hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ボツリヌス神経毒素と新たに発見した受容体構成成分との分子間相互作用の解析

ボツリヌス神経毒素と脂質受容体の相互作用を検討するため、A, B, C, D, E型毒素の受容体結合領域の組換え体(Hc)を作製し、GD1b,GT1b及びホスファチジルエタノールアミン(PE)への結合についてBIACORE2000を用いて検討した。その結果、GD1b,GT1bに対してはC型Hcのみが結合し、PEに対してはD型Hcのみが結合した。A, B, E型毒素の結合にもガングリオシドが関与すると考えられているが、本実験では結合が認められなかったことから、C型毒素は他の型に比べてガングリオシドへの親和性が特に高いことがわかった。また、牛ボツリヌス症から新たに分離された菌が産生するD/Cモザイク毒素の結合特異性を調べた。D/Cモザイク毒素由来HcはC型Hcと77%の相同性をもつことから、各種ガングリオシドへの結合活性を比較検討した結果、C型HcはGD1b>GT1b>GQ1bの強さで結合したのに対し、D/CモザイクHcはGQ1b>GT1b>GD1bの強さで結合した。このことから、C型毒素及びD/Cモザイク毒素と各ガングリオシドの親和性には、糖鎖末端のシアル酸が関与しており、この末端シアル酸はC型毒素では結合を弱め、D/Cモザイク毒素では逆に結合を強める働きがあると考えられた。一方、D型HcはPE含有リボソームに対してわずかに結合し、この相互作用はGDlbやGTlb共存下で増強されることがわかった。D型HcはGD1bあるいはGT1bだけを含有させたリボソームには結合しないため、これらのガングリオシドはD型毒素とPEの結合に対して補助的に働いていると考えられる。本研究で得られた成果は、C型及びD型毒素と他の型との差異を明確にするものであり、毒素の作用機構の全貌を解明する上で重要な知見であると考えられる。ボツリヌスC型Hc(重鎖C末端領域)およびD型Hcの受容体認識機構について解析を行い,受容体認識に関わるアミノ酸残基を明らかにした。C型Hcには他型にも存在するガングリオシド結合領域が一部保存されており,これらアミノ酸残基の点変異体から,W1257(1257位のトリプトファン),Y1258,G1270,H1282が受容体結合に関与していることがわかった。特にH1282はC型にのみ特異的に存在するアミノ酸残基であり,ガングリオシドへの親和性を高める要因の-つであると考えられる。一方,D型については,結合親和性の異なる2種のHc(003-9株由来と1873株由来)に着目し,これらのキメラ変異体,点変異体を作製した。結合活性を比較検討した結果,003-9株由来毒素分子内の1113番目から1138番目の領域が結合親和性を高めるのに重要であることがわかった。この領域内において,2種のHc間では6残基の違いが認められる。そこで,003-9株由来毒素のK1117(1117番目のリジン),S1127,I1129,K1135を1873株由来毒素の対応するアミノ酸残基に点変異させた結果,K1117の変異により結合活性は顕著に減少した。一方,S1127,I1129は結合活性に影響しなかった。K1117は1873株由来毒素ではEに置換しており,電荷が正反対になっていることから,003-9株由来毒素分子内のK1117の正電荷が受容体への結合親和性に重要であると考えられた。これまで,他の型では受容体認識に関与するアミノ酸残基はC末端側に局在していると報告されているが,D型では他型とは異なり,C末端から約100残基以上N末端側に,結合親和性に関与するアミノ酸残基が存在していることが明らかとなった。現在,C型,D型Hcの結合様式をより明確にするため,リボソームを用いた実験系の構築を進めている。

このことから、C型毒素及びD/Cモザイク毒素と各ガングリオシドの親和性には、糖鎖末端のシアル酸が関与しており、この末端シアル酸はC型毒素では結合を弱め、D/Cモザイク毒素では逆に結合を強める働きがあると考えられた。一方、D型HcはPE含有リボソームに対してわずかに結合し、この相互作用はGDlbやGTlb共存下で増強されることがわかった。D型HcはGD1bあるいはGT1bだけを含有させたリボソームには結合しないため、これらのガングリオシドはD型毒素とPEの結合に対して補助的に働いていると考えられる。本研究で得られた成果は、C型及びD型毒素と他の型との差異を明確にするものであり、毒素の作用機構の全貌を解明する上で重要な知見であると考えられる。
細胞のネットワーク培養によるバイオデバイスの構築

この研究は,マイクロスタンプ法による細胞のパターン培養と,電気化学的な細胞計測を組み合わせる融合研究としてスタートした。マイクロスタンプ法の改良によって,ガラス基板上に心筋細胞やPC12細胞などの興奮性細胞を単一セルレベルで配列することが出来た。得られた細胞パターンに沿った情報伝達を,共焦点蛍光顕微鏡による細胞内Ca2+イオン濃度の計測によって追跡し,単一細胞レベルネットワークにおけるギャップ結合やシナプス結合の形成と機能を確認できた。細胞パターン形状と細胞活性の対応付けにも,マイクロ電極を用いる独自の計測で成功している。また,細胞パターンをマイクロ流路チップ内に作成して,細胞パターンの局所に薬剤投与が可能であること,それによって細胞間の機能的連結の薬剤応答を精密に評価できることを示した。これらの成果により,本研究の当初の目的は達成できたといえる。さらに,研究の過程で,電気化学反応を利用して細胞の接着箇所を書き込む技術「電気化学バイオリソグラフィー」を新規に開発することが出来た。これは,細胞培養環境下で行うバイオリソグラフィーであり,異なる細胞種を順次配列してネットワーク化することが原理的には可能と期待できる。マイクロスタンプ法を含む既存の方法で作成できる細胞パターンは1種類の細胞に限られていた。電気化学バイオリソグラフィーの適用で,異種細胞間(神経細胞と筋細胞など)の機能的結合に対する薬剤応答を評価する研究ツールが作成できると期待している。神経細胞や筋細胞などの興奮性細胞のマイクロパターンをガラス基板上に作成してネットワーク化する技術の開発と,蛍光顕微鏡などによって,細胞間結合の機能に由来するネットワーク活性を評価するシステムの開発によって,細胞チップ・デバイスの開発に展開するのが目的である。今年度は以下の成果を得た。1.マイクロパターン培養:ポリジメチルシロキサンによるマイクロスタンプを作成し,これを用いて細胞接着タンパク質(フィブロネクチン)を疎水化ガラス基板上にパターン転写した。子宮頚癌細胞(HeLa),ウシ大動脈内皮細胞,ニワトリ胚由来心筋細胞,PC12神経様細胞などを培養したところ,これらすべての細胞株が5μmの精度でパターン化された。2.長期パターン培養:マイクロスタンプ法を改良し,フィブロネクチンおよび細胞非接着性ポリエチレンクリコールを共有結合によってパターン固定した結果,細胞パターンの耐久性が顕著に向上した。マイクロメートル精度の細胞パターンが,血清中であっても5日以上保持された。3.細胞間結合活性の評価:心筋細胞や神経細胞のパターンに対して、ネットワーク活性の評価システムを開発検討した。ポリジメチルシロキサン(PDMS)で作製したマイクロ流路デバイスのチャンネル内に単一細胞レベルの細胞パターンを培養し,層流を利用してパターンの一部分だけに薬剤を投与することに成功した。心筋細胞のパターンにオクタノールを投与した場合には,投与部のみで自動拍動の抑制が観測された。これらは,細胞ネットワーク活性を指標とするバイオアッセイの可能性を示唆するものである。
筋萎縮性側索硬化症の分子病態研究

1.孤発性筋萎性側索硬化症(ALS)の脊髄運動ニューロン死にはAMPA受容体を介したCa2+の過剰な流入が関与している.AMPA受容体を介したCa2+流入はAMPA受容体サブユニットであるGluR2のQ/R部位の編集酵素adenosine deaminase acting on RNA2(ADAR2)の活性低下による.本年度、ALS脊髄運動ニューロンにおいてADAR2を制御するnuclear isomerase Pin1の細胞質内発現が増加していること明らかにした.また、ADAR2核内輸送に関与するimportin-α4(KPNA3)の核膜での発現が低下していることを明らかにした。同様の変化が孤発性ALSの病態モデルであるAR2マウスでも見られることを確認した。AR2マウスのmatingが遅れたためwestern blot analysisに関しては今後行う予定。Matingは2019年4月の時点で成功している.概ね順調に進展し、ALSにおけるPin1およびimportin-α4の発現に関するデータを取得した。また、ADAR2活性測定培養細胞系についても確立できた。ALSの病態モデルマウス(AR2)を用いたwestern blot analysisを現在行なっている.1.AR2マウスの脊髄前角のサンプリングを行いwestern blot analysisによりPin1の発現の増加を確認する.2.Pin1阻害およびPin1過剰発現によるADAR2活性への影響1.孤発性筋萎性側索硬化症(ALS)の脊髄運動ニューロン死にはAMPA受容体を介したCa2+の過剰な流入が関与している.AMPA受容体を介したCa2+流入はAMPA受容体サブユニットであるGluR2のQ/R部位の編集酵素adenosine deaminase acting on RNA2(ADAR2)の活性低下による.本年度、ALS脊髄運動ニューロンにおいてADAR2を制御するnuclear isomerase Pin1の細胞質内発現が増加していること明らかにした.また、ADAR2核内輸送に関与するimportin-α4(KPNA3)の核膜での発現が低下していることを明らかにした。ALSの病態モデルマウス(AR2)を用いたwestern blot analysisを現在行なっている.1.AR2マウスの脊髄前角のサンプリングを行いwestern blot analysisによりPin1の発現の増加を確認する.AR2マウスの研究に関する費用が次年度に持ち越したため.
現代民主主義の構築における司法の役割と国民的基盤－司法行動・制度改革の実証的研究

2018年度では、まず全体研究会において、1司法制度改革の成果、影響の分析、2司法の国民的基盤の確立、3わが国の司法、司法制度改革を分析する視点を得るための比較法・比較制度研究、という3つの柱で共同研究を行った。第一の柱に関わっては、木佐茂男氏(北海道大学・九州大学名誉教授)の報告「<司法改革>論から<司法制度改革>への30年」による研究会を5月に、秋葉丈志氏(国際教養大学准教授)の報告「国籍法違憲判決と日本の司法」による研究会を7月に開催した。第二の柱に関わっては、佐藤伸彦氏(立命館大学先端総合学術研究科)の「法教育」に関する報告、研究分担者の平野の要件事実教育に関する報告を受けての研究会を2019年2月に開催した。第3の柱に関わっては、蔡秀卿氏(立命館大学政策科学部教授)による報告「台湾における司法および司法改革」(11月)、芦田淳氏(国立国会図書館主査)による報告「イタリアにおける憲法裁判所及び司法制度に関する近年の動向」(12月)、林来梵(リン・ライファン)清華大学教授による報告「現代中国の違憲審査・立憲主義の現段階」(2019年3月)を得て、それぞれ研究会を開催した。上記の第3の柱に関わる国際調査としては、2019年3月にドイツ、フランスへの訪問調査、台湾への訪問調査を実施した。前者のヨーロッパ調査では、ヨーロッパ人権裁判所への訪問調査も行い、ヨーロッパ統合を背景にどのようにヨーロッパ各国の司法制度の改革、運営が行われているかを分析できた。後者の台湾調査では、近時、徹底した司法制度改革を行っている台湾の状況を実際に確認することができた。個別領域での判決行動の動向や司法制度改革後の法曹や司法の各領域の変化については、研究分担者ごとに分担調査を行っており、それを踏まえての各調査チーム(公法訴訟分析班、民事司法調査班、刑事司法調査班)での検討、分析を進めた。全体研究会の実施はほぼ2ヶ月に一度、有力なゲストスピーカーも招聘して行い、研究分担者・研究協力者や、若手の院生なども参加した活発な議論も喚起できている。多くが立命館大学に所属する研究者であることもあり、日頃から緊密に情報交換も行っている。海外での調査も、現地の研究者、実務家との連携によりスムーズに行えている。研究分担者個々の調査、研究も進んでいる。ただし、各研究調査チームごとの調査、分析は、2018年度にようやく本格化してきたため、進捗している項目と、これから具体化する必要のある項目があり、課題もある。2019年度が研究最終年度であるので、これまでの3年間の研究のまとめを行う。具体的には、まず、公法訴訟分析班(責任者・北村、副責任者・多田)による憲法訴訟の動向、行政訴訟の動向の分析、民事司法調査班(責任者・平野、吉村)による司法アクセス、広義の法教育、政策形成型訴訟の動向、家族関係訴訟の動向、知的財産権訴訟の動向の分析、刑事司法調査班(責任者・松宮)による裁判員裁判の動向、刑事司法改革立法過程の分析を前半期中にいったんまとめる。さらに、国際比較研究については、これまでのアメリカ、オーストラリア、ドイツ、台湾についての国際調査の結果の分析を深め、それを公法訴訟分析班、民事司法調査班、刑事司法調査班による上記のまとめに反映させる。また、平成30年度に研究会での報告を得たイタリア、中国、韓国などの司法制度とその現状について補足的な訪問調査を実施し、その結果を最終まとめに反映させる(責任者・坂田)。これまでの研究の継続として、最高裁データベースを更新し、司法の変化の一部として、最高裁の司法行動の分析も行う(責任者・渡辺)。この分析結果も各班における上記分析に反映される。各班における分析結果について、司法制度改革から約15年で、改革直後とはどのような変化が生じているか、またそれらの領域ごとに「司法の国民的基盤」がどのような形で形成されつつあるのか、あるいはできていないのかといった視点からの総括的な分析を行う。こうした研究総括の案の作成を市川・渡辺が責任者として担当し、研究総括案について全研究分担者からなる全体研究会で検討を加える。その上で、学外の法曹関係者、識者の参加を得ての大規模な研究会またはシンポジウムを開催し、そこで研究総括結果についての評価を得た上で、最終的なまとめを作成する。2016年度は、6回の研究会を行った。5月に斎藤浩「原発訴訟と裁判官人事」吉村良一「フクシマ事故に対する賠償訴訟の現状」、7月に市川正人代表「わが国における「司法審査と民主主義」論の経緯と展望」9月に大久保史郎「S.Breyerアメリカ最高裁判所論:違憲審査と"Public trust"12月にゲストの村松昭夫弁護士による「アスベスト訴訟と最高裁判決についてー泉南アスベスト訴訟を中心に」2月にゲストの井垣敏生弁護士(元判事)による「裁判の判断形成に関係があった可能性のある内在的及び外在的な諸要因自身の関与した裁判を素材に」、3月にゲストのJearn-Paul Costa国際人権研究所所長(元・欧州人権裁判所長官)による「国内裁判所および国際裁判所による人権の保護、比較」が、その報告者およびテーマである。メンバーによる研究会であるが、メンバー以外の学内の研究者の参加もあり、それぞれの会で活発な議論が行われ、社会的に影響があるような裁判の動向とその制度的・人的な背景、司法審査権、人権保護のしくみについての研究を進めた。また、最高裁判決のデータベースの作成にも着手しており、1970年代から現在までの分についておよそ入力が終わっている。

海外調査としては、3月にキャンベラとシドニーに調査に行き、オーストラリアのハイコートおよびそこでの司法審査の実情や裁判官の任用のあり方について、オーストラリア国立大学・シドニー大学およびニューサウスウェールズ大学の憲法学の研究者との研究交流およびヒアリングを行った。ハイコートの最近の動向とその政治的な背景、またオーストラリアでの人権擁護のしくみについて知見を深めることができた。立命館大学のメンバーが中心であるため、研究会の組織が比較的容易であることもあり、順調に研究会を計画、実行している。多様な専門のメンバーと、有力な実務家の経験を踏まえた報告をもとにした研究会で充実した議論が実現している。2017年度は、判事経験者をゲストとした研究会の実施およびそうした研究会への参加を精力的に行い、最高裁をはじめとする日本の裁判所の制度運用の実情や司法行動の構造の研究を進めた。4月に井戸謙一氏「最近の原発訴訟からみる裁判所の変化」、6月に井垣敏生氏「裁判の判断形成に関係がある可能性が懸念される司法人事等の実態と改革の方向」、11月20日に守屋克彦氏「刑事裁判・少年審判と私」という題目でのご報告を得て、判事としての経験のほか、現在手がける事件についての情報を得た。最高裁判事経験者の講演会への参加も積極的に行ったほか、7月に市川正人代表による「泉徳治裁判官と最高裁ー泉徳治『一歩前に出る司法』を中心に」と最高裁判事へのインタビューを手がけた渡辺康行氏によるコメントまた、各分野ごとの司法制度改革後の変化を検討するべく、宮脇正晴氏による知財訴訟の動向の報告も得た。国際調査としては、ワシントンD.C.で合衆国調査を行った。連邦最高裁判所で、現職の連邦最高裁判事であるブライヤー判事へのインタビューを行った。また、司法の国民的基盤の形成にとって重要な役割を担っている裁判所や司法部門の情報公開や報道の在り方についての調査も行った。また、2016年度より研究を進めていた社会的耳目を集めるような政策形成型の訴訟の日米比較の契機として、アメリカで伝統あるALCUの調査も行った。また、アメリカでの理論的研究の動向として憲法研究者である坂田隆介氏の研究報告を行った。個別領域での判決行動の動向や司法制度改革後の法曹や司法の各領域の変化については、研究分担者ごとに分担調査を始めている。現時点では、研究成果は主としてそれぞれが国内外の学会や研究会での方向による発信と、論文による公表を中心に行っている。研究会の実施は12ヶ月に一度、有力なゲストスピーカーを招聘して行い、研究分担者・連携研究者・研究協力者や、若手の院生なども参加した活発な議論も喚起できている。多くが立命館大学に所属する研究者であることもあり、日頃から緊密に情報交換も行っている。海外での調査も、現地の研究者との連携によりスムーズに行えている。ただし、各研究調査チームごとの調査は、進捗しているものと、これから具体化する必要のある項目があり、課題もある。2018年度では、まず全体研究会において、1司法制度改革の成果、影響の分析、2司法の国民的基盤の確立、3わが国の司法、司法制度改革を分析する視点を得るための比較法・比較制度研究、という3つの柱で共同研究を行った。第一の柱に関わっては、木佐茂男氏(北海道大学・九州大学名誉教授)の報告「<司法改革
がんの炭素イオン線抵抗性におけるヘテロクロマチンの役割に関する研究

マウス扁平上皮がん細胞株NR-S1に対しX線及び炭素イオン線を繰り返し照射し、放射線抵抗性がん細胞株としてそれぞれX60及びC30細胞を独自に樹立した。解析の結果、X60細胞はX線だけでなく炭素イオン線抵抗性であること、C30細胞のX線や炭素イオン線感受性はNR-S1細胞とほぼ同等であること、X線及び炭素イオン線抵抗性とヘテロクロマチンドメイン数は強く相関すること、X60細胞ではX線や炭素イオン線照射後のRad51フォーカス形成が亢進することが示された。この研究により、がん細胞のX線及び炭素イオン線抵抗性にはヘテロクロマチン領域で起こる相同組換え修復が関与する可能性が示唆された。がんにおけるX線と炭素イオン線抵抗性におけるヘテロクロマチンの役割を解明するため、マウス扁平上皮がん細胞株NR-S1細胞に総線量60GyのX線を照射して樹立したX線及び炭素イオン線抵抗性がん細胞株NR-S1-X60(X60)細胞、X60細胞よりクローニングされたNR-S1-X60-A3(A3)及びNR-S1-X60-H2(H2)細胞を用いて研究を行った。これまで、X60、A3、及びH2細胞は、NR-S1細胞に比べて紡錘形の細胞を多く含むこと、ヘテロクロマチンドメイン数とX線及び炭素イオン線抵抗性は有意に相関することが示されている。これらの結果は、X線及び炭素イオン線抵抗性には上皮間葉転換やヘテロクロマチン関連因子が深く関与していることを示唆している。そこで先ず、上皮間葉転換の発生について解析した。しかし、上皮間葉転換の指標であるE-cadherinと発現減少及びN-cadherinの発現増加は検出できなかった。次に、ヘテロクロマチン関連タンパク質の発現や局在を免疫蛍光染色法により解析した。その結果、X60、A3、及びH2細胞におけるHP1βの蛍光強度はNR-S1細胞の約2倍高いことが示された。さらに、それぞれ4Gy及び2GyのX線及び炭素イオン線照射後のHP1βの核内局在の変化を解析した結果、照射後約3時間以内にHP1βは核内に拡散し、その後、その局在は照射前と同様に徐々に戻る(回復する)ことを発見した。また、この照射後のHP1βの局在回復はX60、A3及びH2細胞ではNR-S1細胞に比べて早く起こることも見出した。この現象とX線及び炭素イオン線抵抗性の関係を調査するため、現在、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤であるChaetocinやクロマチン構造の弛緩剤として働くChloroquineを用いて、解析を行っている。がんのX線及び炭素イオン線抵抗性の原因とこれらにおけるヘテロクロマチンの役割を解明するため、マウス扁平上皮がん細胞株NR-S1に総線量60GyのX線(200 KVp, 20mA)を照射して樹立したX60細胞と、総線量30Gyの炭素イオン線(290MeV/n)を照射して樹立したC30細胞を用いて解析した。X60細胞はX線と炭素イオン線の両方に抵抗性であり、C30細胞は炭素イオン線のみに対して抵抗性だった。次に、X60、C30及びNR-S1細胞にX線もしくは炭素イオン線を照射し、その後、相同組換え(HR)修復に必要なタンパク質であるRad51の核内フォーカス形成を経時的に解析した。その結果、X60細胞ではX線及び炭素イオン線照射1時間後に形成されるRad51フォーカス数がC30及びNR-S1細胞より有意に多いことが示された。この結果によりX線及び炭素イオン線抵抗性にはHR修復が深く関与していることが示唆された。昨年度までにヘテロクロマチンに集積するタンパク質であるHP1βがX60細胞ではNR-S1細胞より約2倍程度高く、さらにHP1βの核内拡散がNR-S1細胞より照射後早期に起こることが示されている。近年ではヘテロクロマチン領域のDNA二本鎖切断は、ヘテロクロマチンの弛緩に続きHR修復を受けることが報告されている。これらの研究はX60細胞ではX線や炭素イオン線照射後のヘテロクロマチンの弛緩とその後のHR修復の開始がNR-S1細胞よりも早い可能性があることを示している。本研究によりX線及び炭素イオン線照射後のヘテロクロマチンの弛緩とその後のHR修復ががんにおけるX線と炭素イオン線抵抗性と深く関連することが示された。マウス扁平上皮がん細胞株NR-S1に総線量60GyのX線を照射して樹立したX60細胞と、総線量30Gyの炭素イオン線を照射して樹立したC30細胞を用いて、がん細胞のX線及び炭素イオン線抵抗性におけるヘテロクロマチンの役割について検討した。昨年までにX60細胞では、ヘテロクロマチンに集積するタンパク質であるHP1βの核内集積がNR-S1細胞に比べて高いこと、相同組換え(HR)修復に関与するタンパク質であるRad51のX線及び炭素イオン線照射後の核内フォーカス形成が他の細胞に比べて有意に亢進することを示した。これらはX60細胞のHR修復能は他の細胞に比べて高い可能性があること示唆している。そこで、各がん細胞株におけるシスプラチン感受性を評価した。その結果、X60細胞は他の細胞に比べてシスプラチンに対して著明に抵抗性であることが示された。

シスプラチンはDNA鎖間架橋を生じさせるが、近年ではこれらの除去にHR修復が関わることが知られている。従ってX60細胞のHR修復能亢進がこの解析結果からも示された。次にHR修復の阻害剤であるB02による炭素イオン線増感効果を評価した。その結果、B02の併用によりNR-S1細胞とX60細胞において有意な炭素イオン線増感効果が得られた。しかし、B02の併用後のX60細胞の生存率は、NR-S1細胞よりも高かった。一方、C30細胞では、B02の炭素イオン線増感効果は確認出来なかった。これらの結果から、X60細胞のX線及び炭素イオン線抵抗性はHR修復能の亢進だけで説明できないことが示された。ヘテロクロマチンに集積するタンパク質HP1はHR修復を促進するとの報告もあることから、X線及び炭素イオン線抵抗性がん細胞ではヘテロクロマチン領域はDNA修復の支持に重要な役割を持つ可能性が示された。マウス扁平上皮がん細胞株NR-S1に対しX線及び炭素イオン線を繰り返し照射し、放射線抵抗性がん細胞株としてそれぞれX60及びC30細胞を独自に樹立した。解析の結果、X60細胞はX線だけでなく炭素イオン線抵抗性であること、C30細胞のX線や炭素イオン線感受性はNR-S1細胞とほぼ同等であること、X線及び炭素イオン線抵抗性とヘテロクロマチンドメイン数は強く相関すること、X60細胞ではX線や炭素イオン線照射後のRad51フォーカス形成が亢進することが示された。この研究により、がん細胞のX線及び炭素イオン線抵抗性にはヘテロクロマチン領域で起こる相同組換え修復が関与する可能性が示唆された。本研究で樹立したX線及び炭素イオン線抵抗性がん細胞の樹立に関する解析結果は論文誌(K. Sato, et al., Radiation Research, 182, 408-419)に掲載されており、さらにH26年度に得られた結果は、現在論文誌への投稿の準備を進めているところであることから概ね順調と言える。医歯薬H26年度にはX線及び炭素イオン線抵抗性がん細胞において相同組換え修復が亢進していることを見出した。今後はヘテロクロマチンの弛緩と相同組換え修復能について詳細に研究する必要がある。これらについてはあまり知られていないため、研究を続ける価値は高い。また、本研究の結果は相同組換え修復の阻害剤がX線及び炭素イオン線抵抗性腫瘍に対する増感剤として利用できる可能性を示している。従って相同組換え修復の阻害剤であるB02等を用いた研究が必要である。H25年度に得られた結果(X線及び炭素イオン線抵抗性がん細胞の樹立とDNA修復に関する結果)は論文誌への投稿を終え、現在は改訂中であることからも、研究は概ね順調と言える。X線及び炭素イオン線抵抗性がん細胞株X60、A3、及びH2細胞では上皮間葉転換は誘発されていなかったことは想定外の結果だった。しかし、X線及び炭素イオン線照射後のX60、A3、及びH2細胞と親細胞株NR-S1細胞におけるヘテロクロマチンタンパク質HP1βの局在変化の違いを見出したことは、がんの放射線抵抗性におけるヘテロクロマチンの役割を解明するための重要なポイントになることから成果と言える。H26年度は、次世代シーケンサーを使った遺伝子発現解析等も取り入れながら研究を行う予定である。また、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤Chaetocinやクロマチン構造の弛緩剤であるChloroquine等はヘテロクロマチンと放射線抵抗性の解析には必須であるため、これらの薬剤を使った解析を継続し、がんにおけるX線及び炭素イオン線抵抗性の原因について検討する。平成27年度に開催される2015
立体構造に基づくヒストンメチル化因子間のあらたな調節機構の解明

高等生物においてヒストンは様々な修飾を受け、その組み合わせは精巧な転写制御を生み出し多様な高次生命現象に関与している。本研究ではヒストン修飾因子のうち転写活性化能を持つメチル化因子MLLと抑制能を持つHPC2の相互作用に注目し、因子間の調節メカニズムの解明を目指した。二つの因子の構造学的な解析から、お互いが相反する機能を持つドメインを介して直接相互作用することが判明し、これにより機能のバランスを取って転写を行っている事が示唆された。本研究は、多様な転写制御に関わるヒストンのメチル化に注目し、メチル化酵素を生化学的、構造学的な手法によって調べることで、メチル化修飾による転写制御の調節機構についての新たな知見を得ることを目的としている。特にメチル化酵素が他の分子によって活性制御を受ける、あるいは他のヒストン修飾等により制御を受ける現象に注目することで、ヒストンメチル化の新たな調節メカニズムの提案を目指すものである。平成20年度においては、ヒトのヒストンメチル化酵素であるMLL蛋白質及び、MLLと相互作用するヒストンメチル化関連蛋白質HPC2の構造学的解析、相互作用解析を行った。NMR法を用いた実験からMLLとHPC2の相互作用する領域を決定し、MLLのCXXCと呼ばれるドメインがHPC2のクロモドメインと直接相互作用する事を発見した。MLLのCXXCドメインはDNA結合ドメインであり、MLLをメチル化する予定のゲノム領域にリクルートする役目を持っている。このCXXCドメインがアミノ酸変異したMLLは、本来メテル化するべきゲノム領域に対するメチル化能が失われることが知られている。HPC2のクロモドメインはこの領域に結合することから、HPC2はMLLに結合することでMLLのメチル化能を調整している可能性が考えられた。そこで、まずはこの分子間相互作用メカニズムを明らかにするため、MLL CXXCドメインとHPC2クロモドメインのX線結晶構造解析を行い、それぞれドメイン単独で立体構造を決定することに成功した。平成21年度は、それぞれのドメインの機能がこの相互作用によりどのように変化するのかについて解析を進める予定である。本年度はヒストンのメチル化(H3K27)を認識して転写制御を行うポリコーム蛋白質HPC2に注目して研究を行った。ポリコーム蛋白質はヒストンメチル化酵素MLLと共にホメオティック遺伝子をはじめとする発生分化に関わる遺伝子群のクロマチンを凝集させることで転写抑制を行っているが、そのメカニズムは明らかでない。我々は独自にHPC2のクロモドメインがメチル化ヒストンだけではなくDNAとも強く結合して凝集を引き起こすことを発見した。この機能はクロマチン凝集に関わるクロモドメインの新たな制御機構であることが予想された。そこでこのメカニズムを解明するためクロモドメインとメチル化ヒストン、DNA、及びMLLとの複合体構造の決定を試み、クロモドメイン-メチル化ヒストン複合体の構造決定に成功した。得られた構造はダイマーを形成しており、興味深いことにDNA結合部位と考えられる領域はダイマー表面の両端に離れて存在していた。他のクロモドメインファミリーではこのようなダイマー構造は報告されておらず、HPC2のクロモドメインはこの独自な構造によりDNAあるいはヌクレオソームをクロスリンクしてクロマチン凝集を引き起こすという新たな機能をもっている可能性が示唆された。このダイマー両端に存在する保存された塩基性アミノ酸残基に変異を入れるとDNAの凝集が抑えられた。この新たな凝集機構について、前年度に得られているMLLに関する結果と共に論文公表の準備を進めている。
老人性白内障及びアトピー性皮膚炎に合併する白内障の成因としての自己抗体の研究

実験1:白内障患者血清中のヒト水晶体上皮蛋白に対する抗体価目的、方法;白内障患者血清中の抗水晶体蛋白抗体が何であるのか確かめるため、白内障患者より採取した水晶体上皮蛋白を抗原とし、患者血清と正常人血清とをウェスタンプロット法にて検索し、患者血清で反応性の高い抗体を調べた。結果;ヒト血清との反応は非特異性のバンドが数多く検出されるが、約70kDa及び30kDaの位置のバンドは、患者血清でより濃く染まり、正常人血清と比べ有意に検出された。結論;正常人血清に比べ上記分子量蛋白に対する抗体価が白内障患者血清で高く、白内障患者に特異的な抗体と思われた。今後の研究計画;上記の抗体に対する抗原を抽出し、実験動物に免疫し、産生された抗体が水晶体上皮細胞に毒性があるかを調べる。実験2:水晶体器官培養下での抗体の水晶体嚢透過性目的、方法;昨年度は抗水晶体上皮蛋白抗体添加した水晶体器官培養下で、水晶体上皮細胞の障害度をトリパンブルー染色法にて検索し、間接的に抗体の嚢透過性を証明したが(国際白内障研究会(平成9年11月)および日本眼科学会総会(平成10年4月)で報告)、本年度は、同じく抗水晶体上皮蛋白抗体を添加したラット水晶体器官培養後、凍結切片を作成し、酵素抗体法を用い水晶体嚢を透過した抗体を検出し、抗体が水晶体嚢を通過することの直接的な証明を試みた。結果;現在までのところ培養後の水晶体上皮細胞に抗水晶体上皮蛋白抗体の存在が認められない。現在条件を変え、また、酵素抗体法に工夫を加え、検索中である。目的:以前より水晶体蛋白に対する自己抗体が多くの老人性白内障患者血清中に認められることは報告されており、細胞培養系では抗水晶体蛋白抗体が水晶体上皮細胞に付着し障害を与えることは報告されている。しかし抗体が水晶体嚢を通過するかの検討はなされていない。今回ラット水晶体器官培養において抗体が水晶体嚢を通過し、上皮細胞に障害を与えるかを検討した。方法:摘出したLewisラットの水晶体を3時間の予備培養後、マウスβ-クリスタリン抗体及び100kDa以上で分離した白内障患者血清を加え24時間培養し、その上皮細胞障害の程度をトリパンブルー染色法にて検討した。対照として各々非感作マウス血清、健常人血清を用いた。結果:マウスβ-クリスタリン抗体、白内障患者血清を投与した両群において中央部よりも増殖帯で障害が強く、増殖帯では600700/mm^2の上皮細胞障害を認めた。対照群では障害された上皮細胞は100/mm^2以下であった。結論:以上の結果より抗水晶体蛋白抗体が水晶体嚢を通過し、上皮細胞に障害を及ぼすことが示唆され、もし抗体が眼内に移行するならば血清中の抗水晶体蛋白抗体が白内障を起こす可能性があると思われた。今後の研究計画:血清中の抗体が血液ー眼関門柵の障害により眼内に移行し、水晶体上皮細胞を障害するか否かを確認する。また抗体自体の存在を酵素抗体法を用い、検索する。
高次エピゲノムが生み出す生命情報を読み解く統計解析法の開発

本研究課題では、クロマチン相互作用を網羅的に解析するChIA-PET法により得られた高次エピゲノムデータから、2領域間のクロマチン交互作用を予測するベイズモデルを構築し、高次エピゲノムによる遺伝子発現制御機構を解明するための統計解析法を開発した。具体的には、以下の成果が得られた。(1)ChIA-PETシークエンスタグのリファレンスゲノムへの確率的アライメント、(2)ポアソンモデルによるバイアスの補正、(3)負の二項分布の混合ベイズモデルによる相互作用領域の検出、(4)細胞特異的、シグナル伝達下で変化する転写ファクトリーの同定、(5)ChIA-PETデータ解析パイプラインの開発。エピゲノムによる遺伝子発現制御機構を解明するためには、ヒストン修飾やDNAメチル化などの化学的制御が関与する一次エピゲノム機構に加えて、クロマチン構造変化などの物理的制御が関与する高次エピゲノム機構を解析することが重要である。本研究課題では、統計科学による数理モデリングとスーパーコンピュータによる大規模計算の融合により、クロマチン相互作用を網羅的に測定するChIA-PETから得られる高次エピゲノムデータから、クロマチン交互作用過程を予測するベイズモデルを構築し、高次エピゲノムによる遺伝子発現制御機構を解明するための統計解析法を開発する。平成25年度は以下の二点に進展があった。1アライメントされたリード配列に確率的要素を取り入れ、クロマチン相互作用過程について、負の二項分布を用いた混合ベイズモデルによる定式化を行った。また、モデルのパラメータの推定法として、ChIA-PETデータ以外に、ChIP-seqによるタンパクの結合やヒストン修飾、FAIRE-seqによるクロマチン開閉領域などのシークエンスデータからの結果を事前分布として表現し、パラメータ推定に取り込むベイズ推定法を導出した。また、シミュレーションデータを用いて、構築されたモデルの有用性を検証した。2ChIA-PETデータからクロマチン高次構造を推定する方法として、いくつかの統計手法について検討した。解析の結果、ChIA-PETデータによるクロマチン相互作用情報だけでは、高次元構造の再構築が困難であることが確認された。以上の検討を踏まえ、クロマチン相互作用を網羅的に測定する技術として新たにhi-C法から得られるクロマチン相互作用情報について、同様の解析法の適用を試みた。その結果、シミュレーションデータを通じて、hi-Cデータによるクロマチン相互作用情報については、統計的モデリング手法を用いて、高次元構造の再構築が可能であることが確認された。エピゲノムによる遺伝子発現制御機構を解明するためには、ヒストン修飾やDNAメチル化などの科学的制御が関与する一次エピゲノム機構に加えて、クロマチン構造変化などの物理的制御が関与する高次エピゲノム機構を解析することが重要である。本研究課題では、統計科学による数理モデリングとスーパーコンピュータによる大規模計算の融合により、クロマチン相互作用を網羅的に解析するChIAーPETから得られる高次エピゲノムデータから、クロマチン相互作用過程をベイズモデリングにより解析し、高次エピゲノムによる遺伝子発現制御機構を解明するための統計解析手法を開発する。平成26年度は以下の二点に進展があった。1前年度開発したクロマチン相互作用過程のベイズモデルとその推定法の改良を行った。具体的には、ChIPーseqによるタンパクの結合やヒストン修飾、FAIREーseqによるクロマチン開閉領域の共局在情報を事前情報として取り込むベイズ推定法を開発した。また、シミュレーションデータおよび実データによる構築されたモデルの有用性を検証した。2クロマチン高次構造情報を取り入れた遺伝子発現制御機構に関する数理モデルの構築を行った。具体的には、1のベイズ推定を用いて、二種類の細胞株(A549、HUVEC)のChIAーPETデータを解析し、細胞の特異性を決める転写ファクトリーを同定し、構造の違いがどの程度転写ファクトリーに存在する遺伝子の発現に影響を与えるかをモデル化した。エピゲノムによる遺伝子発現制御機構を解明するためには、ヒストン修飾やDNAメチル化などの化学的制御が関与する一次エピゲノム機構に加えて、クロマチン高次構造変化などの物理的制御が関与する高次エピゲノム機構を解析することが重要である。本研究課題では、統計科学による数理モデリングとスーパーコンピュータによる大規模計算を用いて、クロマチン交互作用を網羅的に解析するChIA-PET、hi-Cなどの高次エピゲノム構造情報を解析し、高次エピゲノムによる遺伝子発現制御機構を解明するためのベイズモデリング手法を開発する。平成27年度は以下の進展があった。1前年度までに開発したクロマチン交互作用過程のベイズモデルとその推定法をシミュレーションデータ、及び公開データベースで登録されたChIA-PETデータに適用し、モデルの有用性の検証を引き続き行った。その結果、TNF-α刺激下において刺激後にクロマチン高次構造が大きく変化する転写ファクトリーを同定した。これらの方法論に関する成果は論文投稿中である。2本研究課題で開発した高次クロマチン構造データ解析を行うベイズモデリング手法のためのソフトウェアを開発した。具体的には、ChIA-PET、hi-Cデータの前処理、アライメント、クロマチン交互作用領域の検出、転写ファクトリーの同定を行うための関数をまとめた解析パイプラインを統計言語Rの解析パッケージとして開発した。

(1)ChIA-PETシークエンスタグのリファレンスゲノムへの確率的アライメント、(2)ポアソンモデルによるバイアスの補正、(3)負の二項分布の混合ベイズモデルによる相互作用領域の検出、(4)細胞特異的、シグナル伝達下で変化する転写ファクトリーの同定、(5)ChIA-PETデータ解析パイプラインの開発。研究実績の概要で述べたように、平成26年度は本研究課題に必要な解析の要素技術を深化させ、研究協力者との共同研究も順調に進めることができたが、研究代表者の所属先研究機関の変更と新しい研究室の立ち上げ作業により、モデルの検証作業に一部遅延が生じた。そのため、当初の研究計画を一部変更し、モデルの検証および研究成果の発表を平成27年度に引き続き行うこととする。バイオインフォマティクス前年度までに行った研究成果を踏まえ、高次クロマチン構造データ解析の理論基盤を構築し、高次クロマチン構造による遺伝子発現制御機構の解明を目指す。また、得られた研究成果を論文として投稿し、国内外での学会発表のほか、開発したソフトウェアの公開を通して、広く社会へ発信する。研究実績の概要で述べたように、平成25年度は本研究課題に必要な要素技術について、順調に研究が進展している。また、連携研究者との共同研究についても順調に進んでおり、今後の成果が期待できる。当初の研究計画では、平成27年3月までに、数理モデルの構築および実データを用いたモデルの検証実験を実施するとともに国際学会において研究発表を行い、研究成果をとりまとめる予定であったが、研究代表者の所属先研究磯関の変更と新しい研究室の立ち上げ作業により、当該研究に関する実験に遅延が生じたため、全体の研究計画の進捗が遅れ、当初の研究訓画を変更する必要が生じ、未使用額が発生した。前年度に行った研究成果を踏まえて、モデルとその推定法の改良を行う。また、実データの解析結果について、生物学的考察を行い、高次クロマチン構造データ解析の知見を深め、エピゲノムによる遺伝子発現制御機構の解明につなげる。このため、前年度に行うことができなかったモデルの検証と国際学会での発表を次年度行うこととし、未使用額はそのための経費に充てることとしたい。平成25年度に本研究課題の推進に必要なデータベースの基盤整備のために人件費・謝金を計上していたが、申請者自らが整備を行ったため、使用しなかった。また、物品費として大規模データ解析のための方法論を開発するメインのデスクトップPCを計上していたが、東大医科学研究所ヒトゲノム解析センターのスーパーコンピュータシステム上で開発を行ったため、物品費を当初の予定より小規模に抑えることができた。本研究課題は、連携研究者の協力(実験等)をいかに得るかが問題であり、既に連携関係ができている実験系の研究者に加えて、新たに共同研究を探索する必要がある。そこで、研究成果の発表や情報収集のため、国内外の研究集会に積極的に参加する予定である。
CAR-T細胞療法の最適化に資するCARの構造/機能連関解析システムの構築

[抗原認識領域改変CARの構造活性相関解析]4種類のanti-VFGFR2 scFv cloneを用いて構築したCARの中には、T細胞膜上に発現してVEGFR2特異的結合能を有する構造体を含んだが、ほとんどのCARはT細胞膜上に発現するもののVEGFR2結合親和性が非常に乏しい構造体や、膜への発現効率が低く細胞内での凝集が認められる構造体であった。scFvを構成するリンカーの種類や長さあるいは可変領域の順序の入替ではCAR発現効率およびVEGFR2結合親和性を向上させるには至らなかったが、CDR-graftingによりCAR膜発現強度の改善効果が認められた。本研究の成果は、有望なscFvを取得したとしてもCARとしてT細胞膜上に発現させることができずに開発を断念してきたケースに対して、scFv構造改変からの打開策を示すものである。[ヒンジ領域改変CARの構造活性相関解析]CARコンポーネントであるCD28由来ヒンジ領域に含まれるシステインをアラニンに置換したCAR改変体を構築したところ、基本構造体で認められたジスルフィド結合を介した複合体形成が阻害された。基本構造体と比較してアラニン置換体ではCAR-T細胞の抗原特異的な細胞傷害活性に大きな変化は認められなかった。また、ウエスタンブロッティングにおけるCAR単量体バンドは、脱糖鎖酵素処理によって低分子量側にシフトしたことから、CAR分子は糖鎖修飾を受けていることが判明した。現在、CARのジスルフィド結合を介した複合体形成に寄与する膜タンパク質の同定と、糖鎖修飾部位のアミノ酸残基を置換したCAR改変体の発現・機能解析を進めており、CAR翻訳後修飾とCARシグナル伝達効率との連関を明らかにしたいと考えている。様々に構造改変したキメラ抗原受容体(CAR)の機能比較を円滑に遂行するために、各種構造改変CAR遺伝子を搭載したレトロウイルスベクターを迅速に作製できるシステムを確立した。また、独自の抗体ライブラリにより標的分子特異的な一本鎖抗体(scFv)を網羅的に探索できるファージ表面提示法を駆使して、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR2)に対してaffinityが異なる複数のscFVを単離するとともに、それらを組み込んだCARを構築した。また、CAR発現レベルの解析にあたっては構造改変に伴う検出法の変更をなくすために、すべてのCARのN末端側に挿入されたHA tagに対する同一抗体によるフローサイトメトリー解析法を確立した。各種構造改変CARのマウスT細胞における発現レベルの比較解析により、CARの発現量および発現期間にはCARの膜貫通領域の構造が大きく影響することが明らかとなった。また、CAR発現T細胞の抗原刺激に伴う機能変化を解析したところ、CAR発現レベルが同等であっても膜貫通領域の構造が異なればT細胞へのシグナル入力強度に違いが現れることが判明した。引き続き、各種構造改変CARの機能解析を進めることにより、CAR構造/活性相関に関する基礎情報の集積を図っている。各種構造改変CARの構築ならびに機能解析のための基盤システムの確立ともに、当初の研究計画に従って遂行できている。CAR構成要素のヒンジ領域(HD)および膜貫通領域(TMD)の構造改変がCAR-T細胞機能を調節しうる可能性について精査したところ、CARのHD/TMDは膜発現の強度や安定性のみならず、抗原刺激に対するシグナル伝達効率にも寄与していることが示された。すなわち、HDあるいはHD/TMDの改変によってCAR-T細胞の活性化閾値あるいは反応性を調節できる可能性が見出せた。現在、これらHD/TMD改変によるCAR構造ー活性相関についてより詳細な情報を収集するべく、各種CAR改変体のT細胞膜上における発現様式や複合体形成に着目した解析を進めている。また、CD3ζ由来細胞内シグナル伝達領域(STD)に加えて各種免疫機能分子に由来するSTDを追加したCAR構造改変体(第二世代CAR)を発現させたCAR-T細胞の機能解析から、CARへの機能付加を狙ったSTDの追加においてはタンデムに結合させるだけでは望みの機能発揮に至らないケースも現れるため、HD/TMDに用いる分子の選択や複数STDの結合順など、細胞内構造を最適化するアプローチが必要であることが示唆された。現在、CARへのSTDの追加挿入とCAR-T細胞の機能変化との連関を明らかにすべく、これら各種第二世代CAR改変体のSTDについてシグナル伝達活性の解析を進めている。標的抗原へのaffinityが異なるscFvを用いてCAR構造改変体を数種類作製したところ、原因は不明であるがT細胞膜上に発現できなかったり、発現したとしてもscFvでの標的抗原への特異性および親和性が失われたりする現象が認められた。したがって、標的抗原に対するCARのaffinity調節は、特異性・親和性の異なるscFv領域変換のみでは困難であることが示唆された。平成28年度に確立したCAR機能解析システムを活用して、各種構造改変CARの発現プロファイルならびに機能発現比較を当初の研究計画に従って遂行できている。

本研究の成果は、有望なscFvを取得したとしてもCARとしてT細胞膜上に発現させることができずに開発を断念してきたケースに対して、scFv構造改変からの打開策を示すものである。[ヒンジ領域改変CARの構造活性相関解析]CARコンポーネントであるCD28由来ヒンジ領域に含まれるシステインをアラニンに置換したCAR改変体を構築したところ、基本構造体で認められたジスルフィド結合を介した複合体形成が阻害された。基本構造体と比較してアラニン置換体ではCAR-T細胞の抗原特異的な細胞傷害活性に大きな変化は認められなかった。また、ウエスタンブロッティングにおけるCAR単量体バンドは、脱糖鎖酵素処理によって低分子量側にシフトしたことから、CAR分子は糖鎖修飾を受けていることが判明した。現在、CARのジスルフィド結合を介した複合体形成に寄与する膜タンパク質の同定と、糖鎖修飾部位のアミノ酸残基を置換したCAR改変体の発現・機能解析を進めており、CAR翻訳後修飾とCARシグナル伝達効率との連関を明らかにしたいと考えている。CARの標的抗原に対するaffinityを測定する評価系の確立については、当初の計画にあった表面プラズモン共鳴法を利用したシステムのみならず、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を利用した方法など、他の手法についても検討を進める。CARの標的抗原に対するaffinityを測定する評価系として、CAR scFv領域とFcとの融合体を作製し、それを用いた表面プラズモン共鳴法を確立する。また、質量分析装置を用いた解析手法により、各種構造改変CARのT細胞膜上における発現様式および複合体形成について明らかにする。さらに担癌マウスモデルを用いた各種構造改変CAR-T細胞の有効性および副作用発現を比較するとともに、CAR構造ー活性相関の理論的根拠を強化すべくヒトCAR-T細胞を用いた情報の収集を図る。実験動物生産業者において納品可能な実験動物(7週齡マウス)の不足により、計画よりも週齡の若いマウスを購入したため差額が生じた。(理由)実験動物生産業者において納品可能な実験動物(マウス)の不足により、計画よりも少ない匹数のマウスしか購入できなかったため差額が生じた。(使用計画)次年度の実験動物購入費に充てる。次年度の実験動物購入費に充てる。
腫瘍細胞における細胞周期の制御と増殖阻害の分子機構

1.腫瘍T細胞における増殖阻害とアポトーシス:腫瘍T細胞をT細胞レセプターを介して活性化することによって誘導される増殖阻害においては、まずG1期アレストが起こり、これに引き続きアポトーシスが誘導される。このことは、活性化に伴うG1期アレストは起こるが、アポトーシスを伴うわない変異株が分離できることからも支持された。2.G1期アレストとG1サイクリン/cdcキナーゼ:腫瘍T細胞では、G1サイクリンの中でも、サイクリンC,C2,C3,Eが発現しており、サイクリンD1は発現していないことが判明した。これらのG1サイクリンの中では、サイクリンEが細胞周期に伴って、顕著にその発現を変化させた。これらと会合しているcdc2系キナーゼにおいては、cdc2および、cdk2両者とも細胞周期に伴って変動した。活性化に伴う増殖阻害が誘導されると、G1サイクリンのうち、サイクリンE,D3およびcdk2キナーゼのmRNAが顕著に減少し、D2は逆に上昇した。これらの変化が、G1アレストを引き起こすと考えられ、サイクリンE,D3,cdk2を恒常的に高発現した場合増殖阻害が起こらないか調べるため、これら遺伝子の導入T細胞株およびこれらG1サイクリンに対する抗体も作製したので今後解析する予定である。3.活性化によるアポトーシスとFas抗原によるアポトーシス:Fas抗原を抗Fas抗体で刺激することによりアポトーシスが誘導されるが、腫瘍T細胞で活性化されることによって起こる増殖阻害、アポトーシスとの関係を調べるためFas抗原を発現させた腫瘍T細胞を作製した。T細胞レセプターを介する刺激によるアポトーシスは、G1アレストに続いて起こり、サイクロスポリンAで阻害されるが、Fas抗原を介して誘導されるアポトーシスは細胞周期に依存せず、サイクロスポリンAによっても阻害されず、この両者のアポトーシスが異なる機序で誘導されていることが判明した。
現代ウクライナ政治の総合的研究

ウクライナは、歴史上、様々な国家に分割統治されてきた国であり、国民をまとめあげる共通の民族的アイデンティティーを欠いている。このためウクライナ政府は、市場経済移行、民族創出、脱ユーラシア入欧など、同国にとっては実現困難なスローガンを次々に打ち出さざるを得ず、同国の政治は、きわめてイデオロギッシュなものとなる。その反面、旧国有資産の私有化、共産党体制からマシーン政治(カシキスモ)への移行という条件下で、ウクライナ政治におけるクランや地縁集団は異常発達した。こうして、ウクライナは、他のCIS諸国では例を見ないような、公式の言説・憲法体制と政治実態とが極端に乖離する政治体制を持つことになったのである。この二面性は、次のような諸局面に現れている。<政党制、議会>権力を握るクラン政党と、議会選挙では相対的に強いが権力からは疎外されている左右両極の世界観政党。く地方制度>公式には単一国家、州知事と郡行政府長官の任命制、実態においては地方ボス政治・カシキスモ。く外交>公式路線としての脱ユーラシア・入欧と、実態としてのエネルギー・私有化(資本導入)におけるロシア依存・欧州側のウクライナへの嫌悪。なお、本来ならば、公式面での正当化機能と実態面でのクラン間のバランス維持という二重の機能を果たすべき大統領府であるが、2000年から2001年にかけて浮上した「カセット危機」(依頼殺人疑惑)に示されるように、もはやクラン政治の虜になってしまった感がある。本基盤研究は、本年度11月より開始されたため、短期間で調査体制を創出し、嚆矢的業績をあげることが求められた。1.現地協力者への委託調査の結果、独立後の大統領府の人脈の変動、議会多数派、いわゆるオリーガーキー、外交上の諸問題などについて資料が収集された。2.慶応大学博士課程藤森信吉がウクライナのガストレイダーについて現地調査を行い、スラブ研究センター冬期シンポジウムにおいて英語で報告した。3.露語・ウクライナ語インターネット・サイト「ウクライナ・リージョンの政治エリート」(http://src-h.slav.hokudai.ac.jp/ukrregions/index.html)が開かれた。このデータに基づいて、ロシア東欧学会年次大会、およびスラブ研究センター冬期シンポジウムにおいて松里が英語で報告(後者の討論者は末澤)。現地調査:松里が、平成13年9-10月に主にハリキフ州で、平成14年2-3月に主にザカルパッチャ州で2度にわたって現地調査を行った。出版:研究報告シリーズ第2輯『ウクライナのリージョン:政治史と指導者、ハリキフ州』(露語、135頁)を出版した。研究会活動および招聘:キエヴォ・モヒラ・アカデミー大学政治社会研究センターおよび現代政治研究センター(モスクワ)との協力で、平成13年12月7-8日、上記大学において、「ロシア地域学のウクライナ政治研究への適用可能性」をめぐってシンポジウムを開催した。また、同大学よりV・ヤクシク教授を招聘して、スラブ研究センター冬期国際シンポジウムにおいて、「ヨーロッパとユーラシアの間の新たな鉄のカーテン:分化する『新東欧』」を組織した。そのほか、ウクライナのクランと政党、大統領府の機能、ウクライナのCISおよび欧州連合との関係などのテーマで委託調査を組織し、本基盤研究の目標であるウクライナ政治入門書出版に大きく近づいた。