hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
メタボリック症候群発症の分子機構の解明:CD36欠損状態をモデルとして

本研究は、近年問題になっているメタボリック症候群発症の分子機構を、本邦で頻度の高いCD36欠損症をモデルに明らかにしたものである。特に、メタボリック症候群における脂質代謝異常として空腹時における高トリグリセリド血症、食後高脂血症が知られているが、その分子機構は全く明らかではなかった。本研究において、以下の点が明らかとなった。CD36欠損症では、空腹時において高トリグリセリド(TG)血症、低HDL-コレステロール血症を呈した。また、脂肪負荷試験たよって、食後の高TG血症、アポB48の増加を認めた。このことからCD36欠損症における高TG血症の原因として小腸由来リポ蛋白の増加が示唆された。次にCD36ノックアウトマウスを用いて以下の結果を得た。まず、最初にCD36ノックアウトマウスが食後高脂血症を呈するか否かをオリーブ油負荷にて確認した。その後、食後高脂血症のメカニズムを解明するためTriton-WRを用いたリポ蛋白の異化の阻害実験を行った。CD36ノックアウトマウスでは、空腹時に行ったTriton-WR実験では、対照と差をみとめないものの、オリーブ油負荷後に行った実験において、対照より高い血清TG値を示し、本症においては、小腸からのカイロミクロン分泌が増加していることが示唆された。実際、腸リンパ液を直接採取してTG値を測定したところ、CD36ノックアウトマウスで増加しており、CD36欠損状態では、小腸からのカイロミクロン分泌が増加していることが示唆された。本研究の結果、CD36欠損状態では、小腸における食後のカイロミクロン産生が増加していることが明らかとなった。この結果は、本症における高TG血症、食後高脂血症の一因と考えられ、メタボリック症候群の際の高脂血症の発症の分子機構として重要であると考えられる。CD36欠損症は、我が国において発見された高頻度に認められる遺伝的疾患であり、申請者らは世界に先駆けて本症がインスリン抵抗性、脂肪酸ダイナミズム異常に関連して高脂血症、耐糖能異常などメタボリック症候群の表現型を呈すること、またその表現型は加齢、脂肪負荷など後天的要因によって大きく変化する可能性を示した(Lancet.2001. Diabetes Care, 2003.Trends Cardiovasc Med,2003)。本年度は、CD36ノックアウトマウスに、オリーブ油を負荷することによって、CD36欠損症と同様に食後高脂血症を来すことを確認したのち、以下の検討を行った。Triton WRを静脈内投与して、血清トリグリセリド値を経時的に測定することによって、肝臓からのトリグリセリド分泌を検討したところ野生型とノックアウトマウスで差を認めなかった。Triton WRを静脈内投与下後に、オリーブ油負荷を行い、経時的にトリグリセリドを測定するとノックアウトマウスでは、トリグリセリドの上昇が野生型より極めて速く生じた。このことから、ノックアウトマウスでは小腸からのトリグリセリドリッチリポ蛋白の分泌が多いことが示唆された。そこで、オリーブ油負荷マウスを経時的にと殺して小腸上皮細胞をオイルレッドO染色したところ、ノックアウトマウスでは負荷後、30分ですでに上皮細胞内に油の吸収像が観察された。さらに、マウスの腸リンパ管液を採取し、トリグリセリド値を測定したところノックアウトマウスでは、著明に増加していた。以上より、CD36欠損マウスでは、オリーブ負荷後、小腸よりの脂質吸収が亢進しており、これが食後高脂血症の原因と考えられた(投稿準備中)。

CD36欠損症は、申請施設にて発見された我が国に高頻度に認められる遺伝的疾患であり、申請者らは世界に先駆けて本症が、インスリン抵抗性、脂肪酸ダイナミズム異常に関連して高脂血症、耐糖能障害などメタボリック症候群の表現型を呈すること、またその表現型は、加齢、脂肪負荷など後天的要因によって大きく変化する可能性を示した(Lancet 2001,Diabetes Care.2003)。そこで、本年度はCD36欠損状態をモデルに、メタボリック症候群発症の分子機構の詳細、特に高トリグリセリド血症、低HDL-コレステロール血症の機構を明らかにすることを目的とした。CD36ノックアウトマウスに、オリーブ油を経口投与して、経時的に採血及び腸リンパ液を採取して、コレステロール、中性脂肪、HDL-コレステロールなどを測定した。CD36ノックアウトマウスでは、オリーブ油負荷によって腸リンパ液中へのカイロミクロン分泌が著明に増加していた。さらに、CD36欠損症のメタボリック症候群の表現型の一つであるHDL-コレステロール低下のメカニズムを明らかにする目的で、小腸上皮細胞におけるATP-binding cassette transporter-A1の発現を検討したところCD36ノックアウトマウスでは、mRNA,タンパク量とも著明に低下していた。腸上皮細胞のモデルであるCaco2細胞においてCD36を過剰発現させたところABCA1蛋白の発現が増加した。これらの結果は、CD36欠損状態における高TG血症、HDL-C低下のメカニズムであり、CD36欠損状態におけるメタボリック症候群発症の分子機構の1つと考えられた。
活性酸素による転写因子HIF-1制御を基盤とする新たな白血病の分子標的療法の確立

白血病の治療は抗癌剤による化学療法が主体であるが、時として致命的な合併症や副作用が問題となる。近年、新しい治療法として分子標的療法が注目されており、本課題ではより侵襲の少ない新たな白血病に対する分子標的療法の確立を目的とした研究を行った。われわれは活性酸素(ROS)を介する白血病のアポトーシス誘導機梼について検討してきたが、この際、MPO(myeloperoxidase)がROSの産生調節に極めて重要な意義を有することを見出し、詳細な活性酸素種の同定を行った。緑茶成分のEGCGはROSを産生し、MPO陽性白血病細胞のアポトーシスを誘導した。MPO特異的阻害剤ABAH、ヘム合成阻害剤succinylacetone存在下では、EGCGによるROS産生およびアポトーシス誘導は認めなかった。さらに、MPO陰性K562細胞にMPOを強制発現させると、EGCGに対する感受性を回復するとともに、酵素学的にMPO活性を有さない変異MPO導入株ではEGCGの効果は認められなかった。以上より、MPOはROSの産生および白血病細胞のアポトーシス誘導に対して重要なkey regulatorと考えられた。さらに、アポトーシス誘導を来たす活性酸素種を同定するために、最近開発された新たな蛍光probe(AFP,HPF)を用いた検討では、hydroxy radical(-OH)によるDNA障害がアポトーシス誘導に直接働くと考えられた。この現象は、EGCGのみならずROSを産生することが知られている亜ヒ酸やアントラサイクリン系抗癌剤でも認められ、MPOを指標にしたROSをターゲットとした新たな白血病の分子標的療法の可能性が示された。さらに、DNAマイクロアレイ法による網羅的遺伝子解析の結果、HIF-1α遺伝子とその下流遺伝子(RNP-1,EGR-1,BNIP3,VEGF)の発現が上昇し、標的分子としてHIF-1αが重要であると考えられた。白血病に対する新たな分子標的治療薬の開発を目的に、天然物由来生理活性物質を用いて検討した。緑茶成分カテキン誘導体epigallocatechin gallate (EGCG)は濃度および時間依存性に種々の骨髄性白血病細胞のアポトーシスを誘導した。EGCGはミトコンドリア膜電位を低下させ、チトクロームCをミトコンドリアより放出し、caspase-3,-9を活性化した。また、同時にBaxを誘導し、Mcl-1の発現を低下することで白血病細胞のアポトーシスを誘導した。EGCGは活性酸素(ROS)を極めて短時間で産生した。抗酸化剤catalase,NACの前処置にてEGCGによるミトコンドリア膜電位の低下や、それに引き続き誘導されるアポトーシスは完全に阻害されることより、EGCGによる骨髄性白血病細胞のアポトーシス誘導は、ROSの産生により惹起されるものと考えられた。次に、EGCGの臨床応用を目的に免疫不全マウスNOD/SCIDマウスに白血病細胞を移植するモデルを用いてin vivoにおける効果を検討した。その結果、生食のみを投与したコントロール群に比較し、EGCG投与群では有意に腫瘍重量が縮小した。以上、よりEGCGはROSを産生し、骨髄性白血病細胞のアポトーシスを誘導することが明らかになったが、引き続き次年度はROSにより、活性化される転写因子HIF-1およびその下流分について検討していく予定である。同様に、東南アジアに自生する植物由来の1'-acetoxychavicol acetate (ACA)も白血病細胞のアポトーシスを誘導し、その増殖を抑制した。ACAは興味深いことにミトコンドリアおよびdeath receptor, Fas,の両者の経路を用いて白血病細胞のアポトーシスを誘導したが、まずROSを産生することにより2つの経路が活性化されることが明らかになった。

さらに、その詳細な分子機構を解析する予定である。白血病は今日にあっても治癒の難しい造血器腫瘍である。これまでの、成果においてわれわれは、天然物由来生理活性物質により活性酸素(ROS)が産生され、白血病細胞のアポトーシスが誘導されることを見出した。今年度は、さらに詳細な分子機構の解明を行った。緑茶成分カテキン由来EGCGはROSを産生し、白血病細胞のアポトーシスを誘導するが、その際、myeloperoxidase(MPO)陽性白血病細胞への感受性が高かった。EGCGに感受性を有するMPO陽性白血病細胞株HL-60,NB4はMPO阻害剤ABAHおよびヘム合成阻害剤succinylacetoneにより前処置することにより、EGCGによるアポトーシス誘導は阻害された。MPO陰性K562細胞にMPO遺伝子を導入したMPO過剰発現細胞は、EGCGによりROSを産生し、EGCGに対する感受性を回復した。しかしながら、MPOのカルシウム結合領域に変異を有し、MPO酵素活性を欠損した変異MPO遺伝子を導入しても、EGCGへの感受性は回復しなかった。さrに、MPOを介して産生される詳細な活性酸素種について検討したところ、ヒドロキシラジカルが白血病細胞のアポトーシス誘導に重要であることが明らかになった。しかしながら、MPOを介するROS産生に関与する転写因子、特にHIF-1の関与については明らかでなく、今後の検討課題と考えられた。このように、ROSを標的にした白血病細胞のアポトーシス誘導は新たな白血病の治療戦略になると考えられた。同様に、本年度は生姜成分に由来するzerumboneは白血病細胞の細胞周期G2/M停止を介して、アポトーシスを誘導することを明らかにした。また、大黄成分emodinによるJAK/STAT経路を介する骨髄腫細胞のアポトーシス誘導も見出した。
体外において全能性獲得過程を再現する卵細胞産生系の構築

27年度はDox inducibleな過剰発現とノックダウンの実験系の確立に注力した。その結果、高効率に十分なノックダウンを期待できる系と、強制発現ベクターの作製を効率よく進める系の両方が確立でき、対象とする約25遺伝子全てに対して、過剰発現とノックダウンができるようになった。この系を利用すれば、対象とする遺伝子数が現状からさらに増えても対応が可能である。従って、実験系の確立は当初想定していたよりも進展したと言える。また、CRISPR-Cas9の系を用いて、Npm2-KI ES細胞も樹立できた。今後はこれらの系を利用し、ネットワーク構成因子の精選に努めていく。27年度が最終年度であるため、記入しない。
骨髄由来細胞をターゲットにした動脈硬化性疾患に対する治療戦略

背景:リンパ球・単球・マクロファージなどの骨髄由来細胞は平滑筋類似の形質を獲得し、血管リモデリングに寄与することが報告されている。本研究において、我々はリンパ球・単球・マクロファージのサブクラスの多様な機能と分化制御機構に着目し、血管病への骨髄由来細胞の機能を明らかにすることを試みた。方法と結果:1)マウスを用いた実験:マウス高分化型(収縮型)平滑筋に発現する平滑筋マーカー、平滑筋ミオシン重鎖(SM myosin heavy chain ; SM-MHC)に対するきわめて特異度の高い抗体を新たに作製、さらに細胞起源を研究する目的でSM-MHCノックインマウス(SM-MHCを発現するとLacZを発現する=X-gal染色で青色に染まる)、やや分化度の低い平滑筋にも発現する平滑筋マーカー、平滑筋α-アクチン(SMα-actin)が発現するとGFPが発現するトランスジェニックマウスの両マウスラインを確立、それらのマウスの骨髄細胞を放射線により骨髄細胞を破壊した野生型マウスに移植し、さまざまな血管リモデリングのモデルマウス(ガイドワイヤーによる血管障害モデル、ApoEノックマウスを用いた高コレステロール動脈硬化モデル、心移植による動脈硬化モデル)を行い、骨髄由来細胞の関与と分化度を検討した。その結果、骨髄由来細胞は、(1)血管リモデリング部位に浸潤する(2)SM-MHCは発現しないが、SMα-actinは発現する。ということが明らかとなった。そのため、血管リモデリングにおいて、骨髄由来細胞は、平滑筋細胞様の形質を獲得するが、高分化型平滑筋細胞へは分化しない、ということが明らかとなった。さらに、その骨髄由来平滑筋"様"細胞の働きや細胞系を詳しく解析するため、動脈リモデリングマウスから骨髄由来SMα-actin陽性細胞(骨髄由来平滑筋"様"細胞)を単離し、その形質を詳細に検討したところ、骨髄由来平滑筋"様"細胞は炎症性単球(inflammatory monocytes)の形質を有することが明らかとなった。2)心筋梗塞症例の閉塞冠動脈から吸引された血栓の解析:心筋梗塞の診断にて東京大学付属病院に入院した68人から吸引された108個の冠動脈内血栓を組織学的に検討したところ、血栓内に含まれる幼若細胞(CD34陽性細胞)の比率が高いほど、慢性期の再狭窄が高率であった。結語:骨髄由来細胞は血管障害に際し動員され、病変に浸潤、炎症細胞としての形質と同時に平滑筋の形質を一部発現しながら、血管リモデリングの促進にはたらくと考えられる。

平成21年度に、われわれはSMα-actin-EGFPレポーターマウス骨髄を野生型に移植した骨髄置換(キメラ)マウスに対し血管病変形成を誘導し、病変を含む血管組織を採取、細胞を単離した上でフローサイトメトリーを用いGFP発現細胞(=SMα-actin陽性細胞)を分離、フローサイトメトリーを用いて詳細な表面マーカー発現・機能(遊走能、増殖能などの解析を行った結果、血管病変に集簇する骨髄由来SMα-actin陽性細胞は、マクロファージ、あるいは単球の形質を有しながら、SMα-actinも同時に発現していることが明らかとなった。特にマクロファージのサブタイプの中でも炎症を促進すると考えられるM1マクロファージの形質を強く発現していることが示された。それらを勘案すると、血管病変において観察される骨髄由来SMα-actin陽性細胞は、これまでに腎臓・肺で繊維化などの臓器リモデリングに寄与すると報告されたcirculating fibrocytesと大きな相同性を有することが示唆され、同細胞の詳細な解析は動脈硬化のみならず、さまざまな臓器リモデリングの解明に極めて有用である可能性が考えられた。さらに、平成21年度にわれわれは、SMα-actinプロモーターによってヒトジフテリア毒素受容体を発現するトランスジェニックマウスの作成に成功し、そのマウスを用い、骨髄由来SMα-actin陽性細胞を選択的に除去することでそれらの動脈病変形成に対する寄与を詳細に・明確に解析することが可能となった。さらに血管内皮側からの持続的・物理的血管障害により大動脈リモデリング(大動脈瘤形成・大動脈解離など)を発症する全く新たなマウスモデルも確立(釣り糸モデル)し、大動脈リモデリングに関するメカニズムの解析を開始した。これまでに、SMα-actin-EGFPレポーターマウス骨髄を野生型に移植した骨髄置換(キメラ)マウスに対し血管病変形成を誘導し、病変を含む血管組織を採取、細胞を単離した上で表面マーカー発現・機能(遊走能、増殖能などの解析を行った結果、血管病変に集簇する骨髄由来SMα-actin陽性細胞は、マクロファージ、あるいは単球の形質を有しながら、血管平滑筋細胞や線維芽細胞に発現するSMα-actinも同時に発現していることが明らかとなった。特にマクロファージのサブタイプの中でも炎症を促進すると考えられるM1マクロファージの形質を強く発現していることが示されたたことから、血管病変において観察される骨髄由来SMα-actin陽性細胞は、さまざまな臓器で繊維化などの臓器リモデリングに寄与するとされるcirculating fibrocytesと相同性を有することが示唆された。次にM1マクロファージに強く発現する表面マーカーCD11bとLy-6cを発現しているSMα-actin-EGFPレポーターマウスの骨髄細胞をソーティングし、血管障害モデルマウス末梢血に混入したところ、障害血管の新生内膜のみならず中膜や外膜にもGFP陽性細胞の集簇を認めたため、動脈硬化に代表される血管リモデリングにはSMα-actinを発現しながら骨髄由来の主にM1マクロファージの形質を有する平滑筋"様"細胞が重要な役割を果たしていることが明らかとなった。また、血管内皮側からの持続的・物理的血管障害により大動脈リモデリングを発症する新たなマウスモデルを用いて大動脈リモデリングのメカニズムを解析したところ、障害に対して急性期に局所で放出される物質、TNFαが大動脈破裂に対し重要な防御的役割を担っていることが明らかとなった。さらに、臨床的には急性心筋梗塞症例の冠動脈から吸引された血栓を病理学的に解析したところ、浸潤した細胞には骨髄由来未分化細胞が含まれており、その比率が続発する再狭窄の比率と密接な関係があることが明らかとなった。
ミュータンスレンサ球菌の齲蝕原性に関わる遺伝子多型を利用した齲蝕リスク評価の構築

ミュータンスレンサ球菌群のうち、ヒト口腔から比較的多く分離される菌としてはStreptococcus mutansやStreptococcus sobrinusがある。これらの菌が有する齲蝕原性の一つとして、非水溶性グルカン(WIG)を合成し歯面上に固着する能力が挙げられる。今回S.mutansの非水溶性グルカン合成酵素GTF-Iに注目し、これをコードするgtfBの遺伝子多型とWIG合成能の関連性を検討した。小学生を被験者として刺激唾液を採取し、唾液からS.mutansを分離した。唾液中にS.sobrinusを保有していた児童および複数のS.mutans株を保有していた児童は対象から除外した。得られたS.mutans株21株からDNAを抽出し、gtfBを複数の領域に分けてダイレクトシークエンシングを行い、gtfB全体の塩基配列を得た。GTF-Iは409-427の19アミノ酸(ANDVDNSNPVVQAEQLNWL)および446-454の9アミノ酸(DSIRVDAVD)配列が酵素活性に非常に重要であることが分かっている。また、C末端側1/3には保存性の高い繰り返し配列があり、この繰り返し配列がデキストランとの結合に重要であることが分かっている。また、gtfBの上流には幾つかのE.coliプロモーター様配列が存在し、gtfBの転写に影響していると考えられている。今回、21株のS.mutans分離株由来gtfBにおいて、409-427および446-454のアミノ酸配列に影響を与える変異は認められなかった。また、gtfB上流のE.coliプロモーター様配列にもWIG合成能と関連を示すDNA多型は認められなかった。GTF-IのC末端側においては菌株によるばらつきが比較的多く認められ、WIG合成能の低い幾つかの菌株で、GTF-IのC末端側繰り返し配列の欠失を伴う変異が認められた。小学生を被験者として刺激唾液を採取、また歯科検診を行い歯牙所見を得た。採取した唾液をミュータンスレンサ球菌の選択培地であるMSB培地に接種培養し、ミュータンスレンサ球菌分離株を得た。S.mutans、S.sobrinusの同定はMSB培地上でのコロニー形態および各種糖の発酵性を調べることで行った。これらの分離株を1%Sucrose添加Heart Infusionbrothに接種、培養し、産生したグルカン及び菌量を測定した。現在までの所、グルカン合成能の低い菌株と高い菌株では、培養に用いたガラス試験管の管壁に強固に付着したWIG(firm adherent WIG)量で約4倍、弱く付着したWIG(loose adherent WIG)量で約3倍程度の差が認められている。また、齲蝕のない被験者由来の菌株に比べ齲蝕を持つ被験者由来の菌株では、ガラス管壁に付着したWIG(firm adherent WIGとloose adherent WIGの合計)量の多い傾向が認められた(p<0.1)。菌株によりWIG産生量が大きく異なること、および齲蝕の有無によって保有菌株が産生する付着性WIG量の異なる傾向が認められたことから、ミュータンスレンサ球菌株のWIG合成能の測定を齲蝕リスク評価に取り入れることは有用であることが確認された。

ただ、今回用いたWIG合成能の測定法は、リスク評価に組み込むには方法が煩雑であるため、遺伝子的に容易に判定できるような検査法を、残りの研究期間で開発していく予定である。ミュータンスレンサ球菌群のうち、ヒト口腔から比較的多く分離される菌としてはStreptococcus mutansやStreptococcus sobrinusがある。これらの菌が有する齲蝕原性の一つとして、非水溶性グルカン(WIG)を合成し歯面上に固着する能力が挙げられる。小学生を被験者として刺激唾液を採取し、また歯科検診を行いDFT所見を得た。唾液から分離したミュータンスレンサ球菌株を1%Sucrose添加Heart Infusionbrothに接種、培養し、産生したグルカン量を測定することで、グルカン合成能を調べた。また1年後、歯科検診を行い、1年間の齲蝕増加歯数を計算した。43名の被験者中、39名から計51株のミュータンスレンサ球菌が検出された。ミュータンスレンサ球菌非検出群とWIG合成能の低いミュータンスレンサ球菌株保菌群(低WIG MS保菌群)、WIG合成能の高いミュータンスレンサ球菌株保菌群(高WIG MS保菌群)の3群に分けて、齲蝕経験および1年後の齲蝕増加を比較した。その結果、WIG合成能の高い菌株と低い菌株を区別するためのcut-off値を150,200とした時に、高WIG MS保菌群の平均DFTが他の2群に比べ高い値を示したが、この差は有意ではなかった。またWIG合成能のcut-off値を200とした時、高WIG MS保菌群の齲蝕増加歯数がMS非検出群に比べ有意に高い値を示し(p<0.05)、低WIG MS保菌群に比べ高い傾向を示した(p<0.1)。以上の結果から、WIG合成能がどの程度以上のミュータンスレンサ球菌株を保有すると、齲蝕の発生に影響がみられるかという基準が明らかとなった。今後、これらWIG合成能の高いミュータンスレンサ球菌株に特有な遺伝子型について検討し、菌の存在を容易に判定できる検査法を開発する予定である。ミュータンスレンサ球菌群のうち、ヒト口腔から比較的多く分離される菌としてはStreptoccus mutansやStreptocococcus sobrinusがある。今回S.mutansの非水溶性グルカン合成酵素GtfBに注目し、これをコードするgtfBの遺伝子多型とWIG合成能の関連性を検討した。小学生を被験者として刺激唾液を採取し、唾液からS.mutansを分離した。唾液中にS.sobrinusを保有していた児童および複数のS.mutans株を保有していた児童は対象から除外した。得られたS.mutans株21株からDNAを抽出し、gtfBを複数の領域に分けてダイレクトシークエンシングを行い、gtfB全体の塩基配列を得た。GtfBは409-427の19アミノ酸(ANDVDNSNPVVQAEQLNWL)および446-454の9アミノ酸(DSIRVDAVD)配列が酵素活性に非常に重要であることが分かっている。
急性ストレスによるゴナドトロピン分泌抑制におけるメラトニンの生理的関与

(1)生理的LH分泌のストレス性抑制におけるメラトニンの関与の検討:卵巣摘除ラットのパルス状LH分泌はメラトニン投与及び急性緊縛ストレス負荷によって抑制されるが、ストレスによる分泌抑制は松果体摘出により阻止されなかった。したがって、パルス状LH分泌のストレスによる急性抑制には松果体以外の因子が関与すると考えられる。(2)メラトニン作動性ストレス抑制部位の検討:メラトニンはナロキソン誘起LH分泌を抑制するが、LHRH誘起LH分泌を抑制しないことから、メラトニンの作動部位が視床下部にあることを明らかにした(投稿準備中)。また、ストレス負荷中のナロキソン誘起LH分泌抑制は松果体摘除の影響を受けないが、負荷後の遅延性ナロキソン誘起LH分泌抑制は松果体摘除により阻止されることを明らかにした(投稿中)。(3)急性緊縛ストレスによるメラトニン放出の確認:急性緊縛ストレスによりラット松果体メラトニン含量及び血中メラトニン濃度が著しく上昇した(投稿中)。(4)松果体へのストレス性入力の検討:ストレスによる松果体メラトニン放出増加は、副腎摘出またはβアドレナリン受容体阻害薬により阻止されることから、副腎髄質アドレナリンのβ作用によると考えられる。(5)総括:以上の研究の結果、ストレスは副腎髄質のアドレナリン分泌を促進し、そのβ作用によって松果体メラトニン放出が刺激され、メラトニンは視床下部内でナロキソン作動部位により下位で作用して、LH分泌を抑制することが明らかになった。しかし、ストレス負荷中の急性分泌抑制には松果体由来以外の因子が関与し、松果体メラトニンはストレス負荷後の回復過程における遅延性LH分泌抑制に関与すると考えられる。
液胞内タンパク分解の定量化とその生理的役割の解析

細胞活動は絶えず合成と分解が動的な平衡関係によって維持されている。タンパク質の細胞内分解経路としてはユビキチン経路とリソソーム(液胞)経路とが知られている。最近我々は酵母の液胞に於ける分解が高等動物の自食作用と同様な機構によることを明らかにして来た。本研究は液胞内での分解-自食作用がいかなる機構によって誘導されるか、また液胞内の分解はいかなる生理的役割を担っているかについて、タンパク質分解を定量化することを通じて明らかにすることを目的とした。本年度の研究によって得られた主な成果は以下の通りである。(1)自食作用不能株(apg1-15)、タンパク分解酵素欠損株、液胞欠損株などを用いて、放射性アミノ酸標識細胞のタンパク分解における自食作用の寄与を明らかにした。(2)PMSFを用いることにより野生型酵母の液胞内タンパク質分解を定量化し、栄養飢餓下に誘導されるタンパク質分解が細胞の生存率の維持に必須の役割をもつことを示した。(3)自食体の液胞内分解に欠損をもつ変異株を系統的に分離し、4つの変異abd1-4を同定した。abd1,2,3はそれぞれ液胞膜H^+-ATPaseの構成サブユニットをコードするVAM遺伝子の変異であった。自食体の分解にはH^+-ATPaseが必須である。
アルツハイマー病アミロイドタンパクの分子イメージング

本研究では、基本骨格をスチルベン、フラボンを中心とする化合物から考案した数種類のリガンドの性質を比較検討してきたが、もっとも普及しつつあるピッツバーグ大学化合物であるPIBによるイメージング研究との比較研究も実施した。さらにオーロン化合物を開発した研究成果も報告する。12ケ月齢のPSlxTg2576のdouble transgenicマウスの尾静脈から標識PIBを投与したが、マウス脳には検出できる十分なシグナルは検出できなかった。PET解析をしたマウスを解剖しアミロイド斑を免疫抗体法によって検出したところ、検出されるに十分な老人斑を確認することができた。一方、もう1つのモデルマウスであるAPP23の高齢化マウスでは明瞭なシグナルを得ることができた。これらのイメージング像の違いは、樋口博士(放医研)との共同研究により、ピログルタミン酸修飾アミロイドであることを証明した。次に、新規のPET化合物としてオーロン化合物を標識リガンドとして開発した。同化合物は、in vitroでAb1-42に対してKd値が1.2から6.8nMと強い親和性を示すことが出来た。同化合物は、脳内への速やかな移入と、脳内からの急速な排出を確認することが出来た。早期発症をあらわすダブルTg(Tg2575xPS1A260V)はAb1-42が多いことが示されているが、このモデル脳組織で強い老人斑染色をした。脳切片では強いアミロイドタンパクへの結合シグナルを検出することが出来た。アルツハイマー病の脳病理学的な特微はアミロイドの異常沈着である。従来から死後の脳組織を取り出して、顕微鏡観察することで確定診断となり、進行度を判断することができた。本研究は生前の状態でアミロイドを画像化することを目的としている。このために、アミロイドと特異的に開発する色素であるチオフラビンあるいはコンゴレッドを改良し、脳血管関門を通過するように改変した化合物を合成し、放射能標識したものを用いて、PET画像を解析しようとするものである。初年度である本年度は、研究対象となるアミロイド老人斑を有するマウスの調製とリガンドとなる化合物の試験管内でのアミロイド結合試験を中心に実施した。その結果、モデルマウス脳内にアミロイド老人斑が蓄積していることが確定し、検査対象としての動物の準備を整えた。また、リガンド化合物についても、ELISAプラスチックプレートを用いたin vitroでの実験系で(E)-3-スチリルピリビジン誘導体およびスチルベン誘導体がアミロイドと高度に特異的に結合することを明らかにした。放射性ヨード標識したリガンドを用いて、マウス脳組織へのすみやかな移行と排出を観察することができた。さらにアルツハイマー病脳組織をもちいてリガンド化合物とアミロイド抗体の染色結合性を比較検討し、高度にアミロイド異常沈着物への結合を蛍光顕微鏡で観察することに成功した。これらの化合物の性質についても専門学会に口頭発表するだけでなく英文論文として国際誌に発表することができた。認知症の代表疾患としてのアルツハイマー病の社会的意義を考えるとき、医療現場での正確さ、迅速な対応、コスト面など大きな課題がある。とくに診断法の新規開発に関する本研究の重要性は年を追って増してきているのが実情である。本年度では、初年度成果としての実際のモデルマウスでのアミロイドイメージングPET画像解析を進めることができた。まず、マウス脳組織へのすみやかな移行と排出が、複数のリガンドについて観察した。さらに本年度の特徴は、PIB化合物を用いたヒトを対象とした臨床研究を始めることができた点である。

現在、30例以上の症例数を経験しており、アミロイドイメージング経験数は、日本国内で一番である。世界的には豪・メルボルン大学オースチン病院での経験数が50例を超えており、同病院の主任研究考Villemagne博士との相互訪問から、本研究のグローバルな位置づけを確認できた。これは今後の研究の推進にとって、大きな成果であると考えている。臨床成果の一部は、現在専門誌に投稿中であり、学会でも口頭発表する予定である。本研究では、基本骨格をスチルベン、フラボンを中心とする化合物から考案した数種類のリガンドの性質を比較検討してきたが、オーロン化合物を開発した研究成果を報告する。オーロンに注目した理由は、フラボン化合物の合成の難易度を下げること、チオフラビン構造の利点をさらに取り込む事を目的としたデザインとなっている。さらに、アミノ基に炭素同位体標識したオーロンを厳密に比較するために、まずアミロイド1-42ペプチド重合体への解離定数を検討した。その結果、スキャッチャードプロットにより約7.9nMと十分強固なことが示されたので、さらにヨード標識したアミノ基、モノメチル体、ジメチル体を比較したところ、モノメチル体がもっとも強力な結合阻害活性をもつことが判明した。同化合物は、脳内への速やかな移入と、脳内からの急速な排出が期待されるが、尾錠脈から注入したオーロン化合物は、2分後には1.9-4.6%という迅速な取り込みがある反面、30分後には0.5%以下に排出され脳内に停留しないという特牲が確認された。さらに、早期発症をあらわすダブルTg(Tg2575xPS1A260V)はAb1-42が多いことが示されているが、このモデル脳組織でも特異的な強い老人斑染色を確認することができた。今後、このオーロン化合物は、フラボン化合物と並び重要なアミロイドリガンドとして有力なPET化合物として検討に値すると考えられる。
LB法による個体基板と化学結合した超薄組織膜の作製と評価

主な研究成果は、以下の項目にまとめることができる。1.長鎖クロロシラン化合物のクロロシリル基数の違いによる展開単分子膜の物性および構造の変化;クロロシラン化合物の展開単分子膜は、シラノール基リッチな膜であることがX線光電子分光法及び赤外分光法によりわかった。また、膜の物性や構造は、クロロシリル基数の違いによって、劇的に変化することが確認された。特に、トリクロロオクタデシルシラン(TCOS)単分子膜においては、Brewster角顕微鏡によって観察された展開直後から形成される数百μmサイズの巨大な凝縮相ドメインは、直径数μm程度のマイクロドメインの集合体であることが原子間力顕微鏡観察によって明らかになった。クロロジメチルオクタデシルシラン展開単分子膜においては、水面温度20°C付近のわずか数°Cの範囲でのみ、非常に稀な二段相転移を示すことが見いだされた。2.長鎖トリクロロシラン化合物の鎖長、および水面温度の違いによる展開単分子膜の物性および構造の変化;OTCSを中心として炭化水素鎖長の異なる化合物が用いられた。展開単分子膜におけるマイクロドメインは、鎖長の増加に伴ってより小さくなり、また、同じ膜物質内でも、水面温度が低い方が、より小さなマイクロドメインを形成することが明らかになった。これらは、膜の展開時における過飽和度の違いにより説明された。3.炭化水素系トリクロロシラン化合物の、長鎖炭化フッ素系化合物との混合による相分離構造の構築;OTCSと部分フッ素化化合物の適当な比率で混合された溶液から展開単分子膜を形成させると、OTCSの直径数百nmの円形凝縮相ドメインが、炭化フッ素の膨張相の中に分散した組織構造が得られることがわかった。これらの成果の一部は、第49回コロイドおよび界面化学討論会(東京)およびASOMF'1(筑波)で発表された。
Kupffer細胞と肝細胞の相互作用について

種々の刺激によってクッパー細胞から放出されるモノカインの一つであるインターロイキン1(以下ILー1)が、肝細胞機能の一つである薬物代謝能に与える影響を検討した。Invivo study:pilot studyとして0.04,0.4,4μg/100gBWのILー1をラットの腹腔内に投与し、12時間後に肝ミクロソーム分画中のチトクロームPー450(以下Pー450)を測定したところ、高用量でPー450の減少を認めたため、以下の実験には0.4を使用した。0.4μg/100gBWのILー1をラットに投与し18時間後に屠殺し、血液生化学・補体を測定するとともに、肝薬物代謝酵素としてPー450,b_5,NADPHーdependent cytochrome creductase(cyt c red)、aniline hydroxylase(AH)、aminopyrine demethylase(AD)活性を測定した。IL-1投与によってラットの外見上及び行動上の異常は見られなかった。IL-1投与によって体重は若干減少したが肝重量には差がなかった。血清総蛋白・アルブミン・総ビリルビン・GOT・GPT・LDHに有意差は見られなかったが、A1ーPは有意に上昇しTG・βリポ蛋白は有意に低上した。Pー450・b_5・cytc red・AH・AD活性はILー1投与群においてそれぞれ20・12・20・40・22%の活性低下を認めた。In vitro study:ラット肝細胞を初代培養し、0・4・20・100・500u/mlのILー1を添加し14時間培養後、肝細胞をシャーレより剥がし肝細胞内のPー450を測定した。Pー450は濃度依存性に減少した。以上のことから、ILー1がクッパー細胞を含む単球系細胞より分泌される病態下にあっては肝薬物代謝能が低下することが判明した。
選択的幼弱血管阻害分子BRAKの臨床応用に向けて

我々はBRAK/CXCL14ノックアウトHSC-3細胞をすでに獲得済みである。そこで1HSC-3細胞、2CXCL14ノックアウトHSC-3細胞の培養上清を使用しHUVECに作用させた際の遺伝子発現の変動についてマイクロアレイ解析を行う。本研究とかかわる可能性のある遺伝子群を抽出後、最終的にはBRAK/CXCL14ノックアウトHSC-3細胞に発現ベクターを導入し、遺伝子発現変化が逆の動きをするかどうかを検討した。この遺伝子変動についてはデータマイニングを行い整理行った結果、データ解析では血管の発生や分化に関連するもの、糖代謝に関連するもの、癌に関連するもの等いくつかのカテゴリーに分類された。これまで我々はサイトカインCXCL14が癌抑制遺伝子であることを頭頸部扁平上皮癌を用いて初めて解明した。現在当研究室ではCXCL14の抗腫瘍効果メカニズムを解明することに重きを置き研究を進めている。CXCL14の抗腫瘍効果メカニズムとしては血管新生阻害、免疫系細胞の活性化への関与が報告されている。今回我々は特に血管新生阻害に注目し検討を行った。癌における血管新生阻害を介した抗腫瘍効果というと、すべての血管新生を阻害することが理想だと思われやすいが、実際は異なる。成熟した血管は温存し、幼弱な血管のみを阻害することが理想的とされている。癌の血管新生メカニズムと幼弱な血管新生の問題点は、癌細胞が血管内皮増殖因子を過剰に放出することで、癌組織周囲に存在する血管内皮細胞のみが異常増殖した結果、相対的に血管周皮細胞が少なくなる。一般的にこれを幼弱な新生血管といい、血管透過性が亢進することで細胞間圧が高まり栄養分である酸素や糖は癌組織に到達するが、抗癌剤は到達しにくい状態となる。CXCL14トランスジェニックマウスを作製し検討したところ、我々がターゲットとするCXCL14は成熟した血管は温存しつつ、血管内皮細胞の増殖を明らかに抑制する結果を得た。またCXCL14はVEGF、IL-8、bFGF、IP-10など癌の血管新生に重要な役割を果たす分子に結合することで血管新生抑制作用を示す可能性が報告されている。今回の研究では血管内皮細胞と血管周皮細胞を細胞を主なターゲットとし、CXCL14の作用について解析することで腫瘍組織における血管新生のメカニズムや抗がん剤投与における血管の正常化の重要性について新たな展開を見出せると考えられる。血管内皮細胞と血管周皮細胞の培養条件検討に時間を要している。その後の実験手技については確立しており、計画通り実験を進められると思われる。我々はこれまでに、サイトカインBRAK/CXCL14が癌抑制遺伝子であることを頭頸部扁平上皮癌を用いて解明した(Biochem Biophys Res Commun. 348. 406-412 (2006))。現在、当研究室では複数のチームで研究を進めている。我々はBRAK/CXCL14の抗腫瘍効果メカニズムに対して解明することに重きを置き研究を進めている。BRAK/CXCL14の抗腫瘍効果メカニズム解明のため、BRAK/CXCL14トランスジェニックマウスを作製し、検討したところ明らかに腫瘍内における幼弱血管の新生を阻害する所見を得た。(Transgenic Res. 19. 1109-1117 (2010))。癌における血管新生阻害を介した抗腫瘍効果と聞くと、すべての血管新生を阻害することが理想的を誤解を招きやすいが、実のところ成熟した血管は温存し、幼弱な血管のみ阻害することが理想的とされている。我々が着目するBRAK/CXCL14は前述したように、幼弱な血管を選択的に阻害する作用があり、今後の癌における血管新生において重要なタンパク質として考えられる。本研究ではBRAK/CXCL14がなぜ幼弱な血管を選択的に阻害するかを解明することを目的とした。BRAK/CXCL14ノックアウトHSC-3細胞を作製し、1HSC-3細胞、2BRAK/CXCL14ノックアウトHSC-3細胞、3BRAK/CXCL14ノックアウトHSC-3細胞に再度BRAK/CXCL14を発現させた細胞を用意し、BRAK/CXCL14の有無が細胞培養時にどのように影響を与えるか、マイクロアレイ解析を行い、網羅的な解析を行った。マイクロアレイでは癌に関連するもの、糖代謝に関連するもの、発生や分化に関連するものなどいくつかのカテゴリーに分類された。血管内皮細胞と血管周皮細胞のマイクロアレイデータを解析後、in vitroの実験を進める。また実験が遅れる場合はin vivoでの研究を先に進める。口腔外科血管内皮細胞と血管周皮細胞の培養条件検討に時間を要し、実験が進まなかったため。マイクロアレイ解析やin vivoでの実験に研究費を使用する予定。
次世代の5-ALA光線力学診断および治療機器の開発

5-ALA蛍光ガイド法により、悪性神経膠腫の切除率は向上し、患者の予後は改善した。しかし、診断法としての未解決の問題点も存在する。例えば、励起光量不足による偽陰性の問題、肉眼的な主観的判断による診断の曖昧さの問題などがある。これらの欠点を克服するためには、安全な補助光源の開発、定量的な蛍光診断装置の開発が望まれる。本研究では、これらの欠点を克服する機器群(診断用LED光源装置、分光蛍光輝度定量システム、蛍光センサー駆動の超音波メス)の開発をおこない、臨床に応用し、有用性について検証した。腫瘍切除サンプルを用いて、各種脳腫瘍(悪性神経膠腫、星細胞腫、髄膜腫、悪性リンパ腫、下垂体腺腫、聴神経腫瘍、血管芽細胞腫)のプロトポルフィリンIXの第一ピーク波長である635nmにおける蛍光輝度を分光蛍光輝度計(JETI社製、spectrabos 1201)を用いて測定した。悪性神経膠腫においては、血管面積、血管周囲径、血管密度との間に相関があり、腫瘍における血管新生との関連が示唆された。また、腫瘍の細胞密度やMIB-1インデックスとの間にも相関があり、腫瘍自体のviabilityとの関連も有していると考えられる。髄膜腫に関しては、悪性神経膠腫とほぼ同等の蛍光輝度を有していた。近年、発生頻度が増加傾向にある悪性リンパ腫は、50%の確率で腫瘍蛍光を有していたが、その蛍光輝度は悪性神経膠腫に比べて約半分であり、淡い蛍光を呈していることが判明した。このことから、悪性リンパ腫では、偽陰性に注意が必要である。下垂体腺腫、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍は、いずれもプロトポルフィリンIXの僅かな蛍光の痕跡も認めることは無く、腫瘍蛍光が陰性の腫瘍であることが判明した。ハンドース型の診断用LEDの開発と臨床応用1)ハンドピース型の診断用LEDの開発:高効率にPpIXを励起する405nmを中心波長とする高輝度LED光源を開発し、その研究成果としてCCS株式会社により「エスペラルース」として医療機器認可された。しかし、LEDヘッドがやや大きいために、深部の病巣の観察の際に励起光軸と観察光軸が重なることで腫瘍蛍光の観察に支障を生じていた。この欠点を克服するためにハンドピース型の診断用LEDを試作した。励起光量は、従来型と同等であった。LEDヘッドのサイズは、従来品が4×6cmであったのが3cmφと小型化が達成できた。2)ハンドピース型の診断用LEDの開発:病院倫理委員会の承認のもと5-ALA蛍光ガイド下悪性脳腫瘍摘出術に応用を行った。通常の蛍光観察に問題なく、深部蛍光の観察において視野を妨げは、大幅に軽減可能であった。予定通りのハンドピース型LED励起光源の開発を完了し、臨床応用も完了できた。膨大な、腫瘍サンプルデータから蛍光輝度解析を行うことが出来た。5-ALA用の治療用LEDを開発を行う。また、5-ALA用の治療用LEDの安全性試験をラットを用いて行う。具体的には、636nmのLED光をラットの脳に対して、経頭蓋的に脳に照射し、照射光量と脳損傷(脳浮腫、脳血液関門の破綻、神経細胞の減少、アポトーシス)の関係を明らかとし、照射光量の安全域を決める。脳神経外科治療用LEDの開発、ハンドピース型の診断用LEDの開発などを行っていく。治療用LEDに関しては、安全性試験をラットを用いて行う。研究費は概ね計画通りに使用した。しかし、若干の節約が可能であり未使用額か生じました。
産業ライフサイクルの進展と下位企業の戦略的対応

本研究の目的は、小規模な企業が長期にわたり高い業績を維持するにはどのような戦略を採ればいいか、という問題に対して経験的な解答を与えることであった。一般に「小企業規模な企業」と言えば中小企業ということになるが、デ-タ入手可能性の問題から、本研究では上場企業のうち最小クラスの会社を主たる研究対象とした。2年間にわたる調査研究から得られた知見を要約すると以下のようである。まず、「下位企業は高収益性を維持しながらライフサイクルを乗り切るために、立ち上げ期:成長期と成熟・衰退期でそれぞれ異なる製品系列の方針を採用する」という本研究の基本仮説は、少なくとも下位の上場生産財メ-カ-の場合には、当てはまりそうにないことがわかった。すなわち、高業績の下位上場生産財メ-カ-は、産業ライフサイクルの進展にもかかわらず、製品構成を大きく変化させることなく高業績を維持する傾向を見せたのである。鉄鋼・化学といった典型的な成熟産業ですら、これらの企業は全体として市場成長をはるかに上回って成長している。この事実が何を意味するかと言えば、それは競争相手のシェアを奪うことによる成長しか考えられないだろう。経営比率分析の結果もまた、全般的に言って、成長産業によりも停滞産業における方が高業績の下位企業はよりコスト削減努力をしていることを示唆している。したがって、停滞産業における高業績の下位生産財メ-カ-は、コスト競争力を武器に競争相手のシェアを奪いながら高い成長性と収益性を持続させている、という推論が成り立つ。実際に企業訪問をしてみると、このような企業努力を目の当りにすることができる。高業績の下位上場生産財メ-カ-に共通して言えるのは、(1)得意技術の周辺から決して外れない製品展開、(2)世界一流の企業を取引先として持つ、(3)基礎研究ではなく応用研究の積み重ねによる新製品開発がが特徴的だということであった。89年度を通じて、鉄鋼・繊維など6つの業界における約170社の上場企業について、過去20年間にわたる各種経営デ-タが収集され、ハ-ドディスクの内部にデ-タベ-スとして蓄積された。まだ、統計分析による本格的な仮説検証の段階には至っていないが、視角的に得られた情報にもとづく確認は可能である。その結果得られた若干の知見を、当該年度の研究成果として以下のようにまとめたい。当初の研究計画によれば、下位企業にふさわしい戦略型として集中戦略というものが、本研究における鍵概念として設定された。しかしながら、集中戦略は産業ライフサイクルの進行過程のどの段階でも有効なわけではなく、合理的な企業であれば、急成長期には拡散型を停滞期には集中型と戦略のパタ-ンを使い分けるであろうと仮設された。十分に根拠のある仮設だと思われたが、結論から言えば、戦略型の使い分けという仮設はデ-タによってまったく支持されていないようだ。ただし、上場下位企業の長期にわたる業績(収益性と成長性)を左右する要因として、製品/市場ミックスの展開状況は明らかに集中型の方が有利であるように見える。優良な上場下位企業が示した長期にわたる戦略にかんして、予期せず得られた知見は次のようなものである。まず、優良グル-プは20年間にわたって、実に一定した新製品導入・育成のパタ-ンを保っていることが印象的である。旧製品系列と新製品系列の密な連係を保ちながら、ほぼ10年の間隔で主軸となる製品を後退させているのである。そして、このような企業群は業界全体の浮き沈みにもかかわらず、平均以上の収益性を維持しながら着実な成長を示している。逆に低迷下位企業グル-プでは、長期にわたって終始拡散的で変化の少ない製品/市場ミックスを維持する傾向が認められる。

これらの企業の業績は、その結果として、産業ライフサイクルとともに波乗りのように大きく変動するのである。本研究の目的は、小規模な企業が長期にわたって高い業績を維持するにはどのような戦略を採ればいいか、という問題に対して経験的な解答を与えることであった。一般に「小企業規模な企業」と言えば中小企業ということになるが、デ-タ入手可能性の問題から、本研究では上場企業のうち最小クラスの会社を主たる研究対象とした。2年間にわたる調査研究から得られた知見を要約すると以下のようである。まず、「下位企業は高収益性を維持しながらライフサイクルを乗り切るために、立ち上げ期・成長期と成熟・衰退期でそれぞれ異なる製品系列の方針を採用する」という本研究の基本仮説は、少なくとも下位の上場生産財メ-カ-の場合には、当てはりそうにないことがわかった。すなわち、高業績の下位上場生産財メ-カ-は、産業ライフサイクルの進展にもかかわらず、製品構成を大きく変化させることなく高業績を維持する傾向を見せたのである。鉄鋼・化学といった典型的な成熟産業ですら、これらの企業は全体として市場成長をはるかに上回って成長している。この事実が何を意味するかと言えば、それは競争相手のシェアを奪うことによる成長しか考えられないだろう。経営比率分析の結果もまた、全般的に言って、成長産業によりも停滞産業における方が高業績の下位企業はよりコスト削減努力をしていることを示唆している。したがって、停滞産業における高業績の下位生産財メ-カ-は、コスト競争力を武器に競争相手のシェアを奪いながら高い成長性と収益性を持続させている、という推論が成り立つ。実際に企業訪問をしてみると、このような企業努力を目のあたりにすることができる。高業績の下位上場生産財メ-カ-に共通して言えるのは、(1)得意技術の周辺から決して外れない製品展開、(2)世界一流の企業を取引先として持つ、(3)基礎研究ではなく応用研究の積み重ねによる新製品開発が特徴的だということであった。
アロ移植片の免疫寛容維持における単球系抑制性細胞の役割

抑制系細胞の“記憶維持"すなわち免疫寛容の維持機構を解明に挑戦する。本研究では、癌の免疫回避機構やアレルギーの制御機構など抹消性(局所)の免疫寛容を誘導するミエロイド系抑制細胞(myeloid derived suppressor cells: MDSC)に注目し、マウス異所性心移植のアロ移植免疫寛容モデル(CD80/86抗体投与)を用いて、移植片の寛容状態にMDSCがどのように貢献しているかを検討する。さらに、申請者らが研究開発したin vitro誘導性のMDSC、中でも抑制能や制御性T細胞の誘導能の高い単球系MDSCを今回より効率よく培養誘導する技術基盤を構築する。
非線形・非定常船体運動のスペクトル解析に関する研究

本研究課題では、非線形・非定常船体動揺を解析するための瞬間高次スペクトル解析法の開発を行った。この方法は時変係数多変量自己回帰モデルを用いた瞬間パワースペクトル解析法を高次スペクトル解析へ拡張応用したものであり、練習船を用いた実船実験解析結果より、旋回運動中の高次スペクトルの時間的変化を明らかにし、国内外の学会で高い評価を得ることができた。よって、本研究課題の目標を達成することができたといえる。本研究課題では、パラメトリック横揺れ等の非線形・非定常船体動揺を主な解析対象として、変針増減速を含む通常航行時の船体動揺を高次スペクトル解析するアルゴリズムの開発を試みている。具体的には、理論的研究、模型船を用いた水槽実験、練習船を用いた実船実験という3つに分けて研究を行っている。平成20年度に得られた具体的研究成果は以下のとおりである。1.理論的研究:時変係数自己回帰モデルによって定義される瞬間パワースペクトル解析をリアルタイムで行えるようにアルゴリズムの改良を行った。これは本解析法を高次スペクトル解析に拡張する際に必要となる改良であり、これによって効率的な高次アルゴリズムの開発が可能となる。2.模型船を用いた水槽実験:大振幅の動揺を計測するために、研究室で保有する本学附属練習船「汐路丸」の1/40模型船に自航システム、動揺計測システムを自作して搭載した。現在は水槽内での模型船位置計測のための位置情報推定用MOTEキットの水槽天井への取り付け作業を行っている。3.練習船を用いた実船実験:汐路丸実験航海(3月)に参加し、非線形・非定常船体動揺データの計測を行った。できる限り詳細な海象データを得るために、海上保安庁第三管区海上保安本部に協力を要請し、野島埼灯台に設置されているレーダ波高観測データを入手することができた。平成21年度に得られた具体的研究成果は以下のとおりである。1.理論的研究:昨年度開発した、時変係数自己回帰モデルによるリアルタイム瞬間パワースペクトル解析法に関する論文をOMAE'09で発表した。さらに、本計算法を高次スペクトル解析が行えるようにアルゴリズムを拡張し、本研究課題の主目的である、非線形・非定常船体運動のスペクトル解析が可能となった。この解析法を実船実験結果に適用した結果をOMAE2010に投稿し、論文審査に合格したところである。平成22年6月に発表する予定である。また、本研究課題の解析法に関連して、デンマーク工科大学のニールセン准教授と共同研究を実施し、同じくOMAE2010に論文を投稿し、論文審査に合格したところである。2.模型船を用いた水槽実験:本学調査・研究船「やよい」の模型船を製作し、自航システム、動揺計測システムを自作中である。模型船は年度当初で製作する予定であったが、「やよい」を建造した造船所からの図面の入手と、精密模型船製作業者の数が少なくなっているため、かなりの時間を要したが、十分満足のいく模型船が完成し、水槽実験での成果が期待できる。3.練習船を用いた実船実験:本年度も汐路丸実験航海(3月)に参加し、非線形・非定常船体動揺データの計測を行った。できる限り詳細な海象データを得るために、汐路丸で実験中の波浪レーダのデータも入手した。本研究課題では、パラメトリック横揺れ等の非線形・非定常船体動揺を主な解析対象として、変針増減速を含む通常航行時の船体動揺を高次スペクトル解析するアルゴリズムの開発を試みた。最終年度である平成22年度は、開発した瞬間高次スペクトル解析法を練習船による実船実験結果に適用し、得られた結果を学会で公表した。また、模型船を用いた水槽実験、練習船を用いた実船実験についても実施した。得られた具体的研究成果は以下のとおりである。アルゴリズムの有効性を検証するために、昨年度製作した本学調査・研究船「やよい」の模型船に、本研究で開発した動揺計測システムならびに自航システムを搭載した。船体動揺計測用とオートパイロット用を兼ねてバーティカルジャイロを搭載し、PICの回路によって模型船の制御を行った。まず、基本的航行性能を東京海洋大学垂直循環型回流水槽において確認した。次に、運航性能試験水槽では計測された船体動揺データのワイヤレス送信が不安定であることが分かったため、自作EEPROM回路によってデータ記録することにし、船体動揺データが取得可能となった。本研究課題の成果公表するために、瞬間高次スペクトル解析法に関する論文をOMAE2010ならびに日本航海学会において発表した。本解析法はTVVARモデルを用いた瞬間パワースペクトル解析法をバイスペクトル解析とトライ

スペクトル解析に拡張応用したものであり、周波数平面における汐路丸実船実験データの非定常性を検討した結果、縦揺れ、横揺れ、上下加速度の歪度が旋回中に大きくなる傾向があることが確認できた。さらに、瞬間トライスペクトルの推定における本アルゴリズムの有効性を示すことができた。以上により、本研究課題の目標を達成したと思われる。