hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨格筋の発達・維持・萎縮における負荷依存性の分子基盤の理解

筋萎縮には力学的負荷の低下による可逆的なものと、加齢や疾病による不可逆なものが知られる。後者の不可逆性は、ユビキチン-プロテアソームによる筋タンパク質分解亢進等の筋萎縮に共通したパスウェイでは説明が出来ない。一方近年、筋幹細胞の減少や機能低下が不可逆的な筋萎縮をもたらすことが示された。このような研究の背景をふまえ、本研究は、ゼブラフィッシュを用いて、無重力による筋萎縮のメカニズムを問うとともに、それを廃用性筋萎縮や加齢による筋萎縮機構と比較し、その解析に基づく骨格筋萎縮の新規の制御機構の解明を目指してきた。本年度はまず、国際宇宙ステーション日本実験棟「きぼう」に、ゼブラフィッシュを35日間滞在させることによって、微重力環境におかれることによりゼブラフィッシュの骨格筋が萎縮することを見出した。そして、宇宙滞在後2日後、35日後、地上帰還後2日目、30日目のRNAを骨格筋などから単離し、それらのトランスクリプトームを地上に棲むゼブラフィッシュをコントロールとして比較解析し、変動する遺伝子を調べた。さらに、運動抑制モデルとして麻酔薬トリカインで処理した魚のトランスクリプトームを行い、この運動抑制フィッシュと宇宙滞在フィッシュの遺伝子発現変化の共通性・差異を探ることによって、骨格筋萎縮に関わるあらたなパスウェイを見出すことに成功した(未発表)。また、筋維持・萎縮の基盤として神経筋接合部の形成・維持・筋再生機構解明にも取り組んだ。神経筋接合部形成に関与する増殖因子活性化機構の解明(Kamezaki A et al., Sci. Rep., 2016)、神経細胞からメタロプロテアーゼ依存的に分泌される糖タンパク質の解析(Tsumagari K., et al., Genes to Cells, 2017)、損傷筋の再生時に起こる炎症反応の解析(投稿準備中)などの研究を行った。上記のように、骨格筋のトランスクリプトームを調べることにより、我々は筋萎縮につながるあらたなパスウェイを見出すことができた。成功の要因は第一に、宇宙滞在後2日、35日後、地上帰還後2日目、30日目、という時間経過を調べることによって、これまでよりも詳細な遺伝子変化を知り得たことにある。第二に、個体ごとのトランスクリプトームを行うことにより、多くの遺伝子に関して統計的に有意な差を捉えることができたところにある。第三に、運動抑制モデルとして麻酔薬トリカインで処理したゼブラフィッシュのトランスクリプトームを行い、それと比較することによって、変動遺伝子を分類することができたところにある。そして第四に、体幹の骨格筋だけでなく、他の臓器のトランスクリプトームも解析し、共通性と臓器特異性を評価したところにある。最後に、この変化が宇宙放射線で誘導される可能性も考慮に入れ、宇宙放射線を研究する計画研究A3の高橋(群馬大)や公募研究原田(京大)チームと共同で、ゼブラフィッシュにガンマ線を照射した際に変動する遺伝子との比較も行い、さらに分類の精度を高めたところにある。また、計画研究A2の森田(岐阜大)らの耳石ー前庭核研究、計画研究A1の細胞レベルや線虫をモデルとする成瀬・東谷の研究、メダカの宇宙実験を行った公募研究茶谷(昭和大)等、他の研究との情報交換・ディスカッションも、本研究の遺伝子パスウェイを調べる上で、きわめて重要な役割を果たした。上記のように、宇宙での骨格筋萎縮の新たなメカニズムを見出している。では、それらの遺伝子変化が宇宙滞在によってどのようにもたらされているか、メカニズムを知る必要がある。まず、それらの遺伝子変化が微重力によってもたらされるのかどうかを知るため、宇宙ステーションでゼブラフィッシュを遠心機にかけて1Gを達成し、微重力のままの個体と遺伝子変化を比較する予定である。この研究は、JAXAの「きぼう」の船内環境を利用する「フィージビリティースタディー」に採用され、本年度後半に宇宙実験を実施する予定である。また、運動抑制モデルとして麻酔薬トリカインで処理した魚においても変化が起こる遺伝子群に関しては、この実験系を用いることにより、どのようなメカニズムで遺伝子変化が起こるのか、地上実験として調べることが可能になった。一方、トリカイン処理では変化しない遺伝子群でも、興味ある遺伝子(群)がいくつか見られる事から、これらに関してはCRISPR-Cas9システムを用いて筋萎縮に関わるかどうかを検証する。また筋萎縮メカニズムとの関連において、筋再生機構、神経筋接合部形成・維持の研究はますます重要性を増しており、それらの研究も引き続き行う。ゼブラフィッシュの宇宙滞在実験をもとに、微重力環境による筋萎縮のメカニズムを、運動抑制・加齢による筋萎縮と比較しながら検証し、筋萎縮/維持の新しい機構の解明を目指している。運動抑制による筋萎縮は廃用性筋萎縮と考えられており、プロテアソーム系の活性化が既に知られている。今回のゼブラフィッシュ運動抑制においても多数のプロテアソーム関連遺伝子の発現増加が認められた。このことはゼブラフィッシュにおいても運動抑制によって廃用性筋萎縮が誘発されていることを示唆しており、ゼブラフィッシュが筋萎縮研究のモデル動物として有用であることを示すことができた。一方、加齢に関しては運動抑制と同様にいくつかのプロテアソーム関連遺伝子の発現増加が認められたが、運動抑制では変化が認められなかった遺伝子に関しても多数発現量が変化した遺伝子が確認された。これらの遺伝子の中には筋萎縮性疾患の原因遺伝子も含まれており、新規の加齢による筋萎縮メカニズムの解明の手がかりになると考える。宇宙滞在実験に関しては、軌道上2日後、軌道上約1カ月後、初めて成功した地上帰還後のゼブラフィッシュを試料として用いトランスクリプトーム解析を行っている。

軌道上約1カ月後の解析結果より、これまでの報告と同様の発現変動を示す遺伝子も確認されたが、逆の変動を示す遺伝子も多数確認されるなど、興味深い結果が得られている。また、経時的(地上→軌道上→地上)な遺伝子発現変動を解析することにより、宇宙滞在および地球帰還に対して早期に発現量が変化する遺伝子を同定することができた。これらの遺伝子の中には、既に筋萎縮との関連が報告されている遺伝子も含まれており、詳細な解析を進めるにあたり対象とする因子の選定に非常に有用なデータが得られた。個体ごとに次世代シークエンスによるトランスクリプトームを行うことによって、良質なデータが得られており、研究は順調に進んでいる。筋萎縮には力学的負荷の低下による可逆的なものと、加齢や疾病による不可逆なものが知られる。後者の不可逆性は、ユビキチン-プロテアソームによる筋タンパク質分解亢進等の筋萎縮に共通したパスウェイでは説明が出来ない。一方近年、筋幹細胞の減少や機能低下が不可逆的な筋萎縮をもたらすことが示された。このような研究の背景をふまえ、本研究は、ゼブラフィッシュを用いて、無重力による筋萎縮のメカニズムを問うとともに、それを廃用性筋萎縮や加齢による筋萎縮機構と比較し、その解析に基づく骨格筋萎縮の新規の制御機構の解明を目指してきた。本年度はまず、国際宇宙ステーション日本実験棟「きぼう」に、ゼブラフィッシュを35日間滞在させることによって、微重力環境におかれることによりゼブラフィッシュの骨格筋が萎縮することを見出した。そして、宇宙滞在後2日後、35日後、地上帰還後2日目、30日目のRNAを骨格筋などから単離し、それらのトランスクリプトームを地上に棲むゼブラフィッシュをコントロールとして比較解析し、変動する遺伝子を調べた。さらに、運動抑制モデルとして麻酔薬トリカインで処理した魚のトランスクリプトームを行い、この運動抑制フィッシュと宇宙滞在フィッシュの遺伝子発現変化の共通性・差異を探ることによって、骨格筋萎縮に関わるあらたなパスウェイを見出すことに成功した(未発表)。また、筋維持・萎縮の基盤として神経筋接合部の形成・維持・筋再生機構解明にも取り組んだ。神経筋接合部形成に関与する増殖因子活性化機構の解明(Kamezaki A et al., Sci. Rep., 2016)、神経細胞からメタロプロテアーゼ依存的に分泌される糖タンパク質の解析(Tsumagari K., et al., Genes to Cells, 2017)、損傷筋の再生時に起こる炎症反応の解析(投稿準備中)などの研究を行った。上記のように、骨格筋のトランスクリプトームを調べることにより、我々は筋萎縮につながるあらたなパスウェイを見出すことができた。成功の要因は第一に、宇宙滞在後2日、35日後、地上帰還後2日目、30日目、という時間経過を調べることによって、これまでよりも詳細な遺伝子変化を知り得たことにある。第二に、個体ごとのトランスクリプトームを行うことにより、多くの遺伝子に関して統計的に有意な差を捉えることができたところにある。
胚性幹細胞からつくる腸管に壁内神経系をつくる

まず、マウス胚性幹細胞から腸管様細胞塊(ES腸管)を作った。特別の分化誘導因子を加えない培地でのハンギングドロップ培養によるES腸管では、腸壁内神経細胞はほとんど存在しない。すなわち、内胚葉由来のマーカータンパク、サイトケラチン(Ker)、トレフォイルファクター3(TFF3)、カルシノエンブリオニックアンチジェン(CEA)は免疫染色陽性であり、中胚葉由来のマーカータンパク、スムーズマッスルアクチン(SMA)やc-kitは確実に免疫染色陽性であったが、神経の分化してくる外胚葉のマーカー、S-100は免疫染色陽性であったが、p75(neurotrophin receptor ; NTR)、c-retは陰性であった。そこで、神経栄養因子として、neurogrowthfactor(NGF)、glia cell line-derived neurotrophic factor(GDNF)、brain-derived neurotrophic factor(BDNF)等のうち腸管の壁内神経系の発生に最も有望と思われるBDNFをEB培養時に作用させると、神経堤細胞の形成を介して壁内神経系が分化誘導されるという結果が得られた(新規日本特許出願済;出願番号:特願2005-59547)。すなわち、BDNFの受容体であるtrk proto-oncogene(trkB)はEBと付着培養14-21日を通して発現が確認され、c-retはEBと付着培養14日目で発現が確認できた。一方、ニューロフィラメント(neurofilament ; NF)の免疫染色を行うと14-21日目でNF陽性の神経節や神経線維の分化を確認できた。ICCのマーカーであるc-kitについてはBDNFの処理、非処理に関わらず14-21日目で陽性であった。trkBおよびc-retはマウス胚からのin vivoにおける正常な壁内神経系の発生時に発現する。従ってEBからのin vitro分化において、まずBDNFがtrkBに作用し、神経堤を形成し、神経堤由来の細胞からNF陽性の神経節や神経線維(壁内神経系)が分化誘導されたと考えられる。in vitroの系において、in vivoにおける正常な壁内神経系の発生と同様な経路で、BDNFはES腸管に壁内神経系を形成したと思われる。今後はGDNFやNT-3によってBDNFと同じ結果が得られるかどうか検討する予定である。胚性幹細胞から特定の分化誘導因子を作用させることなくhanging drop法によって培養するとLIFを除いただけで、一定の確率で蠕動様運動を発生する腸管様細胞塊を分化誘導することが出来た(Stem cell,2002)。この細胞塊には壁内神経系は形成されず、神経細胞が少し散在するのみであった。しかし、特定の分化誘導因子(特許発願手続中)を作用させると一定の確率で出来た腸管様細胞塊において、複数の神経節から構成される壁内神経系を分化誘導させることに成功した。これらは、抗PGP9.5抗体や抗ニューロフィラメント抗体で免疫染色をすると綺麗に染まった。これらの神経を20Hzのトレイン刺激を用いて焦点電気刺激法により刺激すると、神経細胞内のカルシウム濃度上昇反応を示した。さらに、1ヶ所を刺激しただけで複数の神経節細胞のカルシウム濃度上昇反応が起こり、神経節とそれをつなぐ神経線維からなる壁内神経系のネットワークの形成が確認された。これらの成果はこのようにして出来た壁内神経系のネットワークが生理的に機能しうることを示している。つぎに、このような神経細胞が分化誘導された細胞塊でペースメーカー細胞であるカハールの間質細胞(ICC)も分化誘導出来ているかどうか抗c-Kit抗体で免疫染色した。その結果、神経だけでなく、ICCも分化誘導することが出来た事がわかった。このような腸管様細胞塊の運動を観察すると、袋状の構造という限界はあるものの、まさに高度にコーディネートされた蠕動運動が発生した。このような運動の発生には壁内神経系とICCの両方が必要である。

ICCのマーカーであるc-kitについてはBDNFの処理、非処理に関わらず14-21日目で陽性であった。trkBおよびc-retはマウス胚からのin vivoにおける正常な壁内神経系の発生時に発現する。従ってEBからのin vitro分化において、まずBDNFがtrkBに作用し、神経堤を形成し、神経堤由来の細胞からNF陽性の神経節や神経線維(壁内神経系)が分化誘導されたと考えられる。in vitroの系において、in vivoにおける正常な壁内神経系の発生と同様な経路で、BDNFはES腸管に壁内神経系を形成したと思われる。今後はGDNFやNT-3によってBDNFと同じ結果が得られるかどうか検討する予定である。
赤外線サーモグラフィーによる埋設地雷の探査に関する研究

赤外線サーモグラフィーは、遠隔非接触のリモートセンシングで物体表面から放射される熱放射エネルギーを感知し、二次元の熱画像として情報を提供することを特色としている。しかも比較的広範な領域を逐次探査可能である。この方法は、これまで単に物体表面の温度分布を可視化的に把握する手段として利用されてきたが、物体表面温度場の歪みから逆に隠れた物体内部を探査することには利用されていなかった。また探査のメカニズム、その伝熱機構および探査限界などは、当然明らかにはされていなかった。このことから本研究では、まず赤外線サーモグラフィーによる探査技法の基本的事項を明確にし、表層地下人口埋設物(埋設地雷、埋設危険物など)の探査へと応用した。すなわち、実験室スケールにて様々な材質・内部状況を有した試験片について探査の基礎的検討を加えた。次いで、専用砂場の表層地下に熱エネルギー(太陽熱入射、人工熱入射)を付加することによって人工埋設物上部地表面に発生する温度分布の歪みから対象物を検知する方法とその有効性について実験的な検討を加えた。同時に、数値シミュレーションを実施することで、探査の数理モデリングを行い、探査に付随する伝熱機構や探査限界(探査可能深度、対象物規模および材質など)を明らかにした。本研究で得られた知見は、要約すると以下のようになる。1)赤外線サーモグラフィーは、表層地下人工埋設物の探査に有効な手法であることを確認した。2)探査可能深度は、本実験の範囲内において、200mm程度である。3)赤外線サーモグラフィーは、森林地帯よりもむしろ砂漠などの比較的表面の放射率が均一な場所での探査に有効である。4)本研究で提案した数理モデルが実際の物理探査現象を模擬する上で有効なものであることを確認した。
同種移植片拒絶におけるHLAクラスI抗原分子由来ペプチドの意義

ドナーがHLA-B35を持ち、レシピエントがHLA-B51を持つ腎移植患者で、すでに移植腎が拒絶された患者の末梢血より、HLA-B35特異的アロCTLクローンを樹立するために、腎移植患者のドナー、レシピエントの組み合わせを検索した。300例の症例のうち、3例に、この組み合わせが認められた。このうち1例のレシピエントの末梢血より、HLA-B35特異的アロCTLクローンの樹立を試みたが、うまくいかなかった。これは、免疫抑制剤投与による、CTLの前駆細胞の減少が原因と思われた。残りの2例よりCTLクローンの樹立を試みたが、樹立できなかった。トランスジェニックマウス間の心移植で免疫抑制作用を有するα2ドメイン由来のペプチド(CDLGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIA)のアミノ酸配列から、over lapping peptidesを17種類作成した。これらのペプチドの免疫抑制効果をマウス心移植で判定したが、どのペプチドも抑制効果がなかった。(3)トランスジェニックマウス間の心移植では、移入したHLA分子は、アロ抗原として認識された。また、その拒絶反応の場合には、T細胞による細胞性免疫が主に働いていることが判明した。現在、残りの2例より、CTLクローンを樹立すべく、鋭意努力中である。トランスジェニックマウス間の心移植で免疫抑制作用を有するα2ドメイン由来のペプチド(CDLGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIA)のアミノ酸配列から、CDLGPDGRL、DLGPDGRLL、LGPDGRLLR、GPDGRLLRG、・・・・・・・・、SAYDGKDYI、AYDGKDYIAの如くoverlapping peptidesを17種類作成した。残りの2例よりCTLクローンの樹立を試みたが、これもだめであった。トランスジェニックマウス間の心移植で免疫抑制作用を有するα2ドメイン由来のペプチド(CDLGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIA)のアミノ酸配列から、.CDLGPDGRL、DLGPDGRLL、LGPDGRLLR、GPDGRLLRG、・・・・・・・・、SAYDGKDYI、AYDGKDYIAの如くoverlapping peptidesを17種類作成した。これらのペプチドの免疫抑制効果をマウス心移植で判定したが、どのペブチドも抑制効果がなかった。
軟弱地盤上の防波堤の変状と崩壊機構に関する研究

軟弱な海底地盤上に築造された防波堤は、変状や崩壊を生じ易く、その防災機能を失いつつあるものが少なくない。防波堤に関する最近の災害・事故例の報告によると、特に漁港施設においてその傾向が顕著にみられる。本研究においては、かかる事態を踏まえて次のような研究を実施した。1.軟弱な基礎地盤を処理するために、防波堤施工時に、締固め砂杭工法などに代表される地盤改良が行われる。しかし設計に当っては、複合地盤の支持力理論が完全でないために、依然として円狐すべり法が用いられている。本研究では、地盤改良に伴う周辺地盤の乱れ、および初期応力状態(特に静止土圧係数)の変化を、既往の現場計測結果と室内三軸試験結果より仮定しこれらの影響を加味した有限要素解析を実施した。その結果、地盤改良後ある放置期間を設けることによって、改良域周辺地盤にも自然地盤以上の強度を期待できることが分った。2.軟弱地盤上の防波堤では、捨石マウンド内にH型鋼材などを設置する場合がある。これは沈床と呼ばれるが、その効果やメカニズムは、いまだ十分に解明されていない。本研究においては、捨石マウンドを従来の連続体として仮定した場合と、捨石マウンドは個々の捨石の集合体であり、不連続的挙動を呈するとして、新たに開発した要素境界すべりモデルを用いた場合の2ケースについて有限要素解析を行った。その結果、後者のモデル化を用いれば、沈床の変形拘束効果とそのメカニズムが明らかとなることがわかった。3.軟弱地盤上の防波堤は、多少とも必ず沈下を生じるので、嵩上げ問題を避けられない。そこで本研究においては、宮城県石巻漁港の防波堤構築現場で計測されているケーソン沈下、側方変位、間隙水圧などの経時変化と、粘塑性アルゴリズムに基づく有限要素解析の結果を比較することにより、適切な嵩上げ時期の判断基準を提案した。
連環画の総合的研究

本研究は、20世紀中国の主要な視覚メディアである連環画(絵物語)を取り上げ、人々のイメージの生成と伝播、受容の様相を明らかにせんとするものである。連環画は、内容は多岐に渡り、数量も膨大であり、なにより今まで研究対象として扱われることがあまりなかったメディアであるため、その整理と保存が危急の課題と言えるものである。平成30年度の研究成果は、昨年同様、以下の三点に集約される。それらは「1、研究会の開催」「2、連環画の整理に関する作業」「3、学術研究誌『連環画研究』の編集と刊行」である。研究会は9月に開催され、招聘したゲストスピーカーを含めた研究者たちの間で、当該分野に関する活発な意見交換が実現した。連環画の整理に関しては、前年度に引き続き、1950年代から80年代頃までの低年齢層向けの連環画(絵本を含む)を中心に作業を進めた。学術研究誌『連環画研究』には、多種多様な論考が寄せられた。例えば、ベルギーの作家エルジェの漫画作品の連環画版について整理し、その中国表象を取りあげたものや、伝統的な芸術形式の一つである剪紙(切り紙)を用いた連環画作品を扱うもの、アマチュアの描き手たちによる連環画の雑誌投稿のさまについて仔細に記したものや、内モンゴルで起こった事実がどのように物語化されて、広く普及していったかを整理分析するものなどがある。これらの成果は、いずれも新中国における視覚文化の興味深い様相を明らかにするものと言える。本研究は、20世紀中国の主要な視覚的メディアである連環画(絵物語)を取り上げ、人々のイメージの生成と伝播、受容の様相を明らかにせんとするものである。連環画は、1920年代に上海で出版され、新中国の初期にプロパガンダメディアとして全国的に広まっていき、80年代後半ころに衰退し始めるものであるが、内容は多岐にわたる上、数量は膨大であり、なにより研究対象として扱われてきた歴史が浅いこともあって、その研究に際しては、データベース構築や資料収集といった基礎的な作業が早急に求められているといった現状にある。また連環画は、時期ごとの政治や政策、映画や演劇、新聞や雑誌などとの関連が大変に深く、さらに中国絵画および絵物語の伝統の影響を考え合わせながら研究を進めねて行かねばならない対象でもある。上記を踏まえた上で、平成28年度の研究成果は、具体的に次のようなものである。「1、研究会の開催および学術研究誌『連環画研究』の編集と刊行」「2、連環画のデータベース化に関する作業」、「3、中国における資料及び関連施設の調査」である。とりわけ研究誌に関しては、80年代の連環画における日本表象、民国期に活躍した漫画家の新中国での活動、香港における絵物語(マンガ)、古典小説の視覚的受容、連環画製作の技法分析、などをテーマにした論考が寄せられ、それぞれが連環画という研究対象の興味深い様相を明らかにしている。また同時に、それらを一つにまとめた冊子じたいが、連環画という対象の抱える問題の豊饒性を示す結果となっている。平成28年度の進捗状況は、定例研究会の開催、国内外への資料調査、関連書籍の購入、研究誌の刊行など、おおむね予定通りである。ただ、資料のデータベース化に関して、上半期は準備作業にあて、下半期にスキャン作業を本格的に開始したため、若干の進度の遅れが認められる。内容は多岐に渡り、数量も膨大であり、なにより今まで研究対象として扱われることがあまりなかったメディアであるため、その整理と保存が危急の課題と言えるものである。平成29年度の研究成果は、具体的に以下の三点に集約される。それらは「1、研究会の開催」「2、連環画の保存と整理に関する作業」「3、学術研究誌『連環画研究』の編集と刊行」である。連環画の保存と整理に関しては、今年度はとくに、1950年代から80年代頃までの低年齢層向けの連環画(絵本を含む)を中心にスキャン作業を進めた。それらは、20世紀中国の図像文化と児童文化を知る上での、大変に貴重な資料群と言えるが、いままで日本の研究機関などでは、ほとんど顧みられることがなかったものばかりである。本作業は、その書誌データおよび版面を記録し整理するという基盤作りにあたる。学術研究誌については、ソビエト文学(およびそれを元にした映画・ドラマ)の中国的受容、1980年代のカンフー映画を連環画にした「電影連環画」の表象分析、文革期における劉少奇形象の分析と解説、民国期から新中国にかけて活躍した漫画家の活動の軌跡、民国期に生まれた少年形象「三毛」の建国後の変容、台湾発絵本の表象分析、などをテーマにした論考が寄せられた。提出された論文それぞれが、連環画(および漫画や絵本)という研究対象の興味深い様相を明らかにしている。平成29年度の進捗状況は、定例研究会の開催、関連書籍の購入、資料の整理と保存、国内での資料調査、研究誌の刊行など、おおむね予定通りである。

本研究は、20世紀中国の主要な視覚メディアである連環画(絵物語)を取り上げ、人々のイメージの生成と伝播、受容の様相を明らかにせんとするものである。連環画は、内容は多岐に渡り、数量も膨大であり、なにより今まで研究対象として扱われることがあまりなかったメディアであるため、その整理と保存が危急の課題と言えるものである。平成30年度の研究成果は、昨年同様、以下の三点に集約される。それらは「1、研究会の開催」「2、連環画の整理に関する作業」「3、学術研究誌『連環画研究』の編集と刊行」である。研究会は9月に開催され、招聘したゲストスピーカーを含めた研究者たちの間で、当該分野に関する活発な意見交換が実現した。連環画の整理に関しては、前年度に引き続き、1950年代から80年代頃までの低年齢層向けの連環画(絵本を含む)を中心に作業を進めた。学術研究誌『連環画研究』には、多種多様な論考が寄せられた。例えば、ベルギーの作家エルジェの漫画作品の連環画版について整理し、その中国表象を取りあげたものや、伝統的な芸術形式の一つである剪紙(切り紙)を用いた連環画作品を扱うもの、アマチュアの描き手たちによる連環画の雑誌投稿のさまについて仔細に記したものや、内モンゴルで起こった事実がどのように物語化されて、広く普及していったかを整理分析するものなどがある。これらの成果は、いずれも新中国における視覚文化の興味深い様相を明らかにするものと言える。定例研究会の開催、国内外への資料調査、関連書籍の購入、研究誌の刊行などを引き続き行なう予定である。なお、平成29年度の研究会は、ゲストスピーカーを招聘する。また、資料のデータベース化について、人員や作業時間を増やすなどの措置を講じる。定例研究会の開催、国内外への資料調査、関連書籍の購入、資料の整理と保存、研究誌の刊行などを引き続き行なう。また、平成30年度の研究会もまた、ゲストスピーカーを招聘する。最終年度であることに鑑み、資料やデータベースの一部公開に向けて、その方法について議論を重ねる。また、より多くの資料を保存するために、作業にあたる人員や作業時間を増やすなどの措置を講じる。次年度使用額が生じた理由は、データベース構築に関わる作業がやや遅れ気味であること、資料購入が少なめであったことなどを理由とする。次年度使用額が生じた理由は、予定していた国外調査を行なわなかったこと、資料の購入が少なめだったことによる。最終年度にあたる次年度は、国外における資料調査を実施する予定。また、引き続き、ゲストスピーカーを招聘し、研究会の更なる活性化を図り、その成果を研究誌に結実させる。データベース構築に関わる作業の遅れを取り戻すべく、次年度以降は、人員および作業時間を微増させ、資料購入についてもまた積極的に行なう予定である。また、ゲストスピーカーを招聘し、研究会の活性化を図る。国内外への資料調査、研究誌の刊行はひきつづき行なう。
リステリア属細菌由来ヘモリシンのマクロファージ内活性発現の分子機構

リステリア属細菌が産生するヘモリシンに我々が新規に見いだした宿主サイトカイン誘導活性について、リコンビナント蛋白や変異ヘモリシン産生遺伝子組換え菌株を用いて研究し、次のような新たな知見が得られた。(1)リステリア属細菌のヘモリシンであるLLO, ILO, LSOは構造上いずれも4つのドメインから成り、従来知られているヘモリシン活性発現はC末端側のドメイン4に依存するが、サイトカイン誘導活性はN末端側のドメイン1-3だけに依存する。(2)ILOにはドメイン1にあるべきPEST配列が欠如しているためサイトカイン誘導活性が極めて低い。(3)LLOはまずマクロファージを刺激して各種炎症性サイトカインを誘導し、マクロファージ由来のIL-12とIL-18がIFN-γ誘導因子として主としてNK細胞に作用し、内因性IFN-γ産生を起こす。(4)LLOによるサイトカイン誘導活性には、マクロファージ上のTLRが必要であり、とくにTLR4とTLR2の両者が認識と結果的なNF-κB活性化に必要である。(5)TLRを発現しない上皮系細胞に微量LLOが作用しておこるサイトカイン応答は、N末端依存的なTLRを介した刺激によるものとは異なり、膜傷害によるCaイオンの流入に由来するサイトカイン遺伝子発現がおこるためである。(6)LLO完全欠損変異株の樹立に成功し、このL.monocytogenes Δhly株に種々の関連ヘモリシン遺伝子を組み込んだ株を用いてマクロファージへの感染実験を行い、サイトカイン誘導には菌の細胞質への脱出が必須であること、PEST配列を有するヘモリシンが細胞質内で作用することが必要であることが確認された。(7)リステリアがマクロファージに感染すると、hly遺伝子とその上流で制御に関与するprfA遺伝子の発現が亢進することを観察し、さらにその亢進にはマクロファージ活性化により産生される活性酸素が関与することを明らかにできた。リステリア属細菌に由来するヘモリシン蛋白が、実際にそれらを産生する細菌がマクロファージに感染し食胞から細胞質へエスケープした際にサイトカイン産生誘導活性を発揮するか否かを解析した。(1)細胞質でのアクチンテイルを染色してエスケープを観察する方法を用い、各種リステリア菌株と変異株のマクロファージ内動態とサイトカイン発現誘導をしらべた結果、細胞質へエスケープしなければサイトカイン応答を誘導しないこと、食胞からエスケープしても、ivanolysin OのようにN末端のサイトカイン誘導ドメインに異常のあるヘモリシン産生株ではサイトカイン発現を誘導しないことが明かとなった。(2)野生株リステリア菌(L. monocytogenes EGD)によるマクロファージ感染後のサイトカイン発現誘導は、アクチノマイシンDやバフィロマイシンA1の添加で細胞質へのエスケープを阻害すると著明に抑制され、細胞質内でシグナル伝達がおこることが強く示唆された。(3)当初計画の非病原株L. innocuaでの各種ヘモリシン発現組換え株は作製できたが、エスケープが見られ難い問題が顕在化したため、新たに野生株L. monocytogenesからトランスポソン挿入によりヘモリシン遺伝子を変異させたΔhly株を宿主とする組み換え変異株の作製を行い、今後の解析に必要な種々の変異株を揃えることができた。(4)リステリア属各種菌株由来リコンビナント標品のサイトカイン誘導活性とペプチド配列の検討から、N末端のPEST配列の存在がサイトカイン誘導活性発現に必須であると考えられる成績が得られた。

リステリア属細菌に由来するヘモリシン蛋白によるマクロファージ活性化、サイトカイン誘導の機構に関し、これまでは主としてリコンビナントタンパクを用いて解析をしてきた。本年度は、リステリア菌(Listeria monocytogenes)のLLO遺伝子(hly)をインフレームに欠損させた変異株(Δhly株)を樹立し、種々のヘモリシン遺伝子を組み込んだプラスミドをΔhly株に入れて発現させたものを作製して研究を行った。Δhly株はマウスに対する病原性が著明に低下し、マクロファージヘの感染率は野生株と同等であったが、食胞から脱出して細胞質で増殖することはできなかった。この株に正常なhly遺伝子をプラスミド性に保有させると、その病原性やエスケープ能は回復した。Δhly株によるサイトカイン産生誘導活性は野生株に比べ著明な低下がみられ、hly遺伝子の補完で回復した。この条件で種々のLLO関連遺伝子の役割を比較したところ、LLOの1-3ドメインをコードする第4ドメイン遺伝子欠損プラスミドや第4ドメイン部分だけの遺伝子を組み込んだプラスミドでは食胞からのエスケープは回復せず、サイトカイン誘導活性も低いままであった。L.seeligeriのLSO遺伝子プラスミドではエスケープが弱く、サイトカイン誘導能の回復もあまり強いものではなかった。さらにL.ivanoviiのILO遺伝子を組み込んだプラスミドでは、食胞からのエスケープはみられたが、サイトカイン応答はあまり亢進されなかった。以上より、食胞からの脱出のみならず活性の高いヘモリシンタンパクが細胞質で産生されることが、リステリア感染での自然免疫応答誘導に必須であると結論された。リステリア属細菌に由来するヘモリシン蛋白(リステリオリシンO:LLO)によるマクロファージ活性化、サイトカイン誘導の機構に関して研究を行い、以下の新たな成果が得られた。1 LLOがマクロファージに誘導する各種Th1サイトカインの中で最も重要なIL-18は、LLOによる転写の誘導によるものではなく、IFN-β依存的にFas-FasLを介して起こるカスパーゼの活性化がIL-18の成熟をきたすことによるものであることが示された。2 LLOはこれまで明らかにしてきた非細胞傷害型にみられるTLRを介したシグナルによるNF-κBの活性化とは別に、細胞死を起こさない低濃度の細胞傷害型では上皮系細胞の膜不安定化を起こす結果、Caイオンの流入を促し、Caイオン依存的なNF-κB活性化とそれに続くI1-6など炎症性サイトカイン産生を誘導することが明らかとなり、侵入門戸である非マクロファージ系腸管上皮細胞の応答に新たな知見を加えることができた。3昨年度の研究ではLLO遺伝子であるhlyを欠損させたΔhly株を作製し、正常なhly遺伝子をプラスミド性に保有させて実験を行った。本年度はさらに相同組換え法をhlyや関連遺伝子を染色体に組み込んだ株の作製に成功した。Hly遺伝子だけが異なるisogenicな菌株を用いた実験により、マクロファージ感染によりリステリアが誘導するIFN-γ誘導性サイトカインの産生刺激は、細胞質で菌が脱出することが必須であり、さらにLLOのN末端に依存することを証明することができた。さらにLLOが実際に細胞質へ注入されると同様のサイトカイン応答が誘導されることを、HVJエンベロープを用いた細胞質内タンパク導入法を確立して確認することができた。
緑内障性神経節細胞死に対する新たな分子標的療法の研究

緑内障は、視神経障害による視野欠損を特徴とする我が国における第1位の失明原因であり、加速する少子高齢化社会において、失明対策上最も重要な疾患である。本疾患は、高眼圧緑内障と正常眼圧緑内障に大きく分類されるが、我が国では全体の約7割が正常眼圧緑内障で占められる。従って、本疾患に対する効果的な治療薬を開発することは、世界レベルで重要な研究課題である。本研究では、視神経軸索障害モデル、虚血モデル、正常眼圧緑内障モデルなど各種緑内障モデル動物を用いて、網膜神経節細胞に対する新規ペプチド(Tat-μCL)の効果を評価した。その結果、虚血モデルに対してTat-μCLの効果が有意に観察された。今年度は、本研究課題を遂行する上で必要となるグリタミン酸輸送体欠損マウス(GLAST KOマウス)の繁殖に努めた。年度当初は、出産後に食殺が続き、思うように繁殖する事が出来なかったが、飼育条件などを変えながら試行錯誤を繰り返す中で、年度終盤に差し掛かり徐々にGLAST KOマウスを増やすことが出来るようになった。そこで、GLAST KOマウスを正常眼圧緑内障モデルである事の確認として、3ヶ月齢の網膜を調べたところ、網膜神経節細胞の数が顕著に減少していることが分かった。この結果から、自ら繁殖させたGLAST KOマウスが正常眼圧緑内障モデルとして使用できる事が確認された。現在は、交付申請書に記載した「研究計画・方法」に従って、GLAST KOマウスで観察される網膜神経節細胞死に、ミトコンドリアカルパインとアポトーシス誘導因子(AIF)が関与しているのか否かを、形態学的、生化学的、電気生理学的および分子生物学的に評価している。具体的には以下の3項目について評価している。1)GLASTKOマウスの網膜凍結切片を作製し、網膜神経節細胞の核内にAIFが移行しているのか否かを免疫組織化学的手法にて評価。2)GLASTKOマウスの網膜を分画しタンパク質およびRNAを抽出し、ミトコンドリアカルパインおよびAIFの活性化が起こっているのか否かを生化学的に評価。また、それらの遺伝子発現の変化を分子生物学的に評価。3)GLAST KOマウスにミトコンドリアカルパイン阻害ペプチドを連日点眼し、経時的に網膜電図測定を行うことで、GLAST KOマウスの視機能の変化を評価。網膜電図においては、b波に続く陰性波である神経節細胞由来成分PhNR (Photonic negative response)を測定することで評価。以上の実験を遂行中であり、次年度中には学会発表を行う予定である。今年度は、正常眼内緑内障モデルであるグルタミン酸輸送体欠損マウス(GLAST KOマウス)を用いて、網膜の神経節細胞死にミトコンドリアカルパインとアポトーシス誘導因子AIFが関与しているのかを評価した。その結果、3ヶ月齢のGLASTKOマウスの網膜では神経節細胞および双極細胞のアポトーシスが観察された。さらに免疫組織化学的手法にて、網膜神経節細胞の核内にAIFが蓄積していることが確認された。また生化学的解析により、3ヶ月齢のGLAST KOマウスの網膜ではミトコンドリアカルパインが活性化していることが分かった。これらの結果より、グルタミン酸輸送体が欠損した網膜では、少なくともミトコンドリアカルパインとAIF依存的な神経節細胞死が起こっていることが示唆された。しかしながら問題点として、食殺や不妊などによりまとまった数のGLAST KOマウスを確保することが非常に難しく、有意差検定を実施できるデータ数には達していない。従って、来年度も引き続きGLAST KOマウスの繁殖に努めて、有意差検定ができるマウスの数を確保したい。また今年度は、交付申請書の「研究計画・方法[平成26年度]」に記載した虚血・再灌流モデルに対するミトコンドリアカルパイン阻害ペプチドの効果を調べた。その結果、ミトコンドリアカルパイン阻害ペプチド点眼群では、1TUNEL陽性神経節細胞数の減少、2逆行性トレーサーであるフルオロゴールドで染めた神経節細胞の数の保護(網膜フラットマウント解析による)、3網膜電図におけるa波およびb波の振幅低下の抑制、4AIFの限定分解の阻害、などが観察された。従って、ミミトコンドリアカルパイン阻害ペプチドによって神経節細胞死が抑制され、網膜の機能が保持されていることが分かった。これらの結果は来年度中に論文にまとめて国際誌に投稿する。本疾患は、高眼圧緑内障と正常眼圧緑内障に大きく分類される。高眼圧緑内障の治療に対しては眼圧を下降させる点眼剤が広く使用され、視野障害の進行をある程度遅延させることができる。が一方、我が国では全体の約7割が正常眼圧緑内障で占められることから、本疾患に対する効果的な治療薬・治療法を開発することは、世界レベルで非常に重要な研究課題である。本研究は、各種緑内障モデル動物を用いてミトコンドリアμ-カルパイン阻害ペプチド(Tat-μCL)がより脆弱といわれる神経節細胞に対して保護効果を示すのか評価することを目的として実施した。実施した研究項目は、正常眼圧緑内障モデル動物、視神経軸索障害モデル動物、虚血モデル動物を用いて、Tat-μCLが神経節細胞死を抑制するか、および視機能の低下を抑制する否かを評価した。

評価は、形態学的、生化学的、電気生理学的な手法を用いて行った。正常眼圧緑内障モデルであるグルタミン酸輸送体(GLAST)欠損マウスにおいては、ミトコンドリアカルパインの活性化とアポトーシス誘導因子(AIF)の限定分解と核移行が観察されなかった。この結果から、GLAST欠損マウスでは、ミトコンドリアカルパインとAIFを介した網膜神経節細胞死が起こっているのではなく、それ以外の経路を介して網膜神経節細胞が変性していることが示唆された。Tat-μCLの点眼によっても網膜神経節細胞死を抑えることはできなかった。視神経軸索障害モデルラットにおいては、Tat-μCLの点眼を施したが、網膜神経節細胞に対する保護効果は見られなかったが、高眼圧虚血モデルラットにおいては、Tat-μCLの点眼により有意に網膜神経節細胞死を抑えることができた。緑内障は、視神経障害による視野欠損を特徴とする我が国における第1位の失明原因であり、加速する少子高齢化社会において、失明対策上最も重要な疾患である。本疾患は、高眼圧緑内障と正常眼圧緑内障に大きく分類されるが、我が国では全体の約7割が正常眼圧緑内障で占められる。従って、本疾患に対する効果的な治療薬を開発することは、世界レベルで重要な研究課題である。本研究では、視神経軸索障害モデル、虚血モデル、正常眼圧緑内障モデルなど各種緑内障モデル動物を用いて、網膜神経節細胞に対する新規ペプチド(Tat-μCL)の効果を評価した。その結果、虚血モデルに対してTat-μCLの効果が有意に観察された。正常眼内緑内障モデルであるグルタミン酸輸送体欠損マウスにおいて、食殺や不妊などにより有意差検定を実施できる数のGLASTKOマウスを確保できていないため、当初の研究計画よりはやや遅れている。しかし虚血・再灌流モデルに関しては、研究成果を論文にまとめている最中であるため、研究計画通り順調に進展している。細胞生化学研究計画としては、グルタミン酸輸送体欠損マウスにおける網膜神経節細胞死に対して、ミトコンドリアカルパイン阻害ペプチドの硝子体内投与または点眼投与が効果的か否かを、形態学的、生化学的、分子生物学的および電気生理学的に評価する。グルタミン酸輸送体欠損マウスの繁殖については、飼育ケージに遊具を設置したり、野生型マウスを里親にしたり、餌を変えたりするなど出来る限りの工夫を施したい。交付申請書に記載した「研究計画・方法」の実験項目の1つに関して、ポジティブな実験結果が得られ、その研究成果を国際誌に投稿する準備をしているため。具体的には、虚血・再灌流障害モデルにおける網膜神経節細胞死に対して、ミトコンドリアカルパイン阻害ペプチドの点眼投与によって、保護効果が観察された。さらに、その網膜神経節細胞死にアポトーシス誘導因子であるAIFが関与していることが示された。正常眼内緑内障モデルであるグルタミン酸輸送体欠損マウスについて、不妊や食殺などにより当初の計画通りに繁殖できず、それに伴って実験に費やす予定であった試薬・消耗品費が過剰に余ったため。来年度は当マウスの繁殖に努め、研究計画の遅れを取り戻す。
海洋コンクリート構造物の疲労特性とその性能向上に関する研究

約240本の供試体に対して疲労試験を行い、コンクリートの圧縮疲労寿命の分布がどの分布モデルに最も適合するか、供試体寸法や繰返し載荷速度、コンクリートの静的強度などが疲労強度や疲労寿命のばらつきに及ぼす影響に関して検討した。その結果、最も適合性の良い疲労寿命の分布形は3母数ワイブル分布と対数正規分布であることがわかった。また、コンクリートの静的強度のばらつきと疲労寿命とのばらつきは密接に関係するが、コンクリート強度、供試体寸法および0.115Hzまでの範囲の載荷速度は疲労寿命にほとんど影響しないことが明らかとなった。次に、水中における鉄筋コンクリートはり(RCはり)の疲労試験では、湿潤環境下でRCはりが繰返し荷重を受けた場合、気中で曲げ破壊しても水中ではせん断破壊になり易いこもが明らかとなった。また、実験結果から、示方書に規定されていないせん断耐力式を暫定式として提案した。最後に、炭素繊維補強プラスチック(CFRP)板の接着工法は、構造部材の鉄筋が不足している断面の不足鉄筋を断面の外側から補足でき、またCFRP板が錆びないために腐食環境下において広く使用されるようになると考えられる。このCFRP板で補強されたRCはりの静的および疲労荷重下における強度と変形特性を検討した結果、CFRPを接着しかつ静的漸増荷重を受けたはりの破壊様式は、曲げ破壊になり、曲げ剛性および終局強度とも増加することが明らかになった。繰返し荷重下におけるCFRP板を接着したはりの疲労破壊は、CFRP板の疲労破断ではなく、鉄筋の疲労破断によってもたらされた。CFRP板で補強したRCはりの200万回の疲労強度は同一はりの静的強度の57%であった。1.の腐食環境条件(気中、水中、海水中)の相違がコンクリート構造物の破壊様式や疲労寿命に及ぼす影響を明らかにする研究においては、鉄筋比、コンクリート強度、せん断スパン比(a/d)、せん断補強鉄筋の有無、繰返し荷重の大きさ(終局耐力の40-80%)等を要因に選んだ鉄筋コンクリート(RC)はりの疲労試験を実施した。その結果、曲げ疲労破壊においては、気中では主鉄筋の疲労破断で破壊するはりであっても水中や海水中ではコンクリート圧潰型の破壊になりやすく、気中と水中や海水中とではRCはりの破壊様式が異なることが明らかにされた。また、一般的な破壊としては、気中で曲げ破壊する場合であっても水中や海水中ではせん断破壊になりやすいこと、さらに、この場合のせん断破壊はスターラップの疲労破断を伴わないのが特徴で、海洋コンクリート構造物に生じやすいと考えられるこの種のせん断疲労破壊に対する耐力式を提案できる見通しがたった。また、この試験を通して、コンクリートや鉄筋素材の疲労特性とRC部材の疲労特性との関連性を検討した。その結果、主鉄筋の疲労破断で破壊するはりに対しては、コクリート中の鉄筋の疲労強度は裸鉄筋の疲労強度よりも大幅に増加するが、気体から水中へ、水中から海水中へと腐食環境がシビアーになるに伴って疲労寿命が短くなること、コンクリート圧潰型のはりに対しては、海水中と水中での疲労寿命には大差なく、海水中の疲労試験が水中で代用できることが明らかになった。次に、2.の水中における鉄筋コンクリートはりの耐疲労性向上に関する研究においては、コンクリート表面に樹脂塗装を施し水の侵入を遮断する手法を用いることによる耐疲労性向上の可能性を検討した。その結果、繰返し荷重下でひびわれ追従性の大きな樹脂を用いることによって、耐疲労性の向上が図れることを明らかにした。以上のように、本年度の計画は順調に消化している。

水中および気中における疲労試験の結果、湿潤環境下でRCはりが繰返し荷重を受けた場合、気中で曲げ破壊しても水中ではせん断破壊になりやすく、このせん断破壊においてはスターラップの疲労破断を伴わないこと、算定せん断耐力比(Rc:作用せん断力と二羽式によるせん断耐力との比)で整理すれば、a/d≧3.0の範囲においては、コンクリート強度や鉄筋量の相違は疲労強度にほとんど影響を及ぼさないこと、長寿命域になるに伴ってせん断補強筋の有無が疲労寿命に及ぼす影響が小さくなること、水中でスターラップの疲労破断を伴わないRCはりの疲労は、ある繰返し回数から急激に進行し、せん断力の大小による疲労寿命差はきわめて小さくなること等が明らかとなった。また、示方書に規定されていないせん断耐力式を暫定式として提案した。また、耐久性に優れかつ引張り強度の高いCFRP板を接着して補強する工法が、現状において信頼性の高い鋼板接着工法の代用として適用できるかどうかの検討を行った結果、CFRP板を接着しかつ静的漸増荷重を受けたはりの破壊様式は曲げ破壊となり、曲げ剛性および終局強度とも増加することが明らかになった。繰返し荷重下におけるCFRP板を接着したはりの疲労破壊は、CFRP板の疲労破断ではなく、鉄筋の疲労破断によってもたらされ、また、CFRP板で補強したRCはりの200万回疲労強度は同一はりの静的強度の57%であることが判明した。
津軽海峡文化圏域の民俗学的研究

津軽海峡を挟む北海道側と本州側は、いわゆる異文化が相互に接する周辺地域(marginal area)であった。津軽海峡文化圏域を中心に、北方民族およびそれが担う生活文化が本州のどの地域にまで及び、また本州側の母村を異にする人々によって北海道にもたらされた生活文化が津軽海峡を隔てて北海道側のどの地域にまで及び、どのように複合・重層しているかを、機能から逆照射して探るのが本研究の目的であった。この地域は、(1)北方民族と和人が担う異文化が相互に接触する地域であり、遺跡から出土する遺物や、地名、民具などからその共通性が把握されている。アイヌのアトゥシは青森県や岩手北部などで近代まで庶民が着用していた。(2)和人相互の内的接触による文化複合がみられる地域である。人々は、にしんを追い弧を描くように、積丹半島、小樽、留萌、羽幌などへと北上し、遠くは礼文、利尻の両島にまで及んでいる。社会構造や網元を頂点とする労働組織は類似し、衣生活におけるドンジャとよばれる労働着、年中行事の食習では、正月のクジラ汁や一月十五日の女の正月のケの汁などが、荒馬踊りなどの民俗芸能や繁次郎に代表される口承文芸が、対岸の青森県各地と共通している。(3)藩制時代以降に、交易によって上方や北陸地方から受容した生活文化の重層構造の共通性である。下北半島の要のむつ市の田名部神社やその周辺にくり広げられている例大祭、江差町の姥神神社、福島町や乙部町など道南西域一円にみられる例大祭の山車に、京都祇園祭りの流れをくむ上方の生活文化の受容が濃厚にみられる。(4)北海道で用いられているデメン(出面=日雇い)という言葉は、お雇い外国人がもたらしたday's menに由来しているとされ、この造語が青森県地方に及んでいる点も無視できない。青森県の船大工は、北海道のにしん場で修行した者が多く、こうした出稼ぎ人による北海道側からの逆移入は、造船などの技術文化においてもみられる。
p53制御分子Pirh2の新規ユビキチン化標的を介したがん化への寄与

p53のユビキチンプロテアソームシステムによる分解の基質認識分子の一つとして同定されたPirh2は、細胞周期進行を負に制御するp27の分解にも携わっていること、Pirh2の発現レベルの亢進が複数種の癌で認められることが明らかとなっている。これらの知見より、Pirh2は癌発生と進行にアクセル的な機能を持つと推測される。しかしPirh2タンパクの量的変動がどのようなメカニズムで制御されているのかは、全くわかっていない。われわれはまずどのような環境下でPirh2タンパク量が変動するのかをスクリーニング的に調べた。その結果、DNAアルキル化剤によるDNAダメージを与えた細胞ストレス負荷時には、Pirh2タンパク量が低下することを見いだした。現在はその量的調節機構の解明に向けた研究を進めている。過去の報告で、Pirh2以外のp53ユビキチンリガーゼであるMdm2はDNAストレスによって転写抑制によって減少することがわかっているが、Pirh2のタンパク量減少は翻訳後調節によるもので、転写レベルに変化は認められなかった。またPirh2タンパクはユビキチン化修飾が亢進していたため、ユビキチンプロテアソームシステムによる分解が促進することでタンパク量が減少しているものと考えられた。今後はこの分解に関わるE3リガーゼの同定を試みる予定である。またどのようなシグナルがE3による分解が誘導されるために必要となっているのか、各種酵素阻害剤を用いた検討を進行中である。p53のユビキチンプロテアソームシステムによる分解の基質認識分子の一つとして同定されたPirh2は、細胞周期進行を負に制御するp27の分解にも携わっていることを、われわれは過去に報告した。Pirh2によるp27タンパク量の制御が果たしている役割を評価するため、まずPirh2をノックダウンした培養細胞を用いて細胞増殖スピードへの影響を調べた。その結果、複数のがん細胞株でPirh2の減少によってp27タンパク量の増と共に、細胞倍化時間が延長したことがわかった。臨床では多種の臓器由来の癌でp27タンパク量の有意な減少が報告されている。一方Pirh2発現量の変動の有無は、肺癌以外殆ど報告がない。そこで我々は肺癌以外の臨床癌においてもPirh2発現量の変動が癌の性状に影響を与えている可能性を検討することにした。まずPirh2抗体の組織免疫染色の特異性を評価する為に、Pirh2ノックダウン処理(+/-)後の細胞株でcell blockを作成して染色性の妥当性を確認した。次に外科的切除された口腔癌および同一患者の正常部を対象とした組織免疫染色により、癌化に伴うPirh2およびp27タンパクレベルの変動、さらに両者の変動の相関性を調べた。その結果、正常部ではPirh2発現はほとんど認められなかったのに対して癌部では有意に発現が亢進しており、一方p27の正常部と癌部間の発現パターンの変動傾向はPirh2と反対だった。また、Pirh2の発現レベルの亢進は予後に相関していたことがわかり、統計学的解析では独立予後因子として同定された。