hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分子進化解析と個体NMR法を用いた糖転移酵素タンパク質機能部位の解明

購入したPCクラスターマシンを用いて、バクテリアの糖転移酵素遺伝子の系統解析を行った。特に、大腸菌の複数の株で変異が知られている細胞壁外の糖構造を与える糖転移酵素遺伝子群(大腸菌ゲノム中で直列に並んでいる)に着目して、それら20余のアミノ酸配列をクエリーとして相同性検索を行い、遺伝子系統樹を作成した。その結果、基質特異性の異なる数種類の糖転移酵素がひとつの相同群を形成した。これは、長い進化のあいだに、相同性を保ちながらも、一連のアミノ酸が置換することによって、基質特異性が変化していったことを示唆する。そこで、そのうちで大腸菌K12株のゲノムに存在する遺伝子waa0を選び、適切なプラスミドに挿入してそれを大腸菌に感染させ、この遺伝子の産物を大量発現させた。Hisタグを用いてカラム精製を行い、NMR解析に十分な量が得られた。固体NMR法で炭素13スペクトルを調べたところ、いくつかの明瞭なピークが観察された。特にラベルしていないので、自然界に少量存在する炭素13のシグナルを計測したことになる。さらに、このタンパク質が本当に糖転移酵素であるならば、基質となる糖が酵素表面の特定の場所に付着するはずであると考え、炭素13でラベルされたグルコースを購入し、上記と同様に作成したwaa0と混合し、凍結乾燥後に少量の水で洗浄し、固体NMR法のスペクトルを測定した。その結果、グルコースと思われる信号が検出され、waa0へのグルコースの特異的な結合を示唆することが出来た。本年度の予算で購入したPCクラスターマシンを用いて、バクテリアの糖転移酵素遺伝子の系統解析を行った。その結果、気質特異性の異なる数種類の糖転移酵素がひとつの相同群を形成した。そこで、そのうちで大腸菌K12株のゲノムに存在する遺伝子Waal(旧名称はrfal)を選び、適切なプラスミドに挿入してそれを大腸菌に感染させ、この遺伝子の産物を大量発現させた。個体NMR法でそのスペクトルを調べたところ、いくつかの明瞭なピークが観察された。そこで、このタンパク質が本当に糖転移酵素であるならば、基質となる糖(グルコースであると推定されている)が酵素表面の特定の場所に付着するはずである。そこで、炭素13でラベルされたグルコースおよびUDPグルコースを購入し、それらの付加によって、固体NMR法のスペクトルがどのように変化するのかを調べれば、基質が付着する酵素表面の特定の場所が推定できるはずである。来年度(2004年度)はこの方針で実験解析を発展させる。また、国立遺伝学研究所で構築・公開されている、タンパク質の立体構造予測データベースGTOPも用いることによって、この糖転移酵素の立体構造の詳細と基質が付着する酵素表面の特定をめざす。昨年度の成果をもとに,大量発現させた大腸菌K12株の遺伝子WaaOの産物のNMRパターンと,その基質であるグルコースを物質量比で500倍程度加え、凍結乾燥後に過剰なグルコースを洗い流した場合のNMRパターンを比較した。添付した図の下が昨年度作製したWaaOのみのスペクトル、上が今回作製したフルラベルグルコースとWaaOの複合体のスペクトルである。60ppmから100ppmにかけて、下のスペクトルにはないピークが上のスペクトルで見られる。左上に示したα、β-Glucoseの化学シフトの表の値にも近く、これらがグルコースの炭素原子からのピークと考えられる。

信号強度が弱いため,2次元NMR法によるピークの帰属は出来なかったが、この結果は、WaaO酵素タンパク質にグルコース基質が付着したことを示唆している。十分なタンパク量が得られなかった主な原因として、これまで作製したWaaOは精製過程で沈殿しやすかったことが挙げられる。我々は1段階目の精製に用いるHisタグが沈殿しやすい原因ではないかと考え,ベクターを改良して,1段階目の精製直後にプロテアーゼでHisタグを削除できるようにした。これによって,十分なタンパク量が得られること,また、Hisタグの削除の前後で2回同じカラムによる精製を行うことで,これまで多少残っていた、Hisタグに近い性質を持つ共雑タンパク質がさらに少なくなることが期待される。このため、今後はこれまでより信号強度の面でもピークの線幅の面でも、より改善されたNMRパターンが得られるであろう。一方,大量発現した酵素の活性測定をUDP-glucoseを用いて試みたが,条件設定がはっきりしなかったため,うまくゆかなかった。
腱細胞力学応答における細胞間ギャップ結合コミュニケーションの制御機構解明

MEMS技術を用いて,腱細胞生体内環境を模擬した微小溝実装PDMS製薄膜を組み込んだ実験デバイスを開発し,腱細胞のカルシウムイオン応答を観察した.生理的レベル(引張ひずみ4%,せん断応力O.lmPa)の力学負荷に対して細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる細胞が観察され,特に同時引張りひずみ・せん断同時負荷の場合は反応を示す細胞の割合が有意に増加した.またギャップ結合を介した細胞間物質輸送をFLIP実験によって定量的に評価することにも成功した.今年度は引き続き,MEMS技術を用いてMicrogroove実装PDMS製薄膜を組み込んだ実験デバイスを作製し,実験に用いた.このデバイスは腱細胞がin vivoで見せる形態・配向が再現できるようMicrogrooveの幅・間隔・深さの3つのパラメータが最適化され,繰返し引張りひずみと流れせん断応力を培養環境下で選択的あるいは同時に細胞に作用させることが可能である.ウシ前肢中指足関節伸筋腱から採取した腱細胞の懸濁液をデバイス流路入り口から流し込み,静置培養することでMicrogroove内への接着を促進し,腱組織環境を模擬した実験系を確立した.このデバイスを顕微鏡ステージ上で伸展する繰返し引張り・流れせん断刺激同時負荷装置に装着し,北海道大学ニコンイメージングセンター所有の共焦点走査型レーザー顕微鏡を用いた細胞応答のリアルタイム観察を行った.まず,昨年度に引き続き,腱細胞のカルシウムイオン応答を観察した. 4%または8%の繰返し引張りひずみ,または0.1Paまたは0.1mPaオーダーの流れせん断応力をそれぞれ独立に負荷した.更に,別の実験において引張りひずみとせん断応力を同時に負荷した.その結果,生理的レベルの力学負荷に対して細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる細胞が観察され,特に同時引張りひずみ・せん断同時負荷の場合は反応を示す細胞の割合が有意に増加したことが示された.またギャップ結合を介した細胞間物質輸送をFLIP実験によって定量的に評価することにも成功し,力学刺激が及ぼすギャップ結合物質輸送への影響を調べた.これらのことから,腱細胞は引張り刺激と流れせん断刺激の両方に対してメカノセンシティブであることがわかり,その応答は単一細胞レベルと複数細胞レベルの両方で起こることが明らかにされた.MEMS技術を用いて,腱細胞生体内環境を模擬した微小溝実装PDMS製薄膜を組み込んだ実験デバイスを開発し,腱細胞のカルシウムイオン応答を観察した.生理的レベル(引張ひずみ4%,せん断応力O.lmPa)の力学負荷に対して細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる細胞が観察され,特に同時引張りひずみ・せん断同時負荷の場合は反応を示す細胞の割合が有意に増加した.またギャップ結合を介した細胞間物質輸送をFLIP実験によって定量的に評価することにも成功した.今年度は,はじめにMEMS技術を用いてMicrogroove実装PDMS製薄膜を組み込んだ実験デバイスを作製した.まず腱細胞がin vivoで見せる形態・配向が再現できるようMicrogrooveの幅・間隔・深さの3つのパラメータを最適化した.次いで,平行平板型流路を持つPDMS製フローチャンバーを別途作製し,Microgroove薄膜をこれに組み込むことで,繰返し引張りひずみと流れせん断応力を培養環境下で選択的あるいは同時に細胞に作用させるデバイスを作製した.ウシから採取した腱細胞の懸濁液をデバイス流路入り口から流し込み,静置培養することでMicrogroove内への接着を促進し,生体内で見られる形態と類似したMicrogroove長軸方向への整列・配向を達成した.次に,このデバイスを顕微鏡ステージ上で伸展する繰返し引張り装置を作製した.装置はリニアアクチュエータが2基搭載され,このアクチュエータと別途用意したシリンジポンプが同時に制御プログラミングソフトLabVIEWによって制御されるように作製された.作製したデバイス内の力学場(流れ場およびひずみ場)を実験的・解析的に検証した.さらに,作製した装置を用いて腱細胞Ca2+応答を観察した. Microgroove内に播種した腱細胞にCa2+指示薬Fluo-4を導入し,共焦点走査型レーザー顕微鏡上に設置した装置を用いて繰返し引張りひずみと流れせん断応力を選択的あるいは同時に負荷した.観察領域内の細胞のFluo-4に由来する蛍光強度を負荷直後から経時的に記録し,Ca2+濃度変化を解析したところ,生理的レベルの力学負荷に対して細胞内Ca2+濃度を上昇させる細胞が観察され,特に同時引張りひずみ・せん断同時負荷の場合は反応を示す細胞の割合が有意に増加したことが示された.これらの結果は2件の国内学会および1件の国際会議で発表された.本年度は研究実施計画に沿って,実験デバイスの作製ならびに腱細胞の力学刺激に対するCa2+応答を調べることを行った.いずれもおおむね計画通りに進み,国内および国際学会で成果発表するとともに,現時点で投稿論文を準備中である.なお,当初の計画ではコネキシン遺伝子発現解析を行う予定であったが,実験デバイスの作製および検証に予想外に時間を要したため,逐行とはならなかった.次年度への課題としたい.実験デバイスが完成したことによって実験系が確立されたので,今後は随時実験を行い,当初の研究実施計画に沿って研究を推進していく.北海道大学ニコンイメージングセンターを利用して,力学刺激が分子レベルGJICに及ぼす影響,力学刺激がイオンレベルGJICに及ぼす影響,そして力学刺激によるギャップ結合turnoverの制御機構の解明について調べる.

次年度使用額が発生した理由は,当初想定したよりもMEMS関連の消耗品の購入が少なかったことが挙げられる.この繰り越される研究費は次年度支給される研究費と合わせて,交付申請書に記載した内容に沿って消耗品等物品の購入や旅費として使用する予定である.
超音波リニアモータを使用した完全埋め込み型人工心臓の開発に関する研究

本年度は超音波モータを使用した人工心臓システムの構築の基礎的研究として,1)超音波モータの基本特性の調査およびいくつかのデザインの検討,2)心房の吸着防止を含む循環制御アルゴリズムの構築,3)供給電力およびモータ回転数による差圧・流量推定アルゴリズムの構築の3つを行った.作成した試作ポンプは流量・負荷特性は実用レベルであったが,効率・耐久性に問題があり,実用化に向けて更なる改良が必要である.昨年度開発した,左心は体循環の制御を行い,右心において吸着を防止するような制御アルゴリズムについて,モック循環系および山羊を用いた急性動物実験を行い,その制御特性を検討した.その結果,本制御法によって,吸着を防止しつつ左心における循環制御を行えることが示された.本制御の利点は,吸着発生の前兆もしくは発生時に左心の循環制御を中断することを回避できることである.また,これまで考慮していなかった肺循環系の動特性を考慮した制御アルゴリズムの導入の必要性が明らかになった.昨年度提案した,ARXモデルを利用した差圧・流量推定アルゴリズムについて,本年度は,回転数および電流計測法の改善と実験によるアルゴリズムの検証を行うとともに,実用性を考慮して,予めモック等で同定したパラメータで動物実験中に推定可能であるかを検証した.その結果,粘性が変化した際の推定精度を向上することができ,流量の推定精度は実用レベルであったが差圧の精度は流量に比べ低く課題が残った.さらに,本推定システムを体内に埋め込むことを考慮して,本アルゴリズムをマイコンに実装した小型の推定システムを開発し,モック実験においてその有効性が確認された.本年度は超音波モータを使用した人工心臓システムの構築の基礎的研究として,1)超音波モータの基本特性の調査およびいくつかのデザインの検討,2)心房の吸着防止を含む循環制御アルゴリズムの構築,3)供給電力およびモータ回転数による差圧.流量推定アルゴリズムの構築の3つを行った.一般的な心臓の一回拍出量は約70mLであるが,体内にポンプを埋め込むために,ポンプサイズとアクチュエータのサイズを小型化しなければならない.そのため本研究では,一回の拍出量を少なくし、その分高い心拍数で駆動するように設計した.高い心拍数でポンプを駆動した場合,その流速波形は定常流のそれに近づく.このようなポンプの場合,しばしば脱血カニューレが心房壁に吸着することが知られており,人工心臓の流量制御を困難にしている.そこで,左心は体循環の制御を行い,右心において吸着を防止するような制御アルゴリズムの開発をおこない,定常流型ポンプを取り付けたモック循環系および山羊を用いた急性動物実験を行い,その制御特性を検討した.その結果,本制御法によって,吸着を防止しつつ左心における循環制御を行えることが示された.しかし,制御パラメータの値によっては断続的な吸着や右心流量の過剰な増加などの不具合も明らかとなった.差圧・流量推定アルゴリズムは,ポンプ特性を基にしたモデルと経時的に変化すると考えられる血液粘性等を補償するために導入された時変モデルの2つのARXモデルで構成される.本アルゴリズムをモック循環系および山羊を用いた急性動物実験によって得られたデータに対して適用した結果,平均推定誤差は差圧に関して,約6mmHg,流量に関して約0.5L/minであり,比較的制度よく推定を行うことができた.本年度は超音波モータを使用した人工心臓システムの構築の基礎的研究として,1)超音波モータの基本特性の調査およびいくつかのデザインの検討,2)心房の吸着防止を含む循環制御アルゴリズムの構築,3)供給電力およびモータ回転数による差圧・流量推定アルゴリズムの構築の3つを行った.作成した試作ポンプは流量・負荷特性は実用レベルであったが,効率・耐久性に問題があり,実用化に向けて更なる改良が必要である.昨年度開発した,左心は体循環の制御を行い,右心において吸着を防止するような制御アルゴリズムについて,モック循環系および山羊を用いた急性動物実験を行い,その制御特性を検討した.その結果,本制御法によって,吸着を防止しつつ左心における循環制御を行えることが示された.本制御の利点は,吸着発生の前兆もしくは発生時に左心の循環制御を中断することを回避できることである.また,これまで考慮していなかった肺循環系の動特性を考慮した制御アルゴリズムの導入の必要性が明らかになった.昨年度提案した,ARXモデルを利用した差圧・流量推定アルゴリズムについて,本年度は,回転数および電流計測法の改善と実験によるアルゴリズムの検証を行うとともに,実用性を考慮して,予めモック等で同定したパラメータで動物実験中に推定可能であるかを検証した.その結果,粘性が変化した際の推定精度を向上することができ,流量の推定精度は実用レベルであったが差圧の精度は流量に比べ低く課題が残った.さらに,本推定システムを体内に埋め込むことを考慮して,本アルゴリズムをマイコンに実装した小型の推定システムを開発し,モック実験においてその有効性が確認された.
金属錯体集積体の時空間制御による低次元性ナノストレス配位空間の構築

最近、金属錯体集積体のもつ配位空間を利用した小分子の取り込み、触媒反応、特異的な磁性などが注目されている。配位空間の機能発現は、空間がゲストに与えるストレス、あるいは空間に凝集したゲストがホスト集積体にもたらすストレスが相乗的に作用した結果と考えられる。そこで本研究では、配位空間をストレス凝集空間(場)として捉え、ストレスを合目的に時空間制御することで新しい集積体の構築を目指した。低次元性ナノストレス空間の構築を目的として、新規一次元チャンネルを有する金属錯体集積体と二次元金属錯体集積体を合成し、それらをもとにストレス配位空間の設計と合成を行った。ストレス空間においては、ゲスト分子、ホスト錯体双方に束縛が生じ、双方の運動性の変化、ゲスト分子の特異な配列をもたらし、外場応答性、分子認識能等、特異的な機能発現に至る。そこで、まず特異的な物性を持つ一次元配位高分子および二次元格子を構築し、空間へのストレス導入を検討し、さらに、以下の重点課題検討を行った。1.動的チャンネルの構築:伸縮自在な一次元配位高分子により作られる外場応答性動的チャンル、molecular muscleの構築。2.ストレスを貯蔵する層状化合物の構築:大きな運動性と自由度を有し、ΔSの"貯蔵"が可能な長鎖アルキル鎖を導入した層状化合物の構築。3.インターカレーションによるゲスト分子の導入:合成された層状化合物に機能性分子(たとえば、スピンクロスオーバー錯体)をゲストとして導入し、アルキル鎖がもたらすストレスにより誘発される物性変化の検討。
百貨店のダイナミズム―グローバリゼーションとデジタライゼーションの視点から―

本研究は、グローバリゼーションとデジタライゼーションという2つの視点から、小売業態としての百貨店のダイナミズムを解明することが目的である。日本で百貨店が誕生してから現在までの約120年の歴史を対象に、百貨店は小売業態としての競争優位をどのように構築してきたのか、またその競争力はいかに変化してきたのかを歴史実証的に、かつ日本と欧米の百貨店を比較しながら分析し、百貨店研究の現代的意義を明らかにしたい。
毒結合タンパク質複合体の解析によるトラフグ毒輸送機構の解明

本研究はトラフグ体内における毒輸送機構の解明を目標とし,毒の輸送に関わると考えられている毒結合タンパク質複合体の多様性と主要な毒蓄積部位の変動を解析することで目標達成を目指す.実験内容としては,雌雄や成長段階などの条件が異なるトラフグを試料として,毒結合タンパク質の遺伝子群の発現解析を行うこと,血液中に存在する毒結合タンパク質複合体の性状を明らかにすること,などを通して毒の蓄積部位との関連を解析する.本研究はトラフグ体内における毒輸送機構の解明を目標とし,毒の輸送に関わると考えられている毒結合タンパク質複合体の多様性と主要な毒蓄積部位の変動を解析することで目標達成を目指す.実験内容としては,雌雄や成長段階などの条件が異なるトラフグを試料として,毒結合タンパク質の遺伝子群の発現解析を行うこと,血液中に存在する毒結合タンパク質複合体の性状を明らかにすること,などを通して毒の蓄積部位との関連を解析する.
画像システムによる青果物の損傷果の検出に関する研究

この研究は,画像処理による青果物の損傷果検出の作業を自動化する目的で,モモ等を対象にその分光反射特性を可視領域と近赤外領域にわたって調ベ,損傷果検出に適する光学フイルタを選定し,カラーカメラと赤外カメラを用いた画像処理システムを構築し,果実表面の正常部と損傷部とのカラー画像色度と近赤外画像濃度値に基づいて,果実の傷検出の可能性を検討した。その結果,実用化への見通しが確立された。実験結果の主なものは次のとおりである。(1)青果物における表面色の差による分光反射率の差は,可視領域において顕著に現れるが,近赤外領域においては,その差は小さくなる。(2)ナシ,リンゴ共に,圧縮損傷による分光反射率の差は,他の損傷に比べて小さい値である。(3)画像処理を目的とするための分光反射特性は,その標準偏差により表示する必要がある。(4)リンゴ,なしの損傷果の検出を対象とする波長は,可視領域に近い赤外領域の波長を用いることにより可能となるであろう。(5)モモの傷検出には,近赤外画像を用い,判別しきい値法と領域・エッジ併用法で傷の抽出を行っている。(6)近赤外画像では,中心波長が850nmが適する。(7)モモの腐り,虫害,傷痕,裂果等の損傷画像の抽出については,判別しきい値法が有効である。(8)明確な輪郭のある傷(虫害,傷痕及び裂果等)に対して,領域・エッジ併用法が有効であった。また,傷の面積と傷画像濃度は関係がなく,傷画像抽出の精度も高い。この実験を通して,両方法共果柄部と果頂部の窪み及び縫合線の部分の検出の検討をすることにより,より実用化に近づくものである。この研究は,画像処理を用いた桃の傷の検出システムを開発する目的であり,本年はその基礎研究として,桃,ミカン,トマト,リンゴ,カキ,ナシについて,その表面の傷を対象に分光反射特性を調べた。ここに,想定される傷は,圧縮,落下,衝撃,腐り,擦り傷,切り傷,刺し傷,剥皮傷等であるが,自然状態で得難いものについては,人為的に傷をつけた。また,分光反射特性については,正常果と損傷果の比較検討を行なった。これらの研究から,次のような実験結果が明らかとなった。(1)分光反射率は,青果物の熟度の進行と共に減少する傾向がある。(2)青果物の表面色の違いによる分光反射率差は,可視領域において生ずるが,近赤外領域においては,表面色の影響が無くなり,ほぼ近似した値になる。したがって,正常果における近赤外領域での差のないことが,次の段階として,損傷果との間に差が生じることがあれば,この差が選別の対象となる。(3)青果物の損傷部と正常部における分光反射率差は,損傷の程度,種類により異なるが,可視領域から近赤外領域において生ずる。その差は525%に達する。近赤外領域においても,以上の差が存在することから,この差が傷検出の対象となり,十分に常果と損傷果の選別ができることが明らかになった。したがって,この基礎研究をもとに,次年度は画像処理装置の開発研究を行う。我が国の農産物に対する多様化,高品質化の指向が年々強くなりつつある中で,近年,ミカン,ナシ,リンゴ等に対する画像処理技術の導入により,形伏と色の階級,等級選別の分野は,大きな発展を遂げつつある。しかし,選果システムの中で,多くの人手により青果物の損傷果の選別が行われているのが実情である。

これらのことから,この研究は,ナシ,モモ,カキ,ミカン,リンゴ等の主要な青果物に対して,損傷果実の判定を画像処理システムの開発により行なうことを目的とする。従って,研究の手順として,損傷果(圧縮,落下,衝撃,腐り,擦り,切傷,刺し傷,剥皮傷,病斑等)の分光反射特性と正常果の分光反射特性を測定し,それらの平均値と標準偏差を求め,それぞれの分光反射率の信頼区間を算出した。この信頼差から画像処理によるモモ損傷果の検出に鮮適の波長帯域を明らかにした。以上の実験から,モモについては,画像処理を行なうに最適の波長域は800900nmであることが明らかになった。また,検出のための,カラカメラと赤外カメラを用いた画像処理システムを製作し,モモノ傷の画像を背景より分離する手法を確立した。したがって,モモの傷の検出で傷の特徴を有する画像部をモモの画像から分割し,種々の特徴を抽出して,これらの抽出量と予め作った標準傷デ-タベ-スにあるクラスと同じクラスに割り当てることにより傷を検出することができた。また,損傷部の平均濃度は正常部のものより可成の低く,10階以上の差があることが明らかになった。また,損傷モモの画像ヒストグラムによって,画像濃度は条峰性を示し,傷の画像の分割には,再帰判別しきい値法による二値化処理が有効であることがわかった。次年度は,実用化に向けてその研究を行う予定である。最終年度にあたる本年は、過去2ケ年にわたる果実損傷果の分光反射特性の研究に基づいて、モモの表面のカラー画像の色度と近赤外画像の濃度に基づいて、モモの損傷果を検出する可能性を検討している。また、モモの近赤外画像を用いて、判別しきい値と領域・エッジ併用のアルゴリズムを開発し、試作画像処理実験装置を用いて、損傷領域を抽出するための有効な手段を明らかにしている。実験の結果の主なものは次の通りである。(1)カラー画像では、切傷、腐り傷など人の目に見える傷の検出は可能であった。(2)一方、モモ表面の色の影響を受ける、圧縮、衝撃あるいは表面色により隠された腐り傷の検出は容易でない。(3)近赤外画像では、供試した損傷果のほとんどすべてが検出可能であり、特に、カラー画像処理で検出できない傷も検出できた。この実験では、カラ画像、近赤外画像とも、果柄部と果部のくぼみ、及び縫合線の部分のミス検出が生じたが、今後はプログラムの修正開発により検出が可能と考えられる。(4)近赤外画像において、果実の成分によるものと考えられる影響が生ずる波長もあるが、中心波長850nm近辺ではその影響が少ないことが確められた。(5)モモの腐り、虫害、傷跡、裂果等には判別しきい値法が有効である。(6)明確な輪郭のある傷に対しては、領域・エッジ併用法は非常に有効であることが認められた。
放射性同位体/電気生理/オミクス解析を組合せた根表層でのミネラル獲得機序の解明

根のミネラル吸収機構が環境の変化にどのように応答するのかを、時間、空間の点から詳細に解析するため、電気生理を用いたFlux測定を実施した。実験では、一週齢のイネの根を用いて、伸長領域と成熟領域に着目し、塩ストレス(30 mM NaCl処理)開始前後のナトリウム、カルシウム、カリウムイオンのFluxを同時測定した。その結果、ナトリウムイオンは根の伸長域においては流入と流出が短時間で連続的に生じるが、成熟域においては塩ストレス開始直後にナトリウムイオンの大きな流入が観察された。そして、この流入は5分後には収束し、その後は伸長域と同様の流入と流出が捉えられた。通常環境下において根へのナトリウムイオンの流入を担う経路が、高濃度のナトリウムに応答して速やかに閉鎖する仕組みがある可能性が示された。同時に計測したカリウムイオンは常に流出が観測され、時間とともに特に成熟域での流出速度が上昇する傾向が見られた。カリウムイオンの流出は塩ストレスの一因になると考えられるため、今後、これを担う分子の同定が重要なターゲットになると思われる。カルシウムイオンも塩処理直後には流出が観察されたが、10分後にはFluxが止まることが分かった。カルシウムは、細胞内から流出したのではなく、細胞壁に含まれていたカルシウムが高濃度のナトリウムによって解離したもので、塩ストレスによるFluxの変化は無いか極めて小さいと推測された。また、昨年度の実験においてマグネシウム欠乏によってマグネシウム吸収速度の上昇が確認されたことに基づき、トランスクリプトーム解析を実施した。その結果、マグネシウム吸収速度が上昇している時間帯においても、マグネシウム輸送体として知られているMRS2/MGTファミリーの9遺伝子には発現の変化が認められず、マグネシウム欠乏によるマグネシウム吸収速度の上昇には未知の輸送体が関わる可能性が示唆された。イネ(日本晴、コシヒカリ)とシロイヌナズナ(Col-0)の根による複数のイオン吸収特性について、放射性同位元素と微小電極を用いた解析を進めた。放射性同位元素を用いた解析では、根全体でのイオン吸収量が正確に算出できる一方で、吸収部位の特定に関しては数mm単位が限界である。この点について、微小電極を用いた高解像度でのイオン動態解析によって補完することで、根におけるイオン吸収の全容を明らかにしようとしている。【イオン吸収速度の算定】2週齢のイネのナトリウムの吸収速度は、1日間の50mMのNaCl処理によって半分程度に低下することがNa-22を使ったトレーサー実験によって示された。マグネシウムの吸収速度をMg-28を使って測定したところ、2週齢のイネでは3日間の、1週齢のシロイヌナズナでは1日間のマグネシウム欠乏処理によって1.52.0倍に上昇することが分かった。特に、シロイヌナズナにおいては根端から36 mmに位置する組織での吸収活性が45倍に高まっていることが示唆されたため、この組織でのマグネシウムフラックスを詳細に検討することにした。【イオンフラックス測定】年度後半にタスマニア大学に滞在し、微小電極法(MIFE)によるフラックス計測法を修得した。さらに、シロイヌナズナの根において、細胞レベルでのイオンフラックス(流入および流出)の計測を試みた。カルシウムとナトリウムのフラックスは計測可能な状況になったが、マグネシウムのフラックス測定については、電極に用いるイオノフォアのイオン選択性が不十分であったため、イオノフォアの変更を計画している。放射性同位元素を用いたイオン吸収速度の計測は、イネ、シロイヌナズナともに実験系を確立し、安定的にデータを得られている。微小電極を用いたフラックス計測については、マグネシウムの計測手法に改良が必要な状況であるが、いくつかの解決法を考案しているので、研究全体としては、おおむね順調に進展していると評価した。MIFEに関しては、マグネシウムイオノフォアの変更を試みる。

放射性同位元素を用いた実験では、イオン吸収活性が最も高い部位をイオンごとに特定する。その上で、当該部位におけるトランスクリプトーム解析を実施する。大学院生がタスマニア大学に滞在するために必要な費用について、農学生命科学研究科が主催する大学院生の留学を支援するプログラムから援助が得られたため。次年度に繰り越した予算については、次年度に予定しているタスマニア大学での再実験で使用する。
脂質二分子膜およびその類似構造系の安定性を膜張力と膜粘弾性から明らかにする研究

リン脂質を含む両親媒性物質の形成する吸着膜や会合体の安定性を、表面に生じる表面波の性質から調べる研究を行った。リン脂質系としては、炭化水素鎖長の異なるリン脂質混合物の水溶液を対象とし、鎖長が6のジヘキサノイルホスファチジルコリン(DHPC)と鎖長が8のジオクタノイルホスファチジルコリン(DOPC)の混合水溶液系の表面拡張粘弾性をElectrocapillary wave法を用いて測定した(スペインのコンプルテンセ大学)。電気毛管現象によって生じる表面波の周波数を変化させ、またリン脂質の混合組成を変化させながら測定を行ったところ、DHPCおよびDOPCの各単独成分系に比べて両者を混合した系では拡張粘弾性の値が大きいことが分かった(周波数100400kHz)。それに加えて、拡張粘弾性の値が極大となる混合組成が、表面張力測定の結果の熱力学的解析から得られる吸着の剰余Gibbsenergyが極小となる組成と概ね一致することが分かった。一方で、表面に熱的に自然に生じる表面波(リプロン)の性質をレーザーの散乱現象を用いて検出し、そこから表面拡張粘弾性の値を得る準弾性表面光散乱装置のセットアップを研究室において行い、界面活性剤水溶液系への適用を行った。最終的に粘弾性の値を得るまでには至らなかったが、それに必要なスペクトルを得、粘弾性に寄与する重要なパラメーターであるリプロンの複素周波数を得ることができた。これまでに気体膜から膨張膜、あるいは膨張膜から凝縮膜といった異なる吸着膜状態間の転移を起こすことが示されている陽イオン性界面活性剤のドデシルトリメチルアンモニウム(DTAB)、非イオン性のエチレングリコールモノドデシルエーテル(C12E1)系のそれぞれについて表面波の複素周波数を調べたところ、その実部と虚部の両者が転移点において特徴的な変化を示し、粘弾性の値と吸着膜の状態転移との間にも相関があることが示唆された。リン脂質の形成する膜会合体の安定性を調べるために,炭化水素鎖長の異なるリン脂質混合物の水溶液を対象として研究を行った。鎖長が6のジヘキサノイルボスファチジルコリン(DHPC)と鎖長が8のジオクタノイルホスファチジルコリン(DOPC)の混合水溶液系の表面張力-濃度曲線には会合体形成を示す折れ曲がり点が観測され、またその曲線の解析からDHPCは界面活性剤が一般に形成する比較的会合数の小さいミセル(Mと表記)を形成し、DOPCはDHPCよりも会合数の大きな会合体(Aと表記)を形成することが分かった。これは先行研究の光散乱および中性子散乱測定の結果と一致する結果である。また、DHPCに富む混合組成の表面張力-濃度曲線には複数の折れ曲がり点が観測され、濃度の増加に伴いモノマー溶液からA、A+M、Mという順に会合体が形成されるという描像が得られた。混合水溶液の組成に対して会合体が形成あるいは変化する濃度をプロットすることで会合体形成の状態図を得た。この状態図は、組成一定で濃度を変化させたときの会合体の変化だけでなく、組成を変化させたときの会合体の種類の変化や会合体の形成のしやすさなどを定量的に理解できる点で非常に重要である。例えば、DOPCが会合体Aを形成するのに要する濃度はDHPCを混合することによって減少し、混合することでより会合体Aを形成しやすくなることが示唆された。また、相図の熱力学的解析から得られた会合体中での組成からも会合体AにDHPCが含まれることが示され、DHPCが会合体Aに分配して安定化していることが確かめられた。更に、会合体形成時の界面張力が組成によってほとんど変化しないという結果に熱力学関係式を適用することで、会合体形成時には平衡にある会合体と界面に形成される吸着膜の組成がほぼ等しいという重要な結果も得た。短鎖リン脂質の混合物が形成する膜会合体の安定性を明らかにするために,前年度に引き続き,炭化水素鎖長が6のジヘキサノイルホスファチジルコリン(DHPC)と鎖長が8のジオクタノイルホスファチジルコリン(DOPC)の混合水溶液を対象として実験を行った。まず、DHPCに富む組成の水溶液に対する表面張力のデータを新たに得ると共に、結果の熱力学的解析から吸着の相図を作成し,それに基づいて吸着膜の組成や吸着膜中における分子の混和性について調べた。その結果、DHPCとDopcは吸着膜中で均一に混合し、かつ混合による剰余Gibbsエネルギーは負になることが分かった。これは2成分の疎水鎖の長さの違いが、疎水鎖間の相互作用と双性イオン性頭部問の静電引力相互作用の両者を有効に働かせる吸着膜の構造を実現するためであると結論づけた。さらにこの結果を検証するため、スペインに留学して、Complutense大学のRamon.G.Rubio教授の研究室にて同系の表面粘弾性をElectrocapillary waveという手法で測定した。その結果、表面の拡張(面積変化)に対する表面拡張弾性と表面拡張粘性の値は、剰余Gibbsエネルギーが極小となる組成付近で極大の値をとることが分かった。このことは、吸着膜においてDHPC-DOPC分子間に引力的な相互作用が働く結果として粘弾性の大きな吸着膜となるということで定性的には矛盾のない結果である。現在研究室においても、表面粘弾性を調べるための表面光散乱装置という装置を作製しており、この手法を用いることによってElectroсapillary waveとは異なる周波数領域における粘弾性の値を得ることができる。

この装置についてはスペイン留学前に装置の立ち上げをほぼ完了し、留学中に解析についても学ぶことができたので、それに基づいて今後測定を進めていく予定である。リン脂質を含む両親媒性物質の形成する吸着膜や会合体の安定性を、表面に生じる表面波の性質から調べる研究を行った。リン脂質系としては、炭化水素鎖長の異なるリン脂質混合物の水溶液を対象とし、鎖長が6のジヘキサノイルホスファチジルコリン(DHPC)と鎖長が8のジオクタノイルホスファチジルコリン(DOPC)の混合水溶液系の表面拡張粘弾性をElectrocapillary wave法を用いて測定した(スペインのコンプルテンセ大学)。電気毛管現象によって生じる表面波の周波数を変化させ、またリン脂質の混合組成を変化させながら測定を行ったところ、DHPCおよびDOPCの各単独成分系に比べて両者を混合した系では拡張粘弾性の値が大きいことが分かった(周波数100400kHz)。それに加えて、拡張粘弾性の値が極大となる混合組成が、表面張力測定の結果の熱力学的解析から得られる吸着の剰余Gibbsenergyが極小となる組成と概ね一致することが分かった。一方で、表面に熱的に自然に生じる表面波(リプロン)の性質をレーザーの散乱現象を用いて検出し、そこから表面拡張粘弾性の値を得る準弾性表面光散乱装置のセットアップを研究室において行い、界面活性剤水溶液系への適用を行った。最終的に粘弾性の値を得るまでには至らなかったが、それに必要なスペクトルを得、粘弾性に寄与する重要なパラメーターであるリプロンの複素周波数を得ることができた。これまでに気体膜から膨張膜、あるいは膨張膜から凝縮膜といった異なる吸着膜状態間の転移を起こすことが示されている陽イオン性界面活性剤のドデシルトリメチルアンモニウム(DTAB)、非イオン性のエチレングリコールモノドデシルエーテル(C12E1)系のそれぞれについて表面波の複素周波数を調べたところ、その実部と虚部の両者が転移点において特徴的な変化を示し、粘弾性の値と吸着膜の状態転移との間にも相関があることが示唆された。
不斉界面の構築とキラリティ評価

牛体分子の殆どはキラルな構造・配置を持ち,その機能性発現に重要な役割を果たしている.触媒反応に極めて重要である表面や界面のような分子数が非常に少ない箇所では,キラリティの評価は難しく,まだ十分に理解していないことが事実である.本研究では,このような不斉表面・界面のキラリティの高感度検出及び分子配向の決定を,和周波発生(SFG)振動分光法と原子間力顕微鏡(AFM)によって実現することを目指す.本研究ではキラリティ測定のために最適化されたブロードバンドSFG計測システムを用い,表面のキラルとアキラルの信号を測定した.(1)ビナフトール系キラル分子:キャスト法やスピンコーティング法で作製された薄膜から強いSFG信号を観測した.アキラル信号との干渉により,キラリティの違いについて測定してみた.R体とS体のSFGスペクトルのピークの向きが完全に逆となったが,ラセミ膜では,その差分が非常に小さいことから,SFG分光によりキラリティの検出ができたと分かった.さらに,単分子膜レベルの界面キラリティを高感度に検出するために,チオール結合を含むビナフトール誘導体を新規に合成し,金基板表面に自己組織化単分子膜の構築も試みている.(2)リン脂質系キラル分子:キャスト法で作製した(L)または(D)のジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)の脂質分子のからのキラリティのSFGキラル信号が検出できた.LB法で作製したDPPCの超薄膜からのキラルSFG信号の計測にも成功し,キラルSFG測定の感度が証明された.さらに,L型リン脂質分子のみと触媒作用する酵素PLA_2の立体選択の特性を利用し,種々のキラル組成の脂質二分子膜の加水分解に伴う膜表面の構造変化について調べ,酵素反応の速度制御や反応機構理解に貢献できた.生体分子の殆どはキラルな構造・配置を持ち,一種のキラリティの集合体と言っても過言ではない.そのキラルな分子からなる材料の立体構造及びその表・界面の構造解明は,分子レベルでその機能性の理解において非常に重要である.一方,表面や界面のような分子数が非常に少ない箇所では,キラリティの評価は困難を極めている.本研究では,このような不斉表面・界面のキラリティの高感度検出及び分子配向の決定を,二次非線形振動分光法である和周波発生(SFG)分光法によって実現することを目指す.初年度において,キラリティ計測の可能性を確かめると同時に,計測システムの最適化を実現することを目標として設定していた.そこで,まず高いキラリティ強度をもつ(R)-または(S)-ビナフトール(BN)のキャスト薄膜について評価した.(R)-BN薄膜では,通常のアキラル分子系ではSFG信号が全く観測されないpsp偏光状態(SFG,p偏光;可視,p;IR,p.以下同)において,強いSFG信号が観測された.(R)-BN分子のキラリティに由来するキラルSFG信号が薄膜の表面及びそのバルクの両方から由来されるものと考える.キラルとアキラルのSFG信号の干渉を利用し,測定の高感度化とキラリティ信号の違いの区別を調べてみた.そこで,R体とS体のSFGの差分SFGスペクトルのピークの向きが完全に逆となったのに対して,1:1混ぜているラセミ体の薄膜では,差分SFGスペクトルのピークが非常に小さいことが分かった.SFG測定により,ビナフトール分子のキラリティについて評価できた.さらに,分子の数を減らしながら測定感度の向上を試みている.牛体分子の殆どはキラルな構造・配置を持ち,その機能性発現に重要な役割を果たしている.触媒反応に極めて重要である表面や界面のような分子数が非常に少ない箇所では,キラリティの評価は難しく,まだ十分に理解していないことが事実である.本研究では,このような不斉表面・界面のキラリティの高感度検出及び分子配向の決定を,和周波発生(SFG)振動分光法と原子間力顕微鏡(AFM)によって実現することを目指す.本研究ではキラリティ測定のために最適化されたブロードバンドSFG計測システムを用い,表面のキラルとアキラルの信号を測定した.(1)ビナフトール系キラル分子:キャスト法やスピンコーティング法で作製された薄膜から強いSFG信号を観測した.アキラル信号との干渉により,キラリティの違いについて測定してみた.R体とS体のSFGスペクトルのピークの向きが完全に逆となったが,ラセミ膜では,その差分が非常に小さいことから,SFG分光によりキラリティの検出ができたと分かった.さらに,単分子膜レベルの界面キラリティを高感度に検出するために,チオール結合を含むビナフトール誘導体を新規に合成し,金基板表面に自己組織化単分子膜の構築も試みている.(2)リン脂質系キラル分子:キャスト法で作製した(L)または(D)のジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)の脂質分子のからのキラリティのSFGキラル信号が検出できた.LB法で作製したDPPCの超薄膜からのキラルSFG信号の計測にも成功し,キラルSFG測定の感度が証明された.さらに,L型リン脂質分子のみと触媒作用する酵素PLA_2の立体選択の特性を利用し,種々のキラル組成の脂質二分子膜の加水分解に伴う膜表面の構造変化について調べ,酵素反応の速度制御や反応機構理解に貢献できた.
ヘリコン波励起プラズマスパッタ法による酸化亜鉛エピタキシーと微小共振器形成

微小共振器ポラリトンレーザは新たな原理によるコヒーレント光源として興味深い。本研究では、独自のヘリコン波励起プラズマスパッタ法により、酸化亜鉛をベースとする微小共振器構築に必須な酸化マグネシウム亜鉛系半導体のエピタキシャル成長を行った。また、誘電体及び導電性分布ブラッグ反射鏡の設計と作製を行い、新規導電性酸化膜(アナターゼ相ニオブ添加酸化チタン)のエピタキシャル成長にも成功した。安価なスパッタ技術で先端エピタキシー技術と遜色の無い上記材料群のエピタキシャル成長が可能な事を示した成果を発展させることにより、ヘテロ構造、量子構造デバイス形成への道を拓くことができた。ポラリトンレーザの実現は、新たな原理によるコヒーレント光の出現という学術的意義と、超低閾値化や未踏波長領域の光源実現という応用上の意義をあわせ持つ。本年度は、将来的に「電気を流せる」pn接合型微小共振器作製へのショートカットをする目的から、p型結晶の成長がZnOよりも容易な窒化物半導体との積層構造形成を念頭に、ヘリコン波励起プラズマスパッタ(HWPS)法を用いてサファイヤa面基板だけでなくGaNテンプレート上にZnO薄膜のエピタキシャル成長を行った。また、サファイヤ基板上のZnO薄膜に対してCAICISS測定を行い、酸素極性成長することを明らかにした。また、サファイヤ基板上へのZnO成長において高温熱処理自己バッファ層(HITAB)の効果が顕著に現れたことから、今後はGaNテンプレート上でもHITABの挿入を試みる。これと平行し、SiO_2、ZrO_2誘電体酸化物薄膜を反応性HWPS(R-HWPS)法で堆積して分布ブラッグ反射鏡を形成し、計算値にほぼ一致する反射率スペクトルを得た。さらに、新たな透明導電性薄膜として注目されはじめたNb添加(n型)TiO_2薄膜のR-HWPS製膜を開始した。これにあたり、屈折率分散の文献値を用いてZnO:Alとのλ/4n厚積層構造の計算を行い、導電性非単結晶DBR形成への指針を構築した。また、ZnO:Alよりも低抵抗化が期待されているZnO:GaのHWPS薄膜堆積を行い、抵抗率制御の基礎データを取得した。H20年度は、ヘリコン波励起プラズマススパッタエピタキシー(HWPSE)法成長酸化亜鉛(ZnO)エピタキシャル成長薄膜の高品質化を目的として、水熱合成ZnO基板上にZnOのホモエピタキシャル成長を行った。Zn極性基板を用いた場合、920°C以上の高温成長で成長条件を最適化することにより、分子線エピタキシー(MBE)法やレーザMBE法と遜色のない高品質な薄膜の成長に成功した。低温のフォトルミネッセンススペクトルには、A、B自由励起子の第一励起状態からの発光や、A、B励起子ポラリトンの発光が明瞭に観測された。まさにHWPSE法の長所を発揮させることに成功した。これと平行し、SiO_2、ZrO_2誘電体酸化物薄膜を反応性HWPS法で堆積して分布ブラッグ反射鏡を形成し、計算値にほぼ一致する反射率スペクトルを得た。さらに、新たな透明導電性薄膜として注目されはじめたNb添加(n型)TiO_2薄膜のHWPS製膜を開始し、比較的比抵抗の低い薄膜体積に成功した。また、屈折率分散を測定してZnO : Alとのλ/4n厚積層構造の計算を行い、導電性非単結晶DBR形成への指針を構築した。さらに、Ga添加ZnOやCu添加NiO等のn型、p型透明導電膜のHWPS薄膜堆積を行い、抵抗率制御の基礎データを取得した。微小共振器ポラリトンレーザの実現は、新たな原理によるコヒーレント光の出現という学術的意義と、超低閾値化や未踏波長領域の光源実現という応用上の意義をあわせ持つ。酸化亜鉛(ZnO)をベースとした微小共振器構造の構築を目指し、H21年度はヘリコン波励起プラズマスパッタエピタキシー(HWPSE)法によるZnOと酸化マグネシウム亜鉛(MgZnO)混晶のヘテロ構造の形成、高品質化を行った。成長用基板には、前年度の経験を生かして水熱合成Zn極性ZnO単結晶基板を用いた。MgZnO薄膜の表面が原子層レベルで平坦となる成長温度はZnOよりも高く、960°C以上の高温成長が適している事を明らかにした。

この結果、薄膜のモゼイクの指標となるX線ロッキングカーブの半値幅が、基板の値と変わらないMg_<0.06>Zn_<0.94>O/ZnOおよびMg_<0.15>Zn_<0.85>O/ZnOヘテロ構造を形成することができた。また、MgZnOターゲットの純度が低いため期待薄であったものの、低温において二次元電子ガスによるシュブニコフ・ドハース振動と量子ホール効果的な磁気抵抗の変化が観測された事は、HWPSE法のポテンシャルを示すものであった。技術的にはMBE法に追いついたと言える。上記と平行し、Nb添加(n型)TiO_2薄膜の、ガラス上へのHWPS製膜とGaN基板へのHWPSE成長を行い、比較的抵抗率の低いアナターゼ相TiO_2:Nb薄膜の堆積およびエピタキシャル成長に成功した。また、Ga添加ZnOやCu添加NiO等のn型、p型透明導電膜のHWPS薄膜堆積を行った。これらの技術を用いてMgZnO/ZnO等の分布ブラッグ反射鏡構造や量子井戸構造の形成が期待できる。
軸索内リボソーム機能障害による翻訳能低下に基づくALS/FTLD病態の統合的理解

ALS/FTLDモデルマウスを用いたリボソーム蛋白質の発現増加による神経保護効果を検証するため、患者関連変異型TDP-43およびリボソーム蛋白質翻訳促進因子である遺伝子Xを発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを生直後のマウス側脳室内に投与し、TDP-43過剰発現による運動症状出現の有無を経時的に観察した。投与後1年経った時点で変異型TDP-43発現マウスで運動麻痺症状が出現し始めており、今後引き続き観察を行う。遺伝子X発現マウスでは特に明らかな症状はみられていない。合わせて患者関連変異型TDP-43トランスジェニックマウスをJackson Laboratoryより導入し運動症状出現の有無を観察した。明らかな運動症状の出現なしに死亡する個体がみられ、今後他のトランスジェニックマウスの導入を含めた検討を行う。またリボソーム蛋白質の発現を増加させる既存薬をリボソーム蛋白質遺伝子プロモーター領域を用いたルシフェラーゼレポーターアッセイを構築してライブラリーからのスクリーニングにより行い、約20種類の薬剤でリボソーム蛋白質の発現が3倍以上に増加することを確認した。ALS/FTLD患者剖検組織として延髄錐体より運動神経軸索を採取し、リボソーム蛋白質mRNAの量を定量PCRにより測定したところ、複数のリボソーム蛋白質mRNAが有意にALS/FTLD患者群で減少していることを確認した。ALS/FTLDモデルマウスの確立およびその症状観察、病理学的解析に時間がかかっており、引き続きいくつかの方法を用いて確立を目指す。今後他系統の導入も含めたALS/FTLDモデルマウスの確立を行うとともに、現在までに得られたリボソーム蛋白質発現促進薬剤のALS/FTLD治療薬としての可能性につき、in vitro、in vivoでのALS/FTLDモデルを用いた保護効果の確認により検証していく。1TDP-43の発現変化による軸索内リボソーム蛋白質mRNA輸送、蛋白質翻訳能への影響の検討レンチウイルスベクターを用いたTDP-43の発現低下あるいはALS/FTLD関連変異型TDP-43の過剰発現のいずれによってもマウス初代培養神経細胞の軸索におけるリボソーム蛋白質mRNAの量は減少した。またこれらの発現変化により神経細胞軸索でのリボソームによる蛋白質合成能にも低下がみられた。これらよりTDP-43によるmRNAの軸索への輸送機能の障害によりリボソーム蛋白質mRNAの軸索への輸送が減少し、軸索局所でのリボソーム機能が障害されることが示された。2培養神経細胞およびショウジョウバエモデルにおけるTDP-43発現変化の神経変性への影響およびリボソーム蛋白質の保護効果の解析マウス初代培養神経細胞でTDP-43の発現を低下させたところ、軸索伸長の障害がみられた。その際同時にリボソーム蛋白質を過剰発現させたところ、軸索の伸長は改善した。ヒト野生型TDP-43を複眼で過剰発現するハエでは複眼変性がみられた。このハエをリボソーム蛋白質を複眼で過剰発現するハエと交配し両者を過剰発現するハエを作成したところ、複眼変性が明らかに抑制された。これらよりTDP-43関連神経毒性に対しリボソーム蛋白質が保護効果を持つことが確認された。TDP-43の発現変化により、その軸索への輸送標的mRNAとして我々が同定したリボソーム蛋白質mRNAの輸送と機能が低下することがin vitroおよびin vivoで示されており、おおむね計画した実験結果は得られていると考えられる。投与後数ヶ月経った現時点で明らかな症状はみられておらず、今後引き続き観察を行うとともに、他の方法によるモデルマウスの確立を目指す。またリボソーム蛋白質の発現を増加させる化合物をリボソーム蛋白質遺伝子プロモーター領域を用いたルシフェラーゼレポーターアッセイを構築してライブラリーからのスクリーニングにより検索している。この系を用いて陽性対照として種々のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を添加してその発現促進効果を検討した結果リボソーム蛋白質の発現が増加することが確認され、今後この系を用いた新規化合物スクリーニングを行う予定である。2ALS/FTLD患者由来神経細胞におけるTDP-43細胞内局在、軸索内リボソーム蛋白質mRNA輸送、蛋白質翻訳能と神経変性との関連解析対照健常人およびTDP-43遺伝子変異を持つALS患者の線維芽細胞をPTBP1遺伝子の発現低下を介したdirect reprogrammingにより神経細胞へと分化させることができた。ALS患者由来の神経細胞は健常対照と比較してTDP-43の細胞質での発現がやや多い傾向にあり、神経突起伸長が障害されていることが確認された。現在まだALS/FTLDモデルマウスが確立できておらず、今後いくつかの方法を用いて確立を目指す。

遺伝子X発現マウスでは特に明らかな症状はみられていない。合わせて患者関連変異型TDP-43トランスジェニックマウスをJackson Laboratoryより導入し運動症状出現の有無を観察した。明らかな運動症状の出現なしに死亡する個体がみられ、今後他のトランスジェニックマウスの導入を含めた検討を行う。またリボソーム蛋白質の発現を増加させる既存薬をリボソーム蛋白質遺伝子プロモーター領域を用いたルシフェラーゼレポーターアッセイを構築してライブラリーからのスクリーニングにより行い、約20種類の薬剤でリボソーム蛋白質の発現が3倍以上に増加することを確認した。ALS/FTLD患者剖検組織として延髄錐体より運動神経軸索を採取し、リボソーム蛋白質mRNAの量を定量PCRにより測定したところ、複数のリボソーム蛋白質mRNAが有意にALS/FTLD患者群で減少していることを確認した。ALS/FTLDモデルマウスの確立およびその症状観察、病理学的解析に時間がかかっており、引き続きいくつかの方法を用いて確立を目指す。来年度はリボソーム蛋白質の発現を増加させる薬剤のスクリーニングを行い、その薬剤によるTDP-43神経毒性の保護効果をin vitroおよびin vivoで検証し、ALS/FTLDの創薬に結びつく研究へと展開していく予定である。今後ALS/FTLDモデルマウスの確立と合わせ、リボソーム蛋白質の発現を促進する化合物のスクリーニングを順次行っていき、新たなALS/FTLDの治療薬の開発を目指す。また患者剖検組織を用いたリボソーム蛋白質mRNAの解析を行い、ALS/FTLDの病態におけるリボソーム蛋白質mRNAの軸索輸送障害の意義につき検証する。今後他系統の導入も含めたALS/FTLDモデルマウスの確立を行うとともに、現在までに得られたリボソーム蛋白質発現促進薬剤のALS/FTLD治療薬としての可能性につき、in vitro、in vivoでのALS/FTLDモデルを用いた保護効果の確認により検証していく。異動により新たな所属機関にて組み換えDNA実験、動物実験等の実験計画申請書類を改めて提出する必要があり、承認されるまで研究を中断する必要があったため、支出額が当初計画よりも少なかった。(理由)ALS/FTLDモデルマウスの確立、リボソーム蛋白質発現促進化合物のスクリーニングにやや手間取っており、その解析に必要な経費の支出がまだ行われておらず、支出額が当初計画よりも少なかった。(使用計画)次年度は効率的に研究を進め、本年度分と合わせて経費を支出する予定である。次年度は細胞培養実験を中心に効率的に研究を進め、本年度分と合わせて経費を支出する予定である。