hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自己意識における時間性

現象的自己と物語論的自己の具体的なあり方とその神経基盤の解明を目標として掲げたが、現象的自己については、現在自己と将来自己の連続性がどのような要因によって左右されるか、時間経験と知覚がどう関係するか、知覚がどんな多層性と能動性をもつか、意識の共時的な統一性とはどのようなものか、といった点について研究を行い、まずまずの成果が得られた。また、物語論的自己については、心的時間旅行において過去自己の表象と将来自己の表象がエピソード記憶と意味記憶のそれぞれからどんな影響を受けるか、自己は存在論的にどう位置づけられるか、時間経験を表現する論理体系はどのようなものになるか、物語論的自己がどのようにして眺望的自己を媒介にして成立するか、意識の通時的な統一性とはどのようなものか、といった点について研究を行い、まずまずの成果が得られた。現象的自己と物語論的自己の神経基盤については、まだ十分な研究成果が得られず、神経基盤の観点から現象的自己と物語論的自己のあり方を見直すことが十分にはできなかったが、全体として当初予定した研究をおおむね遂行することができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。現象的自己と物語論的自己の脳内表象についてさらに研究を進めるとともに、自己制御の時間的本質を明らかにするという課題に取り組む。自己制御には共時的側面と通時的側面がある。共時的な自己制御は、いま現在、何をするのが最善かを適切に判断し、その判断に従って最善と思われることを実際に行うように自己を律することである。そのためには、いま現在の自己である現象的自己の統一が必要である。この統合が成立しないと、自己は葛藤に陥ったままとなり、深刻な場合には、分裂の様相を呈する。このような基本的な考えのもとに、共時的な自己制御を実現する現象的自己の統一がどのようなものであるかを明らかにする。また、自己制御には、共時的な側面だけではなく、通時的な側面も不可欠である。いま現在、最善だと判断することと、長期的な展望のもとで最善だと判断することは必ずしも一致しないが、自己制御にはこのふたつの判断を一致させるような通時的な自己制御が必要である。そのためには、過去から未来へと心的時間旅行を行いつつ、自己の経験を一つの一貫した物語として捉える物語論的自己が構築されなければならない。現在の現象的自己がこの物語論的自己のうちに整合的に位置づけられると、共時的な自己制御は通時的な自己制御ともなり、自己制御が成立する。このような基本的な考えのもとに、過去から未来にわたる諸経験の通時的な統合がどのようなものかを明らかにし、それを通じて、通時的な自己制御を可能にする物語論的自己のあり方を明らかにする。
口腔扁平上皮癌でのヒトパピローマウイルスの発現に関する疫学的検索と発癌機序の検討

1.正常口腔粘膜におけるHPV16の発現(37%):40歳未満では,11例全例が陰性であったが,40歳以上では,50%の陽性率であった。2.上皮異形成症におけるHPV16の発現(60%):50歳未満では3/4例が陰性であったが,50歳以上では63%の陽性率であった。本群と口腔扁平上皮癌群との間に発現の有意差が認められた。3.口腔扁平上皮癌におけるHPV16の発現:(1)原発巣での発現(34%):50歳未満での陽性率は(10%)であったが,50歳以上では51%の陽性率であった。視診上での分類では,白斑型(60%)が潰瘍型(19%)に比較して有意に陽性率が高かったが,他型との有意差はなかった。(2)転移リンパ節での発現(0%):同一患者の原発巣と転移巣で検索し得た例は,6例であった。原発巣では2/6例が陽性を示したが,転移巣では全例陰性であった。(3)多発癌例での発現:多発癌では,3/7例の陽性率で,同一患者では時期に関係なく常に陽性であった。また,多発癌が疑われた3例では全例陽性で,これらも時期に関係なく常に陽性であった。4.HPV18,33の発現:HPV16を検索した組織で検索した。HPV33は検出されなかったが,HPV18は多発癌の2例で検出された。5.口腔扁平上皮癌由来培養細胞におけるHPV16,18,33の発現:検索した全9株で,どのタイプのHPVも検出されなかった。6.HPV16陽性の癌では,陰性例と比較して有意にcyclin D1の発現が低下していた。また,HPV16陽性の白板症でも同様の傾向が見られた。しかし,他の細胞周期調節因子とHPV16発現との相関性は認められなかった。正常粘膜,上皮異形成症(ED),口腔扁平上皮癌(OSCC)における陽性率は,各37%,60%,34%であり,EDとOSCC群では陽性率に統計学的有意差が認められた。特に,経過観察中に癌化した例の陽性率は22例中18例(82%)であり,非癌化例での陽性率29例中13例(45%)との間に有意差を認めた。また,3群共に若年者では陰性率が高かったが,性,部位,異型性,分化度により陽性率に有意差は認められなかった。OSCCの視診型分類では,白斑型(9/15例)は潰瘍型(6/32例)に比べて陽性率が有意に高かったが,他の型との有意差はなかった。6例のリンパ節転移例で,原発巣では2例陽性であったが,転移巣では全例陰性であった。多発癌では,7例中3例,また,多発癌の疑われた3例では全例が陽性であり,同一患者では時期に関係なく常に陽性であった。EDからの癌化例では,EDと癌でともに陽性は16例,ともに陰性は4例,EDは陽性で癌化後に陰性を示したものは2例,EDが陰性で癌化後か陽性であった例はなかった。

2.HPV18と33DNAの組織での発現HPV33は検出されなかったが,HPV18は多発癌の2例で検出された。この2例では,HPV16と18は,ともに組織採取時期には関係なく,常に陽性であった。3.OSCC由来培養細胞におけるHPV16,18,33DNAの発現検索した9株で,どのタイプのHPVも検出されなかった。1.正常口腔粘膜におけるHPV16の発現(37%):40歳未満では,11例全例が陰性であったが,40歳以上では,50%の陽性率であった。2.上皮異形成症におけるHPV16の発現(60%):50歳未満では3/4例が陰性であったが,50歳以上では63%の陽性率であった.本群と口腔扁平上皮癌群との間に発現の有意差が認められた。3.口腔扁平上皮癌におけるHPV16の発現:(1)原発巣での発現(34%);50歳未満での陽性率は(10%)であったが,50歳以上では51%の陽性率であった。視診上での分類では,白斑型(60%)が潰瘍型(19%)に比較して有意に陽性率が高かったが,他型との有意差はなかった。(2)転移リンパ節での発現(0%):同一患者の原発巣と転移巣で検索し得た例は,6例であった。原発巣では2/6例が陽性を示したが,転移巣では全例陰性であった.(3)多発癌例での発現:多発癌では,3/7例の陽性率で,同一患者では時期に関係なく常に陽性であった。また,多発癌が疑われた3例では全例陽性で,これらも時期に関係なく常に陽性であった。4.HPV18,33の発現:HPV16を検索した組織で検索した。HPV33は検出されなかったが,HPV18は多発癌の2例で検出された。5.口腔扁平上皮癌由来培養細胞におけるHPV16,18.33の発現:検索した全9株で,どのタイプのHPVも検出されなかった。6.HPV16陽性の癌では,陰性例と比較して有意にcyclin D1の発現が低下していた。また,HPV16陽性の白板症でも同様の傾向が見られた。しかし,他の細胞周期調節因子とHPV16発現との相関性は認められなかった。
光電子エネルギー分布を利用する分光スペクトル測定素子の開発

光電効果により光電面から放出される電子のエネルギー分布を利用するコンパクトな分光素子製作に向けた基礎データの取得を目指した。光電子増倍管を改造し,多段電極(ダイノード)への種々の印可電圧配分での光電子エネルギーの波長依存性の観測を試みた結果,第1ダイノードへの電圧印可なしでも光電子の検出が可能であることを見出した。また,最大のノイズ源と予想していた印可電圧のゆらぎ(0.05 V)よりも光電面からの熱電子放出による信号ゆらぎ(1 V)の方が大きいことが判明し,分光素子製作を実現するためには,熱電子パルスと光電子パルスの分離を行う必要があることが明らかになった。光の波長分布(分光スペクトル)を測定する方法として,従来型のプリズムや回折格子による空間的な光の分離ではなく,光電効果におけるエネルギー保存則を利用する分光スペクトル測定を目的として研究・開発を開始した。光検出器の光電面上に設置した格子電極の負電位を掃引して光電子エネルギー分布を測定し,入射光と光電子のエネルギーの間の対応関係を利用して入射光の分光スペクトルを得ることができるコンパクトな光検出器の製作を目的としている。本年度は初年度の計画に従って,光電効果分光素子の試作,素子への光照射部,および素子からの出力シグナル処理回路の製作を行った。当初,分光素子の基本構造を,光電子増倍管の光電面と第1電極の間に負電位をかけるための格子電極を設置した形とする予定であったが,設計に必要な基本情報を取得するために,光電面材料としてSb-CsおよびSb-Rb-Cs等を有する市販の光電子増倍管を改造し,印加電圧の配分を変化させる動作試験を行った。試作した分光素子に既知の波長分布をもつ光(低圧水銀灯)を入射し,光電子増倍管用高圧直流電源(自作)を利用して第1電極への印加電圧を変化させ,光電子エネルギーの積分スペクトルを測定した。観測したスペクトルは予想以上にブロードであり,水銀原子の発光線を十分分離して観測できるレベルには至らなかった。しかし,種々の印加電圧での測定の結果,光電子エネルギーの積分スペクトルを分解能よく観測するためには,印加電圧の大きさや組み合わせ方のみでなく電極間相互の距離と角度を適切に調整する必要があることを見出し,次年度の課題として取り組むこととした。初年度の実施計画に掲げた市販光電子増倍管を改造する光電効果分光素子の試作については当初の予定に従って進めた。また,試作素子への光照射部と出力シグナルの処理回路を含めた試作素子評価システムの製作を完了した。しかし,本研究で製作する分光素子は分光スペクトルそのものではなく,積分されたスペクトルを観測し,その微分から目的とするスペクトルを得ようとするものであるため,わずかな迷光も積分値に誤差として大きく寄与してしまうことが判明し,光照射部の迷光遮断の改善作業に長時間を費やした結果,光電素子自体の細部に関する改善に十分な時間をかけることができなかった。ただし,観測される積分スペクトルの強度と感度が,電極への印加電圧の分割パターンだけでなく,電極間の距離および配向に大きく依存することが判明したことは,次年度に向けた改善ポイントとして有益な収穫点である。また,電極に電圧を印可する高圧直流電源1台での測定では,光電子エネルギーの制御を容易かつ速やかに行うことができないことも判明したので,急遽,電源1台を追加自作し,測定効率の向上を実現した。研究目的に掲げた「光検出器(光電子増倍管)の光電面上に設置した格子電極の負電位を掃引して光電子エネルギー分布を測定し,入射光と光電子のエネルギーの間の対応関係を利用して入射光の分光スペクトルを得る」という点に関して,現時点では,光電子エネルギー分布の観測に至っていない点をふまえて「やや遅れている」と評価した。光の波長分布(分光スペクトル)を測定する方法として,プリズムや回折格子による従来型の空間的な波長分離ではなく,光電効果により光電面(受光面)から放出される電子のエネルギー分布を利用するコンパクトな分光素子の製作を目的としている。本年度は,分光素子の電気的特性に関する基礎データを取得するために,光検出器(光電子増倍管)の多段電極(ダイノード)への最適印可電圧配分を変更し,光電子エネルギーの波長依存性の観測を試みた。初年度に実施した光電面と第1ダイノード間の印可電圧制御では,光電子の加速が大きすぎることが判明したため,本年度は第1ダイノードには電圧を印可せず,光電面と第2ダイノードの電位差を制御して光電子エネルギー差の観測を試みた。その結果,第1ダイノードに電圧を印加しなくても,十分な感度で光電子検出が可能であることが明らかになった。さらに,観測光源を2種の発光ダイオード(緑色(500 nm),赤色(650 nm))に変更し,可視域での光電子エネルギー差の観測を試みたところ,波長の短い緑色ビームの光電子量の方がやや多い傾向は見られたものの,出力信号のゆらぎが大きく,光電子エネルギー差を十分な精度で観測することはできなかった。電圧印可に利用している電源の電圧ゆらぎ(0.05 V)は500 nmと650 nmの光子のV単位換算のエネルギー差0.6 Vに比べて十分小さいが,光電面からの熱電子放出による信号ゆらぎが1 V以上あることが原因である。

以上の観測から,具体的な熱電子対策として,光電面の冷却による熱電子発生の抑制,および熱電子パルスと光電子パルスの分離による改良を行う必要があることが明らかになった。引き続き,素子製作に向けて,ダイノードへの印可電圧配分の最適化と熱電子抑制を実施する予定である。光電効果により光電面から放出される電子のエネルギー分布を利用するコンパクトな分光素子製作に向けた基礎データの取得を目指した。光電子増倍管を改造し,多段電極(ダイノード)への種々の印可電圧配分での光電子エネルギーの波長依存性の観測を試みた結果,第1ダイノードへの電圧印可なしでも光電子の検出が可能であることを見出した。また,最大のノイズ源と予想していた印可電圧のゆらぎ(0.05 V)よりも光電面からの熱電子放出による信号ゆらぎ(1 V)の方が大きいことが判明し,分光素子製作を実現するためには,熱電子パルスと光電子パルスの分離を行う必要があることが明らかになった。1.初年度の試作素子によるデータを参考にしつつ,第1電極上方に光電子エネルギー選別用のメッシュ電極を設置する構造をもつ光電効果分光素子の本格設計および製作を行う。光電面,第1電極,および第2電極からなる光電子エネルギー制御電極のサイズおよび配向の最適条件を電場中での電荷の運動シミュレーションソフトウェアを利用して割り出し,設計・製作に応用する。製作した分光素子を真空排気装置内に設置し,オイルフリードライポンプで背圧排気されるターボ分子ポンプを用いて0.1 μTorr以下に排気するシステムを構築する。2.初年度に完全に遂行できなかった水銀原子の発光線の観測を行い,続いて,分子の電子遷移の発光スペクトル測定を行う。交付申請書に記したように,広い波長範囲での測定試験としてはアンモニア(NH3)の紫外光解離で生成するNH2ラジカルのA2B1ーX2B1やO2のB3Σu-ーX3Σg-, S2のB3Σu-ーX3Σg-およびf1Δuーa1Δg,あるいはSOのB3Σ-ーX3Σ-などの電子遷移にともなう振動バンド構造の観測を行い,実測データだけから分光スペクトルのピーク強度比が得られることを検証する。また,分光素子のエネルギー分解能のチェックとして,OHのA2Σ+ーX2Π, NHのA3ΠーX3Σ-およびc1Δーa1Δ遷移の発光分光スペクトル観測を行い,近接ピークの分離状態から分解能の評価を行う。3.実測のエネルギー積分スペクトルから波長(あるいは波数)分布スペクトルを得るための解析ソフトウェアを開発・公開し,利用希望者に無償で配付する。得られた成果を,学会,学術雑誌,webサイト上で発表・公表する。物理化学の解説書として代表者のwenサイトにて無料配布している「物理化学Monographシリーズ」(全27タイトル,総ページ数896)のうち10タイトル(409ページ)の改訂版を発行した。反応物理化学
植物システイン・プロテアーゼの多段階翻訳後プロセッシングと細胞内輸送

ケツルアズキ(Vigna mungo)発芽種子の子葉で新合成され、吸水後2-3日目に著しい活性上昇を示すシステインエンドペプチダーゼ(SH-EP)は、子葉中の貯蔵グロブリンの分解に主要な役割を担っている。この酵素は膜結合リボソーム上で45kD前駆体として翻訳され、翻訳と同時にシグナル配列の切除を伴って43kDポリペプチドとしてERに導入されるが、ついで43kD→39kD→33kD(成熟型)という特徴的な多段階プロセシングを受けて活性化されることが分かっている。本分担課題では、このSH-EP前駆体の翻訳後プロセシングと細胞内局在化の過程を知る目的で研究を行い、次のような結果を得た。(1)発芽種子の子葉からミクロソーム画分及びプロテインボディ(PB、タンパク質貯蔵型液胞)画分を単離し、抗SH-EP抗体を用いて免疫ブロット分析したところ、前者には43kDポリペプチドが、後者には33kD成熟型SH-EPが検出された。このことは、ERで生成した43kDポリペプチドは、PBへの輸送途中またはPBへの集積後に33kD成熟型になることを示している。(2)SH-EP in vitroプロセシング系と各種プロテアーゼ阻害剤を用いた実験研究から、SH-EPのプロセシングには少なくとも2種のプロセシング酵素(PE-1及びPE-2)の関与が推定できた。PE-1は43kD→36kDの、PE-2は36kD→33kDのプロセシングにそれぞれ作用していると考えられる。PE-1は還元剤を要求するがE-64やロイペプチンにより阻害されないことから、従来知られているシステインプロテアーゼとは別のファミリーに属するとみられる。また、PE-1はナタマメのアスパラギニルエンドペプチダーゼに対する抗体と交叉反応した。(3)cDNAから推定されるSH-EPアミノ酸配列のC末端にはLys-Asp-Glu-Leu(KDEL)配列が存在する。C末端KDEL配列はタンパク質のER残留シグナルとして機能することが知られている。そこで、次にSH-EPのC末端配列の解析を試みた。臭化シアン分解したSH-EPのペプチド断片のアミノ酸配列、アミノ酸組成分析及びSH-EPのマススペクトル分析の結果、成熟型SH-EPにはC末端KDEL配列は存在せず、翻訳後プロセシングの過程でKDEL配列を含む10アミノ酸からなるC末端プロペプチドが切除されることが明らかになった。
近接型AEダブレット解析による地下き裂システムの連係進展過程評価法の開発

近接型AEダブレットは,波形相似なAE信号(Acoustic Emission)が1s程度の短い時間差で入力する現象である。近接型AEダブレットの進展ベクトルの標定は,伝播媒質に変化がないため正確である。近接型AEダブレットの進展ベクトルを使って地熱貯留層の動きを推定するために,本研究では,新たには時間-ケフレンシ解析および時間-ケフレンシ解析へのMUSIC法の応用等の信号処理法を考案し,それを使って実データを解析,さらに,表示システムの開発を行った。近接型AEダブレットは,波形相似なAE信号が1s程度の短い時間差で入力する現象である。近接型AEダブレットの相対震源標定は,伝播媒質に変化がないため,従来の旭ダブレット/マルチプレット解析より正確である。近接型AEダブレットのP波の入力時間差はケプストラム解析より高い精度で検出できる。しかし,近接型AEダブレットのケプストラムには,P波の入力時間差とS波の入力時間差の2つのピークがあり,その判別が難しかった。第2S波の入力時刻より前を時間窓を使って取り出すとともに,その時間窓長を変化させてケプストラムの変化を比較して,近接型AEダブレットのP波の入力時間差を検出する時間-ケフレンシ解析を考案した。この信号処理法の性能を,計算機シミュレーションにより検証した。オーストラリア・クーパーベイズンの水圧破砕実験で観測した近接型AEダブレットのケプストラムは,ソルツと勇払の近接型AEダブレットのケプストラムより,入力時間差の線ケプストラムの幅が広い特徴があった。この現象はパワースペクトルが低周波数帯域に集中しているためでないことを計算機シミュレーションで検討した。そして,この現象の原因が地下き裂の進展過程自体が原因であることを明らかにした。近接型AEダブレットの入力時間差を高分解能で検出するために, FFTにより求めた対数パワースペクトルにMUSIC法を使って,ケプストラムを求める手法を考案した。MUSIC法を使うことにより, FFTを使ったケプストラム解析より格段に高い分解能で入力時間差を検出できる可能性を示した。近接型AEダブレットの相対震源標定は,伝播媒質に変化がないため,従来のAEダブレット/マルチプレット解析より正確である。さらに,時間-ケフレンシ解析の結果の誤認識を避けるために時間-ケフレンシ解析の結果を等高線表示するプログラムを開発した。近接型AEダブレットの入力時間差を高分解能で検出するために,FFTにより求めた対数パワースペクトルにMUSIC法を使って,ケプストラムを求める手法を考案した。そして,MUSIC法で解析する相互相関行列の次元とP波入力時間差の誤差の関係を検討した。AE源分布の全体像とAE源間の相対座標を同時に表示するシステムを開発した。この表示システムでは,2つのウィンドウを使い,両者の回転・平行移動・スケーリングを同期させて,AE源分布の全体像と相対震源座標の関係を分かりやすく操作できるようにした。しかし,近接型旭ダブレットのケプストラムには,P波の入力時間差とS波の入力時間差の2つのピークがあり,その判別が難しかった。1993年ソルツ地熱フィールドで観測した15089個のAEを解析して,230個の近接型AEダブレットを検出した。

それらを時間-ケフレンシ解析して,4観測点でP波の入力時間差を検出できた9個の相対震源を標定した。また,2005年に苫小牧勇払油ガス田で観測した3708個のAEを解析して234個の近接型AEダブレットを見つけたが,4点の観測点でP波入力時間差を検出できたイベントはなかったため,相対震源標定には至らなかった。
ファージディスプレー法による機能性ヘム集合体のデザイン

本研究では、それ自体反応性に富む低分子化合物と蛋白質との複合体を作製し、その低分子化合物の持つ反応性を制御し、触媒として応用しうる新たな系を創出することを目標とした。具体的には、非ヘム酵素であるがミオグロビンと一次構造上の相同性を示し、ヘムと弱い結合をするグルタミン酸ラセマーゼ(GluR)を基に、ファージディスプレー法を用いて多様な結合様式をもつGluR-ヘム複合体を調製し、新しい機能を有するへムタンパク質複合体の構築を目指した。このためpBluescriptに由来するファージミド6D9wt-pComb3を基に、M13ファージコート蛋白質gpIIIのN-末端部分にGluRを融合タンパク質として発現するためのファージミド、GR-pCom3を構築した。ファージコート蛋白質上のGR発現は、ファージ液をSDS-PAGE上に展開し、GluR抗体でwestern blottingすることにより確認した。次ぎにEAH sepharose 4Bとヘミンを結合させた固定化ヘミンに対する、GR発現ファージの結合能を検討した。10^8個のGR発現ファージ粒子を含むファージ液と、対照実験として、ヘミンと構造上の類似性をもたないクロラムフェニコール誘導体に対する抗体を発現した同数のファージ(Phage-6D9)をヘミン・EAH sepharose 4Bカラムに供し、高塩濃度の緩衝液で洗浄した後、低塩濃度の緩衝液で溶出した。この結果、1.6x10^5個のGR発現ファージがカラムに結合したのに対し、Phage-6D9の結合は認められなかった。本研究では、GluRのファージコート蛋白質上への発現、およびpanningシステムの構築が確認できたが、ファージコート蛋白質、gpIII中のGluR融合タンパク質の存在確率は極めて低いものと考えられた。
ジストロフィンDp71による筋衛星細胞の分裂制御に関する研究

Duchenne型筋ジストロフィー(DMD)では、骨格筋にある筋衛星細胞の分裂が抑制され、筋前駆細胞の産生障害がある。ジストロフィンDp71(Dp71)は、細胞分裂を抑制する新しい分子として近年大きく注目されている。しかし、Dp71は骨格筋には発現しないとされ、衛星細胞の分裂制御とDp71との関連は未解明である。申請者は、つい最近Dp71が骨格筋でも発現していることを世界に先駆けて明らかにした。このことは、骨格筋における唯一の分裂細胞である衛星細胞にDp71が発現していることを強く示唆した。本研究は、衛星細胞の核にDp71が発現することを明らかにするとともに、その発現を阻害したり過剰発現させたりすることにより、Dp71が衛星細胞の分裂を制御することを明らかにするものである。よって、Dp71が衛星細胞の分裂制御因子であることを示す世界で初めての最先端研究である。本研究では、ヒト筋衛星細胞の核にDp71が発現すること、そして衛星細胞の分裂をDp71が制御していることを明らかにするものである。本年度の研究において、ヒト衛星細胞のRNAから全長のDp71mRNAのRT-PCR法による増幅に成功した。さらに、その塩基配列の解析により特異なアイソフォームが発現していることを明らかにした。また、Western blot法によりDp71タンパクの同定に成功した。こうしたことにより、Dp71の発現をmRNAとタンパクの2つのレベルで確認した。今後、筋衛星細胞にDp71の過剰発現あるいは発現阻害をはかり、それぞれの条件下での細胞分裂を解析することを計画している。さらに、Dp71が筋衛星細胞の細胞分裂を制御している分子であることを明らかにする予定である。ヒト衛星細胞でDp71が発現することを明らかにすることにまず着手した。骨格筋衛星細胞におけるDp71の発現を明らかにするために、ヒト衛星細胞のRNAとタンパクを入手した。そして、RT-PCR法によりDp71mRNAの検出をはかった。Dp71はDMD遺伝子の産生するアイソフォームの1つで、構成するエクソンのうちエクソンG1のみがDp71に特異的で、他のエクソンは他のDMDアイソフォームと共通である。そこで、エクソンG1とエクソン79にプライマーを置いてDp71の全長を一挙にPCR増幅することを試みた。その結果、ほぼ想定通りの増幅産物を得た。増幅産物塩基配列を解析することにより、Dp71と同定した。しかし、同定したDp71は非常に特有なアイソムフォーム形態をとった。すなわち、発現するDp71のアイソフォームは予想外にも唯一種で、しかも2つのエクソンを欠くものであった。このことは、衛星細胞の機能とこのアイソフォームの発現に強い関係のあることが想定された。また、ウエスターンブロッド法によりDp71タンパクの同定をはかった。まず、正常コントロールとして、人為的に発現させたDp71を得た。そして、これと衛星細胞溶解液とを同時に解析したところ、両者で同じ位置にジストロフィン抗体に反応するバンドを検出し、Dp71タンパクの発現を明らかにした。こうして、Dp71が衛星細胞で発現することをmRNAとタンパクレベルで明らかにした。当初の計画であるDp71の衛星細胞での同定に成功し、研究は順調に進んでいる。本研究は、筋衛星細胞の核にDp71が発現すること、そして衛星細胞の分裂をDp71が制御していることを世界で初めて明らかにするものである。これまでに、衛星細胞でDp71mRNAのRT-PCR法による検出と、Western blot法によりDp71タンパクを同定した。さらに、Dp71が筋衛星細胞の細胞分裂を制御している分子であることを明らかにする予定であるDuchenne型筋ジストロフィー(DMD)では、骨格筋にある筋衛星細胞の分裂が抑制され、筋前駆細胞の産生障害がある。

今後、筋衛星細胞にDp71の過剰発現あるいは発現阻害をはかり、それぞれの条件下での細胞分裂を解析することを計画している。さらに、Dp71が筋衛星細胞の細胞分裂を制御している分子であることを明らかにする予定である。ヒト衛星細胞でDp71が発現することを明らかにすることにまず着手した。骨格筋衛星細胞におけるDp71の発現を明らかにするために、ヒト衛星細胞のRNAとタンパクを入手した。そして、RT-PCR法によりDp71mRNAの検出をはかった。Dp71はDMD遺伝子の産生するアイソフォームの1つで、構成するエクソンのうちエクソンG1のみがDp71に特異的で、他のエクソンは他のDMDアイソフォームと共通である。そこで、エクソンG1とエクソン79にプライマーを置いてDp71の全長を一挙にPCR増幅することを試みた。その結果、ほぼ想定通りの増幅産物を得た。増幅産物塩基配列を解析することにより、Dp71と同定した。しかし、同定したDp71は非常に特有なアイソムフォーム形態をとった。すなわち、発現するDp71のアイソフォームは予想外にも唯一種で、しかも2つのエクソンを欠くものであった。このことは、衛星細胞の機能とこのアイソフォームの発現に強い関係のあることが想定された。また、ウエスターンブロッド法によりDp71タンパクの同定をはかった。まず、正常コントロールとして、人為的に発現させたDp71を得た。そして、これと衛星細胞溶解液とを同時に解析したところ、両者で同じ位置にジストロフィン抗体に反応するバンドを検出し、Dp71タンパクの発現を明らかにした。こうして、Dp71が衛星細胞で発現することをmRNAとタンパクレベルで明らかにした。当初の計画であるDp71の衛星細胞での同定に成功し、研究は順調に進んでいる。本研究は、筋衛星細胞の核にDp71が発現すること、そして衛星細胞の分裂をDp71が制御していることを世界で初めて明らかにするものである。これまでに、衛星細胞でDp71mRNAのRT-PCR法による検出と、Western blot法によりDp71タンパクを同定した
注意の時空間配分の神経メカニズム

本研究の目的は選択的注意において注意リソースを空間・時間上に配分する際の神経メカニズムを、課題遂行中のサルの神経活動を記録することで明らかにすることだった。この目的を達成するためには、サルによる時間計測課題の開発や、内的な時間計測の神経メカニズムの同定が必要であった。申請者はサルに、左右視野に一定間隔で交互に現れる視覚刺激に対して眼球運動を同期させる課題(同期サッカード課題)を訓練した。結果としてサルは刺激に対する同期運動を学習することができた。また同課題中のサルから、同期運動の神経基盤の一つとして数えられる小脳の単一細胞記録を行い、同期運動時の運動間間隔の調整に関わる神経活動を見出した。空間的注意に関する研究は数多く行われてきたが、情報が入力される時間が既知の場合は注意選択を特定の時間に効率よく行うことが重要となる。本研究の目的は時間予測時の注意選択メカニズムを明らかにすることであった。1つ目の研究はサルを用いた神経生理学的検討であった。受容野内に提示される刺激への時間予測・空間的注意の有無を直交操作し,時間予測と空間選択の統合過程を調べるために,ニホンザルを訓練した。現在,1頭のサルの訓練が順調に進み,課題を習得しつつある。また2頭目のサルを訓練中である。2つ目は自動的な時間処理である。サルを用いた時空間的注意を調べるにあたり,サルとヒトの時間情報処理の違いは研究の発展性において重要である。指標として,ミスマッチ関連陰性電位(Mismatch Negativity, MMN)を用いた。MMNは特定の刺激の特徴に対する自動的な処理を反映する一過性の脳波成分である。本研究はヒトで示されている刺激の持続時間処理に関するMMNがサルでも生じるかどうかを検討した。結果としてサルでは持続時間MMNが生じず,自動的な短い時間の処理はサルとヒトで異なることが示唆される。この研究成果は,チンパンジーからMMNを測定している学外の研究者と共著の論文を執筆する前提で議論され,現在,よりノイズの少ない脳波測定のための準備を行っている。3つ目の研究では能動的な時間処理に焦点を当てた。これまで,特定のリズムを持った刺激に対する同期運動(いわゆる「のる」運動)はサルには備わっていないと考えられてきた。本研究は左右に一定間隔で交互に現れる視覚刺激への同期的眼球運動をトレーニングした。結果としてサルにも同期運動の能力があることがわかり,能動的な時間予測に基づく運動能力はヒトと類似することがわかった。この成果は国内の研究会・学会で発表し、国外の研究者と共著の論文を執筆中である。サルを用いた時間予測・空間的注意の研究では,視覚刺激に対する感覚処理を検討するために,あえて眼球運動を伴わない手がかり刺激に対する注意の影響を検討するパラダイムを用いている。そのためサルにトレーニングする課題がやや難しく,計画よりも時間がかかっている。しかし,現在1頭のサルは同課題をほぼ習得しており,細かい実験パラダイムを設定し次第,単一細胞記録を開始する。またサルの課題を策定中のため,直接比較するためのヒト脳波実験を停止中であるが、サルのトレーニングが済み次第速やかに実験を開始する。脳波計の使用や分析については予備的なデータの取得ができるまでに準備が進んでいる。そのような状況において,同時並行して特別な訓練を要しないMMNの測定をサル・ヒト双方で行った。これまでヒトMMNは安定的に記録されている。一方でサルの脳波は,固視点を見つづける課題を設定したことで眼球運動によるアーチファクトの混入は抑えられ,十分な加算回数があるために比較的安定した信号が得られている。しかし,サルが吸い口からジュースを飲む際などには大きなノイズが混入する。現在,サル硬膜上に電極を常置する手術を準備している。電極の作成やサルMRI画像からの電極位置の策定などは完了している。また脳波解析用のプログラムは頭皮上より脳波記録時に作成済みのものを用いるため、測定が可能になれば速やかに分析できる準備が整っている。サルのリズム刺激に対する同期運動の研究においては,サルを用いた実験は既に終了しており,論文化の準備を進めている。同課題におけるサルとヒトの違いを直接的に比較するために,ほぼ同じ手続きでヒトを対象とした実験も行っている。これらはサル神経生理実験のためのサル訓練等の準備の合間に行われた。脳が一度に処理できる情報量には限りがあるため,重要なイベントがいつ起きるかを予測し,その時点において情報の取捨選択をする機能は非常に重要である。研究開始当初の目的はこのような時間予測に基づく選択的注意の神経メカニズムを、行動、脳波、単一細胞記録の複数の方法を用いて多角的に検討することであった。しかしこの目的を達成するために、まずはサルがどのように未来の時間を予測しているか、あるいはそのような予測が可能なのかどうかを明らかにする必要があった。また同様に、サルにおける時間処理についてヒトとの異同についても検討の余地があった。そこで研究の目的を時間処理そのものについてサルとヒトの違いを明らかにすることとし、実験的検討を行った。まずヒトとサルの自動的な時間処理を探るために,ミスマッチ陰性電位を記録したところ,ヒトでは音の高さ,色,刺激の時間長の逸脱に対して明瞭な陰性電位が記録されたのに対し,サルでは刺激の時間長のみでミスマッチ電位が観察されず,音声的なコミュニケーションに重要な時間長の知覚処理はヒトとサルで異なる可能性が示唆された。

次に能動的な時間計測に関わる課題として,左右に一定間隔で交互に現れる視覚刺激に対して眼球運動を同期させる同期サッカード課題をサルに訓練した。結果としてサルは同期運動を学習したので,課題遂行中のサル小脳歯状核より単一細胞記録を行ったところ,同期運動が崩れた際に活動が増強するタイプの神経細胞があり,このような活動が同期運動時の微調整に関わっていると考えられた。本研究により,サルとヒトの脳内時間計測システムの異同および計時に関わる脳活動の一部が明らかになった。本研究の目的は選択的注意において注意リソースを空間・時間上に配分する際の神経メカニズムを、課題遂行中のサルの神経活動を記録することで明らかにすることだった。この目的を達成するためには、サルによる時間計測課題の開発や、内的な時間計測の神経メカニズムの同定が必要であった。申請者はサルに、左右視野に一定間隔で交互に現れる視覚刺激に対して眼球運動を同期させる課題(同期サッカード課題)を訓練した。結果としてサルは刺激に対する同期運動を学習することができた。また同課題中のサルから、同期運動の神経基盤の一つとして数えられる小脳の単一細胞記録を行い、同期運動時の運動間間隔の調整に関わる神経活動を見出した。サルの選択的注意機能に関する神経生理実験は,継続してサルの訓練を行う。現在課題を習得済みのサル1頭は,課題のパラメータを決定し次第,速やかに神経生理実験を行う。LIP野から単一ニューロン活動を記録し、受容野内に提示された刺激に対する反応を分析する。ただし、注意による効果が刺激提示前の自発活動の変化として観察される可能性や、その時間経過が注意により異なる可能性があるため、刺激提示前後の広い時間帯の神経活動を分析する。時間予測と空間的注意が統合される脳部位が同定され次第、多点電極記録・多層解析を行い、細胞における統合過程を明らかにする。さらにヒト脳波実験においては、注意を向けるための手がかりとなる刺激に対して出現するであろう前頭部のγ波、刺激出現の直前に注意側の対側半球で減衰する後頭α波、および注意によって変動する視覚誘発成分・高周波律動の3つを主に分析する。この研究により予測された特定の時間における空間的注意選択の制御過程を明らかにする。サルおよびヒトのMMNの研究は、準備中の硬膜上電極布置手術を行い、安定した脳波計測を行う。MMNは視覚・聴覚それぞれの感覚モダリティで実験を行う。また持続時間だけでなく、音の高さや視覚刺激の色など、さまざまな条件でMMNを計測し、ヒトと比較する。この研究によりヒトとサルの自動的な時間処理の差異を検討する。刺激に対する同期運動の研究では,速やかにヒトの追加実験を行い,執筆中の論文を投稿する。持続時間MMNと同期運動には小脳の関与が指摘されている。昨年度より申請者が所属の研究室ではウイルスベクターを用いた研究が開始しており,これを利用した実験も視野にいれ研究を継続する。28年度が最終年度であるため、記入しない。神経生理学28年度が最終年度であるため、記入しない。
フェリック・フェラスポリカチオンの短距離・中距離構造と複雑凝集

水溶液中の金属鉄の腐食のおいては、水に溶解したフェラスイオン(Fe(II))とフェリックイオン(Fe(III))からポリカチオンの凝集が起こり、いわゆる腐食生成物が形成する。それらの過程で、複雑な構造のオキシ水酸化鉄や酸化鉄が生成ずる。本研究では、それらの酸化鉄等における短距離構造に及ぼす異種カチオンや異種アニオンの影響を明らかにするため、EXAFS測定法、定量的X線回折法による系統的な構造解析を行った。それとともに、水溶液の反応条件を電位やpHの測定により精密に評価し、様々なポリカチオンの凝集挙動を検討した。ここでは、特にフェラスイオンを多く含むGreen Rust(GR)を合成し、温度や酸素供給速度等を制御した反応条件で、GRが異なる種類の酸化鉄やオキシ水酸化鉄に変化する過程を解析した。一連の結果から、GRからオキシ水酸化鉄への構造変化が、水溶液の温度やpHによって敏感に変化することなどを明らかにした。また、様々なポリカチオンの構造に及ぼすMnなどの異種原子の影響を調べるには、FeとMn等の原子番号が近いため通常のX線構造解析法では得られない。そこで、この欠点を克服できるX線異常散乱法を用いた解析により、Mn等がFe_3O_4のカチオンサイトに均一に分散することを明らかにした。さらに、反応条件を制御して合成したフェラスイオンを含むGRに異種アニオンを加え、水溶液中で酸化させたときに構造変化するオキシ水酸化鉄の中距離構造・短距離構造等も明らかにした。これらの結果は、GRtからオキシ水酸化鉄へ構造変化する際に異種イオン(ケイ酸塩イオン等)が取り込まれ、原子レベルの構造が乱れることなどを示した。これらの原子レベルの構造乱れは、粒子の形態だけでなくイオン選択性等の特性にも影響していることなどを考察した。水溶液中の鉄イオンからフェリック・(FeIII)フェラス(FeII)ポリカチオンが凝集する過程は、FeO_6八面体が連結する過程である。本研究では、これらのポリカチオンの凝集過程におけるFeO_6八面体連結の乱れ等を定量的に評価し制御することを目的としている。本年度は、凝集過程に及ぼす異種カチオンによる多面体ユニット置換や異種アニオンによるポリカチオンの変化の観点から、β-FeOOHの構造乱れに及ぼすCrや硫酸イオンの影響について調べた。ポリカチオンの中距離構造を定量的に明らかにするために、Crや硫酸イオンを添加したβ-FeOOHに対するX線異常散乱法(各元素の原子散乱因子の違いに着目してエネルギーの異なるシンクロトロン放射光を利用)による測定結果から、定量的な散乱プロファイルを求め、干渉関数を精度良く求めた。これらの結果に、リバースモンテカルロシミュレーション法を適用して、数ナノメートル領域におけるFe-O、Fe-Fe、O-Oの二体分布関数を求めた。これらの解析結果から、Crや硫酸イオンの添加によるβ-FeOOHの原子レベルの構造乱れを明らかにした。また、水溶液中で構造が変化するFe-O系の酸化物についても、局所構造解析や中距離構造の精密構造解析を行った。その測定のために、in-houseエネルギー可変X線発生装置を用いたEXAFS測定装置を導入し、水溶液中における水酸化物からオキシ水酸化物、酸化物への変換過程における局所構造に関する知見を得た。これらの過程においても、硫酸イオン等の異種アニオンが原子レベルの構造に大きな影響を及ぼすことを明らかにした。

水溶液中の鉄錯イオンからフェリック・フェラスポリカチオンが凝集する過程でのFeO_6八面体構造(短距離構造)の変化およびそれらの及ぼす異種カチオンや異種アニオンの影響を明らかにするために、in-houseのEXAFS測定装置や定量X線回折法、さらに反応環境の精密評価(水溶液分析)により、それらの凝集挙動について検討した。これらの研究においては、これまで解析が困難であったフェラスイオンを含む化合物(Green Rust)をについて、温度や酸素分圧を制御した試料を作製し、それらの構造変化の過程を各種の評価法により解析した。その結果、水溶液中においてGreen Rustから異なる構造のオキシ水酸化鉄や酸化鉄が形成することを明らかにし、その形成条件についても解明した。さらに、様々なポリカチオンの中距離構造(乱れ)を明らかにするために、定量的なX線異常散乱法等により干渉関数を精度良く評価した。これらの実験においては、各種のフェラスイオンを含むGreen Rustを合成して、水溶液中でのそれらの酸化過程と中距離構造・短距離構造の関係を明らかにするために、リバースモンテカルロシミュレーション法を応用して数ナノメートル領域におけるFe-O、Fe-Fe、O-Oの二体分布関数を求めた。その結果、凝集過程において異種元素を取り込むことにより、複雑な構造を持つことなどを解明した。これらの研究では、ポリカチオンの短距離・中距離構造が比較的軽い元素(例えばSi)を含む化学種によっても影響を受けるため、このようなイオンの取り込みによる構造乱れを赤外吸収分光法等も用いて評価した。それらの結果は、定量的なX線異常散乱法等による原子レベルの構造解析の結果と対応していることを示した。水溶液中の鉄錯イオンからフェリック・フェラスポリカチオンが凝集する過程におけるFeO_6八面体構造(短距離構造)の変化およびそれらの及ぼす異種カチオンや異種アニオンの影響を明らかにするために、EXAFS測定法、定量的X線回折法、さらに反応環境の精密評価(水溶液分析)により、それらの凝集挙動を解明した。特に、これまで解析が困難であったフェラスイオンを含む鉄系化合物(Green Rust)をについて、温度等の反応条件を制御した凝集して形成する異なる種類の酸化鉄やオキシ水酸化鉄試料を作製し、それらの変換過程を解析した。Green Rsutからオキシ水酸化鉄への構造変化が、温度やpHによって敏感に変化することなどを明らかにした。様々なポリカチオンの中距離構造、短距離構造を明らかにするために、定量的なX線回折法等により干渉関数を精度よく求める。出発試料には、制御した条件で合成したフェラスイオンを含むGreen Rustを、水溶液中での酸化させることにより、構造変化させた酸化鉄やオキシ水酸化鉄の中距離構造・短距離構造を明らかにする。これらの試料に対して、リバースモンテカルロシミュレーション法を応用して数ナノメートル領域におけるFe-O、Fe-Fe、O-Oの二体分布関数を求めた。Green Rustからオキシ水酸化鉄へ構造変化する際に、異種イオンが取り込まれ、原子レベルの構造が乱れることなどを明らかにした。フェリック・フェラスポリカチオンの短距離・中距離構造は、鉄鋼等に添加される異種元素(例えばMn)を含む化学種によっても影響を受けることが考えられる。このため、このようなGRの変換過程に及ぼす異種元素の影響を、メスバウアー分光法等も用いて評価した。
組換え体ラミニンレセプターに対する抗体の作製とその肺癌転移抑制効果

ラミニンは分子量約85-100万の糖蛋白で、基底膜の主要な構成成分の一つである。またラミニンはその分子上の様々なレセプターを介して細胞や他の結合組織成分(コラーゲン、プロテオグリカンなど)と結合し、細胞の増殖、移動、接着、癌の転移浸潤に重要な役割を果たしていると考えられる。我々は、67kDa高親和性ラミニンレセプター(LR)の前駆体蛋白である40kDaラミニン結合蛋白(LBP)のcDNAをヒト肺癌細胞よりクローニングし、またそのmRNAレベルの発現が肺癌の生物学的悪性度に相関することを見いだしている。本研究ではLR及びLBPに対する特異性の高い抗体を得る目的で、まずクローニングしたcDNAをプラスミドベクターに組み込み、大腸菌に発現させて組み替え体LBPを得た。組み替え体LBPを家兎に免疫して得られた抗LBP多クローン抗体は、ヒト線維肉腫細胞HT1080を用いたウェスタンブロットの結果、LBPのほかに分子量約67,000と32,000の蛋白と反応した。以上の結果より、LBPは必ずしもLRの前駆体蛋白として細胞膜に組み込まれるのではなく細胞質内に留まって何らかの機能をしている可能性が示唆された。一方、LBPのcDNAは全長でも約1kbであり、67kDaのLRを全てコードするには短すぎることから、LBPはLRの一ドメインにすぎず未知の遺伝子産物との会合によってLRが完成すると想定されている。しかし、P4抗体を用いたウエスタンブロットで還元下においても複数の蛋白との反応が認められたことから、LRとLPBとはアミノ酸配列に高いホモロジーを有する別個の蛋白である可能性も示唆された。従って、さらに次のような点が今後の課題と考えられる。●分子量約67,000のバンドがLRと同一か否かを確認すること。●癌組織の免疫染色により細胞内のLRとLBPの局在を解明すること。●抗体による細胞への影響(特に癌細胞の接着能や転移能への影響)を観察し、LR、LBPの役割を解明すること。
直鎖状ポリオキシムを利用した伸縮可能ならせん型分子導線の設計と合成

サリチルアルドキシム部位を直鎖状に連結した配位子の合成とその錯形成によるらせん型構造の形成について検討を行った。直鎖構造の基本骨格としてイミンを用いた場合にはC=N結合生成の高い可逆性のため不均化して合成には至らなかった。一方、本研究で開発した、salenのイミン部をO-アルキルオキシムに置き換えた新規N202四座キレート配位子salamoは、そのC=N結合の安定性がsalenよりも格段に向上していることがわかった。またこのsalamo配位子と銅(II),亜鉛(II),ニッケル(II)の錯形成により安定な単核および三核錯体が得られた。このsalamo部を2個あるいは3個連結した配位子は、アルデヒドと1,2-ビスアミノオキシエタンを段階的に縮合していくことで合成できた。次に、このオリゴオキシム配位子と金属との錯形成によるらせん型金属一次元鎖の形成について検討を行った。ビス(salamo)配位子と酢酸亜鉛(II)の協同的な錯形成により得られる亜鉛(II)三核錯体は、適切な金属ゲストイオン存在下で金属交換反応を起こし、らせん型ヘテロ三核錯体へと変換できた。この金属ゲストイオンとしては、アルカリ金属<アルカリ土類<希土類の順に得られるヘテロ錯体の安定度が高くなり、アルカリ土類の中ではカルシウムに高い選択性を示した。このときのCa/Mg選択性は従来知られているカルシウム捕捉剤BAPTAに匹敵する。また同様の手法で得られるCu2Gd系三核錯体のCu-Gd間には強磁性的相互作用があることがわかり、らせん構造を通したスピンの伝達が起きていることが明らかとなった。より鎖の長いトリス(salamo)-Zn錯体の場合はBa共存下でらせん型構造となった。このように本研究における直鎖オリゴsalamo配位子が、らせん型の一次元金属配列を有する分子導線の基本骨格として有用であることを明らかとした。複数のオキシム型キレート配位部位を連結したオリゴマー・ポリマーを、1,2-ビスアミノオキシエタンとジアルデヒドの縮合反応により合成した。まず、三量体・四量体・五量体などの鎖長の短いオリゴマーを段階的な経路により合成した。目的の直鎖状配位子の三量体はいずれも数段階の反応により収率よく得られた。この配位子の構造はNMRや質量分析より決定した。この配位子の錯形成能をNMRや吸収スペクトルにより評価した。酢酸亜鉛との錯形成では二量体の場合と異なり、複雑な錯体の混合物となることがわかった。この錯形成の際に1当量のランタンやバリウムイオンを共存させると、単一の錯体を与えることがわかった。一方、カルシウムやマグネシウムなどのイオン半径の小さなイオンを共存させた場合には、このように単一の錯体への収束は見られなかった。ランタン錯体の構造はX線結晶構造解析により行った。その結果、3つの亜鉛がキレー卜型配位部位に、中央のらせん型空孔にはランタンイオンが取り込まれている様子が明らかとなった。配位子部分は一重、1.3周巻いたらせん型の構造となっていたことがわかった。この結果から、本研究における直鎖状配位子がらせん型構造をもつ錯体構造の構築に有用であることがわかった。さらに鎖長の長い配位子の合成を目的として、一段階の縮重合反応によりポリマーの合成についても行った。この場合、二量体・三量体・四量体・五量体の各成分は低収率ではあるが得られた。これらのオリゴマーの錯形成によるらせん構造の構築についても現在検討中である。
プラスミドpCAR1と宿主染色体にコードされるNAPsの協調的転写制御機構の解明

本研究ではプラスミドpCARIとその宿主であるPseudomonas putidda KT2440株をモデルとして,核様体タンパク質(NAPs)によるプラスミド-宿主染色体間相互作用のメカニズムの解明を目的としている.pCAR1はMvaTホモログPmr(腸内細菌のH-NSの機能的ホモログ), NdpAホモログPnd, HUホモログPhuの3種のNAPsをコードしているが,今年度は特にPmrと宿主染色体由来のMvaTホモログTurA, TurBとの機能.性質の違いに着目して研究を行った.MvaTホモログはC末端側のDNA結合ドメインで各因子の標的塩基配列を認識してDNAに結合した後, N末端側の二量体/多量体化ドメインで多量体を形成することで多くの遺伝子の転写を制御する.まず各因子のDNA結合ドメインの標的塩基配列を比較するため, P. putida KT2440 (pCAR1)株由来の塩基配列,及び人工オリゴを用いたDNAライブラリーからSELEX法により高親和性塩基配列の濃縮を試みたものの,タンパク質とDNAとの親和性が低いためか標的塩基配列の濃縮は見られなかった.一方これまでの研究からPmrのホモ多量体形成に重要な残基が明らかとなっていたが, TurBの種々のアラニン置換体のホモ多量体形成能をタンパク質間クロスリンク法により調べたところ, PmrとTurBではホモ多量体形成に重要な残基が異なることが示唆された.また昨年度までに各因子がホモ二量体を形成することが示されていたため,今年度はヘテロニ量体の検出を試みたところ, PmrとTurA, TurAとTurBの組み合わせではヘテロ二量体の形成効率に違いがあることが明らかとなった.TurBについては二量体/多量体化ドメインのアラニン置換体を用いて結晶が得られており,今後結晶化条件の最適化と構造解析を進めることで,プラスミドと宿主染色体にコードされるMvaTホモログの機能・性質の違いや,さらには腸内細菌のH-NSとPseudomonas属細菌のMvaTホモログの違いが明らかになると期待される.(抄録なし)本研究では,プラスミドpCAR1とその宿主であるPseudomonas putida KT2440株をモデルとして,核様体タンパク質(NAPs)によるプラスミド-宿主染色体間相互作用のメカニズムの解明を目的としている.pCAR1上には,H-NS様因子Pmr,HU様因子Phu,NdpA様因子Pndの3つの核様体タンパク質をコードする遺伝子が存在しているが,現在はPmrと宿主染色体由来のH-NS様因子であるTurA,TurBに着目して研究を進めている.今年度は特にタンパク質間相互作用に着目した解析を行った.1.PmrはH-NS様因子として新規な多量体形成機構を持つ.H-NS様因子はN末端側のタンパク質間相互作用ドメインとC末端側のDNA結合ドメインがリンカー領域で繋がれた構造を持ち,ホモ多量体化にはN末端側の領域とリンカー近傍領域の両方が重要であると考えられてきた.しかしPmrについては,アラニン置換体の解析からN末端側の領域がホモ多量体化に重要であることが示されたものの,リンカー近傍領域の多量体化への関与は認められず,Pmrの多量体形成機構は既知のH-NS様因子とは異なることが示唆された.2.Pmrのホモ・ヘテロ多量体形成では親和性や結合比が異なる.Pmrのホモ・ヘテロ多量体形成について知見を得るため,表面プラズモン共鳴法を用いてTurA-Pmr,TurB-Pmr,Pmr-Pmr間の親和性と結合比を定量した.その結果,TurB-Pmr間の親和性は他の組み合わせより弱いこと,いずれの組み合わせでも結合比が異なることが示唆された.共同研究者の研究からPmr,Phu,Pndが協調的に機能することが示唆されていたため,プルダウン法によりタンパク質間相互作用の検出を試みたが,各因子間のヘテロ相互作用はPmr同士,Pnd同士のホモ相互作用よりも弱いことが示された.このことから,Pmr,Phu,Pndによる協調的な機能は直接の相互作用による可能性よりは,DNA上の結合箇所や核様体構造の変化により生じると考えられた,2本研究では,プラスミドpCAR1とその宿主であるPseudomonas putida KT2440株をモデルとして,核様体タンパク質(NAPs)によるプラスミド-宿主染色体間相互作用のメカニズムの解明を目的としている.pCAR1上には,H-NS様因子Pmr,NdpAホモログPnd,HUホモログPhuの3つのNAPsをコードする遺伝子が存在しているが,現在はPmrと宿主染色体由来のH-NS様因子であるTurA,TurBを中心に研究を進めている.今年度は,(1)Pmrのホモ・ヘテロ多量体形成における親和性と結合比の定量,(2)Pmrの結晶化条件のスクリーニング,(3)phu, pndの転写開始点の決定,を行った.(1)については昨年度に引き続き表面プラズモン共鳴法を用いてPmr-Pmr間,TurA-Pmr間,TurB-Pmr間における親和性と結合比の定量を行った.昨年度より実験回数を重ねた結果,各組み合わせの親和性に差は見られなかったものの,TurB-Pmr間の結合比はPmr-Pmr間,TurA-Pmr間の結合比の約半分であることが示唆された.