hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
キャビテーションピーニングによるインプラント周囲炎デブライドメンド法の開発

新たなインプラント周囲炎のデブライドメンド法からリオッセオインテグレーションを獲得するため,ミニインプラント体にPorphyromonas gingivalis由来のLipopolysaccharide (LPS)を付着し,インプラント周囲炎を惹起させることを目的とし,ミニインプラント体をラットに埋入,オッセオインテグレーション後LPSを注入し,インプラント周囲炎を惹起させ,組織評価とμCTによる評価を行なった.LPSは骨密度などに大きな影響を及ぼさず,組織評価では破骨細胞の存在,歯槽骨と上皮下結合組織の境界が不明瞭であり,LPSがインプラント体周囲の骨組織に影響を与えることが示唆された.インプラント周囲炎は口腔インプラントの普及に伴い年々増加の一途を辿っているが,患者にとって自覚症状が少ないため,重症化している症例が多い.インプラント周囲炎に罹患し汚染されたインプラント体を除染する方法としてチタン製スケーラー,切削器具,Er-YAGレーザー,CO2レーザー,β-TCPを用いたエアアブレーション,フォトダイナミックセラピーなどが行われているが,有効な除染法は確立されていない.そこで今回,工業界で応用され水を圧縮させ小さな気泡の形状にし,除染を行うことができるキャビテーションピーニングに着目した.キャビテーションピーニングを用いて除染を行い,インプラント体周囲の歯槽骨にどのような影響を及ぼすのか検証し,低侵襲,簡便,効果的そして安全なインプラント体のデブライドメンド法としてキャビテーションピーニングを国民に供給し,リオッセオインテグレーションの獲得を目指す.本年度は,インプラント体に対するキャビテーションピーニングの有用性を検証するために,歯周病原菌の一つであるA. actinomycetemcomitansのLPSを用いて,インプラント周囲炎モデルの確立を行った.まず,6週齢のウスター系ラット,オスの上顎左側第一大臼歯を抜歯後,直径1.5mm,長さ4mmのチタン製インプラント(JIS規格2)を鋳造により作製したインプラント体を同部に植立する.そのミニインプラントを埋入後4週にCTにてオッセオインテグレーションの獲得を確認したのち,ミニインプラント周囲にA. actinomycetemcomitans由来のLPSを注入,48時間ごとに計4回注入し,インプラント周囲炎を惹起させた.口腔インプラント治療は,固定性補綴の実現,残存歯への少ない侵襲,質の高い審美的・機能的回復が可能であることから,欠損補綴の有力な治療法として臨床応用されているが,インプラントは天然歯の周囲組織よりも栄養血管が少なく,炎症に対する抵抗性が極めて低いという特徴のため,インプラント周囲炎は口腔インプラントの普及に伴い年々増加の一途を辿っている.インプラント周囲炎に対する治療法の中には,汚染されたインプラント体を除染する方法は様々あるが,有効な除染法は確立されていない.工業界で応用されているキャビテーションピーニングに着目し,それを用いて除染を行い,インプラント体周囲の歯槽骨にどのような影響を及ぼすのか検証した.まず,インプラント体に対するキャビテーションピーニングの有用性を検証するために,歯周病原菌の一つであるA. actinomycetemcomitansのLPSを用いて,インプラント周囲炎モデルの確立を行った.6週齢のwister系ラット,オスの上顎左側第一大臼歯を抜歯後,直径1.5mm,長さ4mmのチタン製インプラント(JIS規格2)を鋳造により作製したインプラント体を同部に植立した.そのミニインプラントを埋入後4週にμCTを撮影し,オッセオインテグレーションの獲得を確認したのち,ミニインプラント周囲にA. actinomycetemcomitans由来のLPSを注入,48時間ごとに計4回注入し,インプラント周囲炎を惹起させ,埋入後7週に屠殺した.コントロールとして,インプラント埋入後4週にPBSをミニインプラント周囲に注入したラットを埋入後7週に屠殺した.骨を含んだインプラント体を採取後,現在標本はホルマリンに浸漬後70%アルコールに置換後,μCTによる骨計測,トルイジンブルー染色による組織検査により組織の評価を行った.新たなインプラント周囲炎のデブライドメンド法からリオッセオインテグレーションを獲得するため,ミニインプラント体にPorphyromonas gingivalis由来のLipopolysaccharide (LPS)を付着し,インプラント周囲炎を惹起させることを目的とし,ミニインプラント体をラットに埋入,オッセオインテグレーション後LPSを注入し,インプラント周囲炎を惹起させ,組織評価とμCTによる評価を行なった.LPSは骨密度などに大きな影響を及ぼさず,組織評価では破骨細胞の存在,歯槽骨と上皮下結合組織の境界が不明瞭であり,LPSがインプラント体周囲の骨組織に影響を与えることが示唆された.やや遅れているとした自己点検評価の一番の理由としては,当初インプラント体にA. actinomycetemcomitansをコーティングしその後インプラント体を埋入する予定であったが著しい骨欠損を起こすことが,想定以上に困難であったことにある.現在,別の方法によりインプラント周囲炎を惹起させ,骨欠損を引き起こす研究を遂行中である.一定のインプラント体汚染モデルの確立がこの実験の成功に重要な要素となるため,これを改善していきたいと考える.医歯薬学歯周病原菌の一つであるA. actinomycetemcomitansのLPSを用いて,インプラント周囲炎モデルの確立を行った.

まず,6週齢のウスター系ラット,オスの上顎左側第一大臼歯を抜歯後,直径1.5mm,長さ4mmのチタン製インプラント(JIS規格2)を鋳造により作製したインプラント体を同部に植立する.そのミニインプラントを埋入後4週にCTにてオッセオインテグレーションの獲得を確認したのち,ミニインプラント周囲にA. actinomycetemcomitans由来のLPSを注入,48時間ごとに計4回注入し,インプラント周囲炎を惹起させ屠殺する.骨を含んだインプラント体を採取後,欠損部周囲骨を削合し,汚染面を明示した試料にキャビテーションピーニングを含む各種デブライドメンド法により除染を行い,SEM,XPS,EPMAにより除染の評価を行う.また骨細胞は熱や圧力に弱い性質をもつため,インプラント体の周囲歯槽骨に対する影響を想定し,キャビテーションピーニングやエアアブレーションによる骨細胞への影響を検証する.当初インプラント体にA. actinomycetemcomitansをコーティングしその後インプラント体を埋入する予定であったが著しい骨欠損を起こすことが,想定以上に困難であったため,ラットの購入数が少なくなったたことが原因と考える.現在,別の方法によりインプラント周囲炎を惹起させ,骨欠損を引き起こす研究を遂行中である.一定のインプラント体汚染モデルの確立がこの実験の成功に重要な要素となる.インプラント体汚染モデルの確立後,大量生産を行い,デブライドメンドを行う装置を購入する必要があるため,前年度未使用額を用いて実験を行う必要がある.骨細胞は熱や圧力に弱い性質をもつため,インプラント体の周囲歯槽骨に対する影響を想定し,キャビテーションピーニングやエアアブレーションによる骨細胞への影響を検証する.そのため,アポトーシスを検出するためのキットなど試薬が必要である.
微生物代謝産物のデータベース構築とその活用研究

創薬探索源として天然物が有する欠点を解消する技術基盤の確立を目的として、微生物および植物の抽出物より粗精製物から構成されるフラクションライブラリーを作製した。ライブラリーのLC-MS/MS結果を利用し代謝産物のデータベースNatural Products(NP)プロットを構築した。また、単離された生理活性物質によって誘導されるプロテオームの変化を比較することから活性物質の分子標的を推測する解析システムであるChemProteoBaseを構築した。生理活性を有する天然化合物をより効率的に単離し、その迅速な作用標的予測が可能となったことで、医薬開発・生命工学への寄与が期待される。フラクションライブラリーの構築と微生物代謝産物プロット(MPPlot)を活用した新規物質の単離:リベロマイシン生産菌を培養し、中圧液体クロマト(MPLC)および高速液体クロマト(HPLC)を用いて、部分精製したフラクションライブラリーを作製した(Pure Appl Chem 2012)。各フラクション中に含まれる成分を、天然物の機器分析データを一覧化したデータベース(MPPlot)と照合することによって、新規化合物の存在を予測した。その結果、新規リベロマイシン誘導体を単離、構造決定した。新規誘導体に関しては、天然化合物バンク(NPDepo)に寄託するとともに、生物活性評価を行った(J. Antibiot 2013)。薬剤標的同定のための2D-DIGE解析およびデータベース構築:テルペンドール系化合物を生産する糸状菌の生合成経路を改変することによって、テルペンドールEおよび11ーケトパスパリンを蓄積する技術を確立した(Chem Biol 2012)。その手法で取得したテルペンドールEおよび11ーケトパスパリンをHeLa細胞に添加して、薬剤処理によって変化する細胞内タンパク質を2D-DIGEで解析するとともに、その結果をデータベース(ChemProteoBase)に登録した。これまでの生化学実験により、テルペンドールEの標的タンパク質はマイトティックキネシンEg5であることを明らかにしてきたが、今回のプロテオーム解析の結果から、11ーケトパスパリンの標的分子もEg5であることが強く示唆された。1.天然物フラクションライブラリーの整備と拡充今年度は微生物代謝産物に加えて、植物に拡張してフラクションライブラリーを構築した。風評被害に悩む福島県の農家から、廃棄予定だった大量の非汚染野菜を入手し、フラクションライブラリーを作製した。約1500フラクションを作製し様々な生物活性試験に供した。トマトの茎から作製したフラクションが、がん細胞に対して増殖抑制効果を示すことを明らかにした。2.NPプロットデータベースの構築とそれを活用した新規生理活性物質の探索天然物(NP)フラクションライブラリーのHPLC/PDA/MSデータを三次元表示したNPプロット(X軸にHPLC保持時間、Y軸にMSのm/z、Z軸にUV)を構築した。微生物代謝産物に関しては、菌株に共通の代謝産物と、菌株固有の代謝産物が存在することが一目瞭然となったので、予定を早めて、新規化合物の単離に着手した。その結果、放線菌のフラクションライブラリーから、キノマイシン系の新規化合物RK-1355AとB、糸状菌のライブラリーからデカリン含有新規化合物ピロリジラクトンを単離した。NPプロットの照合により、菌株固有の化合物としてピロリジラクトンを見出したので、その作用機作(標的分子)を解析した。薬剤が誘導する細胞形態の変化およびタンパク質発現変動を、これまでに構築したモルフォベース(MorphoBase)およびケモプロテオベース(ChemProteoBase)に照合して、プロテアソーム阻害剤に近いことが示唆された。精製プロテアソームを用いて、実際に試験管内でプロテアソーム阻害活性を確認した。既知のプロテオソーム阻害剤proteasome inhibitor IIのデータとともにケモプロテオベースに登録した。1.天然物フラクションライブラリーの整備と拡充引き続き植物資源を用いてフラクションライブラリーを拡充した。風評被害により廃棄予定であった福島県産野菜に加え、カルビー(株)より提供されたじゃがいも及びその未利用部位よりライブラリーを作製した。植物はアルカロイドなどの塩基性化合物を含むので、抽出・分離方法を改良し再現性の良い作製条件を確立した。この方法で約1600フラクションを作製し様々な活性試験に供した。じゃがいも塊茎皮や花のフラクションがそれぞれ抗マラリア活性やがん細胞増殖抑制効果を示した。2. NPプロットデータベースの構築とそれを活用した新規生理活性物質の探索フラクションライブラリーの代謝産物情報をNPプロットに登録した。これを用いて化合物探索を行い、放線菌ライブラリーより新規環状オクタデプシペプチド、Octaminomycin AとBを単離した。これらはD体とL体の立体の異なる2つのロイシンを含む特徴的なペプチドであった。さらにその類縁体を見出し、物性情報から構造推定を行った。これらは抗マラリア活性を示した。Terpendole

E生産株の変異体からNPプロットの照合により、より低濃度で作用する新規類縁体11-ketopaspalineを見いだしたので、その作用機作(分子標的)を解析した。薬剤の誘導する形態変化、タンパク質発現変動を指標にしたMorphoBaseとChemProteoBaseで解析したところ、11-ketopaspalineはTerpendole Eと同様にEg5が標的であることが示唆され、試験管内でEg5を阻害することが確認された。また、化合物NPD926をChemProteoBaseで解析したところ、ROS誘導化剤と似ていることから、NPD926がグルタチオンを標的とすることが明らかになった。これらのデータをChemProteoBaseに登録した。26年度が最終年度であるため、記入しない。ケミカルバイオロジー26年度が最終年度であるため、記入しない。当初、放線菌と糸状菌が生産する多様な構造を有する代謝産物に着目して、フラクションライブラリーを作製する計画であったが、福島県の農家から原発事故の風評被害で出荷できなくなった(実際には放射能汚染していない)野菜をもらうことができたので、植物抽出液からもフラクションライブラリーを作製する準備が整った。微生物由来の化合物のスペクトルデータを可視化したデータベース(Microbial Products Plot: MPPlot)を拡張して、現在、Natural Products Plot: NPPlotを構築している。NPPlotでは、ホトダイオードアレイ(PDA)で得た紫外部吸光スペクトル、HPLC(C18-逆相カラム)の保持時間、LC/MS分析より得られたm/zを格納しており、検索可能なデータベースとなる。このデータベースを照合することにより、既知化合物と新規化合物の区別が容易になっており、新規リベロマイシン類縁体および、新規パスパリン誘導体が単離できたことは、予想以上の収穫であった。天然物フラクションライブラリーの作製は、順調に進行しているが、その中から予想以上に新規化合物が見出されている。特に、ピロリジラクトンは構造的にもユニークであり、生物活性も既知のプロテアソーム阻害剤とは異なるタイプの新しいプロテアソーム阻害剤であることが明らかになった。これらの結果は、天然物プロットデータベース、モルフォベース、ケモプロテオベースの拡充が予想以上に進んでおり、その有用性を示すものである。1)すでに微生物を中心としたフラクションライブラリーを構築し、現在、植物も含んだNatural Product (NP)フラクションライブラリーを構築中である。しかし、含まれる物質の量が非常に微量で、構造決定ができないことがあるので、その問題点を解消するための技術を開発する。微生物、植物からの抽出法を規格化し、再現性良く同じフラクションに同じ化合物が含まれるような分離条件を確立する。この結果をHPLC/PDA/MSで検証可能にする。
外来生物の侵入による海洋島送粉生態系のレジームシフトとその進化・生態的影響

小笠原諸島では、グリーンアノールやセイヨウミツバチなどの外来種の侵入により、在来の訪花昆虫が減少し外来の訪花昆虫が優占する送粉系撹乱が生じている。本研究ではシマザクラなどの小笠原在来植物種を対象として、外来種の侵入状況が異なる島間で、訪花昆虫相や繁殖成功、成木及び種子集団の遺伝的多様性などを調べた。その結果、外来種の侵入が著しい父島や母島では、外来種の少ない兄島や聟島に比べて、特に昼行性昆虫の総訪花頻度が著しく低く、結果率も有意に低下していた。一方、シマザクラにおいて、成木及び種子集団の遺伝的多様性や自殖率に島間での差は見られなかったことから、進化的な影響については確認することが出来なかった。小笠原諸島の送粉生態系ネットワークは、グリーンアノールなどの外来動物による在来送粉昆虫の捕食や、外来訪花昆虫のセイヨウミツバチの増加など、外来生物の影響によって大きく変貌しつつある。小笠原では各種外来生物問題の深刻化に伴い、様々な保全対策が喫緊の課題となっているが、送粉生態系ネットワークに関しては保全手法や保全効果を見極めるための基礎的な情報が極端に不足している。本研究は、在来送粉昆虫の減少・絶滅による在来植物の繁殖への影響と、在来植物における外来昆虫の送受粉効果や集団遺伝構造への影響を具体的に評価し、生物の生態的・進化的背景を考慮した保全施策に直接的に貢献することを目的とする。平成26年度は外来種の影響が大きい父島と、外ら種の影響が少ない無人島(兄島と聟島)において、訪花昆虫調査や繁殖状況(結実率)調査、訪花昆虫各種の体表花粉分析や集団遺伝学的解析を行った。その結果、アカテツ、ヒメフトモモ、シマザクラ、オオバシマムラサキなどの小笠原固有樹種について、訪花昆虫各種のインターバル画像データを得ることが出来、アカテツなど一部の植物では夜間にヤモリの訪花も確認された。結実率調査や体表花粉分析は十分なサンプルを得ることができなかったが、各植物種の遺伝マーカー(核SSR)の開発と親個体の集団遺伝学的解析はほぼ終了した。小笠原諸島の送粉生態系ネットワークは、グリーンアノールなどの外来動物による在来送粉昆虫の捕食や、外来のセイヨウミツバチが在来植物に高頻度で訪花するなど、外来生物の影響によって大きく変貌しつつある。平成27年度は前年度に引き続き外来種の影響を受けている有人島(父島と母島)と外来種の影響の少ない無人島(兄島・聟島)において、数種の在来植物を対象に訪花昆虫調査を行い、訪花昆虫相の島間比較を行った。その結果、ヒメフトモモは聟島では昼行性の在来小型ハナバチ類とハエ類が多数訪花していたのに対して、父島では在来小型ハナバチ類の訪花は全く見られず、セイヨウミツバチが頻繁に訪花していた。また、在来昆虫相が残存する兄島においても、在来ハナバチ類よりも高い頻度でセイヨウミツバチが訪花していた。一方、アカテツはいずれの島でもハエやカミキリモドキ・ガなどの夜行性昆虫が頻繁に訪花し、聟島では昼行性のハエ類が高頻度で訪花した。両植物種とも夜間よりも昼間の訪花者相が島間で大きく異なり、夜行性昆虫が昼行性のグリーンアノールの捕食圧を受けにくいことによると考えられる。また、セイヨウミツバチと在来昆虫の受粉効果を比較するため、父島と聟島で採取したシマザクラの成木と種子集団の集団遺伝学的解析を行ったところ、遺伝的多様性や自殖率に島間で有意差はなく、訪花昆虫相の変化はシマザクラ集団の遺伝的多様性に影響を与えていない事が示唆された。また、父島では長距離の送粉が多く確認され、外来のセイヨウミツバチと在来のオガサワラクマバチが長距離の送粉を担っていると推測される。兄島において外来のセイヨウミツバチと在来の小型ハナバチ類の体表花粉分析を行う予定だったが、H27年の調査ではヒメフトモモにはセイヨウミツバチしか訪花せず、在来小型ハナバチ類が全く採集できていない。またシマザクラでは訪花頻度が非常に低く、昆虫を採取することができなかった平成28年度はウラジロコムラサキやオガサワラボチョウジ、シマザクラなどの固有植物種を対象として、主に兄島において、デジタルカメラのインターバル撮影などによる訪花昆虫の観察と、訪花昆虫を捕獲して体表に付着した花粉の収集・分析を試みた。兄島では2013年3月にグリーンアノールの侵入が確認されたものの、侵入防止フェンスによる拡大阻止と駆除を続けてきたことで、グリーンアノールの個体数は極めて低密度に抑えられている。今回の調査においても、ウラジロコムラサキとシマザクラにおいて数多くの在来小型ハナバチが訪花していたが、わずかながら外来のセイヨウミツバチの訪花も確認された。一方で、長い花筒を持つことで蛾などに訪花されていると推測されるオガサワラボチョウジは、訪花頻度が非常に少ないためか、目視観察とインターバル撮影では訪花昆虫を全く確認することができなかった。

訪花昆虫の体表花粉は、ウラジロコムラサキとシマザクラに訪花した在来小型ハナバチを多数採取できたが、セイヨウミツバチは1個体分しか採取できなかったため、分析を行うことが出来なかった。また、オガサワラボチョウジは訪花昆虫は確認できなかったものの、兄島と母島において果実を採取することができたため、SSRマーカーによる種子の親子解析を行った。その結果、兄島ではほとんどの種子が50m以内の花粉親由来であったのに対して、母島では100m以上離れた花粉親由来のものが多く確認された。先行研究において母島ではセイヨウミツバチがオガサワラボチョウジに高頻度で訪花することが知られていることから、訪花昆虫相の違いが花粉の移動距離に影響している可能性が考えられる。平成28年度の研究計画では、在来及び外来訪花昆虫の体表に付着した花粉の分析を行うことが主な目標であった。しかし在来・外来訪花昆虫を同所的に観察できる兄島は無人島であるため、渡島する機会が限られる上に、外来のセイヨウミツバチの訪花頻度が以前に比べて非常に低かったため、十分なサンプル数を得ることができなかった。また花粉の遺伝解析は、当初の計画では花粉一粒ずつ分けてSSRマーカーによる遺伝子型解析を行う予定であったが、この方法は技術的な難しさもあり、これと並行して次世代シーケンサーを用いた分析技術を検討・試行中である。2017年6月に実施した南硫黄島調査において、現地で開花していたクサトベラやノボタンなどの植物種を対象として、デジタルカメラのインターバル撮影による訪花昆虫調査を行った。その結果、ハエ類の訪花が最も多く、次いでハナバチ類の訪花が確認された。小笠原諸島の他の島で比較的多く確認されたガ類やヤモリ類の訪花は非常に少なく、訪花動物種の多様性は低い傾向が見られた。このことは、南硫黄島の生物多様性が他の島に比べて非常に低いことによるものであり、海洋島の生物相が形成される初期過程においては、ハエ類が最も主要な訪花者であることが推定された。また昨年度に引き続き、兄島において訪花昆虫調査を行ったところ、これまでデジタルカメラのインターバル撮影ではほとんど確認されなかったガサワラクマバチが、目視観察では何度も繰り返し訪花していることが確認された。これはオガサワラクマバチの花当たりの滞在時間が非常に短く、花を素早く移動していたことによると思われる。よってインターバル撮影により訪花頻度を評価する際は、訪花昆虫の滞在時間が短い場合は過小評価、長い場合は過大評価する可能性があることに留意しなければならない。兄島における調査において、在来のアサヒナハキリバチやオガサワラツヤハナバチ、オガサワラクマバチと外来のセイヨウミツバチの複数個体から体表花粉の採取を行うことができた。これらの訪花昆虫の行動範囲や送粉者としての有効性を推定するため、採取した体表花粉の種構成及び花粉の遺伝的多様性の分析を現在進めている。小笠原諸島では、グリーンアノールやセイヨウミツバチなどの外来種の侵入により、在来の訪花昆虫が減少し外来の訪花昆虫が優占する送粉系撹乱が生じている。本研究ではシマザクラなどの小笠原在来植物種を対象として、外来種の侵入状況が異なる島間で、訪花昆虫相や繁殖成功、成木及び種子集団の遺伝的多様性などを調べた。その結果、外来種の侵入が著しい父島や母島では、外来種の少ない兄島や聟島に比べて、特に昼行性昆虫の総訪花頻度が著しく低く、結果率も有意に低下していた。一方、シマザクラにおいて、成木及び種子集団の遺伝的多様性や自殖率に島間での差は見られなかったことから、進化的な影響については確認することが出来なかった。訪花昆虫調査は計画通り進行しているが、繁殖状況調査や集団遺伝学的解析は対象植物種や調査地の選定に時間がかかり、やや遅れている。
魚類の生殖に及ぼす内分泌撹乱化学物質のエストロゲン受容体を介した作用機構の解析

魚類における内分泌撹乱化学物質のエストロゲン受容体(ER)を介した作用機構を明らかにする目的で、メダカをモデルとして以下の研究を行った。近年、魚類のERにはαとβ、γの3種類が存在することが明らかとなったが、メダカではまだαタイプしか知られていない。そこで、先ずメダカERβとERγのcDNAクローニングを行うことにより、メダカにおける3種類のERの存在を確認し、3種類のERの構造や機能について比較・検討した。魚類ERβの保存配列より設計されたプライマーを用いたPCRにより、メダカ卵巣由来のcDNAから2種類のER cDNA断片が得られた。これらのcDNAは両者とも約500個のアミノ酸残基をコードするものであり、そのアミノ酸配列はERのタンパク翻訳領域の大部分を含んでいた。分子系統樹による解析から、得られた2種のcDNAはそれぞれメダカERβとERγであることが確認された。次に、メダカ雌における3種のER mRNAの発現組織をRT-PCR法により調べた。ERαmRNAは肝臓と卵巣にのみ検出されたが、ERβmRNAは脳や肝臓、卵巣、筋肉、鰭で発現しており、さらにERγmRNAは調べた組織のほとんどで発現が認められた。以上のように、メダカにおいても3種類のERが存在することが初めて明らかにされた。また、3種類のER mRNAの発現組織に違いがみられたことから、エストロゲンや内分泌撹乱化学物質の作用において3種のERは異なる役割を担っている可能性が高いことが示された。しかし、3種類のERの機能的相違の詳細については、今後の課題として残された。魚類における内分泌攪乱化学物質のエストロゲン受容体(ER)を介した作用機構を明らかにする目的で、メダカをモデルとして以下の研究を行った。近年、ERにはαとβの2つのタイプが存在することが明らかとなったが、メダカではまだαタイプの1種類しか知られていない。そこで先ず、メダカERβのcDNAクローニングを行うことにより、メダカにおけるERβの存在を確認するとともに、2種類のERの構造や機能について比較・検討した。メダカ卵巣由来のcDNAを鋳型とし、魚類ERβの保存配列に基づく縮重プライマーを用いたPCRにより、ERβcDNA断片を増幅した。得られたcDNAは1487塩基対でアミノ酸496残基をコードするものであった。相同性解析の結果、このcDNAのアミノ酸配列はERβのN末端側のA/B領域からC末端側のリガンド結合領域までのほとんどの部分を含んでいることが分かった。またこのアミノ酸配列をメダカERαのそれと比較したところ、DNA結合領域で93%、リガンド結合領域では60%と高い相同性を示したが、他の領域では相同性がみられず、配列全体の相同性は40%程度であった。しかし、他魚種のERβとの間では、DNA結合領域(93-99%)とリガンド結合領域(71-90%)以外の領域でも比較的高い相同性がみられ、特にティラピアERβではA/B領域で71%、D領域でも62%と高い相同性が示された。さらに分子系統樹による解析からも、得られたcDNA断片がメダカERβであることが確認された。従ってメダカにおいても少なくとも2種類のERが存在することが明らかとなった。次に、メダカにおけるERαmRNAとERβmRNAの発現組織をRT-PCR法により解析した。ERαmRNAは肝臓と生殖腺(卵巣と精巣)にのみ発現していたが、ERβmRNAは調べた組織のほとんどで発現が認められた。このように2種類のER mRNAの発現組織に違いがみられることから、エストロゲン(または内分泌攪乱化学物質)作用において2種のERは異なる役割を担っている可能性が高いと考えられた。
科学技術ガバナンスの主体となるための市民リテラシーに関する大学教育プログラム

指導法に関する研究成果として,未来の科学技術ガバナンスを担う市民のための科学リテラシーの具体的内容を明確化し,個々のリテラシーについての指導法を提案することができた。また,評価法に関する研究成果として,上述の科学リテラシーの測定課題と評価ルーブリックを開発することができた。科学技術や環境に関する公共的な問題の解決に関わるリテラシーのうち,解決策の創出に焦点を当て,遺伝子医療技術を扱う科学技術の社会問題を対象にした測定課題を作成し,日本の大学生を対象に,リテラシーの獲得状況に関する調査を実施した。分析の中で,策定した評価ルーブリックを修正・精緻化し,完成させた。(a)文献・資料の収集とデータベース整理:科学技術や環境に関する公共的な問題(SSI)を解決するリテラシーの育成に関わる教育プログラムと評価枠組みの作成に向け,科学教育や科学コミュニケーション,学習科学及び関連領域の学術論文と関連図書を収集し,レビューした。(b)教育プログラム開発:いくつかのSSIに対し,利害関係者間の意見の対立,ベネフィットとリスクのトレードオフ等を踏まえた上で,自分なりの解決策を提案することを目標とした,知識創出型の協調学習を行う教育プログラムのプロトタイプを開発した。(c)評価枠組みと分析フレームワークの策定:(a)の成果を元に,収集した先行研究から,SSIに対する解決策の創出を測定する有力な課題を複数抽出し,それぞれの日本語版を作成するとともに,学習者が創出した解決策の分析枠組みと評価ルーブリックを策定した。大学生を対象に面接調査と質問紙調査を実施し,採取した実例を分析する中で,課題ごとのルーブリックを修正・精緻化する作業に着手した。交付申請書に記載した研究目的については,おおむね順調に達成されている。研究資料収集,教育プログラム開発,評価法策定もほぼ予定通り進めることができており,国際学会において中間成果を発表することも達成できている。科学技術や環境に関する公共的な問題(SSI)に関わるリテラシーのうち,解決策の創出に焦点を当て,遺伝子医療技術を扱う科学技術の社会問題を対象にした測定課題を作成した。課題では,先行研究のレビュー結果を元に,具体的な個別状況を描写したシナリオを2本作成し,回答者自身の意見を明確にした上で,異なる立場を想定させ,解決策を記述させた。作成した課題を用いて,日本の大学生を対象にした調査を実施した。その際,先行研究に準じて,遺伝に関わる概念的知識を評価する課題を加えた。日本科学教育学会研究会では,大学生が記述した解決策について,アーギュメントの観点から分析した結果を発表した。具体的には,論証構造の複雑さとアーギュメントの多視点性の2つの指標で評価し,SSIについて多様な視点から思考することと,その結果を説得力の高い形式で表現することは,多くの大学生にとって難易度の高い課題であることを明らかにした。日本発達心理学会では,SSIに対する賛否が,解決に向けた思考とその表現方法に与える影響について検討した結果を発表した。また,解決策の創出に影響する要因の予備的な検討として,科学的アーギュメンテーションに対する認識論的理解を取り上げ,ライティングのアーギュメンテーションの相互評価場面の分析事例をもとに,学習者が認識論的理解の獲得するプロセスを解明し,その成果をthe 31th International Congress of Psychologyにおいて発表した。質問紙調査で測定した遺伝に関わる概念的知識と解決策創出との関連については,現在詳細な分析を進めている。文献等収集の結果,科学技術リテラシーの構成要素として複雑性・多視点性・現在進行形の探究・健全な懐疑主義という4点を含めることの教育効果が大きいことが判明した.科学技術ガバナンスの主体となるための市民リテラシーを育成する本研究の遂行上,本知見を踏まえると教育プログラムならびに分析フレームワークに関する理論的枠組みの見直しが必須なため,その理論的枠組みを変更した上で教育プログラムを改善し,分析フレームワークを精緻化した上で,実験授業を延長して実施する必要が生じた.科学技術や環境に関する公共的な問題(SSI)に関わるリテラシーのうち,解決策の創出に焦点を当て,遺伝子医療技術を扱う科学技術の社会問題を対象にした測定課題を作成した。ESERA 2017Conferenceでは,大学生が記述した解決策について,インフォーマル推論のパターンの観点から分類し,シナリオが内包するジレンマの強弱がもたらす影響を分析した結果を発表した。要約すると,通常ならば合理的な判断が可能な大学生であっても,ジレンマが強い状況では感情的判断に傾きがちであることを明らかにした。同時に測定した遺伝に関わる概念的知識と解決策創出との関連については, (a)概念的知識の獲得状況を小問レベルで検討し,総得点について,性差ならびに現在の専攻による差,高校時代の生物関係科目の履修状況による差を検討した。(b)大学生が記述した解決策を,遺伝に関する内容知識を用いたもの,その他の理由を用いたもの,理由記述なし,の3カテゴリーに分類し,内容知識の活用における性差,専攻差,ジレンマの強弱による差を検討した。(c)解決策ならびに想定反論を踏まえた反駁の解決策を,アーギュメント(論証構造)の観点から分析し,概念的知識の獲得状況とアーギュメントの質の関連について検討した。分析結果(a)(b)を日本教育心理学会で,(c)を日本科学教育学会で,それぞれ発表した。また,評価法に関する研究成果として,上述の科学リテラシーの測定課題と評価

ルーブリックを開発することができた。科学技術や環境に関する公共的な問題の解決に関わるリテラシーのうち,解決策の創出に焦点を当て,遺伝子医療技術を扱う科学技術の社会問題を対象にした測定課題を作成し,日本の大学生を対象に,リテラシーの獲得状況に関する調査を実施した。分析の中で,策定した評価ルーブリックを修正・精緻化し,完成させた。平成28年度も当初の予定通り,開発した教育プログラムの実施,プログラムの成果評価データに基づく評価枠組みの修正,成果発表を行う。科学技術ガバナンスの主体となるための市民リテラシーの理論的枠組みを修正・拡充した上で,教育プログラムの改善と,分析フレームワークの精緻化を行い,改めて実験授業を実施する。遺伝に関わる概念的知識と解決策創出との関連についての分析結果に基づき,必要に応じて,教育プログラムの精緻化を行う。教育心理学,科学教育研究成果発表・中間まとめが投稿段階であり,次年度に国際会議へ参加しなければならない。また,次年度において文献・資料の収集と国内外の事例に関する実地調査を追加実施する必要が生じたため。文献等収集の結果,科学技術リテラシーの構成要素として複雑性・多視点性・現在進行形の探究・健全な懐疑主義という4点を含めることの教育効果が大きいことが判明した.本知見を踏まえると,科学技術ガバナンスの主体となるための市民リテラシーの教育プログラムならびに分析フレームワークに関する理論的枠組みの見直しが必須なため,その理論的枠組みを変更した上で教育プログラムを改善し,分析フレームワークを精緻化した上で,実験授業を延長して実施する必要が生じた.物品費(図書費など),調査旅費,成果発表旅費,その他(国際会議参加費)等に使用する予定である。
日本列島における前・中期旧石器文化の存否と後期旧石器文化の成立過程

本研究の目的は、日本列島の先行人類文化(前・中期旧石器文化)の存否と変遷、周辺大陸との系統関係の解明を目指すことにある。そして彼らの文化が、新人による後期旧石器文化の成立に果たした役割を明らかにすることをめざす。今年度も昨年度から継続し、先行人類の所産である可能性が考えられている「遺跡」のうち、「人為性は明確だが、年代が不明確なものの検討」を研究テーマに掲げて、研究に取り組んだ。主として島根県松江市鳥ヶ崎遺跡の発掘調査および出土資料の分析等に取り組んだ。昨年度夏・春に実施した発掘調査で得られた試料の分析が進み、鳥ヶ崎遺跡における火山灰層序ならびに古地磁気層序が概ね構築できたため、各堆積物の年代観を整備することができた。これらの研究で生じた課題やこれまでの発掘調査において残された課題解決のため、夏期に3度目となる発掘調査を実施し、課題の解消やデータの補完を果たすことができた。また今回の現地調査から遺跡周辺の地形・地質調査に本格的に着手し、発掘調査区の堆積物を周辺地形・地質のなかで位置づけられる見通しが立った。これらの成果に加えて、河北省文物研究所と進めている共同研究においても、関連する遺跡の資料の検討を進めている。今年度は泥河湾遺跡群の資料の一部を熟覧し、その技術的様相や石材消費のあり方を考察した。これらが約4万年前以後にどのように変化し、それが日本列島とどのように関わるかは、最終年度に残された課題である。本研究計画において予定していたとおり、発掘調査と室内研究を往還する研究サイクルが確立できている。海外共同研究についても、海外調査と国内研究がうまく連動しており、次年度の研究計画の円滑な遂行に向けて準備が整っている。今後取り組む研究項目は、1後期旧石器時代初頭遺跡の資料熟覧、2研究成果の公表である。1については、事例数が多いため目下概要把握に努めており、熟覧にいたったものは僅かである。今年度はそれらの検討に重点的に取り組みたい。2については、鳥ヶ崎遺跡の資料整理、現地調査成果をふまえた研究論文等の公表を予定している。また昨年度までに実施した考古科学的研究の成果をまとめた論文を、現在投稿中である。今年度は先行人類の所産である可能性が考えられている「遺跡」のうち、「人為性は明確だが、年代が不明確なものの検討」を研究テーマに掲げて、研究に取り組んだ。島根県松江市鳥ヶ崎遺跡の発掘調査、愛知県新城市加生沢遺跡の資料熟覧等を実施した。鳥ヶ崎遺跡では、かねてから議論があった「玉髄・瑪瑙製旧石器」の年代や文化的評価問題の前進に寄与しうる新たな成果を得た。また2度にわたる発掘調査において、堆積学や地形学、火山灰編年学の手法を組み合わせた発掘調査の手順を概ね確立できた。周辺地域の調査においても、出雲地域のレス-古土壌堆積、関連する遺跡の状況が把握できた。加生沢遺跡については、これまで個人所蔵であった資料が名古屋市立博物館に寄贈され、その収蔵状況の確認から調査を開始した。資料の熟覧を通じて、前年度までの所蔵者のもとで資料を観察して得た所見を補填することができた。また前年度までに実施した現地調査との接点を補強しうる所見を得ることができた。これらの成果に加えて、河北省文物研究所と進めている共同研究においても、関連する遺跡の資料を熟覧する機会を得、本研究の推進に寄与しうる学術成果を得た。これらの研究については、平成30年度に共同研究協定を締結し、本格的に研究に着手する予定である。本研究計画において予定していたとおり、新規の発掘調査を実施して研究課題に密接に関係した新資料を獲得できた。その他の研究項目についても、資料の概観作業はほぼ終了しており、次年度以降の研究計画の円滑な遂行に向けて準備が整った。

これらが約4万年前以後にどのように変化し、それが日本列島とどのように関わるかは、最終年度に残された課題である。本研究計画において予定していたとおり、発掘調査と室内研究を往還する研究サイクルが確立できている。海外共同研究についても、海外調査と国内研究がうまく連動しており、次年度の研究計画の円滑な遂行に向けて準備が整っている。今後取り組む研究項目は、1今年度の継続研究、2研究成果の公表、3人為性は明確だが、年代が不明確なものの検討、4後期旧石器時代初頭遺跡の資料熟覧、である。1については、今年度発掘調査を実施した鳥ヶ崎遺跡の資料整理が中心となる。年代決定のための降下火山灰分析のほか、地形形成史との関わりのなかで年代を議論するために、地形面区分の確認を目的とした小規模な現地調査を実施予定である。その他、試料の岩種・円磨度の分類、堆積学的情報を加味した分析、出土資料の詳細観察を実施予定である。2については、鳥ヶ崎遺跡の発掘調査以外の調査成果を取りまとめた論文を執筆中である。今年度に導入した機器を活用した研究で、執筆は最終段階に到達しているため、速やかに論文投稿を果たしたい。3については、刊行された調査報告書などから、当該資料をめぐる課題は整理できているため、資料熟覧の機会をもてば確実に成果を見込める。4については、膨大な遺跡数があるため、その概要の把握から取り組む予定である。それらの検討と、13の成果をふまえ、現時点で明言できることと研究法上の課題について、平成30年6月の日本旧石器学会で講演予定である。今後取り組む研究項目は、1後期旧石器時代初頭遺跡の資料熟覧、2研究成果の公表である。1については、事例数が多いため目下概要把握に努めており、熟覧にいたったものは僅かである。今年度はそれらの検討に重点的に取り組みたい。2については、鳥ヶ崎遺跡の資料整理、現地調査成果をふまえた研究論文等の公表を予定している。また昨年度までに実施した考古科学的研究の成果をまとめた論文を、現在投稿中である。
細胞質分子シャペロン・annexinII複合体を介した新規DNA修復制御機構

短波長紫外線(UVC)ストレスに対応し、annexin IIを実行因子、HSP27をシャペロンとするDNA損傷ストレス防御複合体が、UVC抵抗性に関わるとの仮説を立証すべく解析を行った。その結果、1) annexin IIはHSP27と複合体を形成すること、2)両者の複合体は紫外線照射に応じて細胞質から核へ移行すること、3) annexin IIがUVC致死抵抗性に関わることを明らかにした。さらに、4)SP27はシャペロンとしてannexin IIの細胞内量の調節を介して紫外線致死抵抗化に関わる可能性を示唆した。申請者らはこれまでに,HSP27か短波長紫外線(UVC)損傷DNAの修復過程に関与することにより紫外線による細胞死誘導を抑制すること可能性を見いだし,さらに,HSP27結合タンパク質として,HSP70と,新たにannexinIIを同定した。そこで,申請者は,UVCストレスに対応し,annexinII,HSP27,HSP70から成るDNJ損傷ストレス防御複合体が,損傷DNAの修復過程に関わるとの仮説をたてた。この仮説を実証することが本研究の目的である。本年度の実験計画に沿って,annexinIIとHSP27の相互作用の詳細な解析として,紫外線照射後の両者の結合の変化と細胞内局在の変化,さらに,当初平成20年度に予定していたannexinII,HSP27,HSP70の三者の相互作用の解析も同時に行った。その結果,1)HSP27を結合させた樹脂を使用したpull down法と抗体を使用した免疫沈降法により,細胞質画分においては,紫外線照射前にHSP27とannexinIIの結合が認められたが,照射後はほとんど認められなかった。一方,核画分では,逆に,照射前には両者の結合が認められなかったが,照射後認められるようになった。2)HSP27とannexinIIは,ともに,紫外線照射後の核画分でタンパク質量が約2倍に増加した。一方,3)抗HSP70抗体および抗annexinII抗体を用いた免疫沈降により,HSP70とannexinIIとの結合は認められず,また,紫外線照射後の核画分における両者の結合も認められなかった。以上の結果から,annexinIIはHSP27と複合体を形成しているが,両者の複合体は紫外線照射に応じて,細胞質から核へ移行する可能性が示唆された。この複合体にHSP70が含まれる可能性は低いと考えられた。
532nm 励起光を用いた眼底自発蛍光の定量的解析

走査レーザー検眼鏡F-10(NIDEK社)を改良して撮影した532nm励起光による眼底自発蛍光(532AF)の解析を行った。1)正常眼における532AFは、490nm励起光による眼底自発蛍光(490AF)と同様の蛍光輝度分布であった。532AFは黄斑色素の影響が少なく、中心窩の蛍光輝度が490AFよりも有意に高かったため、黄斑部の観察に適していた。2)中心性漿液性脈絡網膜症で異常532AF所見を観察した。532AF過蛍光部位は主に漿液性網膜剥離部位と、漿液性網膜剥離の復位後の網膜外層障害部位に一致した。532AF低蛍光部位は網膜色素上皮障害部位と一致した。3) 532AF定量化のため、改良型F-10内部に蛍光リファレンスチップを設置した。532AF撮影時に同時にリファレンスチップも撮影し、両者の蛍光輝度を比較して定量化を試みた。現在データ収集と解析を行っており、研究を継続中である。眼底自発蛍光は主に網膜色素上皮(RPE)に含まれるリポフスチンの自発蛍光を撮影することで、RPEの代謝機能を非侵襲的に評価できる手法である。通常は青色の励起光(488nm, 490nm)を使用しているが、これは中心窩ではキサントフィル等の黄斑色素にブロックされるため、中心窩の眼底自発蛍光の評価が困難であるという問題点がある。そこで、我々の施設では、市販の走査レーザー検眼鏡であるF-10(NIDEK)のバリアフィルターを改変し、緑色光(532nm)を励起光とする眼底自発蛍光(532AF)の撮影を行っている。本研究では、532AFの自発蛍光について、従来の青色自発蛍光(490AF)との差異を検討・解析し、532AFの臨床応用に向けてのデータを得ることを目的としている。平成23年度は、まず正常眼における532AFの蛍光輝度について解析し平成23年日本眼科学会総会で報告した。次に、病的眼、特に中心窩に異常自発蛍光を示す中心性漿液性脈絡網膜症における532AFを解析し平成23年日本網膜硝子体学会総会で報告した。平成24年度は532AFの定量化を行うために、F-10内部に蛍光のリファレンスを増設した。532AF撮影時にリファレンスの蛍光も同時撮影し、輝度を比較することで532AFの定量化を目指した。データを解析すると、撮影眼の散瞳状態や532AF輝度によってリファレンスが大変暗くあるいは明るく撮影される場合があり単純な輝度比較が困難であった。どのように真の蛍光強度を定量化するか現在解析を進め、学会発表や論文報告を目指している。平成23年度の発表内容については論文投稿準備中である。平成23年度は、まず正常眼における532AFのデータを蓄積し、その蛍光輝度について解析した。従来の490AFのデータと比較し、中心窩での蛍光輝度が高く532AFでは中心窩の自発蛍光所見の観察が可能であった。この結果は平成23年日本眼科学会総会で報告した。

次に、病的眼、特に中心窩に異常自発蛍光を示す中心性漿液性脈絡網膜症における532AFを解析したところ、490AFでは観察できなかった中心窩の小さな異常自発蛍光の観察が可能であり、網膜色素上皮の異常や、漏出部位の特定に有用である可能性が示唆された。この結果は平成23年日本網膜硝子体学会総会で報告した。正常眼並びに病的眼の双方でデータの蓄積ができ、かつ逐次解析し国内学会での報告を行う事ができた。更なるデータ収集・解析を行い、学会での報告や、論文作成、学術雑誌への投稿を目指す。自発蛍光撮影や眼底観察に必要な用具の購入・整備や、データ解析に必要な物品の購入にあてる予定である。
ポリアミド系合成樹脂義歯の適応症の確定とアクリルレジンとの接着について

熱可塑性合成樹脂は4-META/MMA-TBBレジンを用いることによってアクリルレジン(常温重合レジン)やアクリル系の軟質裏装材と接着力が向上することが明らかとなった.特にアクリル系材料と接着が得られないとされているポリアミド系合成樹脂は臨床応用可能な接着強さが得られることが明らかとなった.また熱可塑性樹脂を用いた義歯を装着する場合は中間欠損に限定し,メタルレストを付与しなければならないことが示唆された.熱可塑性合成樹脂は4-META/MMA-TBBレジンを用いることによってアクリルレジン(常温重合レジン)やアクリル系の軟質裏装材と接着力が向上することが明らかとなった.特にアクリル系材料と接着が得られないとされているポリアミド系合成樹脂は臨床応用可能な接着強さが得られることが明らかとなった.また熱可塑性樹脂を用いた義歯を装着する場合は中間欠損に限定し,メタルレストを付与しなければならないことが示唆された.ポリアミド系合成樹脂は弾性に富み,金属製のクラスプを必要としないことから審美性に優れ,金属アレルギーを有する患者にも有効である.また義歯床用軟質材料の中でも吸水性が小さいことから,長期にわたり弾性を維持できる材料である.しかしチェアサイドでのアクリルレジンを用いた修理が不可能なため,支台歯の喪失に対する増歯やリライニングを行うことができない.可撤性の利点である口腔内の変化への対応を容易に行うためには,ポリアミド系合成樹脂とアクリルレジンの接着は必須であると考えられる.そこでポリアミド系合成樹脂の接着に関して実験的検討を行った.プレート状のポリアミド系合成樹脂(バルプラスト,バルプラストジャパン,10.0×10.0×2.0mm)を#600のエメリー紙にて研磨,アルミナサンドブラスト処理し,被着面をテープにて4.8mmに規定した.その後,被着面に置かれたテフロンリング内(直径5.0mm,高さ1.0mm)に接着剤を塗布し,アクリル系義歯裏層材(メタベースM,サンメディカル)を築盛した.接着剤はスーパーボンド(サンメディカル)を使用した.重合後,37°Cの水中に24時間浸漬し,サーマルサイクル0回(TC0)と5,000回(TC5000)行った試料を用意した。計測はAUTOGRAPH(AG-IS,島津製作所)を使用してクロスヘッドスピード2.0mm/min.にて引張試験を行った.アクリル系レジンはレジン系セメントであるスーパーボンドを接着材として用いることにより,ポリアミド系合成樹脂に強力に接着することが明らかとなった,特に接着剤としてスーパーボンドのモノマーとキャタリストだけでなくポリマーを加えることの有効性が示唆された.また耐久試験後も接着力の低下は顕著に認められなかったことから,口腔内においても長期間使用できることが示唆された.粘膜負担圧分布中間欠損模型を用意し,圧力センサー(PS-10KBM,PS-10KAM,協和)を3歯欠損相当部に計3つを設定し粘膜負担圧を測定し,咬合力として5Kgの荷重を与えた.試料は12%金銀パラジウム合金製の金属レスト付き,金属レストなしポリアミド系合成樹脂義歯および金属レスト付きアクリルレジン床の3種類を用意した.結果,金属レストを付与したポリアミド系合成樹脂義歯はアクリルレジンと比較して粘膜負担圧は大きかったものの,レストなしと比較して有意に小さい負担圧を示したことから,金属レストは咬合力の粘膜負担圧軽減に有効であると示唆された.軟質裏装材の接着強さ各種熱可塑性合性樹脂を用いて,軟質裏装材との接着強さを検討した.各種熱可塑性樹脂を2.0×2.0×1.0mmの板状試料にメーカー指示に従い,射出成形,形態修正を行った.試料の表面は#600のエメリー紙にて研磨後,50μmアルミナサンドブラスト処理を行った.また接着材として4META/MMA-TBBレジンを用いた.熱可塑性樹脂にはポリアミド系,PET系,ポリカーボネイト系を使用し,軟質裏装材にはシリコーン系,アクリル系の2種類を選択した.軟質裏装材の厚みが0.2mmになるように専用のジグを用いて,固定した.重合後,万能試験機を用いて引張試験を行い,接着強さとした.結果シリコーン系は専用の接着材の使用を必要とするが,アクリル系の軟質裏装材と比較して,有意に高い接着強さを示した.またさらに接着材として4META/MMA-TBBレジンを用いることにより,より強固な接着が得られることが明らかとなった.
MHC-I依存性抗原提示における細胞内セリン性プロテアーゼの役割とその機構の解明

生体防御機能のなかで抗原提示を行うことは正常な免疫反応を呼び起こす第一歩として重要な意味を持っている。本年は、この抗原提示過程の中でプロテアソームがどの様に抗原ペプチドをプロセシングするのかについて、in vitroの再構成系を用い、抗原ペプチドの前駆体(16アミノ酸、及び28アミノ酸)を合成し、精製した20S及び26Sプロテアソームを反応させ、抗原ペプチドの生成過程について解析を行い以下の結果を得た。26Sプロテアソームは単独で28のアミノ酸よりなる抗原蛋白を20Sよりも効率良く分解することが出来るが、その反応時間をより延長させると20SプロテアソームでもアロCTLによって同じ位認識されるペプチドが生成することが可能なことが判明し、この事は長い蛋白には20Sよりも26Sのプロテアソームが主にその分解に働いていることを示唆している。一方、より短い16のアミノ酸からなる抗原ペプチドの前駆体に対しては、26Sプロテアソームは20Sプロテアソームよりも長いペプチドしか生成出来ないことが判明した。従って、抗原提示の過程で、抗原蛋白は26Sプロテアソームによってある程度の大きさまで分解され、その後は20Sのプロテアソームによってより細かな分解が起こることが推察された。しかしながら、いずれのプロテアソームの場合においても単独ではアロCTL2cによって認識され、Ldに結合する抗原ペプチドを生成することは出来なかった。この事は一つのプロテアソーム単独では抗原蛋白のプロセシングは行われていないことを反映しているのかも知れない。また、26Sプロテアソームは抗原ペプチドの前駆体を分解する際、9アミノ酸からなるLdに結合するペプチドの他にこのアミノ酸配列を含むより長い配列の前駆体を効率良く生成しており、いずれのペプチドのC末端抗原ペプチドのC末端とおなじアミノ酸配列を有していたことは、プロテアソームが抗原ペプチドのプロセシングを行うに当たり、抗原ペプチドのC末端を初期の段階から決定することが可能であり、プロテアソームが抗原ペプチドのC末端の決定に直接関係していることが示唆された。