hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ペルオキシソーム病患者幹細胞・疾患モデル生物を用いた発生異常・病態解明と創薬研究

3年間の研究成果として、ゲノム編集技術により重症型と軽症型の2つのタイプのZellweger症候群モデルフィッシュの作成に成功した。そのうち重症型では、極長鎖脂肪酸を含めたペルオキシソーム代謝機能異常を認め、成長障害、運動機能の低下から早期に死亡する患者の病態を反映する所見が再現された。さらに発生早期から脂肪肝を認めることも確認された。本萌芽研究成果により確立されたモデルフィッシュを用いた病態解析法は、ペルオキシソーム病から脂質代謝異常に基づく生活習慣病である非アルコール性脂肪肝の病態解明、治療法開発研究の展開が期待される。国内唯一のペルオキシソーム病診断拠点を有する申請者が、ペルオキシソーム機能異常と病態との関係を明らかにするために、患者iPS細胞による組織・臓器レベルと、病因遺伝子欠損モデルフィッシュ作成による個体レベルの2つの解析ツールを融合させた斬新な発生異常・病態解明システムを確立し、ペルオキシソーム代謝機能全般を解明して、治療法の開発を目指している。特にZellweger症候群は全てのペルオキシソーム代謝機能が先天的に欠失した究極のペルオキシソーム病で、中枢神経をはじめ全身の臓器に様々な障害を引き起こすが、その病態は不明である。極長鎖脂肪酸やフィタン酸、プラスマローゲンなどのペルオキシソーム代謝異常と病態、発生異常との関連を明確にすることにより、広義のオルガネラ病としての展開が期待される。27年度の成果として、組織レベルではZellweger症候群患者由来の線維芽細胞よりiPS細胞を樹立し、神経細胞への分化過程での形態異常が明らかになったため、検証実験としてヒト対照細胞より樹立したiPS細胞でゲノム編集技術を用いてペルオキシソーム欠損モデルiPS細胞を作成し、次年度の神経分化による発生異常の実証に繋げる。一方、個体レベルではゲノム編集技術を用いて2系統のペルオキシソーム欠損モデルフィッシュの作成に成功した。さらにペルオキシソーム局在化シグナルにGFPを組み込んだ発現ベクターを導入することにより、生体でペルオキシソームが可視化可能なゼブラフィッシュの作成に成功した。またより広範なペルオキシソーム病患者の診断機能強化を目的に、次世代ペルオキシソーム病診断システムを構築した。ペルオキシソーム代謝異常と病態との関連を解明するため、組織レベルでのモデル系としてペルオキシソーム欠損症患者由来のiPS細胞を樹立し、神経系に分化して形態異常を確認し、検証のためのゲノム編集技術を用いたモデルiPS細胞も樹立した。また個体レベルでのモデル系としてゲノム編集技術を用いたペルオキシソーム欠損モデルフィッシュの作成、生体レベルで観察可能なペルオキシソーム可視化ゼブラフィッシュの作成にも成功した。さらに患者診断機能を強化した次世代ペルオキシソーム病診断システムを構築した。以上の患者および疾患モデル系を確立したことにより次年度以降の病態解析に繋げることが可能となった。Zellweger症候群は全てのペルオキシソーム代謝機能が先天的に欠失した究極のペルオキシソーム病で、中枢神経をはじめ全身の臓器に様々な障害を引き起こすが、その病態は不明である。さらにペルオキシソーム病診断機能を強化し、新たなペルオキシソーム病の探索も目指している。極長鎖脂肪酸やフィタン酸、プラスマローゲンなどのペルオキシソーム代謝異常と病態、発生異常との関連を明確にすることにより、オルガネラ病としての新たな展開も期待される。28年度の成果として、診断機能の拡大については質量分析によるペルオキシソーム代謝機能の解析から次世代シーケンサを組み合わせた診断システムを確立し、新規や非典型例のペルオキシソーム病の診断探索を開始した。病態解明については、細胞レベルではZellweger症候群患者線維芽細胞由来のiPS細胞より神経系細胞への分化過程において形態異常が認められたため、検証実験からマイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現解析を行った。さらにゲノム編集技術を用いたペルオキシソーム欠損モデル細胞を作成し、小胞体ストレスやミトコンドリア機能異常の解析によるオルガネラクロストークによる病態解明研究を行っている。個体レベルではゲノム編集技術を用いて作成した2系統のペルオキシソーム欠損モデルフィッシュにおける肝臓における臓器異常を確認し、解析を行っている。診断機能の拡大についてはGC/MSやLC/MS/MSの質量分析による脂肪酸をはじめとしたペルオキシソーム代謝産物の解析から、細胞・タンパク・遺伝子解析にペルオキシソーム関連パネルや全エクソーム解析による大規模遺伝子解析を組み合わせた診断システムを確立し、新規や非典型例のペルオキシソーム病の診断探索を開始した。ペルオキシソーム代謝異常と病態との関連を解明するため、細胞・組織レベルでのモデル系として、ペルオキシソーム欠損症患者由来のiPS細胞を樹立し、神経系に分化して発生異常の確認から、ゲノム編集技術を用いた疾患モデル細胞も樹立した。また個体レベルでのモデル系としてゲノム編集技術を用いたペルオキシソーム欠損モデルフィッシュも作成し病態解明に繋げている。以上の患者および疾患モデル系を確立したことにより最終年度の成果達成に繋げることが可能となった。本研究では国内唯一のペルオキシソーム病診断拠点を有する代表者が、ペルオキシソーム機能異常による発症機序を明らかにするために、細胞、ゼブラフィッシュによる疾患モデル系を確立し、患者試料による解析と併せてペルオキシソーム病の病態解明と治療法の開発を目指した。

そのうちのZellweger症候群は全てのペルオキシソーム代謝機能が先天的に欠失した究極のペルオキシソーム病で、中枢神経や肝臓をはじめ全身の臓器に様々な障害を引き起こすが、その病態は不明である。本萌芽研究では疾患モデルを用いて極長鎖脂肪酸やフィタン酸、プラスマローゲンなどのペルオキシソーム代謝異常と病態、発生異常との関連を明らかにし、患者リソースによる検証可能なペルオキシソーム病研究体系を確立することにより、新たな展開が期待された。最終29年度の研究成果として、ゲノム編集技術により重症型と軽症型の2つのタイプのZellweger症候群モデルフィッシュの作成に成功した。そのうち重症型では、極長鎖脂肪酸を含めたペルオキシソーム代謝機能異常に、成長障害、運動機能の低下から早期に死亡する患者の病態を反映する所見が再現された。さらに発生早期から脂肪肝を認めることも確認された。現在、中枢神経系の病理学的検討と、肝組織を用いたマイクロアレイ解析を進めている。本萌芽研究成果により確立されたモデルフィッシュを用いた病態解析法は、ペルオキシソーム病に留まらず、脂質代謝異常に基づく生活習慣病である非アルコール性脂肪肝の病態解明、治療法開発研究の展開に繋がると予想される。またペルオキシソーム病患者診断機能の拡大についても、従来の典型例の診断システムから、全エクソーム解析と生化学的検証解析を組み合わせた次世代診断システムを確立した。今後、本萌芽研究成果をもとに、国内ペルオキシソーム病診断研究拠点機能を強化し、その成果を国内外に発信していく。3年間の研究成果として、ゲノム編集技術により重症型と軽症型の2つのタイプのZellweger症候群モデルフィッシュの作成に成功した。そのうち重症型では、極長鎖脂肪酸を含めたペルオキシソーム代謝機能異常を認め、成長障害、運動機能の低下から早期に死亡する患者の病態を反映する所見が再現された。本萌芽研究成果により確立されたモデルフィッシュを用いた病態解析法は、ペルオキシソーム病から脂質代謝異常に基づく生活習慣病である非アルコール性脂肪肝の病態解明、治療法開発研究の展開が期待される。組織レベルの解析としては、H27年度の研究成果の検証に引き続き、極長鎖脂肪酸やプラスマローゲンが単独に異常を来すペルオキシソーム病患者iPS細胞を樹立し、神経系細胞を分化誘導してペルオキシソーム代謝産物と遺伝子発現解析を行い、対照、Zellweger症候群患者iPS細胞の解析結果とも比較して、個々のペルオキシソーム代謝異常と神経発生異常や脱髄との関連を明らかにする。個体レベルの解析としては、極長鎖脂肪酸やプラスマローゲンが単独に異常を来すモデルフィッシュを作製して、ヒト欠損症とphenotypeを比較し、代謝産物の測定や遺伝子発現解析を行う。さらにダブル欠損や臓器特異的欠損フィッシュを作製して、個々のペルオキシソーム代謝異常と病態との関連を検証する。
炎症および神経変性疾患の発症・進展を制御する受容体RAGEの多機能性の解明

本計画における成果は以下の通りである。RAGEにリガンドが結合すると、膜直下細胞質領域の391SerがPKCzによりリン酸化を受ける。このリン酸化修飾が後の多彩な信号伝達に必須であり、TLR2とTLR4に共通のアダプタータンパク質であるTIRAPとMyD88をリクルートすることで下流に様々なシグナルを伝達できる(TRAMはリクルートされない)。その結果、NFkB活性化の誘導を介して様々な炎症性サイトカインが誘導される。本成果は、S100タンパク質群をリガンドとするRAGEの炎症憎悪への役割を理解するための大きな手がかりとなるばかりでなく上記疾患の治療対策に貢献することが大いに期待される。RAGEは、多様なS100タンパク質に結合して各々に特異的な情報を細胞内に伝達する機能を持つと考えられているが、その作動機構は未だ不明である。今回我々は、RAGEシグナル伝達機構を解析し、RAGE細胞質領域に結合する候補タンパク質を新に同定した。このことはS100タンパク質群をリガンドとするRAGEの作動機構解明へ向けた大きな手がかりである。RAGE細胞質領域結合タンパク質の発現:HEK293細胞にRAGE細胞質領域を一過性に過剰発現させたところ、発現細胞において顕著なDNA合成の低下とアポトーシスが認められた。またこの発現は、リン酸化酵素Aktの活性阻害と転写因子NFkB、AP-1(炎症生サイトカインの誘導に必須)の活性阻害を引き起こした。これは、RAGE細胞質領域のみの過剰発現が、内因性RAGEに対してドミナントネガティブ効果を生み出していることを意味する。すなわち、RAGE細胞質領域からAkt、NFkB、AP-1の活性化をもたらすシグナルが確かに発せられているのである。RAGE細胞質領域結合タンパク質の解析:HEK293細胞に過剰発現させたRAGE細胞質領域を6Histag抗体共有結合担体によるプルダウンによって回収し、結合タンパク質を高感度質量分析計にて解析した。また同時に、結合の可能性のあるタンパク質群(我々の推測)に対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った。その結果、二つの候補となる結合タンパク質を同定する事ができた。RAGE細胞質領域のリン酸化と候補結合タンパク質の結合:HEK293細胞にRAGE全長を一過性に過剰発現させ、S100A11、S100A12、HMGB1でそれぞれ刺激した。その後、細胞抽出液を調製し、免疫沈降によりRAGE全長を回収したところ、RAGEの細胞質領域が刺激に応じてリン酸化を受けることが判明した。RAGE細胞質領域がリン酸化修飾を受ける事で、結合タンパク質の結合能が上昇した。RAGE活性化状態のイメージングシステムの構築:細胞表面のRAGEにリガンドが結合するとルシフェラーゼ発光が誘導される細胞を作製する事に成功した。現在、本細胞を用いて、各リガンドに対する反応性を比較検討している。RAGEと各リガンドの結合:ビアコア機器を新たに立ち上げ、各リガンドとの相互作用について検討中である。機器の操作のマスターおよび結合の最適条件の決定等に時間がかかったことが理由である。RAGE以外のS100タンパク質受容体の探索:S100A11共有結合担体を用いることで現在、複数のS100A11結合性膜タンパク質を得ることに成功した。現在、他のS100タンパク質に関しても同様に行い、質量分析計にて受容体群の同定を行っている。本研究は、RAGE膜直下シグナル伝達機構の解明に、従来の分子細胞生物学的解析技術と我々独自の生体内RAGE分子の機能状態の動的可視化技術を融合することで、RAGEの作動機構を明らかにし、RAGEを標的とする治療法の開発やスクリーニングシステム開発の基盤にしようというものである。本年度における成果は以下の通りである。1:RAGE膜直下信号伝達機構:RAGEにリガンドが結合すると、膜直下細胞質領域の391SerがPKCζによりリン酸化を受ける。その結果、NFκB活性化の誘導を介して様々な炎症性サイトカインが誘導される。本成果は、S100タンパク質群をリガンドとするRAGEの炎症憎悪への役割を理解するための大きな手がかりとなった。2:RAGE活性化状態のイメージングシステムの構築:HEK293細胞にRAGEイメージングベクター[RAGE(wt)-IRES-GFP-NFkBRE-Luc、および細胞質領域欠損型RAGE(Δcyt)-IRES-GFP-NFkBRE-Luc]を一過性に過剰発現させ、GAGEリガンド(S100A11、S100A12、HMGB1)でそれぞれ刺激した。

その後、RAGEによるNFkB活性(Luc活性)を観察したところ、ワイルドタイプで顕著な活性化を動的に捉えることに成功した。また、Δcytでは、この活性化は検出されなかった。このことより、本実験系がRAGEの活性化検出法として有効であることが示された。3:RAGEと各リガンドの結合:ビアコア機器を立ち上げ、各リガンドとの相互作用について検討を行った。RAGE結合性S100タンパク質間における結合親和定数に大きな差異は認められなかった。4:RAGE以外のS100タンパク質受容体の探索:S100タンパク質共有結合担体を用いることで現在、複数の結合性膜タンパク質を得ることに成功している。現在、各膜タンパク質遺伝子のクローニングを行い、網羅的に相互作用の確認実験を行っている。
大規模地下施設周辺の流体挙動に関するウエルテストトモグラフィー技術の開発

本研究の目的は、地下岩盤中に掘られた観測孔の圧力応答データから岩盤中の浸透率分布を描き出す手段としてウエルテストトモグラフィー技術の開発である。特に、数値逆解析技術の開発、および計測機器の開発を行った。その要点は以下の通りである。(1)多孔質媒体内の三次元圧縮性流れの支配方程式と非線形最小2乗法を組み合わせた非定常データの逆解析技術を開発した。対象領域は3次元差分格子により離散化し、その6面全てに異なる未知浸透率があるものとして逆解析する。逆解析計算は非線形最小自乗法の一つである準ニュートン法、特に、SSVM(Self-scaling Variable Metric method)を組み入れ、目的関数の勾配は最適制御理論により算出するようにした。また、特殊テクニックとして、解析的坑井モデル、変数変換、時間方向の重み付け、ゾーニング、スムージング、行列演算の高速化、主記憶容量の逓減、を図る手法を導入した。(2)数値実験、および室内実験を通して逆解析プログラムの正常動作、再現性、逆解析の分解能、境界条件、初期条件の敏感性などを検討し、良い結果を得た。(3)フィールドにおける計測のために、微小な圧力変化を多点で捉えるマルチパッカー。マルチゲージ受信システムを作成した。圧力センサーは水晶発信型で0-100kgf/cm^2の範囲で誤差は0.01%FSであり、各センサーの読み値はCPUに転送される。(4)ダム建設予定地におけるパルステスト計測結果を利用し逆解析を試みた。逆解析結果は、他の既存データ(地質データ、孔試験データなど)と比較され良い一致が認められた。本研究は、ウエルテストトモグラフィ-技術開発のための、計測機器の開発、実験による検証、および数値解析技術の確立を目的としている。本年度は、以下の研究を行った。1.計測機器の開発高感度の圧力計を装備したマルチゲ-ジ受信システムの開発を行った。この装置は、一つのボ-リング孔内の複数の点で一般的に微弱な圧力変動を観測するものである。圧力計の間にはパッカ-を配置して両者間の干渉を排除している。今後、この装置による室内及び野外実験を行う予定である。2.パルステスト実験2次元岩盤模型を用いて、パルス圧入に伴う受信波形を捉えた。実験では、不飽和帯でのパルステストを想定し、圧入流体を空気とし、圧縮性の高い流体のパルスの有効性を調べた。この結果から、振幅の減衰、位相のズレ等の情報と不均質性との関係を検討中である。3.デ-タ処理のための数値解析技術の確立複数の空間点での圧力変動をデ-タとして、領域内の岩石浸透率分布を求めるためのトモグラフィ-技術の開発、改良、及びケ-ススタディを行った。現在のところ、ワ-クステ-ション上で未知数1000個を越える問題の逆解析が可能となった。ケ-ススタディでは実フィ-ルドスケ-ルの2次元割れ目ネットワ-クモデル、三次元断層モデル等を考え逆解析可能性を検討した結果、いずれもよい再現性が得られたが収束性等改良の余地がある。また、空気を用いた実験の測定値につき逆解析を行い、供試体の浸透率分布との比較を行っている。本年度は、主に次の3点に関し研究を行った。1.マルチゲージ受信システムの改良マルチゲージ受信システムは半径が7cm程度の岩盤孔内に設置するため、地上からの各種配線数をなるべく少なくする必要がある。このため、受信部の水晶発振型圧力計の上部にマイクロコンピュータを取付け、地上からの配線数の減少、地上での情報の取得の効率化を図った。2.室内基礎実験不均質砂岩による二次元岩盤模型を作成し、4点型エアパルステストに関する実験を行った。

岩盤を透過する空気パルスの減衰特性はその周期と岩盤の浸透性に左右されると考えられるため、今年度は、特に、入力されるパルス周期と逆解析特性の関係を調べることを目的として複合パルス(異なる周期のパルスを含むもの)に関する情報計測を行った。3.逆解析技術に関する研究種々のパルス形態を使った実験データの逆解析を行い、逆解析性(収斂速度)の比較を試みた。規則的なパルスと複合的パルスを与えた場合は、収斂計算上、大きな差異はみられなかったが、得られた浸透率分布はどちらも同様の形態を示した。逆解析結果は、今後、実験供試体の部分改変や切りとり小片の浸透率測定などにより検証して行く予定である。本年度の研究の内容及び結果は以下の通りである。(1)ウエルテストトモグラフィーアルゴリズムの改良フィールドデータの大規模逆解析を実行するためのアルゴリズムの作成改良を行った。特に、基本アルゴリズムについて、(a)ウエルモデルの導入・修正、(b)重み付けの検討・修正、スムージングおよび変数変換法の導入と修正、(c)大規模解析における行列演算に関する記憶容量の逓減、を行い、大規模問題をワークステーション上で逆解析出来るようにした。(2)実験室データの逆解析不均質砂岩板中の浸透率分布を求めるためエア-を注入流体とするパルス実験を行った。これは40cm四方の2次元媒体に4点の観測孔を設けた試料に対し、1点を発信点とし全点を圧力受信点とするような計測を繰り返し、最終的に全ての点を発信点とするデータを取得したものである。得られた全てのデータから内部の浸透率を逆解析しその妥当性を検討した。逆解析結果の信頼性を検討するため、試料砂岩板を加工し比較検討を行い、両者の間によい一致をみた。(3)フィールドデータの逆解析フイールドにおける十分なデータの取得は現状では困難であったため、過去にとられているデータより水理物性の逆解析を行った。フィールドでの未知量を約1800とし計算を行ったが、データの質の問題もあり十分な最小化は行われていないが、得られた結果は、現場での他の試験結果との比較から定性的・定量的妥当性が確かめられた。(4)入出力整備と実用解析システムの構築入力インターフェース、解析結果表示グラフィックス等の整備を行い、実用解析システムを整備した。
無電解銅めっきにおける水酸化物コロイドを利用する活性化処理法

プラスチック等の無電解めっきでは、被めっき体表面にめっき核を準備する、いわゆる被めっき体の活性化処理としてSnCl_2とPdCl_2溶液を用いる方法が広く使用されている。本研究ではそれにかわる安価な金属水酸化物コロイドを用いた活性化処理について実験し、次の結果を得た。温度313K、0.2mol/lCuSO_4と0.2mol/lNiSO_4溶液でpH7.8に調整した混合コロイド溶液へABSプラスチックを10分間浸漬し、Cu(OH)_2-Ni(OH)_2の凝集コロイドをプラスチック上に吸着させる。この吸着コロイドを温度298のpH10.6の1g/lKBH_4溶液を用いて還元し、めっき核を形成する。この活性化処理を行うことにより、通常のホルマリン等を還元剤とする無電解銅めっきにより、従来のSnCl_2-PdCl_2系の活性化処理を行なったものと比較しても、均一さ及び光沢においてそん色のない銅めっきが可能であった。また、この活性化処理法を用いて、プラスチック繊維への無電解銅めっきも可能であった。上記の活性化処理条件を鱗片状天然グラファイトの無電解銅めっきに応用した結果、良好な無電解銅めっきが得られた。この活性化処理の良否には天然グラファイト中に含有されるSiO_2を主成分とする灰分が影響し、灰分含有量812%のものには十分な活性化処理が可能であった。グラファイトの銅めっきは、直流モーター用ブラッシの電気伝導度向上に大きな役割を果すと考えられる。上記の活性化処理条件の内、混合コロイドの組成をCu:Niのモル比を1:2あるいはそれ以上にすることにより、ニッケルの無電解めっきも十分可能であった。均一さ光沢においても、従来のSnCl_2-PdCl_2系の活性化処理によるものと比較し、それに近いめっきが可能である。
Aβ蛋白クリアランス促進を基軸としたアルツハイマー病の新規治療戦略

我々が見出した天然資源由来成分Xは、アルツハイマー病の原因タンパク質とされるAβ42を細胞レベルで増加させる。しかしXを長期投与したマウスでは、対象群と比較して脳内Aβ42産生量が減少しており、記憶学習能が高かった。このためXはAβ42の脳内におけるクリアランス機構を活性化させている可能性が考えられた。本研究により、細胞レベル実験においてXに含まれる活性候補化合物Yを単離・同定した。現在Yを長期投与したマウスを作製している。Y投与マウスの脳内Aβ42レベル、記憶学習能を評価し、Yが脳内Aβ42のクリアランス機構に与える影響を解析する予定である。アルツハイマー病(AD)の新規治療戦略としてAβタンパク質枯渇療法を提案する。ADは進行性認知障害を呈する神経変性疾患であり、発症機序はAβの凝集・沈着による神経変性が有力である。申請者は新たに見出した天然資源由来抽出成分X(特許申請のためコード番号とする)含有飼料を用いて、マウス脳内Aβ42(凝集性が高く病因物質と考えられている)産生とクリアランスを促進させた。12カ月飼育後、X含有飼料飼育マウスは通常飼料飼育マウスに比べ脳内Aβ42が減少し、記憶学習能が高くなっていた。本研究はXに含まれる活性成分を単離・同定し、Aβ42産生促進・クリアランスのメカニズムを解析し、Aβ枯渇療法を新構築することを目的とする。本年度は24年齢X含有飼料飼育マウスの作成、Genetipで天然由来成分Xと同様の遺伝子発現を示した既知化合物を添加し、Aβ42の変化を検討を行った。本研究はXに含まれる活性成分を単離・同定し、Aβ産生促進・クリアランスのメカニズムを解析し、Aβ枯渇療法を新構築することを目的とする。24か月齢飼育マウスの解析は終了したが、ターゲットと思われる抽出物の単離に時間がかかっている。アルツハイマー病(AD)の新規治療戦略としてAβ蛋白質枯渇療法を提案する。ADは進行性認知賞を呈する神経変性疾患であり、発症機序はAβの凝集・沈着による神経変性が有力である。申請者は新たに見出した天然資源由来抽出成分X(特許申請のためコード番号とする)含有飼料を用いて、マウスAβ42(凝集性が高く病因物質と考えられている)産生とクリアランスを促進させた。12か月飼育後、X含有飼料飼育マウスは通常飼育マウスに比べ脳内Aβ42が減少し、記憶学習脳が高くなっていた。天然資源由来抽出成分Xから活性成分Yの単離・構造決定はADの根本原因の究明につながる。さらにはAβ42クリアランス促進を基軸としたAβ42枯渇療法はアルツハイマー病の革新的な新規治療法となろう。前年度にターゲット抽出物の単離に時間がかかっていたため、実験の進捗状況が遅れてしまっている。申請者は新たに見出した天然資源由来抽出成分X(特許申請のためコード番号とする)含有飼料を用いて、マウス脳内Aβ42産生とクリアランスを促進させた。本研究はXに含まれる活性成分を単離・同定し、Aβ42産生促進・クリアランスのメカニズムを解析し、Aβ枯渇療法を新構築することを目的とした。本年度は1Xより単離する活性化合物Y(特許申請のためコード番号とする)をドッキングスタディー、核磁気共鳴・質量分析等の分析化学的手法によるYの化学構造解明を行った。2Genetip解析を行い、遺伝子を機能別にクラスター化して、発現遺伝子変動を解析した。過去に報告されたGenetipデータとの比較解析を行った結果、Z(特許申請のためコード番号とする)を長期投与したマウス脳における遺伝子発現とX投与マウスは相同性の非常に高い遺伝子変動をしていることをつきとめた。3Zの化学構造、生理活性よりXにおける活性化合物Yの探索をコンピューターケミストリー手法により探索を行った。またXより単離した活性化合物Y・Z化合物がAβ42産生に関与するか確認するため、現在化合物Y・Z含有餌を用いマウスを短期飼育・長期飼育を行いAβ42産生量評価、行動学的評価、治療効果の評価を行っている過程である。活性化合物Yの単離・大量抽出に時間がとられたため現在も研究が進行中であり、今後の研究において活性化合物Y・Zを投与したマウスの解析を行う。

我々が見出した天然資源由来成分Xは、アルツハイマー病の原因タンパク質とされるAβ42を細胞レベルで増加させる。しかしXを長期投与したマウスでは、対象群と比較して脳内Aβ42産生量が減少しており、記憶学習能が高かった。このためXはAβ42の脳内におけるクリアランス機構を活性化させている可能性が考えられた。本研究により、細胞レベル実験においてXに含まれる活性候補化合物Yを単離・同定した。現在Yを長期投与したマウスを作製している。Y投与マウスの脳内Aβ42レベル、記憶学習能を評価し、Yが脳内Aβ42のクリアランス機構に与える影響を解析する予定である。・スウェーデン型変異を有するヒトAPP695(Aβ産生が著しく増加する変異Aβ前駆蛋白質)を発現する細胞株H4-1NL細胞に、Genetipで天然由来成分Xと同様の遺伝子発現を示した既知化合物を添加し、Aβ42の変化を検討した。しかし、Aβ42に影響を与える天然資源由来成分Xからの活性成分の単離については、現在検討中である。・グリア細胞のマーカーの免疫組織科学染色などの病理的解析を行った。・老年期におけるAβ42定量、行動学的解析を行うため、24か月齢のコントロールマウスならびにX含有飼料飼育マウスを作成中である。抽出物の単離が終わり次第マウスに投与を開始し、解析を行う。29年度は同定した抽出物をAβ42産生過剰細胞に添加・含有飼料飼育のマウスの解析を行い、抽出物の評価を行う。神経病理・Aβ42に影響を与える天然資源由来成分Xからの活性成分の単離・同定を行う。・XによるAβ特異的増加メカニズムを細胞培養系にて明らかにする。・24か月齢のコントロールマウスならびにX含有飼料飼育マウスでのAβ42の定量ならびに行動学的解析を行う。実験の遅れにより、消耗品の購入が遅れた。実験の遅れのため予定通りの支出が不可能であった。購入予定試薬の納品が予定より遅れたため、翌年度支出となった。また研究協力者への謝金が翌年度支出となった。予定通り研究予算として支出する。29年度は、抽出物を細胞に添加・マウスの解析など前年度の予定通りの支出をしていく予定である。予定通り、試薬購入費、旅費、試薬購入費として支出する。
バタフライ型安定有機過酸化物の合成と反応

空気中の酸素をそのまま利用する触媒的有酸素酸化反応により、ビス(アルキルヒドロペルオキシド)類のような複素環を含むバタフライ型有機過酸化物を合成した。この反応条件下で同時に起こるヒドロペルオキシ化反応とエンドペルオキシ化反応の選択性を調べた。得られた結晶性安定型ビス(アルキルヒドロペルオキシド)類を有機酸化剤とする反応を調べた。合成された新規ヒドロペルオキシド類の生理活性(抗菌や除草など)を調べた。空気中の酸素をそのまま利用する触媒的有酸素酸化反応により、ビス(アルキルヒドロペルオキシ)化反応を行い、複素環を含むバタフライ型有機過酸化物の合成を検討した。次に、ヒドロペルオキシ化反応とエンドペルオキシ化反応の選択性は何に基づくかを調べた。得られた結晶性安定型ビス(アルキルヒドロペルオキシド)類を有機酸化剤として用いた反応の検討については、平成23年度までにできなかった。また、合成できた新規ヒドロペルオキシド類について、生理活性試験(殺虫試験、抗菌活性試験、除草試験)を平成23年度中に行い、生理活性の有無を調べた。1.テトラミン酸とテトロン酸誘導体の有酸素酸化反応:どちらの反応からもバタフライ型有機過酸化物は得られなかったが、片方がヒドロペルオキシド、もう片方は閉環してエンドペルオキシドとなった化合物を良好な収率で得ることができた。このことから、ヒドロペルオキシ化反応とエンドペルオキシ化反応の選択性はカルボニル基の性質に基づくと推定できた。2.反応性の検討:テトラミン酸から得られたヒドロペルオキシ体は空気中室温で容易に一酸化炭素の放出を伴って分解し、安定な結晶性オキサゾリジノン類へ定量的に変換されることを見出した。この分解反応にはBaeyer-Villiger型転位反応が含まれていると考えられ、極めて興味ある反応と思われる。この反応については平成24年度にさらに詳しく調べる予定である。3.生理活性試験:本研究で用いた原料や反応で得られた生成物はすべて新規化合物であり、生理活性試験を行った。その結果、幾つかの化合物は殺虫効果と殺菌効果をある程度示したが、その他の化合物は全く活性を示さなかった。得られた結晶性安定型ビス(アルキルヒドロペルオキシド)類を有機酸化剤として用いた反応の検討については、平成23年度中にはできなかった。また、合成できた新規ヒドロペルオキシド類について、生理活性試験(殺虫試験、抗菌活性試験、除草試験)を行い、生理活性の有無を調べた。Mn(OAc)3を酸化剤(触媒)として用いるラジカル反応は、基質および試薬の濃度、反応温度、圧力、雰囲気、反応時間などの反応条件に左右されることを、我々のこれまでの研究で明らかにした。そこで、平成23年度に確立した反応条件をもとに、新しい基質を用いて複素環を含むバタフライ型有機過酸化物の合成を行った。1反応温度はMn(III)錯体のラジカル反応を考慮し、室温とした。また、反応を効果的に行うために、反応温度を50°C以上に上げない定温装置を取り付けたマイクロ波式有機反応実験装置を用いた反応も同時に検討した。2空気中の酸素を取り込みやすくするために、室温でエアーバブラーを取り付けた反応装置で実験を行った。3圧縮酸素(250気圧)の効果を調べるために、オートクレーブ装置(15 kg/cm2200 kg/cm2)を用いて15気圧まで使用可能なガラスリアクター中で反応を行った。4濃度依存性を調べるために、高濃縮条件から高希釈条件まで、それぞれの条件下で本反応を調べた。5複素環-1,3-ジカルボニル化合物はそれ自身Mn(OAc)

3触媒有酸素酸化反応によって直接ヒドロペルオキシ化されるかもしれないと思われたので、アルケン類を加えない複素環-1,3-ジカルボニル化合物自身のMn(OAc)3触媒有酸素酸化反応も詳細に検討した。6各種反応基質によるこれまでの有酸素酸化反応をそれぞれ比較検討し、ヒドロペルオキシ化反応とエンドペルオキシ化反応の選択性を決めるファクターが何であるかを考察した。7合成できた新規ヒドロペルオキシド類について、各種生理活性試験を外部に委託し、調べてもらった。8バルビツール酸類から合成した安定型ビス(アルキルヒドロペルオキシド)類を有機酸化剤として用いたアルケン類のエポキシ化反応やアルコール類の酸化反応、フェノール類の酸化反応などの酸化反応を検討した。目的1の複素環を含むバタフライ型有機過酸化物の合成はおおむね終了したが、他の基質についてもう少し検討してみたい。また、目的3の安定型ビス(アルキルヒドロペルオキシド)類の有機酸化剤としての検討は平成24年度の研究として計画しており、平成23年度までにおおむね研究目的14を達成した。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究目的14のうち、目的1はおおむね達成されたが、他の基質についてもう少し複素環を含むバタフライ型有機過酸化物の合成を検討する。目的2はおおよそ予想がついたので、平成24年度の最終段階で結論づける。目的3は平成24年度の研究計画として実行する。目的4は平成24年年度に新たに合成された基質と生成物について、引き続き生理活性試験を行う。
歯科クラスプ用合金の疲労特性と破壊メカニズム

歯科用金合金、銀合金の機械的性質は350°Cでの時効処理材で最も顕著な時効硬化を示した。一方、溶体化処理材では金合金の引張特性、硬さは時効処理材に比べその値は少なく、しかも溶体化処理温度によって変化しない。銀-パラジウム-銅合金では溶体化処理温度が750°C以上になると引張強さ、硬さが上昇し、時効処理材に匹敵する結果を得た。繰り返し応力10^7回を疲労限とみなした場合の疲労特性は金合金の時効材では52.2MPa、溶体化処理材では60MPaを得た。しかし、疲労限より高い応力振幅では時効処理材の方が疲労までの繰り返し回数が2培長い。これは溶体化処理によって軟化したため、伸びが付与されて疲労限を上昇さたが、強度不足のため疲労限以上の応力に対しては早く破断する。一方、銀-パラジウム-銅合金の溶体化処理材は時効材と比べて疲労限が1.8倍に上昇し、疲労限以上の応力に対しても溶体化処理材が優れている。これは伸びが時効材程減少しないためである。疲労破壊メカニズムをSEM写真から考察すると金合金時効材と溶体化処理材は疲労限に達すると破面ノッチ部に焼きなまし双晶を多く含んだ粒界破面が観察され、中心部に顕著なストライエーション像を認める。この事実をノッチ部のクラック発生とその伝播の抑制により疲労限を向上させている。一方、銀-パラジウム-銅合金では時効材と溶体化処理材とで大きな差がみられる。時効材には粒状析出物を認め、しかもストライエーションの形跡が全く見られない。クラックは粒状析出物にぶつかると析出物とマトリックスの境界に沿って早く伝播したため、疲労限が小さくなる。溶体化処理材ではノッチ部、中心部にストライエーションが観察され塑性変形の跡が認められる。これはα_1相、β相の固溶によりマトリックスが強化され、クラック伝播を抑制したため高い疲労強度が得られた。本結果は合金補綴物の強度向上に大きく寄与すると考えられる。
習慣性飲酒が睡眠と血圧に及ぼす影響

習慣性飲酒者は高血圧の有病率が高く,飲酒は睡眠構築に影響する.平成17年度は,習慣性飲酒が夜間睡眠時の自律神経機能と血圧に及ぼず影響に明らかにするために成人男性37名を対象として調査を行った.自律神経機能は,心電図R-R間隔のデータをもとにパワースペクトル解析を行った.Ambulatory Blood Pressure Monitoringを行うとともに,睡眠時にはパルスオキシメーターを装着しOxygen desaturation index(ODI)を求めた.その結果,習慣性飲酒は用量依存性に夜間睡眠時の自律神経機能を抑制し睡眠時無呼吸とともに日中覚醒時の血圧上昇に関与することが示唆された.平成18年度は急性のエタノール負荷が睡眠と睡眠中の心拍変動との関係に及ぼす影響について明らかにするために行った.対象者は健康な大学生10人とした,各被験者に純エタノール換算で0(contro1),0.5 (LD), L O(HD)g/体重(kg)のアルコール飲料を3週間間隔で摂取させて検査を行った.検査日にはボルター心電図を装着し通常の就床時刻の100分前に飲酒させ,8時間の終夜睡眠時ポリグラフ検査を行った.自律神経機能は,心電図R-R間隔のデータをもとにパワースペクトル解析を行った.その結果,急性のエタノール摂取は睡眠中の副交感神経活動を抑制し交感神経優位な状態をもたらしていた.睡眠構築は高容量のエタノール摂取により特に睡眠前半ではそれほど影響を受けていなかった.今回の結果よりエタノールは睡眠の休息としての側面に影響を及ぼすことが示唆される.この影響は習慣性の飲酒が関与する高血圧の病態生理を考える上で重要な因子の一つと推察された.習慣性飲酒者は高血圧の有病率が高く,飲酒は睡眠構築に影響する.平成17年度は,習慣性飲酒が夜間睡眠時の自律神経機能と血圧に及ぼず影響に明らかにするために成人男性37名を対象として調査を行った.自律神経機能は,心電図R-R間隔のデータをもとにパワースペクトル解析を行った.Ambulatory Blood Pressure Monitoringを行うとともに,睡眠時にはパルスオキシメーターを装着しOxygen desaturation index(ODI)を求めた.その結果,習慣性飲酒は用量依存性に夜間睡眠時の自律神経機能を抑制し睡眠時無呼吸とともに日中覚醒時の血圧上昇に関与することが示唆された.平成18年度は急性のエタノール負荷が睡眠と睡眠中の心拍変動との関係に及ぼす影響について明らかにするために行った.対象者は健康な大学生10人とした,各被験者に純エタノール換算で0(contro1),0.5 (LD), L O(HD)g/体重(kg)のアルコール飲料を3週間間隔で摂取させて検査を行った.検査日にはボルター心電図を装着し通常の就床時刻の100分前に飲酒させ,8時間の終夜睡眠時ポリグラフ検査を行った.自律神経機能は,心電図R-R間隔のデータをもとにパワースペクトル解析を行った.その結果,急性のエタノール摂取は睡眠中の副交感神経活動を抑制し交感神経優位な状態をもたらしていた.睡眠構築は高容量のエタノール摂取により特に睡眠前半ではそれほど影響を受けていなかった.今回の結果よりエタノールは睡眠の休息としての側面に影響を及ぼすことが示唆される.この影響は習慣性の飲酒が関与する高血圧の病態生理を考える上で重要な因子の一つと推察された.【目的】習慣性飲酒者は高血圧の有病率が高く、飲酒は睡眠構築に影響する。本研究は、習慣性飲酒が夜間睡眠時の自律神経機能と血圧に及ぼす影響を明らかにするために行った。【結果】習慣的飲酒量と日中覚醒時の収縮期血圧の平均値(SBP)とは正の相関関係が認められた(Pearsonの相関係数R=0.559 (P<0.001))。飲酒量と睡眠時のULF, VLV, LF, HFのパワーとの間にはそれぞれ負の相関関係が認められ(R=-0.361(P=0.028)、-0.347(P=0.035)、-0.415(P=0.011)、-0.461(P=0.004))、LF/HFとの間には正の相関関係が認められた(R=0.466(P=0.004))。飲酒量とODIとの間には正の相関関係が認められた(R=0.558(P<0.001))。SBPを従属変数として心拍変動解析の各パラメータとODIを投入した重回帰分析では、ODI(B=2.599(95%CI:1.602-3.596)、睡眠前半のHF(B=0-.015(95%CI:-0.005--0.025)、VLF(B=0.002(95%CI:0.001-0.003)が有意であった。【結語】習慣性飲酒は用量依存性に夜間睡眠時の自律神経機能を抑制し睡眠時無呼吸とともに日中覚醒時の血圧上昇に関与することが示唆された。【目的】エタノールは睡眠構築と自律神経系の両者に影響を及ぼすことが知られている.本研究では急性のエタノール負荷が睡眠と睡眠中の心拍変動との関係に及ぼす影響について明らかにするために行った.【方法】対象者は健康な大学生10人とした.各被験者に純エタノール換算で0(control),0.5(LD),1.0(HD)g/体重(kg)のアルコール飲料を3週間間隔で摂取させて検査を行った.

検査日にはホルター心電図を装着し通常の就床時刻の100分前に飲酒させ,8時間の終夜睡眠時ポリグラフ検査を行った.心拍変動解析はMem/Calcシステムを用いて5分間を1エポックとして低周波数成分(LF:0.04-0.15Hz),高周波数成分(HF:0.15-0.4Hz)およびLF/HFを算出した.【結果】睡眠前半でHD群ではcontrol群と比較して中途覚醒回数とREM睡眠時間は減少し(p<0.05),LD群と比較して体動時間は減少した(p<0.05).睡眠後半でHD群ではcontrol群と比較して覚醒時間と睡眠段階1の時間が増加し(p<0.05),LD群と比較してREM睡眠時間は減少した(p<0.05).心拍数はエタノール摂取量が増加するにつれて増加し(F(2,18)=25.14,P<0.001),各周波数領域のパワーは減少した(LF : F(2,18)=3.80,P=0.042,HF:F(2,18)=5.74,P=0.012).HD群ではcontrol群と比較してLF/HFは増加した(p=0.039).【結語】急性のエタノール摂取は睡眠中の副交感神経活動を抑制し交感神経優位な状態をもたらしていた.睡眠構築は高容量のエタノール摂取により特に睡眠前半ではそれほど影響を受けていなかった.今回の結果よりエタノールは睡眠の休息としての側面に影響を及ぼすことが示唆される.この影響は習慣性の飲酒が関与する高血圧や脳血管障害などの病態生理を考える上で重要な因子の一つと推察される.
動脈管の器質的閉鎖における分子機構解明と治療標的分子の同定

早産児の動脈管は、一旦収縮(機能的閉鎖)しても永久的閉鎖(器質的閉鎖)が十分ではなく、容易に再開存する。動脈管の閉鎖過程において、PI3-キナーゼ/Akt系の抑制因子であるPhosphataseandtensinhomologの発現が、内皮細胞で劇的に増加することを見出した。さらに、動脈管収縮前後における網羅的遺伝子解析により、新しい視点から動脈管閉鎖機序の解明に対する手がかりをつかんだ早産児の動脈管は、一旦収縮(機能的閉鎖)しても永久的閉鎖(器質的閉鎖)が十分ではなく、容易に再開存する。さらに、動脈管収縮前後における網羅的遺伝子解析により、新しい視点から動脈管閉鎖機序の解明に対する手がかりをつかんだ1)ラット胎児の動脈管切片の作成:動脈管は胎内では開存しているが、出生後、呼吸の開始とともに収縮が始まる。動脈管の閉鎖機序を調べるためには開存したままの動脈管(妊娠19日目と21日目)と閉鎖後(22日目)の動脈管を調べる必要がある。まず、ラットの胎児を帝王切開で娩出後、動脈管そのものを切り出した。その後、胎児を娩出後、直後に全身凍結ブロックを作成し、切片を作成した。2)動脈管の器質的閉鎖におけるにおけるPI3-キナーゼ/Akt系を調べるために、蛍光染色を行った。動脈管の閉鎖過程において、PI3-キナーゼ/Akt系の抑制因子であるPTENの発現が、内皮細胞で劇的に増加することを見出した。3)ラット胎児の動脈管を、未熟児(妊娠19日目)、満期(21日目)、出生後(22日目)に取り出し、RNAを抽出し、約3万個の遺伝子解析を行った。対象は、大動脈の遺伝子量の変化と比較した。結果を、DAVID Bioinformatics Resourcesを用いて解析した。糖代謝、細胞周期、細胞死との関連を示すことができ、今後の動脈管研究の道しるべとなる結果を得ることが出来た。1)ラット胎児の動脈管切片の作成:動脈管は胎内では開存しているが、出生後、呼吸の開始とともに収縮が始まる。動脈管の閉鎖過程において、PI3-キナーゼ/Ald系の抑制因子であるPTENの発現が、内皮細胞で劇的に増加することを見出した。4)血管内皮特異的PTENノックアウトマウスにおける動脈管の閉鎖過程を検討したかったため、血管内皮特異的PTENノックアウトマウスの増産をおこなった。数回の体外受精をおこなったが、なかなか十分な数の出産数を得ることができなかった。1)妊娠WKYラットをterm (妊娠21日目)あるいはpreterm (妊娠19日目)に帝王切開をし、胎児を娩出した。第一呼吸の前にフェノバルビタール100mg/kgを腹腔投与し、動脈管を摘出した。出生後のラットについては、生後1日目と生後1週間後に動脈管を摘出した。動脈管の組織学的な評価は、胎児を急速全身凍結したあとに凍結ブロックを作成することにより標本を作製した。個体数を増やすことにより、標本作製の手技の安定を得ることができた。2)血管内皮特異的PTENノックアウトマウスにおける動脈管の閉鎖過程を検討したかったため、血管内皮特異的PTENノックアウトマウスの増産をおこなった。出生後の血管内皮特異的PTENノックアウトマウスの血圧は、野生型マウスと違いが見られなかった。3)ラット未熟児(妊娠19日目)、満期(21日目)、出生後(22日目)から得られた遺伝子解析を引き続き行った。4)動脈管の器質的閉鎖におけるにおけるPI3-キナーゼ/Akt系を調べるために、蛍光染色を行った。しかし、p-PTENとpAktには明らかな変化は見られなかった。5)内皮細胞におけるPTENの発現変化については、TissueQuest software (TissueGnostics, Vienna, Austria)を用いて定量解析を行った。血管内皮特異的PTENノックアウトマウスの妊娠率が低いため。

24年度が最終年度であるため、記入しない。血管内皮特異的PTENノックアウトマウスを増産し、胎児の動脈管を、未熟児(妊娠19日目)、満期(21日目)、出生後(22日目)に取り出し、RNAとタンパクの解析を行う。
非受容体型蛋白質チロシンキナーゼp72^<syk>のヒト遺伝子並びに関連遺伝子の同定

チロシンキナーゼp72sykは、当初ブタの脾臓より精製、cDNAクローニングされた。さらにsykは血球系にのみ存在し、他の組織では存在を検出できなかった。しかし、ブタの血球系においてトロンビン、トロンボキサンA2等の刺激にて、sykの活性変化が検出でき、これらの細胞において重要な機能を担っていると考えられた。従って、p72sykのヒトの遺伝子の同定をこころみた。ブタsykのプローブを用い、ヒト脾臓cDNAライブラリーより、low stringencyにてcross hybridizationをおこない、最終的にindependentなクローンを2つ得た。それらのDNA配列、アミノ酸配列をみるとブタsykと約90%の相同性があったことより、ヒトsykのcDNAが取れたものと考えられた。しかし、このcDNAは完全長ではなかったので、再度ライブラリーをスクリーニングし、さらに4つのindependentクローンを得、現在解析中です。尚、完全長cDNAがとれていないため、疾病との関係に着手できなかったが、その前段階として抗体を作ることにした。部分長cDNAの一部を融合タンパク質として大腸菌に作らせ、それを抗原としてモノクローナル抗体の作製を試みたところ、幸いほぼ有用な抗体が得られるものと考えている。したがって、今後は疾病との関わりにも着手できうるし、ま完全長cDNAがとれれば、FISH法にて染色体上の位置決めを行ない疾患に関しての有用な情報が得られるものと期待される。syk関連遺伝子の同定に関して、血球系以外の組織である脳(全脳)よりRNAをとりノザンブロットをおこなったが、結果は否定的であった。しかし、部位(海馬、小脳等)別にRNAを取ったり、あるいはin situ hybridization法にて再検したいと考えています。
次世代シーケンサーを用いたオオムギ耐塩性遺伝子の短期間の同定と作用機構の解明

塩ストレス条件下で稔実歩合を高める遺伝子の単離に向けた大規模選抜を行い、併せて昨年度見出した候補遺伝子(TIFYタンパク質をコードする遺伝子AK357304とF-boxタンパク質をコードする遺伝子MLOC_12120)の塩基配列と遺伝子発現の解析を行い、不稔発生に関わる生理的機構と候補遺伝子の関わりを検討した。1.品種OUE812とOUC613由来のRIL遺伝解析集団から得たBC1F4集団を網羅的SNPタイピングアレイ解析して大規模分離集団を育成した。本集団を用いて検討した結果、塩ストレス条件下で稔実歩合を高く維持するQTL領域が、RIL遺伝子解析集団を用いた連鎖解析によって推定した領域と重なっていることが分かった。2.AK357304のコード領域内には両品種間にSNPが4ヶ所あり、1ヶ所にアミノ酸置換が生じていた。AK357304の遺伝子発現量は、幼穂の発育に伴って減少し、発現量に品種間差がみられなかった。MLOC_12120のコード領域には両品種間にSNPは検出されず、両品種ともアミノ酸配列にTIFYモチーフとJasモチーフを含むことから、本遺伝子はJasmonate ZIM-domain(JAZ)タンパク質をコードする遺伝子であることが明らかとなった。開花直前の葯、雌蕊における本遺伝子の発現量は、両品種とも他の時期の幼穂に比べて高くなり、さらにOUC613はOUE812よりも有意に高かった。3.JAZタンパク質は、雄蕊の発達に必須で、葯の裂開や花粉発芽能力に関与する植物ホルモンであるジャスモン酸のシグナル伝達を負に制御する役割をもつことが明らかにされている。このこととこれまでの本研究の結果とを併せ考えると、JAZタンパク質をコードするMLOC_12120が塩ストレス下でオオムギの花粉稔性低下の品種間差に関わっている可能性が考えられた。耐塩性の高いエチオピア産オオムギ品種(OUE812)と耐塩性の低い中国産オオムギ品種(OUC613)から育成した組換え近交系96系統の中から、200mM NaCl処理しても稔実歩合を高く維持した20系統、稔実歩合の低かった20系統を選び、QTL-seq法で解析したところ、塩ストレス条件でも稔実歩合を高く維持するQTLが第2染色体の約54 cM近傍に推定され、以前QTL Cartographerで推定したQTL領域とほぼ一致した。OUE812とOUC613の交雑F1個体にOUC613を戻し交雑し、目的とする遺伝子を含む領域を持つF2個体を選び、大規模分離集団育成の準備を進めた。0mM NaCl処理、150mMNaCl処理した植物を種子親あるいは花粉親として、NaCl処理濃度の異なる親を交配した結果、OUE613が花粉親の場合のみ150mMNaCl処理によって稔実歩合が有意に低下し、塩ストレスによって引き起こされる不稔が花粉の稔性の低下によるものであることが分かった。150mMNaCl処理が花粉の生存率、柱頭付着花粉数、花粉発芽率に及ぼす影響を検討した。その結果、両品種の花粉生存率は、150mM NaCl処理でわずかに低下したものの、品種間差は見られなかった。柱頭上の花粉数及び花粉発芽率は、両品種とも150mM NaCl処理で大きく低下したが、低下程度はOUC613で大きく、その結果、発芽花粉数もOUC613で少なかった。さらに、全発芽花粉数に対する花粉管が花柱基部まで伸長した花粉数の割合は,両品種とも低下したが、低下程度はOUC613で大きく、その結果、花粉管が花柱基部に達した花粉数はOUE812に比べてOUC613が少ない傾向が認められた。稔実歩合の低下要因が、花粉稔性の低下によっておこると予想して検討を前倒しに進めた。予想通り、稔実歩合が花粉稔性の低下によっておこることが明らかになったので、次年度計画していた花粉稔性の低下要因の検討を予備的に行うことができた。1.これまで、岡山大学のオオムギコレクションから耐塩性品種OUE812と塩感受性品種OUC613を選抜して,長期間の塩ストレスによる子実重の減少程度の違いが稔実歩合の相違にあることを明らかにし、平成28年度にOUE812が稔実歩合を高める量的形質遺伝子座(QTL)をExome QTL-seq法で検出した。検出したQTL領域(約150kb)を本年度データベースで詳しく検索したところ、領域内に90個の遺伝子が含まれており、この中には、TIFYタンパク質をコードする遺伝子とF-boxタンパク質をコードする遺伝子が含まれていることが分かった。3.塩ストレスによっておこる稔実歩合の低下は、柱頭上の花粉数の減少と花粉発芽率の低下によっておこることを明らかにしてきたが、本年度の検討によって、柱頭上の花粉数の減少は、葯内花粉数の減少、葯の裂開不良や花粉飛散率の低下などによっておこることが明らかとなった。一方、TIFYタンパク質をコードする遺伝子は、イネやシロイヌナズナで花粉の成熟や葯の裂開、花粉発芽に関わるとされているJAZ遺伝子と相同性が高く、F-boxタンパク質をコードする遺伝子はイネでは低温ストレス下での花粉の不稔、シロイヌナズナでも花粉の不稔に関係することが知られている。

以上のことから、TIFYタンパク質をコードする遺伝子とF-boxタンパク質をコードする遺伝子の二つの遺伝子を、塩ストレス下で稔実歩合低下の品種間差を引き起こす候補遺伝子と考えた。次世代シーケンサーを用いたExome QTL-seq法によって、塩ストレスでも稔実歩合を高く維持する候補遺伝子を推定できた。塩ストレスでおこる稔実歩合低下の機構の解析もほぼ計画通り進展している。塩ストレス条件下で稔実歩合を高める遺伝子の単離に向けた大規模選抜を行い、併せて昨年度見出した候補遺伝子(TIFYタンパク質をコードする遺伝子AK357304とF-boxタンパク質をコードする遺伝子MLOC_12120)の塩基配列と遺伝子発現の解析を行い、不稔発生に関わる生理的機構と候補遺伝子の関わりを検討した。1.品種OUE812とOUC613由来のRIL遺伝解析集団から得たBC1F4集団を網羅的SNPタイピングアレイ解析して大規模分離集団を育成した。本集団を用いて検討した結果、塩ストレス条件下で稔実歩合を高く維持するQTL領域が、RIL遺伝子解析集団を用いた連鎖解析によって推定した領域と重なっていることが分かった。2.AK357304のコード領域内には両品種間にSNPが4ヶ所あり、1ヶ所にアミノ酸置換が生じていた。AK357304の遺伝子発現量は、幼穂の発育に伴って減少し、発現量に品種間差がみられなかった。MLOC_12120のコード領域には両品種間にSNPは検出されず、両品種ともアミノ酸配列にTIFYモチーフとJasモチーフを含むことから、本遺伝子はJasmonate ZIM-domain(JAZ)タンパク質をコードする遺伝子であることが明らかとなった。開花直前の葯、雌蕊における本遺伝子の発現量は、両品種とも他の時期の幼穂に比べて高くなり、さらにOUC613はOUE812よりも有意に高かった。3.JAZタンパク質は、雄蕊の発達に必須で、葯の裂開や花粉発芽能力に関与する植物ホルモンであるジャスモン酸のシグナル伝達を負に制御する役割をもつことが明らかにされている。このこととこれまでの本研究の結果とを併せ考えると、JAZタンパク質をコードするMLOC_12120が塩ストレス下でオオムギの花粉稔性低下の品種間差に関わっている可能性が考えられた。花粉の稔性が塩ストレスによる子実の登熟歩合を低下させることが分かったので、稔性の低下理由を、葯内花粉数、柱頭における付着花粉数、発芽花粉数、花粉管の伸長などに着目して解明していく。大規模分離集団を育成し、塩ストレス下で稔実歩合を低下させる遺伝子の同定を目指す。平成30年度は、候補遺伝子について品種間で配列や塩ストレス下での発現量を比較し、さらに、候補遺伝子の関与する植物ホルモンの処理の影響などの検討を通じて、耐塩性遺伝子を同定し、研究目的の達成を図る所存である。QTL-seq法による解析にかかる費用が予定よりも大幅に節約できた。次年度計画している大規模分離集団育成には当初予算額を大きく上回ることが予想されるので、節約分を次年度の大規模分離集団育成費にあてて、期間内の目的達成を目指したい。研究成果を国際学会で発表するための旅費と候補遺伝子について両品種の配列決定や塩ストレス下での発現解析のための物品費を計上した。次年度使用額全額(940443円)を大規模分離集団育成のための、マーカーなどの試薬代と材料育成装置作成にあてることとし、当初計画した物品費330000円にこれを加え、物品費として1270443円を計上する。旅費、人件費・謝金、その他は当初計画通り、それぞれ350000円、120000円、100000円を計上する。