hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
女子の理科学習促進のための指導方法・教材の開発

本研究では、女子の理科学習に対する意識や態度の低下が顕著な中学校理科「力学」と「電流」に関する授業において、女子の学習を促進する指導方法と教材を実践的に開発した。その結果、女子の関心や経験に基づき、人体と物理概念とを関連づける「人体アプローチ」、調理と物理学習とを結びつける「料理アプローチ」、実験に美的観賞を取り入れる「美的アプローチ」を教授展開や活動に導入し、女子が協同的な問題解決活動を行える集団組織を編成することが女子の理科学習に効果的であることを明らかにした。本研究は男子と比較して顕著に低下する女子の理科学習に対する意識や態度を改善する三とを目指し、中学校の通常の理科授業に導入しうる具体的な指導方法や教材を開発することを目的としている。同様な状況を打開するための諸外国の先端的な研究を参考にし、(1)人体アプローチ、(2)料理アプローチ、(3)美的アプローチの3種類の方策を創出した。人体アプローチについてはすでに、ず中学校理科の「仕事の原理」の授業に看護的文脈を用いて導入し、22年度はその評価から開始した。その結果、人体アプローチを実践した授業によって、理科の勉強の大切さおよび日常生活や将来への理科の有用性に関する女子の認識が向上したことに加え、協同的な活動を授業に導入することと、学習内容に関する女子の理解度への教師の配慮が女子の物理学習促進につながることを見出した。つぎに、料理アプローチを具体化するために、女子の学習促進の観点による諸外国での料理を題材とした理科授業の特徴を分析した。それらは特に物理学(熱力学やエネルギー等)や生物学の領域で多く実践され、1時間のみの単発授業ではなく、多様な科学概念の学習に「料理」や「食品」に関する題材が用いられていた。また、料理を題材にしているものの「食べる」という行為自体は授業中には行われていないことや、料理を授業の導入時のトピックとしてだけではなく、授業全体に渡る文脈として利用する、つまり、コンテクストベースドアプローチの手法がとられていたことも明らかになった。料理アプローチは女子だけでなく、理科を苦手とする全ての学習者を支援することができ、シェフやパティシエ、食品メーカーの開発者等の職業を利用することでキャリア教育の視点からの効果を期待できることも示した。23年度はこれらの知見に基づき、料理アプローチと美的アプローチを中学校の理科授業においてアクションリサーチ的に実践し、評価することを計画している。本研究では、理科学習に対する女子の意識や態度を改善するための指導方法や教材を開発することを目的とした。具体的には、女子の「理科離れ」が顕在化する中学校理科第1分野の物理学関連領域の授業改善を目指した。23年度においては、その中でも女子が最も苦手とする「電流」単元を対象とし、新潟県内の中学校第2学年の2クラスの理科授業において、開発した方策を単元全体に渡り導入し、生徒の認知的・情意的側面の変容を授業への参与観察や質問紙調査、ワークシートの記述内容等から詳細に調査し、女子の理科学習促進の有効性を検証した。「電流」単元に導入した教授方法・教材は、女子の興味・関心に基づくトピック、創造的・想像的なライティング活動、協同的な問題解決を取り入れた実験の3種類である。これらは女子の理科学習促進に関する研究が進んでいる諸外国において実践された方策と、女子の理科学習に関する日本における先行調査の結果とを勘案して創出した方策である。この3種類の方策を授業に導入する際には、次のアプローチに基づいて具体的な教授内容を選択した。女子は理科の中でも人体の構造や機能に関心が高いことから、それらの内容と物理概念との関連を強調して教授する「人体アプローチ」、女子の身近な経験である調理を物理学習と結びつける「料理アプローチ」、女子は美的な評価を重んじることから、美的要素を観賞できる実験を用いて教授する「美的アプローチ」である。一般的に女子の学習意欲が著しく低下する「電流」単元であるが本実践においては、女子の理科学習に対する意識や態度は低下せず、方策の中でも美的な観賞を取り入れた協同的な問題解決活動の効果が大きく、女子が最も好感を示す方策であったことが明らかとなった。加えて、男子の理科学習に対する意識も向上し、これらの方策が男子の学習を阻害するものではないことも証明できた。
他者との接触がｗｅｌｌ－ｂｅｉｎｇに及ぼす影響－日本型高齢者モデルの構築－

本研究は日本学術振興会特別研究員(PD)採用期間の3年間でwell-beingの概念の整理(研究1)と他者との役割関係が自己過程を通して高齢者のwell-being全体に与える影響を検討する(研究2)ものである。その2年目として、平成26年度は、研究1のためにウィスコンシン大学における研修(8月まで)、研究2に関するデータ(MIDUSおよびMIDJAのデータアーカイブ)の分析、学会発表、学術論文としての投稿などを予定していた。ウィスコンシン大学の研修は平成25年12月より実施し、平成26年8月で終了した。その中で、子どもや配偶者との関係性が自尊感情に与える影響は、アメリカにおいてはライフコースを通して一定であるが、日本では発達段階によって異なることを示し、他者との役割関係と自尊感情(自己過程に関する変数)の関係が日米で異なる傾向を持っていることが示唆された。この結果について、現在論文にまとめ学会誌に投稿中である。また、社会情動的選択性理論を検証するために、MIDUSおよびMIDJAの分析を実施し、加齢とともに顕著になる人間関係の自由な選択は、日本よりもアメリカの文化の中において可能になり易いことを示した。この結果は、GSA's 67th meetingで発表された。また、研究2に関しては、1年目に取得した日本の高齢者のデータを整理した。これにより分析が可能な状況となり、既に大まかな分析結果を実施済みである。この結果を、平成27年度の国内および国際学会にて発表予定である。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は3年間でwell-beingの概念の整理(研究1)と他者との役割関係が自己過程を通して高齢者のwell-being全体に与える影響を検討する(研究2)ものである。その1年目として、平成25年度は、研究1のためにウィスコンシン大学にて研修を受ける、研究2に関するデータ(MIDUSおよびMIDJAのデータアーカイブ)の分析、研究2の予備調査の実施およびそれらの学会発表などを予定していた。ウィスコンシン大学の研修は平成25年12月より実施しており、その中でMIDUSおよびMIDJAのデータ分析を行っている。現時点で明らかとなった内容としては、子どもや配偶者との関係性が自尊感情に与える影響は、アメリカにおいてはライフコースを通して一定であるが、日本では発達段階によって異なることを示し、他者との役割関係と自尊感情(自己過程に関する変数)の関係が日米で異なる傾向を持っていることが示唆された。また、この結果は、15th SPSP (Society for Personality and Social Psychology) annual meetingにおいて学会発表を行った。また、研究2の予備調査としては、シルバー人材センターの会員279名に対して、2波の同一パネル調査を実施した。平成25年6月に実施した弟1波のデータは既にデータ入力およびデータ整理を終了し、分析が可能な状況にある。一方で、2月に実施した第2波のデータは、データ入力中であり、分析はデータ整理後になる。このデータの分析により、役割アイデンティティ(自己過程の1つ)の測定方法を従来のものより改善することができるであろう。ウィスコンシン大学における研修の開始時期が、ビザ等の申請の問題から、当初予定していた平成25年10月からやや遅れ、12月となった点を除けば、概ね順調に進展している。そのため、評価は2とした。平成26年度は、前年度の成果の発表および平成27年度の調査へ向けた準備が主な課題となる。平成27年度は他者との接触がwell-beingに及ぼす影響のメカニズムを同定するための大規模な調査を実施する。この調査は住民基本台帳等を基に無作為抽出した高齢者を対象とするため、平成26年度には自治体等との連携を模索し、調査実施のためのネゴシエーションを行う。また、その過程で更なる研究論文のレビュー、最新の知見の入手(学会などへの参加)も実施する。現時点で、遂行上の問題点は特にない。
ヘアピンプライマーＰＣＲ法を用いたウイルスの高感度検出法に関する研究

我々はシトシンバルジに特異的に結合し、特徴的な蛍光を発する低分子リガンド(DANP)を見いだし、このDANPを用いたPCRの蛍光モニタリング法についての報告を行っている。今回、実用的な迅速且つ高精度なウイルス検出法を目指し、蛍光強度増加型ヘアピンプライマーPCR法への改良による検出の高感度化、ヘアピンプライマーPCR法(HP-PCR法)によるウイルスの感染の確定診断技術開発、新規蛍光分子の開発について検討した結果、既存の技術とは異なった、PCRの進行に伴って蛍光強度が増大する蛍光増大型のPCR法の開発に成功した。この方法はまたRNAの検出に応用可能であることも明らかにした。まずは今まで行っていた蛍光減少型のHPーPCR法を使ったHCVのウイルス検出に応用した。HCVはRNAウイルスであるため、逆転写した後にPCRが必要となる。ウイルスに特異的なヘアピン構造が付加された二種類のヘアピンプライマーを用意し、1チューブ内に患者の血清からの抽出液とプライマーをポリメラーゼを混合し逆転写-PCRを行った。PCRは進行し、夾雑物存在下でもウイルスの検出が可能であることが明らかとなった。またHCVだけでなく、熱帯地方で流行するチクングニア熱にも応用したところ、他のウイルス存在下でもチクングニア熱ウイルスのみを特異的に検出出来ることが分かった。またこの方法は、PCRの開始前と終了時の蛍光を測定するだけで、その蛍光強度の差により、定量も可能であることが明らかとなった。また、RNAウイルスだけでなく、DNAウイルスに対しても同様に検出可能であることが分かった。蛍光強度増加型HP-PCR法への改良による検出の高感度化へアピンプライマーPCR法はPCR前には蛍光が大きく、PCR後には蛍光が減少する蛍光減少型の検出系である。更なる検出感度の向上を狙って、蛍光の増大型の検出系の構築を行い、RNAウイルスの検出を行った。直接DANPがDNA上に共有結合したDNAをポストモディフィケーションによって合成した。DANPの隣接位にはグアニンが来るように配列を設計し、PCR前には隣接塩基のグアニンによって消光しているが、PCRが進行するにしたがって、グアニンとDANPの距離が離れるために蛍光が増大する原理を使った。この蛍光強度増加型のプライマーを合成してPCRを使った遺伝子検出を行うと、PCR前には蛍光強度が弱く、PCR後には強い蛍光増大型の検出法になることがわかった。またこの方法と、既に知られているTaqMan法と比べたところ、ほぼ同じくらいの検出感度を有することが明らかとなった。さらにウイルスの検出に応用すると、この方法で逆転写からPCRまでOne-stepの検出が可能であることを見出した。特別な修飾をしたDNAの合成をする人が見つからず、合成を独りで行う必要があったため、合成法の開発、そしてその特性を調べるために時間がかかり、若干遅れが見られた。新たな蛍光増大型PCR法の開発既に、DNAのシトシンバルジ構造に特異的に結合し特徴的な蛍光を発する蛍光分子DANPがへアピン型のDNAに共有結合しているプライマーの合成法を行い、このプライマーを使った蛍光増大型のPCRの開発には成功している。しかし、このプライマーの設計及び合成には遺伝子毎にプライマーを合成しなければならず、時間とコストがかかり、簡便な方法とは言い難かった。今年度は新たにシトシンバルジ構造を含むへアピン型プローブに着目し、PCR前にはシトシンバルジ構造をとらずDNAPが結合しないために蛍光が増大しないが、PCR後にはシトシンバルジ構造をとり、そのシトシンバルジ構造へのDANPの結合によって蛍光が増大するプローブの設計を行い、新たな蛍光増大型のPCR法の開発を試みた。この方法では蛍光修飾プライマーを使わないために、プライマーの合成が非常に簡便になるというメリットがある。実際にプライマーとプローブを設計してPCRを行うと、PCRの進行とともに蛍光の増大が観測された。しかし、その増大の割合は、プライマーとプローブの設計に大きく依存していることも分かり、更に詳細な検討も必要であることが明らかとなった。

この方法はまたRNAの検出に応用可能であることも明らかにした。特に研究計画の変更は無い。新たな蛍光分子の開発を目指して、合成を行う。有機合成ができる人を引き続き探す予定であるが見つからない場合は、研究室の学生の協力を仰ぎながら、合成を行う。また、分子の設計が明確であるので、計算等も多用して、効率的にDNAに結合する分子の合成を進めて行く予定にしている。さらに、今回は共有結合でDNA上に蛍光分子を結合したプライマーを使ったが、合成が大変なため、新たな方法の開発を行う。27年度が最終年度であるため、記入しない。ゲノム化学25年度に目的としたHP-PCR法によるウイルスの有無を確定診断するPCR条件の確立において、我々が今まで行っていた蛍光減少型のHPーPCR法を使って、HCV,チクングニア熱の検出を行い、HP-PCR法によって定量的、かつ迅速、簡便にウイルス検出が可能であることを明らかにした。一方、蛍光分子をDNA上に共有結合し、蛍光増加型PCRに応用した場合、プライマーの合成に手間がかかり、新たな合成方法もしくは蛍光増加型検出法の開発が必要となることが分かった。更なる検討が必要である。平成25年度に目的としたHP-PCR法によるウイルスの有無を確定診断するPCR条件の確立において、我々が今まで行っていた蛍光減少型のHPーPCR法を使って、HCV,チクングニア熱の検出を行い、HP-PCR法によって定量的、かつ迅速、簡便にウイルス検出が可能であることを明らかにした。今年度は合成をできる補助員をさがしたが、補助者が見つからず、その分の人件費に余りが出た。引き続き蛍光分子の合成を行うため、合成のできる人を雇用する。その雇用費用として、補助金の繰越し金を当てる予定である。平成26年度は平成25年度の結果をふまえ、新たな蛍光増加型のPCR法の開発、そして蛍光分子の最適化を行う。さらに蛍光減少型のHP-PCR法だけでなく、新たに開発した蛍光増加型HP-PCR法をウイルス検出に応用する。DNAウイルスだけでなく、逆転写が必要なRNAウイルスにも応用し、蛍光増大型の簡便、迅速なPCRモニタリングシステムの開発を行う。更にウイルスの亜型まで検出できる方法について検討を行う。
HIV-1 VprによるG2チェックポイント凝似誘導の分子機構に関する研究

エイズの原因であるヒト免疫不全ウイルス1型(HIY-1)のアクセサリー蛋白Vprは宿主細胞周期のG2期からM期への進行を抑制する(G2/M arrest)。このG2チェックポイント擬似誘導は、HIV-1の複製やエイズの発症に深く関与する可能性が示されているが、その分子機構には未だに不明の点が多い。一方、分裂酵母モデル系を用いた研究から、VprによるG2/M arrestにはweel、rad24等の宿主遺伝子が必須であることが報告されている(Masuda et al.,2000)。分裂酵母のRad24はヒトの14-3-3ファミリー蛋白のホモログである。昨年度はヒト14-3-3βがrad24遺伝子の欠損を補完し、Vpr感受性を賦与することを示した。本年度は、種々の他のヒト14-3-3についても同様の検討を行った。その結果、14-3-3ζもrad24欠損を補完し分裂酵母にVpr感受性を賦与することが見出された。また、14-3-3εも弱い補完作用を示したが、他の14-3-3蛋白(γ、η、θ、σ)では認められなかった。各蛋白のアミノ酸配列に基づき作成した進化系統樹では、14-3-3βとζはお互いに近縁であり、Rad24と最も近縁なのは14-3-3εであった。以上の結果は、HIV-1 Vprがヒトの細胞においてG2チェックポイントの擬似誘導を起こす際の分子機構に14-3-3βあるいはζが関与する可能性を示唆している。この可能性についてヒト培養細胞を用いて検証するためのツールとして、今年度はVpr発現用アデノウイルスベクター(Ad-VIG)の構築も行った。このベクターは導入マーカーとして緑色蛍光蛋白も共発現するので、利便性が高い。Ad-VIGベクターを用いた実験により、Vprが霊長類以外にも、ネコ、ウシなどの動物種由来の細胞でG2/Marrestを起こすことが明らかとなった。エイズの原因であるヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)のアクセサリー蛋白Vprは宿主細胞周期の進行をG_2期からM期にかけて抑制(G_2/M arrest)し、エイズの発症にも深く関与する可能性がある。Vprはヒトの細胞だけでなく下等真核生物の分裂酵母にもG_2/Marrestを誘導し、この現象を利用した研究により、VprによるG_2/M arrest誘導にはweel1やrad24などの宿主遺伝子が必須であることが報告されている(Masuda et al.,2000)。分裂酵母のRad24蛋白はヒトの14-3-3ファミリー蛋白のホモログと言われている。また、14-3-3ファミリー蛋白の一つ、14-3-3βはWEE1蛋白の安定化を介して細胞周期の進行を抑制するという報告がある。今年度は、ヒト14-3-3βが分裂酵母のrad24遺伝子欠損を補完し、Vpr感受性を賦与しうるかを検討した。RT-PCRによりヒト14-3-3βのcDNAを単離し、発現ベクターpAUR224に組込んだ(pAUR-14-3-3β)。チアミン除去によりVprの発現が誘導されるベクター(pREP1-Vpr)は以前構築したものを用いた。rad24遺伝子を欠損した分裂酵母株にこれら2つのベクターを共に導入して得られた形質転換株はブレオマイシンによるDNA損傷に対し細胞伸長(cdc表現形)を示し、G_2チェックポイント制御が正常化していた。また、チアミンを除去した際にもodc表現形を示しVprによるG_2/M arrest誘導に対する感受性も回復していた。これらの結果より、ヒト14-3-3βはrad24を補完し、ヒト細胞におけるVprの機能発現にも関与している可能性が示唆された。今後はこの結果に基づき、RNAiにより14-3-3βの発現を抑制したヒト培養細胞でのVprの効果などを解析する予定である。

この可能性についてヒト培養細胞を用いて検証するためのツールとして、今年度はVpr発現用アデノウイルスベクター(Ad-VIG)の構築も行った。このベクターは導入マーカーとして緑色蛍光蛋白も共発現するので、利便性が高い。Ad-VIGベクターを用いた実験により、Vprが霊長類以外にも、ネコ、ウシなどの動物種由来の細胞でG2/Marrestを起こすことが明らかとなった。
漢字認知における構成部品の意味的・音韻的情報の活性化の検討

本研究の第一の成果は,左右分離漢字を構成する各部品の持つ意味と,その部品を含有する単漢字の意味との一致性に関する評定調査の結果をデータベース化したことにある。さらに,2つの実験から,漢字を構成する部品の音韻情報が,漢字処理に影響を及ぼしていることが確認されたことが第二の成果であった具体的には,先行呈示された右部品の音韻情報によって,右部品を共有する近傍漢字でかつ同音であるlexiconが活性化することが示唆された。本研究の目的は,以下の2点である。1,漢字を構成する部品に含まれる意味情報と,その部品を含有する単漢字自身の意味情報との一致性を明らかにし,データベース化する。2,漢字構成部品の音韻的情報および意味的情報が,漢字全体の認知よりも前に活性化されるか否かを明らかにすることを目的とする。本年度は申請時の計画に準拠し,以下に報告する1つの調査と1つの実験を実施した。調査1:漢字の構成部品に含有される意味と単漢字の意味との関連性に関する調査JIS第一水準に含まれる漢字のうち,左右の部品に分離可能な漢字1668字を対象に,これら1668字とその漢字に含まれる1000種類余り(左部品247種類,右部品860種類)の漢字部品を用いて,単漢字の構成部品が有すると判断される主観的意味と,その部品で構成される単漢字が有すると判断される主観的意咲との類似極の程度を大学生に評定きせ,その一致性を確認した。この調査の途中結果については,平成21年12月に開催された日本基礎心理学会で報告した,その後,データ数をさらに追加し,偏は意味を担うと考えられている一般的事実が,如何なる漢字に当てはまり,如何なる漢字には当てはまらないのかを明らかとするとともに,それらをデータベース化した。このような言語材料に関するデータベースは十分には整備されていないため,本調査の結果は他の様々な研究への資料として重要な意味を持つ。実験1:「右部品と単漢字との音韻的一致性および結合可能部品数の多寡が語彙判断課題に及ぼす効果の検討」研究実施計画では平成22年度に実施する予定であった「右部品と単漢字との音韻的一致性および結合可能部品数の多寡が語彙判断課題に及ぼす効果の検討」を21年度に実施した。その結果は,平成22年度の日本心理学会にて「左右分離漢字の構成部品の音韻典型性が語彙判断に及ぼす影響」として発表予定である。1.漢字を構成する部品に含まれる意味情報と,その部品を含有する単漢字自身の意味情報との一致性を明らかにし,データベース化する。2.漢字構成部品の音韻的情報および意味的情報が,漢字全体の認知よりも前に活性化されるか否かを明らかにすることを目的とする。本年度は昨年度の研究結果を基に,以下に報告する1つの実験を実施した。また,構成部品の意味的情報が,漢字認知過程に及ぼす影響を検討するために,21年度に作成したデータベースを用いて,刺激項目の選定を行った。実験1:「左右分離漢字を構成する右部品の音韻的典型性と右部品と単漢字との音韻の一致性が語彙判断課題の遂行に及ぼす効果の検討」本実験では,Fujita & Masuda (2008),藤田(2010)と同様の実験パラダイムを用い,プライマーとして呈示される擬似漢字の右部品の音韻典型性と右部品と単漢字自体の音韻(読み)との一致性を操作し,音韻的典型性の高低および部分と全体との音韻一致性の有無によって,語彙判断課題におけるプライミング効果量に差異が生じるか否かを検討した。その結果,音韻的典型性と音韻一致性が語彙判断課題に影響することが確認された。しかしながら,プライミング効果は認められなかった。本実験結果は,実験参加者サイズが小さかったことによる影響を受けている可能性が否定できないため,引き続きデータを収集し,再度分析を行う必要がある。なお,21年度に実施した調査結果は,現在の所属先である南山大学の個人HPにおいて,データベースとして公開の予定である。
地理学習における地形概念の形成を支援する視覚表現の心理学的分析

本研究の目的は、地形概念の形成を促進する視覚表現のデザイン特性を明らかにし、それを用いた教材の開発に実証的な根拠を提出することにあった。特に、実際の使用頻度が高く、また、汎用性の高い描画(線画)に焦点を当て、以下の調査・実験を行った。1教科書にみられる地形の描画の分類と評価高等学校地理の全教科書を対象に、全てにおいて扱われている「扇状地」の描画を収集したところ、それらの表現形式は、大きく鳥瞰的なものと立体的なものに分類された。両タイプの典型的な事例について、高校生56名、高校教師23名を対象に、評定尺度を用いて評価調査を行った。その結果、鳥瞰的な描画の方が立体的な描画よりも高い評価であり、特に、その傾向は生徒において顕著であっった。また、線画への言語情報の付加は、一貫して無い方が高い評価であった。その成果は日本視聴覚・放送教育学会大会、ならびに、放送教育開発センター研究報告において公表した。2描画のデザイン特性の効果描画の構図の違い(鳥瞰的・立体的)が学習に及ぼす効果を検証するために、輪郭線のみで描いた両タイプの描画を用いて、高校生68名を対象に実験を行った。その結果、両条件の成績には有意差は認められなかった。また、言語情報が不足して描画への依存度が高まる事態でも同様であった。これまでの研究結果と照合すると、地形概念の形成においては描画の評価、ならびに、学習効果は構図ではなく、写実性が重要な要因であることが示唆された。なお、その成果は日本教材学会研究発表大会と年報において公表した。現在、以上の研究結果を踏まえ、最適なデザイン特性の描画を用いた教材のプロトタイプを開発中であり、近く、関連学会において公表する予定である。
小中高英語教育連携によるCLILカリキュラムおよび研修プログラムの開発

本研究は、CLIL(Content and Language Integrated Learning,内容言語統合型学習)を活用し、日本の文脈に合わせた小中校連携によるCLILカリキュラム開発とそれをいかした教員養成・研修プログラム開発を目的としたものである。研究2年目となる30年度は初年度のCLILカリキュラム開発の基礎研究をもとに、現職の小中高教諭と連携し、日本の文脈にあったCLIL指導案・教材を作成、それに基づくCLIL授業を実践し、データを収集した。研究業績は以下の通りである。(1)小中高連携によるCLILカリキュラムに関する基礎研究データ分析(2)小学校・中学校・高等学校教諭との連携によるCLIL指導案作成・教材開発(3)(2)に基づいた小中高教員によるCLIL授業実践・実践指導(4)CLIL研究授業観察(5)CLIL授業実践について実施教員と研究者によるリフレクション(6)CLIL小中校連携による英語教育の研究視察データ分析およびそれに基づく実践研究論文発表(宇都宮大学教育学部実践紀要)(7)小中高英語教育におけるCLIL活用による指導や実践およびその可能性についての学会や研修会での発表(大学英語教育学会・全国英語教育学会・LD学会・宇都宮大学免許更新講習等)本年度は昨年度行った小中高CLIL実践のための情報収集および試案を基盤として、実際に小中高の現職教員と協働し、CLILを活用した小中高連携による授業を実践できた。その授業実践から、各学齢の学びおよび発達段階を考慮した、特に思考を促す発問について、分析を行い、その成果を学会や研究紀要等において広く周知することができた点においては、計画通りと言える。しかし海外事例による情報収集および比較検討、他教科教員とのカリキュラムの協働検討については、次年度に持ち越すこととなったため、おおむね順調に進展しているとした。30年度の研究成果を基盤として,海外事例による情報収集および比較検討、他教科教員との協働による小中高連携によるCLIL授業の実践を行う。その成果を、教員養成・研修にいかし、実践者および学修者と研修参加者の振り返りから,CLILを活用した教員養成・研修プログラムの有効性について検証する。その結果からCLILのカリキュラムと教員養成・研修プログラムの再検討を行いたい。本研究は,日本の小中高の英語教育連携を促す効果的な教科横断型カリキュラムと指導法の探究を目的として,CLIL(Content and Language Integrated Learning,内容言語統合型学習)を活用したカリキュラムおよび教員養成・研修プログラム開発を行うものである。研究一年目となる29年度には、これまでの本研究代表者の研究成果と課題をもとに,国外視察,国内学会,研修会等に参加し,様々な小中高授業実践事例事例・研修から,日本での授業実践に参考になるものを検討を行い、試案を作成の上、実践を試みた。詳細は、以下の通りである。1.中国の英語授業視察を行い、授業実践からアジア諸国におけるCLIL的視点を取り入れた授業実践の現状およびICTの効果的活用法について検討を行った。2.国内学会参加により日本での小中高CLIL実践に基づく事例について、日本の小中高CLIL実践に参考になる情報収集を行った。3.上記1と2を基に、学習目標と言語材料に関して日本の外国語科検定教科書を参考に,英語教育および他教科教育の研究者および実践者と検討を行い,小中高CLIL指導案,教材について試案作成を行い、小中高において実践を試みた。また宇都宮大学教員養成課程の授業において教科横断型授業実践を試みた。4.上記3の実践について、宇都宮大学で研究発表大会を開催し、より多くの教員および学生、英語教育関係者への研究成果の周知を行った。本年度は小中高CLIL実践のための、情報収集および試案作成を目標としており、すでに実践も試みた上で、研究発表会を開催し周知も行えた点においては、研究計画よりも進んでいるといえる。しかし海外事例による情報収集においては、中国のみとなり、さらなる先進事例の収集が必要であり、その点において次年度に持ち越すこととなったため、おおむね順調に進展しているとした。

その授業実践から、各学齢の学びおよび発達段階を考慮した、特に思考を促す発問について、分析を行い、その成果を学会や研究紀要等において広く周知することができた点においては、計画通りと言える。しかし海外事例による情報収集および比較検討、他教科教員とのカリキュラムの協働検討については、次年度に持ち越すこととなったため、おおむね順調に進展しているとした。2年目は上記課題とした小中高CLIL実践に関する海外事例の情報収集を行うとともに、1年目の実践をもとに、さらに日本の文脈における小中高CLIL授業実践を試みる。それに際し,1CLIL授業分析, 2指導教員インタビュー、可能であれば、3生徒への質問紙調査を行い,CLILを取り入れたカリキュラムの可能性と課題について研究する。他教科教員との協働を仰ぎながら、日本の文脈に合わせたCLIL指導案,教材について、さらに検討を行う。30年度の研究成果を基盤として,海外事例による情報収集および比較検討、他教科教員との協働による小中高連携によるCLIL授業の実践を行う。その成果を、教員養成・研修にいかし、実践者および学修者と研修参加者の振り返りから,CLILを活用した教員養成・研修プログラムの有効性について検証する。その結果からCLILのカリキュラムと教員養成・研修プログラムの再検討を行いたい。当初予定していた海外事例情報収集が中国視察のみとなり、そのための予算を繰越しとするため、使用計画と使用額に差が生じた。今年度予定していた海外事例情報収集の実施が十分にかなわず、そのための予算を繰越しとするため、使用計画と使用額に差が生じた。
歯周病関連菌の黒色色素産生に関与する酵素の分子生物学的解析

成人性歯周炎の主要原因菌として重視されているPorphyromonas gingivalisの黒色色素産生性について分子生物学的にその機構の解明を試みた。P.gingivalis381株と33277株の染色体DNAは制限酵素PstIおよびHindIIIでよく消化され、その電気泳動パターンは両菌株で異なっていた。PstIとHindIIIそれぞれの消化断片の遺伝子ライブラリーから大腸菌に形質転換し血液平板培地上にて、黒色色素産生クローンのスクリーニングを試みたが、得ることができなかった。次に標準株の染色体DNAヘトランスポゾン(Tn)を挿入させ、黒色色素産生欠損株のスクリーニングを試みた。Tn挿入プラズミドとしてpR751^*Ω4,pVOH1およびpVal1を用いたところ381株に対する挿入効率はそれぞれ1.7x10^<-9>,9.9x10^<-11>,5.3x10^<-11>,33277株に対するそれは、それぞれ7.5x10^<-9>,3.1x10^<-9>,6.2x10^<-10>であった。しかしその中で黒色色素産生欠損株はpR751^*Ω4でのみ得ることができた。黒色を呈さないコロニーは33277株で18株、381株では2株分離することができた。その中で蛋白分解活性を有するものは33277株では5株、381株では2株ともであり、黒色コロニーを呈さず蛋白分解活性のない株は33277株からの13株であった。次にベクターあるいはTnの挿入数、位置について検討を行った結果、33277株の2株を除いてすべてプラズミドベクター本体が染色体DNA中に挿入されていることが確認された。Tnのみ挿入の株は蛋白分解活性を有するT41株と有さないT3株でありTn挿入は1カ所であった。制限酵素Pst1消化によるTn含有断片はT41株では8kbp、T3株では20kbpであった。今後、このトランスポゾン挿入部位前後の塩基配列および親株と、所有している黒色色素産生欠損臨床分離株とで比較検討する予定である。
三量体Gタンパク質G12ファミリーによる神経機能調節の研究

Gα12/13の新規活性測定法の開発と、Gα12/13のレセプターとの共役の特異性決定因子の解明私は、2002年にセリンスレオニンフォスファターゼ5(PP5)が三量体Gタンパク質G12ファミリーの新規エフェクターであることを見いだした。2003年に私はPP5のTPRドメインが活性型Gα12/13と特異的に結合するという特性を利用して、TPRドメインによるpull-downにより、Gα12/13の活性を測定する新規活性測定法を開発した。Gα12とGα13は、下流でRhoという共通の分子を利用する一方、上流のレセプターとの共役に関しては、それぞれに特異性があることが、Gα12/13のドミナントネガティヴ体を用いて示されていた。そこで、私は上記の新規アッセイ法を用いてthrombin及びLPAがGα12及びGα13を、それぞれ特異的に活性化すること、及びこの特異性が、Gα12/13のN末端アミノ酸配列の差に起因することを解明した。近年、神経細胞において、Gα12は細胞体、Gα13はneuropilと局在が異なることが報告された。このことから、Gα12/13とレセプターの細胞内局在の違いが、それらの共役及びシグナリングに重要であると考えられる。G12ファミリーの新規エフェクター、セリン・スレオニンフォスファターゼ5の同定とその活性制御機構の解析三量体Gタンパク質G12ファミリーは、Rhoを介した細胞骨格調節作用がよく知られているが、その多彩な機能の全体像は分子レベルであまり解明されていない。そこで、yeast two-hybrid法を用いて新たなエフェクター分子を同定することを試みた。常時活性型Gα12、Gα12QLをbaitにしてラット脳cDNA libraryをスクリーニングした結果、セリン・スレオニンフォスファターゼ5(PP5)をクローニングした。PP5はC末端のフォスファターゼドメインとN末端のtetratricopeptiderepeat (TPR)ドメインからなる。抑制性の調節領域であるTPRドメインによりPP5のフォスファターゼ活性は非常に低い。Gα12QLは、PP5のTPRドメインに特異的に結合し、そのフォスファターゼ活性を約2.5倍に上昇させた。アラキドン酸もPP5を活性化するが、Gα12QLはアラキドン酸と協調的にPP5を活性化した。TPRドメインを欠失したフォスファターゼドメインは高いフォスファターゼ活性を示すが、Gα12QLによる活性上昇はみられなかった。また、PP5は通常、細胞質に存在するが、細胞膜で働くGα12QLと共発現させると、PP5は細胞質から細胞膜へと移行した。Gα12はPP5のTPRドメインに結合し、そのフォスファターゼ活性をあげることがわかり、この新規のG12-PP5の経路が生体内で重要な役割を担っていることが考えられる。
青年期から始める生活習慣病一次予防のための新しいバイオマーカー

動脈硬化の原因として、高血圧・糖尿病・脂質異常症・喫煙・肥満・加齢などのリスクファクターがあげられる。実際、東北大学毎年行われる学生健康診断の蓄積データからは、動脈硬化リスクファクター(特に肥満)を有する学生の比率が年々増加してきていることが判明した。そこで、申請者らのサイクロフィリンAに関する基礎および臨床研究における成果を発展させ、近い将来、心血管疾患特に冠動脈疾患(狭心症や心筋梗塞)を発症しうるハイリスク学生の早期診断用検査試薬を開発するための若年動脈硬化患者における血漿サイクロフィリンA濃度の予備解析を行い、冠動脈狭窄における血漿中サイクロフィリンA濃度の臨床的意義を検討した。近年、心血管疾患の発症年齢の若年化が著しい。特に、冠動脈の動脈硬化により発症する狭心症や心筋梗塞の発症年齢の若年化が問題になっている。そこで、申請者らの長年のサイクロフィリンA(CyPA)に関する基礎および臨床研究における成果を発展させ、近い将来、心血管疾患特に冠動脈疾患(狭心症や心筋梗塞)を発症しうるハイリスク学生の早期診断用検査試薬を開発するための臨床研究を行うこととした。研究1として、若年動脈硬化患者における血漿サイクロフィリンA濃度の予備解析を行った。この3年間に東北大学病院に入院した、冠動脈狭窄を呈する若年患者の血清・血漿のライブラリー化を進めた。血漿中サイクロフィリンA濃度測定をまず20例で行い、冠動脈狭窄における血漿中サイクロフィリンA濃度の臨床的意義を検討した。研究実績の概要で記したように、予定通りの検体収集および予備解析が進んでいる。研究2として、ヒト組織発現CyPAに着目した病変活動度の評価法開発として、動脈硬化患者の冠動脈組織を用いて、分子生物学的研究手法や免疫学的研究手法を駆使した多面的な解析を行う。冠動脈の動脈硬化不安定プラーク破綻や大動脈瘤破裂につながる共通分子機構を組織学的視点で検討した。研究3として、BMIに基づくハイリスク学生を対象として、新しいバイオマーカー開発を行う。東北大学保健管理センターにおいて毎年行われる学生健康診断の過去10年間の情報蓄積データからは、動脈硬化リスクファクターを有する学生の比率が著しく増加してきている。そこで、近い将来、心筋梗塞を発症しうるハイリスク学生の早期診断用検査試薬を開発するためのバイオマーカー開発を進めた。

研究2として、ヒト組織発現CyPAに着目した病変活動度の評価法開発として、動脈硬化患者の冠動脈組織を用いて、分子生物学的研究手法や免疫学的研究手法を駆使した多面的な解析を行う。冠動脈の動脈硬化不安定プラーク破綻や大動脈瘤破裂につながる共通分子機構を組織学的視点で解明する。研究3として、BMIに基づくハイリスク学生を対象として、新しいバイオマーカー開発を行う。東北大学保健管理センターにおいて毎年行われる学生健康診断の過去10年間の情報蓄積データからは、動脈硬化リスクファクターを有する学生の比率が著しく増加してきている。そこで、近い将来、心筋梗塞を発症しうるハイリスク学生の早期診断用検査試薬を開発するためのバイオマーカー開発を行う。循環器内科
摂食行動に関与する新規神経ペプチド、オレキシンの生理作用に関する研究

オレキシンは近年同定された神経ペプチドで、視床下部外側野の非常に限られた神経細胞において発現しており、摂食行動や睡眠/覚醒の制御などの重要な生理機能を担うと考えられている。本研究では遺伝子工学的手法を用いて、オレキシン神経特異的に外来遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを作成し、オレキシン神経細胞の生理的役割の解明を行った。オレキシン神経細胞のみを脱落させたataxin-3/orexinマウスは睡眠・覚醒制御に異常が観察され、プレプロオレキシン欠損マウスと同様のナルコレプシー様症状を呈することを明らかとした。このマウスはヒトナルコレプシーにもっとも近いモデルマウスとして今後の治療薬開発などに有用なツールとなることが期待される。また、このマウスは10週齢以降に、摂食量が低下しているにも関わらず肥満傾向を示すため、オレキシン神経細胞は代謝調節にも関わっていることが明らかとなった。オレキシン神経細胞特異的に緑色蛍光たんぱく質を発現させたEGFP/orexinマウスを用いてオレキシン神経細胞の電気生理学的解析を行った。オレキシン神経細胞を単離した後に、パッチクランプ法を用いて、その神経細胞の特徴を明らかにした。オレキシン神経細胞は細胞外液グルコース濃度に応じて、神経活動を変化させるグルコース感受性神経細胞であることを明らかとした。また、末梢由来の摂食調節因子であるレプチンやグレリンによっても活動が制御されており、オレキシン神経細胞は末梢の栄養状態を感知して、覚醒レベルを調節する役割を持った神経細胞である可能性を示した。本年度は、プレプロオレキシン、OX1受容体、OX2受容体各遺伝子をノックアウトさせたマウスを作成した。また、ヒトオレキシン遺伝子プロモータを用いて、神経変性疾患のひとつであるMachado-Joseph病の原因遺伝子のcDNAのうち、ポリグルタミンリピートをオレキシン神経特異的に発現させることにより、オレキシン神経を特異的に除去したマウスを作成した。これらのマウスは摂食行動および、睡眠覚醒の制御に異常を呈することが明らかになり、とくにプレプロオレキシン欠損マウス、OX2受容体欠損マウス、オレキシン神経除去マウスでは、ナルコレプシー様の睡眠障害を呈した。このことから、オレキシン系は摂食行動の制御、睡眠覚醒の制御に重要な役割をもっていると考えられる。一方、薬理学的な実験により、オレキシンは脳内の各種モノアミン系を制御し、覚醒状態、自発運動、摂食行動に影響を及ぼすことが明らかになった。また摂食行動に関しては、一部ニューロペプチドY含有神経の活性化を介することが明らかになった。組織学的な解析により、オレキシン神経と各モノアミン神経系との関係を明らかにした。さらに、オレキシン受容体の脳内組織分布を検討し、オレキシンの投射部位とあわせてオレキシン系の構造的な全貌が明らかになってきた。
ビスマス系銅酸化物高温超伝導ウィスカーの育成および磁場中における物性に関する研究

本研究では、特異な性質を示すウィスカー結晶が研究対象である。1.高温超伝導体おいて、渦糸(量子化磁束)に対するバルクピンニング(結晶欠陥によるピン止め)の効果が寄与して、磁場の増加と共に臨界電流密度(Jc)が上昇してピークに達するというピーク効果が観測される。そして、Jcのピークが現れる磁場をピーク磁場(Hpeak)と呼び、そのHpeakは数100 Oe以上である。しかし、本研究者らがBi2Sr2CaCu2O8+δ(Bi-2212)ウィスカーで発見した弱磁場環境下でのJcのピークは、高温領域において100 Oe以下の磁場で起こる。この領域は、バルクピンニングの効果が渦糸に対して優位に働く温度・磁場領域とは大きく異なる。本研究では、異なる試料幅をもつウィスカーにおいてピーク効果の比較を行ってきた。その結果、Hpeakの値が試料幅に依存して系統的に変化し、Hpeakの値を予想できることが分かった。この結果は、表面バリヤの効果だけでなく、微小な試料サイズによる渦糸数の制限がピーク効果を生んでいることを示唆している。2.Bi-2212ウィスカーの成長制御に関して、本研究者らは、結晶成長のための熱処理を行う前に、前駆体であるBi-2212ペレット(基板)に対して部分的にBi2O3を蒸着することによって、基板の指定した領域にウィスカーを選択的に育成できることを報告した。本研究では、成長の種としてBi2O3微粒子をペレット上に分散させた後で、結晶成長のための熱処理を行って成長制御を試みた。Bi2O3微粒子は均一沈殿法である尿素法によって作製し、その後、Bi2O3微粒子を基板に分散させて熱処理を行った。しかし、ウィスカーは成長しなかった。この結果は装置上の問題(電気炉の温調器のPID値の変更など)が主な要因であり、微粒子分散の影響が結晶成長に直接反映されなかったことが、現在分かっている。本研究では、高温超伝導体であるBi_2Sr_2CaCu_2O_<8+δ>(Bi-2212)ウィスカーにおける弱磁場や自己磁場中での電気的測定によって、微細な系での表面バリヤに影響された特性を評価してきた。標準4端子法を用いた本測定では、電流はウィスカーの長さ(//結晶のa軸)方向、磁場は厚さ(//c軸)方向に沿って印加し、電流-電圧測定や一定輸送電流下での磁場に対する電圧応答の観測を行った。表面バリヤに関連した特異な現象を観測するために、我々が開発した作製方法によって育成した1段超伝導転移を示すBi-2212ウィスカー(T_c=81.5-82.5K)を研究対象とした。様々な幅のウィスカーにおいて、T_c付近の高温領域で下記のように、100 Oe以下の弱磁場領域における臨界電流密度(J_c)のピーク効果や、磁場に対する電圧応答におけるリエントラントな振る舞いを検出した。さらに、これらの現象がウィスカーの幅に依存して変化することを確認した。1.J_cが、磁場の増加にともない上昇してピークに達した後、徐々に減少するという現象(J_cのピーク効果)を観測した。サンプル幅が小さいほどJ_cのピークを与える磁場が高磁場側にシフトすることを確認した。2.自己磁場下でのJ_cよりも大きな電流密度に相当する一定電流下で、磁場の増減にともなって凹型の電圧-磁場曲線を確認した。つまり、磁場の増加に伴って電圧が減少してゼロ電圧状態になった後、さらに磁場が増加すると再び電圧が現れる現象を観測した。さらに、この磁場誘起ゼロ電圧状態は、サンプル幅が極端に狭くなると消失することを確認した。バルクピンニングの弱い領域において、表面バリヤの強い系では試料端に高い電流密度をもつエッジカレントを流すことが可能である。本研究により、自己磁場下でのJ_cに関して、エッジカレントの寄与に関連のあるサンプル幅依存も観測した。

本研究では、成長の種としてBi2O3微粒子をペレット上に分散させた後で、結晶成長のための熱処理を行って成長制御を試みた。Bi2O3微粒子は均一沈殿法である尿素法によって作製し、その後、Bi2O3微粒子を基板に分散させて熱処理を行った。しかし、ウィスカーは成長しなかった。この結果は装置上の問題(電気炉の温調器のPID値の変更など)が主な要因であり、微粒子分散の影響が結晶成長に直接反映されなかったことが、現在分かっている。
溶融塩を媒体とした電析法によるシリサイド金融間化合物膜の作製

本研究では,高融点金属シリサイドの中でも最も超高温材料として期待されてるモリブデンシリサイド膜の作製と他金属への被覆を溶融塩を媒体とした電析法により試みた。本研究でのモリブデンシリサイド膜の作製方針は、MoとSiを順次電析させ、高温媒体化でのプロセスを利用して両者の相互拡散により合金化し、モリブデシンサイドを膜状に生成させようとするものである。始めにSiならびにMoの電析挙動を調べ、これらの電析条件を明らかにした。Siについては、NaCl-KCl塩にK_2SiF_6を添加した浴を使用し、カソード分極曲線の測定により明らかになったK_2SiF_6の還元電位域に定電位カソード分極することにより電着することがわかった。ただし、この場合、電着したSiは下地Niと相互拡散を起こし、Niシリサイド膜となった。Moについては、始めNaCl-KCl塩にLi_2MoO_4を添加した浴を使用し、Li_2MoO_4の還元電位域に定電位分極した。その結果、Li_2MoO_5が電着し、金属Moは電着しないことがわかった。そこで、Li_2MoO_5とともに第二添加塩としてK_2SiF_6を添加した浴中において、定電位カソード分極を行った。その結果、低電位域で金属Moが電着した。モリブデンシリサイド膜の作製は、これらSiならびにMoの電析条件に従って順次SiとMoを電析させることにより行った。Siを電析した後、Moを電析した場合、Mo_3Si膜がNiシリサイド膜上に生成した。逆に、Moを電析した後、Siを電析させると、目的のMo_3Si_2を生成させることができたが、膜状にはならずデンドライトの形態となった。以上のように、溶解塩を溶体とする電析法により、ドリブデンシリサイド膜を作製できることが明らかになった。始めに、1073KのNaCl-KCl溶融塩中に010mol%のK_2SiF_6を添加したときのNi電極のカソード分極曲線の変化を設備備品として購入したポテンショ・スタットを使って調べた。K_2SiF_6を添加を添加していない溶融塩中では、電位を低下させてもカソード電流はほとんど流れないのに対し、K_2SiF_6を添加した溶融塩中では-0.8V(_<vs.> Ag/Ag^+(0.1Ag^+))付近からカソード電流が上昇した。これより、-0.8V以下の電位域ではK_2SiF_6が関与したカソード反応が起こっていることがわかった。そこで、5mol%のK_2SiF_6を添加した溶融塩を試験浴とし、-1.1-1.6Vの各電位に7.2ks間定電位カソード分極を行ってNi試料上にSi膜の電析を試みた。-1.4V以下の電位域では、時間の経過とともに電流は大きく低下した。電流低下の仕方は分極電位が低いほど顕著であった。このため、分極中のカソード電気量は-1.4V以下の電位域では電位低下とともに減少した。これに対応して、Siの電析質量も-1.4V以下の電位域では電位低下とともに減少した。電析反応の電流効率は-1.1-1.2Vの高電位域で高いことがわかった。-1.2、-1.3および-1.5Vに7.2ks間定電位カソード分極を行なった試料の表面および断面をSEMにより観察した。各電位とも試料表面には円錐状の結晶が面全体に均一に析出していることが認められた。

断面観察からは、80200μmの電析層の生成が認められた。電析層は二層構造を有し、表面層には円錐状結晶の析出が認められ、その下には膜状生成物が下地Niを均一に被覆していることが観察された。EDS分析、X線回折よりこれらの電析物はNiSi_2、NiSi、Ni_3Si_2、Ni_4SiなどのNiシリサイドにより構成されていることがわかった。このNiシリサイド膜は、外側ほど高Si化合物であり、傾斜組成を有することがわかった。本研究は、高温溶融塩を媒体とした電析法によりMoならびにSiを電析させ、同時に進行するこれらの合金化を利用してモリブデンシリサイド膜の作製を試みたもので、とくに溶媒塩の組成および分極電位などの電析条件を調査した。本研究で得られた主な成果を要約すると次の通りである。1.NaCl-KCl塩にK_2SiF_6を添加した浴中での定電位カソード分極により、Siが電析し、これが基板Niと合金化してニッケルシリサイド膜が生成した。2.NaCl-KCl塩にLi_2MoO_4を添加した浴中で定電位カソード分極しても、Li_2Mo_2O_5が電析し、金属Moまで還元が進行しなかった。これに対し、Li_2MoO_4とともに第二添加塩としてB_2O_3、AlF_3、KPO_3およびK_2SiF_6を添加した浴中、低電位域において定電位カソード分極することにより、Moが電析した。この場合、AlF_3およびK_2SiF_6を第二添加塩とした場合、良好な形態の電析膜が認められた。3.NaCl-KCl塩にLi_2MoO_4とAlF_3およびK_2SiF_6を添加した浴中においてMoを電析した後、NaCl-KCl塩にK_2SiF_6を添加した浴中においてSiを電析させることにより、MoSi_2およびMo_5Si_3層を生成させることができた。4.NaCl-KCl塩にK_2SiF_6を添加した浴中においてSiを電析させた後、NaCl-KCl塩にLi_2MoO_4とK_2SiF_6を添加した浴中においてMoを電析させることにより、ニッケルシリサイド膜上にMo_3Si膜を生成させることができた。以上のように本研究は、塩化物溶融塩を媒体とした電析法によりモリブデンシリサイド膜が作製できることを明らかにしたもので、高機能材料の表面被覆技術の開発に新たな知見と指針を与えるものある。
ユビキチン経路を介した植物の抗ウイルス防御応答機構のｉｎ　ｖｉｔｒｏ解析

ユビキチン経路とは、ユビキチンを標識することで標的タンパク質をプロテアソームによる分解へ導くタンパク質分解経路である。ユビキチン経路ではE1、E2、E3という3種のタンパク質が働くことが知られている。植物においてユビキチン経路の特異性を担うのはE3であると考えられており、E3を明らかにすることがユビキチン経路の意義およびメカニズムを解明する上で最も重要である。ユビキチン経路はタンパク質の分解系であることから、植物ウイルスに対する抗ウイルス防御反応として機能することが予測される。そこで、本研究ではタバコモザイクウイルス(tobacco mosaic virus; TMV)をモデルウイルスとして用い、植物ウイルスに対するユビキチン経路を介した防御応答の解析を行う。一般に、植物ウイルスは植物細胞内膜を利用し複製工場を形成することで増殖する。したがって、植物の抗ウイルス抵抗性を理解する際には、抵抗性因子がどのようにウイルスの複製工場と相互作用しているのかを可視化し、三次元的に解析することが重要であると言える。以上の背景のもと、本研究ではE3様タンパク質に蛍光タンパク質(green fluorescent protein; GFP)を付加してバーティクルボンバードメント法によりタバコBY-2培養細胞で発現させた。共焦点レーザー顕微鏡を用いた解析の結果、GFP蛍光のシグナルは細胞質及び核において、一様に検出された。この結果は、本因子がどのようにウイルス因子と相互作用するかを解析する上で基盤的な知見であると考えられた。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の遂行にあたり、ウイルスタンパク質の分解とウイルスの複製の両方を同時に評価する系の構築が必須である。そこで本年度は、TMVのin vitro複製系の構築を行った。タバコBY-2培養細胞由来細胞抽出液(BYL)にウイルスRNAおよび各種アミノ酸を加え、ウイルスRNAより複製酵素タンパク質を翻訳させた。続いて、得られたウイルスRNAと複製酵素などから構成される複合体を膜と結合させ、dNTP混合液を加えた後に複製反応させると、ウイルスの複製の指標が検出された。本年度得られた結果は、ウイルスの複製を再現できたものといえる。本年度は、本研究の要となるウイルス複製をin vitroで再現する系の構築を予定しており、達成できている。ユビキチン経路では、E1、E2、E3という3種類のタンパク質が働くことが知られている。ユビキチン経路はタンパク質の分解系であることから、植物ウイルスに対する抗ウイルス防御反応として機能することが予想される。そこで本研究では、タバコモザイクウイルス(tobacco mosaic virus)をモデルウイルスとして用い、植物ウイルスに対するユビキチン経路を介した防御応答の解析を行う。本研究の遂行にあたり、ウイルスタンパク質の分解とウイルスの複製の両方を同時に評価するin vitro系の構築が必須である。本年度は、上記in vitro解析系の構築に向け、単一のin vitro翻訳系において複数のタンパク質を順次翻訳させる条件について検討を行った。タバコBY-2培養細胞由来細胞抽出液(BYL)を用いて複数タンパク質の翻訳活性を評価したところ、二番目以降に加えたmRNAからの翻訳産物の蓄積量は、最初に加えたmRNAからの翻訳産物の蓄積量と比べて、著しく少ないことが明らかになった。そこで、最初のmRNAを翻訳させた後に新鮮なBYLを加え、二番目のmRNAを翻訳させるという手順を踏むことにより、複数のタンパク質を翻訳することが可能であった。ウイルスのin vitro複製系および複数タンパク質のin vitro翻訳系の確立に向けた条件検討に時間がかかったため。

したがって、植物の抗ウイルス抵抗性を理解する際には、抵抗性因子がどのようにウイルスの複製工場と相互作用しているのかを可視化し、三次元的に解析することが重要であると言える。以上の背景のもと、本研究ではE3様タンパク質に蛍光タンパク質(green fluorescent protein; GFP)を付加してバーティクルボンバードメント法によりタバコBY-2培養細胞で発現させた。共焦点レーザー顕微鏡を用いた解析の結果、GFP蛍光のシグナルは細胞質及び核において、一様に検出された。この結果は、本因子がどのようにウイルス因子と相互作用するかを解析する上で基盤的な知見であると考えられた。来年度は、本年度構築した植物ウイルスのin vitro複製系を用いてウイルスタンパク質の分解と複製阻害の関係性について解析する。来年度は、本年度までで構築した実験系を用いてウイルスタンパク質の分解と複製阻害の関連性について解析する。また、E3タンパク質の細胞内局在について解析し、ウイルスタンパク質との相互作用を三次元的に理解する。28年度が最終年度であるため、記入しない。