hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
メカニカルストレスによる骨代謝に対する神経ペプチドの制御機構の解析

メカニカルストレスによる骨代謝に対する神経ペプチドの制御機構の解析のために、神経ペプチドと関連のあるオステオアクチビン(OA)についてヒト歯根膜線維芽細胞について調べた。ラットの臼歯に実験的矯正力を加えたとき、OAは歯根膜線維芽細胞、骨芽細胞、および破骨細胞に発現した。歯根膜線維芽細胞に伸展力を加えるとOAの免疫陽性細胞は減少した。これらの結果より伸展力によってOAの細胞外ドメインが遊離して、伸展側の骨芽細胞に作用し骨形成を促進することが示唆された。本年度は神経ペプチドとともに、矯正力による歯の移動に関連のある低酸素状態の歯根膜への影響を調べた。矯正力を歯に加えると、圧迫側の歯根膜は低酸素状態になることが知られている。また、歯根膜細胞は、高いalkaline phosphatase(ALP)活性など、osteogenio activityをもつことが明らかとなっているが、圧迫力による低酸素状態が歯根膜細胞の,osteogenio activityにどのよう影響を与えている明らかではない。今回、ヒト歯根膜細胞を用い、低酸素状態と、低酸素状態でさらに圧迫力を加えたときのALP活性、Runx2発現について検討した。ヒト歯根膜細胞を、10%FBS含有α-MEMもしくはα-MEMに5091mLアスコルビン酸、100μMβ・グルセロリン酸、10・8Mデキサメタゾンを加えた培養液で4日間培養した。低酸素濃度は5%と1%に設定し、培養液量を増加させることにより5.0g/cm2もしくは8.0g/cm2の圧迫力を加えた。低酸素環境であるかどうか、hypoxia-indudble 1 alpha(HIF1-α)の免疫染色により調べた。上記条件で培養後、ALP活性を測定し、Runx2ならびにHIF1-αの遺伝子発現を半定量的にRT-PCRにて調べた。低酸素でヒト歯根膜細胞を培養後、低酸素を示す核内のHIF1-α陽性反応が認められた。ALP活性は低酸素と圧迫力と相乗的に減少が認められた守低酸素状態では、Runx2発現はコントロールよりも低く、5%O_2より1%O_2の方で、発現が低かった。5%O_2下では、Runx_2発現は、圧迫力の大きさに伴い減少したが、1%O_2下では圧迫力によるRunx2の変化は認められなかった。これらの所見よ駅低酸素環境はヒト歯根膜細胞のosteogenic activiyを減少させ、さらに圧迫力を加えると、低酸素と相乗的にosteogenic acivityを減少させることが明らかとなった。したがって、歯に矯正力を加えたときの圧迫側では、歯根膜細胞が低酸素環境によりosteogenic activityを失い、低酸素という条件も歯根膜細胞による骨代謝に関連していることが示唆された。矯正的歯の移動は、破骨細胞による骨吸収と、骨芽細胞による骨形成による骨リモデリングにより生じ、歯根膜がその骨代謝を調節するキーファクターであることがこれまでに分かっている。本研究では、骨形成因子であるosteoactivin (OA)について着目した。OAは、2001年に大理石病のモデルラットより、その原因遺伝子として分離同定された分子で、当初は骨芽細胞の骨形成を促進する分子であると考えられていたが、様々な働きがあることが分かってきており、骨芽細胞の分化および骨形成促進、破骨細胞の形成促進、ガン細胞の転移抑制、線維芽細胞の増殖抑制などが報告されている。今回我々は、歯周組織の骨代謝におけるOAの働きについて解明するため、in vivoとin vitroでメカニカルストレス下の歯周組織におけるOAの発現について調べた。矯正的歯の移動を生じたラット歯周組織において、OA免疫陽性破骨細胞が圧迫側で認められ、また一方で、多くのOA免疫陽性骨芽細胞が伸展側で観察された。また、PCR法とreal-time PCR法でOAmRNAがヒト歯根膜線維芽細胞に発現しており、メカニカルストレス(圧迫力・伸展力群)によりOA発現が減少することを認めた。さらに、ヒト歯根膜線維芽細胞におけるOAの細胞内・外ドメインの両者の局在について免疫蛍光染色で調べたところ、OA細胞内ドメイン免疫陽性反応は、コントロール群に比較し圧迫力群で増加、伸展力群で減少し、一方OA細胞外ドメイン免疫陽性反応は、圧迫力群ではコントロール群と同様、伸展力群では減少した。このように、遺伝子レベルと免疫染色の結果の相違より、OAがシェディングを受け、オートクライン調節を介して作用している可能性が示された。さらにOA活性化のメカニズムの解析が進めば、歯周組織の骨リモデリングの解明の一助となる。この研究成果をH21年9月22-24日に中国武漢で行われたJADR 57th annual Meeting, 2nd Meeting of IADR Pan Asian Pacific Federation (PAPF) and the 1st Meeting of IADR Asia/PacificRegion (APR)で発表し、Young Investigator Award of JADRを受賞した。

本年度は神経に関連のある骨形成因子であるオステオアクチビン(OA)に着目した。OAは骨硬化症のモデルラットよりその原因遺伝子として分離同定された分子であり、当初は骨芽細胞の骨形成を促進する分子であると考えられていたが、近年、ガン細胞や線維芽細胞にもOAの発現が報告されている。また、神経ペプチドのレセプターを誘導することも報告されている。我々も以前の研究で、歯根膜線維芽細胞(PDL)にもOAが発現していることを見いだした。本年度の研究ではin vivoではラットの臼歯を実験的に歯牙移動させOAの局在を調べた。その結果、OAはPDLのみならず牽引側に存在する骨芽細胞および圧迫側に存在する破骨細胞にも局在が確認された。PDL細胞については免疫陽性反応を示すものの、圧迫側、牽引側でのOA免疫染色の染色性の違いは認められなかった。in vitroでは、ヒトPDL細胞を用い、メカニカルストレス(伸展刺激)を加えた時のOAの発現をRT-PCRおよび免疫染色にて調べた。伸展刺激を加えたPDLは刺激を加えない対照群に比べ、RT-PCRではOAの発現に変化がなかったものの、免疫染色ではOA免疫陽性細胞が減少していた。これらの結果より、PDL細胞に伸展刺激を加えると、OAの発現の変化はないものの、細胞外ドメインの切断(シェディング)が起こり、細胞ドメインが遊離したためにOA免疫陽性細胞が減少したものと考えられた。この伸展刺激により遊離したOAが歯槽骨の骨芽細胞まで到達し、歯牙移動時には牽引側での骨形成の促進に関わっている事が示唆された。
シミュレーション教育におけるフィジカルアセスメントの実践力

本研究は「シミュレーション教育におけるフィジカルアセスメントの実践力」をテーマに医療教育の主流になりつつあるシミュレーション教育がフィジカルアセスメントの看護実践能力に与える影響を明らかにすることを目的に、2年間で以下の4つのミッションを達成することを計画し、実施している。1フィジカルアセスメント看護実践能力を評価するためのデバイスと環境の整備2シミュレーション教育を行うために必要なシナリオの作成と評価・検証3シミュレーション教育における看護師のフィジカルアセスメント実践能力の評価4シミュレーション教育における看護学生のフィジカルアセスメント実践能力の評価平成30年度は1フィジカルアセスメントの看護実践能力を評価するために必要なデバイスや実験環境の整備、評価・検証を行った。また、2シミュレーション教育を行うために必要なシナリオの作成・実施と信頼性・妥当性の評価、それらを活用するためのトレーニングを実施した。3シミュレーション教育における看護師のフィジカルアセスメント実践能力の評価のため、病院勤務の看護師に対してシミュレーション教育を実施し、実施前後での面接・フィジカルイグザミネーション・観察視点となる眼球運動、アセスメントの記述の調査を現在実施している(進行中)。さらに4シミュレーション教育における看護学生のフィジカルアセスメント実践能力の評価の一つとして、看護学生に対するシミュレーション教育後のフィジカルアセスメントの記述内容の達成度を評価するため、作成したシナリオに基づいたシミュレーション教育後の各学年のフィジカルアセスメント記述内容を調査し、テキストマイニングにて分析を現在行っている(進行中)。当該年度に調査実施終了を予定していたが、所属機関の倫理審査システム、規定変更に伴う審査待機期間として約半年間を要した。そのため、調査開始が予定の半年遅れとなり、現在調査進行中の状態である。現在、4つのミッションの3シミュレーション教育における看護師のフィジカルアセスメント実践能力の評価、4シミュレーション教育における看護学生のフィジカルアセスメント実践能力の評価のための調査進行中であり、本年度は調査終了、データ解析、分析を行い、成果をまとめる。所属機関の倫理審査システム・規定変更に伴う審査待機期間として約半年間を要したため、調査開始が予定の半年遅れとなった。当初の予定では当該年度にて調査終了する予定であったが、計画が半年遅れであり、現在調査進行中のため、参加者への謝金を次年度へと繰り越した。
人工細胞膜を介した三次元液滴ネットワークの組み立て

本年度は初めに、昨年度にスウェーデン王立工科大学(KTH)との共同研究で発見したマイクロ足場構造中での液滴生成現象に対する三つの無次元数(2流体の粘度比、接触角の余弦とキャピラリ数)の影響を調べた。この液滴生成現象は、水と油の界面がマイクロ足場構造を通過する過程で水溶液の液滴が生じるというものである。シリンジポンプを利用した流速制御下で、親水の足場構造中では非常に小さい毛管数(10^ー4)でも液滴が生成されることが分かった。従来のマイクロ流体デバイスでは高毛管数で粘性の影響が支配的な場合に液滴が生成されるが、本技術では表面張力の影響が支配的な場合でも液滴が生成可能であることが分かった。この成果は、平成30年10月に札幌で行われた第9回マイクロ・ナノ工学シンポジウムで、特別研究員によりポスター発表され、日本機械学会マイクロ・ナノ工学部門から若手優秀講演表彰を授与された。続いて、神奈川県立産業技術総合研究所(KISTEC)の人工細胞膜システムグループとの共同研究により、足場構造中に生成された液滴アレイを積み重ねることで人工的に脂質二分子膜を形成できることを実証した。ハイドロゲル化で液滴をマイクロ足場構造に固定し、それらを手動で積み重ね脂質二分子膜を形成した。この脂質二分子膜は、微小電流計測によって確認された。この成果は、平成31年1月に韓国ソウルで開催された査読有の国際学会MEMS2019に採択され、研究代表者がポスター発表を行った。これらの成果をまとめ、近日中の論文投稿を予定している。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、円形溝アレイを用いた液滴生成・アレイ化方法の開発を行った。初めに、アクリル微細加工で鋳型を製作し、光硬化性樹脂のモールディングを行い、流路で互いに接続された円形溝アレイを製作した。アレイを水溶液で満たし有機溶媒を導入すると、より表面への濡れ性が高い有機溶媒がアレイの表面を伝播し、円形溝部分に液滴を生成することが可能であることが確認された。従来のピペッティングロボットやマイクロ流路による液滴アレイ生成方法では、精確な個別操作や流体制御が必要であった。これに対し、本手法は溶液や溶媒を滴下するだけで液滴生成可能なため、従来方法に比べて非常に簡単にアレイを生成することが可能である。本手法は、国内特許に出願済みである。この手法は、人工細胞膜を介した液滴ネットワークの形成に関する研究に加え、液滴アレイを利用した生化学アッセイや医療診断分野でも利用され得る技術である。特に、本手法が有する、溶液が二次元に接続した状態から液滴に分割されるという特徴は、拡散を利用した二次元に異なるサンプルの濃度勾配を内包する液滴アレイの生成に利用できる。この点に関しては査読ありの国際学会MicroTAS2016で口頭発表された。また、円形溝アレイの最適な表面状態の検討を行った。グラフティング反応により表面エネルギーが制御可能なポリマー材料Off-Stoichiometric Thiol-Eneを用い、異なる表面状態での液滴の収率を調べた。この結果は、査読ありの国際学会Transducers2017で発表予定である。円形溝のアレイを用いることで、本年度の研究課題であった液滴生成方法の確立を予定通り行うことができた。また、当該手法が二種のサンプルの濃度勾配を有する液滴アレイ生成へ利用可能であることを見出し、計画を一部修正しその実証を行った。この成果についてきわめて競争率の高いMicroTAS2016学会の口頭発表に受理された。また、現在論文を執筆中であり、近日中に投稿予定である。人工細胞膜を介した液滴ネットワークの形成に向けた脂質二分子膜に関しても、現在行っている実験において揮発性の有機溶媒を用いることで形成可能であることが示唆されており、進捗としては順調である。【2次元液滴アレイの細胞死アッセイへの応用】前年度開発した液滴アレイ生成技術は、水成分を連結状態から迅速に液滴アレイに分離可能という特徴を有する。このため、連結状態で形成した試薬の濃度勾配など、アレイの位置によって変わる内容物の条件は液滴アレイにも引き継がれ、異なる条件を有する液滴のアレイの生成が可能である。これは、新薬の効果を示す指標となるIC50の特定など、一度に多くの条件を調査する研究において、非常に有用性が高いと期待できる。シクロヘキシミドという細胞のタンパク質合成を阻害する試薬の濃度勾配を含む液滴アレイを生成し、Sf9細胞という昆虫細胞の生死アッセイを行った。はじめに、Sf9細胞を含む培地をウェルアレイ全体に浸透させた。続いて、ウェルアレイに接触する部分から高濃度のシクロヘキシミド水溶液を拡散させた。30分後シリコーンオイルが加えられ、液滴のアレイが生成された。培養24時間後シクロヘキシミドの濃度上昇に沿ってSf9細胞の死亡率の増加が見られた。この結果から、異なる試薬の濃度の細胞死アッセイが一チップ上で行えることが示された。本成果はLab on a Chip誌に掲載された。【3次元での液滴生成方法の確立】申請者は以前KTHに留学し、やぐら状に連結し合うピラー構造を発表した。このやぐら状構造内には双四角錐状のピラー構造の連続的なパターンが存在する。

この構造全体に水・油成分を順次導入することで、双四角錐内部に液滴を生成できると考えた。やぐら状構造はOSTEというフォトレジストに4方向からUVを照射することで製作された。水溶液を満たし、続いて鉱油を加えることで、3次元での液滴生成に成功した。この成果は特別研究員を口頭発表者として国際学会MEMS2018で報告された。2次元での液滴アレイ生成技術を細胞の生死アッセイに応用し、新薬の効果を示す指標となるIC50の特定などへの応用可能性を示唆した。この成果はLab on a Chip誌に採択され、PCT国際特許出願も果たした。また、微小化のためウェルアレイの作製方法を修正し、その成果を国際学会Transducers2017でポスター発表した。本年度の研究課題であった3次元での液滴生成方法の確立は、スウェーデン王立工科大学(KTH)との共同研究により達成された。平成29年度後期からKTHに滞在し研究を行い、半年という短い期間でありながら3次元のやぐら状構造中での液滴生成に成功した。現地の共同研究者のWouter van der Wijngaart先生の指導の下、MEMS2018学会に採択され特別研究員が口頭発表を行った。以上のように、当初の計画の達成がなされたため進捗は順調であると判断する。本年度は初めに、昨年度にスウェーデン王立工科大学(KTH)との共同研究で発見したマイクロ足場構造中での液滴生成現象に対する三つの無次元数(2流体の粘度比、接触角の余弦とキャピラリ数)の影響を調べた。この液滴生成現象は、水と油の界面がマイクロ足場構造を通過する過程で水溶液の液滴が生じるというものである。シリンジポンプを利用した流速制御下で、親水の足場構造中では非常に小さい毛管数(10^ー4)でも液滴が生成されることが分かった。従来のマイクロ流体デバイスでは高毛管数で粘性の影響が支配的な場合に液滴が生成されるが、本技術では表面張力の影響が支配的な場合でも液滴が生成可能であることが分かった。この成果は、平成30年10月に札幌で行われた第9回マイクロ・ナノ工学シンポジウムで、特別研究員によりポスター発表され、日本機械学会マイクロ・ナノ工学部門から若手優秀講演表彰を授与された。続いて、神奈川県立産業技術総合研究所(KISTEC)の人工細胞膜システムグループとの共同研究により、足場構造中に生成された液滴アレイを積み重ねることで人工的に脂質二分子膜を形成できることを実証した。ハイドロゲル化で液滴をマイクロ足場構造に固定し、それらを手動で積み重ね脂質二分子膜を形成した。この脂質二分子膜は、微小電流計測によって確認された。この成果は、平成31年1月に韓国ソウルで開催された査読有の国際学会MEMS2019に採択され、研究代表者がポスター発表を行った。これらの成果をまとめ、近日中の論文投稿を予定している。28年度に確立した2次元での方法をもとに、3次元での液滴アレイ生成に拡張する。29年度は、液滴生成の骨格として使用する3次元格子構造の製作方法を確立する。この構造の製作に関して、スウェーデン王立工科大学のMicro and Nanosystemsグループと共同研究を開始する。平成29年度に得られた3次元での液滴生成技術を、人工細胞膜及び3次元液滴ネットワークに拡張する。
骨髄間葉系幹細胞に関する研究:造血・造骨・血管新生の連関分子

我々は、マクロファージ系前駆細胞を複数の抗体を用いて分離し、増殖因子としてのM-CSFが、骨芽細胞から産生される膜結合性蛋白RANKLと共存することにより、前駆細胞から破骨細胞分化が進行することを明らかにした。さらに、前駆細胞と骨芽細胞の接着が分化に不可欠であることを示し、破骨細胞分化が骨表面上でしか起きえないことを説明した。可溶性のRANKLでは、破骨細胞誘導能が低く、可溶性RANKLを多量化すると分化が効率よく進むことを確認した。また、RANKは、もともと樹状細胞からクローニングされた受容体で、樹状細胞分化においては、RANKLとGM-CSFの共存が必要であることを示した。さらに、本研究では、胎生期、肢芽軟骨膜にALCAM陽性細胞が存在し、FACSによりこれらの細胞を分離することに成功した。この細胞からは、骨細胞・軟骨細胞・脂肪細胞およびストロマ細胞の分化が試験管内で観察された。また、ALCAM接着分子は、骨への血管進入を促進することを明らかにした。さらに、血管内皮細胞の増殖は、破骨細胞、脂肪細胞層の上で促進され、逆に、軟骨細胞の上で抑制されることを明らかにした。後者においては、chondromodulin-1の他にephrin-B2が特異的に発現しており、これらの分子が血管の進入を制御していると考えられる。本研究により、軟骨を経て骨化が進み、血管、破骨細胞の進入により、骨髄腔が形成され、骨芽細胞、血管内皮細胞を足場に、造血の場が形成される過程の分子解析が進んだ。以下の三つの視点に立って現在研究を展開している。(1)破骨細胞は、単球系前駆細胞から分化し、マクロファージとの分岐機構は、造血細胞の分化決定のモデルとなりうる。(2)破骨細胞の分化は、造血環境の構築という点において緊密に連関し、骨髄造血における重要な機能系である。(3)造血幹細胞由来の破骨細胞と間葉系幹細胞由来の骨芽細胞によるリモデリングは、系譜の異なる細胞の相互作用を考える点で興味深い。我々は、マウス破骨細胞前駆細胞をFACSを用いて純化し、M-CSF,RANKLの作用点を明らかにした。破骨細胞分化は、M-CSFによって発現誘導されたRANK受容体に一定の時間内に、RANKLが結合することによって完了する。M-CSFは、細胞増殖・生存に必要であり、RANKLは分化決定に不可欠と考えられる。RANKが発現していても、RANKLの結合がなければ、前駆細胞はマクロファージへと分化することより、マクロファージ分化はデフォルトの分化経路と考えることができる(J.Exp Med.1999)。さらに、我々は、破骨細胞前駆細胞のコロニー形成系の検討により、インテグリンを介する細胞接着が、破骨細胞の最終分化に重要な役割を演ずることを明らかにした(Blood,2000)。また、この破骨細胞の分化系に対して、GM-CSFは、拮抗的に作用し、樹状細胞分化を誘導する(Blood,in press)。一方、間葉系幹細胞由来の骨芽細胞が、血管新生・破骨細胞分化にどのように関与し、造血環境の構築に貢献しているかについても、アンジオポエチンおよびその新規関連分子(ARPs)を中心に解析を進めている。本研究では、造血幹細胞・血管内皮細胞・ペリオストに発現するアンジオポエチンファミリーを中心とする新しい機能分子の機能解析を通して、「造血はなぜ骨髄で営まれるのか」という問に一定の解を与えるべく研究を進めてきた。1)造血幹細胞の血管新生における役割:造血は、胎生期、胎児と卵黄嚢を結ぶ卵黄動脈などの血管内皮細胞に接して発生することを認めた。これらの血管内皮細胞から、新規の幹細胞因子のクローニングを行い、そのうちの3種について遺伝子ノックアウトマウスの作成を進めた。

また、造血幹細胞がアンジオポエチン-1を介して血管新生に関与することを明らかにした。これを展開させて、造血幹細胞からペリサイト・血管内皮細胞が分化する可能性を示唆した。2)骨髄間葉組織からの骨芽細胞・血管内皮細胞の前駆細胞の同定とその分化誘導:ペリオストに、骨・軟骨・脂肪細胞の前駆細胞が存在することを、幹細胞の色素低標識の特異性(Side Population)とALCAM接着分子に対する抗体を用いて証明した。骨・脂肪細胞が血管新生を誘導するのに対し、軟骨細胞は血管新生を阻止し、これにephrin/Ephのシグナルが関与しているというデータを得た。3)造骨・破骨に関わる新規制御分子の機能解析:造血幹細胞に由来する破骨細胞の前駆細胞をFACSで単離し、M-CSF, RANKLの存在下にその分化を誘導する系を確立した。この培養系を用いてsubtractionにより、G蛋白・抗アポトーシス関連遺伝子のクローニングに成功した。これらをレトロウイルスベクターにより破骨細胞前駆細胞に導入し、その機能を解析している。我々は、マクロファージ系前駆細胞を複数の抗体を用いて分離し、増殖因子としてのM-CSFが、骨芽細胞から産生される膜結合性蛋白RANKLと共存することにより、前駆細胞から破骨細胞分化が進行することを明らかにした。さらに、前駆細胞と骨芽細胞の接着が分化に不可欠であることを示し、破骨細胞分化が骨表面上でしか起きえないことを説明した。可溶性のRANKLでは、破骨細胞誘導能が低く、可溶性RANKLを多量化すると分化が効率よく進むことを確認した。また、RANKは、もともと樹状細胞からクローニングされた受容体で、樹状細胞分化においては、RANKLとGM-CSFの共存が必要であることを示した。さらに、本研究では、胎生期、肢芽軟骨膜にALCAM陽性細胞が存在し、FACSによりこれらの細胞を分離することに成功した。この細胞からは、骨細胞・軟骨細胞・脂肪細胞およびストロマ細胞の分化が試験管内で観察された。また、ALCAM接着分子は、骨への血管進入を促進することを明らかにした。さらに、血管内皮細胞の増殖は、破骨細胞、脂肪細胞層の上で促進され、逆に、軟骨細胞の上で抑制されることを明らかにした。後者においては、chondromodulin-1の他にephrin-B2が特異的に発現しており、これらの分子が血管の進入を制御していると考えられる。本研究により、軟骨を経て骨化が進み、血管、破骨細胞の進入により、骨髄腔が形成され、骨芽細胞、血管内皮細胞を足場に、造血の場が形成される過程の分子解析が進んだ。
観光プロジェクトの需要予測と便益計測に関する研究

本研究は、観光プロジェクトの評価手法の確立を目指し、需要予測および便益計測に関するモデル構築を効用理論からアプローチしようとするものである。最終年度の主な成果は、以下のとおりである。(1)周遊行動を考慮した観光需要予測モデルの構築・・・初年度では本モデルの構築に際し、人々の観光行動のモデル化にネステッドロジットモデルを採用し、吸収マルコフ連鎖型のシミュレーションモデルを組み合わせることによって需要予測モデルを構築したが、本モデルによって与えられる選択確率(観光地間の推移確率)が滞在日数の影響を受けるようなモデル構造になっているので、吸収マルコフ連鎖において定常性およびマルコフ性が成立しないという構造上の問題が残された。再検討の結果、これらの問題に対する解決には至らず、ランダム効用理論に基づくネステッドロジットモデルによって、周遊行動を考慮した観光需要予測モデルを構築した。(2)観光プロジェクト便益計測モデルの構築・・・観光需要予測モデルに組み込まれている効用関数に厚生経済学の分野で用いられている等価的偏差の概念を適用して、観光プロジェクト便益計測モデルを構築した。ここで、当該プロジェクトが「質の改善」というような、市場を形成しない要素の改善プロジェクトの場合には、それによる観光地魅力度の上昇分と等価な一般化交通費用の低下分に置き換えるという操作を施した。(3)観光プロジェクト評価の事例研究・・・分析対象地域を岐阜県に限定し、観光道路建設等による観光行動への影響を評価した。例えば、東海北陸自動車道が全線開通した場合、観光地開発を並行して行わないと、岐阜県内観光地の宿泊客が減少する可能性があることがわかった。本研究は、観光プロジェクトの評価手法の確立を目指し、需要予測(観光客数、観光地周辺交通量等の予測)および便益計測に関するモデル構築を効用理論からアプロ-チしようとするものであり、初年度では理論モデルの構築およびデ-タの収集を中心に研究を進めてきた。その主な成果は、以下のとおりである。(1)周遊行動を考慮した観光需要予測モデルの構築...ランダム効用理論に基づくネステッドロジットモデルによって、周遊行動を考慮した観光需要予測モデルを構築した。このとき、観光レクリエ-ション動態調査結果より、近年の観光行動がピストン型から周遊型に移りつつあること、また観光行動の周遊パタ-んに対して季節、入路、職業、性別、年齢、宿泊日数、同伴者数等が影響を与えることを考慮した。(2)観光プロジェクト便益計測モデルの構築...観光需要予測モデルに組み込まれている効用関数に厚生経済学の分野で用いられている等価的偏差の概念を適用して、観光プロジェクト便益計測モデルを構築した。ここで、当該プロジェクトが「質の改善」というような、市場を形成しない要素の改善プロジェクトの場合には、それにより観光地魅力度の上昇分と等価な一般化交通費用の低下分に置き換えるという操作を施した。以上が本年度の主な成果であるが、次のような課題が残された。すなわち、周遊行動を考慮した観光需要予測モデルの構築に際し、人々の観光行動のモデル化にネステッドロジットモデルを採用したが、本モデルによって与えられる選択確率(観光地間の推移確率)が滞在日数の影響を受けるようなモデル構造になっているので、吸収マルコフ連鎖においてマルコフ性[状態変化の確率は現在に状態のみに依存し、過去の経緯には依存しない]が成立しないという構造上の課題が残された。平成4年度(最終年度)には本モデルの見直しから始める。

(1)周遊行動を考慮した観光需要予測モデルの構築...初年度では本モデルの構築に際し、人々の観光行動のモデル化にネステッドロジットモデルを採用し、吸収マルコフ連鎖型のシミュレーションモデルを組み合わせることによって需要予測モデルを構築したが、本モデルによって与えられる選択確率(観光地間の推移確率)が滞在日数の影響を受けるようなモデル構造になっているので、吸収マルコフ連鎖において定常性およびマルコフ性が成立しないという構造上の問題が残された。再検討の結果、これらの問題に対する解決には至らず、ランダム効用理論に基づくネステッドロジットモデルによって、周遊行動を考慮した観光需要予測モデルを構築した。(2)観光プロジェクト便益計測モデルの構築...観光需要予測モデルに組み込まれている効用関数に厚生経済学の分野で用いられている等価的偏差の概念を適用して、観光プロジェクト便益計測モデルを構築した。ここで、当該プロジェクトが「質の改善」というような、市場を形成しない要素の改善プロジェクトの場合には、それによる観光地魅力度の上昇分と等価な一般化交費用の低下分に置き換えるという操作を施した。(3)観光プロジェクト評価の事例研究...分析対象地域を岐阜県に限定し、観光道路建設等による観光行動への影響を評価した。例えば、東海北陸自動車道が全線開通した場合、観光地開発を並行して行わないと、岐阜県内観光地の宿泊客が減少する可能性があることがわかった。
脈管作動性ペプチドの分子認識構造と生理作用の研究

脈管作動性ペプチドの(1)構造解析、(2)生理作用、(3)生体内分布および(4)受容体の研究を2年度にわたり進め、その分子認識機構と生理作用の解析を行った。1.脈管作動性ペプチドの構造の研究強力な血管拡張作用を有するPACAP(Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide)およびその前駆体上に存在するPACAP関連ペプチド(PRP)を化学合成し、構造を解析した。CDおよびNMRスペクトル分析の結果、PACAP38の9-26位と28-38位にはαヘリックス構造が存在し、20-21位にはヒンジが存在することが明らかとなった。PACAP27の構造は、C端部のヘリックス構造を欠く以外、PACAP38と同じであった。両分子型ともN端部は自由な構造をとっていた。PRPの3位と20位にはαヘリックス構造が存在し、PRPは構造的にPACAPと同様セクレチングルカゴンファミリーのペプチドの特色を備えていることが判明した。脈管作動性ペプチドの生理作用の研究これらの構造解析に基づき、各種誘導体を化学合成し、その生物活性を検討した。PACAP38および27は、麻酔犬の大腿動脈およびモルモットの単離血管標本に於いて用量依存性の強力な血管拡張作用を示した。PACAPの血管拡張作用は内皮細胞およびNOに依存せず、直接作用であり、PACAP38の作用は27より持続性があった。この持続作用にはPACAP38C端の構造が関係しており、PACAP37、36、35、34、33と順次作用時間は減少したが、最大反応量には変化が無かった。PACAPのN端のヒスチジン残基はこのペプチドの作用発現に重要であった。PRP生物活性は、無麻酔犬の左胃動脈およびモルモットの単離血管ならびに胆嚢平滑筋標本に於いて検討した。PRPはPACAPと異なりこれらの血管系において拡張作用を示さなかった。しかし、モルモットの単離胆嚢平滑筋標本ではPACAP同様に収縮反応を示した。3.脈管作動性ペプチドの生体内分布の研究PACAPの生体分布と生合成を研究するために、PACAPおよびPRP特異的ラジオイッムノアッセイ系を確立し、モルモットに於いて両ペプチドの組織含量ならびに生体内分布を解析した。PACAPならびにPRPの免疫活性は視床下部に最も多く存在したが、中枢神経系ばかりではなく、消化管、肺、副腎など広く分布していた。組織抽出物中のPACAPおよびPRPの免疫活性はHPLC上、合成品と同部位に認めた。免疫組織化学的にはPACAPならびにPRPの免疫活性は消化管の粘膜下ならびに筋間神経叢の神経節細胞および神経繊維に存在していた。これらの知見は、モルモットにおいてPRPもしくは類似ペプチドがPACAPと共に生合成され、神経伝達物質として脈管の調節などに関与している可能性を示唆している。4.脈管作動性ペプチドの受容体の研究(1)脈管作動性ペプチドの受容体の構造と分布を免疫組織化学的に検索するために、セクレチンならびにエンドセリン受容体のcDNA構造を基に各種フラグメントを化学合成した。これらのペプチドを家兎に免疫することにより抗血清を得た。ラット膵臓の粗膜標本をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、PVDF膜にブロッテング後、抗セクレチン受容体フラグメント血清により染色した。cDNA構造から推定される約50kDaの分子量に相当する部位が染色された。またセクレチン、エンドセリン受容体抗体により膵導管細胞ならびに肝の伊東細胞が特異的に染色された。(2)PACAPおよびVIP受容体における両ペプチドの分子認識機構を解析するためPACAPならびに両ペプチドのハイブリッドを化学合成し、ラット脳の膜標本に対する結合能ならびにモルモット単離胆嚢平滑筋標本に対する作用を検討した。両ペプチドの構造が最も異なるC端部置換体は脳膜標本への結合能および胆嚢平滑筋標本収縮作用ともに変化はなかった。比較的自由な構造を取るN端部の置換によりPACAPの脳膜標本への結合能は抑制され、胆嚢平滑筋標本に於いて弛緩作用が発現した。したがってPACAPおよびVIP受容体における両ペプチドの分子認識機にはN端部が重要である。

PACAPの血管拡張作用は内皮細胞およびNOに依存せず、直接作用であり、PACAP38の作用は27より持続性があった。この持続作用にはPACAP38C端の構造が関係しており、PACAP37、36、35、34、33と順次作用時間は減少したが、最大反応量には変化が無かった。PACAPのN端のヒスチジン残基はこのペプチドの作用発現に重要であった。PRP生物活性は、無麻酔犬の左胃動脈およびモルモットの単離血管ならびに胆嚢平滑筋標本に於いて検討した。PRPはPACAPと異なりこれらの血管系において拡張作用を示さなかった。しかし、モルモットの単離胆嚢平滑筋標本ではPACAP同様に収縮反応を示した。3.脈管作動性ペプチドの生体内分布の研究PACAPの生体分布と生合成を研究するために、PACAPおよびPRP特異的ラジオイッムノアッセイ系を確立し、モルモットに於いて両ペプチドの組織含量ならびに生体内分布を解析した。PACAPならびにPRPの免疫活性は視床下部に最も多く存在したが、中枢神経系ばかりではなく、消化管、肺、副腎など広く分布していた。組織抽出物中のPACAPおよびPRPの免疫活性はHPLC上、合成品と同部位に認めた。免疫組織化学的にはPACAPならびにPRPの免疫活性は消化管の粘膜下ならびに筋間神経叢の神経節細胞および神経繊維に存在していた。これらの知見は、モルモットにおいてPRPもしくは類似ペプチドがPACAPと共に生合成され、神経伝達物質として脈管の調節などに関与している可能性を示唆している。4.脈管作動性ペプチドの受容体の研究(1)脈管作動性ペプチドの受容体の構造と分布を免疫組織化学的に検索するために、セクレチンならびにエンドセリン受容体のcDNA構造を基に各種フラグメントを化学合成した。これらのペプチドを家兎に免疫することにより抗血清を得た。ラット膵臓の粗膜標本をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、PVDF膜にブロッテング後、抗セクレチン受容体フラグメント血清により染色した。cDNA構造から推定される約50kDaの分子量に相当する部位が染色された。またセクレチン、エンドセリン受容体抗体により膵導管細胞ならびに肝の伊東細胞が特異的に染色された。(2)PACAPおよびVIP受容体における両ペプチドの分子認識機構を解析するためPACAPならびに両ペプチドのハイブリッドを化学合成し、ラット脳の膜標本に対する結合能ならびにモルモット単離胆嚢平滑筋標本に対する作用を検討した。両ペプチドの構造が最も異なるC端部置換体は脳膜標本への結合能および胆嚢平滑筋標本収縮作用ともに変化はなかった。比較的自由な構造を取るN端部の置換によりPACAPの脳膜標本への結合能は抑制され、胆嚢平滑筋標本に於いて弛緩作用が発現した。したがってPACAPおよびVIP受容体における両ペプチドの分子認識機にはN端部が重要である。平成5年度は脈管作動性ペプチドの構造解析、生理作用、受容体、および生体内分布の研究を進めた。PACAPおよびPRPを化学し、その構造を解析した。
保型L関数の近似関数等式

保型L関数のcritical stripでの参動は数論的に重要であるにもかかわらずその係数の不規則性により計算は非常に難しい。谷川氏との共著の論文ではこの困難をのりこえるためLavrik-Turganarievによる近似関数等式を用いた。その結果いくつかの楕円曲線に対応する保型L関数に対して今までにない虚部の大きさまでRiemaun良そうが成立している事が確められた。この研究は一様分布論とも関連し更なる発展を期待させる。Pisot数とそれに附随する数系の研究は一様分布論の重要な問題の一つである。ここではその数系がsub shift of fiuite typeとなる場合に対応する双対タイリングを構成する事ができる。この研究はDiophautos近似と結びついた数論的側面、力学系とエルゴード理論に結びついた側面をもつ興味深い対象をあつかっている。私は、主に`数の幾何'と代数的な議論を用いる事でPisot dual Tilingの基礎的部分を構成し、その基本的性質を導いた。その中にはタイルの弧状〓性タイルの境界の構造がグラフ付き自己アファイン集合の合併である事などの興味深い性質をいつ保証する事ができるのかが研究され、力学系ノルム予想、内点の構造予想などの重要な予想が提起されている。名古屋大の谷川氏との共同による論文では保型L関数の数値計算という問題をあつかった。保型L関数はその係数の不規則性のため、critical stripでの数値計算が難しい。従来の方法はメリン変換による積分表示と保型性を用いる事であるが、変数の虚部の値が大きいと実際の計算は現実的には不可能である。というのはガンマ関数の値が非常に小さくなるので分母子が指数的に小さい分数を扱うこととなり有効数字の大きな桁落ちを生ずるのである。一方でリーマンのゼータ関数やディリクレのL関数は係数が周期的であることを利用して精密な計算方法が与えられ、リーマン予想も虚部の大きいところまで調べられている。そこでこの論文ではLavriok-Turganarievによる近似関数等式の方法を用いて実行可能で誤差の評価を行える方法を確立した。そしてこの論文では数値計算の実例としていくつかの楕円L関数のリーマン予想をある程度の虚部の大きさまで確かめた。第二の論文ではPisot数系の基本的性質を調べた。Pisot数系は、一般的な数の表示と似た性質をもつ。従ってその詳しい性質を調べることは、与えられた数の無理性、代数性、同時近似問題などを調べることに役立つ。この論文ではPisot数系がその体の整数を有限表現するか、有理数が純循環表示されるかなどの基本的問題を考えいくつかの結果を得た。その主要なものは整数が有限表現されるようなPisot unitの場合は十分小さい有理数は純循環であるというものである。この結果は空間の自己相似なフラクタル境界をもつタイルによる充填問題と深く関係しておりさらに研究が進んでいる。第三の論文は一様分布論における概一様分布の概念が素数分布の問題に役立つという新たな問題提起を行った。この方向は鳥取大の後藤氏などによりさらに追求されている。
子宮頸癌におけるトランスレーショナルリサーチへの放射線情報伝達系の利用

進行期子宮頸癌の放射線単独治療による感受性に関与する遺伝子を包括的に検討するために、治療前に採取した子宮頸癌組織を用いて、マイクロアレイにより遺伝子発現プロファイルを観察した結果、XRCC5遺伝子が放射線単独治療効果不良例に高発現した。この結果を検証するために、子宮頸癌89例を対象として、XRCC5遺伝子産物であるKu80蛋白と放射線単独治療後の予後について免疫組織染色を行い、Ku80陽性例の抗腫瘍効果と予後はKu80陰性例より不良であった。放射線によりDNA2本鎖切断が生じた際、Ku80はKu70とヘテロダイマーを作り、DNA-PKcsと結合してDNA末端を覆い切断部位を修復する。XRCC5遺伝子が高発現しているために、修復機能が高く放射線に抵抗を示したと考えられる。一方、子宮頸癌に対して温熱放射線治療は放射線治療単独よりも生存率が良好であると報告されているが、温熱放射線治療効果不良例もみられる。そこで、温熱放射線治療抵抗性に関与する遺伝子について無再発生存群と癌死群の2群に分けて、マイクロアレイによる遺伝子発現プロファイルを観察した。その結果35個の遺伝子が抽出され、これらの遺伝子群には腫瘍の浸潤や転移に関わる低酸素誘導遺伝子であるHIF1A(hypoxia-inducible factor 1A)遺伝子が含まれていた。以上の検討結果から進行期子宮頸癌の放射線治療単独抵抗性に関与するのはXRCC5遺伝子であり、温熱放射線治療抵抗性に関与するのはHIF1A遺伝子である事が分かった。したがって、個々の症例によってそれぞれの治療法の真の適応となる症例を選別できる可能牲があり、オーダーメイド治療の一助となる。子宮頸癌の放射線感受性に関与する遺伝子を包括的に検討するために、マイクロアレイにより遺伝子発現プロファイルを観察した結果、XRCC5遺伝子が放射線抵抗性癌に高発現した。子宮頸癌89例を対象としてXRCC5遺伝子産物であるKu80蛋白と治療後の予後について免疫組織染色を行った結果、Ku80陽性例の抗腫瘍効果と予後はKu80陰性例より不良であった。一方、我々は染色体6p21の欠失が予後不良例に高頻度に認めたと報告した。今回のマイクロアレイを用いた検討で、染色体6p21に局在するHLA-DQA1遺伝子が抵抗性癌で高発現したので、HLA-DQA1とDQB1のハプロタイプを105例の子宮頸癌と334例の正常日本人とで比較した。HLA-DQA1*0103、DQBl*0601、DQB1*03は子宮頸癌症例で有意に多く見られた。HLA-DQA1遺伝子のハプロタイプは子宮頸癌の発症に関与するとの報告があるが、放射線感受性との関連は明らかではない。反対に、放射線高感受性癌にはレチノール酸(RA)の合成とレチノールの輸送に関与するALDH1遺伝子とRBP1遺伝子の高発現が観察された。RAを加えた子宮頸癌細胞は放射線感受性が高くなるとの報告があり、RAはc-Mycを誘導させアポトーシスを引き起こすとの報告もある。次年度は放射線抵抗性の子宮頸癌におけるXRCC5、HLA-DQA1、ALDH1、RBP1遺伝子に関与するバイオインフォマティクスについて臨床検体を用いて検討することで、放射線治療の真に適応となる症例を選別する一方で、抵抗性癌に対する戦略を考案する。進行期

子宮頸癌の放射線単独治療による感受性に関与する遺伝子を包括的に検討するために、治療前に採取した子宮頸癌組織を用いて、マイクロアレイにより遺伝子発現プロファイルを観察した結果、XRCC5遺伝子が放射線単独治療効果不良例に高発現した。この結果を検証するために、子宮頸癌89例を対象として、XRCC5遺伝子産物であるKu80蛋白と放射線単独治療後の予後について免疫組織染色を行い、Ku80陽性例の抗腫瘍効果と予後はKu80陰性例より不良であった。放射練によりDNA2本鎖切断が生じた際、Ku80はKu70とヘテロダイマーを作り、DNA-PKcsと結合してDNA末端を覆い切断部位を修復する。XRCC5遺伝子が高発現しているために、修復機能が高く放射線に抵抗を示したと考えられる。一方、子宮頸癌に対して温熱放射線治療は放射線治療単独よりも生存率が良好であると報告されているが、温熱放射線治療効果不良例もみられる。そこで、温熱放射線治療抵抗性に関与する遺伝子について無再発生存群と癌死群の2群に分けて、マイクロアレイによる遺伝子発現プロファイルを観察した。その結果35個の遺伝子が抽出され、これらの遺伝子群には腫瘍の浸潤や転移に関わる低酸素誘導遺伝子であるHIF1A(hypoxia-inducible factor 1A)遺伝子が含まれていた。以上の検討結果から進行期子宮頸癌の放射線治療単独抵抗性に関与するのはXRCC5遺伝子であり、温熱放射線治療抵抗性に関与するのはHIF1A遺伝子である事が分かった。したがって、個々の症例によってそれぞれの治療法の真の適応となる症例を選別できる可能性があり、オーダーメイド治療の一助となる。
膜タンパク複合体の構造形成および機能発現の生物物理化学

1.高度好塩菌Natronomonaspharaonisには,緑-青から逃げる負の走光性の光レセプターであるファラオニスフォボロドプシン(pharaonis phoborhodopsin, ppRと略す)が存在する.好塩菌の膜中では,トランスジューサいう膜タンパク(pHtrIIと略す)と結合している.ppRとpHtrIIとは水素結合を介して結合し,その水素結合に関与するアミノ酸残基を同定した.一方,高度好塩菌には光Clポンプであるハロロドプシン(NpHR)が存在している.そこで,NpHRの変異体を作製し,pHtrIIと結合できるようにした.その結果,結合体のNpHRはClイオンポンプ能を失うことを発見した.閃光光分解の実験から,イオンポンプを失う機構を考察した.2. NpHRは,界面活性剤であるn-dodecyl-β-maltosideで可溶化した条件下でも,3量体を形成している.モノマーに解離する変異体の作製に成功した.NpHRでは,N中間体はClが結合した状態であり,0中間体はClが解離した状態であると考えられている.そして,Nと0は平衡にあると考えられている.即ち,この平衡はCl濃度に依存している.Clの解離定数は,単量体と3量体では大きく異なった.また,低塩濃度下における安定性は,3量体のほうが勝っていた.3. EmrEは大腸菌膜に存在する多剤排出輸送体である.ホモダイマーで存在することが明らかになっている.この輸送体の膜内でのトポロジーには論争があった.すなわち,2量体が平行に存在しているという説と逆平行であるという説である.逆平行で存在していることを証明した.逆平行であることの生理的意義は将来の問題である.1.ppR(pharaonis phoborhodopsin)は高度好塩好アルカリ性菌Natronomonaspharaonisの細胞膜に存在するレチナールタンパクであり,負の走光性の受容体である.ppRは細胞膜中でトランスジューサ(pHtrll)とよばれている膜タンパクと複合体を作っている.この結合に関与するアミノ酸残基を同定した.膜中では解離定数を測定できないので,界面活性剤中で,本複合体の解離定数を等温滴定型熱量計で求め,種々の変異タンパクを作成して,アミノ酸残基を同定した.2.光照射によってppRおよびトランスジューサに構造変化が起こるはずである.これを,FRETで示した.ppRおよびトランスジューサはシステインを持たないので,それぞれ1つのシステインを目的の場所に導入し,そこに赤外に近い励起波長をもつ2つの蛍光色素を導入して,実験を行った.3.ハロロドプシン(hR)はレチナール膜蛋白であり,光駆動クロライドポンプとして働く.有名なバクテリオロドプシン(bR)と非常に相同性の高い.bRはよく知られているように3量体として存在するが,hRはモノマーであると考えられてきた.N.pharaonis由来のhRは,界面活性剤中でも3量体を作っていることを明らかにした.そして,1つのフェニールアラニンの置換により,モノマーになってしまうことが明らかとなった.4.モノマーとなるhRのイオン輸送能は低く,3量体を形成していることがポンプ機能に重要であることが明らかとなった.1.高度好塩菌Natronomonaspharaonisには,緑-青から逃げる負の走光性の光レセプターであるファラオニスフォボロドプシン(pharaonis phoborhodopsin, ppRと略す)が存在する.好塩菌の膜中では,トランスジューサいう膜タンパク(pHtrIIと略す)と結合している.ppRとpHtrIIとは水素結合を介して結合し,その水素結合に関与するアミノ酸残基を同定した.一方,高度好塩菌には光Clポンプであるハロロドプシン(NpHR)が存在している.そこで,NpHRの変異体を作製し,pHtrIIと結合できるようにした.その結果,結合体のNpHRはClイオンポンプ能を失うことを発見した.閃光光分解の実験から,イオンポンプを失う機構を考察した.2. NpHRは,界面活性剤であるn-dodecyl-β-maltosideで可溶化した条件下でも,3量体を形成している.モノマーに解離する変異体の作製に成功した.NpHRでは,N中間体はClが結合した状態であり,0中間体はClが解離した状態であると考えられている.そして,Nと0は平衡にあると考えられている.即ち,この平衡はCl濃度に依存している.Clの解離定数は,単量体と3量体では大きく異なった.また,低塩濃度下における安定性は,3量体のほうが勝っていた.3. EmrEは大腸菌膜に存在する多剤排出輸送体である.ホモダイマーで存在することが明らかになっている.この輸送体の膜内でのトポロジーには論争があった.すなわち,2量体が平行に存在しているという説と逆平行であるという説である.逆平行で存在していることを証明した.逆平行であることの生理的意義は将来の問題である.
科学的概念の理解を促進する事例外挿法によるストリーミング・学習コンテンツの開発

1)事例外挿法による相対運動の教材開発:事例外挿法とは,基本的な科学的概念の学習を終えた状態の学習者に対し,「より正確で間違いのない」概念形成をねらう(科学の世界への「内挿」)のではなく,「科学的意味の使用が適切であるときの鋭い評価力」を持った事例,具体的には,生活の中の様々な技術的問題の解決場面において,科学的概念が持つパワーが発揮されている事例を与え,学習した概念がどのように使われているのかを考える(テクノロジーの世界への「外挿」)ことにより,柔軟で生き生きとした科学的概念の形成を促進することをねらった教材の開発方法である。この手法により,中学生および高校生を対象にした事例外挿法による相対運動の学習コンテンツを開発した。外挿事例としては,(1)移動する列車から落下する鉄球の動きを予測する基本的ルールの習得を行う「電車サブコンテンツ」,(2)比較的容易な外挿を行う「気象衛星サブコンテンツ」,(3)比較的高度な外挿を行う「VTRヘリカルスキャンサブコンテンツ」からなる。3つのサブコンテンツはWeb経由でインタラクティブに実験条件の設定が可能であり,各条件に合致する動画がサーバーよりストリーミング技術によって配信されるようになっている。2)評価:公立中学校1・2年生21名,現職教員を含む大学院生17名を対象に,事例外挿法による教材の効果を検証した。すると,(1)相対運動のルールの理解は,学習後に向上していた,(2)各コンテンツは,予測通り機能しており,特に「多少理解に困難な伴うコンテンツほど面白さが向上する」という効果を検証することができた。
マイコウイルスの“開かれた生態”仮説の検証：異なる糸状菌間を伝播するのか？

RNAゲノムを有するマイコウイルスの伝搬は、細胞内を移行していく経路のみが知られている。そのためマイコウイルスの伝播は菌糸融合可能な菌体間(多くの場合同種で和合性)のみに限られると考えられているが、我々は野外観察によりウイルスが自然感染する現象を見いだしてきた。本研究では、採取した土壌中に埋設したウイルスフリーの白紋羽病菌にRNAウイルスが自然感染する現象を再現することに成功し、感染したウイルスは新種のパルティティウイルスとエンドルナウイルスであることを明らかにした。マイコウイルスは糸状菌類に感染するウイルスである。多くのマイコウイルスはRNAウイルスであり、その伝搬経路は和合性の菌体が接触、菌糸融合することによる菌体内を通じた経路と考えられている。多くのマイコウイルスは菌の生育に影響しないが、中には菌の病原力を低下させるウイルスなど、菌の表現型に影響するウイルスも存在する。白紋羽病菌は果樹類の根を腐敗させる病原糸状菌である。これまでに、ウイルスフリーの白紋羽病菌を接種したリンゴ樹の根から23年後に接種菌を再分離したところ、7種の新規なRNAウイルスが白紋羽病菌に自然感染した現象を見出した。本現象から、同種で和合性の菌体間での菌糸融合によらない、マイコウイルスの新たな伝搬経路の存在が想定された。そこでこれら新規ウイルスの伝染源を明らかにするため、はじめに7種新規ウイルスを同時に検出することができるマルチプレックスRT-PCR法を開発した。次にウイルスが自然感染した圃場からリンゴ根と土壌を採取し、根圏土壌の糸状菌を土壌希釈平板法により、根表面に生息する糸状菌類を根洗浄法により、2種類の寒天培地を用いて分離した。得られた多数の糸状菌株をスモールスケールで液体培養し、回収した培養菌体から全核酸を抽出した。そして、得られた糸状菌分離株に感染しているウイルス種の検定を、開発したマルチプレックスRT-PCR法によって進めている。RNAゲノムを有するマイコウイルスの伝搬は、菌糸融合により細胞内を移行していく経路のみが知られている。そのためRNAウイルスの伝播経路は同種和合性の菌体間に限られると考えられている。しかしながら野外調査において果樹類白紋羽病菌にウイルスが自然感染する現象を見いだしたため、マイコウイルスはこれまでの概念よりも広範に種を超えて伝播する可能性が示唆された。そこで本研究課題では、ウイルスが異なる糸状菌間で伝播するかについて検討した。本年度は新規7種ウイルスが自然感染した野外土壌から分離した多数の糸状菌株に対してマルチプレックスRT-PCRによるウイルスの検定を続けたが、当該ウイルスを保持した糸状菌の検出には至らなかった。そこで、野外で見られたウイルスの自然感染現象が温室条件など限られた環境下でも再現できるかについて検討した。異なる環境から土壌を採取し、ウイルスフリーの白紋羽病菌を埋設して温室条件下においた。一定期間後に再分離した白紋羽病菌株から粗核酸を抽出し抗dsRNA抗体を用いてドットブロットを行ったところ、2種の新規ウイルスの自然感染が認められた。これらウイルスはパルティティウイルスとエンドルナウイルスの新種であった。このように限られた条件下でも新規ウイルスの感染が再現されたことから、ウイルスの自然感染現象は土壌中で見られるウイルスの伝搬経路のひとつであると考えられる。植物病理学ウイルスが自然感染した宿主を探索するため、当該土壌から多数の糸状菌を分離しウイルスの検出を進めている。自然感染した圃場からの宿主菌の探索を進めるとともに、温室内などにモデル土壌を設定し、ウイルスの自然感染が起こるかどうか検討する。研究を遂行可能な人材確保ができず、人件費について余剰が生じた。糸状菌の分離・培養および同定、およびウイルスの分子生物学的解析を加速させるために必要な物品費として活用する。