hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
RNA合成酵素を用いた自己複製系の構築

Qbeta phageはA2,coat,readthrough,replicaseの四つの遺伝子しか持たない最小の遺伝媒体RNAウイルスである。これら四つの遺伝子はQbeta phageの環境において、全て必要で不可欠である。そこで、我々は二重欠損phageの欠損を補うシステムとしてA2遺伝子を欠損させたQbeta phageゲノムをコードしたプラスミドを用いることによって最小複製単位の獲得ことに有効ではないかと考え、このようなプラスミドを持った大腸菌を指示菌とし、A2を欠損したphage検出することを試みした。結果:1.Qbeta phageのA2遺伝子は大腸菌では溶菌と吸着するのに必要である。そこでA2遺伝子にアンバ・ストップコドンを一が所導入したプラスミドを構築し、A2を供給するプラスミドとしてpBADA2を使った。その結果、獲得したphageはA/λ(Sup+)を指示菌とした時、BE110(Sup-)の時より優位な差が見られた。まだ、野生型に認められないNhe Iサイドが存在することから、A2遺伝子にアンバー変異を持ったphageが検出されたことが示唆された。2.1、の実験を踏まえて、A2を欠損したphageを獲得するため、A2遺伝子に存在するFsp IとPme Iサイドを利用して、A2を欠損プラスミドを構築した。同様にA2を供給するプラスミドとしpBADA2を用いた。その結果、プレート法にはphageのparticleを検出されなかったが、RT-PCRでは欠損したphageのゲノムRNAを確認された。対照に、A2を供給しない場合では欠損したphageのゲノムRNAの確認ができませんでした。即ち、A2を欠損したphageを獲得できることが可能であることが示唆された。そこで、増幅させるため、pBADA2を持った大腸菌にphageを再感染させ、濃縮実験を行った。Round8まで実験した結果、初期よりRT-PCRで欠損phageのゲノムRNAの増幅が見られ、Round5では最大の増幅を確認された。考察:相補系を用いてA2欠損phageの獲得することができた。この実験系によって、最小限複製単位の獲得に大きな一歩を前進したと言える。Qbeta ReplicaseはRNAファージ由来の複製遺伝子である。QbetaファージのゲノムRN上にA2(溶菌・吸着酵素)、Coat(外殻タンパク質)、RT(感染に必要なタンパク質)、β(RNAレプリカーゼのサブニット)の四つの遺伝子をもつ。RNAレプリカーゼのサブニットは大腸由来因子と複合体を形成し、RNA依存型RNA複製酵素となる。また、Qbeta Replicaseは自己認識して複製する鋳型特異性をもつ。そこで遺伝子発現系を必要最小限に単純化するためにQbetaファージRNAからA2、Coat遺伝子を欠損させ、βサブニット遺伝子だけをもつ自己複製システムを構築した。1.pACYCQβ1×A_2+pBADA_2及びpACYC 1×A2プラスミドを作製し、BL21に形質転換した。酵素切断により確認。欠損されたA2遺伝子は欠損ファージを作製するのをタイター測定法で実験した。A2を供給するプラスミドとしてpBADA2を使った。結果、BL21(pACYCQβ1×A_2/pBADA_2)からえられたファージはA/λを指示菌としたとき、BE110より優位さが見られた。また、wideファージに見られない位置にアンパ・ストップコドン存在することを示すNhe Iサイトが確認されたことから、A2欠損ファージであることが示唆された。2.Amberファージを用いたcomplemente成功するかどうかはA 2 Amberファージをp BADA2を持った大腸菌BE110(感染させる大腸菌の条件、F^+、Sup^-)における相補性テストを行なう。結果、A2の溶菌性における相補実験において、A2の溶菌性を持ったなくでも、A2を持ったないBE110より、10^5ぐらいの増幅がみられた。また、A2を溶菌しない場合には、arabinoseの誘導にもかかわらず、A/λとBE110の差がかけたAmber phageより縮小している。このことから、増幅と見られたphageはwild phageであると思われる。A2を溶菌した場合はA2を溶菌しない場合と比べプラークの数が2倍の差しかないですが、arabinoseの誘導するとarabinoseの誘導しないより4倍ぐらい増幅し、さらにA/λとBE110の差がかけたAmber phageより大きく開いた。それはAmber phageであることが示唆される。この実験では、A2の機能と溶菌性の関係は又ははっきり分かっていませんが、言えることはA2が溶菌性を持ってば、Amber phageを作る環境しやすくなると思われる。今後の予定A2をdeletionして、最小限の複製単位を獲得する。

そこでA2遺伝子にアンバ・ストップコドンを一が所導入したプラスミドを構築し、A2を供給するプラスミドとしてpBADA2を使った。その結果、獲得したphageはA/λ(Sup+)を指示菌とした時、BE110(Sup-)の時より優位な差が見られた。まだ、野生型に認められないNhe Iサイドが存在することから、A2遺伝子にアンバー変異を持ったphageが検出されたことが示唆された。2.1、の実験を踏まえて、A2を欠損したphageを獲得するため、A2遺伝子に存在するFsp IとPme Iサイドを利用して、A2を欠損プラスミドを構築した。同様にA2を供給するプラスミドとしpBADA2を用いた。その結果、プレート法にはphageのparticleを検出されなかったが、RT-PCRでは欠損したphageのゲノムRNAを確認された。対照に、A2を供給しない場合では欠損したphageのゲノムRNAの確認ができませんでした。即ち、A2を欠損したphageを獲得できることが可能であることが示唆された。そこで、増幅させるため、pBADA2を持った大腸菌にphageを再感染させ、濃縮実験を行った。Round8まで実験した結果、初期よりRT-PCRで欠損phageのゲノムRNAの増幅が見られ、Round5では最大の増幅を確認された。考察:相補系を用いてA2欠損phageの獲得することができた。この実験系によって、最小限複製単位の獲得に大きな一歩を前進したと言える。
半閉鎖的で特殊な物理環境をもつ海における動物プランクトンの種多様性と群集構造

研究次年度にあたる本年は、スールー海と隣接するセレベス海、南シナ海で行った動物プランクトンに関する初年度の解析結果の公表、ならびにさらなる解析を実施した。さらに、南大洋に隔離された固有種Salpa thompsoniについての研究結果のとりまとめを行った。詳細は以下のとおりである。成果の公表1.スールー海および周辺海域におけるメソ動物プランクトン(高次分類群)の生物量、昼夜鉛直分布、群集構造に関する結果を比較・議論した論文を作成、Deep-Sea Research II誌へ投稿、受理され、印刷・公表された。2.スールー海および周辺海域におけるヤムシ類の分布、多様性について論じた論文を作成、Costal Marine Science誌へ投稿、受理され、印刷・公表された。3.スールー海および周辺海域におけるメソ動物プランクトン、特にカイアシ類の種多様性と群集構造に関する結果をとりまとめ、2007年5月末に開催される国際シンポジウム「4^<th> International Zooplankton Production Symposium」において講演予定である。継続中の解析1.スールー海および周辺海域におけるメソ動物プランクトンの分析のうち、カイアシ類の種レベルの解析を継続した。その結果、1航海分のすべてのガイアシ類試料について解析を終えることが出来た。南大洋固有動物プランクトン種について、鉛直分布と消化管色素量についての解析を行った。現在、他研究機関と共同で結果をまとめている。試料の採集、ソーティング、種レベルの同定の実施研究初年度にあたる本年は、研究船「白鳳丸」による研究航海時にスールー海と隣接するセレベス海、南シナ海でMOCNESSにより昼夜鉛直区分採集された試料を用いて、動物プランクトンのソーティングをまず12の高次分類群ごとに行った。また、カイアシ類、ヤムシ類など一部分類群に関して種レベルの解析を行った。さらに南大洋に隔離された固有種Salpa thompsoniについても試料の採集を行った。データ解析および成果の公表得られたデータを解析することにより、主として以下のことが明らかになった1.各海域間の水柱内の動物プランクトン全体の生物量の有意差は無かった。中層(400m)以深での比較でも同様に海域間で差が見られなかった。2.各海域間の水柱内の動物プランクトン高次分類群組成の比較を行った結果、スールー海で他の隣接海域よりもカイアシ類、貝形類の割合が高いことがわかった。3.各採集深度層での卓越種、出現種数、多様度の算出、およびそれらの鉛直的な比較し、各採集層間で群集構造がどの程度類似するかを調べるため、平衡性を考慮した類似度指数を用いて各採集層間の類似度マトリックスを作成し、それをもとにクラスター分析を行った。その結果、クラスターは海域間よりも深度によって形成されることがわかった。4.ヤムシ類について種レベルでの現存量、鉛直分布の比較をスールー海、セレベス海で行った。これらの結果は、シンポジウム発表1件、論文2本(うち1本は投稿中)にまとめられた。
農林業センサスの客体情報のリンケージによる高度分析基盤の確立

本研究の目的は、農林業センサスにおける客体情報を用いて、農林業センサスの高度利用に向けた基盤構築を行うことである。本研究の遂行により、以下のことが明らかとなった。(1)農林業センサスの調査票の残存状況の整理では、県によっては2080%の市町村で調査票の残存が確認され、貴重な資料群の存在が明らかとなった。(2)農林業センサスの年度間のデータリンケージでは、1995年から2010年までの4時点のリンケージを実施した結果、4時点すべてで販売農家として存在していた客体は、全体の約45.8%となり、長期のパネルデータの構築が可能なことが明らかとなった。年度間あるいは統計調査間のデータリンケージは、統計調査の高度利用方法の一つとして他省庁の統計調査では実施されてきた。農業統計については、一部に年度間リンケージおよび統計調査間リンケージを実施してきているが、まだ農林水産省内、あるいは農林水産省と他省庁との統計調査とのリンケージでは残されているものがある。本研究では、これらのデータリンケージについて挑戦する。またデータリンケージのうち、同一調査の年度間リンケージは、複数年度の調査原票が残存していれば、詳細な個別情報から遡及が可能となる。神立春樹(1995)が記録しているように、いくつかの資料の残存が確認されることから、本研究では、その残存調査と整理を行い、最新データとの接続も含めた高度利用の可能性を探る。農林業センサスと集落営農実態調査の年度間リンケージを行い、さらにそれらを農業集落で地域間リンケージを行うための可能性について検討を行った。また、資料の残存調査は集落単位での整理を行っていったが、年度によって異なるが、市町村ベースでは28割で残存しており、場合によっては、すべての旧市区町村で残存が確認されたものもみられた。平成27年度では、第一に、農林業センサスの年度間リンケージ、集落営農関連調査の年度間リンケージ、そして農林業センサスと集落営農関連調査との地域間リンケージの検討及びリンケージ実験を行った。第二に、農林水産統計と他省庁との統計調査とのデータリンケージに関する情報収集を行った。第三は、岡山大学所蔵されている過去の調査資料の残存調査・整理を行った。いずれも順調に推移しているが、第三の残存調査、整理に関しては、前倒しをして行った。今年度は、昨年度までの残存資料の旧市区町村や集落単位といった地域整理に加え、直近の2015年農林業センサスとの接続に向けた基礎作業、ならびに既存の2000年から2010年までのパネルデータに1995年客体の追加リンケージを行った。その結果、1995年から2010年のパネルデータの実農家数は約309万戸となった。1995年と2000年においては、自給的農家も含めたリンケージとなっており、全部で15のパターンが存在することが明らかとなり、4時点すべてで販売農家として存在していた客体は、全体の約45.8%という結果が得られた。平成28年度は以下のように研究を進めていく予定である。第一は、農業統計の農水省内もしくは他省庁間とのデータリンケージ実験であり、平成27年度に引き続き、統計調査間のデータリンケージの情報収集と検討を行う。第二に、調査原票からの復元を射程に入れたリンケージの可能性を検討は、前年度の残存調査、整理の結果に基づき、引き続き、同調査。整理を行い、残存状況の詳細把握を行う。農業経済学残存調査の調査、整理の部分で研究上の進展が見られたため、次年度計画を前倒しして研究を進めることへの対応として、前倒し請求をした金額の残余が一部で発生している。また、一部の分担者において、データ整理などの予算に対する執行の遅れが発生したために、次年度の使用額が生じているが、研究代表者や他の研究分担者にて調整ができているため、研究計画全体には影響はない。
陸上植物の雌雄生殖細胞分化を担う鍵メカニズムの解析

本研究では、被子植物における卵をはじめとする配偶体細胞の分化と、配偶体の性分化を担うメカニズムを明らかにするため、1)シロイヌナズナのBNB転写因子ファミリーの一員であるBNLの機能を明らかにし、転写複合体形成について調べ、BNLが雌性生殖細胞分化の鍵因子である可能性を検証する。またゼニゴケとの比較により、BNBファミリーの機能の進化について調べる。2)BNBファミリーの標的・下流遺伝子をゼニゴケとシロイヌナズナで比較し、生殖細胞分化メカニズムの全容と進化について調べる。3)BNBファミリーが配偶体の性分化にどのように関わるかを調べる。
総合商社による穀物バリューチェーンの各領域への参入の規定要因に関する実証的研究

近年、中国等の新興国における穀物輸入の増加や、先進国でのバイオ燃料製造により、国際穀物価格が高騰している。そうした中で、総合商社は価格交渉力を維持するため、生産・流通・販売の各領域に事業投資先を配置する、国際穀物バリューチェーンを形成している。本研究では、こうしたバリューチェーンの領域ごとに、参入の仕方へ影響する要因を調査・検討し、総合商社における穀物バリューチェーン形成に当たってのボトルネックを把握する。その上で、将来の安定した穀物輸入体制の構築について示唆を得る。
サイトメガロウイルス前眼部感染症マネージメントの標準化と戦略的病態解明

眼部サイトメガロウイルス(CMV)感染症を診断するうえで前房水real-time PCR検査は有用な検査である。そこでこの検査の標準化を目的に日本においてCMV real-time PCRを行っている代表的な施設群を対象に、感度、特異度評価を行った。その結果、すべての施設において良好な結果を示した。しかしながら、多施設間の結果を比較統合する場合、international Unit(IU)により標準化した数値を使用することが推奨されることを報告し受理された。臨床サンプルを用いた解析より、CMVは角膜内皮炎や、前部ぶどう膜炎の病型においてはCMV DNA量が、網膜炎型よりすくないことが判明した。中でもCMV内皮炎とぶどう膜炎は共通してCMV DNA量と関連して眼圧があがることがさらに確認された。また、CMV内皮炎の病型では、経過が非常に長く断続的な眼圧上昇と角膜内皮ロスをくりかえし、これらに関連して最終的な視力予後が不良になることが判明した。以上の事実は、CMVが角膜内皮のみならずおそらく線維柱帯に慢性に感染していることを示唆している。そこで、CMVの線維柱帯細胞への感染性を検証した。とくにCMVのTowne株やTB40/E株のいずれもが線維柱帯細胞に感染し、その後効率的に増殖し、成熟ウイルス粒子を放出することを報告し受理された。以上の結果は、難治化する症例においては、まずCMVと線維柱帯細胞との相互作用がきっかけになる可能性を示唆していた。そこで、CMVが線維柱帯細胞に感染していかなる分子応答を誘導するのかをRNA sequencingを用いて検証した。その結果、CMV感染後、角膜内皮と同様強いインターフェロン反応を誘導すること、さらにケモカイン群の誘導より線維柱帯のリモデリングを誘導する可能性が示唆された。前眼部サイトメガロウイルス(CMV)感染症の診断には、前房水のCMV-DNA量測定が必須の検査となっており病状の評価や予後予測にとって重要な役割をもつ。CMVコピー数の絶対値の正確さを評価するためCMV感染に対する前房水Real-time PCRを施行している4施設の協力のもと標準検体の検出レベルを評価した。ROC解析を含めた結果、CMV検出値の変動は、施設間の数値は数倍程度以内にとどまり、標準検体を用いることにより、より正確な標準化が達成できることが判明した。CMVの角膜内皮への感染性及び病原性の評価を不死化ヒト角膜内皮細胞を用いて行った。角膜内皮細胞におけるCMVの増殖、さらに、角膜内皮における重要な免疫原性エピトープの発現を確認した。さらに、CMV及び単純ヘルペスを角膜内皮細胞に感染させたときにえられたトランスクリプトーム解析を行い、細胞死を引き起こしえる経路の候補同定を行った。CMVウイルス感染後において強いI型インターフェロン応答が誘導されることから、これを介した細胞死経路の発動を想定した。次に、この経路の制御に中心的に関わる候補因子としてIRF7を同定した。初代角膜内皮細胞は、その増殖能の低さ及びトランスフェクションなどのマニピュレーションに対する脆弱性からその寄与を正確に検証することは非常に困難であるため、遺伝子編集技術によりIRF7欠損角膜内皮細胞の作成を試みた。まず、IRF7 CRISPRプラスミドをデザインし、不死化ヒト角膜内皮細胞へ導入した。次にクローニングを行い候補細胞株を確立しそのスクリーニング作業を行った。Westernブロット、Real-time PCRを用いてIRF7欠損レベル及びその安定性を評価した。以上によりIRF7欠損角膜内皮細胞株を樹立し、CMV感染後の炎症動態の制御にいかにかかわるかの解析に着手した。これまで、CMV前眼部感染症に関して保険収載の薬剤はない。その治療は、適応外使用に頼っている状態であるが、実際にどういった薬剤をどのように使えば良いのかに関して十分なエビデンスは得られていない。保険収載を視野にいれた治療薬剤の開発をめざすため、ガンシクロビルゲル製剤の臨床評価に関わってきた。角膜内皮細胞におけるCMV感染の動態に関しては、臨床分離株及びTB40/Eが実際に角膜内皮細胞に感染し、増殖しえることを確認したため、角膜内皮炎および眼圧上昇へいかに寄与しえるかの検証を始めた。角膜内皮細胞に関しては、IRF7欠損角膜内皮細胞に樹立に成功した。そこでIRF7にかかわる経路が角膜内皮の免疫応答性にいかに寄与するのかの検証を始めた。IRF7経路がいかにウイルスに対する免疫応答に寄与するのかを検討するため、まず、感染力がより強い単純ヘルペスウイルス(HSV-1)を用いて、解析をすすめつつある。CMVは、中年期以後は半数以上が既感染者となるが、なぜ一部の健康な成人にしか発症しないのか判明していない。我々は、この発症機序には、発症者と非発症者の間にCMV特異的な免疫機構に差があるのではと想定してその解析に着手した。とくにCMV特異的細胞障害性リンパ球に着目し、角膜内皮をいかに障害しえるかの解明をはかりつつある。CMV特異的な細胞障害性反応はCMVタンパク特異的であることが想定されるため候補エピトープのスクリーニングを行い、CMV感染角膜内皮細胞において候補エピトープが強度に発現しえることを確認し、さらなる検証をすすめている。

前年に引き続く症例の蓄積により、眼部サイトメガロウイルス(CMV)感染症を診断するうえで有用な検査あるいは特徴を病型(角膜内皮炎、前部ぶどう膜炎、網膜炎)ごとに検証した。前房水のCMV-DNA量および臨床的特徴を用いて各病型別にReceiver Operating Characteristic解析を行った結果、いずれの病型においても最も診断効率が高いのはCMV DNA定量検査であった。その次に有用であったのは、内皮炎や前部ぶどう膜炎においては再発回数、次に眼圧上昇であることが判明した。さらにCMV DNA量がCMV感染症の病態や予後にいかに関連するかの解析をロジスティック回帰およびコックス比例ハザードモデルを用いて行った。その結果、前房内CMV量は、CMVDNA量は、前眼部タイプの疾患においては、CMV網膜症より有意に少ないこと、さらにCMV内皮炎やCMV前部ぶどう膜炎の診断にあてはまらない新たな疾患カテゴリーとされうる病態があることが判明した。CMV角膜炎は、眼圧上昇が特徴的にみられる。その病態において、線維柱帯が眼圧上昇に関与しえるかを検証するため線維柱帯細胞がCMVに感染しえるかを検証した。その結果、Towne株やTB40/E株を用いて検証した結果、CMVは線維柱帯細胞に感染し効率的に増殖し、成熟ウイルス粒子を放出することを見いだした。さらにCMVの線維柱帯への感染は、これまで眼圧に寄与すると考えられるストレスファイバーの形成や、眼圧上昇に関連するケモカインを刺激することを報告した。以上より、CMV感染による線維柱帯の直接障害およびサイトカインシグナルが眼圧上昇に関連する可能性が示唆された。CMVの感染あるいは潜伏が角膜内皮障害や眼圧上昇へいかに寄与しえるかの検証を引き続きすすめている。まず、角膜内皮傷害の発症機序に関しては、免疫的な抗ウイルス作用の減弱あるいは、過剰な抗ウイルス作用による側副障害の可能性が考えられる。とくにCMVは、初老期以後は多くの成人が既感染となりCD8+リンパ球が主要な抗ウイルスメモリー作用を発揮することが知られている。しかしながら、角膜内皮において、CMV感染をブロックするための標的エピトープはこれまで知られていないため、その探索から開始した。まず、代表的なCMVタンパクがヒト角膜内皮細胞や線維柱帯細胞において発現しえるかを検証し、免疫原性の強いエピトープをもつCMVタンパクであるIE1やpp65を角膜内皮や線維柱帯細胞は強く発現することを確認した。つぎにこれらのウイルスタンパクの抗原エピトープペプチドを探索した。CMV内皮炎は、日本人を含めたアジア系に多いため、アジア系にもっとも多いHLAであるA24を拘束HLAとして選択して検証した。その結果、さらにこれらの代表的なエピトープペプチドを角膜内皮はMHC class I拘束性に提示しえることをみいだした。次に角膜内皮炎およびCMV既感染健常者における抗ウイルス性CD8メモリー細胞の角膜内皮への反応性を検証するため、これらの患者の末梢血よりCD8リンパ球を分離し、感染角膜内皮への反応性を検証しつつある。また、CMV感染後の線維柱帯がいかなる分子応答をするのかを検討するため、ヒト線維柱帯細胞を用いて引き続き解析をすすめている。これまで、開放隅角緑内障患者の前房水の解析からケモカインの一つであるMCP-1が眼圧に関連することを見いだした。
学習障害児を対象とした環境対話法の開発

平成6年度、7年度の「環境対話キャンプ」を通して明らかにされつつある学習障害児援助法、「環境対話法」の骨子は下記のとおりである。学習障害の基本的な考え方を「学習の非効率性」に求める立場から、方法論を「効率的な学習」の援助に置いた。学習を効率的に起こす環境とのかかわり方を「環境対話」のコンセプトでとらえている。こうした観点をふまえ、環境対話法を「身体運動を基点とした環境対話により、学習を意図的・計画的・効率的・安全に引き起こし、心身の発達を促進させる教育臨床的手法」と定義するにいたった。具体的なプログラムとしては、(1)認知・言語(2)リトミック(3)教科指導(4)グループワーク(5)生活指導などであったが、指導者(当キャンプではトレーナーと称す)の理論面でのレクチャーにとどまらず、実際場面を想定したことば、表情、四肢の動きのトレーニングプログラムを事前にセットしたことも有効であった。とくに後者のプログラムでは、学習障害児を引き付け、ていねいでわかりやすい反面、余計な情報をカットした指示・説明の仕方を繰り返しリハーサルした。ある意味では「教育は人」論に立ち戻る立場である。(1)からだのイメージを高める身体運動、(2)整理・整頓・分類(元の状態に戻す)、(3)必要な・望ましい環境刺激は強調し、不必要な・望ましくない環境刺激は除去する(4)自分の利益、他人の利益、共有する利益を区別させる、(5)"与える側"と"もらう側"の立場を区別させる、(6)社会・組織で生活するための手順・手続きをパターン化して教える、などの因子が明確になってきた。下記の日程で「LD児の環境対話キャンプ」を実施した。(1)日程:平成7年3月4日(土)3月5日(日)(2)場所:広島県高田郡吉田町吉田406広島県立吉田少年自然の家本キャンプには7家族(LD児数8名)の参加があり、研修を受けた学生トレーナー9名と岡山県立大学助教授上地雄一郎氏(臨床心理学)の協力をえてプログラムを消化した。プログラム内容は、環境対話法の理論的枠組みのなかで大きく「WISC-R、YG性格検査、親子関係テストなどの心理検査メニュー」「レクリェーション(キックベースボール、うどん作りなど)を介したソーシャルスキル獲得メニュー」「認知・数概念・言語概念などの教科学習メニュー」から構成された。キャンプ中の活動内容はビデオ撮影されており、また心理検査でえられたデータも蓄積された。また4日には上地助教授の進行により、約2時間半の保護者を対象としたグループワークを実施。家庭・地域・学校での実情および将来の不安・希望などが話し合われた。この中で「環境対話法」の説明を行ない、家庭・地域・学校で実践してもらえるように依頼した。この結果は平成7年夏のキャンプで確認する予定である。このキャンプでの結果、および平成7年度分科学研究費をもちいた夏キャンプの結果を踏まえて論文作成にとりかかる予定である。なお、今キャンプで収集した結果は45月に分析予定。科研費対象期間内(2年間)に「環境対話法」の仮説からプログラム化された2回のLD児キャンプを実施し、チェックリスト、各種心理検査、保護者へのインタビューなどから得られた知見を要約する。1効率的な環境情報入力一身の回りの環境情報に気づきやすく、また取り込みやすくするために、情報の精選、分類・整理・少量化、魅力化することに学習効果があった。2パターン化された適応行動の獲得-状況にあった適応行動を獲得させるために、具体的場面での具体的指示を強調するプログラムとしたが、学習効果が認められた。同時に獲得させる内容を少なめにし、繰り返し指示をを与える方法に効果があることが明らかとなった。

3環境の選択-管理された環境、強要された環境、楽しくない環境、刺激の多い環境では、ストレスや不適応の問題が出現しやすので、そうした環境を可能なかぎり排除するとともに、対象児の特性(特に性格)を考慮し、相性の合った援助者を選択した。学習効果は大きいと判断された。4小集団への統合-個別援助を除けば、すべてのキャンププログラムは健常児を含めた総合形式としたが、初期場面では喧嘩や物の取り合いなどのトラブルが発生するものの、最終場面ではそうした傾向が消失しており、社会適応の学習が効果的になされたと判断された。5やすらげる場と人の保障-LD児は他者との共存空間に多大なエネルギーを消費する(緊張度が高まる)ので、対象児によっては個別的な場を確保し、さらに母親か援助者との一対一の空間を保障した。こうしたやすらぎ空間の保障は各プログラムの学習に対する取り組み方を積極的にした。特に対象児にとって好きな援助者ができた場合、指示への従い方が有意に高まった。6トーヌスのリラクセーション-集団場面でトーヌスの緊張度が高まりやすい対象児には、簡単な役割を与えたり、みんなの前に出させるなどの機会を多く与えた。援助者が一緒にいてリ-ドする場面もあったが、多くの対象児は集団に慣れ、トーヌスをリラックスしていった。7課題への誘い込み-各種の課題を拒否する対象児に対しては、課題を少量にする、課題レベルを少なくする、援助者が指示の声のトーンを変える、ほめる・励ますためのことばがけを頻繁に使う、といった技法を用いた。特に援助者の表情・声質は、学習促進に大きな影響力があることが明確になった。結果的に、学校教育の場面では援助者たる教師の成熟や子どもとの相性も効果的な学習の要因になることが推論された。なお、平成8年度からは思春期にいるLD児の「環境対話法」の開発に携わる企画をもっている。
新光検出システム確立で目指す大型ニュートリノ・核子崩壊検出装置の高性能化

ニュートリノ・核子崩壊物理を探る次世代の「ハイパーカミオカンデ」計画を、最良の性能と感度と共に実現するため、開発された新型光電子増倍管の本来の性能を、実際に用いる較正精度と共に明らかにする。より現実的な見積もりのため、ハイパーカミオカンデに用いる新型光電子増倍管を、スーパーカミオカンデの検出器タンク内に取り付けて長期実証・性能保証試験を行い、運用技術を確立することを目指す。また、従来型光電子増倍管に比べ、時間精度が倍に向上している新型光検出器を精密に較正するための高精度較正装置を開発する。本年度は12年ぶりにスーパーカミオカンデ内での作業が可能となり、ハイパーカミオカンデのための開発した高性能光電子増倍管を取り付ける絶好の機会を得た。130本程度を内部に取り付け、また内10本には従来の爆縮連鎖抑止のためのカバーではなく、より低い放射性バックグラウンドを実現する新型のカバー2種を導入した。6月から動作を確認しつつ順次取り付けと接続を行い、11月にはタンクへの注水途中で、内部に光源を入れて光電子増倍管の正常動作を確認できた。スーパーカミオカンデの観測を再開してすぐ、2月には光源からのパルス光を元に、光電子増倍管のゲイン調整と時間較正を行い、想定通りの高い分解能を確認できた。ハイパーカミオカンデに類似した安定環境下で、光電子増倍管のノイズであるダークカウントレートを評価し、これまで得られた中で最も低い6kHz前後を得て、かつ特性のばらつきが少ないことを確認できた。今後1年以上のモニタを続けて、性能の安定性を確認する。今回用いた光源は、放出されるバルス光の時間のばらつきが新型光電子増倍管にとっては無視できない広がりを持つ。時間のばらつきを抑えて一様にパルス光を放射できる光源の検討も行うため、いくつかのパルス光源を試し、新型光電子増倍管の時間特性を評価した。現行の「スーパーカミオカンデ」を一旦停止し、予定通りハイパーカミオカンデに向け開発した新型光検出器を130本程度取り付けられた。また、性能も確かめられ、較正測定も行った。ノイズを低減でき、検出効率を最大限に活かせる、ハイパーカミオカンデ用光検出器カバーを製作し、これらも取り付けることができた。精度向上を目指す較正光源の検討を進めている。今後は、短パルス幅光源を用いて、時間較正と光検出器の入射位置依存検証を行い、これらを考慮したソフトウェアを用意して、検出性能の向上具合を見積もる。光が一様に四方へ放出され、また短いパルスが得られるよう光源の設計と調整を行う。再構成精度の向上と新型光検出器の実用性を立証を目指し、スーパーカミオカンデ内に取り付けた100本以上の新型光電子増倍管を長期で継続評価する。ハイパーカミオカンデ完成までに、改善できる点があれば向上の見込みと方策を示す。

再構成精度の向上と新型光検出器の実用性を立証を目指し、スーパーカミオカンデ内に取り付けた100本以上の新型光電子増倍管を長期で継続評価する。ハイパーカミオカンデ完成までに、改善できる点があれば向上の見込みと方策を示す。光源の候補として考えたLEDの選定が遅れ、光の拡散方法の検討にも遅れが生じた。
舌筋由来幹細胞とbioactive scaffoldを用いた新規骨再生法の開発

舌筋由来Sca-1陽性細胞(MTDSC)よりもヒト歯随幹細胞(hDPSC)を用いてNanog遺伝子発現を増強させた細胞(hDPSCーNanog)の方が、より高い骨分化能を示した。また、気孔性炭酸アパタイトフォーム、ゼラチン炭酸アパタイトフォーム、GC研究用scaffold(GC)ならびにβ-TCP強化型ゼラチンスポンジ(MedGel)と比較して、bFGF徐放型bioactive scaffoldをscaffoldとしてヌードマウス皮下に埋入し、骨分化誘導をかけたhDPSCーNanogを注入した方が、途中で異物として排泄されることなく、最も良好な骨様組織の形成につながった。addgene社からマウスNanog遺伝子発現ベクター(pPyCAG-Nanog-IP)を購入し、トランスフォーメーションを行い、大量培養し精製後、このプラスミドベクターを、リポフェクタミンを用いて、舌筋由来Sca-1陽性細胞(MTDSC)に遺伝子導入し、上記ベクターのSelection markerであるPuromycinを用いてstable cloneを作製した。このトランスフェクタント(MTDSCーNanog)を親株であるMTDSCおよび空ベクターを導入したMTDSCーpuroと細胞増殖能および骨分化能に関して比較検討した。その結果、親株MTDSC、空ベクターを導入したMTDSCーpuro、MTDSCーNanogは増殖能に関しては有意差を認めなかった。しかしながら、MTDSCにおいてはAlizarin red染色およびVon Kossa染色にて観察される石灰化細胞外基質の形成が14日目以降に確認され、空ベクターを導入したMTDSCーpuroにおいても同様に14日目以降に確認できたが、MTDSCーNanogでは10日目以降に石灰化細胞外基質の形成が認められた。なお気孔性炭酸アパタイトフォームの試作品も作製できた。マウス由来細胞を用いた骨再生とともにヒト細胞を用いた骨再生を目指し、addgene社からヒトNanog遺伝子発現ベクター(pCDNA3.1-Nanog)を購入し、トランスフォーメーションを行い、大量培養し精製後、このプラスミドベクターを、リポフェクタミンを用いて、ヒト歯随幹細胞(hDPSC)[Lonza PT-5025]に遺伝子導入し、上記ベクターのSelection markerであるHygromycinを用いてstable cloneを作製した。このトランスフェクタント(hDPSCーNanog)を親株であるhDPSCおよび空ベクターを導入したhDPSCーhygと細胞増殖能および骨分化能に関して比較検討した。その結果、親株hDPSC、空ベクターを導入したhDPSCーhyg、hDPSCーNanogは14日目までの増殖能に関しては有意差を認めなかった。しかしながら、骨分化誘導培地を用いて培養を行ったところ、hDPSCにおいてはAlizarin red染色およびVon Kossa染色にて観察される石灰化細胞外基質の形成は14日目以降に確認され、空ベクターを導入したhDPSCーhygにおいても同様に14日目以降に確認できたが、hDPSCーNanogでは8日目以降に石灰化細胞外基質の形成が認められた。前年度マウスNanog遺伝子発現ベクターを舌筋由来Sca-1陽性細胞(MTDSC)に遺伝子導入して得たMTDSCーNanogでは10日目以降に石灰化細胞外基質の形成が認められたことから、今回のヒトNanog遺伝子発現ベクターをヒト歯随幹細胞(hDPSC)に導入して得られたhDPSCーNanogが骨再生により有用と考えられた。Nanog遺伝子発現ベクター(pCDNA3.1-Nanog)を用いて、ヒト歯随幹細胞(hDPSC)[Lonza PT-5025]に遺伝子導入し、stable cloneを作製できており、親株や空ベクター導入株と細胞増殖能および骨分化能が比較検討できており、この点は順調である。ただし作製した炭酸アパタイトフォームは、ヌードマウスに移植しても3ヶ月を越える時点で異物として排出されることが観察されたため、bioactive scaffoldに関して更なる検討が必要であるので、やや遅れていると考えている。前年度に作製した気孔性炭酸アパタイトフォームは、異物として排泄されてしまったため、新たなscaffoldとしてGC研究用scaffoldブロックおよびメドジェル生理活性物質徐放剤MedGelを用いて、ヒトNanog遺伝子発現ベクターをヒト歯随幹細胞(hDPSC)に導入して得られたhDPSCーNanogと、コントロールとして空ベクターを導入したhDPSCーhygとともに、骨分化培地を用いて培養した後に、ヌードマウス大腿骨相当部皮下に埋入した。埋入後3ヶ月まで、異物として排泄されることは無かった。埋入部を切除して、ホルマリン固定後、パラフィンブロックを作製し、薄切切片を用いてHE染色を行った所、MedGelをscaffoldとして用いた方が、GC研究用scaffoldブロックをscaffoldとして用いた場合より、良好な骨様組織が観察された。次にFGF2(1μg)をMedGelに滴下し、4°Cで一晩含浸させて、同様にhDPSCーNanog、hDPSCーhygそれぞれとともにヌードマウス大腿骨相当部皮下に埋入したところ、MedGel単独をscaffoldとして用いた場合と比較して、FGF2を含浸させたMedGelを用いた方が、さらに良好な骨様組織が観察された。MedGelのハイドロゲルからFGF2が徐放されることで、hDPSCーNanogからの骨分化誘導が促進されたことが示唆された。

現在BMP2(1ー5μg)をMedGelに滴下し、4°Cで一晩含浸させて、同様にhDPSCーNanog、hDPSCーhygそれぞれとともにヌードマウス大腿骨相当部皮下に埋入し,BMP2徐放によるhDPSCーNanogの骨分化誘導能を検討中である。舌筋由来Sca-1陽性細胞(MTDSC)よりもヒト歯随幹細胞(hDPSC)を用いてNanog遺伝子発現を増強させた細胞(hDPSCーNanog)の方が、より高い骨分化能を示した。また、気孔性炭酸アパタイトフォーム、ゼラチン炭酸アパタイトフォーム、GC研究用scaffold(GC)ならびにβ-TCP強化型ゼラチンスポンジ(MedGel)と比較して、bFGF徐放型bioactive scaffoldをscaffoldとしてヌードマウス皮下に埋入し、骨分化誘導をかけたhDPSCーNanogを注入した方が、途中で異物として排泄されることなく、最も良好な骨様組織の形成につながった。気孔性炭酸アパタイトフォームの試作品を用いて、ゼラチンハイドロゲル膜の2層構造(外側は3ヶ月程度の分解性と強度を有し,内側は2週間程度の薬剤の徐放性を有する)で覆った3次元構造を有するbioactive scaffold(ゼラチン炭酸アパタイトフォーム)の作製を進める予定である。この進行状況にもよるが、次にゼラチンハイドロゲル膜の内層からbFGFの徐放が可能な3次元構造を有するbioactive scaffold(bFGF炭酸アパタイトフォーム)の作製を進める予定である。今後は、ネオボーン(クアーズテック)、アパタイトペレット(PENTAX)、コンボラス(タキロン)などの既製品やPuraMatrix(3D-Matrix-Japan)、コラーゲン/PLGA/BMP4複合多孔質足場材料(独立行政法人物質・材料研究機構国際ナノアーキテクトニクス研究拠点生体組織再生材料ユニット)などの開発直後の既存品を入手可能な範囲で準備し、主にin vivoの系で骨再生能を評価し、それぞれの利点を解析して、新たなbioactive scaffoldの開発を進めたいと考えている。外科系歯学Nonogを発現するStable cloneを得るために時間がかかったために、Stable cloneと空ベクター導入株ならびに親株における骨分化マーカーの発現の検索が残ったために、物品費の使用の一部を次年度に回し、Western blot.に必要なゲルや試薬の購入に当てる考えである。平成28年度はヒト歯随幹細胞を用いた骨再生医療の検討を行い、Nanog遺伝子導入による骨分化の促進を図っていたため、bioactive scaffoldの開発がやや遅れてしまった。このため平成29年度にネオボーン(クアーズテック)、アパタイトペレット(PENTAX)、コンボラス(タキロン)などの既製品やPuraMatrix(3D-Matrix-Japan)、コラーゲン/PLGA/BMP4複合多孔質足場材料(独立行政法人物質・材料研究機構国際ナノアーキテクトニクス研究拠点生体組織再生材料ユニット)などの開発直後の既存品を入手可能な範囲で準備する予定であり、それらを購入するために、平成29年度に研究資金をまわす必要があったため。
臨床病理・遺伝子発現からみた大腸癌の組織発生、浸潤・転移に関する研究

大腸癌の組織発生,発育・進展に関する検討:ポリ-プ型及び表面型早期癌及び進行癌症例におけるKi-67からみた細胞増殖態度,apoptosis,MUC-1ムチン,pS2蛋白の発現を検討したところ,1. Ki-67標識率はポリ-プ型早期癌に比べ表面型早期癌で有意に高値であった。逆にapoptosisはポリ-プ型早期癌が表面型早期癌に比べ有意に高値であり,各々の増殖態度が異なる事が明らかになった。2. MUC-1ムチンは癌で高率に発現し,腺腫ではほとんど発現しなかった。このことからMUC-1ムチンは腺腫の癌化に関与していると考えられ,また大腸癌と腺腫の鑑別指標の1つになりうる可能性が示唆された。さらに,sm癌・進行癌ではMUC-1ムチン発現が転移能・予後に密接な関連を示し,内視鏡治療の適応決定や予後推定に有用な因子である事が明らかになった。3. pS2蛋白は,癌及び過形成病変が腺腫に比して有意に高頻度であった。また,ポリ-プ型,腫瘍径が大きいもの,右側結腸病変,腺腫併存病変で有意に発現率が高く,癌の組織発生との関連が示唆され,今後他の因子との関係を検索する事が必要である。内視鏡切除遺残大腸癌の悪性度変化に関する検討:ヌードマウス移植大腸癌における高周波電流刺激の影響を検討したところ,1. Ki-67標識率の検討から,高周波電流刺激大腸腫瘍はより高い増殖能を獲得する事が明らかになった。2.腫瘍によっては,刺激前と比べEGF-receptor, TGF-aの発現増強が見られた。しかし,VEGF, bFGF, Type VI collagenaseの発現増強は見られなかった。以上,内視鏡切除遺残大腸癌の一部のものは,治療の影響により高い増殖能を獲得する事が明かになった。1.大腸癌の組織発生,発育、進展の病態を明かにする目的で,ポリ-プ型および表面型早期癌におけるKi-67からみた細胞増殖態度,apoptosis, p53蛋白・bcl-2蛋白の発現,さらにMUC-1 mucin, TGF-α蛋白の発現に関して検討し,以下の結果を得た。1) Ki-67標識率はポリ-プ型早期癌に比べ表面型早期癌で有意に高値であった。一方,逆にapoptosisはポリ-プ型早期癌が表面型早期癌に比べ有意に高頻度で発現しており,ポリ-プ型早期癌と表面型早期癌は増殖態度が異なる事が明らかになった。なお,p53蛋白・bcl-2蛋白の発現と早期癌肉眼型との間には関連はなく,組織発生(de novoあるいはadenoma-carcinoma-sequence)別でも各物質の発現に差はなかった。2)癌関連抗原の1つであるMUC-1 mucinの発現に関して検討したところ,癌で極めて高率に発現し,腺腫ではほとんど発現しなかった。このことからMUC-1 mucinは腺腫の癌化に何らかの関与をしていると考えられ,また大腸癌と腺腫の鑑別指標の1つになりうる可能性が示唆された。3) Ki-67標識率,TGF-α発現の検討から,高周波電流で刺激を受けた内視鏡切除遺残大腸腫瘍はより高い増殖能を獲得する事が明らかになった。この結果に関しては,ヌードマウス移植腫瘍を用いてさらに基礎的な検討が進行中である。2.大腸癌の浸潤・転移機序に関する検討では,sm癌・進行癌ともに浸潤先進部におけるMUG-1 mucin発現が転移能・予後に密接な関連がある事が明らかになった。

3.以上の結果に関して腫瘍内組織多様性を考慮するため,臨床材料の収集と平行してin situ hybridazationによる検討を行う予定である。大腸癌の組織発生,発育・進展に関する検討:ポリ-プ型及び表面型粘膜内癌におけるpS2蛋白の発現を免疫組織学的に検討した結果,癌及び過形成病変が腺腫に比して有意に高頻度であった。また,ポリ-プ型は表面型よりも,腫瘍径が大きいものは小さいものよりも,右側結腸病変は左側結腸病変よりも,腺腫併存病変は腺腫非合併病変よりも有意にpS2蛋白の発現率が高く,pS2蛋白発現と癌の組織発生との関連が示唆され,今後は浸潤・転移との関連や他の因子との相互関係を検索する事が必要である。内視鏡切除遺残大腸癌の悪性度変化に関する検討:ヌードマウス移植大腸癌における高周波電流刺激の影響を検討したところ,Ki-67標識率からみた癌細胞増殖活性の上昇に伴い,腫瘍によっては,刺激前と比べEGF-receptor,TGF-αの発現増強が見られた。しかし,VEGF,bFGF,Type VI collagenaseの発現増強は見られなかった。以上のことから,内視鏡切除遺残大腸癌の一部のものは,治療の影響により高い増殖能を獲得する事が明かになった。しかし,浸潤・転移関連因子との関連は見いだせなかった。
走査トンネル顕微鏡による有機分子(核酸塩基)超構造の創成

(1)分子系超構造を形成する素構造としてDNAの基本要素である核酸塩基分子を選定し、これらの固体表面における吸着状態をSTM像により観察した。これらのSTM観察結果により、核酸塩基分子は種々の表面(SrTiO_3(100),(110)、Si(100)2×1、Pd(100)、Cu(111))上において孤立吸着分子像による分子の判別、また分子による2次元自己組織化が可能であることを明らかにした。これらの実験結果は超高真空下、室温において得られたものであり、素構造(分子)と表面、分子間の相互作用を様々に変化させ、配列制御することを目的に、低温、溶液中といった条件下での分子超構造のSTM観察を行った。これにより、超構造形成における分子と表面、また分子同士の相互作用を種々の条件下で明らかにした。(2)実験のみならず計算科学による理論的な分子-表面相互作用の評価を行った。分子軌道法による分子-表面吸着シミュレーションを行い、吸着分子の分子軌道を導いた。これを(1)によって得られた分子吸着表面の電子状態密度分布と比較し、STMによって得られた結果の正確な解釈、「素構造」分子の配列としての超分子構造、吸着サイト、吸着のエネルギー的評価等の分子吸着現象を明らかにした。
金属ナノ粒子集合体の電子状態-孤立粒子からフラクタル状、樹枝状、粒子単結晶へ

サイズと形状の揃ったナノ粒子を一個の原子と見なして新しい人工格子を作成することが近年、次世代のナノテクノロジーの鍵となる基礎技術として注目を集めている。我々の研究室でも水溶性のチオール修飾子とした金、銀ナノ粒子を作成し、これを操作ユニットとする各種の集積体の作成に成功した。更にナノ粒子をランダムにパッキングさせた球状の集積体、また高温下で結晶化させる事による樹枝状の結晶も得られた。将来の広範な応用を考えて、この粒子を油溶性に変化させるためTOAB, CTAB等の界面活性剤を更にチオール修飾子の周りに修飾し三重構造のナノ粒子を構成する事を今年度の目標とし、それに成功した。更にこれらから成る粒子結晶を作製し、ナノメートルの周期構造を持つ量子ドット結晶の電子構造を分光学的な手法で研究している。各種のナノ粒子集積体を作成するとの観点から水溶性CuIナノ粒子の新しい合成法を二種類開発し論文誌に発表した。作成した粒子のサイズを分別するために各種の方法を検討し、ナノ粒子の相間移動の分別効果を利用し、銀ナノ粒子を標準試料として(鋭い表面プラズモンピークが分別の良いマーカーとなる)、系統的に有機溶媒を変化させ電子顕微鏡によるサイズ分布の測定とあわせ、この方法が有用であることを示した。また次に述べるように収量は小さいが電気泳動法による精密な分別法を適用して粒子結晶の作成を行った。量子結晶を作成するためには粒子のサイズを精密に揃える必要があり、そのため粒子をポリアクリルアミドゲル電気泳動法によりサイズ分別をし、それを出発原料に用いて、気液界面での粒子結晶の連続的な電子顕微鏡測定を行い、その成長メカニズムを検討した。我々は最近ナノ粒子一個を原子と見なして、これを操作ユニットとする各種の人工構造物の作成に成功した。これまで報告されてきた多くの金属ナノ粒子の中で金と銀を取り上げ、ナノ粒子の集積過程での集合体の電子状態変化を連続的に追跡し、新しい物性を見いだすことを目的とする。理論との比較のし易い、プラズモン吸収の顕著な金、銀ナノ粒子を対象として粒子結晶を作製し、超格子形成における特徴的な電子状態の発現を目指す。平成16年度においてはYang博士に我々の開発した水溶性のナノ粒子の作成法を勉強してもらった。特に二カルボン酸チオールであるメルカプトコハク酸の取り扱いに習熟してもらい、それを用いて水溶性CuIナノ粒子の簡単な大量生産に成功した。現在FTIRやっxXRDナノの基礎的なデータをとっている段階である。また銀ナノ粒子の製造も着手しており、電気泳動法によりナノ粒子の魔法数による分別という魅力的なテーマを展開しつつある。来日して未だ5ヶ月未満のため発表論文はないが、すでに予備的に行った実験がうまくいっているので、レター誌へ投稿するため論文執筆中である。その後本格的な実験に取りかかる予定である。
双生児のゲノム・エピゲノム比較解析に基づく先天異常の環境要因遺伝子に関する研究

先天異常である唇顎口蓋裂の一卵性双生児(裂児・非裂児ペア)を対象にゲノム・エピゲノムの網羅的解析を行い、双子間でのDNAメチル化発現の差異の有無・領域の同定、双子間の障害差異要因を探求することで唇顎口蓋裂の発生原因探索を行った。ゲノムDNAメチル化領域の濃縮シーケンス解析、メチル化DNA領域をMethylated DNA Binding Domein (MBD)を用いて濃縮後、次世代DNAシーケンサー(Hiseq 2500)にて全ゲノム配列解析を行った。Edge R検定の結果、口蓋裂罹患者側に特異的なPromoter領域/非Promoter領域における共通した高/低メチル化領域が同定された。本研究では、矯正歯科臨床で多くみられる唇顎口蓋裂や第一・第二鰓弓症候群などの先天異常の一卵性双生児(罹患児・非罹患児のペア)例を対象にゲノム・エピゲノムの網羅的な解析を行い、双子間でのCNV発現量やDNAのメチル化の差異領域を特定し、この影響で発現差異を認める遺伝子、すなわち双子間の障害差異要因の候補遺伝子の同定を行い、先天異常の原因探索を行うことを目的としている。その後、CNV一卵性児間比較を行った結果、個々の一卵性双生児(三生児)口唇口蓋裂罹患児に、非罹患児にない特徴が若干みられた。ゲノムやエピゲノムの配列やパターンは、受精後や組織分化終了後は変化しないと考えられてきた。しかし近年、コピー数多型(CNV)とよばれるゲノム領域やDNAのメチル化に代表されるエピゲノムが一卵性双生児間で異なることが報告され、本研究の口唇口蓋裂罹患/非罹患双生児(三生児)においても若干の差異がみられ、現在まで未知であった領域の実際が解明される一助となったと考えられる。唇顎口蓋裂や第一・第二鰓弓症候群などの先天異常の一卵性双生児(罹患児・非罹患児のペア)例を対象にゲノム・エピゲノムの網羅的な解析を行うことにより、双生児間のコピー数(CNV)多型やDNAのメチル化の差異領域を特定し、この影響で発現差異を認める遺伝子、すなわち双生児間の障害差異要因の候補遺伝子の同定を行い、先天異常の原因探索を行うことを主旨としている。この主旨のもと、昭和大学ゲノム・遺伝子解析倫理審査委員会に申請し、審査・承認を得た。その後、昭和大学歯科病院矯正歯科,昭和大学病院形成外科および小児科を受診・治療希望した唇顎口蓋裂などの先天異常のある患者のうち、当該患者と対照となる児(非罹患児)を有する一卵性双生児のペアにおいて、主任研究者から当研究の主旨を説明し、患者・非罹患児および保護者が理解した上で三者の同意書を書面で得た。次のステップの卵性診断に必要な検査項目の確認し、当該一卵性双生児らから同意を得、卵性診断に必要な患者資料(頬粘膜を特殊な綿棒でこすった粘膜片)採得を終了している。更に次のステップである、資料(採血)採得場所・日時設定を検討しており、双生児間差異を呈するCNV領域の同定実験,メチル化差異領域の同定,関連遺伝子近傍のCNVの選定,関連メチル化差異遺伝子の選定,遺伝子のエピゲノム(DNAメチル化)制御の詳細確認,選定された遺伝子の双生児間の発現差異の証明の解析法と順序の詳細を再検討している。矯正歯科治療を要する先天異常のうち、唇顎口蓋裂の一卵性双生児(裂児・非裂児ペア)を対象にゲノム・エピゲノムの網羅的解析を行い、双子間でのCNVやDNAメチル化発現の差異の有無・領域の特定、さらにはこの発現差異を認める遺伝子、すなわち双子間の障害差異要因を探求することで、唇顎口蓋裂の発生原因探索を行っている。昨年度、卵性診断を行い一卵性双生児であることを確認し、電気泳動による方法およびQーDNA定量による方法により、検体の品質評価を行った。その後、全ゲノムSNPジェノタイピングを行い、SNPおよびCNVコピー数の異常(欠失、Copy-neutral LOH、増幅)を口蓋裂の原因遺伝子といわれている既知のものについて検出・解析を行った。同結果を一卵性双生児間比較を行った結果、唇顎口蓋裂児に、非罹患児にない特徴が若干みられた。本年度は同結果を詳細に解析した結果、有意差を示すことはできないとの結果を得た。そのため、今後は解析対象を基地既知のものだけでなく網羅的い行うことで、新たな遺伝子へのアプローチを行う予定である。さらに、両児ともに唇顎口蓋裂である一卵性双生児を対象に加え、一卵性で同じ口蓋裂という発現形を持っている中で同解析を行い、罹患同士の中でもCNVコピー数の差等、傾向の有無の存在について検討したいと考えている。まずは新たに参加していただく患児とその保護者への説明を行い、同意を得たうえで、卵性診断を行う準備を行った。矯正歯科治療を要する先天異常のうち、唇顎口蓋裂の一卵性双生児(裂児・非裂児ペア)を対象にゲノム・エピゲノムの網羅的解析を行い、双子間でのDNAメチル化発現の差異の有無・領域の同定、さらにはこの発現差異を認める遺伝子、すなわち双子間の障害差異要因を探求することで、唇顎口蓋裂の発生原因探索を行っている。