hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中学校入学時の生徒と保護者の適応援助のための教育的介入プログラム開発

本研究では,すべての子どもが経験する環境移行事態である中学校入学に関して,子どもだけでなく保護者を含めて,どのような適応援助が有効なのかを検討した。まず,研究1・2で,ほとんどの中学校で実施されている新入生とその保護者を対象とした入学説明会に注目し,提供する情報の内容や提供方法を検討した。その結果,学校内や設備の見学(物理的環境)や授業風景の参観(社会・文化的環境),そして上級生である中学生を中心とした説明会プログラム(対人的環境)が効果的であることが明らかとなった(研究1)。特に新入生にとって関心の強い部活動の紹介などは,中学校入学に対する動機づけを高める効果があると推測された(研究2)。なお,新入生や保護者の中にはさまざまな意見や要望があるはずであり,今後はそうした個別の要求に応えられるようなやり方が望まれる。次に研究3・4・5では,環境移行にともなう対人関係の諸問題の発生を予防するとともに,人格形成に重要な意味をもつ友人関係の促進を図るねらいで,新入生を対象に社会的スキル教育の導入を試みた。宿泊合宿で短期間に集中して実施する形態(研究4)では,一定の効果が見られる生徒があった。ただし,効果の持続には問題があることも明らかになった。一方,通常の授業時間に間隔をおいて実施する場合(研究3),入学直後よりも,実際の中学校生活の中で対人関係の諸問題に出合うことが増えると予想される1学期後半に実施することの有効性が示された。ただし,学外者(大学院生)による少ない授業回数(4回)では社会的スキルの向上は見られても,学校生活全般への効果は認められなかった。そこで,回数を8回に増やすとともに,学級担任による授業を行なったところ(研究5),主な目的としたスキル(男子がターゲット)の向上が,男子および学習前にスキルの低い生徒に認められた。本年度は3年計画の初年度にあたり,主に研究協力校(中学校)の選定および来年度の研究実施のための交渉と,介入プログラムの内容検討が中心であった。具体的には,1複数の公立中学校を研究協力校として選定することができた。これにより,学校間の状況の相違を越えた教育的介入プログラムの効果測定が可能になると考えられる。2新入生向けのプログラムとしては,新環境移行事態での社会的スキルの向上を中心とした内容を計画している。実施形態(間隔をおいて実施する分散形式と,新入生合宿での集中形式)と実施時期(中学校入学直後と,それ以外)に関して,プログラムの効果を測定する予定である。3保護者への援助策として,中学校入学説明会に注目し,本年度は主に研究協力校の実態把握を行った。具体的には,これまでの実施内容や実施状況について聞き取り調査し,さらに2000年1月から2月にかけて実施された説明会を観察した。4関係諸学会での資料収集に努めるとともに,学校心理学およびコミュニティ心理学で業績を有する米国人研究者を訪問し,プログラム実施計画に関するレビューを受けた。また,学校と家庭との連携強化を目的とした米国でのカリキュラムの実態に関しても資料を得ることができた。以上の準備状況と経過をふまえて,次年度は新入生向けプログラムの実施と効果の測定を行う。また,保護者を対象にしたプログラムとしては,入学説明会の改善および中学校側からの情報提供面での工夫点を検討し,実施に移す予定である。できれば,米国以外の諸外国の資料も加えて,幅広い視点から検討を重ねるようにしたい。本年度は3年計画の2年目にあたり,初年度に選定した研究協力校(3中学校)で新入生対象の教育的介入プログラムを実施した。また前年度末の新入生と保護者対象の入学説明会の評価と,改善策の提案を行った。

具体的には,(1)中学校新入生の友人関係向上をめざした社会的スキル学習(4セッション)を,正規の授業時間内にクラス単位で実施した。その結果,入学直後の4月よりもむしろ6月に行なう方が,社会的スキルに関して効果のあることが明らかになった。これには,友人関係の安定にともなう新たな人間関係上の問題発生が関係しているのではないかと推測された。(2)別の実施形態として,入学直後の4月に実施された新入生合宿(3泊4日)での集中形式を,事例検討的に試みた。社会的スキル学習は,同じく4セッションであった。その結果,プログラムの実施によって社会的スキルの向上した者については,学校適応に関する他の指標でも好ましい傾向が認められた。(3)前年度入学説明会で,上級生やPTA代表の役割に注目して改善を行った中学校では,説明会記録にもとづく第3者(大学生)による評定の結果,中学校の印象が好ましい方向で評価されることが明らかになった。これは,中学1年生の授業風景の参観などを含めて,中学校についての情報が豊富であること,また多くの面で中学校環境との交流を促進する好ましいアンカーポイント(例:頼りになる上級生,受容的な中学校教員)が提供されることによると考えられた。こうした結果をもとに,今年度末の新入生説明会のための改善点提言を行なった。本年度は3年計画の最終年度にあたり、第2年度の研究成果にもとづき、研究協力校(公立中学校2校)において、続けて新入生と保護者対象の入学説明会の改善点の検討、および新入生対象の教育的介入プログラムの拡充をおこない、その成果について考察した。具体的な成果は次の2点である。1、1校における前年度末の入学説明会で、一昨年度以上に中学生(特に新入生に1番身近な存在である中学1年生)が主体的に準備したプログラムを実施し、新入生と保護者にその評価を求めた。その結果、どちらからも1年生の授業風景参観や、新たに加わった部活動紹介などを含めて、肯定的な評定が得られた。2、中学校1校の1年生を対象に、友人関係向上を目的とした社会的スキル学習を、1週間に1授業時間ずつ合計8時間実施した。前年度は研究者が4時間全部の授業を行ったが、その成果をもとに、今年度は学習内容について研修を受けた学級担任が道徳の時間に行った。社会的スキル学習を実施していない対象校の1年生と比較した結果、男子、および学習前の段階で社会的スキルの低い生徒について、目標とした社会的スキル(自己評定)の上昇が見られた。また、社会的スキルの向上による交友関係の活発化は孤独感を低減すると予想し、それについても検討した結果、男子生徒で社会的スキル学習後の低下が認められた。以上の結果より、新入生およびその保護者にとって、中学校環境との交流を促進する好ましいアンカーポイント(中学校生活や部活動についての情報、生徒会で活躍する上級生、学習環境の体験、新入生にとっての社会的スキルなど)が提供されることの有効性を考察し、試行版ではあるがこれらの提供を目標とした教育的介入プログラムの有効性を確認することができた。
地震学的不連続面における揮発性成分の影響-地球内部のH_2O量,CO_2量の解明に向けて-

本年度は地球内部における水の影響に関する研究として、以下の4編を投稿した。1つはマントル遷移層の水のリザバーと考えられるオリビンの含水高圧相hydrous ringwooditeの弾性的性質を解明し、地震波の観測データと比較することにより地球内部の水の存在について議論した(Yusa et al.,2000)。さらに、地球内部への水の運搬、マントル遷移層中の含水鉱物の性質等を議論し、410km地震学的不連続面への水の影響についても議論した(井上,2000)。最後の話題については、現在国際誌にも投稿中である。さらに、高圧含水相、及び水が加わったマグマの生成についても議論し(井上,2001)、ガーネットと水に富んだマグマの間の希土類元素の分配を調べ、太古代に生成したマグマ「コマチアイト」の生成に水が関与した可能性、すなわち初期地球内部に水が存在した可能性について議論した(Inoue et al.,2000)。上記の研究以外に、放射光その場観察実験に携わり、マントル中の重要な鉱物MgSiO_3 enstatiteの相転移境界(Kuroda et al.,2000)、及びCaMgSi_2O_6 diopsideの相転移境界(Irifune et al.,2000)を精密に決定した。さらに今年度行った研究の中で現在論文執筆中、及びこれから論文執筆にかかろうとしている研究には、ポストスピネル相転移におけるH_2Oの影響に関するもの、及びオリビンのα-β-γ相転移境界におけるH_2O及びCO_2の影響に関するものがある。本年度は地震学的不連続面における揮発性成分の影響の中で、特にH_2Oの影響について明らかにした。まず、マントル遷移層において大量に存在すると考えられているオリビンの高圧相wadsleyiteの含水相hydrous wadsleyiteを合成し、それの結晶構造を調べた(Kudoh and Inoue,1999)。そしてhydrous wadsleyiteには斜方晶系以外に単斜晶系の試料も見いだされているが、この理由を明らかにした。さらに、オリビンの高圧相ringwooditeの含水相hydrous ringwooditeを合成し、SPring-8の放射光とダイヤモンドアンビルを用いることにより、その体積弾性率を求め、地震波の観測データと比較することにより地球内部の水の存在について議論した(Yusa et al.,2000)。現在はオリビンの相転移境界におけるH_2Oの影響について調べており、いろいろ面白い結果が得られている。さらに地球内部における揮発性成分の重要性の研究として、マグマ生成における水の効果を研究しており、このため含水条件下でマントル物質の高圧溶融実験を行った。そして、ガーネットと液との希土類元素の分配を調べ、大古代に生成されたマグマ「コマチアイト」の生成に水が関与した可能性について議論した(Inoue et al.,2000)。更に今までの研究のレビューとして、地球内部における水の重要性について議論し、マグマ生成における水の影響についてまとめ考察した(井上,1999)。
里山の猛禽を支える栽培体系とその地理的差異の解明：農業と生物多様性両立を目指して

里地里山の重要な構成要素である水田(稲麦二毛作田とそれ以外の水田)、果樹園などの農地に注目することで対象地の条件がある程度類似しており、米以外に麦の生産が多いという共通点をもつ地域として、北東北、北関東、北九州の3地域を選んだ。これらの地域の農地は、稲麦二毛作田とそれ以外の水田、果樹園などがある程度共通して存在し、かつその割合や一部の品種(果樹園)が異なっている。3地域(北東北:花巻、北関東:栃木市貝・茂木、北九州:福岡)それぞれに、10km四方の調査ブロックを1-2か所設置した。この調査ブロックは、地域全体の栽培体系を反映する割合で農地が含まれるよう配慮した。野外調査として、サシバなどの猛禽類の繁殖分布は、調査ブロック全域にわたり、車と徒歩で移動しながら発見したサシバなどの位置を記録した。調査ブロック内に1km四方の調査地点を8-10か所設置した。この調査地点で、サシバとノスリの繁殖期にあたる4-8月に餌生物(カエル類、バッタ類、ハタネズミ)の分布、農地の配置とを記録した。餌生物のカエルとバッタについては、各調査地点内の農地割合と同じ割合で含む長さ約100-400mの調査コースを4つ程度配置し、カエルとバッタはコースを徒歩で5-10分間移動しながら確認できた個体を記録した。餌生物のネズミは、10-20mの調査区を設置し巣穴数の記録(花巻、市貝・茂木)とトラップ捕獲率(花巻)を4-7月に2-3回、各3-4日間ずつ記録した。農地の栽培様式も、同じ4-8月に実施した。解析として、2018年8-12月および2019年1-2月に、野外データと既存景観情報をGISで統合し、サシバやノスリの分布と餌生物量の関係、景観構造とサシバやノスリ、餌生物との統計解析を実施した。概ね計画通りに調査区の選定と野外調査、解析は進んでいると判断した。調査区の選定にあたっては、予定よりも時間がかかった。その理由として、麦作、果樹園、稲作の3つの要因がそれぞれ同じ割合で含む場所で、かつ、サシバやノスリが生息する場所がごく限られているか、ほとんどないことを確かめるのに時間がかったことが挙げられる。そこで計画を修正し、稲作と畑作、放棄地、および農業用水用のため池などに注目し、それぞれの組み合わせが入る形で調査地を選定した。ネズミの密度評価法を確立するため、ネズミ密度の高い北東北花巻での調査に重点を置き、巣穴密度と捕獲率の関係を調べつつ、ネズミ密度の季節変化も調べることができた。カエル類とバッタ類の調査も、北東北の花巻で3回実施し、北関東の市貝と北九州の福岡では1回ずつ、予備的に実施し、当初の最低限の目的である猛禽の分布や景観との関係を調べることに重点を置き、その関係が認められることを確かめた。初年度の結果から、今の調査デザインである程度、当初の目的である、猛禽類の生息を支える農地の栽培体系のあり方を、気候条件の違う3地域にまたがって明らかにできる見通しが立った。加えて、その解析結果から、新しい仮説として一年を通したて水分条件が豊かな農地で、猛禽類の餌生物となるカエル類やネズミ類、その捕食者でありかつ猛禽類の餌生物であるヘビ類などの生息密度が高まっていることが見えてきた。年を通して水条件が豊かな場所になる条件として、農業用の池、一部あるいは全てが土でできた中規模の用水路、それらに隣接する湿地状の耕作放棄地などが重要という予想が立てられた。今年度から、昨年確立した調査区デザインをベースに、農地および周辺の水分条件が餌生物を通して猛禽類に及ぼす影響を明らかにする形で、調査区を一部修正する予定である。また、その仮説を実証するための解析も実施する予定である。

解析として、2018年8-12月および2019年1-2月に、野外データと既存景観情報をGISで統合し、サシバやノスリの分布と餌生物量の関係、景観構造とサシバやノスリ、餌生物との統計解析を実施した。概ね計画通りに調査区の選定と野外調査、解析は進んでいると判断した。調査区の選定にあたっては、予定よりも時間がかかった。その理由として、麦作、果樹園、稲作の3つの要因がそれぞれ同じ割合で含む場所で、かつ、サシバやノスリが生息する場所がごく限られているか、ほとんどないことを確かめるのに時間がかったことが挙げられる。そこで計画を修正し、稲作と畑作、放棄地、および農業用水用のため池などに注目し、それぞれの組み合わせが入る形で調査地を選定した。ネズミの密度評価法を確立するため、ネズミ密度の高い北東北花巻での調査に重点を置き、巣穴密度と捕獲率の関係を調べつつ、ネズミ密度の季節変化も調べることができた。カエル類とバッタ類の調査も、北東北の花巻で3回実施し、北関東の市貝と北九州の福岡では1回ずつ、予備的に実施し、当初の最低限の目的である猛禽の分布や景観との関係を調べることに重点を置き、その関係が認められることを確かめた。初年度の結果から、今の調査デザインである程度、当初の目的である、猛禽類の生息を支える農地の栽培体系のあり方を、気候条件の違う3地域にまたがって明らかにできる見通しが立った。加えて、その解析結果から、新しい仮説として一年を通したて水分条件が豊かな農地で、猛禽類の餌生物となるカエル類やネズミ類、その捕食者でありかつ猛禽類の餌生物であるヘビ類などの生息密度が高まっていることが見えてきた。年を通して水条件が豊かな場所になる条件として、農業用の池、一部あるいは全てが土でできた中規模の用水路、それらに隣接する湿地状の耕作放棄地などが重要という予想が立てられた。今年度から、昨年確立した調査区デザインをベースに、農地および周辺の水分条件が餌生物を通して猛禽類に及ぼす影響を明らかにする形で、調査区を一部修正する予定である。また、その仮説を実証するための解析も実施する予定である。野外調査地の変更により、実際に予定していた調査回数よりも少なめに調査を実施した場所があったため、調査の旅費や調査に用いる物品(ネズミ捕獲具やそのための餌、現地での記録用のソフトウエアや野帳、記録用筆記具、調査用紙複写代など)が一部購入されなかったため。今年度の調査回数が増えるため、旅費と調査のための物品(上述のもの)を購入する予定である。
パルス磁場を利用するキラル生体高分子の電磁誘導蛍光検出法の開発

パルス磁場中で生体らせん構造体に生じる誘導起電力の蛍光検出を行った.銀コーティングしたスーパーコイル構造のプラスミドDNA上に蛍光分子を結合し,この分散液のパルス磁場に伴う蛍光強度変化を観測した.その結果,僅かな蛍光強度の変化が観測された.この強度変化は,パルス磁場から100μs程度遅れて起こっており,らせん構造に生じる誘導磁場とパルス磁場の相互作用による配向に起因していることが示唆された.パルス磁場中で生体らせん構造体に生じる誘導起電力の蛍光検出を行った.銀コーティングしたスーパーコイル構造のプラスミドDNA上に蛍光分子を結合し,この分散液のパルス磁場に伴う蛍光強度変化を観測した.その結果,僅かな蛍光強度の変化が観測された.この強度変化は,パルス磁場から100μs程度遅れて起こっており,らせん構造に生じる誘導磁場とパルス磁場の相互作用による配向に起因していることが示唆された.パルス磁場中での蛍光強度測定装置を構築した。2mFのコンデンサーバンクとエッジワイズ巻コイルを使用して、幅0.5ms、最大4Tのパルス磁石を作成した。蛍光の励起光としてAr^+レーザ(波長488nm)を用いた。試料として、代表的ならせん分子であるDNAを用いた。蛍光色素としてOxazole Yellow homodimerの一種であるYOYO-1を用いた。YOYO-1は2重らせんのDNAに特異的に結合し、蛍光性を示す。構築した装置を用い、パルス磁場中で蛍光強度の時間変化を観測したところ、パルス磁場印加に伴って少し蛍光強度が減少した。しかしながら、蛍光励起に使用したレーザの安定性が悪く、ミリ秒の時間スケールでその強度が変動するため、安定した測定が出来ず、明確なシグナル変化を観測するには至らなかった。また所有のコンデンサーバンクでは0.5ミリ秒より短いパルス磁場が出せないためコイルに熱が生じ、磁石が冷却するのを待つ必要があるため繰り返し周波数も0.1Hz以下と低かった。高精度な蛍光強度測定が必要とされる本研究では、パルス磁場の幅を短く、繰り返しを速くする必要があることが分かった。この問題を打破すべく、キセノンフラッシュランプ用の2μFのコンデンサを用いて繰り返し周波数が高いパルス磁石を作成した。磁場の最大強度が1T程度ではあるが、パルス幅が50μsの磁場を発生させることが可能であり、また10Hz程度で繰り返し発生させることができた。これを用いて、蛍光強度検出を行うとノイズを低減させることに成功したが、上記のサンプルでは蛍光強度の時間変化が得られなかった。そこで、径の大きならせん構造を持つプラスミドDNAを試料とすることを検討した。銀ナノ粒子で全体をコーティングして導電性を高め、さらにタンパク質をスペーサとして電位感受性色素であるフルオレセインを結合させることができた。さらにパルス磁場中でわずかではあるが蛍光強度の変化が観測された。本年度は,プラスミドDNAのスーパーコイル構造を試料として用い,誘導起電力の蛍光検出を行った.使用したDNAは6,646bpのColE1 DNAで,これを銀ナノ粒子でコーティング後,グルタルアルデヒドリンカーでヒト血清アルブミン(HSA)を結合した.これは,銀による消光を防ぐためのスペーサーとして使用した.さらに電位感受蛍光色素であるフルオレセインイソチオシアネート(FITC)をHSAに結合した.FITCはモノアニオンからジアニオンの形になると蛍光量子収率が非常に大きくなる.そのpK_aは6.7である.このDNA試料をpH6.4の溶液に分散させ,パルス磁場中での蛍光強度の時間変化を観測した.パルス磁場には幅が100μsのものと500μsのもので測定しその結果を比較した.励起には488nmのArイオンレーザを用いた.500μsのパルス磁場での結果,DNAを試料に含まない場合に比べ,僅かではあるが(0.5%程度)パルス磁場に伴った蛍光強度の増加が観測されたか,100μsのパルス磁場ではこの変化は観測されなかった.また,観測された時間変化を詳しく調べると,パルス磁場の印加時間を渦ぎても,蛍光強度の変化が続いていた.これらの結果は,蛍光強度変化に100μs程度の緩和過程があることを示唆している.時間スケールは,DNAの回転緩和時間に近いことから,パルス磁場と誘導磁場による配向が影響を及ぼしていると考えられる.これは,新しい磁場効果であり,現在のところ報告例は見当たらない.また,想定していた現象とは若干異なるが,sub-μm程度のらせん構造体に磁場により誘導される起電力の測定も可能であると示唆された.更に,イメージングを目指すため,パルス磁場と同期した顕微観測系の構築も行った.ファラデー回転により,磁場と画像取得の同期が行えることを確認した.
エネルギーバランスにおける報酬系GABABシステムの機能解析

ドーパミンニューロンあるいは線条体ニューロン特異的GABAB受容体ノックアウトマウスに高脂肪食を間欠投与すると、高脂肪食の摂取が野生型マウスより増加した。またGABAB受容体アゴニストであるバクロフェンを投与すると高脂肪食の過剰な摂取は抑制された。しかし、ドーパミンニューロンおよび線条体ニューロン特異的GABAB受容体ノックアウトマウスでは高脂肪食の過剰摂取の抑制は来さなかった。以上の結果よりドーパミンニューロンあるいは線条体ニューロンのGABABシステムはエネルギーホメオスタシスの調節には関与しないが、報酬系の活性化を伴う高脂肪食の過剰な摂取を抑制する可能性が示唆された。GABAB1受容体をloxP配列ではさんだノックインマウス(GABABflox/floxマウス)とドーパミンニューロン特異的にCreが発現するDopaminetransporter (DAT)-Creマウス(B&auml;ckmanCM et al., 2006 Genesis)を交配し、得られたGABAB+/floxDAT-CreマウスをさらにGABABflox/floxマウスと交配し、GABAB flox /floxDAT-Creマウス、すなわちドーパミンニューロン特異的GABAB受容体ノックアウトマウスを作成した。また、側坐核を含む線条体特異的にCreを発現するGpr88-Creマウス(Hisatsune C et al., 2013 Transgenic Res)とGABABflox/floxマウスを交配して得られたGABAB+/flox Gpr88-CreマウスをさらにGABABflox/floxマウスと交配し、GABAB flox /flox Gpr88-Creマウス、すなわち線条体特異的GABAB受容体ノックアウトマウスも作成した。ドーパミンニューロン特異的GABAB受容体ノックアウトマウスでは腹側被蓋野を含む中脳を、線条体特異的GABAB受容体ノックアウトマウスでは線条体からDNAを抽出し、ネガティブコントロールとしてそれ以外の脳組織からもDNAを用い、GABAB遺伝子特異的なプライマーを用いたPCRでGABAB遺伝子が腹側被蓋野あるいは線条体で特異的にノックアウトされていることを確認した。組織特異的なGABABノックアウトマウスが作成できたため。GABABflox/floxマウスとDAT-Creマウスを交配して得られたGABAB flox /floxDAT-Creマウス、すなわちドーパミンニューロン特異的GABAB受容体ノックアウトマウスと、野生型マウスにおいて、ドーパミンニューロンにおけるGABAB受容体発現をGABAB受容体特抗体を用いた免疫染色法により比較検討した。野生型マウスでは、ドーパミンニューロンにおけるGABAB受容体発現を認めたが、ノックアウトマウスにおいてはドーパミンニューロン特異的にGABAB受容体の発現が低下していることを確認した。また、GABABflox/floxマウスとGpr88-Creマウスを交配して得られたGABAB flox /flox Gpr88-Creマウス、すなわち線条体特異的GABAB受容体ノックアウトマウスと野生型マウスにおいて、線条体におけるGABAB受容体発現をGABAB受容体抗体を用いた免疫染色法により比較検討した。野生型マウスでは、線条体におけるGABAB受容体発現を認めたが、ノックアウトマウスにおいては線条体特異的にGABAB受容体の発現が低下していることを確認した。さらに野生型マウス、ドーパミンニューロン特異的GABAB受容体ノックアウトマウス、線条体特異的GABAB受容体ノックアウトマウスのぞれぞれに普通食(CE-2)または高脂肪食(60.1%の脂肪および15.6%の炭水化物)を投与し、摂食量、体重の変化の推移を比較検検討した。上記の3種類すべてのマウスにおいて高脂肪食投与は普通食投与よりマウスの体重を増加させた。高脂肪食を投与したマウスにおいてgenotypeによる差を認めるか否かは現在検討中である。ノックアウトマウスにおいてGABAB受容体の発現がドーパミンニューロンまたは線条体特異的に低下していることを免疫染色法で確認できた。また、普通食および高脂肪食投与下でのノックアウトマウスおよび野生型マウスの摂餌量、体重の推移の検討を開始できた。GABAB受容体遺伝子特異的なプライマーを用いたPCR法にて、ドーパミンニューロン特異的GABAB受容体ノックアウトマウスでは腹側被蓋野において、線条体ニューロン特異的GABAB受容体ノックアウトマウスでは線条体において特異的loxP配列の組み換えが生じていることを確認した。またノックアウトマウスと野生型マウスから腹側被蓋野あるいは線条体を含む脳切片を作成し、GABAB受容体の発現をノックアウトマウスと野生型マウスで組織学的手法により比較検討し、腹側被蓋野あるいは線条体特異的にGABAB受容体が欠損していることについても確認した。高脂肪食を野生型マウスおよびGABAB受容体ノックアウトマウスのホモ接合型に離乳時の3週齢より13週間投与したが、野生型マウスとGABAB受容体ノックアウトマウスに有意な体重差は認めなかった。また16週齢での内臓脂肪重量および血糖値においても両群間で有意な差を認めなかった。一方、GABAB受容体ノックアウトマウスのホモ接合型に高脂肪食の間欠投与を行い野生型マウスと比較したところ、雌雄ともに線条体ニューロン特異的GABAB受容体ノックアウトマウスにおいて2時間における高脂肪食の摂取量が有意に増加した。

一方、ドーパミンニューロン特異的GABAB受容体ノックアウトマウスにおいては有意な増加を認めなかった。雄の野生型マウスにおいて、高脂肪食の間欠投与開始30分前にバクロフェン3mg/kg体重を腹腔内投与したところ、高脂肪食摂取量が有意に減少し、普通食摂取量には影響を与えなかった。雌の野生型マウスにおいても同様の結果を認めた。一方、ドーパミンニューロンあるいは線条体ニューロン特異的GABAB受容体ノックアウトマウスにおいて同様の検討を行ったところバクロフェンによる効果は消失した。雌のノックアウトマウスにおいても同様の結果を認めた。ドーパミンニューロンあるいは線条体ニューロン特異的GABAB受容体ノックアウトマウスに高脂肪食を間欠投与すると、高脂肪食の摂取が野生型マウスより増加した。またGABAB受容体アゴニストであるバクロフェンを投与すると高脂肪食の過剰な摂取は抑制された。しかし、ドーパミンニューロンおよび線条体ニューロン特異的GABAB受容体ノックアウトマウスでは高脂肪食の過剰摂取の抑制は来さなかった。以上の結果よりドーパミンニューロンあるいは線条体ニューロンのGABABシステムはエネルギーホメオスタシスの調節には関与しないが、報酬系の活性化を伴う高脂肪食の過剰な摂取を抑制する可能性が示唆された。Creの発現によりloxP配列の組み換えが起こるとGFPを発現するマウス[Ito Y et al., 2013 J Neurosci,既に入手済み]とそれぞれのノックアウトマウスを交配し、得られたマウスから腹側被蓋野や線条体を含む脳切片を作成してGFPの発現を検討することにより、リコンビネースCreが腹側被蓋野あるいは線条体特異的に発現していることを確認する。また、GABAB受容体の抗体を用い、免疫染色法にても組織特異的にGABAB受容体がノックアウトされていることを確認する。ドーパミンニューロン特異的GABAB受容体ノックアウトマウス、線条体特異的GABAB受容体ノックアウトマウスと野生型マウスの表現型の違いの解析を進める。体重、摂餌量のみならず、食の嗜好性の違いも検討する予定である。内分泌代謝学
クロマチンリモデリングを介した放射線誘発DNA損傷の修復制御機構の解明

放射線暴露などで生じるDNA二本鎖切断(DSB)損傷の修復の一連の過程において、近年クロマチンリモデリングの重要性が報告されてきたことから、放射線誘発DSB損傷修復機構過程の進行・完了に関わるクロマチンリモデリング因子を免疫沈降/プロテオミクス解析で同定し、クロマチンリモデリングを通したDSB修復機構制御の全容を明らかにすることを目的とし、本研究を行った。その結果MRE11, KU, RPAと相互作用するクロマチンリモデリング関連因子を複数同定し、その一つ、nucleolinは複製ストレスによるDNA損傷発生時に、ATRの活性化及び相同組換え修復に機能する因子であることを明らかにした。電離放射線暴露などで生じるDNA二本鎖切断(DSB)損傷の修復過程では、非相同末端結合と相同組換えの主要な二機構から適切なものが選択的に開始され、修復の完了に至るが、この一連の過程においてゲノムDNAが形成するクロマチン構造がどのように再構成(リモデリング)されるか、その役割は不明であることから、本研究では放射線誘発DSB損傷修復機構において、DSB損傷検知、修復機構の選択、修復の進行および完了の各段階におけるクロマチンリモデリングの役割をそれぞれの代表制御因子MRE11, KU, RPAと相互作用する因子をプロテオミクス法で同定し、機能解析することにより、クロマチンリモデリングを通したDSB修復機構制御の全容を明らかにすることを目的としてる。27年度研究では、DSB損傷初期過程、それに続くDNA修復の一つ、NHEJ系路で機能するヒストンリモデリング関連因子を同定するために、初期過程因子としてMRE11、NHEJ過程因子としてKU80, KU70をターゲットとし、これら抗体で免疫沈降後、沈降物を質量分析計で解析し、ターゲット因子とDSB損傷発生時に結合しうる候補因子の同定を試みた。MRE11とはヒストンシャペロンタンパク質、RNA metabolism、酸化ストレス応答に関わる候補因子が単離された。抗KU70抗体では同定できなかったが、KU80の場合にはNucleolin, FACT等クロマチンリモデリングに関わる因子、RNA metabolismに関わる候補タンパク質を同定できた。さらにこれら因子がDNA損傷発生時の役割を検討する一次スクリーニング法として、クロマチン画分への集積のウエスタンブロット法による検討を行い、NBS1, RPA70, RAD51など放射線照射時にDNA修復タンパク質のクロマチン集積が確認でき、28年度以降の解析に用いる系が確立できた。放射線で生じるDNA二本鎖切断損傷の一連の修復過程で、ゲノムDNAが構成する安定なクロマチン構造を、DNA修復の進行に伴ってどのように適切にリモデリングしていくかを明らかにするのが本研究の目的であるが、27年度研究では、免疫沈降・質量分析計を用いた解析から、DNA修復初期過程MRE11と結合しうる因子を複数同定でき、NHEJ過程においてもその初期因子KU80と結合しうる因子を複数同定することができた。これらの因子の中にはヒストンリモデリングに機能する因子も複数含まれており、28年に個々の因子の解析を遅滞なく始めることができる。また、免疫沈降・質量分析計による結合因子同定系が27年度研究で確立できたといえ、平成28年度は次の相同組換え修復関連の結合因子の同定も遅滞なく行うことができる。以上の理由から、研究計画は概ね順調に進展していると考えている。電離放射線暴露などで生じるDNA二本鎖切断(DSB)損傷の修復過程では、NHEJとHRの主要な二機構から一つが選択され、修復の完了に至るが、この一連の過程においてクロマチンリモデリングが重要であることが報告されていることから、本研究では放射線誘発DSB損傷修復機構過程の進行・完了に関わるクロマチンリモデリング因子をプロテオミクス法で同定し、機能解析することにより、クロマチンリモデリングを通したDSB修復機構制御の全容を明らかにすることを目的としている。28年度研究では、DNHEJ及びHR系路で機能するクロマチンリモデリング関連因子を、MRE11、Rad51、RPA70、KU80、Ligase IVをターゲットとした免疫沈降法・質量分析計解析し、候補因子の同定を試みた。MRE11とはヒストンシャペロンタンパク質、RNA metabolism、酸化ストレス応答に関わる候補因子、RPAではヒストン修飾関連因子、RNA metabolismにかかわるもの、DNA結合能を持つ因子が単離されたが、Rad51ではRNA結合能を持つもの、DNA損傷応答因子との相互作用が報告される因子が単離できた。一方、NHEJではKU80の場合にはNucleolin, FACT等クロマチンリモデリングに関わる因子、RNA metabolismに関わる候補タンパク質、を同定できた。しかし、Ligase IVでは因子同定はできなかった。さらにこれら同定因子がDNA損傷発生時の役割を検討する一次スクリーニング法として、クロマチン画分への集積のウエスタンブロット法による検討を行って、DNA損傷応答に機能しうる候補因子の絞り込みを行い、そのいくつかについてはsiRNAノックダウン等でDNA損傷との関わりについて解析を進めつつある。29年度も引き続きこれら候補因子のDSB損傷応答での役割の解明を行う予定である。放射線で生じるDNA二本鎖切断損傷の一連の修復過程で、ゲノムDNAが構成する安定なクロマチン構造を、DNA修復の進行に伴ってどのように適切にリモデリングしていくか、そしてクロマチンリモデリングはゲノム安定性の維持への役割を明らかにするのが本研究の目的であり、28年度研究では、免疫沈降・質量分析計を用いた解析から、HR過程でMRE11とともにRPA70, Rad51についても結合因子候補を複数同定でき、NHEJ過程においてもその初期因子KU80と結合しうる因子を複数同定することができた。

これらの因子の中にはヒストンリモデリングに機能する因子も複数含まれており、28年度解析ではDSB損傷応答に機能しうる候補因子の絞り込みができ、その一部についてはsiRNAの機能解析を開始することができている。以上の理由から、研究計画は概ね順調に進展していると考えている。電離放射線暴露などで生じるDNA二本鎖切断(DSB)損傷の修復過程では、NHEJとHRの主要な二機構から一つが選択され、修復の完了に至るが、この一連の過程においてクロマチンリモデリングが重要であることが報告されていることから、本研究ではDSB損傷修復機構過程の進行・完了に関わるクロマチンリモデリング因子をプロテオミクス法で同定し、機能解析することにより、クロマチンリモデリングを通したDSB修復機構制御の全容を明らかにすることを目的としている。29年度研究では28年度までの研究で同定されたクロマチン関連因子について、特にDSB損傷応答・修復経路における役割、特にDSB損傷初期応答因子ヒストンH2AXやHR初期機能因子NBS1と結合し、ヒストンeviction因子でもあるnucleolinについて検討を行った。nucleolinをsiRNAで発現抑制するとカンプトテシン処理による複製ストレス発生時のRPA, RAD51のHR因子のフォーカス形成が低下し、resectionによる一本鎖DNA末端の生成も低下し、nucleolinは複製ストレス時のHR修復に機能することが示唆された。複製ストレス時にはRPA依存的なATRキナーゼの活性化も起こるが、ATRの活性化およびATRによる基質リン酸化はnucleolinノックダウンにより低下した。一方、nucleolin過剰発現細胞ではATRの活性化やRPAの複製ストレス依存的なクロマチン結合が増加した。また、nucleolinはRPAとも結合することから、nucleolinはRPAとの結合を介し、複製ストレス発生時のHR修復及びATR依存的な細胞周期チェックポイントに対して、初期制御因子として機能することが明らかとなった。放射線暴露などで生じるDNA二本鎖切断(DSB)損傷の修復の一連の過程において、近年クロマチンリモデリングの重要性が報告されてきたことから、放射線誘発DSB損傷修復機構過程の進行・完了に関わるクロマチンリモデリング因子を免疫沈降/プロテオミクス解析で同定し、クロマチンリモデリングを通したDSB修復機構制御の全容を明らかにすることを目的とし、本研究を行った。その結果MRE11, KU, RPAと相互作用するクロマチンリモデリング関連因子を複数同定し、その一つ、nucleolinは複製ストレスによるDNA損傷発生時に、ATRの活性化及び相同組換え修復に機能する因子であることを明らかにした。27年度研究で免疫沈降・質量分析計による結合因子同定系が確立できており、この方法を用いて、もう一つの修復系、相同組換え修復時に機能するヒストンリモデリング関連因子を同様のプロテオミクス解析で検討する。
金属との錯形成を鍵とするオキシムエステルからα―酸素化イミンへの高効率分子変換

金属との錯形成によりオキシムエステルをN-オキシエナミンへと異性化させ、オキシムエステルから直接的にα-酸素化イミンを得る手法を開発することが本研究の目的である。昨年度までに、ピリジル基を配向基にもつオキシムエステルが二核イリジウム錯体1と錯形成すると、α-酸素化イミン配位子をもつ単核イリジウム錯体が室温で選択的に生成することを明らかにした。また、イリジウムと同族のロジウムも本転位反応に有効であることを確認した。本年度では、まず、イリジウムおよびロジウムと同族のコバルトや8族金属のルテニウムを用いた反応を検討した。しかし、反応条件を種々検討したものの、α-酸素化イミン錯体は生成しなかった。続いて、ピリジル基をもつヒドラゾン誘導体と錯体1との反応を検討したところ、原料のヒドラゾンが配位した単核イリジウム錯体が生成した。本転位反応に適用可能な金属やイミノ基窒素上のヘテロ原子官能基の種類を拡張するためには、更なる検討が必要である。次に、触媒量の1を用いた、2-アセチルピリジンオキシム酢酸エステル(2)からα-酸素化イミンへの触媒的分子変換を検討した。その結果、α-酸素化イミン錯体とともに未反応の2が残存しており、α-酸素化イミン配位子がイリジウムから解離せず、触媒反応が停止してしまうことが判明した。そこで、イリジウムからのα-酸素化イミンの解離が有利になることを期待し、キレート環サイズを大きくした配向基をもつオキシムエステルなどで反応を検討したが、原料のオキシムエステルが回収される結果となった。本転位反応の触媒化には至っていないが、オキシムエステルのイミンーエナミン異性化には、通常、メチル化を経由する多段階反応や高温条件が必要であることから、本成果は従来法よりも省エネルギーなプロセスでオキシムエステルからα-酸素化イミンを得る手法を提供できるものと考える。オキシムエステルのイミン構造をN-オキシエナミン構造へと異性化できれば、速やかに転位反応が進行してα-酸素化イミンが生成することが知られている。ところが、オキシムエステルのイミンーエナミン異性化を効率的に進行させる手法は未だ確立されておらず、上述した分子変換を有機合成に活用する例は限定されている。本研究は、金属との錯形成を利用して上述の異性化を促進させることにより、オキシムエステルをα-酸素化イミンへと穏和かつ直接的に変換する新手法を開発することを目的としている。そこで本年度では、オキシムエステルと金属錯体との量論反応を検討した。その結果、2-アセチルピリジンオキシム酢酸エステル(1)と二核イリジウム錯体[Cp*IrCl2]2とを室温で反応させることにより、1ではなくα-アセトキシイミンがイリジウムに配位した錯体が82%の単離収率で得られた。さらに、1と同様の分子骨格を有する炭酸エステルおよびスルホン酸エステルを用いた反応でも、対応するα-酸素化イミン錯体がそれぞれ選択的に生成した。一方、1のピリジン環窒素の隣接位にブロモ基を導入したオキシム酢酸エステルを基質とした場合、対応するα-アセトキシイミンの生成は観測されなかった。また、1と類似構造をもつ2-アセチルピリジンオキシムメチルエーテル(2)を配位子とするイリジウム錯体3の重水素化実験により、イリジウムに2のイミノ基窒素が配位することでα-炭素上の水素の酸性度が高まり、イミンーエナミン異性化が促進されるという結果を得た。以上より、本反応ではイリジウムに対して適度な配位力を有するピリジル基が配向基として機能し、オキシムエステルのイミノ基窒素とイリジウムとの錯形成が鍵となってオキシムエステルからα-酸素化イミンへの転位反応が速やかに進行したものと推定される。本研究の目的は、金属との錯形成を利用してオキシムエステルのイミンーエナミン異性化を促進させ、オキシムエステルをα-酸素化イミンへ穏和かつ直接的に変換する新手法を開発することである。さらに、金属との錯形成を鍵とする触媒的α-酸素化イミン合成へと本手法を展開して行く予定としている。本年度では、2-アセチルピリジンオキシムから誘導される酢酸エステル1および各種オキシムエステルと、二核イリジウム錯体[Cp*IrCl2]2とを反応させることにより、それぞれ対応するα-酸素化イミン錯体を得ることに成功した。イリジウム錯体上でオキシムエステルからα-酸素化イミンへの分子変換を観測した例はこれまでに知られておらず、興味深い結果と考える。なお、本反応ではα-酸素化イミン錯体への転位反応が室温で速やかに進行するため、オキシムエステルがイリジウムに配位した中間体を単離することは困難であった。そのため、イリジウムとの錯形成によりオキシムエステルのイミンーエナミン異性化が促進されているかどうかについて、錯体レベルで確認するには至っていない。しかしながら、本転位反応には適度な配位力を有するピリジル基が必要であることに加えて、オキシムエーテル2が配位したイリジウム錯体3のイミンーエナミン異性化が容易に起こるということについては別途実験にて確認することができた。したがって、オキシムエステルについても、イリジウムとの錯形成によりN-オキシエナミンへの異性化が促進され、その結果、α-酸素化イミン錯体が温和な条件下で生成したものと考えられる。

以上、オキシムエステルからα-酸素化イミンへの新規分子変換法を達成するための重要な知見を錯体化学的アプローチにより得ることに成功し、本年度における研究の進捗はおおむね順調と判断した。本研究の目的は、金属との錯形成によりオキシムエステルのイミンーエナミン異性化を促進し、オキシムエステルからα-酸素化イミンへと効率良く変換する手法を開発することである。昨年度は、ピリジル基を配向基にもつ各種オキシムエステルと二核イリジウム錯体[Cp*IrCl2]2 (1)との反応により、オキシムエステルのイミノ基窒素上の酸素官能基がα-炭素上に転位したα-酸素化イミン錯体が生成することを明らかにした。本年度では、本分子変換反応が、分子内反応か分子間反応かを確認するべく、クロスオーバー実験を行った。錯体1と2種類のオキシムカルボン酸エステルの1:1混合物との反応を行ったところ、4種類のα-アセトキシイミン錯体の生成を確認した。したがって、上記のオキシムカルボン酸エステルの変換反応は、一度解離したカルボキシラートイオンがα-炭素と再結合することにより進行しているものと考えられる。続いて、2-アセチルピリジンオキシム酢酸エステルを基質として、イリジウム以外の金属で本分子変換反応が進行するかどうかを調査したところ、反応温度や添加剤などを検討することにより、二核ロジウム錯体[Cp*RhCl2]2 (2)を用いた場合に、α-アセトキシイミン錯体に特徴的なシグナルを1H NMRにより観測した。今後、単離・同定を行う。さらに、酸素官能基導入の鍵となる有機基質の求電子的活性化に関する知見を得るべく検討を進めた結果、過酸化ベンゾイルとジセレニドとの反応を経て生成するセレンのカチオン種が、内部アルキンを求電子的に活性化し、ベンゾイルオキシ基とセレン官能基が内部アルキンに同時に導入されることが明らかとなった。昨年度において、オキシムエステルからα-酸素化イミンへの分子変換に、オキシムエステルのイミノ基窒素とイリジウムとの錯形成が有効であることまでは明らかにしていたが、オキシムエステルの酸素官能基の転位反応が分子内反応か分子間反応かについては詳細な知見が得られていなかった。本年度では、オキシムカルボン酸エステルと二核イリジウム錯体1を用いたクロスオーバー実験を行うことにより、カルボキシラートイオンの解離と再結合を経る分子間反応でα-酸素化イミン錯体が生成することを明らかにした。また、単離には至っていないものの、イリジウムの同族であるロジウムの二核錯体(2)を用いても、オキシム酢酸エステルからα-アセトキシイミン錯体が生成することを1H NMRにより確認することに成功した。さらに、本分子変換反応が、解離した酸素官能基の再結合を経て進行していることが判明したことを受けて、酸素官能基を求核的に導入するために重要となる有機基質の求電子的活性化に関する検討を進めたところ、セレンのカチオン種による内部アルキンの求電子的活性化を鍵とする内部アルキンへの酸素官能基導入を達成した。以上より、本分子変換機構の解明および適用可能な金属種の拡張について一定の成果を得たことに加えて、酸素官能基導入に関する重要な知見を得ることに成功し、研究の進捗はおおむね順調であると判断した。金属との錯形成によりオキシムエステルをN-オキシエナミンへと異性化させ、オキシムエステルから直接的にα-酸素化イミンを得る手法を開発することが本研究の目的である。昨年度までに、ピリジル基を配向基にもつオキシムエステルが二核イリジウム錯体1と錯形成すると、α-酸素化イミン配位子をもつ単核イリジウム錯体が室温で選択的に生成することを明らかにした。
Rab 蛋白質と関連宿主因子によるHIV-1 細胞内輸送システムの解明

細胞内輸送への関与が示されているRab11蛋白質とそのエフェクター蛋白質に着目し、HIV-1の細胞内輸送システムのへの関与を検討した。方法論としては、Rab11を恒常的ノックダウンさせた細胞株または変異体Rab11を過剰発現させた細胞株におけるHIV-1複製とくにそのウイルス粒子形成過程への影響を検討した。その結果、Rab11がHIV-1 Env蛋白質の感染細胞表面への輸送に重要な役割を果たしていることを明らかにした。我々は、細胞内輸送への関与が示されている数種のRab蛋白質とそれらのエフェクター蛋白質に着目し、HIV-1の細胞内輸送システムの詳細を解明することを目的とし研究を行っている。具体的には対象をユビキタスに細胞に発現しているRab5、Rab7、Rab9、Rab11とそれらのエフェクター蛋白質に絞り、Rab蛋白質の恒常的ノックダウン細胞株を作製し、HIV-1粒子形成過程を中心にHIV-1複製過程への影響を検討している。また、Rab蛋白質変異体の過剰発現系においても同様にHIV-1粒子形成過程を中心にHIV-1複製過程への影響を検討している。得られた研究成果は以下のようである。1)HAタグを付与したRab11の野生型、ドミナントネガティブ(DN)変異体、恒常活性型(CA)変異体を293T細胞およびHeLa細胞において過剰発現させたところ、細胞中においてトランスフェクトしたpNL4-3のウイルス蛋白質の合成、放出ウイルス量、ウイルス粒子へのEnv蛋白質の取り込みに大きな影響は認められなかった。2)しかしながら、293T細胞とHeLa細胞の両方において、DN変異体またはCA変異体を過剰発現させた細胞から放出されたウイルスの感染能が発現させた変異体の用量依存的に減少することが明らかになった。3)Rab11蛋白質を恒常的にノックダウンした293T細胞にpNL4-3をトランスフェクトしてHIV-1粒子形成過程に対する影響を検討したところ、細胞中においてトランスフェクトしたpNL4-3のウイルス蛋白質の合成、放出ウイルス量、ウイルス粒子へのEnv蛋白質の取り込みに大きな影響は認められなかったが、放出されたウイルスの感染能がコントロール細胞のそれの約40%に減少していた。以上の結果は、Rab11蛋白質がHIV-1の感染性ウイルス粒子形成に何らかの役割を演じていることを示唆している。HIV-1粒子の主要な構造タンパク質であるGagタンパク質や、宿主細胞表面のレセプターに結合することでウイルスの侵入に関与するEnvタンパク質のウイルス形成部位への輸送や、その分解がどのような宿主因子によって制御されているかについては不明な点が多い。そこで本研究では、エンドサイトーシスやエキソサイトーシスといった細胞内小胞輸送を担うRabタンパク質に着目した。H23年度は、主にRabllaのHIV-1粒子形成への関与の可能性を想定し、検討した結果を報告する。Rabllaの発現抑制や機能阻害における、HIV-1粒子形成への影響を検討した。293T細胞において、shRNA導入により内在性Rabllaタンパク質のノックダウン、またはRabllaの野生型(WT)およびドミナントネガティブ変異体(DN)を一過的に過剰発現した細胞を作製した。引き続き細胞にHIV-1分子クローンを導入し、ウイルスタンパク質産生やプロセッシング、ウイルス粒子への敢り込みをウエスタンブロッティングによって解析した。また、ELISA法によりウイルス放出量の測定、TZM-b1細胞を用いた感染価の測定も行った。内在性RabllaのノックダウンおよびRablla DN過剰発現の両方において、Gagのプロセッシングやウイルス放出量に影響は見られなかった。一方で、Envのプロセッシングおよびウイルス粒子への取り込みの低下が認められ、産生ウイルスの感染価が低下した。低下した感染価はVSV-Gpseudotypeによって回復が認められた。したがって、RabllaがEnvのプロセッシングまたは輸送に関与することによってEnvのウイルス粒子への取り込み量を制御し、感染性HIV-1の粒子形成において一定の役割を演じている可能性を示唆している。H24年度は、前年度に明らかになったRab11aがEnvのプロセッシングまたは輸送に関与することによってEnvのウイルス粒子への取り込み量を制御し、感染性HIV-1の粒子形成において一定の役割を演じている可能性についてさらに詳細に検討を行った、その結果、Rab11aの機能阻害が、機能的なHIV-1 Envの細胞表面発現量を低下させ、その結果ウイルス粒子に取込まれるHIV-1 Env量とそれに伴う感染価の低下が引き起されることが明らかになった。H24年度は、Rab7にも着目し、Rab7を恒常的にノックダウンしたHeLa細胞を作製し、HIV-1複製対する影響を検討した。

その結果、Rab7が細胞内HIV-1 Envレベルを負に制御している可能性が示された。実験結果についての再現性を確認するために予想以上に時間が必要であったため。24年度が最終年度であるため、記入しない。RabllaのHIV-1 Env蛋白質のprocessingや輸送への関与についてEnv蛋白質の細胞内局在や細胞表面への輸送への影響を中心に解析する。Rab7とその関連蛋白質については主にRab7を恒常的にノックダウンしたT細胞株を使用してHIV-1複製への影響を検討する。
ＴＳＰＯ２による時期特異的小胞体コレステロール蓄積と赤芽球の成熟制御

成熟異常を呈する犬のHK赤血球表現型は、コレステロール代謝への関与が想定されるTSPO2遺伝子の変異により生じる。本研究では、細胞形態、細胞表面抗原、ヘモグロビン合成、細胞周期、遺伝子発現等に焦点を置き、後期赤芽球の成熟・脱核とTSPO2の関係を犬骨髄由来赤芽球、赤芽球系培養細胞を用いて解析した。その結果、TSPO2が、後期赤芽球におけるコレステロール代謝の変動を介して細胞増殖、細胞周期、ヘモグロビン合成や脱核の時期を調節し得ることが示された。TSPO2のHK型変異がもたらす赤芽球系細胞の成熟および脱核のプロセスに対する影響を検討するために平成27年度は以下の研究を行った。1.赤血球表現型HK型、LK型の各犬個体より骨髄細胞を採取し、赤芽球誘導培養系(Two phase liquid erythroid culture)を樹立することで両者における成熟および脱核に関する検討を行った。その結果、赤芽球系への誘導後の細胞ペレットにおける色調からHK型赤芽球ヘモグロビン合成量がLK型と比較して少ない傾向が見受けられた。また、脱核中HK型の赤芽球はLK型比べて不均一に大きく核濃縮が不十分であり、核面積も有意に大きかった。脱核後の赤血球の面積もHK型がLK型に比較して大きく、これらの結果からHK型犬において核濃縮の進行の異常、その結果生じる赤血球のサイズの差が現れることが示唆された。2.Tspo2遺伝子をノックアウトしたマウス赤芽球前駆細胞株(MEDEP)を用いた赤芽球成熟モデルを用いた検討によって、HK型犬由来細胞に見られた所見と同様、不十分な核濃縮が認められた。また、後期赤芽球特異的遺伝子(TER119、AE1、TFR)の発現量が低下していたが、前期赤芽球特異的遺伝子(GATA1、GATA2)の発現には大きな影響は認められなかった。このことからTSPO2は主に後期赤芽球成熟に関わっていることが示唆された。同時に、Tspo2ノックアウト細胞においてヘモグロビン合成量およびヘム代謝関連遺伝子の発現量に影響が見られたことからTSPO2がヘム代謝に強く影響することが示唆された。1.HK型犬骨髄由来、およびマウス細胞株由来赤芽球成熟モデルを用いた細胞の性状解析および遺伝子発現解析により、TSPO2の影響が核濃縮の進行、ヘモグロビン合成などに認められ、赤芽球成熟時期特異的であることを示した。2.一方で、TSPO2による小胞体コレステロール蓄積とそれに関する小胞輸送に対する検討は準備段階である。現在、コレステロール含量と細胞内局在の検討方法を試行し、小胞輸送に関してもVSVGを用いた正確な測定系を樹立中である。犬HK型赤血球の原因遺伝子として同定したTSPO2遺伝子は、後期赤芽球に発現し、TSPOとの類似からコレステロールの細胞内輸送を担うことが推定される。本研究の目的は、HK型赤血球の未成熟赤血球の表現型と原因遺伝子産物であるTSPO2の想定される機能に基づき、赤芽球の成熟・脱核過程を、TSPO2が細胞内コレステロール動態変化を介して調節していることを実証することである。平成28年度は、ES細胞由来マウス赤芽球系細胞MEDEP BRC5のTSPO2にCRISPER/Cas9法で変異を導入し、細胞増殖、細胞周期、ヘモグロビン合成、コレステロール蓄積等の解析を行った。TSPO2をノックアウトした細胞(KO13)、ならびにコレステロール結合部位欠損変異体(ΔCRAC)を発現する細胞は、赤芽球分化を誘導後、野生株(WT)に比して細胞核サイズが大きく、ヘム含量、ヘモグロビン含量は低値を示した。脱核時の核のサイズもWTに比べて大きく、濃縮も遅れを呈した。一方、HK型個体の変異C40Yを導入した細胞には、これらの値に有意差は見られなかった。KO13は二核細胞、分裂期細胞の割合がそれぞれ約6%、4.3%であり、WT(各々1.8%、2.4%)に比べて有意に高値を示した。コレステロールの需要・供給バランスが細胞周期に影響し得ること、赤血球成熟にコレステロール供給が不可欠なことは既に知られている。本研究の結果は、これら従来の知見に、TSPO2による細胞内コレステロール輸送と後期赤芽球の分裂・増殖/ヘモグロビン合成との関係という分子基盤の存在を明らかにした重要な知見といえる。これまでの研究成果によって、TSPO2の時期特異的重要性を立証することができた。TSPO2がコレステロール結合モチーフをもつ事実、また今年度示した脱核や核濃縮にコレステロールが深く関与している報告などを踏まえ、TSPO2によるコレステロール代謝の変動に焦点をあてHK/LK型赤血球表現型差異を生じる仕組みを明らかにする。分子医学TSPO2による小胞体コレステロール蓄積とそれに関する小胞輸送に対する検討を行う予定であったが、赤芽球成熟モデルの確立によってHK型変異が持つTSPO