hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
変異イェロープロテインを用いた光反応に必須なアミノ酸残基と高次構造の研究

紅色光合成細菌Ectothiorhodospira halophilaに見出された水溶性の光受容蛋白質であるPhotoactiveyellow protein(PYP)は、高次構造が高分解能で解明されていることから、生物における光受容メカニズムを原子レベルで解明するために現在最も好適な蛋白質である。しかし、変異蛋白質の発現系がまだできていなかったために、アミノ酸レベルでの研究はさほど進んでいなかった。そこで本研究では、最近われわれが調製法を確立した変異PYPを用い、それらの吸収スペクトルの解析とフーリエ変換赤外分光法(FTIR)による水素結合ネットワークの解析を行った。1. PYPの発色団は、Glu、Thr、Tyrと水素結合ネットワークを形成し、Argがこのネットワークを安定化している。これらの残基に変異を導入した変異体を作製し、それらのM中間体の崩壊速度を解析したところ、Y42A、E46Qでは野生型よりも速く、Y42F、E46A、T50A、T50V、R52Qでは遅くなった。そのため、各残基の水素結合の強さだけでなく、大きさも中間体の挙動に影響を与えていることが示された。2.各中間体における発色団の水酸基とGlu46との間の水素結合の変化をFTIRで解析したところ、B、H、L中間体では水素結合が強くなっていたが、M中間体では水素結合はなくなっていた。そのため、M中間体で大きな構造変化が起こっていることが示唆された。3.トランスクマル酸に光照射し、FTIRによってシスクマル酸に特異的な赤外振動モードを抽出した。次に、PYPの各中間体における差FTIRスペクトルを測定し、シス型に特異的な振動モードが中間体でみられるかどうかを検討したところ、すべての中間体に同様のモードがみられたが、基底状態(暗状態)ではみられなかった。PYPの光反応初期過程がレチナール蛋白質のものと同様、発色団の異性化であることを示している。紅色光合成細菌Ectothiorhodospira halophilaに見出された水溶牲の光受容蛋白質であるPhotoactiveyellow protein (PYP)は、高次構造が高分解能で解明されていることから、生物における光受答メカニズムを原子レベルで解明するために現在最も好適な蛋白質である。1.PYPの発色団は、Glu、Thr、Tyrと水素結合ネットワークを形成し、Argがこのネットワークを安定化している。

紅色光合成細菌Ectothiorhodospira halophilaに見出された水溶性の光受容蛋白質であるPhotoactiveyellow protein(PYP)は、結晶構造解析やNMRで、高次構造が高分解能で解明されている。そのため、生物における光受容メカニズムを原子レベルで解明するために現在最も好適な蛋白質である。本研究の開始時点では、大腸菌による効率よい発現系がまだ確立されていなかったために、化学修飾を加えたPYPを用いた研究は、さほど進んでいなかった。そこで本研究では、われわれが確立した発現系を用いて発色団に同位体ラベルを導入し、フーリエ変換赤外分光法(FTIR)によってPYPの光反応中の発色団の挙動を解析した。トランスクマル酸に光照射するとシス型に異性化することが知られている。そこでこの反応を利用して、FTIRによってシスクマル酸に特異的な赤外振動モードを抽出した。次に、PYPの各中間体における差FTIRスペクトルを測定し、1.で抽出したシス型に特異的な振動モードが中間体でみられるかどうかを検討したところ、すべての中間体に同様のモードがみられたが、基底状態(暗状態)ではみられなかった。これらのモードは発色団の同位体ラベルによりシフトしたので、発色団の振動モードであることが確認された。以上の結果はPYPの光反応初期過程がレチナール蛋白質のものと同様、発色団の異性化であることを示している。
SOIを用いた電力・遅延オーバヘッドの少ない耐ソフトエラーフリップフロップの提案

65nmのFD-SOIプロセスを用いて設計した非冗長フリップフロップの放射線起因のエラーの測定を中性子を照射する加速試験により行った。提案回路であるSLCCFFは通常のFFよりも耐性が高く、特に0.4Vと低い動作電圧では約30倍のソフトエラー耐性を持つことを確認した。この値は従来の放射線耐性回路であるstacked FFと等しい値である。SLCCFFは動作速度の点で従来回路よりも優れている。アルファ線と白色中性子線を照射することで加速試験を行い、28nmのFD-SOIプロセスのフリップフロップにおける一過性のエラーであるSingle Event Upset (SEU)の発生率を測定した。アルファ線による加速試験により、FD-SOIプロセスは65nmのバルクプロセスと比較してSEU発生率が低く、約1/300以下である。しかしフリップフロップの保持データ依存性が極めて強く、クロック信号と保持データが共に0の場合では他の条件と比較してSEU発生率が6倍以上高くなった。また、pMOSFETに逆方向の基板電位を印加した場合では更に10倍程度増加する結果となった。FD-SOIは非常に高いSEU耐性を持つ一方で、ある条件下ではそのエラー耐性が大きく低下することが判明した。そのため、基板電位や保持データによってエラー耐性が低下しないようにすることで、LSI全体のエラー耐性が大きく向上すると予想される。今後はエラー耐性が低下しないフリップフロップの構造の検討を行い、研究を進める予定である。測定と同時にデバイスシミュレーションと回路シミュレーションを用いて28nmFD-SOIのSEU発生率を評価した。基板電位依存性ではエラー耐性が低下することを確認できたものの、保持データの依存性では大きな違いが生じなかった。現状ではシミュレーション上で考慮されていない影響が存在すると推測されるため、この原因を究明し、評価精度の向上を目指す。本年度にはFD-SOIプロセスを用いて設計した非冗長化フリップフロップの放射線起因のエラーを測定した。FD-SOIプロセスでは基板に絶縁層であるBOX層が存在するため、放射線によって生じた電荷の収集量を抑制するため、放射線起因のエラーが生じにくい。ただし通常のバルクよりも10倍程度エラー耐性が高いものの、エラーが生じないわけではない。そのため、フリップフロップの構造の一部のみを変更した非冗長化フリップフロップを提案した。中性子を照射する加速試験を大阪大学の核物理研究センターにて行い、提案回路のソフトエラー率を測定した。その結果、電源電圧0.4Vでは通常のフリップフロップの約30倍のソフトエラー耐性を持ち、電源電圧に対して一定のエラー耐性を持つことを確認した。この測定により、地上におけるエラーの原因である中性子に対して十分なエラー耐性を持つことを確認した。放射線の多い宇宙空間では中性子ではなく重イオンが主要なエラーの原因である。宇宙空間でもFD-SOIプロセスが高いエラー耐性を持つことを確認するために、高崎量子応用研究所にて重イオンを照射する実験を行った。測定対象として、65nm FD-SOIプロセスと65nm bulkプロセスを用いて設計したフリップフロップと三重化フリップフロップに代表される冗長化フリップフロップを用意した。バルクプロセスにおいて、冗長化フリップフロップによるエラー耐性の向上量は約10倍であった。重イオンは中性子と比較してLETが高く、複数のトランジスタが重イオンにより生じた電荷の影響を受けてしまう。そのため、冗長化フリップフロップの耐性が10倍程度になっている。一方でFD-SOIプロセスのフリップフロップではバルクプロセスと比較して20倍の耐性を持つことを確認した。冗長化構造よりもFD-SOIの方が宇宙において効果的である。本研究の目的はデバイスシミュレーションと中性子などの加速試験の結果を元にソフトエラー耐性の高いフリップフロップ構造を提案することである。本研究ではFD-SOIプロセスを評価対象としている。26年度では28nm FD-SOIプロセスを用いて設計したテストチップに、中性子とアルファ線照射してソフトエラーの加速試験を行った。中性子線ではエラーが1つも発生せず、65nmバルクプロセスの100倍以上の耐性を持つことを確認した。一方でアルファ線では保持データや基板電位に対する依存性が強い結果となった。基板電位依存性は回路シミュレーションやデバイスシミュレーションでも確認した。これらの結果から、特定の条件でもソフトエラー率が増加しないようにすることでフリップフロップ全体のソフトエラー率が大きく向上すると推測される。ソフトエラー耐性の高いフリップフロップ構造を検討する上で、極めて重要な知見を今年度の研究により取得することができた。またより詳細な依存性を検討するために、フリップフロップの構造を一部変更した3種類のフリップフロップを28nm FD-SOIプロセスを用いて設計を行った。このテストチップは27年度に測定を行う予定である。今後はFD-SOIにおけるソフトエラーの特性や依存性を実測だけでなく、デバイスシミュレーションも用いてより詳細に評価する。その結果を元にソフトエラー耐性の高いフリップフロップの構造や、設計手法の提案を行なっていく。27年度が最終年度であるため、記入しない。

ソフトエラー28nm FD-SOIプロセスでは一部の条件で6倍程度エラー率が上昇することが測定により判明した。一部の条件でエラー率が上昇する原因がデバイスシミュレーションを用いても再現できておらず、シミュレーションを用いたソフトエラー評価の精度が悪化している。ソフトエラー耐性の向上を達成するためにはこのエラー率が上昇する原因を取り除いたフリップフロップを提案する必要がある。また、ソフトエラー評価精度の向上の観点からもこの原因の特定は重要となる。昨年度はエラー率が上昇する原因を検証するため、一部構造の異なるフリップフロップを3種類設計した。今年度はまずエラー率が増加する原因を設計したフリップフロップを実測することで確認する。測定結果とデバイスシミュレーションによる解析を元に高いエラー耐性を持つフリップフロップの構造の提案を行う。また、同様の結果が重イオンでも生じるか、高いエネルギーを持つ重イオンでもFD-SOIが高いソフトエラー耐性を持つかを評価するために重イオンの照射実験を行う。重イオンの測定は高崎市の日本原子力研究所にて6月に行う予定である。重イオンを用いた測定ではアルファ線や中性子線よりも線エネルギー付与(LET:linear energy transfer)の値が大きいため、アルファ線や中性子では発生しなかった一過性のパルス状のノイズであるSET(Single Event Transient)の測定も期待できる。SETの測定結果を元にLETとパルス幅の関係、発生電荷量の関係を明らかにする。27年度が最終年度であるため、記入しない。
共培養した膀胱上皮細胞と膀胱知覚神経細胞のクロストーク解析

膀胱知覚神経と膀胱上皮の相互作用を調べる実験系確立のため、膀胱分布神経の視覚化、膀胱知覚神経培養法、膀胱上皮細胞培養法を確立した。さらに、培養膀胱上皮細胞に機械刺激を与えると同一シャーレ中の周囲の膀胱上皮細胞に興奮が伝達されるという特性を、カルシウムイメージ法を用いて明らかにした。また、排尿機能制御機構解明による排尿・蓄尿障害に対する新しい治療標的発見を目的に、膀胱知覚神経細胞を有するレベルの後根神経節のC線維知覚神経細胞体での、排尿に関与するAタイプカリウムチャネルの基となるKv4および修飾サブユニットの発現を明らかにした。ラットの生体より膀胱上皮、膀胱知覚神経(L6,S1後根神経節細胞)を採取・共培養し、上皮細胞と神経節細胞間の相互作用を調べることによって、排尿機能の自律神経制御機構の中でも、特に、知覚制御機構の直接的解明をすすめ、過活動膀胱等の排尿・蓄尿障害に対し現在行われている治療の強化および新しい治療標的の発見に結びつける事を目的とし研究を進めている。これまでに蛍光標識物質、4%Hydroxystilbamidine(Fluoro Gold)の膀胱壁への注入による膀胱支配神経(求心性知覚神経)の可視化、可視化された膀胱知覚神経を含むL6、S1位の後根神経節に細胞体を持つ神経細胞のHam's F-12培養液での初代培養および神経細胞からの神経突起の伸長を確認し、膀胱上皮のトリプシン処理、既製上皮細胞用培養液(keratinocyte serum-free medium)による初代培養にも成功し、膀胱上皮と膀胱知覚神経との相互作用を明らかにするための実験に必要な細胞を安定して得られるようになった。さらに、カルシウムイメージング技術を用いて、単培養系の膀胱上皮細胞に機械刺激を与えると、同シャーレ中の他の膀胱上皮細胞に興奮が伝達されるという膀胱上皮の特性を明らかにした。以上のように、実験に必要な細胞の単培養系が確立され、加えて、膀胱上皮の特性を示す実験結果も得られたが、膀胱上皮と膀胱知覚神経との相互作用を明らかにするための共培養系の確立が難しく、難航している。これまでに蛍光標識物質、4% Hydroxystilbamidine(Fluoro Gold)の膀胱壁への注入による膀胱支配神経(求心性知覚神経)の可視化、可視化された膀胱知覚神経を含むL6、S1位の後根神経節に細胞体を持つ神経細胞のHam's F-12培養液での初代培養および神経細胞からの神経突起の伸長を確認し、膀胱上皮のトリプシン処理、既製上皮細胞用培養液(keratinocyte serum-free medium)による初代培養にも成功し、膀胱上皮と膀胱知覚神経との相互作用を明らかにするための実験に必要な細胞を安定して得られるようになった。イソフルレン吸入麻酔下のラットより採取した膀胱をMEM培養液中で上皮側が露出するように伸展、固定し、これにディスパーゼ、トリプシンを作用させ収集分散した膀胱上皮細胞を、Defined Keratinocyte Serum Free Medium(LifeTechnologies)で初代培養し、ここに、イソフルレン麻酔下ラットより採取した逆行性神経標識物質で標識された膀胱支配知覚神経の細胞体が含まれるL6、S1位の後根神経節にトリプシン、コラゲナーゼ、DNaseIを作用させることにより分散収集した後根神経節神経細胞を加え、両細胞を上皮培養条件で共培養することを試みた。また、シャーレにて培養中のある膀胱上皮細胞に機械刺激を与えると、周囲の膀胱上皮細胞に興奮が伝達されることが、カルシウムイメージングによって観察できた。加えて、目的である排尿機能の自律神経制御機構の解明をすすめ、過活動膀胱等の排尿・蓄尿障害に対し現在行われている治療の強化および新しい治療標的の発見に結びつき、共培養系での解析標的ともなる可能性のある物質としてKv4.3チャネルのL6、S1位後根神経節での発現を明らかにした。

しかしながら、膀胱上皮細胞と標識した膀胱支配知覚神経を含む後根神経節神経細胞との安定した共培養系を確立することはできず、膀胱上皮細胞と膀胱支配知覚神経細胞との関係を共培養系を用いて明らかにすることはできなかった。共培養実験系の確立に時間がかかっている。試行錯誤を重ねて実験してはいるが、機械刺激実験可能な状態の細胞を得るためには、さらに時間がかかると考えられる。25年度が最終年度であるため、記入しない。共培養実験系の早期確立をめざすが、時間的に確立できない可能性もあり、目的である排尿機能の自律神経制御機構の解明をすすめ、過活動膀胱等の排尿・蓄尿障害に対し現在行われている治療の強化および新しい治療標的の発見に結びつけるために、共培養系での解析標的ともなるような、生理的および病理的状態で排尿に関与する物質(神経伝達物質、チャネル、細胞外マトリックス等)の検索も同時に行う必要がある。
酵素を利用した効率的チーズ製造システムの確立

ゴーダタイプのチーズを製造し、熟成期間の異なるチーズより水溶性の画分を調製した。この画分を逆相カラムを用いたHPLCで分画し、得られた主要ペプチド画分のアミノ酸配列を推定した。熟成期間が異なっても、常に【αs_1】-カゼインのN末端から、19,113,114に相当するペプチが主要な成分であった。さらにこれらペプチドの由来を調べるため、【αs_1】-カゼインのN末端の123のペプチドを基質とし、これにチーズスターターとして用いられている異なる菌株の乳酸菌を作用させたところ、どの菌株にもこのペプチドを分解し、上記ペプチドを遊離するプロティナーゼ活性が見出された。つぎに、この活性をもつ酵素の精製を試みたた。基質には上記した【αs_1】-カゼインのN末端123残基に相当するペプチドを用い、酵素活性はこのペプチドの分解量の減少をHPLCで測定することで決定した。その結果、乳酸菌体中には、2種類のチーズ熟成中のペプチド生成に関与する酵素が存在することが明らかとなり、またいずれの酵素も単一なまでに精製することに成功した。それぞれをLEP【I】,LEP【II】と名付けた。LEP【I】の分子量は98000,最適PHは7,0であり、その活性金属イオンキレート剤で阻害されたことから、活性中心には金属が存在するものと考えられた。LEP【I】の基質特異性はユニークで、Glu-Asnのペプチド結合に対して高い親和性を示すと同時に分子量3000以上のペプチドのペプチド結合は切断しなかった。LEP【II】は、分子量が8000で、LEP【I】と同様に活性中心に金属を配するメタルプロティナーゼであった。この酵素もLEP【I】と同様に分子量4000以上のペプチドを分解しない、いわゆる基質のサイズを認識する新しいタイプの酵素であった。さらに、各種菌株を用いて、ゴーダタイプチーズを製造し、それぞれの風味と上記ペプチドの生成との関連について研究を行なった。
生体型ポルフィリンを用いる芳香族性の探求

2年目においてはこれまでに合成していた共役系に加えて、新しいマクロサイクロとしてピリポルフィリン、ホモポルフィリンの合成を達成した。ピリジン環がマクロサイクル中に含まれた拡張ポルフィリンの合成を行い、その化合物の物性に調査した。通常のピリ環拡張ポルフィリンにおいてはメゾ位のオキソ化が起こるため環状共役系が繋がらず芳香族性が達成されなかったが、ニッケル錯体を効果的に合成することがわかり、イオン認識などに用いることができる可能性がある。また、ピリジン環の3位がオキソ化されたピリドン部位をマクロサイクルユニットに用いることで、その芳香族性を発現させることができることが判明した。このマクロサイクルは極めて安定であり、特に近赤外領域に強い吸収帯を有するため、光線力学療法治療剤としての応用が期待される。また、ホモポルフィリンの合成においては、新しいジヒドロ型のホモポルフィリンの合成と、その酸化反応についての検討を行なった。この過程において、ホモポルフィリンがポルフィリンへと変換される興味深い転位反応を発見した。これらの研究に加え、年度途中において北海道大学工学研究院に異動したため、その環境を活かしてポルフィリン類縁体に止まらない新しい共役系の創製にも挑戦している。生体型ピロールの構成要素でもあるアセチルアセトン構造をあらかじめ酸化的カップリングによって多量化させたのちに環化反応を行い、その後共役系を繋ぐことによって反芳香族性を示す新しい環状構造を作り出すことを目指している。新しい芳香族性を示す拡張型ピリポルフィリン類の合成に成功した。まず、熱力学的に安定なピリジン環と生体型ピロールとのカップリング反応を行うことで新しいオリゴピロールユニットを合成した。本化合物をピロールユニットと酸縮合させることによって、ピリジンユニットをそのπ共役構造に含む化合物の合成を達成した。この場合にはピリジンユニットの局所的な芳香族性によって環全体ではπ共役系としての性能が達成されないことが判明した。そこで、ピリジンの3位をオキソ化することによってあえてその6π共役系を弱めることで、環全体での22π芳香族性が達成されることを突き止めた。このマクロサイクルの性質について現在詳細な検討を行っており、極性溶媒中で芳香族性が強められること、近赤外領域に強い吸収を有し、光線力学療法治療剤として適していることを突き止めた。また、スルースペース共役系を有するとπ共役化合物の合成も達成している。これらについては今後その理論的検証を行い、論文によって発表する予定であり、概ね研究は順調に進展している。これに加えて、北海道大学においてアセチルアセトンを用いた環状多量体の合成に挑戦し、その変換反応に挑戦している。多量体合成については様々な条件検討および共役系をつなぐ手法の準備を行い、新たな環状化合物を生み出すための準備を達成している。今後、環状構造のより詳細な物性についての調査を行う。スルースペース芳香族性に対する理論的な理解をさらに進めてゆき、その上で各種の反応についても考える。また、これらの物性を利用した光線力学療法治療剤などへの応用も試み、これらを社会へ還元できる可能性についても追求する。さらに、マクロサイクル合成への異なるアプローチとして、アセチルアセトンを原料として用いて新しいπ共役系を完成させる。反芳香族性を示す巨大なπ共役系を生み出し、そのこれまでの芳香族性の理解にとどまらない、機能性分子や金属配位子としての応用可能性について探求を進めてゆき、さらに発展した化学につなげてゆく。1年目は、本研究課題に関連して、2報の論文を発表した。これらは生体型ピロールを組み込んだオリゴピロールを利用して2種類のペンタフィリン類の合成を行い、興味深い物性を発現させることに成功したものである。まず、生体型ピロールからなるジピロールエタンとトリピランの酸縮合を利用することで、ジヒドロペンタフィリン(2.1.1.1.1)の合成に成功した。この化合物を酸化することで、24π反芳香族性を示すペンタフィリン(2.1.1.1.1)の合成に成功し、その物性を論文誌に報告した(J. Org. Chem. 2017, 82, 10737-10741)。また、同様に生体型ピロールを用いた2,2'ビピロールを用いたサフィリンの合成を行った。本化合物は結晶構造が明らかとなった初の中性状態でピロールが反転していないサフィリンであり、大きくたわんだ構造を有することが判明した。さらに、銀イオンを作用させることによって転位反応が起こり、Neo-Confused型のサフィリンの合成にも成功した。これについてもChemistry An Asian Journal誌に投稿し、Very Important Paperとして採録、ChemistryViewsでハイライトされた(Chem. Asian. J. 2018, 13, 934-938)。さらに、現在進行している研究テーマについて日本化学会、日本薬学会、基礎有機化学会、International Symposium on Novel Aromatic Compoundsにおいて合計7件の学会発表を行っている。本研究に関する2報の論文発表を行ったのみならず新たな研究展開も見られており、極めて順調に研究が展開されている。生体型ピロールを組み込んだペンタフィリン類について反芳香族性の発現に成功し、新しいビニレン架橋に由来する反芳香族性の発現に成功した。またサフィリンの大きくひずんだ構造ながら発現する芳香族性、その銀錯化による転位反応について論文発表をした。これらの化合物の芳香族性について興味深い成果を得ている。

ジビニルポルフィリン多量化に関しては、生体型ピロールを用いたジビニルポルフィリンの効率的な大量合成に成功した。この化合物は、プロトポルフィリンIIIのカルボキシル基が存在しない構造であり、副反応を抑制できる前駆体となる。これを用いて新しいジビニレン架橋ポルフィリン二量体の合成に取り組んでいる。オレフィンメタセシスを用いる方法については予想に反して反応が効率よく進行しなかったものの、Heck反応を用いることによってビニレン部位を効率的に反応させられることを明らかにした。この反応を利用して、単なる多量化にとどまらないビニレン部位の多様な修飾反応についても検討を行った。得られる化合物群はビニレン架橋部位によってポルフィリンユニットと効率よく相互作用していることも明らかとなった。ピロールの修飾反応についての検討についても進行中であり、新たなビルディングブロックとなりうる生体型ピロールの修飾法についての検討を行っている。ヨウ素化とベンジル基の還元を組み合わせることで、2つのホルミル基を有するピロールの合成および、McMarry反応を用いた本化合物の多量化について検討している。2年目においてはこれまでに合成していた共役系に加えて、新しいマクロサイクロとしてピリポルフィリン、ホモポルフィリンの合成を達成した。ピリジン環がマクロサイクル中に含まれた拡張ポルフィリンの合成を行い、その化合物の物性に調査した。通常のピリ環拡張ポルフィリンにおいてはメゾ位のオキソ化が起こるため環状共役系が繋がらず芳香族性が達成されなかったが、ニッケル錯体を効果的に合成することがわかり、イオン認識などに用いることができる可能性がある。また、ピリジン環の3位がオキソ化されたピリドン部位をマクロサイクルユニットに用いることで、その芳香族性を発現させることができることが判明した。このマクロサイクルは極めて安定であり、特に近赤外領域に強い吸収帯を有するため、光線力学療法治療剤としての応用が期待される。また、ホモポルフィリンの合成においては、新しいジヒドロ型のホモポルフィリンの合成と、その酸化反応についての検討を行なった。この過程において、ホモポルフィリンがポルフィリンへと変換される興味深い転位反応を発見した。これらの研究に加え、年度途中において北海道大学工学研究院に異動したため、その環境を活かしてポルフィリン類縁体に止まらない新しい共役系の創製にも挑戦している。生体型ピロールの構成要素でもあるアセチルアセトン構造をあらかじめ酸化的カップリングによって多量化させたのちに環化反応を行い、その後共役系を繋ぐことによって反芳香族性を示す新しい環状構造を作り出すことを目指している。新しい芳香族性を示す拡張型ピリポルフィリン類の合成に成功した。まず、熱力学的に安定なピリジン環と生体型ピロールとのカップリング反応を行うことで新しいオリゴピロールユニットを合成した。本化合物をピロールユニットと酸縮合させることによって、ピリジンユニットをそのπ共役構造に含む化合物の合成を達成した。
市場経済導入後の東欧における農業構造再編と環境問題

東殴諸国の経済体制変換の中で、市場メカニズム導入が農業部門の発展過程に与えたインパクトを、市場流通、土地制度、経営構造、環境問題の各視点から分析し、以下の点を明らかにした。各国とも、体制移行の初期には、土地生産性を始め、経済全体が決定的な打撃を受け、深刻な低迷状況に陥ったが、その後、徐々に回復基調に転じた。ハンガリーやポーランドでは比較的早く回復に転じ、若干遅れてチェコがこれに続いた。しかし、ブルガリアやルーマニアでは未だに体制転換に伴う混沌から脱しきれずにいる。最も大きな問題は、土地制度の変革である。市場経済化が比較的早く進んだハンガリーや社会主義体制下でも部分的に農場の個人所有が認められていたポーランドでは、国有農地の農民への返還は比較的順調に進んだ。しかし、チェコやブルガリアなど、社会主義体制下において殆どの農地が国有であった諸国では、大規模な国有地を私有化する際に、かなりの困難を伴った。つまり、以前には大規模な国有農地で機械を駆使して経営されていたが、私有化された個人農地が小規模なため、以前の農業機械が使用できないこと、さらに個々の農民が営農技術について充分な知識を有していないことが主な問題である。そのため、多くの東欧諸国では、協同農場経営による営農規模の拡大と農業機械等の共同利用を推進している。市場経済体制への移行により、営農方式が生産性追求型にシフトするにつれて、環境劣化問題が徐々に進行すると危倶されているが、現在のところ、この点に関しては必ずしも深刻ではない。またチェコを始めとして、農業環境対策に真剣に取り組めるほど経済的な余裕はなく、まずは移行後の低迷状況から脱することが先決課題である。数年後にEU加盟を控えて、EU共通の農業環境政策に組み込まれた状況で有効な政策運営ができるよう、厳しい対応が迫られている。本研究課題は、市場経済化による激動期の東欧諸国の農業構造の再編方向と環境保全問題、それに伴う国際農産物市場への影響を明らかにすることを目的としており、本年度が調査研究の初年度に当たる。そこで、そのことを踏まえて、日本国内において入手可能な文献・資料等を収集する(農林水産省・ジェトロ・畜産振興事業団・全国農業会議所等)と共に、海外調査実施に当って研究会を開催し、調査先・調査項目等を確定した。初年度の現地調査は、ドイツ、ポーランド、チェコ、ハンガリー、ギリシャ、オーストリアにおいて以下のように行った。(1)ベルリン大学及びウィーンのIIASAで、共通農業政策編入への調査過程、条件不利地域対策、環境保全特別地域対策、農地制度・経営制度、域内貿易等に関するヒアリング調査と資料の収集を行った。(2)各調査項目については、以下の要領で現地調査を行った。(ア)各国の農林省で構造政策・価格政策・生産政策・農村社会政策等に関する聴取りと資料の収集を行った。(イ)条件不利地域対策・環境保全特別地域対策については、所得補償の実態とその経過に関する調査を行うとともに、主要農産物について出荷業者の聴取り調査を行った。また、生産者団体と主要産地市場の実態調査も併せて行った。(ウ)農地制度と農業経営制度の実態については、ヒアリング調査および資料の収集を行った。(エ)東欧諸国流通制度および域内産地形成の実態についてもヒアリング調査と資料の収集を行った。本研究課題は、市場経済化による激動期の東欧諸国の農業構造の再編方向と環境保全問題、それに伴う国際農産物市場への影響を明らかにすることを目的としており、本年度が調査研究の2年目に当たる。そこで、この課題に沿って、初年度の調査結果をも踏まえて、本年度の現地調査は、ドイツ、ポーランド、ハンガリー、ブルガリア、マケドニアの各国において、以下のように行った。

なお、世銀とコロンビア大学における既存研究の資料収集のため、USAでも追加調査を行った。(1)共通農業政策編入への調整過程、条件不利地域対策、環境保全特別地域対策、農地制度・経営制度、域内貿易などに関する資料の収集を行った。(2)各調査項目については、以下の容量で現地調査を行った。(a)各国の農林省で構造政策・価格政策、生産政策、農村社会政策などに関する聞き取りと資料収集を行った。(b)条件不利地域対策・環境保全特別地域対策については、所得補償の実態とその経過に関する調査を行うと共に、主要農産物については、出荷業者の聞き取り調査を行った。また生産者団体と主要産地市場の実体調査も併せ行った。(c)農地制度と農業経営制度の実態については、ワルシャワ経済大学、ハンガリー農業経営構造整備全国センターなどにおいて、聞き取り調査及び資料の収集を行った。(d)東欧諸国の流通制度及び域内産地形成の実態については、ポーランド国立農業研究所、ハンガリー・ブタペスト大学流通研究所において聞き取り調査及び資料の収集を行った。東欧諸国の経済体制変換の中で、市場メカニズムの導入が農業部門の発展過程に与えたインパクトを、市場流通、土地制度、経営構造、環境問題の各視点から分析し、以下の点を明らかにした。各国とも、体制移行の初期には、土地生産性を始め、経済全体が決定的な打撃を受け深刻な低迷状況に陥ったが、その後、徐々に回復基調に転じた。ハンガリーやポーランドでは比較的早く回復に転じ、若干遅れてチェコがこれに続いた。しかし、ブルガリアやルーマニアでは、未だに、体制転換に伴う混沌から脱しきれずにいる。最も大きな問題は、土地制度の変革である。市場経済化が比較的早く進んだハンガリーや社会主義体制下でも、部分的に農場の個人所有が認められていたポーランドでは、国有農地の農民への返還は比較的順調に進んだ。しかし、チェコやブルガリアなど、社会主義体制下において殆どの農地が国有であった諸国では、大規模な国有地を私有化する際に、かなりの困難を伴った。つまり、以前には、大規模な国有農地で機械を駆使して経営されていたが、私有化された個人農地が小規模なため、以前の農業機械が使用できないこと、さらに、個々の農民が営農技術について十分な知識を有していないことが主な問題である。そのため、多くの東欧諸国では、協同農場経営による営農規模の拡大と農業機械等の共同利用を推進している。市場経済体制への移行により、営農方式が生産性追求型にシフトするにつれて、環境劣化問題が徐々に進行すると危惧されているが、現在のところ、この点に関しては必ずしも深刻ではない。また、チェコを始めとして、農業環境対策に真剣に取り組めるほど経済的余裕はなく、まずは、移行後の低迷状況から脱することが先決課題である。数年後にEU加盟を控えて、EU共通の農業環境政策に組み込まれた状況で有効な政策運営ができるよう、厳しい対応を迫られている。
非接触非線形超音波CTによる構造材料内部劣化及び損傷評価

本研究では,内部に劣化・損傷部を有する構造部材に各方向から一定周波数の大振幅の超音波を入射し、レーザー超音波検出器を用いて透過波をデジタル収録し,それに含まれる高調波(入射周波数の整数倍の周波数の波)成分を検出し、X線CTで開発された再構成アルゴリズムを非線形超音波用に拡張し,劣化・損傷部の3次元分布を明らかにすることを目的とする.研究で得られた主な成果を以下に示す.1.高調波振幅超音波CTを開発する基礎として,水浸法で正方形厚板内部に高減衰領域を含む鋼サシプルと内部に高減衰領域を含まない対比試験片の透過波振幅比の対数値を数百本のビームパスについて測定し,昨年度開発した超音波透過波減衰を用いるCT再構成アルゴリズムを用い,減衰係数分布の再構成を行い,5%以内の誤差で減衰係数分布を再現できることを明らかにした.2.上記手法を正方形厚板内の直径2mmのドリル孔に適用したところ,孔表面での散乱減衰が材料内部微視構造による散乱減衰に比べて極端に大きいにもかかわらず適当なペナルティ値を測定値に乗ずることにより,入射波波長の2倍程度の直径を持つ孔の位置及び直径を再構成できた.3.水浸法により,2次高調波だけを抽出するアナログフィルターを用いて,通常の超音波欠陥画像と同様に,特別な波形処理装置を使用せず高調波振幅の画像化ができ,通常の超音波反射画像では検出できない,液相拡散接合した異種金属界面の微細構造鋼内の非金属介在物などの異種接合部を画像化できることを実証した.4.上記1,2と3を組み合わせることにより,2次高調波CTの再構成が可能となる.通常の劣化・損傷固体材料の基本波振幅に対する2次高調波振幅比は1%程度であるので,内部微視き裂集団を含み,顕著な接触型音響非線形性が発現する損傷材料に適用すれば非線形超音波CTが実現できることが明らかとなった.5.本研究で得られた成果の一部を特許として申請する準備を進めている.本研究では,内部に劣化・損傷部を有する構造部材に各方向から一定周波数の大振幅の超音波を入射し、レーザー超音波検出器を用いて透過波をデジタル収録し,それに含まれる高調波(入射周波数の整数倍の周波数の波)成分を検出し、X線CTで開発された再構成アルゴリズムを非線形超音波用に拡張し,劣化・損傷部の3次元分布を明らかにすることを目的とする.研究で得られた主な成果を以下に示す.1.高調波振幅超音波CTを開発する基礎として,水浸法で正方形厚板内部に高減衰領域を含む鋼サシプルと内部に高減衰領域を含まない対比試験片の透過波振幅比の対数値を数百本のビームパスについて測定し,昨年度開発した超音波透過波減衰を用いるCT再構成アルゴリズムを用い,減衰係数分布の再構成を行い,5%以内の誤差で減衰係数分布を再現できることを明らかにした.2.上記手法を正方形厚板内の直径2mmのドリル孔に適用したところ,孔表面での散乱減衰が材料内部微視構造による散乱減衰に比べて極端に大きいにもかかわらず適当なペナルティ値を測定値に乗ずることにより,入射波波長の2倍程度の直径を持つ孔の位置及び直径を再構成できた.3.水浸法により,2次高調波だけを抽出するアナログフィルターを用いて,通常の超音波欠陥画像と同様に,特別な波形処理装置を使用せず高調波振幅の画像化ができ,通常の超音波反射画像では検出できない,液相拡散接合した異種金属界面の微細構造鋼内の非金属介在物などの異種接合部を画像化できることを実証した.4.上記1,2と3を組み合わせることにより,2次高調波CTの再構成が可能となる.通常の劣化・損傷固体材料の基本波振幅に対する2次高調波振幅比は1%程度であるので,内部微視き裂集団を含み,顕著な接触型音響非線形性が発現する損傷材料に適用すれば非線形超音波CTが実現できることが明らかとなった.5.本研究で得られた成果の一部を特許として申請する準備を進めている.本研究では,内部に劣化・損傷部を有する構造部材に各方向から一定周波数の大振幅の超音波を入射し、レーザー超音波検出器を用いて透過波をデジタル収録し,それに含まれる高調波(入射周波数の整数倍の周波数の波)成分を検出し、X線CTで開発された再構成アルゴリズムを非線形超音波用に拡張し,劣化・損傷部の3次元分布を明らかにすることを目的とする.研究の初年度である本年度の研究で得られた主な成果を以下に示す1.Photorefractive素子をを用いた2波混合方式の高感度レーザー超音波検出器(Tecnar Automation TWM-1500SP)により、光沢面でなくても、0.1-数十MHzの超広帯域にわたりほぼ一定の縦波受信感度が得られることを確認した.これにより,従来の接触式超音波法で計測不可能であった3次以上の高調波も検出することが可能となる.2.不完全接合部における,垂直応力だけの非線形応答を考えた従来の接触要素に加えて,せん断応力の非線形性をも考慮した要素を導入して、閉口き裂に傾斜した方向に伝播する波の非線形挙動を解析する方法を導出し,擬閉口き裂を透過する波の高調波振幅の方位依存性を明らかにした.

3.非線形超音波計測装置を用いて,ほぼ同一の気孔率の噴霧鉄粉及び還元鉄粉焼結体に対して、5MHzの入射波、10MHzの検出波により,2次高調波振幅比に及ぼす気孔率,及び鉄粉種類の依存性を求めた.線形超音波の音速あるいは減衰で評価できない,鉄粉の種類の分別が可能となった.また2次高調波だけでなく3次高調波も検出でき,これによりさらに詳細な微視構造の解析が可能となる本研究では,内部に劣化・損傷部を有する構造部材に各方向から一定周波数の大振幅の超音波を入射し、,レーザー超音波検出器を用いて透過波をデジタル収録し,それに含まれる高調波(入射周波数の整数倍の周波数の波)成分を検出し、X線CTで開発された再構成アルゴリズムを非線形超音波用に拡張し,劣化・損傷部の3次元分布を明らかにすることを目的とする.研究の2年目である本年度の研究で得られた主な成果を以下に示す.1.高調波振幅を用いる超音波CTの基礎として,透過法による超音波減衰を用いるCT再構成アルゴリズムを作製した.不完全なデータ群を用いて再構成が可能なART法プログラムを開発し,内部に円柱状高減衰領域を想定した嵌め合わせ円柱体モデルについて,数値シミュレーションにより,高精度の減衰分布再構成が可能な超音波伝播経路を求めた.円柱状試験体では,中心軸回りの試験体の回転による放射状及びジグを介しての直径断面に平行な面に沿う直線伝播経路の組み合わせにより,高精度の減衰分布再構成が可能であることを明らかにした.2.不完全接合部を含む拡散接合試験体について,直接接触透過法により従来の超音波パルスエコー法で検出できない極わずかな接合不完全性を2次高調波振幅により検出できることを明らかにした.3.極性の異なるバースト波を試験体に入射し,受信波形を重ね合せることにより,2次高調波を抽出するパルス反転法により,特別な波形処理装置を使用せず高調波を検出する方法が利用できることを実証した.本研究では,内部に劣化・損傷部を有する構造部材に各方向から一定周波数の大振幅の超音波を入射し、レーザー超音波検出器を用いて透過波をデジタル収録し,それに含まれる高調波(入射周波数の整数倍の周波数の波)成分を検出し、X線CTで開発された再構成アルゴリズムを非線形超音波用に拡張し,劣化・損傷部の3次元分布を明らかにすることを目的とする.研究の3年目である本年度の研究で得られた主な成果を以下に示す.1.高調波振幅超音波CTを開発する基礎として,水浸法で正方形厚板内部に高減衰領域を含む鋼サンプルと内部に高減衰領域を含まない対比試験片の透過波振幅比の対数値を数百本のビームパスについて測定し,昨年度開発した超音波透過波減衰を用いるCT再構成アルゴリズムを用い,減衰係数分布の再構成を行い,5%以内の誤差で減衰係数分布を再現できることを明らかにした.2.上記手法を正方形厚板内のドリル孔に適用したところ,孔表面での散乱減衰が材料内部微視構造による散乱減衰に比べて過大であるので,適当なペナルティ値を測定値に乗ずることにより,入射波波長の2倍程度の直径を持つ孔の位置及び直径を再構成できた.3.水浸法により,2次高調波だけを抽出するアナログフィルターを用いて,通常の超音波欠陥画像と同様に,特別な波形処理装置を使用せず高調波振幅の画像化ができ,通常の超音波反射画像では検出できない不完全接合部を画像化できることを実証した.4.上記1と3を組み合わせることにより,2次高調波CTの再構成が可能となる.通常の固体の基本波振幅に対する2次高調波振幅比は0.1%以下であるので,内部微視き裂集団を含み,顕著な接触型音響非線形性が発現する損傷材料に適用すれば非線形超音波CTが実現できる.
骨の生体イメージングによる骨髄細胞・骨転移癌の遊走・分化やニッチ環境の可視化

動物の本質は「動き」にある。生体内においても、様々な細胞が適切な場所に適切なタイミングで移動・遊走している。近年、低侵襲で深部組織の観察に適した2光子励起顕微鏡を用いて、生体をそのままで観察することで、細胞動態を高解像度で解析することが可能となってきた。本研究者は特に、従来困難であるとされていた、生きた骨組織・骨髄腔の内部を高い時空間分解能で観察することに世界に先駆けて成功し、古い骨を吸収して骨代謝を調節する破骨細胞のin vivoでの活性制御機構を解明してきた。本研究では、これら生体イメージング技術を生かした骨・免疫動態に加えて、同じく“動く"システムであるがん細胞の動態学研究を遂行した。骨髄腔はリンパ球を始めとして顆粒球・単球など多種多様な血液系細胞の発生・機能分化の主要な場であり、それらの元となる血液幹細胞が自己複製能・多能性を維持して存在する場であり、さらには骨転移腫瘍のように本来存在し得ない細胞が迷入して潜伏する場である。これらの各細胞が骨髄腔内でそれぞれの特殊な環境(=ニッチ)へいかにして遊走し位置決めを行うか、またその場でどのような個別の分化制御を受けるかについて、これまで多くの研究がなされてきたが、その多くは固定骨組織を用いた静的な解析であった。本研究では、研究代表者が最近立ち上げた、二光子励起顕微鏡を用いた骨組織・骨髄内の生体イメージング系(Ishii et al.,Nature,2009)を駆使して、生きた骨組織・骨髄内におけるリンパ球・単球などの骨髄細胞の機能・分化とそのニッチ環境と、癌の骨転移メカニズム・癌幹細胞ニッチの各動態について、実体的かつ統合的な解析を行う。初年度である平成22年度には、本システムを利用した破骨細胞動態の解析(Ishii et al.,J Exp Med,2010)に加えて、骨髄内環境の生きた可視化のための種々の基盤技術の開発を行い、(1)骨髄内ストロマ環境の可視化、(2)白血病細胞の骨髄内での可視化、(3)がんの骨転移の可視化、などに成功しつつある。さらには、細胞の位置情報のみならず、分化・形質変化を捉える新たな方法論の開発を行い、種々の条件検討・最適化により十分な解析が可能な実験系が立ち上がってきている。平成23年度以降は、これらの成果を元に、骨髄・骨組織内でのニッチ環境・がん細胞動態について具体的な解析を行っていく計画としている。生命システムでは「動き」が重要である。多種多様な細胞の動態は時空間的に精緻にコントロールされている。このようなシステムの研究には、従来の組織学的解析法では不十分であった。固定・薄切した組織観察では、細胞の「形態」や「分子発現」などを解析することはできるが、細胞の「動き」を解析することはできなかった。細胞の動きを見るためには、「生きた細胞」を、「生きた組織」「生きた個体」の中で観察する必要がある。本研究代表者は深部組織の観察に適した多光子励起顕微鏡を駆使して、動物を生かしたままの状態で組織・臓器を観察する研究を行ってきたが、特に、従来極めて困難であると考えられていた、生きた骨組織・骨髄腔の内部を高い時空間分解能で観察することに世界に先駆けて成功し、古い骨を吸収して骨代謝を調節する破骨細胞のin vivoでの活性制御機構を解明した。本研究ではこの方法をさらに改変・発展させ、慢性骨髄性白血病や多発性骨髄腫などの血液系悪性腫瘍の骨髄腔内での動態や、それらに対する細胞性免疫応答の可視化に取り組む。平成23年度までに、蛍光標識したbcr-abl発症白血病細胞を骨髄腔に定着させイメージングにより観察することに成功している。現在、さらに抗がん剤耐性がん幹細胞の動態やそのニッチ環境の可視化にむけて研究を進めている。また同時に、免疫不全マウスへのゼノグラフト系を用いて、がん細胞の浸潤・転移の生体多光子励起イメージングについても進めている。本研究者は浸潤する細胞を1細胞レベルで同定し、それらで高発現する分子の同定にも成功している。平成24年度以降に、これらの成果をもとに、骨組織内でのがん細胞動態を制御する分子機構・微小環境の統合的解明を行う。本研究では生体多光子励起イメージングの方法論を用いて、生きた動物の骨組織・骨髄内をリアルタイムで可視化する独自の実験系を確立させ、これを駆使して破骨細胞による骨破壊や骨芽細胞による骨新生の過程、およびその両者の生体内相互作用を時空間的に統合的に解明している。

平成25年度は破骨細胞が骨に接着し、破壊・吸収する過程を詳細に解析し、破骨細胞を「骨を活発に破壊するタイプ」と「比較的不活性のタイプ」の2種類に機能的に分類することができた。また、炎症性骨破壊では炎症性T細胞がこの機能的形質を変化させることが明らかになった。さらに。骨芽細胞と破骨細胞の2重標識化に成功し、両者の動的な相互作用を動的経過として可視化することができた。一方で、本研究では平成24年度までに、骨髄内における破骨細胞・マクロファージの骨髄内での定着・遊走が、脂質メディエーターであるスフィンゴシン1リン酸(S1P)やその受容体によって動的に制御されていることをすでに明らかにしていたが、平成25年度は、このS1Pによる破骨細胞制御が、旧来より骨保護作用をもつと言われながらもその具体的な作用機序が不明であった活性型ビタミンDによって制御を受けることを明らかにした。これは骨破壊制御の治療の観点から重要な成果とされている。さらに平成25年度は、骨髄内でのがん細胞動態の動態制御の解明の観点から、蛍光標識したbcr-abl発症白血病細胞、または骨髄性白血病のライン化した腫瘍細胞を用いて、標識したがん細胞が定着する部位、およびその部位での動態、周囲のストロマ細胞との細胞間相互作用を可視化することに成功した。また、これらの白血病細胞にOVAを発現させるがん細胞の作成に成功しており、OT-IT細胞を用いて抗白血病免疫の実体を解明する基盤を確立した。本研究では当研究代表者がこれまで独自に開発・改良を行ってきた、骨組織の生体リアルタイムイメージング系を用いて、生きた実験動物内での骨組織・骨髄内における破骨細胞による骨破壊や骨芽細胞による骨新生の過程、および骨髄内腫瘍細胞の動態・相互作用について統合的に解析することを目的とするものである。当該年度においては、前年度に明らかにしていた、骨表面に接着しや破骨細胞の機能的分類化、即ち「骨を活発に破壊するタイプ」と「比較的不活性のタイプ」の2種類へのサブクラス化をさらに推し進め、様々な骨病態においてこれらの機能分化がどのように変化されるかについて統合的に解明を行った、特にビスホスホネートなどの骨吸収抑制剤がこれらの機能分類化された破骨細胞にどのように作用するかについて、実体的な解明を行った。また、破骨ー骨芽細胞および骨破壊部位の多重標識系の確立に成功し、破骨ー骨芽細胞の2者の相互作用の実体およびその骨環境の維持における個別機能について詳細に解明した。さらには、白血病細胞の細胞株を用いて、標識したがん細胞が骨髄内で定着するする過程や、増殖・拡大する過程、および抗がん剤投与によって多くの癌細胞が細胞死を誘導される中で残存するがん細胞(抗がん剤耐性癌細胞≒白血病幹細胞)の同定や、それらが存在する特殊環境(ニッチ)の実体的同定についても成功した。さらには、およびその部位での白血病がんの動態、周囲のストロマ細胞との細胞間相互作用を可視化のみならず、がん細胞にOVAペプチドを発現させることで、OT-IT細胞を用いてin vivoでの抗腫瘍免疫の実体を可視化することにも成功した。本研究代表者は深部組織の観察に適した多光子励起顕微鏡を駆使して,動物を生かしたままの状態で組織・臓器を観察する研究を行ってきた。本研究ではこの方法をさらに改変・発展させ,慢性骨髄性白血病や多発性骨髄腫などの血液系悪性腫瘍の骨髄腔内での動態や,それらに対する細胞性免疫応答の可視化に取り組んでいる.平成24年度には,蛍光標識したbcr-abl発症白血病細胞を骨髄腔に定着させることに成功し,抗がん剤耐性がん幹細胞の動態やそのニッチ環境の可視化にむけて研究を進めた.
RI検出光ファイバーカテーテルによる動脈内進行性硬化病変診断の基礎的、臨床的研究

RIシンチレーションカテーテル本体(IVRD)については、通過性、トルク、細さについて検討を加えて、ブタの冠動脈へ頚動脈からのアプローチが可能なまでになっており、現在臨床的にも応用可能なまでに成功した。また外部RI線源でのシンチレーションファイバーカテーテルでの線源の描出能、分解能、感度などは基本的に充分臨床に耐えるものであることも確認した。これは犬の、股動脈外部に設置した線源でのカテーテルによる検出という静的実験、また動いている冠動脈外膜下に設置した線源での冠動脈内カテーテル下での実験も充分に満足の行くものであった。またこのシンチレーション確認カテーテルは感度良く、さらにノイズの消去という意味において特殊な方式を利用したものであり、これは現在特許を申請中のものである。また、バックグラウンドが高くても確認可能であった。また、実際の隣接臓器、血液などのバックグラウンドをシミュレーションしての小線源の確認も可能であろうとの報告もした。現在このRI検出光ファイバーカテーテルは、まさに開発トレーサを利用して、血管内部の動脈硬化病変の検出段階に来たと考えられる。トレーサについては、前出のLOX-1、あるいはF-18-Fluorodeoxyglucose (FDG)が動脈硬化病変に効率よく取り込まれていくことをウサギの摘出大動脈病変で確認しており、実際に硬化病変での取り込みをカテーテル下で確認するまでに至っている。実際に共同演者は、マクロファージの数とF-18-FDG取り込みが良い相関を示すことも報告している。更にブタでの動脈硬化層におけるカテーテル操作、そしてRI検出感度の実験も終了しており十分に臨床化が可能であるデータが出ている。RI検出カテーテルの動物実験を行った。IVRD新カテーテルの操作性や、安全性、そしてRI検出の空間分解能、時間分解能を犬の腸骨動脈、及び冠動脈でin-vivoに行った。動脈硬化病変検出実験の前に、対外マーカーにFDG-RI標識を行い、動脈外固定の上、このカテーテルによる検出能を見た。RIステント通過時の、カテーテルのRI検出能、感度、反応性を見るものであり、マーカーの位置、間隔、径、さらにRI濃度を変えて効果病変の多様性に対応したデータを集めた。この結果、このカテーテルによる腸骨動脈、及び冠動脈での感度、分解能は血管病変の検出に十分であることを知った。また次の段階で、冠動脈内に自然発症の血栓を作ることを目的に、拍動冠動脈を外膜側からピンチングし内膜破損から血栓形成を誘発し、FDGトレーサを血管内投与した。実験犬のと殺後にこの血管病変部分を取り出して固定し、さらにこのIVRDカテーテルによる通過時のカウント変化を確認した。硬化病変破綻時の、血栓付着モデルとして検討した結果、血管内新鮮血栓の描出にも効果的であること確認した。さらに次段階で動脈硬化作成ミニ豚の動脈硬化病変(内膜損傷に高脂肪食飼育)で、その病変に取込む標識化合物をカテーテルによりin-vivoで検討した。この結果は、屠殺後の取り出し標本のex-vivoによる病変のカウント、あるいは病理標本と比較した。自然発症の硬化病変の検討をしたが、動脈硬化病変が極めて軽微であったため正常像、正常カウントの確認に終わった。FDGによるLOX-1モノクローナル抗体によるラベル法は終了している。閉塞性動脈硬化病変を有するASO患者への投与を計画中である。今年度は1)IVRD(intravascular radiation detector)カテーテルの操作性を実験豚にてIN-VIVO実験すること、更には、2)犬実験で下肢と冠動脈における血栓性閉塞を念頭に置いた実験系を組んだ。これは、犬の冠動脈を露出して(左前下行枝)、部分的に何箇所か血管外皮のピンチングを行って、血栓を血管内皮上に作成するものである。

血栓作成上、IVRDをIN-VIVOに使用し、操作性を確認した。ピンチの後で血管内部に血栓が出来上がり、血流の停滞ないし途絶が生じた時点で犬をsacrificeして、血管を剥離、その後、F18-FDG(ポジトロントレーサ)を血管内部に打ち込み、さらに血管標本を圧かけて緊張させながら血管内部をsalineで潅流し、その中をIVRDを通過させ、EX-VIVOの画像評価を行った。更には冠動脈摘出後切片をEX-VIVOでのIVRD画像評価をした後に、内皮に付着した血栓と血管の病理標本と対比検討するものである。豚冠動脈での改良型新IVRDカテーテルの操作性は極めてよく、冠動脈の末梢病変に対応する臨床応用に十分供することのできるものであることを確信した。また上記の犬実験の、IN-VIVOでのIVRDの操作性は良く、冠動脈への挿入、通過性には問題は無かった。また剥離血管内においてのIVRD操作による検討では、血栓の付着部位におけるFDGの取り込みの高いこと、またそれをIVRDが確実に線源として捕らえていることを確認した。更にはIVRD下でのバックグラウンドとの対比も良く血栓診断における画像化にも適すると考えられた。この病理標本ではFDGのRIの集積の高い部分での血管内皮の障害と赤色血栓の存在を確認している。また今回IVRDの下肢動脈の臨床に向けて、倫理委員会に申請の上、このRIトレーサの評価、RI検出光ファイバーカテーテルIVRDの操作性、検出能について野原が中心に下肢動脈造影とともに施行する予定であったが予定は遅れて施行は出来なかった。しかし,これらの実験結果から臨床への応用は極めて可能性が高いと考えられる。