hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
頭頸部癌におけるシスプラチン感受性規定因子の解明ー網羅的タンパク解析法を用いて

ヒト頭頸部細胞株のシスプラチン感受性株、その獲得耐性株、自然耐性株を用いて、シスプラチン感受性に関連するタンパクの網羅的解析を行い抵抗性株に特異なピークの減弱を2つ検出した。これらピークの減弱が見られる症例は、シスプラチン耐性症例であると迅速に判断できる可能性が示唆された。またiTRAQ法によりシスプラチン特異的耐性因子としてαエノラーゼを同定し、siRNA法により感受性再獲得を示した。本研究は、臨床におけるシスプラチン耐性症例を事前に選択し無用な抗がん薬投与を避けることができること、さらには新たなる頭頸部癌治療法開発にも繋がり、トランスレーショナル研究の観点からも有用な研究であると思われる。本年度の研究では、前年度までに進行したSELDI-TOF-MS(表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析)で網羅的に解析し、複数の候補タンパクのピークを絞り込むことに次いで、以下の知見を得た。まずはシスプラチン感受性株(UM-SCC23)、シスプラチン自然耐性株(UM-SCC81B)、シスプラチン獲得耐性株(UM-SCC23-CDDPR)より抽出したタンパクを電気泳動(Q-PAGEを使用)により比較。銀染色にて発現の差があったスポットを切り出しゲル内消化後、MALDI-TOF-MS(マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析)を使用したペプチドマスフィンガープリンティングにて解析、そのタンパクを同定することができた。そのうちいくつかのタンパクをウエスタンブロッティング法で発現の差を確認することに成功した。さらにシスプラチン感受性株(UM-SCC23)、シスプラチン獲得耐性株(UM-SCC23-CDDPR)、シスプラチン自然耐性株(UM-SCC81B)と共に、5FU耐性株(UM-SCC-W/R)をも比較する試みをiTRAQ®(4PLEX)とタンデムマススペクトメトリー(Triple TOF5600)を組み合わせる方法で行った。液体クロマトグラフィーにはnano HPLCを使用。ESIでイオン化後Qq-TOFのマスを組み合わせ解析を行った。その結果をProtein Pilot®を使用して検討。全体で2173個のタンパクを同定することができ、そのうち多剤耐性因子に関わると思われるタンパクを13個、CDDP耐性に特異的に関与すると思われるタンパクを7個同定することができた。その結果はウエスタンブロッティング法でも確認し同様の結果を得ている。現在Si-RNAを使用し機能解析を行っている。前前年度に行ったSELDI-TOF-MS(表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析)網羅的解析による、複数の候補タンパクピークの絞り込みの成功、次いで前年度に行ったシスプラチン感受性株(UM-SCC23)、シスプラチン自然耐性株(UM-SCC81B)、シスプラチン獲得耐性株(UM-SCC23-CDDPR)より抽出したタンパクの電気泳動(Q-PAGEを使用)、銀染色発現差スポット切り出しによる、MALDI-TOF-MS(マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析)、ペプチドマスフィンガープリンティングにてのタンパク同定、ウエスタンブロッティング法による発現差確認を元に、本年度の研究では、シスプラチン感受性株(UM-SCC23)、シスプラチン獲得耐性株(UM-SCC23-CDDPR)、シスプラチン自然耐性株(UM-SCC81B)と共に、5FU耐性株(UM-SCC-W/R)をも比較する4検体の同時比較を、iTRAQ法;(4PLEX)とタンデムマススペクトメトリー(Triple TOF5600)を組み合わせる方法で行い、Protein Pilotを使用しタンパク同定を試みた。その結果、全体で2173個のタンパクを同定することに成功し、そのうち多剤耐性因子に関わるタンパクを13個、シスプラチン耐性に特異的に関与するタンパクを7個同定し得た。さらにウエスタンブロッティング法でも発現の差を確認した。最終的に、多剤耐性因子に関わるタンパクの中でもCa2+結合転写制御因子に関連するカルレチクリン、さらにシスプラチン耐性に特異的に関与するタンパクの中でも、解糖系に関与するαエノラーゼに着目し、siRNAを使用しそれらの機能解析を行った。その結果、αエノラーゼがシスプラチン特異的耐性に関連すること、またカルレチクリンが多剤耐性因子に関わることを証明した。本年度の研究では、ヒト頭頸部癌細胞株を用いてシスプラチン感受性に関連するマーカータンパク質をProteinChip; Systemを用いて検出することを目的として実施した。シスプラチン感受性細胞株とこの感受性株にシスプラチンを暴露し耐性を獲得した耐性獲得細胞株、さらにシスプラチン自然耐性細胞株の3株の比較、検討を行った。その結果、感受性株と考えられるUM-SCC-23とその獲得耐性株であるUM-SCC-23:CDDP-Rとの間で検出量に差が見出された。

さらにこれらピークの検出パターンは、自然耐性株であるUM-SCC-6と類似パターンを示した。以上からこれらピークの減弱が獲得耐性に伴うだけではなく、自然耐性においても減弱することから、頭頸部癌における真のシスプラチン耐性化因子と考えられる可能性が示唆された。しかしながら抗癌剤多剤耐性化に伴う減弱とも予想されるため、さらに5-FU耐性細胞株でも同様の解析を行った。しかし5-FU耐性株においては、これらピークの発現は認められ、今回見出されたピークはシスプラチン耐性によってのみ減弱し、シスプラチン耐性に特異的な変化であり、シスプラチン効果予測に有効なマーカーとなる可能性が示唆された。さらに、ExPASy Molecular Biology ServerのSWISS-PROTを用いて、発現タンパクの分子量を基に、近似分子量を持つタンパクの検索を行った。その結果、候補タンパクとして様々な種類が同定された。今後さらに頭頸部癌におけるタンパクレベルからの網羅的解析を行うことで、シスプラチン、耐性化規定因子を精度高く同定するだけでなく、その予後因子をも探索することで、最善の抗癌剤治療法選択、治療効果予測、あるいは減弱したタンパクを導入することにより、シスプラチン感受性を再獲得できる可能性も示唆された。・シスプラチン感受性株(UM-SCC23)、シスプラチン自然耐性株(UM-SCC81B)、シスプラチン獲得耐性株(UM-SCC23-CDDPR)より抽出したタンパクを電気泳動により比較。銀染色にて発現の差があったスポットをMALDI-TOF-MS(マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析)を使用したペプチドマスフィンガープリンティングにて解析、そのタンパクを同定することができた。そのうちいくつかのタンパクをウエスタンブロッティング法で発現の差を確認することに成功した。・シスプラチン感受性株(UM-SCC23)、シスプラチン獲得耐性株(UM-SCC23-CDDPR)、シスプラチン自然耐性株(UM-SCC81B)と共に、5FU耐性株(UM-SCC-W/R)をも比較する試みをiTRAQ®(4PLEX)とタンデムマススペクトメトリー(Triple TOF5600)を組み合わせる方法で行った。液体クロマトグラフィーにはnano HPLCを使用。ESIでイオン化後Qq-TOFのマスを組み合わせ解析を行った。その結果をProtein Pilot®を使用して検討。全体で2173個のタンパクを同定することができ、そのうち多剤耐性因子に関わると思われるタンパクを13個、CDDP耐性に特異的に関与すると思われるタンパクを7個同定することができた。その結果はウエスタンブロッティング法でも確認し同様の結果を得ている。現在Si-RNAを使用し機能解析を行っている。今後上記結果をあわせ学術論文として報告する予定である。○1 SELDI-TOF-MSによるタンパク同定:それぞれの細胞株から抽出したタンパクを抽出した。SELDI-TOF-MS(陽イオン、陰イオン交換チップを使用)を用い、これらを網羅的に解析し、それぞれの細胞株でピークが異なる部分を見出した。
超分子錯体光融媒の高機能化と半導体光触媒との有機的な連結法の開発

1.触媒部のペリフェラル配位子の最適化による、これまで報告された中で、最高の二酸化炭素還元効率を示す可視光駆動超分子錯体光触媒の開発超分子のレニウム錯体部分のペリフェラル配位子を、種々変えた錯体を合成し、その光触媒特性を調べた。いずれの超分子錯体も、CO2をCOへと選択的に還元する光触媒機能を示した。しかし、その量子収率およびターンオーバー数は、ペリフェラル配位子の種類に大きく依存した。特に、亜リン酸トリエチルを配位子とする錯体の光触媒特性は優れており、CO生成の量子収率は0.21と、これまで報告された可視光で駆動する均一系光触媒で最高の効率を示した。反応機構を詳細に検討した結果、いずれの錯体を用いた場合も、反応初期に配位子の脱離が起こり、溶媒が代わりに配位した溶媒錯体が真の光触媒として働いていることが分かった。ところが、溶液中に放出されたピリジン分子や塩化物イオンが、光触媒反応を阻害もしくは超分子錯体の分解を加速するために、そのような悪影響を与えない亜リン酸トリエチルが配位した超分子錯体が優れた光触媒能を示すことが分かった。2.電子移動を駆動する光増感錯体部と、触媒錯体部の連結距離の制御レドックス光増感作用を示すRu(II)錯体部と触媒として働くRe(I)錯体部の距離を、架橋配位子上のアルキル鎖長を変えることで、変化させ、その光触媒特性に与える効果を調べている。現在までに得られた結果から、アルキル鎖長が短い時(n=0-2)は、錯体間の距離が短いほど反応の効率が高いことが示された。しかし、nが3および4とアルキル鎖長が長くなると、CO生成速度にほとんど変化は認められなかった。この知見と、1で述べたペリフェラル配位子の最適化の結果を組み合わせることで、CO2を還元する光触媒機能のさらなる向上が期待できる。3.ギ酸や水素を選択的に与える新規超分子光触媒の開発ルテニウム(II)ビスカルボニル錯体を触媒部に導入したルテニウム3核錯体を新規に合成した。この超分子錯体は、CO2をギ酸へ選択的に還元する光触媒機能を持つことが分かった。その量子収率は0.05で、ターンオーバー数は250を超える。また、さらに触媒部としてレニウムビスカルボニル錯体を導入した超分子錯体が、水素発生の光触媒として働くことを見出した。1.二酸化炭素還元光触媒として最適化した超分子錯体^1レニウムビピリジン錯体とルテニウム錯体を連結した多核錯体を合成し、その光触媒特性を調べた。いずれの錯体を用いても、ほぼ選択的にCOが生成したが、その生成量は架橋配位子に強く依存した。すなわち、非共役系の架橋配位子により連結された1を用いると、対応するモデル単核錯体混合系よりCO生成量は二倍多くなることが分かった。本光触媒反応は、(1)Ru部が光励起され、Ruより架橋配位子へ電荷が移動した励起状態(MLCT)の生成、(2)BNAHによる、この励起状態の還元的消光(3)Ruに配位したビピリジン部からReに配位したビピリジン部への分子内電子移動を経由することで進行する。1のRe上の配位子をCl^-からP(OEt)_3に変えた超分子錯体3は、1と比較して約2倍の二酸化炭素還元触媒能を示した。CO生成の量子収率は22%、ターンオーバー数は、200を超え、可視光で駆動する最も高性能な均一系光触媒である。1のRe(CO)_3Cl部位に変えて、Ru(tpy)(CO)を導入したRu2核超分子錯体を光触媒として用いると、ギ酸だけが選択的に生成することを見出した。2.水からの水素発生に最適化した集積型錯体の開発上述した、二酸化炭素光還元超分子触媒の開発で得られた情報を基に、水素発生触媒であるコバルトジイミン錯体を導入した超分子錯体の合成を試みている。右式に示す反応により、Ru-Co4核錯体がin situで生成することがわかった。この錯体は、水素発生の光触媒として機能する。3.半導体へのアンカー官能基を有する超分子触媒の開発ヒドロキシアルキル基やカルボキシル基を有するビピリジンがRuサイトに配位した超分子錯体を合成した。これらの超分子錯体を、酸化力の強い半導体光触媒表面に結合させることに成功した。

反応機構を詳細に検討した結果、いずれの錯体を用いた場合も、反応初期に配位子の脱離が起こり、溶媒が代わりに配位した溶媒錯体が真の光触媒として働いていることが分かった。ところが、溶液中に放出されたピリジン分子や塩化物イオンが、光触媒反応を阻害もしくは超分子錯体の分解を加速するために、そのような悪影響を与えない亜リン酸トリエチルが配位した超分子錯体が優れた光触媒能を示すことが分かった。2.電子移動を駆動する光増感錯体部と、触媒錯体部の連結距離の制御レドックス光増感作用を示すRu(II)錯体部と触媒として働くRe(I)錯体部の距離を、架橋配位子上のアルキル鎖長を変えることで、変化させ、その光触媒特性に与える効果を調べている。現在までに得られた結果から、アルキル鎖長が短い時(n=0-2)は、錯体間の距離が短いほど反応の効率が高いことが示された。しかし、nが3および4とアルキル鎖長が長くなると、CO生成速度にほとんど変化は認められなかった。この知見と、1で述べたペリフェラル配位子の最適化の結果を組み合わせることで、CO2を還元する光触媒機能のさらなる向上が期待できる。3.ギ酸や水素を選択的に与える新規超分子光触媒の開発ルテニウム(II)ビスカルボニル錯体を触媒部に導入したルテニウム3核錯体を新規に合成した。この超分子錯体は、CO2をギ酸へ選択的に還元する光触媒機能を持つことが分かった。その量子収率は0.05で、ターンオーバー数は250を超える。また、さらに触媒部としてレニウムビスカルボニル錯体を導入した超分子錯体が、水素発生の光触媒として働くことを見出した。
蛍光マウスを用いた着床のバイオイメージングと必須遺伝子の解析

近年の遺伝子工学技術の目覚ましい進歩に伴い、胎盤への遺伝子導入に関しても種々の検討が行われている。代表的な例として、ウイルスベクターを用いた胎盤や子宮内腔への局所投与、胎盤特異的なプロモーターの利用などが挙げられるが、胎盤組織に対するダメージが大きく、遺伝子発現の強さや特異性が十分でないといった問題点があり、現時点では満足のいく技術の開発には至っていなかった。本研究では「透明帯を除去した胚盤胞にレンチウイスルベクターを感染させる」という極めて簡便な方法で、胚にダメージを与えることなく、また胚への遺伝子導入を全く起こすことなく胎盤特異的に遺伝子を導入することができることを示し、胎盤イメージングの手法に革新的な方法を確立することに成功した。また胎盤のイメージング技術の基礎を確立することができたことにとどまらずその応用にも着手し、この技術が特定の遺伝子の胎盤における機能解析に使用できることを示すためにEtsなど欠如により胎盤の機能が不全となり、それが原因で流産または胚性致死となるノックアウトマウスを材料として取り上げ、それらKOマウスの胎盤に対して特異的に欠如している遺伝子を導入して胎児をレスキューし、生後における解析ができることを示した。このことは個体レベルでの遺伝子機能研究の発展に貢献できることを示したばかりではなく、胎盤のイメージングを目指した本研究の成果は「胎盤の遺伝子治療」への道を開いたものと考えている。マウスに遺伝子操作を行い、精子の先体部分に緑色蛍光たんぱく質(GFP)を発現させ、精子の中片部に赤色蛍光たんぱく質(RFP)を発現させた。この精子はなんら染色などの前処理を行うことなく精子の受精能の有無をGFPの蛍光で検出することができ、精子の運動をRFPの赤色たんぱく質の蛍光で検出することができた。このようにして作製した遺伝子操作マウスの精子の受精能が、正常であるか否かを検討し、正常な受精能を有することを体外受精の系や、通常の受精で正常な産仔が得られることで確認することができた。交尾後に輸卵管内へ精子が上昇する様子をさまざまな系で確認し、最も適したバイオイメージングの手法の開発を試みた。オリンパス社製の超細型レンズ付レーザー顕微鏡で、輸卵管内の精子を観察したり、子宮内にこのレンズを入れて着床卵の撮影に成功したりした。しかしながら、この顕微鏡はまだ開発段階であり、レーザー光による観察のみが可能であり、普通光で組織の様子を同時に観察することができず、この点を改良しなければ有効なツールになりえないことが分かった。また動物の臓器を生きたまま観察するために高倍率での観察では呼吸などの動きで視野が大きく動く点に関しても何らかの改善が必要であるとの結論に達した。ついでこの遺伝子操作マウスを、不妊疾患モデルマウスであるカルメジンノックアウトマウスに交配させて、不妊マウスの精子がメスの子宮内でどのような挙動を取るのかを観察した。その結果精子は子宮内にはたくさん存在するが輸卵管内には入ってゆかず、子宮卵管接合部であるUTJが閉じており、そのあたりの壁面への接着がこの部位の通過には必要であるということを、バイオイメージング法を用いて明らかにすることができた。マウスに遺伝子操作を行い、精子の先体部分に緑色蛍光たんぱく質(GFP)を発現させ、精子の中片部に赤色蛍光たんぱく質(RFP)を発現する精子を作製した。この精子を利用することにより、染色などの前処理を行うことなく精子の受精能の有無をGFPの蛍光で検出することができ、精子の運動をRFPの赤色たんぱく質の蛍光で検出した。このトランスジェニックマウスを別途作製した受精能に影響がでる遺伝子改変マウスと交配させることにより、各遺伝子改変マウス精子の輸卵管内への精子の移行状態についてバイオイメージングの手法で解析した。おどろいたことにこれまでに見つかっている透明帯への結合不全によると思われていた5つの独立した遺伝子改変動物のすべてについて、輸卵管への移行障害があることが判明した。また、レンチウイルスを胚盤胞期の卵子に感染させることにより、胎児には全く遺伝子導入が起こらない条件で、胎盤にのみ高率で遺伝子導入が可能な系を開発した。この開発にあたりレンチ-GFPベクターによる胎児・胎盤の蛍光イメージング技術を開発しながら証明した。

この手法の開発により、なんらかの遺伝子欠損が原因で流産に至るEts2欠損マウスやMapk14欠損マウスのような場合であっても、着床前の胚盤胞期に、レンチウイルスでこれらの遺伝子を胎盤特異的に導入することによって、胎児に遺伝子操作が行われる危険性を排除しながら流産をレスキューすることが可能であることを実証した。将来はヒトの流産の予防にもつながる可能性が示された。我々は胎児期からほとんどすべての細胞においてGFPを発現する発現するマウスを作製しており、実験動物としての有用性を様々な方面で提示してきた。通常の遺伝子操作動物を利用した研究には既存の遺伝子導入(TG)や遺伝子欠損(KO)法があるが、胎児に遺伝子を導入せず胎盤や脱落膜のみを遺伝子操作することができれば、着床のバイオイメージングとして様々な応用が期待されるため、今回研究を行った。胎盤の機能を分子生物学的に解明する一環として我々は、レンチウイルス(LV)ベクターを胚盤胞に感染させることで栄養膜細胞特異的な遺伝子導入、ひいては胎盤特異的な遺伝子導入ができるのではないかと考え、着床のバイオイメージングを試みた。レポーターとしてEGFPを発現するLVベクターを調製し、酸性タイロード処理により透明帯を除去した胚盤胞に感染させて偽妊娠マウスの子宮に移植した。胎生13.5日目に解剖して観察したところ、胎児への遺伝子導入は確認されず、胎盤のみに緑色蛍光が検出された。胎盤特異的な遺伝子導入はPCR解析によっても確認された。さらに、応用として胎盤異常のために胎児が死亡するようなKOマウスをこの遺伝子導入法によりレスキューしたところ産仔を得ることができた。また、着床や胎盤形成に重要な合胞体栄養膜細胞の融合メカニズムを解明するために、syncytinに着目してさまざまな変異体を293T細胞に発現誘導させたところ融合を再現することができた。これらの結果から合胞体栄養膜細胞の融合にsyncytinが重要な役割を担っていること、およびsyncytinのもつfurin領域が融合に重要であることが明らかになった。
左右非対称な形態形成に関与する新規遺伝子226の機能解析

我々の研究室で単離された新規遺伝子226の生体における機能を調べるため、ノックアウトマウスが作製されたところ、226ノックアウトマウス(226 KO)は胎生致死であり、重度の心臓奇形、心臓大血管の異常が観察された。特に興味深い表現型として、左右の異常である左側相同が、高頻度に心房と肺において観察された。まず、心臓大血管が形成され始める10.5日胚から、流出路が大動脈と肺動脈に分かれる12.5日胚において、226 KO胚の心臓の切片を作成し、観察したところ、将来の肺動脈になる第6大動脈弓が見られず、大動脈と肺動脈を分ける中隔も螺旋状に形成されていなかった。また、心房、心室の中隔を形成するための心内膜クッション異常が見られた。これらの結果から、226 KOの表現型である心房、心室中隔欠損、肺動脈の閉鎖、大動脈右室起始の原因の一端が明らかになった。226 KO胚では、器官の左側でのみ発現し、左を決定する転写因子Pitx2の右側における異所発現は見られないため、226が器官の右側を積極的に決めることが推測される。高頻度に左側相同が観察される心房と肺芽において、226mRNAの発現を調べたところ、左右両側において226の発現が観察されたことから226は、器官の左側特異的に、Pitx2もしくはPitx2の下流遺伝子によって機能阻害されることによって右側を決めることが推測された。226は機能未知であるため、226タンパク質の細胞内局在を詳細に調べるため、226と蛍光タンパク質であるvenusとの融合タンパク質(226-venus)を発現するトランスジェニックマウスを作製した。まず、心臓大血管が形成され始める10.5日胚から、流出路が大動脈と肺動脈に別れる12.5日胚において、226 KO胚の心臓の切片を作成し、観察したところ、将来の肺動脈になる第6大動脈弓が見られず、大動脈と肺動脈を分ける中隔も螺旋状に形成されていなかった。226 KO胚では、器官の左側でのみ発現し、左を決定する転写因子Pitx2の右側における異所発現は見られないため、226が器官の右側を積極積的に決めることが推測される。高頻度に左側相同が観察される心房と肺芽において、226 mRNAの発現を調べたところ、左右両側において226の発現が観察されたことから、226は、器官の左側特異的に、Pitx2もしくはpitx2の下流遺伝子によって機能阻害されることによって右側を決めることが推測された。226とPitx2との関係を調べるため、器官の左側におけるPitx2の発現を消失させたマウス(Pitx2ΔASE)と226のダブルノックアウトマウス(D KO)を交配により作成中である。解析は、今後行う予定である。我々の研究室で単離された新規遺伝子226の生体における機能を調べるため、ノックアウトマウスが作製ざれたところ、226ノックアウトマウス(226KO)は胎生致死であり、重度の心臓奇形、心臓大血管の異常が観察された。まず、心臓大血管が形成され始める10.5日胚から、.流出路が大動脈と肺動脈に別れる12.5日胚において、226KO胚の心臓の切片を作成し、観察したところ、将来の肺動脈になる第6大動脈弓が見られず、大動脈と肺動脈を分ける中隔も螺旋状に形成されていなかった。これらの結果から、226KOの表現型である心房、心室中隔欠損、肺動脈の閉鎖、大動脈右室起始の原因の一端が明らかになった。226KO胚では、器官の左側でのみ発現し、左を決定する転写因子Pitx2の右側における異所発現は見られないため、226が器官の右側を積極積的に決めることが推測される。高頻度に左側相同が観察される心房と肺芽において、226mRNAの発現を調べたところ、左右両側において226の発現が観察されたことから、226は、器官の左側特異的に、Pix2もしくはpitx2の下流遺伝子によって機能阻害されることによって右側を決めることが推測された。

226とPitx2との関係を調べるため、器官の左側におけるPitx2の発現を消失させたマウス(Pitx2ΔASE)と226のダブルノックアウトマウス(DKO)を交配により作成中である。226は機能未知であるため、226タンパク質の細胞内局在を詳細に調べるため、226と蛍光タンパク質であるvenusとの融合タンパク質(226-venus)を発現するトランスジェニックマウスを作製した。解析は、今後行う予定である。我々の研究室で単離された新規遺伝子226の生体における機能を調べるため、ノックアウトマウスが作製されたところ、226ノックアウトマウス(226 KO)は胎生致死であり、重度の心臓奇形、心臓大血管の異常が観察された。特に興味深い表現型として、左右の異常である左側相同が、高頻度に心房と肺において観察された。まず、心臓大血管が形成され始める10.5日胚から、流出路が大動脈と肺動脈に分かれる12.5日胚において、226 KO胚の心臓の切片を作成し、観察したところ、将来の肺動脈になる第6大動脈弓が見られず、大動脈と肺動脈を分ける中隔も螺旋状に形成されていなかった。また、心房、心室の中隔を形成するための心内膜クッション異常が見られた。これらの結果から、226 KOの表現型である心房、心室中隔欠損、肺動脈の閉鎖、大動脈右室起始の原因の一端が明らかになった。226 KO胚では、器官の左側でのみ発現し、左を決定する転写因子Pitx2の右側における異所発現は見られないため、226が器官の右側を積極的に決めることが推測される。高頻度に左側相同が観察される心房と肺芽において、226mRNAの発現を調べたところ、左右両側において226の発現が観察されたことから226は、器官の左側特異的に、Pitx2もしくはPitx2の下流遺伝子によって機能阻害されることによって右側を決めることが推測された。
膜タンパク質の機能・構造に対する脂質の影響の解析

本研究では、ミトコンドリア内膜に局在する輸送体タンパク質ミトコンドリアキャリアとミトコンドリアキャリアと相互作用することが知られている脂質カルジオリピンをモデル膜タンパク質ー脂質系として用い、膜タンパク質の機能および構造に対する脂質の役割を明らかにすることを目的として研究を行った。本研究では、酵母とマラリア原虫のミトコンドリアキャリアを対象に輸送活性に対するカルジオリピンの影響を解析した。その結果、カルジオリピンの添加によりミトコンドリア膜の局在するものは輸送活性が上昇するが、他の膜系に存在するしないものには活性促進効果が見られないことが明らかになった。本研究では、ミトコンドリア内膜に局在する輸送体タンパク質ミトコンドリアキャリア(MC)とMCと相互作用することが知られている脂質カルジオリピンをモデル膜タンパク質ー脂質系として用い、膜タンパク質の機能および構造に対する脂質の役割を明らかにすることを目的として研究を行う。平成27年度は、我々が解析に使用しているアゾレクチンの脂質分析を行い、アゾレクチン中にはカルジオリピンがほとんど含まれていないことを確認した。また、シロイヌナズナの細胞内局在部位が異なる8種のMCについてそれらの輸送活性に対するカルジオリピンの影響を解析し、特定の膜系に局在するMCにおいてカルジオリピン存在下で輸送活性が上昇することを見出した。平成27年度は、アゾレクチンの脂質分析を行い、アゾレクチン中にはカルジオリピンがほとんど含まれていないことを確認し、シロイヌナズナの8種のMCについて輸送活性に対するカルジオリピンの影響を解析し特定の膜系に局在するMCにおいてカルジオリピン存在下で輸送活性が上昇することを見出した。またカルジオリピンの構造への影響を解析した。これらの結果の一部は分子生物学会と植物生理学会にて発表した。本研究では、ミトコンドリア内膜に局在する輸送体タンパク質ミトコンドリアキャリアとミトコンドリアキャリアと相互作用することが知られている脂質カルジオリピンをモデル膜タンパク質ー脂質系として用い、膜タンパク質の機能および構造に対する脂質の役割を明らかにすることを目的として研究を行う。平成28年度は、シロイヌナズナの細胞内局在部位の異なる8種のミトコンドリアキャリアについて輸送活性に対するカルジオリピンの影響を詳細に解析した。その結果、局在部位の異なるミトコンドリアキャリア間では再構成したリポソームのカルジオリピンの至適濃度が異なることが明らかになった。ミトコンドリア内膜に局在するミトコンドリアキャリアでは、ミトコンドリア内膜に含まれるカルジオリピンの濃度とおおよそ等しい15%前後の濃度で高い輸送活性が観察されたが、そのほかの膜系に局在するミトコンドリアキャリアファミリータンパク質ではそれらと異なる濃度域で最大の輸送活性が観察された。また、輸送体の活性において、輸送速度だけでなく輸送の質的な面にも脂質が影響を与えている可能性を探るために、輸送基質特性に対する脂質の影響についても解析を行った。その結果、脂質組成を変えたリポソームを用いた場合特定の基質に対する輸送活性が変化する輸送体が存在することが見出され、一部のミトコンドリアキャリアでは輸送基質の特異性もリポソームの脂質組成に依存して変化することが明らかになった。平成28年度は、ミトコンドリアキャリアの輸送活性に対する再構成リポソームにおけるカルジオリピン濃度の影響を詳細に解析した。それぞれのミトコンドリアキャリアはそれらが局在する膜系の脂質組成に適応して特定の脂質存在下で高い活性を発揮できるよう進化していった可能性を示唆する結果を得ることができた。また、脂質組成を変えることで一部のミトコンドリアキャリアは輸送基質の特異性も変化する結果を得た。これらの結果の一部は、プロテインアイランド松山シンポジウムで発表した。本研究では、まず酵母とマラリア原虫のミトコンドリアを対象に輸送活性に対するカルジオリピンの影響を解析した。その結果、リポソーム中のカルジオリピンの濃度を変えるとミトコンドリアキャリアの輸送活性が変化することが明らかになった。ミトコンドリアキャリアの多くは、ミトコンドリア内膜に局在するが、別の膜系に局在しているものも存在する。ミトコンドリア内膜はおおよそ15%前後のカルジオリピンを含んでおり、ミトコンドリア内膜に局在するミトコンドリアキャリアは15%のカルジオリピンを含む条件で活性が高まったのに対し、それ以外の膜系に局在するものではそのような活性の上昇は観察されなかった。これらの結果は、ミトコンドリアキャリアファミリータンパク質が進化の過程で様々な膜系に進出していくと同時に、それらの膜系の脂質環境で効率的に働くように最適化されていったことによるのかもしれない。最終年度は、ミトコンドリア内膜にカルジオリピンを含まない生物のミトコンドリアキャリアを集め、内膜にカルジオリピンを含む生物のものと輸送活性におけるカルジオリピン依存性を比較解析した。その結果、カルジオリピンを持つタイプの生物のミトコンドリア内膜に局在するミトコンドリアキャリアはカルジオリピン存在下で活性が上昇するのに対し、カルジオリピンを含まないタイプの生物のミトコンドリア内膜に局在するミトコンドリアキャリアは輸送活性に対するカルジオリピンの影響は観察されなかった。これらの結果は、論文にまとめており、一部の結果については現在投稿中である。

本研究では、ミトコンドリア内膜に局在する輸送体タンパク質ミトコンドリアキャリアとミトコンドリアキャリアと相互作用することが知られている脂質カルジオリピンをモデル膜タンパク質ー脂質系として用い、膜タンパク質の機能および構造に対する脂質の役割を明らかにすることを目的として研究を行った。本研究では、酵母とマラリア原虫のミトコンドリアキャリアを対象に輸送活性に対するカルジオリピンの影響を解析した。その結果、カルジオリピンの添加によりミトコンドリア膜の局在するものは輸送活性が上昇するが、他の膜系に存在するしないものには活性促進効果が見られないことが明らかになった。これまでの結果から、MCの中にはカルジオリピンの有無で輸送活性が変化するものがあることが明らかになった。平成28年度は、輸送基質に対する特異性に対してもカルジオリピンが影響を与えるのかについて解析を行う。また、カルジオリピンの構造への影響を解析するためにCDスペクトル解析を行う予定である。これまでの結果から、膜輸送体の活性はその輸送体が存在する脂質組成が影響を与えることが明らかになってきた。今後は、このような影響がシロイヌナズナ以外の膜輸送体にも普遍的に観察されるのか、また脂質の活性に与える影響は輸送体の構造に対する影響を介しているのかについて解析を行う予定である。膜輸送体タンパク質の機能解析
マルチエージェント環境下での群知能を用いた行動獲得における汎化能力に関する研究

群知能の1つであるアントコロニー最適化法(Ant Colony Optimization:ACO)は,実際の蟻の採餌行動にヒントを得た最適化手法である.蟻はフェロモンと呼ばれる化学物質を用いたコミュニュケーションを行うことで効率的に経路を発見している.ACOではフェロモンの散布と蒸発を繰り返すことにより,その濃度によりエージェントの行動決定する.しかし,このACOではフェロモン濃度に基づき確率的に最適解を求めるため,解への収束速度の向上と解の候補の多様性の維持という問題が残されている.そこで,本取組では,この問題の解決を目指し,ACOを用いた協調行動獲得手法の提案を行った.本年度,新たに評価実験において使用する目的で高速演算装置を購入し,実験環境の構築を行った.これは,提案手法に対する有効性の確認するために,平成23年度から継続している評価実験を行うためである.これにより,前年度よりも多くの実験データを収集することに成功した.そして,この実験システムの上で提案手法をベースとなるエージェントプログラムとし,その行動決定処理を改良したエージェントプログラムを作成した.具体的には,異なる役割を担うエージェントが混在するマルチエージェントシステムにおいて,同一の役割を担うエージェントではあるが,行動決定処理に関するアルゴリズムが異なるエージェントを混在させ,シミュレーション実験を実施し,その結果を考察した.これにより,本研究における新たな研究指針を得るに至った.さらに,論文誌J. of Machine Learning and Computingにおいて論文が採択され,今年度までの研究成果が公開された.これ以外にも,国際会議や国内開催の研究会・シンポジウム等において9件の口頭発表を行い,研究成果を報告した.本研究では,群知能の一手法であるアントコロニー最適化手法を用いて,マルチエージェント環境下における協調行動獲得及びエージェントの試行錯誤により獲得されたものを汎化する手法を提案することを目的とした.さらに,提案手法をマルチエージェントシステムに適用し,評価実験を通して提案手法の有効性を確認した.群知能の1つであるアントコロニー最適化手法( Ant Colony Optimization;ACO )は,実際の蟻の採餌行動にヒントを得た手法である.蟻はフェロモンと呼ばれる化学物質を用いたコミュニュケーションを行うことで効率的に経路を発見している.具体的には,蟻は最初はランダムに餌場の探索を進める.もし餌が見つかった場合,それを巣(コロニー)へ持ち帰る際,特殊なフェロモンを散布しながら巣へ戻る.他の蟻はこのフェロモンを感知した場合,それに従い餌場へと到達する.これを繰り返し,コロニーと餌場の間の経路は強化されていく.また,蟻の巣には「勤勉に働く蟻」と「勤勉に働いているようには見えない蟻」が一定の割合で混在し,それらが混在することにより巣を効率的に運営されているということを生物学の研究者は報告している.そして,これらの蟻たちにはフェロモン感度に差があることを報告している.最終年度は,この研究成果にヒントを得て,ACOにおいてフェロモンへの対応が異なるエージェントが混在する手法を提案した.これによりエージェントの行動に多様性が生まれ,単一種のエージェントでは生成することが不可能であった解の候補の生成を目指した.そして,RoboCup Rescue Simulationを用いて評価実験を行った.その結果から提案手法の有効性を確認した.そして,複数の実験条件においてシミュレーション実験を実施することにより,新たな課題が残されていることを明らかにし,今後の研究の指針を得るに至った.群知能の1つであるアントコロニー最適化法(Ant Colony Optimization:ACO)は,実際の蟻の採餌行動にヒントを得た最適化手法である.蟻はフェロモンと呼ばれる化学物質を用いたコミュニュケーションを行うことで効率的に経路を発見している.ACOではフェロモンの散布と蒸発を繰り返すことにより,その濃度によりエージェントの行動決定する.しかし,このACOではフェロモン濃度に基づき確率的に最適解を求めるため,解への収束速度の向上と解の候補の多様性の維持という問題が残されている.そこで,本取組では,この問題の解決を目指し,ACOを用いた協調行動獲得手法の提案を行った.本年度は,メタヒューリスティクスの一手法であるアントコロニー最適化法(Ant Colony Optimization;ACO)をマルチエージェントシステムに適用する手法を提案した.そして,実験用システムを構築し,評価実験結果からその有効性を確認した.ACOはDorigoらにより提案された群知能の一つの手法であり,この蟻の採餌行動におけるフェロモンを用いた最短経路選択行動にヒントを得たアルゴリズムである.本研究では,マルチエージェントシステムの1つであるRoboCupレスキューシミュレーションシステムを実験のために用いた.このRoboCupレスキューシミュレーションシステムとは,火災や地震等の災害が発生する都市をコンピュータ上に仮想的に再現し,この中で災害救助等を行うためのシステムである.この際,被災の大きさや救助した人命に従い,災害時の各プログラムの活動を可視化することができる.初年度の評価実験では1種類のエージェント(Fire-brigadeエージェント)に対して提案手法を適用し,消火活動の際の給水行動の効率化を目指した.また,この評価実験では,このRoboCupレスキューシミュレーションシステムにおいて,提案手法を組み込んだエージェントによる結果と提案手法を組み込まないエージェントによる結果とを比較した.その結果,組み込んだエージェントによる場合のシミュレーションにおけるスコアが僅かながら上回っており,この結果から提案手法の有効性を確認した.評価実験の環境構築を行い,評価実験結果からデータの収集を継続している.また,査読付き論文1編,査読付きの国際会議での発表4件等の研究成果の公開も積極的に行なっている.

しかし,エージェントにおける汎化処理を行うためには学習用データ量がまだ不足しており,今年度,引き続き実験を行い,データ収集を継続する必要がある.さらに,エージェント間の通信の失敗が生じる等,まだ解決すべき問題点が残されているので,平成25年度は,それらの問題点を解決し,さらに研究を進める予定である.初年度の取組として,RoboCupレスキューシミュレーションシステムにおける1種類のエージェント(Fire-brigadeエージェント)に手法を適用し,評価実験を実施するところまでは完了している.また,実験結果からその有効性を確認できた.さらに,その成果を関連する国際会議等において発表した.平成25度は主に下記2点に注力する.まず1点目は,汎化処理のための学習用データの収集を継続する.これまで実施してきたマルチエージェント環境下における実験を継続し,データの容量を増やすことを目指す.この学習データを活用し,エージェントの行動決定に関する汎化処理を組み込み,その有効性を確認する予定である.2点目は,アントコロニー最適化法におけるフェロモン濃度の影響に関する考察を深める.昆虫のアリの個体においてもフェロモンの感知の度合いに差があり,それにより個体の行動の差が生じていることが,生物学の研究成果から明らかになっている.平成24年度の研究成果の1つにこれを同一の役割を担うエージェントにおいて組み込み,シミュレーション実験における結果を考察した.平成25年度はこれをより深化させる予定である.初年度の研究成果を,RoboCupレスキューシミュレーションシステムにおける他種類のエージェント(Police-forceエージェント及びAmbulanceエージェント)に展開し,異なる役割を有するエージェント間での提案手法の有効性を確認していく予定である.さらに,アントコロニー最適化法のアルゴリズムを深化し,研究を展開することを予定している.平成25年度へ研究費の繰越が生じた理由は,平成24年度は高速演算処理装置と大容量データ保存装置の購入を行う予定であったが,そのための評価実験環境の構築が予定よりも遅れている.このため,機器購入ができず,繰越が生じてしまった.平成25年度は評価実験をさらに高度化させるために,高速演算処理装置と大容量データ保存装置を購入し,研究を推進する予定である.この物品購入に研究費を使用させて頂く予定である.さらに,研究成果を雑誌論文あるいは国際会議等において研究発表を行い,その成果を公開して行く予定である.そのため,論文別刷りの費用,外国語論文の校正費用,学会・会議の参加費や旅費に研究費を使用させて頂く予定である.本研究の初年度いは比較的小規模な計算量で済む評価実験が多く,計算機のリソースに余裕があり,実験用ワークステーション等の物品購入を見送った.そのような理由から次年度へ繰り越す研究費が生じた.
SDS-FRL法による膜分子定量的局在解析法の技術基盤の強化

SDS-digested freeze-fracturereplica labeling method(SDS-FRL法)は、2次元的に広がる細胞膜上の分子局在を電子顕微鏡レベル解像度で定量的に解析することが出来る独特な方法である。我々の研究室では試行錯誤の結果、既存の分子局在解析法の欠点を補完できることを示してきたが、技術的制約が存在しその適用範囲はまだ狭い。そこで本研究では、SDS-FRL法の技術基盤の強化を行い、より多種の分子に対応できる技術にすることを目指した。その結果、レプリカ前処理法の検討や感度の向上を経て、低密度に発現する標的分子の解析や細胞膜内葉に分配される分子に対する解析も信頼性良く定量的に行えるようになった。電子顕微鏡を用いた定量的な分子局在解析は、高い空間解像度を持ち、生理学的機能計測法と組み合わせることにより、細胞レベルの現象を分子生物学的に理解するために必須な知見を提供できる。中でもSDS-digested freeze-fracturereplica labeling method(SDS-FRL法)は、2次元的に広がる細胞膜上の分子局在を定量的に解析することが出来、既存法の欠点を補完できることを示してきた。しかし現状では、幾つかの技術的制約によりその適用範囲は狭い。そこで本研究では、SDS-FRL法の技術基盤の強化を行い、より多種の分子に対応できる技術にする。1)凍結組織割断時の分子分配様式の解析分子生物学的解析で広く用いられているペプチド配列タグ(FLAG,myc,HA,AU1など)、或いは緑色蛍光タンパク質(GFP)等の蛍光タンパク質タグを細胞内外に持つレポーター分子を作製し、年度中にこれらタグを発現する遺伝子改変マウスとラットを作製した。2)凍結割断レプリカ膜で複製された細胞質側脂質膜面(P-face)の分子定量性の向上。グルタミン酸受容体抗体に関してa)SDS処理条件と、b)抗原賦活化の前処理、c)ブロッキング、d)抗体反応条件を最適化した。中でもSDS-digested freeze-fracturereplica labeling method (SDS-FRL法)は、2次元的に広がる細胞膜上の分子局在を定量的に解析することが出来、既存法の欠点を補完できることを示してきた。1)凍結組織割断時の分子分配様式の解析分子生物学的解析で広く用いられているペプチド配列タグFLAGと緑色蛍光タンパク質(GFP)を細胞内外に持つレポーター分子を発現する遺伝子改変マウスを作製し、有用な系統を選出した。上記動物を用いて、特異的な反応の得られる抗体を選別し、更にa)SDS処理条件と、b)抗原賦活化の前処理、c)ブロッキング、d)抗体反応条件をさいてきかし検討した。凍結割断レプリカ法は、生体膜の3次元的な微細構造を解析するために開発され、1970年代頃に盛んに用いられた形態観察法の一つである。しかし、観察部位の同定や構造と機能の関連付けが困難であることから近年では殆ど利用されていない。ところが、レプリカ膜面に生体分子(脂質、蛋白質、糖)が保持されており、界面活性剤(SDS)による前処理と免疫金標識とを組み合わせることで、膜分子の局在解析法として有用であることが報告された(Fujimoto, 1995)。そこで、この方法を脳組織の局在解析に応用し、従来法に比べ高い検出効率を持ち(Tanaka et al., 2005)、既存法では検出できなかった膜ドメイン上の分子局在までも検出できることを明らかにした。これらの成果から、この方法の有用性は国内外に認められ、研究分野を間わず多くの研究者から共同研究や技術協力の依頼を受けており、その基本的な手法に関しても発表を行ってきた(深澤・重本, 2006, Fukazawa et al., 2008)。しかし、この方法を適用できる分子種は細胞膜上に発現する分子の中でも限られたものでしかないことを経験してきた。そこで本研究では技術基盤の改良と強化を図りこの技術の応用範囲を拡大することを目指した。加えて、取得した電子顕微鏡画像からより多くの、また、正確な情報を得るために、新たな画像解析法についても検討した。
多様体の胞体分割とコホモロジ-次元

科研費は主に研究分担者による他大学との資料収集及び共同研究にあて、それらをもとに本学においては、ゼミナ-ル等討論,情報交換に多くの時間を費やした。一つの目的として確率空間の位相的性質を調べ,それを自由位相群の構造の解明に応用することを試みた。これは分担者横山良三,山田耕三を中心に議論を進めた。この結果として山田耕三は、「距離空間Xの自由可換位相群A(X)のすべての長さn以下の語から成る部分空間An(X)がkー空間である必要十分条件はA_4(X)がkー空間であることである。」を証明した。これを中心にkー空間の安定性について論文をまとめ発表する予定である(裏面参照)。また、代表者及び分担者菅原邦雄はPL多様体の極小近似の研究を進めAlexandropf widthのコホモロジ-次元的接近を試みた。これについて係数群が無限巡回群IIまたは位数Pの巡回群IIpの場合は一定の成果を得た。すなわち、「コンパクト距離空間XのG係数コホモロジ-次元,ただしGはIIまたはIIp,がn以下である必要十分条件はG係数Alexandropf width Gーa^<n+1>_n(X)が零であることである。」が得られた。この結果は今春の日本数学会年会トポロジ-分科会で発表する予定である。具体的な実績は上述のようなものであるが、科研費を利用して共同研究が進み、今後の問題,課題が明らかになってきた。これからこの芽が大きくなればより大きな実績と成り得るだろう。」を証明した。」が得られた。
スピロ骨格を有する新規不斉触媒の開発と応用

本課題では、不斉合成の分野において未開拓といえる光学活性なスピロ化合物に注目し、新しいエナンチオ選択的な触媒反応への応用を通じて、光学活性なスピロ化合物の高い不斉誘起能を実証することを目的として、研究を行った。イソオキサゾリンやイソオキサゾール環を有する新規なスピロ型不斉配位子(SPRIX)を合成し、様々な遷移金属錯体と組み合わせて、従来の不斉配位子を用いても実現不可能な新規不斉触媒反応の開発を目指して検討した結果、Pd-SPRIX触媒系での新しい不斉環化反応を見いだした。1,3-ジケトンでは、互変異生体であるエノール型構造が共役エノンとなるためにその寄与が比較的大きいことに注目し、2-アリルシクロヘキサ-1,3-ジオンを20mol%のトリフルオロ酢酸パラジウムと22mol%の(P, R, R)-i-Pr-SPRIX並びに2当量のベンゾキノン存在下、ジイソプロピルエーテル中室温で反応させると、分子内でWacker型反応が進行し、2,3,6,7-テトラヒドロクロメン-5-オン誘導体が収率45%,80%eeで得られた。本反応では、異性体である7,8-ジヒドロ-2H-クロメン-5(6H)-オン誘導体が副生したが、触媒反応条件下でも両化合物間の相互変換は全く起こらなかった。また、本反応では基質の1,3-ジケトンの片方のカルボニル基が反応後も未反応のまま残っていることに着目し、2-アリルフェノール誘導体の反応への展開を試みた。Pd-SPRIX触媒を用いて、同様の条件下で2-アリルフェノール誘導体を反応させたところ、2H-クロメンが中程度の収率とエナンチオ選択性で生成することがわかった。近年、キラルイオン液体が注目され、開発研究が行われている。しかしながら、未だ高い不斉誘起能を有するキラルイオン液体は報告されていない。今回、我々は、新規なスピロ型光学活性イオン液体の開発を行った。まずは、イオン液体としては、一般的なイミダゾリウム塩に着目し、スピロ骨格を導入した対称型スピロビスイミダゾリウム塩、および異なる置換基を導入した非対称型のスピロビスイミダゾリウム塩の合成を検討した。対称型スピロビスイミダゾリウム塩(Brアニオン)な、融点が300°C以上であったため、カウンターアニオンの交換により、室温下での液体化の検討を行った。N(CF_3(CF_2)_2SO_2)_2にアニオンを変換したところ、室温で液状の化合物が定量的に得られた。そのガラス転移温度は、示差走査熱量測定装置(DSC)を用いることで、-10°Cであることがわかった。同様に、非対称型スピロビスイミダゾリウム塩についても、(CF_3SO_2)_2N^-をカウンターアニオンとして導入すると、室温で液化した。DSCにより、ガラス転移温度は-20°Cであることがわかった。次に光学異性体分離カラムにより上記スピロビスイミダゾリウム塩の光学分割を検討した。その結果、セミ分取用Sumichiral OA-4500を用いることで、光学分割に成功した。光学活性体のカウンターアニオンを(CF_3(CF_2)_2SO_2)_2N^-へ変換し、対称型のガラス転移温度をDSCにより測定したところ、両鏡像体は、光学活性体においてもガラス転移温度が、それぞれ-11°C、ならびに-10°Cであった。尚、本例は、非天然物由来のキラリティーを有するイオン液体を純粋な光学活性体として得た世界で初めて例である。
遷移金属ラジカル反応によるカスケード型カルボニル化

アルキルヨージドを用いる原子移動型のカルボニル化反応は光照射条件下で進行するが、第2級や第3級のアルキルヨージドにおいて顕著である反面、ヨウ素原子移動過程が円滑ではない第一級のアルキルヨージドにおいては著しく緩慢であるという問題点を残していた。また、合成化学的に有用性の高い環化過程を組み込んだ多段階カスケード型反応への応用も課題であった。本研究では光照射条件下における原子移動型ラジカルカルボニル化反応系について、触媒量の遷移金属錯体の関与を組み入れることで反応の加速化が起こるという基礎的知見を元にその潜在性を詳細に検討することとしたが、本年度においては以下に述べる成果を得た。アルコール存在下にアルキルヨージドの光照射条件下でのカルボニル化反応をそれぞれ触媒量のPd(PPh_3)_4を存在させた条件と存在させない条件で試みた。その結果、いずれの場合もパラジウム種の添加による著しい反応の加速化効果を認めた。一方、アミンを共存させた光-パラジウム系でのカルボニル化反応では第一級のアルキルヨージドからのアミド生成が迅速化されることを確認した。また、この反応結果の応用として唐辛子の辛み成分のひとつであるジヒドロカプサイシンの簡潔合成に成功した。一方、アミンの使用量が生成物に大きな変化を与えることを明らかとした。例えば、アミンの使用量を5当量に増やすと、連続カルボニル型生成物であるα-ケトアミドが主に生成した。ケトアミド生成条件を4-ペンチニルヨージドを用いたカスケード型カルボニル化反応に応用した。その結果、期待したトリプルカルボニル化体が生成した。反応の最終ステップであるα-ケトアミドの生成にはアシル(カルバモイル)Pd種の関与が強く支持される。この反応においては、4つの炭素-炭素結合生成と4炭素成分の連結を、一段の反応操作で実現しており、ラジカル種と遷移金属種のハイブリッド型反応によるカスケード型合成プロセスを実現した。
肝発癌におけるC型肝炎コア蛋白の遺伝子発現修飾作用とその細胞内結合蛋白の同定

C型肝炎ウイルス(HCV)のコア蛋白をネオマイシン耐性遺伝子とともに培養細胞に導入し、コア蛋白発現細胞株を樹立した。ウエスタンプロットにて22kDのコア蛋白の発現が確認された。蛍光抗体法で細胞内の局在を検討したところ、コア蛋白は細胞質にのみ存在していた。血清除去下に細胞を培養することによって細胞をG0期に同調させた後、血清を添加して細胞周期を進行させてコア蛋白の細胞内局在の変化を検討した。コア蛋白は細胞質にのみ存在したまま変化は無く、局在の細胞周期による変化は認められなかった。またコア蛋白の発現による細胞周期の変化も認められなかった。次いで、HCVコア遺伝子導入トランスジェニックマウスを樹立し、その肝細胞内におけるコア蛋白の局在を検討した。ウエスタンブロットにて22kDのコア蛋白の発現が確認された。免疫組織染色によると、コア蛋白は培養細胞と同様に細胞質に限定して存在していた。