hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
難治性アレルギー性皮膚疾患の新規バイオマーカーと新規治療法の開発研究

1)痒みの強い湿疹病変では肥厚した表皮内に多神経線維が侵入しており,ヒト皮膚NGFの非侵襲的な測定方法としてtape-stripping法により角層内のNGFを定量する方法を確立し,測定された角層NGF値はAD患者の〓痒や皮疹の状態を反映することから,痒みの強い皮膚病変における末梢神経の表皮内侵入に関係し,アトピー皮膚炎(AD)の病勢や治療効果の評価法として有用な検査となることを示した。2)ADはTh2細胞優位の疾患とされていたが,近年慢性期の病態形成にTH1細胞の関与が示唆され,血清IgE値が高いextrinsic型と血清IgE値が余り上昇しないintrinsic型に分類されるが,AD様皮疹が皮表の黄ブ菌の増加を伴って自然発症するDS-Nhマウスは,Staphylococcal enterotoxin B(SEB)による所属リンパ節細胞の刺激培養でIL-4でなくIFN-γとIL-13の産生が上昇し血清総IgE値の軽度上昇を伴ってAD様皮疹が発症・悪化することから、intrinsic型に類似し、血清IL-18値が皮疹スコアと有意に相関してsuper Th1細胞が主役のADの自然発症マウスに相当することが示された。従って、AD患者の血清IL-18値もAD皮疹スコアと有意に相関するため、ヒトAD病態もDS-Nhマウスと同様にsuper Th1細胞が関与している可能性が高いことを示した。3)DS-NhマウスでTNCB感作前のCyclophosphamide(Cy)投与群では無投与群に比べAD様皮疹が増強し、SEB刺激所属リンパ節細胞のIFN-γやIL-13の産生が上昇したが、血清IgE値は上昇せず、TNCB感作直前にCy無投与マウス由来のCD25+CD4+T細胞を移入することでCy投与によるAD様皮疹の悪化と皮表黄ブ菌数の増加に対し抑制効果を示し、Cy投与1日後の脾臓や腸間膜リンパ節のCD25+CD4+Foxp3+T細胞比率が低下したため、抑制活性のあるCD25+CD4+Foxp+調節T細胞はCD25-CD4+superTh1細胞によるIFNγとIL-13の産生を抑制してAD様皮疹発症を免疫調節することが示唆された。4)AD患者や前述したDS-Nhマウスの血清や皮膚において環境ストレスを抑える作用があるHemoxygenase-1(HO-1)が増強し、HO-1を誘導するヘミンの投与がDS-NhマウスにおけるAD様皮疹の発症・悪化を抑えることを示した。
「労働の人間化」の視点からの裁量労働制に関する研究

当該年度は、裁量労働制を経営学的に研究するための基礎づくりとして、文献研究と実証研究を行い、その実態把握及び労働の人間化研究の中での裁量労働制の位置づけの明確化に努めた。文献研究では、国内外の労働の人間化関連の文献のサーベイ及び裁量労働制導入企業の事例に関する文献、雑誌、新聞記事等を精力的に収集、分析した。実証研究では裁量労働制を導入している企業6社に対するインタビュー調査及びアンケート調査を承諾して下さった企業への質問票調査を行い、裁量労働制の実態について定性的データ、定量的データの蓄積を行った。その結果、裁量労働制は仕事を離れた生活の確立を容易にする可能性が高いこと、成果と評価が結びつきモチベーションが高まること等、労働の人間化の視点からもホワイトカラーの新しい働き方として有効であることが確認された。しかし、実際にその制度のもとで働く労働者の勤務状況は、裁量労働制導入以前と比べてそれほど変化していないこともインタビュー調査等から確認された。しかし、それは裁量労働制の制度そのものに起因するのか、導入後それほど時間が経過していないためなのかは今後の更なる検討を要するものである。なお、阪神大震災の影響で質問票締切を3月末日に設定せざるを得なかったため、現時点では論文の形にまとめられた成果はまだない。質問票が返送され次第、可及的速やかに論文の形にまとめ公表する予定である。
自信と批判-「徳の倫理」における道徳の客観性と相対性

近代の倫理学を代表する義務倫理と功利主義という二つの流れは、道徳的行為を規制し導くものを「原則ないし目的」として定め、それらを普遍的合理性の観点から彫琢してきた。しかしそれは複数の原理の間の解消不能な対立状況を招くだけでなく、個別の状況に対する各人の認知的反応の形成の面、ひいては行為の喚起力の面での無力さを露呈した。そうした反省から近年では、伝統や慣習、具体性を重視する徳の倫理が新たな流れを形成しつつある。しかし徳の倫理の復権は、批判を欠いた頑なな保守主義に陥る可能性もある。そこで本研究では、近代啓豪的合理性をふまえた現代において、徳倫理を論ずることにどのような意義があるか、という問題意識を背景に、道徳の相対性と客観性という論点をめぐって考察をし、以下の諸点を明らかにした。1.近代倫理が古代の徳倫理を乗り越えざるを得なかった事情の一つに、コスモスや人間の目的の喪失ということがある。そうした究極目的の喪失状況下で(功利主義のように他の目的を代用することなく)倫理学を語ろうとするとき、徳もまた義務倫理の内に包摂され再定義さえることを、カントの思想によって検証した。2.近代倫理の諸概念は空虚で抽象的で(生命倫理など)具体的問題状況に応えることができない、という徳倫理からの批判に対して、近代倫理の側を超越論的観念論としての実在論(パットナムの内的実在論)の観点から見直すことで、新たに開ける徳倫理とリベラルな正義論の統合の可能性を模索した。3.視点拘束的な内的実在論において、自己の限界を乗り越え反省や批判をなしうる可能性は、外在的(超越的)視点を確保によってではなく、むしろ多元的な世界を自分の中で生きることで出会われる複数のアスペクトの獲得と、ある種の反省的均衡によって達成されるという見方を提示した。本年度は、徳論の歴史研究の観点から、一方で近代倫理が古代の徳論を乗り越えざるをえなかった事情を、市民社会の形成という社会・経済史的観点を交えながら、おもにカントの思想の内に跡づけ、他方で近代倫理の諸概念が今日の徳倫理の側から「空虚で抽象的である」として批判されている点を、人格の概念を取り上げ検証した。前者の論点については、カントに於て、通常「義務を越える善行」とされる仁愛の行為が対他不完全義務として「義務論」の範疇に入れられなければならなかった事情を、パタ-ナリズム批判、啓蒙、自由などという観点から考察した。後者の論点については、今日、功利主義の立場ではロック的な自己意識要件に局限して解されがちな人格の概念が、カントにおいては一面で社会的な承認の対象でありながら、他面で経験的検証を越える理念性を有するものとして論じられており、徳倫理が批判する功利主義の難点を回避する可能性を有することを明らかにした。続いて、現代において徳倫理が注目されている事情を、「近代啓蒙主義的倫理学批判」および「道徳的実在論の復権」という論点との連関でまとめた。とりわけ、「正義」や「善」「人格」という近代倫理の希薄な概念に代えて、「思いやりがある」「臆病」といった濃い概念と、それへの自信(confidence)に基礎をおくべきであるとするB・ウィリアムズの考えと、H・パットナムの「内的実在論」とを参考にしながら、徳倫理を道徳的実在論の一様態として特徴づけ、かつ近代理性主義倫理とは異なった形で、価値認知の発展の可能性を見込むことができることを、ホ-リズムの成果を活用しながら明らかにした。

前年度の歴史的研究をふまえて、本年度は、近代の啓蒙的合理主義をへた現代において「徳の倫理」を語る意義を中心に考察をすすめた。徳の再考を促す現代のコミュニタリアニズムは「普遍的で合理的理論としての倫理学」への根本的懐疑を掲げながらも、単純に古代の徳倫理を復権するわけでもなく、また道徳判断にある種の客観性を認めながらも、素朴な道徳的実在論を提唱するわけでもない。それは現代の徳倫理が、近代の合理主義的倫理(とそれに対する様々な批判)をしかるべく継承しているからであると考えられる。具体的には、功利主義も含めた現代の正義論が問題にする正義の原則と、原則への行為の適合性だけでは、具体的行為を導いてはくれない。その意味では状況が求める意味(価値)とそれに対する適切な応答の仕方を伝える手段として、身体・実践的な刷り込みを含む性格(ヘクシス)形成は有意味であり得る。そのことをウィットゲンシュタインの言語ゲーム論を参考に明らかにした。しかし近代以降の開かれた社会と正義や価値の一元的原理とそれを元にした批判的視点を獲得した後、特定の共同性が求め反省以前の盲目的慣習の領域に沈潜することは、原理的に不可能であるだけではなく、近代の成果を放棄することでもある。そこで本研究ではパットナムの内的実在論を参考にしながら、現代において価値と事実が不可分なものとして認知される場をカントの言う超越論的観念性としての経験的実在性に定めた上で、その中で価値の多元性と相互承認を可能にするリベラルな徳の可能性を模索した。その際、あらゆる評価判断にたいして外在的で超越的な(近代倫理の)一元的原理が、必ずしも有効ではないことを明らかにした。
メタセシスの機能を持つ六族(Cr,Mo,W) カルベン,カルビン錯体の合成及び反応

Crカルベン錯体を用いるメタセシス反応の開発我々は既にアルケン上に電子供与性の置換基を持つエニンはFischerCrカルベン錯体によってメタセシス反応の起きる事を見いだし報告している。そこでカルベン錯体の炭素上の置換基と同じ置換基をアルケン上にもつエニンをCrカルベン錯体と反応させるならばCrに関して触媒反応になるものと考えた。10mol%のCrカルベン錯体3aとE-1aおよびZ-1aを反応させたところ目的とするメタセシス生成物2aを得ることが出来た。又Crカルベン錯体3bを用いて1bと反応させたところ2bがえられた。
高等植物における液包の構造と形態形成に関する機能の解析

液胞は高等植物の多くの細胞で生長にともなって体積を増し,やがて細胞体積の大半を占める巨大液胞へと発達する.この巨大液胞は,細胞伸長をはじめとする細胞の生長において中心的な役割を果たしている.まず,巨大液胞が形成する際の液胞構造の変化を明らかにすることを目的として,巨大液胞を欠くタバコBY-2ミニプロトプラストから巨大液胞が再生する過程について解析を行なった.その結果,巨大液胞の再生過程において複雑な網状の液胞構造が一過的に生じること,液胞の膨張に先駆けて液胞表面積が増大することなどが顕微鏡解析から明らかになった.このような巨大液胞再構成過程における液胞および細胞構造の数値化にあたって,多数の顕微鏡像から細胞領域や液胞領域を自動抽出する画像解析ソフトウェアの開発を行なった.とくに機械学習を用いた画素分類器生成をはじめ,適応的計算手法を用いることで細胞組織レベルの顕微鏡解析に対して汎用的なシステムの構築を目指した.さらに,液胞構造の形成や発達の物理的な制御機構を検討することを目的として,液胞の動きの定量的解析を行なった.そのために液胞膜の蛍光像や明視野像からの計測に適した動画像解析ソフトウェアを開発した.とくに周波数解析と画像相関スペクトル法を生体膜の蛍光像に適用することで,領域抽出などの前処理なしで高効率に液胞の動きを解析できるようになった.その結果,液胞の動きには,細胞周期の進行による時間的変化,細胞内での位置による空間的差異,液胞表層におけるアクチン繊維の局在との相関,という時間的空間的な制御要因が存在することがわかった.高等植物細胞の細胞質分裂における液胞膜系の構造および動態解析タバコ培養細胞BY-2の分裂期に分裂装置周辺に出現する管状の液胞膜構造として近年見出したTVMについて,細胞質分裂における機能を探った.複雑なTVMの分布と形態を立体的に明らかにするため,立体再構築ソフトウェアREANTの開発を行なった.それによりスピニングディスクCLSM等により取得した連続光学切片からTVMの局在変化と巨大液胞化の過程を立体的かつ経時的に捉えることができた.TVMは細胞板形成にともなう切断の後,細胞板近傍に集積し,形成中の細胞板に一過的に蓄積することがわかった.また,蛍光色素FM4-64を用いた細胞板形成過程の可視化法を開発し,FM4-64の局在パターンについて画像解析を行なった.これらの実験からTVMが細胞板の成熟過程において膜成分の回収先として働いていることが示唆された.細胞伸長時における液胞構造の発達過程の解析細胞の形態変化における液胞構造の機能を明らかにするために,細胞の形が著しく変化する原形質分離,細胞伸長,ミニプロトプラストからの巨大液胞再生の3つのモデル系における液胞の構造変化について定量化等を行なった.とくに立体再構築を介して一細胞レベルで液胞の体積や表面積を導出し,液胞の立体構造変化の定量的解析に成功した.その結果,(1)原形質分離における細胞の体積減少がほぼ完全に液胞の収縮によるものであること,それにも関わらず液胞の表面積が一定に保たれていることがわかった.(2)細胞伸長時においては巨大液胞中に細胞の伸長方向に沿った太い細胞質糸が出現すること,(3)巨大液胞再生系においては液胞の巨大化に先んじて網管状の液胞構造が細胞全体に分布するようになり,その一部が膨張して巨大液胞になることが新たに見出された.液胞は高等植物の多くの細胞で生長にともなって体積を増し,やがて細胞体積の大半を占める巨大液胞へと発達する.この巨大液胞は,細胞伸長をはじめとする細胞の生長において中心的な役割を果たしている.まず,巨大液胞が形成する際の液胞構造の変化を明らかにすることを目的として,巨大液胞を欠くタバコBY-2ミニプロトプラストから巨大液胞が再生する過程について解析を行なった.その結果,巨大液胞の再生過程において複雑な網状の液胞構造が一過的に生じること,液胞の膨張に先駆けて液胞表面積が増大することなどが顕微鏡解析から明らかになった.このような巨大液胞再構成過程における液胞および細胞構造の数値化にあたって,多数の顕微鏡像から細胞領域や液胞領域を自動抽出する画像解析ソフトウェアの開発を行なった.とくに機械学習を用いた画素分類器生成をはじめ,適応的計算手法を用いることで細胞組織レベルの顕微鏡解析に対して汎用的なシステムの構築を目指した.さらに,液胞構造の形成や発達の物理的な制御機構を検討することを目的として,液胞の動きの定量的解析を行なった.そのために液胞膜の蛍光像や明視野像からの計測に適した動画像解析ソフトウェアを開発した.とくに周波数解析と画像相関スペクトル法を生体膜の蛍光像に適用することで,領域抽出などの前処理なしで高効率に液胞の動きを解析できるようになった.その結果,液胞の動きには,細胞周期の進行による時間的変化,細胞内での位置による空間的差異,液胞表層におけるアクチン繊維の局在との相関,という時間的空間的な制御要因が存在することがわかった.
経説絵巻の基礎的研究

中世日本で、経典に基づく詞と絵を備える絵巻が果たした絵画史上の役割を、作品調査に基づく詞と絵、また典拠経典の分析を通じて考察した。本研究期間内に計11件の作品調査を実施したほか、写真などを用いた画像資料の収集を行った。その結果以下の三点に関する新知見を得た。(1)鎌倉時代の絵巻に描かれる閻魔王庁の場面には、『白宝口抄』などに掲載される図像や経説からの影響が濃厚であり、経説絵巻と密教図像集との制作環境の近さがうかがわれる。(2)唐末宋代にかけての作例が残る「十王経図巻」の図像からの影響は、13世紀後半の日本における作例である聖衆来迎寺蔵「六道絵」(掛幅)にも痕跡をとどめており、絵入りの経巻は中世日本の仏教説話画の図像的淵源のひとつであった。(3)従来、経説との関わりについては等閑視されてきた「伴大納言絵巻」の図像分析を通じ、同時代の「六道絵」をはじめとする浄土教絵画と共通する図像パターンについて指摘した。以上の成果の一部は、「聖衆来迎寺蔵「六道絵」閻魔王庁幅と焔魔天図像」(『共立女子大学文芸学部紀要』58、2012年)、「鳥羽炎魔天堂の場と造形」(『仏教美術論集4図像解釈学-権力と他者』、竹林舎、2013年)などの出版物として公刊している。1)作品調査:下記3件の絵巻に関する作品調査・撮影を実施した。(1)「法華経絵」1巻(香雪美術館蔵)、(2)「観音経絵」1巻(メトロポリタン美術館蔵)、(3)「北野天神縁起絵巻」5巻(メトロポリタン美術館蔵)。また「法華経絵巻」1巻(京都国立博物館蔵)に関して展観の機会を得た。さらに、(1)(2)の比較対象として掛幅「観音経絵」(本土寺蔵)、(3)の比較対象として掛幅「六道絵」(聖衆来迎寺蔵)に関する展観の機会を得た。2)画像の整理とデータベース化:上記の調査を通じて、部分図を含む詳細な画像データを蓄積した。また、既存の高精細画像(4×5ポジなど)も入手しそのデジタルデータ化を行い、データベース作成の準備を整えた。3)分析と考察:作品調査(3)を通じ、元来縁起絵巻の最古例としての関心が高かった「北野天神縁起絵巻」に、漢文の原典を訓読した上で詞書を作成し絵巻化するという、鎌倉期の経説絵巻にも通じる特性があるという新たな着眼を得た。特に、今回調査を行った「北野天神縁起絵巻」(メトロポリタン美術館蔵)と承久本「北野天神縁起絵巻」(北野天満宮蔵)には、経説に基づく六道絵を盛り込むか否かという大きな違いがあり、両絵巻における典拠テキスト選択のメカニズムを分析することが、今後の課題のひとつとして浮上した。また、経説を絵画化する場合の絵巻と掛幅における場面選択や表現上の差異に関して、特に『法華経』と『十王経』を軸に考察し、その途中経過を口頭発表と論文として発表した。なお、掛幅「六道絵」(聖衆来迎寺蔵)における「閻魔王庁幅」のモティーフに、『白宝口抄』など密教図像集からの影響が濃厚であり、その表現が鎌倉期の絵巻にも継承されているという新知見を得、目下この点に関する論文を準備中である。1.作品調査:下記3件の絵巻に関する作品調査・撮影を実施した。(1)「地獄草紙」断簡(シアトル美術館蔵)、(2)「北野天神縁起絵巻(弘安本)」断簡(シアトル美術館蔵)、(3)「天地院縁起」(シカゴ美術館蔵)。さらに、(1)の比較対象として「地獄草紙」(メトロポリタン美術館蔵)、(2)の比較対象として「北野天神縁起絵巻(弘安本)」(東京国立博物館蔵)及び「北野天神縁起絵巻」(防府天満宮蔵)に関する展観の機会を得た。

2.画像の整理とデータベース化:上記の調査を通じて、部分図を含む詳細な画像データを蓄積した。また、既存の高精細画像(4×5ポジなど)も入手しそのデジタルデータ化を行い、データベース作成の準備を整えた。3.分析と考察:経説を絵画化する場合の絵巻と掛幅における場面選択や表現上の差異に関して、引き続き『法華経』と『十王経』を軸に考察し、その途中経過を発表した。特に、掛幅「六道絵」(聖衆来迎寺蔵)における「閻魔王庁幅」のモティーフに、『白宝口抄』など密教図像集からの影響が認められる点について、論文を発表した。また、平安時代を通じて密教的なコンテクストにおいて信仰されていた閻魔天の属性が、鎌倉時代に至り浄土教的な閻魔王信仰と混交する現象について、経文と画像の双方から考察を進め、特に「北野天神縁起絵巻」(メトロポリタン美術館蔵)に登場する閻魔王には、その両方の属性が看取されるという分析結果を得た。現在、この点に関する口頭発表と論文を準備中である。以下の作品調査を行い、高精細画像を収集した。1)九州国立博物館にて「病草紙」(3面)・「九相図巻」(1巻)・「九相詩絵巻」(1巻)の熟覧と撮影、2)チェスタービーティライブラリーにて「浄土宗過去帳」(1冊)の熟覧、3)岡山県立博物館にて「西大寺縁起絵巻」(1巻)の熟覧を実施した。以上の調査で得た材料に基づき、典拠経典と絵巻詞書と絵画画面の対応関係に関する分析、経説と仏教説話との接点に関する分析、中近世絵巻における中国版本利用に関する分析を行った。さらに、上記の研究内容の普及を目指し、一般雑誌へ以下の記事を発表した。1)死への想像力ー九相図がつなぐ、過去と現在(『芸術新潮』2012年10月号、新潮社)、2)六道の情景ー「地獄草紙」「地獄草紙」「病草紙」(村重寧監修『別冊太陽日本のこころ201やまと絵』、平凡社、2012年10月)。作品調査に関しては在外重要作品を重点的に実施し、高精細画像を蓄積した。また、考察結果を学会発表と論文の形で順次公開している。24年度が最終年度であるため、記入しない。次年度は本研究課題の最終年度にあたっており、残された作品調査を可能な限り9月までに終え、データの分析と成果の発表に十分な時間を割く必要があると認識している。また過年度までの研究成果を踏まえて、経説絵巻という広範なテーマの中でも特に「追善と逆修の場に関連する経文とその絵画化」という論点が、考察の上での重要な軸として浮上してきた。さらに、絵巻(小画面)と掛幅(大画面)における、経文利用の共通点と相違点に関する比較検討という問題にも留意して、次年度の調査と考察を進める。
バイオ３Ｄプリンタ、幹細胞技術を用いた心血管組織の開発と、組織内細胞動態の解明

組織工学技術にヒトiPS由来細胞などの幹細胞技術を応用することで移植可能な機能的な心血管組織を開発すると共に、その組織の成熟過程における細胞動態を解明することを本研究の目的としている。心筋細胞の成熟要素の1つとして、電気刺激が言われており、心筋の発生過程において電気刺激は、収縮とは無関係に心筋特異的遺伝子発現や心筋分化に影響を及ぼすことが示唆されている。我々はThe Gibco&reg; PSCCardiomyocyte Differentiation Kitを使用し、iPS細胞を心筋前駆細胞まで分化させた後、培養筋細胞電気刺激システムを用いて、電気刺激を与えながら培養した群と電気刺激を与えず培養した群で心筋成熟や分化、収縮性に違いがあるか検討を行った。両群ともにトロポニンT、アクチニン、β-レセプター抗体を使用して、免疫染色を行い共焦点顕微鏡で観察を行った。トロポニンT、アクチニン、β-レセプターは電気刺激群で若干、密に観察された。電気刺激群での心筋成熟優位性が示唆されたが、拍動性においては評価困難であった。今後は蛋白定量評価などの追加実験をおこない、さらなる検討が必要であると考えられた。2-Cl-C.OXT-Aを投与することで、より高機能なiPS細胞由来心筋スフェロイドの作製に成功し、PDFを介して拍動、収縮が促進されることを示した。心筋構造体に関しては移植実験までは進んでいないが、より大型化した心筋構造体の作製には成功した。血管様構造体の作製においては、線維芽細胞を主体とするスフェロイドを積層した構造体をバイオリアクターで成熟させることで、大動物実験において3か月以上の血流開存を得た。血管構造体においては構築法、成熟方法の改良によって、移植において十分な力学的強度が得られ、線維芽細胞を主体とするものであるが、長期的な大動物移植結果が得られてきている。心筋構造体に関してはより高機能な心筋組織型スフェロイドの作製、その作用機序の解明にも成功した。移植実験までは進んでいないが、大型化した心筋構造体の作製にも成功し、おおめね順調に進展していると判断した。引き続きヒトiPS細胞から機能的心筋組織の構築法とバイオリアクター内での組織成熟方法を確立し、組織の大型化に向けて研究を進める。血管構造体においては構造体の成熟方法をさらに改良することで、移植後のより長期的な検証へと発展させたい。本研究ではバイオ3Dプリンタ技術に幹細胞技術を応用することで移植可能な機能的な心血管組織を開発すると共に、その組織の成熟過程における細胞動態を解明することを目的としている。平成28年度は計画予定どうりヒトiPS由来細胞で構成された心筋・血管組織型スフェロイドの最適化を図った。ヒトiPS細胞由来心筋細胞にヒト皮膚由来線維芽細胞やiPS細胞由来血管内皮細胞を配合し心筋組織型スフェロイドを作製した。スフェロイド形成後の培養期間に応じた血管網や細胞外マトリックス(ECM)の増加の病理組織学的、分子生物学的評価を行った。ヒト皮膚由来線維芽細胞を加えた方が、心筋細胞単独より細胞同士が接着(凝集)する現象が促進し、細胞外マトリックスの産生も向上する傾向を認めた。ヒトiPS細胞由来血管内皮細胞を配合し、スフェロイド内部に微小血管網を作ることを組織染色で確認し、さらにスフェロイドの高機能化を目的としてiPS細胞由来神経前駆細胞を配合したり、ゼノフリーな新たな試薬を加えるなどして、心筋組織型スフェロイドの拍動効率解析(動画解析ソフトを用いた収縮率、収縮速度、拍動数など)を行った。心筋細胞の拍動効率は培養液の温度にも影響をうけやすいため、温度CO2制御チャンバー内で解析した。スフェロイド形成段階で細胞外マトリックスが生理的に産生されているのに加え、単一細胞のみの培養より複数の細胞を組み合わせたほうがより高機能化することが確認できた。また今後データの蓄積により、混同する細胞腫や細胞比率、培養液の調整で、心筋組織型スフェロイドの拍動率、心拍数をある程度コントロール可能となることが示唆された。Scaffold freeな状態で立体細胞構造体を構築する上で、基盤となる心筋・血管組織型スフェロイドの最適化において重要な結果を得ることができ概ね順調に伸展していると判断した。当研究室では従来、古典的な細胞自己凝集現象(スフェロイド形成)やスフェロイド融合現象を利用し、任意の3次元組織を構築する技術を開発してきた。ヒトiPS由来心筋細胞を用いて大型な組織を作製するために大量のiPS由来心筋細胞が必要となる。簡便で安価なiPS由来心筋細胞を入手するため、iPS細胞253G1株でPSC Cardiomyocyte Differentiation Kitを用いた分化誘導とMACSソーティングによる心筋細胞の濃縮を行った。分化誘導開始後から14dayにて心筋細胞の濃縮とフローサイトメーター(MACSQuant Analyzer)を使いTnT陽性細胞の測定を行った。PSC-derived Cardiomyocytes Isolation Kitによる濃縮後の純度が74%とやや低い傾向であったが、初期値の細胞数の量がやや少ないことや細胞解離が不十分なことが原因と推測された。

iPS由来心筋細胞及び線維芽細胞、iPS由来血管内皮細胞を混合させたより高機能な混合型心筋スフェロイドの作製を用いて拍動する心筋構造体の作製に成功した。血管様構造体の作製においては、線維芽細胞を主体とするスフェロイドを積層した構造体をバイオリアクターで成熟させることで、ヒト正常血圧の10倍以上の力学的強度(圧力破砕試験)を確認し、大動物実験において1か月以上の血流開存を得た。今後さらに心筋及び血管組織型スフェロイドの最適化や血管様構造体の構築法、成熟方法を確立することで、移植後のより長期的な検証へと発展させたい。外来異物を一切含まずScaffold freeな状態で立体細胞構造体を構築する上で、基盤となる心筋・血管組織型スフェロイドの最適化において重要な結果を得ることができた。、血管構造体においては構築法、成熟方法の改良によって、移植において十分な力学的強度が得られてきている。一方、心筋構造体に関しては大量のiPS由来心筋細胞の獲得のための実験や、混合型心筋スフェロイドの作製から心筋構造体の作製に成功しているが大型化まで至っておらずやや遅れていると判断した。組織工学技術にヒトiPS由来細胞などの幹細胞技術を応用することで移植可能な機能的な心血管組織を開発すると共に、その組織の成熟過程における細胞動態を解明することを本研究の目的としている。心筋細胞の成熟要素の1つとして、電気刺激が言われており、心筋の発生過程において電気刺激は、収縮とは無関係に心筋特異的遺伝子発現や心筋分化に影響を及ぼすことが示唆されている。我々はThe Gibco&reg; PSCCardiomyocyte Differentiation Kitを使用し、iPS細胞を心筋前駆細胞まで分化させた後、培養筋細胞電気刺激システムを用いて、電気刺激を与えながら培養した群と電気刺激を与えず培養した群で心筋成熟や分化、収縮性に違いがあるか検討を行った。両群ともにトロポニンT、アクチニン、β-レセプター抗体を使用して、免疫染色を行い共焦点顕微鏡で観察を行った。トロポニンT、アクチニン、β-レセプターは電気刺激群で若干、密に観察された。電気刺激群での心筋成熟優位性が示唆されたが、拍動性においては評価困難であった。今後は蛋白定量評価などの追加実験をおこない、さらなる検討が必要であると考えられた。2-Cl-C.OXT-Aを投与することで、より高機能なiPS細胞由来心筋スフェロイドの作製に成功し、PDFを介して拍動、収縮が促進されることを示した。心筋構造体に関しては移植実験までは進んでいないが、より大型化した心筋構造体の作製には成功した。血管様構造体の作製においては、線維芽細胞を主体とするスフェロイドを積層した構造体をバイオリアクターで成熟させることで、大動物実験において3か月以上の血流開存を得た。血管構造体においては構築法、成熟方法の改良によって、移植において十分な力学的強度が得られ、線維芽細胞を主体とするものであるが、長期的な大動物移植結果が得られてきている。心筋構造体に関してはより高機能な心筋組織型スフェロイドの作製、その作用機序の解明にも成功した。移植実験までは進んでいないが、大型化した心筋構造体の作製にも成功し、おおめね順調に進展していると判断した。
長期前向きコホート研究から探る、歯を失った国民の健康長寿に資する口腔保健目標

約30年にわたる8020運動により、80歳で20歯を有する高齢者は51.2%にまで増加したが、80歳を前に20歯を下回る人口は依然として多く、そうした国民への具体的な口腔保健目標は無い。本研究は、・20歯未満の高齢者の介護予防に繋がる口腔機能の基準や保健習慣とは何か?・そのような基準や習慣に,年代による違いがあるか?について明らかにする事を目的にし、既に歯を失い8020を保健目標にできない国民に対する介護予防や健康寿命の延伸のための、年代に応じた「口腔保健目標」の提言を目指す。検診項目は口腔保健に関する項目として口腔内診査、最大咬合力測定、舌圧測定、咀嚼機能検査、口腔湿潤度、嚥下機能検査、質問紙調査(口腔関連QOL、主観的咀嚼能力、嚥下機能、歯科受診行動、口腔衛生習慣)を実施し、介護予防と健康長寿に関わる項目として頭部MRI画像、頸動脈エコー検査、脈波伝播速度、認知機能低下、抑うつ傾向、運動指標について調査する。アウトカムは要介護発生および死亡とし、口腔保健指標と要介護発生、死亡及び要介護に関わる指標との関連を多変量解析にて検討する。平成30年度には、対象の岩手県花巻市大迫町に居住する55歳以上の一般住民99名(男性34名、平均年齢67.0歳)の調査を行い、口腔内診査、アンケート調査の他に細菌カウンタを用いた口腔内細菌数、ムーカスを用いた口腔湿潤度、グミゼリーを用いた咀嚼能率検査およびデンタルプレスケールを用いた咬合力検査、さらに舌圧測定も行いコホートデータの蓄積、集計を行った。本研究は、岩手県花巻市大迫町に居住する55歳以上の一般住民を対象とした検診データを基に実施するものであるが、平成30年度の検診事業は、計画通りに遂行され、検診の項目についても計画通りに実施された。一部データの解析も開始しており、進捗状況は概ね順調である。平成31年度には、平成30年度に引き続き、被験者の選択、歯科・医科学検査を継続し被験者の増員を図るとともに測定項目のデータベースを追加する。平成31年度も5回の検診を予定しており、この検診に参加するおよそ100名の対象者に研究内容について説明を行い、同意を得られたものに対し、口腔内診査・咀嚼機能検査、要介護発生など調査を行う。さらに医科データとの関連を、多変量解析にて検討しその成果を国内外の学会にて発表する。平成32年度は、さらに被験者を増員し、データベース追加をするとともに統計解析を進め、国内外への学会発表、論文投稿を行う予定である。検診に同行する人員が予定より少なかったため、平成30年度の使用額が少なかった。次年度に人員を増員する予定のため、次年度使用する予定である。
沖縄県久米島における地域歯科保健データベースシステムの構築

1.研究対象の変更点当初の研究計画では、対象を1991年にフッ化物洗口を開始した沖縄県久米島の具志川村、仲里村としていたが、比較検討するためには群間比較も有用と考えた。そこで対照地区として僻地的性格をもつ石垣島と都会的性格をもつ豊見城村(那覇市に隣接)を加えた。4地域の小学校1および6年生を対象に歯科検診および保護者対象に質問紙法調査を行った。2.研究結果の概要1)フッ化物洗口法の永久歯う蝕予防効果(1)DMF者率:1年生のDMF者率は具志川村30.9%、仲里村40.2%、石垣島36.3%、豊見城村44.8%であった。統計的には具志川村と豊見城村との間で有意差を認めた(p<0.05)。6年生では何れの地域でも90%を越えており、差は認められなかった。(2)DMFT-index:1年生のDMFT-indexは具志川村0.59、仲里村0.83、石垣島0.61、豊見城村1.02であった。6年生ではそれぞれ4.77、4.87、3.99、5.78であった。1年生では具志川村と豊見城村間に有意差を認めた。6年生では具志川村と仲里村間を除く全ての群間で有意差を認めた。群内比較では具志川村小学校1年生においては1991年の1.27から0.59と約半分に、6年生では5.77から4.77と約1歯減少しており、3年経過ながらフッ化物洗口法は、着実に効果を発揮していた。2)歯科保健に関する知識、意識、行動生活習慣に地域差は認められなかったが、具志川村6年生における歯痛経験者が対照地区の石垣島、豊見城村同年齢児に較べ、有意に少なかった。歯科保健に関する意識において、、具志川村・仲里村の保護者共に、「最近むし歯が減少している」と回答した割合が対照地区に較べて有意に高く、これはフッ素洗口に対する期待の現れ、効果の認識によるものと推察された。またこのことは、よ蝕予防の優先順位で具志川村・仲里村の保護者が「フッ素利用」を上位にあげていることによっても裏付けられた。
近代東アジアにおける中華秩序の変動過程-その現代的意義-

(1)本研究は近代東アジアにおける中華秩序の変動過程を歴史的に分析し、その現代的意義を考察するのもである。19世紀末から20世紀初頭の近代への移行期を振り返って、中華秩序の変動過程を具体的に解明する作業は、「脱国民国家」モデルが模索される今、中国ならびにアジアにおける国民国家の意味を問いなおす意味からも、現代中国研究に欠かせない作業である。研究代表者および分担者は、中華秩序の変動をモノの流れ、ヒトの移動、認識の変化などの側面から具体的に検討する作業を行った。(2)たとえばモノの流れから19世紀末の東アジアを検討する作業の一貫として、上海を中心とする物流の数量データを収集してコンピューターに入力する作業を行った。19世紀後半の上海は世界経済と地域経済を接合する役割を果たすネットワーク・センターとして活発な展開を示しており、そのネットワークは天津や漢口等の中国国内の開港場を結び付けると同時に、東シナ海を越えて長崎や神戸等の日本の開港場、さらには仁川等の朝鮮の開港場へも延びていた。近代東アジア国際関係史は従来、中国、日本、朝鮮という三国間の国家間関係史を中心に議論されてきたが、本研究では東シナ海を巡る東アジア地域圏という空間を設定することによって、中華秩序の変動を地域レベルの地域間関係史を考察するという特徴を有している。本年7月の香港返還によって、香港を中核とする華南経済圏と上海を中心とする地域経済圏の関係にも変化が生じる可能性もある。19世紀後半の東アジアで機能している地域経済圏の実態は、(1)情報の果たす役割、(2)開かれた地域経済圏の重要性、(3)東アジアを国家間関係と同時に地域間関係からも眺める必要性、などの点で現代東アジア域圏研究にも示唆的である。(3)本年度はグループの研究会活動の他に、研究計画B02班研究会・全体研究集会へ出席して研究交流を行った。
摩擦力顕微鏡一体型加工評価装置の試作と極微細加工のメカニズムに関する研究

ナノメータスケールの機械加工現象を正確に理解し,超精密加工の高精度化,高能率化を達成するためには,加工単位の微小化に伴う加工現象の変化を実験的に観測することが重要である.本研究では,水平分力測定が可能な摩擦力顕微鏡(FFM)機構を用いて,従来の単粒加工実験よりも小さく,かつ原子間力顕微鏡(AFM)による加工よりも大きな加工単位での単粒加工実験が可能な装置を開発した.開発にあたっては,改造や実験条件設定の自由度を優先し,全てのシステムを独自に設計・試作した.ここで鍵となったのは,測定用カンチレバーの1000倍以上のたわみ剛性を有し,ダイヤモンド砥粒を切れ刃とした加工用カンチレバー(単結晶シリコンの異方性エッチングを用いて作製)である.これにより,10nmオーダの切込み量の機械的除去加工を実現した.また,加工時と加工痕測定時でカンチレバーを交換できる機構を装備し,加工痕形状の高精度なAFM測定を両立させた.そして,開発した装置を用いて微小加工実験を行い,FFM機構を用いた加工特性を把握した.また,微小な機械加工に伴う諸現象を観測することを目的とした実験では,1)切込みの小さなスクラッチ加工においては材料表面の変質層の影響で切れ刃に作用する水平分力が変化すること,2)4つの金属材料と3つの硬脆材料の極微小加工から材料により切りくずの形状および水平分力が異なること,3)切れ刃摩耗の定量評価からナノオーダの切削加工においても初期摩耗・定常摩耗そして寿命へ至る摩耗進行過程が存在すること,などを明らかにした.以上の研究成果により,本研究で開発した装置が,これまでに無い加工単位での機械加工実験を実現し,極微小加工における現象解明に有効であることを示した,また,FFM機構を応用したナノスケール切削加工技術の基礎を築くことができた.ナノメータスケールの機械加工現象を正確に理解し,超精密加工の高精度化,高能率化を達成するためには,加工単位の微小化に伴う加工現象の変化を実験的に観測することが重要である.本研究では,水平分力測定が可能な摩擦力顕微鏡(FFM)機構を用いて,従来の単粒加工実験よりも小さく,かつ原子間力顕微鏡(AFM)による加工よりも大きな加工単位での単粒加工実験が可能な装置を開発した.開発にあたっては,改造や実験条件設定の自由度を優先し,全てのシステムを独自に設計・試作した.ここで鍵となったのは,測定用カンチレバーの1000倍以上のたわみ剛性を有し,ダイヤモンド砥粒を切れ刃とした加工用カンチレバー(単結晶シリコンの異方性エッチングを用いて作製)である.これにより,10nmオーダの切込み量の機械的除去加工を実現した.また,加工時と加工痕測定時でカンチレバーを交換できる機構を装備し,加工痕形状の高精度なAFM測定を両立させた.そして,開発した装置を用いて微小加工実験を行い,FFM機構を用いた加工特性を把握した.また,微小な機械加工に伴う諸現象を観測することを目的とした実験では,1)切込みの小さなスクラッチ加工においては材料表面の変質層の影響で切れ刃に作用する水平分力が変化すること,2)4つの金属材料と3つの硬脆材料の極微小加工から材料により切りくずの形状および水平分力が異なること,3)切れ刃摩耗の定量評価からナノオーダの切削加工においても初期摩耗・定常摩耗そして寿命へ至る摩耗進行過程が存在すること,などを明らかにした.以上の研究成果により,本研究で開発した装置が,これまでに無い加工単位での機械加工実験を実現し,極微小加工における現象解明に有効であることを示した,また,FFM機構を応用したナノスケール切削加工技術の基礎を築くことができた.本研究では,極微小加工における物理化学作用を本質的に理解することを目的として,微小領域での力学情報の観測が可能なツールとして摩擦力顕微鏡に着目し,本来の表面評価機能に加えて極微小加工機能を重視した摩擦力顕微鏡一体型加工評価システムを新たに試作・構築した.具体的な成果は以下の通りである.1.極微小加工の機能を具備し,かつ加工面評価が可能な摩擦力顕微鏡一体型加工評価装置を設計・試作した.主要な開発項目を以下に示す.(1)加工時の大きな接触力に耐えうる高剛性の加工用探針を開発した.これには単結晶シリコンの異法性エッチングを応用し,従来の観察用カンチレバ-の1000倍程度の剛性を持たせること成功した.(2)垂直分力に加えて水平分力を検出するための4分割フォトセンサを用いた光てこ方式の変位検出機構を導入し,加工分力の測定を可能にした.(3)化学的効果を考慮した液中実験ができる顕微鏡構造を構築した.(4)加工用カンチレバ-と観察用カンチレバ-の交換機構を新たに導入し,高精度のAFM観察を実現した.2.上記の開発要素を満足した摩擦力顕微鏡一体型加工評価装置の基本性能を評価するとともに問題点を抽出し,解決した.3.開発した摩擦力顕微鏡一体型加工評価装置を用い,単結晶シリコン,ガラスならびに各種金属の加工評価実験を行い,目的を達するに十分な加工性能と観察性能を具備していることを確認した.次年度は,被加工材料の結晶方位や加工雰囲気等をパラメータとした極微小加工実験を行い,得られた力学情報と画像情報から極微小加工にまつわる物理化学的諸現象を理解するための基礎データを取得・分析し,極微小加工のメカニズムを解明していく.

本研究では,極微小加工機構を本質的に理解することを目的として,微小領域での力学情報の観測が可能なツールとして摩擦力顕微鏡に着目し,本来の表面評価機能に加えて極微小加工機能を重視した摩擦力顕微鏡一体型加工評価システムを新たに試作・構築した.さらに,それを用いた極微小加工実験を行い,得られた力学情報と画像情報から極微小加工にまつわる諸現象を理解するための基礎データを取得・分析した.得られた結果を以下に示す.(1)加工雰囲気や工具材料,被加工材(結晶方位含む)などを変化させた場合の加工特性を作用分力と加工形状の変化から把握し,極微小加工にともなう加工現象の特異生と支配因子を抽出した.(2)極微小加工現象のモデル化を行うとともに,従来の加工原理と比較しながらそのメカニズムを検証した結果,切れ刃がダイヤモンドであることで従来の加工メカニズムに支配されたものであることがわかった.(3)加工後の表面には加工変質層が存在しており,これがKOH水溶液によるエッチングにおいてマスキングの効果を示すことを明らかにした.今後は,切れ刃にダイヤモンド以外の砥粒を用い,加工界面での物理化学現象の究明を行っていく.
脳におけるモデル同定型強化学習機構とその工学的応用

◇ガウス過程のオンラインベイズ学習法の開発ガウス確率過程に対するオンライン型ベイズ学習法に基づき、環境のシステム次数や環境変化を自動推定できる手法を開発した(Hirayama, et al.,2004)。混合ガウス過程のベイズ学習法とそのためのモデル構造選択アルゴリズムを開発した(吉本,他,2003)。環境の確率過程が非ガウス過程である場合に適用できるような、逐次モンテカルロ法に基づく手法を開発し、その成果を視覚追従制御に応用した(Bando, et al., in press)。◇オンライン学習法とモデル同定型強化学習法の工学応用神経振動子を用いた2足歩行ロボットシミュレータの、強化学習による自律的な2足歩行運動制御に世界で初めて成功した(中村,他,2004)。また、方策勾配型の強化学習法を用いることに拡張した(森,他,2005)。オンライン学習法に基づくモデル同定法を用いて、2足歩行ロボットシミュレータの学習を加速した(Nakamura, et al., 2005)。またモデル同定法を用いて同定されたシステムを制御する制御器を強化学習法によりスイッチすることで、劣駆動型ロボットであるアクロボットの振り上げ倒立制御に成功した(西村,他,2005)。オンライン型のモデル同定法を用いて相手戦略を学習するエージェントを、モデル同定型強化学習による試行錯誤学習によって訓練することで、人間と同程度に強いトランプゲームプレーヤの作成に成功した(Ishii, et al., 2005;藤田,他,2005)。◇サル電気生理学実験による前頭前皮質情報処理機構の解明ニホンザルによるアンチサッカード課題を用いた電気生理学実験によって、報酬情報に基づく刺激と行動の保持機構において、刺激保持は報酬に大きく依存するが、行動保持は余り依存しないことを見いだした(Amemori, et al.,2005)。◇ヒト前頭前皮質の情報処理機構のモデル化と認知実験による解明マルコフ決定過程を遂行する際のヒトの情報処理過程のモデル化を行い、機能的磁気共鳴図(fMRI)を用いて脳活動を調べた結果、特に背外側前頭前皮質が関わっていることを見いだした(吉田,他,2005;Yoshida, et al.,2005)。環境に不確実性がある場合のマルコフ決定過程においては、前部前頭皮質の役割が重要であることを見いだした(Yoshida, et al.,in press)。○ガウス過程のオンラインベイズ学習法の開発ガウス過程、特に線形ダイナミカルシステムのオンラインベイズ学習法を開発し、強化学習に応用した(Yoshimoto, Ishii, Sato,2003)。これにより、環境の変化に追随しながら、システム次数やノイズの大きさを自動推定できる。一方で、環境変動を離散的なイベントとして推定する手法を開発し、現在論文投稿中である。一方で、ロボットの実機制御に用いることを目的として、非ガウス確率過程を仮定した逐次モンテカルロ法によるシステム同定法を開発し、移動型ロボットの位置推定(Kanemoto, Yoshimoto, Ishii,2004)、およびヒューマノイドロボットによる移動物体の指標追尾(論文投稿中)に応用した。

また、神経振動子を用いた2足歩行ロボットシミュレータの自動制御に成功した(中村,佐藤,石井,2004)。○サル神経生理学実験ニホンザルに遅延期間中にルールが提示されるアンチサッカード課題を行わせ、背外側前頭前野の神経細胞活動を記録し、ワーキングメモリに関わるポピュレーション・ダイナミクスの解析を行った(論文投稿準備中)。○ヒト認知科学実験機能的磁気共鳴図(fMRI)を用いて、マルコフ決定過程タスクを遂行する際のヒトの脳活動を調べ、特に背外側前頭前野が関わっていることを見い出した(Yoshida, Ishii,2003,および論文投稿中)。また、移動物体の指標追尾遂行時に、物体移動の予測の必要性に応じて、MT野とMST野とで有意に活動が異なることが分かった。ガウス確率過程に対するオンライン型ベイズ学習法に基づき、環境のシステム次数や環境変化を自動推定できる手法を開発し、論文発表を行った(Hirayama et al.)。環境の確率過程が非ガウスである場合に適用できるような、逐次モンテカルロ法に基づく手法を開発し、国際会議発表(Bando et al.)し、またその成果を視覚追従制御に応用した研究は論文投稿中である。また、上記のシステム同定法に基づいた強化学習法を開発し、2足歩行ロボットシミュレータあるいは多関節ロボットシミュレータに応用することで、ロバストな制御が可能になることを確認した。これについては論文投稿中である。また、この手法に基づく実機制御のため、多関節ロボットおよびヒューマノイドロボットの実機を制作中である。加えて、環境の確率過程に依存せずに直接マルコフ決定過程を解くことのできる手法を開発し、国際会議発表(Yohsimoto et al.)を行った。また、環境(相手)の予測を含む強化学習法をマルチエージェント環境に適用し、良い結果を得たので、論文として発表した(Ishii et al.)。ニホンザルによるアンチサッカード課題を用いた電気生理学実験によって、報酬情報に基づく行動選択に前頭前野が大きく関わること、さらに動機付けに応じた行動の効率化に前頭眼野が関わることが分かった。この結果は現在論文執筆中である。機能的核磁気共鳴図を用いて、部分観測環境、あるいは階層性がある環境での同定に関わる脳の情報処理機構の解析を行い、部分観測環境での同定には前部前頭前野、階層環境では背外側前頭前野の役割が大きいことが分かった。この成果の一部は国際会議発表(Funakoshi et al.)し、また論文執筆中である。強化学習は予測を伴う条件付け学習として動物の行動系におけるプリミティブな学習法であり、脳の学習機構を知る生物学においても、未知環境に適合するロボット創造などの工学応用にも重要である。特にヒトやロボットなどは非定常性のある困難な環境で意思決定をする必要がある。ベイズ推定法は、環境から逐次的に情報が与えられる状況での、環境同定法に自然な理論的枠組みを与える。
“Acidotic Preconditioning"は存在するか?

1.ウサギ摘出灌流心モデル:クレブス液で用いた摘出灌流心モデルを作成し,左室バルーン法により,感受性が高く安定した心機能測定が可能となった.2.プレコンディショニングが心筋スタニングに及ぼす影響A.短時間虚血によるプレコンディショニング(ischemic Preconditioning)3分間の虚血と3分間の再灌流を3回繰り返すことでPreconditioningを行った後,常温30分間の虚血を作成し,再灌流後の心機能の回復を測定し,Preconditioningを行わなかった対照群と比較検討した.30分間の虚血中に生じた心筋拘縮の発生時間とその程度には差を認めなかったが,再灌流60分後の心機能回復はischemic Preconditioning群の方が対照群よりも良好であった.B.高CO_2灌流液によるプレコンディショニング(acidotic Preconditioning)高CO_2灌流液(PCO_2160180mmHg,pH7.357.40)と通常の灌流液で3分間ずつ交互に3回灌流することでischemic Preconditioningと非常に類似した心機能の変化が認められた.しかし,それにひき続く30分間の常温虚血後の心機能回復は対照群よりも不良であった.実験数が,まだ不十分の為,明らではないが、acidotic Preconditioningの条件を変えることで,これがどう変化するのかひき続き検討中である。
西日本出土古人骨に対するゲノム解析の可能性調査

日本人の起源を探るには先史時代人骨からゲノム情報を取得し、集団の遺伝的特徴の時間変化を知ることが重要である。本研究では、日本列島の中で古人骨ゲノムデータが不足している関西から琉球列島にかけての遺跡から出土した古人骨について、ゲノム解析に耐えうるDNAの保存状態を有している試料の選別を試みた。古人骨からDNAを抽出するためには数百mgの骨粉が必要となるが、そのような試料の大きな破壊を伴わずにDNAの保存状態を推測するため、まずアスパラギン酸のラセミ化率を測定した。ラセミ化率が良好な値を示した試料のみからDNAを抽出することで、試料の破壊を最小限に留めながら、スクリーニングを行うことができた。主に関西から中国地方で出土した縄文時代から弥生時代にかけての人骨から骨粉を採取し、コラーゲンに含まれるアスパラギン酸のラセミ化率を測定した。ラセミ化の程度からほとんどの試料はDNA分析の成功の見込みが低いと推定されたが、和歌山県地ノ島遺跡出土の弥生時代人骨1体がDNA分析が成功するだけのDNA保存状態を維持していることが期待できる結果を示した。今後はこの試料のDNA分析を進め、その保存状態がゲノム解析に耐えうるものかどうか引き続き検証する。その他の資料では、岡山県里木貝塚出土の縄文時代人骨、同船穂貝塚出土の縄文時代人骨、和歌山県鳥の巣遺跡出土の弥生時代人骨が、基準には満たないものの比較的低いラセミ化率を示したため、これらの試料もDNA分析の対象候補としする。沖縄県武芸洞遺跡出土の貝塚時代人骨およびサキタリ洞遺跡出土のグスク時代人骨に加え、出土した層位から旧石器時代のものと推測される人骨のサンプリングを行った。これらの試料については今後ラセミ化率の測定を進める予定である。沖縄県宮古島の長墓遺跡から出土した遊離歯のサンプリングを行った。歯については、その他の骨組織と異なり、アスパラギン酸のラセミ化率とDNAの保存状態に明確な相関関係が無いことが報告されているため、ラセミ化率の測定は行わず、全ての試料についてDNAを抽出し、ミトコンドリアDNAのHVR1領域のPCRが成功するか否かで試料をスクリーニングする予定である。今年度は関西から中国地方にかけて分布する遺跡から出土した約30個体分の古人骨のラセミ化率を測定した。全体的に保存状態が悪い試料がほとんであったが、和歌山県地ノ島遺跡出土の弥生時代人骨1個体が低いラセミ化率を示し、DNAの保存状態が良好であることが示唆された。今後は、この試料について本格的にDNA分析を進める予定である。微量の骨粉試料からアスパラギン酸のラセミ化率を測定することで、DNA分析に適した資料を選出することができた。DNA分析成功の見込みのない試料を同定することで、貴重な古人骨試料の無駄な破壊を防ぐことができたと言える。また、琉球列島の各地から出土した様々な時代の古人骨試料をサンプリングすることができた。これらの中にDNAの保存状態が良い試料があれば、琉球列島のヒト集団史を明らかにする上で極めて重要な知見を得ることが期待できる。人骨の年代は、旧石器時代、貝塚時代、グスク時代のものであり、いずれの時代も琉球列島のヒトの集団史を考える上では非常に重要な時代である。亜熱帯域出土の古人骨であるため、すべての試料でDNAの保存状態が良いという可能性は高くは無いが、いずれかの試料が保存状態の良いDNAを保持していれば、自然人類学的に非常に重要な知見を得ることが期待できる。沖縄本島の武芸洞遺跡とサキタリ洞遺跡、宮古島の長墓遺跡から出土した人骨のラセミ化率測定を行った。武芸洞遺跡から出土した人骨は、貝塚時代からグスク時代にかけての計6個体で、貝塚時代の1個体のみがDNA分析が成功する保存状態を維持していることが期待できる値を示した。サキタリ洞遺跡から出土した人骨は旧石器時代のものとみられ、資料的価値が非常に高いものではあったが、残念ながらコラーゲンが検出されないほど保存状態が悪かった。長墓遺跡から出土した遊離歯サンプルについては、歯に含まれるアスパラギン酸のラセミ化率とDNA分析の成否はそれほどよく相関しないことから、当初はラセミ化率の測定を行わない予定であった。しかし、歯の場合には、高いラセミ化率がDNAの高度な劣化を必ずしも反映しないものの、低いラセミ化率は良好なDNAの保存状態を反映するため、参考値を得るために測定を行うこととした。結果として、11試料中3試料が低いラセミ化率を示したので、この3試料を優先的に使用し、ライブラリー作製を行うこととした。実際の試料を使ってライブラリー作製を行う前に、断片化し希釈した現生DNAサンプルや既に分析に成功している、保存状態が良好な古代DNAサンプルを用いて、ライブラリー作製の条件検討を行った。効率の良いシーケンスを行うためには、アダプターダイマーや重複リードの割合を可能な限り減らすことが重要である。現生DNAに比べ遥かに濃度の低い古代DNAではこれらの割合をゼロにすることは極めて困難であるが、可能な限り最小化できる条件を見つけることができた。この反応条件を本研究の試料にも適用する予定である。今年度は琉球列島に分布する遺跡から出土した約20個体分の古人骨のラセミ化率を測定し、少数ではあるものの、保存状態の良いサンプルをスクリーニングすることができた。