hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アルケンへの高度なラジカル重合反応制御

本研究では、アルケンへの高選択的なラジカル付加反応を可能とする高度分子変換反応を構築し、ラジカル重合反応において分子量や立体構造が高度に制御された高分子の精密合成を行うことを目的とした。とくに、金属触媒などを用いたリビングラジカル重合と、水素結合などに基づく立体特異性ラジカル重合を組み合わせることで、生成ポリマーの分子量と立体構造の同時制御を検討した。さらに、触媒系を設計することで、実用化に適した力量あるリビングラジカル重合系の開発を行った。本研究においては、アルケンのラジカル重合反応において、官能基選択的かつ立体選択的なラジカル付加反応を連続的に可能とする高度分子変換反応を構築し、分子量と立体構造が制御された高分子の精密合成を行い、高分子の精密構造に基づき効率的に機能を発現する材料開発へとつながるラジカル重合反応を構築する。1.遷移金属錯体によるメタクリル酸エステルの立体特異性リビングラジカル重合種々のルテニウム錯体[RuCl_2(PPh_3)_3,Ru(Ind)Cl(PPh_3)_2,RuCp^*Cl(PPh_3)_2]を用いて、メタクリル酸メチル(MMA)およびメタクリル酸2-ヒドロキシエチル(HEMA)の重合を種々の溶媒中で検討した。その結果、RuCp^*Cl(PPh_3)_2を用いて、(CF_3)_2C(Ph)OHなどのフルオロアルコール中で、MMAの重合を行うことにより、分子量が良く制御され(M_W/M_n=1.08)、シンジオタクチシチーの高いPMMAの合成が可能となった(r=88%)。一方、HEMAの重合においては、DMFやDMAなどの非プロトン性極性溶媒中、RuCp^*Cl(PPh_3)_2を触媒として用いることにより、分子量と立体構造の同時制御が可能となった。2.キラルルテニウム錯体によるラジカル付加反応およびラジカル重合反応の制御キラルなホスフィン配位子を有する種々のルテニウム錯体を合成し、ラジカル付加反応における立体選択性の発現を検討した。(-)-DIOPのような二座ホスフィン配位子をもつ錯体{Ru_2Cl_4[(-)-DIOP]_3}を合成単離し、X線結晶解析を行い、これを用いてCCl_3Brと種々のオレフィンの1:1ラジカル付加反応を検討した結果、エナンチオ選択的付加反応が進行した。インデニル基と(-)-DIOPをもつ錯体でも同様なエナンチオ選択性を発現した。さらにこれらの錯体を用いて、MMAやスチレンなどのリビングラジカル重合反応を検討した結果、分子量の制御が可能であることを見出した。本研究は、アルケンのラジカル重合反応において、官能基選択的かつ立体選択的なラジカル付加反応を連続的に可能とする高度分子変換反応を構築し、分子量と立体構造が制御された高分子の精密合成を行い、さらに新規機能性高分子材料開発へとつながる重合反応を構築することを目的としている。本年度は主に以下の成果を得た。1.立体特異性リビングラジカル重合によるステレオグラジェントポリマーの合成立体特異性と反応性の異なるモノマーを立体特異性リビングラジカル共重合することにより、立体規則性が鎖に沿って連続的に変化するステレオグラジェントポリマーの合成に成功した。すなわち、ルテニウム錯体を用いて、水酸基を有するメタクリル酸2-ヒドロキシエチル(HEMA)とその水酸基がt-ブチルジメチルシリル基で保護されたモノマー(SiHEMA)を、嵩高いフルオロアルコール中で重合した。両モノマーのリビングラジカル共重合が進行し、SiHEMAはHEMAの約半分の速度で消費し、重合の進行に伴いシンジオタクチシチーが徐々に増加し、ステレオグラジェントポリ(HEMA)の合成が可能となった。2.多重水素結合によるラジカル重合の立体構造制御プロトン供与部(D)と受容部(A)をDADの順に有するアクリルアミドを合成し、これと相補的な三重水素結合を形成するADA型のイミド化合物を添加することで、高温(60°C)でもシンジオ特異性ラジカル重合が進行することを明らかとした。さらにリビング重合と組み合わせることで、分子量と立体構造の同時制御を可能とした。3.酢酸ビニルのラジカル重合における分子量、立体特異性、位置特異性の同時制御酢酸ビニルのヨウ素移動重合を種々のフルオロアルコール中で行うことにより、分子量と立体構造の制御に加え、頭-頭結合の形成が抑制され、位置選択性の制御が可能となることを明らかとした。

1.異なる二つのラジカル重合反応性二重結合をもつモノマーの位置特異性ラジカル重合ジビニル化合物は通常、ラジカル重合において両方の二重結合が反応し不溶性ポリマーを与える。メタクリル基とビニルエステル基を有するメタクリル酸ビニルのラジカル重合を、アルミニウム化合物の存在下で行うと、メタクリル基のみが選択的に重合し、側鎖にビニルエステル基が完全に残った直鎖状で可溶性ポリマーを与えることがわかった。とくに、嵩高い置換フェノキシ基を有するアルミニウムルイス酸では、高分子量ポリマー(Mn>10^4)を高収率(>85%)で与え、位置特異性ラジカル重合が効果的に進行することを見出した。2.水素結合性化合物によるラジカル重合反応の制御と環境適合型ラジカル重合系への展開一連のチオウレア誘導体を用いて、N,N-ジメチルアクリルアミドなどのモノマーの立体特異性ラジカル重合を検討した。添加物なしの重合ではアタクチック(m50%)なポリマーが生成するが、ある程度の嵩高さをもつチオウレア化合物を添加すると、イソタクチシチー合率が向上し(m70%)、立体特異性ラジカル重合が進行した。チオウレア誘導体とモノマーまたはポリマー末端モデル化合物との相互作用をNMRにより解析し、チオウレア基はカルボニル基に対して1:1または1:2で水素結合により相互作用していることが示唆された。さらに、RAFT重合と組み合わせることで、分子量との同時制御が可能なり、硫黄を含む有機化合物のみでラジカル重合における分子量と立体構造の同時制御が達成された。本研究は、アルケンのラジカル重合反応において、高選択的なラジカル付加反応を連続的に可能とする高度分子変換反応を構築し、分子量や立体構造が制御された高分子の精密合成を行い、さらに実用化に適した力量ある精密ラジカル重合反応を構築することを目的としている。本年度は主に以下の成果を得た。1.高活性マンガン錯体による汎用性の高いリビングラジカル重合系の開発マンガン錯体「Mn_2(CO)_<10>]を光照射下にて用い、マンガンラジカルを発生させこれにより炭素-ヨウ素結合を可逆的に活性化することでリビングラジカル重合が可能となることを見出した。これまでの遷移金属錯体を用いたリビングラジカル重合に比べて、触媒量が少なく、反応が速く、酢酸ビニル、スチレン、アクリル酸メチルなど広範囲のモノマーの重合制御に有効であった。また、炭素-硫黄結合を有するRAFT剤と組み合わせても、同様な重合制御が可能であった。さらに、マンガン錯体を用いた重合系を共重合へと展開した。酢酸ビニルとアクリル酸メチルとの共重合においては、グラジエントポリマーとホモポリマー骨格からなるブロックポリマーが生成した。さらに、アクリル酸メチルと1-ヘキセンとの共重合において、フルオロアルコールなどの極性溶媒を用いることで、交互に近い共重合が可能となり、分子量の同時制御も達成された。このようにマンガン錯体による重合系の高い汎用性が明らかとなった。2.鉄触媒を用いた環境適合型リビングラジカル重合系の開発塩化鉄とホスフィンからなる単純な触媒系を、炭素-塩素結合を有する開始剤と組み合わせることで、スチレンのリビングラジカル重合が可能となることを見出した。とくに、高酸化状態にある鉄(III)を用いても同様な重合が進行することが明らかとなった。この重合系は、鉄を触媒とした重合であると共に、酸化に対して安定な鉄(III)を出発物質とできることからも、実用化に適した重合系であると期待される。
アジアの大都市における人口高齢化に伴う都市経済構造の変容

アジアの大都市における人口高齢化が、予想以上の速さで進んでいることが、各国のセンサス統計から確認された。人口高齢化は出生率低下現象と裏表の関係にある。出生率低下の背景には、家族の意味や女性の家庭での役割の変化が関わっている。女性が社会進出するにつれて、家事・子育て・老親の世話などは、アジアの各都市でも市場に任せられるようになってきているが、そのような施設はまだ不十分といえよう。アジア的文化の特徴として、女性の社会進出に対して全面的に肯定的な見方が必ずしも受け入られているわけではない。親孝行の概念も根強く残っていると考えられる。こうした状況の中で、本研究はアジアの大都市(特に、シンガポール、香港、上海を研究地域とした)が人口高齢化にどのように取り組んでいるか、地理学的、社会学的、経済的観点から考察を加えた。各都市はそれぞれの特徴に基づいた家族政策や高齢者施作を進めている。高齢者扶養を家族に委ねることが、各都市とも限界に達しつつある。今後は高齢者福祉の分野にも民間の活力を利用することが期待される。その結果として、都市の就業構造や産業構造の再編も不可欠になってくる。さらに、人口減少社会において、高齢者をいかに活用するかも重要な柱になってくるであろう。もちろん、都市経済構造の変容は国民経済構造の中で顕在化しているが、都市圏内では、同時に人口の都市内移動に基づく地域構造変化が現れていることは注目してよい。つまり、都心やインナーシティに高齢者の割合が高いことや、郊外の住宅団地は近い将来高齢化したコミュニティが形成される可能性が高い。この点は高齢者の今後の生活様式と関連しており、日本の都市圏の状況とも共通しる課題である。その際、如何にコミュニティを形成するべきかは、理想的な高齢社会を形成する上で重要な課題となっている。本年度はアジアの大都市の人口高齢化に関する既往の文献資料と統計資料などの資料収集とその分析を行った。また、同時にアジアの大都市(シンガポール、マニラ、香港、上海)の研究者との意見交換と現地調査への協力をお願いした。その結果、各都市の特徴からすべての都市に共通の資料が得られない部分もあるが、かなりの基礎的データを収集した。また、現地研究者との意見交換から高齢者の生活実態なども知ることが出来た。さらに、本研究のねらいの一つでもあるが、都市化の中で家族の絆の崩壊に伴い高齢者の扶養の問題が生起していることが明らかになった。加えて、健康な高齢者も産業構造の変化の中で、新しい技術の導入などに伴って、高齢者の雇用の場への適応が困難であることや、また、退職や離職後の再雇用が困難となっている状況を知ることができた。目下、次年度に研究のまとめをするに当たっての研究の視角の精緻化と、今後の調査やわれわれの役割分担などの確認とともに、統計資料の整理、利用方法を検討しているところである。また、収集した資料を分析して早い段階で学会発表などを通して研究成果の一部を公開することを予定している。以上のような過程で気づいたことは、アジアの大都市の人口高齢化が予想以上に速いスピードで進んでいることである。その一方で高齢者施策の立ち遅れも無視できず、今後、アジア大都市の活力を維持する上でも、高齢者施策がますます重要な課題となっていることである。アジアの都市で急速な人口高齢化が進んでいる実態が、各種統計結果から明白となった。このような状況の中で、家族や女性の役割も変化してきており、各都市はそれぞれの特徴に基づいた家族政策や高齢者施策を進めている。高齢者扶養を家族に任せることが、各都市で限界に達しつつある状況である。

今後は、高齢者福祉の分野にも民間の活力を利用する福祉産業の増大が期待される。その結果として、都市の就業構造や産業構造の再編も必要不可欠になってくる。さらに、人口減少社会において、高齢者をいかに活用するかも重要な柱になってくるであろう。もちろん、都市経済構造の変容は国民経済構造の中で顕在化しているが、都市圏内では、同時に人口の都市内移動に基づく地域構造変化が現れていることは注目してよい。つまり、都心やインナーシティに高齢者が割合として多いことや、郊外の住宅団地は近いうちに高齢化したコミュニティが形成される可能性が高い。この点は高齢者の今後の生活様式と関連しており、日本の都市圏の状況とも共通する課題である。その際、如何にコミュニティを形成するか、形成されるべきかは、理想的な高齢社会を形成する上で重要な課題となってくることも明らかとなった。
中米先住民運動における政治的アイデンティティ：メキシコとグアテマラの比較研究

私たちの研究は、メキシコとグアテマラ両国における先住民(先住民族)について、先住民運動の中にみられる政治的アイデンティティについて現地に赴く民族誌調査を通して明らかにしてきた。具体的には、世界の他の地域での民主化要求運動、すなわち自治権獲得運動、言語使用の権利主張や言語復興、土地問題、国政への参加、地方自治などの研究を通して、(a)外部から見える社会的な政治文化としての「抵抗」の実践と(b)内部の構成員から現れてくる文化政治を実践する際の「アイデンティティ構築」という二つのモーメントと、その組み合わせのダイナミズムからなる資料を数多く得ることができた。研究初年度は、グアテマラ共和国とメキシコ合衆国での双方の調査に全員が従事した。そこで調査ならびに報告されたことは以下のとおりである。メキシコ・チアパス州とグアテマラのマヤ系先住民め政治参加に関するプロセスには著しい違いがあり、本研究のテーマが重要であることを確認した(池田)。グアテマラでは、ケクチ、カクチケル、マムの言語を話すマヤ系先住民の社会運動が調査され、悪化する社会治安のなかでも、民族芸術運動、言語運動、地方自治復権運動が活発化し、先住民の諸表象が様々な形をとって先住民の様々な局面におけるアイデンティティ主張に使われていることが明らかになった(太田、滝[=連携研究者]、池田)。メキシコではチアパスの他に、ゲレロ、イダイルゴ、オアバカ州で調査がなされ、先住民知識人や女性運動活動家および避難民などにインタビューが試みられた。その結果、暴力的な紛争形態をもちながらも広範な政治参加と「抵抗」に関する議論が展開されていることが明らかになった(小林、狐崎、池田)メキシコおよびグアテマラの先住民について、彼/彼女らを本質主義的な文化的アイデンティティの担い手とみるのではなく、周縁化による排除から自らの権利行使としての国政への参加や存在の文化的顕示の実践、すなわち先住民の政治的アイデンティティの主体(およびその構築)という観点から捉え直すことが本研究の目的である。本年度は、池田は、グアテマラのサン・マルコス県における調査地の地元協議会(COCODE)と村長派の対立という共同体内の紛争事例の分析をおこない、地方分権化情況における先住民の政治的アイデンティティの覚醒過程について資料収集をおこなった。太田は、グアテマラ・チマルテナンゴ県における内戦時における紛争の記憶や語りについて調べ、内戦に巻き込まれながらも、生き延びてきたマヤ系先住民の人びとが、現在の自分たちの生活と内戦の経験をどう結び付けて理解しているか、という疑問をインタビュー調査により解明した。小林は、メキシコ市のNPO、ミチョアカン州のプレペチャ先住民共同体、プエプラ州のナウァ先住民、モレロス州の祭礼などについて調査をおこない、先住民政治の模索とその失敗の要因について分析を加えた。狐崎は、メキシコ政府社会開発省の役人・官僚ならびにワステカ先住民の代表へのインタビューに成功し、社会開発プログラムの理論的基盤、実施状況と評価手法、評価についてヒアリングを行った。またソノラ州のヤキ先住民共同体における農地・農業問題について現地調査をおこなった。太田(編者)ならびに小林(執筆者)は、この調査を研究における成果報告(一部)として『政治的アイデンティティの人類学』(昭和堂、2012年)を刊行した。メキシコおよびグアテマラの先住民について、彼/彼女らを本質主義的な文化的アイデンティティの担い手とみるのではなく、周縁化による排除から自らの権利行使としての国政への参加や、彼/彼女らの存在の文化的顕示の実践として捉え直す。すなわち先住民の政治的アイデンティティの主体(およびその構築)という観点から先住民社会の現状を把握することが本研究の目的である。この最終年度では、池田は、サンマルコス県コミタンシージョ町を中心に地方自治に関する聞き取りをおこなうと同時に、この町の出身村を出てグアテマラ市周辺に住み、先住民アイデンティティを維持しながらも、他の先住民ならびにラディノ住民と共同しながら、居住地の地域問題(青年のアルコールや薬物中毒あるいは犯罪化)に取り組む男性の活動についてライフヒストリーを聴取した。太田は、チマルテナンゴ県サン・ホセ・ポアキル町を中心に、ポアキル町とその周辺集落との関係変化の歴史について、聞き取り調査をした。その結果アイデンティティの編成に内在する、グアテマラ共和国内でのラディーノとマヤ、北西高原地帯でのキチェとカクチケル、チマルテアンゴ県下でにコマラパとポアキル、そしてポアキル地域での町民と集落民という重層的対立の図式が浮かび上がった。小林は、チアパス州サンクリストバル市等で調査をおこない、メキシコ各地の先住民族の巨大開発プロジェクトに抵抗する運動や土地・領域防衛や自治構築の運動の現況を調べた。とりわけ住民の開発運動に対する抵抗運動(例:テワンテペック地峡部の風力発電反対運動、モレロス州テポストランの高速道路建設反対運動)について調査した。メキシコおよびグアテマラの先住民について、彼/彼女らを本質主義的な文化的アイデンティティの担い手とみるのではなく、周縁化による排除から自らの権利行使としての国政への参加や存在の文化的顕示の実践、すなわち先住民の政治的アイデンティティの主体(およびその構築)という観点から捉え直すことが本研究の目的である。

この目的を完遂するために下記のような調査研究を行った。本年度の池田は、米国サンフランシスコで開催されたアメリカ人類学会総会に参加し、世界の先住民運動の権利運動に関する学会発表を聞き、資料と情報を収集した。その後、メキシコ・チアパス州ならびにグアテマラ共和国サン・マルコス県において、住民の政治参加に関する現地調査をおこなった。太田はグアテマラ共和国チマルテナンゴ県サン・ホセ・ポアキル町と近隣集落での実地調査をおこなった。そこで内戦の経験についての語りのなかに冷戦以前の19世紀末にまで遡れる行政自治意識の歴史認識が見られることを確認することができた。小林は、メキシコで開催されたゲレロ学会で、「文化遺産」を巡る先住民社会の対応の多様性に関し現地研究者と意見交換をした後、メキシコ・トトナカ地方の先住民社会の二つの「世界遺産」の資源活用の実態について調査した。狐崎は、グアテマラにおける地方分権化と公共政策、政治的アイデンティティをテーマに、首都グアテマラ・シティにおいて経済企画省・社会開発省・農牧省等の中央官庁幹部への聞き取り調査と資料収集を行った。研究協力者の滝奈々子(大阪大学)はメキシコのトラヤカパンの吹奏楽団ならびにグアテマラ共和国のアルタ・ベラパス県での伝統音楽ならびに、新世紀以降に若い世代に支持を集めつつあるマヤロックについての基礎資料の収集をおこなった。本研究の研究分担者である太田好信がはじめて提唱した「政治的アイデンティティ」として先住民の現在をみる視座を、メキシコとグアテマラの先住民の現地調査という共同研究を通して明らかにしようとする本研究のテーマは斬新である。現在、各人が試行錯誤しながら着実にインタビュー資料を蓄積しており、これらが将来比較検討されることで、他の地域研究者にも大いなる研究上の展開をもたらすことが期待できる。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の研究分担者である太田好信が提唱した「政治的アイデンティティ」として先住民の現在をみる視座を、メキシコとグアテマラの先住民の現地調査という共同研究を通して明らかにしようとするのが本研究のテーマである。このことにつき調査開始3年間の民族誌資料の蓄積が整いつつあり、資料の分析に供することができるよう準備中である。これらが次年度の最終年度にむけて頻繁に比較検討されることで、本研究班のみならず、メンバー外の同地域の研究者にも大いなる研究調査情の進展をもたらすことが期待できると考える。平成24年度は、本共同研究調査の後半の最初のフェーズになり、最終年度の1年前のものとなるために、現地調調査の前後に、何らかの理論的視座の共有や、これまで蓄積されてきた現地資料の交換や検討が必要となる。このことに関する、共有や議論の積み重ねがこれまで以上に円滑にすすんでいる訳ではない。
含レア・ア-ス機能性材料の化学熱力学的研究

1.YーCuーBa3元系合金の熱着力学的研究YーCuーBaーO系の高温酸化物超伝導体の基礎として重要なYーCuーBa3元系合金の高温における熱力学的性質および状態図を研究し、次のような結果を得た。(1)YーCu,YーBa,CuーBa各2元系の中間化合物の生成熱,熱容量,融解熱などを溶解熱量計や落下型熱量計を用いて測定し、報告値の存在しないこれら化合物の生成自由エネルギ-を温度の関数として導出することができた。(2)YーCuーBa3元系合金の900°C以上の高温状態図を溶解平衡法を用いて作製し、YおよびBaの高組成測には広い2液相ないしは2固相共存領域が、またCu高組成側には均一融体領域が存在することを明らかにした。(3)上記実験により得られた化合物の熱力学デ-タおよび状態図デ-タとコンピュ-タ-による熱力学解析法を用いて、YーCuーBa3元系合金の熱力学諸量および相関係を合金組成および温度の関数として総括的に表わすことのできるパラメ-タ-を算出することに成功した。2.NiーLa系水素吸蔵合金の統計熱力学的研究ジ-ベルト装置を用いてNiーLa系合金のPCT特性(平衡水素圧ー組成ー温度の相互関係)を測定し、大分配関数による統計熱力学の手法を用いて結果の解析を行った。この結果、水素圧が100気圧以下の条件では、水素は、NiーLa単位格子の3fサイトに3ケ,6mサイトに3ケが侵入型に配置するNi_5LaH_6合金を形成するが、強い歪エネルギ-の存在する1000気圧以上の水素圧の条件下では6mサイトに更に3ケの水素が侵入しNi_5LaH_9合金を作り得ることを統計熱力学で明らかにした。
タンパク質の安定性に関わる新規翻訳後修飾、Gdx化システムの分子機構の解明

ユビキチンやユビキチン様タンパク質(UBLs)による翻訳後修飾は、生命現象に必須なタンパク質制御機構である。われわれはこれまでにII型UBLグループに分類されていたGdX/UBL4が新規翻訳後修飾分子(1型UBL)として機能することを示唆するデータを得ていた。GdXの結合タンパク質として同定したcyclin Fが細胞内でGdX化することを示すデータを得たのである。GdX化を受けないcyclin F変異体を細胞に発現させたり、siRNAによってGdXタンパク質の発現量を減少させるとcyclin Fは安定化し、どちらの場合もG2/M期の細胞が増加した。そこで本特定領域研究期間に、より詳細な細胞周期の解析と新規GdX化システムの酵素群(E1(GdX活性化酵素)/E2(GdX結合酵素)/E3(GdXリガーゼ)様分子)の同定を試みた。まず細胞周期解析のために核を可視化したHeLa細胞を用い、shRNAによる誘導型GdX発現抑制細胞株を樹立し、M期の詳細な解析を行った。GdX発現抑制細胞では細胞増殖が低下し、M期の障害(中期形成異常による染色体分配異常や紡錘体形成異常)による多核細胞や分裂期細胞死が増加するという結果を得た。正常な細胞ではS期からM期にcyclin Fの発現量は高くなるが、GdX発現抑制細胞ではそのcyclin Fの分解が遅延し、その結果cyclin Aやcyclin Bの分解時期が遅れていた。Cyclin Bの分解異常により細胞質分裂が完了せず、細胞が2核になることが報告されていることから、GdXはcyclin Fを修飾(GdX化)することによってcyclin Fタンパク質の安定性を制御し、cyclin Aやcyclin Bを制御することが示唆された。このことよりGdXによるcyclin Fの制御が正常な細胞周期の維持に関わっている可能性が強く示唆された。GdX化システムに関しては、E1(GdX活性化酵素)/E2(GdX結合酵素)様分子の同定には至らなかった。しかしcyclin FのGdX化には直接関与しないGdX化のE3(GdXリガーゼ)様分子や新たな基質の候補遺伝子を複数同定することに成功した。それらの解析を含め、細胞周期M期の制御に重要なGdX化システムの分子メカニズム、特にE1/E2様分子の同定が今後の課題である。生化学的手法を用いてGdX化システムに関わる酵素群(GdX活性化酵素E1、GdX結合酵素E2、GdXリガーゼE3)を同定し、その分子機構を明らかにすることを目的とした。われわれはこれまでにこのGdXがI型UBL修飾分子として基質に共有結合(GdX化)することを発見した。GdX化は細胞周期のM期の制御に重要な役割を果たしていることが示唆され、そのM期の制御に関わる基質、cyclin Fの同定に成功し、その機能解析を進めてきた。しかしGdX化システムの分子機構は全く不明のままである。そこで本研究では、生化学的手法を用いてGdX化システムに関わる酵素群(E1,E2,E3)を同定し、その分子メカニズムを解明することを目的とした。まずGdXに結合する分子群をaffinity精製後、一次元電気泳動によりバンドを切り出し、ゲル内消化法によってペプチド断片を抽出する。これを質量分析計を用いて部分アミノ酸配列を決定し、各種データベース検索を行って一致するDNA配列を探索する。特にこれまで報告されているユビキチン、SUMO、Nedd-8のE1,E2,E3と類似領域をもつ分子を探した結果、新規RING fingerタンパク質(以下RFP)の同定に成功した。RINGfingerタンパク質はユビキチンリガーゼとして働くものが多いため、GdX化リガーゼの候補遺伝子としてそのcDNAをクローニングした。得られたcDNAを発現ベクターに組み込んで大腸菌内で大量発現し、組み換えタンパク質を精製した。これをウサギに免疫し、特異的なポリクローナル抗体を作製した。この野生型RFPを細胞株に過剰発現するとcyclin FのGdX化は促進されるが、RING fingerドメインに変異を入れたドミナントネガティブ変異体を過剰発現するとその効果が見られなくなった。現在、作製した特異的抗体やRNA干渉法を用いた機能解析を現在進行中である。

GdX発現抑制細胞では細胞増殖が低下し、M期の障害(中期形成異常による染色体分配異常や紡錘体形成異常)による多核細胞や分裂期細胞死が増加するという結果を得た。正常な細胞ではS期からM期にcyclin Fの発現量は高くなるが、GdX発現抑制細胞ではそのcyclin Fの分解が遅延し、その結果cyclin Aやcyclin Bの分解時期が遅れていた。Cyclin Bの分解異常により細胞質分裂が完了せず、細胞が2核になることが報告されていることから、GdXはcyclin Fを修飾(GdX化)することによってcyclin Fタンパク質の安定性を制御し、cyclin Aやcyclin Bを制御することが示唆された。このことよりGdXによるcyclin Fの制御が正常な細胞周期の維持に関わっている可能性が強く示唆された。GdX化システムに関しては、E1(GdX活性化酵素)/E2(GdX結合酵素)様分子の同定には至らなかった。しかしcyclin FのGdX化には直接関与しないGdX化のE3(GdXリガーゼ)様分子や新たな基質の候補遺伝子を複数同定することに成功した。それらの解析を含め、細胞周期M期の制御に重要なGdX化システムの分子メカニズム、特にE1/E2様分子の同定が今後の課題である。
ローテータグラフのための経路選択アルゴリズムの開発

研究成果を要約すると以下のようになる.・ローテータグラフに対するノードからノード集合への互いに素な経路問題の解決・パンケーキグラフに対するノードからノード集合への互いに素な経路問題の解決・焦げたパンケーキグラフに対するノードからノード集合への互いに素な経路問題の解決・パンケーキグラフに対する2ノード間の内素な経路問題の解決・一般化したローテータグラフに対する2ノード間の内素な経路問題の解決・バブルソートグラフに対する2ノード間の内素な経路問題の解決・部分列反転グラフに対する2ノード間の内素な経路問題の解決・ローテータグラフにおける耐故障マルチキャスト経路選択問題に対するアルゴリズム・トリバレントケイリーグラフにおける最小フィードバックノード集合これらの詳細については,対応する付録を参照されたい.本研究では,ローテータグラフをはじめとして,いくつかのケイリーグラフを対象に,途中の計算機や計算機間のリンクに故障が発生しても,メッセージを送る機能を失わないような経路選択アルゴリズムを開発し,目標を達成した.これらの成果は,超並列計算機に関する研究全体から見れば小さな貢献に過ぎない.しかしながら,超並列計算機の設計や実現において,どのような位相を選択するかは最重要課題の1つであり,本研究成果は,今後の研究の基礎として大きな意味を持つものであると自負している.研究成果を要約すると以下のようになる.・ローテータグラフに対するノードからノード集合への互いに素な経路問題の解決・パンケーキグラフに対するノードからノード集合への互いに素な経路問題の解決・焦げたパンケーキグラフに対するノードからノード集合への互いに素な経路問題の解決・パンケーキグラフに対する2ノード間の内素な経路問題の解決・一般化したローテータグラフに対する2ノード間の内素な経路問題の解決・バブルソートグラフに対する2ノード間の内素な経路問題の解決・部分列反転グラフに対する2ノード間の内素な経路問題の解決・ローテータグラフにおける耐故障マルチキャスト経路選択問題に対するアルゴリズム・トリバレントケイリーグラフにおける最小フィードバックノード集合これらの詳細については,対応する付録を参照されたい.本研究では,ローテータグラフをはじめとして,いくつかのケイリーグラフを対象に,途中の計算機や計算機間のリンクに故障が発生しても,メッセージを送る機能を失わないような経路選択アルゴリズムを開発し,目標を達成した.これらの成果は,超並列計算機に関する研究全体から見れば小さな貢献に過ぎない.しかしながら,超並列計算機の設計や実現において,どのような位相を選択するかは最重要課題の1つであり,本研究成果は,今後の研究の基礎として大きな意味を持つものであると自負している.ローテータグラフは,低い次数,小さな直径と平均距離という望ましい性質を備えた有向グラフであり,並列計算機の相互結合網の位相として,今後有望視されている.しかしながら,このグラフは,近年発表されたために,複雑な通信パタンに対しては,効率的なアルゴリズムが未発見であり,その普及を妨げてきた.本研究では,1対多および多対1の互いに素な経路問題を,その次数の多項式時間で解く算法を提案した.さらに,これを実装し,当補助金によって購入した計算機を用いてシミュレーション実験を行ない,その性能を検証した.また,同じケイリーグラフに属し,無向グラフであるパンケーキグラフに対しても本手法を修正して用いることで,未解決であった1対多の互いに素な経路問題を次数の多項式時間で解くことができることを示し,計算機シミュレーションによって検証した.さらに,本研究における提案手法では,1対1の互いに素な経路問題を多項式時間で解く必要があるため,パンケーキグラフにおいては,未解決であるこの問題に対しても多項式時間の解を与え,シミュレーションにより性能を評価した.ローテータグラフ,は,低い次数,小さな直径と平均距離という望ましい性質を備えた有向グラフであり,並列計算機の相互結合網の位相として,今後有望視されている.しかしながら,このグラフは近年発表されたために複雑な通信パタンに対しては,効率的なアルゴリズムが未発見であり,その普及が妨げられてきた.本研究では今年度以下の点を明らかにすることができた:1ローテータグラフに対して,1対多の互いに素な経路問題を次数の多項式時間で解く単純なアルゴリズムを新たに開発し,国際会議SNPD'02で発表した.2また,拡張したローテータグラフである(n, k)-ローテータグラフに対して1対1の互いに素な経路問題を次数の多項式時間で解くアルゴリズムを開発し,国際会議PDCAT2002で発表した.3ローテータグラフと類似なケイリーグラフの一種である,パンケーキグラフに対して,1対1の互いに素な経路問題を次数の多項式時間で解くアルゴリズムを開発して,論文誌に投稿し,採録が決定されている.4パンケーキグラフを拡張したグラフである,焦げたパンケーキグラフに対して,1対多の互いに素な経路問題を次数の多項式時間で解くアルゴリズムを開発し,研究会で報告した.5さらにケイリーグラフの1種であるトリバレントケイリーグラフにおいて,その除去がサイクルのないグラフを導出するような節点集合を定数時間で発見する手法を開発し,研究会および国際会議PRDC2002において発表した.最終年度に当たるため,従来の研究成果の応用に加えて,研究の取り纏めと成果報告を行った.まず,ローテータグラフ用に開発した節点から節点集合への互いに素な経路問題を次数の多項式オーダで解くアルゴリズムが,他のケイリーグラフにも適用可能なことを発見し,パンケーキグラフ,焦げたパンケーキグラフにおいても,この問題を解決することに成功した.また,節点間の内素な経路問題に対しては,グラフが,部分グラフの直和として構成されている場合,出発節点,目的節点の両方から,それぞれの部分グラフへ1本,あるいは2本の経路を構成して,部分グラフ中で経路を結んでやるという技法を開発した.

これにより出発節点と目的節点との対称性を利用して,簡単な問題に帰着できるようになった.この手法を適用して,バブルソートグラフ,部分列反転グラフにおける2節点間の内素な経路問題を解決することができた.主要な研究テーマに取り組む際に得た知見から,いくつかの問題に対する解法を得ることができた.このうち,トリバレントケイリーグラフにおける最小フィードバックノード集合を示すことに成功し,研究成果としてまとめることができた.
シリア・中心体系と細胞極性制御の分子基盤の構築

本研究課題では、シリア・中心体形成や極性形成に関与するキナーゼについて、リン酸化プロテオミクスを基盤とした基質探索と機能解析を行うことで、下流のリン酸化シグナルおよび細胞の非対称性を担保する分子基盤を明らかにすることを目指している。申請者らが開発した方法によってシリア関連キナーゼの基質スクリーニングを行い、AurAの基質候補として中心体構成蛋白質のCep170を、AurBの基質候補としてシリア内輸送を担うKIF3およびKIFAP3を見出した。NEK1の基質候補としてシリア内輸送関連BBsome構成蛋白質のBBS7、シリア形成制御蛋白質のARL3、およびKIF3、KIFAP3、KIF2Aを見出した。また、極性関連キナーゼであるaPKCが低分子量GTPase Racの活性化因子であるTiam1をリン酸化し、その結果Tiam1の抑制的分子内相互作用を解除して活性化することを示した。aPKCはPAR3、PAR6と共に極性制御複合体を形成し、細胞極性を制御することが知られている。PAR3が恒常的にPDGFRbetaと結合しており、またTiam1とも結合することを見出し、PAR3がPDGFRbeta近傍にTiam1をリクルートすると推察された。PDGF刺激によって、おそらくホスファチジルイノシトールシグナルを介してaPKCが活性化されTiam1をリン酸化することで近傍のRac活性が上昇してdorsal rufflingを誘導することを見出した。このことより、PDGF・極性制御蛋白質・Racシグナルがどのようにリンクするか、その一例が示された。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題では、シリア・中心体形成や極性形成に関与するキナーゼについてリン酸化プロテオミクスを基盤とした基質探索と機能解析を行うことで、下流のリン酸化シグナルおよび細胞の非対称性を担保する分子基盤を明らかにすることを目指している。平成26年度に引き続き、平成27年度にはシリア・中心体形成や極性関連キナーゼであるTTBK2、NEK1、GSK3b、CDK5、MAPK1の基質の探索を行い、多数の基質候補を得た。TTBK2の基質候補として得られたKIF2Aに注目して解析を行った。KIF2Aは微小管脱重合活性を持つユニークなキネシンファミリーメンバーで、微小管のダイナミクスに関与するが、TTBK2がKIF2Aの135番目のSerをリン酸化して脱重合活性を抑制することを示した。TTBK2はCEP164を介してシリア基底部に、+TipsであるEB1/3を介して微小管の成長端に局在することが知られている。本研究では、TTBK2は微小管の成長端でKIF2A活性を抑制することで安定した微小管成長をもたらすことを示した。HeLa細胞を用いた創傷治癒アッセイにおいて、TTBK2の機能抑制によって細胞の遊走速度が低下し、また方向性にも影響が認められたことから、TTBK2は遊走先端においてKIF2Aの活性を調節することで微小管のダイナミクス・配向を制御し、方向性を持った細胞遊走に寄与すると考えられる。また、リン酸化モチーフを認識する14-3-3やWWドメイン、FHAドメインを用いて、細胞内のリン酸化蛋白質の効率的な濃縮を試みた。その結果、14-3-3では中心体・紡錘体局在蛋白質が、またFHAドメインでは中心体・紡錘体局在蛋白質に加えてキネトコア・セントロメア局在蛋白質が得られ、これら蛋白質のリン酸化状態を解析することが可能となった。本研究では、シリア・中心体系と極性関連キナーゼの基質探索とその機能解析を行うことで、シリア・中心体系と細胞極性形成の間のシグナルフローを見出すことを目指している。平成27年度にはシリア形成制御に関わるキナーゼTTBK2の新規基質としてKIF2Aを同定し、TTBK2が微小管成長端でKIF2A活性を調節することが方向性のある細胞遊走に重要であることを示した。TTBK2やそれ以外のキナーゼについても多数の基質候補蛋白質を得ており、平成28年度には引き続きその解析を行う予定である。また、上記キナーゼの機能抑制・活性化条件下のリン酸化プロテオミクス解析については、平成27年度にリン酸化モチーフ認識プローブ(14-3-3やFHAドメイン)を用いた解析系の構築を行ったので、平成28年度に解析を行う。さらに、シリア制御・構成蛋白質のインタラクトーム解析も行っており、上記のプローブに加えて、キナーゼの活性によって、これら蛋白質間の相互作用に影響があるか、についても解析を開始した。以上のことから、本研究はおおむね順調に進展していると考える。

また、極性関連キナーゼであるaPKCが低分子量GTPase Racの活性化因子であるTiam1をリン酸化し、その結果Tiam1の抑制的分子内相互作用を解除して活性化することを示した。aPKCはPAR3、PAR6と共に極性制御複合体を形成し、細胞極性を制御することが知られている。PAR3が恒常的にPDGFRbetaと結合しており、またTiam1とも結合することを見出し、PAR3がPDGFRbeta近傍にTiam1をリクルートすると推察された。PDGF刺激によって、おそらくホスファチジルイノシトールシグナルを介してaPKCが活性化されTiam1をリン酸化することで近傍のRac活性が上昇してdorsal rufflingを誘導することを見出した。このことより、PDGF・極性制御蛋白質・Racシグナルがどのようにリンクするか、その一例が示された。平成27年度には、TTBK2がシリア形成だけでなく細胞極性の形成・維持にも関わっていることを示した。TTBK2の新規基質として同定したKIF2Aは、シリア形成にも関与が示唆されており、今後、TTBK2を介したシリア形成と細胞極性との関わりを解析すると共に、TTBK2以外の関連キナーゼ基質の機能解析を進める。また、リン酸化モチーフ認識プローブ(14-3-3やFHAドメイン)を用いた解析系を用いて、上記キナーゼの機能抑制・活性化条件におけるリン酸化プロテオミクス解析を行う。さらに上記のプローブに加えて、シリア制御・構成蛋白質のインタラクトーム解析を行い、シリア構成蛋白質の動態を解析する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
岩塩/好塩性古細菌分布データベース作成

種々の場所から集めた(古い時代のものだけでなく新しい時代のものを含めた)岩塩を用いて、注意深く滅菌操作を行い、(1)好塩性古細菌の培養と,(2)PCR法による16SrRNA遺伝子の増幅を試みた。その結果、各地から集めた12の試料の内、3つの岩塩から好塩菌の増殖に成功し、脂質分析から確かに古細菌であることは確認できた。さらに、その16SrRNA遺伝子の塩基配列を、現存する種々の好塩菌と比較した結果、Haloferax属、Haloarcula属、Halococcus属に近いことは判断できたが、系統樹上で明らかに古いものとはならなかった。手に入った岩塩の中で、古い地質時代(カンブリア紀やペルム紀)からのものと思われる試料からは、まったく増殖が観察できなかった。また、抽出試料の直接PCRも、まったく増幅が観察されなかった。岩塩中での好塩菌の生存曲線は明らかではなく、ある一定期間以前の試料からの再生は望めないのかもしれないが、まだ分析した試料の量が少ないので、好塩菌の岩塩中での局在化の問題も含め、検討の余地はある。現存する好塩菌については、そのレチナ-ルタンパクのアミノ酸配列から分子系統樹を作成し、遺伝子重複によって増えたと思える4種類の同族体の関係を明らかにした(投稿中)。この遺伝子重複の時点は進化の時間軸において一つのマーカーとなり、分化時期の推定を確かなものにできるかもしれない。さらに、ATPaseやシトクロームオキシダーゼのような重要なタンパクにも重複が見られることがわかった。この中には、好塩菌の種分化以降に重複を起こしているものがあり、生物間の分岐順序を決めるのにも役立つものと考えられる。
腎の嚢胞化とと発癌に関する分子生物学的研究

透析患者の終末萎縮腎の約半数に後天性多嚢胞腎の合併を認めるが、更にこのような透析嚢胞腎病変には、腫瘍性病変が高率に合併することが明らかとなり、臨床上重要な問題となっている。diphenylthiazole(DPT)はラット腎に多発生嚢胞の発生を誘導することで知られているが、我々はこれを後天性多嚢胞腎のモデルとして利用し、さらに嚢胞壁から癌の発生するモデルの作成を試みた。また、このようなモデルにおける嚢胞の癌化過程の解析には、DPTによる嚢胞形成機序の解明が前提となる。そこで、DPTによる腎の一次的変化が反映される「嚢胞形成初期」に焦点をしぼり、この時期の遺伝子発現の変化について検討した。前者について、DPTの投与によって嚢胞腎を形成したラットに対し、発癌物質であるN-nitrosomorpholine(NNM)を投与し、その結果、10腎(5匹)の内2腎(2匹)に嚢胞壁から発生した腺腫を観察した。現在このモデルの再現性の確認を行っている。後者については、細胞外マトリックス構成の変化を検討するため、laminin、3型および4型collagenを免疫組織的に染色する一方、DPT投与後早期に特異的に発現量の変化する遺伝子をrun-on transcription法、cDNA-cDNA subtraction法、RNA differential display法を用いて検討した。その結果、c-myc、c-fos、c-erbB2を含め、様々な遺伝子が、DPT投与によって発現の低下することが明らかとなった。またこの様な遺伝子の候補として得られた4遺伝子の内、2遺伝子についてはcDNAの部分的な塩基配列を決定した。その塩基配列より、この2遺伝子については、未知のものである可能性が高い。今後も、DPT投与により発現量の変化する遺伝子の探索を進め、さらにNNM投与に特異な遺伝子発現についても同様に検討する予定である。われわれはこれまでに経験した透析患者の腎細胞癌は19例であるがこのうち15例(78.9%)は後天性多嚢胞化腎(ACDK)に合併したものであった。ACDK合併の各腎につき全割標本を作製してその詳細な病理組織学的検討を行った結果、15例中13例(86.7%)に明らかな癌病変のほか、腺腫をはじめ嚢胞壁上皮のhyperplasiaやdysplasiaなどを伴った異型嚢胞を多数認めた。これは嚢胞の形成、嚢胞上皮の増殖が腺腫や癌の発性と密接に関連していることを示すものである。そこでわれわれは、ラット腎に短期間に多発性の嚢胞発生を誘導することが知られている化学物質diphenyl thiazole(DPT)と、同じくラット腎に腫瘍性病変を高率に惹起するhitrosomorpholine(NNM)を経口投与することにより、ACDKにおける発癌モデルの作成を試みた。方法:5週令の雄SDラットに1%DPTを含む飼料を18週間投与した。このうちNNM投与群は、5-11週の7週間はNNM100mgないし200mg/Lを飲水に投与した。NNM投与前、投与終了時、投与終了7週後に腎を摘出し形態学的変化を観察した。結果:NNM投与群において、NNM投与終了後7週間の腎尿細管上皮に一部増殖性のclearcellの出現を認たが、明らかな腫瘍性病変の発生は認めなかった。現在、NNM投与後の観察期間を22週以上に延長して検討するとともに、in situ hybridizationを行って遺伝子発現の変異につき検討している。緒言;昨年度と同様に、後天性多嚢胞腎ならびにこれを発生母地とする腎癌の発現機序について、臨床検体とラットを用いた動物モデルを対象に検討を行った。方法(概要)

昨年度に引き続き、今年度も以下の3点について検討を進めた。まず第1点は、嚢胞形成をもたらす2-amino-4,5-diphenyl-thiazole(DPT)とgenotoxicityの明らかなN-nitroso-morpholine(以下NNM)とラット腎に相互作用させる実験で、NNMの投与を昨年度の検討で明かとなった至適投与量(100mg/L)とし、長期生存実験を試みた。第2点としては、後天性多嚢胞腎や腎癌の臨床検体標本を対象に、陽性コントロールrRNAをprobeとしたin situ hybridizationの条件検討を行った。第3点として、DPT投与ラットにおいて、嚢胞形成初期に特異的に発現する遺伝子の同定を、cDNA-cDNA subtractio法を用いて検討した。結果(概要)および考察;第1点については、DPT+NNM平行投与群5例(10腎)の内、9か月経過した時点で、2例(2腎)に嚢胞上皮由来の好塩基性腫瘍(癌)を認めた。これは、DPT+NNM併用が、後天性腎嚢胞を発生母地とする腎癌の動物モデルとして有用であることを示唆する。第2点については、陽性コントロールであるrRNAをprobeとした場合、多くの臨床検体で安定してこれを検出することが可能となった。しかし、今回用いた方法では、明細胞性腎癌の場合、細胞質の漏出が著しく、このタイプの腎癌には新たな条件の設定が必要と考えられる。第3点については、subtracted cDNAを組み込んだlambdaファージについて、300プラークをスクリーニングし、22個の候補cDNAを得たが、その性質については現在検討中である。昨年度に引き続き、diphenylthiazole(DPT)投与により発生するラット後天性多嚢胞腎に対し、(1)嚢胞壁から癌の発生するモデルの作成、(2)DPTによる一次的変化の反映される『嚢胞形成初期』について、蛋白、遺伝子発現の変化についての検討を行った。【方法】(1)DPT投与によって嚢胞腎を形成したラットに、n-Nitrosomorpholin(NNM)を平行投与し、腺腫の発生頻度について、NNM投与終了後の観察期間により2群(観察期間20週の群並びに40週の群)に分け、検討した。(2)細胞外マトリックス構成要素の変化を検討するため、laminin、3型および4型collagenを免疫組織的に染色するした。またDPT投与後早期(7日以内)に特異的に発現量の変化する遺伝子をin vitro translation法、run-on transcription法、RNA differential display法を用いて検討した。【結果】(1)嚢胞壁から癌発生モデルについては、現在観察継続中である。(2)細胞外マトリックス構成要素の染色性について、DPT投与後その低下が認められた。また今回用いたmRNAからは、in vitro translation法で検出可能な蛋白の合成は行われなかった。
栄養源枯渇におけるゲノム安定性の制御

研究代表者はこれまで、細胞の増殖を制御するシグナル伝達経路(TSCシグナル伝達経路)が栄養源(アミノ酸)の取り込みに対してどのように応答しているのかを分子レベルで明らかにすることを試みてきた。その結果、アミノ酸受容体の局在を制御するユビキチンリガーゼPub1とアレスチン様タンパク質Any1の単離に成功し、それらのタンパク質が協調して、TSCシグナル伝達経路の下流でアミノ酸取り込みの制御に機能していることを明らかにした。細胞が増殖や成長を停止した状態をGO期と呼ぶ。GO期の特徴は、細胞が外部の環境条件に合わせ素早く成長を停止し(GO状態)、かつ急速に増殖サイクルに戻るというその反応の素早さにある。GO状態は高等生物から酵母にまで広く見られる現象であり、とりわけ興味深いのは、いずれの生物種も比較的小さな分子であるアミノ酸や糖に対して、その存在の有無を正しく検知し、細胞の増殖のタイミングを正確につかむという、そのシグナル伝達経路の正確さと早さである。そのシグナル伝達経路に位置する因子としてTSC1/2が知られている。申請者は、遺伝学的操作が容易な分裂酵母のtsc1^+・tsc2^+遺伝子をモデル系として用いている。tsc1^+とtsc2^+のいずれかの遺伝子を欠損する変異株(Δtsc1,Δtsc2)では、栄養源に対する応答が異常になる。Δtsc2の形質を抑圧する変異株の取得を試みたところ、ユビキチンリガーゼE3(Pub1)の変異株を得た。ユビキチンリガーゼPub1の変異がTsc2の変異を抑圧する機構を明らかにすることを目的に今年度は研究を行ってきた。栄養源が豊富にある環境では、アミノ酸透過酵素(SPBC359.03c)はゴルジ体に局在している。栄養源枯渇環境にさらすと、アミノ酸透過酵素は5分以内に細胞膜に局在を移し、再度、栄養源を添加すると10分以内に再びゴルジ体に局在を移すことがわかった。興味深いことに、Δpub1やΔtsc2Δpub1二重変異株では、アミノ酸透過酵素は栄養源が豊富にある環境でも細胞膜局在を示した。また、Δtsc2Δpub1二重変異株では、Δtsc2の形質であるカナバニン耐性が抑圧される他、アミノ酸(ロイシン)の取り込み欠損も抑圧された。これらのことから、Pub1はアミノ酸透過酵素の局在を制御することによって、Tsc2の変異を抑圧している可能性が示唆された。我々は、このシグナル伝達経路が保存されている分裂酵母を用いて、tsc2遺伝子破壊株(Δtsc2)を作製し解析を行ってきた。Δtsc2では、アミノ酸の取り込み能の低下、アルギニン類似体であるカナバニンへの耐性、窒素減涸渇応答の遅延が見られた。この形質を抑圧する変異株を取得したところ、ユビキチンリガーゼE3をコードするpub1+と、エンドサイトーシスに関与するアレスチンのホモログany1+の変異体を得た。折しも最近、Pub1の出芽酵母ホモログRsp5がAny1の出芽酵母ホモログArt1と結合して、エンドサイトーシスを制御しているという報告があった(Lin et al., Cell 2008)。Pub1,Any1それぞれの変異体では、アミノ酸透過酵素の局在制御が異常になり、本来ならば栄養源がリッチである環境ではゴルジ体に、枯渇時には細胞膜に局在するアミノ酸透過酵素が、細胞膜に局在したままとなり変化しなくなる。これは、Pub1またはAny1の変異により、アミノ酸透過酵素をエンドサイトーシスにより細胞内部に取り込めなくなった結果であると考えられる。このことから、TSCの異常はエンドサイトーシスを利用したアミノ酸取り込み・感知機構の異常を引き起こしている可能性が考えられる。申請者は、このシグナル伝達経路が保存されている分裂酵母を用いて、tsc2遺伝子破壊株(Δtsc2)を作製し解析を行ってきた。この形質を抑圧する変異株を取得したところ、ユビキチンリガーゼE3をコードするpub1^+と、エンドサイトーシスに関与するアレスチンのホモログany1^+の変異体を得た。またPub1とAny1は栄養源がリッチな環境ではゴルジ体に局在が見られるが、枯渇時には細胞質全体に広がって観察された。さらにAny1の局在はPub1に依存していることがわかった。これらのことから、Pub1とAny1は協調的に働き、アミノ酸透過酵素の局在を制御していると予想された。

GO期の特徴は、細胞が外部の環境条件に合わせ素早く成長を停止し(GO状態)、かつ急速に増殖サイクルに戻るというその反応の素早さにある。GO状態は高等生物から酵母にまで広く見られる現象であり、とりわけ興味深いのは、いずれの生物種も比較的小さな分子であるアミノ酸や糖に対して、その存在の有無を正しく検知し、細胞の増殖のタイミングを正確につかむという、そのシグナル伝達経路の正確さと早さである。そのシグナル伝達経路に位置する因子としてTSC1/2が知られている。申請者は、遺伝学的操作が容易な分裂酵母のtsc1^+・tsc2^+遺伝子をモデル系として用いている。tsc1^+とtsc2^+のいずれかの遺伝子を欠損する変異株(Δtsc1,Δtsc2)では、栄養源に対する応答が異常になる。Δtsc2の形質を抑圧する変異株の取得を試みたところ、ユビキチンリガーゼE3(Pub1)の変異株とエンドサイトーシスに関与するアレスチンのホモログAny1の変異体を得た。ユビキチンリガーゼPub1とアレスチンホモログAny1の変異がTsc2の変異を抑圧する機構を明らかにすることを目的に今年度は研究を行ってきた。Pub1, Any1それぞれの変異体では、アミノ酸受容体の局在制御が異常になることがわかった。これは、Pub1/Any1の変異により、アミノ酸受容体をエンドサイトーシスにより細胞内部に取り込めなくなった結果であると考えられる。このことは、TSCの異常はエンドサイトーシスを利用したアミノ酸取り込み・感知機構の異常を引き起こしている可能性を示唆するものである。申請者はRhb1抗体による免疫沈殿を行ったところ、Rhb1とともにPub1も共沈してくることがわかった。これらのことから、Rhb1は直接的にPub1に働きかけてアミノ酸受容体の局在制御を行っている可能性が示唆された。細胞が増殖や成長を停止した状態をGO期と呼ぶ。申請者は、遺伝学的操作が容易な分裂酵母のtsc1+・tsc2+遺伝子をモデル系として用いている。tsc1+とtsc2+のいずれかの遺伝子を欠損する変異株(Δtsc1,Δtsc2)では、栄養源に対する応答が異常になる。Pub1,Any1それぞれの変異体では、アミノ酸受容体の局在制御が異常になることがわかった。