hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
看護師のレジリエンス向上のための認知行動コーチングを導入した教育支援の効果検証

本研究では、看護師が様々なストレス状況を乗り越えられる能力・技術(レジリエンス)を教育支援するために、心理学の理論背景に基づく認知行動コーチングを導入した研修を行い、その内容を検討した。対象者は、病院で働く看護師とした。研修会では、知識の説明とそれに関連するグループワークを取り入れた体験学習を行なった。その結果、グループワークによる体験学習は、知識の獲得やそれらの興味を高めることにつながっていた。また、自分自身の傾向を再認識することができ、そのことにより行動変容への意欲につながっていた。しかし一方では、学習したことを活用することの難しさを感じている者もいた。臨床の場で働く看護師は、人間の生命にかかわるという職業特有のストレスフルな状況を経験し、加えて、高度な医療に対応していくことや経験の浅い看護師を育成するなどその役割は多様である。そのため、看護師はストレス低減やストレスを乗り越えるための能力やスキルが必要であると考えた。そこで、本研究の目的は、看護師特有の思考や行動(ビリーフ)の変容および困難な状況を乗り越えるための能力・スキル(レジリエンス)を獲得するために、認知行動コーチングを導入し、効果的な教育支援を展開することであった。本年度の主な目的は、認知行動コーチングを導入した教育支援プログラムの実践および内容の評価と研修実施による看護師のレジリエンス、ビリーフとストレス反応への影響を検討することであった。本年度においては、新人看護師を指導する実地指導者看護師(看護師3年目)を対象に、認知行動コーチングを取り入れた研修会を5回実施した。第1回目では、学習意欲と動機づけ,自尊感情,自己効力感,成人教育学(アンドラゴジー)について、第2回目では、質問することの効果や質問の方法などコーチングについて、第3回目では、思考の転換とアサーディブなコミュニケーションについて、第4回目では、質問の順序や問題となる感情や思考の誤りなど認知行動コーチングについて、第5回目では、セルフコーチングについての講義を行った。そして、研修会開始前には、「レジリエントナース尺度」「看護師のビリーフ尺度」「ストレス反応」などの質問紙調査を実施し、レジリエンスの変化、レジリエンスとストレス反応との関係などについて検討を行った。臨床で働く看護師は、人間の生命にかかわるという職業特有のストレスフルな状況を経験し、加えて、高度な医療に対応していくことや経験の浅い看護師を育成するなどその役割は多様である。本年度の主な目的は、認知行動コーチングを導入した教育支援プログラムの実践および内容の評価と研修実施による看護師のレジリエンスビリーフ、ストレス反応への影響を検討することであった。本年度においては、新人看護師を指導する実地指導者看護師(看護師3年目)に対し、認知行動コーチングを取り入れた研修会を3回実施した。第1回目では、学習意欲と動機づけ,自尊感情,自己効力感,成人教育学(アンドラゴジー)、アサーティブな表現方法について行った。第2回目では、コーチングの講義を行い、演習として問題解決に向けGROW(Goal:目標、Reality:現在の状況の確認、Options:行動案、What, When, Who, Will:「何」「いつ」「だれが」「実行する意思」)を用い質問練習を行った。第3回目ではチーム全体の能力向上を目指し質問を用いた会議の持ち方についての講義および演習を行った。さらにストレスを増強させる要素として考え方や価値観(ビリーフ)に関する講義を行った。本研究は、看護師のレジリエンス向上のための教育支援として、認知行動コーチングを導入した教育プログラムの実践と効果検証を行い、看護師のレジリエンスの向上を目指すものである。H27年度においては、新人看護師の指導・教育にあたる実地指導者看護師の研修を3回実施することとした。継続的変化については検討することができたが、教育プログラムの効果検証するまでには至っていないため、予定していた目的よりは少し遅れていると考える。臨床の場で働く看護師は、人間の生命にかかわるという職業特有のストレスフルな状況を経験し、加えて、高度な医療に対応していくことや経験の浅い看護師を育成するなどその役割は多岐にわたる。そこで、本研究の目的は、看護師特有の思考や行動(ビリーフ)の変容および困難な状況を乗り越えるための能力・スキルとしてレジリエンスを高めるために、認知行動コーチングを導入し、効果的な教育支援を展開することであった。本年度においては、新人看護師を指導する看護師および副看護師長を対象にコーチングとその活用法についての研修会を2病院に実施した。2病院ともコーチングとはどのようなものであるか、コーチングの目標とするものは何かということや、コーチングに必要な基本的なスキルとして、質問するスキル、聞くスキル、(人を)動かすスキルについて講義を行った。加えて、問題解決に向けGROW(Goal:目標、Reality:現在の状況の確認、Options:行動案、What, When, Who, Will:「何」「いつ」「だれが」「実行する意思」)を用い質問練習を行った。

短時間で一回のみの研修であったため、研修については、知識としての学習にはつながっていたが、研修の効果としてどのような効果があったかは検討できなかった。しかし、研修での学びを今後に実践してみたいかとの問いには、「1:全く思わない」「10:とても強く思う」の10段階評定では、平均8.3を示していた。また、どの程度実践できそうか(自信度)との問いには、「1:全くやれそうにない」「10:とても強くやれそうだと思う」の10段階評定では、平均6.3であった。自信度は10段階で8以下となっており、一度の研修ではすぐに実践するのは難しいという記述が得られていることから実践と研修を繰り返すあるいは研修後のフォローの必要性があると考えられた。H28年度においては、コーチングついての研修会は実施できたが、2病院とも短時間で1回のみの研修であり、その研修そのものの効果検証までには至らなかった。臨床の場で働く看護師は、人間の生命にかかわるという職業特有のストレスフルな状況にあり、加えて、高度な医療に対応していくことや経験の浅い看護師を育成するなどその役割は多岐にわたる。そこで、本研究の目的は、看護師特有の思考や行動(ビリーフ)の変容および困難な状況を乗り越えるための能力・スキルとしてレジリエンスを高めるために、認知行動コーチングを導入し、効果的な教育支援を展開することであった。今年度は、認知行動コーチングとして、「問題解決」「アサーティブ行動」のスキルに関する研修会を実施した。困難な状況を乗り越えるためには、問題解決に向けた思考および人間関係が円滑であることが必要と考えこれらの内容を実施した。問題解決思考のスキルとして、思考の柔軟性やプラス思考で問題解決方法を探すことに関する講義や、論理的に思考するスキルとして、自分の考え方の傾向を振り返り、情報を整理して並べ状況を整理する考える方法について講義を行なった。その結果、現状分析としてロジックツリーの作成をしたことで、現在の問題点や今後の取り組みが明確になった、自分の思考や傾向が分かったなどの意見が得られた。さらに、看護師はチームで協同し看護援助を行なうことから、よりよいチームコミュニケーションが求められる。そのためアサーションに関する事柄とチームコミュニケーションの視点で研修会を実施した。これらの研修会では、自己の意見を述べられていなかったという気づきや、また研修会でのグループワークを通じて次第にお互いの意見を聞くことや述べることができるようになっている者もいた。これらのことから、目標を達成するために交流を図る機会が多くあることが、アサーティブ行動を向上につながると考えられた。本研究では、看護師が様々なストレス状況を乗り越えられる能力・技術(レジリエンス)を教育支援するために、心理学の理論背景に基づく認知行動コーチングを導入した研修を行い、その内容を検討した。対象者は、病院で働く看護師とした。研修会では、知識の説明とそれに関連するグループワークを取り入れた体験学習を行なった。その結果、グループワークによる体験学習は、知識の獲得やそれらの興味を高めることにつながっていた。
Maillard反応後期生成物の主要構造の決定、及びその生体内発現機構の解析

高血糖に伴い多くの生体タンパク質が、非酵素的に糖付加反応を受けている。この反応はメイラード反応と呼ばれ、グルコース等の還元糖がタンパク質のリジン残基を介してシッフ塩基を形成し、アマドリ転位反応生成物に至る前期反応と、更に長期の反応を経て褐色変化、蛍光性あるいは分子間および分子内架橋を特徴とする後期生成物(Advanced Glycation End Protducts;AGE)に至る後期反応から構成される。AGEが糖尿病合併症や老化現象と密接に関係することが指摘されているが、その反応経路や生成物の構造に関する情報は極めて少なく、後期段階の如何なる構造体がこれらの病変発症と関係しているかなどの物質論的な情報に乏しいのが現状である。我々は、AGEの主要構造体の化学構造を決定と、その構造体の生体内発現機構の解明を目的として実験を行い下記のような成果を得た。1、主要蛍光物質X1の単離および構造解析2、X1の免疫化学的解析X1が生体タンパク質に発現しているかどうかを解析するために、X1-Tos-lysをカブトガニヘモシアニン(KLH)と重合させ、兎に免疫することにより抗X1-KLH抗血清を得た。抗X1-KLH抗血清はAGE-Tos-lys,AGE-Ac-lys,AGE-GABAのみならずAGE-BSAやその他のAGEタンパク質と有意に反応したが非修飾化合物やタンパク質とは反応しなかった。更に、生体タンパク質であるヒト正常レンズタンパク質とも反応し、その反応性は加齢に比例して増加した。これらの結果より、AGE-Lys誘導体より分離した主要蛍光物質AGEX1は、AGEタンパク質上に発現するAGE共通の主要構造体の一つであり、生体タンパク質にも発現して加齢により増加していることが判明した。
タイト結合分子に着目した悪性中皮腫の新規診断・治療標的の同定

本研究では,タイト結合分子CLDN15およびAngulin-3/ILDR2に着目し,悪性中皮腫の新規診断・治療標的としての意義を明らかにする.まずヒト胸膜中皮腫症例を用いて両分子の発現と臨床病理学的因子の相関を明らかにする.次にin vitro/vivoにおける両分子のgain/loss of functionを評価し,中皮腫の悪性形質に及ぼす影響やそのシグナル伝達機構を解明する.また両分子の細胞外ドメインを認識する阻害抗体を開発し,中皮腫の血清診断や分子標的療法を目指した基盤研究を行う.本研究では,タイト結合分子CLDN15およびAngulin-3/ILDR2に着目し,悪性中皮腫の新規診断・治療標的としての意義を明らかにする.まずヒト胸膜中皮腫症例を用いて両分子の発現と臨床病理学的因子の相関を明らかにする.次にin vitro/vivoにおける両分子のgain/loss of functionを評価し,中皮腫の悪性形質に及ぼす影響やそのシグナル伝達機構を解明する.また両分子の細胞外ドメインを認識する阻害抗体を開発し,中皮腫の血清診断や分子標的療法を目指した基盤研究を行う.
メタラ環状化合物を経る軸不斉ビアリール類の触媒的不斉合成

前年度までに,ジナフトチオフェンとアリールグリニャール試薬とのクロスカップリング反応を詳細に検討し,高い立体選択性と高い収率を実現してきた.例えば不斉配位子としてオキサゾリン-ホスフィン(L^*),触媒前駆体としてNi(cod)_2を用いてクロスカップリング反応をTHF中で行うと,p-トリルおよびフェニルグリニャール試薬は95%eeの生成物,ビナフチルチオール,を与えた.この不斉反応はイオウ-炭素結合の開裂と新たな炭素-炭素結合の形成が進み,この時不斉が誘起される全く新しいタイプの不斉反応である.最終年度である本年度は,このジナフトチオフェンの不斉クロスカップリング反応の不斉誘導機構の解明と新しい基質への展開を行った.まず,ジナフトチオフェン誘導体の溶液中の反転速度をNMRにより測定し,クロスカップリング反応に比べて極めて早く,ジナフトチオフェンはキラルな構造をしているが,アキラルな化合物として取り扱えることを明らかにした.また用いるグリニャール試薬によりエナンチオ選択性が大きく変動することから,生成物の立体化学はトランスメタル化より後ろの段階で決定されているものと考えられる.ジナフトチオフェンの他に1,9位に置換基をもつジベンゾチオフェンもこの開環型不斉クロスカップリングの,良好な反応基質となることを見出した.この基質にはオキサゾリン-ホスフィンよりもむしろ軸不斉単座ホスフィンであるH-MOPが高い立体選択性を示すことが分かった.現在はチオフェン骨格に替わり,環状のヨードニウム塩を用いてパラジウム触媒による開環型不斉反応を試みている.本年度は,これまでに得てきた軸不斉化合物の触媒的不斉合成の知識とノウハウを活かして,ヘテロ元素を含むナフト5員環化合物の不斉開環による軸不斉ビナフチル化合物の触媒的不斉合成を目指した.炭素(sp2)-イオウ結合が低原子価の遷移金属により切断されること,またチオフェンがクロスカップリング反応の基質となることなどの知見を基に架橋ヘテロ元素としてイオウを採用した.不斉配位子,溶媒などの反応条件を検討した結果,不斉配位子としてオキサゾリン-ホスフィン(L^*),触媒前駆体としてNi(cod)_2,を用いてジナフトチオフェンとアリールグリニャール試薬との反応をTHF中で行うと,イオウ-炭素結合の開裂と新たな炭素-炭素結合の形成が進み,クロスカップリング生成物としてビナフチルチオールが定量的な収率で得られた.エナンチオ選択性は極めて高く,p-トリルおよびフェニルグリニャール試薬は95%eeの生成物を与えた.従来の不斉クロスカップリングに高選択的な不斉配位子として用いられたフェロセニルホスフィンやbinapではエナンチオ選択性は低い.この触媒的な不斉クロスカップリング反応は0価ニッケルにチオフェンが酸化的付加して発生するニッケルとイオウを含む多元素環状化合物中間体を経て進行するものと考えられる.この環状化合物中間体はその後グリニャール試薬との反応(トランスメタル化)によりジオルガノニッケル中間体を経て還元的脱離によりクロスカップリング生成物を与え,0価ニッケルを再生する.用いるグリニャール試薬によりエナンチオ選択性が大きく変動することなどから,生成物の立体化学はトランスメタル化より後ろの段階で決定されているものと考えられる.前年度までに,ジナフトチオフェンとアリールグリニャール試薬とのクロスカップリング反応を詳細に検討し,高い立体選択性と高い収率を実現してきた.例えば不斉配位子としてオキサゾリン-ホスフィン(L^*),触媒前駆体としてNi(cod)_2を用いてクロスカップリング反応をTHF中で行うと,p-トリルおよびフェニルグリニャール試薬は95%eeの生成物,ビナフチルチオール,を与えた.この不斉反応はイオウ-炭素結合の開裂と新たな炭素-炭素結合の形成が進み,この時不斉が誘起される全く新しいタイプの不斉反応である.最終年度である本年度は,このジナフトチオフェンの不斉クロスカップリング反応の不斉誘導機構の解明と新しい基質への展開を行った.まず,ジナフトチオフェン誘導体の溶液中の反転速度をNMRにより測定し,クロスカップリング反応に比べて極めて早く,ジナフトチオフェンはキラルな構造をしているが,アキラルな化合物として取り扱えることを明らかにした.また用いるグリニャール試薬によりエナンチオ選択性が大きく変動することから,生成物の立体化学はトランスメタル化より後ろの段階で決定されているものと考えられる.ジナフトチオフェンの他に1,9位に置換基をもつジベンゾチオフェンもこの開環型不斉クロスカップリングの,良好な反応基質となることを見出した.この基質にはオキサゾリン-ホスフィンよりもむしろ軸不斉単座ホスフィンであるH-MOPが高い立体選択性を示すことが分かった.現在はチオフェン骨格に替わり,環状のヨードニウム塩を用いてパラジウム触媒による開環型不斉反応を試みている.
第一原理計算に基づく多面的なアプローチによる超伝導物質探索

これまでに利用されてきた超伝導転移温度の計算手法の精度向上と自動化を目指して研究を進めた。特に、まず、超伝導転移温度の計算の際に必要となるクーロン相互作用の計算の自動化に取り組み、基本的な場合の自動化に成功した。これにより、第一原理計算に基づいた電子格子相互作用、クーロン相互作用の計算を両方自動化できたことになる。現在、この手法を用いて系統的かつ非経験的な超伝導転移温度の計算を進め、データの構築を行っている。また、超伝導転移温度を計算する上で最も基本的な方程式であるEliashberg方程式を低温まで精度よく解くための手法について検討を行い、計算コスト、メモリとも現実的な範囲で計算できる目処がたった。今後、この手法を実装することで、どんな物質でもEliashberg方程式から転移温度を計算することが可能になると考えている。また、実験に対応する計算として、立方晶SnInTeSeにおいて、組成を変化させたときの超伝導転移温度の理論と実験の比較を行った。この際、組成を変化させたときの状況をうまく内挿する手法を開発し、理論と実験が大まかに一致することなどを明らかにした。この物質は組成を中途半端に混ぜたところで最も転移温度が高くなるため、このような系の傾向を再現できたことは、今後の物質探索を進める上においても重要な結果であると考えている。さらに、物質探索の際に必要となる物質の特徴量を抽出することを目的として、第一原理計算からタイトバインディング模型に落とすwannier90と呼ばれるプログラムの改良も行った。この成果の一部は2019年の年初にリリースされたwannier90のバージョン3に取り込まれている。超伝導転移温度の計算手法に関して、計算の自動化、および精度向上の両面において進展があった。また、従来の手法を用いた実験との比較もおおむね良好であり、本手法開発を進めることで、物質探索にもつながること期待されるため。まず、Eliashbergの低温での計算手法を実装する。これにより、プラズモンの寄与など、クーロン相互作用の動的な寄与も考慮できるため、それらの効果をEliashberg方程式の立場から明らかにする。また、計算の自動化については、うまくいかない場合の検証を行い、自動化の精度を高める。これにより、超伝導転移温度のデータベース構築を進め、物質探索を進める。対象としては、構造探査の手法も取り入れ、新規物質の探索も目指す。学内業務の影響で、予定していた国際会議の参加を見送ったため。次年度に同じ国際会議への参加を予定している。
戦争の記憶の政治社会学

本研究の目的は、「戦争の記憶」をめぐる市民運動を、政治社会学の観点から調査・分析することをとおして、そこに含まれる歴史的および現代的特質を索出することにある。本年度は以下のように実証研究および理論研究を実施するとともに、成果を公表した。1、実証研究(1)山口自衛官合祀拒否訴訟まず実証研究としては、昨年度に日本法社会学会で口頭発表を行った、A.メルッチの「新しい社会運動」論の視角からする山口自衛官合祀拒否訴訟の事例分析を、研究論文として再構成し公表した。(2)箕面忠魂碑違憲訴訟加えて、箕面忠魂碑違憲訴訟の支援活動への参加をきっかけとして、自らの戦争体験を語るという活動を始めた当事者のライフ・ヒストリーに即して、(1)その思想形成過程の特質、(2)彼の思想の平和思想としての可能性、さらに(3)彼の思想と行動を支えるエートスの意義と限界を検討し、研究論文として公刊した。(3)ドイツにおける「戦争の記憶」さらに、渡独してワイマール、ハンブルク、ベルリン、ミュンヘンの各都市における戦争記念碑ないし記念施設の視察とともに、関連文書資料の収集を行った。それによって、現代ドイツにおける「戦争の記憶」をめぐる問題状況について以下のような仮説を索出した。すなわち、現代ドイツにおいては、第一次大戦と第二次大戦との意味づけのズレに加えて、旧東独と旧西独における第二次大戦の意味づけのズレという、二重の亀裂ないし緊張関係を内包している、と。2、理論研究つづいて理論研究としては、A.メルッチによる調査研究論およびパーソナリティ論についての知見を踏まえつつ、ライフヒストリー研究の主要な三つの論点(歴史、文化、アイデンティティ)とそれらの論点に対応する方法論のそれぞれと、それら方法論の相互関係について検討する研究論文を作成中である。本年度は以下のように理論研究および実証研究を実施するとともに、成果を公表した。1、理論研究まず理論研究としては、現代の社会運動が個人のアイデンティティ形成と密接に結びつくようになった点に着目するA.メルッチの「新しい社会運動」論の解析・検討を行い、研究論文を発表した。この論文では、とりわけメルッチの公共空間論に焦点を当て、複合システム化した現代社会における公共空間が、もはやそれ自体は政治的行為ではなくなった現代の社会運動と、こうした現代の社会運動がになう変動のポテンシャルを制度化する政治システムとの接点として理論的に位置づけられることを明らかにするとともに、調査研究の持ちうる公共的役割を理論的に位置づけるための手がかりを得た。2、実証研究(1)山口自衛官合祀拒否訴訟続いて実証研究としては、山口自衛官合祀拒否訴訟を取り上げ、東北社会学会大会において口頭発表を行った。この報告では、本来は原告女性の宗教的アイデンティティの侵害に対する異議申し立てから始まった訴訟が、運動当事者たちが戦争の記憶にあまりに強く規定されていたために、反戦・反権力闘争へと傾斜し、人権擁護志向が背景に退いていった点を明らかにした。(2)箕面忠魂碑違憲訴訟上記事例の調査研究と並行して、箕面忠魂碑違憲訴訟の関係者に対して、訴訟終了後の経過および訴訟支援を契機とした各人の現在の活動について聞き取り調査を行った。1、実証研究(1)山口自衛官合祀拒否訴訟まず実証研究としては、A.メルッチの「新しい社会運動」論の視角から山口自衛官合祀拒否訴訟の事例分析を行い、日本法社会学会大会において口頭発表を行った。この報告では、事例分析に即して、法廷をメルッチのいう意味での公共空間としてとらえた場合、法廷が、問題を法的に定義することによって、それを法的問題として開示する場として機能していることを指摘した。それとともに、運動過程において、他律的なアイデンティティ形成が行われていた点、および「良心の自由」志向が反戦・反権力志向に従属させられていた点を指摘した。この報告を踏まえて研究論文を作成し、現在投稿中である。(2)箕面忠魂碑違憲訴訟それとともに、箕面忠魂碑違憲訴訟の関係者に対して、訴訟終了後の経過および訴訟支援を契機とした各人の現在の活動について聞き取り調査を行った。なかでも、箕面忠魂碑違憲訴訟の支援活動への参加をきっかけとして、自らの戦争体験を語るという活動を始めた当事者のライフ・ヒストリーの聞き取りを行い、東北社会学会大会において口頭発表を行った。2、理論研究つづいて理論研究としては、現代の社会運動が個人のアイデンティティ形成と密接に結びつくようになった点に着目するA.メルッチの「新しい社会運動」論の解析・検討を行った。その際には、メルッチの調査研究論に焦点をあわせ、調査研究の持ちうる公共的役割についての理論的位置づけを解析・検討した。1、実証研究(1)山口自衛官合祀拒否訴訟

まず実証研究としては、昨年度に日本法社会学会で口頭発表を行った、A.メルッチの「新しい社会運動」論の視角からする山口自衛官合祀拒否訴訟の事例分析を、研究論文として再構成し公表した。(2)箕面忠魂碑違憲訴訟加えて、箕面忠魂碑違憲訴訟の支援活動への参加をきっかけとして、自らの戦争体験を語るという活動を始めた当事者のライフ・ヒストリーに即して、(1)その思想形成過程の特質、(2)彼の思想の平和思想としての可能性、さらに(3)彼の思想と行動を支えるエートスの意義と限界を検討し、研究論文として公刊した。(3)ドイツにおける「戦争の記憶」さらに、渡独してワイマール、ハンブルク、ベルリン、ミュンヘンの各都市における戦争記念碑ないし記念施設の視察とともに、関連文書資料の収集を行った。それによって、現代ドイツにおける「戦争の記憶」をめぐる問題状況について以下のような仮説を索出した。すなわち、現代ドイツにおいては、第一次大戦と第二次大戦との意味づけのズレに加えて、旧東独と旧西独における第二次大戦の意味づけのズレという、二重の亀裂ないし緊張関係を内包している、と。2、理論研究つづいて理論研究としては、A.メルッチによる調査研究論およびパーソナリティ論についての知見を踏まえつつ、ライフヒストリー研究の主要な三つの論点(歴史、文化、アイデンティティ)とそれらの論点に対応する方法論のそれぞれと、それら方法論の相互関係について検討する研究論文を作成中である。
大型底生性タコ類ミズダコの移動要因の解明に関する研究

ミズダコが季節的に浅所と深所を行き来する要因を初めて明らかにした。本研究では、宗谷海峡において水温を連続的に記録する標識を用いた標識放流調査、水温別の飼育によるミズダコの成長の観察、漁獲されたミズダコの胃内容物観察、ソナーやカメラを用いた固着生物の調査を行った。その結果、ミズダコは夏季に水温が15°C以上になると移動し始め、生理的な限界の水温21°C以上の海域を避けて深所へ移動する。そして、秋季に浅所の水温が19°C未満に下がると、餌条件の良い浅所へ餌を食べに移動して、春季まで留まることが明らかになった。1.ミズダコが深所へ移動する要因の解明(1)野外におけるミズダコの好水温帯の特定:水温ロガーを取り付けたミズダコを平成25年7月19日に宗谷海峡の水深40m付近で12個体、12月17日に宗谷岬の3カ所の漁港から合計80個体放流した。現在までに5個体再捕され、12月4月のミズダコの経験水温が-1.37.0°Cであり、冬期間ほとんど移動せず、放流場所にとどまることが推定された。(2)高水温によるミズダコの成長および栄養要求量への影響評価:未成熟ミズダコを5°C、10°C、15°C、20°Cの各水温条件でスケトウダラを給餌して2か月間飼育した。その結果、20°Cの高水温では摂食はするものの、マイナス成長となり、20°Cを超える高水温では生育が困難であることが明らかとなった。2.ミズダコが浅所へ移動する要因の解明(1)浅所および深所におけるミズダコの食物、摂食状況の比較:宗谷海峡において樽流し漁業で漁獲されたミズダコを7月3日に209個体、11月14日に254個体採集して胃内容物を冷凍保管した。胃内容物が認められたのは、7月で142個体、10月で153個体であり、胃内容物組成の観察が可能となった。(2)摂食状況の差異をもたらす海底環境の解明:平成25年6月1014日にサイドスキャンソナーを用いて宗谷海峡の247.6km2の海域の海底の音響データを取得した。同時に、水中カメラによる撮影を行い、画像データと音響データを照合させることで調査範囲の底質分布図を作製できた。さらに、宗谷岬周辺の藻場の分布状況を明らかにするために、藻場用ソナーを用いて平成25年8月1920日に水深1030mに設定した4定線の音響データと水中カメラによる画像の取得を行った。この結果、岩盤上では、アナメ群落、小型海藻群落、濾過食者群集の順に帯状構造を形成していることが推察された。1.ミズダコが深所へ移動する要因の解明(1)野外におけるミズダコの好水温帯の特定:水温ロガーを取り付けたミズダコを、2013年、2014年に宗谷岬周辺の3カ所の漁港から放流した結果、2014年411月にかけて計16個体再捕された。水温ロガーで観測された経験水温から、岸側の水温が12°Cを超え始めると沖側への移動が始まり、20°C以上の海域に生息する個体は認められなかった。(2)高水温によるミズダコの成長および栄養要求量への影響評価:未成熟ミズダコを2.5°C20°Cの水温条件で12か月飼育した結果、20°Cを超える高水温では生育が困難であることが明らかとなった。2.ミズダコが浅所へ移動する要因の解明(1)浅所および深所におけるミズダコの食物、摂食状況の比較:2004年から2014年に宗谷海峡で採集されたミズダコについて、月別の空胃個体の割合を把握した結果、46月では13.631.7%、911月では26.952.0%となった。20102012年の6月と10月の胃内容物組成を観察した結果、6月では主にカニ類、ヤドカリ類、ユムシ、10月では、魚類、魚卵、ユムシなどであった。(2)摂食状況の差異をもたらす海底環境の解明:2014年6月912日にサイドスキャンソナーを用いて宗谷海峡の41.2km2の海域の海底の音響データを取得した。同時に、水中カメラによる撮影を行い、調査範囲の底質分布図を作製できた。宗谷岬周辺の藻場の分布状況を明らかにするために、藻場用ソナーを用いて2014年5月に水深212m、8月に水深1030mに設定した各8定線の音響データと水中カメラによる画像の取得を行った。画像から景観を構成する生物の被度を計算し、主要な景観構成生物がスガモ、コンブ類、アナメ、ヨレモク、小型海藻、無節サンゴモ、イソギンチャク類であることを明らかにした。1.ミズダコが深所へ移動する要因の解明(1)野外におけるミズダコの好水温帯の特定:2015年度には水温ロガーを装着したミズダコの再捕は無かった。

これまでの再捕個体より得られた経験水温のデータから、岸側の水温が15°C以上になると沖側への移動が始まり、21°C以上では分布できないことが明らかとなった。(2)高水温によるミズダコの成長および栄養要求量への影響評価:これまでの飼育結果をとりまとめ、ミズダコは20°Cを超える高水温ではマイナス成長となり、この水温が生理的な限界と思われた。2.ミズダコが浅所へ移動する要因の解明(1)浅所および深所におけるミズダコの食物、摂食状況の比較:2004年から2015年に宗谷海峡で採集されたミズダコについて月別の空胃個体の割合を把握した結果、主に浅所に分布している時期には空胃率が低く、深所に分布しておる時期では空胃率は高いことから、浅所の方が食物条件が良いと思われた。(2)摂食状況の差異をもたらす海底環境の解明:2015年6月812日にサイドスキャンソナーを用いて宗谷海峡の58.2km2の海域の海底の音響データを取得した。同時に、水中カメラによる撮影を行い、調査範囲の底質分布図を作製できた。宗谷岬周辺の藻場の分布状況を明らかにするために、藻場用ソナーを用いて2015年5月に水深212mの6定線、8月に水深1030mに設定した5定線の音響データと水中カメラによる画像の取得を行った。これまで得られた全ての画像から景観構成生物の種類別被度を計算した結果、宗谷海峡では浅所から深所にかけて海底景観構成種が海藻類からイソギンチャク等の固着動物へと変化し、これら固着生物の被度が減少していくことを明らかにした。ミズダコが季節的に浅所と深所を行き来する要因を初めて明らかにした。本研究では、宗谷海峡において水温を連続的に記録する標識を用いた標識放流調査、水温別の飼育によるミズダコの成長の観察、漁獲されたミズダコの胃内容物観察、ソナーやカメラを用いた固着生物の調査を行った。その結果、ミズダコは夏季に水温が15°C以上になると移動し始め、生理的な限界の水温21°C以上の海域を避けて深所へ移動する。そして、秋季に浅所の水温が19°C未満に下がると、餌条件の良い浅所へ餌を食べに移動して、春季まで留まることが明らかになった。1.ミズダコが深所へ移動する要因の解明(1)野外におけるミズダコの好水温帯の特定:水温ロガーをつけて放流したミズダコが16個体再捕され、解析に用いるデータを得ることができた。(2)高水温によるミズダコの成長および栄養要求量への影響評価:2.5°Cから20°Cまでの2.5°C間隔での飼育実験により、一連の解析に必要なデータを得ることができた。2.ミズダコが浅所へ移動する要因の解明(1)浅所および深所におけるミズダコの食物、摂食状況の比較:宗谷海峡におけるミズダコの胃内容物標本の観察が計画通り進んでいる。日本海のミズダコの胃内容物標本については、6月と10月に礼文島で採集した胃内容物を冷凍保管して、胃内容物の観察を行う計画である。(2)摂食状況の差異をもたらす海底環境の解明:2014年5月、6月、8月に宗谷海峡における海底環境の音響データを取得でき、この音響データと照合する画像も取得でき、解析も計画通り進んでいる。水圏応用科学1.ミズダコが深所へ移動する要因の解明(1)野外におけるミズダコの好水温帯の特定:再捕報告を待つのと平行して収集できたデータの解析を行う。(2)高水温によるミズダコの成長および栄養要求量への影響評価:飼育データの解析を行い、本項目の成果をとりまとめる。2.ミズダコが浅所へ移動する要因の解明(1)浅所および深所におけるミズダコの食物、摂食状況の比較:宗谷海峡で過去に採集した胃内容物標本の処理とデータ解析を進め、季節的な摂食状況を明らかにする。日本海の標本については、過去に礼文島で採集した胃内容物の観察を行う。(2)摂食状況の差異をもたらす海底環境の解明:2014年と同様に、2015年5月、6月、8月に宗谷海峡における海底環境の音響データおよび海底画像の取得を行う。1.ミズダコが深所へ移動する要因の解明(1)野外におけるミズダコの好水温帯の特定:当初計画通りにミズダコの標識放流ができている。
地下回転掘削における土砂の流動特性及び掘削抵抗

本研究は,地下回転掘削において,シールド掘進機により掘削される土砂の流動特性及び掘削抵抗を理論的かつ実験的に明らかにすることを目的としている.理論解析では,大深度地下における圧力状態と機体内部への土砂の流入・流出特性を考慮するために,個別要素法に基づく従来の二次元解析を三次元解析に拡張した.チャンバ内への土砂の流入・流出を考慮しない二次元及び三次元の理論解析結果を実機施工結果と比較し,各理論解析の適用可能範囲について検討した.また,実機施工時に得られた物性値を有する砂質土地盤を掘削する場合について,実機を対象とした三次元理論解析も行った.実験解析では,シールド掘進機スケールモデル,土槽及び油圧式加圧装置等よりなる実験システムを設計・製作した.砂質土地盤及び粘性土地盤においてカッタヘッド前面に作用する地山土圧に相当する圧力を油圧式加圧装置により制御して掘削土砂に負荷し,カッタヘッド前面とチャンバ内の土圧及び掘削抵抗トルクを測定した.流動特性は高速デジタルビデオカメラにより得られた画像情報を画像処理解析し,定量化した.理論解析,実験解析及び実機施工により得られた結果を比較検討し,次の主な結論を得た.(1)カッタヘッド開口部及びチャンバ内の土砂流動状況と掘削抵抗を十分な精度で予測するためには土砂の流入・流出を考慮した三次元解析モデルを用いる必要がある.(2)土砂の流入・流出を考慮しない二次元及び三次元解析モデルについて,前者はチャンバ中間領域の土砂流動状況,後者はチャンバ内の土砂流動状況と中間ビーム及びかくはん翼に作用する掘削抵抗の推測には適している.また,理論解析により得られた結論は次の通りである.(1)カッタヘッド回転起動直後にチャンバ内へ流入する土砂は,中間ビーム回転軌道外側の領域を流動する.(2)カッタヘッドよりチャンバ内に流入する土砂は,チャンバ前部であるカッタヘッド背面では中間ビーム及びかくはん翼と連れ回って流動し,チャンバ後部である隔壁側のチャンバ内壁周辺では滞留する傾向が強い.さらに,実験解析により,平均切羽土圧に対する平均チャンバ内土圧の比と掘削抵抗トルクとの間には線形関係があることを明らかにした.これは,切羽管理土圧の最適設定に有用である.本研究は,地下回転掘削において,シールド掘進機により掘削される土砂の流動特性及び掘削抵抗を理論的かつ実験的に明らかにすることを目的としている.理論解析は,大深度地下における圧力状態と機体内部への土砂の流入・流出特性を考慮するために,個別要素法に基づく従来の二次元解析を三次元解析に拡張した.三次元理論解析結果を実機施工結果及びスケールモデル実験結果と比較検討し,理論解析方法の妥当性を確認した.また,チャンバ内への土砂の流入・流出を考慮しない二次元及び三次元の理論解析結果との比較も行い,各理論解析の適用範囲について検討した.実機施工時に得られた物性値を有する砂質土地盤に対する理論解析を行い,次の主な結論を得た.(1)カッタヘッドよりチャンバ内に流入する土砂は,チャンバ前部であるカッタヘッド背面では中間ビーム及びかくはん翼との連れ回りを生じ,チャンバ後部である隔壁側のチャンバ内壁周辺では滞留する傾向が強い.(2)カッタヘッド開口部及びチャンバ内の土砂流動状況と全掘削抵抗を十分な精度で予測するためには土砂の流入・流出を考慮した三次元解析モデルを用いる必要がある.土砂の流入・流出を考慮しない二次元及び三次元解析モデルについて,前者はチャンバ中間領域の土砂流動状況,後者はチャンバ内の土砂流動状況と中間ビーム及びかくはん翼に作用する掘削抵抗の推測には適している.さらに,実験解析のために,地下回転掘削時の土圧状態を再現するためのプログラム加圧装置を設計した.また,チャンバ内に取り込まれる土砂の排出装置の基本設計を行った.平成11年度では実験装置の製作を完了させ,実験解析を行う.地山土圧に相当する圧力をプログラム加圧装置により制御し,かくはん抵抗等の各種掘削抵抗を測定する.流動特性は高速デジタルビデオカメラで撮影し,画像データを平成10年度に購入したソフトウェアを利用して定量的に解析する.実験結果を個別要素法による理論解析結果及び実機施工結果と合わせて総合的に考察する.本研究は,地下回転掘削において,シールド掘進機により掘削される土砂の流動特性及び掘削抵抗を理論的かつ実験的に明らかにすることを目的としている.理論解析では,大深度地下における圧力状態と機体内部への土砂の流入・流出特性を考慮するために,個別要素法に基づく従来の二次元解析を三次元解析に拡張した.チャンバ内への土砂の流入・流出を考慮しない二次元及び三次元の理論解析結果を実機施工結果と比較し,各理論解析の適用可能範囲について検討した.また,実機施工時に得られた物性値を有する砂質土地盤を掘削する場合について,実機を対象とした三次元理論解析も行った.実験解析では,シールド掘進機スケールモデル,土槽及び油圧式加圧装置等よりなる実験システムを設計・製作した.砂質土地盤及び粘性土地盤においてカッタヘッド前面に作用する地山土圧に相当する圧力を油圧式加圧装置により制御して掘削土砂に負荷し,カッタヘッド前面とチャンバ内の土圧及び掘削抵抗トルクを測定した.流動特性は高速デジタルビデオカメラにより得られた画像情報を画像処理解析し,定量化した.理論解析,実験解析及び実機施工により得られた結果を比較検討し,次の主な結論を得た.(1)カッタヘッド開口部及びチャンバ内の土砂流動状況と掘削抵抗を十分な精度で予測するためには土砂の流入・流出を考慮した三次元解析モデルを用いる必要がある.

(2)土砂の流入・流出を考慮しない二次元及び三次元解析モデルについて,前者はチャンバ中間領域の土砂流動状況,後者はチャンバ内の土砂流動状況と中間ビーム及びかくはん翼に作用する掘削抵抗の推測には適している.また,理論解析により得られた結論は次の通りである.(1)カッタヘッド回転起動直後にチャンバ内へ流入する土砂は,中間ビーム回転軌道外側の領域を流動する.(2)カッタヘッドよりチャンバ内に流入する土砂は,チャンバ前部であるカッタヘッド背面では中間ビーム及びかくはん翼と連れ回って流動し,チャンバ後部である隔壁側のチャンバ内壁周辺では滞留する傾向が強い.さらに,実験解析により,平均切羽土圧に対する平均チャンバ内土圧の比と掘削抵抗トルクとの間には線形関係があることを明らかにした.これは,切羽管理土圧の最適設定に有用である.
喉頭癌におけるYB-1発現が浸潤/転移、抗がん剤耐性に及ぼす影響

YB-1の核内発現は喉頭癌において浸潤や転移とは関連が見られず、予後因子のマーカーにもならなかった。しかし唾液腺癌においてはYB-1の核内発現は高悪性腫瘍である唾液導管癌に多く発現し、増殖因子であるHER2やホルモンレセプターの発現とも相関した。またYB-1の核内発現がリンパ節、遠隔転移と相関して、YB-1の核内発現群が非発現群よりも予後不良であった。よってYB-1の発現が唾液腺癌において増殖や転移に影響を及ぼすバイオマーカーであり、分子標的治療のターゲットになりうると考えられる。喉頭癌は一般的に比較的早期発見が可能で、予後も良好な癌が多い。しかし予想以上に悪性度が高く、放射線治療や化学療法への抵抗性を示すものもなかには見られる。そして治療に難渋し、再発、転移を繰り返すことがある。我々はこのような喉頭癌の治療に影響を与えるものには喉頭癌細胞の増殖様式や抗がん剤、放射線などの治療への抵抗性、あるいは宿主の癌に対する防御能が関与していると考えている。我々はそのメカニズムを解明し、更なる治療成績の向上のために近年特に話題となっているYボックス結合蛋白1(YB-1)を主な標的分子として研究対象に選んだ。そして喉頭癌における悪性度について、YB-1が新しいバイオマーカーとなり得るか否かを検討した。YB-1の核内発現は近年、肺癌や乳癌などで癌の大きさやリンパ節転移、病期の進行と病理学的に関連があると報告されている新しい蛋白質である。我々も喉頭癌の病理標本を用意し、免疫組織化学という手法を用いて癌の悪性度や転移、予後などを病理学的に検討した。しかし蛋白質の核内発現の有無と悪性度や転移、予後とは関連が見られなかった。今後は免疫組織化学以外にDNAやRNA解析などの手法を用いて検討を行っていく予定である。また頭頸部癌の中では喉頭癌よりも悪性度が高く、予後が悪いとわれる舌癌や唾液腺癌の中の唾液導管癌に注目し、その増殖や転移のメカニズムについて免疫組織化学を用いて解明していこうと考えている。唾液腺癌は症例数が少なく、組織型が多彩な癌である。そして組織型によっては予後が良いものと悪いものがある。その中でも唾液導管癌は悪性度が高く、治療抵抗性で再発、転移を繰り返す予後不良な癌である。我々はこの唾液導管癌に着目し、治療成績の向上のためにその増殖や転移のメカニズムを解明しようと近年特に話題となっているYボックス結合蛋白(YB-1)とHER2を主な標的分子として研究対象に選んだ。そして唾液導管癌における悪性度についてこれらが新しいバイオマーカーと成り得るかを検討した。またHER2もその発現が様々な癌で予後と関連し、分子標的治療の対象となる蛋白質である。我々は唾液導管癌とその他の唾液腺癌の病理標本を用意し、免疫組織化学という手法を用いて癌の悪性度や転移、予後を病理学的に検討した。その結果、唾液導管癌はYB-1とともにHER2の発現が増加し、それと共にリンパ節転移の頻度が増加した。またYB-1、HER2発現群とそれぞれの非発現群を比較したところ発現群は非発現群に比べて有意に予後不良であった。今後はこの唾液導管癌を中心に唾液腺癌に注目してHER2遺伝子やEGFR、HER3、c-metなどの蛋白とどのような関連を示すのかその生物学的な特徴を明らかにしようと考えている。そのために病理診断が困難なことも多い。また組織型によって予後が良いものと悪いものがあるが、その増殖、転移のメカニズムは不明であり、新たなバイオマーカーも報告されていない。我々は唾液腺癌の治療成績の向上のためにその増殖や転移のメカニズムを解明しようと近年特に話題となっているYボックス結合蛋白(YB-1)を標的分子として研究対象に選んだ。そして唾液腺癌における悪性度についてYB-1が新しいバイオマーカーと成り得るかを検討した。我々は様々な組織型の唾液腺癌の病理標本を用意し、免疫組織化学という手法を用いて癌の悪性度や転移、予後を病理学的に検討した。その結果、YB-1発現群は非発現群と比較してリンパ節、遠隔転移の頻度が多かった。またYB-1発現群と非発現群を比較したところ発現群は非発現群に比べて有意に予後不良であった。

そしてYB-1は唾液腺癌の中でも予後不良といわれる唾液導管癌に多く発現していた。今後はYB-1が唾液腺癌の予後不良因子また分子標的治療のターゲットとなりうることが示唆された。
哺乳類特異的な、RNAサイレンシングと抗ウイルス反応のクロストーク機構の解析

生体内には内在的にsiRNAやmiRNAなどの小分子ノンコーディングRNAが存在し、RNAサイレンシング機構により塩基配列特異的に広く多様な遺伝子発現ネットワークを制御している。一方、ウイルスなどの外来性RNAはウイルスセンサータンパク質によって感知され、I型インターフェロンの誘導を伴った抗ウイルス反応を誘導する。これらの経路はこれまで独立した別々の経路であると考えられてきたが、2つの経路がクロストークすることを見出した。small interfering RNA (siRNA)、microRNA (miRNA)、PIWI-interacting RNA (piRNA)といった内在性の小分子二本鎖RNAは、RNAサイレンシングという塩基配列特異的な遺伝子発現抑制機構によって、広く多様な遺伝子機能を制御していることが知られている。本研究課題は、哺乳類細胞における、これら内在性の小分子ノンコーディングRNAによるRNAサイレンシング機構と、ウイルスなどの外来性RNAより励起されるインターフェロン応答を伴った免疫応答機構のクロストークを明らかにすることを目的としている。RNAサイレンシング機構とこのようなウイルスなどの外来性RNAに対する免疫応答機構は、共に2本鎖RNAによって駆動される機構であり、両者の間にはクロストークがあると想定されるが、その機構についてはこれまで全く明らかではなかった。2015年度はマウスノックアウト細胞とルシフェラーゼ遺伝子を用いたレポーターアッセイ系によるRNAサイレンシング活性の測定実験や、リアルタイムPCRによる目的の遺伝子の発現量変化を測定することで、これらの経路に関与する因子の詳細な機能解析を行った。さらに近年開発された、ゲノム編集ツールとして知られるCRISPR/Cas9システムにより目的の遺伝子のノックアウト細胞株を樹立した。2016年度はこれらの細胞株を用いた解析を継続して行う予定である。CRISPR/Cas9システムによるノックアウト細胞株の樹立なども含め、2016年度にむけて順調に解析が進んだため。内在性の小分子ノンコーディングRNAであるsmall interfering RNA (siRNA)、microRNA (miRNA)、PIWI-interacting RNA (piRNA)は、細胞内で塩基配列特異的にmRNAに対合し、mRNAの切断や翻訳抑制などを誘導することで、広く多様な遺伝子発現を制御している。一方、ウイルスなどの外来性RNAは、細胞内でウイルスセンサータンパク質に感知され、インターフェロンの誘導を伴った抗ウイルス応答機構を活性化させる。内在性RNAにより誘導されるRNAサイレンシング機構と、外来性RNAにより誘導される抗ウイルス応答機構は、これまでそれぞれ独立した経路であると考えられてきたが、本研究課題では、両経路に共通に作用する因子を同定し、両経路がクロストークすることを明らかにした。2016年度は、2015年度にゲノム編集ツールであるCRISPR/Cas9システムにより樹立したノックアウト細胞株を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子を用いたレポーターアッセイ系によるRNAサイレンシング活性の測定実験や、リアルタイムPCR法による遺伝子の発現量変化の測定実験を行った。また、免疫沈降法により、RNAサイレンシング機構において作用する因子と、抗ウイルス応答機構において作用する因子の相互作用の関係を明らかにした。インターフェロンの誘導を伴った抗ウイルス反応は哺乳類において保存された機構であり、RNAサイレンシングにおいて精力的に研究が進められているハエや線虫では起こらない反応である。本研究課題の進展により、哺乳類の生命現象に保存された分子機構の解明に結びつくと期待できる。2016年度は2015年度に樹立したノックアウト細胞株を用いて、より詳細な機能解析を行う予定である。免疫学
VNC概念による病原性微生物指標の開発

大腸菌に特異的な塩基配列を用いてリアルタイムPCRを行うことで、大腸菌の生菌数を迅速に定量できることができた。定量範囲は1×10^11×10^6cfu/tubeであった。細菌活性の有無を区別できるPMA試薬は、ハロゲン光照射約10分間でDNAを不活化でき、またPMA試薬自身も不活性化された。PMA試薬で菌体液を処理した後、リアルタイムPCR反応を施すことで活性のある菌体とない菌体を定量できるか検討した。添加した熱処理菌体数を変化させても、活性のある大腸菌と閾値サイクル数の間には一定の関係があることが分かった。しかし、熱処理菌体数が活性のある大腸菌の菌数の10倍以上になると検量線の傾きが変化した。またVNC状態の細菌に対する塩素消毒効果を検討する為、水道原水として使用される河川水を用いて塩素消毒実験を行ったところ、生理的活性のあるVNC状態の細菌の不活性化速度定数は培養可能な細菌の1/22/3程度であり、河川水中のVNC状態の細菌は、大腸菌の場合と同様に培養可能な細菌より塩素消毒に対する抵抗性が強いことが明らかとなった。大腸菌に特異的な塩基配列を用いてリアルタイムPCRを行うことで、大腸菌の細菌数を平板培養法よりも迅速に定量できることが実証できた。大腸菌のβグルクロニダーゼ酵素をコードするuidA遺伝子を用いたリアルタイムPCR実験では、定量範囲は1×10^11×10^6cfu/tubeであり、1×10^0cfu/tubeが検出限界であった。活性の有無を区別できるPMA(propidium monoazide)試薬はハロゲン光(300W)の光照射10分間でDNAを不活化でき、PMA試薬自身も光照射10分間で不活化されることが分かった。また、PMA試薬は熱処理した死菌のみを染色でき、生菌は染色しないことが蛍光顕微鏡による観察結果から明らかになった。しかしPMA試薬とリアルタイムPCRを組み合わせた実験では、生菌と死菌を区別して定量できず、VNC状態の大腸菌を選択的に検出定量するまで至らなかった。活性のあるVNC状態の大腸菌のみを検出するには、PMA試薬の適用条件をさらに検討する必要がある。さらにVNC状態の細菌に対する塩素消毒効果を検討する為、水道原水として使用される河川水を用いて塩素消毒実験を行った。菌数の減少率とCT値(残留塩素濃度×処理時間)の関係から不活性化速度定数kを算出したところ、k値は0.70.9(L/mg/min)の範囲で、R2A培地による培養法の1/22/3程度であった。河川水中のVNC状態の細菌は、大腸菌の場合と同様に培養可能な細菌より塩素消毒に対する抵抗性が強いことが明らかとなった。平成19年度の研究では、PMA(Propidium monoazide)試薬とリアルタイムPCRとを組み合わせて実験しても活性のある菌とない菌を区別して定量できなかった。そこで今年度はDNAの抽出方法と照射するハロゲン光の強さを変更した。先ず、DNAの抽出方法としてQiagen社のDNeasy kitを用いて大腸菌のDNA定量実験を行った。増幅効率、決定係数ともInstagene Matrix試薬を用いた場合より精度は高くなかったが、大腸菌DNAの定量を行うことができた。次にハロゲン光の強さ300Wと500WでPMA光照射実験を行い、PMA試薬の効果を確認したところ、300Wの場合ではDNA抽出方法をDNeasykitに変更してもPMAの効果が認められなかったが、ハロゲン光の強さを500Wに変更した場合、照射時間510分間でPMAの効果が明らかに示された。熱処理した大腸菌と無処理の大腸菌を混合した実験では、300Wと500Wいずれの場合も大腸菌の生菌量が減少するにつれて閾値サイクル数が増加する傾向が見られた。しかし熱処理菌体と無処理菌体の差異は期待したほどではなく、定量のための検量線を作成できなかった。VNC状態の大腸菌を選択的に検出定量するには、閾値サイクル数の差をさらに拡大する必要がある。以上のように今年度は大腸菌の計測方法の改善に取り組んだため、真正細菌の定量方法の検討はできなかった。

平成20年度の研究では、熱処理した大腸菌と無処理の大腸菌を混合した実験において、PMA (Propidium monoazide)試薬とリアルタイムPCRとを組み合わせても、大腸菌の生菌量の減少に伴う閾値サイクル数の増加は認められたが、熱処理菌体と無処理菌体のサイクル数の差異は期待したほどではなく、定量のための検量線を作成できなかった。そこで今年度は、大腸菌液を希釈して熱処理、無処理菌体とも低い濃度で混合実験した結果、活性のある無処理菌体液量が増加するにつれて閾値サイクル数が顕著に減少する傾向が認められ、サイクル数の差も活性のある細菌とない細菌を区別して定量するには十分であった。さらに熱処理した一定量の大腸菌を活性のある大腸菌に添加し、活性のある大腸菌のみが定量できるか検討した。添加した熱処理菌体数を変化させても、活性のある大腸菌と閾値サイクル数の間には一定の関係があり、検量線が作成できた。しかし、熱処理菌体数が活性のある大腸菌の菌数の10倍以上になると検量線の傾きが変化し、定量範囲を外れることが知られた。