hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
急性肺障害における肺胞マクロファージを中心とした細胞間シグナル伝達の検討

さらに遺伝子治療の応用については現在プラスミッド大量生産システムを確立中である。本研究は動物実験、臨床データ両面から急性肺障害の発症機序を研究するものである。特に肺胞マクロファージを中心とした炎症性サイトカインのネットワーク、iNOSの変動等について新しい知見を得ることにより急性肺障害における単球系の役割を解明することを目的としている。平成8年度はin vivoの系でクロドロネート包括リポゾームを吸入させて肺胞マクロファージを根絶したマウスモデルを開発した。このマウスを用いて緑膿菌生菌を左肺内投与する亜急性肺障害実験を行った。肺胞マクロファージ根絶マウスでは左肺は無処置マウス以上の強い障害を受けたにもかかわらず遠隔臓器である右肺では障害程度が少なかった。この右肺における変化を見当したところ無処置マウスではiNOS,やTNFα, MIP2, CINCなどの炎症性サイトカインなどの発現が著明であったのに比し、根絶マウスではこれらの蛋白発現が抑制されていた。臨床面においては成人呼吸窮迫症候群を罹患した患者の肺洗浄液中の肺胞マクロファージ中および血清中ののiNOS, IL-1b, TNFa, IL-6, IL-8活性について検討を加え、急性期において肺胞マクロファージ表面にこれらの蛋白が高度に発現していることを示した。さらにRT-PCRを用いて肺胞洗浄液のiNOS, IL-1b, TNFa, IL-6, IL-8などのmRNA発現を検討したところ、早期よりこれらのmRNAが発現し、かつテステロイド投与により強く発現が抑制されることが示された。本研究により肺胞マクロファージを中心とした炎症性サイトカインのネットワーク、iNOSの変動などについて新しい知見を得ることができた。特にクロドロネート包括リポゾームを吸入させて肺胞マクロファージを根絶したラットそしてマウスモデルを開発できた。本法は95%以上の肺胞マクロファージを根絶でき、従来の気管支内直接投与法(70%程度の根絶)よりすぐれたモデルである。平成9年度はこのモデルマウスを用いて緑膿菌生菌を肺内投与する亜急性肺障害実験を行った。肺胞マクロファージ根絶マウスでは当初肺障害の程度も少なく、死亡率も低かったが7から10日前後にかけてほとんどのマウスが死亡した。それに対して無処置マウスは緑膿菌投与直後の死亡率が高かったにもかかわらず半数近いマウスが生存した。また根絶マウスでは腎等の遠隔臓器の障害程度が少なくiNOS,やTNFα,MIP2、CINCなどの炎症性サイトカインの発現が著明に抑制されていた。これらの所見は肺胞マクロファージが生菌の除去に必須であるが炎症初期の過剰反応が時に生体に不利な反応を引き起こす可能性を示唆している。これらの諸事実は一方ではARDSが全身炎症症候群の肺分画症であることの証左でもあり、その過程において肺胞マクロファージが重要な役割を果たしていることが判明した。臨床面においては急性呼吸窮迫症候群を罹患した患者の肺洗浄液中の肺胞マクロファージ中および血清中のiNOS,IL-1β,TNFα,IL-6,IL-8活性について検討を加え、急性期において肺胞マクロファージ表面にこれらの蛋白が高度に発現していることを示し、また肺胞マクロファージにこれらの蛋白が高度に発現していることを蛍光抗体法により示した。
腸内生態の普遍的な特徴とモデル化

本年度は最終年度でもあり、これまで研究してきた内容について、2つの論文を投稿した。1つはヒト唾液細菌叢の概日リズムの発見であり(DNA Res.印刷中)、もう一つは腸内細菌叢が食事や病態の影響を受けない個人間で共通したきわめて普遍的な構造(累積相対量分布; CRAD)を持つことを発見し、さらにその形成メカニズムの数理モデルを考案した内容についてである(PLoS Comp. Biol, revised中)。昨年までに、唾液の細菌叢に概日リズムがあり、食事が与える影響が小さいことを発見していたが、新たに、食後30分前後に食事の内容や、個人によらず、Lautropia mirabilisの相対存在比が増加することを発見した。また、Lautropia以外にも、食事中や、食事直後に食事の内容等に応じて増加する細菌群を同定した。これらの内容を、11月にアメリカ・ヒューストンで行われたHuman Microbiome Congressでポスターにまとめ、発表を行い、その原因について情報交換を行った。現在、原因の探求についての追加実験の解析を行っており、今後論文として投稿する予定である。また、マウスの腸内細菌叢に対して抗生剤を単発投与する実験を行い、菌叢構造の入れ替わりは抗生剤濃度に応じて起こるものの、適量投与でも過剰量投与でも2週間程度で、水飲み投与のコントロール群と同等の水準まで回復し、その回復の速度にはある程度個体差があることを新たに発見した。28年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度までの研究で、ヒトやその他動物の糞便サンプルの既存データを使って、16SrRNA系統解析を行い、種個体数分布がべき分布で近似されるようなロングテールな分布になることを確かめていた。またべき分布で近似した場合、ホスト種が同じであれば、菌叢の個体差や状態に寄らず種個体数分布のべき指数が非常に似通った値になることも確認していた。そのような安定的な種個体数分布がどのように生成されるのか、複数種が3次元格子上で隣接する空間にランダムに成長していく数理モデルを構築し、腸内細菌叢が持つ上記の特徴を再現することを確認した。今年度は新たに、時系列での変動の特徴を抽出するべく、唾液の4時間おきのサンプルを3日間に渡って取り続け、唾液の菌叢に概日リズムのあることを確認した。その変動幅は、平均としては個人差による菌叢の変動より小さいものの、最も菌叢の変化の大きい時間帯同士を比較した場合のUnifrac距離は、個人差を上回ることもあるほどの大きさだった。菌数の絶対量も日内周期しており、朝起床時8:00には、夜20:00の10倍以上の菌が口内に存在する。また個別のtaxaの相対比率の変動について、より詳しく見た結果、門レベルでは、firmicutes門とBacteroidetes門が逆位相の日内変動を示すこと、属レベルにおいては、嫌気、好気性の区別で菌叢全体の約45%の変動のパターンを説明できることを確かめた。すなわち、嫌気的な菌は睡眠時に増殖することが多く、好気的な菌は活動時間帯に増殖する傾向があった。これらの結果は5月にボストンのforsyth研究所で情報交換を行い、その後時差ボケのサンプルの採取や、メタゲノム解析などを引き続き行った。今後は、幼児の概日リズム形成時期の菌叢を調べたり、マウスを使って菌叢の概日リズムと食のリズムの関係性について、さらなるサンプリングを行っていく予定である。一昨年までの研究でヒトやその他動物の糞便サンプルの既存データを使って、16SrRNA系統解析を行い、ホスト種が同じであれば、菌叢の個体差や状態に寄らず種個体数分布が非常に似通った分布になることを確かめており、空間的な競争に基づく資源争いモデルを作成し、一部の種個体数分布を再現することに成功していた。前年度は、そのモデルに、新しい種が経口などで、一定確率で入るパラメータを入れることで、乳児から大人までの細菌叢の形成を説明することができるようになった。シミュレーションの結果、大人では乳児と比較して、腸内細菌叢の形成における既存種の空間争いは比較的に穏やかであり、それに対して外部から新しく入ってくる菌の多さが大きく影響していることが予想された。これらの結果をScienceに投稿準備中である。また、一昨年までの研究において、唾液の細菌叢における概日周期を、4時間おきに観測することで確認しており、現在Nature Communicationに投稿する準備を進めている。それに付随して、昨年は概日周期を引き起こす原因を探るため追加実験を行った。その結果、食事の影響を排除しても口腔内の概日周期が保たれることが明らかになり、口腔内では腸内と違い、食事による菌叢変化の影響はかなり限定的であることが示唆された。また、上記の唾液実験の間に、数ヶ月数年での個人の唾液菌叢の変化が無視できないことを感じ、1ヶ月毎日同じ時間に唾液のサンプリングを行うことで、菌叢の変化の方向や速度について調べる実験を計画、実行した。現在データを取得中。他にも、マウスの腸内において、単発の抗生物質(Vancomycin)投与が、腸内細菌に及ぼす影響と、レジリエンスを細かいタイムポイントで観測する実験等を行った。腸内細菌叢の種個体数分布を再現するモデルについては、一昨年度までに空間的な競争に基づく資源争いモデルを作成し、一部の種個体数分布を再現することに成功していたが、昨年度新たに外部からの菌の流入のパラメータを導入することで、一昨年までは説明のつかなかった乳児と大人等の様々な種個体数分布の形状を説明できるようになった。

現在これらの結果をScienceに投稿準備中である。食事や投薬等によって、どの程度腸内細菌叢が変わり得るのかを更に追求するために、あらたに、マウスの腸内細菌の菌叢撹乱に対する応答を、抗生物質を使って調べた。3日間の4時間おきサンプリングの後、Vancomycinを1回投与し(過剰量、適量、無し、各3匹ずつ)、その後4日間4時間毎のサンプリングを継続し、間隔を空けて、その後2週間サンプリングを継続した。これらの結果から、腸内細菌叢の安定性に関する特徴を抽出することで、数理モデルを時間発展に対応するモデルに改良していくつもりである。また、一昨年までにヒト唾液の細菌叢における概日周期を、4時間おきに観測することで確認しており、Nature Communicationに投稿する準備を進めている。それに付随して、概日周期を引き起こす原因を探るため追加実験を行う必要が出てきたため、食事の前後のヒト唾液細菌叢を10分おきにサンプリングして、菌叢構造の変化を追う実験を行った。唾液細菌叢においては食事の摂取がなくとも菌叢が大きく1日で変動すること、食事を取った影響は指数関数的に減衰し、特徴時間がおよそ1時間であることを新たに発見した。上記の唾液を使った実験の間に、数ヶ月数年の個人の唾液菌叢の変化が無視できないことを感じ、1ヶ月毎日同じ時間に唾液のサンプリングを行うことで、菌叢の変化の方向や速度について調べる実験を新たに計画、実行した。現在次世代シークエンサーのデータを取得中である。本年度は最終年度でもあり、これまで研究してきた内容について、2つの論文を投稿した。1つはヒト唾液細菌叢の概日リズムの発見であり(DNA Res.印刷中)、もう一つは腸内細菌叢が食事や病態の影響を受けない個人間で共通したきわめて普遍的な構造(累積相対量分布; CRAD)を持つことを発見し、さらにその形成メカニズムの数理モデルを考案した内容についてである(PLoS Comp. Biol, revised中)。昨年までに、唾液の細菌叢に概日リズムがあり、食事が与える影響が小さいことを発見していたが、新たに、食後30分前後に食事の内容や、個人によらず、Lautropia mirabilisの相対存在比が増加することを発見した。また、Lautropia以外にも、食事中や、食事直後に食事の内容等に応じて増加する細菌群を同定した。これらの内容を、11月にアメリカ・ヒューストンで行われたHuman Microbiome Congressでポスターにまとめ、発表を行い、その原因について情報交換を行った。現在、原因の探求についての追加実験の解析を行っており、今後論文として投稿する予定である。また、マウスの腸内細菌叢に対して抗生剤を単発投与する実験を行い、菌叢構造の入れ替わりは抗生剤濃度に応じて起こるものの、適量投与でも過剰量投与でも2週間程度で、水飲み投与のコントロール群と同等の水準まで回復し、その回復の速度にはある程度個体差があることを新たに発見した。今年度は、ヒト唾液菌叢の時系列データを実験で得て、そのメタゲノム解析を行い、菌叢と遺伝子機能に概日リズムがあることを発見した。また菌叢全体のおよそ半数が帰属する菌種の嫌気、好気性で挙動が分かれることについても明らかにした。
発がん防御における抗原提示細胞の機能に関する研究

皮膚に過剰の色素細胞を持つトランスジェニック(Mgf-Tg, Hgf-Tg)マウスを作成し、皮膚の抗原捕食と所属リンパ節への輸送の機構をメラニン顆粒を抗原として解析する実験系を開発した。このシステムを用いて、皮膚の自己抗原は所属リンパ節に輸送されていることを明らかにした。腫瘍細胞由来の抗原も同様の経路で輸送されていると考えられる。本年度の研究で、1)自己抗原は炎症等の刺激のない定常状態で、恒常的に輸送されていること、2)CCL19/CCL21ケモカイン欠損マウスでは、この定常状態での輸送には異常がないことを示し、活性化状態と定常状態では異なる機構で抗原が輸送されていることを明らかにした。最近、定常状態の輸送が免疫寛容を維持しているとの報告もなされ、発がん抑制、腫瘍排除にとってこの定常状態の抗原輸送機構は重要であることが理解されてきた。皮膚にのみ色素細胞を増加させたTgマウスでは、末梢性の免疫寛容が成立していると考えられるが、本年度は、中枢性(胸腺内)免疫寛容が成立しているモデルマウスも作製した。エンドセリン3(Edn3-Tg)を皮膚と胸腺に発現させると皮膚のみならず、胸腺にも色素細胞が多数検出できた。この3系統のTgマウスでは、今のところまだメラノーマの自然発症は観察されていないが、今後も、自然発症の有無を観察するとともに、誘発実験も行い正常マウスとの差異を検討する。また、腫瘍を移植して、その拒絶反応が抑制されていることを検討するために、B16メラノーマ腫瘍細胞株を選択し、MGF, Edn3に反応性に増殖しないことを確認した。今後、B16を.Mgf-Tg, Edn3-Tgに移植し、B16細胞の増殖、転移、マウスの生存期間等を指標に自己寛容の腫瘍抵抗性における機能を検討できるシステムが完成した。
がん抑制因子miR-34aの細胞増殖制御機構と大腸発がん過程における役割

大腸がん細胞の増殖を強く抑制するmiR-34aが、どのようにしてがん細胞の増殖を抑制しているか明らかにした。がん細胞内でmiR-34aの量が増加すると、miR-34aがp53と呼ばれる分子を再度活性化して、細胞の増殖を停止させることを明らかにした。また、がん細胞の増殖抑制機能を持つマイクロRNAを効率よくスクリーニングする方法を樹立し、新たながん抑制因子miR-22を単離することに成功した。miRNAは、約22塩基からなるsmall non-coding RNAの一つである。miR-34aは、細胞傷害性ストレスに応答し、がん抑制因子p53によって転写活性化される。miR-34aをがん細胞へ導入すると、細胞老化様の表現型を伴った増殖停止を誘導し、細胞周期関連因子の発現抑制並びにp53の活性化を引き起こす。本年度は、miR-34aによるp53活性化の分子機構の解析を行った。miR-34aによりp53の活性化に重要な382番目のリジン残基(K382)のアセチル化が亢進し、アセチル化体p53が核内へ蓄積することを見出した。また、miR-34aの標的mRNAとして、ヒストン脱アセチル化酵素であり、p53K382のアセチル化を制御することが知られているSIRT1を同定した。miR-34aをがん細胞へ導入するとSIRT1の発現が抑制され、それに伴って、p53の転写活性化能の亢進が認められる、この現象は、細胞へSIRT1を発現させることによって、抑制されることが判明した。さらに、細胞内で、miR-34aとSIRT1 mRNAが相互作用していることを確認した。これらの結果から、miR-34aによるp53活性化の分子機構として、miR-34aによるSIRT1の発現抑制が関連していることが判明した(論文執筆中)。miRNAの標的mRNAを生化学的および分子生物学的に同定する方法の樹立を行っている。現在まで、miR-34aの標的mRNAを特異的に濃縮する方法を開発した。今後は、生物学的意義を有するmiRNAの標的mRNAを網羅的に開発する方法として改良し、応用することが必要である。がん抑制因子miR-34aによる細胞増殖制御機構について、分子レベルでの解明を行った。miR-34aは、p53で発現誘導されるとともに、p53を活性化する、いわゆるポジティブフィードバック制御が存在することを明らかにした。miR-34aは、p53の抑制因子であるSIRT1の発現を直接抑制できることを見出した。また、miR-34aの結合配列を欠失した、SIRT1を細胞へ発現させることで、miR-34aによるp53の活性化が抑制されることも分かった。この細胞内分子サーキットは、発がんストレスに暴露された細胞の内在性防御反応として極めて重要であることが判明した。同様に、ストレスにより発現誘導される新たながん抑制因子miRNAを同定した。miR-Xは、p53により発現調節されること、また、p21を直接抑制することにより、細胞周期停止から、アポトーシスへと細胞の表現型を誘導できる、細胞内分子スウィッチであることを分子レベルで明らかにした(論文投稿中)。興味深い事に、miR-Xはヒト大腸がん検体の70%以上で遺伝子の型アリル欠失を認め、発現が低下してることを明らかにした。この中には、p53遺伝子は、正常(欠失・突然変異なし)であるにも関わらず、miR-Xのみが、欠失・発現低下を示す症例が存在した。したがって、miR-Xは、大腸発がんにおいて、がん抑制遺伝子として機能していることが示唆された。このように、細胞が有する内在性がん抑制因子ネットワークを活性化するmiRNAを同定・解析することにより、新たに発がんと深く関連する細胞内ネットワークの同定が可能となる事を示した。miR-34は、がん抑制因子p53で発現制御されるがん抑制的miRNAである。miR-34aは、DNA傷害などのストレスに応答し、p53依存的に発現が亢進する。miR-34aの活性化は、E2FファミリーやCDK4の発現抑制を介して、細胞周期の停止・細胞老化を誘導する。また、miR-34aによるp53のポジティブフィードバック制御についても明らかにした。しかしながら、大腸がん臨床検体におけるmiR-34aの発現低下は、30%以下であり、他に強力ながん抑制因子miRNAの存在が示唆された。したがって、新たながん抑制的miRNA単離のため、miRNAウィルス発現ライブラリーとマイクロアレイ解析を組み合わせた機能スクリーニング法を開発した。その方法と、ゲノム網羅的解析を用いて、新たながん抑制遺伝子miR-22を単離した。miR-22は、強力な細胞増殖抑制機能を有しており、p53依存的アポトーシスを選択的に引き起こすことが可能である。生化学的手法を用いて、miR-22の標的とする分子の一つとして、p21を同定した。

事実、miR-22存在かでは、DNA傷害によりp53が活性化されても、p21の発現誘導は抑制されたままであることが判明した。また、miR-22存在下では、低用量の抗がん剤処理でがん細胞を効率よくp53依存的アポトーシスへ導けることを証明した。さらに、miR-22もp53によって、発現誘導されるが、その活性化は、アポトーシスが誘導されるストレスに限られていることを見出した。興味深いことに、miR-22遺伝子座は、70%以上の大腸がん検体において、片アリル欠損を示し、それに伴った発現低下が認められた。これらの結果から、miR-22は新規の大腸がん抑制遺伝子の候補であり、細胞がストレスに応答してアポトーシスを選択する際に、重要な役割を果たしていることを証明した。
リソゾ-ム酵素糖鎖リン酸化酵素の解析によるムコリピド-シスの病態解明に関する研究

ムコリピド-シスII型(Iーcell病)とIII型で欠損、あるいは活性の発現不全を示すリソゾ-ム酵素糖鎖リン酸化酵素、GlcNAcー1ーphosphotransferase(GNPT)は、正常組織ではその発現量が低いことや不安定であること、また、活性測定に用いるリン酸供与体([βー^<32>P]UDPーClcNAc)を合成しなければならないことなどから精製が遅れ、その蛋白化学的な解析は皆無であった。従って、II型やIII型の酵素学的な病態解析、あるいは本疾患における酵素の動態は不明である。本研究はこれらの問題を解決すべくGNPTを精製し、その蛋白化学的な追究を目的として、規定の年度内に以下の事柄を明らかにした。(平成2年度)1.GNPTはヒト白血病細胞や血清、あるいは肝癌組織で正常対照に比較して顕著に高活性を示し、酵素の精製源として癌組織が有効である事が明らかになった。実際に、ラット繊維肉腫細胞(KMTー17,北大で樹立では正常ラット肝に比べて20倍の高い非活性を示し、この腹水化細胞でも高活性を維持していたので、これを用いてGNPTのより簡便な精製法を検討している。本方法が成功すれば、ヌ-ドマウス移植ヒト癌組織に適用できる可能性がある(一部、平成3年度)。2.ラット肝より本酵素を高度(約30万倍)に精製し、それに対するポリクロ-ナル抗体を作製した(論文投稿準備中)。本抗体はしかし、ヒト組織のGNPTとは免疫学的に反応しなかった。(平成3年度)1.ラット肝を用いた本酵素の精製法をヒト肝に適用して本酵素の精製を試みたが、約1万倍の精製度(3回施行)に留まった。原因として、ヒト肝の新鮮標本あるいは不凍結組織を得ることが困難であることが挙げられる。2.GNPTはUDPーGlcNAcとマンナンを基質とするが、[βー^<32>P]UDPーGlcNH_2とマンナンのアジ化サリチル酸の誘導体を用いて、光親和標識法によるGNPTの検出法を確立している。これに依って上記病態の本酵素を解析している。ムコリピド-シス(ML)IIとIII型の病態の分子機構を解明するために、その欠損酵素である糖鎖リン酸化酵素をヒト組織から精製してその蛋白化学的解析を行っている。本年度は以下の事を行った。1)UDPーGlcNAc:リソゾ-ム酵素GlcNAcー1リン酸転移酵素の精製ラット肝より本酵素を精製する場合、ゴルジ膜を分離して可溶化後DEAEイオン交換、UDPーグルクロン酸セファロ-ス、アビジンーセファロ-ス、ゲル濾過のクロマトグラフィ-を用いて回収率5%、約3万倍に純化することが出来る。本方法をヒト肝に応用したところ、回収率0.5%で約1万倍の精製度であった。この低精製度の原因として、ヒト肝は剖検以外では得られないことから量的に制約を受けること、凍結組織はゴルジ膜の分画に低収率を招くこと、あるいは本酵素の不安定性などが考えられる。ヒト肝より部分精製した標品を用いてモノクロ-ナル抗体を作製中である。スクリ-ニングは酵素活性の沈降法で検索している。

同様に、ラット肝より高度に精製した標品に付いてもモノクロ-ナル抗体を作製している。これは、ヒトとラットで本酵素の活性部位が共通である事が予想され、従ってラットに対する抗体がヒトの抗原(酵素)の認識に使用できる可能性があるからである。MLーIIとIII型における酵素活性と蛋白量の相関に付いては、抗体が未作製のため蛋白量の分析は未達成であるが、MLの繊維芽細胞及び組織(脳、肝、腎)の活性測定は既に達成している。2)培養細胞を用いた本酵素の寿命や代謝回転速度の追究は抗体の作製の後達成される。ムコリピド-シスII型(IーceII病)とIII型で欠損、あるいは活性発現不全を示すリソゾ-ム酵素糖鎖リン酸化酵素、GlcNAcー1ーphosphotransferase(GNPT)は、正常組織(おもに肝臓)ではその発現量が低いことや不安定であること、また、活性測定に用いるリン酸化糖供与体([βー^<32>P]UDPーGlcNAc)を合成しなければならないことなどから精製が遅れ、蛋白化学的な解析は皆無であった。従って、II型やIII型の酵素学的な病態解析、あるいは本疾患における酵素の動態は不明であることから、本疾患の解析が他の代謝病と比較して最も遅れている。本研究は規定の年度内に以下の事柄を明らかにした。1.ラット肝より本酵素を高度(約30万倍)に精製し、それに対するポリクロ-ナル抗体を作製した(論文投稿準備中)。本抗体はしかし、ヒト肝その他のヒト組織のGNPTとは免疫学的に反応しなかった。2.ラット肝を用いた本酵素の精製法(肝ゴルジ膜→イオン交換クロマト→UDPーガラクツロン酸セファロ-ス→アビジンセファロ-ス→ゲル濾過→ブル-セファロ-ス)をヒト肝に適用して本酵素の精製を試みたが、約1万倍の精製度(3回)に留まった。原因として、ヒト肝の新鮮標本あるいは不凍結組織を得ることが困難であることが挙げられる。凍結組織からゴルジ膜を高収率で得ることは困難であり、凍結合組織を用いた精製法を改良する必要がある。かつ、より効果的なアフィニティ-クロマトを検討する必要がある。3.ラット繊維肉腫細胞(KMTー17,北大で樹立)では正常ラット肝に比べて20倍の高い非活性を示した。この細胞を腹水化しても高活性を維持していたので、この腹水細胞を用いてGNPTのより簡便な精製法を検討している。本方法が成功すれば、ヒト繊維肉腫細胞あるいはヌ-ドマウスで増殖させた組織に適用できる可能性がある。GNPTはヒト白血病細胞や血清、あるいは肝癌組織で顕著に高活性を示すので、酵素の精製源として癌組織が有効である事が明らかになった。
ヒト肝P-450の酵母内発現とそのカクテルによる肝薬物代謝の予測法の開発

本研究においては先ずヒト肝における主要なチトクロームP450であるCYP3Aをクローニングし、さらに既発表のCYP2Cと同様な手法によりさらにヒトNADPH-チトクロームP450還元酵素およびヒトチトクロームb_5を酵母内で個別に発現させた。一方、複数の発現プラスミドが同一酵母内に導入できるように発現ベクターの改良を行い、異種タンパクを同一酵母内に共発現させることが可能となった。今後、選択マーカー遺伝子を次々に変換することにより、多数のチトクロームP450分子種を同一酵母内に発現できるものと考えている。培養条件等の改良により酵母内で生産されるチトクロームP450量を増大させる試みについては、酵母菌株を改良することにより発現した単位タンパクあたりのヘムを含むホロタンパクの含有率を上げることに成功した。しかし全体の発現タンパクの収率を低下させる結果を招いた。この収率の低下を防ぐために、現在改良された酵母菌株に敵した培養条件の検討を行っている。また研究期間内に多くのチトクロームP450を発現させ、それらを用いる酵母カクテルを作り、ヒト肝における薬物代謝をシュミレーションする段階にまでは到らなかった。本研究の最終的な目的を達成させるにはまだ多くの課題を克服しなければならないが、本研究で得られた成果から、ヒトチトクロームP450のカクテルの作成への展望が得られ、医薬品や化学物質のヒトにおける代謝や毒性を研究する上での貴重な材料となるものと考えられる。異種細胞にヒトチトクロ-ムP450を生産しようとする場合、ヘムを抱合するホロタンパクとして発現する必要がある。酵母にチトクロ-ムP450を導入するとヘムを含まないアポタンパクが多く生成する。そこでP-450human-2cDNAを用いて発現の改良を試みた。ヘミンの添加、酵母菌株の修飾、培養条件の変更等を試み、菌株NT8-1よりp゚菌株を作成しこれを宿主に用いることにより、ヘムの含有率向上を目指している。NADPH-cyt.P450還元酵素、cyt.b_5との共発現による活性の向上についてはNADPH-cyt.P450還元酵素cDNAを得てプラズミドに組み込み、現在既に作成したcyt.b_5プラズミドと共にCOS-1細胞に導入して共発現による各cDNA由来タンパクの発現への影響を検討している。複数のP450分子種を発現し至適導入比率条件を検討している。酵母発現P450human-2を用いてこのヒトP450の基質特異性を検討し、新たにフェニトインやシクロホスファミドの代謝活性を持つことが明らかとなった。ヒト肝には薬物代謝に関与する数多くのP450が含まれている、現在CYP3A4のcDNAについて発現用のプラズミドを作成している。またCYP2D酵素遺伝子の単離を行なうためにヒト肝cDNAライブラリ-よりスクリ-ニングを行なっている。前年度に引き続きヒト肝cDNAライブラリーのスクリーニングを行い、その結果ヒトチトクロームP450(CYP)2D6cDNAに対応する数個のクローンが得られ現在その解析を進めている。また単離されたヒトCYP3A4cDNA、ヒトチトクロームb_5cDNAおよびヒトNADPH-チトクロームP450還元酵素cDNAをガラクトース代謝系構造遺伝子GAL7プロモーターとターミネーターを持つ発現ベクターpAA7に挿入するための組換えDNA実験を行った。各々のタンパクをコードするcDNAのうち翻訳領域の全長を含むDNA断片を発現ベクターpAA7のGAL7プロモーターとターミネーターの間に挿入して発現プラスミドを構築した。酵母菌株MT8-1を各々別個に3種の発現プラスミドpTY3A4(CYP3A4cDNA)、pTYHB5(ヒトチトクロームb_5cDNA)、pTYHR450(ヒトNADPH-チトクロームP450還元酵素cDNA)を用いて形質転換し、タンパク生産性酵母MT8-1[pTY3A4]、MT8-1[pTYHB5]およびMT8-1[pTYHR450]を得た。

これらの形質転換酵母を合成培地SGlyLac中で培養し、菌数が前期対数増殖期に達した時点でD-ガラクトースを培地中の添加してタンパクを誘導発現させた。菌体を破砕した後、遠心して破砕画分を除きその上清画分を調製した。ラットの3種の精製タンパクに対する抗血清を用いてウェスタンブロッテイングを行ったところ、抗体に反応するバンドが検出され、各々のcDNAに対応するタンパクの発現が認められた。また同一酵母菌内に複数のタンパクを同時に発現させることを目的として発現ベクターの改良を行った。発現ベクターpAA7よりGAL7のプロモーターとターミネーターを含むDNA断片を単離し、これを選択マーカーがTRP1遺伝子であるシャトルベクターpTV3に移して発現プラスミドpYN800を構築した。発現ベクターの選択マーカー遺伝子がURA3からTRP1に変換されたことによりpAA7由来およびpYN800由来の発現プラスミドが同一酵母内に導入することができ、異種タンパクの酵母内に共発現することが可能になった。
がん浸潤・転移におけるメカノトランスダクションーTRPV2チャネルによる制御機構

機械刺激によりTRPV2チャネルが機械刺激の局所に集積することを新規に見いだした。このことは「細胞膜上に固定されているカルシウムチャネルが、機械刺激にともなって開口しCa2+の流入が生じる」とする従来のモデルとは全く異なる機構であり、チャネル分子自体が機械刺激で細胞表面にトランスロケーションするという、『新規の細胞内カルシウム調節によるメカノトランスダクション制御機構である』。さらにこのTRPV2トランスロケーションがGd3+により抑制されること。ビンキュリンの持続的活性化にはTRPV2のトランスロケーションが重要であり、機械刺激でのアクチンのリモデリングに関与していることがわかった。細胞膜直下の細胞内カルシウム動態を測定する高感度Ca2+センサー・FRETプローブを作製した。ヒトがん(肉腫)細胞に高感度Ca2+FRETプローブを発現させ、機械刺激に伴い細胞内Ca2+が上昇し、また、機械刺激が負荷されている間は断続的にCa2+上昇が繰り返して生じる。さらに、この時の機械刺激部位にTRPV2分子が集積(トランスロケーション)する。このことは、TRPV2が新規の機械受容Ca2+チャネルとしてユニークな調節を受けていることを示している。外界の物理的・力学的な変化を受容し細胞内で生化学的シグナルに変換する機構(メカノトランスダクション)は、細胞膜と細胞骨格間で機能する分子群(メカノセンサー)で構成されている。これまでの検討から、1TRPV2チャネルが細胞膜の機械刺激部位にトランスロケーションするメカノセンサーの一つであること。さらに、2メカノセンサーとして機能するザイキシンも、機械刺激により刺激部に集積すること。また、3細胞接着斑構成分子のビンキュリンの立体構造変化を可視化するプローブで、機械刺激を負荷すると断続的に生じる細胞内Ca2+上昇に続いて、ビンキュリンの立体構造変化が生じることなどを見いだしてきた。このように、機械受容Ca2+チャネルであるTRPV2によるCa2+上昇により接着斑の構造変化が生じる機序があることが判明した。しかし、この他にどのようなメカノセンサー分子が機能し、どのようにしてシグナルが伝達され、最終的に細胞運動につながるかの詳細は不明である。そこで、細胞骨格・接着斑構成分子・細胞伸展関連分子などを可視化するプローブを作製してそれらの動態を明らかにし、メカノトランスダクション機構を現在解析している。高感度に細胞内Ca2+をモニターするプローブを作製し、さらに物理的刺激・伸展刺激を可視化するプローブを作製して、機械刺激にともなう機械刺激部を起点とするカルシウムウェーブと特徴あるカルシウムシグナル、それに伴うシグナル伝達機構、さらにTRPV2トランスロケーション、細胞接着構造のダイナミックな変化をモニターできている。またTPV2のノックアウト・マウスの作製も経過の遅延はあるが順調に進んでいる。細胞内カルシウム動態を測定する数種類の高感度Ca2+センサー・FRETプローブを作製した。ヒトがん(肉腫)細胞にこのプローブを発現させて検討すると、機械刺激に伴い細胞内Ca2+が上昇し、また、機械刺激が負荷されている間は断続的にCa2+上昇が繰り返して生じる。外界の物理的・力学的な変化を受容しその刺激を細胞内で生化学的シグナルに変換する機構(メカノトランスダクション)は、細胞膜と細胞骨格間で機能する分子群(メカノセンサー)で制御されている。申請者はこれまで、1TRPV2チャネルが細胞膜の機械刺激部位にトランスロケーションするメカノセンサーの一つであること。2メカノセンサーとして機能するザイキシンも、機械刺激により刺激部に集積すること。さらに4機械刺激後の早期における新規の細胞内シグナルを見いだした。このように、機械受容Ca2+チャネルであるTRPV2によるCa2+上昇のシグナル機構には、機械刺激の早期のシグナル機構とその後に生じる後期の2つの異なる機構があることが判明した。この他にどのようなメカノセンサー分子が機能し、どのようにしてシグナルが伝達され、最終的に細胞運動につながるのかを細胞骨格・接着斑構成分子・細胞伸展関連分子などを可視化するプローブを作製してそれらの動態を明らかにし、メカノトランスダクション機構の解析をすすめる。高感度に細胞内Ca2+をモニターするプローブを作製し、さらに物理的刺激・伸展刺激を可視化するプローブを作製して、機械刺激にともなう機械刺激部を起点とするカルシウムウェーブと特徴あるカルシウムシグナル、それに伴うシグナル伝達機構、さらにTRPV2トランスロケーション、細胞接着構造のダイナミックな変化の解析を進めている。またTRPV2のノックアウト・マウスの作製も経過の遅延はあるが順調に進んでおり、作製したTRPV2のノックアウト・マウスを共同研究として供与もしている。細胞伸展シグナルにおける細胞内カルシウムシグナルを高感度Ca2+センサー・プローブで、さらにそれと関連するシグナルをヒトがん(肉腫)細胞をモデルと検討した。機械刺激に伴い細胞内Ca2+が上昇し、また、機械刺激が負荷されている間は断続的にCa2+上昇が繰り返して生じる。さらに、この時の機械刺激部位にカルシウムチャネルTRPV2分子が集積(トランスロケーション)する。TRPV2が新規の機械受容Ca2+チャネルとしてユニークな調節を受けていることを見出した。

外界の物理的・力学的な変化を受容しその刺激を細胞内で生化学的シグナルに変換する機構(メカノトランスダクション)は、細胞膜と細胞骨格間で機能する分子群(メカノセンサー)で制御されている。(1)TRPV2チャネルが細胞膜の機械刺激部位にトランスロケーションするメカノセンサーの一つであること。(2)メカノセンサーとして機能するザイキシンも、機械刺激により刺激部に集積すること。また、(3)細胞接着斑構成分子のビンキュリンの立体構造変化を可視化するプローブで、機械刺激を負荷すると断続的に生じる細胞内Ca2+上昇に続いて、ビンキュリンの立体構造変化が生じること。(4)機械刺激後の早期にはPKCの活性化、DGKの活性化が生じることを見いだした。このように、細胞伸展シグナルでは、物理的刺激部位には、シグナルのプラットホームとして細胞内シグナルを惹起する新規の受容機構があることが判明した。その中で、Ca2+チャネルであるTRPV2によるCa2+上昇のシグナル機構には、機械刺激の早期のシグナル機構とその後に生じる後期の2つの異なる機構があることが示唆された。メカノセンサー分子が機械刺激部位で機能しシグナルが伝達する事により、最終的に細胞運動・がん細胞の転移機構につながるの新規のメカノトランスダクション機構の一部が明らかになった。機械刺激によりTRPV2チャネルが機械刺激の局所に集積することを新規に見いだした。このことは「細胞膜上に固定されているカルシウムチャネルが、機械刺激にともなって開口しCa2+の流入が生じる」とする従来のモデルとは全く異なる機構であり、チャネル分子自体が機械刺激で細胞表面にトランスロケーションするという、『新規の細胞内カルシウム調節によるメカノトランスダクション制御機構である』。さらにこのTRPV2トランスロケーションがGd3+により抑制されること。ビンキュリンの持続的活性化にはTRPV2のトランスロケーションが重要であり、機械刺激でのアクチンのリモデリングに関与していることがわかった。さまざまな物理刺激・化学刺激におけるメカノトランスダクション機構との関連性の検討:機械刺激以外の物理・化学刺激にがん細胞がどのように反応して、細胞内Ca2+が変化するかは不明である。申請者はこれまでTRPV2チャネルが機械刺激だけでなく、増殖因子刺激・ケモカイン刺激でもトランスロケーションして活性化することを報告してきた。さらにTRPV2は52°Cの温度刺激でも活性化されると報告されている。そこで、細胞に浸透圧刺激、圧刺激などの物理刺激、酸・アルカリなどの化学刺激、一酸化窒素、過酸化水素などのガス刺激、温度刺激(細胞外の温度を25°Cから60°C)などを負荷して、TRPV2チャネルの局在変化、細胞内Ca2+変化、その際のメカノセンサー分子群の変化を検討する。これより、さまざまな物理・化学刺激におけるメカノセンサー分子群の役割を評価する。
高選択的不斉水素化反応のための不均一系触媒の設計

1.シンコニジン修飾Pd触媒による(E)-α-フェニルけい皮酸の不斉水素化反応(1)各種担持Pd触媒の活性・選択性に対する,触媒調製条件,予備還元の影響,担体効果を調べ,200°C付近で予備還元したPd/TiO_2が最も有効であることを見いだした.(2)触媒上の反応基質および修飾剤の吸着量に対する担体の影響が大きいこと,適度の表面積と適当な量の酸点および塩基点を持つ担体が有効であることを示した.(3)CO吸着により測定したPd分散度と不斉選択性の間の関係および触媒表面の残存塩素の影響を示唆するデータが得られた.(4)極性溶媒の方がよいこと,水素圧や基質濃度は小さい方がよいことなど,Ptーシンコナアルカロイド系触媒によるα-ケトエステルの不斉水素化反応の場合とは異なる傾向を示すことを明かにした.(5)以上の知見に基づいて設計した5%Pd/TiO_2触媒を用いる反応系で,固体触媒によるアルケンの不斉水素化反応としては世界最高の光学収率(72%e.e.)を得た.2.反応機構の検討(1)異なる修飾剤濃度下で光学収率の経時変化を調べ,Pd上の反応基質と修飾剤の吸着平衡が重要であることを示した.(2)上記の結果や反応条件依存性に基づく速度論的な反応機構の考察および基質や修飾剤の構造の影響の検討により,今後,不斉発現のメカニズムを追求する予定である.1.シンコニジン修飾Pd触媒による(E)-α-フェニルけい皮酸の不斉水素化反応(1)各種担持Pd触媒の活性・選択性に対する,触媒調製条件,予備還元の影響,担体効果を調べ,200°C付近で予備還元したPd/TiO_2が最も有効であることを見いだした.(2)触媒上の反応基質および修飾剤の吸着量に対する担体の影響が大きいこと,適度の表面積と適当な量の酸点および塩基点を持つ担体が有効であることを示した.(3)CO吸着により測定したPd分散度と不斉選択性の間の関係および触媒表面の残存塩素の影響を示唆するデータが得られた.(4)極性溶媒の方がよいこと,水素圧や基質濃度は小さい方がよいことなど,Ptーシンコナアルカロイド系触媒によるα-ケトエステルの不斉水素化反応の場合とは異なる傾向を示すことを明かにした.(5)以上の知見に基づいて設計した5%Pd/TiO_2触媒を用いる反応系で,固体触媒によるアルケンの不斉水素化反応としては世界最高の光学収率(72%e.e.)を得た.2.反応機構の検討(1)異なる修飾剤濃度下で光学収率の経時変化を調べ,Pd上の反応基質と修飾剤の吸着平衡が重要であることを示した.(2)上記の結果や反応条件依存性に基づく速度論的な反応機構の考察および基質や修飾剤の構造の影響の検討により,今後,不斉発現のメカニズムを追求する予定である.1.シンコニジン修飾Pd触媒による(E)-α-フェニルけい皮酸の不斉水素化反応(1)アルミナ,シリカ,チタニア,ジルコニア,および,活性炭に担持したPd触媒について,最適条件下で活性・選択性を比較した.その結果,200°Cで1h還元したPd/TiO_2が最も有効であることがわかった.(2)担体の構造,不純物含有量,調製条件などの異なるPd/CおよびPd/TiO_2触媒の選択性を比較した結果,触媒中に残存する塩素は反応活性に影響するが,残存塩素量と選択性とは必ずしも相関関係をもたないこと,また,担体の表面積は大きくない方がよいことがわかった.(3)担体の性質により溶媒効果の水の添加効果において若干の相違がみられた.(4)触媒前処理条件および反応条件の最適化により,生成物の光学収率が,Pd/CについてはPerezらの報告の30%から49%に,Pd/TiO_2については53%から58%にそれぞれ向上した.(5)本研究の補助金による施光度検出器の導入により,上記の光学収率はe.e.として表すと2-5%向上し、最高値は70%に達することがわかった。2.反応機構の検討反応基質および修飾剤の各種担体上の吸着量を測定したところ,担体による差が極めて大きいことがわかった.今後,触媒上の吸着量と吸着の強さの測定および溶媒効果との関連をさらに詳しく調べることにより,不斉発現のメカニズムを考察する計画である.また,反応条件の影響や反応の経時変化に基いて速度論的に検討中である.1.シンコニジン修飾Pd触媒のエナンチオ選択性に対する担体効果(1)アルミナ,シリカ,チタニア,ジルコニア,および,活性炭に担持したPd触媒について,(E)-α-フェニルけい皮酸の不斉水素化活性・選択性を比較した結果,特に200°C付近で予備還元した場合に選択性が著しく向上すると共に,明らかな担体効果が観測されることがわかった.(2)各触媒上の反応物質および修飾剤の吸着量は用いた担体により強く影響されること,また,それらの吸着量と活性・選択性の間に相関関係があることがわかった.(3)適度の表面積と相当な量の酸点および塩基点を持つ担体が有効であることがわかった.2.触媒表面のキャラクタリゼーション結果と不斉選択性の関係

(1)CO吸着により測定したPd分散度と不斉選択性の間の関係を示唆するデータが得られたが,この点についてはさらにデータを加えて検討する必要がある.(2)異なるメーカーのPd/C触媒の比較により触媒表面の残存塩素の影響が示唆された.(3)担体の細孔内におけるPd粒子の分布状態の影響について今後の検討を要する.3.反応機構の検討(1)修飾剤の濃度が高い場合と低い場合について選択性の経時変化を調べ,Pd上の修飾剤の吸着は比較的弱く,反応物質と修飾剤の吸着平衡が重要であることを示した.(2)上記の結果や反応条件の影響に基づいて速度論的に反応機構を検討中である.
カーボンナノチューブの構造に着目した曲率を有する低次元材料の格子欠陥挙動の解明

曲率を有する低次元材料の格子欠陥挙動を研究する目的で、カーボンナノチューブ(CNTs)を用いた原子レベルの計算を行った。Stone-Wales(SW)欠陥から分解してできるPentagon-Heptagon(5-7)欠陥対の解析を通じて、欠陥構造の安定性、運動に対するエネルギー障壁を調べ、材料創成の新プロセスや新機能発現に結びつく基礎的知見を得ることを目的とした。CNTsの5-7欠陥対の安定性や配置間の最小エネルギー経路を考察した。その結果、SW欠陥および5-7欠陥対の局所安定配置とそのエネルギーを評価した。理論結果は、欠陥構造の配置を設計法に対する役に立つ情報を与えてくれると期待できる。本研究は、二次元材料としてのカーボンナノチューブ(Carbon nanotube; CNT)の円筒形状に特有の周方向の周期性と曲率に着目し、グラフェンシート(Graphene Sheet; GS)との比較により、曲率を有する低次元材料の格子欠陥理論の構築に向けた基礎的研究を行う。具体的には、Stone-Wales(SW)欠陥から分解してできるPentagon-Heptagon(5-7)欠陥対の解析を通じて、欠陥構造の安定性、運動に対するエネルギー障壁を調べ、原子モデルを用いた基礎的解析とシェル理論に基づく連続体モデルを用いて、曲面上の格子欠陥論を構築し、材料創成の新プロセスや新機能発現に結びつく基礎的知見を得ることを目的とする。平成26年度は、CNTの展開平面であるGSを用いて、CNTの欠陥の基礎的な知見を得た。具体的には、二次元格子欠陥古典弾性論に基づく格子欠陥理論による基礎的な検討を行った。その中で、5-7欠陥対を転位対(dislocation dipole)とみなして、連続体力学モデルを構築し、格子欠陥に働く力、安定性につい論じた。さらに、外力が作用する場合に、構造変化のための限界値の定量的な評価を行い、局所安定点の数の変化などを考察した。さらに、相対変位と相互作用力の関係方程式を元に、Zigzag型のCNTのせん断力が作用下における原子の相対変位を解析し、構造とエネルギー障壁の定量的な評価を行った。二次元材料としてのカーボンナノチューブ(Carbon nanotube; CNT)の円筒形状に特有の周方向の周期性と曲率に着目し、グラフェンシート(Graphene Sheet; GS)との比較により、曲率を有する低次元材料の格子欠陥理論の構築に向けた基礎的研究を行う。平成27年度は、格子欠陥モデルを用いて欠陥の力学挙動を考察し、具体的、相対変位によるエネルギーを表現し、格子力学(Peierls-Nabarro)モデルを用いて、CNTの5-7欠陥対の相互作用及び最小エネルギー経路を定量的に評価する研究を実施した。その結果、SW欠陥、および、それが分離して生成された5-7欠陥対の局所安定配置とそのエネルギーを評価することに成功した。さらに、得られた隣接するエネルギー極小配置に対して、Nudged Elastic Band法(NEB法)を用いて最小エネルギー経路を求め、平均相対変位の関数として表現した総エネルギーの地形を得ることに成功した。このような配置の変化は、移動、生成、消滅の過程に分類され、グラフ理論により整理されることが明らかとなった。格子欠陥モデルを用いて欠陥の力学挙動を考察し、具体的、相対変位によるエネルギーを表現し、格子力学(Peierls-Nabarro)モデルを用いて、CNTの5-7欠陥対の相互作用及び最小エネルギー経路を定量的に評価する研究を実施した。研究成果は、掲載論文2報、投稿論文1報、国際会議発表3件と国内学会発表3件が公表するなど研究は当初の計画以上に進展している。

さらに、CNTの構造におけるエネルギー変化に注目し,格子欠陥を含むCNTのモデルを作成し,分子動力学法によるシミュレーションによってミクロな原子構造のエネルギーが最小となる配置を求め,CNTのカイラリティや長さ,格子欠陥の入れ方によるエネルギーの変化を背成功に考察した.曲率を有する低次元材料の格子欠陥挙動を研究する目的で、カーボンナノチューブ(CNTs)を用いた原子レベルの計算を行った。Stone-Wales(SW)欠陥から分解してできるPentagon-Heptagon(5-7)欠陥対の解析を通じて、欠陥構造の安定性、運動に対するエネルギー障壁を調べ、材料創成の新プロセスや新機能発現に結びつく基礎的知見を得ることを目的とした。CNTsの5-7欠陥対の安定性や配置間の最小エネルギー経路を考察した。その結果、SW欠陥および5-7欠陥対の局所安定配置とそのエネルギーを評価した。理論結果は、欠陥構造の配置を設計法に対する役に立つ情報を与えてくれると期待できる。平成26年11月の第一子出産の前後約三ケ月休暇をとり、文献読解などの時間に充当したため、当初の計画と一部順序を変更したものの、外力が作用するCNTの格子欠陥の安定性について、新規な研究成果が得られ、3件の学会発表が公表するなど研究はおおむね順調に進展している。上記の休暇に伴い研究期間の延長を申し出て、許可されており、研究計画の一部順序変更分についても速やかに実施できる準備が整っている。さまざまなカイラリティのCNTに対して、転位にはたらく力(Peach-Koehler力)を自由行程上の運動座標の関数として評価し、H26年とH27年に実施したGSの解析と比較し、曲率の有無による結果の違いを調べる。さらに、通常の弾性論を基礎とした転位論を、シェル理論に基づく曲面弾性論を基礎とした転位論に発展させた新理論を定式化する。提案した連続体力学モデルを用いた解析と原子モデルの解析を比較し、理論を検証する。CNTの格子欠陥挙動の曲率依存性の結果および異なる層の格子欠陥同士の相互作用について、得られた結果を取りまとめ、成果の発表を行う。ナノ力学【平成27年度】まず平成26年度に実施した理論解析による検討により得られた知見を、二次元弾性体の転位論に基づく連続体モデルおよび原子モデルの解析結果と比較する。次は元の予定でGS(“曲率のない"CNT展開面)の結果をふまえて、“曲率を有する"CNT上の解析を行う。【平成28年度】まずはさまざまなカイラリティのCNTに対して、転位にはたらく力(Peach-Koehler力)を自由行程上の運動座標の関数として評価し、平成26年度と平成27年度に実施したGSの解析と比較し、曲率の有無による結果の違いを考察する。次はナノコーンは回位(disclination)に起因する低次元材料の面外変形構造とみなすことができて、層間にファンデルワールス力を考えた多層CNTモデルを作成する。
離散凸解析の横断的研究

諸分野における共通の方法論としての離散凸解析を発展させるべく,以下の成果を得た.集合関数のM#(natural)凸性は,共役関数の劣モジュラ性と同値であることが知られているが,その証明はいくつかの命題を積み重ねた形となっている.本研究では,この事実に対する直接的な別証明を与えた.この証明は離散凸解析の専門家でない広い分野の研究者にも理解される形であり,離散凸解析の諸分野への浸透に寄与するものである.整凸関数の近接定理や最小化アルゴリズムが昨年度までの研究で解明され,整凸関数の概念が離散凸解析において基本的な役割を果たすという認識が強まった.そこで,共役性に関わる整凸関数の性質を探求した結果,整数値整凸関数が整数劣勾配を有し,その結果として,双共役関数が自分自身に一致するという基本的な事実が判明した.このことは,長らく専門家の間で漠然と想定されていた事柄を覆す発見である.さらに,整数劣勾配が存在することを利用して,整凸関数に対するDC(差凸)計画の枠組みを構築した.離散凸関数に対する射影,制限,合成積,変数置換などの基本演算について,性質が明らかになっていなかったものを網羅的に解明した.その結果,マルチモジュラ関数,整凸関数,離散中点凸関数を含む離散凸関数の主なクラスについて,その基本演算の可否を一覧表の形に整理することができた.オペレーションズ・リサーチの分野で離散凸解析の応用が盛んであるが,その文脈で最近米国で行われたバイクシェアリング問題の研究について,その数理的な本質がM凸関数のL1ノルム制約付き最小化として理解されうることを指摘し,この一般的な枠組みに対して,最適性条件を与え,最適化アルゴリズムを構築した.また,離散凸解析の在庫管理への応用の最初の論文(Lu-Song, 2005)の議論に不備があることを指摘して,その解決策を示した.本研究は,離散凸解析を工学・数学・社会科学など諸分野における共通の方法論として確立する試みであり,離散凸解析の理論と応用を,(1)連続・離散軸,(2)凸・非凸軸,(3)分野横断軸,の3つの観点から整理することによって,個々の数理的技法や応用諸問題の相互関係を明確にし,「数理手法の開発」,「応用の開拓」,「ソフトウェアの整備」の3つの面で新たな展開を図ってきた.具体的には,以下の通り研究を推進し,研究成果を発表し,いずれもおおむね順調に進展している.「数理手法の開発」に関しては,M凸関数について多重交換公理や共役関数の劣モジュラ性との同値性などの性質を明らかにするとともに,整凸関数やマルチモジュラ関数を含む各種の離散凸関数の基本演算,共役性,近接定理をほぼ完全に解明した.さらに,海外との研究協力の結果,離散資源の公平な配分に離散凸解析が有効であることが判明し,その理論を構築しつつある.研究成果の多くは学会や論文誌で発表済みである.「応用の開拓」に関しては,オペレーションズ・リサーチにおける在庫問題やバイクシェアリング問題,経済学・ゲーム理論におけるオークション理論などを離散凸解析の立場から整理し,計算機科学における値付き制約充足問題(VCSP)やオンラインアルゴリズムへの新たな応用を見出した.以上の成果の多くは学会や論文誌で発表済みである.「ソフトウェアの整備」については,継続的に,離散凸関数の応用に関するデモンストレーションと参考資料を整備してWeb上に公開してきた.以上のように,進捗はほぼ予定通りで,研究は順調に進展したと言える.「数理手法の開発」については,離散資源の公平配分問題の理論構築を海外研究者との共同研究として遂行する.また,昨年度に解明された整凸関数やマルチモジュラ関数の性質がアルゴリズム設計に利用できるかを探求する.「応用の開拓」については,オペレーションズ・リサーチにおける在庫問題と配置問題への応用を中心とし,グラフ上のマッチング問題における離散凸性の研究を継続する.「ソフトウェアの整備」については,引き続き,離散凸関数の応用に関する様々なソフトウェアとデモンストレーションをWeb上に整備する.この研究の遂行のために,以下の方々に協力研究者をお願いする予定である.田村明久氏(慶應義塾大学)にはゲーム理論における離散凸性について,岩田覚氏(東京大学)にはアルゴリズム設計について,塩浦昭義氏(東京工業大学)にはオペレーションズ・リサーチへの展開について協力をお願いする.森口聡子氏(首都大学東京)には整凸関数について,平井広志氏(東京大学)には離散凸概念の一般化について,小林佑輔氏(京都大学)と高澤兼二郎氏(法政大学)には,グラフ問題の離散凸性について協力をお願いする.土村展之氏(関西学院大学)と澄田範奈氏(首都大学東京)にはアルゴリズムの開発とソフトウェアの実現について協力をお願いする.離散凸解析を工学・数学・社会科学など諸分野における共通の方法論として確立すべく,今年度は以下の成果を得た.離散凸解析の枠組みを利用して,DC計画問題(2つの凸関数の差で表される関数を最小化する問題)の離散版の理論を構築した.L凸関数とM凸関数が離散版の「双共役性」と「劣勾配」を持つことに着目して,Toland-Singer双対定理などを見出すとともに,DCアルゴリズムを提案した.さらに,凸拡張可能な離散関数に対して,lin-vex拡張と称する特別な形の凸拡張を用いた連続緩和を用いれば整数性ギャップを回避できることを示し,これに基づくアルゴリズムを開発した.費用制約の下での粗代替性をもつ効用関数の最大化を扱った.