hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
模擬原始地球の化学素材で構成するRNAの試験管内分子進化

リボザイム(RNA酵素)の発見により,原始生命はリボ核酸(RNA)を中心として構成されていたとする「RNAワールド仮説」が提案された.さらにRNAの試験管内分子進化法が登場し,様々なリボザイムを創成できることが示された.しかし従来法では,鋳型DNAやポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの生物由来の素材と手法が必要である.従って,このようなRNAがダーウィン進化的に出現する仕組みがあったかどうかは,原始的な素材を用いて検証しなければならない.本研究では,原始地球上に存在したと考えられる非生物的な素材を用いてRNAの進化的な発展過程を明らかにすることを目的として,以下について検討した.すなわち,RNA分子の集合体からRNAワールドにダーウィン進化的に発展したならば,(1)RNAが自発的に生成する過程,(2)RNAが複製する過程,(3)RNAが増幅する過程,(4)RNAが自然選択する過程,が必要である.本研究では,それぞれの過程が効率よく進む条件を探索し,それらを結合して最終的にRNAがダーゥイン進化的に創成されるシステムを構築することを目標とした.その結果,(1)について,粘土鉱物を触媒としてRNAが非生物的に生成する過程では,ランダムな配列で4種のヌクレオチドを含むRNAが生成することを確かめた.(4)については,高温下での熱による淘汰圧によって熱に強いRNAが生き残った可能性があることが分かった.(2)および(3)についてはDNA鋳型も酵素も存在しない前生物的な複製を可能とするために,種々の検討を試みた.残念ながら現時点ではRNAが複製する条件は見いだせなかったが,その可能性を見いだすことができた.リボザイム(RNA酵素)の発見により,原始生命はリボ核酸(RNA)を中心として構成されていたとする「RNAワールド仮説」が提案された.さらにRNAの試験管内分子進化法が登場し,様々なリボザイムを創成できることが示された.しかし従来法では,鋳型DNAやポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの生物由来の素材と手法が必要である.従って,このようなRNAがダーウィン進化的に出現する仕組みがあったかどうかは,原始的な素材を用いて検証しなければならない.本研究では,原始地球上に存在したと考えられる非生物的な素材を用いてRNAの進化的な発展過程を明らかにすることを目的として,以下について検討した.すなわち,RNA分子の集合体からRNAワールドにダーウィン進化的に発展したならば,(1)RNAが自発的に生成する過程,(2)RNAが複製する過程,(3)RNAが増幅する過程,(4)RNAが自然選択する過程,が必要である.本研究では,それぞれの過程が効率よく進む条件を探索し,それらを結合して最終的にRNAがダーゥイン進化的に創成されるシステムを構築することを目標とした.その結果,(1)について,粘土鉱物を触媒としてRNAが非生物的に生成する過程では,ランダムな配列で4種のヌクレオチドを含むRNAが生成することを確かめた.(4)については,高温下での熱による淘汰圧によって熱に強いRNAが生き残った可能性があることが分かった.(2)および(3)についてはDNA鋳型も酵素も存在しない前生物的な複製を可能とするために,種々の検討を試みた.残念ながら現時点ではRNAが複製する条件は見いだせなかったが,その可能性を見いだすことができた.RNAの試験管内分子進化法は,生命起源の研究手段および創薬ツールとして急速に発展してきた.しかし,ランダムDNAプールやPCR法などの分子生物学的手法が必要などの点で,原始化学進化を検証する手法として大きな課題がある.生命起源の新しい研究ツールを得るために,原始地球上に存在したと考えられる前生物的素材を用いて新しいRNA分子進化系を構築する,初年度はRNAの(1)ランダム生成,(2)自然選択,(3)複製・増幅・変異の各プロセスの統合に向けて(1)と(2)を検討した.4種類(G,A,C,U)のヌクレオチドモノマーについて,5'-位リン酸をイミダゾールで活性化した活性化ヌクレオチドを合成と,モンモリロナイト粘土触媒の調製を行った.これらを用いて4種々の塩基からなるRNAの生成を試みた.(i)分析法の検討:HPLC,本研究課題で取得したキャピラリーLC,およびアガロースゲル電気泳動が利用できるかどうか検討した.単独種類の塩基からなるRNAはHPLCで分析し標準品と比較して鎖長を決定した.塩基種類の混合系では電気泳動を試みた.ただし,生成物の鎖長が短いため分離は難しく,キャピラリーLCを用いて検討を行っている.(ii)反応挙動の解析:混合系でもRNAが生成することを確認した.鎖長は単独の場合と近いことがHPLC分析から推定された.また,GおよびAを含む系では粘土触媒に強く吸着したので生成物の脱着を行い,総生成量を明らかにした.RNAモノマーを逐次添加することで,長鎖長RNAの生成を試みた.HPLC分析でも鎖長の増加は認められたが50鎖長程度のものは確認できなかった.電気泳動法の確立とプライマーの利用を検討すべきであることを知った.(iii)RNAの熱安定性:熱水フローリアクターを用いて,4種類の異なるRNAの熱安定性を分析した.RNAの試験管内分子進化法は,生命起源の研究手段および創薬ツールとして急速に発展してきた.しかし,ランダムDNAプールやPCR法などの分子生物学的手法が必要などの点で,原始化学進化を検証する手法として大きな課題がある.

そこで,原始地球上に存在したと考えられる前生物的素材を用いて新しいRNA分子進化系を構築する.2年めはRNAの(1)ランダム生成,(2)自然選択,(3)複製・増幅・変異の各プロセスの統合に向けて(1)と(3)を検討した.4種類(G,A,C,U)の原始的な活性化ヌクレオチドを用いて4種々の塩基からなるRNAの粘土触媒生成反応と鋳型指示反応を試みた.(i)ランダムRNAの生成:4種類のモノマーの混合系から粘土を触媒として生成したRNAを構造解析した.具体的には,鎖長,塩基種類の割合,3',5'-結合の割合を明らかにした.この結果,混合系から生成するRNAはGを含むものが多いなどの偏りがあることを知った.この結果ランダムRNAの生成挙動について解析を終了した.(ii)LC分析法の検討:本研究で生成するRNA鎖長は1030程度であり,HPLCでも電気泳動法でも分析しにくい.そこで,本研究に適した分析法の開発を試みた.(1)キャピラリーLCに逆相系モノリスカラムを用いると1鎖長分離が可能であった.(2)溶離液に尿素を加えることで,塩基種類にほぼ依存しない分離法を確立した.(iii)鋳型指示反応:原始RNAポリメラーゼモデルとしてポリシチジル酸とし活性化グアノシンモノマーを用いるとオリゴグアニル酸が生成するがその他の鋳型とモノマーの組み合わせでは反応は進まない.これを種々の塩基を含むモノマーの混合系について鋳型指示反応を成功させるために種々の触媒の探索を行ったが現在のところまだ成功していない.RNAの試験管内分子進化法は,生命起源の研究手段として急速に発展した.しかし,ランダムDNAプールやPCR法などの分子生物学的手法が必要な点は,原始化学進化を検証する手法として根本的な欠陥である.そこで,原始地球上に存在したと考えられる前生物的素材と反応を用いて,新しいRNA分子進化系の構築を試みた.最初の2年間で,RNAの(1)ランダム生成および(2)自然選択の手法をおおむね完成した.昨年度後半からは,(3)複製・増幅・変異を起こす非生物的なRNAの反応系の開発を試みた,本年度は以下について検討した.(i)原始的な複製反応を起こさせるためには,RNAの2重構造を安定化させる条件が必要である.そこで,インターカレータおよび原始タンパク質モデルがRNAの2重らせんを安定化させるかどうか調べた.インターカレータはかなり安定化させたが,原始タンパク質モデルではそのような効果は認められなかった.(ii)複製系の検討:原始RNAポリメラーゼモデルとしてポリシチジル酸とし活性化グアノシンモノマーを用いるとオリゴグアニル酸が生成する.この反応はその他の鋳型とモノマーの組み合わせでは反応は進まない.上記の,インターカレータおよび原始タンパク質モデルを添加して影響を調べた.インターカレータ共存下では,反応を少し促進した.しかし,複製反応を起こさせるほどの効率は得られず,さらに検討が必要であることを知った.(iii)本研究で生成するRNA鎖長は10-30程度であり,電気泳動法では分析困難である.また,数10μLの微少試料を扱わなければならない.
強震動・水文地形解析に基づくダム湖縁辺地すべり地の危険度評価法の研究

2008年岩手・宮城内陸地震により誘発された荒砥沢ダム湖上流の地すべりの斜面物質の移動様式を明らかにした.ダム湖縁辺地すべり地の地震危険度を判定するための評価項目,地すべり斜面の(1)強震動予測,(2)地殻変動予測,(3)振動性状と安定性,(4)集水状況,(5)末端脚部の地質構造及び地下水分布,及び(6)PS-InSARによる地震誘発地すべり地の抽出,の有効性を検証した.2008年岩手・宮城内陸地震により誘発された荒砥沢ダム湖上流の地すべりの斜面物質の移動様式を明らかにした.ダム湖縁辺地すべり地の地震危険度を判定するための評価項目,地すべり斜面の(1)強震動予測,(2)地殻変動予測,(3)振動性状と安定性,(4)集水状況,(5)末端脚部の地質構造及び地下水分布,及び(6)PS-InSARによる地震誘発地すべり地の抽出,の有効性を検証した.(1)地すべりの発生機構と斜面物質移動様式地震発生前・後に公表されたオルソ写真の比較から、二つの大きな土塊が表面の形状をあまり変えずに移動した。土塊Aは、斜面が崩壊し液状化物質と共に消失した部分に上流から移動してきた。次に土塊Bが北北西から移動してきて、土塊Aに乗り上げる形で停止した。これらの土塊移動は下流側に液状化によって生じた力学的な不安定が次々に上流側に連鎖して発生したと考えられる。(2)本震時の強震動と地盤変動本震時のダム監査廊基礎地盤での最大地震動は、加速度で1088gal(南北動)、速度で70cm/s(東西動)、変位で70cm(上下動)であった。変位波形から、南西方向へ約55cmの水平変位を伴う約70cmの隆起を得た。一方、ダム湖右岸地山表面では、北東方向への水平変位約28cmを伴う約4cmの隆起であった。両者の変位時刻歴と最終変位量の違いは、地山が地すべりを起こした事による。(3)移動土塊の地盤振動特性余震観測が実施された。土塊Bでの余震記録には主要動付近に長周期パルスが観測される事がある。これは水平動成分では傾斜ステップ、上下動成分では鉛直変位で生じる事が確認できた。地震時、地盤は北北西方向に傾く。傾斜角は地球潮汐と同程度(0.03μradian)から、その30倍程度である。鉛直変位は、0.2cmから26.9cmの沈降である。評価した傾斜とその方位は(1)の土塊Bの移動、乗り上げ運動に整合する。ダム基礎地盤を基準とする土塊BのS波主要動の増幅度特性には、1Hz付近に10倍程度の顕著なピークがある。これは地表の不動地盤には無いため、土塊Bの地震時の共振による。本震時に土塊Bは土塊Aに乗り上げるように衝突して停止したが、時に強い地震波の入射時に共振し、傾斜・沈降してより安定な状態に向かっている。2008年岩手宮城内陸地震で発生した荒砥沢ダム上流部分の巨大な地すべり土塊の地震発生前の水文地形学的特徴を地すべり分布図、地質図、地震発生前後の10mおよび5mDEMを用いた地形解析、地震前後の空中写真判読から、既往の地すべり地で、水流が集中する部分に移動する可能性が高いことを見いだした。このことから、隣接する栗駒ダム周辺でも同様の解析を行い、現地での踏査結果を裏付ける地表変位を検出する方法について検討をおこなった。また、荒砥沢ダム管理事務所の地震発生時に停電で欠測となっていた水位変化データから、地震時にダム湖内で発生した段波状の水位変化について、新たに検討をおこなった。ダム湖内に流入するシツミクキ沢の橋破壊過程と併せて地震発生時あるいは直後に最初に移動を開始した箇所の検討をおこなった。荒砥沢地域の地質は、前期-中期中新世の火山活動による噴出物が、基盤を形成し、特に震源域の南部ではカルデラの発達もみられ、その後第四紀火山である栗駒山の噴出物が地表を覆った。この噴出物の下位には、湖沼または河川により選別された柔らかい凝灰質砂岩やシルト岩が互層をなしており、すべり・流動層は、この内部に存在すると考えられる。地表から数百メートル程度までの地下構造および速度構造を調べるために、荒砥沢ダム湖周辺に短い探査測線を設定し、P/S波による屈折法・反射法探査を試みた。ダム湖左岸測線における屈折初動解析から、基盤相当層の速度は、3.0km/s-4.0km/s、上位の層は、1.0km/s-2.0km/sである。また、基盤が一旦南側に向かって上昇する背斜構造が見られる。測線の中央やや南の高まりには硬質の凝灰岩露頭が見られ、これは、カルデラ壁に相当する可能性もある。屈折トモグラフィー解析から、背斜構造頂部付近に低速度異常が見られ、これが何であるか今後の検討を要する。次年度には、本測線北方延長上に位置する地すべり地域内で同様な地下構造探査を予定している。今回、それに向けての貴重な情報を得ることができた。

前年度の結果から、地震直後に移動を開始した部分は、ダム湖内に流入する3つの沢が液状化し側方流動をおこしたものと結論されたので、巨大な移動土塊が引き続き移動するメカニズムを移動土塊上の点の追跡による3次元土塊移動追跡法を試みた。これを応用して、最も大きな移動土塊のすべり面の形状に関する検討を行った。周辺で発生した地すべりの位置に関する解析を地震前の10mDEMを用いて、河川との位置関係に関する視点から実施した。既設の観測点、及び高密度観測網による地震観測から、(1)2008年岩手・宮城内陸地震時の荒砥沢地すべり斜面の地震動評価、(2)地すべり斜面の震動性状の解析、(3)地すべり斜面の地下構造の推定、(4)強震時に誘発される地すべりの検出を行った。荒砥沢地すべり地域内で、東西、南北の2測線で反射法・屈折法による地下構造探査を実施した。(4)について貴重な結果が得られた。荒砥沢ダム湖右岸背後(南側)の山は地すべり地形とされているが、2008年岩手・宮城内陸地震時には滑らなかったと考えられていた。ダム堤体監査廊基盤に設置された観測点と、同じくダム湖右岸地山表面観測点での本震波形解析から、本震時に滑った結果を得た。ダム湖取水塔被害、山周辺道路の被害もそれに整合する状況を呈している。これは、顕著な地盤変状が直接観察されなくても、既往の地すべり地は中規模以上の地震によって変位する可能性を示唆する。小・中地震により小さな変位を起こした地すべり地を抽出することにより、来るべき大地震時に誘発される大規模地すべり地を予測することが可能である。この誘発地すべり地の抽出法として、中規模以上の地震を経験している既往地すべり地におけるInSARによる地震前後の変位の時系列解析を提言し、これを2007年能登半島地震時の輪島古江地域に適用し、その手法の有効性を示した。
体内時計2振動体カップリングメカニズムの解明

体内時計機構2振動体説は,(1)Evening(E)振動体とMorning(M)振動体,(2)視交叉上核(SCN)振動体と制限給餌周期(restricted feeding, RF)同調振動体(RF振動体),(3)SCN振動体とメトアンフェタミン(MAP)依存振動体(MAP振動体)のそれぞれから考えられてきた.本課題では,行動リズムがスプリッティングを示すCS系マウスを用いて,E/M振動体とRF振動体・MAP振動体との関連性について明らかにすることを目的とし以下の結果を得た.1.CS系の行動リズム・スプリッティング条件を確立するため,6時間暗期を1日に2回行う明暗サイクル(LD6:6:6:6およびLD9:6:3:6)と暗期の長い明暗サイクル(LD9:15)を行ったが,これらの条件下ではスプリッティングは起こらなかった.CS系のスプリッティングは恒暗条件でのみ生じることが分かった.2.恒暗条件でRFを行ったところ,CS系マウスの行動リズムがRFに同調した.RF下でのSCN時計遺伝子(mPer1など)発現リズムは,RFに同調していた.これらの結果から,CS系マウスのSCN振動体はRFに同調することがわかった.またRF中およびRF後のリズムがスプリッティングしなかったことから,E/M振動体とRF振動体に何らかの関連がある可能性が考えられた.3.恒暗条件におけるCS系のスプリッティングリズムヘのMAP(0.01%)投与の影響をみたところ,投与前のスプリッティングリズムの延長成分に加えて,周期が長い成分が出現した.また,MAP投与後のフリーランリズムは,投与前のフリーランの延長線上から開始していた.さらに,MAP投与後は,スプリッティングリズムの2成分のうちM成分が消失した.これらの結果から,E/M振動体とMAP振動体との関連性はないが,M振動体がMAPに影響を受ける可能性が考えられた.体内時計機構2振動体説は,(1)Evening(E)振動体とMorning(M)振動体,(2)視交叉上核(SCN)振動体と制限給餌周期(restricted feeding, RF)同調振動体(RF振動体),(3)SCN振動体とメトアンフェタミン(MAP)依存振動体(MAP振動体)のそれぞれから考えられてきた.本課題では,行動リズムがスプリッティングを示すCS系マウスを用いて,E/M振動体とRF振動体・MAP振動体との関連性について明らかにすることを目的とし以下の結果を得た.1.CS系の行動リズム・スプリッティング条件を確立するため,6時間暗期を1日に2回行う明暗サイクル(LD6:6:6:6およびLD9:6:3:6)と暗期の長い明暗サイクル(LD9:15)を行ったが,これらの条件下ではスプリッティングは起こらなかった.CS系のスプリッティングは恒暗条件でのみ生じることが分かった.2.恒暗条件でRFを行ったところ,CS系マウスの行動リズムがRFに同調した.RF下でのSCN時計遺伝子(mPer1など)発現リズムは,RFに同調していた.これらの結果から,CS系マウスのSCN振動体はRFに同調することがわかった.またRF中およびRF後のリズムがスプリッティングしなかったことから,E/M振動体とRF振動体に何らかの関連がある可能性が考えられた.3.恒暗条件におけるCS系のスプリッティングリズムヘのMAP(0.01%)投与の影響をみたところ,投与前のスプリッティングリズムの延長成分に加えて,周期が長い成分が出現した.また,MAP投与後のフリーランリズムは,投与前のフリーランの延長線上から開始していた.さらに,MAP投与後は,スプリッティングリズムの2成分のうちM成分が消失した.これらの結果から,E/M振動体とMAP振動体との関連性はないが,M振動体がMAPに影響を受ける可能性が考えられた.体内時計機構の2振動体説は,(1)Evening(E)振動体とMorning(M)振動体,(2)視交叉上核(SCN)振動体と食餌周期(restricted feeding,RF)同調振動体(RF振動体),(3)SCN振動体とメトアンフェタミン(MAP)依存振動体(MAP振動体)のそれぞれから考えられてきた.本研究では,E/M振動体間の関係に異常をもつCS系マウスを用いて,E/M振動体とRF振動体およびMAP振動体の関連性を明らかにすることから2振動体機構の解明を目指す.本年度は,CS系リズム・スプリッティング条件の確立およびCS系行動リズムへのRFの影響を検討し,現在までのところ以下の結果を得た.1.6時間交代の明暗サイクル(LD6:6:6:6)下で,回転輪行動による行動リズムを記録し,活動相が2つの暗期に分割するか(スプリッティング)を見た.しかし,この明暗サイクル下ではスプリッティングけ起こらなかった.2.暗期を長くした明暗サイクル(LD9:15)下で,行動リズムの活動相が2分割するかを見たが,この条件でも明確なスプリッティングは起こらなかった.これらの結果から,CS系マウスのスプリッティングは明暗サイクル下では起こらないことがわかり,研究計画の今後の実験は恒暗条件下で行う必要があることが分かった.3.恒暗条件で一定時刻の3時間に餌を与える制限給餌(RF)を行ったところ,CS系マウスの行動リズムがRFに同調した.4.RF下でCSマウスの行動リズムが同調しているときにSCNの時計

遺伝子(mPer1,mPer2,mBMAL1の発現リズムを調べたところ,これらの発現リズムはRFに同調していた.これらの結果から,CS系マウスのSCN振動体はRFに同調することがわかった.5.CS系マウスのリズムスプリッティングとRFへの同調リズムとの関連は今後解析する.サーカディアンリズムを駆動する体内時計機構は,2つの異なる振動体から構成される.この2振動体説は,(1)Evening(E)振動体とMorning(M)振動体,(2)視交叉上核(SCN)振動体と食餌周期(restricted feeding, RF)同調SCN外振動体(RF振動体),(3)SCN振動体とメトアンフェタミン(MAP)依存SCN外振動体(MAP振動体)のそれぞれから考えられてきた.本課題では,行動リズムがスプリッティングを示すCS系マウスを用いて,E/M振動体とRF振動体・MAP振動体との関連性について明らかにすることを目的とした.平成17年度は,(1)E/M振動体へのMAPの影響,さらに(2)SCN振動体除去によるE/M振動体とSCN外振動体への影響を調べることを目的とし,以下の結果を得た.1.CS系マウスとC57BL/6J系マウスを,恒常暗条件(DD)で回転輪行動のフリーランリズムを計測し,CS系マウスの行動リズムが2つの活動相に分割するスプリッティングを示すことを確認した.その後,MAP(0.01%)を給水ビンから投与し,フリーランリズムの変化を観察した.2.MAP投与により,C57BL/6J系マウスではフリーラン周期が延長した.一方,CS系マウスでは,MAP投与下では,投与前のスプリッティングリズムの延長成分に加えて,周期がそれよりもかなり長い成分が出現した.また,MAP投与後のフリーランリズムは,投与前のフリーランの延長線上から開始していた.さらに,MAP投与後は,スプリッティングリズムの2成分のうちM成分が消失した.3.以上の結果から,CS系マウスにおいて,E/M振動体のうちのM振動体とMAP振動体とが関連する可能性が示唆された.
軟骨細胞の増殖、分化における細胞内カルシウムの役割とシグナル伝達系の解析

創傷治癒において、c-fos遺伝子は創傷治癒における早期発現遺伝子であり、治癒過程に重要な役割を担っていると考えられる。成体の関節軟骨では半層損傷は治癒しないが、1998年、Nambaらはヒツジの胎児の半層軟骨損傷が治癒することを報告した。そこで我々は、胎児および成体ラットの半層軟骨損傷を作製し、治癒過程の差異をc-fos遺伝子の発現に注目して比較検討した。胎児においては、損傷後12日で治癒したが、成体では治癒しなかった。また、損傷後の関節軟骨におけるc-fos遺伝子発現の時間的変化をRT-PCRによって見てみると、胎児の方が成体に比べ、損傷後のc-fosの発現がより長く継続していることがわかった。すなわち成体では受傷後、発現レベルに変化はないが、胎児では受傷後1時間から発現が上昇し、6時間継続していた。またそのとき、c-fosは損傷周囲の軟骨細胞に局在して発現していることがin situ hybridizationによって明らかになった。次に細胞内カルシウム濃度とc-fos遺伝子の発現について、培養軟骨細胞、軟骨片を用いて胎児、成体で検討したところ、c-fos遺伝子の発現は細胞内カルシウム濃度によって調節されており、胎児は成体に比べ、細胞内カルシウム濃度の上昇が顕著であり、かつ細胞内カルシウムの上昇を促すATPに対する感度が高いことがわかった。また、新たにP2Y2受容体の軟骨修復における関与や、ATPは軟骨細胞の増殖の制御に関与していることを明らかにした。培養軟骨細胞のシグナル伝達機構を解明するために、関与するmediatorやreceptor,channelの同定を試みた。結果:細胞1個当たりのATP放出量(x10^<-4>nM)リンゲル液のみ:5.0,リンゲル液+UTP:14.0,スラミンのみ:1.9,スラミン+UTP:2.0,ATP放出はUTPにより刺激され、P2 receptor blockerやCl channel blockerにより抑制された。さらに、培養軟骨細胞には自発性カルシウム振動や、機械刺激で発生するカルシウム波が観察された。生体の軟骨に日常かかる圧力はきわめて大きく、カルシウム波が頻繁に生じており、細胞間情報伝達としての役割をしていると推察できる。培養軟骨細胞にはP2U型プリン受容体が存在し、機械刺激により発生するカルシウム波のシグナル伝達に関与している。また、機械刺激により発生するATP分泌は、Clチャネルを使って行っているという、重大な可能性を暗示している。細胞内カルシウムの増大は筋収縮、伝達物質の分泌、細胞増殖、アポトーシス等重要な細胞機能にかかわっているが、この場合にはP2受容体を介した侵害刺激の癒しに関係していると考えている。以上の成果は近日中に学会で発表し、論文にまとめることになっている。体重1.2kg日本白色家兎の膝から関節軟骨を採取後、軟骨細胞を単離し、24穴dishにおいて単層培養した。培養開始後3目、7目、10日後にmediumを廃棄し、各well内をリンゲル液で洗浄の後、0.1mMUTP溶液を0.5mlずつ加えた。(対照としてリンゲル液のみ加えた。)5分間37°Cでincubateの後、エッペンドルフチューブに移し替え-20°Cで冷凍保存しておいた。dishの底面に付着した軟骨細胞数をcountするために0.25%トリプシンを加えた。冷凍したsampleを解凍し、Luciferase Luciferin(40mg/ml)を検体1ml当たり20μlずつ加え、ルミノメーターで放出ATP量を測定した。UTPを加える前に、P2receptor blocker(スラミン)、Cl-channel blocker(Niflumic acid, DIDS)を各々加え、UTP induced ATP releaseの抑制効果をみた。これらの培養期間の違いによる差を検討した。

成体の関節軟骨では半層損傷は治癒しないが、1998年、Nambaらはヒツジの胎児の半層軟骨損傷が治癒することを報告した。そこで我々は、胎児および成体ラットの半層軟骨損傷治癒過程の差異を、c-fos遺伝子の発現に注目して比較検討した。損傷後の関節軟骨におけるc-fos遺伝子発現の時間的変化をRT-PCRによって見てみると、胎児の方が成体に比べ、損傷後のc-fosの発現がより長く継続していることがわかった。すなわち成体では受傷後、発現レベルに変化はないが、胎児では受傷後1時間から発現が上昇し、6時間継続していた。またそのとき、c-fosは損傷周囲の軟骨細胞に局在して発現していることがin situ hybridizationによって明らかになった。よって、成人と比較し、胎児のc-fos遺伝子の発現は胎児の半層軟骨損傷の修復能力に関係している可能性があると考えられた。次に細胞内カルシウム濃度とc-fos遺伝子の発現について、培養軟骨細胞、軟骨片を用いて胎児、成体で検討したところ、c-fos遺伝子の発現は細胞内カルシウム濃度によって調節されており、胎児は成体に比べ、細胞内カルシウム濃度の上昇が顕著であり、かつ細胞内カルシウムの上昇を促すATPに対する感度が高いことがわかった。今後、胎児軟骨修復を追及することで今まで困難とされてきた軟骨損傷の治療の手掛りを得られるのではないかと考える。創傷治癒において、c-fos遺伝子は創傷治癒における早期発現遺伝子であり、治癒過程に重要な役割を担っていると考えられる。そこで我々は、胎児および成体ラットの半層軟骨損傷を作製し、治癒過程の差異を、c-fos遺伝子の発現に注目して比較検討した。胎児においては、損傷後12日で治癒したが、成体では治癒しなかった。また、損傷後の関節軟骨におけるc-fos遺伝子発現の時間的変化をRT-PCRによって見てみると、胎児の方が成体に比べ、損傷後のc-fosの発現がより長く継続していることがわかった。
大脳基底核内の神経伝達物質の機能的意義-眼球運動を指標として

大脳基底核における神経伝達物質に関する最近の研究の発展はめざましい.しかし,これら神経伝達物質が,動物の行動のどのような側面にどのように関与しているかはあきらかでない.これまでのサルをもちい研究で,大脳基底核,とくに尾状核-黒質網様物質-上丘系が,脱抑制によって随意的なサッケードの発現に重要な役割をしていることを報告した.これらの抑制性結合は,ともにGABAを伝達物質としていた.今回は,大脳基底核の眼球運動におけるこのような役割が一般的なものかを調べるために,ラットをもちいて実験をおこなった.サルの場合と同様に,頭部を固定し,サーチコイル法によって眼球運動を記録した.サルにくらべて自発的な眼球運動ははるかに少なく,小さかったが,あきらかなサッケード様の運動を示した.黒質網様部にGABAのagnonistであるmuscimolを微量に注入すると, 1分以内に薬物注入とは反対側に向かうサッケードがおこり始め,その頻度は次第に高くなった.これは,サルでの同様の実験で見られた不随意的サッケードとよく似ていた.されは以下のように解釈することかできる.注入されたmuscimolはGABA receptorが豊富にある黒質網様部ニューロンに結合し,その高い発射活動を抑制する.すると,黒質網様部から上丘への持続的抑制が取り除かれて上丘ニューロンの興奮性が高まり,その結果,反対側へのサッケードの頻度が異常に増加する.しかしサルの場合とは少し異なり, muscimol注入によって眼球運動以外の様々な運動がおこった.頭部,ヒゲ,鼻などは反対側に偏位し,四肢の歩行様運動,そしゃく運動,尾の回転運動がおこった.大きなサッケードは頸部の筋電活動と一致していた.これらの結果から,大脳基底核は多くの運動中枢を持続的に抑制していることが示唆される.そしておそらく眼球運動の場合と同様に,その抑制を取り除くかたちでそれらの運動の発現に関与するのであろう.大脳基底核における神経伝達物質に関する最近の研究の発展はめざましい.しかし,これら神経伝達物質が,動物の行動のどのような側面にどのように関与しているかはあきらかでない.これまでのサルをもちい研究で,大脳基底核,とくに尾状核-黒質網様物質-上丘系が,脱抑制によって随意的なサッケードの発現に重要な役割をしていることを報告した.これらの抑制性結合は,ともにGABAを伝達物質としていた.今回は,大脳基底核の眼球運動におけるこのような役割が一般的なものかを調べるために,ラットをもちいて実験をおこなった.サルの場合と同様に,頭部を固定し,サーチコイル法によって眼球運動を記録した.サルにくらべて自発的な眼球運動ははるかに少なく,小さかったが,あきらかなサッケード様の運動を示した.黒質網様部にGABAのagnonistであるmuscimolを微量に注入すると, 1分以内に薬物注入とは反対側に向かうサッケードがおこり始め,その頻度は次第に高くなった.これは,サルでの同様の実験で見られた不随意的サッケードとよく似ていた.されは以下のように解釈することかできる.注入されたmuscimolはGABA receptorが豊富にある黒質網様部ニューロンに結合し,その高い発射活動を抑制する.すると,黒質網様部から上丘への持続的抑制が取り除かれて上丘ニューロンの興奮性が高まり,その結果,反対側へのサッケードの頻度が異常に増加する.しかしサルの場合とは少し異なり, muscimol注入によって眼球運動以外の様々な運動がおこった.頭部,ヒゲ,鼻などは反対側に偏位し,四肢の歩行様運動,そしゃく運動,尾の回転運動がおこった.大きなサッケードは頸部の筋電活動と一致していた.これらの結果から,大脳基底核は多くの運動中枢を持続的に抑制していることが示唆される.そしておそらく眼球運動の場合と同様に,その抑制を取り除くかたちでそれらの運動の発現に関与するのであろう.
適性試験型の日本語論述課題の開発と項目反応理論による尺度化・得 点等化

本研究では,(1)高等教育における学習意欲や適性,スキルとの相関関係,あるいはそれら自身の間接的な測定までを視野に入れた日本語論述課題の開発を行い(2)客観試験で測定される日本語能力との相関関係および採点者の評定バイアスの除去を考慮に入れた項目反応理論による項目反応データの尺度化の方法を提案した。研究の遂行に際しては,日本留学試験や日本語能力試験に代表されるような得点等化が必要となる年複数回実施の大規模試験における応用・実装可能性が重視された。平成22年度の研究実績について,[1][3]の下位計画ごとに報告を行う。[1]評定データの尺度化に用いる項目反応モデルおよび得点等化法の開発に関しては,ワークステーション等の研究設備・備品を調達するとともに,国内外の文献調査による統計モデルの理論研究を推進した。また,豪州ACERを訪問し,パフォーマンスアセスメントの尺度化における妥当な項目反応モデルについて,研究協力者とのディスカッションを行った。[2]日本留学試験400字記述課題の項目反応理論による試行的尺度化に関しては,採点基準となる評定尺度をより精緻化するために,当初採用する予定であった豪州ACERで用いられているGAMSAT評定尺度に加え,米国TOEFLや英国IELTS,GCSE,GCE等で用いられている論述試験の採点方法に関する情報収集を行った。[3]適性試験型の日本語論述課題の開発に関しては,日本の大学入試で過去に出題された小論文課題を収集する一方で,英国における公的試験GCSE,GCEの日本語科目のサンプル項目を入手し,内容面の検討を行った。また,日本国内の研究協力者とのディスカッションを通して,モニター本試験で用いる修学能力試験CSAT,日本留学試験EJU,日本語能力試験JLPTの既出項目からなる客観試験の構成・版組に関する事前調査に計画を前倒しして着手した。海外モニター試験の実施地に関しては,研究計画の立案段階では韓国のみでの実施を予定していたが,年度中に海外学術機関との積極的な協力関係を樹立し,中国,台湾,香港,韓国,インドネシアでのモニター試験実施に向けて協力者との調整を進めている。平成23年度の研究実績について,[1][3]の下位計画ごとに報告を行う。[1]評定データ用の項目反応モデルおよび得点等化法の研究については,研究協力者との議論を必要に応じて行いながら,多相評定者モデルおよび階層評定者モデルの応用可能性について文献研究および理論研究を進めた。[3]適性試験型の論述課題開発については,日本や海外の大学入試で出題された小論文試験や面接試験の課題英国Cambridge Assessmentで開発・実施されているOxford TSA(Thinking Skills Assessment)の項目などを参考として,平成24年度の海外モニター本試験に投入するための複数の日本語論述課題を準備した。[3]海外モニター試験の実施準備に関しては,韓国外国語大学および釜山外国語大学におけるモニター試験の実施協議に取り掛かり,研究協力者と必要な調整を行った。併せて,中国,台湾,香港,インドネシアの研究協力者ともメールで連絡を取り合いながら,モニター試験の実施可能性を議論した。[3]論述課題と同時に受験してもらう客観試験の組版については,研究代表者の先行研究において項目反応理論による尺度化および等化が行われ,統計的な特性が判明している旧JLPTの上位級および旧EJUの既出問題から構成される項目データベース(文字・語彙,文法,読解領域)より,受験者の言語能力を良く識別する優れた問題項目を60題程度抽出し,日本語能力中上位版を構成した。次いで,日本語能力の比較的低い受験者層向けに下位版を構成した。また,日本語Can-do statements尺度に新規項目を追加してCDS尺度を精緻化した。評定データ用項目反応モデルの研究では,研究協力者との議論を行いながら既存の日本語論述試験のデータ分析結果も考慮して具体的な統計モデルの構築を行い,シミュレーションによるデータ分析を行った。適性試験型の論述課題研究では,研究協力者の助言を受けながら既存の日本語論述試験の分析結果の考察と共に収集した小論文試験の内容分析を行い,高等教育で必要となる適性,スキルとの関連性を課題の内容・形式の両面から考察し,適性試験型の論述課題と評価基準を開発した。論述課題と同時に受験してもらう客観試験の版を確定させ,モニター試験を日本および韓国で行った。客観試験で測定される日本語能力との相関関係,および採点者のバイアス補正を考慮に入れた項目反応理論による評定データの尺度化および得点等化がなされた尺度得点に基づいて,適性試験型の日本語論述課題が測定する言語能力と高等教育における適性,スキルとの相関関係を項目反応理論の枠組に従ってモデル化を行った。各下位研究について概ね計画通りの進行となっており,特段の遅れは発生していないため。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初の研究計画に則って研究を推進する。ただし,可能な範囲でより広範な地域においてモニター試験を実施する。
パーキンソン病原因遺伝子産物によるミトコンドリア維持機構の解明

パーキンソン病原因遺伝子産物であるParkinとPINK1はミトコンドリアの機能維持に関与する。PINK1はParkinをリン酸化することで活性化し、膜電位の低下した不良ミトコンドリアを選択的に除去することが明らかになっている。本研究課題では、PINK1とParkinが分解シグナルであるリン酸化ポリユビキチン鎖を増幅する役割があることを明らかにした。また、患者由来iPSドパミン神経細胞においてこのシステムが破綻していることを示し、発症機構に関与することを示唆した。本研究は、パーキンソン病原因遺伝子産物であるPINK1およびParkinが、どのように不良ミトコンドリアを認識・除去するか解明することで、パーキンソン病の治療・予防への応用につなげることを目的とした。PINK1, Parkinシグナル伝達の最大の謎は、PINK1のキナーゼ活性依存的にParkinが細胞質からミトコンドリアへ移行する分子メカニズムである。この分子メカニズムを解明するために、まずPINK1のキナーゼ基質を探索した。その結果、ユビキチンを同定し、in vitroにおいて、モノユビキチン・ポリユビキチン共にPINK1の基質であることを示した。また、Parkinはリン酸化ポリユビキチン鎖に高い親和性をもつことを明らかにした。そこで、ミトコンドリア上にリン酸化模倣型ポリユビキチン鎖を発現させると、Parkinが細胞質からミトコンドリアへと移行し、そのユビキチンリガーゼ活性が活性化されることを見出した。以上の知見から、PINK1がリン酸化したミトコンドリア上のポリユビキチン鎖に、Parkinが結合・活性化し、効率よく不良ミトコンドリアを認識するメカニズムを解明した。次に、ミトコンドリア変性がみられるPINK1ノックアウトショウジョウバエの筋肉ミトコンドリア上にリン酸化ポリユビキチン鎖の模倣体を発現させることにより、筋肉ミトコンドリアの変性を抑制できることを示した。これは、リン酸化ポリユビキチン鎖の模倣体が内在性のParkinをミトコンドリアへ呼び寄せ、活性化させるためであると考えられ、パーキンソン病予防のヒントとなるアイデアを提示することができた。昨年度、我々はPINK1によるユビキチン(鎖)とParkinのリン酸化が、ParkinのE3リガーゼ活性の活性化とその後のマイトファジーの誘導に必須であることを報告した。今年度は、これらのカスケードに関与する新規分子を同定するために、リン酸化ポリユビキチン鎖に結合する分子群のスクリーニングをiTRAQプロテオーム法を用いて行った。二次スクリーニングとして、PINK1-Parkin介在性マイトファジーを検出できる細胞株を用いて、候補因子のノックダウンがマイトファジーに影響を及ぼすかどうかを検討した。その結果、3つの新規候補因子を同定した。さらに、これらの因子がどのような分子メカニズムでPINK1-Parkinシグナル伝達に関与するかを詳細に解析するためにノックアウト細胞を作製し、現在、解析を進めている。また、ショウジョウバエを用いたin vivoスクリーニングも行い、PINK1-Parkinシグナル伝達に関与する遺伝子を含む遺伝子群欠失ショウジョウバエを数ラインに絞り込んだ。上記のスクリーニングによって同定された遺伝子は、PINK1-Parkinシグナル伝達に関与する可能性が高く、PINK1とParkinに連鎖するパーキンソン病発症機構をさらに解明することが期待でき、これらの情報は創薬の分野においても貢献すると考えられる。また、iPS、剖検脳などのパーキンソン病患者由来のサンプルにおいて、PINK1キナーゼ活性の基質であるリン酸化ユビキチンがどのように発現分布するかを解析した。結果、Parkin連鎖患者サンプルにおいてリン酸化ユビキチンの発現はほとんど観察されず、PINK1-Parkinシグナル伝達の破綻がパーキンソン病を引き起こすことが強く示唆された。当初の研究計画に基づいて順調に進行している。本研究では、PINK1-Parkin依存的に形成されるリン酸化ユビキチン鎖に結合する新規分子を同定し、その役割を解明することで、PINK1-Parkinが関与するマイトファジーの理解を深めるとともに、新規分子の障害がPD発症の要因となるかどうかを明らかにすることを目的とした。in vitroスクリーニングにおいては、リン酸化ユビキチン鎖に結合する2つの新規分子: PPBP1、PPBP2(Phosphorylated Polyubiquitin-Binding Protein)を同定した。PPBP1に関しては、培養細胞においてミトコンドリア膜電位低下に伴いミトコンドリアへ移行すること、また、PPBP1ノックアウト細胞群において、コントロール細胞群と比較しPINK1-Parkinシグナルに関与するオートファジーレセプター群の活性化を負に制御することを明らかにした。さらに、iPS由来TH陽性神経細胞においてもPPBP1の高い発現量と、PINK1-Parkinシグナル伝達依存的な発現量の低下を示したことから、PPBP1がドパミン神経におけるPINK1-Parkinシグナル伝達に関与する可能性を示唆した。また、部分欠失ショウジョウバエライブラリーを用いたin vivoスクリーニングにおいては、PINK1-Parkinシグナル伝達に関与する遺伝子を含む領域を複数同定した。本年度は、PPBP1がPINK1-Parkinシグナル伝達に関与することを明らかにし、現在、ショウジョウバエを用いたin vivo解析も進めている。また、患者由来のiPS由来TH陽性神経細胞においてもPPBP1がこのシグナル伝達に関与することを確認しており、PARK2、PARK6に連鎖するパーキンソン病発症機構への関与を示唆している。また、ヒト患者サンプルを用いたリン酸化ユビキチン鎖の発現分布についての論文を投稿している。以上の結果より、おおむね順調に進展していると判断した。

本研究課題では、PINK1-Parkinマイトファジーに関与する新規分子を同定し、その分子メカニズムを明らかにすることを目的とした。まず、PINK1のリン酸化基質としてユビキチンを同定した。PINK1-Parkin依存的に形成されたリン酸化ポリユビキチン鎖は、膜電位の低下した不良ミトコンドリアの目印となる。PINK1とParkinは、このリン酸化ユビキチン鎖の増幅機構に必須であり、速やかに不良ミトコンドリアを除去する役割を持つことを明らかにした。さらに、ショウジョウバエを用いて、生体内においてもリン酸化ポリユビキチン鎖を介してPINK1とParkinが正常なミトコンドリアの機能維持に必要であることを示した。また、ヒト患者由来iPSドパミン神経細胞ではPINK1-Parkinマイトファジーが起こらないこと、ミトコンドリア膜電位低下させる薬剤を処理すると軸索内のミトコンドリア輸送に異常が生じることを明らかにした。これらの結果は、不良ミトコンドリアの排除不全や軸索内のミトコンドリア輸送機構の異常がPINK1とParkinに連鎖するパーキンソン病発症メカニズムに関与することを強く示唆している。さらに、ショウジョウバエの遺伝学的相互作用を利用したスクリーニングを行っており、PINK1-Parkinマイトファジーに関与する遺伝子領域を絞っている。今後、単一の遺伝子を同定し、解析を進めていく予定である。以上の結果から、PINK1、Parkinに連鎖するパーキンソン病発症機構の一部を解明できたと考えられ、さらなる発症メカニズムの解明・創薬分野に貢献できることを期待したい。パーキンソン病原因遺伝子産物であるParkinとPINK1はミトコンドリアの機能維持に関与する。PINK1はParkinをリン酸化することで活性化し、膜電位の低下した不良ミトコンドリアを選択的に除去することが明らかになっている。本研究課題では、PINK1とParkinが分解シグナルであるリン酸化ポリユビキチン鎖を増幅する役割があることを明らかにした。また、患者由来iPSドパミン神経細胞においてこのシステムが破綻していることを示し、発症機構に関与することを示唆した。本年度は、PINK1のキナーゼ基質としてリン酸化ポリユビキチン鎖を同定し、さらにその役割を報告できた。また、関連する論文(PINK1によるParkinリン酸化の個体レベルでの意義、およびLys63にリンクするポリユビキチン鎖のPINK1-Parkinが介するマイトファジーにおける役割)を2報報告でき、達成度は順調に進展しているといえる。今後も研究計画通り遂行し、来年度までに研究成果としてまとめられるように進めていきたい。また、患者由来のサンプルを用いて、より信憑性のある成果を出していく予定である。
高等植物のガンマーグルタミルトランスフェラーゼとグルタチオン類の異化

(1)ダイコン子葉のプロトプラストから液胞等を調製して可溶性GGT(ガンマーグルタミルトランスフェラーゼ)活性を検討すると、GGTの大部分が液胞に局在することが判明した。そこでGSHをin vivo蛍光標識法で、アシビシン(GGT阻害剤)の影響を検討したところ、GGTがGSHや抱合体(GSX)の異化に関与していることが示された。(2)ダイコンのヘテロダイマー型GGTをコードすると推定される3種類のcDNA(RsGGT-1,2,3)で形質添加したタバコを得た。RsGGT-1と2で形質転換したタバコでは結合型GGT活性が2.516倍活性が上昇した。可溶型GGTは変化しなかった。しかしRsGGT-3による形質転換体は活性の上昇は全く観察されなかった。(3)シロイヌナズナのGGT(AtGGT1、AtGGT2、AtGGT3)の変異株では正常なmRNAの蓄積が認められなかった。AtGGT1は多くの器官で構成的な発現し、変異株では葉やさやで結合型GGT活性が失われていた。AtGGT2は花やさやで部位特異的に発現がみられ、AtGGT2変異株ではさやにおける可溶型GGT活性が減少していた。従ってAtGGT1は植物体における主要な結合型GGTを、AtGGT2は生殖器官で発現する可溶型GGTをコードしていると結論した。これらの結果とAtGGT3は構成的な発現を示したことから考察すると、AtGGT3は主要な可溶型GGTをコードしていると推定できる。しかしAtGGT3変異株のGGT活性は変化していなかった。AtGGT1が結合型GGTであったことは、ダイコンの精製結合型GGTがモノマーであったことと異なっているが、今後の課題である。RsGGT-1,2,3とAtGGT1,2,3はその配列から考えると対応すると考えられるが、機能や局在性についての対応は認められない。今後の検討を要する。今後の検討を要する。1.ダイコン子葉のプロトプラストから液胞等を調製して可溶性GGT(γ-グルタミルトランスフェラーゼ)の細胞内局在性を検討すると、GGTの大部分が液胞に局在することが判明した。そこでGSHをin vivo蛍光標識する方法で、GSHの異化に対するアシビシン(GGT阻害剤)の影響を検討したところ、GGTがGSHや抱合体(GSX)の異化に関与していることが示された。GSXは細胞質で生成後、液胞に輸送され、本研究ではじめて液胞局在性が確認されたGGTによって異化する系が提唱される。2.ダイコンの結合型GGTのcDNAのクローニングおよびシロイヌナズナの推定cDNAを酵母で発現させようとしたが、発現に成功していない。またシロイヌナズナのcDNAでタバコの形質転換を試みたが、得られたタバコからは相当するDNAが検出されなかった。3.ダイコンのヘテロダイマー型GGTをコードすると推定される3種類のcDNA(RsGGT-1,2,3)で形質添加したタバコを得た。

4.AtGGT-1,2,3が破壊されたシロイヌナズナの変異株を入手し、解析した。これらの破壊変異株はいずれも予想されたGGTの遺伝子が破壊されており、トランスクリプトも検出されなかった。AtGGT-1では結合型GGT活性が失われていたが、AtGGT-2では可溶型酵素活性が減少していた。またAtGGT-3株の酵素活性は変化していなかった。AtGGT-1株と野生株のロゼット葉中のGSH量には差がなかったが、GSH合成阻害剤であるBSOを投与すると、AtGGT-1変異株のGSH量は野生株に比べて多く、また変異株のシステイン量は少なかった。1.ダイコンのヘテロダイマー型GGT(RsGGT1,2,3)で形質転換したタバコを用いて100μMの銅イオンを含む培地上で発芽・生育試験をおこなったが、発芽率および生育にほとんど差は認められなかった。2.シロイヌナズナのGGT(AtGGT1、AtGGT2、AtGGT3)の変異株を入手し、さらに細かく検討した。これらの変異株では正常なmRNAの蓄積が認められなかった。AtGGT1は多くの器官で構成的な発現し、葉で結合がGGT活性が失われていたのでさらにさやでも検討したところやはり結合型GGT活性が失われていた。AtGGT2は花やさやで部位特異的に発現がみられ、atggt2変異株ではさやにおける可溶型GGT活性が減少していた。従って、AtGGT1は植物体における主要な結合型GGTを、AtGGT2は生殖器官で発現する可溶型GGTをコードしていると結論した。これらの結果とAtGGT3は構成的な発現を示したことから考察すると、AtGGT3は主要な可溶型GGTをコードしていると推定できる。しかし、atggt3変異株のGGT活性は変化していなかった。AtGGT1が主要な結合型GGTであったことは、ダイコンの精製結合型GGTがモノマーであったことと異なっているが、今後の検討が必要である。またGSHの定量結果も合わせ考えるとAtGGT1はアポプラストでGSH異化に関与していること、アポプラストでのGSH異化は恒常性の維持に寄与していることが示唆された。3.シロイヌナズナの二重変異株についてはまだ二重変異数を得ておらず、作成を継続中である。
1930・40年代日本の露店商集団に関する実証的研究

本研究では、露店商集団研究を、歴史学、特に日本近現代史研究の観点から推進し、新たな視座を構築するための具体的な試みとして、1930年代から40年代にかけての露店商業界紙『関西侠商新聞』・『小商人』・『日本商人』からの情報抽出・整理に基づくデータベース構築と、これに基づく露店商集団の研究を課題とした。最終年度である2018年度には、上記の『関西侠商新聞』1930年1月18日付の1号から1931年1月1日付の12号、『小商人』1931年10月15日付の1号から1937年7月15日付の67号(但し4、52、55、64、65号は欠号)、『日本商人』311号、314号、320号、321号を整理し、そこに掲載された露店商の広告約7000件について、氏名、屋号、業種、住所所在地などの情報を可能な限り抽出し、データベースの基礎となる資料を作成した。また上記の露店商業界紙の分析から得られた知見を生かして昨年度刊行した拙著『近現代日本の都市形成と「デモクラシー」』をふまえ、露店商に関する情報を豊富化するための情報収集や史料調査・収集をおこなった。さらに、上記の1930・40年代の露店商業界紙の分析をふまえ、戦後の露店商集団の在り方に視野を及ぼした内容について、2018年10月28日の部落問題研究所の部落問題研究者全国集会分科会歴史IIにおいて、「占領期大都市近郊都市における「デモクラシー」と地域ー東京都八王子市を事例にー」と題する報告を行った。1、1930・40年代日本の露店商集団に関する情報の豊富化のための基礎調査:2016度は、1930・40年代日本の露店商集団に関する情報の豊富化のため、国立国会図書館や首都大学東京附属図書館等で歴史資料の調査を行なった。また本研究の対象とする時期の前後にあたる近世や現代における関連する社会集団についての研究文献を収集し、本研究で取り扱う露店商集団を歴史的に位置づけるための基礎調査を進めた。2、露店商業界紙の分析に基づく1930・40年代日本の露店商集団の具体相の解明:上記1で得られた知見をふまえつつ、1930年代から40年代にかけて滋賀県、のちに京都府で発行されていた露店商業界紙『関西侠商新聞』・『小商人』・『日本商人』のうち、特に1930年代前期に関する部分の分析に着手し、当該期の露店商集団の具体相を解明するための実証研究を開始した。その現段階での成果については、研究報告「1930年代日本の露店商集団ー「移動する弱者」という観点から」(部落問題研究所歴史研究会、部落問題研究所)において発表をおこなった。本研究報告については、2017年度中に原稿化することを予定している。また研究課題に関連する研究報告として、「20世紀前期日本の地域政治・社会の変容と「国家」イメージ」(占領戦後史研究会、二松学舎大学)をおこない、本研究が対象とする1930・40年代日本の露店商集団を含む20世紀前期の都市下層の動向をより広い歴史的文脈に位置付ける視座についても検討をおこなった。2016年度に実施を計画していた一方の課題であった「関係歴史資料の分析を通じた1930・40年代露店商集団に関する情報の豊富化と具体相解明」については、一定の進展を見たが、もう一方の課題であった「露店商業界紙『関西侠商新聞』・『小商人』・『日本商人』からの情報抽出・データベース作成」については、当初予定していた研究補助者への依頼が困難になったため、十分に実施することができなかった。1.露店商業界紙『関西侠商新聞』・『小商人』・『日本商人』からの情報抽出・データベース作成:前年度(2016年度)に予定していたものの、研究補助者への依頼が困難となり実施が出来なかった1930・40年代日本の露店商業界機関紙『関西侠商新聞』・『小商人』・『小売商人』所載の露店商集団に関する情報の抽出・データベース化について、新たな研究補助者を確保し実施体制を構築した上で、1930・40年代日本の露店商集団に関する情報豊富化のための基礎情報の集積を進めた。2.1930・40年代日本の露店商集団に関する情報豊富化のための調査:2017年度には、上記1の作業等で得られた露店商集団に関する情報を踏まえ、「ふるさと府中歴史館」(東京都府中市)や「神戸市立中央図書館」(兵庫県神戸市)で、露店商集団に関する資料調査を実施した。そのほか関連する研究文献を検討し、当該期の露店商集団の社会的特質を把握するための調査を進めた。3.露店商業界紙の分析に基づく1930・40年代日本の露店商集団の具体相の解明:上記1で得られた知見をふまえ、1930・40年代の露店商集団の具体相について、上記の露店商業界紙『関西侠商新聞』・『小商人』・『小売商人』や、当該期の関連諸史料に即して検討を行い、その成果に基づいて1930・40年代の東京府八王子市における露店商集団の社会的動向を解明し、拙著『近現代日本の都市形成と「デモクラシー」ー20世紀前期/八王子市から考える』の第八章に書き下ろし、発表した。