hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
穿通しない根管の形態と、その対応法について

根管治療において根尖孔の穿通を妨げる原因は,主に根管の狭窄または根管の湾曲である.本研究では電気的根管長測定器を用いた根尖部形態の診断の可能性を検討した.ヒト健全抜去歯771歯の歯冠を削除後,根管内に6%NaClO溶液を満たした状態で,#1 ProFile Series 29(DENTSPLY TULSA, USA)を用いて穿通を確認した.根尖孔にファイル先端が確認できなかったものを非穿通根管とした.これらの根管の根管内に6%NaClO溶液を満たし,ファイル停止位置での根管のインピーダンス(測定周波数0.4kHz, 8kHz)およびRoot ZX(モリタ,大阪)のメーター値を測定した.さらに同じ位置でファイルを固定して撮影したContact-Micro-Radiographyに基づいて,ファイル停止位置までの距離とインピーダンスおよびメーター値について比較検討した.非穿通根管数は,1416根管中70根管であった.このうちファイル先端が根尖から3mm以内で,根尖部が狭窄している群は23根管,狭窄していない群は28根管であった.インピーダンスの比は二つの群で有意差が認められた(P<0.05).またRoot ZXのメーター値が3よりも振れなかった根管は,狭窄群では69.6%(16/23根管)非狭窄群では25%(7/28根管)で有意差が認められた(P<0.05).ファイル先端が根尖から3mm以内に位置しており,Root ZXのメーター値が3まで振れない場合は,穿通を妨げている原因が根管の狭窄である可能性が高いことが示唆された.根管治療において根尖孔の穿通を妨げる原因は,主に根管の狭窄または根管の湾曲である.本研究では電気的根管長測定器を用いた根尖部形態の診断の可能性を検討した.ヒト健全抜去歯771歯の歯冠を削除後,根管内に6%NaClO溶液を満たした状態で,#1ProFile Series 29(DENTSPLY TULSA, USA)を用いて穿通を確認した.根尖孔にファイル先端が確認できなかったものを非穿通根管とした.これらの根管の根管内に6%NaClO溶液を満たし,ファイル停止位置での根管のインピーダンス(測定周波数0.4kHz, 8kHz)およびRoot ZX(モリタ,大阪)のメーター値を測定した.さらに同じ位置でファイルを固定して撮影したContact-Micro-Radiographyに基づいて,ファイル停止位置までの距離とインピーダンスおよびメーター値について比較検討した.非穿通根管数は,1416根管中70根管であった.このうちファイル先端が根尖から3mm以内で,根尖部が狭窄している群は23根管,狭窄していない群は28根管であった.インピーダンスの比は二つの群で有意差が認められた(p<0.05).またRoot ZXのメーター値が3よりも振れなかった根管は,狭窄群では69.6%(16/23根管)非狭窄群では25%(7/28根管)で有意差が認められた(p<0.05).ファイル先端が根尖から3mm以内に位置しており,Root ZXのメーター値が3まで振れない場合は,穿通を妨げている原因が根管の狭窄である可能性が高いことが示唆された.根管治療において根尖孔の穿通を妨げる原因は,主に根管の狭窄または根管の湾曲である.本研究では電気的根管長測定器を用いた根尖部形態の診断の可能性を検討した.ヒト健全抜去歯771歯の歯冠を削除後,根管内に6%NaClO溶液を満たした状態で,#1 ProFile Series 29(DENTSPLY TULSA, USA)を用いて穿通を確認した.根尖孔にファイル先端が確認できなかったものを非穿通根管とした.これらの根管の根管内に6%NaClO溶液を満たし,ファイル停止位置での根管のインピーダンス(測定周波数0.4kHz, 8kHz)およびRoot ZX(モリタ,大阪)のメーター値を測定した.さらに同じ位置でファイルを固定して撮影したContact-Micro-Radiographyに基づいて,ファイル停止位置までの距離とインピーダンスおよびメーター値について比較検討した.非穿通根管数は,1416根管中70根管であった.このうちファイル先端が根尖から3mm以内で,根尖部が狭窄している群は23根管,狭窄していない群は28根管であった.インピーダンスの比は二つの群で有意差が認められた(P<0.05).またRoot ZXのメーター値が3よりも振れなかった根管は,狭窄群では69.6%(16/23根管)非狭窄群では25%(7/28根管)で有意差が認められた(P<0.05).ファイル先端が根尖から3mm以内に位置しており,Root ZXのメーター値が3まで振れない場合は,穿通を妨げている原因が根管の狭窄である可能性が高いことが示唆された.
高速対応型快削鋼の切削におけるセラミック工具の工具摩耗抑制手法の確立

旋削加工においてBN添加鋼を被削材とすることで普通鋼と比べて大幅に長い工具寿命を得ることが出来た.特にTiC添加アルミナセラミックが優れた切削性能を示し工具寿命基準を逃げ面摩耗が0.3mmとしたときおよそ10時間の工具寿命を得ることが出来た.正面フライス切削においてもTiC添加アルミナセラミック工具を用いれば,切込みを小さく抑えて加工すればある程度の時間,加工の継続が可能であることが分かった.窒化チタンアルミナセラミック工具の断続切削における切削性能を調べるために,マシニングセンタを用いた正面フライス加工による切削実験を実施した.機械構造用炭素鋼S45CとBN添加鋼を被削材として鋼材へのBN添加が工具寿命,工具刃先温度および仕上げ面粗さにおよぼす影響について調べた.なお,ここで示す切削時間は空転時を含めた見かけ上の切削時間である.以下に得られた結果の概要を示す.なお,カッタ直径100mm,被削材幅60mm,切削速度V=250m/min,送り=0.15mm/toothである.切り込みdが0.3mmと小さくとりBN添加鋼を切削すると,S45Cと比べて長い工具寿命を得ることができるが,切り込みを0.6mmまで大きくするとBN添加鋼の方がS45Cよりも工具摩耗が早く進行し,S45Cでは確認されなったクレータ摩耗が発生した.切り込みが0.3mmと小さくとりBN添加鋼を切削すると,工具刃先にほとんどチッピングが発生しなかったが,S45Cではチッピングが見られた.切り込みを0.6mmまで大きくするBN添加鋼切削においてもS45Cと同様にチッピングが発生することが分かった.BN添加鋼切削時の工具刃先温度は,S45Cと比べると低い傾向にあった.また,切削速度V,送りf,切り込みdの中で切削速度Vが工具刃先温度に与える影響が最も大きかった.仕上げ面粗さは,切り込みが小さいときBN添加鋼を切削すると,S45Cと比べてわずかではあるがが小さかった.一方で,切り込みが大きいときBN添加鋼の方がS45Cよりも仕上げ面粗さが大きかった.以上のことから被削材の凝着がチッピングを引き起こしそこへ凝着した被削材が空転時に酸化され工具と反応をおこす一連のサイクルにより工具摩耗が進行させ,加工時の温度によりその摩耗進行の程度が変化することが考えられる.旋削加工においてBN添加鋼を被削材とすることで普通鋼と比べて大幅に長い工具寿命を得ることが出来た.特にTiC添加アルミナセラミックが優れた切削性能を示し工具寿命基準を逃げ面摩耗が0.3mmとしたときおよそ10時間の工具寿命を得ることが出来た.正面フライス切削においてもTiC添加アルミナセラミック工具を用いれば,切込みを小さく抑えて加工すればある程度の時間,加工の継続が可能であることが分かった.本研究では,高速旋削時に優れた被削性を示すBN添加鋼への適用性を評価した.BN添加鋼は高速旋削時において工具に窒化物系の保護膜が形成され,最適な工具材種を選択すれば工具寿命が格段に延長できることが知られている.今回は工具の摩耗特性について調査を行った.2種類のセラミック工具の工具寿命は,VB=0.2mmとするとS45C切削時は10-20min程度であったが,BN添加鋼を切削すると純Al2O3セラミック工具が40min,TiC- Al2O3セラミック工具が300minと大幅に延長された.TiC- Al2O3セラミック工具による切削では摩耗の進行速度はほとんど変化せず,VBmax=0.3mmまで切削しても安定した切削が可能で600minの切削ができた.S45Cを切削したいずれのセラミック工具の摩耗面にも粒子の脱落によって形成されたと考えられる明確な溝状の擦過痕が見られる.一方BN添加鋼切削時において,いずれの工具摩耗面にも付着物が確認できる.純Al2O3セラミック工具の摩耗面は部分的に付着物に覆われている.また,TiC- Al2O3セラミック工具の摩耗面はほぼ全面にわたって付着物に覆われていた.触針式3次元粗さ計により測定したすくい面の詳細な幾何学形状から,純Al2O3セラミック工具,TiC- Al2O3セラミック工具ともにS45C切削時は摩耗が進行しているが,BN添加鋼切削時にはどちらの工具も摩耗はほとんど進行せず,表面に付着物が確認できた.また,TiC- Al2O3セラミック工具でBN添加鋼を切削したときの方がその堆積物の量が多いことがわかった.この付着物はAlNを含有する窒化物系保護膜であることが考えられ,工具と被削材間の反応を抑制する保護膜として働き,粒子の脱落などを抑えることで工具摩耗の進行が抑制されたと考えられる.23年度は,標準的な機械構造用炭素鋼とそれをベースとした快削鋼の切削試験において工具摩耗試験を行ない,連続切削である旋削加工における工具寿命の目標としていた600minを達成できる被削材とセラミック工具材種の組み合わせをを明らかにすることができ,機械構造用炭素鋼をセラミック工具で効率よく加工できる可能性を明らかにしたたため.また,工具摩耗面の観察から工具寿命が短時間となるときと長時間となるときの違いを明らかに出来たため.これらの理由から研究はおおむね順調に進展していると判断した.24年度は,旋削加工における切削温度や切削抵抗の測定,仕上げ面品位の評価とともに断続切削である正面フライス切削における適応性を評価する予定としている.

断続切削では,漸進的よりチッピングなどの突発的な摩耗が工具寿命を作用することから,切れ刃長さに占める突発的な摩耗の割合を評価指標としてセラミック工具の機械構造用炭素鋼のフライス切削における適用性を評価することにしている.また,工具寿命の違いにより工具摩耗形態にどのような違いが見られるか観察を行うとともに,断続切削では加工雰囲気も工具摩耗に大きく影響するためこれらのことを考慮して工具摩耗の原因を推測し,工具寿命を延長させる手法を提案する.研究費は,国際会議や国内で開催される学術講演会でのこれまで得られた研究成果の発表や関連する研究者との情報交換のために必要な旅費や大会参加費,欧文誌投稿のための校閲費用およびさらに断続切削において切削試験を実施するために必要な消耗品や旋削加工におけるセラミック工具の摩耗をさらに詳細な観察を行うために必要なサンプルの準備に必要な消耗品の購入に充てる予定としている.
プログラマブルデバイスとマイコンの協調制御による組込みシステム設計支援環境の構築

研究目的:プログラマブルデバイスやマイコンは、自動車をはじめとして組込みシステムに搭載されている基本的デバイスであるが、技術者の育成が社会的に要求されているにも関わらず技術的な知識を獲得する機会が少ない。そこで、本研究では学生が容易に組込みシステムに搭載されているデバイスの学習およびその応用システムを構築することができる実験環境を整備することを目的とした。研究実施計画:1.マイコン実習として、LEDを点灯させる、赤外線センサーを用いて距離を測定し液晶画面に結果を表示させる、ある条件でモータを正回転および逆回転させるような駆動回路を製作するなどのデモンストレーションを多数準備した。プログラマブルデバイスに関しては、LEDを点灯させる、加算回路を作りLEDに表示させる、電子掲示板で文字を表示させる、PCとの通信(有線、無線)を行うなど段階を踏んで複雑な回路設計までできるように実験プログラムを構築した。2.マイコンと周辺回路の設計および動作させるための統合環境の使用方法やプログラミング手法を習得するため、あるいは論理回路の設計手法、ハードウェア記述言語による設計法、FPGAで動作させるための基本操作など容易に理解させるための説明資料やマニュアルを作成した。3.プログラマブルデバイスとマイコンそれぞれの特徴を把握し、両者の利点を活かしつつ協調できる制御回路を検討しシステムを構築することができた。例として人間の動きに応じて自動追尾する車をアナログ入出力や数値演算が容易なマイコンおよび並列処理と論理演算が得意なプログラマブルデバイスとを融合しシステム設計・製作するとともに動作実験も行い、正常に動作することを確認した。研究成果:今回、最初にプログラマブルデバイスあるいはマイコンで制御することができるドットマトリクスLEDを用いた電子掲示板を製作し、どちらのデバイスがどのような特徴を有しているのかを明確に説明できることを目的にシステムを構成し、設計容易性、ハードウェア量、表示文字の変換など、いろいろな面での比較を行うことができた。これによりアナログ入出力や数値演算が得意なマイコン、並列計算が得意なFPGAの特徴を目で見える形で学習・理解することができるようなシステムを構成できた。また、上記したように超音波センサーを用いて人間を自動追尾するシステムを考え、マイコン単独での制御を行うとともに並列計算(並列制御)が可能な論理回路部分はFPGAに置き換え、其々のデバイスの特徴を活かして協調制御を可能とし、教育用のシステムとして活用できる見通しを得た。この協調制御システムでは、システムの効率化、処理の高速性などを学習するためにも極めて効果的であるとともに、様々な分野での応用ができると思われ通信システム、ロボットシステムあるいはハードウェアのアルゴリズム考案などの学習に役立つものと考えられる。さらに、異なったデバイスを用いて同じ制御を実行させることで過酷な環境で使用されるシステムの高信頼化ということも考えられ、協調制御システム以外にも発展できると考えている。
肺癌ゲノム異常の解析とその臨床応用に関する研究

癌の発生進展に関与する全ゲノム網羅的なゲノムDNAコピー数異常、遺伝子プロモーターメチル化異常を解析し、相互関係を統計的に解明することにより、患者の治療や管理のために有用な情報を得るための分子遺伝学的検査法の開発を目的とした。末梢型腺癌80例以上の解析を予定していたが、研究の遂行が遅延したため現在までに約30例の解析が終了している。今後とも研究目的を達成すべく研究を継続する予定である。本研究課題の研究助成決定が平成22年度後期となったため、研究始時期が6ヶ月程度遅延した。平成22年度の研究計画で予定していたマクロゲン社のアレイCGHターゲットスライドを用いた肺癌のアレイCGH解析を施行した。方法は、当初研究計画で記載した方法に沿って行なった。すなわち、(1)検体DNAを蛍光色素Cy5、正常ヒトリンパ球DNAをCy3で標識の後、両者をブロッキングDNAと等量混合しCGHプロープを作成、(2)このCGHプローブをアレイCGHターゲットスライドにハイブリダイズし、3日間静置、(3)ターゲットスライドを洗浄後、レーザースキャナーで蛍光画像の取り込み、(4)解析ソフトウエアで解析、であった。過去に蓄積にある肺癌DNA検体分については、約20例程度についてCGH解析を完了したが、今後とも症例解析の継続が必要である。アレイCGH法は検体癌ゲノムDNAの増加、減少、欠失等の異常を、ターゲットスライド上に貼付するターゲットDNAに対応する全てのゲノムDNA領域について、一回の検査で網羅的に解析する事が可能となるハイスループット分子遺伝学的解析技術である。癌はさまざまなレベルのゲノム異常の蓄積の結果として発生する事が指摘されている。アレイCGH法は主に染色体不安定性といわれる比較的規模の大きなゲノムDNAの量的異常を検出するのに有用な技術である。癌ゲノムDNAの増幅領域には癌の発生進展に関与する癌遺伝子が、また、欠失領域には癌の発生進展に抑制的に作用する癌抑制遺伝子が存在する可能性が高い。このような新規癌関連遺伝子の検出のみならず、特定の癌関連染色体ゲノム異常から、癌の臨床病理学的特性とリンクする異常を抽出し、癌の病態を把握するためのバイオマーカーとして使用する等の利用法も考えられる。われわれの用いる方法の妥当性および信頼性については、既に論文発表を済ませている(Chochi Y, et al.I Pathol 2008)。今年度以降開始予定であるサンプルDNAの遺伝子プロモーターメチル化を網羅的に解析するメチル化アレイ法との併用で、肺癌の発生進展機構へのより詳細な解析、臨床応用が期待される。本研究課題の研究助成決定が平成22年度後期となったため、研究開始時期が6ヶ月程度遅延した。したがって本来、平成22年度の研究計画で、22年度半ば頃から予定していた肺癌ゲノムDNAのアレイCGH解析を、平成23年度初旬から施行し現在も一部継続中である。また、アレイCGHの方法はほぼ研究計画で記載した方法に沿って行なった。すなわち、術前治療を受けていない肺癌患者から外科的に切除された肺癌凍結組織材料より抽出された癌ゲノムDNAを用いて、約50例の解析を終了した。用いたアレイターゲットスライドは、バクテリア人工染色体(BAC)から抽出したヒトゲノムDNAを4200個のターゲットとして、スライドガラス上にスポットとして貼付けたもので、一度の操作で全ゲノム領域のDNAコピー数増減の解析が可能である。さらに平成23年度中盤から肺癌ゲノムDNAコピー数異常解析と平行して、DNAメチル化アレイ解析法のうち全ゲノムDNAメチル化の網羅的解析が可能であるMI醐1法を用いて、癌の発生進展に関与する遺伝子(群)のDNAメチル化異常を全ゲノム領域に渡り網羅的に解析する方法を試みた。しかし、当初の想定外に費用のかかることが判明し、急遽もうひとつのゲノムDNAメチル化網羅的解析技術であり、より経済効率の良いメチル化DNA免疫沈降-チップ解析法(MeDIP-chip法)を採用した。MeDIP-chip法は以下の工程からなる。(1)制限酵素によるサンプルゲノムD単断片化、一部を分取保存[imputサンプル]、残りを抗メチル化シチジン抗体免疫沈降法によりメチル化DNAの濃縮[IPサンプル]、(2)IPサンプル、imputサンプルにそれぞれ異なる蛍光を標識し、ターゲットアレイにハイブリダイゼーション、(3)蛍光像を取り込み、IPサンプルの蛍光強度が増加しているローカスをメチレーションが増強しているものとして評価する。現在、MeDIP-chip法を4例の肺癌ゲノムDNA検体について施行し、概ね信頼性に足る結果を得ている。今後は委任経理金、他の研究助成金等も活用し、当初の研究目標である網羅的な肺癌ゲノムDNAコピー数異常ならびに網羅的な遺伝子プロモーターメチル化の解析により、肺癌の発生進展機構の詳細な解析とその成果の臨床応用をめざす。

平成22年度から平成23年度前半にかけて、DNAメチル化アレイ法(Microarray-based Integrated Analysis of methylation by Isoschizomers; MIAMI)による解析を試みたが、結果の再現性に問題のあることが判明したため、急遽、網羅的DNAメチル化解析法としての実績のあるメチル化DNA免疫沈降法(MeDIP-chip法)を採用することとした。現在、肺癌組織より抽出したゲノムDNAを用いて、MeDIP-chip法により肺癌の発生進展に関与する全遺伝子CpG領域メチル化異常の網羅的解析を行なっている。約30例の解析を実施したが、最終的には80例の解析を完了する予定である。その結果をもとにリンパ節転移、再発予後、生命予後等の患者の臨床経過に関連の深いCpGメチル化異常を同定し、また、既に解析済みの肺癌全ゲノムDNAコピー数異常との相互関係を統計的に評価することで、術前患者の経過予測や、治療方針決定のために有用な情報を取得するための分子遺伝学的検査法の確立を目指している。平成23年度後半には、九州大学生体防御医学研究所の共同研究課題(九州大学・生体防御医学研究所ゲノミクス・エピゲノミクス共同利用課題)に採用され、助成金の配分をいただくとともに、次世代シークエンサーによるMeDIP法解析結果の評価、解析精度の確認を平行して行なっている。本研究課題の研究助成決定が平成22年度後期となったため、研究始時期が6ヶ月程度遅延した。また、サンプルゲノムDNAメチル化の網羅的解析法として予定していたMI酬王法が想定外に費用のかかることが判明し、MeDIP-chip法に変更したためサンプルゲノムDNA解析の開始時期が遅延した。24年度が最終年度であるため、記入しない。現在、MeDIP-chip法を4例の肺癌ゲノムDNA検体について施行し、概ね信頼性に足る結果を得ている。今後は委任経理金、他の研究助成金等も活用し、当初の研究目標である必要数の肺癌症例における肺癌のゲノム網羅的DNAコピー数異常ならびにゲノム網羅的遺伝子プロモーターメチル化の解析により、肺癌の発生進展機構の詳細な解析ならびにその成果の臨床応用を達成する。
アーバスキュラー菌根の脂質代謝・輸送・制御に関わる分子メカニズム

菌根共生では、菌根菌から植物にリン酸が供給され、その一方で植物からはコストとして炭素化合物が菌根菌に供給される。菌根共生による植物の生育促進効果は、このコストーベネフィットによって大きく変わる。植物から菌根菌へ供給される炭素源として、新たに脂質の存在が明らかとなり、共生の維持に脂質供給が重要であることも示された。本研究では、菌根菌への脂質供給に関与する植物の脂質合成・輸送・制御の分子機構を明らかにするため、ミヤコグサ変異体を用いて菌根共生における脂質関連遺伝子の機能を解析するとともに、クロマトグラフィと質量分析により菌根菌へ輸送される脂質を同定する。
レーン・マネジメントに資する所要時間分布推計システムの開発

プローブデータ分析にて,リンク所要時間分布は直進,右左折で異なることを確認し,今後は車線別にデータ蓄積することが有効であることを確認した.また蓄積データの利用を前提とした所要時間分布の短時間予測手法を提案し,従来手法よりも精度が高いことを確認した.ネットワーク全体の所要時間分布を予測するためには交通流シミュレータが必要であり,従来の確率的CTMを一般道路網に適用できるように改良した.本研究の目的は,ナビゲーションシステムの高度化に向けて必要となる,車線単位の所要時間分布の推計システムとして,1)所要時間蓄積データを直接利用する粒子フィルタの適用(数分程度先の予測),2)交通需要とサービス供給の不確実性を考慮し,観測データを入力条件としてシミュレーションする確率的CTMモデルの改良(数時間先の予測),を行うことである.本年度は名古屋市中心部の市販タクシープローブデータを購入し,リンク通過所要時間の蓄積データに対する右左折車両の影響を分析し,特に直進と右折時では対向車両の有無や信号現示の違いからデータ特性が異なり,車線単位の所要時間推計には右左折車両の影響は無視できないことを確認した.従来のリンク通過所要時間は直進・右左折をまとめてデータ蓄積していたが,直進・右左折の区別は,個々の車両軌跡として次の走行リンクの接続情報を付加することで可能となる.さらに直進・右左折を区別したリンク通過所要時間の蓄積データの有効活用ができる推計手法として,メモリー・ベース粒子フィルタの適用を目指し,データ収集間隔が大きい(プローブ普及率が低い)場合でもリンク通過所要時間の推計ができるよう検討を行った.また観測データを入力データとしたシミュレーションに用いる確率的CTMモデルについてもより効率的なアルゴリズムを検討した.当初の研究計画の通り,交通流シミュレーションの比較的容易な入力データとしてタクシープローブデータに着目し,基礎分析として車線別のリンク通過所要時間の特性が異なることを確認した.また実データの利用を想定した所要時間推計モデルや交通流シミュレーションの検討を行い,既存モデルの改良に着手できた.本研究の目的は,ナビゲーションシステムの高度化に向けて必要となる,車線単位の所要時間分布の推計システムとして,所要時間蓄積データを直接利用する粒子フィルタの適用による数分程度先の予測を行うことである.初年度に名古屋市中心部の市販タクシープローブデータを購入し,リンク通過所要時間の蓄積データに関する検討を行った.その結果,所要時間分布は直進・右左折で異なり,蓄積データベースとしてはこれらを区別することが有用であることを確認した.本年度は所要時間予測手法として粒子フィルタの適用・改良を行い,5秒毎のデータ補完を行いながら蓄積データの更新方法を検討した.一般道路を対象とするため,プローブデータのみからの信号現示パターン推計を目指し,交差点の追従関係だけでなく,横断車両の通過実績データも利用する方法を提案し,有効性を確認した.また,推計された信号現示パターンを用いることで,粒子フィルタによる所要時間予測の精度も向上することを確認した.実際のタクシープローブデータはその普及率が低い.そこで,提案手法の有効性検証として,交通流シミュレータにて全交通車両に対するプローブカー普及率に応じた所要時間予測精度の感度分析を行った.その結果,追従関係や横断関係を用いるために予測対象車両数が変化するが(普及率100%で対象車両数は100%,普及率50%で対象車両数100%,普及率25%で対象車両数93%,普及率10%で対象車両数78%),所要時間予測精度は評価指標MAPE(小さい程良い)で100%:32%,50%:32%,25%:39%,10%:36%となり,平均値を予測値とした場合はMAPEは5560%となることから有効であることを確認した.プローブデータ分析にて,リンク所要時間分布は直進,右左折で異なることを確認し,今後は車線別にデータ蓄積することが有効であることを確認した.また蓄積データの利用を前提とした所要時間分布の短時間予測手法を提案し,従来手法よりも精度が高いことを確認した.ネットワーク全体の所要時間分布を予測するためには交通流シミュレータが必要であり,従来の確率的CTMを一般道路網に適用できるように改良した.来年度は,直進・右左折を区別したリンク通過所要時間の蓄積データを用いたメモリー・ベース粒子フィルタの適用による所要時間推計について成果を発表すると共に,交通流シミュレーションの実行に向けてデータ整備,計算アルゴリズムの改良を行う.交通計画大規模なプローブデータ分析に高性能の計算機購入を予定していたが,より安価な計算機購入で作業ができたため.また,プローブデータ整備に関して,当初想定していた作業がなされた状態のデータ購入が可能となり,データ整理補助員費が不要となった(データ購入費は少し高くなったが,全体では研究費を削減できた)ため.初年度の分析結果を学会等で積極的に発表すると共に,実都市を対象とした交通流シミュレーションの実行を目指す.
線虫における減数分裂機構の解析

〈Weel様タンパク質の強制発現の減数分裂に対する影響の解析〉平成8年度の研究で単離された2種のWeel様タンパク質(あるいはそのキナーゼ活性変異タンパク質)を,それぞれGFPとの融合タンパク質として,線虫内で強制発現させた.発現させた個体からは対照と同様に子孫が得られ,Weel様タンパク質の強制発現のみでは減数分裂に顕著な影響を与えないことが明らかになった.しかし,融合タンパク質の発現をGFPの発光により解析したところ生殖細胞での発現が必ずしも明らかでなく,用いるプロモーターシステムなどの検討が必要であることが明らかになった.〈線虫サイクリン・Cdc2タンパク質の大量調製〉平成8年度の研究で,2種の線虫Weel様タンパク質が,ヒトCdc2のT14,Y15の両者をリン酸化するが,T14,Y15に対して逆の基質親和性を有するという興味深い結果が得られている.この結果が線虫Cdc2(他の生物のCdc2に比べN末が長いなどの特徴を持つ)に対しても同様であるか否かを検討するために,線虫サイクリン・Cdc2タンパク質の大量調製を試みた.しかし,野性型Cdc2,リン酸化される部位に変異を入れたCdc2のバキュロウイルスの系での発現は確認されたが,その可溶化に現在までのところ成功しておらず,可溶化の条件を検討中である.〈Weelファミリー遺伝子欠損株の解析〉Tc1トランスポゾンの挿入によりWeel様遺伝子の欠損が起こっている線虫変異株を単離を試みた.しかし,現在までのところ欠損が明らかな株の単離には至っていない.これは,Weel様遺伝子のそれぞれが個体の維持に重要な役割を有するためと考えられた.現在,Weel様遺伝子のアンチセンス遺伝子を導入し特定の条件下で発現させることでこの可能性を確認している。
磁気中性点を利用した新方式のラジカル中性粒子源

本研究は、従来のプラズマ源では困難であった大面積で空間的均一性のよい高密度プラズマを生成する手法を開発することを目的とし、磁気中性点を有効に利用し、効率よく高密度なプラズマを生成し、プロセス用に応用できる装置を開発することを目指した研究を行った。本研究で開発した装置は、プラズマ閉じこめ部に2本のロッドを設置し、そこに電流を流すことによって直線型四重極磁場配位を形成する。その中心部に形成された磁気中性点により空間的均一性のよいプラズマを生成する装置を開発し、その動作特性試験を行った。製作した四重極磁場発生装置の動作試験を行い、計算値と実験結果とのよい一致を得た。また、予想通り容器壁外部へは磁場が漏れ出ていないことも確認できた。プラズマ発生法として、LaB6カソードを用いた直流放電による手法とRFを用いた手法とを比較した。直流放電による手法では、軸方向の端部にプラズマ生成室を設け、そこで生成したプラズマを上記の磁場中性点を持つ容器内に流し出す方式を試みた。一方、RF用の誘導コイルを四重極磁場部に設置し、直接RF放電プラズマを生成すると同時に四重極磁場によってプラズマを閉じ込める手法を実験した。その結果、直流放電時と比較し、1桁以上の密度上昇が観測され、また、磁場印加による密度上昇も観測され、四重極磁場印加の有効性が確認できた。一方、磁気中性点に閉じ込められるプラズマの高密度化を目指して、電磁流体工学試験装置HITOPを用い、一様磁場中に保持された双極子磁場によって形成された磁気中性点近傍でのプラズマ閉じ込めに関する実験をおこなった。この磁気中性点へ高密度プラズマ流を流入させたところ、磁気中性点に対応する場所でヘリウムイオンや中性原子からの発光強度が強く観測され、このような磁場配位に置いても磁気中性点が有効にプラズマ保持に寄与していることが示された。本研究の目的は従来のプラズマ源にない発想に基づいて磁場および電場を組み合わせた閉じこめ方式により、大面積で空間的均一性のよい高密度プラズマを効率よく生成し、ここで生成されたラジカル中性粒子を取り出し、プロセス用に応用できる装置を開発することである。本研究で開発される装置は、プラズマ閉じこめ部に直線型四重極磁場配位を用いて中心部に磁気中性点を作り出し、これによって空間的均一性のよいプラズマを作り出すものである。本装置では永久磁石を使用せず、2本のロッドに電流を流すことによって発生した磁場によりプラズマを閉じこめる。2本のロッドの中央には磁気中性点が生じるため、ここでは磁場が存在せずこの中性点に沿って均一なプラズマが閉じこめられる。ロッドを通った電流は壁面近傍に設置したリターン板を通って環流されるため、容器外部には原理的に磁場が存在しない。さらに、ロッド周辺に近づくにつれ磁場強度が増すためプラズマとロッド表面との相互作用を極力低減できる。また、この装置には軸方向には原理的に制限がなく大面積化も可能であるなど多数の利点を持つ。本年度は、2本のロッドを用いて直線型四重極磁場を発生させるための真空容器を製作し、真空排気テストを行った。さらにロッドに電流を流し中心部で磁場が0G、ロッド周辺部で数100G程度の磁場が発生できる事が確認できた。さらに両端にそれぞれ誘導結合型のRFプラズマ源を取り付け、RF電源からの高周波(周波数13.56MHz)を給電しプラズマ生成を行った。今後は、この生成されたプラズマのパラメーターをラングミュアプローブ等によって測定しながら、動作条件の最適化を行う。

本研究の目的は従来のプラズマ源にない発想に基づいて磁場および電場を組み合わせた閉じこめ方式により、大面積で空間的均一性のよい高密度プラズマを効率よく生成し、ここで生成されたラジカル中性粒子を取り出し、プロセス用に応用できる装置を開発することである。本研究で開発した装置は、プラズマ閉じこめ部に2本のロンドを設置し、そこに電流を流すことによって直線型四重極磁場配位を形成する。この配位では中心部に磁気中性点が生じ、従ってこの中性点に沿って空間的均一性のよいプラズマを作り出すものである。昨年度までの実験ではプラズマ生成領域を四重極磁場の両端で生成し、そのプラズマを磁気中性点で閉じ込める構成であった。しかしながら生成されたプラズマ密度が低い問題点があったため、本年度は、このプラズマ閉じ込め部にRFアンテナを設置し、RF電源からの高周波(周波数13.56MHz)を給電しプラズマ生成を行った。この生成されたプラズマのパラメーターをラングミュアプローブ等によって測定した。現在、RF電力40Wにおいて電子密度10^<10>cm^<-3>電子温度が数eVのアルゴンプラズマが生成されている。このときロッドに電流を流し、磁気中性点を生成したとき中心部においてプラズマ密度の増加が確認された。現在磁場強度やガス圧等の動作条件の最適化を行っている。今後RF電力を最大3kWまで印加することにより、高密度プラズマの生成と大面積化を目指した実験を行っていく。
クロマチン変換による代謝リプログラミングの分子基盤

LSD1ファミリーは、ヒストンH3のリジン脱メチル化酵素であり、フラビン(FAD)がその酵素活性に不可欠である。本研究において、LSD1が脂肪細胞でエネルギー消費を抑制し、脂肪蓄積を促進するエネルギー代謝調節を明らかにした。また、癌細胞においてLSD1が好気的解糖と低酸素誘導性の転写因子HIFの安定化をもたらすことを示した。さらに、LSD2が肝細胞の脂肪毒性に対する防御に働くことが判明した。生命素子と転写環境の観点から、DNAおよびリジン残基のメチル化・脱メチル化によるクロマチン変換に着目した研究を行い、代謝のリプログラミングの分子基盤を明らかにした。エピジェネティクス機構は、刺激の受容で行われる短期応答、そして、刺激が消失した後にも刺激を受容した記憶を維持する長期応答を通して、遺伝子制御に働いている。他方、転写不活性なクロマチンに位置する遺伝子は、刺激に対して不応になり得る。この転写環境としてのエピゲノム制御には、DNAメチル化とクロマチンの形成が関わり、代謝恒常性の維持と破綻に重要な役割を果たしている。本研究では、生命素子と転写環境の観点から、DNAおよびリジン残基のメチル化・脱メチル化によるクロマチン変換に着目した研究を行い、代謝のリプログラミングの分子基盤を解明することを目的とする。LSD1は、ヒストンH3の4番目リジン残基の脱メチル化酵素であり、その酵素活性にフラビン(FAD)が補酵素として不可欠であることが知られている。LSD1が脂肪細胞で高く発現することを見出し、それを契機として、エネルギー消費を調節する新規機序を明らかにした。RNA干渉法や化合物を用いたLSD1阻害によって、脂肪細胞のエネルギー消費遺伝子の発現が誘導され、その結果、ミトコンドリア機能とエネルギー代謝が向上することが判明した。FAD合成経路またはFAD細胞内取込みの阻害によっても、LSD1阻害時と同様の効果が得られることも明らかになった。エピジェネティクス機構の観点から、代謝リプログラミングと病態における新しい知見を提示し、その作動原理と生命活動における意義について解明を進める。LSD1は、ヒストンH3の4番目リジン残基の脱メチル化酵素であり、生命素子のひとつであるフラビン(FAD)がその酵素活性に不可欠であることが知られている。前年度までに、LSD1が脂肪細胞でエネルギー消費を抑制し、脂肪蓄積を促進する新規の機序を明らかにした。RNA干渉法や化合物を用いたLSD1阻害によって、脂肪細胞のエネルギー消費遺伝子の発現が誘導され、その結果、ミトコンドリア機能が向上することが判明した。さらに、肝癌由来の細胞では、LSD1阻害によって、主要なエネルギー代謝経路が好気的解糖からミトコンドリア呼吸にシフトすることを見出した。LSD1ファミリーは、ヒストンH3の4番目リジン残基の脱メチル化酵素であり、生命素子のひとつであるフラビン(FAD)がその酵素活性に不可欠である。本研究の前半に、LSD1が脂肪細胞でエネルギー消費を抑制し、脂肪蓄積を促進する新規の機序を明らかにした。この成果に基づいて、肝癌細胞においてLSD1が好気的解糖と低酸素誘導性の転写因子HIFの安定化を維持していることが分かった。LSD1阻害によって、好気的解糖からミトコンドリア呼吸にシフトすることを見出した。また、もうひとつのファミリー分子であるLSD2が、肝癌細胞で脂肪代謝に重要な役割を果たすことが判明した。エピジェネティクス機構の観点から、代謝リプログラミングと病態における新しい知見を提示し、その作動原理と生命活動における意義について解明を進めた。本研究では、生命素子と転写環境の観点から、DNAおよびリジン残基のメチル化・脱メチル化によるクロマチン変換に着目した研究を行い、代謝のリプログラミングの分子基盤を解明することを目的とした。LSD1ファミリーは、ヒストンH3の4番目リジン残基の脱

メチル化酵素であり、生命素子のひとつであるフラビン(FAD)がその酵素活性に不可欠である。本研究によって、LSD1が脂肪細胞でエネルギー消費を抑制し、脂肪蓄積を促進する新規の機序を明らかにした。この成果に基づいて、27年度には、肝癌細胞においてLSD1が好気的解糖と低酸素誘導性の転写因子HIFの安定化を維持していることを報告した。LSD1阻害によって、好気的解糖からミトコンドリア呼吸にシフトすることが分かった。また、もうひとつのファミリー分子であるLSD2が、肝癌細胞で脂肪代謝に重要な役割を果たすことが判明した。エピジェネティクス機構の観点から、代謝リプログラミングと病態における新しい知見を提示し、その作動原理と生命活動における意義について解明を進めたLSD1ファミリーは、ヒストンH3のリジン脱メチル化酵素であり、フラビン(FAD)がその酵素活性に不可欠である。本研究において、LSD1が脂肪細胞でエネルギー消費を抑制し、脂肪蓄積を促進するエネルギー代謝調節を明らかにした。また、癌細胞においてLSD1が好気的解糖と低酸素誘導性の転写因子HIFの安定化をもたらすことを示した。さらに、LSD2が肝細胞の脂肪毒性に対する防御に働くことが判明した。生命素子と転写環境の観点から、DNAおよびリジン残基のメチル化・脱メチル化によるクロマチン変換に着目した研究を行い、代謝のリプログラミングの分子基盤を明らかにした。エピジェネティクス機構は、刺激の受容で行われる短期応答、そして、刺激が消失した後にも刺激を受容した記憶を維持する長期応答を通して、遺伝子制御に働いている。他方、転写不活性なクロマチンに位置する遺伝子は、刺激に対して不応になり得る。この転写環境としてのエピゲノム制御には、DNAのメチル化とクロマチンの形成が関わり、代謝恒常性の維持と破綻に重要な役割を果たしている。本研究では、生命素子と転写環境の観点から、DNAおよびリジン残基のメチル化・脱メチル化によるクロマチン変換に着目した研究を行い、代謝のリプログラミングの分子基盤を解明することを目的とする。LSD1は、ヒストンH3の4番目リジン残基の脱メチル化酵素であり、その酵素活性にフラビン(FAD)が補酵素として不可欠であることが知られている。LSD1が脂肪細胞で高く発現して、エネルギー消費を調節する新規機序を明らかにした。RNA干渉法や化合物を用いたLSD1阻害によって、脂肪細胞のエネルギー消費遺伝子の発現が誘導され、その結果、ミトコンドリア機能とエネルギー代謝が向上することが判明した。FAD合成経路またはFAD細胞内取込みの阻害によっても、LSD1阻害時と同様の効果が得られることが明らかになった。さらに、このようなエピジェネティックな代謝調節は、肝臓由来の細胞でも同様に働くことが分かった。
DAMPs による血管新生機序解明および新規がん治療薬の創薬研究

がんなどの疾患において、異常な血管新生が病態の悪化に繋がることから、本研究課題では“血管新生阻害薬の創薬の基礎的検討"を目的として研究を行った。我々は、内因性の免疫調節因子であるdamaged assosiated molecular patterns (DAMPs)に着目しており、これはがんの進展および血管新生と関連することが知られている。DAMPsの中でも、糖尿病や加齢によって増加し、あらゆる疾患との関連が報告されているadvanced glycation end products (AGEs)にまずは焦点を当てて検討を行い、以下の結果を得た。平成30年度の研究実施計画に基づき、「1DAMPs刺激による血管内皮細胞およびマクロファージの膜抗原発現パターン解析」を行った結果、AGEs刺激によって、複数の膜抗原が濃度依存的に発現上昇することが示唆された。また、「2マトリゲルアッセイを用いたDAPMs刺激による血管新生機序の解析と関連分子の探索」を行い、AGEsの濃度依存的な血管新生の促進効果が示され、この血管新生促進機序の一部に、複数の膜抗原が同時に関与することを明らかとした。AGEsはエンドサイトーシスによって血管内皮細胞内へ取り込まれており、このエンドサイトーシスが血管新生の促進において重要な役割を果たす可能性も見出した。さらに、AGEsによる異常な血管新生を阻害する食物由来成分を見出した。以上、AGEsによる血管新生促進機序の一部を明らかとし、異常な血管新生を抑制する阻害剤も見出した。よって、我々の“血管新生阻害薬の創薬の基礎的検討"という目的は果たされたと考えられる。特に、食物由来成分を血管新生阻害薬の候補分子として見出したことは非常に有意義であり、今後の創薬研究に大きく寄与すると考えられる。本研究成果は現在、論文投稿準備中である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。がんの増悪には、かん組織周辺の血管新生が重要であり、その抑制は、より有効な新規がん治療薬の開発に繋がるとされている。また、がん組織局所の微小環境を形成するマクロファージの分化異常が、がん増殖に重要であることが知られている。本申請者らの先行研究において、がんの増悪・改善の両方向に作用することが知られているdamaged assosiated molecularpatterns (DAMPs)の一部が、マクロファージのM1/M2両方の分化を増幅し、血管新生に対してそれぞれ抑制的/促進的に作用することを明らかとしている。これらを踏まえて、平成29年度ではまず初めに、模式的な血管新生評価系を作成するために、血管内皮単一細胞による血管新生評価系をマトリゲルアッセイ法により確立した。また、この血管新生評価系を用い、DAMPsのひとつであるAdvanced Glycation End Products (AGE)が、血管新生に促進的に作用し、この血管新生促進機序の一部に、スカベンジャーレセプターのひとつであるCD204が関与する可能性を見出した。さらに、AGE刺激によって、マクロファージの膜抗原発現パターンが大きく変化することも明らかとした。今後は、マクロファージと血管内皮細胞の共培養時の血管新生へのDAPMsの影響および血管新生機序の解明を行う予定である。本研究は、血管新生阻害薬の創薬における基礎的検討を目的としており、新規がん治療薬の開発へ寄与すると考えられる。平成29年度の研究実施計画に基づき、AGE刺激後の血管内皮細胞およびマクロファージにおける膜抗原発現パターン解析を行い、一定の結果を得た。また、マトリゲルアッセイによる血管新生評価系において、AGE刺激による血管新生への影響ならびにその機序の解明を行い、一定の結果を得ている。また、平成30年度には、これらの研究成果を国際学会において発表を予定である。以上、研究は順調に進んており、おおむね良好であるを考えられる。

今後は、血管新生阻害薬の創薬における基礎的検討を目的とし、血管内皮細胞およびマクロファージ共培養系における、血管新生へのDAMPsの影響の解析、ならびにその機序の解明を行う。この研究の遂行により、新規がん治療薬開発に寄与すると考えられる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
C型慢性肝炎の肝内マイクロRNA発現とIFN・リバビリンの治療効果

C型慢性肝炎の生検組織における肝内マイクロRNA(miRNA)発現を、マイクロアレイを用いて解析したところ、肝線維化進行例ではmiR-422aなどの発現が有意に低下し、miR-199a-5p/199a-3pやmiR-221/miR-222などの発現が有意に亢進し、その結果はリアルタイムPCRでも確認できた。またmiR-222の発現は2種類のマウス肝線維化モデルにおいても、肝線維化の進展とともに亢進していた。さらに初代培養マウス星細胞、ヒト不死化星細胞株においても、miR-222の発現は亢進していた。その発現はTNF-α、TGF-αなどによって促進され、NF-κB阻害剤によって抑制された。miR-222発現はWST1アッセイで不死化星細胞株の増殖に影響を与えなかった。miR-222は標的遺伝子であるp27^<Kip1>の3'-UTRに結合しその蛋白発現を調節し、コラーゲン1A1の発現を誘導し、MMP-1の発現を抑制した。以上より、miR-222が肝線維化の進展に関与する可能性が示された。本研究の意義として、マイクロRNAがPEG-IFN・リバビリン療法の治療効果を予測出来るマーカーとなり得る可能性が考えられる。IFNの効果を予測することは、無効例において副作用を伴う治療を避けるためにも、医療経済的な見地からも重要性が高い。具体的内容:C型慢性肝炎の肝生検組織よりマイクロアレイを用いてマイクロRNA(miRNA)発現の網羅的解析を行なった。肝線維化軽度群(F1/F2)では肝線維化進行群(F3/F4)に比較して、miR-422aなどの発現が有意に低下し、miR-199a-5p/199a-3pやmiR-221/miR-222などの発現が有意に亢進し、その結果はリアルタイムPCRでも確認できた。その発現はTNF-α、TGF-αなど炎症性サイトカンによって促進され、NF-κB阻害剤によって抑制された。miR-222は標的遺伝子の一つであるCDKN1B(p27^<kip1>)の3'-UTRに結合しその蛋白発現を調節し、コラーゲン1A1の発現を誘導し、MMP-1の発現を抑制した。意義、重要性:C型慢性肝炎においてmiR-222が肝線維化の進展に関与する可能性が示された。miRNAは血中ではエキソソームで安定した状態で存在すると言われているので、血清中でのアッセイ系を確立すれば肝線維化バイオマーカーとしても利用可能かも知れない。miR-222発現は不死化星細胞株の増殖に影響を与えなかったので機序につき更なる検討は必要であるが、この研究が肝線維化の分子機構解明の一助になれば、新規治療薬の開発にも繋がることが期待される。miR-222と肝発癌との関連も示唆されており、線維化と発癌の関係を理解する上でも重要と考えられる。
マウス受精卵に対する人工染色体ベクター組換えDNAの新しい導入法に関する研究

2つの新しい遺伝子導入法のうち、前核間細胞質マイクロインジェクション法(IPCM;2個の前核の間の狭い細胞質に遺伝子を注入する方法であり、致命的な核引きの無い利点がある)は良好な結果が出た。300 kbのBAC DNAを4段階の濃度(2、5、7.5、10 ng/uL)に調整し、総計1,914個のマウス受精卵でIPCMを試した。レポーター遺伝子発現胚盤胞の総処理卵数に対する比率は2と5 ng/uL群も比較的良好であったが、それらよりも7.5と10 ng/uL群は有意に高いばかりでなく、それぞれ35.8%と39.9%と高い値を示し、IPCMは高い遺伝子改変効率が期待できる有用な導入法と結論した。I.前核間細胞質マイクロインジェクション法本法は2個の前核間の狭い細胞質スペースに高濃度のDNA溶液を注入する新しい導入法であり、本年度は主として本法の有効性を追求した。300 kbの導入DNAを高濃度(5 ng/μL以上)に調整し前核間細胞質に注入した。各実験日あたり4070個程度のBDF1マウス受精卵をマイクロインジェクションしたが、約半年程度の学習期間の後に、実験日によってはインジェクション直後の生存率が80%以上という優れた成績を収めるようになり、その後4日間の培養でもレポーター遺伝子であるtdTomatoが発現する割合は20数%77%とバラツキは多いものの、殆どが胚盤胞に到達するようになった。なお、本法を行うにあたり、研究代表者が提唱・開発してきた振動型マイクロインジェクションシステムを使用した。この場合、維持圧を4050 hPaに保つのみで、インジェクション圧は使用せずに施行した。II.細胞質・前核順次マイクロインジェクション法本法は前核を串刺しにし前核後方の細胞質にインジェクションしつつ、インジェクション針を引き抜く際に前核内にもDNAを注入する新しい導入法である。充分な数の検討は行えていないが、核引き現象(インジェクション針を前核から引き抜く際に前核内の物質を細胞外に引きずり出すこと)の発生が多く、これが起こらなくても細胞質よりも前核内への注入抵抗がはるかに低いため前核に多量のDNAが注入される傾向もあることが分かり、現在のところ良い成績は得られていない。III.通常の前核マイクロインジェクション法300 kbのDNA断片を5 ng/μL以上の高濃度で前核に注入するのは細胞質よりもはるかに容易ではあるが、数kb程度のDNAに比べて非常に高率に核引き現象が起こることが判った。生存した胚も強烈にtdTomatoを発現し発生が停止することも多かった。前核間細胞質マイクロインジェクションの効果を2つの濃度のtdTomato BAC DNA(> 300 kb)溶液で比較した。36頭の雌BDF-1から得られた615個の受精卵を7.5 ng/uLの高濃度投与群(399個)と2.0 ng/uLの低濃度投与群(216個)に二分した。全ての受精卵はインジェクション後6日間培養し発生を観察した。結果:1)12実験日のいずれにおいても、1本のインジェクション針で全てのインジェクションが終了できた(平均58個)。インジェクション直後の生存率は高濃度群で77.7% (310/399)、低濃度群で79.6% (172/216)と差がなく(P = 0.6091、Fisher直接確率検定)、胚盤胞到達率はそれぞれ72.9% (291/399)、79.6% (172/216)と、低濃度群が高い傾向を示した(P = 0.0778)。tdTomatoを発現した胚盤胞の比率は高濃度群35.8% (143/399)、低濃度群6.0% (13/216)であり、高濃度群が有意に高かった(P < 0.0001)。2)低濃度群の場合、途中で針が閉塞し先端を折ることが多かったが、先端を折った後には明らかにBAC DNAの細胞質へのインジェクション量が増加したため、その多寡で2群に分類し比較した。直後の生存率と胚盤胞到達率は両方とも高注入量群で71.9%(46/64)、低注入量群で82.9%(126/152)であり、低注入量群が高い傾向を示した(P = 0.0947)が、発現胚盤胞率はそれぞれ14.1%(9/64)、2.6%(4/152)と、高注入量群の方が有意に高かった(P = 0.0028)。結論:前核間細胞質マイクロインジェクション法は高い生存率が期待できるが、組換えを起こすには高濃度の溶液が必要であること、さらに低濃度の場合はより多くの注入量が必要であることが判った。前核間細胞質マイクロインジェクションの効果を昨年度は7.5 ng/uLのtdTomato BAC DNA(> 300 kb)溶液投与群と2.0ng/uL溶液投与群で比較したが、本年度は5 ng/uLと10 ng/uLの2つの濃度で比較した。57頭の雌BDF-1から得られた1,023個の受精卵を5 ng/uL

溶液投与群に合計406個、10 ng/uL溶液投与群に合計617個割り当てた。全ての受精卵はインジェクション後6日間培養しその間の発生を観察した。前年度の経験から、高濃度BAC DNAを使用すると実験途中でマイクロピペットの先端が閉塞しやすく多くの場合途中で先端を折らざるを得ないことが判っていたので、今回は事前に先端を折って使用することとした。1)インジェクション直後の生存率は、5 ng/uL溶液投与群で72.2% (293/406)、10 ng/uL溶液投与群で65.6% (405/617)と有意に5 ng/uL溶液投与群の生存率が高かった(P = 0.0284、Fisher直接確率検定)。2)胚盤胞到達率もそれぞれ64.3% (261/406)、53.8% (332/617)であり、5 ng/uL溶液投与群の方が有意に良好な発生を示した(P = 0.0010)。しかし、3)レポーター遺伝子であるtdTomatoを発現した胚盤胞の全処置卵に対する比率は5 ng/uL溶液投与群で24.6% (100/406)、10 ng/uL溶液投与群で39.7% (245/617)であり、後者の方が有意に高かった(P < 0.0001)。したがって、5 ng/uL溶液よりは10 ng/uL溶液を投与した方が、インジェクション直後の生存率や胚盤胞への到達する割合は減少するものの、外来遺伝子を発現した動物が産出される割合は高くなることが示唆された。2つの新しい遺伝子導入法のうち、前核間細胞質マイクロインジェクション法(IPCM;2個の前核の間の狭い細胞質に遺伝子を注入する方法であり、致命的な核引きの無い利点がある)は良好な結果が出た。300 kbのBAC DNAを4段階の濃度(2、5、7.5、10 ng/uL)に調整し、総計1,914個のマウス受精卵でIPCMを試した。レポーター遺伝子発現胚盤胞の総処理卵数に対する比率は2と5 ng/uL群も比較的良好であったが、それらよりも7.5と10 ng/uL群は有意に高いばかりでなく、それぞれ35.8%と39.9%と高い値を示し、IPCMは高い遺伝子改変効率が期待できる有用な導入法と結論した。1)提唱している新しい遺伝子導入法の一つである「前核間細胞質マイクロインジェクション法」(2つの前核が近接した時点で、前核間の狭い細胞質に注入する方法)の評価は充分行え、良好な結果を得たと判断している。すなわち、充分な日数の実験日(12実験日)において充分な個数の受精卵(36頭のメスマウスから合計615個)を用いて、高濃度BAC溶液(7.5 ng/uL)と低濃度BAC溶液(2.0 ng/uL)の比較実験を行い、両群ともに70%を超える高い生存率および高い胚盤胞到達率が得られた。さらに、レポーター遺伝子であるtdTomatoを発現した胚盤胞の比率は高濃度群で35.8% (143/399)、低濃度群で6.0% (13/216)という結果も得られた。これらの結果は、「前核間細胞質マイクロインジェクション法」は前核マイクロインジェクションの弊害(前核内への直接投与によって高率に発生する核引き現象による致命的ダメージ)が回避できること、また濃度を上げることによって予想されていた細胞質インジェクションの弊害(核内への直接投与でないために、核内へのBAC DNAの移行が悪く、したがって核DNAへの組換え効率が悪い)も相殺できることが実証できた。2)もう一つの新しい遺伝子導入法である「細胞質・前核順次マイクロインジェクション法」(前核を串刺しにし後方の細胞質に注入しつつ、ピペット抜去の際に前核にも注入する方法)は想定とは異なり、前核マイクロインジェクションと同様に高率に核引き現象を起こすことが判り、現時点では「前核間細胞質マイクロインジェクション法」よりも優れた点が見出せていない。