hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マクロファージ古典的活性化のキーとなる小胞体アミノペプチダーゼの分泌とその制御

最近、私たちは小胞体アミノペプチダーゼ1(ERAP1)がマクロファージにおいて細菌由来のリポ多糖刺激に伴い小胞体から細胞外へと分泌され、貪食活性を亢進することを明らかにした。本研究では、ERAP1の分泌がリポ多糖だけではなく、様々な細菌・ウイルス構成因子によって惹起されることや、ERAP1分泌を直接引き起こす下流の因子(TNF-αとIFN-β)の同定に成功した。また、ERAP1の小胞体貯留/分泌のスイッチングに関与しうるドメインの同定やERAP1が複合体を形成し、マクロファージの貪食活性亢進に寄与することを明らかにした。1.ERAP1の分泌機構の解析前年度に引き続きERAP1の分泌機構のさらなる解明を目指した。その結果、分泌型ERAP1がマクロファージから分泌されたエキソソームと結合していることを明らかにした。すなわち、ERAP1が遊離状態で分泌されるのではなく、エキソソーム構成成分として分泌されることが示唆された。次にERAP1のエキソソーム結合ドメインを明らかにするために、様々な領域の欠失変異体ERAP1を調製し、各変異体とエキソソームとの結合試験を行った。その結果、ERAP1分子中央の欠失がエキソソームとの相互作用を著しく低下させることが明らかになった。2.ERAP1局在型エキソソームのマクロファージ活性化における効果LPSで活性化させたマウスマクロファージ株RAW264.7細胞の培養上清からエキソソームを超遠心法により分画し、得られたエキソソーム画分を未活性化RAW64.7細胞に処理することで本エキソソームのマクロファージ活性化に対する効果を貪食活性を指標に検討した。その結果、ERAP1局在型エキソソームはLPS阻害剤存在下でもLPS刺激時と同程度のRAW264.7細胞活性化能を示した。この活性化効果は遊離型ERAP1を直接マクロファージに処理した場合の3-10倍もあり、またアミノペプチダーゼ阻害剤により1/2-1/3程度抑制された。一方でERAP1非局在型エキソソームを用いた場合、マクロファージの活性化はほとんど認められなかった。これらの結果からERAP1がエキソソームに存在する分子と協調的に作用してマクロファージを活性化させていることが推測される。1.ERAP1による貪食活性亢進機構の解明申請者は分泌型ERAP1がマクロファージの貪食を亢進させることを明らかにしてる。この貪食亢進効果の分子機構を明らかにするために、組換え型ERAP1で処理したRAW264.7細胞の蛍光免疫染色を行った。その結果、ERAP1の添加がオプソナイズされた蛍光分子の細胞表面への吸着量を増大させること、食胞形成を亢進させることが示唆された。また、ERAP1の添加が、Fcg受容体Iの細胞表面量を上昇させたこと、一方で発現量にほとんど影響を与えなかったことから、Fcg受容体Iの細胞膜への移行を亢進しうることを明らかにした。2.ERAP1の新規分泌リガンドの同定TLR1/2、2/6、および9リガンドがマウス腹腔内マクロファージのERAP1分泌を惹起することを明らかにした。いずれの受容体も下流のMyD88依存性経路の活性化がERAP1の分泌を引き起こす原因であった。さらに申請者は、同経路の活性化に伴い分泌されるTNF-alphaとIFN-betaによる共刺激がマウス腹腔内マクロファージにおけるERAP1の分泌を惹起することを明らかにした。このことからERAP1の分泌には(1)TLRとリガンドの結合に伴うMyD88依存性シグナリングの活性化、(2)TNF-alpha、IFN-betaの分泌が重要であることを明らかにした。3.ERPA1の分泌に重要な分子内ドメインの同定ERAP1の各ドメインを欠失させた変異体をHEK293細胞で発現させ、培養上清中の変異体ERAP1量を検出したところ、他の類縁酵素には認めあれない特徴的な挿入配列(エキソン10コーディング領域)の欠失がERAP1の分泌を惹起することを明らかにした。以上の結果から上記挿入配列がERAP1の分泌を制御していることが示唆された。1.ERAP1エキソソーム形成機構の解析-免疫組織化学的実験により、ERAP1が細胞内で多胞体を構成する分子とは共局在しないことが明らかになった。

前年度の結果、すなわち、試験管内でERAP1がエキソソームを混合するだけで両者が結合することから、ERAP1はいったん細胞外へと分泌されたのち、エキソソームと結合することが示唆された。2.ERAP1エキソソームによるマクロファージ活性化機構-ショットガンプロテオミクス解析の結果、ERAP1エキソソームには少なくとも2種のサイトカインが相互作用していることを明らかにした。アミノペプチダーゼおよび各サイトカインの阻害剤を用いてエキソソーム依存性マクロファージ活性化について検討したところ、いずれの阻害剤もマクロファージの活性化を抑制した。以上より、ERAP1エキソソームはERAP1とサイトカインの協調的な作用によりマクロファージを活性化することが示唆された。3.in vivoレベルにおけるERAP1分泌の解析-ERAP1ノックアウトマウスの腹腔内にLPSを投与後、血中のERAP1量を解析したところ、in vitroの結果と同様に、LPS依存的なERAP1の分泌が認められた。また、血中ロイシンアミノペプチダーゼ(LAP)活性もERAP1の分泌と相関性を示した。さらに、血中のアミノ酸レベルはLPS投与前では野生型およびノックアウトマウスにほとんど差は認められなかったが、LPS投与後(ERAP1の分泌が認めれられた後)では、ERAP1遺伝子欠損に伴い10%程度ロイシンやアルギニンの減少が認められた。すなわち、ERAP1のアミノペプチダーゼ活性は血中においてアミノ酸酸性やペプチド分解に寄与していることが明らかになた。以上の結果は、ERAP1は個体レベルにおいてアルギニンの産生や免疫の活性化を調節するペプチドの代謝に寄与している可能性を示している。細胞生物学前年度までに得られた結果(ERAP1の分泌機構)については、すでにJournal of Immunology誌への掲載が決定した。さらに今回、まったく予想外であったがERAP1がエキソソームとして分泌することを示唆する知見を得た。また上記のようにERAP1局在型エキソソームがアミノペプチダーゼ活性を介してマクロファージ活性化効果を示すことを明らかにした。上記のように予想外の新規知見を得たことで当初の実験計画より若干食い違いが生じてきたが、これは研究が前進している結果であり、本研究の目的であるERAP1のマクロファージの古典的活性化への関与を明らかにすることに大きく近づいたと考える。研究実績の概要で示した3については学術論文に掲載された。また、2については、現在投稿中である。さらに、1についても分泌型ERAP1が貪食活性に関与する受容体の機能亢進を担っていることが明らかになりつつあり、分泌型ERAP1による貪食活性亢進機構の解明の端緒を開いた。また、分泌型ERAP1による新しい生理作用も探索しているが、ERAP1遺伝子のノックダウン実験より本遺伝子の発現量もしくは分泌量の低下がERAP1の細胞遊走や細胞の形態に影響を及ぼす可能性があることを確認している。以上のように、分泌型ERAP1のマクロファージ活性化における役割または分子機構が徐々に明らかになってきており、研究は順調に進行していると考える。マクロファージ活性化時にいかにしてERAP1がエキソソームと合流するか、すなわち、ERAP1の小胞体局在と分泌のスイッチング機構を明らかにする。このスイッチングにはERAP1の結合タンパク質が関与すると考えている。そこで、ERAP1含有エキソソームから免疫沈降によりERAP1結合タンパク質を単離し、shotogun解析やMS/MS解析により同定する。特に前年度明らかにしたERAP1の小胞体貯留ドメインがキーになっていると考えられるので、本ドメインの欠失変異体や組み換え型小胞体貯留ドメインを用いる。
麻薬がラット脳アセチルコリン遊離に及ぼす影響の検討-脳内微小透析法による検討-

中枢神経系のコリン作動性神経は、海馬・皮質・線条体領域において学習、記憶、錐体外路系等の運動機能に重要な役割を演じている。一方、麻薬に代表されるオピオイド受容体アゴニストは、鎮痛など麻酔作用・学習と記憶・循環呼吸機能調節などに関与している。したがってオピオイド受容体アゴニストが脳領域のアセチルコリン遊離に対して及ぼす影響を調べることによって、オピオイド受容体アゴニストが中枢神経系に影響を及ぼす機序の解明に役立つと考えられる。本研究では、短時間作用性麻薬でμオピオイド受容体アゴニストであるフェンタニールを腹腔内に投与し、フェンタニールがラット脳の海馬におけるアセチルコリン遊離に及ぼす影響について、HPCL-ECDを組み合わせた無拘束下脳内微少透析法を用い、補助金によって購入したサンプリングシステムを活用して測定し、フェンタニールによる立ち直り反射の消失効果とμアンタゴニストのナロキソンによるその拮抗作用を比較検討した。その結果、フェンタニール50,100,200μg/kgの腹腔内投与により海馬におけるアセチルコリン遊離は有意に抑制された。またフェンタニール50,100μg/kg投与時は立ち直り反射の消失はみられなかったが、200μg/kg投与時には半数に立ち直り反射の消失がみられた。この際、立ち直り反射の消失時間とアセチルコリン遊離の抑制時間は相関する傾向がみられた。またナロキソン100μg/kg投与はフェンタニル100μg/kg投与のアセチルコリン遊離抑制作用を拮抗した。海馬は記憶・学習に大きな役割を持つが、海馬におけるアセチルコリンの遊離はμオピオイド受容体により抑制性の調節を受けることが示唆された。本研究では、短時間作用性麻薬であるフェンタニールを腹腔内に投与し、フェンタニールがラット脳の海馬におけるアセチルコリン遊離に及ぼす影響について、HPCL-ECDを組み合わせた無拘束下脳内微少透析法を用いて測定し、フェンタニールによる立ち直り反射の消失効果と比較検討した。海馬は記憶・学習に大きな役割を持つが、フェンタニールの中枢作用は海馬におけるコリン作動性神経の活動性の低下と関連する可能性が示唆された。
フランス啓蒙主義中等教育改革諸案の研究

イ)フランス啓蒙期(1750-1789)にあらわれた教育論の数は,最低400である.その中心は(1)中等教育改革,(2)女子教育(3)『エミール』批判である.ロ)イエズス解追放に関する関与した高等法院関係者で教育改革論を現した人物として従来知られていたラ・シャロテ,ギトン・ドゥ・モンブオの他にモンクラール(グルノーブル),セサン(グルノーブル),ラヴェルディ(パリ)らがいることがわかったが,教育論の所在はわからなかった.ヘ)先行研究等によれば,従来知られていた三人の中で,もっとも体系的・総合的な教育改革論を著わした人物はラ・シャロテであるとされていたが,この評価はやはり正確であった.ニ)ラ・シャロテは,学生数・コレージヤ数縮減=制限論を展開したが,他の人物は,この点不明である.ホ)従来,テュルゴがその『都市論』において中央集権的教育制度・行政機関の整備を主張したといわれていたが,本当の執筆者はデュポン・ドゥ・ヌムールである.というのが近年の研究成果である.ヘ)中等教育改革論の中にあって,(1)教育からの宗教色の一掃(2)中央集権的教育行政機構の整備・確立(3)教科書・教員管理の制度化などにおいては一致しているが,古典語学習と近代語学習のどちらを重視するかについては意見が多様である.ト)中等教育論にあって,民衆の教育機会の拡大については大方が批判的・否定的であるが,初等教育については肯定的意見がみられる.これをすすめていくと,民衆のための初等教育とブルジョワやエリートのための中等教育という階級的複線型教育制度論に発展していく.その典型が重農主義派のボードーであり,フィリポン・ドゥ・ラ・マドゥレーヌであり,革命後のデステュットゥ・トゥラシーである.イ)フランス啓蒙期(1750-1789)にあらわれた教育論の数は,最低400である.その中心は(1)中等教育改革,(2)女子教育(3)『エミール』批判である.ロ)イエズス解追放に関する関与した高等法院関係者で教育改革論を現した人物として従来知られていたラ・シャロテ,ギトン・ドゥ・モンブオの他にモンクラール(グルノーブル),セサン(グルノーブル),ラヴェルディ(パリ)らがいることがわかったが,教育論の所在はわからなかった.ヘ)先行研究等によれば,従来知られていた三人の中で,もっとも体系的・総合的な教育改革論を著わした人物はラ・シャロテであるとされていたが,この評価はやはり正確であった.ニ)ラ・シャロテは,学生数・コレージヤ数縮減=制限論を展開したが,他の人物は,この点不明である.ホ)従来,テュルゴがその『都市論』において中央集権的教育制度・行政機関の整備を主張したといわれていたが,本当の執筆者はデュポン・ドゥ・ヌムールである.というのが近年の研究成果である.ヘ)中等教育改革論の中にあって,(1)教育からの宗教色の一掃(2)中央集権的教育行政機構の整備・確立(3)教科書・教員管理の制度化などにおいては一致しているが,古典語学習と近代語学習のどちらを重視するかについては意見が多様である.ト)中等教育論にあって,民衆の教育機会の拡大については大方が批判的・否定的であるが,初等教育については肯定的意見がみられる.これをすすめていくと,民衆のための初等教育とブルジョワやエリートのための中等教育という階級的複線型教育制度論に発展していく.その典型が重農主義派のボードーであり,フィリポン・ドゥ・ラ・マドゥレーヌであり,革命後のデステュットゥ・トゥラシーである.日本にある原典とは、(1)Julia編、ha reforme de l'enseignement(Hachette社)(法大教育学科蔵)(2)早大教育学部図書室蔵「フランス教育史コレクション」(3)古沢が国立図書館に発注したMicrofilms,(4)個人の著書・著作集などである。同期の教育論を大別すると、(1)『エミール』をめぐって出版された教育論、(2)イエズス会追放を契期に出版された教育改革論(3)教育内容・方法改改革(宗教教育・女子教育論をふくむ)。日本にあるものは(1)は『エミール』をふくめて3点のみである。(2)については、1762年から70年まで、書名で判断すると16あるが、これらは研究史の中で重要とされたものを多く含んでいるので、次年度はこれらの原典の分析を行ない、教育改革論の内実をさぐりたい。
新規無機陰イオン交換体の開発及び触媒への展開

平成12年度において,骨格内に亜鉛を含むアルミノホスフェート・モレキュラーシーブ(ZnAPO-5)を酢酸水溶液で処理することにより,骨格内の亜鉛を選択的に除去できること,および,四塩化ケイ素を用いて生成した空孔にケイ素を導入することにより,陰イオン交換体を生成できることを見出した.しかし,ZnAPO-5を出発原料に用いているため,骨格内に亜鉛が残れば陽イオン交換点も形成される.また,陰イオン交換量が非常に少ないため,合成条件の最適化が必要である.本年度(平成13年度)では,亜鉛以外の金属を用いて陰イオン交換体を合成すること,および合成条件の検討を行った.亜鉛の代わりに,ホウ素がアルミニウムの一部と同型置換されたBAPO-5を用いて陰イオン交換体の合成を行った.ホウ素を用いた場合には,骨格内にホウ素が残留しても陽イオン交換点は形成されないという利点がある.ホウ素を用いた場合もZnAPO-5の場合と同様に,酢酸中で攪拌することにより,骨格からホウ素を除去できることを明らかにした.この試料を用いて,四塩化ケイ素による骨格へのケイ素の導入を行った.得られた試料を硝酸ナトリウム水溶液により陰イオン交換を行い,硝酸イオンの赤外吸収スペクトルによりイオン交換容量を調べた.その結果,イオン交換容量はZnAPO-5を用いた場合とほとんど変わらなかった.ケイ素の導入法の検討を行った.四塩化ケイ素処理で陰イオン交換能が少ないのは,亜鉛のサイトとに加え,リンのサイトにもケイ素が入ってしまうためであると考えられる.隣接する亜鉛とリンのサイトにケイ素が導入されると陰イオン交換点は生成しない.そこで,ヘキサケイ酸アンモニウム水溶液中でケイ素の骨格への導入を行ったところ,陰イオン交換点が生成した.しかし,陰イオン交換容量は四塩化ケイ素を用いたときとほとんど変わらなかった.陰イオン交換能を持つ代表的なものに,陰イオン交換樹脂がある.これは骨格が有機物でできているため,熱安定性が低い.また,無機陰イオン交換体である層状複水酸化物(ハイドロタルサイトなど)も200°C以上で構造が壊れる.このように,陰イオン交換体で熱安定性の高い物質は報告されていない.そこで,本研究では高温で安定な新規無機陰イオン交換体の開発を行った.イオン交換体の母体には,500°C以上でも構造が壊れないアルミノホスフェート・モレキュラーシーブNo.5(AlPO_4-5,AFI構造)を選んだ.AlPO_4-5は4配位のAlとPがOを介して結合した物質である.3価のAlの代わりに4価のSiを導入できれば,電荷のバランスを補うため陰イオンが必要となり,この陰イオンがイオン交換可能となると考えられる.しかし,AlPO_4-5の合成ゲルにSiを入れて水熱合成した場合,Siは5価のPの代わりに骨格に入り,陰イオン交換体は生成せず陽イオン交換体ができる.そこで,まず,骨格に2価または3価の金属(Me:Zn,Co,Fe)が骨格に入ったAlPO_4-5(MeAPO-5)を合成した.2価または3価のMeは,Alサイトに入ることが知られている.その後,酢酸で100°C,14時間処理することにより,Meの抽出を行った.その結果,Znのみ選択的に骨格から取り出せた.Znを取り除いたあとにできた空孔に4価のSiを入れることができれば,陰イオン交換体が生成する.次に,500°Cで26kPaのSiCl_4蒸気を5時間,Znを取り除いたAlPO_4-5に供給し,骨格内へのSiの導入を行った.得られた試料をNaNO_3水溶液でイオン交換することにより,試料にNO_3^-が取り込まれた.以上の結果から,陰イオン交換体の生成したことがわかった.平成12年度において,骨格内に亜鉛を含むアルミノホスフェート・モレキュラーシーブ(ZnAPO-5)を酢酸水溶液で処理することにより,骨格内の亜鉛を選択的に除去できること,および,四塩化ケイ素を用いて生成した空孔にケイ素を導入することにより,陰イオン交換体を生成できることを見出した.しかし,ZnAPO-5を出発原料に用いているため,骨格内に亜鉛が残れば陽イオン交換点も形成される.また,陰イオン交換量が非常に少ないため,合成条件の最適化が必要である.本年度(平成13年度)では,亜鉛以外の金属を用いて陰イオン交換体を合成すること,および合成条件の検討を行った.亜鉛の代わりに,ホウ素がアルミニウムの一部と同型置換されたBAPO-5を用いて陰イオン交換体の合成を行った.ホウ素を用いた場合には,骨格内にホウ素が残留しても陽イオン交換点は形成されないという利点がある.ホウ素を用いた場合もZnAPO-5の場合と同様に,酢酸中で攪拌することにより,骨格からホウ素を除去できることを明らかにした.この試料を用いて,四塩化ケイ素による骨格へのケイ素の導入を行った.得られた試料を硝酸ナトリウム水溶液により陰イオン交換を行い,硝酸イオンの赤外吸収スペクトルによりイオン交換容量を調べた.その結果,イオン交換容量はZnAPO-5を用いた場合とほとんど変わらなかった.ケイ素の導入法の検討を行った.

四塩化ケイ素処理で陰イオン交換能が少ないのは,亜鉛のサイトとに加え,リンのサイトにもケイ素が入ってしまうためであると考えられる.隣接する亜鉛とリンのサイトにケイ素が導入されると陰イオン交換点は生成しない.そこで,ヘキサケイ酸アンモニウム水溶液中でケイ素の骨格への導入を行ったところ,陰イオン交換点が生成した.しかし,陰イオン交換容量は四塩化ケイ素を用いたときとほとんど変わらなかった.
疾患モデル動物からの未知の病因遺伝子の探求-遺伝性腎癌ラットの病因遺伝子の単離、同定-

我々は、Eker ratの発癌機構を解明すべくpositional cloning法によって原因遺伝子の単離、同定をめざした。ついに我々は、Tsc2遺伝子にレトロトランスポゾン挿入によるgermline mutationを見い出しEker rat発見40年目にして原因遺伝子の同定に成功した。ここにEker ratは、現在全く不明である、多彩な症状を示すヒト結節性硬化症(最近、5800人に1人の出生率との報告があり比較的頻度の高い難病)の発症機序解明及び治療、予防の開発の疾患モデルとして、新しい展開を迎えることとなった。我々は、Ekerラットの発癌機構の解明を目的としてまずEker(Tsc2)遺伝子の全構造の決定と機能解析を行った。本研究において我々は、Eker(Tsc2)遺伝子は癌抑制遺伝子であることを証明した。またEker(Tsc2)遺伝子の機能として転写活性能を見い出した。現在、「Eker ratの腎癌の本態はEker(Tsc2)遺伝子不活性化による遺伝子発現制御の異常にある」との作業仮説を立てtarget遺伝子の単離を進めている。我々の最終目的は、疾患モデルからヒト疾患の診断、予防、治療に資する知見を得ようとするものである。まず、本ラットの腎癌発生は放射線発癌および化学発癌に高感受性であることを明らかにした。この現象を利用して我々は、遺伝解析の為の,戻し交配ラットを短期間に多数,作成する方法を開発した。そして、原因遺伝子はラット染色体10番に局在することを明らかにした。また,ラット染色体10番上にあるDNAマーカーを用いることによって、腎癌細胞にはwild type alleleのloss(LOH)が高率に見られることがわかり,Knudsonの“two-hits"が適用され原因遺伝子は癌抑制遺伝子であることが考えられた。さらに、mappingを進め原因遺伝子は、ヒト結節性硬化症の原因遺伝子(TSC2;human chromosome 16p13.3)のrathomologueに強くリンクしていることを明らかにした。そしてついに、Tsc2遺伝子に本ラットに特異的なgerm line mutationを見いだした。興味あることに、本ラットには腎癌以外にも子宮腫瘍、脾臓腫瘍および下垂体腺腫が高率に発生することが明らかになった。
TEMPO-RNPによる脳梗塞再開通療法後における再灌流障害と出血性脳梗塞の予防

脳動脈閉塞に対する再開通療法は最も重要な脳梗塞治療であるが、再開通療法後に発生する活性酸素種は脳虚血再灌流障害を起こし、脳梗塞を悪化させる。脳虚血灌流障害を防ぐ治療法の開発として、ナノ粒子化活性酸素消去剤(TEMPO-RNP)を、マウス一過性脳虚血モデルに頸動脈投与し、脳神経血管保護効果を検証した。その結果、TEMPO-RNPは脳梗塞を縮小させ、血液脳関門障害を軽減させた。その機序は、脳動脈に投与されたTEMPO-RNPが脳虚血部の血液脳関門を通過し、脳血管に加え中枢神経細胞の保護であった。TEMPO-RNPは、脳虚血再灌流障害を抑制する新たな神経血管ユニット保護治療になると考えられた。血栓溶解薬(t-PA)や血管内治療による血栓回収療法は、脳梗塞超急性期に対する再開通療法として患者の予後を改善させ得るため、近年目覚ましい進歩を遂げている。一方で、再開通に伴う再灌流障害と出血性脳梗塞は、再開通療法の副作用であり、予後を悪化させる原因であるため、早急な治療法の開発が必要である。本研究では、我々が開発した新規DDS化フリーラジカル消去剤であるTEMPO-RNPの脳梗塞病巣への集積を評価し、脳神経・血管内皮保護効果により、再開通療法の副作用である脳虚血再灌流障害と出血性脳梗塞を抑制できるかどうか、動物モデルを用いて検証する。その目的を達成するために、以下の研究計画を立てた。1.ニトロキシドラジカル含有ナノ粒子(TEMPO-RNP)の作製:研究協力者と共にTEMPO-RNPを作成し、TEMPO-RNPの安定性を電子スピン共鳴法(EPR)で確認し、平均粒径が40-60nmであることを、光散乱光度計を用いて測定し、確認した。2.一過性脳虚血モデルの確立:ラット一過性脳虚血モデルを、先端がシリコンコーティングされた塞栓糸を用いて中大脳動脈を1時間閉塞させることで作製した。3.グルコース負荷一過性脳虚血モデルの確立:ラット一過性脳虚血モデルに対し、グルコース(50%グルコース5ml/kg)を腹腔内投与することで、再灌流障害と出血性脳梗塞が起こりやすくなることを確認し、モデルとして確立した。4.ローダミン標識RNPの作製と脳梗塞病巣における集積と局在の評価:研究協力者と共にローダミン標識RNPを作製した。グルコース負荷一過性脳虚血モデルにローダミン標識RNPとEvans blueを静脈投与した。再灌流6時間後に断頭し、血液脳関門が破綻してEvans blueが漏出している部位で、RNPが主に血管内皮上に集積、局在していることを、蛍光抗体法により確認した。再灌流障害の主な原因は、産生されたフリーラジカルによる細胞障害である。当研究では、フリーラジカル消去(TEMPO)をミセル化した新たなDDS化フリーラジカル消去剤であるTEMPO-RNPを用いて、脳虚血再灌流障害に対する脳神経・血管保護療法の開発を目指している。過去に報告した研究では、経静脈的投与による脳梗塞縮小効果を証明したが、本研究では、近年、頸部及び頭蓋内動脈へカテーテルと血栓回収デバイスを経動脈的に誘導する技術が標準化したことから、TEMPO-RNPを再開通後に経動脈的に直接頭蓋内動脈に注入する動物実験プロトコルを確立した。その上で、TEMPO-RNPの効果を検証するために下記の実験を実施した。これらの実験及び解析では、脳虚血再灌流障害に対して、DDS化フリーラジカル消去剤であるTEMPO-RNPを経動脈的投与する動物実験プロトコルを確立し、最適な投与方法、投与時期、投与量を決めることができた。確立したプロトコルをもとに、TEMPO-RNP投与群とPBS投与群の群間比較試験を行い、TEMPO-RNPの脳神経・血管保護効果を証明できた。今後は、TEMPO-RNPの脳神経・血管保護効果のメカニズムの検証により、TEMPO-RNPの有効性を科学的に解明できると考えている。これまで行った実験の成果を以下に記する。研究進捗は順調であり、仮説に合致した興味深い研究成果が得られている。1. TEMPO-RNPの最適な投与量と投与濃度の検証:TMEPO-RNPの投与量と5群に振って、脳梗塞体積と神経学的所見、及びRNPの脳内分布を評価した結果、最適な投与濃度を確定することができた。また総頚動脈から投与したRNPが脳梗塞中心部から周辺部へ集積することを確認した。2. TEMPO-RNPの脳血管保護効果の検証:マウス脳虚血再灌流モデルを用いて、Evans blueの腹腔内投与により脳血液関門の破綻を評価したところ、TEMPO-RNP投与群はコントロール群(PBS群)でBBBの破綻が有意に抑制された。3. TEMPO-RNPの脳神経保護効果の検証:脳梗塞体積の測定では、TENPO-RNP群はPBS群に比べて有意に脳梗塞を縮小させ、神経症状を改善させた。4.アポトーシスの評価:TUNEL染色によるアポトーシスの評価をしたところ、TEMPO-RNP群では脳梗塞周辺部において有意に神経細胞のアポトーシスを抑制した。脳梗塞に対する急性期再開通療法では、再開通療法後に発生する活性酸素種が脳虚血再灌流障害を引き起こし、脳梗塞増大や出血性合併症を起こす。その為、脳虚血灌流障害を防ぐ新たな治療法の開発が急務である。

本研究では、我々が開発したナノ粒子化活性酸素消去剤RNP(Nitroxyle Radical-containing Nanoparticle)を、マウス一過性脳虚血モデルに頚動脈投与することにより、活性酸素の発生を抑制し、虚血再灌流障害を抑制するか検証した。マウス一過性脳虚血モデルにおいて、再開通20分後に薬剤を頸動脈投与し、24h後に以下の評価を行った。1RNPの脳梗塞病巣への分布、2Evans blue漏出の比較による脳血管保護効果、3脳梗塞体積の比較による脳神経保護効果、4血液脳関門保護効果、5神経細胞のフリーラジカル産生とアポトーシス評価、6電子スピン共鳴法(EPR)による摘出脳の抗酸化能評価。その結果、RNPは脳血管壁への分布を認め、有意にEvans blueの漏出を抑制し、脳梗塞を減少させた。また、血液脳関門を保護するとともに、神経細胞内のフリーラジカルの産生、及びアポトーシスを抑制した。EPRによる抗酸化能の評価では、RNP投与群の脳は、ヒドロキシラジカル、ペルオキシラジカル、スーパーオキシドにおいて高い抗酸化能を示した。平成28年度の研究成果として、頚動脈投与したRNPが脳血管壁のみならず、血液脳関門を越えて血管外腔の神経細胞の周囲に集積していることを確認した。また、RNPは神経細胞における活性酸素発現、アポトーシス、DNA損傷を抑制することを示した。このことは、RNPが血液脳関門と中枢神経細胞からなる神経血管ユニットを保護する可能性を示した。RNPは、脳虚血領域の血管内皮細胞と中枢神経細胞を保護することにより、脳梗塞の増悪と頭蓋内出血合併症を抑制すると考えられた。脳動脈閉塞に対する再開通療法は最も重要な脳梗塞治療であるが、再開通療法後に発生する活性酸素種は脳虚血再灌流障害を起こし、脳梗塞を悪化させる。脳虚血灌流障害を防ぐ治療法の開発として、ナノ粒子化活性酸素消去剤(TEMPO-RNP)を、マウス一過性脳虚血モデルに頸動脈投与し、脳神経血管保護効果を検証した。その結果、TEMPO-RNPは脳梗塞を縮小させ、血液脳関門障害を軽減させた。その機序は、脳動脈に投与されたTEMPO-RNPが脳虚血部の血液脳関門を通過し、脳血管に加え中枢神経細胞の保護であった。TEMPO-RNPは、脳虚血再灌流障害を抑制する新たな神経血管ユニット保護治療になると考えられた。平成26年度分研究計画は以下の4つであった。1.ニトロキシドラジカル含有ナノ粒子(TEMPO-RNP)の作製2.一過性脳虚血モデルの確立3.グルコース負荷一過性脳虚血モデルの確立4.ローダミン標識RNPの作製と脳梗塞病巣における集積と局在の評価:それぞれの研究を研究実績の概要の如く行うことができており、おおむね順調に進展している。4のローダミン標識RNPの脳梗塞病巣への集積評価では、今後サンプル数を増やして統計学的な解析を加える予定である。今後は、TEMPO-RNPの脳神経・血管保護効果のメカニズムを検証するために、アポトーシス細胞の評価の他、現在、血液脳関門を構成するoccludin、VE-cadherinの評価、Microgliaや反応性astrocyteの評価、酸化ストレス評価としてiNOS、8OHdG、HNEの評価を実施中である。また、血管内皮細胞、反応性アストロサイト、ミクログリア、神経細胞などがから発現するサイトカイン発現などの解析をreal-time PCRにより解析する予定である。
均一細孔・高酸性セラミックス多孔体に吸着した有機分子の細孔内拡散運動性と膜分離能

1.沸点差の小さいベンゼンおよびシクロヘキサンの選択分離を念頭に、多孔質ガラス(コーニング製、#7930)に対する両基質の透過係数(Q)を測定した結果、(1)基質を単独で供給しても、混合物(モル比1:1)として供給しても、ベンゼンの透過性はシクロヘキサンのそれよりも高い(温度範囲3070°C)。(2)温度を上げると、ベンゼンの透過性は顕著に低下するのに大して、シクロヘキサンではほとんど温度依存性がみられなかった。ベンゼンでは表面拡散が支配的であるのに対して、シクロヘキサンではクヌーセン拡散と表面拡散が拮抗していることを示唆する。(3)多孔質ガラス膜細孔内に銀イオンを固定化したところ(1.65×10^<-5>mol/g)、ベンゼンのQは約1/2に低下したが、シクロヘキサンではほとんど変わらなかった。2.一方、NMRパルス磁場勾配法により細孔内吸着種の自己拡散定数(D)を測定したところ、(1)吸着系では、いずれもが純液体に比べて小さなDの値をもつ。従って、吸着分子の運動性は、分子-表面間のファンデルワールス力により液体状態に比べてより束縛されていると考えられる。(2)純液体では、ベンゼンのDの値の方がシクロヘキサンのそれよりも大きいのに対して、吸着系ではこの関係が逆転した。飽和炭化水素であるシクロヘキサンに対して、π電子をもつベンゼンがガラス表面と吸引的相互作用をすることを示唆する。3.シクロヘキサンに比べてガラス表面との吸引的相互作用の大きいベンゼンでは、相対的に、(1)吸着相におけるDが小さい、(2)膜透過作用状態での吸着両が大きい、の二つの特性をもつものと思われる。Q(ベンゼン)>Q(シクロヘキサン)の結果は、ベンゼンにおいてはDがやや小さいものの、膜透過に有効な表面拡散が優勢に起こったためと説明できよう。パルス磁場勾配を印加したNMRスピンエコー減衰を正確に測定するには,パルス磁場勾配と静磁場との結合によって生ずる一時的な磁場の乱れが, FID信号の取り込み時まで残存していてはならない.この現象は,装置特性に依存して生ずるため,先ず購入した磁場コイル付属NMRプローブと現有設備であるFT-NMR分光計との整合性を検討した.すなわち,信頼できる自己拡散定数(D)の報告値のある液体ベンゼンおよび液体シクロヘキサンについて,第二の磁場勾配パルスを印加後FID信号取り込みまでの待ち時間を5msから45msまで系統的に変え, Dの値を求めたところ,いずれも待ち時間が25msより長い領域で正しい値を再現することがわかった.このような条件下に,多孔質ガラス(コーニング製, #7930)に吸着したベンゼンおよびシクロヘキサンの測定を行ったところ,(1)吸着系では,いずれもが純液体に比べて小さなDの値をもつ.このことは,分子・表面間のファンデルワールスカのために,吸着分子の分子運動性が液体状態に比べてより束縛されていることを示唆する,(2)残留磁場がないにもかかわらず,待ち時間を長くとるとDの値は小さくなった.表面の不均一性のためにDの値に分布があり,エコー減衰の速い成分と遅い成分が観測されたためと考えられる,(3)純液体では,ベンゼンのDの値の方がシクロヘキサンのそれよりも大きいのに対して,吸着系ではこの関係が逆転した.飽和炭化水素であるシクロヘキサンに対して, π電子をもつベンゼンがガラス表面(シラノール基か)と吸引的相互作用をすることを推測させる.興味深いことに,銀イオン修飾多孔質ガラスは無修飾

多孔質ガラスと同じD(ベンゼン)<D(シクロヘキサン)の序列であったが,多孔性アルミナでは逆の序列となった.セラミックス多孔体上にある酸点の性質により,有機分子の細孔内拡散運動性が制御されることを如実に示している.沸点差の小さいベンゼン(b.p.80.1°C)およびシクロヘキサン(b.p.80.7°C)の選択分離を念頭に、コーニング製円筒型多孔質ガラス膜(平均細孔径4nm、比表面積200m^2/g)に対する両基質の透過性を検討した。透過係数(Q)の測定は、バルブ操作により供給ガスおよび膜内外の気相組成をガスクロマトグラフ分析できる自家製装置によった。この結果、(1)基質を単独で供給しても、混合物(モル比1:1)として供給しても、ベンゼンの透過性は、シクロヘキサンのそれよりも高い(測定温度範囲3070°C)、(2)温度を上げると、ベンゼンの透過性は顕著に低下するのに対して、シクロヘキサンではやや低下する程度で、ほとんど温度依存性がみられなかった(例えば単独供給系で、Q(ベンゼン)/Q(シクロヘキサン)の値は、30°Cで28.8、70°Cで4.7)。径が4nm程度の細孔に対する低圧領域での分子透過機構として、分子が膜表面に吸着し、表面をホッピングして移動する表面拡散と、気体分子が表面と衝突しつつガス拡散するクヌーセン拡散が知られている。ベンゼンの温度依存性は、ベンゼンの拡散が主として表面拡散によって起こるとして妥当である。一方、シクロヘキサンでは、高温ほど有利なクヌーセン拡散と低温ほど有利な表面拡散がほぼ拮抗していると考えられる。多孔質ガラス膜を硝酸アルミニウム、アンモニア、硝酸銀の各水溶液で順次表面処理することにより、Ag^+イオンを表面に固定化した(1.65×10^<-5>mol/g)。ベンゼンの透過係数は、Ag^+イオン修飾により約1/2に低下したが、シクロヘキサンではほとんど変化がみられなかった。ベンゼンπ電子ーAg^+イオン間の吸引的相互作用による膜透過性の制御と考えられる。この挙動は、NMRパルス磁場勾配法により測定された自己拡散定数の傾向とも一致した。無機分離膜に対する、このような基質特異的な表面機能化技術の発展が望まれる。
歯周病原性細菌の産生するプロテアーゼの膜輸送システムの解明

歯周病原性細菌Porphyromonas gingivalis(P.g.)の産生する2つのシステインプロテアーゼRgpとKgpは歯周疾患の発症および進行に重要な役割をしていると考えられている。非常におもしろいことに、これら2つの酵素はプロテアーゼドメインと血球凝集素ドメインの2つの機能ドメインをもつ構造上類似した酵素である。今回、2つの酵素の中の一つKgpを用いP.g.を利用した発現系を確立することを試み、活性型のKgpを発現させることに成功した。さらに、Kgpの活性中心に点変異を導入し、活性中心の決定を行った。Kgpの予測される活性中心には248番目と249番目に2つのシステインが存在しているため、これらつをアラニンに置換したコンストラクトを作製し、Kgp発現系と同様の手法を用い変異体を作製した。両方のシステインをアラニンに置換したものではウエスタンブロット法ではKgpの免疫反応物が認められるものの、この変異体には活性が認められないことから、これらのどちらか、あるいは両方がKgpの活性に必要であることが明らかとなった。そこで、さらにそれぞれのシステインをアラニンに置換したコンストラクトを作製したところ、248番目のシステインをアラニンに置換したものでは活性が認められたが、249番目のシステインをアラニンに置換したものでは活性が認められなかった。以上のことから、Kgpの活性には249番目のシステイン残基が必要であることが明らかとされた。これら2つの酵素はプロテアーゼドメインと血球凝集素ドメインの2つの機能ドメインをもつ構造上類似した酵素である。我々は、前回P.g.内でのKgpの発現法を確立し、Kgpの活性中心は248番目と249番目のシステインが重要であることを明らかとした。今回はまず、Kgpの機能面での回復を確かめるために、Kgpによるヘモグロビン結合タンパク質(HGP15)のプロセシングを調べた。Kgpの欠損変異体でほ正常にプロセシングされないためにHGP15の抗体によって目的の位置にバンドを認めることができなかったが、Kgp発現体ではHGP15の正常なプロセシングが認められた。前回の黒色色素能の回復とともにリコンビナントKgpは野生株と同等の機能をもつことが確かめられた。一方、活性中心に関しては、2つのシステインをなくすとウエスタンブロット法ではKgpの免疫反応物が認められるものの、この変異体には活性が認められないことから、これらのどちらか、あるいは両方がKgpの活性に必要であることを明らかとした。そこで、さらにそれぞれのシステインをアラニンに置換したコンストラクトを作製することを試みたところ、248番目のシステインをアラニンに置換したもの、249番目のシステインをアラニンに置換したもの、の両方にKgp活性が認められた。すなわち、両方のシステインが活性中心として機能しうることが考えられた。今後は、さらに構造解析を進め、血球凝集素ドメインのKgp輸送における役割、およびにプロドメインの役割についても解析を加えていきたい。歯周病原性細菌Porphyromonas gingivalis (P.g.)の産生する2つのシステインプロテアーゼRgpとKgpは歯周疾患の発症および進行に重要な役割をしていると考えられている。我々は、P.g.内でのKgpの発現法を確立し、Kgpの活性中心は248番目と249番目のシステインが重要であることを明らかとし、また、Kgpの欠損変異体にKgpを発現させた系において、ヘモグロビン結合タンパク質(HGP15)のプロセシングが回復していることも明らかとした。

一方、活性中心に関しては、2つのシステインのどちらか一方をアラニンに置換したコンストラクトを作製することを試みたところ、248番目のシスティンのみをアラニンに置換したものには酵素活性が認められ、タンパク質も発現していたが、249番目のシステインのみをアラニンに置換したものではタンパク質としては発現していたものの、酵素としての活性は認められなかった。すなわち、248番目のシスティンがKgpでは活性中心として機能していることが明らかとされた。また、C末端側をいくつかのサブドメインで欠損させた変異体を作製し、その発現や酵素活性を調べたところ、活性としてはやや野生株と比べて低いものの、正常な分子型で発現しており、それらのプロセシングに大きな違いは認められなかった。今後は、より細かく分画することで、C末端側のサブドメインの役割について調べていきたいと考えている。
インフルエンザの進入部位を標的とした感染誘発気管支喘息発作の新規治療法の開発

ヒト気管および鼻粘膜上皮細胞がインフルエンザウイルスを活性化するプロテアーゼを発現して細胞内進入を促進し、ウイルス複製や気管支喘息発作を生じる炎症性物質の合成、気道上皮細胞傷害を生じることを明らかにした。また、プロテアーゼ阻害薬がウイルス複製や炎症性物質の合成、気道上皮細胞傷害を抑制することを明らかにした。プロテアーゼ阻害薬がインフルエンザウイルスの細胞内進入を阻止して、感染に伴う気管支喘息の新規の治療薬になる可能性を示した。目的:インフルエンザウイルスの進入部位である、気道上皮細胞のプロテアーゼによる活性化を阻害し、インフルエンザウイルスの感染を阻止する研究を進めるため、ヒト気道上皮細胞を用いて以下を検討した。方法:ヒト気管上皮細胞およびヒト鼻ポリープ粘膜上皮の初代培養を行い、新型インフルエンザ(A/H1N1 pdm 2009)ウイルスと季節性インフルエンザ(A/H3N2 New York)を感染させ、ウイルス放出量、および炎症性物質(IL-6)の放出を測定した。プロテアーゼ阻害薬であるカモスタット、シベレスタット、ガベキサート、ナファモスタット、アプロチニンを細胞に作用させ、インフルエンザ感染抑制作用を検討した。結果:ヒト気管上皮細胞実験;1)細胞は新型インフルエンザウイルスおよび季節性インフルエンザウイルスともに感染し、培養液への放出を確認した。また炎症性物質(IL-6)の放出を確認した。2)アプロチニン、ガベキサート、カモスタット、シベレスタット、ナファモスタットを細胞に作用させ、インフルエンザウイルスの放出抑制およびIL-6の放出量減少を確認した。3)抑制効果の強いカモスタットの濃度依存性を測定し、血中で確認されるカモスタットの濃度(100 ng/mL)においてウイルス放出が抑制されることを確認した。ヒト鼻ポリープ粘膜上皮の初代培養実験;1)増殖した細胞が上皮細胞であることを免疫染色で確認した。2)インフルエンザウイルスを感染させ、培養液へのウイルス放出とIL-6の放出を確認した。結論:ヒト気管上皮細胞においてプロテアーゼ阻害薬がインフルエンザウイルス感染を抑制することを明らかになった。とくに、臨床治療濃度におけるカモスタットのインフルエンザウイルス感染抑制効果を認めた。ヒト鼻ポリープ粘膜上皮細胞がインフルエンザウイルスに感染し、炎症性物質を放出することが明らかになった。目的:インフルエンザウイルスの進入阻害による感染抑制の研究のため、ヒト気道上皮細胞を用いて以下を検討した;1)気管上皮細胞におけるプロテアーゼ発現の確認、プロテアーゼ阻害薬のウイルスRNA複製・HA蛋白開裂抑制作用。2)喘息合併患者の鼻粘膜上皮細胞におけるプロテアーゼ阻害薬のウイルス増殖抑制作用。方法:ヒト気管上皮細胞のプロテアーゼ発現の確認を行った。新型インフルエンザ(A/H1N1 pdm 2009)ウイルスと季節性インフルエンザ(A/H3N2 New York)の細胞内ウイルスRNA複製量、HA蛋白の開裂を解析した。さらに、プロテアーゼ阻害薬によるウイルスRNA複製量抑制作用、プロテアーゼ阻害薬カモスタットのHA蛋白の開裂抑制作用を解析した。鼻ポリープ粘膜上皮細胞のウイルス放出量、細胞内ウイルスRNA複製量と、プロテアーゼ阻害薬のウイルス放出量減少作用を測定した。結果:ヒト気管上皮細胞実験;1)細胞はセリン・プロテアーゼに分類されるtransmembrane protease serine 2 (TMPRSS2)、TMPRSS4、TMPRSS11を発現し、プロテアーゼ阻害薬はこれらの酵素の発現を変化させなかった。2)プロテアーゼ阻害薬はウイルスRNA複製量を減少させた。抑制効果はナファモスタット、カモスタット、アプロチニンの順であった。3)感染細胞はHA0蛋白を開裂して活性化した。カモスタットはHA0蛋白の開裂を抑制した。喘息合併患者の鼻ポリープ粘膜上皮の実験;1)細胞外にインフルエンザウイルスを放出させ、細胞内ウイルスRNAを複製した。2)プロテアーゼ阻害薬のナファモスタット、カモスタットはウイルス放出量を減少させた。結論:ヒト気管上皮細胞におけるセリン・プロテアーゼの発現、プロテアーゼ阻害薬によるウイルスRNA複製量減少が明らかになった。喘息合併患者の鼻ポリープ粘膜上皮細胞におけるプロテアーゼ阻害薬のウイルス放出量減少効果が明らかになった。目的:インフルエンザウイルスの進入阻害による感染抑制の研究のため、以下を検討した;1)気管上皮細胞におけるプロテアーゼ阻害薬ナファモスタットのHA蛋白開裂抑制作用・ウイルス増殖抑制作用、上皮細胞傷害抑制作用および炎症性サイトカイン放出抑制作用。2)鼻腔上皮細胞におけるセリン・プロテアーゼ発現、ナファモスタットのウイルス増殖抑制作用、上皮細胞傷害抑制作用および炎症性サイトカイン放出抑制作用。方法:ヒト気管上皮細胞および鼻腔粘膜上皮細胞を用いて以下を解析した;1)セリン・プロテアーゼ発現。2)新型インフルエンザ(A/H1N1 pdm 2009)ウイルス放出量、ウイルスRNA複製量、ウイルスHA蛋白の開裂、炎症性サイトカイン放出量。結果:ヒト気管上皮細胞および鼻腔粘膜上皮細胞;1)セリン・プロテアーゼ(TMPRSS2、4、および11D)mRNAを発現し、ナファモスタットは発現に影響を与えなかった。2)ナファモスタットはウイルス放出量およびウイルスRNA複製量を減少した。

3)ウイルス感染はIL-6およびTNF-αの放出を促進し、ナファモスタットは放出を抑制した。4)ウイルス感染による剥離脱落細胞数がナファモスタットで減少した。ヒト気管上皮細胞;ナファモスタットは放出されたウイルスのHA蛋白の開裂を抑制した。鼻腔粘膜上皮細胞;気管支喘息およびアレルギー素因を有する患者の細胞においてナファモスタットはウイルスの複製、IL-6およびTNF-αの放出を抑制した。結論:ヒト気管および鼻腔上皮細胞におけるセリン・プロテアーゼの発現、プロテアーゼ阻害薬ナファモスタットによるインフルエンザウイルス複製の減少が明らかになった。喘息合併患者を含むアレルギー素因を有する患者の鼻腔上皮細胞におけるプロテアーゼ阻害薬のウイルス放出および炎症惹起物質放出の減少効果が明らかになった。ヒト気管および鼻粘膜上皮細胞がインフルエンザウイルスを活性化するプロテアーゼを発現して細胞内進入を促進し、ウイルス複製や気管支喘息発作を生じる炎症性物質の合成、気道上皮細胞傷害を生じることを明らかにした。また、プロテアーゼ阻害薬がウイルス複製や炎症性物質の合成、気道上皮細胞傷害を抑制することを明らかにした。プロテアーゼ阻害薬がインフルエンザウイルスの細胞内進入を阻止して、感染に伴う気管支喘息の新規の治療薬になる可能性を示した。理由:当初の計画に沿って研究が実施されている。すなわち、ヒト気管上皮細胞がセリン・プロテアーゼを発現してインフルエンザのヘマグルチニンを活性化させ、インフルエンザの進入以降の増殖過程を促進していることが明らかになった。また、プロテアーゼ阻害薬がヘマグルチニンの活性化段階を抑制させ、ウイルスの増殖を抑制することが明らかになった。さらに、気管支喘息合併患者の鼻粘膜上皮細胞においてインフルエンザウイルスが感染すること、およびプロテアーゼ阻害薬がウイルス放出を減少することが明らかになった。呼吸器内科学:呼吸器ウイルス感染による気管支喘息および慢性閉塞性肺疾患の増悪の機序および治療法の研究ヒト気管上皮細胞の細胞膜におけるセリン・プロテアーゼの蛋白発現を確認し、論文投稿の予定にしている。さらに、気管支喘息合併患者におけるセリン・プロテアーゼ阻害薬のインフルエンザウイルス感染誘発の気道炎症抑制効果を明確にするため、気管支喘息合併患者の鼻粘膜上皮細胞におけるウイルス増殖量およびIL-6の放出量に関して、喘息非合併患者の細胞と比較検討する。当初の計画に沿って研究が実施されている。すなわち、平成25年度において、ヒト気管上皮細胞におけるインフルエンザウイルスの感染をプロテアーゼ阻害薬が抑制すること、IL-6の放出を抑制することを明らかにした。また、培養ヒト鼻ポリープ粘膜細胞が上皮細胞であることを確認し、インフルエンザウイルスの感染系を確立した。また、ヒト鼻ポリープ粘膜
血友病をもつ学童期の子どもの包括的口腔ケアプログラムの開発

【平成30年度研究目的】血友病をもつ学童期の子どもの口腔状態および口腔保健行動を把握する【研究実施計画】1ンタビューガイドの作成:血友病の病態生理、先行研究、および、学童期の子どもが必要とする口腔保健行動と学童期の発達に応じたセルフケア能力を検討して作成した。所属する研究機関の倫理審査委員会の承認を得た。2血友病患者会へ調査・研究参加の依頼・説明:患者会会長へ研究参加の依頼・説明を実施し、承諾を得た。インタビュー調査を実施中である。対象者は、調査日を受診日等で提示しているため、調査可能な日程がかなり限定している状況である。研究倫理に則り、対象者の状況に配慮して進めている。3聞き取り調査内容の分析、課題の抽出:聞き取り調査と分析を並行して実施中である。また、対象者の体調や緒事情等により調査日程が延期することもあり、計画当初より調査進度が遅延している。倫理的観点より、調査が対象者の負担になることがないよう慎重に進めるべきと考えている。平成30年度の研究は質的研究であり、分析途中でデータを追加して分析することが可能である。調査と分析を並行して実施している。結果は学会で公表する予定である。次年度使用額が発生した理由は、研究発表が延期となったこと、解析ソフトの購入にあたり内容を比較検討し年度内に購入できなかったことである。使用計画として、解析ソフト、および、個人情報保護を目的とした分析専用のノートパソコンを購入する。国際学会への参加を検討する。
生産者米価の低落が水田利用経営の大規模化に及ぼす影響に関する研究

1.本年度は上記の課題に関し、文献的、統計的研究を行なった。第一に既存の研究成果の収拾・分析・整理を行った。特に生産者米価の低下や農地制度の修正等と水田の貸借・売買との関係に関する記述的・計量的分析結界を収集・分析・整理した。第二に、水田の需要サイドと供給サイドの需給行動の計量分析を行うための県別・地帯別・全国の農地価格、転用価格、地代、農地売買面積・件数、農地貸借面積・件数、要素価格、生産費等の時系列デ-タを農業会議所、農水省、不動産研究所等の資料により、デ-タ・ベ-スとして形成した。第三に、形成されたデ-タ・ベ-スに基づき、生産者米価の低下、農地制度・土地税制の変化、稲作技術の変化、要素価格の変化等が水田の貸借・売買行動と稲作経営の規模拡大にどの様な影響を与えるかという問題を明らかにするため、稲作経営の水田貸借・売買行動に関する試行的理論モデル及び計量モデルを構築しその推定を行なった。第四に、生産者米価とコメ米生産費の相互規定性に鑑み、日本・タイ・アメリカの三国のコメ生産費が稲作経営規模・技術・コメ生産性、要素価格及び為替レ-トによりどのように規定されてきたかを、長期時系列的に国際比較分析し、生産者米価の低下とコメ生産費及び稲作経営規模との関係に関する国際的比較検討を行なった。なお本研究は萌芽的研究のカテゴリ-で採択されており、上述の計量的計測結果は未だ試行的であり論文として発表するには至っていない。2.上の文献的・統計的研究を補完するため、本年度には北海道空知、山形庄内、佐賀の稲作地帯において稲作経営の水田貸借・売買行動に関する実態調査及び東京で農水省等において農地制度・土地税制の変化に関する服き取り調査を実施した。
英語史研究支援の異写本パラレル・テクスト・コーパス

古英語から中英語へのいわゆる「移行期」は英語の受難期でもあり、文献が乏しくこれまで研究は困難とされてきた。その研究の可能性を探る試みは異写本資料の比較研究を援用するとき大きな進展を見た。英語史研究の大きな課題である「英語散文の連続性」の問題の解明もこの「移行期」の言語状況の解明なしには不可能で、異写本資料比較研究の果たす役割はその意味でも重要である。13世紀初頭英国西中部方言域で成立のAncrene Wisse『修道女案内』(以下AW)は「移行期」のほぼ最終端に位置し、「英語散文の連続性」の問題を解明、検証する上で、きわめて重要であることは多言を要しない。本研究課題はそのAWコーパスの作成を課題とする。比較的長編であり異写本資料の数の多さのためなお時間を必要とするが、完成の暁には、13-15世紀の英国西中部方言域における言語的実態の通時的・共時的研究、ひいては社会史的、文化史的研究全般に対し、研究のための確固たる基盤を提供することは明らかである。そのパラレル・テクストはその時期の方言域の英語史的言語変化・変異に関する情報を一目瞭然な形で提供する。パイロット・スタディの役割を担うこのAWコーパスに呼応して各方面において同種の正・異写本パラレル・テクスト・コーパス作成作業が13世紀の他の作品群、また、その前後の時期の作品について行われ、それらとの比較が可能となるとき、さらに資料的価値が高められるばかりでなく、「移行期」およびその前後の時期の英語史研究はその厳密性を飛躍的に増すこととなるはずである。Ancrene Wisse(『修道女案内』以下AW)は「移行期」のほぼ最終端に位置し、「英語散文の連続性」の問題を解明、検証する上で、きわめて重要であることは多言を要しないであろう。本研究課題によってAWコーパスが完成するとき、13世紀初頭から15世紀にかけての英国西中部方言域における音韻、綴字、形態、統語法、句読法、語彙、文体等にわたる通時的研究はもちろん、方言研究、ひいては社会史的、文化史的研究全般に対し、研究のための確固たる基礎を提供することは明らかである。そのパラレル・テクストはその時期の方言域の英語史的言語変化情報を一目瞭然な形で提供する。また、AWには同時代の羅仏訳があり、それらとの比較参照を容易にすることは当時の言語生活の状況の実態を理解する上できわめて有効であろう。パイロット・スタディの役割を担うこのAWコーパスに呼応して各方面において同種の異写本パラレル・テクスト・コーパス作成作業が13世紀の他の作品群、また、その前後の時期の作品について行われ、それらとの比較が可能となるとき、さらに資料的価値が高められるばかりでなく、「移行期」およびその前後の時期の英語史研究はその厳密性を飛躍的に増すこととなるはずである。本年度は、第3,4章の写本テクストの検討と入力、校正作業を中心に進め、同時に前期の研究成果として公刊したElectronic Parallel Diplomatic Manuscript Text of the AW,Preface,Parts I&II:a printed trial version(1997)の改訂作業を行った。その研究成果の発表は、池上、小野、田辺が1998年8月マンチェスターで開催の第10回国際英語史学会において一部行ったほか、上記の1997年版を増補改訂し、序文および第1-3章を収録した1999年版としてその中において行うべくその公刊に向けて編集準備作業を行った。13世紀初頭英国西中部で成立のAncrene Wisse(『修道女案内』以下AW)は「移行期」のほぼ最終端に位置し、「英語散文の連続性」の問題を解明、検証する上で、きわめて重要である。