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慢性カドミウム暴露による貧血における腎性機序の関与についての実験的研究

ウィスターラットに塩化カドミウムを皮下注射で6ヵ月ならびに9ヵ月間にわたって投与し、おのおのの時点で末梢血、24時間尿、腎臓、等を採取し、慢性カドミウム中毒による貧血と腎臓障害との関連を調べた。その結果は以下のとおりである。・6ヵ月目、9ヵ月目ともに著明な貧血が観察された。・著明な貧血があるにも関わらず、末梢血中のエリスロポエチンの増加は見られなかった。・血漿鉄のレベルは低下し、総鉄結合能は上昇していた。・尿量の増加、尿中への低分子蛋白やアミノ酸の排泄の増加等、腎臓尿細管障害を示す所見が得られた。・9ヵ月目のラットの腎臓病理標本では尿細管の萎縮、変性、尿細管腔の拡大等が観察された。・腎におけるエスロポエテンmRNAの発現は、6ヵ月目のラットでは対照とはほぼ同じレベルにとどまっており。さらに9ヵ月目のラットではむしろその発現は低下していた。以上の結果より、慢性カドミウム中毒で引き起こされる貧血には、鉄欠乏性貧血に加えて、腎臓障害による腎でのエリスロポエチンの発現の低下が重要な働きをしていることが明らかになった。現在のところ、これらの結果はすでに論文にまとめ、雑誌に投稿中である。
ケーシーエヌキュー1によるインスリン分泌調節とその分子機構の解明

ラット単離β細胞を用いた検討により、KCNQ1阻害薬が高グルコース下のインスリン分泌を有意に増加させること、GLP-1分泌細胞(NCI-H716)を用いた検討によりKCNQ1阻害剤がbethanecol刺激時のGLP-1分泌を増加させること明らかにした。さらに、正常対照者においてKCNQ1の危険対立遺伝子はインスリン分泌の指標(HOMA-β)と負の相関を示し、2型糖尿病患者においてKCNQ1を含む2型糖尿病感受性遺伝子座の危険対立遺伝子の総和が高値であるとインスリン治療が必要となる頻度が有意に高くなっていることを明らかにした。本研究は当研究室で同定した新規2型糖尿病感受性遺伝子KCNQ1の2型糖尿病発症に関わる分子機構の解明を目的とする。本年度はまず膵β細胞でのKCNQ1の機能を知るためにラット単離膵ラ氏島およびβ細胞を用いた検討を行った。ラット膵ラ氏島におけるKCNQ1およびβサブユニットの発現をreverse transcription PCRとウェスタンブロット法で解析した。単離膵ラ氏島ではKCNQ1の発現はmRNA、タンパクともに認められた。またβサブユニットはKCNE2の発現が確認できた。次にKCNQ1阻害剤(chromnol 293B)がインスリン分泌に及ぼす効果を検討した。ラット単離β細胞をchromanol 293B 100μMで1時間前処理し高グルコース(16.71mM)、Tolbutamide(300μM、高KCL (30 mM)存在下でのインスリン分泌をvehicle処理の細胞(コントロール)と比較検討した。Chromanol 293B処理細胞では低グルコース条件下(2.8mMではコントロールとインスリン分泌に差を認めなかったが、高グルコースおよびtolbutamide存在下のインスリン分泌はコントロールに比し増加を認めた(高グルコース386.0士74.5 vs.608.8±100.9,p<0.05、tolbutamide 465.3±65.5 vs.627.6±85.9 p<0.1)。KCIによるインスリン分泌には差は認めなかった。次にKCNQ1がGLP-1分泌に及ぼす効果を検討するためにGLP-1分泌細胞(NCI-H716細胞を用いて検討した。NCI-H716細胞ではKCNQIおよびKCNEI-5の発現が確認できた。Chromanol293B(100μm処理細胞ではmeathydrolysateおよびbethaneco1刺激時のGLP-1分泌がコントロール細胞に比し増加が認められた。IonomycineによるGLP-1分泌には差は認められなかった。以上よりKCNQIはインスリンおよびGLP-1分泌調節に関与する事が示唆された。KCNQ1過剰発現細胞ではインスリン分泌への効果が明らかでなかった事よりトランスジェニックマウスの作成は中止し次年度以降はさらに単離膵β細胞およびGLP-1分泌細胞での検討を引き続き行なう。現在までの検討により、1)単離膵ラ氏島においてKCNQ1およびβサブユニットのKCNE2発現がmRNA、タンパクレベルで認められること、2)KCNQ1阻害剤(chromanol 293B)がラット単離β細胞において低グルコース条件下(2.8mM)、高KCL(30mM)存在下でのインスリン分泌には影響を及ぼさないが、高グルコースおよびtolbutamide存在下のインスリン分泌を有意に増加させること、3)KCNQ1およびKCNE1-5の発現がGLP-1分泌細胞(NCI-H716)においても認められること、4)KCNQ1阻害剤(chromanol 293B)がGLP-1分泌細胞(NCI-H716)においてmeat hydrolysateおよびbethanecol刺激時のGLP-1分泌を増加させることなどを明らかにした。そこで、本年度は、KCNQ1がインスリン分泌やGLP-1分泌に及ぼす分子機構を知る目的でKCNQ1阻害剤(chromanol 293B)の細胞内カルシウム濃度に及ぼす影響を検討した。Chromanol 293B(100μM)処理ラット単離膵β細胞では無処理の細胞に比し、tolbutamide添加時の細胞内カルシウム濃度上昇が有意に増加した。GLP-1分泌細胞(NCI-H716)においてもChromanol 293B(100μM)処理によりbethanecol添加時の細胞内カルシウム濃度上昇は、無処理の細胞に比し有意に高くなっていた。またKCNQ1阻害剤(chromanol 293B)は細胞内cAMP濃度の変化には影響を及ぼさなかった。以上よりKCNQ1はインスリンおよびGLP-1分泌を細胞内カルシウム濃度上昇を介して調節する事が示唆された。

次年度以降はさらに単離膵β細胞およびGLP-1分泌細胞での検討を引き続き行なうとともに、2型糖尿病患者あるいは対照者における遺伝子型とインスリン分泌能との関連を検討する。現在までの検討により、1)単離膵ラ氏島においてKCNQ1およびβサブユニットのKCNE2発現がmRNA、タンパクレベルで認められること、2)KCNQ1阻害剤(chromanol 293B)がラット単離β細胞において低グルコース条件下(2.8mM)、高KCL(30 mM)存在下でのインスリン分泌には影響を及ぼさないが、高グルコースおよびtolbutamide存在下のインスリン分泌を有意に増加させること、3)KCNQ1およびKCNE1-5の発現がGLP-1分泌細胞(NCI-H716)においても認められること、4)KCNQ1阻害剤(chromanol 293B)がGLP-1分泌細胞(NCI-H716)においてmeat hydrolysateおよびbethanecol刺激時のGLP-1分泌を増加させること5)Chromanol 293B (100μM)処理ラット単離膵β細胞では無処理の細胞に比し、tolbutamide添加時の細胞内カルシウム濃度上昇が有意に増加すること、6)GLP-1分泌細胞(NCI-H716)においてもChromanol 293B (100μM)処理によりbethanecol添加時の細胞内カルシウム濃度上昇は、無処理の細胞に比し有意に高くなっていること、7)KCNQ1阻害剤(chromanol 293B)は細胞内cAMP濃度の変化には影響を及ぼさないことを明らかにした。本年度は、さらに2型糖尿病患者あるいは対照者における遺伝子型とインスリン分泌能との関連を検討した。正常対照者においてKCNQ1の危険対立遺伝子はインスリン分泌の指標(HIMA-β)と負の相関を示した。また、2型糖尿病患者においてKCNQ1を含む11の2型糖尿病感受性遺伝子座の危険対立遺伝子の総和が高値であるとインスリン治療が必要となる頻度が有意に高くなっていた。本研究は新規2型糖尿病関連遺伝子KCNQ1がいかにして疾患感受性に関与するかを知ることを目的としている。現時点で、インスリンおよびGLP-1分泌調節にKCNQ1が関与すること、さらに細胞内カルシウム上昇に関与する分子機構に影響することなどを明らかにしており、目的の成果は得られていると考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。単離膵β細胞、GLP-1分泌細胞での検討を引き続き行う。また他の2型糖尿病感受性遺伝子についても同様の検討を行い、機序の違いを比較することでさらにKCNQ1の作用点を模索する。さらに、ヒトでの関連解析で2型糖尿病患者あるいは対照者における遺伝子型とインスリン分泌能との関連を検討し、ヒト2型糖尿病の病型の違いとKCNQ1の遺伝子型との関連を知ることでKCNQlの作用機構を推測する。
戦前・戦災復興都市計画にみる景観形成理念とその現代的意義の検証に関する研究

本年度の研究実績としては、戦前戦後の日本全国の主要都市における都市計画公園および風致地区指定の計画理念について、その計画理念と事業化の過程を把握するための資料調査を進めた。なかでも、戦災復興都市計画により河川沿い緑地が計画され、実現した7都市(前橋市、富山市、呉市、広島市、宇部市、鹿児島市、徳島市)を主たる研究対象として分析を進めた。その成果の一部については、「戦災復興都市計画における河川沿い緑地計画に関する研究」(三輪潤平,山口敬太,川﨑雅史,都市計画報告集No.17, pp.277-282, 2018年8月)として発表を行った。広島市においては河川沿い緑地の構想が種々の人々によって唱えられ、河川の美を生かすために計画されたが、これに対し呉市、宇部市、鹿児島市、徳島市においても「都市美」や「美観」、「観光」に寄与するねらいをもって河川沿い緑地計画されたことを明らかにした。また、人工河川沿いに公園道路が計画された前橋市と富山市においては、水辺を散歩道として確保して公園間をつなぐという構想の存在を明らかにした。また、大阪市については、戦後の緑化政策の一環としての緑道整備に着目し、その実態を把握した。その成果の一部については、「都市における緑道の計画・形成に関する歴史的考察」(黒島大樹,山口敬太,川﨑雅史,土木計画学研究・講演集No.57,CD-Rom,29-04, 8p,2018年6月)として発表を行った。戦災復興都市計画により河川沿い緑地が計画され、実現した7都市(前橋市、富山市、呉市、広島市、宇部市、鹿児島市、徳島市)については、資料調査と分析を進めることが出来たという点で、研究はおおむね順調に進んでいるといえる。2019年度は、日本における戦災復興都市計画における都市計画公園の計画理念について調査研究を進める。なかでも、河川沿に緑地以外にみる都市公園や風致計画の特徴について、計画理念と事業化の過程を把握するための資料調査を進める。なかでも京都市と大阪市、城崎町に関する資料を収集し分析を行った。その成果の一部については、「戦前の京都都市計画風致地区内における建築物等の行為許可の実態について」景観・デザイン研究講演集No.13(pp. 261-267, 2017年12月)において発表を行った。本年度は研究計画通り,日本における都市計画黎明期の都市計画公園および風致地区指定の計画理念と事業化の過程を把握するため、全国の主要都市を対象に資料調査を進めた。平成30年度は、日本における戦災復興都市計画における都市計画公園の計画理念について調査研究を進める。なかでも、河川沿に緑地帯を設けた主要な都市を対象に、その計画理念と事業化の過程を把握するため、資料調査を進める。本年度は、関西地方の資料調査を優先し、一部の東京での国立公文書館や国会図書館での資料調査は次年度に持ち越したため、旅費に未使用額が生じた。

これについては平成30年度で使用する予定である。物品費についても同様であり、一部平成30年度に持ち越した。2018年度に行う予定であった調査や成果報告(学会発表、論文発表)の一部が2019年度以降にずれ込んだため。
左右大脳半球間の情報処理に働く論理機構のニュ-ロンレベルでの解析

大脳の働きを理解する為には,素子としての大脳皮質ニュ-ロンの機能を十分に知る必要がある。又,大脳皮質ニュ-ロンは二つに大別できる。一つは,大脳と大脳以外を結ぶもので,主に投射ニュ-ロンで代表される。もう一つは,大脳皮質間の情報の受持に関するもので,連合性ニュ-ロンと交連線ニュ-ロンが含くまれる。ところが,皮質一皮質間ニュ-ロンについては,投射ニュ-ロンに比べてあまり研究が進んでいない。そこで,交連性ニュ-ロンを皮質一皮質間ニュ-ロンのモデルと考えて,その生理学的機能を明らかにして行くことを目的とした。この際,交連性ニュ-ロンである事の同定を逆行性スパイクの有無により判定する必要がある。この為,脳梁に刺激針を挿入し電気刺激を行わなければならない。そこでまず,大脳皮質のどの部位が脳梁の何処を通って対側に線維を送っているかを決める必要が生じたので,WGAーHRPを注入した。70匹のネコでの詳細な結果は班長(津本忠治阪大教授)に提出したので,それに譲る。今回は3a野及び2v野の結果についてだけ述べる。3a野からの通過線維は脳梁膝の直後の部位に認められた。2v野からの通過線維は脳梁前端から約1/3の部位に認められた。これを参考に刺激針を刺入し,2v野からニュ-ロン活動を記録し,前庭神経の電気刺激と脳梁刺激に対する応答について検討を加えた。ネコ15匹から674個のニュ-ロンを記録し89個が脳梁刺激に順行性に応答した。逆行性には数個しか応答しなかった。89個のうち,前庭窓の刺激には8個が応じ,このうち1個のみが前庭膨大部神経の刺激に応じた。脳梁刺激に応じなかったニュ-ロンでは,52個が前庭窓の刺激に応じ,うち,5個が前庭膨大部神経刺激に応答した。以上の事から,2v野は脳梁を介して対側から信号を受け取るがその割合は約13%であった。この割合が他の部位ではどのようであるか将来,検討を続ける所存である。
ロジウム触媒を用いた置換アレンの立体選択的合成法の開発

アレン化合物は、軸性キラリティーなど興味深い特徴をもつ化合物群であり、有機合成化学の重要なビルディングブロックである。本研究の目的は、ロジウム触媒のβ-酸素脱離を鍵過程とする、置換アレンの立体選択的合成法を開発することである。我々は昨年度の研究により、ロジウム錯体存在下でアルキニルオキシランに有機ボロン酸を作用させてシン体のα-アレノールをジアステレオ選択的に得る反応において、これまで困難であった末端アルキンを有するアルキニルオキシランでも良好な収率でα-アレノールを得る反応条件を見出した。また、これらの知見を基盤にして、マダガスカル産センダン科植物(Cipadessa boiviniana)の樹皮から単離されたBoivinianin Bの全合成を達成した。また、この研究の過程で、生じたα-アレノールに対してアリールボロン酸が立体選択的に付加することを見いだした。そこで本年度は、この反応について詳細に検討を行った。その結果、触媒量の[Rh(OH)(cod)]2の存在下で、α-アレノールとして4-フェニルブタ-2,3-ジエン-1-オールを用い、小過剰のo-トリルボロン酸を作用させると、収率71%で(Z)-1-フェニル-2-トリルブタ-1,3-ジエン(スチルベン誘導体)が立体選択的に得られることを見出した(E/Z=<5/95)。パラジウム触媒を用いた同様のカップリング反応では(E)体が優先的に得られるのに対して、本反応は(Z)体が選択的に得られることを特微とする。また本反応は、様々なアリールボロン酸に適用可能であった。ついで、反応の基質一般性ついて検討したところ、(Z)体選択的に反応が進行するためには、α-アレノールの末端にアリール基が置換していることが必要であることがわかった。ロジウム触媒を用いた末端アルキンに対するアリールボロン酸の付加反応は、しばしば複雑な混合物を与える。そこで本研究では、エチニルオキシランとフェニルボロン酸からα-アレノールを合成する反応について反応条件について詳細に検討した。その結果、[Rh(OH)(cod)]2を触媒として用い、エチニルオキシランに対して1.1当量のフェニルボロン酸を0°Cで作用させると、対応するα-アレノールがシン選択的に好収率で生成することがわかった。鎖状のアルキニルオキシランの場合、トランス体のオキシランの方がシス体よりも高いジアステレオ選択性を示した。この傾向は内部アルキンをもつアルキニルオキシランでも見られた。シン体のα-アレノールが立体選択的に得られることは、アリールロジウム種がアルキン部位に付加して生成するアルケニルロジウム種において、オキシラン環の酸素がロジウムに強く配位して、シン選択的なβ-酸素脱離を誘導するためであると説明できる。トランス体の場合、より大きな立体障害のためにこの配位効果が弱められ、シス選択性が低下したものと解釈できる。次にテトラヒドロフラン骨格の2位と5位に不斉中心を有するセキステルペンであるBoivinianin Bを標的化合物として選び、ロジウム触媒を用いたα-アレノールの立体選択的合成法を応用してその全合成を試みた。その結果、2-ブチン-1-オールから出発して7段階を経て立体選択的に(±)-Boivinianin Bを合成することに初めて成功した。
新規多分岐ポリカーボネートを用いたリチウムイオン二次電池へ応用可能なSPEの創製

多分岐高分子と線状高分子を用いた固体高分子電解質の種々様々な物性値を評価した。線状高分子は、リビングアニオン重合により調整し、分子量並びに分子量分布の狭い高分子量体を得た。また、分子量の制御は容易であり、任意の分子量を持つ線状高分子を得ることが可能である。また、分岐度の異なる多分岐高分子の調整も可能であることを明らかとした。異なる分子量ならびに異なる分岐度を自在に制御可能であることを確認できている。調整した多分岐高分子並びに線状高分子へ過塩素酸リチウムを加えたところ、それぞれ異なる塩の溶解度を示した。具体的には、線状高分子では、ある濃度から明確に不溶の塩が析出していることが目視でも確認できるばかりか、融点測定により、室温より若干高い4050度付近に融点を持つことが明らかとなった。その一方で、多分岐高分子においても異常ともいえる高濃度であれば塩の析出並びに結晶化と思われる融解挙動が確認されたが、リチウム塩の溶解量は、線状高分子の3倍以上であり、かつ線状高分子から調整された固体電解質よりも著しく高いイオン電導度を示した。さらには、活性化エネルギーが低いことを明らかとしたことで、昨年度の報文(Polymer誌、2018年出版済)同様に多分岐高分子が線状高分子よりも低い活性化エネルギーを示すことを再度確認した。上記の通り、分岐構造の導入により高分子固体電解質として優れた性質を示すことを明らかとした。分岐構造の導入により高分子固体電解質として、明確な物性改善を確認するに至った。多分岐高分子は、線状高分子よりも明確に高いイオン電導度を示し、かつ塩の溶解量も多くなった。塩の溶解量の向上は、より高いイオン電導度を示すために有効である。また、熱物性の改善をも発現しており、ガラス転移温度の低下により、低温地域でも使用可能な電池開発への可能性が示された。また、熱分解温度も向上しており、自動車などの高温にさらされる充電池へも利用可能と考えられる。この通り、多分岐構造の導入が優れた高分子固体電解質の開発に有効であることを明らかとしつつある。末端官能基を種々様々に変換した高分子固体電解質を合成し、種々のリチウム塩との複合高分子電解質を調整する。調整した高分子電解質の種々の物性(DSCによるガラス転移温度、TGA測定による熱分解温度、力学物性の評価)を行う。本年度は、目的とする高分子電解質の原料となるモノマーの合成を行った。本研究では、種々の分子量および分岐度を有する多分岐ポリカーボネートを得るために環状モノマーである5-Methyl-5-(hydroxymethyl)-1,3-dioxolan-2-onの合成法を詳細に検討した。既報(K. D. Weilandt et al. Macromol. Chem. Phys. 197,3851-3868 (1996))に従って、ジメチルカーボネートとトリメチロールエタン、塩基性触媒としてナトリウムメトキシドを用いた。触媒量、温度、反応条件を詳細に検討したが、目的とする5-Methyl-5-(hydroxymethyl)-1,3-dioxolan-2-onは、5%程度でごく少量しか得られなかった。次にジエチルカーボネートとトリメチロールエタン、固体酸性触媒としてAmberlighを用いたところ22%の収率で目的とする5-(hydroxymethyl)-1,3-dioxolan-2-onを得た。得られた5-(hydroxymethyl)-1,3-dioxolan-2-onを用いて、無溶媒あるいは、種々の溶媒中で重合反応を行った。得られたジエチルエーテル不溶成分は、1H-NMR測定により主鎖にカーボネート基を、末端に水酸基を有する数平均分子量が1,000に満たないオリゴマーであった。化学構造の詳細な評価により、分岐度を見積もることは可能で有ることが明らかとなった。今後は分子量の向上を試みるために重合方法をさらに検討し、分子量が3,000程度以上となる重合条件を評価、見当する予定である。目的とする高分子電解質合成のためのモノマーの合成は、収率は低いものの行うことができた。しかしながら得られたモノマーの重合反応により得られる化合物の収率が非常に低いばかりでなくオリゴマー程度の分子量(数平均で1000程度)でしかないため、物性評価に至っていない。

その一方で、多分岐高分子においても異常ともいえる高濃度であれば塩の析出並びに結晶化と思われる融解挙動が確認されたが、リチウム塩の溶解量は、線状高分子の3倍以上であり、かつ線状高分子から調整された固体電解質よりも著しく高いイオン電導度を示した。さらには、活性化エネルギーが低いことを明らかとしたことで、昨年度の報文(Polymer誌、2018年出版済)同様に多分岐高分子が線状高分子よりも低い活性化エネルギーを示すことを再度確認した。上記の通り、分岐構造の導入により高分子固体電解質として優れた性質を示すことを明らかとした。分岐構造の導入により高分子固体電解質として、明確な物性改善を確認するに至った。多分岐高分子は、線状高分子よりも明確に高いイオン電導度を示し、かつ塩の溶解量も多くなった。塩の溶解量の向上は、より高いイオン電導度を示すために有効である。また、熱物性の改善をも発現しており、ガラス転移温度の低下により、低温地域でも使用可能な電池開発への可能性が示された。また、熱分解温度も向上しており、自動車などの高温にさらされる充電池へも利用可能と考えられる。この通り、多分岐構造の導入が優れた高分子固体電解質の開発に有効であることを明らかとしつつある。重合方法の詳細な検討を行う。目標とする分子量は、少なくともGPC(ポリスチレン換算)で3000以上の分子量を有するポリマーを得る。得られたポリマーの化学構造を評価する。特に分岐度の評価法は、平成29年度中に確立した方法で行う。重合条件により得られる多分岐高分子の分子量および分岐度を評価する予定である。末端官能基を種々様々に変換した高分子固体電解質を合成し、種々のリチウム塩との複合高分子電解質を調整する。調整した高分子電解質の種々の物性(DSCによるガラス転移温度、TGA測定による熱分解温度、力学物性の評価)を行う。当該研究における試料の分子量測定のためのゲルパーミエーションクロマトグラフィー(GPC)の不調により、研究の進捗において深刻ではないものの若干の消耗品費用の予定に遅れが出たため、当該予定よりも使用残額が発生した。実施予定であった、合成ならびに測定を次年度に実施するため、必要な薬品ガラス器具など消耗品を購入する予定である。
新規抗がん剤としてのリボヌクレアーゼの機能解析

ウシガエル卵由来シアル酸結合性レクチン(SBL)は、レクチン活性とリボヌクレアーゼ活性を併せ持ち、さらに抗腫瘍効果を示すことが明らかになっている。今回、SBLおよび他の抗腫瘍性リボヌクレアーゼを作製し、それらのレセプター様分子の探索を行った。さらに悪性中皮腫細胞に対する抗腫瘍効果について解析を行った。その結果、レセプター様分子候補としてアクチンが同定された.また、SBLは既存薬剤であるペメトレキセドなどと比較しより広範囲かつがん細胞選択的な抗腫瘍効果を示すことが明らかになり、さらにSBLとペメトレキセドの併用では相乗効果が得られ、SBLが新規抗がん剤になる可能性が示された.本年度は,(1)種々のRNaseリコンビナントタンパク質作製の効率化,(2) SBLおよび他のRNaseの抗腫瘍作用に関わるレセプター様分子の探索に焦点を当て研究を行った.(1)に関しては,SBLとONCのリコンビナント作製条件を最適化し,ともにペリプラズム移行シグナルを用いた発現系が適していること,またSBLは発現用大腸菌としてBL21 (DE3) pLysS株を利用し,培地画分から可溶性体を回収することが最も効率が良い一方で,ONCはBL21 (DE3)株を利用し,不溶性画分からdenature,refoldすることが最も効率が良いことを明らかにした.さらに,RNaseをラベルするためのCys変異体の作製も検討し,それぞれ同様の発現系が最適であることが分かった.カラム精製後の回収効率はSBLで1 mg / L (大腸菌培養) , ONCで10 mg / Lとなり,研究材料確保の観点から,SBL作製のさらなる効率化は今後の検討課題と考える.(2)に関しては,(1)で得られたSBL (Cys変異体), ONC (Cys変異体)をBiotinでラベルし,それらの細胞に対する結合をキャラクタリゼーションした.その結果それらの結合は,細胞のSialidase処理により減少する一方で,グリコシルセラミド合成酵素の阻害では影響を受けないことから,シアル酸を含む糖タンパク質がRNaseの殺細胞作用に関係する可能性が示唆された.さらに,ビオチンラベルトランスファー実験により,SBLおよびONCががん細胞表面に結合した際に,それらの近傍に存在するタンパク質の探索を行い.MS分析の結果からいくつかの候補分子の同定に成功した.さらに,次年度に予定した研究(悪性中皮腫に対する効果)にも着手した.本年度は研究目的(2) SBLおよび他のRNaseの抗腫瘍作用に関わるレセプター様分子の探索、および(3)アスベスト禍の問題で注目される悪性中皮腫細胞に対する抗腫瘍効果に焦点をあて研究を行った.(2)に関し,昨年度に引き続きビオチンラベルトランスファー実験によるSBLのレセプター様分子の探索を行った.MS分析の結果,アクチンがその標的分子として同定され,in vitroにおける結合実験においてもその結合を確認した.近年,細胞表面のアクチンは抗腫瘍性T2リボヌクレアーゼのレセプターとして報告され,新規のがん標的になる可能性が議論されており,アクチンがSBLの抗腫瘍性に関わる可能性が示唆された今回の結果は非常に興味深いものになった.今後これらの詳細な機構を精査する必要がある.(3)に関し,現在,悪性胸膜中皮腫に対する化学療法は限られており,本邦においてはペメトレキセド(Pem)とシスプラチン(Cis)の併用療法のみ適応が認められているが,奏功率の低さや耐性の出現が問題になっており,新規薬剤の開発が期待されている.今回,悪性胸膜中皮腫に対するSBLの抗腫瘍効果をPemおよびCisと比較し,また,SBLとそれらの薬剤との併用効果について検討した.その結果,SBLがPemやCisと比較してより広範囲およびがん細胞選択的な抗腫瘍効果を示すことが明らかになった.さらに,Combination indexを用いた相乗効果解析の結果から,SBLとPemを併用した場合相乗的な抗腫瘍効果が観察され,その相乗性は既存療法であるPemおよびCisの併用と同等以上であることが示された.これらのことから,SBLが新規の悪性中皮腫治療薬になる可能性が期待できる.現在in vivoにおけるSBLの有効性の検証を予定している.ウシガエル卵由来シアル酸結合性レクチン(SBL)は、レクチン活性とリボヌクレアーゼ活性を併せ持ち、さらに抗腫瘍効果を示すことが明らかになっている。その結果、レセプター様分子候補としてアクチンが同定された.また、SBLは既存薬剤であるペメトレキセドなどと比較しより広範囲かつがん細胞選択的な抗腫瘍効果を示すことが明らかになり、さらにSBLとペメトレキセドの併用では相乗効果が得られ、SBLが新規抗がん剤になる可能性が示された.本年度予定していた(1)種々のRNaseリコンビナントタンパク質作製の効率化,(2) SBLおよび他のRNaseの抗腫瘍作用に関わるレセプター様分子の探索,に関しては予定通りに進捗し,2種のRNase (SBLおよびONC)のリコンビナントタンパク質の作製・確保に成功し,それらを用い,それらRNaseのがん細胞に対する結合のキャラクタリゼーション,およびレセプター様分子のMS解析まで進むことができた.

さらに次年度に予定していた(3)アスベスト禍の問題で注目される悪性中皮腫細胞に対する抗腫瘍効果についても研究を始めており,SBLが悪性中皮腫に有効性を示すことを明らかにし,また,現在臨床で使用されるペメトレキセドとの併用効果,比較研究も進んでいる.さらに研究計画にあるSBL耐性細胞の樹立も進んでおり,そのキャラクタリゼーションが進んでいる.生物系薬学当初の計画に従い,以下の(1) (3)の研究を進行する.(1)種々のRNaseリコンビナントタンパク質作製の効率化に関しては,既に検討を終えたが,研究材料確保のため常にサンプル調製を進める.SBLに関しては収量が低いため,経済的に可能であれば,スケールアップが可能になるよう機材を用意する.(2) SBLおよび他のRNaseの抗腫瘍作用に関わるレセプター様分子の探索に関しては,概ね研究目的を達成しているが,得られた結果を確認するための研究(ELISAや蛍光顕微鏡による確認)を行い,論文発表に備える.(3)アスベスト禍の問題で注目される悪性中皮腫細胞に対する抗腫瘍効果に関しては,予定通り耐性細胞の作製に成功しているので,そのキャラクタリゼーションや耐性機序の検討を行う.また既に数種の悪性中皮腫細胞および正常中皮由来細胞に対するSBLとペメトレキセドとの併用効果,比較研究も進んでおり,SBLがペメトレキセドよりもががん細胞へ選択性が高い可能性など明らかにしているので,さらに詳細な検討を行う.当初の予定よりも研究の進捗が早かったため,大腸菌培養関連費,細胞培養関連費を節約することができた.研究実績の概要および今後の方策欄に記載したように,今後も研究材料確保が必要であり,大腸菌培養によるリコンビナントサンプル確保のための費用に当てる.
植物セラミドを用いた新規口腔乾燥治療法の開発と多軸的評価

表皮の細胞間脂質に存在するセラミドは,保湿やバリア機能に深く関与し,加齢やストレスで減少し,乾燥肌患者では著しく減少する事が報告されている.口腔乾燥患者の舌粘膜もこれと類似し,舌乳頭が委縮し保水しにくいため,舌粘膜の水分量が低下し,口腔乾燥感が悪化する.すなわ,舌粘膜におけるセラミドの減少と舌乳頭の委縮による保水効果の低下との関連性が強く推察できる.そこで,我々は,パイナップルセラミドの補給が,口腔乾燥症により委縮した舌乳頭を改善し,舌粘膜での保水効果を高めることで口腔乾燥感を改善するとの仮説を立てた.本研究の目的は,これまで申請者らが行った口腔乾燥ならびに保湿剤に関する一連の研究成果をもとに,植物セラミドを用いた新規口腔乾燥治療法を開発し,その有効性について多軸的に評価するものである.平成29年度は,測定方法の構築とセラミド錠の開発と評価を行った.測定は,口腔水分量に日内変動はないという報告を参考に,被験者への身体的負担を考慮し,全ての測定を同日に行うこととした.その結果,口腔乾燥感とQOL評価を行った後,口腔水分量の計測と舌乳頭の形状測定を行う方法を確立した.内服用試料については,シクロデキストリントローチを母体として検討を行い,食品として認可済みのパイナップルセラミドを含有したセラミド錠と含有しないプラセボ錠を作製した.また,セラミドの含有量,服用回数,服用期間について検討を行った.平成30年度は,口腔乾燥の自覚自覚症状を有する者16名を対象にセラミド錠とプラセボ錠との交差試験を行った.評価項目を,舌粘膜の水分量,口腔乾燥に関する自覚症状(VAS値)ならびに舌の茸状乳頭としてセラミド錠とプラセボ錠の服用前後での値を比較した.現在,結果を分析中である.口腔乾燥の自覚症状を有する被験者の確保に難航したため交差試験の開始が当初の計画より遅れたため.平成31年度は,引き続き,セラミド錠とプラセボ錠との交差試験の結果を分析し,成果発表を行う.また,セラミド錠で得られた量を参考にセラミドジェルの開発に着手する.市販保湿ジェルをベースにセラミドを含有したものの理工学的性状についての検討も行う.表皮の細胞間脂質に存在するセラミドは,保湿やバリア機能に深く関与し,加齢やストレスで減少し,乾燥肌患者では著しく減少する事が報告されている.口腔乾燥患者の舌粘膜もこれと類似し,舌乳頭が委縮し保水しにくいため,舌粘膜の水分量が低下し,口腔乾燥感が悪化する.すなわ,舌粘膜におけるセラミドの減少と舌乳頭の委縮による保水効果の低下との関連性が強く推察できる.そこで,我々は,パイナップルセラミドの補給が,口腔乾燥症により委縮した舌乳頭を改善し,舌粘膜での保水効果を高めることで口腔乾燥感を改善するとの仮説を立てた.本研究の目的は,これまで申請者らが行った口腔乾燥ならびに保湿剤に関する一連の研究成果をもとに,「植物セラミドを用いた新規口腔乾燥治療法を開発し,その有効性について多軸的に評価する」ものである.平成29年度は,測定方法の構築とセラミド錠の開発と評価を行った.測定は,口腔水分量に日内変動はないという報告を参考に,被験者への身体的負担を考慮して,全ての測定を同日に行うこととした.その結果,口腔乾燥感とQOL評価を行った後,口腔水分量の計測と舌乳頭の形状測定を行う方法を確立した.内服用試料については,シクロデキストリントローチを母体として検討を行い,食品として認可済みのパイナップルセラミドを含有したセラミド錠と含有しないプラセボ錠を作製した.また,セラミドの含有量,服用回数,服用期間について検討を行った.現在,口腔乾燥の自覚自覚症状を有する患者を対象にセラミド錠とプラセボ錠との交差試験を行っている.口腔乾燥の自覚症状を有する被験者の確保に難航しているため交差試験がやや遅れている.表皮の細胞間脂質に存在するセラミドは,保湿やバリア機能に深く関与し,加齢やストレスで減少し,乾燥肌患者では著しく減少する事が報告されている.口腔乾燥患者の舌粘膜もこれと類似し,舌乳頭が委縮し保水しにくいため,舌粘膜の水分量が低下し,口腔乾燥感が悪化する.すなわ,舌粘膜におけるセラミドの減少と舌乳頭の委縮による保水効果の低下との関連性が強く推察できる.そこで,我々は,パイナップルセラミドの補給が,口腔乾燥症により委縮した舌乳頭を改善し,舌粘膜での保水効果を高めることで口腔乾燥感を改善するとの仮説を立てた.本研究の目的は,これまで申請者らが行った口腔乾燥ならびに保湿剤に関する一連の研究成果をもとに,植物セラミドを用いた新規口腔乾燥治療法を開発し,その有効性について多軸的に評価するものである.平成29年度は,測定方法の構築とセラミド錠の開発と評価を行った.測定は,口腔水分量に日内変動はないという報告を参考に,被験者への身体的負担を考慮し,全ての測定を同日に行うこととした.その結果,口腔乾燥感とQOL評価を行った後,口腔水分量の計測と舌乳頭の形状測定を行う方法を確立した.内服用試料については,シクロデキストリントローチを母体として検討を行い,食品として認可済みのパイナップルセラミドを含有したセラミド錠と含有しないプラセボ錠を作製した.また,セラミドの含有量,服用回数,服用期間について検討を行った.

平成30年度は,口腔乾燥の自覚自覚症状を有する者16名を対象にセラミド錠とプラセボ錠との交差試験を行った.評価項目を,舌粘膜の水分量,口腔乾燥に関する自覚症状(VAS値)ならびに舌の茸状乳頭としてセラミド錠とプラセボ錠の服用前後での値を比較した.現在,結果を分析中である.口腔乾燥の自覚症状を有する被験者の確保に難航したため交差試験の開始が当初の計画より遅れたため.平成30年度は,引き続き,口腔乾燥の自覚症状を有する患者を対象にセラミド錠とプラセボ錠との交差試験を行う.また,セラミド錠で得られた量を参考にセラミドジェルの開発に着手する.市販保湿ジェルをベースにセラミドを含有したものの理工学的性状についての検討も行う.平成31年度は,引き続き,セラミド錠とプラセボ錠との交差試験の結果を分析し,成果発表を行う.また,セラミド錠で得られた量を参考にセラミドジェルの開発に着手する.市販保湿ジェルをベースにセラミドを含有したものの理工学的性状についての検討も行う.物品の一部の購入と調査研究旅費について,研究計画の変更により次年度に執行予定となったため.研究計画の変更に従い,平成30年度に購入予定であった物品と調査研究旅費を平成31年度に行う.
インドの教育および開発政策の分析-理論と実証-

本年度はインド研究の前準備として、人的資本(教育)と経済成長の関係を、クロスカントリーデータを用いて農業・非農業別に分析した。下半期は上記を踏まえ、実際に分析を行った。計量分析の手法は、Dynamic Panel Dataなどに由来する内生性に対処するためSystem-GMMを用いることとした。計量分析の結果、人的資本が技術進歩率に与える効果は農業部門のほうが小さいこと、そしてこれを裏付けるかのように、労働やGDPで測った農業シェアの高さは人的資本の蓄積に負の影響を与えることがわかった。次にこれら計量分析結果に基づき二地域動学的CGEモデルを作成し、シミュレーション分析を行った。その結果、農業教育・農業技術開発の促進などによって農業部門における人的資本の効果を高めることは、自国だけでなく外国にも大きな利益をもたらすことがわかり、途上国に対する農業技術支援の重要性を示唆した。また計量分析からは、技術水準の収束性も農業のほうが小さいことがわかった。これは経済全体の収束スピードが部門構成によって変わりうることを示唆するが、シミュレーション分析の結果、その違いは微小なものであることがわかった。
妊娠高血圧-免疫ネットワークの接点と病態成立機構の解明

近年の急速な少子化の進展は,平均寿命の伸長による高齢者の増加と相まって,我が国の人口構造にひずみを生じさせ,21世紀の国民生活に深刻かつ多大な影響をもたらしています.これは,単に"子供を産むための社会的な環境不備"だけでなく,『出産に伴う様々な危険因子』を回避できないことにも大きく起因しています.その危険因子の代表格である妊娠中毒症は,高血圧を中心病態として,全身各臓器に多様な病変をきたします.一方,胎児は免疫学的には一種の移植片であるため,母胎相互の免疫制御の破綻が妊娠中毒症を引き起こすとも考えられています.どちらも,重症化によって母子双方に流産を含めた重篤な合併症を伴いますが,その成因については確定されていません.申請者らは,酸性プロテアーゼであるヒトレニン(hRN)とその基質でありアンジオテンシンIIの前駆体・ヒトアンジオテンシオーゲン(hANG)に関する発生工学的研究を行い,♂hRN導入(-Tg)マウスと交配させた♀hANG-Tgマウスにおいて,妊娠期間特異的に高血圧が誘発されることを世界で初めて発見いたしました.この時に,タンパク尿の排泄,腎臓疾患,胎盤浮腫および求心性心肥大等の臓器障害や痙攣発作を伴う"妊娠中毒症"に類似した症状が見出されました.そこで本研究は,明確な遺伝的バックグラウンドを持ち,妊娠高血圧が100%発症する申請者らが開発したモデル動物を用い,血圧調節系と免疫系の接点を解明することを目的といたしました.本年度は,妊娠高血圧マウスの胎児発育遅延が,アンジオテンシンII受容体拮抗薬で劇的に改善されることを明らかにしました.今後は,新規7回膜貫通型受容体とアンジオテンシンII受容体の遺伝的拮抗作用を解析していく予定です近年の急速な少子化の進展は,平均寿命の伸長による高齢者の増加と相まって,我が国の人口構造にひずみを生じさせ,21世紀の国民生活に深刻かつ多大な影響をもたらしています.これは,単に"子供を産むための社会的な環境不備"だけでなく,『出産に伴う様々な危険因子』を回避できないことにも大きく起因しています.その危険因子の代表格である妊娠中毒症は,高血圧を中心病態として,全身各臓器に多様な病変をきたします.一方,胎児は免疫学的には一種の移植片であるため,母胎相互の免疫制御の破綻が妊娠中毒症を引き起こすとも考えられています.どちらも,重症化によって母子双方に流産を含めた重篤な合併症を伴いますが,その成因については確定されていません.申請者らは,酸性プロテアーゼであるヒトレニン(hRN)とその基質でありアンジオテンシンIIの前駆体・ヒトアンジオテンシオーゲン(hANG)に関する発生工学的研究を行い,♂hRN導入(-Tg)マウスと交配させた♀hANG-Tgマウスにおいて,妊娠期間特異的に高血圧が誘発されることを世界で初めて発見いたしました.この時に,タンパク尿の排泄,腎臓疾患,胎盤浮腫および求心性心肥大等の臓器障害や痙攣発作を伴う"妊娠中毒症"に類似した症状が見出されました.そこで本研究は,明確な遺伝的バックグラウンドを持ち,妊娠高血圧が100%発症する申請者らが開発したモデル動物を用い,血圧調節系と免疫系の接点を解明することを目的といたしました.本年度は,妊娠高血圧マウスの脾臓の赤脾髄に有核細胞の浸潤が顕著に観察されることを明らかにしました.今後は,脾臓での組織変化の実体を解析していく予定です.近年の急速な少子化の進展は,平均寿命の伸長による高齢者の増加と相まって,我が国の人口構造にひずみを生じさせ,21世紀の国民生活に深刻かつ多大な影響をもたらしています.これは,単に"子供を産むための社会的な環境不備"だけでなく,『出産に伴う様々な危険因子』を回避できないことにも大きく起因しています.その危険因子の代表格である妊娠中毒症は,高血圧を中心病態として,全身各臓器に多様な病変をきたします.一方,胎児は免疫学的には一種の移植片であるため,母胎相互の免疫制御の破綻が妊娠中毒症を引き起こすとも考えられています.どちらも,重症化によって母子双方に流産を含めた重篤な合併症を伴いますが,その成因については確定されていません.申請者らは,酸性プロテアーゼであるヒトレニン(hRN)とその基質でありアンジオテンシンIIの前駆体・ヒトアンジオテンシオーゲン(hANG)に関する発生工学的研究を行い,♂hRN導入(-Tg)マウスと交配させた♀hANG-Tgマウスにおいて,妊娠期間特異的に高血圧が誘発されることを世界で初めて発見いたしました.この時に,タンパク尿の排泄,腎臓疾患,胎盤浮腫および求心性心肥大等の臓器障害や痙攣発作を伴う"妊娠中毒症"に類似した症状が見出されました.そこで本研究は,明確な遺伝的バックグラウンドを持ち,妊娠高血圧が100%発症する申請者ら開発したモデル動物を用い,血圧調節系と免疫系の接点を解明することを目的といたしました.本年度は,妊娠高血圧マウスから生まれる新生児の発育遅延が,アンジオテンシンII受容体を介していることを遺伝的に明らかにしました.今後は,アンジオテンシンII受容体を介する薬理学的効果を解析していく予定です近年の急速な少子化の進展は,平均寿命の伸長による高齢者の増加と相まって,我が国の人口構造にひずみを生じさせ,21世紀の国民生活に深刻かつ多大な影響をもたらしています.

これは,単に"子供を産むための社会的な環境不備"だけでなく,『出産に伴う様々な危険因子』を回避できないことにも大きく起因しています.その危険因子の代表格である妊娠中毒症は,高血圧を中心病態として,全身各臓器に多様な病変をきたします.一方,胎児は免疫学的には一種の移植片であるため,母胎相互の免疫制御の破綻が妊娠中毒症を引き起こすとも考えられています.どちらも,重症化によって母子双方に流産を含めた重篤な合併症を伴いますが,その成因については確定されていません.申請者らは,酸性プロテアーゼであるヒトレニン(hRN)とその基質でありアンジオテンシンIIの前駆体・ヒトアンジオテンシオーゲン(hANG)に関する発生工学的研究を行い,♂hRN導入(-Tg)マウスと交配させた♀hANG-Tgマウスにおいて,妊娠期間特異的に高血圧が誘発されることを世界で初めて発見いたしました.この時に,タンパク尿の排泄,腎臓疾患,胎盤浮腫および求心性心肥大等の臓器障害や痙攣発作を伴う"妊娠中毒症"に類似した症状が見出されました.そこで本研究は,明確な遺伝的バックグラウンドを持ち,妊娠高血圧が100%発症する申請者らが開発したモデル動物を用い,血圧調節系と免疫系の接点を解明することを目的といたしました.本年度は,妊娠高血圧マウスの胎児発育遅延が,アンジオテンシンII受容体拮抗薬で劇的に改善されることを明らかにしました.今後は,新規7回膜貫通型受容体とアンジオテンシンII受容体の遺伝的拮抗作用を解析していく予定です
転写モジュレーターによる乳癌内分泌療法の効果増強に関する研究

乳癌臨床例において、NCoR1高発現例は内分泌療法に反応しやすく、AIB1高発現例は内分泌療法の効果が明らかでなかった。培養細胞系では転写モジュレーターと内分泌療法の関連は明らかにすることはできなかった。FISH法にて判定したERα遺伝子の増幅が、臨床例の約20%に認められ、増幅例はER蛋白発現と強い相関があり、内分泌療法の効果と関連があった。この増幅の有無によりホルモン依存性をさらに正確に予測できる。乳癌は代表的なホルモン依存性腫瘍であり、様々な内分泌療法が行われている。乳癌組織内ではAIB1(SRC3)、HDAC1、HDAC6、NcoR1などの転写共役因子の発現がホルモン依存性増殖と関連がある。我々はこれら転写共役因子やそれらの阻害剤を含めた"転写モジュレーター"が内分泌療法の効果増強あるいは耐性の克服として重要であると着目し、それらの相乗効果について研究を進めている。1、乳癌組織における転写共役因子の発現:ホルモン療法の効果が判明している乳癌臨床例において初回手術癌細胞における転写共役因子の発現をRT-PCRあるいは免疫染色法にて半定量化し、これらの臨床的重要性について検討した。2、NCoR1についてはヒト乳癌組織を使用し、mRNAおよび蛋白レベルでの発現を検討し、抗エストロゲン剤の反応性が高い症例ではNCoR1の発現が高いことを証明した。しかしながら、同じような転写共役因子であるAIB1では逆に高発現例で抗エストロゲン剤の効果が明らかでないことを明らかとした。同様に、HDAC6、HDCA1が重要であることが判明した。3、乳癌培養細胞(MCF-7、T47D、MBA-MB231)の転写共役因子の発現を様々な培養条件で検討している。現在HDAC阻害剤の作用における増殖抑制増強効果について検討している。現在、in vitroでの細胞調整を終え、薬剤投与の段階であるが、ホルモンレセプターを保持しながら、エストロゲン依存性を消失した株を調整中である。また、現在in vivoでの研究を進めるために、ヌードマウスに乳癌細胞株を生着させている。我々はこれら転写共役因子やそれらの阻害剤を含めた“転写モジュレーター"が内分泌療法の効果増強あるいは耐性の克服として重要であると着目し、それらの相乗効果について研究を進めている。1.乳癌組織における転写共役因子の発現:ホルモン療法の効果が判明している乳癌臨床例において初回手術癌細胞における転写共役因子の発現をRT-PCRあるいは免疫染色法にて半定量化し、これらの臨床的重要性について検討した。NCoR1についてはヒト乳癌組織を使用し、mRNAおよび蛋白レベルでの発現を検討し、抗エストロゲン剤の反応性が高い症例ではNCoR1の発現が高いことを証明した。2.非浸潤性乳管癌における浸潤へのマーカーとESR1遺伝子、ATBF1A遺伝子の関与:上記実験系の副産物として、非浸潤性乳管癌が浸潤する過程でsurvivinのようなanti-apoptosisの関与や、ESR1遺伝子の増幅が関与することが判明した。また、新しい乳癌の癌抑制遺伝子であるATBF1の機能喪失には遺伝子変異よりもメチレーションやヘテロ接合性の消失の関与が考えられ、今後の新しいマーカーとなる可能性が得られた。
フラビウイルス性脳炎の病態形成におけるタンパク質品質管理機構の関与についての解析

申請者のこれまでの研究から、神経細胞の機能や生存に必須なプロテアソームやオートファジーなどのタンパク質品質管理機構が、神経向性フラビウイルスの増殖に利用され、破綻する可能性が示されている。本研究の目的は、フラビウイルス性脳炎の病態形成機構におけるタンパク質品質管理機構の重要性を明らかにすることである。神経向性フラビウイルスであるウエストナイルウイルス(WNV)が感染した神経細胞では、タンパク質品質管理機構が破綻した際に認められる変性タンパク質の蓄積が認められる。WNVのゲノムにコードされている10個のウイルスタンパク質をそれぞれに細胞に発現させた結果、Capsid(C)タンパク質が変性タンパク質の蓄積を誘導することが明らかになり、さらに蓄積に重要なアミノ酸も同定された。WNV感染細胞ではプロテアソームには影響がないが、オートファジーが阻害されることが明らかになり、この阻害はCタンパク質に変異を導入したWNVでは認められなかった。これらの結果から、Cタンパク質がオートファジーを抑制することが示唆され、オートファジー誘導因子との結合を解析した結果、最上流のAMPKがCタンパク質と結合し、分解されることが明らかになった。また、Cタンパク質に変異を導入したWNVを病態モデルであるマウスに接種した結果、死亡率が野生型に比較して有意に低下した。これらの結果から、Cタンパク質とAMPKの結合によるオートファジーの抑制がWNV感染の病態形成機序の一因となることが明らかになった。当該年度の研究計画では、神経向性フラビウイルスのウイルス粒子の形成、出芽、放出過程に影響を受けるタンパク質品質管理機構の特定、影響するウイルス因子および、宿主因子を明らかにする予定であった。これらの解析により、上述の過程とは異なるが、Cタンパク質の細胞内発現によりタンパク質品質管理機構であるオートファジーを抑制されることが明らかになった。さらにCタンパク質はオートファジー誘導因子の1つであるAMPKと結合し、ユビキチン・プロテアソーム系によってAMPKを分解させることも明らかにしている。これらの結果を基に、AMPKとの結合領域に変異を持つWNVを作出し、マウスを用いて病原性解析を実施した結果、変異ウイルスの病原性が低下することも明らかとなった。現在、AMPKのウイルス感染に与える影響やCタンパク質とAMPKの結合領域の特定を実施しており、AMPKの結合領域を細胞に発現させるとウイルス感染による細胞死が抑制されることが明らかになってきた。今後、WNV感染におけるAMPKの機能について詳細に解析し、WNV感染による脳炎の治療について検討していく予定である。また、Cタンパク質と結合する宿主因子を質量分析法により網羅的に解析し、AMPKの分解や、その他に変性タンパク質の蓄積につながる結合タンパク質について、ユビキチン・プロテアソーム分解系に関連するタンパク質を中心に検討している。本年度はCタンパク質とAMPKの結合に着目し、結合の阻害によるウイルスの増殖や細胞の機能に与える影響について詳細に検討する。さらに、AMPKの結合領域を可能な限り短い領域で特定し、結合領域のペプチドがフラビウイルス性脳炎に対する治療効果および、細胞や生体にもたらすに影響について検討する。また、解析中のCタンパク質と結合する宿主タンパク質から、ユビキチン・プロテアソーム分解系に関連するタンパク質を抽出し、Cタンパク質との相互作用や、ウイルス増殖への影響ならびに病原性との関連について遺伝子改変技術を用いて解析する。さらに、これらのタンパク質複合体は変性タンパク質の蓄積誘導に関連しており、超遠心機を用いて分離可能であることが報告されている。候補が多数で絞り込みが困難な場合を想定して、WNV感染細胞またはCタンパク質発現細胞を超遠心機により分離、精製後、再び質量分析法により解析を実施する。

これらの結果を基に、AMPKとの結合領域に変異を持つWNVを作出し、マウスを用いて病原性解析を実施した結果、変異ウイルスの病原性が低下することも明らかとなった。現在、AMPKのウイルス感染に与える影響やCタンパク質とAMPKの結合領域の特定を実施しており、AMPKの結合領域を細胞に発現させるとウイルス感染による細胞死が抑制されることが明らかになってきた。今後、WNV感染におけるAMPKの機能について詳細に解析し、WNV感染による脳炎の治療について検討していく予定である。また、Cタンパク質と結合する宿主因子を質量分析法により網羅的に解析し、AMPKの分解や、その他に変性タンパク質の蓄積につながる結合タンパク質について、ユビキチン・プロテアソーム分解系に関連するタンパク質を中心に検討している。本年度はCタンパク質とAMPKの結合に着目し、結合の阻害によるウイルスの増殖や細胞の機能に与える影響について詳細に検討する。さらに、AMPKの結合領域を可能な限り短い領域で特定し、結合領域のペプチドがフラビウイルス性脳炎に対する治療効果および、細胞や生体にもたらすに影響について検討する。また、解析中のCタンパク質と結合する宿主タンパク質から、ユビキチン・プロテアソーム分解系に関連するタンパク質を抽出し、Cタンパク質との相互作用や、ウイルス増殖への影響ならびに病原性との関連について遺伝子改変技術を用いて解析する。さらに、これらのタンパク質複合体は変性タンパク質の蓄積誘導に関連しており、超遠心機を用いて分離可能であることが報告されている。候補が多数で絞り込みが困難な場合を想定して、WNV感染細胞またはCタンパク質発現細胞を超遠心機により分離、精製後、再び質量分析法により解析を実施する。(理由)研究計画の進行の都合により、平成30年度に実施する予定の実験を次年度に持ち越したため、次年度使用額が生じた。(使用計画)研究を申請時の計画に従い実施し、平成30年度の研究計画の結果生じた使用額については、次年度研究費と合わせ、必要な試薬、消耗品費として使用する。また、研究成果を報告できる場合、国内学会参加の旅費として使用する。
3次元図形の骨格抽出及び構造記述に関する研究

本研究では以下の事柄について研究を行った。(1)骨格化手法の開発ユークリッド距離、濃度値、等、今まで3次元画像からの骨格化/細線化ではあまり利用されなかった情報を利用した骨格化/細線化手法を開発した。(2)実画像への適用と評価このようにして得られた方法を、CT装置から得られた胸部3次元ディジタル画像から抽出した肺血管図形,肺気管支図形に対して適用し、従来の手法に比べて、線図形抽出手順として有用であることを示した。(3)構造記述方法の開発骨格化の結果得られた線図形,面図形を利用して、3次元図形の概形・構造を表現するための手法として重み付グラフ表現を利用し、これを気管支図形に適用することで、気管支のモデルとの対応づけを行った。(4)人体ナビゲーションへの応用得られた構造記述の結果を人体内部の表示システムに適用し、肺の気管支での構造情報とモデルとの対応づけにより、気管支の各部分とそれに対応する気管支名をナビッゲーションシステムで利用可能にするための基礎的な実験を行った。