hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
癌化学療法と細胞免疫療法との相乗効果に関する研究

従って,両者併用することにより特異的免疫細胞療法とハーセプチンとの相乗効果が得られ,難治性乳癌の成績向上に寄与することが示唆され,更なる臨床試験などによる検証が待たれる.また,我々はさらにその理論的根拠となる特定な抗癌剤と細胞免疫療法との相乗的効果を証明するための基礎的解析を行い,プロテアソーム阻害薬はプロテアソームというこれまでと異なる分子を標的にした新しい機序の薬剤Bortezomibにより免疫活性化分子TRAILを介した各種消化器癌のアポトーシス感受性が亢進することがわかった。更に,現在,臨床有効例の患者末梢血リンパ球を用いて,自己癌細胞との2週間リンパ球腫瘍混合培養(MLTC)により自己活性化リンパ球を誘導し,in vitroで各種抗癌剤と様々の組み合わせで自己腫瘍細胞やtarget tumor cell lineに添加投与を行う.両者の相互作用についてリンパ球の性状や腫瘍細胞傷害性をFlow cytometryや^<51>Cr release assay等にて評価するほか,抗癌剤の抗腫瘍作用による腫瘍細胞のapoptosis, cross-presentationによって抗原提示細胞(APC)の抗原提示能の変化や免疫細胞の抗腫瘍効果の増強などについても解析を開始している。H20-21年度の研究にて分子標的治療薬のTrastuzumab(Tr)、化学療法剤(Gemcitabine, S-1)及びプロテアソム阻害薬のBortezomibと活性化リンパ球との相乗的抗腫瘍効果を確認された。今年度は活性化リンパ球による細胞療法のほか、新たにペプチドワクチン療法も含めた免疫療法と既存の治療薬との相乗的作用の基礎的機序について研究を行った。まず、臨床有効例の患者末血リンパ球を用いて,自己癌細胞との2週間リンパ球腫瘍混合培養(MLTC)により自己活性化リンパ球を誘導し,in vitroで各種抗癌剤と様々の組み合わせで自己腫瘍細胞やtarget tumor cell lineに添加投与を行う.両者の相互作用についてリンパ球の性状や腫瘍細胞傷害性をFlow cytometryや^<51>Cr release assay等にて評価した。その結果、抗癌剤の抗腫瘍作用により腫瘍細胞のapoptosis, cross-presentationによって抗原提示細胞(APC)の抗原提示能の変化が向上し、免疫細胞の抗腫瘍効果が増強されたことを解明した。一方では、標準治療抵抗性の乳癌を中心に抗癌剤併用ペプチドワクチン療法の臨床試験を行い、ペプチド投与前及び6回、12回投与後の進行性乳癌患者のがん免疫機能を解析した。これまでに31例が登録され、いずれも重篤な有害事象は認めなかった。その中で1クール以上を終了し、評価可能な進行・再発転移症例20例の臨床効果はCR1/PR1/SD11/PD7例で、SD症例中腫瘍マーカーの減少例は2例であった。抗ペプチド特異抗体価は6回投与後に20例(CR:1,PR:1,SD:11/NE:1)において上昇を認め、7例(CR+SD:4/PD:3)では増加が見られず、12回投与後に9例中9例(CR+SD:6/PD:3)において抗体価上昇を認めた。従って、6回より12回長期投与した症例において抗体価の上昇が著明であった。標準治療が無効となった症例においても臨床的効果は認められたことから、ペプチドワクチンによるがん集学的治療としての意義が示唆された。次年度より、同研究も継続的に行う予定である。
ヘムオキシゲナーゼに関わる蛋白間相互作用およびＣＯによるシグナル伝達機構の解明

ヘムオキシゲナーゼは、シトクロムP450還元酵素やビリベルジン還元酵素など複数のタンパク質と相互作用し、基質ヘムをビリベルジン、次いでビリルビンへと変換するヘム分解系で働く酵素である。本研究課題では、ヘムオキシゲナーゼに関わる酵素群との相互作用機構を明らかとすることを目的としている。また研究の一環として、新しい手法であるNMR緩和分散測定法が、タンパク質の未知機能探索に有効であることを実証していく。ヘムオキシゲナーゼ(HO)は、シトクロムP450還元酵素(CPR)やビリベルジン還元酵素(BVR)など複数のタンパク質と相互作用し、基質ヘムをビリベルジン、次いでビリルビンへと変換するヘム分解系で働く酵素である。一方、HOはガス状シグナル伝達物質と目される一酸化炭素(CO)を副産物として発生する生体内で唯一の酵素である。本研究課題では、HOに関わる酵素群との相互作用機構、および、COによるシグナル伝達機構を明らかとすることを目的としている。本年度は、HOのNMR緩和分散測定よって見出した、本酵素の基質ヘム結合時に特異的に動く(揺らぐ)アミノ酸残基のうち、77番目のLeuの変異体(L77A)が野生型よりも高い酵素活性を示す原因について調べた。その結果、L77Aは反応生成物であるビリベルジンの放出が速くなることで酵素反応のターンノーバーが上昇し、野生型よりも高い活性が見られたのだと判断された。また、この変異体は、次反応(ビリベルジン→ビリルビン)を行うBVRとの親和性が野生型よりも高いことも示唆された。一方で、HOとCPRとの複合体の結晶構造を明らかとした。これまでにHO-CPR複合体の調製は、互いの結合力が低いことから困難であった。しかし、CPRのドメイン間連結部位を短縮させた変異体を作製したところ、HOとの高い親和性を示し、安定した複合体を形成した。このHO-CPR複合体の結晶化に成功し、構造解明に至った。結果として、両タンパク質間でのユニークな電子の授受法が明らかとなった。CPRは、薬物代謝などに関与するシトクロムP450をはじめとする多くの酵素の電子供与体としても働くことから、それらの電子授受機構の重要なモデルとなった。ヘムオキシゲナーゼ(HO)は、シトクロムP450還元酵素(CPR)やビリベルジン還元酵素など複数のタンパク質と協同して基質ヘムを分解する酵素である。一方、HOはガス状シグナル伝達物質と目される一酸化炭素(CO)を副産物として発生する生体内で唯一の酵素でもある。HOのNMR緩和分散測定を行ったところ、基質ヘム結合時に関連して、特定の3つの領域のアミノ酸に動き(揺らぎ)が観測された。それらの領域の内の1つは、ヘム結合部位よりも離れたタンパク質分子表面に位置し、これまでHOの機能と関連付けられてこなかった。よってその領域のアミノ酸が何故ヘム結合時に揺らぐのかを調べるために、全てについてAla置換変異体を作製し、その酵素活性を測定した。その結果、それぞれの変異体において野生型HOとは異なる活性が示され、これらアミノ酸は全て酵素機能に何かしら関与していることが分かった。このことにより、NMR緩和分散測定法はタンパク質の未知機能アミノ酸を検索するのに有効であると考えられた。上記の変異体のうち、Phe79Alaは最も低い活性を示した。この変異体を詳細に調べていくと、Phe79はHOのヘム結合制御に関わることが分かった。一方、間接的ではあるが、近傍のArg185がCPRからの電子伝達に関与することが明らかとなった。HOの電子伝達に直接関わるアミノ酸残基が調べられたのは今回が初めてとなる。Phe79と周辺のアミノ酸がヘム結合時に揺らぐことが1つのアクションとなり、電子伝達を含めた一連の酵素反応が起こるモデルを現在考察している。ヘムオキシゲナーゼ(HO)は、シトクロムP450還元酵素(CPR)やビリベルジン還元酵素など複数のタンパク質と相互作用し、基質ヘムをビリベルジン、次いでビリルビンへと変換するヘム分解系で働く酵素である。本研究課題では、HOに関わる酵素群との相互作用機構を明らかとすることを目的としている。昨年度において明らかとなったHO-CPR複合体の立体構造から、両タンパク間での電子の授受経路が見出された。そのために、平成24年度に結論付けたHOのF79A変異体解析の結果を再考する必要が生じ、改めて検討を行った。

以前までは、HOのR185はCPRとの相互作用に関わり、さらに同タンパク質からの電子の受け取りを行っているとことが示唆された。しかしながら複合体の構造から、このHOのR185は電子供与体であるCPRのFMNから距離が離れており、電子受容体の可能性は低いと考えられた。R185の近傍にあるF79のAla置換変異は、CPRとの相互作用が低下しており、そのF79A変異体の立体構造を調べてみると、R185の側鎖の配向に影響を及ぼしていた。このことから、R185はCPRとの結合のみに大きく関わっていると考えられ、これはHO-CPR複合体の構造とも矛盾しない結果となった。NMR緩和分散測定において、F79近辺のアミノ酸はHOのヘム結合時に動的変化が観察されている。これらのアミノ酸は、ヘム結合部位から離れているにも関わらず、いくつかの変異体の解析において、ヘムとの結合に関わっていた。HOはヘムと結合することでCPRとの相互作用が強くなることが明らかとなっているが、上記F79周辺にCPRとの相互作用に関わるR185が存在するのは興味深い。HOのヘム結合とCPRからの電子の授受が、一連の微細な動作によって効果的に行われていると考えられた。分子生物学/生化学前年度中は、NMR緩和分散測定法の実証について達成できたと考えている。また、変異体解析から、HOとCPRとの相互作用と未知であった電子伝達系の解明においても大きく進展した。そして本年度においては、HOと相互作用するCPRとの複合体構造を明らかとし、その作用機構を解明した。一方で、HOのL77A変異体の研究から、BVRとの相互作用に関する情報も得られている。本年度計画していた可溶性グアニル酸シクラーゼ(sGC)の調製法について、まだ明確な結果が得られてないという点を除いては、ほぼ計画通りに研究が遂行されていると判断している。本年度中に予定していた、NMR緩和分散測定法のタンパク質の未知機能検索ツールとしての有効性の実証については達成できたと考えている。また、HOの変異体解析から、HOとCPRとの相互作用と未知であった電子伝達系の解明においても大きく進展した。しかしながら、これらの研究成果の学術論文による報告が遅れており、その点を含めて上記の評価とした。現在、NMRの研究については論文を投稿中であり、また、相互作用・電子伝達系の解明については投稿準備中である。平成26年度の研究方針は、まずHOとBVRとの複合体の調製を行っていく。この研究については、「研究実績の概要」にあるHOの変異体L77AがBVRと高い親和性を示すことから、この変異体を用いて複合体の調製を行う。その後は、立体構造解析を目指した結晶化を検討する。HOが反応副産物として発生するCOの生理機能の解明については、cGMPを合成するsGCとHOとの相互作用を調べていく。現在のところ、ターゲットとしたい哺乳類のsGCの安定した調製法が構築されていない。一方で、昆虫のsGCについては、大腸菌内での発現・精製法が確認されているので、この方法を参考にし、哺乳類のsGCについても大腸菌内での発現系の構築を行う予定である。また次年度は本課題研究期間の最終年度であるため、成果発表も重点的に行っていく。
Webニュースと補助教材，課題の精選を支援する小学校教師のためのNIE支援の実現

新聞を教育に活用するNIE(Newspaper in Education)が初等教育機関で実施されている.しかし,新聞には児童にとって読めない漢字や意味のわからない表現があるため,記事を探せない,読んでも理解できない等の実践課題が存在する.また,多忙な教師にとって,授業で使う記事の選定や補助資料などの教材準備は負荷が大きい.本研究では,NIEを実践する小学校教師の教材準備に関する課題に注目し,NIEに適したニュースの推薦や記事の選択支援,記事を補足するコンテンツの自動収集と提示など,NIE支援における各種基盤技術と,NIE支援システムの構築を目指す.新聞を教育に活用するNIE(Newspaper in Education)が初等教育機関で実施されている.しかし,新聞には児童にとって読めない漢字や意味のわからない表現があるため,記事を探せない,読んでも理解できない等の実践課題が存在する.また,多忙な教師にとって,授業で使う記事の選定や補助資料などの教材準備は負荷が大きい.本研究では,NIEを実践する小学校教師の教材準備に関する課題に注目し,NIEに適したニュースの推薦や記事の選択支援,記事を補足するコンテンツの自動収集と提示など,NIE支援における各種基盤技術と,NIE支援システムの構築を目指す.
慣れの測定と聴覚における情報処理の関係

「慣れ」について検討するためには長時間の刺激を用い,日常生活に近い自然な状況下で実験を行う必要がある。今回はそのための刺激として,家庭にいて日常生活の中で聞こえる音の中から、物売りの声,テレビからの音声,洗濯機,掃除機,自動車交通騒音など現実の音を用いた。刺激の継続時間は10数分90分とした。実験1では精神作業をしながら,実験2ではテレビの画面をみながら,聞こえてくる様々な音の評価をカテゴリー連続判断法により連続的に行うよう被験者に求めた。なお,カテゴリー連続判断法は時々刻々変化する刺激を聞いて,時々刻々の印象をコンピュータのキーボードを用いて入力する方法で,印象が変わった時,対応するキーを押し,印象がかわらなければキーを押す必要はない。しかし,精神作業を課した実験1では一定時間被験者がキーを押さなければ,モニタに押し直すよう警告を提示し,警告がでているにもかかわらずキーを押さなかった時間を測定し,慣れの指標とした。また,実験2ではテレビで映像をみながらの音の評価を行う条件と音のみを提示した条件の比較を行った。これらの実験から次のことが示唆された。1)慣れを測定する指標として,音に対する反応回数が適当である。すなわち,被験者が課題に熱中し音に対する判断を忘れた時間や,あるいはある時間内での音に対する反応回数などが,慣れの指標となりうる。2)音圧レベルの低い音の方が高い音よりも慣れやすい。3)「慣れ」は音が気にならない,主観的にはいわば聞こえていない状態に近く,音の大きさの印象が減少するわけではない。4)「慣れ」には個人差が大きく,音に慣れやすいグループと慣れることが難しいグループがあり,アンケート調査と実験の結果間でよい対応がみられた。
DNA脱メチル化による始原生殖細胞分化運命決定のエピジェネティックな制御

mil-1、Blimp1、およびStellaは制御領域に保存配列を持ち、そのPGCsに特異的な発現は分化運命決定期に活性化される。本研究では、はじめに、mil-1、Blimp1、およびStellaの制御領域で段階的にDNA脱メチル化が進行し、それに伴って、3遺伝子の発現が開始・活性化されていくことを見出した。次に、胚性幹細胞において、siRNAを用いた維持型DNAメチル基転移酵素Dnmt1の阻害を試みたところ、3遺伝子全ての近傍領域はDNA脱メチル化しており、それらの遺伝子発現は上昇していた。さらに、Dumt1ノックアウトマウス胚のエピブラストにおいて、近傍領域はDNA脱メチル化状態にあり、3遺伝子の早熟な発現が観察された。以上により、共通した近傍領域のDNA脱メチル化がPGC発生過程における特異的遺伝子群の発現活性化を担うことが明らかとなった。一方で、代表的な体細胞性遺伝子であるHoxa1およびHoxb1、ならびに神経特異的遺伝子GfapはPGCsにおける発現が認められないものの、その発現抑制はDNAメチル化に依らないことがわかった。すなわち、PGCsにおいて、各遺伝子の近傍領域はヒストンH3リジン4トリメチル化(H3K4me3)およびH3K27me3のバイバレントなヒストン修飾を受けており、これによって遺伝子発現が抑制されていることが想定された。過去の報告から、PGCsはその発生過程において、ゲノムワイドにDNAメチル化を低下させると同時にH3K27me3の修飾レベルを上昇させることが知られていた。本研究の成果により、PGCsは、DNA低メチル化という脱抑制的なゲノム状態においても、バイバレントなヒストン修飾により体細胞性遺伝子群を将来的な活性化まで発現しないように留めている一方で、DNA脱メチル化によりPGC特異的遺伝子群を発現活性化させ、発生の適正な進行を保証するエピジェネティックな選択的遺伝子制御システムを用いていることが強く示唆された。始原生殖細胞発生過程における選択的な遺伝子発現を制御するエピジェネティックな機構を、特異的遺伝子および体細胞性遺伝子の代表例を挙げて記述することに世界で初めて成功した。これまでの研究結果のゲノムワイドでの検証が今後の課題である。そのために、次世代シークエンサーを用いたDNAメチル化、ヒストン修飾、遺伝子発現解析を遂行する。また、エピジェネティックな機構が始原生殖細胞発生そのものへ与える影響を評価するため、in vitro系を用いた候補分子のRNAiスクリーニング、ならびにノックアウトマウスでの解析を検討中である。1.始原生殖細胞の分化運命決定期における生殖系列特異的遺伝子群のDNA脱メチル化の検出分化運命決定前の未分化細胞(6.0日胚)および分化運命決定後の始原生殖細胞(7.5および9.0日胚)において、mil-1遺伝子の発現制御領域(保存配列ICEを含む)のDNAメチル化状態を解析した。その結果、mil-1の発現制御領域は、分化運命決定期(6.07.5日)において部位特異的にDNA脱メチル化を開始し、その後(7.59.0日)全領域的にDNA脱メチル化を進行することが明らかとなった。また、この発現制御領域におけるDNA脱メチル化の進行とmil-1発現量の上昇とはよく相関することが発現定量によって示された。他の生殖系列特異的遺伝子BlimplおよびStellaそれぞれについても、分化運命決定の前後にわたって、保存配列ICEを含む近傍領域のDNA脱メチル化の進行と遺伝子発現上昇との相関を示す、mil-1と同様の結果が得られつつある。したがって、生殖系列特異的遺伝子群は、保存配列ICEを含む発現制御領域がDNA脱メチル化を受けるという共通のエピジェネティック制御によって、その特異的発現を開始・増幅することが示唆される。2.DNAメチル化による生殖系列特異的遺伝子群の発現開始誘導の検証維持型DNAメチル基転移酵素Dnmtlをノックアウトしたマウス胚について、発現定量によって現在解析中である。Dnmtlノックアウトマウス胚においてはDNAメチル化状態が維持されないため、早期のDNA脱メチル化が起こり、生殖系列特異的遺伝子群の発現開始時期が早まることが予想される。したがって、Dnmtlノックアウトマウスの未分化細胞(6.0日胚)におけるmil-1,Blimpl,Stellaの発現量は野生型の未分化細胞(6.0日胚)に比べて高いことが期待される。1.分化運命決定期において、始原生殖細胞特異的遺伝子群はDNA脱メチル化を受ける。分化運命決定前の未分化細胞および分化運命決定後の始原生殖細胞において、分化運命決定期に発現を開始する始原生殖細胞特異的遺伝子群mil-1,Blimp1,Prdm14およびStellaの保存配列ICE近傍領域のDNAメチル化状態を解析し、両者を比較した。その結果、各始原生殖細胞特異的遺伝子の保存配列ICE近傍領域は、発現開始前の未分化細胞に比べて、発現開始後の始原生殖細胞においてDNA脱メチル化状態にあった。2.分化運命決定期におけるDNA脱メチル化は始原生殖細胞特異的遺伝子群の発現を制御する。まず、遺伝子発現プロファイルが未分化細胞と始原生殖細胞の中間的性質を示す胚性幹(ES)細胞において、CpG配列にDNAメチル化を付与するDNAメチル基転移酵素群であるDnmt1,Dnmt3aおよびDnmt3bに対するRNAiによるノックダウンを行った。その結果、各始原生殖細胞特異的遺伝子の発現上昇ならびに保存配列ICE近傍領域でのDNA脱メチル化が認められた。続いて、早期のDNA脱メチル化が起こることが予想される、維持型DNAメチル基転移酵素Dnmt1を欠損したマウス胚を解析した。

その結果、各始原生殖細胞特異的遺伝子は、通常は発現開始前である未分化細胞において早熟に発現しており、また、それらの保存配列ICE近傍領域でのDNA脱メチル化が認められた。以上により、始原生殖細胞の分化運命決定の際、保存配列ICE近傍領域におけるDNA脱メチル化は始原生殖細胞特異的遺伝子群の発現を共通して制御することが明らかとなった。現在、DNA脱メチル化が始原生殖細胞の分化運命決定そのものを制御する可能性を検証すべく、Dnmt1欠損マウス胚における始原生殖細胞の形成状態について、詳細な解析を行っている。mil-1、Blimp1、およびStellaは制御領域に保存配列を持ち、そのPGCsに特異的な発現は分化運命決定期に活性化される。本研究では、はじめに、mil-1、Blimp1、およびStellaの制御領域で段階的にDNA脱メチル化が進行し、それに伴って、3遺伝子の発現が開始・活性化されていくことを見出した。次に、胚性幹細胞において、siRNAを用いた維持型DNAメチル基転移酵素Dnmt1の阻害を試みたところ、3遺伝子全ての近傍領域はDNA脱メチル化しており、それらの遺伝子発現は上昇していた。さらに、Dumt1ノックアウトマウス胚のエピブラストにおいて、近傍領域はDNA脱メチル化状態にあり、3遺伝子の早熟な発現が観察された。以上により、共通した近傍領域のDNA脱メチル化がPGC発生過程における特異的遺伝子群の発現活性化を担うことが明らかとなった。一方で、代表的な体細胞性遺伝子であるHoxa1およびHoxb1、ならびに神経特異的遺伝子GfapはPGCsにおける発現が認められないものの、その発現抑制はDNAメチル化に依らないことがわかった。すなわち、PGCsにおいて、各遺伝子の近傍領域はヒストンH3リジン4トリメチル化(H3K4me3)およびH3K27me3のバイバレントなヒストン修飾を受けており、これによって遺伝子発現が抑制されていることが想定された。過去の報告から、PGCsはその発生過程において、ゲノムワイドにDNAメチル化を低下させると同時にH3K27me3の修飾レベルを上昇させることが知られていた。本研究の成果により、PGCsは、DNA低メチル化という脱抑制的なゲノム状態においても、バイバレントなヒストン修飾により体細胞性遺伝子群を将来的な活性化まで発現しないように留めている一方で、DNA脱メチル化によりPGC特異的遺伝子群を発現活性化させ、発生の適正な進行を保証するエピジェネティックな選択的遺伝子制御システムを用いていることが強く示唆された。始原生殖細胞発生過程における選択的な遺伝子発現を制御するエピジェネティックな機構を、特異的遺伝子および体細胞性遺伝子の代表例を挙げて記述することに世界で初めて成功した。これまでの研究結果のゲノムワイドでの検証が今後の課題である。そのために、次世代シークエンサーを用いたDNAメチル化、ヒストン修飾、遺伝子発現解析を遂行する。
抗ミエリンプロテインモノクロナル抗体による歯髄疾患の神経病理組織診断

出発材料として、当初、ラットの歯髄を取り出しホモジナイズ後、ショ糖密度勾配遠心を行ったが、有髄神経の絶対量が少なすぎ、ミエリン画分を得ることができなかった。そこで、ラットの腋窩、筋皮、正中、橈骨、尺骨、座骨の各神経をホモジナイズ後、ショ糖密度勾配遠心を行ったところ、6匹のラットからでも界面に明瞭なミエリン画分を得ることができた。ショ糖密度勾配遠心は、浮上法と沈降法を比較検討したが沈降法の方が、より顕著にミエリン画分を得ることができた。密度勾配遠心にて得られたミエリン画分を、低張処理したのち遠心し沈澱物の純度を検討するため、透過型電子顕微鏡で観察した。その結果この沈澱物は、層板状構造をとるミエリンからなっていることが確認できた。粗ミエリン画分は、酸不溶性分画、脱脂操作を行ったのち、Sephacryl S-100カラムでゲル濾過したところ、1つの大きなピ-クを得ることができた。このピ-クに相当するフラクション約20μlを、SDSを含むポリアクリルアミドスラブゲルで電気泳動を行っても、蛋白量が少なすぎ、ク-マシ-ブル-染色にてバンドを検出することができなかった。次にこのフラクションを、アミコンのセントリプレップ-10を用いて約12倍に濃縮し、同様に電気泳動したところ、ク-マシ-ブル-、PAS染色にて約32KDの位置に単一のバンドが確認できた。ゲル濾過、電気泳動の結果から、今回、分離・精製されたミエリン蛋白は、PO糖蛋白と結論でき、今後は、ゲル濾過後の濃縮サンプルを直接抗原として、in vitro法によるモノクロナル抗体を作製し、歯髄疾患時の歯髄神経の変性・再生現象を検討していきたいと考えている。ラットの橈骨、尺骨、正中、腋窩、坐骨の各神経を取り出し、0.32Mショ糖液中でホモジネートを作り、そのろ過液を0.656Mショ糖液上に重層し密度勾配遠心(40,000×g30分間)を行った。界面に生じた画分は約2倍に希釈し、再度密度勾配遠心を行った。得られた画分は0.25Mのショ糖液となるよう蒸留水で希釈したのち、10,000×gで10分間遠心した。沈澱は10mMトリス緩衝液でホモジナイズののち氷浴中に20分間静置した。これを10,000×gで10分間遠心ののち、得られた沈澱を生化学的分析の材料とした。なお、この沈澱物の形態を検討するため、通法により電顕用試料を作製ののち、超薄切片を透過型電顕で観察した。その結果、この沈澱物は層板状構造をとるミエリンであることが確認できた。次に、上記沈澱物を0.03Mの塩酸でホモジナイズ後、4°Cで13時間かくはんした。これを23,000×gで60分間遠心したのち、得られた酸不溶性画分をクロロホルム:メタノール(2:1)に溶解・ホモジナイズ後、7,000×gで30分間遠心した。脱脂された最終残査は冷風で十分乾燥ののち、10%ソディウムドデシルサルフェート(SDS)添加リン酸緩衝液に再溶解した。これを26,000×gで15分間遠心後、上清をセファクリル-100HRゲルクロマトグラフ分析した。

280nmでピークの出現したフラクションチューブ内容液をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ミエリン糖蛋白のバンドの出現を観察した。今回、はじめの末梢神経の湿重量が5匹のラットから約1gと少量であり、フラクション液を直接(約20μl)サンプルとして電気泳動を行っても、蛋白量が少なすぎ、クーマシーブリリアントブルー染色を施してもバンドを検出することができなかった。今後は、出発材料の量をふやすとともに、電気泳動前にあらかじめサンプル液の濃縮を行う必要があると結論できる。末梢神経のミエリンには、50%以上を占めるPO糖蛋白の存在することが特徴である。この糖蛋白は、ミエリンの多重層形成に重要な役割をはたしていると考えられている。本研究は、このPO糖蛋白を分離・精製したのち、これに対するモノクロナル抗体を作製し、この抗体を使って歯髄疾患の病態を神経病理組織学的に解明することにある。1回の実験に9週齢のウイスタ-ラット(250300g)を6匹使用した。エ-テル麻酔のうち、頸椎脱臼にてラットを屠殺し、腋窩、筋皮、正中、橈骨、尺骨、座骨の各神経を摘出した。摘出神経は、8倍量の0.32Mショ糖液でホモジナイズした。その後、ショ糖密度勾配遠心を2度行い、粗ミエリン画分を得た。次に、ミクロゾ-ム、軸索細胞質を除去する目的で、遠心、低張処理操作を行った。得られた沈殿は、0.03M塩酸中でかくはん後、遠心にて酸不溶性画分を得た。最後に、メタノ-ル・クロロホルムにて溶解ののち遠心し脱脂を行った。脱脂乾燥された試料は、10%SDSに再溶解したのち、遠心上清をゲル濾過用試料とした。試料約1mlをSephacryl Sー100カラムにかけ、2%SDSを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH7.2)を用い3mlずつ分画した。ピ-クの検出されたフラクションは約12倍に濃縮後、0.1%SDSを含む12.5%ポリアクリルアミドスラブゲルで電気泳動した。20mAで約2時間泳動後、CB、PAS染色を行った。CB、PAS染色にて約32KDの所にバンドが認められた。このことから、今回、分離・精製されたものはPO糖蛋白と結論できる。また、電気泳動の結果、単一のバンドが得られたので、今後は、ゲル濾過後の濃縮サンプルを直接抗原として使用し、in vitro法によるモノクロナル抗体を作製し、歯髄疾患時の歯髄神経の変性・再生現象を検討していきたいと考えている。
看護基礎教育の中の小児看護学の教育内容・方法に関する総合的研究

本研究の第一の目的は、小児看護教育の現状を知ること、及び臨床が求めている新卒看護婦の小児看護の知識・技術のレベルを知ることであった。調査は、第一段階として全国レベルでの小児看護教育の実態調査と、調査対象となる教育施設を限定して実際に訪問・面接し、可能な限り実態を観察する第二段階の調査に大別される。前者では小児看護学の講義内容、担当者、教室内実習の内容、時間数、臨床実習の内容、時間数等を調査し、この結果、看護教育施設の中には小児看護担当教員が不在のものが29%あること、小児看護担当教員の中に小児看護の臨床経験1年未満のものが15%いること、特に看護専門学校では非常勤講師への依存が多いこと、実習は135時間の規定通りが多いことなどが明らかになった。平成7年には実習指導体制に焦点を絞って詳細な調査を行い、学校側による指導は48.7(【.+-。】20.8)%という数字を得た。訪問・面接による第二段階の調査では、受持患児の実態として大部分の学生が患児1人のみを受持っていること、患児を選択する余地がない程患児数が少ない施設があること、施設によって実習環境として大きな差があることなどが知られた。学生の実習の中心は日常生活の援助であり、治療・処置へのかかわりは半数程度であった。付添いの多い実習施設では、日常生活の援助が付添いによって行なわれ、実習できない実態も伺われた。教室内実習では、少ない時間数の中で教室内実習の時間を確保することが困難であり、一部学生のみが実際に行なう、またはデモンストレーションのみに留まるものも多かった。新卒看護婦に関しては、神戸周辺の事情により、第二段階の調査を行なうことはできなかった。訪問・面接による調査によって、質問紙では得られない実態も明らかになり、少子化の中で実習施設にも多くの問題があることもわかり、小児看護学教育のモデルプログラム作成に向けて貴重な示唆が得られた。平成2年の看護婦学校カリキュラム改訂後、小児看護学の教育内容にどのような変化があったかを中心に、主として小児看護概論、小児保健の教育内容と方法を知るために、看護婦学校230校に質問紙を送付した。平成2年にカリキュラムが改訂されても、小児看護学の講義時間は120時間のままで変更はなかったため、カリキュラム変更の意図がどのように内容を変化させているかが注目された。全国の看護大学、短大、看護専門学校および高校専攻科230校のうち、98校より回答があった。学校のうち、小児看護学を担当する専任教員が不在のもの約30%、専任教員の小児看護臨床経験は3年未満約40%であり、講義は非常勤講師に大きく依存しており、医師による講義も多かった。小児看護概論では“学生の子どもの理解を助けるために"視聴覚教材が多く用いられ、少子化の中で、小児看護学の専任教員がいる学校では見学、学内実習、グループワークなどさまざまな教授法が試みられていた。小児看護臨床実習についても、同様の全国調査を行ない、230校のうち125校から回答があった。現状の把握とともに、10年前の同様の調査との比較も行なった。カリキュラム改訂により、実習時間は180時間から135時間に減少した。実際の実習時間は規則通りが約2/3であった。小児の病棟で実習しているものは約2/3であった。実習施設と学校が遠距離のもの、他校と重複しているもの、小児が少数で受持患児選択に支障があると思われるものもみられた。

臨床実習指導は、病院が中心または殆どが病院とするものが過半数であり、専任教員が受持患児の選択に関わらない1/4、評価に関わらない1/3など、専任教員の役割の問題が指摘された。第1段階の調査は、小児臨床看護の教育内容の調査を残してほぼ終了した。第一段階の調査の中で唯一未完であった小児臨床看護の講義にかかる教育内容の調査は終了し、現在整理中である。この部分は主として神戸市立看護短大において進行中である。本年度当初は、新卒看護婦の知識・技術に関する調査研究を行なう予定であったが、諸事情によりこの調査を行なうに最適の時期(卒業後3か月前後)を逃してしまったため、この研究は平成7年度に実施することとし、今年度は小児看護学教育の実態に関する第二段階の調査を優先して行なうこととした。小児看護学教育の実態調査に関しては、臨床実習を調査項目の中心におき、実習施設の概要、実習病棟の特徴、入院患児の主な疾病の種類、患児数と学生数との関係等の事前調査を行ない、入院患児数が少なくとも学生数の2倍以上であって、一定の方針のもとに臨床指導担当者が受持患児を“選択"することが加納である教育施設を選んで、受持患児の方針と選択の状況について、必ず研究者が教育施設に出向いて、さまざまな資料の提示をうけながら面接調査を行なった。この方法により、質問紙法では得られなかった詳細にわたる教育の実態を知る貴重な資料を得ることができた。この方法の延長として、小児看護において優れた指導者と評価されている指導者が小児看護教育に携わっている施設について、やや遠距離の施設も含めて訪問し、資料の提供と詳細な説明を得た。現在、資料を整理中である。小児臨床看護の講義内容の調査では、医師および臨床看護婦への依存が多く見られること、内容の組み立ては疾患別が多いこと、手術を受ける小児を75%、障害児を60%、看護過程の展開は83%が取り上げていることなどがわかった。小児看護実習指導の中で、特に学校と臨床側指導者とのかかわりの実態について全国調査を行なった。118校からの回答(69%)によれば、1グループの学生数の平均は6.5名、学校側指導者の指導割合は48.7(±20.8)%であった。臨床側に指導者が決められている場合、指導者には3タイプがあり、指名されてある期間継続するものが最も多く75%であった。小児看護実習の中の受持患児についての面接による東京周辺4県における詳細な調査では、実習病棟の小児数が学生の2倍以上の教育施設を対象とし、31校の教員46名から、学生256名の受持患児についての資料を得た。学生の受持患児数は1人のものが74%、2人を同時に受持つものはなく、学生の約半数が受持実日数79日、受持患児の70%が乳幼児、疾患は悪性腫瘍が21%、うち白血病10%であった。安静度の制限なし46%、経過では回復期31%、慢性期23%、処置では点滴67%、学生の主たるケアは日常生活援助が91%、治療処置に伴うケア53%であった。実習環境としては、付添いなしが多く、60%は手術が行なわれる病棟、受持決定には大部分に教員がかかわっており実習に対する教育的配慮には課程による特徴がみられた。一方、付添いの多い病院で実習を行なっている学生の調査からは、日常生活援助が十分行なえない実態も明らかになった。小児看護学の教室内実習については、別の4県において20校を訪問、面接によるより詳細な実態を調査した。
担癌動物で癌細胞を特異的に傷害するエフェクター細胞の誘導機構の分子生物学的解析

我々は、最近、がん細胞を主要組織適合性抗原(MHC)の異なるマウスの腹腔内に移植した際に誘導される、がん細胞を直接傷害するエフェクター細胞が従来の常識に反しマクロファージ系細胞であり、その標的細胞特異性は自己がん細胞にも同様な強い細胞傷害活性を示したが、自己正常細胞には全く傷害活性を示さないことを見いだした。そこで、そのエフェクター細胞の誘導機構解明の手始めとして、これまで報告されているマクロファージ同様に骨髄細胞由来であるかどうかを調べた。その結果、X線照射したC57BL/6マウスをF1(C57BL/6xC3H/He)マウスの骨髄細胞で再構成後、がん細胞を腹腔内移植後、非自己のがん細胞を移植すると未処理C57BL/6マウス同様のエフェクター細胞が出現し、がん細胞は拒絶排除された。また、再構成マウスの局所に浸潤するエフェクター細胞は未処理マウスと同様のフェノタイプを持ち、形態及び標的細胞特異性も同様であり、またその主要組織適合性抗原はC57BL/6(H-2^b)ではなくF1(C57BL/6xC3H/He)(H-2^<b/k>)であった。以上の結果より、この新しいエフェクター細胞は骨髄細胞由来であることが明らかとなった。
子宮内膜癌浸潤機序におけるCD9分子の機能解析

我々は、白血球分化抗原の一つであるCD9分子が、脱落膜に接し浸潤を停止しているExtravillous trophoblast(EVT)に強く発現しており、EVTの培養系に抗CD9抗体を作用させることにより、これらの細胞の浸潤が再開することを見いだした。このことはCD9分子が細胞浸潤の制御に深くかかわっていることを示唆している。さらに我々は、他の女性生殖器の検索により子宮の内膜腺上皮細胞にもCD9分子が特異的に発現していることを見いだした。そこで本研究は、子宮内膜腺上皮細胞由来の子宮内膜癌につき、CD9分子の発現とその浸潤に対するCD9分子の作用を解析することを目的とした。まず正常子宮内膜上皮における月経周期におけるCD9の発現の変化につき検討したところ、CD9の発現強度には変化は認められず恒常的な発現が認められた。次に子宮内膜上皮におけるCD9とIntegrinとの関連につき検討するために、子宮内膜組織から得た蛋白に対し抗CD9抗体を用いた免疫沈降法を行い、共沈したCD9分子に結合する分子をWestern blott法により検討したところ、Integrin α3及びα6がCD9分子と結合していることが明らかとなった。次に子宮内膜増殖症と子宮内膜癌についてCD9の発現を検討したところ、子宮内膜増殖症では強い発現が認められたのに対し、浸潤能を有する子宮内膜癌ではその発現が減弱していた。また、子宮内膜癌細胞株RL952、Ishikawaに抗CD9抗体を作用させると、これらの細胞の浸潤が増強した。今後、子宮内膜癌浸潤制御に対するCD9分子の役割とIntegrinのその関与につき更に検討を行う予定である。次に子宮内膜癌細胞株RL952にIntegrin α3、β1またはα6に対する中和抗体を添加したところIntegrin α3,β1及びα6の機能を抑制することによりRL952細胞の浸潤能が抑制された。さらに、抗Integrin中和抗体により浸潤能の抑制されたRL952細胞に抗CD9抗体を添加すると抗Integrin α3抗体により抑制されたRL952細胞の浸潤能が回復した。一方、抗Integrin α6,β1抗体により抑制された細胞浸潤能は回復しなかった。以上の結果より、子宮内膜癌細胞の浸潤に深く関与するCD9分子はIntegrin α3,β1及びα6に結合しており、CD9分子はIntegrin β1,α6を介した浸潤抑制機構に関与していることが示された。

また、子宮内膜癌細胞株RL952、Ishikawaに抗CD9抗体を作用させると、これらの細胞の浸潤が増強した。今後、子宮内膜癌浸潤制御に対するCD9分子の役割とIntegrinのその関与につき更に検討を行う予定である。次に子宮内膜癌細胞株RL952にIntegrin α3、β1またはα6に対する中和抗体を添加したところIntegrin α3,β1及びα6の機能を抑制することによりRL952細胞の浸潤能が抑制された。さらに、抗Integrin中和抗体により浸潤能の抑制されたRL952細胞に抗CD9抗体を添加すると抗Integrin α3抗体により抑制されたRL952細胞の浸潤能が回復した。一方、抗Integrin α6,β1抗体により抑制された細胞浸潤能は回復しなかった。以上の結果より、子宮内膜癌細胞の浸潤に深く関与するCD9分子はIntegrin α3,β1及びα6に結合しており、CD9分子はIntegrin β1,α6を介した浸潤抑制機構に関与していることが示された。我々は、白血球分化抗原の一つであるCD9分子が、脱落膜に接し浸潤を停止しているExtravillous trophoblast(EVT)に強く発現しており、EVTの培養系に抗CD9抗体を作用させることにより、これらの細胞の浸潤が再開することを見いだした。このことはCD9分子が細胞浸潤の制御に深くかかわっていることを示唆している。さらに我々は、他の女性生殖器の検索により子宮の内膜腺上皮細胞にもCD9分子が特異的に発現していることを見いだした。そこで本研究は、子宮内膜腺上皮細胞由来の子宮内膜癌につき、CD9分子の発現とその浸潤に対するCD9分子の作用を解析することを目的とした。まず正常子宮内膜上皮における月経周期におけるCD9の発現の変化につき検討したところ、CD9の発現強度には変化は認められず恒常的な発現が認められた。次に子宮内膜上皮におけるCD9とIntegrinとの関連につき検討するために、子宮内膜組織から得た蛋白に対し抗CD9抗体を用いた免疫沈降法を行い、共沈したCD9分子に結合する分子をWestern blott法により検討したところ、Integrin α3及びα6がCD9分子と結合していることが明らかとなった。次に子宮内膜増殖症と子宮内膜癌についてCD9の発現を検討したところ、子宮内膜増殖症では強い発現が認められたのに対し、浸潤能を有する子宮内膜癌ではその発現が減弱していた。
施設で生活している高齢者の死生の在り様に関する研究

本研究の目的は施設で生活している高齢者の死生の在り様を明らかにすることである.研究参加者は施設で生活している高齢者8名で,平均年齢87歳,平均要介護度3.5であった.データ収集は半構成的面接で行い,生活の中で感じている死や生について自由に語ってもらった.分析は逐語録を作成後,死や生について語られている箇所を抽出し,類似したものでまとめカテゴリー化した.倫理的配慮は,まず研究参加者に寄り添い生活のリズムを把握した.そして,生活のリズムを壊さないよう自然な流れで面接を行った.施設で生活している高齢者の死生の在り様は,【思いどうりにいかない人生の苦にさいなまれる】ことで,【今までの生き方を省みる】ということをしていた.また,【拠りどころとのかかわりに支えられ,癒される】なかで,【存在価値,生きる意味・目的を見出す】ことに向かっていることが明らかになった.本研究の目的は、施設で生活している高齢者の死生の在り様を明らかにすることである。そのために、平成24年度は、前年度に引き続き、死生の有り様の定義について熟考を重ね、最終的に、スピリチュアリティをもつ存在として死や生にどのように向かっているのかとした。また、前年度からの高齢者の死生に関する文献検討を続け、高齢者に対するスピリチュアルケアについてまとめ、成果を学会発表した。さらに、研究の方法論を洗練させるため、各学会主催の学術集会(2回)・研修会(1回)、大阪大学主催のセミナー(3回)に参加し、方法論の知識を得、研究者間での意見交換を行った。研究の概要については次のとおりである。研究参加者は同意が得られた施設で生活している高齢者8名で、女性7名、男性1名、平均年齢87歳、平均要介護度3.5であった。データ収集は、半構成的面接で行った。面接内容は、生活の中で感じている死や生について自由に語ってもらった。承諾が得られたため、全員ICレコーダーに録音した。分析は、逐語録を作成し,死や生について語られている箇所を文脈を損なわないように抽出し、内容を要約したコードとした。そして、コードの類似したものでまとめサブカテゴリーとし、サブカテゴリーの類似したものでまとめ、カテゴリーとした。倫理的配慮は、研究参加者の施設での生活のリズムを壊さないように研究参加者1名につき異なる日で2回、生活の場に寄り添い、研究参加者の生活のリズムを把握した。そして、3回目に自然な流れで面接を行うようにした。施設で生活している高齢者の死生の在り様は、【思いどうりにいかない人生の苦にさいなまれる】ことで、【今までの生き方を省みる】ということをしていた。また、【拠りどころとのかかわりに支えられ、癒される】なかで、【存在価値、生きる意味・目的を見出す】ことに向かっていることが明らかになった。今後、成果発表の予定である。本研究の目的は施設で生活している高齢者の死生の在り様を明らかにすることである.研究参加者は施設で生活している高齢者8名で,平均年齢87歳,平均要介護度3.5であった.データ収集は半構成的面接で行い,生活の中で感じている死や生について自由に語ってもらった.分析は逐語録を作成後,死や生について語られている箇所を抽出し,類似したものでまとめカテゴリー化した.倫理的配慮は,まず研究参加者に寄り添い生活のリズムを把握した.そして,生活のリズムを壊さないよう自然な流れで面接を行った.施設で生活している高齢者の死生の在り様は,【思いどうりにいかない人生の苦にさいなまれる】ことで,【今までの生き方を省みる】ということをしていた.また,【拠りどころとのかかわりに支えられ,癒される】なかで,【存在価値,生きる意味・目的を見出す】ことに向かっていることが明らかになった.本研究の目的は、施設で生活している高齢者の死生の有り様を明らかにすることである。そのために、平成23年度は、高齢者施設における死生や看取りに関する研究について文献検討し、高齢者の死生や、看取りの動向を明らかにすることを目的とした。高齢者施設、死生、看取り等をキーワードに文献検討を行った。文献検討を行う中で、死生の有り様を死や生への態度という視点からみることができることを見いだせた。このことは、研究の目的をよりはっきりさせ、明確な結果を導くために重要であり、研究計画書の見直しをスーパーバイズを受けながら行った。また、文献検討を行う際、高齢者の死生や看取りをさらに幅広く捉えるため、高齢者施設に限定せずに行う必要があることが分かり、平成24年も継続して文献検討を行う。研究の実施に関しては、平成24年度から対象者に研究の同意を得、インタビューを開始する予定である。そのため、平成23年度はその準備として、まず所属する大学の倫理委員会に審査申請し、承認を得た。そして、研究対象である施設の理事長、施設長に研究協力の依頼を行い、承諾を得た。研究を進めるにあたり、適宜スーパーバイザー、理事長、施設長のアドバイスをいただいた。今後も、アドバイスをしていただけるよう依頼し、快く引き受けてくださっている。現在、施設長に対象者の選定条件を提示し、対象者の選定を依頼しているところまで、準備が進んでいる。また、研究の対象者以外でプレテストを行い、インタビュー内容の妥当性、信頼性を検討している。

研究の意義、重要性については、今回、死生の有り様を死や生への態度という視点でみれることを見いだせたことは、より明確な結果を導くことができ、重要度が高い。結果が明確になることで、高齢者が最期の時まで成長し、自分らしく生きることへのかかわりがはっきり提言できるようになったことは意義深い。平成23年度は、高齢者施設における死生や看取りに関する研究について文献検討し、高齢者の死生についてや、看取りの動向を明らかにすることを目的とした。文献検討を行う中で、死生の有り様を死や生への態度という視点からみることを見いだせたのは、今後研究を行う上で焦点がよりはっきりし、成果であると考える。また、平成24年度から、対象者に研究の同意を得、インタビューを開始する予定であるが、その準備がほぼ整えられたことは成果であると考える。以上の理由から、おおむね順調に進展していると自己評価する。平成24年度は、高齢者の死生や看取りについて、高齢者施設に限定せずに、幅広く文献検討を継続する。また、文献検討をする中で、主要な概念が見つかれば、その概念についてまとめる。成果は、学会で発表する。研究の実施に関しては、対象者の選定が終了すれば、対象者と家族に研究の概要説明をし、書面と口頭で同意を得る。そして、リッチなデータを得るため、インタビューを行う前に、施設に訪問し、対象者と交流を深める。具体的には、高齢者の心身の状態に留意し、高齢者が慣れ親しんでいる生活の場で3日間交流を深める。4日目に1時間程度のインタビューを行う。インタビュー後は、逐語録を作成し、データ分析を行い、成果をまとめる。物品費に関しては、研究に必要な文房具類、USB、本などを購入する。旅費に関しては、研究を進めるにあたり必要なデータの収集、研究者間の交流のため各学会に参加する。また、対象者とインタビュー前に交流を深めたり、インタビューを行うために各施設を訪問する。また、適宜理事長や施設長との研究打ち合わせや、アドバイスを受けるために各施設を訪問する。謝金等に関しては、文献検討を継続するため、文献整理、データ整理を依頼する。また、インタビュー後の逐語録の作成、データ整理も依頼する。その他に関しては、研究成果発表費用として使用する。
脊髄後角におけるβエンドルフィンの鎮痛機序の解明：サブスタンスP放出への影響

脊髄後角におけるβエンドルフィンの鎮痛機序を明らかにするため、各オピオイド受容体選択的拮抗薬投与下での、ホルマリン誘発性急性炎症モデルにおいてサブスタンスP放出に与える影響をNK1受容体インターナリゼーションを指標に評価した。髄腔内へのβエンドルフィン投与はサブスタンスPの放出を抑制し(前抑制)、μ受容体拮抗薬により拮抗されたが、δ受容体拮抗薬では有意に拮抗されなかった。この結果から、βエンドルフィンにはδ受容体を介した鎮痛作用機序にサブスタンスP放出を介さないメカニズムがあることが示唆された。内因性ペプチドホルモンであるβエンドルフィンは、オピオイド受容体を介して鎮痛作用のみならず多幸感や情動にも影響をおよぼすと考えられている。脊髄後角での興奮性神経伝達物質であるサブスタンスPなどの放出抑制が、この鎮痛機序の一つであると推測されているが未だ報告がない。本研究ではβエンドルフィンの髄腔内投与および選択的オピオイド受容体拮抗薬との併用時における脊髄レベルでの鎮痛作用の確認と、脊髄後角でのシナプス前性および後性についての作用機序を明らかにするため、脊髄後角表層におけるサブスタンスPの求心性一次繊維からの放出をneurokinin 1(NK1)受容体の内在化(インターナリゼーション)で評価し、また神経興奮マーカーであるc-Fosタンパク発現を免疫組織学的に評価し、これらの薬剤の侵害受容性シナプス伝達に与える影響を評価する。内因性ペプチドホルモンであるβエンドルフィンは、オピオイド受容体を介して鎮痛作用のみならず多幸感や情動にも影響をおよぼすとされている。脊髄後角でのにおける一次求心性線維では、興奮性神経伝達物質であるサブスタンスPの放出抑制が、この鎮痛作用機序の一つであると推測し評価を行った。本研究ではβエンドルフィンの髄腔内投与および選択的オピオイド受容体拮抗薬との併用時における脊髄レベルでの鎮痛作用の評価、脊髄後角でのシナプス前性および後性についての作用機序を明らかにするため、脊髄後角表層におけるサブスタンスPの一次求心性線維からの放出をneurokinin 1(NK1)受容体の内在化(インターナリゼーション)で評価し、また神経興奮マーカーであるc-Fosタンパク発現を免疫組織学的に評価し、侵害受容性シナプス伝達に与える影響を明らかにした。計画通り、順調に進捗しているため。医歯薬学本研究成果を、学会発表および論文執筆・投稿などにより広く伝えていく。痛み行動自動計測装置(100万円超)の購入を想定していたが、同じ研究室内で同装置を購入し、本実験にて活用することができたため購入を見合わせる事ができた。そのため、他の実験用器具、実験に必要な物品、実験動物の購入費用等にあてて、より一層充実した研究環境を整える方針である。
感覚フィードバックシステム

事故・腫瘍などにより頸髄を損傷すると、脳から四肢への神経情報が伝わらないため四肢麻痺になると共に、四肢から中枢への経路も遮断されるため感覚が喪失する。本研究では、末梢の神経・筋系を機能的電気刺激(FES)によって制御するときに惹起される手指の位置の変位・把持力などの量を患者本人の肩への皮膚刺激を介して感覚量としてフィードバックするシステムを開発するための基礎を確立することが目的である。本年度は計画の第2年度にあたり、昨年度に得られた基礎的なデータをもとに、次に示すように電気刺激によるファントムセンセーション(PS)に関する心理物理特性について調べ、システムの設計に資する知見を得た。(1)2組の電極対間を1つに融合した刺激像(PS像)が滑らかに移動して感じられるように、電極対に印加する刺激電流の振幅を等感覚曲線に沿って時間と共に相補的に増・減させる新しい刺激法を考案した。(2)刺激振幅の平均値が知覚閾値の2倍程度でPSが知覚されやすい。(3)刺激点間路離が電気刺激に対する空間分解能(約40mm)よりもやや広い時(6080mm)にPSが最もよく感じられる。(4)刺激の周波数が振幅の変化の周波数に比べ、充分に高い場合(100pps以上)にPSが知覚されやすい。(5)刺激像の移動感をもたらす振幅の変化の周波数が12Hzの時にPSが最もわかりやすい。(6)PSは、2点間のみでなく3点以上の刺激点にわたり広い範囲に感じることができる。(7)刺激振幅の変化量を加減すると、これに対応して刺激像の皮膚上の移動範囲が変化して感じられる。この差異の識別によって情報の伝達を行うことができる。特に3点間では正答率を高くすることができ、確実な情報伝達の手段となりうることが示された。以上の結果を踏まえ、実用的なシステムを開発することが今後の課題である。交通事故などにより脊髄を損傷すると、脳から四肢への神経情報が伝達されないため、四肢麻痺になると共に、四肢から中枢への神経情報のルートも切断されているので感覚機能も喪失してしまう。本研究では、末梢の神経・筋系を直接、機能的電気刺激(FES)によって制御する場合に、発生される指先の変位、握力などの量を患者本人の肩への皮膚刺激を介して感覚量としてフィードバックさせるシステムの開発をめざしている。本年度は計画の第一年度であるため感覚情報の基本特性を次の3点について明らかにし、設計にそなえた。(1)機械的振動刺激による感覚情報の伝達特性:十分駆動力のある加振器を用い、肩、首の皮膚への機械的振動刺激を与え、閾値、周波数弁別能などを定量的に求めた。振動音の影響があることと、装置が大形になるため実用化には向かないと結論された。(2)電気刺激による感覚情報の伝達特性:【◯!1】周波数変化に対して刺激電流振幅の閾値の変動が小さいため、周波数変化に対する振幅の設定は容易である。しかし、刺激する位置による閾値の差があり、多点刺激の時の振幅の設定には注意が必要である。【◯!2】刺激振幅のダイナミックレンジは1215dBなので周波数変化、刺激位置変化と組合せるべきである。【◯!3】周波数fとその変化分△fとの比で定義される周波数弁別閾はf≦200Hzでほぼ0.3であった。【◯!4】空間分解能は約40mmであった。【◯!

5】その他に、時間分解能、位相差分解能、伝達情報量も求めた。(3)電気刺激による新しいファントムセンセーション(PS)の与え方:機械振動刺激で報告されているPSを、2個の電極対間で、相補的に振幅が時間と共に増・減する新しい刺激法を考案した。これをさらに2電極の等感覚曲線で補正して刺激すると2電極対の間をスムーズに移動する感覚を発生させることが出来た。この方法を上記の基本的特性と総合したシステムを開発することは次年度の課題である。