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『論語義疏』古抄本の研究

現存する『論語義疏』抄本の所在を調査した結果、35種の抄本が確認できた(この他、48種のどうしても行方が判らない抄本がある)。所在の判明した35種の抄本を用いて、定本と校勘記を作成中である。(その成果の一部は発表済み)また、それらの抄本の中でも最も詳細に訓点が施され、筆写者や来歴経緯がはっきりしている「大槻本」の翻刻訓読を試みて、文明十九(1487)年当時の訓読の様態を明らかにしつつある。(その成果の一部も発表済み)さらに、「大槻本」その他の抄本に附される訓点や注記を参考にして、『論語義疏訳注』を作成予定である。パリのフランス国立図書館に唐代に書かれた『論語義疏』が所蔵される。これを実見して、いままで不明確であった敦煌本の実態を明らかにし得た(詳細は後日発表予定)。本年度は『論語義疏』抄本35種のいわゆる親子関係、兄弟関係を明らかにするため、諸抄本の問の文字の異同を調査するとともに、根本刊本・武内校本がどのくらい文字を改めているかをも考究した。その一先ずの結果を10月8日、日本中国学会第58回大会において「『論語義疏』をめぐる諸問題」と題して発表した。その内容を述べれば、文明本・清熙園本・足利本・京大本・(重文本・東大本)は近い関係にあり、大槻本・延徳本・青淵本・上原本・(応永本・江戸本・新井本)は別のグループを形成し、宝勝院本・蓬左本はさらにまた別系統であろうと推定されること。また、根本刊本は意をもって文字を改めたり、削除したりしていること、武内校本は誤植がかなり多く見られ、定本としては不安が残ることなどを実例をあげて示した。その後、35種のほか、さらに2種の抄本の存在が判明した。一つは萩市立萩図書館に所蔵される十巻五冊本。これは江戸後期の写本で萩明倫館第六代学頭繁澤豊城の玄孫寅之助が明治43年に寄贈したものである。もう一つは、足利学校遺跡図書館所蔵の第四巻のみの一冊本。これは明治期に足利本を模写したものである。後者は模写本であるから除き、前者の萩図書館本を加え、合計36種の抄本で何晏集解序疏の校勘記を作成して文字の異同を調べた。実際には何晏集解序疏を欠く10種を除いた26種の抄本を用いたのであるが、比較材料として根本刊本・武内校本を加えてある。この結果、盈進斎本・国会図書本・江風本・泊園書院本が一まとまりにくくれそうであり、市島本と萩図書館本に関連性が見られることが判明した。本年度の研究実績を、年度当初に提出した研究実施計画に沿って述べる。1)台湾故宮博物院所蔵本(七種)の後半三分の二の紙焼きを、台湾故宮博物院図書文献館及びフィルムを有する慶応大学附属研究所斯道文庫の許可を得て作成し、研究が終わるまで斯道文庫から貸与されている。また東洋文庫所蔵本(二種)の後半三分の二の紙焼きを作成した。2)昨年度に引き続き35種の抄本と敦煌本とを校勘に用い、武内本の補訂作業を進めているが、『論語義疏』そのものが長編であり、また校勘に用いる抄本の数が多いため、成果の公表にはな時間を要する。3)現在所在不明の抄本には、桃華斎本・有不為斎本・皎亭本があるが、いずれも、競売に附されてからの行き方がわからないままである。また新た京都の東福寺即宗院に文之玄昌の筆になる『論語義疏』巻四と巻五とがあったことが判明し、現地に赴いて調査したが、残念ながら昭和13年の展観以後の消息は知れなかった。4)35種の抄本の系統を調べる作業も2)に関連して行なっている途中である。5)文明十九年写の大槻本の訓読を忠実に復元する作業も鋭意進行中であり、平成20年度には皇侃自序、何安集解叙疏をはじめとして順次公刊する予定である。2007年4月に中国から『儒蔵』本の『論語義疏』が出版された。これは日本に数多くある抄本を全く無視して作られたものである。

そこで本年度末、後漢経学研究会の場をかりて、『儒蔵』本の持つ問題点を指摘し、その使用に当たっては十分注意すべきことを喚起した。1、パリのフランス国立図書館に所蔵される敦煌本『論語義疏』について。2008年12月23日から2009年1月2日まで、現地に赴いて実物を調査する機会を得た。日本人で敦煌本『論語義疏』の実物を手にとって精査した人は皆無に近い。この写本は学而、為政、八〓、里仁の一部であり、全篇が揃っているわけではないが、罫線が引かれた中に書かれ、書名を示す朱引きのほか、科段を示す鉤や円形の符号、破読字点などが朱筆で書き入れられていて、東洋文庫に所蔵されるモノクロの写真では確認できなかった様々なことが判明した。詳細については、後日発表する予定である。2、所在の判明した35種の写本を用いて武内本、儒蔵本の校勘を行うことについて。現在、鋭意進めている最中であり、一篇ずつ公表する予定である。また、35種のうち最も詳細に訓点が附されている「大槻本」について、その訓点に基づいて訓読したものを順次発表することにし、現在「皇侃自序」「何晏集解序」の部を公刊した。3、未だ所在不明の写本の捜索について。新たに吉田氏文淵閣蔵本(室町中期以前写本)が存在することを長澤規矩也氏の著書から知り、現在も古書店として営業している吉田氏浅倉屋まで出かけたが、残念ながら戦前の記録はすべて戦災で焼いてしまったとのことで、詳細は不明であった。
多発性硬化症に対する糖脂質免疫調節療法の開発

研究代表者らは、NKT細胞の新たな糖脂質リガンドであるOCHによって、多発性硬化症の動物モデル実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)が治療できることを示している。本プロジェクトでは、OCHによるEAE治療の分子メカニズムの解析と、OCHのヒトNKT細胞に対する活性の研究を平行して進めた。初年度は、OCHのスフィンゴシン鎖またはアシル化脂肪鎖のどちらかを短くしたアナログを10種類合成し、マウスNKT細胞に対する活性を比較する実験を開始した。また、健常者末梢血単核細胞のsingle cell sortingによってNKT細胞クローンを複数樹立することに成功し、OCHおよびそのひな形リガンドであるアルファ・ガラクトシルセラミド(alpha-GC)に対する反応性を比較した。本年度は、特にヒトNKT細胞クローンの解析に進展が見られた。樹立されたNKT細胞クローンは、CD4陰性のクローンと、CD4陽性のクローンに分類された。CD4陰性のクローンはalpha-GCに対して強い増殖反応を示し大量のサイトカインを産生したが、OCHに対してはまったく反応しなかった。一方、CD4陽性のクローンはalpha-GCとOCHの両者に反応した。興味深いことに、OCH刺激ではCD4陽性NKT細胞によるIL-5やIL-10の産生がalpha-GC刺激による場合に比べて相対的に高まった。この結果は、OCHがマウスだけでなくヒトにおいてもTh2偏倚を誘導できることを意味し、多発性硬化症の治療薬として検討に値することを支持する。前年度までNKT細胞を刺激する糖脂質リガンドの中から、多発性硬化症の動物モデルEAEを抑制する活性を持つ合成リガンドの開発に取組んで来た。当研究グループが発見した糖脂質OCHはNKT細胞に選択的IL-4産生を誘導し、よってEAEの治療効果を誘導する。一方NKT細胞の雛形リガンドであるアルファ・ガラクトシルセラミド(αGC)はIL-4とインターフェロンガンマ産生を誘導するために、治療効果を発揮できない。本年度はOCHがαGCと異なる活性と示す原因を分子レベルで解析した。その結果、αGCに比べてOCHではCD1dへの結合時間が不十分であり、その結果NKT細胞に短時間のシグナルしか入らず、それがIL-4の選択的な誘導につながることがわかった。以上の結果は、糖脂質のCD1d結合に関与する脂肪鎖がOCHでは短いことに起因すると考えられた。

今後OCHよりもEAE治療効果の優れた物質の探索に役立てられる情報である。さらに、ヒト末梢血からNKT細胞クローンを複数樹立して、それからの糖脂質に対する反応性を解析した。健常者から樹立したCD4陽性NKT細胞クローンでは、CD4陰性クローンに比べてサイトカイン産生能が優れ、OCHに反応して、より効率的にTh2型のサイトカインを産生することが示された。OCHの臨床応用の可能性を支持する結果と考えられる。
葉内コンダクタンス測定のための減圧パルス-クロロフィル蛍光計測法の開発

本研究では、明期条件下において光合成を行っている葉の周辺空気を瞬間的に減圧(減圧処理)し、これに対するクロロフィル蛍光強度の応答を解析することで光合成機能の定量評価を試みた。具体的には、内容積100mlの透明アクリル製チャンバに葉を圧着固定し、青色LED光源からの光照射により励起されたクロロフィル蛍光をCCDカメラで撮像(13fps)した。光合成速度、蒸散速度、チャンバ内気圧も同時に記録した。減圧パルス(0.3秒以内に101.3kPaから50.7kPaに減圧、その後10秒間49kPa以下を維持)は、三方向電磁弁によりチャンバ内を密閉した直後に逆止弁付きの気体採取器を用いてチャンバ内空気を手動で引き抜くことでこれを行った。クロロフィル蛍光強度は、減圧パルス開始とほぼ同時に上昇し、約3秒後に最大となり、その後次第に低下した。なお、減圧処理後のクロロフィル蛍光強度の上昇幅を"Peak height"と定義した。この間、熱放散経路は活性化されておらず、また、減圧パルス前後で光合成速度と蒸散速度に変化は認められなかった。明期条件下にて二酸化炭素濃度を変化させながら、減圧パルス-クロロフィル蛍光計測を行った結果、光合成速度とPeak heightの間に強い相関があることが分かった。この結果は、減圧パルス-クロロフィル蛍光計測法により光合成速度を簡便に測定できる可能性を示唆していた。なお、当初、本計測法により内部コンダクタンス計測を試みたが、減圧処理への蛍光強度の応答速度が0.05秒以下であったため、内部コンダクタンスの測定は困難であると結論付けた。光合成の基質であるCO2は,大気中から気孔を通って葉内に取り込まれた後,葉緑体のストロマに輸送され,カルビン・ベンソン回路の働きにより固定される。本研究では,葉内におけるCO2輸送において重要な役割を果たしている葉内コンダクタンス(=1/葉内抵抗)を簡便かっリアルタイムに計測するための「減圧パルス-クロロフィル蛍光計測法」を開発することを目的としている。クロロフィル(Ch1)蛍光は,光合成の主色素であるCh1aから発せられる光であり,これを正確に計測することにより光合成反応系の状態を非破壊かつ非接触でモニタリングできる。本研究では,このCh1蛍光計測技術と生物環境工学的なチャンバ内環境制御技術を合体させ,全く新しいアプローチで葉内コンダクタンスを連続的かつ簡便に計測する画期的なシステム「減圧パルス-クロロフィル蛍光計測法」の開発を試みる。本システムの計測の手順の概要は,(1)特製チャンバに葉を固定し,光合成を定常状態にする,(2)チャンバ内圧力を急激に低下させ,一時的に低圧状態とする(減圧パルス),(3)この間,Ch1蛍光を連続的にモニタリングし,減圧パルス開始時点からCh1蛍光に減圧パルスの影響が出るまでにかかった時間(タイムラグ=Ti)を測定する,である。平成21年度は,減圧パルス-Ch1蛍光計測システムの作製とその性能確認を行った。作製した減圧パルス-Ch1蛍光計測システムでは,固定した植物葉の光合成を定常状態として,チャンバ内を瞬間的に減圧し,同時に,装着した携帯型Ch1蛍光計測装置(Mini-PAM, Walz)から出力される電圧を記録して,Ch1蛍光(蛍光強度,電子伝達収率)の経時変化をモニタリングできることを確認した。

減圧パルス(0.3秒以内に101.3kPaから50.7kPaに減圧、その後10秒間49kPa以下を維持)は、三方向電磁弁によりチャンバ内を密閉した直後に逆止弁付きの気体採取器を用いてチャンバ内空気を手動で引き抜くことでこれを行った。クロロフィル蛍光強度は、減圧パルス開始とほぼ同時に上昇し、約3秒後に最大となり、その後次第に低下した。なお、減圧処理後のクロロフィル蛍光強度の上昇幅を"Peak height"と定義した。この間、熱放散経路は活性化されておらず、また、減圧パルス前後で光合成速度と蒸散速度に変化は認められなかった。明期条件下にて二酸化炭素濃度を変化させながら、減圧パルス-クロロフィル蛍光計測を行った結果、光合成速度とPeak heightの間に強い相関があることが分かった。この結果は、減圧パルス-クロロフィル蛍光計測法により光合成速度を簡便に測定できる可能性を示唆していた。なお、当初、本計測法により内部コンダクタンス計測を試みたが、減圧処理への蛍光強度の応答速度が0.05秒以下であったため、内部コンダクタンスの測定は困難であると結論付けた。
アブリコソフ渦糸格子の融解相転移

アブリコソフ渦糸格子の自由エネルギーを二次元,三次元の場合に,ギンツブルグ・ランダウ模型の結合定数gに関して高次摂動計算した。特にランダムポテンシャルの影響を調べる為に,ランダムポテンシャル及びランダム表面上での相転移・イジング模型及びパーコレーション模型を研究し,超伝導の液滴間のトンネル効果及び磁束液体とスピングラス糸との類似を調べた。ランダム表面上でのパーコレーションはアプリコソフ渦糸格子融解と不純物が強い場合に関係するが,この問題は二次元重力と物質(イジングスピン等)の結合した臨界現象の問題に帰着出来る。従って,この問題をワークステーションを使って数値計算し,相転移の次数及び臨界指数の値を数値的に求めることが出来た。摂動の次数は8次まで求め,ファイマンダイアグラムはランダム表面を実現する,NXNのエルミート行列でN→∞の極限を考察した。一般的に,中心電荷Cの値を変えて,臨界指数がどの様に変化するのか調べた。C=1を境にして,臨界指数は異なる様子を示し,特にC=3の時に,三次元イジング模型(ランダム表面上でなく,通常の格子上で定義される)の臨界指数とよく似た臨界指数(特に比熱の臨界指数)が得られ,新しい発展が見られた。また磁場がある場合のスケーリング則による臨界指数も数値的に計算した。アブリコソフ渦糸格子の不純物がある場合の融解は渦糸グラスの相転移として見ることが出来るが,別にゲージグラスの問題とも共通したものがある。格子ゲージ理論でのN→∞での極限はその意味で重要であるが,これも二次元重力と物質が結合した糸の問的とも一到する部分があり,更に本研究を進める必要がある。数値計算は多くの計算時間を必要とし,臨界指数の値を精度よく求めるには更に次数を上げる必要があるが,モンテカルロ法と比べ,この方法は精度の点で利点がある所が判明した。
骨代謝における転写因子ＮＦＡＴｃ１を制御する新規メカニズムの解明

これまでに我々は、RANKLシグナルによって誘導される破骨細胞分化において、アルクチゲニンがNFATc1の転写機能の活性化を抑制することを見出した。本研究は、これまで知られていた核移行の阻害によるNFATc1の機能抑制とは異なる、新しいNFATc1転写活性の制御機構を明らかにした。骨芽細胞に依存したNFATc1の転写活性にも、カルシニューリンシグナルに依存したNFATc1の転写活性にもアルクチゲニンは阻害的に作用した。リン酸化制御を介してNFATc1をドミナントネガティブ型に変換することが示唆された。破骨細胞分化を抑制するアルクチゲニンを用い、NFATc1が関わる細胞内シグナルについて解析し、以下の成果を得た。1.前年度に見出したアルクチゲニンによるNFATc1のリン酸化修飾の減少とそのリン酸化部位の解析結果から、9種類のリン酸化修飾模倣型NFATc1を作成した。これらの変異型NFATc1をレトロウイルス遺伝子導入法を用いて破骨細胞前駆細胞に発現させ、破骨細胞分化を検討した。いずれの変異型NFATc1も、アルクチゲニンによる分化抑制を回復することができなかった。また、恒常活性型NFATc1も、アルクチゲニンによる抑制を解除することができなかった。2.NFATc1を必須とする細胞系譜に対するアルクチゲニンの影響:リンパ細胞におけるアルクチゲニンの作用を解析するために、脾臓由来のT細胞前駆細胞を用いてNFATc1のリン酸化状態や標的遺伝子の発現を検討した。イオノマイシンおよびTPA刺激によるT細胞分化はアルクチゲニンによって阻害されなかった。また、NFATc1のリン酸化状態には差がなかった。さらに、活性型T細胞の指標であり、NFATc1の標的であるIL-2やGM-CSFなどの遺伝子発現は、アルクチゲニンによって抑制されなかった。これまでの結果から、破骨細胞分化を抑制する濃度のアルクチゲニンは、他のNFATc1発現細胞に対して悪影響を与えないことが示唆された。破骨細胞の分化と骨吸収を抑制するアルクチゲニンを用い、破骨細胞における標的因子の探索および骨代謝への関与を検討し、以下の成果を得た。1.NFATc1の転写活性に影響を与えるアルクチゲニンの阻害機構の解析:これまでの解析から、アルクチゲニン処理でNFATc1は核移行をしていたが転写活性を失っていた。本年度は、免疫沈降によりNFATc1を精製しMALDI-TOFおよびnanoLC-QTOF質量分析計を駆使して、リン酸化部位の同定を試みた。その結果、NFTAc1のDNA結合領域に新規リン酸化部位の候補をいくつか同定することが出来た。2.NAFTc1が関与する細胞系譜に関するアルクチゲニンの影響:骨芽細胞におけるアルクチゲニンの作用を解析するために、骨芽細胞の増殖における影響を解析した。また、分化マーカ遺伝子の発現解析を行なった。その結果、高濃度のアルクチゲニン存在下であっても、骨芽細胞増殖を抑制することは無かった。さらに、Alpl、Bglap、Runx2、Osterixなどの骨芽細胞分化マーカの発現には影響しないことが判った。活性型ビタミンD添加によるRanklやOpgなど破骨細胞支持に関連する発現にも影響を与えないことが判った。3.マウス動物モデルを用いた骨代謝におけるアルクチゲニンの作用の解析:低カルシウム食で誘導される骨吸収モデルを用いてアルクチゲニンの骨減少抑制作用を解析した。その結果、血清カルシウム値の亢進はアルクチゲニン投与群においても観察された。1.前年度に作製した9種類のリン酸化修飾模倣型NFATc1の重複組合せを行って、レトロウイルス遺伝子導入法を用いて破骨細胞前駆細胞に発現させ、破骨細胞分化を検討した。2箇所および3箇所を修飾模倣型に変えた変異型NFATc1でも、アルクチゲニンによる分化抑制を回復することができなかった。また、T細胞で特異的にリン酸化されると報告のあったTyr371の変異でも回復することはできなかった。2.NFATc1を必要とする細胞系譜におけるアルクチゲニンの影響:分化過程においてNFATc1を高発現する樹状細胞系譜において、アルクチゲニン処理はCD80/CD86陽性の成熟樹状細胞の形成を阻害することはなかった。3.骨吸収機能におけるアルクチゲニンの作用機序の解析:破骨細胞の細胞骨格形成に関与するPyk2、Src、Cbl、FAK、Cas、vATPase、avb3-integrinの遺伝子発現を定量的RT-PCR方により解析した。骨吸収を抑制する濃度において、これらの遺伝子発現は影響を受けなかった。また、免疫組織学的解析を行なったところ、Srcの細胞内局在はアクチンリングの領域に存在し、アルクチゲニン添加の影響を受けなかった。

また、Srcのリン酸化状態をウェスタンブロット法により解析したところ、有意な差は見られなかった。カルシウムオシレーションをコンフォーカル顕微鏡で経時的に観察したが、アルクチゲニン処理群は対照群と同様にオシレーションが観察された。口腔生化学NFATc1のリン酸化修飾に対してアルクチゲニンが作用しているという仮説に基づきリン酸化を模倣した変異型NFATc1を作成したものの、アルクチゲニンによる抑制効果を解除するには至らなかった。NFATc1は高度にリン酸化されていることから、これらの模倣変異を組み合わせることが必要である。また、T細胞の分化におけるアルクチゲニンの影響は遺伝子発現レベルでは認められないことが判った。アルクチゲニンの標的因子NFATc1の転写活性の阻害がDNA結合部位におけるリン酸化修飾に依存していることを示唆するデータが得られた。また、骨芽細胞の分化におけるアルクチゲニンの影響は遺伝子発現レベルでは認められないこと、破骨細胞支持能についても影響しないことが判った。細胞生物学的解析は計画以上に達成できた。動物を用いた解析では、急激な骨吸収誘導の阻害は見られなかった。これまでに、NFATc1上のアルクチゲニン標的部位候補に変異を導入して解析してきた。ひとつずつの変異体の解析では、分化抑制の解除に至らないことから、いくつかの変異の組合せを今後行なう予定である。また、骨芽細胞や免疫細胞など、NFATc1を必要とする細胞において、アルクチゲニンは分化抑制などの影響を与えなかった。今後は破骨細胞と起源を同じくする樹状細胞における分化およびその細胞系譜の振り分けに対する作用も明らかにしたい。また、NFATc1の活性制御にはカルシウムシグナルが関与している。カルシウムオシレーションに対するアルクチゲニンの影響を破骨細胞で解析する予定である。これまでに、破骨細胞の分化を抑制する天然化合物アルクチゲニンを発見し、その標的因子NFATc1の転写活性を阻害することを明らかにした。新たに同定したリン酸化修飾とアルクチゲニンの機能の関連を詳細に生化学的・細胞生物学的な方法で明らかにしようと考えている。また、NFATc1を必須とする免疫系細胞の分化や機能に対する作用との比較を行い細胞特異性について明らかにしたい。繰越金は物品の値引き等により発生した。申請した助成金とあわせて、次年度の実験用試薬などの消耗品の購入に使用する。申請した助成金とあわせて、次年度のRT-PCR解析の合成オリゴプライマーなどの消耗品の購入に使用する。
微生物酵素によるプラスチックの分解に関する研究

1.ポリー3ーヒドロキシ酪酸(PHB)分解菌Alcaligenes faecalis T_1のPHBデポリメラ-ゼのPHB界面認識部位の検索:PHB分解酵素をトリプシンで処理すると分子量が47Kから42Kに減少し、酵素分子の疎水性が低下し、水溶性のD(-)ー3ーヒドロキシ酪酸オリゴマ-に対する活性は変化しないままPHB分解活性は失われる。またジイソプロピルフルオロ燐酸(DFP)で修飾するとオリゴマ-ならびにPHBに対する分解活性は共に失なわれたが、PHBに対する吸着力は元とかわらなかった。これらの結果はPHB分解酵素中にエステル結合を切断するに必要な部位に加えて、PHB界面を認識する部位が存在することを示唆している。トリプシンで切断される箇所は、分解酵素の遺伝子を解析して明らかになった一次配列の(末側の最初のアルギニンであった。従ってC末の約5Kのペプチド部分にPHB界面認識部位が存在する可能性がある。しかしながら種々の証拠に基づいて、特定のアミノ酸配列(ペプチド)がPHBとの相互作用に重要である訳ではなく、PHB界面認識部位は立体的に構成されている可能性が示された。2.D(-)ー3ーヒドロキシ酪酸オリゴマ-ヒドロラ-ゼ遺伝子のクロ-ニングならびにその塩基配列の決定:A.faecalis T_1の遺伝子を適当な大きさに切り、EcoRIリンカ-をつなぎファ-ジλgt11に組み込み、オリゴマ-エステラ-ゼに対する抗体を用いてクロ-ニングを行った。抗体ポジティブなプラ-クを得て現在解析中である。3.3ーヒドロキシ酪酸のコポリマ-のPHB分解酵素による分解:3ーヒドロキシ吉草酸(3HV)あるいは4ーヒドロキシ酪酸(4HB)のコポリマ-をPHB分解酵素により分解したところ、4HBを含む3ーヒドロキシ酪酸コポリマ-はその含量に応じて容易に分解し、3HVを含むコポリマ-は分解しにくくなることがわかった。(1)ポリー3ーヒドロキシ酪酸(PHB)分解菌Alcaligenes faecalis T_1のPHBデポリメラーゼの疎水性部位の特定:PHB分解酵素をトリプシンで処理すると分子量が47Kから42Kに減少し、酵素分子の疎水性が低下し、水溶性のD(-)ー3ーヒドロキシ酪酸オリゴマーに対する活性は変化しないままPHB分解活性が失われる。このトリプシン修飾デポリメラーゼの性質を調べると、PHBに対する活性は完全になくなっている訳ではなく元の0.8%程度残っていることが判明した。測定中の塩濃度を高めるとこの修飾デポリメラーゼのPHB分解活性は約40倍上昇した(IM硫酸アンモニウム中)。このことはデポリメラーゼは疎水性の相互作用をPHBとしていることを示している。さらにデポリメラーゼのPHB分解活性はアルコールにより、その鎖の長い順に強く阻害されたことから上述の結論が支持された。またPHB分解活性はグリセロールにより阻害されたことより水素結合も関与していると考えられる。一方PHB分解酵素をトリプシンで処理した混液にPHB顆粒を加えPHBに吸着するものを除いた上清をゲルロ過にかけ、低分子量に相当する吸収の山の高さは、PHB処理しなかったものと全く同じであった。そこで特定のアミノ酸配列(ペプチド)がPHBとの相互作用に重要でなく、PHB結合部位は立体的に構成されているものと推定した。

またトリプシンによる酵素の切断部位はc未側の最初のアルギニンあるいはリジンであることが判った。(2)D(-)ー3ーヒドロキシ酪酸オリゴマーエステラーゼ遺伝子のクローニングならびにその塩基配列の決定:A.faecalis T_1の遺伝子を適当な大きさにわけ、ECORIリンカーをつなぎファージλgtllに組み込み、オリゴマーエステラーゼに対する抗体を用いてクローニングを行うことを現在進めている。抗体ポジティブのプラークを得て現在解析中である。1.D(-)-3ヒドロキシ酪酸オリゴマ-ヒドロラ-ゼの遺伝子のクロ-ニングならびにその塩基配列の決定:PHB資化菌Alcaligenes faecalis T_1はPHBデポリメラ-ゼの他にD-3-ヒドロキシ酪酸オリゴマ-(水溶性)のみを分解し、PHBは分離しないオリゴマ-ヒドロラ-ゼをも菌体外に分泌する。電気泳動的に均一に精製した酵素の抗体を用いて、λgも11の系でオリゴマ-ヒドラ-ゼ蛋白の発現を行うことにより、クロ-ン化をした。現在その塩基配列を決定中である。2.A.faecalis T_1PHBデポリメラ-ゼの化学修飾:PHBデボリメラ-ゼの性質のうち、PHBに対する強い吸着力は、PHBを加水分解する上で不可欠である。トリプシンによる限定分解をうけ47Kから42Kにすこし小さくなった酵素は、水溶性オリゴマ-加水分解活性は未処理と同程度あるのに対し、PHB分解活性は完全に消失する。この酵素は活性セリン残基を持ち、ジイゾプロピルフルオロ燐酸(DFP)で修飾され、オリゴマ-ヒドロラ-ゼ活性もPHB分解活性も共に失う。DFPでデポリメラ-ゼで処理し、精製した修飾酵素を用いて、未処理のPHBデポリメラ-ゼのPHB分解に及ぼす影響をみた。修飾酵素は未処理酵素のPHB分解活性を阻害した。また修飾酵素が未処理酵素と同程度にPHB顆粒に吸着することが判った。この結果はPHBデポリメラ-ゼ中にエステル結合を切断するに必要な部位の他に独立してPHBの界面を認識する部位が存在することを、あらためて示唆している。今後PHB界面認識部位のみをブロックするような修飾試薬を捜したい。3.PHBデポリメラ-ゼのPHB結合部位のオリゴマ-ヒドロラ-ゼへの導入:現在検討中である。
急性腎障害における肺腎相関の病態解明と診断マーカーとしてのミッドカインの臨床応用

ICU患者2582例の後ろ向き研究で急性腎傷害(AKI)の発症率は30%と高頻度で,院内死亡に対して関連性がみられ,重症度に従ってオッズ比が上昇することを明らかにした.次に,気管支肺胞洗浄を行った重症呼吸不全(ALI/ARDS)52例の検討で,AKIは肺局所でのケモカイン/サイトカインのdysregulationを介して,非心原性肺水腫に寄与する肺腎連関を示した.さらにAKIの早期診断のため,尿中ミッドカインのAKIバイオマーカーとしての有用性を明らかにした.本邦でいまだ認識が不十分であるAKIの重要性を示すため,まずICU領域におけるAKIの疫学研究をおこなった.名古屋大学病院ICU入室患者(n=2582)を対象にうしろ向き研究を行い, AKIN分類及びKDIGO分類におけるAKIの発症率はそれぞれ29.6%, 38.5%であった.多変量ロジスティク解析において, AKIは院内死亡に対して関連性がみられ, AKIの重症度に従って,オッズ比の上昇が認められることを明らかにした.次にAKIにおける腎と他臓器連関について肺に着目した.気管支肺胞洗浄を行った重症呼吸不全(ALI/ARDS)52例の検討を行った.46%がAKIを呈したが,ピークのCr値が高々1.38±0.63mg/dl程度のAKI群で人工呼吸管理(NPPV)失敗が有意に高率であった(83% vs. 46%, P=0.009).ALI/ARDSの誘因となった肺内・肺外の病因には両群で差を認めないにもかかわらず,気管支肺胞洗浄液中の好中球数はAKI群で有意に上昇していた.ケモカイン/サイトカインのプロファイルは大きく異なり, IL-6, IL-8, IL-10, IIFN-γ, MCP-1, PAI-1は有意に人工呼吸管理失敗に関連した.ヒトにおいても, AKIにより,肺局所でのケモカイン/サイトカインのdysregulationを介して,非心原性肺水腫に寄与する可能性が示唆された.さらにAKIの早期診断のため,尿中ミッドカインのAKIバイオマーカーとしての有用性を検討した.開心術後AKI,部分腎摘出術後AKI,腎移植後AKI(delayed graft function)でCr変動に先立ち,尿中ミッドカインの上昇をみとめた.現在ミッドカインのAKI診断薬としての検証を継続している.ICU患者2582例の後ろ向き研究で急性腎傷害(AKI)の発症率は30%と高頻度で,院内死亡に対して関連性がみられ,重症度に従ってオッズ比が上昇することを明らかにした.次に,気管支肺胞洗浄を行った重症呼吸不全(ALI/ARDS)52例の検討で,AKIは肺局所でのケモカイン/サイトカインのdysregulationを介して,非心原性肺水腫に寄与する肺腎連関を示した.さらにAKIの早期診断のため,尿中ミッドカインのAKIバイオマーカーとしての有用性を明らかにした.(研究1)ICU領域におけるAKIの疫学研究:名古屋大学医学部附属病院ICUに入室した症例(n=2582)を対象とした解析では, AKIN分類およびKDIGO分類におけるAKIの発症率はそれぞれ29.6%, 38.5%であった.多変量ロジスティク解析において, AKIは院内死亡に対して関連性がみられ, AKIの重症度に従って,オッズ比の上昇が認められた.院内死亡に対するROC(receiver operating characteristic)曲線下の面積は, AKIN分類: 0.73, KDIGO分類: 0.76であった.これまで本邦で報告の乏しいAKIの実態を,本研究で明らかにした.(研究2)急性期肺腎クロストークの検討:非侵襲的陽圧呼吸管理(NPPV)導入となったALI/ARDS症例のうち、NPPV導入日もしくはその翌日に気管支肺胞洗浄を施行した52症例を対象とし、気管支肺胞洗浄液中の、炎症細胞(Neu.,MΦ)、向および抗炎症性メディエーター(IL-1β,sTNF-α,IL-6,IL-8,IFN-γ,MCP-1,IL-10)、血管内皮傷害マーカー(TM)、肺胞上皮傷害マーカー(SP-D)、接着分子(ICAM-1)、凝固マーカー(PAI-1)の測定を行い、AKIの有無によるプロファイルの違いを示した。AKIの存在が上記メディエーターのdysregulationを介し、非心原性肺水腫の病態であるALI/ARDSの肺局所におよぼす影響を明らかにした。(研究3)尿中ミドッカインのAKIバイオマーカーとしての有用性:基礎研究において尿細管上皮障害マーカーとなることが示されているミッドカインに注目し、実地臨床でAKI診断のバイオマーカーとなり得るか検証するための臨床サンプル収集を進めた。(研究1)ICU領域におけるAKIの疫学研究:解析が終了し論文投稿間近である。(研究2)急性期肺腎クロストークの検討:大部分の解析が終了し、国際学会発表の準備を進めるとともに、論文作成中である。(研究3)尿中ミドッカインのAKIバイオマーカーとしての有用性:平成23年度に検体収集の目途をたてた。平成24年度も引き続き検体収集を継続し、目標症例数に達したら測定、解析をおこなう準備を進めている。(研究1)ICU領域におけるAKIの疫学研究:論文投稿を進める(研究2)急性期肺腎クロストークの検討:論文作成を進める。(研究3)尿中ミドッカインのAKIバイオマーカーとしての有用性:収集したサンプル中の、ミッドカイン、既知バイオマーカー(NGAL、IL-18、L-FABP、NAGなど)を一気に測定する。

a.鑑別診断能に関する検証では、AKIと他の腎疾患との鑑別診断能をROC曲線解析し、バイオマーカー間の比較を行う。b.早期診断能に関する検証では、AKI群とnon-AKI群のバイオマーカー推移を経時的に比較し、各バイオマーカーの特性を見出す。c.予後推定能に関する検証では、集中治療室入室時に採取したサンプル中のミッドカイン値から、生命予後・腎予後を検証するためのROC曲線解析を行う。以上の結果は、単にバイオマーカーの優劣を明らかにするのでなく、それぞれの特性を踏まえ、複数のバイオマーカーをパネル化することによって、より正確な診断方法を開発する。経費の75%を研究に使用する消耗品に計上した。尿および血中におけるミッドカイン・既知のバイオマーカー(NGAL、IL-18、L-FABP、NAGなど)、RAS (renin, angiotensinogen, ACE, AT-I, AT-II)・ケモカイン(MCP-1, TNF-α, IL-6 etc.)・接着因子(ICAM-1)などの発現を検討するために、ELISAキット、マルチプルサイトカインアレイキット、プラスティク器具の購入を予定している。また経費の20%を各種調査・研究の打合せ、研究成果の発表に関する国外の学会のための旅費・及び論文作成費用として計上した。各種調査・研究の打合せの経費が高額であるが、本研究は多方面から生体サンプルおよび臨床データーを収集する必要がある。
柔道の競技パフォーマンスを規定する遺伝子多型の探索

本研究では、柔道選手の競技能力及び形態・体力と遺伝子多型の関連性を明らかにすることを目的とした。男子大学柔道選手216名のalpha Actinin 3(ACTN3)、アンジオテンシン変換酵素(ACE)、インスリン様成長因子(IGF-2)など10個の遺伝子多型について解析した。さらに対象者は形態および体力測定を半年に1回実施し、最高競技成績に基づいて競技力を決定した。その結果、ACTN3及びACE遺伝子多型と柔道の競技力の関連性は認められなかったが、IGF2遺伝子多型は競技力との関連性が認められた。またACTN3及びIGF2遺伝子多型は一部の筋力関連項目との関連性が認められた。近年、ヒトのスポーツパフォーマンスを規定する遺伝子が多数報告され、競技能力や運動トレーニングの効果に見られる個人差を説明する要因の一つとして遺伝子多型が注目されている。しかし、柔道をはじめとする武道系の競技パフォーマンスと遺伝子多型についての関連性を検討した報告は少ない。そこで本研究では、男子柔道選手を対象に、筋肉量および瞬発系・パワー系運動能力に関与する遺伝子多型と競技能力および階級制の関連性を明らかにすることを目的とした。対象者は全日本学生柔道優勝大会で最多の優勝回数を誇るT大学男子柔道部の現役およびOBの部員156名とし、大学入学後の最高競技成績に基づいて、競技能力を5つのランクに分類した。また、各選手が最も多く試合に出場した階級を用いて、軽量級(60kg・66kg)、中量級(73kg・81kg・90kg)、重量級(100kg・100kg超)の3つに分類した。遺伝子多型解析は唾液からDNAを抽出し、PCR法、PCRーRFLP法、TaqMan Genotyping Assay法のいずれかによってαアクチニン3(ACTN3)やアンジオテンシン変換酵素(ACE)遺伝子等、筋肉量および瞬発系・パワー系運動能力に関与する8種類の遺伝子多型を分析した。今回検討した8種類の遺伝子多型の頻度を先行研究で報告されている一般人の頻度と比較した結果、一部の競技能力や階級の柔道選手に有意な差が認められた。また、2つの遺伝子多型の組み合わせ頻度をランク別で比較した結果、頻度に大きな差がつく組み合わせが複数認められた。以上から競技能力や階級の違いが遺伝子多型と関連している可能性が示唆された。また2種類の遺伝子多型を組み合わせることによって、柔道の競技能力を単一の遺伝子多型で検討するより規定できる可能性が示唆された。体型やスポーツの競技パフォーマンスに影響する遺伝子多型が数多く報告されており、α-アクチニン3(ACTN3)やアンジオテンシン変換酵素(ACE)遺伝子はその中でも代表的な遺伝子である。我々は既に、柔道の競技パフォーマンスとACTN3及びACE遺伝子は単一での関連性が低いことを報告している。そこで平成26年度は、骨格筋の発達に寄与するインスリン様成長因子2(IGF2)遺伝子や脂肪量に影響する脱共役タンパク(UCP1、UCP2)遺伝子を分析することで、競技パフォーマンスとの関係性が明らかにできると仮説を立てた。競技パフォーマンスがトップレベルの男子大学柔道選手156名のIGF2、UCP1、UCP2遺伝子多型をポリメラーゼ連鎖反応制限酵素断片長多型(PCR-RFLP)法を用いて分析した。さらに対象者の一部に対して、体組成や形態の測定及び体力測定を実施した。その結果、IGF2遺伝子多型においては競技パフォーマンスや体力測定のいくつかの項目と関連性が認められた。そのため、ACTN3、ACE遺伝子多型ではできなかった単一の遺伝子多型によって日本人柔道選手の競技パフォーマンスに与える可能性を示唆した。またIGF2とACTN3やACE遺伝子多型の結果を組み合わせることで単一の遺伝子多型での判定よりも競技パフォーマンスを規定する可能性があることも発見した。これらの知見は将来的な競技能力の推定やトレーニング方法の検討に役立てられるかもしれない。しかし、UCP1及びUCP2遺伝子多型では競技能力との関連性は認められなかった。今後、柔道選手における体脂肪量とUCP遺伝子多型の関係性について検討していく予定である。以上より、本研究では、IGF2遺伝子と柔道の競技パフォーマンスの関連性が示唆された。スポーツの競技パフォーマンスや体力に影響する遺伝子多型は、α-アクチニン3(ACTN3)遺伝子やACE遺伝子などいくつか報告されている。我々は、柔道選手の競技パフォーマンスや筋力とインスリン様成長因子2(IGF2)遺伝子多型が関連し、日本人柔道選手への遺伝的な影響を明らかにした。その一方、競技パフォーマンスとACTN3及びACE遺伝子多型の関連性は低いことを報告した。先行研究では、骨格筋量および筋力に影響する遺伝子多型との関連性を検討した報告が多くされているが、脂肪量と関連する遺伝子多型と競技パフォーマンスの関連を検討した報告は少なく、柔道選手では行われていない。そこで最終年度は肥満遺伝子とよばれる肥満と関連する遺伝子である脱共役タンパク質(UCP)1および2遺伝子多型と柔道選手の形態や脂肪量および脂肪率との関連性を検討した。研究実施期間において、トップレベルの大学に所属経験のある220名の男子柔道選手を対象とし、UCP1およびUCP2遺伝子多型の分析を現在行っている。また、対象者のうち現在学生の柔道選手を対象に、年2回の体組成(体重、体脂肪率、骨格筋量など)と形態測定(頚囲、胸囲、腹囲、臀囲、大腿囲、下腿囲、上腕伸展囲、上腕屈曲囲、前腕囲)を完了させた。

遺伝子多型の解析終了後に、柔道の階級及び体力、形態等との関連性を統計学的に比較し、階級、体力、形態への遺伝的な影響を明らかにする。本研究では、柔道選手の競技能力及び形態・体力と遺伝子多型の関連性を明らかにすることを目的とした。男子大学柔道選手216名のalpha Actinin 3(ACTN3)、アンジオテンシン変換酵素(ACE)、インスリン様成長因子(IGF-2)など10個の遺伝子多型について解析した。さらに対象者は形態および体力測定を半年に1回実施し、最高競技成績に基づいて競技力を決定した。その結果、ACTN3及びACE遺伝子多型と柔道の競技力の関連性は認められなかったが、IGF2遺伝子多型は競技力との関連性が認められた。またACTN3及びIGF2遺伝子多型は一部の筋力関連項目との関連性が認められた。平成26年度は、骨格筋の発達に寄与するインスリン様成長因子2(IGF2)遺伝子や脂肪量に影響する脱共役タンパク(UCP1、UCP2)遺伝子を分析することで、柔道の競技パフォーマンスとの関係性が明らかにできると作業仮説を立てて検討した。その結果、IGF2遺伝子多型においては競技能力や体力測定のいくつかの項目と関連性が認められたこと、一方、UCP1及びUCP2遺伝子多型では競技能力との関連性は認められなかったことを明らかにできた。武道学(柔道)今後も、IGF2のような柔道の競技パフォーマンスを規定する新規な遺伝子多型を探索する予定である。特に、柔道選手における体脂肪量を規定する遺伝子多型について、脱共役タンパク(UCP1、UCP2)以外の遺伝子についても検討していく予定である。計画していた8種類の遺伝子多型について150名以上の被験者で検討できている。年度末に解析を予定していた消耗品を購入する必要がなくなったため、次年度分と合わせて、有効に活用する。当初の実験計画通りに、1年目で検討した8種類の遺伝子多型について、柔道競技能力を評価するパフォーマンステストの成績と形態(体脂肪率、除脂肪体重、胸囲、大腿囲等)の関連について検討する予定である。パフォーマンステストの項目としては、ベンチプレスの最大挙上重量(1RM)、スクワット1RM、ダンベルスナッチ1RM、最大無酸素パワー、垂直跳び、パワークリーン、背筋力、握力である。形態計測としては、生体インピーダンス法による体脂肪率や除脂肪体重、9カ所の周囲径(頚囲、胸囲、腹囲、臀囲、大腿囲、下腿囲、上腕伸展囲、上腕屈曲囲、前腕囲)について検討する予定である。遺伝子多型解析のための試薬の購入に活用する予定である。初年度の後半から、156名の対象者の8種類の遺伝子多型を検討する過程で、効率的に遺伝子多型を同定することに成功したため、当初予定していた実験回数を実施する必要がなくなった。そのため、PCR関連の試薬を節約することができ、物品費に計上していた予算が残った。2年目は、柔道競技能力を評価するパフォーマンステストの成績と形態(体脂肪率、除脂肪体重、胸囲、大腿囲等)の関連について検討する予定であり、得られるデータ数が莫大になる。そのため、形態・体力測定等のデータを正確に取るために当初の予定よりも験者の人数を増やす予定であり、今回の余剰予算を有効に活用する。
アルツハイマー病の診断・治療に資する新規SPECTプローブの創製

アルツハイマー病(AD)は先進諸国を中心に多くの罹患者がいるが,その診断・治療法は未だ確立されていない.近年では,1)βアミロイド(Aβ)オリゴマーの生成,2)タウ凝集体の蓄積,3)神経細胞死という過程を経てADを発症するという概念が提唱されており,この概念を基盤とした病態解明および治療薬開発に関する研究が進められていることから,これらに対応したADの診断法の確立が求められている.本研究では,1)Aβオリゴマー,2)タウ凝集体,3)神経細胞死の指標となりうるシナプス小胞タンパク2Aを標的とした核医学分子イメージングプローブを開発することを目的としており,今後の患者数の増加を考慮し,多数の画像診断によるAD検査を可能にするため,PETに比べて汎用性に優れたSPECT用プローブの開発研究を行う.平成30年度は2)に関して重点的に検討した.2)SPECT用タウ凝集体イメージングプローブの開発タウ選択的SPECTプローブとして開発してきたBIP-NMe2と窒素原子の導入数が異なる数種の化合物を合成し,BIP-NMe2との比較検討を行なった。その結果、窒素原子が1つ増加したN3-aおよびN3-cはAD患者脳切片を用いたin vitroオートラジオグラフィーにおいてタウに対する選択的結合性を示した.なかでもN3-cはBIP-NMe2と同等のタウ結合性およびAβとの選択性を有していた.さらに正常マウスを用いた体内放射能分布実験において,投与後2分においてBIP-NMe2に比べて高い脳移行性を示し,その後速やかに脳から消失した.以上の結果より,SPECT用タウイメージングプローブとして有用な新たな化合物を見いだすことに成功した.オリゴマーおよび神経細胞死についてのプローブ開発に遅れは見られるが,タウ凝集体に関しては,既存の骨格に比べて優れた性能をもつ骨格を見いだすことに成功したため,全体としてはおおむね順調に進展しているとの評価をした.1)Aβオリゴマーを標的としたSPECTプローブの開発既存の化合物群を用いたスクリーニング研究,および新たな化合物の開発を並行して進める.2)SPECT用タウ凝集体イメージングプローブの開発平成30年度に見出した母核に関して置換基の最適化を行う.3)神経細胞死の指標となりうるシナプス小胞タンパク2A(SV2A)を標的としたSPECTプローブの開発SV2Aへの結合性を有する化合物を基本骨格とし,ヨウ素の導入を考慮した新規化合物の開発を進める.アルツハイマー病(AD)は先進諸国を中心に多くの罹患者がいるが、その診断・治療法は未だ確立されていない。近年では、1)βアミロイド(Aβ)オリゴマーの生成、2)タウ凝集体の蓄積、3)神経細胞死という過程を経てADを発症するという概念を基盤として、病態解明および治療薬開発に関する研究が進められており、これらに対応したADの診断法の確立が求められてる。本研究では、1)Aβオリゴマー、2)タウ凝集体、3)神経細胞死の指標となりうるシナプス小胞タンパク2Aを標的とした核医学分子イメージングプローブを開発することを目的としており、今後の患者数の増加を考慮し、多数の画像診断によるAD検査を可能にするため、PETに比べて汎用性に優れたSPECT用プローブの開発研究を行う。平成29年度は1)および2)に関する検討を実施した。1)Aβオリゴマーを標的としたSPECTプローブの開発分子設計に関しての情報を得ることを目的に、これまでに開発してきたAβイメージングプローブであるBAP-1を用いて、そのAβ凝集体形成時の蛍光強度の上昇を経時的に測定した結果、チオフラビンTとほぼ同様の蛍光上昇を示した。また、BAP-1へのメチル基の導入数の増加がAβ凝集体への結合性に対して影響を与えることを見出した。2)SPECT用タウ凝集体イメージングプローブの開発タウ選択的SPECTプローブとして開発してきたBIP骨格と窒素原子の導入数や一部の環構造が異なる数種の化合物を合成した。その結果、窒素原子が1つ増加したMK-613はBIP誘導体と同様にAD患者脳切片を用いたin vitroオートラジオグラフィーにおいてタウに対する選択的結合性を示した一方、窒素原子が1つ減少したTH-42はAβに対しても結合性が見られ、環構造を変化させたMK-649はいずれの凝集体に対しての結合性も失われた。1)Aβオリゴマーを標的としたSPECTプローブの開発新たな化合物設計につながる知見を得ることができたため。2)SPECT用タウ凝集体イメージングプローブの開発これまでに開発してきたBIP骨格を基盤に、新たなSPECT用タウイメージングプローブの母核のなり得る構造を見いだすことができたため。アルツハイマー病(AD)は先進諸国を中心に多くの罹患者がいるが,その診断・治療法は未だ確立されていない.近年では,1)βアミロイド(Aβ)オリゴマーの生成,2)タウ凝集体の蓄積,3)神経細胞死という過程を経てADを発症するという概念が提唱されており,この概念を基盤とした病態解明および治療薬開発に関する研究が進められていることから,これらに対応したADの診断法の確立が求められている.

本研究では,1)Aβオリゴマー,2)タウ凝集体,3)神経細胞死の指標となりうるシナプス小胞タンパク2Aを標的とした核医学分子イメージングプローブを開発することを目的としており,今後の患者数の増加を考慮し,多数の画像診断によるAD検査を可能にするため,PETに比べて汎用性に優れたSPECT用プローブの開発研究を行う.平成30年度は2)に関して重点的に検討した.2)SPECT用タウ凝集体イメージングプローブの開発タウ選択的SPECTプローブとして開発してきたBIP-NMe2と窒素原子の導入数が異なる数種の化合物を合成し,BIP-NMe2との比較検討を行なった。その結果、窒素原子が1つ増加したN3-aおよびN3-cはAD患者脳切片を用いたin vitroオートラジオグラフィーにおいてタウに対する選択的結合性を示した.なかでもN3-cはBIP-NMe2と同等のタウ結合性およびAβとの選択性を有していた.さらに正常マウスを用いた体内放射能分布実験において,投与後2分においてBIP-NMe2に比べて高い脳移行性を示し,その後速やかに脳から消失した.以上の結果より,SPECT用タウイメージングプローブとして有用な新たな化合物を見いだすことに成功した.オリゴマーおよび神経細胞死についてのプローブ開発に遅れは見られるが,タウ凝集体に関しては,既存の骨格に比べて優れた性能をもつ骨格を見いだすことに成功したため,全体としてはおおむね順調に進展しているとの評価をした.1)Aβオリゴマーを標的としたSPECTプローブの開発平成29年度に得た知見を基盤に新たな化合物の開発を進める。2)SPECT用タウ凝集体イメージングプローブの開発平成29年度に見出した母核の構造最適化および、タウ選択的結合性を有する新たな母核の探索研究を進める。3)神経細胞死の指標となりうるシナプス小胞タンパク2Aを標的としたSPECTプローブの開発V2Aへの結合性を有する化合物を基本骨格とし、ヨウ素の導入を考慮した新規化合物の開発を進める1)Aβオリゴマーを標的としたSPECTプローブの開発既存の化合物群を用いたスクリーニング研究,および新たな化合物の開発を並行して進める.2)SPECT用タウ凝集体イメージングプローブの開発平成30年度に見出した母核に関して置換基の最適化を行う.3)神経細胞死の指標となりうるシナプス小胞タンパク2A(SV2A)を標的としたSPECTプローブの開発SV2Aへの結合性を有する化合物を基本骨格とし,ヨウ素の導入を考慮した新規化合物の開発を進める.
3Dプリンターで製作したデジタル義歯の臨床エビデンスの構築

CAD/CAM技術の飛躍的な進歩によって、クラウンや義歯製作のデジタル化が可能となり、今や歯科治療において、中心的手段になろうとしている。現在,クラウン・ブリッジ・インプラント治療については臨床応用されている一方で、義歯治療は未だ実用化には至っていない。本研究では、ランダム化比較試験を立案し、CAD/CAM法で製作したデジタル義歯と従来法義歯を同一患者で新製を行い、臨床効果(満足度,咀嚼能力,咬合力)を明らかにすることで、デジタル義歯の臨床応用に向けたエビデンスの構築とその実用化を目指す。
呼吸器感染症と間質性肺炎における好中球遊走因子の種類とその病的意義に関する研究

呼吸器系では、感染病のみならず喘息,間質性肺炎など各種の疾患でもある時期には好中球浸潤がみられる。これは好中球が感染防御に加えて肺病変の成立にも密接に関係することを示唆している。好中球の遊走浸潤には好中球遊走因子が重要な働きをすると考えられている。本研究は1.この好中球遊走因子の種類や量が肺疾患によって2.あるいは呼吸器系の部位によって異なるか否か3.各好中球遊走因子の起源はどこかという点を解明することを目的として各種の呼吸器疾患の病態や好中球遊走因子の検討を行なった。その結果、細菌性感染症患者の気管支肺胞洗浄液(BALF)中の好中球数比率及び絶対数は共に著しく増加し、間質性肺炎では軽度の増加がみられた。また、BALF中の好中球遊走因子活性はミクロケモタクティックチャンバーで測定した。BALF中の好中球遊走因子活性は、各種疾患のBALF中の好中球数と比較的関連性が認められ、遊走因子活性の高い場合、好中球数は増加していた。従って、好中球遊走因子の量は、肺への好中球浸潤に重要な役目を有すると考えられる。更に健常肺においても呼吸器系のうち気管支領域には、肺胞領域を主とする下部気道領域に比較し、好中球が多く存在しており、同時に補体C5由来因子を含む好中球遊走因子が認められた。気道は健常者においても外来微生物などに対して感染防御機構が発現し準備された状態にあるものと考えられる。気道感染症のBALF中にも好中球増加と共に補体由来因子の増加が認められ、気道領域の感染性疾患では、補体成分が好中球遊走因子として重要であることが示唆された。一方、間質性肺炎などのBALF中には、補体成分と共に肺胞マクロファージ由来の遊走因子が増加していた。このことは呼吸器系の部位と共に疾患によっても関与する好中球遊走因子の種類や量が異なることが考えられる。今後、動物実験での検索を進める必要がある。
東アジアの地球環境の構成要素としての黄砂の役割の解明:個々の粒子の性状分析

東アジア起源の鉱物粒子、いわゆる黄砂の性状を調べる目的で2004年の3月と10月に直接観測を行った。いずれの観測においても、気球搭載の自動インパクター集塵装置(AIS)を使用したことにより黄砂発生源地域(敦煌市、中国)上空、特に自由対流圏高度に存在する大気中粒子状物質(大気エアロゾル)の採集に成功してる。このAISは大気エアロゾルをサイズ別に採集できる2段式インパクターを3個装備可能で、高度別に試料を得られるのが特徴である。これと並行し、同様の技術で地上における大気エアロゾルの採集も行った。また、AIS放球後短時間のうちに同じく気球搭載の光散乱式粒子個数濃度測定器(OPC)を打ち上げ、どの高度にどの大きさの粒子が卓越しているのか、という粒子の分布状態も調べられた。黄砂が大陸内部で発生した後、長距離輸送される過程でどのような変質をうけるのか、この問題解明には、発生源と風下地域の両地点での比較が必要である。汚染物質と黄砂の関連を調べる目的で、東アジア有数の都市域である北京市内においても係留気球を用いた観測を行っている。各地点で採集された大気エアロゾル試料は後にエネルギー分散型X線分析器(堀場、EMAX-500)搭載の走査型電子顕微鏡(日立、S-3000N)により粒子個々に観察、分析された。その結果、発生源地域上空、自由対流圏で採集された(より長距離輸送に寄与すると思われる)黄砂の粒子表面は季節を問わず「きれい」な状態にあったことがわかった。一方、風下地域で採集された黄砂の粒子表面には硫酸塩等の存在が確認されている。黄砂に含まれる硫黄の含有量が母体となる黄砂の組成、採集時の相対湿度などに依存していたことから、風下における硫酸塩の存在は粒子表面で起きる不均一反応によりSO_2が酸化され、生成した結果であると指摘した。以上の結果は学術雑誌に投稿準備中である。
高齢マウスを用いた認知機能低下を反映するバイオマーカー研究

本研究では,これまでの研究成果を応用させ,認知機能の低下とその生物学的マーカーの探索を行う。そこで,高齢マウスの認知機能低下のレベルと組織学的所見,血液学的所見を検討する。これにより,認知機能低下を細胞外マトリックス分子の変化の点から理解し,認知機能経過の予測を行える検査の確立,治療薬の探索に繋げる。