hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
境界プラズマの電位形成と輸送の運輸論的解析

ダイバータ・プラズマについて解析を行い,末広がり磁場による不純物流入防止の効果を確認すると共に,プラズマ-ガス相互作用を利用した熱流制御の有効性を示した.(1)高温プラズマの流出によって開放磁場中に電位降下が生じる.壁の近傍で生成された低温イオン及び不純物イオンは,電位によって捕捉され,閉じ込め領域への流入を妨げられる.(2)低温イオンの生成率が閾値を越えると,磁場の変化に伴う電位降下はなくなり,低温イオン又は不純物イオンに対する流入防止の効果はあまり期待できなくなる.(3)大型トカマクのダイバータ実験で観測されている熱伝達係数の著しい低下は,主にガス電離や荷電交換反応の影響によるものと推測される.2.ダイバータ・プラズマ中のイオン分極ドリフトに起因した静電的な非線形現象について解析し,磁力線を横切る方向に種々の構造を持つ電位が形成され得ることを示した.(1)プラズマ方程式の発散解,ソリトン解,及び振動解を求め,電位形成がイオンの分極ドリフトに起因することを示した.また,磁力線を横切る方向のダブルレイヤーや衝撃波等が形成され得ることを示した.(2)電位の形成によりイオンは磁力線を横切ってドリフト運動をする.電位の空間変化は,C_S/ω_<ci>で特徴づけられる.3.ヘリカル装置の磁場アイランドを利用したダイバータ配位を提案し、エルゴディック境界の存在によりダイバータ部の放射冷却と閉じ込め領域のHモードとが共存し得ることを述べた。1.トカマク装置のダイバータ領域における電位形成および熱伝達について理論解析を行い、ダイバータ領域におけるプラズマ-ガス相互作用の影響について、以下のことを明らかにした。(1)プラズマ-ガス衝突に伴いダイバータ内に低温プラズマが蓄積され、ダイバータ板手前に局所的にプレシース電位が形成される。電離で生じた低エネルギー電子はスクレイプオフ層へ流入し、これに伴ってダイバータ領域全体の電位降下は小さくなる。(2)荷電交換によるプラズマ流の冷却ガス電離による粒子束の増幅および生成低エネルギー電子の流入により、ダイバータ板へのプラズマの熱伝達係数は中性粒子との衝突の回数が増すにつれtて小さくなる。(3)米国のDIII-D装置や日本のJT60-U装置のダイバータ実験で観測されている熱伝達係数の減少は、上記のプラズマ-ガス相互作用の効果によるものと推測される。2.磁場反転配位やミラーの開放端部におけるガスのリサイクリングの影響について解析し、磁場による障壁効果について以下の結果を得た。(1)リサイクリング率がしきい値より小さい場合、末広がり磁場による障壁効果が期待でき、生成された低温イオンおよび不純物イオンは開放端部に閉じ込められる。(2)リサイクリング率がしきい値を超えると磁場による障壁効果はなくなり、低温イオンおよび不純物イオンは閉じ込め領域に流入するようになる。3.ヘリカル装置の磁場アイランドを利用したダイバータ配位を提案し、エルゴディック境界の存在によりダイバータ部の放射冷却と閉じ込め領域のHモードとが共存できることを述べた。1.ダイバータ・プラズマについて解析を行い,末広がり磁場による不純物流入防止の効果を確認すると共に,プラズマ-ガス相互作用を利用した熱流制御の有効性を示した.(1)高温プラズマの流出によって開放磁場中に電位降下が生じる.壁の近傍で生成された低温イオン及び不純物イオンは,電位によって捕捉され,閉じ込め領域への流入を妨げられる.(2)低温イオンの生成率が閾値を越えると,磁場の変化に伴う電位降下はなくなり,低温イオン又は不純物イオンに対する流入防止の効果はあまり期待できなくなる.(3)大型トカマクのダイバータ実験が観測されている熱伝達係数の著しい低下は,主にガス電離や荷電交換反応の影響によるものと推測される.2.ダイバータ・プラズマ中のイオン分極ドリフトに起因した静電的な非線形現象について解析し,磁力線を横切る方向に種々の構造を持つ電位が形成され得ることを示した.

(1)プラズマ方程式の発散解,ソリトン解,及び振動解を求め,電位形成がイオンの分極ドリフトに起因することを示した.また,磁力線を横切る方向にダブルレイヤーや衝撃波等が形成され得ることを示した.(2)電位の形成によりイオンは磁力線を横切ってドリフト運動をする.電位の空間変化は,C_s/ω_<ci>で特徴づけられる.3.ヘリカル装置の磁場アイランドを利用したダイバータ配位を提案し,エルゴディック境界の存在によりダイバータ部の放射冷却と閉じ込め領域のHモードとが共存し得ることを述べた。
アストログリア微小突起の構造とシナプス機能制御

中枢神経系において、シナプス-アストロサイトの構造・機能連関を研究した。中枢神経系シナプスの近傍にはアストロサイト突起が存在してシナプス伝達に影響を与えることが近年広く知られるようになった。しかしながら、これは主に多くの電気生理学的実験から得られた知見であり、それに比して形態学的証拠はいまだ非常に少ない。さらに、アストロサイトがシナプス機能に関与することを裏付けるには「生きた組織」での解析が重要だが、報告は皆無であった。そこで、生きた海馬組織を用いてシナプス構造とアストロサイトを可視化し、それらの動態を二光子顕微鏡を用いて長時間観察し、両者の構造的・機能的連関を解析した。マウスから海馬スライス培養を作製し、組み換えアデノウイルスを用いてアストロサイトをGFPで可視化し、さらに単細胞電気穿孔法を用いてローダミンで錐体細胞樹状突起を可視化した。これにより、樹状突起から突出するスパイン/フィロボディアとその直近に存在するアストロサイト突起を生きた状態で、二光子顕微鏡を用いて長時間のタイムラプス観察することが可能となった。解析の結果、アストロサイトの接触を受けたフィロボディアは安定化し、その後の成熟スパインへの発達が促進されることを示した。さらにアストロサイト-樹状突起間のシグナリング(EphA4-ephrinA3)を撹乱した場合に出現して間もないフィロボディアの安定化が阻害され、また、Rac1依存的なアストロサイトの運動性を低下させるとスパインへの形態変化が阻害された。この"アストロサイトの接触による個々のフィロボディア安定化及びスパイン発達制御"を示した報告は、Nishida H and Okabe S(2007) Direct astrocytic contactsregulate localmaturation of dendritic spines. The Journal of Neuroscience 27,331-340.として掲載された。シナプス構造は生体内ではアストログリアのもつ微小突起によって取り囲まれ,アストログリアの直接相互作用によるシナプス機能の制御の可能性やシナプス新生におけるアストログリアの役割が示唆されているが,その実態に関しては依然不明の点が多く,そのようなアストログリアの役割を支持するような形態学的解析は,主に神経とアストログリアを同時にイメージングすることの技術的困難さのために欠落している状態である.そこで我々は当研究室で開発された,マウス海馬スライス標本におけるシナプス結合をシナプス前部・後部特異的な蛍光標識を行なうことにより可視化する技術を応用して,海馬スライス標本においてアストログリアをアデノウイルス感染によるloxp-Creシステムを用いたGFP発現によって可視化し,さらに近傍の海馬錐体細胞をローダミンデキストランの単細胞へのエレクトロポレーションによって可視化した.こうして,アストログリア微小突起とその近傍に存在する神経の構造的関係を生きた状態で検出することが可能となった.また,研究代表者は昨年度において,シナブス-アストログリアの海馬CA3およびCA1領域における微細構造の,電子顕微鏡連続切片からの完全な立体再構築を行なっており,電子顕微鏡解析像と二光子顕微鏡解析像を比較することが可能であり,このような蛍光顕微鏡画像と電子顕微鏡画像を比較検討的に解析できることは本研究の特色のひとつである.先述した方法を用いてアストログリアと神経を可視化した海馬スライス標本を二光子顕微鏡を用いてタイムラプス観察することにより,両者の構造的ダイナミクスを検出する実験系を確立した.我々は海馬スライス標本の幼若な時期に注目し,この時期にしばしば見られるフィロポディアやstubbyと呼ばれる樹状突起から突出する未成熟な突起の成熟過程に対して,アストログリアが何らかの積極的な役割を持つのではないかと考え研究を進めてきた.培養3-7日の幼若な海馬スライス標本を二光子顕微鏡を用いてタイムラプス観察した結果,これまでに次のようなことがわかった.それは,「アストログリア突起の接触があった樹状突起から突出する未成熟な突起は,アストログリアの接触がまったくなかった突起よりも存在時間が有意に長く」,「アストログリア突起との接触をもつ樹状突起からの未成熟な突起は,接触がない突起よりもスパインを形成しやすく(スパインは樹状突起から突出する突起の成熟した形態であると考えられている)」,さらに「Rac1の変異型(ドミナントネガティブ)をアデノウイルスを用いてアストログリアに発現させると,樹状突起から突出している未成熟な突起は,コントロールよりも有意に長く,かつスパインではない形態を示した」というものである.これらの結果は,アストログリアの接触と,神経の突起の成熟過程において相関関係があるのみならず因果関係があることをも示唆するものである.今後はさらに上で述べた結果に関係する可能性のある分子を,その機能を阻害した条件での形態学的観察を行なって調べていく予定である.可能性のある分子メカニズムの具体例としては,アストログリア膜上に豊富に存在するEphrinA3とそのレセプターであり神経に発現しているEphA4のシグナルを介したメカニズムや,細胞外基質の1つでありアストログリアが分泌するthrombospondinなどを想定して実験を進める予定である.アストログリアを生きた組織でタイムラプス観察をした報告はまだごくわずかしかなく,その点で本研究は先進的である.さらにスパインの成熟過程に対するアストログリアの役割を示唆する報告は皆無であることから本研究の重要性は非常に高いものである.これらの成果の一部を文部科学省科学研究費補助金特定領域研究「グリア-ニューロン回路網による情報処理機構の解明」班会議(今年度7月,1月)において報告した.中枢神経系において、シナプス-アストロサイトの構造・機能連関を研究した。

中枢神経系シナプスの近傍にはアストロサイト突起が存在してシナプス伝達に影響を与えることが近年広く知られるようになった。しかしながら、これは主に多くの電気生理学的実験から得られた知見であり、それに比して形態学的証拠はいまだ非常に少ない。さらに、アストロサイトがシナプス機能に関与することを裏付けるには「生きた組織」での解析が重要だが、報告は皆無であった。そこで、生きた海馬組織を用いてシナプス構造とアストロサイトを可視化し、それらの動態を二光子顕微鏡を用いて長時間観察し、両者の構造的・機能的連関を解析した。マウスから海馬スライス培養を作製し、組み換えアデノウイルスを用いてアストロサイトをGFPで可視化し、さらに単細胞電気穿孔法を用いてローダミンで錐体細胞樹状突起を可視化した。これにより、樹状突起から突出するスパイン/フィロボディアとその直近に存在するアストロサイト突起を生きた状態で、二光子顕微鏡を用いて長時間のタイムラプス観察することが可能となった。解析の結果、アストロサイトの接触を受けたフィロボディアは安定化し、その後の成熟スパインへの発達が促進されることを示した。さらにアストロサイト-樹状突起間のシグナリング(EphA4-ephrinA3)を撹乱した場合に出現して間もないフィロボディアの安定化が阻害され、また、Rac1依存的なアストロサイトの運動性を低下させるとスパインへの形態変化が阻害された。この"アストロサイトの接触による個々のフィロボディア安定化及びスパイン発達制御"を示した報告は、Nishida H and Okabe S(2007) Direct astrocytic contactsregulate localmaturation of dendritic spines. The Journal of Neuroscience 27,331-340.として掲載された。
ヤヌス型分子接合素子による多成分系超分子ポリマーの創製

超分子ポリマーは、モノマー同士が可逆的な二次的相互作用によって結びついて形成され、自己修復能や刺激応答能をはじめとする独特の機能を潜在的にもつ優れた物質群である。本研究では、ヤヌス型分子接合素子による多成分系超分子ポリマー作製を行う。ヤヌス型分子接合素子とは表裏二面で異なる分子を捕捉し、これらを貼り付ける様に会合体を形成する分子認識分子である。環状ピリジルパラジウム(II)三核錯体に各種官能基を導入することでヤヌス型分子接合素子を調製し、これを用いて異なるサイズ・形状のゲストを交互に認識した多成分系超分子ポリマーの構築を試みる。
オルトバナジン酸ナトリウムによる放射線誘発アポトーシス抑制機講の解明

本研究ではオルトバナジン酸ナトリウム(バナデート)のアポトーシス抑制効果の解明を進め、その作用点(標的分子)を明らかにすることにより、アポトーシス制御による新しいタイプの放射線防護剤開発の一助となることを目指した。実験を進めた結果、バナデートは放射線や抗癌剤によるアポトーシスを抑制し、他の幾つかの刺激によるアポトーシスは抑制しなかったことから、DNA損傷が引き起こすアポトーシス経路を主として抑制していると考えられた。またバナデートは、直接のカスペース活性阻害効果は認められなかったが、バナデート処理した照射細胞のカスペース活性化を抑制することによりアポトーシスを阻害していたことが明らかとなった。そこで、カスペース活性化の上流反応であるミトコンドリア膜電位低下やBax構造変化に対する効果を検討したところ、これらの反応も抑制したことから、バナデートはミトコンドリアの上流に位置するアポトーシス過程に作用していると考えられた。そこで更に上流のアポトーシス過程についてバナデート効果を詳細に解析した結果、バナデートは放射線応答の重要な初期過程に関わる転写因子p53に作用し、その構造を不活性型構造に変化させること、また、不活性化されたp53にはDNA結合能がなく、照射後のp53応答遺伝子の転写活性化が行えなくなっていることを見出した。また、p53遺伝子型の異なる細胞株、およびp53 siRNAの細胞内恒常発現によって得られたp53発現のノックダウン細胞株の比較から、バナデートの抗アポトーシス作用のp53特異性が明らかとなり、バナデートの標的分子はチロシンボスファターゼではなくp53であると結論付けられた。本研究はこれまでチロシンホスファターゼ阻害剤として用いられていたバナデート作用の既成概念を覆しただけでなく、バナデートをリード化合物とするp53阻害性の放射線防護剤開発への道を開いた。本研究ではオルトバナジン酸ナトリウム(バナデート)のアポトーシス抑制効果の解明を進め、その作用点(標的分子)を明らかにすることにより、アポトーシス制御による新しいタイプの放射線防護剤開発の一助となることを目指している。また、バナデートは、直接のカスパーゼ活性阻害効果は認められなかったが、バナデート処理した照射細胞のカスパーゼ活性化を抑制することによりアポトーシスを阻害していたことが明らかとなった。そこで、カスパーゼ活性化の上流反応であるミトコンドリア膜電位低下やBax構造変化に対する効果を検討したところ、これらの反応も抑制したことから、バナデートはミトコンドリアの上流に位置するアポトーシス過程に作用していると考えられた。更に上流のアポトーシス因子について解析を進めた結果、バナデート処理したMOLT-4細胞内のp53は不活性型構造に変化しており、その結果、照射後のp53標的遺伝子の転写活性化の抑制とDNA損傷誘導アポトーシスの抑制が引き起こされていること、およびp53遺伝子型の異なる細胞株の比較からバナデートはp53依存性のDNA損傷誘導アポトーシスを抑制していることが明らかとなった(投稿中)。本研究はこれまでチロシンホスファターゼ阻害剤として用いられることが多かったバナデート作用の既成概念を覆し、今後、実験動物を用いたバナデートの放射線防護剤としての有効性の検討、および更に詳細な抑制分子機構の解析を進めることにより、放射線障害防止におけるp53制御の有用性を明らかにしていくことが期待される。
パルス電磁場刺激がヒト正常骨由来骨芽細胞様細胞の細胞増殖因子に与える影響-特にBone morphogenetic protein(BMP)の遺伝子発現に関する研究-

これまでに,インプラント埋入後の治癒機転を加速する試みとしてパルス電磁場刺激(以下.PEMFs)の応用を試み,新生骨形成促進効果があることや骨芽細胞のBMP-2,-4,-5のmRNAの発現を増強する効果を確認してきた.今回は,PEMFsのヒト正常骨由来骨芽細胞様株(SV-HFO)に対するBMPのmRNAの発現機序,BMPタンパクレベルでの検索ならびにその他のグロースファクターの発現に与える影響について検索した.(1)磁場強度0.3mT,パルス幅25μsec,周波数100Hzのパルス電磁場刺激を16時間作用させたSV-HFO細胞では,いずれにおいてもPGE2の産生には有意な影響は認められなかった.(2) BMP-2、-4、-5のいずれのバンドにおいてもPCR 35cycle時までの発現で有意な差は認められなかった。パルス電磁場刺激を6時間作用させたときのconditioning mediumはSV-HFO細胞のBMP-2、-4、-5のmRNAの発現には影響を及ぼさなかった。(3) EGTAによりPEMFsによるBMPsのmRNAの発現がブロックされたことにより細胞外カルシウムがPEMFsの機序の一部に関与していることが示唆された.(4)ウエスタンブロット,ドットブロット法によるBMPsのタンパクレベルでの検索ではわずかにBMP-2が増強されている傾向が見られたが,発現が微量であり今後さらに実験試料の濃縮化しての再度検討が必要であることが示唆された.(5)その他のグロースファクターのmRNAの発現について検索したところ,TGF-βIの増強がPEMFs開始後6時間から確認された.これまでに,インプラント埋入後の治癒機転を加速する試みとしてパルス電磁場刺激(以下,PEMFs)の応用を試み,新生骨形成促進効果があることを報告してきが,その作用機序は未だに不明な点が多い.そこで今回は,PEMFsの骨形成促進効果のメカニズムを明らかとするために,PEMFsがヒト正常骨由来骨芽細胞様株(SV-HFO)の骨形成因子であるBMP-17のmRNAの量伝子発現に与える影響をIn vitro的に検討した.実験に先立ち,SV-HFO細胞に対する最適な磁場強度を検討する目的で,磁場強度00.6mTの範囲で変動させ,パルス電磁場刺激がSV-HFO細胞の細胞増殖に及ぼす影響をmitochondrial dehydrogenase活性を指標としたXTT細胞増殖assayより検討した.細胞がサブコンフルエントに達したときからPEMFsを与え,mRNAの抽出はAGPC法にて刺激開始時から1時間後から48時間後まで経時的に行った.実験の評価はreverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)法にて行い,以下の結果を得た.(1)磁場強度を00.6mTまで変化させて細胞増殖を対照群と比較した結果,磁場強度が0.3mTが33%の増加を示し,変動させた磁場強度の中で最も高い増殖を示した.ついで0.4mTの29%であった.なお,以後のパルス電磁場刺激条件を磁場強度0.3mT,パルス幅25μsec,周波数100Hzとした.(2)SV-HFO細胞は無刺激条件下において,BMP-1,-2,-4,-5,-7のmRNAの発現が認められたが,BMP-3,-6についてはその発現が認められなかった.(3)無刺激条件下でBMPmRNAの発現が検出されたもののうち.パルス電磁場刺激では,6時間後から時間依存性にBMP-2,-4BMPのmRNAレベルを増加させ,6から24時間後に最も増加されており,BMP-5は6時間後のみが増加されていた.しかし,その他のBMP-1,-7のmRNAのレベルは,いずれにおいても増加は認められなかった.これまでに,インプラント埋入後の治癒機転を加速する試みとしてパルス電磁場刺激(以下.PEMFs)の応用を試み,新生骨形成促進効果があることや骨芽細胞のBMP-2,-4,-5のmRNAの発現を増強する効果を確認してきた.今回は,PEMFsのヒト正常骨由来骨芽細胞様株(SV-HFO)に対するBMPのmRNAの発現機序,BMPタンパクレベルでの検索ならびにその他のグロースファクターの発現に与える影響について検索した.(1)磁場強度0.3mT,パルス幅25μsec,周波数100Hzのパルス電磁場刺激を16時間作用させたSV-HFO細胞では,いずれにおいてもPGE2の産生には有意な影響は認められなかった.(2) BMP-2、-4、-5のいずれのバンドにおいてもPCR 35cycle時までの発現で有意な差は認められなかった。(3) EGTAによりPEMFsによるBMPsのmRNAの発現がブロックされたことにより細胞外カルシウムがPEMFsの機序の一部に関与していることが示唆された.(4)ウエスタンブロット,ドットブロット法によるBMPsのタンパクレベルでの検索ではわずかにBMP-2が増強されている傾向が見られたが,発現が微量であり今後さらに実験試料の濃縮化しての再度検討が必要であることが示唆された.(5)その他のグロースファクターのmRNAの発現について検索したところ,TGF-βIの増強がPEMFs開始後6時間から確認された.
ニューロン分化におけるSUMO化制御機構

RanGAP1は、神経前駆細胞からニューロンへ分化する過程において、急速な脱SUMO化と分解を受けた。これにより、核-細胞質間におけるRanGTP-GDPの勾配が変化し核内輸送が阻害された。細胞分裂制御因子であるCdc6の核内移行阻害は、細胞周期の停止を促進した。これらの結果は、RanGAP1を介した核-細胞質間輸送機構の再構築が、ニューロン分化における細胞周期の停止に重要であることを示唆している発達過程におけるマウス胎仔脳や、マウス胎仔大脳皮質由来の神経前駆細胞を用いた実験から、RanGAP1がニューロン分化直後に脱SUMO化と分解を受けることが分かっていたが、さらに神経前駆細胞において、RanGAP1は大部分がSUMO2により修飾されており、SUMO2修飾RanGAP1のみが脱SUMO化と分解を受けることが分かった。SUMO2修飾基質の脱SUMO化を主に行い、また核膜孔複合体に局在するSUMO proteaseはSenp2であることから、神経分化過程におけるSenp2の発現を検討したところ、Senp2は神経前駆細胞ではプロテアソームで分解され、非常に不安定であるが、ニューロン分化と共に安定し、核膜孔に局在することが分かった。また、Senp2を単独で発現させてもRanGAP1の脱SUMO化はほとんど起きなかったが、Necdinと共発現することで脱SUMO化が亢進することが分かった。RanGAP1は、核-細胞質間輸送の制御に関わることから、ニューロン分化過程の核-細胞質間輸送を視覚化するために、GFPにSV-40の核局在化シグナル(NLS)と、HIV-revの核外移行シグナル(NES)を付加した融合蛋白質(GFP-NLS-NES)をレンチウイルスベクターにより神経前駆細胞に発現させ、培養条件化でニューロンへ分化させた。その結果、神経前駆細胞において核で強く発現していたGFP-NLS-NESは、ニューロンにおいては細胞質において主に発現しており、その細胞内局在が変化していた。この細胞内局在の変化は、胎生14.5日目のマウス脳にエレクトロポレーション法を用いてGFP-NLS-NESを発現させた結果でも同様に観察された。これまでに、マウス胎仔大脳皮質由来の神経前駆細胞を用いた実験から、RanGTP activating proteinであるRanGAP1がニューロン分化において、急激に脱SUMO化され、分解を受けることが分かった。またそのメカニズムとして、脱SUMO化酵素の一つであるSenp2の関与を明らかにした。今年度では、ニューロン分化におけるRanGAP1の発現低下が、核-細胞質間におけるRanGTP-GDPの勾配に与える影響を検討した。その結果ニューロン分化において、核内のRanGTPのレベルが減少することが分かった。さらにRanGAP1の発現減少によって影響を受ける蛋白質をスクリーニングしたところ、DNA複製に関与するCdc6の細胞内局在が、核から細胞質へ移動することが分かった。さらに神経前駆細胞においてRanGAP1をRNAiにより発現抑制すると、Cdc6が核から細胞質へ移動し、細胞増殖が抑制されるだけでなく、ニューロン遺伝子の発現を上昇させることが分かった。このことはRanGAP1が細胞増殖だけでなく、ニューロン分化に必要な蛋白質等の核-細胞質間輸送も制御している可能性を示唆している。RanGAP1の発現減少や、Cdc6の核から細胞質への移動は、血清飢餓の線維芽細胞では起こらない一方、脂肪細胞分化では確認されたため、最終分化における共通のメカニズムであると考えられ、最終分化細胞においてDNA複製が伴わない理由の一つであることが明らかになった。やや遅れていると評価した点は、RanGAP1の発現減少に伴う核-細胞質間輸送の変化に影響を受ける内在性蛋白質のスクリーニングに非常に時間がかかったからである。その理由としては、核局在化シグナル(NLS)や核外移行シグナル(NES)を持つ蛋白質のデータベースが存在せず、一つ一つ検討していく必要があったからである。しかし検討の結果、NLS、NESを持つCdc6の細胞内局在がニューロン分化において核から細胞質へ移動することを発見することが出来た。またCdc6の発現パターンが、ニューロン分化や、脂肪細胞分化といった最終分化と、線維芽細胞の血清飢餓におけるG0期とでは全く異なることが分かった。本研究は、最終分化細胞における不可逆的な細胞周期の停止メカニズムを核-細胞質間輸送の観点から検討する初めての研究であり、やや遅れていると評価したが、当初の交付申請書に記載した研究目的を十分に達成していると考えている。2015年度までに、マウス胎仔大脳皮質由来の神経前駆細胞を用いた実験から、RanGTP activating proteinであるRanGAP1がニューロン分化において、短時間で脱SUMO化を受け、分解されることを示した。また、その過程に、脱SUMO化酵素のSenp2が関与することを明らかにした。さらに、RanGAP1の急激な発現減少は、DNA複製に必要なCdc6の細胞内局在を、核から細胞質へ移動させ、細胞増殖を抑制し、ニューロン遺伝子を上昇させることを明らかにした。最終年度では、論文投稿に必要な追加の実験を行った。まず神経前駆細胞から分化するアストロサイトにおいて、Cdc6の細胞内局在を検討したところ、Cdc6は主に核内で発現していた。

次に、GFPにHIV-revの核外移行シグナル(NES)と、SV-40の核局在化シグナル(NLS)を付加した融合蛋白質(vNES-vNLS)を、in vitroエレクトロポレーション法で神経前駆細胞へ導入し、アストロサイトへ分化させたところ、vNES-vNLSは主に核内で発現していた。さらにCdc6に蛍光蛋白質のtd-Tomatoを付加した融合蛋白質(Cdc6-Tmt)を分化させたアストロサイトへ発現させたところ、Cdc6-Tmtはニューロンとは異なり、主に核内で発現していた。これらの結果は、核-細胞質間輸送の変化が、不可逆的な細胞周期の停止に特有であることを改めて示したものであると考える。RanGAP1は、神経前駆細胞からニューロンへ分化する過程において、急速な脱SUMO化と分解を受けた。これにより、核-細胞質間におけるRanGTP-GDPの勾配が変化し核内輸送が阻害された。細胞分裂制御因子であるCdc6の核内移行阻害は、細胞周期の停止を促進した。これらの結果は、RanGAP1を介した核-細胞質間輸送機構の再構築が、ニューロン分化における細胞周期の停止に重要であることを示唆しているこれまでの実験結果から、RanGAP1が脱SUMO化と分解を受けることは分かっていたが、SUMO2修飾フォームのRanGAP1のみが脱SUMO化と分解を受けることが分かった。さらにRanGAP1の脱SUMO化と発現減少は、ニューロン分化誘導後6時間程度で起きることが分かった。また6つのSUMO proteaseのうちSenp2がRanGAP1の脱SUMO化に重要な役割を果たすことを突き止めた。Senp2、Necdin単独ではRanGAP1の脱SUMO化はほとんど起きなかったが、Necdinとの共発現により脱SUMO化を促進することが分かった。次にRanGAP1の発現減少の生理学的役割を解析するために、GFP-NLS-NES融合蛋白質をレンチウイルスを用いて神経前駆細胞に発現させ、ニューロンへ分化させた。その結果、神経前駆細胞で主に核で発現していたGFP-NLS-NESはニューロンでは主に細胞質で発現していた。RanGAP1以外にRanを介した核-細胞質間輸送に関わる、RanBP1やRanBP2、CRM1、RCC-1は分化前後でほとんど変化しない、もしくはRanGAP1よりもかなり遅れて減少していたことから、分化初期に起こる核-細胞質間輸送の変化にはRanGAP1が重要な役割を果たすと考えられる。これらの結果は、当初の研究計画通りに進行しており、交付申請書に記載した研究目的の達成度について、「おおむね順調に進展している」とした。本研究課題は分子メカニズムという点においては、ほぼ解析は終了している。そこで今後の研究課題としては、これまでにin vitroニューロン分化系で観察された現象が、個体レベルでも当てはまるかを検討することである。そのためにエレクトロポレーション等を用いた遺伝子導入方法により、マウス胎仔脳にRanGAP1のRNAiや過剰発現を行うことを検討している。また、アルツハイマーやALS等の神経変性疾患では、その原因蛋白質の細胞内局在が変化していることが多数報告されていることから、ニューロンにおける核-細胞質間輸送と神経保護機能についての検討を行いたい。そのために疾患マウスモデル由来のニューロンや、患者iPS細胞由来のニューロンを用いて核-細胞質間輸送のメカニズムについて検討を行いたいと考えている。
高速な任意精度数値計算のための実数計算ライブラリの実現方式に関する研究

本研究は,任意精度数値計算のための実数計算ライブラリの高速な実現方式の追求を目的とし,開発中のIFNライブラリの高速化を目指している.H30年度には,IFNにおける精度保証付き算術演算の詳細設計の改善検討,実数表現に対するFBCSの適用可能性の検討,および,並列化を中心とした高速化に対する検討などを行った.IFNにおける精度保証付き算術演算の実現方式の検討は本研究における重要課題である.これまでに得た,多倍長区間演算ライブラリMPFIの使用の妥当性についての知見を踏まえ,C言語版およびHaskell版の両者の実装について,独自の数値表現による算術演算(Q演算と呼んでいる)とMPFIによる方法とを比較した.種々の実験の結果,期待に反し,前者が後者を凌ぐ可能性は低いとの結論を得た.Q演算の部分ハードウェア化による高速化可能性を踏まえてもMPFIの優位性は覆されず,少なくとも現状ではIFNの高速化のためにはMPFIを有効活用することが得策であると考えられる.IFNにおける(無限リストによる)実数表現をFBCS(要素の位置と誤差の絶対値とを対応させる)方式にすることによるトップダウンな精度保証再計算制御は,高速化に繋げられる可能性が低いとの結論を得た.Haskell版IFNの高速化を目指し,Haskell処理系の一つであるGHCの並列処理機能を活用した並列化による高速化の効果の予備評価を実施した.部分式評価における比較的単純な細粒度タスク並列処理の結果,forkIOでは並列化オーバヘッドが大き過ぎ,rpar/rseqでは効果が期待できることがわかった.ただし,Haskellの管理外からのメモリアクセスの競合を排除するための工夫が必要であることが分かった.H30年度には,H29年度に得られた結果を踏まえてより明確な評価結果をまとめるべく取り組んだが,知見の蓄積はあるものの,開発中のライブラリの性能向上に繋がる直接的な成果を論文発表するには至らなかった.したがって,進捗状況は「やや遅れている」と判断される.IFNライブラリ内での精度保証付き算術演算および数値表現については,当初採用していた独自方式およびそのチューニングによる高速化を目指していたが,種々の最適化や設計変更による性能改善が奏功せず,MPFIの利用に対する優位性を確認できなかった.「再計算制御の抜本的改善」の一つの可能性として,FBCSの高速化の成果を踏まえ,IFNにおける実数表現をFBCSのようにしてトップダウン精度制御にする方法を模索したが,IFNの高速化に繋げられる目処が立たなかった.当初に挙げていた検討項目のうち,着手することができなかったものがいくつかあり,時間配分の見積りにも改善が必要であると考えられる.これまでに得られた知見を踏まえ,今後は次の項目について研究を進める.まず,IFNライブラリにおける要素演算としてMPFIを効率的に利用する方法を追及する.チューニングの余地は,MPFI(およびMPFR)のデータ構造を意識したメモリ管理方式にあると考えられる.C言語版およびHaskell版の双方で取り組む.無限リストの表現方法の改善により,データ参照の効率化や所要メモリ領域削減は研究開始当初よりも進められているので,要素演算の設計については一区切りできる結果が得られるものと期待している.IFNライブラリの基本機能の高速化への方策としては,マルチコアを活用する並列化の効果の追及が残されている.H30年度の試行では,数式に対する単純なタスク並列処理の粒度管理(並列処理によるオーバヘッドの削減)の課題が明確に見られたので,改善を試みる.Haskell版ではGHCの並列処理ランタイムとMPFI(およびMPFR)によるメモリ読み書きとの効率的な整合性担保に課題が見られているが,GHCで提供されるソフトウェアトランザクショナルメモリの活用などによる解決を検討する.並列処理に関しては,精度改善のための再計算の並列処理による投機的実行も試みる.当初に挙げていた検討項目のうち,静的解析との連携や数値表現類別による効率化等についても検討する.本研究は,任意精度数値計算のための実数計算ライブラリの高速な実現方式の追求が目的である.初年度には,我々が開発中の実数演算ライブラリIFNの高速化に向けて,いくつかの観点からの改良を試みた.取り組みの内容を大別すると,(1)個々の近似値に対する精度保証付き数値表現方式の改善検討,(2)遅延評価によって無限リストとして実現される近似値の無限列の表現方式の改善検討,および,(3)再帰で記述される精度改善制御の高速化手法の検討,の三点である.それぞれ,開発中の実数計算ライブラリの高速化のための異なる観点からの取り組みである.上記の(1)については,近似値の精度保証付き数値表現として,精度情報を浮動小数点表現に埋め込んだ我々のオリジナルの特殊な浮動小数点表現から区間演算ライブラリMPFIで用いられているデータ表現に置き換えた場合の効果について,C言語による記述とHaskellバインディングによる記述についてプロトタイプを設計し,簡単な評価を行った.(2)については,近似値の無限列の表現としてFBCSを用いる効果に関する情報を得るため,FBCSを用いた既存の(IFNとは別の方式による)実数計算ライブラリの高速化を試み,評価した.(3)としては,再帰によって記述されるプログラムの一般的な枠組みの下での高速化手法について調査および実測評価を行った.初年度の取り組みの中にはより詳細な実験・評価を要するものもあるが,高速な実数計算ライブラリの設計のために有用な幾つかの知見を得ることができた.研究計画では,開発中のシステムに対する改良のために期間中に取り組むことを想定した項目として,「要素演算の抜本的改善」に4項目,「再計算制御の抜本的改善」に6項目が挙げられている.

このうち,初年度の具体的な取り組みやそれに基づく評価が何らかの形式で発表・公表されたものは4項目であった.項目数をみる限り,研究計画に対して若干の遅れがみとめられるといえる.これまでに得られた知見としては,個々の近似値の精度保証付き数値表現として区間演算ライブラリMPFIのデータ表現形式の利用が有望であること,また,近似値の無限列の表現方式としてFBCSのようにインデックス情報を加味した近似値列表現の適用可能性が具体的に確認されたことが挙げられる.また,区間演算ライブラリMPFIを用いた拡張IFNライブラリや,HaskellによるAPI提供のためのHaskell-MPFIバインディングのプロトタイプの設計・実装は概ね予定通り行われている.総合的に見て,研究計画に対して若干の遅れはあるものの,大幅な遅れは無いと考えられる.本研究は,任意精度数値計算のための実数計算ライブラリの高速な実現方式の追求を目的とし,開発中のIFNライブラリの高速化を目指している.H30年度には,IFNにおける精度保証付き算術演算の詳細設計の改善検討,実数表現に対するFBCSの適用可能性の検討,および,並列化を中心とした高速化に対する検討などを行った.IFNにおける精度保証付き算術演算の実現方式の検討は本研究における重要課題である.これまでに得た,多倍長区間演算ライブラリMPFIの使用の妥当性についての知見を踏まえ,C言語版およびHaskell版の両者の実装について,独自の数値表現による算術演算(Q演算と呼んでいる)とMPFIによる方法とを比較した.種々の実験の結果,期待に反し,前者が後者を凌ぐ可能性は低いとの結論を得た.Q演算の部分ハードウェア化による高速化可能性を踏まえてもMPFIの優位性は覆されず,少なくとも現状ではIFNの高速化のためにはMPFIを有効活用することが得策であると考えられる.IFNにおける(無限リストによる)実数表現をFBCS(要素の位置と誤差の絶対値とを対応させる)方式にすることによるトップダウンな精度保証再計算制御は,高速化に繋げられる可能性が低いとの結論を得た.Haskell版IFNの高速化を目指し,Haskell処理系の一つであるGHCの並列処理機能を活用した並列化による高速化の効果の予備評価を実施した.部分式評価における比較的単純な細粒度タスク並列処理の結果,forkIOでは並列化オーバヘッドが大き過ぎ,rpar/rseqでは効果が期待できることがわかった.ただし,Haskellの管理外からのメモリアクセスの競合を排除するための工夫が必要であることが分かった.H30年度には,H29年度に得られた結果を踏まえてより明確な評価結果をまとめるべく取り組んだが,知見の蓄積はあるものの,開発中のライブラリの性能向上に繋がる直接的な成果を論文発表するには至らなかった.したがって,進捗状況は「やや遅れている」と判断される.IFNライブラリ内での精度保証付き算術演算および数値表現については,当初採用していた独自方式およびそのチューニングによる高速化を目指していたが,種々の最適化や設計変更による性能改善が奏功せず,MPFIの利用に対する優位性を確認できなかった.
無職女性の就業意欲規定要因の解明および就業促進策の効果に関する計量経済学的分析

女性就業促進のためには、女性自身の就業意識が非常に重要な要因となる。そこで、女性の就業意欲規定要因の解明を目的として研究を行った。まず、育児期の女性を対象としたインターネット調査を実施し、その個票を用いて、専業主婦の再就職希望、就業継続意欲形成の時期とその要因、働く母親の葛藤とピア効果について分析した。また、女性の就業促進策の検討として、政府公表データを利用して「認定こども園の女性就業支援策としての効果」を執筆した。さらに最終年度には、女性の経済的自立について長期的な視点から分析するため、年金シニアプラン総合研究機構の個票データを利用して、女性の厚生年金からの退出行動について研究を行った。女性の就業促進策の成功の可否には、女性自身の就業意識が非常に重要な要因となる。そこで、無職女性の就業意欲規定要因を解明するため、育児期の女性を対象としたインターネット調査を実施した。このインターネット調査の個票を用いた論文として、「専業主婦の再就職希望に関する考察」を執筆した。調査対象の専業主婦のうち、「そのうち働きたい」と考えている人が約7割を占め、就業再開の時期を左右する要因として結婚前のキャリアの蓄積や家計の状況が関係していることがわかった。また、0歳児を持つ母親451人のうち、3年以内に就業を希望する人が278人)で再就職希望者の約7割を占める。こうした母親が実際に働き出すことを促すための支援が重要であることが確認された。さらに、非正規での再就職希望者は末子が3歳頃の再就職を考えており、幼稚園入園の時期を再就職時期として検討していることが窺える。保育の受け皿の1つとして、こども園に注目した論文は現在投稿中である。地方都市を含む都市部(政令指定都市および中核市)を分析対象とし,認定こども園の類型と地域事情との関係を調べた(2013年現在の状況)。幼保連携型こども園の場合には,待機児童対策としての効果が期待できることが確認できた。幼稚園型こども園については待機児童対策としての効果は期待薄であるものの,幼稚園児の母の就業再開を支援する効果がある。現在では幼稚園入園後に就業を再開しにくい状況にあることを鑑みると,幼稚園型子ども園が果たしうる役割は大きい。今後の方策として、1歳児定員の増加により育休の取得促進で0歳児枠への需要を抑えつつ、2歳児以降はこども園を活用した女性の就業促進策が有効であることを指摘した。アンケート調査票の設計を行い、その後、調査会社へ委託してインターネット調査を実施した。調査会社の提携インターネット調査パネルを用いたオンライン調査で、平成28年9月8日(火)16日(水)にかけて実施し、関西圏2府4県に在住する小学生以下の子どもを持つ24-49歳の女性を対象とした。無職女性のみ、あるいは、有職女性のみを対象とすることによるサンプル・セレクション・バイアスを回避するため、無職女性、有職女性それぞれを対象とした2種類のインターネット調査を同時に行った。無業者調査では2,869人、有業者調査では2,483人からの回答を得た。この調査の単純集計はすでに介護職に関する研究課題(15K03520)で作成・公表済みである。さらに状況把握のための論文、「専業主婦の再就職希望に関する考察」を執筆した。また、現在投稿中の「認定こども園の女性就業支援策としての効果」は、本年度研究予定であった「育児期の休職支援金拡充の政策効果」の分析の切り口を子ども園に変更したものである。当初の目的である女性の就業促進および待機児童解消への方策を論じたもので、育児期の休職支援金拡充の必要性を裏付けるものとなっており、研究活動はほぼ計画通りの成果を挙げているといえる。なお、研究成果発表の一環として、公務員女性職員対象の研修や高校生対象の進路説明会・模擬授業、自治体審議会等の会議、ラジオ出演等で研究成果を踏まえた情報発信を行ってきた。今後も女性の就業促進に向け研究成果の公表および情報発信を行う予定である。無職女性の就業意欲規定要因を解明するため、2015年度に実施した育児期の女性を対象としたインターネット調査の個票を用いて分析を行い、2つの論文を執筆した。(1)就業継続意欲形成の時期とその要因出産後の就業行動は、現在の状況だけではなく、出産前に形成されていた就業意識によって大きく影響を受けることを明らかにした。無職者の場合には再就職希望者の就業再開の時期や希望する働き方に影響を与えており、就業者の場合には、雇用形態や年収の多寡にも影響を与えていることがわかった。また、女性自身が経済力を持つ必要性を認識することや、仕事が楽しいと思った経験が、「もともと働くつもりだった」として育児期の就業につながることを明らかにした。こうした結果から、女性の就業継続意欲の形成のための方策として2点の具体策を挙げた。1つは、職業選択の時期までに教育現場での啓蒙活動等を通じ、女性自らが経済力を持つ必要性を認識してもらうことである。もう1つは、キャリアの早い段階で、仕事の楽しさ・やりがいを実感できるための方策である(投稿中)。(2)働く母親の葛藤とピア効果母親の就業意欲阻害要因としての罪悪感に着目した。多くの母親は働くことについて葛藤を抱えており、時には就業することに罪悪感を覚える。こうした罪悪感をもたらす要因を明らかにしたうえで、周囲の母親の働き方に対する認識によって罪悪感の抱き方がどう影響されるかを明らかにすることを分析目的とした。

分析の結果、働く母親が抱く「罪悪感」の要因として、1家族に迷惑をかけている気持ち、2就業することについて夫との関係、3子供が寂しい思いをする、4保護者活動で肩身が狭い、の4点があることを示した。さらに、未就学児の母親が就業することが一般的である状況では、こうした罪悪感は抱かれにくいことを実証的に明らかにした(投稿準備中)。平成28年度の予定は、地域性とpeer effectの影響力およびその長期的効果を分析することにあった。研究の優先度を考慮し、分析テーマを一部変更して研究を実施した。(1)就業継続意欲形成の時期とその要因:当初の予定は、政府統計を用いて、地域性とpeer effectの影響力およびその長期的効果を分析し、さらに、子育て期にも就業していることが中高年世代となった時点での労働力・就業状況をどの程度押し上げているかを明らかにすることにあった。しかし、アンケート個票データを精査することにより、子育て期の就業を促進するためには出産前の意識が重要で、かつ、長期的効果を有することがわかり、本分析テーマを優先させた。(2)「罪悪感」とpeer effectに関する研究:当初予定どおり、独自アンケートの個票を用いることで研究を実施した。地域性の継続を説明するにあたり、個人が属するグループの主観的な状況を規範としてとらえた。各個人が抱く「未就学児の母の一般的な就業行動」を規範として、これと異なる行動をとる場合に罪悪感を抱くことを明らかにした。以上のことから、若干の分析テーマの変更はあったものの、研究活動はおおむね計画通りの成果を挙げているといえる。また、独自アンケート個票および政府統計を用いる予定でいたが、予定外に非常に有益な新たな個票データを入手することができ、現在、データ整備および分析を行っているところである。なお、研究成果発表の一環として、公務員女性職員対象の研修や高校生対象の進路説明会・模擬授業、自治体審議会等の会議、一般市民向け講座等で研究成果を踏まえた情報発信を行ってきた。今後も女性の就業促進に向け研究成果の公表および情報発信を行う予定である。女性の就業促進策の成功の可否には、女性自身の就業意識が非常に重要な要因となる。そこで、女性の就業意欲規定要因を解明することを目的として研究を行った。まず、育児期の女性を対象としたインターネット調査を実施した。このインターネット調査の個票を用いた論文として、「専業主婦の再就職希望に関する考察」「就業継続意欲形成の時期とその要因」「働く母親の葛藤とピア効果」を執筆した。また、女性の就業促進策の検討として、政府公表データを利用して「認定こども園の女性就業支援策としての効果」を執筆した。当初の目的である女性の就業促進および待機児童解消への方策を論じたもので、育児期の休職支援金拡充の必要性を裏付けるものとなっている。さらに最終年度には、女性の経済的自立について長期的な視点から分析するため、年金シニアプラン総合研究機構の個票データを利用して、女性の厚生年金からの退出行動について研究を行った。
肺血菅内皮細胞傷害の機序及びその早期診断法についての研究

多形核白血球から放出される活性酸素が,肺血管内皮細胞を傷害す事が報告されている.本研究では1)肺血管内皮細胞傷害の原因としての多形核白血球の役割2)肺血管内皮細胞傷害の指標の確立3)肺血管内皮細胞傷害の予防,治療の確立について検討した.1)肺血管内皮細胞傷害の原因としての多形核白血球の役割:高濃度酸素暴露によって肺血管内皮細胞は障害を受ける。高濃度酸素暴露(100%酸素又は体外循環中)を受けたヒト多形核白血球の活性酸素産生能について検討した.比較的短時間の高濃度酸素暴露において,多形核白血球の活性酸素産生能に変化は認められなかった.培養ブタ血管内皮細胞をヒト多形核白血球より放出される活性酸素で傷害する実験系では内皮細胞傷害は確認できたものの,内皮細胞よりの逸脱物質はごく微量であったため定量は困難であった.2)肺血管内皮細胞傷害の指標の確立:肺血管内皮細胞よりの逸脱物質(ACE,VWF)を高濃度酸素暴露下のヒトで定量した.比較的短時間の高濃度酸素暴露では,血管内皮細胞よりの逸脱物質の値に大きな変化は認められなかった.血管内皮細胞よりの逸脱物質は,肺血流量によってその値に修飾を受ける事を報告した.ラット呼吸不全モデル(PMA気管内投与,寄生虫感染)では,肺傷害の時期に一致して,肺血管内皮細胞よりの逸脱物質の値が上昇する事を確認した.3)肺血管内皮細胞傷害の予防,治療の確立:ヒト多核白血球,ブタ血管内皮細胞実験系において、各種スカベンジャーによる内皮細胞傷害の抑制について検討した.SODは活性酸素による血管内皮細胞傷害を抑制する事が観察された.以上より肺血管内皮細胞傷害の発生に,多形核白血球より放出される活性酸素が関与する事,又,内皮細胞傷害の指標として,血管内皮細胞よりの逸脱物質がその指標となり得る推察された.多形核白血球から放出される活性酸素が,肺血管内皮細胞を傷害す事が報告されている.本研究では1)肺血管内皮細胞傷害の原因としての多形核白血球の役割2)肺血管内皮細胞傷害の指標の確立3)肺血管内皮細胞傷害の予防,治療の確立について検討した.1)肺血管内皮細胞傷害の原因としての多形核白血球の役割:高濃度酸素暴露によって肺血管内皮細胞は障害を受ける。高濃度酸素暴露(100%酸素又は体外循環中)を受けたヒト多形核白血球の活性酸素産生能について検討した.比較的短時間の高濃度酸素暴露において,多形核白血球の活性酸素産生能に変化は認められなかった.培養ブタ血管内皮細胞をヒト多形核白血球より放出される活性酸素で傷害する実験系では内皮細胞傷害は確認できたものの,内皮細胞よりの逸脱物質はごく微量であったため定量は困難であった.2)肺血管内皮細胞傷害の指標の確立:肺血管内皮細胞よりの逸脱物質(ACE,VWF)を高濃度酸素暴露下のヒトで定量した.比較的短時間の高濃度酸素暴露では,血管内皮細胞よりの逸脱物質の値に大きな変化は認められなかった.血管内皮細胞よりの逸脱物質は,肺血流量によってその値に修飾を受ける事を報告した.ラット呼吸不全モデル(PMA気管内投与,寄生虫感染)では,肺傷害の時期に一致して,肺血管内皮細胞よりの逸脱物質の値が上昇する事を確認した.3)肺血管内皮細胞傷害の予防,治療の確立:ヒト多核白血球,ブタ血管内皮細胞実験系において、各種スカベンジャーによる内皮細胞傷害の抑制について検討した.SODは活性酸素による血管内皮細胞傷害を抑制する事が観察された.以上より肺血管内皮細胞傷害の発生に,多形核白血球より放出される活性酸素が関与する事,又,内皮細胞傷害の指標として,血管内皮細胞よりの逸脱物質がその指標となり得る推察された.
細胞周期依存的なコヒーシン一分子ダイナミクスの解析

コヒーシン複合体は姉妹染色分体間接着に必須の因子であり、そのダイナミクスは接着の確立や解除といったステップと密接に関わっているが、コヒーシンダイナミクスの一分子レベルでの理解が欠如していた。本研究では、DNA上のコヒーシンを一分子レべルで観察する系を確立し、その細胞周期の進行に応じた挙動を明らかにするとともに、そのダイナミクスを制御するメカニズムの解明を行った。さらにコヒーシンダイナミクスを制御するこれらの機構が進化の過程でどの程度保存されているのかという点についても考察できる成果を得た。本研究では、姉妹染色分体間接着を担うコヒーシン複合体のダイナミクスを、一分子レベルで理解することを目的とする。コヒーシン複合体は細胞周期を通じてその局在やDNAに対する結合性を変化させ、姉妹染色分体間接着の必要な時に、必要な場所で、コヒーシン結合因子や修飾因子と協調しながら接着を達成している。しかしながら従来の細胞生物学的、生化学的解析では、コヒーシン複合体の挙動を分子集団として捉えることしかできず、コヒーシン分子が実際にどのようにDNA上で挙動し、接着に寄与しているのか、その詳細は明らかにできない。本研究ではDNA上のコヒーシンを一分子レベルで観察する系を確立し、その細胞周期に応じた挙動を明らかにするとともに、そのダイナミクスを制御するメカニズムを明らかにすることを目指す。平成25年度においては、コヒーシン一分子観察系の確立を目指した。まず、一分子観察に適した全反射顕微鏡システムをセットアップした。コヒーシン複合体は、ヒトコヒーシン複合体(Smc1/Smc3/Scc1/SA1からなるヘテロ四量体)を昆虫細胞へのバキュロウイルス感染系を用いて発現させ、FlagタグIPとHisタグ精製を組み合わせた2段階精製法により、stoichiometricな複合体を精製することに成功した。Scc1サブユニットのC末端にEGFPを付加することで、蛍光観察可能な複合体を得た。また、直鎖DNAは、アビジンコートしたカバーガラス上に、両端をビオチン化した直鎖DNAを貼り付けることで調製した。DNAを付加したカバーガラス上に、幅2mm、厚さ100umのflow cellを作製し、顕微鏡下で、直鎖DNAを様々な溶液と反応させることができる系を構築した。この系を用い、実際にコヒーシン複合体が直鎖DNA上に結合する様子が、バッファー中およびツメガエル卵抽出液中で観察できた。平成26年度においては、一分子観察系においてD NA複製を行う系の構築を試みた。アフリカツメガエル卵抽出液より調整した核抽出液を、倒立顕微鏡上にセットしたFlow chamberに流すことで、顕微鏡下でDNA複製を進行させる系を構築できた。平成26年度の目標はコヒーシン一分子の細胞周期を通じた挙動について、おもにS期におけるダイナミクスを明らかにすることであった。そのために重要なDNA複製を顕微鏡下で再現することができ、あとはこの系において、コヒーシン複合体のダイナミクスを観察するのみである。平成27年度においては、一分子観察系においてDNA複製とコヒーシン一分子をリアルタイムで観察できる系の構築を試みた。アフリカツメガエル卵抽出液より調整した核抽出液を用いて複製を誘起する手法に基づいて、より長時間、長距離の複製追跡を行える条件の検討を行い、DNA複製中におけるコヒーシン一分子の観察に成功した。DNA複製のリアルタイム観察系の最適化(タンパク質精製と蛍光標識)に時間を要している。また、一分子観察系で用いる抗体の作製が遅延し、平成26年度から27年度に計画を繰り越している。これに伴い、全体の計画がやや遅れている。コヒーシン複合体は、そのDNAとの結合性が細胞周期の進行に伴って多段階に変化し、それぞれが接着の確立や解除といったステップと密接に関わっている。しかしながらコヒーシンはこれまで、分子集団として観察・解析がなされており、コヒーシン一分子のDNA上での挙動は明らかになっていなかった。