hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ハードウェア/ソフトウェア協調設計に対する形式的検証とその要素技術に関する研究

1.多段プロパティ分割とその改良を用いた有界モデル検査手法の三段階以上への拡張前年度までに提案した有界モデル検査では二段階までの分割しか行えないため、初期状態から遠い位置に誤りがあった場合の検出が非効率的になるという問題があった、そこで、今年度は三段階以上の任意の分割が可能となるような手法の提案を行った。そのような分割方法では、各段階において異なるパラメータを使用できるため自由度が高い。そこで、効率的な探索が可能となるようなアルゴリズムを提案し、実験によりその効率性を確認した。また、手法全体に対してもよりフォーマルに再定義を行った。その結果、前年度よりも更に手法が詳細化・具体化され、手法の正当性が更に高まった。2.割り込み処理の具体的なモデル化まず、前年度までに扱えなかった割り込み処理について、並列モデルによってモデル化する手法を提案した。しかしながら、割り込みをモデル化した場合にはモデル全体の並列度が上昇し、検証の難易度が大幅に上昇する。そこで、並列モデルを逐次モデルに変換する技術である順序化を導入し検証の効率化を図った。既存の順序化手法では割り込みが扱えないためそれを割り込みを扱えるように拡張し、さらにSatisfiability Modulo Theory(SMT)ソルバを導入して考えられる全ての逐次記述を同時に出力できる手法を提案した。実験により、並列モデルの探索効率化手法である半順序簡約を用いた場合に比べて数倍の効率化を実現できていることが確認された。本年度は,以下の三種類の研究を行った。1.割り込みによるHW-SW間の通信を行う設計に対する形式的検証手法を実現するための調査を行い、検証方法の検討を行った。割り込みは任意のタイミングで発生し得るため、単純に扱うと計算量が増大してしまう。そこで、割り込み許可/禁止信号の解析により、割り込みが発生しうるタイミングを得る。さらに、割り込みにより送受信されるデータの依存を解析する事で、割り込みのタイミングが異なってもデータフローが同一である状況は単一事象として扱う。以上の工夫により状態数が削減され、実際的な設計が検証可能となると考えられる。2.大規模な設計に対する等価性検証では、計算量が設計規模や制御の複雑度などに対して指数的であるという問題がある。そこで、設計に対して等価な変換を適用して、同一の正規形に変換されれば二つの設計は等価であるという判定を行う手法を提案する。動作の解析を行わないため、高速な判定が可能であると考えられる。現在、本手法の項書き換えシステムへの帰着に向けて、項書き換えシステムの調査が完了している。3.既存の検証ツール開発では、入力となる設計記述言語の種類や抽象度が多様化しているという問題点がある。さらに、レジスタ転送レベル以上の高位設計の検証において重要であるワードレベルに対応する有用な中間表現は現時点で乏しい。そこで本研究では、FSMDと、システム依存グラフをベースとした効率的な中間表現を提案する。システム依存グラフを探索することにより検証に必要な情報を効率的に抽出でき、全ての設計をFSMDに変換することにより、入力言語に依存しない検証システムを開発可能となる。現在、提案する中間表現を実現するためのライブラリのうちFSMD部分の開発が完了している。1、高位合成を利用したデータパス抽象化による等価性検証手法まず、前年度までに提案した手法に対する証明を行った。等価性検証手法は数学的手法によるものであるため、手法自体に数学的正当性が求められる。したがって、昨年度までに提案した手法だけでは不十分であり、今回提案した証明と併せて始めて完全であると言える。具体的には、等価なデータパスを持つ二つのFSMDに対して成立するルールに対する数学的証明を行った。次に、それらのルールを適用するアルゴリズムを提案した。それらのルールは単独では意味を持たず、ルールを適用するアルゴリズムと併せて意味を持つものである。したがって、今回提案したアルゴリズムにより実設計への適用が可能となる。さらに、既存の等価性検証手法との比較実験を行った。提案した手法はルールベースであるため、特定の設計については既存手法よりも高速に等価性が証明できる可能性がある手法である。今回の比較実験により、条件分岐を多く含む設計に対しては、既存手法よりも提案手法の方が高速に等価性を証明できることを確認した。2、多段プロパティ分割とその改良を用いた限定モデル検査手法まず、前年度までに提案した二段階の手法に対し、更に多段階の限定モデル検査を適用する手法を提案した。第一段階の初期状態を無視したモデル検査による反例への到達可能性を検査する第二段階を、同様の分割手法で再帰的に分割する。これにより、更なるモデル検査の効率化に寄与できると考えられる。次に、実装をパブリックなモデル検査器であるNuSMVをベースとしたものに変更した。パブリックなモデル検査器を使用することにより、実験において提案手法による効果が確認しやすくなり、さらに汎用的な実験が可能となった。発表文献では、この新しく実装したツールを用いた実験を行っている。

また、手法全体に対してもよりフォーマルに再定義を行った。その結果、前年度よりも更に手法が詳細化・具体化され、手法の正当性が更に高まった。2.割り込み処理の具体的なモデル化まず、前年度までに扱えなかった割り込み処理について、並列モデルによってモデル化する手法を提案した。しかしながら、割り込みをモデル化した場合にはモデル全体の並列度が上昇し、検証の難易度が大幅に上昇する。そこで、並列モデルを逐次モデルに変換する技術である順序化を導入し検証の効率化を図った。既存の順序化手法では割り込みが扱えないためそれを割り込みを扱えるように拡張し、さらにSatisfiability Modulo Theory(SMT)ソルバを導入して考えられる全ての逐次記述を同時に出力できる手法を提案した。実験により、並列モデルの探索効率化手法である半順序簡約を用いた場合に比べて数倍の効率化を実現できていることが確認された。
一酸化窒素の慢性的合成阻害により誘導される微少管血管りモデリングの病態と分子機構

【目的】我々は一酸化窒素(NO)合成阻害薬(N^wnitro-L-arginine methylester、L-NAME)をラットに投与すると7日以内に冠動脈壁に単球の浸潤、monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1)の発現、サイトカインや増殖因子の発現などの動脈硬化性病変が生じ、28日以降には血管壁のリモデリング(線維、化中膜肥厚、軽度の内膜肥厚)が生じることを明らかにした。本研究の目的は、NO産生抑制による血管壁の炎症性変化がAT1受容体拮抗薬により修飾されるかどうかを明らかにすることである。【結果】1.L-NAME投与により単球の冠血管壁への浸潤、MCP-1の発現の増加、NF-kBの活性化を認めた。大動脈では、内膜への単球侵入の増加とO2^-産生を認めた。2.AT1受容体拮抗薬を同時投与した2群ではL-NAME投与群でみられた変化は防止された。【考察】NO産生抑制による血管壁の炎症性変化はAT1受容体拮抗薬同時投与により防止された。この炎症性変化はO2^-産生増加とNF-kBの活性化を伴った。したがって、本研究により、NO産生抑制モデルでの炎症性変化は局所アンジオテンシンIIの作用によって惹起されることが明かとなった。1.NO産生阻害による組織レニン-アンギオテンシン系の活性化.ラットにNO合成阻害薬を投与すると血管リモデリングの発生に先行して組織アンギオテンシン変換酵素ACE活性が増加すること(このとき血清ACE活性は増加していない)、ACE活性化は血管周囲線維化部位と内皮細胞であること、ACE阻害薬の同時投与によって血管リモデリングが予防されること、を報告した(J Clin Invest 1997)。さらに、アンギオテンシン受容体が増加していること、アンギオテンシン受容体AT1mRNA発現が亢進していること、これらの変化がL-arginineで防止できること、を発表した(1996年11月、米国心臓学会AHA)。現在、TGF-βの中和抗体によって組織ACE活性の増加が防止されるかを検討中である。2.実験モデルにおける心筋虚血の誘発.ブタNO合成阻害モデルにおいてパパベリンを冠動脈内に投与すると心電図ST低下と心筋乳酸産生が誘発された。対照動物では誘発されなかった。このことはパパベリンによって心筋虚血が生じたことを示す。現在、この心筋虚血の原因をマイクロスフェア法を用いて検討中である。3.NO産生阻害によって生じるレニン-アンギオテンシン系活性化の分子機構.培養内皮細胞ならびに平滑筋細胞にNO合成阻害薬を投与するとACEとAT1mRNAが増加することを発見した。現在、この分子機構を検討中である。【目的】我々は一酸化窒素(NO)今成阻害薬(N^wnitro-L-arginine methylester、L-NAME)をラットに投与すると7日以内に冠動脈壁に単球の浸潤、monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1)の発現、サイトカインや増殖因子の発現などの動脈硬化性病変が生じ、28日以降には血管壁のリモデリング(線維化、中膜肥厚、軽度の内膜肥厚)が生じることを明らかにした。
重合過程を利用して得られる高分子ウイスカーの生成条件の確立

ポリ(p-オキシベンゾイル)(POB)ウイスカーの生成を支配している速度過程を明らかにすべく、溶液重合での各段階の生成オリゴマーの重合度と生成量を高速液体クロマトグラフィーで追跡する基礎を確立した。この点に関してはさらに現在も研究を継続中である。また、溶媒の種類によるウイスカー長のコントロールの可能性を検討し、らせん転位をもったラメラ晶の数を制御することで任意の長さのウイスカーを調製できることを示した。POB以外の剛直高分子ポリ(2-オキシ-6-ナフトイル)やポリ(4-メルカプトベンゾイル)でウイスカー調製に成功した。さらに、ポリ(4-オキシ-4'-フェニルベンゾイル)(POPB)では、重合初期生成物中にらせん成長による結晶の積層形態が観察され、らせん転位による結晶成長の妥当性を支持した。p-アセトキシ安息香酸(p-ABA)とm-アセトキシ安息香酸(m-ABA)の溶液共重合を行った結果、m-ABAの仕込み量30mol%までウイスカー形態が観察され、そのウイスカー中のm成分を調べた結果数mol%しが結晶中には入っていないことが明らかになった。この例では溶液結晶化過程に律速されたウイスカー生成は分別効果をともなったオリゴマーの結晶化で起こっていることを示した。一方、p-ABAと4'-アセトキシビフェニル-4-カルボキシリックアシド(ABPA)との溶液共重合では数mol%のABPAを仕込むことでウイスカー形成は阻害され、球状の形態が観察された。これは溶液中での重合による重合度の上昇とともにオリゴマーの融点が上昇するが、溶媒に溶解せずその重合温度で液・液相分離が起こる。そして、濃厚相中でのさらなる重合度の増加で融点上昇が起こり、結晶析出が起こることで説明できる。このような例はポリ(p-オキシシンナミル)でも見いだされ、球状形態の重合温度や重合時間依存性の検討からオリゴマーの液・液相分離を通して析出が起こっていることが実証された。このように、重合結晶化の新しい機構を見いだした。これに基づいて従来のウイスカー生成とともに重合過程での形態制御法をさらに発展さすべく現在も勢力的に研究を進めている。ポリ(p-オキシベンゾイル)(POB)ウイスカーの生成を支配している速度過程を明確にすべく、溶液重合での各段階の生成オリゴマーの重合度と生成量を高速液体クロマトグラフィーで追跡した。各種溶媒を用いた場合均一重合によって生成するオリゴマー分子の分子量分布と生成結晶の形態の関係を明確にし、結晶化を起こすオリゴマーの臨界長を求めた。これらの結果を総合することで一般的なウイスカー生成条件の確立を目指している。また、POB以外の剛直高分子ポリ(2-オキシ-6-ナフトイル)やポリ(4-メルカプトベンゾイル)でウイスカー調製に成功した。p-ABAとm-ABAの溶液共

重合を行った結果、m-ABAの仕込み量30mol%までウイスカー形態が観察され、そのウイスカー中のm成分を調べた結果数mol%しか結晶中には入っていないことが明らかになった。この例では溶液結晶化過程に律速されウイスカー生成は分別効果をともなった結晶化で起っている。一方、p-ABAと4'-アセトキシビフェニル-4-カルボキシリックアシド(ABPA)との溶液共重合では数mol%のABPAを仕込むことでウイスカー形成は阻害され、球状の結晶形態が観察された。これは溶液中での重合で重合度の上昇とともにオリゴマーの融点が上昇するが溶媒に溶解せず重合温度で液・液相分離が起こる。そして、濃厚相中でのさらなる重合度の増加で融点上昇が起こり、結晶析出が起こることで説明できる。このように、重合結晶化の新しい機構を見い出しており重合過程での形態制御法を発展さすべく勢力的に平成6年度も研究を進めて行く予定である。本年度は、昨年から継続していたポリ(p-オキシベンゾイル)(POB)ウイスカーの生成を支配している速度過程を明らかにすべく、溶液重合での各段階の生成オリゴマーの重合度と生成量を高速液体クロマトグラフィーで追跡する基礎を確立した。この点に関してはさらに現在も研究を継続中である。POB以外の剛直高分子ポリ(4-オキシ-4'-フェニルベンゾイル)(POPB)についてもウィスカ-調製を試みたが針状結晶を得ることができなかった。しかし、重合初期生成物中にらせん成長による結晶の積層形態が観察され、らせん転位による結晶成長の妥当性を支持した。p-アセトキシ安息香酸(p-ABA)とm-アセトキシ安息香酸(m-ABA)の溶液共重合を行った結果、m-ABAの仕込み量30mol%までウイスカー形態が観察され、そのウイスカー中のm成分を調べた結果数mol%しか結晶中には入っていないことが明らかになった。この例では溶液結晶化過程に律速されたウイスカー生成は分別効果をともなったオリゴマーの結晶化で起こっていることを示した。一方、p-ABAと4'-アセトキシビフェニル-4-カルボキシリックアシド(ABPA)との溶液共重合では数mol%のABPAを仕込むことでウイスカー形成は阻害され、球状の形態が観察された。これは溶液中での重合による重合度の上昇とともにオリゴマーの融点が上昇するが、溶媒に溶解せずその重合温度で液・液相分離が起こる。このような例はポリ(p-オキシシンナミル)でも見いだされ、球状形態の重合温度や重合時間依存性の検討からオリゴマーの液・液相分離を通して析出が起こっていることが実証された。このように、重合結晶化の新しい機構を見いだした。これに基づいて従来のウイスカー生成とともに重合過程での形態制御法をさらに発展さすべく現在も勢力的に研究を進めている。
レンサ球菌症抵抗性のヒラメの生物特性の解明

選抜育種したレンサ球菌抵抗性及び感受性のヒラメの家系の生物特性の解析と関連遺伝子座の詳細化を目的に物理地図への発現遺伝子のマッピングを進めた。抵抗性の個体は感染後に単球や顆粒球の増加が起こり自然免疫系が活性化されるのに対して、感受性の個体では自然免疫系の活性化が見られなかった。物理地図の詳細化により抵抗性に寄与率の高い連鎖群10番の領域にはTLR21及びNKEFが存在することが分かった。そこで、抵抗性と感受性、養殖魚のゲノム塩基配列を比較したところ、抵抗性の個体ではTRL21の発現調節領域に特異的な一塩基多型が見られ、感受性の個体では第9エキソンとイントロンにまたがる領域の欠損が同定された。4つのQTLマーカーで選抜されたレンサ球菌感染症抵抗性の家系のヒラメ及びコントロールのヒラメの受精後6ヶ月の個体にレンサ球菌を腹腔内注射することにより感染を成立させた。感染後、2時間、4時間、8時間、10時間及び2日目に血液及び腎臓の採取を行い、抽出したRNAをもとにcDNAライブラリーを作成し、Illumina社のGenetic Analyger IIによる網羅的塩基配列の解析を行った。1サンプル当たりの解析数は平均2000万リードであった。得られた配列情報をNCBIで公開されているヒラメの発現遺伝子の配列にマッピングすることによって、解析したヒラメの腎臓で実際に発現している遺伝子の相対的なコピー数の比較を行った。腎臓特異的に発現している遺伝子群をターゲットとしたためマッピング率は5パーセントであった。解析の結果、レンサ球菌感染症抵抗性の個体では、感染後自然免疫に関連するインターロイキンやToll like受容体、NKEF、補体、チゾチーム遺伝子以外にc-kit遺伝子やdct.コルチゾールなどリンパ球の幹細胞や色素細胞の分化に関連する遺伝子の発現も多く見られた。また、抵抗性の家系では感染前からToll like受容体の遺伝子群の発現が高いことが分かった。また、感染後にサンプリングすることなく飼育実験を行って生き残ったヒラメでは無眼側が黒化する傾向が見られた。以上のことから、これまでの顆粒球やマクロファージの測定の結果とあわせて、選抜されたレンサ球菌耐病性のヒラメの家系では、元々自然免疫系の活性が高く、感染後にさらに自然免疫系が活性化されるために耐病性を示す可能性を示唆する。また、リンパ球や色素細胞の分化に関連する遺伝子の発現も増加し、感染後生存した個体では無眼側で黒化が進むことは極めて興味深い。この様に、研究計画通りに、次世代シークエンサーを使用した網羅的発現解析では、直接コピーをを比較出来るため、DNAチップによる解析よりも正確に発現様式を解析出来ることが証明された。本研究では、QTL解析により同定されたDNAマーカーを用いて選抜育種したレンサ球菌抵抗性のヒラメがどの様な分子カスケードの活性化によりハダムシ抵抗性の表現型を獲得したかを解明することを目的にしている。本年度は、昨年度の研究でレンサ球菌抵抗性の家系で感染後に発現が増加することが分かっている遺伝子(インターフェロン、インターフェロン制御因子、Toll2, MHC遺伝子、TNF、NKEF、IL-1、マクロファージ活性化因子、ガレクチン、セリンプロテアーゼ)を物理地図にマッピングを行った。また、抵抗性家系、感受性家系、市販のヒラメを材料に、レンサ球菌抵抗性の家系特異的な一塩基多型がこれらの遺伝子のコーディング領域にないかについて調べた。また、レンサ球菌ワクチンを投与しても発現増強が見られるかについて調べた。その結果、上記遺伝子のうちTNFとNKEFはレンサ球菌抵抗性と連鎖する連鎖群10番にマッピングされた。特にTNFは選抜に用いたマーカーの近傍にマッピングされた。この2遺伝子以外は免疫応答関連遺伝子が多く存在する連鎖群15番にマッピングされた。現在のところ、これらの遺伝子のコーディング領域にはレンサ球菌抵抗性の家系特異的な一塩基多型は見つかっていない。しかし、もしTNFのゲノム遺伝子の発現調節領域上に特異的な一塩基多型が見つかればレンサ球菌抵抗性を制御する原因遺伝子の有力な候補となる。また、レンサ球菌用のワクチンを投与したところ、インターフェロン制御因子、Toll2、TNF、NKEF、IL-1、マクロファージ活性化因子の発現の増強が見られた。ただ、感染実験を行った場合と異なり、感受性の家系の個体でもこれらの遺伝子の発現の増加が見られた。以上のことから、TNFが抵抗性に関連する可能性、ワクチンの効果は育種の効果を超える可能性が示唆された。ヒラメの発現遺伝子の塩基配列の情報をNCBIから網羅的に検索し、約3,800遺伝子の塩基配列情報を得ることが出来た。

この中から65種類の免疫応答関連遺伝子と昨年度のIllumina社のGenetic Analyzer IIによる網羅的塩基配列の解析でレンサ球菌感染症抵抗性の家系の個体で感染後に発現が増加する遺伝子の配列情報をもとに発現解析用のプライマーの設計を行った。昨年度、レンサ球菌の感染実験を行った感染後、2時間、4時間、8時間、10時間及び2日目の抵抗性及び感受性の全96個体の腎臓から抽出したRNAをもとにcDNAの調整を行い、108遺伝子について経時的な発現変化をリアルタイムPCRで解析した。その結果、免疫応答に関連するインターフェロン、インターフェロン制御因子、Toll2, MHC遺伝子、TNF、NKEF、IL-1、マクロファージ活性化因子、及びガレクチン、セリンプロテアーゼ、c-kidの発現がレンサ球菌感染後10時間以降に増加していることが分かった。そこで、これらの遺伝子の物理地図へのマッピングを行った。その結果、レンサ球菌感染症抵抗性と連鎖した連鎖群7,10,11,17ではなく、連鎖群15に相当する領域にマッピングされた。この領域には多くの免疫応答関連遺伝子がマッピングされており、レンサ球菌抵抗性を決定づける遺伝子の発現ではなく、2次的に発現が増加する免疫応答関連遺伝子を同定している可能性がある。以上のことから、これまでの顆粒球やマクロファージの測定の結果とあわせて、選抜されたレンサ球菌耐病性のヒラメの家系では、自然免疫系が活性化されるために耐病性を示す可能性を示唆する。この様に、研究計画通りに、次世代シークエンサーを使用した網羅的発現解析で同定された遺伝子の発現様式が、集積回路チップを用いたリアルタイムPCRにより再現性を確認することが出来た。これまでの研究からレンサ球菌感受性の家系のヒラメは、レンサ球菌に感染させても自然免疫系が活性化されないため、抵抗性を示さないことが分かっている。そこで、今年度はヒラメの感受性家系にワクチンを投与した後にレンサ球菌の感染実験を行い、獲得免疫が活性化されるかを調べた。感染後2週間経過後にワクチンを打たない実験区では約半数の個体が死亡したのに対して、ワクチンを投与した感受性家系の試験区では死亡する個体がなかった。血液を採取してリンパ球をはじめ生体防御に関与する血球の計測を行ったところ、リンパ球の増加が見られたこと、抗体価が検出できるようになったことから自然免疫が活性化されにくい家系でもワクチン投与により自然免疫が活性化されることが分かった。マウスやヒトの免疫の研究では自然免疫が低い個体は、Bリンパ球やTリンパ球を増加させるリンフォカインの分泌が低いためワクチン効果が低いことが分かっており、ヒラメでは何らかの違う自然免疫系を活性化する分子カスケードが存在する可能性も示唆された。次に、これまでの連鎖解析から、連鎖群10番の特定領域が抵抗性に最も寄与率が高いことが分かっている。物理地図の詳細からこの領域にはTLR2、NKEFが存在することが分かっている。そこで、TLR2、NKEFと感染後発現が増加するTNF遺伝子について感受性、抵抗性、養殖魚のゲノム遺伝子の解析を行ったところ、抵抗性の個体のTLR2の発現調節領域に特異的な一塩基多型があること、逆に感受性の個体では第9エキソンとイントロンに欠損があることがわかり、これが抵抗性と感受性の表現型に深く関わっている可能性が示唆された。
プロポリスの機能性解明を目指した化学生物学的研究

ミツバチの生産物であるプロポリスは、健康食品素材として広く利用されている。本研究では、プロポリスの機能性について化学的および生物学的アプローチから解明することを目的とした。特に、韓国済州島産およびソロモン諸島産のプロポリスの成分研究を行い、済州島産プロポリスについては現地における調査も行うことで、起源植物(プロポリスの原料植物)が明日葉であることを明らかにした。ソロモン諸島産プロポリスからは、いくつかの新規プレニルフラボノイドを見出した。さらに、沖縄産プロポリスおよびその構成成分に関するin vitroおよびin vivoにおけるガン血管新生抑制活性についても評価した。ミツバチの生産物であるプロポリスは、現在、健康食品素材として広く利用されている。プロポリスの原料は樹脂などの植物由来物質であるが、実際の成分組成はミツバチが利用する植物種(起源植物)によって異なる。そこで本研究では、プロポリスの起源植物を化学的および生物学的アプローチから解明することを目的とした。さらに、プロポリスや起源植物、またそこから単離、同定した成分についてガン血管新生抑制活性を中心とした生理活性評価を行い、最終的にはプロポリスの機能性に物質レベルでの科学的根拠を与えることを目標とした。前年度は、韓国済州島産のプロポリスについて、その詳細な成分研究と起源植物の探索を実施したが、本年度はソロモン諸島産プロポリスの成分研究とガン血管新生抑制活性を中心に研究を進めた。ソロモン諸島産プロポリスは、前年度までの研究から新たなタイプのプロポリスであることが判明していたが、今年度のさらなる成分研究により、新規化合物を含むいくつかのプレニルフラボノイドを同定することに成功した。さらに、沖縄産プロポリスから見出されていたnymphaeol-AおよびBなどのプレニルフラボノイドがソロモン諸島産プロポリスにも含まれていることが明らかになり、ソロモン諸島と沖縄産プロポリスは同様な起源植物Macaranga tanariusであることが考えられた。nymphaeol-AおよびBは、in vitroおよびin vivoにおいてもガン血管新生抑制活性を示し、ウエスタンブロッティング法による解析から、それぞれの化合物の分子レベルにおける血管新生抑制活性機構を明らかにすることもできた。前年度までに、ソロモン諸島産プロポリスの成分研究とガン血管新生抑制活性を中心に研究を進めてきたが、本年度も引き続きソロモン諸島産プロポリスを中心に研究を進めた。前年度までの研究から、ソロモン諸島産プロポリスは新たなタイプのプロポリスであることが判明していたが、今年度のさらなる成分研究により、ソロモン諸島産プロポリスより新規化合物を含むいくつかのプレニルフラボノイドを同定することに成功した。さらに、沖縄産プロポリスから見出されていたnymphaeol-AおよびBなどのプレニルフラボノイドがソロモン諸島産プロポリスにも含まれていることが明らかになった。nymphaeol-AおよびBは、in vitroおよびin vivoにおいてもガン血管新生抑制活性を示し、ウエスタンブロッティング法による詳細な解析より各化合物の分子レベルにおける血管新生抑制活性機構を明らかにすることもできた。その他、パプアニューギニアやセネガル産プロポリスについても成分研究を実施した。特に、プロポリスや起源植物、さらにそこから単離、同定した成分についてガン血管新生抑制活性を中心とした生理活性評価を行い、最終的にはプロポリスの機能性に物質レベルでの科学的根拠を与えることを目標とした。本年度は、主に韓国産プロポリスとソロモン諸島産プロポリスを対象に研究を進めた。まず韓国の様々な地域のプロポリスについて構成成分を調べたところ、済州島産プロポリスが韓国の他産地のプロポリスと異なる成分組成を有することが明らかとなった。そこで、済州島産プロポリスの詳細な成分研究を行い、8個の新規カルコン類と19個の既知化合物を同定した。既知化合物の大半は明日葉(Angelica keiskei)の含有成分として報告されていたため、済州島産プロポリスの起源植物は明日葉である可能性が強く示唆された。そして済州島現地で調査を行った結果、起源植物として推測された明日葉の傷や茎の切断面から滲出する乳液を集めるミツバチの観察に成功した。さらに、済州島産プロポリスと明日葉乳液の成分組成の一致を確認し、同プロポリスの起源植物を明日葉と同定した。

明日葉がプロポリスの起源植物であるという知見は、本研究ではじめて得られたものであった。一方で、ソロモン諸島で採集されるプロポリスについても成分研究を行った。その結果、新規化合物を含むいくつかのプレニルフラボノイドを同定し、ソロモン諸島産プロポリスは新たなタイプのプロポリスであることを明らかにした。当該年度の研究計画としては、韓国済州島産やソロモン諸島産に代表される特異な成分組成を有するプロポリスについて、詳細な構成成分を明らかにすることと生理活性を評価することにあった。韓国済州島産プロポリスについては、前年度までに成分研究を実施し、その成果はPhytochemistry誌に投稿、受理され、印刷中である。また、済州島産プロポリスの起源植物が明日葉であることも解明でき、この成果はBiosci. Biotechnol. Biochem.誌に発表した。なお、これら一連の済州島産プロポリスに関する研究に関しては、2012年度(平成24年度)日本農芸化学会本大会において学会のトピックス賞にも選出された。一方、ソロモン諸島産プロポリスについても、新規なプレニルフラボノイド化合物を見出し、その研究成果は日本農芸化学会をはじめとするいくつかの学会で発表した。第14回静岡ライフサイエンスシンポジウムにおいては、本研究成果は最優秀研究発表賞に選ばれ、成分研究に関しては、Biosci. Biotechnol. Biochem.誌およびJ. Agric. Food Chem.誌にも発表した。ソロモン諸島産プロポリスより見出したプレニルフラボノイドの中には、沖縄産プロポリスから見つけられていたnymphaeolと呼ばれる化合物もあったが、それらについてガン血管新生抑制活性を調べたところ、顕著な抑制活性が見出された。また、ウエスタンブロッティング法を用いた分子レベルにおける解析も行い、この成果も論文発表予定である。以上のことから、本研究課題については、おおむね順調に進展していると判断できる。当該年度の研究計画としては、韓国済州島やソロモン諸島産に代表される特異な成分組成を有するプロポリスについて、詳細な構成成分を明らかにし、起源植物を解明することにあった。韓国済州島産プロポリスについては、新規化合物を複数個同定し、起源植物が明日葉であることを解明することにも成功した。起源植物は明日葉であったが、明日葉がプロポリスの起源植物の一つとして利用されているという研究報告はこれまでになく、今回の研究により、新たな知見が得られた。この研究成果は、学術的に新規性があるだけでなく、済州島でのプロポリス生産における品質管理に役立てられるため、済州島の養蜂産業の発展につながる成果であることが期待された。
混酸・加熱処理と選択的レーザー溶融法を応用した次世代骨誘導チタンメッシュの創成

2018年度は研究機関の最終年度として以下の研究成果を得た。昨年度までの研究で、積層造形チタン人工骨の表面処理として混酸・加熱処理がもっとも高い骨形成能をもつことを、メッシュ状にした積層造形チタン人工骨設置ラット頭蓋骨骨欠損モデルで証明した。擬似体液を用いた非生体において、混酸・加熱処理の高い骨形成能は報告されているが、生体内での他処理法と比較・検証した報告は世界で初めてである(Yamamoto K, Ueno T, et. al. RSC Advanced 2018)。この研究をさらに発展させ、骨欠損部に形体を一致させた埋め込み型積層造形チタン人工骨を用いて欠損部における積層造形チタン人工骨の骨形成能評価を行なった。非脱灰研磨標本とマイクロCT観察において積層造形チタン人工骨には周囲から活発な骨形成がなされ骨と一体化する様子が観察された。この結果は、積層造形チタン人工骨が生体内においてカスタムメイド人工骨として使用される可能性を強く示唆している。またヒトの顎骨欠損症例においても患者CTデータをもとにカスタムメイドで積層造形チタンメッシュを作製・使用(大阪医科大学:特定臨床研究審査委員会にて特定臨床研究として承認)し、欠損部への適合性、安全性、骨形成有効性の評価を行い期間内に7名の患者で、良好な結果を得ることができた(Ochi A, Ueno T, et .al. The 26th EACMFS, Munich, 2019. Inoue K, Ueno T, et. al. Implant Dentistry 2019)。今後は、引き続き積層造形チタン人工骨の有効性と安全性を検証して実用化を目指す。この課題では、生体に親和性の高いチタンを自由に造形できる積層造形法Selective Laser Melting法により自由造形を行ったチタン人工骨に生体活性処理を施し骨欠損部への埋め込み型の全く新しい骨再生技術を確立し、実用化するためにこの研究を行った。実施した内容は:SDラットの頭蓋骨骨欠損モデルを使用して人工的な骨欠損(円形径7mm)を作製し、積層造形法で作製した純チタン性膜を作製し、下記の5つの処理を施し、生体活性チタン膜を作製し、メッシュ膜で骨欠損部を被覆しスクリュー固定を行い、1)NaOH加熱処理(n=15)2) NaOH・HCl・加熱処理(n=15)3) NaOH・CaCl2・加熱・温水(n=15)4)混酸・加熱(n=15)5)無処理(n=15)埋植から、2、4、7週目に摘出し、マイクロCTを用いた画像解析、および非脱灰切片の組織学的観察を行い、骨形成の評価を行った。結果、混酸・加熱処理群でもっとも高い骨形成能が観察された(右図)。全群においてチタン膜周囲の炎症性反応、骨欠損部よりのチタン膜の逸脱など不具合は認めなかった。これらの結果から、造形純チタン人工骨においては混酸・混酸・加熱処理がもっとも高い骨形成能を示したことを証明した。この研究において1)造形チタンが高い生体親和性を持つこと、2)生体活性処理の種類による骨形成能の経時的変化をin vivoで解明した。これまでに生体内で造形チタンに化学処理を施し比較検証した報告はなく、きわめて新規性が高い結果である。さらに、この結果から、造形チタンに生体活性処理を施すことで生体適合性、強度、高い骨形成能が確認され、今後の造形チタン人工骨の実現にむけた貴重な成果を得ることができた。混酸・加熱処理による骨形成が、従来のチタン表面処理の骨形成能を大きく上回ることが証明できた。この結果、新規の人工骨開発への根拠が示せ、論文などの成果報告を早められる。また積層造形チタンが、生体内で感染などの有害事象を引き起こさないことが明らかとなり、今後の臨床応用の礎となる成果が研究初期に確認できた。この2つが大きな理由である。我々は、腫瘍や外傷などで喪失した骨組織の再建材料として「顎顔面領域における再建用医療機器」の開発を積層造形技術を用いて進めている。これまでに、選択的レーザー溶融法による純チタン粒子からの自由造形の作製に成功しラットなどの小動物の骨欠損での基礎研究を行ってきた。この申請課題では、積層造形チタン人工骨の、機械的強度や生体内安全性を動物実験にて行っていき早期の実用化を目指している。過去に多くの臓器再生の研究がなされてきた。その中で最も重要であり解決されていない課題として再生する目的臓器の「形態制御」、つまり様々な形態を持つ欠損臓器を個々の個体に合わせて作製することが挙げられる。申請者らは、大阪医科大学の強みである「枠組みを超えた研究」として積層造形技術を応用し、立体的自由造形を、生体親和性の最も高いマテリアルであるチタンを用いて完成し、かつ、世界で初めて積層造形チタンに化学処理を施し、化学処理チタン人工骨の骨形成能促進効果を証明した(2016ー2017年:本学研究拠点育成症例助成、2016年硬組織再生生物学会学会賞、橋渡し加速研究基盤事業シーズB)。また、並行して積層造形チタンメッシュ人工骨を病院倫理委員会の承認を得て顎骨骨欠損再建に使用し、現在まで10例の患者に使用し最長19か月の長期間の安定した臨床結果を得ている(第72回日本口腔科学会発表)。そしてこれらの研究成果をもとに国内での医療機器承認を得るため日本医薬品機構PMDAのRS戦略相談を実施し今後の具体的な研究目標として生体内での機械的強度、人工骨作製過程における機器・素材の選定、販売ルート確保などの構築の指示を受けた。

積層造形技術を応用し、立体的自由造形を、生体親和性の最も高いマテリアルであるチタンを用いて完成し、かつ、世界で初めて積層造形チタンに化学処理を施し、化学処理チタン人工骨の骨形成能促進効果を証明することができた。並行して積層造形チタンメッシュ人工骨の臨床応用を開始することができた。したがって,おおむね順調に進展しているといえる。2018年度は研究機関の最終年度として以下の研究成果を得た。昨年度までの研究で、積層造形チタン人工骨の表面処理として混酸・加熱処理がもっとも高い骨形成能をもつことを、メッシュ状にした積層造形チタン人工骨設置ラット頭蓋骨骨欠損モデルで証明した。擬似体液を用いた非生体において、混酸・加熱処理の高い骨形成能は報告されているが、生体内での他処理法と比較・検証した報告は世界で初めてである(Yamamoto K, Ueno T, et. al. RSC Advanced 2018)。この研究をさらに発展させ、骨欠損部に形体を一致させた埋め込み型積層造形チタン人工骨を用いて欠損部における積層造形チタン人工骨の骨形成能評価を行なった。非脱灰研磨標本とマイクロCT観察において積層造形チタン人工骨には周囲から活発な骨形成がなされ骨と一体化する様子が観察された。この結果は、積層造形チタン人工骨が生体内においてカスタムメイド人工骨として使用される可能性を強く示唆している。またヒトの顎骨欠損症例においても患者CTデータをもとにカスタムメイドで積層造形チタンメッシュを作製・使用(大阪医科大学:特定臨床研究審査委員会にて特定臨床研究として承認)し、欠損部への適合性、安全性、骨形成有効性の評価を行い期間内に7名の患者で、良好な結果を得ることができた(Ochi A, Ueno T, et .al. The 26th EACMFS, Munich, 2019. Inoue K, Ueno T, et. al. Implant Dentistry 2019)。今後は、引き続き積層造形チタン人工骨の有効性と安全性を検証して実用化を目指す。今後は、初期の2週間で混酸・加熱処理群が骨形成が促進された理由を組織学的手法を用いて解明する。特に、骨芽細胞、破骨細胞動態について、摘出組織の術後早期での細胞動態やアパタイトなどの結晶蓄積を観察し、早期骨形成の科学的根拠を探索する。平行して積層造形チタンの実際の骨欠損ぶへの適合状態などの確認を行う。今までの臨床研究成果の蓄積とPMDAの意見を反映して実用化に向けた基礎的研究を行う。臨床研究については、骨形成のCT画像による評価に加えて有害事象の発生について2015年経産省ガイドラインに従い検証を行う(対象患者:外科手術の禁忌とならない成人、歯科口腔外科手術に際して骨造成が必要な患者で同意が得られた者として創部の炎症の有無、マテリアルの露出など安全性の観察)。基礎研究においては、ラット頭蓋骨骨欠損モデルを用いて骨欠損部に積層造形チタン人工骨埋植を行う。埋植後4,8,16週後にラット頭蓋骨摘出を行い、マイクロCTにてX線学的観察を行う。その後に、頭蓋骨の機械的強度を評価し、各種処理法の形成骨の強度を比較する。また強度試験後は、チタン人工骨・形成骨の状態を非脱灰研磨標本作製し、トルイジンブルー染色を行い骨・チタンの結合状態を比較検証する。
松果体実質性腫瘍の新しい腫瘍マーカーの開発

これまでに我々は,メラトニン合成酵素の一つで,正常組織では松果体と網膜に特異的に発現しているHIOMT(Hydroxyindole-O-methyltransferase)が松果体実質細胞性腫瘍において高頻度に発現していることを,mRNAレベルで確認し,同蛋白の腫瘍マーカーとしての有用性を強調してきた。今回の萌芽的研究では,HIOMTの発現を蛋白質レベルで検索すべく抗ヒトHIOMT抗体の作製を試みている。平成10年度に行った研究内容と結果を以下に示す。1.抗ヒトHIOMT抗体を得るための抗原を作製すべくGST/HIOMT融合蛋白の精製を試みたが,大腸菌からの抽出段階で可溶化が得られなかった。融合蛋白が合成された後にinclusion bodiesが形成されることがその原因と考え,種々の変性剤を使用してその可溶化を試みたが,最終的に水溶性分画に融合蛋白を溶出させることはできなかった。2.次に,HIOMT cDNAの中で,より親水性の強いアミノ酸を多くコードしている部分を部分的に合成し,昨年度と同様の方法でGST/HIOMT融合蛋白を作製し精製を試みたが,結果は同様であった。3.現在,HIOMT cDNAの全長,或いは一部をもとに,N末端にhistidine tagを付加した蛋白を合成し,ニッケルカラムで抽出する方法を用いて,抗原の精製を試みているところである。次年度では、十分に精製されたHIOMTを抗原としてモノクローナルならびにポリクローナル抗体を作製し、enzyme linked immunosolbent assay(ELISA)法による測定系を確立した上で、実際の松果体実質性腫瘍患者の血清・髄液中のHIOMT濃度を測定し、健常人ならびに松果体実質性腫瘍以外の脳腫瘍患者に於ける濃度と比較しつつHIOMT蛋白測定の有用性を検討してゆく予定である。
植物のフラボノイドＣ配糖化酵素の反応機構の解明

本課題では、その生理活性が注目されている「フラボノイドC-配糖体」の生合成に関わる「C-配糖化酵素」をソバやカンキツ類、マメ科植物などの植物から同定した。これらの酵素について詳細な酵素反応解析とタンパク質の結晶構造解析を行い、C-配糖化酵素がベンゼン環と糖の間の特殊な炭素ー炭素結合を形成する反応の機構を推定した。また、これらの酵素遺伝子を保持する大腸菌を利用し、フラボノイドをそのC-配糖体に高効率で生物変換する系を構築した。C-配糖体は、フラボンやカルコンなどの化合物に対し、糖が炭素ー炭素結合した化合物群である。その結合のため、グリコシダーゼや酸による加水分解を受けないという特徴を持ち、種々の生理活性を示すことが報告されている有用化合物である。その生合成に関わるC-配糖化酵素の理解は、これら化合物の有効利用の観点からも重要であるが、植物の他の配糖化酵素と比べ、ほとんど研究が進んでいない。本研究では、これまでに解析を行ってきたソバおよびマメ科植物に加え、フラボノイドおよびカルコンC-配糖体の蓄積が報告されている種々の植物のESTなどの公開データベースを検索してソバのFeCGTと相同性を示す候補遺伝子を選定し、その全長配列をRT-PCRにより獲得した。大腸菌で異種宿主発現させた組換え酵素のC-配糖化活性を検討し、新たに数種のC-配糖化酵素遺伝子を同定した。また、得られたC-配糖化酵素について、その反応性の解析を行った。さらに、C-配糖体を多量に蓄積する有用な公開データベースのない植物について、次世代シークエンサーによるRNA-Seq解析を進めて、C-配糖化酵素遺伝子の探索を行っており、現在、そのデータ解析中である。次に、これまでにソバおよびマメ科植物から獲得した6種の酵素タンパク質について、結晶化解析を目的とした大量発現と精製条件の検討を行った。その結果、大量発現が可能であった酵素について、結晶化の条件検討を行った。さらに、C-配糖化酵素を発現させた大腸菌を用いて、基質の投与によるC-配糖体への生物変換を検討した結果、投与した基質の80ー95%をC-配糖体に変換することが可能な変換系の確立に成功した。以上のように、本研究では、C-配糖化酵素の反応機構の解析を通じたC-配糖体の有効利用へ向け、着実に成果を挙げている。フラボノイドC-配糖体は、フラボンやカルコンなどの化合物に対して糖が炭素ー炭素結合した化合物群である。その結合様式のため、C-配糖体糖部の加水分解を受けない安定な化合物であり、種々の生理活性を示すことが報告されていることから、今後の有効利用が期待される化合物である。そのため、生合成に関わるC-配糖化酵素の同定やその反応機構の解明が重要であるが、他の配糖化酵素と比べ、ほとんど研究が進んでいない状況である。本研究では、昨年度に引き続き、種々の植物由来の配糖化酵素の単離とその異種宿主発現酵素の反応性の解析を進めた。特に、カンキツ類のC-配糖化酵素の反応性について、昨年度構築した大腸菌を用いた配糖体生産系により作出した基質を用いて詳細に解析を行い、カンキツ類におけるジ-C-配糖体生成酵素の同定に成功した。また、これまでに単離したマメ科植物のC-配糖化酵素の反応性についても詳細に解析した。さらに、C-配糖体を蓄積する植物のRNAシークエンスを行い、その結果を基にして、新規の反応性を持つC-配糖化酵素の探索を進めている。上記と同時に、ソバのC-配糖化酵素の結晶構造解析を進めた。昨年度検討した条件をもとにさらに条件を最適化した結果、単結晶を得ることに成功した。この結晶についてX線構造解析を行ったところ、良好な回折像が得られたため、そのデータ解析を進めている。以上のように、C-配糖化酵素の反応機構の解析およびC-配糖体の有効利用に向けて、順調に研究を進めている。目標のとおり、ソバ由来のC-配糖化酵素の結晶作出に成功した。得られた結晶についてX線構造解析を行っているなど、その結晶構造の解明に向けた研究が進行している。また、これまでに確立したC-配糖体への変換系を用いて作成したC-配糖体を基質として、単離したC-配糖化酵素の詳細な解析を行った。特に、カンキツ類のフラボノイド-ジ-C-配糖体生成酵素を同定するなど、順調に成果を挙げている。そのほか、新規酵素遺伝子の単離を目指したRNAシークエンスも予定通り進めており、いくつかの候補遺伝子の単離に成功した。以上より、全般に、おおむね良好かそれよりも速いペースで研究が進展していると評価した。その結合様式のため、C-配糖体糖部の加水分解を受けない安定な化合物であり、種々の生理活性を示すことが報告されていることから今後の有効利用が期待される化合物である。そのため、それぞれの生合成に関わるC-配糖化酵素の同定やその反応機構の解明が重要であるが、他の配糖化酵素と比べ、ほとんど研究が進んでいない状況である。

特に、ワサビにおけるフラボノイドC-配糖化酵素の解析を進め、ワサビ植物からタンパク質を精製して遺伝子単離を行うとともに、酵素反応性の解析を行った。その結果、ワサビにおけるC-配糖化酵素は、これまでに我々が解析してきたソバやカンキツ、マメ類のC-配糖化酵素とは異なり、フラボン骨格に直接配糖化する酵素であることを明らかにした。また、ソバのC-配糖化酵素の結晶構造解析を進め、その立体構造の解明に成功した。その結果、C-配糖化酵素もO-配糖化酵素と類似した立体構造を持つことが明らかとなった。そこで、点突然変異の導入によりC-配糖化反応に必須なアミノ酸残基の同定を行い、C-配糖化酵素の反応機構を推定した。さらに、その情報や既知のO-配糖化酵素との比較からC-配糖化酵素に変異を加え、弱いながらO-配糖化酵素を示す酵素に変換することに成功し、C-配糖化活性とO-配糖化活性の違いに関する知見を集積した。以上のように、C-配糖化酵素の詳細な反応機構の解明に向けて順調に研究を行った。本課題では、その生理活性が注目されている「フラボノイドC-配糖体」の生合成に関わる「C-配糖化酵素」をソバやカンキツ類、マメ科植物などの植物から同定した。これらの酵素について詳細な酵素反応解析とタンパク質の結晶構造解析を行い、C-配糖化酵素がベンゼン環と糖の間の特殊な炭素ー炭素結合を形成する反応の機構を推定した。また、これらの酵素遺伝子を保持する大腸菌を利用し、フラボノイドをそのC-配糖体に高効率で生物変換する系を構築した。これまでに、目的に掲げたとおりにC-配糖化酵素の結晶化条件の検討を行い、結晶構造解析に向けた準備が整ってきている。また、種々のC-配糖体を蓄積する植物からC-配糖化酵素の候補遺伝子を単離し、その異種宿主発現酵素の解析を行ったほか、新規酵素遺伝子の探索を目的とした次世代シークエンサーによるRNASeq解析も、予定通り進行している。また、大腸菌などの異種宿主発現系を用いたC-配糖体への生物変換系の確立にも成功した。以上より、全般に、おおむね予定通りかそれより早いペースで研究が進展していると評価した。おおむね、当初の計画通りに研究を推進する。C-配糖化酵素と基質との共結晶を作出してX線構造解析を行うとともに、アミノ酸残基に変異導入した酵素の解析を通じて、C-配糖化酵素の反応機構の解明に取り組む。また、新規反応性を持つ酵素の探索、特に、グルコース以外の配糖体生成に関与するC-配糖化酵素の同定を行う。植物生化学おおむね、当初の計画通りに研究を推進する。これまでに検討した結晶化条件の最適化を行い、C-配糖化酵素の結晶化を行うとともに、そのX線構造解析を試みる。また、RNAseq解析の結果をもとにして新規反応性を示す酵素の探索を行うとともに、それぞれの酵素反応性の解析を進める。さらに、di-C-配糖体を生成する酵素の反応性の解析と、グルコース以外の糖を転移する活性を持つ酵素の探索を行う。当初計画で見込んだよりも構造解析などが順調に進み、消耗品の使用が少なくて済んだことや、投稿準備中の論文の投稿が年度内に終了せず、掲載料が発生しなかったことなどにより、次年度使用額が発生した。当初計画で見込んだよりも安価に研究が進んだため、次年度使用額が生じた。
原始惑星系円盤内縁における岩石微惑星形成と地球型惑星の起源の解明

本研究の目的は、原始惑星系円盤の内縁に存在する乱流境界線という領域における局所的な岩石微惑星形成を調べることで、系外惑星系や太陽系などの多様な惑星系を説明できる惑星形成モデルを構築することである。今年度は、初めに、乱流境界線における微惑星形成を1次元のダスト・ガス円盤進化計算によって調べた。この研究では、幅広い円盤乱流強度・ダスト臨界付着速度のもとで、乱流境界線で形成される微惑星の総質量を調べた。これにより、太陽系などの低質量惑星系・スーパーアース系などの高質量惑星系を形成するのに望ましい円盤パラメータ範囲に制限を与えた。さらに、上記ダスト進化計算の結果をもとに、輻射輸送計算を行い、乱流境界線でのダスト濃集が作り出す円盤表層の影をモデル化し、微惑星形成の間接的な証拠としての影の観測モデルを構築した。影は10AU程度まで広がりうるため、高解像度の赤外線観測装置を使うことで検出できることが期待される。続いて、上記計算を、より太陽系に近い形成環境に応用することで、乱流境界線で太陽系の地球型惑星を形成するのに必要な円盤の条件を調べた。その結果、乱流境界線での岩石微惑星形成によって、現在の太陽系の地球型惑星の軌道・質量分布を上手く再現できる円盤条件を明らかにすることに成功した。特に、微惑星の総質量が円盤乱流強度に強くするため、乱流強度を強く制限することに成功した。これらと並行して、より詳細に微惑星形成過程を明らかにするため、2次元ガス円盤構造とダスト進化を同時に計算する計算コードの開発を行った。その結果、簡単なダスト進化モデルの元、2次元の円盤の温度・力学構造・ダスト進化を同時に計算する世界で初めての計算コードを開発することに成功した。今後は、このコードをより複雑なダスト進化モデルに拡張し、乱流境界線での微惑星形成過程を詳細に調べる予定である。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
In vivo生体顕微鏡を用いた植物ポリフェノールの微小循環に対する作用の検証

本研究では、植物ポリフェノールの微小循環に対する作用を検証するためのツールとしてin vivo生体顕微鏡観察システムを構築し、それを利用した評価を実施した。対象としてラットの腸間膜細動脈および挙睾筋細動脈を選択し、麻酔下でプラスティックチャンバーにそれぞれの臓器を展開後、95% N2-5%CO2でエアレーションしたKrebs-Ringerでチャンバーを満たし、pH7.3-4、37°C条件下でCCDカメラを搭載した実態顕微鏡で直接的に血管の観察を試みた。その結果アセチルコリン(Ach)やphenylephrinの添加による血管の収縮・弛緩を可視化することができた。この実験系を用いて、高脂肪食負荷ラットにプロシアニジンを反復摂取させ、腸管膜細動脈のAchに対する応答能を観察したところ、高脂肪食摂取によってAch応答性は顕著に元弱し血管内皮機能の低下が示唆されたが、プロシアニジン摂取群ではそのような変化は認められなかった。一方、麻酔下でプロシアニジンを単回投与した場合、挙睾筋細動脈血流の著明な上昇が確認されるとともに、大動脈におけるeNOS発現量および血中NO代謝物濃度の有意な増加が認められた。これらの結果から、今回開発したin vivo生体顕微鏡観察システムは食品成分の微小循環系を評価する有用なツールであることを確認した。高ポリフェノール含有食品の摂取は心血管系疾患のリスクファクターを改善するが、その詳細については未だ不明な点が多いことから、今回我々は生体顕微鏡を用いることによって、生理的条件下におけるポリフェノールの微小循環に対する作用をIn vivo生体顕微鏡を用いて直接観察した。ラットに15%ラード含有飼料およびココア1%を含有する高脂肪食を摂取させ6週間飼育し、麻酔下で腸間膜をKrebs緩衝液で満たしたチャンバ内に展開し、生理的状態での細動脈血管径を記録した後、Phenylephrine処理し局所的収縮状態に保った後に、Acetylcholin(Ach)処理し内皮依存性細動脈拡張を記録した。その後Papaverine処理し、最大血管拡張状態で血管径を計測した。生理的状態における血管拡張度は対照群に比較し、高脂肪食摂取群で有意に低下していたが、この低下はココア群では認められなかった。Ach処理による血管内皮依存性血管拡張能は正常食群に比較して高脂肪食群で有意に低下したが、ココア群では高脂肪食による低下の改善が認められた。また最大血管拡張に対する内皮非依存性の血管拡張度についても正常食群で有意な低下が認められたが、ココア群では正常群との間に差異は認められなかった。また、ラットの挙睾筋をウレタン麻酔下で剥離し、ココア、ココアに含まれるプロシアニジンを経口投与し投与後の赤血球速度、細動脈径、開存毛細血管数などの微小循環の変化を経時的に記録した。ココアおよびココアに含まれるポリフェノールは投与後10分から有意に赤血球速度上昇させ、開存毛細血管数を増加させたが、細動脈血管径に対して明確な作用は示さなかった。以上の結果から、プロシアニジンをはじめとするポリフェノールは摂取直後から微小循環動態の改善作用を及ぼし、その結果として高脂肪食によって誘導される血管内皮障害の発生を抑制することが示唆された。以上の結果から、ポリフェノールの種類によって、微小循環および大循環に対する作用強度には大きな差異が認められることが示唆された。対象としてラットの腸間膜細動脈および挙睾筋細動脈を選択し、麻酔下でプラスティックチャンバーにそれぞれの臓器を展開後、95% N2-5%CO2でエアレーションしたKrebs-Ringerでチャンバーを満たし、pH 7.3-4、37°C条件下でCCDカメラを搭載した実態顕微鏡で直接的に血管の観察を試みた。

この実験系を用いて、高脂肪食負荷ラットにプロシアニジンを反復摂取させ、腸管膜細動脈のAchに対する応答能を観察したところ、高脂肪食摂取によってAch応答性は顕著に元弱し血管内皮機能の低下が示唆されたが、プロシアニジン摂取群ではそのような変化は認められなかった。一方、麻酔下でプロシアニジンを単回投与した場合、挙睾筋細動脈血流の著明な上昇が確認されるとともに、大動脈におけるeNOS発現量および血中NO代謝物濃度の有意な増加が認められた。これらの結果から、今回開発したin vivo生体顕微鏡観察システムは食品成分の微小循環系を評価する有用なツールであることを確認した。当初本年度に計画していたホリフェノール類の挙睾筋動脈血流および心拍数・血圧に対するさようについて成分間差を見出すことができていることから、概ね計画通りであると思われる。24年度が最終年度であるため、記入しない。ポリフェノールの種類によって循環系に対する作用強度が大きく異なることが示唆されたことから、当初予定していたプロシアニジン以外のポリフェノール化合物についても比較検討する必要性が生じた。このことから、今後は調査対象の幅を広げ検討することとする。