hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
複合糖質オリゴ糖鎖ライブラリーの作製と機能化

複合糖質の分子認識に関わる重要オリゴ糖単位を合成するため、グリコシダーゼを触媒素子とし従来では達成し得ない実践的合成プロセスの確立し、これらオリゴ糖鎖ライブラリーを作製する。合成したオリゴ糖鎖を認識マーカーとして高分子に組み込んだ糖鎖高分子を構築し、レクチンとの相互作用の解析から糖鎖認識発現の機作を究明する。1.Bacillus circulans由来β-D-ガラクトシダーゼのガラクトシル糖転移特性を解したところ、GlcNAcとGalNAcを受容体とすると(1-4)-結合形成が優先し(1-3)-結合の生成は見られないが、GlcとGalに対しては前者の他に(1-3)-結合形成がかなりの割合で生じ、C-2のacetmamido基が位置選択性を支配していることを明らかにした。2.ポリラクトサミン系糖鎖に含有する3糖単位(GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc)をNocardio orientalis由来β-N-アセチルヘキソサミダーゼ(β-NAHase)を用い、N-アセチルラクトサミン(LacNAc)を受容体にGlcNAc転移させる合成法を確立した。3.ムチン型オリゴ糖鎖I型およびこれを基本としたII型オリゴ糖鎖構造を作製するために、ブタ糖巣由来β-D-ガラクトシダーゼとN.orientalis由来β-NAHaseの特異転移反応を活用し、ムチン型II型糖鎖コアーGalβ1-3[GlcNAcβ1-6]GalNAcα-pNPの逐次合成法を開発した。4.これまでに酵素合成した一連のβ-ガラクトシルやN-アセチルグルコサミニル2糖を出発原料としてこれらを側鎖を高分子に導入したポリアクリル型やポリグルタミン酸型の人工糖鎖高分を構築した。これらを用い各種レクチンとの相互作用を解析したところ、糖鎖プローブとしての利用の可能性が実証できた。本研究は、オリゴ2糖を出発基材としてグリコシダーゼの転移・水解反応を利用して複合糖質の分子認識シグナルに関わるとされる重要オリゴ3-4糖の実践的オリゴ糖鎖構築法を開発し、糖鎖ライブラリーの作製を行うことを目的としている。1.ムチン型オリゴ糖鎖I型のミミック単位であるGalβ1-3GalNAcα-pNPからNocardia orientalis由来β-N-アセチルヘキソサミニダーゼ(β-NAHase)の糖鎖延長反応を活用しムチンII型構造を有する型Galβ1-3[GlcNAcβ1-6]GalNAcα-pNP単位の位置選択的酵素合成法を確立した。2.上記成果によるN.orientalis由来β-NAHaseのG1cNAc転移反応を応用し、N-アセチルラクトサミン(LacNAc)受容体基質に適用したところ、GlcNAcβ1-3 Galβ1-4GlcNAc3糖単位の合成も可能であった。この場合、受容体とシクロデキストリンとを包接複合体と成し反応を行うとGlcNAc転移の位置選択性の操作が可能で、目的化合物の収率の向上をもたらした。3.Alcaligenes sp.由来α-L-フコシダーゼを触媒素子としてp-ニトロフェニルα-L-フコピラノシドからラクトースやLacNAc受容体のOH-3'位にに高位置選択的にフコシル転移した3'-0-フコシル・ラクトース(Fucα1-2Galβ1-4GLc)および3'-0-フコシル・ラクトサミン(Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc)が高収率で得られる実践的酵素合成法を確立した。

昨年度の成果に基づき糖質水解酵素の得異な糖転移作用や糖転移酵素の合成作用を駆使し、分子認識オリゴ糖鎖の実践的合成プロセスを確立し、さらなるオリゴ糖鎖ライブラリー化を推進するとともに、これらオリゴ糖鎖の糖鎖プローブとしての工学的な展開研究を行った。1.ムチン型オリゴ糖鎖I型およびこれを基本としたII型オリゴ糖鎖構造を作製するために、ブタ精巣由来β-D-ガラクトシダーゼとN.orientalis由来β-NAHaseの特異な転移反応を活用し、ムチン型II型糖鎖コアーGalβ1-3[GlcNAcβ1-6]GalNAcα-pNPのの実践的な逐次合成法を開発した。2.ウシ血清由来のβ1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを用い、UDP-GlcNAc供与体からラクトース受容体OH-3'位への位置特異的転移により高収率でラクト-N-トリオース11(GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNac)を合成できた。3.オリゴ2糖鎖ライブラリーを活用し、N-アセチルラクトサミンおよび関連2糖をポリスチレン型、ポリアクリル型、ポリグルタミン酸の高分子側鎖に組み込んだ人工糖鎖高分子を系統的に合成した。これらを用い各種糖結合特異性がよく知られているレクチンとの相互作用を解析したところ、2糖鎖程度の短鎖側鎖であってもレクチンの糖鎖認識に応じた結合特性を示すばかりか、高分子効果(クラスター効果)による反応性の増幅作用も持ち合わせていた。
LDL受容体mRNAの分解抑制による高コレステロール血症改善の分子基盤解明

近年、HepG2細胞において、AICAR (5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside)という化合物がLDL受容体mRNA量を増加させると報告された。申請者がそのメカニズムを解析したところ、AICARによるLDL受容体mRNA量の増加は、転写に起因するのではなく、mRNAの安定化に起因することが明らかとなった。これまでに申請者は、LDL受容体mRNAに結合する因子としてAUF1 (ARE/Poly(U)-binding degradation factor)とHuR (Human antigen R)を同定している。AUF1,HuR共にLDL受容体mRNAに結合して、その分解を抑制することが示されていることから、AICARによってこれらの因子の結合能が変化する可能性が考えられた。そこで、AICARで処理したHepG2細胞におけるLDL受容体mRNAとの結合量を解析した結果、AICARおよびHuR共に、AICARによってLDL受容体mRNAへの結合が増加することが示された。AICARによるLDL受容体mRNAの安定化が、生体におけるLDL代謝に反映されるかについて解析するため、高コレステロール血症状態にしたハムスターにAICARを投与した。その結果、AICARを投与した群で、血中LDL値の低下が認められた。以上の結果から、AICARによってAUF1およびHuRのLDL受容体mRNAへの結合が増加してmRNAが安定化すること、またmRNAの増加はLDLのクリアランスを亢進させることが明らかとなった。これまでに申請者は、LDL受容体mRNAの安定性を規定する領域として、3'UTRに存在するARE(AU-richelement)1を見出し、このARE1に結合するタンパク質を探索した結果、複数のタンパク質が結合している可能性を示した。siRNAを用いた解析により、ARE1結合タンパク質の1つがAUF1(ARE/Poly(U)-binding degradation factor)であることを同定し、AUF1がLDL受容体mRNAの分解を抑制することを明らかにした。本年は、AUF1とLDL受容体mRNAの結合実験を行い、AUF1とLDL受容体mRNAが結合することを明らかにした。これにより、AUF1によるLDL受容体mRNAの分解抑制が、直接的な作用に起因することが示された。また、AUF1をノックダウンしたときの、LDL受容体のタンパク質発現量を解析するために、蛍光ラベルされたDiI-LDLの取り込み実験を行った。予想では、AUF1をノックダウンしたときLDL受容体mRNAの分解は亢進するので、LDLの取り込みは減少するはずであったが、AUF1をノックダウンした細胞でのLDL取り込みは増加していた。ウエスタンブロット解析の結果、同条件では、LDL受容体遺伝子の転写活性化に働くSREBP2(sterol regulatory element binding protein)が活性化しており、この矛盾点を説明することは可能であると言える。さらに、AUF1とは別に、siRNAを用いた解析により、ARE1結合タンパク質の1つがHuR(Hu antigen R)であることを同定し、HuRがLDL受容体mRNAの分解を抑制することを明らかにした。
メラノサイト分化におけるPKAとPKCの関与-miミュータントマウスでの解析-

メラノサイトの初期の発生に関わる因子のうちKit ligand(Kitl)/Kit情報伝達系はメラノサイトが神経管から皮膚への移動の時期に必須であること、endothelin3(Edn3)がこの時期のKit陽性のメラノサイト前駆細胞を爆発的に増殖させる結果、メラノサイトが全身に供給されると考えられている。またMitfはチロシナーゼやtyrosinase rerated protein 1(Tyrp1)の転写因子であるが、Mitfのミュータントはメラノサイトが存在しないため白色毛であり、Mitfの重要な役割は他にもある可能性がある。平成15年度Mitfの機能を検討するためMitf^<mi-ew>マウスの神経冠の培養系にメラノサイト分化に関与する因子を添加し、Mitfの機能を補える因子があるか検討した。まず、メラノサイト分化の初期に重要な因子であるKitlおよびエンドセリン3(Edn3)を使用し、TPAとCTについても検討した。結果:kitl、Edn3、Kitl+Edn3を添加培養した神経冠細胞中にはこの培養系での初期のメラノサイトのマーカーとなるKit陽性細胞は出現しなかった。ところが、Kitl+Edn3にTPAとCTをすべて添加すると、弱いがKit陽性細胞が持続的に観察された。さらに、メラノサイトの分化マーカーであるTyrp1,Tyrp2およびチロシナーゼ陽性細胞の出現を検討したところ、Tyrp1のみであったが陽性細胞が出現し、その数は経時的に増加しKit陽性細胞より強くそして数多く観察された。この結果からはTPAとCTはMitf^<mi-ew>マウスにおいてMitfの機能を一部補い、Tyrp1を発現し、チロシナーゼを発現する前の段階までメラノサイトの分化を誘導できることがわかった。平成16年度平成15年度の結果から、生存に関与するMitfの機能はTyrp1を発現してメラノサイトの分化を誘導することである可能性が考えられた。メラノサイト細胞株を用いてMitfをノックダウンし、Tyrp1の発現が減少し、細胞死にいたればその仮説の裏ずけとなると考え、MitfのsiRNAを用いてRNA interference(RNAi)を行った。前回の本研究で報告したKit陰性のcell lineNCCmelb4M5が現在報告されている最も幼若な細胞株なので、これを使用した。結果:まだ初歩的実験であるが、Mitfが効果的にノックダウンできると、Tyrp1のRNAの発現量も劇的に減少し、細胞死が誘導された。再現性を確認すると同時に次は、Tyrp1をノックダウンし細胞死が誘導されるか確認する必要がある。メラノサイトの初期の発生に関わる因子で近年明かにされた因子のうちstem cell factor(SCF)とそのレセプターであるKIT、endothelin3(EDN3)とそのレセプターであるEDNRBそして転写因子であるmicrophthalmia-

assogiated transcription factor(MITF)に着目し、それらが発生のどの時期にどの様に相互作用するか明らかにする事を目的とした。野生型では神経冠培養細胞はSCFを添加培養するとKIT,TYRP2,TYRP1,tyrosinaseの順に陽性細胞が出現することを報告してきたが、MITFのミュータントマウスの神経冠をSCFやEDN3を添加培養してもメラノサイトに分化しない事が報告されている。しかし、前年度の本研究ではPKCの活性化因子であるTPAとPKAの活性化因子であるコレラトキシンをSCFとEDN3とともに添加したところKIT,TYRP1陽性細胞すなわちメラノサイトの出現が確認された。本年度はその出現時期を検討した。KIT陽性細胞は培養2日から確認できたが培養4日、6日が最も多かった。またSCF,EDN3,TPA,コレラトキシンの各種の組み合わせのうちで最も陽性細胞が多かったのはSCF+TPA+コレラトキシンであり、EDN3はその発現を抑制した。また、培養を継続してもtyrosinase陽性細胞は出現せず、過去の報告涌りtyrosinaseの発現にはMITFが必須であることが再確認された。メラノサイトの初期の発生に関わる因子のうちKit ligand(Kitl)/Kit情報伝達系はメラノサイトが神経管から皮膚への移動の時期に必須であること、endothelin3(Edn3)がこの時期のKit陽性のメラノサイト前駆細胞を爆発的に増殖させる結果、メラノサイトが全身に供給されると考えられている。またMitfはチロシナーゼやtyrosinase rerated protein 1(Tyrp1)の転写因子であるが、Mitfのミュータントはメラノサイトが存在しないため白色毛であり、Mitfの重要な役割は他にもある可能性がある。前年度の本研究でMitfの機能を検討するためMitf^<mi-ew>マウスの神経冠の培養系にメラノサイト分化に関与する因子を添加し、Mitfの機能を補える因子があるか検討した。その結果、TPAとCTはMitf^<mi-ew>マウスにおいてMitfの機能を一部補い、Tyrp1を発現し、チロシナーゼを発現する前の段階までメラノサイトの分化を誘導できることがわかった。この結果から、生存に関与するMitfの機能はTyrp1を発現してメラノサイトの分化を誘導することである可能性が考えられた。今年度はメラノサイト細胞株を用いてMitfをノックダウンし、Tyrp1の発現が減少し、細胞死にいたればその仮説の裏ずけとなると考え、MitfのsiRNAを用いてRNA interference(RNAi)を行った。前回の本研究で報告したKit陰性のcell line, NCCmelb4M5が神経冠由来の現在報告されている中で最も幼若な細胞株なので、これを使用した。結果:まだ初歩的実験であるが、Mitfが効果的にノックダウンできると、Tyrp1のRNAの発現量も劇的に減少し、細胞死が誘導された。実験の回数を増やして再現性を確認すると同時に次は、Tyrp1をノックダウンし細胞死が誘導されるか確認する必要がある。
内喉頭筋を支配する疑核運動神経細胞への上位中枢からの投射に関する研究

喉頭の代表的な機能には発声、呼吸、嚥下機能が挙げられる。喉頭運動は、直接的には延髄疑核に存在する運動神経細胞から迷走神経を介して制御されているが、周辺臓器との複雑な協調運動である発声、呼吸、嚥下運動を遂行するためには疑核には上位中枢からの複雑な入力があることが示唆されている。疑核は吻尾方向に長くかつ細胞密度が疎な神経核であることと、延髄の腹側に位置するという解剖学的な特殊性から、選択的に神経トレーサーを疑核のみに注入することはきわめて困難であった。このため疑核への上位中枢からの投射経路を明確にすることは喉頭研究における未解決の課題であった。近年、神経親和性を有し、シナプスを越えて感染を起こすヘルペスウイルスを神経トレーサーとして利用する手技が確立された。ウイルスを神経トレーサーとして用いた研究は少数の報告があるのみで、喉頭に関しては未だ体系的な報告がない。本研究では、疑核運動神経細胞へ投射する上位中枢の局在を、ヘルペスウイルスを神経トレーサーとして使用する手法によって解明することを目的とした。マウス輪状甲状筋および甲状披裂筋支配細胞にヘルペスウイルスを注入し、一定の生存期間の後に灌流固定を行い、全脳を摘出、凍結連続切片を作製し、抗ヘルペスウイルス抗体を用いた免疫組織化学法を施行した。再現性の高い標識結果を得ることが可能であった。これらの結果から、疑核への上位中枢からの投射を神経解剖学的に解明した。標識された神経核は輪状甲状筋注入群では、疑核後核、網様核、孤束核、最後野、傍三叉神経核、前庭神経核であり、甲状披裂筋注入群ではこれらに加え、蝸牛神経核も標識された。これらの神経核は両側性に標識され、疑核への投射は両側性であることが確認された。ウイルスを神経トレーサーとして用いた研究は少数の報告があるのみで、喉頭に関してはほとんど報告がない。我々はヘルペスウイルスを神経トレーサーとして使用し、内喉頭筋を支配する疑核運動神経細胞への上位中枢からの投射について検討を行った。実験にはマウスを用いた。まず、輪状甲状筋または甲状披裂筋・外側輪状披裂筋に蛍光色素を局注し、一定の生存期間の後、灌流固定を行って脳幹を摘出した。脳幹の凍結連続切片を作成し蛍光顕微鏡下に観察、マウス疑核における内喉頭筋支配運動神経細胞の局在を確認した。他の動物種と同様、輪状甲状筋支配細胞は疑核の吻側に、甲状披裂筋・外側輪状披裂筋支配細胞は疑核の尾側に局在した。次に、同様の部位にヘルペスウイルスを局注し、一定の生存期間の後灌流固定を行って全脳を摘出した。全脳の連続切片を作成し、ヘルペスウイルスに対する特異抗体を用いて免疫染色を施行し、結果を解析した。疑核、疑核後核、延髄網様体、孤束核、傍三叉神経核、最後野などに陽性細胞を認めた。この結果はこれまでの電気生理学的手法、薬理学的手法を用いた報告を裏付けるものであった。現在、外喉頭筋や下咽頭収縮筋を支配する神経回路に関し同様の手法を用いて検討中である。
高リスク神経芽細胞腫に対するテロメラーゼ標的型ウイルスを用いた複合免疫療法の開発

小児の代表的ながんである神経芽細胞腫は難治性の疾患であり、新たな治療法の開発が重要な課題である。近年、免疫チェックポイント阻害剤が成人に対する第4のがん治療として注目されているが、小児の悪性腫瘍に対する治療効果はいまだ不明である。申請者は、がんに対する新たな治療法であるテロメラーゼを標的とする腫瘍融解ウイルス療法がMYCN増幅型神経芽細胞種株に対する治療効果を示すことを明らかにした。本研究では、高リスク神経芽細胞腫株に対するテロメラーゼ標的型ウイルスと免疫チェックポイント阻害剤(抗PD-1抗体)の併用効果について解析を行い、有効性と臨床応用の可能性を検証する。
Todd類の源を求めて

(1)複素ベクトル束の切断の組による,対応するChern類の局所化理論を展開した.またこの場合の孤立特異点における留数の解析的,代数的および位相幾何的な具体的表示を与えた.最高次Chern類の場合はThom類がその局所情報を含み,Bochner-Martinelli核を通じて解析的,代数的,位相幾何的諸不変量を生み出す源となっていた。他のChern類についても"中間Thom類"を見い出した.ここで用いられた方法は,複素ベクトル束の間の準同型写像の退化集合の問題にも極めて有効であることが判明し,いわゆるThom-Porteous公式の見通しの良い新しい証明が得られた.この方法は,多様体が特異点を持つ場合にも有効であるという利点をもつ.(2)特性類の局所化および留数理論の複素力学系理論への応用として,複素特異曲面の自己双正則写像とその不変曲線に対し,留数公式を証明し,これを用いて孤立特異点を持つ複素曲面の自己双正則写像の不動点における双曲曲線の存在を証明した.このために,特異複素曲面内の曲線の交点理論を展開した.これは特異多様体上のGrothendieck留数を基礎とした解析的な局所理論と,Chern類の局所化理論を基礎とした大域理論からなり,両者はCech-de Rhamコホモロジー理論および階層化された空間上の積分理論で結びつけられる.W.Fultonの著書"Intersection Theory"では代数的な交点理論が展開されているが,上記2項目の成果は幾何学的,解析的観点をも含んだ大きな理論体系となり得るもので,本研究課題の目標に向けての大きな一歩である.上記課題研究のため、研究代表者諏訪を中心に、まずChern類の局所化と留数に関する詳細な研究を行った.従って,留数Res_c^n(s,E|v;S_λ)が具体的に求められるたびに重要な公式が得られる.本年度はS_λが孤立点pからなる場合に,留数の三種類の具体的表示(解析的,代数的,位相幾何学的表示)を与えた.解析的表示はV上のGrothendieck留数で与えられ,計算可能である.代数的にはC-代数O_<W,p>/F(V)の次元として与えられる.ここで,O_<W,p>はpにおけるWの正則関数の芽のなす環,F(V)はsのFittingイデアルとVのpにおけるイデアルで生成されるO_<W,p>のイデアルを表す.位相幾何学的には,sをV\{p}からStiefel多様体への写像と思ったときの写像度として与えられる.応用として特異点の既知のさまざまな不変量の計算法,表現法,新しい不変量,およびそれらの間の興味深い関係式等を与えた.研究代表者諏訪を中心に上記課題につき研究を行い,次のような成果を得た.複素ベクトル束の最高次Chern類の一つの切断による局所化理論を一般化し,ベクトル束の切断の組による,対応するChern類の局所化理論を展開した.またこの場合の孤立特異点における留数の解析的,代数的および位相幾何的な具体的表示を与えた.最高次Chern類の場合はThom類がその局所情報を含み、Bochner-Martinelli核を通じて解析的,代数的,位相幾何的諸不変量を生み出す源となっていた.他のChern類についても"中間Thom類"を見い出した.これは本研究課題の目標に向けての大きな一歩である.特性類の局所化および留数理論の複素力学系理論への応用として,複素特異曲面の自己双正則写像とその不変曲線に対し,留数公式を証明し,これを用いて孤立特異点を持つ複素曲面の自己双正則写像の不動点における双曲曲線の存在を証明した.このために,特異複素曲面内の曲線の交点理論を展開した.これは特異多様体上のGrothendieck留数を基礎とした解析的な局所理論と,Chern類の局所化理論を基礎とした大域理論からなり,両者はCech-de Rhamコホモロジー理論および階層化された空間上の積分理論で結びつけられる.この方法は一般次元の特異多様体上の交点理論の構成にも有効で,本研究課題への応用が期待される.(1)複素ベクトル束の切断の組による,対応するChern類の局所化理論を展開した.またこの場合の孤立特異点における留数の解析的,代数的および位相幾何的な具体的表示を与えた.最高次Chern類の場合はThom類がその局所情報を含み,Bochner-Martinelli核を通じて解析的,代数的,位相幾何的諸不変量を生み出す源となっていた。他のChern類についても"中間Thom類"を見い出した.ここで用いられた方法は,複素ベクトル束の間の準同型写像の退化集合の問題にも極めて有効であることが判明し,いわゆるThom-Porteous公式の見通しの良い新しい証明が得られた.この方法は,多様体が特異点を持つ場合にも有効であるという利点をもつ.(2)特性類の局所化および留数理論の複素力学系理論への応用として,複素特異曲面の自己双正則写像とその不変曲線に対し,留数公式を証明し,これを用いて孤立特異点を持つ複素曲面の自己双正則写像の不動点における双曲曲線の存在を証明した.このために,特異複素曲面内の曲線の交点理論を展開した.

これは特異多様体上のGrothendieck留数を基礎とした解析的な局所理論と,Chern類の局所化理論を基礎とした大域理論からなり,両者はCech-de Rhamコホモロジー理論および階層化された空間上の積分理論で結びつけられる.W.Fultonの著書"Intersection Theory"では代数的な交点理論が展開されているが,上記2項目の成果は幾何学的,解析的観点をも含んだ大きな理論体系となり得るもので,本研究課題の目標に向けての大きな一歩である.
寝床振動センサーを用いた睡眠モニタリング法の開発-転落防止策の確立を目指して-

研究について十分説明し、実験協力の同意を得られた健康成人を対象に、試作した体動検知パネル(以下パネル)を用いて睡眠中の活動量と、パネルによって得られたひずみ値(ε)及びその変化量(Δε)を計測した。活動量及びひずみ値は5秒毎に計測し、データロガーに記録した。ひずみ変化量(Δε)と活動量を時系列分析したところ、活動量がひずみ変化量より30秒から1分程度先行していた(交差相関係数:CCF>0.5)。試作したパネルによって睡眠時の体動を精度良く感知できることから、起き上がり前の動作(起床予備動作)を把握することができれば事故防止策として活用可能といえる。さらに、被験者からは背部の違和感などの訴えはなかったことから、長期間継続したモニタリングに適していることが明らかとなった。睡眠中の活動量測定は睡眠障害の診断補助や臨床研究などに有用であるとされていおり、このパネルを用いた睡眠時体動計測システムにより、睡眠潜時や中途覚醒を推定することができるため、睡眠の客観的評価ツールとして十分活用できると思われる。しかし、パネルを含めたシステム全般の安全性や基本構成など検討すべき点が多く実際に転倒事故を起こしやすいケースを対象にした実用性などに関する検討は十分できなかった。現在、睡眠中の体動きをモニタリングする装置及び計測データの分析に関する基本的な枠組みは構築できており、機器の安全性や信頼性を確認しながらパネル及び計測システムの実用化を目指している。さらに、パネルを用いることで乳児の呼吸に伴う胸郭運動の観察が可能であることが明らかとなり、乳児用ホームモニタリング装置の開発に向け準備をしている。本研究課題は、ベッドからの転落事故防止策を確立するために、睡眠中の体動を検知するセンサーを用いて睡眠深度を推定する睡眠評価システムを開発することである。市販されている転落防止用センサーでは、睡眠深度を推定できる予備動作は感知できるとはいえない。また、信頼できる睡眠評価システムを臨床に導入するためには高価であるという状況である。そこで、比較的安価でかつ信頼性のあるシステムを開発する必要性がある。本年度は、体動によって生じる振動を継続的に測定するシステムの構築を目指した。従来の圧電素子や空気圧を利用したセンサーの場合、ノイズを除去したり、サンプリング回数を増やしたりする必要がある。市販されている振動計では、ベッド全体の振動を感知してしまうだけでなく、ベッド以外の寝床ではモニタリングできないということが明らかとなった。そこで、ひずみゲージを使った体動検出器の開発を試みた。試作した体動検知装置をマットレスもしくは布団の下で、臥床者の腰の位置に設置し、体動によって生じるひずみの値を継続的に観察したところ、臥床者に負担かけることなく、寝返りや起き上がりの動作を感知することができた。また、体動検知装置による終夜モニタリングによって睡眠中の体動状況を記録することができた。現在、睡眠中の体動状況を腕時計式活動記録器(アクチウォッチ)で記録し、体動検知装置で得られたデータと比較を試みているところである。より正確に体動を検知するために、検知装置の基本構造に更なる改良を加えている。さらに、サンプリング回数やデータ解析法を検討している。また、実際の覚醒状況との関連について更に検討を進めるためにアクチウォッチと構築した体動モニタリングシステムのデータとの両方を収集している。今後、実際に夜間など転倒転落の恐れのあるケースを対象とした臨床研究も同時に行っていく予定である。
有機小分子に誘発される発光性ナノ金属種の自己集合を利用した機能開拓

水溶液中で特定の物質を検出する化学センサーへの応用を目指して、親水性のポリエチレングリコール(PEG)で表面被覆された発光性カドミウムカルコゲニドクラスターの光学特性を調べるとともに、有機小分子との相互作用による集積化、発光増強の機構に関して基礎的観点から考察を進めた。その結果、クラスター由来の光学特性がPEG部位の鎖長に依存することを明らかとし、取り囲むPEGの極性が無機コアの電子状態に影響を与えることを明らかとした。また、環境汚染物質とも関連する親油性のフェノール類がPEGとの弱い相互作用によってクラスターの集積化を誘起し発光増強をもたらすことを明らかとした。本研究では、有機小分子との相互作用を通じて形成される「PEG修飾した発光性ナノ金属種(クラスター)の自己集積体」の形成機構を解明するとともに、「自己集積化にともなう発光増強」を利用して特異な光化学的応答性を示す機能物質を創出することを目的とする。本年度は、構造単位となるクラスターをPEG部分、無機骨格部分、リンカー/スペーサー部分に分割し、様々なPEG修飾クラスターを分子設計をするとともに、クラスター単独系の水溶液中での自己集積体形成能について詳細に検討した。特に、PEG部分の鎖長に注目し、重合度が47の短い鎖長を有するものについては、分子量の分布が存在しない一連の単分子前駆体を合成し、エーテルリンカー部分を介してクラスターに導入した。続いて、ゲストの存在しないクラスター単独の条件下で、水溶液中での光化学特性を紫外可視吸収スペクトル、発光スペクトルを調べたところ、加熱によって不可逆的に変化を起こし、特に発光スペクトルについては明確な強度増大を示すことが明らかとなった。一方、加熱後のクラスターサイズについて動的光散乱を用いて検討を行なったところ、PEG鎖の重合度5以上のクラスターについては、加熱の前後でサイズの明確な変化は観察されず、吸収スペクトル、発光スペクトルとの相関はないものと考えられる。これに対して、PEG鎖の重合度4の場合には、加熱時に明らかな自己集積化挙動が観察され、同時に発光スペクトルの増大がみられた。現時点では、これらのスペクトル変化を支配する因子を特定することは困難であるが、PEG鎖のコンホメーション変化が関与していることが示唆される。次年度以降は、これらの知見をふまえて、適切なPEG鎖を選択し、有機小分子との相互作用に伴う会合やスペクトル応答性に軸足を移していく。本研究では、有機小分子との相互作用を通じて形成される「PEG修飾型発光性ナノ金属種(クラスター)の自己集積体」の形成機構を解明するとともに、「自己集積化にともなう発光増強」を利用して特異な光化学的応答性を示す機能物質を創出することを目的とする。平成25年度の研究においては、24年度に得られた様々な鎖長を有するPEG鎖を無機骨格表面に直結させた一連の半導体性硫化/セレン化カドミウムクラスター群について、その発光応答性を議論する上で不可欠となる基本的な光物性および疎水性フェノールに対する応答機能に関する調査を行なった。その結果、明確なPEG鎖長依存性が吸収スペクトルにおいて観察され、PEG鎖のコンホメーションがクラスターの電子特性に影響を与えることがわかった。さらに詳細な検討を進めたところ、PEG鎖のコンホメーション(コイルまたはへリックス)との相関性が観察され、クラスターの無機骨格でのポリマー鎖の二次構造がクラスターの電子特性に影響することが示唆された。続いてビスフェノールAに誘起される集合体形成活性を調査したところ、PEG鎖長依存性はほとんど観察されず、表面ポリマー部分の立体構造の影響は無視できることがわかった。以上の検討と並行して、クラスター間架橋構造形成を誘起すると期待される分子ユニットを組み込んだクラスターの構築を検討した。その中で、ボロン酸部位を導入したクラスターが単糖類とのエステル結合形成に伴って、10 nm程度の集積体を形成し、会合誘起型の発光増大を示すことを見いだした。本研究では、「PEG修飾型発光性ナノ金属種(クラスター)の自己集積体」の形成機構を解明するとともに、「自己集積化にともなう発光増強」を利用して化学センサーなどに応用可能な特異な応答性を示す機能物質を創出することを目的とする。昨年度の研究では、特徴的な発光性を示す硫化/セレン化カドミウムクラスター群を無機コアとして様々な鎖長を有するPEGで表面修飾された一連の水溶性クラスター群の電子特性に関する検討を行い、無機コア由来の吸収スペクトルがPEG鎖長に強く依存することを見いだした。一般にクラスター化合物の電子的性質はコアのサイズと構造に強く依存することが知られているが、本系では取り囲む有機部位の性質が重要であることを示しており興味がもたれる。そこでこれらの赤外吸収スペクトルを測定し、PEG鎖のコンホメーションの検討を行ったところ、鎖長が短い場合にはトランス配座が優勢であるのに対し、鎖長が長い場合にはゴーシュ配座が優勢となることが判明し、こうした配座構造の違いがもたらす双極子モーメントの相違がクラスターコア由来の電子構造に影響を与えたものと結論した。一方、親油性フェノールをはじめとする、各種の有機ゲストに誘起される集合体形成活性および発光応答性を評価したが、それらにはPEG鎖長依存性はほとんど観察されなかった。これらの検討と並行して、集合体形成にともなう発光増大を利用したセンシング系の構築を目指して、標的物質との相互作用を通じて架橋構造が誘起するような分子修飾や架橋重合による発光性ナノゲルの構築を試みた。しかし、直接の分子修飾や機能性・反応性官能基を導入したPEG誘導体の分子設計が予想以上に困難であり、当初の補助事業期間内に完遂することはできなかった。

本研究では、発光性ナノ金属種(クラスター)の集積化にともなう発光応答の学理を基礎的側面から解明し、それを利用して化学センサーなどに応用可能な特異な応答性を示す機能物質を創出することを目的とする。ここでは特に、特徴的な発光性を示す硫化/セレン化カドミウムクラスター群を無機コアに用いて、様々なPEG修飾水溶性クラスターを設計し、1)光化学特性、電子構造に関する基礎的な知見を蓄積するとともに、2)集積化を誘起するユニットを組み込むことで特定のゲストに対して選択的に発光応答する系の構築、を目指した。1)について、昨年度までに無機コアにPEG鎖を直結させたクラスターを合成して吸収、発光特性の調査を行い、吸収スペクトルパターンがPEG鎖長に強く依存することを見いだした。さらに、赤外吸収スペクトルによる検討の結果、PEG鎖のコンホメーションと密接に相関する双極子モーメントが無機コアの電子構造に摂動をあたえていることが示唆された。そこで、PEGの電子的効果についてより詳細な知見を得るために、PEG鎖と無機コアの間に直鎖アルキルスペーサーを導入した一連のクラスターの光学特性を調べたところ、アルキル鎖の伸長とともにPEG鎖に起因する電子的効果の減少が確認され、長鎖PEGユニットがもたらす高極性の化学環境が無機コア近傍に配置された場合に、特異な電子的摂動効果が発現することが明らかとなった。これらについては結果をまとめて学術誌に報告した。一方、2)については昨年度に引き続いて、標的物質との相互作用を通じて架橋構造が誘起するような分子修飾が施された有機配位子の合成を行い、クラスター表面への導入の検討を行った。しかし、導入された官能基によって無機コアの分解が誘起されて目的とする物質を単離するにいたらず、合成戦略を再考する必要があることが判明した。水溶液中で特定の物質を検出する化学センサーへの応用を目指して、親水性のポリエチレングリコール(PEG)で表面被覆された発光性カドミウムカルコゲニドクラスターの光学特性を調べるとともに、有機小分子との相互作用による集積化、発光増強の機構に関して基礎的観点から考察を進めた。その結果、クラスター由来の光学特性がPEG部位の鎖長に依存することを明らかとし、取り囲むPEGの極性が無機コアの電子状態に影響を与えることを明らかとした。また、環境汚染物質とも関連する親油性のフェノール類がPEGとの弱い相互作用によってクラスターの集積化を誘起し発光増強をもたらすことを明らかとした。本年度は、昨年度までに確立されたクラスターの集積化とそれに伴う発光増強に関する知見を基盤として、クラスターの集積化を誘起する分子認識ユニットや架橋重合性官能基を戦略的に組み込んだPEG修飾クラスターを合成し、特定のゲストに対して選択的に発光応答する系の構築を目指した。しかし、昨年度に見いだされた吸収スペクトル特性のPEG鎖長依存性が極めて想定外であり、過去にもそうした現象は知られていないことが判明したため、本年度にも並行して追加検討を行い、取り囲む有機部位の極性が大きなファクターであることを明らかとした。これはクラスターの機能化戦略において重要な知見を与えるものであり今後の展開が期待できる。
好酸球と線維芽細胞の相互作用に注目した好酸球性鼻副鼻腔炎の病態解明

好酸球性副鼻腔炎は鼻粘膜への好酸球浸潤とニカワ状鼻汁,鼻茸形成を特徴とする難治性疾患で,その病態は不明な点が多い。本研究では,好酸球と線維芽細胞との相互作用が好中球や好酸球などの炎症細胞浸潤を促進していると考えられた。また,好酸球に発現する組織因子を起点として凝固系が活性化され,凝固因子が鼻粘膜のプロテアーゼ活性型受容体(PARs)を介して鼻粘膜の線維芽細胞に作用すると,細胞外マトリックスの沈着や好酸球の浸潤をさらに誘発することがわかった。さらに,好酸球性炎症のラット鼻炎モデルにEGF受容体阻害薬の投与を行うと鼻粘膜への好酸球浸潤や杯細胞化生が抑制され,新しい治療の可能性が示唆された。1)鼻茸線維芽細胞と好酸球性株EoL-1細胞との共培養2)凝固因子トロンビン、活性化第X因子の鼻茸線維芽細胞に対する作用組織学的検討から、好酸球性副鼻腔炎に浸潤する好酸球は凝固系の開始蛋白である組織因子を豊富に発現していることがわかった。また、鼻茸組織には凝固系の最終産物であるフィブリンの沈着を認めることも確認した。このことから浸潤する好酸球を起点に凝固系が鼻茸組織中で活性化され、凝固因子が鼻茸線維芽細胞に作用する可能性があると考えた。最初に好酸球性副鼻腔炎鼻茸から分離培養した鼻茸線維芽細胞がトロンビンや活性化第X因子の受容体であるprotease-activated receptorsを発現していることを確認した。次に、鼻茸線維芽細胞をトロンビンまたは活性化第X因子で刺激して上清中の各因子を測定した。その結果、トロンビンと活性化第X因子はそれぞれ上清中のフィブロネクチンとサイトカイン(TGF-&#61538;1、Eotaxin-1、RANTES、IL-6、IL-8)の濃度を有意に上昇させた。以上から、好酸球は凝固系を介して鼻茸線維芽細胞に作用し、細胞外マトリックスの沈着やさらなる好酸球の浸潤などを促していることが示唆された。鼻線維芽細胞と好酸球の相互作用について,関連する因子を同定することができ,さらに凝固因子の関連について詳細に検討することができている。1)鼻茸線維芽細胞と好酸球との共培養前年度は好酸球性細胞株を用いたが、今年度は末梢血から好酸球を分離し、共培養に用いた。鼻茸線維芽細胞と末梢血好酸球との共培養では上清中のIL-6、IL-8、Eotaxin-1、RANTES濃度がそれぞれ上昇することが明らかとなった。好酸球は鼻茸線維芽細胞からのIL-6、IL-8、Eotaxin-1、RANTES産生を促すことによって、鼻粘膜局所にさらに好酸球や好中球といった炎症細胞の浸潤を促進させる可能性があると思われた。2)凝固因子トロンビン、活性化第X因子の鼻茸線維芽細胞に対する作用組織学的検討から好酸球性副鼻腔炎に浸潤する好酸球は凝固系の開始蛋白である組織因子を豊富に発現していることがわかった。浸潤する好酸球を起点に凝固系が活性化されると活性化凝固因子が線維芽細胞に作用する可能性があると考えた。トロンビンや活性化第X因子刺激によって鼻茸線維芽細胞の上清中のFibronectin、TGF-alpha、Eotaxin-1、RANTES、IL-6、IL-8濃度がそれぞれ上昇することがわかった。トロンビンや活性化第X因子はprotease-activated receptors (PARs)を介して作用するため、線維芽細胞がPAR-1からPAR-4までの4つの受容体を発現していることを、蛍光免疫染色とRT-PCR法で確認した。4つの受容体のアゴニストペプチドを用いて鼻茸繊維芽細胞を刺激すると、主にPAR-1、PAR-2刺激で各因子の濃度が上昇した。PAR-4刺激では上清中の各因子の濃度は変化しなかった。以上から、鼻粘膜に浸潤する好酸球を起点とした凝固系の活性化は、PARsを介して粘膜の線維芽細胞に作用し、細胞外マトリックスの沈着や好酸球の浸潤をさらに誘発することが示唆された。鼻茸線維芽細胞と好酸球の相互作用については、昨年度の好酸球性細胞株に加えて、末梢血好酸球を用いて検討し、関連する因子を同定することができた。凝固因子との関連については鼻茸繊維芽細胞上のレセプターの発現を確認し、各レセプターアゴニストペプチドの作用について検討することができた。1)鼻茸線維芽細胞とEoL-1細胞の共培養では,添加するEoL-1細胞の数に依存してVEGF濃度が上昇した。また,鼻茸線維芽細胞と末梢血好酸球との共培養では,IL-6,IL-8,Eotaxin-1,RANTES濃度がそれぞれ上昇した。好酸球は鼻茸線維芽細胞からのVEGF産生により血管透過性の亢進や血管新生を促進させ,IL-6,IL-8,Eotaxin-1,RANTES産生によって鼻粘膜局所に好酸球や好中球といった炎症細胞の浸潤を促進させていると考えられた。2)好酸球性副鼻腔

炎に浸潤する好酸球は凝固系の開始蛋白である組織因子が豊富に発現し,鼻茸には凝固系の最終産物であるフィブリンの沈着を認めた。さらに鼻茸線維芽細胞には,トロンビンや活性化第X因子の受容体であるprotease-activatedreceptors (PARs)がPAR-14まで発現していた。鼻茸線維芽細胞をトロンビン・活性化第X因子で刺激したところ,フィブロネクチンとIL-6,IL-8,Eotaxin-1,RANTES,TGF-β1濃度が有意に上昇した。このことから,鼻粘膜に浸潤する好酸球を起点とした凝固系の活性化は,PARsを介して粘膜の線維芽細胞に作用し,細胞外マトリックスの沈着や好酸球の浸潤をさらに誘発することが示唆された。さらに鼻茸上皮細胞を用いた検討では、好酸球の分化・生存に重要なGM-CSFが活性化凝固因子の刺激で産生されることが分かった。3) EGF受容体インヒビターは,線維芽細胞からトロンビン刺激で産生されるeotaxin-1とRANTES,鼻茸上皮細胞からトロンビン刺激で産生されるGM-CSFをそれぞれ抑制した。さらに好酸球性炎症のラット鼻炎モデルに,EGF受容体インヒビターの全身または鼻腔局所投与を行うと,鼻腔粘膜への好酸球浸潤や杯細胞化生が抑制されることが明らかとなった。好酸球性副鼻腔炎は鼻粘膜への好酸球浸潤とニカワ状鼻汁,鼻茸形成を特徴とする難治性疾患で,その病態は不明な点が多い。本研究では,好酸球と線維芽細胞との相互作用が好中球や好酸球などの炎症細胞浸潤を促進していると考えられた。また,好酸球に発現する組織因子を起点として凝固系が活性化され,凝固因子が鼻粘膜のプロテアーゼ活性型受容体(PARs)を介して鼻粘膜の線維芽細胞に作用すると,細胞外マトリックスの沈着や好酸球の浸潤をさらに誘発することがわかった。さらに,好酸球性炎症のラット鼻炎モデルにEGF受容体阻害薬の投与を行うと鼻粘膜への好酸球浸潤や杯細胞化生が抑制され,新しい治療の可能性が示唆された。1)共培養から得られた相互作用のメカニズムについて,実際の臨床検体(鼻汁や鼻粘膜)で主要なメディエーターの発現を,ELISA法やmRNAの測定,免疫組織化学などで確認していく予定である。2)細胞間相互作用の抑制を指標に新たな治療手段のターゲットを決定し,ラット鼻粘膜のLPS刺激と好酸球性炎症の炎症モデルでの有効性を検討していく予定である。1)末梢血好酸球と鼻茸繊維芽細胞の共培養で上昇した因子を指標に、好酸球と線維芽細胞の相互作用のメカニズムについてさらに検討を行う。2)細胞間相互作用の抑制あるいは凝固因子刺激の抑制を指標に新たなターゲットを決定し、ラット鼻炎モデルを用いて有効性を確認していく。耳鼻咽喉科学
頭頚部癌増殖能の客観的評価法の開発と臨床へのフィ-ドバック

計画通り、頭頚部癌組織について各種のモノスペシフィックモノクロ-ナル抗体を用いて免疫組織学的に研究し、特に増殖動態および転移能の面から、臨床的悪性度と対比検討することにより、ほゞ目的を達成することができた。また、これらの結果から今後の研究の方向が定まった。(1)S期細胞標識率について初年度においてS期細胞標識率と下咽頭癌粘膜下不可視病変の拡がりの程度とが正の相関を示すことを見出し、手術時の切除範囲設定に役立てることが可能となったが、術前に化学療法および放射線治療を行うことによる修飾を考慮する必要を生じ、2年度3年度において、これら治療に伴う経時的変化を追求し、これらの治療に応じて腫瘍縮小を来したものにおいても、残存する腫瘍細胞群は治療前とほゞ同等の増殖能を示すことが判明し、担癌期間の延長が転移の危険性を増加させている可能性が示され、急ぎ転移能について研究せざるをえなくなった。(2)転移能について癌巣周囲膜の主たる構成蛋白である4型コラゲンについて検討し、これが連続性を示すものでは頚部リンパ節転移が認められないのに対して、断続あるいは発現性を示さないものでは有意に転移が多いことが判明し、転移に最も関係の深い因子として注目するところとなった。他に、コラゲン詭弱化物質、着床助成因子については腫瘍細胞および間質の両面から目下検討中である。(3)唾液腺腫瘍について組織学的に多彩な唾液腺腫瘍については末だ発生起源が明白でない。そこで主としてサイトケラチンサブクラスを中心に正常唾液組織について研究し、導管サテライト細胞と命名した末分化な細胞群のあることが判明し、これがすべての腫瘍の発生母地となるものと考えられた。(1)BrDU免疫組織染色によるS期細胞指数頭頚部癌患者の生検組織の一部を利用し、抗BrDUモノクロ-ナル抗体による免疫組織染色により、S期細胞指数を計測した。下咽頭癌と他の頭頚部癌とを比較し、有意に下咽頭癌で高値であった。下咽頭癌切除標本から粘膜下不可視病変進展度を計測し、それとS期細胞指数とが正の相関を示すことを明らかにして学会誌上に報告した。S期細胞指数が高値を示すものでは、切除範囲を大きくする必要があることが明らかとなった。(2)ケラチン免疫組織染色による下咽頭粘膜病変の評価サイトケラチンNo.1、3、7、8、10、11、13、14、18、19に対するモノスペツフィックモノクロ-ナル抗体を用いて、正常粘膜上皮、病的上皮、下咽頭癌について免疫組織染色を行った。その結果ケラチン発現パタ-ンはそれぞれの状態で特有であることが明らかとなった。そこで、ケラチン発現パタ-ンをみることによって、異型上皮、上皮内癌、癌分化度の診断を客観的に行いうることが明らかとなり、USA咽頭科学会で報告することが決定している。さらに、これらのパタ-ンの観察結果から、下咽頭粘膜の分化、癌化および癌の分化についての資料がえられ、学会誌に報告の予定である。(3)次年度へ向けて、下咽頭癌以外の頭頚部癌についても目下検索中である。頭頚部がん組織片をBrdU加培養液にて処理後薄切切片とし、抗BrdUモノクロ-ナル抗体を用いて免疫組織染色してS期細胞指数を計測した。組織分化のheterogeneityに対応して差のあることを確認した。また、下咽頭癌は他の扁平上皮癌に比して高値であることを確認した。核DNA ploidy,サイケラチン発現性,複合糖質発現性,間質ラミニンおよび4型コラゲン発現性との関係について目下検索中である。2。

細胞質構成蛋白正常粘膜上皮,異型上皮,上皮内がん,浸潤がん(分化度別)について、サイトケラチンSubtypeの発現性について各モノスペンフィックモノクロ-ナル抗体による免疫組織染色により検索し、上皮の分化、異型化,癌化,癌の分化に応じてその発現性に規則性のあることを見出した。その結果をまとめて日本耳鼻咽喉科学会会報および国外誌に発表した。発生部位により差のあること(特に気道系と食道系)を見出し、現在夫々について検索中である。3.間質ラミニンおよび4型コラゲン癌胞巣周囲膜構成成分であるラミニンおよび4型コラゲンについて各モノクロ-ナル抗体を用いて免疫組織染色し、それらの発現性とリンパ節転移および血行性遠隔転移との関係について検索中である。4.細胞質複合糖質5種のレクチンを負荷して特異的結合を行わせた後,夫々に対するモノクロ-ナル抗体を用いて免疫組織染色することにより、組織型,分化度,S期細胞指数,DNAパタ-ン,ケラチン発現性などとの関係を現在検索中である。頭頚部癌生檢組織から、その増殖特性についてのより多くの情報を得ることにより、治療にフィ-ドバックしてより良い成績をあげることを目的として、免疫組織学的に研究し、めざましい成果をあげることができた。1.腫瘍細胞構成蛋白についてサイトケラチンの13種のサブクラスについてのモノクロ-ナル抗体を用いて研究し、粘膜上皮の異型上、癌化に伴う特徴的発現性変化を発見した。癌の分化度に応じて発現性の異ることを発見し、逆にその発現性から分化度を客観的に判定する方法を確立した。唾液腺腫瘍の発生起源を確定することを目的として正常唾液腺組織構成細胞について同称の研究を行い、発生母地と考えられる“導管サテライト細胞"の存在をつきとめることに成功した。2.増殖活性についてBrdU取込み法によりS期細胞標識率を算定し、これが臨床上如何なる意義を有するかについて研究し、粘膜下不可視病変の拡がりと正の相関を有することを発見し、切除範囲決定に直接役立てることができた。照射化学療後の残存腫瘍でも活発な増殖能を有することを確認し、これら治療における長期担癌状態が転移の可能性を大きくしていることを確認した。3.転移能について癌巣周囲膜4型コラゲンの発現性と頚部のリンパ節転移について研究し、連続性をもつものでは頚部転移はまずマイナスであるのに対して、発現性のないものでは高頻度に転移を伴うことを発見し、それによって予防的頚部郭清術の適応を判断しうるものと結論した。以上、微小な生檢組織から臨床上重要な多くの客観的情報が得られることを確認することができた。
腎尿細管細胞のイオンチャンネルを制御する細胞内調節因子の役割

ウサギ腎近位尿細管初代培養細胞を使って細胞容積調節機構を調べた。近位尿細管細胞は、低張液ショック後一過性にその容積が増加し(約一分後)元の容積に復する。この時間経過は外液のCaに依存しており、OCa+0.1mMEGTA添加で有意に増加した。この細胞の頂部膜にはCaーactivated K channel(200 ps)が存在し、低張液ショックにより著しく活性化されることがわかった。5mM Ba(bath)は、低張液ショックによるKチャンネルの活性化をほぼ完全に抑制した。さらにBaは細胞容積調節に要する時間を有意に増加した。Wholeーcell clamp法(currentーclamp mode)で細胞内電位を測定すると、細胞内電位は低張液ショック後一過性に過分極し、続いて脱分極した。この時間経過は、低張液ショック後の細胞容積変化の時間経過に一致した。二次的な脱分極の原因として1)Kチャネルの非活性化、2)Kチャネル以上のチャネル、例えばC1チャネルの活性化が考えられた。patch電極の電解質組成をKC1からKgluconateに置換し同様の実験を行ったところ、低張液ショック後の二次的な脱分極は観察されなくなった。細胞外液5 mMBa存在下で低張液ショック後のCl電流を測定した。Cl電流は部分的に細胞外Caに依存し、20uMSITSにより有意に抑制された。以上まとめると、低張液ショック後の細胞容積調節には細胞内から細胞外へのKC1放出が必要である。KとC1はそれぞれ独立した経路(Kチャネル及びC1チャネル)を通って細胞外へでると考えられる。特にKチャネルの活性化には細胞外から細胞内へのCa流入が必要である。本年は二年継続の初年度にあたり,腎尿細管細胞のイオンチャネルをパッチクランプ法で研究する為の基礎的研究を行なった。その結果以下の事実が明らかとなり,次年度への発展の足がかりとなった。(1)多細胞集合体である腎尿細管をトリプシン等の酵素処理により単一細胞化することは、細胞個々のイオンチャネル解析に必要不可欠であるが,この操作は細胞膜構造蛋白(イオンチャネル)の脱落を伴った(細胞内負電位の低下(脱分極))。(2)酵素処理により損傷を受けた細胞を10%血清を含む培養液でincubationすると,細胞膜蛋白は修復された(細胞内負電位の回復)。しかし,細胞膜イオンチャネルは,血清内に含まれる種々の生理活性因子・増殖因子等により活性化しており,Oscilloscope上でのGiga-seal判定が困難であった。従ってトリプシンで単離した細胞を一昼夜血清を含む培養液でincubationした後,血清を含まない培養液で数時間incubationすれば,ほぼ健常な細胞で再現性よく実験ができることがわかった。1個の細胞におけるdouble-patching実現の為,パッチクランプ増幅器(日本光電,CEZ2200)を購入した。二本のパッチ電極を同一細胞に乗せる為,現在やや大型の細胞(線維芽細胞,L cells)においてトレ-ニング中である。G蛋白を介するイオンチャネルの活性化機構を研究する為,培養近位尿細管細胞において,GTPγS注入実験を開始した。この結果,Non-selective cationチャネルが,GTPγSにより活性化されることがわかった。このチャネルが細胞内Ca増加に重要な役割を演ずるか否かを明らかにする為,細胞内・外のイオン置換,Caチャネル阻害剤を用いた実験が必要である。

この時間経過は外液のCaに依存しており、0Ca+0.1mMEGTA添加で有意に増加した。この細胞の頂部膜にはCaーactivated K channel(200 pS)が存在し、低張液ショックにより著しく活性化されることがわかった。5 mM Ba(bath)は、低張液ショックによるKチャネルの活性化をほぼ完全に抑制した。さらにBaは細胞容積調節に要する時間を有意に増加した。Wholeーcell clamp法(currentーclamp mode)で細胞内電位を測定すると、細胞内電位は低張液ショック後一過性に過分極し、続いて脱分極した。この時間経過は、低張液ショック後の細胞容積変化の時間経過に一致した。二次的な脱分極の原因として1)Kチャネルの非活性化、2)Kチャネル以外のチャネル、例えばClチャネルの活性化が考えられた。patch電極の電解質組成をKClからKgluconateに置換し同様の実験を行ったところ、低張液ショック後の二次的な脱分極は観察されなくなった。細胞外液5 mMBa存在下で低張液ショック後のCl電流を測定した。Cl電流は部分的に細胞外Caに依存し、20uMSITSにより有意に抑制された。以上まとめると、低張液ショック後の細胞容積調節には細胞内から細胞外へのKCl放出が必要である。KとClはそれぞれ独立した経路(Kチャネル及びClチャネル)を通って細胞外へでると考えられる。特にKチャネルの活性化には細胞外から細胞内へのCa流入が必要である。
ミクロ・メゾスケールにおける骨材種を考慮した受熱したコンクリートに関する研究

本研究は、放射光を用いた非破壊測定を用いてミクロ-メゾスケールの現象を結びつけることを目的としている。このような横断的な研究は少なく本研究の独創的な点である。そして本研究を行うことで将来火災を受けたコンクリートの化学分析を行うことで受熱したコンクリートの強度を推定できる判定方法を開発する足掛かりになることが期待される。また、骨材種による受熱の影響によるミクロストラクチャーの変化を明らかにすることで、コンクリートに使用される細骨材の耐火度判定試験法を開発できる可能性ができる。本研究は今後、被災した建物の調査診断に対する指標になることが期待される。