hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アミロイド前駆体蛋白の分解過程に関する分子生物学的研究

アルツハイマー病は脳のAβ沈着症ととらえることが出来ることから、APPが細胞のどこで、どの様な機構によって分解・処理を受けてAβが生成されるのかについてモノクロナール抗体を用いて以下の通り検討した。また、リソソーム蛋白分解酵素の阻害剤であるロイペプチンを培養液に加えてAPPの分解・処理過程に対する影響を検討した。I)APPの各ドメイン、Aβに対するモノクロナール抗体の樹立:APPはN-末端からシグナルペプチド、インヒビタードメイン、細胞外ドメイン、Aβ、細胞内ドメインの順に配列されている。これらの各ドメインのペプチドを合成しマウスを免疫してモノクロナール抗体の作製を試みた。N-末端、細胞外ドメイン、Aβ、細胞内ドメインに対するモノクロナール抗体の樹立に成功した。インヒビタードメインに対するモノクロナール抗体は樹立出来なかった。II)APPの細胞内での分解・処理過程の検討:1)ヒト血球由来細胞株を培養してホモジナイズして細胞分画を行なった。Western blottingによって各分画に含まれるAPP断片にはamyloidogenic,non-amyloidogenicな断片が多数認められた。このうち、これまでに報告されていない完全長のAβを含む50kDaのAPP断片がミトコンドリア画分、可溶性画分に見出された。2)リソソーム蛋白分解酵素阻害剤(ロイペプチン)を培養液に添加して前述の細胞を培養し同じ様に分画すると、完全長のAβを含む50kDaのAPP断片はミトコンドリア画分、可溶性画分でより明瞭となつた。さらに詳しく分画しリソソーム酵素の活性と比較すると、この50kDaのAPP断片は酵素活性のピークと一致して認められた。以上の結果はリソソーム経路がAPPの分解過程に関与しAβの生成に重要な役割を演じていることを示唆するものと考えられる。アルツハイマ-病(AD)脳には、アミロイドβ蛋白の沈着による特有の病変が見られる。アミロイド前駆体蛋白(APP)からβ蛋白への分解・沈着過程を明らかにすることは重要であり以下の実験をおこなった。1 APPの各ドメイン、β蛋白部分に対するモノクロ-ナル抗体の樹立1)モノクロ-ナル抗体の樹立;APPの各ドメインはNー末端からシグナル・ペプチド、細胞外ドメイン、インヒビタ-・ドメイン、β蛋白、細胞内ドメインの順に配列している。APPのアミノ酸配列に従って6部位のペプチドを合成した。これを抗原としてmcAbの樹立を試みたところ、βペプチド部分、細胞外ドメインに対する極めて力価の高いmcAbを得る事に成功した。しかしほかのドメインに対する抗体は、力価が低かったためカップリング法に改良を加えて、再度免疫してmcAbの樹立を行っている最中である。2)mcAbのエピト-プの解析;既に樹立したAPPと強く反応するmcAbについて、多数の合成ペプチドを用いてエピト-プを詳細に決定する事が出来きた。この抗体はヒトβ4ー10を特異的に認識する事が分かった。同様の方法を用いてβ蛋白にたいするmcAbについてもエピト-プのマッピングを終えた。2 APP関連物質に関する検討;以上の通り性格の明かなmcAbによりAPPの分解過程を調べた。1)血小板、リンパ球のAPPについての検討;AD,ほかの痴呆性疾患、健常者から血小板、リンパ球を分離して培養上清と細胞分画成分についてそれぞれ刺激前後のAPPの性質をmcAbを用いて調べた。血小板、リンパ球の培養上清ではAD、他の痴呆性疾患、健常者で120kDa程度のAPPが見られβ蛋白部分を含ものが認められた。2)培養細胞のAPPについての検討;HeLa

細胞、HVT78(T細胞由来)、Raji細胞(β細胞由来)、U937(モノサイト由来)などの株化細胞をもちいて同様に調べた。その結果APPの産生や処理過程は細胞の種類が異なると差異がある事を示唆する所見がえられた。そのため現在APPのmRNAの定量を同時に行い詳細を明らかにすべく検討している。アルツハイマー病脳には特有のアミロイド沈着構造物が見いだされる。アミロイド前駆体蛋白(APP)がどのような分解をうけてアミロイドとして沈着するのかを明らかにするために次のような実験を行った。1)APPの各ドメインに対するモノクローナル抗体の樹立;APPの種々の部分に対するモノクローナル抗体(mcAb)を樹立してきたが、これまでに得られなかったN末端、KPIドメイン、C末端部分、β蛋白9-25部分に対するmcAb'sの作製を試みた。APPのアミノ酸配列に従って上記の合成ペプチドを作製し幾つかの方法で蛋白と架橋させマウスを免疫した。このうちN末端とC末端部分に対する高力価のmcAbを樹立することができた。KPI部分とβ蛋白9-25については多クローン抗体を作製した。これによりAPPに対する有用な抗体のパネルができた。2)血小板におけるAPP関連物質の検討;血小板をトロンビンで刺激するとAPPを分泌する。この分泌型APPは抗N末端抗体、抗A2抗体とは反応し抗β抗体、ならびに抗C末端抗体とは反応しないことが確認された。興味あることは、トロンビン刺激後の血小板のホモジナートには抗β9-25、C末端抗体と反応を示す分子量の小さなAPPの断片があるらしいことである。この断片はAPPの分泌過程に伴う分解産物であるのか、あるいはAPPには別の代謝経路があることを示唆していると考えられる。しかし、細胞のホモジネートを用いてウエスタン・ブロットを行うと非特異的反応が生じることがあるため特異性について更に検討している。3)ヒト脳、髄液のAPP関連物質の検討;これまでに樹立したアミロイドに対するmcAbのエピトープを解析したところ、Apo E、SP-40、40を認識する抗体があることが明かになった。この抗体を用いて体液中のApo E、SP-40、40の定量が可能となり診断的価値について検討している。4)APPのcDNAサブクローンの作製;制限酵素をもちいたり、PCR法を応用してサブクローンの作製を続けている。
新規消化管ホルモン,グレリンの分泌調節機構の検討

動物モデルを用いたグレリン分泌機構の検討ムスカリン受容体タイプ3(M_3)欠損マウスでは、血漿グレリン濃度に有意な変化を認めないものの、胃粘膜中グレリン濃度が有意に上昇していた。また、2型ヒスタミン受容体(H_2)欠損マウスでは、血漿グレリン濃度に有意に上昇し、胃粘膜中グレリン濃度が有意に低下していた。一酸化窒素(NO)合成阻害薬であるL-NAMEをラットに1週間投与したところ、血漿グレリン濃度が有意に上昇した。以上より、グレリンの分泌調節に迷走神経や末梢のNO産生神経が密接に関与し、グレリンが脳腸相関のキーファクターとなり得る可能性が示唆された。慢性胃炎患者におけるグレリン動態の検討国立循環器病センターの寒川らとの共同研究により確立した高感度のRadioimmunoassayを用いて69名の慢性胃炎の患者に対し,内視鏡施行時に血漿グレリン濃度,血清ペプシノーゲンI,II濃度を測定したところ、H.pylori除菌前群と除菌後群の2群間は血漿中グレリン濃度に有意な差を認めなかった。特にH.pylori除菌後群において内視鏡的に胃体部まで萎縮が進行している群(open type atrophy群)ではそうでない群(closed type atrophy群)と比較して、有意に、血漿グレリン濃度が低値であった。また、血漿グレリン濃度は血清ペプシノーゲンI濃度、ペプシノーゲンI/II比と有意な相関を示した。また、高度萎縮性胃炎の一症例についてH.pylori除菌後の2年間にわたって血漿グレリン濃度を詳細に追跡したところ、著明な変動を認めなかった。以上より、血漿中グレリン濃度が安定した萎縮性胃炎のマーカーとなりうる可能性が示唆された。ストレプトゾトシン誘導糖尿病ラットにおける検討我々はグレリンの発見者である国立循環器病センターの寒川らとの共同研究により,確立したRadioimmuno assayによる血中及び眉粘膜中のグレリンの測定、定量的RT-PCRによるプレプログレリンmRNAの測定、免疫組織化学によるグレリン陽性細胞数の検討といった測定系を確立した。まず、1型糖尿病のモデル動物である低体重及び過食を呈するストレプトゾトシン(STZ)誘導糖尿病ラットにおけるグレリン動態を検討した。STZ誘導糖尿病ラットにおいて,血漿グレリン濃度および胃粘膜中のプレプログレリンmRNA発現が増加する一方で,胃粘膜中のグレリン含有量,単位面積あたりのグレリン陽性細胞数が減少するが,インスリン投与により,体重が回復し、これらの変化が正常化することを明らかにした。このSTZラットにおけるグレリン動態から低体重という負のエネルギーバランスが,胃粘膜中からのグレリン分泌及び産生を刺激していると考えられた(Masaoka et al. FEBSLett 541:64-8, 2003)。次に,Helicobacter.pylori (H.pylori)陽性胃炎の有用なモデル動物であるスナネズミを用いてH.pylori感染のグレリン動態への影響について検討した。H.pylori感染スナネズミにおいて,血漿グレリンが増加する一方で,胃粘膜中のグレリン含有量,単位面積あたりのグレリン陽性細胞数、プレプログレリンmRNA発現が減少した。また、胃粘膜中の好中球浸潤を反映するミエロペルオキシダーゼ活性と血漿グレリン値とが有意に正相関した。このことからH.pylori感染によって血漿中と胃粘膜中のグレリンが変動することが明らかになった(Suzuki, Masaoka et al. Gut 53:187-94, 2004)。
肝細胞成長因子(HGF)による受精卵着床機構の研究

肝由来のHGFbeta-subunitを純化精製した子宮内膜間質細胞培養系に作用させ、HGF産生を刺激し、この時の全RNA量を測定し、HGF刺激による反応に対する子宮内膜間質細胞のHGF産生がいつ行なわれるかを検討した。子宮内膜間質細胞からのHGF分泌の検討から、種々の月経周期での子宮内膜由来のHGFの発現を検討し(Northen blotやPCR法による)子宮内膜でのHGFの分泌の意義を検討した。この結果、HGFは妊娠初期、胎盤形成期、子宮腔の拡張、分娩前の4期に大量に出現し、いずれの時期でも、子宮内膜の再編成に関与しているものと考えられた。妊娠初期や胎盤形成期には子宮内膜と絨毛細胞との相互作用にHGFは不可欠であり(内膜層への純毛細胞の湿潤と再生)、子宮腔の拡張期や分娩前期には子宮内膜自身の再構成が子宮腔全体に発現しており、その過程でHGFは子宮内膜間質細胞の増殖、子宮内膜上皮細胞の修復に関与していることが示唆された。流産過程でのHGF産生の検討を行ない、脱落膜細胞由来のHGFとの役割を比較検討した。流産過程での子宮内膜間質細胞からのHGF産生は有意に上昇し、流産の進行度に応じて分泌量が増加した。一方、脱落膜細胞由来のHGF産生は逆に減少する傾向があった。子宮内膜で主にHGFを産生する子宮内膜間質細胞をin situ hybridizationで確認し、子宮内膜間質細胞層内での局在を検討し、子宮内膜基底層の存在をHGFの分布から明確にした。HGFは子宮内膜基底層の特に上層の細胞に局在し、基底層下部の細胞には局在がきわめて少ない傾向があった。子宮内膜基底層の上層細胞のHGF産生が周期的な変化を示し、月経後の子宮内膜の再生に関与していることが明らかになった。これらの成果はHGFが子宮内膜の初期の再生のメカニズムに多くの作用を行なっていることを示唆し、性ステロイドホルモン以外の増殖因子の関与が子宮内膜で明確となった。
分子進化工学的手法によるデハロゲナーゼの開発:物質生産と環境浄化への応用

環境浄化や有用物質生産に利用しうる新規デハロゲナーゼの開発を目的として研究を実施した。(1)DL-2-クロロプロピオン酸を唯一の炭素源として含む培地を用いてスクリーニングを行い、静岡県浜松市の佐鳴湖の湖水からデハロゲナーゼ生産菌Methylobacterium sp.CPA1を取得した。本菌体抽出液から、DL-2-ハロ酸デハロゲナーゼを精製すると共に、遺伝子を単離し、一次構造を明らかにした。本酵素は2-クロロプロピオン酸のD-体、L-体のいずれにも作用し、ハライドイオンの脱離を触媒することを明らかにした。クロロ酢酸やブロモ酢酸には作用したが、フルオロ酢酸には作用しなかった。また、本酵素はハロ酸アミド(2-クロロプロピオン酸アミド)にも作用した。本酵素は、ハロ酸アミドの酵素的変換や、酵素によるハロ酸とハロ酸アミドの識別機構の解析などに有用であると考えられる。(2)フルオロ酢酸を炭素源として含む培地を用いて土壌細菌のスクリーニングを行い、フルオロ酢酸の加水分解的脱フッ素反応を触媒するフルオロ酢酸デハロゲナーゼを生産するBurkholderia sp.FA1を得た。本酵素は、クロロ酢酸やブロモ酢酸よりもフルオロ酢酸を良好な基質とした。遺伝子を単離し、一次構造を明らかにした。(3)DL-2-ハロ酸デハロゲナーゼの触媒機構を解析した結果、他の2-ハロ酸デハロゲナーゼとは異なり、溶媒の水分子が、直接、基質のα-炭素を求核攻撃し、加水分解反応が進行することが明らかとなった。(4)L-2-ハロ酸デハロゲナーゼのD10N変異型酵素による反応機構を解析し、酵素のAsn10が触媒残基として機能し、中間体としてシアノアラニン残基が生成するというユニークな機構で反応が進行することを明らかにした。DL-2-クロロプロピオン酸を唯一の炭素源として含む寒天培地でのコロニー形成を指標としてスクリーニングを行い、静岡県浜松市の佐鳴湖の湖水からデハロゲナーゼ生産菌を取得した。16SrDNAの塩基配列から、本菌はMethylobacterium属であることが明らかとなり、Methylobacterium sp.CPA1と命名した。本菌体抽出液から、硫安分画、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーによって、デハロゲナーゼを精製した。サブユニット分子量は約34,000、ネイティブ酵素の分子量は約137,000であったことから、本酵素は四量体として存在するものと考えられた。精製酵素は、2-クロロプロピオン酸のD-体、L-体のいずれにも作用し、ハライドイオンの脱離を触媒した。また、本酵素はハロ酸のみならず、ハロ酸アミド(2-クロロプロピオン酸アミド)にも作用した。L-2-クロロプロピオン酸を基質としたときの至適pHは約9、Vmax値は27μmol.min^<-1>.mg^<-1>、Km値は0.76mMであった。フルオロ酢酸デハロゲナーゼ(FAc-DEX)はフルオロ酢酸の加水分解的脱フッ素反応を触媒し、グリコール酸とフッ化物イオンを与える。

強固な炭素-フッ素結合の切断を触媒する唯一の既知酵素である。これまでにMoraxella sp.Bから単離されている(FAc-DEX H1)が、一次構造が明らかにされたのはこの一例のみで、同種酵素間の構造比較による機能性アミノ酸残基の推定などは不可能であった。また、本酵素の反応機構の詳細を明らかにする上でX線結晶構造解析は必須であるが、FAc-DEX H1については構造解析に適した単結晶を得ることが困難であった。そこで、新しいFAc-DEXを取得すべく、土壌細菌のスクリーニングを行った結果、生産菌としてBurkholderia sp.FA1が得られた。本酵素は、クロロ酢酸やブロモ酢酸よりもフルオロ酢酸を良好な基質とした。遺伝子の塩基配列を決定した結果、本酵素は304アミノ酸残基からなり、分子量は34,082であることが分かった。本酵素はFAc-DEX H1と61%の相同性を示した。FAc-DEX H1で触媒中心残基として機能することが示されたAsp105とHis272は、FAc-DEX FA1においても保存されていた。本酵素はハロアルカンデハロゲナーゼやエポキシドヒドロラーゼなどの加水分解酵素、および、非ヘム・非金属型のハロペルオキシダーゼと相同性を示した。立体構造モデルを作製した結果、活性中心のAsp104とHis271の近傍には、Phe35、His104、Arg106、Arg109、Tyr148、Trp151、Tyr213、Gln248、Phe273が存在することが示唆された。これらのうちGln248以外は、すべてFAc-DEX FA1においても保存されており、これらの残基がフッ素の引き抜きに関与すると推定された。
イオンチャネル立体構造の機能的解明:電位センサーが脂質膜内を浮動することの検証

イオンチャネル立体構造のおおよそのイメージはもっぱらMackinnonら(2003)によるKチャネルの結晶構造解析から得られた。すなわち電位センサー部分がホアの外側の脂質膜部分に位置し電位に影響を受け浮動しながら,イオンを通す部分(ホア部分)と互いに比較的独立したユニットとして振る舞うことが予想されている。Naチャネルに特異的に結合するシガトキシンは分子量がおよそ1000で13個の環状構造(AM環)がつながった比較的固い構造をもち,脂溶性が高い。そのような毒はおそらく電位センサー部分に脂質膜側からアクセスしNaチャネルの機能を改変するであろう。従ってシガトキシンとNaチャネルの相互作用を明らかにすることがNaチャネルの立体構造を機能的に解明することに至ると考え研究を遂行した。その結果以下の4つのNaチャネルの構造に関する重要な所見が得られた。1.CTX3C(合成シガトキシン類の1つ)は4つあるドメインの電位センサーのうちDII(ドメインII)に特異的に作用することがわかった。2.B環ビオチン付加CTX3CやM環にOH基を導入した51-OH-CTX3Cの実験からA-B環側がNaチャネルに対する官能基として重要であることがわかった。3.CTX3C構造の中間に位置するF環を本来の9員環から8または10員環にすることでシガトキシンの能力の大きな低下が見られた。F環のわずかな構造変化がA,B環の位置を大きく移動させることがその原因と推測される。4.CTX3Cはテトロドトキシン耐性で侵害受容を司るNa_v1.8のDIIに特異的に作用し異常感覚や痛覚過敏を引き起こすようなNaチャネルの機能改変を引き起こすことがわかった。以上の結果から今後はさらにDIIの電位センサー部分とポア部分をつなぐサイトに注目し脂質膜からのシガトキシンがアクセスする様子を具体的に明らかにしてゆきたい。[目的]イオンチャネルの電位センサー部分の立体的配置がチャネル蛋白の最外層に位置し、脂質膜を移動して機能するという仮説に対して、合成シガトキシン同族体のCTX3CというNaチャネル毒を利用して機能的根拠をあたえる。なおCTX3Cは分子量が大きく硬い構造をしており脂質膜を貫通して機能すると考えられるのでCTX3Cの作用部位は脂質膜に面すると考えられる。その上でNaチャネルの電位センサーとされる部分や関連する部位のアミノ酸に変異を加えCTX3Cの機能に影響を与えるかを検討する。またCTX3Cそのものに親水性の基を導入しそれらが脂質膜への進入をどのように阻害するかをもってCTX3CのNaチャネルに対する結合配置を考える。[結果]Naチャネル各ドメインのS6に囲まれたチャネル孔に面するsite-2に感受性のあるmutantsは概ねCTX3Cの作用に影響しない。D1S6の孔に面せず、D1S6のD4に近い側のmutantsでsite-5と言われる部位はCTX3Cの活性化促進作用を喪失させる。またS4の陽電荷を有するアミノ酸を全ドメインにわたって一つずつグルタミンに変異し電位センサーの電荷をneutralizeするとD2のみCTX3Cのブロック効果を逆に電流増大効果に改変する。また、その効果はneutralizeする電荷の位置依存的である(細胞外に近いほど効果は大きい)。以上のことから予想通りCTX3Cは従来のsite-5に加え電位センサー部位を受容体とすることがわかった。さらにCTX3CのB環OH基に長短のリンカーで親水性の基であるビオチンを付加したものを2種類合成した。ビオチンがCTX3Cの効果にどのように影響を与えるかを今後検討する。[目的]電位依存性Naチャネルの電位

センサー部がシガトキシンとなんらかの相互作用を起こし、Naチャネルの機能が修飾させるであろうことが、前年までの成果から示唆されている。即ちチャネル分子のユニットであるD2S4 (domain2 segment4)に配置された電位センサーの電荷部分のアミノ酸を改変することによって中性化すると、シガトキシンのNaチャネルブロック作用が消失することがわかった。Mackinnonらのモデル(2003)では電位センサーはチャネル分子の最外層に位置していることをチャネルの結晶をX-線構造解析することによって示した。したがって脂溶性が高く、膜を貫通するほど大きく、環状構造が直鎖状に連なった固い構造を持つシガトキシンは脂質膜相から電位センサーにアクセスするであろうと考えられる。この事が正しければシガトキシンに親水性の基(ビオチンなど)を付加することによって、その付加した親水基が作用部位へのアクセスを阻害すれば、シガトキシンの機能が失われるであろう。従って本年度はCTX3CのB環に長短のリンカーを介してビオチンを付加した2種類のアナログを作成し、それらのNaチャネルに対する効果を見た。[結果]短いリンカーを持ったビオチン化CTX3C (type D)および長いリンカーをもったビオチン化CTX3C (type B)をrNa_v1,2チャネルにそれぞれ300nM投与した(type Dがシガトキシンの機能を失ったとしても、type Bの方はリンカーが長いのでビオチンが作用を阻害しにくいと考えて2種類のアナログを使用した)。いずれのtypeのビオチン化CTX3Cとも全くシガトキシンの作用を示さなかった。従ってB環に近い部位がチャネルとの結合に重要な関わりを持っていることが示唆された。すなわちB環の反対の極に位置するM環側はシガトキシンの機能にそれほど重要ではないこともうかがえる。M環にOHを付加した51-OH CTX3CがrNav1.2チャネルに対しCTX3Cとほぼ同等の効果だったことはこの考えを支持する。今後M環にビオチンを付加した場合シガトキシンの機能が保存されれば以上の仮説が更に支持される事となろう。Naチャネルに特異的に作用するシガトキシン類は分子量がおよそ1000で13個の環状構造(AM環)がつながった比較的固い構造をもち,脂溶性が高い。そのようなトキシンがNaチャネルの機能を修飾する作用を有するにはシガトキシン分子がNaチャネル分子にどのような機構で結合するのかを突き止めることは大変重要と考える。Naチャネルを含む電位依存性チャネルはもっぱらKチャネルの結晶構造解析によって電位センサー部分とイオンを通す部分(ポア部分)が互いに比較的独立したユニットとして振る舞うことが予想されている。本研究で示したようにCTX3CのB環部分にビオチンを付加すると機能しなくなること,また対側のM環にOH基を付加することがシガトキシンの機能に影響も与えないことから,A-B環側が官能基として重要であることがわかった。さらに中間に位置するF環の構造が本来9員環から8または10員環にすることでも大きくシガトキシンの能力の低下が見られた。F環の構造がA,B環の位置を変化させることがその原因と考えられた。
自立型発電システムを用いたサンゴ再生促進技術の開発

微弱電流によりサンゴの成長を促進させる技術の開発を目的として,以下のような現地調査,水理実験,サンゴ育成用モルタル基盤の開発およびサンゴ飼育実験を実施した.現地調査は沖縄県において実施し,実際のサンゴ被害およびサンゴ再生の現状について調べた.水理実験では循環型水路を使用して,サンゴ再生を目的とした自立型発電システムの設計および性能試験を実施した.サンゴ育成用モルタル基盤の開発では材料や形状について検討し,設計した.飼育実験では実際にサンゴが生息している海底を再現した水槽においてサンゴを飼育し,サンゴ育成用モルタル基盤の条件や微弱電流の有無による成長率を比較した.微弱電流によりサンゴの成長を促進させる技術の開発を目的として,以下のような現地調査,水理実験,サンゴ育成用モルタル基盤の開発およびサンゴ飼育実験を実施した.現地調査は沖縄県において実施し,実際のサンゴ被害およびサンゴ再生の現状について調べた.水理実験では循環型水路を使用して,サンゴ再生を目的とした自立型発電システムの設計および性能試験を実施した.サンゴ育成用モルタル基盤の開発では材料や形状について検討し,設計した.飼育実験では実際にサンゴが生息している海底を再現した水槽においてサンゴを飼育し,サンゴ育成用モルタル基盤の条件や微弱電流の有無による成長率を比較した.微弱電流によりサンゴの成長を促進させる技術の開発を目的として,以下のような研究を実施した.(1)サンゴ再生を行っている沖縄県において現地調査を実施し,資料収集を行うとともにサンゴ再生の現状および問題点を明らかにした.実際にサンゴ再生で用いている板状の基盤は本研究で開発するサンゴ育成用モルタル基盤の参考とした.(2)実験室において,サンゴが生息している海底の水流,水質,照明などの条件を再現した水槽を製作し,サンゴの飼育実験を開始した.特に水温や塩分,カルシウムなどの条件を試行錯誤で変化させて,サンゴを安定して飼育できる最適な環境を構築した.また,モルタル基盤に通電と電流測定をリアルタイムで行える装置を製作した.(3)ゼオライトや炭素粒子などの添加,水セメント比,ポーラスなどの条件を検討して,微弱電流を流せるサンゴ育成用モルタル基盤を検討した.また,モルタル基盤を長期間水中で使用することを踏まえて,水質や電気伝導度の変化を水槽実験で測定した.(4)モルタル基盤にサンゴを設置して,微弱電流を流した飼育実験を実施したが,サンゴが死滅してしまった.水質分析を行ったところ,銅イオンが多量に発生しており,電極に使用していた銅が想定以上に流出していることが判明した.(4)二次元造波水路において,流力振動を利用した圧電セラミックによる発電装置の性能試験を実施した.実際にサンゴが生息する海底での流速を考慮して0.1 m/s程度の流れを発生させた.(5)上記の発電装置に加え,より高電圧の発電を目指し,電磁誘導を利用した発電装置を開発して,同様に水理実験を実施した.微弱電流によりサンゴの成長を促進する技術の開発を目的として以下の研究を実施した.(1)サンゴ再生を行っている沖縄県において現地調査を実施した.開発しているサンゴ育成用モルタル基盤(以下,基盤)の形状,大きさ,材料,表面,サンゴの設置方法等について,サンゴ植樹を行っているNPO等と検討を行った.また,サンゴが生育している海域(以下,サンゴ海域)で潜水調査を実施して,実証実験を行うサイトの選定を行った.(2)サンゴ海域の水流,水質,照明等の条件を再現した水槽を用いて,サンゴの飼育実験を実施した.特に基盤の材料(普通モルタル,ゼオライトモルタル,炭素粒子モルタル)および電流を変化させて,サンゴの成長を調べた.(3)基盤には切断したサンゴを設置するが,切断面から白化が進行する懸念があった.そこで,上記の3種類の基盤を用いて,サンゴの成長における切断面の影響について飼育実験を実施した.(4)サンゴの成長率を測定する方法として3Dスキャナーと3Dプリンターの組み合わせを検討した.非接触で計測できる利点は高いが,サンゴを海水中から取り出さないといけないこと,計測に時間がかかること,サンゴ表面の複雑な凹凸が高精度で計測できないことなどの問題点が明らかになった.(5)通電するためには基盤に電極を挿入しなくてはならない.そこで,電極の種類や形状,基盤への埋込み型,供試体の作成法等を検討した.(6)サンゴ海域の流速を把握するため数値解析を実施した.支配方程式に線形長波理論を採用し,スタッガード格子を用いたLeap-frog法で差分化した.計算領域は沖縄県チービシ環礁付近とし,潮汐を境界条件として入力した.(7)二次元造波水路において流力振動を利用した圧電セラミックおよび電磁誘導による発電装置の改良を行った.特に従来の振動柱の上流側にカルマン渦生成中を新たに設置し,振動を増大させることができた.水に関連した災害や環境問題微弱電流によるサンゴの成長促進を調べるため,飼育実験を行ってきた.

しかし,開発中のモルタル基盤にサンゴを設置し,微弱電流を通電させたところ,電極から想定以上の銅イオンが流出し,サンゴが死滅してしまった.飼育実験は既に再開しているが,サンゴの成長に関するデータは取り直しとなったため,予定より遅れが生じている.しかし,サンゴ育成用モルタル基盤の開発は予定通り進んでいることと発電に関する水理実験は予定より進んでいるため,研究全体としての遅れは僅かである.サンゴ育成用モルタル基盤の材料の選定や構造については検討が進んでいるため,電極の素材の選定およびモルタル基盤への設置方法について検討を行う.平行して,流力振動および電磁誘導による発電システムをモルタル基盤に設置する構造の設計を行う.また,サンゴの飼育実験を継続して,微弱電流による成長促進の定量的な把握を行う.サンゴの飼育実験中にサンゴが死滅した.その原因は電極に用いていた銅が想定以上にイオン化して流出したためである.そこで,新たな電極の検討およびサンゴの追加購入が必要となった.次年度,引き続き開発するモルタル基盤では,電極についても検討する予定であった.また,飼育実験も継続するため,サンゴの追加購入を予定していた.よって,平成25年度に購入した物品は次年度の研究でも使用できるため,全体としては特に問題は生じない.
知的障害者に対する自己決定・意見表明への援助-個別面接を通して-

施設で生活をする知的障害者に対して個別面接を年に4回実施している。本人記入のアンケート結果より希望者のみに面接を継続している。95年9月より実施しており、99年3月までに対象となったのは32名(うち継続希望者13名、退所者゚5名、辞退者7名、その他7名)である。回数は最多は15回、最少は1回である。面接を継続する中で、2つ知見が得られた。(1)対象者が自信をつけ、自分を肯定的に表現しはじめること(2)施設の規則や職員への要望を表現するようになってきたことである。ただ彼らの要望は面接の中でのみ語られているに過ぎず、施設の規則に反映されたり、職員に伝えるまでには成長していない。彼らの了承を得たうえで、彼らの要望を筆者が職員に伝えるという試みを2回もった。職員は、その7割が筆者の面接活動を「施設で生活する人のストレスを発散する場」として評価していた。その一方で、筆者が面接に基づいて彼らの要望と具体的な改善(起床就寝時間・金銭や薬やロッカー管理の改善)を提案すると反発が強かった。しかし施設長は筆者の提案を一部実施したいとの意向であった。来年度は面接を年に6回に増やしつつ、職員との話し合いの時間を長く取り、施設生活者の生活改善にむけて協力できる体制づくりを行う予定である。筆者は、97年、98年共に8月に.スウェーデン、イエテボリを訪れ、知的障害者団体FUBの代表者アンデッシュ・ベルシュトローム氏に本研究についでのレビューをうけた。彼によると、施設のもっている閉鎖性は世界共通の問題で奔ること、スウェーデンは知的障害者施設解体を世界ではじめて実施しており、問題・混乱もあるが、障害者の生活の質は大きく向上し、障害者本人が幸福感が感じている。筆者の研究について、障害者の気持ちを聴いていくことはとても大切であり、また彼らの要望を職員だけでなく、施設外の人に伝えていくことが大切であるとのアドヴァイスをいただいた。施設で生活する知的障害者に対して個別面接を5月、7月、10月、1月に実施した。現在まで希望者30名に順次面接を開始し、面接終了後にアンケートを実施し、今後の面接の希望を問うた。アンケート結果に従って「もう一度話したい」と回答した対象者にのみ面接を継続している。現在(98年3月)面接継続希望者は14人、辞退希望者は9人、その他(退寮など)7人である。14人のうち面接回数は最多は11回(2人)、最少は1回で、(1人)で、ひとりあたりの平均面接回数は、5.9回であった。自分を表現することを保障された個別面接を継続する中で、今年度2つ知見が得られた。ひとつは、対象者が自信をつけ、能動的になり、自分を肯定的に表現しはじめる、ということである。もうひとつは、施設の生活・規則や職員に対する疑問や不満を表現するようになってくる人もいる、ということである。ただ彼らの声は、全体の声となって生活を変えていくまでには成長していない。彼らの声をどのように束ねていくのかが来年度にむけての仮題となってきた。この結果は日本社会福祉学会第45回全国大会で報告した。また筆者は、今年8月にスウェーデン、イエテボリを訪れ、知的障害者団体FUBの代表者アンデッシュ・ベルシュトローム氏に本研究についてのレビューをうけた。彼によると、施設のもっている閉鎖性は世界共通の問題であること、スウェーデンは知的障害者施設解体を世界ではじめて実施しており、問題・混乱もあるが、障害者の生活の質は大きく向上し、障害者本人が幸福感が感じているなどのコメントをいただいた。筆者の研究についてはふたつめの知見である。疑問や不満を施設外の人に伝えていくことが大切であるとのアドヴァイスをいただいた。来年度も再びレビューをうける予定である。

筆者は、97年、98年共に8月に.スウェーデン、イエテボリを訪れ、知的障害者団体FUBの代表者アンデッシュ・ベルシュトローム氏に本研究についでのレビューをうけた。彼によると、施設のもっている閉鎖性は世界共通の問題で奔ること、スウェーデンは知的障害者施設解体を世界ではじめて実施しており、問題・混乱もあるが、障害者の生活の質は大きく向上し、障害者本人が幸福感が感じている。筆者の研究について、障害者の気持ちを聴いていくことはとても大切であり、また彼らの要望を職員だけでなく、施設外の人に伝えていくことが大切であるとのアドヴァイスをいただいた。
癌抑制遺伝子IRF-1による細胞増殖及びアポトーシスの制御機構の解析

インターフェロン系を制御する転写活性化因子IRF-1の機能解析から、IRF-1が癌抑制遺伝子として機能する事、アポトーシスの制御に重要である事を明らかにした。一方、多くのヒト癌組織で遺伝子変異のみられる癌抑制遺伝子p53が、細胞周期、アポトーシスの制御に重要であることが示されているが、細胞周期の制御におけるIRF-1の役割は明らかではなかった。そこで、IRF-1欠損胎児線維芽細胞(EF)を用いて、X線照射、抗癌剤投与によるDNA損傷時の細胞周期の変化を、野生型およびp53欠損EFと比較、検討を行った結果、野生型EFではG1停止が認められたが、IRF-1欠損EFではp53欠損EFと同様に細胞周期の停止が認められなかった。更に、野生型EFとは対照的に、CDK2、CDK4活性はIRF-1、p53欠損EFでともに抑制されないことが判明し、IRF-1はCKIの発現制御に関与していると推測された。そこで現在知られている全てのCDK抑制因子の発現を検討した結果、p21の発現のみがIRF-1欠損EF及びp53欠損EFで低下しており、またDNA損傷による発現誘導も認められなかった。さらにp21のプロモーターにはp53結合部位の他、IRF結合部位に類似した配列が存在すること、p21遺伝子プロモーターがIRF-1及びp53によって協調的に活性化されることを見出した。この様な癌抑制機能をもつ転写活性化因子の協調作用を見出したことは始めてであり、現在両癌抑制遺伝子がどのような機構で癌抑制に関わっているかを、IRF-1及びp53を同時に欠損したマウスを作成し、解析している。
遺伝子操作による非造血系組織の脱分化及び可塑性獲得と造血系への分化転換

遺伝子操作による人為的分化転換の可能性、特に、非造血系組織が造血系へ分化転換することが可能かどうかを検討した。具体的には、骨格筋細胞を脱分化させる作用のあるMsx1遺伝子を、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いてマウス骨格筋で一過性に発現させ、そこに出現する単核細胞が造血系への分化能を有するかどうかを調べた。AAVベクターで導入した遺伝子は、その殆どが染色体に組み込まれない形で存在するため、骨格筋細胞がMsx1の働きにより脱分化して増殖するようになると、Msx1遺伝子は次第に失われ、細胞は再び分化を始めるという想定に基づくものである。脱分化誘導用としてマウスMsx1遺伝子、コントロールベクター用としてマウスEpo遺伝子をAAVベクターに搭載し、また非発現AAVベクターも用いた。マウス前脛骨筋にAAV-Msx1あるいはコントロールベクターを注射し、同部位の骨格筋より分離した単核細胞を用いてin vitroコロニー形成実験を行ったところ、Msx1ベクターを筋注した部位で造血前駆細胞の増加を認めた。さらに、同部位の単核細胞は、in vivo造血系再構築能を有する未分化造血幹細胞を多く含むことを見出した。この骨格筋の中に出現する造血幹細胞が骨格筋の脱分化・再分化という現象に基づくものか、あるいは組織障害を修復するために移動してきた骨髄由来のものであるかを調べるため、造血系と骨格筋を区別できるようにしたキメラマウスを作製し、研究をさらに進めている。その他、AAVベクターで骨格筋に導入した遺伝子の動態解析をin vivoイメージング装置を用いて行った。Msx1遺伝子を導入した場合は、コントロール遺伝子と異なり、数週後には失われていく傾向を認め、予想した結果が得られた。骨格筋から脱分化段階を経て造血幹細胞を生み出すことが可能となれば、新たな幹細胞ソースになるものと期待される。本研究では、遺伝子操作による人為的分化転換の可能性、特に、非造血系組織が造血系へ分化転換することが可能かどうかを探った。具体的には、筋細胞を脱分化させる作用のあるMsx1遺伝子を、AAVベクターを用いてマウス骨格筋で一過性に発現させ、そこに出現する単核細胞が造血系への分化能を有するかどうかを調べた。AAVベクターで導入した遺伝子は、その殆どがエピソームの形で存在するため、筋細胞がMsx1の働きにより脱分化して増殖するようになると、Msx1遺伝子は次第に失われ、細胞は再び分化を始めるという想定に基づくものである。具体的には、1型あるいは5型の血清型のAAVベクターを作製し、搭載する遺伝子は、脱分化誘導用がマウスMsx1遺伝子、コントロールベクター用がマウスエリスロポエチン(Epo)遺伝子とした。マウス前脛骨筋にAAV-Msx1あるいはAAV-Epoを注射し、同部位および無処置の骨格筋より経時的に単核細胞を分離し、フローサイトメトリー解析・in vitroコロニー形成実験を行った。その結果、Msx1遺伝子を発現させた骨格筋内に、造血系マーカーを持った単核細胞が出現し、その中の造血前駆細胞が有意に増加していることが判明した。また、そのような単核細胞の中に造血幹細胞レベルの細胞が存在することが、in vivo造血系再構築実験により示された。このように、脱分化誘導遺伝子により一旦運命づけられた分化の方向性を解除することが可能となれば、新たな幹細胞のソースを生み出すことができるものと期待される。

遺伝子操作による人為的分化転換の可能性、特に、非造血系組織が造血系へ分化転換することが可能かどうかを検討した。具体的には、骨格筋細胞を脱分化させる作用のあるMsx1遺伝子を、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いてマウス骨格筋で一過性に発現させ、そこに出現する単核細胞が造血系への分化能を有するかどうかを調べた。AAVベクターで導入した遺伝子は、その殆どが染色体に組み込まれない形で存在するため、骨格筋細胞がMsx1の働きにより脱分化して増殖するようになると、Msx1遺伝子は次第に失われ、細胞は再び分化を始めるものと考えられる。1脱分化誘導遺伝子搭載AAVベクターの作製:主に5型の血清型のAAVベクターを作製した。脱分化誘導用としてマウスMsx1遺伝子、コントロールベクター用としてマウスEpo遺伝子、あるいは非発現AAVベクターを用いた。2マウス骨格筋へのAAV-Msx1の注射と、同部位における造血系細胞の解析:骨格筋の中に検出される造血系前駆細胞の由来について解析するため、造血系と骨格筋を区別できるようにしたキメラマウスを作製した。マウス前脛骨筋にAAV-Msx1あるいはコントロールベクターを注射し、同部位の骨格筋より分離した単核細胞を用いてin vitroコロニー形成実験(検証実験)、ならびにin vivo造血系再構築実験を実施している。3 AAVベクターで骨格筋に導入した遺伝子の動態解析:マウス前脛骨筋にAAV-Msx1あるいはAAV-EpoをAAV-Lucと共に注射し、導入遺伝子の動態をin vivoイメージング装置を用いて解析した。Msx1遺伝子を導入した場合は、コントロールと比較して、数週後には失われていく傾向を認め、予想した結果が得られた。骨格筋から脱分化段階を経て造血幹細胞を生み出すことが可能となれば、新たな幹細胞ソースになるものと期待される。
グリア細胞成長因子に対するグリア細胞応答機構:カルモジュリン依存性細胞内反応

ウシ脳より精製されたグリア細胞成長因子(GMF)は分子量19KMr、等電点4.75の酸性タンパクで、ラットグリア芽細胞の増殖を促進し、引き続いてアストロサイト様形態に分化誘導する。今回研究者はGMFによるグリア芽細胞の形態分化が細胞内Caおよびそのregulatorであるカルモジュリンによりどのように制御されているかを検討した。GMF刺激による形態分化はサイトカラシンD(1μM)により促進されコルヒチン(50μM)により強く阻害された。これらの事実に加えて、NBD-ファラシジン、抗チュブリン抗体、抗GFAP抗体を用いた螢光染色観察によっても、GMFによる形態分化がアクチンケーブルの消失(脱重合)と微小管およびグリアフィラメントのbundle化により促進されることが示唆された。このようなGMF刺激によるグリア芽細胞の形態分化とそれに伴なう細胞骨格の変化はA23187存在下でのCaにより阻害された。しかしながら同時にW-7(50μM)が存在することによりこのような阻害は解除された。これらのことから細胞内Caイオンは形態分化に対しカルモジュリンを介して阻害的に作用することが示唆された。一方、24時間のGMF刺激(形態分化発現の直前)により、グリア芽細胞の【^(45)Ca】イオン取り込みが3040%抑制された。このような【^(45)Ca】イオン取り込みの抑制はW-7によりさらに抑制され、またCa拮抗剤であるベラパミルやニフェジピンによってもさらに抑制された。これらのことから、GMF刺激によるグリア芽細胞の形態分化に先行して、Ca取り込みが抑制され細胞内Ca濃度の減少が示唆された。また細胞内Ca濃度の減少はカルモジュリンの機能を抑制せしめ、このようなカルモジュリンの頁の制御が細胞骨格の変化を促進し、アストロサイト様形態への分化誘導に通ずるものと考えられた。
植物発生ロジックの多元的開拓

本課題は、『植物発生ロジック』最終年度での研究班員における各種メタボロミクスデータ取得の、予定外のずれ込みによる、支援班活動経費の繰り越しである。最終年度を越えても継続された班員の活動支援と、その取りまとめのため、事務経費、取りまとめにかかる書類作成等の経費がかかったが、本年度は予定通り順調に事業が進行した。基本的にメタボロミクス解析以外はデスクトップ上での支援が中心であったが、それぞれの班員の成果・論文発表も活発に進み、トップジャーナルへの寄与が多数見られた。そのため2018年9月に開催された最終ヒアリングの判断も、A評価で判断をいただき、順調な研究活動が高く評価された。また新学術領域『植物発生ロジック』の5年間の研究活動をとりまとめた結果としての、本新学術領域の成果を代表するe-learning教材を納めたDVDは、予定通り完成し、班員全員に送付することができた。これは本領域が当初より目指していた、「教科書を書き換える」発見を紹介する内容の、学部教育に用いることのできる教材である。現在、各方面で教材等での活用に供していただいている。さらに前年度まではメタボロミクス解析の勉強会という形で開催していたメタボロミクス研究会を、今年度は成果の発表会として、2019年2月に山形県鶴岡メタボロミクスキャンパスで開催した。発生と代謝をつなぐ新たな視点の研究を立ち上げるという、本課題の目標は大いに達成できたことが、そこで再確認された。その場で披露された各成果は、既に論文化されつつある。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。2013年11月28日、奈良先端科学技術大学院大学においてシンポジウム「細胞を創る操る」を、NAIST植物科学グローバルトップ教育推進プログラム、西谷新学術領域と共に共催、また2014年3月、富山大学・五福キャンパスで開催の第55回日本植物生理学会年会において、シンポジウムを主催した。さらに2014年11月24-26日にはケルン・マックスプランク研究所において、基礎生物学研究所、マックスプランク研究所(ドイツ)、テマセク研究所(シンガポール)の3研究所合同の国際シンポジウム「HORIZONS IN PLANT BIOLOGY」を共催した。若手支援としては2013年11月30日から12月2日の3日間にわたり、第1回若手ワークショップを開催し、若手の間の交流を推進し、研究発表を通じて互いの研究内容の熟知を促して共同研究を推進した。また2014年2月8ー10日にかけて、山形県鶴岡市メタボロームキャンパス(理研鶴岡ブランチ)でメタボローム勉強会を開催し、メタボロミクス解析を新たに導入する希望を持つ班員を中心に検討会を開いた。これらの活動を通じて、若手の研究交流と新規分野開拓を支援した。さらにシロイヌナズナ転写因子ライブラリーの整備を進めた。さらにゼニゴケ研究支援として、京都大・河内研を中心にゼニゴケをモデル植物として用いるための研究技術基盤整備を進め、そのノウハウの普及活動を推進した。また次世代シークエンス解析、数理解析、またフローサイトメトリー解析の支援活動を推進した。関連集会・シンポジウム等の開催: 3月19日には日本植物生理学会・富山大会でシンポジウムを主宰、5月30日には日本発生生物学会・名古屋大会でシンポジウムを開催、9月13日には日本植物学会・神奈川大会でシンポジウムを主宰した。また11月18日には奈良先端大のシンポジウム「植物の中をめぐる多様なシグナル分子」を共催。11月24-26日にはケルン・マックスプランク研究所において国際シンポジウム「HORIZONS IN PLANT BIOLOGY」を共催した。また12月8-10日には、神戸大学において国際ゼニゴケワークショップを共催し、ゼニゴケ研究の世界的高まりを促進した。ゼニゴケ研究については支援班で班員に対し、手厚い支援を進めてきた。研究成果報告会(班会議)は7月7-8日に大阪大学において開催し、支援班活動について改めて周知し、共同研究を推進する取り組みとした。若手の育成として、11月20-22日に熱海において、若手ワークショップを開催、口頭発表49題、ポスター発表25題という盛況を得た。また2月14-16日には鶴岡メタボロキャンパスで第2回メタボローム研究会を開催し、メタボロミクスを発生生物学に取り込む方策について改めて議論し、メタボロミクス解析の支援活動をさらに推進した。さらにシロイヌナズナ転写因子ライブラリーを完成させ、スクリーニングのための班員への配布をはじめたほか、マイクロアレイ解析、次世代シークエンス解析、数理解析、またフローサイトメトリー解析の支援を進めた。計画前半の公募班と共に推進した期間の最終年度として、多元的な研究の場を提供すべく、各種集会や研究会、技術講習会を開催した。また若手の育成のための若手の会や、シンポジウムを企画し、本年度は以下の総括班活動を推進した。5月14,15日領域班会議(研究成果報告会)(キャンパスプラザ京都);5月16日ゼニゴケ研究支援ワークショップ(京都大学);6月5日第48回日本発生生物学会年会(つくば)シンポジウム開催"Topics in plant and animaldevelopment";8月20-23日日本進化学会大会シンポジウム共催(中央大学);8月27,28,31日、9月1日ERATO東山ライブホロニクスプロジェクト主催・国際シンポジウム&テクニルワークショップ共催;9月14日数理モデル研究会(大阪大学理学部);11月6日、7日国立遺伝学研究所研究会-

植物の生殖成長期の発生を制御する分子機構(共催);11月24日-26日若手ワークショップ(小豆島ふるさと村);平成28年1月19日、20日領域班会議(研究成果発表会)(大阪大学豊中キャンパス国際棟シグマホール);2月13-15日メタボローム勉強会(山形・理研鶴岡ブランチ)また研究支援のための転写因子ライブラリー(シロイヌナズナ2455転写因子がエントリークローン化された)の作成と配布、6班9テーマのメタボローム解析、ゼニゴケ研究支援、数理解析支援、マイクロアレイ解析、また研究成果に関するフォーラム活動を推進した。特にゼニゴケに関しては、ポータルサイトを立ち上げ、実験技術手法や研究コミュニティーへの提言を含めたPCP誌特集号を企画し、出版した。領域全体の目標として掲げた「教科書に載る・教科書の従来の記述を塗り替える」成果を班員が出すにあたって必要な研究支援を推進してきた。その結果として、すでに、従来の仮説と異なる、背腹性制御の変化によらない壺状葉の形成メカニズム(Nature Comm)、温度刺激は植物の場合、表皮の生物時計が情報処理をしていることの発見(Nature Plants)、機構の密度制御に置いて2因子が競合的に働くことの発見(Nature)など、研究開始時点には想定していなかった全く新規の知見が得られている。繰り越しの経緯としては、平成28年11月、平成29年3月の国際シンポジウムに招聘していた海外の著名研究者が、急遽本人の都合で年度内には来日できなくなった。国際シンポジウムにおける当該研究協力者との議論・情報交換は本年度の領域全体の成果とりまとめに不可欠であるため、日程の再調整を行なった結果、平成29年5月に当該協力者を招聘して国際シンポジウムを開催することとなったものである。新学術領域の研究成果を国際的に発信するためにイスラエル・Weizmann InstituteのYuval Eshed教授を招聘し、2017年5月8日には東京大学大学院理学系研究科で特別セミナーをしていただいたほか、10日(水)には、船堀で開催された日本発生生物学会50周年大会において、Eshed教授を演者に迎え、塚谷代表が国際シンポジウムを主宰した。また2017年9月7日の日本植物形態学会、引き続く9月8-10日の日本植物学会の年大会において、新学術領域の研究成果に関する情報発信と情報収集を進めた。さらに一般へのアウトリーチ活動のため、2017年4月4日6月11日に国立科学博物館において展示協力した企画展『卵からはじまる形づくり』へ展示協力の上、5月13日には塚谷代表が一般向け講演を開催した。繰越最終年度のため記入しない。本課題は、『植物発生ロジック』最終年度での研究班員における各種メタボロミクスデータ取得の、予定外のずれ込みによる、支援班活動経費の繰り越しである。最終年度を越えても継続された班員の活動支援と、その取りまとめのため、事務経費、取りまとめにかかる書類作成等の経費がかかったが、本年度は予定通り順調に事業が進行した。基本的にメタボロミクス解析以外はデスクトップ上での支援が中心であったが、それぞれの班員の成果・論文発表も活発に進み、トップジャーナルへの寄与が多数見られた。
反応集積化を活用したトリアゾール類の新しい分子変換反応の開発

我々は既に,ロジウム触媒の存在下で,末端アルキンから容易に合成可能な1-スルホニル-1,2,3-トリアゾールに,水やアリルアルコールを作用させると,α-アミノケトンやα-アリル-α-アミノケトンが生成することを報告している。また,反応集積化を活用し,銅触媒を用いる末端アルキンからのトリアゾールの合成とロジウム触媒反応をワンポットで行えることも見いだしている。すなわち,炭素ー酸素結合や炭素ー窒素結合,および炭素ー炭素結合と異なる結合を一挙に末端アルキンへ導入することができた。今回,アリルフェニルスルフィドを作用させると,アリルアルコールの場合とは異なる位置で炭素ー炭素結合を導入することに成功した。具体的には、CuTC錯体とRh2(OCOtBu)4錯体の存在下でフェニルエチンにトシルアジドとアリルフェニルスルフィドを作用させ,室温で6時間撹拌した後に,さらに120度で30分間マイクロ波照射すると4-フェニル-4-フェニルスルファニル-5-(N-トシルイミノ)ペンタ-1-エンが収率81%で得られた。さらに,α,β-不飽和アルデヒドを作用させると,trans-2,3-ジヒドロピロールが立体選択的に得られることも見いだした。本反応は,トリアゾールから生じたα-イミノロジウムカルベンにクロトンアルデヒドが付加し,4-オキサゾリン中間体が系中で生成する。ついで,N,O-アミナール部位の開環及び環の巻き直しが起こり,trans-2,3-ジヒドロピロールに至ったものと考えられる。これらトリアゾールを経由する末端アルキンの多官能基化反応は,ステップエコノミーに優れているだけではなく,いずれも目的化合物以外に副生するものは窒素分子のみであるためアトムエコノミーにも優れ,廃棄物を出さないという観点からも環境調和を志向した新しい手法であるといえる。今後とも更に発展させていきたい。25年度が最終年度であるため、記入しない。入手容易な炭化水素から多官能性の有機化合物を合成するには,一般に多段階を要する。したがって,様々な官能基を一挙に炭化水素分子に導入することができれば,ステップエコノミーに優れた効率的な合成手法になる。最近,筆者らのグループとFokin(米国)らのグループが,トリアゾールの環鎖互変異性によりわずかに生じるα-ジアゾイミンを起点とした遷移金属カルベン種の生成とそれを利用した触媒反応をそれぞれ独立して見出し,トリアゾールが反応基質として高い潜在性をもつことを示した。例えば,筆者らは末端アルキンから容易に合成可能な1-スルホニル-1,2,3-トリアゾールにロジウム触媒の存在下で水を作用させると,α-アミノケトンが生成することを報告した。本反応は形式的ではあるが,アミノ基とヒドロキシル基を位置選択的に末端アルキンへ導入することになる。今回,水にかえてアリルアルコールを作用させることで,α-アミノケトンのα位にさらにアリル基を導入することに成功した。また,銅触媒を用いる末端アルキンからのトリアゾールの合成とロジウム触媒反応をワンポットで行えることも見出した。本研究課題では、含窒素化合物の新合成手法の開発を目指し、「同一時間的反応集積化」に焦点をあて、以下の三つの柱を中心に研究を推進する予定であった。1.トリアゾールの脱窒素アレン挿入反応による三置換ピロールの位置選択的合成2.トリアゾールの脱窒素水和反応を鍵とするαーアミノケトンのワンポット合成3.トリアゾールを起点とするTiffeneau-Demjanov型脱窒素環拡大反応の開発いずれの課題も終え、現在、1番目は論文を投稿中で、2番目と3番目は、論文にて報告した。

前年度までの研究を活かし、以下の研究を新たに行う。1.トリアゾールの脱窒素過程により生成するαーイミノロジウムカルベン種とアリルフェニルスルフィドとのDoyle-Kirmse転位を鍵過程とする4級不斉炭素構築法の開発2.トリアゾールの脱窒素過程により生成するαーイミノロジウムカルベン種とカルボン酸との分子間付加反応を鍵過程とするアミノ機が置換したエノールエステルの立体選択的合成3.トリアゾールの脱窒素過程により生成するαーイミノロジウムカルベン種とシラノールとの分子間付加反応を鍵過程とするアミノ基が置換したシリルエノールエーテルの立体選択的合成25年度が最終年度であるため、記入しない。25年度が最終年度であるため、記入しない。