hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規な金属ナノ粒子担持LDHナノシート電極触媒材料の合成

電気化学的な水の酸化反応である酸素発生反応(OER)は、リチウム空気電池の充電や水電解による水素燃料の生成など、次世代のエネルギー運用技術に関わる重要な反応の一つであるが、反応を進行させるために大きな過電圧を必要とすることが問題となっている。OERを効率的に進行させる電極触媒材料の開発が長年に渡って行われてきたが、いまだ実用化に十分な性能は達成されていない。本研究は、新規な電極触媒として層状複水酸化物(LDH)に金属ナノ粒子を担持することにより、低い過電圧でOERを進行させる金属ナノ粒子担持LDHナノシート(NPs /LDH-NSs)電極触媒を開発することを目的とする。本年度は、CoMn, NiCo, ZnCo-LDHを共沈法によって合成し、金ナノ粒子の担持を試みた。粉末X線回折測定から、合成したLDHは、全て同様のハイドロタルサイト構造を有することが分かった。金ナノ粒子を担持したNPs /LDH-NSsを、透過電子顕微鏡を用いて観察したところ、全てのLDH上において直径2-4nm程度の金ナノ粒子の担持に成功したことを確認した。合成した触媒をOERに適用したところ、金ナノ粒子を担持したCoMn, NiCo-LDHは、各々の未担持のLDHよりも低い過電圧で反応を進行させたのに対し、ZnCo-LDHは金ナノ粒子の有無に関わらず、ほぼ同様の過電圧を示した。今回合成したLDHは、全て同様の結晶構造を有していることから、金ナノ粒子による活性向上の有無は、LDHの構成金属の違いに由来すると考えられる。したがって、活性向上の発現にはLDHを構成する2価の金属イオンとしてCo2+、Ni2+が必要であることが明らかとなった。本年度は、様々な遷移金属で構成されるLDHに金ナノ粒子を担持してNPs/LDH-NSsを合成することに成功した。また、これらの触媒を用いてOERを行ったところ、金ナノ粒子の担持によりCoMn, NiCo-LDHのOER活性を向上させることに成功し、LDHへの金ナノ粒子担持が高活性化に有効な手段であることを見出した。一方で、ZnCo-LDHは担持により活性が向上しないことが明らかとなったことから、NPs/LDH-NSsにおける触媒設計の一つの指針が得られた。今回合成したLDHは全て同様の結晶構造を有しており、担持された金ナノ粒子はほぼ同様の粒径を有していたことから、金ナノ粒子担持による高活性化の有無はLDHの構成金属イオンに由来すると考えられる。すなわち、Co2+、Ni2+が高活性化に必要であるという知見が得られた。今後は、LDHを構成する金属イオンの種類をさらに検討し、金ナノ粒子による高活性化の影響を明らかにする。また、金ナノ粒子の担持量が触媒特性に与える影響を検討する。合成したNPs/LDH-NSsにおける各金属の化学状態をX線光電子分光やX線吸収微細構造測定を用いて調べると共に、金ナノ粒子担持による高活性化のメカニズムを明らかにすることを試みる。さらに、担持する金属ナノ粒子の種類を変更し、LDHのOER活性に与える影響を検討すると共に、最も高い活性を達成するLDHと金属ナノ粒子の組み合わせを明らかにすることを目指す。

一方で、ZnCo-LDHは担持により活性が向上しないことが明らかとなったことから、NPs/LDH-NSsにおける触媒設計の一つの指針が得られた。今回合成したLDHは全て同様の結晶構造を有しており、担持された金ナノ粒子はほぼ同様の粒径を有していたことから、金ナノ粒子担持による高活性化の有無はLDHの構成金属イオンに由来すると考えられる。すなわち、Co2+、Ni2+が高活性化に必要であるという知見が得られた。今後は、LDHを構成する金属イオンの種類をさらに検討し、金ナノ粒子による高活性化の影響を明らかにする。また、金ナノ粒子の担持量が触媒特性に与える影響を検討する。合成したNPs/LDH-NSsにおける各金属の化学状態をX線光電子分光やX線吸収微細構造測定を用いて調べると共に、金ナノ粒子担持による高活性化のメカニズムを明らかにすることを試みる。さらに、担持する金属ナノ粒子の種類を変更し、LDHのOER活性に与える影響を検討すると共に、最も高い活性を達成するLDHと金属ナノ粒子の組み合わせを明らかにすることを目指す。
アポプラストで作用する無機元素の生理学・生化学

本研究は,高濃度の塩,低pH,アルミニウム過剰,カルシウム欠乏など,土壌に起因するストレス(edaphic stress)に対して耐性を持つ作物を育種するための基礎研究を行うことにある。間藤(京都大学農学研究科)はエンドウUDP-Xylose合成酵素タンパク質を精製し,そのアミノ酸配列情報を基に遺伝子を単離した。この遺伝子はそのDNA配列の類似性からラムノース2,4デヒドラターゼをコードしていると考えられてきたものであったが,精製酵素からの情報でUDP-Xylose合成酵素であることを明らかにした。さらにラムノガラクツロナンIIに特異的な2-keto-3-deoxy糖である3-deoxy-D-mannno-oct-2-ulosonate-8-phosphate synthaseの遺伝子をクローニングし,二つのアイソザイムが発現していることを見いだした。これらは根,地上部で別々に発現していた。藤原(東京大学農学研究科)はシロイヌナズナのホウ素吸収に関する突然変異株borl-1株とマクロアレイ法を用いて実験を進め,ホウ素吸収に関係していると思われる遺伝子を同定した。この遺伝子の翻訳タンパク質は陰イオン輸送タンパク質と相同性が高かった。馬(香川大学農学部)はアルミニウムの根伸長阻害が,アルミニウムのペクチンへの結合によって生じることを明らかにした。その結合部位は,細胞膜近傍の分泌直後のペクチンであることを示した。さらにこの部位へのアルミニウムの結合が細胞が分泌するクエン酸,リンゴ酸,シュウ酸などの有機酸によって阻止され,それゆえにこれらの有機酸の分泌が植物のアルミニウム耐性に寄与していることを明らかにした。本研究の目的は,高濃度の塩,低pH,アルミニウム過剰,カルシウム欠乏など,土壌に起因するストレス(edaphic stress)に対して耐性を持つ作物を育種するための基礎研究を行うことにある。この遺伝子はそのDNA配列の類似性からラムノース2,4デヒドラターゼをコードしていると考えられてきたものであったが,精製酸素からの情報でUDP-Xylose合成酵素であることを明らかにした。藤原(東京大学農学研究科)はシロイヌナズナのホウ素吸収に関する突然変異株bor1-1株とマクロアレイ法を用いて実験を進め,ホウ素吸収に関係していると思われる遺伝子を同定した。間藤、藤原はホウ素、カルシウム、馬はアルミニウム、ケイ酸について検討を進め、以下の結果を得た。細胞壁へのカルシウムの吸着に関係するペクチンメチルエステラーゼについて検討を進め、生育にカルシウム要求性の高い双子葉植物のペクチンメチルエステラーゼでは活性発現に20mMのカルシウムイオンを要求するが、カルシウム要求性の低いイネでは活性にカルシウムを必要としないことを明らかにした。さらにタバコ培養細胞を用いて、培養液中のカルシウム濃度が01mM以下になると細胞はカルシウム欠乏障害を受けること、培地濃度がO.1mMまで低下しても細胞壁中のカルシウム濃度は110mMに維持されていることをカルシウム特異的蛍光色素を用いて示した。藤原はホウ素吸収に関係するBor1タンパク質がイネ幼穂で発現していることを示した。

またシロイヌナズナでbor1ノックアウトミュータントを作成しホウ素吸収が損なわれていること示した。さらに酵母を用いてbor1の機能解析を進め、Bor1が細胞からのホウ素の排出に機能している可能性を明らかにした。馬はケイ酸のアナログであるゲルマニウム酸とアジ化ナトリウムで誘導したイネの突然変異株を用いてケイ酸吸収変異体のスクリーニングを進め、ケイ酸吸収の欠損した突然変異体GR1株を単離しケイ酸吸収機構の解明を進めた。アルミニウムの結合部位を検討した。
楕円変調アルベン波によるタンデムミラーアンカー部のイオン加熱と巨視的安定性

ガンマ10の極小磁場アンカー部のイオン加熱は,セントラル部で励起されたアルベン速波が楕円形の磁力管による空間変調を受け,アンカー部でアルベン遅波にモード変換することが最近明らかになった。本研究の主目的は,アンカー部イオン加熱とセントラル部イオン加熱を独立に調節することにより,広範囲のプラズマベータ値を実現し,タンデムミラーの巨視的安定性限界を実験的に求め,フルート不安定性理論と実験結果を比較することである。研究結果をまとめると, (1)アンカー部ベータ値を速波励起用高周波電力を変調することにより変化させ,巨視的安定性限界を求める方法を確立した。(2)セントラル部のイオン温度(圧力)の非等方性を反磁性ループアレイから推定すね方法を確立した。(3)巨視的安定性限界はセントラル部とアンカー部のベータ比がある閾値以下であればよいことが実験的に求められた。(4)限界ベータ比は圧力非等方性に依存しており非等方性が強くなると限界ベータ比が大きくなることが分かった。(5)非等方性を考慮したフルート不安定性理論解析を行い,実験結果をよく説明できることが分かった。非等方性性が強くなると磁力線方向の高温イオンの分布がピーキングし,悪い曲率領域の圧力が減少し,安定性が増大するためと考えられる。(6)片方のアンカー部ベータ値のみが変調することにより,両アンカーのベータ値の和がある限界値以上なら,安定性が保てること,即ち,平均極小磁場安定化が実証された。(7)不安定性の同定のため,静電プローブおよびマイクロ波散乱/反射法による密度揺動測定がなされ,安定性限界付近でフルートモードが増大することが分かった。(8)径方向電場が増大すると,正,負にかかわらずセントラル部の揺動が増大し蓄積エネルギーが減少することが観測されたが,エンドプレートバイアスによる電場制御で抑制できることを実証した。
海洋動物プランクトン、特にカイアシ類の寄生生物の分類・生態に関する研究

カイアシ類の体表に寄生する隔口類繊毛虫Vampyrophrya pelagicaの生活史、各ステージの細胞学的特徴、宿主特異性、水温と各ステージの滞留時間の関連、隔口類の分布を調査した。生活史の完結にはフォロントを付着させているカイアシ類が無脊椎動物捕食者に食されることが重要であるが、魚類による捕食は重要でなかった。フォロント内の細胞はすでに繊毛を持っており、いつでもハッチできる状態であった。また、急速に巨大化するトロフォントの食胞膜の前駆体と推定される膜状構造を備えていた。トロフォントの細胞口の位置とサイズを明らかにした。水温の影響を最も受ける分裂期のトモントの滞留時間は、瀬戸内海の最低水温では最高水温の約20倍の時間を要した。このことが晩冬から初夏まで大型カイアシ類以外のカイアシ類に寄生が見られない主要な原因である。瀬戸内海、有明海などの沿岸域に加えて、大洋島周辺、深海近底層に生息するカイアシ類にも隔口類の付着が確認され、海洋生態系の理解には隔口類の機能的役割を地球規模で調査する必要があると指摘した。瀬戸内海産カイアシ類において隔口類以外にも寄生性鞭毛藻類3種の存在を確認し、季節的出現パターンを明らかにした。瀬戸内海産アミ類Siriella okadaiの育房内に寄生して卵を捕食するカイアシ類の新属種、等脚類の新種を記載した。これら2種の季節的出現パターンを明らかにした。それぞれの最高寄生率は11,19%にも達する。カイアシ類は18月、等脚類は811月に出現し、両寄生虫の寄生部位と食物をめぐる競合があることを示した。浮遊性等脚類およびアミ類に寄生するエロビオプシス類の出現を報告し、後者においては寄生によって間性が引き起こされることが示唆された。ヤムシ類に寄生する渦鞭毛藻類の韓国での出現、アキアミの間性などについても報告した。瀬戸内海およびその他の海域において、動物プランクトン、特にカイアシ類、アミ類、ヤムシ類の寄生生物の分類、生態の調査を実施した。瀬戸内海において、隔口類繊毛虫Vampyrophrya pelagicaのphorontの浮遊性カイアシ類への付着状況を通年調査した。カイアシ類21種の成体および未成体の体表に本繊毛虫のphorontの付着が確認された。その宿主特異性は顕著で、Microsetella norveigicaには付着が通年全く確認できず、Oithona similisにもほとんど見られなかった。付着率の季節変動は顕著で、夏初冬にかけては最優占種Paracalanus parvus s.l.にはほぼ100%、その他のカイアシ類にも高頻度で付着が見られたが、晩冬春にかけては本種や小型種には付着が見られず、Calanus sinicusなどの大型種に限定されていた。こうした付著率、宿主の季節変動はカイアシ類の捕食者であるヤムシ類の密度との関連していることが示唆された。本繊毛虫の各ステージの細胞内微細構造を観察した結果、phoront内ですでに繊毛が完成しており、カイアシ類がヤムシ類などに捕食さるか、または傷付いた場合、いつでもphorontからハッチして、カイアシ類の組織を摂食し始めると考えられた。また、phorontおよびtrophont初期には特殊なラメラ構造が見られ、これが細胞膜あるいは食胞膜の前駆体と推定した。

つまり、繊毛虫がカイアシ類の組織を多量に短時間に食べるため、細胞容積が急激に増大することへの適応と推測される。瀬戸内海産アミ類Siriella okadaiの雌の育房内に寄生する等脚類アミヤドリムシの1種Prodajuss.p.(未記載種)が発見され、その雌雄成体、幼生の記載を行ない、寄生状況、生活史などの生態について調査した。育房内に本種の雌が発見されるのはほぼ611月に限定されており、この間の最高寄生率は27%にも達した。一方、クリプトニスクス幼生は、アミ類の成体雌では育房内、その他の性、ステージでは主に腹部に吸盤状口器で付着しており、幼生の出現も611月であった。幼生の寄生率は最高8%であった。アミヤドリムシ類の複数種が南西諸島でも確認された。八丈島産アミ類Siriella japonica izuensisにはエロビオプシス類の1種が育房内面に寄生していた.その宿主の内、1個体は雌化した雄と同定され、本寄生生物がアミ類にインターセックスを引き起こす可能性を示唆した。その他、南西諸島、スールー海にてオキアミ類に寄生する等脚類、南西諸島でクラゲノミ類に寄生するエロビオプシス類、瀬戸内海にてヤムシ類に寄生する渦鞭毛藻類などを確認した。この宿主としての動物プランクトンの調査の中で、カイアシ類の生物学に関わる新知見についても公表を行なった.瀬戸内海及びその他の海域で動物プランクトンの寄生生物の分類及び生態について以下のような新知見を得た。瀬戸内海産アミ類Siriella okadaiの雌の育房内に寄生し、その卵を食するカイアシ類の分類学的検討を行った結果、本邦では正式な記録がないNicothoidaeに属する未記載属であることが判明し、記載を行った。成体雌雄、コペポディッド幼体がアミ類の育房から発見された。寄生率を1年間調査した結果、2003年6月に最高約9%に達した。同所的に、同宿主の育房内には寄生性等脚類のProdajus sp.(新種の記載と発生段階の論文を投稿中)も寄生するが、宿主の卵を巡る資源競争があると推定される。なお、等脚類の寄生率が高い時期には宿主育房内にはカイアシ類が見られないこともわかった。瀬戸内海産浮遊性カイアシ類に付着する隔口類繊毛虫Vampyrophrya pelagicaのtrophontを電子顕微鏡で観察したが、細胞先端に大きな細胞口が存在するので飲作用でカイアシ類の組織などを摂食しているのではないと考えられる。また、phorontが付着するカイアシ類をヤムシ類などの肉食者が捕食することがこの繊毛虫の生活史を完結させる上で重要であると示唆されているが、稚仔魚(アユを使用)の捕食の関与についても実験を行った。しかし、繊毛虫はカイアシ類とともに消化されてしまい、消化管の内部でphorontからハッチすることはなかった。沖縄の沖合及びスールー海の深海近底層から発見された肉食性及びデトリタス食性カラヌス目カイアシ類の付属肢にも隔口類繊毛虫のphorontが付着していることが確認された。浅海のみならず深海においても、これらの繊毛虫の食物連鎖における機能を評価する必要があろう。韓国南部沿岸域からヤムシ類Sagitta crassaに外部寄生する渦鞭毛藻類Oodinium inlandicumを発見した。日本の瀬戸内海に次いで2番目の出現記録となる。その他、カイアシ類、アキアミ類、アミ類などの寄生生物を探索する過程で、それらの生物学的な新知見を見いだしたので公表を行った。
セラミックにおける難溶解性不純物の固溶と格子欠陥構造

セラミックスをより優れた材料とするためには、ある特定のしかも微量の不純物が焼結性やクリープなどの機械的性質、そのほかセラミックスの機能性において果たす役割を明確にしておく必要がある。にもかかわらず不純物特に難溶解性の不純物の固溶度と拡散、その不純物の固溶が成分元素の拡散に与える影響を明らかにした研究はほとんどない。そこで本研究では通常の方法では測定困難な微量の不純物の固溶度を測定するための新しい方法を見出すこと、それらの不純物の拡散係数および固溶による格子欠陥構造さらに成分元素の拡散に与えるそれらの不純物の影響を明らかにすることにした。高温においてセラミックス中に導入される点欠陥も難溶解性不純物の一つとしてとらえることができる。スピネル(Mg【Al_2】【O_4】あるいはNi【Al_2】【O_4】)と【Al_2】【O_3】の2相が共存する多結晶体と純粋な【Al_2】【O_3】単結晶体とからなる拡散対法を考案し、MgOおよびNiOのバルク中の固溶度を始めて明らかにすることができた。【Al_2】【O_3】中における【Mg^(2+)】イオンの不純物拡散係数を明らかにした。この結果より【Al_2】【O_3】の格子欠陥構造を明らかにした。【Li_2】O中への微量のMgOの固溶度を粉末X線回折法により求める新しい方法を見出した。その方法を用いてMgOの固溶度を明らかにした。MgOの固溶量を種々変えた【Li_2】Oについてイオン伝導度を測定し、成分イオンの拡散係数および格子欠陥構造を明らかにした。3.その他のセラミックスについてセラミックスをより優れた材料とするためには、ある特定のしかも微量の不純物が焼結性やクリープなどの機械的性質、そのほかセラミックスの機能性において果たす役割を明確にしておく必要がある。3.その他のセラミックスについて
DOC分画手法を用いた溶存有機物のトリハロメタン生成能

霞ヶ浦湖水(6地点)および流入河川水(主要5河川)中の溶存有機物を,フミン物質分離に基づく,疎水性-親水性,酸性-塩基性の違いによってフミン物質,疎水性中性物質,親水性酸,塩基,親水性中性物質の5つに分画した。引き続いて,ろ過サンプル,フミン物質,親水性画分(親水性酸+塩基+親水性中性物質)を1mgC L^<-1>に調整し,トリハロメタン生成能(THMFP)をヘッドスペースGC/MSで測定した。前年度はTHMFPをμgTHM・mgC^<-1>として測定した。この単位系は水質基準として重要なものであるが,トリハロメタン生成能を科学的に評価する場合に問題があるため,THMの単位をμgTHMからμmoleTHMに変更した。また,フィールドでの存在濃度を考慮するためにTHMFPに溶存有機物濃度(DOC)を乗じたμmoleTHM L^<-1>としてTHMFPを評価した。霞ヶ浦湖水における親水性画分のTHMFPはフミン物質のそれよりも明白に大きかった。従って,親水性画分はトリハロメタン前駆物質としてフミン物質よりも重要であると明白に結論された。河川水では,親水性画分とフミン物質のTHMFPはほぼ同程度の値を示した。従って,河川水では,既存学説通りに,フミン物質も代表的なトリハロメタン前駆物質と言える。しかしながら,湖水の場合には,明らかに親水性画分のほうが重要なトリハロメタン前駆物質であると結論される。この発見は湖水を水道水源とする場合の浄水処理場の在り方に一石を投じるものと言える。非イオン性XAD8樹脂,陽イオン交換樹脂,陰イオン交換樹脂を用いて,湖沼河川水中の溶存有機物を,溶存有機炭素(DOC)をパラメータとして,疎水性酸(フミン物質),疎水性塩基,疎水性中性物質,親水性酸,親水性塩基,親水性中性物質の6つに分画する手法(DOC分画手法)を確立した。この手法を琵琶湖,霞ヶ浦および流入河川水等に適用し,湖水および河川水溶存有機物の特性や起源について検討した。湖水と河川水,および流域特性の異なる河川水ではDOC分画分布および紫外部吸光度(UV):DOC比に有意な違いが認められた。各分画成分の存在分布を把握した。湖水および流入河川水ともに,DOC成分として有機酸(フミン物質+親水性酸)が卓説していた(>65%)。湖水では親水性酸が,河川水ではフミン物質が優占した。特に,森林自然河川水でフミン物質の存在比が極めて高かった。湖水のUV:DOC比は,親水性酸,湖水DOC,フミン物質の順に増大する傾向を示した。河川水の場合,河川水DOCのUV:DOC比は湖水のそれよりも著しく高い値を呈し,土壌由来DOCの影響が大きいと推察された。しかしながら,分離された河川水フミン物質のUV:DOC比は既報の河川水フミン物質の値としてはかなり低く,湖水フミン物質のUV:DOC比よりも顕著に高いものではなかった。特に都市系河川水中のフミン物質のUV:DOC比は湖水フミン物質よりも低かった。湖水および河川水,各分画成分のトリハロメタン生成能を評価する手法を確立した。微量のサンプルに対応するために次亜塩素酸処理プロセスをできる限りスケールダウンし,多量のサンプルに対応するためにヘッドスペースオートサンプラーGC/MSによりトリハロメタン生成能を測定を開始した。

昨年度開発した溶存有機炭素(DOC)分画手法を.再現性向上のために,サンプルDOCを疎水性酸(フミン物質)、疎水性中性物質.親水性酸,塩基,親水性中性物質の5つに分画する手法にバージョン・アップした。この手法を霞ヶ浦湖水,流入河川水および霞ヶ浦流域のDOC源に適用し,溶存有機物の特性や起源について検討した。また.霞ヶ浦湖水については,ろ過サンプル、フミン物質,親水性画分(親水性酸+塩基+親水性中性物質)を1mgCL^<-1>に調整し,トリハロメタン生成能をヘッドスペースGC/MSで測定した。霞ヶ浦湖水、流入河川水,森林渓流水、畑地浸透水、田面流入水,田面流出水,生活雑排水、下水処理水、ヨシ・ガマの繁茂する池水,藍藻類培養後の培地ろ過水を分画した。全てのサンプルで有機酸画分(フミン物質+親水性酸)が優占していたが,フミン物質と親水性酸の存在比はサンプル起源により顕著に異なった。土壌との接触が顕著な森林渓流水や畑地浸透水ではフミン物質が圧倒的に優占した。河川水ではフミン物質と親水性が同程度存在したが、湖水では親水性酸の存在比が上回った。生活雑排水,下水処理水および池水で親水性酸が優占し、藻類培養液では親水性酸が顕著に優占した。生活雑排水では疎水性物質の存在比が大きく,藻類培養液では親水性中性物質が著しく高かった。疎水性中性物質は生活雑排水中のLAS等の洗剤,親水性中性物質は藻類代謝物の糖類物質と考えられる。霞ヶ浦ろ過湖水、フミン物質、親水性画分の平均トリハロメタン生成能は、それぞれ28.4,26.9,31.4μgトリハロメタンmgC^<-1>であった。親水性画分のトリハロメタン生成能はフミン物質のそれよりも有意に大きがった。親水性画分のDOC濃度はフミン物質より約2倍高い。従って,親水性画分はトリハロメタン前駆物質としてフミン物質よりも重要と結論される。この結果は既存学説を覆す新しい発見と言える。霞ヶ浦湖水(6地点)および流入河川水(主要5河川)中の溶存有機物を,フミン物質分離に基づく,疎水性-親水性,酸性-塩基性の違いによってフミン物質,疎水性中世物質,親水性酸,塩基,親水性中性物質の5つに分画した。引き続いて,ろ過サンプル,フミン物質,親水性画分(親水性酸+塩基+親水性中性物質)を1mgCL^<-1>に調整し,トリハロメタン生成能(THMFP)をヘッドスペースGC/MSで測定した。前年度はTHMFPをμgTHM・mgC-1として測定した。この単位系は水質基準として重要なものであるが,トリハロメタン生成能を科学的に評価する場合に問題があるため,THMの単位をμgTHMからμmoleTHMに変更した。また,フィールドでの存在濃度を考慮するためにTHMFPに溶存有機物濃度(DOC)を乗じたμmoleTHM L^<-1>としてTHMFPを評価した。霞ヶ浦湖水における親水性画分のTHMFPはフミン物質のそれよりも明白に大きかった。従って,親水性画分はトリハロメタン前駆物質としてフミン物質よりも重要であると明白に結論された。河川水では,親水性画分とフミン物質のTHMFPはほぼ同程度の値を示した。従って,河川水では,既存学説通りに,フミン物質も代表的なトリハロメタン前駆物質と言える。しかしながら,湖水の場合には,明らかに親水性画分のほうが重要なトリハロメタン前駆物質であると結論される。この発見は湖水を水道水源とする場合の浄水処理場の在り方に一石を投じるものと言える。
超対称性の破れとその現象論的応用に関する研究

超対称性がミクロな世界にあらわれているという仮定は、理論的に美しく、長年議論されてきたテーマである。本研究では、超対称性の破れがヒッグス粒子やトップクォークとどのように結合しているかに着目し、その理論的定式化と現象論への応用について研究した。理論的な側面として「隠れた重力」模型の構築に成功した。また、スカラートップクォークのコライダー現象論や、超対称トップカラー模型の構築も成しとげた。本研究では、超対称性模型においてヒッグス粒子がどのように超対称性の破れと結合するかに着目して、新しい可能性を探り、そのLHC実験などでの探索・検証方法を考察した。特に、ヒッグス粒子が超対称性の破れと直接結合している可能性に着目し、その低エネルギー有効理論の構築を行った。特に、超空間上にミンコフスキー空間を埋め込み、その部分空間上にヒッグス場を導入する定式化に成功し、この方法により、ヒッグス場が超対称変換に対して非線形に変換するようなラグランジアンの構成法が定式化された。さらに、LHC実験において、超対称の破れのセクターを直接観測する可能性を議論し、隠れた重力模型を構築した。これは、超空間上に埋め込んだミンコフスキー空間に計量を導入することにより、超対称不変に自然に構成された。また、これはカイラルラグランジアンにおけるrho中間子の導入方法の一般化されたものである。LHC実験における生成断面積を計算し、その発見可能性を議論した。これらは、いままでの超対称模型の構築法と異なる、低エネルギー有効理論からのアプローチで、今まで考えられていなかったシグナルや質量パターンが実現されるユニークな試みである。特に、隠れた重力模型は超対称性の破れのミクロな模型の構築なしに、シグナルを議論でき有用である。当然、有効理論なので、ミクロな模型とのマッチングも可能で、実際に発見されれば有用なツールとなる。これらの研究成果をまとめて、論文にまとめて、JHEP誌に投稿し掲載された。また、名古屋大学で行われた国際会議、SCGT09で発表した。本研究では、超対称性の破れが標準模型のセクターと直接結合しているようなシナリオを想定し、それを記述する有効理論の構築と現象論への応用を研究した。今年度は、前年度に確立した理論的定式化をふまえて、現象論的応用の議論を中心に行った。特に、超対称性の破れと電弱対称性の破れとの関連に着目した。電弱対称性を破るビッグスセクターやそれと強く結合するトップクォークのセクターには超対称性の破れが弱くつたわり、それ以外のセクターでは大きく超対称性を破っているような状況は、現象論的に魅力的であるので、その場合について、LHC実験でどのようなシグナルが重要であるか研究し、論文にまとめた。この論文はJHEP誌に掲載された。LHC実験の早い段階でのスカラートップクォークの発見法を提案したので、この研究は超対称性の実験的検証に重要な役割を果たす。また、有効理論からのアプローチだけでなく、超対称模型において、電弱対称性がダイナミカルに破れるような模型も考案した。これは、トップカラー模型といわれるトップクォーク対の凝縮による電弱対称性の破れをゲージ理論で実現する試みである。超対称性の導入により、現実的な模型として提唱できた。これまでは、様々な理論的仮定の上に成り立っていたシナリオであったが、この研究によって、より具体的な現象論的検証が可能となった。この研究を論文にまとめ、JHEP誌に掲載された。
精子の受精能獲得時に生じる生理動態の解明

哺乳類においては、精子が正常に受精するためには受精能獲得という過程を経る必要がある。この過程では、細胞内でのカルシウム動態の変化、ならびにpHシグナルの変化(アルカリ化)、膜電位の変化も並行して起きることが知られている。pHシグナル、膜電位変化については、カルシウム動態になんらかの重要な役割を示すことが示唆されている一方で、詳細なメカニズムについては分かっていない。我々はマウスの精子を用い、この点を検証した。前年度では、マウスの精子を用いたカルシウムイメージング、pHイメージングの実験系を確立することに成功した。また、受精能獲得用の専用培地を投与して観察することで、精子におけるカルシウムシグナル、pHシグナルの変化を検出することに成功した。検証の結果、カルシウム応答の変化は、pHシグナルの変化に先んじて生じることが明らかになり、pHはカルシウム上昇のトリガーとなるのではなく、むしろその応答量を調整する役割があることが示唆された。また、申請者は既に精子の膜電位変化を調べるため、精子からのパッチクランプ法を確立し、アルカリ化に伴った過分極応答を計測できる実験系を確立していた。本年度はこのシステムを利用し、過分極応答を担う精子特異的カリウムチャネルSlo3の修飾メカニズムについて重要な知見を見出した。したがって、このような修飾メカニズムが精子の受精能を決定している可能性が考えられた。以上から、精子の受精能獲得における生理的変化について、複数のアプローチから明らかにした。精子が受精能獲得を経るとき、細胞内ではカルシウム動態が変化することが知られているが、この時精子の中ではpHシグナルの変化(アルカリ化)、および膜電位の変化も並行して起きていることが知られている。これら二つの精子における生理応答はカルシウム動態になんらかの重要な役割を示すことが示唆されているが、その詳細なメカニズムや関連性については深くは研究がなされていない。そこで我々はマウスの精子を用いてこの点の検証を行った。まず本検証を行うための基盤を整えるため、マウスの精子を用いたカルシウムイメージング、pHイメージングの実験系を確立した。これに、精子の受精能獲得用の専用培地を投与して観察することで、精子におけるカルシウムシグナル、pHシグナルの変化を検出することに成功した。また、両者の応答の時間経過を比較することで、両者の関連性についての考察を行った。加えて、精子のアルカリ化と膜電位変化の関連性を調べるため、精子からパッチクランプ法を適用し、アルカリ化に伴った過分極応答を計測できる実験系を確立した。最後に、膜電位変化とカルシウム動態の関連性を比較するためにカリウムイオンイオノフォアであるバリノマイシン存在下で細胞外のカリウムイオン濃度を変化させることにより精子の膜電位を制御し、この状態で受精能獲得専用培地を投与するという実験も行った。その結果、精子の脱分極時においてもある程度のカルシウムシグナルは認められた。従って受精能獲得時の精子の過分極はカルシウムシグナルの発現自体に必須ではなく、なんらかの修飾的な機能を果たしている可能性が考えられた。本研究課題を遂行するにあたり、それに必要な実験系の確立に成功したため。上記実験手法を適用し、精子の受精能獲得時に生じている生理動態について薬理学的な手法を用いることで詳細に検討する。実験を行うにあたり、一部の試薬の購入に遅れを生じたため。翌年度は当該助成金を用いて試薬を購入し、これまでの計画通りの実験を遂行する予定である。
不整地での転倒に対して機構的ロバスト性を有する超対称型探査ロボットの開発的研究

広範囲を効率よく探査するために,複数台のロボットによる探査や,投擲式の探査ロボットの研究が行われている.我々は,この投擲式ロボットの中でも,機構全体が対称構造のものを提案している.災害現場での不整地における走行を考えた場合,懸架装置や連結作動機構によらず,駆動機構のみに着目した場合,車輪型よりも,クローラの方が走破性が高いと一般的には言われている.そこで,我々は,車輪型を用いた正四面体型(図2)のみならず,移動用駆動機構として,円形断面クローラ(円筒型クローラ)を用いた投擲式探査機を開発し,その有効性を試作機を用いて確認することを目的として取り組んだ.実機を設計・試作し,試作機を用いて提案した実機構造および,投擲型探査の効果・有効性を確認した.本研究では,全方向移動性を有し,転倒しても走行継続が可能な不整地移動ロボットによる災害後の被災者の迅速・広範囲探査の実現を目指している.具体的には,火星などの惑星上や,地震・テロ攻撃後の瓦礫上といった不整地において,不意な転倒が発生しても,走行を継続することが可能な超対称型移動探査ロボットの開発を第一の主要な目標として,研究開発に取り組んできている.実際の物理的な構造体としての機能を確認する最も確実性の高い手法として,実際に実機を設計・試作して,実験を通して基本機能を確認するやり方で研究開発を進めてきた.具体的な機体構成として,構造自体が対称性を有する円形断面を有する駆動機構を3つ対称配置することにより,不整地移動性と対転倒性を高めることに挑戦した.平成24年度は,着地性の向上および駆動機構の特異線を無くすことによる走破性の向上に努めた.飛行体からの投擲実験によって上空から投下しても,着地姿勢によらずに走行姿勢に戻ることが可能なように,重心を機体中心からずらして配置する構成とし,実験を通して転倒からの復帰性の向上を確認した.また,前年度から取り組んでいる超対称性ロボットの足回りである円形断面クローラにおいては,より滑らかな全方向移動性を実現するために,円形の断面構造を維持した状態で,特異線を持たず,任意方向に駆動力を生成することが可能な機構の考案・開発が必要となっていた.そこで,通常のクローラ構造を湾曲させて1ユニットとし,それを上下方向に対象配置することで,全体の断面を円形にするクローラ構造を新たに考案・設計・試作した.本実機を用いた実験により,特異線がなく,斜め方向へも移動可能という連続的で滑らかな全方向移動性を確認することができた.実環境での活動を求められる探査体の研究として,転倒しても移動継続が可能で任意方向に移動可能な構造体を構築したことは高い意義があると考える.広範囲を効率よく探査するために,複数台のロボットによる探査や,投擲式の探査ロボットの研究が行われている.我々は,この投擲式ロボットの中でも,機構全体が対称構造のものを提案している.災害現場での不整地における走行を考えた場合,懸架装置や連結作動機構によらず,駆動機構のみに着目した場合,車輪型よりも,クローラの方が走破性が高いと一般的には言われている.そこで,我々は,車輪型を用いた正四面体型(図2)のみならず,移動用駆動機構として,円形断面クローラ(円筒型クローラ)を用いた投擲式探査機を開発し,その有効性を試作機を用いて確認することを目的として取り組んだ.実機を設計・試作し,試作機を用いて提案した実機構造および,投擲型探査の効果・有効性を確認した.本研究においては、円形断面クローラの小型・軽量化及び機体全体の対称構造化を優先課題として設定し、以下を目標として設定した。(1)小型円形断面クローラ部分の構成の成立性の確認、(2)円形断面クローラの小型化の性能,つまり直径を1/2以下に抑え、且つ全方向移動性維持の確認、(3)対称構造化による転倒対応機能の実験を通しての有効性の確認である。上記目標を達成すべく、機体の小型化・対称構造化の達成および、当達成による全方向からの転倒後の走行継続性を、実機を用いた実験を行い、その妥当性を確認した。基本走行・投擲試験により機能の確認および目標性能を上回る転倒における走行継続性の性能を屋外走行試験を通して確認した。さらに、三連式の構造のための衝撃吸収装置の考案、試作による機能確認を次なる課題として、例えば,駆動力伝達ベルトに緩みを発生しない構造の考案・試作や,対象構造型の衝撃吸収装置の考案・設計・試作による機能確認などを設定し、試作機の設計を行っている段階である。衝撃吸収要素の剛性と減衰係数を調整することで、対称型構造の衝撃吸収機能が効果的に働かせることが可能になる構成した設計となっている。この構造は、環境投入時のみならず、不慮の転倒が起こり得る不整地移動ロボットにおいて、著しく有用であり、全方向衝撃吸収装置として、高い実用性のみならず、設計の機能的全方向化という共通項を生み出すといった、学術的にも重要な内容に仕上げることができるものと考えている。

現在までに,当初今年度予定していた(1)小型円形断面クローラ部分の構成の成立性の確認、(2)円形断面クローラの小型化の性能,つまり直径を1/2以下に抑え、且つ全方向移動性維持の確認、(3)対称構造化による転倒対応機能の実験を通しての有効性の確認は,概ね達成できており、このことは、スケジュールを意識しての取り組みと、学術講演会発表時に各先生方からのご意見を素早くフィードバックしてよりよい研究内容に仕上げていくという努力を継続したためであると考えている。今後の実用化を目指しての耐久性の向上が課題としてあるが、それも実機試作を何度か行い改良を重ねる上で達成可能である。前述したように、研究達成度は概ね良好で、進捗はいいペースで行う事ができているため,研究そのものの推進は今の状態を維持し、学会などの学術発表の方にも今年度は力を入れて取り組んでいく予定である。さらに、それら学会発表を通して得られた先生方含む聴講者からのご意見を、研究内容に出来るだけ早くフィードバックし、実環境で役立つ技術に仕上げるため、さらに実用性を高めることを意識して研究に取り組んでいくことを考えている。研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため当初の見込み額と執行額は異なったが、研究計画に変更はなく、研究内容の達成度も高さを維持しており、引き続き前年度の研究費を研究費も含め、当初予定通りの計画を進めていく。
生理活性分子をパターニングした多孔質足場材料の創出

マイクロパターン構造を有する多孔質足場材料は、生体内の細胞微小環境を模倣していることから、機能性組織の再生においてきわめて有望と考えられている。そこで本研究では、生理活性分子を三次元的にパターン化した多孔質足場材料の創出を目的とした。生理活性分子溶液の描画法と凍結乾燥法を組み合わせた手法を確立し、パターン化多孔質足場材料を開発した。生理活性分子とコラーゲンからなる混合溶液の凍結物はマイクロパターンを形成するための鋳型として用いた。このことによって生理活性分子の分布を空間的に制御することに成功した。マイクロパターン構造を有する多孔質足場材料は組織再生を空間的に制御するのに有用と考えられる。本研究では、生理活性因子を三次元的にパターン化した多孔質足場材料の開発を目的としている。パターン化多孔質材料の作製にあたって、平成25年度は下記の13の項目について検討した。1多孔質材料原料への生理活性因子の導入条件2生理活性因子を導入した多孔質原料水溶液によるライン状パターンの描画条件3多孔質原料水溶液とライン状パターンの生理活性因子の凍結条件なお、13に続く工程である4凍結乾燥法による多孔質構造の形成、5架橋による多孔質構造の固定化については、まずはこれまでに申請者らが用いてきた方法をそのまま適用することにした。項目1において、生理活性因子の作用を持続させるためには、その導入方法を検討することが重要である。多種類の条件を検討する必要があると考え、生理活性因子としてVEGFよりも安価に入手できるインスリンを用いた。種々の仕込み量でインスリンを導入したコラーゲンスポンジを作製し、走査型顕微鏡により連通した空孔構造が観察された。項目1の研究成果を論文にまとめた。項目2、3については、平成26年度に学会発表を行う予定である。本研究では、インスリンなど種々の生理活性因子を三次元的にパターン化した多孔質足場材料の開発を目的としている。平成25年度は、パターン化多孔質足場材料を作製するため、下記の13の項目について検討した。1多孔質材料原料への生理活性因子の導入条件、2生理活性因子を導入した多孔質原料水溶液によるライン状パターンの描画条件、3多孔質原料水溶液とライン状パターンの生理活性因子の凍結条件である。13に続く工程である4凍結乾燥法による多孔質構造の形成、5架橋による多孔質構造の固定化については、まずはこれまでに申請者らが用いてきた方法をそのまま適用することにした。2、3を検討するとともに、項目1の研究成果を論文にまとめた。平成26年度は、パターン化材料を用いて細胞を培養した。空孔構造などパターン化多孔質足場材料のパラメータを種々の値に変えたものを作製した。作製したパターン化多孔質材料に細胞を播種し、細胞の接着、分布、増殖、および細胞生存性などを調べパターン構造の影響について明らかにした(現在、論文投稿準備中)。高分子生体材料学平成25年度はパターン化多孔質足場材料の作製方法を検討することが目標であったので、おおむね順調に進んでいると考えている。生理活性因子をコラーゲンスポンジに導入する手法を検討し、その研究成果を論文として発表することができた。また、生理活性分子を含む凍結物のパターンを融解させず、かつ多孔質体原料の凍結をコントロールするのは挑戦的な検討項目であったが、平成25年度のうちに温度条件を見出すことができたので、平成26年度に学会にて発表する予定である。平成25年度までに検討した作製方法および条件を用いて、生理活性分子をパターン化した多孔質足場材料を作製する。パターン状多孔質足場材料において、平均空孔サイズ、生理活性分子導入領域のライン幅、生理活性分子導入領域のライン間隔等を種々の値に変える。今後は、作製したパターン化多孔質材料を用いて、細胞の接着、分布、増殖、および細胞への毒性を調べる。さらに、動物実験を行う場合、実験用動物の使用を必要最小限に抑えるため、パターン化多孔質材料の作製条件を十分に最適化し、必要最小限のサンプルで実験を行う必要がある。
RANKとToll-likeレセプターシグナルの阻害による歯周病治療法の確立

1歯周疾患モデルマウスを用いたToll-likeレセプターシグナルの解析マウス歯槽骨部に1コPSを注射することにより歯周疾患を惹起させるモデルを現在開発中である。この実験系を用いて、invivoにおけるToll-likeレセプターシグナルの解析を行うことが可能となると考えている。2 MyD88シグナルの骨形成促進作用の解析骨芽細胞による骨形成シグナルにおいては、MyD88分子は必ずしも重要ではないことを示す実験結果が培養系を用いた実験系によって明らかとされた。3 LPS以外のToll-likeレセプターを介する細菌表層成分の骨吸収における作用ムラミルジペプチドによるToll-likeレセプターを介する破骨細胞分化に対する促進効果について明らかとすることができた。4ヒト破骨細胞のLPSシグナル伝達の解析5歯槽骨破壊をブロックする新規化合物の同定6 RNAiによるMyD88発現の抑制MyD88に対する約20bpの2重鎖siRNA(Small interfering RNA: siRNA)を、レンチウイルスベクターを用いて骨芽細胞または成熟破骨細胞に導入し、MyD88の発現抑制を行うことを目的にsiRNAの実験系を導入中である。7関節リウマチ(RA)モデルマウスに対するRANKとMyD88シグナル遮断1歯周疾患モデルマウスを用いたToll-likeレセプターシグナルの解析マウス歯槽骨部に1コPSを注射することにより歯周疾患を惹起させるモデルを現在開発中である。7関節リウマチ(RA)モデルマウスに対するRANKとMyD88シグナル遮断高齢者における歯の喪失は、歯周疾患による歯槽骨吸収が大きな原因を占める。この歯槽骨破壊の原因の一つとして、歯周ポケットに存在するグラム陰性菌外膜由来のリポ多糖(LPS)が知られており、炎症性骨吸収を防止することが、歯周病の確実な治療法と考えられる。1998年、破骨細胞分化因子(RANKL)の同定とその遺伝子クローニングが成功した。そして偶然なことに、1998年、LPSの受容体として、Toll-like receptor 4(TLR4)が発見された。Toll-like receptor(TLR)は、ショウジョウバエの病原体認識分子Tollの哺乳類のホモログである。LPSはTLR4を介して信号が伝達されるが、その後の信号はアダプター分子であるMyD88依存性の経路とTRAM-TRIF依存性の経路が存在する。LPSによる破骨細胞の分化と骨吸収機能発現には、MyD88シグナルが必須であることが明らかとなった。細菌のペプチドグリカンはTLR2を介して細胞内にシグナルを伝達する。ペプチドグリカンの構成成分であるムラミルジペプチド(MDP)は、破骨細胞の分化を促進する因子であることが明らかとなった。最近、骨の形成に関与する骨芽細胞と骨吸収の主役である破骨細胞の相互作用が明らかとなってきた。我々は、骨吸収と骨形成のカップリング(共役)機構を明らかにすることを目的に、各種の遺伝子欠損マウスを用いて実験を行っている。破骨細胞の分化と機能を阻害し骨粗鬆症を呈するオステオプロテゲリン(OPG)遺伝子欠損マウス、破骨細胞が存在しないために大理石骨病を呈するop/opマウスおよびc-fos遺伝子欠損マウスなどである。骨誘導因子(BMP)の移植による異所性骨形成の検討を通じ、破骨細胞出現のメカニズムを解析している。BMPペレットにおける破骨細胞の出現は、石灰化に先立つものであった。破骨細胞は、ALP陽性骨芽細胞に近接した部位にのみ認められた。BMPペレット周囲の細胞にRANKLタンパク質の発現が認められた。OPG-FcのBMPペレットへの添加は、破骨細胞前駆細胞の出現には影響しなかったが、破骨細胞の分化を強く阻害した。RANKL欠損マウスへの移植では,RANKLの腹腔内投与により,骨組織にのみTRAP陽性細胞が出現した。以上の結果より、破骨細胞形成に関与する未知の因子の存在も示唆された。1ヒト破骨細胞のLPSシグナル伝達の解析本年度はヒト破骨細胞によるピット形成能や生存・延命に対するLPSシグナルの解析を行うことを目的に、まずヒト破骨細胞の純化方法の確立を目指した。従来の方法では、RANKLとM-CSFによって誘導された培養破骨細胞をディッシュ上から生きた状態で回収することは不可能であった。

今年度においては、温度感受性ゲルコーティングディッシュを用いることにより、RANKLとM-CSFによって誘導されるヒト末梢血CD14陽性細胞由来の成熟破骨細胞を純度良く回収する実験系を確立することができた(未発表)。この実験系を用いて、現在ヒト破骨細胞によるピット形成能や生存・延命に対するLPSシグナル伝達機構を詳しく解析中である。2歯槽骨破壊をブロックする新規化合物の同定骨芽細胞におけるMyD88シグナル(PKC→MEK/ERK)の阻害を指標にして、天然物由来の化合物をスクリーニングするための準備を行っている。現在、Two-hybrid法を用いてTRIFと結合するアダプター分子を同定するために、破骨細胞のcDNAライブラリーが構築できた段階である。3 RNAiによるMyD88発現の抑制MyD88に対する約20bpの2重鎖siRNA(Small interfering RNA : siRNA)を、レンチウイルスベクターを用いて骨芽細胞または成熟破骨細胞に導入し、MyD88の発現抑制を行うことを目的に、siRNAの実験系を導入中である。4関節リウマチ(RA)モデルマウスに対するRANKとMyD88シグナル遮断本年度中に、II型コラーゲン誘発性関節リウマチモデルマウスの実験系が確立できた。
表層微小管パターンの構築機構の解明

中心体を持たない植物細胞では微小管は多様な高次元構造体を構築するが、こうした微小管パターンがどのように形成されるのかはよくわかっていない。本研究では、in vitroでの微小管パターン再構築を目的として、モデル植物アラビドプシスから重合活性をもつチューブリンを効率よく精製する方法を確立するとともに、新規に同定した重合核複合体因子を用いてアラビドプシス表皮細胞における微小管重合様式の詳細を明らかにした。1.動物MORZART1のアラビドプシスorthologs (MZT1a,MZT1b)のT-DNA挿入機能破壊株は単独では表現形はなかったが、両者の二重変異株は胚性致死であった。機能的なMZT1a-GFP又はGFP-MZT1aをを用いてMZT1a含有複合体をアラビドプシス植物体から精製したところ、gTuRC因子GCP2,GCP3と同様の構成サブユニットが同定されたが、GCP2/3含有精製複合体に含まれていたNEDD1制御サブユニットは含まれていなかった。MZT1a-GFPの細胞内局在性は、M期ではGCP2/3と良く似た局在性を示した。間期では、GCP2/3と同様に表層微小管上に出現し、速やかに娘微小管を形成したが、GCP2/3とは異なり、微小管が存在しない細胞膜上には出現しなかった。詳細な動態観察結果より、GCP2/3を含むgTuRCの一部として、微小管重合活性が昂進したMZT1含有gTuRC集団が存在することが示唆された。2.植物特有の微小管重合調節因子を検索するために、アラビドプシス培養細胞から微小管付随タンパク質画分を高度に精製し、この画分に濃縮されているタンパク質をプロテオミクス法により網羅的に同定した。高度に濃縮されている機能未知のタンパク質:20種について、それらのGFP融合タンパク質を微小管赤色標識アラビドプシス系統において一過的に発現させたところ、1種類の微小管付随タンパク質(t77と呼ぶ)が微小管重合核に局在を示し、このt77-GFPで標識された箇所から新規の微小管が誕生することが判明した。t77遺伝子はアラビドプシスゲノムに2コピー(t77aとt77b)あり、t77aのヌル変異株は野生型と区別できない。t77bのT-DNA挿入株はC末端のみが欠失した変異株のみ入手可能であり、これらの二重変異株は特に目立った表現形を示さなかった。植物細胞の微小管パターン自体がどのように形成されるのか、よくわかっていない。本研究では、試験管内での微小管パターンの再構築系の開発を最終目標として、微小管重合核複合体の新規調節因子の同定と重合活性能を保持した微小管重合核複合体の単離・精製を行う。本年度は、アラビドプシス培養細胞から精製した微小管結合性タンパク質画分から見出された新規タンパク質をGFPに融合し、植物細胞で一過的に発現させる実験手法により、微小管重合核に付随する新規因子Msd1を同定した。アラビドプシスではMsd1aとMsd1bの2つの相同性の高いタンパク質をもち、どちらも微小管重合開始点に局在する。微小管結合活性があることから、微小管上に重合核複合体を局在させ、その場所で娘微小管を開始するのに寄与している因子であると推定される。アラビドプシスのmsd1a msd1b二重変異株は顕著な細胞分裂と細胞伸長の表現形を示さないが、現在、変異株における微小管重合様式を詳細に解析している。Msd1に結合するタンパク質をアラビドプシス植物体から精製したところ、WDR8というタンパク質が同定された。カビのMsd1ホモログはカビのMDR8ホモログと複合体を形成することが最近報告されていることから、植物においてもMsd1-MDR8複合体が微小管重合に係ることが推測される。MDR8-GFPをアラビドプシスで発現させると、微小管重合開始点を標識した。母親微小管から娘微小管が生まれる際は、約40度の角度に枝分かれ様式で新生する場合と、母親と平行に娘微小管が新生する場合があるが、そのどちらの場合においても母親のプラス端に向かって大部分の娘微小管が重合すると報告されている。この報告では重合開始点の観察方法に問題があるため、新たに重合開始点をMORZART1-GFP、微小管をmCherry-&#61538;-tubulinで二重標識したアラビドプシス系統を作出した。我々の観察によると、枝分かれ重合では、99%の娘微小管が母親微小管のプラス端に向けて重合した。一方、平行様式の重合では、既報とは異なり、母親微小管のプラス端とは逆方向(マイナス端方向)に生まれる娘微小管が80%を占めた。

また、重合開始複合体はカタニンによる切断が起こる前に母親微小管が消失した場合、娘微小管のマイナス端を追跡して移動する現象などを捉えることに成功した。また、微小管重合複合体に付随する新規タンパク質(2種のホモログ)を同定し、酵母2ハイブリッド法によりこのタンパク質同士が相互作用し、重合複合体コアタンパク質であるGCP2及びGCP4と相互作用する可能性を示した。1.植物個体から重合活性をもつチューブリンを効率よく精製する方法を確立した。チューブリンへテロ二量体に結合する微小管結合因子TOG1をカラムに充填した、チューブリン精製カラムを作製し、植物体粗抽出タンパク質液から直接に一段階で内在性野生型チューブリンを精製することに成功した。精製したチューブリンの翻訳後修飾を市販の動物チューブリン修飾抗体を用いて調べたところ、植物チューブリンではC末端のチロシン残基の除去は見られず、ポリグルタミン化も起こっていなかった。K40リジン残基のアセチル化は不明瞭な結果であった。また、ストレス処理した植物体から精製したリン酸化チューブリンは重合活性が低かった。さらに、ポリペプチド鎖内部にポリヒスチジンを挿入したチューブリンを発現させたアラビドプシス培養細胞から、組換えチューブリンを精製することにも成功した。2.微小管重合活性を保持したγチューブリン含有環状複合体を精製するために、複合体因子であるMZT1aのC末端にGFPとStrepIIタグを付加した融合蛋白質を安定的に発現させたアラビドプシス培養細胞T87系統を作出した。この培養細胞系統の蛋白質粗抽出液からStrep tactinビーズを用いて目的とする複合体を精製することに成功した。この精製複合体と精製チューブリンをin vitroで混合すると、GFPで標識された複合体から効率よく微小管が重合した。今後は、精製した複合体の全構成成分を抗体やMS解析などにより明らかにすると共に、微小管依存的な微小管重合に係るオーグミン複合体を同様の手法により精製し、植物細胞で見られる微小管重合様式を再現できる可能性が示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。植物分子細胞生物学26年度が最終年度であるため、記入しない。活性をもつ微小管重合核複合体の精製には成功していないが、新規微小管重合核構成成分の同定と機能解析は順調に進行した。植物における微小管重合に係る新規因子の同定に成功した。表層微小管を蛍光二重標識することにより、従来は不明瞭であった微小管の極性と娘微小管の重合方向の関連を明らかにすることができた。また、微小管重合複合体に付随する新規タンパク質は、ホモログ遺伝子が2つあるために、変異株解析が遅れているが、それ以外の機能解析はほぼ順調に進展している。1.微小管重合核複合体微小管重合核複合体にはMORZART1を含むサブ複合体とNEDD1を含むサブ複合体の少なくとも2種類の集団が存在する可能性を追求するために、MORZART1複合体とNEDD1複合体をそれぞれ植物細胞から精製し、それぞれの複合体の構成因子を同定する。また、MORZART1とNEDD1を異なる蛍光タンパク質で標識し、細胞内でそれぞれが同一複合体に局在するかどうかを調べる。2.新規複合体構成因子新規の微小管付随タンパク質T77はアラビドプシスゲノムに2つ遺伝子が存在する(T77a,T77b)ため、二重遺伝子破壊変異株を作製し、微小管関連(特に重合開始)の異常を示すかを調べる。また、T77が植物細胞内で微小管重合核複合体を形成するか否かを、T77含有複合体またはT77相互作用タンパク質を調べることにより、明らかにする。