hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
時間、空間、音声の知覚に共通するチャンネル間処理の解明

本研究課題では、ヒト聴覚のチャンネル間処理(異なる周波数チャンネルや左右の耳に跨って行なわれる情報処理)と、時間、空間、音声知覚におけるチャンネル間処理の共通性を検討した。その結果、心理音響学的手法で測定したそれらの知覚のチャンネル間処理の指標には有意な相関があることが分かった。この結果は、聴覚神経機構の脳幹と聴覚野の神経科学的測定とも対応した。更に、チャンネル間処理が視覚においても働いていることを示す結果も得られた。テーマ別に以下に記す。【A】チャンネル間処理の共通性の実証:周波数内、周波数間、及び両耳間無音検出の閾値、/b/-/p/のカテゴリー境界を測定し、測定値間の相関分析を行った。その結果、周波数間と両耳間無音検出閾値には有意な相関があり、両者は共通のチャンネル間処理を反映していることが示唆された。【B】チャンネル間処理の脳内メカニズムの同定:周波数間及び周波数内無音聴取時の下丘の活動を脳磁図(MEG)で測定した。呈示刺激にはギャップ前後の周波数が800Hzあるいは3200Hzで同じ(周波数内)、あるいは異なる(周波数間)純音とした。その結果、ギャップ後の音の立ち上がりに対する反応に周波数内と周波数間で違いがみられた。また、MEGの解析により800Hzと3200Hzにそれぞれ対応する大脳聴覚野の領域が特定された。これは、無音検出の「周波数チャンネル」を具体的な脳領域として同定した世界最初の知見である。【C】促音知覚と視覚におけるチャンネル間処理の検討:促音知覚に関しては、日本人と英語母語者を対象として促音聴取実験と事象関連電位の測定を行った。その結果、日本人は摩擦促音を無音としてとらえる傾向があるが、英語母語者にはないことが分かった。視覚に関しては、空間周波数次元におけるチャンネル間処理をギャップ検出実験で検討した。その結果、ギャップ前後の周波数が異なる場合は同じ場合と比べてギャップ検出感度が低下し、視覚においても聴覚と同様にチャンネル間処理が作用している可能性が示唆された。以上の成果はInterspeech(8月、リヨン市)、MPR2013(11月、京都)、日本音響学会春季研究発表会(2014年3月、東京)等で発表した。また、8月に九州大学(福岡市)でキックオフワークショップを開催し、科研メンバー全員が参加した。【A】チャンネル間処理の共通性の実証:昨年(H25)度から継続して,周波数内、周波数間、及び両耳間無音検出の閾値、/b/-/p/の同定反応を測定し、測定値間の相関分析を行った。実験参加者数を49名に増やして分析した結果、周波数間と両耳間無音検出閾値の相関は有意であった。これは両者に共通のチャンネル間処理が存在することを示唆する。一方,/b/-/p/の同定反応と無音検出閾値の間には有意な相関が無かった。【B】チャンネル間処理の脳内メカニズムの同定:周波数内及び周波数間無音聴取時の脳内活動を,同一聴取者と同一の刺激を用いて聴性脳幹反応(ABR)と脳磁図(MEG)で測定するとともに,心理測定関数も測定した。その結果、ABR波形には明確なパターンが見られなかったものの,MEGと心理測定関数には共通した傾向が観察された。【C】促音知覚と視覚におけるチャンネル間処理の検討:促音知覚に関しては、日本語母語者と英語母語者を対象として摩擦促音を含む音声に事象関連電位の測定を行った。その結果、両者の反応に違いがあることが分かった。視覚に関しては、空間周波数次元におけるチャンネル間処理をギャップ閾値測定により検討した。その結果、ギャップ前後の周波数が異なる場合は同じ場合と比べて閾値が上昇し,チャンネル間処理によりギャップ感度が低下することが示された。以上の成果に関しては,Ear & Hearing誌とFrontiers in Neuroscience誌に論文が掲載され,日本音響学会秋季(2014年9月、札幌)及び春季研究発表会(2015年3月、東京)等で発表を行った。8月にはトロント市(カナダ)近郊でワークショップを開催し、科研メンバー全員が参加した。【A】チャンネル間処理の共通性の実証:知覚的学習の手法を用いて共通性を検証した。無音検出課題を23週間行う訓練群と全く行わない非訓練群で,その前後での/da/-/ta/の音声同定と弁別成績を測定した。その結果,音声同定での/da/-/ta/識別境界値には2つの群で有意な変化見られなかったが,訓練群では音声弁別成績が向上する傾向が見られた(田村ら, 2015)。【B】チャンネル間処理の脳内メカニズムの同定:周波数内及び周波数間無音聴取時の聴性脳幹反応(ABR)を測定した。その結果、周波数内あるいは周波数間に関わらず,無音長が10 msを超えると後続音のABR振幅が大きくなることが確認された(Mori & Iramina, 2015)。先行音長が50 msであることを考え合わせると,先行音のオンセットから60 ms以内では後続音のオンセット反応が抑制され,無音検出が困難になるという知見と一致する。【C】

促音知覚と視覚におけるチャンネル間処理の検討:促音知覚に関しては、摩擦促音を含む音声に対するEEGを測定し,日本人話者と英語話者とで促音知覚の情報処理が異なることが示唆された。視覚に関しては、ギャップ前後の刺激の傾きが90°異なる場合のギャップ閾値を測定し、前年度の傾き差15°の場合と同様に,ギャップ前後の周波数が異なる場合は同じ場合と比べて閾値が上昇することが分かった。3つのサブテーマともほぼ当初計画通りに進んでいる。ABRに関しては技術的な問題に重点的に対応したため,かなり測定が進んだ。その結果として,時間,空間,音声のチャンネル間処理の解明とその脳内地図の同定に関しては,全て査読付論文(Mitsudo et al.,2014: Mori et al., 2015; Mori & Iramina, 2015)を出版することが出来た。今年度はABRの測定に重点を置いたため,脳磁図(MEG)の測定が余り進まなかったのが反省材料である。促音知覚の研究も順調に進んでいる。視覚のチャンネル間処理に関しては,当初の計画よりやや遅れ気味であるが,実際の画像に近い刺激を使うなど新たなアプローチを試している段階であり,来年度には当初計画に近い水準の研究が可能と考えている。テーマ別に以下に記す。【A】チャンネル間処理の共通性の実証:時間と空間のチャンネル間処理の共通性に関しては,単耳(時間)と両耳間(空間)での無音検出閾値を測定し,無音前後の周波数が異なる時に2つの閾値に共通性が見られた(Ito et al., 2016)。音声と時間に関しては,同じ刺激を用いて音声同定カテゴリーと同時性閾値を測定した結果,刺激パラメータの変化に伴い2つの値が共通の方向に変化した(Tamura et al., 2016)。【B】チャンネル間処理の脳内メカニズムの同定:周波数間無音検出状況での聴性脳幹反応(ABR)を測定したところ,無音前後の周波数に応じてABRの潜時に変化が見られた(Takamura et al., 2016)。また【A】の音声同定カテゴリー測定と同じ刺激でABRを測定したところ,ABRの潜時に同定カテゴリーと同程度の長さの変化が観察された。以上の結果は,周波数間無音検出と音声知覚のチャンネル間処理に脳幹が関与していることを示唆する。【C】促音知覚と視覚におけるチャンネル間処理の検討:促音知覚に関しては、子供を対象とした実験を行い、促音の書取とかなの読みのテストの成績が高い子どもほど「っ」を無音の一拍と混同する傾向にあることが分かった。視覚に関しては,ホワイトノイズ画像にフィルタをかけて作成した低周波数刺激と高周波数刺激を用いてギャップ検出実験を行った。その結果,ガボール刺激を用いた場合と同様に,周波数内と比べて周波数間のギャップ検出閾値が上昇した。以上の成果に関してはINTER-NOISE2016(2016年8月,Hamburg)や5th Joint Meeting of ASA and ASJ(2016年12月,Honolulu)等で発表した。また5th Joint Meetingでは無音知覚のSpecial Sessionを行った。チャンネル間処理の共通性に関しては研究手法を知覚学習から心理物理実験へと変え,複数の実験を平行して進めている。ABRに関しては技術的な問題がかなり解決されたため,無音検出状況や音声知覚時の測定実験が進むようになり,成果を挙げている。
地域比較栽培試験に基づく水稲の生育特性および多収機構のモデル解析

1.水稲品種コシヒカリの生育・収量データの収集京都(低収地域、玄米収量約5t/ha)で作期や水温を変化させた圃場栽培試験を行い、玄米収量、乾物生産および窒素や非構造性炭水化物(NSC)含有率の異なる水稲の生育データをさらに収集した。2.水稲の窒素栄養状態を考慮した葉面積および乾物生産の動的予測モデルの構築水稲の生育・収量予測モデルのサブモデルとして、水稲体内の窒素栄養状態と気象経過から水稲の葉面積および乾物生産を動的に予測するモデルの構築を目的として、上記のデータに加えて、既に収集したオーストラリアのリベリナ地域(超多収地帯、玄米収量約12t/ha)および長野県伊那市(多収地帯、玄米収量約8t/ha)における水稲の生育データの解析を行った。その結果、水稲の窒素含有量と気温、日射量の気象条件から水稲の葉面積および乾物生産を動的に予測するモデルを構築した。今後は、水稲の窒素吸収能と土壌の窒素供給能の関係を解析し、水稲の窒素吸収過程のモデル化を行う予定である。3.水稲の日射変換効率のモデル解析上記のモデルを用いて、リベリナ地域、伊那および京都における水稲の受光日射の乾物への変換効率(日射変換効率)を比較、解析した。日射変換効率は、伊那が極めて高く、超多収地帯のリベリナ地域は低収地域の京都とほぼ同程度であることがわかった。さらに水稲の窒素吸収パターンが日射変換効率に及ぼす影響を解析した結果、窒素吸収パターンを改良することにより日射変換効率が向上することが示唆された。
“記憶の局所フィードバック仮説”ーその中枢単一同定ニューロンでの検証

記憶の素過程と想定されるニューロン同士のつながり形成については、まだよくわかっていない。その機構として、申請者は"ローカルフィードバック仮説"を案出した(Science, 2005)。このミクロの細胞機能をマクロの行動に結びつけるため、ショウジョウバエの摂食行動を司令する"フィーディング・ニューロン"を発見した(Nature, 2013)。さらに、脳内を見ながら機械刺激を摂食行動に連合するパブロフの条件付けに成功し、条件付けに伴うフィーディング・ニューロンの活動性変化を確認した(発表準備中)。この記憶のミクロとマクロの対応により仮説を検証し、記憶の分子細胞機構を解明する。本課題は、ニューロンのつながりとして記憶痕跡が成立する分子メカニズムと行動制御の連関に挑む研究である。「シナプス前終末とシナプス後膜の両側からの伝達物質の放出が互いに強め合って局所的に続くことが即時的な記憶痕跡をつくり、それが形態変化を誘導して永続的な痕跡となる」と仮定する独自のローカルフィードバック仮説をショウジョウバエを用いて証明する独自性の高い課題である。ローカルフィードバック仮説を検証するために、研究代表者がこれまでの研究で同定したショウジョウバエの摂食コマンドニューロンに注目し、遺伝学的解析手法、行動解析、顕微鏡による先端的な観察手法を確立しつつ研究を進めている。独自技術を駆使して短期記憶から長期記憶への変換過程をライブ追跡するなど挑戦的な内容を目標としており、達成できればそのインパクトは大きい。
腎、心及び肺の病態におけるNa,K-ATPase遺伝子の発現制御調節機構

腎,心および肺の病態や発生を擬する培養細胞系や、組織抽出液を用いて、Na-K-ATPase遺伝子の発現調節機構を多面的に解析した。腎の系については、高浸透圧や血清およびコルチコイドホルモンなどの刺激にたいするNa-K-ATPase遺伝子の発現調節様式を、腎尿細管細胞や血管平滑筋細胞を用いてノーザン法を用いて解析した。α1サブユニットおよびβ1サブユニット遺伝子ともに各刺激による発現促進が見られ、それらが転写レベルで起こることを明らかにした。調節にかかわるエレメントが両遺伝子のプロモーター近傍に存在することが一過性形質転換でわかった。心の系については、Na-K-ATPaseα3サブユニット遺伝子の心筋特異的な発現調節エレメントがNF-YおよびSp1/Sp3結合エレメントであることをゲルシフト法やフットプリント法で、各エレメントが協同性をもって正の作用していることを一過性形質転換法で解明した。、また、因子のエレメントへの結合が心筋特異的に起こっていることなどをin vivoフットプリント法にて明らかにした。肺の系においては、AlveolarII型細胞において、Na-K-ATPaseβ1サブユニット遺伝子の高酸素による発現誘導が転写レベルで起こり、その反応性エレメントが-84から-44に存在することを明らかにした。また、胎児および成体ラット肺の核抽出液を調製し、Na-K-ATPaseα1サブユニット遺伝子の試験管内転写系を確立した。胎児と成体における同遺伝子の発現量の相違を再現できた。成体においては-375から-201の領域に負の制御エレメントが存在し、胎児では。-155から+31の領域で十分な転写活性が保たれているのに対し、成体では+66から+92の領域がさらに必要となった。肺の病態におけるナトリウムポンプの制御のモデルとして、培養細胞(肺胞上皮II型細胞やMDCKなど)を高酸素にさらすと、α1、β1両サブユニットmRNAの誘導がみられる。転写レベルでの制御を観察するためにα1、β1各遺伝子の5`上流域に欠失をもったレポーターコンストラクトを作成し、一過性形質転換法でその反応性が再現できることを確認した。β1については反応性エレメントをほぼ同定した。腎においてはコルチコステロイドホルモンや高浸透圧などの刺激がナトリウムポンプの生合成を誘導することが知られている。誘導の分子機序を解明する目的で、これらの現象を再現することができる培養細胞系を確立した。腎尿細管細胞や血管平滑筋等でα1、β1両遺伝子のmRNAの誘導が観察された。また、これらの誘導はナトリウムイオンや蛋白質合成、ホルモンレセプターを要求する局面と要求しない局面が存在することが明らかとなった。ラット心筋では生後α3遺伝子が一過性に発現され、その後α2に切り替わることが知られている。心筋の一次培養細胞を用いて一過性形質転換を行うとα3遺伝子は効率よく転写される。心筋での同遺伝子の発現を司るエレメントを同定するために、欠失変異、点突然変異遺伝子を用いた解析を行った。-59付近及びTATAbox下流の-30から-10周辺に転写に必須な領域が同定された。腎の系については、高浸透圧や血清刺激によってNa, K-ATPaseα1及びβ1サブユニット遺伝子の発現が血管平滑筋においても誘導されることや、またその誘導が転写レベルで起こることなどを明らかにした。これらの刺激に対する遺伝子上の反応性エレメントを同定するために、Na, K-ATPaseαおよびβ1サブユニット遺伝子をルシフェラーゼレポーター遺伝子に融合して一過性形質転換を行った結果、α1では3倍、β1では6倍程度の活性上昇が見られた。エレメントの局在については解析中である。

心の系については、α3サブユニット遺伝子の制御エレメント及び、制御因子を培養心筋細胞を用いた一過性形質転換法と、核抽出液を用いたゲルシフト、フットプリント法などで解析した結果、NF-Yの結合するエレメントが1カ所Sp1/Sp3の結合するエレメントが2カ所存在し、各々正の制御エレメントとして機能した。これら3カ所のエレメントは協同性をもって働くことも明らかとなった。肺の系については、高酸素反応性エレメントをNa, K-ATPaseβ1サブユニット遺伝子の5'上流域-84から-44に見いだした。同領域には2カ所のSp1/Sp3結合コンセンサスが観察されたが、これらは、高酸素に対する反応性とは無関係であった。また、胎児および成体ラットの肺の核抽出液を調製し、Na, K-ATPaseα1サブユニット遺伝子の試験管内転写系を確立できた。この系を用いた解析によって胎児と成体とにおけるNa, K-ATPaseα1サブユニット遺伝子の発現量の相違をほぼ再現できた。成体においては、-375から-201の領域に負の制御エレメントが、存在することを明らかにした。また、胎児では、-155から+31の領域で十分な転写活性が保たれているのに対し、成体では、+66から+92の領域がさらに必要となることも明らかとなった。腎の系については、Corticosteroneおよび11-dehydrocorticosteroneによってNa,K-ATPaseα1およびβ1サブユニット遺伝子の発現が血管平滑筋において誘導されることや、その誘導が転写レベルで起こることなどを明らかにした。これらの刺激に対する遺伝子上の反応性エレメントを同定するために、Na,K-ATPaseα1およびβ1サブユニット遺伝子をルシフェラーゼレポーター遺伝子に融合して一過性形質転換を行った結果、α1およびβ1での活性上昇が見られた。エレメントの局在については解析中である。心の系については、昨年度同定したα3サブユニット遺伝子の制御エレメント:NF-Y結合エレメントと上流のSp1/Sp3の結合するエレメントが、培養心筋細胞ではタンパク結合しているが、同遺伝子を発現していない血管平滑筋においては、タンパク結合の見られないことをIn vivoフットプリント法にて明らかにした。また、コアプロモーターエレメントとして、TATAやイニシエーター配列が機能していないことも明らかにした。肺の系については、α1サブユニット遺伝子の制御因子であるSix4およびSix5因子が誕生前の肺では核抽出液中に存在するが、誕生後は、Six5のみの存在となることを、特異的抗体を用いて明らかにした。またSix2およびSix4の胚発生に伴う発現を抗体染色で解析したところ、Six2は9日胚の時期から、中胚葉性の細胞で発現し後に、筋肉や結合組織での発現が見られたのに対し、Six4は脳や脊髄、末しょう神経節に10、5日から11、5日をピークに一過性に発現し、神経分化に関与することが示唆された。
グラファイトフィルムの設計-構造と機能の設計-

充分デザインされた機能を持つグラファイトフィルムを調製し,応用するための基礎科学および工学を確立することを目的とし,芳香族ポリイミドフィルムを前駆体に選び,その構造,組織の設計および制御を検討すると共に,それらと機能との関係を検討した.1)構造の設計,制御と評価:芳香族ポリイミドフィルムから,簡単な高温加熱処理によって,クラックやポア-の無いカーボンおよびグラファイトフィルムが得られることを明らかにした.芳香族ポリイミドフィルムから高結晶性のグラファイトフィルムを得るためには,以下の3つの条件,すなわち,(1)高い平面性を持つ分子であること,(2)平面分子がフィルム面に対して高度に配向していること,(3)炭素化・黒鉛化処理の過程での脱ガスによってこの配向が乱されないこと,を満足させる必要のあることを明らかにし,高結晶性フィルムを合成した.2)機能の制御と評価:グラファイト構造への変化の段階での機能,特に電磁気機能の評価を行い,イミド分子中の窒素が21002200°Cの高温まで残留し,グラファイト構造の発達を抑制していることを明らかにした.この残留した窒素は炭素の六角網平面中に炭素原子を置換固溶している.2300°C付近での窒素の放出は急激で,フィルムを変形させる.従って,高結晶性のグラファイトフィルムの調製には,2200°C付近にいったん保持し,充分窒素ガスを放出させることが必須要件である.3)機能の拡張:ボロンおよび鉄のド-ピングを行うとともに,それら異種原子の状態を種々の手法によって検討した.ボロンはポリイミド分子の熱分解の過程でその窒素と反応し,ペア-を作って炭素六角網面中に存在することを明らかにした.鉄については,炭素化の段階で凝集し,鉄微粒子が分散したカーボンフィルが得られることを,XRDおよび磁性測定から明らかにした.グラファイト構造中への窒素のド-ピングの可能性も示唆された.充分デザインされた機能を持つグラファイトフィルムを調製し,応用するための基礎科学および工学を確立することを目的とし,芳香族ポリイミドフィルムを前駆体に選び,その構造,組織の設計および制御を検討すると共に,それらと機能との関係を検討した.1)構造の設計,制御と評価:芳香族ポリイミドフィルムから,簡単な高温加熱処理によって,クラックやポア-の無いカーボンおよびグラファイトフィルムが得られることを明らかにした.芳香族ポリイミドフィルムから高結晶性のグラファイトフィルムを得るためには,以下の3つの条件,すなわち,(1)高い平面性を持つ分子であること,(2)平面分子がフィルム面に対して高度に配向していること,(3)炭素化・黒鉛化処理の過程での脱ガスによってこの配向が乱されないこと,を満足させる必要のあることを明らかにし,高結晶性フィルムを合成した.2)機能の制御と評価:グラファイト構造への変化の段階での機能,特に電磁気機能の評価を行い,イミド分子中の窒素が21002200°Cの高温まで残留し,グラファイト構造の発達を抑制していることを明らかにした.この残留した窒素は炭素の六角網平面中に炭素原子を置換固溶している.2300°C付近での窒素の放出は急激で,フィルムを変形させる.従って,高結晶性のグラファイトフィルムの調製には,2200°C付近にいったん保持し,充分窒素ガスを放出させることが必須要件である.3)機能の拡張:ボロンおよび鉄のド-ピングを行うとともに,それら異種原子の状態を種々の手法によって検討した.ボロンはポリイミド分子の熱分解の過程でその窒素と反応し,ペア-を作って炭素六角網面中に存在することを明らかにした.鉄については,炭素化の段階で凝集し,鉄微粒子が分散したカーボンフィルが得られることを,XRDおよび磁性測定から明らかにした.グラファイト構造中への窒素のド-ピングの可能性も示唆された.1.構造の設計と評価:構造を異にする2種のイミド分子を選び,そのポリアミック酸の段階での一軸延伸処理が2800°Cでの黒鉛化処理によるグラファイト構造の発達に大きな影響を持つことを実験的に示した.一軸延伸処理はイミド分子の配向を面配向から軸配向に変化させ,そのために高温処理での黒鉛構造の発達が阻害されることを,X線回折および磁気抵抗測定から明らかにした.また,ポリイミド分子中の窒素原子が2000°C以上の高温でも残留し,その離脱の際にフイルムの品位を低下させることが明らかとなった.2.機能の制御と評価:各種のポリイミドフイルム(Kapton,Novax及びPPT)を炭素化し,さらに3000°C以上の高温に加熱処理することによって,従来高品位グラファイトフイルムと言われているHOPGに匹敵する結晶完全性を有するフイルムが得られることを明らかにした.フイルムの品位はフイルム状態でのX線回折,残留抵抗比,液体窒素および液体ヘリウム温度での磁気抵抗およびホール係数の測定,電子チャンネリングコントラスト像の観察,高分解能透過電子顕微鏡観察によって評価した.

3.機能の拡張:ポリイミドから調製した高品位グラファイトフイルムに対して,MoCl_5をインターカレーションさせステージ4構造を持つ層間化合物を合成した.得られた層間化合物について300,77及び4. 2Kの温度で電気伝導度,磁気抵抗,ホール係数を測定するとともに,X線回折,電子チャンネリングコントラストによって結晶完全性を評価した.磁気抵抗の磁場依存性にはShubnikov-de Haas振動が測定され,高い品位が保たれていることが明らかとなった.1)構造の設計と評価高結晶性・高配向性グラファイトフィルムを作製するためのプリカーサーとして,ポリアミック酸メチルエステルを合成し,それをイミド化,炭素化,黒鉛化した.生成したフィルムは,メチルエステル化していないポリアミック酸から同様に作製したフィルムよりも高い黒鉛結晶性を示すことが,X線回折,磁気抵抗測定から明らかとなった.高結晶性・高配向性グラファイトフィルムの作製に対して,イミド部分と架橋部分の組み合わせの選択のみでなく,メチルエステル化も効果を持つことが明らかとなり,プリ-カーサーの選択幅がさらに拡張された.2)機能の制御と評価ポリイミドフィルム(カプトン)から作製されたフィルムの電気伝導度,磁気抵抗,ホール係数などの電磁気物性を,処理温度の関数として詳細に検討した.その結果,これらの物性が2300°C付近で飛躍的に変化し,それより高温での加熱処理によって急激に黒鉛となることを見出した.そして,その飛躍的な変化がフィルム中からの残存窒素原子の脱離に起因すること,その窒素原子は炭素六角網平面内に置換固溶して網平面に大きな歪みを与えていることを明らかにした.3)機能の拡張ボロンのド-ピングを,1)グラファイトフィルムを炭化ボロン中で高温に加熱すること,および2)プリカーサーの段階で有機ボロン化合物を混入し,炭素化する,2つの方法によって試みた.後者の方法では,添加ボロンが炭素化の段階でポリイミド中に存在した窒素と反応し,その状態を大きく変えることが明らかとなった.この結果は,炭素を置換固溶したボロンがアクセプターとして働き,生成グラファイトフィルムの物性を変えるのみでなく,ボロンの添加がポリイミドの炭素化過程を変える可能性を示唆している.1)構造の設計,制御と評価:芳香族ポリイミドフィルムの内,カプトンフィルムについて,その構造・組織および電磁物性(残留抵抗比,磁気抵抗およびホール係数)の処理温度に伴う変化を詳細に追跡した.2200°C以下の熱処理によっては,構造の発達はかなり強く抑制されており,コ-クスなどの易黒鉛化性炭素よりも劣っている.しかし,2300°C以上では急激に構造が発達し,極めて高い結晶性が得られることを明らかにした.これらのポリイミドフィルムから得られたグラファイトフィルムは現在モノクロメータなどとして実用化されている高配向性熱分解黒鉛に匹敵する.また,ユ-ピレックスフィルムに付いては,3000°Cへの熱処理によってもグラファイト構造の発達はほとんどみられず,フィルムの厚さ方向での構造傾斜が認められた.2)機能の制御と評価:グラファイト構造への変化の段階で,イミド分子中に存在した窒素が21002200°Cの高温まで残留し,グラファイト構造の発達を抑制している.この残留した窒素は炭素の六角網平面中に炭素原子を置換固溶していることをXPSの詳細な解析から明らかにした.このことは,窒素原子のグラファイト構造中ヘの置換固溶が可能であることを示唆している.2300°C付近での窒素の放出は急激で,フイルムを変形させる.従って,高結晶性のグラファイトフィルムの調製には,2200°C付近にいったん保持し,充分窒素ガスを放出させることが必須要件である.3)機能の拡張:ポリイミドフィルムの合成段階で,ボロンを添加することによって,そのド-ピングを行うとともに,その化学結合状態をXPSによって倹討した.
下顎骨前上方回転が気道に与える影響の流体力学的解析：睡眠時無呼吸の新規治療戦略

骨格性下顎後退症患者に適用される下顎骨前方移動術においては、術後の下顎骨の後戻りに伴う上部気道の狭窄が指摘されている。しかし、この気道狭窄が単なる形態的変化にとどまるのか、機能的な変調を伴うのかは不明である。また、外科的矯正治療が通気に与える影響に対して、計算流体力学が応用される機会が増えつつあるものの、機能的評価は未だ不十分である。本研究では、下顎骨周囲筋や顎関節への影響が少ないと考えられる『下顎骨のオートローテーションを用いた上下顎移動術の安定性および上部気道への形態的・機能的影響を解明する』ことを本研究の具体的な目的とし、睡眠呼吸障害に対する新規治療法となり得るかを検討する。
育種上重要な遺伝子機能解明のための新たな変異創成法の開発

育種上重要な遺伝子機能の効果的解明のため、相同組換えによる遺伝子ターゲティングやトランスポゾンを用いた遺伝子タギングなどの逆遺伝学的変異導入法の関連手法の開発を試みた。遺伝子ターゲティング関連ではコンディショナル・ノックアウト法やsubtle変異導入法の開発を試み、内在性DNAトランスポゾンnDart1を利用したタギングの最適化を念頭に転移活性の制御機構解明を図り、さらに得られた変異体の解析も行った。本研究で扱う新たな変異創成法とは、逆遺伝学的変異導入法のことであり、塩基配列が明らかにされた生物に於いて、目的とする遺伝子の生体内における機能を解析するために、目的遺伝子内に選択的に変異を導入することであり、この手法は、先ず変異体を分離して原因遺伝子を同定する手法とは逆の手順を踏んでいることから、逆遺伝学的手法と呼ばれ、相同組換えによる遺伝子ターゲティングやトランスポゾンを用いた挿入変異などが含まれる。我々はポジティブ選抜マーカーとネガティブ選抜マーカーを用いて、世界に先駆けて逆遺伝学的変異導入に係わるイネの相同組換えによる遺伝子ターゲティングに成功し、複数の目的とする遺伝子内にポジティブ選抜マーカーを組込んだ稔性ある遺伝子破壊株であるノックアウト改変体を得ることができたが、中にはノックアウト改変変異体が致死的なために遺伝子機能を詳細に解析できない場合なども観察された。それ故、育種上重要な遺伝子機能の解明には、遺伝子破戒によるnull変異の導入だけでは充分ではなく、育成中に標的遺伝子の発現をOffからOn、もしくはOnからOffへ変換できるコンディショナル・ノックアウトの開発や目的とする点変異だけをピンポイントで導入する大変クリーンなsubtle変異導入法の開発が必要不可欠である。本年度は本研究の初年度にあたるので、形質転換などに必要な設備備品を整えて稼働させ、予備的な形質転換を実施し、さらに本研究に必要な一連の導入ベクターも構築中である。本研究で扱う新たな変異創成法とは、基本的には逆遺伝学的変異導入法のことであり、塩基配列が明らかにされた生物に於いて、目的とする遺伝子の生体内における機能を解析するために、目的遺伝子内に選択的に変異を導入することであり、この手法は、先ず変異体を分離して原因遺伝子を同定する手法とは逆の手順を踏んでいることから、逆遺伝学的手法と呼ばれ、相同組換えによる遺伝子ターゲティングやトランスポゾンを用いた挿入変異などが含まれる。我々はポジティブ選抜マーカーとネガティブ選抜マーカーを用いて、世界に先駆けて逆遺伝学的変異導入に係わるイネの相同組換えによる遺伝子ターゲティングに成功し、複数の目的とする遺伝子内にポジティブ選抜マーカーを組込んだ稔性ある遺伝子破壊株であるノックアウト改変体を得ることができたが、中にはノックアウト改変変異体が致死的なために遺伝子機能を詳細に解析できない場合も観察された。それ故、育種上重要な遺伝子機能の解明には、遺伝子破戒によるnull変異の導入だけでは充分ではなく、例えば育成中に標的遺伝子の発現をOffからOnへ変換できるコンディショナル・ノックアウトの開発などが必要不可欠である。このような目的の為に、P1ファージ由来の部位特異的組換え系であるlox-Creを用いて、ポジティブ選抜遺伝子をlox配列で挟まれた遺伝子ターゲット改変カルスに、誘導可能なCre遺伝子や選抜遺伝子がlox配列で挟まれたベクターを導入して、Cre遺伝子を一過的に誘導し、標的遺伝子内の選抜遺伝子と共に再導入したCre遺伝子や選抜遺伝子も同時に除くことを試みている。さらに、従来我々が手掛けてきたイネの内在性DNAトランスポゾンによる遺伝子タギングについても、育種上重要な遺伝子の機能解明を目指す。本研究で扱う新たな変異創成法とは、基本的には逆遺伝学的変異導入法のことであり、塩基配列が明らかにされた生物に於いて、目的とする遺伝子の機能解析のため、目的遺伝子内に選択的に変異を導入することである。この手法は、先ず変異体を分離して原因遺伝子を同定する手法とは逆の手順を踏んでいることから、逆遺伝学的手法と呼ばれ、相同組換えによる遺伝子ターゲティングやトランスポゾンを用いた挿入変異などが含まれる。我々はポジティブ選抜マーカーとネガティブ選抜マーカーを用いて、世界に先駆けてイネの相同組換えによる遺伝子ターゲティングに成功し、複数の目的とする遺伝子内にポジティブ選抜マーカーを組込んだ稔性ある遺伝子破壊株であるノックアウト改変体を得ることができたが、中にはノックアウト改変変異体が致死的なために遺伝子機能を詳細に解析が容易ではない場合もあった。それ故、育種上重要な遺伝子機能の解明には、遺伝子破戒によるnull変異の導入だけでは充分ではなく、例えば育成中に標的遺伝子の発現をOffからOnへ変換できるコンディショナル・ノックアウトの開発が必要である。そこで、P1ファージ由来の部位

特異的組換え系であるlox-Creを用いて、ポジティブ選抜遺伝子をlox配列で挟まれた遺伝子ターゲット改変カルスに、エストラジオール処理により誘導可能なCre遺伝子で選抜遺伝子やCre遺伝子もlox配列で挟まれたベクターを導入し、Cre遺伝子を一過的に誘導し、標的遺伝子内の選抜遺伝子と共に再導入したCre遺伝子や選抜遺伝子も同時に除き、相同組換えによりコード領域に導入した点変異と非コード領域に34 bpのlox配列だけをゲノム上に残したイネの作出に成功した。さらに、イネの内在性DNAトランスポゾンによる遺伝子タギングについても、育種上重要と思われる遺伝子の機能解明を行った。平成23年7月と9月の2度にわたり温室が故障したため。24年度が最終年度であるため、記入しない。遺伝子ターゲティングに係わるコンディショナル・ノックアウトについては、引続き部位特異的組換え系lox-Creを利用して、選抜遺伝子やCre遺伝子を除いた稔性イネの作出と解析を目指す。遺伝子タギングについても、引続き育種上重要な遺伝子の機能解明を図る。
水辺環境を中心とした環境政策

日本各地および近隣国である中国へも出かけていって、水辺に関わる調査をし、水環境施策について考えた。調査は伝統的な水の使用法から、現在の使い方まで、ヒヤリング等を通じて丁寧な聞き取りと、調査票を使った調査をした。現在、ダムなどによって水を蓄え、それを上水道として使用するといういわゆる近代化の波が押し寄せ、それに対して湧き水などの淡水は放置されつつある。この淡水の課題を後の研究成果で述べるように詳しく調査した。そしてユーザビリティ論という政策論を提示した。近い将来、世界的に淡水が逼迫し、深刻な課題となるであろうという予想のもとに、人びとの水(淡水)利用実態を分析しようとするのが、この研究の政策的な関心である。もっとも、この研究は上記の関心をもう少し絞って、コミュニティがどのように水利用と関わっているのかという地域の住民の日常の水利用を考えようとしている。その理由は、地域住民の水利用の実態とその考え方が、水政策に影響を与える側面が少なからずあると想定するからである。本年度は、水利用に必要な文献データの収集と、現地での調査を行った。現地調査は中国と沖縄の調査を中心として、それと琵琶湖など、すでに本研究の代表者が長年調査をしている地域の調査とを行った。本年度はとくに、湧き水の調査と、調査の過程で、森林のあり方が意味を持つことを学び、森林と湧き水との関係についても調査の項目に加えていった。調査内容は、過去の水利用の実態を聞き取りで、編年的に追っていくようにした。コミュニティを単位として、コミュニティ全体で、どのような水利用のルールがあり、そのルール下で、人びとはどのような利用をしていたのかを知ろうとした。また、そのルールの基礎に、山や水に対する信仰があるので、山の神や水の神についての信仰についても調査をした。それに加えて、水利用の実態を左右する水質についても、かなり丁寧な測定をした。具体的にはとくにCODおよびリンとチッソの測定をした。コミュニティ内の小さな湧き水や溝や、小川において、水質を調査し、その水質と水利用の実態、およびその地区ごとのルールを知るためである。これらを総体として理解することで、地域での水利用の今後のあり方を検討してみたいと思っている。沖縄をはじめとして、長野県小諸市など日本国内の水辺に関わる地域を訪れフィールド調査を行った。伝統的な湧き水の利用実態、またその水の水質の測定などを行った。集中的に調査をした湧き水施設は、南城市垣花の樋川および同市の仲村渠樋川および糸満市の嘉手志川である。この水辺環境を政策的に考える場合、我が国においてはとりわけ地域コミュニティが大切な役割を果たすので、調査期間中は、とりわけ環境の保全とコミュニティのあり方について意をそそいだ。その成果の一つとして、形としては一般向けであるが、新書の形の書物も出版することができた。ただ、そこでは昔年の関心であるまちづくりについて、かなりの頁を割くことにはなった。沖縄の研究を通じて、湧き水施設の利用の実態を詳しく調査し、また、その結果に基づいて、地元のコミュニティでどのような使い勝手のよさ(ユーザビリティ)を確立できるものなのかを検討した。人間工学で発達したユーザビリティの考え方を導入し、地域の環境的問題に適用しやすいようにモデルを変形して、それで分析を行った。現在、沖縄では上水道が普及していっているが、それは北部のヤンバル地方のかなりの数のダム建設による森林破壊を前提としているので、なんとかそれに代わる政策をつくる必要があるのである。その政策について、当該年度に学会報告を行ったが、それはまだペーパーの形では公表できず、翌年に学会誌に公表する予定である。
TNFα及びγIFN遺伝子導入腫瘍細胞を用いた癌のワクチン療法に関する基礎的研究

1.マウス乳癌細胞株(FM3A)へのTNFα遺伝子の導入.1)TNFα遺伝子はC3H/Heマウスの脾臓より分離したリンパ球をcon-Aにて24時間刺激した後,total RNAを抽出しRT-PCRにて個々の遺伝子を増幅,T-vectorにsubcloningした後,再びRSV-LTRをプロモーターにもつ発現ベクターRSV.5neoにsubcloningし,RSV.5-mTNFを作成した.2)上記の作成遺伝子をFM3A細胞に電気穿孔法を用いて遺伝子導入を行なった後,G418にて選択,cloningして導入遺伝子の発現レベルをノーザンブロット法,FACS解析,ELISAを用いて評価し,導入遺伝子が高発現を示すクローンFM3A-mTNFを選別した.1)FM3A-mTNF細胞とFM3A細胞はin vitroでの細胞増殖速度に差は認めなかったが,FACS解析においてFM3A-mTNF細胞は明らかにMHC class I抗原の発現上昇を認めた.2)C3H/Heマウスに1x10^6個のFM3A細胞を皮下接種し,その後後8日目から14日目にかけて総計1x10^7個のマイトマイシン処理したFM3A-mTNF細胞を腹腔内に注射したところ,最初に皮下接種した腫瘍の増大速度には変化なく,ワクチン効果は認められなかった.以上の実験より,癌細胞株にTNFα遺伝子を導入することによりMHC発現増強等による癌免疫応答を賦活できることは確認できたが,ワクチン療法としての効果はさらなる検討を要すると考えられた.1.マウス乳癌細胞株(FM3A)へのTNFα遺伝子の導入.1)TNFα遺伝子はC3H/Heマウスの脾臓より分離したリンパ球をcon-Aにて24時間刺激した後,total RNAを抽出しRT-PCRにて個々の遺伝子を増幅,T-vectorにsubcloningした後,再びRSV-LTRをプロモーターにもつ発現ベクターRSV.5neoにsubcloningし,RSV.5-mTNFを作成した.2)上記の作成遺伝子をFM3A細胞に電気穿孔法を用いて遺伝子導入を行なった後,G418にて選択,cloningして導入遺伝子の発現レベルをノーザンブロット法,FACS解析,ELISAを用いて評価し,導入遺伝子が高発現を示すクローンFM3A-mTNFを選別した.1)FM3A-mTNF細胞とFM3A細胞はin vitroでの細胞増殖速度に差は認めなかったが,FACS解析においてFM3A-mTNF細胞は明らかにMHC class I抗原の発現上昇を認めた.2)C3H/Heマウスに1x10^6個のFM3A細胞を皮下接種し,その後後8日目から14日目にかけて総計1x10^7個のマイトマイシン処理したFM3A-mTNF細胞を腹腔内に注射したところ,最初に皮下接種した腫瘍の増大速度には変化なく,ワクチン効果は認められなかった.以上の実験より,癌細胞株にTNFα遺伝子を導入することによりMHC発現増強等による癌免疫応答を賦活できることは確認できたが,ワクチン療法としての効果はさらなる検討を要すると考えられた.
リンパ球大量培養法の開発とその応用

本計画は,担癌患者末梢血リンパ球を固相化CD3刺激によって大量に増殖し,臨床応用するところから出発した.大量培養法を確立し,13症例について,39回の培養を行い,うち37培養を用いて細胞移入療法を施行した.培養法および培養経過を報告書に示した.また,症例一覧,治療内容と臨床経過および副反応の推移を報告書に示した.10^<10>前後またはそれ以上の移入ができた担癌8症例について,少なくとも一時的に効果があったと考えられる5例のほか,併用他療法が奏功した1例があった.症例は雑多であったが,PRの得られた症例6(MTD)は治療計画のモデルになると考えられた.すなわち,局所療法,高活性NK,ついでCTLの移入というダイナミックな考え方である.当初はT細胞の増殖を期待したが,固相化CD3で刺激したにもかかわらずNK細胞が増殖することがしばしばあり,強い活性があった.ヒト血清中に含まれるIgGを介した,NKの活性化によると考えられた.固相化IgG刺激によるNKの選択的活性化法の開発に着手した.微量の固相化IgGによりNKは選択的に粘着性を獲得したため,これをNKの精製に応用した.この刺激でNKは活性化し,一部が増殖一部はapoptosisに陥った.刺激培養条件の詳細な検討が必要であった.活性化NKはCD16を喪失し,1dcにはCD25を強く発現した.これと細胞死を指標として刺激培養初期の条件を検討した.IL2が必須であること,培養初期にT細胞の共存が必要であること,Moの残存は活性化と細胞死の両面の効果があること,刺激後期にNKを分離回収してIL12を添加することによってMoの活性化効果のみを代替えできることなどが判明し,これらの条件を満たす刺激培養法を開発した.これにより高純度NKの1000倍の増殖が得られた.固相化IgG刺激法の主要部分は平成9年度科研費によったため,ここでは概略のみを示した.本計画は,担癌患者末梢血リンパ球を固相化CD3刺激によって大量に増殖し,臨床応用するところから出発した.大量培養法を確立し,13症例について,39回の培養を行い,うち37培養を用いて細胞移入療法を施行した.培養法および培養経過を報告書に示した.また,症例一覧,治療内容と臨床経過および副反応の推移を報告書に示した.10^<10>前後またはそれ以上の移入ができた担癌8症例について,少なくとも一時的に効果があったと考えられる5例のほか,併用他療法が奏功した1例があった.症例は雑多であったが,PRの得られた症例6(MTD)は治療計画のモデルになると考えられた.すなわち,局所療法,高活性NK,ついでCTLの移入というダイナミックな考え方である.当初はT細胞の増殖を期待したが,固相化CD3で刺激したにもかかわらずNK細胞が増殖することがしばしばあり,強い活性があった.ヒト血清中に含まれるIgGを介した,NKの活性化によると考えられた.固相化IgG刺激によるNKの選択的活性化法の開発に着手した.微量の固相化IgGによりNKは選択的に粘着性を獲得したため,これをNKの精製に応用した.この刺激でNKは活性化し,一部が増殖一部はapoptosisに陥った.刺激培養条件の詳細な検討が必要であった.活性化NKはCD16を喪失し,1dcにはCD25を強く発現した.これと細胞死を指標として刺激培養初期の条件を検討した.IL2が必須であること,培養初期にT細胞の共存が必要であること,Moの残存は活性化と細胞死の両面の効果があること,刺激後期にNKを分離回収してIL12を添加することによってMoの活性化効果のみを代替えできることなどが判明し,これらの条件を満たす刺激培養法を開発した.これにより高純度NKの1000倍の増殖が得られた.固相化IgG刺激法の主要部分は平成9年度科研費によったため,ここでは概略のみを示した.癌のリンパ球移入療法は,T4によるサイトカイン産生や,タ-ゲティングの基礎研究を志向しているが,本質的問題が別の所にある.移入細胞の腫瘍局所での血管外遊出,腫瘍細胞との最初の非特異的接着,腫瘍細胞のMHCによる自己抗原の提示が挙げられる.移入療法に合わせて,炎症性サイトカインの局所高濃度を図り,接着分子を誘導すれば,強力な手段となろう.1ー2.【Lyの非特異的活性化と増殖培養】固相化CD3刺激法では,まず,T4細胞が増殖し2次的にNKが増殖活性化する.非特異的活性はNKの頻度と強く相関しT3とは負の相関であった.重回帰分析ではT8その他の要因の寄与は小さかった.本法により,NKの著名な増殖と,古典的LAKの20ー30倍の活性が得られた例では臨床的にも秦効した.今後は,NK細胞の増殖と活性強化を目指したい.臨床使用可能なIL2亜至適量に,臨床的濃度のIFNーα併用して顕著な活性の回復が得られた.TCRγδ細胞は増殖してこなかった.LFAー1は,腫瘍細胞のICAMー1と関連して検討したい.3.【Lyの特異的活性化】炎症性サイトカインによる腫瘍細胞のclassI抗原の増強,腫瘍を含めた広範囲な細胞でのclassIIの誘導が報告されている.これによる自己抗原の提示は,T細胞による腫瘍の直接的認識と破壊の段階で重要な概念となろう.

次年度課題を勘案した株化細胞の検討では,classIは9/15株で発現,うち,胃癌由来では5/6,大腸癌0/2に発現,ClassII発現は1/15株であった.炎症性サイトカインの意義を見るモデル作成を進めている.大腸癌の原発巣からの初代培養が全例で成功するようになった.応用上,2代目への植継ぎが現在の課題である.【臨床応用】移入療法を施行した13例中5例が評価対象となり,うち,2例でBRM的効果,局所炎症を惹起し得た大腸癌肝転移で著効.慢然と移入した2例は無効であった.また,腹腔内移入時に末梢Lyからの著名な動員が見られ,局所環境への操作が重視された.肝転移中心の計画に変えて施行中である.[リンパ球培養法の開発]T細胞の増殖法はほぼ確立し,増殖の悪い担癌患者でも開始時の粘着細胞の大部分除去により増殖性は著名に改善した。一方,固相化CD3刺激培養細胞の強力な活性は,二次的に増殖するNK-LAKによることが判明した。活性は古典的LAKより一桁高く顕著に増殖するが出現は不定であり頻度も最高数十%程度であった。この細胞の意図的な増殖法を開発している。(1)培養開始時の血清が重要で,諸報告と異なり,ヒト血清でNKが,FCSでTが増殖した。(2)ICAM-1を発現し,class Iを発現していないK562に刺激効果があった。(3)固相化FN,リンパ球培養上清は無効であった。(4)IL-1/6共刺激によるNKのIL-2R誘導を検討中である。(5)培養1週の自己Mφに,強力なNK刺激作用があり,長期培養Lyで全どT4となり,増殖せず,活性の全く無いものからもNKが選択的に増殖して過半となり,強い活性が回復した。(6)これに用いるMφの作成を検討した。末梢血粘着細胞の培養開始時の血清濃度と以後のpHが重要であり,よい条件で低刺激下で維持すれば1週以内なら,IFT-γの添加で任意の時期にMφへの分化が可能となった。Mφ刺激Ly法を開発中である。[癌細胞の培養]ICAM-1/class I発現頻度別の株化細胞パネルを作成し保持している。新培養株は継代ごとに凍結保存している。上記(6)の細胞を用いた,接着分子の研究に供する。[臨床応用]本年度は移入療法を14回実施し,移入療法の有用性が確認されたが,IL-2が高価なものとなり,従来のままでは臨床応用が困難となっている。培養法の効率化,質的改善,局所適用などの努力が一段と要求されている。また,熊谷らの,ICAM-1/LFA-1,CD44発現による転移臓器の相違の報告からも臨床応用では接着分子が軽視できない。江川らの自家腫瘍免疫におけるallo抗原の意義,内田らの,NK活性,TIL,自家腫瘍による被刺激性と相関せずに予後と相関するATK活性など,移入療法上配慮すべき問題点は複雑化している。癌の細胞移入療法を行ってきた.固相化CD3刺激法で末梢血リンパ球を培養すると強力な細胞障害活性が得られ,時に古典的LAK細胞の20-30倍の活性に達した.この活性はCD16^+の頻度とのみ強く相関し,NK細胞が担うと考えられた.10日以上大量培養した31培養のうち,NKが700-6000倍に増殖した例が7培養あったが,このような増殖は他の方法では得難く,NK細胞の活性化とfeederとしてのT細胞の存在が注目された.そこで,意図的にこの状況を成立させる目的で,選択的増殖の条件を検討した.使用血清に選択的増殖効果があった.
膵癌根治のための新しい診断・治療

1.膵癌の新しい特異的診断法の開発:(1)膵癌切除標本から培養癌細胞株6株を樹立し,膵癌細胞に特異的に発現する膜蛋白と分泌蛋白の遺伝子クローニング(SST変法)を行った.新規遺伝子を同定し,膵癌の特異的診断法開発へむけ研究を展開している.(2)膵癌発生母地と考えられる膵管系幹細胞を同定することを目的として,膵管不完全結紮モデルにおいて,膵発生過程で必須の分化誘導因子であるPDX-1発現を検討した.過形成性膵管上皮にPDX-1発現細胞が存在し分化増殖能を有することを証明したので,臨床検体の異型膵管上皮でのPDX-1発現を検討中である.2.胎児膵での原始膵管細胞からの分化増殖機構:(1)ヒト胎児膵と膵癌切除標本でのアポトーシス関連因子の発現を検討し,無秩序な細胞増殖を呈する膵癌細胞と,秩序だった細胞分化増殖を示す胎児膵におけるアポトーシス関連因子発現様式の共通性を明らかにした.(2)マウス胎生膵原基3次元培養法を確立し,(1)膵原基単独培養では分化が見られない,(2)周辺マトリックス添加培養により成熟膵へ分化,(3)人工的ゲル環境培養下では膵原基が導管系細胞だけに分化,(4)アクチビン添加により内分泌膵も形成されることを明らかにした.現在,膵原基単独培養とゲル環境培養下でのmRNA発現をDD法で解析して新規の分化増殖因子を探索中である.3.膵癌の腫瘍血管新生と治療法開発:(1)膵癌切除検体の解析から,MT-MMP-1・活性型MMP-2・VEGF・PD-ECG・CXCR-4などの分子が膵癌腫瘍血管増殖因子として,METH-1が増殖抑制因子として血管新生の制御に関与していることを明らかにした.(2)膵癌脾注肝転移マウスモデルでの治療実験では,CXCR-4競合的阻害剤投与では肝転移抑制ないが,MMP活性化阻害剤投与で肝転移巣形成の有意の抑制が認められた.1.膵癌の新しい特異的診断法の開発:(1)膵癌切除標本から培養癌細胞株6株を樹立し,膵癌細胞に特異的に発現する膜蛋白と分泌蛋白の遺伝子クローニング(SST変法)を行った.新規遺伝子を同定し,膵癌の特異的診断法開発へむけ研究を展開している.(2)膵癌発生母地と考えられる膵管系幹細胞を同定することを目的として,膵管不完全結紮モデルにおいて,膵発生過程で必須の分化誘導因子であるPDX-1発現を検討した.過形成性膵管上皮にPDX-1発現細胞が存在し分化増殖能を有することを証明したので,臨床検体の異型膵管上皮でのPDX-1発現を検討中である.2.胎児膵での原始膵管細胞からの分化増殖機構:(1)ヒト胎児膵と膵癌切除標本でのアポトーシス関連因子の発現を検討し,無秩序な細胞増殖を呈する膵癌細胞と,秩序だった細胞分化増殖を示す胎児膵におけるアポトーシス関連因子発現様式の共通性を明らかにした.(2)マウス胎生膵原基3次元培養法を確立し,(1)膵原基単独培養では分化が見られない,(2)周辺マトリックス添加培養により成熟膵へ分化,(3)人工的ゲル環境培養下では膵原基が導管系細胞だけに分化,(4)アクチビン添加により内分泌膵も形成されることを明らかにした.現在,膵原基単独培養とゲル環境培養下でのmRNA発現をDD法で解析して新規の分化増殖因子を探索中である.3.膵癌の腫瘍血管新生と治療法開発:(1)膵癌切除検体の解析から,MT-MMP-1・活性型MMP-2・VEGF・PD-ECG・CXCR-4などの分子が膵癌腫瘍血管増殖因子として,METH-1が増殖抑制因子として血管新生の制御に関与していることを明らかにした.(2)膵癌脾注肝転移マウスモデルでの治療実験では,CXCR-4競合的阻害剤投与では肝転移抑制ないが,MMP活性化阻害剤投与で肝転移巣形成の有意の抑制が認められた.1.膵癌診断のための胎児膵と膵癌に発現する蛋白の同定膵発生の中期から後期の標本を採取し,時間特異的に発現する分化誘導因子を検討した。CaR(カルシウムセンシング受容体),アクチビン,βセルリン等の有意の発現が胎生期膵と膵癌組織で確認された.分化のポテンシャルの高い膵導管系幹細胞を同定しこれらの因子の発現との関連を今後研究する.また,胎児性抗原であるCEAのmRNAのtwo-step RT-PCR法を確立し,胎児膵で検討するとともに,臨床への応用を図った.その結果,膵癌患者における末梢血及び門脈血中の微小膵癌細胞を高感度で検出することが可能となり,臨床での膵癌診断のうちでも,化学放射線療法の治療効果や膵癌根治的切除後の再発予測の判定に応用できることが判明した.2.膵癌の腫瘍血管新生とその機序膵癌切除検体の解析から,基底膜破壊酵素であるMMP-2発現と腫瘍の膵周囲浸潤・リンパ節転移・遠隔転移能が密接に相関することが判明した.また膵癌組織の血管内皮