hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高効率な有用物質生産能を複合的に有する海洋性珪藻細胞の開発

海洋性珪藻類は、地球上のCO2固定および地球規模のリン循環に大きな影響を及ぼし、海水中より獲得した無機炭素およびリンは、有用物質生産にも利用される。本研究では、海洋性珪藻類の無機炭素およびリン酸獲得機構に関与する因子を同定し、これらを共高発現させることにより、2つの異なる有用物質生産能に優れた新規珪藻株の作出を試みた。候補因子の詳細な機能解析から、葉緑体包膜局在型無機炭素輸送体PtSLC4-7および細胞膜局在型リン酸輸送体PtSLC34-2の同定に成功した。さらに、ポリリン酸合成・分解酵素の候補因子を見出し、リン酸応答性を確認した。また、遺伝子共発現用珪藻形質転換ベクターを新たに構築した。本研究課題は、2種のモデル海洋性珪藻を研究対象に珪藻の油脂およびポリリン酸などの有用物質生産の原料物質の獲得機構および有用物質の細胞内蓄積機構を明らかにし、これを基にした複数の有用物質生産能を高次元で有する珪藻細胞を遺伝子改変技術を用いて開発すると共に、有用物質を低コストで生産・供給するための技術基盤を確立することを最終目標としている。平成26年度は、研究計画に従い、以下に示す4つの実験を遂行し結果を得た。1.葉緑体局在型無機炭素輸送体候補因子の探索および細胞内局在解析を行った。その結果、複数の輸送体候補因子のうちPtSLC4-6およびPtSLC4-7が珪藻の葉緑体4重包膜系に局在していることがGFPとの融合タンパク質発現解析によってわかった。2.リン酸輸送体候補因子の探索とリン酸欠乏環境下における候補遺伝子の発現量解析、および候補因子の細胞内局在解析を行った。その結果、複数のリン酸輸送体候補因子を発見し、そのうち5遺伝子がリン酸欠乏環境下において顕著に誘導されることがわかった。さらに、このうちの2遺伝子の翻訳産物であるPtSLC34-2およびPtSLC34-5は、GFP蛍光観察により、細胞膜局在型タンパク質であることを確認した。3.ポリリン酸合成および分解酵素候補因子の探索、配列決定および珪藻細胞内局在解析用コンストラクトの作製と珪藻の形質転換を行い、複数の形質転換体を得ることに成功した。4.リン酸欠乏環境下における野生型珪藻細胞の生理学的解析を行った。2種のモデル海洋性珪藻は、共にリン酸欠乏環境下に細胞を晒した際、数日で積極的なリン酸取り込み活性を示した。また、これに付随するように細胞外アルカリフォスファターゼ活性の上昇も確認できた。このことから細胞種間でのリン酸欠乏環境下におけるリン酸獲得機構に大きな違いはないことが示唆される結果を得た。本研究課題は、モデル海洋性珪藻の無機炭素およびリン酸獲得・蓄積機構を明らかにすることにより、珪藻内に蓄積される有用物質である油脂およびポリリン酸の生産能を複合的に強化した新規珪藻細胞を作出するための技術基盤を確立することを最終目標としている。平成27年度は、平成26年度に得られた研究成果と申請した研究計画に従い、以下に示す3つの実験を遂行し結果を得た。1.葉緑体包膜局在型無機炭素輸送体候補因子PtSLC4-7の機能解析を行った。細胞膜局在型重炭酸イオン輸送体PtSLC4-2とPtSLC4-7の共発現株の作出を行い、光合成パラメーターおよび無機炭素輸送活性をPtSLC4-2単独発現株と比較した。その結果、共発現株において、無機炭素に対する親和性の上昇および無機炭素輸送活性の上昇を確認した。このことから、PtSLC4-7は葉緑体包膜上で無機炭素輸送体として機能していることが強く示唆された。さらに、珪藻細胞において、異なる遺伝子を一度に複数発現させることにも成功した。この技術は、本研究課題の最終目標である有用物質生産を複合的に強化するための応用に重要な成果である。2.リン酸欠乏環境下で誘導されるリン酸輸送体候補因子の直下に緑色蛍光タンパク質あるいは短鎖ペプチドを付加させ、発現させた株を目的候補タンパク質の過剰発現体として、リン酸輸送活性測定に用いた。しかしながら、野生株と比較して顕著な輸送活性の上昇は確認できなかった。3. 1および2の研究成果を踏まえ、PtSLC4-7遺伝子およびリン酸輸送体候補遺伝子をターゲットとしたノックダウンおよびノックアウト株の作出を試みた。現在、複数のノックダウンおよびノックアウト候補株を取得し、ターゲット遺伝子のmRNAの蓄積量解析および生理学的解析を進めている。葉緑体包膜局在型無機炭素輸送体候補因子については、機能解析が順調に進んでいる一方で、リン酸輸送体候補因子に関して、当初の研究計画通り、候補因子の過剰発現株を用いてリン酸輸送活性測定を行ったが、野生型と有意な差が認められず、機能解析が滞ったためである。これらの進捗状況を踏まえた結果、研究課題全体として、やや遅れていると判断した。

さらに、ポリリン酸合成・分解酵素の候補因子を見出し、リン酸応答性を確認した。また、遺伝子共発現用珪藻形質転換ベクターを新たに構築した。本研究課題は、モデル海洋性珪藻類の無機炭素およびリン酸獲得・蓄積機構を解明し、これらの最終産物である油脂およびポリリン酸などの有用物質生産能を複合的に強化した新規珪藻細胞を作出するための技術基盤を確立することを最終目標とした。平成28年度は、これまでの研究成果と申請した研究計画に従い、以下に示す2つの実験を遂行し成果を得た。1.葉緑体包膜局在型無機炭素輸送体候補因子PtSLC4-7の機能解析を行った。前年度までに細胞膜局在型重炭酸イオン輸送体PtSLC4-2とPtSLC4-7の共過剰発現株の作出を行い、光合成親和性および無機炭素輸送活性をPtSLC4-2単独過剰発現株および野生株との比較を行った結果、共過剰発現株における光合成親和性および無機炭素輸送活性の上昇を確認した。そこで、この結果の再現性を得るため、共過剰発現株を新たに取得し、同様の解析を行った。その結果、新規に取得した共過剰発現株においても、光合成親和性および無機炭素輸送活性が上昇していた。さらに、CRISPR/Cas9システムを利用したPtSLC4-7ノックアウト株の作出を試み、複数の候補株を取得したが、詳細な機能解析までには至らなかった。2.リン酸輸送体候補因子PtSLC34-2およびPtSLC34-5の機能解析をRNA干渉によるノックダウン候補株および過剰発現株を用いて行った。その結果、リン飢餓環境下において、PtSLC34-2ノックダウン候補株のリン酸輸送活性は、野生株より50%低下し、PtSLC34-2過剰発現株におけるリン酸輸送活性は、野生株と比較して約2倍高くなっていた。一方で、PtSLC34-5ノックダウン候補株および過剰発現株におけるリン酸輸送活性は、どちらも野生株と同程度であった。これらの成果から、PtSLC34-2は、珪藻細胞内において、リン酸輸送体として機能していることが強く示唆された。平成27年度の実験計画で予定していたいくつかの葉緑体局在型無機炭素輸送体候補およびリン酸輸送体候補の細胞内局在をすでに明らかにし、遺伝子の発現量解析も終えている。現在、局在解析に用いた形質転換体を無機炭素およびリン酸輸送体候補因子の高発現株として利用し、無機炭素およびリン酸の輸送活性の解析実験に取りかかっていることから、おおむね順調に進展していると判断した。葉緑体包膜局在型無機炭素輸送体候補因子については、当初の計画通り、詳細な機能解析を終了し、これまでの研究成果等を踏まえた上で、海洋性珪藻における無機炭素獲得機構のモデル化を目指す予定である。一方で、リン酸輸送体候補因子の機能解析に関しては、当該輸送体のノックダウンあるいはノックアウト株を作出し、これらの株における生理学的解析を早急に行っていく予定である。植物分子生理学当初の研究計画通りに遂行する。平成27年度は、細胞内局在解析によって得られた形質転換体を輸送体候補因子過剰発現体として利用し、無機炭素輸送体候補およびリン酸輸送体候補の輸送基質の同定とエフェクター分子の決定を行う。また、ポリリン酸合成および分解酵素候補因子の細胞内局在の決定を終了させ、最終年度に予定している有用物質生産能を複合強化した珪藻細胞の開発に繋げる。リン酸輸送体候補因子の機能解析の滞りと、予定していた国際および国内学会への参加を見送ったため余剰分が発生した。
機能的MRI解析を用いた努力性呼吸困難感の新たな評価法の確立

ネットワーク内のconnectivity解析では、呼吸困難時に島回ー背側前部帯状回(SN)内と小脳内ネットワークにてConnectivity増加、SNー上頭頂葉(DAN)ー後部頭頂葉ネットワーク(CEN)同士のConnectivity増加を認めた。一方、default mode network(DMN)内のConnectivityは減少し、DMNーDAN同士のConnectivityも減少した。これらの変化が呼吸困難の脳内バイオマーカーとして有用であることが示唆された。気流閉塞体感器を用いた健常人における努力性呼吸に伴う呼吸困難感をfMRIを用いて脳内活動変化を可視化し、呼吸困難に関与する中枢機能ネットワークを解明したいと考えている。現在、健常人に関しては、10名の検査が終了している。解析に関しては合計18名終了時点で行う予定である。その後、COPD患者への検討も行っていく予定である。今回の検査に使用する気流閉塞体感器の妥当性を評価するのに時間を要した。その後、健常人のエントリーを開始となった。機能的MRIを施行する前に、検査日の流れを知るうえで、別日に呼吸訓練を行うスケジュールとなっているが、日程がなかなか合わず遅れている。若年健常者16例を対象とし安静時および呼吸困難時のfMRIを撮像した。fMRIは3T(GE社製、Discovery)を用い、撮像条件はTR 2sec、TE 30msec、flip angle 80度、1 scan 34スライス、スライス幅4mm、Matrix 64x64とした。1sessionは400秒(200scan)。データ解析は、位置ずれ補正、スライスタイミング補正、スムージング後に、各個人毎にICA(Independent Component Analysis)を施行した。次に動きのノイズ、生理学的ノイズを除去した。その後に脳の形を標準脳に合わせて変形させた。さらにグループのICAを施行し、default mode networkなどの安静時ネットワークを描出した。安静時および呼吸困難時のネットワーク内のconnectivity解析にはdual regression解析を用いた。さらに安静時および呼吸困難時のネットワーク同士のconnectivity解析にはFSlNet解析を追加した。現在の結果として、呼吸困難時にはSN内および小脳内のConnectivityが増加を認め、先行研究から予想されたとおりであった(Evans KC, 2010)。さらにSNーDANーCEN同士のConnectivity増加を認めた。一方DMN内のConnectivityは減少し、DMNーDAN同士のConnectivityも減少した。SNへの感覚入力のためにSN内のConnectivityが増加し、DANーCENのConnectivity増加ももたらし、CENと拮抗関係にあるDMNのConnectivity減少をきたしたものと思われた(Menon V, 2015)。呼吸訓練の実施できる時間帯の拡大と1回あたりの訓練時間の短縮を進めていく。また、機能的MRIの予約時間の枠を増やしていくことで、対応する予定。医歯薬学現在、機能的MRIや採血などの検査を施行している健常人は10名であり、進捗状況がやや遅れているため、検査にかかる費用などが使用出来なかったため。スケジュールなどの問題は改善されているため、今後は比較的スムーズにエントリーがされていくと考えており、それに応じて機能的MRIをはじめとする検査および解析も行う予定である。結果の妥当性が確認できれば、軽症COPD患者に対しても行っていく予定である。
異常胆汁酸を指標とするコレステロール代謝異常症（ＳＬＯＳ疾患）のメタボローム解析

先天性コレステロール代謝異常症では、生合成中間体やそれらの異常代謝産物が顕著な量で血中に蓄積、あるいは一部が尿中に排泄される。本研究課題では、肝における先天性奇形疾患である先天性コレステロール代謝異常症の一つであるSLOS疾患(スミス-レムリ-オピッツ症候群:7-デヒドロコレステロール欠損症、Dhcr7)を対象とし、本疾患の特異的指標として期待される4α- and 4β-ヒドロキシ-7-デヒドロコレステロール異常代謝産物の化学合成を行うと共に、液体クロマトグラフィー-タンダム質量分析(LC/ESI-MS/MS)法を用いるメタボローム解析を行い、本疾患の早期発見と確定診断に寄与することにある。本研究の目的は、肝におけるコレステロール代謝異常による先天性奇形疾患であるスミス-レムリ-オピッツ症候群(Smith-Lemli-Opitz Syndrome:SLOS)を対象とし、本疾患の特異的指標(疾患バイオマーカー分子)として期待される異常胆汁酸(abnormal bile acid)の代謝産物標品の化学合成を行うと共に、液体クロマトグラフィー-タンダム質量分析(LC-MS/MS)法を用いるメタボローム解析を行い、本疾患早期発見と確定診断に寄与することにある。SLOS疾患は胎児、新生児において重篤な疾病であり、その早期発見と対症療法が極めて重要視されているものの、本疾患のバイオマーカーの特定とメタボリックプロファイリングは確立されておらず、その解明が焦燥の急務課題とされている。本研究は特にSLOS疾患に対象を絞り、その包括的な化学的診断法システムを構築し、広く臨床の場に提供しようとするものである。なお、SLOS疾患は肝において、7-デヒドロコレステロール前駆体からコレステロールへの変換を司る生合成最終過程で作用する酵素の欠損あるいは活性低下に起因することから、7-デヒドロコレステロールレダクターゼ欠損症(Dhcr7)とも称される。平成25年度はリトコール酸から1,3-ジヒドロキシ-5,7-コラジェン酸の合成中間体である1,3-ジヒドロキシ-5β-コラン酸の化学合成を高収率・高選択的で達成した。引き続き、実施計画に基づき1,3-ジヒドロキシ-コレスタン-5,7-ジエン、3,5-ジヒドロキシ-コレスタン-7-エン等、SLOS疾患に特異的な指標として期待される疾患バイオマーカー分子を高度な有機合成化学的手法を用いて調製することを目的としている。平成24年度はコレステロールから3,4-ジヒドロキシ-コレスタン-5,7-ジエン立体異性体の化学合成を高収率・高選択的に達成した。

なお、SLOS疾患は肝において、7-デヒドロコレステロール前駆体からコレステロールへの変換を司る生合成最終過程で作用する酵素の欠損あるいは活性低下に起因することから、7-デヒドロコレステロールレダクターゼ欠損症(Dhcr7)とも称される。平成24年度はコレステロールから3,4-ジヒドロキシ-コレスタン-5,7-ジエン立体異性体の化学合成を高収率・高選択的に達成した。引き続き、実施計画に基づき1,3-ジヒドロキシ-コレスタン-5,7-ジエン、3,5-ジヒドロキシ-コレスタン-7-エン等、SLOS疾患に特異的な指標として期待される疾患バイオマーカー分子を高度な有機合成化学的手法を用いて調製することを目的としている。化学現在まで、当初予定の標的化合物全ての化学合成には至っていないが、1,3-ジヒドロキシ-5,7-コラジェン酸の合成中間体である1,3-ジヒドロキシ-5β-コラン酸及びその関連化合物の化学合成を達した。これらの研究成果は学術論文として投稿準備を行っていると共に、LC-MSスペクトルデータは日本質量分析化学会のMSデータベース(MassBank)に登録し、世界に発信・公開する予定である。現在まで、当初予定の標的化合物全ての化学合成には至っていないが、本疾患のバイオマーカーとして大いに期待される3,4-ジヒドロキシ-コレスタン-5,7-ジエン立体異性体及びその関連化合物の化学合成を達した。化学合成の終了した化合物から順次LC-MS/MS法による信頼度の高いメタボリックプロファイリングを本疾患者の尿試料との対比・検討する予定である。次いで、それらの情報を基にそれぞれの化合物について最適なプリカーサーイオンスキャンやニュートラルロススキャンを生じる条件を見出す。さらに標的化合物を用いてグラジェント分析に付し、至適な分離分析条件を検討する。さらに、保持時間とm/zによる二次元マップを作成し、各化合物のスポットを確認する。これらのメタボリックプロファイリングを基盤として、特にSLOS疾患の簡易かつ高感度な化学的確定診断法の確立に繋げる。ガラス器具の破損が少なく、消耗品の節約も行い予定よりも費用を使わずに済んだため。繰り越し分の研究費はろ紙やマイクロチューブ等の消耗品の購入に充てる。
トランスポゾンを用いたin vivo遺伝子発現長期化による新規慢性疾患療法の開発

昨年度、哺乳類において目的遺伝子のゲノムへの組込みが可能なプラスミドベクターの構築を目的に、piggy bacトランスポゾン認識配列内に目的遺伝子を有するドナーベクターおよびドナーベクターからの目的遺伝子の切り出しおよびゲノムへの組込みに関与するトランスポザーゼを発現するヘルパーベクターをそれぞれ構築した。本年度は、piggy bacトランスポゾンのアデノウイルやPCR産物によるベクター作成の可能性を検討するため、環状プラスミドDNAを切断またはPCRにより作成した直鎖状および環状のベクターを構築し、ヒト由来細胞HEK293細胞を用いてpiggy bacトランスポゾンによるゲノムへの組み込みにおけるベクターの形状の影響を評価した。その結果、いずれの直鎖状ベクターの場合も環状ベクターと比較するとゲノムへの組込みは極めて低かった。また、遺伝子発現効率が低い事が知られている初代培養系の細胞におけるpiggy bacトランスポゾンによるゲノムへの組込みの確認を目的に、EmGFP発現遺伝子を搭載したドナーベクターを新たに作成し、初代培養細胞間葉系幹細胞を用いてゲノムへの組込みが可能であることを確認した。さらに、ドナープラスミドおよびヘルパープラスミドが同一細胞内で作用する効率の増大により、ゲノムへの組込み可能な細胞数を増加させることを目的に1つのプラスミドにpiggy bacトランスポゾン認識配列内に目的遺伝子を有する配列とトランスポザーゼの配列を同時に有するベクターを作成し、HEK293培養細胞およびマウスにおいて効率よく遺伝子組込みが起こることを確認した。以上、哺乳類においてpiggy bacトランスポゾンにより目的遺伝子のゲノムへの組込みが可能であることを明らかにし、更にpiggy bacトランスポゾンの応用展開を目指したベクター設計に有益な情報を得ることができた。実験計画初年度の本年度は、まずpiggy bacトランスポゾンのベクター作成を行った。レポータータンパク質としてfirefly luciferase遺伝子および抗生物質に対する耐性遺伝子を搭載したドナーベクターを作成した。また、ゲノムDNAへの組み込みに必要な酵素トランスポザーゼを発現するヘルパーベクターを作成した。まずヒト肝がん由来細胞に対して、両ベクターを同時にトランスフェクションし、抗生物質含有培地で培養したところ、細胞の増殖が確認された。一方、ヘルパーベクターのかわりにトランスポザーゼを発現しないコントロールベクターとドナーベクターを同時に、トランスフェクションすると細胞は増殖しなかった。従ってドナーベクターとヘルパーベクターの同時トランスフェクションにより目的遺伝子がゲノムへ組み込まれたことが示唆された。次に、血中分泌型レポーター遺伝子であるGaussia luciferase遺伝子を搭載したドナーベクターを新たに作製した。これとヘルパーベクターを同時にマウスにハイドロダイナミクス法で投与し、血中のGaussia luciferaseを経日的に観察したところ、少なくとも60日後までは持続的な発現が観察された。しかしながら、発現量の緩やかな減少力弐認められたため、プロモーターをCMVからEF1に変更したところ、発現量は減少せず60日後も一定に持続的であった。さらにマウスの肝臓から抽出したDNAのシーケンス解析によりゲノムへの組み込みの確認を行った。また、ヘルパーベクターとドナーベクターの投与量には最適な比率が存在することも明らかとなった。以上、piggy Bacトランスポゾンを用いてベクターおよび投与量を最適化することによりマウスの生体内においてゲノムDNAへ目的遺伝子の組み込みおよび遺伝子発現の持続化が可能になった。これまで哺乳類の生体内でのpiggy Bacトランスポゾンによる目的遺伝子のゲノムDNAへの挿入に関する報告は我々(Mol Ther apr. 2010. accepted)の他に1例のみである。
中央アジア・東欧農業における生産・流通組織と農業発展に関する研究

中央アジアや中東欧の移行期経済では、持続可能な経済成長を可能にするために、マクロ経済の安定を基礎にして、生産・流通部門において経済活動の担い手となる近代的経営組織、そして流通組織の発展と、それらの活動を保障・支援する新しい制度の確立を含む経済・社会政策の導入が必要視されている。本研究は、中央アジア・東欧諸国の農業分野に焦点を絞り、新旧の生産・流通組織の構造とパフォーマンスの変化を比較分析・理解し、その結果をもとに政策分析を行い、移行期経済が持続可能な経済成長をとげるための政府の役割に関する包括的な政策的含意の導入を図ることを目的とした。これまでに以下のことが達成された。1)急速に変容を遂げる移行期経済における経済改革の状況とそれに関する研究成果について把握することができた。2)東欧はハンガリーから、中央アジアはウズベキスタンから農家データと中央統計局が集計した地域別データを入手し、データベースをつくった。新古典派の経済分析手法により、農業生産者らは経済的に合理的な行動をとっていることが確認された。3)これらをもとにデータ分析を実施した。移行経済の農業部門においては、投入財市場や生産財市場において存在する旧来の制度が、農業生産と流通の効率性の向上を阻害していることがいくつかの事例を通して分かった。そして、東欧においては阻害の程度が軽く、中央アジアにおいては、その程度が重いことが確認された。またこれは、中央アジアにおいては、協同組合であろうと個人農であろうと、直面している問題であることが分かった。4)研究結果の一部は12回国際農業経営学会大会、1999年度日本農業経済学会大会、第7回欧州農業経済学会大会、第23回国際農業経済学会大会で報告した。初年度である本年度は、以下の調査研究作業を実施した。1.各種出版資料と現地からの郵便による予備資料の収集を行い、一国レベルでの経済政策と各種農業政策の変化について分析した。2.ウズベキスタンにおける現地調査では、経済改革の進捗状況と各種経済政策が農業生産・流通組織体に及ぼしている影響についてデータの収集および聞き取り調査を行った。タシュケントにある農業省、統計局、大蔵省、タシュケント国立大学等における聞き取り調査を実施した以外にも、東南地域の国営農場や協同農場、流通組織において聞き取り調査を実施した。政府買い上げ制度や為替政策等が、農業生産組織のパフォーマンスと農業発展を疎外していることが確認された。またポーランドにおいては、ワルシャワにある農業食糧研究所、農業省、ワルシャワ農業大学、ワルシャワ経済大学におけるヒアリングの他に、小農、近代化した個人農、民営化された国営農場と協同農場、流通組織等において聞き取り調査を実施した。さらにハンガリーにおけるヒアリングは、ブタペスト経済大学、ハンガリー科学アカデミー経済研究所、同土壌研究所、農業省、農業経済研究所、旧国営農場と協同農場、新規に誕生した小農、流通組織等に対して実施された。なおそれぞれの国における農業生産・流通組織に対するヒアリングは質問状作成の目的のパイロット的なものであった。さらに、現地調査に際しては、この移行期経済に関する先進的な研究をしている米国のカルフォルニア大学、ミネソタ大学、コーネル大学、農務省経済研究所等みおいて、マクロデータ分析結果の中間報告とデータや研究手法に関する情報収集と意見交換が行われた。3.現地研究分担者と日本チームの間では、翌年度以降の本調査の打ち合わせが実施された。4.またハンガリーの研究分担者を、日本に招聘して、現地調査で収集したデータの分析を共同で実施した。本年度の研究においては、以下の作業がおこなわれた。1.各種出版資料と現地からの郵便による予備資料の収集が行なわれ、一国レベルでの経済政策と各種農業政策の変化について再分析が実施された。2.東欧と中央アジアにおける現地調査では、経済改革の進捗状況と各種経済政策が農業生産・流通組織体に及ぼしている影響について、データの収集および聞き取り調査が実施された。

各国においては、農業省、統計局、大蔵省、関連大学・研究機関等における聞き取り調査以外にも、旧国営農場や協同農場、流通組織において聞き取り調査が実施された。また、中央アジアのウズベキスタンにおける農業生産・流通組織に対するヒアリングにおいては、昨年度に作成した質問状を使い、個別ミクロデータの収集がおこなわれた。さらに、現地調査に際しては、この移行期経済に関する先進的な研究をしている米国のミネソタ大学、コーネル大学、農務省経済研究所等において、ミクロデータ分析結果の中間報告とデータや研究手法に関する情報収集と意見交換が実施された。3.また東欧と中央アジアの研究協力者を、日本に招聘して、現地調査で収集したミクロデータの分析と考察を共同で実施した。農業組織の経営における収益性の差は、経営者の教育レベル、性別、地域の違いに依存することが、ハンガリーの事例から分かった。4.また、分析結果の一部は論文としてまとめ、日本農業経済学会、国際農業経営学会、欧州農業経済学会の大会で報告した。本年度の研究においては、以下の作業が実施された。1.各種出版資料と現地からの郵便による予備資料の収集を行われ、一国レベルでの経済政策と各種農業政策の変化について再分析が行われた。2.東欧と中央アジアにおける現地調査では、経済改革の進捗状況と各種経済政策が農業生産・流通組織体に及ぼしている影響について、データの収集および聞き取り調査が実施された。各国においては、農業省、統計局、大蔵省、関連大学・研究機関等における聞き取り調査を実施する以外にも、旧国営農場や協同農場、流通組織において聞き取り調査を実施した。なお、それぞれの国における農業生産・流通組織に対するヒアリングにおいては、改良を加えた質問状を使い、個別ミクロデータの収集を行った。さらに、現地調査に際しては、この移行期経済に関する先進的な研究をしている米国のミネソタ大学、コーネル大学、農務省経済研究所において、ミクロデータ分析結果の報告とデータに関する情報収集と意見交換を行った。3.またハンガリーとウズベキスタンの海外研究分担者を、日本に招聘して、現地調査で収集したミクロデータの分析を共同で実施した。さらに論文の作成も行った。4.また、分析結果の一部は、論文にしてと国際農業経済学会の大会で報告した。研究結果は、まとめて報告書の形にした。
ヘミデスモソーム構造の解離と再構築に着眼したの口腔癌浸潤機構の解明

ヘミデスモソーム構成因子のひとつであるBP180は、水疱性類天疱瘡の主要な抗原のひとつとして知られている。申請者は、現在までに行ってきた類天疱瘡の病態解明研究において、【類天疱瘡における基底膜構造の解離様式が、癌浸潤でみられる様式と類似している】ことに気付き、BP180が仲立ちする類天疱瘡と口腔癌発症の関連性について注視してきた。これまでに、各種ヘミデスモソーム構成因子が皮膚の創傷治癒や癌進展に関わっていることが証明されているものの、BP180については、その発現制御機構や癌の病態における役割は未解明のままである。そこで、本研究課題では口腔癌浸潤におけるBP180の役割を明らかにする。
半導体ナノコラムにおける多重量子井戸ポラリトン

新しい原理に基づくレーザーであるポラリトンレーザー実現の候補として、GaN系の多重量子井戸を考えた.しかし、井戸ごとに組成揺らぎが生じ、異なる井戸同士のポラリトン結合を妨げることが障害になることが予想された.そこで、本研究では、直径100nm程度の柱状結晶であるナノコラムを用いることでそれを解決しようと計画した.しかし、現実にはポラリトン結合の確認には至らず、コラムという形状に起因する光学特性の研究に集中した.GaNナノコラムは通常の薄膜やバルクに比べて非常に良く光るが,その原因はコラム側面からのポラリトン発光が寄与していることが判明した.また,励起子の束縛エネルギーはバルクと変わらないのに,励起子分子の束縛エネルギーが大きくなっていることを見いだした.直径100nm程度という大きさでは電子系は1次元ではないが,励起子分子の大きさになるとこの程度の直径でも閉じこめ効果を受けることがわかった.InGaN/GaNナノコラムでは,InGaNを量子ディスクとして挿入したものと,InGaNのナノコラムにしたものとを比較した.InGaNナノコラムでは,バルクと同じ広く分布した束縛励起子からの発光が現れたが,量子ディスクの方では,単一の束縛状態からの発光が確認された.このことは,一つのInGaN/GaNナノコラムは単色で発光していることを意味しており,今後の発光デバイスへの応用に関して重要な情報をもたらした.新しい原理に基づくレーザーであるポラリトンレーザー実現の候補として、GaN系の多重量子井戸を考えた.しかし、井戸ごとに組成揺らぎが生じ、異なる井戸同士のポラリトン結合を妨げることが障害になることが予想された.そこで、本研究では、直径100nm程度の柱状結晶であるナノコラムを用いることでそれを解決しようと計画した.しかし、現実にはポラリトン結合の確認には至らず、コラムという形状に起因する光学特性の研究に集中した.GaNナノコラムは通常の薄膜やバルクに比べて非常に良く光るが,その原因はコラム側面からのポラリトン発光が寄与していることが判明した.また,励起子の束縛エネルギーはバルクと変わらないのに,励起子分子の束縛エネルギーが大きくなっていることを見いだした.直径100nm程度という大きさでは電子系は1次元ではないが,励起子分子の大きさになるとこの程度の直径でも閉じこめ効果を受けることがわかった.InGaN/GaNナノコラムでは,InGaNを量子ディスクとして挿入したものと,InGaNのナノコラムにしたものとを比較した.InGaNナノコラムでは,バルクと同じ広く分布した束縛励起子からの発光が現れたが,量子ディスクの方では,単一の束縛状態からの発光が確認された.このことは,一つのInGaN/GaNナノコラムは単色で発光していることを意味しており,今後の発光デバイスへの応用に関して重要な情報をもたらした.新しい原理に基づくレーザーであるポラリトンレーザー実現の候補として,GaN系の多重量子井戸がある.しかし,現状では,以下の問題点が存在する.1.多重量子井戸全体にまたがる貫通転位が存在する.2.井戸とバリアの格子不整合のためにピエゾ電界が生じ,励起子の振動子強度を低下させる.3.井戸ごとに組成揺らぎが生じ,異なる井戸同士のポラリトン結合を妨げる.この3つの問題点のうち,「1」と「2」は,GaNをナノコラムにすることで克服できている.したがって,本研究では,「3」に重点を絞って研究を進める.すなわち,本研究課題の目的の第一は,「GaN多重量子井戸ナノコラムにおいて井戸垂直方向に光を介した励起子間の輻射結合,すなわちポラリトン結合が実現することを確認する」ことである.その目的に向かって,平成18年度はポラリトン結合の特徴を見いだすための実験をいくつか行った.しかし,残念なことに,そのような特徴を見いだすことはできなかった.その理由として,ナノコラムという幾何学的特徴に起因する光物性が予想していた以上に複雑であったことが挙げられる.GaNナノコラムの幾何学的な光学特性の特徴として,以下のことが判明した.1.ナノコラムの直径が小さくなると,コラム表面の効果が大きくなり,側面からの発光が顕著になる.その結果として,通常はc軸に垂直方向に双極子モーメントを持つA励起子しか観測されないが,側面から光るB励起子,およびC励起子が観測にかかるようになる.つまり,ナノコラムの発光では,側面からの成分を十分に考慮する必要がある.2.GaNのA励起子が2個束縛した励起子分子の束縛エネルギーは通常56meVであるが,ナノコラムでは10meV以上と大きいことが判明した.励起子分子の大きさは10nm程度と予想され,コラムの直径は100nm以上あるので,量子閉じこめが効いている領域ではない.それにもかかわらず,束縛エネルギーが大きいということは,見かけ上の大きさよりも小さいポテンシャルがあることを示唆している.新しい原理に基づくレーザーであるポラリトンレーザー実現の候補として,GaN系の多重量子井戸を考えた.しかし,井戸ごとに組成揺らぎが生じ,異なる井戸同士のポラリトン結合を妨げることが障害になることが予想された.そこで,本研究では,直径100nm程度の柱状結晶であるナノコラムを用いることでそれを解決しようと計画した。しかし,現実にはポラリトン結合の確認には至らず,コラムという形状に起因する光学特性の研究に集中した.

GaNナノコラムは通常の薄膜やバルクに比べて非常に良く光るが,その原因はコラム側面からのポラリトン発光が寄与していることが判明した.また,励起子の束縛エネルギーはバルクと変わらないのに,励起子分子の束縛エネルギーが大きくなっていることを見いだした.直径100nm程度という大きさでは電子系は1次元ではないが,励起子分子の大きさになるとこの程度の直径でも閉じこめ効果を受けることがわかった.InGaN/GaNナノコラムでは,InGaNを量子ディスクとして挿入したものと,InGaNのナノコラムにしたものとを比較した.InGaNナノコラムでは,バルクと同じ広く分布した束縛励起子からの発光が現れたが,量子ディスクの方では,単一の束縛状態からの発光が確認された.このことは,一つのInGaN/GaNナノコラムは単色で発光している)とを意味しており,今後の発光デバイスへの応用に関して重要な情報をもたらした.
海洋コンクリート中の鉄筋腐食分布の空間構造評価に関する研究

本研究では、海洋コンクリート中の鉄筋を対象に、腐食分布の異方性や偏在などの空間構造を評価することを目的として現地調査および劣化促進実験を行い、種々の部材内異方性および部材間異方性等の腐食現象の局所化・偏在メカニズムおよびその発生条件を解明する。また、鉄筋腐食の局所化や偏在を再現したRC部材の載荷実験および数値解析の結果を踏まえて、構造物や部材の構造性能評価手法についての検討を行い、腐食分布の空間構造の違いが構造物や部材の破壊モードや構造的危険度に及ぼす影響についても考察する。初年度は、港湾構造物(桟橋上部工)から採取した鉄筋の腐食分布を計測し、鉄筋腐食の局所化を定量化した。また、このような鉄筋腐食の局所化がRC部材の構造性能に及ぼす影響を載荷実験により明らかにした。さらに、電食により鉄筋を促進的に腐食させた試験体を製作し、載荷実験および劣化分析実験を通して、実環境下における鉄筋腐食との違いに着目した考察を行った。後年度は、前年度までに明らかとなった鉄筋腐食の局所化・偏在がRC構造物や部材の構造性能に及ぼす影響の程度を検討するため、腐食の局所化・偏在を再現したとモデル試験体を作製し、載荷実験および数値解析を行った。これらの結果に基づいて、鉄筋腐食の局所化・偏在が生じたRC構造物や部材の構造性能評価手法を提案した。これら2年間に得られた知見に基づき、海洋環境下にあるRC構造物の防食、すなわち劣化の進行を抑制する場合に、鉄筋腐食の局所化・偏在の取り扱いについての検討を行い、現状の防食方法(劣化進行抑制方法)に対する改善案の提案を試みた。これらの成果を総合的に考察し、腐食分布の空間構造の違いを加味して、海洋環境下に建設されるRC構造物のライフサイクルマネジメントに基づく維持管理の手法について取りまとめ、提案した。本研究では、海洋コンクリート中の鉄筋を対象として、腐食分布の空間構造(異方性や偏在など)を評価することを目的として、港湾構造物を対象とした現地実態調査および劣化促進実験により、種々の部材内異方性および部材間異方性等の腐食現象の局所化・偏在メカニズムおよびその発生条件を解明することを第一の目的とする。また、鉄筋腐食の局所化や偏在を再現した鉄筋コンクリート(RC)部材の載荷実験および数値解析の結果を踏まえて、構造物(部材)の構造性能評価手法についての検討を行い、腐食分布の空間構造の違いが構造物(部材)の破壊モードや構造的危険度に及ぼす影響についても調べる。平成18年度は、海洋環境下にあるRC構造物の鉄筋腐食の局所化・偏在について、港湾構造物における現地実態調査、劣化促進手法に基づく再現実験を実施した。港湾構造物(桟橋上部工)から採取したRC部材を解体して鉄筋を取り出し、その腐食分布を計測することで、鉄筋腐食の局所化を調べた。また、このような鉄筋腐食の局所化がRC部材の構造性能に及ぼす影響を載荷実験により検討した。さらに、鉄筋腐食の促進試験として電食試験を実施し、コンクリート中の鉄筋を腐食させた試験体を製作した。これらの試験体の載荷実験および劣化分析実験を行うことで、実環境下における鉄筋腐食との違いに着目した検討を行った。本研究では、海洋コンクリートの中の鉄筋を対象に、腐食分布の異方性や偏在などの空間構造を評価することを目的として、港湾において長期間供用されている鉄筋コンクリート(RC)構造物を対象とした現地実態調査および劣化促進実験により、種々の部材内異方性および部材間異方性等の腐食現象の局所化・偏在メカニズムおよびその発生条件を解明する。

平成19年度は、前年度までに明らかとなった鉄筋腐食の局所化・偏在がRC構造物や部材の構造性能に及ぼす影響の程度を検討するため、モデル試験体の載荷実験および数値解析を行った。その際、モデル試験体は鉄筋腐食の局所化・偏在を劣化促進実験により忠実の再現したとともに、数値解析では、上記のモデル試験体を対象とし、腐食した鉄筋とコンクリート間の付着劣化のモデル化を試みた。これからの結果に基づいて、鉄筋腐食の局所化・偏在が生じたRC構造物や部材の構造性能評価手法を提案した。2ケ年にわたり得られた知見に基づき、海洋環境下にあるRC構造物を防食、すなわち劣化の進行を抑制する場合に、鉄筋腐食の局所化・偏在の取り扱いについての検討を行い、現状の防食方法(劣化進行抑制方法)に対する改善案の提案を試みた。その際、コンクリート中の鉄筋腐食の空間的不均一性が腐食ひび割れ発生限界に及ぼす影響についても検討を行った。これらの成果に基づき、海洋環境下に建設されるRC構造物のライフサイクルマネジメントに基づく維持管理の手法について取りまとめ、提案した。
G蛋白共役型オーファン受容体を利用した新規消化管ホルモンの検索に関する研究

本研究では、消化管組織に存在するオーファン受容体に対するリガンドを分離同定し、また、その生理機能を解明する。我々は、オーファン受容体APJに対するリガンドとして新規消化管ホルモン、アペリンを同定した。本研究では、アペリンの消化管における生理作用を検討し、アペリンが腸内分泌細胞からコレシストキニン(CCK)を低濃度で遊離すること、腸由来のSTC-1細胞からもCCKを遊離することを見いだした。また我々は、アペリンが血圧を低下させ、NO由来の血中NOx濃度を上昇することを見いだした。さらに我々は、アペリンの延髄腹外側領域の投与が血圧を上昇させ心拍数を増加させることを見いだした。これは、アペリンが循環中枢ニューロンを刺激し、昇圧、頻脈応答を誘発したものと考えられた。アペリン抗体による免疫染色では、延髄腹側表面に顕著なアペリン染色が観察された。また、我々は脂肪細胞におけるアペリンの遺伝子発現とその発現調節について検討した。マウス分離脂肪細胞では、アペリンおよびAPJmRNAの発現が認められた。そして、アペリンmRNAレベルが3T3L1細胞の分化誘導2日目から増加し、6日目には未分化細胞レベルの3.9倍に達することを見いだした。3T3L1脂肪細胞におけるアペリンmRNA発現はインスリン濃度依存性に増加し、デキサメタゾン濃度依存性に低下した。これらの結果は、脂肪細胞においてアペリンmRNAの発現がインスリンおよびグルココルチコイドによって調節されていることを示唆している。一方、我々は、ヒト肺癌細胞においてボンベシンレセプターサブタイプ3(BRS-3)の活性化によるラミニン依存性接着に対する効果を検討し、そのシグナル伝達に関する研究を行った。BRS-3の内因性リガンドは未だ同定されていないが、合成ペプチド[D-Phe^6,β-Ala^<11>,Phe^<13>,Nle^<14>]Bn(6-14)はBRS-3に特異的に結合してBRS-3を活性化することができる。本研究で我々は、NCI-N417肺癌細胞においてBRS-3の活性化によりfocal adhesionが形成されて接着を促進すること、その接着促進機構には細胞内カルシウムおよびチロシンキナーゼの伝達経路が関与していることなどを見いだした。また、BRS-3の活性化が肺癌細胞の細胞外基質への接着および遊走を促進し、がん細胞の浸潤や転移などに何らかの役割を果たしている可能性を示唆した。我々はアペリンの消化器における生理作用を検討し、アペリンが腸内分泌細胞からコレシストキニン(CCK)を低濃度で遊離すること、腸由来のSTC-1細胞からもCCKを遊離することを見いだした。

アペリンは、胃粘膜や脂肪組織から分泌されCCKを遊離する作用を有することから、レプチン分泌などを介した摂食調節因子として消化器と脂肪組織からのシグナルを脳に伝達してエネルギー代謝のバランスに生理的役割を担っている可能性を検討している。また我々は、アペリンの添加でNO由来の血中NOxの濃度が5-40μMほど上昇することを見いだした。アペリン36は、アペリン12より弱い血圧降下作用を有するにもかかわらず、アペリン12と同程度にラットの血中NOx濃度を上昇した。アペリンは動脈内皮に局在し血圧降下作用を有することから、アペリンがeNOSを活性化し一酸化窒素(NO)を産生する可能性が考えられた。そこで我々は、DAF-2を用いた直接蛍光法を用いてNOの放出を測定したところ、アペリン12が冠動脈血管からNOを放出することを観察した。さらに我々は、アペリンを循環呼吸中枢に密接な関連をもつ延髄腹外側領域に投与したところ、血圧が上昇し心拍数が増加することを見いだした。これは、アペリンが循環中枢ニューロンを刺激し、昇圧、頻脈応答を誘発したものと考えられた。アペリン抗体による免疫染色では、延髄腹側表面に顕著なアペリン染色が観察されたが、近傍のニューロンにはアペリン染色細胞があまり見当たらなかった。これらの結果から循環中枢に対するアペリンの関与が示唆された。我々は、ブタの胃および腸組織抽出液からBRS-3受容体リガンドの分離精製に関する研究を行い、BRS-3受容体の内因性リガンドが分子量3000ダルトン程度のペプチドであることを見いだした。しかし、精製の過程でリガンドの著しい失活を伴うこと、また、組織中のリガンド含量が微量であることなどから、内因性リガンドの化学構造を決定するまでには至らなかった。そこで、BRS-3受容体の発現細胞および合成リガンドを用いて、BRS-3受容体の情報伝達機構および生理作用の解明に関する研究を行った。その結果、BRS-3受容体リガンドの細胞内カルシウムを介した情報伝達機構を解明し、BRS-3受容体リガンドの細胞増殖および細胞遊走における新しい作用を見いだした。一方、我々は新規生理活性物質アペリンの摂食に関する作用を検討するため、アペリン12をラット脳内に投入したところ、夜間では投入から2-4時間後に濃度依存的に摂食量が減少することを観察した。一方、昼間ではアペリン12の脳内投入によりラットの摂食量が増大することを見いだした。これらのことから、アペリン12が夜間と昼間におけるラットの摂食量を調節する脳内物質である可能性を示唆した。さらに、我々はブタ脳および腸組織からBRS-3受容体以外の新規オーファン受容体リガンドを検索するため、受容体発現細胞アッセイ法を用いて一連の精製実験を行った結果、新しいリガンドの単離に成功し、現在、その化学構造の同定に関する研究を行っている。
クラスレート化合物を利用した冷熱蓄熱に関する研究

現在、電力消費の昼夜間の不均衡を緩和するための手段の一つとして、ビルなどの空調に氷蓄熱が採用され始めている。これは、需要が少ない夜間の電気料金を昼間より安く設定し、この電力を用いて製氷を行い、昼間の冷房に使用するものである。水(氷)は身近な物質であり、安価で安全である上に、凝固・融解の潜熱が大きいという利点がある。しかし、その凝固・融解温度である0°Cは、冷房目的にはやや低過ぎ、冷凍機動力の点からは問題がある。本研究では、氷蓄熱を上回るエネルギー効率を実現するための物質として、クラスレート水和物に着目し、この物質を冷熱蓄熱材として使用する際に必要となる基礎的物性の測定を行った。諸条件を考慮した上で本研究で選択した物質は、臭化テトラ-n-ブチルアンモニウム(tetra-n-butylammonium bromide;以下ではTBABと略す)と呼ばれる有機物である。質量濃度040%のTBAB水溶液を冷却すると、O12°Cで凝固し、水和物の結晶が生成される。この温度は、水の凍結温度よりも有意に高く、冷凍機動力の大幅な低減が期待できる。なお付け加えるならば、生成された水和物結晶と残りのTBAB水溶液はスラリー状液体となり、流動性を保持する。本研究では、示差走査熱分析装置を用いて、水溶液濃度と凝固・融解温度および相変化潜熱の関係を求めた。また、相変化後の固相・液相の比率、両相の屈折率などを測定した。さらに、高倍率の顕微鏡により、水和物結晶の形態観察を行い、結晶の基本的な形態は細長い柱状であるが、生成条件によっては他の形態も取りうることを確認した。本研究が最終的に目指すところは、適切なクラスレート水和物(包接水和物)を利用することによって、現在の氷による冷熱蓄熱を上回る高効率の蓄冷システムを実現することにある。氷蓄熱は電力需要の昼夜の不均衡(とくに夏期の冷房電力による不均衡)を是正する方策として普及が進められているが、氷の場合相変化温度が0°Cとやや低すぎるきらいがある。通常の冷房に必要な冷却媒体の温度が10°C前後であることを考えると、この程度の温度で相変化する物質を用いて蓄冷ができれば、冷凍機動力を大幅に軽減でき、システム全体の効率向上が達成されることになる。本研究では、上述の目的に適う物質としてクラスレート水和物に着目し、冷熱蓄熱材として使用する際に必要となる基礎的物性に着手した。諸条件を考慮して選定した物質は臭化テトラ-n-ブチルアンモニウム(tetra-n-butylammonium bromide;以下ではTBABと略す)である。濃度040%のTBAB水溶液を冷却すると、012°Cで凝固しクラスレート水和物の結晶が生成される。本研究ではまず水溶液濃度と凝固・融解温度、密度、粘性率の関係を測定によって明らかにした。また、示差熱分析装置を用いてクラスレート水和物生成・融解時の潜熱を測定した。さらに、高倍率の顕微鏡により水和物結晶の形態を観察し、結晶が細い円柱状であること、また結晶はある程度の大きさ以上には成長せず、スラリー状となることを確認した。本研究の最終目標は、適切なクラスレート水和物(包接水和物)の利用によって、現在の氷による冷熱貯蔵を上回る高効率の蓄冷システムを実現することにある。

通常の冷房に必要な冷却媒体の温度が10°C前後であることを考えると、この程度の温度で相変化する物質を用いて蓄冷ができれば、冷凍機動力を大幅に軽減でき、システム全体の効率向上が達成されることになる。本研究では、上述の目的に適う物質としてクラスレート水和物に着目し、冷熱蓄熱材として使用する際に必要となる基礎的物性の測定を行った。諸条件を考慮して選定した物質は臭化テトラ-n-ブチルアンモニウム(tetra-n-butylammonium bromide;以下ではTBABと略す)である。質量濃度040%のTBAB水溶液を冷却すると、012°Cで凝固しクラスレート水和物の結晶が生成される。本研究では示差熱分析装置を用いて、水溶液濃度と凝固・融解温度および潜熱の関係を明らかにした。また、相変化後の固相・液相の比率、両相の密度・屈折率などを測定した。さらに、高倍率の顕微鏡により水和物結晶の形態を観察し、代表的な形態は細長い柱状であるが、条件によっては別の形態も取りうること、また濃度25%以下では凝固相はスラリー状となることなどを確認した。
哺乳類初期発生における遺伝子リプログラミングとクロマチンとエピジェネティクス

今回我々はマウス卵子特異的に発現するリンカーヒストンH1fooの機能解析を行うことを目的にモルフォリノを利用してH1fooの発現阻害を行った。BDF1マウスよりPMSG刺激後48時間にてGV卵を回収し、H1fooに対するモルフォリノをマイクロインジェクションした。マイクロインジェクション後時間を追って免疫染色およびウエスタンブロッティングにてH1foo蛋白量の変化を観察したところ逆相補配列をもつコントロールのモフォリノをインジェクションした卵にくらべてH1fooが減少していることがわかり、40時間以上たっと免疫染色およびウエスタンブロッティングにてH1fooは検出されなくなった。そこでモルフォリノによりH1fooをノックダウンした卵をin vitro maturationさせて第1極体の放出による成熟率を検討した。その結果、コントロールにくらべノックダウン卵では有為に成熟率が低い傾向が得られた。但し、成熟した卵を単為発生させた場合、前核形成率でみた発生率に関してコントロールとの間に差はみられなかった。また、リコンビナントH1fooをMPF(Maturation Promoting Factor)の活性中心であるリコンビナントcdc2/cyclinBと放射性同位元素によってラベルしたATPと反応させることによって、H1fooがin vitroでリン酸化されるかどうか検討した結果、H1fooがMPFによってリン酸化された。以上の結果よりH1fooが卵成熟、すなわち減数分裂の過程で機能していることが強く示唆された。今回我々は、標的遺伝子のmRNAに相補鎖を形成するモルフォリノアンチセンスオリゴ(モルフォリノ)を卵子内にマイクロインジェクションすることで、特異的な蛋白質の翻訳阻害効果を検討した。すでにゼブラフィッシュやカエルでは卵子や初期胚にモルフォリノをマイクロインジェクションすることによって遺伝子機能解析を行った報告が多数なされているが、哺乳類卵子においてモルフォリノのマイクロインジェクションを行った報告はほとんどない。我々はマウス卵子特異的に発現するリンカーヒストンH1fooの機能解析を行うことを目的にモルフォリノを利用してH1fooの発現阻害を行った。マイクロインジェクション後時間を追って免疫染色およびウエスタンブロッティングにてH1foo蛋白量の変化を観察したところ逆相補配列をもつコントロールのモフォリノをインジェクションした卵にくらべてH1fooが減少していることがわかり、40時間以上たつと免疫染色およびウエスタンブロッティングにてH1fooは検出されなくなった。そこでモルフォリによりH1fooをノックダウンした卵をin vitro maturationさせて第1極体の放出による成熟率を検討した。今後レスキュー実験を含めモルフォリノによる発現阻害の特異性について更に検討する必要はあるが、H1fooが卵成熟、すなわち減数分裂の過程で機能していることが強く示唆された。本研究では、卵子の成熟化機構におけるH1oo蛋白の役割を明らかにするために、H1ooとCSF (Cytostatic factor), MPF (Maturation promoting factor)との関連について検討を加えた。大腸菌発現ベクターにH1ooの翻訳領域をクローニングし、リコンビナント蛋白を作成する。作成されたH1oo蛋白は、C末端に追加されたヒスチジンのエピトープにより、ニッケルレジンカラムで精製し実験に使用した。リコンビナントH1ooを受精前後の卵子抽出物やMPF (Maturation Promoting Factor)の活性中心であるリコンビナントcdc2/cyclinBと放射性同位元素によってラベルしたATPと反応させることによって、H1ooが実際にリン酸化されるかどうか検討する。また、過排卵により回収されたマウス卵子及びマウス初期胚を使用し、抽出蛋白を抗H1oo抗体で免疫沈降することによって卵子成熟・初期発生の各時期でのH1oo蛋白を回収する。

回収したH1oo蛋白をpolyacrylamideゲルにて泳動し、セルロース膜にブロッティングした後、抗H1oo蛋白抗体でのリン酸化の卵子成熟・初期発生における変化を検討した。その結果、卵子抽出物やリコンビナントcdc2/cyclinBによってH1fooがリン酸化されることが明らかとなった。また、GFP-H1oo,GFP-H1c恒常発現3T3細胞を作成し、核蛋白抽出キット(Pierce)を使用して、核蛋白を抽出し、抗体アレイを使用し、核蛋白をアレイに結合させ、さらに抗GFP抗体でアレイ上に残った蛋白と結合しているGFP-H1oo,GFP-H1c蛋白を検出した。実際に細胞周期関連蛋白や細胞死関連蛋白がH1fooと蛋白相互作用を有することが明らかとなり、H1fooが細胞周期における重要なレギュレーターであることが示唆された。
加齢黄斑変性における脈絡膜新生血管発生と網膜細胞障害の機序解明と臨床への応用

本年度は、マウス実験的脈絡膜新生血管(Choroidal Neovascularization: CNV)における、High-mobility group protein B1 (HMGB1)の関与解明を目的とした。1.マウス実験的CNVにおけるHMGB1の過剰発現の確認.麻酔下でC57BL6Jマウスの眼底にレーザーを行い、CNVを作成した。レーザー施行後、12時間、1日、3日、7日後に眼球を摘出し、網膜と網膜色素上皮-脈絡膜複合体に分離し、それぞれのサンプルを使って、ELISA法あるいは、ウェスタンブロッテイング法でHMGB1の過剰発現を確認した。対照は、レーザーを施行していない眼球とした。2.抗HMGB1抗体によるマウス実験的CNVの抑制効果の検証.麻酔下でC57BL6Jマウスの眼底にレーザーを行い、実験的CNVを作成、その直後にマウスの硝子体内に抗HMGB1抗体を注射した。反対眼にはアイソタイプの抗IgG抗体を対照として同様に注射した。レーザーと硝子体注射6日後にフルオレセイン蛍光眼底造影検査(FA)を行い、CNVの活動性を対照群と比較した。また7日後に眼球摘出し、網膜色素上皮-脈絡膜のフラットマウントを作成し、FITC標識レクチンでCNVを染色し、共焦点顕微鏡でCNVの画像を撮影し、ImageJソフトウェアでCNVの体積を測定し対照と比較した。抗HMGB1抗体を投与したものでは、有意にCNVの活動性とサイズが抑制されていることが確認できた。実験を担当していた大学院生が関連病院に出向になり、動物実験に充分な時間を確保することが困難になっているため。大学院生、実験助手の確保など、人員の補充に取り組む。(理由)物品購入の際に端数が生じた。(使用計画)物品費として使用する。