hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フィリピンにおけるデング熱媒介蚊の集団遺伝学的研究：飛翔パターンと感染経路

また,2015年12月にインドネシア・バンドンにおいて,国際シンポジウム“Overview of Facts In The Field Againts Mosquitoes, Dengue Virus, Human And Problems in Bandung City"を開催し,気候変動や社会変動に伴うデング感染リスクに関する研究発表や意見交換を行った。フィリピンのメトロマニラとターラックにおいて,デングウイルスを媒介するネッタイシマカ成虫を採捕して,DNA多型解析を行った。その結果,蚊の交流範囲や蚊の飛翔範囲が5km未満など,デングウイルスの伝播範囲の予測に繋がるベクターの空間生態を明らかになった。また,メトロマニラの全604行政区における洪水強度と土地利用区分に関するGISデータを整備し,これらを説明変数として,行政区間のデング感染率(人口当たり感染数)の違いを記述する回帰木モデルを作成した。高い精度で実測されたデング感染率を説明するモデルが構築され,洪水がリスク因子としての寄与率が高いことも示された。予定通り,課題14を進捗することができたので,順調に進展と評価できる。27年度が最終年度であるため、記入しない。生態疫学H26年度にサンプル準備、分子生物学的解析のプロトコル作成はほぼ完了したので、これら成果に基づいて、H27年度に予定通り研究を完了する。現地タクラバンにおける台風災害の影響を受けて一部調査地点の変更があったものの,迅速に大体調査地(ターラック)を選定して調査を開始できたので,概ね計画通りに順調に進展していると判断できる。今年度予定にしていた次世代DNAシークエンシング解析等の一部の分子生物学的実験を次年度に繰り越して行う実験計画に変更したため。分子生物学的実験に必要なネッタイシマカサンプルを十分量に採取した後に,DNA情報を使った蚊の集団遺伝解析およびウイルスRNA解析による蚊集団のデング感染率を解明していく。さらに,GIS解析を開始して,土地情報や雨季の出水情報を整理し,蚊の生息環境条件や気候変動に伴う蚊幼虫の生息分布予測に必要なデータ収集にも着手する。分子生物学的実験の消耗品や委託解析費として主に使用する計画である。今年度から一部開始する予定にしていた次世代DNAシークエンシング解析等の分子生物学的実験を次年度にまとめて集中して行う実験計画に変更したため。
腫瘍血管内皮細胞の革新的分離法の確立とそれを標的とした新規血管新生阻害療法の開発

本研究では癌に特有な微小環境下に存在する腫瘍内血管内皮細胞において正常な血管内皮細胞と比較して生物学的特性が異なることに着目して、1選択薬剤耐性遺伝子およびEGFPを血管内皮細胞において特異的に発現するトランスジェニック・マウス(TGマウス)を作製し、分離と継代培養が容易ではない腫瘍血管内皮細胞を純度を保ちながら培養するための革新的分離法を確立する。2得られた腫瘍血管内皮細胞の生物学的特性を解析して、特異的に発現する遺伝子産物の機能を抑制する阻害剤や腫瘍血管内皮細胞の細胞機能に対してのみ抑制効果を示す低分子化合物を探索・同定して、より特異性の高い癌の新規血管新生阻害療法の開発を目的とする。
頭頸部癌におけるcyclin D1標的sgRNAによる新規遺伝子標的治療の開発

新たな遺伝子発現抑制法であるTRUE gene silencing法によってcyclin D1 mRNAを標的としたsgRNAを用い,頭頸部扁平上皮癌細胞のcyclin D1の発現抑制を介して癌細胞の増殖を抑制できることを培養細胞で明らかにすることができた。臨床の場においてcyclin D1強発現を有する頭頸部癌患者さんに対し、cyclin D1 mRNAを標的としたsgRNAの投与を行うことで腫瘍の縮小・生存率の向上を確認することができれば、これら遺伝子標的治療が革新的な治療手段のひとつとして加えられる可能性を有していると考えられる。本研究では、頭頸部癌術後の局所再発リスクであるcyclin D1高発現群に対する新規追加治療を開発するため、「cyclin D1を標的としたsmall guide RNA(以下sg RNA)の付加により頭頸部癌細胞株のcyclin D1遺伝子mRNAの標的塩基配列を切断すること、cyclin D1蛋白量を減少させることを確認し遺伝子標的治療としての妥当性を確認し遺伝子標的治療としての妥当性を確認」、「sg RNA付加による頭頸部癌細胞の増殖抑制による治療効果を確認」を目的としている。また、マウスモノクローナル抗体を用いたcyclin D1の免疫組織学的発現と、局所再発・生命予後に関する臨床研究は並行して行っており、腫瘍組織内におけるcyclin D1高発現群および、切除断端におけるcyclin D1高発現群においては、局所再発リスクの増加・生命予後の低下に関わることが確認されている。これらの研究成果に関しては日本頭頸部癌学会等の国内学会で発表しており、他施設の研究者からの意見を取り入れることにより、今後の研究のブラッシュアップにつなげたいと考えている。TRUE gene silencing法を用いCCND1を標的とした数種のsgRNAを設計し,頭頸部癌細胞培養系においてこれらの導入によるCCND1発現抑制および増殖抑制作用を調べることを目的として下記の実験を行い研究実績を得た.【結果】HSC-2およびHSC-3細胞いずれの細胞でも,CCND1 mRNA量は,各種sgRNAの導入によって20-70%のレベルに低下した.これらのsgRNAのCCND1発現抑制効果は,lipofectamineを用いないで培地に加えただけの場合でも認められた.設計したsgRNAの標的部位によって抑制効果には差があり,HT型では,HT-2, HT-5による抑制効果が大きかった.sgRNAのHT型,H型およびL型の違いはCCND1発現抑制活性には大きな差異は認められなかった.Western blotによる検討から,sgRNAの導入によってCCND1のタンパク質レベルも低下した.【研究実績】以上の研究から,新しい遺伝子発現制御法であるTRUE gene silencing法を用い,適切に設計されたsgRNAの導入によって,頭頸部癌細胞であるHSC-2およびHSC-3細胞においてCCND1の発現を抑制させることが明らかになった概ね研究計画通りに進捗している.【実験内容】ヒトcyclin D1 mRNAの二次構造を解析し、5'-half-tRNA (HT)型・heptamer (H)型およびlinear (L)型のsgRNA (sgHT1-6, sgH1-6およびsgL1-6)を設計し、これらの2'-O-methyl化したRNAを化学合成した。ヒト頭頸部扁平上皮癌細胞株であるHSC-2もしくはHSC-3細胞を培養用プレートに播種し、種々のsgRNAを導入した。さらに細胞を培養後、全RNAを抽出し、リアルタイムPCR法によりcyclin D1 mRNA量、ウエスタンブロット法によりcyclin D1、RBおよびpRBのタンパク量を測定した。また、sgRNAに加えてシスプラチンの添加を行い、その効果について調べた。【実験結果】HSC-2およびHSC-3細胞におけるcyclin D1 mRNA量は、設計した各種sgRNAの導入によって20-70%のレベルに低下した。設計したsgRNAの標的部位によって抑制効果には差があり、HT型ではsgHT-2およびsgHT-5による抑制効果が大きいことが判明した。これらの2'-O-methyl化したsgRNAはトランスフェクション試薬を用いないで培地に加えただけで,細胞内に取り込まれ核周辺の細胞質に局在し、加えたsgRNAの量に応じてcyclin D1 mRNAレベルが低下した。cyclin D1のタンパクレベルについても同様に減少が認められた。Cyclin D1の標的であるRBのリン酸化も抑制された.これらのsgRNAの導入によって、HSC-3細胞の細胞周期がG1/G0期の割合が増加し,細胞のDNA合成量が減少した。sgRNAのタイプ(HT型,H型およびL型)による違いはcyclin D1発現抑制活性には大きな差異は認められなかった。平成26年度実験において、TRUE gene silencing法が頭頸部癌細胞において機能することを立証できた。これは本研究の根幹をなす部分であり、これを立証できた成果は小さくないと考える。

sgRNAをトランスフェクト後、シスプラチン(CDDP)添加し、生細胞数をMTT法,Capase3/7活性をCaspase-Glo 3/7 Assay Systemsを用いて測定することで、遺伝子発現及びタンパク発現のみならず生細胞数が減少していることを確認しsgRNAが有する抗がん効果を検証する,耳鼻咽喉科研究計画書に従い、今後は最も効果的なcyclin D1遺伝子の標的領域・sgRNAの型をRT-PCR法によるcyclin D1遺伝子mRNA発現低下量の定量により比較し決定する。2015年度は当初の予定より参加学会が少なく、旅費が予定より少なく計上された.学会参加費及び学会参加のための旅費が、当初の予定よりも低額に収まったことによる。最終成果に関して、学会発表および英文誌投稿を予定しており旅費および英文校正費、掲載料が必要となる見込みである.学会参加費・学会参加のための旅費、英語論文校正のための費用、実験器具等の購入に充てる予定である。
分子から社会までの統合的アプローチによる自己制御の形成・修復支援

人間の精神機能は、自分自身を知り(自己意識・自我・メタ認知[=自分自身の認知・行動を対象化し、自己像として認識すること])、社会環境適応的な自己制御性を持つという、他の動物にない特長を持つ。ヒトの自己制御をその神経基盤も含めて包括的に解明し、それにもとづいて自己制御の形成・修復の支援方法を開発することは、精神疾患が急増していることを鑑みれば喫緊の課題である。本領域では、5年間の研究を通して、自己制御の障害を呈する思春期精神病理における神経基盤を明らかにし、自己制御の支援方法を具体的に提案することに成功した。本研究(A03)では,思春期における精神機能の自己制御の形成過程(A01)と神経基盤(A02)の理解にもとづき,思春期の若者が精神機能の自己制御性を育み,自己を発展させ,成熟した人間形成に至る過程の支援策(分子,神経モジュレーション,心理社会的介入)を開発する.笠井は,多チャンネルNIRSによるニューロフィードバック法を開発し,随意的に酸素化ヘモグロビン上昇・下降をコントロール出来る可能性を見出した.サルとヒトで実施可能な協調運動課題を作成,その神経基盤や種間差を検討した(A02連携).思春期コホートサブサンプルに対し,神経画像計測の準備を進めた.第二次性徴前後での認知・情動・行動の制御と発達に関わる神経回路について,仮説を精緻化した(A01連携).田中は,神経性無食欲症患者(26例)と健常者(20例)に,身体指標計測,頭部MRI撮像,神経心理検査,fNIRS,顔画像認知試験を行った.Situation Reality技術を,神経性無食欲症患者への支援導入可能性について検討した(A02連携).村井は,対人コミュニケーションにおける衝動性・リスク態度・社会選好の自己制御メカニズムを明らかにし,対人コミュニケーションにおける自己制御支援策開発を進めた.(1)健常者,(2)統合失調症患者,(3)脳損傷患者,(4)依存症患者,(5)発達障害者を対象として,心理課題・機能的MRI課題作成とデータ収集,構造MRI画像データベースの構築と心理指標との関連の検討,心理測定ツールの開発を順次進めた.山脇は,情動・気分の自己制御能力修復支援法開発に向け,新入大学生の大うつ病エピソード発症に関するコホート研究を,24年4月より開始する準備を進めた.また,山梨大学と共同し,気分障害患者への経頭蓋直流刺激法(tDCS)について研究を進めた.ラットによる検討では,母子分離と離乳後の単離飼育による,Social Interaction Testでの接触行動低下を見出した.山崎は,言語・認知による自己制御支援法(メタ認知訓練法)の効果と脳基盤検討のため,統合失調症患者に実施する施行者のトレーニングとセットアップ,パイロット施行を行い,継続的な施行体制を確立した.笠井は、思春期に発症し自己制御障害を呈する統合失調症患者を対象にした包括的な生物学的研究を推進した。また、健常者の社会的関係性などに深い関わりを持つ主観的Quality of Lifeの神経基盤の検討を行った。さらに、思春期の自己制御の発達の脳基盤を解明するため、A01との密接な連携により、10代の児童に対するホルモン・エピゲノム・神経画像の計測を開始し、これまでに40組の親子にMRI撮像を行った。村井は、衝動性・依存・社会行動障害という自己制御の障害の諸側面に注目し、支援策開発を進めた。特に統合失調症患者において自己制御に関わる脳構造の変化と、心理指標との関連を見出した。岡本は、精神の自己制御性の獲得によるうつ病発症予防介入に向け、新入大学生を対象として行ったコホート研究に引き続き、認知行動療法を用いた無作為割付比較試験として、リスク群に対して介入を開始した。また、認知行動療法に参加した17名に対してfMRIを用いて自己制御評価の脳賦活課題を行い、介入前後で課題遂行中の脳活動が変化する傾向を見出した。田中は、神経性無食欲症患者の脳機能および構造画像を検討することで、社会的孤立の認知傾向の健常者との違いなどに関する示唆を得た。山崎は、言語・認知による自己制御支援法の効果検討のため、精神病症状を持つ患者にメタ認知訓練法の施行を継続し、プログラム前後で生活機能全般の改善を認めた。A02-A03連携によるサルEcoGとヒトfMRIでの共通の計測系を用いた社会的文脈理解の脳基盤研究では予備的な検討を行った。また、岡本らによるうつ病発症に関するコホート研究と、A02の自己制御の神経基盤に関する画像研究の連携を開始した。笠井は、統合失調症の早期段階におけるガンマ帯域反応の異常を明らかにし、思春期におけるGABA神経伝達系の成熟における異常を示唆した。思春期の自己制御の発達の脳基盤を解明するため、A01との連携により10代児童のホルモン・エピゲノム・神経画像の計測を継続し、自己制御の指標と脳形態に有意な正の関連を見出した。統合失調症の代謝関連物質による治療法を開発するため、その意義を分子生物学的に明らかにし、当該物質の自主臨床試験開始に結びつけた。NIRSを用い、メタ認知機能を担う前頭極の賦活とメタ認知的信念尺度に関連を認めた。山崎は、統合失調症を対象としたメタ認知訓練法により、自尊心の有意な改善を認めた。A02-A03連携としてサルとヒトの社会性・メタ認知の神経基盤を比較検討する共同研究を推進した。藤井らのサル用課題をもとに作成したヒトfMRI用の情動認知課題を用いて12名の健常者でfMRI撮像を行った。

この際の経時的な脳活動のパターンはA02藤井のサルでの結果と類似し、情動認知過程における相同の神経基盤の存在が示唆された。村井は、うつ病における共感性の変化に関わる神経基盤をfMRIを用いて示唆した。外傷性脳損傷では、社会認知と機能的予後の相関を示した。病的賭博については、島皮質の賦活が罹病期間と相関していることをfMRIを用いて示した。岡本は、精神の自己制御性の獲得によるうつ病発症予防介入に向け、新入大学生を対象として認知行動療法を用いた無作為割付比較試験を行い、閾値下抑うつの改善を認めた。行動活性化が、閾値下うつの大学生のメタ認知およびそれに関わる神経基盤に変化をもたらすことを示した。田中は、神経性無食欲症患者41名、健常者43名の脳機能・構造画像を検討することで、社会的孤立の認知傾向が健常者と異なる示唆を得た。患者34名からゲノムサンプルを採取し5例に希なゲノムコピー数変異を認めた。笠井は、分子・神経モジュレーション・心理社会的アプローチによる思春期精神病理への支援方法の開発を続けた結果、特定物質の自主臨床試験の開始につなげた。また、神経モジュレーション法としてのニューロフィードバック法の有用性を見出すとともに、心理社会的介入法としてのメタ認知訓練法についても自己制御の重要因子である自尊心に改善を見出した。これらのことから、分子・神経モジュレーション・心理社会的アプローチのいずれにおいても、当初の計画以上に支援方法の開発が具体的に進展していると考えられた。村井らは、衝動性・依存・社会行動障害という自己制御の障害の諸側面に注目し、メカニズムを検討し、支援策への示唆を得ることを目的とした。並行して複数のデータ収集・解析を実施し、順に学術論文として公表されている。岡本らは、精神の自己制御性の獲得によるうつ病発症予防介入に向け、新入大学生を対象として行ったコホート研究に引き続き、認知行動療法を用いた無作為割付比較試験を行い、閾値下抑うつの改善を認めたが、これは予定通り平成26年12月に終了できた。田中らは、神経性無食欲症患者において、言語流暢性課題中の賦活効果が健常群と比較して乏しく、さらに健常者群で眼窩部血流と社会不安指標との間の負の相関を認め、社会的孤立の認知傾向の群間の違いを示唆し、英文誌に掲載された。A01-03連携である思春期コホートサブサンプル研究では、10代児童に対する疫学・ホルモン・エピゲノム試料の採取、MRI親子撮像を開始し、これまでに150組という国際的に見ても大規模なサンプルサイズの収集を果たした。A02-A03連携としてサルとヒトの社会性・メタ認知の神経基盤を神経画像ベースで比較検討する共同研究を開始し、サルとヒトで相同の結果を示したことも、これまでに類をみない研究成果であると考えられた。笠井は児童思春期の自己制御障害のモデル疾患である注意欠如多動性障害(ADHD)に対して、塩酸メチルフェニデート徐放剤の効果を、光トポグラフィー検査により予測できることを明らかにし、分子による自己制御修復の支援方法選択のバイオマーカーとなる可能性を示した。また統合失調症の前駆状態や初回エピソードの患者において、ガンマ帯域反応の潜時成分により異常のパターンが異なることを明らかにし、思春期精神病理の修復支援のバイオマーカーとなる可能性を見出した。
移植後冠状動脈硬化症の分子生物学的病因解明と遺伝子治療技術を応用した防止策の開発-In Situ PCR法による病因遺伝子同定の試み-

まず、移植心浸潤細胞をIn vivoに追跡するために雄性遺伝子DNAを標的としたPCR In situ hybridization法の確立を試みた。組織固定法、Protease処理条件、PCR条件、Primer及びProbeの選択などの条件を検討したが、満足すべき特異シグナルを得るに到らず、本法の確立にはなお研究が必要であることが明らかとなった。そこで約40種のラットサイトカイン、増殖因子のRT-PCRによる半定量法の確立に着手し、これについては移植心組織を用いた各種増殖因子mRNAの定量が可能である事が明らかとなった。今後慢性拒絶反応時の増殖因子mRNAの変化を解析する手段として応用する予定である。慢性拒絶反応の発症機序を分子レベルで解析する手法の開発を行うと同時に、戻し心移植法による慢性拒絶反応を細胞生物学的に検討した。一次宿主のT細胞またはマクロファージを抗体もしくはクロノロデ-ト投与により除去することで、慢性拒絶反応発症には移植後5日以内のCD4^+またはCD8^+T細胞とマクロファージによる初期免疫応答が必須であることが明らかとなった。また2次宿主にF1動物またはT細胞を欠くヌードラットを用いることで、慢性拒絶反応の発症に術後5日以後のT細胞によるアロ免疫応答は必須でないことが明らかとなった。今後のこのF1動物への再移植モデルにおいて血管内膜肥厚病変の進展と一次宿主からの浸潤細胞の推移、局所でのサイトカイン産生の関係を分子レベルで検討すべく研究をすすめる予定である。本年度はラット心組織を用いた組織上での浸潤細胞の由来同定を目的として、Rat Y染色体特異的SRY遺伝子のPCRIn Situ Hybridization法を確立すべく実験を行った。まずsolutionでの通常のPCRを行って、SRY遺伝子に対して合計10種類以上のPrimer setを設計し、PCRの効率及び至適条件を検索した。その結果、4種類のPrimer setでの高感度のSRY遺伝子検出が可能であった。合わせてrat Y染色体特異的繰り返し配列RN91ES8に対しても4種類のPrimer setで検討したが、何れも非特異的産物の形成が強く目的に合致した高感度の検出には不向きであった。そこで1細胞に1遺伝子と検出感度の面から技術的な困難は予想されるが、組織上でのPCR標的遺伝子をSRY遺伝子とすることに決定した。In Situ PCR法を行うには個々の組織に適した組織固定条件、Protease処理条件、PCR条件を決定する必要があるが、10%Formalin37度の条件で固定を行ったところ、16時間では固定が強すぎるために組織中のDNAが傷害されPCR signalが得られにくくなること、4時間では逆に組織固定が不十分でおそらくPCR産物が流出してしまうためにやはりPCR signalが得にくい事が明らかとなった。そこで現在8時間固定の心組織を用いてSRY DNAに対するPCR In Situ Hybridizationを検討しているが、現時点ではSignalの特異性、高いBackgroundの問題など実用までに解決されねばならない点が予想以上に多くあることが判明した。昨年度に引き続き雄性遺伝子DNAを標的としたPCR In situ hybridization法を確立すべく、組織固定法、Protease処理条件、PCR条件、Primer及びProbeの選択などの条件を検討したが、満足すべき特異シグナルを得るに到らず、本法の確立にはなお研究が必要であることが明らかとなった。そこで約40種にわたるラットサイトカイン、増殖因子のRT-PCRによる半定量法の確立に着手し、これについては移植心組織を用いた各種増殖因子mRNAの定量が可能である事が明らかとなった。今後慢性拒絶反応時の増殖因子mRNAの変化を解析する予定である。以上の如く慢性拒絶反応の発症機序を分子レベルで解析する手法の開発を行うと同時に、戻し心移植法による慢性拒絶反応を細胞生物学的に検討した。

また2次宿主にF1動物またはT細胞を欠くヌードラットを用いることで、慢性拒絶反応の発症に術後5日以後のT細胞によるアロ免疫応答は必須でないことが明らかとなった。今後もこのF1動物への再移植モデルにおいて血管内膜肥厚病変の進展と一次宿主からの浸潤細胞の推移、局所でのサイトカイン産生の関係を分子レベルで検討すべく研究をすすめる予定である。
地域社会における社会階層と社会的ネットワークに関する計量社会学的研究

近年、社会関係資本やソーシャル・キャピタルが脚光を浴びているが、その中でもネットワークの指標は、主観的なものから客観的なものまで様々な測定の仕方がある。例えば、社会的資源を測定するためにしばしば用いられる地位ジェネレータは測定が簡便で効率がよいが、指標の妥当性・信頼性を明らかにする研究が十分に蓄積しているとはいえない状況にある。本研究では、大阪府吹田市、東京都世田谷区における無作為抽出による郵送調査データを用いて比較分析を行った。社会的ネットワークの指標の一つとして、社会階層と社会移動に関する全国調査1995年B票調査で用いられている地位ジェネレータを参考に、親戚・近隣・友人におけるネットワークについて分析を行った。その結果、(1)両地域における社会関係資源を表す潜在変数の測定不変と地位ジェネレータの枠組みの支持、(2)その上での、医師・弁護士などの専門職、会社の社長や役員、小売り店主・飲食店主などで表される社会関係資源における有意な地域差、などについて、平均構造モデルでの分析結果を得た(n=945,CFI=98,df=122,χ2=182.4,χ2/df=1.5,RMSEA=.03,IMPS 2007,the 15th International and 72nd Annual Meeting of the PsychometricSocietyにて発表)。今後、新たに実施した群馬県桐生市における調査データを含めての分析により、分析・知見の一般性の確認と地域差の切り分けを進め、地位ジェネレータによって構成される社会関係資源/他の測定方法によるネットワーク指標と、社会階層変数の関連を分析することで、経済的な側面以外の格差メカニズムに注目していくことが重要である。社会的なサポートや資源、情報網、準拠枠などとして様々な形で作用する社会的ネットワークを把握するために、多様な測定方法の比較と関連についての基礎作業や分析を行った。まず、ネットワーク指標の分析のために、吹田市、世田谷区における地域調査データの整備と比較分析を行い、社会的属性と社会的ネットワーク指標の関連の強さを探った。また、ポジション・ジェネレータにおける、測定に含める職種の取捨選択の基準について検討を行った。それぞれのネットワーク指標は、社会領域と職業領域の複数の因子から影響を受けるものとして、構造方程式モデリングによる分析を行ったところ、CFI=.983.985であり、適合度は悪くなかった。この分析をもとに、吹田市と世田谷区のデータを用いて多母集団の同時分析を行った結果、適合度は、配置不変モデルにおいてAGFI=.950、CFI=.989、測定不変モデルにおいてAGFI=.952、CFI=.989、分散共分散の等価制約を施したモデルではAGFI=.948、CFI=.984等となった。以上から判断すると、今後、さらに他の地域や異なる条件での分析を積み重ねる必要はあるものの、今回測定した指標間の関連は、ある程度安定しているものと考えられる。これらの分析結果については日本行動計量学会、日本大学社会学会などにおいて発表した。また、主観的・客観的な様々なネットワーク指標の検討と探索的な分析を行うためにサンプル数700程度の自記式調査票調査を実施し、様々な指標間の関連について検討を進めている。
興奮性シグナルによるAMPK活性化とGABAB受容体の脱感作抑制機構の解明

GABA_B受容体R2サブユニットのAMPKによるリン酸化部位p783レベルの上昇は、同受容体の脱感作を抑制する。p783レベルはDMEM培地で培養した神経細胞に対してNMDAを曝露することで増加した。一方このリン酸化部位は少なくともin vitro実験系でAMPKの活性低下とともに、容易に脱リン酸化されることが判明した。したがってGABA_B受容体の作用はAMPKの活性化に対して鋭敏に影響されることが示唆される。マウス胎児由来初代培養神経細胞におけるGABAB受容体の783番目のセリン残基のリン酸化(p783)がグルタミン酸受容体の作動により増加するメカニズムを解明するため、より興奮性毒性に対する応答が良い培養条件を検討することにした。初代培養方法には種々あるが、現在もっともポピュラーといえるNeurobasalにB27サプリメントを添加した培養条件では、p783はほとんど検出されなかった。一方、DMEM/F12を基礎培地とした条件ではp783が強く認められた。後者の条件では培養6-8日目以降、アポトーシスが起こり始めることから、この培養条件ではグルタミン酸等による興奮性毒性が生じ、それに応答してp783がリン酸化しているのではないかと推察された。神経系幹/前駆細胞(以下、神経系前駆細胞)は、レチノイン酸曝露により、神経細胞に分化誘導可能な細胞である。分化誘導された神経細胞には、グルタミン酸作動性およびGABA作動性神経が含まれていることが知られている。したがって、中枢神経系の発達段階のAMPK及びGABA受容体の重要性を調べる目的で、本年度は分化前の神経系前駆細胞の単離・培養と、AMPK・GABA及びそのリン酸化を中心に培養条件を検討した。マウス胎児から調製した神経系前駆細胞には、AMPKが発現していること、およびそのリン酸化が同細胞に特徴的な細胞塊、ニューロスフェアの形成に応じて増加することが判明した。AMPK活性化剤メトホルミンあるいはAMPK活性阻害剤C化合物を曝露すると、神経系前駆細胞の増殖はそれぞれ促進あるいは抑制されることが判明し、AMPKの活性依存的な増殖制御の可能性が示唆された。このリン酸化にはリアノジン受容体からのカルシウム流出が関与する可能性が示唆された。今後はこれら神経系前駆細胞の分化誘導を行い、AMPKによりGABAB受容体のリン酸化への影響の解析へと移行したい。抑制性神経伝達を担うGABA_B受容体の二つのサブユニットR1及びR2のうち、R2の783番目のセリン残基(S783)は、5'-AMP活性型キナーゼ(AMPK)によりリン酸化される。AMPKの触媒サブユニットの172番目のスレオニン残基(T172)は、カルモジュリンキナーゼキナーゼ(CaMKK)によりリン酸化されることから、AMPKは興奮性刺激に応答して活性化することが考えられる。本研究では、培養日数経過に伴うNMDA受容体の機能的発現、R2の発現及びS783のリン酸化レベルの変動について解析した。方法として、マウス胎児大脳皮質から調製した神経細胞を、基礎培地としてNeurobasalまたはDMEM/F12を用いて培養した。細胞内蛋白質の発現及びリン酸化の変動をウェスタンブロッティング法により解析した。NMDA受容体の機能的発現はカルシウム指示薬(Fluo-4)の蛍光増加、神経細胞の生存はMTT還元能の測定により確認した。その結果、いずれの培養条件でも、培養日数経過に伴い、NR1及びR2の発現は増加し、培養9日目でNMDA曝露に伴うCa^<2+>イオンの流入が確認された。一方で、培養日数経過に伴い、R2発現に対するS783の相対的リン酸化レベルは減少した。培養9日目の細胞生存率はDMEM/F12による培養条件下では、Neurobasalよりも減少し、細胞生存率が低いDMEM/F12による培養条件ではS783の相対的リン酸化レベルが比較的高値傾向が認められた。培養8日目の細胞にNMDAを15分間曝露したところ、AMPK及びR2のリン酸化のレベルが増加した。以上のことから、NMDA受容体の新規シグナルとしてAMPK活性化を介したGABA_B受容体R2サブユニットS783のリン酸化が明らかとなった。また、S783のリン酸化レベルが神経細胞の分化や生存に関与する可能性が推察される。
ケミカルバイオロジーに基づいた骨形成促進剤の開発に向けた 戦略的研究

破骨細胞あるいは骨芽細胞の分化に作用する新規小分子化合物の探索は,新たな歯槽骨の吸収抑制あるいは再生医療技術に結びつく可能性がある。本研究で我々は, NFAT/ルシフェラーゼレポーター破骨細胞前駆細胞およびI型コラーゲン/GFPレポーター骨芽細胞を用いたハイスループットスクリーニングシステムを構築し,これらのスクリーニングシステムを用いることで,破骨細胞あるいは骨芽細胞の分化に作用する小分子化合物を高い信頼性をもって検出することに成功した。これらの成果は,今後の骨形成を促進する新規化合物の開発に貢献するものと期待される。抜歯、歯周病等に起因する歯槽骨吸収を抑制し、失われてしまった歯槽骨を再生することは、補綴歯科治療の良好な予後のために非常に重要な課題である。本研究の目的は、ケミカルバイオロジーのアプローチによって、多数の生理活性小分子化合物の中から骨代謝を骨形成に強力に促す分子を同定し、補綴歯科治療において切望される歯槽骨形成治療薬として臨床応用へと展開するための研究基盤を確立することである。本年度は、破骨細胞分化に重要な役割をするNFAT活性を指標としたルシフェラーゼレポーター破骨細胞株を用いて、オーファンリガンドおよびLOPAC小分子化合物ライブラリーのスクリーニングを行った。その結果、破骨細胞分化に抑制的に作用する数十種類の化合物を同定している。一方で、骨芽細胞分化の初期マーカー分子である1型コラーゲンを指標としたGFPレポーター骨芽細胞前駆細胞株を用いて同様のライブラリースクリーニングを行い、骨芽細胞分化に作用する化合物を同定した。さらに、スクリーニングに際してレポーター骨芽細胞前駆細胞株のGFPを検出すると同時に、骨芽細胞分化マーカーであるアルカリフォスファターゼ活性を染色によって検出し、結果を比較検討することで、骨芽細胞分化促進化合物を簡便で高い精度でスクリーニングを可能にするシステムを構築した。これら二種類のレポーター細胞を用いることで、破骨細胞分化抑制作用を有し、かつ骨芽細胞分化促進作用を有するいくつかの小分子化合物を同定している。現在、これらのヒット化合物が間葉系幹細胞あるいはiPS細胞の骨芽細胞分化にも同様の作用を有するか否かを確認し、細胞内における化合物の作用機序の解析を進めている。前年度は,破骨細胞レポーター株および骨芽細胞レポーター株を用いてケミカルライブラリースクリーニングを行い、破骨細胞分化に対して抑制的に作用し、骨芽細胞分化に対して促進的に作用するいくつかの化合物を検出した。本年度は、得られた骨形成促進因子候補化合物のなかで、スクリーニング結果から骨芽細胞分化を促進する可能性の高いものを3つ選択し、実際に骨芽細胞の分化に作用するか否かを、前駆骨芽細胞株および間葉系間細胞を用いて、アルカリフォスファターゼ活性(ALP染色)、細胞外基質の石灰化(von Kossa染色)、骨芽細胞分化特異的遺伝子発現(リアルタイムRT-PCR法)について評価した。その結果、これらのヒット化合物候補は強力にこれらの細胞の骨芽細脚分化を促進することが明らかとなった。また化合物の細胞毒性についても、WST-1法,死プロテアーゼ蛍光検出法で評価し、これら3つの化合物の細胞毒性が低いことを確認した。今後は、これら化合物について、生体内で骨形成に及ぼす作用を動物実験で評価していく予定である。本研究の目的は、ケミカルバイオロジーのアプローチによって、数千種類もの生理活性化合物の中から骨代謝を骨形成に強力に促す分子を同定し、補綴歯科治療において切望される歯槽骨形成治療薬として臨床応用へと展開するための研究基盤を確立することである。前年度までに、破骨細胞レポーター株および骨芽細胞レポーター株を用いてケミカルライブラリースクリーニングを行い、破骨細胞分化に対して抑制的に作用する化合物、および骨芽細胞分化に対して促進的に作用する化合物を検出してきた。本年度は、検出した3種類の化合物(骨形成促進剤候補化合物)の細胞毒性について検討した。WST-1法、死プロテアーゼ蛍光検出法の結果、これら候補化合物は10μM以下の濃度では細胞毒性を引き起こさないことが明らかとなった。また、これらの化合物が、マウスの骨芽細胞前駆細胞、間葉系幹細胞およびiPS細胞の骨芽細胞分化に促進的に作用することを、アルカリフォスファターゼ活性測定、RT-PCR解析およびvon Kossa染色法を用いて確認した。

また、候補化合物を頭蓋骨欠損ラット実験モデルに投与し、術後21日後の骨組織再生を、HE染色およびマイクロCT画像解析により評価した。その結果、頭蓋骨欠損部位への候補化合物の投与は、骨組織体積および骨塩量を有意に増加させた。以上の結果から、本研究で構築したスクリーニングシステムは、骨芽細胞分化促進因子の検出を良好な信頼度で可能とすることが示唆された。今後、本研究で得たヒット化合物が標的とする骨芽細胞内の分子機構を明らかにし、各化合物の薬理活性を化学的な修飾によって向上することで、骨再生医療への創薬へつながることが期待される。本研究課題は、ケミカルバイオロジーのアプローチによって、多数の生理活性小分子化合物の中から骨代謝を骨形成に強力に促す分子を同定し、前槽骨形成治療薬として臨床応用へと展開するための研究基盤を確立することを目的にしている。これを達成するために、本年度までに効率的なスクリーニング法を確立し、これから3つの候補化合物を同定している。24年度が最終年度であるため、記入しない。本年度までの研究成果により同定した3つの化合物候補について、今後は予定通り、試験管内だけではなく、生体内でも骨再生作用を有する可能性を動物実験によって検証していく予定である。評価には,ラット頭蓋骨欠損モデルによる骨形成評価法を用いる予定であり、現在手術方法および骨組織再生を評価する時期について予備実験を進めている。
標的組換えによるガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の発生過程での機能解析

1.標的遺伝子組換え用ベクターの作製マウス129系統の染色体DNAライブラリーより単離したβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ(Gal Tase)遺伝子をもとに標的遺伝子組換え用ベクターを作製した。Gal Tase遺伝子の第1エクソンの翻訳開始コドンを含む0.4kbの領域を削除して、代わりにポジティブ選択用のネオマイシン耐性遺伝子を挿入し、5'末端にはネガティブ選択用のジフテリアトキシンA断片遺伝子を結合したベクターを作製した。5'側の相同領域は6.2kb、3'側の相同領域は1.7kbで、3'側の領域でPCR法により相同組換え体を検索できるようにプライマーを設定した。翻訳開始領域を削除しているので、相同組換えにより置換すれば、Gal Taseは全く合成されないはずである。2.相同組換えES細胞の単離このベクターをR1というES細胞に導入して、G418耐性のコロニーを多数単離し、PCR法で検索したところ、180個のうち12個という高い頻度で陽性クローンが得られた。サザン・ハイブリダイゼーション法で調べたところ、このうち9個のクローンが相同組換え体であることが確認された。形態的に未分化状態をよく保持しているクローンを3個選び、キメラマウスの作製を行った。通常よく行われている胚盤胞への注入法ではなく、10-15個のES細胞塊を2個の8細胞期胚ではさみこむ集合キメラ法を用いた。すでにIL-1β遺伝子を欠損させたR1細胞を用いて、この方法により非常に効率よく生殖系列キメラマウスを作製した実績がある(浅野ら未発表)。実際この場合も、3個のうち2個のクローンから19匹のキメラ率70%以上の雄のキメラマウスが得られた。現在、交配により生殖系列への伝達を調べているところであるが、IL-1βの経験から今年度中にはGal Tase欠損マウスが得られることは間違いない。Gal Tase遺伝子欠損マウスができれば、マウス発生過程におけるGal Taseの機能を詳細に解析して行きたいと考えている。
酸化物系全固体電池に適した微細構造の解明と設計

放電プラズマ焼結(SPS)法を用い「緻密化」と「微構造」を両立した高イオン伝導性の酸化物系固体電解質(SE)層や、SEと活物質が均一分散した電極複合体を作製し、高速充放電可能なフルセルを構築するための技術開発を行っている。本年度は、固体電解質層の焼成炉による焼結、SPS法による焼結、酸化物系イオン伝導性ガラスを分散させることによる焼結の検討を行った。酸化物系ガラスとして、低融点・高イオン伝導性を示す擬2成分系混合アニオン組成を組み合わせたLi4SiO4-Li3BO3系ガラスを双ローラ超急冷装置により作製し、微細化した後、粒径を調製したLiLaZrO2(LLZO)固体電解質に分散させ、成型後焼結を行った。LLZOだけを焼結した場合は緻密化するには1150°Cの高温が必要だったが、SPS法による焼結により800°Cでの焼結で十分緻密化していることがわかった。また、超急冷ガラスを微細化・混合した場合、通常の焼成炉による800°Cでの焼結でも非常に硬く焼結されていた。FE-SEMにより断面を観察した結果、超イオン伝導性ガラスとLLZO固体電解質粒子間には空隙がなく、緻密な成型体が形成されていることが分かった。また、LLZOの粒子サイズは、焼結前とほとんど変わらず、通常の焼結やSPS焼結で観測された粒成長が起こっていないことがわかった。超イオン伝導ガラスの導入により、「緻密化」と「粒成長を抑制した微細粒子からなる微構造」を両立した、高イオン伝導性の固体電解質層を作製することができた。高イオン伝導性の酸化物系固体電解質の導入により、「緻密化」と「微構造」を両立した酸化物系固体電解質(SE)層や、SEと活物質が均一分散した電極複合体を作製し、高速充放電可能なフルセルを構築するための技術開発を行っており、本年度予定した「緻密化」と「微構造」を両立した固体電解質層の開発に成功したため、順調といえる。固体電解質と活物質が均一分散した緻密な電極複合体を作製し、高速充放電可能なフルセルを構築するための技術開発を行う。イオン伝導性の高い酸化物固体電解質である立方晶Li7La3Zr2O12(LLZO)を安定化させる目的で、Al、または、TaをドープしたLLZO粉末を、ゾルゲル法を用いて合成した。立方晶LLZOが得られる条件を見出し、これを遊星型ボールミルを用いて粒径約1μmに粉砕した。LLZOの放電プラズマ焼結(SPS)法により、焼結性とイオン伝導性について比較・検討した。SPSの焼結条件として、到達温度、プレス圧力、印加電流パルス幅、SPS雰囲気を変化させて、最適条件を探索した。1段目で高温・高圧・長パルス幅で短時間焼成し、2段目で低温・低圧・短パルス幅で長時間焼成してち密化を行った。用いたSPS装置では直流電流を流していたため、SPS焼結を行った電解質層は、カソード側にリチウムが偏析し、膜厚方向の組成ムラが認められ、組成ムラの抑制という課題が見出された。Liの偏析が解消される条件に付いては明らかにできなかったが、ポーラリティーの逆転によりすぐさま組成ムラが反転することが分かった。また、当初予定したナノサイズのLLZO粒子を用いた結晶配向性の有無の確認はできなかったが、VersaSTATを用いたバルク・粒界抵抗、イオン伝導性に対する結晶子サイズと配向性の影響について、データーを収集した。計画通り、LLZOにAl、または、Taをドープした立方晶LLZO粉末の合成をゾルゲル法を用いて行った。また、粒径1μmの立方晶LLZOが得られる条件を見出せた。また、ち密なLLZO結晶を作製するSPS焼成条件を見出した。ところが、焼結後のLiの偏析という課題を見出したため、交流印加等の検討も含め、若干の遅れが生じたので、深い検討は控えた。また、SPSプロセスによる結晶配向性の発現や、バルク・粒界抵抗、イオン伝導性に対する結晶子サイズと配向性の影響について、統一した解釈はできていないが、データーがさらに蓄積されれば、解釈が可能となるため、概ね順調と言える。

また、当初予定したナノサイズのLLZO粒子を用いた結晶配向性の有無の確認はできなかったが、VersaSTATを用いたバルク・粒界抵抗、イオン伝導性に対する結晶子サイズと配向性の影響について、データを収集した。その結果、特に相関関係は無く、イオン伝導性の改善の検討はできなかった。酸化物系の活物質と硫化物の組成比に傾斜を持たせた見当が、SPS装置では上手く行かなかったので、SPS処理の不要な硫化物系で検討した。負極としてLi3PS4-Si、正極としてLi3PS4-NMCーグラファイト系で、固体電解質層の比率を変えて検討したが、セル作製条件が見出せず、別組成系で検討している。酸化物系の組成傾斜の検討が、SPS装置では上手く行かなかったので、SPSの不要な硫化物系で検討した。負極としてLi3PS4-Si、正極としてLi3PS4-NMCーグラファイト系で、固体電解質層の比率を変えて検討したが、こちらも上手く行っていない。別組成系で検討の必要があるため。放電プラズマ焼結(SPS)法を用い「緻密化」と「微構造」を両立した高イオン伝導性の酸化物系固体電解質(SE)層や、SEと活物質が均一分散した電極複合体を作製し、高速充放電可能なフルセルを構築するための技術開発を行っている。本年度は、固体電解質層の焼成炉による焼結、SPS法による焼結、酸化物系イオン伝導性ガラスを分散させることによる焼結の検討を行った。酸化物系ガラスとして、低融点・高イオン伝導性を示す擬2成分系混合アニオン組成を組み合わせたLi4SiO4-Li3BO3系ガラスを双ローラ超急冷装置により作製し、微細化した後、粒径を調製したLiLaZrO2(LLZO)固体電解質に分散させ、成型後焼結を行った。LLZOだけを焼結した場合は緻密化するには1150°Cの高温が必要だったが、SPS法による焼結により800°Cでの焼結で十分緻密化していることがわかった。また、超急冷ガラスを微細化・混合した場合、通常の焼成炉による800°Cでの焼結でも非常に硬く焼結されていた。FE-SEMにより断面を観察した結果、超イオン伝導性ガラスとLLZO固体電解質粒子間には空隙がなく、緻密な成型体が形成されていることが分かった。また、LLZOの粒子サイズは、焼結前とほとんど変わらず、通常の焼結やSPS焼結で観測された粒成長が起こっていないことがわかった。超イオン伝導ガラスの導入により、「緻密化」と「粒成長を抑制した微細粒子からなる微構造」を両立した、高イオン伝導性の固体電解質層を作製することができた。高イオン伝導性の酸化物系固体電解質の導入により、「緻密化」と「微構造」を両立した酸化物系固体電解質(SE)層や、SEと活物質が均一分散した電極複合体を作製し、高速充放電可能なフルセルを構築するための技術開発を行っており、本年度予定した「緻密化」と「微構造」を両立した固体電解質層の開発に成功したため、順調といえる。SPSプロセスによる結晶配向性の発現や、バルク・粒界抵抗、イオン伝導性に対する結晶子サイズと配向性の影響について、統一した解釈を行うためのデーターの蓄積を継続する。また、SPSによる正極複合体(LCO/LLZO)の作製と正極ハーフセルの電気化学的評価、活物質(LCO)/SE(LLZO)界面の元素拡散を抑制するため、LCOコア-LLZOシェル型粒子を作製し、電極複合体層に用いる。さらに、LLZO粒子とLCOコア-LLZOシェル型粒子をニ層に充填して同時焼結接合し、対極にLi箔を張り付け、正極ハーフセルを作製する。充放電測定、及び、交流インピーダンス測定より、LLZO/LCO界面抵抗やLLZO粒界抵抗を調べる。
頭頸部癌におけるTLRの発現と生物学的意義の解明

Toll-like receptor(TLR)は自然免疫における重要なセンサーであり,種々の細胞に発現し免疫応答を誘導することが知られている。近年,癌細胞においてもTLRが発現していることが明らかとなってきたが,頭頸部癌でのTLRの発現およびその生物学的な役割についてはいまだ不明な点も多い。我々は頭頸部癌においてTLRの発現について検討した。8種類の異なる頭頸部扁平上皮癌細胞株を用いて, in vitroでmRNAおよび蛋白レベルでTLRの発現についての検討を行った。また, TLR2のリガンドであるPam3CSK4, TLR3のリガンドであるpolyinosine-polycytidylic acid(poly I : C)で細胞株を刺激しその変化について検討した。その結果,頭頸部癌においてTLRは発現しており,なかでもTLR2およびTLR3は強発現する傾向にあった。また,頭頸部癌においてTLR2を介する刺激を加えると細胞増殖が, TLR3を介する刺激を加えると細胞のアポトーシスが誘導されることが明らかとなった。さらに, TLR2を介する刺激は細胞増殖以外にも浸潤能増加にも関与が示唆された。これらの研究成果より, TLR2については頭頸部癌の増殖や浸潤に関わる因子として, TLR3については頭頸部癌のアポトーシスを誘導する因子として,いずれも臨床に直結する治療標的として応用が期待される。Toll like receptor (TLR)は自然免疫を担う重要なセンサーのひとつとして近年注目されている。TLRの各メンバーが病原微生物の構成成分をそれぞれ特異的に認識し,非自己の認識を司っている。また,TLRを介した自然免疫系の活性化は獲得免疫系の活性化への重要な橋渡しを行うため,免疫応答の最初のトリガーとしても重要な役割を担っていることが明らかとなってきた。一方で,最近の研究でTLRは各種癌細胞においても発現することがわかってきた。これまで,TLRは生体防御にきわめて重要な役割を担っていると考えられてきたが,生体を侵略する癌細胞自体がTLRを発現するという相反する現象が明らかとなり,その意義については非常に興味深い。これまでマウスの肺癌や血液疾患モデルを用いた研究で,TLRを介する経路で宿主のCTLや樹状細胞など自然免疫系が内因性に活性化され,抗腫瘍効果を示すといった報告は散見されるが,現在のところ癌細胞自体におけるTLRの役割についてはほとんど解明されていない。今回我々は,頭頸部扁平上皮癌細胞株において,in vitroでTLRの発現についての検討を行った。また,TLR3のリガンドであるpoly I:Cで細胞株を刺激し,その変化について検討した。今回の研究で我々は,頭頸部癌でも多くの細胞株でTLR2,3が発現しているが,その発現の程度は様々なこと,またTLR3を介する経路での癌細胞自身のアポトーシス誘導されることを解明した。さらに,その経路にはsurvivinが関与していることが示唆された。その結果,TLR3は将来的に頭頸部癌において新たな治療のターゲットとなりうると考えられた。一方で,最近の研究でTLRは各種癌細胞においても発現することがわかってきたが,現在のところ癌細胞自体におけるTLRの役割についてはほとんど解明されていない。前年度までに我々は,頭頸部扁平上皮癌細胞株において,in vitroでTLRの発現についての検討を行い,頭頸部癌においてはTLR2およびTLR3が強発現する傾向があり,TLR3のリガンドであるpoly I:Cで細胞株を刺激すると,TLR3を介する経路での癌細胞自身のアポトーシス誘導されることを解明した。本年度は,頭頸部癌細胞株をTLR2のリガンドであるPam3CSK4で刺激し,細胞増殖能に関与するかについて検討した。

その結果,TLR2の発現の程度によって,またリガンド濃度依存性に細胞増殖が誘導された。またその現象はTLR2発現ベクター導入後では促進され,siRNA導入後では抑制されることより,TLR2を介する刺激で癌細胞自体の細胞増殖が誘導されることが解明された。この結果,口腔内常在菌をはじめとする細菌感染が頭頸部癌の増悪因子のひとつとなっている可能性が示唆された。また,同じ癌細胞でもTLR2とTLR3の発現の程度は多様であり,さらにそれらを介する刺激でアポトーシスと細胞増殖という相反する現象が誘導されるという興味深い結果となった。Toll-like receptor (TLR)は自然免疫系の重要なセンサーである。近年,癌細胞においてもTLRが発現していることが報告されているが,その機能については未解明な点が多い。前年度までに我々は,in vitroでの研究で(1)頭頸部癌において発現の程度の差はあるがTLR2およびTLR3が強く発現する傾向があること,(2)頭頸部癌細胞株をTLR2のリガンドであるPam3CSK4で刺激すると添加後12時間をピークに細胞増殖がみられ,その増殖はTLR2の発現の程度およびリガンド用量に依存して生じること,(3)頭頸部癌細胞株をTLR3のリガンドであるpoly I:Cで刺激すると,添加後24時間をピークに細胞のアポトーシスが誘導され,そのアポトーシスはTLR3の発現の程度およびリガンドの用量に依存して生じること,(4)TLR3を介する頭頸部癌細胞株のアポトーシスにはsurvivinのdown-regulationの関連が示唆されることを明らかにした。本年度はTLR2が頭頸部癌において増殖促進能以外に浸潤能などに促進的に作用するかという点について検討を計画した。Pam3CSK4で刺激後,actinfilament, DAPIなどの蛍光染色を行い,共焦点レーザー顕微鏡にて細胞の形態を観察した。その結果,リガンド刺激後の細胞では,刺激しない細胞と比較して,phillopodial formationがみられた。またTLR2 siRNAを細胞株に導入し,同様にPam3CSK4で刺激を行ったところ,negative control siRNA導入群ではphillopodial formationがみられたが,TLR2 siRNA導入群ではphillopodialformationはみられなかった。この結果より今後の検討は必要であるが,TLR2を介する刺激は頭頸部癌細胞の浸潤能増加についても関与が示唆された。今後も頭頸部癌において新たな機能が解明される可能性がある。今回の研究成果より,TLR2については頭頸部癌の増殖や浸潤に関わる因子として,TLR3については頭頸部癌のアポトーシスを誘導する因子として,いずれも臨床に直結する治療標的として応用が期待される。
酸化チタンと共役ポリマーとのハイブリッドナノ構造複合体に関する研究

本研究は、酸化チタン光触媒の高性能化と可視光応答化を目的としている。合成戦略としては、酸化チタン表面に高分子やカーボンを固定化してナノ構造複合体を形成させ、酸化還元電位の制御を行う。ここでは、エレクトロスピニング法によって作製した酸化チタンナノファイバーを用いることで、材料の高比表面積化をねらう。当該年度の研究成果は主に以下の2点である。(1)酸化チタン-カーボンナノ構造複合体の合成と機能評価酸化チタンナノファイバー表面を親水化し、有機アルキル鎖シランカップリング剤を反応させることで、酸化チタン-カーボンナノ構造複合体を得た。カーボンおよび酸化チタンの複合体形成は、X線光電子分光測定によって確認した。さらに、光触媒活性は酸化チタンナノファイバーのみの場合より高くなり、かつ可視光に応答した。(2)酸化チタン-導電性ポリマーナノ構造複合体の合成と機能評価酸化チタンナノファイバー上でアニリンの酸化重合を行い、酸化チタン-ポリアニリンナノ構造複合体を得た。走査電子顕微鏡による観察の結果、酸化チタンナノファイバーの直径は複合体形成によって倍程度になっていた。酸化チタンの重量パーセント濃度が30%のとき、光触媒反応によるメチルオレンジの酸化分解速度は最大となった。以上の研究成果は後述する1件の学会発表として報告済みである。本研究で用いた手法は、比較的容易に光触媒の高性能化を達成できるため、新奇機能性材料としての応用が期待される。本研究は、酸化チタン光触媒のさらなる高性能化を目的としている。研究戦略としては、酸化チタン表面に高分子や貴金属微粒子などを固定化してナノ構造複合体を形成させ、酸化還元電位の制御を行う。ここで、エレクトロスピニング法によって作製した酸化チタンナノファイバーを用いることで、高比表面積化と材料としての応用をねらう。(1)酸化チタン-導電性ポリマーナノ構造複合体の合成と機能評価酸化チタンナノファイバー上でアニリンの酸化重合を行い、酸化チタン-ポリアニリンナノ構造複合体を得た。(2)酸化チタン-銀微粒子ナノ構造複合体の合成と機能評価酸化チタンナノファイバーを硝酸銀溶液中に浸漬し、還元剤を添加することで、酸化チタン-銀微粒子ナノ構造複合体を得た。銀および酸化チタンの複合体形成は、X線光電子分光測定によって確認した。さらに、光触媒活性は酸化チタンナノファイバーのみの場合より高くなった。以上の研究成果は後述する2件の学会発表として報告済みである。