hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
がん幹細胞及びそのアポトーシスの可視化システムの構築と放射線化学療法への応用

腫瘍内低酸素領域をニッチとするがん幹細胞は,放射線治療後の再発や転移の原因として問題視されている。腫瘍内低酸素細胞アポトーシスを非侵襲的リアルタイムに可視化するシステムは,がん幹細胞を標的とした放射線治療の評価に有用であると考え,我々はそのシステム構築を目的とした。エビ由来環状型ルシフェラーゼ(Luc)第三世代を用いた低酸素細胞アポトーシス可視化システムにおいて,アポトーシス誘発時の発光量は従来構築したホタル由来環状型Lucと比較し350倍以上の高い発光値を示し,システムの改良に成功した。数の少ないがん幹細胞のアポトーシスを可視化するため、このシステムの高発光化と熱安定化は必須であると考える。がん幹細胞は,正常組織中に存在する幹細胞同様に,自己複製能と多分化能を併せ持つ腫瘍組織内の未分化な細胞である。この細胞は低酸素領域に存在することと,低い細胞分裂頻度,また高いDNA修復能のため,DNAを標的とする放射線や抗癌剤治療に対し抵抗性を示す。このため,治療後に残存し腫瘍の再発,転移の原因として問題視されている。これら問題解決のアプローチとして我々は,生体腫瘍内低酸素領域で誘導される細胞死を非侵襲的,かつリアルタイムに可視化するシステムの構築を目的とした。これまでに,我々は低酸素応答因子(HIF)を応用した低酸素応答アポトーシス可視化システムを構築し低酸素細胞アポトーシスのリアルタイム可視化に成功している。しかし,近年,HIFが活性化していない,より低酸素な腫瘍領域内にがん幹細胞が存在していることを示唆する報告もあり,構築した低酸素応答アポトーシス可視化システムを用いがん幹細胞アポトーシスを可視化するには限界がある。つまり,がん幹細胞に対する殺細胞効果を評価するには,生体腫瘍内におけるがん幹細胞そのものの分布とそのアポトーシスを可視化する新たなシステムを構築する必要がある。このシステム構築のため,今年度,我々はがん幹細胞アポトーシス可視化システムにおいて要である2断片化したGFPの再構成方法の検討および蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を応用したアポトーシス細胞可視化システムの検討を試みた。その結果,GFPの再構成に関しては,プロテインスプライシングを応用することでGFPの蛍光強度上昇を確認し,その再構成に成功した。FRETを応用したアポトーシス細胞可視化に関しては,抗がん剤を添加したアポトーシス細胞群と非添加細胞群で2種の蛍光波長の割合が異なることを確認した。しかし、その蛍光強度は低く,今後の生体腫瘍実験を見据え,高い蛍光強度を有するシステムへの改良が必要である。プロテインスプライシングとは,ポリペプチドのインテインが取り除かれエクステインが連結する反応過程である。幹細胞特異的に発現がみられるKlf4,Oct3/4とSox2等の転写因子で,エクステインを付加した2分割GFP断片の発現をそれぞれ制御することで,がん幹細胞のみでGFPの再構成がおこなわれ,がん幹細胞を蛍光細胞としてイメージングすることが可能となる。アポトーシス細胞の可視化にはFRETを応用したシステムを用いる。GFPとRFPをカスパーゼ3の基質となるプロテアーゼ認識配列DEVDを含むリンカーで繋いだアポトーシスFRETプローブは,通常,483 nmの励起した場合,GFPからRFPへのFRETが起こりRFPの蛍光波長である584 nmの蛍光が検出される。これに対し,活性型カスパーゼ3によりリンカーペプチドが切断されるとFRETが2分子間で起こらずGFPの蛍光波長である506 nmの蛍光が検出される。つまりアポトーシス細胞と非アポトーシス細胞を緑色と橙色,異なる蛍光色を持つ細胞としてイメージングすることが可能となる。現在までに,エクステイン配列をGFP2断片遺伝子配列に付加したプラスミド,またアポトーシスFRETプローブをコードしたプラスミド,さらに上記2つの特性を付与したプラスミド構築をおこない,その機能評価をおこなった。その結果,プロテインスプライシングは機能し,2断片化したGFPの細胞内再構成に成功した。またアポトーシスFRETプローブを用い,抗がん剤を添加したアポトーシス細胞群と非添加細胞群を比較した結果,2種の蛍光波長の割合が異なることをフローサイトメトリー解析により確認した。しかし,2つの特性を付与したプラスミドを遺伝子導入した細胞はアポトーシスFRETプローブのみをコードしたプラスミドを遺伝子導入した細胞と比較し,GFP,RFP共に発光強度の低下が観察された。がん幹細胞とは,自分自身を複製する自己複製能と,がん細胞へ分化しがん組織を構築する多分化能を有する細胞である。治療後のがん幹細胞の残存を基にがん階層構造の再構築がおこなわれ,腫瘍の再発,転移を引き起こす。つまり,がんの根治を目指す上で,がん幹細胞の増殖制御をおこなうことは喫緊の課題である。このような背景下,我々はがん幹細胞のアポトーシス可視化は,新規抗がん剤の探索や放射線治療における分割照射条件検討による治療法開発に有用な評価方法であると考え,リアルタイムにがん幹細胞のアポトーシスを可視化するシステム構築を目的としている。一昨年度は,蛍光タンパク質プローブを用いたがん幹細胞アポトーシス可視化システムにおいて要である2断片化した緑色蛍光タンパク質(GFP)の再構成を試みた。その結果,プロテインスプライシングを応用することでGFPの蛍光強度は上昇し,その再構成に成功した。昨年度は,蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を応用したアポトーシス検出プローブを用い,がん幹細胞のニッチである低酸素領域でのアポトーシス検出を試みた。

通常,GFPの蛍光エネルギーはFRETにより赤色蛍光タンパク質(RFP)に移動し赤色蛍光(RF)を放つが,アポトーシスによりGFPとRFP間のDEVD配列が切断されるとその間の距離が離れFRET効率が減少し緑色蛍光(GF)を放つ。つまりGF/RFよりアポトーシス細胞のイメージングが可能となる。実験の結果,アポトーシス誘発剤スタウロスポリン(STS)添加群のGF/RFは非添加群と比較し上昇し,アポトーシス細胞の検出に成功した。しかし,低酸素分圧下においてはSTS非添加・添加群間でRFからGFへのFRETは認められたが,そのRF強度は非常に低く,このプローブを用い低酸素環境下,数の少ないがん幹細胞およびそのアポトーシスを可視化することは困難であると考えられた。昨年度は,2種類の蛍光タンパク質プローブを用いアポトーシス細胞可視化について検討した。1つは近赤外蛍光タンパク質(IFP)を用いたiCasper法であり,もう1つはFRETを応用したFRET法である。iCasper法は,アポトーシス誘発により活性化したカスパーゼ3が,その認識配列であるDEVD配列を特異的に切断し,その結果IFPが細胞内で再構成され近赤外蛍光にてアポトーシス細胞のイメージングを可能にする。この方法を用いSTSで誘発したアポトーシス細胞の可視化を試みたが,フローサイトメトリーで近赤外蛍光は観察されなかった。次に,もう1つの方法であるFRET法を用いアポトーシス細胞の可視化を試みた。通常状態ではGFPの蛍光エネルギーはFRETによりRFPに移動しRFを放つが,アポトーシスによりGFPとRFP間のDEVD配列が切断されるとGFPとRFP間の距離が離れFRET効率が減少しGFを放つ。実験の結果,STS添加群のGF/RFは非添加群と比較し上昇し,アポトーシス細胞の検出に成功した。また我々は低酸素領域にがん幹細胞が存在することを考慮し,塩化コバルトを用い疑似的な低酸素環境下でのアポトーシス細胞検出について評価した。その結果,塩化コバルトとSTS添加群のGF/RFはSTSのみを添加した群と同様な値を示し,擬似的な低酸素環境下でのアポトーシス細胞の検出に成功した。さらに,我々は実際に0.1%酸素分圧下でのアポトーシス蛍光プローブタンパク質の蛍光特性評価をおこなった。0.1%酸素分圧下STS非添加・添加群間でRFからGFへのFRETは認められたが,そのRF値は非常に低く,このプローブタンパク質を用い低酸素環境下,数の少ないがん幹細胞およびそのアポトーシスを可視化することは困難であると考えられた。がん幹細胞を標的とし、その増殖制御をおこなうことは、がん根治を目指す上で喫緊の課題である。このため、我々の研究室では腫瘍内のがん幹細胞アポトーシスを非侵襲的リアルタイムに可視化するシステム構築し、がん治療へ応用したいと考えている。
使い捨て可能な大腸用自動挿入内視鏡の開発

大腸内視鏡挿入は難易度が高く,穿孔を引き起こす事例や,盲腸まで到達しない事例も少なくない。そのため現在医師しか行うことができない検査である。また,内視鏡は検査後に洗浄が必要なため,人手や手間がかかる。そこで,本研究では使い捨て可能で内視鏡を安全に自動挿入可能な方法を模索することを目的として,1)使い捨て可能な自動挿入デバイスの開発,2)挿入デバイスの電動操作と小型カメラによる撮影,3)大腸モデルへの挿入検討,4)安全性確保のためのフィードバック,5)動物に対する挿入実験,6) AIによる挿入方向判断の検討を実施する。
位置選択性光電解重合反応による機能化導電性高分子マイクロパターン作製

位置選択性光電解重合反応による機能化導電性高分子マイクロパターン作製をテーマに、主として固体と溶液との界面への光照射に伴って起る現象のキャラクタリゼーションと機能デバイスへの応用を目指した。1)位置選択性光電解重合反応系の開発半導体を電極として溶液に浸漬し光照射を行うと、半導体表面で生じた光キャリアと溶液中物質が、光照射された部分で反応を起こす。反応として重合反応を選べば、位置選択的に重合反応を起こせるはずである。本研究では、これを位置選択性光電解重合と名付け、ピロールをモノマーとして種々の半導体上に導電性高分子の細かいパターンを形勢させることに成功した。2)取り込み反応を利用した導電性高分子膜の高機能化光電解重合を発展させ、ポリピロール膜中に機能性分子を取り込む手法を開発した。膜形成と同時に、カチオン性色素とアニオン性色素のどちらをも取り込むことができる。この手法による機能化の例として、エレクトロクロミズム素子への応用を示した。3)光導波路分光法の開発と半導体溶液界面反応への応用光電解反応をより深く理解するための手法として、光導波路法を開発した。これにより、半導体表面反応により生じる小さな光学的変化を、数十倍から数百倍以上に増やして観測することができる。この手法の基本特性の評価と、比較的簡単な系への応用を試みた。4)レーザー誘起光起電力法による種々の界面のキャラクタリゼーション半導体と溶液との界面を含む種々の界面のキャラクタリゼーションのために、レーザー誘起光起電力法を検討した。モデルとして半導体同士の接合への適用を行い、界面におけるバレドの曲りや、リーク電流の評価法をして秀れた手法であることを示した。本研究の目的は,光電極反応を利用した位置選択性光電解重合反応を使って,機能化された導電性高分子のマイクロパターンを作製するための基礎を作ることである. 62年度の計画は次の3点からなる.(1)位置選択性光電解重合反応による導電性高分子析出機構の解明と膜のキャラクタリゼーション.(2)導電性高分子膜への色素取り込みによる機能付加.(3)光電解重合反応をつかったホログラフィック・グレーティング作製.以下に各項について得られた知見と研究実績を列挙する.また,新たに検討を行った項目についての知見も併せて記す.(1)酸化チタンー酸化亜鉛の透明薄膜半導体電極をスプレイパイロリシスによって作製し,位置選択的に生成したポリピロールのパターンの特性を調べた.特に,電解重合反応によるポリマーとの比較を行った.また,酸化亜鉛の薄膜を無機フォトレジストとして用いる方法を提案し,種々の形式のパターン作製が可能であることを示した.これらの結果はJournal of Electrochemical Societyに掲載された.(2)光電解重合の際に種々の色素分子が取り込まれることが確認された.特に,色素分子の持つ荷電に拘らず,膜中に高濃度で濃縮されることが判った.この結果はChemistry Lettersに掲載された.(3)酸化亜鉛をフォトレジストとして用い,ホログラフィックグレーティングが作製できた.これはJournal of Applied Physicsに掲載された.(4)ガラスや半導体などの透明基板上のポリピロール薄膜や色素分子のキャラクタリゼーションを行うために,光導波路法を採用発展させた.特に,光導波路上で電気化学過程や光化学過程を追うことに初めて成功した.これらの結果は,既にいくつかの学会報告で公にし, Thin Solid Filmsなどに投稿中である.位置選択性光電解重合反応による機能化導電性高分子マイクロパターン作製をテーマに、主として固体と溶液との界面への光照射に伴って起こる現象のキャラクタリゼーションと機能デバイスへの応用を目指した。1)位置選択性光

電解重合反応の開発半導体を電極として溶液に浸漬(光照射を行うと、半導体表面で生じた光キャリアと溶液中の物質が、光照射された部分で反応を起こす。反応として重合反応を選べば、位置選択的に重合反応を起こせるはずである。本研究では、これを位置選択性光電解重合と名付け、ピロールをモノマーとして種々の半導体上に導電性高分子の細かいパターンを形成させることに成功した。2)取り込み反応を利用した導電性高分子膜の高機能化光電解重合を発展させ、ポリピロール膜中に機能性分子を取り込む手法を開発した。膜形成と同時に、カチオン性色素とアニオン性色素のどちらをも取り込むことができる。この手法による機能化の例として、エレクトロシズム素子への応用を示した。3)光導波路分光法の開発と、半導体-溶液界面反応への応用光電解反応をより深く理解するための手法の一つとして、光導波距法を開発した。これにより、半導体表面で生じる小さな光学的変化を、数十倍から5数百倍以上に増巾して観測することができる。この手法基本特性の評価と、比較的簡単な系への応用を試みた。4)レーザー誘起光起電力法による種々の界面のキャラクタリゼーション半導体と溶液との界面を含む種々の界面のキャラクタリゼーションのために、レーザー誘起光起電力法を検討した。モデルとして半導体同士の接合への適用を行い、界面におけるバンドの曲りや、リーク電流の評価法として秀れた手法であることを確認した。
ゼロ次元応力源を利用した鉱物の弾性特性測定法の開発

本研究では,流体包有物をゼロ次元の応力源として利用する鉱物の弾性特性測定法の開発に挑んだ.地球内部を探る手法の中で地震波トモグラフィーは傑出した存在感を示しつつあり,その解釈に必要な鉱物の弾性特性の重要性も増しつつある.しかし,既存の弾性特性には問題がある.鉱物の弾性特性は化学組成に強く依存するにも関わらず,天然鉱物から得た値は少なく,しかも測定値の有効数字は2桁程度である.地震波速度構造の精密な解釈には鉱物の弾性特性の精度・確度を共に高める必要があろう.そこで本研究では,微小な天然鉱物でも精度良く鉱物の弾性特性を測定できる新たな手法の開発に挑んだ.本研究では,流体包有物をゼロ次元の応力源として利用する鉱物の弾性特性測定法の開発に挑んだ.地球内部を探る手法の中で地震波トモグラフィーは傑出した存在感を示しつつあり,その解釈に必要な鉱物の弾性特性の重要性も増しつつある.しかし,既存の弾性特性には問題がある.鉱物の弾性特性は化学組成に強く依存するにも関わらず,天然鉱物から得た値は少なく,しかも測定値の有効数字は2桁程度である.地震波速度構造の精密な解釈には鉱物の弾性特性の精度・確度を共に高める必要があろう.そこで本研究では,微小な天然鉱物でも精度良く鉱物の弾性特性を測定できる新たな手法の開発に挑んだ.平成26年度に計画していた主な作業は「低圧力に対応できるアンビルセルの構築」および「流体密度測定精度の向上作業」である.流体包有物を持つ鉱物をアンビルセル中に封入し,加熱すると,流体包有物の内圧を上昇させることができる.また,鉱物の外圧はアンビルセルを構築することで制御できる.これにより,鉱物内外の圧力を自在に制御できるようになるため,鉱物を様々な条件で弾性変形させることが可能になる.上記の用途に耐え得るアンビルセルとして,様々な素材および加熱機構を検討したところ,サファイア製アンビルセルと熱風式加熱機構の組み合わせにたどり着いた.現在,この機能を有するセルを設計中である.また,「流体密度測定精度の向上作業」については,予定通りの成果を出すことができ,顕微ラマン分光分析による二酸化炭素流体密度測定では世界最高精度を得ることに成功した.本研究では,流体包有物をゼロ次元の応力源として利用する鉱物の弾性特性測定法の開発に挑んだ.地球内部を探る手法の中で地震波トモグラフィーは傑出した存在感を示しつつあり,その解釈に必要な鉱物の弾性特性の重要性も増しつつある.しかし,既存の弾性特性には問題がある.鉱物の弾性特性は化学組成に強く依存するにも関わらず,天然鉱物から得た値は少なく,しかも測定値の有効数字は2桁程度である.地震波速度構造の精密な解釈には鉱物の弾性特性の精度・確度を共に高める必要があろう.そこで本研究では,微小な天然鉱物でも精度良く鉱物の弾性特性を測定できる新たな手法の開発に挑んだ.平成27年度は,前年度から引き続いてサファイアアンビルセルの導入とその調整ならびに流体密度測定精度の向上作業をおこなった.二酸化炭素密度の測定精度は0.01 g/cm3をはるかに下回るレベルに達しており,本研究で必要となる精度に近づきつつある.さらに,カンラン石の弾性変形を利用した圧力マーカーの作成にも着手するとともに,窒化ボロンを利用した圧力マーカーの作成作業も開始した.窒化ボロンは流体との反応性が低いため,超臨界二酸化炭素を主成分とする圧媒体中でも圧力マーカーとして機能する可能性が高い.また,高温環境における耐性も重要である.一般的にアンビルセル実験においてはルビー蛍光を圧力マーカーとして利用することが多いが,400°Cを超える環境では使えない.窒化ボロンやカンラン石であれば本研究が対象とする高温環境でも使用できる可能性が高い.今後,両者を用いることにより,より確度の高い圧力値を得ることができるようになるだろう.研究代表者の所属組織(北海道大学総合博物館)が平成26年度より耐震改修工事によって使用し難い環境になった.平成27年度は当該研究の実施スペースであった研究室・実験室の移転があり,時間的にも研究環境的にも支障を来した.しかし,研究スペースの環境整備は平成27年度内に完了させたため,今後は遅れを取り戻すペースで当該研究に取り組む予定である.ペースを速められる理由を簡単に記す.従来は換気や電源容量の制限によって実施できない研究作業があったが,この度の研究スペースの移転によってその辺りの制約はほとんど解消されたため,予定以上の研究作業をおこなえるようになったためである.本研究では,流体包有物を応力源とする鉱物の弾性特性測定法の開発を目指した.流体包有物を含む鉱物が加熱されると,流体圧力の上昇によって周囲の鉱物が弾性的に変形し,流体包有物は膨張する.つまり,流体密度の変化からホスト鉱物の弾性特性を読み取れるのではないかとの着想に至った.この推察が正しければ,人為的な加熱によって流体包有物をさらに膨張させることができるはずである.その膨張率を精密に測定できれば,ホスト鉱物の弾性特性を読み取ることが可能となる.流体包有物は天然鉱物に広く見られるため,この手法の開発に成功すれば,様々な天然鉱物の弾性特性を一挙に決定する道が拓けるにちがいない.本研究のコアとなった研究作業は「低圧力対応アンビルセルの構築」である.当該アンビルセルは窓材としてサファイアを用い,加熱装置として熱風ヒーターを導入したことによって,セル内部を1 GPa・700°Cの環境にすることが可能となった.

これにより,流体包有物の内圧は鉱物の加熱により上昇させることができ,鉱物の外圧はアンビルセルで制御できる環境を作り上げることができた.つまり,鉱物内外の圧力を自在に制御できるようになったため,鉱物を様々な条件で弾性変形させることが可能となった.また,研究作業の一つとして重視していた「流体密度測定精度の向上」も達成できた.室温や試料の温度を制御することで,分光器やスペクトルへの外来要因の影響を極限まで低減させることに成功し,安定したスペクトルを得られるようになった.本研究では,流体包有物をゼロ次元の応力源として利用する鉱物の弾性特性測定法の開発に挑んだ.地球内部を探る手法の中で地震波トモグラフィーは傑出した存在感を示しつつあり,その解釈に必要な鉱物の弾性特性の重要性も増しつつある.しかし,既存の弾性特性には問題がある.鉱物の弾性特性は化学組成に強く依存するにも関わらず,天然鉱物から得た値は少なく,しかも測定値の有効数字は2桁程度である.地震波速度構造の精密な解釈には鉱物の弾性特性の精度・確度を共に高める必要があろう.そこで本研究では,微小な天然鉱物でも精度良く鉱物の弾性特性を測定できる新たな手法の開発に挑んだ.平成26年度中にアンビルセルを導入する予定であったが,加熱機構の検討に時間を要したため,導入時期は平成27年度にずれ込んでしまった.ただし,アンビルセルを用いる研究分野では世界初の加熱機構を試すことになるため,想定以上の成果が得られる可能性が出てきた.流体密度測定精度の向上作業においては予想通りの成果が得られており,レター誌ではあるが,既に査読論文を公表するに至った.今年度は当該研究の最終年度に当たるため,計画していた研究作業を完遂できるよう努める.具体的には,導入したサファイアアンビルセルへの二酸化炭素の封入に関して,方法の改良とセル内鉱物中流体包有物の分光測定を実施する.セル内の圧媒体は二酸化炭素であり,鉱物中流体包有物の主成分も二酸化炭素であるため,それらの測り分けが可能かどうかが本研究の技術的な難所になると想定している.その対策については様々なアイデアを有しているため,実現可能性は高いと考えている.地球化学研究代表者の所属部局(北海道大学総合博物館)で耐震改修工事が行われており,実験作業室の移転等が避けられない状況である.その影響は少なからず出ると思われるが,当初の予定に沿って課題を遂行できるよう努める.研究代表者の所属組織(北海道大学総合博物館)が平成26年度より耐震改修工事によって使用し難い環境になった.平成27年度は当該研究の実施スペースであった研究室・実験室の移転があり,時間的にも研究環境的にも支障を来し,この状況が平成27年度末まで続いた.そのため,研究計画全体に遅れが生じ,物品の導入にも少しずつ遅れが出ている.平成26年度に導入予定であったアンビルセル(およそ100万円)の設計が遅れたため.研究スペースの環境整備は平成27年度内に完了させたため,今後は遅れを取り戻すペースで当該研究に取り組む予定である.
重層社会を作るヒヒ類の社会生態学的、集団遺伝学的研究

サバンナヒヒの単層で母系の社会からマントヒヒの重層社会への転換過程を解析するため、これまで研究されてきたエチオピアのマントヒヒとは地理的に隔離されたアラビア半島のマントヒヒがエチオピアと同じような社会構造を持つのか調査した。両地域のマントヒヒの遺伝的相違を調べるため、サウジアラビアの7カ所(Dharan, Medina, Taif, Al Baha, Abha, Bisha, South Coastのワジ・ダーバン)で捕獲採血をした。血液蛋白の分析からサウジアラビアの方がエチオピアより変異が多いことから,マントヒヒのアラビア半島起源説を庄武は唱えていたが、今回のミトコンドリアDNAの分析では、逆にエチオピア側の方がサウジアラビアより多様なハプロタイプを持つことがわかり、前説とは逆の結果を得た。一方、サウジとエリトリアのハプロタイプが、アヌビスヒヒと共通のクレード入るといった、前説を支持する結果も得た。これらの結果は、さらなる研究を促す。タイーフでは、500頭以上の個体からなるダムサイト群を集中的に調査した。ユニット内のメスがリーダーオスのコドモをどれほど残すのかという観点から、毎年捕獲採血を行った。マイクロサテライトDNAの分析は、ワン・メール・ユニットのリーダーオスがユニット内のアカンボウの父親であることは少ないことを示した。捕獲個体の耳にタッグを装着し、社会生態的観察に用いた。1988年から2003年までの間に、209頭を耳タッグで標識したが、着けた耳タッグは脱落するものもあるので、2002、2003、2004年には、57、89、105頭の個体が標識されていた。標識個体の5年間の継年調査から、ワン・メイル・ユニットが不安定で、様々な形でメスのユニット間の移籍が起こっていること、クランやバンドが年を越えて継続しないこと、オスの未成年個体が消失することなど、クランやバンドといった構造に疑問を呈し、また、父系制にも疑問を提出した。サウジアラビア国タイーフ市のマントヒヒのダムサイト群を対象に、2002年7、8月、11月-2003年2月の期間に研究組織メンバーが交代でフィールド観察を続けた。イヤー・タッグで識別した個体の確認から社会構造の変化を調べた。また、群の個体数カウントをした。全体は約500頭だが、連続的に道路を横切る個体数はばらつきが多く、しばしば分かれて移動していることが分かった。マントヒヒの捕獲は2003年1月に4日間行い、86頭捕獲した。捕獲個体は計測、採血、イヤー・タグつけを行った後、放した。採集した血液はサウジアラビナで遠心分離し、分画中のバフィーコート(白血球等の有核血液細胞を含む)のみを持ち帰った。今後実験室で分析する。また、捕獲後も新たにタグをつけた個体の社会関係を観察した。識別個体を用いたデータの分析から、ユニットの安定性は比較的低いことが分かったが、ユニットの寿命を計算するには、データが十分でない。また、識別個体から、ダムサイト群は少なくとも3バンドから成り立っていることが分かった。これまで集めた血液サンプルの分析を進めている。サウジアラビアとエチオピアのマントヒヒの遺伝的変異性の分析からマントヒヒの種分化過程を分析している。ミトコンドリアDNAのD-loopの上流可変領域の430塩基の配列を決めた。サウジアラビアの6地点、それぞれ、15,8,8,5,5,14個体、エチオピア東部の1地点の10個体の合計65個体の解析を行った。

サウジでは15のハプロタイプが見いだされ一部地域極在性の傾向も見られたが全般によく混ざり合い、北から南までgene flowが起きていると示唆された。エチオピアの10個体は全て異なるハプロタイプを示しその半分はサウジに近縁だった。この結果はエチオピアの方が変異性が高いように見えるが解析個体が少なく、さらに材料を増やして分析する必要がある。サウジアラビア国タイーフ市のダムサイト群で2003年8,9月,12月フィールド調査を行った。標識個体から見た社会構造の分析では、ワン・メイル・ユニットの雌の一部がユニットを離れ別のユニットに加わることが分かった。エチオピアで見られるリーダー雄の弱体に伴いユニットが崩壊し全部の雌が移籍するのとは違う様相を示す。バンドについては、2002年には4バンドが確認された。内1バンド(約70頭)が消失した。2002年には、コンパクトに集まり、クラン的特徴を示したC集団は2003年も継続した。しかし残りの2バンドのメンバーは混ざり合い区分できなかった。Cの若いオトナ雄が、C以外の雌を集めて新たなユニットを作ったが、Cをクランとすると、出身クランの中でしかユニットを作らないという通説とは異なる。マントヒヒが父系であるという仮説とは違った結果を示唆する。2000年に標識をつけ、以後確認できなかった雌が、2003年に近隣集団からダムサイト群に一時的に参加した2ユニットに混ざっていた。ダムサイト群は閉系でなく、マントヒヒのユニット関係には、ゲラダヒヒと似たものがあると分かった。招聘した海外共同研究者のブークは、2000年に行った毎月調査の行動タイムサンプリングデータの集計・分析を行い、季節特徴的な活動収支及び日周リズムを明らかにする等の結果を得た。12月にはダムサイト群で2回の捕獲を行い、雄21頭、雌16頭の採血および標識付けを行った。またダムから南西に22キロのシャファの地溝帯の崖でも捕獲を行い、雄6頭、雌15頭の採血・標識付けを行った。資料は持ち帰ってマイクロサテライトを標識とし血縁関係を解析中である。また、mDNAのD-loopの上流域の340 baseの配列を決定しつつある。比較のためエチオピア中央部のマントヒヒ、アヌビスヒヒのmDNAの配列も決めた。サウジのマントヒヒ中にもアヌビスヒヒに似た配列を示す個体が出現し複雑な系統関係を示している。森は、サウジアラビア、タイーフ市のダムの水飲み場にやってくるマントヒヒの観察を行った。この群れでは、1998年以来毎年マントヒヒを捕獲し、耳タッグで標識し、放している。標識個体を確認すると同時に、標識個体の加わっているユニットの構成確認をした。ユニット間の共存率から、ユニット間の近縁関係を解析した。これらの結果を、過去4年間のデータと比較し、ユニットの動態を明らかにした。結果はサウジアラビアのユニットはエチオピアのものと比べて安定性が低い。クラン構造やバンド構造は不明確である。ダム地域群は閉鎖系ではなく、近隣の群れに集団で移住したり、また、帰ってきたりすることを見いだした。庄武・山根は、タイーフ市から南東に約200キロ離れたBishaのセメント工場敷地内
心筋分化誘導後ヒトiPS細胞による薬剤評価システムの開発

本研究の最終目標は、心筋分化誘導後ヒトiPS細胞の膜電位を計測、コンピュータシミュレーションでこの計測結果を再現し、各種病態時における不整脈発生のメカニズム解明に繋げることにある。平成22年度は1)心筋分化誘導後ヒトiPS細胞からの膜電位データ採取法の検討、さらに2)活動電位および興奮伝播異常をコンピュータシミュレーションで再現するための数理モデルの開発を試みた。1)予備実験段階で心筋分化誘導後マウスiPS細胞からの膜電位データ採取はほぼ確立されたと考えられ、これをヒトiPS細胞に適用することを試みたが、細胞の単離および分化段階の調整が困難であった。また活動電位記録は自動能を有する細胞群から得られるものが多く(PLoS ONE (2011)6:e16734)、動物実で得られるような心室筋細胞の活動電位記録を安定して行うためには更なる工夫が必要であると考えられた。2)心筋細胞の興奮伝播の再現に欠かせないギャップジャンクションチャネル(Gap)の新しい数理モデルを開発した(Progress in Biophysicsand Molecular Biology (2010) 103:102-110)。動物実験より得られた細胞内遊離MgとGapの開閉状態関係を数式化し、高濃度Mgによる伝導障害をコンピュータシミュレーションで再現することができた。一般的に心筋虚血により細胞内ATP量は減少するが、これに伴い細胞内遊離Mgが増加することよ、今回の検討は虚血性不整脈の解明に繋がると考えられる。今後ヒト心筋モデルへの調整、薬剤による修飾へと発展が期待できる。本研究の最終目的は、1)薬剤負荷に伴う、心筋分化誘導後ヒトiPS細胞の膜電位変化を計測、2)コンピュータシミュレーションでこの計測結果を再現し、3)負荷された薬剤のターゲット(膜上どのイオンチャネルに作用しているか)を推定できるシステムを構築し、病態解明に繋げることにある。具体的には、薬剤負荷に伴う細胞膜電位変化を再現可能な"心筋分化誘導後ヒト幹細胞数理モデル"を開発し、薬剤負荷の影響を推定できるシステムを構築、さらにこのシステムを用いて細胞レベルでの薬剤誘発性不整脈のメカニズムや誘発条件について評価することである。平成21年度は主に心筋分化誘導後ヒトiPS細胞からの膜電位データの採取法の検討を試みた。予備実験段階(Biochem Biophys Res Commun. 2009 30; 379(1):115-20.)で心筋分化誘導後マウスiPS細胞からの膜電位データ採取はおおよそ確立されたと考えられ、これをヒトiPS細胞からの膜電位データ採取はおおよそ確立されたと考えられ、これをヒトiPS細胞に適用することを試みたが、細胞の単離および分化段階の調整が困難で、活動電位記録は自動能を有する細胞群から得られるものが多かった。このため、当初予定していた薬剤を各種イオンチャネル阻害薬から交感神経作動薬に変更し、モデル細胞構築も先ずは洞房結節細胞typeの心筋細胞とすることにした。交感神経作動薬の負荷法および膜電位への影響を動物実験で確認(J Physiol Sci. 2009 59 supplement 1:254)、また、モデル細胞を用いた薬剤誘発性不整脈のメカニズムおよび誘発条件について検討(Journal of Arrhythmia. 2009 25:261.)した。
核多角体病ウイルスの宿主特異性決定機構の解析

本研究は核多角体病ウイルスの宿主特異性決定機構の解明を目的として、昆虫培養細胞の一種であるSf9細胞へのカイコ核多角体病ウイルス(BmNPV)の感染特性について調査した。これまでの研究によりBmNPVのSf9細胞への感染はウイルスの遺伝子発現以前に抑制されることが明らかとなっている。昨年度ではウイルス接種直後のウイルス膜タンパク質の細胞内局在性を調査し、ウイルス粒子が細胞内へと取り込まれていることを示した。本年度はさらにヌクレオキャプシドが核内へ侵入しているか否かを明らかにする目的で、主要構成タンパク質であるVP39の細胞内局在性を調査した。その結果、BmNPVのVP39はSf9細胞の核内でわずかにしか検出されなかった。Sf9細胞内で増殖可能であるAcMNPVの感染では、核内にVP39のシグナルが多量に検出されたことから、BmNPV感染はヌクレオキャプシドが核へと侵入する以前に抑制されると結論した。また昨年度に引き続き、Sf9細胞でのBmNPVの増殖を可能にする遺伝子の探索をAcMNPVゲノム中より行った。二次感染が生じるか否かに基づき増殖促進能を持つ配列の探索をしたところ、異なった二つのAcMNPVゲノム断片を同時に導入したSf9細胞でのみBmNPVの二次感染が確認された。このことはBmNPVをSf9細胞内で増殖させるために複数の遺伝子の関与が必要であることを示している。また一方の断片中にウイルスの侵入に深く関与する膜融合タンパク質GP64がコードされていたため、AcMNPVとBmNPVそれぞれのGP64タンパク質の膜融合能を比較した結果、BmNPVが持つGP64の膜融合能が著しく弱いことが明らかとなった。現在はgp64遺伝子の組換えによってBmNPVがSf9細胞の核内へ侵入可能となるか、またBmNPVの感染停止が膜融合段階で生じているかを調査している。本研究はカイコ核多角体病ウイルス(BmNPV)と昆虫培養細胞であるSf9細胞を用いてNPVの宿主特異性決定機構を明らかにすることを目的としている。今までの研究により、BmNPVのSf9細胞への感染はウイルス遺伝子発現以前に停止することがわかっている。そこで本年は、ウイルスゲノムDNAが核入輸送される機構に注目し、まず侵入停止投階の決定を試みた。ウイルスの膜融合タンパク質GP64に対する抗体を用いた細胞免疫染色を行った結果、エンドサイトーシスによるBmNPVのSf9細胞への取り込みは起こりうることが明らかとなった。しかし、Sf9細胞を宿主細胞とするAcMNPV接種ではウイルスの侵入に伴いGP64のシグナルの強度が変化したのに対し、BmNPV接種では同様の変化は認められなかった。GP64タンパク質はNPVの出芽ウイルスの侵入初期段階に必須なタンパク質である。そのため、このBmNPV接種とAcMNPV接種で認められたGP64のシグナル変化の相違が、BmNPVの侵入不全のどのような機構を反映した結果であるかを現在検討中である。また、BmNPVの複製を可能にする遺伝子の探索を上記の研究と並行して行った。BmNPVとAcMNPVはゲノムの遺伝子構成などが非常によく似ている。この性質を利用し、AcMNPVより宿主特異性決定因子の単離を試みた。AcMNPVから作出したコスミドライブラリーを用い、BmNPVの複製を可能にする遺伝子の探索を試みた結果、単一のコスミドクローンの導入によりNPV感染の最終産物であるポリヘドリンタンパク質の蓄積が認められるようになった。現在はこのコスミドクローンより宿主特異性決定にかかわる遺伝子の探索を行っている。
ジオシンセティクスを用いた農業用水用パイプラインの耐震工法の研究開発

近年の多発する地震ならびに,老朽開水路の更新を背景に,開水路のパイプライン化が進展してきている.しかしながらパイプラインは,曲がり部を多数有する複雑な構造物であるため,現在の設計では,パイプラインの曲部に発生するスラスト力に抵抗するために,コンクリートブロックを打設し,その背面の受働土圧で支持する設計となっているが,これらは重量構造物であり地震時等に他の部分と位相差が生じるため,逆に弱点となっている.この様な背景より,軽量な耐震性を考慮したスラスト防護工法の研究開発が急務であると考えられ,当課題に着手した.具体的な研究開発の流れとそのおもな成果を以下に示す.H17年度より,ジオグリッドを活用したスラスト防護新工法の提案を行うとともに,小型模型埋設実験を遂行し,提案工法の基本特性ならびにその有効性について明らかにした.さらにH18年度は,大規模なφ300模型管路を対象に大規模な埋設実験を遂行し,当工法の安全性ならびにジオグリッドの伸びを考慮した新設計手法の提案を行った.最終年度では,(独)農村工学研究所の所有する大型3次元振動台を用いて,提案耐震工法ならびに従来工法であるコンクリートブロックを用いたφ200の模型パイプラインを対象として,大規模な振動台実験を実施し,定量的な評価を行い,耐震性の評価ならびにその挙動特性について検討した.さらに,(独)水資源機構の協力を得て,φ800実用管路にて,当工法の施工性・安全性の確認までを遂行した.近年の多発する地震ならびに,老朽開水路の更新を背景に,開水路のパイプライン化が進展してきている.しかしながらパイプラインは,曲がり部を多数有する複雑な構造物であるため,現在の設計では,パイプラインの曲部に発生するスラスト力に抵抗するために,コンクリートブロックを打設し,その背面の受働土圧で支持する設計となっているが,これらは重量構造物であり地震時等に他の部分と位相差が生じるため,逆に弱点となっている.この様な背景より,軽量な耐震性を考慮したスラスト防護工法の研究開発が急務であると考えられ,当課題に着手した.具体的な研究開発の流れとそのおもな成果を以下に示す.H17年度より,ジオグリッドを活用したスラスト防護新工法の提案を行うとともに,小型模型埋設実験を遂行し,提案工法の基本特性ならびにその有効性について明らかにした.さらにH18年度は,大規模なφ300模型管路を対象に大規模な埋設実験を遂行し,当工法の安全性ならびにジオグリッドの伸びを考慮した新設計手法の提案を行った.最終年度では,(独)農村工学研究所の所有する大型3次元振動台を用いて,提案耐震工法ならびに従来工法であるコンクリートブロックを用いたφ200の模型パイプラインを対象として,大規模な振動台実験を実施し,定量的な評価を行い,耐震性の評価ならびにその挙動特性について検討した.さらに,(独)水資源機構の協力を得て,φ800実用管路にて,当工法の施工性・安全性の確認までを遂行した.全国的に近年の地震発生確率は極めて高くなってきており,農業用施設の耐震性向上が急務であると考えられる.さらに,近年では,多くの老朽化開水路は更新時期を迎え,維持管理の利便性から開水路のパイプライン化が進展してきているが,もとより線状構造物であるパイプラインは,曲がり部を多数有する複雑な構造物である.現在の設計手法では,パイプラインの曲部に発生するスラスト力(不平衡力)に抵抗するために,コンクリートブロックを打設し,その背面の受働土圧で支持する設計となっている.しかしながら,これらのブロックは,重量構造物であり地震時等に他の部分と位相差が生じるため,地盤の液状化と相まって破壊する主要因となっている.この様な背景より,軽量なスラスト防護工法の研究開発が急務であると考えられ,近年注目されているジオシンセティクスを活用した新工法の研究開発を開始した.今年度は,ジオシンセティクスを鉛直方向に配置した防護方法の挙動メカニズムを解明するために,小型土槽を製作し,水平載荷実験を実施した.その結果,以下のことが明らかになった.(1)緩詰め地盤条件では,無対策のパイプに対して,ジオシンセティックスを配置したケースの水平抵抗力は1.4倍程度になる.(2)また,密詰地盤条件では,1.61.7倍の水平抵抗力を発揮し,ジオシンセティックスの効果が極めて高い.(3)パイプ後方部を一体化したモデルでは,コンクリートブロックを模擬した□形状模型の場合の約1.3倍の抵抗力を有する.(4)さらに,ジオグリッドで一体化を図った領域の下部位置における鉛直土圧は,パイプの水平載荷に伴って上昇し,特に密詰地盤の場合ピークを有している.(5)このことは,ジオシンセティックスで囲まれた領域が一体化していることを示唆するダイレーションによるものと考えられる.近年の地震発生確率は極めて高くなってきているとともに,多くの老朽化開水路は更新時期を迎え,維持管理の利便性から開水路のパイプライン化が進展してきているが,もとより線状構造物であるパイプラインは,曲がり部を多数有する複雑な構造物である.現在の設計手法では,パイプラインの曲部に発生するスラスト力(不平衡力)に抵抗するために,コンクリートブロックを打設し,その背面の受働土圧で支持する設計となっている.しかしながら,これらのブロックは,重量構造物であり地震時等に他の部分と位相差が生じるため,地盤の液状化と相まって破壊する主要因となっている.

この様な背景より,軽量なスラスト防護工法の研究開発が急務であると考えられ,昨年度,小型模型実験によりジオシンセティクスを活用したスラスト防護新工法の有効性について明らかにした.今年度は,ジオシンセティクスを鉛直方向に配置した防護方法の実大規模実験を行い,提案工法の施工性の確認や,ジオグリッドの強度などが,当工法の有効性に与える影響について検討した.その結果,以下のことが明らかになった.1.負荷したスラスト力と土圧計の実測結果から求めた水平抵抗力は同等の荷重レベルであり,実験の整合性が確認できた.2.当提案工法により付加された抵抗力は曲管の抵抗力に対し,最大で6割程度であり,当工法の実用規模における有効性が認められた.3.ジオグリッドに発生する延伸方向のひずみは,引抜き側から徐々に低下するが,ジオグリッド後端部では0とはならず,プレートによる受働抵抗が発揮されていることが確認された.また,深度方向のひずみの変化は小さく,管径が小さい場合無視できることがわかった.4.当工法で用いられるジオグリッドの剛性および長さは,プレートによる受働抵抗や地盤との摩擦抵抗の大きさに影響する.近年の多発する地震ならびに,老朽開水路の更新を背景に,開水路のパイプライン化が進展してきている.しかしながらパイプラインは,曲がり部を多数有する複雑な構造物である.現在の設計手法では,パイプラインの曲部に発生するスラスト力に抵抗するために,コンクリートブロックを打設し,その背面の受働土圧で支持する設計となっているが,これらは重量構造物であり地震時等に他の部分と位相差が生じるため,弱点となっている.この様な背景より,軽量なスラスト防護工法の研究開発が急務であると考えられ,一昨年度より,小型模型実験によりジオグリッドを活用したスラスト防護新工法の有効性について明らかにするとともに,ジオグリッドの伸びを考慮した設計手法の提案までを遂行した.今年度は,(独)農村工学研究所の所有する大型3次元振動台を用いて,提案耐震工法ならびに従来工法であるコンクリートブロックを用いたφ200の模型パイプラインを対象として,大規模な振動台実験を実施し,定量的な評価を行った。さらに,(独)水資源機構の協力を得て,φ800実用管路にて,当工法の施工性・安全性の確認までを遂行した.その結果,以下のことが明らかになった.1.液状化地盤において,従来用いられるコンクリートブロックは大きく移動し,隣接管との間に大きな隙間が発生し,極めて危険である.2.当提案工法を用いた場合,曲管部の水平移動量は小さく,液状化地盤において,耐震性に優れている.3.特に,ジオグリッド周辺に砕石を用いる場合,ジオグリッドによる引抜き抵抗力は大きく,曲管部の移動量は極めて小さくなる.4.φ800の実用管路の敷設替え施工に,当提案工法を採用し,通水時の埋設挙動計測を行い,内圧の上昇に際して,水平反力が大きくなるものの,移動量はほとんど発生せず,実用規模レベルにおいても,当工法は極めて有用な耐震工法であるといえる.
歯周炎で誘導されるインフラマソーム活性化が動脈硬化に及ぼす影響とその制御

歯周病原性細菌P. ginigivalis(P. g.)の経口感染は、インフラマソームを活性化して炎症性サイトカイン産生を誘導し、その結果Th17細胞の誘発、IL-17の増強により慢性炎症が持続する可能性が示唆された。さらにこれらの活性化には、ジンジパインや線毛が関与していることが示唆された。またApoEshlマウスへのP. g.感染はLDLの酸化変性増強作用を誘導した。In vitro実験において、P.g.及びP.g. LPSは血管内皮細胞からの活性酸素(ROS)産生を増強した。更に、P.g.はox-LDLと共通エピトープを有し、分子相同性による炎症増強にも関与していた。1.歯周病原性細菌感染による自然免疫受容体の発現増強と疾患増悪ーP.g.生菌感染群は線毛欠損株(KDP150)又はジンジパイン欠損株(KDP136)感染群と比較して歯肉および大動脈におけるTLR-2, -4, -9発現の有意な増加を認め、さらに大動脈洞内のプラーク形成面積や骨吸収も有意に増加していた。動脈硬化進展度および骨吸収の割合はP.g。生菌>KDP136>KDP150>CMCの順であった。2.歯周病原性細菌感染による炎症性サイトカイン活性化ーApoeshlマウスへのP.g.生菌の経口感染は、腹腔マクロファージにおけるIL-1β、IL-18およびTNF-α産生を有意に増加した。一方、KDP150及びKDP136は、P.g.生菌と比較してIL-1β、IL-18およびTNF-α産生の有意な減少を認めた。3.歯周病原性細菌感染によるインフラマゾーム活性化ーApoeshlマウスへのP.g.生菌感染は、歯肉組織や大動脈起始部においてNLRP3, pro-IL-β, pro-IL-18及びprocaspase-1等のインフラマソーム関連因子や内因性シグナル(HSP60,酸化LDL)を有意に増強した。一方、KDP136及びKDP150の経口感染は、P.g.生菌と比較するとインフラマソーム関連因子や内因性シグナル発現は有意に抑制されていた。4.インフラマゾーム構成成分欠損による歯周病原菌感染マウスからの炎症性サイトカイン産生及び動脈硬化誘発機序への影響ーNLRP3欠損マウスへの歯周病原菌感染は野生マウスと比較して、歯肉や大動脈での炎症性サイトカイン(Pro-IL-1及びPro-IL-18)やRANKL、OPG発現を有意に抑制し、歯槽骨吸収や動脈硬化を有意に抑制した。更に、P.g.は抗ox-LDL抗体と反応することが確認され、この反応性はジンジパイン阻害剤やジンジパイン欠損株で有意に抑制された。従って、P.g.はox-LDLと共通エピトープを有し、P. g.による直接の酸化作用のみならず、分子相同性による炎症増強にも関与している可能性が示唆された。2.酸化LDL刺激未熟樹状細胞の確立と制御性T細胞への誘導を試みるべく、骨髄から単離した未熟樹状細胞を酸化LDLと共にマウスへ移入した。移入後、2, 4, 6, 8, 10日目にレシピエントマウス脾臓からCD4+T細胞を単離し、CD25+Foxp3+陽性率を検討した結果、8日目で最大となった為、移入8日目のCD4+CD25+Foxp3+ T細胞を実験に供した。現在、CD4+CD25+Foxp3+ T細胞の増殖能や抗原特異性を検討中である。歯周病原性細菌P. ginigivalis(P. g.)の経口感染は、種々のインフラマソーム(NLRP3, ASC, Caspase-1)を活性化して炎症性サイトカイン産生を誘導し、その結果Th17細胞の誘発、IL-17の増強により慢性炎症が持続する可能性が示唆された。またApoEshlマウスへのP. g.又はA. a.感染はLDLの酸化変性増強作用(4HNE, ox-LDL, PLA2, MPO, CD36の大動脈組織での発現増加や心臓組織におけるLOX-1やNADPHオキシダーゼの発現増強)を誘導した。In vitro実験において、P. g.及びP. g. LPSは菌数依存的に単球及び血管内皮細胞からの活性酸素(ROS)産生を増強した。更に、P.g.はox-LDLと共通エピトープを有し、P. g.による直接の酸化作用のみならず、分子相同性による炎症増強にも関与している可能性が示唆された。本年度は、乳酸菌の経口投与における歯周病並びに歯周病誘発動脈硬化の改善について検討した。2上記の乳酸菌を用いて、活性酸素消去能及び脂質過酸化能を測定した。L. salivarius IT2711以外の菌株はいずれも高い活性酸素消去能及び低い脂質過酸化能を示したが、特にL. paracasei JCM1133で顕著であった。以上の結果から、マウス実験の乳酸菌候補として、抗菌活性が最も高かったL. gasseri 03-2及び高い活性酸素消去能及び低い脂質過酸化能を示したL. paracasei JCM1133を選択した。3乳酸菌を5週間にわたりApoeshl欠損高脂血症マウスに経口投与後、P. gingivalis381株を経口感染し、歯槽骨吸収量を計測した。

更に、心臓の凍結切片を用いてOil-red O染色を行った。L. gasseri 03-2及びL. paracaseiJCM1133投与群は、いずれもP. gingivalis感染による骨吸収を有意に抑制した。一方、動脈効果発症に対する影響はL. gasseri 03-2だけがP. gingivalis感染によるプラークの蓄積を有意に阻害した。更に、歯肉や大動脈組織のおけるIL-18発現の顕著な減少が認められた。これらの結果から、L. gasseri 03-2の経口投与は歯周病並びに歯周病から派生する動脈効果の予防に有用である可能性が示唆された。本年度の実験に際し、乳酸菌の候補として高い抗菌活性を持つ菌株(L. gasseri 03-2)と高い活性酸素消去能及び低い脂質過酸化能を有する菌株(L. paracasei JCM1133)を選択したところ、L. gasseri 03-2は歯槽骨吸収と大動脈のプラーク形成をいずれも抑制したが、L. paracasei JCM1133は歯槽骨吸収のみを抑制した。更に、L. gasseri 03-2投与群は歯肉や大道脈組織の炎症性サイトカイン発現を有意に抑制した。これらの結果は、抗菌活性の高い乳酸菌がP. gingivalis感染で生じた腸内細菌の負のバランスを正のバランスに戻している可能性を示唆する。その結果、P. gingivalis感染で生じた炎症を有意に抑制したと考えられる。本年度は、乳酸菌の経口投与における歯周病並びに歯周病誘発動脈硬化の改善について、歯肉の炎症状態やマウス腸管関連リンパ組織におけるリンパ球の動態について検討した。更に、Porphyromonas gingivalis感染により生じる腸管Dysbiosisに対する影響を検討した。1乳酸菌を5週間にわたりApoeshl欠損高脂血症マウスに経口投与後、P. gingivalis381株を2週間経口感染し、30日後の炎症性サイトカイン発現を解析した。歯肉においては、いずれの乳酸菌もP. gingivalisで増加するIL-1βやIL-18, RANKL発現を有意に減少したが、OPG発現はL. gasseri 03-2投与で減少したものの、L. paracasei JCM1133投与群は逆に増加した。大動脈組織においては、いずれの乳酸菌もP. gingivalisで増加するIL-1β発現を更に増強したが、IL-18の発現はL. gasseri 03-2投与で減少したものの、L. paracasei JCM1133投与群は逆に増加した。2P. gingivalis381株の最終感染から1日後に小腸を摘出し、細胞染色を行った。小腸の粘膜固有層におけるT細胞解析においては、いずれの乳酸菌もP. gingivalisで増加するIFN-g+T細胞の比率を抑制した。特に、L. gasseri 03-2投与で減少が有意であった。更に、いずれの乳酸菌もCD25+Foxp3+T細胞の比率を有意に増加した。一方、P. gingivalis感染で減少するIL-17+T細胞に対しては、L. gasseri 03-2投与で回復が見られたものの、L. paracasei JCM1133投与群ではさらなる減少が見られた。3P. gingivalis381株の最終感染から1日後に糞便を採取し、メタゲノム解析を行った。
有機溶剤依存の病態および治療に関する分子生物学的研究

実験動物は生後50日齢のWistar系雄性ラットを用いた。動物を透明なプラスティック容器(60×40×35cm)内にトルエン(2ml,2000ppm)を吸収させたろ紙の入ったシャーレを置き、その中に飼育ケージごと動物を3時間ずつ吸入曝露させた。トルエン吸入曝露させた群を単回投与(急性曝露)と2週間連続投与(慢性曝露)のものを作製し、対照動物も同様の処置をトルエンの入っていない別の容器を用いて同時に行った。また、容器内のトルエン濃度・酸素濃度も同一条件にした。4%パラホルムアルデヒドで灌流固定後脳を摘出し、クリオスタットにて切片を作成した。synaptophysinに対する特異抗体(1次抗体)を室温で4日から7日間反応させたのち、型通りのABC法をおこない光学顕微鏡を用いて観察した。その結果、トルエン急性曝露群において、対照群に比してsynaptophysin免疫反応が大脳皮質前頭前野,側頭葉皮質,側坐核で増強する傾向が認められた。また慢性曝露群においても側頭葉皮質,側坐核の一部で増強する傾向が認められた。これらが、依存等に関与するドーパミンA1Oニューロンの分布に合致することから、有機溶剤による依存の形成にsynaptophysinが関与していることを明らかにした。この、synaptophysin免疫反応構造を定量形態学的に測定したところ有意な増加であることを確認した。併せて、RT-PCRやノーザンブロットを用いて、synaptophysin mRNAの発現量の増加が、上記各部位で認められた。有機溶剤の吸入により生じる精神症状や精神依存がドーパミンやセロトニンといった脳内モノアミンニューロンの神経伝達や神経可塑性と深く関わっていることから、前シナプスでシナプス小胞の開口放出において細胞膜との融合孔形成に関与する分子の一つであるsynaptophysinに着目し、免疫組織学的手法を用いて生体内中枢神経系における有機溶剤依存のメカニズムを検索した。トルエン曝露は以下の方法で行った。動物を透明なプラスティック容器(60×40×35cm)内にトルエン(2ml,2000ppm)を吸収させたろ紙の入ったシャーレを置き、その中に飼育ケージごと動物を、3時間ずつ吸入曝露させた。対照動物も同様の処置をトルエンの入っていない別の容器を用いて同時に行った。抗synaptophysin抗体を用いた免疫組織化学法による実験を行った。4%パラホルムアルデヒドで灌流固定後脳を摘出し、ショ糖に48時間浸けたのち凍結しクリオスタットにて切片を作成した。synaptophysinに対する特異抗体(1次抗体)を各々室温で4日から7日間反応させたのち、型通りのABC法をおこない光学顕微鏡を用いて観察した。有機溶剤単回吸引による急性曝露群は対照群に比して、synaptophysin免疫陽性細胞の増加傾向が認められた。有機溶剤単回吸引による急性曝露群におけるsynaptophysin免疫陽性細胞は、主にnucleus accumbens、prefrontal cortexとtemporal cortexにおいて増強する傾向がみられた。次年度は、例数を増やし、長期間(2-4週間)吸入による慢性曝露群との比較をおこない、有機溶剤依存のメカニズムを明らかにしていきたい。