hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
持久的運動が抗酸化能に及ぼす影響に関する研究

本研究の学術的な特色・独創的な点として、生体内では抗酸化的な酵素や物質が相補的・複合的に作用していると考え、血清の総抗酸化能(TAA)の測定・評価方法に関して検討を行い、方法を確立した。また、貪食細胞の活性酸素種(ROS)の産生を比較可能とする測定方法を確立した。ラットを用い、肺胞洗浄液(BALF)中の抗酸化物質濃度等を測定し、BALF中のタンパク質濃度は急性的な酸化的ストレスの、またチオバルビツール酸反応物(TBAR)濃度は中長期的な酸化ストレスの良い指標となると考えられた。さらに、肺胞マクロファージ(AM)のROS産生能とAM培養上清中のサイトカイン(IL-1β、IFNγ、及びTNFα)濃度を測定し、強制あるいは自発的な運動負荷の違いによる影響を明らかにした。ヒトを対象とした実験として、市民ランナーのマラソン前後で測定を行った。マラソン後には好中球数が増加し、IL-6、IL-8、及びG-CSF濃度も著明に増加していた。これらのサイトカインが好中球の動員に関与していると考えられる。さらに、マラソン完走者の好中球機能及びCD11bとCD16の発現を測定したが、レース後に好中球機能は低下し、その機能低下はCD16の発現減少に伴うと推察された。好中球数の増加は、機能低下に対する補償的な反応とも考えられる。女子大学生の長距離選手を被験者とし、持久的な運動負荷が繰り返される夏期合宿において血清の抗酸化物質濃度とTAA及び血漿中サイトカインを測定した。TAAと血清中抗酸化物質等との相関関係を検討したが、TAAとTBARの間にのみ正の強い相関関係が認められた。サイトカインの変動より、合宿によって全身の炎症性の反応はむしろ抑えられ、Th2活性を抑制した可能性が考えられる。また、運動習慣による血清中抗酸化物質等への影響を地域在住の高齢者を対象に調査研究を行ったが、男性の運動習慣あり群ではTAAとTBARの間に正の相関関係が認められた。本研究で確立した血清TAAは酸化・抗酸化の状況を示す良い指標になると思われる。本年度はヒトを対象とした研究の基礎として、実験小動物としてWistar系ラットを用い、肺胞マクロファージ(AM)の活性化によるサイトカインの産生増加が抗酸化能に及ぼす影響の理論的な裏付けを得る事を主たる目的とした。Wistar系ラットの成熟期として11週齢と17週齢を設定し、トレッドミルによる強制運動群、回転式運動量測定ケージで個別飼育した自発的運動群、自発的運動群と同じ床面積で個別飼育した自発的運動群の対照群、及び通常飼育の対照群を作成した。実験開始から6週間後と12週間後に既報の方法により気管支肺胞洗浄を行い、AMを採取した。コールターカウンターを用いてAM数を測定し、Dulbecco MEMで60万個/mLに調整した後にAM活性を測定した。AM活性として、本年度に主要設備備品として購入した超高感度化学発光法解析装置(アルファ-Basic47、トッケン)を用い、AMからの活性酸素種の産生を絶対比較が可能な化学発光法で測定する条件を確立し、ラットのプール血清でオプソニン化したザイモサンを刺激剤としてルシゲニン依存性化学発光を96穴マイクロプレートを用いて測定した。

ラットAMの活性酸素種産生能の持久的運動による変動に関する成果はLuminescenceに掲載された。また、抗酸化能の変動を肺胞洗浄液から推定する事を目的に、肺胞洗浄液中の抗酸化物質濃度等を測定して報告した。さらに、サイトカイン産生への持久的運動の影響を明らかにする為にAMを12時間培養し、AM培養上清中のIL-1β、IFNγ、及びTMFαをラットのモノクロナ-ル抗体を使ったELISA測定キット(Bio Source)で測定した。測定結果は現在統計処理中であり、学会報告の準備を行っている。次年度に予定するヒトを対象とした研究の準備として大学駅伝選手を被験者とした練習量、栄養等の調査を行い、その成果は体力・栄養・免疫学会雑誌に掲載された。また、マラソン選手を被験者としたサイトカイン濃度の変動についても検討を行い、成果を報告した。本年度は持久的な運動の習慣を有する被験者として、都内某大学の陸上競技部に所属する長距離選手、市民ランナーでマラソンレースの参加者、及びジョギング愛好家を対象とした。研究目的と当該研究によって得られる個人的情報の保護と人権の尊重に充分に配慮する事を説明して協力をお願いし、同意を得てから研究を行った。駅伝選手やジョギング愛好家等は日常的に運動を行っており、調査日前の運動影響がない安静時のデータは取り難い。そこで、本年度は持久的な運動の前後での変動を測定する事に重点を置いた。また、調査時に身体計測及び採血・採尿を行い、肉体疲労度等に関して自記入式アンケートも実施した。本研究の学術的な特色・独創的な点である血清の総抗酸化能を超高感度化学発光法解析装置によって測定し、さらに血清中の抗酸化物質濃度・酵素活性等の測定を行った。また、市民ランナーを対象としてマラソン前後での末梢血中好中球と血中及び尿中のサイトカインの動態について検討を行った。レース後に棹状核好中球の増多が見られ、好中球の活性化を示すミエロペルオキシダーゼ等の血中濃度も増加し、マラソン後には好中球数の増加のみでなく、活性化もおきていると思われた。さらに、インターロイキン6及び8、顆粒球コロニー刺激因子の血中及び尿中濃度も著明に増加しており、これらのサイトカインが好中球の動員と活性化を仲介していると考えられる。この研究成果はMed Sci Sports Exercに掲載された。さらに、マラソンを完走した36名の男性を被験者としてマラソンレース前後での好中球の活性酸素種の産生、食作用、及びCD11bとCD16の発現を測定した。マラソンレースによって好中球機能は低下し、その一部はCD16の発現減少に伴うと推察された。好中球数の増加は、機能低下に対する補償的な反応とも考えられる。この研究成果はLuminescenceに掲載された。当該研究課題の最終年度にあたり、実験小動物より得た理論的な裏付けを基に、持久的な運動の習慣を有する被験者から得られた得られた結果を検討し、持久的な運動による抗酸化能への影響が評価できるようにする事を目的とした。また、本研究の学術的な特色・独創的な点である血清の総抗酸化能の測定方法に関する研究成果は、J phys Fit Nutr Immunolに掲載された。本年度も大学の陸上競技部に所属する長距離選手、実業団所属のマラソン選手、及びジョギング愛好家を対象とした。
ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬と抗HIV薬の併用による腎癌新規治療法の開発

ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害薬単独での効果的な小胞体ストレス誘導は困難である。HIVプロテアーゼ阻害薬は分子シャペロンおよびプロテアソーム阻害作用を持つと共にP-glycoprotein阻害作用も有するため、両者の併用が効果的に小胞体ストレスとヒストンアセチル化を誘導すると仮定し研究を行った。HDAC阻害薬entinostatとHIVプロテアーゼ阻害薬ritonavirの併用は腎癌細胞においてアポトーシスを誘導し、相乗的に細胞増殖を抑制した。また、予測通り、小胞体ストレスおよびヒストンアセチル化を誘導した。マウス皮下腫瘍モデルを用いた検討でも、併用は有意に腫瘍の増大を抑制した。ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害薬は、分子シャペロンを抑制することで細胞内にunfolded proteinを増加する。一方、増加したunfolded proteinは、プロテアソームによって分解されるため、HDAC阻害薬単独での効果的な小胞体ストレス誘導は困難である。HIVプロテアーゼ阻害薬は分子シャペロンおよびプロテアソーム阻害作用を持つと共に、CYP3A4阻害作用も有するため、両者を併用することで相乗的な小胞体ストレスおよびヒストンアセチル化を誘導できると仮定した。今年度は、当研究室で保有する腎癌細胞株(769-P, 786-O, Caki-2)に対して、HDAC阻害薬entinostatとHIVプロテアーゼ阻害薬ritonavirを用いて併用療法を行い、その効果と分子生物学的なメカニズムを検証した。まず、cell viabilityをMTS assayを用いて検討したところ、全ての細胞株において相乗的な殺細胞効果を認めた。また、colony formation assayでは、有意なコロニー形成阻害作用を認めた。細胞周期の変化を検討したところ、有意なsub-G1 fractionの増加を認め、またwestern blot法では、cyclin D1、cyclin-dependent kinase 4の発現減少を認めた。同様に、アポトーシス誘導を検討したところ、併用療法によってannexin V陽性細胞の効果的な増加を認めた。またwestern blot法でアポトーシス関連蛋白の効果的な発現増加が立証できた。作用メカニズムに関してはwestern blot法で小胞体ストレスマーカーの発現増加を認めるとともに、相乗的なヒストンアセチル化も確認された。今年度は、更に、entinostatとritonavirを用いたin vivoにおける検討も開始した。当初の仮定通り、腎癌細胞におけるHDAC阻害薬entinostatとHIVプロテアーゼ阻害薬ritonavirの併用では、in vitroにおいて相乗的な抗腫瘍効果を認めた。また、そのメカニズムとして、小胞体ストレスの誘導、およびヒストンアセチル化を示すことが出来た。更に、in vivoにおける検討も開始出来ており、研究は、おおむね順調に進展していると言える。本研究は、腎癌に対して小胞体ストレスおよびヒストンアセチル化誘導による新しい治療を開発することを目的としている。ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害薬は、分子シャペロンを抑制することで小胞体ストレスを誘導する。一方で、HIVプロテアーゼ阻害薬は分子シャペロンおよびプロテアソーム阻害作用を持つと共に、CYP3A4阻害作用も有するため、両者を併用することで相乗的に小胞体ストレスおよびヒストンアセチル化を誘導できると仮定して研究を進めている。今年度は、HDAC阻害薬entinostatとHIVプロテアソーム阻害薬ritonavirを用いて、これまでの実験の再現性の確認、およびin vivoにおける効果を検討した。当研究室で保有する腎癌細胞株(769-P, 786-O, Caki-2)を用いて、併用療法を行い、cell viabilityをMTS assayを用いて検討したところ、全ての細胞株において相乗的な殺細胞効果を認め、また、colony formation assayでは、有意なコロニー形成阻害能を認めた。細胞周期の変化を検討したところ、有意なsub-G1 fractionの増加を認め、いずれの実験でも再現性を確認できた。一方で、Caki-2を用いてヌードマウス皮下腫瘍モデルを作成し、in vivoにおける併用療法の効果を検討した。マウスをコントロール群、entinostat投与群(2 mg/kg)、ritonavir投与群(50 mg/kg)、併用群に分け、それぞれ腹腔内投与による治療を10日間行った。致死的な副作用は認めず、併用群においては腫瘍の増大が有意に抑制された(P = 0.0284)。さらに治療終了後にマウスを安楽死させ、腫瘍を摘出し、RIPA bufferを用いてlysateを作成した。ウェスタンブロット法による検討を行ったが、小胞体ストレスマーカーの発現、ヒストンアセチル化には有意な差が見られなかった。今後、免疫組織化学による検討を追加する予定である。HDAC阻害薬entinostatとHIVプロテアーゼ阻害薬ritonavirの併用について、in vivoにおける抗腫瘍効果の検討を更に推進していく。特に、in vivoにおける腫瘍検体に関して、in vitroでのメカニズムと同様に作用しているかを確かめるためにwestern blot法で蛋白発現を検証する。

更に、他のHDAC阻害薬、HIVプロテアーゼ阻害薬を用いて同等の治療効果、さらには更に強い抗腫瘍効果を認めるか検証を進める。また、小胞体ストレスとヒストンアセチル化の関連について、小胞体ストレス阻害薬を用いた検討を行うことで、相互関係を追究していく。29年度が最終年度であるため、記入しない。泌尿器腫瘍学29年度が最終年度であるため、記入しない。
ガスリッチ矮小銀河進化に及ぼす水素分子冷却の効果

銀河の成り立ちを理解するためには、そこでの星間物質の進化過程を詳らかにする必要がある。特に、星間物質の主成分は水素なのであるから、構造形成に先立つ水素分子の形成過程に関して深い洞察が必須である。また、こういった水素分子形成の環境効果を把握するためには、ガスリッチな矮小銀河が最適である。なぜならば、そこでは、銀河形成及び進化への外因的な環境効果が少ないからである。初年度には、この水素分子過程への輻射場への影響を論文としてまとめあげた。興味深いことに、銀河形成に重要な水素分子形成へは、赤外線輻射による水素分子形成阻害が重要となる、新しい知見を本論文中で見出すことに成功した。赤外線輻射の起源としては、小質量星からの輻射の重ね合わせが重要となる。よって、銀河一般の進化を理解するためには、大質量星の形成史だけに注意を払うだけでは不十分であることが、本研究論文により明らかになったのである。その後、逆に大質星の進化過程の効果を考え、矮小銀河の進化を理解するためには、大質量星の効果が複雑系の物理として発現することを見出した。併せて、こういったガスリッチ矮小銀河が、宇宙の大規模構造の進化期に、実際にガスリッチであることを実証的に示すための議論も行い、これも論文としてまとめている。銀河が形成する際には、それに先立つ暗黒物質塊の形成が必要であり、この事実は、宇宙背景放射の詳細解析や信用に足りる数恒シミュレーションにより確立されたと思われる。その暗黒物質塊に銀河間物質が流れ込み、星形成が進むことで銀河が誕生していくのである。こういった一連の研究経験から、実際に銀河進化を理解するために、晩期型星の進化の理解も欠かせないことが改めて確認された。そこで、晩期型星の輻射場に強い興味があるため、恒星からの質量放出と輻射強度の進化を詳らかにしようと考えた。その結果、質量放出に伴う惑星状星雲形成と進化が、恒星晩年の輻射強度の進化と密接に結びついていることが、副産物の研究成果として得られた。この研究も学術論文誌に公表済みである。ガスリッチ矮小銀河の形成と進化を明らかにすることは、それ自体深い物理的考察の対象であるが、原始銀河形成の解明への一助となる意味で非常に意義深い。実際、綾小銀河におけるような金属量の小さい星間物質の進化を理解することは、まさに初期段階にある原始銀河の星間物質進化の理解に直接的な示唆を与える。このように、本研究課題は、現代宇宙物理学の根幹をなす。本年度は、特に、金属量の小さい星間空間における水素分子形成過程の再検討を行った。以前は、少しでも金属量のある、つまり星間塵のある環境においては、水素分子は星間塵上における形成が有効とされてきた。この理由は、気相での水素分子反応が遅いからではなく、星間輻射場により気相での水素分子の破壊のため形成自体が阻害されるためであった。しかし、ガスリッチ燈小銀河では、水素分子の破壊に効く輻射の平均自由行程が短くなる。このため、少しくらい星間塵が存在しても、気相中での水素分子形成が星間塵上での形成を凌駕できることが分かった。加えて、最終的な水素分子形成量には、今まできちんとその重要性が認識されていなかった、赤外線による水素分子破壊が重要となり得ることが判明した。この成果は学術論文としてまとめ、出版済みである。加えて、ガスリッチ媛小銀河の星間物質は、複雑系としての振る舞いをすることが指摘されているため、その非線形な振る舞いを再吟味した。特に、媛小銀河の重力ポテンシャルは浅いため、銀河本体からの質量離脱の効果を考慮した。その結果、質量離脱効率が大きい場合には、非線形的時間発展の発現が遅れることが分かった。昨年度は、この水素分子過程への輻射場への影響を論文としてまとめあげた。本年度は、逆に大質星の進化過程の効果を考え、矮小銀河の進化を理解するためには、大質量星の効果が複雑系の物理として発現することを見出した。併せて、こういったガスリッチ矮小銀河が、宇宙の大規模構造の進化期に、実際にガスリッチであることを実証的に示すための議論も行い、これも論文としてまとめあげることができた。銀河が形成する際には、それに先立つ暗黒物質塊の形成が必要であり、この事実は、宇宙背景放射の詳細解析や信用に足りる数値シュミレーションにより確立されたと思われる。

次の研究段階として、過去の暗黒物質塊に銀河間物質が実際に流れ込む様子を観測することが必須となる。その観測可能性を、基礎物理学の素過程積み上げることで論じたのである。結果、前景の銀河団による重力レンズ効果がなければ、実証的に流入する銀河間物質の検出が難しいことが判明した。これは、形成期にある矮小銀河を検出するための観測戦略に大きな寄与を与える成果と考えられる。銀河の成り立ちを理解するためには、そこでの星間物質の進化過程を詳らかにする必要がある。特に、星間物質の主成分は水素なのであるから、構造形成に先立つ水素分子の形成過程に関して深い洞察が必須である。また、こういった水素分子形成の環境効果を把握するためには、ガスリッチな矮小銀河が最適である。なぜならば、そこでは、銀河形成及び進化への外因的な環境効果が少ないからである。初年度には、この水素分子過程への輻射場への影響を論文としてまとめあげた。興味深いことに、銀河形成に重要な水素分子形成へは、赤外線輻射による水素分子形成阻害が重要となる、新しい知見を本論文中で見出すことに成功した。赤外線輻射の起源としては、小質量星からの輻射の重ね合わせが重要となる。よって、銀河一般の進化を理解するためには、大質量星の形成史だけに注意を払うだけでは不十分であることが、本研究論文により明らかになったのである。その後、逆に大質星の進化過程の効果を考え、矮小銀河の進化を理解するためには、大質量星の効果が複雑系の物理として発現することを見出した。併せて、こういったガスリッチ矮小銀河が、宇宙の大規模構造の進化期に、実際にガスリッチであることを実証的に示すための議論も行い、これも論文としてまとめている。銀河が形成する際には、それに先立つ暗黒物質塊の形成が必要であり、この事実は、宇宙背景放射の詳細解析や信用に足りる数恒シミュレーションにより確立されたと思われる。その暗黒物質塊に銀河間物質が流れ込み、星形成が進むことで銀河が誕生していくのである。こういった一連の研究経験から、実際に銀河進化を理解するために、晩期型星の進化の理解も欠かせないことが改めて確認された。そこで、晩期型星の輻射場に強い興味があるため、恒星からの質量放出と輻射強度の進化を詳らかにしようと考えた。その結果、質量放出に伴う惑星状星雲形成と進化が、恒星晩年の輻射強度の進化と密接に結びついていることが、副産物の研究成果として得られた。この研究も学術論文誌に公表済みである。
二次元における高分子の相溶性の研究

空気-水界面において安定な単分子膜を形成することが知られているポリエチレンオキシド(PEO)、ポリ酢酸ビニル(PVAc)、ポリアクリル酸メチル(PMA)、ポリメタクリル酸メチル(PMMA)の中からPEO-PMMA,PEO-PVAc,PVAc-PMA,PVAc-PMMAの4種類の混合膜について表面圧測定を行った。さらに、PEO-PMMAおよびPVAc-PMA混合膜については、空気-水界面に吸着したそれら吸着層厚さおよび屈折率が得られるエリプソメトリ-による測定も行った。1)表面圧測定より、一定表面圧における表面積あるいは崩壊圧と混合組成のプロットからPVAc-PMMA膜を除き、全ての混合膜は互いに相溶することが分った。特に、PVAc-PMA膜はその化学構造が似ていることを反映してほぼ理想的に混合することが明らかになった。さらにこれら相溶性は固体状態(三次元状態)における相溶性に相関があることが分った。2)エリプソメトリ-の測定により、PEO-PMMA膜の吸着層厚さは、その混合組成を変えても15-20Åと薄くなり、これはPEOあるいはPMMAのそれぞれの単独膜の吸着層厚さが共に15Å以下であることに対応している。一方、PVAc-PMA膜の吸着層厚さは、濃度と共に増加し、表面圧が一定値となる表面濃度以上では150Åという厚い吸着層となった。この吸着層厚さは、PMA単独膜の厚さ、25ÅよりむしろPVAc単独膜の厚さ、150Åに近くなることが明らかになった。固体状態、すなわち三次元において相溶するポリエチレンオキシド(PEO)とポリメタクリル酸メチル(PMMA)および非相溶のポリ酢酸ビニル(PVAc)とPMMAのそれぞれの混合高分子膜を空気ー水界面に拡げ、種々の混合組成でその濃度を変化させて表面圧測定を行った。一方、エリプソメーターにより空気ー水界面に拡げたPEOとPMMA混合膜について測定を行った。表面圧ー表面積(πーA)曲線より、一定表面圧での表面積を求め、その混合組成のモル分率に対するプロットから低圧部、すなわち低濃度における二次元状態での異種高分子の相溶性を検討した。さらに、高い表面濃度でその濃度が増加してもその表面圧は変らないプラトー表面圧と混合組成のモル分率とのプロットからも二次元状態における高分子混合膜の相溶性を評価した。一方、エリプソメーターによる測定から混合膜の厚さおよびその屈折率を求めた。PEOーPMMA混合膜は測定した全混合組成においてその表面濃度にかかわらず、相溶することが明らかになった。またエリプソメーターから得られた屈折率からも両高分子は、均一に混合していることが明らかになり、これら結果は固体状態でPEOーPMMAが相溶することに良く対応していることが分った。PVAcーPMMA混合膜は、低い表面濃度の場合には測定した全混合組成において非相溶であり、高い表面濃度の場合にはPMMAの高い混合組成のみで相溶することが明らかになった。この結果もまたPVAcーPMMA混合物が固体状態で非相溶であるという事実と良く対応していることが分った。以上の結果から2次元状態での異種高分子同士の相溶性は、固体状態での相溶性に良く対応していることが明らかになった。表面圧測定の結果から空気ー水界面において相溶性であることが明らかになったポリエチレンオキシド(PEO)とポリメタクリル酸メチル(PMMA)の混合膜および理想的に混合するポリ酢酸ビニル(PVAc)とポリアクリル酸メチル(PMA)の混合膜そしてPMA単独膜のエリプソメトリ-を行った。エリプソメトリ-の測定により空気ー水界面に吸着した高分子膜あるいは混合膜の吸着層厚さ、tおよびその屈折率が求められるので空気ー水界面における高分子膜などの吸着形態が推定できる。1)PEOーPMMA

混合膜のtは、混合組成を変えても15ー20【.Augstorm.】と薄く、これはPEOおよびPMMA単独膜のtが15Å以下であることに対応しているものと思われる。この混合膜のtは、重量混合比がほぼ1で最大となることが明らかになった。2)PVAcとPMAは、主鎖にエ-テルが結合している(PVAc)かエステルが結合している(PMA)かの違いだけでそのくり返し単位の化学構造はまったく同じである。しかしながらそれら高分子膜の空気ー水界面における表面圧ー面積曲線は著しく異なっていることが知られている。ところが、これら高分子膜の空気ー水界面での構造あるいは吸着形態については、ほとんど分っていない。エリプソメトリ-による測定からPMAのtは25ー30Å、PVAcのtは150Åと得られ、空気ー水界面においてPMAはPVAcに比べてかなりコンパクトな状態で存在し、表面圧の違いを示唆する結果が得られた。また、PVAcとPMA混合膜のtは、その表面圧が一定になる表面濃度以上において混合組成に関係なくほぼ同じ厚さ、150Åとなった。
再生医学的視点による腫瘍内マクロファージの樹状細胞への再分化法の建立

Granulocyte macrophagecolony stimulatingfactor(GM-CSF)単独でF4/80陽性腫瘍内マクロファージ(TIM)を処理してもマクロファージの性質は変化しなかったが, GM-CSFに加えてM-CSF受容体(M-SCF-R)に対するsiRNAで抑制しながらTIMを処理すると細胞内のシグナルタンパクの一部の変化がみられ,樹状細胞の時にみられるタンパクの発現がみられた。以上より, TIMを単球由来樹状細胞様の形質に再教育できることが示され,マクロファージの可塑性が示された。腫瘍内浸潤骨髄球系細胞(CD11b)陽性の中には,少量ではあるが,顆粒球(Gr-1強陽性)や樹状細胞(CD11b中等度陽性,CD11c強陽性)が含まれている(全CD11b陽性細胞中10%程度の場合が多かった。)ことが分かったので,当初の計画の通り,マクロファージのマーカーであるF4/80を用いて腫瘍内からマクロファージ系の細胞を精製した。その後,フローサイトメトリーによる表面抗原の特徴の解析と,F4/80陽性細胞の全RNAを用いたRNA解析(リアルタイムPCR法,マルチプルPCR法)にて解析し,F4/80陽性細胞は,ケモカイン受容体のCCR2とCCR5を強度に発現することが分かった。この結果は,腫瘍内のF4/80陽性細胞は,マクロファージと考えたほうが良い細胞であり,樹状細胞とは言い難い表現型であることが裏付けられた。そこで,更に腫瘍内浸潤F4/80陽性細胞の細胞内情報伝達系(Stat1,3,5,6など)を解析したが,その結果も樹状細胞系の情報伝達系は活性化しておらず,単球・マクロファージ系で活性化している情報伝達経路が活性化していることが分かった。つまり,腫瘍内の骨髄球系細胞は,今回用いたMCA38マウス大腸癌細胞の腫瘍内浸潤F4/80陽性細胞は単球・マクロファージ系の特徴を備えていると考えられた。なぜマクロファージへの分化が明確に起こるのかは,IL-2とTNF阻害を組み合わせた系を用いた研究の成果から,マクロファージのCD115発現が強く寄与していることが示唆された。(現在両方とも論文作成中である。)1)腫瘍内浸潤F4/80陽性細胞は、以前CD11b抗体で精製した場合の結果と同様マクロファージのM1マーカーとM2マーカーの性質を併せ持っていた。ただし、CD11b陽性細胞で精製したときと比べて、Gr-1強陽性細胞はほとんど含まれず、MDSC分画を含まないマクロファージ主体の分画と思われた。2)GM-SCFによる培養:単球が樹状細胞へと分化する場合、GM-CSF、IL-4,TNFαなどを用いる。そのため、まず、F4/80陽性の腫瘍内マクロファージをGM-CSFを加えて培養した。しかし、細胞表面のマーカーに変化はなかった。また、細胞内シグナル蛋白の発現パターンにも明らかな変化はみられなかった。つまり、細胞表面上も細胞内シグナル上もGM-CSFのみではF4/80陽性の腫瘍内マクロファージとしての形質を変化させることは出来かなかった。3)GM-SCFの添加およびM-CSFRに対するsiRNAの併用の結果:2)の結果から考えて、マクロファージへの分化を誘導する因子を抑制しながらではないと、GM-SCFの処理は効果がないのではないかと考えられたため、マクロファージが産生していることが、以前の検討で分かっているマクロファージへの分化に必須な因子であるM-CSFを、M-csFRに対するsiRNAで抑制しつつGM-CSFも同時に加えた。すると表面抗原の発現パターンに変化はないが,細胞内シグナル伝達経路において樹状細胞への分化に必要なSTAT1,STAT5,STAT6が有意に発現するようになった。つまり細胞内シグナルの上では樹状細胞様の性質を一部示した。4)抗原提示能の検討:GM-CSF単独処理、GM-SCFとM-CSFに対するsiRNAの併用の両者の抗原提示能については両者とも抗原提示能があり、両者間に差異は認められなかった。腫瘍内のマクロファージを対象にして,マクロファージへの分化促進因子や樹状細胞への分化抑制因子を抗体を用いて阻害したり,それらに対する受容体の発現をsiRNAで抑制しながら樹状細胞への分化を促進させるGM-CSF,IL-4,Flt-3Lなどで処理して,樹状細胞への再分化法を確立することが平成22年度平成23年度にかけての目的であり,今年度は以下の内容の論文の掲載を得た。また,実験ではIL-4の併用などの実験も行ったが,細胞が死んでしまうなどの影響で評価が困難であった。論文掲載内容:以上の事から,腫瘍内浸潤マクロファージを単球由来樹状細胞様の形質に再教育できることが示され,マクロファージの可塑性という当初の目的の一つは達成できた。
組織硬さ分布計測と免疫組織学的手法を対応させた肝線維化率の評価

平成16年度に開発した「免疫組織学的手法に用いる薄組織切片の弾性率分布計測に適した走査型顕微鏡」の開発を継続すると共に、開発した装置を用い以下の手順で肝臓の硬変に関する以下の知見を得た。1.組織を生理的条件に維持したままに計測するための特殊なチャンバーを開発した。組織が水溶液に浸った状態では高感度の計測が実現できないため、スライス切片をメンブレン上に半浸法させ、センサが接触する表面にはポリ-L-リシン薄膜(約100nm)を張り水分の蒸発を防ぐと共にセンサの物理的接触条件を一定とした。2.ラットを実験動物として用い、チオアセタマイド(TAA:200mg/kg)注入法により硬変肝および慢性肝炎モデルを作成した。血液を生理食塩水で環流した後に臓器を取り出し、振動式マイクロスライサーを用いて固定せずに薄層切片を作製した(厚さ50300μm)。測定範囲900μm×900μmを30μm刻みで計961点計測した。現行のシステムではマイクロタクタイルセンサの周波数計測におけるサンプリング(毎秒200サンプル)が律速となり、計961点の計測に15分程度を要した。3.測定した薄層切片をアザン染色し、細胞質と膠原繊維を同定した。比較的厚い切片であるために、測定した表面のみを染色させるたアザン染色の各浸透時間や方法を改良した。4.ラット慢性肝炎において細胞質部位19.6±3.02kPa、膠原繊維部位43.6±8.54kPaであった。硬変肝では細胞質部位13.6±6.24kPa、膠原繊維部位43.0±7.73kPaであった。病状によらず各部位の弾性率はほぼ同じ値を示し、硬変肝の進行に伴い臓器が硬化するメカニズムは膠原繊維の蓄積と3次元構造の構築にある事が示された。マイクロタクタイルセンサ(MTS)の技術を応用し、以下の手順で免疫組織学的手法に用いる薄組織切片の弾性率分布計測に適した走査型顕微鏡を開発した。(1)プローブにはMTSを改良して用いた。有限要素法を用いたセンサの振動モード解析及び周波数解析から、弾性を計測する縦振動に加えて接触により消失する程度振幅の横振動を含むようにMTSをデザインし、非線形応答を得て弾性計測に加えた接触検知を実現した。(2)先端径20μmのMTSを用いた条件下において、5μm進入時に必要な薄膜厚みは等量の5μmであり、MTSを用いた弾性測定には従来応力歪み法を用いた際の試料の「厚みは進入量の10倍必要である」という制約を大きく改善した。(3)従来専門知識に基づく微調整が必要であったMTSを駆動するための位相シフト回路の調整を、PLL技術を応用したデジタル自動チューニング装置を開発(協力:有限会社マイコンロジック・福島県郡山市)することで専門知識を必要とせず容易に実現可能とした。(4)MTSの走査には、100nmの実測分解能を持つステッピングパルスモーター2機を各軸に持つ粗動XYZ軸と、8nm実測分解能を持つボール軸受けねじ回転拘束方式ステッピングパルスモーターによる微動Z軸を加えた走査システムを開発し(協力:有限会社ピーアンドエム・福島県会津若松市)用いた。(5)組織を生理的条件に維持したままに計測するための特殊なチャンバーを開発した。組織が水溶液に浸った状態では高感度の計測が実現できないため、スライス切片をメンブレン上に半浸法させ、センサが接触する表面にはポリ-L-リシン薄膜(約100nm)をはり水分の蒸発を防ぐと共にセンサの物理的接触条件を一定とした。(6)開発したシステムを用いて組織切片の表面形状及び弾性率分布(ヤング率)測定の有用性を確認した。硬変肝では細胞質部位13.6±6.24

kPa、膠原繊維部位43.0±7.73kPaであった。病状によらず各部位の弾性率はほぼ同じ値を示し、硬変肝の進行に伴い臓器が硬化するメカニズムは膠原繊維の蓄積と3次元構造の構築にある事が示された。
婦人科癌の細胞特性に関与する糖鎖遺伝子に関する研究

1.ガラクトース転移酵素遺伝子に関する検討β1,3ガラクトース転移酵素(β1,3GT)およびβ1,4ガラクトース転移酵素(β1,4GT)の酵素活性を選択的に測定する系を作成し、両者の活性を測定した。また、ノザンブロット法にてβ1,4ガラクトース転移酵素mRNAの発現を検討した。その結果、子宮体癌におけるβ1,3GT活性はβ1,4GT活性に比べ高値であり、またβ1,4GTmRNAの発現レベルは子宮頸癌や卵巣癌に比べ低下していた。さらに、子宮体癌由来培養株細胞あるいは卵巣癌由来株細胞にヒトβ1,4ガラクトース転移酵素cDNAを導入し、β1,4GTの高発現株あるいは低発現株を作成し、両者の細胞特性を検討した。その結果、β1,4GTの高発現株はcontrolに比べ細胞増殖能、細胞外基質への接着能が亢進し、一方β1,4GT低発現株は細胞増殖能、細胞外基質への接着能は低下した。以上の結果から、β1,4GTは子宮体癌や卵巣癌細胞の特性に関与している可能性が示唆された。2.AKT2遺伝子に関する検討最近クローニングされたAKT2遺伝子の産物は、細胞増殖シグナルの伝達物質の一つであることが明らかになっており、また膵臓癌においてAKT2遺伝子の異常増幅の有無が病勢や予後と関連があることが示唆されている。そこで、子宮体癌や卵巣癌におけるAKT2遺伝子の発現動態を解析した。AKT2のgenomic fragmentをプローブとして、卵巣癌症例についてAKT2遺伝子増幅の頻度を同一個体の非癌部分をコントロ-ルとしたスロットブロット法にて検討した。その結果、子宮体癌に関しては、培養細胞を用いた解析にて子宮体癌由来培養株細胞6種類のうち1種類にてAKT2遺伝子の異常増幅が認められた。一方、卵巣癌患者25例中の検索した範囲では、AKT2遺伝子の異常増幅は認められなかった。婦人科癌のなかでとくに子宮体癌(以下体癌と略す)と卵巣癌における糖鎖遺伝子に関する検討を行い、ガラクトース転移酵素について以下の研究成果が得られた。1. β1,3ガラクトース転移酵素(β1,3GT)とβ1,4ガラクトース転移酵素(β1,40GT)の発現:1型糖鎖の合成を規定するβ1,30Tの酵素活性の測定系を申請者らが作成したヒト型モノクローナル抗体HMST-1を用いた薄層クロマトグラフイー免疫染色法を用いて確立した。また、2型糖鎖の合成を規定するβl,40Tの酵素活性の測定系をモノクローナル抗体H11を用いたELISA法にて確立した。本測定系にて培養細胞および正常組織、癌組織のGT活性を測定した結果、体癌におけるβ1,3GT活性はβ1,4GT活性に比べ高値を示した。また、子宮頸癌や卵巣癌ではβ1,3GT活性はβ1,40T活性に比べ低値であった。さらに、ノーザンブロット法にて体癌由来株では頸癌株や卵巣癌株に比べβ1,4GTmTRNAの発現は低下していることを明らかにした。以上より、婦人科癌における1型糖鎖や2型糖鎖の発現にはβ1,30Tおよびβ1,4GTが関与していることが示された。2. β1,4GT遺伝子の発現と細胞特性の関連:子宮体癌由来株細胞SNG-Mにβ1,4GT遺伝子のセンスcDNAあるいはアンチセンスcDNAを導入し、GT高発現株,およびGT低発現株を作成した。また、卵巣癌由来株細胞RMG-IIにβ1,4GT遺伝子のアンチセンスcDNAを導入し、GT低発現株を作成した。

そして、β1,4GTの高発現株およびβl,4GTの低発現株のin vitroにおける細胞特性を解析した。その結果、β1,4GT高発現株は細胞の増殖能や細胞外基質への接着能が冗進したのに対し、β1,4GT低発現株は増殖能・接着能は低下した。従って、β1,4GT遺伝子の発現は細胞の増殖能や接着能に関与している可能性が示唆された。1.ガラクトース転移酵素遺伝子に関する検討平成10年度にひき続いてβ1,4ガラクトース転移酵素の遺伝子導入細胞を用いた実験系を用いた検討を行った。本年度は、とくにヒト卵巣癌由来培養株細胞にβ1,4ガラクトース転移酵素のアンチセンスcDNAを導入した細胞の特性を検討した。まず、ノザンブロット法にてβ1,4ガラクトース転移酵素(β1,4GT)のアンチセンスcDNAを導入した細胞ではmRNの発現レベルは低下していることが判明した。そこで、in vitroにてβ1,4GT低発現卵巣癌株の細胞増殖能やコラーゲンに対する接着能を解析した結果、β1,4GT低発現株はmockに比べ細胞増殖能・コラーゲンへの接着能は低下していることが明らかになった。2.AKT2遺伝子に関する検討AKT2遺伝子の産物は、細胞増殖シグナルの伝達物質の一つであることが明らかになっており、また膵臓癌においてAKT2遺伝子の異常増幅の有無が病勢や予後と関連があることが示唆されている。そこで、本年度は子宮体癌や卵巣癌におけるAKT2遺伝子の発現動態を解明した。AKT2のgenomic fragmentをプローブとして、子宮体癌由来培養株細胞あるいは卵巣癌症例についてAKT2遺伝子増幅の頻度をスロットブロット法にて検討した。なお、卵巣癌組織については、microdissection法にて癌部分と非癌部分を採取し、非癌部分をコントロールとした。その結果、子宮体癌に関しては、培養細胞を用いた解析にて子宮体癌由来培養株細胞6種類の内1種類にAKT2遺伝子の異常増幅が認められた。一方、卵巣癌患者25例中検索した範囲では、AKT2遺伝子の異常増幅は認められなかった。
癌抑制G蛋白共役型受容体S1P2の作用機構の研究

G蛋白共役型受容体(GPCR)はあらゆる受容体のうち最大のファミリーを構成しており、現在使用されている医薬品の重要な標的分子である。我々がクローニングし、スフィンゴシン-1-リン酸(S1P)を生理的リガンドとすることを同定したGPCR S1P_2受容体は、G_<12/13>に共役しRho活性化の下流においてRacを抑制することにより細胞遊走を抑制するユニークな受容体であることを明らかにしている。本研究は、これら一連の我々自身の研究成果に基づいて、がん細胞・宿主細胞それぞれに発現するS1P_2受容体ががんの増殖・浸潤・転移にどのような役割をはたすのか、またその分子機構を明らかにすることを目的とする。C57BL/6マウスにLLC(ルイス肺がん)細胞を皮下接種し、腫瘍の増大と腫瘍血管新生を観察したところ、われわれの作出したS1P_2受容体ノックアウト(S1P_2KO)マウスにおいて、腫瘍増大と血管新生がともに増強されることが明らかとなった。皮下接種後10日目において腫瘍体積は約2倍、重量は1.7倍に達した。腫瘍血管を内皮細胞の表面マーカーであるCD31、血管平滑筋・周皮細胞のマーカーであるαsmooth muscle actin(αSMA)の二重蛍光染色で検出した結果、S1P_2KOマウスにおいては同腹野生型マウスに比し、腫瘍血管の断面積が増加しているばかりでなく、周皮細胞をともなった成熟した血管が多数出現していた。血管新生関連シグナル分子の発現レベルを定量的RT-PCRにより解析した結果、VEGF-Aをはじめとする様々な血管新生関連分子の発現増強が認められた。以上から、宿主細胞に発現するS1P_2受容体は、腫瘍の生育を抑制性に制御すること、その分子機構の一部に腫瘍血管新生の抑制制制御を担っていることが明らかとなった。1.培養血管内皮細胞SVEC4-10(S1P_2を内因性に中等度発現する)を用い、コラーゲングル内in vitro管腔形成におよぼすS1Pの作用を検討した。その結果、(1)S1PはSVEC4-10細胞のin vitro管腔形成を抑制すること、(2)S1P_2特異的阻害剤存在下でS1Pの抑制効果が阻害され、in vitro管腔形成が促進することを見出した。逆に、(3)S1P_2安定強発現SVEC4-10細胞では、S1Pの抑制効果が増強することが明らかとなった。これらの所見はS1P_2が血管新生を抑制性に制御することを強く示唆する。2.C57BL/6(野生型)マウス側腹部皮下に血管新生を促す成長因子を溶解したマトリゲルを植え込み、マトリゲル内に生成するin vivo血管新生の程度を定量的に検討した。その結果、(1)S1Pは血管新生をそくしんすること、(1)S1P_2特異的阻害剤存在下で血管新生がさらに増強し、管腔が大きく、血管壁の厚い比較的成熟した血管が多数できること、マトリゲルのヘモグロビン含量も多いことが明らかとなった。血管新生を認めたマトリゲルにおいて、RT-PCRでS1P_2の発現を確認した。以上の所見は、S1Pは従来報告されているようにS1P_1、S1P_3を介して血管新生を促進するが、これに加えて、マウス皮下組織(あるいは末梢血中の血管前駆細胞)に発現する内因性のS1P_2を介して、逆に血管新生を負に制御することを強く示唆する。3.C57BL/6(野生型)

マウスを用い、大腿動脈絡紮後虚血により誘導される血管新生がS1Pの局所投与によりどのように修飾されるかを、ドップラー血流測定、内皮細胞マーカー免疫組織染色により検討した。その結果、虚血後血管新生、血流回復がS1Pの用量依存性に増大すること、S1Pの最大効果は強力な血管新生作用を持つ線維芽細胞成長因子と同等であることを見出した。この作用はS1P_2以外の受容体サブタイプを介するものと考えられた。G蛋白共役型受容体(GPCR)はあらゆる受容体のうち最大のファミリーを構成しており,現在使用されている医薬品の重要な標的分子である。我々がクローニングし,スフィンゴシン-1-リン酸(S1P)を生理的リガンドとすることを同定したGPCR SIP2受容体は,G_<12/13>に共役しRho活性化の下流においてRacを抑制することにより細胞遊走を抑制するユニークな受容体であることを明らかにしている。本研究は,これら一連の我々自身の研究成果に基づいて,がん細胞、宿主細胞それぞれに発現するSIP_2受容体ががんの増殖、浸潤、転移にどのような役割をはたすのか,またその分子機構を明らかにすることを目的とする。C57BL/6マウスにLLC(ルイス肺がん)細胞を皮下接種し,腫瘍の増大と腫瘍血管新生を観察したところ,われわれの作出したSIP_2受容体ノックアウト(SIP_2KO)マウスにおいて,腫瘍増大と血管新生がともに増強されることが明らかとなった。皮下接種後10日目において腫瘍体積は約2倍,重量は1.7倍に達した。腫瘍血管を内皮細胞の表面マーカーであるCD31,血管平滑筋、周皮細胞のマーカーであるαsmooth muscle actin(αSMA)の二重蛍光染色で検出した結果,SIP_2KOマウスにおいては同腹野生型マウスに比し,腫瘍血管の断面積が増加しているばかりでなく,周皮細胞をともなった成熟した血管が多数出現していた。血管新生関連シグナル分子の発現レベルを定量的RT-PCRにより解析した結果,VEGF-Aをはじめとする様々な血管新生関連分子の発現増強が認められた。以上から,宿主細胞に発現するS1P2受容体は,腫瘍の生育を抑制性た制御すること,その分子機構の一部に腫瘍血管新生の抑制制制御を担っていることが明らかとなった。
自然言語意味概念記述言語CDLによる次世代知能化Web基盤

情報流通・共有のグローバルなインフラに成長し,今後も重要性を増すWWW(Web)の次世代基盤として,Semantic Webの国際的標準化が進められている.Semantic Webはメタデータの共通的記述を対象にするのに対し,本研究ではWebの主要なソース情報である自然言語テキストが表す概念意味の共通的記述言語CDL(Concept Description Language)による次世代Web基盤に向けての研究を行った.CDLはNPO法人ISeC(石塚はこのメンバー)を中心に仕様を定め,W3Cで国際標準化活動を行っているが,この活動と連携して研究を進めた.大きな目標はコンピュータにもWebコンテンツの概念意味を把握できるようにする次世代Web基盤の構築であり,これを土台としてコンピュータが意味に踏み込んで人間と協働する範囲を格段に拡大することである.CDLは簡素な3つ組構造を基本とするが(概念を表すノードと関係を表すアークによるグラフ構造となる;ただし,ノードは属性-属性値が付加できる),現状での大きな課題は自然言語テキストから全自動でCDLに変換することは困難なことである.従って,意味役割(semanticrole)を出力するパーサを活用し,自然言語テキストから可能な3つ組構造を抽出する手法について研究し,成果を得た.現状では抽出困難な概念間の関係は人手で与えるものとし,これを容易にするインタフェースとしてのグラフィカル・エディタを開発した.(次第に人手の部分を減らし,自動化率を向上させていく予定である.)Semantic WebとCDLは対極的であると共に相補的でもあるので,両者を融合させて発展させる道を拓くため,CDL記述をSemantic WebのRDF(Resource Description Format)で表現する機能の開発も行った.情報流通・共有のグローバルなインフラに成長し,今後も重要性を増すWWW(Web)の次世代基盤として,Semantic Webの国際的標準化が進められている.Semantic Webはメタデータの共通的記述を対象にするのに対し,本研究ではWebの主要なソース情報である自然言語テキストが表す概念意味の共通的記述言語CDL(Concept Description Language)による次世代Web基盤に向けての研究を行った.CDLはNPO法人ISeC(石塚はこのメンバー)を中心に仕様を定め,W3Cで国際標準化活動を行っているが,この活動と連携して研究を進めた.大きな目標はコンピュータにもWebコンテンツの概念意味を把握できるようにする次世代Web基盤の構築であり,これを土台としてコンピュータが意味に踏み込んで人間と協働する範囲を格段に拡大することである.CDLは簡素な3つ組構造を基本とするが(概念を表すノードと関係を表すアークによるグラフ構造となる;ただし,ノードは属性-属性値が付加できる),現状での大きな課題は自然言語テキストから全自動でCDLに変換することは困難なことである.従って,意味役割(semanticrole)を出力するパーサを活用し,自然言語テキストから可能な3つ組構造を抽出する手法について研究し,成果を得た.現状では抽出困難な概念間の関係は人手で与えるものとし,これを容易にするインタフェースとしてのグラフィカル・エディタを開発した.(次第に人手の部分を減らし,自動化率を向上させていく予定である.)Semantic WebとCDLは対極的であると共に相補的でもあるので,両者を融合させて発展させる道を拓くため,CDL記述をSemantic WebのRDF(Resource Description Format)で表現する機能の開発も行った.
オートファゴソームにリクルートするＲａｂ不活性化因子群の機能解析

近年、低分子量G蛋白質Rabの複数の不活性化因子がオートファゴソーム上に局在することが報告されたが、それらのオートファゴソームへのターゲティング機構やオートファジーにおける機能は明らかではなかった。本研究課題では、Rab33Bの不活性化因子OATL1に焦点を当て、LC3結合配列とオートファゴソーム膜の局在との関連性について解析を行った。その結果、OATL1がLC3との結合を介してオートファゴソームの外膜のみに局在することにより、オートファジーによる分解から回避すると共に、オートファゴソームの成熟過程に関与することが示唆された。オートファジーは細胞内の蛋白質分解機構の一種で、飢餓時におけるエネルギーの産生や細胞内の異物(蛋白質凝集塊や細胞内に侵入した菌など)の除去に利用されている。オートファジーの基本的な仕組みは既に良く知られており、二重膜構造を持つ隔離膜がまず伸長し、細胞質やオルガネラなどをとり囲み、オートファゴソームが形成する。その後、オートファゴソームはリソソームと融合することにより内容物が消化・分解される。このようにオートファジーは非常にダイナミックな膜輸送過程を伴うことから、膜輸送の制御因子による緻密な制御が想定されるが、オートファジーを制御する膜輸送の制御因子の実体は未だ十分に解明されていない。近年、当研究室を含む幾つかの研究グループによりRabのオートファジーへの関与が報告されているが、その詳細な制御機構は未だほとんど明らかになっていない。最近、我々はオートファゴソーム上にOATL1(Rab33不活性化因子)を含む複数のRab不活性化因子がリクルートすることを初めて見出した。そこで本研究課題では、これらのRab不活性化因子群の機能解析を通して、これまで謎に包まれていたRabによるオートファジー制御の分子基盤の解明を目指している。本年度は、オートファゴソームと共局在を示す二種類のRab不活性化因子(GAPCenA及びKIAA1055)に焦点を当て、それらの分子のオートファゴソームへのリクルート機構の解析に取り組んだ。各種変異体(欠失及び部位特異的アミノ酸置換変異体)を用いた解析の結果、GAPCenAとKIAA1055は異なるメカニズムでオートファゴソーム上にリクルートすることが明らかになった。近年、当研究室を含む幾つかの研究グループにより膜輸送の普遍的制御因子であるRabのオートファジーへの関与が報告されているが、その詳細な制御機構は未だほとんど明らかになっていない。本研究課題では、これらのRab不活性化因子群の機能解析を通して、これまで謎に包まれていたRabによるオートファジー制御の分子基盤の解明を目指している。本年度は、オートファゴソームと共局在を示す二種類のRab不活性化因子(GAPCenA及びTBC1D2B)のオートファゴソームへのリクルート機構の解析に取り組み、TBC1D2BはOATL1と同様なLC3結合配列を持ち、その配列依存的にオートファゴソームにリクルートすることを見出した。一方、GAPCenAは特徴的なLC3結合配列を持たず、前者二つとは異なる機構でオートファゴソーム上にリクルートすることが明らかになった。オートファジーは細胞内の蛋白質分解機構の一種で、飢餓時におけるエネルギーの産生や蛋白質凝集塊など細胞内の異物の除去に重要な役割を担っている。

また近年、膜輸送の普遍的制御因子であるRabのオートファジーへの関与が報告されているが、その詳細な制御機構に関しても不明な点が多い。最近、我々はオートファゴソーム上にOATL1(Rab33不活性化因子)を含む複数のRab不活性化因子がリクルートすることを初めて見出した。本研究課題では、これらのRab不活性化因子群の機能解析を通して、これまで謎に包まれていたRabによるオートファジー制御の分子基盤の解明を目指してきた。本年度は、OATL1がLC3との結合を介してオートファゴソーム上に局在するにも関わらず、オートファジーの基質とはならない(すなわち、分解されない)ことを見出した。免疫電子顕微鏡による観察から、LC3はオートファゴソームの外膜・内膜の両側に均一に分布するが、OATL1はオートファゴソームの外膜のみに局在することが明らかになった。このOATL1のオートファゴソーム膜上での非対称分布が、オートファジーによる分解からの回避に密接に関連するものと考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。細胞生物学26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の目的であるRab不活性化因子のオートファゴソームへのリクルート機構の一端を解明することに成功した。当初の目的であるRab不活性化因子のオートファゴソームへのリクルートに必要な領域を絞り込み、GAPCenAとTBC1D2Bが異なる機構でオートファゴソームに局在することを明らかにした。当初の予定通り研究計画を推進する。当初の予定通り研究計画を推進し、Rab不活性化因子のオートファジーにおける役割を明らかにする。本年度は解析が順調に進んだため、当初の予定よりも消耗品費等を削減することが出来た。次年度は研究支援者1名を雇用し、不活性化因子の基質探索をより円滑に行う予定である。本研究課題で雇用していた研究支援者1名が年度の途中で転出したため、約3ヶ月分の給与と当該研究支援者が使用する予定であった消耗品費などが未使用となった。来年度は研究補助者2名を雇用し、研究の円滑なる遂行を目指す。