hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
流動層内メゾスコピック反応解析モデルの構築

本研究では二酸化炭素吸着などに用いられる流動層を対象に流動層内メゾスコピック反応解析モデルの構築を行った。解析モデルの構成は、粉体の挙動については粒子ごとに離散要素法(DEM)を用いて粒子ごとの運動および反応の解析を行う。気体の運動については、Euler座標系のSMAC法を用いる。これらを組み合わせた、DEM-CFDモデルによりミクロスケールである粉体の運動および反応とマクロスケールでの気体の運動および反応を解析することができる。本モデルにより、反応プロセスの効率化が期待でき、循環型社会の構築に貢献できる。日本国内のエネルギー需給を取りまく環境は、2011年の東日本大震災以降大きく変化し、未だ明確な指針が定まっていない。震災以前電力供給の約10%を占めていた原子力発電所での発電が未だ制限された状態であり、不足した電力供給の補填は大部分が化石エネルギーを利用する火力発電によって行われているのが現状である。この火力発電では二酸化炭素の排出量が多く、近年の二酸化炭素排出量の削減の流れとは逆行する形となっている。よって本研究では二酸化炭素吸着や排ガス処理などに用いられる流動層を対象に流動層内メゾスコピック反応解析モデルの構築を行い、反応および吸着工程の最適化および支配因子の解明を目的とする。数値解析モデルの構成は、粉体の挙動については粒子ごとに離散要素法(Discrete Element Method, DEM)を用いて粒子ごとの運動および反応の解析を行う。気体の運動については、Euler座標系のCFDを用いて数値計算を行う。これらの計算手法を組み合わせることで、ミクロスケールである粉体の運動および反応とマクロスケールでの気体の運動および反応を解析することができる。本研究の達成により、化学プラントでの反応プロセスおよび廃棄物の処理の効率化が期待でき、環境問題およびエネルギー問題の解決にひいては、循環型社会の構築に貢献できる。当該年度においては、数値解析モデルの基礎部分の構築を行い、二酸化炭素吸着に伴う発熱および固気間伝熱の再現を試みた。当該年度においては、数値解析モデルの基礎部分の構築を行った。まず初めに、実験スケールに合わせて、DEM-CFDモデルの構築を行った。CFDの計算方法としてSIMPLE法とSMAC法の両者を導入し検討を行った。検討よりSMAC法の方がより流動層解析に適していることが確認され以降のモデルでは、SMAC法を採用した。次に数値解析モデルに対して、CO2吸着の際の発熱および気相との熱交換を導入した。固定層の条件でガスの流入を行った場合、層内および気相の温度分布は実験と近い結果を示した。以上の事から、当該年度の目標である数値解析モデルの基礎部分の構築および実験との比較を行い、良好な計算精度が得られたことから、本研究は、おおむね順調に進展しているといえる。構築したDEM-CFDモデルでは、粒子と気相との運動の相互作用やCO2吸着の際の発熱および気相との熱交換などについて解析が可能である。また、固定層の条件でガスの流入を行った場合、層内および気相の温度分布は実験と近い結果を示した。今後の研究方針としては、さらなる計算精度の向上に加えて計算対象および計算領域の拡大に取り組む。計算精度については、構築したモデルと実験で得られる情報との比較を行うことでより、精度のよいモデルの選択および構築を行う。

計算対象については、吸着だけでなく界面でおきる気体の分解や、粉体のガス化についても解析を行えるよう、反応速度論に基づきそれぞれの反応もモデルの構築に取り組む。計算領域の拡大については、解析モデルの高速化がそのまま計算領域の拡大につながるため、並列化をはじめとした手法の導入を行う。解析領域については、ラボスケールからパイロットプラント、最終的には実プラントスケールでの解析を目指す。並列化の手法としてまずOpenMPの導入を行う。OpenMPは共有メモリ型並列計算機で用いられる並列化手法であり、主に単一の計算機での計算の並列化に用いられる。次に導入に取り組むのは、MPIの導入である。MPIは分散メモリ型並列計算機、つまり複数の計算機間での行う計算の並列化手法である。OpenMPと比べ、複数の計算機が必要となり、また対象とする系によっては計算機間の通信速度が問題となり、十分な効率が得られない場合もあるため、計算対象に合わせて適切な計算条件および環境を設定する必要がある。29年度が最終年度であるため、記入しない。金属プロセス工学29年度が最終年度であるため、記入しない。
触媒的フルオラールの発生法の開発と不斉アルドール反応への展開

14年度に引き続き、安価な光学活性なアミノ酸、L-プロリンを触媒とする触媒的フルオラールの発生法の開発とそれに続く不斉アルドール反応について検討した。L-プロリン触媒存在下、ケトン類としてアセトンを用いたところ、系内で効率良くキラルエナミンとトリフルオロアセトアルデヒドが発生し、連続する炭素-炭素結合生成反応および加水分解を経て相当するβ-トリフルオロメチルアルドール付加体を収率良く与える事がわかった。しかしながら生成物のエナンチオ選択性は50.8% eeであった。その他のケトンとしてシクロヘキサノンやシクロペンタノンを用いた場合、相当する化合物を高いジアステレオ選択性で与えることがわかった。また、他の触媒として各種1級および2級アミンを有機酸もしくは固体酸共存下用いると、触媒的フルオラールの発生法とそれに続くアルドール反応が進行することが明らかとなった。アミンとして1級および2級アミンが用い得ることは、触媒の構造チューニングを行う上で非常に有効な知見を得られたものと考えられ、今後の展開が広まった。また、酸としては、酢酸やシリカゲルが有効であり、特にシリカゲルを用いた場合、回収が容易であった。すなわち、本反応系が均一系だけでなく不均一系でも進行することから、シリカゲルやポリマーに固定化した試薬を用いる環境調和型(不斉)手法への展開が見えてきた。今後は、更なる反応条件の検討と不斉触媒の構造最適化、また、本反応の一般性を調べるために各種ケトン類との反応を詳細に検討し、反応収率およびエナンチオマー過剰率を実用可能なレベルにまで向上させることが課題である。先ず、市販で安価な光学活性なアミノ酸、L-プロリンを触媒とする触媒的フルオラールの発生法の開発とそれに続く不斉アルドール反応について検討した。L-プロリン触媒存在下、ケトン類としてアセトンを用い、極性の高い溶媒(DMSO、DMF等)中、トリフルオロアセトアルデヒドエチルヘミアセタールを室温という温和な条件で反応させたところ、系内で効率良くキラルエナミンとトリフルオロアセトアルデヒドが発生し、連続する炭素-炭素結合生成反応および加水分解を経て相当するβ-トリフルオロメチルアルドール付加体を収率良く与える事がわかった。しかしながら、得られたアルドール付加体はほとんどラセミ体であり、反応における不斉誘導はほとんど発現していない事がわかった。そこで次に各種溶媒を検討した。その結果、低極性の溶媒(ベンゼン、アセトン、クロロホルム等)を用いるとエナンチオ選択性が格段に向上することが明らかとなった。しかしながら、そのエナンチオ選択性は高々50.8%eeであり、生成物の収率が低下するという問題点も明らかになった。また、反応溶媒としてアセトンを用いた場合、収率35%、光学純度39.5%eeで相当するアルドール付加体を与えた。これは、solvent-freeな反応としてアトムエコノミーを考慮した時、興味深い結果であると思われる。
血管内皮細胞におけるNO合成酵素の調節機構

血管内皮細胞における一酸化窒素合成酵素(ecNOS)の調節機構を検討する目的で以下の検討を行なった。1.ecNOS活性に及ぼす各種脂質の影響:ウシ大動脈内皮細胞よりpollockらの方法を用いてecNOSを抽出し、その活性を^3H-arginineから^3H-citrulineへの変換を用いて測定した。各種の脂質が活性に及ぼす影響を検討すると、リゾフォスファチジルコリン(LPC)、フォスファチジルコリンなどのリン脂質はCa^<2+>ならびにcalmodulin存在下にecNOS活性を増加させるが、アラキドン酸は減少させることが判明した。以上の検討により血管内皮細胞ecNOS活性は各種脂質により調節されており、またそのmRNA発現はサイトカイン、LPC、酸化LDLにより影響を受けることが判明した。
日本の企業組織における文化の多層性と外国人労働者のウエルビーイングの検討

外国人労働者を雇用する日本の職場組織への効果的な介入プログラムの開発・実施・評価を将来的な最終目標として、本年度の研究目的は、本研究の中核となる「文化の多層性」の概念化を目指した。当初は、量的調査に加え、質的調査を実習する予定であったが、研究者代表の個人的理由により時間の制限とキーインフォーマントの多数確保に困難があり、本年度は、外国人労働者を有する企業の日本人従業者に焦点をおき、非外国人労働者からの視点による「文化の多層性」の尺度作りの基盤を作った。主な業績は下記のとおりである。(1)関東地区、東海地区、北陸地区において、4箇所の企業から数名づつのキーインフォーマントを確保して2年目にむけて質的調査の打ち合わせを行った。(2)量的調査にむけて項目の作成と選定をおこなった。(3)既存の労働調査データの分析を行い、量的調査用紙の概略を作成した。(4)アメリカ(ニューヨーク)とインドネシア(マカサー)にて、上記のデータ分析の発表をおこない、現地での外国人労働者と非外国人労働者の状況について、数社の企業から聞き取りをした。(5)さらに、量的調査用紙の複数言語への翻訳を実施中である。研究代表者の個人的理由(実家の父親の不幸)にて、2017年夏に予定していたパイロットデータの収集及びインタビュー、フォーカスグループは実施できなかった。「多層性文化尺度(仮題)」の作成を行い、外国人労働者を含む企業組織においてその項目分析を通して、信頼性・妥当性を検討する。さらに、質的データの分析をおこない、1外国人労働者用、2日本人労働者用、3管理者(上司)用の3種類の「多層性文化尺度」を作成する。その構成概念は、9側面(レべルとレべル間)を軸に構成され、それに基づき質問項目を作成する。尺度は英語で作成し、それをバックトランスレーション法(back-translation;Brislin, 1973)を用いて4ヶ国語(日本語、中国語、韓国語、ポルトガル語)に翻訳する。3種類の尺度作成に当たり、尺度間の比較検討をするために、共通項目も準備する。作成した全ての尺度の妥当性と信頼性は、日本企業3社の外国人労働者、日本人労働者(同僚)、及び管理者(上司)を対象にデータを収集し、項目分析を実施、基準関連妥当性(例文化適応、言語、上司関係)を検証する。加えて、当該企業周辺の一般地域住民を対象に、オンライン調査を実施し、企業組織に働く外国人労働者の受け入れ等についてデータを収集し、社会規範を理解した上で、「多層性文化尺度(仮題)」の最終項目を決定する。本年度実行不可能であったプロジェクト項目を実施するため残額が不足していたため、旅費の支出を保留した。2019年度予算と合算して旅費を支出する。
フ-リエ解析の基礎的研究

初年度には、フ-リェ級数の概収束に関する諸結果が得られた。それと同時に、擬測度に関する基礎的研究が進んだ。次年度には、研究代表者の交代(海外出張による)のため、概収束に関する進展はみられなかった。擬測度に関しては、測度空間の位相的性質に関していくつかの結果と問題点が得られた。最終年度には、前年度の問題点の1つが数学世界で独立であることが示された。1.概収束問題について.(1)有界関数のフーリェ級数が擬(exPL)ー収束であることを示した.(2)有界関数の分類に新しい有界変分性を導入しこれを使って有界関数のフーリェ級数の一様収束,擬一様収束性に応用した. (3)ウィーナーのBV_2の近くのフーリェ級数の絶対収束性を新しい有界変分性を使うことによって論じた.2.ウォルシュ・フーリェ解析について.(1)現在までに得られた結果を整理した.(2)ウォルシュ・フーリェ級数の単一性の問題について, Δmμ(In(x))=ο(1)(一様)であるウォルシュ級数のクラスについていくつかの結果を得た.上記の1(1)(3), 2(1)は現在執筆中の本に取り入れられる. 2(2)は現在論文化中である.3.確率変数の概収束について,(1)ラーデマッハ関数の大数の法則にあらわれる概収束について結果を得た.4.その他,(1)概収束の概念を測度空間より広い空間,例えばL^2,にまで広げる為の基礎研究を行った.5.擬測度の概念を組合せ論的に扱うための基礎的研究を行った.研究代表者が前年度に変更したままのなで、研究は主に補助的な周辺分野を対象に行われた。前年度の研究成果として、空間(主に実数空間)の位相的性質に関するものがあったが、今年度の成果は、1.前年度の研究から興味がもたれるハウスドルフgapに関するもの.2.ユ-クリッド空間のstrong homotopyについて“non-trivialなhomologyが存在するか?"に関するもの.の2点にある。(1.に関して)ハウスドルフgapが与えられたとき、それがfilledされる部分はイデアルをなすが、そのイデアルの性質のいくつかを解明した。2.1.ある集合論的仮定(dl=w_1)の下で、non-trinialなhomologyは存在する。2.2.別の集合論的仮定(PFA)の下で、non-trinialなhomologyは存在しない。を示し、更に、gapとの関連に言及し、Problemを掲げている。今年度の成果として、2.3. 2.1の仮定dl=w_1は、より弱い仮定lb=w_1にすることはできない2.4. gapとの関連を解明.を行うことにより、Problemのある部分に解を与え、又問題点をより明確にした。今年度は、ルベ-グ測度に関する組合せ論的性質の研究も行ったが、ここに述べられる程の成果は得られなかった。
膀胱上皮細胞がおこす膀胱痛の発生機序

膀胱上皮の静水圧による伸展(5cmH_2Oから45cmH_2O)は圧比例的にATPの分泌をおこした。膀胱上皮細胞にあるTRPV1チャネル、EP1受容体、ムスカリン受容体の刺激は細胞内小胞体からのCa^<2+>の放出によるATPの分泌をおこした。またアデニル酸シクラーゼにより産生されたcAMPはATP分泌を増加させた。伸展や化学刺激で小胞体内のCa^<2+>は放出され、これが枯渇すると貯蔵量作動性Ca^<2+>チャネルによるCa^<2+>流入がおき、先のアデニル酸シクラーゼ活性を阻害しATPの分泌を抑制した。これは膀胱が伸展に応じてATPが持続的に放出し続けるのに必要な機構と考えられた。無麻酔拘束ラット・マウスを用いて膀胱内の持続灌流実験を行い、膀胱灌流液を生理的食塩水からPGE_2(10^<-5>M)、ノルアドレナリン(10^<-5>M)にかえると排尿間隔の短縮が認められた。PGE_2の効果はEP1拮抗薬ONO8713(10^<-5>μM)で、ノルアドレナリンの効果はα1A拮抗薬シロドシン(10^<-8>μM)で消失した。EP1受容体ノックアウトマウスではPGE_2灌流による排尿反射亢進はおきなかったが、酢酸(0.1%)及びカプサイシンによる排尿反射亢進はおきた。またα1A受容体ノックアウトとα1D受容体ノックアウトマウスではノルアドレナリン灌流による排尿反射亢進はおきなかったが、酢酸及びカプサイシンによる排尿反射亢進がおきた。ウッシングチェンバーに圧刺激を加えると圧依存性にATP放出量の増大が認められた。アセチルコリン、カプサイシン、プロスタグランジンの刺激によってもATPの放出が認められた。小胞体からのCa^<2+>放出機能を停止させるATP放出は消失した。ところが、細胞外Ca^<2+>のわずかな低下でもATP放出が著しく低下することから、細胞内Ca^<2+>放出によるATP放出促進機構に加えて細胞内Ca^<2+>流入によるATP放出機能が存在する可能性が出てきた。脊髄・脳幹の排尿に関する中枢の神経核におけるα_1アドレナリン受容体の存在と効果について検討した。RT-PCR法により、中脳中心灰白質・橋排尿中枢・青斑核のいずれにおいてα_1A、α_1B、α_1D受容体サブタイプのmRNAが存在した。無麻酔拘束ラットの膀胱をカテーテルを用いて生理的食塩水で持続的灌流し引き起こした排尿反射に及ぼす影響を、腰部脊髄髄腔内および第三脳室に各種α_1アドレナリン受容体の拮抗薬を投与し検討した。第三脳室へのα_1A受容体サブタイプ拮抗薬(シロドシン)もα_1D受容体サブタイプ受容体拮抗薬(BMY7378)も薬物量依存的に排尿間隔を延長したが、最大排尿圧は変化させなかった。一方、腰部脊髄髄腔へのα_1A受容体サブタイプ拮抗薬の投与は薬物量依存的に排尿間隔を延長したが、α_1D受容体サブタイプ拮抗薬の投与は排尿間隔に影響を与えなかった。いずれの拮抗薬も最大排尿圧には影響を与えなかった。従って脳幹ではα_1A、α_1D受容体サブタイプのいずれもが排尿反射に寄与することが示された。さらに、脳幹から脊髄への下行性ノルアドレナリン性神経は、排尿反射の求心性機構にα_1A受容体サブタイプを介して作用していることが明らかとなった。蓄尿で膀胱が伸展するのに伴い内側にある上皮細胞はATPを分泌する。このATPは骨盤神経知覚神経終末を興奮させ、排尿反射がおこる。これまでの研究から小胞体からのCa2+の細胞内上昇がATP分泌をおこす。この小胞体Ca2+が枯渇すると貯蔵量作動性Ca2+が流入しこれは逆にATP分泌を抑制した。これは貯蔵量作動性Ca2+がアデニル酸シクラーゼタイプ6を抑制しATP分泌を抑えている機構が存在した。この抑制機構は膀胱伸展に応じてATPを分泌し続けるに役立っている可能性を示した。膀胱炎がおきると膀胱内にはPGE2分泌量が増加し、同時に頻尿・骨盤部痛が認められる。これはATPなどにより膀胱知覚神経の活動が高まったと考えられている。低出力ダイオードレーザーは痛み局所へ照射でその信号がなくなることが知られている。

ダイオードレーザー(830nm)をパルス照射することにより局所への熱効果をもたらさず組織深部の到達させることが可能となったことを利用しラット仙部の後方から膀胱からの知覚神経に照射し排尿反射への影響を検討した。生理食塩水を膀胱灌流しておこした排尿反射にはレーザー照射が影響ないことを確認し、PGE2(10^<-5>M)または0.1%酢酸水で膀胱を灌流すると、排尿反射は亢進し、排尿間隔は短縮した。この状態でパルスレーザーの照射(6.7W/cm^2、10mson,90msoff,3min)は排尿反射の間隔を延長させ、ほぼ生理食塩水灌流を行なった時と同じ排尿間隔となった。従来の持続レーザー照射(0.67W/cm^2,3min)では排尿間隔の延長は認められなかった。したがって膀胱でPGE2が求心性線維の終末を刺激して排尿反射の亢進がおき、これは膀胱からのC線維の活動により排尿反射が亢進すると考えられ、仙部パルスレーザー照射は骨盤神経の求心性線維のなかでも膀胱異常知覚をつかさどるC線維を抑制すると予測された。
ＶＣＰ阻害剤による眼疾患に対する新たな神経保護治療法の研究開発

我々が開発したVCPのATPaseに対する阻害剤が、眼疾患の治療薬となりうるか検討した。NMDAによる急性網膜神経節細胞障害モデル、高眼圧を呈するDBA2Jマウス、慢性神経節細胞障害モデルであるGLAST欠損マウスにおいて、VCP ATPase阻害剤は、網膜神経節細胞減少・神経線維層菲薄化を抑制した。rd10やrd12マウス、網膜色素変性ウサギにおいて、VCP ATPase阻害剤は、視細胞減少・視機能低下を抑制した。細胞内のATP濃度低下を抑制し、小胞体ストレスを軽減することにより、神経保護作用を示すと考えられた。VCP ATPase阻害剤が、眼疾患に対して新規進行抑制薬となる可能性がある。1)実験動物における網膜リアルタイムイメージング法の確立動物に薬剤投与を行いその効果判定をするにあたって、同一個体で神経節細胞・神経線維層、視細胞の変性状況をリアルタイムで継続的に撮影することで効率的かつ客観的な評価が可能になる。今までに、複数色の蛍光撮影も同時に可能な動物用最新型OCT(Multiline OCT)を用い、Thy1-CFPマウスにNMDAを硝子体内投与した際の神経節細胞障害を、CFP撮影による神経節細胞数、OCT撮影による神経節細胞・網膜神経線維層厚の両面から経時的に評価できることを確認した。また、網膜色素変性症モデルマウスおよびウサギにて、視細胞層あるいは、視機能に関係するとされる外節・内節の接合部の形態変化に関して経時変化を評価する系を確立した。画像取得後に、実際に眼球摘出後、組織像と、蛍光眼底画像および光干渉断層計での網膜描写像とを比較し、今までの組織学的な評価と同等以上の評価が蛍光眼底撮影+光干渉断層計でも可能であることを確認した。2)NMDA傷害緑内障モデルマウスに対するVCP阻害剤の網膜神経節細胞消失抑制効果の検証Thy1-CFPマウスに2nmol NMDAを硝子体注射し急性神経節細胞傷害を惹起する緑内障モデルマウスにおいて、VCP阻害剤により、網膜神経節細胞死が抑制されるか検証を行った。NMDA硝子体内投与前、1、4、7、14日後にMultiline OCTを用いてCFP蛍光眼底撮影と網膜断層OCT同時撮影を行い、CFP画像を用い神経節細胞数を、OCT画像を用い網膜神経線維層厚を計測し、薬剤投与群とコントロール群での比較を行っいVCP阻害剤の効果を確認した。1)眼圧上昇緑内障モデルマウスに対するVCP阻害剤の網膜神経節細胞消失抑制効果の検証:眼圧上昇を伴う遺伝性緑内障モデルであるDBA/2Jマウスに対し、VCP阻害剤が網膜神経節細胞の消失、神経線維層菲薄化、視神経乳頭陥凹拡大に対する抑制効果の検証を行った。DBA/2Jマウスは、生後半年程度で眼圧が上昇し始めるため、眼圧上昇前の2カ月齢から、VCP阻害剤を経口投与し、眼圧が上昇し始めたのち、6,7,8,9,10カ月齢にてOCT撮影を行い、神経線維層厚および視神経乳頭陥凹の評価を行った。その結果、薬剤投与群では、有意に網膜内層厚が保たれ、また、組織学切片による評価より、残存神経節細胞数が多いことが解った。また、視神経乳頭陥凹も、薬剤投与群で有意に抑制されていることが明らかになった。2)網膜色素変性症モデルマウスrd10に対するVCP阻害剤の視細胞消失抑制効果の検証:生後2ヶ月までに杆体細胞が消失する網膜色素変性症のモデルマウスrd10に対し、VCP阻害剤の杆体の消失に対する抑制効果の検証を行った。rd10マウスに生後7日齢からVCP阻害剤を腹腔内投与し、生後21,25,29,33日齢でOCT撮影を行い、視細胞層厚、視細胞内節外節接合部の描出状態、および網膜電図検査より視機能の評価を行った。その結果、薬剤投与群では、有意に全層網膜厚が保たれ、また、網膜電図のb波振幅低下も抑制されることがわかった。VCP阻害剤が網膜疾患に対し、保護剤としての新たな治療薬となりうるか、眼疾患動物モデルを使用し、その治療効果を検討した。まず、緑内障や網膜色素変性症モデル動物を用い、網膜神経節細胞や視細胞変性・神経線維層の菲薄化の過程を描出し、薬剤効果の評価系を確立した。ついで緑内障モデルマウス(NMDA硝子体内投与モデル、高眼圧モデルDBA/2J、正常眼圧モデルGLAST欠損マウス)、網膜色素変性症モデル(rd10,rd12マウス、網膜色素変性モデルウサギ)、網膜変性モデル(CCR2欠損マウス)にVCP阻害剤を投与し、それぞれ神経節細胞の変性脱落、神経線維層の菲薄化、あるいは視細胞の変性脱落が抑制されるか、組織学的および視機能の両面から評価した。

またVCP阻害剤がどのような作用機序により網膜細胞保護効果を示すか明らかにした。以上より、幅広い網膜の疾患に対しての神経保護による新たな治療に発展させる基盤の形成を行った。1)黄斑変性モデルマウスCCR2欠損マウスでの網膜変性抑制効果の検討生後16ヶ月までに黄斑変性を発症するCCR2欠損マウスに対し、生後2カ月齢よりVCP阻害剤を内服投与し、生後6、10、14カ月齢にてOCT撮影、網膜電図測定、および眼底写真撮影を行い、網膜の変性度合いを評価、病態抑制効果を検証した。その結果、VCP阻害剤投与群では、ドルーゼン数の増加が抑制され、網膜電図上も、視機能減弱が抑制されることが明らかになった。2)VCP阻害剤の網膜神経節細胞に対する保護効果の作用機序の解明現在までに培養細胞を用いた予備実験にて、VCP阻害剤を加えた細胞では、ストレス時に細胞内ATP濃度が保たれている事が明らかになった。さらに、NMDA投与後12時間、24時間での網膜各群10眼を用い次世代シーケンスによる遺伝子発現プロファイル解析を実施、候補遺伝子が見つかりつつある。26年度が最終年度であるため、記入しない。眼科学26年度が最終年度であるため、記入しない。予定していた実験をほぼ遂行できており、結果がそろいつつある。予定していた実験をほぼ遂行できており、結果が出始めている。今後は、VCP阻害剤の効果判定に関して、以下の動物モデルで検証予定である。1)正常眼圧緑内障モデルマウスでのVCP阻害剤の網膜神経節細胞消失抑制効果の検討:グルタミン酸輸送体であるGLASTの欠損マウスでは、生後一年程度で網膜神経節細胞が変性脱落し、正常眼圧緑内障のモデルとして使用されている3)。このGLAST欠損マウスとThy1-CFPマウスを交配させて神経節細胞をCFPにて蛍光ラベルしたマウスを作成、生後1カ月齢よりVCP阻害剤を内服投与し、生後3、6、9、12カ月齢にCFP蛍光眼底撮影により神経節細胞数を、OCT撮影にて網膜神経線維層厚をそれぞれ評価する。すでにマウスは使用できる状態になっており、薬剤投与は前年度より開始する。2)網膜色素変性症モデルマウスrd12での阻害剤の視細胞消失抑制効果の検討:rd10より変性のゆっくりな網膜色素変性症モデルマウスであるrd12に、生後2カ月齢からVCP阻害剤を内服投与し、平成24年度3)に準じて、生後6、8、10、12カ月齢にて視細胞の変性度合いを評価する。発症に1年近くかかるため、薬剤投与は前年度に開始する。3)網膜色素変性症モデルウサギでのVCP阻害剤の視細胞消失抑制効果の検討:生後7ヶ月までに杆体細胞が消失する網膜色素変性症のモデルウサギ2)(網膜色素変性症ウサギ:ヒトの変異型ロドプシンを発現させたトランスジェニックウサギ)に対し、生後1カ月齢よりVCP阻害剤を内服投与し、生後2、3、4、5カ月齢でOCT撮影を行い視細胞層の厚み、視細胞外節・内節接合部の評価、網膜電図検査により視機能の評価を行う。発症まで数ヶ月かかるので薬物投与は前年度より開始する。4)黄斑変性モデルマウスCCR2欠損マウスでの網膜変性抑制効果の検討今後は、VCP阻害剤の効果判定に関して、以下の動物モデルで検証予定である。1)正常眼圧緑内障モデルマウスでのVCP阻害剤の網膜神経節細胞消失抑制効果の検討:グルタミン酸輸送体であるGLASTの欠損マウスでは、生後一年程度で網膜神経節細胞が変性脱落し、正常眼圧緑内障のモデルとして使用されている。
マイクロビームを用いた細胞核・細胞質照射における防御細胞応答の解析

陽子線マイクロビーム細胞照射装置SPICEにおける細胞核・質の打ち分け技術を確立し、本装置の有効性を実証した。そして、放射線による細胞質損傷とその細胞応答ならびにDNA修復機構に対する作用機序を明らかにすることを目的とした。ヒト肺正常WI-38細胞の細胞核(N)、細胞質(C)、またはその両方(N+C)に陽子線を照射し、それぞれの照準部位に対する生物効果を評価した。また、細胞核内に誘発されたDNA二本鎖切断(DSB)をγH2AXを指標に検出した。その結果、1(C)への照射によって、放射線による直接的なDSB誘発は無いことが示唆された。2また、照射16時間後以降に残存するγ-H2AX量は、(N)にのみへの照射に比べて(N+C)の方が低く観察されたことから、細胞質損傷がDSB修復を促進した起因であると考えられた。3また、(C)にのみ照射すると、照射4時間後におけるγ-H2AX量は線量依存的に増加した。このことから、細胞質損傷がトリガーとなり間接的にγ-H2AX誘発することを示唆した。1ー3は、J Radiat Cancer Resに発表した。さらに、細胞質損傷に対する細胞応答経路についても研究を進めた。4(C)照射によって、酸化ストレス応答経路に関わる転写因子NRF2の活性化とその標的遺伝子であるHO-1、NQO-1が発現することから、放射線の直接的なDNA損傷誘発が無くともNRF2が活性化されること実証した。5さらに、DSB修復に関わるXRCC4とRAD51の発現の上昇を確認した。6そして、56はミトコンドリア特異的抗酸化物質によって抑制された。NRF2とDSB修復経路の関連性ついては、さらに検討が必要である。しかし、本課題において、細胞質損傷が防御的な細胞応答のトリガーとして働いていることを明らかにしたと考える。5-7については、Cancer Sciに発表した。本題の目的は、陽子線マイクロビームを活用し、細胞核のみに照射した細胞と比較して、細胞質にのみ、さらには、細胞核・細胞質の両方に照射細胞のDNA二本鎖切断(DSB)修復ならびに、酸化ストレス応答経路の活性化に着目して解析することで、細胞質内ダメージのDSB修復機構への影響を評価することである。平成28年度において、1細胞核のみ、2細胞質のみ、3核と質の両方の3条件を設定し、陽子線をヒト肺正常WI-38細胞に照射し、照射の1、4、8、16、24時間後にヒストンタンパク質H2AXのリン酸化(γ-H2AX)に対して免疫蛍光染色を行った。細胞蛍光画像より細胞核当たりのγ-H2AX量を算出し、その生成・消失について解析を行った。その結果、1細胞核への照射では、照射1時間後でγ-H2AX量はほぼ比例的に増加し、その後24時間にかけて非照射細胞と同等のレベルまで減少した。2細胞質照射では、照射4時間後のγ-H2AX量は照射粒子数依存的であった。3細胞核・質両方照射では、細胞核と細胞質とも陽子線を500個照射し、細胞核のみに照射した場合と比較すると、両方照射の方が4時間後において若干高い値を示し、その後16時間後、24時間後において若干低い値を示した。これらの結果より、細胞質照射によってもDSBが誘発されるが、細胞質内ダメージがトリガーとなり、DSB修復を促進すると考えられた。細胞質照射による酸化ストレス応答タンパク質の挙動を解析するために、Nrf2-Keap1経路に着目し、細胞質照射によってNrf2転写因子の細胞核移行について検討を開始した。細胞核のみ、および細胞質のみに500個の陽子線照射し、Nrf2タンパク質の核への移行を確認した。つまり、非DNA損傷を起因としてNrf2-Keap1経路が活性化することを突き止めた。放医研マイクロビーム細胞照射装置SPICEを利用するにあたって、ほぼ要望したビームタイム数を配分していただいた。よって、平成28年度実験計画として提案したマイクロビーム照射実験の以下1ー3を実施することができた。1ヒト正常肺細胞WI38の細胞「核」照射によるγH2AX量の照射粒子数依存性と照射後時間の経時変化を測定した。細胞核当たり100個、250個、500個の陽子線を照射し、照射後1,4,8,16,24時間後のγH2AX量の結果を得た。次に2細胞「質」照射によるγH2AX量の照射粒子数依存性と照射後時間の経時変化を測定した。細胞「質」当たり100個、250個、500個の陽子線を照射し、照射後1,4,8,16,24時間後のγH2AX量の結果を得た。そして、3細胞「核」と細胞「質」の両方照射によるγH2AX量の照射粒子数依存性と照射後時間の経時変化を測定した。細胞「核」当たり250個、500個に対して、さらに細胞「質」に200個、500個の陽子線を照射し、照射後1,4,8,16,24時間後のγH2AX量の結果を得た。再現性を確認するため、追加実験を実施する必要がある。細胞質照射による酸化ストレス防御応答タンパク質の挙動を解析するために、Nrf2-Keap1経路に着目し、質照射によってNrf2転写因子の細胞核移行することを確認した。線量依存性およびγH2AX量との相関についての解析は今後の課題である。

また、ヒト肺がんA549細胞を用いて、Nrf2ノックダウン株の作成を開始し、10個程度のクローンを採取したが、安定株の樹立にはまだ至っていない。放射線の生物効果は、放射線誘発DNA損傷が主因となり、細胞死、突然変異、がん化などの終焉を決定すると考えられている。また、一方で、細胞質への影響については、近年、突然変異頻度が増加するなどの新しい知見が報告されつつあるが、機序解明には至っていない。我々は、細胞質損傷がトリガーとなり、DNA損傷修復を修飾し、放射線感受性を左右するのではと考えた。そこで、陽子線マイクロビーム細胞照射装置SPICEを活用して、細胞核・質の狙い撃ち照射を行った。細胞核にのみ照射した条件と比較して、細胞質にのみ、さらには核・質の両方に照射するといった三条件での照射を実現した。そして、同方法によってDSB誘発と修復に着目して解析を行った。平成29年度は、SPICEを用いた照射実験を合計8日間実施した。DSB検出には、γ-H2AXを指標に算出した。まず、核にのみ照射する条件において、照射粒子数最大500個までは、照射1hr後のγ-H2AX量はほぼ線形的な増加を示した。一方で、細胞質照射では、有意な増加は見られなかったが、照射後4時間後におけるγ-H2AX量は、照射粒子数依存的な増加を示した。また、活性酸素種(ROS)の発生も、照射粒子数依存的にROS発生が高くなることを確認した。つまり、細胞質損傷を起因として内在性ROSが増加し、間接的にDSBを誘発したと考えられた。また、両方照射についても、照射4hr後におけるγ-H2AX量が核のみの照射より高く、また細胞質への粒子数に依存して高いことを確認した。しかし、これとは反対に、照射16hr後、24hr後における残存するγ-H2AX量は両方照射の方が核のみの照射にくらべて低い値を示した。これより、細胞質ダメージによって、ROSが産生し、DSBを誘発する一方で、DSB修復経路を活性化することで修復を促進した。非常に新規性かつ重要な知見を得ることができた。平成29年度において、1細胞核照射実験において、照射粒子数100個ー500個の範囲におけるγ-H2AX量の測定および照射後の経時的な変化の測定を行うことを目的とし、照射粒子数100個、250個、500個の三点において照射後1時間後の結果を完成させた。また、照射1,4,8,16,24時間後における残存γ-H2AX量の測定についても完了した。2細胞質照射実験についても、細胞核照射の粒子数、ならびに残存するγ-H2AX量の経時変化について結果を取得した。さらに、照射4時間後に照射粒子数依存的にγ-H2AXが増加するといった特徴的な現象を確認した。また、このγ-H2AX量の増加について、活性酸素種(ROS)に着目し、DCFH-DA蛍光試薬を用いて細胞内ROS発生量の測定を実施した。その結果照射4時間後におけるROSは細胞質への照射粒子数依存的に増加していることを確認した。3核・質の両方照射については、細胞核への照射粒子数250個と500個のそれぞれの条件において、細胞質へ照射粒子数250個または、500個の二つの条件で実施し、また残存するγ-H2AX量についても照射1時間後に加えて、4,8,16,24時間後まで測定を完了した。その結果、照射4hr後のγ-H2AX量が核のみの照射より高く、また細胞質への粒子数に依存して高いことを確認した。
触覚情報を活用して感性増幅を図る視聴覚コンテンツの作成・呈示方法

人工的に作り出し自由なタイミングで利用できるアーティフィシャルな振動触覚を、音楽聴取時や動画映像視聴時に取り入れた時の感性増幅作用を検討した。その結果、音楽をより魅力的に聴取できるアーティフィシャルな振動触覚の種類及び付与タイミング等が明らかになった。また、動画映像における衝撃音の発生シーンや心理的な衝撃シーンでの振動触覚刺激の感性面での作用を明らかにした。さらに、テレイグジスタンスや仮想現実空間での触覚刺激の有効性も導くことができた。1.音楽にアーティフィシャルな触覚刺激を利用した体感音楽聴取方法人為的に作られた振動を音楽の一部として組み込み、人間の感性に起こる変化を検証し、より感動的な音楽の表現方法を提案することを目的とし、基礎的な実験を実施した。まず、被験者にサンプル振動楽曲を鑑賞させ、リズムの取りやすさ、振動の有無でどのような変化が起こるかを一対比較法による主観評価を実施した。その結果、リズム、楽曲共に音に合わせて構成した振動が、聴取者の感性増幅要因となることが明らかになった。また、振動にエフェクトを使用したものを複数鑑賞させ、それぞれで印象が異なるかをSD法による主観評価を実地した。その結果、使用したエフェクトそれぞれの印象が異なり、振動の質を変えられることが明らかになった。次に、振動はどの音階が感じ取りやすいのかを一対比較法による主観評価を実施した。その結果、音楽の音階に対応した振動階を感じ取ることができることがわかった。2.感性増幅を意図した視聴覚コンテンツにおける触覚情報の利用方法トラッキング機能を有したH.M.D(ヘッドマウントディスプレイ)でCG映像を見ながらエアロバイクトレーニングを行った場合の感性への影響を把握する実験を行った。具体的には頭の動きに合わせた情景シーン(CG映像)を見ながら風の触覚を付与することによる、疲労感・臨場感への影響を、一対比較法による主観実験により検討した。その結果、トラッキング機能を有したH.M.Dによるエアロバイクトレーニングは臨場感を増すが、疲労感や気分の悪さを増加させることが分かった。ただし、風と言う触覚刺激を付加すると疲労を軽減し臨場感がより高まることを明らかにした。1.音楽にアーティフィシャルな触覚刺激を利用した体感音楽聴取方法今期は、異質の振動触覚を体の異なる箇所に与えた場合の感性への影響、振動触覚の時間経過が感性に与える影響を検討した。まず、音楽を構成する楽器の中で、リズムを与えるドラム音とベース音からそれぞれ取り出した振動を別々の振動付与体で体の別々の場所に与えたとき、音楽の印象がどのように変化するのかを実験した。ドラム音とベース音の振動を分離して取り出すために、MIDIによる音楽ソフトを用いた。また、振動付与体としては、手のひらに振動を付与する振動素子と体の背面の幅広い箇所に体ごと振動を与えるボディソニックを用いた。その結果、手のひらにベース音に基づく振動触覚を与え、体の背面から体全体をドラム楽器音による振動を与える音楽聴取形態は、それぞれ単独に振動触覚を与える音楽聴取形態に比べ、臨場感や魅力を増すとの結果が得られた。次に音楽聴取時に2つの振動触覚刺激を長時間与えた場合、時間の経過によって、それぞれの印象がどのように変化するのかSD法による主観評価を実施した。その結果、時間が経過すると共に、疲労感や嫌悪感が増すということが分かった。2.感性増幅を意図した視聴覚コンテンツにおける触覚情報の利用方法今期はテレイグジスタンス時に触覚刺激を加えた場合、および3D・CGゲームに触覚刺激を加えた場合の感性評価を行った。まず、ラジコンカーに無線カメラを取り付け、その映像をHMD(ヘッドマウントディスプレー)に無線電波で送り、そのHMDを装着した操作者がラジコンカーを操作するテレイグジスタンス環境を構築し、ラジコンカー操作時に自動車の振動や音を付与する感性評価実験を行った。振動はボディーソニックを用いて与えた。SD法による因子分析を行った結果、インパクト因子や楽しさ因子においては、HMDだけ、HMD+振動、HMD+音楽およびHMD+エンジン音に比べ、HMD+エンジン音+振動、およびHMD+音楽+振動の因子得点が飛躍的に大きくなることが分った。次に、加速度センサーのついたHMDを装着して、アバターの主観で頭を動かした方向に画面が動くように設定されたシューティングゲームを行う場合の感性評価実験を行った。シューティング時の効果音とその低音成分による振動をボディーソニックに与えた場合、臨場感と楽しさ因子が飛躍的に大きくなる結果が得られた。1.音楽にアーティフィシャルな触覚刺激を利用した体感音楽聴取方法今年度は、音楽聴取時に被験者自身が能動的に振動を出力し、その振動を感じた時の感性への影響を評価した。具体的には、音楽のみを聞いた場合、音楽+音楽に付随した受動的振動を感じた場合、被験者が音楽を聞きながら能動的に振動を出力した場合の三つの実験を行い、これらを一対比較法により評価した。

その結果、音楽聴取時に能動的に振動を出力する場合の方が、音楽のみや音楽と共にそれに付随した振動を感じてもらうより魅力や迫力が増すことがわかった。このことから、振動が人に与える心理的影響は大きく、振動それ自体が娯楽となる可能性があると考えられる。また、能動的に振動を出力する音楽聴取方法では、入出力器具の違いによってどのような感性の違いがあるかをSD法にて評価した。その結果、入力部分の感触の違いで、迫力や落ち着きと言った因子が大きく変化している。また振動を感じる部位としては、掌よりボディーソニックにより体全身で振動を感じたほうが好まれるとの結果が得られた。このことより、入出力部分を工夫することで、より効果的に聴取することができると思われる。2.感性増幅を意図した視聴覚コンテンツにおける触覚情報の利用方法今期は、動画映像シーンを視聴する際に振動触覚を有効に付与する指針を得るための実験を実施した。筆者等の従来の検討では、複数の振動素子に1種類の振動しか出力できなかったが、今回、振動を2chに分けることによって2種類の振動を振動素子に別々に出力することを可能にした。具体的には、ボクシング試合の動画映像シーンにおいて、音楽制作ソフト「CUBASE STUDIO5」を用いて左、右パンチに応じた振動をMIDIで作成し、両手、顔などの複数個所に振動を与えながら動画映像を視聴した場合の感性への影響を検討した。その結果、付与する場所を変えることで動画内の誰に感情移入するのかをコントロールすることができることがわかった。さらに、パンチの振動の質を変えると動画映像の印象が大きく変わること、振動のタイミングを早くずらした時よりも遅くずらずらした方が臨場感や迫力などが大きく低下すること等の実験結果が得られた。これらの結果を触覚情報呈示設計法に反映していく。
アンモニアの魚類好中球に対する影響とその許容濃度

鰾を用いた好中球の分離法として、まず25°Cに順化したティラピア(体重約100g)を使い、その鰾内に大腸菌死菌(5mg/ml)を0.2ml注射して、24時間後に鰾を取り出した。鰾内に浸出している細胞を抜き取り、その細胞数と種類を調べ多ところ、少なくとも12x10^6個/ml採集され、その97%以上が好中球であった。この方法は従来の比重遠心法などと比べて、格段に好中球数が多く、高純度、簡易な操作という点でも優れた方法である。コイ、ブリ、マダイ、シ-バスなどの他の魚種でも応用できた。上記のようにして得たティラピア好中球-ハンクス液中にアンモニアを0、1、2ppm(NH_4^+として。NH_3としては0、0.011、0.023ppm)添加し、好中球の貧食能を検討したところ、アンモニア濃度に比例して貧食能が低下していた。次いでティラピアを0、1、2ppm(NH_4^+として。NH_3としては0、0.003、0.006ppm)に設定したアンモニア水中(水温25°C、pH7.2、溶存酸素6ppm以上)に7日間飼育した。0、1、3、7日目に上記の方法で好中球を分離して貧食能、化学発光能を調べたところ、アンモニア濃度や飼育日数との間に有為な関係がなかった。この実験で用いたティラピアの血中アンモニア濃度を分析したところ、水中アンモニア濃度と飼育日数に関わらず約1.52.5ppmで(NH4+として)、水中アンモニアと血中アンモニア濃度は比例していなかった。ティラピア血液がアンモニアを緩衝する能力が高いためと考えられた。この実験を通して、ティラピアが行動学的に社会順位の下位の個体に向かって攻撃を繰り返すのが、頻繁に観察された。下位の個体はストレス下に置かれていると考えられ、好中球を分離してその機能を調べたところ、上位個体と比べて著しくその機能が低下していた。攻撃行動とそれによるストレス及び生体防御能の低下はほとんど研究が進んでおらず、今後の展開が望まれる。供試魚として、25°Cに順化したティラピアを用い、その鰾内に大腸菌死菌を注射して、12、24、48時間後に解剖して鰾を取り出した。その鰾内浸出している細胞を抜き取り、その細胞の種類、数、貧食能、遊走能、異物処理能(化学発光量)を調べた。その結果、いずれの時間でも鰾内に浸出してくる細胞は97%以上が好中球で、わずかにマクロファージが混入していることが分かった。浸出する好中球の数は24時間後で最も多く12×10^6個であり、95%以上の生存率を示した。この結果は他の好中球収集方法と比べて、格段に優れたものであった。この方法を他の魚種で検討したところ、大きな有管鰾をもつブリやコイにも応用できることがわかった。25°Cに順化したティラピアの腹腔に、実験の3および2週間前に大腸菌死菌を注射して、抗体価を4000以上にした。

その免疫処理ティラピアの鰾内に大腸菌死菌を注射して、12、24、48時間後に解剖して鰾を取り出した。浸出した好中球の数は、いずれの時間でも非免疫処理魚のそれを上回るか、同等であった。しかし免疫処理の効果は、好中球の化学発光能等には反映していなかった。水温の影響を調べるため、20°Cと25°C、30°Cに順化したティラピアを用い、上記と同様の実験を行った。その結果25°C順化ティラピアに比べて、20°C順化ティラピアでは浸出する好中球数が非常に少なかった。一方、30°C順化ティラピアではその数が非常に多く、かつ浸出に要する時間も短かったが、その好中球の能力を検討したところ、30°C順化ティラピアの好中球は25°C順化ティラピアの好中球に比べて化学発光能、遊走能、貧食能で劣っていた。適水温から外れた低・高水温は、免疫学的にストレッサーとして働いていることが分かった。鰾を用いた好中球の分離法として、まず25°Cに順化したティラピア(体重約100g)を使い、その鰾内に大腸菌死菌(5mg/ml)を0.2ml注射して、24時間後に鰾を取り出した。鰾内に浸出している細胞を抜き取り、その細胞数と種類を調べ多ところ、少なくとも12×10^6個/ml採集され、その97%以上が好中球であった。この方法は従来の比重遠心法などと比べて、格段に好中球数が多く、高純度、簡易な操作という点でも優れた方法である。コイ、ブリ、マダイ、シ-バスなどの他の魚種でも応用できた。上記のようにして得たティラピア好中球-ハンクス液中にアンモニアを0、1、2ppm(NH_4^+として。NH_3としては0、0.011、0.023ppm)添加し、好中球の貧食能を検討したところ、アンモニア濃度に比例して貧食能が低下していた。次いでティラピアを0、1、2ppm(NH_4^+として。NH_3としては0、0.003、0.006ppm)に設定したアンモニア水中(水温25°C、pH7.2、溶存酸素6ppm以上)に7日間飼育した。0、1、3、7日目に上記の方法で好中球を分離して貧食能、化学発光能を調べたところ、アンモニア濃度や飼育日数との間に有為な関係がなかった。この実験で用いたティラピアの血中アンモニア濃度を分析したところ、水中アンモニア濃度と飼育日数に関わらず約1.52.5ppmで(NH4+として)、水中アンモニアと血中アンモニア濃度は比例していなかった。ティラピア血液がアンモニアを緩衝する能力が高いためと考えられた。この実験を通して、ティラピアが行動学的に社会順位の下位の個体に向かって攻撃を繰り返すのが、頻繁に観察された。下位の個体はストレス下に置かれていると考えられ、好中球を分離してその機能を調べたところ、上位個体と比べて著しくその機能が低下していた。攻撃行動とそれによるストレス及び生体防御能の低下はほとんど研究が進んでおらず、今後の展開が望まれる。
非アポトーシス性プログラム細胞死の制御に関わる分子機構の解明

これまでに我々はグリオーマ細胞や神経芽腫細胞等においてRasシグナル伝達経路の恒常活性化によりアポトーシスとは異なった(non-apoptotic)プログラム細胞死が誘導されること、またこのようなnon-apoptoticプログラム細胞死がヒト生体内でも実際にがんの抑制や神経変性疾患の発生に関与している可能性を明らかにし、さらにその分子機構の解明を進めてきた。本研究課題においても引き続きこのような細胞死の制御に関与する分子の同定を試みた。本研究課題において特に重点的に検討を行ったのは、Ras依存的に活性化されることが明らかにされており、かっnon-apoptoticプログラム細胞死への関与の可能性が指摘されているc-Jun N-terminal kinase (JNK)である。Ras依存的non-apoptoticプロスラム細胞死制御へのJNKの関与について検討を行ったところ、Rasにより神経芽腫細胞にnon-apoptotic細胞死が誘導される過程で、細胞死に先行してJNKの活性化がおきていることが確認された。また、細胞死誘導能を持たない不活性型RasがJNKを活性化しないことも確認された。さらにこのようなRas依存的なJNKの活性化がRasによるnon-apoptotic細胞死誘導に必要か否かを明らかにするためJNKの特異的阻害薬やJNKの優性抑制変異体等を用いて検討を行ったところ、Ras依存的な神経芽腫細胞の細胞死がJNKの活性阻害によりJNKの活性抑制の程度と平行する形で抑制されることが明らかになった。これらの所見はJNKがRas依存的non-apoptoticプログラム細胞死の細胞死シグナル伝達において重要な役割を果たしている可能性を示唆するものであり、Ras依存的non-apoptoticプログラム細胞死の制御機構の新たな一面を明らかにすることができた。Ras依存的非アポトーシス性プログラム細胞死のin vitroモデル実験系を用い、Rasから非アポトーシス性細胞死に至るシグナル伝達の制御機構について検討を行った。これまでの解析結果からRas依存的に制御されるnon-apoptoticプログラム細胞死はミトコンドリア膜透過性亢進の関与しないプログラム細胞死であることが判明している。またPI3キナーゼを介する細胞内シグナル伝達経路およびRacがRas依存的細胞死のシグナル伝達に重要な役割を果たしていることも明らかにしている。これに加えて最近RhoAやCdc42等Rac以外のRhoファミリータンパク質もRas依存的細胞死の制御に関与していることが明らかになった。一方、Bcl-2ファミリータンパク質はミトコンドリアを介する非アポトーシス性プログラム細胞死の制御に関与していることが知られている。しかしながら、Bcl-2ファミリータンパク質による細胞死制御の分子機構ついてはまだ重要な点に未解明の部分が残されている。その代表がBH3-onlyタンパク質によるミトコンドリア膜透過性亢進のメカニズムである。そこでBH3-onlyタンパク質の一つであるHrkの標的分子を酵母two-hybrid screeningにより探索したところ、Hrkがミトコンドリア膜チャネル形成タンパク質であるp32と結合することが明らかになった。さらにp32の優性抑制変異体やsiRNAを用いた機能解析の結果、p32の発現・活性がHrkによる細胞死誘導に必須であることも確認された。以上の結果よりBH3-onlyタンパク質Hrkはp32と結合しそのチャネル活性を制御することによってミトコンドリア膜透過性を変化させている可能性が考えられるようになってきた。これまでに我々はグリオーマ細胞や神経芽腫細胞等においてRasシグナル伝達経路の恒常活性化によりアポトーシスとは異なった(non-apoptotic)

プログラム細胞死が誘導されること、またこのようなnon-apoptoticプログラム細胞死がヒト生体内でも実際にがんの抑制や神経変性疾患の発生に関与している可能性を明らかにし、本研究課題においてこのような細胞死の制御に関与する分子の同定を試みた。本年度はこれまでにRas依存的に活性化されることが明らかにされており、かつnon-apoptoticプログラム細胞死への関与の可能性が指摘されているc-Jun N-terminal kinase(JNK)がRas依存的non-apoptoticプロスラム細胞死の制御に関与している可能性について検討を行ったが、その結果、Rasにより神経芽腫細胞にnon-apoptotic細胞死が誘導される過程で細胞死に先行してJNKの活性化がおきていることが確認された。また、細胞死誘導能を持たない不活性型RasがJNKを活性化しないことも確認された。次いでこのようなRas依存的なJNKの活性化がRasによるnon-apoptotic細胞死誘導に必要か否かを明らかにするためJNKの特異的阻害薬を用いて検討を行ったところ、Ras依存的な神経芽腫細胞の細胞死が阻害薬によるJNKの活性抑制の程度と平行する形で抑制されることが明らかになった。これらの所見はJNKがRas依存的non-apoptoticプログラム細胞死の細胞死シグナル伝達において重要な役割を果たしている可能性を示唆するものである。今後はこれらの所見の確認を進める予定である。