hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自己増殖する人工二分子膜の創出による「生命の起源」問題へのアプローチ

本研究の目的である、生命の究極的なモデルとなるような自己増殖する機能を有する脂質二分子膜系を構築するために、昨年度の有機溶媒中における研究により探索された縮合反応を、水中に構築された疎水性環境を反応場として進行させることを試みた。すなわち、ベンズアルデヒド誘導体とオクタンチオールから、触媒として長鎖アルキル基が置換したチアゾリウム塩を用い、アゾベンゼンを酸化剤とする酸化的縮合反応によって相当するチオールエステルが生成する反応について、この反応を水中で臭化セチルトリメチルアンモニウムが形成するミセル、あるいは臭化ジメチルジパルミチルアンモニウムが形成する二分子膜中で行わせた。この結果、反応基質、および触媒は水中に作られた疎水性環境に取り込まれて均一系を形成し、目的とする酸化的縮合反応が比較的効率よく進行することが判明した。副生成物として、アゾベンゼン還元体との縮合反応生成物が得られた。詳細な条件検討により、この反応の速度や生成物分布は、水溶液のpHや、ミセルあるいはベシクル構成分子の構造および濃度に著しく依存することが明らかになった。反応速度のpH依存性は、触媒となるチアゾリウム塩の解離平衡のpH依存性によって説明される。この反応は、生体細胞内で営まれているチアミンピロリン酸を触媒とするピルビン酸からアセチル-CoAが生成する反応と極めて類似しており、生体内の縮合反応のモデルとなる反応を生体環境に近い水中で行わせることができた意義は大きい。この反応を、生成するチオールエステルが両親媒性となる系に発展させることにより、水中でそれ自身が形成する二分子膜を反応場として酸化的縮合反応が進行する反応系、すなわち本研究が目的とする自己増殖機能を有する二分子膜系ができるものと期待される。本年度は、本研究の目的である、生命の究極的なモデルとなるような自己増殖する機能を有する脂質二分子膜系を構築するために必要となる縮合反応の探索を行なった。様々な反応を試みた結果、ベンズアルデヒド誘導体をオクタンチオールと塩基の存在下、チアゾリウム塩を触媒としてアゾベンゼンと反応させると、アゾベンゼンが酸化剤として作用し、酸化的縮合反応が進行してチオールエステルが生成することを見出した。この反応は、生体内において営まれているチアミンピロリン酸を触媒としてピルビン酸からアセチル-CoAが生成する反応と類似した反応であり、二分子膜を反応場として行なうことのできる縮合反応として有望である。この反応の機構を理解する目的で、反応の初期におけるベンズアルデヒド誘導体の減少速度をNMRを用いて測定したところ、反応次数はベンズアルデヒドに対して一次であることが判明した。さらに、基質の減少速度定数に対するベンズアルデヒドの置換基効果を検討したところ、Hammettプロットが直線から大きくずれることを見出した。また、基質の減少速度定数に対するアゾベンゼンの置換基効果を調べたところ、p-ブロモベンズアルデヒドを用いた場合には、ほとんど置換基効果が観測されなかったのに対して、p-シアノ誘導体を用いた場合には正の反応定数をもつ大きな置換基効果が見られた。これらの結果から、反応基質として用いるベンズアルデヒドの電子受容性によって、チオールエステル生成反応の律速段階が、触媒のアルデヒドへの求核的反応の過程からアゾベンゼンによる酸化反応の過程へと移動することが結論された。この結果は、二分子膜を反応場として行なうことができるような効率のよい酸化的縮合反応系を構築するために、有用な情報となる。
p53遺伝子欠損マウスを用いた分化間葉細胞系の樹立

1.p53遺伝子欠損マウスからの骨芽細胞様細胞系の樹立p53遺伝子欠損マウスの新生仔頭蓋冠より細胞を単離し、アルカリフォスファターゼ活性を指標に、分化した骨芽細胞として形質をもった細胞系を樹立した(MMC2)。MMC2はアルカリフォスファターゼ活性に加えて、I型コラーゲン及びオステオカルシン遺伝子を発現している。またascorbic acid添加で培養を継続すると、in vitroにおいて石灰化巣を形成する。旺盛な増殖能を示し、不死化細胞と考えられるが、接触阻止及び足場依存症の増殖を示し、癌細胞としての形質は有していない。ヌードマウスでの腫瘍形成も認められないが、異所性骨化巣を形成する。In vitroにおいてBMP2及び4を産生し、かつBMP受容体を発現していることより、MMC2自体が骨化巣を形成した可能性と、宿主細胞に作用して骨化を誘導した可能性が考えられた。2.p53遺伝子欠損マウスからの破骨細胞様細胞系の確立新生仔マウス骨髄から間質細胞を分離、クローニングしたのち、活性型Vitamin D3(VD3)添加の培養で酒石酸抵抗性酸ファスファターゼ(TRAP)活性を指標に破骨細胞の前駆細胞と思われる細胞系を単離した(BM2C3)。BM2C3はVD3及びprostagladin Eを添加して培養するとTRAP陽性の多核細胞を多数形成する。しかしdentin sliceを用いた実験では、明らかな骨吸収窩は示さず、TRAP陽性所見との解離が認められた。p53遺伝子欠損マウスからの脂肪前駆細胞系の確立同様に新生仔マウス骨髄間質細胞から得られたクローンの中からdexamethason添加の培養にて、豊富な脂肪摘を有するadipocyte様の形態を呈する細胞系を樹立した。現在、そのadipocyteとしての形質を解析中である。
画像診断支援システムのための離散時間振動子ネットワーク系の機能的設計に関する研究

画像診断支援システムに適用可能な動的画像領域分割システムの基盤技術を開発することを目的として,離散時間振動子ネットワーク系の設計について研究した。カオス応答が複数の領域分割候補(フラグメント集合)を出力することから,カオス応答が発生しうるシステムパラメータ値を解析により見いだした。更に,最大局所リアプノフ指数の最適化問題から,カオス応答が発生するパラメータ値を自動探索する手法も提案した。カオス応答が発生しうるパラメータ値の下で提案システムが医用画像のフラグメントを生成できることを例証するとともに,離散時間振動子単体構造の簡略化やグラフィック専用装置実装による高速化も行った。本研究代表者らは,離散時間振動子を結合したネットワーク系を構築し,振動子応答の同期現象を有効利用した動的画像領域分割法を考案している。本研究の目的は,離散時間振動子結合系を画像診断支援システムに適用するため,振動子間の結合方式,カオス振動応答の有効利用,系のパラメータ最適化など,結合系の機能的設計に関する検討を行うことである。平成25年度に得られた研究成果は以下のとおり。1.星型に結合した離散時間振動子を構築し,数個の濃度値を持つ画像入力を想定した場合の縮約系を解析することにより,振動子から非周期的振動応答(カオス振動応答)が発生するパラメータ値を求めた。さらに,カオス振動応答を有効利用することにより,単一のフラグメント(類似濃度値を持つ画像領域)だけでなく複数のフラグメントが組み合わされた画像も抽出できること,すなわち,フラグメント集合(画像領域分割結果の候補群)の生成が可能であることを見いだした。2.カオス振動応答の発現が期待されるようにパラメータ値を設定した星型結合系を用いて,3次元画像における特徴画像領域を1スライス画像毎に自動抽出するための逐次的アルゴリズムを提案した。さらに,3次元CT画像を用いた実験を通じて,提案アルゴリズムが有効であることを例証した。3.上述のとおり,カオス振動応答が画像領域分割処理において有用であることから,カオスが発生するパラメータ値を最大リアプノフ指数に基づいて自動探索する手法を考案した。また,カオスを生成する離散時間力学系に対する数値実験を通して,本考案法の有効性を確認した。なお,このパラメータ自動探索法は,離散時間振動子結合系に限らず一般的な離散時間力学系に対して適用できることから,高い汎用性を有する。これら研究成果の一部を国際会議で発表したとともに,学術論文および書籍の原稿として投稿した。本研究代表者らは,離散時間振動子を結合したネットワーク系を構築し,振動応答の同期現象を有効利用した動的画像領域分割法を考案している。平成26年度では,カオス振動応答が発生するパラメータ領域を自動探索する手法を改良した。これら研究成果の一部を学会で口頭発表するとともに,学術論文および書籍として誌上発表した。本研究代表者らが開発した離散時間振動子ネットワーク系を画像診断支援システムに適用するため,振動子間の結合方式,カオス振動応答の有効利用,系のパラメータ最適化など,結合系の機能的設計を行うことが本研究の目的である。本研究で得られた成果は次のとおり。1.まず,格子状又は星型に結合した離散時間振動子ネットワーク系を詳細に解析することにより,振動子から非周期的振動応答(カオス振動応答)が発生するパラメータ値を求めた。更に,カオス振動応答を有効利用することにより,単一のフラグメント(類似濃度値を持つ画像領域)だけでなく,複数のフラグメントが組み合わされた画像列(画像領域分割結果の候補群)を生成できることを見いだした。2.カオス振動応答の発現が期待されるパラメータ値に設定した星型結合系を用いて,3次元画像における特徴画像領域を抽出するための逐次的アルゴリズムを提案した。更に,3次元CT画像を用いた実験を通じて,提案アルゴリズムの有効性を検証した。また,カオスを生成する離散時間力学系に対する数値実験を通して,本考案法の有効性も確認した。4.画像領域分割処理に要する計算コストを削減するため,離散時間振動子単体の構造を簡略化した。更に,その離散時間振動子ネットワーク系をGPU装置に実装した。上記研究成果の一部を国内外の学会で発表するとともに学術論文として誌上発表した。最大リアプノフ指数を用いた分岐制御法については計画どおり達成しているが,4ヶ月間の在外研究を行ったこともあり,一部の研究計画(クラスター同期現象に着目した解析作業)にやや遅れが見られる。非線形数理工学振動子のクラスター同期現象に着目して,振動子間の結合強度等に関する検討を行う。また,解析結果に基づいた3次元画像領域分割処理システムを提案し,その有効性を検討する。

星型に結合した離散時間振動子系の縮約系においてカオス振動応答が見られるパラメータ値を求めるとともに,カオス振動応答を利用することで複数のフラグメントを生成できることを見いだした。さらに,一般的な離散時間力学系において,カオスが発生するパラメータ値を最大リアプノフ指数に基づいて自動探索する手法を考案した。これら研究成果を研究目的および研究実施計画に照らし合わせれば,本研究は順調に進展していると判断できる。4ヶ月間の在外研究により,今年度予定していた国内外学会等での成果発表を翌年度に延期したため。画像領域分割処理における計算コストを削減するため,振動子ダイナミクスの次元削減を検討するとともに,様々な結合方式の振動子ネットワーク縮約系における同期現象の解析を継続する。特に,類似濃度値の振動子がほぼ同相で同期し,他の濃度値の振動子とは異なる位相差で同期するというクラスター同期現象に着目して研究を進めていく予定である。主に,国内外の学会にて成果発表するための旅費と参加費等に使用する予定である。
NPM型教育行政改革における市民の位置づけに関する研究

本研究では、ニュージーランドのニュー・パブリック・マネジメント型教育行政改革を事例に、改革における市民の位置付けについて実証的に検討した。結果、改革実現においては先住民の自決運動が大きな役割を果たしたこと、また結果責任を強く求められる新たなニュージーランド版チャーター・スクールは市民の学校運営参加が必須とされていないものの、先住民や移民の教育向上や文化承認の機会として評価するマイノリティ市民もいること、しかし制度自体はその正統性が民主的に担保されているとは言い難いことなどを明らかにした。妊娠に伴う体調不良、出産に伴う産前産後休暇及び育児休業の取得により、調査・研究活動は殆ど行えなかったが、以下の作業に進捗をみた。1.ニュージーランドにおける教育行政改革の事例をもとに、改革の背景をなす政治的・思想的伝統の整理を行いNPM(ニュー・パブリック・マネジメント)型教育改革を成立させる条件を見出した。2.NPM型教育改革を促したグローバルな背景要因について理論的整理を行った。3.以上から、NPM型教育改革の多国間比較を可能にするための参照項の抽出と理論的枠組みの構築を行った。なお補助事業は2014年9月12日から中断した(産前産後休暇:2014年9月12日から12月18日、育児休業:2014年12月19日から)。また再開後、補助事業延長の申請を予定している。補助事業再開後は、NPM型教育行政改革における市民の位置づけに関する多国間比較を行うため、以下の計画により展開していく。1.資料・文献収集及び調査:ニュージーランド同様にNPM型教育改革が遂行されながらも、ニュージーランドとは対照的に市場よりむしろ市民社会による統治が理念化されてきたオランダ及び/もしくはデンマークを比較対象に、二国の教育行政改革プランにおける市民の位置づけを資料・文献調査から明らかにする。2.現地調査:改革後の現実における市民と学校の関係性について現地調査を行う。3.二国における教育及び政治に関する思想的・制度的背景についてまとめ、1と2の研究成果との関係について考察する。4.成果発表:以上について学会発表及び投稿論文の形で成果発表を行う。本研究の目的は、NPM(ニュー・パブリック・マネジメント)型教育行政改革における市民の位置づけについて、これまで研究代表者がニュージーランドの教育行政改革を対象に行ってきた調査研究の成果をもとに、ニュージーランド同様にNPM型改革が遂行されながらも、市場よりもむしろ市民社会による統治が理念化されてきたオランダ、デンマークを比較対象として、二国の教育行政改革プランにおける市民の位置づけ、現実における市民と学校の関係性、それらの背景をなす教育や政治に関する思想的・制度的伝統について検討することである。平成27年度は、1ニュージーランドとの比較を念頭にデンマーク及びオランダの学校体系及び教育形態の多様性を把握すること、2NPMモデルの採用状況について、ニュージーランドとの共通点及び相違点を把握すること、3NPMモデルが採用されるに至る政治及び教育に関する制度的・思想的背景について検討する計画で研究を進めた。1については基本的な文献及び資料を収集し、学校体系の全体像の把握に努めた。2については、次年度以降に実施する現地調査に向けて準備すべく、関連する先行研究を収集し、文献等からNPM型として確認できる制度的特徴ないし政策事項の把握に努めた。3については、オランダ及びデンマークのNPMモデルにおける市民の位置づけについて明らかにするための前段階として、背景にある教育的・政治的思想の比較分析を行うための分析枠組みを、これまでの研究代表者によるニュージーランドを事例とした研究成果から構築した。3デンマーク及びオランダにおけるNPMモデルの採用を条件づけた制度的・思想的背景について、ニュージーランドとの比較を行うための分析枠組みの構築をほぼ完成させることができた。しかし、1学校体系及び教育形態と2NPMモデルの採用状況について把握する作業が遅れている。産前産後の休暇及び育児休業の取得に伴い研究は平成27年度9月1日から再開した。本研究の目的は、NPM(ニュー・パブリック・マネジメント)型教育行政改革における市民の位置づけについて、同改革を市場原理のもとに実施してきたニュージーランドと比較すべく、市場よりもむしろ市民社会による統治を理念化してきた国との比較を通じて、改革理念における市民の位置づけ、現実における市民と学校の関係性、またそれらの背景をなす教育や政治に関する思想的・制度的伝統について検討することである。教育行政改革におけるNPMモデルの採用を条件づけた制度的・思想的背景について比較研究を行うためにH27年度に構築した分析枠組みをふまえ、平成28年度は、日本との比較検討及びニュージーランドにおける実態調査を行った。日本との比較検討においては、日本で市民(保護者・住民)が運営参加する制度として設置が拡大している学校運営協議会(コミュニティ・スクール)の法制化を条件付けた理念及び思想的背景について整理・考察した。ニュージーランドにおける実態調査については、先住民マオリの部族により創設・運営されている先住民学校を対象に現地調査を行った。また市民或いは民間により運営される学校として近年ニュージーランドで法制化されたパートナーシップ・スクール(アメリカにおけるチャーター・スクールにあたる)に着目し、多様に展開されている同スクールの事例調査を行うと同時に、同スクールが開校された学区内の公立学校訪問調査、教育省等聞き取り調査を実施し、NPM型改革を行ってきた公教育制度全体における制度の意味について検討しつつ、2つの学校種における市民の位置づけについて考察した。H27年度に構築した多国間比較のための分析枠組みを用い、日本の学校運営協議会制度(コミュニティ・スクール)の法制化を条件づけた理念及び思想的背景について検討し、同制度が目指すとするコミュニティの活性化については、その道筋を具体的に基礎づける思想や理論は不在もしくは捨象されていった可能性を指摘した上で、その空白を埋めるべく地域社会の活性化に向けた課題を理論的に整理した。

また市民或いは民間主導で創設・運営される学校として近年ニュージーランドで法制化されたパートナーシップ・スクール(いわゆるチャーター・スクール)について現地調査(学校訪問調査、学校長対象インタビュー調査、教育省等聞き取り調査)を行い、NPM型教育行政改革を行ってきた同国の公教育制度を取り巻く文脈において同制度はどのような理念のもとに位置づけられ、具体的にはどのような特徴を持つ学校が開設され、そこにはどのような多様性が見られ、またそれぞれいかに運営されているのか、それぞれの学校運営において市民はどのような役割を果たしているかについて検討した。本研究は、NPM(ニュー・パブリック・マネジメント)型教育行政改革における市民の位置づけについて、市民と学校の関係性、また背景をなす教育や政治に関する思想的・制度的伝統について検討するものである。研究期間全体を通じて、主として市民による学校運営参加の理念のもとに改革を進めたニュージーランドを事例に、多数派ヨーロッパ系生徒との間の教育格差が著しいマイノリティの先住民及び移民(太平洋島嶼系)生徒の在籍比率が高い学校を中心に調査研究を行った。2015年度には、同国における制度改革の背景をなした政治的・思想的条件について整理し、同国の改革が、左派が準備した改革構想を土台に、先住民マオリの民族自決運動を象徴的に利用しつつ新制度派経済学の論理が導入され、その後マネジリアリズムとの両輪がニュー・ライトの後押しのもと貫かれる形で成立したことを見出した。2016・2017年度は、同国における2種の学校タイプ、すなわち先住民マオリ市民が民族自決運動の文脈において草の根レベルの運動により創設し、運営してきた経緯をもつ公立の先住民学校と、新たに近年法制化されたチャーター・スクールにあたるパートナーシップ・スクールに着目し、現地調査を行った。結果、民族自決運動を展開してきたマオリ系市民にとって、NPM型改革は二重の意味をもたらしていること、またニュージーランド版チャーター・スクール制度はその正統性が民主主義的に担保されているとは言えず、広く学校関係者の間に深刻な軋轢を生んでいる一方で、結果責任が強く求められる同学校制度は先住民生徒や太平洋島嶼系移民生徒の教育向上に資すると期待する向きもあること、とりわけ太平洋島嶼系生徒にとっては自文化の新たな承認の機会となっていること、等を明らかにした。本研究では、ニュージーランドのニュー・パブリック・マネジメント型教育行政改革を事例に、改革における市民の位置付けについて実証的に検討した。
Y染色体無精子症責任領域の遺伝子多型と精子濃度の関連についての研究

先頃,我々は1.日本人男性(子どものある人)のY染色体を4つに分類し,それぞれのタイプの男性の精子数を調べると,タイプにより精子数が有意に異なる。2.精子数の少ないタイプは,他のタイプに比べて無精子症になりやすい。ことを報告した。また,いくつかのマスコミで報じられたように,このうち精子数の少ないタイプは原日本人(縄文系)のタイプと考えられる。これらの事実から,直ちに発せられる質問の代表的なものは,「なぜ精子数が少なく無精子になりやすい男性の系統が生き残ってきたのか」ということであり,さまざまな研究の方向性が考えられるが,本研究では1.ヒトとヒトで,どの程度Y染色体の構造が違うのが。2.Y染色体の構造の違いがどのようにして,精子数の違いにつながるのか。に絞って研究を進めた。Y染色体には今のところ精子形成に関与していると考えられる遺伝子2つ(RBM,DAZ)が報告されているが,どちらも複数コピーある。これらの遺伝子が精子形成に関わっているという確たる証明がなされてはいない一方で,他の遺伝子がある可能性も指摘されている。本研究ではRBM,DAZを含め,個体によるY染色体の構造の違い(遺伝子のコピー数,各コピーのプロモータ領域,コーディング領域の塩基配列の違いを解析することを目的としているが,まずコピー数の違いから検討した。P.Yenの方法によるとDAZのそれぞれのコピーの違いを判別することができる。この方法を日本人にも当てはめ,まず,P.Yenのプローブと実験系を使って,日本人の4つのタイプのY染色体において,DAZの構造を解析,その違いを明らかにした。その結果,タイプIIとしていた系統の男性では,他のタイプの男性に見られるバンド1本が明らかに欠失していた。一方,将来の研究展望のもと理化学研究所藤山秋佐夫先生との共同で4つの男性の系統のY染色体特異的ライブラリーを樹立を試みている。ことを報告した。
多連続不斉中心を含む鎖状系有機分子構築法の開発と天然物合成への応用

多不斉中心を有する鎖状有機分子を高立体選択的に作り分ける精密有機合成手法の開発は現代有機化学の重要なテーマである。本研究はエポキシドの求核置換反応を基軸とし,新しい概念に基づく立体特異的鎖状有機分子構築法を開発するとともに,それらを生理活性天然物の全合成へ応用展開し,有機合成に新局面を拓くことを目的として行われた。その結果,本基盤研究費が交付された平成12年14年度の3年間に以下の研究成果を得た。(1)2,3-エポキシアルコールのC2位選択的アルキル化反応の開発(2)有機アルミニウムートリアルキルシリルトリフラートの組み合わせによるエポキシドの立体特異的アルキル化-シリル化反応の開発(3)γ,δ-エポキシ-α,β-不飽和エステル系の立体選択的S_N2'反応の開発(4)二重立体反転を伴う立体特異的鎖状有機分子構築法の開発(5)ホウ素キレートのエンド開環反応を機軸とする2,3-エポキシアルコールのC2位選択的求核置換反応の開発また特異な生物活性と化学構造を有する以下の天然物の全合成を達成した。(1)トウモロコシの宿主特異的病原毒素PM-Toxin A及びBの不斉全合成(2)高歪み天然物インゲノールの全合成(3)強力な抗癌活性を示す海産天然物サイトファイシンCの立体選択的全合成(4)イオノフォアー抗生物質ジンコフォリンの不斉全合成多不斉中心を有する鎖状有機分子を高立体選択的に作り分ける精密有機合成手法の開発は現代有機化学の重要なテーマである。(1)トウモロコシの宿主特異的病原毒素PM-Toxin A及びBの不斉全合成(2)高歪み天然物インゲノールの全合成(3)強力な抗癌活性を示す海産天然物サイトファイシンCの立体選択的全合成(4)イオノフォアー抗生物質ジンコフォリンの不斉全合成(1)エポキシアルコールのC-2位選択的アルキル化およびアルキニル化反応の開発2,3-エポキシアルコールのC-2位選択的炭素-炭素結合形成反応は合成的に非常に有用であるにもかわらず,これまで有機銅試薬によるアルキル化反応を除いて全く知られていない。申請者らは,独自にアート型アルミニウム反応剤を用いる方法論を考案し,エポキシアルコールのC-2位選択的かつ立体特異的アルキル化およびアルキニル化反応を開発した。新たに開発した手法は,従来の有機銅試薬よりもはるかに高い立体選択性ならびに化学収率で生成物を与えることが判明した。これらの成果を現在アメリカ化学会に投稿中である。(2)シスおよびトランスエポキシドの立体特異的相互変換これまで困難とされていた「シスおよびトランスエポキシドの立体特異的相互変換」をエポキシスルフィドを用い,二重立体反転を伴うハロゲン置換反応を設計することにより高選択的かつ高効率的に行えることを発見した。本法は天然物合成を含む有機合成に有力な手法を提供するものと考えられる。(3)海洋産天然物ミサキノライドの不斉全合成研究強力な抗癌活性を有する海産天然物ミサキノライドの不斉全合成研究を展開し,ピラン環部および10個の不斉中心を含む重要中間体の高立体選択的合成に成功した。これらの成果をイギリス化学会誌および日本化学会誌に発表した。(4)海洋産天然物サイトフィシンの不斉全合成研究強力な抗癌活性を示す海産天然物サイトフィシンの全合成研究を行い,合成上の最重要課題となるジヒドロピラン環部およびポリプロピオネート鎖の立体選択的合成に成功した。(1)二重立体反転を伴う立体特異的鎖状有機分子構築法の開発(研究代表者)エポキシスルフィドと有機アルミニウムとの置換反応を詳細に検討し、エピスルホニウムイオンを経由し二重立体反転を伴って進行する新しい立体特異的アルキル化及びアルキニル化反応を開発した。本法は、従来の立体反転を伴って進行するエポキシドの求核置換反応とは全く異なり、二重立体反転を伴った生成物を高立体選択的に与えることから、有機合成に極めて有力な手法を提供する。これらの成果をアメリカ化学会(J. Org. Chem.)に発表した。(2)エポキシアルコールのC-2位選択的アルキル化およびアルキニル化反応の開発(分担者)2,3-エポキシアルコールのC-2位選択的炭素-

炭素結合形成反応は合成的に非常に有用であるにもかかわらず、これまで有機銅試薬によるアルキル化反応を除いて全く知られていない。今回、独自にアート型アルミニウム反応剤を用いる方法論を考案し、エポキシアルコールのC-2位選択的かつ立体特異的アルキル化およびアルキニル化反応を開発した。これらの成果をアメリカ化学会(Org. Lett.)に発表した。(3)海洋産天然物サイトファイシンCの不斉全合成研究(研究代表者)強力な抗癌活性を有する海産天然物サイトファイシンCの高立体選択的全合成を達成した。(4)シスおよびトランスエポキシドの立体特異的相互変換(分担者)これまで困難とされていた「シスおよびトランスエポキシドの立体特異的相互変換」をエポキシスルフィドを用い、二重立体反転を伴うハロゲン置換反応を設計することにより、世界に先駆けて達成した。これらの成果をドイツ化学会誌(Angew. Chem. Int. Ed. Engl.)に発表した。(1)シスおよびトランスエポキシドの立体特異的相互変換「シスおよびトランスエポキシドの立体特異的相互変換」をエポキシスルフィドを基質とし,二重立体反転を伴うハロゲン置換反応を設計することにより,世界に先駆けて達成した。これらの成果をドイツ化学会誌(Angew. Chem. Int. Ed.)に発表した。(2)アセチレンジコバルト錯体を基軸とする分子間[5+2]型付加環化反応の開発アセチレンジコバルト錯体を5炭素ユニットとし,シリルエノールエーテルを2炭素ユニットとする分子間[5+2]型付加環化反応を考案し,シクロヘプタノン類の高立体選択的合成を達成した。成果をアメリカ化学会(Org. Lett.)に発表。(3)インゲノールの全合成トウダイグサ科の植物から単離されたジテルペンで発癌プロモータ活性や抗白血病活性など特異な生理活性を示すインゲノールの全合成および不斉全合成を達成した。これらの成果をアメリカ化学会誌(J. Am. Chem. Soc.)に発表。(4)サイトファイシンCの立体選択的全合成独自に開発した立体特異的鎖状有機分子構築法を基盤とし,強力な抗癌活性を示す海産天然物サイトファイシンCの立体選択的全合成を達成した。成果をAngew. Chem. Int. Ed.誌に投稿中。(5)Zn(II)イオンを取り込む特異な抗生物質ジンコフォリンの高立体選択的全合成新たに開発した立体特異的鎖状有機分子構築法を基軸とし,Zn(II)イオンを取り込む特異な抗生物質ジンコフォリンの高立体選択的全合成を達成した。
新らしい揮発性細胞増殖因子

正常ヒト繊維芽細胞を培養皿にフタ無しの状態で培養すると、細胞の増殖が著しく減少すること、また二つに仕切られたシャ-レの片方で細胞を培養し、もう一方に牛胎児血清を入れておくと細胞の増殖が有意に高まることを見出した。この現象は細胞あるいは血清由来の揮発性細胞増殖因子の存在を示唆している。以上のことから二の因子の単離同定を試みた。牛胎児血清を凍結乾燥させその蒸気部分を二重トラップすなわちー40°Cのエンタノ-ルトラップによる水の回収とー195.8°Cの液体窒素トラップによる残りの物質の回収により凝固集収した。その結果液体窒素トラップ中に小量の強い臭いのある画分が得られた。この画分は液体クロマトグラフィ-では吸着が強く溶出が不能であった。ガスクロマトグラフィ-ではTENAXーTAやキャピラリ-カラムを用いた場合に分離が可能であった。そこでTENAXーTAカラムを用いたガスクロマトグラフィ-・マススペクトロメトリ-(GCーMS)によって分離同定を試みた。その結果エタノ-ル,アセトン,アンモニア,シクロヘキサノ-ルが既知物質として同定されその他数種類の物質が認められたが未同定のまゝである。同定された4種類の物質には増殖促進効果は認められなかった。しかしながらシクロヘキサノ-ルや飲酒によらないエタノ-ルが血中に存在する亊実は興味深くこれらの生理的意義は検討するに値いすると思われる。現在、未同定の物質について更にGCーMSやMSーMSによる同定を試みている。正常ヒト繊維芽細胞を培養皿にフタ無しの状態で培養すると、細胞の増殖が著しく減少し、また二つに仕切られたシャ-レの片方で細胞を培養しもう一方に牛胎児血清を入れておくと細胞の増殖が有意に高まる。以上のことからこの因子の単離同定を目的として以下の実験を試みた。牛胎児血清を凍結乾燥させてその蒸気部分を二重トラップすなわち一段階目は-40°Cのエタノ-ルトラップ、二段階目は-195.8°Cの液体窒素トラップを用いて回収した。その結果エタノ-ルトラップでは主としてH_2Oが、液体窒素トラップでは小量の強い臭のある画分が得られた。この画分の高速液体クロマトグラフィ-による分離を様々なカラムを用いて試みたが、いづれも吸着が激しく溶出が不能であった。そこで、ガスクロマトグラフィ-による分離を試みた。TENAXーTAあるいはキャピラリ-カラムで分離が可能であった。TENAXーTAカラムでは数種のピ-クが、またキャピラリ-カラムではそれ以上のピ-クが得られた。しかしながらガスクロマトグラフィ-による分取は困難であるばかりかたとえ分取できても量が少な過ぎて細胞に対する増殖促進効果を測定することはできない。また同様に分取して物質の同定することも勿論困難である。そこで本物質が低分子であることから、GCーMSによる分離同定を行い、それを合成して生理活性を調べる方針で現在研究を進めている。前年度に引き続いて物質の単離同定を試みた。牛胎児血清を凍結乾燥させてその蒸気部分を二重トラップで回収した。前年度報告した通り,液体窒素トラップで回収した部分はTENAXあるいはキャピラリ-カラムによるGC分離は可能であるが,少量のため回収はできない。そこでGCーMSによる構造解析を試みた。その際サンプルは無修飾のものおよびメチル化したものの両方について試めした。その結果,既知物質としてエタノ-ル、アセトン、アンモニア、シクロヘキサノ-ルが同定され、その他数種類の物質が認められたが未同定である。同定された4つの既知物質について細胞増殖に対する効果を調べたところ、低濃度では(10mM)いづれも促進も抑制も引き起さず、高濃度になると当然のことながら毒性を示した。

従ってこれらの物質のいづれかヾ増殖因子の本体とは言い難い。しかしながら、血中にアセトン、アンモニアが存在することは従来よりよく知られていたが、飲酒によらないエタノ-ルやシクヘキサノ-ルが存在するという報告は見当らず、これらの生理的役割を検討することは意味があると思われる。現在本サンプルの様々な修飾を試みており、それによって液クロ系が使えないかどうかを検討している。更に未同定の物についてはGCーMSによる解析を繰り返し行っている。
SERMによるエストロゲン受容体と転写共役因子間のクロストーク-FRETを用いたタンパク質分子間相互作用の解析-

当初の本研究の目的は、エストロゲン受容体とそのコアクチベーターまたはコレプレッサーの相互作用をGFPとERalphaのキメラタンパク質を用いて解析することであった。研究の初年度に、研究に用いるGFP融合キメラタンパク質を作成し、そのキメラタンパクがERalphaの性質を有しているか確かめる実験の過程で、偶然ある興味深い結果が得られた。ERalphaは核内受容体の一種であり、エストロゲンなどのリガンドにより核内の分布が変化することが知られている。我々は、EGFやIGF-1などの成長因子でも同様の分布の変化を発見した。この現象は、エストロゲン感受性の腫瘍細胞が、ホルモン療法に抵抗性を獲得するメカニズムに深く関与することを推察させるものであった。そこで、この成長因子によるエストロゲン受容体分布の変化のメカニズムを明らかにすることにした。成長因子によるエストロゲン受容体分布の変化は、エストロゲンでは5分以内に変化が発生するのに対し、30から60分後に認められた。成長因子によるERalphの分布の変化は、MAPキナーゼまたはPI3キナーゼの阻害剤によってそれぞれ抑制された。また、エストロゲン受容体のAF2を欠失したmutantをもつERalphaを発現させた細胞では、エストロゲンおよび成長因子投与によるエストロゲン受容体の変化は認められなかった。また、エストロゲン依存性の遺伝子発現をルシフェラーゼアッセイにて検討したところ、エストロゲンは約8倍の遺伝子発現の増加を示し、成長因子は約3倍の増加をしました。成長因子によるこの遺伝子発はMAPキナーゼまたはPI3キナーゼの阻害剤の前投与で抑制された。以上の結果は、成長因子によるERaplhaの核内分布の変化は、少なくともERalphaのAF2部分が関与しており、MAPキナーゼ経路またはPI3キナーゼ経路が関与していることを示唆する。今回の研究は、選択的エストロゲン受容体モジュレーター(SERM)の臓器特異性を転写共役因子との相互作用の観点からFRET解析を行い明らかにすることを目的とした。今年度は、ERα融合GFPタンパク質の作成を行い、GFP-ERαの局在および機能について解析を行った。GFP-ERαのキメラコンストラクトを作成後、ERαを持たないCOS-7 cellへlipofection法を用いて遺伝子導入し、蛍光顕微鏡を用いて細胞内の局在を観察した。GFP-ERαは核内に発現が認められた。次にエストロゲン応答性をみるためにCOS-7 cellに遺伝子導入後luciferase法を用いERE-tkのプロモーターアッセイを行った。コントロールと比較して約8倍の活性比が認められた。さらに、ligand投与によるGFP-ERαの核内分布の変化を共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。Ligandはエストロゲン及びSERMであるタモキシフェン、ラロキシフェンを用いた。これまでの報告同様、エストロゲン、タモキシフェン、ラロキシフェン投与後10分以内にGFP-ERαの核内分布は顆粒状に変化した。以上より、今回作成したGFP-ERα融合タンパク質は機能的にERαと同様の性質を有していることがわかった。また、AF-2ドメインの欠失したERαを用いて、GFP-mtERαのキメラコンストラクトを作成し、GFP-ERαと同様に細胞内局在、ERE-tkのプロモーターアッセイ、ligandに対する核内分布の変化を観察した。AF-2ドメインを欠失したGFP-mtERαはエストロゲン、SERMに対する応答性は観察されなかった。次年度は、転写共役因子融合GFPタンパク質を作成し、今年度作成したGFP-ERαとの相互作用についてFRET解析を行う予定である。

昨年までの研究で、エストロゲン受容体α(ERα)とgreen fluorescent protein(GFP)のキメラ蛋白質(GFP-ERα)の作成および各種リガンド(エストロゲン、タモキシフェン、ラロキシフェン)による核内分布の変化について検討した。これらの実験結果を踏まえ今年度は転写共役因子融合GFP蛋白質の作成およびGFP-ERαと転写共役因子融合GFP蛋白質の相互作用の解析を行う予定であったが、GFP-ERαの核内分布の変化がリガンド以外の成長因子でも観察される事を発見したため、今年後は成長因子によるGFP-ERαの核内分布の変化を解析することにした。成長因子はERαを介して細胞の増殖に関与することが知られているが、ERαの核内分布と成長因子の関係について検討を行った報告はまだない。成長因子として、epidermal growthfactor(EGF)、insulin growthfactor-1(IGF-1)を用い、GFP-ERαを発現させたMCF-7細胞におけるGFP-ERαの核内分布の変化およびその細胞内シグナル伝達機構について検討を行った。EGF、IGF-1はGFP-ERαの核内分布をリガンドと同様に顆粒状に変化させた。しかし、その変化はリガンドが数分以内で観察されるのに対し、EGFでは投与後30分、IGF-1では投与後60分で観察された。EGF投与によるGFP-ERα核内分布の変化はMAPキナーゼ阻害薬で抑制された。IGF-1投与によるGFP-ERα核内分布の変化はPI3キナーゼ阻害薬で抑制された。さらに、ERのAF-2ドメイン欠失ミュータント融合GFPα(GFP-mtERα)を発現させたMCF-7細胞では、BGFおよびIGF-1投与によるGFP-mtERαの核内分布は変化しなかった。本研究の当初の目的は、選択的エストロゲン受容体モジュレーターの作用機序の一つと考えられるエストロゲン受容体(ER)とそのコアクチベーターの相互作用をGFPも用いて解析する事であった。平成15年にERalpha融合GFPタンパク質の作成と乳がん細胞のcell lineにおける発現実験を行った。ERはリガンドであるエストロゲンを投与する事によってその核内分布が変化する事がこれまでに報告されていたが、非リガンドであるEGFやIGF-1などの成長因子によってもERの核内分布が変化する事が実験の過程で明らかになった。この結果は、EGFまたはIGF-1による細胞膜にある各々の受容体(EGF、IGF-1受容体)を介した細胞内シグナルが核内へ伝達しERの分布を変化させたことを示唆するものである。この現象は、ホルモン依存性の腫瘍のホルモン療法に対する感受性の低下のメカニズムを明らかにする事につながると考えられる。そこで平成16年度は、当初の予定を変更し、リガンド非依存性のER受容体の核内分布の変化のメカニズムについて解析を行った。解析の結果、EGFやIGF-1は、MAP kinase経路またはPI3 kinase経路による細胞内シグナルを介してER受容体の核内分布を変化させていることがわかった。
眼球側面画像を用いた視線ジェスチャの識別

本研究の目的は,手足が不自由な運動弱者の生活の質を改善するため,眼球を側面から撮影した画像を用いて特定の眼球運動パターン(視線ジェスチャ)を識別することにより,情報機器のハンズフリー操作を可能にするウェアラブルインタフェースを開発することである.平成30年度は,メガネフレームに眼球側面撮影用カメラ(アイカメラ)を装着するためのジョイントの改良,眼球回転による黒目領域消失時の画像処理アルゴリズムの開発,及び視線ジェスチャによる情報機器の操作方法の検討・開発に取り組んだ.最初に,ジョイントの改良について,新たに3自由度をもつ小型軽量のジョイントを設計・開発した.これにより,昨年度の試作品と比較してアイカメラの位置・方向の調整が容易になった.次に,眼球側面画像では,眼球がアイカメラの反対側へ大きく回転すると黒目(虹彩)領域が消失して白目領域のみとなってしまう.このような眼球が一側に大きく回転した状態を視線ジェスチャの1つとして入力操作に利用するため,HSV色空間を用いた白目領域検出法を開発した.特定の眼球運動パターンと情報機器の操作コマンドを対応づける従来の視線ジェスチャ方式には,ジェスチャ(操作コマンド)の数が少ないという課題がある.そこで,4種類の簡単な視線ジェスチャと5段階の頭部回転動作を組み合わせた20通りのコマンド入力方法を開発した.ユーザは,正面のディスプレイを見ながら,頭を上に回転させる(U),頭を下に回転させる(D),頭を右に回転させる(R),及び眼を正面→右→正面の順に素早く動かす(S),という4種類の視線ジェスチャ(U,D,R,S)の中から1つのジェスチャを実行した後,正面方向を見ながら頭を左方向に5段階の角度で回転させることで情報機器をハンズフリーで操作する.PCを用いたコマンド入力実験により,20通りの入力が可能であることを確認した.市販のメガネフレームにアイカメラを装着するためのジョイントを改良した.これにより,アイカメラの位置・方向の調整が容易となった.アイカメラの反対方向への眼球回転により黒目領域が消失した状態を検出する画像処理法を開発し,この状態を視線ジェスチャの1つとして利用することができるようになった.さらに,4種類の簡単な視線ジェスチャと5段階の頭部回転動作を組み合わせた20通りのコマンド入力方法を開発し,PCを用いた視線操作実験により20通りのコマンド入力が可能であることを確認した.これまでに,眼球側面画像撮影用カメラと市販のメガネフレームからなる視線追跡メガネ及び視線ジェスチャを検出するための画像処理アルゴリズムを開発した.次年度は,快適なハンズフリー操作を実現するという観点から,新たな視線ジェスチャとその検出方法を検討・開発するとともに,実際にPC上のアプリケーションをハンズフリー操作したときの視線ジェスチャの利便性について評価する.本研究では,手足が不自由な運動弱者の生活の質を改善するため,眼球を側面から撮影した画像を用いて視線ジェスチャを識別することにより,キャリブレーションフリーで情報機器のハンズフリー操作を可能にするウェアラブルインタフェースを開発する.平成29年度は,眼球撮影用カメラ(アイカメラ)を装着した視線追跡メガネの試作と画像処理アルゴリズム(眼球領域の自動決定法と眼球特徴点の抽出方法)の開発,及び眼と頭の動きを利用した視線ジェスチャの検討に取り組んだ.最初に,ユーザ所有のメガネ(または市販のメガネ)を利用できるように,メガネフレームのテンプル部分にアイカメラを装着するためのジョイントを開発した.このジョイントは,強度と軽量化を両立させるためにハニカム構造をもち,最大で幅7 [mm]のメガネフレームにアイカメラを接続し,カメラ位置を上下方向に最大15 [mm],テンプル方向に最大25 [mm]の範囲内で調節できるようになっている.次に,画像処理アルゴリズムについて,視線追跡メガネで撮影した眼球側面画像には眼球と無関係な背景などの領域が含まれる.そこで,閉眼画像と開眼画像の輝度値の変化を利用した眼球領域決定法を開発し,まばたきするだけで眼球領域を取得できることを確認した.次に,眼球領域内から視線の動きに連動する特徴点を検出する方法を開発し,自然照明下において30フレーム/秒で特徴点を検出できることを確認した.特定の眼球運動パターンと情報機器の操作コマンドを対応づける従来の視線ジェスチャ方式には,ジェスチャの種類が少ないという課題がある.そこで,眼の動きと頭部の回転動作を利用した首振り視線ジェスチャについて検討し,眼球側面画像から2種類の眼球運動(サッカードと前庭動眼反射)を検出することによりリアルタイムでPCの視線入力操作が可能であることを確認した.アイカメラを市販のメガネフレームのテンプル部分に接続するためのジョイントを設計・開発し,視線追跡メガネを試作した.次に,自然照明下において,アイカメラ画像から眼球領域を決定し,眼球特徴点を検出する画像処理アルゴリズムを開発した.さらに,試作した視線追跡メガネを用いて首振り視線ジェスチャを検出し,リアルタイムでPCの視線入力操作が可能であることを確認した.本研究の目的は,手足が不自由な運動弱者の生活の質を改善するため,眼球を側面から撮影した画像を用いて特定の眼球運動パターン(視線ジェスチャ)を識別することにより,情報機器のハンズフリー操作を可能にするウェアラブルインタフェースを開発することである.平成30年度は,メガネフレームに眼球側面撮影用カメラ(アイカメラ)を装着するためのジョイントの改良,眼球回転による黒目領域消失時の画像処理アルゴリズムの開発,及び視線ジェスチャによる情報機器の操作方法の検討・開発に取り組んだ.

最初に,ジョイントの改良について,新たに3自由度をもつ小型軽量のジョイントを設計・開発した.これにより,昨年度の試作品と比較してアイカメラの位置・方向の調整が容易になった.次に,眼球側面画像では,眼球がアイカメラの反対側へ大きく回転すると黒目(虹彩)領域が消失して白目領域のみとなってしまう.このような眼球が一側に大きく回転した状態を視線ジェスチャの1つとして入力操作に利用するため,HSV色空間を用いた白目領域検出法を開発した.特定の眼球運動パターンと情報機器の操作コマンドを対応づける従来の視線ジェスチャ方式には,ジェスチャ(操作コマンド)の数が少ないという課題がある.そこで,4種類の簡単な視線ジェスチャと5段階の頭部回転動作を組み合わせた20通りのコマンド入力方法を開発した.ユーザは,正面のディスプレイを見ながら,頭を上に回転させる(U),頭を下に回転させる(D),頭を右に回転させる(R),及び眼を正面→右→正面の順に素早く動かす(S),という4種類の視線ジェスチャ(U,D,R,S)の中から1つのジェスチャを実行した後,正面方向を見ながら頭を左方向に5段階の角度で回転させることで情報機器をハンズフリーで操作する.PCを用いたコマンド入力実験により,20通りの入力が可能であることを確認した.市販のメガネフレームにアイカメラを装着するためのジョイントを改良した.これにより,アイカメラの位置・方向の調整が容易となった.アイカメラの反対方向への眼球回転により黒目領域が消失した状態を検出する画像処理法を開発し,この状態を視線ジェスチャの1つとして利用することができるようになった.さらに,4種類の簡単な視線ジェスチャと5段階の頭部回転動作を組み合わせた20通りのコマンド入力方法を開発し,PCを用いた視線操作実験により20通りのコマンド入力が可能であることを確認した.これまでに,眼球側面画像撮影用のカメラ(アイカメラ)とメガネフレームからなる視線追跡メガネを試作し,画像処理アルゴリズム(眼球領域の決定法と眼球特徴点の抽出方法)を開発した.平成30年度は,ユーザの目の形状にあわせて画像処理パラメータを自動決定する方法の開発に取り組む.さらに,視線入力実験を行い,快適なハンズフリー操作を実現する視線ジェスチャについて検討する.
がん遺伝子MYCNの神経発生での役割とその変異により起こる新規症候群の病態の解明

巨脳症、特異顔貌、指趾異常(両側多指症)、神経芽腫を示す患者を対象として全エキソーム解析を実施し、MYCN遺伝子にde novoのミスセンス変異(c.173C>T;P.Thr58Met)を同定した。変異の意義を明らかにするために、HEK293T細胞に変異蛋白を発現させたところ、T58のリン酸化が変異体では消失していた。T58のリン酸化はMYCNのユビキチン化による分解に必須のリン酸化であり、変異によりT58リン酸化が失われることで蛋白分解が障害され、変異蛋白が蓄積することが予想される。そこで、マウスから樹立した神経幹細胞を用いて、変異蛋白の安定性を調べたところ、変異蛋白では安定性が増加し、さらに、下流のCCND1およびCCND2の発現が増加していることを明らかにした。CCND1およびCCND2の機能亢進は既存の巨脳症の原因であることが知られている。したがって、患者に同定された変異はMYCNの安定性を亢進することで、下流遺伝子の発現増強を介して巨脳症を引き起こすことを明らかにした。さらに、野生型MYCNと変異型MYCNを子宮内胎仔脳遺伝子導入法によりマウス脳に導入したところ、どちらも神経細胞の増殖を促進することを明らかにした。この結果は変異MYCNが機能を維持していることを示す。これらの結果から、患者に同定された変異は機能亢進型変異であり、MYCNの機能亢進型変異が新規巨脳症症候群の原因となることを世界で初めて明らかにした。同時に、野生型MYCNおよび変異型MYCNをマウス発生期の脳で過剰発現させたところ、神経細胞の遊走が障害され、MYCNは神経細胞の遊走においても重要な役割を果たしていることを明らかにした。患者に同定した変異の機能解析を細胞生物学的および、子宮内胎仔脳遺伝子導入法のin vivoの系を用いて実施し、この変異が機能亢進型変異であることを解明した。さらに、そのメカニズムとして、ユビキチン蛋白分解に必須のリン酸化部位の障害であり、その結果蛋白安定性が増加すること。その結果、下流の遺伝子発現が増加すること。さらに、変異蛋白のin vivoにおける機能が維持されていることを示すことができ、機能亢進のメカニズムを解明することができた。これまでにMYCNの機能喪失型変異はFeingold小頭症症候群の原因となることは報告されていたが、機能亢進型変異が巨脳症を示すことは報告されていいず、今回の結果が世界初の報告である。患者に同定された変異の機能を解明できた点で、当初の計画は達成できたと考える。同時に、CRISPR/Cas9を用いたMYCNのノックインマウスの作成に取り組んでいる。患者変異を導入したF0マウスを得ることができ、現在F1マウスの作成を行っている。しかし、現時点ではまだF1マウスは得られていず、引き続き作成を進めている。RISPR/Cas9を用いたMYCNのノックインマウスについてはF0が得られ、野生型との交配を行っているが、現時点ではF1は得られていない。引き続き交配を進めて、F1マウスを得る作業を続ける。F1が得られた場合は、得られた変異マウスの中枢神経の評価を形態学的、遺伝学的、生化学的に評価する。すなわち、Myncの発現、下流のCcnd1、Ccnd2の発現を評価する。同時に、ヒト患者で見られた指趾の発生異常の有無、神経芽腫の発生の有無を評価し、モデル動物としての特徴を評価する。変異マウス特異的な異常が明らかになれば、これらの症状を対象として、種々の薬剤による効果の評価を行い、創薬のための基礎実験を行う。特に、mTOR経路の関与の程度を明らかにするために、mTOR阻害剤の影響を評価する。これまでの研究により、MYCN変異解析および機能解析の系を確立した。ヒト患者において巨脳症、指趾異常、神経芽細胞腫を示す患者を全国から集積し、変異解析と機能解析を行い、MYCN機能亢進により起こるヒト病態の解明を行う。患者集積に当たっては、学会などでMYCN変異例についての発表を行い、広く全国から患者を集積する。このように、モデルマウスを使った病態研究と患者集積によるヒトにおけるMYCN関連症候群の全体像の解明とを両輪とした研究を推進する。

したがって、患者に同定された変異はMYCNの安定性を亢進することで、下流遺伝子の発現増強を介して巨脳症を引き起こすことを明らかにした。さらに、野生型MYCNと変異型MYCNを子宮内胎仔脳遺伝子導入法によりマウス脳に導入したところ、どちらも神経細胞の増殖を促進することを明らかにした。この結果は変異MYCNが機能を維持していることを示す。これらの結果から、患者に同定された変異は機能亢進型変異であり、MYCNの機能亢進型変異が新規巨脳症症候群の原因となることを世界で初めて明らかにした。同時に、野生型MYCNおよび変異型MYCNをマウス発生期の脳で過剰発現させたところ、神経細胞の遊走が障害され、MYCNは神経細胞の遊走においても重要な役割を果たしていることを明らかにした。患者に同定した変異の機能解析を細胞生物学的および、子宮内胎仔脳遺伝子導入法のin vivoの系を用いて実施し、この変異が機能亢進型変異であることを解明した。さらに、そのメカニズムとして、ユビキチン蛋白分解に必須のリン酸化部位の障害であり、その結果蛋白安定性が増加すること。その結果、下流の遺伝子発現が増加すること。さらに、変異蛋白のin vivoにおける機能が維持されていることを示すことができ、機能亢進のメカニズムを解明することができた。これまでにMYCNの機能喪失型変異はFeingold小頭症症候群の原因となることは報告されていたが、機能亢進型変異が巨脳症を示すことは報告されていいず、今回の結果が世界初の報告である。患者に同定された変異の機能を解明できた点で、当初の計画は達成できたと考える。同時に、CRISPR/Cas9を用いたMYCNのノックインマウスの作成に取り組んでいる。患者変異を導入したF0マウスを得ることができ、現在F1マウスの作成を行っている。しかし、現時点ではまだF1マウスは得られていず、引き続き作成を進めている。RISPR/Cas9を用いたMYCNのノックインマウスについてはF0が得られ、野生型との交配を行っているが、現時点ではF1は得られていない。引き続き交配を進めて、F1マウスを得る作業を続ける。F1が得られた場合は、得られた変異マウスの中枢神経の評価を形態学的、遺伝学的、生化学的に評価する。すなわち、Myncの発現、下流のCcnd1、Ccnd2の発現を評価する。同時に、ヒト患者で見られた指趾の発生異常の有無、神経芽腫の発生の有無を評価し、モデル動物としての特徴を評価する。変異マウス特異的な異常が明らかになれば、これらの症状を対象として、種々の薬剤による効果の評価を行い、創薬のための基礎実験を行う。特に、mTOR経路の関与の程度を明らかにするために、mTOR阻害剤の影響を評価する。これまでの研究により、MYCN変異解析および機能解析の系を確立した。ヒト患者において巨脳症、指趾異常、神経芽細胞腫を示す患者を全国から集積し、変異解析と機能解析を行い、MYCN機能亢進により起こるヒト病態の解明を行う。患者集積に当たっては、学会などでMYCN変異例についての発表を行い、広く全国から患者を集積する。このように、モデルマウスを使った病態研究と患者集積によるヒトにおけるMYCN関連症候群の全体像の解明とを両輪とした研究を推進する。研究分担者