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経済的・社会的ハイリスク母子に対する食・栄養教育に関する研究

本研究は経済的・社会的ハイリスク妊産婦に対する食・栄養教育方法を明らかにするものである。文献検討、産婦人科外来・産科病棟・保健センターの看護職、保育所栄養職員に対し経済的・社会的ハイリスク妊産婦の課題を調査した。また経済的・社会的ハイリスクと地域的ハイリスクにある妊産婦の食生活および栄養調査を行い課題を明らかにした。その結果、経済的・社会的ハイリスク妊産婦は虐待予防としても食・栄養教育が重要であり、経済、理解力、調理経験などに特別な配慮が必要である。看護職が教育できる簡便な教材が必要であった。この結果を踏まえて経済的・社会的ハイリスク妊産婦に対する食・栄養教育の教材を開発した。平成25年度は産婦人科診療施設の看護管理者・看護者、県・市町保健師、公立保育所長への半構成面接を実施した。経済的・社会的ハイリスク妊産婦および母子は地域性が大きく対応頻度は施設間で異なった。対象者の背景は若年、性風俗産業や非正規雇用などの生活基盤のなさと経済問題、経済的問題を抱える外国人があげられた。要因では精神疾患やメンタル面での異常、幼少時からの過酷な成育歴、経済的困窮、社会保険未加入を含めた社会保障の問題、妊娠に対する自覚のなさがあげられた。対応に苦慮する事例では未受診の精神疾患、社会性のなさ、乳児虐待予防などの慎重な対応、クレームなどであり、経済的な困窮では収入よりも支出のアンバランスが問題であり、家庭の経済管理教育の必要性があげられた。食・栄養教育などの健康教育は、いずれも必要性を感じていたが対応に追われ十分に行うことができないことがあげられた。次に、一般妊婦および経済的・社会的ハイリスク妊産婦の食生活状況を明らかにするために、首都圏都市部に居住する妊婦85名、中山間部に居住する50名に対してBDHQ(佐々木式食物摂取頻度調査)を実施した。その結果、都市部居住妊婦の摂取エネルギーは1602.5kcal(推定エネルギー必要量の66%)鉄分6.7mg、カルシウム503.2mg、葉酸282マイクログラムであったが、中山間部に居住する妊婦ではエネルギー1580kcal(同72%)、鉄分6.0mg、カルシウム421.4mg、葉酸237マイクログラムであった。年収200万円以下の低所得群では、いずれの栄養素摂取量も低い傾向にあった。以上から経済的・社会的ハイリスク妊産婦に対する食・栄養指導のために必要とする教育方法を検討した。調理経験や関心がない、初等教育の理解が十分ではない対象者に、動機づけとなる教育媒体を作成する必要があることが明らかとなった。周産期における経済的・社会的ハイリスク妊産婦の現状と問題点を系統的レビューにて文献検討後、専門職への半構成面接を実施し問題点を明らかにした。文献は国内に限定し、データベース検索では医学中央雑誌を用いて、検索式を社会的ハイリスク妊娠or飛び込み分娩or未受診妊婦or(貧困and妊娠)or(貧困and分娩)とし、得られた538件の文献を一次スクリーニングで181件、その後二次スクリーニングにて33件を抽出し検討した。さらにハンドサーチにて得られた35件のうち、一次・二次スクリーニングを行い、重複を除く5件、計38件の文献を検討した。現在我が国における経済的・社会的ハイリスク妊産婦への研究はほとんどなされておらず、38件のうち37件が対象地域もしくは対象施設にて対応した妊産婦の後方的な調査報告であり、文献研究は1件であった。都道府県単位の周産期の現状と医療対応の調査報告は4件、未受診妊婦の全国的な調査報告は1件であった。経済的・社会的ハイリスク妊娠の定義は定まっておらず、文献によって定義が異なった。経済的・社会的ハイリスク妊娠の発生率は0.22.5%で、年間2,0005,000件の分娩が未受診妊婦と推測された。対象妊産婦は医療と生活、育児の問題を抱えており、看護上では周産期の高度医療と看護、住所不定などの生活基盤の欠如、生活と育児支援者の不在、社会一般常識と規範の欠如による生活支援の必要性と困難さの問題を有していた。経済的・社会的ハイリスク妊産婦の対応や健康教育を行う専門職へのインタビューでは、産婦人科診療施設の現状として、未受診に伴う医療の危険性、公的支援を含む経済的問題、家族関係の破綻、被虐待経験を有する母親の子育て、母親の生活リズム等の問題があり、対応が短期間に集中するため産科医師や助産師の負担は大きく、健康教育を支援するサポートの必要性が明らかとなった。平成26年度は経済的・社会的ハイリスク妊婦への調査として、周産期医療の過疎が課題となっているである中山間地区の妊婦(地理的なハイリスク妊婦)に対して、食事に関する現状を調査した。日本の中山間地域であるA町に在住する妊娠期の女性40名に質問紙調査を行い、35名(調査地区の年間分娩数の70%に相当)より結果を得た。対象者は初産婦が11名(31.4%)、経産婦が24名(68.6%)であった。調理担当が本人であるのは31名(88.6%)であり、調理が好きであると回答したものは19名(54.3%)であった。食事作りの情報源はスーパーマーケットが35名全員、次いで家族や近所より貰うとの回答が16名(45.7%)であった。

食に関する知識では季節や行事、食のマナーに関する設問の回答率は80%以上であったが、野菜の摂取量の目安や清涼飲料水に含まれる糖質等の正答率は50%以下であった。妊娠期に健康教育を受けた経験を有さない対象者であり、妊娠以前の食教育を行うこと、妊娠期の健康管理と食教育の充実が課題であることが明らかとなった。また、経済的・社会的ハイリスク母子の食の対応経験や有する課題を、公立保育所の栄養士および調理職員58名に調査した。ハイリスク母子の対応経験を有していたものは28名(48.3%)であり、内容ではネグレクトや被虐待、離乳食などの段階的な食事をすすめてこなかった、インスタント食品の多用と野菜摂取経験がない等であり、経済的・社会的ハイリスク妊産婦の事例が有する課題と同じであることが明らかとなった。経済的・社会的ハイリスク妊産婦はその背景に応じて、小児期の食まで応用できる基本的な食教育を行うことが必要であることが明らかとなった。平成27年度は、経済的・社会的ハイリスク妊産婦への食生活と栄養調査を実施した。平成27年4月9月に総合病院の産婦人科診療施設に受診し分娩を行った経済的・社会的ハイリスク妊産婦に対して、食生活および簡易版食物摂取頻度調査を実施した。対象者は16名であった。調査の結果、平均摂取エネルギーは1,653kcal/日、たんぱく質摂取量は60.0g/日、脂質割合は28.8%であり、平成25年度に実施した比較群の調査結果および国民健康栄養調査結果と同様であった。微量素栄養素摂取ではこれまでの調査と同様であったが、カルシウムと葉酸の摂取量は個人差が大きく、推奨量を満たすものが3名、鉄分では0名であった。16事例のうち2事例に深刻な栄養不足や問題のある事例が存在した。これまでの調査より調査の総括を行った。全ての妊産婦に食・栄養教育は必要であるが、特に経済的・社会的ハイリスク妊産婦は栄養アセスメントを行い、重点的な指導を行う対象者を選定することが必要である。また経済的・社会的ハイリスク妊産婦は子ども虐待予備軍であり子どもの食生活に問題を有する場合があり、虐待予防の視点からも周産期からの食・栄養教育は重要である。また、経済的・社会的ハイリスク妊産婦への食・栄養教育には、経済的問題、理解力、食体験や調理経験が一般の妊産婦に比して低下している場合があること、妊産婦自身と児への関心が低い場合があり、従来行われている食・栄養教育とは異なる指導方法が必要であること、周産期医療を担う看護職や、地域保健活動を行う看護職は差し迫った経済的・社会的問題、周産期の異常、母子の子育て支援などへの対応があり、時間をかけた食・栄養教育を行うことが出来ないことが明らかとなった。このような課題と現状を踏まえて、経済的・社会的ハイリスク妊産婦に対する看護職が食・栄養教育を行うことが出来るような教育媒体を作成した。本研究は経済的・社会的ハイリスク妊産婦に対する食・栄養教育方法を明らかにするものである。文献検討、産婦人科外来・産科病棟・保健センターの看護職、保育所栄養職員に対し経済的・社会的ハイリスク妊産婦の課題を調査した。また経済的・社会的ハイリスクと地域的ハイリスクにある妊産婦の食生活および栄養調査を行い課題を明らかにした。その結果、経済的・社会的ハイリスク妊産婦は虐待予防としても食・栄養教育が重要であり、経済、理解力、調理経験などに特別な配慮が必要である。看護職が教育できる簡便な教材が必要であった。この結果を踏まえて経済的・社会的ハイリスク妊産婦に対する食・栄養教育の教材を開発した。
計算論的トポロジーによる病理形態解析アルゴリズムの連携展開

本研究では画像形態の位相的な性質に注目し、診断医と協働しながら以下の2つの医療画像データ群に,計算論的トポロジー手法を適用した。1ウサギ腱移植モデルのマイクロCT画像データから再構築した3次元構造について、微細構造の骨梁数、開気孔、閉気孔の数を示す位相的不変量を計算した。組織学的観察結果と比較しながら、骨形態計測における定量的指標としてベッチ数比を提案した。2病理診断の免疫組織化学について、パーシステントホモロジー理論による定量的評価法を提案した。乳がん患者の染色画像データから計算したパーシステント図から新しい特徴量を定義し、病理医らの目視判断による従来の結果と比較検討した。計算論的トポロジー理論に基づいた画像データ解析手法をソフトウェアプログラムとして実装し、医学分野の連携研究者らから提供される医学データを具体的に解析する。医学病理画像は多種多様な組織像を示し、その再現性のある組織分類方法の確立は病理形態学の基本的な解決困難な問題である。また計測技術の発達により、画像診断のデータ量は急激な増加を続けるビッグデータとなっており、その分析には、計算機と実用的な解析アルゴリズムが必要とされている。従来の画像解析で経験的に設定されていた画像処理のパラメータ設定問題について、パーシステントホモロジー群の考え方を導入し、数学的に裏付けされた再現性のある組織分類手法を確立する。ホモロジー量による診断指標がどのような医学的意味を持ち、有用であるかを示すには、現場の医学データへの適用事例を増やす必要がある。連携研究者から提供されるマイクロCTデータ、顕微鏡標本データからパーシステンスダイアグラムを具体的に計算し、統計分析に基づいた議論により実用的な解析手法の構築にもフィードバックする。空間3次元データについて、パーシステントホモロジー群を計算するため、既存ソフトウェアの拡張を行い、空間次元、境界条件が異なるデータに適用可能となった。具体的な病理画像に適用するため、系統的なダイアグラム作成法について検討を進めた。効果的な標本データの撮影方法と判定方法についても検討し、他研究機関と連携して、それぞれの倫理委員会の審査を開始した。ホモロジー理論による病理画像の形態分析として、免疫組織化学染色された乳がんの顕微鏡画像からパーシステントズダイアグラムを計算した。病理医が目視観察し、直感的な判断、または実際に数えることによって算出する標識率に対応する量として、パーシステントホモロジー指数を定義し、パーシステントダイアグラムの計算結果から評価した。この指数は、連携研究者との共同作業と議論から考案し、病理医の直感に近いものとなっている。標識率だけでなく、細胞核の形態についての情報抽出についても検討した。結果を英文の共著論文としてまとめ、国際学術誌に投稿し、応用トポロジーの国際学会で発表予定である。また結果の一部を和文総説として、病理学分野の国内誌に発表した。計算トポロジー解析の計算事例を増やすことを目指し、高分子共重合体系のミクロ相分離モデルを考案した。その数値シミュレーションによって,興味深いトポロジーを持つ相分離構造群を再現することに成功し、3Dトモグラフィーによって実験から再構成された構造と比較した。結果を、実験研究者を含む材料科学分野の研究者らと英文の共著論文としてまとめ,国際学術誌に発表した。免疫組織化学への応用例として、浸潤性乳がんの染色画像のパーシステントダイアグラムによる定量的な分析を行った。ホモロジー理論に基づく数値指標を提案し、病理医の目視判断と比較評価した。最終年度(平成29年度)は成果発表を中心に行った。免疫組織化学染色された乳がんの顕微鏡画像から計算したパーシステントダイアグラムについて、パーシステントホモロジー指数(Persistent Homology Index, PHI)を定義し、病理医の目視観察による画像診断指標と比較した。我々が導入したPHIは、従来の指標である標識率と整合的であり(統計的に有意な順相関がある)、ホルモン療法適用基準に対する核グレード分類においては、標識率よりもよい正答率を確認した。成果を連携研究者の病理医らとの欧文共著論文としてScientific Reports誌に発表した。応用トポロジーの国際会議(Applied Argebraic Topology 2017)において口頭発表、また日本応用数理学会2017年度年会において、正会員主催オーガナイズドセッション「計量(デジタル)病理学のフロンティア」を企画し、4名の講演者を招待して座長を行った。計算ホモロジーの適用事例を増やすことも本研究の目的である。マイクロCT画像から再構成する3次元構造の分析については、1次元、2次元ベッチ数と0次元ベッチ数との比を分類指標として定義し、その数学的な基礎を与えた。骨微細構造データに適用し、その結果を連携研究者の整形外科医らとの欧文共著論文としてまとめ、現在、投稿中である。日本数学会2018年度年会では、口頭発表を行った。高分子共重合体系のミクロ相分離モデルの数値シミュレーションについては、温度変化に対する3次元構造変化(ラメラ状からオニオン状へ)を再現することに成功し、実験における観察結果と比較した。成果を実験研究者を含む材料科学分野の研究者らと英文の共著論文としてまとめ,国際学術誌に発表した。

1ウサギ腱移植モデルのマイクロCT画像データから再構築した3次元構造について、微細構造の骨梁数、開気孔、閉気孔の数を示す位相的不変量を計算した。組織学的観察結果と比較しながら、骨形態計測における定量的指標としてベッチ数比を提案した。2病理診断の免疫組織化学について、パーシステントホモロジー理論による定量的評価法を提案した。乳がん患者の染色画像データから計算したパーシステント図から新しい特徴量を定義し、病理医らの目視判断による従来の結果と比較検討した。病理画像データに計算ホモロジー解析を適用し、標識率による従来の結果との比較検討しながら、パーシステンスダイアグラムに基づいた定量的な判定方法を示す。計算ホモロジーの計算を免疫組織化学の他の染色画像についても適用し、方法論の汎用性を示す。新しく倫理委員会での審査承認を待つ必要がある。数学的見方と病理医側からの見方では、重要視する点が異なる場合が多い。視点を交差し、お互いの分野の価値観を尊重した協働姿勢が重要である。成果発表においては。この点についても強調する必要がある。ホモロジー理論による計算事例を単に増やすだけではなく、築いた連携体制を維持強化し、研究ネットワークの拡大を目指す。応用数学年度途中( H 27年7月)での採択決定により、国際会議等への参加計画に間に合わなかった。購入予定の計算機ワークステーションのバージョンアップが年度内に間に合わず,それを待ってから購入を実施するために次年度へ繰り越すことにした.3年ぶりのバージョンアップである為,それを待つことによって,現在使用中の計算機ワークステーションを効果的に更新できる.国際会議等、成果発表及び連携研究者らとの打合せのための旅費として使用する。また、ソフトウェアの更新費用として一部使用する。バージョンアップが年度を明けた4月に実施されたため,予定どおりに計算機ワークステーションを購入し,必要なソフトウェアと合わせて整備する.
遷移金属触媒による含典型元素π共役系の構築

本年度は金触媒によるベンゾシロール骨格構築反応、ロジウム触媒によるベンゾフラン骨格構築反応を開発した。1. Buchwald型ボスフィン配位子を持つカチオン性金触媒存在下、ジクロロメタン中室温下においてアリルジメチル(2-ペンチニルフェニル)シランを反応させたところ、分子内transアリルシリル化が進行し、3-アリル-1, 1-ジメチル-2-プロピルベンゾシロールを97%収率で与えた。アルキン末端置換基としてアルキル基、エステル基、アルキニル基、アリール基、ハロゲンが適用可能であり、対応するベンゾシロールを良好な収率で与えた。また、アリル基をメタリル基、クロチル基、シクロヘキセニル基などに変えても反応が進行した。同様の条件下、分子内transアリルゲルミル化によりベンゾゲルモール誘導体も得られた。2. 2-フェニルエチニルフェノールを[RhCl(cod)]_2とrac-BINAPから調製した触媒存在下、トルエン中80°Cで加熱したところ、分子内環化反応が進行し、2-フェニルベンゾフランが75%収率で得られた。10等量のアクリロニトリルの存在下、THF中80°Cでこの反応を行うと、中間体のベンゾフラニルロジウム種の電子不足アルケンへの1, 4-付加が進行し、3-(2-フェニルベンゾフラン-3-イル)プロパンニトリルを75%収率で与えた。アクリロニトリルやメチルビニルケトンなどの電子不足アルケンも同様に反応し、対応する生成物を与えた。また、イソシアナートやホルムアルデヒドなどのカルボニル求電子剤も本反応に適用可能であった。分子内にあらかじめ求電子的な反応点を組み込んだ基質の反応では、連続的な酸素-炭素/炭素-炭素結合生成によって3環性、4環性のベンゾフラン誘導体が得られた。本年度は2つのシロール骨格を構築する反応として、ルテニウム触媒二重trans-ヒドロシリル化による2,5-ジアリールシロールの合成、および閉環メタセシスによるシロール合成を開発した。1.カチオン性ルテニウム触媒([Cp*Ru(MeCN)3]PF6)存在下、1,2-ジクロロエタン中室温下において1,4-ジフェニルー1,3-ブタジインにジフェニルシランを反応させたところ、二重trans-ヒドロシリル化反応が進行し、1,1,2,5-テトラフェニルシロールを51%収率で与えた。一方、ヒドロシリル化剤として9-シラフルオレンを用いたところ、対応するスピロ型シロールが80%収率で得られた。非対称1,4-ジアリール-1,3-ブタジインやヘテロアリール置換1,3-ジインなども本反応に用いることができ、それぞれ対応するシロールを与えた。また、シロールをモノマーとする鈴木-宮浦カップリングからはシロール部位を主鎖に持つ共重合体が得られた。2.ジメチル(1-フェニルビニル)(2-ビニルフェニル)シランをGrubbs第1世代触媒存在下、トルエン中80°Cで加熱したところ、閉環メタセシスが進行し、2-フェニル-1-シラインデンが17%収率で与えた。一方、Grubbs第2世代触媒を用いたところ、反応効率が劇的に向上し、定量的に閉環メタセシス生成物が得られた。また、本閉環メタセシス反応はSchrock触媒によっても進行した。ケイ素架橋ジエンの閉環メタセシスによるシロール合成は様々な置換基および官能基を持つ基質に適用でき、従来法では合成が困難であった多置換シロールも得ることができた。得られた1-シラインデンの中には極めて高い蛍光量子収率を持つもの(2-フェニル:83%,2-(2-ナフチル):96%)があった。

分子内にあらかじめ求電子的な反応点を組み込んだ基質の反応では、連続的な酸素-炭素/炭素-炭素結合生成によって3環性、4環性のベンゾフラン誘導体が得られた。
気体カー効果を応用した非接触空間電荷電界・密度の測定法

気体カー(Kerr)効果を用いた非接触空間電界測定法を発展させて、従来、測定が困難とされてきた弱電離空間の電界および空間電荷密度を非接触で測定するシステムの構築が本萌芽研究の目的である。平成20年度の成果をまとめると以下のようになる。B.ポアッソン場計測可能性の検討1)イオン量と空間電界を独立に制御できる装置を用いて、大気圧開放空気中に生じる複屈折(位相差)の測定を行い、検出された複屈折はイオン流量と正の相関関係があることを見出した。2)イオン流量の影響に関して、イオン流によってコロナ風と呼ばれる中性分子の流れが生じるため、その影響をイオン流量の影響とを分離して測定する必要があることが判明した。そこで、イオンを遮蔽し、イオン風による中性分子の流れの影響を測定した結果、イオンのカー効果と共に、コロナ風による中性分子密度の揺らぎの影響が支配的であることを示唆する結果が得られた。3)上記2)の結果からイオン流場におけるカー効果を精度良く測定するためには、中性分子の影響を除去する必要があり、今後の課題と言える。中性分子の影響を除去することができれば、放電空間やイオン存在下における電界の測定が可能であり、また、その空間電界からイオン密度を算出することが可能と考えられる。本研究の目的は、イオンのカー効果を実験的に検証することにより、気体カー効果による非接触電界計測法の信頼性を高め、かつその適用範囲をポアソン場へ拡張すること、および新しいイオン密度計測手法を提案することである。まず、気体イオンのカー定数を測定するために、イオン量と電界が独立に制御できるような実験系を構築した。この実験系は3枚の平行平板電極から構成される。最上部の平板電極には多数の針電極が設置され、針電極とメッシュ状中間電極のとの間の電圧を調整することでコロナ放電状態を変化させてイオン量を調整できる。また、メッシュ状中間電極と最下部の接地平板電極間の電圧を調整することで、測定空間の印加電界を調整できるような構造である。この実験系により形成されるイオン流場に対して、筆者らが開発した高感度複屈折測定装置を適用して、複屈折現象を観測することによりカー定数の評価を行った。高感度複屈折測定装置は、投光部(レーザ、レーザ、偏光子、位相変調器)、多重反射ミラーユニット、受光部(O/E変換器)、信号処理部(ロックインアンプ、オシロスコープ)より構成される。本年度の研究成果を以下にまとめる。(1)大気圧空気中のイオン流場における気体Kerr効果測定電極装置を作製し、偏波間位相差、電界強度、イオン密度の定量的な測定を行うことに成功した。(2)大気圧空気中のイオン流場において、電界強度とイオン量のそれぞれの影響を分離して測定することに成功した。これにより本測定系を電界強度おびイオン量測定装置として適用できることを示せた。(3)大気圧空気中のイオン流場においては、複屈折に対して与える影響を電界強度とイオン量で比較すると、イオン量の影響が支配的であることを示した。特に、大気中のイオン密度が1.7×10^14m^-3を超えた揚合に、大きな偏波間位相差が観測された。
染色体分離と小胞輸送制御への関与が期待される低分子量G蛋白質Gieの機能解析

低分子量G蛋白質は様々な細胞内のシグナル伝達を制御するスイッチ分子として機能する蛋白質群であり、生理応答の制御に極めて重要な位置を占めている。当研究室で単離・同定した低分子量G蛋白質Arl8/Gieは、多細胞生物種間で非常に高度に保存されていることや線虫においてArl8の発現抑制が胚性致死の表現型を示すことから、生体内で非常に重要な機能を担っていると考えられた。近年になり、Arl8はリソソーム小胞に局在することが報告されたが,未だその詳細な機能及び分子機構に関しては不明だったことから、私は培養細胞を用いてArl8の機能の解明を進めた。私はEpidermal growth factor(EGF)の輸送過程をモニターすることにより、Arl8を発現抑制した細胞において、細胞内に取り込まれたEGFが通常よりも早いタイミングでリソソームに輸送され、分解されることを明らかにした。このArl8の発現抑制により生じる早いEGFの分解は後期エンドソームに局在するSNARE分子syntaxin7の発現抑制により部分的に抑制されたことから、Arl8は後期エンドソームとリソソームの融合に対して抑制的に働く分子であることが示唆される。さらに、私はArl8の発現抑制により、cation-independent mannose 6-phosphate receptor(CI-M6PR)のリソソームによる分解が引き起こされること、また、後期エンドソーム、リソソームの形態に異常が生じることを明らかにし、Arl8が正常なリソソームの形成に必須な分子であることを見出した。当研究室で単離・同定した低分子量G蛋白質Ar18/Gieは、多細胞生物種間で非常に高度に保存されていることや線虫においてAr18の発現抑制が胚性致死の表現型を示すことから、生体内で非常に重要な機能を担っていると考えられた。近年になり、Ar18はリソソーム小胞に局在することが報告されたが、未だその詳細な機能及び分子機構に関しては不明だったことから、私は培養細胞を用いてAr18の機能の解明を進めた。リソソームは細胞内に取り込まれた蛋白質あるいは脂質の分解の場として主に機能している。そこで、私はリソソームにおける蛋白質分解にAr18が関与しているかについて検討し、Ar18の発現抑制が蛋白質の分解の遅延を引さ起こすことを見出した。更に、このようなリソソームの機能に関して、Ar18がどのような分子を介して働いているのかを明らかにするために質量分析を用いて相互作用因子を探索し、その結果、複数の候補分子を同定した。今後はAr18がこれらの相互作用因子を介して、どのように蛋白質分解機構に関与しているのかを明らかにしていくことが課題である。また、Ar18の個体での機能を明らかにするためにAr18欠失マウスを作製したので、前述のin vitroの実験と平行して、Ar18の欠失が個体にどのような影響を与えるかについて解析していきたいと考えている。リソソームはエンドサイトーシスやオートファジーによって取り込まれた蛋白質・脂質等の分解の場として機能し、内部には非常に多くの加水分解酵素群を有している細胞小器官である。また、リソソーム酵素の欠失等によるリソソーム機能の異常は、リソソーム病を代表とした様々な重篤な疾患の原因にもなっている。我々の研究グループが単離・同定した低分子量G蛋白質Arl8は、主に後期エンドブーム/リソソームに局在することが報告されている唯一のArf/Arl蛋白質であるが、その生理的役割に関しては未だ明らかになっていない。私は、Arl8の機能的役割を解析する目的で、Arl8を発現抑制した際の細胞内オルガネラの形態及び機能について検討した。その結果、Arl8を発現抑制した細胞において後期エンドソーム/リソソームが核近傍に集積すること、さらに、リソソーム酵素の一つであるカテプシンDの成熟型の量が顕著に減少することを見出した。一般にリソソーム酵素群は、ゴルジ体においてマンノース6-リン酸受容体と結合するによりエンドソームヘと輸送され、前駆体から中間体へとプロセシングを受けることで、最終的に生成した成熟型酵素がリソソームに局在することが知られている。興味深いことにArl8を発現抑制した細胞ではマンノース6-リン酸受容体の発現の消失が認められ、カテプシンDの前駆体から中間体へのプロセシング速度が遅延していた。以上の結果は、Arl8の発現抑制によりマンノース6-リン酸受容体量が減少し、ゴルジ体からエンドソームヘのカテプシンDの輸送速度が低下したことで、成熟型カテプシンDの量が減少したことを示唆している。以上により、Arl8がリソソーム酵素の正常な成熟過程に必須の役割を果たす低分子量G蛋白質であることが考えられた。

近年になり、Arl8はリソソーム小胞に局在することが報告されたが,未だその詳細な機能及び分子機構に関しては不明だったことから、私は培養細胞を用いてArl8の機能の解明を進めた。私はEpidermal growth factor(EGF)の輸送過程をモニターすることにより、Arl8を発現抑制した細胞において、細胞内に取り込まれたEGFが通常よりも早いタイミングでリソソームに輸送され、分解されることを明らかにした。このArl8の発現抑制により生じる早いEGFの分解は後期エンドソームに局在するSNARE分子syntaxin7の発現抑制により部分的に抑制されたことから、Arl8は後期エンドソームとリソソームの融合に対して抑制的に働く分子であることが示唆される。さらに、私はArl8の発現抑制により、cation-independent mannose 6-phosphate receptor(CI-M6PR)のリソソームによる分解が引き起こされること、また、後期エンドソーム、リソソームの形態に異常が生じることを明らかにし、Arl8が正常なリソソームの形成に必須な分子であることを見出した。
海産ポリエーテル天然物の全合成およびその構造と生物活性の多様性との相関関係

ブレベトキシン類を代表とする海産ポリエーテル系天然物は、複雑で巨大な分子構造と強力な生物活性を有することから、有機化学や生化学領域で多いに注目されている。これら天然物は、中員環エーテルが梯子状に連続縮環した共通の構造モチーフを有するにもかかわらず、非常に多様性に富んだ生物活性を発現する。本研究者は、分子構造と生物活性の多様性との相関を解明すべく、一連のポリエーテル系天然物およびその構造類縁体を有機合成によって調達・ライブラリー化し、多面的に生物活性評価を行うことで、情報の集積化をはかることとした。本年度は、昨年度に引き続き、新規海産ポリエーテル系天然物ブレベナールの全合成研究を行った。独自に開発した収束的ポリエーテル骨格合成法に基づき五環性骨格を構築した後、左右の不飽和側鎖を順次導入し、Badenにより報告された提出構造式の全合成を達成した。しかし、提出構造式の合成品の^1Hおよび^<13>CNMRスペクトルが天然物のそれらと一致しなかったことから、提出構造式の改訂の必要性を明らかにした。合成品と天然物それぞれのスペクトルデータを詳細に解析したところ、C26位の立体化学が誤って決定された可能性が示唆された。そこで、提出構造式のC26エピマーを改訂構造式とし、これを全合成した。その結果、合成品と天然物の、旋光度を含めた各種スペクトルデータが完全に一致した。以上により、ブレベナールの全合成、構造改訂ならびに絶対立体配置の決定に成功した。さらに、本天然物およびその構造類縁体の量的供給を実現すべく、より効率的な第二世代全合成研究を行った。また、本年度は抗真菌活性ポリエーテル天然物ガンビエル酸の全合成研究に着手した。まず、非環状部分構造を含むAB環部フラグメントの収束的合成を、アルデヒド-アセチリドカップリング反応とジアステレオ選択的ブロモエーテル化を鍵工程として達成した。1.海産ポリエーテル系天然物ブレベナールの全合成研究:ブレベナールは、赤潮原因渦鞭毛藻Karenia brevisより単離・構造決定された海産ポリエーテル系天然物である。本天然物は、神経毒ブレベトキシン類の電位依存性ナトリウムチャネルに対する結合を競争阻害する拮抗剤であるが、魚毒性を示さない点で興味深く、チャネル蛋白の機能解析における新しいタイプの有機小分子として期待できる。ブレベナールの構造を基盤とするチャネル蛋白機能制御分子の創出を目指し、本年度はその一環として本天然物の全合成研究を行った。筆者らが独自に開発した鈴木-宮浦カップリング反応を機軸とするポリエーテル骨格構築法を駆使し、ブレベナールの五環性ポリエーテル骨格を収束的に合成した後、多置換ジエナール側鎖をStille反応により立体選択的に構築し、さらに数段階を経て全合成を達成した。しかし、合成品の各種スペクトルデータは、天然物のそれらと一致しなかったことから、Badenらにより提出された構造式の改訂が必要であることを明らかにした。2.海産神経毒ガンビエロールの構造活性相関:ガンビエロールはシガテラ食中毒原因渦鞭毛藻Gambierdiscustoxicusの培養藻体より単離・構造決定されたポリエーテル天然物で、強力なマウス致死毒性を発現する。しかし、本天然物の藻体からの試料調達が非常に困難であるため、その生物活性の発現機構はこれまで未解明であった。本年度は、マウス味覚細胞を用いた電気生理学的研究により、ガンビエロールが電位依存性カリウムチャネルを特異的に阻害することを明らかとした。次いで、現在までに化学合成により調達したガンビエロールの構造改変体の生物活性を評価することで、カリウムチャネル阻害能に関する構造活性相関につき一定の知見を得た。

まず、非環状部分構造を含むAB環部フラグメントの収束的合成を、アルデヒド-アセチリドカップリング反応とジアステレオ選択的ブロモエーテル化を鍵工程として達成した。
窒素類に関する森林流域の水質浄化機能の定量評価手法の開発に関する研究

昨年度までに収集した森林流域での気温と地温データを用いて,気温値を利用して地温を予測する地温モデルを構築した.そしてこれまで構築してきた硝酸態窒素流出タンクモデルに応用し,硝酸態窒素の流出過程についてのモデル化の検討を行った.1.気温-地温サブモデルの構築:硝酸態窒素の流出過程を精度よくモデル化するためには地温データが必要となる.また可能であれば観測例の豊富な気温データを利用して地温を推測できればモデルの汎用性が広がる.そこで徳島県白川谷森林試験流域で収集した気温,地温データを使って,気温-地温サブモデルの構築を行った.その結果日平均地温を精度よく再現できるサブモデルを構築することができた.2.気温-地温サブモデルの硝酸態窒素流出タンクモデルへの適用:気温-地温サブモデルを硝酸態窒素流出タンクモデルに適用して,土壌中の硝化量の算定に用いた.そして渓流水質の季節変化の再現を通してモデルの検討を行った.その結果,これまで気温を硝化量の算定に用いてきた同流出モデルよりも精度の良い流出モデルを構築することが出来た.特に盛夏から晩秋にかけての渓流水濃度の再現精度は以前のモデルより増した.しかしながら梅雨期の渓流水質変化の再現性が若干悪く,これは硝化量の算定に地温以外の要素も大きな影響を与えていると結論を得た.そこで今後は温度以外の要素(例えば土壌水分量の変化)もモデルに取り込んで,より精度の良いモデルとすることが必要である.窒素類を代表する物質として硝酸態窒素に注目し、その流出機構をモデル化するために必要な観測データの収集とモデル化のための検討を行った。1.モデル化のための観測データ収集徳島県白川谷森林試験流域(徳島県三好郡山城町栗山)においてこれまで行ってきた、渓流水、土壌水及び降水の水質観測の他に、月1回の頻度で土壌のサンプリングを行った。1回のサンプリングでは深さ10cmから50cmまで、10cm毎に合計5つの土壌を採取した。この作業は来年度半ばまで継続して行い、全窒素量の分析に供する予定である。あわせてモデリングに必要不可欠な地温データ(深さ20cmと40cmの2深度)も収集した。2.モデル化のための検討前年までに得られた、気温データ及び水質データを利用して、硝酸態窒素の流出機構(硝化・流出)のモデリングを行って、渓流水質(硝酸態窒素濃度)の季節変化の再現を試みた。その結果、気温データと水質データだけでも渓流水質の季節変化を大まかに表現できたが、春期から夏期にかけての変化を的確に再現するためには、当初の構想通り、地温データをモデルに組み入れる必要があることが分かった(水工学論文集42巻で発表)また、硝化過程のモデリングや脱窒過程を検証するデータとして土壌中の全窒素量の把握も必要であることか分かった。3.次年度の予定収集している地温データと土壌サンプルを用いて、硝酸態窒素の森林土壌からの流出過程をより的確に表現しうるモデルの構築を行い、森林流域の水質浄化機能の定量評価を試みる予定である。昨年度までに収集した森林流域での気温と地温データを用いて,気温値を利用して地温を予測する地温モデルを構築した.そしてこれまで構築してきた硝酸態窒素流出タンクモデルに応用し,硝酸態窒素の流出過程についてのモデル化の検討を行った.1.気温-地温サブモデルの構築:硝酸態窒素の流出過程を精度よくモデル化するためには地温データが必要となる.また可能であれば観測例の豊富な気温データを利用して地温を推測できればモデルの汎用性が広がる.そこで徳島県白川谷森林試験流域で収集した気温,地温データを使って,気温-地温サブモデルの構築を行った.その結果日平均地温を精度よく再現できるサブモデルを構築することができた.2.気温-地温サブモデルの硝酸態窒素流出タンクモデルへの適用:気温-地温サブモデルを硝酸態窒素流出タンクモデルに適用して,土壌中の硝化量の算定に用いた.そして渓流水質の季節変化の再現を通してモデルの検討を行った.その結果,これまで気温を硝化量の算定に用いてきた同流出モデルよりも精度の良い流出モデルを構築することが出来た.特に盛夏から晩秋にかけての渓流水濃度の再現精度は以前のモデルより増した.しかしながら梅雨期の渓流水質変化の再現性が若干悪く,これは硝化量の算定に地温以外の要素も大きな影響を与えていると結論を得た.そこで今後は温度以外の要素(例えば土壌水分量の変化)もモデルに取り込んで,より精度の良いモデルとすることが必要である.
ナノ分析顕微鏡を用いた光電変換現象の原子分解能観察

本研究では、光と物質との相互作用を原子レベルで調べるために、1光入射型走査型プローブ顕微鏡を実現し、2原子操作技術によってクラスタを作成することを目的とした。基板試料として用いる透明試料(Al2O3やLaAlO3、SrTiO3)の原子レベルでの平坦化に成功した。特にAl2O3 (0001)表面では、ユニットセル内の原子を高分解能に画像化することに成功した。光入射用のAl2O3プリズムを用いた入射実験をできるように加熱可能なサンプルホルダを開発した。Al2O3 (0001)表面でSi(111)表面上で、室温環境で原子操作を行い、AuやPb、Snなどの金属原子のクラスタを作成することに成功した。本研究では、測定試料基板を原子レベルで平坦な表面清浄化されたサファイヤ(もしくはルチルTiO_2やチタン酸ストロンチウムSTOなどの金属酸化物材料)のプリズム(1辺が1cm以下程度)とし、試料表面に光電変換材料を配置させる予定である。探針は導電性の金属探針を用い、電極も兼ねており、光によって生じる電荷(電流)を検出する。単結晶プリズム表面への光電変換材料の配置は蒸着によって行う。光電変換材料はナノレベルではクラスタ状のナノ構造体となっている。リズム背面からレーザー光を入射させ、クラスタ材料内部の電子を励起させる。全反射プリズムを使う理由は、探針先端(原子1個のレベル)で光による電子状態を捉えるために必要であると判断したためである。つまり、一般的な面内入射では、探針先端でない箇所と試料の別の位置との応答を見てしまう可能性があると考えている。このような実験構成でクラスタ構造と電子励起の状態を原子レベルで画像化する。具体的には、クラスタ構造の原子分分解能測定にはNC-AFM測定を、ナノ構造体の電子状態の測定はSTM、光によって励起された電荷の測定はKPFMを利用する。今年度はサファイヤの短冊形試料を用いて、試料清浄化条件と非接触原子間力顕微鏡での測定条件の探索を行い、原子分解能測定に成功した。来年度はプリズム型の平坦な試料を作製し、光入射型NC-AFMの導入、清浄表面プリズム上でのナノ構造体の実現と電荷測定、を行う。平成25年度の研究計画としては、(1)測定試料基板を原子レベルで平坦な表面清浄化されたアルミナのプリズムを実現させ、(2)試料表面に光電変換材料をクラスタ構造で配置し、(3)原子レベルで光電変換現象を観察することを目指した。プリズム上のクラスタ構造の原子分解能測定には非接触原子間力顕微鏡(NC-AFM)を、ナノ構造体の電子状態の測定は走査型トンネル顕微鏡(STM)を、光によって励起された電荷の測定はケルビンプローブ力顕微鏡(KPFM)を利用する。具体的な研究の進め方としては、アルミナの短冊形試料を用いて、再現性のある試料清浄化条件を見出し、それをプリズムに適用したいと考えていた。また、光入射型NC-AFMの導入し清浄表面プリズム上でのナノ構造体の実現と電荷測定を行う計画であった。短冊状のアルミナ試料の清浄表面測定において、R31xR31ユニットセル内部の個々の原子を、凹凸像としては初めて明瞭に観察することに成功した。一方、清浄表面作成には再現性が低いことがわかり、加熱によるアルミナ材料の還元やアルミな表面へのSi蒸着による表面の還元などを検討し実験を行った。その結果、清浄表面が作成できる頻度が向上した(実験階数がまだ少ないため、数値的には明確な改善が見られていない)。また、プリズムの清浄化に向けてプリズム用ホルダを開発した。このホルダの特徴は、小型のプリズムを固定しても光路を確保できる、プリズムの加熱を行うことができる、などの特徴をもつ。また、光を照射しない状態での原子レベルでの実験も平行して進めた。その結果、AFM/STM同時測定の制御性を向上させ、力とトンネル電流の関係を明らかにすることができた。また、原子操作実験に関しては原子を移動させてクラスタ作成を行うことに成功した。今後、アルミナ表面の清浄化に関する問題を解決し、本研究課題の主テーマを直ちに実行する。プリズム材料で用いるAl2O3(0001)表面の清浄化について、再現性が問題であった。真空に導入する前に行う処理の改良を行うことで、再現性を向上させることが可能になった。LaAlO3(100)表面においても表面清浄化に成功した。

原子操作におけるクラスタ作成においては、Pbトライマーを構成する3個のPb原子と位置交換したSiアドアトムの吸着位置とスイッチング機構の解明を、STM局所状態密度の実験と理論計算などで行なった。その結果、Pbトライマーを作製して、STMトンネル電子注入を行った場合、Pb2Si3クラスターが吸着位置を変えていることを、実験と理論計算の比較で明らかにした。また、2個のPb原子がSiアドアトムと交換して吸着していることも明らかにした。Pb2Si3クラスターのスイッチは、室温で5個のバイナリー原子クラスターが位置交換することを発見した。26年度が最終年度であるため、記入しない。走査型プローブ顕微鏡26年度が最終年度であるため、記入しない。サファイヤ基板表面の清浄化条件の探索に時間がかかり、その結果、装置組み込みに遅れが生じた。今年度は装置組み込みに注力していく予定である。真空外からの光路を確保できるような装置設計を完成させ、単結晶プリズムを加熱できる処理部も同時に作成する。アルミナ表面の清浄化プロセスではスパッタとアニールを繰り返し行うが、実験を進めていくうちに試料作成条件に再現性があまりないことがわかってきた。パソコンを用いた自動制御で同じ条件での試料作成であっても、清浄表面が出来ない場合が多くあった。そこで、アルミナ表面に関する文献を調査し、またアルミナや触媒を研究している研究者の方々と議論をした結果、アルゴンイオンのような荷電粒子をアルミナに照射するには、アルミナ全体を還元の状態にしておくことが重要であることがわかってきた。このように、アルミナを還元するための様々な方法を試したことが、研究に遅れが生じた原因である。一方、光を照射しない状態での原子レベルでの実験も平行して進めた。その結果、AFM/STM同時測定の制御性を向上させ、力とトンネル電流の関係を明らかにした。また、原子操作実験に関しては原子を移動させてクラスタ作成を行うことに成功した。したがって、アルミナ表面の清浄化に関する問題を解決することができれば、本研究課題の主テーマを直ちに実行できるものと考えている。プリズム表面の清浄化処理を行い、本研究にかかる実験を進める。アルミナを還元する具体的な方法として、1500Kの加熱、もしくはSiをアルミナ表面に蒸着する方法が有効であることが文献調査によってわかってきた。平成25年度にこの実験を行い頻度が向上しているようなデータが得られたが、実験回数がまだ少ないため、数値的には明確な改善が見られていない。そこで、平成26年度の初頭では、まず、これらの2つの方法の有効性を確認する。有効性を確認し、清浄表面作成の再現性が改善されたならば、同じ試料作成条件でプリズム表面の清浄化を試みる。次に、半導体探針を用いて、光から電荷へのエネルギー変換現象の検出を試みる。具体的には、プリズム表面にレーザー光を入射させ、プリズム表面にエバネッセント光を発生させる。この状態で半導体探針を近づけると、探針に電子ー正孔対が生成され静電気力が働くことが、これまでの実験でわかっている。さらに、プリズム表面にナノ構造体、例えばシリコンや色素などを蒸着し、電荷を高分解能で観察する。大型の観測チャンバーを別のもので代用できることがわかり、残額が生じた。当該経費は、次年度経費として使用する。アルミナ清浄表面の作成条件の実験に遅れが生じており、そのための実験を平成25年度に集中して行わざるを得なかった。
アレンの分子内環状付加反応を合成戦略とする天然物の合成

多環式構造を有する天然物の分子骨格構築法として分子環状付加反応は有用な反応である.本研究では,特にアレンを分子肉親ジエン剤として用いることにより従来の常識では考えられない程の高い反応性を有する環状付加反応を実現することに成功し,これを基本戦略として以下に述べる様な,有用な合成反応を確立した.更にこの手法により幾つかの天然物合成も行った.1.多環式ラクトン合成法の開発.アレニルエーテルを親ジエン剤とする分子内Diels-Alder反応は極めて容易に進行するのみならず,付加体は水和と酸化により対応するラクトン化合物に高収率で変換することが可能であり天然物の基本骨格として多くくられる多環式ラクトン類の一般的合成法として有用である.本法をキーステップに用いることにより,ユニークな構造を有するノルセスキテルペン系天然物の(I)Platyphyllide及びセコフラノエレモフィランカルボラクトンの全合成に成功した.特に後者は不斉合成にも成功した.2.フラン環転送反応とイソベンゾフラの心発生法.アレニル・フラフリルエーテルの分子内Diels-Alder反応は容易に進行して一挙に縮環式フラン化合物を与えることを見い出した.更に本生成物は酸触媒下容易に脱水して,反応性中間体として知られるイソベンゾフラン類を与えることも判明した.これらの手法を用いて有用な整理活性を有するフラノセスキテルペン系天然物の基本骨格の簡易合成法を確立した.3.新規インドール合成法の開発.アレンの高い反応性をジエナミドとの分子内Diels-Alder反応に活用することにより,従来法とは全く異なる新奇なインドール合成法を開発することに成功した.本法は非環式化合物から一挙にテトラヒドロインドール骨格を構築する点がユニークであり注目に値する.本法を用いて,興味ある生理活性を有するフェナンスリドンアルカロイドの一種であるHippadineの合成に成功した.多環式構造を有する天然物の分子骨格構築法として分子環状付加反応は有用な反応である.本研究では,特にアレンを分子肉親ジエン剤として用いることにより従来の常識では考えられない程の高い反応性を有する環状付加反応を実現することに成功し,これを基本戦略として以下に述べる様な,有用な合成反応を確立した.更にこの手法により幾つかの天然物合成も行った.1.多環式ラクトン合成法の開発.アレニルエーテルを親ジエン剤とする分子内Diels-Alder反応は極めて容易に進行するのみならず,付加体は水和と酸化により対応するラクトン化合物に高収率で変換することが可能であり天然物の基本骨格として多くくられる多環式ラクトン類の一般的合成法として有用である.本法をキーステップに用いることにより,ユニークな構造を有するノルセスキテルペン系天然物の(I)Platyphyllide及びセコフラノエレモフィランカルボラクトンの全合成に成功した.特に後者は不斉合成にも成功した.2.フラン環転送反応とイソベンゾフラの心発生法.アレニル・フラフリルエーテルの分子内Diels-Alder反応は容易に進行して一挙に縮環式フラン化合物を与えることを見い出した.更に本生成物は酸触媒下容易に脱水して,反応性中間体として知られるイソベンゾフラン類を与えることも判明した.これらの手法を用いて有用な整理活性を有するフラノセスキテルペン系天然物の基本骨格の簡易合成法を確立した.3.新規インドール合成法の開発.アレンの高い反応性をジエナミドとの分子内Diels-Alder反応に活用することにより,従来法とは全く異なる新奇なインドール合成法を開発することに成功した.本法は非環式化合物から一挙にテトラヒドロインドール骨格を構築する点がユニークであり注目に値する.本法を用いて,興味ある生理活性を有するフェナンスリドンアルカロイドの一種であるHippadineの合成に成功した.複雑な構造を有する天然物の分子骨格を構築するのに分子内環状付加反応は極めて有用な反応である。本研究では特に分子内親ジエン剤としてアレン中間体を用いることで容易に各種多環式化合物を合成することに成功した。即ち、アレン分子の"直交性"という幾何学的特性を巧みに活用することにより従来の常識では考えられなかった高い反応性を実現することができ、これにより有用な天然物の基本骨格を極めて容易に合成できるようになった。1.多環式ラクトン合成:アレニルエーテルを分子内親ジエン剤として分子内Diels-Alder反応を行なうとジヒドロフラン型の付加体が高収率で生成する。本化合物は酸触媒存在下容易に水付加が起こり、ラクトールとなりこれを酸化することにより天然物の基本骨格として多く見られる縮環型ラクトンへと導くことに成功した。本法により各種多環式ラクトン類を高収率で合成し、更に本法をキーステップとしたノルセスキテルペン系天然物であるPlatyphyllideの合成にも成功した。2.フラン環転送反応:ジエン部分にフラン誘導体を用いたアレニルエーテルの分子内Diels-Alder反応は、付加だけに留まらず更に進行して、一挙に縮環式フラン化合物を高収率で与えることが判明した。本法は又、反応性中間体であるイソベンゾフラン誘導体の発生法としても有用であり多環式化合物の合成法としての有用性が一段と増した。本法を利用して、フラノセスキテルペン類の基本骨格である三環式フラン誘導体の簡易合成に成功した。3.インドール合成:アレン類の高い反応性をジエナミドとの分子内Diels-Alder反応に応用し、インドール骨格の新規合成法の開発に成功した。

本法はベンゼン誘導体から出発する従来のインドール合成法に比べ、非環式化合物から一段階でインドール骨格を構築してしまう点が極めてユニークであり応用範囲も広い。
イネの発生・形態形成を制御する遺伝子機能の解明

イネの発生・分化の分子機構を理解することを目的とし,主に葉の発生に焦点を当て,以下の様な研究を遂行した。[1] WOX遺伝子ファミリーの一員であるWOX4は,茎頂メリステムを維持する促進因子として,当研究室の先行研究により同定された(Ohmori et al. Plant Cell, 2014)。本研究では,DEX誘導系を用いて,葉の発生初期にWOX4遺伝子の発現を低下させ,その効果を解析することにより,葉の発生におけるWOX4の機能の解明を目指した。WOX4の発現を低下させると,維管束分化の停止や中肋形成の不全,葉肉細胞の活性低下など,重篤な異常が引き起こされた。この時,LOG遺伝子の発現が低下することから,この異常にはサイトカイニンが関わっていることが示唆された。トランスクリプトーム解析を行った結果,WOX4は,細胞周期やホルモン作用などに関わる遺伝子など多くの遺伝子の発現を制御していることが明らかとなった。これらの結果から,WOX4はイネの葉の初期発生を制御する鍵因子であると結論した。[2]葉の形態が異常となったhal1変異体の解析を行った。hal1の葉は細く上向きにカールしていること,その結果,葉は一見直立して見えることが判明した。また,hal1変異体は不完全優性であることを示した。組織学的解析の結果,カールする原因は,機動細胞の成長が不完全であることが明らかとなった。さらに,hal1変異は,内外穎のサイズ制御を通して,小穂形態にも影響を与えていることが示された。[3]細葉の表現型を示すdsl1変異体(alm2より改名)や異型葉的性質を示すcul1変異体を用いて,葉の形態形成に関する発生学的研究をすすめた。また,分げつ形成が不全となったted1変異体やメリステムの維持制御を制御する遺伝子に着目して,腋芽形成の分子機構の解明を目指す研究を遂行した。[1] WOX4が葉の初期発生に重要な役割を果たしていることを明らかにし,論文として発表した(Yasui et al., PLOS Genetics, 2018)。[3] dsl1変異体は,当初細葉という形質を示したため,葉の形態形成の分子機構を解明する目的で研究を開始した。詳細な表現型を行った結果,dsl1では,葉の葉脈パターンや表面構造にも影響があることが判明した。さらに,葉のみではなく,植物体全体や花序(穂)にも,表現型が現れることが判明し,DLS1はイネの発生・形態形成に多面的なはたらきをしていることが明らかになりつつある。また,ポジショナルクローニング法により遺伝子単離を進め,ほぼ,dsl1変異の遺伝子を同定している。cul1変異体を用いた研究も順調に進んでおり,植物の成長に伴って,葉の形態が変化するというユニークな性質がわかりつつある。これまでの研究により,CUL1は転写制御に関わるタンパク質をコードしていることが判明しているので,cul1変異体と野生型との発現を比較するために,マイクロアレイ解析を行い,どのような遺伝子がCUL1によって制御されているのかを解明するための研究も進めている。ted1変異体を解析した結果,腋芽は正常に形成されること,腋芽の伸長が抑制されていることが判明した。腋芽伸長には,オーキシンなどいろいろな植物ホルモンが関与するため,ホルモン作用との関連も視野に入れて解析を進めている。腋芽メリステムに関しては,幹細胞の確立や維持という観点から,既知遺伝子の機能との関連で研究を進め,新たな知見が得られつつある。以上の様に,2つの論文を発表し,他の研究も順調に進んでいることから,上記のような自己評価とした。dsl1変異体に関しては,葉以外の表現型を詳細に解析し,DSL1遺伝子が,イネの形態形成全般にどのように関わっているのかを調べる。現在一つに絞っているDSL1の候補遺伝子を,CRISPR-CAS9法により破壊し,表現型を解析し,dsl1と比較検討する。また,トランスクリプトーム解析を行い,DSL1がどのような遺伝子の発現を制御し,下流遺伝子と表現型との関連を調べる。CUL1に関しては,マイクロアレイ解析によって得られたデータを用いて,詳細な解析を進める。cul1変異体は植物の成長に伴って,葉の形態が変化するため,野生型とcul1変異体の成長初期の葉原基と後期の葉原基を用いて,4つの発現プロファイルを比較する。また,野生型のCUL1ゲノムをcul1変異体に導入し,表現型が相補されるかどうかを検討する。ted1に関しては,ポジショナルクローニング法と次世代シーケンサー解析を併用して,原因遺伝子の同定を行う。同定された場合には,当該遺伝子をCRISPR-CAS9により破壊し,表現型を観察する。また,ted1変異とホルモン作用との関連の解析を進める。