hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗酸菌感染症における宿主の殺菌機構の分子生物学的解明

本研究では抗酸菌感染症における宿主の殺菌機構にNADPHoxidase (Nox)を介したシステムが大きく関与していることが示唆された。培養マクロファージ内に存在する細胞内寄生菌としてのらい菌や非結核性抗酸菌は、マクロファージの活性化とともに代謝活性が減少し生菌率が減少すること、そして、それらの菌の周囲にはNoxタンパク複合体が集積していることが種々の蛍光色素の組み合わせと蛍光顕微鏡や共焦点レーザー顕微鏡による観察で細胞レベルにおいて明らかとなった。殺菌機構には種々の系が考えられているが、Noxにより産生される酸素ラジカルの殺菌への関わりが実際に示された。本研究では抗酸菌感染症における宿主の殺菌機構の分子生物学的解明を、主としてNADPHオキシダーゼ(Nox)を介したシステムを中心として行うことを目的としている。初年度(25年度)は宿主マクロファージ内にて増殖する細胞内寄生菌である抗酸菌に対する殺菌現象を細胞レベルで可視化することを試みた。最初に、ヒトやマウスマクロファージを8ウェルチェンバースライド、もしくはカバースリップ内で培養して張り付かせた。そして、非結核性抗酸菌やハンセン病の起因菌であるらい菌を感染させメタノールで迅速処理した後、oregon greenもしくはauramineを添加して菌を緑色蛍光標識した。さらに、cyano-tetrazolium chloride (CTC)を添加し数時間培養した。CTCは生菌の呼吸代謝によりCTFとなって赤色蛍光を発するCTFとなることからCTFを持っている菌は生菌として評価できることが判明している。このように二種の蛍光色素で標識された試料スライドを共焦点レーザー顕微鏡下で観察した。その結果、マクロファージを活性化することが知られているサイトカインのひとつであるIFNγで刺激を受けたマクロファージ中の抗酸菌(緑色蛍光部分)の赤色蛍光が減弱していることが判明した。さらに抗phox抗体を用いNox関連タンパク質を別の蛍光色素で染色して多重染色を施した試料を観察したところ、phoxの集積量が多いほど菌の赤色蛍光が減弱しており菌がダメージを受けていることが分かった。一方、対照マクロファージではphoxの発現量は低く菌周囲へのphoxタンパクの集積も少なかった。従ってIFNγにより誘導されたマクロファージの抗菌システムにおいては、活性酸素を産生するNADPHオキシダーゼ(phoxタンパク)の発現が増強して、菌周囲へ集積することが必要な条件であることが判明した。本研究では抗酸菌感染症における宿主の殺菌機構の分子生物学的解明を行うことを目的としている。抗酸菌はマクロファージを中心とした貪食系細胞に寄生して増殖する細胞内寄生菌である。宿主側はそのような細胞内寄生菌に対し細胞内に保有する殺菌関連酵素を用いて殺菌、もしくは増殖抑制を行って抵抗する。このような酵素は通常リソソームに含まれ、ファゴゾーム内に含まれている細胞内寄生菌に対しリソソームを融合させることにより殺菌を試みる。このような殺菌機構のほか、マクロファージは酸化窒素や酸素ラジカルを用いて殺菌作用を高める機構をも持ち合わせている。一般的にマクロファージはIFNγといった他の免疫細胞集団、特にT細胞が産生するサイトカインによって刺激を受け活性化して殺菌力を高める。よって、本研究では殺菌機構を可視化して解析することを試みており、IFNγ刺激を受けたマクロファージにおいて酸素ラジカル産生に関わるNADPHオキシダーゼ(Nox)酵素タンパクが抗酸菌周囲に集積する現象を見出した。方法論としてはin vitroで非結核性抗酸菌やハンセン病の起因菌であるらい菌を感染させて培養したヒト末梢血単球由来マクロファージをメタノールで迅速処理した後、菌を蛍光色素で標識し、さらに、生菌により代謝を受けると蛍光を発する色素を添加し共焦点レーザー顕微鏡下で観察した。その結果、生菌の減少とNADPHオキシダーゼ(Nox)酵素タンパクの菌周囲への集積量の増大が同時に見られる像が多く観察された。現在これら蛍光強度の数値化を行っているところである。宿主側はそのような細胞内寄生菌に対し細胞内に保有する殺菌関連因子を用いて殺菌、若しくは増殖抑制を行って抵抗する。このような殺菌因子の中には、通常リソソームに含まれる酵素があり、ファゴゾーム内に含まれている細胞内寄生菌に対しリソソームを融合させることにより殺菌を試みる。このような殺菌機構の他、マクロファージは酸化窒素や酸素ラジカルを用いて殺菌作用を高める機構をも持ち合わせている。一般的にマクロファージは、IFNγといったT細胞と呼ばれれる他の免疫集団が産生するサイトカインによって刺激を受けて活性化して殺菌力を高める。よって、本研究では上述の殺菌機構を可視化して解析することを試みており、IFNγ刺激を受けて活性化したマクロファージにおいて、酸素ラジカル産生を高めるNADPHオキシダーゼ(NOX)タンパク複合体が抗酸菌周囲に集積する現象を見出した。方法論としてはin vitroで非結核性抗酸菌やハンセン病の起因菌であるらい菌を感染させて培養したヒト末梢血単球由来マクロファージをメタノールで迅速固定したのち、菌を蛍光色素で標識し、さらに、生菌により代謝を受けると別波長の蛍光を発する色素と共培養し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果、生菌の減少(蛍光色素発色量減少)とNOX酵素タンパクの菌周囲への集積増大が見られた。

これまで、IFNγは細胞性免疫を増強させる代表的なサイトカインとして知られてきた。このサイトカインにはマクロファージを活性化させ抗菌活性を増強させる作用があることが分っている。マクロファージの抗菌活性は、マクロファージと菌の混合培養から回収された試料中の生菌量を調べることで測定できる。また、特殊な方法として、培養不能ならい菌の場合、感染したマクロファージかららい菌を回収し放射性同位元素で標識した基質の代謝活性を測定することで菌の生死を評価できる。但し、放射性同位元素を扱うという観点からRI取扱施設が必要であり簡便な方法とは言えない。そ子で、種々の方法を比較検討したところ、生菌による代謝反応によってある種の色素分子は基質として作用し、蛍光を発するようになり、その発色強度を比較す方法が有用であり定量化も可能であることが判明した。しかも、抗酸菌は増殖速度が他の菌と比べて遅い為、菌を細胞から回収して固形培地にまき培養開始、その後、コロニーにより菌数が把握できるまで数週間を要する。それに比べると、蛍光色素発色のために必要となる培養時間とそれに続く共焦点レーザー顕微鏡による画像解析は蛍光色素を加えてから一日以内で結果が得られるという時間的なメリット大である。但し、蛍光色素の発色強度を定量化するための画像解析方法の確立が求められる。これまで得られた膨大な量の写真データをいかに迅速かつ正確に解析できるかが本研究のポイントとなると思われる。本研究では抗酸菌感染症における宿主の殺菌機構にNADPHoxidase (Nox)を介したシステムが大きく関与していることが示唆された。培養マクロファージ内に存在する細胞内寄生菌としてのらい菌や非結核性抗酸菌は、マクロファージの活性化とともに代謝活性が減少し生菌率が減少すること、そして、それらの菌の周囲にはNoxタンパク複合体が集積していることが種々の蛍光色素の組み合わせと蛍光顕微鏡や共焦点レーザー顕微鏡による観察で細胞レベルにおいて明らかとなった。殺菌機構には種々の系が考えられているが、Noxにより産生される酸素ラジカルの殺菌への関わりが実際に示された。ハンセン病を引き起こすらい菌は細胞内寄生性細菌である。らい菌特異的な細胞性免疫反応が欠落している場合、病巣に存在するマクロファージ内でらい菌が増殖するが(LL型)、同反応が亢進しているとマクロファージが活性化して菌が排除されるため菌は稀にしか見られない(TT型)。らい菌は人工培養できないので解析が難しく、マクロファージ内での増殖、または排除機構について不明な点が多い。これまで放射性同位元素標識脂肪酸を基質として利用する代謝活性を生菌の指標として、ヒトマクロファージの活性化状態と同細胞中のらい菌の生存率との関係を調べてきた。その代替方法として生菌選択的蛍光染色試薬を用い共焦点レーザー顕微鏡下で細胞内のらい菌の生死を鑑別したところ、IFNgにより活性化したマクロファージでは生菌(蛍光発光しているらい菌)数が減少しており、放射性同位元素を利用する方法に匹敵する有用な抗らい菌活性測定法だと思われた。
微生物反応によるカオリナイトの溶解促進因子の定量化

微生物反応によるカオリナイトの溶解促進因子を明らかにし、その定量化評価を行うことを目的として、Pseudomonas fluorescensを含む反応系でのカオリナイトの溶解実験を行った。実験結果からカオリナイトの溶解速度を求めて微生物の影響を定量化するとともに、溶液中に放出された有機分子の同定と定量を行って微生物起源溶解促進因子の特定を試みた。その結果、10^9ceus/ml系で約1倍の溶解促進効果が確認され、溶液中の有機分子分析により微生物細胞から放出されたタンパク質が主要促進因子として機能していることが明らかとなった。タンパク質による溶解促進効果を検証するため、構造およびアミノ酸組成が既知のアルブミンを含む系でのカオリナイトの溶解実験を行った結果,1.0mg/mlの系で約16倍の溶解促進効果が認められ、タンパク質がカオリナイトの溶解促進因子として機能することが確認された。タンパク質によるカオリナイトの溶解促進効果を定量評価するため、配位子促進溶解理論に基づいて、タンパク質のもつ電荷サイト数で溶解速度の規格化を行った結果、タンパク質によるカオリナイトの溶解はタンパク質のカルボキシル基脱プロトン化サイトとカオリナイト端面のA1-OH_2^+サイトとの反応が主要な反応機構であることが明らかとなった。その結果、10^9cells/ml系で約10倍の溶解促進効果が確認され、溶液中の有機分子分析により微生物細胞から放出されたタンパク質が主要促進因子として機能していることが明らかとなった。タンパク質によるカオリナイトの溶解促進効果を定量評価するため、配位子促進溶解理論に基づいて、タンパク質のもつ電荷サイト数で溶解速度の規格化を行った結果、タンパク質によるカオリナイトの溶解はタンパク質のカルボキシル基脱プロトン化サイトとカオリナイト端面のAl-OH_2^+サイトとの反応が主要な反応機構であることが明らかとなった。その結果、10^9 cells/ml系で約10倍の溶解促進効果が確認され、溶液中の有機分子分析により微生物細胞から放出されたタンパク質が主要促進因子として機能していることが明らかとなった。タンパク質によるカオリナイトの溶解促進効果を定量評価するため、配位子促進溶解理論に基づいて、タンパク質のもつ電荷サイト数で溶解速度の規格化を行った結果、タンパク質によるカオリナイトの溶解はタンパク質のカルボキシル基脱プロトン化サイトとカオリナイト端面のAl-OH_<2^+>サイトとの反応が主要な反応機構であることが明らかとなった。
北海道南部のアイヌ語の語彙表現法の調査ーー主として散文と韻文(歌謡)における異同を中心としてーー

1.音声資料の録音・録画昭和63年8月・平成元年2月に次の諸地域で録音・録画を行った。北海道沙流郡平取町において、同町旭在住の上田トシ氏(女)から昔話と歌謡、同町二風谷在住の青木愛子氏(女)から歌謡、同町貫気別在住の小川シゲ氏(女)から昔話と神謡、同じく同町貫気別在住の黒川セツ氏(女)から口競べを採録した。北海道静内郡静内町において、同町豊畑在住の織田ステノ氏(女)からユーカラ(英雄叙事詩)を、同町春立在住の葛野辰次郎氏(男)から子守歌等を採録した。北海道中川郡本別町において、同町下仙美里在住の沢井トメ氏(女)から歌謡を採録した。また、アイヌ語映像資料作成のために、昔話や口頭伝承に語られている地域や風物、村落、家屋などの録画も行った。2.資料の整理・分析a.これまでに収集した資料について、テープの聴き取り、意味解釈など、整理・分析の作業を行った。昭和63年8月・平成元年2月に上記のインフォーマントらに疑問点・不明点の質問調査を行い、『アイヌ語音声資料6』を仕上げた(印刷中)。続刊の準備も進めている。b.昨年度までに、これまで出版した『アイヌ語音声資料1』『同2』『同3』『同4』のテキストを、パーソナルコンピュータにページ番号・行番号を付して入力してあったが、それに『同5』を加えた。そして、印刷中の『同6』も加えて、『同4』『同5』『同6』の索引を作成する準備をした。さらに、アイヌ語沙流下流方言の用例付辞書作成の準備として、田村がこれまでに収集整理した資料のコンピュータ入力を行った。
転写中断解除因子と組織特異的転写活性化因子の協調作用に基づく遺伝子発現制御機構

これまでに、S-II遺伝子ノックアウトマウスが胎児肝臓の低形成を伴って胎齢13日前後に致死することを明らかにしている。また、胎児肝細胞のフローサイトメトリー解析から赤芽球の画分が消失していることが明らかとなり、S-IIが赤芽球への分化に必須であることがわかっている。本年度は、赤血球系譜以外の血液細胞の分化における異常の有無について解析を行った。胎児肝臓細胞を各種サイトカインを含有する半固形培地に繙種し、710日間培養して生じたコロニーを観察した。その結果、野生型マウスと比較してノックアウトマウスにおいては、顆粒球・単球系譜の前駆細胞CFU-GM, CFU-G, CFU-M、および骨髄球系譜の前駆細胞CFU-Mixの胎児肝臓一つあたりの総数が減少することがわかった。そこで、胎児肝臓中の造血幹細胞にフローサイトメトリー解析を行った結果、c-Kit(+)Sca-1(+)Lin(-)の表現型をもつ細胞画分の割合は減少していないが、胎児肝臓一つあたりの総数は減少することが明らかになった。さらに放射線照射した成体マウスに野生型マウス、ノックアウトマウス由来の胎児肝臓細胞を移植して造血幹細胞の機能異常の有無を解析したところ、野生型マウス細胞は移植16週後に高い寄与率を示したのに対し、ノックアウトマウス細胞は全く寄与しないことが明らかになった。ついて解析を行った。これらの結果から、S-IIノックアウトマウスでは赤血球系譜以外の造血細胞にも異常を示すこと、またS-IIは造血幹細胞の自己複製能の維持に必須の役割を果たすことが明らかになった。S-II遺伝子ノックアウトマウスの解析から本遺伝子欠損が胎齢13日前後に肝縮小を伴う致死を導くことを明らかにした。この時期の肝臓は主要な造血組織であることから、ノックアウト胚の末梢血赤血球を組織学的に解析したところ、成体型赤血球の産生がほとんど見られないことが明らかとなった。そこで、造血前駆細胞がノックアウト胚において存在するかを解析したところ、赤血球系前駆細胞BFU-E, CFU-Eはともに存在していることが明らかとなった。この結果から、S-II欠損胎児の肝臓ではCFU-Eから赤芽球、成熟型赤血球の分化が阻害されているのではないかと考え、胎児肝細胞に対してフローサイトメトリー解析を行った。その結果、ノックアウト胚においては、赤芽球の画分が消失していることが明らかとなり、S-IIが赤芽球への分化に必須であることがわかった。赤芽球の分化、生存にはサイトカインの一種であるエリスロポエチン(EPO)が必須であることが報告されている。そこでノックアウト胚においてEPO遺伝子の発現が低下しているか否かを解析したところ、発現量の低下は見られず、むしろノックアウト胚において増大していることを見出した。この結果から、ノックアウト胚においては、EPOによるシグナル伝達の過程が障害されていることが考えられた。また、マウス10,11日胚のcDNAライブラリからS-II相互作用因子としてDNA複製関連因子MCM10を単離した。現在MCM10が転写に関与するか否かを解析中である。これまでに、S-II遺伝子ノックアウトマウスが胎齢13日前後に肝縮小を伴う致死を導くことを明らかにしている。また、胎児肝細胞のフローサイトメトリー解析から赤芽球の画分が消失していることが明らかとなり、S-IIが赤芽球への分化に必須であることがわかった。また、EPOの下流で機能すると考えられている転写因子STAT5の発現とEPO依存の活性化は、野生型マウスと差がないことが明らかになった。一方、STAT5によりEPO依存的に転写活性化される遺伝子Bcl-XLの発現量が、野生型マウスと比較してほぼ半分に低下することがわかった。Bcl-XLタンパクはアポトーシスの抑制に働くことが知られており、そのノックアウトマウスはS-II欠損同様に胎児肝造血の異常により胎生中期で致死することが知られている。そこで、S-IIノックアウトマウスの肝臓に対してTUNEL染色を行ったところ、野生型マウスと比較して陽性細胞が増加しており、アポトーシスが亢進していることがわかった。これらの結果から、S-IIはBcl-XL遺伝子の発現を促進することにより胎児肝の赤血球産生に寄与すると考えられる。

そこで、胎児肝臓中の造血幹細胞にフローサイトメトリー解析を行った結果、c-Kit(+)Sca-1(+)Lin(-)の表現型をもつ細胞画分の割合は減少していないが、胎児肝臓一つあたりの総数は減少することが明らかになった。さらに放射線照射した成体マウスに野生型マウス、ノックアウトマウス由来の胎児肝臓細胞を移植して造血幹細胞の機能異常の有無を解析したところ、野生型マウス細胞は移植16週後に高い寄与率を示したのに対し、ノックアウトマウス細胞は全く寄与しないことが明らかになった。ついて解析を行った。これらの結果から、S-IIノックアウトマウスでは赤血球系譜以外の造血細胞にも異常を示すこと、またS-IIは造血幹細胞の自己複製能の維持に必須の役割を果たすことが明らかになった。
治療を目的とした筋萎縮性側索硬化症でのMT-Ⅲ発現低下エピゲノムメカニズムの解明

筋萎縮性側索硬化症(ALS)患者において金属代謝関連タンパクであるメタロチオネイン(MT)-3や、亜鉛輸送体であるZnT3の脊髄中の発現量の減少を確認している。ALS発症に小胞体ストレスの関与が示唆され、本解析で小胞体ストレスによるMT3発現低下、ZnT3発現上昇が認められた。ZnT3については小胞体ストレスに対する防御効果を示すことが示唆された。ヒト剖検解析のエピゲノム解析は、マイクロRNAについてALS剖検にて有意に変動するものを2種類見出すことができた。一方は標的予測プログラムからZnT3を直接調節する可能性があり、ALSにおけるエピゲノムメカニズムの一端を示すことができた。筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、原因不明の神経変性疾患であり進行は早く、発症から35年の内に呼吸麻痺等で死亡する。これまでに、ALS患者の脳脊髄液中の亜鉛濃度の上昇、ならびに金属代謝関連タンパクであるメタロチオネイン(MT)-3や、亜鉛輸送体であるZnT3の脊髄中の発現量の減少を確認している。これらの発現量の低下に、遺伝子プロモーター領域におけるエピジェネティクス変化が関与していると考え、ヒト神経芽細胞株(SH-SY5Y細胞)やヒト胎児腎細胞(HEK293細胞)を用いて、解析を行った。まずは、MT3やZnT3の遺伝子誘導機構は全く解明されていないのと、ALS発症に小胞体ストレスが関与している可能性があることから、小胞体ストレス誘導剤に対する反応性を検討した。小胞体ストレス誘導剤であるツニカマイシン曝露により、ZnT3の遺伝子発現量の上昇が認められた。また一方、ツニカマイシン曝露による、MT3遺伝子発現量の減少傾向が認められた。よって、これらの遺伝子が小胞体ストレスによって、反応する可能性があることが示された。また、MT3を過剰発現させたHEK293細胞において、ツニカマイシン曝露による細胞死が抑制されたこと、またZnT3のノックダウン細胞において、ツニカマイシン曝露による細胞死が促進されたことからも、MT3とZnT3は小胞体ストレスに対しての防御効果を有する可能性が示唆された。従って、この2つの分子は、細胞内ストレスから起因する孤発性ALSの治療標的としての可能性が示唆された。MT3とZnT3の遺伝子プロモーター解析を行うために、レポータージーンアッセイ用のベクターの構築し、その検討を行っている。ヒトの検体についての、倫理審査に遅れが生じALS臨床検体における解析を予定通り進めることができなかった。エピジェネティクス解析における標的になる、遺伝子プロモーターについての解析を行う前に、これまでにヒトALS検体において変動が認められたMT3とZnT3に関して、ヒト培養細胞を用いて、小胞体ストレス曝露による遺伝子発現量の変動を確認することができた。MT3とZnT3遺伝子プロモーターを組み込んだレポータージーンベクターは構築することができたが、詳細な遺伝子プロモーターの機能的解析までは至っていない。しかしながら、MT3とZnT3に関する小胞体ストレスの保護効果を確認することができ、この2つの分子は、細胞内ストレスから起因する孤発性ALSの治療標的としての可能性が示唆された。また、ALS原因遺伝子の1つであるTDP43の変異体を導入したHEK細胞で、ツニカマイシンによる細胞死および細胞内凝集体の増加が認められた。従って、TDP43変異体導入細胞は小胞体ストレスに対して脆弱であることが示唆された。さらに、TDP43変異体導入細胞におけるZnT3遺伝子発現量は、小胞体ストレス曝露により有意に減少した。前年度において、ALS発症に小胞体ストレスが関与している可能性があることから、HEK細胞にツニカマイシンを処置したところ、MT3遺伝子の発現低下およびZnT3発現上昇が認められた。レポータージーンアッセイによりこれらの発現調節領域の機能解析を試みたが、アッセイ系の構築が上手くできなかった。またMT3についてはウエスタンブロットによる検出が技術的に困難であり、解析を断念した。そこで、もう一方のZnT3について注目した。するとZnT3は小胞体ストレスについての防御効果を示すことが示唆された。さらにヒト剖検解析についてもエピゲノム解析を進めたが、DNAメチル化とヒストン修飾に関しては、技術的な確立を完了することはできなかった。しかしながら、もう1つのエピジェネティクス因子であるマイクロRNAについてはALS剖検にて有意に変動するものを新規に2種類、見出すことができた。一方は標的予測プログラムからZnT3を直接調節する可能性があり、新規のALSにおける金属関連遺伝子調節のエピジェネティクスメカニズムの一端を示すことができた。

一方は標的予測プログラムからZnT3を直接調節する可能性があり、ALSにおけるエピゲノムメカニズムの一端を示すことができた。今後は、ヒトに関する倫理審査が承認され次第、ヒトALS検体の解析を中心にMT3およびZnT3プロモーター領域におけるエピゲノム解析を早急に行う予定である。そして、ヒト培養細胞やALSモデル細胞を用いてレポータージーンアッセイによる遺伝子プロモーター解析を行う。これらの結果を総合的に組み合わせることで、ヒトALSにおけるエピゲノムメカニズムを解明する。薬物治療学、分子生物学物品費において、必要な試薬の価格の関係上、次年度使用額として生じてしまった。次年度使用額が比較的少額であり、本来の使用計画にはほぼ影響は与えないので、当初の計画通りに使用する。
カルシウム拮抗剤投与による歯肉増殖機構の解明

カルシウム拮抗剤は、高血圧症患者等に比較的頻繁に長期に使用され、それによる歯肉増殖症に悩む患者も多い。研究者は、カルシウム拮抗剤による歯肉増殖の機構を解明していくため、まず増殖細胞核関連蛋白質である、PCNAの発現を検討した。カルシウム拮抗剤性の歯肉増殖症患者の歯肉を歯肉整形切除時に、炎症等を認めない正常と思われる歯肉を抜歯時に一部採取し、上皮基底細胞のPCNA発現陽性細胞を免疫組織化学的に比較検討した。その結果、基底細胞のPCNA発現率はカルシウム拮抗剤性歯肉増殖症患者において有意に(危険率5%以下)高かった。また細胞増殖関連EGF-receptorに関しても、上皮細胞、線維芽細胞が数多く陽性に染色され、両細胞の増殖傾向の強さが示された。また、本患者歯肉のワンギ-ソン染色では、正常歯肉と比較して、コラーゲン繊維の強い増生が認められた。従ってカルシウム拮抗剤による歯肉増殖症は、上皮成分と上皮下線維成分の増生が相まって生じており、かつ増殖に関係するといわれている蛋白質を発現していることは、ある程度うかがい知ることができた。従って、この増殖に関する細胞の情報伝達の研究を進め知見をえることが重要である。更にウシ胎児血清を用いた倍地によって、歯肉増殖症患者の線維芽細胞を培養し、線維芽細胞の増殖に関する細胞内情報伝達に関して、解明していく予定であるが、現在の時点では、本領域での新たな知見はまだ得られていない。
植物病原菌の病原性に与る遺伝子のクローニングとその発現制御

本研究は植物病原菌の病原性を遺伝子または分子レベルで解析し、病害防除の基礎を確立しようとするものである。研究は対象とする病原性を主に侵害力に焦点を合せ胞子発芽から侵入菌糸形成に至る過程、とくに付着器発芽のキーフアクターと考えられるセルラーゼとメラニン合成に関与する酵素の合成やその活性制御を突然変異株と遺伝子組み換え技術を用いて追求した。1.ウリ類炭そ病菌の侵入欠損変異株による付着器侵入の必須要因の解析:本菌分生胞子をニトロソグアニジンで処理し、セルロース膜に侵入できない変異株を3株得た。その内の1株はセルラーゼ分泌機構が欠失したものであり、残りの2株は貫穿糸形成能欠失株であることが分かった。2.ウリ類炭そ病菌の寄主体侵入に必須なセルラーゼの純化:本菌の分生胞子懸濁液をグルコースを含むKawamoriの培地に接種し、24°C、60時間〓とう培養した。その後、グルコースの代りに0.2%アビセルを炭素源とした培地に菌体を移しセルラーゼ合成を誘発した。培養3液中のCMC分解酵素のみが目的とする温度感受性型であったのでCMCaseの純化を行った。培養3液を約20倍に濃縮し、硫安塩析したのちセファデックスGー25で脱塩した。その後、DEAE-Bio GelA、フェニルセファロース、mono-sカラムで分画後、10%SDS-PAGEを行い、58000ダルトンのCMCaseを純化した。3.イネごま葉枯病菌のメラニン合成酵素のクローニング:本菌の分生胞子懸濁液をPDA液体培地に接種し、28°C、60時間培養した。菌体を磨砕し、遠心分離した上清を塩析した。脱塩後DEAEセファデックス、DEAE Bio GelA mono Qカラムで分画後、75%SDS-PAGEで分画し、分子量23000ダルトンのScytlone dehydrotataseを得た。本酵素を気相アミノ酸分析装置によってN未アミノ酸配列を決定した。その内対応するコドン数の少ない部分についてオリゴヌクレオチドを合成した。これをプローブとして用い、mRNAのcDNAをスクリーニングし、ポジティブクローンを得た。本研究は植物病菌の病原性を遺伝子および分子レベルで解析し,病害防除の基礎を確立することを目的として行った.まず,ウリ類炭疽病菌の付着器侵入において,付着器のメラニン化が病原性獲得に必須であることは我々の研究ですでに明らかになっている.そこでメラニン合成の制御機構を明らかにするため,メラニン合成酵素の一つであるScytalone dehydrataseの〓化を行った.その際,同じメラニン合成系をもち,さらに合成活性が高いと思われるイネごま葉枯病菌を選んだ.本菌は菌系全体がメラニン化するため,またメラニン合成が同調的に始まることが分かったので,最も合成活性の高い時期に酵素抽出を行った.種々のカラムクロマトによって分析し,最終的に23000ダルトンのポリペプチドであることが分かった.そしてこの酵素の抗体を作製することに成功した.現在菌体からのmRNAの抽出法が確立されたので,抗体によるmRNAの同定を行っている.

一方,いくつかの色素突然変異株を作出することに成功したのでそれらの遺伝解析を行い,各メラニン合成酵素系の次損部位を決定した.つぎに,ウリ類炭疽病菌の付着器侵入において,重要な酵素としてセルラーゼが存在する.本酵素は本菌が植物体に侵入し,感染成立のために必須の酵素であることはすでに我々の研究で明らかにされている.まず本酵素を大量に得るため,酵素誘導条件を詳しく検討した.その結果,本菌を3日間培養したのち,培地からグルコースを除き,炭素源としてアビセルだけを与えることによって,培養ろ液中にセルラーゼが大量に分泌させることに成功した.また,付着器から分泌されるセルラーゼガ温度感受性であることがすでに分かっているが,今回抽出されたCMCを基質とするセルラーゼも温度感受性であることが分かり,本酵素の遺伝子をクローニングすることにした.植物病原菌の病原性を遺伝子または分子レベルで解析し、病原性に与る遺伝子のクローニングとその発現制御を分析するために行った。1、イネごま、葉柘病菌のメラニン合成酵素のクローニング純化したscyta lene olehydse taseは分子量23000ダルトンであった。N未のアミノ酸20残基を決定し、予想されるオクゴスクレオチドを合成した。このヌクレオチドをプローブとして用い、mRNAのcDNAからポジティブクローンを分離した。2、ウリ類炭そ原菌の寄生体侵入に必須なセルラーゼの純化に成功した。本菌の分生胞子顕濁液をグルコースを含むKawamoriの培地で、24°C、60時間塩とう培養したのち、グルコースをアビセルに代えセルラーゼ合成と誘導した。培養ろ液中のCMC合解酵素のみが、目的とする温度感受性のセルラーゼであったのでCMCaseの純化を行った。培養ろ液を約20倍濃縮し、硫安塩析、DEAEBiolylA、フェルセファロース、monoS、SDSーPAGEを行い、58000ダルトンのCMCaseを純化した。3、イネごま葉枯病菌のメラニン生合成系に関与する遺伝子の遺伝子解析突然変異の誘起処理によってアルビノ変異株(almー1.2)、褐色変異株(brm)赤色色素分泌する白色変異株(scy)株を得た。本菌のメラニン合成系はナフタリン系のメラニンである、scy株はscytaloneの1、3.8ーTHNの転換に欠損があり、brm変異株は1、3.8ーTHNからバーメロンへの転換が損害されていることが分かった。almー1株はペンタケタイドの環状化の欠損があり、almー2については欠損部位は明らかでない。交配実験からalmー1、almー2brmの遺伝子座は密接に連鎖していることが明らかとなった。SCYの遺伝子座はこれらの遺伝子座とは明確な連鎖関係は認められず、異なる染色体上に位置していることが考えられた。
二酸化炭素同族体の活性化と変換

本研究は、セレン化カルボニルを二酸化炭素の活性化形態としてとらえ、その反応特性の解明と合成反応への応用を目的として行ったものであり、下記に示す研究成果を得た。セレン、アミン、一酸化炭素を常温、常圧の条件下反応させ、生成したセレノール炭酸塩を低温下で酸分解することにより、セレン化カルボニルの効率的発生法を開発した。また、得られたセレン化カルボニルと種々の求核剤との反応を検討したところ、求核剤の種類によりセレン化カルボニルの反応点が異なるという興味ある結果を得た。すなわち、アミンなどのハードな求核種は、中心炭素を攻撃しカルバモセレノアート類を与えるのに対し、炭素アニオンなどのソフトな求核種はセレンを選択的に攻撃することを明らかにした。さらに、硫黄との反応を詳細に検討した結果、塩基存在下、セレン化カルボニルと硫黄が穏和な条件で交換反応を起こし、二酸化炭素同族体であるチオカルボニルを生成することを見いだした。また、この原理を発展させ、二酸化炭素と等電子構造を有するチオイソシアナートの生成反応に、セレン、およびテルルが高い触媒能を有することを見いだした。さらに、セレンを用いるカルボニル化反応として、炭素求核剤とセレン、一酸化炭素との反応を検討し、リチウムエノラートやベンジルリチウムなどの比較的安定な有機リチウム化合物が、常圧の一酸化炭素雰囲気下で効率よくセレノカルボキシル化されることを見いだした。この反応経路は現在検討中であるが、おそらく次のようであると推測している。本反応は、有機リチウム化合物とセレンとの反応によりリチウムセレノラートが生成し、これが一酸化炭素と反応して不安定なアシルリチウム中間体を与え、続く転位によりセレノカルボキシラートに至る経路で進行していると考えられるが、反応機構の詳細については現在検討中である。
迅速免疫組織染色装置を用いた肺腫瘍の術中自動病理診断法の開発

外科治療には術中迅速病理診断が必須である.しかし本邦の病理専門医不足深刻である.本研究の最終目標は病理専門医不要の自動迅速病理診断の確立である.我々は20分以内に免疫組織染色を終える装置を開発した.この装置を用いて術中に免疫組織染色を行い、術中迅速診断の自動化を検討している.自動化のためには免疫組織染色を客観的に評価する指標が必要である.陽性コントロールには2種類ある.一つは形態コントロールで、もう一つは濃度コントロールである.濃度コントロールは高分子ミクロハイドロゲルに目的タンパク質を含有させて、その含有量を変えることにより作成できた.形態コントロールは培養細胞を用いて作成するができた.外科治療には術中迅速病理診断が必須である.しかし本邦の病理専門医不足深刻である.本研究の最終目標は病理専門医不要の自動迅速病理診断の確立である.我々は20分以内に免疫組織染色を終える装置を開発した.この装置を用いて術中に免疫組織染色を行い、術中迅速診断の自動化を検討している.自動化のためには免疫組織染色を客観的に評価する指標が必要である.陽性コントロールには2種類ある.一つは形態コントロールで、もう一つは濃度コントロールである.濃度コントロールは高分子ミクロハイドロゲルに目的タンパク質を含有させて、その含有量を変えることにより作成できた.形態コントロールは培養細胞を用いて作成するができた.最近肺癌手術件数が増加している.早期に発見される機会が増加して術前に肺癌の診断がつかない症例も増加している.また区域切除など進行度に応じた個別化治療が普及してきており,リンパ節転移を含めた術中病期診断は重要である.そのため肺癌手術には術中迅速病理診断が必須で,その件数は増加してきている.一方,病理医不足は深刻で増える目途は立っていない.そのため術中迅速病理診断を多用する肺癌手術は危機的状況である.本研究の最終目標は病理医不在でも結果が出る迅速病理検査の確立である.今回申請した研究期間で我々の開発した迅速免疫染色装置を用いて術中に免疫染色し,結果を解析して肺癌の診断が出来るか,またHE染色を用いた病理専門医による術中迅速病理診断と同等の結果が得られるかを検討することを目的に本研究を提案した.本年度は保存してある肺腫瘍組織を用いて多数の抗体により免疫組織染色を行う.病理専門医がHE染色を用いて診断した結果を基準にして,免疫組織染色を用いた細胞機能的癌診断法を確立することを計画した.しかし将来の自動化を見据えた場合に免疫組織染色で陽性・陰性であることを客観的に評価するための指標が必要と判断した.陽性コントロールには2種類ある.一つは染まるべきものが正しく染まっているかをみる形態コントロールで,もう一つは染色濃度を見る濃度コントロールである.この検討では培養癌細胞を用いて形態コントロールを作成して検討した.また濃度コントロールを高分子ゲル・反応性ミクロハイドロゲルにより作成した.培養癌細胞として肺癌細胞と悪性リンパ腫を用いた.免疫染色は最も使用頻度が高い抗サイトケラチン抗体、抗Ki67抗体を用いた.種々の条件で検討し,最終的には培養細胞による陽性コントロールの作成方法を決定した.濃度コントロールは反応性ミクロハイドロゲルに目的のタンパク質を含有させて作成し良好な結果を得た.肺癌手術には術中迅速病理診断が必須で、その件数は増加してきている.一方、病理医不足は深刻で増える目途は立っていない.そのため術中迅速病理診断を多用する肺癌手術は危機的状況である.本研究の最終目標は病理医不在でも結果が出る迅速病理検査の確立である.今回申請した研究期間で我々の開発した迅速免疫染色装置を用いて術中に免疫染色し、結果を解析して肺癌の診断ができるか、またHE染色を用いた病理専門医による術中病理診断と同等の結果が得られるかを検討することを目的として本研究を提案した.将来の自動化を見据えた場合には免疫組織染色で陽性・院生であることを客観的に評価するための指標が必要であると判断した.陽性コントロールには2種類ある.一つは染まるべきものが正しく染まっているかを見る形態コントロールで、もう一つは染色濃度を見る濃度コントロールである.培養細胞を用いて形態コントロールを作成して検討した.また濃度コントロールを高分子ゲル・反応性ミクロハイドロゲルにより作成した.培養細胞として肺癌細胞と悪性リンパ腫を用いた.免疫染色は最も使用頻度が高い抗サイトケラチン抗体、抗K67抗体を用いた.平成24年度には両コントロールは完成したと判断したが、問題があり、この改良研究を進めた.1.培養細胞を用いた陽性コントロールは保存時間が長くなると抗原性が低下して安定性に問題があることが判明した.この点を改善するために細胞の固定法を変更することにより解決した.高分子ゲルを用いた陽性コントロールは顕微鏡下で観察した時の粒子径に問題があり、作成方法を検討することで顕微鏡下に観察可能なサイズを作成することが可能となった.外科学本年度は保存してある肺腫瘍組織を用いて多数の抗体により免疫組織染色を行い,病理専門医がHE染色を用いて診断した結果を基準にして,免疫組織染色を用いた細胞機能的癌診断法を確立することを計画した.しかし免疫組織染色の判定は病理医でさえ主観的で曖昧であった.将来の自動化を見据えた場合に陽性・陰性であることを客観的に評価するための指標が必要と判断した.そのため本年度は陽性・陰性コントロールを作成することに専念した.

今後は作製した陽性・陰性コントロールを用いて免疫組織染色の染色程度を客観的に評価する.そして保存してある肺腫瘍組織を用いて多数の抗体により免疫組織染色を行い,病理専門医がHE染色を用いて診断した結果を客観的評価基準にあわせて免疫組織染色を用いた細胞機能的癌診断法を確立したい.今回は免疫組織染色の陽性・陰性コントロールの作成に専念したので本年度に予定していた大量の免疫組織染色を行わなかった.そのため免疫組織染色で支出予定の消耗品費が予定より少なかった.次年度に本年度行えなかった免疫組織染色を行うため,次年度使用額が増えた.次年度(平成26年度)は平成25年度に計画していた「保存してある肺腫瘍組織の免疫組織染色」と平成26年度に計画していた「手術で得られた肺腫瘍組織を我々が開発した迅速免疫染色装置を用いて免疫染色をして診断する方法に関する実験」を続けて行うため,当初の計画より免疫組織染色を大量に行う必要がある.そのため,免疫組織染色の消耗品費を次年度使用額と平成26年度支出予定額を合わせて支出する予定である.
日本社会における移民宗教の受容プロセスへのジェンダーの影響の解明

グローバル化の進展とともに多文化共生の考え方が広まり、滞日移民とその宗教がいかに地域社会に包摂されうるかが課題となっている。一方で、宗教におけるジェンダー不平等性が存在し、女性は抑圧され周辺化されてきた。本研究では、移民宗教と日本の地域社会の相互作用の中にジェンダー不平等性があるのかを追究することを主眼とする。日本における移民宗教のジェンダー階層性と地域コミットメントの関係性の解明を目指し、日本国内でインタビュー調査をおこなう。日本における移民女性の地域参加モデルを示すことで、グローバル化が進む日本社会への寄与を目指す。
マイクロ波レ-ダによる積雪構造および雪質計測の研究

FM-CWレ-ダは媒質中の境界面からの反射を検出し、媒質内部のプロファイルが得られる特徴がある。我々は、マイクロ波周波数を使って、雪質が計測でき、野外の長期観測に適したFM-CWレ-ダシステムの開発を行った。我々のシステムでは、マイクロ波の周波数は6から12GHzを10msの速さで掃引した。積雪表面に放射されたマイクロ波は、内部の様々な境界面で反射され、受信信号の周波数は観測現場でスペクトラムアナライザのモニタ-に表示された。同時に、時間領域の信号はCPUに送られ、処理・記憶された。そして、時間領域の受信信号は周波数領域の信号に変換された。雪中の境界面に対応する周波数を使って、誘電率、密度、相当水量などが算出された。積雪内部の構造の変化は、システムによって得られた一連のデ-タを使って作られ、CRT上に映像として表示された。また、1)融雪2)乾雪3)氷板4)積雪層の形成過程についての画像の解釈を行った。日本で最初の地球観測衛星MOS-1が1987年に打ち上げられた。1989年、MOS-1航空機検証計画に同期して、札幌のグランドトル-スデ-タを取得する目的で、我々のFM-CWシステムを使った積雪の物理量の計測が行われた。FM-CWレ-ダシステムは、雪質や積雪構造を遠隔計測するのに有効であるとともに、MOS-1のような、軌道衛星に搭載されたパッシブマイクロ波センサによって得られた積雪量を評価する際にも有用である。1.積雪観測レーダの作製:厳冬期の野外に持出し可能で,積雪内部からの反射を周波数スペクトラムとして表示・記録できるマイクロ波レーダを作製した. 612GHzを10msで掃引するFM-CW方式を採用することによって,積雪内部の境界面を検出するのに必要な距離分解能が達成できた.今後,より手軽に運べるシステムに改良したり,分解能をさらに向上させるためにシステム内部の不整合を極力減じ,信号処理の方法を改善することを計画している.2.室内実験:冬期野外実験の基礎資料を得るため,数種類の誘電体材料を用いて積層模型を作り,内部の境界面と散乱反射波の周波数成分の相関を測定した.また,同じ模型に水を含侵させて,止水面の位置と周波数成分および含水量とスペクトラム強度の相関を測定した.さらに低温室で規格化した雪粒を用いて,融解,凍結の過程で同様な測定を行った.これらの実験の結果を考察し,内部の境界面や止水面の位置を精度良く求めたり,誘電率を計測する方法について検討を加えた.3.野外実験:乾雪期や融雪期に,本研究機関の露場,近郊の平野部あるいは北海道北部で,自然積雪をマイクロ波レーダを使って測定して取得したデータを室内実験の結果を参照して分析した.乾雪期には積雪内部の層構造を明瞭に表示でき,この構造は気温の変化にはほとんど影響されないことがわかった.データを分析して求めた積雪の比誘電率から密度や積雪水量を推定できることがわかった.融雪期のデータを分析した結果は,気温や雪温の変動に伴う積雪中の水分の増減が,積雪の内部構造や融電率に大きな影響を及ぼすことを明らかにした.1.測定システムの改良積雪の構造や雪質を計測するために、FMーCW方式のマイクロ波レーダを開発し、室内実験や野外実験を実施してきた。これらの結果を参照して、測定システムの改良を行った。長期の積雪観測を行うためには、自然環境の激変に左右されないシステム構成が必要である。このため、観測現場では積雪内部の不連続面を周波数領域信号としてリアルタイムで表示し、同時に、遠方に設置されたデータ記録・処理用コンピュータに時間領域信号で伝送し、この信号に様々な前処理を施した後、周波数領域の信号に変換する方式に改めた。この結果、積雪の長期観測が可能になり、分解能やSN比も改善された。

2.積雪の内部構造の画像化FMーCWレーダシステムによって得られたデータに何のような処理を施せば、積雪の内部構造の画像化あるいは可視化が可能であるかを検討した。可視化の手法として、周波数スペクトラムの形で得られたデータを画素の濃淡で表現する方法と、スペクトラムのピーク値を検出して時系列に並べる方法を開発した。3.実験結果の解析昭和63年の1月から3月にかけて、改良システムを用いて、48日間の長期積雪観測を実施した。この実験で得られたデータに上記の可視化手法を施し、積雪内部の層構造の季節変化を表わす画像を作成した。これらの画像は、積雪内部における境界面の履歴、乾雪と湿雪の層構造の差違、新雪が降り積り、圧密や変態により次第に層を形成する様子などを明隙に表現した。昭和63年12月からは、4か月以上にわたる長期観測が継続されており、得られたデータは次年度に解析される予定である.平成元年度は、本研究の最終年度に当たるので以下の項目を重点に研究を進めてきた。1.前年度までの実験観測の補足これまでの実験では、48日間の積雪観測が最長であった。マイクロ波による積雪構造および雪質計測システムの改良をおこない、天候の激変に影響されない安定なシステムに改めた。この結果、積雪の発生から消滅まで4か月の長期にわたり自然積雪の計測を続けることができるようになった。2.得られた資料の整理、理論解析計測システムの小型化と雑音の低減について検討した。システムの小型化については試作を行い、野外実験で改良のための基礎資料を得ることができた。雑音の低減は、予めシステムの内部雑音を電波暗室で測定しておき、これを野外観測デ-タから差し引くことで可能になった。つぎに、積雪層の形成過程を可視化する方法について検討した。その結果、積雪構造の履歴を追跡できる手法と、雪質の変化を明瞭に表す手法の二つを開発することができた。さらに、本研究の成果を広域の水資源の予測に役立てる方法について検討した。本計測システムで得られた積雪構造と雪質の資料をグランドトル-スとして用いると、MOS-1に搭載されたMSRデ-タから広域の積雪量が推定できることがわかった。3.研究成果の公表これまでの成果を、国際会議などで公表した。平成2年5月には、米国で開催されるURSI-FおよびIGARSSの国際会議でも公表を予定している。また、本研究の成果報告の小冊子を印刷・製本した。
事業法と競争法の協働に関する研究

本研究課題では、欧州情報通信分野への事前規制としての事業法規制の中に競争法的思考の存在意義を示した。情報通信産業を規制から競争的環境へ移行させるため、常に競争法的観点からの分析を行うということで上記移行に係る法規制の断絶を回避することが可能となったと評される。もっとも、詳細な競争法理論を用いた規制は、規制当局側の規制コストの増大、事業者側に対する法の過剰規制が問題として明らかとなった。結果、法運用コストの観点から事業法と競争法の関係を検討する必要性が生じた。本年度では、競争法と事業法という2つの法の関係を明らかにするため、それぞれの法体系における企業結合事例を素材にして整理した。具体的には、米国の情報通信領域における単一の企業結合事例に対して、複数の当局(競争当局である「DOJ」、「FTC」、規制当局である「FCC」)が、それぞれの所管する法の解釈運用の際に生じる多元性の実態を明らかにする作業を行った。米国の競争当局と規制当局による企業結合規制の多元性を分析することは、日本の独禁法と事業法、公取委と総務省の関係を再考するという意義があると考えられる。米国の企業結合に対する法執行の多元性は、訴訟手続等において特に当事事業者に審理の重複という多大な負担をかけることになるとの予想は難くない。これを解決するために訴訟前後の関係当局間の協力関係は重要である。しかしながら、米国の事例を整理することで、競争法に基づく訴訟の場では特に競争当局に対して、従来規制当局が考慮する企業結合における公益性等の競争概念以外の証明等負担が生じる可能性が高く、結果、法執行の多元性に係る審理の重複は回避できず、また、競争法解釈に競争概念以外の表現の多様性などを含めるか否かという論点も惹起することになりうる。それでもなお、企業結合法制度においては、競争法が担うべき役割が大きいことはこれまでの事例から疑うことはできないと言える。本年度における米国の事例整理からは、競争法と事業法の協働を考える上で両法の役割分担の必要性が求められており、その制度設計が両法に整合的な法解釈を提供するものでなければならない点が改めて確認された。特に、これまでに企業結合の事例において総務省と公取委との間における手続的な相互関与の場はなかった点は見直す必要があるとも言える。本研究課題では、特に、欧州における情報通信分野に対する法規制の枠組みを素材にして、競争法的視点から当該法規制を考察した。それは、2002年に採用された欧州の情報通信分野に対する事業法による事前の規制には、競争法的思考形式を背景とする規制体系が組み込まれていることが特徴的と評されているからである。欧州では、特定の情報通信に関する市場を事前に画定し、画定された市場において事前の規制を行うか否かについて、競争法上の市場画定理論、市場支配力分析、競争法上の問題を解消する措置を一体化させたSMP(Significant Market Power)分析を導入している。さらに、欧州レベルにおいて加盟国間の当該分析枠組みの齟齬が生じないように欧州委員会が欧州統一ルールを作成し、加盟国がこれを国内法制化するという法規制枠組みの執行体系も用意されている.本研究課題では、欧州における競争法的思考に基づく事前規制を素材として、情報通信分野に対する事前規制としての事業法規制の中に競争法的思考の存在を示すことで、競争法と事業法の関係を考察した。もっとも、加盟国間の市場構造や競争の程度の違いは規制枠組みの統一的運用に大きな障害を生じさせ、規制当局側の規制コストを増大させており、また、事業者側には法の過剰規制問題も指摘されている。結果、法運用コストの観点から事業法と競争法の関係を捉えなおすという必要性が新たな検討課題として明らかとなった。
ヒト神経障害性疼痛に神経炎症はあるのか？-in vivo神経イメージングでの検討

下歯槽神経の神経障害性疼痛に神経炎症を認めうるのかを明らかにするために、1.5テスラの臨床MRI装置を使用して、新たな神経選択的な3次元高分解能画像の開発、表面コイルの使用による下歯槽神経の描出、MRアンギオグラフィーの下歯槽神経血管束への応用に関する検討を行った。その結果、下歯槽神経の良好な描出が可能となり、ヒトで非侵襲的に下歯槽神経損傷による神経障害性疼痛と神経炎症との関連を検証できる基盤が確立されつつあると考えられるが、今後も更なる検討が必要である。以前より所属分野と新潟大学統合脳機能研究センターと共同で高磁場MRI(3テスラ)による神経選択的な3次元高分解能画像を開発し、三叉神経領域の末梢神経の描出を可能にしていた。本研究では、臨床MRI装置(1.5テスラ)に同手法を応用するため、まず初めに正常被験者による撮像パラメータの最適化を行った。その結果、高磁場MRIと同程度の分解能で三叉神経領域の末梢神経の描出が可能となった。また、T2強調の高分解能3次元画像は口腔顔面領域ではアーチファクトが強く、今まで用いることができなかったが、近年アーチファクトに強いパルスシークエンス(Cube)が開発された。本研究では、このパルスシークエンスを末梢神経の描出に応用することを目的に正常被験者による撮像パラメータの最適化を行った。その結果、良好な末梢神経の描出が可能となった。神経障害性疼痛と神経炎症の関連は急性期動物実験から推測されていたが、実際にヒトによる検証は困難であった。しかし、T2強調の神経選択的な3次元高分解能画像の開発により、ヒトの三叉神経領域の末梢神経で神経炎症をみることを可能にする強力なツールとなり得ること、そしてそれを応用して、ヒトで非侵襲的に神経障害性疼痛と神経炎症の関連を検証できる可能性があることが示唆された。昨年度は以前より所属分野と新潟大学統合脳機能研究センターとの共同で開発した高磁場MRI装置(3テスラ)による神経選択的3次元高分解能画像により可能となった三叉神経領域の末梢神経の描出を臨床MRI装置(1.5テスラ)でも可能にするため、正常被験者による撮像パラメータの最適化を行った。その結果、3テスラのMRI装置と同程度の分解能で三叉神経領域の末梢神経の描出が可能となった。本年度は口腔顔面領域の神経損傷では最も頻度の高い下歯槽神経に着目し、下歯槽神経の微細な画像の精密かつ明確な描出のため、通常は頭頚部コイルで行っていた撮像を表面コイルを使用して撮像を行った。表面コイルを使用することで体表表面付近からの信号を効率よく検出し、感度が高くなり分解能が向上する。下顎孔からオトガイ孔までの下歯槽神経が描出できるような位置に表面コイルを皮膚に接触させ、ずれないようにテープで固定した状態で撮像した。その結果、頭頚部コイルを使用した画像と比較して表面コイルを使用した画像の方がより高い分解能で下歯槽神経を描出することが可能であった。これは昨年度に撮像パラメータの最適化を行ったT2強調画像の神経選択的3次元高分解能画像でも同様な結果が得られた。この結果から、下歯槽神経の微細な画像の描出が可能となり、その画像を利用して精密な画像解析を行うことができることが示唆された。さらにその画像解析によって、今後ヒトで非侵襲的に下歯槽神経損傷による神経障害性疼痛と神経炎症との関連が検証できる可能性があることが示唆された。以前より所属分野と新潟大学統合脳機能研究センターとの共同で開発した高磁場MRI装置(3.0テスラ)による神経選択的3次元高分解能画像により可能となった三叉神経領域の末梢神経の描出を臨床MRI装置(1.5テスラ)を使用しても可能にするために、また特に口腔顔面領域の神経損傷では最も頻度の高い下歯槽神経の微細な画像の精密かつ明確な描出を実現するために、正常被験者による撮像パラメータの最適化および表面コイルを使用した撮像を行った。その結果、臨床MRI装置を使用しても高磁場MRI装置と同程度の分解能で下歯槽神経を描出することが可能となった。また、口腔顔面領域ではアーチファクトが強く、今まで使用することができなかったT2強調の高分解能3次元画像であったが、近年アーチファクトに強いパルスシークエンスが開発されたことから、このパルスシークエンスを下歯槽神経の描出に応用するために、正常被験者による撮像パラメータの最適化および表面コイルを使用した撮像を行った。その結果、良好な下歯槽神経の描出が可能となり、T2強調の神経選択的3次元高分解能画像が使用可能となった。本年度は造影剤を使用せずに血流の可視化を行う手法であるMRアンギオグラフィー(MRA)を下歯槽神経血管束に応用することを目的に、臨床MRI装置および表面コイルを使用して正常被験者による撮像パラメータの最適化を行った。パルスシークエンスは頭頚部領域のMRAで頻繁に用いられている3D-TOF(time of flight)を使用した。その結果、下歯槽神経に伴走する血管と考えられる高信号領域が認められた。この結果から、下歯槽神経血管束の微細な画像の描出が可能となったことが示唆された。