hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
オートファジーに必須なタンパク質Atg8の脂質修飾機構の解明

昨年度に引き続き、出芽酵母Atg7単体およびAtg7CTD-Atg8複合体の立体構造の精密化を行なった。また、結晶構造からはAtg8とAtg7のadenylation domain間の相互作用の情報を得ることができたが、変異体解析によってAtg7はadenylation domainによる認識に先立って、C末端領域によってAtg8を捕まえていることが示唆された。しかし、この相互作用に関しては結晶構造からは十分な情報が得られなかったため、Atg7のC末端ペプチドを作成しAtg8との複合体構造をNMRを用いて明らかにした。これらの構造情報と各種変異体を用いたin vitroでの解析によって、Atg7はこれまで研究されてきたcanonical E1とはユビキチン様タンパク質の活性化の機構が大きく異なることを明らかにした。まず、Atg7はそのC末端領域によってAtg8を捕らえ、その後活性化の活性中心である自身のadenylation domainへと移行させるという二段階の認識機構を持つことを示した。また、活性化されたAtg8はE2分子であるAtg3へとtransの機構によって受け渡されていることを示した。これらのcanonical E1とは大きく異なったAtg7の特徴は今後オートファジーにおけるAtg8系とAtg12系の役割を明らかにするうえで重要であると考えられる。また、他のE1と大きく異なる立体構造および活性化の分子機構はAtg7特異的阻害剤を作成するうえで重要な情報といえる。本年度は上記の研究の結果をまとめ、学術誌Molecular Cellにて発表を行なった。オートファジー結合系においてE1様酵素の役割を担うAtg7の結晶構造を得ることを目的として,酵母Atg7を大腸菌にて発現させ,精製後に結晶化スクリーニングを行なった.当初は蒸気拡散法,自由界面拡散法どちらの手法を用いても良質な結晶を得ることができなかったが,結晶化サンプルにZn2+を加えることで蒸気拡散法で結晶を得ることに成功した.得られた結晶を高エネルギー加速器研究機構において測定したところ,約13Aの分解能であった.構造解析のためには,さらに高分解能のデータを得ることが必要であるため,構造的にフレキシブルであると予想されるAtg7のC末端を削ったコンストラクトを用いて結晶化を行なった.その結果,大型放射光施設SPring-8において約4Aの分解能のデータを取得することに成功した.Atg7の構造解析は,オートファジー結合系の制御機構の解明に大きな役割を担うだけでなく,世界初のnon-canonicalなE1様酵素の構造として構造生物学的にも大きな意味を持つ.Atg7全長だけでなく,各種プロテアーゼを用いた限定分解法によって,Atg7の機能ドメインの探索を行なった.その結果,Atg3およびAtg10というE2様酵素の認識を担うドメイン(N末端ドメイン),Atg8のアデニル化およびAtg8-Atg7チオエステル結合体形成を担うドメイン(C末端ドメイン)を同定することに成功した.N末端ドメインは良好なNMRスペクトルが得られたため,E2様酵素との相互作用およびダイナミクスの解析を目指してNMR解析に着手した.昨年に引き続き,オートファジーにおけるE1酵素である酵母Atg7の構造解析可能な分解能の結晶が得られる条件をスクリーニングした.その結果,高エネルギー加速器研究機構のビームラインにおいて、最大分解能3Aのデータを収集することに成功した.構造解析のための位相決定は分子中に含まれる硫黄原子を利用し,Zn-SADによって決定した.決定したAtg7の構造はN末端とC末端にそれぞれドメイン構造を有しており,C末端ドメインは従来のE1酵素に共通して存在するadenylation domainによく似た構造であったが,N末端ドメインは既知の構造ドメインとは相同性のみられない新規構造ドメインであることが判明した.得られた構造情報からAtg7のドメイン境界を再定義し,N末端ドメインはE2酵素であるAtg3とC末端ドメインはユビキチン様タンパク質であるAtg8とそれぞれ結合能を有していることを明らかにした.さらにAtg7 C末端ドメインとAtg8との共結晶化を行ない,Atg7C-Atg8複合体の立体構造を明らかにすることに成功した.これらの情報からAtg7はAtg8の認識,さらにAtg3の認識およびAtg3へのAtg8受け渡しの分子メカニズムがこれまで構造既知のE1酵素とは大きく異なっていることが予想される.この成果は構造生物学的に大きなインパクトであるとともに,オートファジー関連タンパク質に特徴的な構造情報は,のちのオートファジー阻害剤研究にも大いに役立つものと考えられる.昨年度に引き続き、出芽酵母Atg7単体およびAtg7CTD-Atg8複合体の立体構造の精密化を行なった。

また、活性化されたAtg8はE2分子であるAtg3へとtransの機構によって受け渡されていることを示した。これらのcanonical E1とは大きく異なったAtg7の特徴は今後オートファジーにおけるAtg8系とAtg12系の役割を明らかにするうえで重要であると考えられる。また、他のE1と大きく異なる立体構造および活性化の分子機構はAtg7特異的阻害剤を作成するうえで重要な情報といえる。本年度は上記の研究の結果をまとめ、学術誌Molecular Cellにて発表を行なった。
哺乳類細胞での合成生物学を志向した次々世代型ジェネティックエンジニアリング技術

本研究では哺乳類細胞のゲノムに特化した技術、任意の標的配列を編集もしくは改変できる技術としてヌクレアーゼによるゲノム編集技術であるZFN、TALEN、CRISPR-Cas9システムの3技術の各特長を組み合わせ、合成生物学研究に利用できる基盤技術としての体系化を推進した。その成果として、ラパマイシンにより会合が誘導されるFKBP-FRBドメインを利用したDNA切断系の構築と転写制御システムへの応用が挙げられる。ZF、TALEドメインにFKBPを融合し、FokIドメインにFRBを融合させたタンパク質を構築した。ZFN、TALENでは標的配列上でFokIドメインが二量体形成してDNA切断が誘導される。DNA結合ドメインとFokIドメインをつなぐリンカー部分にFKBP、FRBを導入し、ラパマイシン添加によって二量体形成が再現される仕組みとした。各ドメインをin vitro translationで得て、in vitroでの標的DNA切断実験を行った。その結果、ZFNとTALE-FKBP/FRB-FokIの組み合わせで切断が確認された。リンカー部分にFKBP-FRB会合ドメインを利用しているため、標的配列の最適化によってより高い切断効率が得られると予測されるため今後の課題としている。ラパマイシンによる転写活性制御においてはTALEドメイン/dCas9を基にIL-1RNプロモーター領域に結合するDNA結合タンパク質を作製し、ラパマイシン存在下において、転写活性化または抑制ドメインと会合して転写活性制御ができる仕組みを構築した。哺乳類細胞を用いたレポーター遺伝子アッセイによってラパマイシン添加の有無によって遺伝子発現調節のon/offが可能であり、プロモーター領域の複数箇所を標的とすることで各人工転写因子の協奏的な効果が得られた。また、内因性遺伝子プロモーターにも適用可能であった。27年度が最終年度であるため、記入しない。ゲノムを自在に操作,および制御する技術は,Synthetic Biology(合成生物学)研究のなかでも特に哺乳類細胞における研究の発展に大きく貢献すると考えられる。これまでの研究においてジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)や標的遺伝子特異的に組換えるDNA組換え酵素(ジンクフィンガーリコンビナーゼ:ZFR)を用いたゲノム編集に関する研究を推進してきた。本研究では哺乳類細胞のゲノムに特化した技術,任意の標的配列を編集もしくは改変できる技術としてヌクレアーゼによるゲノム編集技術であるZFN,TALEN,CRISPR/Cassystemの3技術の各特長を組み合わせ,合成生物学研究に利用できる基盤技術としての体系化を推進する。多要素な生体分子ネットワークを哺乳類細胞で再構築するには特に複雑な遺伝子改変技術が必要であるため,(1)人工遺伝子回路のゲノムへの導入技術,(2)細胞バーコーディング技術,(3)ゲノムワイドな染色体改変技術,(4)細胞特異的プロモーター活性の利用技術,(5)トランスジェニック(ノックアウト)細胞ラインの樹立技術,を研究計画として挙げている。(1),(2),(4)の各項目については標的配列に特異的に働くZFN,TALEN,CRISPR/Casを構築することに成功し,それぞれの細胞に対する変異導入率も定量することができた。従って,次年度においてドナー遺伝子として人工回路遺伝子やプロモーター配列,もしくはバーコーディングに利用する蛍光タンパク質遺伝子の導入方法を検討する段階に達している。(3),(5)に関しては比較的多数の細胞からクローンを選択してくる基盤は構築しており,次年度の研究において設計通りに変異が導入されたクローンの取得,およびその効率化に取り組む段階である。研究計画に挙げた各項目における実施状況は以下の通りであり,当初の予定通り実施することができた。(1)人工遺伝子回路のゲノムへの導入技術について,本研究では直接的に人工遺伝子回路を遺伝子座に導入することで細胞株を選ばない研究を可能にするため,導入部位としては他の遺伝子や細胞機能に影響を及ぼさないsafe harborとされているAAVS1を選択し人工遺伝子回路の要素

配列をコードしたプラスミドの構築,導入する遺伝子座としてAAVS1を標的とするZFNおよびTALEN,CRISPR/Casを構築した。(2)細胞バーコーディング技術について,本研究ではジェネティックな改変を行った細胞について,簡易な検出法で操作の有無を区別するための手法の一つとして,バーコード情報となる蛍光タンパク質遺伝子発現系を安全な遺伝子座に導入する系を構築し,導入遺伝子座と蛍光タンパク質を複数組み合わせることでバーコード化する。AAVS1遺伝子座について蛍光タンパク質(EGFP,ECFP,EYFP)それぞれをコードするドナー遺伝子を構築した。(3)ゲノムワイドな染色体改変技術では染色体上での転座は細胞のがん化などに関連するが,転座を人工的に制御することで各染色体上に存在する遺伝子座の間でのトランスの関係性などを探る研究などが可能になる。本年度はIL-1RN遺伝子を標的とするガイドRNAプラスミドを複数構築し,Cas酵素と細胞に同時導入して切断効率を検討した。(4)細胞特異的プロモーター活性の利用技術ではゲノムワイドに遺伝子の発現系の利用,制御が可能であれば,合成生物学研究の領域拡大が望める。本年度はプロモーター領域を標的とするZFN,CRISPR/Casを構築し,効率的に遺伝子配列を欠損させることが可能であることを見出した。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後の推進方針としてはこれまでの研究が当初の計画に沿って進捗しているため、当初の研究計画に則って実施する予定である。各研究項目では以下のように予定している。(1)人工遺伝子回路のゲノムへの導入技術/人工遺伝子回路をゲノムに導入し,蛍光顕微鏡およびフローサイトメーターによる蛍光強度の測定から回路形成を確認する。人工遺伝子回路はドナー遺伝子として構築するが,ZFNによる切断配列の周辺約1,000bp程度と相同性をもつ配列を人工遺伝子回路の配列に加えることで効率的に導入することが可能になる。(2)細胞バーコーディング技術/蛍光タンパク質遺伝子をドナーとして細胞へ導入し,遺伝子座へ安定的に導入した細胞を樹立し,蛍光顕微鏡,フローサイトメーターでの観察,定量を行う。(3)ゲノムワイドな染色体改変技術/切断効率が高く,off-target効果の低いガイドRNAを用いて各遺伝子座を同時切断し,染色体転位を検出する。(4)細胞特異的プロモーター活性の利用技術/これまで用いられているプロモーターによる発現だけでなく,内在性プロモーターの直下流に組み込むことで,細胞の状態に応じたプロモーター活性による発現システムを構築する。
アイヌ民族の住居(チセ)の成立に関する研究-竪穴住居から平地住居への展開過程-

本年が4年計画の最終年にあたる。当研究課題においては、アイヌ民族の建築施設の内、生活文化の中心である住居(チセ)を中心に研究を進めた。現在、ケトゥンニ(三脚サス)2組とキタイオマニ(棟木)で基本フレームを構成する小屋組構造(以下、ケトゥンニ構造とする)は、チセの構造的特徴を代表するもので、チセのTipicalな構造形式であるとする考え方が定説化しているが、本研究によって、アイヌ民族にかかわる近世文書、絵画資料や近代以降の記録、論文を集成し、チセの小屋組構造を中心に検討すると、かつて、ケトゥンニ構造とは異なる多様な小屋組構造が存在したことを解明できた。さらに従来の定説(チセの純粋形態の証明=ケトゥンニ構造の採用)はなぜ形成されたかを解明するため、既往の研究、特に建築学研究者による研究成果を中心にその論点を再整理検討した結果、建築学研究者による研究は、昭和10年前後の数名の研究者によるものに限られ、それ以後、系統的な研究は行われていないこと、なかでも鷹部屋福平博士による研究業績が質量ともに群を抜き、結果的に氏の論考が定着し、再検討を受けないまま今日までの定説化に至った事を解明することが出来た。また、ケトゥンニ構造の構造力学的評価については、従来、ケトゥンニ2組とキタイオマニで小屋組構造の主体を構成する合理的な構造と説明されてきたが、タルキの下端部分が直接側桁に接続し、タルキが直接的に荷重を負担する構造であることなどから、必ずしもケトゥンニとキタイオマニ主体の構造とは言えず、むしろ「垂木構造」に近い構造と考えられると言う結論を得た。さらに、住居遺構の上部構造復元研究として、竪穴住居から平地式住居に至る小屋組架構の変遷試案を提示した。また、擦文文化期を中心に、発掘住居遺構の実測図を集成し、竪穴住居の類型化を試みた。さらに竪穴住居から平地住居への変容過程について、「変容因子」を設定して考察を試み、壁と自由な開口部の確保が、その要因の大きな点であると推定した。平成10年度から13年度までの4年間の研究計画の中で調査研究を進めている。本年度については、従来の研究(アイヌ民族における建築施設の成立と変遷過程に関する建築史的研究)の成果について再整理を行うと同時に、埋蔵建造物に関する基礎的資料の収集、整理を行うことを主要な目的として、調査研究を進めた。具体的な調査研究項目は以下の通りである。1.絵画・文献資料の集成整理;いわゆる「アイヌ絵」などの絵画資料を中心に資料を収集し、住居に関わる資料の集成整理作業を進めた。具体的には「アイヌ絵」資料をデータベース化するため、写真撮影済みの資料をスキャナによってパソコンに取り込み、描かれる内容の検討、絵画情報の検索が可能な処理を行っている(平成11年度継続予定)。2.既発掘遺構に関する報告書、文献の収集整理;本研究の主題である擦文文化期からアイヌ文化期に関わる発掘遺構の報告書、民族誌に関わる文献などについて収集、購入し、住居に関わる資料の抽出・分析を行った。3.復元住居の実地調査;北海道内・外における復元住居について実地調査を行った。以上の調査・整理作業をふまえて、「アイヌ民族の住居(チセ)に関する史的考察2-「西洋人」の見た近代アイヌの住居」として研究報告の発表を行った。

この論文は、従来の住居に関する固定的な概念を再構築する手段として、近世において、いわゆる「西洋人」が記録した近代アイヌの住居と言う「異文化のまなざし」のフィルターを活用して、分析を試みたものである。この論文によって、幕末・明治初期から昭和戦前期に至る近代にも様々な形態、構造、材料の住居(チセ)が存在したことが再確認でき、従来の固定化したアイヌ民族の建築・住居像を払拭し、あらたにその実相をとらえることが出来た。本年度は4年間の研究期間の2年目である。本年度については、アイヌ民族の平地式住居の成立と変遷過程を解明する上で重要と考えられる、いわゆる平地式住居遺構(考古学で言う掘建柱住居)に関する資料の収集、整理、分析を行うことを中心的な目的として、調査研究を進めた。具体的な調査研究項目は以下の通りである。1.絵画・文献資料の集成整理;平成10年度に引き続き、絵画資料、文献資料を収集し、住居に関わる資料の整理作業と分析を進めた。2.発掘報告書、文献の収集整理;本研究の主題である擦文文化期からアイヌ文化期に関わる発掘遺構の報告書、民族誌に関わる文献などについて収集、購入し、住居に関わる資料の抽出・分析を行った。具体的には、過去10年程度を目途に、近年の発掘報告書を中心に平地式住居遺構のデータを整理し、分析を行った。3.復元住居の実施調査;北海道内における近年の復元住居や道外における復元住居について実施調査を行った。以上の調査と前年度までの調査実績をふまえて、「アイヌ民族の住居(チセ)に関する研究ー近世アイヌ民族の住居と近代アイヌ民族の住居に関する検証と成立過程についてー」として論文を発表した。この論文では、1,近代以降、近年までの研究史の再整理。2,近世・近代における関連史料の分析。3,平地式住居遺構(地上に残る柱穴列遺構)の整理分析を行った。この論文をまとめることによって、絵画・文献資料から知るチセは、18世紀後半以降に限られるにもかかわらず、チセの形態が画一的にとらえられてきたこと。一方、住居遺構の整理分析から、中世における平地式住居については、その規模、構造は多様であり、その柱穴列の形式と規模の相関などから建築遺構の性格や用途についての推定方法の指針を提示できた。また、「縄綴船」の技術を持っているのにも拘わらず、チセの大きな特徴として針葉樹の大径材や割材を使用せず、広葉樹の小径材を多用する点に注目し、擦文文化期以前からの割材使用文化の断絶が意味するものについても考察した。平成10年度から13年度までの4年間の研究計画の中で調査研究を進めている。本年度については、過年度の調査研究の成果について再整理を行い、同時に、考古学の成果による埋蔵建造物に関する資料の収集、整理を行うことを主要な目的として、調査研究を進めた。1.絵画・文献資料の集成整理;いわゆる「アイヌ絵」などの絵画資料を中心に資料を収集し、住居に関わる資料の集成作業を進めた。具体的には「アイヌ絵」資料をデータベース化し、描かれる内容の検討を行った(平成11年度から継続)。2.既発掘遺構に関する報告書、文献の収集整理;本研究の主題である擦文文化期からアイヌ文化期に関わる発掘遺構の報告書、民族誌に関わる文献などについて収集、購入し、住居に関わる資料の抽出・分析を行った(平成11年度から継続)。3.復元住居の実地調査;北海道内の擦文文化期の遺跡、北海道外における復元住居(主に弥生文化期)について実地調査を行った。
軍事基地がもたらす排除と依存の人類学的研究－マーシャル諸島・イバイ島の事例から

北部太平洋のマーシャル諸島共和国は独立国であるが、国内のクワジェリン環礁に米国軍事基地を有する。環礁住民の多くは、基地建設に伴って、同環礁内のイバイ島への移住を強いられた。一方、軍事基地での労働機会を求める、他環礁からの自発的な出稼ぎ移住者もイバイ島に流入した。現在では、同環礁を出身地とする強制移住者およびその子孫と、他環礁出身の出稼ぎ者が島内で共存する。本研究は、イバイ島を事例として、軍事基地の周辺において構築される社会経済の態様を、実地調査および歴史文書調査により明らかにしようとするものである。主に、人々の日常的な経済実践、社会関係の形成、そして伝統的制度の歴史的変容に着眼する。
日英の賃金/収入のジェンダー統計分析-個人と世帯の関係を考慮して-

当初の目的に沿って、ジェンダー統計論の視覚を基礎に置きながら、一定程度進めることができた。(1)男女間賃金格差の検討では、要因分解手法の内在的限界を提示し、より正確な分析結果を導き出すことに貢献できた。(2)収入構造および夫妻の収入比率の日英比較では、日英のミクロデータを使い、先行研究の弱点・不足点を克服して、労働市場および世帯においてジェンダー平等が、日本よりイギリスで進んでいることを確認した。さらに低所得層における男女格差の分析を進めた。(3)男女の賃金/収入に関する政府統計の調査票や集計方法等の改善すべき点を明らかにした。本研究は、ジェンダー視点から、収入の個人と世帯、そしてその関係性を検討する。個人レベルにおいて労働市場で発現する男女間の賃金の格差・差別を検討し、世帯レベルでは世帯単位にみた男女の収入を検討する。その際、ジェンダー統計の視角を基礎にする。具体的には4つの課題がある。(1)男女間賃金格差・差別について、要因分解手法の限界を配慮して、日英比較を行うこと。(2)片稼ぎ世帯、妻正規雇用型共稼ぎ世帯、妻非正規雇用型共稼ぎ世帯の収入構造を日英比較すること。(3)それぞれの世帯について世帯収入階級別夫妻間の収入比率を検討し、さらに夫間、妻間、世帯間の収入格差とそれらの関係を分析し、日英比較することである。(4)さらに、賃金/収入の「男性稼ぎ主」型の程度と生活できる程度かに注目しながら、制度や政策を含めてイギリスとの比較を行い、日本の諸制度・政策を考察する。1.男女間賃金格差・差別の要因分解手法の意義と限界の検討。要因分解手法として最も頻繁に使われるブリンダー・ワハカ分解手法の意義と内在的限界を論文としてまとめた。限界は、(1)「格差」と「差別」の大きさは、利用する説明変数によって、変化するという問題、(2)労働者の属性の男女差に影響を与えている差別の軽視・無視を指摘し、さらに(3)日本の先行研究に見られる説明変数ごとの要因分解の問題点を明示した。当該手法の限界を理解した上で、限定的に利用する必要である。2.家計分析ジェンダーの視点から、「単身家計・共稼ぎ家計と女性の経済力」をまとめ(『三訂消費生活経済学』所収)、さらに、英国について、共同で、雇用者世帯の可処分所得に対する税・社会保険料負担や社会保障給付等の影響を、英国のミクロデータを用いて分析した(『家計所得の国際比較研究』に所収)。3.賃金統計のジェンダー視点からの検討。政府統計を用いて労働条件のジェンダー統計分析を行い『男女共同参画統計データブック2009』に一部掲載し、労働条件に関する政府統計の課題を示した。また、ジェンダー統計研究部会代表として及び個人でも、統計委員会の素案に対し、ジェンダー統計の視点から改善点のパブリック・コメントを提出した(2008年11月25日)1.男女間賃金格差・差別の分析手法について。日本の男女間賃金格差やジェンダー経済格差の方法論(前提となる仮説、分析方法や結論の妥当性など)の先行研究をサーベィ・検討し、男女間賃金格差の分析視角や盲点などを再考した(これは、社会政策学会ジェンダー部会「今日のジェンダー経済格差の要因と解消を考える-賃金・就業機会・家事負担-」(2009年5月24日)のコメンテータとして一部発表)。さらに、国際フェミニスト経済学会(IAFFE)大会(於:ボストン)で、昨年検討した要因分解手法の意義と限界を発表し(2009年6月28日)、男女間賃金格差を研究する海外の複数の研究者と意見交換をし、次の研究への足がかりを作ることが出来た。2.フェミニスト経済学について。IAFFE大会(2009年)およびプレカンファレンスに出席し、フェミニスト経済学の現況をライブリーに把握し、複数の研究者と現地で実際に研究交流をすることができた。経済統計学会「ジェンダー統計研究部会ニュースレターNo.17」に記事をまとめた。3.ジェンダー統計について。(1)ESCAP地域のジェンダー統計活動の到達点と課題についてまとめた(第53回経済統計学会全国研究総会で報告)。(2)世界経済フォーラムのジェンダー格差指数の2009年のデータの正確性を検討し、日本のデータ等の修正へと導いた(読売新聞等からの取材があり、記事が掲載された)。1.イギリスの低所得層のデータ分析低所得層に着目するのは、そこに多くの女性が男性以上に多く占めており、男女間の所得格差の主たる要因となっているからである。そこで、イギリスのミクロデータを使用して、社会保障給付(児童税額控除や就労税額控除など)の捕捉率を、家族構成および男女の違いにも着目して計算し、さらに低所得層のジェンダー分析を他の研究者と共同で試みた。しかし、低所得層の分析には、サンプル数や限定の仕方などでより検討が必要なことが明らかとなった。2.ジェンダー統計の国際的展開と国内の課題

(1)第3回世界ジェンダー統計フォーラム(10月11-13日)およびジェンダー統計機関間・専門家グループ会合(10月14日、いずれもフィリピンにて開催。国連統計部とフィリピン国家統計調整局主催)に参加し、情報収集を行い、ネットワークの構築を行った(経済統計学会「ジェンダー統計研究部会ニュースレター」No.21に掲載)。(2)第三次男女共同参画基本計画とジェンダー統計について検討し、前進点と課題を明示した(これは、例えば、学会報告や国立女性教育会館(NWEC)フォーラムのNWEC主催ワークショップ「地域づくりと男女共同参画統」で発表した)。1.男女間賃金格差分析とジェンダー統計(1)格差が拡大している中、低所得層に着目して、OECDのデータを使って男女間の賃金格差の国際比較を行い、フルタイム労働者に限定しても、日本は、女性の低賃金層の割合が高くかつその男女間格差が大きいことを示した。(2)厚生労働省の男女間賃金格差に関する研究会報告書を検討し、ジェンダー統計の重要性が認識されたことを評価しつつ、政府統計改善との動きが弱く、個々の企業や労働者に任されている点の弱さなどを指摘した。(3)国際的なジェンダー統計書である『世界の女性2010』を共同で翻訳した。(4)労働条件のジェンダー統計分析を行った。2.イギリスの低所得層の検討イギリスの社会保障のうち児童税額控除や就労税額控除に関わるデータの収集方法を検討し関連文献を翻訳し、そして引き続き社会保障制度の捕捉率を検討しより正確にデータ把握を可能にするよう改善を重ねてきた(これらは共同研究であり、その一部は、統計情報研究開発センターの叢書[2012年刊行予定]に掲載予定)。3.日本の労働市場と女性労働-震災を通じて-3.11は、日本の男女共同参画の進展の遅れを露呈した。男性稼ぎ主型の脆弱性も露わになった。本科研のキーワードである労働と生活、個と共同の関係を、3.11を考慮しながら、改めて検討し、ジェンダー不平等が女性の生活を脅かしていることを見た。
酸化ストレス防御能を有するヒトiPS細胞由来の歯根膜シートの開発と歯周組織再生

歯根膜は生理的条件下において歯の支持、血管網による栄養の供給、感覚の受容、歯周組織の維持・再生に重要な役割を果たしている。また、歯根膜は咀嚼力や咬合力といったメカニカルストレスから歯と歯周組織を保護し、恒常性を維持している。歯周病により歯周組織が破壊されると、自然治癒は見込めず、重度の歯周組織の破壊が生じた場合には抜歯が不可避となり、患者の審美性や咬合機能が著しく損なわれる。これまで、失われた歯周組織の再生を促す治療方法として、組織再生誘導法やエムドゲインが知られている。近年、歯根膜細胞シートを用いた歯周組織の再生が期待されている。また、チタン製インプラント体に歯根膜の発生学的由来である歯小嚢を付与することにより、歯根膜機能を有したバイオハイブリットインプラントの作製が可能であることが報告された。しかし、将来これらの技術を広く臨床応用するためには、いかに少ない患者への侵襲で必要十分量の安全な歯根膜細胞を確保するかという細胞ソースの課題を解決しなければならない。iPS細胞は、無限の増殖能と多分化能を有し、歯周組織再生の細胞ソースとなり得る。そこで本研究課題では、歯周組織の再生とバイオハイブリッドインプラントへの応用を目指した、ヒトiPS細胞由来歯根膜細胞シートの作製方法の開発のための研究を行ってきた。今年度は、昨年に引き続き、ヒトiPS細胞から歯根膜細胞の前駆細胞への効率的な誘導方法の検討を行った。まず、ヒトiPS細胞からneuroectodermal spheroidを誘導した。さらに、そのneuroectodermal spheroidから神経堤様細胞を誘導し、遺伝子発現を解析した。その結果、神経堤細胞マーカーの発現が認められ、iPS細胞由来歯根膜細胞の前駆細胞の樹立に成功した。現在、先天的及び後天的歯の欠損部位への補綴治療として用いられているデンタルインプラント治療は機能回復において有効とされているものの、歯根膜組織が欠落しているため、歯根膜機能や神経機能などの歯の生理的機能を有しておらず、完全な機能的咬合系の回復することはできていない。また、近年多能性を有するiPS細胞が作製され、再生医療への応用が期待されている。このような背景から、欠損歯の咬合機能回復に貢献する歯根膜機能を、幹細胞と組織工学技術によって補うことが可能となれば、天然歯とほぼ同等の生理機能を有する次世代のハイブリット型インプラントとして、より機能的な咬合系の回復が可能であると考えられる。また、歯根膜線維を有したインプラントが患者の生活の質を向上させるだけでなく、人工歯根膜再生の知見が、歯周病の治療及び歯周組織再生への応用も期待される。そのため、人工歯根膜再生の基盤的技術の開発は、患者及び術者から切望されている。ヒト歯根膜から分離した細胞に、京都大学iPS研究所でサブクローニングされたiPS細胞作製用プラスミドを遺伝子導入してiPS細胞樹立を試みた結果、iPS細胞様細胞が得られた。得られたiPS細胞様細胞がES細胞と同様に多分可能を有しているか、今後検討を進めていく予定である。当初の計画通り進捗している。今後も継続して進める予定である。今年度は、iPS細胞由来歯根膜細胞を誘導するための前駆細胞として、ヒトiPS細胞から神経堤様細胞の誘導を行い、それらの細胞のキャラクタライゼーションを行った。ヒトiPS細胞から歯根膜細胞への分化誘導方法の確立に、当初計画よりも時間がかかっているため。

また、歯根膜は咀嚼力や咬合力といったメカニカルストレスから歯と歯周組織を保護し、恒常性を維持している。歯周病により歯周組織が破壊されると、自然治癒は見込めず、重度の歯周組織の破壊が生じた場合には抜歯が不可避となり、患者の審美性や咬合機能が著しく損なわれる。これまで、失われた歯周組織の再生を促す治療方法として、組織再生誘導法やエムドゲインが知られている。近年、歯根膜細胞シートを用いた歯周組織の再生が期待されている。また、チタン製インプラント体に歯根膜の発生学的由来である歯小嚢を付与することにより、歯根膜機能を有したバイオハイブリットインプラントの作製が可能であることが報告された。しかし、将来これらの技術を広く臨床応用するためには、いかに少ない患者への侵襲で必要十分量の安全な歯根膜細胞を確保するかという細胞ソースの課題を解決しなければならない。iPS細胞は、無限の増殖能と多分化能を有し、歯周組織再生の細胞ソースとなり得る。そこで本研究課題では、歯周組織の再生とバイオハイブリッドインプラントへの応用を目指した、ヒトiPS細胞由来歯根膜細胞シートの作製方法の開発のための研究を行ってきた。今年度は、昨年に引き続き、ヒトiPS細胞から歯根膜細胞の前駆細胞への効率的な誘導方法の検討を行った。まず、ヒトiPS細胞からneuroectodermal spheroidを誘導した。さらに、そのneuroectodermal spheroidから神経堤様細胞を誘導し、遺伝子発現を解析した。その結果、神経堤細胞マーカーの発現が認められ、iPS細胞由来歯根膜細胞の前駆細胞の樹立に成功した。ヒト歯根膜から分離した細胞に、京都大学iPS研究所でサブクローニングされたiPS細胞作製用プラスミドを遺伝子導入してiPS細胞樹立を試みた結果、iPS細胞様細胞が得られた。得られたiPS細胞様細胞がES細胞と同様に多分可能を有しているか、今後検討を進めていく予定である。当初、ヒトiPS細胞から間葉系幹細胞を誘導し、さらに歯根膜細胞を誘導する計画であった。最近の知見から、神経堤様細胞の誘導を介した、iPS細胞から歯根膜細胞の分化誘導が有効である可能性が示された。そこで今後は、ヒトiPS細胞由来の神経堤様細胞を介した歯根膜細胞の樹立方法についても検討を行い、効率的なiPS細胞由来歯根膜細胞の樹立方法の確立を目指す。
新しいα_1アドレナリン受容体サブタイプのクローニングおよび生理機能に関する研究

血圧・脂質代謝などで重要な生理的役割を演じているα_1アドレナリン受容体について研究を行い,以下の成績を得た。1. α_1-アドレナリン受容体のクローニングウサギ肝臓cDNAライブラリーより,α_<1b>,α_<1d>サブタイプをクローニングした。塩基配列・アミノ酸配列およびcos7細胞に発現したサブタイプの薬理学的特性は,ヒト,ラットなどで同定されたα_<1b>,α_<1d>サブタイプと高い相同性を示した。これとは別に,α_<1a>、サブタイプをクローニングしたところ,長さの違う3種類のクローンが得られた。塩基配列およびアミノ酸配列を決定したところ,これらはC末構造の異なるスプライスバリアントであった。バリアントのC末構造は他種とは異なったが,薬理特性はα_<1a>サブタイプの性質を示した。体内分布をmRNAで定量したところ,各バリアントの発現は臓器ごとで異なっていた。2.各種生体組織でのα_1サブタイプの同定下記組織に分布するα_1アドレナリン受容体を薬理学的に同定した。ヒト前立腺(α_<1A>,α_<1L>サブタイプ),ヒト尿道(α_<1L>サブタイプ),ヒト大動脈(α_<1B>サブタイプ),ラット前立腺(α_<1A>,α_<1L>サブタイプ)3. α_<1a>,アドレナリン受容体発現細胞の機能測定CHO細胞にα_<1a>,サブタイプを持続的に発現させ,microphysiometerを用いて細胞近郊の外液の酸性化率(EAR)を指標にして機能測定し,以下の成績を得た。・EARはα_1アゴニストに対し,濃度依存性の変化を示した。・濃度作用曲線と受容体密度の関係から,完全作用薬の場合には余剰受容体が存在することを証明した。・EARを指標にして,α_1アゴニストを完全作用薬と部分作用薬に分類した。・競合的アンタゴニストの親和性がシルド解析より得られることを証明した。ウサギ肝臓よりmRNAを抽出し,cDNAを作製した。そして,このcDNAからプラークハイブリダイゼ-シヨン法を用いてスクリーニングを行い,二つのα_1アドレナリン受容体クローンを得た。一つは1731の塩基対からなり567ヶのアミノ酸をコードするタンパクで,もう一つは1398の塩基対で466ヶのアミノ酸をコードしていた。ホモロジー検索の結果,前者はα_<1d>サブタイプ,後者はα_<1a>サブタイプに高い相同性を示した。COS-7細胞にトランスフェクションし,薬理学的特性を調べたところ,前者はα_<1d>サブタイプに特異的なBMY7378に高親和性を,後者はα_<1a>選択的薬物(oxymetazolineやYM617)に高親和性を示した。ウサギにおいてmRNAレベルの組織分布を調べたところ,前者は胸部大動脈,大脳皮質,輸精管,前立腺に,後者は肝臓,脳幹,視床,輸精管に多く存在した。以上,今年度の研究において,ウサギのα_<1a>およびα_<1d>アドレナリン受容体サブタイプの構造と薬理学的特性を明らかにした。しかし,両サブタイプはprazosinに高親和性を示したので,目的のα_<1L>サブタイプとは考えられなかった。更にスクリーニングを進め,新しいサブタイプを探究する予定である。

血圧・脂質代謝などで重要な生理的役割を演じているα_1アドレナリン受容体について研究を行い,以下の成績を得た。1. α_1-アドレナリン受容体のクローニングウサギ肝臓cDNAライブラリーより,α_<1b>,,α_<1d>サブタイプをクローニングした。塩基配列・アミノ酸配列およびCOS7細胞に発現したサブタイプの薬理学的特性は,ヒト,ラットなどで同定されたα_<1b>,α_<1d>サブタイプと高い相同性を示した。これとは別に,α_<1a>サブタイプをクローニングしたところ,長さの違う3種類のクローンが得られた。塩基配列およびアミノ酸配列を決定したところ,これらはC末構造の異なるスプライスバリアントであった。バリアントのC末構造は他種とは異なったが,薬理特性はα_<1a>サブタイプの性質を示した。体内分布をmRNAで定量したところ,各バリアントの発現は臓器ごとで異なっていた。2.各種生体組織でのα_1サブタイプの同定下記組織に分布するα_1アドレナリン受容体を薬理学的に同定した。ヒト前立腺(α_<1A>,α_<1L>サブタイプ),ヒト尿道(α_<1L>サブタイプ),ヒト大動脈(α_<1B>サブタイプ),ラット前立腺(α_<1A>,α_<1L>サブタイプ)3. α_<1a>アドレナリン受容体発現細胞の機能測定CHO細胞にα_<1a>サブタイプを持続的に発現させ,microphysiometerを用いて細胞近郊の外液の酸性化率(EAR)を指標にして機能測定し,以下の成績を得た。・EARはα_1アゴニストに対し,濃度依存性の変化を示した。・濃度作用曲線と受容体密度の関係から,完全作用薬の場合には余剰受容体が存在することを証明した。・EARを指標にして,α_1アゴニストを完全作用薬と部分作用薬に分類した。・競合的アンタゴニストの親和性がシルド解析より得られることを証明した。
減数分裂における細胞周期の制御

分裂酵母の減数分裂の進行を制御する2つの遺伝子(mei4とspo6)について詳細な検討を行った。1.mei4遺伝子の解析:mei4遺伝子破壊株は減数第一分裂前期(G2期)で減数分裂の進行を停止する。Mei4蛋白質がフォークヘッドDNA結合領域を持つこと、spo6遺伝子を含む複数の有性生殖関連遺伝子の転写に影響することから、遺伝子産物は減数分裂特異的な転写因子と推定した。このことを証明するため、リコンビナントMei4蛋白質とターゲットオリゴヌクレオチドとの結合を、ゲルシフト法により調べた。Mei4蛋白質はヒトフォークヘッド蛋白質の結合配列であるGTAAAYAを含むspo6転写制御領域の21塩基対の合成DNAと特異的に結合した。また、コア配列のAAAを他のヌクレオチドに置換すると結合できなくなった。Mei4結合配列を欠失したspo6変異遺伝子を作成したところ、下流の転写が完全に阻害されたことから、この配列が転写必須領域として機能することが明らかとなった。つぎに、出芽酵母のGa14結合領域との融合蛋白質を発現した転写活性化能を調べた。その結果、Mei4蛋白質のC末端側175アミノ酸の領域に転写活性化が存在することがわかった。以上の実験結果からMei4蛋白質は減数分裂特異的な転写因子として機能することが証明できた。2.spo6遺伝子の解析:spo6遺伝子の塩基配列決定からSpo6蛋白質は出芽酵母のG1/S期に必須のDbf4と類似性を示す領域を有していた。そこで、本遺伝子の破壊株を作成し、FACS分析を行ったが、減数分裂前DNA合成は完了することが示された。しかしDAPI染色による核染色の結果、spo6遺伝子破壊株は二核の状態で停止する傾向を示し、減数第二分裂に欠損があることが示唆された。
DNAナノビーズ創成に関する研究

細胞への組み変え遺伝子導入の際、切断されやすいDNAファイバの保護を目的として、これを包み込む微粒子(DNAナノビーズ)の加工技術の開発を行った。ビーズの原料としては生体分解性のあるアルギン酸カルシウムゲルが適しているが、従来の撹拌乳化法によるゲルビーズ生成では、過大な剪断力がかかる・粒径が揃わない、などの問題があった。本研究では微細ピペットから液滴を生成することでDNAを切断せずに粒径の揃ったビーズを製作する方法を選択した。一方、表面力の影響の大きなミクロのスケール下でピペットから液滴を引き剥すには慣性力や流体力では難しくなる。本研究では基板と液滴との親和力(表面張力)を用いてこれを行った。具体的には、FIB(収束イオンビーム)加工機を用いで先端径0.53μmの微細ピペットを作製し、ピエゾアクチュエータで先端を周期的に基板(例えばガラス)に近付け、吐出したゲル原料液(アルギン酸ナトリウム水溶液)が大きな液滴を形成する前に基板に接触させピペットから切り離すようにした。基板を並進運動させて連続的にゲル原料液の微小液滴を形成した後、塩化カルシウム永溶液を滴下してゲル化し、直径3μm程度の径の揃ったビーズを生成できた。また、あらかじめλ-DNA、またはプラスミドDNAをゲル原料液と混合しておくことにより、DNAを封入したビーズの生成も行った。ビーズ生成のパラメータについて、当初ゲル原料液の吐出流量を制御する計画であったが、微細流路においてこれを制御するのは難しく、それよりも吐出条件を一定にしたまま、基板表面の状態(親水度)を制御することが有効であることが分かった。オクタデシルシランによって疎水処理したガラス基板上に上記FIBを用いて直径5μmのドット状の親水性のパターンを形成することによって、粒径の粒径を意図した大きさに制御できることを確認した。今年度は細胞への実際の遺伝子の導入までは行えなかったが、ビーズ生成装置を応用し、従来より効率的なオンチップ形質転換法を検討した。ビーズ生成と同様の装置構成で、蒸発防止のための溶媒中で細胞培養液の液滴とビーズを生成し、液滴の中でビーズと接触させながら細胞の培養が行えることを確認した。次年度以降に、培養空間を微細化したことによる効果を確認する計画である。具体的には、FIB(収束イオンビーム)加工機を用いて先端径0.53μmの微細ピペットを作製し、ピエゾアクチュエータで先端を周期的に基板(例えばガラス)に近付け、吐出したゲル原料液(アルギン酸ナトリウム水溶液)が大きな液滴を形成する前に基板に接触させピペットから切り離すようにした。基板を並進運動させて連続的にゲル原料液の微小液滴を形成した後、塩化カルシウム水溶液を滴下してゲル化し、直径3μm程度の径の揃ったビーズを生成できた。

本研究では基板と液滴との親和力(表面張力)を用いてこれを行った。具体的には、FIB(収束イオンビーム)加工機を用いで先端径0.53μmの微細ピペットを作製し、ピエゾアクチュエータで先端を周期的に基板(例えばガラス)に近付け、吐出したゲル原料液(アルギン酸ナトリウム水溶液)が大きな液滴を形成する前に基板に接触させピペットから切り離すようにした。基板を並進運動させて連続的にゲル原料液の微小液滴を形成した後、塩化カルシウム永溶液を滴下してゲル化し、直径3μm程度の径の揃ったビーズを生成できた。また、あらかじめλ-DNA、またはプラスミドDNAをゲル原料液と混合しておくことにより、DNAを封入したビーズの生成も行った。ビーズ生成のパラメータについて、当初ゲル原料液の吐出流量を制御する計画であったが、微細流路においてこれを制御するのは難しく、それよりも吐出条件を一定にしたまま、基板表面の状態(親水度)を制御することが有効であることが分かった。オクタデシルシランによって疎水処理したガラス基板上に上記FIBを用いて直径5μmのドット状の親水性のパターンを形成することによって、粒径の粒径を意図した大きさに制御できることを確認した。今年度は細胞への実際の遺伝子の導入までは行えなかったが、ビーズ生成装置を応用し、従来より効率的なオンチップ形質転換法を検討した。ビーズ生成と同様の装置構成で、蒸発防止のための溶媒中で細胞培養液の液滴とビーズを生成し、液滴の中でビーズと接触させながら細胞の培養が行えることを確認した。次年度以降に、培養空間を微細化したことによる効果を確認する計画である。
活性酸素の老化調節機構の解析

酸素は多くの生物の生存に必須であるが、酸素の一部は代謝の過程で活性酸素へと変わる。私たちは、モデル生物の線虫Caenorhabditiselegans、酵母Saccharomyces cerevisiae、哺乳動物培養細胞を用いて活性酸素感受性に変化を示す突然変異体を取得し、その解析を行ってきた。本年度の研究では、線虫C. elegans突然変異体の解析、および、人々の健康増進に有用な機能性物質の探索を行った。<活性酸素高感受性変異体oxy-7の原因遺伝子の解析>突然変異体oxy-7の原因遺伝子を同定した。(以前は、oxy-8と記述していたが、以降、oxy-7に変更する。)昨年度の解析で、酸素濃度を変化させ(1%と21%)、oxy-7の寿命を測定した。oxy-7は21%酸素下では寿命が短縮するが、1%酸素下ではその短縮が軽減されることが、示唆されていた。本年度は、実験をさらに繰返し、その再現性の確認ができた。また、oxy-7の活性酸素生成について定量的な解析を試み、予備的な結果であるが、oxy-7では野生型と比較し、活性酸素生成が上昇していることを見出した。これらのことより、oxy-7の活性酸素感受性の増大は、細胞内の活性酸素生成量の増大が原因であると考えられた。<人々の健康増進に有用な機能性物質の探索>機能性物質のソースとして、インド亜大陸の伝統医学であるアーユルヴェーダで使用される多数の薬草を用い、それらより抽出液を作成し、有用な物質のスクリーニングを行う。これまでの研究で、マウス個体の、放射線防御および皮膚の光老化防止に有効な薬草抽出液を見出しており、さらにそれらの効果には、抗酸化物質が関与することを見出している。その物質の同定のために、培養細胞を用いた簡易的なアッセイ系の確立を試みた。実験作業そのものは、おおむね順調に進めることができた。必ずしも期待した通りの結果が得られなかったものもあるが、引き続き実験を進めたい。本年度は、oxy-7の活性酸素生成量について調べた。まず、個体レベルで活性酸素の生成量の定量を試みたが、個体差が大きく、はっきりとした結論を得ることができなかった。そのため当初の予定を変更し、細胞抽出液を作成し活性酸素の定量を試みた。現在おおむね満足のいく結果を得られていると考えている。そして、予備的な結果ながら、oxy-7は野生型と比較し、活性酸素の生成量が高いことを示すデータを得ている。引き続き解析を進める予定である。有用な機能性物質の探索では、培養細胞を用いた簡易的なアッセイ系の確立を試みたが、血清のロットが活性酸素の感受性に影響を与えることが判明したため、現在予備調査を行っている。上述したように、本研究課題の研究方針に大きな変更はない。<活性酸素高感受性変異体oxy-7の原因遺伝子の解析>当初の予定通り、本年度も引き続き、oxy-7突然変異体および同遺伝子の解析を行う。本年度は、まず、活性酸素の生成量の測定を完了させる。次いで、C. elegansを用いて、様々な金属イオンへの感受性、特に亜鉛を中心にして、感受性を調べる。また、金属イオン量、特に亜鉛量の調節が、oxy-7の活性酸素高感受性にどのように影響するか調べる。亜鉛イオンと活性酸素の制御機構について新たな知見が得られることを期待している。<人々の健康増進に有用な機能性物質の探索>培養細胞を用いた抗酸化効果や細胞増殖の簡易的なアッセイ系を確立する。薬草抽出液をHPLCにて分画し、シングルピークになるまで精製する。得られたピークを質量分析計似て解析し、その物質の構造を推定する。老化防止につながるような物質の発見を期待している。本年度の研究では、線虫C. elegans突然変異体や遺伝子改変体の寿命の測定、および活性酸素感受性の測定を行った。<課題1>活性酸素の老化調節機構の解明遺伝子改変体については、oxy-4、oxy-5、rad-8遺伝子の過剰発現体が取得されていたので、それらの寿命測定や活性酸素感受性測定を行った。野生型と比較して、寿命延長効果や活性酸素抵抗性が見られることもあったが、実験ごとの変動が大きく、結論を出すには至っていない。また、各遺伝子につき複数の安定発現株を取得し、その寿命や活性酸素感受性を測定したが、それらの発現株間にも差が見られ、遺伝子の挿入部位の違いが影響していると考えられた。<課題2>活性酸素高感受性変異体oxy-7の原因遺伝子の解析突然変異体oxy-7の原因遺伝子を同定した。)酸素濃度を変化させ(1%と21%)、oxy-7の寿命を測定した。oxy-7は21%酸素下では寿命が短縮するが、1%酸素下ではその短縮が軽減された。したがって、oxy-7の寿命短縮には酸化ストレスが関与することが示された。現在、実験を繰り返し、再現性の確認を行っている。加えて、Feeding RNAi法を用いて、oxy-

7遺伝子をノックダウンし、活性酸素感受性を測定した。コントロールの空ベクターと比較し、有意な差は検出されなかった。ノックダウンの効率が十分でないことが原因と考えられる。実験作業そのものは、おおむね順調に進めることができた。必ずしも期待した通りの結果が得られなかったものもあるが、想定される範囲内であり、引き続き実験を進めたい。今年度の成果として、特に、oxy-7突然変異体の寿命解析では重要な結果が得られつつある。oxy-7の寿命は通常酸素下で野生株と比較し短縮するが、低濃度酸素下で培養することで、短縮の度合いが小さくなった。このことから、oxy-7の短寿命の原因は酸化ストレスであると考えられた。現在、oxy-7の寿命解析を繰り返している。酸素は多くの生物の生存に必須であるが、酸素の一部は代謝の過程で活性酸素へと変わる。私たちは、モデル生物の線虫Caenorhabditiselegans、酵母Saccharomyces cerevisiae、哺乳動物培養細胞を用いて活性酸素感受性に変化を示す突然変異体を取得し、その解析を行ってきた。本年度の研究では、線虫C. elegans突然変異体の解析、および、人々の健康増進に有用な機能性物質の探索を行った。<活性酸素高感受性変異体oxy-7の原因遺伝子の解析>突然変異体oxy-7の原因遺伝子を同定した。(以前は、oxy-8と記述していたが、以降、oxy-7に変更する。)昨年度の解析で、酸素濃度を変化させ(1%と21%)、oxy-7の寿命を測定した。oxy-7は21%酸素下では寿命が短縮するが、1%酸素下ではその短縮が軽減されることが、示唆されていた。本年度は、実験をさらに繰返し、その再現性の確認ができた。また、oxy-7の活性酸素生成について定量的な解析を試み、予備的な結果であるが、oxy-7では野生型と比較し、活性酸素生成が上昇していることを見出した。これらのことより、oxy-7の活性酸素感受性の増大は、細胞内の活性酸素生成量の増大が原因であると考えられた。<人々の健康増進に有用な機能性物質の探索>機能性物質のソースとして、インド亜大陸の伝統医学であるアーユルヴェーダで使用される多数の薬草を用い、それらより抽出液を作成し、有用な物質のスクリーニングを行う。これまでの研究で、マウス個体の、放射線防御および皮膚の光老化防止に有効な薬草抽出液を見出しており、さらにそれらの効果には、抗酸化物質が関与することを見出している。その物質の同定のために、培養細胞を用いた簡易的なアッセイ系の確立を試みた。必ずしも期待した通りの結果が得られなかったものもあるが、引き続き実験を進めたい。本年度は、oxy-7の活性酸素生成量について調べた。まず、個体レベルで活性酸素の生成量の定量を試みたが、個体差が大きく、はっきりとした結論を得ることができなかった。そのため当初の予定を変更し、細胞抽出液を作成し活性酸素の定量を試みた。現在おおむね満足のいく結果を得られていると考えている。