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リーダーシップと集団効力感が学校組織の力量向上に及ぼす影響に関する心理学的研究

平成23年度の研究目的は、三つであった。第一は、近年のリーダーシップと集団効力感に関する研究動向について、リーダーの認知的視点からまとめることであった。第二は、学校組織における集団効力感とリーダーシップが組織として力量に及ぼす影響に関する調査研究成果をまとめて発表することであった。第三は、現実の学校の場を対象とした時系列的なアクション・リサーチ研究を行い、学校組織に協働や力量向上のために、ミドルリーダーのどのような働きかけが効果的であるのかについて、実証的に検討することであった。第一に関しては研究成果を、以下の論文や図書にまとめた。渕上克義2012年管理職の主体的で効果的リーダーシップ古川久敬編集先取り志向の組織心理学有斐閣。鈴木薫・渕上克義2012年これまでの養護教諭のコーディネーションに関する研究動向と今後の展望日本養護教諭教育学会誌。第二については、日本教育心理学会第53回総会について、シンポジウム「学校の組織力向上に関する教育心理学的研究」を企画・立案し、話題提供も行った。さらに研究成果を以下の学会において発表した。渕上克義・杉本伸一・鎌田雅史2011年教師の協働性、対人的交流記憶が教職へのコミットメントに及ぼす影響.原康之・渕上克義2011年教員における文脈的業績に関する研究.日本教育心理学会第53回総会発表。渕上克義2011年スクールリーダーのアセスメント能力の改善に関する実証的研究日本グループ・ダイナミックス学会第58回大会発表。第三については、ある小学校を対象にアクションリサーチ研究を行い、ミドルリーダーである主任の以下の四つの具体的な働きかけ、(1)教職員参画、(2)相互援助関係の構築、(3)仕事コミュニケーションの活性化、(4)価値の共有化が、学校組織の力量向上に有効であることが明らかになった。当初の計画通り、文献研究、調査研究、アクションリサーチ的研究が進展しており、一定の研究結果が見出され、それらが研究成果として有機的に結びついていると考えられるため。最終年度である平成24年度は、アクションリサーチ研究の分析を行い、得られた研究成果について学会で発表を行う。そして、三年間の研究成果をもとにしながら、的確なリーダーシップと狂死し勇断の効力感の高まりが、学校組織の力量向上にどのような影響をもたらすのかについて、まとめる予定である。研究課題の初年度である本年度の目的は、三つであった。まず第一は学校組織の力量向上とリーダーシップ、集団効力感の関係に関する先行研究についての文献を収集し、組織の力量向上にリーダーシップと集団効力感がどのように関連しているのかについてまとめ、これまで看過されてきた問題点について整理した。第二の目的は、学校組織の力量向上に関する教師による文脈的行動の構造を明らかにすることであった。教師の文脈的行動を構造的に把握するために、中学校教師を対象とした質問紙調査を実施した。分析の結果、教師による文脈的行動は、(1)個人への支援、(2)環境作りへの支援、(3)組織への支援の三つの構造から構成されていることが明らかになった。さらに教師による文脈的行動は学校組織の協働性を高め、結果として組織の力量向上につながることが示唆された。得られた研究成果については、平成23年度の教育心理学会において発表する予定である。集団効力感の内容を構造的に把握して、集団効力感のどのような側面が、教師の仕事に対するコミットメントに肯定的な影響をもたらすのかについて、教師一人一人を対象とした研究だけでなく、学校ごとを分析対象とした研究を実施した。今後詳細に分析を行う予定であるが、教師の仲間意識の向上だけではなく、授業などの教育活動における協働性や校務分掌・保護者対応などの連携がなされてこそ、教師の仕事に対するコミットメントや職務に対する誇りが向上することが期待される。研究成果については、日本グループ・ダイナミックス学会や日本教育心理学会などで発表する予定である。

第三については、ある小学校を対象にアクションリサーチ研究を行い、ミドルリーダーである主任の以下の四つの具体的な働きかけ、(1)教職員参画、(2)相互援助関係の構築、(3)仕事コミュニケーションの活性化、(4)価値の共有化が、学校組織の力量向上に有効であることが明らかになった。当初の計画通り、文献研究、調査研究、アクションリサーチ的研究が進展しており、一定の研究結果が見出され、それらが研究成果として有機的に結びついていると考えられるため。最終年度である平成24年度は、アクションリサーチ研究の分析を行い、得られた研究成果について学会で発表を行う。そして、三年間の研究成果をもとにしながら、的確なリーダーシップと狂死し勇断の効力感の高まりが、学校組織の力量向上にどのような影響をもたらすのかについて、まとめる予定である。
１変数ベキ級数の関係式と空間曲線の反復積分によるコーディング

2文字X、Yとそれらの逆元となる文字からなる語全体は語の結合を積とすることで代数学における群の構造を持つ。この群の元はXY平面の整数格子点で折れまがる折れ線を定める。平面曲線はこのような折れ線の、一般化した対象、つまり一般化されたX、Yの語と捉えられる。この観点から平面曲線全体の群としての構造を研究し、曲線のX、Yの語としての展開、また曲線の形式的対数を、自由リー環の元として考察し、部分的結果をえた。当該研究課題の目的の一つである曲線の反復線積分によるコード化の理論と常微分方程式の解の研究結果について2012年10月15ー19日にフランス、ルミニーCNRS研究所で開かれた複素葉層の国際研究集会で発表し,そこでの多くの参加者と研究討論することができた。また、そこでのノビコフ教授との議論を継続するため2013年2月にイスラエル、ワイツマン研究所に招かれた。この訪問中のノビコフ教授、ヨムディン教授との議論により平面曲線のモーメント行列とその曲線に付随する常微分方程式のセンター条件が少なくとも表面的には密接に関連していることが明らかになった。ヨムディン等のアーベル常微分方程式のセンター条件すなわち原点に近い全ての解が閉じているための条件におけるモーメント条件とは、平面幾何学的側面だけについて述べると、方程式に対応する平面曲線の始点と終点が異なる場合は、それらを結ぶ直線とで囲まれた領域の曲線の巻き付き数の分布の線分の法線方向への射影が自明である、つまり0であることである。ヨムディン等の近年の一連の注目される結果は、平面曲線が多項式関数でパラメトライズされるとき、そのモーメント条件が対応する常微分方程式のセンター条件を導くことであり、またそれから派生する様々な問題の解決である。しかしながら、これらのことは多項式的でない一般の曲線あるいは一般の常微分方程式では成り立たないことが予想され、いくつかの反例がみつかっている。上の共同研究により一般の閉曲線に対してモーメント条件とセンター条件を共に課したとき巻き付き数のモーメント行列が退化していなければならないことを発見した。この結果の真の理由は現段階では不明であるが、モーメント行列の退化条件の常微分方程式にたいして持つ意味のさらなる研究の必要がある。2元生成の自由群の可換化のケーリグラフは平面の整数格子を頂点集合とするグリッド格子である。また自由群の元はこのケーリグラフの中の折れ線(ケーリー図式)を定める。平面曲線はこのような折れ線の一般化とみなせる。この観点から、平面曲線のなす群の構造を研究し、曲線の自由群のホール基底による展開、また生成元の形式的対数により生成された自由リー環の元である曲線の"対数"の反復線積分による展開について多くの結果を得た。この自由リー環は、2つの生成元の高次にネストしたリー括弧積により生成されていることが知られているが、その括弧構造をそのまま交換子におきかえ、リー環の生成元をその指数、即ち群の元々の生成元に置き換えればホール基底となる。しかしながら、ホール基底の対数はそれと同じ形をしたリー括弧積だけでなく、多くのほかの形の括弧積との線形結合となることが実験的にあきらかになった。この線形結合の各係数はカンベルーハウスドルフ型の公式により、リー括弧積をホール基底の定めるケーリー図式に沿っての反復線積分により与えられる。この部分の数学的背景を明らかにするために、ホール基底と対応する高次のリー括弧積を同一視し、幾つかの次数(Grade)において、リー括弧積をホール基底ケーリー図式上での反復線積分の値を成分に持つ行列を求め、その固有値と固有ベクトルを決定した。この結果は、ただちに一般の平面曲線の自由リー環への対数展開を経由してホール基底への展開を与えることを可能にしている。メキシコ、グアナファトCIMAT研究所でおこなわれた葉層の研究集会に参加し、複素力学系の研究について情報収集した。2011年度はじめに、特異写像のファイバーの上に作用する、通常の方法では捉えられることのできない多価の力学系の構造を発見し、これについて9月、スペイン、トルデシアスでの特異点の研究集会で、また12月には京都大学数理解析研究所で開かれた特異点論研究集会で発表した。この成果の一部を成すWEB構造に関する部分は論文にまとめられ、公表にむけて雑誌に投稿中である。また、昨年11月にレンヌ大学(フランス)で開かれたWEB幾何学の国際研究集会でもこの成果を発表した。1変数多価力学の構造はその関数要素からなる語の問題と等価であり、一般の語の関係式を探すセンター問題についての実験の場を与えている。12月にオルセー大学のDeroin教授を招き、この問題について議論をした。この問題の研究から語の問題の進展への新しい発想による貢献が期待される。

本研究課題のなかの1変数複素解析同相の関係式については、計算機を用いた解析同相の語のテイラー係数の直接計算により、語の構成文字の生成する可換化されたケーリーグラフのなかに語が定めるパスのモーメント等の幾何量によるテイラー係数の表現を与えた2010年の柳井佳奈との共同研究の結果の正当性を追認し、関係式を持つ様々なテイラー級数の組を作ることができたが、それらの収束性の判定にはまだ至っていない。一方でまた、ランダムな語やパスのモーメントからランダム語やランダム1変数常微分方程式の積分のテイラー級数を求めるについての研究の準備段階として、GPGPUによる並列計算の環境を整えつつある。研究計画の中で直ちに実行可能であると考えられていたランダム平面曲線に沿った繰り返し反復積分の統計的性質をさぐるための計算実験の実行に不可欠であったGPUによる並列計算にたいして、LINUX上のマテマティカが対応するのが、当初謳われてていたバージョンではなく、一世代後のバージョンのさらなるマイナーバージョンアップまで待たなければならなかったことに、1年半以上の実験の遅れの原因がある。一方でこのことは、時間を主に理論的研究に時間を割くことにつながり、進捗は緩やかではあるが、結果的に本来の研究姿勢を保つことになった。ハードウェアに関係する技術面では、複数の計算用グラフィックボード(GPU)を搭載したLInuxワークステーション上のMathematicaを使った実験で、CUDAを用いたプログラムに問題が発生し、本来の性能を発揮できていない。この問題をウルフラム社に照会中であるが、まだ回答をもらっていない。本研究課題の中心的問題の理論面からの研究の可能性は開かれており、CUDAのバージョンアップ等を待つ間、それに専念すべきであるが、昨年春から夏にかけて、3次の写像位相構造につき新たな発見があり、その結果をまとめることに時間を割いた事も一因である。平面曲線のモーメント行列の退化条件とセンター条件との関係を明らかにする。また全ての平面曲線を記述する自由リー環に値を持つ常微分方程式の解を表すマグナス展開の各係数の幾何的解釈を探り、それより1変数形式ベクトル場のリー環に値を持つ常微分方程式の解に還元したときのマグナス展開の各テイラー係数の幾何的解釈を探る。常微分方程式のセンター問題を理論面から攻撃する。ワークステーションのCUDA環境を整えつつ、実験的にCUDAプログラム等の並列プログラムを作成し、複数GPUカーネル、または多数のCPU計算カーネルを用いて常微分方程式の解の考察をする。レンヌ大学で開かれる、複素力学系の研究集会で研究発表を行うとともに、多くのこの問題の専門家との研究討論をし、情報収集する。研究費を以上の計画のための研究連絡のための出張旅費と、また計算機環境の整備にあてる。フランス、レンヌ大学で開かれる葉層の研究集会で研究成果を発表するための旅費に充てる。可能な範囲で、ワークステーション上のMathematicaのライセンス数の購入をする。ワークステーションの周辺機器を購入する。研究図書の購入する。研究資料の整理をする。
黄色ブドウ球菌の産生するロイコシジンのヒト好中球崩壊機構の解明

黄色ブドウ球菌の産生する白血球崩壊毒素ロイコシジン(Luk)はLukS、LukFからなり、ヒト及びウサギ白血球を特異的に崩壊する。崩壊活性の発現にはLukSのリン酸化、及び両成分による膜孔形成が必須である。本研究はLukの白血球崩壊機構の全容を解明することを目的とする。そこで最終年度である本年度は以下のことを行った。前年度までに酵母を用いたtwo-hybrid systemにおいてLukSのリン酸化部位を含むC末端領域をプローブとして、このLukSに結合性を示すクローンをヒト末梢血白血球cDNAlibraryからスクリーニングした結果、toll-like receptor 4の細胞外ドメインに結合する膜表層タンパク質MD-2を取得した。MD-2をコードするcDNAをpET-22b(+)にクローニングし、大腸菌を形質転換し、C末端にHis-tagを付加させたMD-2(MD-2-6His)を発現させた。現在、MD-2-6Hisを精製し、LukSとのin vitroでの結合を検討中である。2.Lukのヒト白血球崩壊活性に対するraftの関与の検討LukSのヒト白血球の認識にGM1が関与すること、及び白血球に結合したLukSが非イオン性界面活性剤によって可溶化されないことから、Lukのヒト白血球崩壊活性に細胞膜マイクロドメインraftが関与していることが示唆された。そこで、raftを崩壊させるmethyl-β-cyclodextrin(MBCD)の効果を検討したところ、MBCDによってLukの活性が阻害された。また、毒素処理したヒト白血球をBrij 35で可溶化した後、lysateをショ糖密度勾配法で分画した結果、毒素成分がraftの含まれる画分に分画された。以上の結果、Lukのヒト白血球崩壊活性にraftが関与している可能性が強く示唆された。
潰瘍性大腸炎治療におけるメサラジン腸溶製剤の有用性評価

【研究目的】メサラジンの経口腸溶製剤は、回腸末端から大腸においてメサラジンが放出されるよう製剤設計された薬剤であり、抗炎症効果の向上が期待されている。そこで、メサラジンの従来型経口製剤又は経口腸溶製剤を服用中の潰瘍性大腸炎(UC)患者の大腸生検組織を用いて、大腸粘膜中のメサラジン濃度に及ぼす製剤設計の効果及びUCの疾患活動指数であるClinical activity index(CAI)との相関解析より、大腸粘膜中濃度がUCの治療効果と関連性を有するか否かについて明らかにすることを目的とした。【方法】メサラジン経口製剤(n=13)または経口腸溶製剤(n=35)を服用中のUC患者のうち、大腸洗浄剤による前処置を行わず生検採取が可能な患者を対象とした。大腸生検組織は、内視鏡検査の際に3カ所程度採取し(1mm角1個)、速やかに液体窒素中にて保管した。大腸組織中のメサラジン濃度は、高速液体クロマトグラフ・タンデム質量分析(LC-MS/MS)法により測定した。CAI情報は電子カルテより抽出し、メサラジンの大腸粘膜中濃度との相関解析を行った。また、タクロリムスを用いた治療を実施している患者については、CYP3A5多型と予後との関連性について検討を加えた。なお、本研究は京都大学大学院医学研究科・医学部及び医学部附属病院医の倫理委員会の承認を得て実施した。【結果・考察】大腸組織中のメサラジン濃度の検討において、メサラジン濃度1組織重量1メサラジン投与量の値は、メサラジン経口製剤及び経口腸溶製剤の間で有意差が見られなかった(P=0.2557)。今年度では、安定期の患者を中心とした検討であったことから、炎症反応の強い(CAIの高い)状態における検討の必要性という問題点が新たに見出された。一方、タクロリムスの検討では、薬物治療に対する反応性において、CYP3A5^*3/^*3群でより反応性の高いことを見出した。今後、治療初期段階からの介入を視野に検討を進める予定である。
インターロイキン3活性抑制因子の精製

今年度の実施結果1.大量サンプルの精製に先だって少量のサンプルより精製ステップの検討を行い、硫安分画、疎水クロマトグラフ、陰イオンクロマトグラフ(1)、陽イオンクロマトグラフ、までの精製ステップを確立した。2.次に陰イオンクロマトグラフ(2)で得られたいくつかの分画を更にゲル濾過クロマトグラフにかけてメジャーピークを単離したが、この段階でNIL-3活性は分散してしまった。この段階の幾つかのサンプルについてアミノ酸配列を決定したところ、プレアルブミンであることが判明した。3.そこでプレアルブミンのNIL-3活性について検討したが、プレアルブミンにNIL-3活性は検出できなかった。但し、マウスのプレアルブミンは市販品が存在しない為、ヒトのプレアルブミンを使用した。4.最終段階にまで精製を進めるため、NIL-3の精製源を約10リットル集めた。今後の展開に関する計画1.陰イオンクロマトグラフ(2)の段階で活性分画が分散してしまったので、メジャーピークとして活性分画を得るための条件を再検討する。この条件検討の為に、ある程度のサンプル量を準備中である。2.今回の予備精製で、最終段階近くまでプレアルブミンがメジャーピーク中に混ざってくることが判明したので、プレアルブミン除去の方法を検討する。3.マウスのプレアルブミンについてもNIL-3活性を検討する必要がある。4.最終段階までの精製めどがついたところで、サンプル取得時に得られた細胞よりライブラリーを構築する準備を進める。
高齢者敗血症患者におけるB細胞機能低下のメカニズムを探る

宿主免疫においてB細胞は重要な働きをするにも関わらず、敗血症急性期におけるB細胞の役割や老化との関連については十分にわかっていない。本研究では敗血症急性期におけるB細胞の免疫能を解析することと老化との関連を検討することを目的とした。敗血症急性期には疲弊B細胞が増加していた。高齢敗血症患者では血清IgM濃度は重症度スコア、臓器障害スコアと負の相関関係にあった。B細胞を単離培養し産生されるIgMは、高齢者、敗血症患者で低下していた。敗血症時における疲弊B細胞の増加によりIgM産生が低下し、敗血症患者、その中でも特に高齢者においては重症度、二次感染と関連している可能性がある。申請者らは高齢敗血症患者におけるB細胞の機能解析を行うため、健常若年成人、健常高齢成人、若年敗血症、高齢敗血症と罹患後1週間後の同じ敗血症患者より末梢血を採取し、血清IgM値、末梢血中B細胞のサブタイプ解析を行った。予備実験と異なり、健常人、敗血症患者双方において、若年群、高齢群の血清IgM値、B細胞のサブタイプに有意な差を認めることができなかった。しかし、高齢敗血症患者のみに注目すると、血清IgM値は集中治療における重症度と負の相関関係にあり、血清IgM値が低値であるほど重症度が高いことを見出した(p<0.05)。また、健常成人群(若年成人+高齢成人)と比較し、敗血症群(若年敗血症+高齢敗血症)の末梢血中B細胞のサブタイプにおいて、慢性感染症時に認められる疲弊B細胞と同様のphenotypeをもつCD21negative B細胞群の割合の有意な増加をしていることを確認した(p<0.001)。さらに末梢血中B細胞を磁気分離し、CpGを添加し1週間培養。その培養上清中のIgM値を測定すると、健常群と比較し、敗血症群において有意に低下していることがわかった(p<0.05)。上記より、1,発症時の血清IgM値が重症度と関連している可能性が示唆され、2,その原因として慢性感染症罹患時に認められるような疲弊したB細胞と類似した細胞の割合が増えることで、細菌に対して十分な免疫グロブリンの産生ができなくなっている可能性が示唆された。平成26年度の推進方策に則り、免疫機能解析を行うため敗血症モデルマウスの作製に着手した。一般的に用いられる敗血症モデルマウスには盲腸結紮穿刺モデルとリポ多糖投与モデルの2種類がある。当初、盲腸結紮穿刺モデルマウスを作成したが穿刺孔の大きさ、穿刺回数、穿刺部位などで侵襲の大きさが大きく変わることに加え、それらを同様にしても個体毎の糞便の性状、腹膜に排出される菌体数によって、腹膜炎の重症度が異なり生存率が安定しなかった。このことは疲弊B細胞と同様のphenotypeを有するB細胞群のような少数の血球群を観察するのに不向きである。一方、リポ多糖投与モデルマウスでは、20mg/kgの腹腔内投与により、投与後48時間での生存率は20%程度(その後の生存率は1週間後も一定)であることが確認できた。しかし、リポ多糖の投与は実際の感染症と異なり、極短期間のシグナル伝達となるため、自然免疫より遅れて生じるB細胞の誘導をみることに適していない。以上より、本研究を遂行するために新しい敗血症モデルマウスを用いる必要があると考え、我々はマウスの糞便より採取した大腸菌のシングルコロニーを培養し、尾静脈より静注する菌血症モデルマウスを作成した。本モデルでは、大腸菌投与48時間での生存率が30%程度で安定、さらに採取した血液をLB培地上で培養により大腸菌コロニーを確認できた。本モデルは個体間での菌体数の差異や腸管内常在菌の種類が異なることによる影響を受けない敗血症モデルであり、本研究の遂行に用いるために適切なモデルであると考えられ、現在研究を進行中である。加えて平成26年度の研究実績として報告した、敗血症患者における末梢血B細胞の免疫能解析結果については、SHOCKにてacceptされている。得られた結果は高齢敗血症患者のみに焦点をあてたものではないが、申請者らが平成26年度に予定していた敗血症罹患時、敗血症罹患後における末梢血B細胞の機能解析は概ね終了することができた。2016.4.25以降、掲載予定。救急・集中治療発症時の血清IgM値が重症度と関連している可能性を検討するため、敗血症モデルマウス(盲腸結紮穿刺法もしくはLPS投与)に対してIgM投与を行うことで、生存率が改善するか検討する。

さらに、申請者らはBcells deficientマウスとIgMが分泌できないマウスを2種保有しており、それらが敗血症モデルで生存率がどのようになるか、またIgM投与で生存率が改善するかを検討する。また、ヒト末梢血にIgMを投与することによる免疫機能の変化も予定通り行う。そして、今回新たに見出した疲弊B細胞様の細胞についても解析を行う。同細胞の検討を敗血症患者に加え、透析患者でも行い、いわゆる免疫不全患者において増加がないか確認し、その分泌能についても検討する。概ね計画通りの額面を使用できたが、上記額の助成金が余剰となった。次年度に持越し、計画通りに研究を遂行するため使用させて頂きたい。
更年期うつ症状の発症機構における酸化ストレスの関与に関する基礎的研究

本研究は、更年期症状の中でも頻度が高く、かつ身体・心理・社会的負担が最も大きい症状の一つでありながら、その発症機構が完全には解明されていない更年期うつ症状に関する研究である。(2)上記の知見に基づき、われわれは酸化ストレスが更年期うつ症状発症に対する主要な寄与因子であるという仮説に立ち、実験動物を用いた研究を行った。閉経女性のモデルとしてICRマウスの卵巣を9週令で摘出し、2週間後に強制水泳試験によりうつ病様行動を評価するとともに、血液中の酸化ストレスマーカーdROMsおよび抗酸化力マーカーBAPにより評価した酸化ストレス状態との関連性について検討した。また、うつ病の発症に関連する血清マーカーであるthiol、HSP70、MDA、corticosterone等の変動についても検討した。その結果、卵巣摘出により強制水泳試験により評価されるうつ病様行動が増加すること、すなわちうつ症状が重症化することを確認したが、一方でこれらの症状の変化と酸化ストレスマーカー・抗酸化力・うつ病血清マーカーの変化とは単純には相関していなかった。われわれは当初の仮説を棄却し、拘束を加えることにより増加する外的ストレスが、卵巣摘出に伴ううつ病様行動・酸化ストレスマーカー・うつ病血清マーカーの変動に影響を与えるか否かの検討を現在行っている。当該年度のわれわれの目標は、まず閉経の動物モデルである卵巣摘出マウスを偽手術マウスと比較し、強制水泳試験によるうつ症状の比較を行うことであった。このためマウス用テールサスペンション&強制水泳実験装置を購入して実験を開始しようとしたが、本学の動物実験センターではこれまで動物行動解析実験をP2区画で行っており、われわれの研究グループが実験装置を動物実験施設に独自に搬入して実験を行うことはできず、P2区画にわれわれの装置を追加して、P2区画で実験を行っている他グループと装置を共有する必要があり、そのためにはP2区画の利用者全員が新たに追加するわれわれの実験装置に関する訓練を受ける必要があることが判明した。現在動物実験センターを中心にこのような煩雑な内規を改訂するための調整を継続しており、未だに実験を開始するには至っていないのが現状である。このため、われわれの先行研究を論文化することに注力することとし、2016年4月に、ミドルエイジ女性のうつ症状が酸化ストレスと関連することを明らかにした論文"Depressive symptoms are associated withoxidative stress in middle-aged women:a cross-sectional study"をオンライン公開することができた(Hirose et al.BioPsychoSocial Medicine (2016) 10:12)。上述のように、本学の動物実験センターではこれまで動物行動解析実験をP2区画で行っており、われわれの研究グループが購入したマウス用テールサスペンション&強制水泳実験装置実験装置を動物実験施設に独自に搬入して実験を行うことはできず、P2区画にわれわれの装置を追加して、P2区画で実験を行っている他グループと装置を共有する必要があり、そのためにはP2区画の利用者全員が新たに追加するわれわれの実験装置に関する訓練を受ける必要があることが判明した。平成27年度に目標としていた基礎的な動物実験、すなわち閉経の動物モデルである卵巣摘出マウスと偽手術マウスについて、強制水泳試験によるうつ病様行動を比較する動物行動解析試験に関しては、本学動物実験センターのP2区画で実験を行うための調整に膨大な時間を要したが、平成28年8月にようやく実験を開始することが可能となった。しかし平成28年8月から平成29年3月までの実験では、先行論文(Bekku 2005 Psychopharmacology; Bekku 2006 Psychopharmacology)に報告されているような、うつ症状を表す指標、すなわち無働時間の増加が、対照群に比して卵巣摘出群に有意に多く認められるという知見は再現されておらず、現在その原因を追究しているところである。その一環として、平成29年度には大豆イソフラヴォンを含まない餌を両群のマウスに与えた上で手術を行い、その後に動物行動実験を行うことを計画している。一方で、卵巣摘出群から採取した血液中の酸化ストレスマーカーdROMは対照群に比して有意に高く、閉経が酸化ストレスを誘起することが確認されている。また、HSP70やthiolなどうつ症状と関連するバイオマーカーも卵巣摘出群において上昇しており、エストロジェン低下・酸化ストレス・うつ症状の関連を生化学的に確認することができた。平成29年度には、これらの生化学的変化と動物行動学的変化が同期するか否かを引き続き確認していく予定である。上述のように平成27年度に予定した基礎的な動物実験の開始が遅れたが、P2区画において実験を行うための調整を終了し、平成28年度より研究を進めることができている。現在の問題点は、先行論文にある「卵巣摘出群におけるうつ病様行動の増加」が再現できていないことであるが、大豆イソフラヴォンを含まない餌を与えるなどの改良によってこの点を克服しようと試みている。更年期女性における精神症状の頻度は高く、かつQOLを著明に低下させるが、その発症機構は未だに明らかではない。われわれは、更年期うつ症状発症機構への酸化ストレスの関与について明らかにするための卵巣摘出動物モデル実験において、適度な外的ストレスが視床下部ー下垂体ー副腎皮質(HPA)軸を介して体内の酸化ストレスを抑制することを示すレジリエンス曲線が、エストロジェン欠乏によって変化する可能性を見出した。この現象は、更年期女性において外的

ストレスに対するレジリエンスが低下し精神症状を発症し易くなる機構を説明できる可能性がある。本動物実験によって得られた当初の予想に反する結果からは、「強制水泳試験のような外的ストレスを加えた場合に発生する体内酸化ストレスの程度が偽手術マウスと卵巣摘出マウスでは異なる」ことを示している。一般に、いわゆる「外的ストレス」と「体内酸化ストレス」との関係に対しては視床下部ー下垂体ー副腎皮質系が関与することが知られている。すなわち、適度な外的ストレスはコルチゾールを介してむしろ体内酸化ストレスを軽減させるが、過剰な外的ストレスはかえって酸化ストレスを増幅させる(Aschbacher 2013 Pshychoneuroendocrinology)。外的ストレスが加わった場合に精神症状を発症しやすいか(脆弱性vulnerability)発症しにくいか(レジリエンスresilience)は心理社会的要因に左右されるが、上述の実験結果はエストロジェンの低下がこの作用曲線(レジリエンス曲線)を変化させ得る可能性を示唆している。この現象をより詳細に検討することにより、同程度の外的ストレスを受けた場合に更年期女性がより精神症状を発症しやすい機序を明らかにできる可能性がある。平成27年度に実施を計画していた基礎的な動物実験、すなわち閉経の動物モデルである卵巣摘出マウスと偽手術マウスについて強制水泳試験によるうつ病様行動を比較する動物行動解析試験に関して、本学動物実験センターのP2区画で実験を行うための調整に膨大な時間を要し、平成28年8月にようやく実験を開始することが可能になった。そのため全体の実験計画に遅延を生じ、研究の当初目標を達成できていないため。本研究は、更年期症状の中でも頻度が高く、かつ身体・心理・社会的負担が最も大きい症状の一つでありながら、その発症機構が完全には解明されていない更年期うつ症状に関する研究である。(2)上記の知見に基づき、われわれは酸化ストレスが更年期うつ症状発症に対する主要な寄与因子であるという仮説に立ち、実験動物を用いた研究を行った。閉経女性のモデルとしてICRマウスの卵巣を9週令で摘出し、2週間後に強制水泳試験によりうつ病様行動を評価するとともに、血液中の酸化ストレスマーカーdROMsおよび抗酸化力マーカーBAPにより評価した酸化ストレス状態との関連性について検討した。また、うつ病の発症に関連する血清マーカーであるthiol、HSP70、MDA、corticosterone等の変動についても検討した。その結果、卵巣摘出により強制水泳試験により評価されるうつ病様行動が増加すること、すなわちうつ症状が重症化することを確認したが、一方でこれらの症状の変化と酸化ストレスマーカー・抗酸化力・うつ病血清マーカーの変化とは単純には相関していなかった。われわれは当初の仮説を棄却し、拘束を加えることにより増加する外的
昆虫便乗性線虫による昆虫病原微生物デリバリーシステム

バックグラウンド情報としてマツノマダラカミキリ、およびその近縁種の保持線虫相調査を行った結果、マツノザイセンチュウをはじめ、ニセマツノザイセンチュウ、Contortylenchus genitalicolaなど、複数種(合計6種類)の線虫と何らかの相互関係を有していることを確認した。そして、昆虫便乗性自由生活性線虫の一種、Diplogasteroides sp.を新種、D. andrassyiとして記載した。これに、Beauveria bassiana F263株とMetarhizium sp.を伝搬させたところ、高い伝搬効率を得るには口腔のより広い種が適していると考えられた。本申請研究は、材内での移動能力の高い昆虫便乗線虫(昆虫に直接的な寄生性、病原性は持たず、移動分散手段としてのみ用いる線虫)をキャリアとして利用することにより、木材内部など、病原微生物の届きにくい環境に生息する害虫に安定的な効果を発揮できる生物防除手法の開発を目指し、同時に、微小動物による糸状菌類の胞子分散への寄与を明らかにすることを目指す。初年度は計画に従い、マツノマダラカミキリノ保持線虫相の調査を行い、これらの中から本研究の目的にかなう線虫の選択を行った。この結果、マツノマダラカミキリは、マツノザイセンチュウをはじめ、ニセマツノザイセンチュウ、Contortylenchus genitalicolaなど、複数種(合計6種類)の線虫と何らかの相互関係を有していることを確認した。そして、これらの中では、昆虫便乗性自由生活性線虫の一種、Diplogasteroides sp.が利用可能であると考えられた。この線虫に関しては、培養試験の結果、細菌食性自由生活性線虫の標準的な培養法である、大腸菌OP50株とNGM培地を用いた培養法が適用可能であることを確認し、今後詳しい種の同定、もしくは記載を行う予定である。また、次年度の実験に用いるマツノマダラカミキリ幼虫、および、昆虫病原菌株の準備を行った。さらに、Diplogasteroides sp.の培養株の確立を行った。これに加えて、当初予定していた病原菌株、Beauveria bassiana F263株以外に高い殺虫活性を有する可能性のあるMetarhizium sp.を野外より分離し、菌株の確立を行った。室内系での線虫の菌類運搬能力、及び、これによって伝搬される菌類の殺虫活性に関しては、材料の不足のため、一部のみを行うにとどまった。次年度以降に引き続き検討を行うこととした。昆虫病原微生物、微小動物を用いた生物防除は現在、幅広く行われているが、木材内部など、微生物、微小動物の移動分散が困難な場所ではその有効性が大きく低下することが知られている。本研究では、そのような分散困難な場所での高い分散能力と、昆虫特異的指向性をもつ、「昆虫嗜好性線虫」に着目し、これを媒介者(伝搬者)として、昆虫病原糸状菌の分生子を運搬させ、防除対象とする木材穿孔性害虫へ届けるための手法開発を目的としている。また、同時に、線虫類他、微小動物による微生物の分散への寄与を明らかにし、微生物生態学への寄与を試みるものである。本研究の材料としては、マツ材線虫病の媒介昆虫であり、主要な防除対象となっているマツノマダラカミキリを選定した。上記目的のため、初年度は、マツノマダラカミキリに便乗する昆虫嗜好性線虫相の調査を行い、本研究の目的にかなう材料の選定を行った。また、複数の昆虫病原糸状菌類の中から分生子サイズ、昆虫に対する病原力などを基準に候補菌株の選定を行った。この結果、マツノマダラカミキリ、および、これに近縁のヒゲナガカミキリ虫体より、細菌食性自由生活性線虫、Diplogasteroides sp.を分離し、この種同定、および、分類学的所属を明らかにした。この結果、本種は未記載種であるということが確認され、新種として記載を行うこととした。記載論文は投稿中であり、本年度内に受理、掲載の見込みである。また、候補菌株としては、病原力が強く、分生子サイズが小さい(線虫に運ばれやすい)ものとして、従来より使用されているボーベリア属菌が最も適しているものと考えられた。初年度の目標としては、候補となる昆虫嗜好性線虫、および昆虫病原糸状菌株の選定を行い、糸状菌分生子(胞子)を線虫に保持させる可能性について検証することであった。現在までのところ、線虫、糸状菌株は選定が済まされており、また、線虫の分生子保持に関しても概ね実験は終了しており、計画に大きな遅れは無いものと考えている。本年度は、二年目(最終年度)であるため、実際に線虫を用いて菌類分生子を伝搬させ、昆虫の生息場所まで届ける可能性を検証する。

この検証は、当初、丸太を用いた野外系で行うことを考えていたが、環境の均質性、材料の均質性を確保するために、実験室内で取り扱い可能なサイズの小丸太を用いて、主として室内系で行うこととする。前年からの繰越額はその他経費に繰り込むこととする。
ミトコンドリアの恒常性維持を基盤としたサーチュインの糖尿病腎症に対する意義の解明

糖尿病腎症(以下腎症)の病態形成に重要なミトコンドリア(Mt)酸化ストレスは活性酸素種産生/抗酸化バランスとMt機能低下・恒常性維持の破綻により生じるが、NAD+依存性脱アセチル化酵素(Sirt3)は、Mt酸化還元の制御とMt恒常性維持に重要な役割を果たしている。糖尿病Zucker diabetic fattyラット腎近位尿細管細胞ではNAD+分解酵素(CD38)の発現増加に起因するNAD+消費の亢進とSirt3機能低下がMt酸化ストレスの増強に寄与していること、さらにオートファジー機能の低下による異常Mtの蓄積の結果、Mt恒常性の破綻が生じ、腎症の発症・進展に関与している可能性を見出した。2型糖尿病腎症の発症・進展抑制に対するカロリー制限の腎保護効果と糖代謝に及ぼす影響を検証するため、2型糖尿病モデル動物である、Zucker Diabetic Fatty (fa/fa)(ZDF)ラット(7週齢雄)と非糖尿病Zucker Lean (ZL)ラットを通常食群と40%カロリー制限食群に分別し、18週間飼育した。体重・摂食量は毎週、血糖値(空腹/随時)は2週間ごとに測定し、18週後にHbA1C値・尿アルブミン排泄量(UALB)・腎重量・腎組織(PASおよび、マッソン・トリクローム染色によるメサンギウム領域の拡大・線維化)を評価した。糖尿病ラットの通常食群と比較してカロリー制限食群において、体重(通常食:カロリー制限食382.4±40.9:390.7±94.9g, n=5, NS)は有意差を認めなかったが、腎重量(通常食:カロリー制限食3.24±0.34:2.41±0.14g, n=5, p<0.001)は有意に減少した。また、糖尿病カロリー制限群では、通常食群に比べ、血糖値(通常食:カロリー制限食635.5±35.9:229.4±101.1mg/dl, n=5, p<0.001)およびHbA1C値(通常食:カロリー制限食8.8±0.90:5.8±1.69%, n=5, p<0.001)の有意な低下を示した。さらに糖尿病カロリー制限食群は、通常食群と比較して、UALBの有意な低下(通常食:カロリー制限食3479±2705.6:22.55±34.84mg/gCr, n=5, p<0.001)及び、腎組織(メサンギウム領域の拡大と尿細管間質の線維化)の改善を認めた。以上より、カロリー制限は、2型糖尿病ラットにおける糖代謝の改善と腎保護効果を示すが、今後、カロリー制限のサーチュインの活性化、さらにミトコンドリアの恒常性維持に係わる詳細を明らかにする予定である。腎重量、尿アルブミン/L-FABP排泄量、血漿シスタチンC値、腎線維化・尿細管障害・炎症および電子顕微鏡下における近位尿細管細胞のミトコンドリア(Mt)の膨化/断片化はZL群に比べZDF+STD群で有意な増加を認めた。ZDF+STD群での変異は18週間のCRにより改善。CRによる腎障害改善効果はHbA1c値が部分的な低下もZL群とほぼ同等までに改善したことより血糖低下効果とは独立した作用である。尿中8-OHdG排泄量・腎皮質MtDNA中8-OHdG含有量は、ZL群に比べZDF+STD群で有意な増加を認めた。Mn-SOD,イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(IDH)2の抗酸化酵素活性は、Sirt3による脱アセチル化により制御を受けている。糖尿病腎におけるMn-SOD,IDH2アセチル化は、ZL群に比べZDF+STD群で増強していることから、糖尿病腎ではSirt3活性低下に起因するMn-SOD,IDH2のアセチル化の亢進/活性低下とMt酸化ストレスが増強した可能性がある。Sirt3の発現量にZL群とZDF群間で差を認めなかったため、現在腎におけるNAD+/NADH比の測定を行っている。通常Mtは酸化ストレスを含む細胞内ステレスにより障害を受けると、その障害部位を分裂し切り離した後、Mtバイオジェネシスの増加と引き続き生じるMt融合によりその恒常性が維持される。分裂し断片化したMtはオートファジー(AP)による分解後リサイクルされる。電子顕微鏡による近位尿細管細胞Mtの形態的観察において、糖尿病ラットでは、Mtの膨化/断片化などの形態異常が存在していること、またDRP(Mt分裂関連蛋白)の発現増加およびp62の蓄積(AP低下の際増加)を認めた。これらの結果から糖尿病腎近位尿細管では、Mt酸化ストレス亢進⇒Mt分裂増加⇒AP機能低下による断片化Mtの細胞内蓄積⇒更なる酸化ストレス、炎症、尿細管細胞機能障害⇒腎線維化⇒腎機能低下をきたしている可能性が推察される。ラットを用いたin vivo実験はおおむね順調に進展している。

糖尿病Zucker diabetic fattyラット腎近位尿細管細胞ではNAD+分解酵素(CD38)の発現増加に起因するNAD+消費の亢進とSirt3機能低下がMt酸化ストレスの増強に寄与していること、さらにオートファジー機能の低下による異常Mtの蓄積の結果、Mt恒常性の破綻が生じ、腎症の発症・進展に関与している可能性を見出した。糖尿病ラットに対するカロリー制限の介入と各種サンプルは得ているため予定の解析を行っていくことができる。今後の課題・展望として、糖尿病腎尿細管におけるSirt3の活性低下が、糖尿病状態に起因する腎障害の原因として重要であるかどうかの直接的な証明が必要である。そのために、培養尿細管細胞を用い、siRNAによるSirt3ノックダウン(活性低下を模倣)によるミトコンドリア蛋白のアセチル化、Mn-SODおよびIDH2アセチル化およびそれら酵素活性と酸化ストレス、炎症、ミトコンドリア形態異常、オートファジーの評価を行う。さらにオートファジーあるいは、ミトコンドリア分裂/融合の制御に関わる蛋白の機能制御にSirt3が関与しているかどうか、その点に関する新たな標的蛋白を見出したい。糖尿病カロリー制限の介入による、抗老化とミトコンドリア恒常性維持機構(とくに融合/分裂とオートファジー(ミトファジー)バランス異常)の関与、ならびにミトコンドリアの恒常性維持に対するサーチュインの意義を明らかにするために、引き続き上記の2型糖尿病モデルラットの組織を用いて検証を継続する。ミトコンドリア酸化ストレスの評価、とくに腎臓における炎症性変異の検出を行う。炎症関連遺伝子TNF-α・MCP-1・IL-6などの評価、炎症マーカーCD68を用いた免疫染色を行う。ミトコンドリア恒常性破綻の検証を、腎組織に於けるミトコンドリア数/細胞、ミトコンドリアDNA量の測定をし、加えて組織内のミトコンドリアバイオジェネーシスの評価として、RT-PCRを用いたミトコンドリア関連転写調節因子PGC-1α・NRF1などの発現の測定、ミトコンドリア融合/分裂・ミトファジーの評価として電子顕微鏡的のミトコンドリア形態の観察を行う。さらにミトコンドリア融合・分裂関連蛋白のmitofusin(mfn1、mfn2)・OPA1・PINK、Parkinなどの活性、変異の評価を行い、ミトコンドリア蛋白のアセチル化/脱アセチル化についての検証を、リジンアセチル化抗体のウェスタンブロットにて行う。腎組織における各サーチュインの発現や変異を、ウェスタンブロット、RT-PCR法を用いて評価する。
病変を伴う小動脈内の血流と血球同士の干渉による特異流動

血球の干渉と血流の数値シミュレーション実際の血液のヘマトクリット値は40-50%と非常に高く,赤血球同士が結合してルーロー(連銭)を形成するなど複雑な挙動を示すため,赤血球同士の干渉を表現することは実際の血流を取り扱う上で非常に重要なステップである.申請者はこれまでに,Bradyらが剛体球の濃厚サスペンションを対象に開発したStokesian Dynamics Simulationの手法を微生物溶液に適用し,ミクロスケールの粒子間の流体力学的干渉を厳密に表現することに成功してきた.本年度はその手法を赤血球に適用し,赤血球の濃厚溶液である血液の数理モデル化を行った.特に赤血球の近距離干渉に焦点を当て,高分子の架橋構造による干渉力をばね力でモデル化することに成功した.狭さく部を通る血流の数値シミュレーションも行い,解析結果を実験結果との比較した.赤血球を用いた血球の干渉実験および血流の可視化実験シミュレーションの妥当性を検討するには,対応する実験データが不可欠である.そこで本研究では,研究室に既存のconforcal-micro PIVシステムを用い,染色した赤血球の干渉実験および血流の可視化実験を行った.微小血管の狭さく部を模擬した流路は,PDMS micro channelを用いて作成した.実験結果を数値シミュレーション結果と比較検討し,解析手法の妥当性を確認した.赤血球モデル同士の干渉を表現する数値解析モデルの開発これまでに申請者が開発した数値解析手法は単一赤血球の変形と応力極(Stresslet)を表現できるため,ヘマトクリット値(体積分率)が低い希薄溶液を取り扱うことができる.しかし実際の血液のヘマトクリット値は40-50%と非常に高く,赤血球同士が結合してルーロー(連銭)を形成するなど複雑な挙動を示すため,赤血球同士の干渉を表現することは実際の血流を取り扱う上で非常に重要なステップである.そこでBradyらが剛体球の濃厚サスペンションを対象に開発したStokesian Dynamics Simulationの手法を赤血球モデルに適用し,赤血球の濃厚溶液である血液の数理モデル化を行った.この手法では,遠方の流体力学的干渉を細胞表面の応力をモーメント展開して表現し,近距離の干渉は境界要素法で2体干渉のデータベースを構築し,計算時にそれを随時参照する.この手法を用いて細胞溶液のレオロジー特性を調べた成果を,11に記す国際会議で報告した.研究成果は更に上がっており,平成18年度も幾つかの学会で講演発表を行う予定である。模擬赤血球同士の干渉挙動の可視化実験数値解析手法の精度を検証するため、赤血球同士の干渉実験を計画している.本年度は,細胞同士の流体力学的な干渉を調べる予備実験が終わった段階である.次年度は本実験に移り,多くのデータを収集して解析結果との比較検討を行う予定である.血球の干渉と血流の数値シミュレーション実際の血液のヘマトクリット値は40-50%と非常に高く,赤血球同士が結合してルーロー(連銭)を形成するなど複雑な挙動を示すため,赤血球同士の干渉を表現することは実際の血流を取り扱う上で非常に重要なステップである.申請者はこれまでに,Bradyらが剛体球の濃厚サスペンションを対象に開発したStokesian Dynamics Simulationの手法を微生物溶液に適用し,ミクロスケールの粒子間の流体力学的干渉を厳密に表現することに成功してきた.本年度はその手法を赤血球に適用し,赤血球の濃厚溶液である血液の数理モデル化を行った.特に赤血球の近距離干渉に焦点を当て,高分子の架橋構造による干渉力をばね力でモデル化することに成功した.狭さく部を通る血流の数値シミュレーションも行い,解析結果を実験結果との比較した.赤血球を用いた血球の干渉実験および血流の可視化実験シミュレーションの妥当性を検討するには,対応する実験データが不可欠である.そこで本研究では,研究室に既存のconforcal-micro PIVシステムを用い,染色した赤血球の干渉実験および血流の可視化実験を行った.微小血管の狭さく部を模擬した流路は,PDMS micro channelを用いて作成した.実験結果を数値シミュレーション結果と比較検討し,解析手法の妥当性を確認した.
甲状腺ホルモン受容体C末端側転写活性ドメインの機能解析

機能的なT_3受容体(TR)にはα1とβ1がある。我々は、TRα1とβ1のC端にある転写活性ドメインの機能の差を調べるため、全身型甲状腺ホルモン不応症で発見されたC端11個のアミノ酸を欠失する異常TRβ1(βF451X)と、これと全く同一のC端欠失を持つよう作成した異常TRα1(αF397X)を用い、種々のTR応答領域(TRE)における両者の機能の差を比較検討した。1,consensusTREであるpalindrome(Pal)、direct repeat(DR4)やnative TREであるmalic enzyme(ME)、myosin heavy chain α(MHCα)、lysozyme silencer(F2)における正常TRα1、TRβ1に対するドミナントネガテイブ作用を比較した。ドミナントネガテイブ作用はTRE依存性で、Pal、DR4、F2においてはβF451Xの方がαF397Xよりも有意に強いドミナントネガテイブ作用を示したが、MHCα、MEでは両者に差を認めなかった。正常TRに対する選択性はなく、βF451XがTRβ1を、αF397XがTRα1をより強く阻害するといったことはなかった。2,DR4においてパートナー蛋白であるレチノイドX受容体(RXR)を同時発現させた場合、αF397Xのドミナントネガテイブ作用は増強したがβF451Xのそれは変化しなかった。3,T_3非存在時、DR4とPalにおいてαF397XもβF451Xと同様に基礎転写活性を抑制した。4,酵母の転写因子GAL4のDNA結合ドメインとRXRの融合蛋白に対する親和性は、αF397Xの方がβF451Xよりも有意に強かった。以上より、αF397XもβF451Xと同様に5種のTREで強いドミナントネガテイブ作用を示すこと、ドミナントネガテイブ効果はTRE依存性で、ある種のTREではβF451Xの方がαF397Xよりも強いドミナントネガテイブ作用を発揮すること、RXRとの親和性や充分量のRXR存在下でのドミナントネガテイブ作用に両者で差があることが明らかとなった。αF397Xも甲状腺ホルモン不応症を起こし得ると考えられ、今後αF397Xを発現させたトランスジェニックマウスを作成し、生存の可能性や表現型を観察する方針である。
オットー光学配置を利用したペーパープラズモニックセンサの構築

紙の上に形成された金属表面で表面プラズモン共鳴が発現することを示し、「紙」を化学・バイオセンサ用のチップ基材とするペーパープラズモニックセンサの構築を研究目的とする。紙は、安価で軽量、加工性に優れるほか、センサ基材として使用後容易に裁断、焼却などの処分が可能である。本研究では、Otto光学配置を利用し紙をセンサシートとする物質のセンシングの可能性について検討を行った。塗工紙表面に金の連続膜を蒸着したものをプラズモン場を発生させるセンサシートとし、プリズムと紙との間にギャップを形成、赤外および近赤外のp偏光を入射光としてOtto光学配置を構築した。反射率の入射角依存性を計測したところ、伝搬型表面プラズモン共鳴が紙上の金表面で発現することを確認した。金表面でタンパク質が特異吸着する系を導入した場合、タンパク質吸着後に共鳴角シフトを確認することができた。紙表面に形成した金のパターンアレイにおけるCCDカメラでのタンパク吸着イメージングについては、プラズモン場となる金表面が基材の紙表面のラフネスを追随し共鳴角が各パターン位置によってずれるため、金パターン間におけるタンパク質吸着前の像の濃淡が不均一となり、吸着の有無を判断できる像の取得には至らなかった。一方、平成29年度に見出した、10nm以下の膜厚の紙上の金不連続膜が室温でもマイグレーションし、局在表面プラズモン共鳴による発色および色相変化を起こす挙動について、温度条件や紙の表面ラフネスなどの条件を振って検討を行った。その結果、マイグレーション挙動は、紙ー金、金ー空気、空気ー紙の3つの界面における自由エネルギーの総計が最小となるよう金がその形状を変化させる「固体脱濡れ」現象によるものと推定した。室温よりも高い温度で固体脱濡れが促進する一方、ラフネスが大きくなると脱濡れが阻害されることも分かった。紙の上に堆積された金表面をプラズモン場とするOtto光学配置の形成により、表面プラズモン共鳴を観測することに成功した。金は真空蒸着法によって紙の上に堆積された。測定は、ガラスプリズムと紙の間に1マイクロメートル以下のギャップが存在する状態で、633nmのp偏光を全反射条件でプリズム側から入射し、それに対する反射光を計測することにより行われた。その結果、表面プラズモン共鳴発現時に特徴的な楔形の波形を有する、反射率分散カーブを得ることができた。紙表面のラフネスは、プラズモン特性の発現において重要なファクターであり、なるべくラフネスが小さくなるような塗工紙が基材として好ましい。加えて、金の蒸着速度や紙の表面自由エネルギーといったパラメータも、堆積される金のグレインサイズを決定付け、表面プラズモン共鳴の発現に関わる重要なファクターであることが分かった。一般的な市販の塗工紙の場合、蒸着速度が遅くなるにつれて金のグレインサイズが大きくなり、反射率分散のディップ波形が鋭くなる。一般的に基材として使用されるガラス表面に比べ、紙のラフネスの大きさは不利に働くが、金属の堆積速度の制御によって大きいラフネスという不利な点をある程度補うことができることが分かった。紙を基材に用いるプラズモンセンシングの試験として、ギャップのメディアを空気から水に置換したところ、反射率分散カーブにおける共鳴角が屈折率の増加に応じて高角度側にシフトすることを確認することができた。当初の計画書に記載の通り、誘電体メディア層としての非常に狭いギャップ層像乳によるOtto光学配置の形成や紙上へ堆積した金属表面での表面プラズモン共鳴発現に成功している。また、多くの種類の紙で実験を行い、そのなかから表面プラズモン共鳴の発現が可能な紙の種類を抽出することができた。加えて、金属の蒸着速度や紙のみかけの表面自由エネルギー値と得られる金属表面状態の相関性に関する検討を行うことができている。一方、紙の平滑性を担保できるようなコーティングについては、予想に反し、塗工紙に施されている紙へのコーティングが多種多様であり、非常に平滑性の高いものが存在していることが分かったので、今後は必要に応じて行う程度とする。また、金属層の印刷に関しては、現状、一般的な印刷用金属インクに有機物の含有が多いので、伝搬型の表面プラズモン共鳴の発現は確認できなかったが、紙表面の帯電処理および印刷後の熱処理によって、局在型のプラズモン共鳴による発色が確認された。伝搬型と局在型のプラズモン共鳴が結合するような系を蒸着と印刷を利用して設計できる可能性がある。コート紙の上に堆積した金の表面をプラズモン共鳴場とするOtto光学配置において、タンパク質の特異吸着を検出することに成功した。プラズモン共鳴場でセンシングを行うには、伝搬長を長くし、反射率の入射角分散で現れるディップの半値幅を小さくさせる必要がある。昨年度の検討で、コート紙上への金の蒸着速度が小さいほど、堆積される金のグレインサイズが大きくなり、ラフネスも小さくできることを明らかにした。そこで、低ラフネスの金表面を必要とするため、0.01 nm/sの低堆積速度でコート紙の上に金を真空蒸着した。検出ターゲットのタンパク質モデルであるストレプトアビジンを用いるため、これと特異吸着するビオチンを末端とする分子を紙上の金表面に化学修飾し、これをセンサシートとした。まず、センサシートを構築したOtto光学系にセットし、反射率の入射角分散測定を行った。