hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ニューロモジュレーションとブレインマシンインターフェイス連携による革新的技術開発

ブレインマシン・インターフェイス(BMI)に用いる脳信号は個人間の変動が大きく、安定した脳信号を検出するためには被験者に長期間の訓練を要することが問題となっている。大脳皮質の興奮性を変化させるニューロモジュレーションを用いることで、BMIに用いる脳信号パターンを増幅しBMI精度を向上させる研究を行った。健常者に加え、BMIの臨床応用が期待されている四肢切断患者のような運動障害を持つ患者においてもニューロモジュレーションにてBMI精度が向上する可能性が示唆された。外部から刺激を行い大脳皮質の興奮性を変化させるニューロモジュレーション法がリハビリテーション分野にて注目を集め、主に反復経頭蓋磁気刺激(rTMS)、経頭蓋直流電気刺激(tDCS)が用いられている。しかしながら、刺激方法は経験則に由来し効果を認めない症例もあり、個人間の変動及び刺激時の状態に左右されない適切な刺激条件の設定が求められている。脳信号を解析し運動及びコミュニケーションの補助を行う技術はブレイン・マシン・インターフェイス(Brain-Machine Interface; BMI)と呼ばれ、リハビリテーション分野において注目を集めている。脳波を利用した非侵襲型BMIは、得られる信号が微弱で個人間の変動が大きいこと、安定した脳信号を検出するためには被験者に長期間の訓練を要することが問題となっている。上記の問題点を解決するために、非侵襲的に刺激可能な経頭蓋直流電気刺激を用いる事で大脳皮質の興奮性を変化させ、BMIに用いる脳信号パターンを増幅・脳信号のコントロール訓練効果の増大を引き起こし、BMI精度を向上させる基礎実験を行った。興奮性刺激では脳波信号の増強、抑制性刺激では脳波信号を低下する傾向を認めBMI精度向上に結びつくと考えられた。健常者に加え、BMIの臨床応用が期待されている四肢切断患者を対象としニューロモジュレーション後の脳信号パターンを解析し、運動障害を持つ患者においてもBMI精度が向上する可能性が示唆された。この研究を基にBMI技術を利用し脳活動を被験者にフィードバックすることにより被験者自身で脳活動をコントロール・安定化させ、脳活動の状態に合わせた監視型ニューロモジュレーション法の開発に結びつくと考えられた。リハビリテーション分野において外部から刺激を行い大脳皮質の興奮性を変化させることによって、中枢神経疾患の運動機能改善、言語機能や認知機能への治療が研究されている。これらの手法はニューロモジュレーションと呼ばれ、主に反復経頭蓋磁気刺激(rTMS)、経頭蓋直流電気刺激(tDCS)が用いられている。上記の問題点を解決するために、非侵襲的に刺激可能な経頭蓋直流電気刺激を用いる事で大脳皮質の興奮性を変化させ、運動イメージ中の脳波信号変化を計測し、BMI効率の改善を目指す基礎実験を行っている。興奮性刺激では脳波信号の増強、抑制性刺激では脳波信号の低下が得られているがさらなる解析が必要と考えられる。健常者に加え、BMIの臨床応用が期待されている運動麻痺が残存した脳卒中患者及び四肢切断患者を対象とし検討を重ねる予定である。健常者だけでなく、BMIの臨床応用が期待されている運動麻痺が残存した患者群においても研究が進んでいるため。ニューロモジュレーションで大脳皮質の興奮性を変化させ、BMIに用いる脳信号パターンを増幅・脳信号のコントロール訓練効果の増大を引き起こし、BMI精度を向上させる。BMI技術を利用し脳活動を被験者にフィードバックすることにより被験者自身で脳活動をコントロール・安定化させ、脳活動の状態に合わせた監視型ニューロモジュレーション法を検討する。上記計画のため脳波解析ソフトの購入を予定している。また次年度使用額は、今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額であり、平成24年度請求額とあわせ、次年度に計画している研究の遂行に使用する予定である。
小脳興奮性シナプスにおける新規可塑性のシグナリング機構

平成18年度には、主に薬理学的実験により、申請者自身が見出した一酸化窒素(NO)依存的な小脳平行線維-プルキンエ細胞シナプスにおけるLTPが細胞内のカルシウム上昇に依存することが示された。しかもイメージング法を用いた解析により、このCa上昇は、申請者自身の先行研究により示されていた、LTP誘導に必要なNOシグナルと空間的に一致することが示された。これらの結果は、LTP誘導時に小脳プルキンエ細胞内で活性化されるNOシグナルとCaシグナルの間に強い関連性があることを示唆する。そこで平成19年度は、両シグナルの関連性を明らかにすることを目標に研究を行った。先ず、NOシグナルによりCaシグナルが活性化される可能性を検討するため、マウス小脳スライス標本においてNO供与体を細胞外から投与し、プルキンエ細胞内Ca濃度に与える影響をイメージング法によって調べた。その結果、NO供与体投与により、プルキンエ細胞内Ca濃度に上昇がみられることが明らかとなった。引き続き、平行線維刺激により産生される内因性NOによってもプルキンエ細胞内Ca濃度上昇が見られることが明らかとなった。さらに、NOシグナルがプルキンエ細胞内Ca上昇を引き起こす分子機構を解明する一環として、細胞内NO受容タンパクである可溶性グアニル酸シクラーゼの関与を調べた。しかし、可溶性グアニル酸シクラーゼの阻害薬等を投与したところNOシグナルによる細胞内Ca上昇に阻害効果は見られなかった。1.一酸化窒素(NO)はガス性の細胞間シグナル伝達因子で、様々な生命現象への関与が示唆されている。中枢神経系においてもNO合成酵素の発現が広く見られ、様々な神経機能へのNOの関与が推測されている。しかしながら、神経活動依存的なNO放出の動態やその生理的意義については、多くの点で不明である。本研究では、NOシグナルとCaシグナルのイメージングに電気生理学的手法・薬理学的手法を加えた多角的なアプローチにより申請者自身が見出したNO依存的な小脳平行線維-プルキンエ細胞シナプスにおける長期増強(LTP)へのCaシグナル系の関与を明らかにし、さらにNOシグナル系とCaシグナル系とのクロストークを調べることで、このNO依存的LTPの分子機構の解明を目的として計画された。平成18年度には、先ず薬理学的実験により、NO依存的な小脳平行線維-プルキンエ細胞シナプスにおけるLTPが細胞内のカルシウム上昇に依存することが示された。さらにイメージング法を用いた解析により、この細胞内Ca上昇は、細胞内Caストアからの放出に依存することが明らかとなった。しかも、このCa上昇は、申請者自身の先行研究により示されていた、LTP誘導に必要なNOシグナルと空間的に一致する。これらの成果は、平成19年度の得られる予定の成果の一部とともに、論文投稿予定である。2.上記の成果に加えて、1)小脳平行線維シナプスの機能維持へのプルキンエ細胞のIP3シグナル系の関与、2)小脳プルキンエ細胞内のリアノジン受容体とCa感受性カリウムチャネルとの機能共役機構、3)小脳平行線維シナプスにおける長期抑圧現象へのカルシニューリンの関与を明らかにし、それぞれ、研究発表の欄に記した雑誌論文として公表された。平成18年度に行われた薬理学的実験により、申請者自身が見出した一酸化窒素(NO)依存的な小脳平行線維-プルキンエ細胞シナプスにおけるLTPが細胞内のカルシウム上昇に依存することが示された。先ず、NOシグナルによりCaシグナルが活性化される可能性を検討ずるため、マウス小脳スライス標本においてNO供与体を細胞外から投与し、プルキンエ細胞内Ca濃度に与える影響をイメージング法によって調べた。

その結果、NO供与体投与により、プルキンエ細胞内Ca濃度に上昇がみられることが明らかとなった。引き続き、平行線維刺激により産生される内因性NOによってもプルキンエ細胞内Ca濃度上昇が見られることが明らかとなった。さらに、NOシグナルがプルキンエ細胞内Ca上昇を引き起こす分子機構を解明する一環として、細胞内NO受容タンパクである可溶性グアニル酸シクラーゼの関与を調べた。しかし、可溶性グアニル酸シクラーゼの阻害薬等を投与したところNOシグナルによる細胞内Ca上昇に阻害効果は見られなかった。
トラフグ寄生虫の着定メカニズムの解明とその駆除

トラフグは経済価値の高い水産重要種である。このトラフグの鰓に寄生する単生類ヘテロボツリウムは、宿主に吸血による貧血症状を誘発し、重篤な場合は死に至らしめるなど、トラフグ養殖の現場で大きな問題となっている。卵から孵化したヘテロボツリウムの幼生は体表に繊毛上皮細胞を有し、この細胞表面にある繊毛を用いて自由遊泳を行うが、宿主に到達するとこの細胞を脱落させ、すみやかに寄生期へと移行する。この現象、すなわち脱繊毛は、トラフグの体表を覆う粘液中の何らかの分子を幼生が探知することで生じると考えられている。本研究において、その分子が、マンノースに親和性を持つIgM抗体であることが明らかとなった。トラフグの鰓に寄生する単生類ヘテロボツリウムの着定メカニズムを解明するため、寄生のファーストステップである脱繊毛を誘導する因子を検索した。先行研究から、トラフグ皮膚粘液中に含まれるユリ型マンノース結合レクチン(パフレクチン)がその候補因子として挙げられていたため、まずトラフグ粘液から、アフィニティークロマトグラフィーによりマンノース結合画分を精製した。SDS-PAGEの結果、この画分には、メジャータンパクであるパフレクチンに加えて、マイナー成分である2種類のタンパク質が検出された。LCーMS/MS解析により、これらのタンパク質はマンノース結合IgMおよびカリクレクチンであることがわかった。これら3分子の混合画分はヘテロボツリウム幼生の脱繊毛を誘導した。しかしゲルろ過により3分子を完全分離し、脱繊毛活性をしらべたところ、パフレクチンではなく、マンノース結合IgMに活性が認められた。マンノース結合IgMの脱繊毛誘導活性は濃度依存的であり、マンノースの添加により有意に低下した。また、免疫染色により、マンノース結合IgMがヘテロボツリウム幼生に結合することを示した。血清より精製したトラフグIgMをマンノースカラムに供し、その素通り画分から非マンノース結合IgMを得た。このIgMは脱繊毛を誘導しなかった。以上の結果により、ヘテロボツリウム幼生の脱繊毛誘導因子はトラフグマンノース結合IgMであり、本分子が幼生の表面に存在するマンノースを含む分子に結合することで、脱繊毛が生じるものと考察された。昨年度、トラフグの血清より精製したマンノース結合IgMがヘテロボツリウム幼生の脱繊毛を誘導することを見出した。本年度は、1)実際の寄生部位である鰓粘液に、脱繊毛を誘導する十分量のマンノース結合IgMが含まれているかどうかを、抗トラフグIgM抗体を用いたウエスタンブロット解析により調べた。また、2)ヘテロボツリウム幼生のどの分子にトラフグマンノース結合IgMが結合するのか、リガンド探索を行った。1)に関して、まず脱繊毛を誘導しうるマンノース結合IgMの最小濃度を検討した。マンノース結合IgMの倍々希釈系列にヘテロボツリウム幼生を曝露したところ、約25マイクログラム/ml以上の濃度で脱繊毛が認められた。つぎに、トラフグ3個体から綿棒を用いて鰓粘液を採取し、これをマンノースアガロースと反応させた。マンノースアガロースを洗浄後、結合画分をマンノース結合IgMの倍々希釈系列とともにウエスタンブロット解析に供し、シグナル強度を比較した。その結果、3個体の鰓粘液中には25マイクログラム/ml以上の濃度のマンノース結合IgMが存在することが示され、in vivoにおいても本分子がヘテロボツリウム幼生の宿主認識に関与していることが明らかとなった。2)ヘテロボツリウム幼生に存在するリガンドを探索するため、幼生約35000個体から、SDS可溶性画分(膜タンパク質画分)を得た。これをSDS-PAGEに供した後、抗トラフグIgM抗体を用いたウエスタンブロット解析に供した。その結果、13kDaおよび16kDaの2つのタンパク質画検出された。これらをプロテインシーケンサーに供しN末端アミノ酸配列を解析したところ、16kDaタンパク質から7残基の配列を得た。16kDaタンパク質については配列を得ることが出来なかった。現在、これらの分子の同定を試みている。トラフグの鰓粘液中に、ヘテロボツリウム幼生が脱繊毛を起こすのに十分な量のマンノース結合IgMが含まれていることがわかり、実際に本分子がin vivoでヘテロボツリウムの宿主認識に関与していることが示された。またリガンド候補も2つ検出することが出来た。これらの結果から、本研究はおおむね順調に進展しているものと思われる。昨年度までの研究により、単生類寄生虫ヘテロボツリウムがトラフグ粘液中のマンノース結合IgMを宿主認識に利用していることを突き止めた。今年度は、主にマンノース結合IgMの特性を明らかにすることを目的として、以下の実験を行った。まず、このIgMが、マンノース以外の糖と結合しうるかを検討した。具体的には、精製したマンノース結合IgMを市販の4種類の糖結合アガロースカラム(ラクトース、フコース、GalNAc、GlcNAc)に供し、結合画分および非結合画分を得た。これをSDS-PAGEに供したところ、いずれの場合においても非結合画分にバンドが認められた。このことから、トラフグのマンノース結合IgMは、少なくとも上記の4つの糖には結合しないことが示された。

次に、マンノース結合IgMの可変領域のcDNA配列のクローニングを行った。まず、LC-MS/MSで得られたアミノ酸配列から縮重プライマーを設計した。次にこのプライマーを用いて5 ́RACEを行ったところ、187bpのcDNA配列を得た。今後、この情報を活用し、ゲノム編集技術を用いたマンノース結合IgMノックアウト個体を作出することで、寄生虫フリーのトラフグの生産を目指したいと考えている。トラフグは経済価値の高い水産重要種である。このトラフグの鰓に寄生する単生類ヘテロボツリウムは、宿主に吸血による貧血症状を誘発し、重篤な場合は死に至らしめるなど、トラフグ養殖の現場で大きな問題となっている。卵から孵化したヘテロボツリウムの幼生は体表に繊毛上皮細胞を有し、この細胞表面にある繊毛を用いて自由遊泳を行うが、宿主に到達するとこの細胞を脱落させ、すみやかに寄生期へと移行する。この現象、すなわち脱繊毛は、トラフグの体表を覆う粘液中の何らかの分子を幼生が探知することで生じると考えられている。本研究において、その分子が、マンノースに親和性を持つIgM抗体であることが明らかとなった。ヘテロボツリウム幼生の脱繊毛を誘導する因子を同定できたため、おおむね順調に進展していると思われる。トラフグを2群に分け飼育し、一方の飼育水にマンノース結合IgMを添加する。その後へテロボツリウム幼生による攻撃試験を行い、寄生率を比較することで、本分子のヘテロボツリウム駆虫剤としての可能性を検討する。魚類免疫・ウエスタンブロットやアフィニティークロマトグラフィーを用いて、ヘテロボツリウム幼生の表面に存在する、トラフグマンノース結合IgMのリガンドを検索する。ヘテロボツリウム卵が郵送可能だったため、旅費の使用が抑えられた。ヘテロボツリウム幼生の郵送が可能だったため、旅費の使用が抑えられたため。投稿論文作成時の英文校閲代として使用する。飼育実験に必要な水槽設備の拡充に使用する。
葉緑体転写を統御する核-葉緑体クロストーク機構の解明

本年度は黄色ブドウ球菌をモデル生物として採用し、主として1)本菌のシグマ因子群の整理、および2)シグマ因子結合タンパク質群の検索を行った。1)従来の相同性検索に基づく手法によると、黄色ブドウ球菌のゲノムにはシグマ因子遺伝子が2種類しか見いだされない。したがって、本菌のシグマ因子は2種類のみであると考えられてきた。本年度申請者は本菌の遺伝子の「配置」保存性を近縁種と比較することで、従来のシグマ因子に加え、もう一つ新規なシグマ因子遺伝子をが存在することを見いだした。その遺伝子がコードするタンパク質は他のシグマ因子と同様にRNAポリメラーゼと相互作用した(pull-down assayにより確認)。また、本遺伝子を黄色ブドウ球菌に強制発現させると、特定の遺伝子群の転写産物が劇的に蓄積誘導されることを見いだした。以上の結果により、本遺伝子がシグマ因子をコードすることを示した。グラム陽性菌の全シグマ因子群の系統解析を行った結果、本新規シグマ因子はグラム陽性菌が獲得した最初の代替シグマ因子であることが示唆された(以上Genes to cellsに投稿中)。2)primary sigmaであるSigAに結合するタンパク質群をpull-down assayにより検索した結果、数種類の結合タンパク質が存在することが確認できた。現在MULDI-TOF-MSによる同定を試みており、今後も継続研究する予定である。
食教育の観点からみた食物選択と食物噴好との関連に関する発達心理学的研究

今年度は,以下のことを実施した.1.平成18年度に実施した大学生の食物選択に関する分析平成18年度に大学生56名に対して実施した調査,すなわち昼食としてコンビニエンスストアのおにぎりとデパートの地下食料品店のおにぎりのいずれかを選択し,試食する実験的調査,普段の食への態度,食の位置づけ等に関する質問紙調査,日本版DEBQ質問紙,2日間に渡って購入した食品,飲食した内容を携帯の写真機能を使って送信してもらうことによる食事調査の3つに関する詳細な分析を実施した.2.中学生・大学生を対象とした調査研究中学生と大学生それぞれ男女10名ずつ,計20名を対象として,食物選択,食物嗜好に関する実験的研究,食態度に関する質問紙,DEBQ質問紙,偏食尺度,非連続の3日間にわたる実際の食事調査に関する携帯写真機能を利用した食事調査,分析を実施し,中学生と大学生の特徴についての比較をおこなった.3.幼児から大学生までの食教育に関する提案平成16年度から19年度までの幼児,中学生,大学生の調査結果に基づき,発達心理学的な視点からの食教育について提案した.その際に重要なこととして,特に年齢が低い段階における母親へのアプローチが必要であることを指摘している.近年,子どもの体型は,肥満とやせの両極化が顕著であり,そのような変化を大きな問題と考えられる.本研究では,そのような観点も念頭においた食教育の重要性を論じている.本年度は,食教育の観点からみた食物選択と食物嗜好との関連に関する発達心理学的研究における第1年目として,以下のような2つの基礎的研究を実施した.第1は,食物選択と食物嗜好との関連を検討するために,幼児と大学生を対象に実物大料理カードを材料として実施した調査の分析を実施した.その結果,幼児は食物選択と食物好悪には感覚要因が関与することが多いのに対して,大学生は食物選択には認知要因,食物好悪にはイメージ要因が関与することが多くなり,発達とともに食物選択と食物好悪に関与する要因が異なってくることが示唆された.現在は,対象者によって選択された食物の栄養価について詳細な分析をおこなっている段階である.第2は,食物選択と食物嗜好に関する先行研究と家族と食行動に関する先行研究についての検討である.食物選択,食物嗜好に関しては,近年研究の進展がめざましく,より長期的な発達の中でどのように変化していくのか考察をおこなっている.また,子どもの食教育をおこなう上で,家族の中で食がどのようにとらえられているか検討することは必要不可欠なことである.そこで,主にマーケッティング関係の調査から得られた結果や個人の面接調査などをふまえた栄養学的な研究を収集し,家族における食の現状を検討中である.なお,本年度11月より1年間研究代表者が産休・育休のため,一時研究を中断する.従って,本報告は2004年10月まで実施した内容である.本年度は,食教育の観点からみた食物選択と食物嗜好との関連に関する発達心理学的研究における第1年目(後半)として,以下のような2つの基礎的研究を実施した(研究代表者は,本研究の初年度である平成16年11月より1年間産休・育休を取得したため,本報告は,平成17年11月から3月までに実施した内容である).第1は,食物選択と食物嗜好との関連についての調査対象者のうち,大学生を対象として,食物選択,食物嗜好と抑制的摂食,情動的摂食,外発的摂食に関する3つの食行動,肥満との関連について分析を実施した.その結果,男性は肥満の程度が高いほど野菜が中心の副菜の選択数が少ないが,栄養所要量と食物好悪には特徴がみられないこと,抑制的摂食は主菜の選択数が少なくそれに関係するタンパク質等の所要量が少ないことが示唆された.一方,女性は肥満と食物選択,食物好悪との間に関連はみられなかったが,外発的摂食は脂肪,糖質を多く含む料理を選択し,肥満につながりやすい料理を好むこと,抑制的摂食は選択数には特徴がないが,肥満につながりやすい料理を選択することが少なく,健康的なおやつを好むことが推察できる.第2は,食教育をおこなっていく上での基礎的資料として,子どもをもつ親がどのような食生活を営み,どのような食事観をもっているか,またそれらの背景として親の家事労働の時間等の変遷について,これまでに実施された大規模な調査を分析した.その結果,仕事をもつ夫婦の家事関連時間は,10年前よりは若干夫の分担が増えているものの,まだまだ妻の負担が大きいこと,家族の食卓には,年代を問わず中食の利用が増え,食が外部化されていること,家族が食卓を共にして同じメニューを食べるということが減ってきて,個食化が進んでおり,これを親は個人の尊重ととらえていること等が明らかになった.本年度は次以下の4つの研究を実施した。1.食の問題に関する保育土への調査公立保育園1園に在園した保育土,看護師,栄養土を対象に,近年保育回の中で子どもの食の問題と家庭での親の食への対応について自由記述を基本とした質問紙調査を実施し,それに基づきインタビューをおこなった。その結果,朝食の欠食,偏食の多さ,親の食事の偏り,食事としての内容の問題などが問題としてとらえられていた。2.乳幼児をもつ母親へのインタビュー調査公立保育園1園の0,2,4歳児クラスに在園する保護者を対象に,子どもの食の問題,家庭での食の悩みや工夫などをインタビュー調査した。その結果,子どもの食の問題でとても悩んだ経験のある保護者は1名のみであり,その他の保護者は特に困っているという状況ではなかった。

各クラスによって話し合われた内容は異なったが,多忙な中どのような食事作りの工夫をしているか等が中心となった。3.食の問題をもつ母親に対するインタビュー調査2のインタビューにおいて子どもの食の問題について困った経験のある母親を対象に,その子どもの妊娠時から現在にいたるまでの生育歴,家庭環境,具体的な食の問題の経過などをインタビュー調査した。なお,本年研究計画時には,対象児の縦断観察を実施する予定であったが,現在は食の間題が改善しているということから,観察対象者としての該当者がおらず,実施に至らなかった。4.大学生の食物選択に関する研究大学生56名に対して,昼食としてコンビニエンスストアのおにぎりとデパートの地下食料品店のおにぎりのいずれかを選択し,試食する実験的調査,普段の食への態度,食の位置づけ等に関する質問紙調査,日本版DEBQ質問紙,2日間に渡って購入した食品,飲食した内容を携帯の写真機能を使って送信してもらうことによる食事調査の3つを実施した。なお,これらの調査に関する分析は,次年度におこなう。今年度は,以下のことを実施した.1.平成18年度に実施した大学生の食物選択に関する分析平成18年度に大学生56名に対して実施した調査,すなわち昼食としてコンビニエンスストアのおにぎりとデパートの地下食料品店のおにぎりのいずれかを選択し,試食する実験的調査,普段の食への態度,食の位置づけ等に関する質問紙調査,日本版DEBQ質問紙,2日間に渡って購入した食品,飲食した内容を携帯の写真機能を使って送信してもらうことによる食事調査の3つに関する詳細な分析を実施した.2.中学生・大学生を対象とした調査研究中学生と大学生それぞれ男女10名ずつ,計20名を対象として,食物選択,食物嗜好に関する実験的研究,食態度に関する質問紙,DEBQ質問紙,偏食尺度,非連続の3日間にわたる実際の食事調査に関する携帯写真機能を利用した食事調査,分析を実施し,中学生と大学生の特徴についての比較をおこなった.3.幼児から大学生までの食教育に関する提案平成16年度から19年度までの幼児,中学生,大学生の調査結果に基づき,発達心理学的な視点からの食教育について提案した.その際に重要なこととして,特に年齢が低い段階における母親へのアプローチが必要であることを指摘している.近年,子どもの体型は,肥満とやせの両極化が顕著であり,そのような変化を大きな問題と考えられる.本研究では,そのような観点も念頭においた食教育の重要性を論じている.
キネシンモーター分子群による細胞内物質輸送の分子機構：構造、機能、動態及び制御

神経細胞を始め全ての細胞機能の基盤となる細胞内輸送機構をその主役であるキネシンスーパーファミリーモーター分子群(KIFs)を中心に解明した。分子細胞生物学、分子遺伝学、構造生物学を駆使して、13種の新しいKIFsの一次構造を決定し、以下を明らかにした。KIF1A/KIF1B beta及びKIF17の解析により、KIFsは、主にアダプター蛋白質を介してカーゴ膜小器官を認識・結合し、カーゴとの乖離は、small G-proteinのGTP加水分解とモーター尾部のリン酸化がその主な機構である。輸送の方向性決定の重要な機構として、軸索微小管が、GTP tubulinに富むことが重要である。KIF4は、活動依存性の神経細胞の生死を決定する鍵分子であり、KIF26Aは、GDNF/Retシグナル伝達の抑制因子として働き、腸管神経節の発生を制御し、KIF16Bは、FGF受容体の輸送により、初期発生に必須であり、KIF17は、NMDA受容体を輸送するだけでなく、リン酸化CREBを介してKIF17,NR2B mRNAの転写,蛋白合成、NR2Aのユビキチン・プロテアゾーム系による分解を制御し、記憶・学習の重要な基盤となることと解明した。Mg^<++>ADPから水分子とMg^<++>が抜ける過程の構造を解明しATP加水分解のほとんどの過程の構造を明らかにして、モーター分子の動く機構を解明した。神経細胞や上皮細胞をはじめすべての細胞は、細胞の機能にとり必須の機能蛋白分子を合成後、様々な膜小器官あるいは蛋白複合体さらにはmRNA蛋白複合体として目的地へ適正な速度で輸送する必要がある。この細胞内の物質輸送は細胞の重要な機能、形作りそして生存のため必須である。私達は今までにこの輸送機構の主役である微小管をレールとしたキネシンスーパーファミリーモーター分子群(KIFs)を発見し哺乳類の全遺伝子45個を同定した。この研究は, KIFの細胞及び、個体レベルの機能、作動原理等すべての課題について世界に先駆けて研究を大きく発展させることを目的とする。具体的には以下の課題を研究する。(1)新しいモーター分子の構造と機能の分子細胞生物学的解析(2)モーター分子によるcargoの認識・結合およびその制御機構(3)モーター分子による細胞内輸送の振り分け機構(4)モーター分子の機能の分子遺伝学的解析(5)モーター分子によるmRNAの輸送機構の解明(6)モーター分子の作動機構及びCargo結合機構の構造生物学的・生物物理学的解析神経細胞を始め全ての細胞機能の基盤となる細胞内輸送機構をその主役であるキネシンスーパーファミリーモーター分子群(KIFs)を中心に解明した。1.新しいモーター分子の構造と機能の分子細胞生物学的解析。主に13種のKIFについて細胞内での機能を明らかにするため、全長配列の同定、発現様式の解析、抗体の作成、結合蛋白の解明、RNAiによる発現阻害による機能阻害等の分子細胞生物学的解析を行っている。2.モーター分子によるcargoの認識・結合およびその制御機構。制御機構の有力な候補として、グルタミン酸受容体を輸送するKIF17についてはリン酸化による制御を明らかにしつつある。また幼若神経細細に多く発現されるKIF4が核内でPARP1と結合しPARP1の活性を抑制するが神経細胞の活動依存性にCaM kinaseIIによりPARPがリン酸化されるとKIF4からはずれPARP1は活性化し、KIF4は核から出てモーター分子として働くことを明らかとした。モーター分子が活動依存性に神経細胞の生存をコントロールする分子スイッチであることを明らかにした。(Midorikawa, et. al. Cell 2006)3.モーター分子の機能の分子遺伝学的解析。新しく同定されたKIFについてそのKOマウスを作成し、すでに樹立されたKIFKOと共にその表現型の解析を分子細胞生物学的手法を駆使して行っている。4.モーター分子によるmRNAの輸送機構の解明。GST pull-down法を用いて解離させたタンパクーRNA複合体から直接KIF5に結合するタンパク質を単離同定し、そのタンパク質とKIF5との結合部位を決定した。神経機能とmRNAの輸送の関係を解析している。

5.モーター分子の作動機構及びcargoの結合機構の構造生物学的・生物物理学的解析。電子顕微鏡:モーター分子KIFの動きの仕組みの解明の為には、レールである微小管との相互作用の解析が不可欠である。この目的には、クライオ電子顕微鏡が非常に有効である。電解放射型透過型電子顕微鏡を用い精度の高い画像解析により、2次構造に迫る10Åの解像度を達成した。(Kikkawa & Hirokawa EMBO J2006)1.新しいモーター分子の構造と機能の分子細胞生物学的解析:主に13種のKIFについて細胞内での機能を明らかにするため、全長配列の決定,発現様式の解析、抗体の作製、結合蛋白の解明、RNAiによる機能阻害等の分子細胞生物学的解析を行っている。2.モーター分子によるcargoの認識・結合およびその制御機構:NMDA型グルタミン酸受容体を主に樹状突起で輸送するKIF17による輸送をモデルとして、KIF17c末1029セリンがCaMKinaseIIにより燐酸化されるとアダプター蛋白、Mint1との結合が乖離し、cargoを脱離することを明らかにした。(Guillaud, et. al. Nature Cell Biol.2008)3.モーター分子の機能の分子遺伝学的解析:新しく同定したKIFについてKOマウスを作製し、すでに樹立されたKIF KOマウスとともにその表現型の解析を分子細胞生物学的手法を駆使して行っている。1)モーター分子によるカーゴの認識・結合及と制御機構(a)燐酸化によるカーゴの結合の制御機構: KIF17は足場蛋白Mint1を介して、グルタミン酸受容体を認識しこれを神経樹状突起で輸送する。FRETを使って、KIF17の尾部とカーゴの結合の制御機構を解析した。KIF17尾部にCaMKIIが結合し、活性化されるとKIF17尾部Ser1029がリン酸化されカーゴのMint1が、KIF17より脱離し、シナップス後部へ受容体が組み込まれることが分かった。(Guillaud et.al. NatuFe Cell Biol 10 : 19-29, 2008)2)モーター分子の作動機構の構造生物学的解析ATP加水分解の律速段階であるMg^<++>ADPからADP状態にいたる課程の構造をKIF1Aのモーター領域についてX線結晶解析により初めて解いた。(Nitta et.al. Nature Struct Mol Biol 15 : 1067-1075、2008)ADPはMg及びその配意水の密な水素結合ネットワーク(Mg-water cap)に覆われ、ATPポケット内にトラップされ、さらにSwitch I, Switch IIを介してL7に結合し安定化されていた。L7の先端部は微小管センサーとして働きbeta tubulinのH4 helixを認識すると静電的引力により引かれる。するとL7とADPの周りの結合が外れ、Mg-watercapが外れ、ADPが出て行く。ATP加水分解の重要なステップである微小管による化学的チェックポイント解除の原子レベルの機構が明らかとなった。
酵母プリオンタンパク質の線維形成機構の解明

プリオンは,正常型タンパク質からプリオン型タンパク質への構造変換を触媒することによって伝播する感染性のタンパク質である.哺乳類プリオン(PrP)はヒトにおいてはヤコブ病,牛においては狂牛病の原因となる.酵母においても[PSI^+]などのタンパク質性の遺伝因子が存在する.[PSI+]は翻訳終結因子であるSup35の凝集体の自己増幅によって引き起こされる.in vitroにおいて,Sup35N末ドメイン(Sup35NM)は線維化し,in vivoにおける凝集体形成を再現できると考えられている.これまでに当研究室ではin vitroにおいて,Sup35NMが線維化する際に自己触媒的な構造変換が必要となる可能性を見出した.in vitroにおける線維化反応の機構をさらに理解するには速度論的なパラメーターを求めることが前提となる.そこで本研究では最初にSup35線維化反応を速度論的に解析することにした.Sup35NMの線維化を検出する方法として,アミロイド線維に特異的に結合し,蛍光を発する色素であるThioflavin Tを用いた方法およびSup35NM線維がSDSに耐性であることを利用して,Sup35NMのモノマー量をSDS-PAGEによって定量する方法を構築した.この方法を用いて臨界濃度,kon,およびkoffを求めたところ各々300nM,0.22μM^<-1>s<-1>,および0.072 s<-1>となった.臨界濃度はサブミリモーラーとなったこと,プロットから求めた直線から考えてもSUP35NMの線維化反応は不可逆的な反応であることが示唆された.プリオンは,正常型タンパク質からプリオン型タンパク質への構造変換を触媒することによって伝播する感染性のタンパク質である.哺乳類プリオン(PrP)はヒトにおいてはヤコブ病,牛においては狂牛病の原因となる.酵母においても[PSI^+]などのタンパク質性の遺伝因子が存在する.[PSI+]は翻訳終結因子であるSup35の凝集体の自己増幅によって引き起こされる.in vitroにおいて,Sup35N末ドメイン(Sup35NM)は線維化し,in vivoにおける凝集体形成を再現できると考えられている.これまでに当研究室ではin vitroにおいて,Sup35NMが線維化する際に自己触媒的な構造変換が必要となる可能性を見出した.in vitroにおける線維化反応の機構をさらに理解するには速度論的なパラメーターを求めることが前提となる.そこで本研究では最初にSup35線維化反応を速度論的に解析することにした.Sup35NMの線維化を検出する方法として,アミロイド線維に特異的に結合し,蛍光を発する色素であるThioflavin Tを用いた方法およびSup35NM線維がSDSに耐性であることを利用して,Sup35NMのモノマー量をSDS-PAGEによって定量する方法を構築した.この方法を用いて臨界濃度,kon,およびkoffを求めたところ各々300nM,0.22μM^<-1>s<-1>,および0.072 s<-1>となった.臨界濃度はサブミリモーラーとなったこと,プロットから求めた直線から考えてもSUP35NMの線維化反応は不可逆的な反応であることが示唆された.
マイクロリアクターを用いた光反応システムの構築

光源と反応場の特徴を有効に組み合わせた光反応システム開発を目指し、光不斉合成、光触媒の酸化、還元力を用いた有機反応等をモデル系として、光反応に最適化したマイクロリアクターを設計、高収率、高選択率反応プロセスの実現を目的に研究を進めた。まずマイクロリアクターを用いた光不斉増感反応の実効性の検証を試みた。(Z)-シクロオクテンの光増感エナンチオ区別異性化反応、および(R)-(+)-リモネンへのメタノール極性付加反応をマイクロリアクター中とバッチ反応容器中で行ったところ、バッチ反応容器に比べマイクロリアクター中では極めて短い滞留時間で高い収率が達成された。またマイクロリアクター中でフロー条件を制御することにより、副反応を誘起するラジカルの生成が抑制され、反応の選択性が向上することが明らかとなった。マイクロリアクターの流路内に酸化チタンを担持させ、光触媒の酸化力を用いた環境汚染物質の分解、光触媒によるニトロ基の還元などの反応を行わせると、極めて短時間に高い収率が得られた。光源としてのUV-LEDの利用は装置全体の小型化、フォトンコスト低減に極めて有用であり、光触媒担持マイクロリアクターと組み合わせると、フォトン効率もバッチ系に比べ1桁以上高くなることが見出された。またアミンのアルキル化の研究では、通常のバッチ反応系では進行しない、あるいは事実上観察できないほどに効率の低い反応が、比界面積の極めて高いマイクロリアクターでは発現することが明らかとなった。マイクロ流路型のリアクター表面に光触媒を担持させれば、比表面積が極めて大きいことから効率よく光触媒反応を行わせることが可能となると考えられる。そこで本研究では酸化チタン膜を流路内に焼成させたマイクロリアクターを用い、有害化学物質、内分泌撹乱物質類のモデル化合物として、ジメチルホルムアミド、3-クロロフェノール、およびビスフェノールAの光分解に応用した。反応容器のみならず装置全体の小型化を達成するため、光源としてレーザー、紫外ランプに加え、紫外発光ダイオードを用いた光分解を試みた。滞留時間5秒の場合3-クロロフェノールで分解率30%、ビスフェノールAで分解率13%とバッチ反応容器の場合と比べ極めて短時間に高い分解率が得られることが明らかとなった。さらにこのマイクロ反応容器を有機合成反応に応用するため、モデル反応としてアルコール溶媒中でのベンズアルデヒドのベンジルアルコールへの還元、およびニトロトルエンのトルイジンへの還元反応を用いて反応効率、反応機構の検討を行った。いずれに反応もバッチ系に比べ極めて短時間に高効率に反応が進み、マイクロリアクターを用いた光触媒反応系の有用性が示された。さらに流路形状、励起波長、光照射時間、酸化チタン膜厚、結晶構造などの反応条件の最適化を行い、またリアクターを積層化した場合の光損失、リアクター形状と光源の性質等を考慮しながらナンバリングアップ手法を探った。これらの技術の確立にょる、光源とマイクロリアクターを複合化した省資源、省エネルギー、環境負荷低減型の新規マイクロ化学プロセスの開発を目指した研究が進捗している。近年、マイクロリアクターを用いて高速混合、高速熱交換、高い比表面積、層流の形成が容易、といった特性を活かした各種反応系の開発が進められている。一方で、マイクロリアクターの特性を光反応に応用しようという試みはまだほとんど行われていないと言える。そこで本研究では光源と反応場の特徴を有効に組み合わせたマイクロ光化学システムの構築を目指し開発を行った。まず顕微分光法を用いてマイクロリアクター反応場を解析しながら、光反応に最適化したマイクロリアクターを設計、高収率、高選択率反応システムの開発を試みた。流路内に光触媒薄膜を担持したマイクロリアクターを用いると、比表面積が非常に大きいという効果が顕著に現われ、有機化合物の酸化分解、還元反応が極めて高効率に進行することが明らかとなった。アミンのN-アルキル化反応等では、バッチ系と異なる、マイクロ反応場特有の新規な反応性を示す系の存在することが見出された。

通常のバッチ反応系では進行しない、あるいは観察できないほどに効率の低い反応が、比界面積の極めて大きいマイクロリアクターでは発現したものと考えられる。またフロー条件の精密な制御により、逐次的な反応の生成物の比を制御することが出来るという結果が、このアミンのアルキル化、オレフィンの酸化反応などの研究で得られた。リアクターを積層化した場合の光損失、最適な流路形状、光源の性質等を考慮しながらナンバリングアップ手法を探り、省資源、省エネルギー、環境負荷低減型のマイクロ光化学システム構築のための基礎データを得た。
顎関節症の環境・宿主因子に関する疫学的研究

一次調査ならびに予備調査の結果を踏まえて,改変・追加を経て2003年8月までに二次調査のための調査票を作成し,二次調査を1年間実施した.1.集計結果適応基準に合致する対象患者555名に調査への参加を要請し,542名(97.7%)から調査票を回収した.集計データの代表値は中央値(25,75パーセンタイル)で示す.女性389名,男性153名,年齢中央値は34歳(25,51歳),症型割合はI型21.6,II型15.3,III型56.3,IV型5.4,V型1.3%だった.症状では無痛開口域35mm(27,42mm)有痛開口域40mm(32,46mm),疼痛部位では咬筋と下顎頭外側極が最も多かった.日常生活障害では大開口に関する障害が最も多く,食品摂取支障度でも開口困難が強かった.疼痛強度(100mmVAS)は33mm(15,59mm)であり,疼痛性質は鈍痛的,情動的表現が強かった.半数が頭痛を自覚し緊張型頭痛が多かった.疑診以上の不安は40%,抑うつは19%を示し,性格的には神経症と外向的傾向は同程度だった.生活上の寄与因子では多忙,上下歯列接触癖,キーボード作業,片咬み癖などが多かった.咬みあわせ違和感の自覚は42%にみられ,違和感強度(100mmVAS)は43mm(16,74mm),持続期間は7週(3,7週)だった.2.分析結果予備調査に組み込み,今回も調査した日常生活障害質問項目の交差妥当性を両調査結果を用いて検討し,良好な結果が得られた.疼痛の慢性化に関与する要因を検索し,不安,生活習慣としての高い・硬い枕の使用,うつ伏せ読書,不良姿勢,重量物運搬などが抽出された.今回初めて調査票に組み込んだ咬みあわせ違和感に関連する要因を検索し,睡眠状態の悪化,食品のすりつぶし困難感,片かみ癖,夜間ブラキシズムの自覚といった項目との関連を見出した.今回の調査結果から本調査票の有用性が確認できた.一次調査ならびに予備調査の結果を踏まえて,改変・追加を経て2003年8月までに二次調査のための調査票を作成し,二次調査を1年間実施した.1.集計結果適応基準に合致する対象患者555名に調査への参加を要請し,542名(97.7%)から調査票を回収した.集計データの代表値は中央値(25,75パーセンタイル)で示す.女性389名,男性153名,年齢中央値は34歳(25,51歳),症型割合はI型21.6,II型15.3,III型56.3,IV型5.4,V型1.3%だった.症状では無痛開口域35mm(27,42mm)有痛開口域40mm(32,46mm),疼痛部位では咬筋と下顎頭外側極が最も多かった.日常生活障害では大開口に関する障害が最も多く,食品摂取支障度でも開口困難が強かった.疼痛強度(100mmVAS)は33mm(15,59mm)であり,疼痛性質は鈍痛的,情動的表現が強かった.半数が頭痛を自覚し緊張型頭痛が多かった.疑診以上の不安は40%,抑うつは19%を示し,性格的には神経症と外向的傾向は同程度だった.生活上の寄与因子では多忙,上下歯列接触癖,キーボード作業,片咬み癖などが多かった.咬みあわせ違和感の自覚は42%にみられ,違和感強度(100mmVAS)は43mm(16,74mm),持続期間は7週(3,7週)だった.2.分析結果予備調査に組み込み,今回も調査した日常生活障害質問項目の交差妥当性を両調査結果を用いて検討し,良好な結果が得られた.疼痛の慢性化に関与する要因を検索し,不安,生活習慣としての高い・硬い枕の使用,うつ伏せ読書,不良姿勢,重量物運搬などが抽出された.今回初めて調査票に組み込んだ咬みあわせ違和感に関連する要因を検索し,睡眠状態の悪化,食品のすりつぶし困難感,片かみ癖,夜間ブラキシズムの自覚といった項目との関連を見出した.今回の調査結果から本調査票の有用性が確認できた.平成1213年度に実施した予備調査結果の解析から,本調査に用いる調査票項目を一部改変した.すなわち,因子分析から日常生活障害に関する13項目は10項目に,日本語版マギル疼痛質問票歯科領域版も元の24表現から13表現に減らすことができた.さらに顎関節症の症状維持に関連する寄与因子の調査項目は,yes/noの回答から5段階のリッカートスケールに変換した.また予備調査の段階で頭痛を訴える症例,あるいはかみあわせの違和感を訴える症例がしばしば見られていることから,これらの質問項目を加えるとともに,予備調査と同様に不安および抑うつをスクリーニングするためHospital Anxiety and Depression Scale (HADS),ならびに神経症と外向性性格傾向調査票であるEysenck Personality Questionnaire Short-from (SEPQ)を含めて本調査票を完成した.この調査票を用いた来院患者での横断調査は,東京医科歯科大学歯学部および東京慈恵会医科大学・医学部における倫理委員会の承認を経て2003年9月から開始した.症例の選択基準は1.除外診断法にて他疾患の鑑別が終了している.

2.日本顎関節学会診断基準に準ずる一次診断がついている.3.顎関節領域ないし咀嚼筋等に1週間以上継続する疼痛を有する.4.年齢12歳以上.5.新患ならびに他施設からの治療継続依頼患者を問わないが服薬中の患者ではWashout期間をおく,とし,除外基準は1.他疾患に由来する疼痛を有する.2.系統的骨・関節疾患を随伴している.3.12歳未満.4.消炎鎮痛薬,抗不安薬,抗うつ薬,抗精神薬を定期的に服用している.5.第二大臼歯単独欠損を除く放置臼歯部欠損があるとした.2004年1月末段階でインフォームド・コンセントを得た約100名の対象患者から質問票を回収し,順次データベースを構築しつつある.平成15年9月1日から翌年8月31日まで一年間,1週間以上持続する疼痛をもつ顎関節症新患患者を対象として,自記式質問票による調査を実施した.内容は疼痛,機能障害による日常生活での障害種類とその程度,疼痛種類と強度,頭痛の有無種類と強度,不安と抑うつの程度,神経症的傾向と外向的傾向,日常生活上の寄与因子として習慣や癖・スポーツ実施状況・職場や学校,家庭生活上の環境要因・睡眠中のブラキシズムの自覚程度・楽器や歌唱等の有無と程度,咬合違和感の有無と程度である.また米国で使用されているRDC/TMD調査票との相関を調べるために,同質問票における障害の有無,疼痛程度項目も和訳版を用いて同時に調査した.調査には550名の患者が参加し,そのうち542例(女性389名71.8%,男性153名28.2%)を解析対象とした.年齢(中央値,25および75パーセンタイル)は34(25,51)歳であった.症型別ではI型117例21.6%,II型83例15.3%,III型305例56.3%,IV型29例5.4%と分類された.現時点ではまだ予備的解析段階ではあるが,生活障害項目ならびに疼痛に関してRDC/TMD調査項目との相関係数は0.5-0.6と高かった.障害項目ではあくびのような大開口,長時間食事の困難が多く見られた.VASによる初診時疼痛強度は33(15,59)mmであり,疼痛表現では「疲れる」,「わずらわしい」が最も強く意識されていた.頭痛では緊張型頭痛が最も多く,付随する肩こりは30%以上の患者が自覚していた.不安および抑うつの存在が疑われる割合はそれぞれ39%,19%であった.生活上の要因として程度の差はあれ,80%以上の患者が睡眠不足,硬固食品嗜好,上下歯列接触癖,多忙,生活上の心配を有していた.咬合違和感の訴えは約半数の219例に見られ,VASによるその強度は44(17,75)mmであった.
ルイス酸性のない一電子酸化剤を用いた官能基許容性の広い一電子酸化反応の開発

複雑化合物の特定の官能基を変換できる有機反応は、医薬や天然物の種々の誘導体合成を可能にし、新たな医薬のスクリーニングに有用である。一電子酸化剤を用いた反応は、ラジカル種・カチオン種・ラジカルカチオン種といった様々な活性種由来の分子変換ができることが知られているため、医薬や天然物の誘導体合成へ応用できれば創薬において強力なツールになりえる。しかし一般的に強力な一電子酸化剤はルイス酸性を有しており、配位性の官能基で失活してしまう。そのため一般的な一電子酸化剤を用いた反応の官能基許容性はしばしば狭くなり、複雑化合物の誘導体合成による生理活性物質のスクリーニングに十分利用されているとは言えない。本年度はまず、ルイス酸性のない一電子酸化剤として最適な中心金属、配位子を持つ錯体の合成を検討した。その結果、中心金属として鉄、配位子としてフェナントロリンを持つFe(phen)3(PF6)3が、様々な官能基が系中に存在しても、一電子酸化剤として働くことを見出した。本錯体を用いて、芳香族化合物のラジカルカチオンを発生させ、系中のピリジンと反応させ、N-アリールピリジニウムイオンを得たのち、ピペリジンで処理することによって芳香族第一級アミンが得られることを見出した。本反応は期待通り官能基許容性が非常に広く、エステル、アミド、メトキシ基、メチル基が存在しても円滑に反応が進行することを見出した。これは系中の官能基によってFe(phen)3(PF6)3が失活しなかったためと考えられる。またベンジルシランをアセトニトリル中でFe(phen)3(PF6)3によって酸化することで、ベンジルアセトアミドが得られることを見出した。本反応は収率に改善の余地を残すが、炭素ケイ素結合を炭素窒素結合に変換する新たな手法であるといえる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
神経Ca^<2+>チャンネルの生理機能と調節機構に関する研究

1)蛋白リン酸化酵素A(PKA)に上る神経Ca^<2+>チャンネルの調節本研究の目的は、神経性Ca^<2+>チャンネルであるP/Q型(α1A)やN型(α1B)チャンネルが、PKAによりどのような調節を受けるのか、その分子機構を明らかにすることである。この2年間で、当初研究計画のほぼ全てを完了した。即ち、1)PKAによりP/Q型チャンネル活性が増強されること、2)パッチクランプ法を用いた単一チャンネル解析で、PKAはP/Q型チャンネルの単位コンダクタンスには影響を与えなかったこと、3)キメラチャンネルや変異α1Aサブユニットを用いて、α1AサブユニットC末に存在する1スレオニン残基がPKAによるP/Q型チャンネル調節に必須であることを同定したこと、4)α1Aリン酸化ペプチドに対する抗体を調製し、3)で同定したスレオニン残基がPKA依存性にリン酸化されることを確認したこと、5)4)の抗体を用いて、ラット小脳でもP/Q型チャンネルα1Aサブユニットがリン酸化されていることが明らかとなったことである(論文投稿中)。残された問題は、in vivoにおけるP/Q型チャンネルのPKA依存性リン酸化の意義であり、脳切片でのパッチクランプを現在進行中であり、また、このスレオニンを慣換した変異α1Aサブユニットのノックインマウス作製を開始した。本研究の目的は、P/Q型やN型チャンネルを特異的に阻害するDHP誘導体開発のための基礎的データを提供することである。N型とR型チャンネル間の1アミノ酸置換を行った変異チャンネルα1サブユニットを用いて、DHP誘導体であるAmlodipineのN型チャンネル活性阻害効果の実体が、Amlodipineのα1Bサブユニットに対する高親和性結合部位の存在にあることを明らかにし、この結合部位の形成に必須のロイシン残基を同定した(論文準備中)。心臓のL型Ca^<2+>チャンネルの蛋白リン酸化酵素A(PKA)による活性増強はよく知られた現象である。しかし、神経性Ca^<2+>チャンネルであるP/Q型やN型チャンネルが、PKAによりどのような調節を受けるのか、その分子機構には不明な点が多い。この問題を解決するため、α1A(Ca_v2.1)およびα1B(Cav_2.2)Ca^<2+>チャンネルをアフリカツメガエル卵母細胞およびベビーハムスター腎(BHK)細胞に機能的に発現させた。PKAの特異的阻害剤(H89、Rp-cAMPS)により、α1A(P/Q型)チャンネル活性の減少が見られた。このPKA特異的阻害剤の効果は、蛋白脱リン酸化酵素阻害剤(オカダ酸、calyculin A、cyclosporin A)の前処理で抑制された。一方、PKAの触媒サブユニッ卜の細胞内微量注入により、P/Q型チャンネル活性の増強が見られた。パッチクランプ法(cell-attached)でα1Aチャンネル電流を観察したところ、PKAの特異的阻害剤は単一コンダクタンスを変えることなく、有意に単一電流を減少させることが分かった。また、PKA特異的阻害剤の抑制効果は、チャンネルα2/δサブユニットの共発現ではなく、βサブユニットの共発現で増強された。以上のことから、P/Q型チャンネルの一部は静止状態でPKAにより活性化されており、そのチャンネル活性は、リン酸化の程度と脱リン酸化の程度のバランスにより決まることが示唆された。一方α1B(N型)チャンネルに対しては、たとえチャンネルβサブユニットを共発現させても、PKA阻害剤は大きな効果を示さなかった。

さらに、P/Q型とN型とのキメラチャンネルや、P/Q型のC末削除変異チャンネルを用いて、P/Q型チャンネルのC末が、PKAによるチャンネル活性調節に必須であることを確認した。1)蛋白リン酸化酵素A(PKA)による神経Ca^<2+>チャンネルの調節本研究の目的は、神経性Ca^<2+>チャンネルであるP/Q型やN型チャンネルが、PKAによりどのような調節を受けるのか、その分子機構を明らかにすることである。この2年間で、当初研究計画のほぼ全てを完了した。本年度の実績は、1)Cell-attachedパッチクランプ法を用いた単一チャンネル解析で、PKAはP/Q型チャンネルの単位コンダクタンスには影響を与えなかったこと、2)点変異α1Aサブユニットを用いて、PKAによるP/Q型チャンネル調節に必須のスレオニン残基を、α1AサブユニットC末で同定したこと、3)α1Aリン酸化ペプチドに対する抗体を調製することで、2)で同定したスレオニン残基がPKA依存性にリン酸化されることを確認したこと、4)3)の抗体を用いて、ラット小脳でもP/Q型チャンネルα1Aサブユニットがリン酸化されていることが明かとなったことである(論文投稿中)。残された問題は、in vivoにおけるP/Q型チャンネルのPKA依存性リン酸化の意義であり、脳切片でのパッチクランプを現在進行中であり、また、このスレオニンを置換した変異α1Aサブユニットのノックインマウス作製を開始した。本研究の目的は、P/Q型やN型チャンネルを特異的に阻害するDHP誘導体開発のための基礎的データを提供することである。N型とR型チャンネル間の1アミノ酸置換を行った変異チャンネルα1サブユニットを用いて、DHP誘導体であるAmlodipineのN型チャンネル活性阻害効果の実体が、Amlodipineのα1Bサブユニットに対する高親和性結合部位の存在にあることを明らかにし、この結合部位の形成に必須のロイシン残基を同定した(論文準備中)。