hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＲＮＡ結合ドメインを用いたｉｎ　ｖｉｖｏＲＮＡ解析手法の創製と応用

本研究課題では、RNAの生理機能を解明するための手法開発を目指す。開発する手法は、標的RNAを認識するためにRNA結合タンパク質PUMを用いることとしたが、その前提として、内在性PUM自体の機能を解析することを第一の目的とした。申請者は初年度に48 mRNAがPUMにより分解されるRNAと実験的に同定した。さらに、CDDPやCPTといったDNA損傷を誘起する抗がん剤を投与した細胞で、PUMが減少しPUM分解標的が増加することが分かった。本年度は、同定した抗がん剤がPUMの減少およびPUM分解標的の増加を誘起することを実験的に確認するために、CDDPを投与した細胞におけるタンパク質とRNA量を解析した。ウェスタンブロットの結果、CDDP添加時にPUMタンパク質が消失することが分かった。一方、qPCRによりRNA量を解析した結果、PUM分解標的mRNA量(PCNAやUBE2A mRNAなど)が上昇した。PUM減少により増加するPCNAやUBE2A mRNAなどは損傷組み換え修復に関与していることが分かっている。そこで、実際に損傷組み換え修復が活性化するかどうかを検証した。CDDPを添加した際にPCNAがPUM減少依存的にユビキチン化することが分かった。このユビキチン化されたPCNAがPolηを損傷したDNAに局在させることを細胞内の局在解析によって明らかにした。DNA伸長を定量化できるBrdU-ELISAを用いてCDDP添加後のDNA伸長を測定した結果、PUM過剰発現細胞ではDNA伸長が阻害されていた。一連の結果から、CDDPが添加されるとPUMが減少することでPCNAやUBE2A mRNAなどが上昇し、損傷組み換え修復が活性化することで細胞が生存することが分かった。申請者は、細胞内のRNAを解析するための手法開発に取り組んでいる。計画していたRNA結合タンパク質PUMを用いたプローブ開発とともに、PUM自体の機能研究を遂行している。申請者は大規模シークエンス解析の結果、PUMが結合し分解するmRNA(標的mRNA)を48種同定することに成功した。さらに情報解析により、DNA障害を誘起する抗がん剤投与時にPUMが減少することで、標的であるPCNA mRNAやUBE2A mRNAなどDNA修復に関連するmRNAが安定化し細胞内の存在量が増加することを示した。さらに、PCNAなどの上昇が損傷乗り換え修復の経路を活性化することを解明した。この研究では、今までの手法では解明できなかったPUMの生理的機能(DNA修復におけるPUMの果たす役割)を解明することに成功した。PUMが抗がん剤への抵抗性と関連しているという事実は、ガン治療において重要な知見となり得る。申請者の研究は、将来的にはPUMを含むRNA分解機構が抗がん剤治療の対象となることを示唆しており、医歯薬学分野への貢献が期待される。現在は,論文を投稿している段階で、これは当初の計画より早い。また、国際学会でも、RNA分解やRNA結合タンパク質の研究者から高評価を得られており、当初の計画以上に進展していると判断した。PUM自体の機能解析研究においては本年度中の論文掲載を目指す。また、RNA結合タンパク質PUMを用いたプローブ開発については、核内RNAの分解を実現させる。具体的には、核局在シグナルを付加した16塩基認識PUM-HDに様々なRNAヌクレアーゼ(XRN1など)を融合させ、RNA分解プローブを作製する。さらに作製した各々のRNA分解プローブの性能を評価する。培養細胞にRNA分解プローブを導入した後RNAを抽出する。その中で、最も標的RNAの量が減少していたプローブを採用する。開発したRNA分解プローブを用いてTERRAやNEAT1を分解し、プローブの性能を評価する。本申請者は、細胞内のRNAを解析するための手法開発に取り組んでいる。本年度は計画していたRNA結合タンパク質PUMを用いたプローブ開発の前提として、細胞内に存在するPUM自体の機能研究を遂行ししている。本申請者は、大規模シークエンス解析の結果、ヒトのがん細胞においてPUMが結合し分解するmRNA(標的mRNA)を48種同定することに成功した。さらに情報解析により、抗がん剤投与時にPUMが減少することで、標的mRNAが安定化し細胞内の存在量が増加することを示した。これらの結果から申請者は、PUMが減少することで、標的mRNAの分解が抑制され、細胞内mRNAの量が増加することを明らかにした。さらに、細胞活性を測定した結果、PUMを過剰発現させた細胞では、PUM標的mRNAの量が増加しないため、通常細胞と比べ抗がん剤投与時に生存率が低下することを明らかにした。この研究では、今までの手法では解明できなかったPUMの生理的機能(PUMが減少することで、細胞が抗がん剤への抵抗性を獲得する)を解明することに成功している。PUMが抗がん剤への抵抗性と関連しているという事実は、ガン治療において重要な知見となりえる。したがって、本研究は将来的にはPUMを含むRNA分解機構が抗がん剤治療の対象となることを示唆しており、医歯薬学分野への貢献が期待される。次年度は、一連の成果を報告するために論文を執筆、投稿する。PUMは5'-UGUANAUA-3'という8RNA塩基を特異的に認識する。PUMは結合に関しては詳細に解明されている一方で、機能に関しては限定的な理解に留まっている。これは、PUMが実際に分解するRNAが特定できないことによる。そこで、PUMに結合し、細胞内のPUMを欠損させた際に安定化する遺伝子群を同定した。

PUMが結合するRNAをゲノムワイドに決定するために、RIP-seqを行い、PUMに結合している3097種のRNAを同定した。次に、PUMによるRNA分解を解析するためにゲノムワイドにRNAの半減期を測定できるBRIC-seqを行った。PUMを欠損させた細胞では、101種のRNAにおいて半減期が有意に上昇した。両者の結果を重ね合わせた結果、48種が同定された。この48種がPUMにより分解されるRNAである。PUMによるRNA分解の生理的意義を解明するために、PUM標的RNAがどのような刺激で制御されているかを明らかにした。その結果、CDDPやCPTといったDNA損傷を誘起する抗がん剤を投与した細胞で、PUMが減少しPUM分解標的が増加することが分かった。同定した抗がん剤がPUMの減少およびPUM分解標的の増加を誘起することを実験的に確認するために、CDDPを投与した細胞におけるタンパク質とRNA量を解析した結果、CDDP添加時にPUMタンパク質が消失する一方、PUM分解標的mRNA量が上昇した。抗がん剤投与時のPUM機能を解明するために、細胞生存率とPUM減少との間に関連があるかを検証した。PUM過剰発現させた細胞は、CDDPを投与した際に、通常細胞と比べてより生存率が低かった。これら一連の結果、抗がん剤投与時に細胞はPUMを減少させることでPUM分解標的mRNA増加させ、結果として抗がん剤への抵抗を高めていることが明らかになった。本研究課題では、RNAの生理機能を解明するための手法開発を目指す。開発する手法は、標的RNAを認識するためにRNA結合タンパク質PUMを用いることとしたが、その前提として、内在性PUM自体の機能を解析することを第一の目的とした。申請者は初年度に48 mRNAがPUMにより分解されるRNAと実験的に同定した。さらに、CDDPやCPTといったDNA損傷を誘起する抗がん剤を投与した細胞で、PUMが減少しPUM分解標的が増加することが分かった。本年度は、同定した抗がん剤がPUMの減少およびPUM分解標的の増加を誘起することを実験的に確認するために、CDDPを投与した細胞におけるタンパク質とRNA量を解析した。ウェスタンブロットの結果、CDDP添加時にPUMタンパク質が消失することが分かった。一方、qPCRによりRNA量を解析した結果、PUM分解標的mRNA量(PCNAやUBE2A mRNAなど)が上昇した。PUM減少により増加するPCNAやUBE2A mRNAなどは損傷組み換え修復に関与していることが分かっている。そこで、実際に損傷組み換え修復が活性化するかどうかを検証した。CDDPを添加した際にPCNAがPUM減少依存的にユビキチン化することが分かった。このユビキチン化されたPCNAがPolηを損傷したDNAに局在させることを細胞内の局在解析によって明らかにした。DNA伸長を定量化できるBrdU-ELISAを用いてCDDP添加後のDNA伸長を測定した結果、PUM過剰発現細胞ではDNA伸長が阻害されていた。
セントロメアに特異的なクロマチン構造を形成するために必要な分子複合体の機能解明

セントロメアクロマチン構造の解明を目的として、クロマチン免疫沈降実験と高感度質量分析によりCENP-T/CENP-Wクロマチン結合タンパク質群を同定した。これらのタンパク質の1つEaf6は、ヒストンアセチル化酵素と相互作用し、セントロメアに局在することを明らかにした。Eaf6遺伝子破壊株を用いたSILAC法により、Eaf6欠損時に複数のセントロメアタンパク質の局在が減少する結果を得た。この結果は、Eaf6に依存して生じるアセチル化がセントロメア構築に関与する可能性を示唆している。本年度は、これらTW-chropのセントロメア機能における機能解析について以下の3点を中心に実施した。1、各TW-chropのニワトリDT40細胞内における局在解析各TW-chropとGFPタンパク質を融合し、ニワトリDT40細胞に導入して細胞内局在を網羅的に観察した。その結果、TW-chropの一つであるEaf6タンパク質(CENP-28)がセントロメアに局在することを明らかにした。2、Eaf6タンパク質複合体の精製および同定FLAGタグ融合型Eaf6を発現するDT40細胞株を樹立した。その細胞株の全細胞抽出液からFLAGタグ特異抗体ビーズを用いた共免疫沈降によりEaf6タンパク質複合体を精製し、高感度質量分析に供した。その結果、ヒストンアセチル化酵素を含むEaf6タンパク質複合体因子の同定に成功した。3、TW-chropの遺伝子破壊DT40細胞株の作製TW-chropの細胞における機能解析を目指し、ニワトリDT40細胞において各々の遺伝子破壊株の作製に着手した。Eaf6遺伝子破壊株の作製は既に終了し、今後詳細な機能解析を行う計画である。CENP-T/CENP-W複合体が結合するCENP-A近傍のクロマチン構造の実体解明を目指して、CENP-T/CENP-W複合体をベイトとして、ニワトリDT40細胞からクロマチン免疫沈降実験を行い、複数の成分(CENP-T/CENP-W chromatin associated proteins:以下TW-chropと呼ぶ)を見出している。これまで、TW-chropにはクロマチンリモデリング複合体を含む複数のタンパク質が存在することを見出した。その中のEaf6タンパク質(CENP-28)はセントロメア局在を示した。そこで23年度は、Eaf6タンパク質(CENP-28)に焦点をしぼり、セントロメアに特異的なクロマチン構造形成にどのように働くのかについて以下の2点を中心に実施した。1.遺伝子破壊DT40細胞株を利用したEaf6の機能解析Eaf6タンパク質は、高感度質量分析によりヒストンアセチル化酵素を含む複合体に含まれ、DT40細胞Eaf6遺伝子破壊株を用いた解析から生存に必須な因子であることが明らかとなった。さらにEaf6遺伝子破壊株を利用し、Eaf6欠損時における各種セントロメアタンパク質、およびセントロメア機能に与える影響を解析した。これまで、SILAC法により複数のセントロメアタンパク質の局在が減少する結果を得た。2.Eaf6タンパク質の異所局在による機能解析Eaf6-LacI融合タンパク質を作製し、染色体の任意の場所にLacO配列を挿入したDT40細胞へ導入を行った。この細胞株を使用し、LacO-LacI実験系によりEaf6を異所局在化させ、その異所局在に依存したセントロメアクロマチン構造の形成誘導活性の検証に向けた準備を行った。クロマチン構造変換によるセントロメアの誘導を目指した本実験系は、学術的および医学的にも意義のある試みである。正確な染色体分配に必須なセントロメアは、通常、染色体上の一カ所に特有なクロマチン形成を伴い構築される。しかし、どのようにセントロメア領域が規定されるのか不明な点が多い。本研究では、このクロマチン領域に集合するタンパク質を同定し、セントロメアに特異的なクロマチン形成に働く仕組みを解明することを目的とした。これまでCENP-T-W chromatin associated proteins(TW-chrop)を見出し、セントロメア機能との関連を示唆するタンパク質の特定を行ってきた。23年度は、TW-chropの機能解明に向けた以下の研究を行った。1)セントロメアに特異的なクロマチン形成におけるTW-chropの役割の解明各種セントロメアタンパク質を染色体の任意の場所へ異所局在化させ、セントロメア特有なヒストンバリアントであるCENP-Aの取り込みを指標に、セントロメアクロマチン誘導活性の検証を行った。その結果、CENP-C、CENP-IおよびHJURPの異所局在によってCENP-Aの取り込みを伴った完全なセントロメアが誘導されることを見いだした(J.C.B., 2013)。今後セントロメアクロマチン誘導機構の理解に向け、TW-chropと上記タンパク質の相互作用を中心に解析を進める計画である。2)セントロメアに特異的なクロマチン構造の形成に必須なタンパク質の生物活性の実体解明CENP-T-W-S-Xへテロ4両体を再構成し、ダイヌクレオソームとの相互作用を解析した。

その結果、CENP-Tへテロ4量体は100bpサイズのリンカーDNAを有すダイヌクレオソームと相互作用することが分かった(投稿準備中)。今後TW-chrop複合体のセントロメアクロマチン構築における活性検証に向け、TW-chrop複合体と上記複合体を利用した試験管内実験を行う計画である。セントロメアクロマチン構造形成に関与が示唆される分子複合体の同定を行い、現在機能欠損および異所局在による解析を進行していることから、研究目的の達成に向けおおむね順調に進展していると考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後の推進方策LacO-LacI異所局在実験系によるセントロメアクロマチン形成におけるTW-chropの役割の解明、および試験管内再構成系によるセントロメアクロマチン構造形成に必須なタンパク質の生物活性の実体解明を行う。
超微細加工を目的とした真空紫外超短パルスレーザー装置の開発

本研究は小型放電装置で高密度生成された希ガスエキシマによって赤外超短パルスレーザーの高次高調波を増幅し、レーザー加工に必要なミリジュール程度の出力を有する真空紫外極端パルスを発生させることを目的として研究を行ってきた。本年度は最終年度であり、以下のに示す希ガスエキシマの高次高調波による増幅評価を行った。まず、真空紫外増幅実験として、クリプトンガスキャピラリーへのYb : YLF超短パルス光照射によって7次高調波光(波長146nm,1μJ)を発生した。この7次高調波をエキシマ増幅器により増力し、サブミリジュール出力を得、当初の目的をほぼ達成することに成功した。この際、エキシマ増幅器にはこれまでに開発されてきた高クリプトンガス圧の安定なグロー放電装置を使用した。次に、真空紫外増幅光の評価として、反応素過程を踏まえた時間変動増幅モデルを構築し、数値計算と実験データを比較検討した。レーザー出力のガス圧依存性や時間波形が実験値と定量的にほぼ一致したことから増幅モデルが信頼性の高いものであることがわかった。加工部周辺への熱伝達前に加工を終了させると同時に加工物の化学結合を高い光子エネルギーで直接切断することで熱作用を伴わない次世代超微細加工を実現するためのツールとして真空紫外超短パルスレーザーの開発を行っている。有機物質の加工にはミリジュール程度のエネルギーが必要であるため、近赤外超短パルスレーザー光の高次高調波をシード光(種光)として、これを放電励起希ガスエキシマにより増幅することにより真空紫外超短パルスレーザー光を発生させる。平成14年度は、近赤外超短パルス光の高機能化と真空紫外高次高調波発生、および高密度希ガスエキシマ生成のための放電装置開発を行った。近赤外超短パルス光の高機能化として半導体レーザー直接励起による全固体再生増幅システムを開発し、24mJのパルス出力を10Hzの繰り返しで長時間安定に得ることに成功した。なお、24mJのパルス出力は、同レーザーシステムとしては世界最高出力である。このレーザー光を希ガスに集光照射することで高次高調波による真空紫外レーザー光を発生させ、波長145nm(7次高調波)において10μJのエネルギー取り出しに成功した。一方、高次高調波の増幅部として利用する放電励起希ガスエキシマ装置を開発した。高密度の希ガスエキシマを生成するためには高ガス圧下において短パルス放電による高エネルギー注入が必要である。局所的なアーク放電を避けるために予備電離ピンを増やすことで全放電領域にわたってグロー放電が得られ、1mの長尺にわたり10^<17>cm^<-2>の高いクリプトンエキシマ密度を得ることに成功した。本年度は、従来、複雑な数値シミュレーションによって間接的に求められてきた脱励起機構を、シード光をプローブ光として種々の脱励起機構を定量的に直接明らかにし、エキシマ放電装置の最適化を図った。まず、増幅に適した放電装置として長尺(1m)の放電装置を設計・製作し希ガスエキシマ生成量および空間分布を測定した結果、クリプトンエキシマは径方向中心部において10^<16>cm^2程度に高密度生成されていることがわかった。さらに、超短パルス近赤外光の高次好調波を放電部に入射し、その出射光の出力測定により利得係数0.011が見積もられた。得られたデータから反応素過程に基づくエキシマ生成モデルを構築し数値シミュレーションを行ない、ガス圧を10気圧にまであげることで数百μJの増幅出力が得られると予想しており、最適設計を行なった。また、増幅計算から真空紫外光と高次高調波であるシード光との波長は一致していることが必要であることや希ガス圧による波長掃引が予想より少ないことから、超短パルスレーザーの基本波の波長を最適化する必要性があると判断した。Yb:YAGレーザーの発振波長1030nmの7次高調波が最適であると考え、新たにYb:YAG結晶による超短パルスレーザーの開発についても並行してはじめた。既存のYb:YLFレーザーの結晶をYb:YAGに変更して分光測定を行い、高次高調波発生に必要な短パルス発生が可能であることがわかった。また、真空紫外光増幅時の自然放出による増幅光(ASE光)を低減するにはシード光による効率よいエネルギー引き出しが重要である。数値計算からエキシマが十分に生成される時間は数ナノ秒と比較的長く、ASE光低減にはエキシマ生成時に放電部にシード光があることが望ましいことからマルチパス増幅が適していることがわかった。
細胞質ホスホリパーゼA2(cPLA2)相互作用分子に関する研究

グルタチオンSトランスフェラーゼ融合cPLA2をプローブとして利用したFar-Western解析によって検出された、ラット線維芽細胞株3Y1細胞に存在する分子量60kDaのcPLA2結合タンパク質(P60)は核マトリックスを豊富に含む画分(1%NP-40不溶性画分)に大部分が存在していたので、本画分を大量に調製し同定を試みた。ポリアクリルアミド電気泳動で分離後、P60のバンドを切り出し、リジルエンドペプチターゼを用いたクリーブランド法によるペプチドマッピングを行い、2つのペプチド断片のN末端アミノ酸配列を決定することができた。これらの配列をもとに3Y1のcDNAをtemplateに用いたdegenerated PCRによりP60のcDNA断片を得た後、遺伝子データベース検索した結果、細胞骨格系タンパク質であるビメンチン(分子量57kDa)と完全に一致した。先に決定したN末端アミノ酸配列は2つともビメンチンの配列中に見いだされ、双方ともにリジン残基の直後に位置していた。実際にcPLA2とビメンチンが結合するか否かを検討するため、大腸菌を用いてリコンビナントのビメンチンを作製しFar-Western解析を行った結果、結合が検出された。また、ビメンチンを自然発生的に欠損した株が存在する培養細胞SW13を材料に用いてFar-Western解析を行うと、天然型SW13細胞には分子量60kDaのバンドが検出されたが、ビメンチン欠損株では検出されなかった。以上の結果から、分子量60kDaのcPLA2結合タンパク質P60はビメンチンであると結論した。大腸菌を用いて調製したグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合cPLA_2及びT7-tag融合cPLA_2を材料に使用して、cPLA_2相互作用タンパクの検索をFar-Western法により行った。その結果、マウス腹腔マクロファージ、マウス骨芽細胞株MCT3T3-E1及びラット線維芽細胞株3Y1に、GST-cPLA_2とT7-cPLA_2の双方を用いた際に同様に検出される、分子量約60kDaのタンパク(p60)を見いだした。Far-Western解析を行う際に、バキュロウイルス発現系で調製したcPLA_2を過剰量添加すると、p60のバンドがほぼ完全に消滅したことから、p60はcPLA_2に特異的に結合すると結論した。また、cPLA_2のN末端領域には、Ca^<2+>濃度依存的な膜移行に必須なC2ドメイン(アミノ酸の18番142番)と呼ばれる配列が存在している。そこで、膜移行機能を有するペプチドとして報告されている、cPLA_2のN末端138アミノ酸のみを融合したタンパクであるGST-cPLA_2(1-138)を作製しFar-Western解析を行った結果、このタンパクがp60と強く結合することがわかった。また、GST-cPLA_2(1-35)およびGST-cPLA_2(36-81)とp60の結合は観察されなかった。さらに、p60とcPLA_2の結合をEDTAが阻害した。従って、p60とcPLA_2の結合は、Ca^<2+>濃度依存的にCaLBドメインを介していることが予想された。3Y1細胞を材料にp60の細胞内局在性を検討した結果、p60は細胞質画分にはほとんど存在せず、核画分、特に核膜を豊富に含む画分に局在していた。以上の結果から、p60が細胞内Ca^<2+>濃度上昇を伴う刺激の際のcPLA_2の核移行に関与することが考えられる。現在は、この分子の同定を目標に研究を進めている。
細胞類似型マイクロ化学システムをめざした次世代人工細胞膜モデルの研究

細胞内小器官に相当するサブシステムを持つ次世代細胞類似型マイクロ化学システム(次世代人工細胞)の構築に用いる膜モデルとして,内部に脂質膜ベシクルを持った巨大脂質膜ベシクル(オリゴベシキュラーベシクル,OVV)を利用する可能性について検討をおこなった.手法の改良によって,課題であったOVV形成の確実性を向上させることができた.またサブシステムの基盤となるOVV内部巨大ベシクルを複数形成することが可能となる条件について有用な知見を得た.初歩的なシステムの構築と検討をおこない,これらの結果から,次世代人工細胞の構築におけるOVV利用の可能性を示した.「細胞類似型マイクロ化学システム」(人工細胞)の高度化には,細胞内小器官に相当するサブシステムを持った従来にない次世代人工細胞膜モデルが必須である.このサブシステムを持つ次世代人工細胞モデルとして内部に巨大ベシクルを保持した巨大ベシクル(オリゴベシキュラーベシクル(OVV))を考え,OVVの形成と修飾・機能化手法の開発をおこない,その可能性,問題点,限界を明らかにすることを目的として研究をおこなった.平成24年度には,当初の計画どおり,巨大ベシクル系への機能分子の組み込みにあたっての指針を得るための諸検討をおこなった.まず,シンプルな化学システムを組み込んだモデルの構築を試みるにあたり必要となる人工基質分子の設計をおこなった.さらに,化学システムを構成する単位反応に関する予備的検討をin vitroにおいておこなった.また,巨大ベシクルにおけるベシクル内部への物質移動速度に関する検討をおこなった.これらの検討により,実際の反応系構築の試みが可能となった.OVVの形成手法に関しては,マイクロマニュピレーションによるOVV形成において形成成功率が低下する原因について前年度からさら検討・考察を進め,その結果に基づいた手法の改良をおこなうことによって,従来と比較して2倍程度高い成功率でOVV形成を誘起することが可能となる条件を見いだした.これにより,マイクロマニュピレーションによるOVV形成の有用性を高めることができた.平成25年度には,前年度に得られた結果を基づいて,内部に巨大ベシクル(GV)を保持する巨大ベシクル(オリゴベシキュラーベシクル(OVV))を用いた次世代人工細胞コンセプトモデルの構築を試み,その過程で本システムの可能性と問題点とを明らかにした.マイクロ化学システムとしての挙動を解析するため,電気生理的手法の導入を検討した.また,OVV形成誘起条件の最適化と機構の解明,およびOVVの修飾・機能化方法の検討に関しては,エレクトロフォーメーション条件の最適化により従来よりもサイズの大きいGVの形成できることを明らかにし,卵細胞に匹敵する大きさの人工細胞を得る可能性を示した.さらに従来よりも大きな膜構造体に対する物理的マイクロマニピュレーションを利用したOVV形成の検討,GVのマイクロマニピュレーションへの微小電極の利用の検討,GVの迅速形成現象における膜構造体成長と膜融合との関係に関する解析などをおこなった.期間全体の研究により,「細胞類似型マイクロ化学システム」(人工細胞)の高度化に必須である細胞内小器官に相当するサブシステムを有する従来にない次世代人工細胞膜モデルとしてOVVを用いるにあたり,最も大きな課題であるOVV形成の確実性を従来よりも高める事に成功した.また,機能化においてもサブシステムの基盤となる内部GVを多数,確実に形成することが可能となる条件について有用な知見を得る事ができた.これにより,OVVを基盤として用いた,複数の内部サブシステムを持つ,より高度な細胞類似型マイクロ化学システムへの将来的な展開の可能性を示した.細胞内小器官に相当するサブシステムを持つ次世代細胞類似型マイクロ化学システム(次世代人工細胞)の構築に用いる膜モデルとして,内部に脂質膜ベシクルを持った巨大脂質膜ベシクル(オリゴベシキュラーベシクル,OVV)を利用する可能性について検討をおこなった.手法の改良によって,課題であったOVV形成の確実性を向上させることができた.またサブシステムの基盤となるOVV内部巨大ベシクルを複数形成することが可能となる条件について有用な知見を得た.初歩的なシステムの構築と検討をおこない,これらの結果から,次世代人工細胞の構築におけるOVV利用の可能性を示した.本研究では,細胞内小器官に相当するサブシステムを有する次世代人工細胞モデルとして,内部に巨大ベシクルを保持する巨大ベシクル(オリゴベシキュラーベシクル(OVV))を考え,OVVの形成と修飾・機能化手法の開発をおこない,その可能性,問題点,限界を明らかにするとともに,実証のため,比較的シンプルな化学反応系を組み込んだ次世代人工細胞のコンセプトモデルの構築を試みることを目的としている.平成23年度にはOVV形成方法の開発として,第三物質の添加による巨大ベシクルの形態変化を用いたOVV形成において,形態変化誘起能を持つ物質群の検索および母ベシクルである巨大ベシクル側の状態の影響など誘起条件に関する検討をおこない,ハロゲン化物イオンのイオン半径と誘起能との相関を見いだすなどの成果を得た.これらの成果は未だ明らかでないこのOVV形成誘起現象の機構解明にあたり重要となる知見である.またこれとは異なるOVV形成方法として,マイクロマニュピレーションにより巨大ベシクル膜を直接変形しOVV形成に導く手法について検討をおこない,従来よりも確実にOVVを得ることができる条件を明らかにした.これは本OVV形成手法を次世代人工細胞モデル構築に応用するにあたり重要な成果である.その他に,エレクトロフォーメーションにより巨大ベシクルの形成を小さなベシクルを共存させた状態でおこなうことでOVVを得る手法についてその可能性を検討し,可能ではあるが現状では効率の良いOVV形成にはさらなる改良が必要であることを示す結果を得た.

また,タンパク質等種々の物質のOVVへの内包を試みその可否を明らかにした.これは,次世代人工細胞コンセプトモデルの構築にあたり必要な予備的な知見である.研究の目的である,OVVの形成と修飾・機能化手法の開発に関しては,これまでに手法の問題点に関して検討・考察をおこない手法の改良を進めてきている.また,比較的シンプルな化学反応系を組み込んだ次世代人工細胞のコンセプトモデルの構築の試みに関しては計画のとおり予備的な検討が進んでいる.交付申請書に記載した「研究の目的」のうち,OVVの形成と修飾・機能化手法の開発をおこないその可能性,問題点,限界を明らかにする点に関しては,平成23年度に実施を計画した事項は達成している.また,実証のため比較的シンプルな化学反応系を組み込んだ次世代人工細胞のコンセプトモデルの構築を試みる点についても,当該年度に実施を計画した範囲の予備的な知見を得ることができた.当初の計画のとおり,最終年度である平成25年度にはこれまでに得られた結果を基にして,シンプルな化学システムを組み込んだOVVを用いた次世代人工細胞コンセプトモデルの構築を実際におこない,その過程で本システムの有効性および問題点等を明らかにする.問題点に関しては可能な範囲において改良のための検討をおこなう.反応速度,物質移動など化学工学的視点からも解析を試み,マイクロ化学システムとしての知見を得る.基本的には当初の計画に従って今後の研究を推進する予定である. OVVの形成と修飾・機能化手法の開発に関しては,平成23年度における成果から有望であることが明らかとなったマイクロマニュピレーションによるOVV形成についてさらに検討をおこない,より実用的なものとなるように改良を試みる.また,同様に知見が必要であることがわかった巨大ベシクル形成の温度への依存についても検討を実施する.前年度未使用額が生じた理由は,平成23年度申請時に購入を計画した備品(顕微鏡カメラシステム)が計画よりも少ない費用で構築できたため,および平成24年度の研究が当初計画で見込んだよりも安価に完了したためである.次年度には,当初の計画にある比較的シンプルな化学反応系を組み込んだ次世代人工細胞のコンセプトモデルの構築の試みおよびマイクロマニュピレーションによるOVV形成のさらなる検討と改良および巨大ベシクル形成の温度への依存に関する検討に充当する.直接経費として,物品費2,600,000円(温度制御型巨大ベシクル形成装置,巨大ベシクル原料脂質等の試薬,マイクロマニュピレータ維持部品,顕微鏡装置維持部品,超純水製造装置,プラスティック・ガラス器具などの消耗品の購入),旅費100,000円(国内学会への2回の参加),その他126,379円(研究遂行に必要な図書・資料の収集,成果取りまとめ・発表),計2,826,379円を計画している.
周波数応答の逆解析を用いた交流電磁場CT法による物体表面下の欠陥同定手法の開発

本研究の目的は,申請者らが開発した直流電気ポテンシャルCT法を拡張して,周波数を変化させたときの交流電気ポテンシャル分布などを用い,逆問題解析を行うことにより,表面直下の欠陥およびき裂を測定する交流電磁場CT欠陥同定手法を開発することである.主な研究成果は以下の通りである.1.物体の表面にあるき裂について,き裂面が表面と垂直であり,これに交流電流が負荷される場合について,境界要素電磁場解析をA-φ法により定式化し,これを組み入れたき裂長さの較正関係を作成した.2.2次元貫通縁き裂について交流電気ポテンシャル測定実験を行い,較正関係の有効性を検証し,手法が原理的に有効であることを確認した.3.表皮効果が大きく表皮の深さが0に近似的に等しい極限における電気ポテンシャル分布を計算した.4.3次元表面き裂における交流電気ポテンシャル分布を実験的に求めた.極限状態の近似解析と完全3次元解析の結果を測定結果と比較した.条件を選択すれば近似解析が有効であることがわかった.5.3次元電磁場解析法を組み入れたき裂同定プログラムを作成し,電位の実験値よりき裂の同定を行った表面き裂の同定に対して,この手法を適用し,手法の適用性を確認した.6.周波数が低い場合および直流電流負荷のもとにおける電気ポテンシャルCT法の適用性を数値シミュレーションおよび実験により調べた.複数き裂の同定に対して,細胞融合型遺伝的アルゴリズムを提案した.7.異種接合体の界面き裂の同定のため,2次元走査解析と3次元解析からなる階層的解析手法を構築した2次元および3次元界面き裂の同定に関する数値シミュレーションと実験を行い,手法の適用性を示した.本研究の目的は、申請者らが開発した直流電気ポテンシャルCT法を拡張して、周波数を変化させたときの交流電気ポテンシャル分布および電磁場応答を総合して用い、逆問題解析を行うことにより、表面直下の欠陥およびき裂を測定する交流電磁場CT欠陥同定手法を開発することである。このため、交流電流を通電したあるいは誘導電流を流したときの応答を周波数をかえて集録し、一方、周波数をパラメータとした電気ポテンシャル分布および電磁場分布の応答を電磁場解析により求め、これらを比較することにより、逆問題的にき裂の位置と形状を推定した。主な研究成果は以下の通りである。1.磁性をもつ物体の表面にあるき裂について、き裂面が表面と垂直であり、これに垂直に交流電流が負荷される場合について、境界要素電磁場解析をA-Φ法により定式化し、これを組み入れたき裂長さの較正関係を作成した。2.2次元貫通縁き裂について交流電気ポテンシャル測定実験を行い、較正関係の有効性を検証し、手法が原理的に有効であることを確認した。3.表皮効果が大きくなり表皮の深さが0に近似的に等しい極限における電気ポテンシャル分布を計算した。4.3次元表面き裂における交流電気ポテンシャル分布を実験的に求めた。極限状態の近似解析と完全3次元解析の結果を測定結果と比較した。条件を選択すれば近似解析が有効であることがわかった。5.3次元電磁場解析法を組み入れて、交流電気ポテンシャル分布より欠陥・き裂を同定するプログラムを作成した。電位の実験値にこの手法を適用し、き裂形状の同定を行った。本研究の目的は,申請者らが開発した直流電気ポテンシャルCT法を拡張して,周波数を変化させたときの交流電気ポテンシャル分布などを用い,逆問題解析を行うことにより,表面直下の欠陥およびき裂を測定する交流電磁場CT欠陥同定手法を開発することである.主な研究成果は以下の通りである.1.物体の表面にあるき裂について,き裂面が表面と垂直であり,これに交流電流が負荷される場合について,境界要素電磁場解析をA-φ法により定式化し,これを組み入れたき裂長さの較正関係を作成した.2.2次元貫通縁き裂について交流電気ポテンシャル測定実験を行い,較正関係の有効性を検証し,手法が原理的に有効であることを確認した.3.表皮効果が大きく表皮の深さが0に近似的に等しい極限における電気ポテンシャル分布を計算した.4.3次元表面き裂における交流電気ポテンシャル分布を実験的に求めた.極限状態の近似解析と完全3次元解析の結果を測定結果と比較した.条件を選択すれば近似解析が有効であることがわかった.5.3次元電磁場解析法を組み入れたき裂同定プログラムを作成し,電位の実験値よりき裂の同定を行った表面き裂の同定に対して,この手法を適用し,手法の適用性を確認した.6.周波数が低い場合および直流電流負荷のもとにおける電気ポテンシャルCT法の適用性を数値シミュレーションおよび実験により調べた.複数き裂の同定に対して,細胞融合型遺伝的アルゴリズムを提案した.7.異種接合体の界面き裂の同定のため,2次元走査解析と3次元解析からなる階層的解析手法を構築した2次元および3次元界面き裂の同定に関する数値シミュレーションと実験を行い,手法の適用性を示した.本研究の目的は,申請者らが開発した直流電気ポテンシャルCT法を拡張して,周波数を変化させたときの交流電気ポテンシャル分布および電磁場応答を総合して用い,逆問題解析を行うことにより,表面直下の欠陥およびき裂を測定する交流電磁場CT欠陥同定手法を開発することである.このため,電流を通電したあるいは誘導電流を流したときの応答を集録し,一方,電気ポテンシャル分布および電磁場分布の応答を電磁場解析により求め,これらを比較することにより,逆問題的にき裂の位置と形状を推定した.主な研究成果は以下の通りである.

1.磁性をもつ物体の表面にあるき裂について,き裂面が表面と垂直である場合について,境界要素電磁場解析をA-φ法により定式化し,これを組み入れたき裂長さの較正関係を作成した.2.2次元貫通縁き裂について交流電気ポテンシャル測定実験を行い,較正関係の有効性を検証した.3.表皮効果が大きくなり表皮の深さが0に近似的に等しい極限におけるポテンシャル分布を計算した.4.3次元表面き裂における交流電気ポテンシャル分布を実験的に求めた.極限状態の近似解析と完全3次元解析の結果を測定結果と比較した.条件を選択すれば近似解析が有効であることがわかった.5.3次元電磁場解析法を組み入れたき裂同定プログラムを作成し,電位の実験値よりき裂の同定を行った.6.異種接合体の界面き裂の同定のため,2次元走査解析と3次元解析からなる階層的解析手法を構築した.7.界面き裂の同定に関する数値シミュレーションを行い,手法の適用性を確認した.8.界面き裂を有する異種接合体の電気ポテンシャル測定を行い,表面き裂の同定を行った.本研究の目的は,申請者らが開発した直流電気ポテンシャルCT法を拡張して,周波数を変化させたときの交流電気ポテンシャル分布および電磁場応答を総合して用い,逆問題解析を行うことにより,表面直下の欠陥およびき裂を測定する交流電磁場CT欠陥同定手法を開発することである.このため,電流を通電したあるいは誘導電流を流したときの応答を集録し,一方,電気ポテンシャル分布および電磁場分布の応答を電磁場解析により求め,これらを比較することにより,逆問題的にき裂の位置と形状を推定した.主な研究成果は以下の通りである.1.表面き裂をもつ試験片における交流電気ポテンシャル分布を実験的に求めた.極限状態の近似解析と完全な3次元解析の結果を測定結果と比較した.条件を選択すれば近似解析が有効であることがわかった.2.3次元電磁場解析法を組み入れたき裂同定プログラムを作成し,電位の実験値よりき裂の同定を行った表面き裂の同定に対して,この手法を適用し,手法の適用性を確認した。3.周波数が低い場合および直流電流負荷のもとにおける電気ポテンシャルCT法の適用性を数値シミュレーションおよび実験により調べた.複数き裂の同定に対して,細胞融合型遺伝的アルゴリズムを提案した.4.異種接合体の界面き裂の同定のため,2次元走査解析と3次元解析からなる階層的解析手法を構築した2次元および3次元界面き裂の同定に関する数値シミュレーションを行い,表面き裂および内部き裂の同定に対しても,手法が適用できることを確認した.2次元および3次元界面き裂を有する異種接合体の電気ポテンシャル測定を行い,その結果をもとに表面同定を行い,手法の適用性を明らかにした.
新規超原子価ヨウ素（Ｖ）触媒の設計及びそれを用いる高選択的酸化反応の開発

2-ヨードキシ安息香酸(IBX)をはじめとする超原子価ヨウ素(V)化合物は、アルコールの酸化反応やフェノールのオルト位選択的酸化反応において有用な酸化剤として知られている。しかし、化学量論量のIBXを用いる酸化反応は、コスト面や安全性に課題が残されている。一方、当研究室では触媒量の2-ヨードベンゼンスルホン酸塩と共酸化剤としてOxoneを用い、系中で調製される2-ヨードキシベンゼンスルホン酸(IBS)を触媒とするアルコールの高効率的酸化反応及びフェノールのオルト位選択的酸化反応による1,2-キノンの効率的合成に成功している。今回、私は本触媒システムを用いて、従来法では困難であった非対称な2-置換フェノールの2位選択的酸化反応による1,2-キノールの効率的合成法の開発に成功した。4,5-Me2-IBSを用いることで、低温条件下においても効率よく反応が進行し、高い位置選択性で目的とする1,2-キノールを得ることができた。さらに、基質の2位にシリルメチル基を導入して本手法に適用することで、位置選択性がさらに向上することを見出した。一方、本基質の酸化反応において化学量論量のIBXを用いた場合、大きな位置選択性の向上は見られなかった。得られた含シリルキノールは様々な有用骨格へと誘導可能である。本手法は、超原子価ヨウ素を用いた初の1,2-キノール合成法であり、従来法と比較して基質適用範囲が広く実用性も高いため、環境低付加型の優れたヨウ素(V)触媒システムであると言える(Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, in press, DOI: 10.1002/anie.201612463.)。28年度が最終年度であるため、記入しない。5価の超原子価ヨウ素化合物である2-ヨードキシ安息香酸(IBX)は重金属酸化剤や遷移金属触媒の代替酸化剤としてこれまで多くの酸化反応に用いられてきた。しかし、IBXは溶解性が悪く、また爆発性を有するなどの課題が残されている。これに対し、当研究室では触媒量の2-ヨードベンゼンスルホン酸塩(pre-IBS)とOxoneからin situで調製される5価の2-ヨードキシベンゼンスルホン酸(IBS)を酸化剤として用いるアルコールの高効率的及び高選択的酸化反応、ならびにフェノールのオルト位選択的酸化反応による1,2-キノンの効率的合成法の開発にそれぞれ成功している。これまでに、本触媒システムは工業化に成功しており、非常に価値の高い酸化反応システムである。26年度の研究では、IBS/Oxone触媒的酸化反応システムの汎用性の拡張として、フェノールのオルト位選択的酸化反応による1,2-キノールの合成法の開発を行った。IBS触媒はIBXと比較して、ヨウ素のLewis酸性が高く、強い酸化能力を有する。そのため、従来のIBX酸化法では酸化されにくい基質においても、IBS/Oxone触媒的酸化反応システムに適用することで効率的に酸化することができた。また、従来法では困難であった非対称フェノールの高位置選択的酸化反応の開発に成功した。本手法を用いて、高い化学収率で天然物(±)-Biscarvacrolを得た。さらに、フェノールのベンジル位にシリル基を導入することで、位置選択性を大きく向上させることに成功した。この発見により、一般的に困難であった、o-クレゾール類の位置選択的酸化反応に成功した。また、現在新規超原子価ヨウ素(V)触媒の設計、及びその触媒活性の検討を行っている。これに対し、当研究室では触媒量の2-ヨードベンゼンスルホン酸塩(pre-IBS)とOxoneからin situで調整される5価の2-ヨードキシベンゼンスルホン酸(IBS)を酸化剤として用いるアルコールの高効率的及び高選択的酸化反応、並びにフェノールのオルト位選択的酸化反応による1,2-キノンの効率的合成法の開発にそれぞれ成功している。これまでに、本触媒システムは工業化に成功していおり、非常に価値の高い酸化反応システムである。26年度の研究では、フェノールのオルト位選択的酸化反応による1,2-キノールの合成法の開発を行い、基質のオルトベンジル位にシリル基を導入することで、位置選択性を大きく向上させることに成功した。そこで、27年度の研究では、シリル基置換フェノールの酸化反応における基質適用範囲の拡大、及びシリル基の誘導を目指して研究を行った。基質適用範囲の検討では、フェノールの4位に置換基を有する基質において、生成物の1,2-キノールが二量化しにくく、系中の酸性度によって生成物からオルトキノンメチドが発生すること初めて突き止めた。オルトキノンメチドを有効利用した付加環化反応によってクロマン骨格の合成にも初めて成功した。一方、系中の酸性度を抑えることで、オルトキノンメチドの発生を抑制し、1,2-キノール誘導体を選択的に得ることにも成功した。シリル基の誘導では、シリル基の脱保護に限らず、オレフィン化や、続くエポキシ化によって有用な骨格への誘導も達成することができた。

現在の研究目的は超原子価ヨウ素(V)触媒を用いる高選択的な酸化反応の開発である。本研究員は、当研究室で開発されたIBS/Oxone触媒システムを用いてフェノールの酸化反応による1,2-キノールの効率的合成に成功した。この過程で、ベンジル位にシリル基を導入することでより位置選択性が向上することを新たに見出し、従来にない高選択的な酸化反応の開発を達成することができた。また、シリル基を有効活用することで、研究開始当初では予期していなかった様々な有用骨格の合成にも適用することが可能となった。この新発見は、当初予定していた不斉合成への展開にも活かすことのできる重要な知見であると言え、当初の研究計画以上に進展していると言える。2-ヨードキシ安息香酸(IBX)をはじめとする超原子価ヨウ素(V)化合物は、アルコールの酸化反応やフェノールのオルト位選択的酸化反応において有用な酸化剤として知られている。しかし、化学量論量のIBXを用いる酸化反応は、コスト面や安全性に課題が残されている。一方、当研究室では触媒量の2-ヨードベンゼンスルホン酸塩と共酸化剤としてOxoneを用い、系中で調製される2-ヨードキシベンゼンスルホン酸(IBS)を触媒とするアルコールの高効率的酸化反応及びフェノールのオルト位選択的酸化反応による1,2-キノンの効率的合成に成功している。今回、私は本触媒システムを用いて、従来法では困難であった非対称な2-置換フェノールの2位選択的酸化反応による1,2-キノールの効率的合成法の開発に成功した。4,5-Me2-IBSを用いることで、低温条件下においても効率よく反応が進行し、高い位置選択性で目的とする1,2-キノールを得ることができた。さらに、基質の2位にシリルメチル基を導入して本手法に適用することで、位置選択性がさらに向上することを見出した。一方、本基質の酸化反応において化学量論量のIBXを用いた場合、大きな位置選択性の向上は見られなかった。得られた含シリルキノールは様々な有用骨格へと誘導可能である。本手法は、超原子価ヨウ素を用いた初の1,2-キノール合成法であり、従来法と比較して基質適用範囲が広く実用性も高いため、環境低付加型の優れたヨウ素(V)触媒システムであると言える(Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, in press, DOI: 10.1002/anie.201612463.)。当初研究目的は、超原子価ヨウ素(V)触媒を用いるフェノールの高位置選択的酸化反応の開発である。申請者は、26年度の研究として当研究室で開発されたIBS/Oxone触媒的酸化反応システムを2-置換フェノール類の酸化反応に適用することで、超原子価ヨウ素触媒を用いた初のフェノール類の酸化反応による1,2-キノール類の効率的合成に成功した。本手法を用いることで、従来法では酸化が困難であった基質においても反応が進行することを見出した。さらに、従来法と比較して、高い位置選択性を発現させることに成功した。さらに本研究員は、これらの結果から得た知見を応用し、基質のo-メチル位にシリル基を導入することで、より位置選択性を向上させることに成功した。この発見により、基質一般性や位置選択性が大幅に向上し、一般的に困難であったo-クレゾール類の位置選択的酸化反応に成功した。
ベトナムの市場で販売される家鴨卵中の抗高病原性鳥インフルエンザウイルス抗体調査

本研究は、北部ベトナムの市場で売られているアヒル卵が保有する移行抗体から、親鳥における鳥インフルエンザウイルスに対する抗体保有率を明らかにする。2010年4月から2012年3月までの2年間、毎月、ハノイ市内、10カ所の市場から各10個のアヒル卵を入手し、H4, H5, H6, H7, H9, H11亜型ウイルスに対する抗体を調べた。その結果、抗体陽性率は抗H4(0. 8%),抗H5(44. 1%),抗H6(11. 5%),抗H7(0%),抗H9(1. 2%),抗H11(2. 1%)を示した。これらの結果から、卵を用いて簡易にアヒルにおける鳥インフルエンザウイルスの流行状況を知ることができた。本研究は、北部ベトナムの市場で売られているアヒル卵が保有する移行抗体から、親鳥におけるH5N1亜型鳥インフルエンザウイルス(以下H5N1)の自然感染状況を把握し、食の安全に関する調査を目的とする。平成21年度は、ウエスタンブロッティング法に用いるNS1抗原の作製および精製法を確立した。NS1タンパク質はウイルス粒子に取り込まれない非構造タンパク質で、ワクチン接種ではNS1タンパク質に対する抗体は産生されず、抗NS1抗体の存在はウイルスに感染したことを示し、ワクチン接種鳥とウイルス感染鳥を分けることが可能となるタンパク質である。作製したNS1抗原はベトナムにおいて人から分離されたH5N1のNS1タンパク質遺伝子をpGEX-5X-1ベクターに挿入し、GST結合型NS1タンパク質として大腸菌に発現させ、グルタチオンセファロースに吸着させて精製、濃縮した。各タンパク質の大きさはNS1タンパク質が約28kD、GSTが約26kDで、SDS-PAGEにて、合計約50kD付近に発現タンパク質のバンドを検出した。精製NS1タンパク質はベトナム国立獣医検査局(NCVR)から分与されたH5N1感染アヒル血清と反応することをウエスタンブロッティング法にて確認した。さらに、分担研究者である伊藤、村瀬らが2006年から2007年に北部ベトナムの農場から採取したアヒル血清を用いて、その反応性を確認した。本年度はハノイ市内の市揚(10市場)から購入したアヒル卵(1市場10個)の卵黄からIgYを精製し、抗H5特異HI抗体保有状況を調べ、さらに作製したNS1抗原を用いたウエスタンブロッティング法にて、NS1抗体調査を行う。昨年度は毎月、ハノイ市内の市場(10市場)から購入したアヒル卵(1市場10個)の卵黄からIgYを精製し、抗H5,H6,H9特異HI抗体保有状況を調べた。現在までに平成22年4月から7月までの合計384検体の解析が終わっている。HI抗体保有率は抗H5が約47%、抗H6が約18%、抗H9が約1.8%であった。このうち、8192力価以上の高いHI力価を示した検体は抗H5に7検体、抗H6に28検体、抗H9に4検体あった。そして、抗H9特異HI抗体が高い値を示すと抗H5および抗H6特異HI抗体価も交差して高くなる傾向がみられたが、更なるデータ蓄積が必要である。また、国の行政指導で行っているH5N1ワクチン接種については、高い力価を示した7検体を除いて、約50%という抗H5特異HI抗体保有率は自然感染ではなくワクチン由来の可能性が高いと考えられるが、抗H5特異HI抗体の非保有率も50%であり、国の指導が行き届いていないことも浮き彫りになった。これらの結果から、産卵アヒルは食肉アヒルよりも長期間、飼育されるにも関わらず、ワクチン接種が徹底されておらず、インフルエンザ流行地では危険な状態にあることが解った。本年度は残りの精製IgY検体について、HI試験を行うと共に、毎月、ハノイ市内の市場(10市場)からアヒル卵(1市場10個)を購入し、データの蓄積を継続する。毎月、ハノイ市内の市場(10市場)から購入したアヒル卵(1市場10個)の卵黄からIgYを精製し、抗H5,H6,H9特異HI抗体保有状況を調べた。

平成22年4月から平成24年3月までの間に合計2398検体の解析を行った。HI抗体保有率は抗H5が約44%、抗H6が11%、抗H9が1.2%であった。ベトナムでは、1年に2回抗H5N1ウイルスに対するワクチン接種を行っているため、抗体調査では、陽性抗体がワクチン接種によるものか、自然感染によるものかの区別は困難である。しかしながら、3ヶ月から5ヶ月周期で、抗体陽性率が変動していることから、H5(N1)ウイルスがアヒルの中で自然感染していることが予想される。また、調査を行った2年の間に、抗H6抗体陽性率が2010年4月に40%と2010年10月と11月にそれぞれ55%,51%を示し、この時期以外の陽性率は平均5%であったことから、アヒルの中で2回のH6亜型ウイルスの大規模な流行があったことが示唆される。最後に陸生鳥類が宿主であるH9ウイルスに対する抗体陽性率は2年間を通して1.2%だったことから、陸生鳥類から水禽類であるアヒルへのH9亜型ウイルスの感染拡大は少数であることもこれらの結果から示唆された。本研究により、ベトナムでのインフルエンザウイルス流行調査に卵黄から精製したIgYを用いることで、有用な情報を得られることが証明された。また、疫学調査は長期間の監視を行うことが重要であり、卵黄を用いることで、安価かつ簡便に長期間の調査が可能となることが明らかになった。