hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
化学情報変換・増幅能をもつ新しい人工二分子膜システムの開発

脂質二分子膜と膜タンパク質からなる細胞膜は、化学信号を電気信号に変換するトランスデュ-サとしての機能を持っている。本研究では細胞膜の分子識別機構をモデル化した新しいタイプの分子認識、情報変換システムの開発を目的に研究を行った。本年度の研究成果の概要は以下の様である。(1)チオ-ル基を含むリン酸型脂質を設計・合成し、エタノ-ルからの化学吸着法により金電極上に単分子膜電極を作成させた。この単分子膜は、系のpHの変化によりレドックス種の透過を制御することができた。さらにアルカリ土類金属に反応し、レドックス種のサイクリックボルタモグラムを変化させることがわかった。すなわちこの極限の超薄膜電極はイオンセンサとしての機能を持つことがわかった。(2)二分子膜系で分子・イオン情報を電気信号に変換するデバイスの開発に対する基礎的検討を昨年に引き続き行った。化学構造の異なるポリイオンコンプレックス型脂質をパタ-ン電極上に修飾し、複素インピ-ダンス特性と膜化学構造の相関を調べたところ、相転移の交流信号変換にたいして、4級アンモニウム型脂質は顕著であったが1級アンモニウム塩は、変化を示さなかった。また1鎖型の4級アンモニウム脂質は、転移熱量が2鎖型の1/30であるにもかかわらず、2鎖型同様転移に伴い大きなインピ-ダンス変化が得られた。次に生体脂質であるジミリストイルフォスファチフィルコリン(DMPC)を用いて二分子膜を作成し、これをパタ-ン電極上に修飾した。75%の相対湿度下温度を変化させ複素インピ-ダンスを測定した。DMPCフイルムは気相下において、53°Cに相転移を示し、この温度領域で急激なインピ-ダンス及びキャパシタンスの変化が測定された。コ-ル、コ-ルプロット解析によりこの現象のメカニズムについて考察した。
肝細胞癌におけるGlypican-3の発現調節機構に関する臨床病理学的研究

グリピカン-3(以下GPC3)は各種の癌で発現が認められ、肝細胞癌(以下HCC)で高発現することが知られている。本研究ではHCCにおけるGPC3の意義について臨床病理学的に検討を行った。GPC3が細胞膜に発現するHCC症例は予後不良で、腫瘍の悪性度を高めるとされるM2型マクロファージの腫瘍内浸潤がより多く認められた。HCCの原発巣と転移巣におけるGPC3の発現は、約半数に違いがみられた。新たなELIZA系を用いて測定した術前血清GPC3値が高いHCC症例ほど、予後不良であった。尚、研究の過程で、乳酸の輸送に関与するモノカルボン酸輸送体4がHCCにおける新たな予後不良因子であることを示した。当該年度において研究の成果が上げられたのは、研究目的のうちの1つ、「B.肝細胞癌内に浸潤するマクロファージ(以下MΦ)とグリピカン3 (以下GPC3)との関連」についてである。検討方法は、外科的に切除された肝細胞癌切除症例(n=225)において、各症例につき肝細胞癌とその周囲の正常肝組織を含む任意の1箇所に対して、MΦとGPC3を同定するための免疫染色を行った。MΦの同定には、MΦを広く認識するCD68、M2形質のMΦ(以下M2-MΦ)を同定するとされるCD204を使用した。癌細胞におけるGPC3の染色性の評価は、全周性の膜陽性所見が得られる癌腫ほど点数が高くなるスコアリング(GPC3スコア; Liver Int 2011; 31: 120-31.)を用いた。結果は、GPC3スコアと腫瘍内に浸潤するCD204陽性MΦ数は、正の相関を示した(p= 0.0003)。また、CD68またはCD204いづれにおいても、腫瘍内に浸潤する陽性MΦは、腫瘍周囲の正常肝組織に浸潤するMΦよりも有意に多かった。また、CD204陽性MΦが腫瘍内に多く浸潤する症例(腫瘍内に浸潤するMΦが平均以上を`多い'と定義; n=93)は、CD204陽性MΦの腫瘍内浸潤が少ない症例よりも予後不良であった(p= 0.015)。しかし、CD68陽性MΦの腫瘍内浸潤とGPC3スコアには有意な相関はなく、CD68陽性MΦの腫瘍内浸潤の多寡は、予後に関係しなかった。尚、以上の結果を含む内容を論文発表した(Liver Int 2014, in press)。本成果にて、M2-MΦが肝細胞癌の悪性形質を高める可能性が示せた。またGPC3の発現調節機構にM2-MΦが関与し得る可能性があるかもしれない。最終年度に行った研究の成果は主に3つである。1肝細胞癌におけるグリピカン3 (GPC3)の腫瘍内発現につき、原発巣と転移巣の間でGPC3の発現に差異があるかを剖検症例(n=44)を用いて免疫組織学的に検討した。GPC3の発現に関する半定量的な評価として、細胞膜染色性を加味したGPC3スコア(Liver Int. 2011;31:120-31.)を用いた。結果、52%(n=23)の症例において原発巣と転移巣のGPC3スコアに変化が見られたが、その変化に一定の傾向は認めなかった。2術前の血清GPC3値が臨床病理学的に予後不良因子となりえること、またその際に用いた血清GPC3を検出する新たなELIZA系が、過去に報告されているELIZA系よりも優れている可能性がある(Int J Cancer, in press)。研究期間全体を通じて、GPC3が細胞膜に陽性となる肝細胞癌が特に予後不良となったことに着目し、そのような症例ではM2形質のマクロファージがより多く腫瘍内に浸潤する傾向を示した。その際の検討でmonocarboxylatetransporter 4が肝細胞癌の新たな予後不良因子であることを見出した。一方、本研究の臨床的な意義としては、GPC3の治療抗体として期待されるGC33抗体を用いた検討であることから、肝細胞癌内のGPC3局在の不均一性に関する検討結果は、転移巣に対する治療効果の予測に多少なりとも寄与する結果と思われる。また本研究で用いたGPC3に対するELISA系は、術前の血清GPC3の評価に有力なツールとなる可能性がある。

病理学研究がやや遅滞と判断した理由は、初年度の予定に含まれていた懸案、肝細胞癌におけるグリピカン3 (以下GPC3)のHeterogeneityと、肝細胞癌の転移巣におけるGPC3とマクロファージの検討、が未施行のためである。遅滞した理由は、仕事全体における病理診断業務の占める割合が高く、研究時間が捻出できなかったためである。当該研究の目的として残されている、1肝細胞癌におけるグリピカン3 (以下GPC3)のHeterogeneity、2肝細胞癌の転移巣におけるGPC3とマクロファージ(以下MΦ)の関連性、3肝細胞癌におけるGPC3、MΦ、Hepatocyte growthfactoractivator inhibitor type 1の関連性、を検討していく。推進方法に大きな変更はないが、今後も病理診断業務の比率が変わらないときは、遅滞の可能性は避けられない。対応としては、短・中・長期的目標を定め、経過中の自己評価を行い、その都度遅滞事由の対応をとる予定である。病理診断業務が総仕事時間の大半を占めることになったことから、研究への時間の捻出が困難であり、結果、科研費未使用額が発生した。また、実験計画を1年間という大きい区切りで捉えていたことも、途中経過の遅滞に十分な配慮ができず、研究の遅滞に拍車をかけたものと思われる。病理診断業務の大幅な軽減は望めないため、本年度において短・中・長期的な計画に基づき、科研費を使用していく。前年度の未使用分は、本年度4月に早速使用し、研究遅滞とならぬように配慮した。
骨肉腫に対するIGF受容体を標的とした新規キメラ抗原受容体T細胞療法の開発

新たながん治療法として、キメラ抗原受容体(CAR)を用いた遺伝子改変T細胞療法(CAR-T療法)は有望であり、各種がんへの応用が期待されている。本研究では、骨肉腫の表面に高発現する抗原に対する新規キメラ抗原受容体遺伝子改変T細胞を作成するためのpiggyBacトランスポゾンベクターと、piggyBacトランスポゾン法を用いて高い導入効率を可能とする培養方法を開発した。本研究で開発したベクターと培養法を用いて作成した新規CAR-T細胞は、ヒト骨肉腫細胞に対して強力な細胞傷害性を発揮した。本研究により、骨肉腫に対する新規免疫療法の基盤データを得ることができた。1)本研究は、がんの新たな免疫療法として期待されているキメラ抗原受容体遺伝子導入T細胞療法を、従来の治療方法では治せない骨肉腫患者の新規治療法として開発するための基盤研究である。2)本研究では、キメラ抗原受容体遺伝子を遺伝子導入する方法として、ウイルスベクターより安全性の高いとされている非ウイルスベクターであるpiggyBacトランスポゾン法を用いた。3)我々は持っているpiggyBacトランスポゾンベクターを改変し、IGF-R1特異的キメラ抗原受容体(IGF-R.CAR)トランスポゾンベクターを作製した。4)このベクターを用いてIGF-R.CAR-T細胞の作製、培養を行うことができるようになった。IGF-R.CARトランスポゾンベクターとpiggyBacトランスポサーゼ発現ベクターを末梢血単核球にエレクトロポレーションによって遺伝子導入し、その後サイトカインを添加した培地で約2週間培養することにより、IGF-R.CAR-T細胞を作製することができるようになった。5)piggyBacトランスポゾンベクターを使用した遺伝子導入における、遺伝子導入効率を上昇させる培養方法の検討を行った。その結果、CARのT細胞への遺伝子導入効率を従来の培養方法と比較して大幅に上昇させ得る培養方法を開発した。本培養方法は従来のトランスポゾンベクターの弱点とされていた遺伝子導入効率の低さを克服しえる重要な発見であった。今後の研究では本培養方法を用いてIGF-R.CARの培養を行う予定である。6)3種類のヒト骨肉腫由来細胞株を用いてIGF-R1およびIGF-R2の発現をフローサイトメトリーで解析したところ、3種類ともに両受容体の細胞表面上への高い発現を認めた。これら受容体を発現する腫瘍細胞はIGF-R.CARを遺伝子導入したT細胞の標的となり得ると考えられた。1)使用予定のベクターの作製に時間がかかったが作製に成功した。2)遺伝子導入効率を上昇させるための培養方法を検討して計画当初よりも導入効率を上昇させた。3)上記に時間がかかったため、CAR-T細胞の機能解析がまだ十分に行えていない。4)遺伝子導入に用いるベクターおよび使用する細胞株が得られたため、今後の研究に進展が期待される。1)本研究は、がんの新たな免疫療法として期待されているキメラ抗原受容体(CAR)遺伝子改変T細胞療法を、従来の治療に抵抗性の骨肉腫患者の新規治療法として開発するための基盤研究である。2)本研究では、キメラ抗原受容体遺伝子の導入方法としてウイルスベクターより安全性の高いとされている非ウイルスベクターであるpiggyBacトランスポゾン法を用いた。3)我々は、他のCARを発現するpiggyBacトランスポゾンベクターを遺伝子組換え技術を用いて改変し、X特異的キメラ抗原受容体(X.CAR)トランスポゾンベクターを作成した。4)このベクターを用いて、X.CAR-T細胞の作製、培養を行った。X.CARトランスポゾンベクターとpiggyBacトランスポザーゼ発現ベクターを末梢血単核球にエレクトロポレーションによって遺伝子導入し、その後インターロイキン7、インターロイキン15を添加した培地で約2週間培養することにより、X.CAR-T細胞を作製できた。5)piggyBacトランスポゾンベクターを用いた遺伝子導入で、導入効率を上昇させる方法を開発した。6)3種類のヒト骨肉腫細胞株を用いてX1、X2の発現をフローサイトメトリーで確認し、X.CAR-T細胞、コントロールCAR-T細胞と共培養を行ったところ、X.CAR-T細胞は抗原特異的に強い細胞傷害性を発揮することを確認した。7)inverse PCRと次世代シークエンサーを用いて、CAR遺伝子のゲノムへの挿入部位を決定する方法を開発した。2)次年度に予定していた遺伝子挿入部位の解析方法を確立した。3)上記に時間がかかったため、免疫不全マウスを用いた動物実験が行えなかった。4)さらにCAR-T細胞の機能解析を進め、動物実験を行うことで、今後の進展が期待される。3)我々は、他のCARを発現するpiggyBacトランスポゾンベクターを遺伝子組換え技術を用いて改変し、抗X特異的キメラ抗原受容体(抗X.CAR)トランスポゾンベクターを作成した。4)このベクターを用いて、抗X.CAR-T細胞の作製、培養を行った。

抗X.CARトランスポゾンベクターとpiggyBacトランスポザーゼ発現ベクターを末梢血単核球にエレクトロポレーションによって遺伝子導入し、その後インターロイキン7、インターロイキン15を添加した培地で約2週間培養することにより、抗X.CAR-T細胞を作製できた。5)piggyBacトランスポゾンベクターを用いた遺伝子導入で、導入効率を上昇させる方法を開発した。6)3種類のヒト骨肉腫細胞株を用いてX1、X2の発現をフローサイトメトリーで確認し、抗X.CAR-T細胞、コントロールCAR-T細胞と共培養を行ったところ、抗X.CAR-T細胞は抗原特異的に強い細胞傷害性を発揮することを確認した。7)inverse PCRと次世代シークエンサーを用いて、CAR遺伝子のゲノムへの挿入部位を決定する方法を開発した。8)ヒト骨肉腫細胞株を免疫不全マウスの皮下に注射し、ヒト骨肉腫細胞マウスを作成した。そのマウスに抗X.CAR-T細胞またはコントロールCAR-T細胞を注射し、in vivoでの抗腫瘍効果を観察したが、本モデルでは抗X.CAR-T細胞のコントロールT細胞を上回る抗腫瘍効果は見られなかった。新たながん治療法として、キメラ抗原受容体(CAR)を用いた遺伝子改変T細胞療法(CAR-T療法)は有望であり、各種がんへの応用が期待されている。本研究では、骨肉腫の表面に高発現する抗原に対する新規キメラ抗原受容体遺伝子改変T細胞を作成するためのpiggyBacトランスポゾンベクターと、piggyBacトランスポゾン法を用いて高い導入効率を可能とする培養方法を開発した。本研究で開発したベクターと培養法を用いて作成した新規CAR-T細胞は、ヒト骨肉腫細胞に対して強力な細胞傷害性を発揮した。本研究により、骨肉腫に対する新規免疫療法の基盤データを得ることができた。1)我々が確立した培養方法を用いて、IGF-R.CAR-T細胞を作製していく。5)免疫不全マウスにIGF-R発現骨肉腫細胞株を皮下移植し、ヒト骨肉腫モデルマウスを作製し、IGF-R.CAR-T細胞を輸注することで、IGF-R.CAR-T細胞が生体内で腫瘍の増殖を抑えることができるかの検討をする。1)我々が確立した、高い遺伝子導入効率を可能とする培養方法を用いて、X.CAR-T細胞を作製していく。3)免疫不全マウスにX発現骨肉腫細胞株を移植し、人骨肉腫モデルマウスを作製し、X.CAR-Tで治療することでin vivoでの細胞傷害性がみられるかの検討を行う。4)研究結果を国内外の学会で発表する。5)論文作製を行う。小児血液がん出席予定であった学会に体調不良により出席不可となってしまったために旅費が少なくなった。また、プラスミドの作成と培養方法の確定が予定よりやや遅れたため、予定していた機能解析ができなかった。培養方法の最適化を行っていたため、CAR-T細胞のin vitro細胞傷害性試験まで行ったところで、さらに免疫不全マウスを用いた動物実験を行うことができなかったH28年度は2回の海外学会出張を予定しているため、旅費として使用。また、昨年度に実施できなかった機能解析実験のための物品費として使用。免疫不全マウスを用いた骨肉腫モデルマウスを作製する。
葉層構造、接触構造とEuler類に関する研究

3次元多様体上の葉層構造に対し,W.Thurstonにより,その葉層構造がReeb成分を持たなければ,その葉に接する平面場のEuler類に関する所謂Thurstonの不等式が成立する事が示された.しかしながら,3次元球面上の古典的なReeb葉層もこのThurstonの不等式を自明に満たしており,また,本研究に関わる以前の研究によりReeb成分を持つ葉層構造に対してもその不等式が成立する場合が他にもある事がわかってきていた.2006年度の本研究の成果として,或る種の葉層構造(回転可能葉層)に対して,不等式が成り立つ為の或る十分条件を得た.また,Thurstonの不等式が成立しない状況を具体的に捉える事ができた.それらは,回転可能葉層を定めるmonodromy微分同相の言葉で記述される.2007年度は,より精しい不等式(Thurstonの不等式相対版)に関して,接触構造の葉層構造への収束という観点からの前年度までの研究成果を踏まえ,研究を深めた.また,Reeb成分を持ち,かつThurstonの不等式を満たす葉層構造で,それまでに知られているものは総てその(接束の)Euler類が自明であったが,非自明であるものを組織的に構成する方法を開発した.回転可能葉層のEuler類の非自明性を保証する或る条件が前年度までの研究で得られている.その条件を満たす回転可能葉層のReeb成分をDehn手術することによって,新しい葉層構造でReeb成分を持ち,Euler類は非自明であるものが得られる.このとき,D.Gabaiのsutured manifold理論により,元の回転可能葉層をうまく選べばThurston normが縮退するDehn手術は有限個であることが示せる.3次元多様体上の葉層構造に対し,W.Thurstonにより,その葉層構造がReeb成分を持たなければ,その葉に接する平面場のEuler類に関する所謂Thurstonの不等式が成立する事が示された.しかしながら,3次元球面上の古典的なReeb葉層もこのThurstonの不等式を自明に満たしており,また,本研究に関わる以前の研究によりReeb成分を持つ葉層構造に対してもその不等式が成立する場合が他にもある事がわかってきていた.2006年度の本研究の成果として,或る種の葉層構造(回転可能葉層)に対して,不等式が成り立つ為の或る十分条件を得た.また,Thurstonの不等式が成立しない状況を具体的に捉える事ができた.それらは,回転可能葉層を定めるmonodromy微分同相の言葉で記述される.2007年度は,より精しい不等式(Thurstonの不等式相対版)に関して,接触構造の葉層構造への収束という観点からの前年度までの研究成果を踏まえ,研究を深めた.また,Reeb成分を持ち,かつThurstonの不等式を満たす葉層構造で,それまでに知られているものは総てその(接束の)Euler類が自明であったが,非自明であるものを組織的に構成する方法を開発した.回転可能葉層のEuler類の非自明性を保証する或る条件が前年度までの研究で得られている.その条件を満たす回転可能葉層のReeb成分をDehn手術することによって,新しい葉層構造でReeb成分を持ち,Euler類は非自明であるものが得られる.このとき,D.Gabaiのsutured manifold理論により,元の回転可能葉層をうまく選べばThurston normが縮退するDehn手術は有限個であることが示せる.Thurston normは実数係数2次元homology群上のpseudo normであるが,3次元多様体に関してはPoincare-Lefcshetz双対定理により実数係数1次元cohomology群上に定義されていると考える事ができる.近年,幾つかの仕事によりその下界が得られてきた.特に,C. McMullenによるAlexander normとV. Turaevによる"homological estimate"が重要であると思われる.これらの仕事を踏まえて,Thurston normに関する単位球体(それは多面体となることが知られている)の記述を試行中である.諸般の困難の為,計算の自動化が遅れる等,十分な結果が得られているとは言えないが,この知見は重要であり,さらに計算,記述を進めたい.3次元多様体上の葉層構造に対し,W. Thurstonの定理により,その葉層構造がReeb成分を持たなければ,その葉に接する平面場のEuler類に関する所謂Thurstonの不等式が成立する.本研究に関わる研究によりReeb成分を持つ葉層構造に対してもその不等式が成立する場合がある事がわかってきたが,さらにその為の或る十分条件を得た.また,Thurstonの不等式が成立しない状況を具体的に捉える事ができた.しかし,Reeb成分を持ちながら不等式が成立する為の十分条件は,それを満たせばそのEuler類は自明となるものであった.これに関して非自明なEuler類を持ちかつ不等式を満たす例を無限個構成することができた(Shigeaki MIYOSHI and AtsuhideMori : Reebcomponents and Thurston' s inequality, preprint).Thurston単位多面体の記述に関しても円周上の曲面束及び回転可能葉層に対しては一般的な解明が望まれ,その為に以上の結果を精密に検討評価すべく,試行中である.

3次元多様体上の葉層構造に対し,W.Thurstonにより,その葉層構造がReeb成分を持たなければ,その葉に接する平面場のEuler類に関する所謂Thurstonの不等式が成立する事が示された.前年度までの本研究の成果として,必然的にReeb葉層を持つ回転可能葉層に対するThurstonの不等式の成立及び不成立それぞれの為の十分条件が得られている.今年度は,より精しい不等式(Thurstonの不等式相対版)に関して,接触構造の葉層構造への収束という観点からの前年度までの研究成果を踏まえ,研究を深めた.また,Reeb成分を持ち,かつThurstonの不等式を満たす葉層構造で,それまでに知られているものは総てその(接束の)Euler類が自明であったが,非自明であるものを組織的に構成する方法を開発した.回転可能葉層のEuler類の非自明性を保証する或る条件が前年度までの研究で得られている.その条件を満たす回転可能葉層のReeb成分をDehn手術することによって,新しい葉層構造でReeb成分を持ち,Euler類は非自明であるものが得られる.このとき,D.Gabaiのsutured manifold理論により,元の回転可能葉層をうまく選べばThurston normが縮退するDehn手術は有限個であることが示せる.3次元多様体の2次元homology群の単位多面体の記述に関しては,円周上の曲面束についてそれを計算するアルゴリズムを設計中である.その正当性を完全に証明するには至っていないが,多くの例を計算し,さらに回転可能構造について拡張する事によって回転可能葉層のReeb成分に沿うDehn手術に関するThurston normの縮退性について知見を深める事が期待される.
インド洋熱帯域の海洋循環の力学に関する研究

インド洋熱帯域の海洋循環、特に数十日程度の季節内変動に伴う表層循環の変動は、観測データ不足などから、その詳細は未だ明らかになっていない。本研究は、近年得られるようになった観測データと高解像度海洋モデルの結果を用いて、インド洋熱帯域における海洋循環の力学過程に関する研究を行うことを目的としている。本年度は、インドネシア通過流の主要経路の一部となっているロンボク海峡およびオンバイ海峡における海洋の季節内変動と、東部インド洋赤道域における同様の季節内変動との関連性について調べた。(独)海洋研究開発機構が東部インド洋赤道域に設置している係留系(TRITONブイおよびm-TRITONブイ)での表層流速観測データおよび関連する海洋観測データと高解像度海洋大循環モデルの結果を用いて、2004年1月から2006年11月までの期間における季節内変動を解析した。その結果、東部インド洋赤道域とロンボク海峡およびオンバイ海峡域での季節内変動には高い相関があることが明らかになった。すなわち、インド洋赤道域の東西風変動により励起された季節内変動は赤道ケルビン波としてスマトラ島沿岸に達し、その後スマトラ島、ジャワ島南岸に沿って沿岸ケルビン波として伝播している。さらにラグ相関分析より、表層の季節内変動は第1傾圧モードと関係しているが、亜表層の水温躍層付近での季節内変動は第2傾圧モードと関連していることが示された。この成果の一部は、World Ocean Conferenceにて発表するとともに、現在論文作成中である。平成19年度はインド洋の赤道潜流の力学的研究については、必要となる観測データや高解像度数値モデルの結果を収集・解析した。解析の主目的はインド洋の赤道潜流は波動伝播に伴う過渡的な応答が本質的であるのか、太平洋の潜流のように平均的な力学バランスとして存在しているかを明らかにすることであった。解析の結果インド洋の東西の圧力差が変動を強く支配していることを確かめた。この結果は米国で開催されたOcean ScienceMeetingで発表し、また論文としてGeophysical Research Letterに受理され("Impact of the Indian Ocean Dipole on the intraseasonalzonal currents at 90E on the equatoras revealed by self-organizing map")平成20年前半にも発行される予定となっている。またインドネシアの技術評価応用庁においてもセミナーを行い研究成果の発表および意見交換をした。一方、上記力学的な研究と同時に、海洋一時生産の指標となるクロロフィル濃度の人工衛星データを取得し、大スンダ列島南岸沖に現れる冷水域の変動と海洋一次生産との関連についての解析も進めた。まだ解析途中であるが、2008年日本海洋学会春季大会にて発表し、現在論文をJournal of Geophysical Researchに投稿するため準備中である。また観測データやモデルの結果を保存して解析するため、また論文作成等に必要となる計算機及びハードディスクを購入した。インド洋赤道帯の海洋表層には、大気の季節内変動に関連した西風応力により励起される数十日程度の短周期の活発な東向流が観測されており、これはスマトラ島・ジャワ島沿岸をケルビン波として伝播する。平成20年度は、この波動現象による流速変動とその影響を調べるため、JAMSTECが東部インド洋に設置している流速計の観測データと、インドネシア海域の主要な海峡で通過流量を観測した係留系データをもとに解析を行った。その結果、インド洋赤道域起源の季節内スケールの流速変動は、インドネシア海域に広く影響が現れ、ロンボク・オンバイ海峡はもとより、内海のマカッサル海峡にも影響が及んでおり、各所への伝播速度も把握できた。この結果は、今後学会等で発表予定である。この結果は、インド洋赤道帯で卓越する大気の季節内振動の影響が海洋波動を通して従来考えられていたよりも非常に広汎に及ぶことを明らかにした。この変動は伝播する波動の性質から予測可能であり、同国の海運や水産などの産業にも役にたつ知見であるため、今後学会等で積極的に発表する予定である。
生殖制御における新規脳内分子機構の解明

本研究により、我々が発見した新規脳ホルモンである生殖腺刺激ホルモン放出抑制ホルモン(GnIH)は生殖腺の機能と生殖行動の発現を抑制することが見いだされた。次に、GnIH作用の分子機構、GnIH発現の分子制御機構、GnIH作用の生理的意義などが明らかになった。さらに、GnIHの起源は原索動物と棘皮動物に遡ることやGnIHの分子進化が明らかになった。また、GnIH発現の異常が生殖腺の機能に障害を導くことがわかった。新規脳ホルモンであるGnIHに着目した本研究により、生殖制御における新規脳内分子機構が解明された。本年度における主たる成果は以下の通りである。「GnIH生殖抑制作用の分子機構の解析」:GnIH標的細胞である生殖腺刺激ホルモン産生細胞(LbetaT2細胞)を用いた解析により、GnIHはマップキナーゼやイノシトール三リン酸を介したシグナル伝達系を抑制することを明らかにした。「GnIH発現の分子制御機構の解析」:メラトニンはGnIHニューロンに発現しているMel1cを介してGnIHの発現と放出を誘導することやストレスがグルココルチコイドの分泌を高め、GnIHニューロンに存在するグルココルチコイド受容体を介してGnIHの発現を誘導することを明らかにした。「生殖腺におけるGnIHの局所作用機構の解析」:生殖腺に発現するGnIHは局所作用によりステロイド合成酵素の発現を低下させ、プロゲステロンなどの性ステロイドの合成を抑制することを明らかにした。「GnIHによる生殖行動の発現制御機構の解析」:GnIHニューロンが脳幹のニューロンに投射して、生殖行動の発現を抑制することを明らかにした。「GnIH遺伝子のノックダウンによるGnIH生理作用の解析」:GnIHsiRNAによるGnIH遺伝子ノックダウンによる解析から、GnIHは生殖や生殖行動・自発運動を抑制することを明らかにした。「GnIHによるヒト生殖機能異常の分子機構の解析」:GnIH遺伝子とGnIH受容体遺伝子の変異がヒトの生殖機能異常の要因であることを明らかにするために、生殖機能異常症のDNA検体を採取すると共に変異解析法を確立させた。「動物界におけるGnIHの起源と分子進化の解析」:GnIHの起源と分子進化を明らかにするために、原索動物であるナメクジウオと無脊椎動物であるタコの脳を採取すると共にGnIHの同定法やシンテニー解析法を確立させた。本年度に以下の主たる成果を得た。「GnIH生殖抑制作用の分子機構の解析」:生殖腺刺激ホルモン産生細胞を用い、GnIHはGiタンパクと共役するGnIH受容体を介してアデニル酸シクラーゼとマップキナーゼによるシグナル伝達を抑制して生殖腺刺激ホルモンの合成を抑制することを明らかにした。「GnIH発現の分子制御機構の解析」:GnIHニューロンにはメラトニンとグルココルチコイドの受容体が発現していることを見いだした。メラトニンはGnIHの発現と放出を制御することやストレスはグルココルチコイドを介してGNIHの発現を誘導することを明らかにした。「生殖腺におけるGnIHの局所作用機構の解析」:生殖腺に発現するGnIHは局所作用によリステロイド合成細胞のcAMP合成の低下を引き起こし、3beta-水酸基脱水素酵素の発現を低下させ、プロゲステロン合成を抑制することを明らかにした。ジGn璽Hによる生殖行動の発環制御機構の解栃」:G蛋}田はG醸Hニューロンを介して生殖行動の発愛を挿制することを明らかにした。「GnIH遺伝子のノックダウンによるGnIH生理作用の解析」:GnIH siRNAによるGnIH遺伝子ノックダウンを行い、GnIHは生殖行動や自発運動などを抑制することを明らかにした。また、GnIH遺伝子ノックアウト動物を作成した。「GnIHによるヒト生殖機能異常の分子機構の解析」:GnIH遺伝子とGnIH受容体遺低子の変異がヒトの生殖機能異常の要因であることを明らかにするために、生殖機能異常症のDNA検体を採取すると共に変異解析法を確立させた。「動物界におけるGnIHの起源と分子進化の解析」:無顎類のヤツメウナギの脳からGnIHを同定して、構造と生理作用を明らかにした。GnIHの起源は最も下等な脊椎動物である無顎類に遡ることがわかった。「GnIH生殖抑制作用の分子機構の解析」:GnIHの標的細胞であるGnRHニューロン(細胞株GT1-7)においてGnIHはcAMP合成を低下させてERKのリン酸化を阻害することを明らかにした。GnIHの標的細胞であるキスペプチンニューロン(細胞株rHypoE22)におけるGnIH作用の分子機構を解析した。「GnIH発現の分子制御機構の解析」:GnIHの発現は光周期がメラトニンや甲状腺ホルモンを介して、ストレスがグルココルチコイドを介して、社会環境がノルエピネフリンを介して変動させることを明らかにした。

「生殖腺におけるGnIHの局所作用機構の解析」:卵巣の顆粒膜細胞と精巣の間質細胞に発現するGnIHの局所作用により性ステロイド合成酵素の発現と性ステロイドの合成が低下することを明らかにした。「GnIHによる生殖行動の発現制御機構の解析」:GnIHが脳内P450aromの活性を高めてエストロゲン合成を増加させ、生殖行動の発現を抑制することを明らかにした。「GnIH遺伝子のノックダウンとノックアウトによるGnIH生理作用の解析」:GnIH遺伝子のノックダウン(ウズラ)により、GnIHは生殖と生殖行動を抑制することを明らかにした。GnIH遺伝子のノックアウト(マウス)により、GnIHの生理作用を解析した。「GnIHによるヒト生殖機能異常の分子機構の解析」:中枢性生殖機能異常症患者のDNA検体を継続して集積し、次世代シーケンサーによりGnIH遺伝子とGnIH受容体遺伝子の変異解析を進めた。「動物界におけるGnIHとGnIH受容体の起源と分子進化の解析」:GnIHとGnIH受容体は脊椎動物のみならず、原索動物(ナメクジウオ)に存在することを明らかにした。これまでに同定した全ての遺伝子のシンテニー解析を行い、GnIHとGnIH受容体の起源と分子進化を解析した。本年度に以下の主たる成果を得た「GnIH生殖抑制作用の分子機構の解析」:GnIHは生殖腺刺激ホルモン産生細胞においてcAMP合成を低下させ、ERKのリン酸化を阻害して生殖腺刺激ホルモンの合成を抑制することを明らかにした。GnIHはGnRHニューロンにおいてcAMP合成を低下させてGnRHの合成を抑制することを明らかにした。「GnIH発現の分子制御機構の解析」:メラトニンとグルココルチコイドがGnIHの発現を高め、生殖制御鍵遺伝子DIO2が合成する活性型甲状腺ホルモンがGnIHの発現を低下させることを明らかにした。「生殖腺におけるGnIHの局所作用機構の解析」:GnIHは卵巣の顆粒膜細胞においてcAMP合成を低下させてプロゲステロン合成を減少させるというGnIHの新しい生殖抑制作用機構を発見した。「GnIHによる生殖行動の発現制御機構の解析」:GnIHは脳内のエストロゲン合成を変動させて生殖行動を制御するという新しい脳内分子制御機構を発見した「GnIH遺伝子のノックダウンによるGnIH生理作用の解析」:GnIH遺伝子のノックダウンにより、GnIHの生殖抑制作用を証明した。さらに、GnIHは動物の覚醒を抑えるという新しい生理作用を発見した。「GnIHによるヒト生殖機能異常の分子機構の解析」:生殖機能異常症患者のDNA検体を集積し、次世代シーケンサーによりGnIH遺伝子とGnIH受容体遺伝子の変異解析を進めた。「動物界におけるGnIHとGnIH受容体の起源と分子進化の解析」:GnIHとGnIH受容体は全ての脊椎動物に加えて無脊椎動物である原索動物(ナメクジウオ)にも存在することを明らかにし、動物界におけるGnIHとGnIH受容体の起源と分子進化に重要な知見を得た。本年度の研究より、「生殖制御における新規脳内分子機構」に関する重要な新知見が数多く得られた。「GnIH生殖抑制作用の分子機構」:GnIHニューロンが投射するキスペプチンニューロンにはGnIH受容体が発現していることを明らかにした。
実験的神経因性膀胱の研究

[目的]虚血-再灌流傷害による膀胱機能と一酸化窒素の関係を検討したので報告する。[実験方法]雄Wisterラットの大動脈分岐部を血管クリップでクランプし、はずすことで膀胱の阻血再灌流モデルを作製した。この膀胱を用いて1)様々な阻血時間での恒温槽を用いた機能実験、2)阻血時間30分再灌流時間30分でNO合成阻害剤であるL-NAMEの様々な濃度を与えた機能実験、3)L-NAME,L-NMMAをそれぞれ30mg/kgを投与し阻血時間30分再灌流1週後とし、この薬剤の予防効果を機能実験で確認した。4)阻血時間30分再灌流時間30分での持続膀胱内圧測定、5)レーザードップラーを用いた血流量、NO電極を用いたNO放出量の測定、6)抗eNOS,INOS抗体を用いた免疫染色を施行した。[結果]機能実験で膀胱平滑筋は阻血時間依存的に障害された。阻血30分に設定すると再灌流30分にてその傷害は増強されたが、この障害はL-NAMEの容量依存的に予防できた。阻血時間30分とし、再灌流1週間後は膀胱平滑筋の障害は再灌流30分に比べ優位に回復したがNO合成阻害剤の投与のよりコントロールのレベルまで回復した。持続膀胱内圧測定では阻血30分で排尿時膀胱内圧は優位に低下した。再灌流30分で排尿時膀胱内圧はやや回復し、L-NAME投与によってコントロールレベルまで回復した。NO電極を用いた膀胱平滑筋の阻血-再灌流時におけるNO産生の変化は、阻血開始直後より増加し阻血開始約45分でベースラインの155.3%で平衡に達した。再灌流を開始するとNO産生が急激に低下し、ベースラインで平衡に達した。コントロールではeNOSが移行上皮に存在し、阻血再灌流においてiNOSが膀胱に浸潤してきた多核球に観察された。[考察・結論]膀胱は阻血で障害され再灌流でさらに傷害が増強した。この傷害は多核球から産生されるNOが増悪因子であった。NO合成阻害剤でこの阻血再灌流傷害は予防でき、NOが増悪因子の可能性を示唆した。実験方法1)阻血ー再灌流障害は、ラット腹部大動脈分岐部直上に血管クリップをかけ、またはずすことにより作成した。。この操作で膀胱の血流量は5-10%まで減少する。ここで様々阻血時間、再灌流時間を設定した。また一酸化窒素(NO)合成酵素阻害剤(L-NAME)を投与することによってその予防治療効果を調べた。2)in vivoで上記の実験動物の阻血ー再灌流時膀胱におけるNO合成量、血流量の変化をNO電極、レザードップラー計を用いて測定した。またこのとき上記薬剤によってNO合成量、血流量がどのように変化するかを検討した。3)様々な阻血ー再灌時間の実験動物(8週齢のWister rat)の膀胱を摘出し、この摘出した平滑筋標本から平滑筋切片を作成し、恒温槽にマウントしカルバコールを作動薬として収縮力を評価した。免疫組織学的にどのタイプのNO syntaseによりNOが産生されているか調べた。結果1)膀胱平滑筋の阻血ー再灌流における機能実験では阻血時間に比例して収縮力の傷害が観察された。阻血時間30分で収縮機能に障害が生じ、再灌流30分でその障害が増悪することが観察された。2)阻血30分前にL-NAME10mg/kgを投与すると再灌流障害はある程度防止でき、30,100mg/kgを投与すると有意に再灌流傷害は防止できた。NOは再灌流において増悪因子であることが示唆された。3)NO産生の変化は、阻血開始直後より増加し阻血開始約30分で平衡に達した(155.3%)。再灌流を開始するとNO産生が急激に低下し、ベースラインの90.1%で平衡に達した。4)阻血ー再灌流障害において主に障害される部位は粘膜下組織および平滑筋組織で、粘膜は光学顕微鏡での観察では比較的傷害されにくかった.eNOSは正常ラット膀胱の移行上皮に観察された。iNOSは阻血ー再灌流障害により浸潤した多核球に観察された。

阻血30分に設定すると再灌流30分にてその傷害は増強されたが、この障害はL-NAMEの容量依存的に予防できた。阻血時間30分とし、再灌流1週間後は膀胱平滑筋の障害は再灌流30分に比べ優位に回復したがNO合成阻害剤の投与のよりコントロールのレベルまで回復した。持続膀胱内圧測定では阻血30分で排尿時膀胱内圧は優位に低下した。再灌流30分で排尿時膀胱内圧はやや回復し、L-NAME投与によってコントロールレベルまで回復した。NO電極を用いた膀胱平滑筋の阻血-再灌流時におけるNO産生の変化は、阻血開始直後より増加し阻血開始約45分でベースラインの155.3%で平衡に達した。再灌流を開始するとNO産生が急激に低下し、ベースラインで平衡に達した。コントロールではeNOSが移行上皮に存在し、阻血再灌流においてiNOSが膀胱に浸潤してきた多核球に観察された。[考察・結論]膀胱は阻血で障害され再灌流でさらに傷害が増強した。この傷害は多核球から産生されるNOが増悪因子であった。NO合成阻害剤でこの阻血再灌流傷害は予防でき、NOが増悪因子の可能性を示唆した。
「街を教室にする」プロジェクト―社会参加をめざす日本語教育における教員の役割

本研究では、「社会につながる」日本語の教育の実践における教員の役割を明らかにすることを目的とし、学習者と母語話者のインターアクションを取り入れた学習活動(「街を教室にする」プロジェクト)を実施し、参加者の意識や学びの質に教員が及ぼす影響を調査・分析した。データは参与観察、録音・録画、インタビュー、アンケートにより収集し、学習者・母語話者・教員の三者の側面から分析をおこなった。その結果、学習活動のタイプによって、三者の関係に変化が生じ、役割が流動化することで、それぞれの意識に変化があらわれ、「社会につながる」日本語の教育に影響をもたらすことが確認された。この研究は、「社会につながる日本語の教育」をめざし、地域の母語話者とのインターアクションを取り入れた学習活動(「街を教室にする」プロジェクト)の実施において参加者(学習者・母語話者)の意識と学びの質に教員が及ぼす影響を調査・分析し、社会と学習者を結ぶファシリテーターとしての教員の役割を明らかにすることを目的としている。今年度は、第1次調査として学習活動を実施してそのデータを収集することと国内外のインターアクションを取り入れた学習活動に関する情報収集をおこなった。学習活動のデータ収集では、インターアクションを取り入れた学習活動をデザインしたうえで実施し、それに関わる教員・学習者・母語話者の3者に対して、インタビューとアンケートによる意識調査をおこなうとともに、教室観察をして参加者や教員のふるまいを記録した。教員に対しては、アンケートと半構造化インタビューをおこない、学習活動に臨む意識を調査した。学習者には、活動の前と後にアンケート調査をおこない、母語話者とのインターアクションへの不安の変化を分析した。さらに母語話者については、学習者とのインターアクションで感じたことについて、活動の直後に聞き取り調査を実施した。また、情報収集活動としては、国内外の学会や研究会に参加し、インターアクションを取り入れた学習活動を実施している機関や研究者らと意見交換し、それぞれの機関や活動の実施者が抱える問題点やその解決法についての情報を収集した。本研究は、「社会につながる日本語の教育」の実現のために、学習者と母語話者のインターアクションを取り入れた学習活動(「街を教室にする」プロジェクト)を実施し、その過程において参加者の意識と学びの質に教員が及ぼす影響を調査・分析し、社会と学習者を結ぶファシリテーターとしての教員の役割を明らかにすることを目的としている。2年目となる今年度は、昨年度の実績にもとづき、新たな学習活動を立案して実施し、データを収集した。そして、今回収集したデータを、昨年度実施した学習活動のデータと比較し分析をおこなった。また、国内外の学会等に参加し、インターアクションを取り入れた学習活動や教員の役割、成長に関する情報収集をおこなった。今年度のデータ収集のための学習活動では、活動の場を「街」に移し、学習者自身がインターアクションの相手を探すという新たな形での実施を試み、その過程における学習者、母語話者、教員それぞれの意識をアンケートやインタビューによって調査した。その結果、学習者は活動の場においては教員の手助けを必要としていないが、自分の力だけでインターアクションの相手となる母語話者を探せるほど地域とのつながりを持っておらず、つながりを作るために教員の手助けが必要となることが明らかになった。また、母語話者同士も自分の属するコミュニティ以外のところで新たな関係を作ることはむずかしく、ある意味で閉ざされた関係の中にいることがわかった。このような関係のなかで、教員がファシリテーターの役割を果たすためには、教員自身も社会のなかの居場所を持つことが必要であり、「街」に学習の場を広げることで、教員自身の意識に変容が生まれることもわかってきた。今年度得られた知見は、学習活動の「場」の重要性ということであり、今後の研究の方向性を確認するうえで非常に有意義であった。今年度の当初の計画は、初年度に引き続き、第2次調査として学習活動実施データ収集(第1次調査の補充および比較のためのデータ収集)および国内外の学習活動の情報収集、収集したデータの整理をおこなうことであった。この計画のとおり、第2次調査としての新たな学習活動を実施してデータ収集をおこなったほか、国内外での情報収集も進めた。また、データの分析も進め、一部の研究成果の発表も進めている。さらに当初の計画以上の知見も得られ、次年度のデータ収集と研究のまとめのための調査計画も進んでいる。本研究は、学習者と母語話者のインターアクションを取り入れた学習活動(「街を教室にする」プロジェクト)を実施することで、「社会につながる日本語教育」のあり方を考えるために、参加者の学びの質と意識に教員が及ぼす影響を調査・分析し、社会と学習者を結ぶ日本語教育における教員の役割を明らかにすることを目的としている。1年目は、大学の授業における学習活動に地域の母語話者が参加した場合の、学習者・母語話者・教員の三者のかかわりを中心に研究を行ない、2年目は、学習活動の場を「街」に移すことでどのような変化が生じるかを分析した。そして、3年目の2016年度は、「街」のなかにある既存の活動に教員も一参加者として関わり、母語話者・学習者・教員の関係性を再構築する試みと「街」に学習目的ではなく新たなつながりを模索する活動を創出することで、教員の新しい役割を見出す試みを実施した。そして、その過程での三者それぞれを対象に調査した。具体的には、地域の母語話者が主催する「町歩き」に学習者と教員がともに参加する活動やスマートフォンアプリを利用した交流型イベントの実施、それぞれの活動の参加者に対する調査を行なった。また、教員に対する継続的なインタビュー調査も実施した。

その結果、教員と学習者という関係に変化が生じ、教員から学生へという一方向から、双方向の関係性が構築できること、それにより教員の意識にゆとりが生じ、客観性が増すことが観察された。また、「授業」や「学習」を離れた交流の場においては、参加者間のつながりが密になり、その後の個人的な親交へと発展していきやすいことがわかった。さらに、教員に対する継続的な調査からは、こうした活動に参加して、母語話者や学習者との新たなかかわりが生まれることにより、教員自身に自分の役割を見直す意識が生まれ、自身の成長を意識化していることが確認できた。本研究では、「社会につながる」日本語の教育の実践における教員の役割を明らかにすることを目的とし、学習者と母語話者のインターアクションを取り入れた学習活動(「街を教室にする」プロジェクト)を実施し、参加者の意識や学びの質に教員が及ぼす影響を調査・分析した。データは参与観察、録音・録画、インタビュー、アンケートにより収集し、学習者・母語話者・教員の三者の側面から分析をおこなった。その結果、学習活動のタイプによって、三者の関係に変化が生じ、役割が流動化することで、それぞれの意識に変化があらわれ、「社会につながる」日本語の教育に影響をもたらすことが確認された。本研究は、インターアクションを取り入れた活動型学習をもちいた「社会につながる日本語」の教育において、社会と学習者とを結ぶファシリテーターとしての教員がどのようにあるべきかを明らかにすることを目的としている。今年度は第1次調査として、活動型学習を実施しそこにたずさわる教員・学習者・母語話者の3者について基礎的なデータを収集した。このデータ収集に関しては、当初の計画のとおり、進められている。一方で、国内外の他機関の活動型学習の実施状況に関しては、限定的な情報収集にとどまっている。次年度以降は、さらに範囲を広げた情報収集をおこなっていきたい。次年度は研究の最終年度となるため、収集したデータを分析・考察し、成果を発表して、国内外の研究者からの検証を受ける予定である。具体的には以下の手順で進める。1.第1次調査、第2次調査で収集したデータを分析・考察する。2.国内外の学会等で研究の中間報告・成果発表をおこない、日本語教育研究者からの検証を受ける。また、これまでの調査で得られた知見をもとに、新たな調査計画も生まれており、研究のまとめと並行して進めていく予定である。日本語教育学社会言語学今年度に引き続き、第2次調査として学習活動実施データ収集(第1次調査の補充および比較のためのデータ収集)および国内外の学習活動の情報収集、収集したデータの整理をおこなう。1.今年度の補充調査とともに、初年度に収集したデータとの比較のため、テーマや手順を変えてプロジェクト型学習活動をおこない、初年度と同様の調査を実施する。2.今年度に引き続き、国内外の他の機関で実施されているインターアクションを取り入れた学習活動についての情報を収集し、担当の教員と情報交換をおこなう。3.収集したインタビューデータを文字化しデジタルデータ化する。
集学的診断手技を用いた膵癌の精密画像診断-経乳頭的および経皮的アプローチによる早期診断と進展度診断-

A)膵癌の早期診断および慢性膵炎との鑑別<経乳頭的アプローチ>(1)内視鏡的逆行性バルーン膵管造影(バルーンERP)本法を用いた背臥位圧迫撮影により分枝領域まで膵管像の精査が可能となった。膵癌症例と慢性膵炎症例の膵管像を比較検討した結果、膵管狭窄部における管腔の偏異、狭窄部への急峻な移行、乏分枝所見、造影剤の管腔外漏出などが悪性所見として明らかになった。また、造影終了後にセクレチンを負荷して膵液を採取し、膵液中の腫瘍マーカーの定量および細胞診を行うことで診断精度が向上した。(2)経口膵管鏡検査(POPS)極細径のファイバースコープを用いることにより、膵管鏡検査の対象患者(膵管鏡を挿入可能な患者)が増加し、主膵管内の隆起症病変の診断に有用であった。しかし、スコープにアングル機構がないため、症例によっては病変部を視野にとらえにくく、直視下に観察して診断するという点で問題が残った。(3)内視鏡的膵管生検内視鏡的乳頭括約筋切開術(診断的EST)を施行後、特注の片開き生検鉗子を用いて膵頭部-体部の病変部膵管の生検を行った。しかし、病変部手前の膵管の屈曲部を越えにくい症例もあり、診断率を向上させるためには、ガイドワイヤーを使用可能な鉗子の開発が望まれた。(4)膵管内超音波検査主膵管拡張例に対しては、主膵管内に細径超音波プローブ(7.2Fr,20MHz)を挿入して膵実質の鮮明な断面画像を得ることができた。本法は、嚢胞性膵腫瘍の性状診断に極めて有効で、主膵管内乳頭腺癌の垂直方向の壁進達度や長軸方向の表層進展範囲の診断にも有用であった。B)進行膵癌の進展度診断<経皮的アプローチ>(5)経皮経肝的胆管内走査による超音波検査今回検討した症例では、近位側胆管へ壁内進展した膵癌症例が少なかったので、進行膵癌の進展度診断における本法の有用性については、今後の検討が必要である。
水生植物根圏への芳香族化合物分解細菌の集積メカニズムの解明と浄化技術への応用

水生植物とその根圏に集積する細菌を活用した根圏浄化法は、環境適合型の浄化技術として期待される。本研究では、ウキクサ根圏における芳香族化合物分解促進機構の解明を目指し、一連の研究を行った。芳香族化合物として4-tert-ブチルフェノール(4tBP)を用い、4tBP分解が生じたウキクサ根圏に集積された細菌群集を解析したところ、根圏の細菌叢は、環境水中の細菌叢と大きく異なっており、芳香族化合物分解への関わりが知られる細菌が多く存在していた。また、ウキクサ根圏から単離された4tBP分解細菌OMI株のトランスクリプトーム解析から、4tBPの代謝にピバル酸代謝経路が関連していることが明らかになった。今年度は下記2つの課題に注力した。(1)ウキクサ根分泌物の分析:多様なアルキルフェノール類を分解する細菌Sphingobium fuliginis OMIなどがその根圏から発見されているウキクサ(Spirodela polyrhiza)への芳香族化合物分解細菌集積メカニズムの解明を目指し、その根分泌物を回収し化学分析を行った。その結果、有機酸としてはクエン酸、リンゴ酸、ピルビン酸、コハク酸が、糖類としてはグルコース、キシロースが、アミノ酸としては、セリン、ロイシンが多く含まれることが明らかとなった。(2)芳香族化合物分解細菌の遺伝子発現解析:まず、OMI株のドラフトゲノム配列を解析したところ、芳香族化合物分解に関わることが知られているカテコール-2,3-ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子を含む7つの領域が見出された。特に領域4については、アルキルフェノール類の分解に関わる遺伝子群が多数存在しており、アルキルフェノール分解に関わる可能性が高いと推測された。これら遺伝子の発現をreal-time PCRにより調べたところ、4-tert-ブチルフェノールによる培養条件下では、グルコースによる培養条件下と比較して560倍に発現していることが示された。これより、これら遺伝子が4-tert-ブチルフェノールの分解に関わっていることが示唆された。水生植物根圏から単離されたSphingobium fuliginis OMI株の芳香族化合物分解メカニズムを明らかにすべく、トランスクリプトーム解析を行った。RNA-SeqによってOMI株の遺伝子の転写を網羅的に解析したところ、tbp遺伝子群の転写は、4-tert-butylphenolの添加によって1.02-5.13倍に上昇した。また、検出された全遺伝子のうち、極めて高い転写促進が見られた(11.4-63.2倍)一連の遺伝子群は、いずれもOMI株による4-tert-butylphenolの分解の過程で蓄積する中間代謝物であるピバル酸の代謝経路に関わることが推測され、これより、OMI株によるピバル酸代謝経路を推定することができた。さらに、4-tert-butylphenol代謝時のtbp遺伝子群の転写量をreal-time PCRを用いて確認したところ、4-tert-butylphenol添加直後の0時間においてtbpA1、tbpBの転写が上昇していることが確認された。さらに、4-tert-butylphenolが42 %分解された0.5時間においてはtbpA1、tbpB、およびレギュレータータンパク質をコードするtbpR2の転写量が2.0-6.2倍となった。以上、tbp遺伝子群の転写量は4-tert-butylphenolの添加により有意に上昇したことから、tbp遺伝子群は4-tert-butylphenolの分解に関わることが強く示唆された。OMI株による芳香族化合物分解はウキクサ根圏において活性化されることが明らかとなっており、OMI株はウキクサによる芳香族分解活性化機構のモデル生物とみなすことができる。本研究によって明らかとなったOMI株の4-tert-butylphenol分解に関する遺伝子群は、活性化機構の解明に向けた大きな手がかりとなると考えられることから、(2)おおむね順調に進展していると判断した。根圏より単離した細菌の分類学的特徴付けと芳香族化合物分解特性の解析に注力した。大阪大学吹田キャンパス内の池より環境水を採取し、孔径10μmのフィルターでろ過することで、粗大粒子を除き、水試料を得た。滅菌した三角フラスコ中の水試料に無菌化したウキクサ(Spirodela polyrrhiza)を植え付け、人工気象器内で3日間栽培し、水試料中の細菌をウキクサに付着させた。栽培後のウキクサをホモジナイズした液、ウキクサ培養前の水試料、及び培養後の水試料をそれぞれ適宜希釈してR2A寒天培地に塗布し、28°Cで1週間培養した。得られたコロニーを純化し実験に用いた。続いて、単離した細菌から市販のキットを用いて抽出したゲノムDNAを鋳型とし、プライマーセット27F及び1392Rを用いたPCRにより16S rRNAを増幅した。それらの塩基配列を決定し、NCBI BLASTによる解析することで菌株の同定を行った。その結果、ウキクサ培養前の水試料及びウキクサ培養後の水試料からはそれぞれ17株、ウキクサのホモジナイズ液からは10株、合計44株の細菌株が単離された。ウキクサ培養前の水試料には5つの綱に属する細菌がほぼ均等に含まれていた一方で、ウキクサ培養後の水試料ではAlphaproteobacteria綱に属する細菌が多く含まれ、また、ウキクサのホモジナイズ液からはBetaproteobacteria綱細菌が多く単離された。