hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
宿主アポトソームと病原体のクロストークの解明による感染制御の新秩序の探索

本研究では、1)アポトーシスとクラミジア感染の関連についての解析ならびに2)アポトーシス制御に関与するYAPシグナルの観点から、メダカ個体と三次元オルガノイド培養系を用いた解析を遂行した。1)アポトーシス制御における宿主の因子を解明する実験において、我々は、Hela細胞やMEFにおける肺炎クラミジア感染をApaf-1が促進する一方、Caspase-9の抑制がその感染を制限していることを見出した。2)メダカおよびヒト培養細胞を用いた遺伝子発現解析から、YAPによる免疫系シグナル分子の発現制御は、魚類からヒトに至るまで進化的に保存されていると考えられた。病原体(クラミジア、肺炎球菌、セレウス菌などの微生物のうち感染宿主モデルが成立しやすい病原体を選択して進める)の病原因子と宿主のアポトソーム分子との相互作用など、未だ解明されていない宿主でのアポトーシス制御機構を実験的に解明することが本研究の目的である。本年度はクラミジアの感染と宿主アポトーシス制御におけるアポトソーム分子(Apaf-1とCaspase-9)の機能解析を試みた。マウス胎児由来線維芽細胞(Mouse embryonic fibroblast)などを用いた一連の解析から、クラミジアの感染にはCaspase-9の活性化が必要であり、この活性化はApaf-1の有無に関わらず生じることを見出した。その一方で、Apaf-1はクラミジアの感染に対して抑制的に機能することが判明した。今回の結果から、Apaf-1とCaspase-9の両アポトソーム分子の発現バランスが、クラミジアに対する宿主の易感染性に影響を与えうると考えられた。本年度に実施したクラミジア感染と宿主アポトーシス制御におけるアポトソーム分子の機能解析を通じて、クラミジアと宿主アポトソーム分子との相互作用について新たな知見を得ることができ、論文化するに至ったことから(Rahman et al. 2015)、本年度の研究進捗状況は概ね順調と考えている。本研究は、病原体(クラミジア、肺炎球菌、セレウス菌などの微生物のうち感染宿主モデルが成立しやすい病原体を選択する)と宿主のアポトソーム分子との相互作用など、未だ解明されていない病原体-宿主の相互作用機構を実験的に明らかにすることが主な目的である。本年度は昨年度の成果を基盤として、広く生物学的情報を整理・統合することにより情報解析学的に未解明のアポトーシス制御機構の解析を進めた。また、小型魚類メダカおよびオルガノイド培養系をモデル系として用いて、Hippo-YAPシグナルなどのアポトーシス関連シグナルの観点から宿主と病原体の相互作用を解析し、感染制御の新秩序の探索を行うこととした。具体的には、メダカ野生型胚3サンプルとYAP変異体胚3サンプルから独立してtotal RNAの抽出を行い、最終的に合計6つのRNAサンプルを得た。これらのRNAサンプルを用いてRNA-seq解析を行った結果、YAP変異体胚において顕著な発現変動を示す複数の遺伝子を明らかにした。さらに、マウスの腸を用いた三次元オルガノイド培養系の樹立を行った。今回樹立に成功した三次元オルガノイドは、年単位の長期的な培養が可能であり、ゲノム編集技術を適用して遺伝子改変することが容易であることから、宿主と病原体の相互作用を解析する上でモデル実験系として中心的な役割を果たすことが期待される。今後はこれらの知見をもとに、感染発症とその増悪化に関与するシグナル伝達系に着目してさらなる詳細な解析を試みる予定である。本研究課題の研究目的を達成するにあたり、従来のマウス培養細胞を用いた解析に加え、新たに本年度からモデル生物メダカを用いた解析システムをいち早く導入することができ、概ね本研究は順調に進展しているといえる。本研究は、病原体と宿主のアポトーシス分子との相互作用をはじめ、病原体-宿主の未知の相互作用機構を明らかにすることを目的とする。本研究では、1)アポトーシスとクラミジア感染の関係についての解析ならびに2)アポトーシス制御に関与するYAPシグナルの観点から、メダカ個体と三次元オルガノイド培養系を用いた解析を遂行した。1)アポトーシス制御における宿主の因子を解明する実験において、我々は、Hela細胞やマウス上皮細胞(MEF)における肺炎クラミジア感染をApaf-1が促進する一方、Caspase-9の抑制がその感染を制限していることを見出した。Apaf-1は細胞内の自然免疫レセプターであるNOD1とドメイン構造を共有しており、クラミジア感染を制御する戦略の中で重要な役割を果たしている可能性が考えられる。2)RNA-seq法によりメダカ野生型胚とYAP変異体胚との間の比較トランスクリプトーム解析を行った結果、免疫系のシグナル伝達分子などに顕著な発現変動が認められた。そこでヒトRPE1細胞(網膜色素上皮細胞)においてq-PCR法により遺伝子発現解析を行ったところ、YAPのノックアウトに伴い免疫系のシグナル伝達分子の発現が上昇する傾向が認められた。以上の結果から、YAPによる免疫系シグナル分子の発現制御は、魚類からヒトに至るまで進化的に広く保存されている可能性が考えられた。次に、大腸オルガノイド培養系においてサルモネラを培地に添加し感染を試みたが、宿主細胞内へのサルモネラの侵入を確認するには至らなかった。そこで、マイクロインジェクション法により、オルガノイド内腔へサルモネラを直接導入し感染効率の向上を試みた。今後、細菌感染オルガノイドを用いたトランスクリプトーム解析を行うことにより、YAPシグナル系が宿主-病原細菌間の相互作用に与える影響を明らかにできると考えられる。

本研究では、1)アポトーシスとクラミジア感染の関連についての解析ならびに2)アポトーシス制御に関与するYAPシグナルの観点から、メダカ個体と三次元オルガノイド培養系を用いた解析を遂行した。1)アポトーシス制御における宿主の因子を解明する実験において、我々は、Hela細胞やMEFにおける肺炎クラミジア感染をApaf-1が促進する一方、Caspase-9の抑制がその感染を制限していることを見出した。2)メダカおよびヒト培養細胞を用いた遺伝子発現解析から、YAPによる免疫系シグナル分子の発現制御は、魚類からヒトに至るまで進化的に保存されていると考えられた。今後は本年度の成果を基盤として、広く生物学的情報を整理・統合することにより情報解析学的に未解明のアポトーシス制御機構の解明を進める。また、ヒトのオルガノイド培養系とメダカをモデル系として用いて、Hippoシグナルなどのアポトーシスシグナル伝達系の観点から宿主-病原体の相互作用を解析し、感染制御の新秩序の探索を行う。YAP下流標的遺伝子についてCRISPR-Cas9法を用いたKO・KIメダカの作成を進めることにより、アポトーシス関連シグナルの観点から宿主と病原体の相互作用を解析し、感染制御の新秩序を明らかにすることができるものと考えられる。感染症内科学本研究課題の研究目的を達成するにあたり、他の研究グループが最近発表した論文を新たに精査した結果、当初の研究方法を見直して新たな研究手法の開発や動物モデルの導入などを検討する必要が生じたため。次年度使用額が生じた理由は、本研究課題で使用した試薬類がこれまでに所属研究室が保管していた試薬でまかなうことができたためである。さらに、本研究課題の目的遂行のために用いる三次元培養技術などは日進月歩に進んでおり、当初の想定を上回る新たな培養技術の導入を検討する必要が生じたためである。従来のマウス培養細胞を用いた解析に加えて、新たにヒト三次元オルガノイド培養系ならびにモデル生物メダカを用いて感染制御における宿主-細菌間相互作用の分子機序を明らかにする。モデル生物メダカを用いた解析に加えて、新たにヒト三次元オルガノイド培養系を用いた解析技術を導入し、宿主と病原体の相互作用に関与するアポトーシス制御機構の一端を明らかにする予定である。
アディポネクチンの超分子構造・相互作用

アディポネクチンの各領域の分子間相互作用を明らかにするため、様々な構成のアディポネクチンフラグメントを作成し、物理化学的な解析を進めた。全長アディポネクチンは還元状態、5°CでのCDスペクトルにおいて235nm付近にコラーゲン様トリプルヘリックス構造に由来する正のピークを示した。この波長におけるモル楕円率の変化を温度に対して測定すると、19°Cおよび67°Cにおいて転移が観測された。低温側の転移では正のピークが消失しておりコラーゲン様ドメインが変性していることが示された。また、球状ドメイン単独ではβシート構造に特徴的なスペクトルが得られ、70°Cにおいて転移が認められた。に、構造転移と会合状態の関係を調べるために、コラーゲン様ドメインの変性温度の前後である5°Cと40°Cにおいて、超遠心分析による分子量測定を行った。そして、全長アディポネクチン、球状ドメインいずれも両温度で三量体であった。一方、コラーゲン様ドメインのみでは5°Cでのトリプルヘリックス構造の形成は見られず、三量体形成も認められなかった。従って、アディポネクチンの三量体形成には球状ドメイン間の会合が支配的であるといえる。予想に反し、コラーゲン様ドメイン単独での構造安定性は低く、球状ドメインが三量体を形成し末端が拘束されてはじめてトリプルヘリックスが形成できた。また、三量体より大きな会合体形成については、高濃度での超遠心分析によっても還元状態ではその形成を確認できなかった。一方酸化状態では部分的に高分子量の会合体形成が起こるものの、ランダムな会合による凝集には至らず、適当な多量体として安定化する仕組みが存在していることが示唆された。アディポネクチンは、脂肪組織で高発現する脂肪組織特異的な分泌蛋白質であり、BMIが高く体脂肪の多い人では発現量が低いことが知られている。生体内では種々の多量体を形成しており、高分子量のアディポネクチンがより活性が強いことが明らかにされている。このように、その多量体の生理的意義は非常に興味深い。アディポネクチンはSignal sequence, Variable region(V),Collagen-like domain(C)及びGlobular domain(G)4つのドメインから構成されている。これまでにアディポネクチンの多量体形成モデルとして、アディポネクチン3量体はVドメインに位置する3個のCys36のうち2つが分子間S-S結合を形成し、残りのフリーのCysが別の3量体のフリーのCysとS-S結合を形成し6量体を形成する機構が提唱されている。しかし本研究では、アディポネクチン分子には三本鎖を形成することが知られているCドメインが存在することから、会合体の形成にはS-S結合のほかに、非共有結合が大きく寄与しているのではないかと考え、S-S結合が形成されない還元剤存在下で物理学的手法により多量体形成能を解析した。会合体の形成機構および各ドメインの寄与を解明するため、各ドメインを組み合わせた配列からなるサンプルVCG,CG,G及びVCを調製し、還元剤存在下でCD,DSC,超遠心分析により熱安定性と多量体形成能を解析した。その結果、(1)Vドメインは3量体の安定化には寄与していない、(2)3量体形成にはGドメインが必須であり、Gドメインは単独で3量体形成能を有する、(3)CドメインはGドメインを伴っているときに三本鎖構造を形成することが分かった。以上よりS-S結合はアディポネクチンの3量体形成に必須ではないことが示された。
反応・拡散・移流系に現れる空間パターンと分岐現象

本研究は反応・拡散・移流系の解が呈するパターンに関する研究である.反応・拡散・移流系のうちでも特に,1977年Deneubourgによって提案された社会性昆虫の巣の建設過程に関するモデル方程式系に着目した.このモデルは3因子系であるが,定常問題を考えると2因子系に帰着され,1993年,三村教授・辻川教授によって提案された三村・辻川系でよく近似されるため,本研究課題を遂行するにあたってはこちらの系を扱った.これまで三村・辻川系については,三村・辻川両教授と八木教授及び研究代表者の共同研究によって,2乗ルベーグ可積分な無限次元の関数空間をベースに解及び指数アトラクターが構成されているが,本研究ではその発展として,無限次元力学系の視点からパターン解の自由度を考察する目的で指数アトラクターの次元の評価を行った.この研究は,大阪大学・中口悦史氏及びドイツ・ミュンヘン工科大学・M.Efendiev氏との共同研究であり,中口氏と研究ディスカッションを行うため旅費を使用した.既に成果はまとめられており,論文投稿準備中である.一方,三村・辻川系の解が呈する六角形パターンの解析については,前年度までの分岐理論を用いた解析と数値計算結果との間に関連性があることが分かったため,その成果を盛岡応用数学小研究集会(世話人飯田雅人氏)において発表した.この際旅費を使用した.この研究については,福岡工業大学・久藤衡介氏,千葉大学・櫻井建成氏,宮崎大学・辻川亨氏との共同研究であり,福岡において研究ディスカッションを行うため旅費を使用した.その他,前年度より引き続き行っている反応・拡散系におけるスパイラルパターンの大域制御項導入による安定化について,櫻井氏と共同で,系の近似常微分系を構成し,それを解析することで,一定の成果を得たため,非線形科学関連の学術雑誌にその成果を発表した.現在は,反応・拡散系にみられるパターンで重要なスパイラルパターンについて,キネマティック方程式によるアプローチを行い,定常解の存在とその安定性を解析中である.この研究に関しては,ドイツ・マックスプランク研究所に所属のモデル提案者であるA.Mikhailovを訪れ研究ディスカッションを行なった.また,国内共同研究者との打ち合わせも行なっている.さらには,解の形状と時間発展の様子を調べるため,パーソナルコンピュータを購入し数値計算を行なっている.反応・拡散・移流系に見られる六角形パターンについても,関数空間を正六角形関数のつくる部分空間に制限し,固有値0に対する固有空間の次元を1にし(京都大学・西田教授等の用いた方法),偶関数性を課した2重フーリエ級数を用いて120度回転不変性を持ったモードが分岐することを示す手法で,現在存在証明を行なっている.この研究に関しても国内研究者との共同研究ディスカッションを行った.現在は,反応・拡散系にみられるパターンで重要なスパイラルパターンについて,キネマティック方程式を用いたアプローチを行い,その定常解の存在と安定性に関する論文,およびパターンの制御に関する論文の2件を投稿準備中である.この研究に関しては,旅費を使用して国内共同研究者との打ち合わせを行なっている.また,具体的な解の形状と時間発展の様子を調べるため,パーソナルコンピュータを購入し数値計算も行なっている.加えて,反応・拡散・移流系に見られる六角形パターンについても論文を準備中で,国内研究者との共同研究ディスカッションを行っている.本研究は反応・拡散・移流系の解が呈するパターンに関する研究である.反応・拡散・移流系のうちでも特に,1977年Deneubourgによって提案された社会性昆虫の巣の建設過程に関するモデル方程式系に着目した.このモデルは3因子系であるが,定常問題を考えると2因子系に帰着され,1993年,三村教授・辻川教授によって提案された三村・辻川系でよく近似されるため,本研究課題を遂行するにあたってはこちらの系を扱った.これまで三村・辻川系については,三村・辻川両教授と八木教授及び研究代表者の共同研究によって,2乗ルベーグ可積分な無限次元の関数空間をベースに解及び指数アトラクターが構成されているが,本研究ではその発展として,無限次元力学系の視点からパターン解の自由度を考察する目的で指数アトラクターの次元の評価を行った.この研究は,大阪大学・中口悦史氏及びドイツ・ミュンヘン工科大学・M.Efendiev氏との共同研究であり,中口氏と研究ディスカッションを行うため旅費を使用した.既に成果はまとめられており,論文投稿準備中である.一方,三村・辻川系の解が呈する六角形パターンの解析については,前年度までの分岐理論を用いた解析と数値計算結果との間に関連性があることが分かったため,その成果を盛岡応用数学小研究集会(世話人飯田雅人氏)において発表した.この際旅費を使用した.この研究については,福岡工業大学・久藤衡介氏,千葉大学・櫻井建成氏,宮崎大学・辻川亨氏との共同研究であり,福岡において研究ディスカッションを行うため旅費を使用した.その他,前年度より引き続き行っている反応・拡散系におけるスパイラルパターンの大域制御項導入による安定化について,櫻井氏と共同で,系の近似常微分系を構成し,それを解析することで,一定の成果を得たため,非線形科学関連の学術雑誌にその成果を発表した.
農・園芸活動が果たす農芸教育的役割に関する研究

平成14年度も主として、園芸活動を取り入れた小中学校や社会教育の場としての農業小学校を訪ねてその実情を視察するとともに、これを支援する人々の体験談を聞いた。その概要は次のとおり。花の栽培に初めはあまり関心をもたない児童・生徒も、先生の指導のもとに実践をすすめ、花が大きくなるにつれて関心が高まり、徐々に積極的に参画するようになる。また、野菜類の栽培では、自分たちが手入れをしているという意識が顕著に感じられ、収穫への期待も大きい。このような共同体験は児童生徒と教師・指導者との対話の機会を増やし、地域社会や産業へと視野を広げるきっかけになっている。たとえば、収穫直前のスイカを盗まれたり、鳥やネズミに食べられた児童生徒には、身をもって社会の恥部に目を注ぎ、自然のきびしさを学ぶ貴重な体験となっている。また、予想したほど美味しくなかった収穫物を通して、美味しい農産物を生産する農家の技術の確かさを実感している。地域社会との関係では、父兄や地域社会の目が学校に注がれ、学童の園芸指導を楽しみしている高齢者が出てきたり、老人クラブが先生役を買ってでる例などのほか、学校と地域との連携行事が円滑になる、学校にそっぽを向いていた父兄が頻繁に学校に出入りするようになるなど、さまざまな効果が認められている。気になることは、園芸活動の支援に参画している人々が、植物を育てることそのものの重要性よりも、対人関係、対地域社会関係などの目立ちやすい変化に目を奪われている傾向が感じられる点である。なぜそういう変化が起こるようになってきたのかをもっと考えたうえでの実践を期待したい。初年度は、小学校と中学校での農・園芸活動の実態調査を中心に進め、必要に応じてインタビューを行った。福岡県内の全公立小、中学校1121校にアンケート用紙を送り、635校から回答を得た。内容は1)回答者とその学校の概要、2)農・園芸活動の実態(指導を行った人)、3)農・園芸活動に対する関心と意見(指導経験のない人)、4)農・園芸活動の今後のあり方であり、質問は総数27項目である。回答のうち主な点は次のとおりである。なお、これらの成果はこの夏から秋にかけての関係学会で発表予定である。農・園芸活動を行った学校は、小学校91%、中学校66%であり、その目的では、情操教育、教科との関連、栽培の楽しみ、収穫の楽しみ、環境教育を50%以上の回答者が支持した。内容としては、花づくり、野菜作りが圧倒的に多くいずれも80%に及び、それらは主に生活科、理科、総合的な学習のなかで取り上げられている。行った場所としては、花壇、学級農園、容器類などが50%を超える。活動の内容では80%以上が、水やり、草取り、苗植えや植え替え、収穫を行い、1週間あたりの時間数は2時間以下が77%に及ぶ。このような農・園芸活動を行ううえでの問題点として、30%以上が時間がないこと、費用がないこと、場所がないこと、立地条件が悪いことをあげていた。ほとんどの回答者が農・園芸活動がさまざまな効果をもたらすことを支持し、もっとも多くの回答者(約80%)が支持した児童・生徒の変化は栽培への興味・関心が高まったことである。活動にあたっては、75%が地域(特にPTA)の協力を得ていた。農・園芸の指導をしたことのない人の78%は関心をもっているが、経験や知識のないことが指導に自信をもてないことを訴えている。これを背景に、指導経験者も含めて約60%の人が講習会等の開催を希望している。平成12年度は主として、小中学校における農・園芸活動の実態をアンケート調査によって探った。今年度はまず、園芸活動を取り入れた小中学校を訪ねてその実情を視察するとともに、指導者の体験談を聞いた。その概要をまとめるとほぼ次のとおりである。学校の美化につながる花の栽培に対しては児童・生徒は深い関心をもっていて、熱心な先生がいると徐々に参画するようになる。この共同体験とその産物である花と景観を通して児童生徒と教師との意志疎通が円滑になる。きれいに花の咲いた校庭は彼らに誇りと自信を与え、コンクール等に入賞するとより一層熱意が高まる。問題はこの活動が継続できるかどうかである。実際、花づくりに熱心な教師が転勤したあとには荒れた花壇が残っているだけという例もあれば、教師は替わっても毎年コンクールに入賞するという学校もある。その違いは、地域の協力があるかいなかによる例が多いようである。次に、農耕を学び、家族や市民の交流の場としての試みが拡大しつつある、いわゆる農業小学校の実態を探った。大きく二つのタイプがあり、一つは児童生徒に対する体験学習ならびに交流の場とするもの、いま一つは、農耕活動そのものとその環境がもつ心身の癒しや人間的成長の効用を活かして、おとなを含めた人間の心身の健康を回復し、健全な成長を図ろうとするものである。いずれかといえば、表立った物には前者が多い。さらに、市民農園の実態を調べ、児童生徒の教育の場としての活用の可能性を探った。市民農園には食べ物として利用する作物の大部分が栽培されていて、それらがどのように生育しているか、どの部分が食べ物として販売されているかなど、を学ぶうえで重要な役割を、市民農園は果たしうることが明らかになった。

花の栽培に初めはあまり関心をもたない児童・生徒も、先生の指導のもとに実践をすすめ、花が大きくなるにつれて関心が高まり、徐々に積極的に参画するようになる。また、野菜類の栽培では、自分たちが手入れをしているという意識が顕著に感じられ、収穫への期待も大きい。このような共同体験は児童生徒と教師・指導者との対話の機会を増やし、地域社会や産業へと視野を広げるきっかけになっている。たとえば、収穫直前のスイカを盗まれたり、鳥やネズミに食べられた児童生徒には、身をもって社会の恥部に目を注ぎ、自然のきびしさを学ぶ貴重な体験となっている。また、予想したほど美味しくなかった収穫物を通して、美味しい農産物を生産する農家の技術の確かさを実感している。地域社会との関係では、父兄や地域社会の目が学校に注がれ、学童の園芸指導を楽しみしている高齢者が出てきたり、老人クラブが先生役を買ってでる例などのほか、学校と地域との連携行事が円滑になる、学校にそっぽを向いていた父兄が頻繁に学校に出入りするようになるなど、さまざまな効果が認められている。気になることは、園芸活動の支援に参画している人々が、植物を育てることそのものの重要性よりも、対人関係、対地域社会関係などの目立ちやすい変化に目を奪われている傾向が感じられる点である。なぜそういう変化が起こるようになってきたのかをもっと考えたうえでの実践を期待したい。
原子間力顕微鏡を用いた血管の「硬さ」測定による動脈硬化病変の評価法の確立

本研究においては、動脈硬化における内皮細胞の機能に及ぼす微小環境の力学的性質(硬さ)の影響を分子生物学的に検討します。血管内皮細胞を硬さの異なる細胞外基質において培養し、基質の硬さにより細胞機能を制御に影響を与えるか検討します。さらに、動脈硬化マウスでの組織弾性の変化と病態、細胞で影響を受けた遺伝子の発現と局在を解析し、組織弾性の変化と病態との関係を明らかにします。今回は、ヒト臍帯静脈内皮細胞を1,2,4,8,25kPaの硬さの異なるコラーゲンコートしたポリアクリルアミドゲルシャーレ上で培養し、内皮細胞刺激因子を添加し、細胞の形態の変化を観察しました。内皮細胞刺激因子の添加濃度、添加後の培養時間等を検討し、内皮細胞刺激因子の添加前後で細胞の大きさ、縦横比を測定しました。その結果、各条件で細胞の大きさに差は観察されませんでした。また、各硬さにおいて、内皮細胞刺激因子添加の有無で、縦横比の値に差はなく、内皮細胞刺激因子添加による影響は確認されませんでした。しかし、軟らかいほど縦横比が大きく細胞が長い形状を示す条件があることを確認できました。そこで、同じ条件で培養した細胞から、mRNAを抽出し、血管新生に関わる遺伝子の発現量をリアルタイムPCRにて解析しました。内皮細胞刺激因子添加の有無両方の条件で、硬さに比例して発現が減少する遺伝子があることを確認できました。また、同じ硬さで比べた場合、内皮細胞刺激因子添加により、発現量は多い傾向が確認できました。内皮細胞刺激因子の添加濃度、添加後の培養時間等を検討し、その結果、軟らかいほど細胞が長い形状を示す条件があることを確認できました。また、内皮細胞刺激因子添加による影響は確認されませんでした。さらに、mRNAを抽出し、血管新生に関わる遺伝子の発現の増減をリアルタイムPCRにて解析し、内皮細胞刺激因子添加の有無両方の条件で、硬さに比例して発現が減少する遺伝子があることを確認できました。つまり、血管内皮細胞において、基質の硬さにより影響を受ける遺伝子を見つけることができたため、予定していた、in vitroにおけるその遺伝子の発現局在を解析することができることから、順調であると考えられます。一方、進んでいない点としては、1,2kPaのゲルは、軟らかいため、ゲルに傷をつけないで、安定してシリンダーを固定することが困難で、細胞が付着していない領域をゲル上に作成することができていません。そのため、周辺の細胞が増殖・遊走する様子を解析することができていません。また、マウス組織の硬さ測定のために、組織を固定する方法の確立が困難で、まだ、マウス組織の硬さ測定ができていません。今後は、ヒト臍帯静脈内皮細胞を1,2,4,8,25kPaの硬さの異なるコラーゲンコートしたポリアクリルアミドゲルシャーレ上で培養し、今回とは異なる内皮細胞刺激因子を添加し、内皮細胞刺激因子の添加濃度、添加後の培養時間等を検討し、さらに、mRNAを抽出し、今回とは異なる血管新生に関わる遺伝子の発現の増減をリアルタイムPCRにて解析し、内皮細胞刺激因子添加の有無、硬さに対する影響を検討します。また、増減が確認できた遺伝子に関連したタンパク(受容体など)について、タンパク量及びリン酸化される量をELISA法およびウェスタンブロッティングで定量し、基質の硬さが及ぼす影響を解析します。硬さの異なるゲル上に、シリンダーを置いて、内皮細胞を播種し、細胞付着後、シリンダーを除いて、一部細胞が付着していない領域に周辺の細胞が増殖・遊走して細胞が増殖する速度、形態を顕微鏡下で観察する実験については、シリンダーではなく、シリコン栓等、他の材料をゲルにのせて、細胞が付着していない領域を作成する方法を検討します。また、基質の硬さにより影響を受ける遺伝子を見つけることができたため、今後、マウス血管組織におけるその遺伝子の発現局在性とマウス血管組織の硬さの分布を比較するため、マウス血管組織の硬さを測定します。しかし、マウス組織の硬さ測定のために、組織を固定するなど、方法の確立が困難であることから、マウスを多く扱っている研究室に出向し、血管組織の固定方法等を習得する予定です。

また、各硬さにおいて、内皮細胞刺激因子添加の有無で、縦横比の値に差はなく、内皮細胞刺激因子添加による影響は確認されませんでした。しかし、軟らかいほど縦横比が大きく細胞が長い形状を示す条件があることを確認できました。そこで、同じ条件で培養した細胞から、mRNAを抽出し、血管新生に関わる遺伝子の発現量をリアルタイムPCRにて解析しました。内皮細胞刺激因子添加の有無両方の条件で、硬さに比例して発現が減少する遺伝子があることを確認できました。また、同じ硬さで比べた場合、内皮細胞刺激因子添加により、発現量は多い傾向が確認できました。今回は、ヒト臍帯静脈内皮細胞を1,2,4,8,25kPaの硬さの異なるコラーゲンコートしたポリアクリルアミドゲルシャーレ上で培養し、内皮細胞刺激因子を添加し、細胞の形態の変化を観察しました。内皮細胞刺激因子の添加濃度、添加後の培養時間等を検討し、その結果、軟らかいほど細胞が長い形状を示す条件があることを確認できました。また、内皮細胞刺激因子添加による影響は確認されませんでした。さらに、mRNAを抽出し、血管新生に関わる遺伝子の発現の増減をリアルタイムPCRにて解析し、内皮細胞刺激因子添加の有無両方の条件で、硬さに比例して発現が減少する遺伝子があることを確認できました。つまり、血管内皮細胞において、基質の硬さにより影響を受ける遺伝子を見つけることができたため、予定していた、in vitroにおけるその遺伝子の発現局在を解析することができることから、順調であると考えられます。一方、進んでいない点としては、1,2kPaのゲルは、軟らかいため、ゲルに傷をつけないで、安定してシリンダーを固定することが困難で、細胞が付着していない領域をゲル上に作成することができていません。そのため、周辺の細胞が増殖・遊走する様子を解析することができていません。また、マウス組織の硬さ測定のために、組織を固定する方法の確立が困難で、まだ、マウス組織の硬さ測定ができていません。今後は、ヒト臍帯静脈内皮細胞を1,2,4,8,25kPaの硬さの異なるコラーゲンコートしたポリアクリルアミドゲルシャーレ上で培養し、今回とは異なる内皮細胞刺激因子を添加し、内皮細胞刺激因子の添加濃度、添加後の培養時間等を検討し、さらに、mRNAを抽出し、今回とは異なる血管新生に関わる遺伝子の発現の増減をリアルタイムPCRにて解析し、内皮細胞刺激因子添加の有無、硬さに対する影響を検討します。また、増減が確認できた遺伝子に関連したタンパク(受容体など)について、タンパク量及びリン酸化される量をELISA法およびウェスタンブロッティングで定量し、基質の硬さが及ぼす影響を解析します。硬さの異なるゲル上に、シリンダーを置いて、内皮細胞を播種し、細胞付着後、シリンダーを除いて、一部細胞が付着していない領域に周辺の細胞が増殖・遊走して細胞が増殖する速度、形態を顕微鏡下で観察する実験については、シリンダーではなく、シリコン栓等、他の材料をゲルにのせて、細胞が付着していない領域を作成する方法を検討します。また、基質の硬さにより影響を受ける遺伝子を見つけることができたため、今後、マウス血管組織におけるその遺伝子の発現局在性とマウス血管組織の硬さの分布を比較するため、マウス血管組織の硬さを測定します。
窒化物半導体微細構造制御による蛍光体フリー高効率多波長発光ダイオードの開発

研究目的『窒化物半導体微細構造制御による蛍光体フリー高効率多波長発光ダイオードの開発』{11-22}GaN基板とInGaN量子ドット活性層を組み合わせて用いることで蛍光体無しで高効率かつ高演色性LED(テイラーメイドLED)を作製できると考えた.研究進捗状況前年度までに行った(0001)面上InGaN量子ドットの作製に引き続き,(-1-12-2)GaN基板上へのInGaN量子ドットの結晶成長も行った.成長方法は有機金属気相成長法を用い,基板上へ直接975°C付近でGaN薄膜をホモエピタキシャル成長し,原子レベルでフラットな表面を得た.その後,InGaN量子ドット層の成長のため,成長温度を約700-840°Cとして,数ML(1MLは0.136A)だけ原料を供給した.成長様式を調べた結果,GaN上にまずInGaNが一面に成長したのち,数ML程度の揺らぎが存在していることがわかり,ML揺らぎによりQDが自己形成していると考えられる.また,量子ドットとして機能しているかを調べるため(-1-12-2)InGaNQDの時間分解PL測定を行った.得られた減衰寿命(典型値102ps)は極性面(InGaN/GaNQDにおいて数ns)および無極性面QD(AIN/GaNQDにおいて約300ps)の報告よりも短く,半極性InGaN/GaNQDにおいては全方位的に内部電界が低減されていることを示唆している.In組成の不均一があるInGaNのTRPL減衰寿命の発光エネルギー依存性は低エネルギー側程寿命が長くなる傾向にある一方,(-1-12-2)InGaN/GaNQDでは低温でのTRPL寿命の発光エネルギー依存性はほぼなく,むしろ高エネルギーほど寿命が長くなっている.これは,ポテンシャル揺らぎではなく一つ一つのドットとして機能している可能性を示唆するデータである.研究目的『窒化物半導体微細構造制御による蛍光体フリー高効率多波長発光ダイオードの開発』{11-22}GaN基板とInGaN量子ドット活性層を組み合わせて用いることで蛍光体無しで高効率かつ高演色性LED(テイラーメイドLED)を作製できると考えた.研究進捗状況研究に先立ち,従来用いられている(0001)面GaN上へのInGaN量子ドットの作製と評価を行った.成長方法は有機金属気相成長法を用い,サファイア基板上へ低温バッファ層を用いて約3μmのGaNを作製し,その上にS-K量子ドットの作製を試みた.V族原料/III族原料比を5500と設定して650-690°C付近で2,4分子層(ML)だけInGaNを供給した.作製されたドットの直径は約20-30nm,高さは0.5nm程度,密度は3.1×10^<10>/cm^2,InGaN4ML(6s成長)では,直径20-50nm,高さが0.5-4.0nm程度,密度は5.9×10^<10>/cm^2の分布を持つ量子ドットが形成された.成長時間の増加とともにドットの直径,高さ,密度を変化できることがわかった.650°C成長のInGaN QDの低温フォトルミネッセンス測定を行った結果InGaN4MLでは2.3eV付近に,2MLでは2.6eV付近に非常にブロードなピークが確認できた.成長時間が短い方が高エネルギー側にピークがあり,量子ドットのサイズの違いによる量子サイズ効果の影響に由来すると考えられる.また,4ML成長のサンプルにおいて低温(10K)に対する室温(300K)のPLスペクトルの積分強度比を計算すると19%となった.同じ成長炉で作製した同程度の発光波長のInGaN QWサンプルでは1%以下であり,QDにしたことでキャリヤの3次元的な閉じ込めがQWよりも顕著になり非幅射中心へのキャリヤの拡散が抑制されているものと考えられる.また,同程度の発光波長を呈する3nm膜厚InGaN/GaN量子井戸からのPLスペクトルと比べると,InGaN QDの方が半値幅が3倍程度広く,多波長発光への応用に非常に有利であることがわかった.また,{11-22}GaNバルク基板上へのInGaN QD成長も行っており,光学的測定により,発光を観測している.研究目的『窒化物半導体微細構造制御による蛍光体フリー高効率多波長発光ダイオードの開発』{11-22}GaN基板とInGaN量子ドット活性層を組み合わせて用いることで蛍光体無しで高効率かつ高演色性LED(テイラーメイドLED)を作製できると考えた.研究進捗状況前年度までに行った(0001)面上InGaN量子ドットの作製に引き続き,(-1-12-2)GaN基板上へのInGaN量子ドットの結晶成長も行った.成長方法は有機金属気相成長法を用い,基板上へ直接975°C付近でGaN薄膜をホモエピタキシャル成長し,原子レベルでフラットな表面を得た.その後,InGaN量子ドット層の成長のため,成長温度を約700-840°Cとして,数ML(1MLは0.136A)だけ原料を供給した.成長様式を調べた結果,GaN上にまずInGaNが一面に成長したのち,数ML程度の揺らぎが存在していることがわかり,ML揺らぎによりQDが自己形成していると考えられる.また,量子ドットとして機能しているかを調べるため(-1-12-2)InGaNQDの時間分解PL測定を行った.

得られた減衰寿命(典型値102ps)は極性面(InGaN/GaNQDにおいて数ns)および無極性面QD(AIN/GaNQDにおいて約300ps)の報告よりも短く,半極性InGaN/GaNQDにおいては全方位的に内部電界が低減されていることを示唆している.In組成の不均一があるInGaNのTRPL減衰寿命の発光エネルギー依存性は低エネルギー側程寿命が長くなる傾向にある一方,(-1-12-2)InGaN/GaNQDでは低温でのTRPL寿命の発光エネルギー依存性はほぼなく,むしろ高エネルギーほど寿命が長くなっている.これは,ポテンシャル揺らぎではなく一つ一つのドットとして機能している可能性を示唆するデータである.
骨および関節軟骨疾患に対する生体組織工学を用いた再生医療に関する研究

間葉系幹細胞のゼラチンβTCPスポンジ内における細胞増殖能の証明を行い、馬の骨欠損に対する間葉系幹細胞混合BMP2含浸βTCPスポンジの骨再生効果を明らかにした。さらに、関節軟骨欠損に対するPRP含浸ゼラチンマイクロスフィアの関節内投与により、線維性軟骨の再生を促進た。最後に、離断性骨軟骨症に対して、間葉系幹細胞混合BMP2含浸βTCPスポンジとPRP含浸ゼラチンマイクロスフィアを臨床応用し、骨再生ならびに関節軟骨再生効果を明らかにした。塩基性線維芽細胞増殖因子(以下bFGF)は血管平滑筋細胞増殖作用を有することから、再生医療分野で血管誘導、皮膚再生に広く応用されている。さらに、骨形成蛋白(BMPs)あるいは軟骨修復作用を有する形成転換成長因子β1(TGF-β1)などが知られている。これらの因子の半減期は短いために関節内や広範におよぶ骨折部位に応用するには長期間にわたり因子の作用が維持されることが望ましい。近年、この因子を含浸させたゼラチンハイドロゲルを用いることにより、ある一定期間持続的に因子を放出(徐放化)するドラックデリバリーシステム(DSS)の基礎的検討が進められている。すなわち、bFGF(BMP-2,TGFβ1)含浸ゼラチンハイドロゲルを用いることにより、骨折治癒を促進させ、治癒期間を短縮することが期待される。以上のことから、骨製スクリューを用いることで骨折部位に骨芽細胞誘導のための足場を形成し、bFGF(BMP-2,TGFβ1)含浸ゼラチンハイドロゲルを用いることで骨芽細胞(軟骨細胞)の遊走を促進し、重症骨折例に対する骨折治癒期間の短縮が期待される。本年度は、bFGF含浸ゼラチンハイドロゲルの設計を行い、in vivoにて馬の第三中手骨骨欠損モデルに対するbFGF含浸ゼラチンハイドロゲル関節内投与を実施し、関節軟骨ならび骨増生をマルチディテクトのCT値により評価した。その結果、bFGF含浸ゼラチンハイドロゲルの骨に対する誘導能が示された。また、in vitroにて近位種子骨切断モデルに対して骨製スクリューを用いた固定を行い、引っ張り強度試験を実施した。その結果、馬の重症骨節例への臨床応用に必要な強度と適切な形状を持つ骨製スクリューの創製が確立された。骨形成蛋白(BMPs)は骨再生の成長因子として、多血小板血漿(PRP)は形成転換成長因子β1(TGF-β1)を含み軟骨再生因子として基礎的研究が進められている。近年、ゼラチンハイドロゲルを用いることにより、ある一定期間持続的に因子を放出(徐放化)するドラックデリバリーシステム(DSS)の生体組織工学の技術が確立された。また、セラチンにβTCPを含有させることで細胞の足場材としての強度を保有した生体分解性スポンジが開発された。そこで、BMP-2ならびにPRP含浸ゼラチンβTCPスポンジを用いることにより、骨ならびに関節軟骨の再生を促進させ、治癒期間を短縮することが期待される。本年度は、間葉系幹細胞のゼラチンβTCPスポンジ内における細胞増殖能の証明を行い、馬の骨欠損に対する間葉系幹細胞混合BMP2含浸βTCPスポンジの骨再生効果を明らかにした。さらに、関節軟骨欠損に対するPRP含浸ゼラチンマイクロスフィアの関節内投与により、線維性軟骨の再生を促進し、部分的な硝子軟骨の再生が可能であることを示した。最後に、サラブレッド種馬の距骨に発生した離断性骨軟骨症に対して、関節鏡視下において間葉系幹細胞混合BMP2含浸βTCPスポンジとPRP含浸ゼラチンマイクロスフィアを臨床応用し、骨再生ならびに関節軟骨再生効果を明らかにした。

最後に、サラブレッド種馬の距骨に発生した離断性骨軟骨症に対して、関節鏡視下において間葉系幹細胞混合BMP2含浸βTCPスポンジとPRP含浸ゼラチンマイクロスフィアを臨床応用し、骨再生ならびに関節軟骨再生効果を明らかにした。3年計画の研究目標のうち1年目、2年目は終了し、一部3年目の計画を遂行している。基礎実験が予測した成績を収めたことに加え、臨床例への応用を検討することが可能であった。現在、1年目ならびに2年目の研究計画に関する成績2件は国際雑誌に掲載され、別3件は国際雑誌にアクセプトされinprint中であり、残り7件が投稿中である。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後、最終年度の計画を遂行する予定である。すなわち、大腿骨内側顆骨軟骨欠損モデルを作成し、TGF-β1含浸ゼラチンスポンジ、BMP-2含浸β-TCPゼラチンスポンジおよび間葉系幹細胞(1×107)の骨増生への影響を評価する。これにより、大骨軟骨欠損の大きい腿骨内側課骨嚢胞等に対する生体組織工学を用いた再生医療を構築する。さらに、臨床研究をすすめることで、骨および関節軟骨疾患に対する生体組織工学を用いた再生医療技術の確立を目指す予定である。
備前焼「金・銀彩」模様の形成機構の解明とそれらの再現法の確立

備前焼粘土と炭酸カリウムを大気中にて1230°Cまで昇温した後、電気炉内にアルゴンと一酸化炭素(Ar : CO = 90 : 10 (vol%))の混合ガスを導入し、1230°Cで6時間保持した後、混合ガス中で900°Cまで冷却後、炉内を大気中とし、900°Cで2時間保持(酸化処理)した後、室温まで冷却した。得られた試料の表面は、備前焼作家から提供された金彩備前焼と同じ色調であった。得られた試料の断面を薄片化し、走査透過電子顕微鏡を用いて微構造観察を行った結果、作家が作製した金彩備前焼と同様に、約100nmのα酸化鉄(ヘマタイト)が生成していることを確認した。また、混合ガス中にて900°Cまで冷却した後、酸化処理を行わず室温まで急冷した試料表面の色調はグレーであった。この試料表面には、約5nmの金属鉄粒子が生成していることがわかった。混合ガスを導入することにより、電気炉内は還元雰囲気となり、試料表面付近の鉄イオンが金属鉄まで還元され、この金属鉄が900°Cで2時間の酸化処理によりヘマタイトとなり、これが結晶成長することにより、約100nmのヘマタイト層が形成したと考えられた。一方、備前焼粘土のみを上記と同じ条件下で熱処理した結果、試料表面は黒色となった。得られた試料の微構造観察を行った結果、Mg-Fe-Al-O系のスピネル構造化合物が主に生成していた。混合ガス中で熱処理した後、大気中の酸化処理温度を900°Cよりも高温で熱処理した試料および900°Cの酸化処理を2時間よりも長くした試料表面は赤色となった。これは、ヘマタイト層が厚くなることに起因すると考えられた。備前焼作家である連携研究者から提供された「銀彩」備前焼について、構成相および微構造を透過型電子顕微鏡(TEM)により検討した。これまで、陶磁器表面の金属光沢模様は、焼成時に付着した炭素膜による干渉色と考えられてきたが、提供された銀彩模様の断面および酸処理により取り出した結晶相についてTEM観察を行った結果、炭素の存在は確認できなかった。しかし、酸化鉄が試料表面に生成していることを見出した。電子線回折の結果、この酸化鉄は備前焼を代表する特徴的な赤色模様のヘマタイト(α-Fe2O3)ではなく、近年次世代の磁性材料として注目されている、Fe2O3の多形であるε-Fe2O3であることを見出した。また、酸化鉄粒子以外に、アルミニウムおよびマグネシウムを含む粒子が生成していることがわかった。作家による金・銀彩備前焼の作製条件について調査した結果、成形した備前焼粘土と稲わらを酸化雰囲気下で昇温した後、木材や炭による還元雰囲気下で冷却すると作品表面に金属光沢が現れる確率が高くなり、酸素分圧により色調が変化することがわかった。これらの調査結果を基に電気炉による再現実験を行う。実験計画通り、おおむね順調に進展している。連携研究者から提供された銀彩備前焼について、発色構成相が炭素膜でなく酸化鉄であり、イプシロン型酸化鉄(ε-Fe2O3)であることを明らかにすることができた。備前焼作家である連携研究者の焼成条件を調査した結果、備前焼表面が金や銀色などの金属光沢に呈色しやすい焼成条件が明らかになった。以上の結果を基に、現在電気炉による再現実験を開始しており、平成27年度は概ね達成できたと判断した。備前焼作家により制作された金彩備前焼について、表層の結晶相について粉末X線回折および透過型電子顕微鏡観察により検討した。金色は、これまで燃料として用いられる赤松に含まれる炭素が作品表面に付着し、この炭素膜による干渉色によると考えられてきたが、炭素は検出されず、厚さが約100nmの酸化鉄(ヘマタイト、α-Fe2O3)が表面に生成していることが明らかとなった。また、メスバウアー分光測定においても、ヘマタイトの生成を確認した。このヘマタイトとガラス相の散乱光により金色に見える可能性があることがわかった。金彩および銀彩備前焼を制作されている備前焼作家に、金属光沢模様が現れやすい焼成条件について聞き取り調査を行った。稲わらを巻いた作品を登り窯にて酸化雰囲気下で昇温した後、過剰の薪または炭を加え、還元雰囲気下で冷却すると金彩や銀彩模様が現れやすいことがわかった。よって、備前焼表面の金属光沢は、稲わらと反応して生成した液相中に酸化鉄が析出することにより現れると考えられた。作家による焼成条件を基に、電気炉にて再現実験を行った。稲わらの主成分はシリカ(SiO2)であるが、カリウムが約13wt%含まれており、カリウムが備前焼粘土と反応してガラス相が形成すると考えられる。そこで、稲わらの代わりに炭酸カリウム(K2CO3)を用い、大気中にて1230°Cまで昇温後、アルゴンガスに一酸化炭素を10%混合したガス中で冷却を行った。現在、生成相の検討および熱処理条件の最適化を行っている。昨年度は銀彩備前焼表面に生成している結晶相を特定し、今年度は金彩備前焼表面に生成している結晶相を特定した。更に、作家による焼成条件が明らかとなり、再現実験を進めている。以上の結果から、平成28年度の目的はおおむね達成できたと判断した。

備前焼粘土と炭酸カリウムを大気中にて1230°Cまで昇温した後、電気炉内にアルゴンと一酸化炭素(Ar : CO = 90 : 10 (vol%))の混合ガスを導入し、1230°Cで6時間保持した後、混合ガス中で900°Cまで冷却後、炉内を大気中とし、900°Cで2時間保持(酸化処理)した後、室温まで冷却した。得られた試料の表面は、備前焼作家から提供された金彩備前焼と同じ色調であった。得られた試料の断面を薄片化し、走査透過電子顕微鏡を用いて微構造観察を行った結果、作家が作製した金彩備前焼と同様に、約100nmのα酸化鉄(ヘマタイト)が生成していることを確認した。また、混合ガス中にて900°Cまで冷却した後、酸化処理を行わず室温まで急冷した試料表面の色調はグレーであった。この試料表面には、約5nmの金属鉄粒子が生成していることがわかった。混合ガスを導入することにより、電気炉内は還元雰囲気となり、試料表面付近の鉄イオンが金属鉄まで還元され、この金属鉄が900°Cで2時間の酸化処理によりヘマタイトとなり、これが結晶成長することにより、約100nmのヘマタイト層が形成したと考えられた。一方、備前焼粘土のみを上記と同じ条件下で熱処理した結果、試料表面は黒色となった。得られた試料の微構造観察を行った結果、Mg-Fe-Al-O系のスピネル構造化合物が主に生成していた。混合ガス中で熱処理した後、大気中の酸化処理温度を900°Cよりも高温で熱処理した試料および900°Cの酸化処理を2時間よりも長くした試料表面は赤色となった。これは、ヘマタイト層が厚くなることに起因すると考えられた。備前焼表面に現れる金属光沢模様は、備前焼粘土に稲わらを巻いて酸化雰囲気下で焼成した後、還元雰囲気下で冷却すると現れやすいと考えられている。本研究では、稲わらの代わりに試薬の炭酸カリウムを用い、アルゴン/一酸化炭素が10/90(vol%)の混合ガスを導入することにより還元雰囲気とした。備前焼粘土と炭酸カリウムを1230°Cまで大気中で熱処理した後、混合ガスを導入して6時間保持し、室温まで冷却した。得られた試料表面にはガラス相は生成していたが、色調は青味を帯びたグレーであった。電子顕微鏡観察により生成相を検討した結果、試料表面には数nm程度の金属鉄(α-Fe)が生成していることがわかった。備前焼作家が作製した金彩備前焼表面には酸化鉄(ヘマタイト)が生成していることから、混合ガス中で900°Cまで冷却した後、電気炉内を大気中として900°Cで2時間保持した。その結果、試料表面にヘマタイトが生成し、表面は金属光沢を呈することが明らかになった。備前焼作家が作製した金彩備前焼表面には、約100nmのヘマタイトが生成する。試料表面をフッ酸処理してヘマタイト相を取り出し、電子顕微鏡観察により粒子形態および結晶方位について詳細に検討した。その結果、粒子径が500nmのヘマタイトが二次粒子を形成していることが明らかになった。電子線回折の結果、個々の粒子の方位はほぼ同じで配向性が高いことがわかった。また、ヘマタイトはc軸は試料表面にに対して垂直であることがわかった。断面試料についても電子線回折によりc軸が試料表面に対して垂直であることを確認した。実験計画通り、おおむね順調に進展している。平成28年度は金彩備前焼表面に生成している結晶相を特定し、平成29年度は金彩備前焼の作製条件について詳細に検討し、還元雰囲気下で冷却し、冷却過程で酸化雰囲気として熱処理する必要であることを明らかにし、金彩備前焼の再現に成功した。
iPS細胞の技術を応用したマルファン症候群に対する新規保存治療薬の開発

マルファン症候群(MF)は、微細線維と呼ばれる弾性機能を司る細胞外マトリックス成分の機能不全を原因に致死性の解離性大動脈瘤を発症する致死性の結合組織疾患である。これまでMFの治療に関して、薬物療法と外科手術で正常の人なみに寿命を延長することが可能になったが、完全に抑制する事は出来ないため、再外科治療を余儀なくされる事が多い。研究代表者はマルファン症候群の病態にADAMTSL6betaーADAMTS4の複合体によるversicanの破壊促進機構が関わり事を明らかにした。この結果より、マルファン症候群の治療薬としてADAMTS4の阻害薬が候補になることが示された。本研究では、遺伝性歯周炎の病態解明と、新規治療技術の開発を目的としている。そのため、MFの口腔内より採取した細胞から(MF derived iPS cell:MiPS)を樹立とその品質管理および細胞バンク化を行い、同時に歯根膜細胞へ分化誘導して、「微細線維再生モデル」の構築と創薬開発を行う。この目的に、微細線維形成誘導能を有するADAMTSL6β由来のペプチドを用いて、微細線維再生製剤の開発を行う。またマルファンモデル動物を用いた遺伝性歯周炎の前臨床研究にて検証する。従って本研究は、MiPSの樹立技術を確立し、微細線維再生する新規バイオ製剤を開発し、遺伝性歯周炎の治療技術の開発を目的にしている。今年度の研究計画に関して、ADAMTSL6βのマルファン症候群に対する治療効果を確認するため、マウスモデルを用いて実験を行った。治療計画のデザインに関しては、ADAMTSL6βの過剰発現マウスを作製し、マルファンモデル動物であるC1039Gと交配した。その結果、マルファン症候群でみられる微細線維の形成不全は改善された。しかし長期飼育するとさらに結合組織の崩壊の促進が観察された。組織崩壊のメカニズムを解析すると、ADAMTSL6βを過剰発現させるとADAMTSメタロプロテアーゼの活性が促進し、Versicanという結合組織の維持に働く細胞外マトリックスの分解の促進が観察された。このことからADAMTSL6βはマルファン症候群の原因である微細線維の形成を誘導するばかりで無く、逆に細胞外マトリックスの破壊にも関わる事が判明した。これらの結果よりADAMTSL6βに関して、組織破壊に関わるドメインを欠失させて変異体を用いた技術開発の必要性が示唆された。MFは遺伝病であるにも関わらず、35千人に1人と高い割合で発病し、日本国内でも2万5千人4万1千人の近くの患者がいると考えられている(Miyairi et al,Int.Heart J 2013)。これまでMF症候群の患者には延命に必要な薬物療法と人工血管置換手術に加え、妊娠、激しい運動の回避、極度の近視などのライフスタイルに制限があり、これらを改善する新たな治療技術の開発が切望されている。研究代表者は微細線維を再生するADAMTSL6βを発見し、MF予防薬としての開発を行ってきた。このADAMTSL6βは微細線維の重合を促進する作用があり、また生体内に投与すると微細線維を再生する事が出来る。本研究期間でADAMTSL6βは同じADAMTSsuperfamilyに属するADAMTS4のメタロプロテアーゼ活性に関して促進的に働く事を明らかにした。ADAMTSL6βをマルファン症候群モデルマウスの大動脈瘤に強制発現させると、ADAMTS4と物理的に結合して結合組織の強度を調整しているversicanの分解を促進した。この結果よりADAMTSL6βをマルファン症候群の治療薬として開発するためには、ADAMTS4と結合しない変異体(⊿TSP)の開発が必要出有ることが示された。これまで研究代表者はマルファン症候群のモデル動物を用いてADAMTSL6βの機能解析を行ってきた。この中で、ADAMTSL6βが同じADAMTSファミリーに属するADAMTS4と結合することで破壊的に働いていることを示した。また研究計画で記載されているADAMTSL6αおよびβのノックアウトマウスの作製も順調に進んでおり、昨年度にこれらのマウスを得ることが出来た。また抗ADAMTSL6および抗fibrillin-1抗体の作製も完了し、これらを用いてマルファン症候群の患者サンプルを用いてこれらの分子が病態進行に関わるかも進めている。これらの発見は研究計画当初とはことなる新知見を得ることが出来た。これらの成果に関して、論文投稿準備を進めている。以上の理由により本研究計画はおおむね順調に進んでいる。微細線維は、fibrillin-1 (FBN-1)を主成分に形成される線維状細胞外マトリックスで、様々な分子間ネットワークを形成することで、歯、皮膚、骨格および血管などの結合組織における弾性機能と機械的強度の維持に関わる。FBN-1の遺伝子変異を原因とするMarfan症候群(MFS)は、FBN-1の遺伝子変異を原因に微細線維崩壊症を引き起こし、体全体の結合組織が脆弱化し、歯周炎や解離性大動脈瘤を含む様々な結合組織疾患を引き起こす。このことから、微細線維は結合組織で強度維持に働いている普遍的な機能分子であり、その崩壊機構は全身の結合組織疾患と歯周炎などの歯科領域での疾患を繋げる共通の標的と考えられる。