hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
セルフ・アジュバント機能を持つ、革新的ワクチンプラットフォーム技術の確立

SV40から作製したウイルス様粒子(VLP)に抗原エピトープを導入してマウスに免疫すると、人工的アジュバントを加えなくても効率よくエピトープ特異的細胞傷害性T細胞(CTL)を誘導することができる。従って、VLP自体に自然免疫を活性化するセルフ・アジュバント活性が存在すると考えられる。本研究では、さまざまなアプローチを使って、このセルフ・アジュバント機能を解明することを試みた。そして、VLPの刺激で発現量に変化がみられる分子を明らかにした。また、VLPは粘膜免疫にも有効であった。さらに、さまざまなCTLエピトープでも、効率よくCTLが誘導できることを示した。本研究では、SV40ウイルスから作製したウイルス様粒子(VLP: virus-like particle)を使用して、新しいワクチンプラットフォームを開発することを目的としている。我々は、Influenza A virusのmatrix protein由来のHLA-A2拘束性CTLエピトープであるFMP 58-66を、SV40 VLPの表面に導入した(VLP-FMP-58-66)。このVLP-FMP-58-66を、HLA-A2トランスジェニックマウスに投与して免疫すると、効率よくFMP特異的CTLが誘導できた。特筆すべきは、この免疫に副作用を伴うアジュバントを加える必要がなかったことである。すなわち、SV40-VLP自体に、自然免疫系を活性化するセルフ・アジュバント機能があると考えられる。本研究年度では、主に、このVLPの刺激によって、どのように自然免疫系が活性化されるのか、そのセルフ・アジュバント機能のメカニズムを解析した。SV40-VLPをマウスリンパ球に反応させると、自然免疫活性化の指標であるCD86などの分子の発現が増強した。そして、これらの分子が発現誘導されるさまざまな免疫担当細胞を解析した。さらに、VLPで刺激した免疫担当細胞からmRNAを抽出し、次世代シーケンサーでRNAシーケンスを行い、また、免疫沈降物の質量分析を行い、発現量に変化がある遺伝子を網羅的に探索した。VLP刺激による細胞内シグナル伝達経路の解析も行った。本研究の目的は、SV40ウイルスから作製したウイルス様粒子(VLP: virus-like particle)を使用して、新しいワクチンプラットフォームを開発することである。Influenza A virusのmatrixprotein由来のHLA-A2拘束性CTLエピトープであるFMP 58-66をVLPに結合させてマウスに免疫すると、アジュバントを加えることなく効率よくFMP特異的細胞傷害性T細胞(CTL)を誘導することができる。すなわち、VLP自体に、自然免疫系を活性化するセルフ・アジュバント機能があると考えられる。一般的にアジュバントは副作用があるので、この特徴はVLPにとって大きな利点である。昨年度は、このセフル・アジュバント機能のメカニズムを解析するために、VLPで刺激された細胞のRNAを調整し、発現量に変化がある遺伝子を網羅的に探索した。本研究年度では、mRNAの発現量において有意差がみられた、細胞表面分子やサイトカインなどが、VLPの刺激によって細胞に発現誘導されることを、Flow cytometryやELISA法を用いることによって確認した。また、VLP刺激によっていくつかの抗原提示に関係する細胞内分子も誘導されることが示された。そこで、これらの分子を発現しない細胞株を作製し、解析を進めることを新たに計画した。そのために、ゲノム編集の実験系を構築する必要があった。そこで、さまざまな試行錯誤の結果、CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集技術、FACSによる特定の細胞のsorting技術の習得によって、特定のゲノム遺伝子をノックアウトした細胞株を作製する実験系を確立した。本研究課題において、最も重要な目的は、VLPの刺激で自然免疫を活性化する、セルフ・アジュバント機能のメカニズムを解明することである。平成26年度においては、さまざまな免疫担当細胞を用いて、VLP刺激によって発現増強する分子を網羅的に解析し、いくつかの分子の発現が増強されることを明らかした。平成27年度では、これら有意差がみられた分子、液性因子が、VLPの刺激によって細胞に発現誘導されていることを、Flow cytometryやELISAなどさまざまなアッセイ法を用いて確認した。これらの分子をさらに解析するために、新たにCRISPR/Cas9を用いることにした。CRIPSR/Cas9は、ゲノム遺伝子を特異的に切断してノックアウトできる遺伝子改変技術である。本研究年度のほぼ1年間をかけて、さまざまな試行錯誤を繰り返し、この技術とFACSによるsorting技術を使って、特定のゲノム遺伝子をノックアウトした細胞株を作製することに成功した。今後は、このゲノム編集技術を利用して、VLP刺激によって発現増強すると思われる分子をノックアウトした細胞株を作製し、VLPの刺激を作用させ、自然免疫が活性化されるかどうか、抗原提示がされるかどうかを検討する必要がある。SV40ウイルスから作製したウイルス様粒子(VLP: virus-like particle)の表面に、Influenza A virusのmatrix protein由来HLA-A2拘束性CTLエピトープを導入して、HLA-A2トランスジェニックマウスに免疫すると効率よくインフルエンザ特異的CTLが誘導できる。その際、免疫賦活作用のあるアジュバントを加える必要がない。本研究の主要な目的は、このセルフ・アジュバント機能のメカニズムを詳細に解析し、新しいワクチンプラットフォームを開発するための研究基盤を確立することである。

昨年度までに、VLPで刺激された細胞において、遺伝子の網羅的解析から、細胞表面分子やサイトカイン、抗原提示関連分子において発現量に変化がみられることが明らかになった。また、その発現量の変化を、フローサイトメトリーやELISA法で確認した。また、さらなる解析のためにゲノム編集の実験系を確立した。本研究年度では、VLP刺激で発現量に変化がみられた一連の細胞内抗原提示関連分子に焦点を当て、それら分子の相互作用をさまざまな分子生物学的手法で検討した。そして、ゲノム編集技術を用いてそれら分子のゲノム遺伝子をノックアウトした細胞株の作製を試みた。また、HLA型に制約されないプラットフォームを構築するため、抗原タンパク質を組み込んだVLPでMHCの異なるマウスに免疫し、CTLを誘導させた。さらに、粘膜ワクチンに応用するため、経鼻免疫で呼吸器粘膜にCTLが誘導できることを明らかにした。本研究課題において最も重要な点は、VLP刺激によって自然免疫を活性化するセルフ・アジュバント機能のメカニズムを解析・解明することにより、新しいワクチンプラットフォームを開発するための研究基盤を確立することである。平成2627年度において、VLPで刺激されたことにより、いくつかの細胞表面分子やサイトカイン、抗原提示関連分子の発現量に変化がみられることが明らかになった。そして、さらなる解析のためにゲノム編集の実験系を確立した。当初予期していなかったことは、一連の抗原提示関連分子が検出されたことである。これらの分子は、抗原特異的CTLの誘導に極めて重要な分子であり、VLPのセルフ・アジュバント機構に密接に関連している可能性が高い。そこで、これらの分子の解析に焦点を当て、さまざまな分子生物学的手法で検討している。さらに、ゲノム編集技術を用いてそれら分子のゲノム遺伝子をノックアウトした細胞株の作製を試みている。細胞株の作製には、もう少し時間が必要である。また、予定通り、HLA型に制約されないプラットフォームを構築するため、抗原タンパク質を組み込んだVLPを使って、CTL誘導を検討した。また、粘膜ワクチンへ応用するために、マウスへ経鼻免疫で呼吸器粘膜にCTLが誘導できることを明らかにした。以上のように、抗原提示関連分子の関与という当初予期していなかった結果が出始めているが、他の計画に関しては研究計画の通り進んでいると考えられる。SV40ウイルスから作製したウイルス様粒子(VLP: Virus-like particles)にCTLエピトープを導入してマウスに免疫すると、CpGのようなアジュバントを加えなくても効率よくエピトープ特異的細胞傷害性T細胞(CTL)を誘導することができる。したがって、VLP自体に自然免疫を活性化するセルフ・アジュバント活性が存在すると考えられる。
診断・治療開始時期のがん患者と家族への看護師主導型サポート支援に関する研究

本研究では、開発した看護師主導型オリエンテーション・プログラム(以下、本プログラム)の有用性を検証することを目的としている。具体的には、1アウトカム指標の検討とプログラムの改訂作業を行い、2有用性試験の実施を予定している。2018年度は、看護師のアウトカム評価について検討した。がん診療連携拠点病院に勤務し、認知症認定看護師と老人専門看護師、がん相談支援センターに従事する専門看護師からヒアリングを行った結果、せん妄や認知症など認知機能が低下した高齢がん患者への対応が課題として挙げられ、早期からの対応(発症と重症化の予防)と専門家を含む多職種との連携が大事であることが分かった。ヒアリング結果を受け、本プログラムを実施するにあたり、看護師のレディネスを担保するため、認知機能が低下した高齢がん患者への看護実践を評価する尺度を開発した。具体的には、せん妄または認知症をもつがん患者の看護経験のある看護師511名を対象にWeb調査を行った結果、知識尺度において、せん妄の症状やリスクに関する質問、せん妄の発症と重症化の予防対策に関する質問の計11項目、認知症の症状に関する質問、認知症の評価と対応に関する質問の計14項目が同定され、識別力と困難度が確認された。自信尺度において、探索的因子分析の結果、「I.認知機能が低下した患者へのケアの概要と実践」、「II.認知機能が低下した患者に対する医療者間での情報共有と連携」の2ドメイン16項目から構成される尺度を同定し、因子妥当性・既知集団妥当性、内的整合性が確認された。2018年度と2019年度は、1を予定しており、2に向け順調に準備を進めている。2018年度と2019年度は、1を予定しており、2に向け継続して準備を進めていく。研究費の余剰金が発生した理由として、調査において人件費を計上していたが、Web調査にて研究費の効率的な運用を試みたこと、外部研究者との打合せや臨床家からのヒアリングにおいて、学会参加の合間やSkypeの活用を試みたことなどが挙げられる。次年度も引き続き、効率的な研究費の活用を心掛け、2018年度の余剰金などは2019年度のプログラム資材開発費への計上を検討している。
細胞工学方法によるテラトカルシノーマの分化誘導と腫瘍遺伝子発現の制御

(1)テラトカルシノーマ核移植細胞を用いた細胞分化系譜の決定機序の解明;未分化幹細胞であるテラトカルシノーマ(胚性奇型腫)の分離核を、分化したラット筋芽細胞の脱核細胞質に核移植を行った細胞をクローン分離した。この核移植細胞は全て筋芽細胞様形態及び蛋白合成パターンを示し、分化誘導によって多核形成を示し、分岐した筋管様構造を示し筋特異的蛋白であるα-トロポミオシン等を合成した。即ち分化した筋芽細胞の細胞質に未分化幹細胞の核遺伝子に作用して筋芽細胞へ決定する因子の存在することが初めて見出された。(2)発癌遺伝子産物による細胞系譜の決定因子の阻害;成人性白血病(ATL)の原因ウィルスとしてHTLVが知られ、癌化に関与する遺伝子として特異的遺伝子pxが存在するが、その作用は殆んど不明である。前記の筋芽細胞に決定されたテラトカルシノーマ核移植細胞にHTLV-【II】px遺伝子の移入を行うと、px遺伝子が発現した細胞は全て形態的に元の未分化テラトカルシノーマにもどり未分化細胞の形質発現を示した。この結果はpx遺伝子産物P【38^x】蛋白の直接的作用は筋芽系への決定因子の阻害であり、これによって筋芽様核移植細胞が元の未分化細胞にもどったものとも考えられる。即ちある発癌遺伝子は分化の決定を阻害することによって分化の異常を引きおこす可能性が見出された。(3)発癌遺伝子のヒト染色体上のマッピング;発癌遺伝子c-erbB-2がヒト染色体No.17に座位していること、また胃癌細胞でこの発癌遺伝子の増巾していることが見出された。(4)細胞質小環状DNAのヒト染色体への組込み;細胞質には染色体外DNAとして小環状DNAが存在する。ヒト癌細胞(HeLa)より分離した小環状DNAのクローン(Hspc)を用いてヒト染色体にも存在するか否かを調べた所、染色体切断等の起り易い部位に一致してHspcが組み込まれていることが見出された。即ちHspcはトランスポソン様に組み込まれ、その部位を切断され易くしていた。
高度擬似表現を用いた超高圧縮映像符号化の研究

画像の複雑なテクスチャ領域に擬似表現技術を適用することで画質に違和感を与えることなく,高圧縮化を図ることができる手法を開発した.テクスチャ領域の一部をパッチとして符号化し,復号側で合成拡大を行った後に,非テクスチャ領域とポアソン画像合成する.この際,顕著性マップおよびテクスチャ特徴ベクトルを用いて,エンコードするパッチ位置とサイズを自動設定できることを明らかにするとともに.非テクスチャ領域とテクスチャパッチ成分に対する適切な量子化制御方式を明らかにし,画質を保ちつつ符号量を2030%に抑えることができた.また,ポアソン合成処理を高速化することで,従来の3%以下の処理速度を達成した.本研究は,「送り側の映像を正確に再現する必要はなくその意図が伝わればよい」という新しい発想に基づき,テクスチャ合成・画像検索などを画像符号化に適用する新しいアルゴリズムを検討し,H.264/AVC,JPEGなど従来手法の510倍の超高圧縮映像符号化を達成することが目的である.H25年度の検討ではまず,顕著性に基づいたテクスチャ合成とポアソンブレンディングを用いた新しいコンセプトの圧縮フレームワークを提案した.エンコーダでは,領域分割によりテクスチャ領域を検出し,検出された領域中の一部のパッチのみを符号化伝送する.デコーダでは,伝送されたパッチを復号するとともにテクスチャ合成手法を用いて領域拡大し,対応するテクスチャ領域に貼り付ける.エンコーダ側で符号化するパッチ領域の選択に関しては顕著性マップを利用する.また,デコーダでの貼り付けにはポアソンブレンディングを導入して自然な合成画像を生成する.シミュレーション実験では,従来のJPEGでは高圧縮化した場合に著しいブロック雑音が検知されるが,提案方式では高圧縮化しても比較的自然な画質が得られることがわかった.RD特性の観点からデータ収集を行ったところ,従来のJPEGと比較して最大で7080%の符号量削減を達成しつつ.画質を維持できていることが主観評価実験によって明らかになった.一方,上記方式ではデコーダ側のポアソン合成処理時間が膨大となる問題があった.このため,合成元および合成先の画像を一旦縮小してポアソン画像合成を行った後に拡大処理を行う,拡大の際には補間処理が必要であるが,バイキュービックなど通常の手法ではボケが発生する.そこで,縮小前画像の勾配情報を利用した非線形拡大を新たに提案し,合成画質の劣化を抑えつつ処理時間の高速化を図った.実験により,画像合成処理部分の処理時間を1/100程度まで削減することができた.本研究は,従来の原画忠実性に基づく画像圧縮方式に対して,「送り側の映像を正確に再現する必要はなくその意図が伝わればよい」という新しい発想に基づき,画像合成技術等を符号化に適用する新しいアルゴリズムを検討するものであり,H.264/AVC,H.265/HEVC,JPEGなど従来手法の510倍の超高圧縮映像符号化を達成することが目的である.昨年度の検討で,顕著性に基づいたテクスチャ合成とポアソン合成を用いた新しいコンセプトの圧縮フレームワークを提案したが,H26年度は細部の検討を進め,提案方式を実現する上でのいくつかの課題を解決に導いた.主な実績は,1デコーダでのポアソン合成の高速化およびその性能評価,2復号画像の詳細な主観評価実験の実施,3エンコーダにおけるパッチ領域自動選定手法の確立,4原画像からのテクスチャ成分分離手法の検討,5学会を通じた提案手法のプロモーション,の5点である.具体的には,まず,1については,H25年度に既に方式提案を行っていたが,高速化のための画像縮小率やポアソン合成における繰り返し回数と合成後の画質との関係を明らかにし学会発表を行った.2においては符号化画像の主観評価実験により,原画忠実性に基づくSNやSSIMでは従来方式よりも劣るものの実際に目で見たときの主観画質は大きく向上することを明らかにした.3においては領域分割後の各領域がテクスチャ領域なのか非テクスチャ領域なのかをHaralick特徴量に基づいて学習し,サポートベクトルマシンによって決定を行う手法を提案した.4においては,テクスチャ合成の際に,Total valiationフィルタ/Waveletフィルタ/Bilateralフィルタにより原画像から分離したテクスチャ成分を用いる手法を提案し,合成画質と処理時間のバランスからBilateralフィルタが優れていることを確認した.これまで,擬似表現符号化として,画像中のテクスチャ領域からパッチを抽出して符号化し,復号側でテクスチャ合成する圧縮手法を検討し,パッチ領域の抽出および合成画像の自然さ維持のために顕著性マップおよびポアソン合成技術を導入することで大局的な信号の変化に対応できるようにした.今年度はこれを発展させ,テクスチャ表現,パッチの自動選択,動画テクスチャへの拡張について検討した.まず,周波数成分分離型テクスチャ合成を画像符号化に応用する際の量子化パラメータについて検討を行った.トータルバリエーションフィルタにより骨格成分とテクスチャ成分に分離を行った後,骨格成分は直接,テクスチャ成分は一部のパッチを,それぞれHEVCを用いて符号化する.その際に骨格成分符号化とパッチ符号化に異なる量子化パラメータを適用し,発生符号量と復号画質の関係から,量子化パラメータの最適な組み合わせ条件を明らかにした.結果として,HEVCに比べて70%以下の符号量で同画質の画像を復元できた.次に,復号画像の画質を決定する重要な要因となるパッチ領域決定手法を検討した.本検討では,比較的簡易なHaralick特徴量の組み合わせで,合成画像と原画像の視覚的類似性を自動推定できることを示した.切り出し位置および切り出しサイズの異なる複数の候補パッチで合成した画像の視覚的類似性を本手法によって推定し,類似度の最も高いパッチを選択することで,原画類似性の高い合成画像が得られる.

最後に,動画像のテクスチャ合成については,提案手法を時空間方向へのテクスチャ合成に拡張することで実現できることを示した.以上の検討により,視覚的類似度という新しい評価基準の下でHEVCを上回る圧縮符号化効率の実現が可能となり,CGMに代表される大規模画像の効率的なネットワーク配信システム設計への一つの方向性を明らかにできた.画像の複雑なテクスチャ領域に擬似表現技術を適用することで画質に違和感を与えることなく,高圧縮化を図ることができる手法を開発した.テクスチャ領域の一部をパッチとして符号化し,復号側で合成拡大を行った後に,非テクスチャ領域とポアソン画像合成する.この際,顕著性マップおよびテクスチャ特徴ベクトルを用いて,エンコードするパッチ位置とサイズを自動設定できることを明らかにするとともに.非テクスチャ領域とテクスチャパッチ成分に対する適切な量子化制御方式を明らかにし,画質を保ちつつ符号量を2030%に抑えることができた.また,ポアソン合成処理を高速化することで,従来の3%以下の処理速度を達成した.研究計画においては,(1)擬似表現符号化の基本的性能把握,(2)テクスチャ検索とポアソン画像合成による画像再構成手法の検討,(3)動的テクスチャに対する擬似表現符号化適用の検討,(4)擬似表現符号化ソフトウェアプログラム作成と性能評価,の4つのステップで進めている.このうち(1)は昨年度実施し,H26年度の当初予定としては(2)(3)についての検討結果を明らかにするとしていた.H26年度の実際の検討では,(2)の画像再構成手法の検討を行うとともに,H27年度実施予定としていた(4)のソフトウェアプログラム作成の一部を先行して行った.その理由としては,H25年度およびH26年度の取り組みで静止画像に関しての一連のアルゴリズムを詳細に検討することができ,全体の系を通しての静止画像用ソフトウェアシミュレーションによる性能把握を先行して行った方が,動画像に適用する場合のパラメータ絞り込みが容易になると考えたためである.そのため,(3)の動画像向け擬似表現符号化は最終年度であるH27年度に回すこととした.これまでの達成度としては,(1)の基本性能把握は100%完了し,(2)の静止画用アルゴリズム検討はテクスチャ分離手段の詳細検討を除いて80%が完了している.また,(4)に関しては静止画像向け(40%)と動画像向け(60%)からなるが,静止画像向けソフトウエアがほぼ完成している.検討手順を若干変更しているものの全体としては,ほぼ予定通りの進捗状況であるといえる.一方,これまでの検討で得られた新しい技術的知見を学会に発表し広く公表し,同類のテーマに取り組む大学研究室や産業界からの意見・コメントを分析することで,本課題の検討に資することができた.さらに,本研究課題の位置づけや重要性に関して学会誌への投稿,および研究会での講演を通して広く認知させる活動を行った.
ゲノムの低メチル化とレトロポゾンの活性化を特徴とする大腸がんの診断・治療開発

ヒトの主要なレトロポゾンであるLINE-1が低メチル化により活性化している大腸がんにおいて、5-FUの効果が高いメカニズムを解析した。その結果、LINE-1の発現自体は直接5-FUの効果に影響を与えておらず、LINE-1の低メチル化によりクロマチン構造が弛緩することが5-FUの効果に関与していると判明した。LINE-1の発現亢進は細胞障害よりもむしろ細胞増殖に関与しており、5-FUとの併用効果を認める抗がん剤ではLINE-1の発現を抑制することが抗腫瘍効果発現メカニズムの1つであると示唆された。5FUによるLINE-1発現誘導の機序を解明するため、LINE-1のプロモーターをルシフェラーゼの上流に挿入したレポータープラスミドを構築した。これをSW480に一過性発現させ、5-FU投与時のレポーター活性を測定したが、有意な変化を認めなかった。5-FUによるLINE-1発現誘導は転写後の変化と考えられたため、Actinomycin Dを用いて、KINE-1 mRNAの分解速度を解析した。しかし、5-FU投与によりRNAの分解速度にも変化は認めなかった。また、LiNE1 RNAとTSの結合や、LINE-1蛋白の核移行も認めなかった。そこで、上記レポーターを安定発現するSW480を作成して解析したところ、5-FU投与によりレポーター活性の亢進を認めた。これらの結果から、5-FUによるLINE-1発現誘導はクロマチン構造の変化を介していると示唆された。LINE-1による細胞障害活性が5演FUの効果発現に直接関与しているのかを確かめるために、RNA干渉を利用してLINE-1発現を抑制した状態で5-FUの抗腫瘍効果を解析した。5-FUの効果解析にはMTT assayとコロニー形成法を利用した。その結果、いずれの方法においてもLINE-1の発現は5-FUの効果発現に直接は関与しなかった。また、LINE-1のノックダウンによりSW480の増殖は抑制され、LINE-1の発現亢進は細胞障害よりもむしろ細胞増殖に関与していると示唆された。LINE-1の発現を調節する薬剤をスクリーニングするために、上記で作成したレポーターを安定発現するSW480を使用して、複数の薬剤暴露によるレポーター活性の変化を解析した。その結果、既知の抗癌剤やリン酸化阻害剤の多くはHNE演1の発現を抑制する効果があり、抗腫瘍効果のメカニズムとしてLINE-1を介した機序をさらに検討する価値があると考えられた。LINE-1のメチル化を新たなバイオマーカーとして臨床応用するために、大腸がんにおける複数の既存バイオマーカーとLINE-1メチル化の関係を探索した。その結果、K-ras codon 12に変異のある大腸がんではLINE-1メチル化は有意に高いという関係を認めた。K-ras codon 13の変異とLINE-1メチル化には有意な関係を認めなかった。B-raf遺伝子の変異を伴う大腸がんではLINE-1メチル化は有意に高かった。チミジル酸合成酵素の遺伝子座におけるLOHを認める大腸がんではLINE-1メチル化は有意に低かった。チミジル酸合成酵素の遺伝子型はLOHにより2, 3G, 3Cのいずれかのアレルだけが残存することになるが、これらのアレルのうち3Gが残存している症例ではLINE-1メチル化は有意に高かった。また、LOHを認めない大腸がんに限って解析すると、LINE-1メチル化は概ね高値であったが、3C/3Cの遺伝子型を持つ大腸がんだけは他の遺伝子型と比較してLINE-1メチル化は有意に低かった。以上の結果から大腸がんの予後や抗がん剤感受性との関連を認める複数の既存バイオマーカーとLINE-1メチル化との間には多くの相関関係を認め、LINE-1自体を予後予測や抗がん剤の個別化に利用できると示唆された。昨年度までの解析で5-FUはLINE-1の発現を亢進させる一方で、多くの抗がん剤はLINE-1の発現を抑制することがレポーターアッセイを用いた研究で明らかとなった。そこで、臨床的に効果が確認されている、5-FUとオキザリプラチン併用時のLINE-1発現状態を解析した。大腸がん細胞SW480を5-FU処理するとLINE-1の発現は亢進するが、オキザリプラチンとの同時処理によりLINE-1の発現はむしろ減弱し、細胞増殖も抑制された。この結果から、臨床で使用されている5-FUとオキザリプラチンの相乗効果にはLINE-1の発現制御も影響する可能性が示唆された。5-FUの効果とLINE

-1のメチル化の関係にはメチル化とクロマチン構造の相関が介在すると示唆されたため、クロマチン構造を定量的に評価できる解析法、Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Element (FAIRE)法を改変してゲノム全体のクロマチン構造を評価する手法を開発した。この方法を用いて5-FU投与時のクロマチン構造の変化を観察した。LINE-1のメチル化レベルが高く、クロマチンが凝集している細胞CaR-1では5-FU投与によるクロマチン構造の変化は軽微であった。LINE-1のメチル化レベルが低く、クロマチンが弛緩している細胞SW480では、5-FU投与によりクロマチンの弛緩は著名に増強した。抗ヒストンH3抗体を用いたChIPアッセイで解析したところ、SW480ではヒストンと結合する総DNA量は減少したが、CaR-1では変化を認めなかった。クロマチンの弛緩に伴ってSW480では核内にリン酸化ヒストンH2AXのfocusが出現し、DNAの2重鎖切断が起こっていると考えられた。クロマチン凝集のマーカーであるヒストンLys9メチル化とリン酸化ヒストンH2AXを2重染色すると、両蛋白は核内で排他的に存在し、DNAの2重鎖切断はクロマチンの弛緩部位に起こると確認された。以上の結果から、LINE-1の低メチル化を認めるがんではクロマチン構造が弛緩しているため、5-FUのDNA取り込みによるDNA2重鎖切断が起こりやすく、この機序が5-FUへの高感受性の背景にあると考えられた。血液中に存在する遊離DNAから低メチル化LINE-1の検出を試みた。PCRのプライマー配列を最適化することにより、大腸がん患者の血中遊離DNAから低メチル化LINE-1を検出することが可能であった。がんの血液診断に臨床応用できる可能性が示唆された。交付申請時に予測していた結果とは一致しなかったため、一部予定の変更が必要となった。しかし、当初予定した研究内容は概ね達成できたため、今後の研究展開の見通しを含めて順調と判断する。25年度が最終年度であるため、記入しない。LINE-1のメチル化と5-FUの感受性が相関するメカニズムが解明され、このメカニズムを利用してLINE-1低メチル化とレトロポゾンの活性化を特徴とする大腸がんに対し新規治療法を開発する基盤が整った。また、大腸がんの血液診断に関しても、LINE-1の低メチル化をターゲットにできることを示唆する研究成果が得られ、今後、診断法開発においても研究推進できる状況になった。このように、当初予定した研究内容は概ね達成できたため、今後の研究展開の見通しを含めて順調と判断する。当初LINE-1の機能自体が証FUの効果発現に関与しているとの予測のもとに研究計画を立案したが、平成23年度の研究結果からこの予測が否定された。5-FU投与によるLINE-1の発現変化にはクロマチン構造が深く関与していることが新たに判明したことから、5-FUの効果発現とクロマチン構造の変化が相関する可能性が新たに想定される。今後は、LINE-1の低メチル化とクロマチン構造および5-FUの効果との相互関係をin vitroと臨床検体の両者で解析を進める。
単分散系エマルジョンを用いた革新的薬剤送達系に関する基礎的検討

膵癌に対する高濃度抗癌剤投与を可能とするため、新たな薬剤送達系の開発を行った。癌組織と正常組織の微小循環の違いに着目し、正常組織には残留せずに癌組織に停滞する、極めて細径のエマルジョンを作成することを目指した。このため抗癌剤とリピオドールを用手的に混和する従来のエマルジョンを改良することとした。界面活性剤を使用し、SPG膜という内部に均一な径の孔を有するガラス膜を使用することで、単一な粒子径を有するw/o/wエマルジョン(単分散系エマルジョン)の作成に成功した。粒子径測定ではエマルジョン径がほぼ均一であることが示された。本研究で得られた基礎的知見は今後の臨床応用の礎になるものと考える。本研究の目的は、正常組織と腫瘍組織の微小循環の差異に着目し、正常組織の障害を起こすことなく、腫瘍内の薬剤分布を最適化する、動注療法用の新たな薬剤送達系を開発することである。具体的には、膜乳化法を用いて、比較的均一な抗癌剤-リピオドール懸濁液(単分散系エマルジョン)を作成することを目標としている。本研究の第一段階は、様々なサイズの膜を用いて目標とする10μm以下のエマルジョンを作成し、その物理化学的特性や安定性を検討することである。次に第二段階として、動物実験にて単分散系エマルジョンの挙動を調べることを予定である。研究計画書に示したとおり、平成27年度の目標としては第一段階を終了することであった。以下実際の成果について述べる。まず3μm及び5μmの膜を使用し、直接膜乳化法を用いてエマルジョンの作成を試みた。エマルジョンは二段階の乳化によって作成され、二次乳化の際に直接膜乳化を行う。安定したエマルジョンの作成には適切な一次乳化が肝要である。一次乳化の方法を検討したところ、攪拌機を用いた乳化が最適であるという結論に達した。しかし安定したエマルジョンを得ることに難渋し、試行錯誤を繰り返し、複数回の実験を要した。またエマルジョンの安定には、適切な界面活性剤の選択が必須であるが、その選定に時間を要した。最終的に光学顕微鏡レベルで観察しうる限りにおいて、安定したエマルジョンの作成に成功した。現在はエマルジョン粒子径の正確な分布を求めるため、粒度分析を行っているところである。上述のごとく、安定した一次乳化物を得るのに時間を要した。また適切な界面活性剤の選択に難渋した。これらの技術的な問題を解決するのに終始したため、予定よりも実験はややは遅れている。しかしエマルジョンの作成には成功し、現在その物理化学特性を確認しているところである。平成28年度は抗癌剤のエマルジョン化に関して追加実験を試行した。前年平成27年度の実験では光学顕微鏡によるエマルジョンの観察に留まり、粒子径分布に関する知見を得ることができなかった。粒子径分布を求めるためには一般的にレーザー解析等による粒度分析が必要であるため、これを行うと試みた。しかし費用が高く、施行困難であることが判明した。このためデジタルマイクロスコープを用いて粒子径測定を行った。この測定によりほぼ単一のピークを有する粒子径分布が得られていることがわかり、単分散系エマルジョンの作成に成功したことが判明した。また異なる温度、ph環境下でもエマルジョンの安定性を検討したところ、異なる条件下でも比較的安定であることが判明した。この研究成果を元にした論文を現在執筆中である。国際学会であるCIRSE 2016に参加し、当該研究に関する知見を深めた。今後完成したエマルジョンの物理化学的特性を検証していく。それが終わり次第、研究計画書記載のとおり、ウサギを用いた動物実験に移行する予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。放射線医学28年度が最終年度であるため、記入しない。
ラットの脳の高次機能および行動に対する飼料中油脂の違いによる影響

「母性行動異常における母ラットの行動特性と仔ラットの成長との関係」動物(ラット)にサフラワー油、およびシソ油、の2種類をそれぞれ給与して飼育し母性行動を観察した。結果はサフラワー油が食殺率が高く約30%(死亡率として)シソ油が約5%であった。サフラワー油、およびシソ油の食殺率の高低関係は再現性の高い実験であることが4回の繰り返し実験で明らかとなった。「胎生期ラットの海馬神経細胞の初代養におけるDHAおよびAAの役割」はDHAおよびAAの培地中での有無にかかわらず化学的刺激(カリウムイオン濃度を変える)を加えて培養を継続した方がそうでない方に比べてわずかに神経線維が太く、細胞維持期間も延びるようであった(有意性なし)。これは、さらに検討が必要である。また、アセチルコリン放出量を細胞活性の指標としたが今回は測定できなかった。「初代培養における脳胞の連続培養」では2ヶ月半近く培養が可能であった。但し、装置のトラブルがなければより長期間の培養が可能である。DMEM/F12培地で無血清培養では約1.5ヶ月目に突然神経線維の萎縮と細胞の死が始まった。この培地に非働化馬血清を5%添加して培養したものは2ヶ月半の長期間培養が可能であった。以上、アップダウン方式とボトムアップ方式の両方法でn-3系列およびn-6系列の脂肪酸の脳神経系への影響をみてきたが、脳神経系以外にも影響しそうな組織もあり、さらに検討の必要がある。また、生体脳を模倣した装置もかなりの事に(神経幹細胞、グリア細胞と神経細胞の関係さらにシナプス可塑性など)に充分役立つことがわかった。現在トラブルのより少ない装置に改良している。胎生期18日目のSD系ラット胎仔を用い、その脳の海馬部分を定法に従って分散処理を行い、細胞培養に供試した。そして、血清10%を含む培地に懸濁した。培養容器はポリエチレンイミン処理をほどこした24穴のマルチプレートを用い、それぞれのウェルに細胞数として1平方cm当たり3×10^5個となるように播種した。播種したプレートは37°Cで5%CO_2ガスと95%空気の混合ガスの条件(CO_2インキュベーター)で1日置いた。その後無血清培地と交換した。この時、培養溶液中(DF培地)に10^<-6>Mアラキドン酸(AA)、または10^<-6>Mドコサヘキサエン酸(DHA)をいれ、コントロールにはAAとDHAを溶かすために用いた0.1%ジメチルスルホキシド(DMSO)をいれた。これら操作の後、37°Cで5%CO_2ガスと95%空気の混合ガスの条件(CO_2インキュベーター)で72時間の培養を行った。その後、細胞数の計測とアセチルコリンの放出量の測定を行った。コントロールは72時間後に、神経繊維や樹状突起であろうと考えられるネットの形成も維持されず細胞らしきものの存在も少なくなっていた。また、アセチルコリンの放出量も少なかった。AAの添加された培養基は従来の報告にあるように、細胞数や神経繊維と考えられるネット形成が維持され、アセチルコリンの放出もみられた。これと同様に、DHAの添加された培養基でも細胞数はAA添加に比べて少なくなるものの、アセチルコリンはAA添加の場合と同程度の放出があった(統計的有意性はなし)。先年度報告に引き続き今年度はさらに、アラキドン酸(AA)、ドコサヘキサエン酸(DHA)を培地中にBSAを用いて添加した結果、前報告でのDMSOを使用した添加実験よりも、全体的に細胞数の変動が少なく、特にAAとDHA添加の方が細胞数維持に効果が認められた。また、海馬脳細胞の初代培養における細胞の長鎖脂肪酸の変動について、経日的に調べた結果、細胞数の変動と不飽和脂肪酸、特にAAおよびDHAの間に正の相関が見られた。これらのことは細胞膜が細胞の代謝活性を制御しているように推察された。しかし、今回のin vitro実験では、in vivoと違い、AAによる細胞障害もみられなかった。In vitroではin vivoほど細胞への刺激も少なく、AAの代謝産物であるプロスタグランジン系物質がほとんど産生されなかったためと推察した。今後は、刺激(パルス刺激および連続刺激)負荷で培養した場合のAA添加とDHA添加の状態を比較するつもりである。母性行動異常については、放射状迷路を改良したものを独自に作成し実験を行った結果、コーン油、サフラワー油(リノール酸70%含有)およびシソ油(α-リノレン酸60%含有)を給与した母ラットの母性行動において正解率および正解の場所にいる時間の長さはサフラワー油の供与されているラットがもっともよかった(傾向のみ)。この結果は食殺行動と併せて考えると矛盾しているようであるが、その行動様式から動物心理を推察すると非常に神経質な面があったと推察された。他者での実験の報告と併せて推察するとこれらの報告は矛盾しない。また、同時に海馬神経細胞の初代培養法の開発を予備実験的に行った。その結果は長期培養にも対応でき、種々の解析に使えそうである。

サフラワー油、およびシソ油の食殺率の高低関係は再現性の高い実験であることが4回の繰り返し実験で明らかとなった。「胎生期ラットの海馬神経細胞の初代養におけるDHAおよびAAの役割」はDHAおよびAAの培地中での有無にかかわらず化学的刺激(カリウムイオン濃度を変える)を加えて培養を継続した方がそうでない方に比べてわずかに神経線維が太く、細胞維持期間も延びるようであった(有意性なし)。これは、さらに検討が必要である。また、アセチルコリン放出量を細胞活性の指標としたが今回は測定できなかった。「初代培養における脳胞の連続培養」では2ヶ月半近く培養が可能であった。但し、装置のトラブルがなければより長期間の培養が可能である。DMEM/F12培地で無血清培養では約1.5ヶ月目に突然神経線維の萎縮と細胞の死が始まった。この培地に非働化馬血清を5%添加して培養したものは2ヶ月半の長期間培養が可能であった。以上、アップダウン方式とボトムアップ方式の両方法でn-3系列およびn-6系列の脂肪酸の脳神経系への影響をみてきたが、脳神経系以外にも影響しそうな組織もあり、さらに検討の必要がある。また、生体脳を模倣した装置もかなりの事に(神経幹細胞、グリア細胞と神経細胞の関係さらにシナプス可塑性など)に充分役立つことがわかった。現在トラブルのより少ない装置に改良している。
DNA修復遺伝子欠損細胞を用いたDNA損傷抗癌剤感受性の網羅的検討とその臨床応用

【緒言】泌尿器科領域において、化学療法抵抗性となった癌腫は、難治性となり生命予後に直接関与する。特に若年層に多く発生する精巣腫瘍では、化学療法で約70%が治癒可能であるが、残りは難治性となり予後不良であり、抗癌剤抵抗性を克服することが現在の課題である。DNA損傷型の抗癌剤による抗腫瘍効果は、DNAの損傷と修復のせめぎあいである。このため、抗癌剤投与後のDNA修復機構を検討することで、抗癌剤感受性の増強や補助化学療法の開発が可能となる。今回私たちは、DNA修復関連遺伝子欠損細胞株におけるトポイソメラーゼII阻害剤であるエトポシドおよびアドリアマイシン(ICRF193,)の感受性を検討した。【対象と方法】ニワトリBリンパ球由来のDT40細胞を用いて、様々なDNA修復関連遺伝子の欠損細胞株を作成した。これらの細胞にエトポシドを暴露させ、コロニーアッセイによって生存率を検討した。【結果】DNA二本鎖切断後修復遺伝子の一つである、非相同DNA末端結合(NHEJ)の欠損株ku70,lig4はエトポシド・ICRF193ともに高い感受性を示した。当初予測されなかった損傷乗り越えDNA合成(TLS)の欠損株であるrev3,rad18も中等度の感受性を示した。ku70とrev3またはrad18との二重欠損変異株のエトポシドに対する感受性は、相加効果が認められ、NHEJとTLSは独立して、エトポシドによるDNA損傷の修復に関与している可能性が示唆された。VP16と同様にTLSの欠損株であるrev3にも中等度の感受性を示した。【まとめ】エトポシドおよびICRF193による抗腫瘍効果発現には、NHEJ以外に、TLSの機能低下の関与が考えられた。また、NHEJとTLSはそれぞれ独立してDNA損傷の修復に関与していた。今回私たちは、DNA修復関連遺伝子欠損細胞株におけるトポイソメラーゼII阻害剤であるエトポシドの感受性を検討した。【結果】DNA二本鎖切断後修復遺伝子の一つである、非相同DNA末端結合(NHEJ)の欠損株ku70,lig4はエトポシドに高い感受性を示した。【まとめ】エトポシドによる抗腫瘍効果発現には、NHEJ以外に、TLSの機能低下の関与が考えられた。また、NHEJとTLSはそれぞれ独立してエトポシドによるDNA損傷の修復に関与していた。
重合性界面活性剤を用いた新規ナノ細孔体の創製と機能解明

本年度は、ポリマーミセルの形状を制御するための条件について検討した。最終的な目標は、高比表面積材料の創製であるため、集合体の形状が重要であると考えたからである。まず、界面活性剤の対イオンの影響を同一とするためにNaBr添加系における水溶液物性の解析をWilhelmy法による表面張力測定から検討した。その結果、PGについて、NaBr濃度を増加させると非球状ミセル領域が認められ、昨年度までに得られた球状以外のポリマーミセルを得られる可能性が示された。この非球状ミセル領域において、cryo-TEM観察による集合体の直接観察を行ったところ、紐状ミセルの形状を有していることがわかり、この領域(PG濃度:10mM、NaBr濃度:0.02M)において同様の重合反応を試みたところ、TEM観察より、円筒状のポリマーミセルが得られることがわかった。本研究によりナノオーダーの長さと空間を有するポリマーの創製が可能となった。
表面実装部品はんだ接合部の強度設計のためのCAEシステムの開発

本研究でははんだ接合部の疲労強度試験と応力・ひずみ評価の効率化を図り、表面実装部品のはんだ接合部の強度評価法に基づき、表面実装部品の強度設計のための効率的なCAEシステムを開発することを目的とした。本研究の研究成果を具体的に示せば、以下のようになる。(1)表面実装部品のはんだ接合部における応力・ひずみの評価法を確立した応力ひずみ評価法を用いてEWS上で正確に各種表面実装部品のはんだ接合部の弾塑性・クリープ解析を行った、各非線形ひずみ成分(塑性ひずみとクリープひずみ)に影響する諸因子の挙動を明らかにした。(2)(1)で得られた解析結果に基づいて、温度サイクル試験を受ける各種はんだ接合部の応力・ひずみ履歴を評価し、疲労試験の温度サイクル加速試験法の開発と実施を行った。(3)より効率良くはんだ接合部の熱疲労強度を評価するために、温度サイクル試験の加速試験として機械的疲労試験法の開発および実施を行った。加速試験を実施し、既に得られた熱サイクル疲労試験の結果と比較して、熱サイクル試験の代用として加速試験の有効性について確認できた。(4)表面実装部品のはんだ接合部の熱疲労試験およびその加速試験の結果などに基づいて、はんだ接合部の熱疲労強度評価にける解析・実験強度・信頼性評価技術を確立することができた。正確にはんだ接合部に生じる非線形ひずみを評価することができれば、Manson-Coffin則によってはんだ接合部の熱疲労強度を評価できることを明らかにした。(5)実験計画法を用いた表面実装部品の強度設計のためのCAEシステムの開発を行った。本システムにおいて、設計モデル(はんだ接合部の種類と形状)、使用材料、使用環境・条件、疲労寿命の評価基準等のデータベースを構築し、設計者が簡単に強度設計を行うことができるように効率性をはかった。電子デバイスはコンピュータのみならず自転車、産業用ロボットをはじめとする産業のあらゆる分野に用いられるようになってきている。本研究では表面実装電子部品のはんだ接合部の疲労強度試験と応力・ひずみ評価の効率化を図り、表面実装部品のはんだ接合部の強度評価法に基づき、表面実装部品の強度設計のための効率的なCAEシステムを開発することを目的とした。平成7年度の研究成果を具体的に示せば次のようになる。(1)表面実装部品のはんだ接合部における応力・ひずみの簡易評価法の確立・EWS上で各種表面実装部品のはんだ接合部の弾塑性・クリープ解析を行い、応力・ひずみに影響する諸因子の挙動を明らかにし、はんだ接合部の応力・ひずみ特性を理解するために有意な知見が得られた。・弾塑性・クリープの解析結果から、はんだ接合部の応力・ひずみに大きく影響するパラメーターを抽出し、簡易な応力・ひずみ解析法を確立した。(2)(1)で得られた解析結果に基づいて、熱サイクル疲労試験の加速試験法の開発と実施・熱サイクル疲労試験の最適条件を確定し、効率のよい熱サイクル疲労試験法を確立した。また、熱サイクル疲労試験を行ない、強度評価を行なった。・熱サイクル疲労試験を行ない、強度評価を行なった。・熱サイクル疲労試験の温度変化を受ける部品のはんだ接合部に生じるひずみの履歴を再現できるような機械的疲労試験を加速試験として選定した。・加速試験を実施し、既に得られた熱サイクル疲労試験の結果と比較して、熱サイクル試験の代用として加速試験の有効性について確認できた。

本研究でははんだ接合部の疲労強度試験と応力・ひずみ評価の効率化を図り、表面実装部品のはんだ接合部の強度評価法に基づき、表面実装部品の強度設計のための効率的なCAEシステムを開発することを目的とした。本研究の研究成果を具体的に示せば、以下のようになる。(1)引き続き平成7年度の研究の実施し、表面実装部品のはんだ接合部の効率のよい熱疲労試験の加速試験法が開発でき、はんだ接合部の強度・信頼性評価技術を確立することができた。・熱サイクル疲労試験の温度変化を受ける部品のはんだ接合部に生じるひずみの履歴を再現できるような機械的疲労試験を加速試験の選定基準を確立した。・加速試験を実施し、既に得られた熱サイクル疲労試験の結果と比較して、熱サイクル試験の代用として加速試験の有効性について確認できた。(2)現在得られた知見と平成7年度の研究結果から、実験計画法および表面実装部品の強度設計のためのCAEシステムの開発・このシステムに、(1)設計モデル(はんだ接合部の種類と形状)、(2)使用材料、(3)使用環境・条件、(4)疲労寿命の評価基準等のデータベースを構築し、設計者が強度設計を行うときの前処理の労力の軽減を図る。・既に開発された表面実装部品全体の3次元熱伝導・熱応力解析プログラムと平成7年度に開発される簡易応力・ひずみ評価法を用いて任意使用条件を受ける各種はんだ接合部の応力・ひずみ評価システムを開発する。・はんだ接合部の強度評価則に基づいて、はんだ接合部に生じる応力・ひずみの解析結果と接合部の強度結果のデータベースから表面実装部品の寿命を迅速に予測できるCAEシステムの開発を行う。
ステロイドホルモン核内受容体による転写促進能の解析

ステロイドホルモン核内受容体群はリガンド誘導性転写制御因子である。ステロイドホルモン作用発現を理解する上で、これら受容体の性状を明らかにすることは必須の課題である。特に核内受容体の主たる機能である転写促進能の機構は、主としてトランスフェクション転写系により詳細な解析が行なわれてきたが、今尚不明な点が多いのが現状である。特に核内受容体の標的エンハンサーは数多くのコンセンサス配列の同定が行なわれてきたが、核内受容体タンパク群の共通機能の理解に比較し、今だに統一的な法則が得られていない。我々はすでにオバルブミン遺伝子5′上流に新しいタイプのエストロゲン応答配列(OV-ERE)を見出した。OV-EREは、従来知られていたエストロゲン応答配列とはDNA構造が大きく異なりむしろレチノイン酸(RAR、RXR)、ビタミンD(VDR)、甲状腺ホルモン(TR)受容体の標的配列に近い構造であった。そこで本来のOV-ERE配列とともに合成DNAを用いた人工的な配列を用い、エストロゲン受容体(ER)、RAR、RXR、TR、VDR、による転写促進能を調べた。その結果従来より知られていたコンセンサス配列の他に、TRを除く他の核内受容体すべての標的エンハンサーになりうる配列を見出した。これらの知見が、トランスフェクション転写系(CAT assay)によるものであったので、次にin vitro DNA結合実験(ゲルシフト法)により受容体とDNAとの結合能を調べた。その結果転写促進能とほぼ比例して各受容体はDNAと結合することがわかった。以上の結果からある種の標的エンハンサーは一種の受容体のみならず複数の受容体によりその機能が調節されることがわかった。このことは、ステロイドホルモンや脂溶性ホルモン間のクロストーク機構の一端を明らかにするものであった。
オープンセル型ニッケルフォームの構造と強度

目的:オープンセル型金属多孔体は,高通気性と高比表面積により,化学反応触媒・脱臭剤・消臭剤・電池電極材などの担体として,あるいは,各種フィルターとして工業的に広く利用することができる.しかし,その力学的な特性についての情報は非常に限られている.本研究の目的はオープンセル型ニッケルフォームの圧縮変形における応力ー歪曲線の特徴を明らかにし,変形機構を検討すること,既報の引張試験結果との比較を行なうことにある.方法:供試材は,湿式メッキ法により作成された純ニッケルのオープンセルフォームで,固体ニッケルに対する密度比すなわち相対密度は0.06(気孔率は94%),セル寸法は約1mmである.厚さ10mmの原板から,辺長10mm,高さ20mmの正4角柱状試験片を切り出し,インストロン型万能試験機による大気中での定速圧縮試験(ε=1.4×10^<-4>s^<-1>)に供した.結果:(1)圧縮試験により得られた公称応力ー公称歪曲線は以下の3領域に大別できる。(図1):直線的な線形弾性領域,塑性降伏とそれに続く長いplateau領域,応力が急上昇する緻密化領域.(2)plateau領域はなめらかな曲線で,クローズドセル型のAlフォームにみられるような応力振動は現われない.これはAlフォームとは異なって本供試材の塑性崩壊が試料全域で一様に起こることを示唆する.(3)弾性率,塑性崩壊応力とも負荷方向にはよらない(図1).また両者とも,セルの圧縮変形をモデル化することにより定量的に説明することができる.目的:オープンセル型金属多孔体は,高通気性と高比表面積により,化学反応触媒・脱臭剤・消臭剤・電池電極材などの担体として,あるいは,各種フィルターとして工業的に広く利用することができる.しかし,その力学的な特性についての情報は非常に限られている.本研究の目的はオープンセル型ニッケルフォームの圧縮変形における応力ー歪曲線の特徴を明らかにし,変形機構を検討すること,既報の引張試験結果との比較を行なうことにある.方法:供試材は,湿式メッキ法により作成された純ニッケルのオープンセルフォームで,固体ニッケルに対する密度比すなわち相対密度は0.06(気孔率は94%),セル寸法は約1mmである.厚さ10mmの原板から,辺長10mm,高さ20mmの正4角柱状試験片を切り出し,インストロン型万能試験機による大気中での定速圧縮試験(ε=1.4×10^<-4>s^<-1>)に供した.結果:(1)圧縮試験により得られた公称応力ー公称歪曲線は以下の3領域に大別できる。(図1):直線的な線形弾性領域,塑性降伏とそれに続く長いplateau領域,応力が急上昇する緻密化領域.(2)plateau領域はなめらかな曲線で,クローズドセル型のAlフォームにみられるような応力振動は現われない.これはAlフォームとは異なって本供試材の塑性崩壊が試料全域で一様に起こることを示唆する.(3)弾性率,塑性崩壊応力とも負荷方向にはよらない(図1).また両者とも,セルの圧縮変形をモデル化することにより定量的に説明することができる.
新規リポペプチド系抗生物質カイコシンの標的同定

前年度までに、カイコシンEの標的について、温度感受性変異株の結果から推定し、物理的な解析により同定することに成功した。当該年度においては、黄色ブドウ球菌のin vivoで、カイコシンEが前年度に同定した標的に作用しているか否かを、標的の生合成に預かる遺伝子群を破壊した株を用いて解析した。その結果、これらの破壊株はカイコシンEに対して高度耐性を示し、殺菌されなかった。また、カリウムリークを測定する解析により、カイコシンEによる膜破壊も起こらなくなっていることが明らかになった。従って、カイコシンEの膜破壊活性、及び、それに引き続いて起こると考えられる殺菌活性は、黄色ブドウ球菌に標的物質が存在していないと起こらないことがわかった。さらに、人工リポソームを用いて、カイコシンEの膜破壊活性における標的の必要性について検討した。その結果、カイコシンEは標的を含まない人工リポソームに比べ、標的を含む人工リポソームに対して特異的に膜破壊活性を示した。一方、同じリポペプチド系抗生物質であるダプトマイシンには選択性が認められなかった。従って、カイコシンEは、脂質二重膜中に存在する標的と結合して、膜破壊活性を示し、抗菌活性を発揮していると考えられる。以上の成果から、カイコシンEはこれまで知られている抗生物質とは全く異なる作用機序により殺菌性を示すと考えられる。また、カイコ感染モデルを利用した治療効果を指標とした探索系の有用性、及び、温度感受性変異株を利用したメカニズム解析手法の有用性が示されたと考えられる。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、我々が確立したカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを用いて、治療効果を指標とした独創的な探索法によって同定された、新規抗生物質カイコシンの作用機序を明らかにすることである。本年度において、新たに我々が確立した、薬剤耐性かつ温度感受性株を用いた薬剤耐性遺伝子同定法により、カイコシン低度耐性株の変異遺伝子を複数同定し、それらが同じ代謝化合物の生合成経路であることを見いだした。そこで、その生合成経路の最終代謝物を、カイコシンEの抗菌活性測定系に加えたところ、カイコシンEの抗菌活性が阻害されること、及びカイコシンEと代謝物を培地中で混合すると沈殿を生じることを見いだした。さらに、マイクロカロリーメーターを用いた解析から、カイコシンEとその化合物は1:1で結合することを見いだした。従って、カイコシンEの標的を同定できたと考えられる。また、カイコシンEの標的となる化合物の活性を阻害しても、ほ乳類の個体では、黄色ブドウ球菌と異なり急性致死に至るような役割をしていないことが知られており、カイコシンEのマウスに対する毒性が低いことも説明できる。さらに、これまでに知られている様々な抗生物質の標的と比べても、カイコシンEの標的は異なっており、その作用機序は新規メカニズムに基づくと考えられる。従って、カイコシンEは新規クラスの抗生物質であると考えられる。今後は、カイコシンEの膜障害性における、標的化合物との相互作用メカニズムの詳細について検討する必要がある。また、カイコシンEの標的同定に利用した温度感受性変異を用いた方法について、他の抗生物質や抗菌薬について利用できるか検討する予定である。本研究の最大の目的であった、新規抗菌環状リポペプチドのカイコシンの作用標的を同定できたことから、計画はほぼ達成できたと考えられる。根研究の当初の目的の重要な部分について達成できたことから、今後はカイコシンEと同定した標的の膜障害における作用メカニズムの詳細、及び、今回標的の同定に用いた手法を他の抗生物質に応用できるか否か検討する。