hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エラストグラフィの特性と安全性評価のための長期安定高粘性ゲルファントムの開発

臨床において非侵襲的に生体組織の粘弾性を評価するために,エラストグラフィが利用されている.エラストグラフィの定量性や再現性を評価したり,異なるシステム間で粘弾性パラメータを比較したりするためには,粘弾性が既知なファントムが必要である.これまでのファントムには生体と比較して粘性が低い問題がある.本研究では,生体組織を模擬した経時的安定性を有するファントムを開発することを目的とした.高粘性を達成するために溶媒にグリセリンを付加するなどの薬品配合量や作成法の最適化を行った,本研究では,生体組織を模擬したファントムの作成に成功すると共に,経時的安定性を有することを確認できた.エラストグラフィで画像化可能で,生体組織と同等の粘性と弾性を併せ持ち,少なくとも1年程度は経時変化が少ない高分子ゲルファントムを開発することを目的とした.このような性質をもつゲルとして,今年度はアクリルアミドを主成分とする高分子ゲルを作成した.溶媒を蒸留水だけにした場合の粘性は非常に低いため,溶媒にグリセリンを含ませることで粘性率がどの程度向上するかを確認した.また,溶媒にグリセリンを用いることで,薬品の撹拌が困難となるため,大容量のファントム内部を均一にして作成するためのプロトコルを検討した.粘弾性の測定には,物理測定装置であるレオメーターと研究者が開発したMRエラストグラフィシステムを用いた.グリセリン濃度を70%程度にすることで,生体組織に近い粘性率を実現可能であることを確認した.MRエラストグラフィで画像化可能で,生体組織と同等の粘性と弾性を併せ持つ高分子ゲルファントムを開発するとともに,少なくとも1年は経時変化がないことを確認した.昨年度,アクリルアミドを主成分とする高分子ゲル選定し,粘性率向上のために溶媒にグリセリンを70%含ませることで生体組織に近い粘性率が達成できることを確認した.一方,溶媒に多くのグリセリンを用いることで,薬品の撹拌が困難となったことで,大容量のファントムを安定して均一に作成することが困難であることがわかった.そこで,H27年度は薬剤の配合量や作製プロトコルを改良することでグリセリン濃度を下げても生体組織と同程度の粘弾性率を達成可能とした.当初の計画どおり,生体軟組織を模擬した粘弾性を持つゲルを開発するとともに,3Dプリンターを用いて鋳型を作製し,作製したファントムを対象としたMRE測定を実施した.これにより,ヒトを対象とした撮像における撮像パラメータを検証することができた.非侵襲的に生体組織の粘弾性を評価可能なエラストグラフィは,肝線維症のステージ判定などに利用されている.エラストグラフィには磁気共鳴画像装置(MRI)と超音波診断装置を用いる2種類の手法がある.現時点で両装置を対象とした経時的安定性を有するゲルファントムがないため,装置の定量性と再現性を評価することができない.そこでアクリルアミドを主成分とする高分子ゲルを用いることで,エラストグラフィで画像化可能で,生体組織と同等の粘性と弾性を併せ持つ高分子ゲルファントムを開発した.昨年度までに開発したゲルでは,生体と同程度の粘性を達成するために溶媒に粘性の高いグリセリンを70%含ませる必要があるため,薬品の撹拌が困難となり,大容量のファントムを安定して均一に作成することが困難である問題が生じた.これを解決するために,薬剤の配合量や作製プロトコルを改良することでグリセリン濃度を下げても生体組織と同程度の粘弾性率を達成可能とした.光ファイバ温度計を利用することで,作成時の温度とゲルの粘弾性との関係性を明らかにした.新しい配合量のファントムでも1年は経時変化をしないことを確認した.また,このゲルに散乱体を加えることで,MRI装置だけでなく超音波診断装置でも測定可能なファントムの作成に成功した.開発したファントムを利用することで,複数のMRエラストグラフィシステムの定量性と再現性を確認することができた.臨床において非侵襲的に生体組織の粘弾性を評価するために,エラストグラフィが利用されている.エラストグラフィの定量性や再現性を評価したり,異なるシステム間で粘弾性パラメータを比較したりするためには,粘弾性が既知なファントムが必要である.これまでのファントムには生体と比較して粘性が低い問題がある.本研究では,生体組織を模擬した経時的安定性を有するファントムを開発することを目的とした.高粘性を達成するために溶媒にグリセリンを付加するなどの薬品配合量や作成法の最適化を行った,本研究では,生体組織を模擬したファントムの作成に成功すると共に,経時的安定性を有することを確認できた.当初の計画どおり,真空定温乾燥機を購入し,効率的にサンプルを作成可能な環境を構築することができた.また,事前の日程調整により共同研究機関における測定も行うことができた.MREで利用する外部加振による運動エネルギー,超音波エラストグラフィで与える集束超音波などにより,撮像対象の表面や内部ではエネルギー伝の案による温度上昇が生じている.安全性の評価のために,撮像対象領域での温度変化を測定する.生体工学臓器形状を模擬したエラストグラフィ用ファントムを作成し,最適撮像条件を検討する.また,撮像パラメータによる患者への負担の差を測定するなど,交付申請書に記入した実施計画に即して研究を遂行する.本課題で開発したファントムを他施設で評価するにあたり,外部業者へ発注する必要がある.昨年度までに開発したファントムの作製プロトコルによる再現性評価実験を十分に検討してから発注することが望ましいと考え,次年度に予算を残すことにしたため.昨年度までに開発したファントムの作製プロトコルによる再現性評価実験を十分に検討できしだい外部業者へ発注する.
外見に関する不適応的な信念の変容が身体不満足感および食行動異常に及ぼす効果

【目的】外見によって自己評価が大きく左右される傾向を表す「自己評価の特徴(Self-Evaluative Salience : SES)」と外見を管理し,精神的安定を得るために自己の容姿を様々な方法で繰り返し確認することが役立つと考える「安全希求および体重・身体コントロール(Safety Beliefs and Body Control : SBBC)」は,身体不満足感の増加に影響を及ぼすことが示されている(Ambo, Suga, & Nedate, 2012)。そこで,本研究では,SESやSBBCの影響について受容的に思索する認知行動的介入が身体不満足感とそれにかかわる認知・行動的問題,主観的幸福感に及ぼす効果について検証することを目的とした。【方法】身体不満足感が高く,極端な痩せあるいは肥満体型ではなく,不満の対象となる身体部位は医学的問題とは無関係である,などの基準を満たす健常な青年期女性を対象とした。スクリーニング調査の対象者は691名であり,このうち,本実験の参加基準を満たし,参加の同意が得られた27名をSESおよびSBBCについて受容的に思索を行う認知行動的介入群(n=9),SESやSBBC以外の外見に関することについて思索を行う傾聴群(n=9),外見以外のことについて思索を行う統制群(n=9)に振り分けた。【成果】本研究における認知行動的介入は,身体不満足感,自己評価が外見的魅力によって左右される傾向,社交不安傾向の低減に効果があることが示唆された。さらに,このような支援法は,青年期女性の人生満足感と主観的幸福感の増加に有効であることが示唆された。【意義】本研究によって,青年期女性の精神的健康を維持・増進し,精神的不調を低減・予防するための新たな効果的アプローチが明らかになったといえる。本年度は,交付申請書に記載した研究計画に沿って,研究8のデータの収集と解析を完了した。研究は順調に進展し,本年度をもって交付申請書に記載した研究計画をすべて完了した。ちなみに,研究1から研究8をまとめ,平成25年1月に博士(人間科学)の学位を取得した。本年度をもって,交付申請書に記載した研究計画はすべて完了した。今後は交付申請書に記載した研究6から研究8の論文を学会誌に投稿する予定である。【目的】本研究では,認知行動カウンセリングの立場から,身体不満足感を測定する新たな尺度を開発し(研究4,研究5),青年期女性の身体不満足感に関するメカニズムの検討を行った(研究6)。次に,メカニズム研究の知見に基づく介入法を考案し,その効果を検証した(研究7)。【方法】青年期の大学生女性を対象に,調査および実験を実施した。【成果】外見全般に関する否定的感情の特性的側面と状態的側面を測定することのできる尺度が作成され,その十分な信頼性および妥当性が確認された。身体不満足感のメカニズムを検討した結果,外見的な魅力を重視する信念は,身体不満足感や食行動に否定的な影響を及ぼす一方で,人生満足感には肯定的な影響を及ぼすことがわかった。介入研究においては,外見的魅力を重視する信念に対する受容的な自己理解を促進することが,身体不満足感の低減と自尊感情の増加に有効であることが示された。【意義】本研究は,身体不満足感に対する,従来の認知行動カウンセリングが外見全般に関する身体不満足感に与える効果の検証が不十分であったという問題点を解決することにつながる。また,身体不満足感への介入で用いられてきた認知的再構成法や身体部位へのエクスポージャーは,効果がある反面,課題に対する抵抗感や苦痛を生じさせやすいことが考えられる。本研究によって,外見全般に関する不満を持つ本邦の青年期女性に対しては,外見的魅力を重視する信念に着目することが重要であり,このような信念に対する受容的な自己理解を深めるアプローチは,身体不満足感とこれにかかわる行動的問題の低減に効果があることが示唆された。このことは,青年期女性の食行動異常や対人場面における回避行動,外見に関する強迫的な確認行動などといった行動的問題の悪化を予防し,青年期女性の心身における健康の維持および増進の一助となると考えられる。【成果】

本研究における認知行動的介入は,身体不満足感,自己評価が外見的魅力によって左右される傾向,社交不安傾向の低減に効果があることが示唆された。さらに,このような支援法は,青年期女性の人生満足感と主観的幸福感の増加に有効であることが示唆された。【意義】本研究によって,青年期女性の精神的健康を維持・増進し,精神的不調を低減・予防するための新たな効果的アプローチが明らかになったといえる。本年度は,交付申請書に記載したとおり,研究4から研究7までのデータの収集と解析を完了し,論文にまとめた。交付申請書に記載した研究計画に沿って,順調に進んでいる。本年度は,交付申請書に記載した研究計画に沿って,研究8のデータの収集と解析を完了した。研究は順調に進展し,本年度をもって交付申請書に記載した研究計画をすべて完了した。ちなみに,研究1から研究8をまとめ,平成25年1月に博士(人間科学)の学位を取得した。2012年の4月からは,研究8のデータの収集を開始し,9月にはすべて終了する予定である。その後,研究1から研究8を博士学位論文としてまとめ,2012年の10月には,博士学位論文の審査を受ける予定である。なお,研究8が完了した時点で,交付申請書に記載した研究計画はすべて終了する。本年度をもって,交付申請書に記載した研究計画はすべて完了した。今後は交付申請書に記載した研究6から研究8の論文を学会誌に投稿する予定である。
ピコリン誘導体を利用したペプチド可溶化タグの創生

本研究は、難溶性ペプチドの溶解性を高める可溶化タグの開発を目的として行っている。あるタンパク質の部分ペプチドや膜タンパク質の膜貫通ドメインなどは、自身の疎水性により、高い凝集性、難溶性を示す。こういった難溶性ペプチドの調製は困難を極め、その機能解析も遅れている。これらペプチドの特徴は、ペプチド鎖に電荷が少なく、水溶液に対する親和性が極めて低いことであると考えた。そこで本研究では、ペプチドの電荷状態を高め、溶解性を向上させるピコリンを母核骨格とした可溶化タグの開発を行うことにした。まずは、目的のピコリン骨格を持つ可溶化タグの合成を行った。1つ目の合成ルートでは、イソニコチン酸エステルを出発原料として、アリルグリニャール試薬により、アリル基が2つ導入された3級アルコールを調製した。次に、2つのアリル基にヒドロホウ素化と続く酸化反応により、末端アルコール体へと変換した。しかし、この反応では、ホウ素付加の位置選択性が低く、複数の異性体混合物を与える結果となった。保護基の導入等を行い、選択性が改善されるかどうか、検討を行ったものの、いずれも良好な結果を得ることはできなかった。そこで、異性体混合物を分離し、メチルスルホン酸エステルへ誘導した後、続けて、アミノ基の導入を試みた。しかし、この工程では、ピリジン窒素の求核攻撃によるポリマー化が進み、窒素求核剤を変更しても、収率よく目的物を得ることはできなかった。一部、目的の可溶化タグまで誘導することができたが、出発原料からの総収率は、約1ー2%と極めて低く、実用に耐える合成ルートではないことが判明した。そこで、現在は、アミノ基のシントンを予めグリニャール試薬に導入し、イソニコチン酸エステルと反応させる第二経路を現在検討している。本研究の本筋である、新規可溶化タグの効果を検証する段階まで到達することができていない。加えて、可溶化タグの構築も完了しておらず、合成ルートの開拓に難儀している状態である。よって、現状、本研究計画はかなり遅れていると判断せざる負えない。まずは、可溶化タグの構築と、アミノ酸誘導体への導入を最優先目標として計画を進める予定である。現在は、ピコリンに導入したN-ジアリルアミンの脱保護に苦戦している状態であるため、その反応条件の最適化を行うと共に、別の合成経路として、アリル基をラジカル的に官能基化した後、種々保護基変換を経て、可溶化タグの合成を行おうと考えている。次に、グルタミン酸側鎖のカルボン酸に可溶化タグの導入を行い、次に、固相合成法に応用することで、本可溶化タグが、固相合成法に利用可能なのかどうか検証する。最後に、難溶性ペプチドに本可溶化タグを導入し、その効果を検証することを行いたい。

次に、グルタミン酸側鎖のカルボン酸に可溶化タグの導入を行い、次に、固相合成法に応用することで、本可溶化タグが、固相合成法に利用可能なのかどうか検証する。最後に、難溶性ペプチドに本可溶化タグを導入し、その効果を検証することを行いたい。使用した溶媒や消耗品をまだ購入しなかったため、来年度はこれらの補充に執行する予定である。
両眼立体視における観察距離によるスケーリング処理過程の検討

対象までの距離が変わると対象の奥行きを示す両眼視差や輻輳角が変化する.本研究では,視覚系がこうした距離の変化の情報を利用してどのように奥行きをスケーリングしているかを検討した.実験の結果,観察者が移動したときの両眼視差の動的な変化の情報自体は,奥行きの正しいスケーリングに影響を及ぼさないこと,輻輳角による対象の奥行き定位は刺激の物理的位置に依存すること,輻輳角による奥行きのスケーリングの特性は,対象内,対象間の奥行きで異なる可能性があることを示した.対象までの絶対距離の情報が両眼視差から奥行きへのスケーリングに及ぼす影響について検討し,以下の成果を得た.(1)観察者が移動することによる両眼視差の変化が対象の奥行きの知覚に及ぼす影響について,絶対距離を複数設定して検討した.観察者が対象に向かって移動すると絶対距離の長短にかかわらず対象内の奥行きを過大視し,奥行きの恒常性は保たれなかった.また,絶対距離が短い条件の方がその程度は大きく,移動に伴う視差の変化の度合いに依存した.さらに,観察者の移動によって生じるリアルタイムな視差の変化の情報自体は正確な奥行きの知覚に寄与しなかった.(2)輻輳角を変えることで,対象内および対象間の奥行き知覚がどのように変化するか,また,その変化に違いがあるかを検討した.実験の結果,対象内,対象間のどちらの条件においても輻輳角が小さい方が奥行き検出の感度が上昇する傾向が見られた.ただし,対象間の奥行きの方が輻輳角の変化による感度の変化が大きく,特に対象間の奥行きの処理において,絶対距離の情報に応じて感度を動的に変化させている可能性を示した.(3)壁紙効果のような見えを生じる刺激を用い,この刺激を物理位置と異なる輻輳角で融像した場合に知覚される奥行き位置を検討した.実験の結果,刺激までの距離の絵画的手がかりを統制した場合でも,刺激は輻輳角の示す奥行き位置には知覚されず,刺激の位置が観察者に近いほど刺激が近くに知覚されることが示された.以上より,観察者が移動することによる両眼視差の変化の情報は奥行きの正しいスケーリングに影響を及ぼさないこと.輻輳角による絶対距離情報による奥行きのスケーリングの特性は対象内,対象間の奥行きで異なる可能性があること,輻輳角による対象の奥行き定位は刺激の物理的位置に依存することを示した.対象までの距離が変わると対象の奥行きを示す両眼視差や輻輳角が変化する.本研究では,視覚系がこうした距離の変化の情報を利用してどのように奥行きをスケーリングしているかを検討した.実験の結果,観察者が移動したときの両眼視差の動的な変化の情報自体は,奥行きの正しいスケーリングに影響を及ぼさないこと,輻輳角による対象の奥行き定位は刺激の物理的位置に依存すること,輻輳角による奥行きのスケーリングの特性は,対象内,対象間の奥行きで異なる可能性があることを示した.(1)観察者が移動したときに生じる両眼視差の変化が,対象の奥行きの知覚にどのように影響を及ぼすかを心理物理実験により検討した.移動前と移動後にそれぞれ静止した刺激を提示するのみの条件と,移動時にもリアルタイムに両眼視差の変化を提示する条件を設け,その奥行き知覚の違いを検討した結果,どちらの条件でも奥行きが一定に知覚されるのは移動後の方が理論値よりも奥行きが小さくなるように両眼視差を設定した刺激であった.すなわち,近距離になるにつれて奥行きが過大視されることが示された.静止した2フレームのみの提示条件と両眼視差の変化を連続的に提示する条件の間では明確な差が認められなかったことから,移動中のリアルタイムな視差変化の情報は,観察者の移動を伴った正確な奥行きのスケーリングに大きな影響を及ぼさないことが示された.(2)観察距離の情報をもたらす生理的手がかりには輻輳角がある.この輻輳角が奥行きスケーリングに及ぼす影響を実世界に重畳するオートステレオグラムを用いて検討した.透明なディスプレイに壁紙効果を生じさせるオートステレオグラムを提示し,輻輳角を刺激の物理的位置と異なる角度で融合した時に,刺激の奥行き位置がどのように定位されるかを心理物理実験により検討した.実験の結果,定位された奥行き位置は輻輳角から理論的に予測される値よりも刺激の物理的位置に近くなった.また刺激の物理的位置を操作したところ,その物理的距離に依存して知覚される奥行き位置も変化することが示された.これらの実験結果から,(1)観察者の移動に伴う両眼視差の変化の情報自体は正確な奥行き知覚に大きく寄与することはない,(2)透明なディスプレイ上に提示した刺激を壁紙効果によって現実世界に重畳した場合,正しい奥行き位置に定位されない,という両眼立体視の知覚特性を示すことができた.心理物理学的研究については順調に進展しており,平成24年度の研究成果は3DSA2013およびECVP2013の2つの国際学会にて成果発表を行う予定である.fMRIの実験については平成24年度より高知工科大学において本格的に稼働したMR装置で実験準備を行い,マルチボクセルパターン分析によるデコーディングの実験を行うために,被験者の視覚野を同定するためのレチノトピーのMRI実験および,刺激の作成を行った.立体刺激を用いた本実験は平成25年度において行う予定である.

心理物理実験においては,予定通りプロジェクタを用いてサイズの大きい刺激を投影し,3-4 mの観察距離から観察者が移動する条件で実験を行う.fMRI実験ではマルチボクセルパターン分析による奥行き知覚の推定の手法を用いて,正答率を指標とした両眼視差のスケーリングによる奥行き恒常性の処理領野の検討を行う本実験を中心的に行う.平成24年度は予定よりfMRIの実験の回数が少なかったため,残額が生じた.残額分は平成25年度のfMRI実験の被験者への謝金として用いる予定である.
ガン細胞の走化浸潤を担うダイナミンナノクリップ:新たな制ガン剤の分子標的

これまでに181種類のダイナミン阻害剤ダイナソアの構造類縁化合物につきアクチン線維形成阻害を有する分子をスクリーニングした結果、ダイナソアよりも、強力なアクチン線維形成阻害作用を持つ分子DBHA (N'-(4-(diethylamino)benzylidene)-4-methoxybenzohydrazide)を同定した。この分子の抗がん効果を調べた。DBHAは、ヒト肺がん細胞株の血清刺激依存性ラッフル膜形成、遊走、浸潤能を強く阻害した。遊走、浸潤能の阻害を示すDBHAの濃度では、細胞毒性も見られなかった(論文作成中)。さらに、阻害剤作用の基本となるダイナミンによるアクチン制御機構の一部を解明した。ダイナミン・コルタクチン複合体は、数本のアクチン線維を束化することによりアクチン線維を安定化する。このアクチン制御機構は、神経細胞突起伸長、がん細胞の遊走に必要であり、ダイナミン阻害剤の作用機序を知る上で、非常に重要な知見が得られた。これらの結果の一部をJ. Neuroscience誌に発表した。得られた知見は、神経再生、がん細胞の転移治療の基盤になることが期待される。(1)アクチン重合を指標としたダイナミン阻害剤スクリーニングATP存在下ビレンでラベルした単量体アクチンを脳細胞質に加え、ホスファチジルセリンを含んだ人工脂質膜で刺激すると、アクチンの重合を誘導できる。22年度は、これまでにスクリーニングし、既存のダイナミン阻害剤dynasoreよるも3倍程度強くアクチン重合を阻害するNo94分子の構造類似体38分子のスクリーニングを行った。この結果、3個同程度、もしくは2倍強い分子を同定することができた。23年度は、この分子の構造を元に、スクリーニングをさらに進める予定である。(2)ダイナミンによるアクチン制御機構の解析細胞が大きく形態変化を行う過程で、ダイナミンがタンパクキナーゼによりリン酸化を受けることを見いだした。本年度は、コルタクチンが、ダイナミンをリン酸化するタンパクキナーゼによりリン酸化されることを、in vivo、in vitroで明らかにした。さらに、これらリン酸化酵素によりリン酸化をうける部位を同定した。23年度は、これらリン酸化が、アクチンダイナミクスにどのような影響を与えるのかをin vitroを中心に解析する。アクチン重合を指標としたダイナミン阻害剤スクリーニング平成22年度に引き続き、アクチンの動態を指標とした阻害剤スクリーニング法を用いて、さらに84種類の低分子化合物の阻害効果を調べた。その結果、3分子が、これまでスクリーニングした分子より、同等もしくは強力であった。今回、スクリーニングに供した分子のいくつかは、現在臨床系で、他の目的に使われ、アクチン動態に関する効能が未知の薬剤であった。既に、これら薬剤は、人への安全性が確認されている。これらの結果は、アクチン動態を標的とした創薬を考える上で、幅広い展開が可能になる重要な結果である。さらに、スクリーニングを進め、これら分子と活性阻害との構造相関を調べ、スクリーニングに活かしていく。ダイナミンによるアクチン制御機構ダイナミン阻害剤であるダイナソアの仮足形成阻害様式は、アクチン線維を急速に不安定化させ、脱重合を促進することによる(Yamada et al., BBRC, 2009)。しかしながら、急速なアクチン線維の不安定化は、ダイナミン・コルタクチン複合体の脱共役のみでは、説明できなく、その他因子の存在(シグナル伝達を含む)が示唆される。この因子の探索を行うためアクチン重合阻害分子の側鎖を有機化学的に修飾し、結合するタンパクを単離するシステムを構築中である。本年度は、修飾による阻害効果への影響を調べ、有効な側鎖修飾基を探索した。ダイナミンは、リン酸化によりエンドサイトーシスにおける機能が調節されている。アクチン制御においても、前述のようなリン酸化による制御が起こるのか否かを調べている。本年度は、試験管内で、コルタクチンがSrcとは異なるキナーゼによりリン酸化されることを実証した。さらにリン酸化部位も同定した。来年度も引き続き、これらコルタクチンのリン酸化部位の変異体のアクチン骨格への効果を調べる。これまでに181種類のダイナミン阻害剤ダイナソアの構造類似体をアクチン線維形成を指標としてスクリーニングした。

既知のダイナミン阻害剤ダイナソアよりも、強力なアクチン線維形成阻害作用を持つ分子DBHA(N'-(4-(diethylamino)benzylidene)-4-methoxybenzohydrazide)を同定できた。この分子の、がん細胞の遊走に対する効果を調べた。DBHAは、ヒト肺ガン細胞株(H1299)の血清刺激依存性ラッフル膜形成を強く阻害した(IC50=16.7 μM)。さらに、創傷治癒試験によりDBHAが遊走活性を顕著に抑制する事も判明した。細胞遊走を阻害するDBHAの濃度では、細胞毒性も見られなかった。これら結果をまとめて、論文を作成中である。ダイナミン・コルタクチンによるアクチン制御機構の一部を解明した。ダイナミン・コルタクチン複合体は、成長円錐の糸状仮足上に局在しており、ダイナミンの阻害剤やコルタクチンの発現抑制により、これら分子の機能を抑制すると、速やかな成長円錐の退縮を引き起こした。分子機構については、ダイナミン・コルタクチンは、アクチン線維を束化することにより糸状仮足を安定させることが判明した。これら結果の一部をまとめ、米国神経科学会誌に発表した(Yamada et al., J. Neurosci., 2013)。リン酸化によるダイナミン・コルタクチンの機能制御の可能性を考え、まず、タンパクキナーゼCによってin vivoでリン酸化を受けるのかを調べた。コルタクチンは、in vitroでタンパクキナーゼCによりリン酸化された。コルタクチンは、リン酸化によりそのアクチン束化能は顕著に減少した。今後、ダイナミン・コルタクチン複合体におけるリン酸化の生理的意義を調べていく予定である。アクチン動態を変化させる分子のスクリーニングは、順調に行われており、さらに新規な効果のある分子が発見された。さらに、既に、別の用途で使用されている薬剤のいくつかが、アクチン制御を行う可能性を初めて発見した。これら発見は、創薬を考える上で、非常に重要であると考えられる。ダイナミン・コルタクチンによるアクチンバンドリング機構の解明は、リン酸化制御が実際に存在しうる結果を得た。次年度は、これら詳細を、調べていく。24年度が最終年度であるため、記入しない。基本的には、アクチンの動態を変化させる分子の試験管内での実験によるスクリーニングと、細胞生物学的、生化学的手法を用い、細胞レベルで、ダイナミン・コルタクチンによるアクチンバンドリング機構を解析する。共同研究者の山田博士、渡部博士と密接に連携して遂行する。
ワクチニアウイルスの吸着と侵入に関わる細胞膜成分の分離と同定

ワクチニアウイルスの細胞への侵入活性を担うVP23-29Kタンパクに対し存在が予測される、宿主細胞膜上のリセプターの同定を目指して一連の研究を行い、今年度以下の結果を得た。(1)ウイルス粒子から界面活性剤SDSを用いて抽出したタンパク質サンプルを細胞培養に添加すると、DNAの断片化を指標としてみたアポトーシス誘導作用を示すことが明らかになった。同サンプルより特異抗体を結合したアフィニティーカラム用いて分離したVP23-29Kにも同様の活性が認められ、VP23-29Kと細胞膜レセプターとの結合がアポトーシス誘導の引き金になることが示唆された。(2)VP23-29Kのアミノ酸配列をアポトーシス誘導作用を有する既知の生理活性物質と比較したところ、tumor necrosis factor(TNF)-αの活性部位と極めて類似する(11アミノ酸中7)箇所が存在することが見出された。TNF-αの活性に必須とされる3箇所のアミノ酸はいずれもVP23-29Kの配列中に保存されており、アポトーシス誘導の機構としてTNF-αとVP23-29Kとの機能的相同性が考えられる。(3)TNF-α存在下にウイルスを培養細胞に感染させると、濃度依存的に感染効率の低下が認められ、VP23-29KとTNF-αが同一のリセプターに競合的に結合する可能性が示唆された。(4)昨年度の研究で、可溶化した細胞膜タンパクをVP23-29Kとのアフィニティーにより分画すると4種のタンパクが回収されることを見ている。これらのいずれか、特に分子量の類似から分子量55、000のタンパクがTNFリセプターと同一の分子である可能性を考えているが、他施設から供与された抗TNFリセプター抗体にはVP23-29Kによるアポトーシス誘導の阻止作用はなく、また上記4種のタンパクとの反応も認められなかった為、現在この点について更に解析を行っている。ワクチニアウイルス構成タンパクに対するモノクローナル抗体を用いた解析から、ウイルスの血球凝集素(HA)とVP23Kが、それぞれ細胞への吸着活性、および侵入(細胞融合活性)に直接関るタンパクと想定している。この2種のタンパクが反応する細胞成分の同定を目的とする解析を行っており、現在までに以下の知見を得ている。(1)細胞膜の脂質画分から得られた成分で処理すると、HA^+ウイルスの吸着活性が大幅に低下する。またこの成分をシアリダーゼで処理すると吸着阻害活性は消失する。HA^-のウイルスの細胞吸着活性はHA^+ウイルスの1/20程度であり、細胞膜脂質画分の阻害物質の影響を受けない。したがって、HAはその化学的性状から糖脂質に属する細胞膜成分に親和性を有すると考えられる。遺伝子を組込んだ大腸菌で産生したVP23KをSepharoseに結合し、種々の条件で可溶化した細胞膜タンパクとの結合を調べた結果、オクチルグリコシド可溶化タンパク中にVP23Kとの結合を示す成分を見出された。結合活性を示す細胞膜タンパクは中性条件下では少なくとも12種類検出されるが、このうちウイルスの細胞への侵入・細胞融合を著しく促進する酸性条件下(ph5.0)で安定的に結合するタンパクは5種類であった。Sephacryl S-300を用いたゲルろ過でこれら5種のタンパクは分子量100万以上の分画に分離せずブロードに溶出されるので、これらは複合体を形成しているのかもしれない。

上記5種のタンパクを含む分画で免疫し作成した抗血清は、ワクチニアウイルスの酸性条件下での細胞への感染を効果的に抑制した。また、中性条件下で細胞への強い侵入・融合活性を示すVP23K変異株M4に対しては、抗血清は中性条件下でもその効果を発揮することが明らかになった。これら5種のタンパク中にVP23Kの結合タンパクが含まれている可能性が考えられ、今年度の研究で更に検討を続ける予定である。ワクチニアウイルスの細胞への侵入活性を担うVP23-29Kタンパクに対し存在が予測される、宿主細胞膜上のリセプターの同定を目指して一連の研究を行い、今年度以下の結果を得た。(1)ウイルス粒子から界面活性剤SDSを用いて抽出したタンパク質サンプルを細胞培養に添加すると、DNAの断片化を指標としてみたアポトーシス誘導作用を示すことが明らかになった。同サンプルより特異抗体を結合したアフィニティーカラム用いて分離したVP23-29Kにも同様に活性が認められ、VP23-29Kと細胞膜レセプターとの結合がアポトーシス誘導の引き金になることが示唆された。(2)VP23-29Kのアミノ酸配列をアポトーシス誘導作用を有する既知の生理活性物質と比較したところ、tumor necrosis factor(TNF)-αの活性部位と極めて類似する(11アミノ酸中7)箇所が存在することが見出された。TNF-αの活性に必須とされる3箇所のアミノ酸はいずれもVP23-29Kの配列中に保存されており、アポトーシス誘導の機構としてTNF-αとVP23-29Kとの機能的相同性が考えられる。(3)TNF-α存在下にウイルスを培養細胞に感染させると、濃度依存的に感染効率の低下が認められ、VP23-29KとTNF-αが同一のリセプターに競合的に結合する可能性が示唆された。(4)昨年度の研究で、可溶化した細胞膜タンパクをVP23-29Kとのアフィニティーにより分画すると4種のタンパクが回収されることを見ている。これらのいずれか、特に分子量の類似から分子量55、000のタンパクがTNFリセプターと同一の分子である可能性を考えているが、他施設から供与された抗TNFリセプター抗体にはVP23-29Kによるアポトーシス誘導の阻止作用はなく、また上記4種のタンパクとの反応も認められなかった為、現在この点について更に解析を行っている。
オープンイノベーション環境での企業と大学研究者のマッチングシステムの開発

本研究は,オープンイノベーションの初期段階において,共同研究に繋がる可能性がある企業や研究者の発見のために,特許や論文のような科学技術文書から,企業と研究者の繋がりを発見する手法の開発を目的とする.文書集合において,1文書内で共起する単語の組に着目する.この単語の組が同じ2文書で共起し,どちらの単語も他のどの文書にも出現しない時,その単語の組を特徴語として抽出する.この特徴語を頂点とし,2つの特徴語の共起を辺とするグラフを出力する検索システムを作成した.辺が結ぶ2つの特徴語が出現する2文書の研究者を,その辺のラベルとして付与する.この研究者が2つの特徴語において繋がっていることを示す.本研究は,オープンイノベーションの初期段階において,共同研究に繋がる可能性がある企業や研究者の発見のために,特許や論文のような科学技術文書から,企業と研究者の繋がりを発見する手法の開発を目的とする.文書集合において,1文書内で共起する単語の組に着目する.この単語の組が同じ2文書で共起し,どちらの単語も他のどの文書にも出現しない時,その単語の組を特徴語として抽出する.この特徴語を頂点とし,2つの特徴語の共起を辺とするグラフを出力する検索システムを作成した.辺が結ぶ2つの特徴語が出現する2文書の研究者を,その辺のラベルとして付与する.この研究者が2つの特徴語において繋がっていることを示す.本申請研究は,オープンイノベーションや産学連携のために,特許明細書や論文などをデータとして,研究開発に直接繋がる可能性がある連携効果の高い企業,研究者の繋がりを発見する手法の開発を目的としている.企業,研究者間の繋がりを定量化する指標の開発が申請研究の中で最も重要な課題である.平成25年度は,例外的な関連抽出に着目した,企業と研究者の繋がりを定量化する指標の開発を行った.出現頻度の多い単語では,誰でも見つかる自明な繋がりが発見されると考え,出現頻度の低い単語に着目した.特許明細書を発明者,出願人ごとに分類した時,少数の発明者,出願人のみに出現する単語に着目した.競合企業や研究開発に繋がる可能性の高い企業,研究者間では,このような単語が多いと仮説を立てた.実験では,専門的な意味を表す単語が抽出されたが,有用な単語なのか,偶然に少数の発明者,出願人のみにしか出現しなかった単語なのか,詳しい分析が必要であることなどが明らかになった.また,少数の発明者,出願人のみに出現する単語と概念束との関連について考察した.この他に,企業と研究者の繋がりを可視化する簡単なシステムを作成し,Second IIAI International Conference on Advanced AppliedInformaticsにおいて発表を行った.このシステムは,検索語として単語と企業,研究者を入力した時,その企業,研究者の特徴語を抽出し,その特徴語に関連する企業,研究者を表示するものである.しかし,特徴語の抽出や,特徴語に関連する企業,研究者の抽出については改良を行う必要があり,上記の企業,研究者間の繋がりを定量化する指標を実装する必要があることが分かった.本申請研究は,オープンイノベーションや産学連携の初期段階における共同研究のパートナー発見のために,科学技術文書から共同研究の可能性がある企業や研究者の繋がりを発見する手法の開発を目的としている.最終年度は,文書間の局所的な類似度に着目し,企業や研究者の繋がり発見する研究を行った.本申請研究は,対象とする文書として,1文書に研究者の名前と研究内容に対する複数のキーワードが書かれている文書を想定している.文書集合が与えられた時,2文書で共起する2つのキーワードで,どちらのキーワードも他のどの文書にも出現しない2つのキーワードを抽出する.抽出した2つのキーワードは同じ2文書にのみに出現するため,このキーワードによって繋がる研究者は2文書の研究者のみであり,他の研究者とは繋がらない.この2文書の研究者は,抽出されたキーワードによって共同開発の可能性があると考えた.本申請研究では,単語を入力として与えた時,その単語の出現する文書集合から,上記の条件を満たすキーワードをノードとし,2つのキーワードの共起を辺とするグラフを表示するマッチングシステムを作成した.辺には,その辺によって繋がれる2つのキーワードが出現する文書の研究者がラベルとして付与される.この成果は,4th International Congress on Advanced AppliedInformaticsにおいて発表予定である.今後の研究の展望として,論文や特許のような複数の種類の文書集合からシステムを構築することが挙げられる.テキストマイニング本申請研究は2年計画であり,平成25年度は,企業と研究者の繋がりを定量化する指標の開発を行う計画であった.そして,企業と研究者の繋がりを定量化する指標について,頻度の低い単語に着目し実験を行い,指標の問題点が明らかになった.また,研究協力者と複数回のセミナーを行った.研究目的を実現するためには,指標のさらなる改良が必要であることが分かったが,おおむね計画通り進んだことから,おおむね順調に進展していると評価した.平成25年度の研究によって明らかになった問題に対応しながら,引き続き,企業と研究者の繋がりを定量化する指標の開発を行う.頻度の低い単語に着目することにより,意外な企業,研究者の繋がりの発見手法の開発を行う.全ての単語を用いた場合の企業,研究者間の類似度と,頻度の低い単語のみを用いた場合の類似度を比較し分析を行う.開発した指標の評価とフィードバックを繰り返すことによって,より精度の高い指標の開発を行う.また,開発した指標をマトリックス検索システムに実装することにより,企業と研究者の繋がりの可視化を行う.
自己相関蛍光法の特性解析と応用法拡大に関する研究

前年度までの研究成果を踏まえて、蛍光相関法について、通常の蛍光光度法の光学系を用いた、細胞形状の変化(大腸菌のサイズに対するマイトマイシンの影響評価)、円石藻の殻(円石)の付着による水中内運動性の評価、共焦点光学系を用いたローダミン6Gによる水/アルコールの粘度測定について研究した。本研究では、ラマン散乱への自己相関法の応用を目的に含めたが、研究には至らなかった。自己相関蛍光法は、細胞内の蛋白質、DNA、ウィルスなどのサイズを測定する方法として、近年急速に発展している手法である。この方法は、特定の蛍光測定対象体積からの粒子の(ブラウン運動による)拡散時間が、粒径に対応していることによって、測定を行う。通常分子のサイズは、10^<-3>から10^<-5>f(フェムト:10^<-15>)Lとされるため、測定には共焦点光学系が用いられている。本年度は、共焦点光学系を組み立て、水のラマン散乱光を対象に、自己相関関数を計測する方法を開発することを目的にした。本年度は、浜松ホトニクス製オプティカルブロックを用いて、共焦点光学系を組み立て、色素分子の蛍光を解析することによって、溶媒の年度を測定する方法を開発した。このため光源にはシングルモード光ファイバーとカップルするレーザーを用いた。また通常の蛍光光学系において、藻類など細胞全体のサイズを測定する方法を検討した。この系では多数の粒子を計測するため、実際に得られた信号がどの粒子の粒径に反映するかを具体的に明らかにした。将来的にはラマン散乱光に自己相関法を適用することを考えたい。現在まで緑色蛍光タンパク質(GFP)を細胞へ導入・発現した大腸菌について、細胞分裂とカルシウムイオンの濃度関係を明らかにした。とくに細胞内部位への対応するため、共焦点光学系をもちいたラマン散乱計測系の確立を検討している。蛍光相関法について、観察増を拡大しない非共焦点光学系を用いて、大腸菌細胞のサイズ変化の測定を行った。大腸菌に緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現させ、この懸濁液を強制撹拌させる系は,昨年度と同じである。しかし昨年度行った測定では.光源にHe-Cdレーザー(発振線:325nm)を使用したため、GFPが励起できないことが指摘され、再度基礎的な検討を行ったところ、擬似的な相関曲線を得ていることが判明した。そこで光源をアルゴンレーザー(発振線:488nm)に換えて、抗がん剤、マイトマイシンCによる細胞サイズの変化を測定した。マイトマイシンCによる大腸菌細胞サイズは、0.1→0.2μg/mLを添加させることによって、ほぼ10倍細胞サイズが増大することが,観察できた。この系は、共焦点光学系が1千万円以上するのに対し、光源を工夫することによって約1/10の価格で,μmレベル(細胞サイズに対応している)の変化を観察するのに適していることを指摘した。同様の系で、炭酸カルシウムの殻を作る円石藻について、殻の形成の水流に対する抵抗を調べた。海洋バイオマスとしての植物プランクトン(円石藻を含む海洋微細藻類)は、海洋表層で生育した後沈降分解し、栄養塩類(リン、窒素、ケイ素)や微量元素の海洋伝の分布を決めているとされている。従って,海洋微細藻類の沈降は重要であるが,沈降速度は藻類の表面粘性抵抗によって決まる。上記の撹拌を使った蛍光相関法では、ベルヌーイの流速を超えない限り、蛍光微粒子の表面粘性抵抗が、蛍光相関法の核酸時間に反映すると考えられる。本研究では円石藻のクロロフィル蛍光に基ずく蛍光相関法を行なった。円石藻の炭酸カルシウムの殻を外すと、粘性抵抗が16%減少すること、、またフローサイトメトリーからは、この過程で大きさが変化しないことを明らかにした。現在共焦点光学系を組み立て、最初のデータが出つつある。本年度は、浜松ホトニクス製のオプティカルブロックを組み合わせ、共焦点光学系を組み立てた。オプティカルブロックを組み合わせた共焦点光学系は、調整が難しく、幾つかの改良を加えた(サンプルホルダー、出口スリットの位置調整)。この結果比較的短時間に、共焦点系を構築できるシステムが実現できた。この装置のより、まず水/エタノール混合溶媒における粘度分布を、測定した。対象に用いた色素は、ローダミン6Gである。水/エタノール系では、エタノールのモル分率が0.23付近で最大の粘度を与えるが、キャノン・フェンスケ粘度計によるマクロ粘度、および蛍光相関法の色素の拡散時間から算出されるミクロ粘度の双方の実測値について、最大粘度を与えるエタノールモル分率は、ほぼ一致した。ただしアルコールのモル分率が0.23を超えた領域では、見掛け上蛍光相関法から算出される粘度は、マクロ粘度に比較して高い粘度を与えた。この事は言い方を変えると、エタノールモル分率の低い側では、マクロ粘度より、蛍光相関法によって与えられる粘度は(メモリを大きさを変えると)小さくなると言い変える事も出来る。多くの分光学的測定から、水/

エタノール混合溶媒系において、エタノールモル分率の低い領域では、色素分子は(疎水性であるため)エタノールのクラスターの周囲を取り囲まれ、その周辺を水が取り巻く構造になっているとされている。従って、蛍光相関法の色素のブラウン運動に基づく粘度は、エタノールモル分率の低い領域ではこうした溶液構造によって、見掛け上マクロ粘度よりも小さい粘度が与えられる事が考えられる。なお蛍光標識したタンパク質(Anti-human VEGF R2/KDR-Phycoerythrin:モノクロナール抗体)を用いて鉛(II)イオン添加によるの変性状態を試験的に調べたが、鉛(II)イオンをpH6.5でμMレベルで添加したところ、拡散時間が増加、すなわち見掛け上分子量の増大が起きている事が見出された。今後詳細にタンパク質の金属変性について調べていく予定である。
ホスホコリンを介した器官間コミュニケーションの分子遺伝学的解析

1.コリンによる生育阻害は、リン酸の欠乏による阻害とは表現型が異なることがわかった。従って、コリンによる生育阻害は、コリン自身の蓄積によるか、あるいは、コリンがホスホコリンに変換されてもリン酸欠乏を引き起こしていない可能性が考えられる。2.コリンは生育阻害を起こすが同濃度のベタインは生育阻害を起こさないことがわかった。このことから、コリンによる生育阻害は、その代謝物であるベタインによるものではないことが示唆された。3.ベタインの添加は、シロイヌナズナの根の成長を促進した。さらに、コリンを添加するとコリンの濃度に依存して地上部の生育阻害が観察された。今後は、ベタインを含む培地を基本として、コリン感受性変異株のスクリーニングにとりかかるつもりである。4.酵母の栄養要求性の相補を指標にして、L-セリンからのコリン合成の初発反応を触媒するセリン脱炭酸酵素のcDNAのクローニングを試みた。ホスファチジルセリン合成酵素を欠くためにリン脂質が合成できず生育ができない酵母変異株にナタネの根由来のcDNAプラスミドライブラリーを導入し、最小培地で生育を回復した酵母クローンを単離した。その結果、グループ2に属するピリドキサルリン酸依存型ヒスチジン脱炭酸酵素(HisDC)と高い相同性を示すクローンが単離された。植物では、トマト果実の成熟初期に発現するTOM92が、同じようにHisDCと相同性を示すことがPictonら(1993)によりすでに報告されているが、TOM92は根や葉などの栄養器官では発現していない。本研究によりヒスチジン脱炭酸酵素が植物に広く存在する酵素であることが示唆された。単離したクローンがヒスチジンやセリンを基質とするかを、大腸菌発現タンパク質をもちいて確認している。
オンチップロボティクスを基盤とする光合成細胞の能動計測と機能解明

マイクロ流体チップ内にマイクロ・ナノロボットを組み込み,これを非接触で操作することで,光合成細胞であるラン藻(Synechocystis sp.PCC 6803)の浸透圧変化に対するマルチパラメータ計測を高速かつ連続的に行い,ラン藻の浸透圧調整機構の仕組みを明らかにすることを目的とした.まず,独自の磁気駆動技術をベースに,ラン藻のマルチパラメータをオンチップで高速かつ連続的に計測するシステムの構想をまとめ,基本システムを構築した.次に,これを利用してラン藻の浸透圧変化による応答を,単一細胞レベルで直接観測し,機械刺激受容性チャネルの仕組みを解明するための培養細胞の準備を行った.また,ラン藻の粘弾性を測ることで,糖を形成する遺伝子や環境条件との関係を調べて評価するための培養細胞の基礎評価を行った.(1)微細加工技術・システム構築(新井)フェムト秒レーザ加工と,フォトリソグラフィを組み合わせ,三次元的にナノ構造体を実現するための加工システムを構築し,コンピュータ制御により三次元露光した.また,力計測プローブに変位縮小機構をマイクロ流体チップに組み込んで磁気駆動するシステムを考案し,従来と比べて精度を約10倍改善できた.(2)細胞計測・制御(新井,川原)磁気駆動技術を利用し,細胞の粘弾性を計測するロボットシステムを制御し,高速ビジョンと組み合わせて位置決め特性を大幅に改善した.(3)環境計測・制御(新井,丸山)マイクロ流体チップの流体制御を行い,流れの安定化を行った.また,光ピンセットを利用してラン藻を流路内で計測位置に固定するシステムの設計を行った.(4)細胞計測・評価・機能解析(魚住)ラン藻Synechocystissp.PCC 6803を,200mM NaCl培地で増殖させることで,細胞表層を固くすることが可能であることを顕微鏡観察と細胞表層染色で確認した.マイクロ流体チップ内にマイクロ・ナノロボットを組み込み,これを非接触で操作することで,光合成細胞であるラン藻(Synechocystis sp.PCC 6803)の浸透圧変化に対するマルチパラメータ計測を高速かつ連続的に行い,ラン藻の浸透圧調整機構の仕組みを明らかにすることを目的とした.まず,独自の磁気駆動技術をベースに,ラン藻のマルチパラメータをオンチップで高速かつ連続的に計測するシステムの構想をまとめ,基本システムを構築した.次に,これを利用してラン藻の浸透圧変化による応答を,単一細胞レベルで直接観測し,機械刺激受容性チャネルの仕組みを解明するための培養細胞の準備を行った.また,ラン藻の粘弾性を測ることで,糖を形成する遺伝子や環境条件との関係を調べて評価するための培養細胞の基礎評価を行った.(1)微細加工技術・システム構築(新井)フェムト秒レーザ加工と,フォトリソグラフィを組み合わせ,三次元的にナノ構造体を実現するための加工システムを構築し,コンピュータ制御により三次元露光した.また,力計測プローブに変位縮小機構をマイクロ流体チップに組み込んで磁気駆動するシステムを考案し,従来と比べて精度を約10倍改善できた.(2)細胞計測・制御(新井,川原)磁気駆動技術を利用し,細胞の粘弾性を計測するロボットシステムを制御し,高速ビジョンと組み合わせて位置決め特性を大幅に改善した.(3)環境計測・制御(新井,丸山)マイクロ流体チップの流体制御を行い,流れの安定化を行った.また,光ピンセットを利用してラン藻を流路内で計測位置に固定するシステムの設計を行った.(4)細胞計測・評価・機能解析(魚住)ラン藻Synechocystissp.PCC 6803を,200mM NaCl培地で増殖させることで,細胞表層を固くすることが可能であることを顕微鏡観察と細胞表層染色で確認した.
劇症ウイルス病多発のインドネシアにおける弱毒ウイルス探索とワクチン利用の展開

世界の農作物で難防除害虫が媒介するウイルス病が大問題となっている。特に周年で露地栽培しているインドネシアではウイルス病が激発しているので、その病原ウイルスの遺伝子の解析と弱毒ウイルス(ワクチン)の分離を検討した。その結果、クリニウイルス強毒株の病原性決定遺伝子を明らかにするとともに、インドネシアではベゴモウイルスの変異が頻発していること、媒介昆虫に対する天敵の利用が防除に適していることを見出した。また、タケとイチゴでインドネシア未記載のウイルスを見出した。最近、世界中の様々な農作物でコナジラミ伝搬性ウイルスが猛威をふるっている。我が国でもトマト黄化葉巻ウイルス(TYLCV)とトマト退緑ウイルス(ToCV)が大問題となっていて、インドネシアでもコナジラミ伝搬性ウイルスの劇症系統が大発生し、トマトやトウガラシ、ダイズなどが大打撃を受けている。一方、わが国ではウイルス病防除対策の一つとして、弱毒ウイルス(ワクチン)の利用が広がりつつある。しかし、ワクチン株は他国から輸入すべきでなく、その国で選抜しなければならない。そこで本研究では、ウイルス病激発地のインドネシアで難防除害虫のコナジラミ、アブラムシが媒介する強毒ウイルスの弱毒株を探索し、ワクチンとして圃場レベルで利用する防除法を確立するとともに、強毒株・弱毒株を遺伝子レベルで比較・解析して、世界で通用する弱毒株の選抜法と防除法の確立を目指す。本年度はまずインドネシアを訪問し、発生するコナジラミ伝搬性ウイルスを採集して分析したところ、わが国ではほとんど発生しなくなったトマトインフェクシャスクロロシスウイルス(TICV)も分離されたので、その全塩基配列を決定し近縁のToCVと比較した。また、わが国でわが国でワクチンとして利用を考えている非虫媒性TYLCVの遺伝子解析を行い、インドネシア株と比較した。さらに、インドネシアで多数の激発圃場を巡って病徴のほとんどない植物体を採集し、海外共同研究者にスポンジ法による無病徴株の維持管理を依頼した。近年、地球の温暖化に伴い、植物ウイルスを媒介する昆虫の分布が変わってきて、コナジラミなどの難防除害虫が媒介するウイルスが世界的に分布を拡大し、emerging virusとして大問題となっている。このため、わが国でもインドネシアでもトマトやキュウリでコナジラミ伝搬性ウイルスが多発している。一方、薬剤耐性虫が出現して農薬の効果が低下し、また消費者の減農薬志向もあるため、わが国ではウイルス病防除対策の一つとして弱毒ウイルス(ワクチン)の利用開発が広がりつつある。そこで本研究では、ウイルス病激発地のインドネシアで難防除害虫のコナジラミ、アブラムシが媒介する強毒ウイルスの弱毒株を探索し、ワクチンとして圃場レベルで利用できる防除法を確立するとともに、強毒株・弱毒株を遺伝子レベルで比較・解析して、世界で通用する弱毒株の選抜法と防除法の確立を目指す。平成27年度もインドネシアを訪問し、ウイルス病激発地で採集を行った。特に本年度は、コナジラミ伝搬性ウイルスに感染していると思われたウリ科作物を採集して分析したところ、わが国では未報告のTomato leaf curl New DelhivirusとSquash leaf curl China virusがメロンで大発生していて、アブラムシ伝搬性ウイルスがほとんど発生していないことが判明した。さらに両ウイルスの間で様々な遺伝子組換えが起きていることを世界で最初に見出した。さらに、インドネシア側研究者の要請で、インドネシアの輸出産物である竹に発生するウイルス病の調査を行い、Bamboo mosaic virusを中国・台湾以外で初めて検出し、全塩基配列を決定し、感染性クローンを構築した。また、インドネシア株が台湾株に近縁であることを見出した。また、インドネシア側の共同研究者とセミナーを開催し、防除法の確立に向けて意見交換した。本研究の目標は1)弱毒株の探索、2)ワクチンによる防除法の確立、3)弱毒ウイルスの遺伝子解析と感染性クローンによる弱毒株の保存、の3項目である。申請時は、年に2回ずつインドネシアを訪問して広範囲にわたってウイルス激発地で無病徴株を採集することを計画していたが、予算の関係上、1年に1回しか訪問できない点が、1)と2)の課題における弱毒ウイルスが感染していると思われる無病徴植物の探索、維持と弱毒ウイルスの選抜に大きく影響していると考えられた。しかし、3)に関連した遺伝子解析は順調に進展している。特に今年度は、インドネシア側共同研究者の要請で、インドネシアの輸出植物である竹のウイルス病の発生調査を行い、Bamboo mosaic virusを中国・台湾以外で初めて検出し、全塩基配列を決定し、感染性クローンを構築した。また、同様にインドネシア側共同研究者とともにメロンのコナジラミ伝搬性ウイルスの研究を開始し、新しいウイルスの全塩基配列を決定し、現在は感染性クローンの構築を行っている。よって「やや遅れている」と自己評価した。近年の温暖化の影響で昆虫の分布が変化するとともに、コナジラミなどの難防除害虫が媒介する植物ウイルスが世界的に急速に拡大し、emerging virusとして大問題となっている。この状況は、ジカ熱やインフルエンザの流行といったヒトのウイルス病の状況と同一である。このため、わが国でもインドネシアでもコナジラミ伝搬性ウイルスが激発しているが、コナジラミは小さくて防除が難しく、最近では薬剤耐性虫が出現して農薬の効果が低下している。