hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
コーパス分析に基づく英語法助動詞と法副詞の研究と英語教育への応用

助動詞や副詞などのモダリティ表現(可能性や必然性などについて話し手、書き手の心的態度を表す言語表現)は、コミュニケーション活動において重要な役割を果たす。しかしながら、モダリティ表現を習得して、それらを言語の使用目的や状況に合わせて適切に使用することは、EFL/ESL学習者には、非常に難しいとされる。本研究では、大規模英語母語話者コーパスと学習者コーパスの分析に基づき、日本人英語学習者の確信度や丁寧さを表す助動詞と副詞の使用傾向を調査し、平成30年告示の新高等学校学習指導要領の記述も参照しながら、助動詞や副詞を用いて効果的なコミュニケーションを図るための指導内容を提案することを目指す。
細胞内在化機能を有する抗体を利用した安定かつ無毒性生体内イメージング技術

抗モータリン抗体の細胞内在化特性を診断や運搬に応用するために、抗モータリン抗体を作製し、機能を解析した。内在化能を持つ抗体と持たない抗体では、異なるエピトープを有していた。内在化の機序を複数の阻害剤で調べた結果、ナイスタチンにより最も強く阻害されたことから、脂質ラフトを介するエンドサイトーシスの関与が示唆された。さらに、三つのラフト経路の阻害剤を用いて調べた結果、内在化はダイナミン阻害剤で強く阻害される一方で、カベオリン-1阻害剤とCDC42阻害剤には弱い効果を示した。これらにより、抗モータリン抗体の細胞内在化は、ダイナミンとカベオリンに依存性のエンドサイトーシスの関与が大きいと結論した。本研究は、幹細胞、再生医療、診断の研究分野において、広い応用性のあるイメージング技術を開発することを目的としている。当研究室で見出したモータリン抗体は細胞内在化の性質を持つことから、in vitro、in vivoを問わず、遺伝子導入やイメージング実験の強力なツールとなることが予想される。しかし、モータリンを抗原とする全ての抗体がこの性質を示すわけではなく、特異性と抗体価が同じでも内在化しない抗体があるため、高い細胞内在化機能を有するモータリン抗体の作製が必要である。そこで、初年度、より内在化効率の高いモータリン抗体を得るために、モータリンに対する新しいポリクローナルおよびモノクローナル抗体の作製に着手した。Hisで標識化した組換えモータリンタンパク質をバクテリア内で発現させ、NTAアガロースを用いて精製した。タンパク質の純度は、SDSゲルにより確認し、単一バンドを有する高純度のタンパク質をウサギおよびマウスへの免疫に使用し、モータリンに対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の作製に成功した。これらの抗体のヒト細胞モータリンに対する反応性をウェスタンブロッティングおよび免疫染色により検討し、高い特異性を確認した。また、細胞内在化機能を検討したところ、新規に作製したポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、過去に作製した細胞内在化抗体と同様、培養液に加えるだけで内在化する特徴的な機能が確認された。初年度の解析から、本プロジェクトにおいて作製した抗体は、過去に作製した抗体に比べ、モータリンタンパク質に対する特異性が高く、細胞内在化能も高いことが示唆された。新規抗体の細胞内在化の分子機構を解析し、モータリン抗体をナノキャリアとして用いたバイオイメージングや遺伝子導入のツール開発へと繋げていきたい。作製したモータリンモノクローナル抗体について、モータリンタンパク質の欠損変異体と合成ペプチドを用いて、各クローンのエピトープを決定した。ELISA解析の結果、モータリンのAA279-291に対応するDQALLRHIVKEFK配列がB80-M2とB80-M11クローンのエピトープであり、B80-M29クローンはAA397-409に対応するQTVQDLFGRAPSKをエピトープとすると結論した。抗体クローンにつき、6種のヒトがん細胞を用いて、細胞への内在化能を調べ、B80-M29が最も良い内在化能を示すことがわかった。がん細胞、間葉幹細胞、iPS細胞を用い、抗体に量子ドットを結合させ、ナノ運搬体としての可能性を調べた。in vitro、in vivoにおいても、これらの細胞では、長時間にわたり量子ドットによるラベルが見られた。内在化された抗体の細胞における保持時間は、3-5時間であった。抗体の内在化のメカニズムについて、エンドサイトーシスの4種の阻害剤、クロルプロマジンとサイトカラシンB、Mβ-CD、ナイスタチン、EIPAを用いて調べた。抗体の内在化はナイスタチンにより最も強く阻害されたことから、脂質ラフトを介するエンドサイトーシスが関与することが示唆された。ラフトが関与する抗モータリン抗体の内在化につき、(1)ダイナミンとカベオリンに依存、(2)ダイナミン依存性でカベオリン非依存性、(3)ダイナミン非依存性かつCDC42依存性、の三つのラフト経路の特異的な阻害剤を用いて調べた。これにより、内在化はダイナミンの阻害剤、ダイノールで強く阻害されることがわかった。一方、カベオリン-1阻害剤であるダイゼインとCDC42阻害剤ML141は弱い効果を示した。これらにより、抗モータリン抗体の細胞内在化には、ダイナミンとカベオリンに依存性のエンドサイトーシスの関与が大きいと結論した。本年度、新規に作製した細胞内在化抗モータリン抗体のエピトープ解析を2つの方法により行った。まず、V5タグモータリン欠損変異体を哺乳類細胞内で発現させ、細胞溶解液をモータリン抗体で免疫沈降した。これにより、抗モータリン抗体への結合に必須の80アミノ酸を同定した。

次に、バクテリアを用いてHisタグ付組換えモータリンの欠損変異体を作製し、NTAアガロースで精製した。標準化した精製条件により、SDSゲル上で単一バンドの高純度タンパク質を得た。Hisタグ組換え変異モータリンタンパク質を基質とし、新規抗体を用いてELISA解析を行い、246-330及び375-415アミノ酸残基を含む2つの候補エピトープ領域を同定した。次年度、これらの領域からペプチドを化学合成し、最終的なエピトープを決定する。また、候補エピトープの1つに対する単鎖抗体を、バクテリア内で発現するHisタグ付き組換えタンパク質を作製することにより得た。この単鎖抗体のモータリンタンパク質に対する反応性を、ウェスタンブロッティングにより調べた。この単鎖抗体は、モータリンタンパク質に対し高い反応性を有したが、細胞内在化能は優れていなかった。これらのデータから、ウサギあるいはマウスにおいて生成された従来型の抗体が、より高い細胞内在化能を持つという結論に至った。今後、細胞内在化のメカニズム解明により、従来の単鎖抗体の細胞内在化におけるこのような差の原因を明らかにする。さらに、抗体の細胞内内在化効率を2つの方法により調べた。1つは、抗体をがん細胞培養液中に添加し、6-24時間培養後、2次抗体で染色した。2つ目は、Qdotsを結合させた抗体を細胞培養液に添加し、6-24時間培養後、顕微鏡下で観察した。本研究で得られたポリクローナル抗体及び3つのモノクローナル抗体のうち1つのクローンについて、両方法により細胞内在化が明らかになった。モータリンタンパク質に対し特異性が高く、細胞内在化特性を有するポリクローナルおよびモノクローナルの抗モータリン抗体を得ることができた。新規に作製した抗体は、高い細胞内在化能を有しており、イメージングに利用できる有用な抗体を作製することができたと考えられる。本年度、イメージングや遺伝子導入におけるモータリン抗体の利用を学会や誌上等で発表し、社会に発信することもできた。25年度が最終年度であるため、記入しない。我々は、細胞内在化特性を有する新規抗体を大量培養、精製し、新規クローンの分子特性解析を成し遂げた。新規抗体のエピトープは約100アミノ酸まで絞り込むことができた。抗体の細胞内在化効率および経時的研究も順調に進んでいる。新規に作製した抗体のエピトープおよびパラトープ解析を進める。さらに、抗体の細胞内在化について、様々なヒトがん細胞株を用いて検討する。新規に作製した抗モータリン抗体のエピトープを決定する。がん細胞、間葉幹細胞iPS細胞を標識するプロトコールを確立する。阻害剤を用いたアプローチにより抗体内在化のメカニズムを調べる。
持続型アンチmiRNA創薬の開発と心疾患治療薬への展開

相補的な2本鎖DNA間を脱塩基部位でクロスリンク(CL)する方法が、2本鎖RNA、2'-O-methyl RNA(MeRNA)に対しても有効であることをはじめに実証した。続いて、CL2本鎖構造は隣接する1本鎖における相補鎖とのハイブリを高度に安定化することを見出した。この性質に基づき、MeRNAから成るCL2本鎖を、miRNAに相補的な配列の両末端または一方のみに有するanti-miRNAoligo (AMO)を合成した。両末端にCL2本鎖を導入したAMOは従来型AMOよりも高い抑制活性と持続的効果を示すこと、またそれぞれの末端のCL2本鎖はAMOにおいて異なる役割を有することを見出した。1)2本鎖RNAの末端部位での架橋:2本鎖RNA(20 mer)の向い合う5'と3'末端同士を2価のアミノ基またはアミノオキシ基の架橋剤(クロスリンカー)で化学的に結合させるために、RNAの5'末端に5'-アミダイトRNAを用いて5'-5'結合を有するRNAを合成した。続いて、2本鎖RNAを過ヨウ素酸酸化し、過剰の過ヨウ素酸を除去した後、クロスリンカーによる連結を試みた。反応の結果、2本鎖RNA間が連結されたことを確認した。これは、5'-5'結合RNAの5'末端と相補鎖の3'末端がともに酸化されてアルデヒド基を生成し、それらがクロスリンカーで架橋されたことを意味しており、新しいタイプの架橋化反応が同手法で可能であることを確認した。2)2本鎖RNAの内部配列での架橋:相補的なRNAまたは2'-OMe化RNAの中央にデオキシウリジン(dU)を有するRNAを合成後、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)で処理し、生じたAP site間をクロスリンカーで架橋可能かどうかを調べた。反応の結果、RNAおよび2'-OMe化RNAのいずれの場合でも架橋体が得られることを確認した。4)細胞アッセイシステムの構築:合成したアンチmiRNAオリゴ(AMO)のmiRNA抑制活性を細胞内で評価するために、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の停止コドンの下流にmiRNA(miR-21)の結合配列を導入し、miRNA検出ベクターを構築した。続いてこのべクターを培養細胞に導入し、24時間後にルシフェラーゼ活性を測定したところ、細胞内のmiR-21によってウミシイタケルシフェラーゼの活性が抑制されることを確認した。また、この評価系を利用して市販のAMOのmiR-21抑制効果を確認した。1)2本鎖RNAの架橋化反応2本鎖DNAの相補的な部位に脱塩基部位を生成させ、それらを2価の架橋化試薬によって連結する反応を以前に開発していた。同架橋化反応が、2本鎖RNAに対しても有効かどうかを調べた結果、RNA鎖中にも脱塩基部位を形成させ、架橋化も可能であることを明らかにした。しかしながら、架橋されたRNAは保存期間中にわずかに分解が見られ、架橋化DNAよりもやや不安定である可能性が示された。そこで2'-O-methyl RNAの2本鎖に対する架橋化反応を行い、DNA、RNAと同様に脱塩基部位の生成とその架橋化が可能であることを確認した。2)架橋化2本鎖構造を有するDNAおよび2'-O-methyl RNAの熱力学的安定性の解析RNAと相補的な配列を有するDNAが、RNAとの結合配列に隣接して架橋化2本鎖構造を有する場合、RNAとの結合がどのような影響を受けるかどうかを調べた。実験の結果、ハイブリ領域に隣接して通常の2本鎖構造を有するDNAは、1本鎖のDNAと同じ融解温度(Tm)を示した。一方で、架橋化2本鎖構造を隣接部に有するDNAは、標的RNAとの結合を高度に安定化することを明らかにした。またこの安定化効果は、2'-O-methyl RNAにおいても同様に保持されることを見出した。がん化した細胞において多く発現していることが知られているmiR21と相補的な配列を有する2'-O-methyl RNAの両末端に、架橋化2'-O-methyl RNAを結合させた核酸を合成し、細胞内におけるmiR21の抑制活性を調べた。実験の結果、架橋化2本鎖構造を有する核酸では、通常の2本鎖構造あるいは1本鎖構造のみの核酸よりも高い抑制活性を有することを明らかにした。昨年度までに、DNAおよびMeRNAのCL2本鎖が、隣接する1本鎖上におけるRNAとのハイブリを高度に安定化する特性を有することを明らかにした。はじめに安定化効果がDNAに対しても発揮されるかどうかを確認したところ、通常の1本鎖MeRNAではDNAに対するハイブリの安定化は確認されなかったが、CL2本鎖を有するMeRNAは高い安定性を示すことを明らかにした。これはCL2本鎖による安定化効果が1本鎖MeRNAにも作用し、その性質を変化させたことを示唆している。昨年度までに、MeRNAで合成したmiRNAとの相補的配列の両末端にCL2本鎖構造を導入したAMOが、miRNAの作用を効果的に抑制することを明らかにした。今年度、miRNAの5'側、3'側それぞれに単独でCL2本鎖を有するAMOを合成し、HeLa細胞内におけるmiRNA抑制活性を評価した。細胞導入後48時間の抑制活性を調べたところ、5'CL体と3'CL体とで活性が大きく異なるなど、構造活性相関が有ることを見出した。また、それぞれのAMOが、RISCとの複合体に結合していることも、免疫沈降とノーザンブロットによって確認した。

H27年度は、CL2本鎖の有する隣接ハイブリの安定化効果とそれを利用したmiRNA阻害核酸(AMO)の開発を進め、それぞれに関して新たな知見を得ることができた。特にCL2本鎖含有AMOの開発においては、CL2本鎖の導入部位が抑制活性に大きく影響することなど、予想外の結果を得ることができ、特許に関して国内優先権出願も行った。そのため、H27年度の本研究課題は概ね計画通りに進んでいると考えた。昨年度までに、DNAおよびMeRNAのCL2本鎖が、隣接する1本鎖上におけるRNAとのハイブリを高度に安定化することを明らかにした。H28年度では、CL2本鎖を有する1本鎖プローブと標的RNAとのハイブリの融解温度から熱力学的パラメータを算出し、安定化効果を詳細に解析した。実験の結果、CL2本鎖は隣接1本鎖におけるハイブリにおいてエントロピーの低下を抑制する効果を有し、それによってハイブリを安定化していることを明らかにした。昨年度までに、miRNAとの相補的配列の両末端にCL2本鎖構造を導入したAMOが、miRNAの作用を効果的に抑制すること、ならびにその5'および3'末端それぞれに導入されたCL2本鎖の、miRNA抑制活性における役割が異なることを見出した。これらの結果はいずれも、miR-21に対する効果で評価していたため、H28年度においてはmiR-21以外のmiRNAに対するAMOの効果を調べた。miRNAとしてmiR-16およびlet-7cを選択し、それぞれに対するCL2本鎖含有AMOを複数種類合成し、HCT116ならびにHeLa細胞を用いて各AMOの阻害効果を調べた。実験の結果、それぞれのmiRNA阻害においても、CL2本鎖の有効性は同様に観察され、CL2本鎖は他のmiRNAの阻害にも有効な構造であることを確認した。これらの結果より我々は、CL2本鎖が核酸分解酵素に対する耐性の向上と、ArgonauteのN-domain側との相互作用を介することでmiRNAに対する高い親和性を発現する分子機構を提案するに至った。相補的な2本鎖DNA間を脱塩基部位でクロスリンク(CL)する方法が、2本鎖RNA、2'-O-methyl RNA(MeRNA)に対しても有効であることをはじめに実証した。続いて、CL2本鎖構造は隣接する1本鎖における相補鎖とのハイブリを高度に安定化することを見出した。この性質に基づき、MeRNAから成るCL2本鎖を、miRNAに相補的な配列の両末端または一方のみに有するanti-miRNAoligo (AMO)を合成した。両末端にCL2本鎖を導入したAMOは従来型AMOよりも高い抑制活性と持続的効果を示すこと、またそれぞれの末端のCL2本鎖はAMOにおいて異なる役割を有することを見出した。架橋された2本鎖構造による隣接ハイブリの安定化効果は、当初は想定していない予想外の結果であった。そこでこの特異な現象の原因を明らかにする実験を2014年度は中心に進めた。また架橋化核酸を用いてmiRNAに対する阻害効果を、細胞を用いて評価するまでを行い、従来型のアンチmiRNA核酸よりも高い抑制活性を有するこをと確認した。これらの成果より、概ね予定通りに実験は進んでいると判断した。
アンドロゲン依存的形態形成における血管形成の意義の解明

血管形成は胚発生に必須であり、マウス生殖腺において、雄特有の血管形成は精細管形成に必須であることが知られている。一方で生殖腺に隣接し、アンドロゲン依存的雄性化を示す中腎領域における血管の性差の有無やその機能については、ほとんど報告されていない。本研究ではホルモン依存的性分化過程における血管形成の性差獲得プロセスの解剖学的基盤を明らかにしたうえで、その分子細胞学的メカニズムと意義の解明を目指す。平成29年度の解析から器官培養による血管内皮細胞の動態制御が困難と思われたため、平成30年度は血管内皮細胞の機能解析について、血管内皮特異的遺伝子組換えマウスを用いてin vivo解析を行うこととした。Cdh5Cre-ERT2マウスを導入し、レポーターラインであるROSA-tdTomatoと交配し、中腎管雄性形態形成における血管内皮細胞の機能を解析するのに適切な組換え誘導時期の検討を行った。中腎領域血管構造の性差獲得プロセスの解剖学的解析においては、性分化のごく初期において中腎血管叢(MVP)と傍大動脈隆起(PAR)に形成される血管叢との連絡様式に性差が見られ、後の静脈形成に関わる可能性が示唆される等、正常発生における解剖学的基盤が明らかになりつつある。特に、性差が見られたMVPから中腎周辺組織への血管走行については、アンドロゲンの作用を検討する為に、免疫組織化学法を用いてCD34(血管内皮)とアンドロゲン受容体(AR)の多重染色を行った。その結果、中腎管周辺間葉の内側において一部共染色を認めたが、MVPや中腎傍管側の間葉における発現の顕著な関連性は見られなかった。血管走行を忠実に再現する器官培養条件が確立できず、中腎領域における血管形成を4次元的に雌雄で比較するためのライブイメージングを行うことができなかった。一方で同条件を用いて解析予定であった、中腎管の雄性形態形成における血管形成の機能解析では、培養系に変わって、Cre/loxPシステムを応用した血管内皮細胞を遺伝的に除去することができるマウス系統を導入しており、予定通り安定供給が可能となり、現在解析中である。血管形成におけるアンドロゲンシグナルの機能解析では、性的二型を示す血管におけるアンドロゲン受容体の発現を解析した結果、血管内皮細胞は位置によってその性質(アンドロゲン応答能)を変化させる可能性が示唆された。これまでの解析より、血管形成におけるアンドロゲンシグナルの機能を解析するためには、より後期のステージに着目する必要があり、サンプル調整に時間がかかっている。中腎とその周辺領域の性分化過程における血管形成の性差獲得プロセスの解剖学的基盤について明らかになったことをまとめて論文とする。また、中腎管の雄性形態形成における血管形成の機能解析では、遺伝的血管内皮除去実験を進める。Cdh5Cre-ERT2とROSA-DTAのマウス系統を用いて、中腎領域の器官培養において血管内皮細胞を除去し、主に中腎管の雄性化を検討する。当初の予定では培養系を用いて解析することを予定していた、血管形成の性差構築におけるアンドロゲンシグナルの機能解析では、血管構造を維持したままの培養が困難と思われたため、妊娠マウスへのアンドロゲン阻害薬(フルタミド、エンザルタミド)や、アンドロゲン依存性の細胞増殖因子の阻害剤投与によるin vivo阻害実験を行こととする。場合によっては血管内皮特異的AR KOマウスを作製するためAR-floxマウスの導入も検討する。血管形成は胚発生に必須であり、胚の生存を保つのみならず、正常な形態形成において重要な機能を果たす。マウス生殖腺において、雄特有の血管形成は正常な精細管形成に必須であることが知られており、精巣決定因子(Sry)によって制御されることが知られている。平成29年度は中腎領域における血管形成プロセスを観察し、発生に雌雄差を示す血管とその形成開始時期を同定した。Flk-BAC TgマウスやCD31(血管内皮マーカー)のWhole mount immunofluorescenceと共焦点顕微鏡を用いてデータを収集し、Amiraを用いて3次元構築を行った結果、中腎血管叢(MVP)から中腎周辺組織への血管走行、MVPと大動脈との連絡様式に性差が認められ、これらはE12.5より明確になることがわかった。特に雌のMVPは傍大動脈隆起(PAR)に見られる血管叢に連絡するのに対し、雄ではこの連絡が見られなかった。胎生後期のマウス胚の解析より、このMVP-PAR連絡血管は後主静脈(後の腸骨静脈)へ連絡することがわかり、後の子宮静脈や子宮膣静脈叢の形成に寄与する可能性も示唆された。一方で、血管系発生をライブイメージングするために行った器官培養では、心臓からの血流が断たれたことによる血管の退縮が問題となり、イメージングに最適な培養方法を確立することはできなかった。Flk-BAC TgマウスやCD31(血管内皮マーカー)のWhole mount immunofluorescenceと共焦点顕微鏡を用いてデータを収集し、Amiraを用いて3次元構築を行った結果、内生殖器性分化のごく初期における性的二型を見出すことに成功した。

一方で、血管系発生をライブイメージングするために行った器官培養では、心臓からの血流が断たれたことによる血管の退縮が問題となり、イメージングに最適な培養方法を確立するに至らなかった。このため、Cre/loxPシステム(Cdh5-CreERT2マウスとROSA-DTAマウスを交配)を新たに導入し、遺伝的に血管内皮細胞を除去する系を作製することとし、マウスコロニーを作製し、現在安定した試料供給が可能となりつつある。血管形成は胚発生に必須であり、マウス生殖腺において、雄特有の血管形成は精細管形成に必須であることが知られている。一方で生殖腺に隣接し、アンドロゲン依存的雄性化を示す中腎領域における血管の性差の有無やその機能については、ほとんど報告されていない。本研究ではホルモン依存的性分化過程における血管形成の性差獲得プロセスの解剖学的基盤を明らかにしたうえで、その分子細胞学的メカニズムと意義の解明を目指す。平成29年度の解析から器官培養による血管内皮細胞の動態制御が困難と思われたため、平成30年度は血管内皮細胞の機能解析について、血管内皮特異的遺伝子組換えマウスを用いてin vivo解析を行うこととした。Cdh5Cre-ERT2マウスを導入し、レポーターラインであるROSA-tdTomatoと交配し、中腎管雄性形態形成における血管内皮細胞の機能を解析するのに適切な組換え誘導時期の検討を行った。中腎領域血管構造の性差獲得プロセスの解剖学的解析においては、性分化のごく初期において中腎血管叢(MVP)と傍大動脈隆起(PAR)に形成される血管叢との連絡様式に性差が見られ、後の静脈形成に関わる可能性が示唆される等、正常発生における解剖学的基盤が明らかになりつつある。特に、性差が見られたMVPから中腎周辺組織への血管走行については、アンドロゲンの作用を検討する為に、免疫組織化学法を用いてCD34(血管内皮)とアンドロゲン受容体(AR)の多重染色を行った。その結果、中腎管周辺間葉の内側において一部共染色を認めたが、MVPや中腎傍管側の間葉における発現の顕著な関連性は見られなかった。血管走行を忠実に再現する器官培養条件が確立できず、中腎領域における血管形成を4次元的に雌雄で比較するためのライブイメージングを行うことができなかった。一方で同条件を用いて解析予定であった、中腎管の雄性形態形成における血管形成の機能解析では、培養系に変わって、Cre/loxPシステムを応用した血管内皮細胞を遺伝的に除去することができるマウス系統を導入しており、予定通り安定供給が可能となり、現在解析中である。血管形成におけるアンドロゲンシグナルの機能解析では、性的二型を示す血管におけるアンドロゲン受容体の発現を解析した結果、血管内皮細胞は位置によってその性質(アンドロゲン応答能)を変化させる可能性が示唆された。これまでの解析より、血管形成におけるアンドロゲンシグナルの機能を解析するためには、より後期のステージに着目する必要があり、サンプル調整に時間がかかっている。性的二型を示す血管形成に関してアンドロゲンの機能を解析する。器官培養系の最適化を再度検討するとともに、in uteroにおけるアンドロゲンまたはその阻害薬の投与が血管形成に与える影響を検討する。また、アンドロゲン受容体(AR)発現細胞と血管内皮細胞(CD31)の二重染色し、これら細胞間の相互作用形態を検討する。
葉緑体mRNA転写に関わる新規制御因子の分子遺伝学・分子生物学的研究

葉緑体遺伝子発現調節においては、RNA Polymerase複合体以外にも数多くの制御タンパク質の存在が予測され、近年遺伝子の同定遺伝子の同定等が進められている。本研究は、葉緑体研究においては新規な適用であるOne hybridscreening法を用いた分子生物学的アプローチ、またアルビノ突然変異体を用いた分子遺伝学的アプローチによって、更に新規な葉緑体遺伝子発現制御因子の同定・単離および機能解析を目的とした。葉緑体ゲノム上に存在し光化学系D2タンパク質をコードするpsbDは、光応答性プロモーター上流にエンハンサー領域が存在することが知られている。そこで、この領域の結合タンパク質候補cloneをOne hybrid screening法を用いてArabidopsis cDNA libraryより単離を試みた結果、bHLHモチーフを持つ新規なタンパク質が一種同定された。この遺伝子は、in vitro実験系(One hybrid system)、in vivo実験系(GFP融合タンパク質系の蛍光顕微鏡観察、突然変異体の単離とノザン解析)により、葉緑体に移行する塩基配列特異的結合な転写活性化タンパク質であることが確認された。これは、これは世界最初の葉緑体トランスアクティングファクター単離例であり、TFPD(transacting factor of plastid psdD LRP)と命名した。タバコアルビノ変異体aliは(albino by heavy ion beam)葉緑体mRNAの発現が特異的に低下した突然変異体であることが確認されている。このゲノムDNAについてRLGS法による検討にことにより、野生型タバコゲノムには存在するものの、アルビノ変異体ゲノムにおいては欠失された標識スポットを検出することには成功した。しかし、期間内には該当スポットのクローニングには至らなかった。
アマゾン熱帯林における野生クモザルの社会構造と音声コミュニケーションの進化

野生クモザルにおける離合集散型の社会構造の実体を解明するために、2人の観察者が同時に同じ群れの異なる2個体を追跡して観察する同時2個体追跡を行った。同時に各観察者の位置をGPSを用いて記録して対象個体の位置と推定し、群れ内の2個体間距離を算出し、その分布パタンを指標として群れの集合性を定量化した。また、集合性と関連する社会的文脈において、どのような発声がなされたかを明らかにした。これらの結果をニホンザルでの先行研究と比較し、離合集散する社会における社会構造と社会性の特徴を明らかにした。クモザルは離合集散する群れを作る霊長類である。離合集散する社会の実態を明らかにすること、その社会を支える音声コミュニケーションの機能と多様性を明らかにすることを目的として、2008年夏に、エクアドルに生息するケナガクモザル1群を対象として野外調査を行った。本調査より、以下を明らかにした。(1)群れ内の個体の空間分布パタンとその時系列に沿った変化の動態を、個体間距離という指標を用いて定量的に分析した。その結果、個体間距離は0-2409mまで幅広く分布し、全体の48%が100m以内だったが、100m以上の分布がほぼ均一に見られた。また、パーティの広がりは約50mだった。(2)近距離音声のwhinnyはパーティ同士が合流した時に交わされるのに対し、長距離音声であるロングラウドコールは遠く離れた個体間で交わされた。(3)録音したロングラウドコールの音響的特性について分析を行い、個体差や性差があるのかを検討し、比較的大きな個体差があることが明らかになった。申請者らはニホンザルで同様の研究を既に行なっている。群れ型で、ほぼ同じサイズの行動域を持つの社会を持つにもかかわらず、ニホンザルとクモザルでは個体の空間分布パタンに大きな違いがあることが示された。また発声と個体間距離の関連のパタンに大きな差が見られ、2種が同種他個体との距離に関して全く異なる認識を持っていることが明らかになった。これらを量的データを持って示したのは本研究が初である。本研究の目的は、(1)霊長類の群れ内における個体の空間分布パタンをGPSを用いた同時二個体追跡を行うことによって客観的かつ量的に示すことにより、異なるタイプの社会を持つ複数の種における社会構造の量的な比較を行うこと、(2)社会構造の複雑化は、個体間の社会的場面をより多様にし、それに伴い、様々なコミュニケーション手段が進化すると考えられるため、異なる社会構造を持つ種における音声コミュニケーションの交わされ方と音声そのものに含まれる情報の量と質を検討することにある。平成20年度には離合集散型の社会を持つ野生クモザルを対象に、エクアドル・ヤスニ国立公園において2か月間の調査を行い、現地助手と共に同時二個体追跡を行った。その結果、クモザルの群れ内の個体の分布は02420mにまで及び、同じパーティ内にいる個体は42m以内にいる個体と定義づけられるのに対し、それ以上離れた個体は異なる2つのパーティにいることが明らかになるなど、個体の空間分布の詳細が明らかになった。また、群れ内の個体の音声には、基本周波数帯などの音響構造に個体差が見られることが明らかになった。これらの結果をニホンザルでの先行研究と比較すると、集合性の強い群れをつくるとされているニホンザルでも季節的に個体の空間分布パタンは変化するが、一時的な2つのパーティに分かれるサブグルーピングが見られるだけであり、300mほどの比較的広い広がりをもった群れとしての活動が基本にあるのに対し、クモザルでは50mほどの小さい広がりを持った小さなパーティとしての活動が基本にあり、日常的に、1000m以上の分散が見られるというようにその違いを量的に示すことができた。これは社会構造を量的に比較する初めての研究となった。本研究で用いた方法は、全く同じ方法で他種でも利用可能であり、霊長類の多様な社会構造を理解する上で重要な手法を確立したと言える。
表現内容規制/内容中立的規制二分論の意義と射程-制度論的根拠からの再検討

アメリカの表現内容規制/内容中立的規制二分論の根拠論を再検討し、二分論が価値論等の原理的根拠のみならず、制度的根拠によっても基礎付けられていることを確認した。そして、制度的根拠が重要な位置を占めているとすれば、制度運用の経験的検証を通じて、二分論の相対化を図ることが可能となる。これらの点を踏まえれば、日本においても二分論を過度に厳格に解することは妥当でなく、内容中立的規制にも適切な審査を及ぼしていくべきだといえる。本年度は、(1)内容規制/内容中立的規制二分論を扱う邦語文献を収集、読解し、論点整理する作業、(2)1990年までのアメリカの二分論に関する学術論文を収集、読解し、論点整理する作業、(3)1990年以降の、二分論を制度的側面から根拠付けるアメリカの学説を収集、読解し、論点整理する作業を行った。(1)については、日本の従来の二分論を性格に把握し、その問題点を明確にする目的で作業を行った。(2)は、特に日本の従来の学説が主として参照することが多かったアメリカの学説を再度検討するためのものである。そして、(3)は、22年度の中心的作業であった。ここで、90年までのアメリカの学説を洗練化し、新たに二分論を統治機関間の権限配分という制度的側面から根拠付ける学説を検討した。ここで検討したF.Schauer、L.Alexander等の学説は、アメリカ連邦最高裁の二分論の根拠をより説得的に論じるものであり、アメリカの法理の正確な理解に資するものである。わが国への二分論の応用に際しても、この流れに属する学説の理解は欠かせないとの認識から、検討を行った。日本の憲法学説が二分論を熱心に提唱してきたにもかかわらず、最高裁においてそれが表現の自由保護的に運用されることはなかった。本研究課題は、その理由を探り、今後の二分論の裁判法理としての現実化を試みることを主たる目的としている。23年度は、特に(3)の学説に対する批判説を詳細に検討し、その意義と射程をさらに明確化する。そして、わが国における二分論の改善の方向性を述べることとしたい。本年度は以下の手順で研究を進めた。(2)米国の言論の自由法理の硬質性を一般的に論じる文献、特に比較法的考察を行う文献を綿密に分析した。特に米国のSchauerの諸論文、さらに英国のE.Barendt、I.Hare、カナダのR.MoonやK.Mahoneyの諸論文等を検討した。また、これらに引用されている論文のうち、特に重要なものも収集のうえ検討した。(3)上記の作業で扱った各論文を文献管理ソフトEndnoteにまとめ、要点を抜き出し、メモにまとめた。(4)上記の米国の議論を、22年度に検討したAlexander等の二分論の硬質性を重視する議論と比較し、その相違点をまとめた。(5)22、23年度を通して検討した米国の学説を参考に、わが国の学説・判例の二分論の問題点を明確にする作業を行った。
顔の無意識的脳内表象過程を探る：知覚交代現象を用いた脳磁場反応解析

【研究の概要】本研究は、両眼視野闘争(binocular rivalry: BR)により、顔刺激と家刺激を知覚競合させ、顔の情報が入力されているが「視覚的に認知されていない」とき、また「視覚的に認知されているとき」の脳内処理機構の違いを明らかにすることを目的とした。本研究では、顔画像として、「ヒトの顔」、「サルの顔」、顔刺激のコントロール画像として「家」画像を用いて実験を行った。これら画像の組み合わせを断続的に呈示し、それぞれの刺激の認知に応じて誘発反応を計測した。脳活動は306ch全頭型脳磁場計測装置(MEG)によって計測した。またBR条件のコントロールとして単眼のみに刺激を呈示する疑似視野闘争条件(Pseudo rivalry: PR)を用いた。【2013年度の内容から大幅な実験手続きの変更を行った】A.MEGによる両眼視野闘争を用いた視覚的気付き前後で生じる顔情報処理機構の検討(周波数解析)⇒誘発反応による検討に変更B.視覚的気付き前後で生じる顔情報処理機構の機能的連関の検討(ビームフォーマーによる電流源推定を行う計画だった。)⇒最小ノルム法による誘発反応の電流源推定へ変更C.疑似視野闘争条件による顔認知特異的脳活動の検討(周波数解析)⇒2014年から中止。誘発反応による検討に変更【結果】手続きの変更の結果、有用なデータを多く取得できるようになった。本研究の結果、(1)顔認知に関連するM170の出現には視覚的な気づきが極めて重要であること(2)知覚競合状態で生じたM170にも顔の種類による潜時差が現れること(3)本研究でM170より速い成分として観察されたM130には刺激の種類による違いが見られないことが分かった。本研究の結果は英語論文にまとめ終えており、現在投稿中の状態である。また、本研究の成果はH26基礎心理学会(12月)で報告することができた。26年度が最終年度であるため、記入しない。両眼視野闘争により、知覚交代現象を生じさせ、視覚的気付き前後で変化する「顔情報」の処理機構を明らかにすることを目的とする。本研究では、顔画像として、「ヒトの顔」、「サルの顔」、コントロール画像として「家」画像を用いて実験を行う。これらの画像の組み合わせで、両眼視野闘争を生じさせ、それぞれの見えの直前、直後を比較検討し、306ch全頭型脳磁場計測装置(MEG)によって視覚的気付き前後において顔特異的な脳磁場活動が生じているかを検討する。2013年度は、「MEGによる両眼視野闘争を用いた視覚的気付き前後で生じる顔情報処理機構の検討」と「疑似視野闘争条件による顔認知特異的脳活動の検討」の実験を行うことを目的とした。申請当初の研究計画では、刺激を持続的に30秒程度呈示し、被験者の見えのレスポンスに同期して実験を行う計画だった。また、被験者による自発的な知覚の変化の解析に使用できそうだと考えた、γ帯域の活動を見るために脳磁場のデータはウェーブレット解析を用いて解析していた。2013年の8月まで上記の方法でデータを13名ほど取得し、解析を行った。しかしながら、被験者の反応のタイミングに、個人内また個人間のばらつきが大きく、周波数解析のデータを加算平均すると、知覚に関連する反応が消失し、無意識的な顔の知覚に関連する脳活動を見出すことは困難だった。この問題を解決するために、8月以降、曖昧刺激(ネッカーキューブやルビンの壺等)や両眼視野闘争刺激による知覚交代現象の実験手段として注目されている間欠的呈示法を用いることにした。現在視覚刺激を呈示する前後に生じた、視覚的気づき前後に生じている可能性のある、顔認知特異的な事象関連磁場の解析を行っている。本研究の結果、(1)顔認知に関連するM170の出現には視覚的な気づきが極めて重要であること

(2)知覚競合状態で生じたM170にも顔の種類による潜時差が現れること(3)本研究でM170より速い成分として観察されたM130には刺激の種類による違いが見られないことが分かった。本研究の結果は英語論文にまとめ終えており、現在投稿中の状態である。また、本研究の成果はH26基礎心理学会(12月)で報告することができた。26年度が最終年度であるため、記入しない。当初計画していた実験方法では、成果が得られなかったため、先述したような大幅な実験計画の変更を行った。そのため学会発表は行えなかったが、多くの質の良い研究データを得ることができた。現在得られているデータを解析したところ、従来言われていた顔認知に関連する右の後側頭部から生じる170ms付近の活動とは異なる早期の時間帯(130-140ms)の左の後相当部付近に、顔認知に関連する可能性がある成分が見られた。研究手法を大幅に変更したが、データの取得、また解析用プログラムの作成まではH25年度中に完了したため、一定の成果が得られたと考えている。被験者のレスポンスのタイミングのばらつきによる問題を解決するために、8月以降、曖昧刺激(ネッカーキューブやルビンの壺等)や両眼視野闘争刺激による知覚交代現象の実験手段として注目されている間欠的呈示法を用いることにした。この方法は、実験刺激の呈示開始に合わせて被験者の反応を解析する手法である。この手法を用いるよって、刺激呈示のタイミングに合わせた事象関連磁場を計測できるようになった。新しい実験手法に切り替えてから、2014年3月までに12名のデータを新たに取得した。現在、疑似視野闘争条件の時に誘発される事象関連磁場と、両眼視野闘争条件の時に誘発される事象関連磁場の解析中である。
子宮内膜症による骨盤内炎症が卵巣予備能に及ぼす影響に関する研究

子宮内膜症による骨盤内炎症が卵巣機能に及ぼす影響を検討した.子宮内膜症は,卵巣皮質の炎症・線維化と表層上皮の陥入・化生変化を促進し,チョコレート嚢胞の発生・進展とともに卵巣皮質における原始卵胞の恒常性維持機構を破綻させる.その機序として,原始卵胞のリクルートメントと初期発育卵胞の閉鎖が同時に亢進して卵巣予備能の低下が進行する病態(burn-out)を明らかにした.チョコレート嚢胞への外科処置は卵胞発育に影響を与え,骨盤内炎症の重症度は術後の卵巣機能の回復に関与する.これらは,骨盤での局所炎症が女性の生殖機能に持続的な影響を与え,早期の医療介入が卵巣予備能の低下を予防できる可能性を示唆している.本年度は,卵巣表層に存在する顕微鏡的な微小子宮内膜症病変が周囲の正常卵巣皮質組織に与える影響を解析し,組織炎症と卵巣予備能との関連を検討した.連続組織切片のHE染色標本から顕微鏡的内膜症病変の有無を評価し,内膜症組織や炎症細胞浸潤のある卵巣組織を選択したうえ,それらでの組織学的特徴を検討した.内膜症病変では微小血管の増生とマクロファージ浸潤およびそれらに一致してHGFの発現が認められた.内膜症病変周囲では著明な線維化に伴って卵巣表層上皮の陥入および封入嚢胞が認められた.陥入上皮は腹膜中皮の性状を維持していたが,嚢胞壁では上皮への化生が認められた.周囲皮質では間質組織の破壊と初期卵胞の閉鎖が認められた.これらは,経卵管月経血逆流により卵巣表層に付着した内膜組織が生着・進展するに従って周囲皮質では組織恒常性が消失し,初期卵胞の消失=卵巣予備能の低下につながることとを示す結果である.また,卵巣チョコレート嚢胞は表層微小内膜症病変による組織破壊・線維化と内膜症から放出されるサイトカインによる化生変化が起点となって形成されることを支持する所見である.内膜症および非内膜症コントロールから得られた腹水中のAMH,IL-6あるいはTNFa濃度を測定した.腹水中AMH濃度はコントロールに比して重症内膜症で有意に低下しており,内膜症群では腹水中AMHに年齢や末梢血AMH濃度との間に有意な相関は認められなかった.一方,内膜症では腹水中AMHとIL-6は逆相関を示す傾向が認められた.これらは,腹水中AMHが内膜症の炎症性腹腔内環境を関連していることを示唆している所見と考えられた.前年度までに得られたチョコレート嚢胞形成過程での組織炎症が周囲皮質組織に存在する初期卵胞の恒常性に与える影響は,「burn-out現象」として子宮内膜症における卵巣予備能低下の新たな病態と捉えられ,論文にまとめた.子宮内膜症による骨盤内炎症が卵巣機能に及ぼす影響を検討した.子宮内膜症は,卵巣皮質の炎症・線維化と表層上皮の陥入・化生変化を促進し,チョコレート嚢胞の発生・進展とともに卵巣皮質における原始卵胞の恒常性維持機構を破綻させる.その機序として,原始卵胞のリクルートメントと初期発育卵胞の閉鎖が同時に亢進して卵巣予備能の低下が進行する病態(burn-out)を明らかにした.チョコレート嚢胞への外科処置は卵胞発育に影響を与え,骨盤内炎症の重症度は術後の卵巣機能の回復に関与する.これらは,骨盤での局所炎症が女性の生殖機能に持続的な影響を与え,早期の医療介入が卵巣予備能の低下を予防できる可能性を示唆している.本年度は,腹腔鏡手術を受けた卵巣チョコレート嚢胞を有する女性において,疾患自身および疾患に対する外科処置が卵巣予備能に及ぼす影響を評価する目的に,腹腔鏡手術を受けた子宮内膜症および非子宮内膜症コントロールから採取した末梢血および腹水を用いて,末梢血中AMHおよび腹水中の炎症促進性サイトカイン濃度(IL-6およびTNFa)をELISA法により測定し,進行期などの子宮内膜症の臨床病理的因子やサイトカイン濃度による腹腔内炎症の程度とAMHの相関を解析した.とくに卵巣チョコレート嚢胞に対して薬物療法を施行したうえで2期的手術を受けた症例で,手術および薬物療法の前後の腹水中の炎症促進性サイトカインと末梢血中AMHの推移との関連を検討した.取得したデータは現在解析中であるが,子宮内膜症による骨盤内炎症の亢進および骨盤内臓器の癒着の進行は,末梢血AMH濃度と関連しており,これらが卵巣予備能に影響していることが推察されている.また,子宮内膜症に対する外科処置は,卵巣に対する手術操作が限定的であっても術後のAMH低下(=卵巣予備能の低下)は避けられない可能性があることが判明しつつある.一方,子宮内膜症女性から得られた卵巣皮質組織において,皮質に存在する初期卵胞の形態的評価を行い,チョコレート嚢胞を有する卵巣から得られた皮質組織では,初期卵胞のリクルートメントおよび閉鎖の亢進が認められた.これらは,免疫染色による卵胞顆粒膜細胞でのPCNA陽性率の亢進と一致していた.また,形態的に閉鎖していると判断された初期卵胞ではアポトーシスの調節蛋白である活性型カスパーゼ3の局在が認められた.これらの結果は,チョコレート嚢胞の形成過程において,卵巣皮質に存在する原始卵胞が消失する(=卵巣予備能の低下)機序を解明する端緒となる知見である.本年度は,卵巣チョコレート嚢胞に対して一期的あるいは薬物療法を併用して二期的腹腔鏡下手術を行った例を対象に,骨盤内炎症と卵巣予備能との関連を解析した.子宮内膜症では有意に腹水中IL-

6濃度が高く,それらはプロゲスチン療法により有意に低下した.血中AMHは術後3ー6ヶ月まで一旦有意に低下し,その後12ヶ月ごろまでに一定の回復を示す傾向が認められた.卵巣組織でのAMHの発現は一次卵胞から前胞状卵胞の顆粒膜細胞で最も強い発現が認められた.これらの知見は,手術による炎症や組織ストレスにより,AMHの主な産生源である初期発育卵胞が一過性に消失したのち,原始卵胞の選択・発育機構が再構築されることを示唆している.また,AMHの回復と子宮内膜症の重症度に関連が認められ,骨盤内炎症が強い例では卵巣予備能が低下し,さらに手術操作での原始卵胞の消失が著しく,術後に卵巣機能が低下することが推察された.本年度および前年度までに得られた本研究での知見をまとめる.卵巣の表層性子宮内膜症では,マクロファージの浸潤と炎症性サイトカイン産生により,周囲正常皮質の炎症・線維化ならびに表層上皮の陥入と化生変化を促進し,チョコレート嚢胞の発生・進展とともに原始卵胞の恒常性維持機構が破綻する.その機序として,原始卵胞のリクルートメントと初期発育卵胞の閉鎖が同時に亢進して卵巣予備能の低下が進行する病態(burn-out)を明らかにした.子宮内膜症と手術侵襲は原始卵胞ならびに初期卵胞の発育調節に影響を与え,骨盤内炎症の重症度は術後の卵巣予備能の回復に影響を与える.これらの知見は,骨盤での局所炎症が女性の生殖機能維持に持続的な影響を与えており,医療的な介入により卵巣予備能の低下を予防できる可能性を示唆している.一方で,炎症が原始卵胞の維持にどのような分子生物学的機序により関与しているかは不明な点が多く,今後の更なる解析が必要である.産婦人科学本年度は卵巣皮質組織における炎症関連遺伝子発現をlaser capture microdisectionにより解析する予定であったが,組織形態および組織中mRNAが適切に維持された凍結卵巣皮質組織を得ることが困難で,組織特異的mRNAの解析が遅れている.組織の凍結および切片の作成並びにlaser capture microdisectionの行程でのmRNAの質の保持が困難なところに起因する問題と考えられるので,それら手技の調整を行い実験手技の適正化が必要である.ELISAおよび免疫組織化学的手法による解析を優先的に行い,機器の調整を行いつつ実験を行っていく予定である.本年度は主に免疫組織染色とELISA法による検討を行ったが,生殖年齢(20から30代前半)の卵巣チョコレート嚢胞あるいは良性卵巣腫瘍コントロール症例で正常卵巣組織を得るためのインフォームド・コンセントの取得が困難で,検体の収集が遅れており,検体数が目標数に達していない.子宮内膜症およびコントロール症例から採取した腹水中のマクロファージ数をフローサイトメトリーで解析する予定であったが,フローサイトメーターの調整がうまくいってないためか満足のいく結果が得られていない.ひとまずELISA法および免疫組織化学的手法による解析を優先して行い,機器の調整を行いつつ実験を行っていく予定である.腹腔鏡手術を施行する子宮内膜症および非子宮内膜症コントロールから末梢血・腹水および卵巣皮質組織の収集に努め,検体数の増加を図る.腹水中あるいは組織中に発現している炎症関連蛋白(サイトカイン・ケモカイン)および組織間接着因子の発現を免疫組織化学的手法あるいはELISAを用いて追加検討を行う.
核酸クロマトグラフィーを利用した薬剤反応性予測SNP検出法の開発

現在、医薬品の効果や副作用などの反応性の一部が薬物代謝酵素などの一塩基多型(SNP)の影響を大きく受けることが明らかにされている。そこで我々は、ベッドサイドや診療現場で簡便迅速に患者の薬剤反応性遺伝子のSNP検出を行うことができるデバイス(核酸クロマトグラフィーストリップ)の構築を目指した。ストリップ上に青色のラインが検出された位置を読み取ることにより、遺伝子型を1本のストリップで検出できる。核酸クロマトグラフィーを利用して、患者のベッドサイドや外来の診療現場で簡便かつ迅速に薬剤反応性を予測する一塩基多型(SNP)検出法を開発することが本研究の目的である。現在までに開発されているSNP解析法として、PCR-制限酵素-電気泳動法、TaqMan PCR法、Hybridization Probe法、Invader法、ダイレクトシークエンス法など様々な方法が挙げられるが、これらの方法は操作の煩雑性、高額な検出機器の必要性、解析結果を解釈するための専門的な知識を必要とするため、受託解析会社や大学・研究機関に依頼して行わざるをえない。しかしながら、実際の臨床現場で遺伝子解析結果を治療に応用するためには、簡便・迅速、低コスト、解析結果の容易な解釈が可能な方法が必要とされる。そこで本研究では遺伝子多型部位を特異的に増幅する対立遺伝子特異的(Allele Specific )PCR法とSingle TagHybridizationーPrinted Array Strip(STH-PAS)法を組み合わせて、ミトコンドリアDNAの1555番目の遺伝子多型の有無を1本のストリップ上で可視化し、遺伝子型の特定を簡便かつ迅速に行う核酸クロマトグラフィー法を構築した。方法は、DNAタグ及びビオチンラベルした対立遺伝子特異的プライマーを用いてPCR法により増幅し、その産物をアビジンラベルした青色ナノ粒子を含む展開液と混合し、DNAタグと相補的な配列を持つ10塩基程度のオリゴDNAがライン上に塗布されたストリップに展開する。数分後、ストリップ上に青色のラインが検出された位置を読み取ることにより、SNPの有無を1本のストリップで検出できる。本法を用いることにより、血液のDNA精製から結果を得るまでに約2時間で検出が可能である。特に近年、抗凝固薬ワルファリンの代謝酵素であるCYP2C9と標的分子であるビタミンKエポキシド還元酵素複合体1(VKORC1)のSNPが同薬の凝固活性を予測する遺伝子多型マーカーとして注目されている。そこで、最終年度はCYP2C9の1075A>C及びVKORC1の1173C>T多型を同時に検出できる核酸クロマトグラフィー法を開発した。数分後、ストリップ上に青色のラインが検出された位置を読み取ることにより、SNPの有無を1本のストリップで検出できた。本法を用いることにより、血液のDNA精製から結果を得るまでに約2時間で検出が可能であった。研究期間全体を通じて、ミトコンドリアDNAの1555番目の遺伝子多型検出系も構築した。平成26年度は、(1)ミトコンドリアDNA 1555A>G多型を同定する対立遺伝子特異的PCRプライマーの設計、(2) Multiplex PCR条件の設定、(3)最適なDNAタグ配列の探索と核酸クロマトグラフィー展開条件の設定、(4)プライマーダイマー排除法の検討の4項目を計画した。その結果、プライマー長は20mer程度とし、オリゴDNAの3'端にSNPが位置するように設計する。また、3'端の隣の塩基をA、T、G、Cにした人為的ミスマッチプライマーを野生型及びSNP型検出プライマーをそれぞれ4種類作製し、その中から最適な1組のプライマー配列を決定できた。次に、プライマーの精製グレード(ゲル濾過、OPC精製、HPLC精製)、DNAポリメラーゼの各社製品、反応温度条件の最適条件を決定し、PCR終了後、核酸クロマトグラフィー上に展開した際の青色のバンドが明確に目視できるような展開条件(バッファー組成など)も最適化を行った。

最後にできるだけプライマーダイマーが形成されないような反応条件を設定して、この検出系が確立できた。ゲノム薬理学現段階では改善の必要がある点も存在する。ラテックスビーズを用いた検出では、感度良く検出が可能であるが、金コロイドを用いた検出よりも非特異的バンドが強い。一方、金コロイドを用いると感度は低いが、非特異的バンドの検出を回避することができる。偽陽性を防ぎ、感度の良い結果を得るためには、野生型および変異型サンプルのAllele Specific PCR増幅量をそろえることが必要である。それにより両者のそれぞれの欠点を補うことができ、より正確性の高い検出が可能になると考える。今後取り組むべき点としては、以上の点に加えて、本法の正確性の確認、唾液などの血液以外のサンプルから遺伝診断する方法の構築、DNA精製を経ずにサンプルを直接PCRし、時間短縮および簡便化することなどが挙げられる。加えて、抗凝固薬ワルファリンの代謝酵素であるCYP2C9と標的分子であるビタミンKエポキシド還元酵素複合体1(VKORC1)のSNPが同薬の凝固活性を予測する遺伝子多型マーカーとして注目されている。そこで、平成27年度はCYP2C9の1075A>C及びVKORC1の1173C>T多型を同時に検出できる核酸クロマトグラフィー法を平成26年度の検討と同様にして開発する。
振動変調ボルタンメトリー法の開発とその超微量分析への応用

く形波変調振動電極法(振動電極法)が対流変調電解法の新らたな一方法となる可能性については既に報告した。本研究では,(【I】)装置,特に電極の振動方法および差変調電流の計測方法の検討を行ない,つぎに(【II】)く形波(回転)変調円板電極法(回転電極法)としながら基礎的研究を行なった。つづいて(【III】)流れ分析における応用を試みた。その結果,(【I】)については周波数60Hzと0Hzを用いるのが最も実用的であることが確認され,差電流の計測方法については本法に開発した多重サンプリング方法が十分低雑音性であることが認められた。(【II】)の結果振動電極法によって得られた差変調電流と濃度との関係は良好で回転電極法と同等の検出限界濃度(【10^(-7)】【10^(-8)】モル1l)が得られた。さらに電極周辺における溶液の移動現象の解析を試みたが振動に伴う溶液流動が複雑で実験結果を満足する電流式は得られなかった。つぎに(【III】)の結果,本装置を用いシスチン/システインの微量分析を試みたところシスチンで【10^(-8)】モル1l,システインで【10^(-6)】モル1lの桁の分析が可能であった。さらに本法をフローインジェクション分析法と組み合わせシスチンの検出を試みたところ2×【10^(-12)】モルの検出が可能であった。以上の結果本法の特徴である微量試料による高感度分析は流れ分析の検出手法として有用なことが確認された。