hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
女性骨盤底機能障害の解剖学的および機能的研究

骨盤底弛緩を有する女性27名を対象に,骨盤MRI T2強調,矢状断(正中より左右に3cm),横断像(膀胱頚部を中心に上下5cm)を安静時と怒責時の2回撮像した.画像はすべてデジタルデータ(DICOM形式)とし,各個人の問診による情報,および鎖膀胱尿道造影をはじめとする各種客観的所見とともにパソコン上に保存した。MRI画像データは他の所見をすべて隠した状態で,画像解析ソフトを用いて解析した.すなわち,肛門挙筋の体積(LA-V),肛門挙筋裂孔面積(LA-A)の算出や,肛門挙筋の左右差の有無,障害部位があればその場所と程度などを記録した.なお,QOL評価としてKHQ(キング健康調査票)の日本語版の質問と,既往歴等についての問診(とくに骨盤内手術の有無と出産歴については詳細に)を行った。コントロールのボランティアには,同意の得られた女性に対し,骨盤底弛緩のある女性に行った条件とまったく同様の条件でMRIを施行した。(2)筋力測定用経膣プローベによる女性骨盤底の機能的評価[評価の実際]経膣プローブの構造は,円柱形(直径2cm×長さ30cm)の金属の駆体先端に,細長い板ばねになった接触圧-変位計のセンサーが90度間隔に4本取り付けられている.これらセンサーは金属の駆体内に出し入れが可能で,外に出すと外周が大きくなる構造となっている.プローブ全体にコンドームをかぶせ膣内に挿入し計測する.被検者の体位は砕石位とし,計測は膣内の3つの高さ(a;腔円蓋部,b;LAが膣に接する部,c;aとbの中間)にセンサーがくるようにプローベを保持し,それぞれの高さで,i.23秒間の随意的骨盤底筋の収縮(VPFMC)と,ii.35回の咳嗽を命じて反射性に誘発させる骨盤底筋収縮(CPFMC)の2種類の筋収縮力を評価した.(3)まとめ上記(1),(2)より,本年度は以下の検討結果を得た。閉経女性では加齢に伴い恥骨-尾骨筋体積が減少する.しかし,骨盤内臓器下垂のない正常骨盤底を有する女性では,肛門挙筋裂孔の面積は変化せずほぼ一定であった.恥骨-尾骨筋の体積を肛門挙筋裂孔面積で除したLA-V/LA-Aは,骨盤底のLaxityのよい指標となる可能性があると思われた.(1)MRIによる女性骨盤底の解剖学的評価[評価の実際]骨盤底弛緩を有する女性27名を対象に,骨盤MRI T2強調,矢状断(正中より左右に3cm),横断像(膀胱頚部を中心に上下5cm)を安静時と怒責時の2回撮像した.画像はすべてデジタルデータ(DICOM形式)とし,各個人の問診による情報,および鎖膀胱尿道造影をはじめとする各種客観的所見とともにパソコン上に保存した。MRI画像データは他の所見をすべて隠した状態で,画像解析ソフトを用いて解析した.すなわち,肛門挙筋の体積(LA-V),肛門挙筋裂孔面積(LA-A)の算出や,肛門挙筋の左右差の有無障害部位があればその場所と程度などを記録した.なお,QOL評価としてKHQ(キング健康調査票)の日本語版の質問と,既往歴等についての問診(とくに骨盤内手術の有無と出産歴については詳細に)を行った。(2)筋力測定用経膣プローベによる女性骨盤底の機能的評価[評価の実際]経膣プローブの構造は,円柱形(直径2cm×長さ30cm)の金属の駆体先端に,細長い板ばねになった接触圧-変位計のセンサーが90度間隔に4本取り付けられている.これらセンサーは金属の駆体内に出し入れが可能で,外に出すと外周が大きくなる構造となっている.プローブ全体にコンドームをかぶせ膣内に挿入し計測する.被検者の体位は砕石位とし,計測は膣内の3つの高さ(a;腔円蓋部,b ; LAが膣に接する部,c ; aとbの中間)にセンサーがくるようにプローベを保持し,それぞれの高さで,i.23秒間の随意的骨盤底筋の収縮(VPFMC)と,ii.35回の咳嗽を命じて反射性に誘発させる骨盤底筋収縮(CPFMC)の2種類の筋収縮力を評価した.(3)まとめ上記
光重合を利用した新たな分子配向技術の構築と光学機能フィルムの創製

本研究は,二次元分子配向パターンの一段階形成が可能となる新規な分子配向技術「動的光重合法」の開発および新規光学機能フィルムの創製を目標としている。これまでも,光学機能フィルムの創製を目指し,有機合成的アプローチにより多種多様な機能分子が合成されてきた。しかしながら,材料の機能化において重要な分子配向の開発は黎明期にあり,自在かつ微細な二次元分子配向を大面積でパターン化することは困難であった。そこで本年度は,新たに見出した分子拡散に基づく分子配向を利用して,多彩な分子配向制御による光学機能材料の創製について検討した。はじめに,表面処理などを一切施さない基板を用いて,フォトマスクを介して光重合を施したところ,光照射領域境界において分子が拡散し,拡散方向と平行に分子が配向した。この知見に基づき,フォトマスクの空間形状を設計したところ,一次元および二次元の分子配向制御に成功した。放射状の分子配向に関しては2マイクロメートルまで微細化でき,従来の光配向法と比較して,1/100,000ほどの解像度であった。さらに,適用できる化学種(分子骨格や重合反応の種類)の制限が極めて少ないことがわかった。ついで,重合過程において光を動かすことにより,光移動に追随する形で分子配向が大面積化できた。マスクを利用せずに多彩な光学パターンが照射可能な新たな光重合装置を用いたところ,照射光パターンに応じて微細な二次元分子配向パターン(放射状や同心円,面内らせん配向また文字に沿った複雑な分子配向)が一段階で大面積に形成できた。作製したフィルムの光機能を評価したところ,従来技術では発現困難な特異な偏光変換や光回折機能を有することが明らかとなった。本研究で開発した動的光重合法は,重合可能な材料系や基板の選択肢が極めて広く,多彩な配向パターンを付与できるため,様々な機能性ソフトマテリアル創製の基盤技術となり得る。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
自己免疫性糖尿病発症に与える、神経性制御に関する研究

(1)NODマウスに対する神経性制御神経内分泌物質の投与条件の設定CGRP、Glucocorticoidは、いずれも発症を遅らせ、l-Enkephalin,DHEAは、発症を促進する。免疫系の検討(2)BBラットに関する神経性制御脳の定位固定法により、膵島炎の起こさない条件を検討したが、完全に起こさない条件はなかった。腹内側核の破壊は悪化、外側核の破壊は改善の傾向を示した。
脂質メディエーター受容体を標的とした創薬基盤

Gタンパク質共役型受容体の一種であるリゾホスファチジン酸第四受容体(LPA4)のノックアウトマウスの解析により、申請者はLPA4が2型糖尿病の増悪化と密接に関連していることを以前より明らかにしていた。本研究では白色脂肪細胞においてLPA4がRhoとRhoキナーゼ系を介してミトコンドリア増生抑制シグナルを送り、脂肪細胞の分化を抑制する働きを明らかにした。このLPA4の働きをアンタゴニストの開発によって制御できれば、脂肪細胞の分化を促進して2型糖尿病の治療に役立つと期待される。そこで本研究では化合物ライブラリーからLPA4アンタゴニストのスクリーニングも行った。1特異的アンタゴニストの探索生来LPAに反応しないB103ラット神経芽腫細胞にヒトLPA4を安定発現させた株を使って、アンタゴニスト活性を持つ化合物をスクリーニングするに当たっての実験条件を決定した。すなわち、アンタゴニスト活性の指標は、LPA4の活性化に伴って惹起される細胞内カルシウム流入反応の阻害とした。このアッセイを行うための条件について検討・最適化を施した項目は、実験前日に播く細胞数、血清飢餓の有無、ロードするカルシウムプローブの種類、ロードの温度と時間、ロード後のバッファー置換の有無、カルシウム反応を惹起するLPAの濃度、等である。2糖尿病以外のLPA4関連疾患の探索と発症機構の解明血管新生を伴う疾患モデルとして、網膜内血管新生・移植ガンの腫瘍形成の程度をLPA4-KOマウスと野生型マウスの間で比較した。(1)網膜血管新生:生後7日目(P7)マウスを高酸素条件下(75%o 2)でP12まで飼育し、その後大気圧条件下(21%o 2)に戻してP17まで飼育した。摘出した眼球より網膜の固定標本を作製した。病的な血管新生領域は、網膜中心部の無血管領域の出現とともに期待通り確認できた。しかし、新生児網膜で観察される病態が一腹毎に大きくばらつくことが明らかになり、このばらつきを抑えるため今後は同腹仔の野生型とKOマウスで比較することとした。(2)腫瘍形成:マウス肺癌由来のLewis Lung Carcinoma(LLC)細胞をマウスの皮下に注射し、腫瘍を形成させた。皮下に現れた腫瘍の大きさを体外からノギスで経時的に計測したが、野生型とKOマウスとの問で有意差は認められなかった。1特異的アンタゴニストの探索生来LPAに反応しないB103ラット神経芽腫細胞にヒトLPA4を安定発現させた株を使って、アンタゴニスト活性を持つ化合物をスクリーニングした。化合物は東京大学創薬オープンイベーションセンター保有の化合物ライブラリーを利用した。LPA4-Gq経路による細胞内カルシウム濃度上昇反応への阻害効果を指標とした評価を用いて、約1万種類の化合物の中からアンタゴニストとして有望な化合物を複数個得ることができた。引き続き東京大学創薬オープンイベーションセンターと協力して、合成展開によって化合物の構造の最適化を進め、成果を2型糖尿病治療薬の創薬に役立ていく予定である。2 LPA4の細胞内シグナルの解析LPA4-WTマウスとLPA4-KOマウスの内臓脂肪組織由来のRNAを用いてマイクロアレイ解析を行ったところ、ミトコンドリア関連パスウェイが全体的にKOマウスで上昇していることが示された。また、脂肪細胞に分化させたC3H10T1/2細胞をserum starvation後にLPA4のアゴニストであるBrP-LPAで刺激すると、ミトコンドリアバイオジェネシス関連遺伝子の発現が低下する一方、脂肪組織の繊維化に関わる遺伝子の発現が上昇することが観察された。この細胞をsiRNAや阻害剤で処理することにより、BrP-LPAによる上記の遺伝子発現変化が三量体Gタンパク質G12/13、G12/13によって活性化される低分子量Gタンパク質Rho、そしてRhoによって活性化されるRhoキナーゼを介していることが示された。LPA4-KOマウスではミトコンドリアのバイオジェネシスが亢進することで脂肪細胞の分化が進むとともに、脂肪組織の繊維化が抑制されることも相まって、高脂肪食餌下での炎症が抑制されるのであろう。リゾホスファチジン酸(LPA)の第四受容体(LPA4)の細胞内シグナルによる脂肪細胞分化抑制機構の解明が本研究の目的である。in vitroで脂肪細胞へ分化させることができるマウス由来の胎児線維芽細胞(MEF)またはマウス3T3L1繊維芽細胞において高いレベルで発現するLPA4を選択的に活性化し、脂肪細胞分化に関わるシグナルへの影響をまず観察した。LPA受容体は6種類存在するが、本研究においてLPA4を特異的に活性化できるアゴニストを同定することができた。

そこで、このアゴニストでMEFのLPA4を選択的に刺激して、以下のin vitro解析を行った。3. Wnt/β-カテニン経路(Yang et al., PNAS [2005])にLPA4刺激が影響するかを検討したが、影響は認められなかった。一方、in vivoの研究では網膜血管新生におけるLPA4の影響をLPA4-KOマウスを使って観察した。生後7日目(P7)マウスを高酸素条件下(75% O2)でP12まで飼育し、その後大気圧条件下(21% O2)に戻してP17まで飼育した。摘出した眼球より作製した網膜の固定標本において、期待通り病的な血管新生領域が網膜中心部の無血管領域とともに確認できた。しかし、同腹仔の野生型とKOマウスで比較したところ両者に明らかな違いは認められなかった。実験系の確立は順調であり、研究課題の達成に支障を来す問題は生じていない。今年度以降は、実験を繰り返し、論文発表に向けてデータを蓄積する予定である。25年度が最終年度であるため、記入しない。引き続き、LPA4受容体について特異的アンタゴニストの探索及び病態生理学的意義の解明を、研究計画通りに研究を推進する。LPA4特異的アンタゴニストの探索とLPA4の細胞内シグナルの解析を引き続き進める。また、倫理委員会の承認が得られたので、妊娠糖尿病におけるLPA産生酵素の関与の検討を平行して行う。
間葉系幹細胞からの顆粒膜細胞の創出と分化メカニズムの解明

卵巣顆粒膜細胞は、卵子を取り巻き、その発達に必要不可欠である。本研究の目的は、幹顆粒膜細胞の分化誘導系を確立して、その分化メカニズムを解明することである。そして、間葉系幹細胞や未分化な顆粒膜細胞に転写因子のSF-1/Ad4BPを含む遺伝子を導入することにより、分化した顆粒膜細胞に非常に似た性質を示す細胞を誘導することができた。これらの分化誘導系を用いることにより、顆粒膜細胞の分化に関わる因子やヒトに高濃度で存在するアンドロゲンを発見するなどの成果を挙げることができた本研究は、卵巣顆粒膜細胞の分化誘導系を確立し、それを用いて細胞分化の分子メカニズムを解明することを目的とする。そこで、前年度は、幹細胞から顆粒膜細胞の分化誘導系と共に顆粒膜細胞前駆細胞から分化した顆粒膜細胞を誘導する系の確立を試みた。そして、ヒト顆粒膜細胞腫由来で比較的未分化状態の細胞株であるKGN細胞に、アデノウイルスやレトロウイルスを用いて転写因子Steroidogenic factor-1 (SF-1/Ad4BP)遺伝子の導入を行った。すると、SF-1/Ad4BPを導入したKGN細胞では、CYP19A1やAMHといった顆粒膜細胞のマーカー遺伝子の発現が誘導された。また、培地液中のステロイドホルモンを測定したところ、エストラジオールの産生が検出された。よって、未分化な顆粒膜細胞は、SF-1/Ad4BP遺伝子を発現させることにより女性ホルモン(エストラジオール)産生能を有する状態に分化することが分かった。この分化の分子メカニズムを解明するために、分化前後に発現が変化する遺伝子の網羅的な探索を行った。そこで、GFP遺伝子とSF-1/Ad4BP遺伝子を導入したKGN細胞から、それぞれ抽出したmRNAを用いることにより、DNAマイクロアレイを行った。すると、ステロイドホルモン産生酵素を含む機知のSF-1/Ad4BPの標的遺伝子に加えて、転写因子や成長因子、サイトカインを含む非常に多くの遺伝子が分化前後に発現が大きく変動することが分かった。ヒト顆粒膜細胞の新たな分化誘導モデルを作製し、これを用いて分化メカニズムの解析を行い、分化に重要な候補遺伝子や顆粒膜細胞の新たな機能に関わることが期待される多くの遺伝子を同定したことから、研究は順調に進行していると考えられる。前年度までに構築化したKGN細胞に転写因子SF-1/Ad4BPを導入し、cAMP処理することにより成熟顆粒膜細胞を分化誘導する系を用いて、CYP19A1遺伝子の転写メカニズムに関する研究を行った。CYP19A1は、KGN細胞において低レベルでしか発現していないものの分化により強力に発現が誘導される。この機構を調べるために、CYP19A1遺伝子の5'上流域を含んだルシフェラーゼベクターを用いたレポーターアッセイを行ったところ、CYP19A1遺伝子のプロモーター活性には、これまで同定されている転写開始点-130bp付近に存在するSF-1/Ad4BP結合サイトに加えて、-250bp付近と-200bp付近に存在する計3ヶ所の転写因子結合配列が重要であることが分かった。さらに、分化前には、これらの領域への転写活性化因子の結合は、転写抑制因子が結合することにより阻害されていることも明らかになった。よって、CYP19A1遺伝子は、分化前後に、プロモーター領域中に結合する転写因子が入れ替わることにより、転写が調節されていることが明らかとなった。さらに、顆粒膜細胞は、LH刺激によって黄体化することに伴いCYP19A1の発現は低下するが、この時は、再びプロモーター領域に結合していた転写活性化因子が外れて、転写抑制因子が結合する可能性も強く示唆された。また、CYP19A1に加えて、DNAマイクロアレイにより同定された分化に伴い発現が誘導される遺伝子群についても、転写メカニズムの解析を行い新たにSF-1/Ad4BPの標的遺伝子を同定した。KGN細胞において、新たに構築した顆粒膜細胞の分化系を用いて、CYP19A1(アロマターゼ)遺伝子の転写制御メカニズムの詳細を明らかにすることができた。CYP19A1は、エストロゲン産生に関わる顆粒膜細胞の機能や分化に必須な遺伝子であることから、研究は比較的順調に進展していると言える。今年度は、これまでに確立した未分化顆粒膜細胞から分化した顆粒膜細胞を誘導する系、さらには分化した顆粒膜細胞から黄体化顆粒膜細胞を誘導する系を利用して顆粒膜細胞の分化メカニズムを調べる実験を行った。未分化な顆粒細胞、分化した顆粒膜細胞、黄体化顆粒膜細胞モデル由来の細胞を用いたDNAマイクロアレイにより遺伝子の発現変化を網羅的に調べたところ、一酸化窒素合成酵素のうち誘導型の酵素であるiNOSは、分化モデル系において、顆粒膜細胞への分化後に発現レベルが低下することが分かった。一方、内皮性の一酸化窒素合成酵素であるeNOSは、顆粒膜細胞が黄体化するにあたって上昇することが分かった。この一酸化窒素合成酵素の発現は、顆粒膜細胞の重要な分化マーカーであり、エストロゲン産生に必要不可欠なCYP19A1の発現と対照的なパターンであった。そこで、ラットの卵巣におけるiNOSの発現を調べたところ、未分化な顆粒膜細胞に発現が高いものの、CYP19A1が発現する時期になると発現が著しく低下していた。初代培養の未分化な顆粒膜細胞は、FSHによってCYP19A1の発現が上昇するが、iNOSは反対にFSHにより発現が低下した。

さらに、一酸化窒素の生成剤を未分化な初代培養の顆粒膜細胞に添加したところFSHによるCYP19A1の発現上昇は、強く抑制された。以上の結果より、iNOSは一酸化窒素の産生を介してCYP19A1の発現を抑制し、顆粒膜細胞の分化を抑制していることが明らかとなった。卵巣顆粒膜細胞は、卵子を取り巻き、その発達に必要不可欠である。本研究の目的は、幹顆粒膜細胞の分化誘導系を確立して、その分化メカニズムを解明することである。そして、間葉系幹細胞や未分化な顆粒膜細胞に転写因子のSF-1/Ad4BPを含む遺伝子を導入することにより、分化した顆粒膜細胞に非常に似た性質を示す細胞を誘導することができた。これらの分化誘導系を用いることにより、顆粒膜細胞の分化に関わる因子やヒトに高濃度で存在するアンドロゲンを発見するなどの成果を挙げることができた今年度は、前年度にKGN細胞の分化系を用いたDNAマイクロアレイで分化前後に発現の変化が認められた遺伝子が、顆粒膜細胞分化や顆粒膜細胞の機能において果たす役割を調べる。そこで、候補遺伝子をアデノウイルスやプラスミドによる過剰発現やsiRNAによるノックダウンを行い、顆粒膜細胞のマーカー遺伝子の発現やステロイドホルモンの産生量を測定する。効果が認められた遺伝子については、ヒト卵巣や顆粒膜細胞の検体を用いて、in vivoにおける発現や機能の詳細を調べる。さらに、幹細胞や他の未分化細胞から、新たな顆粒膜細胞を分化誘導する系を新たに確立する。新たな分化系が確立された場合、DNAマイクロアレイや次世代シーケンサーを用いることにより、顆粒膜細胞の分化や機能に関わる遺伝子を、さらに探索し、機能解析を行う。引き続き、DNAマイクロアレイにより同定された分化に伴い発現が誘導される遺伝子群について、ルシフェラーゼベクターを用いたレポーターアッセイにより転写メカニズムの解析を行うと共に、これらの遺伝子群をsiRNAによりノックダウンして、顆粒膜細胞分化における役割を調べる。さらに、新たな顆粒膜細胞分化誘導系を構築するために、様々な間葉系幹細胞にSF-1/Ad4BPや他の遺伝子の導入を行う。エストロゲンの産生やマーカー遺伝子の発現により、顆粒膜細胞様に分化することが分かった細胞については、DNAマイクロアレイを行い分化に重要な候補遺伝子群を新たに同定する。生殖内分泌最終年度は、これまでの成果の多くを論文にするので、その投稿料や掲載料が必要となることから一部繰越しをすることにした。論文掲載料(一部) 53,295円
エポキシ基を含むビニルポリマーの合成と応用

1.水酸基含有スチレン誘導体とエピクロルヒドリンの相間移動触媒反応により,一段階で収率良く含エポキシスチレン誘導体を合成することができた.2.エポキシ含有スチレンとスチレンの共重合で得たポリアーは光分解性スルホニウム塩存在下で光照射することにより容易に不溶化する.この不容化はエポキシ基のカチオン重合で進み,その反応性はポリマー主鎖とエポキシ基間ヘスペーサーを導入して距離を増加すると増大した.またエポキシ基にメチル基を導入すると架橋反応性が増加した.3.エポキシ含有スチレンとスチレン,ジビニルベンゼその懸濁共重合により得たゲル型含エポキシビーズとポリエチレングリコールの反応によりジオール構造を有する固定化ポリエチレングリコールを合成した.この固定化グリコールはエポキシ基とポリエチレングリコールが1:1で反応した構造と2:1で反応した構造を含み,エポキシ基含量の少ないビーズやスペーサー型ビーズの場合,前者の1:1構造が多くなった.三相系下での脱離反応に対する触媒活性とエポキシ基含量,スペーサー鎖長,ポリエチレングリコール鎖長の関連を詳細に検討し,高活性の固定化ポリエチレングリコールを得ることができた.4.アクリル酸ブチルと含エポキシスチレンとの共重合によりペンダントエポキシ含有アクリルゴムを合成し,これをエポキシ樹脂の改質剤として用いた.アクリル酸ブチルユニット74%,ビニルベンジルグリシジルエーテルユニット26%からなるアクリルゴムをアミン硬化エポキシ樹脂系に20重量%添加すると,硬化物の破壊じん性値が30%増加した.破断面の観察からアクリルゴムが微粒子としてエポキシマトリックス中に分散したミクロ相分離構造の存在が認められた.1.水酸基含有スチレン誘導体とエピクロルヒドリンの相間移動触媒反応により,一段階で収率良く含エポキシスチレン誘導体を合成することができた.2.エポキシ含有スチレンとスチレンの共重合で得たポリアーは光分解性スルホニウム塩存在下で光照射することにより容易に不溶化する.この不容化はエポキシ基のカチオン重合で進み,その反応性はポリマー主鎖とエポキシ基間ヘスペーサーを導入して距離を増加すると増大した.またエポキシ基にメチル基を導入すると架橋反応性が増加した.3.エポキシ含有スチレンとスチレン,ジビニルベンゼその懸濁共重合により得たゲル型含エポキシビーズとポリエチレングリコールの反応によりジオール構造を有する固定化ポリエチレングリコールを合成した.この固定化グリコールはエポキシ基とポリエチレングリコールが1:1で反応した構造と2:1で反応した構造を含み,エポキシ基含量の少ないビーズやスペーサー型ビーズの場合,前者の1:1構造が多くなった.三相系下での脱離反応に対する触媒活性とエポキシ基含量,スペーサー鎖長,ポリエチレングリコール鎖長の関連を詳細に検討し,高活性の固定化ポリエチレングリコールを得ることができた.4.アクリル酸ブチルと含エポキシスチレンとの共重合によりペンダントエポキシ含有アクリルゴムを合成し,これをエポキシ樹脂の改質剤として用いた.アクリル酸ブチルユニット74%,ビニルベンジルグリシジルエーテルユニット26%からなるアクリルゴムをアミン硬化エポキシ樹脂系に20重量%添加すると,硬化物の破壊じん性値が30%増加した.破断面の観察からアクリルゴムが微粒子としてエポキシマトリックス中に分散したミクロ相分離構造の存在が認められた.今年度の研究で得られた成果は次のようである。1.エポキシ基含有スチレン誘導体は水酸基含有スチレンとエピクロルヒドリンやメチルエピクロルヒドリンを相関移動触媒反応により好収率で得ることができた。2.エポキシ基含有スチレンの単独あるいはスチレンとのラジカル共重合で得たポリマーは光分解性スルホニウム塩存在下で光照射(高圧水銀灯)することにより容易に不溶化することが判った。この不溶化の反応性はポリマー主鎖とエポキシ基間の距離の増加とともに増大した。ペンダントエポキシ基の易動度の増大によると考えられる。また不溶化の反応性はエポキシ基の構造にも依存しており、メチルエピクロルヒドリンからのポリマーの方が高い反応性を示した。これはメチル基の存在でエポキシ基の反応性が増大したことに対応している。3.エポキシ基含有スチレンとスチレン,ジビニルベンゼンのゼラチン/ポリアンモニウム塩を安定剤とした懸濁重合により、ゲル型の含エポキシポリマービーズを得ることができた。このビーズとテトラエチレングリコールをNaH又は酸触媒の存在下で反応させることによりグリコール構造を固定化することができた。この化合物は三相系下での脱離反応の有効な触媒となることが認められた。4.エポキシ基含有スチレンとジビニルベンゼンのポリビニルピロリドンを安定剤,稀釈剤としてメチルペンタノール/オクタン系を用いる懸濁重合により、大きな表面積を有するエポキシ基含有MR型ビーズを得ることができた。次年度はこのMR型ビーズのエポキシ基と種々の化合物の反応を行ない、その生成物の機能について検討する。
血管平滑筋アクトミオシンのCa^<2+>制御,殊にカルモデュリン結合蛋白質を介する機構

血管平滑筋収縮は骨格筋同様に【Ca^(2+)】によって制御されており、この制御機構の解明は各種循環器疾患の病態解明に寄与するものと考えられる。一般に平滑筋収縮のメカニズムの基本はアクチン-ミオシン相互作用にあるが、その【Ca^(2+)】制御機構については不明な点が多い。私たちは既に、砂嚢平滑筋におけるアクチン-ミオシン相互作用が、【Ca^(2+)】-カルモデュリン依存性ミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)によるミオシンの二重リン酸化(ミオシン側制御)と、カルモデュリン-カルデスモン-アクチン間のフリップ・フロップ結合(アクチン側制御)の両側から制御されていることを明らかにした。本年度、血管平滑筋におけるアクチン-ミオシン系【Ca^(2+)】制御機構追究の一環として、牛頸動脈平滑筋から硫安分画・カルモデュリンアフィニティーカラム・イオン交換樹脂HPLCによりカルデスモンおよびMLCKを分離精製し、砂嚢平滑筋の各蛋白質と比較検討した。私たちの開発した精製法は簡便であり、2日間で97%以上の純度をもつカルデスモンとMLCKが得られる。血管平滑筋と砂嚢平滑筋カルデスモンは分子量が少し異なるものの、アクチン結合性はほぼ同じであり、また共通抗原性を持つ。MLCKについては、分子量やアクチン結合定数が異なるが、アクチンへの最大結合量・酵素活性はほぼ等しく、やはり共通抗原性を持っている。培養血管平滑筋ではカルデスモン・MLCKはともにストレス線維に添って分布している。以上のことから、血管平滑筋にも砂嚢平滑筋と同様のアクチン側とミオシン側の両系による収縮制御機構が存在すると考えられる。また、平滑筋収縮におけるトロポミオシンおよびフィラミン(ABP)の役割をin vitro査構成実験により詳細に検討した。カルデスモンはトロポミオシンと共存下において、ABP-アクチン間を効率よく制御していることを明らかにした。
変異H-フェリチントランスジェニックマウスを用いた家族性胃癌の発癌機序の解析

【目的】我々はこれまで、家族性胃癌患者においてFerritin H鎖遺伝子のiron responsive element(IRE)領域に点突然変異(A49T)が認められる家系を複数報告した。本研究では、変異H一フェリチン遺伝子の導入実験及びトランスジェニックマウスを作成することにより、この遺伝子が家族性胃癌の原因遺伝子であるかどうかを検討した。(2)ノックインベクターの作製:マウスBacクローンよりPCR法によりH-ferritin遺伝子を増幅してサブクローニングし、同遺伝子のIRE-loopのsecond baseにA/T変異を導入した。このA/T変異を含むfragment、splice acceptorであるen-2、encephalomyocarditis virus(EMCV)のinternal ribosome-entry site(IRES)、β-galactosidase、β一geo及びSV40のpolyA signalを含むノックイングベクターを作製した。(3)マウスES細胞への遺伝子導入と胚細胞へのインジェクショシ:マウスのES細胞にエレクトロポレーション法によりノックイングベクターを導入し、G418耐性の68クローンを獲得した。これらのクローンよりDNAを抽出し、PCR-RFLP法により15個のノックイン細胞を獲得し、更にシークエンス解析により9個のクローンを確認した。これらのクローンを、ブラストシストにインジェクションしてキメラマウスを作成し、野生型マウスと交配してヘテロマウスを作製した。現在、まだ週齢が若く、これから発癌の有無を検索する予定である。【結論】A49T変異H-ferritin遺伝子の発現により8-OhdGが増加し発癌に関与することが示唆された。マウスH-ferritin遺伝子のノックインベクターをES細胞に導入し、キメラマウス及びヘテロマウスを作製した。現在、これらのマウスを観察し、発癌の有無を調べる予定である。【目的】胃癌の1015%が家族性胃癌とされているが、その原因遺伝子は依然不明である。我々はこれまで、家族性胃癌患者においてフェリチンH鎖遺伝子のiron responsive element(IRE)領域に点突然変異(A49U)が認められる家系を複数報告した。本研究では、変異H-フェリチン遺伝子のトランスジェニックマウスを作成し、この遺伝子が家族性胃癌の原因遺伝子であるかどうかを検討した。【方法と結果】(1)ノックインベクターの作製(2)マウスES細胞への遺伝子導入マウスのES細胞を培養し、エレクトロポレーション法によりノックイングベクターを導入(ノックイン)し、G418耐性の68クローンを獲得した。現在、これらのクローンよりDNAを抽出し、PCR-RFLP及びシークエンス解析により、H-フェリチン遺伝子のノックインされた細胞を選択中である。【結論】マウスH-フェリチン遺伝子のノックインベクターを作製し、ES細胞に導入した。現在、得られたクローンの解析を行っている。これらのクローンよりDNAを抽出し、PCR-RFLP法により15個のノックイン細胞を獲得し、さらにシークエンス解析により9個のクローンを確認した。

現在これらのクローンを用いてキメラマウスを作成中である。【結論】マウスH-フェリチン遺伝子のノックインベクターを作製し、ES細胞に導入した。現在、得られたクローンを用いてキメラマウスの作成を行っている。
ラジカル重合における生長速度定数の再評価

ラジカル重合は、開始、成長、停止および連鎖移動反応からなる連鎖反応機構を基に、既に体系化され、その成長速度定数(kp)も色々な方法が考案されて報告されているが、同じ条件下でし、測定者により大きな差があり、どれが正しい値か明白ではなかった。IUPACでは、その点に注目し、ワーキンググループを発足させ、正しい速度定数の見積りが進められている。パルスレーザーを用いるPulse-laser-Polymerization(PLP)法が測定法の中心となって進められているが、其の方法にも問題点があり、他の方法が平行に行われる事が望まれていた。申請者らは、これまで、ラジカル重合系の電子スピン(ESR)共鳴法を用いた研究を行い、色々なビニルモノマーの生長末端の観測に成功し、末端の構造に新たな情報を提供する事ができた。本研究では、ESR法を用いて、スチレン誘導体、メタクリル酸誘導体のkp値の決定を行い、その再評価をおこなった。メタクリル酸n-ブチルでは、測定温度は-30から90°Cで行い、定常状態を確認後、生長速度定数を決定した。その結果を基に、生長速度定数(kp)に対し、kp=(3.40±0.4)x10^6Exp(22.0±1.0)なる関係がある事を明らかにした。さらに、このデータをPulse-laser-Polymerization法によって得られたデータと比較した処、誤差の範囲て良く一致した。本研究結果は、これまで誤差などで問題となっていたESR法が信頼のできる成長速度定数決定手段になる事を裏付けるものである。この研究成果を踏まえて、これまで測定が困難と言われていた塩化ビニルのESR測定とそれを用いた生長速度定数の決定を行った。その結果,室温で、kp=(5800±140)M^<-1>s^<-1>となった.ラジカル重合は、開始、成長、停止および連鎖移動反応からなる連鎖反応機構を基に、既に体系化され、その成長速度定数(kp)も色々な方法が考案されて報告されているが、同じ条件下でし、測定者により大きな差があり、どれが正しい値か明白ではなかった。その結果,室温で、kp=(5800±140)M^<-1>s^<-1>となった.申請者らは、これまで、ラジカル重合系の電子スピン(ESR)共鳴法を用いた研究を行い、色々なビニルモノマーの生長末端の観測に成功し、末端の構造、電子状態に新たな情報を提供する事ができた。現在、生長速度定数の決定に目を向けた研究を勧めている。今年度は、メタクリル酸n-ブチルおよび塩化ビニルの生長ラジカルの観測と生長速度定数の決定を行った。その結果,室温で、kp=(5800±140)M^<-1>s^<-1>となった。この値を、回転セクター法で決定された値と比較した。次年度には、電子スピン共鳴法の精度や確度を更に深く検討する。スチレン誘導体、メタクリル酸誘導体に注目すると同時に他のモノマーへ対象を広げる。また、メタクリル酸エステルの測定に付属する未解決問題にも挑戦する。

申請者らは、これまで、ラジカル重合系の電子スピン(ESR)共鳴法を用いた研究を行い、色々なビニルモノマーの生長末端の観測に成功し、末端の構造、電子状態に新たな情報を提供する事ができた。現在、生長速度定数の決定に目を向けた研究をている。今年度は、メタクリル酸t-ブチルおよびベンジルの生長ラジカルの観測と生長速度定数の決定を行った。メタクリル酸t-ブチルでは、測定温度は-30から90°Cで行い、定常状態を確認した後、生長速度定数を決定した。その結果を基に、メタクリル酸t-ブチルの生長速度定数(kp)に対し、kp=(3.40±0.4)x10^6Exp(18.0±1.0)なる関係がある事を明らかにした。さらに、このデータをPulse-1aser-Polymerization法によって得られたデータと比較した処、その差は明らかに誤差の範囲を越えていた。分子量分布を調べてみると、メタクリル酸t-ブチルの場合には、低メタクリル酸t-ブチル温重合で得られるポリマーの中には分子量1000以下のオリゴマーが存在していた。オリゴマーのkpは大きいため、低温での速度定数が大きく見積もられ、見かけの活性化エネルギーが下がったものと推定した。一方、低温でもオリゴマーの生成量が少ないメタクリル酸ベンジルの場合には、得られたkp値は、PLP法で得られたkp値と誤差内で一致していた、今年度の研究成果は、ESR法で信頼のできる成長速度定数を得るためには、オリゴマーの生成が無視できる様な条件下での測定が必要であるという筆者の作業仮設を裏付けるものである。その他、生長末端の動的挙動で新たな知見をえた。
内皮細胞フロントライン防衛酵素の機能低下に起因する病態の発症とその分子機構

血管腔区画に相対する血管内皮細胞のゾーンディフェンスラインを形成している活性酸素消去酵素extracellular-superoxide dismutase(EC-SOD)は,血管系で発生する活性酸素を効率よく消去し,血管壁のホメオスタシスの維持に貢献している.また,血管腔内においては血漿中に存在する遊離型と内皮細胞表面に局在する結合型との間で形成される平衡状態を保って存在している.そのため,血管系でのEC-SODの存在様式は酸化ストレスおよびそれに起因する様々な病態を鋭敏に反映していると考えられる.そこで本研究では,動脈硬化症や血栓症の危険因子として注目されているホモシステインや,感染・炎症反応において誘導型NO合成酵素の発現を介して過剰に発生したNOやそれ由来の窒素酸化物が血管系でのEC-SODの生理機能に対しどのような影響を及ぼしているかを明らかにすることを目的とした.その結果,(1)動脈硬化症患者血清中のホモシステイン濃度と血清中EC-SOD濃度との間に有意な相関性が認められた.(2)ヒト大動脈由来内皮細胞(HAEC),ウシ大動脈由来内皮細胞(BAEC)やヘパリンコーティングプレートへのr-EC-SODの結合はホモシステイン処理により有意にかつ濃度依存的に低下した.(3)ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC),BAEC,ヘパリン結合プレートへのr-EC-SOD結合量はNO供与体であるSNAP、NOR4の添加により濃度依存的に有意に低下した.(4)ヒト単球J-774 A-1細胞をLPSにて刺激した場合にNO産生が亢進されたことを確認した後,HUVECを上記のLPS刺激J-774 A-1細胞と共培養した結果,HUVECへのr-EC-SOD結合量は有意に低下した.さらに,NO合成酵素阻害剤であるL-NNAを同時に添加した場合,r-EC-SOD結合量は回復した.以上の結果から,血漿中のホモシステイン濃度の上昇や活性化された好中球等から過剰に発生したNOは内皮細胞表面に局在するヘパラン硫酸プロテオグリカン類の機能低下を招き,血管内皮細胞へのEC-SOD結合量を低下させるため,内皮細胞フロントラインにおいて発生する活性酸素に対する防御能の低下を招いていることが示唆された.最近,動脈硬化等の血管系疾患が炎症病態として捉えられるようになってきたが,これらの危険因子としてのホモシステインや過剰なNOの作用機序の一つとして重要であると考えられた.血管腔区画に相対する血管内皮細胞のゾーンディフェンスラインを形成している活性酸素消去酵素extracellular-superoxide dismutase(EC-SOD)は,血管系で発生する活性酸素を効率よく消去し,血管壁のホメオスタシスの維持に貢献している.また,血管腔内においては血漿中に存在する遊離型と内皮細胞表面に局在する結合型との間で形成される平衡状態を保って存在している.そのため,血管系でのEC-SODの存在様式は酸化ストレスおよびそれに起因する様々な病態を鋭敏に反映していると考えられる.そこで本研究では,動脈硬化症や血栓症の危険因子として注目されているホモシステインや,感染・炎症反応において誘導型NO合成酵素の発現を介して過剰に発生したNOやそれ由来の窒素酸化物が血管系でのEC-SODの生理機能に対しどのような影響を及ぼしているかを明らかにすることを目的とした.その結果,(1)動脈硬化症患者血清中のホモシステイン濃度と血清中EC-SOD濃度との間に有意な相関性が認められた.(2)ヒト大動脈由来内皮細胞(HAEC),ウシ大動脈由来内皮細胞(BAEC)やヘパリンコーティングプレートへのr-EC-SODの結合はホモシステイン処理により有意にかつ濃度依存的に低下した.(3)ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC),BAEC,ヘパリン結合プレートへのr-EC-SOD結合量はNO供与体であるSNAP、NOR4の添加により濃度依存的に有意に低下した.(4)ヒト単球J-774 A-1細胞をLPSにて刺激した場合にNO産生が亢進されたことを確認した後,HUVECを上記のLPS刺激J-774 A-1細胞と共培養した結果,HUVECへのr-EC-SOD結合量は有意に低下した.さらに,NO合成酵素阻害剤であるL-NNAを同時に添加した場合,r-EC-SOD結合量は回復した.以上の結果から,血漿中のホモシステイン濃度の上昇や活性化された好中球等から過剰に発生したNOは内皮細胞表面に局在するヘパラン硫酸プロテオグリカン類の機能低下を招き,血管内皮細胞へのEC-SOD結合量を低下させるため,内皮細胞フロントラインにおいて発生する活性酸素に対する防御能の低下を招いていることが示唆された.最近,動脈硬化等の血管系疾患が炎症病態として捉えられるようになってきたが,これらの危険因子としてのホモシステインや過剰なNOの作用機序の一つとして重要であると考えられた.近年、動脈硬化症や血栓症の危険因子としてホモシステインが注目されるようになり、その作用機序の一つとして血管内皮細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカン類の構造および機能への障害が考えられている。Extracellular-superoxide dismutase(EC-SOD)は血漿中の主な活性酸素消去酵素であり、血管腔内においては血漿中に存在する遊離型と内皮細胞表面に局在する結合型との間で形成される平衡状態を保って存在している。そのため、血管腔内でのEC-SODの存在様式は血管系における酸化ストレスおよびそれに起因する様々な病態を鋭敏に反映していると考えられる。

そこで本研究では血管系でのEC-SODの存在様式に対するホモシステインの影響を明らかにすることを目的とした。その結果、(1)動脈硬化患者の血清中ホモシステイン濃度と血清中EC-SOD濃度との間には有意な相関性が認められた。(2)ヒト皮膚線維芽細胞におけるEC-SOD産生量は高濃度のホモシステイン処理によって有意に低下した。(3)培養血管内皮細胞へのEC-SOD結合量は低濃度のホモシステイン処理により有意に低下していた。(4)ヘパリン結合プレートに対するEC-SODの結合量もコントロール群に比べホモシステイン処理群では有意かつ濃度依存的に低下していた。以上の結果から、血漿中ホモシステイン濃度の上昇が内皮細胞表面に局在するヘパラン硫酸プロテオグリカン類の機能低下を招き、血管内皮細胞へのEC-SODの結合量を低下させ、血漿中EC-SOD濃度の上昇をもたらしていることが判明した。これにより、ホモシステインが内皮細胞表面の微小環境において発生する活性酸素に対する防御能の低下を招いている可能性が示唆された。このことは動脈硬化をはじめとする一連の血管病変の危険因子としてのホモシステインの作用機序の一つとして重要であると考えられた。最近,動脈硬化等の血管系疾患が炎症病態として捉えられるようになってきた.血管腔区画に相対する血管内皮細胞のゾーンディフェンスラインを形成している活性酸素消去酵素extracellularsuperoxide dismutase(EC-SOD)は,血管トーヌスに関与している一酸化窒素(NO)について,その産生細胞である内皮細胞から標的細胞である平滑筋細胞への移行を制御するとともに,血管腔内で発生する活性酸素を効率よく消去し,血管壁のホメオスタシスの維持に貢献している.感染・炎症反応においては,誘導型NO合成酵素の発現を介して過剰に発生したNOやそれ由来の窒素酸化物が多彩な病態生理活性を発現することが知られている.EC-SODは活性酸素を消去することにより,NO代謝を制御しているが,それ自身の機能も逆にNO代謝物により制御されるている可能'性がある.そこで本研究では,NOあるいはその代謝物がEC-SODの血管腔内での存在様式にどのような影響を及ぼしているかを解明することを目的とした.その結果,(1)ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC),ウシ大動脈内皮細胞(BAEC)へのr-EC-SOD結合量はNO供与体であるSNAP、NOR4の添加により濃度依存的に有意に低下した.(2)ヒト単球J-774A-1細胞をLPSにて刺激した場合,NO産生が亢進されたことを確認した後,HUVECを上記のLPS刺激J-774 A-1細胞と共培養した結果,HUVECへのr-EC-SOD結合量は有意に低下した.さらに,NO合成酵素阻害剤であるL-NNAを同時に添加した場合,r-EC-SOD結合量は回復した.(3)ヘパリン結合プレートへのr-EC-SOD結合量もSNAP、NOR4の濃度依存的に低下した.さらにこの作用は亜硝酸塩の処理によっても認められた.以上の結果から,体内で過剰に産生されたNOは血管内皮に局在するグリコサミノグリカン類の機能低下をもたらし,EC-SODの血管系における存在様式を変化させることが示唆された.
抗酸化能を始めとする各種機能性を保持した糖修飾鶏肉タンパク質の最適化法による開発

メイラード反応により得られたマルトース修飾鶏筋原線維(Mf)タンパク質は,低イオン強度溶液に対する溶解性および微弱ながら抗酸化能を獲得していた。そこで,ランダムセントロイド最適化法を用いて最大の抗酸化能を発揮する糖化Mfタンパク質の調製条件を検索し,得られた糖化Mfタンパク質が加熱ゲルを形成することも認めた。これらのことは,この糖化Mfタンパク質から貯蔵に酸化防止剤を必要としない練り製品を無塩にて製造できる可能性を示唆している。鶏肉は,安価で栄養的にも優れているが,ハムやソーセージなどの加工食品の原料としては,加工特性の乏しさから豚肉のように利用されておらず,その特性を広げることが望まれているタンパク質源である。申請者は,鶏肉にメイラード反応を用いて糖修飾すると低イオン強度溶液への可溶化・熱安定性の増大・抗酸化性の獲得などの機能改変が生じることを認めた。本研究では,ランダムセントロイド最適化法を用いて抗酸化能を中心とした機能性を十分発揮できる糖種・量・反応条件(温度・湿度・時間・pH)を探り当て,鶏肉の食品素材としての加工特性を広げる。このことで鶏肉より嚥下訓練食・流動食・抗酸化能を唱った特定保健用食品の開発が可能となる。平成22年度は,上記の目的に従って,鶏肉より筋原線維を調製し,糖としてマルトースを選び,ランダムセントロイド最適化法を用いて,温度(40-70°C)・相対湿度(25-45%)・反応時間(24-48h)・筋原線維とマルトースの重量比(1:2-8),pH(6-9)を条件として選び,電子スピン共鳴(ESR)測定時の試料溶液への溶解度を指標として,最も抗酸化効果を発揮する糖化筋原線維調製条件を検索した。14回の実験条件が示され,検討を行った結果,温度63.3°C・相対湿度39.2%・反応時間34.53h・筋原線維とマルトースの重量比1:4.53・pH7.57の時,スーパーオキサイドラジカルに対する抗酸化能の指標であるsuperoxide anion radical scavenging activityが,541±74units of superoxide dismutase/gofproteinを示す糖化筋原線維の調製に成功した。この値は,抗酸化物質であるポリフェノールを多く持つ乾燥デラウエアと同程度の値であった。前年度,鶏肉より筋原線維を調製し,糖としてマルトースを選び,ランダムセントロイド最適化法を用いて,温度(40-70°C)・相対湿度(25-45%)・反応時間(24-48h)・筋原線維とマルトースの重量比(1:2-8)を条件として選び,電子スピン共鳴(ESR)測定時の試料溶液への溶解度を指標として,最も抗酸化能を発揮する糖化筋原線維調製条件を検索した。その結果,温度64.9°C・相対湿度40.7%・反応時間36.2h・筋原線維とマルトースの重量比1:5.03の時,スーパーオキサイドラジカルに対する抗酸化能の指標であるsuperoxide anion radical scavenging activity(SOSA)が541±74 units of superoxide dismutase(SOD)/gof proteinを示す糖化筋原線維の調製に成功した。平成23年度は,ペプシンを用いて,この糖化筋原線維を部分分解し,抗酸化能を測定することで,この糖化筋原線維の抗酸化能に果たすタンパク質の役割を調べた。その結果,軽くペプシンで消化すると,溶解度は31.5%から58.5%に上昇したが,SOSAは半減した。このことは,タンパク質の形はともかく,一次構造かまたは特定のペプチド配列が,マルトース修飾鶏筋原線維の抗酸化能を発揮するのに寄与していることを示唆していた。また,このマルトース修飾鶏筋原線維は,90°Cの加熱によりゲルを形成し,加熱時間(240分)に依存してしっかりとしたゲルを形成した。これは,同じ加熱条件下で形成させたnaive鶏筋原線維ゲルよりもしっかりとしたゲルであった。SDS-PAGE法により,加熱中のタンパク質の変化を追ったところ,加熱後期ではSS結合以外の共有結合による架橋を形成していることが判明した。さらに,90°Cで120分加熱することでえられたnaive鶏筋原線維ゲルと糖修飾鶏筋原線維ゲルをクライオ走査電子顕微鏡観察により比較すると,前者に比べて後者の方が構造体の発達が認められた。このことが,よりしっかりとしたゲルを形成した理由と考えられた。

前年度まで,温度64.9°C・相対湿度40.7%・反応時間36.2h・筋原線維とマルトースの重量比1:5.03の条件で,マルトース修飾鶏筋原線維を調製すると,スーパーオキサイドアニオンラジカルに対する抗酸化能の指標であるsuperoxide anion radical scavenging activity(SOSA)が541±74 units of superoxide dismutase(SOD)/g of proteinを示すことが判明した。また,この筋原線維は,90°Cで240分加熱することにで,加熱ゲルを形成することも認められた。平成24年度は,このようなマルトース修飾鶏筋原線維加熱形成ゲルが,抗酸化能を保っているか検討した。電子スピン共鳴(ESR)法で抗酸化能を測定するために,ゲルを尿素とSDSを用いて水溶化した。その結果,マルトース修飾鶏筋原線維タンパク質ゲルのSOSAは,43 units of SOD/g of proteinを示した。これは上記の値の1/10の抗酸化能である。しかし,ゲル化前のマルトース修飾鶏筋原線維を同じ系で測定したところ,46 units of SOD/g of proteinを示したことから考えると,この系では,SOSAは,かなり低値に出ることが示唆される。しかしながら,これらのことは,ゲル化してもマルトース修飾鶏筋原線維は加熱前と同程度の抗酸化能を有していることを示している。以上の結果は,抗酸化能を持つマルトース修飾鶏筋原線維タンパク質が,抗酸化性を持ったゲル状食品の素材となる可能性を示唆している。が,正確な抗酸化能については,変性剤を用いない方法で,可溶化する手法の開発あるいは,他の方法(ESR以外の)での測定法の開発が必要であることが,判明した。ランダムセントロイド最適化法を用いて,鶏筋原線維とマルトースをメイラード反応により反応させ,低イオン強度溶液への溶解性を失うことなく,最も強い抗酸化能を発揮できうる糖化鶏筋原線維を得る条件を突き止めることができた。また,この抗酸化能の発現に,筋原線維タンパク質の形はともかくも,一次構造かまたは特定のペプチド配列が,寄与していることを示唆できた。また,得られた糖化鶏筋原線維のゲル形成能を検討したところ,形成能を保持していること,また,そのゲル形成性が,nativeな筋原線維よりも,良いことを明らかとした。24年度が最終年度であるため、記入しない。得られた糖化筋原線維が良質なゲル形成性を保持していることは,認められた。さらに,ゲルとなっても抗酸化能を保持していることが判明すれば,タンパク質系ゲル状食品の有望な素材となるばかりでなく,保存に際して,抗酸化添加物を加えずとも,貯蔵できる加工食品の開発が,可能となる。今後,この点に付き検討する。また,マルトースを多糖類・少糖類に代え,ランダムセントロイド最適化法を用いることで,低イオン強度溶液へのさらなる溶解性を獲得しながら,さらに強力な抗酸化能を発現する糖化筋原線維の調製が可能かどうか検討する。
出芽酵母におけるストレスで誘導される遺伝子の解析

昨年度に引き続き,出芽酵母(Saccharomycescerevisiae)を対象として,熱ショックやグルコース飢餓(培地中の糖源としてガラクトースを用いる),あるいは生育状態(対数増殖期と定常期)に応じて発現量が変化する遺伝子を同定し,構造解析や遺伝子破壊などによる機能解析を行なった。本年度は特に生育の定常期にのみ高発現する遺伝子群を網羅的に同定するために,cDNAクローンのdifferential displayによる解析を行い,約100種類の候補クローンを得た。これらのクローンについて個別にNorthern hybridizationを行って遺伝子の発現量を測定し,生育の対数増殖期にはほとんど発現が見られないが,定常期には高い発現量を示す約40種類の遺伝子を同定した。同定したそれぞれの遺伝子について塩基配列を決定し,得られた塩基配列データを出芽酵母のゲノムデータベースと比較して対応する遺伝子の染色体上の位置を確認するとともに,その5^<'->上流域および3^<'->下流域のシス配列を解析した。また,得られた遺伝子についていわゆるホモロジー検索を行い,機能の推定を行った。これらに加えて,昨年までに同定した同様な発現パターンを示す遺伝子について,5^<'->上流域をlacZ遺伝子に接続し,種々のストレス条件下での発現量を測定した。
情動ストレス刺激による摂食障害のメカニズム

ストレスを生体に負荷すると、摂食が増強、或いは、抑制される。しかし、その脳機構については不明であった。本研究の目的は情動ストレスによる摂食障害の動物モデルを構築し、カテコラミンニューロンとペプチドニューロンの役割を明かにすることであった。本研究は、まず固形飼料を用いて、摂食量を経時的に自動的に長期間測定する機器を試作した。この機器を用いることにより、暗期の摂食量を自動的に計測することが可能となった。この機器を用い、ストレスによる摂食に対する効果を検討した。軽い痛み刺激を加えると、加える前日に比べ、有意に摂食量が亢進した。これに対し、心理的ストレスの1つである拘束ストレスは摂食を抑制した。次に、ストレスの神経回路を明らかにする目的で、痛み刺激あるいは条件恐怖刺激のときに活性化される神経細胞の同定とその投射先の同定をFos蛋白質と神経伝達物質あるいはその合成酵素に対する免疫組織化学的検索、さらに、逆行性トレーサーを組み合わせた方法で検討した。その結果、摂食を亢進するストレス刺激である痛み刺激は摂食亢進機能のあるオレキシンニューロンを活性化させた(Zhu et al.,2002)。これに対し、情動ストレスである条件恐怖刺激は、視床下部に投射する延髄弧束路核のA2ノルアドレナリンニューロン、特に、摂食抑制作用がある神経ペプチドであるPrRPを含有するニューロンを活性化させた(Zhu & Onaka 2002、Zhu & Onaka,2003)。さらに内因性のPrRPを阻害しておくと、自由摂食下の、あるいは、絶食後の摂食量が増加した。拘束ストレス負荷時による摂食抑制も減弱した。以上のデータは、侵害刺激時にはオレキシンニューロンが活性化され摂食が亢進し、情動ストレス負荷時には、PrRPを含有するノルアドレナリンニューロンが賦活化され、摂食が抑制されるという可能性を示唆している。ストレスを生体に負荷すると、神経内分泌反応が誘発され、摂食が増強、或いは、抑制される。しかし、その脳機構については不明である。本研究では、まず固形飼料を用いて、摂食量を経時的に自動的に長期間測定する機器を試作した。そこで、ストレスによる摂食に対する効果を検討した。これに対し、拘束ストレスは摂食を抑制した。次に、ストレスの神経回路を明らかにする目的で、痛み刺激あるいは条件恐怖刺激のときに活性化される神経細胞の同定とその投射先の同定をFos蛋白質と神経伝達物質の合成酵素に対する免疫組織化学的検索、さらに、逆行性トレーサーを組み合わせた方法で検討した。その結果、痛み刺激は、意識下では、視床下部に投射する延髄弧束路核のA2ノルアドレナリンニューロンと延髄腹外側部のA1ニューロンを活性化させ、その結果オキシトシンニューロンを活性化させた。これに対し、情動ストレスである条件恐怖刺激は、視床下部に投射する延髄弧束路核のA2ノルアドレナリンニューロンを選択的に活性化させオキシトシンニューロンを活性化することを明かにした(Zhu&Onaka 2002)。