hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
核医学代謝画像を用いた腫瘍多様性の研究と診断法の開発

腫瘍のPositron emission tomography (PET)検査から腫瘍の代謝多様性を検討した。脳腫瘍では糖代謝とアミノ酸代謝、低酸素状態の差異から腫瘍の種類の違いを明らかにし、診断と治療に有用と考えられた。次に進行した頭頸部腫瘍にて糖代謝と低酸素状態を測定し、放射線あるいは化学療法となった症例の初期治療反応性を腫瘍縮小率で検討したところ、良い負の相関を得た。治療反応性の予測に適応可能と思われた。さらに、乳癌でも糖代謝と低酸素状態に多様性が認められた。異なる種類の術前脳腫瘍患者8例(WHO Grade I ; 1例、II ; 2例、III ; 2例、IV ; 2例、脳原発悪性リンパ腫;1例)における^<18>F-フルオロデオキシグルコース(FDG)による糖代謝、<11>^C-メチオニン(MET)によるアミノ酸代謝、<18>^F-フルオロミソニダゾール(FMISO)による低酸素状態をPET/CTにて測定し、比較することができた。FMISOについては、安全性を確認し、7.4MBq/kg投与し、2時間後に撮像する条件を確認した。集積度をSUV(standardized uptake value)で定量し、比較検討した。腫瘍の種類によって、集積度が異なることが確認された。膠腫においては、WHO分類によって各集積が変化する傾向があったが、低悪性度の膠腫では、FDG集積が大脳皮質集積よりも低いために評価が困難であったが、MET集積は脳集積が乏しいので腫瘍病変を認識しやすかった。逆に、MET集積度は悪性度との関連が低かった。しかし、WHO Grade Iの髄膜腫では、FDGとMETの集積が高かった。FMISO集積度は、WHO分類と相関が最も良かった。膠腫では悪性度が低酸素状態と関連していることが推察された。一方、脳原発悪性リンパ腫では、FDG集積とMET集積が高かったが、FMISO集積は乏しかった。これは、悪性リンパ腫では初期の治療反応性が高いことと関連すると関連すると思われた。腫瘍の代謝多様性が、腫瘍の種類や治療反応性や予後に関連していることが推察される。今後の本研究の妥当性が示されたと考える。脳腫瘍患者に加えて、本年度は進行頭頸部癌8例における^<18>F-フルオロデオキシグルコース(FDG)による糖代謝、^<18>F-フルオロミソニダゾール(FMISO)による低酸素状態をPET/CTにて測定し、比較することができた。FMISOについては、7.4MBq/kg投与し、2時間後に撮像した。それぞれの集積度をSUV(standardized uptake value)で定量し、比較検討した。全て扁平上皮癌であったが、FMISO集積度の強い腫瘍ほど、早期の治療反応性が悪い傾向が認められた。頭頸部腫瘍の低酸素状態と治療抵抗性の関係が示されていると考えられ、臨床上重要な知見と考えられる。また、糖代謝との関連性では、腫瘍におけるFDGのSUVとFMISOのSUVが逆相関を示した。頭頸部扁平上皮癌では、糖代謝と低酸素状態が関連していることを示唆している可能性がある。一方で、脳腫瘍では、糖代謝、アミノ酸代謝、低酸素状態は、多様であった。腫瘍の種類によって、代謝パターンが異なることがわかった。神経膠腫において、WHOの臨床分類と最も良く相関したのは、FMISO集積度であった。低酸素状態が治療抵抗性に関連すると考えられる知見である。糖代謝やアミノ酸代謝は、良性腫瘍でも種類によっては、高いことがあることが示された。FMISOによる腫瘍の治療反応性の評価が、種々の悪性腫瘍にて有効な可能性が示唆された。その他の腫瘍でもFMISO集積度と治療反応性の関係を調べることの妥当性が示されたと思われる。脳腫瘍での糖、アミノ酸、低酸素状態の代謝多様性について、学会発表した。腫瘍の種類によって、集積パターンが異なることがわかった。良性腫瘍でも、糖代謝が高い腫瘍やアミノ酸代謝が高い脳腫瘍の存在が確認できた。組織学的な悪性度との関連では、FMISO集積が最も相関が高い可能性が示唆された。腫瘍の代謝パターンにて腫瘍診断の可能性が示すことができたことは重要である。特に、膠芽腫ではメチオニン/FDG集積比が比較的一定しているのに対して、悪性リンパ腫では比が異なった。悪性膠腫と中枢神経原発リンパ腫の鑑別に有用と考えられた。脳PET画像の統計画像解析については、メチオニンPET/CT画像にて試み、脳の変形や欠損が大きくない場合は可能であることを確認した。頭頸部癌では、FMISO集積度と早期治療反応性について学会発表した。治療法に限らず早期治療反応性とFMISO集積度の間に負の相関を認めた。FMISO集積度によって治療法を変更すれば、治療効果や予後を改善できる可能性が示された点が重要である。

新たに乳癌にて糖代謝とFMISOによる代謝パターンの違いについて検討を開始した。これまで40例の検査実施を行い、乳癌の組織学的な性質との関連性を検討している。まず、初めの12例では、FMISO-PET/CTにて採血による定量法とSUV法による定量法の関連を確認した。乳癌においても脳腫瘍や頭頸部腫瘍と同様に良い相関が認められたので、実用上はSUVmaxで問題ないことを確認した。免疫組織学的所見とFDGおよびFMISO集積度との関係を検討し、学会発表の準備中である。乳癌においてもFDG集積度よりも悪性度とFMISO集積度が最も相関する可能性が示された。糖代謝、アミノ酸代謝、低酸素の各PETイメージングを各種癌患者で施行できている。腫瘍の種類によって、代謝パターンの違いが判明してきている。これは、当初の目的に沿っている。代謝パターンの特徴が、治療反応性との関連があることが明らかとなってきていることは重要である。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度からは、乳腺腫瘍にて調べ始めている。今後は、これまでに施行してきた脳腫瘍や頭頸部腫瘍のデータを元に、代謝パターンの違いと治療反応性との関連についてまとめ、論文にしていく。アミノ酸や低酸素の脳イメージングについては、統計的画像解析法の可能性について試みる。
マメ科植物種子におけるプロテアーゼインヒビター遺伝子の発現制御に関する研究

熱帯産マメ科植物であるシカクマメは,多量のKunitz型キモトリプシンインヒビター(WCI)を種子および塊根に,また少量のWCIを茎に蓄積する。WCI遺伝子の器官特異的な転写制御機構の解明を目的として,WCI遺伝子の転写開始点上流約1.0kbpのプロモーター領域に結合するタンパク質の探索を行った。その結果,酵母One-Hybridシステムにより,4種類のタンパク質cDNAを得た。これらのcDNAがコードするタンパク質はそのN末端側にシステインおよびヒスチジンに富む領域,C末端側にホメオドメインを有しており,新規タンパク質と考えられたため,これらをWBHD2 a,b,c,dと命名した。WBHD2は既知の植物ホメオドメインタンパク質との相同性は低かった,アラビドプシスおよびイネのゲノム中に相同性の高い配列が存在することから,種を越えて保存されている重要な因子であると考えられる。ノザンブロット解析により,WBHD2遺伝子群はいずれもシカクマメの種子および花芽で強く発現しているが,その発現パターンは種子の成熟段階で異なっていた。組み換えWBHD2タンパク質を用いてゲルシフト解析を行ったところ,WCI遺伝子プロモーターの複数位置に結合することが示された。WBHD2遺伝子群と相同性の高い遺伝子群が,分子生物学的研究のモデル植物であるシロイヌナズナに種を越えて見出されたことから,シロイヌナズナの各器官における4種のWBHD2相同遺伝子群のノザンブロット解析を行い,WBHD2の発現パターンがシロイヌナズナにおいても保持されているかを検討した結果,4遺伝子ともWBHD2遺伝子群と同様に花芽および種子で発現していた。また,シロイヌナズナにおけるWBHD2相同遺伝子群の器官特異的な機能発現に選択的スプライシングが関与していることが示唆された。熱帯産マメ科植物シカクマメの種子および塊根に多量に蓄積するKunitz型キモトリプシンインヒビター(WCI)の転写レベルにおける発現調節機構を解析するために,WCI遺伝子プロモーターに結合するタンパク質cDNAのクローニングを酵母One-Hybridシステムを用いて行った。シカクマメの成熟中期種子由来のcDNAライブラリーより,2.0×10^7個のファージをスクリーニングした結果,レポーター遺伝子の高レベルの発現を誘導するクローンを複数個得た。これらクローンの塩基配列を解析したところ,相同性の高い4種のcDNA由来であった。これらcDNAがコードするアミノ酸配列を用いてデータベースを検索した結果,低いながらも動物由来のホメオドメインと相同性を示すことが明らかとなった。我々はこの4種のcDNAがコードするタンパク質をwinged bean homeodomainprotcin(WBHD)2a,2b,2c,2dと命名した0しかしながら,植物由来のホメオドメインとは相同性をほとんど示さないことから,WBHD2は植物における新規のホメオドメインタンパク質であると考えられた。WBHD2a2dの各遺伝子の発現パターンを解析した結果,いずれのクローンも種子と花芽において強く発現していたが,種子の成熟段階における発現パターンはお互いに異なっていた。アラビドプシスのゲノムプロジェクトにより明らかになった塩基配列の解析から,アラビドプシスにはWBHD2と高い相同性を示す遺伝子が少なくとも2種類存在していた。次年度はこれら遺伝子が破壊されたアラビドプシス変異株を取得し,WBHD2タンパク質の植物における機能解析を行っていく。
膵内肝細胞分化に関する研究

我々は、銅欠乏食投与後のラット膵に新に出現してきたpancreatic hepatocyteについて背景にある遺伝子レベルの変化、機能面について検討を加えている。まず、我々の教室の専門分野であるコレステロール代謝、胆汁生成の面からpancreatic hepatocyteの機能について肝細胞としての成熟度を見ることにした。銅欠乏食投与後数週ごとに膵を採取し、RNAを抽出、さらにreverse transcriptaseによって一本鎖DNAとし肝臓におけるコレステロール代謝の代表的酵素7α-hydroxylase,5β-reductaseのプライマーを用いてそのPCRの増幅産物に対して以下の実験を行った。銅欠乏食投与後に膵が高度に萎縮するために充分な量の膵を確保できないという難点のためにこの様な実験系を用いざるを得なかった。7α-hydroxylase,5β-reductaseの両酵素は、mRNAレベルにおいて肝で行われているごとく膵内でも発現しているだけでなく酵素の日内変動も認められることがわかった。このように膵内に分化した肝類似細胞は成熟肝細胞のごとくコレステロールを代謝し胆汁を生成する能力があるのではないかと考えられた。まず、我々の教室の専門分野であるコレステロース代謝、胆汁生成の面からpancreatic hepatocyteの機能について肝細胞としての成熟度を見てきた。銅欠乏食投与後ラット膵からRNAを抽出しそのPCRの増副産物に対して以下の実験を行った。cholesterol 7 α-hydroxylaseは、mRNAレベルにおいて膵内で発現しているだけでなく酵素の日内変動も認められることがわかった。さらにin situ hybridizationによってpancreatic hepatocyteに一致してcholesterol 7 α-hydroxylaseのmRNAの局在を認めた。従ってpancreatic hepatocyteにはコレステロールを代謝する酵素の発現が存在すると考えられた。現在はin vivoにおいて膵液中の胆汁酸を検出すべく実験を行っている。
感覚臓器としての骨の役割を探る

重力や運動といった機械的刺激の感知に重要である骨細胞を大量に埋め込んだ骨組織を感覚臓器と捉え、メカノセンサーである骨細胞からの感覚刺激の伝達により、成長板付近の軟骨細胞で神経伝達物質の産生が誘導され、求心性神経を介して脳へと神経刺激が入力されるとの仮説を明らかにすべく以下の研究を行った。・マウス軟骨前駆細胞株ATDC5を用いて、軟骨前駆細胞または軟骨細胞へと分化を誘導したもので、RT-PCRによるTyrosine hydroxylase(TH)遺伝子の発現を検討したがATDC5ではTH遺伝子の発現は見られなかった。理由として、ATDC5はテラトーマ由来の細胞株であるため、大腿骨成長板の軟骨細胞とは性質が異なるからだと考えられる。・8-9週齢のマウス大腿骨および頸骨から成長板の軟骨細胞をコラゲナーゼにて単離・抽出し、リアルタイムPCRによるTH遺伝子の発現を調べたが、現時点では発現が確認できていない。現在、2-3週齢の若齢マウスからの成長板軟骨細胞の抽出を行い、軟骨細胞分化誘導試薬添加下で培養した上でTH遺伝子の発現の検討を行っている。・幼若マウス・成体マウス・老齢マウスの大腿骨または脛骨の骨組織切片にてTH抗体を用いた増幅蛍光免疫染色を行い、成長板付近での軟骨細胞でのTH発現に関して週齢ごとに検討を行う。・骨細胞除去マウスの大腿骨凍結切片を用いた免疫蛍光染色により、成長板軟骨細胞のTHタンパク発現を確認したところ、野生型マウスと比較して変化は見られなかった。・成長板軟骨細胞がTHを利用して最終的にカテコラミンを合成しているとすれば、骨切片を用いたカテコラミンとglyoxylic acidとの化学反応を用いた蛍光染色(Glyoxylic acid histofluorescence technique)が可能なはずである。心臓の切片では蛍光が捉えられたが骨切片ではサンプル調整が難しく、現在条件検討を行っている。骨組織が感覚臓器として眼や耳のように複数の細胞で構成される神経情報伝達機構を持つと考え、メカノセンサーである骨細胞からの感覚刺激の伝達により、成長板付近の軟骨細胞で神経伝達物質の産生が誘導され、求心性神経を介して脳へと神経刺激が入力されるとの仮説を明らかにすべく以下の研究を行った。・マウス軟骨前駆細胞株ATDC5ではTH遺伝子発現が確認できなかったため、8-9週齢のマウス大腿骨および頸骨から成長板軟骨細胞を抽出し軟骨細胞分化誘導試薬添加下で培養してTH遺伝子発現を検討したが発現確認はできなかった。さらに、生後2-3日のマウス大腿骨および頸骨から抽出した成長板軟骨細胞でも発現検討を試みたが発現は確認できなかった。・成長板軟骨細胞がTHを利用してカテコラミンを合成しているか否かを調べるためにglyoxylic acid法にて蛍光染色を行ったが、サンプル調整が難しく実験が難航している。・上記のように神経関連因子として注目したTHでは実験が難しかったため、Brain derivedneurotrophic factor(BDNF), Glial cell derivedneurotrophic factor(GDNF)にも注目して発現検討を行ったところ、ATDC5およびマウスより抽出したprimaryの細胞でGDNFの発現が確認され、軟骨分化に従って発現が上昇していくことを確認した。・GDNFはRETとコレセプターであるGFRα1を介してシグナル伝達することが知られている。GDNFシグナルが軟骨細胞自身にautocrineに働くのか、他の骨の細胞(骨芽細胞や骨細胞)もしくは神経細胞にparacrineに働くのかを確認するために現在様々な細胞株を用いてレセプターの発現検討を行っている。26年度が最終年度であるため、記入しない。骨代謝学26年度が最終年度であるため、記入しない。参考論文に従い順調にプライマリー軟骨細胞の単離・抽出までを行ったが、Tyrosine hydroxylase遺伝子の発現が確認できておらず、細胞培養による実験がやや遅れている。・軟骨細胞培養に関しては、2-3週齢の若齢マウスからの成長板軟骨細胞の抽出を行い、軟骨細胞分化誘導試薬添加下で培養した上でTH遺伝子の発現の検討を行う。さらにPhalloidinもしくはCD44にて免疫蛍光染色した骨細胞の加齢による変化を検討し、軟骨細胞のTH発現変化と比較して関連を検討する。・骨細胞からの感覚刺激入力と軟骨細胞でのTH発現の関連を明らかにするため、骨細胞が機械的刺激を感知して産生する因子であるPGE2、sclerostin、IGF1を添加してTH遺伝子の発現変化を調べる。・尾部懸垂により後肢を地面につかないようにしたマウスでは、骨細胞による機械的刺激が入らず軟骨細胞への感覚信号が入力されないはずなのでTH産生が減弱すると思われるため、これらのマウスの骨組織切片を用いた増幅免疫蛍光染色にてTHの発現を確認する
19世紀アメリカ合衆国における連邦統合論の編成--ラディカリズムと政治的妥協

本研究の中心的課題は、初期合衆国政治における党派性の観念を重視しつつ、第二次米英戦争(1812-15)以降に見られた政党政治および政治社会の変容過程を解き明かすことにある。この課題を考察するにあたって、本研究が注目してきたのが、第二次米英戦争(1812-15)以降に訪れた「好感情の時代」と呼ばれる戦後ナショナリズムの時代の思潮である。合衆国政治史において唯一、政党対立が消滅したこの時期こそが、党派性の観念および共和主義的思考様式の変容を理解するための鍵になると考えている。本年度は、従来と方向性を大きく転換し、グローバル・ヒストリーや環大西洋史といった史学研究の動向を意識しつつ、主題の前提となる史的文脈をより広い世界に求めることを心がけた。具体的には、ナポレオン戦争の世界的な影響関係という史的文脈において、合衆国の政治観念の変容を理解しなおすという作業である。研究の進展過程をまとめ、平成26年5月にお茶の水政治研究会(於・日本大学法学部)において建国史と合衆国の主権に関する口頭発表を実施した。さらに、同年6月には、アメリカ学会年次大会(於・沖縄コンベンションセンター)にて、合衆国第22議会議事録を主たる根拠として、南北戦争以前の主権観念を考察する口頭発表をおこなった。学会報告に際して、国内諸大学の初期アメリカ史研究者より、今後の研究に繋がる有益な講評を多数頂戴した。研究成果の発表として、学会報告を敷衍する形で19世紀前半の主権観念を考察する論文を『アメリカ太平洋研究』(東京大学)に投稿中である。さらに、政治指導者の書簡を主な史料として、無効宣言論争における妥協関税法案の成立過程を明らかにする論文を執筆する予定である。今後の方針としては、欧州諸国での革命と君主政体をめぐる論争が合衆国内の政治社会に与えた影響に注目し、史料および文献の蒐集を進める予定である。本研究課題は平成26年度が最終年度のため、記入しない。本研究の中心的課題は、アメリカ合衆国における民主主義的統治原理の確立過程に着目することを通して、19世紀前半の連邦統合論の諸相を政治史および政治思想史的観点から明らかにすることにある。特に初期共和国政治における「党派性」(partisanship)の観念を重視しつつ、第二次米英戦争(1812-15)以降に見られた政党政治および政治社会の変容過程を解き明かすことを課題としている。平成25年度は、報告者が修士課程より継続して研究対象としている無効宣言論争(1828-33)に関する史料的裏付けを強化するとともに、それに先立つ1810年代から1820年代に至る時代の知見を幅広く吸収した。具体的には、まず連邦議会議事録や政治指導者の史料集などの刊行史料を1830年代を中心に精査した。また、夏季長期休暇を利用して、アメリカ合衆国への海外出張を実施し、連邦議会図書館、ヴァージニア州歴史協会、サウスカロライナ州歴史協会にて手稿史料等を収集した。文献調査を通して、建国初期に見られた「暴民政治」や「反動政治」への強い危惧が通説よりもかなり遅い時期まで観念されていた可能性を探り出すことができた。この点は、安定的な「アメリカ民主主義」史像とは異なる解釈に繋がる可能性を有しており、同時代のグローバルな史的連関を考える上でも有意な示唆を与えるものと思われる。研究発表としては、平成25年4月20日の日本アメリカ史学会「修士論文報告会」において、無効宣言論争における従来では等閑視されてきた連邦政治家の動きに関する報告を行い、討論者およびフロアより建設的な評価を得た。また、平成25年6月に来日したジョン・L・ブルック教授(オハイオ州立大学)と、本研究分野における最新の研究動向をめぐって活発な意見交換を果たした。本年度に収集した史料および文献にもとづき、日本アメリカ学会年次大会(平成26年6月)にて研究報告することがすでに決定している他、成果をまとめた論文を投稿に向けて執筆中である。

さらに、政治指導者の書簡を主な史料として、無効宣言論争における妥協関税法案の成立過程を明らかにする論文を執筆する予定である。今後の方針としては、欧州諸国での革命と君主政体をめぐる論争が合衆国内の政治社会に与えた影響に注目し、史料および文献の蒐集を進める予定である。本研究課題は平成26年度が最終年度のため、記入しない。二次文献の整理が進み、米国における最新の研究動向を把握したことに加え、連邦議会議事録等の一次史料の精査が独自の発見に結びついたため。19世紀前半のアメリカ合衆国の連邦統合論を理解するにあたり、第二次米英戦争(1812-15)がその後の国内政治に及ぼした影響が極めて大きいことが文献調査を通して明らかとなってきた。それゆえ、今後は研究対象とする時代をやや前にずらして、1810年代から1820年代の連邦政治史を重点的に研究する予定である。さらに、扱う史料も連邦議会議事録のみならず、各地の新聞や機関誌などから当時の思潮や時代感覚を読み解くことが肝要となるだろう。
実多項式で定義される複素曲面とその実部との相対位相型

「RP^1×RP^1上のbidegree(4,4)の実代数曲線(の複素化)で分岐するCP^1×CP^1の2重被覆」(これはK3曲面)に付随する「条件付き対合付き格子)の種(genus)全体の表(これは1995年に得た。)に基づき、本年度は、各「種」を実現するRP^1×RP^1上のbidegree(4,4)の実代数曲線の位相的性質(isotopy型,dividingness,complex orientationなど)の限定を進めた。結果について、1997年1月6日から10日にTorontoのFields Instituteで開かれた、Workshop on Real Algebraic Variertiesで発表した。発表後、S.Finashin氏から、「種(genus)でなく同型類と、位相的性質との対応についてはどうか?」と質問された。これは今後の課題である。発表の最後で、キ-となる疑問点をいくつか挙げたが、特に重要なのは、次である:<コホモロジー類[∞×CP^1]の2重被覆への引き戻しh_1に対し、不変量δ_<h1>に関して、「∞×CP^1の実部が2重被覆の実部におけるZ_2-boundaryならばδ_<h1>=0」であるが、その逆は成り立つか?>参加者から、既知だという答えが無かったので、考える価値があると再認識した。発表に関し、Oleg Viro氏からも有益な助言を得た。同じ結果について、1997年1月27日から30日に開かれた京大数理解析研究所の研究集会「実特異点のトポロジーとその関連話題」でも発表した。上述の疑問点については、今後「実K3曲面とその実部」という特殊な状況にとらわれずに、一般に、4次元シンプレクティク多様体における曲面や、Z_2作用を持つ4次元多様体とその不動点集合という見方でアプローチしていきたい。
幕末期長州藩の軍事科学的洋学の展開-幕府・西南諸藩・東北諸藩との比較検討を通じて

研究実施計画にもとづき調査をすすめ、史料をフィルムに撮り、焼き付け(A5・CH版)を行い、整理・解読・検討を遂行した。最大の成果は、幕末期洋学の軍事科学化を飛躍的にすすめた存在として不可欠である長崎海軍伝習所について、その教育の具体的内容を明らかにできたことである。同所におけるオランダ人教師による実地教育については、主に、勝安房『海軍歴史』巻之三・四・五(海軍伝習之上・中・下)、カッテンディーケ『長崎海軍伝習所の日々』、赤松範一『赤松則良半生談』、秀島成忠編『佐賀藩海軍史』、島津家編纂所編『薩藩海軍史』上巻、藤井哲博『長崎海軍伝習所』などに収められた資史料に依拠して、教師及び直伝習生の氏名・構成、伝習期間・方法、教授科目・時間割・規則・心得などを明らにすることができよう。しかし、教育実態の究明には、根本的に史料上の制約が大きく、研究の遅滞が生じていたというのが現状である。こうしたなかで、調査実施の一環として、佐賀県立博物館において、同所での軍艦運用術の伝習内容と思われる史料「操練所伝習」を発見し収集できたは意義は大きい。本史料は、保存状態は良好で、「ブラムステング之揚方」「パルヅーン之成立」「ワント之成立」「ブレガット之ワント掛様ノ図」「セール之区別」「帆木綿之用法」などについて、それぞれ図入りの詳細な説明がみられ、軍艦運用術の直伝習の模様をつぶさに知ることができる貴重なものである。これまで、同所に関する新史料の出現は皆無に近かっただけに、幕末期洋学の軍事科学的展開を究明する上で、その基盤拡大に大きく資することができるものと考えられる。技術的な内容が高度に専門化しているため、現在、科学史家と連携した研究体制を継続中であるが、近く成果を打ち出す予定である。研究計画にもとづき、本年度は幕末期長州藩及び西南諸藩の海外留学生に焦点を当て調査を進めた。これは、当該期の海外留学は実質的には視察や洋行と未分化の状態であったが、その目的は国際的環境を踏まえた海外各国の事情探索(軍事科学技術・政治・文化などの導入、移植)であった点を注目したことによる。長州藩の海外留学生については、これまで、高杉晋作の上海視察、井上聞多・伊藤俊輔等5人の英国留学が研究対象となり、そのほかの留学生の動向については究明が等閑に付されてきた。『幕末明治・海外渡航者総覧』(柏書房、1992年)という画期的な成果にもかかわらず、未だ脱漏は否めない。この度の調査により、次に示す留学生の動向が明らかとなった。紙幅の都合上、留学(渡航)先・年月・氏名のみ記すに止める。万延元年1月(北条源蔵:遣米使節に随行)、文久元年4月(桂右衛門・山尾庸三:幕船亀田丸の露領巡航に便乗)、同年10月(杉徳輔:遣欧使節に随行)、文久2年4月(高杉晋作:幕使上海派遣に随行)、文久3年5月(井上聞多・伊藤俊輔・山尾庸三・遠藤謹・野村弥吉:英国留学)、慶応元年4月(山崎小三郎・南貞助・竹田庸次郎:英国留学)、慶応3年2月(毛利幾之進・福原五郎・河瀬安四郎・藤本盤造:英国留学)、同年7月(河北義二郎・天野清三郎・服部潜蔵・池田梁蔵・伊藤湊・遠藤貞一郎:英国留学、飯田吉次郎:和蘭留学)。2については、1と同様の視点から、佐賀藩11人、薩摩藩32人の留学生の動向を確認できた。本研究の成果の一部は、著書『幕末期長州藩洋学史の研究』(平成9年度科学研究費補助金「研究成果公開促進費」一般学術図書)に反映させた。

これまで、同所に関する新史料の出現は皆無に近かっただけに、幕末期洋学の軍事科学的展開を究明する上で、その基盤拡大に大きく資することができるものと考えられる。技術的な内容が高度に専門化しているため、現在、科学史家と連携した研究体制を継続中であるが、近く成果を打ち出す予定である。
熱ショック転写因子によるHSP遺伝子転写制御機序と動脈硬化発症に関する研究

熱ショック応答では高温などのストレスにより、熱ショック転写因子(HSF)がπ8P遺伝子の転写を誘導する。HSFは三量体を形成し、標的遺伝子のHSEに結合する。今回の研究により、HSEタイプ1を持つHSPではHSFの三量体形成能を必要とし、タイプ2を持つHSPでは必要でないことが明らかとなった。また、動脈硬化症の進行に伴い、動脈起始部のHSP25発現が変化した。血漿中も同様の変化を見せたことから、HSP25は粥状動脈硬化症の進行を推定することができる特異的マーカになりうる可能性が考えられた。生物に普遍的な熱ショック応答では、高温などのストレスにより、熱ショック転写因子(HSF)が熱ショックタンパク遺伝子の転写を誘導する。HSFは三量体を形成し、標的遺伝子のHSE(Heat Shock Element)に結合する。HSEは5'-nGAAn-3'の逆向き反復配列であり、3個のリピート(nGAA=3)にはHSF三量体が1つ、4個以上のリピート(nGAAn≧4)には三量体が2つ結合する。一方、酵母Hsf1の転写活性化能力は、熱ショックにより引き起こされるリン酸化、および、これに伴う何らかの構造変化により制御されていると考えられている。三量体形成領域に変異を持つHsf1タンパクは、酵母菌内においてnGAA=3のHSEにはほとんど結合できないが、nGAAn≧4のHSEには結合能力を示した。これにより、変異酵母株は致死にはならないが、熱ショック応答においていくつかの標的遺伝子の転写を誘導できず高温感受性になることが示された。さらなる解析より,オリゴマー形成はHsf1のリン酸化にも必須であることが明らかになった。一方この変異Hsf1の表現型は、DNA結合領域の203番のValがAlaに置換することにより抑圧された。V203A変異は、nGAAn≧4のHSEへの結合を野生型Hsflレベルにまで回復させ、さらに、nGAAn=3のHSEへの結合を促進した。これらの結果より、DNA結合領域は、Hsflのオリゴマー形成および三量体間の相互作用に重要な役割を果たし、203番のValがその一端を担っていることが示唆された。粥状動脈硬化症は酸化LDL、高コレステロール血症、ずり応力などの血行力学的作用、化学的損傷、感染症などから生じる血管内皮細胞障害と炎症によって特徴付けられる多因子疾患である。それらはストレス応答を活性化させ、熱ショックタンパク質(HSP)を誘導すると考えられている。動脈硬化症の進行とHSPの関係を明らかにする為に、動脈硬化自然発症モデルマウスであるApoE KOマウスの大動脈起始部を用い、HSPの局在、タンパク質発現量、および血漿中HSPのタンパク量を解析した。HSP25、HSP70の発現は大動脈組織では血管平滑筋細胞及びマクロファージの発現量に依存していた。また大動脈起始部でのHSP25およびHSP70タンパク量は、動脈硬化症の進行により変化した。HSP25の組織化学的所見および生化学的所見が同様の傾向をとったことから、血漿におけるHSP25の濃度が粥状動脈硬化症の進行の特異的マーカーとなりうる可能性が示唆された。それに対しHSP70においては、組織化学的所見と生化学的所見が一致せず、血漿中のHSP70は他の臓器からのHSP70であり、血管組織からのHSP70でないことが考えられた。血漿中のHSP70は粥状動脈硬化症の特異的マーカーとはならないものの、血漿中のHSP25およびHSP70のタンパク量を比較することで、粥状動脈硬化症などの血管障害と他の疾患を見分ける指標になると示唆された。
高機能性人工核酸による遺伝子発現制御法の開発

任意の遺伝子の発現を制御する新たな方法論として、機能性キメラ型オリゴヌクレオチドを創製した。その遺伝子発現制御効果について種々検討を行ない、以下のような知見を得た。1)核酸塩基対とこれを認識するヘテロ環化合物に対する分子軌道計算の結果や、生体内においてDNA結合タンパク質がDNAの塩基配列をどのように識別しているかを参考に、新たなヘテロ環化合物の分子設計を進めた。設計したヘテロ環化合物を種々合成し、それぞれBNA骨格へ導入した。得られた非天然核酸は三重鎖形成オリゴヌクレオチドヘ組み込んだところ、今回開発した人工核酸分子により、ピリミジン塩基の認識が可能であることが見いだされた。2)機能性官能基をオリゴヌクレオチドへ導入する手法として、クリックケミストリーを利用した新しい方法論の開発に成功した。また、別タイプの機能性官能基導入法として、転写因子結合配列をオリゴヌクレオチド末端に導入したキメラ型分子の創製にも成功した。3)上記1で開発した非天然核酸を含む三重鎖形成オリゴヌクレオチドを単独で、或いは、これまで我々が開発してきた「アンチジーンブロック法」と併用して利用することで、培養細胞での遺伝子発現を効果的に制御することに成功した。さらに、上記2で開発した転写因子結合配列をオリゴヌクレオチド末端に導入したキメラ型分子を用いた際に、標的となる遺伝子のmRNA発現レベルを数倍上昇させることが可能であるという新知見を見いだした。この知見により、生きた細胞内での遺伝子発現を抑制するばかりでなく、積極的に活性化する道すじが開けたものと考えている。4)これまでに開発してきた人工核酸の化学構造と三重鎖形成能を詳細に解析し、三重鎖形成能の更なる向上を目指した新規な架橋型人工核酸の開発を進めた結果、従来のBNA以上の三重鎖安定性を示す新たな架橋型人工核酸(第2世代BNA)を創製することに成功した。今年度は、主に人工核酸分子の精密構造制御と遺伝子発現挿制への展開について研究を進めてきた。以下に成果の概要を示す。核酸が形成する二重らせん構造の外側はリン酸ジエステル結合等のバックボーンが取り巻いており、遺伝子発現制御を考える際に肝心となる核酸塩基は、らせんの中央に位置している。そのため、塩基配列を認識するための分子はメジャーグルーブ或いはマイナーグルーブと呼ばれるDNAらせん上の二つの溝のいずれかにそってアクセスすることが必要である。申請者は、分子認識の要となる各種官能基の配置を考慮し、メジャーグルーブ側からオリゴヌクレオチドを用いた三重鎖形成により塩基配列の認識を行った。天然の三重鎖形成オリゴヌクレオチドによる塩基配列の認識はA及びGといったプリン塩基に限定されており、TやCといったピリミジン塩基は認識できない。そこで、まず計算化学的手法により、新たなヘテロ環化合物の設計を行った。すなわち、標的とする塩基対とこれを認識するヘテロ環化合物に対しそれぞれ分子軌道計算を行い、それらの電子密度表面上に投影した静電ポテンシャルを解析することで核酸塩基とヘテロ環との分子認識の成否を予測した。また一方で、生体内においてDNA結合タンパク質が二重鎖DNAの塩基配列をどのように識別しているかという点を参考に、新たなヘテロ環化合物の分子設計を進めた。このようにして設計したヘテロ環化合物を申請者らが既に開発した架橋型フラノース類とカップリングさせ非天然の核酸分子へと導くことに成功した。

得られた非天然核酸は三重鎖形成オリゴヌクレオチドへ導入し、標的となるDNA配列を厳密に認識し得るか否か詳細に評価した。その結果、今回開発した人工核酸分子により、TやCといったピリミジン塩基の認識が可能であることが見いだされた。さらに、これら人工核酸を細胞系における遺伝子発現制御に利用し、極めて良好な知見が得られている。今年度は、強固な三重鎖形成能を有する架橋型人工核酸BNAを含有するオリゴヌクレオチドに、各種の転写活性化因子をリクルートするための機能性を付与し、任意の遺伝子の発現を抑制するばかりでなく活性化させるための手法開拓を目指し研究を実施した。まず、標的となる二重鎖人工核酸に転写因子が結合するペプチド配列やDNA配列を導入したキメラ型分子の開発を行った。まず第一に、転写活性化能を持つとされる種々のペプチドと人工オリゴヌクレオチドとのゴンジュゲート体合成の検討を、クリックケミストリーを利用した新しい方法により実施した。また、別タイプの転写活性化法として、DNA配列を導入したキメラ型分子の創製も行った。これまでに申請者らが開発してきた新たな遺伝子発現抑制法である「アンチジーンブロック法」は、BNA修飾したオリゴヌクレオチドの末端にステムーループ構造を形成するDNAを結合することで、転写因子が標的とするDNA配列へ結合することを効果的に阻害し、転写の抑制を行うものであるが、ここではこの方法論を改良し、逆に転写因子をDNA上にリクルートするためのDNA配列を結合させた人工オリゴヌクレオチドを化学合成し転写の促進効果を検証した。その結果、各種培養細胞において、標的としたIL-2R遺伝子の発現を数倍程度促進するという非常に興味深い知見が得られた。これにより、生きた細胞内での遺伝子発現を抑制するばかりでなく活性化する道すじが開けたものと考えている。また、本検討の過程で、「アンチジーンブロック法」では標的となる転写因子の結合部位はもちろんのこと、その下流のDNA配列に人工オリゴヌクレオチドが結合することで、効率的な転写制御が可能となるという予想外の知見を得ることにも成功している。
砂防ダムを利用した水質環境の改善に関する研究

1.透過型砂防ダムが流水の懸濁物質(SS)濃度に及ぼす影響岐阜県の根尾川上流に施工された砂防ダム群の中から、満砂状態である3基の透過型ダムを対象に、ダム堆砂面上での流水とダムのスクリーン部分を透過した水のSS値を計6ヶ所で定期的に測定し、SS濃度差を求めた。その結果、ダム堆砂面上での流水とダムの透過水のSS値を比較すると、798%k濃度差が認められた。ダム堆砂域でのSS値が高い場合、ダム透過水のSS値の減少率は高く、80%以上を示した。各ダムを比較すると、下流のダムほど減少率が高くなる傾向を示した。なお、流量、流速とSS濃度の間には明瞭な相関は認められなかった。2.流路工区間における落差工が流水の溶存酸素(DO)濃度に及ぼす影響岐阜県多治見市を流れる市之倉川に設置された8基の落差工を対象に、落差工の上下流でのDO濃度の差異を半月に1度の割合で調べ、酸素供給に関する落差工の影響を考察した。緩勾配の流路工区間では工場排水や家庭廃水が途中で流入するために、水中のDO濃度は流下過程で徐々に減少するが、落差工の越流する際に再び増加することが明らかになり、調査域の最下端で最大値を示した。落差工1箇所当たりの増加率は最大で25%であったが、大部分は10%未満であった。季節的には水温が上昇し、水中植物の光合成作用が活発になる夏季において、落差工の越流する際の増加が顕著であった。DO増加率は落差工の形状と密接に関連し、落下部分がプール状では落差の違いにかかわらず、増加率は24%でほぼ一定の値を示したが、落下部分がコンクリートの「叩き」状を呈する箇所では、落差に比例して増加率の上昇する傾向が認められた。その結果、ダム堆砂面上での流水とダムの透過水のSS値を比較すると、7.098.5%の濃度差が認められた。ダム堆砂域でのSS値が高い場合、ダム透過水のSS値の減少率は高く、約79%を示した。減少率について3基のダムを比較すると、下流のダムほど高くなる傾向を示した。ただし、流水のSS値については、ダム越流後、いったんは低下するが、その下流で再び増加する傾向がみられた。越流水によって河床堆積物が撹拌され、下流域での懸濁物質の増加につながったと推測される。2.都市河川に施工された落差工が流水の溶存酸素(DO)濃度に及ぼす影響岐阜県多治見市を流れる市之倉川に設置された8基の落差工を対象に、落差工の上下流でのDO濃度の差異を調べ、酸素供給に対する落差工の影響を考察した。調査の結果、緩勾配の河床区間では流入水や家庭廃水の影響を受けて、DO濃度は流下過程で徐々に減少するが、落差工の越流する際に増加することが明らかになった。ただし、増加率は8%未満であった。

DO増加率は落差工の高さ及び落下部の水深によって異なり、単位幅当りの流量が0.01m^2/s以上の場合、落差2.5mで約7%と最大の値を示した。落差がそれ以上大きくなると、増加率は減少傾向を示し、落差4.4mで約0.4%となった。また落下部が「たたき」状と「プール」状の箇所を比較すると、後者ではDO増加率は0.3%程度多くなる傾向が認められた。1.透過型砂防ダムが流水の懸濁物質(SS)濃度に及ぼす影響岐阜県の根尾川上流に施工された砂防ダム群の中から、満砂状態である3基の透過型ダムを対象に、ダム堆砂面上での流水とダムのスクリーン部分を透過した水のSS値を計6ヶ所で定期的に測定し、SS濃度差を求めた。その結果、ダム堆砂面上での流水とダムの透過水のSS値を比較すると、7.098.5%の濃度差が求められた。ダム堆砂域でのSS値が高い場合、ダム透過水のSS値の減少率は高く、約79%を示した。3基のダムを比較すると、下流のダムほど減少率が高くなる傾向を示した。なお、流量、流速とSS濃度との間には明瞭な相関は認められなかった。2.都市河川に施工された落差工が流水の溶存酸素(DO)濃度に及ぼす影響岐阜県多治見市を流れる市之倉川に設置された8基の落差工を対象に、落差工の上下流でのDO濃度の差異を調べ、酸素供給に関する落差工の影響を2年間にわたって考察した。緩勾配の流路工区間では工場排水や家庭廃水が途中で流入するために、水中のDO濃度は流下過程で徐々に減少するが、落差工の越流する際に再び増加することが明らかになり、調査域の最下端で最大値を示した。ただし、1箇所当たりの増加率は10%未満であった。季節的には水温が上昇し、水中植物の光合成作用が活発になる夏季において、落差工の越流する際の増加が顕著であった。DO増加率は落差工の形状と密接に関連し、落下部分がプール状では落差の違いにかかわらず、増加率はほぼ一定の値をとるが、落下部分がコンクリートの「たたき」状を呈する箇所では、落差に比例して増加率の上昇する傾向が認められた。
「緑の福祉国家」の形成と展開:フィンランドの事例研究を中心に

本研究では、フィンランドにおける福祉国家の展開を事例研究として、経済成長だけでなくエコロジカルな意味での持続可能な社会開発を希求する立場から、「緑の福祉国家」に関する理論と実践について研究した。エコロジカルな視座は、人間中心主義を超える生命中心主義の考え方から福祉国家のありようを捉え直す可能性を提供する。エコロジーは環境と経済の関係だけでなく、社会の各レベルでの意思・政策決定に関するパワー関係の見直しをも要請する。グローバル経済の浸透により知識経済化が進む中で、人類は人間社会の社会的格差や社会的排除の問題群との取り組みと同時に、越境的かつ地球規模の生態系保全を持続可能な社会開発として探求する環境倫理的な責務を負う。フィンランドの福祉国家は、北欧型福祉国家モデルを基盤として20世紀後半から発展し、1980年代には環境運動をはじめとする社会運動のリーダーを中心とするゆるやかな組織を出発点として、緑の党が形成された。1990年代からは与党政権にもなっている。福祉の政治の場では、緑の党は社会民主党との政策協調を通じて、社会的公正を強調する政策指向を示している。したがって、フィンランドの緑の党は、ドイツやスウェーデンの緑の党と同様に、環境問題にとどまらず、世代間責任や環境の公正といった概念を中心に社会政策へのアプローチを模索・確立してきた。緑の党だけでなく、福祉の政治の緑化という意思決定・政策決定プロセスの変容を通じて、緑の福祉国家が形成されている。本年度は海外調査研究の初年度であり、フィンランドでの海外調査とともに、このプロジェクトに関連する主要理論や概念についての分析を行うことに主眼を置いて研究を遂行した。5月から7月にかけて、研究代表者・高橋は、海外研究協力者との打ち合わせに先立ち、研究分担者Mervioとともに、「緑の福祉国家」モデルの理論的課題を整理した。この研究テーマには、福祉レジーム論だけでなく、開発、環境(エコロジー)、福祉といった人間の安全保障にも通じる研究課題が含まれるが、人間中心主義を超えたディープ・エコロジーともパラダイムを共有する立場で、いかにして福祉国家の持続性を追求するかが問われる。8月にはフィンランドのタンペレ大学社会政策学科でSipila教授との研究打ち合わせを中心とする海外調査を実施した。この打ち合わせにおいて、本研究が提唱する「緑の福祉国家」モデルについての意見交換だけでなく、日本とフィンランドの家族政策の現況を中心に福祉国家制度の比較研究のための理論的な枠組みとについても討論した。今年度のフィンランドでの海外調査研究の成果として、タンペレ大学やフィンランド社会保健省を中心とする海外調査を通じて、北欧型福祉国家の現在の課題についても最新の資料や情報を得ることができた点が挙げられる。さらに、9月以降には、緑の福祉モデルについての最新の理論研究の展開に注目しつつ、主としてTony Fitzpatrickらの理論(環境と福祉、エコ・ウエルフェア)の展開について整理するとともに、近年のフィンランドやスウェーデンにおける福祉モデルに関する議論との関連付けを試みた。これと並行して、国内でEUの環境・社会政策に関する資料収集を行なった。また、平成16年1月から3月にかけては、平成16年度に予定している北欧諸国での海外調査の準備のために、関係分野の大学関係者らへの連絡を行なった。研究代表者・高橋は、平成16年5月27-28日に京都で同志社大学ビジネス研究科の長谷川治清教授(研究協力者)と本プロジェクトについて意見交換を行い、研究分担者Mervioとともに7月28日から9月14日の間に海外学術調査をフィンランドで実施し、フィンランドの福祉国家のジェンダー関連政策と環境政策の現状について調査した。高橋は、海外研究協力者Jorma Sipila教授(タンペレ大学総長)の助言を得つつ、福祉レジーム理論についてのフィンランドでの議論、フィンランドの福祉国家の主要政策課題とジェンダーの位置付け、緑の党(グリーン連合)の役割、家族政策の課題について資料収集と関係方面へのインタビューを行った。また、フィンランドにおけるジェンダー研究の最新の研究成果について、ヘルシンキ大学クリスティーナ女性研究所およびタンペレ大学女性研究学科において資料収集を行い、タンペレ大学のUlla Vuorela教授(社会人類学、ジェンダー研究)、Anneli Anttonen教授(社会政策、ジェンダー論)およびLiisa Rantalaiho

名誉教授(労働社会学、ジェンダー論)から専門的知識の提供を得た。Mervioは8月28-30日にクオピオ大学で、社会・医療サービス経営におけるフィンランドと日本との比較研究に関する研究方法の選択肢と問題点について、同大学大学院行政経済学部Jari Vuori教授と意見交換を行った。12月10-13日にかけて高橋は在京のフィンランド文化研究所やEU代表部等を中心に研究資料・情報の収集を行い、平成17年1月から3月にかけてMervioと今年度得た資料と情報の分析を行った。今年度は、研究代表者高橋が5月中旬に『フィンランドに学ぶ教育と学力未来への学力と日本の教育』への参加の機会を得て、担当章では北欧型福祉国家とくにフィンランドの福祉国家が果たす幅広い役割について執筆した。本書は7月末に明石書店から出版されすでに三版に至っている。高橋は6月8-9日には東京で研究資料収集を行い(EU日本代表等)、6月10-11日には日本社会福祉学会中国・四国支部年次大会での分科会の座長の1人として参加しつつ研究情報を収集した。6月16日には、愛知地球博で開催された北欧セミナーに参加し、環境問題への取り組みや北欧型福祉国家の動向について北欧の専門家たちの知見を得た。6月20-23日には、ソウル梨花女子大学で開催されたWomen'sWorld Congressにおいて、武田宏子(シェフィールド大学講師)とK.ギフィン(ブラジル・国立オズワルド公衆衛生研究所教授)とともに、「健康・環境とリスク」と銘打ったワークショップを実施し研究成果を発表した。8月には高橋はフィンランド、ベルギー、イタリアにおいて海外調査を実施し、ベルギーではブリュッセルの日本代表部において本プロジェクトに関する福祉と環境政策についての研究資料・情報を得た。また、イタリアでは、ローマ大学のM.ヴィアネッロ教授から欧州における北欧型福祉国家の位置付けやEUの環境政策と福祉政策の連関について貴重な知見を得ることができた。フィンランドでは、高橋が研究資料の収集を行ったほか、研究分担者Mervioがクオピオ大学のJ.ヴオリ教授との共著で比較研究の視角から日本とフィンランドの福祉社会についての出版プロジェクトの草稿を完成させた(出版物の刊行は来年度の見込み)。10月には高橋が日本社会学会に参加しとくに環境社会学についての研究情報を得た。11月23-26日には、東京での研究資料収集および来年度執筆予定の出版プロジェクトについての打ち合せを出版社と行った。1月から3月にかけては、最終年度となる来年度の準備のために、関係者への連絡と収集した資料の分析を行った。
接着ブリッジ用支台歯の接着性能診査に関する臨床的研究

1.目的:接着ブリッジの実施に先立って支台歯となる個々の歯の接着性能診査を行い、的確な接着技法の条件を見出すと共に、5年後と10年後の臨床成績と比較検討できる情報を得る。2.方法:接着ブリッジの支台歯形成に入る前にリンガルボタンを接着し、24時間後の接着強さをニッパ型剪断接着強さ測定器を用いて測定する。リンガルボタンは金合金製の円板(被着面:直径3mm)で、接着性プライマ-(VBA)で表面処理する。一方、支台歯は(1)形成後、(2)エッチング後、(3)剥離後にそれぞれ付加型シリコン印象材で印象をとり、包埋用樹脂を注入してレプリカを作製しSEMによる観察を行い、接着強さとの関連を検討した。3.結果:接着ブリッジ用の支台歯20歯について行い、以下の結果を得た。(1)接着強さが小・グル-プ(3kg未満)のエッチング像はエナメル小柱の脱灰が周りの小柱鞘より少なく、中央が盛り上がり、小柱尾の脱灰が進んで小柱の輪郭が小紋状になる。(2)接着強さが中・グル-プ(35kg未満)では小柱も脱灰が進み、中央の盛り上がっている部分にも微細な凹凸が生じている。(3)接着強さが大・グル-プ(510kg)では小柱の脱灰がさらに進み、小柱鞘が逆に残って壁のようになり、全体の凹凸は増して溝も深くなる。全て6065%リン酸溶液で30秒間エッチングにも拘らず、このような差が生ずるのは石灰化度の個体差や同一人でも歯種による石灰化時期のずれや小柱の配列のちがい等に起因すると推察できるが、今回の症例数では明確にならなかった。4.研究成果の今後の展開:患者の年齢、部位等を明記した上で、支台歯の接着力、エッチング像を「接着性能診査」録に記録しており、今後症例数を増すと共に、5年後ないしは10年後の術後経過と比較、検討する予定である。
魚類モノクローナル抗体遺伝子の新規探索法と抗体発現系の確立

イヌザメ(bamboo shark)のIgNARのcDNA配列を得て、定常部位の配列を抽出した。IgNARの可変部位をアンプリコンシーケンスし、個々の遺伝子の発現頻度を測る系を確立した。イヌザメに1ヶ月おきに抗原(HEL、BSA、MMP-09)を数回投与して投与1ヶ月後に採血した。BSAに関してELISAで抗体価を測定し、抗体価の上昇と連動して発現頻度の上昇した遺伝子を複数特定した。CHO細胞を用いてサメ抗体の可変領域と定常領域を組み合わせた発現コンストラクトを調製し、分泌生産に成功した。これらの成果からトランスクリプトーム解析による抗原得意的抗体遺伝子の同定とその発現系の確立はほぼ完了した。本研究開始前より飼育していたサメ5匹より1年間にわたり採血を行いサンプルを得た。その後、得られた末梢血の白血球を分画分離の後、cDNAライブラリの作製を行うことができた。また、IgM、IgW、IgLに関する知見も得ることができた。ヤツメウナギの飼育を開始し、トラフグ飼育の準備を進めた。また二次抗体の抗原とするIgNAR定常部位の発現系の構築を進めた。これらのことによりおおむね順調に進展していると考えている。平成28年度は平成26年夏から飼育を開始し、5ヶ月間、経時的に抗原接種と採血を行った5匹のイヌザメのIgNAR遺伝子のトランスクリプトーム解析を行った。トランスクリプトームの解析対象部分はIgNAR遺伝子の可変領域である。その部分を特異的に増幅するPCRプライマーを設計した。5匹のサメから各5回採血し、それらの末血から調整したcDNAを元に可変領域を増幅しアンプリコンシーケンシングを行った。シーケンシングにはMISEQを使い両エンドから300塩基のデータを得た。増幅した可変領域は500550塩基程度であるため、両エンドからのシーケンスを結合すれば、可変領域を完全にカバーする可変領域のcDNA配列を得ることができる。その結果、それぞれのサンプルから2040万の完全長IgNAR可変領域のデータを得ることができた。これらによって得られた配列を解析した結果、5種類のサメで得られた配列、その長さの分布、各配列の出現頻度をデータベース化できた。特に本研究にとって重要である、それぞれの配列が抗原接種に伴ってどのように変化するか、という点についてデータを得られたことは大きな成果である。これらに加えて、採血した血液から血清を回収し、抗原特異的なIgNARを検出するためのELISA系を確立した。その結果、それぞれのサメで、最初に抗原を接種してから3、4ヶ月で抗原特異的に抗体量が増加していることが検証できた。さらにドチザメIgNAR重鎖保存領域をコードする大腸菌組換えタンパク質を調製し、得られた組換えタンパク質に対するウサギポリクローナル抗体を作製した。得られた抗体を用いたWestern Blottingによりドチザメ血清中のIgNARを検出できた。また、宿主細胞としてCHO細胞を用いたサメ抗体(IgNAR抗体)の分泌生産系を構築することを目的として,IgNAR抗体の定常領域を変化させた抗体フォーマットを作成し,CHO細胞における抗体分泌能を検討した。前述のようにイヌザメを対象に、可変領域配列が異なるそれぞれのIgNAR遺伝子の発現量を観測する実験系を確立した。そして実際に抗原接種前、および接種後5ヶ月に渡って、5匹のイヌザメから採血し、それぞれの採血サンプルから個々のIgNAR遺伝子の発現量がどのように変動したかについて、データが得られた。またそれぞれの血液中の抗原特異的IgNAR量を観測するためのELISA系を確立できた。一方、トラフグについては飼育の容易さは個体に大きく依存するが、最初のトライアルは飼育上の問題で中断している。現在飼育条件を検討中である。またヤツメウナギは個体サイズが小さく、生かしたままの経時的採血が難しかったため、実験は抗原接種前の採血までに止めた。本研究においてサメのIgNARは立案当初から本研究の最大の研究対象である。サメで得られた結果は、本研究が意図するトランプクリプトームによる発現変動と抗原特異的な抗体の血清中での量的変動を照合して、抗原特異的な抗体遺伝子を同定するプロセスの根幹をなすものであり、本研究は極めて順調に進んでいる。前年度までに行ってきたイヌザメ2系統の免疫サンプルの解析を進めた。1系統はニワトリ卵白リゾチーム(HEL)、もう1系統はHELとウシ血清アルブミン(BSA)の混合物の免疫である。HEL単独免疫の末梢血トランスクリプトーム解析のデータとIgNARの抗原特異的結合を検出するELISAの結果を照合した結果、抗原HELとIgNAR抗体の結合と同調して発現量が増加しているIgNAR可変領域遺伝子をリスト化できた。その中で発現量の多い遺伝子を選択、抗原抗体の結合予測を行い、結合性が示唆された5個の遺伝子を選別し、CHO細胞での発現実験を開始した。HELとBSAを同時に免疫した系統については、2016年6月から2017年8月までの期間に免疫を行った。5匹のイヌザメに免疫を行ったが、途中で3匹が死亡した。2匹は6回以上抗原接種を行い、同時に採血を行った。これらのサンプルについてもRNAからcDNAを合成し、IgNAR可変領域を特異的にPCRで増幅後、MiSeqによるシーケンシングを行って、平均100万以上の配列データを得た。