hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
総義歯補綴の臨床的評価に関する研究

上顎無歯顎患者を被験者とし,Wilhelmら(1992年)の方法に準じてHAAGテンションゲージ(ジャモス)を用いて,上顎総義歯の維持力を計測し,測定方法の妥当性および患者の上顎義歯の維持安定性に対する主観的評価と維持力測定値との関連性について検討し,以下の結果を得た.1.Wilhelmらの報告した維持力計測方法は,上顎中切歯舌側面にテンションゲージを用いて回転力を加え,上顎義歯が後方部から離脱した時の力を維持力とするものであるが,上顎総義歯の前方弓状部の床翼の長さに影響を受けるため,本研究ではこの計測とともに,上顎総義歯の上唇小帯切痕に下方向への力を加えたときの離脱力も同時に計測した.これらの計測方法は,測定のための特別な義歯調整もいらず,短時間に計測が終了できるため患者の負担も少なく,また測定値のばらつきも±20N程度であることから,臨床サイドでの維持力の評価方法としてかなり有用な方法であると考えられた.2.各被験者の計測値は,義歯の咬合状態・計測直前のかみしめの程度・測定時の開口量によって影響を受けるため,計測誤差も含めた測定値のばらつきは認められたが,平均値とともに計測値の範囲を比較することにより,被験者間の比較は可能であると考えられた.3.各被験者の維持力は,100N以下から1000N以上までと様々であり,同一被験者における2つの計測方法による差も認められた.現義歯の維持力に対して患者自信が不満を持つ症例では,その維持力は200N以下であったが,1000N以上の大きな維持力を示した症例においても`強すぎる'と判断する患者は認められなかった.また旧義歯と新義歯,リベース前後の維持力の変化を数値として比較することも十分可能であった.上顎無歯顎患者を被験者とし,Wilhelmら(1992年)の方法に準じてHAAGテンションゲージ(ジャモス)を用いて,上顎総義歯の維持力を計測し,測定方法の妥当性および患者の上顎義歯の維持安定性に対する主観的評価と維持力測定値との関連性について検討し,以下の結果を得た.1.Wilhelmらの報告した維持力計測方法は,上顎中切歯舌側面にテンションゲージを用いて回転力を加え,上顎義歯が後方部から離脱した時の力を維持力とするものであるが,上顎総義歯の前方弓状部の床翼の長さに影響を受けるため,本研究ではこの計測とともに,上顎総義歯の上唇小帯切痕に下方向への力を加えたときの離脱力も同時に計測した.これらの計測方法は,測定のための特別な義歯調整もいらず,短時間に計測が終了できるため患者の負担も少なく,また測定値のばらつきも±20N程度であることから,臨床サイドでの維持力の評価方法としてかなり有用な方法であると考えられた.2.各被験者の計測値は,義歯の咬合状態・計測直前のかみしめの程度・測定時の開口量によって影響を受けるため,計測誤差も含めた測定値のばらつきは認められたが,平均値とともに計測値の範囲を比較することにより,被験者間の比較は可能であると考えられた.3.各被験者の維持力は,100N以下から1000N以上までと様々であり,同一被験者における2つの計測方法による差も認められた.現義歯の維持力に対して患者自信が不満を持つ症例では,その維持力は200N以下であったが,1000N以上の大きな維持力を示した症例においても`強すぎる'と判断する患者は認められなかった.また旧義歯と新義歯,リベース前後の維持力の変化を数値として比較することも十分可能であった.
グローバル・インテグレーションを目指した薄膜マイクロ電池材料の開発

本研究では、まず、既存のゾルゲル・ディップコート法やスパッタ法により(1)面積1cm2、厚さ200νm程度の薄膜電池の試作をおこなう。さらに、エキシマ・レーザーによるレーザー安武レーション装置を用い、(2)面積1mm2、厚さ100mm程度のうすまくマイクロ電池の試作を目指した。電池系として、大気中での操作力河能な銀系を用い、多層薄膜電池の試作と、基本枝術の確立を行い、その成果を基に、よりエネルギー密度の高い、リチウム系・ナトリウム系等への拡張を行った。最大の課題と見ていたアモルファス固体電解質薄膜については、試みた結果、既知のオキシハライド系、オキリカルコゲナイド系ガラスなどが最適な材料となりそうである。薄膜評価は、既設の顕微ラマン、FT-IR/ATR、薄膜X線、蛍光X線、走査電子顕微鏡等により行い、電池特性は既設の電気化学・インピーダンス測定装置にて解析した。これらの結果を基に、薄膜マイクロ電池としての微小化の限界や、他の素子とのグローバル・インテグレーションについて評価・検討を行った。
結び目のデーン手術によるレンズ空間の構成

結び目のデーン手術とは,3次元多様体を生成する基本的な手法である。本年度は,双曲型結び目のデーン手術によるレンズ空間の生成に関する研究を行った。双曲型以外の結び目に対しては,レンズ空間の生成問題は完全に解決されている。双曲型結び目のデーン手術によって,いつどんなレンズ空間が得られるかいう問題の全貌を明らかにすることは依然として困難なことである。現在までに,散発的な現象が知られているに過ぎない。本研究は,結び目の種数という全く新しい観点から,レンズ空間の生成問題を捉えたものである。研究実施計画の段階では,結び目の種数を1に制限し,さらにレンズ空間の形をも限定する予定であったが,これらの制限を行わずに十分な成果をあげることができた。本年度の主な成果は次の2点である。1.種数gの双曲型結び目のデーン手術によってレンズ空間が生じる場合,そのレンズ空間の基本群の位数は,12g-7以下でなければならない。2.種数1の双曲型結び目のデーン手術によってレンズ空間は得られない。また,本研究を進める段階において,合成型結び目および双曲型結び目のデーン手術によるクラインボトルの生成問題に関する研究に対してもまた,関連課題としていくつかの成果を得ることができた。残念ながら,1の評価は最適とは思われない。今後は,この評価を改善してゆくことが課題となる。本年度の研究実施計画では、種数1の双曲型結び目のデーン手術によるレンズ空間の生成に関する研究を行うこととした。種数1の結び目のデーン手術によって、位数2の基本群をもつレンズ空間は得られないこと、およびクラインボトルを含むレンズ空間は得られないことをすでに証明している。いずれの場合も、レンズ空間に含まれる向き付け不可能閉曲面を本質的に利用した結果である。レンズ空間は、2つのタイプに大別される。基本群の位数が偶数のものと奇数のものである。前者は、向き付け不可能閉曲面を許容するが、後者はそうではない。本年度の目標は、前者のタイプのレンズ空間は、種数1の双曲結び目のデーン手術によって得られないという予想を証明することであったが、この予想の完全な解決には至っていない。しかし、先に述べた結果を導く議論をさらに進めることにより、部分解決を得ることができた。1つは、レンズ空間が含む最小種数向き付け不可能閉曲面と、手術によってはりつけたソリッドトーラスは1度しか交われないこと、そして2つめは手術のスロープに関する上界を与えることができたことである。これにより、これまで知られていなかった無限に多くのレンズ空間について、種数1の双曲型結び目のデーン手術によっては得られないことが証明できた。また、これらの議論の副産物として、今年度さらに2つの結果を得た。1つは、種数1の結び目のデーン手術によってクラインボトルを含む3次元多様体が生成されるのならば、その結び目はダブル型結び目でなければならないことである。これにより、クラインボトルの生成とレンズ空間の生成は両立できないことも証明できた。2つめとして、合成型結び目のデーン手術によってクラインボトルを含む3次元多様体が生成される場合、その合成型結び目は2-ケーブル型結び目2つの連結和でなければならないことを証明した。
抗免疫エスケープ腫瘍ペプチドワクチンの開発

がん細胞に対する免疫応答(CD8+ T細胞応答)は臨床的にも治療効果をもたらすが、その一方で免疫応答から逃避するがん細胞の存在が知られており、そのメカニズム解明が重要である。本研究では非小細胞肺がん患者のがん組織を解析し、全体の70%以上にtapasin発現低下が認められること、さらにtapasin発現低下は予後悪化と関連するリスクファクターであることを示した。さらにがん細胞モデルを用いた検証から、tapasin欠損によりCD8+ T細胞の標的であるがん抗原ペプチドの産生量が低下することで、がん細胞に対するCD8+ T細胞応答低下を招いているメカニズムを明らかとした。腫瘍を標的としたペプチドワクチン治療はその簡便さと普及性に加えて副作用の少なさからも新しい治療法として期待される。腫瘍抗原ペプチドは腫瘍細胞のMHCクラスI上に提示され、宿主のCD8+T細胞(あるいはcytotoxic T lymphocyte、CTL)はこれらを認識し特異的に傷害することが可能である。しかしながら、多くのヒト癌組織でMHCクラスI抗原プロセシング関連分子であるtapasinが発現低下しMHCクラスI低下を招いていることが明らかとなってきている。これらtapasin欠損型の腫瘍は多くのCTL認識を回避する免疫エスケープバリアントと考えられ、CTL治療を考えるうえで大きな問題点となり得る。本研究では、このようなエスケープバリアント腫瘍を特異的に標的可能な抗原ペプチドの同定を主眼としている。当該年度では、マウスモデルを用いて、tapasin欠損細胞に対する特異的なCD8+T細胞応答が惹起できること、これは従来知られている多くの腫瘍抗原とは異なったユニークな免疫応答であることを確認した。今後はこのような新しいタイプの抗原ペプチドの同定を継続し、腫瘍に対するペプチドワクチン治療モデルへと応用をすすめていく。腫瘍抗原ペプチドは腫瘍特異的なCTL応答を惹起し抗腫瘍免疫応答の中心的役割を担うが、多くの腫瘍細胞においてこれら抗原ペプチドをつくりだすためのプロセシング機構の異常が報告されている。本研究ではとくに広く知られているtapasin異常・発現低下した腫瘍細胞に焦点をあて、通常のCTL応答をエスケープするこれら腫瘍バリアントを対象とした新しい腫瘍抗原の同定・ペプチドワクチン開発を目指す。当該年度ではヒト大腸がんSW480およびヒト肺がんLHK2細胞株からそれぞれtapasin欠損バリアントをCRISPR/Cas9システムを用いて作成し、既知の内在性腫瘍抗原に対するCTL応答を確認した。いずれの細胞株でもsurvivin2B抗原の遺伝子発現に変化がないものの、tapasin欠損バリアントに対するsurvivin特異的CTL反応が大きく低下する結果となった。また同時に、非小細胞肺癌85症例において免疫組織化学検討を行ったところ、約70%でtapasin発現低下が認められ、これは腫瘍浸潤CD8+T細胞の低下を伴って患者生存率低下と有意な相関性を示した。以上から、本年度においてはtapasin単独欠損によるCTL応答の低下をヒトがん細胞モデルで実証し、臨床データ・患者予後との関連性を示すことができた。肺がん、大腸がんを含め多様な腫瘍プライマリー組織におけるtapasin発現低下が報告されており、CD8+T細胞浸潤割合の低下と相まって患者予後への影響が示唆されてきたが、これまでにヒトがん細胞モデルを用いたCTL応答の検討はなされていなかった。当該年度においてはヒト肺がんおよび大腸がん細胞株のtapasin欠損バリアントを作成し、さらに内在性腫瘍抗原に対するCTL応答低下を実験モデルではじめて実証することができた。非小細胞性肺がん患者がん組織85例を免疫染色にて検証したところ、約73%の症例においてtapasinの発現低下が認められた。興味深いことに、tapasin発現低下および腫瘍部へのCD8+細胞の浸潤低下はともに患者生存期間低下と有意に相関し、tapasin発現とCD8+細胞浸潤でも相関性が認められた。Tapasin発現低下とCTL抗腫瘍応答を検証するために、ヒト肺がん細胞株(LHK2)およびヒト大腸がん細胞株(SW480)からそれぞれtapasin欠損株、YS3と3G12を作成した。YS3はLHK2とほぼ同等に既知のがん抗原survivinを発現するものの、YS3に対するHLA-A24拘束性survivin 2B特異的CTLの反応は著しく低下する。また3G12とSW480も同程度にsurvivnおよびcep55がん抗原を発現するものの、survivin 2B特異的CTLおよびcep55特異的CTLいずれもSW480のみに反応し、3G12には反応しない。さらにSW480および3G12を免疫不全マウスに移植し、cep55特異的CTLを輸注したところ、SW480腫瘍増殖は抑制されたが、3G12腫瘍は抑制されず増殖を続けた。一方で、生化学的手法によりSW480と3G12それぞれの細胞抽出液中に含まれるsurvivin 2Bおよびcep55ペプチドを定量すると、いずれのペプチド産生量も3G12では大きく低下する結果となった。以上から、tapasin発現低下は内在性がん抗原のプロセシング阻害を引き起こし、この抗原プロセシング異常によりHLA提示ペプチドが減少し、結果的に腫瘍のCTL応答エスケープにつながるメカニズムが明らかとなった。

本研究では非小細胞肺がん患者のがん組織を解析し、全体の70%以上にtapasin発現低下が認められること、さらにtapasin発現低下は予後悪化と関連するリスクファクターであることを示した。さらにがん細胞モデルを用いた検証から、tapasin欠損によりCD8+ T細胞の標的であるがん抗原ペプチドの産生量が低下することで、がん細胞に対するCD8+ T細胞応答低下を招いているメカニズムを明らかとした。1.Tapasin欠損細胞を特異的に認識するCD8+T細胞ハイブリドーマの樹立:これまでにtapasin欠損マウス由来脾細胞をMHCマッチした野生型マウスに免疫することにより、tapasin欠損細胞を特異的に認識するCD8+T細胞が繰り返し誘導できている。結果は免疫の後のCD8+分画におけるIFN-gamma産生アッセイで確認した。誘導したCD8+T細胞を用いてハイブリドーマ化(細胞フュージョン)を試行しているが、現時点でハイブリドーマは作成できていない。ひとつの原因として、免疫マウスに含まれる目的CD8+T細胞の割合が少ないことがあげられる(脾細胞の1%前後)。目的細胞のフュージョン効率をあげるために、現在はIFN-gamma産生細胞をセルソーターで単離濃縮し、その後にフュージョンを行う方法へ切り替えて継続中である。2.ヒト大腸がん細胞株SW480のtapasin遺伝子欠損株の作成:Tapasin欠損したヒトがん細胞に対するCD8+T細胞応答の変化を並行して解析している。この目的のために、当該年度ではCRISPRシステムを用いてヒト大腸がんSW480細胞のtapasin遺伝子欠損株を作成できた。同遺伝子の欠損は、樹立した細胞株のtapasin遺伝子配列解析、およびウエスタンブロットによるタンパク発現の欠損の2つの方法で確認できた。以上から、ハイブリドーマ化がまだ未完であるものの、研究計画としてはおおむね順調に進展していると考える。抗原提示異常とくにtapasin発現低下細胞におけるCTL応答低下をペプチド分子レベルで解明したい。さらに本研究の主眼であるこれらCTLエスケープバリアント腫瘍に対する新しい免疫応答と新規ペプチドワクチン開発を目指す。前年度までのマウスtapasin欠損モデルに加えて、今回ヒト大腸がんおよび肺がん細胞株でtapasin欠損モデルが確立できたことを踏まえ、とくにヒトがん細胞モデルを用いて細胞表面でのペプチドレパートリーをマススペクトロメトリーで網羅的解析し、tapasin発現有無によるHLAクラスIリガンドームの変化を解析する。さらにtapasin欠損腫瘍にのみ提示されるユニークなペプチドを選定し、HLA結合能およびヒトPBMCからのCTL誘導による抗原性確認を行い、ワクチン候補として開発をすすめていく。腫瘍免疫Tapasin欠損細胞を特異的に認識するユニークなCD8+T細胞のリガンド同定を目的として、同CD8+T細胞のハイブリドーマ化を目指す。前述したセルソーターの組み合わせなど手法的な変更・改善を組み入れているもの、実験計画の流れには全く変更はない。
十八世紀フランスの思想と文学の相関関係

本研究は、十八世紀フランスの先鋭的な思想家たちの特にフィクション作品群の形式と内容の相関関係を検証することに努めた。その結果、主に、(1)モンテスキューの書簡集小説『ペルシア人の手紙』が、書簡、翻訳、寓話、風刺などの文学的な仕掛けを介して表現しようとする専制批判の思想、(2)ディドロの小説群が、語り、筋、対話、比喩などの文学的な仕掛けを介して語ろうとする人間存在の限界の認識、を解明することができた。本年度は、計画どおりモンテスキューの『ペルシア人の手紙』を取りあげ、この作品の複数のエディションを網羅的に検討し、部分的な翻訳も実践しながら作品の精読を試みた。具体的には、複数の文通者によるフィクションの書簡集という文学的形式を介して、哲学、政治、経済、道徳に関する多方向的な思考を表現するこの作品独自の方法論を詳細に分析し、それを通じて、思想内容とその表現形式の間に、それ以前のいかなる思想的・文学的系譜にもなかった新たな関係を構築しようとするモンテスキューの思考実験が見出されることを明らかにした。さらに、このような文学的形式を介して思想を語るモンテスキューめ方法論め根底に、「もはや新たに語るべき独創的な思想内容など存在するのか?」という原理的な問題意識が流れていることを跡づけながら、『法の精神』に関する思想史的アプローチにばかり傾きがちなモンテスキュー研究の動向に対して、「思想史と文学史の総合」という新たな研究方法の可能性を示すことができた。また、以上の研究の進展を踏まえながら出版した著書『ディドロ限界の思考』(博士論文に加筆・修正を施したもの)においては、「人間の理性の限界」という思想的問題を、複雑な文学的仕掛けを駆使しながら表現するディドロの小説作品群の方法について、様々な視点から検討を施した。これは、日本で初めてディドロのフィクション作品群の特徴を俯瞰することに成功した研究成果であり、筆者の目指す「思想史と文字史の総合」に向けた重要な第一歩と位置づけることができるものである。以上の点で、いまだに積み残した課題(モンテスキューにおける「神」の位置づけの問題など)は多いものの、本年度は着実な成果をあげることができたと言える。今年度は、18世紀フランスにおける思想と文学の相関関係を幅広く検証するという研究の目的を着実に実践し、研究内容、社会的評価の両面で大きな前進があった。研究内容の面では、(1)前年度に引き続き、モンテスキューの『ペルシア人の手紙』(1721年)における政治思想(専制批判)とフィクションの構造(書簡、寓話)の関係を明らかにする試み、(2)ディドロの『自然の解明に関する断想』(1753年)における科学思想(自然学、物理学、化学)と文学形式(断片、寓話、補遺、夢想)の関係を明らかにする世界初の試み、(3)ヴォルテールの『寛容論』(1763年)における政治思想(寛容論、国家統治)と文学形式(演劇的叙述)の関係を明らかにする世界初の試み、(4)前項の研究に基づき、17世紀から現代までの寛容思想の系譜、およびその系譜におけるヴォルテール独自の立ち位置を明らかにする試み、の4点について、研究の萌芽や進捗があった。具体的な成果としては、(1)との関連で『ペルシア人の手紙』の一部翻訳の発表、(4)との関連で寛容思想の系譜をたどる論文の執筆等を挙げることができる。また(2)と(3)については、来年度中にそれぞれ論文を発表する予定である。一方、社会的評価の面では、2010年6月、本科研費の成果として出版した著書『ディドロ限界の思考』(風間書房、2009年)が第27回渋沢・クローデル賞特別賞を受賞したことにより、新聞、雑誌、講演等を通して、ディドロの思想と文学の相関関係をめぐる自らの研究について広く発信する機会を持つことができた。このことは、「理性中心主義」「合理主義」などの安直な紋切型のもとで一括されてきた18世紀フランスに新たな光を当てるという当初の課題に照らして、これまで進めてきた研究が実質的な成果を挙げたことを意味している。この他、前年度より続けてきた18世紀研究の基本資料の収集に関しても、着実に進めることができた。今年度は、十八世紀フランスにおける思想と文学の相関関係を幅広く検証するという研究の目的に向かって、一定の前進を見た。研究内容の面では、(1)前年度に引き続き、ディドロの『自然の解明に関する断想』(1753年)における科学思想(自然学、物理学、化学)と文学形式(断片、寓話、補遺、夢想)の関係を明らかにする世界で初めての試み、(2)ディドロが編集を担当した『百科全書』における思想と文学の相互作用に関する検証、(3)十八世紀フランスの思想と文学の相関関係を検討するうえで必要と思われる、当時の文化史に関する俯瞰的な研究、(4)ディドロの美学理論と文学的方法の関係に関する検証、の4点について研究の萌芽や進展があった。

具体的な成果としては、(1)に関して、来年度、論文を3本程度発表する予定である。(2)に関しては、フランスのディドロ研究誌に、共著の短いフランス語論文が掲載された。(3)に関しては、来年度に刊行予定の『フランス文化事典』(丸善ライブラリー)に寄稿した5項目が校正作業を終了している。(4)に関しては、同じく来年度に刊行予定の『ディドロ著作集』(法政大学出版局)に寄稿した翻訳と解題がもうすぐ校正に入るはずである。そのほかにも、同じディドロ研究者、大橋完太郎氏の大著『ディドロの唯物論』(法政大学出版局)の刊行を機に、「理性中心主義」「合理主義」といった安直な紋切型では捉えきれないディドロの思想と文学の方法について、書評を執筆したり、シンポジウムにパネリストとして参加したりすることで、人文系の研究者間の交流も深めることができた。また、前年度より続けてきた十八世紀研究の基本資料の収集に関しては、とりわけ当時の「科学思想」に関連する文献を集める作業に着手することができた。本研究は、十八世紀フランスの先鋭的な思想家たち(モンテスキュー、ヴォルテール、ルソー、ディドロ)が、神学的世界観の崩壊によって生じた思想的危機を乗り越えるために、さまざまな文学的形式を介してみずからの思想を表現するという画期的な方法を創出したことを跡づけ、再評価することを第一の目標とした。また、この検証作業を通じて、十八世紀フランス文化の特異性を明らかにし、いまだに根強く残るこの時代への思想史的・文学史的偏見を一掃するとともに、「思想史と文学史の総合」という人文科学の普遍的な課題にひとつの道筋を切り開くことを第二の目標とした。この二つの目標を達成するために、本研究は、十八世紀フランスの思想家たちのフィクション作品における言説編成とその美学的・イデオロギー的効果を検証するという方法を選択した。具体的に言えば、この方法は以下の二つに大別することができる。(1)フィクション作品群におけるメタ言説的・自己解説的な言表の分析を通して、言説編成の仕組みを解明する。(2)前述の言説編成に基づいて組織される修辞技法、詩的想像力、物語の構造、文学ジャンルの設定(演劇、対話、寓話、書簡、風刺、断片、小説)などが、作品の思想内容そのものにどのような仕方で、いかなる変容を迫っているのかを解明する。以上の方法に基づき、(1)モンテスキューの書簡小説『ペルシア人の手紙』における政治思想(専制批判)と文学的仕掛け(書簡集、翻訳、寓話、風刺)の相関関係、(2)ディドロの小説作品群における思想(人間の理性の限界の認識)と文学的仕掛け(語り、筋、比喩、描写)の相関関係、(3)寛容思想の系譜におけるヴォルテールの位置づけ、とりわけ演劇的な構造を介して寛容思想を語る主著『寛容論』の思想史的位置づけについて、具体的な研究成果を挙げた。ただし、ルソーの研究に関しては多くの課題を残している。当初の計画では、3年目までの間に、ディドロ、ヴォルテール、モンテスキューにおける思想と文学の相関関係について研究を進めるということが目標であった。この目標はおおむね達成されていると言ってよい。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画では、ルソー、サド、ラクロなどの諸作品に関する検証も進めることを目指していた。しかし、2011年3月11日の原発震災以降、18世紀の思想と文学の相関関係を歴史的に問うばかりではなく、現代をも照らし出すような問題提起性について考察する試みが必須であるとの確信を抱くにいたった。
励起癌細胞の蛍光スペクトル分析検診法の研究

研究の目的蛍光プローブ法を用いて,短時間で迅速に癌細胞を自動的に識別し得る計測学的細胞診を提供する目的で,レーザー励起蛍光スペクトル分析システムを開発した.また,細胞レベルにおける蛍光スペクトル上で,特異的に識別するため各種の蛍光色素を用い,種々の細胞を標本にして各種のスペクトルを測定することも目的である.研究の経過及び成果最近の医療技術の進歩により,難病である癌も,早期に発見することにより,治療可能になってきている.しかし,現在行われている形態学的診断では集団検診は困難である.著者らはそのために自動大量測定可能な分光学的診断システムを開発している.スライドガラス上に塗布した主体細胞を直ちに蛍光プローグ用色素で染色し, 1時間未満の放置の後,レーザー照射を行い,蛍光スペクトルを観測するための,レーザー励起差分蛍光分光システムを試作した.資料細胞に各種培養細胞を用いて,蛍光プローグ色素にはヘマトポルフィリン誘導体などを採用して,癌性判断の基礎となる蛍光スペクトルデータを種々の条件で測定した.その結果,正常細胞と顕著に異なる癌性細胞特有のスペクトル形や蛍光強度,さらには波長シフトなどが見いだされた.また,スライドガラス上の細胞分布なども本システムを用いることで測定可能なことがわかった.本年度試みた肺癌患者からの生検では,腫瘍親和性に基づく蛍光強度と波長シフトが見いだされ本システムの有用性もたしかめられた.今後,さらに生検のデータを蓄積して癌床応用を試みるつもりである.研究の目的蛍光プローブ法を用いて,短時間で迅速に癌細胞を自動的に識別し得る計測学的細胞診を提供する目的で,レーザー励起蛍光スペクトル分析システムを開発した.また,細胞レベルにおける蛍光スペクトル上で,特異的に識別するため各種の蛍光色素を用い,種々の細胞を標本にして各種のスペクトルを測定することも目的である.研究の経過及び成果最近の医療技術の進歩により,難病である癌も,早期に発見することにより,治療可能になってきている.しかし,現在行われている形態学的診断では集団検診は困難である.著者らはそのために自動大量測定可能な分光学的診断システムを開発している.スライドガラス上に塗布した主体細胞を直ちに蛍光プローグ用色素で染色し, 1時間未満の放置の後,レーザー照射を行い,蛍光スペクトルを観測するための,レーザー励起差分蛍光分光システムを試作した.資料細胞に各種培養細胞を用いて,蛍光プローグ色素にはヘマトポルフィリン誘導体などを採用して,癌性判断の基礎となる蛍光スペクトルデータを種々の条件で測定した.その結果,正常細胞と顕著に異なる癌性細胞特有のスペクトル形や蛍光強度,さらには波長シフトなどが見いだされた.また,スライドガラス上の細胞分布なども本システムを用いることで測定可能なことがわかった.本年度試みた肺癌患者からの生検では,腫瘍親和性に基づく蛍光強度と波長シフトが見いだされ本システムの有用性もたしかめられた.今後,さらに生検のデータを蓄積して癌床応用を試みるつもりである.
ATL・エイズの母子感染防止ワクチン及び感染成立の分子論とウイルスRNA証明研究

本年度は主にレトロ(エイズ・ATL)ウイルスのワクチン開発を目的としたウイルス蛋白外穀の構造解析のためのデータ入力及び計算のための(ソフトウェア、ハードウェア及び人的)環境整備を行うことができた。概に米国の研究機関大学では限界はあるが、他のウイルスの構造解析において力を発揮しているスーパーコンピュータの科学データ可視化プログラムによるウイルス蛋白外穀の電子密度解析を日本アイビ-エムマルチメディアデベロッパークラブテクニカルグループを組織し、同アイビ-エム研究所(神奈川県大和市)のPVS(power visualitation computer system)を用いて行う研究プログラムを構築した。尚、同PVSは本年はpower PC cpvを数十個搭載したsystemにコンパクトにかつ性能アップさせた、よりComputer解析、ウイルス蛋白外穀の電子分布のdigitalマップを完成しうるものとなる予定である。
抗CD40Lモノクローナル抗体を用いた新しい免疫抑制療法の開発

本研究の目的は、我々が開発した天疱瘡モデルマウスを用いて、抗CD40L抗体の予防的、治療的効果を判定し、抗CD40L抗体の臨床的応用を目指した基礎実験を行うことである。CD40-CD40L阻害による自己免疫反応抑制は皮膚科領域の疾患の中で評価されたことがなく、抗CD40L抗体の効果を評価しその免疫抑制作用機序を解析することにより、臨床に還元できる新たな特異的免疫抑制療法の開発につながる。平成15年度は、既に発症した天疱瘡モデルマウスにMR1を投与し、その治療効果を評価した。表現型の推移を天疱瘡スコアにて評価したが、MR1を投与したマウスは投与開始後42日にスコア値の低下を認めたがコントロールとの間に有意差を認めなかった。また組換えDsg3を抗原として用いたELISA法にて、Dsg3に対する抗体価はMR1投与マウスとコントロール共に投与開始から減少傾向が認められたが、両群の間に有意差を認めなかった。免疫を施さずに発症させた、ナイーブ脾細胞を用いて発症させた天疱瘡モデルマウスについても同様の検討を行ったが、表現型・抗体価ともにMR1投与マウスとコントロールとの間に有意差を認めなかった。以上のことから、一度抗体産生が開始した後ではCD40/CD40L相互作用を阻害するだけで抗体産生を抑制し、症状の改善を期待するのは難しいと考えられた。しかし平成14年度の結果から、抗体産生初期の時点でのMR1投与は、形態学的・病理組織学的に有効であり、また抗体産生抑制作用を明らかに,示した。重症な天疱瘡の治療において、ステロイド単剤では治療に難渋することが多い。MR1はステロイドや他の免疫抑制剤との併用により、抗体産生抑制作用の一助となり得、有効な治療薬として期待できると考えられた。CD40-CD40L阻害による自己免疫反応抑制は皮膚科領域の疾患の中で評価されたことがなく、抗CD40L抗体の効果を評価し、その免疫抑制作用機序を解析することにより、臨床に還元できる新たな特異的免疫抑制療法の開発につながる。平成14年度は、発症前の天疱瘡モデルマウスに抗マウスCD40Lモノクローナル抗体(以下MR1)を投与し、MR1の予防的効果を評価した。MR1を投与したマウスはコントロールに比して、形態学的には体重減少を認めず、脱毛・びらんを生じなかった。病理組織学的には、硬口蓋より採取した口腔粘膜組織のHematoxylin-Eosin染色および蛍光染色を行ったが、天疱瘡に特徴的な水疱形成を認めず、表皮細胞間に抗体の沈着を認めなかった。また組換えDsg3を抗原として用いたELISA法にてもDsg3に対する抗体価の上昇を認めず、ELISPOT法にて抗Dsg3抗体生産B細胞数を計測したが、脾臓・骨髄・リンパ節の全てにおいて有意に減少していた。Dsg3に対する免疫寛容を獲得していないDsg3-/-マウス由来の脾細胞(T細胞、B細胞)を移植すると、レシピエントマウス内において内因性のDsg3と出会い、Dsg3に対するIgG抗体を持続的に産生することになるが、以上の結果よりMR1はCD40-CD40L阻害により天疱瘡の発症を予防することが示された。平成15年度は、既に発症した天疱瘡モデルマウスにMR1を投与し、その治療効果を評価する予定である。
富栄養化海域の自立的環境修復を促す生態系工学技術(汎用性と藻場機能付加)の開発

平成17年冬季にワカメの種をつけたロープを尼崎の3つのプラントの床に設置し,(1)水質調査,(2)成長過程,(3)生物相について比較検討を行った.(1)水質ワカメの成長に最も影響の与える光量子束密度は,プラントA(DL-0.5m),プラントB(DL-1.0m),プラントC(DL-1.5m)の順に,115,110,87μmol/m2/secであり,水深が大きくなるにしたがって,その値は小さくなり,海藻の成長のための条件は悪化していた.(2)成長過程2004年12月設置時のワカメの藻長は7.6±3.6cmであった.2005年3月2日回収時にはプラントAでは58.6±31.6cm,プラントBでは60.0±37.4cm,プラントCでは50.0±27.3cmとそれぞれ成長していた.各プラントでのワカメの大きさを比較すると,プラントB, A, Cの順となっていた.プラントCで成長が悪かったのは,光条件が悪いためであるが,プラントAでは水深が浅く,波の影響を受けやすかったことがやや成長が悪かった原因と思われる.(3)生物相直立の壁面では,イソカイメン属,ウスカラシオツガイ,オウキムシロ科,カタユウレイボヤなど懸濁物を食する生物が優占していたが,ワカメの葉上では肉食生物のイボニシ,堆積物食生物のフトメリタヨコエビ,カマキリヨコエビ,クビナガワレカラなど多様な藻場に出現する生物が認められた.またワカメの乾燥重量と葉上動物の湿重量の間には正の相関が見られた.以上のことから,藻場が消滅した大阪湾の湾奥であっても適当な浅場を設けるとワカメは生育し,そこに藻場特有の生物相が形成されることがわかった.平成17年冬季にワカメの種をつけたロープを尼崎の3つのプラントの床に設置し,(1)水質調査,(2)成長過程,(3)生物相について比較検討を行った.(1)水質ワカメの成長に最も影響の与える光量子束密度は,プラントA(DL-0.5m),プラントB(DL-1.0m),プラントC(DL-1.5m)の順に,115,110,87μmol/m2/secであり,水深が大きくなるにしたがって,その値は小さくなり,海藻の成長のための条件は悪化していた.(2)成長過程2004年12月設置時のワカメの藻長は7.6±3.6cmであった.2005年3月2日回収時にはプラントAでは58.6±31.6cm,プラントBでは60.0±37.4cm,プラントCでは50.0±27.3cmとそれぞれ成長していた.各プラントでのワカメの大きさを比較すると,プラントB, A, Cの順となっていた.プラントCで成長が悪かったのは,光条件が悪いためであるが,プラントAでは水深が浅く,波の影響を受けやすかったことがやや成長が悪かった原因と思われる.(3)生物相直立の壁面では,イソカイメン属,ウスカラシオツガイ,オウキムシロ科,カタユウレイボヤなど懸濁物を食する生物が優占していたが,ワカメの葉上では肉食生物のイボニシ,堆積物食生物のフトメリタヨコエビ,カマキリヨコエビ,クビナガワレカラなど多様な藻場に出現する生物が認められた.またワカメの乾燥重量と葉上動物の湿重量の間には正の相関が見られた.以上のことから,藻場が消滅した大阪湾の湾奥であっても適当な浅場を設けるとワカメは生育し,そこに藻場特有の生物相が形成されることがわかった.溶存酸素の不足することの無い水深帯に護岸付帯式の床を設け,そこに堆積物食生物をはじめとする多様な生物の定着を促し,滞りの無い物質循環を形成させることを目的とする.実験プラントの形状はL字型をしており,その底面は夏季に発生する貧酸素の影響を受けない高さ,DL-0.5m, DL-1.0m, DL-1.5mにそれぞれ3基(以下,type A, B, C)設けた.(1)夏季の貧酸素化DOは夏季において2003年の夏季にはtype BCの水深帯であるD.L.-1.0m以深でも貧酸素化の基準である3.5mg/lを下回ることがあった.(2)生物多様性と堆積物食生物堆積物食生物の個体数や種類数は一年を通じてプラントが既設護岸よりも概ね高い傾向にあった.これは底部に生物の定着を促すPCなどの部材を用いたことやDOの豊富な水深帯に底部を設けたことが要因であると考えられる.(3)ムラサキイガイの摂餌,排泄および脱落に伴う物質循環既設護岸の単位幅壁面上のムラサキイガイ個体群は527.57gC/dayを摂餌し,318.65gC/dayを排泄しており,type Cでは336.02gC/dayを摂餌,202.96gC/dayを排泄している結果となった.しかしエコシステム護岸の設置によって排泄物由来の汚濁負荷を64%削減し,ムラサキイガイの脱落量の約56%を受け止めていた.(4)尼崎港の環境改善効果の試算

沈降物の酸素消費速度から尼崎の港湾全体で考えると,護岸近傍を除く水域では沈降物によって131kgO_2/dayの酸素が消費されるが,護岸近傍では全沈降物の酸素消費量の17%に相当する27kgO_2/dayの酸素消費が生じていると推定された.エコシステム護岸はこの有酸素層で活性の高い酸素消費物質を一旦受け止め,そこで好気分解や堆積物食動物などの餌として利用させ,海底付近での激しい酸素消費を防ぐという考えである.実測すると1.96gO_2/m^2/dayの酸素消費速度に対し,2.76gO_2/m^2/dayの一次生産があり,エコシステム護岸の床付近の表層部では酸素収支は足りており,かつ海底部での沈降物由来の酸素消費量の17%を削減することができると言える.本研究では,3港湾で直立護岸と港内の沈降粒子および堆積物を比較し,直立護岸における底質環境の特徴を抽出した.さらに,懸濁物食生物の摂餌,排泄行動から直立護岸による環境悪化のメカニズムについて検討を行った.また,懸濁物を起点とした物質循環の改善を促すことを目的とした実証構造物の貧酸素改善効果について検討した.以下に本研究で得られた主要な結果を要約し述べる.1)直立護岸における沈降粒子のPOC Fluxは港内よりも大きいことがわかった.また,堆積物の有機物濃度,AVSは港内よりも直立護岸で高く,底質環境が悪化していることがわかった.2)ムラサキイガイおよびマガキの排泄物は沈降粒子と比較すると有機物濃度が高いことがわかった.また,直立護岸の沈降粒子には排泄物が含まれており,直立護岸においては底質環境悪化の要因となることが示唆された.3)小松島港,尼崎港において直立護岸壁面の生物相は懸濁物食生物が卓越していた.小松島港では優占種であるムラサキイガイ,マガキの同化量は小松島港全体における一次生産量の1/50に相当することが推定された.一方で,二枚貝の排泄量は脱落量よりも大きく,堆積物食生物による捕食はわずかであるため,直立護岸では排泄物を起点とした物質循環が滞っていると考えられた.4)水柱における沈降粒子由来の酸素消費量は港内で約15%,直立護岸で約33%であり,直立護岸では沈降粒子による酸素消費量の割合が増加することがわかった.さらに,呼吸量などを含めると直立護岸における酸素消費の多くは懸濁物食生物由来であることが示唆された.5)実証構造物A, Bは前方における沈降粒子の酸素消費を直立護岸と比較してそれぞれ33,29%削減できることがわかった.また,小松島港に実証構造物Aを適用した場合,1.6kgO2/day削減可能であると推定された.平成17年冬季にワカメの種をつけたロープを尼崎の3つのプラントの床に設置し,(1)水質調査,(2)成長過程,(3)生物相について比較検討を行った.(1)水質ワカメの成長に最も影響の与える光量子束密度は,プラントA(DL-0.5m),プラントB(DL-1.0m),プラントC(DL-1.5m)の順に,115,110,87μmol/m2/secであり,水深が大きくなるにしたがって,その値は小さくなり,海藻の成長のための条件は悪化していた.(2)成長過程2004年12月設置時のワカメの藻長は7.6±3.6cmであった.2005年3月2日回収時にはプラントAでは58.6±31.6cm,プラントBでは60.0±37.4cm,プラントCでは50.0±27.3cmとそれぞれ成長していた.各プラントでのワカメの大きさを比較すると,プラントB,A,Cの順となっていた.プラントCで成長が悪かったのは,光条件が悪いためであるが,プラントAでは水深が浅く,波の影響を受けやすかったことがやや成長が悪かった原因と思われる.(3)生物相直立の壁面では,イソカイメン属,ウスカラシオツガイ,オウキムシロ科,カタユウレイボヤなど懸濁物を食する生物が優占していたが,ワカメの葉上では肉食生物のイボニシ,堆積物食
大脳皮質領野形成過程におけるPax6遺伝子の機能解析

ラット胎生11.5-13.5日にかけて、終脳背側(将来の大脳新皮質背側領域)で産生された神経細胞の一群は終脳腹側へと移動し、終脳背/腹の境界移動方向を90度転換する。これらの神経細胞は新皮質発生過程で最も早くに生まれる神経細胞であり、プレプレートと呼ばれる層を形成する。正常胚では終脳腹側にはこれらの神経細胞は侵入しないが、Pax6機能欠損変異ラット胚ではこれらの神経細胞の方向転換がおこらず、終脳腹側へこれらの細胞集団が侵入する。これまでの研究により、終脳腹側にephrin-A5が、また移動する神経細胞の細胞表面にEphA4が特異的に発現していることが明らかとなっている。またephrin-A5を強制発現した場合、背側から移動してくる神経細胞はephrin-A5の強制発現領域には侵入できない。さらにephrin-A5の機能欠損マウスでは終脳背側から移動してくる細胞が背/腹境界で方向転換せず、終脳腹側へと侵入するという、Pax6変異胚と同様の表現型を示す。以上の結果より、Pax6遺伝子はephrin-A5の発現を制御することで、終脳背側から腹側へと移動する神経細胞の移動様式を制御していることが明らかとなった。さらにこれらの細胞移動が異常になった場合、どのような皮質構築過程が異常になるかを調べる目的で、胎生18日目のPax6変異ラット胚とephrin-A5機能欠損マウス胚の嗅皮質の構造を詳細に検討した。その結果、ラット胎生11.75日(マウス9.75日)に産生される細胞は、野生型では嗅皮質の嗅索近傍(第I層)に特異的に局在することがBrdUパルスチェイス法によって明らかとなった。一方Pax6変異ラット胚とephrin-A5機能欠損マウス胚では、BrdU陽性細胞の第I層への局在が減少し、より腹側の嗅結節付近に蓄積していた。以上の結果は、終脳背側から移動する細胞は将来の嗅皮質第I層を構築すること、Pax6/ephrin-A5の機能がこの細胞の移動機構を制御していることが明らかとなったラット胎生11.5-13.5日にかけて、終脳背側(将来の大脳新皮質背側領域)で産生された神経細胞の一群は終脳腹側へと移動し、終脳背/腹の境界移動方向を90度転換する。本年度はEphAとephrin-Aサブファミリーの発現解析とPax6遺伝子による発現制御の有無、ephrin Aの強制発現が神経細胞の移動様式に及ぼす影響、ephrin-A機能欠損マウスにおけるこの神経細胞の移動様式の検討を行った。In situ hybridizationによるEphAとephrin-Aサブファミリーの詳細な発現解析を行ったところ、終脳腹側にephrin-A5が、また移動する神経細胞の細胞表面にEphA4が特異的に発現していることが明らかとなった。またPax6変異胚では終脳腹側でのephrin-A5の発現が減少していること、Pax6遺伝子の強制発現によりephrin-A5の発現が誘導されることを見いだした。ephrin-A5が実際にこれらの神経細胞の移動様式を制御しうるかを検討するため、哺乳類全胚培養系を用いて、正常胚とPax6変異胚に対してephrin-A5の強制発現を行った。いずれの場合においても、ephrin-A5を強制発現した場合、背側から移動してくる神経細胞はephrin-A5の強制発現領域には侵入できないことが明らかとなった。さらにephrin-A5の機能欠損マウスでのこれらの神経細胞の移動様式を検討した。その結果、このマウスのホモ接合胚では終脳背側から移動してくる細胞が背/腹境界で方向転換せず、終脳腹側へと侵入するという、Pax6変異胚と同様の表現型を示した。以上の結果より、Pax6遺伝子はephrin-A5の発現を制御することで、終脳背側から腹側へと移動する神経細胞の移動様式を制御していることが明らかとなった(野村ら、投稿準備中)。

以上の結果より、Pax6遺伝子はephrin-A5の発現を制御することで、終脳背側から腹側へと移動する神経細胞の移動様式を制御していることが明らかとなった。さらにこれらの細胞移動が異常になった場合、どのような皮質構築過程が異常になるかを調べる目的で、胎生18日目のPax6変異ラット胚とephrin-A5機能欠損マウス胚の嗅皮質の構造を詳細に検討した。その結果、ラット胎生11.75日(マウス9.75日)に産生される細胞は、野生型では嗅皮質の嗅索近傍(第I層)に特異的に局在することがBrdUパルスチェイス法によって明らかとなった。一方Pax6変異ラット胚とephrin-A5機能欠損マウス胚では、BrdU陽性細胞の第I層への局在が減少し、より腹側の嗅結節付近に蓄積していた。以上の結果は、終脳背側から移動する細胞は将来の嗅皮質第I層を構築すること、Pax6/ephrin-A5の機能がこの細胞の移動機構を制御していることが明らかとなった
脳神経回路維持の基盤となる睡眠依存性のシナプス可塑性

本研究では、以下に記すように、睡眠-覚醒状態に依存したシナプス結合の可塑的変化が大脳皮質と海馬で観測されことを示し、そのメカニズムに迫ることができた。大脳皮質では、体性感覚野スライス標本を用いたin vitroパッチクランプ実験と、体性感覚応答を覚醒時と睡眠時で比較するin vivo実験を行った。覚醒時にシナプス結合が増強し、睡眠中には減弱していることを示す結果が得られた。さらに、感覚遮断実験により、覚醒時の増強が経験依存的である可能性を示した。大脳皮質と同様に海馬CA1領域でも、in vitro実験も行い、覚醒時にシナプス結合が増強していることやその増強が経験依存的である可能性を示した。1年目である平成26年度は、多くの研究者が考えているがまだ実証されていない「睡眠-覚醒状態依存的にシナプス結合が変化すること」を確認する実験を行った。実験では、シナプス長期増強時に挿入されるCa透過型AMPA受容体がシナプスに存在しているかどうかを調べるin vitro実験を行った。睡眠の効果を調べるために、睡眠をとっている動物(睡眠群)と睡眠をとらなかった動物(覚醒群)において脳標本を作製し比較を行った。その結果、覚醒群のスライス標本のシナプス部にはCa透過型AMPA受容体が存在するが、睡眠群では存在しないことを示唆する結果が得られた。Ca透過型AMPA受容体はシナプス長期増強が誘導された直後にのみ存在することから、以上の結果は、睡眠時には覚醒時とは異なりシナプス結合が増強されていないことを示唆している。この実験では以下に記すような方法で断眠を行った。(i)動物を常に動画撮影して、動物が動いているかどうかを調べることで睡眠状態か覚醒状態かを判定する。(ii)動物に体動が見られない時(つまり睡眠の可能性があるとき)には実験者がケージを動かすなどして覚醒を促す。脳波を測れば睡眠状態かどうかを正確に判定できるが、(i)に記したように体動だけでは、体動がない安静覚醒状態と睡眠状態を区別できず正確に睡眠状態を抽出できない。また、(ii)の方法は、断眠を行っている間は実験者が常に動物ケージの傍に待機しなければならず、実験者への負担が大きく非効率である。我々はこの2つの問題を解決するために自動断眠装置を作成した。この装置は、記録した脳波をリアルタイムで解析して睡眠-覚醒状態を判定し、睡眠状態と判定された場合はケージを自動で揺らすというものである。この装置を使った予備実験により、90%以上の正確さで断眠できることを確認した。今後はこの装置を利用して実験を進めていく予定である。これまでの我々の研究によって、暗期終了時(朝8時)に作成した標本には直前にシナプス結合が強くなった痕跡が存在するが、明期終了時(夜8時)に作成した標本にはその痕跡が存在しないことを示す知見が得た。朝8時と夜8時に作製した標本で見出されたこの差は、断頭前に動物が主に覚醒している(朝8時)か、それとも眠っている(夜8時)かによってその差が生じていると我々は解釈しているが、24時間周期の日周リズムの位相の違いが影響している可能性を否定できず、差が生じる原因を未だ確定できていない。そこで我々は、全ての動物で同じ日周リズムの位相において断頭するが、その直前に覚醒している動物と睡眠状態の動物に分けて比較する実験を計画した。そのため、ほとんどの動物が眠っている明期の開始時点において、動物を人為的に覚醒させて(断眠させる)、2つのグループを用意することとした。予備実験において、さまざまな断眠法を試したが、動物が眠っている時にケージを揺らす方法が安定して断眠できることが分かった。ただしこの方法は、リアルタイムで脳波等の生体信号から動物が眠ったかどうかを判定する必要がある。判定は、熟練した実験者が脳波等の視察によって行われる方法が普及しているが、この方法では断眠中に実験者は実験室を離れることができず実験者の負担が大きいという問題がある。この負担を軽減するため我々は、自動睡眠判定システムを製作することとした。具体的には、脳波・筋電図をリアルタイム(10秒間隔)で解析して睡眠-覚醒状態を判定するプログラムと、ノンレム睡眠と判定した時に適切な強さで飼育ケージをゆらす装置を作成した。この作成した装置で断眠ができるかどうか予備実験を行った。その結果、ノンレム睡眠の出現時間を半分以下に、レム睡眠は完全に剥奪できることが確認できた。平成28年度はこの装置を利用して研究を進める計画である。当初は断眠した動物を用いて生理実験(in vitro実験)を行う計画を立てており、前半はそ計画通り実験を行った。しかしながら、in vitro実験の直前に行う断眠が、実験者への負担が大きすぎてなかなか実験例数を増やすのが難しかった。この問題を解決するために、自動断眠装置を作成することにしたことは、実績概要で報告したとおりである。この装置を利用することで、平成28年度は当初の計画を超えてより効率的に実験を進められると期待される。睡眠の重要な役割として、適切な神経結合強度の維持に睡眠が寄与しているとする『シナプスホメオスタシス仮説』が近年注目されている。この仮説では、覚醒中に脳内のシナプス結合は増強され、その後の睡眠中に結合が減弱することで、シナプス結合強度が一定の範囲内に保たれているとしている。

多くの研究者達によって、このシナプスホメオスタシス仮説は検証されているが、その研究対象の多くは大脳新皮質であった。本研究では、記憶の中枢として知られる海馬にもシナプスホメオスタシス仮説が当てはまるかどうかを検証するため、海馬CA1領域においてシナプス長期増強の痕跡として知られるCa透過性AMPA受容体が睡眠-覚醒状態依存的に変化するかどうかを調べるin vitro電気生理学実験を行った。in vitro電気生理実験は、脳スライス標本を作る直前に主に自発的に覚醒していた動物(覚醒群)、人為的に睡眠を妨害した動物(断眠群)、自由に睡眠をとらせた動物(睡眠群)の3群で行われた。実験(パッチクランプ記録)では、シャーファー側枝を電気刺激した際にCA1領域で惹起されるeEPSCがCa透過性AMPA受容体の拮抗薬により影響を受けるかどうかを調べた。覚醒群や断眠群の動物から得られた標本では、拮抗薬によって有意なeEPSC振幅の減少が見られた。一方、睡眠群ではほとんどの標本において、拮抗薬を投与しても振幅に変化は見られなかった。以上の結果は、海馬でも神経回路が睡眠-覚醒状態依存的に再編成されていることを示しており、シナプスホメオスタシス機能が海馬でも働いていることを示唆するものと言える。今年度(2016年度)は、海馬においても睡眠-覚醒状態依存的に神経回路の再編成されていることを示唆する結果が得られたが、そのメカニズムを特定するところまで研究を進めることができなかった。メカニズムに迫るため、2017年3月に終了する予定だった本研究を2018年3月まで延長することとした。最終年度(2017年度)には、これまでとり貯めた実験データを統計的に分析して、睡眠-覚醒状態依存的なシナプス結合の可塑的変化が大脳皮質および海馬で観測されるか調べた。大脳皮質に関しては、体性感覚野のスライス標本を用いたin vitroパッチクランプ実験の結果と、感覚応答の刺激を覚醒時と睡眠時で比較したin vivo実験の結果を分析した。前者では、断頭直前に睡眠をとった群(睡眠群)と覚醒していた群(覚醒群)に分けて比較した。その結果、シナプス結合の増強に関与する受容体(Ca透過型AMPA受容体)が睡眠群にはほとんど存在しないが、覚醒群には存在していることを統計的に示した。また、後者に関しては、数分間の睡眠の前後で感覚応答の振幅が変化すること(睡眠前と比べて睡眠後には応答振幅が小さくなること)を見出した。以上の結果は、昨年度までの結果と同様に、覚醒時にシナプス結合が増強し、睡眠中には減弱していることを示唆している。さらに、感覚遮断を行うと、覚醒時に見られるCa透過型グルタミン酸AMPA受容体の挿入が見られなくなることも見出した。これは、覚醒時のシナプス結合の増強は経験依存的であることを示唆している。海馬に関しては、2年目以降に行ったスライス標本を用いたin vitro実験の結果を統計的に分析した。この実験でも、睡眠群と覚醒群に分けたが、大脳皮質と同様に、覚醒群でのみシナプス結合が増強していることを示唆する結果が得られた。さらに、2種類の方法(enriched environment: EEとgentle handling)により断眠を行い比較した。その結果、海馬がより活性化されるEE条件での断眠の方が、Ca透過型AMPA受容体が多く挿入されていることが示唆された。