hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
PD-1阻害免疫賦活ナノ粒子と電磁加温を用いた食道癌に対する樹状細胞療法の開発

(3)抗腫瘍効果の増強のメカニズムを科学的な裏付けを示す。現在まで(1)Lip-PD-1の確立、EPR効果の検証および免疫賦活能の評価を主に行ってきた。まず、PD-1抗体を包埋するリポソームの作成を行った。これは過去に研究室で作成したリポソームと同様の作成技術で作成した。このリポソームの生体内での動態を評価するため、リポソームにICGをマーカーとして付着させ、腫瘍を移植したマウスSCCVIIに上記リポソームを静脈内投与し蛍光カメラにてその動態を観察した。その結果、腫瘍に選択的にリポソームが集積していることが確認できた。一方、免疫賦活効果であるが、前述のEPR効果で腫瘍に集積した部位に赤外線を用いた温熱療法を加えることでCTL分画の増加が確認され、同様に免疫賦活効果を認めた。本研究ではLip-PD-1の確立、EPR効果の検証および免疫賦活能の評価、Lip-PD-1による温熱療法と樹状細胞腫瘍内局注免疫療法の増強効果についての検討、抗腫瘍効果の増強のメカニズムを科学的な裏付けを示すこと、PD-1の血中タンパク濃度と食道癌悪性度評価および予後との関連性をを統計学的に検討することである。我々は食道癌の免疫逃避機構の一つとして、PD-1およびそのリガンドであるPD-L1、PD-L2の血中濃度を測定し、食道癌の進行とともにこれらのタンパクレベルがどのように変化するかを検討し、PD-1関連タンパクのバイオマーカーとしての可能性について考察した。対象は当科を受診した新規食道癌症例86例。これらの症例の治療前の血漿を用い、ELISA法にて血中のPD-1、PD-L1、PD-L2タンパクを測定し腫瘍の進展度との相関を検討した。深達度別の濃度(T1/T2/T3/T4):PD-1(44。3/39。2/38。7/58。1 pg/ml)、PD-L1(12。9/16。0/15。2/16。0 pg/ml)、PD-L2(182。8/183。5/221。0/240。0 pg/ml)であり、PD-L2がもっとも深達度と相関しており、深達度が深いほど血中PD-L2濃度は高かった。また、リンパ節転移個数別の濃度(0個/ 1-3個/3-6個/7個以上):PD-1(38。0/57。8/46。2/48。8 pg/ml)、PD-L1(13。0/16。9/14。2/15。9 pg/ml)、PD-L2(182。1/211。4/219。5/231。0 pg/ml)であり、リンパ節転移個数に関してもPD-L2が最も相関しており、リンパ節転移個数が多いほどPD-L2濃度は高かった。以上をまとめると、PD-1関連タンパクのうち、PD-L2が腫瘍の進展ともっとも相関があった。また、腫瘍の進展に伴い血中PD-L2タンパク濃度も上昇しており、病勢のマーカーとなる可能性がある。一方で、PD-L2タンパクは、食道癌の免疫逃避状態のサロゲートマーカーとして機能している可能性が示唆された。今後、さらに計画を進めてゆく。(1)Lip-PD-1の確立、EPR効果の検証および免疫賦活能の評価:LiposomeにPD-1/PD-L1/PD-L2抗体を封入したLip-PD-1の製造手法を安定化させ、in vivoの担癌マウスモデルにおけるLip-PD-1のEPR効果を確認する。また封入抗体を単独とした場合、複数抗体のMixtureとしカクテル化した場合等抗体組成別の免疫誘導能を定量化する。(2)Lip-PD-1による温熱療法と樹状細胞腫瘍内局注免疫療法の増強効果についての検討:第二のステップとしてLipo-PD-1と温熱療法の併用、Lipo-PD-1と樹状細胞腫瘍内局注免疫療法の相乗効果をin vitro, in vivoにおいて確認する。
薬物体内動態に影響を与える因子として、有機アニオン系薬物の排泄に関与するトランスポーター、特に血管側膜取り込みトランスポーターOATP2/SLC21A6、胆管側膜排泄トランスポーター多剤耐性関連蛋白2(MRP2/ABCC2)に着目した検討を進めた。OATP2に関しては、東洋人において発現される遺伝的多型変異体機能を解析するために、HEK293細胞安定発現株を作成し、数種類のリガンドを用いた検討を進めた。その結果、東洋人で比較的高頻度で生じる遺伝的多型変異は、輸送速度論パラメーターに変動をもたらすという検討結果を得ることができた。MRP2に関しては、部位突然変異により作成した変異体の機能解析を進め、基質輸送に必須なアミノ酸残基を示唆することができた。さらに、東洋人においてMRP2の新規な変異を見出すことができたほか、日本人の臨床癌より確立した細胞株を用いた解析を進め、種々の変異を見出すことに成功を修め、また一部変異がリンクする場合があることを見出した。一方、OATP2およびMRP2を共発現するMDCK極性細胞を用い、その経細胞輸送、取り込み過程、排泄過程について詳細な速度論的検討を加えた。その結果、本in vitro実験系にOATP2/MRP2の変異体を発現させ、wild typeとの比較検討を行うことにより、変異を有するヒトにおけるin vivoでの動態を予測しうることが示唆された。薬物の排泄能力の個人差は、薬物体内動態、ひいては薬理効果の個人差の原因となる。このうち、臨床上重要な薬物を含む、いくつかの有機アニオン系化合物は、肝細胞膜血管側膜上に発現されるhumanorganic anion transporting polypeptide 2(OATP2)により肝臓に取り込まれ、multidrug resistance associated protein 2(MRP2)により胆汁中へと排泄される。本研究では、OATP2およびMRP2に遺伝的多型の存在を解析し、これらの多型により胆汁排泄能力がどの程度影響を受けるかについて検討を加えている。健常人より得られた血液より白血球分画を採取し、DNAを抽出した。さらに、exon/intron配列を考慮したprimerを作成し、PCR産物の配列を決定することにより、変異の同定を行った。東洋人を用いた解析結果、現在までOATP2に観察されるSNPsを見出すことができた。現在、HEK細胞を用いた発現系を作成することにより、変異体の機能解析を進めている。また、同様に、MRP2に関しても高頻度で観察される変異を検出することができた。MRP2に関しては、変異体の機能を検出するため、組換え型baculovirusを作成し、感染させたSf9細胞より膜ベシクルを調製することにより、その機能を解析する方法論を確立した。さらに、膜貫通ドメインに存在する、荷電性アミノ酸が、基質の認識、輸送に重要な役割を果たすことを示すことができた。肝臓における有機アニオン系薬物の排泄における個人差に特に注目し、血管側膜取り込みトランスポーターOATP2/SLC21A6、胆管側膜排泄トランスポーターの多剤耐性関連蛋白2(MRP2/ABCC2)の機能個人差が生じる要因をin vitro系により検討を加えた。OATP2については、東洋人において発現される遺伝的多型変異体機能を解析するために、HEK293細胞安定発現株を作成し、数種類のリガンドを用いた検討を進めた。その結果、東洋人で比較的高頻度で生じる遺伝的多型変異は、輸送速度論パラメーターに変動をもたらすという予備検討結果を得ることができた。また、MRP2に関しても、東洋人における変異について検討を加え、新規な変異を見出すことができた。さらに、日本人の臨床癌サンプルより確立した細胞株を用いた解析を進め、種々の変異を見出すことに成功を修めたほか、変異がリンクする場合があることを見出した。一方、これらのMRP2変異体の機能のみをin vitro実験によって決定しても、in vivoにおける胆汁排泄能力の定量的評価は困難である。そこで、OATP2およびMRP2を共発現するMDCK極性細胞を用い、その経細胞輸送、取り込み過程、排泄過程について詳細な速度論解析を加えた。
アルカリ土類充填スクッテルダイト化合物の熱電機能開拓

希土類充填スクッテルダイトRT_4X_<12>(R:希土類、T : Fe, Ru, Os)は、多彩な物性を示す。これまで主に、三価のRイオンの持つ4f電子が物性に及ぼす効果が研究されてきた。しかし、遷移金属Tの持つd電子の寄与は不明である。そこで本研究では、非磁性で二価のアルカリ土類金属Aを充填したAT_4Sb_<12>(A=Ca, Sr, Ba)の多結晶試料を作製し、磁性、伝導、熱物性の測定により、Feの3d、Ruの4d、Osの5d電子の寄与を比較した。上記の諸物性の測定と、^<123>Sb-NQR実験により、AFe_4Sb_<12>が強磁性に近い金属であることが分かった。これらのRu化合物は反磁性を示すことから、Ruの4dバンドは磁気モーメントを持たないことが分かった。磁化率測定から、AOs_4Sb_<12>が増強された常磁性体であることが分かった。一方、熱伝導率は、T=Fe, Ruの場合に観測された極大を示さない。これは、Sbの作る20面体中にあるAイオンが、複数のポテンシャル極小間をトンネリングし、音響フォノンと強く相互作用しているためである。また、電気抵抗率に肩が出現するのは、Aイオンのトンネリングに起因する、強い電子-格子相互作用が存在するためであることを明らかにした。AFe_4Sb_<12>のFeサイトを、3d電子の1個多いCoで置換し、磁性と熱電物性の変化を調べた。xの増加に従いフェルミ準位での状態密度が急減し、x=0の強磁性に近い状態から、x【greater than or equal】2.5では反磁性へ変化した。また、x【greater than or equal】2.5では、充填スクッテルダイトではあまり報告例のない、n型伝導を示した。希土類充填スクッテルダイトRT_4X_<12>(R:希土類、T:Fe, Ru, Os)は、多彩な物性を示す。これまで主に、三価のRイオンの持つ4f電子が物性に及ぼす効果が研究されてきたが、Tの持つd電子の寄与は不明である。また、約50K以下で10^<-3>μ_B/Fe程度の小さな残留磁化を観測した。この原因を微視的に調べるため、ミュオンスピン緩和実験を行った結果、試料中の体積分率にして高々20%のみが弱い強磁性状態にあることが分かった。不均一な弱強磁性の原因として、結晶格子の不均一歪みによる、バンド構造の変化を提案した。比熱測定から求めた電子比熱係数の比較によって、Osの5dバンドは、AFe_4Sb_<12>のFe-3dバンドと、ARu_4Sb_<12>のRu-4dバンドとの中間のエネルギーを持つことが分かった。これは、Sbの作る20面体中にあるAイオンが、複数のポテンシャル極小間をトンネリングし、音響フォノンと強く相互作用していることを示唆する。xの増加に従いフェルミ準位での状態密度が減少し、x=0の強磁性に近い状態から、x【greater than or equal】2.5では反磁性へ変化した。

一方、熱伝導率は、T=Fe, Ruの場合に観測された極大を示さない。これは、Sbの作る20面体中にあるAイオンが、複数のポテンシャル極小間をトンネリングし、音響フォノンと強く相互作用しているためである。また、電気抵抗率に肩が出現するのは、Aイオンのトンネリングに起因する、強い電子-格子相互作用が存在するためであることを明らかにした。AFe_4Sb_<12>のFeサイトを、3d電子の1個多いCoで置換し、磁性と熱電物性の変化を調べた。xの増加に従いフェルミ準位での状態密度が急減し、x=0の強磁性に近い状態から、x【greater than or equal】2.5では反磁性へ変化した。また、x【greater than or equal】2.5では、充填スクッテルダイトではあまり報告例のない、n型伝導を示した。
咀嚼能力とストレス

本研究の目的は良く噛めることがストレスを軽減する効果があるかを調べることにある。健常成人19名を被験者として選択し、実験的ストレスとして約30分間計算作業を行わせた。テスト前後とテスト終了10分後に唾液の採取を行い、唾液ストレスマーカーであるクロモグラニンA(CgA)の定量評価を行った。実験はテスト後にガム咀嚼有り、無しの条件で繰り返して行い、唾液CgAの比較を行った。また各被験者の咀嚼能力を咀嚼能力判定用ガムを用いて測定した。ガム咀嚼を行った条件ではガム咀嚼無しの条件に比較してCgA値に有意な低下が認められた。ガム咀嚼前後のCgA値の変化量と、各被験者の咀嚼能力の間に有意な相関が認められた。咀嚼能力が実験的な環境で与えられた急性ストレスに及ぼす影響を調査する目的として健常成人被験者を対象として以下の研究を行った。内田クレペリンテストを実験的ストレスとして用い、テスト前とテスト直後並びにテスト終了10分後に、唾液の採取を行い、唾液中に含まれるストレスマーカーの一種であるクロモグラニンA(CgA)の定量分析を行った。実験はクレペリンテストテスト終了後、安静を務めた条件と、ガム咀嚼を3分間行う条件の二回を繰り返して行い、それぞれの条件でCgA値の変化を比較した。また各被験者の咀嚼能力を咀嚼能力判定用色変わりガムを用いて数値的に評価した。この結果、内田クレペリンテストによるストレス負荷後のCgA値は、ガム咀嚼を行った条件では有意に減少することが明らかとなった。一方ガム咀嚼を行わず安静を務めた条件ではテスト終了直後と10分後のCgA値に明確な変化は認められなかった。またガム咀嚼前後のCgA値の変化量と、咀嚼能力の間に有意な相関が認められた。この結果は、咀嚼能力が高く良く噛める被験者ほど、より効果的なストレス緩和効果がガム咀嚼により得られることを示していると考えられた。本研究課題では「噛むこと」によるストレスに対する効果を調査する目的で,実験的なストレス負荷後の唾液ストレスマーカーの測定を行った.以下に本年度に行った研究の概要を示す.顎機能に異常のない健常成人被験者8名を対象として選択した.各被験者には実験的ストレスとして約30分間単純な計算作業を繰り返す内田クレペリンテストを実施し,テスト終了直後と10分経過後に唾液の採取と分析を行った.唾液中のストレスマーカーはαアミラーゼ(Amy)とクロモグラニンA(CgA)を対象とし,Amyの分析は唾液アミラーゼモニター(NIPRO社製)を,CgAはELISA法を用いて行った.またテストによってもたらされた急性ストレスに対する咀嚼の効果を評価する目的で,テスト後に3分間無味無臭のガムを咀嚼した場合と,安静に努めた場合の,二つの条件でストレスマーカーの変化を比較した.さらにガム咀嚼時の咀嚼筋活動量を咬筋の表面EMGにより測定した.解析の結果,テスト終了10分後のストレスマーカーの値は安静条件では上昇し,ガム咀嚼を行った条件では低下する傾向が認められた.また二つの条件でAmyの変化を比較すると活性値の変化量の差分と咀嚼時の筋活動量との間に弱い正の相関が認められた.この結果によって咀嚼によってストレスは軽減し得るが,その効果を得るためには強くしっかりと噛むことが必要であることが明らかとなった.本研究の成果の一部は平成24年度(社)日本補綴歯科学会中国四国・九州支部合同学術大会において報告を行った.目的:本研究の目的は噛むことによるストレスに対する効果を評価するとともに、良く噛めることがその効果に関係するかを調査することにある。方法:歯科的な異常のない健常成人19名を被験者として選択した。各被験者には実験的ストレスとして約30分間単純な計算作業を繰り返す内田クレペリンテストを実施し、テスト終了直後と10分経過後に唾液の採取を行った。採取した唾液試料は凍結保存の後にELISA法を用いて分析し、クロモグラニンA(CgA)の定量測定を行いストレスの指標とした。

またテストによる急性ストレスに対する咀嚼の効果を評価する目的で、テスト後に3分間無味無臭のガムを咀嚼した場合と、安静に努めた場合の二つの条件でCgAの変化を比較した。咀嚼はリズム信号に従って自由に行うように指示し、咀嚼時の筋活動量を評価するために咬筋の表面EMG測定を行った。また各被験者の咀嚼能力を、咀嚼能力判定用ガムを用いて評価した。結果:ガム咀嚼を行った条件ではテスト終了直後に比較し10分後のCgA値は有意に低下していたが安静を務めた条件では変化を認めなかった。被験者の内、ガム咀嚼後にCgAの低下を認めた12名と、それ以外の7名で咀嚼時の咬筋EMGと咀嚼能力を比較すると、咬筋の活動量には差が認められなかったが、咀嚼能力についてはCgA低下群において有意に高い値が認められた。またガム咀嚼前後のCgAの変化量と咀嚼能力の間には有意な負の相関が認められた。考察:この研究の結果はCgA値を指標とした場合、ガム咀嚼は実験的急性ストレスを軽減する効果を持ち得るが、その効果を得るためには、咀嚼能力が高く良く噛めることが有利であることを示している。歯科補綴学本年度の結果より本研究課題の目的である「噛みやすさ」や「良く噛めること」が咀嚼によるストレス緩和効果に与える影響を明らかにすることができた。本研究の成果の一部は、現在査読のある欧文誌に投稿中である。少数例ではあるが実験的に負荷した急性ストレス反応に対して咀嚼することによる緩和効果を確かめることができた。しかしストレスを評価する指標として用いた唾液ストレスマーカーの計測値のバラツキが予想以上に大きかったため、統計的に咀嚼強さとストレス緩和効果の相関を明確にするために被験者数が充分ではなかった。健常者の測定に引き続いて、咀嚼機能に障害をもつ被験者群を対象にして歯科治療による咬合機能の回復がストレスに及ぼす影響について調査を行うよう予定している。また噛みしめ習癖やブラキシズムを伴う顎機能障害を対象とすることで、パラファンクションとストレスと関係についても検討を行い、噛むこととストレスの相互関係の総合的な検証を行いたいと考えている。1.本年度に行った実験プロトコールを踏襲し被験者数を追加し、本研究計画の第一段階として、咀嚼によるストレス緩和効果を明らかにする。ついで各被験者の咀嚼能力を咀嚼力判定用ガムや、咬頭嵌合位の咬合接触を分析することによって咀嚼能力を数値化する。これらの結果を踏まえて踏まえた上で、「噛みやすさ」や「良く噛めること」がストレス緩和にどのように影響するかを調査する。2.健常者の測定に引き続いて、歯科治療による咬合機能の回復がストレスに与える影響について検討を行う。ついで欠損補綴の必要な患者群を対象として治療前後において同様の測定を行い、咀嚼能力の回復がストレスに及ぼす影響について調査を行う。また噛みしめ習癖やブラキシズムをともなう顎機能障害を持つ症例を対象とすることで、ストレスとパラファンクションの関係について検証を行う。該当年度における使用状況は、ほぼ計画通りであったが初年度からの繰越金があったため次年度使用額が生じた。研究成果発表のための海外旅費としての使用を予定している。唾液ストレスマーカーであるクロモグラニンAのELISA分析用の測定キットや、唾液アミラーゼモニター用測定チップ、ディスポーザブル電極などの実験用消耗品を購入する他、研究協力者への謝金と、研究打合せ並びに成果発表のための旅費として使用する。次年度への繰越額はELISA分析に用いるピペットチップ等の消耗品に使用予定である。
アルカリハライド結晶中に埋め込まれた酸化亜鉛微粒子の光強励起効果

本研究は、アルカリハライド結晶中に埋め込まれた酸化亜鉛微粒子における励起子発光帯の光強励起効果について行ったものである。酸化亜鉛(ZnO)の励起子発光帯は紫外光領域の発光素子への応用が期待されている。特に紫外領域での固体レーザー発振素子としての期待が大きい。我々は、2枚の石英板を重ねてできたミクロンサイズの隙間にZnO粉末を混ぜたアルカリハライド融液を導入し冷却固化させて作製した試料を開発してきた。昨年度までの研究で、我々の試料においても励起強度の増大に伴いM発光帯が現れることを確認した。M発光帯は励起子分子が励起子と光とに解離することによって現れる発光帯であり、その強度は励起光強度の増大に対して急激に増大する。今年度はM発光帯を利用したレーザー発振を目指して以下のような実験を行った。直線状の光を試料面に垂直に照射して、その直線に沿い、なおかつ試料面に平行な方向からの発光強度を測定した。照射光の長さに対する発光強度の変化からM発光帯の利得係数を得ることができた。その結果、励起光強度の増大とともに利得が増大するがわかり、レーザー発振可能と判断した。そこでレーザー発振を実現させるため、試料の片面の石英板表面に金を蒸着し、反対面から励起して発光強度を測定した。我々の試料は平行度が非常によいため、蒸着した金を反射面することで試料自身が光キャビティを形成すると考えられる。励起強度の増大とともに特徴的な構造を持つスペクトルの発光帯が現れることを観測した。この発光帯は指向性が強いことからレーザー発振光であると考えられる。さらに特徴的な構造はキャビティの縦モードによると考えられる。励起子発光帯の出現には良質の試料が求められ、これまで分子線エピタキシー(MBE)法などの大がかりな装置を用いて試料が作製されてきた。しかし本研究で用いた試料作製法は、2枚の石英板を重ねてできた隙間にZnO粉末を混ぜたアルカリハライド融液を導入し、冷却固化させるという、非常に簡単なものである。にもかかわらずこの試料は、MBE法で作製された試料と同程度の励起子発光特性を示す。本年度は、この試料における励起子発光帯の光強励起効果を観測し、高密度状態の励起子の振る舞いについて調べた。試料は種々のアルカリハライドに酸化亜鉛微粒子を埋め込んだものを上記の方法で作製した。それらをクライオスタットで極低温に置き、窒素レーザーを用いて強励起下での発光スペクトルを測定した。励起強度は減光フィルターを用いて変化させた。励起強度の増大とともに低エネルギー側に裾を引く新たな発光帯が出現するのを観測した。その強度は励起強度の1.6乗に比例した。そのスペクトル形状と発光強度の励起強度依存性から、この新たな発光帯は励起子分子が励起子を残して消滅する際に生じるものと考えられる。この発光帯の出現エネルギー位置から、この試料における励起子分子の束縛エネルギーは15meVと見積もられた。さらにこの発光帯の詳細な解析から、縦波励起子と横波励起子をそれぞれ残す発光帯に分裂していることが明らかとなり、縦波-横波励起子分裂幅は2.5meVと見積もられた。
特異光波動場の生成と制御

本研究は,偏光やコヒーレンスなどベクトル光波のもつ統計的性質を精密に計測・制御するための基礎技術を開発することを目的とする.具体的には,最近我々が提案したコヒーレンスホログラフィーという3次元空間のスカラー場のコヒーレンス関数を自由に生成・制御するための原理をベクトル場に発展させてベクトル光波動場の相関をあらわすコヒーレンス偏光行列の各要素や一般化ストークスパラメータを制御することを目指す.今年度の成果を以下に要約する.1.ベクトル場コヒーレンスホログラフィーの提案とコヒーレンス偏光Vortexの生成ベクトル光波の偏光とコヒーレンスを統合した偏光コヒーレンス場の一般化されたvan Cittert-Zernikeの定理を導出した.この定理を基礎原理としてスカラー場のコヒーレンスホログラフィーの原理を発展させ,直交する2偏光成分に対して個別のコヒーレンスホログラムを設計することにより,空間の任意の2点間のベクトル光波動場のコヒーレンス偏光行列を制御するベクトル場コヒーレンスホログラフィーの、原理を提案し,コヒーレンス偏光行列要素に所望の位相特異点をもつ特異波動場の生成に成功した.2.ストークスホログラフィーの提案と実証実験偏光コヒーレンス場を制御するための新しい技術として次のようなストークスホログラフィーの原理を提案した.物体光と参照光に互いに直交した偏光を用い,従来の強度干渉縞に代わる偏光状態の干渉縞を生成し,それを静止位相拡散板で散乱させて,偏光干渉計で散乱場の偏光成分を検出して空間的相関関数を求めると,記録された物体像が一般化ストークスパラメータの空間分布として再生されることを理論的に予測し実験により確認した.本研究は位相,偏光,コヒーレンスなど光波のもつ多次元自由度を精密に計測・制御する技術を開発するとともに,位相特異点や偏光特異点やコヒーレンス特異点などの空間的な特異構造をもつ波動場を生成し,その物理的性質を解明することを目的とする.本年度は,着任後6ヶ月という短期間であるので,研究の準備期間と位置づけて以下の予備的な研究を行った.1.最近我々が提案したコヒーレンスホログラフィーという3次元空間のスカラー場のコヒーレンス関数を自由に生成・制御する原理をベクトル場に発展させて偏光場のvan Cittert Zernikeの定理を導出し,それを用いて偏光複素コヒーレンス関数の位相に特異点を持つStokes vortexを発生させるための方法を検討した.2.偏光コヒーレンス場の伝搬の数値計算モデルと数値計算プログラムコードを開発した.3.ベクトル光波動場の偏光状態の空間分布を一枚の干渉縞画像から精密計測するための空間周波数多重化偏光干渉計の設計と試作を行った.2次元波動場の偏光の空間分布を全視野同時計測するために空間キャリア周波数が可変で外乱に強い共通光路サニャック偏光干渉計の原理を提案した.この原理に基づいた可変空間キャリア型の偏光干渉計を試作した.試作した干渉計による偏光分布の計測結果を解析し,光学素子の収差とアライメント誤差が精度に与える影響を分析した.そして,偏光干渉計の光学素子と干渉計のアライメント誤差を較正する原理を考案し計測精度の向上をはかった.本研究は位相,偏光,コヒーレンスなど光波のもつ多次元自由度を精密に計測・制御する技術を開発するとともに,位相特異点や偏光特異点やコヒーレンス特異点などの空間的な特異構造をもつ波動場を生成し,その物理的性質を解明することを目的とする.この目的のために本年度は以下の事項を実施した.1.光子相関ホログラフィーの提案と実証実験静止すりガラスにホログラムを投影し,散乱されたスペックルの強度相関関数から3次元物体の像再生をする光子相関ホログラフィーの原理を提案し,実験によりその有効性を実証した.2.一般化ストークスパラメータへのVortexの生成と検出コヒーレンスホログラフィーと偏光制御の原理を組み合わせることにより,ランダム偏光場の一般化ストークスパラメータの空間分布にVortexを生成し,それを干渉計を用いて検出することに成功した.3.偏光状態の空間分布を計測するための安定化した干渉計の開発共通光路Sagnac干渉計で直交偏光状態の参照光波を発生させることにより,参照光の直交成分間の位相差の安定化を実現した干渉計を開発し,実験によりその有効性を確認した.4.位相シフトコヒーレンスホログラムを自然光照明する空間コヒーレンス制御法空間的にインコヒーレントな自然光として高輝度プロジェクタを光源に用い,位相シフトコヒーレンスホログラムを照明することにより,3次元空間のコヒーレンス関数を制御する方法を提案し実験によりその有効性を実証した.本研究は,偏光やコヒーレンスなどベクトル光波のもつ統計的性質を精密に計測・制御するための基礎技術を開発することを目的とする.具体的には,最近我々が提案したコヒーレンスホログラフィーという3次元空間のスカラー場のコヒーレンス関数を自由に生成・制御するための原理をベクトル場に発展させてベクトル光波動場の相関をあらわすコヒーレンス偏光行列の各要素や一般化ストークスパラメータを制御することを目指す.今年度の成果を以下に要約する.1.ベクトル場コヒーレンスホログラフィーの提案とコヒーレンス偏光Vortexの生成ベクトル光波の偏光とコヒーレンスを統合した偏光コヒーレンス場の一般化されたvan Cittert-Zernikeの定理を導出した.この定理を基礎原理としてスカラー場のコヒーレンスホログラフィーの原理を発展させ,直交する

2偏光成分に対して個別のコヒーレンスホログラムを設計することにより,空間の任意の2点間のベクトル光波動場のコヒーレンス偏光行列を制御するベクトル場コヒーレンスホログラフィーの、原理を提案し,コヒーレンス偏光行列要素に所望の位相特異点をもつ特異波動場の生成に成功した.2.ストークスホログラフィーの提案と実証実験偏光コヒーレンス場を制御するための新しい技術として次のようなストークスホログラフィーの原理を提案した.物体光と参照光に互いに直交した偏光を用い,従来の強度干渉縞に代わる偏光状態の干渉縞を生成し,それを静止位相拡散板で散乱させて,偏光干渉計で散乱場の偏光成分を検出して空間的相関関数を求めると,記録された物体像が一般化ストークスパラメータの空間分布として再生されることを理論的に予測し実験により確認した.
内分泌かく乱作用物質(環境ホルモン)の膵ホルモン分泌動態への影響の検討

いわゆる環境ホルモン、内分泌攪乱化学物質が社会的な関心を得ている。内分泌攪乱化学物質の中にはエストロゲン様作用を示すと指摘されている物質がある。エストロゲンは生殖、発生に重要な女性ホルモンの一種であるが、同時に、ヒトの様々な部分でもその役割を果たしている。その役割の一つとして、膵臓のランゲルハンス島におけるインスリン分泌を制御している可能性が示唆されている。そこで、本実験ではエストロゲン様作用が指摘されている2種の薬剤(ポリカーボネイド樹脂製食器からの溶出が指摘されているビスフェノールA(Bis-A)と非イオン界面活性剤として広く利用されて水質汚染が注目されているノニルフェノール(NP))がインスリン分泌にいかなる影響をあたえるかを検討した。ラ島にはエストロゲン受容体遺伝子がα型、β型ともに発現していることが明らかになった。また、エストロゲン様作用を指摘されている2種の薬剤(Bis-A、NP、各10ppb)は、急性反応、長時間曝露(24時間)にて、両薬剤ともブドウ糖刺激によるインスリン分泌を促進した。このことよりいわゆる環境ホルモンと呼ばれる薬剤の一部には糖代謝に影響を与えるものが存在することが明らかとなったいわゆる環境ホルモン、内分泌攪乱化学物質が社会的な関心を得ている。このことよりいわゆる環境ホルモンと呼ばれる薬剤の一部には糖代謝に影響を与えるものが存在することが明らかとなった<目的>エストロゲン様作用を指摘されている2種の薬剤ビスフェノールA(Bis-A)とノニルフェノール(NP))がインスリン(I)分泌に影響をあたえるかを検討した。<方法>8週齢Wistar系雄性ラットを用いコラゲナーゼ法にてランゲルハンス島(ラ島)を単離した。2種のエストロゲン受容体遺伝子発現をRT-PCR法にて検討した。またbatch incubation法にてBIis-A、NP存在下に(I)分泌を検討した。またBIis-A、NP(各10ppb)存在下に培養を用いて長時間曝露後の(I)分泌への影響を検討した。<成績>1)alpha型は予想された601bpの一本のシグナルとして認められたが、beta型のシグナルは認められなかった。2)Bis-A、NP存在下に(I)分泌を測定した。ブドウ糖(G)8.3、16.7mM存在下に刺激をした場合には、Bis-A、NP共に10ppbでピークとなる(I)分泌の有意な増強作用が見られた。3)Bis-A、NP(各10ppb)存在下に24時間培養後のラ島を用い(G)による(I)分泌を検討した。コントロール群に比し8.3、16.7mM刺激時には(I)分泌の有意な増強が見られた。<結論>環境ホルモンと呼ばれる薬剤の一部には糖代謝に影響を与えるものが存在することが明らかになった。このことよりいわゆる環境ホルモンと呼ばれる薬剤の一部には糖代謝に影響を与えるものが存在することが明らかとなった
絨毛癌完全治癒への高度先端技術の応用

1.再発防止についてマウスMoAbを用いた超高感度hCG測定系を確立し、測定法の詳細と測定の臨床応用について発表した。この測定系により絨毛癌患者の寛解時血清中hCGを測定した結果、従来考えられていたよりも更に長い期間微量hCGが検出された。この結果、絨毛癌寛解基準をさらに厳しくし、現在はhCG陰転後56コースの化学療法を追加するとともに、再発high risk症例に対してmaintenance療法を施行している。樹立絨毛癌株4株のhCG産生性を検討した結果、腫瘍マーカーとしてhCGを利用する時、由来細胞種によりhCG産生能は10倍以上の差のあることが判明し、絨毛癌寛解判定時の留意すべき点であると考えるに至った。2.縮小した腫瘍の再増殖に対する対応策について長期間(7年間)治療患者由来の絨毛癌株を樹立し、その性状を分析した結果、ACTD、MTXともに薬剤耐性を認めた。耐性の機序については薬剤uptake量の減少を認めたが、現在更に検討中である。絨毛癌細胞の産生する胎盤性アルカリフォスファターゼ(pALP)に対するMoAbを作製した。この抗体がpALPにのみ反応し、IgG classに属することが判明し近く日産婦誌に発表する。このMoAbを使用し、婦人科癌患者血清中pALPを測定し日本癌学会で発表した。今後ヒトにおけるミサイル療法およびradioimmunodetectionを検討している。1.再発防止について(1)モノクローナル抗体を用いた高感度hCGの測定を確立し、測定法の詳細と、測定の臨床応用につきEndocrinol、Japon.に発表した。この則定結果を中心とする検討により、治療をいつ打ち切ることが出来るのか、寛解規準の設定を行い、再発防止に務めた。さらに現在、寛解導入後の維持療法の規準を定め実施している。2.縮小した腫瘍の再増殖について(1)【^(131)I】ラベル抗アルカリホスファターゼモノクローナル抗体によるradio-immunoditectionの系をヌードマウス移植腫瘍の系で確立し、Jpn.J.cancer Resに発表した。現在、あらたに、特異的かつ、さらに安定なモノクローナル抗体を得るように努力しており、近く、ヒトにおける腫瘍のimagingが可能となりかつミサイル療法も可能となろう。(2)絨毛性癌が胎盤性アルカリフォスターゼを組識内に保持し、かつ血中濃度が高くないため、PLAPが絨毛癌の微小病巣imagingに有用であることを示し、発表した。(Obst.and Gynec.)(3)樹立絨毛癌につき、薬剤感受性に差異のあることを日産婦誌に発表し絨毛癌における感受性は薬剤up take量にほぼ相関することを明らかにしさらにこれをDHFRの、DNAを使用し、証明した。1.再発防止について(1)高感度hCG測定系を利用した絨毛癌寛解規準を設定し,再発防止につとめている.現在,寛解導入後の,維持療法症例を重ねている.(2)絨毛性疾患における腫瘍マーカーとして, hCG以外の分泌ホルモン(例:ステロイドホルモン)の測定を重ね,データを得つつある.これを腫瘍マーカー研究会で発表した. (3)再発を操りかえした患者の肺転移巣より,新たに絨毛癌株と樹立した.現在,この細胞株の性状を分析している.2.縮小した腫瘍の再増殖について(1)絨毛癌細胞が産生している胎盤状アルカリフォスファターゼに対するモノクローナル抗体IgGクラスの作成に成功し,この抗体の特異性と,この抗体を使用してのassary系を日本産科婦人科学会に発表予定である.(2)絨毛癌の合泌するhCGは, wholc hCGに対して, freeーβーhCGの割合が高いことを見い出し, J.Clin Fndcdin Matabに発表した.1.再発防止に対する研究計画(1)hCGの絨毛癌細胞に対する腫瘍マーカーとしての意義をさらに追究し、その産生性には10倍以上の差のあることが判明した。

このように由来する絨毛癌により大量産生する細胞を少量産生する細胞にhCGにこのように差のあることは、患者治療上、留意しなければ重要な問題点であると思われる。この事実は日産婦誌に発表した。(2)再発、寛解を繰りかえし、長期に渡る治療をうけた絨毛癌患者より細胞株を樹立し、その薬剤感受性を決定した。絨毛癌に対する特効薬とも云われ、また、この患者に7年間に渡り使用したActinomycinーDとMethotrexateに対して、この絨毛癌株は数十倍の薬剤耐性を示した。日本癌治療学会に発表した。2.縮小した腫瘍の再増殖について絨毛癌細胞が産生している胎盤性アルカリフォスファターゼに対するモノクローナル抗体を作成し、このモノクローナル抗体作成結果を日産婦誌に発表予定である。また、この抗体を使用し、Emzyme-immuro assay系を組み、絨毛癌を含む産婦人科癌患者血清中の胎盤性アルカリフォスファターゼを測定し、日本癌学会に発表した。3.絨毛癌の移植免疫性について
子の意思尊重原理と子のための手続代理人：日独墺比較研究

日本・ドイツ・オーストリアにおける手続代理人制度の分析・実態調査を通じ、比較法的観点から、日本における家事事件手続法上の「子の手続代理人」制度がより効果的に運用され、子の意思が充分に尊重された家事紛争の解決を図るには、下記の点が特に重要であることを提言し、論文として公表した。つまり、1報酬の国費負担の探求、2手続代理人における諸費用の適切な償還、3特に発達心理学など、他の専門領域との学際的協働による、継続的な手続代理人の専門養成、4地域間の専門性の格差を是正するため、全国的な専門養成のネットワークの構築、5一般市民(特に子ども)への手続代理人制度の情報アクセス・認知度の向上等が挙げられる。平成25年度においては、国内における手続代理人制度の運用が実際にどのような状況にあるかを把握することに努めた。実態調査の一環として、日弁連主催の手続代理人制度の活用に向けた研究会ならびに市民大会へ参加し、また、日本家族<社会と法>学会において、家事事件手続法施行後の制度運用につき見識を深めた。具体的な成果としては、日弁連子どもの権利委員会による研究会「子どもの手続代理人の拡大を目指して」において、各単位会からの手続代理人活動報告を受けて、ドイツ法の議論をもとに、今後の課題等につき指定コメントを行った。実態として、ドイツにおける制度運用上の論点としても挙げられていた、1年齢に応じた子の意思の把握と裁判所での具体的反映方法、2専門養成(特に、日本法は選任対象が弁護士のみであることもあり、心理的要素をいかに踏まえるか)3費用負担(国費負担原則とするドイツ法との制度上の違い)について、検討課題として残されていることが確認できた。また、その内容の一部を踏まえ、「家事事件手続法と子の利益」法学セミナー706号(2013年11月)18頁以下に、手続代理人制度の運用実態に対する評価を行っている。また、現在、『離婚紛争の合意による解決と子の意思の尊重』(日本加除出版社)の中で、ドイツ法制度の評価について執筆中である。なお、比較法的分析のもとでは、次年度以降の分析対象となるドイツ・オーストリア法制の各論、とりわけ、ドイツ法における手続補佐人の職務・費用に関わる判例について、順次、分析を進めている。また、2014年3月には、台湾静宜大学における、台日家族法・国際私法研究会において、「未成年子の手続行為能力と手続代理人」と題して、家事事件手続法における子どもの手続行為能力について概要を解説し、手続代理人制度の運用について報告する機会を得た。平成26年度においては、ドイツ法における手続補佐人制度の運用実態の把握について努めた。平成25年度の研究により把握した国内法制における制度運用上の検討課題をもとに、ドイツにおける手続補佐人制度との比較から制度運用面について評価を行った。この内容については、具体的成果として、論文「ドイツにおける子の意思の尊重ー家庭裁判所と少年局、そして手続補佐人の役割」を執筆し、二宮周平・渡辺惺之(編)『離婚紛争の合意による解決と子の意思の尊重』(日本加除出版2014)320頁以下に掲載することができた。また、平成26年度の研究計画の核でもあるドイツ法制度の運用実態調査については、ミュンヘンをはじめとしてドイツ国内における運用状況につき、研究者・裁判官・手続補佐人等に直接にヒアリング調査をすることで、選任事案の傾向や地域間の連携、専門養成の体制等について知ることができた。なお、実地調査の準備として、手続代理人の活動の実情に詳しい弁護士のもとで、手続代理人マニュアルの内容も踏まえながら、昨年からの日本法制の運用状況の確認を兼ねてヒアリング調査を行った。ドイツ調査においては、ドイツ法制度の制定経緯上、重要な位置づけとなるBadBall会議を踏まえ、同会議が開かれたEv.Akademie Bad Ballがいかなる性質の機関であるか、調査も行った。これらの調査結果については、論文としてまとめ、公表すべく、現在、執筆中である。なお、今年度は、研究テーマである家事事件手続における子の意思尊重原理に関して、面会交流事案をもとに、函館家裁・旭川家裁において講演を行う機会を得ることができた。本研究の補助事業期間最終年度となる平成27年度では、当初の研究計画としてはオーストリアにおける「子ども補佐人」法制の実態分析を行い、これまでのドイツ「手続補佐人」法制の実態分析と合わせた上で日本法への示唆を抽出し、公表することに重点を置いていた。しかし、最終年度の研究主眼であったオーストリア法制の具体的運用に関する実態調査にまで至ることができず、制度発足の歴史的経緯や制度概要の把握、関連資料の収集、実定法との関連から2013年親子法改正による子の福祉規定(ABGB138条)の確認、配慮権手続の手続期間短縮に向けた家庭裁判所援助制度の把握に留まった。子ども補佐人制度オーストリアにおける子ども補佐人制度については、ドイツ法制と具体的職務や専門養成等の点で若干異なり、また、現時点に於いて詳細が報告されていないこともあるため、今後その内容をまとめた論文を執筆・公表することで、より手続代理人制度が活用される一助としたいと考えている。なお、採択初年度より、日弁連子どもの権利委員会における手続代理人制度の研究会等を通じて実際の手続代理人の活動からいかなる課題が存在するか確認しているが、同研究会においてはドイツ法制の運用等をもとに課題解決への示唆を行った。本研究における具体的な研究実績としては、日本法の制度運用上の課題を踏まえ、ドイツ手続補佐人制度の運用実態から、専門性の確保や報酬・費用償還等の観点より示唆を抽出した「ドイツ手続補佐人制度の運用と日本法への示唆」を執筆し、二宮周平・渡辺惺之(編)

『子どもと離婚』(信山社、2015)253頁以下に公表したことが挙げられる。将来的により手続代理人制度が適切に活用されるための要素として、専門養成の向上に向けた発達心理学との学際的な協働の必要性、地域間の専門性格差の是正、一般市民への情報アクセスの拡充、国費負担の必要性について言及した。日本・ドイツ・オーストリアにおける手続代理人制度の分析・実態調査を通じ、比較法的観点から、日本における家事事件手続法上の「子の手続代理人」制度がより効果的に運用され、子の意思が充分に尊重された家事紛争の解決を図るには、下記の点が特に重要であることを提言し、論文として公表した。つまり、1報酬の国費負担の探求、2手続代理人における諸費用の適切な償還、3特に発達心理学など、他の専門領域との学際的協働による、継続的な手続代理人の専門養成、4地域間の専門性の格差を是正するため、全国的な専門養成のネットワークの構築、5一般市民(特に子ども)への手続代理人制度の情報アクセス・認知度の向上等が挙げられる。平成26年度の研究内容は、大別すると、1ドイツ手続補佐人制度の運用状況に関する実地調査、2オーストリア法制度における子ども補佐人制度の概要の把握、3次年度予定のオーストリア法制度の調査研究の準備として、学説・判例分析の3点であった。1については、ドイツに赴き、ミュンヘン・ハイデルベルク等において、研究者、裁判官、手続補佐人等から現在の運用状況及び課題につきヒアリング調査を行い、また、日本法制の運用状況に対する指摘を受けることができたため、当初の目的をおよそ達成することができたと評価できる。2については、オーストリア非訟事件手続法における「子ども補佐人」制度の概要及び非訟事件手続法の改正と「子ども補佐人法」制定経緯の概略について把握しており、この点についても当初の目的をおよそ達成できていると評価できる。3については、オーストリア法制度の各論点(子の年齢に応じた意思の把握と意思尊重原理に基づく裁判所への反映方法の具体的内容・子ども補佐人の専門養成システム・費用負担体系等)の詳細に関する詳細な分析はまだ十分ではないが、調査予定先及び日本法制・ドイツ法制との比較から調査すべき内容についてはおよそ整理することができている。民法(家族法)事業期間の最後の年度となる平成27年度においては、以下3点につき研究を順次進めていく。つまり、1オーストリア法における「子ども補佐人」制度につき、現地ヒアリング調査に基づく運用実態の解明、2日本・ドイツ・オーストリアそれぞれの法制度の運用実態を踏まえた、日本の手続代理人制度への具体的示唆の抽出、3これまでの研究結果につき論文等を通じて公表するという流れとなる。平成26年度の研究計画においては、最終年度におけるオーストリア法制の調査に向けた法制度の概要及び制定経緯の把握を掲げていたが、これについては、およそ既に把握できている。日本法・ドイツ法でも検討を行った、裁判所における子の意思の具体的反映方法・専門養成とそれを支える諸機関の連携・費用負担問題につき、オーストリア法制における実態がいかなるものか、現地ヒアリング調査を通じて究明することに努めるものとする。
動脈管筋収縮制御タンパク質のリン酸化解析とメタボロミクス解析

動脈管における筋収縮制御タンパク質及び低分子量ヒートショックプロテイン(HSP)20、27のリン酸化の検討を、酸素又は窒素曝露したラット胎仔動脈管/主肺動脈、胎仔や成獣の下行大動脈(対照)を試料として、調製した抗体などを用いフォスタグ電気泳動法により進めた。HSP20は胎仔血管ではリン酸化を検出しなかったが、成獣ではリン酸化シフトが検出された。HSP27は、酸素や窒素曝露試料にリン酸化が検出された。トロポミオシン2は、動脈管と肺動脈のリン酸化のパターンが酸素・窒素曝露の前後で共に異なっており、動脈管の収縮制御に特別な関与をしている可能性が考えられた。本研究の動脈管メタボロミクスの結果から、高濃度酸素曝露条件の動脈管には主肺動脈に比べてカルニチン、パントテン酸が豊富に存在することが判明している。これらはいずれも補酵素CoAの産生に寄与する。今年度は、カルニチン、パントテン酸並びにアセチルCoA関連酵素のmRNA発現量を、ラット満期胎仔動脈管(無処理、酸素又は窒素曝露)を試料として比較した。カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼI(Cpt1a肝臓タイプ, Cpt1b骨格筋タイプ, Cpt1c脳タイプ)によりパルミチン酸などのアシル基がカルニチンに結合するが、この内Cpt1bが酸素曝露の動脈管でコントロールに比べて約6倍増加した。この他カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼII,カルニチン/アシルカルニチントランスロカーゼ,カルニチンアセチルトランスフェラーゼ,アセチルCoAトランスフェラーゼ、パントテン酸キナーゼなど10種以上を検討したが、酸素曝露により明らかな増加を示したものは、Cpt1bのみであった。この結果は、生後の動脈管における筋収縮とリモデリングに、ミトコンドリアへの長鎖脂肪酸輸送の増加をCpt1bが転写レベルで関与する可能性を示唆した。本年度は、動脈管酸素刺激時のメタボロミクス解析を、肺動脈を対象として実施した。分析に必要な試料量は、30-40mg程度であることから、計6匹の妊娠21日目のラットから計66匹の満期胎仔を得、動脈管(計29.9 mg)及び主肺動脈(計28 mg)を冷生理的食塩液中で採取し、酸素(95%O2-5%CO2)刺激を与え、液体窒素で急速凍結し-80°Cで保存した。質量分析法によるメタボローム解析は、キャピラリー電気泳動(CE)と質量分析(MS)による水溶性イオン性物質の同定と定量を行った。CE-MSはエネルギー代謝などによって変動する水溶性イオン性物質の分離に有効な手法である。肺動脈より動脈管において、目的ピークの面積値を内部標準物質の面積値(x試料量)で除した相対面積値の比として2以上を示したものは、カルニチン,グルタミン, Isethionic acid,Toluic acid,パントテン酸であった。1.5以上を示したものは、hypotaurine, Acetylasparatic acid, NADPH divalent,アセチルカルニチン, Spermidineであった。パントテン酸はCoA合成に用いられる。カルニチンは脂肪酸をミトコンドリア内部に運搬する。脂肪酸はβ酸化を受け酢酸にまで分解され、生成したアセチルCoAはクエン酸回路を通じてエネルギーに転換される。アシルCoAはカルニチンと結合しアシルカルニチンへと転換される。アシルカルニチンはミトコンドリア内部に運搬され、アシルCoAへと転換される。フリー体のカルニチンは細胞質に戻る。このように解釈すれば、満期胎仔の動脈管は、肺動脈に比べて、アセチルCoAを中心としたエネルギー産生能が高いと推定された。また、動脈管に発現する低分子量ヒートショックタンパク質のリン酸化の研究のための試料の調製はすでに進めており、電気泳動・ウェスタンブロッティング・リン酸化の検出作業を近く開始したい。今年度は、ラット満期胎仔の動脈管と肺動脈についてメタボロミクス解析を実施し、興味ある結果を得ることができた。本知見はまったく新規のものであり、これからの研究の方向に大きな示唆を与えるものと考えている。また、動脈管に発現する低分子量ヒートショックタンパク質のリン酸化の研究のための試料の調製はすでに進めており、電気泳動・ウェスタンブロッティング・リン酸化の検出作業を開始できる状態である。本研究ではHSP27やHSP20を検出する抗体を多くの実験で必要とする。ラットや家兎の胎仔血管が主な対象試料であるため、試料中のタンパク質量を増やすことも容易ではない。これら試料のウェスタンブロットの検出に市販の抗HSP27モノクローナル抗体を使用したところ検出感度が極めて低かったことから、ポリクローナル抗体を自作することとした。家兎HSP27とHSP20の全コード領域をPCRクローニングし、pET19b大腸菌発現プラスミドに挿入した。発現した10xヒスチジン融合HSP27やHSP20タンパク質は、多量であったが、いずれも不溶性タンパク質であった。界面活性剤などを用いてこれらを可溶化し、ニッケルビーズカラムを用いて精製、濃縮してアジュバントと混和し、抗原として複数のマウスに皮下投与した。数ヶ月に渡り、マウスの尾からたびたび採血し、抗原に対して高タイターの抗血清を得た。

家兎やラット血管試料から尿素・チオウレア・界面活性剤のCHAPを含む溶解液でタンパク質を抽出し、これらをSDS電気泳動して調製したウェスタンブロットに、得られた抗HSP27抗血清を一次抗体として用いたところ、HSP27を高感度に検出できた。HSP27のリン酸化の検出条件の検討のために、家兎成獣の下行大動脈に、in vitroで血管収縮作用剤であるエンドセリン1や塩化カリウムを添加、37°Cで培養し、収縮血管試料を調製した。脱リン酸化阻害剤を含む上記溶解液でタンパク質を抽出し、フォスタグ電気泳動、続いてブロッティングによりブロットを得た。このブロットを、作製した抗HSP27抗マウス血清を用いて検出すると、HSP27の複数のリン酸化状態を示すバンドが未処置コントロール試料に対して変動するのを確かめることができた。初年度はメタボロミクス解析を進め、興味深い結果を得た。本年度は、ヒートショックタンパク質(HSP)27やHSP20のリン酸化状態を検出するために必須である抗体を作製することができた。また、実験動物の血管試料からのタンパク質抽出法、フォスタグ電気泳動法、ブロット作製条件、ケミルミネッセンスによる高感度検出法など一連の手法をほぼ確立できた。HSP20については、未完成であるが、本研究の主目的である動脈管の収縮・弛緩に関わる低分子量HSPのリン酸化変動を検出できるところまで進めることができたので。動脈管における筋収縮制御タンパク質及び低分子量ヒートショックプロテイン(HSP)20、27のリン酸化の検討を、酸素又は窒素曝露したラット胎仔動脈管/主肺動脈、胎仔や成獣の下行大動脈(対照)を試料として、調製した抗体などを用いフォスタグ電気泳動法により進めた。HSP20は胎仔血管ではリン酸化を検出しなかったが、成獣ではリン酸化シフトが検出された。HSP27は、酸素や窒素曝露試料にリン酸化が検出された。トロポミオシン2は、動脈管と肺動脈のリン酸化のパターンが酸素・窒素曝露の前後で共に異なっており、動脈管の収縮制御に特別な関与をしている可能性が考えられた。本研究の動脈管メタボロミクスの結果から、高濃度酸素曝露条件の動脈管には主肺動脈に比べてカルニチン、パントテン酸が豊富に存在することが判明している。これらはいずれも補酵素CoAの産生に寄与する。今年度は、カルニチン、パントテン酸並びにアセチルCoA関連酵素のmRNA発現量を、ラット満期胎仔動脈管(無処理、酸素又は窒素曝露)を試料として比較した。カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼI(Cpt1a肝臓タイプ, Cpt1b骨格筋タイプ, Cpt1c脳タイプ)によりパルミチン酸などのアシル基がカルニチンに結合するが、この内Cpt1bが酸素曝露の動脈管でコントロールに比べて約6倍増加した。この他カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼII,カルニチン/アシルカルニチントランスロカーゼ,カルニチンアセチルトランスフェラーゼ,アセチルCoAトランスフェラーゼ、パントテン酸キナーゼなど10種以上を検討したが、酸素曝露により明らかな増加を示したものは、Cpt1bのみであった。この結果は、生後の動脈管における筋収縮とリモデリングに、ミトコンドリアへの長鎖脂肪酸輸送の増加をCpt1bが転写レベルで関与する可能性を示唆した。ラット満期胎仔の動脈管と肺動脈についてメタボロミクス解析の結果から、満期胎仔の動脈管は、肺動脈に比べて、アセチルCoAを中心としたエネルギー産生能が高いと推測された。この仮説をさらに証明するために、エネルギー代謝・産生に関わる遺伝子群の発現の違いをまず検討したい。