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「個人の尊重」を解釈基準とすることによる、社会権諸条項の解釈の変革

「個人の尊重」やその自律、あるいはそれと密接な関係を有するドイツ連邦共和国基本法1条の「人間の尊厳」について、その理解を深める為に、これらに関する日本およびドイツの文献を研究し、その理解の進化を図った。その成果の一部が、これらと間接的に関係する論文である「『故人の尊厳』保護」及び「人間像の転換?」である。そして、「生存権」の保障の最も典型的な具体化である「生活保護」について、その法制度と解釈・運用の実態について研究を行った。そしてその問題点を克服するには、正に憲法25条の「生存権」を13条の「個人の尊重」を解釈基準として捉えなおす必要があると確信し、それを表したのが論文「生活保護と『個人の尊重』-受給者の自由とその『人間像』の問題-」である。そこでは具体的には、生活保護受給者の自由の制限と、野宿者の生活保護からの排除の問題を取りあげた。これにはとりわけ、これまでも私が憲法13条に基づいて批判してきた、一定の「人間像」とそれによる自由の制限の問題が典型的に現れているからである。即ち生活保護受給者は、一般の人には極めてありふれた行為でさえ制約されることがあるが、それは憲法25条の「最低限度の生活」からイメージされる人間像に基づいていることを明らかにした。そして野宿者の生活保護からの不当な排除も、保護機関の想定する被保護者に対する人間像に起因し、それが生活保護を受けるに至る生活困窮者の生き方を実質的に規制していることを示した。そして、このような問題を克服する為に、生存権、ひいては社会権が「自由の実質化」を目的とするものであるという原点に立ち戻り、憲法25条の背後には13条の「個人の尊重」が存在するという憲法規範の重層構造を明らかにした。そしてこの構造からすれば、生活保護受給者、さらに一般的に社会保障を受けている人も、その保障の下で個性ある生活を送ることを憲法は要請しており、上記のような規制や排除は許されないことを論じた。この論文により、社会権のうち生存権については、その背後にある「個人の尊重」の存在を明確化することによって、その解釈の変革の方向性は示せたと思う。本年度は、日本国憲法の規定する社会権のうち、26条の「教育を受ける権利」について、人権の中核となる思想を表す憲法13条の「個人の尊重」を解釈基準として捉えなおす研究を行った。またその前提として、「個人の尊重」やその自律、あるいはそれと密接な関係を有するドイツ連邦共和国基本法1条の「人間の尊厳」について、これらに関する日本およびドイツの文献を研究し、その理解の進化を図った。その成果の一部が、これらに関係する論文である「人間像の転換?」、「無期限の保安拘禁の合憲性」及び「日本国憲法における実定規範としての『人間の尊厳』の位置づけ」である。このうち「人間像の転換?」では、「個人の自律」について、これを憲法改正等により実定法の文言に取り込むことは、「自律した個人」が既に存在するかのような現実隠蔽的機能を帰結し、自律の前提条件を等閑視させるイデオロギーとなるがゆえに回避すべきことを説いた。また「無期限の保安拘禁の合憲性」の中では、期限のない保安拘禁は「人間の尊厳」に反しないというドイツ連邦憲法裁判所の判決を検討した。また「日本国憲法における実定規範としての『人間の尊厳』の位置づけ」では、あくまでも「個人の尊重」を中心とする人権体系を維持したまま、日本国憲法に「人間の尊厳」を実定法上取り入れる場合の、当該規範の根拠条文やその機能を明らかにしたものである。日本国憲法26条の解釈におけるこの問題点を克服する為には、原理的には学習権の主体が教育内容を選択できることを想定し、未成年等の場合例外として成長段階等に応じた選択権の代位を認めるという構造を採るべきだと考える。
共感性の系統発生

本研究では3つの項目を検討した。1つは、共感性の動物モデルの確立であった。共感性を2個体間の情動とその一致性によって4分類し,マウスを対象にそれらの可否を検討した。2つめは、共感性の機能と生態因の検討であった。鳥類および霊長類の比較検討によって、協同繁殖と一夫一妻が、共感性進化の生態因であることを示唆した。3つめは、共感性の認知基盤の検討であった。高次共感を霊長類および食肉類で比較検討し、サルおよびイヌの第三者に対する情動評価能力を見出した。これら3項目の研究によって、共感性がヒト以外の動物においても協力性と随伴進化し、高次認知はそれとは独立に進化する可能性を示唆した。(1)マウスの情動表出の弁別刺激効果については、社会的選好試験を用い、マウスが痛覚状態より非痛覚状態のラットの表情を好むこと、さらに、オペラント弁別を用い、これらの視覚弁別が可能であることを明らかにした。鏡への選好を調べた補足実験では、鏡への選好が見られたが、実際のマウスとの選択場面では選好が見られなかった。体温変化を指標とした共感の測定については、集団ストレス条件によるストレス軽減、不公平条件(自分だけ拘束されケージメイトは無拘束)によるストレス増強を明らかにした。しかし、ケージメイトは拘束され、自分は無拘束という不公平条件ではストレスは見られなかった。(2)フサオマキザルとイヌにおける共感性関連行動の分析では、フサオマキザルは隣室にいる仲間に自身の食物を分与することがあるが、その頻度は低く、またほぼ価値の低い食物に限られていることを示した。またイヌは第3者間のやり取りから非協力的なヒトを回避するという感情的評価をすることを示した。(3)カラス2個体対戦場面における身体同期性は見られなかった。しかし、劣位個体が服従情動反応を呈する個体間距離が、再遭遇とともに、延長する現象を見出し、情動伝搬空間の可塑性を検証する課題を構築しつつある。集団下における慰め行動の発達検証について、若鳥には見出されず、成鳥との比較データを取得し終えた。マウスについては以下5点を明らかにした(1)これまで不公平嫌悪を拘束というネガティブな状態で確認してきたが、食物の大小というポジティブな状態でも確認することができた。(2)メタンフェタミン投与個体が他個体に持つ強化効果の共通経験依存性を条件性場所選好で認めた。すなわち、被験個体が事前にメタンフェタミン投与経験がある場合にのみ強化効果が認められた。(3)マウスが交尾、闘争のビデオに選好を示すことがわかった。闘争については順位の情報になる可能性が考えられる。(4)BTBRの導入、繁殖に成功し、社会的順位、鏡選好についてはすでに結果を得ており、現在視覚の心理物理学の実験を遂行中である。(5)神経ペプチド、オキシトシンの強化・報酬効果について、マウスを被験体として条件性場所選好および条件性社会選好の手続きを用いて検討し、オキシトシンが雌マウスにおいて同種他個体への強化効果を持つことを明らかにした。霊長類ではフサオマキザルの積極的な食物分配を検討したが、肯定的結果は得られなかった。イヌの第三者的評価ならびに他者の行為の理解に及ぼす自己経験の効果に関しては肯定的結果を得た。鳥類では,援助行動のモデルとして闘争後宥和交渉をカラス若鳥集団について解析した。結果,当該の交渉は見出されず,若鳥個体間に協力関係がないことと矛盾しない結果が得られた。また,糞中コルチコステロンを計測し若鳥間の順位とストレスの関係を調べたところ,オスは上位ほど高ストレスで,メスは下位ほど高ストレスという性的逆相関という興味深い結果が得られた。渡辺は、マウスの共感性について検討した。1餌の不公平嫌悪について、体表温指標ではストレス誘発性高体温が確認されたが、行動指標では餌を摂取しているケージメイトへの選好がみられた。これらの同時検討を行った結果、両者が同時生起している興味深いデータが得られた。2マウスの援助行動を複数条件で検討した。ラットの先行研究と異なり、マウスは明白な援助行動を示さなかった。3薬物投与個体の強化効果はハロペリドールによって拮抗されなかったため、オピエート系の関与が考えられる。4オキシトシンが雌間の他個体選好を促進する効果があることを見出した。5自閉症モデルBTBRマウスについて、視力が良いこと、優劣順位が不安定であること、刺激間の時間的予測を要する学習に障害があることを示唆する結果を得つつある。藤田は、霊長類とイヌの共感性関連行動を分析した。フサオマキザルとリスザルを対象に、同種個体/異種個体への給餌者に対する選好を調べた。その結果、フサオマキザルでのみ同種個体に給餌した個体への選好傾向がみられた。フサオマキザルやイヌで既に見出した他者に冷淡な演技者の回避という第三者評価に加え、リスザルでは他者に親切な者への好みが示されたことになる。これとは対照的に、イヌは他者への援助者に対する選好は示さなかった。伊澤は、カラスの共感性関連行動について調べた。昨年度まで、若鳥の異性・同性個体間では、給餌や羽づくろいなど利他行動に互恵性がないことを見出したが、本年度は、つがい個体間では互恵性があることを見出した。

これは、社会関係・発達と利他行動に随伴性があることを示唆する。若鳥オス間の相互羽づくろいが第三者メスの存在によって促進されることを支持するデータが一部得られた。2個体間の優劣関係形成に伴って個体間距離が伸長することを見出し、情動生理反応の検討に向けた心電図計測と自律神経系薬理作用の評価系を立ち上げた。個別の実験操作内容については計画からの変更や修正が一部あったものの、検討事項についてはおおむね計画通りに進んでいる。進展に伴って計画以上の新たな検討も進んでおり、自閉症モデルマウスの社会行動の検討による発達班との接合の試みや、海外機関との共同研究による類縁種(デグー、トンケアンマカク、オナガなど)との比較研究についても結果が得られつつある。渡辺は、マウスの共感性について検討した。(1)不公平嫌悪の行動指標とSIH(stress-induced hyperthermia)の同時計測:サーモグラフの特性を生かし行動とSIHの同時計測を行った結果、社会的不公平はSIHを生じさせるが、行動選好も引き起こした。後者は情報価の強化効果によると考えられる。(2)救援行動:国際共同研究先であるライプニッツ研究所でデグーでの救援行動を実験検討した。渡辺が既に所属機関で実施したマウス実験と同様に、明白な救援行動はみられなかった。このことはげっ歯類の救援行動が限定的であることを示唆する。(3)共通経験の強化効果:累進投与法(progressive dosing)による用量-反応曲線の迅速測定法を開発し、メタアンフェタミン強化効果の社会的促進の用量-反応曲線をえた結果、社会的促進はpotencyの促進であることが分かった。(4)向社会行動:国際共同研究先であるナンテール大学でのモルモット、カピパラ実験に等価な実験をマウスで行ったところ、個体差が大きく、個体数を追加し実験継続している。(5)共感のおよぶ範囲:マウスの表情画像のオペラント弁別を行い、これに成功した。さらに多種の表情の選好実験をマウスとヒトで行い、現在解析中である。藤田は、フサオマキザルとイヌの共感性を分析し、また、ネコの第三者評価や嫉みを明らかにした。トンケアンマカクの第三者評価について、ストラスブール霊長類研究所のMeunier博士と共同研究を継続している。試験中のイヌの視線計測技術を愛媛大の十河博士と共に確立しつつある。伊澤は、カラスの共感性について調べた。霊長類で報告されている向社会行動課題装置を鳥用に開発し、ウィーン大学をはじめ海外3機関において、カラス科複数種の比較研究を進めた。優劣形成場面における他個体の情動表出(優位シグナル)に対する感受性がオスとメスで異なるという情動感受性の性差を見出した。げっ歯類の救援行動の限定性や共感の及ぶ範囲などの新たな示唆や、海外機関との共同研究による種間比較研究についても結果が得られつつある。過年度までに見出していた集団下における薬物強化効果の社会的促進を、さらに検討する方法として累進投与法を開発した。この方法を用いることで、薬物強化効果の社会的促進が個体数依存的に生じることを見出した。
筋骨格モデリングソフトを用いた変形性膝関節症症例の手術前後における力学的動態解析

筋骨格モデリングソフトSIMM Gaitを用いて、内側型変形性膝関節症(膝OA)症例における、病期別および人工膝関節置換術(TKA)前後の膝関節周囲筋の動的筋機能を検証した。対象は、54例89膝の内側型膝OA症例、年齢・体格が一致したcontrol群15例、およびTKA前後で歩行分析を施行した47例74膝の内側型膝OA症例とした。術後平均経過観察期間は23.6ヵ月であった。上記症例に対してVicon370を用いて歩行分析を行い、VCMにて解析し、膝関節モーメントおよびパワーを求めた。膝関節周囲筋の筋電位を計測し、SIMM Gaitを使用して、個々の筋の収縮幅および筋力を算出した。膝OA症例における膝関節周囲筋の歩行中最大筋腱長および最大筋力の平均変動係数はそれぞれ1.02.5%、0.26.0%、級内相関係数は0.960.99、0.92.0.98であり、非常に高い信頼性を得た。内側型膝OA初期から膝伸筋の遠心性収縮が低下することにより、歩行中の膝における衝撃吸収作用が有意に低下していた。また、大腿二頭筋は膝伸展時の内反拮抗筋としての作用をも有し、内側型膝OA初期から立脚期の筋収縮幅が有意に減少し、内反拮抗作用が低下していた。衝撃吸収作用および内反拮抗作用の低下による膝内側関節面に加わる圧迫力の増加が、内側型膝OAの発症に関与している可能性が考えられた。TKA施行後、下肢前額面alignmentの改善に伴い、前額面の膝関節周囲筋の筋機能は改善していたが、膝伸筋の遠心性収縮が低下したままであり、歩行中の膝における衝撃吸収作用が有意に低下していた。また、SD FASTおよびDynamic pipelineを使用し、SIMMで作製した筋骨格モデルの慣性モーメント、ボディセグメントの質量、質量中心データを与えることにより、床反力や筋電波形を計測しなくても、関節モーメントやパワーを近似的に逆動力学解析により求めることが可能であった。変形性膝関節症(膝OA)症例と年齢をあわせたcontrol群の筋力測定、および歩行分析を行った。Hill type modelを用いた筋骨格モデリングソフト(SIMM Gait ; Motion Analysis Corporation, Santa Rosa, USA)を用いて、膝OA症例の病期別および人工膝関節置換術(TKA)前後における膝関節周囲筋の経時的筋収縮幅および筋力を計測した。膝OA症例における大腿二頭筋長頭の歩行中最大筋腱長の平均CVは2.0%(0.1-4.8)、ICCは0.97、最大筋力の平均CVは1.6%(0.2-4.7)、ICCは0.98であり、非常に高い再現性を得た。内側型膝OA初期症例では、膝関節・股関節周囲筋の筋力や関節位置覚の低下が見られ、荷重時における膝関節のscrew home movementが破綻し、膝内側顆部の支持機構の破綻を引き起こすことが、膝関節内側コンパートメントの変性をきたし、内側型膝OAの進行に関与していることが分かった。また、TKAを行なったことによる下肢alignmentの改善や疼痛の緩和、関節可動域の増加等だけでは前額面の動的筋機能は改善がみられても、矢状面での動的筋機能は早期に改善が得られなかった。現在Neptuneら(J Biomech Eng 1998)に準じて、サブルーチンソフトウェアDynamics Pipelineおよび機構解析ソフトウェアSD/FASTを用いて、変形性膝関節症症例の自転車こぎモデルを作製し、膝周囲筋の刺激(活動度)パターンを与えることにより、重力を考慮した筋-骨格モデルの順動力学解析を行っている。

また、SD FASTおよびDynamic pipelineを使用し、SIMMで作製した筋骨格モデルの慣性モーメント、ボディセグメントの質量、質量中心データを与えることにより、床反力や筋電波形を計測しなくても、関節モーメントやパワーを近似的に逆動力学解析により求めることが可能であった。
組織工学による３次元自己細胞由来心血管組織を用いた次世代型心臓手術技術の開発

細胞のみで構築する3次元化心臓血管外科組織構築法を開発した。主な血管の構成細胞である、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、繊維芽細胞を用い、各種細胞の懸濁液を混合させ、自己凝集現象である血管組織型スフェロイドを作成した。目的とする3次元形状とするため、組織体形成装置を独自に開発した。本装置を用いることにより細胞だけを3次元化させ比較的強度を持たせた心膜型(弁膜型)組織体、円筒形の血管型組織体を構築することに成功した。本手法は、きわめて簡便に細胞の凝集現象の、時間、空間的凝集能を制御して3次元組織を構築でる手法であり次世代の心臓血管外科領域の再生医療研究にきわめて有用と考えられる。近年のiPS細胞をはじめとした幹細胞研究や組織工学技術がめざましく発展し臨床応用へむけた研究開発が加速する中で、我々は自己の細胞のみで任意の形状の立体細胞構造体を構築する組織工学の新技術を開発してきた。本研究目的は、新規組織工学技術および幹細胞研究を心臓血管外科領域の手術に応用し、足場(scaffold)となるコラーゲンや生体溶解性素材すらも、含まない自己細胞のみで構成した組織による次世代型心臓血管外科治療方法の開発を目指す。期待される成果として、抗免疫性、抗感染等、従来の組織工学では未解決の問題をクリアーする心臓血管臓器再生技術の開発となると考えられる。平成25年細胞ソースの検討:1.細胞の培養条件の検討と組織構築に必要な適正スフェロイドの細胞選択、混合比率の決定。現在研究室ではヒト血管内皮、線維芽細胞、平滑筋細胞、ラット胎児初代心筋細胞、マウスES細胞由来心筋細胞などを大量培養しており培養条件はある程度確立している。2.適切なスフェロイドサイズ配合の決定:3次元培養は単一細胞のみの培養より複数の細胞を組み合わせたほうがより、タンパクの産生が向上することが知られているため細胞の混合比率や混合する細胞の種類を検討し、スフェロイド標本の免疫染色やウェスタンプロッティングなどでタンパク発現の解析を行い最もよい条件のスフェロイドを使用する。(例:血管内皮細胞:血管平滑筋細胞:線維芽細胞=1:3:4に配合、総細胞数は3X105など。)3.最適化した3次元パッチモデルの検討:3次元組織構築システムは現在九大で管理して共同使用してるが、将来的には本研究費と別予算で佐賀大学医学部に導入を検討している。本研究では低圧系の右心系への移植をまず考えているため厚みや強度などを検討してデザインを考える。現段階では大きさは1cm四方で、厚みは2mm程度と考えている。平成26年度は、ヒト細胞の血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、線維芽細胞を用いて、血管組織型スフェロイドを作成。このスフェロイドを効果的に3次元化させ、血管や、心膜、弁膜様の3次元構造体を作成するシステムを構築することに成功した。既存の細胞接着性が少なく、熱耐性が良好なPTFEのブロックを用いて、一時的に培養液内に半閉鎖的な空間を作成できるシステムを構築。培養器ないで24時間、最適化した大きさ、量のスフェロイドを精緻培養させると任意の面積の血管組織型パッチを作成できるシステムを構築した。また、本パッチは、培養液内で重しによる加重をかける事でその形状を維持したまま成熟培養できるシステムを構築することに成功した。さらには、血管組織型パッチは特に高価な機材を用いることなく、円筒形のつまり血管のようなチューブ状の構造を細胞だけで構築できるシステムを開発した。上記内容を、組織体形成装置、およびキットとして特許出願した。心臓血管外科本研究は、細胞のみを用いて、細胞が元来有する自己凝集現象であるスフェロイド形成、およびスフェロイドが生理学的・生物学的な活性・機能を維持させたまま融合しより3次元化した立体組織構造体を構築する過程を組織工学を用いてコントロールし、心臓・血管外科手術治療に応用できる手法を開発することにある。本年度は細胞のみで、弁膜症治療や、血管の修復に応用出来る強度のあるパッチ状組織構造体を作成すべく、3次元培養システムの開発を行った。3次元培養システムの構築に時間がかかったが、新規性のあるシステムの構築に成功した。組織学的な評価やタンパク解析が計画より遅れているが、合算すると順調に経過していると考えている。本年度の研究成果により、予定通り大きさ1cm前後、厚さ1mm程度の細胞のみで構築されたパッチ構造体が作成できた。刺激を与えて、形状を維持したまま培養出来るシステムを開発したため今後は、機能解析、強度解析を行いより最適化した、動物への移植可能な構造体を構築したい。

動物実験は当初犬を予定していたが、より安価で、ヒト細胞組織も移植可能な、ヌードラットの右心房の心房壁を本構造体で置換してデータを重ね、すこしずつ大動物へ移行していく方針としたい。機能解析もしくは、動物実験(ラット)完了後に論文化をよていしている。また、3次元培養システムは、5月中に佐賀大学法人で特許出願することが委員会で承認されている。
病原性アスペルギルスにおける細胞周期関連プロテインキナーゼの研究

侵襲性アスペルギルス症は致死率50%を越えるため、新しい治療法の開発が渇望されている。本研究ではアスペルギルス症の主要原因菌Aspergillusfumigatusのプロテインキナーゼの解析を通じて細胞周期と菌糸成長速度との関係を解明することを目的とする。阻害剤、遺伝子破壊、遺伝子発現抑制、化学遺伝学などの手法を用いて4種類のプロテインキナーゼを解析し、Auk1およびMps1が生育に必須であることを見いだした。アスペルギルス症の新しい治療戦略の基礎を構築するのに貢献でき、基礎生物学的にもユニークな細胞周期の制御メカニズムという新しい知見を与えることが期待される。医療の高度化に伴って、深在性真菌症が問題となっている。その中でも侵襲性アスペルギルス症は致死率50%を越えるため、新しい治療法の開発が渇望されている。平成22年度は、Polo-likeキナーゼ、Auroraキナーゼ、MPS1キナーゼ、Kin4キナーゼの4種類のプロテインキナーゼを対象として、A.fumigatusの遺伝子組換え体の作製を中心に、各プロテインキナーゼの機能と菌糸生育との関係を探った。まず、キナーゼ特異的阻害剤として、市販のAuroraキナーゼ阻害剤2種類およびMPS1キナーゼ阻害剤1種類はA.fumigatusの生育には影響なかった。キナーゼ阻害剤の特異性がヒトとA.fumigatusとの間で異なることが予想される。次に、上記4種類7遺伝子の遺伝子破壊株を作製した。ハイグロマイシン耐性遺伝子をキナーゼ遺伝子と相同組換えにより置換した。Auroraキナーゼ1(Auk1)および2(Auk2)、MPS1キナーゼの遺伝子破壊株が数度の試行でも取得できなかったことから、これらは生育に必須であることが予想される。この3遺伝子が必須かどうかを確認するために、キナーゼ遺伝子発現をNiiAプロモーターの制御下に置いた。NiiAプロモーターはアンモニウム塩存在下で転写が抑制されることが知られている。必須と考えられるAuk1、MPS1キナーゼの遺伝子発現抑制株を作製したところ、Auk1およびMPS1キナーゼを抑制した場合に生育が顕著に抑制された。以上の結果および今後の発展により、アスペルギルス症の新しい治療戦略の基礎を構築するのに貢献でき、基礎生物学的にもユニークな細胞周期の制御メカニズムという新しい知見を与えることが期待される。平成23年度は、平成22年度に必須であると予想されたMps1キナーゼに焦点を当てて研究を行った。キナーゼ特異的阻害剤として、ヒトのMps1キナーゼ阻害剤であるAZ3146ではA.fumigatusの生育を阻害しなかったが、真菌のMps1キナーゼ阻害剤であるLY83583によって生育阻害が観察された。この結果より、ヒトと真菌のMpslの阻害様式が異なることが示唆された。次に、MPS1のアナログ感受性変異株を作製し、膜透過性ATPアナログ阻害剤(1NM-PP1)を用いて、A.fumrgatusのMPS1キナーゼのリン酸化活性を特異的に阻害する系を構築した。578番目のメチオニンをグリシンに置換したMPS1遺伝子およびハイグロマイシン耐性遺伝子を形質転換し、相同組換えにより染色体上のMPS1遺伝子にアナログ感受性変異を導入した。変異株にINM-PP1を作用させたところ、分生子の膨潤は阻害しなかったが、分生子からの出芽および菌糸成長が顕著に抑制された。DAPI染色により核の挙動を観察したところ、MPS1キナーゼ活性の阻害により染色体分裂が正常に行われず、巨大な核やちぎれた核が観察された。以上の結果から、MPS1キナーゼは正常な核の分裂を制御し、分生子からの出芽と菌糸成長に重要な役割を担っていることが示された。
成虫休眠を調節する神経機構の解明

昆虫の多くは光周期によって制御される休眠をもち、それによって成長や生殖に不都合な季節をきりぬけている。本研究の目的は、成虫期にそのようなしくみをもつルリキンバエにおいて、休眠を制御する神経機構を解明することである。放射化学アッセイ法により、アラタ体の幼若ホルモン(JH)合成活性を測定した。その結果、JH合成活性が低くなることによってルリキンバエは生殖休眠に入ることがわかった。また、生殖休眠は脳間部・脳側方部ニューロンによる調節とJHによる調節を受け、これらは互いに別の経路で卵巣発達を調節していると示唆された。細胞内色素注入と細胞内電気記録により脳間部に3種類、脳側方部に2種類のニューロンを同定した。休眠条件と非休眠条件でこれらニューロンの活動を比較した結果、1種類の脳間部ニューロンではスパイク持続期間に、1種類の脳側方部ニューロンではスパイクの高さに違いが見られた。また免疫組織化学により、脳間部、脳側方部ニューロンに対し免疫陽性を示す4種類の神経ペプチド、FMRFアミド、甲殻類色素拡散ホルモン、コラゾニン、コレシストキニンが見つかった。様々な神経ペプチドや脳組織とアラタ体を共に培養し、JH合成活性に対する影響を調べた結果、FMRFアミドと脳葉がJH合成活性をわずかながら抑制することがわかった。本研究により、成虫休眠の調節に関わる脳間部ニューロンと脳側方部ニューロンの形態学的、電気的性質を明らかにし、JH合成活性を調節する候補を挙げることができた。ルリキンバエは、光周期や温度に反応して卵巣の発達を抑制した成虫休眠に入る。本研究はこの休眠を調節する神経機構を解明することを目的としている。平成13年度は、培養条件下でアラタ体の幼若ホルモン合成活性を測定する方法によって、脳を同時培養するとアラタ体の幼若ホルモン合成活性が低下することを発見した。これにもとづいて、脳が分泌するアラタ体活性抑制物質の単離・同定へと進めてゆきたい。脳間部神経細胞を除去することが非休眠条件下で卵巣発達を抑制し、脳側方部神経細胞を除去することが休眠条件下で卵巣発達させたが、これらの処理は培養条件下でのアラタ体の幼若ホルモン合成活性に明瞭な影響を与えなかった。したがって、これらの神経細包除去の休眠におよぼす効果はアラタ体の幼若ホルモンを介さない可能性が浮上した。さらに、脳の神経細胞の電気的活動と休眠の関係を明らかにするために、アラタ体およびその周辺に終末を送っている脳間部および脳則方部神経細胞における電気的活動の細胞内記録方法を確立し、これらの細胞の微細な構造と電気的活動の特徴を明らかにした。その結果、脳間部に2種類(Ia、Ib)、脳側方部に2種類(La、Lb)の細胞群を同定した。組織化学および電気生理学的特徴から、Ia、Ib、La細胞はホルモンを分泌する神経分泌細胞であると推定された。一方、Lb細胞はホルモンを分泌しない通常の神経細胞と考えられ、免疫組織化学によってコラゾニンと色素拡散ホルモンを伝達物質として用いていることが示唆された。今後は、これらの神経細胞の休眠調節における役割を明らかにしてゆく。ルリキンバエのメス成虫は、短日・低温条件下で卵巣発達を抑制した休眠に入る。これまでに、休眠中はアラタ体による幼若ホルモンの合成活性が低下することがわかっている。本研究はこの成虫休眠を調節する神経機構を明らかにすることが目的である。平成14年度は、まず、アラタ体やその周辺に終末する脳内のニューロンを免疫組織学的に同定した。11種類の神経ペプチドに対する抗体で染色した結果、FMRFアミド、甲殻類色素胞拡散ホルモン、コラゾニン、コレシストキニン4種類の抗体に対し、目的のニューロン群が免疫陽性を示した。少数の脳間部ニューロンがFMRFアミド免疫陽性を示した。

脳側方部に細胞体を持つニューロンは5種類に分類された。そのうち、2種類には、甲殻類色素胞拡散ホルモン、コラゾニン、コレシストキニン様物質が共存していた。2種類のニューロンはFMRFアミド陽性であった。また、FMRFアミド陽性ファイバーはアラタ体に終末しており、他3種類のペプチド陽性ファイバーは側心体に終末していることがわかった。次に、平成13年度に確立した幼若ホルモン合成活性測定法を用いて、これらペプチド4種類のアラタ体における幼若ホルモン合成活性に対する影響を調べた。コラゾニン、コレシストキニン(CCK8)は合成活性に影響を与えなかった。一方、甲殻類色素胞拡散ホルモンにより、幼若ホルモンの合成活性はわずかに上昇し、FMRFアミドにより合成活性は抑制された。このことから、休眠中、脳間部あるいは脳側方部ニューロンに存在するFMRFアミド様物質がアラタ体の幼若ホルモン合成活性を抑制している可能性が示唆された。今後は、これらニューロンの電気的活動を調べるとともに、これらの上流にあるニューロン群を探ってゆく予定である。ルリキンバエのメス成虫は、短日・低温条件で休眠に入り、卵巣発達を抑制させる。これまでに、休眠中はアラタ体による幼若ホルモンの合成活性が低下すること、脳間部、脳側方部ニューロンはアラタ体とは別の経路で休眠調節に関わっていることがわかっている。本研究はこの成虫休眠を調節する神経機構を明らかにすることが目的である。本年度は、まず、アラタ体やその周辺に終末する脳側方部、脳間部ニューロンからの細胞内電位記録および染色を行いニューロンの形態と電気的性質を調べた。その結果、3種類の脳間部ニューロン(PIa,PIb1,PIb2)と2種類の脳側方部ニューロン(PLa,PLb)が同定された。PLbニューロンのスパイク持続時間は通常のニューロンと同程度(1-2ms)であったが、PIa,PIb1,PIb2,PLaニューロンでは比較的長く(3-10ms)、これらが神経分泌細胞であることが示唆された。PLbニューロンは神経ペプチド、コラゾニン、FMRFアミド、色素拡散因子に対し免疫陽性を示した。また、PIb2、PLaニューロンはアラタ体内部に終末していた。次に、これらニューロンの電気的活動を非休眠条件(長日・高温)と休眠条件(短日・低温)で比較した。その結果、PIa、PLbニューロンにおいて条件間で有意な差がみられた。PIaニューロンではスパイク発火のない個体が非休眠条件で見られた。スパイク発火する個体で比較すると、休眠条件のスパイク持続期間は非休眠条件のものより長かった。PLbニューロンでは休眠条件のスパイクの高さが非休眠条件のものより大きかった。以上より、PIb2、PLaニューロンはアラタ体の調節に、PIa、PLbニューロンは休眠の調節に関与する可能性が示された。今後、本研究で同定された各ニューロンの投射形態をもとに、これらニューロンへの入力系を探る研究へと進むことができるだろう。
マイクロクラスターにおけるメソタイムスケールダイナミクス

マイロクフスターにおけるメソスケールの特異現象、とくにアルカリハフイド(AH)および金属クラスターにおける高速拡散現象のメカニズムの解明をめざして研究を行っている。とくに、AHと金属系で異なる拡散機構が発現する原因を、クラスターの持つ空孔エネルギーの観点から説明することを試みている。このため、クラスターの静的な構造から空孔生成および空孔移動エネルギーを評価した。一方で、これに対して、クラスターのダイナミクスにおける空孔濃度および空孔移動頻度を計算し、空孔エネルギーとの整合性を調べることで、空孔ダイナミクスの性質とそのエネルギー評価の妥当性を検証した。この結果、空孔ダイナミクスはArrhenius型温度依存性をもち、それをもとに空孔エネルギーを評価することができた。これと静的な評価を比較した結果、空孔ダイナミクスと整合性をもった空孔生成・移動エネルギーを、クラスターの静的な構造をもとに評価することが出来ることがわかった。一方で、AHクラスターの混合の有無はそのイオン種の半径比によって決定されるとされているが、時間無限大での混合状態を計算することでこのイオン種依存性の起源について調べた。このため、混合のエントロピーを解析的に評価し、数値的に求めた生成熱と合わせて現象論的な自由エネルギーを構成し、その極小状態と分子動力学シミュレーションとの比較を試みた。この結果、AHクラスターにおける高速拡散現象のイオン種依存性を、生成熱依存性として説明できる見通しをえることができた。また、これによって空孔移動の過程を特定することが可能になったため、その力学的相関を評価する準備が整った。さらに、クラスター等のポテンシャル超曲面構造を連結グラフによって可視化し、その統計的性質を記述する手法の開発を共同研究として行った。ミクロカノニカル集団を形成するマイクロクラスターのような少数粒子系において、非一様な粒子温度分布が形成されうることを数値シミュレーションによって明らかにし、全並進・全角運動量保存を取り入れたミクロカノニカル測度を用いた統計力学的な解析によって、粒子温度分布や運動エネルギー分布関数の解析的表式をえた。短報論文ですでに公表したこれらの結果に加えて、直観的な粒子温度分布の表式を導出することで、全並進・全角運動量保存がこの現象の原因となっていることを明確にした。以上の結果の詳細をPhysical Review E誌に投稿した。これと並行して、クラスターにおける高速拡散現象について分子動力学シミュレーションをもちいた研究をおこない、アルカリハライドと金属クラスターでは拡散の進行するメカニズムが異なることを明らかにすることができた。また、この拡散機構の違いを説明するために、クラスター内の原子空孔移動のダイナミクスに注目し、そのポテンシャル超曲面上の局所安定点と鞍点のエネルギーを評価することで、空孔生成および移動エネルギーを評価した。この結果、後者に関しては議論の余地があるものの、生成エネルギーに関しては相対的にサイズ依存性が認められた。ただし、クラスター系においてはこのエネルギーの絶対値は定義によって大きく異なる値をとりうることもわかった。このような結果に対して、空孔濃度の温度依存性を評価することで、空孔生成エネルギーとして妥当な定義はどのようなものであるかを議論することができると考えており、空孔移動のダイナミクスおよびそのエネルギー評価とあわせて今後の課題である。
アフリカツメガエル初期胚におけるSGK1の機能解析

アポトーシスは胚の形作りに重要な役割を果たすが、それがどのように制御されるかについて詳しいことはわかっていない。発生過程でのアポトーシスを理解するために、アポトーシス経路を構成するシグナル伝達分子の同定とその制御機構を明らかにすることが重要である。私のこれまでの研究で、プロテインキナーゼSGK1がアフリカツメガエルの発生においてDISCという蛋白質複合体を制御し、アポトーシスを抑制することを見出した。本年度も、SGK1によるアポトーシス制御の詳細な分子メカニズムを明らかにするために、アフリカツメガエルを用いて研究を進めた。SGK1は初期胚の内胚葉および中胚葉に多く存在するが、SGK1をノックダウンした胚では外胚葉にアポトーシスが誘導される。この結果は、内胚葉と中胚葉に存在するSGK1が外胚葉細胞のアポトーシスを抑制することを示唆している。実際、SGK1を除去した外胚葉細胞片にはアポトーシスが誘導されないこと、および、胚の内胚葉と中胚葉にあるSGK1を特異的にノックダウンしても外胚葉にアポトーシス誘導されることから、SGK1は細胞非自律的に外胚葉をアポトーシスから保護していることが考えられる。本研究のこれまでの結果から、PI3K-SGK1-NF-κB経路が内胚葉および中胚葉でBMP7の生成を促し、分泌されたBMP7がDISCの発現量を低下させることで外胚葉のアポトーシスを抑制するというメカニズムが示唆される。発生過程でのアポトーシスを理解するために、アポトーシスのシグナル伝達分子がどのように制御されるのかを明らかにすることが重要である。私のこれまでの研究で、プロテインキナーゼSGK1が発生過程でアポトーシスを抑制することを見出した。本年度は、SGK1によるアポトーシス制御の分子メカニズムを明らかにするために、以下の(1)から(3)について、アフリカツメガエルを用いてSGK1の下流で働く分子を探索した。(1)DISCを制御する因子の探索:DISC構成因子はSGK1によって発現が抑制されるアポトーシスシグナル伝達分子である。私はDISC構成因子のプロモーター領域をクローニングし、Smad-binding element(SBE)がDISC遺伝子のプロモーター領域に存在することを見出した。TGFβ/BMPファミリー分子はSBEを介して遺伝子の発現を制御することが知られている。私はBMP7の発現がSGK1によって正に制御され、さらにBMP7はDISC構成因子の発現を抑制することを見出した。(2)マイクロアレイで発現変化した機能未知遺伝子の機能解析:私が行ったマイクロアレイ解析から、SGK1ノックダウン胚で発現量に有意な差がある機能未知遺伝子の存在が明らかとなった。そのひとつがE3ユビキチンリガーゼのHACE1である。アフリカツメガエル胚でHACE1をノックダウンすると形態形成に異常が生じることから、HACE1はアフリカツメガエル初期発生に必須の遺伝子であることが分かった。(3)SGK1の基質の探索:DISCを制御する分子BMP7((1)で同定)のプロモーター領域にNFκB-binding siteが存在することを見出し、実際NFκBは生体内でその領域に結合することを示した。NFkBはSGK1の基質となることが過去に報告されており、実際にアフリカツメガエル胚でもリン酸化されるかを調べることが今後の研究課題である。
脳・腎薬物輸送におけるトランスポーターの分子実体の解明と機能の統合研究

H+/有機カチオン交換輸送体であるMATEについて、薬物の他、内因性代謝物・蛍光物質の尿中排泄に関わること、さらに、cimetidinenなどによる腎排泄における薬物間相互作用の一部はMATE阻害で説明できることを明らかにした。NPT4が促進拡散により利尿薬などアニオン性薬物を輸送する。OCT2が尿中排泄を受ける有機カチオンのうち極性の高い化合物を主に基質とするのに対して、新たにMCT9がOCT2とは異なる基質選択性を示す有機カチオントランスポーターであることを明らかにした。MCT9は腎臓に加えて血液脳関門にも発現が認められることから、薬物の脳内動態にも関与しているものと考えられる。MATE阻害剤pyrimethamineの投与条件を見直し、従来よりも高い血漿中濃度を達成することができ、ほぼ完全にMate機能を阻害する条件を構築した。本条件を用いた結果、MATEにより細胞内から排出される薬物を複数同定することができ、腎尿細管分泌におけるMATEの重要性を示唆する結果を得た。Mate基質の1つであるH2受容体拮抗薬cimetidineについては、腎刷子縁膜ベシクルでは、pyrimethamineの阻害効果が認められるも、マウスin vivoでは、阻害効果は認められず、他の排出輸送機構(能動輸送)が関与しているものと考えられる。cimetidineは医薬品の腎排泄を阻害し、薬物間相互作用を生じる。これまで腎取り込み過程の阻害であると信じられてきたが、in vitro輸送実験・in vivo試験により、MATEによる細胞内からの排出輸送を阻害していることを明らかにした。Pyrilamineの取り込み輸送低下が認められたJvsマウス腎の発現プロファイルを野生型マウスと比較した結果、脂質代謝酵素ならびに刷子縁膜側のトランスポーターの発現変動が認められたが、オーファン・基底膜側トランスポーターの発現変動は認められなかったことから、mRNAレベルでの発現低下ではないことが示唆された。薬物トランスポーター阻害剤を投与した臨床検体中の代謝物を検索した結果、阻害剤投与により尿中排泄が低下する内因性代謝物を複数見いだした。新規腎特異的有機アニオントランスポーターNPT4が利尿剤など複数の医薬品を基質とすること、またHEK293細胞にてSLC16A9をノックダウンした結果、カチオン性薬物の取り込み低下が認められた。SLC16A9は腎・脳毛細血管に発現していることから、脳への薬物輸送に関与していることが期待される。腎排泄は生体内の主要な排泄経路であり、特に生理的なpHで解離する官能基を有する化合物の大部分は尿細管分泌を受ける。この分泌経路の解明は不可欠である。現在、カチオン性薬物の尿細管分泌では取り込み過程にOCT2が、排出過程はH+/有機カチオン交換輸送体であるMATE(MATE1およびMATE2-K)が重要であると考えられている。両トランスポーターの基質選択性を比較した結果、βブロッカーではOCT2よりも排出側トランスポーターであるMATEの方が幅広い基質選択性を示し、脂溶性の高いカチオン性薬物も基質とできることを、強制発現系を用いたin vitro試験で確認した。MATE1とMATE2-Kは非常に類似した基質選択性(輸送活性)を示したが、腎排泄における薬物間相互作用を生じるtrimethoprimについては、MATE2-Kに対して高親和性の基質であることを明らかにした。MCT9について、免疫染色を行った結果、腎では近位尿細管の基底膜に、また脳では脳毛細血管に発現が認められた。MCT9はOCT2基質であるTEAによる阻害能は低いことを明らかにした。摘出したサル腎切片を用いた阻害実験で、TEA非感受性の取り込みも認められた。生体内の主要な排泄組織の1つである腎臓において、尿細管分泌に関わる薬物トランスポーター分子に関する知見を得た。本成果により、腎薬物輸送における薬物間相互作用の分子メカニズムの理解に貢献した。腎・脳に発現するトランスポーターとしてMCT9の機能解析に取り組み、新たな薬物トランスポーターとして、薬物の拝謁や組織分泌に働くことを示唆する結果を得た。Pyrimethamineを投与した被験者の血漿・尿検体中の内因性MATE基質(N-methylnicotinamide)の腎クリアランスを測定した結果、プローブ基質として用いたmetforminとは異なり、腎クリアランスの大部分は消失しており、本化合物がMATEを介した薬物間相互作用を定量的評価に利用できるプローブ化合物であることを明らかにした。Pyrimethamine阻害の特異性を検証するため蛍光物質としてrhodamine123ならびにASPの腎臓内濃度がpyrimethamine投与に増加することに基づき、in vivo共焦点レーザー顕微鏡を用いて、Mate1が発現する近位尿細管への蛍光物質の蓄積を確認した。

腎排泄過程におけるcimetidineによる相互作用に関して、pyrimethamineによる阻害が見られなかった薬物に対して、cimetidineとの併用効果を検証したが、相乗作用は見られず、どちらもMate1阻害であることが考えられた。これまでMATE1とMATE2-Kの機能は同等とされてきたが、文献報告に基づいて、両者を区別するためのin vitro阻害剤を確認した。本阻害剤を利用することで、腎刷子縁膜におけるMATE1とMATE2-Kの重要性を明らかにすることができるものと期待している。NPT4の基質選択性を利尿剤以外にも拡張するとともに、OAT3との共発現系を構築し、NPT4が排出輸送を行うことを確認した。さらに、NPT4阻害剤として、C型肝炎治療薬であるtelaprevirが良好な阻害剤となることを見いだした。MCT9についても、KD細胞株、過剰発現細胞を構築し、基質選択性を明らかにすると共に、免疫染色を実施するためのポリクローナル抗体をC末に対して調整した。Western blotで、サル脳毛細血管内皮細胞の発現を確認することができた。OCT2・MATEを中心とした分泌機構を解析するための条件を確立し、新たな薬物トランスポーター分子に関する知見を得ることが出来、ほぼ計画通りに進捗している。25年度が最終年度であるため、記入しない。MATEを中心とした腎尿細管分泌機構をin vivo・in vitroで評価する阻害剤を開発し、その体内動態における重要視を実験動物・臨床検体を用いて実証した。また、新たな薬物トランスポーター分子(NPT4・MCT9)の基質探索に利用可能なスクリーニング系を構築し、その基質選択性に関する知見を得ることができた。NPT4については実験動物に適用可能なNPT4阻害剤も見いだした。MCT9についても、当初期待通り、脳毛細血管での局在も認められた。ほぼ計画通りに進捗している。確立した実験を条件に基づいて基質薬物のスクリーニングを実施するとともに、未同定のトランスポーターの探索をさらに進める。腎に発現する薬物トランスポーターに対する阻害剤選択性を確立し、腎取り込みおよび排泄過程、血液脳関門における薬物輸送における各トランスポーターの重要性を明らかにすることに取り組む。
下咽頭癌特異的mRNAによる増殖機構の解明

私たちは、下咽頭癌は、分子Xにほぼ完全に依存した状態で増殖していることを見いだした。分子Xをノックダウンすると癌細胞は増殖停止に陥るが、この分子機構はいまだ明らかではない。最近私たちは、分子X "タンパク"からのシグナルは癌細胞の増殖に影響せず、分子X "mRNA"が必須の因子である予備実験結果を得た。
悪性黒色腫の転移メカニズムの解明

本研究の目的は悪性黒色腫の転移メカニズムを解明することである。特に悪性黒色腫細胞がEMT(Epithelial Mesenchymal Transition:上皮間葉移行)を来たすことで転移能を獲得するかどうかを中心に検討する予定である。悪性黒色腫細胞A375にEMTのmaster regulatorである転写因子snailのcDNAを定常的に発現する細胞株を樹立した。Snailを導入することで悪性黒色腫細胞がEMTを来たし,上皮系の表現形から間葉系の表現形へと形質変化を来たすことが期待される。今後は悪性黒色腫細胞の運動性,形態などをメルクマールとして実際に形質変化を起こしているかどうかを検討する。EMTを惹起するシグナル伝達系はTGF-β,stat,RTK-Ras,Wntなどが知られている。我々はWntシグナル伝達系に注目し,Wntシグナルが活性化することで悪性黒色腫にEMTが起こるか否かを検討する予定である。我々は悪性黒色腫患者の切除標本においてWntシグナル伝達系を構成する中心的な蛋白である,β-cateninの発現を免疫組織学的に検討した。その結果,悪性黒色腫の真皮内への浸潤病巣の先端部でβ-cateninが強く発現していることを見出した。腫瘍細胞の浸潤する先端部分は腫瘍細胞がEMTを起こしている部分でもあり,この結果は活性化したWntシグナルがEMTを惹起する可能性を示唆するものである。今後はβ-cateninなど,Wntシグナルを活性化する遺伝子を悪性黒色腫細胞に導入して,細胞株にEMTが誘導されるかどうかを検討する予定である。特に悪性黒色腫細胞がEMT (Epithelial Mesenchymal Transition:上皮間葉移行)を来たすことで転移能を獲得するかどうかを中心に検討する予定である。Snailを導入することで悪性黒色腫細胞がEMTを来たし、上皮系の表現形から間葉系の表現形へと形質変化を来たすことが期待される。今後は悪性黒色腫細胞の運動性、形態などをメルクマールとして実際に形質変化を起こしているかどうかを検討する。EMTを惹起するシグナル伝達系はTGF-β、stat、RTK-Ras、Wntなどが知られている。我々はWntシグナル伝達系に注目し、Wntシグナルが活性化することで悪性黒色腫にEMTが起こるか否かを検討する予定である。我々は悪性黒色腫患者の切除標本においてWntシグナル伝達系を構成する中心的な蛋白である、β-cateninの発現を免疫組織学的に検討した。その結果、悪性黒色腫の真皮内への浸潤病巣の先端部でβ-cateninが強く発現していることを見出した。腫瘍細胞の浸潤する先端部分は腫瘍細胞がEMTを起こしている部分でもあり、この結果は活性化したWntシグナルがEMTを惹起する可能性を示唆するものである。今後はβ-cateninなど、Wntシグナルを活性化する遺伝子を悪性黒色腫細胞に導入して、細胞株にEMTが誘導されるかどうかを検討する予定である。
再生組織工学の手法を用いた消化管再生の研究

これまで再生しないと信じられてきた哺乳類の消化管を新しい再生組織工学の手法を使ってどこまで再生させうるか、主にビーグル犬を用いた動物実験で解明した。細胞外基質(ECM)であるコラーゲンスポンジを足場に用いた予備実験で消化管上皮を伴った新たな組織が食道や胃・小腸・胆管においても再生することは確認していたので、本研究では蠕動運動をするような神経支配を伴った筋組織が再生するか評価し、あわせて平滑筋の再生のメカニズムの解明を行った。また、犬の穿刺骨髄から間葉系幹細胞を培養増殖させる手技を確立しており、再生促進するものとして応用した。消化管組織上においたブタ由来アテロコラーゲンは体内にin situ Tissue Engineeringの手法を用いて埋入すると、そこに結合織が入り、内面には消化管上皮が両端より伸展する。ここには腺組織も再生することを確認した。しかしながら筋層の再生はECMと誘走細胞のみでは困難であり、一度出現したα-アクチン陽性の筋原細胞もmyofibroblastになってしまうことが判明した。そこで筋肉から前駆細胞を集め増殖させ、それを体内のscaffold内に散布する系を最終年度に始めている。また再生の場を作るためにVEGFも併用して血流を改善させて筋肉の再生を促す試みも行っている。このように観察期間は短いが、筋組織様の構造物が今までになく多量に形成されることがわかってきており、今後この場の理論に基づく再生医学のこの分野での発展が期待される。1)ビーグル犬の胃壁に5×5cm大欠損部を作り、同部の再生案験を行った。シリコンシートで内腔面から隔離した欠損部に再生の足場となるコラーゲンスポンジを埋殖した。平滑節の再生を促すために、骨髄よりの間葉系幹細胞に加えて、消化管の平滑筋細胞を含漬させる実験を行った。さらに、細胞外マトリックスにFGF、EGF等組織増殖因子を複合化すると再生を促進することが判明した。2)小腸と大腸は各々5cmの置換実験をビーグル犬で行った。これまでの予備実験で平滑筋の再生と術後の収縮を防ぐことが、臨床応用に向けた大きな課題であることが明らかになっていたので、今回はまずは生体内分解性ステントを用いて再生の場を保持させ、筋細胞の源となる細胞を自己の平滑筋から導入した。3)総胆管(CBD)はVater乳頭から1cmの位置で1cm長の置換実験を行った。ビーグル犬10匹へ埋入した。至適なステントの抜去時期を決定するための埋入実験を継続している。これまで再生しないと信じられてきた胃、腸をはじめとする消化管を新しい再生組織工学の手法を使ってどこまで再生させうるか、大型動物を用いた動物実験で解明した。コラーゲンスポンジを足場に用いた予備実験で消化管上皮を伴った新たな組織が食道や胃・小腸においても再生することは確認しているので、本研究では蠕動運動をするような神経支配を伴った筋組織が再生するか評価し、あわせて平滑筋の再生のメカニズムの解明を行った。胃、大腸、小腸、胆管においたブタ由来アテロコラーゲンは体内にin situ tissue engineeringの手法を用いて埋入すると、それを足場にして結合織が入り、内面は消化管上皮が両端より伸びてくる。ここには腺組織も再生することが認められた。問題点としては術後の狭窄が起こり、一度再生した管状の組織が時間が経つと収縮してしまうことである。この点を改善することが、この技術を臨床応用する鍵となることが判明した。消化管を構成する組織は大きく分類して内側から粘膜上皮、粘膜下結合織、筋層、漿膜である。この消化管組織の中に消化液を分泌する腺組織や自律神経系の神経が分布する。

本研究の再生研究ではin situ Tissue Engineeringの手法を用いて消化管の全層の再生を試みた。再生の足場にはコラーゲンスポンジとPGA不織布を、細胞としては周囲から動員される自己細胞に期待した。ビーグル犬で胃、小腸、大腸、総胆管における欠損の補填実験を行い、各組織の再生能を検討した。すると、このシステムでも粘膜上皮と結合織ならびに腺組織は極めて早期に再生することが判明した。しかしながら消化管を構成する筋組織(主に平滑筋)の再生が見られなかった。このためFGFやTGFβなどの増殖因子を併用したりしたが、筋肉の再生は十分ではなかった。これは筋原細胞の欠如と血流の不足によると考え、そこで最終年度には、筋肉の前駆細胞を自己筋肉より分離培養して増殖させ、その細胞を使いつつ、VEGF等の血管誘導因子を併用して筋組織の再生を試みた。このシステムを用いることにより、家兎の大腿骨の筋肉ではあるが再建早期より筋組織様の形態をもった組織が再生してくることを確認した。また平行して、消化管に分布する自律神経の再生の研究を行った。これは末梢の運動神経、感覚神経の再生研究をふまえたものであり、生体内吸収性の人工神経管で内臓神経のdefectをbridgeする方式である。斯くの如く、本研究では消化管の組織が大型動物でもin situ Tissue Engineeringの手法を用いれば再生可能であることが確かめられ、今後の臨床応用への扉を用いたものと思われる。