hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ウイルスベクターを用いたサクラ属果樹の遺伝子機能評価系の開発およびその園芸的利用

主要果樹種を多く含むバラ科サクラ属果樹では,早くから重要な園芸形質に関する遺伝子研究が精力的に進められてきた.しかしながら,遺伝子の機能を実証する有効な手法が確立されていないため,得られた成果を果樹栽培・育種に十分に活用できていないのが現状である.そこで本研究では,サクラ属果樹においてウイルスベクターを用いた遺伝子機能評価系を確立し,基礎研究で蓄積されたゲノム関連情報を果樹栽培・育種に有効活用することを目的とする.今年度は,昨年度に引き続き,果実生産・育種において実用性の高い花成関連遺伝子に着目し,安定したウイルスベクターの接種および早期開花誘導を実現するため,(1)in vitro転写系を用いたALSV接種法の検討および(2)ウイルスベクター感染の品種間差異の調査に取り組んだ.(1)pBICAL1およびpBICAL2-NbPDS(ベンサミアーナタバコPDSの部分配列を含む)からin vitro転写によりALSV RNAを合成し,cap構造およびpoly Aを付加した.RT-PCRによりALSV RNAの合成に成功したことを確認した後,ALSV RNA1およびRNA2を等量混合し,遺伝子銃でベンサミアーナタバコの葉に接種した.RT-PCRおよび葉の白化を指標として接種系の有効性を確認したが,cap構造やpoly Aの有無によらず,ALSV感染は確認されなかった.(2)シロイヌナズナFTの全長配列(発現誘導),ウメTFL1およびアンズPDSの部分配列(VIGSによる発現抑制)を有するALSVベクターをモモ`川中島白桃',`おかやま夢白桃',`白皇',`桃水'の4品種の発根直後の子葉に接種したところ,いずれも高い感染率を示した.しかしながら,上位葉で激しい病徴が発生し,形質変化は観察されなかった.現在,TRVベクターなどALSV以外のウイルスベクターの構築・接種を進めている.主要果樹種を多く含むバラ科サクラ属果樹では,早くから重要な園芸形質に関する遺伝子研究が精力的に進められてきた.しかしながら,遺伝子の機能を実証する有効な手法が確立されていないため,得られた成果を果樹栽培・育種に十分に活用できていないのが現状である.そこで本研究では,サクラ属果樹においてウイルスベクターを用いた遺伝子機能評価系を確立し,基礎研究で蓄積されたゲノム関連情報を果樹栽培・育種に有効活用することを目的とする.本年度は,果実生産・育種において実用性の高い花成関連遺伝子を対象に,本研究を遂行する上で基礎となる遺伝子機能評価系の開発を行った.シロイヌナズナおよびウメFTの全長配列(AtFT,PmFT),あるいはアンズおよびウメTFL1の部分配列(ParTFL1,PmTFL1)を組み込こんだALSVベクターを作製した.遺伝子銃を用いて各ALSVベクターを発根直後のアーモンドの未熟子葉へ接種し,外来FTの発現誘導あるいは内生TFL1の発現抑制を試みた.RT-PCRにより組換えALSVの感染を確認したところ,数個体の茎頂,葉,茎,根において感染が確認された.しかしながら,いずれのALSVベクター感染個体においても花芽形成などの形態的変化は確認されなかった.各器官における内生の花成関連遺伝子(AP1,FT,SOC1,LFY)の発現量を調査したが,コントロールと差がみられるものはなかった.一方,ParTFL1-ALSVあるいはPmTFL1-ALSV感染個体では,茎頂および根における内生TFL1の発現量が減少する傾向がみられた.これらの結果から,外来FTの発現誘導あるいは内生TFL1の発現抑制だけでは,花成誘導に不十分である可能性が考えられた.しかしながら,全体的に感染率が低く,正確な評価ができていない可能性もある.今後は安定した感染率を得るために接種法の改善に取り組む.本年度は,アーモンドを対象にALSVベクターを用いた花成関連遺伝子の発現制御を行い,遺伝子機能評価系の基礎開発および開花促進への応用に取り組んだ.しかしながら,今回用いた接種法では十分数の感染個体が得られず,当初計画していた「花成関連遺伝子の発現解析」および「生育条件の検討」について詳細な調査を行うことができなかった.これらの理由から,やや遅れていると評価した.主要果樹種を多く含むバラ科サクラ属果樹では,早くから重要な園芸形質に関する遺伝子研究が精力的に進められてきた.しかしながら,遺伝子の機能を実証する有効な手法が確立されていないため,得られた成果を果樹栽培・育種に十分に活用できていないのが現状である.そこで本研究では,サクラ属果樹においてウイルスベクターを用いた遺伝子機能評価系を確立し,基礎研究で蓄積されたゲノム関連情報を果樹栽培・育種に有効活用することを目的とする.今年度は,昨年度に引き続き,果実生産・育種において実用性の高い花成関連遺伝子に着目し,安定したウイルスベクターの接種および早期開花誘導を実現するため,新規ベクターの開発ならびに接種源の調整法の検討を行った.シロイヌナズナおよびウメFTの全長配列(AtFT,PmFT;発現誘導),あるいはアンズおよびウメTFL1の部分配列(ParTFL1,PmTFL1;VIGSによる発現抑制)を単独で有するALSVベクターに加えて,クローニングサイトを新規に設計し,複数遺伝子の同時発現制御が可能なベクターを開発した.これらのベクターをベンサミアーナタバコおよびキヌアに接種し,ベントナイトを用いてウイルスRNAを精製・濃縮した.リアルタイムRT-PCRによるウイルスRNAの絶対定量を行ったところ,従前の方法と比較して7.540倍にウイルスRNAを濃縮することに成功した.しかしながら,濃縮RNAをアーモンド,カンカオウトウ,アンズに接種したところ,明確な感染率の改善は確認できなかった.

また,感染個体における早期開花誘導もみられなかった.今後は,引き続き接種源の調整法を検討するとともに,ALSVベクター以外のウイルスベクターの接種にも取り組む.本年度は,アーモンド,カンカオウトウ,アンズにおいて安定したウイルスベクターの接種および早期開花誘導を実現するため,新規ベクターの開発ならびに接種源の調整法の検討を行った.しかしながら,今回用いた方法では,接種効率改善・早期開花誘導の両面において明確な改善効果は得られず,当初計画していた「早期開花個体における受粉試験・後代の獲得」および「ウイルス伝播調査・既存品種への接種試験」について詳細な調査を行うことができなかった.これらの理由から,やや遅れていると評価した.主要果樹種を多く含むバラ科サクラ属果樹では,早くから重要な園芸形質に関する遺伝子研究が精力的に進められてきた.しかしながら,遺伝子の機能を実証する有効な手法が確立されていないため,得られた成果を果樹栽培・育種に十分に活用できていないのが現状である.そこで本研究では,サクラ属果樹においてウイルスベクターを用いた遺伝子機能評価系を確立し,基礎研究で蓄積されたゲノム関連情報を果樹栽培・育種に有効活用することを目的とする.今年度は,昨年度に引き続き,果実生産・育種において実用性の高い花成関連遺伝子に着目し,安定したウイルスベクターの接種および早期開花誘導を実現するため,(1)in vitro転写系を用いたALSV接種法の検討および(2)ウイルスベクター感染の品種間差異の調査に取り組んだ.(1)pBICAL1およびpBICAL2-NbPDS(ベンサミアーナタバコPDSの部分配列を含む)からin vitro転写によりALSV RNAを合成し,cap構造およびpoly Aを付加した.RT-PCRによりALSV RNAの合成に成功したことを確認した後,ALSV RNA1およびRNA2を等量混合し,遺伝子銃でベンサミアーナタバコの葉に接種した.RT-PCRおよび葉の白化を指標として接種系の有効性を確認したが,cap構造やpoly Aの有無によらず,ALSV感染は確認されなかった.(2)シロイヌナズナFTの全長配列(発現誘導),ウメTFL1およびアンズPDSの部分配列(VIGSによる発現抑制)を有するALSVベクターをモモ`川中島白桃',`おかやま夢白桃',`白皇',`桃水'の4品種の発根直後の子葉に接種したところ,いずれも高い感染率を示した.しかしながら,上位葉で激しい病徴が発生し,形質変化は観察されなかった.現在,TRVベクターなどALSV以外のウイルスベクターの構築・接種を進めている.今後はALSVの接種効率改善を最優先の課題として研究を進める.具体的には,ウイルスの増幅効率が高いキヌアを介してALSVを増幅し,精製・濃縮した上で接種を行う.in vitroでのウイルス産生についても検討する.複数遺伝子の発現制御が可能な新規ベクター構築は先行して進めることができているため,接種法の改善と並行して新規ベクターの接種を行い,開花促進の有効性を評価する.
ブルーム症候群細胞のヌクレオシドプール欠損と高頻度姉妹染色分体交換誘発機構の解析

ブルーム症候群(BS)は,高発癌性疾患として知られ,その最も著しい細胞学的特徴は高頻度姉妹染色分体交換(SCE)(細胞当り70SCE)である.我々は, BSと正常の混合培養の研究においてBSの高頻度SCEが混合培養1日目においてすでにもともとの70SCEから35SCEまで減少する事実を観察し,細胞と細胞が密着している時にのみ正常細胞からBSへ何等かのメタボライトが移ることを示し, BSにおけるヌクレオシドプール欠損を暗示し,本研究では各ヌクレオシド(dA,dG,dC,T)の影響を詳細に調べた.これまでBS細胞SCEは, Tにより70SCEから約35SCEまで, dCにより70SCEから約55SCEまで減少し, dA,dGはSCEを70から90レベルまで上昇する事実を得ている.これらの結果からBS細胞にはTプールの著しい減少が考えられるが, SCE測定にあたりBUとTを2細胞世代取り込ませる方法ではBUとT(analogue)の取り込みにCompetitionが起こり, BUの取り込み量の減少がBS SCEを減少させた疑いも考えられる. S_1にBUラベルされたBS細胞はS_2にBUを除いてもSCE頻度はS_1,S_2共にBUラベルされた場合と同じ高頻度(70SCE)SCEを呈したが,本年度の研究ではBS細胞をあらかじめ第1回目S_1のみをBUラベルし, BUを取り除いた2回目のS_2でT(100μM)のみを加え(すなわち, BUをtemplateにDNA合成を行うとき)てSCEへの影響を調べたが,その効果は2サイクル継続的に取り込ませた時とほとんど差が70から35SCEまで減少する事実を得, BS細胞におけるチミジンプール欠損の強力なevidenceを得た.さらに本年度の研究では高速液体クロマトグラフ法でもTのプール測定により,これを裏付けるデータを得ており,現在BS SCEに関する遺伝子の染色体座位を同定しつつある.本年度購入したバイオハザードキャビネットは本研究には非常に有意義だった.ブルーム症候群(BS)は,高発癌性疾患として知られ,その最も著しい細胞学的特徴は高頻度姉妹染色分体交換(SCE)(細胞当り70SCE)である.我々は, BSと正常の混合培養の研究においてBSの高頻度SCEが混合培養1日目においてすでにもともとの70SCEから35SCEまで減少する事実を観察し,細胞と細胞が密着している時にのみ正常細胞からBSへ何等かのメタボライトが移ることを示し, BSにおけるヌクレオシドプール欠損を暗示し,本研究では各ヌクレオシド(dA,dG,dC,T)の影響を詳細に調べた.これまでBS細胞SCEは, Tにより70SCEから約35SCEまで, dCにより70SCEから約55SCEまで減少し, dA,dGはSCEを70から90レベルまで上昇する事実を得ている.これらの結果からBS細胞にはTプールの著しい減少が考えられるが, SCE測定にあたりBUとTを2細胞世代取り込ませる方法ではBUとT(analogue)の取り込みにCompetitionが起こり, BUの取り込み量の減少がBS SCEを減少させた疑いも考えられる. S_1にBUラベルされたBS細胞はS_2にBUを除いてもSCE頻度はS_1,S_2共にBUラベルされた場合と同じ高頻度(70SCE)SCEを呈したが,本年度の研究ではBS細胞をあらかじめ第1回目S_1のみをBUラベルし, BUを取り除いた2回目のS_2でT(100μM)のみを加え(すなわち, BUをtemplateにDNA合成を行うとき)てSCEへの影響を調べたが,その効果は2サイクル継続的に取り込ませた時とほとんど差が70から35SCEまで減少する事実を得, BS細胞におけるチミジンプール欠損の強力なevidenceを得た.さらに本年度の研究では高速液体クロマトグラフ法でもTのプール測定により,これを裏付けるデータを得ており,現在BS SCEに関する遺伝子の染色体座位を同定しつつある.本年度購入したバイオハザードキャビネットは本研究には非常に有意義だった.
ショウジョウバエ始原生殖細胞の遺伝子発現制御における細胞内代謝経路の役割

多くの動物種において生殖系列の前駆細胞(始原生殖細胞:PGC)は、他の体細胞に比べて抑制的なクロマチン状態、低い転写活性、潜在的な分化多能生など様々な発生学的特徴を持つことが知られている。本研究では、このPGCの発生学的特徴の形成にあたって、PGCがもつ細胞内代謝状態が果たす役割の解明を目指す。研究の第一歩として、PGCがもつ細胞内代謝状態を明らかにするために、セルソーターおよびCE-MSベースのメタボロミクスを用いた、PGCに対する単一細胞種in vivoメタボロミクスを行った。その結果、PGCでは他の体細胞に比べて解糖系が亢進していること、さらにPGCの発生が進むに従って解糖系が減弱することが明らかとなった。またPGCと体細胞を比較した場合、PGCにおいてはメチオニン(Met)の一次代謝産物であるS-アデノシルメチオニン(SAM)の含有量が著しく低いことが明らかとなった。そこで、PGC中における解糖系の亢進およびSAM合成抑制が、PGCの発生過程において果たす役割を明らかにするために、これら代謝経路を制御する因子をコードする遺伝子の発現を観察した。その結果、PGCにおいては体細胞に比べて、Gapdh1やPyKといった解糖系遺伝子の発現が高いこと、さらにSAM合成に必要なSam-Sの発現が低いことが明らかとなった。このことは、上記のPGCに特徴的な細胞内代謝状態が遺伝子発現レベルで制御されていることを強く示唆している。次にこれら代謝経路のPGCの発生過程における機能を明らかにするために、解糖系中間代謝酵素についてはその機能をRNAiにより阻害すること、そしてSam-SについてはPGC中での強制発現することを試みた。このうち、解糖系については解析を終えており、解糖系はPGCの細胞死誘導に必要であることを明らかにした。25年度が最終年度であるため、記入しない。1:メタボロミクスによる始原生殖細胞の細胞内代謝状態の解明:本研究の申請時において、始原生殖細胞(PGC)に対するメタボロミクス解析により、PGCにおいては体細胞に比べて解糖系およびTCA回路が亢進していること、さらにメチオニン代謝が異なることを示す予備的結果を得ていた。この結果を確認するため、CE-TOFMS法およびCE-QqQ法によるメタボロミクス解析を重複して行った。その結果、申請時に得ていた予備的結果に対する再現性が確認され、また統計的に有為な結果であることを確認した。2:PGCにおける解糖系代謝酵素遺伝子の発現解析:本研究の申請時において、胚発生初期のPGCにおいて解糖系代謝酵素をコードする遺伝子(解糖系遺伝子)が高いレベルで発現していることを確認していた。引き続きTCA回路を構成する酵素をコードする遺伝子(TCA遺伝子)の発現も同様に確認し、TCA遺伝子の一つidhが初期PGCにおいて高いレベルで発現することを確認した。3:PGCの発生過程における解糖系の役割の解析:本研究の申請時において、PGCにおいて解糖系遺伝子をRNAi法によりノックダウンした場合、そのような胚ではコントロールに比べ有為に多いPGCが見られた。このことはPGCにおける解糖系の亢進はPGCの数を制御する上で重要な役割を果たしていることを示唆していた。そこで申請時の仮説の一つである、解糖系はPGCの分裂抑制、あるいは分化抑制に関与するという可能性を検証した。その結果、解糖系ノックダウン胚のPGCにおいて細胞分裂マーカーおよび分化マーカーの発現に差はないことが明らかとなった。このことよりPGCの発生過程における解糖系の役割は、もう一つの仮説であるPGCの細胞死誘導を制御するという可能性が高まった。

そこで解糖系によって発現制御される細胞死誘導遺伝子の特定を進めている。PGCの細胞内代謝状態の解明について、3反復の解析を行うことで結果を確かなものにすることが出来、また新たにPGCにおけるTCA回路の亢進の原因と考えられる遺伝子(idh)の特定に成功した。これは今後、遺伝学的解析を用いて細胞内代謝の生物学的意義を解析するにあたって重要な基礎になるものである。またPGCの発生過程における解糖系の機能についても、解糖系がPGCの細胞死誘導機構を制御するという可能性に絞り込むことが出来た。現在、解糖系の機能の全貌を明らかにするには至っていないが、24年度の研究をもとに25年度、解糖系によるPGCの細胞死誘導機構、およびその過程での遺伝子発現制御について明らかにする予定である。24年度の研究により、PGCの発生過程における解糖系の役割は、当初予想していた可能性の一つであるPGCの細胞分裂抑制あるいは分化抑制ではなく、PGCの細胞死を誘導することにあると考えられた。そこで25年度は解糖系によって発現制御される細胞死誘導因子の特定およびその機能解析を行う。解糖系によって制御されるPGCの細胞死はネクローシスであると考えられるので、25年度は、解糖系によって発現制御されるProgrammed Necrosis制御因子の特定を行う。さらにその機能解析により、PGCの細胞死誘導機構における解糖系の役割の全貌を明らかにすることを試みる。25年度が最終年度であるため、記入しない。
ピリミジン代謝阻害を標的とした臓器移植免疫抑制法の開発

Leflunomideはピリミジン代謝阻害によって強力な免疫抑制作用を発揮する薬剤で自己免疫疾患に対しても臨床治験が行われたが、半減期が長いという問題点のため臓器移植においては臨床応用化されることは無かった。FK778・FK779はこの問題を解決するために生まれた新規leflunomide誘導体である。本研究では主にFK778・FK779の免疫抑制効果・薬物動態・副作用等をラット心移植およびイヌ腎移植モデルを用い検討し、本剤の単独療法並びにカルシニューリン阻害剤(tacrolimus ; TAC、cyclosporin ; CsA)との併用療法を試みた。実際、これらの移植モデルではFK778・FK779単独でアログラフトの生存期間延長を認め、カルシニューリン阻害剤との併用により著明な生存期間延長を認めた。イヌ腎移植モデルにおいてFK778は6mg/kg/dayで白血球・ヘモグロビン減少を観察したが大きな副作用は認めなかった。更に、FK779の効果をハムスターからラットへの異種心移植モデルでも検討したところ、TAC/CsAとの併用あるいはCTLA4Ig/CD40Ig組込みアデノウイルスベクターによるB7及びCD154シグナル遮断と併用することで異種移植後の急性血管性拒絶反応および急性細胞性拒絶反応が制御可能であった。新規ピリミジン代謝阻害であるFK778・FK779は臨床臓器移植において有望な免疫抑制剤と考える。【背景】leflunomideが強力な免疫抑制剤であることは様々な実験で証明され実際自己免疫疾患に対しても臨床治験が行われたが半減期が長いという問題点のため臓器移植においては臨床の場で市販化されることは無かった。FK778はこの問題を解決するために生まれた新規leflunomide誘導体である。【目的】本研究においてはFK778の免疫抑制効果・薬物動態・副作用を検討するためビーグル犬腎移植モデルを用いて本剤の単独療法並びにカルシニヌーリン阻害剤(タクロリムス:Tacとサイクロスポリン:CsA)との併用療法を試みた。【対象と方法】ドナーにHBD犬レシピエントにビーグル犬を用いて腹腔内所性腎移植を行った。免疫抑制剤は連日経口投与で91日間服用させた。薬物動態・血液生化学検査・病理学的検討を行った。レシピエントの生存期間はLogrank testで検定を行った。【結果】単独療法ではコントロールに比べ有意ではあるが中等度の生存期間延長を認めた。カルシニヌーリン阻害剤との併用では著明な生存期間延長を認めた。特にTacとの併用では相乗効果を示した。薬剤の蓄積性は6mg/kg/dayの単独投与群で観察された。一方併用療法で薬剤投与期間中生存し続けた動物のFK778トラーフレベルは40から100micro g/mlであった。FK778、Tac、CsAの血中濃度は併用療法において御互い干渉されなかった。またFK778:6mg/kg/dayで白血球・ヘモグロビン減少を観察したが大きな副作用は認めなかった。【結論】FK778は臨床臓器移植において有望な免疫抑制剤と考える。昨年度は新規ピリミジン代謝阻害薬FK778の免疫抑制効果をイヌ同種アロ腎移植モデルで検討し、その結果を報告した。今年度はもう一つの新規ピリミジン代謝阻害薬であるFK779をtacrolimus(TAC)、cyclosporin(CsA)、CTLA4Ig/CD40Ig組込みアデノウイルスベクター(AdCTLA4Ig/AdCD40Ig)によるB7及びCD154シグナル遮断と併用することで異種移植における急性血管性拒絶反応(AVR)や急性細胞性拒絶反応(ACR)が制御可能か検討した。ハムスターからラットへの異種心移植モデルを用いた。FK779(10mg/kg)は移植前日より8日または30日間、TAC(2.5mg/kg)もしくはCsA(10mg/kg)は移植日からグラフト拒絶まで経口投与した。AdCTLA4Ig及びAdCD40Igは各々移植当日及び2日前に単回静脈投与(10^9PFU)した。

無治療及びAdLacZ投与群(control)の移植心正着期間中央値(MGS)は共に3日でAVRによる拒絶であった。TAC、CsA単独投与群及びAdCTLA4Ig/AdCD40Ig群のMGSは全て3日でAVR抑制効果を認めなかった。FK779単独投与群では一時的にAVRを抑えたがMGSは7日であった。FK779とTAC或はCsA併用群ではMGSは各々59.5及び62.5日でcontrol群に比べ正着期間を有意に延長した。FK779とAdCTLA4Ig/AdCD40Ig併用群では全例が長期正着(MSG>100日)しAVR及びACRは完全に抑制された。しかし、長期正着グラフトには病理学的に慢性拒絶反応像を認めた。FK779にTAC/CsAもしくはAdCTLA4Ig/AdCD40Ig遺伝子治療併用でAVR及びACRを有効に抑制し得る。しかし、本免疫抑制療法では慢性拒絶反応に対する更なる治療戦略が必要であると考えられた。
組織性カリクレインによる神経幹細胞の増殖促進機構の解析

この研究は組織性カリクレインによる神経幹細胞の増殖促進作用機構メカニズムの解明のために,カリクレインの基質の同定と作用メカニズムの解明を目指した。その結果,カリクレインが神経幹細胞のNF-κB経路を抑制することが確認された。そこで,NF-κB経路を活性化する経路を調べた結果,カリクレインはIL-1 type I受容体を切断することが示され,このタンパク質がカリクレインの基質であることが明らかとなった。NF-κB経路の活性化は神経幹細胞の分化を促進する報告があることから,カリクレインは神経幹細胞の分化を抑えることにより,みかけの細胞増殖速度を増加させていることが考えられた。平成25年度は二次元電気泳動を用いたプロテオーム解析を行い、カリクレインの基質候補タンパク質の同定を行った。その結果、SDS-PAGE、二次元電気泳動を用いて、神経幹細胞の培養上清よりカリクレインにより分解されるタンパク質を検索した結果、いくつかの基質候補となるバンドを見出したが、そのタンパク質の同定には至らなかった。カリクレインによる神経幹細胞の増殖促進作用メカニズムとして、細胞増殖の促進、アポトーシスの抑制、分化抑制、細胞老化の抑制が考えられるため、これらの可能性について検討した。カリクレインが細胞老化に与える影響をp21遺伝子発現量により調べた結果、p21遺伝子の発現量は大きな変化を示さずカリクレインが細胞老化を積極的に抑制していないことが示唆された。神経幹細胞の分化に与える影響について、GFAP、DCX、SOX2遺伝子の発現量変化を調べた結果、これらの遺伝子の発現量はほとんど変化していなかった。この結果は、カリクレインが神経幹細胞の分化抑制をしていない可能性か、今回用いた培養条件では神経幹細胞の分化がほとんど起こらない可能性が示唆された。一方、NF-κB経路の活性化は神経幹細胞の分化を促進することが報告されているので、カリクレインがNF-κB経路にどのような影響を与えるか調べた。その結果、IKKα/βやRelAのリン酸化が抑制されることがウエスタンブロット解析により明らかになり、カリクレインはNF-κB経路を抑制することが示唆された。また、ウエスタンブロット解析により、カリクレインがERKを活性化することが明らかになった。しかし、ERKの上流分子であるc-RafやMEKなどは活性化されていないことから、ERKは一般的なMAPKカスケードとは異なるシグナル伝達経路により活性化されていることが示唆された。昨年度,カリクレインを神経幹細胞の培養液に添加することにより,NF-κB経路が抑制される可能性が示されたため,本年度はこの点について確認を行った。ウエスタンブロット解析によりIKKα/βとRelAのリン酸化が抑制されることが確認された。また,カリクレインを添加した神経幹細胞のリン酸化RelAを免疫細胞染色により調べた結果,細胞内のリン酸化RelA量が減少することが確認された。さらに,神経幹細胞を分化誘導したとき,リン酸化RelA量は23日目に最大となり,核内の陽性部位も増加していたが,カリクレイン添加によりこのようなリン酸化RelAの量や分布の変化は抑制されていた。NF-κB経路の活性化は神経幹細胞の分化を促進する報告があることから,カリクレインは神経幹細胞のNF-κB経路を抑制することにより,神経幹細胞の分化を抑え,その結果みかけの細胞増殖速度が増加していることが考えられた。そこで,NF-κB経路を活性化するIL-1, TNF-αのリガンドおよび受容体の発現量を調べた。その結果,神経幹細胞ではIL-1β,IL-1 type1, II受容体,TNF-α,TNF-α受容体が発現していることが明らかとなった。そこで,これらのうち,IL-1 type I受容体がカリクレインにより切断されるかウエスタンブロット解析により調べた結果,IL-1 typeI受容体がカリクレインの神経幹細胞における基質のであることが明らかとなった。これまでの研究でカリクレインが神経幹細胞のNF-κB経路を抑制することが確認された。NF-κB経路の活性化は神経幹細胞の分化を促進する報告があることから,カリクレインは神経幹細胞の分化を抑え,その結果みかけの細胞増殖速度が増加していることが考えられた。そこで,本年度はIL-1シグナルの阻害が神経幹細胞に与える影響を解析した。はじめに,IL-1受容体アンタゴニスト(IL-1RA)が神経幹細胞に与える影響を調べた。IL-1RAによりNF-κB経路が抑制されるか免疫染色で調べた結果、IL-1RAにより、リン酸化RelA陽性細胞が減少していることが確認され,IL-1RAによりNF-κB経路が抑制されることが確認できた。そこで,IL-1RAをNSCの培養液に添加して細胞増殖を調べたところ,0300 ng/mLの濃度では増殖抑制作用が認められず,IL-1RAでは神経幹細胞の増殖促進作用を示さないことが分かった。次に,カリクレインによるIL-1 typeI受容体の加水分解と同様の現象を再現するために,siRNAによるIL-1 type1受容体のノックダウンを試みた。"siDirect"を利用してIL-1 typeI受容体に特異的なsiRNAな配列を検索し,3つのsiRNAの合成を行った。

このsiRNAを用いた結果,3種類のsiRNAのうち,2種類について十分なIL-1 typeI受容体の発現量が抑制され,神経幹細胞のIL-1 typeI受容体をノックダウンするsiRNAを調製することができた。現在,これらのsiRNAを用いてIL-1 typeI受容体のノックダウンが神経幹細胞の増殖に与える影響を解析している。この研究は組織性カリクレインによる神経幹細胞の増殖促進作用機構メカニズムの解明のために,カリクレインの基質の同定と作用メカニズムの解明を目指した。その結果,カリクレインが神経幹細胞のNF-κB経路を抑制することが確認された。そこで,NF-κB経路を活性化する経路を調べた結果,カリクレインはIL-1 type I受容体を切断することが示され,このタンパク質がカリクレインの基質であることが明らかとなった。NF-κB経路の活性化は神経幹細胞の分化を促進する報告があることから,カリクレインは神経幹細胞の分化を抑えることにより,みかけの細胞増殖速度を増加させていることが考えられた。今年度の研究で,二次元電気泳動を用いて,カリクレインの基質候補を見つけ出すことはできなかった。しかし,別の方面からの試みにより神経幹細胞の細胞膜上に存在するIL-1 typeI受容体がカリクレインの基質であることが明らかになった。NF-κB経路を活性化するリガンドおよび受容体はこの他にもあるのでこれらの分子がカリクレインの基質となるか調べる必要があるが,その他の候補についてはまだ調べることができていない。生化学現在までの達成度でも述べたように,IL-1受容体(typeII受容体は抑制的に働くため今回は関係ないと考えられる)以外のリガンド,受容体に対するカリクレインの作用を調べる必要がある。カリクレインの添加またはNF-κB経路の抑制により神経幹細胞の分化が抑制されることを確認できていないので,この点も調べる必要がある。さらに,IL-1受容体アンタゴニスト,IL-1 typeI受容体siRNA,NF-κB経路阻害剤により神経幹細胞の増殖が促進されるか確認する必要がある。以上の点について確認することにより,カリクレインによる神経幹細胞の増殖促進メカニズムの解明ができると考えられる。現在、組織性カリクレインの基質検索が遅れている。これは電気泳動による基質検索において、試料が微量であるため同定に手間取っているためである。使用する抗体の数が予定よりも少なかったため基質検索は試料量を増やして電気泳動を行う予定である。また、活性中心を変異させたカリクレインを調製してこのタンパク質と結合するタンパク質を調べることを検討している。また、カリクレインがNF-κB経路を抑制することがわかったので、この結果と神経幹細胞の増殖促進メカニズムとの関係を調べる予定である。siRNAを使用することも計画しているので,これらの注文に用いる予定である。消耗品の割引により、予定よりも安く消耗品を買ったため。残った額は消耗品として使用する予定である。
脳-心相互作用による新しい心不全病態メカニズムの解明

以前より、動脈硬化・虚血性心疾患の危険因子の一つとして、うつ病気質が提唱されている。一方、Brain-Derived NeurotrophicFactor(BDNF)は脳内で産生分泌される神経栄養因子であるが、脳内での産生が低下するとうつ病の原因となることが報告されている。また、BDNFのノックアウトマウスのホモ接合体は、胎児期に心不全を起こして死亡することも報告されている。これらのことから、BDNFが心血管系に対して病態生理学的な役割を果たしていることが示唆される。そこで我々は、BDNFと虚血性心疾患の関係に注目し検討した。まず、全身性のBDNFノックアウトマウスは死亡するため、BDNFの誘導型コンディショナルノックアウトを作成した。これらのマウスに心筋梗塞を作成してみると、梗塞後の心機能は悪化していた。また、心筋細胞特異的にBDNFの受容体を欠損させたマウスを作成しところ、同様に梗塞後の心リモデリングの進行を認めた。これに対して、心筋細胞特異的にBDNFを欠損させたマウスを作成し、心筋梗塞を作成してみると、梗塞後の心機能は野生型マウスと比較して変化はなかった。さらに検討を進めたところ、心筋梗塞後に中枢神経系や血液中のBDNF濃度が上昇していることがわかった。そこで、心臓から中枢神経系への求心性繊維を薬理学的にブロックしたところ、中枢神経系や血液中BDNF濃度の上昇が消失し、梗塞後の心機能は悪化した。また、中枢神経特異的にBDNFを欠損させたマウスにおいても、血液中BDNF濃度の上昇が消失し、梗塞後の心機能は悪化した。以上の結果より、心筋梗塞後には中枢神経を介してBDNFの挙現が調節され、心臓保護的に働いていることが予想された。そこで我々は、BDNFと虚血性心疾患の関係に注目し検討したところ、虚血性心疾患をもつ症例では健常群と比べて血中のBDNF濃度が有意に低いことが分かった。その低下は、糖尿病や高血圧など既知の危険因子とは独立した因子であることも明らかとなった。BDNFのノックアウトマウスのヘテロ接合体に急性心筋梗塞モデルを作成してみると、野生型マウスと比較して、心筋梗塞後の死亡率の増大傾向と梗塞後のリモデリングの進行がみられた。BDNFの発現は心筋梗塞後低下するが、野生型マウスの心筋梗塞モデルにBDNFを投与することによって梗塞後のリモデリングは抑制された。つまりBDNFの低下は、急性心筋梗塞の原因となる動脈硬化の進展や梗塞後の心不全の原因となるリモデリングの促進に関わっている可能性がある。そこで、BDNFの誘導型コンディショナルノックアウトを作成し、同様に心筋梗塞を作成してみると、梗塞後の心機能は悪化していた。以上のことより、心臓以外で産生されるBDNFが梗塞後の心機能低下を抑制している可能性がある。今後は、他臓器のBDNFの役割についてさらに検討を進めていく。
大気環境中での微量汚染ガスの核生成による粒子化現象の評価と制御

大気中に浮遊するサブミクロンオーダーの微粒子分散系(エアロゾル)は、大気汚染の直接の原因となり、人体への悪影響および地球の温暖化への影響が問題となっている。しかしながら、大気環境中で微粒子が生じる過程として重要な、ガス分子からの粒子化の初期過程の評価は、核生成現象に支配されるために、現在明らかになっていない。そこで本研究では、日本と欧米の研究者の協力により、特に大気汚染現象と関連して重要な、大気中の微量不純物ガスの核生成による微粒子化過程ならびに微粒子とガスの気相中での挙動と沈着過程について調べた。まず実験的には、NO_x,SO_x,H_2Oなどを含む23成分系のガスからの核生成現象を、放射線源を設置した小容器ならびに断熱膨張装置を用いて検討した。ここではクラスターおよび粒子のサイズ分布の測定等により、核生成速度およびイオンによる核生成の促進の効果が定量的に明らかとなった。また理論的には近代核生成理論に基づいたモデリングによりイオンによる核生成促進の機構を検討し、これにより実験結果を説明することが可能となった。さらに、発生した微粒子の成長過程ならびにガスと粒子の気相中での輸送・沈着現象をモデル化するための、一般動力学方程式と移流拡散方程式を導出した。これらの式を数値計算で解析した結果は、化学反応による粒子の生成実験や、ガスおよび微粒子を浮遊させた空間を用いた実験の結果をうまく説明できた。以上のことより、本研究の実験と理論的検討で得られた成果は、環境中の微粒子の影響を評価する数理モデルを構築するのに有用であると考えられる。まず実験的には、NO_<x′>SO_<x′>H_2Oなどを含む23成分系のガスからの核生成現象を、放射線源を設置した小容器ならびに断熱膨張装置を用いて検討した。また理論的には近代核生成理論に基づいたモデリングによりイオンによる核生成促進の機構を検討し、これにより実験結果を説明することが可能になった。、これらの式を数値計算で解析した結果は、化学反応による粒子の生成実験や、ガスおよび微粒子を浮遊させた空間を用いた実験の結果をうまく説明できた。
集落地域整備計画のための地域合意形成支援システムの研究

非農用地化を含む土地利用計画策定のための換地は地権者の思惑が錯綜して関係者間の合意形成が非常に困難になっている。非農用地の設定場所は関係地権者の得失を大きく左右するが、どこに非農用地を設定するかは「計画」されるものであって、土地評価等に基づいて客観的に定まるものではないからである。またしたがって合意は種々の候補案から修正を経て得られるしかないが修正案ごとに対応する換地計画(これも一通りではない)の作成に時間がかかるせいでもある。しかし、全関係地権者とその一筆ごとの所有地の属性をコンピュ-タベ-ス化し、地権者の希望とプランナ-の計画判断のクロス結果をCRT上にリアルタイムに地図の形で示して討議することが出来ればこの合意形成過程は著しく加速されるのみならず、より適切な計画に到達できるはずである。本研究はそのような計画支援システムの具備すベき条件を見定め、そのソフトウエアの開発を目的としたものである。戸奈良地区、上篠井地区を事例地区として、全地権者の、(1)一筆単位での地番入り農地所有状況、(2)営農内容、家族構成などの世帯状況、の2つの地権者デ-タファイルを作成し、次に地区の全土地について、(3)地籍図を地番つきでディジタイザ-入力し、(4)一筆ごとの土地条件を調査して、一筆地デ-タファイルを作成した上で、そのクロス分析・CRT表示ソフトのVer.1の開発を終えた。これを地区の土地利用計画案の分析と計画案についての地権者との意見交換の場に供して、ソフトが備えるべき機能を改善した。すなわち地権者の土地利用意向・希望をファイル(1)(4)を介して整理集計し、CRT上に土地利用図の形で示して土地利用計画観点からのコメント付きで地権者に示して討議することによって、地権者の土地者の土地用意向・希望の自主修正を促すと共に(1)(4)のファイル構造の欠陥を把握し、有効な形に改善することができた。非農用地の設定場所は関係地権者の損失を大きく左右するが、どこに非農用地を設定するかは「計画」されるものであって、土地評価等に基づき客観的に定まるものではないからである。しかし、全関係地権者とその一筆ごとの所有地の属性をコンピュ-タ内にデ-タベ-ス化し、地権者の希望とプランナ-の計画判断のクロス結果をCRT上にリアルタイムに地図の形で示して討議することが出来ればこの合意形成過程は著しく加速されるのみならず、より適切な計画に到達できるはずである。本研究はそのよな計画支援システムの具備すべき条件を見定め、そのソフトウエアの開発を目的としたものである。

戸奈良地区を事例地区として、全地権者の、(1)一筆単位での地番入り農地所有状況、(2)営農内容、家族構成などの世帯状況、の2つの地権者デ-タファイルを作成し、次に地区の全土地について、(3)地籍図を地番つきでディジタイザ-入力し、(4)一筆ごとの土地条件を調査して、一筆地デ-タファイルを作成した上で、そのクロス分析・CRT表示ソフトのVer.1の開発を終えた。これを地区の土地利用計画第一次案の分析と次案についての地権者との意見交換の場に供して、ソフトが備えるべき機能の発見整理に務めている。すなわち地権者の土地利用意向・希望をファイルの(1)(4)を介して整理集計し、CRT上に土地利用図の形で示して土地利用計画観点からのコメント付で地権者に示して討議することによって、地権者の土地意向・希望の自主修正を促すと共に(1)(4)のファイル構造の欠陥を把握し、有効な形に改善することができた。非農用地化を含む土地利用計画策定のための換地は地権者の思惑が錯綜して関係者間の合意形成が非常に困難になっている。非農用地の設定場所は関係地権者の得失を大きく左右するが、どこに非農用地を設定するかは「計画」されるものであって、土地評価等に基づいて客観的に定まるものではないからである。またしたがって合意は種々の候補案から修正を経て得られるしかないが修正案ごとに対応する換地計画(これも一通りではない)の作成に時間がかかるせいでもある。しかし、全関係地権者とその一筆ごとの所有地の属性をコンピュ-タ内にデ-タベ-ス化し、地権者の希望とプランナ-の計画判断のクロス結果をCRT上にリアルタイムに地図の形で示して討議することが出来ればこの合意形成過程は著しく加速されるのみならず、より適切な計画に到達できるはずである。本研究はそのような計画支援システムの具備すべき条件を見定め、そのソフトウエアの開発を目的としたものである。今年度は新たに上篠井地区を事例地区として、全地権者の、(1)一筆単位での地番入り農地所有状況、(2)営農内容、家族構成などの世帯状況、の2つの地権者デ-タファイルを作成し、次に地区の全土地について、(3)地籍図を地番つきでディジタイザ-入力し、(4)一筆ごとの土地条件を調査して、一筆地デ-タファイルを作成した上で、昨年度開発のクロス分析・CRT表示ソフトのVer.1を地区の土地利用計画第一次案の分析と一次案についての地権者との意見交換の場に供して、地権者の土地利用意向・希望をファイル(1)(4)を介して整理集計し、CRT上に土地利用図の形で示して土地利用計画観点からのコメント付きで地権者に示して討議することによって、地権者の土地用意向・希望の自主修正を促すと共に(1)(4)のファイル構造の欠陥を把握し、有効な形に改善した。またその結果の3次元表示方法についても検討した。
プロテインキナーゼCの機能異常による神経変性疾患発症メカニズムの研究

PKCγ変異由来の脊髄小脳変性症の患者から異なったアミノ酸に変異がはいっていることが次々に報告されている。PKCγへの変異箇所は10以上報告されている。これまで1分子解析を用いていくつかの変異由来のPKCγの細胞膜上での滞在時間が短くなっていることを確認していたが、今回新たに報告された変異体についても同様な解析をおなった。PKCγの脂質結合部位に点変異が入っているものは、これまでの結果と同様に細胞膜上の滞在時間が短くなる傾向をもっていた。一方、キナーゼドメインに変異が入っているものは変化がみられなかった。以上のことから神経変性症の発症がPKCγの活性化と何らかの関与があると考えられた。PKCはCa^<2+>によってその活性化が制御されることがよく知られている。細胞がレセプターを介して刺激を受けると細胞内のCa^<2+>濃度が上昇し、細胞の増殖やシグナルの伝達などイベントが起きる。最近、新しくそのCa^<2+>の上昇に重要なカルシウムチャネルが発見された。チャネルが発見される以前から、生理学的にそのカルシウムチャネルとPKCとの関連が報告されており、変位PKCがチャネルの制御になんらかの作用をるすことが示唆されたため、詳しく変異体との関与を調べることにした。その結果、wild typeのPKCはチャネルをリン酸化し、リン酸化によりチャネルの活性を変化著しく変化させることが明らかになった。また、チャネルのリン酸化サイトを同定することに成功した。変異体PKCとの相互作用については現在、研究中であるが、これらの成果を国際学会にて発表を行った。脊髄小脳変性症の原因遺伝子はいくつか知られている。最近、一部の患者でPKCγに点突然変異があることが原因になっていると報告された。患者は運動失調や認知低下の症状を示す。変異の同定がごく最近であることから、発症解明の研究は全く進んでいない。本研究では、PKCの機能異常による神経変性疾患発症メカニズムの解明を目指している。まず、変異PKCγ由来の精髄小脳変性症のモデルマウス作成のため、変異PKCγ-GFPを発現する遺伝子操作動物を作製している。具体的には1、ノックインベクターの作成2、ES細胞へのトランスフェクションと相同組替えES細胞の獲得3、キメラマウスの作成4、ヘテロマウス作成現時点では2、相同組み換えES細胞の獲得に難航している段階である。ところでPKCγ変異由来の脊髄小脳変性症の患者から異なったアミノ酸に変異がはいっていることが次々に報告されている。これまで1分子解析を用いていくつかの変異由来のPKCγの細胞膜上での滞在時間が短くなっていることを確認していたが、今回新たに報告された変異体についても同様な解析をおこなった。PKCγの脂質結合部位に点変異が入っているものは、これまでの結果と同様に細胞膜上の滞在期間が短くなる傾向をもっていた。まず、変異PKCγ由来の脊髄小脳変性症のモデルマウス作成のため、変異PKCγ-GFPを発現する遺伝子操作動物を作製している。しかし、相同組み換えES細胞の獲得に難航している段階である。現在、まず手始めにPKCによるチャネルリン酸化サイトを同定している最中である。

PKCγの脂質結合部位に点変異が入っているものは、これまでの結果と同様に細胞膜上の滞在時間が短くなる傾向をもっていた。一方、キナーゼドメインに変異が入っているものは変化がみられなかった。以上のことから神経変性症の発症がPKCγの活性化と何らかの関与があると考えられた。PKCはCa^<2+>によってその活性化が制御されることがよく知られている。細胞がレセプターを介して刺激を受けると細胞内のCa^<2+>濃度が上昇し、細胞の増殖やシグナルの伝達などイベントが起きる。最近、新しくそのCa^<2+>の上昇に重要なカルシウムチャネルが発見された。チャネルが発見される以前から、生理学的にそのカルシウムチャネルとPKCとの関連が報告されており、変位PKCがチャネルの制御になんらかの作用をるすことが示唆されたため、詳しく変異体との関与を調べることにした。その結果、wild typeのPKCはチャネルをリン酸化し、リン酸化によりチャネルの活性を変化著しく変化させることが明らかになった。また、チャネルのリン酸化サイトを同定することに成功した。変異体PKCとの相互作用については現在、研究中であるが、これらの成果を国際学会にて発表を行った。
微小核試験による初代培養腫瘍細胞の放射線感受性測定と最適放射線療法の研究

細胞の放射線感受性に関するパラメ-タ-のうち,線量生存率曲線におけるα値は大変重要である。なぜならば、α値は細胞のおかれた状態に余り依存しない、修復し難い放射線損傷を表現しているからである。また臨床における慣用分割照射ではα値の大小が腫瘍の最終反応を決めると考えられているからである。そこで、このα値を簡便、かつ短時間で推定する方法を研究した。照射後の細胞にcytochalasinB2μg/mlを加え、細胞一周期の間培養すると、分裂期を通過した細胞は2核細胞として容易に同定できる。蛍光顕微鏡観察下にmicronucleusや核の不均等分裂等の異常を伴わない、正常核分裂細胞の比率を求め、片対数グラフ上にプロットし、線量効果関係を求めると、広い線量域(0ー10Gy)でほぼ直線になった(γ>0.98)。細胞の放射線感受性をコロニ-形成法と本法で調べ、そのデ-タを各々、ーlnSF=αD+βD^2,ーlnF=aD+bのモデルで解析し、α値とa値の一致の程度を検討した。SCCVII,EMT6/Ku,RIFー1,Vー79,CHOの諸細胞について検討すると、=ー789×10^<ー6>+1.04α(γ=0.982)となり、a値はほぼα値に等しいと言える事が解った。また照射線量率を変化させてa値に対する影響をSCCVII,RIFー1について調べると、a値の変化は小さかった。一方、β値の要素をも含むmicronucleus頻度に対する線量率変化の影響は大きかった。そこで、この方法で14症例のヒト食道癌細胞(手術材料より培養)における推定の値の分布を調べた。病理組織型の分布は高分化型6例,中分化型4例,低分化型4例である。中分化型4例はいずれもの値が小さく,高分化型,低分化型は共にα値の大きいものから、小さいものまで比較的幅広い分布を示した。本法は正常細胞(線維芽細胞)のα値の個体差を研究する手段にもなると考えられ、今後その方向へも研究を発展させる予定である。
ネギ類共通ＥＳＴマーカーによるネギとタマネギのシンテニー解明

ネギ「北葱」由来自殖系統の9つの組織、ステージからmRNAを抽出し、等量のRNA混合物を作成後、完全長均一化cDNAを合成し、GS-FLXによる配列取得を行った。アセンブルにより4.2万のコンティグ(リファレンス配列)を得た。また、ネギ3系統の様々な組織、ステージ(計8サンプル)からmRNAを抽出して、HiSeq2000による配列取得を行い、アセンブルにより12.1万のコンティグを得た。これらのアセンブル配列をリファレンス配列と統合して、54,862のunigene set(TSA)を得た。ネギTSA配列とタマネギEST配列(約1.4万)とを比較し、10,668個が相互にトップヒットの関係を示し、これらの配列はオルソロガスな関係と推察された。5.4万のネギTSAから、SSR検索した結果、2,074のunigeneの2,396箇所でSSRモチーフが検出され、395組のEST-SSR特異的プライマーセットを設計した。HiSeq2000により得られた各系統のアセンブル配列から、9,002のSNPと4,335のInDelを検出した。この中で主に2bp以上のInDelをターゲットとしたプライマーセット、ならびにSNPをターゲットとしたCAPSプライマーセットを、それぞれ244、117組を設計した。さらに、GS-FLXから得た2.6万のコンティグ(>500bp)を用いてイネゲノム配列との比較を行った結果、1.7万のコンティグがイネと高い相同性を示すとともに、このうち2,668コンティグの5,505箇所において、イネゲノム上のexon-intron境界と相同性を示し、これらの推定イントロン領域をターゲットとするイントロンマーカーを設計した。これらのネギTSA由来マーカーを用いて、364マーカー、17連鎖群からなる全長1,150cMの連鎖地図を構築した。
グローバルエデュケーターとしての英語教員を目指す統合的留学プログラムの効果と課題

グローバルエデュケーターとしての英語教員を育成するための教員養成課程に統合された長期留学プログラムの効果と課題を検証する本研究から明らかとなったことは大きく分けて2つある。1つ目は、留学前に英語の多様性に対しどのような理解・態度を抱いているかにより、留学中の多様な英語話者との接触の解釈が異なること、2つ目は「留学」という体験の捉え方により、同じ事象でもそれに対する意味付けが異なることである。これらのことから、留学を留学前教育からの一つのパッケージとして捉え、留学前に英語の多様性への理解の促進・教員というキャリア形成の中での留学の意義付けを十分に行っていくことの高い必要性が窺える。本研究は英語教員養成課程に統合された約9か月間の留学プログラムが、地球市民育成の役割を担うようになった英語教員というプロフェッションに対する理解にどのような変化をもたらすのか、英語教員を目指す学生を追跡調査し、英語教員養成に有効な統合的留学プログラムの要素を明らかにすることを目的としている。【研究方法】研究代表者が所属する玉川大学文学部英語教育学科の留学プログラムを対象とし、アンケート、半構造化インタビュー、観察調査を通して、留学前・留学中・留学後の意識の経時変化を把握・分析する。この他に、関連分野の文献調査、他大学の類似プログラムとの比較を通して、目的を達成することを目指している。【研究成果の意義・重要性】国際共通語としての英語(English as a Lingua Franca)、英語教員養成、地球市民育成という多角的・複合的な視点から学生の留学前から留学中(留学先滞在1か月目・6か月目)の意識変化を検証した暫定的な結果の1つとして、留学前にどのような知識・態度を英語という言語に対して抱いているのかにより、留学中の体験の理解が左右されるという点が挙げられる。この点は留学プログラムを教員養成に有効なものにするためには、留学前教育が重要であるということを示唆している。今後、留学終了後の意識を詳細に調査し総合的に検証していく必要があるが、学生たちが英語教員という職業に必要な知識・態度・スキルを最大限に発展させるためには、留学を留学前教育からの1つのパッケージとして捉えることが必要であるという点を見いだせたことは意義深い。本研究の目的は、9か月間の留学プログラムを通して、学生が英語教員というプロフェッションに対する理解をどのように変化させるのかを経時的に追跡し、教員養成に有効な留学プログラムの要素を洗い出すことである。平成28年度に実施した調査は1)玉川大学文学部英語教育学科の留学プログラムの構成要素の確認・留学前教育の内容確認、2)留学前アンケートの実施(平成28年8月)、3)現地インタビュー調査2回(平成28年9月、平成29年2月)、4)留学中アンケートの実施(平成29年23月)である。1)に関しては、類似したプログラムを有する大学のプログラムと比較を行う予定だったが、研究対象の研究代表者の所属校の分析のみにとどまっている。2)に関しては、ほぼ分析を終了している。その分析結果の一部を平成29年6月に行われるThe 10th International Conference of Englishas a Lingua Francaで発表(ポスター展示)予定である。3)の現地調査については、研究計画の時点ではイギリスの2大学に留学中の学生を中心にインタビューを実施し経時変化を追うことを予定していた。平成28年9月はイギリス2大学だけでなくアイルランド1大学を訪問し、学生10グループ35名とそれぞれの大学のプログラムディレクター3名にインタビューをすることができた。平成29年2・3月にも同じ大学に訪問し、学生に再度インタビューをすることを予定していたが、校務の都合により訪問することができなかった。その代り校務の関係で、アメリカの大学2校を訪問することとなり、その際に空き時間を活用し、それらの大学に留学中である10グループ30名にインタビューを行った。これら2回のインタビュー調査のデータは現在整理中であり、分析には至っていない。4)に関しては回収が終わり、結果の集計に入る段階である。【研究方法】研究代表者が所属する玉川大学文学部英語教育学科の留学プログラムを対象とし、アンケート、半構造化インタビュー、観察調査を通して、留学前・中・後の意識の経時変化を掌握・分析する。この他に、関連分野の文献調査を通して目的の達成を目指す。【研究成果の意義・重要性】国際共通語としての英語(English as a Lingua Franca)、英語教員養成、地球市民育成という多角的・複合的な視点から学生の留学前から留学中の意識変化を検証した暫定的な結果の1つとして、2016年度は「留学前の英語という言語に対しての知識・態度が留学中の体験の理解を左右する」ということを挙げた。これに加えて、2017年度の検証からは、「留学という体験を消費と捉えるか、投資と捉えるか」により、同じ事象でもその解釈が大きく異なること、また、その事象の体験にどのような見返りを求めるかも大きく異なる、ということが分かった。このことは、留学プログラムを地球市民としての教員養成により有効なものとするためには、留学前教育のなかで留学が将来の教員という職業に対しどのような意味をもたらすのかを批判的に考察させることの重要性を示していると言えよう。