hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
早老症候群の疾患ｉＰＳ細胞樹立と加齢性変化の分子メカニズム解明

遺伝性早老症Werner症候群(以下、WS)は、思春期以降全身性に老化徴候を示し、糖尿病や動脈硬化、がんを好発し、40歳代で死亡する。WSの早老発症メカニズムを解明するために、WS患者由来iPS細胞を樹立を目指す。WS患者の皮膚由来線維芽細胞にOct-4, Sox2, Klf4,c-Mycの山中4因子を導入し、無限分裂能と三胚葉系細胞への分化能(奇形腫形成)を獲得した細胞の樹立に成功した。リプログラミングによりWS患者由来iPS細胞を得ることができた。さらに、ナンセンス変異を持つWS由来線維芽細胞に対し、読み飛ばし活性を持つリードスルー薬の保護効果を調べ、治療薬としての可能性を考察した。代表的な遺伝的早老症Werner症候群(以下、WS)は、思春期以降全身性に老化徴候を示し、糖尿病や動脈硬化、がんを好発し、40歳代で死亡する。1996年にWSの原因遺伝子としてDNAヘリケース(WRN)が同定されたが、個体・細胞レベルで早老をきたすメカニズムの解明は国内外を通じて進んでいない。理由の一つとして、WRN遺伝子のノックアウトマウス(KO)が早老の表現型を示さず、健常に生育するため、有用な動物モデルが無い点にある。またWSの皮膚由来線維芽細胞は、通常、数代の継代培養により老化関連βガラクトシダーゼ活性上昇などの細胞老化形質を示し、分裂を停止する。そのため、患者由来細胞を用いた発症メカニズムの解明も容易ではない。本研究では、WSの早老発症メカニズムを解明するために、無限分裂能を有するiPS細胞の技術を用いて、WS患者由来iPS細胞を樹立することを目的とする。WS患者の皮膚由来線維芽細胞にOct-4, Sox2, Klf4,c-Mycの山中4因子を導入し、無限分裂能の獲得した細胞の樹立に成功した。この細胞を免疫不全マウスの精巣への移植により三胚葉系細胞への分化(奇形腫形成)を確認した。一方、WSには一部の患者にナンセンス変異が知られている。近年、読み飛ばし活性を持つリードスルー薬が開発され、遺伝子欠損の改善例が報告されている。ナンセンス変異を持つWS由来線維芽細胞に対し、リードスルー薬の保護効果を調べ、治療薬としての可能性を考察した。Werner症候群(以下、WS)の皮膚由来線維芽細胞は、通常、数代の継代培養により老化関連βガラクトシダーゼ活性上昇などの細胞老化形質を示し、分裂を停止する。同細胞にOct-4, Sox2, Klf4,c-Mycのいわゆる山中4因子をレトロウイルスベクターで導入し、老化関連βガラクトシダーゼ活性低下や無限分裂能の獲得を確認した。この細胞は、ES細胞に特徴的な未分化マーカーを発現し、免疫不全マウスの精巣への移植により三胚葉系細胞への分化(奇形腫形成)を確認し得た。以上の結果から、リプログラミングによりWS患者由来iPS細胞を得ることができた(Shimamoto et al. submitted for publication)。WS由来iPS細胞を樹立できたため。WS由来iPS細胞から分化誘導した細胞(以下、分化細胞と略)について、その継代初期(passage 25)に経時的にRNAを抽出、マイクロアレイによる網羅的な解析を実施、健常者由来iPS細胞との比較により、早発性老化に関わる新規の候補遺伝子を同定する。In vitroで、RNA干渉によるsilencingならびに過剰発現系を用い、分化細胞におけるこれら遺伝子の機能を解析する。さらに、ChIP-sequenceによりゲノムワイドなヒストン修飾の解析を行い、早老形質に関連したエピゲノム変化と老化関連遺伝子の発現調節の関連を理解する。近年、長寿遺伝子として知られるSirtuinの一つSirt6が、ヒストンの脱アセチル化を介してテロメアとWRNヘリケースの結合を強め、細胞老化を抑制することが示唆されており(Michishita E etal. Nature, 2008)、WS細胞を対象としたエピジェネティック解析が、新たな発見をもたらすと予想する。研究試薬に600千円、成果発表費用に100千円の合計700千円を予定している。
ユリ科花卉園芸植物における形質転換技術を用いた耐病性品種作出のための基礎的研究

本実験では,ユリ科花卉園芸植物において形質転換技術により耐病性品種を作出することを最終目的として,以下の項目について検討した.(1)培養組織からの効率的な植物体再生系の確立数種・品種のユリ,アガパンサスおよびムスカリにおいて,高い増殖能力および植物体再生能力を保持したカルスまたは懸濁細胞培養系を確立した.タカサゴユリ,アガパンサス,ムスカリにおいては,組織学的観察により不定胚または不定芽経由の再生が起こっていることを明らかにした.さらに,タカサゴユリにおいては,長期間の継代・維持を経た懸濁培養細胞における再生能力の低下を確認し,また,その回復にはTIBA処理が有効であることを明らかにした.(2)選抜薬剤耐性濃度の調査数種・品種のユリ,アガパンサス,ヘメロカリスおよびムスカリにおいて,培地へのハイグロマイシンまたはビアラフォスの添加により,カルスの増殖および植物体再生が完全に抑制されることを明らかにした.(3)アグロバクテリウム法による形質転換系の確立数種・品種のユリ,アガパンサスおよびムスカリにおいてアグロバクテリウムによる形質転換を試み,そのうち現在までに,アガパンサスおよびムスカリにおいて効率的な形質転換系を確立している.(4)抗菌性タンパク質遺伝子ホモログのクローニング数種のアブラナ科植物から複数のディフェンシン遺伝子ホモログを単離し,発現ベクターへの組み込みおよびアグロバクテリウムへの導入を行った.現在,アグロバクテリウム法によるアガパンサスへの導入を試みている.本実験では,ユリ科花卉園芸植物において形質転換技術を用いた耐病性品種を作出することを最終目的として,以下の項目について検討した.1.培養組織からの効率的な植物体再生系の確立数種・品種のユリ,アガパンサスおよびムスカリにおいて,高い増殖能力および植物体再生能力を保持したカルスの培養系を確立した.特に,タカサゴユリ,アガパンサス,ムスカリにおいては,植物体再生過程を組織学的に観察し,不定胚経由の再生が起こっていることを明らかにした.2.選抜薬剤耐性濃度の調査数種・品種のユリ,アガパンサスおよびムスカリにおいて,カルスの増殖および植物体再生に及ぼす数種類の抗生物質および除草剤の影響を調査した.その結果,全ての植物種において,培地へのハイグロマイシンまたはビアラフォスの添加により,カルスの増殖および植物体の再生が明らかに抑制されることが示された.3.抗菌性タンパク質遺伝子ホモログのクローニング数種のアブラナ科植物およびユリ科植物から抽出したmRNAを鋳型として,RT-PCR法によりディフェンシン遺伝子のホモログの単離を試みた.現在までのところ,アブラナ科植物から修種の数種のホモログが単離されており,発現ベクターへの組み込みおよびアグロバクテリウムヘの導入を完了している.本実験では,ユリ科花卉園芸植物において形質転換技術により耐病性品種を作出することを最終目的として,以下の項目について検討した.(1)培養組織からの効率的な植物体再生系の確立数種・品種のユリ,アガパンサスおよびムスカリにおいて,高い増殖能力および植物体再生能力を保持したカルスまたは懸濁細胞培養系を確立した.タカサゴユリ,アガパンサス,ムスカリにおいては,組織学的観察により不定胚または不定芽経由の再生が起こっていることを明らかにした.さらに,タカサゴユリにおいては,長期間の継代・維持を経た懸濁培養細胞における再生能力の低下を確認し,また,その回復にはTIBA処理が有効であることを明らかにした.(2)選抜薬剤耐性濃度の調査数種・品種のユリ,アガパンサス,ヘメロカリスおよびムスカリにおいて,培地へのハイグロマイシンまたはビアラフォスの添加により,カルスの増殖および植物体再生が完全に抑制されることを明らかにした.(3)アグロバクテリウム法による形質転換系の確立数種・品種のユリ,アガパンサスおよびムスカリにおいてアグロバクテリウムによる形質転換を試み,そのうち現在までに,アガパンサスおよびムスカリにおいて効率的な形質転換系を確立している.(4)抗菌性タンパク質遺伝子ホモログのクローニング数種のアブラナ科植物から複数のディフェンシン遺伝子ホモログを単離し,発現ベクターへの組み込みおよびアグロバクテリウムへの導入を行った.現在,アグロバクテリウム法によるアガパンサスへの導入を試みている.
超高記録密度磁気ディスク用極薄保護膜／潤滑膜の表面・界面化学構造に関する研究

本研究では、1平方インチあたり4テラビット以上の超高記録密度を実現する次世代磁気ディスク方式(熱アシスト磁気記録HAMR)に用いられる膜厚1nm以下の極薄潤滑膜/保護膜の化学構造を測定する手法を開発し、膜および界面の解析を行うことにより、耐摩耗・耐食性の材料設計指針を提示することを目的とする。開発した測定技術は、超高感度プラズモンセンサにより深さ分解能0.1nmで極薄膜および界面の化学構造分布を表面増強ラマン散乱スペクトルにより測定する。また静的構造解析に加えて摺動における摩擦・摩耗の状態をサブナノメートルレベルで動的な変化を観察して、潤滑膜や保護膜(ダイヤモンドライクカーボン、DLC)の膜内や界面の構造変化を解析し、耐摩耗構造の指針を提示する。さらに、高湿度における腐食のメカニズムを解明し、保護膜/磁性膜界面も含めて防食構造の指針を提示する。今年度は上記測定装置を用いて、さまざまなカーバイド系保護膜(SiC,TiC,WC)の極薄膜をプラズモンセンサに被覆し500°Cでレーザー加熱を行った結果、カーボン膜は酸化分解を生じるのに比べカーバイド膜は変化が無く優れたHAMR耐久性が確認された。また潤滑膜がレーザー加熱の際に磁気ディスク面から蒸発し、センサ側へ移着することが確認された。また耐摩耗性プラズモンセンサを開発し、1Nでの磁気ディスクと同センサの摺動時における極薄DLC膜の化学構造変化と摩擦力の同時測定に成功した。また同センサはHAMRにおける加熱ヘッドである近接場トランスデューサ(NFT)と同じメカニズムなので、同センサを摺動子に用いてレーザー加熱をすることにより、MAMRのエミュレーション実験が可能であることを示した。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、1平方インチあたり4テラビット以上の超高記録密度を実現する次世代磁気ディスクに用いられる膜厚1nm以下の極薄潤滑膜/保護膜の化学構造を測定する手法を開発し、膜および界面の解析を行うことにより、耐摩耗・耐食性の材料設計指針を提示することを目的とする。今年度は上記測定装置を用いて、極薄(2nm)窒素ドープDLC膜の深さ方向の化学構造の測定・解析を行い、膜表面から膜内およびCo合金磁性膜界面までに存在する炭素中の窒素化合物、有機物、およびCo水酸化物の分布を0.1nmの深さ分解能で測定することに成功した。それらの成分の分布は、成膜方法(化学蒸着(CVD)法、フィルタード・カソーディックアーク法)や成膜ガス成分などで変化することが確認された。またレーザーで加熱しながら膜の化学構造の時間変化を測定する手法を開発し空気中ではで酸化によりDLC膜が劣化するが、窒素中では酸化が生じないことを明らかにした。また、潤滑膜は加熱により容易に消失することが確認できた。これは熱アシスト磁気記録方式では大きな技術課題になる可能性がある。さらに次年度に備えて磁気ディスクとの摩擦を測定する治具を開発し、その動作確認を行った。本研究は1平方インチあたり4テラビット以上の超高記録密度を実現する次世代磁気ディスクに用いられる膜厚1nm以下の極薄潤滑膜/保護膜の化学構造を測定する手法を開発し、膜および界面の解析を行うことにより、耐摩耗・耐食性の材料設計指針を提示することを目的とする。提案する技術は、超高感度センサにより、深さ分解能0.1nmで極薄膜および界面の化学構造分布を表面増強ラマン散乱スペクトルにより測定する。また静的構造解析に加えて摺動における摩擦・摩耗の状態をサブナノメートルレベルで動的な変化を観察して、潤滑膜や保護膜(ダイヤモンドライクカーボン)の膜内や界面の構造変化を解析し、耐摩耗構造の指針を提示する。今年度は埋め込み型耐摩耗センサの試作を行った。またプラズモンセンサを搭載する磁気ディスクの摺動試験機を試作し、摺動中のラマンスペクトルと摺動中の温度および摩擦力の同時測定を実証した。摺動中の温度はダイヤモンドライクカーボン保護膜のラマンスペクトルのGバンドピーク強度および摩擦力の大きさと対極関係にあることが分かった。これはセンサが摺動中に跳躍し、固体接触の低減による摩擦力の減少とプラズモン電界の減少にともなって温度の低下がもたらされたものと考えられる。埋め込み型耐摩耗センサは、石英基板上にTIO膜を下地にしてコーティングしたゾルゲルSiO2膜にSi針を押し込み、電気めっきによりAuまたはAu-Agを孔内部に析出させて作製した。本センサはCu表面の酸化膜のラマンスペクトルを測定できるほどの感度を有していることがわかった。本年度は、磁気ディスクの摺動における摩擦力とラマンスペクトルを同時に測定するツールを開発し、併せてプラズモンセンサの開発を行うことにより当初の研究の目標を達成する環境が整った。

本研究では、1平方インチあたり4テラビット以上の超高記録密度を実現する次世代磁気ディスクに用いられる膜厚1nm以下の極薄潤滑膜/保護膜の化学構造を測定する手法を開発し、膜および界面の解析を行うことにより、耐摩耗・耐食性の材料設計指針を提示することを目的とする。開発した測定技術は、静的構造解析に加えて摺動における摩擦・摩耗の状態をサブナノメートルレベルで動的な変化を観察して、潤滑膜や保護膜(ダイヤモンドライクカーボン、DLC)の膜内や界面の構造変化を解析し、耐摩耗構造の指針を提示する。さらに、高湿度における腐食のメカニズムを解明し、保護膜/磁性膜界面も含めて防食構造の指針を提示する。今年度は上記測定装置を用いて、パルスレーザー加熱による極薄(2nm)DLC膜の耐熱性を測定した。次世代超高密度記録方式の熱アシスト磁気記録の条件(327°C、1回当たり5ns、累積加熱時間0.5ms)では、DLC膜の劣化は問題ないことを明らかにした。またCVD膜よりもFCVA法によるta-C膜が最も耐熱性が良いことを明らかにした。また金属磁性膜中に酸化物を含むグラニュラー媒体を用いて、金属とDLC膜の加熱温度が異なり、金属をキュリー温度(600K)まで加熱するとDLC膜は500°Cまで加熱されることを明らかにした。しかしそれにも係わらずDLC膜の耐熱寿命はパルス加熱により問題ないことを明らかにした。また加熱温度による膜の劣化を迅速に測定できる、パワー可変照射機構を開発し、室温から最大1000°C程度まで連続的に加熱しながらラマンスペクトルを同時観察した。その結果、He中での加熱は空気中加熱よりも熱伝導率により温度が10度以上下がることを明らかにし、He封入ディスクドライブの可能性を提案した。今年度で完成した励起レーザーのパルス化機構と連続パワー可変機構により、DLC膜の耐熱性の測定と寿命推定が可能となった。またアンチストークス線とストークス線の比から測定する温度測定法により、加熱によるDLC膜、磁性膜およびその界面の温度分布を測定することに成功した。また開発したラマンスペクトルとトライボロジー特性を同時に測定する装置と耐摩耗性プラズモンセンサを用いて摺動時のDLC膜の摩擦力と化学構造の変化を測定することができた。本研究では、1平方インチあたり4テラビット以上の超高記録密度を実現する次世代磁気ディスク方式(熱アシスト磁気記録HAMR)に用いられる膜厚1nm以下の極薄潤滑膜/保護膜の化学構造を測定する手法を開発し、膜および界面の解析を行うことにより、耐摩耗・耐食性の材料設計指針を提示することを目的とする。開発した測定技術は、超高感度プラズモンセンサにより深さ分解能0.1nmで極薄膜および界面の化学構造分布を表面増強ラマン散乱スペクトルにより測定する。また静的構造解析に加えて摺動における摩擦・摩耗の状態をサブナノメートルレベルで動的な変化を観察して、潤滑膜や保護膜(ダイヤモンドライクカーボン、DLC)の膜内や界面の構造変化を解析し、耐摩耗構造の指針を提示する。今年度は上記測定装置を用いて、さまざまなカーバイド系保護膜(SiC,TiC,WC)の極薄膜をプラズモンセンサに被覆し500°Cでレーザー加熱を行った結果、カーボン膜は酸化分解を生じるのに比べカーバイド膜は変化が無く優れたHAMR耐久性が確認された。
キイロショウジョウバエの可動因子Pエレメントの転位を制御する分子機構に関する研究

ショウジョウバエのP因子には, 3個のイントロンが含まれが,生殖細胞系列ではこれらがすべて切り出され, 4個のORFで,おそらく1種の酵素タンパクが作られるものと思われる.そして,これは転位酵素と考えられる.細菌のTn3などにみられるような制御因子に関する遺伝子は特に存在しないと思われる.しかし,ハイブリッド・ディスジェウィシスの実験から分るように, PサイトタイプによってP因子の転位が抑制されることは知られている.この抑制機構として私達は,次のような考えを提唱した.すなわち,「完全型P因子が転位すると共に不完全型P因子はゲノム中に散在するようになる.この不完全型P因子によってコードされるタンパクのなかでDNAにバインドするドメイン(おそらくORF1周辺)を保持している分子が制御因子の役割を果たす.不完全型P因子がより多くゲノム中に存在すれば,抑制はより強くなろう.不完全型P因子由来のタンパクが抑制的に働く機構は他にも考えられる.が,いずれの場合も,転位を抑制するには不完全型P因子のコピーがゲノム中に相当数必要となろう.本研究の目的は,この推測を実験的に検討することにあった.限られた方法ではあるが,本研究では不完全型P因子のみをもつ系統のなかに,強いPサイトタイプを形成するものがあることを確認することを試みた.結果的に,小笠原父島由来の1系統が得られた.今後は,抑制因子の実体,作用機序などより生化学的な研究が必要となる.本研究で得られた系統や考え方は,そうした研究の基礎となるものである.さらには,挿入部位に8bpの重複をもたらす可動因子として,トウモロコシ(Ac),キンギョソウ(Tam),アフリカツメガエル(1723)など他生物のものが研究されているが,こうした因子と比較検出する研究も新しい発見を導く可能性があろう.ショウジョウバエのP因子には, 3個のイントロンが含まれが,生殖細胞系列ではこれらがすべて切り出され, 4個のORFで,おそらく1種の酵素タンパクが作られるものと思われる.そして,これは転位酵素と考えられる.細菌のTn3などにみられるような制御因子に関する遺伝子は特に存在しないと思われる.しかし,ハイブリッド・ディスジェウィシスの実験から分るように, PサイトタイプによってP因子の転位が抑制されることは知られている.この抑制機構として私達は,次のような考えを提唱した.すなわち,「完全型P因子が転位すると共に不完全型P因子はゲノム中に散在するようになる.この不完全型P因子によってコードされるタンパクのなかでDNAにバインドするドメイン(おそらくORF1周辺)を保持している分子が制御因子の役割を果たす.不完全型P因子がより多くゲノム中に存在すれば,抑制はより強くなろう.不完全型P因子由来のタンパクが抑制的に働く機構は他にも考えられる.が,いずれの場合も,転位を抑制するには不完全型P因子のコピーがゲノム中に相当数必要となろう.本研究の目的は,この推測を実験的に検討することにあった.限られた方法ではあるが,本研究では不完全型P因子のみをもつ系統のなかに,強いPサイトタイプを形成するものがあることを確認することを試みた.結果的に,小笠原父島由来の1系統が得られた.今後は,抑制因子の実体,作用機序などより生化学的な研究が必要となる.本研究で得られた系統や考え方は,そうした研究の基礎となるものである.さらには,挿入部位に8bpの重複をもたらす可動因子として,トウモロコシ(Ac),キンギョソウ(Tam),アフリカツメガエル(1723)など他生物のものが研究されているが,こうした因子と比較検出する研究も新しい発見を導く可能性があろう.P因子の構造と転位のtransactivationの機構については、ほゞその全貌が明らかになったが、P因子の転位を抑制する因子(リプレッサー)についてはDNA及びタンパクレベルの研究からもまだはっきりした答えは得られていない。本研究では、日本を中心とした野外集団由来の単一雌系統,近交系統のキイロショウジョウバエの常染色体とY染色体に存在する全P因子について転位酵素活性とPサイトタイプ決定力に主眼をおいて遺伝学的解析を行った。得られた主な結果は次の2点である。1)転位酵素活性は、雌の不妊と雄組換えの発生率と強い相関があった。2)転位酵素活性はみられないが、Pサイトタイプを維持する系統が見っかった。また、これらの系統をサザーンブロット法により注意深く解析したところ、完全長のP因子は1コピーも存在しないことが確認出来た。まず、第一点はハイブリッドディスジェネシスの諸現象は、P因子の転位によるものだということを示している。第二点は今まで提唱されてきたいくつかのPサイトタイプ形成機構のモデルに対する反証である。従来のモデルでは、リプレッサーの本体は転位酵素の働きで染色体上のP因子から産生される染色体外のP因子であり、それらが存在する細胞質の状態をPサイトタイプとする。したがって、Pサイトタイプを維持するには完全型のP因子が染色体上に存在することが必要条件になると考えられる。しかし、本研究で見出したように、その条件を満たさない系統が存在するので、Pサイトタイプ決定にむしろ不完全型P因子が重要な役割を果している可能性が高い。この可能性を検討するために、本研究で得られた最長の不完全型P因子の構造解析,及びマイクロインジェクションによる転換個体の検討が望まれる。(これらは、62年度のテーマである。)
トランスジェニック鳥類によるモノクローナル抗体の卵中への生産

トランスジェニックニワトリは、組換えタンパク質生産のための動物工場として提案されてきた。これまで、トランスジェニック鳥類を作出するために様々な方法が報告されてきたが、目的遺伝子を実用可能なレベルで発現するものは得られていない。我々は、モロニーマウス白血病ウイルスをベースとした複製欠損型レトロウイルスベクターでベシキュラーストマティティスウイルスGタンパク質を外皮タンパク質とした汎感作性レトロウイルスベクターを鳥類胚への遺伝子導入に用いた。モノクローナル抗体を生産するトランスジェニックニワトリを作出するために、まずモデル抗体として、抗プリオンモノクローナル抗体由来の一本鎖抗体フラグメントにヒトIgG1のFc領域を融合したscFv-Fcを発現させるためのウイルスベクター生産用プラスミドを構築した。放卵後55時間孵卵したニワトリ胚の心臓に高力価に濃縮したウイルスベクター溶液を注入し、胚培養によって孵化させることによって、トランスジェニックニワトリ(G0)を作出することができた。これらのニワトリでは、血清や卵中に高レベル(5.6mg/ml)で組換え遺伝子産物を比較的安定して生産していた。生産が高かった個体での卵白中での発現レベルは、卵白の主要タンパク質であるオボアルブミンの10分の1であり、またリゾチームと同等以上のレベルであった。さらに、このG0ニワトリからG1やG2世代のトランスジェニックニワトリを得ることも可能であり、これら後代ニワトリでも血清や卵中に目的遺伝子発現がみられた。次に、抗体のH鎖とL鎖をEMCV由来のIRESを介して同時発現する抗CD2キメラ抗体を発現させるためのウイルスベクターを調製した。このウイルスベクターを先ほどと同じように放卵後55時間孵卵したニワトリ胚に注入して孵化させることで、抗CD2抗体の血清や卵での発現するG0ニワトリを作製することができた。ヒトCD2に対するモノクローナル抗体を生産するマウスハイブリドーマHB195細胞からの抗体可変領域遺伝子をヒトlgGの定常領域遺伝子と結合させ、治療用のヒト抗体生産のモデルとして、マウス-ヒトキメラ抗体の生産を試みることとした。このためにまず、遺伝子導入用のベクターの調製を行った。抗体はH鎖とL鎖の2つのポリペプチドから構成されるので、それぞれの遺伝子を別々にベクターに導入したものとIRES(internal ribosomal entry site)を介してバイシストロニックに1つのベクターで発現させるものを作製した。プラスミドベクターとして、動物細胞での発現ベクターとレトロウイルス生産用のベクターを用いた。H鎖とL鎖の遺伝子を別々に発現させるベクターでは、両ベクターのコトランスフェクションによって、CHO細胞およびニワトリ胚性繊維芽細胞で抗体が生産できることを確認した。H鎖とL鎖の発現量によって抗体生産量が異なるかを明らかにするために、コトランスフェクション時のプラスミド量比をかえた際の抗体生産量への影響を調べたところ、L鎖の発現ベクターの割合が多い方が若干抗体生産量が多くなった。またIRESを介して共発現するベクターでは、L鎖の遺伝子をプロモーター側に配したものの方が、H鎖のものより高発現となった。ウイルス生産用ベクターからレトロウイルスベクターを調製し、CHO細胞に遺伝子導入したものについても抗体生産を試みたところ、抗体を安定的に発現している細胞を取得することができた。生産された抗体は、CD2を発現しているJurkat細胞の膜画分を用いたウェスタンブロット解析において、CD2と思われる50kDa付近のタンパク質を特異的に認識することがわかった。今後、作製したレトロウイルスベクターによってモノクローナル抗体を生産するトランスジェニック鳥類の作製を行う予定である。ヒトCD2に対するモノクローナル抗体を生産するマウスハイブリドーマHB

195細胞からH鎖、L鎖の可変領域の抗体遺伝子を取得し、ヒトIgGの定常領域遺伝子と結合させ、ニワトリβ-アクチンプロモーターの制御で、H鎖、L鎖遺伝子を同時に発現するユニットとしレトロウイルスベクター生産用プラスミドに導入した。ウイルスベクターを生産するGP293パッケージング細胞を作製し、外被タンパク質としてVSV-Gを用いて、パッケージング細胞からウイルスベクターを生産させた。ウイルス溶液を超遠心により10^8cfu/ml以上の力価に濃縮してから、55時間孵卵した胚に注入したのち、この胚を胚培養法により孵化させた。11の胚にウイルス溶液をインジェクトし、4羽孵化させることができた。1羽は孵化後4日目に死亡したが、その他のヒナは外見上の奇形などはなく、正常に成長した。各個体の血清中のヒト抗体濃度を測定したところ、620μg/mlの抗体を生産していることがわかった。約5ヶ月後、メスニワトリでは正常に卵を産み始めたので、卵中の抗体濃度についても測定を行ったところ、卵白で1015μg/ml、卵黄で23μg/mlの抗体を生産していることがわかった。個体によって生産量に差があるものの、1年以上の長期間にわたって血清中および卵中に安定して組換え抗体を生産していることがわかった。また、卵白に生産された抗体をアフィニティカラムにより精製し、抗原結合能を測定したところ、CD2を発現しているJurkat細胞のライゼートを用いたWesternでは、CD2に相当する位置のタンパク質を特異的に認識しており、FITC標識した抗体を用いたFACS解析においても、ニワトリ卵白で生産された組換え抗体がJurkat細胞を特異的に認識していることがあきらかとなった。前年度までの研究で、ヒトCD2に対するモノクローナル抗体を生産するマウスハイブリドーマ細胞からH鎖、L鎖の可変領域の抗体遺伝子を取得し、ヒトIgGの定常領域遺伝子と結合させ、ニワトリβ-アクチンプロモーターの制御で、H鎖、L鎖遺伝子を同時に発現するユニットとして、レトロウイルスベクター生産用プラスミドに導入した。ウイルスベクターを生産するパッケージング細胞からウイルスベクターを生産させ、胚に微量注入したのち、胚培養法により孵化させた。孵化させた3羽の個体について、血清中やメンドリで卵中のヒト抗体濃度を測定したところ、血清中では620μg/ml、卵中では卵白で1015μg/ml、卵黄で23μg/mlの抗体を生産していた。これらの個体について、長期にわたる抗体生産性について検討したところ、1年以上、血清や卵で安定した生産がみられた。通常の抗体では、Fc領域にN結合型糖鎖が付加しており、抗体の機能発現に重要であることがわかっているが、ニワトリで生産させた抗体でも糖鎖の付加が確認でき、付加した糖鎖の構造を解析したところ、血清中に生産されたものと卵白中で生産されたものでは糖鎖パターンが若干異なっていることがわかった。抗体機能と糖鎖パターンの関係については今後検討するつもりである。
高精度の位置決めと環境測定を細胞内において一粒で可能にする粒状蛍光プローブ

細胞生物学はもちろん、細胞を治療や診断の対象にしようとする革新的な医療技術や新しい産業技術においては、空間的にも時間的にもめまぐるしく変化する細胞内環境を計測すること、細胞内分子や器官の働きを連続して捉えること、の2つが同時に求められる。本研究では、細胞内環境に感受性を持ち、環境を記述するのに十分な空間分解能とリアルタイムで計測が可能な時間分解能とを併せ持つ新しいプローブ、またこれらプローブに適した計測技術をセットで開発することを目指した。本年度に我々は、提案していたボトムアップ型ナノセンサーの開発に成功した。タンパク質一分子の計測から細胞の活動を定量化することを目ざし、細胞内クリック反応を経て四個の蛍光色素が単一鎖アビジンに結合したナノセンサーを作成する、ボトムアップな方法を提案した。一つの蛍光ナノセンサーの時空間分解能は、使用した光学顕微鏡の条件下では約1Hzのときおよそ10 nmだった。細胞内の任意の部位の局所的な環境を、標的一分子のレベルで計測する基盤技術を提供すると期待される。特に「環境」パラメータとして「温度」を扱う研究では、動物個体での温度イメージングを指向した蛍光ナノ粒子型の温度センサーの開発も行い、蛍光ナノ粒子型の温度計をショウジョウバエの幼虫へ経口投与して、モデル生物に限らず微小な個体で体内温度をマッピングする手法を提案した。また一細胞温度計測において、計算と実験との間にある5桁のギャップを説明した。開発した細胞内温度センサーを用いてナノ粒子が神経細胞内に生じる温度分布を計測する実験が発展的に展開し、ピエゾ特性を持つナノ粒子と超音波を組合わせて神経細胞を非接触に刺激する手法を提案することができた。局所温度勾配が細胞に与える影響をさらに調べたところ、球状の細胞および神経細胞の新しい応答を見いだした。27年度が最終年度であるため、記入しない。細胞内では多数の異なる物質、構造体がひしめき合い、薄い溶液系とはまるで異なる特殊な細胞内環境を作り出している。さらに細胞内・間の情報伝達や細胞運動といった活動により、このような細胞内環境は空間的にも時間的にもめまぐるしく変動する。細胞生物学はもちろん、細胞を治療や診断の対象にしようとする革新的な医療技術や新しい産業技術においては、このように変化する細胞内環境を計測すること、細胞内分子や器官の働きを連続して捉えること、の2つが同時に求められる。本研究では、細胞内環境に感受性を持ち、環境を記述するのに十分な空間分解能とリアルタイムで計測が可能な時間分解能とを併せ持つ新しいプローブ、またこれらプローブに適した計測技術をセットで開発することを目指す。この新しい方法を用いれば、細胞内の局所で、カルシウム濃度を初めとした細胞内環境の変化と分子や器官の位置の変化とを、これまでにない精度で測ることが可能となる。初年度はまず、蛍光顕微鏡を用いて小胞体の温度を測る技術を開発した。生きた細胞の膜小胞体(ER)に局在する低分子型の温度計分子を見出したのち、ER膜上のCa2+ポンプを主要な熱源とする熱産生を狙い、カルシウムショックに伴う熱産生の計測と細胞内Ca2+動態との相関を得た。また、大型甲虫が生きたままその内部状態を計測するin vivo蛍光イメージング系を開発した。エサに混ぜたさまざまな蛍光色素を、経口投与を介して大型甲虫の体内に取り込ませることで筋肉を蛍光染色し、電気刺激による筋肉のCa2+応答が検出できることを示した。初年度には、新規プローブの開発および大型甲虫のin vivoイメージング系の開発に成功しており、おおむね計画の通り進んでいるものと判断している。研究計画の変更は予定していない。初年度の研究を継続し、当初の研究計画に沿って次年度も研究を進める。
転写因子FFRP群による緑膿菌クロラムセンシングの新たな発現制御機構の解析

毎年の多剤耐性緑膿菌(MDRP)による院内感染の新聞報道に、いつものことながら、病原菌対策の重要性を痛感させられる。緑膿菌は、多様な環境下に生育するグラム陰性細菌であるが、深刻な院内感染を引き起こすが如く、その適応能力を発展させている場合もある。一方、あたかも多細胞真核生物のように、シグナルを介して菌集団全体での協調した遺伝子発現制御機構が存在する。これは、細菌細胞間の低分子物質を介した情報伝達機構を利用したものであり、その一部はクロラムセンシングシステム(QS system)として知られている。我々は、このQS systemに転写因子グループFFRPタンパク質群(Feast/Famine Regulatory Proteins)が関与していることを見い出した。さらに、QS systemで発現制御されている病原性因子でもある第二次代謝物・ピオシアニン色素の産生におけるFFRP群の転写制御の関与について研究を行った。すなわち、FFRP群によるピオシアニンの産生量の変化をHPLCで測定し、RT-PCR法によるmRNAの発現を解析した。その結果、8種のFFRPのうち3種がピオシアニン色素の産生経路の最終酵素の生産量を減少させていることを見い出した。毎年の多剤耐性緑膿菌(MDRP)による院内感染の新聞報道に,いつものことながら,病原菌対策の重要性を痛感させられる。緑膿菌は,多様な環境下に生育するグラム陰性細菌であるが,深刻な院内感染を引き起こすが如く,その適応能力を発展させている場合もある。一方,あたかも多細胞真核生物のように,シグナルを介して菌集団全体での協調した遺伝子発現制御機構が存在する。これは,細菌細胞間の低分子物質を介した情報伝達機構を利用したものであり,その一部はクロラムセンシングシステム(QS system)として知られている。我々は,このQSsystemに転写因子グループFFRP群が関与していることを見い出した。平成19年度は,QS systemで発現制御されている病原性因子でもある第二次代謝物、ピオシアニン色素の産生におけるFFRP群の転写制御の関与について研究を行った。すなわち,FFRP群によるピオシアニンの産生量の変化をHPLCで測定し,RT-PCR法によるmRNAの発現を解析した。その結果,8種のFFRPのうち3種がピオシアニン色素の産生経路の最終酵素の生産量を減少させていることを見い出した。我々は、このQS systemに転写因子グループFFRP群が関与していることを見い出した。平成19年度は、QS systemで発現制御されている病原性因子でもある第二次代謝物・ピオシアニン色素の産生におけるFFRP群の転写制御の関与について研究を行った。
足浴及びアロマハンドマッサージのストレス軽減効果に基づく血流改善による血栓症予防

我々はこれまでに、足浴やローズマリーを用いたハンドマッサージが、血漿プラスミノゲンアクチベータインヒビター-1濃度の低下による線溶系の促進効果に基づく血栓症予防効果を有することを示唆してきた。本研究では、これまでの研究をさらに発展させ、足浴やアロマハンドマッサージのストレス軽減効果を自律神経バランスを指標に検証し、続いてそれらの血流に及ぼす影響、さらには足浴やアロマハンドマッサージのストレス軽減効果と血流に及ぼす影響との相関性を検討することにより、“看護ケアによるストレス軽減が血流改善による血栓症予防効果と相関する"という大胆な仮説を証明することを目的とする。
半導体の原子尺度での制御に関する研究

本研究は、原子尺度で制御された半導体ー超構造半導体ーについて、個々に進められている研究を総合的かつ効果的に進めるために、研究の内容、進め方について討議すること、および重点領域研究の研究領域として研究を推進するための組織作りを行なうことを目的とした。三つの重要研究項目(原子尺度の微構造の作成、原子尺度での評価、原子尺度の微構造の物性とその応用)を設定し、各分担者が各自の準備研究を推進するとともに、各種学会、国際会議等に出席して内外の研究動向の調査を行なった。主要研究課題、具体的な研究手法、研究を推進するための組織などにつき討議するため、数回にわたる小規模の会合を重ね、平成元年1月には全員参加の検討会を開催した。この検討会では、各分担課題についての紹介と質疑応答を行ない、さらに、本研究を重点領域研究の研究領域として申請する(申請領域名:超構造半導体)ことが合意され、その内容の詳細な検討を行なった。昭和63年度第49回応用物理学会学術講演会(昭和63年10月4日10月7日)においては、「半導体の原子尺度での制御と評価」と題したシンポジウムを開催した。本総合研究の分担者が講師となり、終日熱心な発表・討論が行なわれ、本研究課題の重要性があらためて確認された。以上の結果、重点領域研究で取り組むべき研究課題が明確になり、重要研究課題を効果的に推進するための組織作りが行なわれ、本研究の新期の目的が達成された。
統合的レキシコン理論の開発と言語学教育への応用研究

構造・形態構造がそれらの語嚢的意味とどのように対応するかを結果構文、中間構文、受身文、複合語、派生語など多様な現象について考察し、語嚢概念構造とクオリア構造を一体化することによって、形態・意味・統語を包括した総合的なレキシコンの理論を提示した。更に、そこから得られた理論的成果を大学上級学年から大学院の言語学所学者に平易に解説し、言語分析の手助けとなる概説書を上梓した。結果構文と中間構文の適格性に基づいて辞書的知識と語用論的知識の線引きを行った。英語で音放出動詞が移動を意味するようになる現象について,経路句が持つ語彙概念構造の様態部分に音放出動詞の意味を補充する操作を提案した。種々の言語における受身文や再帰構文に見られる例外的な現象が属性叙述という意味機能に収束することを明らかにし,出来事項の抑制というメカニズムを提案した。迷惑受身,直接受身,状態性受身など日本語受身文が持つ多様な解釈が,接辞「られ」が様々な機能範疇に付加されることから導出されることを示した。例外とされてきた外項を含む複合述語を分析し,属性叙述という機能を有することを明らかにした。(以上,影山)/分裂能格性の現象について,幾つかの能格言語の格形態と統語特性を調べ,語彙的アスペクトが重要な役割を果たすことを明らかにした。(浦)/統語構造で主要部移動によって形成される語と形態的な要請により生成される語との違いについて,少なくとも日本語のような膠着言語の場合には形態的な特徴と統語的な移動を結びつける必然性がないことを明らかにした。(岸本)/移動動詞および前置詞句経路の性質を検討した。(松本)/類似した機能を持つ接辞間の競合・相補関係を明らかにした。(杉岡)/複合動詞および複合形容詞・形容動詞の意味解釈が,主要部の項構造により決定されるものと,名詞のクオリア構造の情報を必要とするものとがあることを明らかにした。(由本)/朝日新聞からの資料に基づいて所有および保持を表す漢語サ変動詞の用法を調べ,その意味を明らかにした。(小林)/動詞の語彙概念構造と名詞句のクオリア構造を組み合わることで動詞の多義性を分析した。(松村・板東)/日本語使役動詞の結果状態をキャンセル可能性を過去形「タ」との関わりで検討した。(板東)/「テイル」の多義性をクオリア構造のアスペクト特性から再考した。(中谷)【影山】英語・タイ語・ハンガリー語などの結果構文を分析し,主動詞のクオリア構造に示された意味情報から結果述語の分布が予測でき,また,その意味情報によって結果構文の統語構造が決定されることを明らかにした。一般に不可能とされる外項を抱合する複合語を調査し,属性叙述という特別な性質を有することを解明した。日本語受身文と英語get受身文について概念構造と統語構造の対応関係と相互作用を考察した。【杉岡】日本語のECM構文と複雑述語形成の関係を分析し,主観的事象の記述に特有の意味特徴や,小節構文と形容詞につく動詞化接辞に見られる意味的・語彙的に緊密な関係を明らかにした。【岸本】述語とその項の関係について検討し,述語の表す意味に移動や状態変化のようなクラスを設ける必要があることと,述語の意味と項の標示の形式の間に相関関係があることを明らかにした。【由本】日本語の統語的複合動詞の統語的側面に焦点をあて,複合動詞の後項動詞が,前項動詞の代わりに事象を表す名詞を目的語とした場合の格標示やθ付与について分析した。【中谷】テ系複雑述語や結果述語といった複合的述語をリアルタイム文理解の予測可能性という観点から検討し,複雑述語の項構造が融合的であることを明らかにした。【板東】日本語動詞「つく」と「つける」の多義性に関して,多義に共通する抽象的な基語を仮定し,潜在項を含むその共通基語の語彙概念構造から多義が派生されるメカニズムを提案した。【浦】動詞および動詞句が表す意味的な要素である事象タイプや完結性が,統語的に離れた名詞句に動詞が格を与える時の局所性にも影響することを幾つかの言語で発見した。【小林】救済や建築を表す漢語サ変動詞を分析し,語彙による意味・用法の相違や新しい用法を明らかにした。本研究課題は語彙理論の開発とその教育面への応用という2つの側面を持つ。理論研究に関しては次のような成果を挙げ,国内外の専門誌および学会大会で発表した.[影山]統語構造と意味構造の関わりに関して,諸言語の結果述語の分布が動詞の辞書情報に基づく含意的階層によって決まることを実証し,またこの意味的な階層が英語における結果述語の統語的移動の可否を左右することを明らかにした。形態論と統語論・意味論の関わりについては,動作主を取り込む特殊な複合語が属性叙述の機能を持つことを解明した。[浦]

日本語の非標準的格付与現象にアスペクトが関与することを示した。[松本]使役移動と結果構文について検討を進めた。[岸本]動詞と「ない」が結合して複合形容詞になる過程を考察することによって,日本語の否定語「ない」が機能範疇として機能する場合と,文法化する以前の意味機能を保っているものがあることを明らかにした。[杉岡]認識動詞を含む日本語複雑述語の統語的特性と英語の類似構文との異同を考察し,また,複合語の枝分かれ方向と再帰性や生産性との関係を明らかにした。[由本]既存の名詞・形容詞・動詞から新たに動詞や形容詞を作る際に働く項の具現化のメカニズムを明らかにした。[板東]日本語の打撃動詞が様々な名詞句と共起して多義性を生み出すメカニズムを語彙概念構造とクオリア構造によって考察した。[中谷]形容詞的「テイル」の意味を語用論的前提と論理的含意の対立という観点から分析した。[小林]「新築,増築」などの動詞的名詞の意味分析を行った。また,本研究から得られた理論的・記述的知見を言語学教育に応用することに関しては,ほぼ毎月一回の頻度で研究集会を開き,出版を予定している2冊の解説書(『動詞と形容詞の意味と構文』,『動詞と名詞の意味と構文』)の原稿を批判的に検討しあう作業を進めた。統合的レキシコン理論の構築を目指す最終年度では,種々のタイプの複合語に重点を置いて,形態的な特徴と意味解釈との相互関係を考察し,形のみに注目する伝統的な形態論が不十分であり,意味をベースとした新しい形態論のアプローチが必要であることを論じた。具体的には,「太っ腹(な)」のような外心複合語および「無気力(な)」のような接頭辞派生語において,後部要素が名詞であるにも拘わらず全体としては形容動詞を形成するという「形と意味のミスマッチ」が起こることを指摘し,「太っ腹」=「腹が太い」,「無気力」=「気力がない」と言い換えられることから,形態構造では前部から後部への修飾関係であるのに,意味構造では後部(腹)を主語,前部(太い)を述部とする主述関係に反転するために,見かけ上は「外心構造」という変則的な形態が生じることを明らかにした。これは,形の構造と意味の構造を同時並行的に表示する<並行表示モデル>の妥当性を支持する証拠となる。その他,複合語や結果構文の容認性の判断において,動詞が持つ語彙概念構造と,目的語等の名詞が持つクオリア構造の相互作用が重要な役割を果たすことを明らかにした。以上の理論研究の成果に加え,研究計画のもう一つの柱である「言語学教育への応用」の実践として,『形容詞・副詞の意味と構文』を出版した。これは,物の状態や属性を表す形容詞類と副詞類を全般的に扱った解説書であるが,従来の文法研究が出来事・動作を表す表現に集中していたのに対し,状態と属性が意味解釈だけでなく統語的にも重要であることを明らかにした点で,理論的な意義も大きい。
水ヒートパイプにおける凝縮部熱伝達の劣化現象の実験的解明

本研究は、ヒートパイプ内の凝縮熱伝達について、特にその熱伝達率が水を作動流体とした時非常に小さくなる原因について研究したものである。そのため、凝縮部の熱伝達と凝縮部での除熱量を正確に測定できる実験装置を製作し各種パラメータを変化させて伝熱測定実験を行った。作動流体としては、水を主に用いたが、その他比較のため、フレオンとエタノールを使用した。またこの実験装置以外にも、管内での流動状態を観察するためのガラス製ヒートパイプを製作し可視化実験も行った。以下に今回の研究で得られた知見を示す。水を作動流体とすると従来の測定データで示されるように、ヒートパイプの熱設計で推奨されているヌッセルトの相関式よりかなり小さい凝縮熱伝達率となることが分かった。またこの原因として、エントレイン液滴による液膜厚さの増加と非凝縮性ガス(空気)の効果とを考え、実験的に検討を行った。エントレインについては可視化実験から、水の場合蒸気と液との密度比が大きいため多くの液体が凝縮部に移送されることが判明した。ただ、伝熱実験において凝縮部の温度分布を測定したところ、凝縮部下部のみが高く、上部は非凝縮(断熱)の様相で低いことが分かり、エントレインメントが劣化の主原因では無いとの結論を得た。非凝縮性ガスについては、管内の蒸気のガス分析を行った。その結果、空気が少量含まれており、完全に脱気することは困難であることが判明した。しかしこの空気の含有を考慮しても、凝縮熱伝達の劣化は説明出来ないことが示された。データを最整理し、また他研究者のデータも再検討した結果、フレオンやエタノールの実験においても低熱流束では同じ伝熱劣化が観察されることがわかり、液膜厚さの計算から、伝熱劣化の主な原因は、液膜厚さがある程度大きくならないと流下せず、結果としてそれが凝縮の伝熱抵抗となってためであることが結論として導かれた。
脳梗塞後、ペントラキシン3を起点とした新たな治療法の開発

現在、ペントラキシン3の脳梗塞後の効果について、下記の項目について検討している。I in vitroの系1.神経幹細胞に対するPTX3の作用を明らかにする:ラット神経幹細胞初代培養に対しrecombinant PTX3(rPTX3)を投与し、PTX3の作用を確認中である。現在、増殖、細胞障害の程度、神経細胞や他のグリア細胞への分化を評価をしており、rPTX3の投与により、細胞増殖の抑制と神経細胞への分化抑制を示している。2.オリゴデンドロサイト前駆細胞に対するPTX3の作用を明らかにする:ラットオリゴデンドロサイト前駆細胞初代培養を用いてrPTX3による影響を評価する。オリゴデンドロサイト前駆細胞にrPTX3を投与しても明らかな変化は認めなかった。しかし、オリゴデンドロサイト前駆細胞はFGF2を投与し増殖を確認、FGF2とrPTX3を投与しオリゴデンドロサイトへの分化抑制を確認中である。II in vivoの系白質梗塞モデルマウスを作成し、PTX3の脳梗塞後の影響を確認する。本研究では初代培養細胞を用いてrPTX3の作用を確認すること(in vitroの系)と、白質梗塞モデルマウスを用いてPTX3の作用を確認すること(in vivoの系)を行っている。In vitroの系は順調に進んでいる。さらにin vivoの系も順次すすめていく予定である。ただし当初予定していたよりin vivoの系は準備に時間を要している。これは脳梗塞モデルマウスの作成に少し時間を要しているためで、現在実験数を確保している。今後は、まず白質梗塞モデルマウスを作成し、亜急性期にPTX3 siRNAを投与することでPTX3の発現を抑制する。亜急性期におけるPTX3の役割を神経再生と白質再生の点から評価する。さらに成体脳において脳室下帯(subventricular zone:SVZ)で神経幹細胞からの神経新生が認められることから、梗塞周囲とSVZで神経幹細胞と神経細胞の発現に関しても検討を行う。初代培養細胞を用いたin vitroの系の研究は順調に進んでいるが、モデルマウスを用いたin vivoの系の準備に一部時間を要した。試薬や抗体は使用期限があるため、必要に応じて直前に購入をする為、これに係る経費は次年度に繰り越すことにした。今後の使用計画としては、in vitroおよびin vivoの研究費用に使用する。
魚類卵レクチン機能の分子機構解析と応用への展開

魚類卵から単離したラムノース結合特異性レクチン(RBL)の機能性に係る分子機構を解析した。RBLは,糖脂質やリポ多糖を介して細菌や微胞子虫に結合し,生体防御に働くことを示した。シロサケRBLであるCSL13の精密構造を新規クロマト技術とX線結晶解析により明らかにした。CSLは,魚類マクロファージにおける貪食作用や,炎症性サイトカインと活性酸素の産生を促進するとともに,緑膿菌の感染阻止やヒト結腸ガン細胞のアポトーシスを誘導した。これらの機能性を応用するためにCSL組換え体の発現系を構築した。本研究では,シロサケの未受精卵から単離した3種類のL-ラムノース結合特異性レクチン(RBL), CSL1, CSL2, CSL3によるニジマス由来免疫細胞活性化の分子機構解明と乳病原微生物制御への応用に資することを目的にした。新規ファミリーであるRBLは,いずれも4本のドメイン内SS結合で安定化された約95アミノ酸残基からなる糖鎖認識ドメイン(CRD)が23回タンデムに繰り返された構造からできており.魚病細菌や原虫病を引き起こす微胞子虫と特異的に結合し,ニジマス腹腔内マクロファージの培養細胞(RTM5)における炎症性サイトカイン(TNF-α, IL-1, IL-8など)や,抗体産生細胞に働くサイトカイン(IL-11)等の誘導,食食作用と浩性酸素の生成を誘導した。従来,ゲル濾過カラム担体との非特異的な相互作用のためCSLの正確な分子量測定は困難であったが,新開発カラムの応用によってCSL13のサブユニット構造を決定し,多量体形成とレクチン活性の相関を明らかにした。すなわち,これらのRBLは, 4量体, 18量体, 2量体を構成しており,多量体であるほど強い活性を示した。また, RBLのRTM5における食食作用促進にはCRDが関わっているが,活性酸素の生成にはRBLのCRD以外の部位が働いていることが分かった。そのため, RBLとその変異体を作威して構造と機能の相関を調べることとし,ベクターpTV118Nと大腸菌JM109を用いて発現系を構築した。発現タンパク質の精製には糖鎖結合活性を基にアフィニティークロマトグラフィーを用いたが宝,収量が低く, RBLに多く存在するSS結合の正確な巻き戻しが必要であることが分かった。サケ科をはじめとする多くの魚類卵から単離したラムノース結合特異性レクチン(RBL)の生物機能の分子機構を解析し,微生物感染制御に応用することを研究の目的とした。RBLの糖鎖認識ドメイン(CRD)構造は,線虫からヒトにいたる多くの生物に存在することが明らかになった。高度に保存された4つのジスルフィド結合および約95アミノ酸残基からなる魚類RBLのCRDは,2回または3回直列に繋がってサブユニットを構成する。シロサケから単離した3種類のRBLでは,新規ゲルろ過クロマト担体を使用した分子量測定により,それぞれ4(CSL1),18(CSL2),2(CSL3)のサブユニットが非共有結合していることを明らかにした。これらのRBLは,Gb3糖鎖への特異的な結合を介して,微生物と相互作用するばかりでなく魚類免疫細胞を活性化して炎症性サイトカインの発現や貪食作用,活性酸素の産生を誘導した。さらにその分子機構を解明するために,CSL3の立体構造をX線結晶解析で決定するとともに,CRDのリコンビナント体発現系を構築した。前年度までに構築したCSL2に加えて,CSL1とCSL3の発現系をベクターpTV118Nと大腸菌JM109を用いて構築したが,発現したタンパク質は封入体として得られた。これらの可溶化とリフォルディングが困難であったため,3回のCRD繰り返し構造をもつCSL1のcDNAを用いて,N末端,中間,C末端のCRDに対応する発現プラスミドを構築し,E.coli BL21(DE3)に形質転換してHisタグ融合タンパク質として発現に成功した。また,CSLのアミノ酸側鎖の化学修飾により,Arg側鎖とTyr側鎖がそれぞれ異なる血球凝集活性と活性酸素産生刺激における機能を有していることが分かり,機能改変を目指すCRD変異体作出のための重要な知見を得た。シロサケから単離したCSL13は,それぞれ4量体,18量体,2量体であり,これらのレクチンのサブユニットは糖鎖認識結合ドメイン(CRD)の繰り返し構造を有しているが,構成サブユニット数と各レクチンの生理活性の強さには高い相関がみられた。

そこでCRD機能の分子機構を明らかにするために,CSL1サブユニットの中で直列に繋がった3つのCRDの発現系を大腸菌を用いて構築した。CRDをコードする断片を増幅させ,N末端側にHisタグを有するpET-15bベクターにサブクローニングし,発現プラスミドpET-15b-CSL1N,CSL1M,およびCSL1Cを構築した。これらをE.coli BL21(DE3)に形質転換してリコンビナントCRDを発現させた。ニッケルキレートカラムで単離したリコンビナントCRDを1Mジチオスレイトールを含む6Mグアニジン塩酸塩に溶解後,アルギニン誘導体とグルタチオン酸化型/還元型を含む溶液中でリフォルディングを行った。リコンビナントCSL1N,CSL1M,CSL1Cをラムノースアフィニティーカラムでかけて精製し,各ドメインのCRD活性および免疫細胞におねる生体防御機能の分子機構を解析した。