hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
３次元森林構造に蛍光分布情報を付加した新しい光環境―光合成モジュールの開発

本研究ではLiDAR観測などに基づく詳細な野外観測による、3次元の森林情報を収集した。そしてこれらの詳細な森林情報を入力データとして利用することが可能な太陽光励起クロロフィル蛍光・光環境モデルを開発した。本研究の結果、新しい蛍光放射伝達モデルが開発され、モデルの感度解析や全球シミュレーションを実施することに成功した。そして、この解析から本開発モデルの適用可能性やその限界が明らかとなった。クロロフィル蛍光の観測値は光合成活性指標として注目されている衛星観測物理量の一つである。今後、開発したモデルを用いて衛星によるクロロフィル蛍光観測の物理的解釈が進められると期待される。本年度は、モデル開発に必要となる三次元林分構造とクロロフィル蛍光、光合成の観測を実施した。単木レベルの研究では、オオシマザクラの樹木を対象とし、樹木の三次元構造を得るために、2013年7月と2014年1月に3次元レーザースキャナー調査(株式会社パスコへ調査依頼)を実施し、樹木とその周辺環境の3次元点群データを得た。そして得られた点群データからオオシマザクラの樹木の情報を抽出し、10cm単位のボクセル情報への変換を試みた。また、新たに購入した簡易光合成測定器(簡易光合成測定器EARS社製MiniPPM 300)と超高波長分解能分光放射計(Ocean Optics社製HR4000:現有機器)を用いて、葉のクロロフィル蛍光と光合成の季節変化データの取得方法について検討を行った。さらに、これらの観測と並行してシュートレベルの形質、フェノロジー観測、土壌水分量、単葉の色素分析、比葉面積、インターバルカメラによるフェノロジー観測も実施し、本研究に最適な観測手法を見出すことができた。また、得られたデータをもとに放射モデルFLiESの改良を進めた。アラスカサイトでは、本年度は予備調査を実施し、mini-PPMを用いてクロロフィル蛍光観測の方法を検討するとともに、シュート角度など、いくつかの群落構造の調査を実施した。その他、岐阜県高山市の落葉広葉樹林帯などで分光、フェノロジー調査を実施した。また、1次元の放射モデルを含む陸域生態系モデルとしてBiome-BGCを選択し、その放射コードや光合成計算ルーチンの解析を行った。その結果、1次元と3次元のスケーリング関係を把握することができれば、陸域生態系モデルへの組み込みが比較的容易となることが分かった。今年度は昨年度に引き続き単木レベルのクロロフィル蛍光、クロロフィル指標、光合成、高波長分解能分光スペクトルなどの季節変化の観測を1-2週間おき実施した。また日本の高山サイトとアラスカのポーカーフラットサイトおよびアラスカ・ハイウェイ沿いの数地点においてデジタラルカメラによるフェノロジー撮影した。ポーカーフラットサイトでは2時期(9月と3月)に分光計測を行った。アラスカでは、葉群バイオマスの季節性には、積雪期間に影響を受ける林床の植生フェノロジー(植物季節)が重要であることが明らかになった。加えて、毎日観測した衛星データを用いて、日本とアラスカにおける着葉期間の空間分布の年々変動をマッピングした。着葉期間の時空間マップの構築など、潜在的な光合成期間と光合成生産量を広域的に推定するための重要な基礎データが構築できた。蛍光を数値計算するための放射モデルFLiESの開発に関しては、昨年度に引き続き計算コードの改善を進めるとともに、昨年度取得したLiDARデータから葉面積密度の格子データを作成し、そのデータを入力値としてクロロフィル蛍光の三次元分布やクロロフィル蛍光の2方向性反射率計算などを行った。その結果、近赤外域における森林からの上向きクロロフィル蛍光輝度には、森林の形状に依存するものの、10%程度の多重散乱成分が含まれることが明らかとなった。こうした成分は、蛍光と光合成量を結びつける際には、誤差要因となることから衛星などで観測される蛍光輝度値の利用については注意が必要であることが明らかとなった。ビックリーフタイプの生態系モデルについては、モデルのシミュレーションに必要な気象・衛星データなどの収集にめどがつき、衛星データを利用して不確実性を低減させた光合成量のデータセットの構築が進んだ。(テーマ1)2015年8月にアラスカ州フェアバンクス郊外のクロトウヒ疎林を訪問し、分光計HR4000とMiniPPMを用いてクロトウヒの林床植生のクロロフィル蛍光(SIF)輝度と光合成活性の調査を行った。また、平成26年度末に設置した地表面分光連続観測装置のデータ回収とデータ解析を行い、夏季の林床植生のSIF、光合成活性及び、ブロードバンド分光反射率を比較した。また、小型のタイムラプスカメラ(ラズベリーパイ)を設置し、林床の変化の様子を連続モニターした。(テーマ2)前年度に引き続きSIF計算用の放射伝達モデル(FLiES)の開発と修正を行い、モデル構築を完了した。また、3次元森林景観を用いてSIFの感度解析を実施し、樹冠SIF輝度の観測角度依存性や陽葉、陰葉別の寄与、葉面積指数との関係、波長による違い、SIF放射の林内での多重散乱効果などについて調査し、衛星観測で利用される近赤外の樹冠SIF輝度においては多重散乱効果の寄与が直接蛍光放射と比較して、最大30%近くに達することが明らかとなった。(テーマ3)1次元、3次元スキームにおけるSIFシミュレーション値の比較を行った。1次元スキームは水平均一の葉群景観とし、3次元スキームと同じ放射伝達モデル(FLiES)で比較した。この比較の結果、1次元スキームで計算されるSIFは、同じ葉面積条件下では後方散乱方向を中心に過大推定する傾向があることが明らかとなった。

また、SIFシミュレーションを全球で実施し、GOME-2によるSIFの衛星観測値及びサポートベクター回帰で推定した全球総光合成量(GPP)の結果と比較した。その結果、本研究で構築したモデルは、全球の衛星SIF及びGPPの季節変化と良好な一致をみた。しかし、開発したモデルは衛星のSIF推定値よりも大きめに計算されることが明らかとなった。本研究ではLiDAR観測などに基づく詳細な野外観測による、3次元の森林情報を収集した。そしてこれらの詳細な森林情報を入力データとして利用することが可能な太陽光励起クロロフィル蛍光・光環境モデルを開発した。本研究の結果、新しい蛍光放射伝達モデルが開発され、モデルの感度解析や全球シミュレーションを実施することに成功した。そして、この解析から本開発モデルの適用可能性やその限界が明らかとなった。クロロフィル蛍光の観測値は光合成活性指標として注目されている衛星観測物理量の一つである。今後、開発したモデルを用いて衛星によるクロロフィル蛍光観測の物理的解釈が進められると期待される。平成26年度の観測調査に関しては、概ね予定通りに実施することができた。単木レベルの観測では平成25年度の予備調査の実施状況を勘案し、超光波長分解能分光計HR4000における葉のクロロフィル蛍光観測を葉の表面だけでなく裏面についても実施して葉の両面からの蛍光輝度のデータを収集した。また、アントシアニンメーターを新たに購入し、葉内のアントシアニン色素の季節変化の計測も実施しその季節変化を得た。アラスカにおける観測でも林床の状態の異なる2時期において分光観測を行うとともに、多点における植生フェノロジー情報を得ることができた。三次元放射モデルFLiESにおけるクロロフィル蛍光計算については、平成25年度に取得したLiDAR点群データからボクセル(格子)情報を抽出し、そのデータと単葉レベルの蛍光データを組み込んで樹冠上端及び樹木の三次元クロロフィル蛍光シミュレーションを実施することができた。一方で、LiDAR点群データをボクセル化する作業や放射モデルへの読み込みモジュール開発に時間がかかり、光合成モジュールとの結合まで行うには至らなかった。光合成モデルの結合作業については、平成27年度に引き続き実施するものとしたい。ビックリーフタイプの生態系モデルについては、モデルシミュレーションに必要な気象・衛星データセットなどの収集が予定通り進み、光合成量の初期的なデータセットの構築が終わり、研究を順調に進めることができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。陸域リモートセンシング本年度までの研究によりクロロフィル蛍光や光合成、植物の季節変化などの観測調査に関しては順調に推移している。最終年度となる平成27年度も引き続き同様の観測を単木レベルとアラスカのポーカーフラット調査地などで実施し、モデルの入力・検証データとなる情報を得る。また、国内外の学会や学術論文などでの成果の公表を進める。三次元放射モデルのクロロフィル蛍光輝度値の計算については、今までの検討結果が概ね妥当な計算値が出力できるところまで来た。一方で、光
光活性化PEG脂質を用いた、迅速かつ一細胞単位の多種細胞パターニング技術の開発

複数種類の細胞を、種類ごとに望みの位置に配置する技術は、迅速な複数種細胞のアッセイや生体の細胞配置を模した人工組織構築など、次世代の細胞研究において強力なツールとなる。本研究では、そのような多種細胞パターニングを可能とする分子として、光に応答して細胞を基板上に固定化できる光活性化PEG脂質を開発した。本分子を修飾した表面上では、細胞種ごとに光照射と細胞播種・洗浄を繰り返すことで、どのような細胞でも迅速に一細胞単位で多種細胞パターニングすることが可能であった。さらに、この表面上で目的の細胞のみを光捕捉することで、血中循環ガン細胞といった医療において重要な細胞を捕獲・単離することができた。複数種類の細胞を、種類ごとに望みの位置に配置する技術は、次世代の細胞研究において強力なツールとなる。そのような多種一細胞パターニングを可能とする分子として、PEG脂質の細胞固定化機能を余剰の光分解性脂質でケージングした光活性化PEG脂質を開発した。本研究では、その表面修飾条件の探索や、駆動原理の解明、有用性を示すアプリケーションの実施等を目的とした。まず、本年は光活性化PEG脂質の接着性細胞への応用を行った。これまで、接着性細胞が基板への接着等の細胞活性を示すコラーゲン表面では、光活性化PEG脂質表面が構築できていなかった。そこで本分子のコラーゲン表面への修飾条件を検討したところ、反応溶液中に30v/v%以上のDMSOを混和することで、光活性化PEG脂質/コラーゲン表面を構築できた。また、本表面では、光パターニングされた接着性細胞が、接着・伸展等の活性を示すことが観察されている。次に、本分子の駆動原理の解明の為に、PEG脂質がどのような分子でケージングされるか、分子のスクリーニングを行った。その結果、PEG脂質に短鎖脂肪酸や一般的に吸着阻害分子として知られるPEGを結合させた時は、PEG脂質の細胞結合機能はケージングされなかった一方、長鎖脂肪酸や疎水性化合物を結合させた時には、ケージングがなされた。したがって、本分子の駆動には、分子の疎水性が大きく寄与することが示された。最後に、実用的なアプリケーションとして、血中循環ガン細胞(CTC)の単離を行った。まず、坦ガンマウスから採取した末梢血中のCTCを抗体により蛍光標識した。これを光活性化PEG脂質表面に播種し、顕微鏡観察により検出したCTCを光固定し、基板表面を穏やかに洗浄したところ、数万以上におよぶ目的外の細胞はすべて基板上から除去され、数細胞のCTCのみが基板上に単離された。これまでの研究において、まず、平成27年度の目標の一つである、非接着性細胞・接着性細胞共に利用可能な光活性化PEG脂質表面の構築を達成した。コラーゲン表面上に構築した光活性化PEG脂質表面を用いることによって、接着性細胞と非接着性細胞の共パターニングだけではなく、接着性細胞とリポソームといった生物と無生物といった全く異なる性質を持つ物体の共パターニングにも成功しており、本分子の強力な汎用性が確認されている。また、光活性化したPEG脂質のブロッキング剤として有効な物質も探索されており、ブロッキング剤を用いることで、パターニング間のコンタミネーションの少ない7細胞集団からなる共パターンの構築がなされた。一方、本分子の駆動原理の理解においては、駆動に必要な因子が解りつつあるものの、駆動メカニズムの直接的な解析については今後の課題として残っている。しかし、次年度の目標としていた、光活性化PEG脂質の有用性を示すアプリケーションの実施においても、CTCの単離という形で達成しており、本研究は非常に順調に進展していると言える。これまでに7種類の細胞群のパターニングに成功しているが、より多くの細胞群のパターニングには、個々の細胞のパターニングに必要な時間の短縮が必須となる。現行の実験操作において、時間短縮が可能と思われる作業として、PEG脂質の光活性化があげられる。PEG脂質表面は、共焦点顕微鏡に標準装備されている405 nmレーザー光を使用し、ROI (Region of Interest -関心領域観察機能)を用いた光パターン描画により活性化している。現在のPEG脂質に含まれている光分解性基では、細胞固定化表面に変化するのに数分/mm2の光照射時間を要してしまう。そこで、405 nmの光への応答性が高い分子を光活性化PEG脂質の合成に用いることにより、光活性化にかかる時間の短縮を図る。そのような新規光分解性基の探索方法として、ニトロベンジル型光分解性基を骨格とし、鈴木・宮浦カップリングによりコンビナトリアルに光分解性基ライブラリーを作製する方法を用いる。

すなわち、ニトロフェネチル基の光応答性に影響があることが解っている4位に、市販されているボロン酸誘導体をカップリングすることにより簡便に種々の光分解性リンカーを調製し、その中から目的に適う化合物を用いて光活性化PEG脂質を合成する。上記の様な方法で、より多くの細胞種がパターニングされた細胞チップを作製し、ハイスループットな細胞動態の解析に用いる。材料工学
神経再生軸索の分散・収束に関する実験的研究

顔面神経など分枝に富む神経の再建においては、複数の神経を利用して多元的に神経再生を図ることが必要である。利用できる神経源は限られているため、真に有効な神経縫合が求められる。本研究では、直径の異なる神経どうしの縫合、分枝の取り扱い方の2点に絞ってラットを用い研究をおこなった。その結果、1神経縫合後の末梢側の神経再生は、最終的には末梢側の元々の軸索受け入れ可能性に負うところが大であり、末梢側には直径の大きいdonor nerveを選ぶことが望ましい、2臨床的には、障害を受けた神経や細い神経にいかに太い新鮮なdonor nerveを縫合しても効果が期待されない可能性がある、ことが明らかとなったラットの顔面神経頬骨枝と頬枝をその共通幹からの分岐部周辺で剥離露出し、同一ラットの一側で共通幹の部で切断し再縫合し、(分散Dispersionモデル)、他側では切断した共通幹を頬骨枝のみと縫合した(収束Convergenceモデル)。その後、一定の待機期間(16週)を経た時点で評価を行った(nは各15)。「評価方法」:神経縫合部の前後で神経標本を採取し、エポン包埋後トルイジンブルー染色を施し、画像解析装置を用いて再生軸索数、軸索再生率、再生軸索短径を測定した。「結果」:分散モデル群と収束モデル群の間で再生軸索数、軸索再生率、再生軸索短径に関して統計的有意差を認めなかった。「考察」:今回の実験では長期経過例を検討した。短期経過例では両群の間に差が認められたが、その差は長期経過例では消失した。したがって、神経縫合後の末梢側の神経再生は、最終的には末梢側の元々の軸索受け入れ可能性に負うところが大であると考えられた。つまり神経の断面積が重要であり、神経移植を行う際には末梢側には直径の大きいdonor nerveを選ぶことが望ましいと言える。神経縫合後の軸索再生は供給側の量よりも受容側のcapacityに左右される傾向にあり、中枢側が細い神経であっても末梢側が太ければかなりの機能回復が期待される。臨床的には、顔面神経麻痺の再建において、障害を受けた神経(不全麻痺側の神経)や細い神経にいかに太いfreshなdonor nerveを縫合しても効果が期待されない可能性がある。つまり、近年導入されて盛んに行われるようになった神経信号の付加手技の適応拡大には慎重であるべきかと考えられる。その後、一定の待機期間(6週と12週)を経た時点で評価を行った(nは各20)。「評価方法」神経縫合部の前後で神経標本を採取し、エポン包埋後トルイジンブルー染色を施し、画像解析装置を用いて神経線維数、直径を測定した。「結果」6週の時点での比較では、神経線維直径ではD群とC群で差は見られなかったが、神経線維数ではC群が勝っていた。しかし、12週の時点では、直径、線維数ともに差は認められなかった。「考察」神経縫合後の末梢側の神経再生は、当初は分散型縫合と収束型縫合で差が生じるが、最終的には末梢側の元々の軸索受け入れ可能性に負うところが大であると考えられた。つまり神経の断面積が重要であり、神経移植を行う際には直径の大きいdonor nerveを選ぶことが望ましいと言える。予備実験の評価で大きなばらつきが出たのは、経過期間が3週間と短かったため、各個体間における再生軸索の伸長の速度の影響を強く受けたためと思われる。神経縫合後の軸索再生は供給側の量によって左右されるというよりも受容側のcapacityに左右される傾向にあり、中枢側が細い神経であっても末梢側が太ければかなりの機能回復が期待される。臨床的には、顔面神経麻痺の再建における顔面交差神経移植において健側のごく末梢の分枝であってもmotor sourceとして十分な有用性を持つものと思われた。方法:Wister系ラット20匹の顔面神経頬枝と頬骨枝を露出し、頬骨枝を切離し、その中枢端一側においては同根の頬枝に端側縫合(loop群)、他方は切離した(非loop群)ままとした。同時に頬枝と頬骨枝の合流部より中枢において神経を切断し、直ちに10-0ナイロンにて再縫合した。術後6週間で縫合部の中枢と末梢で神経を採取した。評価:縫合部より遠位の神経を採取し、2%グルタールアルデヒド固定、エポン包埋の後トルイジンブルー染色。

神経断端の軸索の数、短径を、画像解析ソフトImageJで計測した。優位差検定はウイルコクソンで行う。結果:loop群において,神経軸索数の10%程度の増加が認められたが、軸索短径に差は認められなかった。神経軸索は端側縫合部を通じて元の神経幹に入りこむものの、臨床的な差が出るまでに多量の流入が見られなかったのは、神経幹の直径が最大受け入れ数を限定するためと考えられた。したがって、神経血管柄付き筋肉を採取する際、神経幹から分岐する枝を切離後loop型に再縫合しても神経接合部に至るneural signalは増強されない可能性が大であると言える。この研究を通じて判明したことは、傷害された神経に対して神経端側縫合によりneural signalを増強しようとする方法は、極めて限定的にしか奏効しないという事実である。現在、臨床的にしばしば行われているneural augmentationの術式に警鐘を鳴らしたい。形成外科学有意差が出ない、いわゆる"negativeをdata"が多いこと、長期経過観察例が必要なこと、から実験検体数ふやすことを強いられている。まだ最終的な結論を発表できるに至っていない。評価方法として予定していたビデオ画像の分析がまだ確立されていないため。地道に検体数をふやしていくこと。以下の第III実験を急ぐこと。(III.端側型端々縫合と端々縫合の再生軸索収束の比較検討ラット顔面において頬筋枝と頬骨枝をその共通幹を含めて剥離し、分岐部を切除し、口径の大きな共通幹と細い頬枝とを縫合するが、顔面の一側においては端側型端々縫合、他側においては端々縫合でおこなった。その後、一定の待機期間(6週、12週)を経た時点で、神経ならびに表情筋の評価を行う(nは各40)。実験動物(ラット)の顔面の表情を惹起させる方法として、再現性のある方法を案出する。また、ラットの頭部の固定法を工夫して、表情筋の動きのみが捉えられるようにする。3/4を実験動物の購入・飼育費、実験用薬品に用い、1/4を標本作製のための人件費・物品代金に用いる予定である。
イヌ乳腺腫瘍におけるFGFRの発現解析

近年ヒト腫瘍で高い発現が報告されている線維芽細胞増殖因子受容体(Fibroblast growth factor receptor:FGFR)の発現を、イヌで発生の多い乳腺腫瘍において検索し、その発現と悪性度の関連を検索する。検索対象としてイヌの乳腺腫瘍組織と乳腺細胞株を用いる。各FGFRの発現と悪性度との関連を調べ、悪性度をはかるマーカーとなりうるかを検討する。またヒトで報告のある遺伝子変異箇所などの検索をおこない、遺伝子変異の有無や発現の変化の腫瘍細胞の特性への影響を調べる。
スタチン系薬物と脂質・ステロイド誘導体の閉用によるがん細胞の細胞死誘導

スタチン系薬物と脂質・ステロイド誘導体の併用による乳ガン細胞や腎ガン細胞などのがん細胞の細胞死誘導について検討を行い、以下のような結果を得た。n-3系不飽和脂肪酸含有トリグリセライドと卵黄レシチンを用いて0/W型エマルションを調製し、エマルション中に含まれるメナテトレノンのラットにおける体内動態について比較検討を行い、大豆油と卵黄レシチンから調製したエマルションと同様に脂溶性薬物のキャリアーとして有用であることを明らかにした。ヒト乳ガン細胞(MCF-7)において、エイコサペンタエン酸の含有率の高い0/W型脂質エマルションにより増殖が抑制された。そしてその抑制はエマルションの細胞内取り込み量に起因しないことを認め、細胞内脂質過酸化の関与することが示唆された。40%酸素条件下、ヒト腎ガン細胞(ACHN, ACVB)ではブチオニンスルフォキシミン処置でグルタチオンを低下させることにより、20%酸素条件下よりも、生存率が低下しやすいことを認めた。更に、ステロイド誘導体の2-メトキシエストラジオール(2-ME)による殺細胞効果は40%酸素条件下、増強されることを観察した。また、40%酸素条件下2-MEと過酸化水素やインドメタシンとの併用により、細胞内活性酸素レベルの上昇とともに生存率の低下を認めた。ACVBにおいてシンバスタチンはプラバスタチンと比較し、低濃度で細胞生存率の低下を認め、そのシンバスタチンの殺細胞効果に細胞内メバロン酸とゲラニルゲラニルピロリン酸レベルの低下による影響が大きいことが観察された。また、ドコサヘキサエン酸の殺細胞効果は細胞内H202レベルの上昇と、ファルネシルピロリン酸とゲラニルゲラニルピロリン酸の低下による影響が共に大きいことが示唆された。本研究によりスタチン系薬物と脂質・ステロイド誘導体の併用により、がん細胞において細胞死を誘導し得ることを認めた。スタチン系薬物(シンバスタチン、プラバスタチン)によるがん細胞の細胞死について検討を行った。すなわち、スーパーオキシドディスムターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼなどの活性酸素消去酵素の活性バランスが異なるがん細胞(ACHN, ACVB)を用い、シンバスタチン、プラバスタチンなどのHMG-CoA還元酵素阻害剤と共に培養し、シンバスタチンはプラバスタチンよりも低濃度で細胞生存性へ影響を与えることを明らかにした。次に、不飽和脂肪酸含有O/W型エマルションの体内動態について検討を行った。ω-3不飽和脂肪酸を含む油脂と卵黄レシチンを用いて高性能乳化機(マイクロフルイダイザー)により、粒子径などを制御したO/W型エマルションを調製した。エマルション中に含まれるメナテトレノンのラットにおける体内動態や血中滞留性について、ω-3不飽和脂肪酸を含む油脂を用いたエマルションと大豆油と卵黄レシチンによるエマルションと比較し、ω-3不飽和脂肪酸を含む油脂を用いたエマルションも大豆油と卵黄レシチンによるエマルションと同様に脂溶性薬物のキャリヤーとして有用であることを明らかにした。その成果の一部は第19回日本薬物動態学会年会(2004.10.18金沢)にて発表を行った。また、ステロイド誘導体を用いたがん細胞の細胞死については、ACHN, ACVBにおける2-メトキシエストラジオールの高酸素条件下、細胞生存性におよぼす影響について解析した。

また、ブチオニンスルフォキシミン(BSO)を持いて細胞内グルタチオンレベルを低下させることで、細胞内活性酸素消去酵素活性のバランスを修飾した状態における高酸素条件下、2-メトキシエストラジオールの細胞生存性におよぼす影響について解析し、ACVBにおいて顕著な殺細胞効果を得た。その成果の一部は日本薬学会125年会(2005.3.29東京)にて発表を行った。エストロゲン代謝物の2-メトキシエストラジオールによる腎ガン細胞(ACHN,ACVB)の細胞死について検討を行った.その結果,細胞内のグルタチオンレベルを低下させた場合,2-メトキシエストラジオールと過酸化水素の併用による細胞死誘導効果が顕著に増強することを認めた.そして細胞内の活性酸素レベルが上昇した場合,腎ガン細胞では細胞死に至りやすいことが示唆された.40%酸素条件下で腎ガン細胞ACHNを培養した場合,通常の20%酸素下での培養時よりもグルタチオンレベルを低下させると,細胞生存率の低下しやすいことを認めた.そしてさらにロテノンを処置した場合,細胞内活性酸素レベルが上昇し,細胞死に誘導される細胞の多いことを観察した.これら成果の一部は日本薬学会第126年会(2006.3.39仙台)で発表を行った.各種のo/w型脂質エマルションで肝ガン細胞HepG2を処置したところ,n-6系不飽和脂肪酸の含有率の高い大豆油で調製したエマルションにより細胞生存性の低下することが観察され,その殺細胞効果はn-3系不飽和脂肪酸を高含有する脂質を用いて調製したエマルションよりも強いことが認められた.その成果の一部は日本薬学会第126年会(2006.3.39仙台)で発表を行った.シンバスタチンによる腎ガン細胞ACVBの細胞死にグルタチオンレベルの影響は少ないことを認めたが,n-3系不飽和脂肪酸のドコサヘキサエン酸(DHA)ではグルタチオンレベルの低下により殺細胞効果の増強効果を認め,その際細胞内過酸化水素レベルの上昇と細胞内過酸化脂質量の増加を観察した.またDHAの殺細胞効果にメバロン酸経路の関与していることを示唆する結果を得た.その成果の一部は第16回日本医療薬学年会(金沢)で発表を予定している.40%酸素条件下、ヒト腎ガン細胞(ACHN、ACVB)を培養した場合、グルタチオンを低下させることにより、通常の20%酸素条件下における培養よりも、生存率の低下しやすいことを認めた。更に、エストロゲン代謝物の2-メトキシエストラジオールによる殺細胞効果は40%酸素条件下、増強されることを観察した。エストロゲン代謝物の2-メトキシエストラジオールとインドメタシンによるACHN、ACVBの細胞死について検討を行った。その結果、細胞内活性酸素レベルを上昇とともに生存率の低下を認め、腎ガン細胞では細胞内活性酸素レベルを上昇させることにより、生存率が低下しやすいことが示唆された。その成果の一部は第16回日本医療薬学年会(金沢)で発表を行った。ACVBにおいてシンバスタチンの殺細胞効果は細胞内H_2O_2レベル上昇の及ぼす寄与は少なく、メバロン酸とゲラニルゲラニルピロリン酸の低下による影響が大きいことが推察された。また、ドコサヘキサエン酸(DHA)の殺細胞効果は細胞内H_2O_2レベルの上昇と、ファルネシルピロリン酸とゲラニルゲラニルピロリン酸の低下による影響が大きいことが推察された。
ピロリ菌がんタンパク質 CagA による胃がん発症機構とその制御

CagAタンパク産生能を有するヘリコバクター・ピロリ(ピロリ菌)の持続感染はヒトの胃がん発症にきわめて重要な役割を演ずる。本研究を通して、ピロリ菌がCagAを標的胃上皮細胞内に注入する分子機構が明らかとなった。また、細胞内に侵入したCagAが機能模倣する宿主タンパク質としてPragminを同定した。さらに、CagAによる細胞内シグナル撹乱が胃上皮細胞のリプログラムを誘導し、腸上皮への異分化を惹起する機構を明らかにした。一方、CagAタンパク質の結晶化に成功し、その三次元構造を世界に先駆けて明らかにした。ヘリコバクター・ピロリ(ピロリ菌)は、自らが保有するミクロの注射器様装置(IV型分泌機構)を用いて発がんタンパク質CagAを標的となる胃上皮細胞内に直接注入し、細胞のがん化につながる種々の細胞機能障害を引き起こす。今年度の研究により、ピロリ菌がCagAを標的細胞内に移行させる分子機構が明らかとなった。まず免疫電子顕微鏡を用いた解析から、ピロリ菌内で産生されたCagAはIV型分泌機構の先端に固定した状態でピロリ菌体表面に露出して存在することが解った。一方、ピロリ菌が直接接触した胃上皮細胞の細胞膜表面側(外葉)に、本来は細胞膜内葉にのみ存在するリン脂質ボスファチジルセリン(PS)が反転露出することを見出した。この標的細胞膜表面に露出したPSはピロリ菌表面に存在するCagAと相互作用する。CagA-PS相互作用の結果、標的細胞膜にボアあるいはチャンネル様の構造が形成され、CagAが細胞質内に移行することが明らかとなった。さらに、PSが結合するCagA分子内領域の同定を行い、分子中央部に存在する2つのアルギニン残基(RxR)が重要な役割を担うことが明らかとなった。このアルギニン残基に変異を導入しPSが結合できなくなったCagA変異体を産生するピロリ菌は、CagAを細胞内に注入する能力を失っていた。宿主胃上皮細胞内に移行したCagAは細胞膜内葉に局在する。CagAの細胞膜局在は、がん化に関わるCagAの病原生物活性に重要な役割を担っているが、CagAと細胞膜との相互作用にも、内葉に濃縮して存在するPSとCagA間の相互作用が関わる。この相互作用は極性化させた上皮細胞において顕著に認められ、上皮極性化により細胞膜のPS含有量が変動する可能性が示唆された。本研究は、CagA-PS相互作用を人為的に阻止することにより、ピロリ菌感染による胃上皮細胞がん化を阻止できる可能性を示唆しており、まったく新たな胃がんの予防法樹立への道を拓くものと考える。これまでの多くの試みにもかかわらず、易分解性などのため安定した組み換えタンパク質の発現がきわめて難しいとされてきた135キロダルトンの全長ピロリ菌CagAの大腸菌における組み換えタンパク質大量発現系樹立に成功した。そこで高度精製した組み換えCagAタンパク質を用いて結晶化を試み、複数の結晶化条件を見いだすとともにX線結晶回折データの取得に成功した。回折データ解析結果から、解像度3.5オングストロームで、CagAタンパク質の立体構造が明らかとなった。結果、CagAは複数のドメイン構造をとるN末側100キロダルトン領域と安定した構造を持たない天然変性構造をとるC末側35キロダルトン領域に分けられることが示された。現在、解像度を上げて、より詳細な立体構造決定を進めている。ヒトプロテオームには、ピロリ菌CagAのチロシンリン酸化部位であるEPIYAモチーフを保有するタンパク質が5種類しか存在しない。これらEPIYA含有タンパク質のひとつPragminがヒト細胞内でSrcファミリーキナーゼによりチロシンリン酸化されることを見いだした。PragminはEPIYAチロシンリン酸化依存的にSrcキナーゼのインヒビターキナーゼであるCターミナルSrcキナーゼ(Csk)と結合し、Cskの細胞膜移行を妨げる結果、Srcキナーゼの持続的活性化を促すことが明らかになった。この事実から、PragminはSrcファミリーキナーゼの正の制御因子として機能することが示された。ピロリ菌CagAはEPIYAチロシンリン酸化的にPragmin-Csk複合体形成を阻害し、Cskを脱制御するとともにSrcファミリーキナーゼを抑制することが明らかとなった。flox-CagAマウスの腹腔内にtamoxifenを投与し、生後め様々な時期のマウスにCagAを誘導発現し、消化管を中心とした病変発現を経時観察している。物理化学的な性状の違いから全長CagAタンパク質(130KDa)は、構造生物学的にN末側の100KDa領域とC末側の35kDa領域に分けられる。

そこで今年度は、N末側の100KDa領域に相当する組み換えCagA断片の大量精製ならびにその結晶化を通してX線構造解析を進め、最終的に3.3Åの解像度でCagA N末領域の三次元構造決定に成功した。得られたCagA N末領域立体構造は23本のαヘリックスならびに1つの大きなβシートを有し、3つの独立した構造ドメインから構成される。一方、NMR解析から、CagA C末側領域に相当する35KDa断片は明確な二次構造を保持しない天然変性領域であることが明らかとなった。この柔軟な構造を有するC末領域の一部はN末領域の相同領域と疎水性4ヘリックス束を形成して分子内相互作用することにより投げ縄様ループ構造を作り出す結果、病原性足場タンパク質としてのCagA生物活性を増強させることが明らかとなった。ピロリ菌感染胃では、胃粘膜上皮が腸管上皮様粘膜に変換する病理学的変化(=腸上皮化生)が惹起される。この腸上皮化生は胃がんの前がん病変と考えられている。これまでの研究から、胃上皮細胞に侵入したピロリ菌CagAによるWntシグナルの異常活性化、とりわけWnt標的分子のひとつCDX1転写因子の異所性発現が腸上皮化生に深く関与することを見いだしていた。そこで本年度は、CDX1異所性発現が胃上皮細胞内に作り出す腸上皮関連転写ネットワークの本態をDNA microarray, ChIP-on-Chip解析等を通して進めた。その結果、CDX1を異所性発現する胃上皮細胞内で発現誘導される遺伝子群の中に細胞リプログラミングにかかわる幹性転写因子SALL4およびKLF5が存在し、これらリブログラム因子が胃上皮細胞の腸上皮様変化に重要な役割を担うことを明らかにした。世界的にも解明が期待されていたピロリ菌がんタンパク質CagAの三次元立体立体構造解明に成功した点はきわめて高く評価できると考える。また、Pragminの発見は宿主と微生物間におけるconvergent evolutionの存在を示し、今後の研究に新たな領域を切り開いた。24年度が最終年度であるため、記入しない。CagAの立体構造をもとに、構造-機能連関の詳細な解析を進める。特に、CagAの分子内相互作用の病態生理学的的意義を明らかにする。
高電気伝導性ポリアセチレンの合成と構造の研究

高い電気伝導性を示すポリアセチレンの電気伝導機構を研究するため、大きな延伸性を示すポリアセチレン薄膜を合成し、これを過塩素酸イオンや、金属カリウムでドープした。その際におこる吸収および、反射スペクトル、紫外光電子スペクトルの変化を定量的に研究した。その結果ドーピングによりおこる構造変化は2段階であり、ドーパント濃度の低い状態では、ミッドギャップバンドを与える荷電ソリトン構造を生じ、次の段階、金属性を与える構造へ変化することが分かった。電気伝導度が30000S/cm近くの高い値を示すポリアセチレンでは、金属に特有の赤外部から遠赤外部に、高い反射率が観測され、薄膜でも、この領域に強い吸収帯が現れる。紫外光電子スペクトルでは、真に金属的な状態の出現を意味するフェルミ準位が観測された。次にドーピングにより、どのような分子構造の変化が起こったかを、明らかにする目的で、荷電ソリトン構造については、C_<11>H_<13>Cl、C_<11>H_<13>Naなど、ポルソン構造にたいしては、C_<13>H_<15>Na_2,C_<13>H_<15>Cl_2などのモデル分子について、ab initio MO法による計算を行い、最適化した分子構造を決定した。荷電ソリトン構造も、ポルソン構造も、ポリアセチレンの鎖のうえに、ドーピングによって生じる準安定状態であり、それぞれに特有の性質を示す。次にこれらの構造を含む、長いポリアセチレン鎖について、エネルギーバンドの計算を行って、実際にポルソン鎖においてのみ、金属的なフェルミ準位が出現することを、明らかにした。これらの結果を合わせて、光電子スペクトルの変化、可視、赤外スペクトルの変化など、分子構造の変化に対応した、電子構造の変化が明らかになり、ドーピングによる高い電気伝導性の発現の機構が明らかになって、今後の電導性高分子の研究に一つの指針が与えられた。ポリアセチレンの合成方法が改善されたことにより、今迄のポリアセチレンに比して、ずっと大きな電気伝導性が示されるようになった。それがどういう高分子構造にもとづいて発現したのかを明らかにする目的で、電気的,光学的性質の研究を行った。高い電気伝導性が、多量のド-ピングにより得られることから、ド-ピングに伴うスペクトルの変化について研究した。特に新しいポリアセチレンは、延伸により高い配向性を示すフイルムが得られるので、その偏光測定を行って、吸収帯の帰属を明らかにすることを試みた。その結果、ヨウ素をCHIyとし、y<0.07の濃度領域では、4500cm^<-1>にピ-クを持つ、荷電ソリトンに由来するバンドが出現し、さらにド-ピングが進むと、500cm^<-1>附近のバンドが強度を増すと共に、金属的電気伝導性が出現することが、明らかにされた。その際、電子構造の変化が、どのようにおこっているかを明らかにするために、分子軌道法によるモデル分子の計算を行い、荷電ソリトン構造と、ポ-ラロン構造が一体となった、ポルソン構造と名付けた新しい単位が、金属的性質と、500cm^<-1>附近のスペクトルのもとになっていることを明らかにした。さらにポリアセチレンのシス体,トランス体の構造と、紫外光電子スペクトルの研究を行い、またド-ピングに伴う、紫外光電子スペクトルの研究を行って、電子構造の変化ー特に金属状態の出現を明らかにすることを試みた。フエル三準位に対応する光電子スペクトルが見出されたことで、実際に金属状態の出現を証明することができた。

ポリアセチレンは、ド-ピングを行うことにより、高い電気伝導性を示すようになる。そのメカニズムを明らかにするために、実験的および理論的研究を行った。新しい合成方法で合成し、引伸したポリアセチレンのフィルムについて、ヨウ素,過塩素酸銅などでド-ピングを行った時、高い電気伝導性が出現するのは、2段階でおこることを、明らかにした。すなわち(CH・(clo4)y)でド-パントの濃度yを現わすと、y=0.020.03の辺までは、電荷は入っても、半導体の電子構造を示し、y=0.04をこえて、金属的性質が出現する。アルカリ金属でド-プした時は、このyの値は0.08位である。この金属的状態になったポリアセチレンのフィルムは、金属的な反射率を示し、光電子スペクトルの実験でも、フエルミ面の近くに状態密度が出現する。反射スペクトルについて、KramersーKronig変換を行って、電気伝導度スペクトルを計算すると、実際に金属的な電子構造を示すようになっていることが、明らかになった。この金属的な状態に対応する分子構造、電子構造を明らかにするために、ド-ピングの過程に対応するド-パントと中性ポリエン,ポリエンラジカルの間でできる電荷移動型コンプレックスについて、分子軌道法による計算を行って、それらの分子構造と、電子構造を明らかにした。次にこの構造をもとにして、モデル高分子のエネルギ-バンド構造について研究した。その結果、ド-ピングの初期段階でできる荷電ソリトン構造の一次元鎖では、バレンスバンドと、コンダクションバンドの中間に、ミッドギャップバンドとよばれる中間のエネルギ-準位ができるが、さらにド-ピングが進んだ時に生ずる“ポルソン"と名付けた構造をもつ鎖において、はじめて一次元金属に近い状態が出現することが明らかにされた。ポリアセチレンが、ドーピングによって絶縁体から金属へ変化する過程を研究するために、薄膜のポリアセチレンの吸収スペクトル、光電子スペクトル、および厚膜の反射スペクトルを研究した。過塩素酸イオン或いはカリウムでドープすると、ドーパント濃度が小さい初期の時には、荷電ソリトン構造によるスペクトルが現れ、次にドーパント濃度が高くなって、初めて金属的なスペクトルの特長が見出された。金属的なポリアセチレンが出きるためには、ポルソン構造とよぶ、新しい構造をもつ久要があることが、実験的研究と、次に述べる理論的な研究によって明らかになった。すなわち、25種類のドープしたポリアセチレンのモデル分子について、最適化した分子構造を求め、その分子軌道を計算した。Na原子、或いはCl原子をドーパントとして計算すると、アリル基とは安定な閉殻構造のコンプレックスを作る。荷電ソリトン構造は、このコンプレックスの両側に、ポリエン鎖の連った構造である。ポルソン構造は、アリルラジカルの両側に、このコンプレックスが連った構造であり、その中に1個の不対電子をふくむ。多数の荷電ソクトン構造が、一次元的に連った鎖では、ミツド、ギャップ準位とよぶエネルギー準位が出現するが、これによっては電気伝導性は現れない。これに対しポルソン構造が一次元的に連結した鎖では、半分満ちたエネルギーバンドが出現して、金属的な高分子鎖が出きることが明らかになった。このようにして、長い間の謎であった、ポリアセチレンで高い電気伝導性が出現するメカニズムが明らかになった。
石灰石微粉末の反応性と流動性の制御による環境低負荷型

石灰石微粉末は高流動コンクリート用の基本材料として、また、環境負荷の低いフィラーセメントの原料として期待されている。本研究では、石灰石微粉末による流動性制御による高機能セメントの材料設計を有効に行うため、石灰石微粉末の反応性と流動性に関する基本的なデータの蓄積を目的とした。石灰石微粉末はアルミネート相と反応し、モノカーボネートなどを生成する。また、セッコウとの競争反応について整理し、少量添加においては、後期にエトリンガイトを再び生成するDelayed Ettringite Formationを生じることを見いだし、材料設計上注意すべきであると指摘した。また、高流動コンクリートのように多量な石灰石微粉末を混和した場合には、このような心配がないことも明らかにした。また、石灰石微粉末は流動性を改善する効果があり、それは充填性効果と形状によるボーリベアリング効果に分離できることを明らかにした。また、粒度分布は多モードとすることで、充填性が向上し、流動性が向上することを明らかにした。さらに、グラフト鎖長の異なるポリカルボン酸塩系分散剤を添加した場合の流動性について検討を加えた。粒子間ポテンシャルの計算においては、グラフト鎖長の長いものが有利になるが、濃厚系サスペンションのレオロジーに関連しては、グラフト鎖長の長い場合には、団粒中に拘束水が増加し、流動性が低下することを明らかにした。従って、ポリカルボン酸塩系分散剤のグラフト鎖長は、水和により埋没することおよび団粒の形成を考慮して、最適な鎖長が存在することを見いだした。石灰石微粉末は高流動コンクリートや高品質吹き付けコンクリート用の混和材料として期待されており、これらを用いることにより、流動性が優れた、しかも炭酸ガス発生量の少ない環境負荷低減型セメントの製造の可能性を有している。特に最近はセメントの流動性制御が切望されているが、セメントはマスプロダクションであり、焼成技術により、流動性を制御することは不可能である。従って、石灰石微粉末などを混合し、流動性を制御することが可能となれば、今後のコンクリート技術の発展に及ぼす影響は絶大である。本研究では石灰石微粉末の反応性と流動性制御に関する基礎的知見を得ることを目的に、セッコウ存在下における各種カルシウムアルミネートと石灰石微粉末との反応およびセメントペーストの流動性に及ぼす石灰石微粉末の影響を検討した。その結果、石灰石微粉末は、セッコウの反応が終了すると各種アルミネートと反応を開始し、モノカーボネートやヘミカーボネートを生成すること、および石灰石微粉末の添加量が少ない領域においては、後からエトリンガイトが生成するDelayed Ettringite Formationを起こす可能性があることを指摘し、材料設計上注意すべき点を明らかにした。また、流動性については、石灰石微粉末への高性能AE減水剤の吸着量が、セメントの場合と比較して少ないこと、石灰石微粉末の流動性改善効果としては、形状による充填効果とボールベアリング効果が大きく寄与していることを明らかにした。さらに本研究を進めることにより、石灰石微粉末を用いた高性能なセメントを開発するための、基盤技術の整理が可能になると思われる。石灰石微粉末とカルシウムアルミネート相との反応について整理した。

石灰石微粉末は流動性を改善する効果があり、それは充填性効果と形状によるボーリベアリング効果に分離できることを明らかにした、また、粒度分布は多モードとすることで、充填性が向上し、流動性が向上することを明らかにした。また、高流動コンクリートなどと関連して重要になる石灰石微粉末とポリカルボン酸塩系分散剤との相互作用について検討した。さらに、グラフト鎖長の異なるポリカルボン酸塩系分散剤を添加した場合の流動性について検討を加えた。粒子間ポテンシャルの計算においては、グラフト鎖長の長いものが有利になるが、濃厚系サスペンションのレオロジーに関連しては、グラフト鎖長の長い場合には、団粒中に拘束水が増加し、流動性が低下することを明らかにした。従って、ポリカルボン酸塩系分散剤のグラフト鎖長は、水和により埋没することおよび団粒の形成を考慮して、最適な鎖長が存在することを見いだした。
各種免疫複合体型糸球体腎炎における病型特異的抗体クローンの検出

免疫複合体型糸球体腎炎の中でも代表的なループス賢炎ならびに膜性賢症について病型特異的抗体クロンの検出を、等電点電気泳動法(IEF)により試みた。1.ループス腎炎における抗DNA抗体について-IgG型抗DNA抗体は、本症における主要な病因の1つとされている。一方本抗体は正常ヒト血清(NHS)中にも証明されることから両者間での比較を行った。その結果、NHSでは本抗体クロンはpH7.5-8.5のアルカリ域に限局性に検出され、一方ループス腎炎例では、同じアルカリ域中により強い抗体バンドとして検出され、両者間には本抗体について量的差の他に抗原結合親和性の差があることが示唆された。そこで、親和性を食塩濃度によるDNA結合活性の違いとしてIEFあるいはELISAにより検出することを試みた。その結果、NHSでは、0.2M食塩の高濃度条件下では本抗体活性の著明な低下が認められ、一方ループス腎炎例では、本条件下で比較的抗体活性が良く保たれた。病変腎糸球体におけるIgG沈着様式と本抗体の親和性の関連では、最も重症型である、メザンジウムおよび係蹄壁型を呈する例は全て高親和性であることが明らかとなった。したがって本研究により、ループス腎炎におけるIgG抗DNA抗体の病原性は高親和性にあることが示唆された。また本抗体のクロン多様性の程度あるいは陽性荷電の程度は病原性とは関連しないことが示唆された。2.膜性腎症における特徴的IgG抗体のクロノタイプ-本症における流血中免疫複合体の主要な構成成分はIgG4サブクラス抗体であることおよび病変腎においてもIgG4抗体が優勢に検出されることが明らかとなった。腎沈着抗体のIEFによる分析では、主にpH5.5-6.5の酸性抗体であることが証明された。血中免疫複合体が易解離性であったことと考え合わせると、本症においては、陰性荷電で希クロン性かつ低親和性であるIgG4抗体の病原性が強く示唆された。
日本型自助組織「断酒会」による社会啓発活動の変遷―薬物乱用対策から自殺予防へ

自助組織(自助グループ、self help group)とは、共通の問題を抱える個人及びその家族が自らの意思で参加し、「言いっ放し・聞きっ放し」という特徴的なコミュニケーションにより問題の解決あるいは緩和をはかる団体である。1930年代にアメリカのアルコール依存症者の間で始まり、欧米を中心に様々な問題を抱える当事者たちの間で形成されるようになった。本研究では、日本型の自助組織として発展をとげてきた「断酒会」の社会啓発活動のあり方及びその変遷を探る。研究代表者はこのような自助組織を「指導者や専門家のいない相互教育集団」ととらえる。断酒会は1960年代に組織されて以来、アルコール依存症者の回復を支援し、「酒害」を未然に防ぐための社会啓発活動を行ってきた。これらの活動に新たに加わったのが「自殺予防」の観点である。日本国内の自殺者数が年間約3万人で推移している状況において、問題飲酒と自殺の関連は無視できない課題となった。それを受けて各地の断酒会が自殺予防のための社会啓発活動を展開している。また、別課題ではあるが、未成年者を対象とした冊子『お酒を手にした未成年のあなたへー断酒会会員と家族からの手紙ー』を編集・刊行したことも本研究課題への取り組みに寄与した。研究代表者は2002年から無記名アンケート「飲酒に関する大学生の意識調査」等を行っているが、国際学会では「(当該の調査では)半数以上の大学生が、酒が薬物であることを認識していない」、「アルコール依存症者らによる自助組織について知るものがほとんどいない」という調査結果に驚きの声があがる。このことも本研究課題に取り組むきっかけとなった。これまでの調査を続行し、今日の日本社会における薬物教育に何が欠落しているのか、何が必要とされるのかを分析する。また、断酒会に通うアルコール依存症回復者及びその家族により語られる「体験談」(断酒会では、参加者の語りを「体験談」と称する)から、高度情報社会と呼ばれる現代の日本社会において、飲酒という行為周辺の諸問題をあぶり出し、その影響下で、断酒会による社会啓発活動がどのような変遷を遂げていったのかその背景を明らかにする。本研究課題の最終年度にあたる平成26年度には、これまでの研究成果を国際学会で発表し、その内容を、研究代表者が「日本型自助組織」とする「断酒会」関連の集まり及び地域社会において発信した。関連の教育活動として、北海道大学主題別科目「社会の認識」講義題目「社会問題としての飲酒」を担当し、2002年より実施している無記名アンケート調査「飲酒に関する大学生の意識調査」の結果などを用いることにより、日本国内における自助組織の受容について分析を加えた。中でも、小規模な調査ではあるが、「断酒会が自殺予防に役立つ」と回答する人が約9割であることを確認できたことは(平成25年8月に大分県で実施の調査より)、研究代表者の仮説の一つである「酒という合法薬物の乱用対策で始まった断酒会による社会貢献活動が、時代と共に変容をとげ、高齢者の孤立・自殺予防においても重要な役割を果たすようになった」ーこれを裏付ける一つの結果として意義深く、今後の研究につながるものであると考える。本研究課題とは別の取り組みではあるが、関連の研究成果として、研究代表者による編集『お酒を手にした未成年のあなたへー断酒会会員と家族からの手

紙ー』(平成25年10月刊行)が北海道大学学術成果コレクション(HUSCAP)で公開されたことをあげる。社会学、教育社会学、教育人類学平成25年度の研究計画にしたがって、国際学会発表、国内における資料収集、教育・研究活動を行った。国際学会発表についてはアメリカ(イリノイ州シカゴ)で開催されたThird Aging and Society: An Interdisciplinary Conference(University Center Chicago, Chicago, USA)において発表を行った(On the Role of Danshukai: A Self-help Group in Japan's Aging Society)。この他、アメリカ(ワシントン州シアトル)ではAA(Alcoholics Anonymous)、Al-Anon(AAの家族グループ)を訪ねた。国内においては沖縄はじめ全国各地の断酒会主導のイベントに参加するなどして資料収集を行った(東京断酒新生会60周年記念大会、全断連第50回全国(沖縄)大会、他)。東日本大震災の被災地の断酒会を訪ねたことも特筆すべきであろう(仙台、塩竈)。教育活動としては北海道大学主題別科目「社会の認識」講義題目「社会問題としての飲酒」を開講・担当し、自助組織の実際について分析を加えた。研究・教育活動に並行して関連のテーマについての講演を行い、その都度資料収集を行った。五島市健康推進員研修会「飲酒関連問題について考える」(6月長崎県五島市健康政策課)、大分住民公開セミナー「社会問題としての飲酒」(8月大分県断酒連合会大分市大南断酒会)などである。なお、他の研究助成を得てではあるが、未成年者を主な対象とする『お酒を手にした未成年のあなたへー断酒会会員と家族からの手紙ー』を編集し、刊行したことも本研究課題への取り組みに寄与したことも記す。平成24年度の研究計画通り、国際学会発表、国内における資料収集、そして教育活動を行った。国際学会発表についてはカナダ、ブリティッシュ・コロンビア大学において開催されたTwelfth International Diversity in Organizations, Communities and Nations Conferenceにおいて発表を行った(What is Danshukai?On“Japanese AlcoholicsNotAnonymous")。国内においては、全日本断酒連盟北海道ブロック北見大会(9月)、大分県断酒連合会(11月)、札幌連合断酒会(10月・11月)、宮城県断酒会(2013年2月)、第34回関東ブロック研修会(神奈川)/かながわ市民公開セミナーにおいて断酒会主催の講座・研修会等に参加し、資料収集を行った。また、長崎県五島列島有川断酒会(2013年3月)、長崎県五島列島五島断酒会(2013年3月)において調査・資料収集を行った。研究・教育活動に並行して関連のテーマについての講演を行い、その際、アンケート調査を行った[全日本断酒連盟四国ブロック大会「断酒会にたどりついたあなたへ」4月香川県高松市]など)。