hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
パケット通信と管理用エキスパ-トシステムを組合せた貯蔵施設の計測制御

これも基本的な問題はないが,エキスパ-トシステムのレベルアップと,観測すべきデ-タに関する実装技術の工夫を行なっている。情報をエラ-フリ-に遠隔地に確実に伝送する手段としてSHF帶の無線によるパケット通信を用い、また正確な判断を行う手段として管理用のエキスパ-トシステムを用い確実な制御をするシステムの構築を試みた。本年度は貯蔵施設における青果物の状態を常時観測し、その状態を貯蔵病管理用エキスパ-トシステムに入力、問い合わせることにより、現状の診断・異状が発生したときの原因の究明、対処すべき処置の提示を行い、当該貯蔵施設の確実な制御を行うシステムを構築することに努めた。エキスパ-ト構築支援ツ-ルとしてはEXSYSを用い、対象青果物としては柑橘,各種根菜類,いも類,各種の葉菜類のうち,ことに貯蔵が問題となる品目を中心に、実用に耐えるエキスパ-トシステムを構成した。貯蔵施設には端末局を,実験室には基地局を置く。エキスパ-トシステム・知識デ-タ(画像デ-タを含む)は基地局に設けられている。端末局・基地局の双方とも送信局にも受信局にもなりうる。通常は貯蔵施設におかれた端末局から基地局にアクセスし,基地局に備えられた所要の知識デ-タを持つエキスパ-トシステムを起動する。エキスパ-トシステムは貯蔵中の青果物の状況に関し貭問を行い、ユ-ザはその貭問に答え,あるいはデ-タを入力し、エキスパ-トシステムから結果が出される迄貭問を繰返す。結果は貯蔵病の診断の場合、推定される病名、その原因、それに関する対処法など一連の指示が提示される。本回は基地局からの画像デ-タを送ることにより、診断の確度を向上させることに努めた。
国境を越える人の移動に対応した社会保障の在り方に関する研究

国境を越える人の移動の増加に伴い、それらの人々が適切な社会保障を受けられることが重要となっている。EUやその加盟国では、人の自由移動を確保するために社会保障に関する措置が講じられている。本研究はこれらの措置について検討し、次のことを明らかにした。国境を越えて移動する人が社会保障に関して不利にならないよう各国の制度を調整する仕組みが必要である。また、国境を越えて移動する労働者の賃金と社会保険の適切な適用を確保することが重要である。さらに、他の国民を受け入れる国への過度の財政負担を避ける観点から、国境を越える人の移動と社会給付受給との関係について検討する必要がある。本研究の目的は、国境を越える人の移動に対応した社会保障の在り方を検討するため、ドイツを対象として、国境を越えて移動する人々が社会保障に関して直面する問題、それを解決するための制度等の分析・検討を行い、それを基に、日本において生じうる問題点を明らかにするとともに、その解決のための具体的な政策の選択肢を示すことにある。このため、平成25年度は、まず、平成24年度において実施した文献調査及び訪問調査により得られた情報を論点に沿って整理・分析した。その結果に基づき、日本での具体的な政策の検討に必要な情報を洗い出し、不足している情報を補うための文献調査及び訪問調査を行った。このほか、EU社会法の専門家であるドイツの研究者を講師とする研究会を実施し、国境を越える人の移動に対応した社会保障の在り方について討議・意見交換を行った。また、2004年にEUに新規加盟した旧東欧諸国からの労働者の移動に関して設けられていた経過的な制限措置が2011年に終了したことに対応して、これらの国々から大量に流入すると予想される労働者に対する社会保障の適切な適用を確保するために講じられた包括的な立法措置に関して、昨年度に実施したオーストリアの状況に関する調査結果を基に、分析・検討を行った。この成果については、2013年10月に開催された社会政策学会第127回大会において、「EU新規加盟国からの労働者の自由移動と社会保障ーオーストリアの取組みー」と題する報告を行い、社会保障政策の専門家などとの討議を行った。さらに、これを踏まえて、「労働者の自由移動と社会保障ーEU加盟国の拡大に対応したオーストリアの取組みー」と題する論文を発表する予定となっている。本研究の目的は、国境を越える人の移動に対応した社会保障の在り方を検討するため、ドイツを対象として、国境を越えて移動する人々が直面する問題、それを解決するための制度等の分析・検討を行い、それを基に、日本において生じうる問題点を明らかにするとともに、その解決のための具体的な政策の選択肢を示すことにある。このため、本年度は、まず、国境を越える人の移動に伴う問題と解決の方向性に関する理論的な検討整理を行った。また、国境を越える人の移動、就労の状況などを把握し、日本についての検討において論点となるべき事項を整理した。そのうえで、ドイツをはじめとするEU加盟国間で移動する人々の医療保障の調整、国境を越えた医療サービスの提供・利用並びに他国から受け入れる医療専門職の資格の相互承認に関する制度などについて、制度の現状、効果と問題点、改善方策を把握し、検討を行った。この成果については、2012年10月に開催された社会政策学会第125回大会において、「国境を越える人の移動に対応した医療制度」と題する報告を行い、EU社会保障政策の専門家などとの討論を行った。さらに、これを踏まえて、「国境を越える人の移動に対応した医療制度ーEUにおける取組みと日本への示唆ー」と題する論文を発表した。さらには、2004年にEUに新規加盟した旧東欧諸国からの労働者の移動に関してドイツ及びオーストリアで設けられていた経過的な制限措置が2011年に終了したことに対応して、これらの国々から大量に流入すると予想される労働者に対する社会保障の適切な適用を確保するための包括的な立法措置が講じられたオーストリアの状況についての調査も行った。平成26年度においては、まず、稼得活動に従事しないEU市民のEU域内での自由移動と社会給付の受給との関係について、分析・検討を行った。その理由は、EU市民にはEU域内での自由移動が認められていることから、ブルガリア及びルーマニアなどの所得水準が低いEU加盟国から社会扶助を受給する目的でドイツなどに移動する人が増加し、それによって不適切な財政負担が生じることへの懸念が高まっているためである。

この成果については、平成26年10月に開催された社会政策学会第129回大会において「国境を越える人の移動と社会給付の受給」と題する報告を行い、社会保障政策の専門家との討議を行った。また、これを踏まえて、「EU市民のEU域内での自由移動と社会給付の受給」と題する論文を発表した。さらに、平成25年度までの研究成果及び上記の研究成果を基に、研究協力者との意見交換も行ったうえで、国境を越える人の移動が社会保障に関してもたらす問題とその解決のための対応策について研究結果の取りまとめを行った。社会科学平成25年度においては、平成24年度において実施した調査により得られた情報を論点に沿って整理・分析した。それに基づき、日本での具体的な政策の検討に必要な情報を補うための調査を行うとともに、ドイツとの調整の相手国であるオーストリアでの調査を行うなど、当初の研究実施計画で予定していた研究を順調に進めることができた。また、EU新規加盟国からの労働者の自由移動に対応して、社会保障の適切な適用を確保するためにオーストリアで講じられた包括的な措置についての分析・検討を行い、その効果と課題を明らかにすることができた。このような平成25年度の調査研究を通じて、平成26年度に本研究を取りまとめ、研究目的を達成するために必要な成果を得ることができた。平成24年度においては、文献調査及び訪問調査を通じて、国境を越える人の移動に伴い生じうる問題と解決の方向性についての理論的な検討・整理、日本についての検討において論点となるべき事項の整理、並びにドイツをはじめとするEU加盟国間を移動する人々の社会保障の調整に関する制度及び他国から受け入れる医師、看護師等に係る資格の相互承認に関する制度の現状、効果と問題点の把握など、当初の研究実施計画で予定していた研究を順調に進めることができた。特に医療制度に関しては、医療サービスの国境を越えた提供及び利用を促進するためのEUの政策を最新の取組みを含めて把握・分析し、これを基に、日本に対する重要な示唆を導き出すことができた。このような平成24年度の調査研究を通じて、本研究の目的達成に向けて平成25年度以降の研究を進めるための重要な基盤となる成果が得られた。平成26年度においては、まず、平成25年度までの検討結果を取りまとめ、その内容について、研究協力者との議論を行い、それに基づいて必要な修正・補足を行う。その結果を基に、日本において、国境を越える人の移動や社会保障を支える人材の受け入れに伴って生じうる問題とその解決のための方策並びにそれを実施した場合に予想される効果と問題点を明らかにする。平成25年度においては、まず、平成24年度の調査によって得られた情報を論点に沿って整理・分析する。その結果に基づき、日本での具体的な政策の在り方を研究する上で追加的に必要な情報を洗い出す。不足している情報を補うために、ドイツでの訪問調査を実施し、研究者・専門家からのヒアリング調査、研究協力者との意見交換及び文献情報の収集を行うことにより、国境を越える人の移動に対応した社会保障についての検討をさらに深める。併せて、ドイツとの調整の相手方である周辺国の状況についても、文献調査及び訪問調査を行うことにより、把握・検討を進める。
担持貴金属ナノ粒子による日本酒の貯蔵、製成法の開発

日本酒などの飲料で、DMTSなどの硫黄化合物が悪臭の原因となることが知られている。従来技術として、活性炭を吸着剤に用いる手法が使われているが、活性炭は空孔内が低極性で、低極性物質を中心になんでも吸着してしまう。日本酒では、吟醸香の主成分であるヘキサン酸エチルなどのエステル類が活性炭により吸着除去されてしまい、商品価値が低下する。我々は、金、銀、白金などの貴金属をシリカなどの酸化物担体に担持した吸着剤が、硫黄化合物の選択的除去に有効であることを見出した。日本酒では、吟醸香を損なわずに選択的に老香(ひねか)と言われる劣化臭を取り除くことができた。金と硫黄が高い親和性を有することはよく知られており、得られた担持金ナノ粒子の応用として、吸着脱硫を試みた。脱硫といえば、石油や天然ガスなどの燃料からの脱硫に固体触媒を用いるのが一般的である。我々は、酒類総合研究所の磯谷らの報告に着目し飲料、特に日本酒からの吸着脱硫を検討した。日本酒は原料米の加水分解、アルコール発酵を経て製造される。火入れ(加熱殺菌)により生化学的反応は止まるが、その後、ゆっくりと化学反応が進行する。その際、生じる好ましくない香りとして、老香(ひねか)というたまねぎ様の硫黄臭が知られており、この原因物質がジメチルトリスルフィド(DMTSであることを磯谷らは報告している。老香が発生すると、通常、酒造会社では活性炭処理を行い、原因物質を除去する。DMTSは0.18ppbという低濃度でも老香を発生するが、これを半分以下に抑えることができる。しかし、活性炭は、色々な有機化合物を吸着してしまう。特に極性の低いエステル類は、低極性の空孔を持つ活性炭によく吸着される。吟醸香の原因物質であるヘキサン酸エチルも吸着されてしまい、香りの薄い酒になってしまうのが問題とされている。我々は、金、銀、白金、パラジウムなどの各種の担持貴金属ナノ粒子がDMTSの吸着に有効であることを見出した。粒子径が2.5 nmの担持金ナノ粒子では、10時間以内にほぼすべてのDMTSが吸着されるが、3.9 nmの金ナノ粒子では3日間を要する。粒子径が大きくなると吸着能力が下がり、金箔になるとほとんど吸着能を示さないことがわかった。Au/DMTSの比を変えて硫黄原子がやや過剰な状態(Au/S < 1)になると吸着量は飽和し、ラングミュアプロットを取ると直線に乗ることから、ラングミュア型の単層吸着となっていることがわかった新開発の担持金ナノ粒子調製法の開発も順調に進み、さらに銀ナノ粒子による老香の吸着除去も効果が高いことがわかり、研究はおおむね順調に進展していると言える。金ナノ粒子を担持する場合、酸化物のうち、アルミナやセリアなどの塩基性担体や、チタニアなどの両性担体には問題なく担持できるが、シリカやゼオライトなどの酸性担体では担持が困難であることが知られている。これは、金などの貴金属を担持するときに一般的に使われる、析出沈殿法における金の沈殿物Au(OH)4ーと酸性担体間の静電反発が原因であると言われている。我々は、この問題を解決すべく、新しい含浸担持法を開発した。、一般的に水への溶解性が高いアミノ酸錯体に注目した。十数種類の天然および人工のアミノ酸を試したところ、多くのアミノ酸から錯体を得ることができた。これら錯体の水への溶解性は高く、必要最小限の量の水での含浸担持(ポアフィリング法)が可能になった。この金-アミノ酸錯体は適度に分解しやすく、焼成過程で速やかに分解し、同時に金が0価に還元され、ナノ粒子を形成する。金の場合、300 °C程度に昇温して焼成するのが一般的であるが、X線吸収分光法のin situ測定や熱重量分析により、塩化金酸よりかなり低く、例えば金-&#61538;-アラニン錯体の場合170 °C前後で分解し、3価から0価へ還元することが確認できた。これにより金の凝集が抑えられる。また、塩基性や両性の担体だけでなく、シリカなどの酸性担体や、活性炭などにも金ナノ粒子を担持することができた。今後、得られた金ナノ粒子を用いて、さらに研究を展開させる。我々は、金、銀、白金などの貴金属をシリカなどの酸化物担体に担持した吸着剤が、硫黄化合物の選択的除去に有効であることすでに見出している。これは、機器分析、官能試験、両面から確認した。日本酒の場合なら、酒造会社等で、劣化した酒を再生させるのに、この吸着剤を用いる。野菜ジュースの場合なら、飲料の工場で、悪臭を取り除く吸着剤や装置を提供する。今年度は、担持金ナノ粒子、担持銀ナノ粒子による吸着速度の違いや選択性の違い、再生条件の違い、また、担持貴金属ナノ粒子調製法の開発と最適化などを行った。その結果、吸着速度の違いに関しては、早い順に、硫化水素、チオール、ジアルキルポリスルフィド、ジアルキルモノスルフィド、チオフェン類であることがわかった。

担持金ナノ粒子を用いた場合は、チオール、ジアルキルポリスルフィドの吸着速度はそれほど差がないが、担持銀ナノ粒子を用いた場合は大きく異なり、チオール類の方が圧倒的に早く吸着される。これはおそらく銀の表面が酸化され易く酸化銀が生成していることが関係していると考えている。一方、吸着剤の再生も検討した。シリカゲル担持金ナノ粒子および銀ナノ粒子にジメチルトリスルフィドを吸着させたのち、焼成して再生を試みた。シリカゲル担持金ナノ粒子の場合、300°Cでの焼成で性能が回復する。しかし、金の粒子径は焼成を繰り返すたびに徐々に増大する。1回あたり0. 5nm程度の増大が見られ、その分、性能が低下した。一方、シリカゲル担持銀ナノ粒子の場合、300°Cの焼成では不十分であり、700800°Cでの焼成が必要であることがわかった。300°C程度で有機物は分解するが、硫黄原子が銀上に残る。この硫黄原子を除去するのに700°C以上の高温が必要である。日本酒などの飲料で、DMTSなどの硫黄化合物が悪臭の原因となることが知られている。従来技術として、活性炭を吸着剤に用いる手法が使われているが、活性炭は空孔内が低極性で、低極性物質を中心になんでも吸着してしまう。日本酒では、吟醸香の主成分であるヘキサン酸エチルなどのエステル類が活性炭により吸着除去されてしまい、商品価値が低下する。我々は、金、銀、白金などの貴金属をシリカなどの酸化物担体に担持した吸着剤が、硫黄化合物の選択的除去に有効であることを見出した。日本酒では、吟醸香を損なわずに選択的に老香(ひねか)と言われる劣化臭を取り除くことができた。今後は、担持金ナノ粒子、銀ナノ粒子とも、DMTS吸着後の再生実験や、吸着状態の表面化学的、物理化学的検討を行う。吸着剤のシリカ担持金ナノ粒子は再利用が可能である。300 °Cで焼成することにより吸着されたDMTSを酸化して除去することができ、3回の再利用には問題なく用いることができた。しかしながら、さらに回数を増やした場合劣化が見られるかどうか、金の状態はどうなっているか、硫黄の状態はどうなっているかなど、詳細は不明である。また、担持銀ナノ粒子の場合、金と異なりラングミュア型の単層吸着にならない可能性もでてきている。また、表面原子数の割に、金よりも吸着速度や飽和吸着量が大きいことが示唆される実験結果が得られている。さらに、金と銀では再生のされかたなども異なる可能性もあるので、詳細な検討を行う。さらに、実際の日本での検討も行う。担持金ナノ粒子でも、担持銀ナオン粒子でも、DMTSなど硫黄の吸着のほかには行わないと考えているが、触媒として働いて、様々な化学反応に関与して、味や香りの変化を引き起こしてしまう可能性がある。この点に留意し、さまざまな担体に担持した金ナノ粒子、銀ナノ粒子を用意して検討する予定である。以前の検討では、日本酒からの吸着脱硫実験を機器分析と官能試験の両面から確かめる実験を行っている。その結果、機器分析でも官能試験でも、シリカ担持金ナノ粒子の有効性が確認できた。0.25ppbのDMTSを0.03 ppbおよび0.01 ppbに低減できているが官能試験では有意差は見出されていないので、この点を解決する。今後、金やほかの貴金属での硫黄化合物の吸着様式や、焼成や還元による再生のされ方の違いなどを詳細に検討し、実用化につなげたいと考えている。有機化学使用したい消耗品の納期が間に合わなかったため。新年度に消耗品を発注する。
音声メディアを利用した情報伝達における相互行為の時間構造的特徴と伝達効率の関係

本研究では,会話による情報伝達効率は会話活性度に依存し,会話活性度は相互行為の時間構造,伝え手(システム)と受け手(人)の親密度,伝え手の話し方等が相互に関係するとの仮定の下に,a.情報伝達会話における会話活性度を向上させる要素を明らかにし,b.これらを満足して会話活性度を向上させる会話システムを実現するとともに,c.実現した会話システムでどの程度情報伝達は効率化するかを明らかにすることを目的とする。このうち,2018年度はa.とb.に取り組んだ。a.会話活性度を向上させる要素の解明にあたっては,a1.相互行為の時間構造(情報伝達会話を構成する基本行為の遷移パターンと遷移時間),a2.伝え手と聞き手の親密度に注目した。まず,情報伝達会話を構成する相互行為は,どのような基本行為に分類できるかを整理するとともに,人同士が円滑に進める情報伝達会話において,基本行為の遷移パターンはどのような性質を呈するかを調査した。また,情報伝達中に関連する豆知識の提供行為や,他者指向の発話行為(相手に共感したり,自己の評価を披露したりする発話)の有無によって,会話の親密度や会話活性度がどの程度変化するかを調査した。b.活性度を向上させる会話システムは,既提案のシナリオ主導会話システムをもとに構成した。これは,伝えようとする記事から自動生成されるシナリオに基づいて会話を進めることで,即時応答性に優れることを特徴とする。新たに検討すべき技術として,b1.即応性を改善するための音声認識技術,b2.ユーザの応答を誘発する音声合成技術に焦点を当てた。b1.については,遅延のない発話末推定技術に取組んだ。b2.については,核(伝えるべき最も重要な部分)と衛星(前置きや補足にあたる部分)の読み分け機能,および間の制御機能の実装に加え,発話表現の自動分類に基づいて表現性を改善することについても検討した。テーマa.においては,まず,人同士の会話における,会話の円滑化を目的とした特徴的な行為を整理すること目的として,文献を調査するとともに,人が実際に記事内容を口頭で伝える会話を収録し,分析した。この結果,関連話題に関するトリビアの提示,他者指向発話(伝達内容に主観的評価を加える発話,聞き手に共感を求める発話,聞き手の発話に共感する発話など)などが多用されることがわかった。ついで,現状の会話システムを用いて実際に会話を行い,これらの発話の有無と会話活性度との関係を調査した。会話活性度は会話中にユーザが行うフィードバック発話の量として定義し,分析には重回帰分析を用いた。この結果,1発話の間の良さはフィードバックの量に寄与する,2質疑応答の質はフィードバックの量に寄与する,3伝達内容に関連するトリビアを披露する行為はトピックへの興味増進および親密感の増進に寄与する,4他者指向的発話は親密感の増進に寄与する,5親密感とフィードバックの量に明確な因果関係は明らかでない,などを明らかにした。テーマb.におけるb1.即応性を改善する音声認識については,発話権のKeep/Releaseに係るユーザの意思を逐次推定することを試みた。狭帯域スペクトログラムにオートエンコーダを適用して得る韻律特徴量,および音声認識結果をLSTMに入力する構成によって,所望の情報を高精度に判定できることを示し,これをシステム発話のタイミング制御に利用できる可能性を示した。b2.ユーザの応答を誘発する音声合成については,核(伝えるべき最も重要な部分)と衛星(前置きや補足にあたる部分)の読み分け機能,および間の制御機能の実装に加え,基本合成器の機能改善についても検討を行った。センテンスコードと感情コードを用いて発話表現を自動分類しながら音声合成用モデルを学習することによって,従来法に比べ表現性を大幅に改善した。テーマa.においては,2018年度に改良した会話システムを用いることで,より精緻化した形で会話活性度向上に資する要素の解明を試みる。18年度の成果として,前節1ー4に挙げたような因果関係が明らかになったが,18年度の実験に用いたシステムは,「会話の間」,「質疑応答の質」が不十分なため,詳細なレベルで会話活性化に資する要因を調査することが困難であった。19年度は,18年度に開発した高精度な発話権の推定器を会話システムに組み込んで,より微妙な会話の間の調整を可能にするととともに,ダミーの質疑応答モジュールを用意して問題を回避し,会話の構成要素の時間構造と会話活性化に焦点を当てた,一段詳細なレベルでの分析を行う。また,18年度に引き続き,人同士の会話に種々の制約を与えることで会話活性度がいかに影響を受けるかについての実験も行う。特に,人が人を相手にする場合とシステムを相手にする場合の発話間ポーズの違いを分析し,人間が何を手がかりに間を制御しているかについて仮説を立て,実験を通じて検証する。テーマb.においては, 18年度に引き続きb1.即応性を改善するための音声認識技術,b2.ユーザの応答を誘発する音声合成技術の高度化ついて取り組むとともに,b3.会話における質疑応答の質の改善に取り組む。b1.においては,言語情報の扱いを中心に,ユーザの状態推定モデルの精緻化について検討する。b2.においては,新たなコードの追加や合成音声の品質改善に取り組み,より効率的な情報伝達を実現する音声合成システムの研究開発に取り組む。b3.は,18年度の検討の結果,質疑応答の質が会話活性度に大きな影響を与えるとの分析結果を受けて,19年度新たに起こすテーマである。項目

a.の実施において,19年度はダミーのモジュールを用いるが,20年度はここで開発するモジュールを用いて全体を自動化する予定である。本研究では,会話による情報伝達効率は会話活性度に依存し,会話活性度は相互行為の時間構造,伝え手(システム)と受け手(人)の親密度,伝え手の話し方等が相互に関係するとの仮定の下に,a.情報伝達会話における会話活性度を向上させる要素を明らかにし,b.これらを満足して会話活性度を向上させる会話システムを実現するとともに,c.実現した会話システムでどの程度情報伝達は効率化するかを明らかにすることを目的とする。このうち,2018年度はa.とb.に取り組んだ。a.会話活性度を向上させる要素の解明にあたっては,a1.相互行為の時間構造(情報伝達会話を構成する基本行為の遷移パターンと遷移時間),a2.伝え手と聞き手の親密度に注目した。まず,情報伝達会話を構成する相互行為は,どのような基本行為に分類できるかを整理するとともに,人同士が円滑に進める情報伝達会話において,基本行為の遷移パターンはどのような性質を呈するかを調査した。また,情報伝達中に関連する豆知識の提供行為や,他者指向の発話行為(相手に共感したり,自己の評価を披露したりする発話)の有無によって,会話の親密度や会話活性度がどの程度変化するかを調査した。b.活性度を向上させる会話システムは,既提案のシナリオ主導会話システムをもとに構成した。これは,伝えようとする記事から自動生成されるシナリオに基づいて会話を進めることで,即時応答性に優れることを特徴とする。新たに検討すべき技術として,b1.即応性を改善するための音声認識技術,b2.ユーザの応答を誘発する音声合成技術に焦点を当てた。b1.については,遅延のない発話末推定技術に取組んだ。b2.については,核(伝えるべき最も重要な部分)と衛星(前置きや補足にあたる部分)の読み分け機能,および間の制御機能の実装に加え,発話表現の自動分類に基づいて表現性を改善することについても検討した。テーマa.においては,まず,人同士の会話における,会話の円滑化を目的とした特徴的な行為を整理すること目的として,文献を調査するとともに,人が実際に記事内容を口頭で伝える会話を収録し,分析した。この結果,関連話題に関するトリビアの提示,他者指向発話(伝達内容に主観的評価を加える発話,聞き手に共感を求める発話,聞き手の発話に共感する発話など)などが多用されることがわかった。ついで,現状の会話システムを用いて実際に会話を行い,これらの発話の有無と会話活性度との関係を調査した。会話活性度は会話中にユーザが行うフィードバック発話の量として定義し,分析には重回帰分析を用いた。この結果,1発話の間の良さはフィードバックの量に寄与する,2質疑応答の質はフィードバックの量に寄与する,3伝達内容に関連するトリビアを披露する行為はトピックへの興味増進および親密感の増進に寄与する,4他者指向的発話は親密感の増進に寄与する,5親密感とフィードバックの量に明確な因果関係は明らかでない,などを明らかにした。テーマb.におけるb1.即応性を改善する音声認識については,発話権のKeep/Releaseに係るユーザの意思を逐次推定することを試みた。
乳腺分泌上皮細胞におけるカルシウム反応と容量性カルシウム流入の役割

乳腺細胞等多くの細胞は機械刺激によりカルシウム上昇、ヌクレオチド分泌を起し、それがプリン受容体を介して隣接する細胞にカルシウム波を発生させる。乳腺上皮細胞の細胞内カルシウムの供給源は小胞体であるが、容量性カルシウム流入の関与もあり、またミトコンドリアからの供給もある。本プロジェクトで、われわれは乳腺上皮にある2種類の上皮細胞における細胞間情報伝達にカルシウム波が関与していることや、容量性カルシウム電流の存在、特に妊娠初期の乳腺上皮細胞の増殖期における容量性カルシウム電流の増大を明らかにした。機械刺激による細胞内カルシウム上昇の機構、ヌクレオチド分泌の機構、カルシウム波の役割について総括する。われわれは機械刺激により発生するCa依存性Kチャネル開口による外向き電流を分析してきたが、同時にClチャネル開口による内向き電流があることが判明した。また、UTPによるATP放出はClチャネル阻害剤ニフルミン酸で抑制される。よって、ヌクレオチド分泌はClチャネルを使っている可能性が高い。パッチクランプで電極内外をATPにし、インサイドアウトシングルチャネル記録を行ってみたが、今のところATP電流は記録できていない。乳癌よりClC3型Clチャネルをクローニングし、培養神経細胞NG108-15に発現させたが、電気生理的測定では、特に変化を認めていない。本プロジェクトの成果は「生体の科学」に印刷中である。乳腺分泌上皮細胞におけるカルシウム反応の機序と役割を探るため、培養した乳腺分泌上皮細胞を用い、細胞内カルシウム反応、各種細胞内小器官の可視化を行った。乳腺細胞の増殖、分化はホルモンのみによってコントロールされており、上皮細胞増殖因子(EGF)は細胞の増殖を、インスリン、プロラクチン、コーチゾル(IFP)は細胞の分化、ミルクの合成分泌を促す。それぞれのホルモン処理細胞での細胞内カルシウム反応及び容量性カルシウム流入の大きさを比較した。その結果、EGF処理細胞において容量性カルシウム流入量がIFPあるいはコントロールの細胞に比較して明らかな増大が見られた。一方、カルシウム反応の大きさ自体に大きな変動は見られなかった。また妊娠日数による容量性カルシウムの変化を測定したところ、EGFが多く分泌され、細胞が増殖している妊娠初期において最大で、妊娠日数が進むとともに急激に低下していくことが明らかとなった。これらのことは容量性カルシウム流入による細胞内カルシウム増加が細胞の増殖と関わっていることを強く示唆している。乳腺細胞における細胞内カルシウム反応は基本的に細胞内ストアである小胞体からの遊離によっているが、細胞内及び小胞体内のカルシウム変化にはミトコンドリア内のカルシウムも関与していることが示唆されている。小胞体、ミトコンドリア間のカルシウムを介した相互作用を明らかにするため、それぞれに特異的な色素を用いて細胞内小器官を可視化し、各種条件変化による形態変化を観測した。また、小胞体内のカルシウム濃度変化を直接測定し、小胞体のカルシウム遊離機構を探るため、細胞膜にイオン透過性を持たせたPermeabilized cellsを作成した。更に次年度はGFPを用いた小器官の特異染色とカルシウム測定を併用し細胞内小器官、カルシウム流入経路、カルシウム反応の関係を明らかにする予定である。乳腺細胞等多くの細胞は機械刺激によりカルシウム上昇、ヌクレオチド分泌を起し、それがプリン受容体を介して隣接する細胞にカルシウム波を発生させることは、最初にわれわれが報告し,すでに古典となった。われわれは機械刺激により発生するCa依存性Kチャネル開口による外向き電流を分析してきたが、同時にC1チャネル開口による内向き電流があることが判明した。この電流は同時に発生する大きな外向き電流に隠れていたものである。以前,私は細胞の機械刺激により脱分極-過分極の2相性の膜電位変化を報告したが、この原因が判明した。また、UTPによるATP放出はC1チャネル阻害剤ニフルミン酸で抑制される。よって、ヌクレオチド分泌はC1チャネルを使っている可能性が高い。さらに、イカ神経節と乳癌よりC1C3型C1

チャネルをクローニングし、培養神経細胞NG108-15に発現させたが、電気生理的測定では、特に変化を認めていない。本プロジェクトの成果は「生体の科学」に印刷中である。
グリア細胞成長因子を介した細胞シグナルの中枢神経発達における役割

本研究では、ヒトおよびマウスのGMFGのgenomic DNAの解析を進めた。また、GMFB、GMFGに対する特異的抗体を用いて酵素抗体法による高感度測定法(EIA)を確立した。また、凍結によって作成した脳損傷モデルラットを用いて、損傷後の脳組織におけるGMFBの発現変化を検討した。[1]GMFGgenomic DNAの解析:ヒト及びマウスGMFGのgenomic DNAをクローニングし、塩基配列を決定した。その結果、ヒトおよびマウスともGMFGは7つのexonより構成されることが判明した。Promoter部位はTATA lessで、housekeeping gene様のGC rich promoterであり、転写開始点が数カ所あることが判明した。また、エンハンサー領域の解析を行った(Kawai et al. BBA,1625,246-252,2003)。[2]Enzyme Immunoaasay(EIA)系によるGMFsの定量:EIA系を用いて、ラットおよびヒトの各種臓器中のGMFB、GMFGの濃度を測定した。GMFBは、中枢神経でもっとも発現が高く、それ以外に、脾臓、胸腺、肺、腸管にも分布していた。一方、GMFGは、胸腺での発現が圧倒的に高く、ついで、脾臓に発現が高かった。また、ラットおよびヒト血清中濃度を測定したところ、GMFBは年齢、性別による変化は無かったが、GMFGは、年齢とともに低下傾向であった(Inagaki et al. BBA 1670,208-216,2004)。[3]ラット脳凍結損傷モデルにおけるGMFBの発現変化:Wistar系ラットの大脳皮質に凍結損傷を作成し、損傷後のGMFBの発現変化を検討した。その結果、GMFBは、損傷周囲の反応性アストロサイトに強く発現していた。mRNAおよびタンパク発現は、損傷後上昇し、14日をピークに以降減少した。これらの結果から、脳損傷後の修復過程においてGMFBが何らかの役割を担っていることが考えられた(Hotta et al. Mol.Brain Res.,133,71-77,2005)。本年度は、ヒトおよび、マウスのGMF-gamma(以下GMFG)のgenomic DNAの解析を進めた。また、昨年度確立したラットGMF-beta(以下GMFB)、GMFGに対するEnzyme Immunoassay(EIA)系を用いて、ラットおよびヒト臓器における分布、血清中の年齢による変化をを検討した。Promoter部位はTATA lessで、housekeeping gene様のGC rich promoterであった。また、転写開始点が数カ所あることが判明した。ルシフェラーゼアッセイによりエンハンサー領域の解析を行った。ヒトGMFGプロモーターについては報告し(Kawai et al.BBA 1625(2003)246-252)、マウスGMFGプロモーターについては投稿準備中である。[2]Enzyme Immunoaasay(EIA)系によるGMFsの定量:昨年度確立したラットGMFB、GMFGに対する特異的抗体によるEIA系を用いて、ラットおよびヒトの各種臓器中のGMFB、GMFGの濃度を測定した。その結果、GMFBは、中枢神経でもっとも発現が高く、それ以外に、脾臓、胸腺、肺、腸管にも分布していた。

一方、GMFGは、胸腺での発現が圧倒的に高く、ついで、脾臓に発現が高かった。また、ラットおよびヒト血清中濃度を測定したところ、GMFBは年齢、性別による変化は無かったが、GMFGは、年齢とともに低下傾向であったが、性別による相違は無かった(Inagaki et al.BBA 1670(2004)208-216)。マウスGMFGのgenomic DNAをクローニングし、塩基配列を決定した。その結果、ヒトと同様、マウスもGMFGは7つのexonより構成されることが判明した。Promoter部位はTATA lessで、housekeeping gene様のGC rich promoterであった。ルシフェラーゼアッセイによりエンハンサー領域の解析を行った。また、転写開始点が数カ所あり、現在解析を進めている。[2]ラット脳凍結損傷モデルにおけるGMFBの発現変化:Wistar系ラットの大脳皮質に凍結損傷を作成し、損傷後のGMFBの発現変化をRT-PCR、Western Blot、免疫組織化学、EIAを用いて検討した。抗体は、昨年度確立したラットGMFB対する特異的抗体を用い、また、タンパクの定量には、この抗体を使用したEIA系を用いた。その結果、GMFBは、損傷周囲の反応性アストロサイトに強く発現していた。mRNAは、損傷後7日で上昇し、14日をピークに以降減少した。GMFBタンパクの発現は、損傷後1日で上昇し、14日をピークに以降減少した。これらの結果から、脳損傷後の修復過程においてGMFBが何らかの役割を担っていることが考えられた。
エリシター誘導性プログラム細胞死におけるミトコンドリア・液胞の機能解析

1)新規細胞死制御候補因子の単離と機能解析比較ゲノム解析用モチーフ検索ツールを開発・活用することにより、シロイヌナズナのゲノムから新規細胞死制御候補因子を単離し、機能解析を進めた。哺乳動物のアポトーシス抑制因子IAPの機能ドメイン(BIR)に類似したBR-like domainを持つ一群の遺伝子(ILP family)を動植物の双方から単離した。AtILP2が細胞死抑制因子として機能する可能性が示唆された。IAPを阻害しアポトーシスを促進する哺乳動物のミトコンドリア因子Smacと共通のドメインを持つシロイヌナズナの遺伝子群AtSmacsを単離した。AtSmac1がミトコンドリアに局在し細胞死促進活性を持っことが示唆された。2)Ca^<2+>シグナル伝達系を介した細胞死の制御とオルガネラエリシター誘導性過敏感細胞死誘導過程において、PCD誘導に先立ち、ミトコンドリア活性のマーカーと考えられているMTT還元酵素活性の急激な低下が観察された。エリシターにより急激に発現が誘導されるCa^<2+>活性化型プロテインキナーゼを単離し、発現抑制株を作成したところ、膜電位依存性Ca^<2+>チャネルOsTPC1の破壊株と同様にMTT還元酵素活性活性の低下とPCDの抑制が見られた。PCD誘導過程においてCa^<2+>シグナル伝達系が、ミトコンドリア等オルガネラの制御に重要な役割を果たす可能性が示唆された。3)細胞死実行過程における液胞・細胞骨格系の動態BY-2細胞のエリシター誘導性同調的PCD誘導系を用いて、細胞死の実行過程における液胞、液胞膜、微小管、アクチン繊維の動態を可視化解析した。PCDの最終段階で誘導される液胞膜の透過性変化に先立ち、液胞膜構造の再編成が誘導されること、液胞膜構造の変化は、アクチン繊維によって調節され、アクチン重合阻害剤によりPCDが促進されることが明らかとなった。感染防御など植物のストレス応答にプログラム細胞死(PCD)が重要な役割を果たすが、その実行や制御の分子機構は不明な点が多い。本研究では、細胞周期を同調させた培養細胞を用いて、感染シグナル(エリシター; PAMP)により同調的な細胞死が誘導される実験系を構築し、動植物の比較ゲノム解析により新規プログラム細胞死制御因子を同定・機能解析すると共に、特にミトコンドリアや液胞などのオルガネラが細胞死誘導に果たす役割を解析することを目指した。エリシターによりPCDが誘導されたタバコBY-2細胞では、細胞質の凝集などの形態的な変化が観察されたが、顕著な核の形態変化やDNAの断片化は観察されなかった。一方PCDに先立ち、エリシター添加後数時間以内にMTT還元活性が低下し、ミトコンドリアの膜電位の脱分極が誘導されると共に、細胞内のATP量の減少が見られた。MTT還元活性の低下は、細胞質のCa^<2+>動員などの初期応答反応と同様、プロテインキナーゼ阻害剤やイオンチャネル阻害剤により濃度依存的に抑制された。また膜電位依存性Ca^<2+>チャネル機能破壊株のイネ培養細胞では、エリシター誘導性細胞死と共にMTT還元活性の低下が著しく抑制された。一方、植物では全く未知だが、動物のミトコンドリアにおいて細胞死制御因子として機能するBcl-xLを過剰発現させたタバコ培養細胞では、エリシターによるミトコンドリア膜電位の脱分極や、ATP量の減少が抑制され、細胞死が阻害された。こうした結果から、植物の感染シグナル誘導性細胞死において、Ca^<2+>チャネルを介したシグナル伝達系の下流で、ミトコンドリアの機能低下が誘導され、PCDの制御において重要な役割を果たす可能性が考えられた。またエリシターによるPCD誘導過程の液胞を経時的に観察したところ、細胞死に先立って細胞質糸が減少し、液胞の構造が変化することが明らかとなった。

3)細胞死実行過程における液胞・細胞骨格系の動態BY-2細胞のエリシター誘導性同調的PCD誘導系を用いて、細胞死の実行過程における液胞、液胞膜、微小管、アクチン繊維の動態を可視化解析した。PCDの最終段階で誘導される液胞膜の透過性変化に先立ち、液胞膜構造の再編成が誘導されること、液胞膜構造の変化は、アクチン繊維によって調節され、アクチン重合阻害剤によりPCDが促進されることが明らかとなった。
分裂酵母網羅的遺伝子ネットワーク構築と染色体制御遺伝子の同定

我々は多数の分裂酵母温度感受性変異株を遺伝的に解析することにより原因遺伝子の解明および変異遺伝子制御因子の発見、その中でも特に染色体制御に関わる因子の発見を目指している。300株の変異体に分裂酵母ゲノムDNAライブラリープラスミドを形質転換し、239株に関して温度感受性を相補するコロニーの取得に成功した。温度感受性が相補された7426個のコロニーからプラスミドを回収しDNA配列を解析することにより628種類のプラスミドが取得されたことが明らかとなった。1株当たり2.6種類のプラスミドが得られており、当初の目的通り変異原因遺伝子とその制御因子が多数取得されている。プラスミド上には複数の遺伝子が含まれるため、それぞれどの遺伝子が温度感受性を相補するかを決定する必要がある。現在までのところ450種類のプラスミドに関して温度感受性を相補する遺伝子の確定に成功している。この結果、Gタンパク質関連因子・ファルネシルピロリン酸シンテターゼ・2C型プロテインホスファテースなどが様々な遺伝子と遺伝的相互作用を示すという新しい遺伝子ネットワークが明らかとなった。また、染色体制御に欠損を示す温度感受性変異株から様々な遺伝子が遺伝的相互作用を示す因子として取得された。これらの遺伝子にはすでに染色体制御に機能することが報告されているものも含まれていたが、それに加えて機能未知の遺伝子やこれまでは染色体制御以外の機能を果たすと考えられていた遺伝子なども多く含まれていた。このことは本研究によって新規の染色体制御因子が多数同定されたことを示している。我々は多数の分裂酵母温度感受性変異株を遺伝的に解析することにより原因遺伝子の解明及び変異遺伝子制御因子の発見、その中でも特に染色体制御に関わる因子の発見を目指している。今年度我々は300株の分裂酵母温度感受性変異株に分裂酵母ゲノムライブラリーを形質転換する作業を完了した。またゲノムライブラリーを形質転換することにより温度感受性が回復した分裂酵母から540個の分裂酵母ゲノム断片を回収した。しかしながらこのゲノム断片には多数の遺伝子が存在している。現在回収したゲノム断片に含まれる遺伝子の内、どの遺伝子が温度感受性を相補するために必要であるかを確定する作業を行っている。これらのうち122個の断片に関して温度感受性を相補する遺伝子を確定した。この結果、同一の温度感受性変異株が複数の遺伝子により相補されることが明らかなった。これはこの複数の遺伝子が機能的相互作用をしていることを示している。我々の発見した相互作用にはこれまで報告のないものが多数含まれており、本研究により多数の新規遺伝的相互作用が明らかとなった。さらに、我々が当初予想した通りいくつかの遺伝子は複数の温度感受性を相補することが明らかとなった。これらの遺伝子は生物中で様々なプロセスを制御している非常に重要な因子であると予想される。また温度感受性を相補する遺伝子には変異原因遺伝子とその制御因子(多コピーサプッレサー)が含まれる。四分子解析法を用いて変異原因遺伝子の確定し、我々が多数の新規温度感受性変異株を取得したことが明らかとなった。
新しい脂質ラフト特異的プローブの開発とその利用

脂質ラフトはスフィンゴ脂質とコレステロールに富んだ細胞膜脂質ドメインで、膜を介する情報伝達、細胞内膜輸送、ウイルスやバクテリアの感染など様々な生物現象に重要であると考えられている。しかし、脂質ラフトの実体についてはまだ分からないことが多い。私は食用キノコを材料にスフィンゴミエリンとコレステロールの複合体に特異的に結合するタンパク質のスクリーニングを行い、新規タンパク質を同定した。本研究ではこのタンパク質と他の脂質ラフト結合性のプローブを併用して脂質ラフトの構造と動態を明らかにするとともに、ウイルス感染における脂質ラフトの役割の解明を目標にしている。本研究ではキノコを材料にスフィンゴミエリン(SM)とコレステロール(Chol)の複合体に特異的に結合するタンパク質と他の脂質ラフト結合性のプローブを併用して脂質ラフトの構造と動態を明らかにするとともに、ウイルス感染における脂質ラフトの役割の解明を目指した。まず初めにこのタンパク質の脂質への結合をいくつかの方法を用いて調べた。その結果、ELISA法、リポソーム結合法において、SM/Cholに特異的に結合することがわかった。このタンパク質を用いて細胞を染色すると、細胞表面は一様に染まり、SMのプローブであるライセニンと共局在した。さらにラフトに存在するといわれているタンパク質(H-Ras)と共局在する一方、ラフト依存的でないK-Rasとは一致しなかった。以上の結果からこの新規タンパク質がラフトマーカーとして使用できることが示唆された。そこで、我々は細胞内にコレステロールが蓄積する病気、ニーマンピックC型病患者(NPC)の細胞を用いて、この細胞の脂質ラフトがどうなっているか調べた。正常細胞では細胞表面が一様に染まるのに対し、NPC細胞では細胞表面にドメインを形成していることが示唆された。さらに近年インフルエンザウイルスの感染に脂質ラフトが重要な役割をしているという報告があることから、このタンパク質を用いて、ウイルスの感染阻害を試みた。その結果、タンパク質があると、インフルエンザウイルスが細胞からリリースされるのが阻害されることがわかった。まだどのような機構で阻害されるかは明らかになっていないが、今後の研究により、このタンパク質が抗インフルエンザ薬として使用できる可能性を示唆している。本年度は脂質の詳細な分布を調べるため、共焦点レーザー顕微鏡や全反射顕微鏡によるプローブの分布の解析を行うとともに、laurdanやdi-4-ANEPPDHQ(Proc Natl Acad Sci USA 100, 15554 (2003))等の膜環境依存性の色素を併用し、膜の物性と脂質の分布との相関を調べた。理化学研究所・小林脂質生物学研究室の岸本琢磨研究員との共同研究により行った。本研究ではコレステロールの代謝に異常のあるニーマンピックC型病の患者の細胞を用いて実験を行った。細胞表面を脂質ラフト結合タンパクを用いて観察したところ、正常な人の細胞と、患者の細胞では染まり方が異なり、細胞表面のコレステロールなどの脂質の分布が異なることが示唆された。本年度は脂質ラフトの構造を明らかにするために、共焦点レーザー顕微鏡を初め、全反射顕微鏡、電子顕微鏡など様々な顕微鏡をもちいて、脂質ラフトの詳細な構造解析を行った。その結果、ラフトに存在する脂質とタンパク質の共局在が確認でき、ラフトの構造が明らかになりつつある。それに加えて、二番目の目的であるウイルス感染における脂質ラフトの役割の解析を調べるために、インフルエンザウイルスを用いた実験を開始した。その結果、脂質ラフト結合タンパク質がインフルエンザウイルスの感染を阻害する予備結果が得られた。どのような機構で阻害するかはこれから研究する必要があるが、本研究は順調に進展していると思われる。これまでの一連の研究を通して脂質ラフトは非常にヘテロであり、脂質ラフトの全体像を理解するためには数多くの脂質プローブが必要であることを痛感している。例えば私たちがスフィンゴミエリンを検出するために用いているライセニンはスフィンゴミエリンがクラスターを結合するときにのみ結合する。一方最近スフィンゴミエリンに結合するタンパク質がいくつか報告されているが、これらのタンパク質とライセニンが同じようなスフィンゴミエリンの認識の仕方をしているのかはわかっていない。

今後はエキナトキシンやクラムライシンのような他のスフィンゴミエリン結合タンパク質とライセニンとの違いを詳細に検討し、もし違いがあればこれらのプローブを駆使することにより、細胞におけるスフィンゴミエリンの集合状態の詳細の情報を得ることを試みる。同様の研究をコレステロールについても行い、脂質ラフトの全体像を理解することを試みる。一方でタンパク質プローブを用いて脂質を標識する方法は結局はタンパクを見る実験になり、脂質の分子振動といったような脂質ラフトの物性の本質にかかわる部分はこの方法では見ることができない。この点を解決するため現在ラマン顕微鏡を用いて脂質を見る方法を導入し、検討を始めている。今年度はこのようなタンパクプローブを使わない脂質の解析方法についても検討したい。次年度に集中して予算を使用する目的で825,216円繰り越した。予算は主として消耗品の購入(プラスチックディッシュ、プラスチックピペット、培地、血清、脂質実験のためのガラス試験管、蛍光標識脂質、抗体)に充てる。
動的な恒星進化計算から迫る、大質量星の超新星直前における激しい質量放出の起源

大質量(太陽の8倍以上)の星は、超新星という大爆発でその一生を終えることが知られている。近年様々な観測データから、一部の大質量の星は超新星が起きる直前に、激しい質量放出が起きることが分かってきた。しかし、その原因はまだ分かっていない。質量放出の起源の候補として、爆発直前の星の外層における、波などによるエネルギー散逸が挙げられている。そこで本研究では、恒星進化計算に爆発直前におけるエネルギー生成を取り入れることで、どれ程の質量放出率が引き起こされ、また超新星の観測的特徴にどれほどの影響を与えるのかを調べることを目的とする。
エピジェネティクスの制御をめざした新しいレトロウイルスベクターの開発

本研究ではshRNA、miRNA及び特定のmiRNAを阻害する新規デコイRNA(TuDRNA)をそれぞれ効率良く発現するユニットをデザインし、これを搭蔵したベクターを作製、改良しながら、ヒトの主要なクロマチン構造変換因子であるSWI/SNF複合体に注目して癌のエピジェネティクスに関する解析を行なった。その結果SWI/SNF複合体の触媒サブユニットの1つであるBrmの発現を欠失したヒト癌細胞株では、外からMLVやHIVを基盤としたベクターを導入してもウイルス遺伝子の発現は長時間持続せず、stochasticなgene silencingがおきることが判明し、Brm型SWI/SNF複合体がレトロウイルスの安定発現を維持するのに必須であることが示された。またBrmの発現欠失は、これらの細胞株の癌の悪性度を増加させていてBrmの癌抑制遺伝子としての機能が明確となった。これらの細胞株のゲノム中には、正常なBrm遺伝子は存在し、しかも活発に転写を受けていて、post-transcriptionalな抑制による制御であることがわかった。この抑制機構として、Brm mRNAを標的とするmiRNAが関与するという作業仮説を立てて実験を行ない、実際にmiR-199aが、Brmを標的としていることを証明した。さらに多くのがん細胞株において、Brmの発現欠失細胞株では例外なしにmiR-199aの発現が高く、反対にBrmの発現がある細胞株はすべてmiR-199aの発現が低かった。我々はさらにmiR-199aとその標的であるBrmが転写制御因子Egr1を介してdouble-negative feedback制御を形成していることを実証した。また同様のdouble-negative feedback制御が、各種の細胞株でmiR-21とその標的のNFIBでも成立することを実証した。また、ヒトRequiemタンパク質がNFκBファミリー内のRelB/p52とSWI/SNFクロマチン構造変換因子の特異的なリンカーとして機能することを明らかにした。そしてREQ遺伝子に対するshort hairpin RNAを高発現するレトロウイルスベクターをRelBの恒常的亢進が見られる細胞株へと導入してREQタンパク質の発現量を抑制すると、平板培養における増殖速度に影響を与えることなしに非足場依存性増殖を効率良く抑制することから、REQが有力な癌の治療標的となることが示された。本研究では、siRNAを恒常的に発現して遺伝子の発現を抑制するレトロウイルスベクター、並びにレンチウイルスベクターを設計、作製しその抑制活性や抑制の維持期間を比較研究することから開始した。その結果、MLVやMSCVを基盤としたレトロウイルスベクターやHIVを基盤としたレンチウイルスベクターのLTRのU3配列中に、siRNAの前駆体として機能するshort hairpin (sh)RNAの発現ユニットを導入した場合には、いずれのベクターにおいても高い抑制活性がみられた。またpolIIIプロモーターの種類として、U6、H2ともに同程度の強い抑制活性を示した。このように開発したベクターに、GFP遺伝子、内在性BRG-1、Brm遺伝子に対するshRNA発現ユニットを搭載させたところ、実際にHela細胞内での標的遺伝子の発現は感染後3日より著しく低下した。さらにGFP遺伝子や内在性Brm遺伝子ではこのような抑制効果は、3ヶ月以上も安定して持続した。

Brmの発現を抑制された細胞では、外からMLVを基盤としたベクターを導入してもウイルス遺伝子の発現は長時間持続せず、Brm型SWI/SNF複合体がレトロウイルスの安定発現を維持するのに必須であるという我々のこれまでの観察を忠実に再現した。しかしBRG-1遺伝子の場合、発現抑制による細胞周期の停止のため細胞は長期間は維持されなかった。shRNA発現ベクターにより、GFP遺伝子の発現が恒常的に低下している細胞系を用い、96種の阻害剤キット(資材班から供給を受けた)からGFPの発現回復を誘導する試薬を検索し、これまでに1次検索を終えて5つの候補化合物を単離した。現在これらについて精査中である。shRNA発現ベクターの開発については、ほぼその目標を達成したので現在天然のmiRNAを発現するウイルスベクター、さらには、特定のmiRNAの生合成系を阻害するウイルスベクターの基本構造を設計し作製を始めている。本研究は、エピジェネティカルな遺伝子発現の制御の乱れやRNA干渉系の異常により生ずるヒト癌の制圧をめざして、その異常が生じる分子機構の解明を進めると共に、その成果に基づいた次世代型の遺伝子治療用のレトロウイルスベクターを開発することを目的としている。まず、shRNA発現ユニットを搭載したレトロウイルスベクター(MLV型)とレンチウイルスベクター(HIV型)の改良を進め、標的遺伝子の発現を1/100程度までに抑えかつ、その抑制活性が2ヶ月以上維持される能力をもつベクターを作出した。次に多くのがん細胞で発現が亢進していることが報告されているmiRNAの1つmiR-21に注目してその生合成系を解析した。そのプロモーター解析から、プロモーター上にはAP-1,PU.1,C/EBPα,NFI-Bの結合配列をもつエンハンサー配列が点在し、このうちAP-1,PU.1がTPA(PMA)刺激によるmiR-21遺伝子の発現誘導に必須であることが示された。AP-1とPU.1並びにこれらによって動員されるクロマチン構造変換因子SWI/SNF複合体により、一般に内在性AP-1活性が高いことが知られるヒト癌細胞でmiR-21の発現が上昇されているものと考えられる。また、独自に開発したアルゴリズムによりmiR-21の標的遺伝子の一つとしてNFI-Bを同定した。NFI-BはmiR-21遺伝子の基底レベルのプロモーター活性を抑制していることからmiR-21によるMFI-B遺伝子の発現抑制はmiR-21の安定発現に重要な働きをなしていて、positive-feedback系路が樹立されるものと考えられる。このことは新規に開発したmiRNA発現レトロウイルスによりmiR-21を細胞内で強制発現させて、内在性NFI-Bタンパク質の発現が抑制されたことによっても支持された。