hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＤＮＡナノ構造体を用いた筋肉再構成系の機能的デザインと内部状態イメージング

本研究では、生命の材料である蛋白質とDNA分子を使って人工筋肉をデザイン・作成し、その特性を蛋白質1個レベルの解像度で観察・解析することで、生命の持つ巧みな省エネ戦略、柔軟性や適応性を解明するのが最終目的である。DNAorigamiと呼ばれる新規技術とモーター蛋白質をハイブリッドさせて、サブミクロンサイズのモーター集合体を作成できた。モーターの個数制御や空間配置制御方法を確立し、詳細な生物物理解析を可能にする技術基盤を構築することができた。本研究では、1分子計測技術とDNAorigami技術の融合によって、モーター分子集合体の空間的デザインと内部運動計測の技術基盤を創るのが目的である。本年度では、昨年度に作成したDNAorigamiに結合可能なモーター蛋白質の組換え体作成および、実際に結合させてモーター分子集合体を作成とその運動観察を行った。最終的なゴールとしては、筋肉のモーター蛋白質であるミオシンIIを集積化して天然の空間周期を持つものから、あえて周期をずらしたデザインでの収縮特性の違いを単分子分解能で計測することである。しかし、ミオシンII重鎖の遺伝子工学的な改変が比較的時間がかかるため、技術基盤の確立という意味で、遺伝子工学的取扱いが容易で、すでに組換え体を構築しその運動特性計測も容易なミオシンV,VI,キネシンを用いた。まず、これらのモーター蛋白質のC末にSNAPタグを付加した組換え体を構築した。次いで、その基質であるベンジルグアニン(BG)をラベルしたオリゴヌクレオチドを調製し、組換え体とBGオリゴを反応させてC末に1本鎖DNAがラベルされたサンプルを用意した。ラベルされた1本鎖DNAに相補的な配列を持つDNAorigamiを反応させて、キネシンについては1ー3個、ミオシンについては、ミオシンVとVIが最大3個ずつ結合可能な分子集合体を作成した。1本鎖DNAのラベル率や結合した分子の個数の確認は電気泳動によるバンドシフトによって行った。キネシンについては、個数を増やすことによって、微小管上での1方向運動距離に劇的な増加がみられた(3個の集合体で1個の時の約10倍)。ミオシンVとVIについては、互いに運動方向が異なるために分子間での綱引きが観察された。DNAorigamiの中に、バネとなるフレキシブルなデザインを施しているため、綱引きしているときの張力の観察と張力存在下での1分子動態観察に成功した。本年度では、筋肉収縮を担うモーター蛋白質であるミオシン分子の空間配置と個数を制御するDNAorigamiテンプレートの設計と作製および精製を行った。天然の筋肉では、14.3 nm間隔(同じ配向を持った分子は42.9 nm間隔)でミオシンモーター部位が配置されている。理論的な粗視化モデルでは、空間周期に依存して筋肉の収縮速度や筋肉に加えられる負荷に対する収縮速度の応答が変化し、いくつかの周期に対して共鳴的に収縮速度が増加もしくは減少する結果が得られている。モーターシステムの機能や効率化に対する空間周期の役割を実験的に検証するために、本年度に作成したDNAorigamiテンプレートにおいては、14.3 ±1 nmの間隔でモーター分子を配置することが可能な結合部位を設計した。この設計により、天然の筋肉で同一のアクチンフィラメントに相互作用可能なミオシン分子の間隔である42.9 nm周期のモーター集合体を始め、周期をずらした人工的な筋肉構造の作製を行うことが可能になった。実際に作製したサンプルをアガロース電気泳動し、バンドのパターンから均一な構造物が得られていることが示唆された。また、ネガティブ染色による電子顕微鏡観察によって、実際にテンプレートが作成されていることが確認できた。次年度においては、モーター分子を結合させて様々な集合体を作成し、アクチンフィラメント上でのすべり運動観察を行い運動速度の解析を行う予定である。24年度では、モーター分子集合体の空間配置と個数を制御するDNAorigamiテンプレートの設計を行うのが目的であった。研究実績にもあるように、天然の筋肉で観察されている空間配置を始め、そこから14.3nm単位で空間周期をずらした形で配置可能なテンプレートの設計ができ、かつ、実際に作製することができた。次年度に向けた準備も進めており、おおむね計画通り順調に進展していると考えられる。25年度では、昨年度までに作成したモーター分子集合体用のテンプレートを用いて、実際にモーター分子の配置を行う。筋肉のミオシンとDNAorigamiを結合させるために、ミオシン軽鎖にSNAP-tagを付加したコンストラクトを作成する。SNAP-tagに20base程度のオリゴヌクレオチドを結合させて、テンプレートのデザインされた位置に配置した1本鎖DNAとハイブリダイズさせることによって、両者を安定に結合させる。SDS-pageによる確認と、電子顕微鏡もしくはAFM観察によって実際に作製された集合体の完成度を評価する。

平行して、1分子イメージングのための光学設計を調整し、集合体のすべり速度や力発生、集合体の内部状態を捉えれるようにする。テンプレートの長さが400 nm程度であり、この領域内に同じ蛍光波長を持った複数の蛍光プローブが存在すると1分子解析を行うことが出来たないため、2ー4色程度の蛍光プローブが結合できるように設計する。ミオシン軽鎖コンストラクト用のプラスミドと発現精製系に用いる試薬の購入を行う。このコンストラクトに付加する合成オリゴDNAや、SNAP-tagに結合させるための基質(ベンジルグアニン)の購入も進める。実験に合わせてDNAorigamiのテンプレートのマイナーチェンジ用に材料となる1本鎖DNAや合成オリゴDNAも購入する。作製した集合体の確認用として生化学試薬や、電子顕微鏡観察、AFM観察で必要な消耗品(染色試薬、グリッド、カンチレバーなど)の購入も行う。1分子計測で用いる自作の蛍光顕微鏡のマイナーチェンジも必要であるため、実験に合わせて適切な光学フィルタやレーザーの購入を行う。その他、情報収集や成果発表のための旅費、解析用のハードウェアやソフトウェア関係の購入も予定している。
新規64Cu標識ソマトスタチン誘導体を基盤とした次世代NET診断／治療薬の開発

神経内分泌腫瘍(NET)の診断や治療において、放射性核種標識somatostatin (SST)誘導体の利用が有益とされている。本研究では、診断治療を同一化合物で行うことが出来る薬剤開発を目標とし、新規Cu-64標識SST誘導体を設計・合成した。これをAR42J細胞移植マウスに投与し経時的にPET撮像をした結果、腫瘍を明瞭に描写することができた。また、投与長時間後においても、対照化合物と比較して腫瘍に対し高い集積を示した。これらの結果は、新規化合物がNET診断薬剤として有益であることを示唆している。近年、欧州では神経内分泌腫瘍(NET)に高発現するsomatostatin receptor 2 (SSTR2)を標的として、放射性薬剤を用いたNETの診断/治療(PRRNT)が標準的に行われている。一方、日本国内ではPRRNTを行うことは現段階では極めて難しく、世界から遅れをとっていることから、新規NET診断/治療薬の開発が期待されている。Fmoc固相ペプチド合成法にて、樹脂上に構築したペプチドN末端にATSM誘導体を導入し、脱保護、分子内環化および精製過程を経て、物性の異なる4種のATSMs-TATEを合成した。これら誘導体を当量の非放射性natCuと反応し、定量的にnatCu-ATSMs-TATEへと誘導することに成功した。また、これら誘導体はlogD値(pH 7.4)が-2.560.92、タンパク結合率は97.399.3%を示した。次に、D-ペニシラミン非共存/共存マウス血清中において安定性を評価したところ、4化合物ともにD-ペニシラミン共存の有無にかかわらず反応4時間後も90%以上の高い残存率を示した。一方、グルタチオン溶液中では、natCu-ATSMs-TATEは85%以下まで残存率が低下し、natCuを経時的に放出することを明らかに出来た。以上から、新規に設計・合成したnatCu-ATSMs-TATEは、血清中では比較的安定であり、標的細胞内などの低酸素部位(高還元活性下)では容易にCuを放出する性質を持った化合物であることが示唆された。平成27年度に合成を予定していた陰電荷型Cuキレーターは、合成過程において目的物が十分に得られず分子設計の変更が必要となった。そのため、キレーター自体に陰電荷を与える構造ではなく、キレーターペプチド間のスペーサー部分に酸性アミノ酸を導入し、分子全体として陰電荷を持たせる構造へと計画を変更した。その結果、物性の異なる合計4化合物ATSMs-TATEの合成に成功し、これらの化合物が非放射性natCuと容易に錯体形成することも確認することができた。また、4種のnatCu-ATSMs-TATEの脂溶性評価、タンパク結合率の評価および安定性評価についても終了しており、平成28年度に計画していたsomatostatin receptorに対する親和性評価についても開始していることから、概ね順調に進行していると考える。欧州では、神経内分泌腫瘍(NET)に対し、RI標識somatostatin誘導体を用いた診断および治療が標準的に行われているが、日本ではその治療法が未承認であるため海外での治療を余儀なくされるケースも多い。本研究では、診断治療を同一化合物で行うことが可能な次世代NET診断/治療薬の開発を最終目標とし、64Cu標識が可能な化合物(HxBTTATE, HpBTTATE, HpBTd3TATEおよびToDBTTATE)を新規に合成した。NETはsomatostatin receptor (SSTR) 2を高発現することが知られている。そこで、新規化合物のSSTR2およびその関連受容体(SSTR3, 5)に対する結合親和性(IC50値)をRIトレーサーを用いた競合法により評価した。これら化合物は、SSTR2に対しIC50値0.46710.9 nMを示し高い結合親和性を有していた。また、それぞれの関連受容体に対する結合親和性は、SSTR2の1/208未満あるいは1/18未満と低く、SSTR2に対し高い選択性を有することも確認できた。次に、代表化合物としてToDBTTATEを選定し、比較対象にDOTATATEを用いて以下の比較実験を行った。64Cu標識後NET担癌モデルマウスに投与し、経時的な64Cu分布評価およびPET撮像を行った。投与後40時間において、腫瘍への64Cu集積量は64Cu-DOTATATEで2.47±0.51であったのに対し64Cu-ToDBTTATEでは3.66±0.30%dose/g、腫瘍血液比は各々1.42、1.92であり、いずれも後者で有意に高値を示した。また、PET撮像実験においても腫瘍を明瞭に描写することに成功した。すなわち、本研究で得た結果は、新規考案したToDBTTATEがNET診断薬としての基本的性質を有していることを示唆している。

平成28年度は、引き続き新規合成した化合物のsomatostatin receptor 2に対する親和性評価を行う。それに加えsomatostatin receptor 3および5などのsubtypeに対する親和性を評価し、受容体結合選択性の評価を行う。次に、化合物の64Cu標識実験を行うとともに、64Cu標識体を作成した担癌マウス(AR42J細胞移入NETモデルマウス)の尾静脈から投与する。投与後、経時的なPET撮像実験および臓器摘出法による64Cu体内分布評価を行い、64Cuの腫瘍集積性を評価する予定である。創薬錯体化学平成27年度の計画において、他施設における実験を行うため旅費および人件費・謝金を計上していたが、予定していたCuキレーター合成において、一部化合物で反応がうまく進行しなかった。目的とする分子合成を達成するにあたり、多種の反応条件検討が必要で高額な試薬と検討時間が必要と想定された。そこで、Cuキレーターの設計を変更して合成を行うこととした。この設計変更において、予定外の試薬購入が必要となるが、前述の検討を進める場合と比較して、安価で、かつ迅速に合成が可能であるため、有効な分子設計変更であると判断した。合成計画に変更が生じ別途試薬購入費用を捻出する必要が生じたため、旅費および人件費・謝金を物品費として割り当て使用した。その結果、物性の異なる4種の化合物合成に成功したため、平成28年度に予定していた受容体への親和性評価も一部の化合物で開始した。以上より次年度使用額が発生することとなった。現在までの進捗状況に記載したとおり、平成27年度の研究計画はおおむね順調に進んだと考える。平成28年度分として交付申請した直接経費130万円は、今後の研究の推進方策にあげた内容を遂行するために必要であり、繰り越した次年度使用額を合わせて効率的な課題遂行を目指す。繰り越した次年度使用額は、主として物品費に使用する予定である。
電気核生成の新解釈

融液から凝固する際に大きな潜熱を発生する無機塩類水和物は、太陽熱冷暖房蓄熱材としての用途が期待されているが、そのためには包晶反応を経ることなく直接に目的の水和物を、しかも容易に核生成させることが鍵となる。これまでのところ、他イオンの添加、過電圧印加等の効果が調べられている。なかでも再現性の高い核生成法として注目されている過電圧印加は、系の静電エネルギーの減少が駆動力と考えられているが、系の熱力学的自由エネルギーを上回るような静電エネルギー、つまり電場勾配の印加が可能であろうか、というのが本研究の出発点である。このような観点から、本研究では、これまでしばしば研究されている酢酸ナトリウム水和物融液を例にとり、静電エネルギー(ζE^2)と過冷却度(S_0)が、ζE^2≫S_0となるかどうかの検討から始めた。まず、ζ=V_cε_m(1-ξ)/2kT(2+ξ)において、V_c=1.35×10^<-22>[m^3]、ε_m=2.66×10^<-11>[F/m]とし、さらにE=V/δ=0.2V/200μmとすると、ζE^2は6.42×10^<-13>となりS_0(0.1)に比べて桁違いに小さな値となる。ζE^2≫S_0とするには、δは原子間距離のオーダーとなり、従来の実験結果(δ=2.6×10^<-4>[m])とは反することが分かる。言い換えれば電場勾配を決める銀イオンの分布領域の大きさが、原子間距離のオーダーであるか否かがポイントといえる。光干渉計を用いた濃度分布の測定からは、広範な銀イオンの分布は得られなかったものの、現状の干渉縞の分解能(10μm)では明確な結論を得ることは困難なため、位相シフト法を用いることによる干渉縞の分解能の飛躍的向上を現在進めている。
新しいグルタチオン誘導体の発見とそれによる蛋白質機能制御に関する研究

近年、血管機能が、一酸化窒素(NO)や過酸化水素などの反応性分子種によりレドックス依存的に制御されていることがわかってきた。血管組織のリモデリングは、細胞外マトリックスの分解に関わる蛋白分解酵素であるmatrixmetalloproteinase(MMP)によりもたらされる。MMPは、不活性前駆体として産生され、その活性化はプロペプチドドメインに存在するconsensusmotif(PRCGVPD)のCys残基の酸化によりもたらされることが知られているが、その生理学的意義は不明であった。今回我々は、NOとスーパーオキシドの反応産物であるパーオキシナイトライト(ONOO^-)による全く新しいMMP活性化機構を見出した。この活性化は、生体内の主要なレドックス制御ペプチドであるグルタチオン(GSH)により巧妙に調節される。すなわち、ONOO^-は、GSHのニトロ化反応を介して、GSHとMMPのPRCGVPDとの付加反応(S-glutathiolation)をもたらし、MMPを強力に活性化することが明らかとなった。尚、この際形成されるジスルフィド結合は、これまで生体内生成が知られていなかったジスルフィドSオキシド結合であり、生理的還元反応では解離しない。さらに、本年度の研究においては、NOによる細胞内ニトロ化反応による全く新規のシグナル伝達機構が存在することがわかってきた。具体的には、NOやONOO^-が、細胞内のヌクレオチドプールのグアニンを効率よくニトロ化して、8-ニトログアノシンを生成すること、この8-ニトログアノシンが、強力なレドックス活性を介して細胞内のレドックスレベルを制御することである。このことは、細胞内ニトロ化反応が、血管機能や血管リモデリングを制御していることを示唆している。血管組織のリモデリングは、細胞外マトリックスの分解に関わる蛋白分解酵素であるmatrixmetalloproteinase (MMP)によりもたらされる。MMPは、不活性前駆体として産生され、その活性化はプロペプチドドメインに存在するconsensusmotif (PRCGVPD)のCys残基の酸化によりもたらされることが知られているが、その生理学的意義は不明であった。一方で、ONOO^-に対して過剰なGSHは、GSH分子間での還元反応を介してONOO^-を効率よく消去し、MMPの酸化的活性化を強く抑制する。このことは、血管系において産生されるNO・活性酸素およびGSHによるレドックス反応が、MMPの活性化を調節することにより、血管リモデリングを制御していることを示唆している。
消化器癌薬剤耐性獲得に関するmicroRNAの関与

進行・再発の消化器癌に対して,CDDP+5-FUを中心とした化学療法に,Paclitaxelの併用療法が試みられている.しかし,その奏功率は依然として低く,背景には腫瘍細胞の持つ薬剤耐性機構がある.近年,ゲノムのジャンク配列と思われ,注意の払われていなかったnon-codingが注目を浴びている.特に,miRNAは,複数のmRNAの3'-非翻訳領域に結合し,mRNAの分解あるいは蛋白質の翻訳抑制に働いている.本研究では,消化器癌において薬剤耐性遺伝子の発現制御に関わるmicroRNA(miRNA)を定量的に解析し,薬剤耐性獲得機構との関連を検討した.type III β-tubulinプロモーター領域との結合に必要なdsRNA特定には至らなかったが,type III β-tubulinの発現には,intron1領域のhypermethylationならびにヒストンの脱アセチル化強く関与している所見が得られた.また,ABCB1の過剰発現にはhsa-miR-451,hsa-miR-498のmiRNAの発現低下が関連していた.消化器癌の薬剤体制機構にはmiRNAの発現異常が関与している可能性が示唆され,新らたな治療戦略の立脚につながると考えられた.進行・再発の消化器癌に対して,CDDP+5-FUを中心とした化学療法に,Paclitaxelの併用療法が試みられている.しかし,その奏功率は依然として低く,背景には腫瘍細胞の持つ薬剤耐性機構がある.近年,ゲノムのジャンク配列と思われ,注意の払われていなかったnon-codingが注目を浴びている.特に,miRNAは,複数のmRNAの3'-非翻訳領域に結合し,mRNAの分解あるいは蛋白質の翻訳抑制に働いている.本研究では,消化器癌において薬剤耐性遺伝子の発現制御に関わるmicroRNA(miRNA)を定量的に解析し,薬剤耐性獲得機構との関連を検討した.type III β-tubulinプロモーター領域との結合に必要なdsRNA特定には至らなかったが,type III β-tubulinの発現には,intron1領域のhypermethylationならびにヒストンの脱アセチル化強く関与している所見が得られた.また,ABCB1の過剰発現にはhsa-miR-451,hsa-miR-498のmiRNAの発現低下が関連していた.消化器癌の薬剤体制機構にはmiRNAの発現異常が関与している可能性が示唆され,新らたな治療戦略の立脚につながると考えられた.【目的】進行・再発の消化器癌に対して,CDDP+5-FUを中心とした化学療法に,Paclitaxelの併用療法が試みられている.しかし,その奏功率は依然として低く,背景には腫瘍細胞の持つ薬剤耐性機構がある.腫瘍細胞が薬剤耐性を獲得する主要な機構として,P-glycoprotein(ABCB1,MDR1)の過剰発現がある.ABCB1を過剰発現している腫瘍細胞では,CDDPなどの薬剤排出機構が高まり,自然耐性を獲得することになる.一方,Paclitaxelは細胞分裂時の微小管と重合し,細胞分裂を阻害する作用がある.一部の腫瘍では,type III β-tubulin(neuronal tubulin)を過剰発現させ,微小管の安定性を増すことでPaclitaxelの殺細胞効果を回避している.我々はin vitroの実験データから,この二つの耐性機構に,蛋白質をコードしないnon-coding RNAが関与している可能性を見出した.消化器癌において,薬剤耐性遺伝子の発現制御に関わるmicroRNA(miRNA)を定量的に解析し,薬剤耐性獲得機構との関連を検討する.【結果】(1)Paclitaxel耐性には特定のmiRNAよりもepigeneticな発現制御が強く関連していた.(2)ABCB1の耐性には4種類のmiRNAの発現異常が関連している可能性が視された.【意義・重要性】第3のepigeneticsと呼ばれるmiRNAの発現異常は,ABCB1を標的としたmiRNAによる薬剤耐性の獲得機構に関与している可能性が示唆され,さらに研究を展開させる必要があった.【目的】進行・再発の消化器癌に対して,CDDP+5-FUを中心とした化学療法に,Paclitaxelの併用療法が試みられている,しかし,その奏功率は依然として低く,背景には腫瘍細胞の持つ薬剤耐性機構がある,腫瘍細胞が薬剤耐性を獲得する主要な機構として,P-glycoprotein (ABCB1,MDR1)の過剰発現がある, ABCB1を過剰発現している腫瘍細胞では, CDDPなどの薬剤排出機構が高まり,自然耐性を獲得することになる.一方, Paclitaxelは細胞分裂時の微小管と重合し,細胞分裂を阻害する作用がある.一部の腫瘍では, type III β-tubulin (neuronal tubulin)を過剰発現させ,微小管の安定性を増すことでPaclitaxelの殺細胞効果を回避している.我々はin vitroの実験データから,この二つの耐性機構に,蛋白質をコードしないnon-coding RNAが関与している可能性を見出した.消化器癌において,薬剤耐性遺伝子の発現制御に関わるmicroRNA (miRNA)を定量的に解析し,薬剤耐性獲得機構との関連を検討する.【結果】(1)Paclitaxel耐性には特定のmiRNAよりもepigeneticな発現制御が強く関連していた.(2)ABCB1の耐性には4種類のmiRNAの発現異常が関連している可能性が示唆されたものいずれも有意にABCB1の発現を制御できなかった.(4)cytoplastic HDACの一種であるHDAC6の発現制御に転写因子NACC1が関与している可能性が示唆された.【意義・重要性】

今年度の研究成果により,細胞質内に存在するHDACの作用が抗がん剤の感受性に深く関与している可能性が示唆され,次年度以降の研究課題となった.【目的】進行・再発の消化器癌に対して,CDDP+5-FUを中心とした化学療法に,Paciitaxelの併用療法が試みられている.しかし,その奏功率は依然として低く,背景には腫瘍細胞の持つ薬剤耐性機構がある.腫瘍細胞が薬剤耐性を獲得する主要な機構として,P-glycoprotein(ABCB1,MDR1)の過剰発現がある.ABCB1を過剰発現している腫瘍細胞では,CDDPなどの薬剤排出機構が高まり,自然耐性を獲得することになる.一方,Paclitaxelは細胞分裂時の微小管と重合し,細胞分裂を阻害する作用がある.一部の腫瘍では,type III β-tubulin(neuronal tubulin)を過剰発現させ,微小管の安定性を増すことでPaclitaxelの殺細胞効果を回避している.我々はin vitroの実験データから,この二つの耐性機構に,蛋白質をコードしないnon-coding RNAが関与している可能性を見出した.消化器癌において,薬剤耐性遺伝子の発現制御に関わるmicroRNA(miRNA)を定量的に解析し,薬剤耐性獲得機構との関連を検討する.【結果】(1)Paclitaxel耐性には特定のmiRNAよりもepigeneticな発現制御が強く関連していた.(2)ABCB1の耐性には4種類のmiRNAの発現異常が関連している可能性が示唆されたものいずれも有意にABCB1の発現を制御できなかった.(4)cytoplastic HDACの一種であるHDAC6の発現制御に転写因子NACC1が関与している可能性が示唆された.【意義・重要性】細胞質内に存在するHDAC6の作用は抗がん剤の感受性に深く関与しておりこの機構には核-細胞質シャトル蛋白質のNACC1が強く関与していることが明らかとなった.NACC1は重要ながん治療の標的分子である.
自己粘膜組み込み人工尿路の研究

1.アテロコラーゲンスポンジを用いた膀胱再建術の実験的検討:体重2kgの日本白色兎12羽を用いて、自己粘膜組み込み人工尿路の実験的検討を行った。まず膀胱頂部より採取した組織を粘膜と筋層に分けて細切し、それぞれを酵素処理してから別々にDMEM培地で培養した。3-5代の継代培養後自家細胞をglutar alde処理atelocollagensponge sheetに播種し、1-2週間培養後、このsponge sheetを用いて膀胱再建術を行った。対照として、非細胞播種群にもsponge sheetを用いて膀胱再建術を行った。両群間でcollagen sponge sheetの生着率に差はなかった。組織学的にも差はなかった。2.Atelocollagen-coated polyglycolicacid sheetを用いた兎膀胱再建術の実験的検討:体重約2kgの日本白色兎14羽を用いて、実験的膀胱壁補墳術をを行った。使用した人工材料は生体吸収材料であるpolyglycolic acid(PGA)不織布の表面にsponge化したatelocollagenを重層させたもの(C-PGA)ある。膀胱再建術の前に、第1群は自己血によるpreclottingを行い、第2群はI型collagenをC-PGA表面に塗布しincubateした。術後2-12週で屠殺し肉眼的・組織学的に観察すると、約7週間から筋層再生を認め、第1群は第2群と比較して、組織再生が良好であった。1.正常尿路粘膜上皮の培養:ヒトおよびウサギ正常膀胱移行上皮の初代培養は、コラ-ゲンゲル法を用いて行った。TypeIコラ-ゲン、DMEM培地および各種増殖因子を用いてヒトおよびウサギ正常膀胱粘膜からコラ-ゲンゲル上で移行上皮の初代培養および継代を行った。2.各種マトリックスによる人工尿路素材の作製:ウシTypeIコラ-ゲンによるスポンジを中心として、人工尿路素材を作製し使用した。初期には、アテロコラ-ゲンをスポンジ状に加工しさらに補強用にセグメント化ポリウレタン膜で裏打ちした素材を使用した。その後は、アテロコラ-ゲンスポンジをグルタ-ルアルデヒド処理した素材で補強して使用した。3.人工尿路素材を用いた尿路再建術:セグメント化ポリウレタン膜付きアテロコラ-ゲンスポンジを、吸収性ポリディアクサノン糸によりウサギ膀胱部分切除術後の膀胱拡大用に用いた。この系では、素材の強度は十分であり膀胱拡大は可能であったが、結局セグメント化ポリウレタン膜が吸収されず組織反応を起こして膀胱内に脱落した。また、ポリディアクサノン糸の強度が大きいためこれを核として結石が形成された。そこで、次にグルタ-ルアルデヒド処理した素材で補強したアテロコラ-ゲンスポンジと、クロミックカットグ-ト糸を用いた膀胱拡大術を行った。この系では素材は脱落せず全例膀胱拡大術が可能であった。この素材は長期間で吸収されるが、細胞誘導能は優れていた。4.自己細胞播種によるハイブリッド型人工尿路の基礎的検討:あらかじめ膀胱粘膜を培養してこれを吸収性素材上に播種し、膀胱拡大術をおこなった。この素材は脱落せず膀胱拡大術は成功したが、増殖した細胞が播種した細胞かどうかは検討中である。この方法の問題点は結石形成であり、新しい素材を検討中である。1.アテロコラーゲンスポンジを用いた膀胱再建術の実験的検討:体重約2kgの日本白色兎12羽を用いて、自己粘膜組み込み人工尿路の実験的検討を行った。3-5代の継代培養後自家細胞をglutar aloe処理atelocollagensponge sheetに播種し、1-2週間培養後、このsponge sheetを用いて膀胱再建術を行った。

組織学的にも差はなかった。体重約2kgの日本白色兎14羽を用いて、実験的膀胱壁補填術を行った。使用した人工材料は生体吸収材料であるpolyglycolic acid(PGA)不織布の表面にsponge化したatelocollagenを重層させたもの(C-PGA)である。膀胱再建術の前に、第1群は自己血によるpreclottingを行い、第2群はI型collagenをC-PGA表面に塗布しincubateした。術後2-12週で屠殺し肉眼的・組織学的に観察すると、約7週から筋層再生を認め、第1群は第2群と比較して、組織再生が良好であった。
インスリン水溶液における液液相分離曲線と液滴および結晶のゼータ電位の決定

タンパク質の機能を理解するには、タンパク質分子の精密な3次元構造を知ることが重要である。そのためには良質の単結晶を必要とするが、多くのタンパク質では良質な単結晶が得られず、研究遂行上のボトルネックとなっている。本研究では、タンパク質結晶の良質な単結晶を得るための研究の一貫として、インスリンの結晶形態制御および濃厚な液滴を経由して結晶が形成される現象についての基礎研究を行い、これまで報告されていなかった幾つかの新たな知見を得たタンパク質の機能を理解するには、タンパク質分子の精密な3次元構造を知ることが重要である。本研究では、タンパク質結晶の良質な単結晶を得るための研究の一貫として、インスリンの結晶形態制御および濃厚な液滴を経由して結晶が形成される現象についての基礎研究を行い、これまで報告されていなかった幾つかの新たな知見を得た生体内での蛋白質の機能を理解するには、蛋白質分子の精密な3次元構造を知ることが重要である。そのためには良質の単結晶を必要とするが、多くのタンパク質において良質な単結晶が得られず、研究遂行上のボトルネックとなっている。そのような中で、近年、蛋白質の結晶成長に関連して、蛋白質溶液が液液相分離を起こすと、タンパク質濃度の高い液滴相が溶液中で形成され、その液滴中で結晶核の形成が素早く開始されるという、液滴経由のタンパク質結晶核生成機構のモデル(Two Step Nucleation Model)が提唱され、液滴をうまく利用すれば、溶液全体の過飽和度をあげることなくタンパク質の均一結晶核形成速度を大きくできることが予測された。結晶核形成の駆動力は過飽和度によって決まるので、低過飽和度の溶液中での核形成速度は小さくなるが、一般に成長する結晶は良質となる。従って、液滴をうまく利用すれば、低過飽和度の溶液中でも効率的に良質の単結晶を育成できる可能性が指摘されている。本研究課題は、研究代表者が先に発見したインスリンにおける液滴形成および液滴経由の結晶成長に関して、特になぜ液滴が酸性溶液中でのみ形成されるのか、またなぜ液滴内部ではなく液滴表面に結晶核形成が起るのかという問題を理解する上で重要かつ基本的な物性である、1)溶解度曲線および液液相分離曲線の決定(温度依存性およびpH依存性)、2)液滴および結晶のゼータ電位のpH依存性の決定を試みるものである。平成18年度には、電気泳動装置の調整を行った後、まずインスリン結晶のゼータ電位のpH依存性および粒径依存性を調査した。その結果、インスリン分子の等電点である約pH5.5を境に、インスリン微粒子も低pH側では正に、高pH側では負に帯電しているが、ゼータ電位の変化は低pH側で小さいことがわかった。また、リゾチーム微粒子ではないとされているゼータ電位の粒径依存性が、インスリン結晶にはあることを明らかにした。蛋白質の機能を理解するには、蛋白質分子の精密な3次元構造を知ることが重要である。そのような中で、近年、蛋白質溶液が液液相分離を起こすと、タンパク質濃度の高い液滴相が溶液中で形成され、液滴中で結晶核の形成が素早く開始されるという「液滴経由のタンパク質結晶核生成機構モデル(Two Step Nucleation Model)」が提唱され、液滴をうまく利用すれば、溶液全体の過飽和度をあげることなくタンパク質の均一結晶核形成速度を大きくできると予測された。核形成の駆動力は過飽和度によって決まるので、低過飽和度の溶液中での核形成速度は小さくなるが、一般に結晶は良質となる。従って、液滴をうまく利用すれば、低過飽和度の溶液中で効率的に良質の単結晶を育成できる可能性がある。本研究は、代表者が先に発見したインスリンにおける液滴形成および液滴経由の結晶成長に関して、特になぜ液滴が酸性溶液中でのみ形成されるのか、またなぜ液滴内部ではなく液滴表面に結晶核形成が起るのかという問題を理解する上で重要かつ基本的な物性である、1)溶解度曲線および液液相分離曲線の決定(温度依存性およびpH依存性)、2)液滴および結晶のゼータ電位のpH依存性の決定を試みるものである。H19年度は、電気泳動装置の調整後、安定した液滴が得られるpH4のインスリン溶液を中心に、1)インスリン結晶および液滴のゼータ電位測定、2)バルク溶液相および液滴層の粘度測定、3)濃度対屈折率の検量線の作成、4)バルク相および液滴相の濃度測定を、いくつかの低温の溶液に対して試みた。これまでのところ、特に液滴の濃度測定値にばらつきがあるため、発表するには至っていないが、いくつかのデータは精度よく取得することができた。近年、蛋白質溶液が液液相分離を起こすと、蛋白質濃度の高い液滴相が溶液中で形成され、液滴中で結晶核の形成が素早く開始されるという「液滴経由のタンパク質結晶核生成機構モデル(Two Step Nucleation Model)」が提唱され、液滴をうまく利用すれば、溶液全体の過飽和度をあげることなくタンパク質の均一結晶核形成速度を大きくできると期待された。

核形成の駆動力は過飽和度によって決まるので、低過飽和度の溶液中での核形成速度は小さくなるが、一般に結晶は良質となる。従って、液滴をうまく利用すれば、低過飽和度の溶液中で効率的に良質の単結晶を育成できる可能性がある。本研究は、代表者が先に発見したインスリンにおける液滴形成および液滴経由の結晶成長を理解する上で重要かつ基本的な物性である、1)溶解度曲線および液液相分離曲線の決定(温度依存性およびpH依存性)、2)液滴および結晶のゼータ電位のpH依存性の決定を試みるものである。H20年度も前年度に引き続き液液分離曲線の決定とゼータ電位のpH依存性の決定を試みた。その結果、インスリン結晶のゼータ電位に特異なpH依存性を確立することができた。しかし、液滴に関する測定データはいずれもばらつきが大きく、今後の課題となった。
イネの一年生/多年生に関連するチロシン代謝系遺伝子の機能解析

Glutathione S-transferase(GST)は、生体内の多様な過酸化物質の解毒に関与する一群の酵素であるが、その中のzeta型のGST(GSTZ)は、他のGSTとは異なり、チロシン代謝経路の中間産物である毒性物質ホモゲンチジン酸の解毒に関与しているMAAIであることが報告されている。一年生/多年生の大きな違いは、老化組織からの窒素の転流であると考えられているが、多年生植物では、老化組織におけるチロシン代謝物の解毒に関与ずるMAAI活性が維持されると考えられる。本研究で、アジア栽培イネ(Oryza sa ti va)のGSTZ遺伝子の構造を解析したところ、2個の681Z遺伝子(GSTZ1,GSTZ2)がタンデムに連結して存在することを明らかにした。そこで、多年生のアジア栽培イネ(O. sativa)および一年生のアフリカ栽培イネ(O. glaberrima)のGSTZ遺伝子の構造を比較したところ、O. glaberrimaにおいては、GSTZ1遺伝子を含む1Mbに渡る大きなDNA断片が欠損していることを見いだした。この欠失は、O. glaberrimaの祖先型野生種とされるO. barthiiにおいても認められた。一方、アジア栽培イネの祖先型野生種には、多年生の傾向が強いO. rufipogonaおよび一年生のO. nivaraが知られているが、O. nivaraにおいてO. glaberrimaと同じGSTZ1遺伝子の欠損は認められなかった。しかしながら、両種の間でGSTZ遺伝子周辺のゲノム構造に差異があることを示唆する結果を得ている。他に、様々な植物種における類縁関係を調査して、一年生/多年生等の生態型分化との関連があるかどうかを調査した。また、本研究を遂行するために効率の良いゲノム歩行法(Right Walk)を開発した。平成15年度に本研究に関する以下の研究を実施した。イネのGSTZ遺伝子のプロモーターの機能解析1)イネの2つのGSTZ遺伝子を含む大きなゲノムDNA断片(約7.0kb)を単離し構造遺伝子部分をGUSおよびGEPレポーター遺伝子にそれぞれ置換したプラスミドを構築した。今後、パーティクルガンによる遺伝子導入法を用いて2つのGSTZ遺伝子プロモーターの機能を解析する予定である。2)GSTZ1およびGSTZ2遺伝子のエキソン配列、イントロン配列及び3'非翻訳配列にもプロモーター活性に関与する塩基配列がないか解析するためのプラスミドの構築している。各種ストレス応答したイネのGSTZ1およびGSTZ2遺伝子発現の解析1)各種ストレスに応答したイネのGSTZ1およびGSTZ2遺伝子発現をLightCycler用いた定量PCR法により測定した。(論文投稿)2)この手法を用いて一年生/多年生野生イネ及び日本型/インド型イネの間で、GSTZ1及びGSTZ2遺伝子の発現量・比の差異を解析し、一年生/多年生との関連を解析中である。イネのGSTZタンパク質の機能解析1)イネのGSTZ1およびGSTZ2遺伝子を大腸菌に導入し、融合タンパク質を産生させることに成功した。今後、このタンパク質を精製し、MAAI酵素活性を測定する予定である。2)イネ(O. sativa)と近縁なアフリカの栽培イネ(O. glaberrima)では、GSTZ2遺伝子は正常に機能しているが、GSTZ1遺伝子は破壊されていること独自に開発したグノムウォーキング法を用い明らかにした。(論文投稿)今後、両種の生理特性を比較することにより、GSTZ1遺伝子の機能を解析する予定である。平成16年度に本研究に関する以下の研究を実施した。イネのGSTZ

遺伝子のプロモーターの機能解析イネの2つのGSTZ (zeta type glutathione S-taransferase)遺伝子は、短い介在配列をはさんでタンデムに並んで存在している。この2つのGSTZ遺伝子がどのような転写制御を受けているのか解析するために、それぞれの遺伝子の5'上流配列を単離してホタルおよびウミホタルのルシフェラーゼ遺伝子に連結したコンストラクトを作製した。この2つのプラスミドをパーティクルガン法を用いてイネの懸濁培養細胞に導入し、ルシフェラーゼの酵素活性を測定したところ、2つのコンストラクトで同定度の遺伝子発現誘導活性を持つことが明らかになった。私達の以前の研究によりGSTZ1遺伝子は、GSTZ2遺伝子よりも30倍量のmRNAを発現することが明らかになっているので、この結果は、2つのGSTZ遺伝子の5'上流配列には最少プロモーター活性を保持しているものの組織特異性およびストレス誘導性に関与する転写調節領域が遺伝子の内部あるいは遠く離れた領域に位置していることを示唆している。今後、2つのGSTZ遺伝子の転写調節領域を明らかにする予定である。一年生/多年生のイネにおけるGSTZ遺伝子の発現解析アジアの多年生栽培イネ(O.sativa)と近縁なアフリカの一年生栽培イネ(O.glaberrima)では、GSTZ2遺伝子は正常に機能しているが、GSTZ1遺伝子は破壊されていること独自に開発したゲノムウォーキング法を用いて明らかにした。そこで、一年生/多年生野生イネおよび日本型/インド型イネの間で、GSTZ1およびGSTZ2遺伝子の発現量を定量PCRを用いて解析を進めており、一年生/多年生との関連を調査する予定である。また、GSTZ1遺伝子を欠損しているアフリカ栽培イネにアジアイネのGSTZ1遺伝子を導入した形質転換イネの作出も試みている。Glutathione S-transferase(GST)は、生体内の多様な過酸化物質の解毒に関与する一群の酵素であるが、その中のzeta型のGST(GSTZ)は、他のGSTとは異なり、チロシン代謝経路の中間産物である毒性物質ホモゲンチジン酸の解毒に関与しているMAAIであることが報告されている。一年生/多年生の大きな違いは、老化組織からの窒素の転流であると考えられているが、多年生植物では、老化組織におけるチロシン代謝物の解毒に関与するMAAI活性が維持されると考えられる。本研究で、アジア栽培イネ(Oryza sativa)のGSTZ遺伝子の構造を解析したところ、2個のGSTZ遺伝子(GSTZ1,GSTZ2)がタンデムに連結して存在することを明らかにした。そこで、多年生のアジア栽培イネ(O.sativa)および一年生のアフリカ栽培イネ(O.glaberrima)のGSTZ遺伝子の構造を比較したところ、O.glaberrimaにおいては、GSTZ1遺伝子を含む1Mbに渡る大きなDNA断片が欠損していることを見いだした。この欠失は、O.glaberrimaの祖先型野生種とされるO.barthiiにおいても認められた。
力学系の解析と関連する幾何学

本研究によって得られた主な成果について,研究計画に対応させながら以下に述べる.1.ハミルトン力学系に関連する研究:伊藤はハミルトン系の可積分性の定義を一般のベクトル場に対して拡張し,解析的ベクトル場の非共鳴な楕円型特異点の近傍での可積分性とベクトル場の収束する標準化変換の存在が同値なことを証明した.これはポアンカレの渦心問題に対して解答を与えるものにもなっている.2.エルゴード理論に関する研究:盛田は散乱型の2次元ビリヤード問題に付随したゼータ関数の研究を行い,適当な条件下においてゼータ関数を複素平面上の領域に有理型関数に拡張することに成功した.3.力学系の分岐理論に関する研究:国府はConleyindex理論をslow-fast系と呼ばれる特異摂動的ベクトル場に対して拡張することをめざして,遅い変数が1次元の場合にtransition matrixを拡張し,それを用いて周期軌道やヘテロクリニック軌道の存在を検証する一般的な方法を得た.4.変分法に関する研究:田中は変分法によって特異ハミルトン系の以下のような解を構成した:(1)無限遠から来て無限遠に飛び去る軌道,(2)-1/r^2の摂動のクラスでの周期解,(3)系のポテンシャルが二つの特異点をもつ場合での非有界でカオス的な軌道.5.シンプレクティック幾何・接触幾何に関する研究:小野がハミルトン系の整数係数のFloer homologyを構成することに成功した.また中居は,1階偏微分方程式を葉層構造・Web幾何の立場から研究し,有限型の一階非線形偏微分方程式に対してアフィン接続を定義し,それの解全体が葉層構造として退化する点集合に沿っての特異性を様々な場合に調べた.本研究によって得られた主な成果について,研究計画に対応させながら以下に述べる.1.ハミルトン力学系に関連する研究:伊藤はハミルトン系の可積分性の定義を一般のベクトル場に対して拡張し,解析的ベクトル場の非共鳴な楕円型特異点の近傍での可積分性とベクトル場の収束する標準化変換の存在が同値なことを証明した.これはポアンカレの渦心問題に対して解答を与えるものにもなっている.2.エルゴード理論に関する研究:盛田は散乱型の2次元ビリヤード問題に付随したゼータ関数の研究を行い,適当な条件下においてゼータ関数を複素平面上の領域に有理型関数に拡張することに成功した.3.力学系の分岐理論に関する研究:国府はConleyindex理論をslow-fast系と呼ばれる特異摂動的ベクトル場に対して拡張することをめざして,遅い変数が1次元の場合にtransition matrixを拡張し,それを用いて周期軌道やヘテロクリニック軌道の存在を検証する一般的な方法を得た.4.変分法に関する研究:田中は変分法によって特異ハミルトン系の以下のような解を構成した:(1)無限遠から来て無限遠に飛び去る軌道,(2)-1/r^2の摂動のクラスでの周期解,(3)系のポテンシャルが二つの特異点をもつ場合での非有界でカオス的な軌道.5.シンプレクティック幾何・接触幾何に関する研究:小野がハミルトン系の整数係数のFloer homologyを構成することに成功した.また中居は,1階偏微分方程式を葉層構造・Web幾何の立場から研究し,有限型の一階非線形偏微分方程式に対してアフィン接続を定義し,それの解全体が葉層構造として退化する点集合に沿っての特異性を様々な場合に調べた.今年度の研究によって得られた成果の主なものを以下に述べる。1.ハミルトン系の問題として,田中は特異ハミルトン系について研究した.とくに,無限遠からきて無限遠に遠ざかる解の構成,および-1/r^2の摂動のクラスに対するエネルギー曲面上の周期解を変分法的好考察によって構成することに成功した.2.エルゴード理論に関して,盛田は散乱型の2次元ビリヤード問題に付随したゼータ関数の研究を行い,適当な条件下においてゼータ関数が複素平面上の領域に有理型関数に拡張することに成功した.3.力学系の分岐理論に関しては,國府がConley Indexと呼ばれる力学系の孤立不変集合に対する位相的不変量の研究を行った.とくに,特異摂動的ベクトル場に対して,Conley Indexの理論を拡張する試みとして,transition matrixをその目的に沿った形に改良した.また,slow-fast systemと呼ばれる特異摂動的ベクトル場に対するConley Index理論の構築の第一歩として,周期軌道やconnecting orbitの存在条件を位相的・代数的なものとして捉えることに成功した.4.シンプレクティック幾何に関連する研究としては,小野が複素曲面の単純特異点のlinkの接触構造に対して,それを凸な境界としてもつコンパクトシンプレクティック多様体の位相に対する制約を論じ,とくにE_8型特異点のlinkの場合,極小型のものはE_8型のカルタン行列であって,標準束は自明であることを示した.今年度の研究によって得られた成果の主なものを以下に述べる.1.ハミルトン系に関連して,伊藤は一般の力学系の可積分性を第一積分の存在と可換なベクトル場の存在の観点から研究し,ベクトル場の非共鳴な楕円型特異点における標準化の収束性と可積分性の同値性を示した.これはPoincareの渦心問題に対する解答を与えるものである.2.複素力学系に関して,志賀は有理写像の正則族を考え,それがあるパラメータ空間上で有限個しかない条件を考察するとともに,そのような族がpunctureのまわりでどのような振る舞いをするかを決定した.

3.エルゴード理論に関して,盛田は日食が生じないように配置された,平面内の3個以上の狭義凸領域の外部領域における撞球力学系のゼータ関数について,実部がある負の数より大きくなる半平面での有理接続可能性を示した.また,その力学系ゼータ関数の原点での特殊値を決定し,それが障害物の個数をあたえる不変量であることを確かめた.5.変分法の研究として,田中は平面上で二つの特異点をもつポテンシャル関数によって定義されるハミルトン系に対して,変分法的手法によって非有界でカオス的な軌道の存在を示した.6.シンプレクティック幾何に関連して,小野が周期的ハミルトン系について,倉西構造や多価摂動の構成を見直すことによって,そのZ-係数のFloer homologyを構成することに成功した.
日本型のテリングの基盤となる卵子提供で家族形成した夫婦の実情

所属機関の研究倫理審査委員会の承認を得て研究を開始した。研究参加者の確保が課題となる研究だが、30年度内に4名の協力を得てインタビューを実施した。インタビュー内容は逐語録にしてナラティブ研究法をもとに分析途中だが、多様性を尊重する日本社会の変化の中、ドナー卵子で家族形成することについては、近代家族のあり方に縛られることなく新たな価値観で家族をつくり、親子関係を築いている様子が語られた。ドナー卵子で母親になることに加え、ドナー卵子で父親になることにも着目していくことが当事者家族の理解につながると考えている。研究倫理審査委員会への計画書提出がやや遅れたため、それに伴い本年度の計画の進捗もやや遅れた。アンケート調査項目は検討を終えたが、実施方法としてWEBサイトにするか、紙面のみとするか、併用とするか検討中である。ドナー卵子で家族形成した当事者へのインタビュー調査は、年度当初の予定よりも進んでいる。本年度は研究ホームページを立ち上げ、引き続き研究参加者の確保に努めるとともに、研究への参加を申し出た方にインタビューを実施する。並行して分析も進めて年度内に学会発表をおこなう。アンケート調査については、年度内に実施し、回収・分析まで進めることとする。インタビュー調査の旅費として予算計上していたが、遠方で宿泊を伴う調査がなかったため執行額が少なく、次年度使用額が生じることとなった。
切削過程のin-situ観察による工具-被削材界面の摩擦現象の理解と応用

切削工具のすくい面と被削材切りくず間の摩擦は,切りくず生成,工具寿命,仕上げ面性状に直接的な影響を及ぼす極めて重要な要素である一方で,すくい面における摩擦力の値やその分布は,切削加工現象における不確定な要素として残された大きな課題となっている.そこで,本研究では,粒子画像流速計測法(PIV)を援用した切削加工現象のin-situ観察を行うことによって,工具-切りくず界面における摩擦現象の解明を行うことを目的としている.本年度は,二次元切削加工の高速度カメラ撮影を可能とする実験装置を構築し,得られたデータをPIV解析することによって,切りくず流れ,ひずみ,ひずみ速度分布を可視化する手法を確立した.そして,工具-切りくず界面のような苛酷な摩擦環境・材料変形挙動を模擬することを目的に,くさび状圧子による押し込み試験を実施した.その結果,摩擦応力による材料の変形挙動は,流体力学で議論される境界層に類似性があることに着目し,(1)材料がBingham塑性体としてふるまうと仮定した場合,理論解と実験値がよく一致すること,(2)インデンター-材料間の摩擦状態の違いによって,材料の変形挙動が大きく変化すること,(3)摩擦状態の違いに起因する材料の変形挙動は,Bingham塑性体モデル内の粘性項の値によって表現できること,などを明らかにした.本年度は,本実験の遂行において不可欠となる,高速度カメラによる撮影システム,および,PIV法による解析手法を確立することができた.さらに,摩擦による材料変形挙動と境界層との類似性に着目する,という大きな指針を獲得することができ,今後の飛躍的な発展・展開が期待できる状況にある.以上の理由から,本研究課題はおおむね順調に進展していると考えている.今後は,以下の点に着目した研究を遂行する予定である.(1)界面の摩擦がインデンター-材料間の滑り量に及ぼす影響の評価,(2)滑り量を考慮した,材料変形特性の評価,(3)材料変形挙動・特性からの摩擦特性を示すパラメータの抽出,(4)工具-切りくず界面における摩擦特性評価への展開,(5)インデンター試験装置を用いた塑性加工における潤滑性評価手法の確立切削工具のすくい面と被削材切りくず間の摩擦は,切りくず生成,工具寿命,仕上げ面性状に直接的な影響を及ぼす極めて重要な要素である一方で,すくい面における摩擦力の値やその分布は,切削加工現象における不確定な要素として残された大きな課題となっている.そこで,本研究では,粒子画像流速計測法(PIV)を援用した切削加工現象のin-situ観察を行うことによって,工具-切りくず界面における摩擦現象の解明を行うことを目的としている.本年度は,二次元切削加工の高速度カメラ撮影を可能とする実験装置を構築し,得られたデータをPIV解析することによって,切りくず流れ,ひずみ,ひずみ速度分布を可視化する手法を確立した.そして,工具-切りくず界面のような苛酷な摩擦環境・材料変形挙動を模擬することを目的に,くさび状圧子による押し込み試験を実施した.その結果,摩擦応力による材料の変形挙動は,流体力学で議論される境界層に類似性があることに着目し,(1)材料がBingham塑性体としてふるまうと仮定した場合,理論解と実験値がよく一致すること,(2)インデンター-材料間の摩擦状態の違いによって,材料の変形挙動が大きく変化すること,(3)摩擦状態の違いに起因する材料の変形挙動は,Bingham塑性体モデル内の粘性項の値によって表現できること,などを明らかにした.本年度は,本実験の遂行において不可欠となる,高速度カメラによる撮影システム,および,PIV法による解析手法を確立することができた.さらに,摩擦による材料変形挙動と境界層との類似性に着目する,という大きな指針を獲得することができ,今後の飛躍的な発展・展開が期待できる状況にある.以上の理由から,本研究課題はおおむね順調に進展していると考えている.今後は,以下の点に着目した研究を遂行する予定である.(1)界面の摩擦がインデンター-材料間の滑り量に及ぼす影響の評価,(2)滑り量を考慮した,材料変形特性の評価,(3)材料変形挙動・特性からの摩擦特性を示すパラメータの抽出,(4)工具-切りくず界面における摩擦特性評価への展開,(5)インデンター試験装置を用いた塑性加工における潤滑性評価手法の確立