間質細胞ST2細胞を用いて、蛍光免疫染色を行い、MGによる酸化的ストレス負荷を加えた系では、これを加えない系に比較して胞体でのsFRP-4シグナルが増加する現象を認めた。今後は、更に、sFRP-4蛋白を始め、Wntシグナル(古典的経路、非古典的経路)の下流の因子の蛋白の変化について検討する予定である。以上の成果の一部を、国内外の学会に於いて発表した。なお、実験器具、実験系に関して、最適な実験系を整備することが出来た。本研究計画においては、sFRP-4遺伝子ノックアウトマウスの全身の表現型・酸化的ストレスに対する硬組織変化の解析を行う。これまで、理化学研究所変異マウス共同開発チームとの共同研究により、sFRP-4遺伝子第1エクソンを破壊し、LacZカセットに挿入したベクターを用いてマウスES細胞に導入し、相同組み換えクローンの単離同定をサザンブロット法にて行い、このES細胞由来のキメラマウスを作成後、F1マウスの交配を経て、ノックアウトマウスの作成が終了した。まずは、natural courseでの同マウスの発育、加齢による硬組織変化を骨形態計測、μCTなどの手法で観察し、正常マウスとの比較を行った。結果:sFRP-4遺伝子ノックアウトマウスは、正常マウスと同様の発生を示し、継代可能であった。体重の推移は、正常マウスと同様であった。また、個々の臓器重量についても、正常マウスと際立った変化は見られなかった。若年(17週齢)個体と高齢(46週齢)個体の大腿骨を用いた解析では、若年マウスでは、骨パラメータ量(骨構造に関するパラメータ(海綿骨量、骨梁幅、骨梁数など)、骨形成に関するパラメータ(類骨面、骨芽細胞面、骨石灰化面、石灰化速度、骨形成率など)、骨吸収に関するパラメータ(骨吸収面、破骨細胞数、破骨細胞面など))において、正常マウスとの間に有意差は見られなかったが、正常マウスに比較して、sFRP-4ノックアウトマウスでは、高齢マウスの骨形成パラメータは保たれることを明らかにした。本研究計画においては、sFRP-4遺伝子ノックアウトマウス(sFRP-4 KO)新生仔頭蓋冠間葉系細胞の回収と、これを用いた培養系の確立を目指した。生後1週間以内の野生型マウス及びsFRP-4 KOマウスより、頭蓋冠を摘出後、間葉系細胞を回収し、頭蓋冠初代培養細胞とした。回収した頭蓋冠初代培養細胞を用いて、前年度までに行った、酸化的ストレス負荷試験と同様の手順でs-FRP-4など種々の遺伝子発現の変化を観察した。また、前年度にnatural courseでの同マウスの発育、加齢による硬組織変化を骨形態計測、μCTなどの手法で観察し、正常マウスとの比較を行ったが、本年度は、個体数を増やして同様の検討を行った。結果:生後1週間以内のsFRP-4 KOマウス由来の頭蓋冠由来間葉系細胞は、概ね3回の継代が可能であった。形態的に、紡錘形細胞であり、ST2細胞などの骨髄間葉系細胞と同質の形態を示した。Methylglyoxal投与による酸化的ストレス負荷の前後で、野生型およびsFRP-4 KOマウス
心筋再生治療の実用化(細胞移植心における致死性不整脈発生機序の解明と予防)

近年障害を受けた臓器の機能を再生させる目的で細胞移植治療に関する研究が進められている。循環器分野でも、不全心へ多様な細胞を移植することによって心機能が向上することが基礎研究から確認された。これらの研究に基づいてヒト不全心への細胞移植が試みられ、その結果致死性不整脈が高頻度に出現することが確認された。今後心臓への細胞移植研究が進展し、細胞移植による心機能回復率がさらに向上したとしても、その実用化には致死性不整脈の制御は避け得ない重要な課題であると考えられる。従って、我々の研究室では細胞移植を受けた心臓の"致死性不整脈の発生機序に関する検討"を進めた。本研究では、ヒト心臓への細胞移植が既に報告されていた骨格筋芽細胞を検討対象とした。平成16年度:骨格筋芽細胞の電気生理学的特性に関して検討した。この結果(1)骨格筋芽細胞は-100mVの深い静止膜電位にあり、筋管細胞へ分化する直前に静止膜電位が大幅に上昇すること(2)筋管細胞分化後は-40mVの浅い静止膜電位で安定すること(3)筋管細胞では小刻みの自発的収縮を繰り返し認めること(4)筋管細胞は隣接細胞との間に電気的連関が全くないことを明らかとした。平成17年度:骨格筋芽細胞と心筋細胞の電気生理学的関連性に関して検討した。この結果(5)筋管細胞は周辺の心筋細胞とは電気的に独立しており、筋管細胞が心筋細胞間の電気的連関を妨害すること(6)ごく一部の筋管細胞は心筋細胞との間で細胞融合を生じること(7)筋管・心筋融合細胞には、心筋細胞型の電気生理学的特性を示すものや骨格筋細胞型電気生理学的特性を示すものがあること(8)一部の融合細胞は周辺心筋細胞と同調した収縮を起こすことを明らかとした。これらの結果から、移植された細胞が電気的に周辺心筋と独立した場合には心筋内の興奮伝播の障壁となることによって、一方、移植された細胞が心筋細胞と融合し電気的連関を周辺細胞との間に獲得した場合には電気的な不均一性の増大によって、致死性不整脈が出現すると考えられた。昨年度の交付金により、これまでに当研究室での検討から以下の事柄が明らかとなった。すなわち、1)骨格筋芽細胞は深い静止膜電位にあり、細胞同士が融合する直前に静止膜電位が上昇すること2)筋管細胞に分化後は概ね-40mV程度の静止膜電位で安定すること3)一部の筋管細胞では自発興奮を認めること4)筋管細胞自体はGap Junctionを隣接細胞間で形成せず電気的に独立していることである。一方骨格筋芽細胞が心筋へ移植された場合に致死性不整脈を起こすことは近年の多くの臨床研究から明らかとされている。この原因として、心筋とは異なる活動電位持続時間を持つ移植骨格筋芽細胞の一部が周辺心筋細胞と細胞融合を起こし、新たな電気的連関を<ホスト心筋細胞-ドナー筋管細胞間>に獲得することに起因することが基礎的検討結果から示唆されている。これらの報告に基づき現在我々は初代培養細胞を用いて、心筋細胞-骨格筋管(筋芽)細胞の融合細胞の電気生理学的な特性を評価(実際には(1)生細胞染色蛍光色素であるRFP遺伝子を導入したラット骨格

筋芽細胞をGEP発現ラット由来の心筋細胞と共培養し、(2)細胞融合を生じた細胞をRFPとGFPの何れもが陽性であることを用いて選別し、(3)この融合細胞の電気生理学的な特性をパッチクランプ法により解析)している。現在までにプレリミナリーな結果ではあるものの、融合細胞の一部では形態的に明らかな筋管細胞様でありながら活動電位持続時間が骨格筋型から心筋型へ明らかに変化しているものがあることを確認している。今後は複数のこれらの融合細胞の電気生理学的特性を評価することによって、骨格筋芽細胞が心筋内へ移植された際に形成される融合細胞の電気生理学的あるいは機能的特性がどのようなものであるかを検討することによって、骨格筋芽細胞の心筋への移植時に生じる不整脈の発生機構を検討していく予定である。骨格筋芽細胞が心筋へ移植された場合に致死性不整脈を起こすことは近年の多くの臨床研究から明らかとされている。しかしながら細胞移植に伴うこの不整脈出現のメカニズムは現在のところ明らかではない。このような背景を元に我々は細胞移植心における致死性不整脈発生機序の解明を目的として本検討を進めた。先ず我々は移植対象細胞である骨格筋芽細胞に関し以下の電気生理学的特性をin vitroの系を用いて明らかとした。すなわち、1.骨格筋芽細胞は深い静止膜電位にあり、細胞同士が融合する直前に静止膜電位が上昇すること2.筋管細胞に分化後は概ね-40mV程度の静止膜電位で安定すること3.一部の筋管細胞では自発興奮を認めること4.筋管細胞自体はGap Junctionを隣接細胞間で形成せず電気的に独立していることである。次に我々は細胞移植により形成される"心筋細胞と骨格筋芽細胞の融合細胞"の電気生理学的特性をin vitroの系を用いて検討した。この結果、5.一部の融合細胞は周辺心筋細胞と同期した収縮を認めるおよび6.一部の融合細胞は心筋細胞同様の活動電位持続時間(APD)を認めることを確認した。なおこの際、不活化センダイウイルスが細胞の生存性に影響を与えず効率よく細胞融合を誘導することを、同時に明らかとした。これらの結果に基づいて、筋芽細胞移植による致死性不整脈発生のメカニズムは以下の2種類に集約されると考えた。すなわち1-4よりa.筋芽細胞の移植によって興奮伝播上の障壁が新たに出現し、リエントリー等のメカニズムに基づいた不整脈が出現するそして5-6よりb.筋芽細胞が心筋細胞との細胞融合を介して周辺心筋細胞と電気的連関を獲得することにより、自動能やtriggered activityに基づいた不整脈が出現することが明らかになった。
児童・生徒の仲間集団の排他性に関する研究

本研究は,児童・生徒の仲間集団の排他性について,自身の排他性欲求と所属集団の排他性行動規範の認知という2つの指標を取り上げた。この2つの要因が学級集団及び所属集団への適応感,学習意欲などに及ぼす影響について検討を行った。複数の調査および実験を行った結果,排他性欲求は適応感や学習意欲を高め,逆に排他性規範は低める傾向が示唆された。ただし,これらの結果は,校種や性が媒介要因として機能しており,一貫していなかった。本研究は,中学生の仲間集団に見られる排他性が学級や自分の所属する集団の適応感,集団内メンバーの関係性,いじめが起こった場合の状況認知に及ぼす影響について検討を行った。排他性は,排他性欲求と排他性規範からとらえることができる。前者は,自分の仲間であるかどうかによって相手に対する態度を変えたり,仲間以外の児童と活動することを楽しくないと感じたりする程度の強さ(三島,2004)と定義されており,後者は,実際に所属している仲間集団がとる行動の規範であり,同一行動から構成されるものと定義できる。研究では,架空場面を用いた実験を採用し,排他性欲求(高・低)×排他性規範(高・低)からなる4つのシナリオのうち1つを読ませることで行った。対象は中学1,2年生400名であり,適応感については,シナリオの登場人物になったつもりで,また,いじめなどの関係内外の認知については,客観的な立場で回答を求めた。分析は,排他性欲求×排他性規範×性別の3要因計画で行った。その結果,自分の所属する集団に対する適応感は,排他性規範が高くかつ排他性欲求が低い条件で最も低く評価された。また,学級適応感では,排他性規範の高群が低群より,排他性欲求の高群が低群より,それぞれ低く評価された。さらに,排他性規範が高群は低群より,メンバーのストレスが高く,いじめが起こりやすく,かつ意見表明がしにくいと評価された。排他性規範が高い場合,本来,対等であるはずの仲間集団の中に地位の差が生じていることを示唆させる研究成果であると言えよう。今後は,これらの知見を踏まえ,仲間集団の排他性が学習意欲などの指標に及ぼす影響過程を明らかにし,こうした問題に対する支援の方策を検討していく。本研究では,中学生・高校生の仲間集団に見られる排他性が及ぼす影響について検討を行うために,尺度の見直しを図った。これまでの研究で,排他性は,排他性欲求と排他性規範からとらえることができ,前者は,仲間集団やそのメンバーとの親密さを確認するために,第三者を排除して仲間集団内だけの活動および,特定のメンバーと一緒にいることを求める傾向,後者は,自分が所属している仲間集団のメンバーがとるべき同一行動についての暗黙の規範のことと定義した。本年度は,中学生のみの分析であるが,排他性欲求,排他性規範と,メンバーの類似性,友人との同一行動,社会的動機づけとの関連を見ることで,尺度の妥当性を検討した。その結果,排他性欲求と排他性規範との間には中程度の相関が見られたが,一方の尺度得点を統制して,メンバーの類似度との偏相関を求めたところ,排他性欲求との間には正の偏相関が,排他性規範との間には負の偏相関がそれぞれ見られ,概念的に独立していることを示唆する結果となった。併せて,社会的動機づけを説明変数,排他性欲求または排他性規範を目的変数とし,性ごとに重回帰分析を行って検討したところ,排他性欲求は,男女とも関係接近動機によって説明できたが,排他性規範は女子のみ関係回避動機よって説明された。以上のことから,女子の仲間集団の排他性規範が,関係回避動機に基づくものであり,排他性規範が高い集団に所属する生徒ほど,対立や葛藤を避けようとする傾向を持ち合わせていると考えられる。本研究は,友人関係・仲間集団の排他性がもつ様々な影響について,様々な側面から検討を行った。特に,排他性は,個人のもつ排他性欲求と,所属する仲間集団の行動規範である排他性規範に分けられることを指摘した。前者は,自分の所属している仲間集団およびそのメンバーに対する概念であり,仲間集団やそのメンバーとの親密さを確認するために,第三者を排除して仲間集団内だけの活動および,特定のメンバーと一緒にいることを求める傾向と定義し,一方で後者は,自分が所属している仲間集団のメンバーがとるべき同一行動についての暗黙の規範のことであり,同一行動とは,同調行動や第三者を排除する行動から構成されるものと定義した。本年度の研究では,排他性欲求,排他性規範が学校生活時間内の感情頻度に影響を及ぼし,そのことが自ら学ぶ意欲の高さに影響していることを仮定し検討を行った。自ら学ぶ意欲のプロセスモデルを援用し,そのモデルに位置づけられている安心して学ぶ環境を構成する要因の一つとして,排他性欲求と排他性規範を考えた。その結果,高校生女子を除いて,排他性欲求が強くなることで,学校生活時間内のポジティブ感情を高め,そのことが自ら学ぶ意欲の欲求・動機面を高めることが示された。

全体的に十分な適合度が得られ,モデルとしては適切であったと言えよう。一方で,排他性規範については,自ら学ぶ意欲への影響が見られず,その原因としては,尺度の床効果の問題や,学校生活時間内の感情の測定方法の問題が指摘された。本来ならば,仲間集団の排他的な行動規範が強いと考えることで,学校生活において,不安や落ち込みといった感情が支配し,学習意欲にマイナスの影響を与えることが予想されたが,本研究ではその影響について十分に明らかにすることができなかった。当初の計画では,もっと広範囲に,調査を行う予定であったが,諸事情により,充分なデータ収集ができていないため。24年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度(平成24年度)は,これまでに実施した研究成果をまとめる。また,本年度中に実施する予定であった排他性欲求および排他性規範と学習態度や学習に対する自己評価との関係性を検討する。なお,質問紙については,本年度完成しており,5月以降,調査依頼をして実施していく。
多層構造物に対するMRダンパーを用いたセミアクティブ制御の実用化に関する研究

初年度は小型鉄骨造モデルの制御を対象とする最大荷重約300Nのダンパーを新たに設計製作して正弦波繰り返し加力により基本特性の把握を行った。また、同ダンパー力学特性をビンガムモデルとして模擬できることを、ランダム加力実験等により確認した。続いて、5層の鋼製小型フレームを製作し、フレームのみ、およびフレームに小型のパッシブオイルダンパー(速度依存型)、を設置した場合それぞれに対して減衰性能評価を行い、推定精度の向上を多面的に検討した。さらに、MRダンパーを1層のみに設置して、種々のアルゴリズムに基づくセミアクティブ制御による制振効果の検証を行った。周期の短い構造の振動制御においては、MRダンパーの電流印加に対する反応の遅れが制御効果を低減させる可能性もあることがわかった。第2年度は、前年度の製作した小型鉄骨造5層モデルを上部構造としてセミアクティブ免震制御の有効性を検証することを目的とした。はじめに、前年度に製作したダンパーと同じ構造をもち、ストロークを免震用に拡大して最大荷重を100N程度とする超小型MRダンパーを設計製作し、その性能を検証した。正弦波繰り返し加力により基本特性の把握を行い、ビンガムモデルとして力学特性を模擬できることを、ランダム加力実験等により確認した。また、三角波による定速度加力中に、電磁石への印加電流を急変することに対するダンパー抵抗力の追従性を検討し、免震建物モデルの制御に関しては、十分な反応速度を有することを確認した。一般的な免震建物では、積層ゴムの変形に伴うシステムの減衰定数は23%であるので、実験用の転がり支承の減衰を可及的に小さくするために、鋼鉄製のV溝を同じく鋼鉄のベアリング転がせる方式を採用することで約3.5%の低減衰を実現した。本研究では、地震入力に対する応答の低減を目標として、建物モデルの振動半サイクル入力エネルギーをMRダンパーにより吸収して、上部構造の大きな加速度応答を抑制すると同時に、免震層の変形を抑えることを目的として制御を行った。古典的に適用される瞬間最適制御による効果との比較検討により、本提案手法の有為性を確認した。解析および振動台実験でもそれを実証する。申請者らは既に20kN400kN級のダンパーの製作、性能検証を済ませているが、今年度は小型鉄骨造モデルの制御を対象とする超小型ダンパーを製作し、その性能を検証した。ダンパーの基本構造は一般的なオイルダンパーと極めて似ているため、当初は市販の小型のオイルダンパーをベースにしてシリンダー内ピストン部に電磁石を設置する方法を検討したが、市販品のオイルダンパーの多くは、摺動部の摩擦抵抗が過大であると判断して、建物モデルの特性に合う最大荷量20-30Nのダンパーを新たに設計製作した。正弦波繰り返し加力により基本特性の把握を行い、ビンガムモデルとして力学特性を模擬できる事を、ランダム加力実験等により確認した。続いて、5層の鋼製小型フレームを製作し、フレームのみ、およびフレームに小型のパッシブダンパーとして線形オイルダンパー(速度依存型)、粘弾性ダンパー(振動数依存型)、摩擦ダンパー(変位依存型)を設置した場合それぞれに対して減衰性能評価を行い、推定精度の向上を多面的に検討した。モデルの最上階にリニアモーターを設置してそれを起振器とする定常加振、および、振動台によるホワイトノイズ加振、地震動加振を行った結果に基づく分析により、各種ダンパーと加振方法の組み合わせに対して高精度な同定が可能であることを明らかにした。

実験では、センサーの使い分け、データ前処理・後処理等につき事前検討を十分に行った。さらに、MRダンパーを1層のみに設置して、種々のアルゴリズムに基づくセミアクティブ制御による制振効果の検証を行った。周期の短い構造の振動制御においては、MRダンパーの電流印可に対する反応の遅れが制御効果を低減させる可能性もある事が分かった。さらに、本手法の一般化に向けては、簡易なコントローラーによる制御手法を構築し、高性能の電源装置を利用した場合との比較検証も重要であり、次年度の課題とする。今年度は小型鉄骨造5層モデルのセミアクティブ免震制御を行なう事を目的とした。はじめに最大荷重が約100Nの超小型MRダンパーを設計製作し、その性能を検証した。正弦波繰り返し加力により基本特性の把握を行い、ビンガムモデルとして力学特性を模擬できる事を、ランダム加力実験等により確認した。また、3角波による定速度加力中に、電磁石への印加電流を急変する事に対するダンパー抵抗力の追従性を検討し、免震建物モデルの制御に関しては、十分な反応速度を有する事を確認した。続いて、5層の鋼製小型フレームを支持する免震層を設計製作した。実験には転がり支障を用いたが、一般的な免震建物では、積層ゴムの変形に伴うシステムの減衰定数は23%であるので、実験用の転がり支障の減衰を可及的に小さくするための仕組には工夫が必要であった。鋼鉄製のV溝を同じく鋼鉄のベアリングを転がす方式を採用することで約5%の低減衰を実現した。研究の行程は若干遅れているが、現在は上部構造を剛体とした1質点モデルを用いた自由振動などによりシステムの基本性能を確認している。制振構造の基本は、外乱により建物へ入力されるエネルギーを、建物の変形や加速度を増加させることに使用されること無く消費される仕組みを合理的に行なうことである。本研究では、地震入力に対する応答の低減を目標として、建物モデルの振動半サイクル中に入力されるエネルギーをMRダンパにより吸収して、上部構造の大きな加速動応答を抑制すると同時に免震層の変形を抑える事を目的として制御を行なう。その後上部構造を5層の鉄骨造もでるに置き換える。制御方法としては古典的に適用される瞬間最適制御による効果との比較検討を行う。本提案手法の有為性は既に解析的には実証を終えているが、今後は実験によりそれを実証する。
多結晶試料を用いた単結晶弾性定数の測定法の開発

本研究の目的は、X線回折に利用できる小型軽量な応力負荷装置を形状記憶合金を用いて作成すること及び,この装置を用いて多結晶試料から単結晶弾性定数の測定を実施することである.1.形状記憶合金を用いたX線回折用小型応力負荷装置の作成と評価TiNi合金製の負荷リング(内径18.5mm,肉厚25mm,厚さ4mm)を外注により作成した.時効無し及び400°Cで50hまでの熱処理を行った負荷リングのMsおよびAs温度は,それぞれ-27-19°C及び139°Cの範囲で変化した.応力負荷は,Ms温度付近でポンチによって内径を広げ,試料挿入後Af温度以上に加熱および室温までの冷却によって実施した.負荷応力はAf温度で最大値をとるが,室温までの冷却中にマルテンサイトが応力誘起されるため負荷応力は減少する.従って室温で最高応力を得るためにはAf温度が低い時効無しのリングが適しており,このリングを用いた場合,最高250MPaの2軸圧縮応力が室温で得られた.Fe-35Ni合金およびZrO_2-8mo1%Y_2O_3の単結晶弾性定数測定両試料とも立方昌系であるので,単結晶弾性定数はC_<11>,C_<12>及びC_<44>によって表される.Fe-Ni試料では3段階の異なる応力値を負荷し,最小2乗法により求めたX線弾性係数より次の値が得られた.同一組成の単結晶試料より得られた値は不明であるが,Fe-30Niに対する値(C_<11>=1.463.C_<12>=0.881,C_<44>=1.132〔10^5MPa〕)と比較して妥当な値と考えられる.ZrO_2-8mo1%Y_2O_3試料に関しては現在試料作成中である.今後立方晶以外に正方晶や六方晶への拡張が期待される.本研究の目的は、X線回折に利用できる小型軽量な応力負荷装置を形状記憶合金を用いて作成すること及び,この装置を用いて多結晶試料から単結晶弾性定数の測定を実施することである.1.形状記憶合金を用いたX線回折用小型応力負荷装置の作成と評価TiNi合金製の負荷リング(内径18.5mm,肉厚25mm,厚さ4mm)を外注により作成した.時効無し及び400°Cで50hまでの熱処理を行った負荷リングのMsおよびAs温度は,それぞれ-27-19°C及び139°Cの範囲で変化した.応力負荷は,Ms温度付近でポンチによって内径を広げ,試料挿入後Af温度以上に加熱および室温までの冷却によって実施した.負荷応力はAf温度で最大値をとるが,室温までの冷却中にマルテンサイトが応力誘起されるため負荷応力は減少する.従って室温で最高応力を得るためにはAf温度が低い時効無しのリングが適しており,このリングを用いた場合,最高250MPaの2軸圧縮応力が室温で得られた.Fe-35Ni合金およびZrO_2-8mo1%Y_2O_3の単結晶弾性定数測定両試料とも立方昌系であるので,単結晶弾性定数はC_<11>,C_<12>及びC_<44>によって表される.Fe-Ni試料では3段階の異なる応力値を負荷し,最小2乗法により求めたX線弾性係数より次の値が得られた.同一組成の単結晶試料より得られた値は不明であるが,Fe-30Niに対する値(C_<11>=1.463.C_<12>=0.881,C_<44>=1.132〔10^5MPa〕)と比較して妥当な値と考えられる.ZrO_2-8mo1%Y_2O_3試料に関しては現在試料作成中である.今後立方晶以外に正方晶や六方晶への拡張が期待される.今年度は形状記憶合金を用いて,X線回折試料に2軸圧縮応力を負荷するジグの作成を行った.目的とする仕様は直径18mm,厚さ4mm程度のX線回折用試料に200MPa以下の任意の応力を負荷できることある。形状記憶合金としてTi-50.6Ni合金を選び、内径18.5mm、肉厚25mmのパイプ(長さ100mm)を外注により作成した.これらのパイプより厚さ4mmのリングを切り出し、試験用の負荷リングとし,文献を参考にして,400°C×50hおよび400°C×1hの2種類の時効処理を施し,応力負荷特性を測定した.DSC測定による変態温度は以下の通りであった.これらのリングを2軸圧縮応力負荷用として用いるには,マルテンサイト相でリングの内孔を拡大する必要があるが,これは先端をテ-パ-加工したポンチを0°Cに保持したリング内孔に押し込むことにより行った.リングの内孔に試料を挿入しない場合,リングはAf温度までの加熱で完全な形状回復を示した.内孔に試料を挿入した場合は,80°Cまでの加熱により試料に100250MPaの応力が負荷できたが.室温までの冷却に伴い負荷応力は9100MPaに低下した.当初の目的の200MPaまでの応力は得られていないが,100MPaでも十分弾性定数測定に利用できるので,今後,別途準備したセラミックス試料をもちいてX線回折測定を行う.これと平行して,さらに負荷リングの改良を行い,より高い応力を負荷できるようにする予定である.

本研究の目的は,X線回折に利用できる小型軽量な応力負荷装置を形状記憶合金を用いて作製すること及び,この装置を用いて多結晶試料から単結晶弾性定数の測定を実施することである.1.形状記憶合金を用いたX線回折用小型応力負荷装置の作成と評価TiNi合金製の負荷リング(内径18.5mm,肉厚25mm,厚さ4mm)を外注により作製した.時効無し及び400°Cで50hまでの熱処理を行った負荷リングのMsおよびAs温度は,それぞれ-27-19°C及び139°Cの範囲で変化した.応力負荷は,Ms温度付近でポンチによって内径を広げ,試料挿入後Af温度以上に加熱および室温までの冷却によって実施した.負荷応力はAf温度で最大値をとるが,室温までの冷却中にマルテンサイトが応力誘起されるため負荷応力は減少する.従って室温で最高応力を得るためにはAf温度が低い時効無しのリングが適しており,このリングを用いた場合,最高250MPaの2軸圧縮応力が室温で得られた.2.Fe-35Ni合金およびZrO_2-8mol%Y_2O_3の単結晶弾性定数測定両試料とも立方昌系であるので,単結晶弾性定数はC_<11>,C_<12>及びC_<44>によって表される.Fe-Ni試料では3段階の異なる応力値を負荷し,最小2乗法により求めたX線弾性係数より次の値が得られた.同一組成の単結晶試料より得られた値は不明であるが,Fe-30Niに対する値(C_<11>=1.463.C_<12>=0.881,C_<44>=1.132|10^5MPa|)と比較して妥当な値と考えられる.ZrO_2-8mol%Y_2O_3試料に関しては現在試料作成中である.今後立方晶以外に正方晶や六方晶への拡張が期待される.
γ-PARCEL：高指向性と安全性を両立する硬度可変型放射線応答性ソフトナノ粒子

抗がん剤の働きを光刺激や放射線等の外部信号によって制御し、一方、使用するナノ粒子自体は光等の刺激によって、物理的性質を変えて柔らかくし、腎排泄させ、肝機能障害等の副作用を緩和し、高いクオリティ・オブ・ライフを達成するための次世代化学療法のベースとなりうるようなナノ粒子材料を開発し、そのナノ粒子の効率的な腫瘍への集積性の向上化技術について開発に成功した。さらに腎排泄性の向上とは異なるが、より興味深い排出性変化の性質として、腫瘍内からの排出性を制御する性質を与えることにも成功した。抗がん剤の働きを放射線で制御し、一方ナノ粒子自体は光によってソフト粒子化し腎排泄させることで消化管障害等の副作用を緩和し、高いクオリティ・オブ・ライフにつながる化学療法を実現する基盤技術となるナノ粒子材料について、効率的な腫瘍近傍への集積技術(a)血中滞留技術(c)を持つナノ粒子と、放射線による放出技術(b)を持つナノ粒子を開発した。c)血中滞留性の向上:ソフトナノ粒子材料であるPARCELゲルにソリッドな粒子である量子ドッドを包含させたところ、生体内での動態変化し、血中滞留性の向上に成功した。a)腫瘍認識能の付与: c)の粒子を担がんマウスに投与したところ、腫瘍への集積が確認できた。b)放射線応答性γ-PARCEL粒子の調製:放射線応答性の結合を含む架橋剤を調製し、バルクサイズゲルを調製して、予備実験として放射線応答性の結合を含む化合物を用いてセンチサイズのゲルについて医薬品モデル化合物の放出制御に成功した。この結果をもとに、放射線応答性の結合を持つX字型の架橋剤を合成し、放射線応答性ソフトナノ粒子(γ-PARCEL)を調製し、放射線照射によって内包物の放出を制御することに成功した。抗がん剤の働きを光刺激や放射線等の外部信号によって制御し、一方、使用するナノ粒子自体は光等の刺激によって、物理的性質を変えて柔らかくし、腎排泄させ、肝機能障害等の副作用を緩和し、高いクオリティ・オブ・ライフを達成するための次世代化学療法のベースとなりうるようなナノ粒子材料について、d')効率的な腫瘍への集積性の向上化技術について、その開発に成功した。さらにe')腎排泄性の向上とは異なるが、より興味深い排出性変化の性質として、腫瘍内からの排出性を制御する性質を与えることにも成功した。d')効率的な腫瘍への集積性向上化技術:昨年開発した、ソフトナノ粒子材料であるPARCELゲルにソリッドな粒子である量子ドットを包含させたものについて、マウスの尾静脈から投与後に、腫瘍近辺にエレクトロポレーションを行うことで、以前よりも高い腫瘍への集積性を達成した。e')腫瘍からの排出性の変化:このエレクトロポレーションの導入によって、以前は、6時間程度の間は腫瘍に留まっていたものの、24時間以内には腫瘍から排出されていたマウス腫瘍内への量子ドット内包PARCELナノ粒子の蓄積時間を、48時間超と今までの2倍以上と非常に長時間の間腫瘍に留まらせることに成功した。今までは24時間以内には腫瘍から粒子の蛍光が完全に消失していたが、研究計画とは異なる電気刺激によるアプローチではあるが、48時間後に腫瘍中で粒子の蛍光を確認出来るなど、腫瘍への蓄積性の大幅な向上を達成することができた。研究期間全体を通した成果としては、放射線に応答して、内包する生理活性物質の機能制御が可能なX字型の架橋剤を合成し、放射線応答性ソフトナノ粒子(γ-PARCEL)を調製し、放射線照射によって内包物の放出を制御することに成功した。さらに、ソフトナノ粒子であるPARCELゲルにソリッドな粒子である量子ドットを包含させたところ、生体内での動態が変化し血中滞留性の向上に成功した。さらに、腫瘍近傍にエレクトロポレーションを行うことで、腫瘍への蓄積が向上することを示した。エレクトロポレーションによって以前は最大24時間程度の腫瘍への滞留を48時間以上に伸ばすことに成功した。最終年度には、PARCELゲルを用いて生体内での実際に送達とMRIによる確認にも挑戦した。f)『動態を高感度で観察可能なMRIプローブ』を加えγ-PARCEL粒子の認識性を向上さ、生体内部での造影を行った。実際に担がんマウスを用いて、腫瘍へγ-PARCEL粒子を用いた抗がん剤の送達を行い、量子ドットの高度な集積に成功した。さらに、MRI造影剤をナノ粒子に包含することで、MRI造影剤から炎症を引き起こす金属イオンの漏出が低減することを発見し、それをラットに応用して、膝の関節腔から投与することで、侵襲を抑え、投与したγ-PARCEL粒子が標的とする組織ではっきり観測できることを示した。今後は、この方面でも展開することで、より汎用的かつ安全に利用が可能なナノ粒子プローブとしても発展が期待できる。

新たな知見によって、研究計画とは一部異なるアプローチであるが、ハードナノ粒子を調製し、腫瘍近傍への集術(A)、血中滞留性の向上(C)を達成することができた。一方放射線による放出技術(B)に関しては計画研究通りに達成している。現時点ではH28年度の研究実施について、計画書記載の通りに実施することで成果が得られると考えている。新聞取材記事医歯薬学物理系薬学現時点ではH26年度の研究実施について,計画書記載の通りに実施することで問題なく成果が得られると考えている。実験用試薬について2,3月に追加購入予定であったが当座に必要な量があったため追加購入を延期した。実験用試薬について3月に追加購入予定であったが、当座に必要な量があったため追加購入を延期した。実験試薬等の購入実験用試薬の購入
ソ連邦末期における民族的資源動員の中範囲理論

本研究では、旧ソ連空間における「非承認国家」問題の端緒である、ソ連邦構成共和国からの独立を試みた共和国非タイトル民族による「分離主義」運動を研究対象とし、特定の民族集団が政治的集合行為を進めるに至った要因を、資源動員論を援用した論理式を用いて解明することを試みた。研究期間中に、ロシア、モルドヴァ、ウクライナにてフィールド調査を実施し、研究成果として、招待講演(ハーヴァード大学ディヴィスセンター)や国際学会での発表、複数の英文査読雑誌での論文掲載を行った。本研究は、旧ソ連諸国における民族紛争・民族間対立の端緒である、ソ連邦構成共和国からの独立を試みた「分離主義」運動を研究対象とし、資源動員論をベースとした論理式を用いてその要因の分析を試みるものである。本年度は、上記の研究目的を達成するためウクライナ、ポーランド、ロシアにて二回(9月及び12月)、日本にて一回(10月)の研究調査を実施した。いずれの研究調査も主要目的は資料収集であった。ウクライナでは、ウクライナ国会図書館、ウクライナ国立文書館へ、ポーランドではワルシャワ大学付属図書館、日本では北海道大学スラブ・ユーラシア研究センターにてそれぞれ調査を実施した。収集した資料は、ソ連時代末期のウクライナ共和国及びクリミア自治州の地方新聞及び一次・二次資料に関するものであった。資料の収集後は夏季から冬季にかけて読解を行った。資料読解の研究成果として、2013年11月に、「ソ連邦末期におけるクリミア・ソヴィエト社会主義自治共和国の『再建』:積極的建国か,消極的建国か?」と題してウクライナ研究会第30会研究報告会にて口頭発表を行った。発表内容は、クリミア問題の「序説」的な位置付けであるため、本格的な発表は今後行なう必要がある。論文発表に関しては、書籍(The Image of the Region in Eurasian Studies)の中に、自身の論文(“Europeanization at the `grassroots' level in Moldova: What are effective ways to deal with the Transnistrian conflict?")が掲載された。同論文は、本研究と密接に関係するテーマである、モルドヴァの沿ドニエストル紛争の解決法に言及したものであった。以上、3回の研究調査、1回の研究発表、1本の論文発表を今年度実施した。本研究では、旧ソ連邦空間で生じた民族紛争・民族間対立の端緒である、ソ連邦構成共和国からの独立を試みた「分離主義」運動を研究対象にし、社会学の資源動員論を援用しつつ、特定民族集団が特定条件下において政治的集合行為を行う要因の分析を試みた。研究上の時間的制約から、当初計画していたフィールドワークの全てをなすことは出来なかったが、モルドヴァ、バルト諸国、ウクライナでの最低限のフィールドワークを実施することができ、また、研究の最大目標であった、特定民族集団が政治的集合行為を行う要因を「論理式化」する点をクリアすることが出来た。論理式に関わる論考は、論文("Ethnic Political Mobilization: An Integrative or Disintegrative Force in the Modern Polity?")の形で発表された。また同論文の内容を、国際学会(BRIT XIV)にて口頭発表した。民族運動の生成要因を論理式で表した論説は国内外でも非常に稀であり、民族問題研究に新たな分析角度をもたらした点で、学界から注目を浴びるものになったとの自負がある。また、困難な研究環境の中にありながら、Europe-Asia Studiesのような一流英文査読雑誌での論文掲載、それを含む4本の論文の執筆、1回の国際学会での発表、1回のハーヴァード大学ディヴィスセンターでの招待講演等を遂行したことは上出来であると自己評価している。国際関係論本年度は、自身の研究環境及び予想外の世界情勢の変化の中で研究活動を継続せざるをえなかった。特に昨今のウクライナ情勢により、クリミア問題を対象とした研究の自由な調査活動及び研究発表が関係諸国(特にロシア)にて制限されたことは、自身の研究を発展・進展させる上で大きな障害になったと言える。しかし、そのような困難な環境の中であっても、ウクライナ、ポーランド、ロシア等の東欧諸国にて、二度の調査活動を実施できた価値は高い。調査活動の中で、現地文書館・図書館にて有用な資料の収集を行うことに成功した。研究発表及び論文発表に関しては、研究発表を日本で一度、論文発表は一本と、自身の例年の研究活動と比較して総体的に少なかったことは否めない。研究発表及び論文発表のタイミングが自分の希望した時期と合致しなかったことも原因であるが、自分自身、概して発表にトライする回数が少なかったことが主要因であると考えている。この点を反省しつつ、最終年度である来年度は、さらなる研究発表及び論文発表を行う必要があると認識している。ちなみに、来年度は、4月にロシアにて、5月に米国にて国際会議での発表が既に決定しており、研究成果の増加という点では良い兆候を見せつつある。また、昨今のウクライナ情勢に伴い、自身の研究価値がより高まりつつある傾向があるため、国内外を問わず、研究発表及び論文発表の機会を増加させ、本年度の研究の遅れを取り戻すべきであろう。

来年度は研究発表回数及び論文発表数の増加が必須課題となる。また、当初予定していたグルジア調査出張が実現できなかった故に来年度に実施しなくてはならない。クリミアへの研究調査は来年度を予定していたが、昨今のウクライナ情勢によりその実現は極めて困難であろう。このため、クリミアへ渡航せずに研究活動を継続する研究方法を考案(キエフで可能な限り用務を済ませる等)しなくてはならない。目標としては、夏にグルジア共和国に1回、秋にウクライナ共和国に1回の研究調査、米国で1回(ハーヴァード大学デイヴィスセンター)、フランスで1回(BRIT2014)、ロシアで3回(サハリン国立大学)、国際会議での研究発表を実施したい。ちなみに、ロシアでの研究発表のうち2回、及び米国での研究発表1回は既に発表日時が決定している。研究発表の場に多く立つことによって、自身の研究および存在をアピールする機会が増えるものと期待している。
抗リン酸化ペプチド抗体を用いた細胞周期制御機構の可視化

細胞周期依存的にリン酸化制御を受けることが細胞分裂に必須な、細胞骨格タンパク質ビメンチンSer71,Ser82について、そのリン酸化修飾を蛍光強度でリアルタイムに検出する方法を開発した。具体的には、無細胞蛋白質合成系を用いてN末端近傍をTAMRAやCR6Gなどのローダミン系蛍光色素でピンポイント標識した一本鎖抗体scFvあるいはFab断片が、抗体内部の芳香族残基による消光(クエンチ)が抗原の結合によって顕著に解消される現象を応用することで、抗原結合によって蛍光強度が増加する抗体プローブQuenchbodyが作れることを見出した。この方法でビメンチンSer71リン酸化認識抗体TM71 scFvをプローブ化したところ、条件最適化の結果、試験管内で対照と比較してリン酸化Ser71ペプチド抗原を加えた場合に最大3倍の蛍光強度上昇が見られた。また、Ser82リン酸化認識抗体MO82scFvにおいては,分子内に複数のCR6G色素を導入することで色素間クエンチ効果により応答性が向上し,最大6倍の抗原依存的応答を得ることができた。これにより,試験管内でnM程度の高感度でリン酸化を検出することに成功した。また、還元的な細胞内への導入を念頭に,より大量に細胞内でも安定なFab型抗体プローブを得ることを目指し,モデル抗体のN末端近傍にラベルのためのCys残基を付加した抗原結合活性のあるFab断片を大腸菌で大量発現・精製することに成功した。今後、抗ビメンチンリン酸化抗体についてこれを行い、Cys残基のSH基を介して蛍光ラベルを導入したFabを調製すれば、これらを生細胞への導入することで細胞内でのリン酸化検出が可能になると考えられる。2種類のビメンチンリン酸化を特異的に検出可能な蛍光プローブ作製に成功し,現在論文を投稿中である。プローブの細胞導入についても,安定性の高いFab型として大量に調製できる目処がついた。今後本研究課題を発展させ,標的細胞自身に発現可能な蛍光抗体プローブの一般的な構築法を確立できれば、そのインパクトは大きいと考えられる。本年度は細胞周期依存的にリン酸化制御を受けることが細胞分裂に必須な、細胞骨格タンパク質ビメンチンSer71,Ser82について、そのリン酸化修飾を蛍光強度でリアルタイムに検出する方法を開発し、改良を行った。最近我々のグループにより、N末端近傍を無細胞蛋白質合成系を用いて蛍光色素TAMRAでピンポイント標識した一本鎖抗体scFvあるいはFabを用いて、抗原非存在下における抗体内部の芳香族残基による消光(クエンチ)が抗原の結合によって顕著に解消される現象が見出された。この現象を応用することで、現在までに抗原結合によって蛍光強度が増加する、多数の抗体プローブ(Quenchbody)が作製されている。この抗体プローブ法でビメンチン内Ser71のリン酸化を認識する抗体TM71をプローブ化したところ、抗原非存在時,非リン酸化ペプチド存在時と比較してリン酸化Ser71ペプチド抗原存在時にのみ、有意な蛍光強度の上昇が見られた。また、プローブの抗原結合部位近傍に蛍光を消光しやすい残基を導入することで、抗原依存的な蛍光強度上昇を向上させることに成功した。現在,測定条件の検討と更なる変異導入により,信号変化率の向上を図っている。また、今後の細胞内導入を念頭に,より大量のプローブ調製のためペプチド認識モデル抗体scFvのN末端近傍にラベルのためのCys残基を付加して大腸菌で発現させた。これを精製した後,SH基を介して蛍光ラベルを導入したscFvを調製することに成功し,試験管内で十分な抗原認識能を有することも確認した。現在,蛍光測定と生細胞への導入条件を検討している。また,特に細胞内でscFvより安定と考えられる蛍光標識Fab断片の調製を進めている。

2種類のビメンチンリン酸化を特異的に検出可能な蛍光プローブ作製に成功し,現在論文を投稿中である。プローブの細胞導入についても,安定性の高いFab型として大量に調製できる目処がついた。今後本研究課題を発展させ,標的細胞自身に発現可能な蛍光抗体プローブの一般的な構築法を確立できれば、そのインパクトは大きいと考えられる。