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シオミズツボワムシのストレス耐性の動的変化と増殖不良の予知

初期餌料生物のシオミズツボワムシ複合種の大量培養を安定化させることを目的として,ストレス耐性の動的な変化に着目し,増殖不調の予知法を開発することを目的とした.まずストレス耐性に関わる遺伝子群を探索するため,次世代シーケンサにより98,437コンティグを得た.続いて網羅的なトランスクリプトーム解析を行った結果,ストレス応答に関わる種々の分子が含む294コンティグが得られた.続いて,加齢にともなうストレス応答の変化を検討した.熱および酸化ストレスについて発生の初期段階における応答機構の有無を調べたところ,孵化前の段階においてもすでに応答機構を有することが明らかとなった.シオミズツボワムシは,海産動物の初期餌量として不可欠な動物プランクトンである.一方,その大量培養では増殖不調や突然の大量斃死といった問題が起こる.そこで本課題は,シオミズツボワムシのストレス耐性に着目し,その動的な変化を明らかにすることを目的とした.GS FLX+(長鎖型;Roche)およびHiseq2000(短鎖型;Illumina)の2つの解析手法で得られた配列情報(約97万リード,長鎖型;約5.5億リード,短鎖型)を基にリファレンスとなるコンティグ配列セットを作製した.その結果として得られた34,914コンティグ配列についてBLASTX検索に供したところ,19,835コンティグについては有効なアノテーション情報が得られた(e-value < 10^-4).そこで,モデル生物においてストレス応答や老化に関連する遺伝子として報告されている計44種類のタンパク質と同一性を示すコンティグを探索した結果,抗ストレス遺伝子群の発現を制御する転写因子であるDAF-16や,ゲノムの安定化に関わるヒストン脱アセチル化酵素SIR-2など計26種類のタンパク質と同一性を示すコンティグが得られた.これらの分子は真核生物で高度に保存されたものであり,ストレス応答分子として有用であると考えられる.そこで,次年度はこれらの分子の発現量を転写産物および翻訳産物のレベルで定量する測定系を確立し,シオミズツボワムシの個体数の変動過程における発現動態を明らかにして,本課題の目標を達成する計画である.初期餌料生物のシオミズツボワムシ複合種の大量培養を安定化させることを目的として,ストレス耐性の動的な変化に着目し,増殖不調の予知法を開発することを目的とした.まずストレス耐性に関わる遺伝子群を探索するため,次世代シーケンサにより98,437コンティグを得た.続いて網羅的なトランスクリプトーム解析を行った結果,ストレス応答に関わる種々の分子が含む294コンティグが得られた.続いて,加齢にともなうストレス応答の変化を検討した.熱および酸化ストレスについて発生の初期段階における応答機構の有無を調べたところ,孵化前の段階においてもすでに応答機構を有することが明らかとなった.シオミズツボワムシ(Brachionus plicatilis species complex)は,海産仔稚魚として有効な唯一の初期餌料生物である.一方,その大量培養では増殖不良の問題が残されている.申請者は,薬剤(ユグロン)耐性を指標としたワムシの生理状態の評価法を開発し,これにより増殖不調の予知が可能であることを見出した.一方,ワムシ個体群を構成する各個体のストレス応答は,動的に変化することが分かっている.そこで,網羅的な転写産物の発現解析により,ストレス耐性の動的変化の実態を明らかにすることを目的とした.本年度は,給餌量に起因するワムシのユグロン耐性の変化に関わる遺伝子群の探索を行った.小規模培養4日目の飽食区および給餌制限区の個体群から得たtotal RNAを用いて,次世代シークエンサを用いて発現解析を行った.ワムシの遺伝情報は未だ十分ではないため,まず長鎖型および短鎖型の2つの解析手法で得られた配列情報を基にリファレンスとなるトランスクリプトーム配列を作製した.その結果,98437コンティグのトランスクリプトーム配列が得られた.次に,得られたトランスクリプトーム配列に短鎖型解析で得られた配列をマッピングし,発現解析を行った.その結果,飽食区で高発現している遺伝子の候補として43コンティグ,給餌制限区で高発現している遺伝子の候補として294コンティグが得られた.現在は,得られたコンティグについてblastX検索による遺伝子の同定およびGO解析を進めている.シオミズツボワムシ複合種(Brachionus plicatilis species complex)は,海産仔稚魚の初期餌料生物として重要な動物プランクトンである.一方,種苗生産の現場における大量培養では,増殖不調や突然の大量斃死などの問題が残されている.申請者は,薬剤(ユグロン)耐性を指標としてワムシの生理状態を評価する手法を開発し,増殖の不調を予知できることを見出した.一方,ワムシの個体群はさまざまな齢の個体から構成されており,齢構成によって個体群は異なる挙動を示す可能性がある.そこで,齢がストレス耐性に及ぼす影響を検討した.まず孵化直後の個体に熱ストレスを処理し,一定の回復時間を設けた後に致死的な濃度のユグロンに曝したところ,熱ストレス処理を行っていない対照区と比べて生存時間が有意に長くなった.したがって,シオミズツボワムシは孵化直後からストレス応答機構を有することが分かった.シオミズツボワムシは単性生殖を営み,2倍体の遺伝的に均一な単性生殖卵を産む.そこでまず携卵個体について上述と同様のストレス耐性試験を行ったところ,孵化した仔虫の生存時間は有意に長くなった.

次に,単性生殖卵のみを分離して同様のストレス耐性試験を行ったところ,無処理の対照区と比べて生存時間は有意に長くなった.すなわち,シオミズツボワムシは孵化前の段階でもすでにユグロンに対する応答機構を有することが明らかとなった.これは,(1)熱ストレスに応じて発現するタンパク質(例えばHSP)の転写産物が細胞分裂の過程で分配されることや,(2)熱ストレス処理によりゲノムに化学的な修飾が起こり,エピジェネティックな遺伝子発現の制御が起こっていたことによる可能性が考えられた.このメカニズムが明らかとなれば遺伝的に均一な個体群に生じる表現形の多様性を説明できるため,今後の検証は極めて重要である.水産学次世代シーケンサにより配列データを得る段階までは計画通りであったものの,得られた配列の精度を高める作業には当初の計画よりも時間を要した.一方,結果的に得られたコンティグ配列は十分な量と質を備えたものであり,当初の期待よりも多くのストレス応答分子群を同定できている.本研究の初年度は,長鎖型および短鎖型の2種類の次世代シークエンサによるトランスクリプトーム(転写産物)を行い,十分な質と量のデータを得ることができた.シオミズツボワムシのゲノム情報はまだ十分ではなく,本研究で得られたデータセットはこれまでにない規模のものである.得られた配列データについて,常法のデータベース検索によるアノテーションを試みたものの,近縁種の情報が皆無であるため,信頼に足る結果は得られなかった.そこで,特定のドメイン構造に絞ってデータベース検索を行ったところ,無脊椎動物から脊椎動物に至るまで広い分類群で保存的な領域を多数のコンティグについて同定できた.この中には老化やストレス応答に関わるシグナル伝達経路を構成する分子群が含まれており,目的とした分子群をシオミズツボワムシにおいて同定できた.本課題では増殖不調の予知実験を水産総合研究センタの協力のもとで行う計画を立てていたが,採択後に予定していた能登島事業所の廃止が決定した.一方,代替の施設として神奈川県内水面試験場が所有する大量培養槽を利用できることとなったため,研究の遂行には支障がない.本研究では,トランスクリプトームおよびプロテオームの2つのレベルでの研究を計画していた.一方,次世代シークエンサによって得られたトランスクリプトームのデータセットが計画時に予想したものよりもずっと質が高く,また量的にも十分なものであった.さらに,保存的なドメイン構造に注目したことにより,困難と考えていたアノテーションも可能であることが分かった.そこで,比重をトランスクリプトームに置き,2年目以降の計画であるストレス応答分子の同定を行うことを計画している.配列データの解析に当初の予定よりも時間を要した.これに引き続いて行う予定であった実験が遅れたため,2年目に予定していた支出が最終年度にずれこんだ.2年目に予定していた実験を3年目の前半に行う計画に変更することで,当初の予定通りに遂行する.初年度の研究費を繰り越す状況は,当初の見積よりも支出が抑えられたからである.少額であるため,次年度の使用計画に大きな変更はない.本研究の2年目の研究費は,特定の遺伝子群の発現量解析にもっぱら費やす計画である.具体的には,定量的リアルタイムPCRの発現量解析系を立ち上げるため,増幅試薬や蛍光プローブを購入する.
近世ヨーロッパにおける宗教・政治・商業空間の構造転換

従来の研究では、ヨーロッパ「近世」の前半(1648年ウェストファリア講和条約頃まで)は宗教戦争の時代とみなされているのに対し、「近世」の後半は、いわゆる主権国家体制が前提とされ、各国ごとに世俗化した啓蒙主義の伝搬が説明されてきた。本研究は、近世後半に顕著になった変化として、(1)政治社会における宗教の位置づけの変化、(2)国家領域を超えた人や集団の結合が領域国家の政治的歴史展開のなかで果たした役割の変化、(3)商業空間の急激な拡大とその質的変化という、三つの歴史的展開を重視し、これらの展開を一国史の枠組みに基づいた内的発展に限定してみるのでなく、国家領域にとらわれない宗教的・政治的・経済的ネットワークの観点から具体的に検討を試みた。また時代はナント王令廃止(1685)と名誉革命(1688-89)という二つのヨーロッパ規模での事件がおこった1680年代に焦点をしぼることにより、ヨーロッパ的連関と英蘭仏のみならずスペイン、ポーランドやスイスなどより多くの地域の比較をあきらかにしようとした。そして13名の研究分担者・研究協力者の協力を得て、2009年3月21日には、国際シンポジウムRethinking the Glorious Revolution in a European Context(基調報告はバンゴール大学トニ・クレイドン教授およびレイデン大学ダヴィド・オネキンク専任講師)、2009年12月19日には、シンポジウム「1680年代から近世ヨーロッパを視る-政治・宗教・商業空間の転換とネットワーク-」(基調報告は本科研のメンバー)を開催した。また研究成果の一部として、科研参加者たちの論考を東京大学大学院総合文化研究科地域文化研究専攻紀要『Odysseus』第14号別冊1(2010年2月刊行)にまとめることができた。一国史をこえた近世ヨーロッパ像の構築はまだ大きな課題を残しているが、本研究はこれらの研究成果によって、ナショナルとトランスナショナルな側面をあわせもつ「近世」像を提示することができたのではないかと考える。本研究は、近世ヨーロッパにおける政治社会における宗教の位置づけの変化、国家領域を超えた人や集団の結合が領域国家の政治的歴史展開のなかでどのような役割を果たしたのか、商業空間の急激な拡大とその質的変化という、三つの歴史的展開を重視している。そしてこれらの展開を一国史の枠組みに基づいた内的発展に限定してみるのでなく、国家領域にとらわれない宗教的・政治的・経済的ネットワークの観点から具体的に検討することによって、近世ヨーロッパ史を新たに構想しようとするものである。10名の研究分担者・連携研究者・研究協力者の協力を得て、ヨーロッパの多地域からの視座を生かしながら、総体的なヨーロッパ像の把握に務めている。平成18年度は、研究代表者および研究分担者のこれまでの個別研究テーマを推進し、総合研究に移行するために、3度にわたる緊密な討議を重ねて、研究内容の連携をはかった。具体的には、代表者・西川は、多角的・広域的な視座から宗派ネットワークを分析をおこなう一方で、1680年代に着目する意義とアプローチについてまとめた。さらに西川は、イギリス、ドイツ、オランダ、フランスにおいて史料収集およびユグノー史研究者・17世紀研究者と情報交換をおこなった。とくに平成20年度にこの科研を利用しておこなう予定であるシンポジウムにむけて、欧米における1680年代研究者のネットワークWilliamite Universeの代表者であるディヴィド・オネキンク氏とトニー・クレイドン氏と議論を重ねた。

ロンドンではユグノー史家のロビン・グウィン氏と近年のユグノー研究の展開について意見交換をおこなったが、その際にグウィン氏を日本にまねき、ユグノー史研究における1680年代の位置付けについて報告してもらうこととなった。また平成21年度にベルファストで開催予定のユグノー国際会議で本科研の成果を公表することとなった。研究分担者のうち、大峰は17世紀後半から18世紀前半にかけてフランスに定着したアイルランド・カトリック信徒について、フランス国内の複数の古文書館より一次史料(教区簿冊、帰化申請書)をマイクロフィルムで取りよせ、整理・分析を行い、商業ネットワークとローマ・カトリック信徒のネットワークの連関の解明を試みた。勝田はジャコバイトや秘密結社の諸活動の汎ヨーロッパ的な展開を重視しながらネットワーク研究を行なう一方で、イギリスとアイルランドにおいて、アイルランドの研究動向の把握・史料収集をおこなった。平成19年度は,研究代表者および研究分担者のこれまでの個別研究テーマを推進し,総合研究をまとめるために,6度にわたる緊密な討議を重ねて,研究内容の連携をはかった。その過程で1680年代の複数のネットワーク網の結節点となったオランダの重要性を再認識したので,オランダ史研究からの視座を得るために,岡山市,就実大学の桜田美津夫教授と東京国際大学の杉浦未樹准教授を招き,それぞれの研究関心からの1680年代に関する報告を聞き,議論を重ねた。また,ニュージーランド在住のユグノー史家ロビン.グウィン博士を招聘し,1680年代を中心としたユグノー研究に関する研究会を東京と神戸でひらき,またグウイン博士が,港湾都市におけるユグノーの活動に関する報告をおこなったシンポジウム(神戸大学文学部において開催)に協力,参加した。さらに西川は,イギリス,スイス,イタリアにおいて宗派的ネットワークの収集を行う一方,Williamite Universeのディヴィド,オネキンク博士(レイデン大学)およびトニー,クレイドン博士(ウェールズ大学)と共に,平成20年3月に開催予定の「1680年代ブリテン諸島およびオランダに関するシンポジウム」の打ち合わせをおこなった。勝田は,イギリスとアイルランドにおいて研究動向の把握,史料収集につとめた。また大峰は,昨年度に引き続き,フランスに定着したアイルランド,カトリック信徒について,一次史料の整理,分析を行った。平成20年度は、研究代表者・西川および連携研究者・勝田俊輔・大峰真理(2008年のみ手続き上の理由で連研究者になった)はこれまでの個別研究テーマを推進し、総合研究をまとめるために、年に5回討議を重ね研究内容の連携をはかった。その際に、ナント王令の廃止と名誉革命がおこった1680年代を、近世ヨーロッパにおけるひとっの転換点とみることができないかと着目し、この10年間を中心に総合的なヨーロッパ像の把握に務めている。その過程で、1680年代の複数のネットワークの結節点となったオランダの重要性を再恥識したので、オランダ史の大西吉之(富山大学)桜田美津夫(就実大学)杉浦未樹(東京国際大学)を、さらに東欧からめ視点を学ぶためにポーランド史の小山哲(京都大学)を招き、それぞれの問題関心から1680代に関する報告をしてもらい議論を重ねた。
簡略化ステップ型接着システムの臨床的スミア層を有する歯面への短・長期的接着性能

1.短期的接着性能に関する研究(1)研削面の違いが接着性能へ及ぼす影響2種のダイヤモンドポイントを用いて形成した歯質研削面に対する各種接着システムの短期的接着性能を、微小引張り接着強さとその破断面のSEM観察の結果、1ステップ型接着システムでは、象牙質接着に対して有利な研削面を形成するためのバー選択が必要であると考えられた。(2)簡略化ステップ型接着システムの接着界面分類1ステップ型接着システムを、#600SiC研磨象牙質面へ接着した場合、その接着界面は(1)樹脂含浸層形成型、(2)機能性傾斜材料型、(3)ナノ相互作用層形成型に分類された。特に(3)は脱灰される歯質の量が少なく、レジンの浸透が充分に期待できるため、劣化の少ない長期に安定な材料であることが期待された。2.長期的接着性能に関する研究(1)2ステップ型セルフエッチングシステム3種の2ステップ型セルフエッチングシステムの加水分解に対する安定性を、100000回サーマルサイクリング試験後の接着強さならびにTEMによる接着界面像を指標に検討した。その結果、接着界面の長期安定性は、機能性モノマー自体の加水分解安定性や機能性モノマーと象牙質との化学的相互作用に依存していることが示唆された。(2)1ステップ型接着システム3種の1ステップ型接着システムについて100000回サーマルサイクリング試験前後の接着強さ測定と接着界面をTEM観察した結果、材料によりサーマルサイクリングの影響の程度は異なるものの、何らかの変化(劣化)が象牙質接着界面に起こっていることが示唆された。3.各種機能性モノマーの歯質に対する化学的相互作用の分析X線光電子分光法分析により、機能性モノマーは歯質と化学的に相互作用することが示された。10-MDPはハイドロキシアパタイトと最も強く反応するだけではなく、Caとの結合は加水分解に対し最も安定であることが判明した。臨床で用いるレギュラーとスーパーファインダイヤモンドポイントを用いて形成した象牙質研削面およびエナメル質研削面に対する各種レジン系接着システムの短期的接着性能を調べるために、接着後24時間の微小引張り接着強さを比較検討し、その破断面の破壊形態をSEM観察するとともに、各システムのスミア層除去能力を調べるため、各システムで処理した研削面をアセトン洗浄したものをSEM観察した。その結果、1)エナメル質接着強さは、研削面による差は認められなかった、2)象牙質接着強さは、1ステップ型の接着システムにおいてスーパーファイン研削面の方が有意に高い値を示した、3)エナメル質においては、歯面処理材のスミア層除去能と接着強さが必ずしも対応していない材料があった、4)象牙質に対して低い接着強さを示した材料では、アセトン洗浄した象牙質表面にスミア層の残存が多く認められたが、高い接着強さを示した材料ではほとんどスミア層が除去されている傾向が認められた。以上より、特に1ステップ型接着システムでは、象牙質接着に対して有利な研削面を形成するためのバー選択が必要であると考えられた。また、長期的接着性能に関する研究の一つとして、異なる機能性モノマー(4-MET, MDP, phenyl-P)を含有する3種の2ステップ型セルフエッチングシステムを用いて接着処理した試料を5°Cと55°Cのサーマルサイクルを50,000回まで行い、象牙質微小引張り接着強さを測定した。その結果、phenyl-Pを含有するシステムでは50,000回のサーマルサイクル後、有意に接着強さは減少した。

このことから、セルフエッチングシステムの象牙質接着性は、含まれる機能性モノマーによって異なり、長期安定性を左右する可能性があることが示唆された。1)短期的接着性能に関する研究最近の簡略化ステップ型特に1ステップ型接着システムを#600SiC研磨象牙質面へ接着した場合、その接着界面は大きく(1)樹脂含浸層形成型、(2)機能性傾斜材料型、(3)ナノ相互作用層形成型に分類された。特に(3)は酸処理される歯質の量(深さ)が少なく、レジンの浸透が充分に期待できるため、劣化の少ない長期に安定な材料であることが期待された。短期的な接着強さも2ステップ型のものに近い値が得られた。2)長期的接着性能に関する研究3種の2ステップ型セルフエッチングシステム、Clearfi Mega Bond(CMB)、Unifil Bond(UFB)およびClearfi LinerBondII(LBII)の加水分解に対する安定性を、100000回サーマルサイクリング試験後の接着強さならびにTEMによる接着界面像を指標に検討した。CMBは100000回後もコントロールと有意差のない接着強さを示したが、UFB・LBIIは経時的に接着強さは減少した。TEM観察の結果、CMBには100000回後も接着界面の超微細構造に変化は見られなかったが、UFB・LBIIの100000回後の接着界面には、ハイブリッド層中に明らかな空隙や不明瞭なコラーゲン線維が認められた。以上より、象牙質接着界面の長期安定性は、機能性モノマー自体の加水分解安定性や機能性モノマーと象牙質との化学的相互作用に依存していることが示唆された。3)各種機能性モノマーの歯質に対する化学的相互作用の分析X線光電子分光法分析により、10-MDP、4-MET、phenyl-Pなどの機能性モノマーは歯質と化学的に相互作用することが示された。また10-MDPはハイドロキシアパタイトと最も強く反応するだけではなく、Caとの結合は加水分解に対し最も安定であることが判明した。本年度は、簡略化ステップ型接着システムのうち、とくに最近臨床での使用頻度が増加している3種の1ステップ型接着システムの象牙質に対する短・長期的接着性能に関する研究を主に行った。1ステップ型接着システムのClearfil S^3 Bond (S3,Kuraray),G-Bond (GB,GC),Absolute (AB,Dentsply/Sankin)について100000回サーマルサイクリング試験前後の接着強さを測定したところ、S3は37%(31.9MPaから20.2MPaへ)減少し、ABは55%(29.9MPaから13.6MPaへ)、G-Bondは82%(29.9MPaから5.4MPaへ)減少した。接着初期の象牙質界面をTEM観察したところ、S3とGBでは幅約数百nmのナノ相互作用層(NIZ)型であり、象牙質表層の脱灰が弱い界面であった。特にGBでは界面に層分離が認められ、接着処理時に強いエアブローが必要であるため術式感受性が高いことが示唆された。ABでは、接着材のpHが低いため、幅約2μmのいわゆるハイブリッド層形成型の界面を示した。100000回サーマルサイクリング試験後の接着界面は、S^3とABでは初期と同様のTEM像を示した。
スニャエフ=ゼルドビッチ効果に基づくハッブル定数測定と銀河団ガスの密度・温度分布

本研究の目的は、銀河団高温ガスの密度および温度分布を、流体シミュレーションを使って詳細に調べることにより、スニャエフ=ゼルドビッチ効果を用いたハッブル定数測定にともなうバイアスを定量的に明らかにすることであった。銀河団高温ガスの進化に関する3次元シミュレーションを用いた研究は、近年さかんに行われている。その結果、標準的な宇宙論モデルで予言される初期条件から出発して、観測されているものと同様なガスの密度・温度分布を再現することに成功している。しかし、これまで行われてきたシミュレーションの分解能が、密度や温度の分布を調べるのに十分であったかどうかについては疑問の余地があった。特に、外側の部分における詳しい温度分布を知ることは、スニャエフ=ゼルドビッチ効果を用いたハッブル定数推定の信頼性を上げるために重要である。そこで、ガスとダ-クマタ-をそれぞれ最大約6万個の粒子で表し、SPH(smoothed particle hydrodynamics)法によるシミュレーションを行って銀河団高温ガスの密度・温度分布を調べた。初期条件における密度ゆらぎの振幅および位相を固定して粒子数だけを変化させたところ、ガス粒子・ダ-クマタ-粒子の個数が5千個以上である限り、結果はほとんど変わらないことが判明した。これは、SPHという手法が、誤差の評価法まどに理論的に確立されていない部分を残しているにもかかわらず、実用上はかなり信頼性の高いものであることを示している。
TCA回路の進化起源は炭酸固定代謝なのか、逆進化実験で解き明かす

前年度にて、本研究で対象とした還元的TCA回路中酵素3種の祖先型酵素を構築した。すなわち、現存酵素のアミノ酸配列に基づいて祖先型酵素のアミノ酸配列を推定し、大腸菌内で発現可能になるような人工遺伝子を合成し、大腸菌での異種発現系の構築を行い、可溶性酵素の取得に成功した。本年度はさらに各酵素の精製手法を確立し、精製酵素を用いて性状解析を進めた。具体的には、祖先型酵素に付与したタグを利用したアフィニティ精製後、陰イオン交換カラムやゲル濾過を用いた高純度精製を行った。各酵素は複数のサブユニットのヘテロ多量体として存在するが、いずれの精製ステップにおいてもサブユニット間の解離は見られず、取得された酵素が正しく多量体構造を形成していることが示唆された。精製酵素を用いた活性測定においては、祖先型酵素が広い基質特異性を有する(複数種の反応を触媒する)という、本研究の作業を仮説を支持する結果が得られた。また、サブユニットごとにアフィニティ精製用タグの有無を変えた祖先型酵素の構築を行い、アフィニティ精製を行った。これにより、各サブユニット間での結合が祖先型酵素においても形成されていることが実験的に示された。研究計画調書に記載の通り、対象とした酵素種について祖先型タンパク質配列の推定・人工合成・また大腸菌での異種発現を行った。いずれの酵素種についても可溶性発現に成功し、計画していた実験に大きな支障は生じなかった。また、各酵素について精製手法を検討し、高純度酵素を用いた活性測定実験を行えるようにした。これにより、各祖先型酵素が活性を有しているか、また活性を有している場合どの反応の触媒活性を有するかの評価が可能となった。精製を行った祖先型酵素のうち活性の弱いものについて、発現条件や精製条件の検討を行い、より状態のいい酵素の取得を行う。反応性の測定を終えた酵素については、結晶構造解析や構造モデリングなどを行い、基質特異性を決定する残基・モチーフの解明を目指す。さらに、祖先型酵素を出発点として、ランダム変異と活性スクリーニングを繰り返し、活性の高い酵素へと人工的に進化させる系に供する。これにより、単一の多機能型酵素から個別の高活性型酵素への進化過程を実験室で再現することを試みる。本年度はまず、本研究で対象とした還元的TCA回路中酵素3種の祖先型酵素を構築した。すなわち、現存酵素のアミノ酸配列に基づいて祖先型酵素のアミノ酸配列を推定し、大腸菌内で発現可能になるような人工遺伝子を合成し、大腸菌で異種発現させ、発現した祖先型酵素を大腸菌から精製する、という実験を行った。本年度構築を試みた3種について、いずれも大腸菌で可溶性発現する酵素が得られた。本実験ステップで可溶性酵素の発現が見られない可能性が本研究計画の懸念として当初考えられていたが、今後の研究遂行に支障のない実験経過が得られたと言える。また、3種の酵素はいずれも複数種のサブユニットからヘテロ複合体を形成するという点で、これまで祖先型酵素構築が試みられてきた酵素の多くと異なる。本研究で用いた祖先型構築という研究手法がヘテロ複合体を形成するタンパク質にも適用可能であることを示す知見と言える。この結果を受けて、サブユニットごとでアフィニティ精製用タグの有無を変えた祖先型酵素の構築も行っており、今後さらに詳細な祖先型サブユニット間相互作用が明らかになることも期待される。得られた祖先型酵素については活性測定も行った。3種類の酵素の内2種は活性を示し、いずれも本研究の作業仮説を指示するような反応の触媒活性が観察された。今後は酵素の精製度や活性測定条件を改善した上で、より詳細な酵素動力学的解析を行うことで各祖先型酵素の性状を明らかにする予定である。各酵素種について可溶性発現した酵素が得られており、今後の研究遂行に支障のない実験材料が得られたと言える。また得られた酵素についても活性測定実験を行い、各祖先型酵素が活性を有しているか、また活性を有している場合どの反応の触媒活性を有するかも評価した。

研究計画調書に記載の通り、対象とした酵素種について祖先型タンパク質配列の推定・人工合成・また大腸菌での異種発現を行った。いずれの酵素種についても可溶性発現に成功し、計画していた実験に大きな支障は生じなかった。また、各酵素について精製手法を検討し、高純度酵素を用いた活性測定実験を行えるようにした。これにより、各祖先型酵素が活性を有しているか、また活性を有している場合どの反応の触媒活性を有するかの評価が可能となった。これまでに活性の検出された2種の祖先型酵素に関しては、酵素の精製度や活性測定条件を改善した上で、より詳細な酵素動力学的解析を行うことで各祖先型酵素の性状を明らかにする予定である。また、活性の得られていない1種の祖先型酵素に関しては、嫌気条件での発現・精製を行うことで活性型酵素が得られないかを試みる予定である。また、得られた酵素を用い、結晶構造解析を試みる予定である。精製を行った祖先型酵素のうち活性の弱いものについて、発現条件や精製条件の検討を行い、より状態のいい酵素の取得を行う。反応性の測定を終えた酵素については、結晶構造解析や構造モデリングなどを行い、基質特異性を決定する残基・モチーフの解明を目指す。さらに、祖先型酵素を出発点として、ランダム変異と活性スクリーニングを繰り返し、活性の高い酵素へと人工的に進化させる系に供する。これにより、単一の多機能型酵素から個別の高活性型酵素への進化過程を実験室で再現することを試みる。研究計画調書提出時に計画していなかったこととして、研究代表者は9月1日に所属機関を異動した。異動前の実験に必要な物品は、本科研費交付内定前に購入済みだったもので支障がなく、物品移動による酵素失活や破損などのトラブルを避けるように努めた。異動後は、実験のセットアップに時間を要したことや予定していた学会参加を見送ったことなどから、次年度使用額として回すこととなった。当該年度で使用を見送っていたDNA実験用試薬やタンパク質実験用試薬の購入、また国内外学会の参加に次年度使用する予定である。研究代表者は初年度9月1日に所属機関を異動した。異動後は、実験のセットアップに時間を要したことや予定していた学会参加を見送ったことなどから、本年度使用額として回すこととなった。この変更に伴い、本年度は当初の予定額900千円よりも多いおよそ1,229千円を使用したが、初年度分の未使用金額を使い切るまでには至らず、次年度使用額が生じた。次年度の研究遂行に必要な試薬購入費や学会参加費などに使用する予定である。
市街地における生活環境資源としての「谷戸」の研究

横浜市など南関東の都市内に残る「谷戸=やと」の地形・実態と、都市生活・都市環境に果たしている役割とその関連行政を分析した。「谷戸」は横浜市域だけで約4,600あり、典型的単位では230mの斜面からなるU字谷の下方に幅数十m奥行き200mほどの平地がある。市街地化したもの、緑地を維持しているものに分かれ、自然が保全されているものでは、その環境的役割・生活的社会的役割は大きく、今後の市街地環境の向上にとって貴重な資源であることを実証した。1.横浜を中心とする「谷戸」に関し、文献収集を行い、地形図、空中/衛星写真などから「谷戸図」をつくり、典型を抽出する作業を行った。この作業ではまず標高データを元にGISを用いて一次集水域の抽出を行った。これに加えて農林業センサスにおける農業集落界データ、土地宝典などから抽出した旧小字地名データ、明治期に作成された迅速測図からの古い地形情報などを組み合わせ、調査研究の対象としての「谷戸」の定義と単位性についての検討を行った。こうした検討をふまえ現在の地形図上で谷戸地形が残る場所を特定し、これらの環境条件と土地利用、宅地化の進行状況との関係を調べ「谷戸」の類型化と類型分けを行った。2.上記で得られた類型より典型数地区を選びだし、神奈川大学を中心に、明治大学、宇都宮大学、兵庫県立大学、神戸大学、広島大学の研究者が協力し、フィールドフィジカル(植生・建物・環境・土地利用)調査/形成経緯歴史文化調査/管理運営状況調査/住民活動調査を行った。特に横浜市戸塚区舞岡地区及び同緑区新治地区に関して、緑地計画、都市計画、農業政策に関する横浜市及び神奈川県の諸制度の体系と実施の状況について精査を行った。横浜市戸塚区舞岡地区では特にノンフィジカルな調査を行い、谷戸を利用した環境教育活動と谷戸の行政管理について重点調査を行った。保土ヶ谷区内においてフィジカルな計測研究を行い、谷戸における気象観測データの収集を行った。1.昨年度標高データを元にGISを用いて作成した「谷戸図」をベースとしつつ、明治期に作成された迅速測図の等高線のトレース作業を行い、過去の地形データと現代の地形データをGIS上で統合し、市街化の進む以前の谷戸の地形と土地利用の状況を図化分析した。こうした作業に加え小字地名の示す範囲について土地宝典と古地図を元に明らかにし、社会的単位性と谷戸の地形的まとまり、土地利用のまとまりについて分析を進め、谷戸の単位性に関する定義の精細化を行った。2.また谷戸環境の現代的活用が見られる典型数地区を選びだし、神奈川大学を中心に、明治大学、宇都宮大学、兵庫県立大学、神戸大学、広島大学の研究者が協力し、特に横浜市戸塚区舞岡地区及び横浜市緑区新治地区に関して、本年度は主に環境管理と活用の側面に着目し、谷戸の環境管理に関わる市民団体とその活動実態、活動拠点等について整理し、谷戸の現代的活用と管理の実態について分析をおこなった。また保土ヶ谷地区、茅ヶ崎地区(港北ニュータウン)を対象に加え、経年的な市街地変容について明らかにし、谷戸地形をベースとした市街化や開発、計画手法についての分析検証を行った。さらに風・気温・微気象に関しては測定を行い、GIS地図化するとともに、谷戸地形の気象的効果およびその波及範囲や条件について検討した。3.以上それぞれの調査と分析によって得られた知見を共有討論する全体研究会を行った。この研究は横浜市など南関東の大都市内に残る地形単位「谷戸」に着目し、都市生活および都市環境に対し谷戸の果たしている役割を明らかにし、環境共生と成熟した地域社会の持続性が求められる現代大都市の再生の手がかりを得ることを目的としている。行った研究を以下に示す。1.谷戸の地形上の定義の検討及びGISを用いた再現性のある谷戸抽出方法の開発。2.地形と地名の対応を検討による谷戸の基礎単位寸法の検討。3.地形及び土地利用特性の比較、及びその関係に基づく谷戸の類型化。4.これら類型を概略調査による詳細調査地域の選定。5.制度、市民活動、市民評価、環境教育に関する調査(舞岡,新治)。6.昭和30年代の谷戸の環境と生活生業社会に関する復元ヒアリング(上倉田)。7.市民活動調査及び計画評価(港北NT)。8.微気候調査(保土ヶ谷)。得られた知見を以下に示す。1)谷戸の同定方法を明らかにした。TPI法と地名法からえた寸法を加えて計算すると横浜市の谷戸は4657ある。2)谷戸のスケールは平地の幅数十mで奥行きは200m以下程度、約1haが単位となる。3)名がつけられた谷戸は概ね農家群と農地からなるのが基本形となる。4)谷戸は農地経営をしつつ生活する仕組みであり、地主+自作農の本家分家結合構造が社会単位となる。5)地形により台地=斜面=低地という谷戸の構造関係が異なる。

6)1960年代からの市街地開発により谷戸の土地利用類型が別れた。7)緑地保全体系は、横浜市独自の制度,ふるさとの森や市民の森など諸制度を土地の実情経緯により適用している。防災や環境問題としての位置づけは不十分である。8)市民活動は谷戸の環境保全、農業体験などの活用、環境教育等に関わっており、概ね肯定的に捉えられている。9)谷戸が緑地として保全または低利用されると、風の道として都市気候緩和の役割を果たす。以上、現代市街地における谷戸の実態とその役割を明らかにすることができた。有効な利活用が見られるモデルとして典型類型を抽出の上、詳細な調査分析を行っているが、今後は若干の類型を加え多角的視点から谷戸の特性評価と計画課題について分析を行う必要がある。25年度が最終年度であるため、記入しない。前年度までにまとめた「谷戸」の実態および典型の詳細とその評価を基礎資料としつつ、下記の各項目についての補完的調査を行いまとめの作業を行う。具体的には1)谷戸管理、2)谷戸の行政的位置づけ、3)谷戸分類、4)谷戸の観察と評価(気象、利活用実態、防災)の項目について整理し、これら調査をまとめた上で、谷戸の特性実態、その評価、地区計画の評価と課題、谷戸の計画指針に関して公開研究会を行う。
cystatin A遺伝子の構造 およびその発現調節の解析

cornifiedcell envelope(CE)は表皮角化細胞における最も強靭な細胞膜裏打ち構造であり、transglutaminaseの活性化にともない急速に形成される。このCEの前駆体タンパクは数多く知られているが、loricrin、involucrin、cystatinA、spr(small proline-rich protein)などがある。我々は以前から乾癬表皮の病態について検討しており、protein kinase Cの活性化シグナルと乾癬表皮の類似性を見いだし、その過程でcornified envelope構成蛋白のひとつであるinvolucrinのprotein kinase C依存性の制御機構について明かにした。しかし表皮細胞における増殖から細胞死へ至る分化へのスイッチングへのメカニズムは依然不明である。本研究の目的はCEの前駆体のひとつであるcystatin A遺伝子構造および発現調節機構を明らかにすることである。ヒト胎盤由来のgenomicDNA libraryからhuman cystatin A cDNAをプローブにしてcystatin Agenomic cloneを単離、その構造を解析したところ、custatin A遺伝子は66、102、126bpのエクソンからなることが明らかになった。次にcystatin Aのpromoter領域(+77から-2595)をchloramphenicol acetyltransferase(CAT)遺伝子につないだexpression vectorを作製し、発現調節領域をin vitroで解析した。cyatatin A promoter活性はprotein kinase CのactivatorであるTPAにより増強し、mRNAレベルにおいても同様の結果が得られた。更にTPAの反応性を規定している領域を各種変異expression vectorを用いて検討したところ、-272から-278領域であるあることが明かとなった。また、gel shift assay、AP-1 expression vectorsでの解析から-272から-278領域にc-Junとc-Fosまたはc-JunとJunDが結合し発現調節を行っていることが推定された。表皮細胞が分化し最終的に強靭な構造であるcornifiedenvelopeの構成成分のひとつであるcystatinA遺伝子の構造を明かにするため、現在我々が保有しているヒト胎盤由来のgenomic DNA libraryからhuman cystatin A cDNAをプローブにしてcystatinAgenomic cloneの単離を試みた。我々は、スクリーニングにより得られた約8kbpのクローンの塩基配列を検討したところ、ふたつのエクソンが含まれていた。さらにその上流域を単離するため、long PCR法を用いて検討したところ、第一エクソンと転写開始点から上流2672bpをふくむPCR産物を単離した。これらの結果から、cystatin A遺伝子は3エクソンからなり、それぞれのエクソンは66bp、102bp、126bpで、第一、第二イントロンは14kbp、3.6kbpであることが明らかになった。
軟骨・血球分化とがん抑制に関わるスプライシング制御機構の研究

RhDのエクソン7に結合するSRSF分子を同定するためにFlag-tag付きのSRSF強制発現系を用いてRNA pulldownを実施。抗Flag抗体を用いたウェスタンブロッティングにてスクリーニングを行った。RNA pulldownの実験条件なども適宜変更しながら実験を重ねた結果、SRSF3, SRSF8, SRSF9などとの結合が観察された。このうち960G>A変異により配列特異的に結合の減弱を認めたのは結局SRSF3であった。RNA-EMSAでも条件を変更して検証したところ抗体スーパーシフトでSRSF3とRhDエクソン7配列の特異的結合が確認された。EMX2のエクソン2、p63のエクソン13についても選択的スプライシングにかかわるSRSF分子やその他のスプラソソーム構成分子を同定するためのRNA pulldownの系を新たに作成した。WeakD/Delの原因変異を導入したカセットベクターについては日本人で報告のある変異について順次作成を行ったがスプライシング異常をきたす変異の同定にはいたっていない。また変異部位がきわめて多く、すべての変異のスクリーニングを終了させることはできなかった。p63の選択的スプライシングでHalo-tag蛋白の発現が消失するモニタリング細胞を用い、軟骨分化作用をもつβisoformへのスプライシングを誘導する化合物をミニライブラリを用いてスクリーニングした。いくつか有望な候補が得られたが、未分化軟骨細胞株C3H10T1/2へこれら候補化合物を作用させALP活性の出現の有無で軟骨分化誘導能を評価したところ、少なくとも単独で軟骨分化を誘導可能な化合物を見出すことはできなかった。EMX2によるスプライシングアッセイ用のベクターは、RhD L320L変異の系で検証したところうまくワークしなかった。そこでp63のexon 12と14を用いて再度Halo-tag, GFP-tag付のカセットベクターを作成し同様の検討を行ったところ、ワークすることが確認できた。このカセットベクターを用いてRhD exon 6, 7, 9のWeakD/Del原因変異についてスプライシング異常の有無を検討した。既知のK409K変異でエクソンスキップが確認されたほか、V319Vでエクソン7の正常なスプライシングの減弱が確認された。RhD L320L変異のエクソンスキップの原因を検討したところ、in silicoで予測されたSRSF1と変異部位RNAとの結合はRNA-EMSAやRNA pulldown assayでは確認されず、他のSRSF分子が関与すると考えられた。候補SRSF計13分子の一過性発現ベクターを作成してRhDミニ遺伝子と同時導入し、splicing patternへの影響を評価した。positiveな変化パターンを呈する複数の候補分子と、正常スプライシングを完全に阻害するSRSF3が同定された。p63, VHL, RhD, EMX2の安定発現・スプライシング解析用のミニ遺伝子を作成した。p63 exon 12-14のミニ遺伝子にHalo-tag, GFP-tagをつけたものをATDC5, HeLaに安定導入し細胞株クローンを作成した。細胞株へのSRSF一過性強制発現系により軟骨分化誘導能のスクリーニングを行った結果、軟骨分化誘導分子の候補としてSRSF1, SRSF5, SRSF11, TRA2Bが示された。アデノウィルス発現系を作成しヒト間葉系幹細胞に導入したところ、SRSF1, SRSF11, TRA2Bの強制発現系に軟骨分化誘導が確認された。EMX2を用いたカセットベクターはうまくワークしなかったが、かわりにp63を用いてHalo-tag, GFP-tag 2種類のtagをつけたカセットベクターを作成しうまくワークすることを確認できた。カセットベクターの作成に時間がかかったため遺伝子変異の解析はRhD遺伝子のみとなっているが、従来機序が不明であったc.957G>A変異のスプライシング異常を確認することに成功した。安定導入によるスプライシングアッセイのためのミニ遺伝子は当初の予定通りalternative splicingを受けるexonをすべて含んだものとすることはできなかったが、予定通り4遺伝子すべてに対し作成することができた。一部安定導入細胞株の作成を前倒しで行っている。SRSFファミリー分子については強制発現系の構築が完全に終了し、一部機能解析を行うことで、SRSFファミリー分子の中に軟骨分化誘導に重要な役割をもつ分子がある可能性を示すことができた。予定以上の進捗状況のものと、予定よりやや進捗状況が遅れているものが混在しており、全体としてはおおむね順調に進行していると考えている。RhDのexon 7の選択的スプライシングにnegativeに作用する因子の候補として同定したSRSF3であるが、RNA-pulldownやRNA-EMSAの系でexon 7への直接の結合を証明することはできなかった。exon 7に直接結合作用するSRSF分子をより効率よくスクリーニングするためにSRSF1-SRSF12, TRA2BのFlag-tag付きの強制発現系を作成した。これを293に強制発現して細胞質分画を抽出、exon 7との特異的結合をRNA-pulldownの系で検証中である。またp63の選択的スプライシングを利用したカセットベクターを用いてexon 9の1270G>A変異が既報のとおりエクソンスキップを生じることを確認した。一方欧米人に多いDel変異M295Iについてはエクソンスキップは生じず従来いわれているようにアミノ酸変異による膜局材能の消失による表現型であると考えられた。軟骨分化、ガン抑制、アポトーシスなど多様な作用をもつp

63分子に着目しexon 12-14 (βisoformの選択的スプライシング)以外に、exon 10-11(γisoformの選択的スプライシング)、exon 10-14のGFP-tag付きミニ遺伝子を作成した。さらにこのC末端にHalo-tagをつけてRT-PCRの特異性を高めるとともにDual-reportersystemにて選択的スプライシングでHalo蛋白が消失する系を作出した。これらをHeLa細胞に安定導入した。この系を用いてスタウロスポリンによるアポトーシス刺激でγisoformへのスプライシングスイッチが生じることを見出した。軟骨細胞分化モデルのATDC5でも同様に安定導入細胞の作成を行い、選択的スプライシングがRT-PCRで検出可能か検証作業中である。RhD遺伝子について頻度の高い既知の2つの変異についてスプライシングアッセイを行い、片方が既報通りスプライシング異常であることを確認、もう一方はスプライシング異常ではないことを新たに確認した。一方RhD exon 7に結合するSRSF分子については予定していた方法で十分特異的な結合能をもちかつスプライシングにpositiveに働く分子を同定できず、Flag-tag付の強制発現系で新たにスクリーニングを行う方針に変更となった。p63のスプライシング解析用のミニ遺伝子についてはexon10-14を含む完全長のミニ遺伝子を含む3種類のDual-reporter vectorの作成、さらに安定導入細胞株の作出に成功し、一部機能解析まで行うことができた。一方、当初予定していたVHL遺伝子やEMX2遺伝子については時間的および予算的制約から、ミニ遺伝子作成以降の作業を行うことができなかった。以上のように予定通りの進捗状況のもの、予定以上の成果が得られたもの、予定通りに実施できなかった部分が混在しており、全体しておおむね順調に進展しているものと判断する。RhDのエクソン7に結合するSRSF分子を同定するためにFlag-tag付きのSRSF強制発現系を用いてRNA pulldownを実施。抗Flag抗体を用いたウェスタンブロッティングにてスクリーニングを行った。RNA pulldownの実験条件なども適宜変更しながら実験を重ねた結果、SRSF3, SRSF8, SRSF9などとの結合が観察された。このうち960G>A変異により配列特異的に結合の減弱を認めたのは結局SRSF3であった。RNA-EMSAでも条件を変更して検証したところ抗体スーパーシフトでSRSF3とRhDエクソン7配列の特異的結合が確認された。EMX2のエクソン2、p63のエクソン13についても選択的スプライシングにかかわるSRSF分子やその他のスプラソソーム構成分子を同定するためのRNA pulldownの系を新たに作成した。
ユウロピウム化合物の新しい電子状態と磁性の発現

今年度も前年に引き続きキラル構造を持つEuTX(T:遷移金属,X: Si, Ge, P)やそれらに関連して,EuGe, EuGe2, EuCu5, EuAu5,EuMnBi2などの新規物質の単結晶育成,基本物性測定,高圧実験を行い,特異な電子状態や磁気状態の探索の研究を推進した。カイラル構造を持つEuPtSiは試料育成条件を最適化し,大型純良単結晶に成功した。それを用い,中性子散乱実験や共鳴X線散乱グループと共同研究を進めたことで,類似結晶構造を持つMnSiで報告されているスキルミオン相が存在するということがほぼ確定的になった。しかし,一方でEuPtSiのスキルミオン相(A相)は磁場を[110], [112]方向へ加えると消失すること,スキルミオン半径が非常に小さい(18オングストローム)など,MnSiとは大きく異なることも明らかになっている。また,[001]方向の周辺にだけA相とは異なる別の磁気相(B相)が出現している可能性があり,国内の多くの研究者と共にさらに研究は進展している。加えて,ドハース・ファンアルフェン効果測定から,結晶構造の反転対称性の破れを反映した大きなフェルミ面の分裂を明らかにした。正方晶反強磁性体EuCu2Ge2の高圧下電気抵抗測定から約7 GPaで反強磁性が消失する磁気臨界点が消失することを見出したが,さらにその臨界点付近を詳細な圧力依存,極低温まで測定したところ,1次転移的に急速に磁気転移温度が抑制され,6.5 GPaで磁気臨界点に達することが分かった。また臨界点周辺を20 mK程度の極低温まで測定したが,新たな相転移は観測できなかった。他,EuGe, EuGe2, EuCu5, EuAu5など新規の物質探索を試み,純良な単結晶育成に成功した。それぞれに奇妙な磁気相を持っていることがわかり,研究が続いている。高圧下で磁気臨界点を迎える物質探索は,多くの進展があった。前年度に見出したEuCu2Ge2を精密な圧力制御と極低温までの測定により,詳細が明らかになってきた。反強磁性転移が,1次転移的な鋭い変化により磁気臨界点へ移行していて,Ce系化合物によく見られていた磁気揺らぎによるものだけでなく,大きな価数揺らぎとが競合しているような振る舞いをしている。現在,理論的なことも含めて,研究は続いている。臨界点付近の極低温でCe化合物で見られるような超伝導の期待をしたが,EuCu2Ge2では発見することができなかった。他にEuGe2の圧力効果測定から,7 GPa付近で反強磁性転移温度が最大になり,8 GPaでは転移温度が減少した。さらに高圧下で磁気臨界点を迎える可能性があることが分かった。EuAu5では,二つの磁気転移を確認し,特に低温側の13.5 Kでの強磁性転移が1次転移的な振る舞いを示すことが初めて確認できた。EuTXでは,EuPtSiにスキルミオン相があることがほぼ確定的になり,初めての希土類物質でのスキルミオン相の発見として,大きな話題になった。今後も大きく発展する研究と期待される。EuPtSiと同じ結晶構造をもつEuPtGeでは,EuPtSiより反強磁性転移温度が低く,3.0 Kの反強磁性体であることが分かってきた。しかし,何度か繰り返し育成を試みているが,EuPtSiに比べると良質で大きな単結晶は得られていない。しかし,1mm角くらいの単結晶での実験から,H || [111]では1 Kで12 kOeと20 kOeで磁化曲線にわずかなメタ磁性転移が現れ,対応するホール抵抗にもこの磁場領域でピーク構造が現れた。このホール抵抗のピーク構造は2 K付近から0.7 Kまで見出され、EuPtSiのスカーミオンを示すA相と類似していることが分かった。本研究では,高圧下実験が重要な役割を果たしている。昨今のヘリウムの供給の危機的状況から,共同研究による高圧実験ではなく,ヘリウム液化施設のある自前の実験装置で行うことが急務となっている。昨年度からの課題は現状も克服できておらず,安定した加圧,圧力媒体技術獲得のためには,安定した実験が達成できるまで熟練者のところに通い,アドバイスを請う必要があると考えている。研究協力者の大学院生とともに早期に10 GPa程度は発生したい考えている。特に,EuGe2の8 GPa以上の高圧実験に期待している。他にも複雑の磁気相を持つことが分かったEuGeや価数転移点近傍の物質と期待されるEuCu5や特異な磁性を示すEuAu5など高圧下の振る舞いは興味深い。10 GPa程度の圧力まで電気抵抗の圧力効果測定を行い,新しい圧力誘起の価数転移や磁気臨界点を持つような新規のユウロピウム化合物を探索する。キラル構造を持つEuTX関連では,EuPtGeの純良化は今後も続けていく。また,育成に成功していないEuIrPも,新たな出発物質を育成して単結晶育成を試みる。EuPtSiは国内の研究者へ単結晶試料を提供し,共同研究を進める予定である。最終年度として,研究成果を精力的に発信する予定にしている。EuCu2(Ge1-xSix)