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監査役監査と内部統制システムとの関係

本研究は、株式会社における監査役監査の有り様と社内に構築・運用される内部統制システムとの関係について、その在り方を模索しつつ、監査役制度の有用性を実証的に論証しようとしたものである。そのため、内部統制システムとの関わりを基調として監査役制度の全体を俯瞰する研究を行い、詳細な論考を書き上げるとともに、他方において、その研究をふまえ、数多くの大会社の監査役および監査役スタッフに対し、講演・研修等を通じて監査役制度の有用性に関する認識を新たにするための啓蒙的活動を行い理解を得た。本研究は、監査役監査と内部統制システムとの関係に在り方を模索しつつ、監査役制度の有用性を実証的に論証しようとするものであり、今後の数年間ほどがその制度的存立を問われる時間であろうと予測している。そのため、研究の期間も平成20年度から3年間の継続研究としていることから、まずその第1段階として、本年度は,監査役制度に関する従前の研究を基礎として、新会社法の下における監査役制度の意義と役割に関する基本的な理解をふまえ、監査役監査と社内に構築される内部統制システムとの関係について、一方において、歴史的ないし比較法的研究を試みるとともに、他の学問領域(会計学・監査論・経営学等)にふみこんだ検討を進めている。また同時に、他方において、監査役および内部統制システムに関わる社会的実態の調査をふまえて実証的検討を試みている。そのため、当初から、内外の最新研究の収集と分析に当たったが、同時並行的に、可能な限り、論説・解説等を著述するほか、さらには講演・研修等を通じて、会社法務関係者に対し監査役制度の有用性に関する認識を新たにするための啓蒙活動も行った。とりわけ,社団法人日本監査役協会や社団法人九州生産性本部等の講演会・研修会(全国5か所(東京,大阪,名古屋,富山,福岡),7回)を通じて,数多くの監査役および監査部門スタッフと直接に面談し,現実の監査実務の問題点を聞き取り調査するとともに,併せて,彼らに対し監査役制度の有用性を説くという活動は意義があったものと思う。本研究は、監査役監査と内部統制システムとの関係に在り方を模索しつつ、監査役制度の有用性を実証的に論証しようとするものであり、今後の数年間ほどがその制度的存立を間われる時間であろうと予測している。そのため、研究の期間も平成20年度から3年間の継続研究としていることから、まずその第1段階として、前年度は、監査役制度に関する従前の研究を基礎として、新会社法の下における監査役制度の意義と役割に関する基本的な理解をふまえ、監査役監査と社内に構築される内部統制システムとの関係について、一方において、歴史的ないし比較法的研究を試みるとともに、他の学問領域(会計学・監査論・経営学等)にふみこんだ検討を進めた。また同時に、他方において、監査役および内部統制システムに関わる社会的実態の調査をふまえて実証的検討を試みた。本年度は、第2段階として、内外の最新研究の収集と分析に当たるとともに、同時並行的に、可能な限り、論説・論文等を著述するほか、さらには講演・研修等を通じて、会社法務関係者に対し監査役制度の有用性に関する認識を新たにするための啓蒙活動も行った。とりわけ、社団法人日本監査役協会を通じて、数多くの監査役と直接に面談し、現実の監査実務の問題点について、内部統制システムの運用状況とその監査体制について聞き取り調査するとともに、併せて、彼らに対し監査役制度の有用性を説くという活動は意義があったものと思う。また、同協会の委嘱に基づき、昨年、結論を得た有識者懇談会の「提案報告書」に取り上げられた「内部統制システムとの関係」という論点について、同協会が本年、その活用を論議した「最終報告書」をまとめたことに対応して、同報告書にまとめられた「監査役監査と内部統制システムとの関係」について分析・検討を行った。そして、その研究成果として、本年4月13日、横浜の国際会議場において2、500名余の会員監査役が参加した同協会全国会議のシンポジウムにおいて、コメンテーターを務め、監査役監査と内部統制システムとの関係について私見を発表したことは意義があったと思う。本研究は、監査役監査と内部統制システムとの関係について、その在り方を模索しつつ、監査役制度の有用性を実証的に論証しようとするものであり、今日ほどその制度的存立を問われる時代はないと確信している。そのため、3年間の継続研究を通じて、監査役制度に関する従前の研究を基礎として、新会社法の下における監査役制度の意義と役割に関する独自の見解を構築し、さらに体系化を図るとともに、監査役監査と社内に構築される内部統制システムとの関係について、一方において、歴史的ないし比較法的研究を試みるとともに、併せて他の学問領域(会計学・監査論・経営学等)にふみこんだ検討を進めた。そのため、内外の最新研究の収集と分析に当たったが、同時並行的に、可能な限り、論説・論文等を著述した。

とりわけ、本年度は、中央経済社が企画した会社法のコンメンタール・シリーズ、『逐条解説会社法』第5巻(予定)において、監査役全体の規定(会社法381条389条)に関する分析と検討を担当し、本研究テーマである内部統制システムとの関わりを基調として監査役全体を{府轍する詳細な論述を書き上げた。さらには講演・研修等を通じて、会社法務関係者に対し監査役制度の有用性に関する認識を新たにするための啓蒙活動も行った。とりわけ,社団法人日本監査役協会を通じて,数多くの大会社の監査役と直接に面談し,現実の監査実務の問題点を聞き取り調査するとともに,併せて,彼らに対し監査役制度の有用性を説くという活動は意義があったものと思う。
エレクトロポレーターを用いた関節炎モデル動物の骨破壊に対する新規治療法の開発

炎症性骨破壊を伴った疾病,特に慢性関節リウマチに対する治療は主に抗炎症薬や免疫抑制薬などを用いた薬物療法や理学療法が主体である.これらの方法では骨破壊を抑制できないため骨破壊を抑制する治療法の開発が求められている.本研究では近年動物組織の任意の部位の細胞内に遺伝子や薬剤を効率的に導入することのできるエレクトロポレーターという装置を用いて,関節炎を発症している局所に炎症を抑制したり,破骨細胞の形成を抑制するサイトカインの遺伝子を投与することによって関節炎の治療や骨破壊の抑制が可能かどうかを検討したい.昨年度は,発現ベクターの構築,in vitroやin vivoでの遺伝子発現の検討を行なった.そこで,本年度は,関節炎モデル動物としてラットアジュバント関節炎モデル動物の確立とエレクトロポレーターを用いた発現ベクターによる関節炎発症の抑制効果に対する検討を行い,以下のことが明らかとなった.(1)ラット尾根部にアジュバントを投与してアジュバント関節炎を誘発させるモデルを確立した.(2)インターロイキン1受容体アンタゴニスト(IL-1ra)発現ベクターを,エレクトロポレーターを用いて関節局所に導入し,関節炎発症の抑制効果が得られる導入条件を明らかにした.(3)IL-1ra発現ベクターのin vivo導入により,効率的にアジュバント関節炎の発症を抑制できることが明らかとなった.炎症性骨破壊を伴った疾病,特に慢性関節リウマチに対する治療は主に抗炎症薬や免疫抑制薬などを用いた薬物療法や理学療法が主体である.これらの方法では骨破壊を抑制できないため骨破壊を抑制する治療法の開発が求められている.本研究では近年動物組織の任意の部位の細胞内に遺伝子や薬剤を効率的に導入することのできるエレクトロポレーターという装置を用いて,関節炎を発症している局所に炎症を抑制したり,破骨細胞の形成を抑制するサイトカインの遺伝子を投与することによって関節炎の治療や骨破壊の抑制が可能かどうかを検討したい.そこで本年度は,発現ベクターの構築,in vitroやin vivoでの遺伝子発現の検討を行ない,以下のことが明らかとなった.(1)炎症を抑制するサイトカインとしてインターロイキン1受容体アンタゴニスト(IL-1ra)を,破骨細胞の形成を抑制するサイトカインとしてオステオプロテグリン(OPG)に着目し,これら遺伝子の発現ベクターを構築した.(2)293T細胞に上記遺伝子をリン酸カルシウム法やエレクトロポレーターを用いて遺伝子導入を行い,発現するかをWestern blot法とフローサイトメーターを用いて解析した.(3)エレクトロポレーターを用いてin vivoでの遺伝子導入の条件を検討した.まず,電極を工夫し,安定に通電する条件を得た.また,動物の局所(筋肉,皮膚,関節など)に遺伝子導入を試み,発現することを確認した.炎症性骨破壊を伴った疾病,特に慢性関節リウマチに対する治療は主に抗炎症薬や免疫抑制薬などを用いた薬物療法や理学療法が主体である.これらの方法では骨破壊を抑制できないため骨破壊を抑制する治療法の開発が求められている.本研究では近年動物組織の任意の部位の細胞内に遺伝子や薬剤を効率的に導入することのできるエレクトロポレーターという装置を用いて,関節炎を発症している局所に炎症を抑制したり,破骨細胞の形成を抑制するサイトカインの遺伝子を投与することによって関節炎の治療や骨破壊の抑制が可能かどうかを検討したい.昨年度は,発現ベクターの構築,in vitroやin vivoでの遺伝子発現の検討を行なった.そこで,本年度は,関節炎モデル動物としてラットアジュバント関節炎モデル動物の確立とエレクトロポレーターを用いた発現ベクターによる関節炎発症の抑制効果に対する検討を行い,以下のことが明らかとなった.(1)ラット尾根部にアジュバントを投与してアジュバント関節炎を誘発させるモデルを確立した.(2)インターロイキン1受容体アンタゴニスト(IL-1ra)発現ベクターを,エレクトロポレーターを用いて関節局所に導入し,関節炎発症の抑制効果が得られる導入条件を明らかにした.(3)IL-1ra発現ベクターのin vivo導入により,効率的にアジュバント関節炎の発症を抑制できることが明らかとなった.
高精度で墨字文書を点字文書に変換する知的自動点訳システムの研究開発

開発したシステムは大別すると墨字原稿をイメージスキャナで取り込んで文書理解・文字認識を行うOCR(光学的文字認識装置)部と、その結果を点字に翻訳して出力する点訳部の2つの処理部から成る。OCR部の主要処理装置はUNIXワークステーションと今回新たに開発した文字認識専用装置である。視覚障害者の様々な要求に応えるために、対象文書として、雑誌(週刊誌)、学会誌、児童向け読み物、教科書、専門書、文庫本、実用書を多数選出した。文書構造理解においては、入力文書中の本文のみならず、ページ番号、図表の見出しや位置、ルビや脚注等の種々の文書構成要素を認識対象とした。実験の結果、本文の行抽出精度約97.4%、図であることの判断正解率89.7%等の良好な成果が得られた。しかし、キャプション、脚注、ページ番号については、書式が多様であるために、文書によって精度に大きなばらつきが認められた。開発した文字認識専用装置は、2528文字/秒の処理速度を達成し、これはソフトウェアで処理を行う場合より58倍速いことが確認された。点訳の精度は辞書、アルゴリズムの改良によって99.5%を達成することができた。ユーザインタフェースについては、認知モデルに基づいた設計を行い、少数の披験者を通じてその有効性の検証を行った。また、ワークステーション、専用文字認識装置、パーソナルコンピュータの3つの主要装置間で、並行処理ならびにパイプライン処理を行うことによって、処理速度の向上と操作性の向上を実現した点は、膨大な処理時間を必要とする日本語文書自動点訳の実用研究として意義が大きいと考える。今後は、システムのキ-操作に対するレスポンス性能の向上を図り操作性能を向上させるとともに、多数の披験者によるシステムの評価実験を行う必要がある。本年度は本研究の最初の年度にあたる。そこで、次年度の知手自動点訳システムの開発・試作に備えて10回を超える研究打合せを行い、各分担研究課題の範囲と相互の連係の在り方を明確にし、それぞれの課題を追究するとともに、目的とする性能を達成するための知的自動点訳システムの設計書を作成した。同時に、文字認識高速化のためのハードウェアシステムの一部を製作した。その概要は次の通りである。1.視覚障害者ならびに晴眼者の何れもが容易に操作でき、実用に耐える性能を有すると共に、拡張性に優れた知的自動点訳システムを設計するための基本方針を策定した。2.上記1.を満たすシステム構成及び情報処理の流れの詳細を明確にし、それらを図式的に表現した。3.本システムが満たすべき性能仕様を明からにした。まずシステム全体の性能仕様を与え、次にその各モジュール(文書護画の領域理解部、文字認識部、自動点訳部、ユーザーインターフェース部)が満たすべき性能仕様を与えた。4.上記3.の性能仕様を満たす各モジュールを設計するための膨大な論理仕様を造り上げた。5.本システムを実現するために必要なハードウェア仕様を作成した6.文字認識を高速化するための画像処理を実行するハードウェアシステムを作成した。7.各分担研究課題について、高度の実用に耐える性能を実現するために必要な基礎技術の研究開発を行った。以上により、次年度(平成5年度)の研究開発の技術的基盤を確立した平成5年度は,主として知的自動点訳システムのハードウェア及びソフトウェア開発とシステム全体の統合を行い,若干のインターフェースの調整を残してほぼ本システムを完成した.その具体的内容は以下の通りである.(1)文字認識の高速化を実現するために,前年度製作したイメージ処理用LSIに加えて,今年度はパターン整合用及び制御用のLSIを開発し,これらを文字認識部に統合したハードウェア装置ZEUSを完成した.これにより20文字/秒以上の認識速度を十分確保することが可能となった.

(2)文字認識に関しては,潰れが生じ易いルビや脚注等の小さい文字をも高精度で認識する手法など高度の実用に耐える文字認識技術を開発した.(3)文書画像のレイアウト理解,つまり,見出しや本文,図や表,キャプション,脚注やルビなどの文書画像の構成を自動的に識別する方法について研究し,それぞれ,文書の構造に関する知識及びグラフ理論に基づいた2種類の手法を開発した.前者は本システムにおいて,文書画像のレイアウト理解の中核をなすものであって,比較的に単純な文書画像,例えば文庫本や高等学校以上の文系の教科書については,レイアウト理解がほぼ満足できるレベルに達している.後者は文書画像の大まかな構造解析に適しているので,前者と相互補完的に組み合わせて活用する方向で検討を進めている.(4)点訳に必要な辞書の整備及び機能の拡大を通して点訳システムEXTRAを高性能化した.更に,日本語英語自動点訳プログラム「EXTRA」Ver.2.0を開発した.(5)盲人にとって使いやすい知的自動点訳システムとするためのインターフェースとして具備すべき諸条件を理論と試行実験の両面から追求し,次年度の本システムの評価に備えた.本年度は本研究の最終年度であり、前年度に試作した本システムの性能評価と実用上の諸問題の解決に重点を置いた。研究実績の概要は次の通りである。1.文書画像レイアウト理解機能:イメージスキャナ上に、文書あるいは本などが置かれた傾きや片側あるいは見開きによらず、頁や見出し、本文、図表とそのキャプション、脚注などの各領域を特定するレイアウト理解機能を実現した。2.文字認識機能:文字認識専用のハードウェアシステムを開発、同時にルビ(振りがな)や脚注等の小さい文字の認識精度を上げ、対象字種が約5000の場合について99%程度の認識率と毎秒20文字以上の認識速度を達成した。3.点訳機能:文書画像のレイアウト理解部と文字認識部からの情報を基にして、頁の表示や改行、図表のキャプションの挿入、ルビの表示等の機能を実現した。又、日本語英語自動点訳プログラム「EXTRA」の機能の大幅な改善を行った。4.墨字文書から点字文書への変換器機能:文庫本や高等学校以上の文系の教科書などについては、文書画像のレイアウト理解、文字認識及び点訳の連係がほぼ正確に達成され、かつ毎秒20字程度の速さで墨字文書を点字文書に変換する機能を実現した。この場合の変換精度(本システムの総合の精度)は98%程度と推定される。5.ユーザーインターフェース機能:ユーザー、特に盲人にやさしいシステムとするため、合成音声装置を通して、システムの使用手順や点訳の進行状況を逐次指示あるいは伝達する機能を実現した。しかし、盲人による使い易さについての評価は今後の大きな課題であって、引続き検討して行く。
隕石および太古代火成岩の親鉄元素同位体分析による地球形成モデルの構築

本研究は、地球マントルと隕石のMo及びRu同位体組成がリンクしないという「親鉄元素同位体のパラドックス」に着目し、その問題解決を通じて地球型惑星の起源に迫ることを目的とする。そのため、コンドライトや分化隕石に加え、原始地球の組成を残しうる太古代コマチアイトを対象に、高精度Mo・Ru同位体分析を実施する。また、月隕石・火星隕石の同位体分析も行い、地球集積最終段階におけるマントル同位体組成の変化を明らかにする。得られた同位体データを地球型惑星の集積成長に関する理論モデルに適用し、地球型惑星の形成に寄与した物質の詳細と、供給物質の時間変化を一体的に解明する。地球内部のマントルと宇宙からの隕石の間で、モリブデンとルテニウムという元素の安定同位体組成が異なっている、という「親鉄元素同位体のパラドックス」に着目し、原始地球の組成を残していると考えられる太古代コマチアイトという岩石が鍵を握る物質だとの作業仮説の下に、この岩石や月・火星などからの隕石の同位体組成を調べて、地球の原材料や形成過程を理解しようとする研究である。本研究で得られる結果は、どのような隕石が集積して地球型惑星が作られたのか、という疑問に対してひとつの解を与えることが期待されるとともに、地球史におけるマントルの進化や核・マントルの相互作用、さらには地球がどのようにして揮発性物質を獲得したのか、というモデルの再考を促す可能性など、地球生命の起源の議論にまで影響を与える可能性がある。
新規強力鎮痛ペプチドとモルヒネの鎮痛作用発現機構の違い

dermorphin誘導体Tyr-D-Arg-Phe-β-ala(I)、Tyr-D-Arg-Phe-β-ala-NH_2(II)及びmorphineの鎮痛作用発現機構の違いについて検討を行なった。三者は既にμ受容体に対して非常に高い親和性を持つことが知られているが、侵害刺激の種類(機械刺激、化学刺激、熱刺激)、によってμ受容体のいずれのsubtype(μ_1及びμ_2受容体)を介して侵害刺激抑制作用を示すかについて検討を行なった。(1)morphineは全ての侵害刺激を抑制するが、機械的侵害刺激抑制作用はμ_1受容体拮抗薬であるnaloxonazineによって拮抗されず、μ_1及びμ_2受容体拮抗薬であるβ-funaltrexamineによって拮抗された。また、化学的侵害刺激に対する抑制作用はnaloxonazineによって不完全ながら拮抗されたことからμ_1受容体の一部を介することが判明した。さらに興味あることに、熱侵害刺激である熱板法における侵害刺激抑制作用は、ほぼ完全にnaloxonazineによって拮抗されたことからモルヒネの熱侵害刺激抑制作用はμ_1受容体を介して発現することが判明した。(2)dermorphine N末端tetrapeptideである2つのpeptide性鎮痛薬のうち(I)の脳室内投与、脊髄クモ膜下腔内投与、皮下投与による全ての侵害刺激抑制作用は、naloxonazineによって拮抗されることよりμ_1受容体を介して発揮される。しかし、(I)のC末端をアミド化した(II)の脳室内投与による機械的及び化学的侵害刺激抑制作用は、naloxonazineによって拮抗されずβ-funaltrexamineによって拮抗されたことから、機械的及び化学的侵害刺激抑制作用はμ_2受容体を介して発現されるものである。しかし、(II)の脊髄クモ膜下腔内投与による化学的侵害刺激抑制作用はμ_1受容体を介して発揮され、機械的侵害刺激抑制作用はnaloxonazineによって拮抗されずμ_2受容体を介して発現することが判明した。1)dermorphin誘導体Tyr-D-Arg-Phe-β-alaおよびmorphineの作用部位を決定するために、μ受容体(μ1およびμ2受容体)拮抗薬であるβ-funaltrexamine(β-FNA)を使用して実験を行った。β-FNAを24時間前にマウスの側脳室又は脊髄腔内に処理し、その後ペプチド性鎮痛薬を皮下投与して、鎮痛効力を測定した。その結果、morphineは脊髄上位脳に作用し、脊髄内にはほとんど作用しないのに対し、ペプチドは脊髄上位脳および脊髄の二部位に作用して鎮痛作用を発揮することがことが判明した。この実験からmorphineとの作用部位の違いが明らかになった。2)ペプチド性鎮痛薬の鎮痛作用はμ1又はμ2受容体のいずれを介して発現するか検討した。本ペプチドを脳室内および脊髄腔内に投与したところ、この鎮痛剤作用はμ1受容体拮抗薬であるnaloxonazineによって拮抗されたが、その程度は脊髄腔内投与時に著しかった。現在まで脊髄内にはμ受容体の存在は明らかではなかったが、この実験結果から、脊髄内にμ1受容体の存在と同時にμ1-agonistも見いだされたことになる。3)morphineはすべての侵害刺激(機械刺激、化学刺激、熱刺激)を抑制するが、機械的刺激はnaloxonazineによって拮抗されず、μ2受容体を介して発揮されることが示唆された。また、化学的侵害刺激による鎮痛作用はμ1受容体の1部を介することが判明した。

dermorphin誘導体Tyr-_D-Arg-Phe-β-ala(I)、Tyr-_D-Arg-Phe-β-ala-NH_2(II)及びmorphineの鎮痛作用発現機構の違いについて検討を行なった。三者は既にμ受容体に対して非常に高い親和性を持つことが知られているが、侵害刺激の種類(機械刺激、化学刺激、熱刺激)によってμ受容体のいずれのsubtype(μ_1及びμ_2受容体)を介して侵害刺激抑制作用を示すかについて検討を行なった。(1)morphineは全ての侵害刺激を抑制するが、機械的侵害刺激抑制作用はμ_1受容体拮抗薬であるnaloxonazineによって拮抗されず、μ_1及びμ_2受容体拮抗薬であるβ-funaltrexamineによって拮抗された。また、化学的侵害刺激に対する抑制作用はnaloxonazineによって不完全ながら拮抗されたことからμ_1受容体の一部を介することが判明した。さらに興味あることに、熱侵害刺激である熱板法における侵害刺激抑制作用は、ほぼ完全にnaloxonazineによって拮抗されたことからモルヒネの熱侵害刺激抑制作用はμ_1受容体を介して発現することが判明した。(2)dermorphine N末端tetrapeptideである2つのpeptide性鎮痛薬のうち(I)の脳室内投与、脊髄クモ膜下腔内投与、皮下投与による全ての侵害刺激抑制作用は、naloxonazineによって拮抗されることよりμ_1受容体を介して発揮される。しかし、(I)のC末端をアミド化した(II)の脳室内投与による機械的及び化学的侵害刺激抑制作用は、naloxonazineによって拮抗されずβ-furaltrexamineによって拮抗されたことから、機械的及び化学的侵害刺激抑制作用はμ_2受容体を介して発現されるものである。しかし、(II)の脊髄クモ膜下腔内投与による化学的侵害刺激抑制作用はμ_1受容体を介して発揮され、機械的侵害刺激抑制作用はnaloxonazineによって拮抗されずμ_2受容体を介して発現することが判明した。
新しいカルモデュリンキナーゼカスケードを介した細胞内カルシウム情報伝達機構の解析

我々は、CaMKKの未知なる生理的機能を検討するため、CaMKKの基質分子をATP類似化合物を用いることで探索し、SyndapinIを発見するに至った。本研究で用いられた方法は、通常組織抽出液中に存在する内在性のタンパク質リン酸化酵素がATP類似化合物をリン酸基供与体として使用できない性質を利用したもので、ラット脳抽出液をATP類似化合物存在下に、本研究にて見いだしたATP類似化合物をリン酸基供与体として使用できるCaMKK□F230G(Phe230Gly)変異体と反応させ、抗リン酸化Thr抗体を用いてウエスタンブロットを行ない、リン酸化の上昇する基質候補タンパク質を探索するという方法である。検出された分子量50kDaのCaMKK基質候補分子を各種クロマトグラフィーを用いて部分精製後、質量分析にてSyndapinIと同定した。SyndapinIは、試験管内または遺伝子導入した培養細胞においても、CaMKKによるThr355のリン酸化が検出された。SyndapinIは、Dynaminと協調して、神経終末端におけるエンドサイトーシスによるシナプス小胞の回収および再生に関与していると考えられている。またCaMKKによるリン酸化部位の近傍にはEHD1が結合するNPFモチーフが2カ所存在し、さらにEHD1はリン脂質2重膜を用いたin vitroの実験で、小胞化を抑制する役割を持つ可能性が指摘されている。CaMKカスケードの生理的役割を解明するため、CaMKKの生理的基質の探索を行なっている。これまで我々が行なってきた方法は的グルタチオンセファロースにGST-CaMKKを結合させ、そこにラットの臓器抽出液を供するという、酵素と基質の結合を利用した方法であった。この方法は一回の操作で基質を精製できる可能性があるという利点をもつ一方で、多くの基質以外のタンパク質分子が非特異的に結合するという欠点をもっていた。我々は、試験管内において、CaMKKがATPだけでなくGTPもリン酸供与体として利用可能である事を発見した。さらに、CaMKKの特異的阻害剤であるSTO-609は、GTPを利用したCaMKKによる基質のリン酸化を阻害した。ほとんどのリン酸化酵素が、GTPをリン酸供与体として用いることができないことから、GTPとSTO-609を用いたCaMKK標的分子の探索が有効である可能性が示唆された。そこで、実際にラット脳抽出液を30°Cで10分間リン酸化をさせた後、anti-phosphoThreonineを用いてウエスタンブロッティングした(下図)。実際に、Ca^<2+>/CaM存在下でリン酸化が上昇し、STO-609処理でリン酸化が減少するバンドとして3つのバンドが検出された。一番上の矢印で示されるバンドは、STO-609処理によるリン酸化の減少がやや弱いが、Ca^<2+>/CaM存在下でリン酸化が上昇した。上から2番目のバンドは、Ca^<2+>/CaM非存在下でもリン酸化されているが、Ca^<2+>/CaM存在下でさらにリン酸化され、STO-609処理によりリン酸化が減少している。上から3番目のバンドはCa^<2+>/CaM存在下でリン酸化が上昇し、STO-609処理でリン酸化が減少している。この3つのバンドのうち真ん中の1つは、ATP用いた場合においては(下図の左側)、バックグラウンドの上昇により判別しづらく、この方法の有効性が示唆された。現在、これら3つのバンドを同定するため、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーにて精製中である。精製後は、質量分析後にてバンドを同定する予定である。そこでまず初めに、ラット脳抽出液をATPまたは6-1MeBu-ATP存在下または非存在下で反応させ、anti-phosphoThr抗体でウエスタンブロッティングしたところ、ATP存在下ではラット脳抽出液中のタンパク質のリン酸化レベルが大幅に上昇したが、6-1MeBu-ATP存在下では、ATPおよび6-1MeBu-ATP非存在下でのリン酸化レベルと変化がなかった。次に、ラット脳抽出液を6-1MeBu-ATP存在下でCaMKKawild typeまたはCaMKKa F230Gと共に反応させウエスタンブロッティングしたところ、CaMKKa F230Gと共に反応させたときのみ、50kDa付近にリン酸化シグナルが上昇するバンドが見られた。そこでこのタンパク質をQ-Sepharose、Superose 6、Mono Qで段階的に精製し、質量分析を行なったところ、Syndapin Iであると同定された。Syndapin Iは、試験管内およびCaMKKアイソフォームによりT355(Thr355)がリン酸化された。またHeLa細胞においても、常時活性型CaMKKアイソフォームによるHA-Syndapin IのT355のリン酸化が確認された。

SyndapinIは、試験管内または遺伝子導入した培養細胞においても、CaMKKによるThr355のリン酸化が検出された。SyndapinIは、Dynaminと協調して、神経終末端におけるエンドサイトーシスによるシナプス小胞の回収および再生に関与していると考えられている。またCaMKKによるリン酸化部位の近傍にはEHD1が結合するNPFモチーフが2カ所存在し、さらにEHD1はリン脂質2重膜を用いたin vitroの実験で、小胞化を抑制する役割を持つ可能性が指摘されている。
脳機能評価を基にした自閉症スペクトラム児者への医学・教育連携支援法

本研究では、自閉症スペクトラム障害(以下ASD)のアセスメントと支援方法を、医学と教育の連携させた観点から確立するために、まず図形を用いたタスクスイッチ負荷を行った際、ASD児者においては健常者で認められる前頭葉機能の賦活化以外の部位も使って対処している可能性を、高い正解率と相反する前頭葉脳血流量低下で示した。次にヒトの顔写真を刺激とした、同様のタスクで検討した結果、ASD者においてはタスクパフォーマンスに応じた前頭葉脳血流の変化が認められず刺激特異的・個体特異的な脳機能の差異があると考えられた。本研究は、自閉症スペクトラム障害(Autism Spectrum Disorder,以下ASDと略す)の多彩な臨床症状を持つ患者一人ひとりのアセスメントと支援方法を、医学と教育の連携させた観点から確立するために遂行されている。今年度は、昨年度までに得られた知見をもとにして、前頭葉機能を要するタスクスイッチ課題における、NIRSによる脳血流測定での比較検討を健常者22名(1951歳、男性6名、女性16名:平均年齢25.2歳)及びASD者11名(1446歳、男性3名、女性8名:平均年齢29.5歳)を対象として行った。タスクは、4種類の色と3種類の形の計12通りの図形をランダムに配し、記憶させ想起させる課題を用いて独自に作成した。課題はワーキングメモリを要する記憶想起課題(ワーキングメモリ課題、以下WM)と記憶を要さない選択課題(ノンワーキングメモリ課題以下NWM)の順番で問題が交互に出され、図形の提示数は1個から順に6個まで増加する。実験の施行中は常にNIRSを装着し、前頭葉機能の変化について測定した。健常群とASD群におけるWMタスクの正解率の比較において、WM1・2の時は、健常群・ASD群ともに正解率が100%と差異は見られなかったが、WM3・5・6では、ASD群で健常群より正解率が上回る結果が得られた。また、健常群の左右前頭葉02Hb濃度相対値は、図形数2から6にかけてWMで増加、NWMで減少する前頭葉機能のタスクに呼応した切り替えの傾向が観察されたが、ASD患者においてはこの変化が著明には認められなかった。これらの結果より、ASD児者では本研究で用いたタスクスイッチにおいて、健常者で認められる前頭葉機能の賦活化以外の部位も使って対処し、むしろ健常者よりも高い正解率を道にいている可能性が示唆された。昨年度までに申請者は、図形を用いたタスクスイッチ負荷を行った際ASD児者においては健常者で認められる前頭葉機能の賦活化以外の部位も使って対処している可能性を、高い正解率と相反する前頭葉脳血流量低下で示した。今年度はこの結果をもとにして、様々な表情をしたヒトの顔写真により、同様のスイッチングタスクを作成した。そしてこのタスクを施行している際の背外側前頭前野(dorsolateral prefrontal cortex: DLPFC)における酸素化ヘモグロビン濃度変化を測定することを通じ、ASD者の神経機能及び接続を詳細に検討することを目的とした。対象者は高機能のASD者5名(IQ>70,14-46歳2名女性)と典型発達者22名(19-38歳,12名女性)であった。タスクはワーキングメモリが要求される(WM)タスクとワーキングメモリが要求されない(NWM)タスクを交互に提示し、さらに刺激提示数は1から順に6まで増加した。刺激として顔刺激を利用した。その結果、典型発達者においてはタスクパフォーマンスに応じたDLPFCの賦活が認められたが、ASD者においては同様の結果が見られなかった。さらに、一名のASD者の側頭葉の賦活について検討したところ、紡錘状回に対応していると考えられるチャンネルにおいて、図形を用いたスイッチングタスクでは賦活が認められたのに対し、顔刺激を用いたスイッチングタスクでは賦活が認められなかった。これらの結果から、異所性の賦活によりタスクパフォーマンスに応じたDLPFCの賦活が障害されている可能性が示唆された。本研究では、自閉症スペクトラム障害(以下ASD)のアセスメントと支援方法を、医学と教育の連携させた観点から確立するために、これまでに、図形を用いたタスクスイッチ負荷を行った際、ASD児者においては健常者で認められる前頭葉機能の賦活化以外の部位も使って対処している可能性を、高い正解率と相反する前頭葉脳血流量低下で示した。さらにこの結果を基にして、ヒトの顔写真を刺激とした、同様のタスクを作成した。

で検討した結果、ASD者においてはタスクパフォーマンスに応じた前頭葉脳血流の変化が認められず刺激特異的・個体特異的な脳機能の差異があると考えられた。これらの脳機能実験から得られた実績を基にして、実際にASD児童を対象として、継続的に前頭葉を刺激するタスクを指導の中に取り入れ、その効果を独自に作成した認知、ワーキングメモリ機能を客観的に評価できるテスト問題を用いて定期的にその正答率と所要時間の評価を行うことを計画した。今年度はそのための予備実験として、小学校特別支援学級に在籍する児童を用いて、旗揚げや数字結びテストなどを行った際の前頭葉脳血流量を近赤外線酸素モニターを用いて評価した。被験者児童6名における旗揚げ施行時の10秒間の酸素化ヘモグロビン値の平均値を比較したところ、旗揚げを施行した際に、前頭葉血流量が右側優位に増加した児童が、6名中4名に観察された。さらに、6人の平均値において、右側前頭葉が優位に賦活していることが分かった。このことより、障害のある児においても一般的に空間認知を賦活すると考えられている課題を施行する際には右側前頭葉優位の賦活が起こる傾向があることが示唆された。今後この課題を実際に学級活動の中で用いて、継続的な刺激の効果を測定したい。
凍結前の精漿曝露がミニブタ精子の耐凍能および受精能に及ぼす影響

先ず,本年度の目的であったミニブタ精漿が精子の細胞膜のコレステロール量の増加および膜の流動性の低下を誘起しているか否かについて検討を行った.精漿に保存した精子のコレステロール量を薄層クロマトグラフィー,filipinを用いて測定した結果,処理区間に有意な差は認められなかった.また,精漿に保存した精子の膜の流動性をM540およびFACSを用いて測定したが,この結果においても処理区間に有意な差は認められなかった.これらの結果より,精漿が精子の耐凍能・受精能を低下させる原因は細胞膜のコレステロール量または流動性とは無関係であると考えられた.そこで,外科的手法を用いて精嚢腺排出管を切断したミニブタを作製し,その個体の精液性状および精子の受精能に及ぼす影響について検討を行った.その結果,手術後の精漿は精子の受精能を抑制しなくなること,またその時の精漿中タンパク質濃度は手術前と比較して1/10以下に減少していたことが明らかとなった.この結果から,ミニブタ精漿中の受精能抑制因子は精嚢腺から分泌されているタンパク質であると推察された.次に,精嚢腺液中の抑制因子がタンパク質であるか否か明らかにする目的で加熱処理およびprotease処理によってタンパク質を変性させた精嚢腺液に精子を保存した.その結果,タンパク質を変性させた精嚢腺液は精子の受精能を抑制しなくなったことからミニブタ精嚢腺液中の受精能抑制因子はタンパク質であると確認された.次に,50%硫酸アンモニウムを用いて回収した精嚢腺液中のタンパク質をゲルろ過カラムおよびイオン交換カラムに用いて精製を行った.その結果,活性の認められる分画には分子量約50kDaのタンパク質が検出された.また,この分子量約50kDaのタンパク質を含む分画は精子の受精能を抑制するだけでなく,精子の運動性も抑制することが明らかとなった.先ず,本年度の目的であったミニブタ精漿が精子の細胞膜のコレステロール量の増加および膜の流動性の低下を誘起しているか否かについて検討を行った.精漿に保存した精子のコレステロール量を薄層クロマトグラフィー,filipinを用いて測定した結果,処理区間に有意な差は認められなかった.また,精漿に保存した精子の膜の流動性をM540およびFACSを用いて測定したが,この結果においても処理区間に有意な差は認められなかった.これらの結果より,精漿が精子の耐凍能・受精能を低下させる原因は細胞膜のコレステロール量または流動性とは無関係であると考えられた.そこで,外科的手法を用いて精嚢腺排出管を切断したミニブタを作製し,その個体の精液性状および精子の受精能に及ぼす影響について検討を行った.その結果,手術後の精漿は精子の受精能を抑制しなくなること,またその時の精漿中タンパク質濃度は手術前と比較して1/10以下に減少していたことが明らかとなった.この結果から,ミニブタ精漿中の受精能抑制因子は精嚢腺から分泌されているタンパク質であると推察された.次に,精嚢腺液中の抑制因子がタンパク質であるか否か明らかにする目的で加熱処理およびprotease処理によってタンパク質を変性させた精嚢腺液に精子を保存した.その結果,タンパク質を変性させた精嚢腺液は精子の受精能を抑制しなくなったことからミニブタ精嚢腺液中の受精能抑制因子はタンパク質であると確認された.次に,50%硫酸アンモニウムを用いて回収した精嚢腺液中のタンパク質をゲルろ過カラムおよびイオン交換カラムに用いて精製を行った.その結果,活性の認められる分画には分子量約50kDaのタンパク質が検出された.また,この分子量約50kDaのタンパク質を含む分画は精子の受精能を抑制するだけでなく,精子の運動性も抑制することが明らかとなった.
3～5世紀の朝陽をめぐる諸民族交渉の研究

本研究は、本研究代表者のこれまでの研究成果の上に立って、35世紀の朝陽およびそれに関連する地域の諸墳墓やその他の遺跡の構造や立地状況、墳墓等から出土した文物等を総合的に検討し、当該時代の朝陽をめぐる地域における鮮卑慕容部を中心とする諸民族の共生、交渉の実態を明らかにすることを目的とした。研究ではまず、遼寧省の朝陽、錦州、内蒙古自治区の呼倫貝爾、興安、通遼、赤峰等における25世紀の墳墓、出土文物等のデータベースを構築した。その上で、8月から9月にかけて現地調査を行なった。本年度の現地調査は、経費と日程の関係から鮮卑拓践部の初期の遺跡に限定し、具体的には内蒙古自治区呼倫貝爾市鄂倫春自治旗の〓仙洞遺趾と満洲里市扎賚諾爾墓群の調査を行なった。また海拉爾区の呼倫貝爾民族博物館で札賚諾爾墓群、拉布大林墓群葬、孟根楚魯墓群等出土の鮮卑拓跋部関係遺物を調査し、さらに黒龍江省博物館、〓順博物館で他の鮮卑族およびその周辺諸民族に関する遺物を調査した。本研究によって、まず鮮卑拓跋部の故地とされる〓仙洞を中心とする大興安嶺山地の森林地帯と、拓跋部の移動後の活動の中心である扎賚諾爾等の呼倫湖周辺のステップ地帯との環境の相違を明らかにすることができた.これによって拓跋部の居住環境と慕容部の居住した朝陽周辺の環境との比較検討の場を得ることができるようになった。そしてその比較の結果、朝陽をめぐる諸民族のうち、牧畜経済を基盤とする拓跋部と半農半牧の慕容部との交渉あるいは競合が、35世紀の朝陽の社会変動の根底をなし、さらに遼東、朝鮮半島に至る地域の変革につながるという見通しを得るに至った。
高濃度トリチウム測定装置の開発

1.目的核融合燃料レベルの高濃度トリチウム(0.12.6Ci/【cm^3】)を対象とする小型でインライン可能な濃度測定装置を開発する。3.実験結果トリチウム濃度と発光強度の関係は蛍光体の種類により発光強度の差があるが、いずれの蛍光体も07気圧の範囲で直線性が認められる。粉末蛍光体を使用したことにより、水素によるβ線の自己吸収の影響を少なくすることができ濃度と発光強度の間に良い直線性が得られたと考えられる。Zn系蛍光体は発光強度が大きく、Y系は小さい。またY系はβ線による損傷と思われる発光強度の低下が、1時間程度の使用で認められた。【Zn_2】【SiO_4】:Mnを使用してトリチウムの昇圧、降圧を繰り返えす実験で2回目からBG値は初期暗電流値の5倍程度となるが、それ以後は平衡に達する。この値はDTがス1気圧の場合の電流値の1/100程度であるので、それほど問題とはならない。【Zn_2】【SiO_4】:Mnを使用してDT混合比を任意に変化させる実験でトリチウム濃度およびDT混合比を±1.5%以内の測定精度で求められることが確認できた。以上の結果より、インラインでかつ微量装荷量で可能な高濃度トリチウム測定装置の実用化の見通しが得られた。
リクライニングが嚥下時の咽頭収縮圧に与える影響

体幹を倒したリクライニング姿勢が咽頭腔内の嚥下時収縮圧にどのような影響を与えるか検証することを目的とした。上咽頭の収縮圧については、唾液嚥下時および水嚥下時の圧力は体幹を倒すほど有意に低下していた。さらに、食道入口部の開大時圧波形では、液体嚥下時、トロミ水嚥下時でリクライニング位は椅座位よりも有意に高くなる傾向があった。以上の結果により、リクライニング姿勢は上咽頭の収縮力の低下した症例にとっては機能的に有利な姿勢となるが、食道入口部の開大の悪い症例では不利な姿勢になる可能性が示唆された。リクライニング位で嚥下すると、重力の影響により食物を咽頭へ送りやすくなるうえに、喉頭が食道の入口より上になることで食物が食道に入りやすくなるために誤嚥しにくくなると考えられている。しかし、摂食・嚥下障害は病態によっては、リクライニング位をとることでかえって咽頭に食物が残留し、誤嚥のリスクが高くなる症例もあるが、リクライニング位が有効な症例かどうかの判断基準については明らかではないため、リクライニング位によって改善される点と阻害される点について明らかにするため、平成25年度には、リクライニング位が嚥下時の上咽頭に与える影響について調査した。健常成人9名を被験者として、90°座位、60°リクライニング位、30°リクライニング位における、空嚥下時、水嚥下時、とろみ水嚥下時、「PΛ」発音時、「KΛ」発音時のそれぞれについて鼻咽腔閉鎖圧を測定した。その結果、空嚥下時および水嚥下時の鼻咽腔閉鎖強度は体幹を倒すほど有意に低下した。一方、とろみ水嚥下時では有意差は認められなかった。また、鼻咽腔閉鎖時間については、どの試行でもリクライニング位による明らかな変化は認められなかった。本研究結果により、鼻咽腔閉鎖強度については食塊の物性や体幹角度によって影響され、鼻咽腔閉鎖時間についてはこれらの影響を受けないことが示唆された。また、本研究結果は、リクライニング位で粘性の低いものを嚥下する際には、強い鼻咽腔閉鎖圧は必要とされない可能性があり、鼻咽腔閉鎖圧の弱い嚥下障害者にとって、リクライニング位は有効である可能性が考えられた。嚥下障害者に対して食物を嚥下する際に体幹を倒したリクライニング位が有効であることは一般的に知られているが、咽頭や食道入口部に対する影響について不明な点が多く、それを明らかにすることを目的に検証を行った。まず、上咽頭の嚥下時の収縮圧について検証した結果、唾液嚥下時および水嚥下時の圧力は体幹を倒すほど有意に低下していた。また、/PΛ/や/KΛ/を発音した際の鼻咽腔閉鎖圧についても体幹を倒すにつれて低くなる傾向を認めた。つぎに、リクライニング位の食道入口部に対する影響を検証したところ、安静時の静止圧は体幹を倒すほど圧が高くなる傾向があり、直立座位と30°リクライニング位の間に有意差を認めた。また、液体嚥下時、トロミ水嚥下時、ゼリー嚥下時のHSP波(食道の入口部が開大したときに生じる陰圧波形)は、直立座位時よりも30°リクライニング位で有意に高い圧が計測されたが、E波(食道入口部に食塊が到達した際に、食道入口部にかかる咽頭収縮圧)およびC波(食塊を食道の下方へと移送する際に生じる圧力)ではリクライニング位による明らかな影響は認められなかった。以上の結果により、30度リクライニングでは直立座位よりも食道入口部の静止圧が高くなり、嚥下時には食道入口部が開大しづらくなる可能性が示唆された。本研究により、リクライニング位では椅座位に比べて発音時や嚥下時に要する上咽頭の収縮圧は低くなる可能性があり、上咽頭の収縮力の低下した症例にとっては機能的に有利な姿勢となる可能性が考えられた。その一方で食道入口部の開大が悪く嚥下後に咽頭内に食物が残留する症例において、リクライニング位を用いると食道入口部がさらに開大しづらくなり、咽頭の残留量が増加する可能性が考えられた。ただし、今回の研究期間で得られた結果は健常成人におけるものであり、実際の症例をもとに今後も検証を続けていく予定である。摂食嚥下障害平成25年度には、リクライニング位における上咽頭の閉鎖圧に与える影響について、その研究成果をJournal of Oral Rehabilitationにて発表することができた。

また、健常者における下咽頭および食道入口部にリクライニング位が与える影響については、予定通りデータを収集できているため。健常者における下咽頭および食道入口部の嚥下圧にリクライニング位が与える影響については今後もデータ解析を進め、学術大会等で発表する予定である。また、リクライニング位は嚥下関連筋の筋活動にも影響を与えている可能性が考えられたため、平成26年度には筋電位の測定を行い、嚥下圧および嚥下関連筋活動の測定値より、リクライニング位が嚥下運動にどのような影響を与えているのか、またどのような患者に有効なのかを検討していく方針である。さらに、実際の摂食嚥下障害患者に対する嚥下圧または筋電位の測定については、引き続き協力して頂ける患者の募集を続ける予定である。昨年度では、健常者を対象として、リクライニング位における嚥下圧の測定を行ったが、嚥下時の嚥下関連筋の筋電位の計測にて有用なデータの収集を行うことができなかった。そのため、当初予定していた学術大会への参加を見送ったことで、繰り越し金が生じた。今年度は昨年度の繰り越し金で筋電位測定用の電極を購入し、さらに今年度の研究費にて筋電位測定用の記録装置およびそのデータを解析するためのソフト購入、学会参加費および旅費、論文翻訳・校閲料等の使用を計画している。
自然界に存在しない物質に対する栄養要求性による新規生物学的封じ込め技術の開発

遺伝子組換え生物、病原体、環境適応性の強い外来種など、「役にたつが危険な生物」が、無制御に環境中で増殖・定着しないように、「自然界には存在しない物質・非天然アミノ酸がないと生きられない生物」を作出する方法を開発した。この方法を施した大腸菌は、実験室や工場で、非天然アミノ酸を与えられた時のみ生存できる。しかし、自然環境中に逃亡しても、非天然アミノ酸は存在しないので、死滅する。(1)非天然アミノ酸依存性翻訳スイッチによる遺伝子発現の調節:非天然アミノ酸依存性翻訳スイッチは、非天然アミノ酸を必須栄養素として要求する大腸菌を作出するための鍵技術である。非天然アミノ酸が存在しないとき、発現量がほぼゼロになることが重要となる。アンバー終止コドンに非天然アミノ酸3-ヨウ化-L-チロシン(IY)を導入するアミノアシルtRNAシンテターゼ/tRNA系では、IYが存在しなくても約7%の漏洩翻訳が認められた。これは、シンテターゼまたはtRNAの発現抑制との併用、標的遺伝子に挿入するアンバー終止コドンの多重化、およびシンテターゼのプロモーターの適切な選択により、<1%に抑制できた。さらに、標的遺伝子の転写調節との二重制御により、漏洩発現をほぼ完全にゼロに抑制することに成功した。成果は論文として公表した。(2)生存に必須な遺伝子の発現が非天然アミノ酸依存する大腸菌の作出:全ゲノム配列が公表されている実験用大腸菌DH10Bに、アンバー終止コドンにIYを導入するアミノアシルtRNAシンテターゼ/tRNA発現プラスミドを形質転換しようとしたが、目的の形質転換体は得られなかった。DH10Bは、アンバー終止コドンの抑制に対して致死であると推測された。そこで、全ゲノム配列が明らかな他の系統として、大腸菌BL21(DE3)を選択し、上記のシンテターゼ/tRNA発現プラスミドの導入に成功した。3-ヨウ化-L-チロシン存在下でアンバー終止コドンを翻訳する条件下で、必須遺伝子のひとつlpxCをアンバー終止コドンを挿入した変異遺伝子と置換した系統を作出した。(1)能動的封じ込め法による非天然アミノ酸に対する栄養要求性大腸菌株の作出:能動的封じ込め法とは、生物が実験室外に逃亡した時、その生物に致死的な効果をもたらす遺伝子が発現するように、遺伝的にプログラムして、逃亡を防ぐ方法である。ここでは、大腸菌に強毒性をもつRNA分解酵素コリシンE3と、それに対する抗毒素イムノE3の遺伝子を、大腸菌BL21-AI株に導入した。イムノE3の翻訳開始コドン直下にアンバー終止コドンを挿入し、非天然アミノ酸ヨウ化チロシンによるアンバー抑制を利用した翻訳スイッチによる制御下に置いた。作出した大腸菌株BL21-AI(IY,1amb-immE3)は、人為的にヨウ化チロシンを与えた培地では生育したが、ヨウ化チロシンがない培地では死滅した。このようにして、自然界に存在しない物質であるヨウ化チロシンに対する栄養要求性をもつ大腸菌株の作出に成功した。(2)ヨウ化チロシン要求性大腸菌株の特性の解明:生物学的封じ込めを施した生物が、生存に必須な因子を遮断した後、どの程度の時間生き残ることができるかは、その生物による外界への影響を予測する上で重要である。そこで、培地中からIYを除去したあと、BL21-AI(IY, 1a-immE3)の生菌数の時間変化を計測した。生菌数は直ちに減少せず、1時間後まではむしろ増加が認められた。2時間以降は、生菌数は指数的に減少した(半減期は、約0.9時間)。生物学的封じ込めで問題となることのひとつは、致死条件に置かれても生き残るエスケーパーの発生である。わずかなエスケーパーが発生すれば、コントロールできない環境中での増殖につながる危険性がある。エスケーパーの発生率は、1.4 x 10-5 mutations/cell/generationと見積もられた。これは、71千分裂に1つのエスケーパーが生じることを意味する。最終年度は、原理的な確立には成功した、非天然アミノ酸に対する人工的栄養要求性による能動的封じ込め法の限界性能を引き出すための工夫を行った。(1)高性能な翻訳スイッチへの置換:非天然アミノ酸導入系に正のフィードバック回路を導入することにより、スイッチの高性能化がはかれるか、フィージビリティスタディを実施したところ、有望な結果を得た。(2)システムの多重化:エスケーパー発生率を抑えるために、ColE3-ImmE3とは別の毒素-抗毒素系ColD-ImmDによる封じ込め装置の併用をこころみた。しかし、ColD-ImmDによる封じ込め装置では、宿主大腸菌は死滅にいたらず、成長阻害をもたらすにとどまった。他の毒素-抗毒素系について、ひきつづき封じ込め装置の構築と性能の検定を進めている。

能動的封じ込め法については、実績概要のとおり、研究は想定以上に進展している。ヨウ化チロシン栄養要求性の大腸菌株の作出に成功した。また、封じ込め性能を評価する重要指標である、ヨウ化チロシン遮断後の生存率低下速度、エスケーパーの発生確率、および親株に対する相対的増殖速度を、精密に決定した。それにより、今後の研究の推進方策を明確に定めることができた。一方、昨年度に主に推進した受動的封じ込め法については、ほぼ同一のアイデアに基づく研究が、他の研究グループにより、2015年1月に公表されたため(Rover et al., Nature 518, 89, 2015)、一旦凍結して、上記の能動的封じ込め法にエフォートを集中している。合成生物学最終年度は、能動的封じ込め法にエフォートを集中し、その限界性能を引き出すための工夫をこらす。高性能な翻訳スイッチへの置換、システムの多重化による性能向上を試みる。翻訳スイッチによって、非天然アミノ酸存在時には十分な発現があり、かつ存在しない時には完全に発現をゼロに抑えることができた。これは、非天然アミノ酸を必須栄養素とする大腸菌系統を作出するのに、この翻訳スイッチは十分な性能をもつことを裏付ける結果である。また、大腸菌の生存に必須な遺伝子のひとつlpxCを、翻訳スイッチの制御下に置くために、アンバー終止コドンを挿入した変異遺伝子置換系統の作出にも成功した。PCRプライマーや消耗試薬類の費用に、見積もりとの差額が生じた。実験結果に影響される避けられない誤差である。現在進行中のlpxCアンバー終止コドン挿入系統の評価を進める。また、非天然アミノ酸存在下でのみ発現する抗毒素による、能動的封じ込めについても、研究に着手する。次年度の同費目として繰り入れて、上記の理由による誤差の緩衝とする。PCRプライマーとして用いるオリゴDNAの合成費用に、見積もりとの若干の差額が生じた。