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邦人音楽作品の社会受容と高等音楽教育―レパートリー形成の観点から

......表記の3名のピアノ作品のいくつかについて、実際に演奏にとりくむにあたって必要な技術的要素や、他の作曲家の作品との相関のなかで見出せる、演奏解釈に必要な要素について、実践的な研究を行った。これらの作曲家の実演において重要な要素として、無作為的な和音の連続を演奏する技術、複数のテンポ感覚の交替をスムーズに行う技術などが重要であることが明らかになった。また、特定の作曲家に焦点を当て、すべての作品を縦断的に研究する必要性があることを再認識することとなった。◆4◆「教育機関向け調査の準備」......国内高等音楽教育機関への大規模調査のプレ調査として、複数の大学関係者、教員へのヒアリング調査を行った。次年度以降、このプレ調査をもとに、具体的な調査を行う予定である。◆5◆「研究成果の発表」......研究成果の発表として、平成24年2月2日にカワイ表参道サロン「パウゼ」において、邦人作曲家のピアノ作品についてのレクチャー・コンサートを実施した。また、平成24年1月28日に旭川市・大雪クリスタルホールにて「奏でる彫刻たち」(演奏業績)、平成24年3月18日に東京・白寿ホールにて「菅野雅紀ピアノリサイタルvol.3」(演奏業績)を行った。本研究の目的は、現代音楽受容と教育の関係を明らかにすること、また、演奏実技指導における課題選択法を確立することであった。研究期間を通して、様々な現代邦人ピアノ作品を分析すると同時に、いわゆるピアノ教本や過去の多様なピアノ作品との比較分析を通して、現代邦人ピアノ作品をレパートリー化するための教育法について研究を進めることが出来た。最終年度においては、これまでの研究成果より、演奏技術面からの教育教材についての研究が必要とのことから、基礎的な演奏技術のトレーニングについて研究を進めた。ピアノの技術教材としては、リスト、コルトー、ドホナーニのピアノメソードに、基礎的な技術要素がすべて網羅されているが、これらのメソードが対象とする作品に、現代邦人ピアノ作品は含まれていない。このため、音の組成そのものに欠落があることがあきらかであった。そこで、これらのピアノメソードを網羅的に分析し、その基本要素(音階、分散和音、跳躍)毎に、現代邦人ピアノ作品において有用ないくつかの旋法(呂旋法、律旋法、MTL)を適用した新たな練習課題を作成した。この結果作られた新たな練習課題は、実際の邦人ピアノ作品においてこの練習課題を用いることが出来る例が数多く見いだすことが出来、きわめて応用可能範囲の広い課題となっていることが明らかになった。最終年度の研究成果は、平成26年6月22日に日本音楽表現学会全国大会において「邦人ピアノ作品における練習課題についての考察」と題して発表した。また、研究機関全体の成果は、平成27年3月8日に「汐留ベヒシュタイン・サロン特別音楽講座」(東京都)において、一般向けの内容として発表し、好評を博した。新たな練習課題については、同講座参加者に向けて印刷、配布を行った。研究機関が作成したものではないが、最終年度の一般向け発表は以下のサイトにあります芸術一般(音楽・ピアノ)教育機関への大規模調査については、当初予定からの遅れが生じている。当初予定と比較し、より広範な音楽作品に対する資料収集の必要性が迫られており、データベース化の費用拠出が困難な現状がある。
「樹皮学」の創成を探る　ー樹皮における物質動態ー

樹皮において、セシウム吸収やイオン交換反応が存在することをこれまでに実験的に明らかにしてきた。そこで本研究では、スギとコナラに焦点をあて、陽イオンの樹皮吸収とプロトン放出との関係解明を目的とした。二重構造の容器を用いて、樹皮片を介して蒸留水と各種イオン溶液を接触させて、イオン輸送やプロトン溶出を調べる実験を行った結果、以下のことが明らかになった;1Na、K、Caが樹皮を介して移動すること、2Caは移動の途中で細胞壁に吸着すること、3Kは両樹種で溶脱しやすい、4プロトンと陽イオンのイオン交換反応は外樹皮で起こること、5陽イオン輸送の対イオンが存在し、本実験ではClイオンである。本研究は「樹皮=垂直化した土壌表層」ととらえ、樹皮の理化学性をミクロ生態系のひとつとして整理するために、スギとコナラに焦点をあて、まず陽イオンの樹皮吸収とプロトン放出との関係解明を行った。名古屋大学稲武フィールドで伐採したスギとコナラから作成した樹皮片を用いて、イオン輸送実験を行った。樹皮片を介して塩類溶液と蒸留水を接触させ、溶液中のイオン濃度変化を調べた。樹皮片としては、スギの場合「外樹皮+内樹皮」、「外樹皮+内樹皮+木部」、「内樹皮+木部」を、コナラの場合は「外樹皮+内樹皮」を使用した。塩類溶液として、塩化なとりうむ、塩化カリウム、塩化カルシウム溶液とコントロールとして蒸留水を使用した。実験前に塩類溶液と蒸留水のpHを測定し、実験開始から3日後、塩類溶液についてはpHを、蒸留水については、pHとNa、K、Ca、Mg濃度、およびCl濃度を測定した。スギ樹皮を用いた実験の結果として、スギの塩類溶液側でpHの低下が確認された。そのプロトン増加量は「外樹皮+内樹皮」>「外樹皮+内樹皮+木部」>「内樹皮+木部」であることから、イオン交換反応は主に外樹皮で起こっていると考えられたる。加えて、(陽イオン増加量の合計)>(プロトン増加量)であったことから、イオン交換反応を起こしたイオンが樹皮を通して輸送されているわけではないと考えられたことが明らかになった。これらのことから、樹皮を通してのイオン輸送の途中で、一部のイオンが外樹皮においてイオン交換を起こしていると考えられたる。コナラ樹皮ではイオン輸送がほとんど見られなかった。その理由としてのは、コナラはコルク組織が発達し、厚いコルク組織を形成するために、イオンが通りにくかったいことが考えられた。本研究ではスギとコナラに焦点をあて、以下の2点を明らかにすることを目標としている。A)陽イオンの樹皮吸収とプロトン放出との関係解明B)樹皮表面に存在する微生物による有機物の無機化反応の評価2016年度は、(A)に関する実験を行い、成果を挙げることができた。福島の原発事故に由来する放射性セシウムのスギにおける樹皮吸収のこれまでの研究結果を踏まえ、スギ樹皮における各種イオン透過性とプロトン交換について、コナラと比較しながら検討した。陽イオンとしては、ナトリウム、カリウム、セシウムを用いて、塩化物溶液として比較した。その結果、セシウムの場合には、樹皮の外側に放出されるプロトンの量が少なく、また内樹皮内への塩化物の輸送量が多いことが明らかになった。一方、コナラでは樹皮の外側にプロトンは放出されないことが明らかとなり、樹幹流観測において、スギでは低pHであるのに対しコナラではpH低下が見られないことと一致した。また、コナラでも内樹皮内まで塩化物イオンは輸送されており、樹皮構造が全くイオンを通さないわけではないことが明らかとなった。また、放射性セシウムの沈着が見られる福島で採取したスギ樹皮について、セシウムの化学形態をカリウムと比較した。その結果、カリウムでは水溶態が50%以上を占め、交換態が40%程度であるのに対し、セシウムは残渣画分が最も多く、交換態、水溶態の順であった。福島の試料では樹皮にセシウムボールのような不溶性セシウムが付着したままになっている可能性があるが、交換態、水溶態の量的関係ではカリウムとセシウムが異なることは明らかであり、樹皮から内部にとりこまれる際の動態も異なることが現場のデータからも示唆された。さらに、樹皮からの養分吸収による苗木成長への効果を、スギ苗を用いて実験している。観察結果からは、樹皮に養分溶液を塗布している苗木は、塗布していないコントロールとは異なる生理状態であるように見受けられ、今後の化学分析の結果とあわせて解析を行う予定である。

2017年度は、樹皮表面に存在する微生物による有機物の無機化反応の評価に焦点をあて、実験を行っていく。名古屋大学キャンパス内に生育するスギとコナラから外樹皮を採取し、洗浄せずに粉砕する。粉砕した試料を50ml遠心管に同量ずつつめ、水分で湿らせた状態で、培養器内において25°C暗条件下で培養する。12週間ごとに、試料のはいった遠心管に、純水を加え一定時間振とうし、ろ過することによって培養によって抽出可能になった陽イオンを分離定量する、同様に、1M酢酸アンモニウム溶液でも抽出定量する。コントロールには、オートクレーブで滅菌した樹皮粉末を用いる。これらの実験結果より、スギとコナラの樹皮に存在する微生物による無機化能力の違いを明らかにする。同様の実験を、内樹皮を用いておこなう。同所的に存在するスギとコナラの試料を他地域(5箇所以上)でも採取し、スギとコナラの樹皮上での無機化特性の違いを明らかにする。森林環境化学実験にあたって人件費を使う予定であったが、本テーマで卒業論文に取り組んだ学生がいたため、人件費が必要なくなった。また、フィールド調査も愛知県内でおこなったため、旅費がほとんど必要なかった。今年度は、微生物をターゲットとして行うため、昨年よりも試薬や実験用具が新たに必要となる。また微生物の童貞には、DNA解析を行う予定であるため、その費用が必要となり、繰り越した研究費をあてる予定である。
膠芽腫の低酸素領域克服に向けた薬剤の同定と解析

本研究は膠芽腫の治療のために、治療抵抗性である低酸素部位をターゲットとした治療法を検討している。低酸素部位特異的に集積する2-ニトロイミダゾール化合物に着目して膠芽腫において放射線との併用、および単剤での治療効果を評価した。膠芽腫の同種同所移植モデルにおいて、15Gyの照射と2-ニトロイミダゾール化合物を併用することで照射単独に比して生存期間の延長を認め、2-ニトロイミダゾール化合物の放射線増感作用を明らかにした。in vitroの系で、膠芽腫幹細胞に対して2-ニトロイミダゾール化合物は低酸素環境下では細胞死を誘導することをPI法で確認した。さらにスフェアで評価したところ低酸素特異的に細胞死を誘導していた。細胞死のメカニズムを評価するために、マイクロアレイを用いた発現解析を行ったところ、2-ニトロイミダゾール化合物による細胞死の原因として活性酸素の関与が示唆された。活性酸素の発生源としてミトコンドリアの関与を検討したところ、2-ニトロイミダゾール化合物投与で酸素消費量が減少し、さらに電子伝達系のcomplexI/II依存的な酸素消費が減少していることが明らかになった。つまり、2-ニトロイミダゾール化合物はミトコンドリアへのダメージを誘導し、細胞内の活う酸素を上昇させることが示唆された。引き続いて、膠芽腫を移植した脳を摘出しスライスカルチャーを行い、2-ニトロイミダゾール化合物の効果を確認した。低酸素環境下ではスライスカルチャーにおいても細胞死を効率的に誘導することを確認し、臨床応用に向けての可能性が示唆された。低酸素の評価をEF5を使用して評価することに成功したため、低酸素環境特異的な評価が可能となった。マイクロアレイの結果から、ニトロイミダゾールによる細胞死のメカニズムを同定できた。ex vivoの系においても2-ニトロイミダゾール化合物の低酸素環境下での効果を示すことができ、研究は順調に進展している。in vitro、ex vivo、でニトロイミダゾール単剤の効果を示すことができたため、今後は膠芽腫の同種モデル(in vivo)での効果を検討する。放射線との併用では増感効果を示せたため、単剤での効果、特に低酸素領域に対する効果をマウスの病理組織を用いて評価する。ミトコンドリア、特にTCAサイクルへの影響を確認するために、2-ニトロイミダゾール化合物投与時のメタボローム解析を行う予定である。更に、ヒト膠芽腫細胞においても2-ニトロイミダゾール化合物が同様の効果があるかを評価していく。未使用額の発生は効率的な物品調達を行った結果である。未使用額は翌年度の動物実験、組織染色検査に充当する予定である。
漸進的門脈遮断を利用した小児部分肝移植の実験的研究

小児部分肝移植が目的であったが、初年度(昭和61年度)はまず自家移植(犬7回)、同所性全肝移植32回(犬28回、豚4回)、異所性全肝移植10回(犬10回)を行ったが、いずれも3日以上の生存は得られなかった。異所性肝移植では肝移植に対する十分な門脈血流が得られなかったのが原因であり、全肝移植ではポンプがなかったために体外バイパスがうまくいかないのが原因であった。62年度は異所性部分肝移植を3回行ったが、異所性では十分な門脈血流を得られなかった。そこでそれ以後は同所性部分肝移植に方針を変更し、初めて1週間以上の生存犬を得ることができるようになった。同所性部分肝移植は63年度も含めて犬で44回行ったが、アメロイドリングを門脈左枝に装着して、漸進的に移植肝への門脈血流を増加させた群は18頭が24時間以上生存し、うち11頭は5日以上生存した。10日以上の生存は6頭に得られ、16日および19日生存した犬の移植肝組織は拒絶反応の徴候はなく、肝小葉もよく保たれていた。これに対し部分肝移植後に一期的に門脈右枝を結紮した群(11頭)では、5日以上の生存は3頭で最長12日であった。12日生存した犬の移植肝は中心静脈周囲の肝細胞に空胞変性を認めた。また残存した宿主肝の組織では、広範に肝細胞の空胞変性、壊死を認めた。以上の実験結果から、肝右葉を残し、アメロイドリングによって残存宿主肝の門脈血流を徐々に遮断する方法は、体外バイパスを必要とせず安全に部分肝移植を行える方法と思われた。またこの方法を用いれば、いわゆるprimary nonfunction liverの場合には、アメロイドリングを除去して次のドナーが現われるまで待機することも可能と思われる。本実験で10日以上生存した犬の死因は消化管出血、肺出血、胆汁性腹膜炎、門脈および肝動脈血栓であり、術後の管理をもっとうまく行えばさらに長期の生存も可能と思われる。漸進的門脈遮断を利用した部分肝移植を目指すため61年度はまず自家移植、同所性全肝移植、異所性全肝移植、同所性部分肝移植の基礎的実験を行った。1)同所性全移植;犬において28回の同所性全肝移植を行ったが犬は出血性ショックに弱く、その結果、厳密な術中管理のために動脈圧、中心静脈圧、体温、のモニター、凍結血漿の使用を導入した。体外循環としては当初シリコンチューブを使用したがその後ヘパリンコーティングチューブに変更することで循環動態の改善がみられ、一応の成果が得られた。肝保存方法が今後の課題として残されている。2)補助的異所性肝移植;異所性全肝移植を10例、異所性部分肝移植を2例に行った。その結果は約1日の生存が2例に得られたのみであり、その原因は門脈、肝上部下大静脈屈曲による移植肝への血行不全が考えられた。3)同所性部分肝移植;2)の実験結果を基にして生理的な血流が得られる同所性部分肝移植を犬において4例に行った。

本術式の特徴はrecipientの右葉はbypassとして残し、部分肝移植を行った後、右門脈を結紮している点である。現在、ショック、肝阻血に弱いとされる犬を用いているため約半日の生存しか得られていないが今後は阡阻血に強い豚でも並行して行い、またアメロイドリングを装着し、漸進的門脈断へと研究実験を進める予定である。昭和62年度は,昭和61年度に実施した犬,豚を使っての自家移植,同所性全肝移植,異所性全肝移植,同所性部分肝移植を基礎にして,研究課題である漸進的門脈遮断を利用した同所性部分肝移植を中心に実験を行った.実験方法:Graftには犬の肝左葉のみをin situで冷却灌流して用いた.Recipientは肝中心葉,左葉を切除し,右葉のみを残した.Recipientの門脈血は残った肝右葉を通って流れるため,体外シャントを必要とせず,術中の循環状態は安定していた.この状態でgraftの下大静脈をrecipientの肝静脈に吻合し, graftの門脈本幹をrecipientの門脈左枝に吻合する方法で同所性部分肝移植を行った.その後, recipientの残存した肝右葉に障害を与え,線維化させる目的で門脈右枝にアメロイドリングを装着した.対照群としてはrecipientの門脈右枝にアメロイドリングを装着するかわりに,門脈右枝を結紮し,アメロイドリング群と生存率, graftの組織,recipientの残存肝右葉の組織を比較検討した.結果:アメロイドリング群は22回実験を行い, 8頭に3日以上の生存を得た.そのうち4頭は, 19,13,13,9日生存した.これらの生存犬のgraft肝組織は拒否反応の所見もなく,生着状態は良好であった.対照群は6回移植実験を行ったが,最長5日間生存したが有意に死亡率が高かった.今後の方針:63年度もアメロイドリングを用いた漸進的門脈遮断による同所性部分肝移植を中心に実験を行い,さらに長期生存を目指す.さらに今後の臨床への応用を想定して安全でかつgraftとして利用できる肝分部切除および灌流の方法の開発,現犬をdonorとするliving donorによる部分肝移植実験などを行う予定である.昭和63年度は漸進的門脈遮断を利用した犬同所性部分肝移植を前年度にひき続き行い、漸進的門脈遮断群として合計33回、一期的門脈結紮群合計11回の実験を行った。漸進的門脈遮断群は33回中18回に24時間以上の生存を得、11頭は5日以上生存した。最長生存は19日であった。一期的門脈結紮群は11回中8回で24時間以上生存した。5日以上の生存は3頭で、最長12日であった。これら2群の結果から以下の結論を得た。1.生存期間、漸進的門脈遮断群は平均7.7±5.8日(n=18)、一期的結紮群は4.5±3.6日(n=8)と漸進的門脈遮断群の方が生存期間が長い傾向にあった。2.術後肝機能の推移、T.Bil、GOT、γーGTPの各値で、術後1日目、3日目、5日目を比較したが、漸進的門脈遮断群の方が低値をとる傾向にあり、肝機能障害がより軽度と思われた。3.術後経過、漸進的門脈遮断の19日、16日生存犬では、術後7日目前後に急性拒絶反応が認められたが、免疫抑制剤の増量で克服できた。10日以上生存した犬の死固は、消化管出血、肺出血、胆汁性腹膜災、血栓症などであった。4.移植後肝重量、漸進的門脈遮断群の移植肝は剖検時術前の約1.8倍に肥大していた。5.組織学検査、長期生存犬では、肝細胞、小葉構造ともによく保たれていた。残存した宿主肝は空胞変性、壊死を広範に認めた。以上の結果から漸進的門脈遮断を利用した部分肝移植は、一期的に門脈を結紮するよりよい成績が得られると思われた。本実験では最長19日の生存しか得られなかったが、術後管理をさらに検討することにより、より長期の生存が得られるようになれば、臨床応用も可能であると思われる。
数学教育における日本語表現改善のための調査・研究

研究補助金をうけた期間をとおして,生徒には分かりにくく教師には教えにくい「必要条件・十分条件」に関連する部分の言葉を調べ,具体的な提案にまとめた。分かりにくく教えにくい原因を,「数学の論理の難しさ」に求める先行研究はあるが,本研究では「言葉遣いにも原因があるのではないか」という観点から取り上げている。平成元年度は,「であるための必要条件」「であるための十分条件」に使われている言葉の問題点を調べ,「である」「ため」「必要」「十分」「条件」が,「解釈を混乱させやすい組合せで用いられている」と言えることを明らかにした。平成2年度は前年度の知見をもとに,この部分の書換え案をつくり,習う側がどう受け取るかを調査した結果,書換えにより分かりにくさが軽減できることが確かめられた。平成3年度は,得られた知見を発表する作業にあてた。口頭発表のかたわら原稿を作成し,日本数学教育学会誌に投稿した(平成4年6月)が,採否についての回答を得ていない。高木貞治博士は,「中学生が読まされる数学は,漢字と仮名とで書かれた擬装外国語なのではなかろうか」と述べておられる。これは,「現行の数学や論理の日本語表現には,数学教育上の問題点があるのではないか」という本研究の問題意識と共通している。しかし数学のむずかしさが,このような観点から議論される機会は少なかったようである。その点で本研究は,いくらかの新しさをもっと言えるように思う。研究目的に述べた項目のうち、(1)の「難解な日本語」を初学者がどう感じ、教育上どのような障害が引起こされているかについて調査は、以下に述べるような進展があった。すなわち本年度の研究実施計画として申請書に記載した、「上記(1)を達成するための準備」である(i)「日本語表現の選定と調査方法の決定」、および(ii)「調査を実施するための準備と調査の実行」は、一部実現した。調査に用いる「日本語表現」としては、「であるための必要条件」「であるための十分条件」を選び、調査校としては東京理科大学理工学部と中央大学理工学部、文学部を試験的に選定し、調査を行った。結果は数学言語研究会(細井,勉東京理科大学教授主催)の各月例会で報告され、批判検討がくわえられている。研究実施計画には述べなかった分野であるが、理論的な面で次のような進展があった。すなわち文の前後関係により、「ため」の意味がどう変わるかについて、かなりまとまった知見が得られた。内容は、平成1年度国語学会の秋期大会(茨城大学)で発表され、学会からも支持が得られた。その要旨は、国語学会誌「国語学」第160集に掲載される予定である。さらに「条件」「条件と状態」については、数学会に属する基礎論分科会のシンポジュウム「MLG研究集会」において発表され、賛同が得られた。全体としては、昨年度提出した実績報告書の延長線上で調査研究を行った。研究実施計画として申請書に記載した「(i)調査に用いる『日本語表現』の選定と調査方法の決定」については、「必要条件・十分条件」に関する記述をとりあげた。方法の決定に際しては、次の二点を考慮した。第一は、「ため」「条件」「必要」「十分」が、前後におかれた言葉との関連で、どの様な意味に解釈されやすくなるかを調べること。第二は、教科書の従来の記述が、生徒にどう受け取られているかの実態を把握すること。研究実施計画に記載した「(ii)調査協力校の選定、調査の準備と調査実施」は、東京理科大学理工学部と中央大学理工学部、文学部を選定し、調査を行った。また「記述をどう変えたら分かりやすくなるか」を探るために、書換え案を用意し調査を行った。その結果、記述を変更する際に留意すべき点として、有益な示唆がいくつかえられた。

作業は進行中であるが、中間的な結果は、数学言語研究会(細井勉東京理科大学理工学部教授主催)の月例会、1990年度MLG研究集会(名古屋工業大学、12月)のほか、森正雄、「必要条件・十分条件」に対する理解と記憶の実態調査、第23回数学教育論文発表会論文集pp.329334(1990)で報告されている。全体としては、昨年度提出した実績報告書の延長線上で調査研究を行った。研究実施計画として申請書に記載した(1)「調査結果を精密に分析し、必要性があれば補足調査を行う」については、高等学校生を対象とした、同様の調査の重要性が浮び上ってきている。これまでの調査によると、「必要条件・十分条件」だけに限っても、現行の言葉遣いは、学習上の困難を生んでいることが明らかになった。困難の実態と、改善の手段を、一層明確な形で把握してゆくための指針が得られたと考える。「必要条件・十分条件」の他にも、同様な困難を生んでいる言葉遣いのあることが分ってきたので、こうした研究を続けることには意義があると思われる。申請書の(2)「報告書の作成を計る」は、「必要条件・十分条件」についてまとめ、平成4年5月に、日本数学教育学会誌に投稿すべく準備を進めている。内容の一部は、平成3年8月の、日本数学教育学会第73回総会で口頭発表した。申請書の(3)「同様の問題が外国にもあるのではないか」という予測については、基礎的な作業をを行っており、具体的には、平成4年にカナダで開かれるICMEー7において、効率的な資料を収集する計画である。上に記した日本数学教育学会第73回総合での口頭発表の内容は、森正雄、教科書のことばと生徒の感じ方、日本数学教育学会誌第73巻臨時増刊、第73回総会特集号p.399に報告されている。
ゲノム分子生物学による生存可能な病原性細菌の直接計数法の研究開発

平成30年度には先ずろ過濃縮したサンプルのPMA処理方法を検討した。以前の研究ではBacLight試薬による染色の結果、フィルターろ過により大腸菌の細胞膜が何らかの損傷を受けている可能性が指摘されていたが、PBS等を適切に使用することでろ過濃縮してもPMA試薬で染色されないように工夫することができた。そこで生活排水、その処理水、河川水の3つの水サンプルと消化汚泥にPCR, PMA-PCR,RT-PCRの3手法を適用して次世代シーケンサーを用いてそれぞれのサンプルの細菌叢解析を行った。生活排水と河川水ではPCRとPMA-PCRを適用したサンプルの細菌叢が類似していたが、RT-PCRを用いた場合細菌叢は異なる傾向を示した。処理水と消化汚泥では3つの手法で明らかな違いが認められた。さらにβ多様性を解析したところ、4つのサンプルとも手法によってβ多様性が大きく異なり、分析手法によって活性のある細菌叢に顕著な違いがあることが知られた。それぞれのサンプル内の多様性を示すα多様性は、排水を除いた3つのサンプルでPCRを用いた場合最も高く、排水ではRT-PCRが最も高くなった。また新しく開発されたPMAxx試薬と従来のPMA試薬を比較する実験も行った。PMAxx試薬はPMAより生存細菌と死滅細菌の分別に効果的であること、活性汚泥のような多数の細菌群からなるサンプルに対しても有効であることが確認できた。PMAxxの添加濃度は、大腸菌と活性汚泥とで50μMが望ましいことが分かった。今年度の研究成果で示したように、ろ過濃縮したサンプルのPMA処理方法の検討や新たに開発されたPMAxx試薬の効果の検討など当初予定していなかった研究課題に取り組む必要があったので、研究は少し遅れ気味になっている。また次世代シーケンサーによる細菌叢解析にかなりの委託分析費がかかり、予算の面からも制約がある。平成31年度には、排水処理プロセスに絞って細菌群挙動解析を実施する予定である。平成30年度にろ過濃縮したサンプルのPMA処理方法が確立できたので、4つの環境サンプルにPCR, PMA-PCR,RT-PCRの3手法を適用して得られた細菌叢に大きな違いがあることが分かった。また新しいPMAxx試薬とPMA試薬を比較した結果、PMAxx試薬の方が分別効果が優れていたので、平成31年度の研究ではPMAxx試薬を使用して排水処理プロセスの各工程を解析する。プロセスの各段階で検水中の細菌叢解析を実施し、各工程が個別の細菌群、特に病原菌についてどのような効果があるか実証する。生活排水の消毒効果については多数の大腸菌が消毒後もVBNC状態で残存しているという報告もあり、それぞれの病原菌に及ぼす消毒効果を精査する。病原性細菌感染リスクの再評価については、処理プロセス中の挙動調査が終わり次第取り組み、微生物基準の検証や消毒方法の改善策の提案につなげたい。また今年度までに得られた成果についてまとめ、論文として海外雑誌に投稿する予定である。また11月に広島で開催される8th IWA Microbial Ecology and Water Engineering Specialist Conference(MEWE2019)でも研究発表する予定である。平成28年度には、先ず細菌細胞内に遺伝子が多く存在するrRNA遺伝子を利用したPMA-qPCR法について生存可能な大腸菌の定量方法を検討した。従来用いてきたuidA遺伝子と比較し、PCRでの対象遺伝子の違いによる分別効果の差異とPMA処理における必要なPMA濃度を実験で求めた結果、23S rRNA遺伝子を対象としたプライマーセットはどちらも10×(-1)(copy数/PCR反応液)レベルまで大腸菌の定量が可能であり、特に、EC23S857は10×(-2)レベルまで検出可能だった。また、PMA-qPCR法の分別効果は、EC23Sのプライマーセットが最も効果が顕著だった。PMA濃度実験では、PMA試薬は大腸菌菌株NBRC3301では10μM、JCM1649では50μMで分別効果が得られることが分かった。全細菌を対象としたPMA-qPCR法の研究開発では、probeを利用したリアルタイムPCR法の方が増幅効率が100%に近く、またSYBERGreenを使用したPCR法を河川サンプルに適用すると、目的外の遺伝子増幅が認められ、probeを利用したPCRの方が全細菌の検出に適していた。PCRおよびPMA-PCR法による河川サンプル中の全細菌数の計測は、BacLight法に比べ非常に少なく、この原因に関しては今後検討していく必要がある。さらに次世代シーケンサーによる細菌叢解析については豊橋技大で行われた研修に参加し、サンプルの作成方法とデータの解析手法を学んだ。河川サンプルの解析結果から、存在割合2%以上の細菌群のみでは全体の23割しか占有しておらず、残りの67割は様々な種類の細菌が非常に少ない割合で多数存在していることが分かった。今年度の研究成果で示したように、rRNA遺伝子によるPMA-qPCR法を利用した生存可能な大腸菌の定量について、PMA処理条件とPCR反応条件が確立できた。全細菌群を対象としたPMA-qPCR法の研究では、プライマーを含めたPCR条件の再検討が必要である。今年度当初予定していたRNAを直接利用するRT-PCR法についても、RNAの抽出と逆転写酵素を使用したワンステップRT-PCR法においてEC23S857プライマーセットで高感度で検出できることが確認できた。

PMA-qPCR法の分別効果を改善できると報告されているターゲット遺伝子の塩基長と、2ステップで増幅を行うnested PCRの関係についても検討した。次世代シーケンサー解析で増幅させる16S rRNA遺伝子のV3, V4領域(塩基長460bp)と16S rRNA遺伝子全領域(塩基長約1500bp)について、3つの熱処理した細菌株を用いてPMA処理による分別効果を比較した。電気泳動結果から3つの細菌ともV3, V4領域を増幅した場合PMA処理で検出されず、一方最初のステップで16S rRNA遺伝子全領域を増幅させた後にV3, V4領域をPCR増幅させたnested PCR法では、3つの細菌とも検出された。そこで第1ステップのサイクル数を短くしてnested PCRを試みたところ検出されない結果が得られた。このようにRT-PCR法やnested PCR法についても研究成果が認められ、研究はおおむね順調に進展していると判断される。平成29年度にはrRNAそのものを使用して、RT-qPCR法の確立による生存可能な大腸菌の定量について検討した。逆転写酵素を用いたRT-qPCR法においてone-step法と2つのtwo-step法を比較したところ、ランダムプライマーを使用したtwo-step法は、低濃度サンプルでも最も感度が良く定量できた。この方法を用いて行った排水と河川サンプルの分析結果では常にRNA濃度がDNA濃度を上回る値を示し、rRNAを利用した計測方法による検出感度改善の可能性が示された。次世代シーケンサーによる生理的活性のある細菌の細菌叢解析のため、2段階で増幅を行うnested-PCRの効果について検討した。次世代シーケンサーの増幅領域である16S rRNA遺伝子のV3-V4領域について、排水サンプルを用いてPMA処理後PCRとnested-PCRを比較したところ、電気泳動の結果からnested-PCRの方が塩基長約450bpのDNA断片を高い濃度で増幅可能であり、3つの購入株の細菌を使用した実験でもnested-PCRの分別効果が確かめられた。そこで熱処理した排水サンプルに培養した大腸菌と糞便性連鎖球菌を添加して、PCR, PMA-PCR,PMA-nestedPCR, RT-PCRの4手法を比較するため次世代シーケンサーで細菌叢を解析したところ、PCR以外の3つの方法では添加した2菌種を検出できたが、RT-PCRのみ添加量を反映した細菌叢が得られた。nested PCRとPCR法による違いはほとんどなく、これらの結果はβ多様性解析によっても確認できた。今年度の研究成果で示したように、次世代シーケンサーによる生理的活性のある細菌の細菌叢解析のための手法はほぼ確立できた。また昨年度BacLight法による直接染色法とPCRやPMA-PCRによる遺伝子増幅法との間で計数値に大きな差異が見られた全細菌を対象としたPMA-PCR法の研究開発では、プライマーの改変とDNA抽出方法の改善を行ったところ、リアルタイムPCRとBaclight法による河川サンプルの全細菌の計測は、どちらの方法でも細菌濃度がおよそ10^(7);個(copy数)/ml以上となった。
好酸球性副鼻腔炎の根治を施行したSIRT-1活性化剤の基礎的研究

本年度は、鼻粘膜上皮初代継代細胞(HNEC)を用いて、SIRT1によるサイトカイン発現制御を検討した。まず、HNECにおける自然免疫シグナルを検討するため、TLR1-9のアゴニストをそれぞれ投与し、mRNAレベルでのサイトカイン発現を検討した。結果、TLR3のアゴニストであるPoly (I:C)によってサイトカイン発現が有意に亢進することがわかった。Poly(I:C)にはTLR3のみならずRIG-I受容体を介して自然免疫シグナルを活性化することがわかっている。RIG-IとTLR3の特異的アゴニストをそれぞれ用いて、サイトカインmRNAの発現を検討したところ、Poly(I:C)はTLR3を介してHNECの自然免疫シグナルを活性化させることが判明した。また、自然免疫シグナルにおけるSIRT1の発現変化を検討中である。これまでにqPCR法、蛍光抗体免疫染色法では自然免疫シグナルの活性化によりSIRT1がmRNAと蛋白質レベルで発現亢進していると示唆される結果を得ている。現在、SIRT1活性の測定を試みているところである。29年度が最終年度であるため、記入しない。
黄色ブドウ球菌の白血球崩壊毒素の偏在の機構の解明-ファージ変換と発現調節機構-

(1)PVLのファージ変換の全貌及びPVL遺伝子の偏在性の機構の解明(a)臨床分離株におけるPVL変換ファージ群の解析:研究協力者より収集されたPVL産生株のうち10株からPVL変換ファージを単離し、これまでに3株のファージゲノムを決定した。これらをφPVL並びにφSLTとの比較した結果、PVL変換ファージは頭部、尾部領域の違いからφPVL型、φSLT型の2つの型に大別されること、さらに各型は、調節・複製領域の違いでサブタイプに細分されることを見出した。以上の結果を踏まえ、(1)PVL並びにattRサイトのPCRによるPVL変換ファージの溶原化の確認、(2)キャプシド、並びにmajor tailをコードする領域のPCRによる2大型別、(3)調節・複製領域のPCRによる細分の3段階から成る、PVL保有株プロファージの型別システムを構築した。現在、PVL産生株のうち、PVL産生株の型別成績から、(1),(2)の段階では型別が可能である。しかし(3)の段階で型別できない株が数株見出されていることから調節・複製領域の異なる新たなPVL変換ファージの存在が示唆された。(b)ファージの受容能の解析:φSLTのminer tailタンパク質であるORF636が菌体表層のテイコ酸の結合することを見出した。(a)の結果と合わせ、ORF636を有するφSLT型のファージのサブタイプにおける宿主域の違いは、調節・複製領域が関与していることを明らかにした。(2)PVLの調節機構並びにPVLと病態との関係の解明φSLTが溶原化してもPVLが発現しない様な指示菌の解析から、sigBあるいはagrによる調節系とは独立した調節系の存在を示唆する結果を得た。現在までにこれらの指示菌に対する形質転換系を確立し、PVLの発現が回復する因子を解析するためのスクリーニングを進めている。一方、溶原化部位が存在するorf及び周辺領域の遺伝子構造に株による多様性があることを見出した。また本研究の過程で、S.intermediusのPVL型毒素LukS-I、Luk-FIによる白血球崩壊には、ロイコシジン及びPVLと同様に膜孔の形成並びにS型成分のリン酸化が必須であることを見出した。(1)PVLのファージ変換の全貌及びPVL遺伝子の偏在性の機構の解明(a)臨床分離株におけるPVL変換ファージ群の解析:研究協力者より収集されたPVL産生株のうちこれまでに10株からPVL変換ファージを単離した。現在、それらの塩基配列の決定を進めている。また、ファージとして回収できない株について、PCRを用いてPVL遺伝子並びに溶原化部位の解析を進めている。これまでに解析した株では所定の位置にPVL-変換ファージが溶原化していることが確認され、そのうち部はプロファージの型別に有効な結果が得られている。(b)ファージの受容能の解析:φSLTを用い、PVL陰性S.aureus群におけるファージの宿主域を検討した。

φSLTは用いた全ての株に吸着したことを確認した。感染しない株についてattB領域の解析を行った。その結果、全ての菌がattBを保有していたが、半数はその位置にPVL遺伝子を持たないファージが溶原化していた。現在溶原化しているファージのimmunityとの関係を解析中である。さらに(a)で得られた複数のPVL変換ファージの宿主域の検討を進めている。(2)PVLの調節機構並びにPVLと病態との関係の解明(13-14年度)具体的にはφSLTが溶原化してもPVLが発現しない様指示菌を複数得た。本菌における形質転換系を確立し、現在PVLの発現が回復する因子を解析するためのスクリーニングを行っている。一方、溶原化部位に存在する遺伝子構造に株による多様性があることを見出し、ファージの感染並びにPVLの発現との関係を解析中である。(1)PVLのファージ変換の全貌及びPVL遺伝子の偏在性の機構の解明(a)臨床分離株におけるPVL変換ファージ群の解析:研究協力者より収集されたPVL産生株のうち10株からPVL変換ファージを単離した。これまでに3株のゲノムを決定した。これらをφPVL、φPV83並びにφSLTとの比較した結果、PVL変換ファージは頭部、尾部領域の違いからφPVL型、φSLT型の2つの型に大別されること、さらに各型のファージは、調節、複製領域の違いでサブタイプに細分されることを見出した。以上の結果を踏まえ、(1)PVL並びにattRサイトのPCRによるPVL変換ファージの溶原化の確認、(2)キャプシド、並びにmajor tailをコードする領域のPCRによる2大型別、(3)調節・複製領域のPCRによる細分の3段階のから成る、PVL保有株プロファージの型別システムを構築した。現在、PVL産生株のうち、PVL保有ファージが回収できない株における型別成績から、(1),(2)の段階では型別が可能である。しかし(3)の段階で型別できない株が数株見出されていることから調節・複製領域の異なる新たなPVL変換ファージの存在が示唆された。(b)ファージの受容能の解析:φSLTのminer tailタンパク質であるORF636が菌体表層のテイコ酸の結合することを見出した。(a)の結果と合わせ、ORF636を有するΦSLT型のファージのサブタイプにおける宿主域の違いは、調節・複製領域が関与していることを明らかにした。(2)PVLの調節機構並びにPVLと病態との関係の解明(13-14年度)具体的にはφSLTが溶原化してもPVLが発現しない指示菌を解析した結果、sigB系、あるいはsgr系の片方または双方に変異が入っていることが確認された。一方で、これらが欠落していてもPVL発現に影響しない株も存在することから、既存の調節系とは独立した調節系の存在が示唆された。一方、溶原化部位に存在する遺伝子構造に株による多様性と、ファージの感染並びにPVLの発現との間には、現在までのところ有意な相関関係は得られていない。
PMCA法を用いた獲得性CJDの迅速診断法の確立

本研究では、プリオンのin vitro増幅系であるProtein Misfolding cyclic amplification(PMCA)を用いて、獲得型クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)のうちV2プリオンが129Met/Metに感染することによって生じる新たなタイプであるCJD-MMiKを迅速に診断できることを明らかにした。これまで感染実験でしか同定できなかったMMiKは、感染源であるV2プリオンと、基質特異性及び増幅産物のタイプに関して全く同じ増幅特性を示すことが明らかとなった。数年の観察期間を必要とする感染実験とは異なり、本法によりCJD-MMiKは1週間で同定可能となった。日本国内に多い硬膜移植後クロイツフェルト・ヤコブ病(dCJD)には、同じ129M/Mの遺伝子型でありながら全く異なる病理像を示す二つのグループがある。一つは孤発性CJD (sCJD)-MM1と同様の病理像を示すグループ、一方はアミロイド班の沈着とタイプ1とタイプ2の中間型の分子量を持つ異常プリオンタンパク質を蓄積するグループである。このグループはプラーク型dCJDと分類され、その特異的な病理像、またヒト型ノックインマウスへの感染実験の結果から、sCJD-VV2またはMV2からの感染が原因であることがわかっているが、その診断は困難である。中間型の異常プリオンタンパク質はルーチンのウェスタンブロッティングで検出することができず、ヒト型マウスを用いた感染実験には2年近くの観察期間を必要とする。そこで本研究では、in vitro増幅系であるprotein misfolding cyclic amplification (PMCA)を用いて、このタイプの獲得性CJDを迅速に診断する方法を確立した。現時点ではsCJD-MM1は基質の遺伝子型が129M、129Vいずれを用いてもほとんどPMCAでは異常プリオンタンパク質を増幅することができない。一方、プラーク型のdCJDは、遺伝子型が129M/Mであるにもかかわらず、129Mではなく129Vの基質で劇的に増幅した。さらに、その増幅産物をタイプ2特異抗体を用いて解析したところ、129Vの基質から産生された産物はすべてタイプ2であった。これらの結果は、sCJD-VV2またはMV2プリオンと同じ増幅特性が、プラーク型dCJDにおいても認められることを示している。プラーク型dCJDを含む100例以上のCJD症例について検討したところ、プラーク型dCJDは解析したすべての症例に関して上述の特徴を持ち、一週間以内に診断可能であった。当初の予定以上に課題の研究は進展しており、すでに学術雑誌にin vitro増幅系を用いたプラーク型硬膜移植後クロイツフェルト・ヤコブ病の迅速診断法に関する論文を発表した。硬膜移植後のクロイツフェルト・ヤコブ病(dCJD)には同じ129M/Mの遺伝子型でありながら、病態の異なる全く二つのタイプがある。一方は孤発性CJD (sCJD)と区別できないタイプ、他方はアミロイド斑を伴い非典型的な分子量を持つプラークタイプである。このプラークタイプのdCJD (p-dCJD)は、これまでのマウスを用いた感染実験によりsCJDの129V/Vのタイプ2 (V2プリオン)が感染して生じたタイプであることが明らかとなっている。本研究ではマウスを用いた感染実験を行わずに、プリオンのin virto増幅法の一つであるprotein misfolding cyclic amplification法を用いて、このp-dCJDを迅速に診断できることを見出した。診断法の基本は、seedとなるp-dCJDのプリオン遺伝子型とは異なる129V型のリコンビナントプリオンタンパク質を基質に用いた場合に劇的に増幅されることと、増幅産物の分子量を特異抗体を用いて解析することである。ヒト型マウスを用いた感染実験ではp-dCJDの診断に数年の観察期間を必要としたが、本法では一週間以内に診断が可能となった。今年度はさらに範囲を成長ホルモン剤由来の医原性CJD (hGHCJD)にまで広げ、同じアミロイド斑を伴うタイプについて同様の試験を行った。ボローニャ大学のピエロ・パーチ教授からフランスで報告されたhGHCJD5例の提供を受け、解析したところ5例全てがp-dCJDと全く同様の増幅プロパティを示した。このことから、提供を受けたhGHCJD5例全てがV2プリオン由来であること、またhGHCJDもまたp-dCJD同様本法により迅速に診断可能であることが明らかとなった。硬膜移植の医原性クロイツフェルト・ヤコブ病のin vitro増幅系を用いた診断法の確立は目途がついたため、欧米で多数報告されてきた成長ホルモン製剤による医原性クロイツフェルト・ヤコブ病についても診断の対象を広げ、本法の信頼性について検討を行った。ボローニャ大学のピエロ・パーチ教授より供与していただいた5例についても同様の解析を行い、国際学会にて成果を発表した。一つは孤発性(sCJD)と区別できないタイプ、一方はアミロイド斑を伴い非典型的な分子量を持つプラークタイプである。このプラークタイプのdCJD (p-dCJD)は、これまでマウスを用いた感染実験によりsCJDの129V/Vのタイプ2 (V2プリオン)が感染して生じたタイプであることが明らかとなっている。

本研究ではマウスを用いた感染実験を行わずに、プリオンのin virto増幅法の一つであるprotein misfolding cyclic amplification (PMCA)を用いて、このp-dCJDを迅速に診断できることを見出した。診断法の基本は、seedとなるp-dCJDのプリオン遺伝子型とは異なる129V型のリコンビナントプリオンタンパク質を基質に用いた場合に劇的に増幅されることと、増幅産物の分子量を特異抗体を用いて検出することである。この方法により、マウスを用いた感染実験では数年の観察期間を必要としたが、本法では一週間以内に診断が可能となった。同様にこの方法は成長ホルモン剤由来の医原性CJD (hGHCJD)にも応用することができ、海外より提供を受けたhGHCJD5例全てがV2プリオン由来であり、p-dCJD同様に陣迅速に確定診断が可能であることがわかった。またhGHCJDについてヒト型マウスを用いた感染実験の結果とPMCA法による結果は完全に一致していることが確かめられ、PMCA法による診断法の確実性が証明された。本研究では、プリオンのin vitro増幅系であるProtein Misfolding cyclic amplification(PMCA)を用いて、獲得型クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)のうちV2プリオンが129Met/Metに感染することによって生じる新たなタイプであるCJD-MMiKを迅速に診断できることを明らかにした。これまで感染実験でしか同定できなかったMMiKは、感染源であるV2プリオンと、基質特異性及び増幅産物のタイプに関して全く同じ増幅特性を示すことが明らかとなった。数年の観察期間を必要とする感染実験とは異なり、本法によりCJD-MMiKは1週間で同定可能となった。当初の計画では、硬膜移植後クロイツフェルト・ヤコブ病の診断のみを研究対象としていたが、研究が予定以上に進展したことから、今後の研究では欧米で多くみられるヒト成長ホルモン製剤による医原性クロイツフェルト・ヤコブ病にも対象を広げる予定である。すでにイタリアのボローニャ大学のピエロ・パーチ教授より当症例の凍結脳サンプルの提供を受けており、これらについても同様の結論を得つつある。これらの研究成果についても発表の準備を進めているところである。ボローニャ大学から提供された成長ホルモン製剤由来のクロイツフェルト・ヤコブ病症例について、ヒト型マウスを用いた感染実験による確認に着手し、in virto増幅系の信頼性について確認を行っている。同時に、この診断法の信頼性をさらに高めるため、増幅困難なタイプのヒトプリオンの高効率な増幅を目的とした条件検討にも着手していく予定である。プリオン
歯科用難削材の研削に関する研究

歯科補綴物材料として,今後高硬度,高強度の材料の使用がますます増加し,従来の回転による機械研削のみでは限界があるので複合研削の用途が増すと考えられた.この複合研削法は研削条件により機械的のみならず,電気化学的要因が研削時に複合現象として現われた.1.歯科技工に用いられているハンドピースによる回転運動の機械研削に電解研磨を併用した場合の歯科用難削材に対する複合研削の実用性について検討した結果,炭化チタンを主材として立方晶窒化ホウ素を配合した導電性砥石を用いると機械研削のみを比べると研削量の増加と研削面性状の改善が認められた.2.電解複合研削法は電解液を用いる湿式研削であり,砥石の回転により電解液の飛散が避けられないため,歯科技工のような手作業では術者の安全性に問題があり,さらに研削部位を直視しずらいので操作性が悪いことも,また電解効果が十分に発現されないことなど考えられた.3.電解複合研削法をより実用的なものにするため,従来の回転運動に変えて新たに往復運動を利用した研削方法について検討を加えた.往復運動を利用した電解複合研削を応用すれば,電解液の飛散もなく,手作業で研磨ができ,しかも加工の主体が電気化学的除去であるので,往復運動の機械研削効率が劣っていも,陽極に生じた表層の反応生成物を除去するのは容易であった.従って,むしろ効率の良い研磨が可能になると考えられた.往復運動を用いた電解複合研削による歯科用難削材の研削システムを確立した.歯科補綴物材料として,今後高硬度,高強度の材料の使用がますます増加し,従来の回転による機械研削のみでは限界があるので複合研削の用途が増すと考えられた.この複合研削法は研削条件により機械的のみならず,電気化学的要因が研削時に複合現象として現われた.1.歯科技工に用いられているハンドピースによる回転運動の機械研削に電解研磨を併用した場合の歯科用難削材に対する複合研削の実用性について検討した結果,炭化チタンを主材として立方晶窒化ホウ素を配合した導電性砥石を用いると機械研削のみを比べると研削量の増加と研削面性状の改善が認められた.2.電解複合研削法は電解液を用いる湿式研削であり,砥石の回転により電解液の飛散が避けられないため,歯科技工のような手作業では術者の安全性に問題があり,さらに研削部位を直視しずらいので操作性が悪いことも,また電解効果が十分に発現されないことなど考えられた.3.電解複合研削法をより実用的なものにするため,従来の回転運動に変えて新たに往復運動を利用した研削方法について検討を加えた.往復運動を利用した電解複合研削を応用すれば,電解液の飛散もなく,手作業で研磨ができ,しかも加工の主体が電気化学的除去であるので,往復運動の機械研削効率が劣っていも,陽極に生じた表層の反応生成物を除去するのは容易であった.従って,むしろ効率の良い研磨が可能になると考えられた.往復運動を用いた電解複合研削による歯科用難削材の研削システムを確立した.1.一般の機械研削は、研削能率および仕上面の粗さについて加工速度の影響が大きく、加工速度を上げれば、それに従って仕上面の粗さも大きくなる。一方電解複合研削では、加工速度が仕上面の粗さにそれほど大きな影響を示さないと言われていた。回転法による電解で電圧および送り速度による仕上面の粗さについて検討した。電圧の影響を余り受けないものがCo-Cr,Ni-Cr系合金、電圧の上昇に従って粗さの大きくなるものがCu-2n,Al,Ag-In系合金、電圧の上昇に伴って粗さの小さくなるものが18-8鋼、高速度鋼であった。2.加工速度に及ぼす砥石速度の影響:砥石速度を増すと加工速度は、逓減的に増加するが、これは電気化学的除去と同様に機械的な摩擦の増加に帰せられた。砥石速度の増加は、被研削材の表面の反応生成物の除去および加工間隙における電解液の流通を促進する。砥石回転数にも限界があり、回転数の2乗に比例する遠心力により、電解液が砥石面に粘着することを阻害されるとともに砥石に付着する空気層が電解液の砥石面への粘着を妨げる。被研削材の材質は、加工速度に関係を有し、機械的因子の外に、個々の難削材の組成による電気化学的可溶性の差異が存在し、異なる種類の不動態被膜を生ずるため、同一研削条件においても異なる電流密度と加工速度の差異が認められた。3.繰り返し研削能率について:機械研削は、研削回数が多くなるにつれて砥石のチップポケットが埋められ目づまりを起こし研削作用を劣化させた。電解複合研削は、研削回数が多くなってもそれほど能率の低下が認められなかった。これは電解複合研削の特長で、通常の機械研削では目づまりなどの影響により連続使用すると研削能率が段々と低下し、目立やドレッシングなどの必要があった。
植物細胞における生体膜共役輸送系の分子基盤と進化を探る

生体膜共役輸送系は、栄養物質や老廃物の輸送に働き、細胞存続の基盤となる。共役イオンとしてH+共役型とNa+共役型が知られているが、陸上高等植物はH+共役型である。我々は祖先植物シャジクモのリン酸輸送系はNa+共役型であることを報告し、本研究においてその輸送系遺伝子の全長決定に成功した。配列系統解析から、シャジクモのリン酸輸送体は、全ての陸上植物の祖先型となり、アオミドロなどと一つのクレードを形成した。配列情報の解析から、H+輸送に必要とされるアミノ酸残基が保存されておらず、Na+共役であることが強く示唆された。また、最初の陸上植物と考えられているゼニゴケについても系統、生理解析を進めている。生体膜共役輸送系は、栄養物質の取り込みや老廃物の排出に働き、細胞存続の基盤となる輸送系である。共役イオンとしてH+共役型とNa+共役型が知られていて、植物と動物を区別する大きな要素の一つである。陸上高等植物はH+共役型であるが、我々はその祖先植物のシャジクモのリン酸輸送系はNa+共役型であることを報告した。シャジクモのESTデータを利用してリン酸輸送体の遺伝子探索を行ったところ、ただ一つの遺伝子が見つかり、それは高等植物の細胞膜リン酸輸送体全ての祖先型であることが判明した。本研究では、このシャジクモリン酸輸送体と高等植物リン酸輸送体の遺伝子解析と、膜輸送体としての生理解析を組み合わせることで、植物細胞における生体膜共役輸送系の分子基盤と進化がどのように成立したかを明らかにすることを目指す。今年度の実験では、シャジクモ節間細胞のESTデータから見つかったリン酸輸送系遺伝子の系統解析から、現在判明している遺伝子配列は、全ての陸上植物の祖先型となり、ミカヅキモやアオミドロの同じ遺伝子と一つのクレードを形成することが明らかとなった。遺伝子全長が明らかではなかったため、その解読を進めるとともに、配列情報の解析を行ったところ、H+輸送に必要とされるアミノ酸残基が保存されておらず、Na+共役であることを強く示唆するものであった。また、生理機能の解析を進め、シャジクモ、オーストラリアシャジクモを用いて、放射性リン酸の輸送活性の測定も行った。また、関連輸送系遺伝子の電気生理学的解析を進めた。シャジクモのESTデータを利用してリン酸輸送体の遺伝子探索を行ったところ、ただ一つの遺伝子が見つかった。本研究では、その全長を決定することに成功し、それは高等植物の細胞膜リン酸輸送体全ての祖先型であることが判明した。このシャジクモリン酸輸送体と高等植物リン酸輸送体の遺伝子解析と、膜輸送体としての生理解析を組み合わせることで、植物細胞における生体膜共役輸送系の分子基盤と進化がどのように成立したかを明らかにすることを目指している。リン酸輸送系遺伝子の系統解析から、シャジクモのリン酸輸送体は、全ての陸上植物の祖先型となり、ミカヅキモやアオミドロの同じ遺伝子と一つのクレードを形成することが明らかとなった。配列情報の解析を行ったところ、H+輸送に必要とされるアミノ酸残基が保存されておらず、Na+共役であることを強く示唆するものであった。また、生理機能の解析を進め、シャジクモ、オーストラリアシャジクモを用いて、放射性リン酸の輸送活性の測定も行ったところ、遺伝子解析に用いたシャジクモもNa+共役型であることが明らかとなった。最初の陸上植物と考えられているゼニゴケについても系統、生理解析を行ったところ、ゼニゴケのリン酸輸送体は陸上植物型で、リン酸輸送はH+共役型であった。現在、分子構造と共役輸送系の関係を明らかにする研究を進めている。植物細胞生物学これまで共役輸送機構の進化に焦点をあてた研究は存在しない。その中で、本研究で目指したリン酸輸送系の解析から、共役イオンが異なることがどのような分子機構で成立しているか、それらがどのように進化しているかを明らかにすることが出来そうである。現在、シャジクモが持つただ一つのリン酸輸送体遺伝子の全長解析を進めているが、これまでどの植物でも知られていなかったほど特殊な遺伝子構造をしていることが明らかになりつつある。