hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
虚血性神経細胞死におけるGluR_2仮説の検証

最近、虚血後にAMPA型受容体のサブユニット構成が変化することによりAMPA型受容体がカルシウム透過性を持つようになり,遅発性神経細胞死を引き起こす可能性が示唆されたが(GluR2仮説),in vivoでの直接的証拠はいまだ無い.本研究は,GluR2仮説をin vivoで直接的に検証することを目的とする.すなわち,カルシウム非透過性を決定するサブユニットGluR2を持たないAMPA型受容体を選択的に阻害する薬剤を脳虚血動物モデルに投与することにより,海馬CA1細胞の虚血性神経細胞死を抑制することが可能かどうかを検討した.虚血モデルには砂ネズミの両側総頚動脈5分間閉塞モデルを用い,カルシウム透過型AMPA型グルタミン酸受容体の選択的阻害薬である1-naphythyl-acetyl spermin(Nasp)を人工髄液に溶解し様々な濃度および時間で左側脳室内投与した.動物は虚血後7日で潅流固定しCA1の残存細胞数を計測した.mini-osmotic pumpを用い,8ul/hで虚血後27時間から24時間連続投与した場合,わずかな保護効果が認められたが,その効果は僅少であった。lul/hで虚血前日から7日間連続投与した場合(1,5,10,50mM),25mMを2.5ul/10minで1回投与した場合(虚血後1時間,24時間)には有意の保護効果は認められなかった.砂ネズミ一過性前脳虚血による海馬CA1遅発性神経細胞死ではGluR2仮説で提唱された虚血後のAMPA型受容体を介したカルシウム流入は,その細胞死進行の機構において大きな役割を担っているとは考えにくいことが示唆された.平成12年度には,視床網様核ニューロンなど海馬CA1ニューロン以外の神経細胞における虚血性神経細胞死でのGluR2仮説の検証を行う予定である.最近、虚血後にAMPA型受容体のサブユニット構成が変化することによりAMPA型受容体がカルシウム透過性を持つようになり,遅発性神経細胞死を引き起こす可能性が示唆されたが(GluR2仮説),in vivoでの直接的証拠はいまだ無い.本研究は,GluR2仮説をin vivoで直接的に検証することを目的とする.すなわち,カルシウム非透過性を決定するサブユニットGluR2を持たないAMPA型受容体を選択的に阻害する薬剤を脳虚血動物モデルに投与することにより,海馬CA1細胞の虚血性神経細胞死を抑制することが可能かどうかを検討した.虚血モデルには砂ネズミの両側総頚動脈5分間閉塞モデルを用い,カルシウム透過型AMPA型グルタミン酸受容体の選択的阻害薬である1-naphythyl-acetyl spermin(Nasp)を人工髄液に溶解し様々な濃度および時間で左側脳室内投与した.動物は虚血後7日で潅流固定しCA1の残存細胞数を計測した.mini-osmotic pumpを用い,8ul/hで虚血後27時間から24時間連続投与した場合,わずかな保護効果が認められたが,その効果は僅少であった。lul/hで虚血前日から7日間連続投与した場合(1,5,10,50mM),25mMを2.5ul/10minで1回投与した場合(虚血後1時間,24時間)には有意の保護効果は認められなかった.砂ネズミ一過性前脳虚血による海馬CA1遅発性神経細胞死ではGluR2仮説で提唱された虚血後のAMPA型受容体を介したカルシウム流入は,その細胞死進行の機構において大きな役割を担っているとは考えにくいことが示唆された.平成12年度には,視床網様核ニューロンなど海馬CA1ニューロン以外の神経細胞における虚血性神経細胞死でのGluR2仮説の検証を行う予定である.
p27遺伝子の一塩基多型解析による自然流産および胞状奇胎のリスク判定と人種間比較

P27^<Kip1>遺伝子(以下p27)は,細胞核内における主要な増殖抑制因子のひとつである.その機能としては,サイクリン依存性キナーゼ阻害タンパクとして特にサイクリンEを阻害することにより細胞周期におけるG1期での増殖抑制に寄与するものである.われわれは本研究を通じてp27の開始コドンから上流79塩基対に1塩基の多型が存在することを明らかにした.この上流の領域はp27がmRNAに転写された際に特有なループ構造を呈し,このループの先端に数種類のRNA結合タンパクが結合することにより,p27タンパクが発現することが知られている.本研究を通じ,われわれはこの1塩基多型つまりこの部位での塩基の違いによるp27タンパク発現量の差について検討し,さらに分子疫学的観点より1塩基多型とp27タンパク発現量の関係,自然流産での分布について得られた知見を報告する.自然流産胎児とp27遺伝子多型につきRFLP解析およびSSCPによりgenotypingを行った.さらに免疫組織化学染色にて流産絨毛におけるp27たん白発現を解析した.95症例の自然流産絨毛,コントロールとして79例の母親脱落膜組織を用い,DNA抽出後各例PCR,RFLP解析,SSCP解析によりgenotypeを決定した.その結果,流産胎児においては,C/C:26例(27.4%),T/C:19例(20.0%),T/T:50例(52.6%)であった.一方母親組織では,C/C:25例(31.6%),T/C:15例(18.9%),T/T:39例(49.3%)であり,両者のgenotype分布には統計学的有意差を認めなかった.さらに,免疫組織化学染色を用いて,胎児genotype別の,絨毛上皮におけるp27たん白発現量を解析した.その結果,C/Cの胎児では,絨毛上皮のたん白染色性は,1+:11例,2+:6例,3+:1例であり,T/Cの胎児では,1+:8例,2+:15例,3+:2例,T/Tの胎児では,1+:4例,2+:8例,3+:6例であった.C/CとT/Tでは,たん白発現分布に統計学的有意差を認めた.また免疫染色のコントロール群として,絨毛上皮にubiquitousに発現しているサイトケラチン染色をおこなったがC/C,C/T,およびT/T間で発現量の差は認めなかった.以上より,この1塩基多型は自然流産のリスクには,直接的に関与していないが,p27遺伝子たん白発現量の調節に関与していると考えた.P27^<Kip1>遺伝子(以下p27)は,細胞核内における主要な増殖抑制因子のひとつである.その機能としては,サイクリン依存性キナーゼ阻害タンパクとして特にサイクリンEを阻害することにより細胞周期におけるG1期での増殖抑制に寄与するものである.われわれは本研究を通じてp27の開始コドンから上流79塩基対に1塩基の多型が存在することを明らかにした.この上流の領域はp27がmRNAに転写された際に特有なループ構造を呈し,このループの先端に数種類のRNA結合タンパクが結合することにより,p27タンパクが発現することが知られている.本研究を通じ,われわれはこの1塩基多型つまりこの部位での塩基の違いによるp27タンパク発現量の差について検討し,さらに分子疫学的観点より1塩基多型とp27タンパク発現量の関係,自然流産での分布について得られた知見を報告する.自然流産胎児とp27遺伝子多型につきRFLP解析およびSSCPによりgenotypingを行った.さらに免疫組織化学染色にて流産絨毛におけるp27たん白発現を解析した.95症例の自然流産絨毛,コントロールとして79例の母親脱落膜組織を用い,DNA抽出後各例PCR,RFLP解析,SSCP解析によりgenotypeを決定した.その結果,流産胎児においては,C/C:26例(27.4%),T/C:19例(20.0%),T/T:50例(52.6%)であった.一方母親組織では,C/C:25例(31.6%),T/C:15例(18.9%),T/T:39例(49.3%)であり,両者のgenotype分布には統計学的有意差を認めなかった.さらに,免疫組織化学染色を用いて,胎児genotype別の,絨毛上皮におけるp27たん白発現量を解析した.その結果,C/Cの胎児では,絨毛上皮のたん白染色性は,1+:11例,2+:6例,3+:1例であり,T/Cの胎児では,1+:8例,2+:15例,3+:2例,T/Tの胎児では,1+:4例,2+:8例,3+:6例であった.C/CとT/Tでは,たん白発現分布に統計学的有意差を認めた.また免疫染色のコントロール群として,絨毛上皮にubiquitousに発現しているサイトケラチン染色をおこなったがC/C,C/T,およびT/T間で発現量の差は認めなかった.以上より,この1塩基多型は自然流産のリスクには,直接的に関与していないが,p27遺伝子たん白発現量の調節に関与していると考えた.今年度は,自然流産胎児とp27遺伝子多型につきRFLP解析にてgenotypingを行い,さらに免疫組織化学染色にて流産絨毛におけるp27たん白発現を解析した.

95症例の自然流産絨毛,コントロールとして79例の母親脱落膜組織を用い,DNA抽出後各例PCR,RFLP解析によりgenotypeを決定した.その結果,流産胎児においては,C/C:26例(27.4%),T/C:19例(20.0%),T/T:50例(52.6%)であった.一方母親組織では,C/C:25例(31.6%),T/C:15例(18.9%),T/T:39例(49.3%)であり,両者のgenotype分布には統計学的有意差を認めなかった.さらに,免疫組織化学染色を用いて,胎児genotype別の,絨毛上皮におけるp27たん白発現量を解析した.その結果,C/Cの胎児では,絨毛上皮のたん白染色性は,1+:11例,2+:6例,3+:1例であり,T/Cの胎児では,1+:8例,2+:15例,3+:2例,T/Tの胎児では,1+:4例,2+:8例,3+:6例であった.C/CとT/Tでは,たん白発現分布に統計学的有意差を認めた.以上より,この1塩基多型は自然流産のリスクには,直接的に関与していないが,p27遺伝子たん白発現量の調節に関与していると考えた.今年度は、自然流産胎児とp27遺伝子多型につきRFLP解析に加え、SSCPによりgenotypingを行った。さらに免疫組織化学染色にて流産絨毛におけるp27たん白発現を解析した。95症例の自然流産絨毛、コントロールとして79例の母親脱落膜組織を用い、DNA抽出後各例PCR、RFLP解析、SSCP解析によりgenotypeを決定した。その結果、流産胎児においては、C/C:26例(27.4%)、T/C:19例(20.0%),T/T:50例(52.6%)であった。一方母親組織では、C/C:25例(31.6%)、T/C:15例(18.9%)、T/T:39例(49.3%)であり、両者のgenotype分布には統計学的有意差を認めなかった。さらに、免疫組織化学染色を用いて、胎児genotype別の、絨毛上皮におけるp27たん白発現量を解析した。その結果、C/Cの胎児では、絨毛上皮のたん白染色性は、1+:11例、2+:6例、3+:1例であり、T/Cの胎児では、1+:8例、2+:15例、3+:2例、T/Tの胎児では、1+:4例、2+:8例、3+:6例であった。C/CとT/Tでは、たん白発現分布に統計学的有意差を認めた。また免疫染色のコントロール群として、絨毛上皮にubiquitousに発現しているサイトケラチン染色をおこなったがC/C、C/T、およびT/T間で発現量の差は認めなかった。以上より、この1塩基多型は自然流産のリスクには、直接的に関与していないが、p27遺伝子たん白発現量の調節に関与していると考えた。
高速衝撃貫入により粒状物質集合体中に引き起こされる諸現象の解明

砂へ飛翔体を高速貫入させ、本研究で開発したマグネット・コイル法を用いて貫入深さと速度減衰履歴を計測した。結果、飛翔体の貫入挙動が変化する速度である遷移速度が存在し、その速度は砂集合体の弾性波速度に一致することがわかった。このことより、遷移速度前後では貫入中の力学状態が異なることが明らかになった。飛翔体高速貫入実験において、貫入軌道は蛇行することがわかった。この軌道を精度良く計測するために、マグネット・コイル法を用い、蛇行を模擬した物体の「偏心+傾き」が出力に与える影響を調査し、理論式を構築した。そして、コイル中心からの偏心量および飛翔体貫入経路を同定する手法を確立するのに有益な知見を得た。砂層貫入中の飛翔体速度減速履歴を高精度で計測する手法として、磁石搭載飛翔体が通過した際の誘導起電力をコイルで検出するマグネット・コイル法を提案してきた。本手法を貫入中に蛇行することがわかっている飛翔体の軌道計測に応用できないか検討した。課題としては1.偏心の計測、2.傾きの計測が挙げられるが、本年度は1.偏心の計測に注力した。結果、コイル中心からの偏心量が大きくなるにつれてコイルの最大出力電圧が単調増加することがわかった。現在、偏心量をパラメータとして導入した理論式を構築中であり、飛翔体が傾いた時のコイル出力のデータも取得・分析することにより、飛翔体高速貫入時の貫入経路の同定手法を今後確立していきたい。マグネット・コイル法で計測した貫入中の飛翔体速度と深さの関係を片対数グラフに示したところ、貫入速度が100200m/sに達すると速度の下がり方に変化が生じることがわかった。この速度(以降、遷移速度と記す)が砂を伝播する波の速度に関わっていると予想し、スプリット・ホプキンソン棒型衝撃圧縮試験装置を用いて波の伝播速度を計測し、遷移速度との比較を行った。また、砂の粒径と充填密度が音速に及ぼす影響について調査した。結果、充填密度を変化させた時の波の伝播速度は充填密度に対して線形的に増加することがわかった。また、粒径の変化による影響は見られなかった。遷移速度に関しては、波の伝播速度と一致することがわかった。ただしまだデータ数が少ないため、再現性確認実験が必要である。粒径:106-300ミクロン、充填密度:1.35×10^3 kg/m^3(間隙率:49%)の砂層に対して高速貫入試験を実施した。設定衝突速度は秒速300 m、500 mとした。砂層貫入中に時々刻々と変化する飛翔体速度を可能な限り正確に計測するためにマグネット・コイル法を提案し、計測手法の確立およびコイル出力の定式化に取り組んだ。まだ計測精度に改良の余地はあるが、過去に報告例のない詳細な速度減衰履歴を取得することができ、本法の妥当性が確認できた。また、コイル巻数、コイル直径、磁束密度、衝突速度をパラメータとした定式化にも成功し、理論値と実験値を一致させることができた。貫入中の飛翔体軌道計測を固形剤による試料凍結技術を用いて実施し、飛翔体は真っ直ぐ貫入するのではなく、進行方向を変えながら貫入していることがわかった。今後、この不規則な貫入中の挙動をマグネット・コイル法による貫入速度計測技術を用いて読み取れないか検討していきたい。物体の貫入軌道周辺粒子の破砕形態および空間分布については、凍結試料を用いてデジタルマイクロスコープにより観察したが、X線CTを用いることにより、より特殊な観察が可能となることから、今後実施していきたいと思う。初年度の砂層への飛翔体高速貫入試験において、貫入する飛翔体の軌道は真っ直ぐではなく、蛇行することがわかった。この時々刻々と変化する軌道を計測するために、これまで貫入速度履歴計測を目的として開発してきたマグネット・コイル法(多数設置したコイルを磁石搭載飛翔体が通過した際の誘導起電力を検出する方法)を応用できないか検討した。結果、コイル中心からの偏心量および飛翔体のコイル面に対する傾きをパラメータとして導入した理論式を構築することに成功し、マグネット・コイル法で得られた波形から飛翔体貫入経路を同定する手法を確立するのに有益な知見を得た。現状では自動的に軌道を算出するには至っていないが、今後はそのシステムの開発が研究課題となる。本成果は、これまで理解するのが困難であった「不均質な粒状体中を高速で貫入する物体周りに誘起される物理現象」の解明のために、有益な情報を提供すると考える。衝撃工学砂層貫入中に飛翔体が蛇行することがわかり、飛翔体の軌道および姿勢をその場計測する手法の開発に主に注力した。

そのため当初の計画以上に進んでいる項目と手がつけられていない項目とがあるが、合わせて概ね順調と判断する。実験については、新たな発見があり、検討項目が増えてはいるが概ね順調に進んでいる。一方、上記の理由から、数値解析による粒状物質への衝撃現象の検討が進んでおらず、次年度には注力していきたい。飛翔体のコイル中心からの偏心量をパラメータとして導入した理論式を構築する。また、飛翔体が傾いた時のコイル出力のデータも取得・分析することにより、飛翔体高速貫入時の貫入経路の同定手法を確立する。飛翔体貫入軌道周辺粒子の破砕形態に関して、X線CTを利用して詳細に観察する。同時に砂粒子の破砕強度を計測し、力の連鎖を検討する。SPHやDEMによる数値解析を行い、離散粒子の複雑な運動を表現する。本年度初期に実験を中心に研究を遂行し、新たな興味深い課題がいくつか見つかり、それらの解決に注力した。次年度は解析にも力を注ぎ、当初の研究計画通りに進めていきたいと思う。未使用研究費が生じているが、これは学内予算が当初の予想以上に確保でき、それを優先して使用したためであり、研究は問題なく遂行できている。圧力測定器購入費、火薬銃の運用消耗品費、ターゲット材料、金属材料および電子部品購入費に主に使用予定である。縦型無隔膜ガス銃の最終組立費、火薬銃の運用消耗品費、圧力測定器に主に使用予定である。
臓器移植におけるＲＡＧＥリガンドを介した新たな免疫制御システムの確立

1.動物実験モデルにおけるRAGEリガンドの動態・機能解析と制御肝臓の虚血再灌流障害(I/R injury)+肝切除モデルを用いて、High mobility group box-1 (HMGB-1)の動態・機能を解析し、その制御を目指した。その結果、肝切除単独群に比べI/Rinjury+肝切除群においては、HMGB-1が有意に肝細胞の核内に強発現し、細胞質へtranslocationしている所見を得た。I/R injury+肝切除群では、cell cycleを抑制するp21が強発現し、肝細胞増殖は有意に抑制され、肝切除単独群に比べ細胞サイズが有意に増大しており、残肝再生は肝細胞のhypertrophyに起因していた。I/R injury+肝切除群に抗HMGB-1抗体を投与した結果、I/R injuryの軽減効果を認めると共に、肝再生においては肝細胞のhypertrophyを軽減し、肝細胞増殖を促進させる所見を得た。2. RAGEリガンドを介した免疫担当細胞の活性化機構の解明と制御ヒトでのMixed lymphocyte reaction (MLR)では、HMGB-1は単球/マクロファージ上の細胞接着因子の発現を増強させ、サイトカイン産生およびTリンパ球増殖反応を促進させた。HMGB-1によるMLRでのTリンパ球増殖反応は、抗ICAM-1抗体・抗B7.1抗体・抗B7.2抗体および抗CD40抗体投与によるcostimulatory signalのブロックによって抑制可能であることを示した。また、RAGE・toll-like receptor(TLR)2/4のノックアウトマウスを用いて、HMGB-1による単球/マクロファージの活性化は主にRAGEを介することを示し、抗RAGE抗体によって、HMGB-1によるMLRでのTリンパ球増殖反応が抑制される所見を得た。本研究では臓器移植における拒絶反応や虚血再灌流障害において、生活習慣病の病態形成に関与するAdvanced glycation end products (AGEs)やHigh mobility group box-1 (HMGB-1)等のReceptor for AGE (RAGE)リガンドが及ぼす影響・メカニズムをIn vitroおよびVivoの両面から解析し、RAGEを介した自然免疫機構の制御による臓器移植医療への貢献を目指してきた。まずIn vitroでは、HMGB-1は主としてRAGEを介して単球/マクロファージ上の細胞接着因子の発現を増強させ、サイトカイン産生およびTリンパ球増殖反応を促進させた。そして、Tリンパ球増殖反応はcostimulatory signalに対する抗体療法および抗RAGE抗体によって抑制し得るデータを得た。Vivoでは、肝臓の虚血再灌流障害モデルにおいてHMGB-1の動態・機能を解析し、抗HMGB-1抗体投与による制御を目指した。その結果、肝臓の虚血再灌流によって肝逸脱酵素の高度上昇と組織学的障害と共に、肝細胞にHMGB-1の核内強発現と細胞質へのtranslocationを認めた。そして、抗HMGB-1抗体投与は、肝細胞でのHMGB-1の核内強発現と細胞質へのtranslocationを抑制し、虚血再灌流障害の軽減効果を示した。このように、臓器移植におけるRAGEリガンドを介した自然免疫機構による拒絶反応や虚血再灌流障害の制御に向けた研究データの集積を達成し得た。平成25年度には、上記の研究成果を国内外に向けて学会発表すると共に、In vitroでの研究結果は英文雑誌に採択・発表され、現在はVivoの研究成果を英文雑誌に投稿中である。本研究においては、生活習慣病の病態形成に関与するAGEsやHMGB-1等のRAGEリガンドが肝臓における虚血再灌流障害(I/R injury)・肝再生過程や臓器移植の拒絶反応に及ぼす影響・メカニズムをVivoおよびIn vitroの両面から解析し、RAGEを介した自然免疫機構の制御を目指してきた。まずVivoでは、肝臓のI/R injury+肝切除モデルにおいてHMGB-1の動態・機能を解析し、抗HMGB-1抗体投与による制御を目指した。その結果、I/R injuryによって肝再生過程の肝細胞にHMGB-1の核内強発現と細胞質へのtranslocationを認めると共に、cell cycleを抑制するp21が強発現し、肝細胞増殖は抑制され、残肝再生は主として肝細胞のhypertrophyに起因していた。そして、抗HMGB-1抗体投与は、I/R injuryの軽減効果を示すと共に、肝再生過程においては肝細胞のhypertrophyを軽減し、肝細胞増殖を促進させる所見を得た。In vitroでは、HMGB-1は主としてRAGEを介して単球/マクロファージ上の細胞接着因子の発現を増強させ、サイトカイン産生およびTリンパ球増殖反応を促進させた。そして、これらヒトMLRでのTリンパ球増殖反応はcostimulatory signalに対する抗体療法および抗RAGE抗体によって抑制し得るデータを得た。このように、RAGEリガンドであるHMGB-1の動態・機能および制御に関するデータを動物実験モデルおよびIn vitroの両面で得ることができ、臓器移植や外科侵襲下におけるRAGEリガンドを介した自然免疫機構の制御に向けた研究データの集積を達成し得た。本邦における臓器移植や肝臓外科領域では、症例数の増加に伴い、糖尿病や動脈硬化症等の生活習慣病を合併する割合も増えている。これら生活習慣病では、最終糖化産物であるAGEsや新規に発見された起炎性因子であるHMGB-1等のRAGEリガンドが病態を進展させる。

そのため本研究においては、生活習慣病の病態形成に関与するAGEsやHMGB-1等のRAGEリガンドが肝臓における虚血再灌流障害・肝再生過程や拒絶反応を含めた臓器移植における免疫機構に及ぼす影響をVivoおよびIn vitroの両面から解析し、RAGEを介した自然免疫機構を制御することによって、新たな免疫制御システムの確立を目指している。まずVivoでは、正常ラットと糖尿病モデルラットにおける肝臓の虚血再灌流+肝切除モデルを確立し、虚血再灌流障害・肝再生・肝アポトーシスにおけるHMGB-1およびAGEsの動態および機能を解析した。肝臓の虚血再灌流+肝切除モデルにおいてはHMGB-1が肝切除24時間後をピークに経時的に発現が増強しており、免疫染色にて発現部位を同定した。その結果、細胞外に放出されたHMGB-1は虚血再灌流障害の増悪に関与する共に、細胞質にtranslocationしたHMGB-1は肝再生による組織修復に機能的に寄与している可能性を示唆するデータを得た。In vitroでは、HMGB-1はTLRとRAGEの両レセプターを介して単球/マクロファージ上の細胞接着因子の発現を増強させ、サイトカイン産生およびTリンパ球増殖反応を促進させた。これらはMAPKおよびNF-κBによる細胞内シグナル伝達を介しているデータを得た。このように平成23年度には、RAGEリガンドの動態・機能に関するデータを動物実験モデルおよびIn vitroの両面で得ることができ、自然免疫機構に及ぼす影響の制御に向けての基礎データの収集を達成し得た。肝臓の虚血再灌流障害(I/R injury)+肝切除動物実験モデルでは、抗HMGB-1抗体投与によってI/R injuryの軽減効果が得られ、肝再生過程においては肝細胞のhypertrophyを軽減し、肝細胞増殖を促進させる所見を得た。今後は、抗HMGB-1抗体投与によるHMGB-1の制御が肝再生過程に及ぼす影響・メカニズムをさらに解析していくと共に、肝切除および肝臓移植における虚血再灌流障害の軽減および肝再生促進を目的とした臨床応用を推進し、臓器移植・外科侵襲におけるRAGEリガンドを介した自然免疫制御システムを模索していく方針である。In vitroでは、HMGB-1による単球/マクロファージの活性化を介したTリンパ球の増殖反応は、costimulatory signalのブロックによって抑制可能であることを示した。また、HMGB-1添加によるMLRでは、単球/マクロファージ上のRAGEおよびTLR-4が強発現していることをFlow cytometryで示し、抗RAGE抗体の投与によって、MLRでのHMGB-1によるTリンパ球の増殖反応が抑制される所見を得た。本研究によって、HMGB-1を主体としたRAGEリガンドによる免疫担当細胞の活性化が臓器移植における拒絶反応の誘発および難治化に関与している可能性が示唆され、今後は臓器移植後の拒絶反応制御を目的としてRAGEリガンドをターゲットとした臨床応用可能な治療法を模索していく方針である。平成23年度には正常ラットと糖尿病ラットを用いた肝臓の虚血再灌流+肝切除モデルにおいて、虚血再灌流障害・肝再生・肝アポトーシスにおけるHMGB-
細胞の情報伝達系に登場した新しいヌクレオチド代謝酵素の機能解析

本研究では、細胞表層上の新しい機能分子と期待されるCD38及びその関連分子PC-1に関わる細胞内シグナル伝達機構、酵素化学的特性、及び転写制御機構などを検討し、以下の知見を得た。1、抗CD38モノクローン抗体(IgG1)でHL-60細胞を刺激すると、癌遺伝子産物p120^<c-cbl>を含む細胞内蛋白質がチロシンリン酸化され、さらにG蛋白質と共役する化学遊走因子受容体刺激を介する活性酸素産生が増強された。この活性酸素産生の増強は、CD38抗体のFc部分がFcγII受容体を刺激して、G蛋白質を介するイノシトールリン脂質3キナーゼの活性化を増強した結果であった。2、ラットCD38を認識するポリクローナル抗体を作製して中枢組織での局在を解析した結果、CD38はアストロ細胞に強く発現していた。さらに共焦点レーザー顕微鏡を用いた観察から、細胞表層のCD38は酵素反応の進行にともない何らかの化学修飾を受けて不活性化されることが明らかにされた。3、CD38の反応産物のADP-riboseは、老化への関与が指摘されている翻訳御修飾であるadvanced glycation end products(AGE)化のよい供与体となることが示された。4、糖鎖修飾を受けたCD38と結合する50-kDaタンパク質をリンパ組織に同定し、CD38のNADase活性がレクチンとの結合により阻害されることを見出した。5、ヒトCD38遺伝子の遺伝子発現について解析し、核内レチノイン酸受容体のRAR(α)/RXRが結合する応答配列が第1イントロン上に存在することを見出した。先に申請者の研究グループは、レチノイン酸によるヒトHL-60細胞の好中球への分化過程でエクト型NAD分解酵素(NADase)が細胞表層に誘導され、この酵素活性がリンパ球表現抗原のCD38によって担われていることを明らかにした。本研究では、細胞表層上の新しい機能分子と期待されるCD38及び関連酵素分子につき、細胞内へのシグナル伝達機構、酵素化学的特性、転写調節の機構などを検討し、以下の知見を得た。1、IgG_1サブクラスに属する抗CD38モノクローン抗体でリンパ球系の細胞を刺激すると、複数の細胞内機能蛋白質がチロシンリン酸化され、さらにG蛋白質と共役する化学遊走因子受容体刺激を介する活性酸素産生は著しく増強された。この増強作用は、CD38抗体のFc部分がFcγII受容体を刺激して、G蛋白質を介するイノシトールリン脂質3キナーゼの活性化を増強した結果であった。2、ラット脳の初代培養法により、各種のグリア、神経細胞を分取してラットCD38の局在を解析した結果、CD38はアストロ細胞に強く発現しており、またその細胞表層には顕著なNADase活性が認められた。さらに共焦点レーザー顕微鏡を用いた観察から、アストロ細胞のCD38は斑点(cluster)状の構造をとり、基質NADの添加によって細胞内陥入(internalization)することが明かにされた。3、これらリンパ球系と神経系の細胞表層には、ヌクレオチドを基質とするPC-1様の酵素(phyrophosphatase/phosphodiesterase)活性が存在し、その一部は分泌型の性状を示した。4、ヒトCD38遺伝子の遺伝子発見について解析し、核内レチノイン酸受容体のRAR(α)/RXRが結合する応答配列が第1イントロン上に存在することを見出した。先に申請者の研究グループは、レチノイン酸によるヒトHL-60細胞の好中球への分化過程でエクト型NAD分解酵素(NADase)が細胞表層に誘導され、この酵素活性がリンパ球表面抗原のCD38によることを明らかにした。

本研究では、細胞表層上の新しい機能分子と期待されるCD38及びその関連分子に関わる細胞内シグナル伝達機構、酵素化学的特性、及び転写制御機構などを検討し、以下の知見を得た。1、CD38の基質特異性について検討し、CD38はNAD以外に、ニコチンアミドを有するNMNなどの多様な化合物のN-グリコシド結合を切断することが示された。2、ラットCD38を認識するポリクローナル抗体を作製して中枢組織での局在を解析した結果、CD38はアストロ細胞に強く発現していた。さらに共焦点レーザー顕微鏡を用いた観察から、細胞表層のCD38は酵素反応の進行にともない何らかの化学修飾を受けて不活性化されることが明らかにされた。3、CD38の反応産物のADP-riboseは、老化への関与が指摘されている翻訳御修飾であるadvanced glycation end products(AGE)化のよい供与体となることが示された。4、糖鎖修飾を受けたCD38と結合する50-kDaタンパク質をリンパ組織に同定し、CD38のNADase活性がレクチンとの結合により阻害されることを見出した。5、ヒトCD38遺伝子の遺伝子発現について解析し、核内レチノイン酸受容体のRAR(α)/RXRが結合する応答配列が第1イントロン上に存在することを見出した。6、構造上CD38に類似したPC-1にはホスホジエステラーゼ活性が存在するが、PC-1 mRNAの翻訳産物から異なるプロセッシングによって、膜貫通型および分泌型酵素が産生する可能性が示された。
副腎白質ジストロフィーの病態解明と治療法の開発

副腎白質ジストロフィー(ALD)の病態の解明と治療法の開発を、ALD遺伝子ノックアウトマウスを用いて行った。ALD蛋白(ALDP)欠損細胞で極長鎖脂肪酸(VLCFA)CoA合成酵素(VLACS)のみの発現を増強してもVLCFAのβ酸化の促進がみられなかったことから、VLCFAのβ酸化においてVLACSが機能を発揮するためにはALDPが必要と考えられた。細胞分画の分析で、VLACSのペルオキシソームへの分布がALDP欠損組織では減少していたことから、ALDPはVLACSがペルオキシソームに分布する過程に働いていると考えられた。ALD発症に関与する因子として炎症細胞に注目して、ALDP欠損がミクログリアの活性化に及ぼす影響を検討したが、インターフェロン-γ/リポポリサッカリドによるミクログリアとマクロファージの活性化は、ALDP欠損によって促進されることはなかった。ALDの治療法開発の一環として、ALD患者で血漿中VLCFAを低下させると報告されたロバスタチンの組織内のVLCFA蓄積に対する効果を評価するために、ALDP欠損マウスにロバスタチンを投与した。しかしながら、脳脊髄を含めた組織中のVLCFAの蓄積は改善されなかった。神経幹細胞の脳内移植治療を試みた。レトロウイルスベクターによりALDPを発現させたC17-2細胞を新生マウスの脳室内に投与したが、定着細胞数が少なく脳全体としてのVLCFA蓄積の改善効果は認められなかった。伴性劣性遺伝型副腎白質ジストロフィー(ALD)は、中枢・末梢神経の脱髄による神経症状と副腎不全を呈する疾患である。病因遺伝子産物のALD蛋白(ALDP)を欠損したマウスを用いて、ALDの分子病態の解明及び治療法の開発を目指して研究を行った。新生マウス脳から得たミクログリアは、ALDP欠損マウスと正常対照とも、IFN-γとLPSの同時投与により活性化された。NO_2産生量はALDP欠損マウスで増加傾向がみられたが、対照マウスとの有意差は得られなかった。TNF-α産生量も有意差はみられなかった。腹腔内マクロファージについても、ALDP欠損マウスと対照マウスで差はみられなかった。マクロファージについてVLCFAの代謝を検討した。VLCFAの組成はC24/C22、C25/C22、C26/C22の比ともALDP欠損マウスで若干の増加がみられたが、組織中の蓄積に比較して軽度であった。また、ALDP欠損マクロファージのリグノセリン酸β酸化活性の低下も軽度であった。オリゴデンドログリアを傷害して脱髄を惹起するcuprizone(0.5%)を生後3週のマウスに3週間経口投与した。正常対照マウスの小脳白質に強い海綿状変化がみられた。同部位は間染色で淡明となり脱髄病変と考えられた。この変化はALDP欠損マウスでも同様にみられ、両マウスで明らかな差異はみられなかった。マウスの神経幹細胞様細胞であるC17細胞に、レトロウイルスベクターを用いてALDPを発現させ、新生マウスの脳室内に2-3×10^4個投与した。1-3週間後に脳を摘出し、X-gal染色によりC17細胞の分布を調べ、VLCFAの組成を分析した。C17細胞はALDPの発現がみられなかったので、レトロウイルスベクターによりALDPを発現させた。脳室内投与2-3週間後の脳をX-gal染色すると、脳実質内に染色がみられ、細胞が実質内に移動し生着していることが確認された。ただし土着細胞数には個体差が大きかった。現在、VLCFAを分析中である。

ALD蛋白(ALDP)欠損細胞で極長鎖脂肪酸(VLCFA)CoA合成酵素(VLACS)のみの発現を増強してもVLCFAのβ酸化の促進がみられなかったことから、VLCFAのβ酸化においてVLACSが機能を発揮するためにはALDPが必要と考えられた。細胞分画の分析で、VLACSのペルオキシソームへの分布がALDP欠損組織では減少していたことから、ALDPはVLACSがペルオキシソームに分布する過程に働いていると考えられた。ALD発症に関与する因子として炎症細胞に注目して、ALDP欠損がミクログリアの活性化に及ぼす影響を検討したが、インターフェロン-γ/リポポリサッカリドによるミクログリアとマクロファージの活性化は、ALDP欠損によって促進されることはなかった。ALDの治療法開発の一環として、ALD患者で血漿中VLCFAを低下させると報告されたロバスタチンの組織内のVLCFA蓄積に対する効果を評価するために、ALDP欠損マウスにロバスタチンを投与した。しかしながら、脳脊髄を含めた組織中のVLCFAの蓄積は改善されなかった。神経幹細胞の脳内移植治療を試みた。レトロウイルスベクターによりALDPを発現させたC17-2細胞を新生マウスの脳室内に投与したが、定着細胞数が少なく脳全体としてのVLCFA蓄積の改善効果は認められなかった。
Development of complex spiking, biophysically realistic multi-compartmental models of the cerebellar Purkinje cell to elucidate dendritic functional signaling during maturation

個々のニューロンの機能を研究するには、高度な実験機器や計算機器の開発を伴う。本作業で急性切片プレパラートにおけるニューロンの細胞間活動と細胞外活動を同時に記録するために組織内実験室と呼ばれる測定方法を確立した。又高密度微小電極アレイ上のパッチピペットの自動移動も実現した。システム全体が急性小脳切片での小脳プルキンエ細胞(PC)の分析に使用された。更にデータ分析を容易にするためPCのコンパートメントモデルを開発した。本モデルはPCの規則的かつ複雑なスパイク活動を再現する。未成熟のPCは複雑スパイク前に短いバーストで不規則持続性発火を示し、成熟したPCは複雑スパイク前にバースト活動を示した。情報学
海水魚の季節繁殖に及ぼすＣＯ２由来の海洋酸性化の影響

二酸化炭素は、地球温暖化を引き起こす主要な温室効果ガスであり、環境に及ぼす影響が懸念されている。その中でも、大気中に放出された二酸化炭素が海水に吸収されて引き起こされている「海洋酸性化」の問題が危惧されており、海洋生物に及ぼす影響の解明が求められている。そこでGUHは魚類の季節繁殖に及ぼす海洋酸性化の影響を明らかにすることを目的として、海洋メダカを14時間明期、10時間暗期の長日条件と10時間明期、14時間暗期の短日条件に1か月暴露し、季節応答性について検討した。その結果、海洋メダカは明瞭な季節繁殖性を示さないことを明らかにした。そこで、季節性が明瞭な淡水のメダカにおいても同様に、酸性化が14時間明期、10時間暗期の長日条件と10時間明期、14時間暗期の短日条件への応答性に及ぼす影響を検討したが、二酸化炭素による酸性化はメダカの季節繁殖に大きな影響を及ぼさないことを明らかにした。生物はある日長を境として応答するが、この日長のことを臨界日長と呼ぶ。GUHはさらに酸性化がメダカの臨界日長に及ぼす影響についても検討したが、臨界日長に対しても酸性化は大きな影響を与えないことを明らかにした。以上のように、本研究では二酸化炭素による酸性化が海洋性、および淡水性のメダカの繁殖活動に大きな影響を与えないことを科学的に明らかにしたが、自然界において将来、地球温暖化が様々な動物の繁殖活動に及ぼす影響については、今後も慎重に検討する必要がある。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。現在地球規模で問題になっている地球温暖化は二酸化炭素が主要な温室効果ガスである。海においては、大気中に放出された二酸化炭素が海水に吸収されて引き起こされる「海洋酸性化」の問題が危惧されている。今後300年間で海水のpHは0.8から1.4も低下すると予想されており、海洋生物におよぼす影響の解明が課題である。自然界に生息する多くの動物は環境が穏やかで、かつ食料が豊富に手に入る春から夏にかけて出産、産卵する「季節繁殖」という生存戦略をとっている。分担研究者はこれまで展開してきた硬骨魚類の酸塩基平行を制御するホルモンについての研究をさらに発展させ、魚類の季節繁殖におよぼす海洋酸性化の影響を明らかにすることを目的とした。29年度は海洋メダカの季節応答を詳細に検討した。長日温暖条件下で飼育した海洋メダカを短日温暖条件に移したが、生殖腺の大きさはほとんど変わらず、海洋メダカは日照時間の変化に対してほとんど応答しないことが明らかになった。そこで、淡水のメダカで季節応答を検討したところ、生殖腺の大きさが明瞭に変化し、季節応答を示すことが確認されたため、現在淡水のメダカにおいて異なるpHが繁殖活動におよぼす影響について検討している。29年度に海水に生息する海洋メダカを用いて、繁殖活動の季節性について検討したが、季節に対する応答が明瞭ではないことが明らかになった。これは、海洋メダカが熱帯(東南アジア)原産であることが原因であると考えられた。そこでより季節応答が明瞭な日本由来の淡水のメダカを使って実験を行うこととした。メダカは臨界日長とよばれる限界値の日照時間を超えると繁殖を開始する。淡水のメダカにおいて臨界日長にpHがおよぼす影響を検討する。また、pHの変化が季節繁殖を制御する遺伝子におよぼす影響を検討し、どのような作用機序でpHの変化が繁殖活動に影響をおよぼしているか明らかにする。
脊柱靭帯骨化症患者の成因に関する内分泌学的研究

「目的」ヒト脊柱靭帯由来培養細胞を用いて脊柱靭帯骨化症患者と非骨化症患者とのestrogenに対する親和性、及びestrogen刺激に対する応答性の相違につき比較検討した。[対象]患者の了解を得て、手術時に採取した本症患者12例の脊柱靭帯費骨化部(後縦靭帯8例、項靭帯4例)及びcontrolとして非骨化症患者10例の脊柱靭帯(後縦靭帯8例、項靭帯2例)をmaterialとした。[結果]receptor bindingassayでは,本症患者由来の培養靭帯細胞内にKD値(解離定数)で平均7.3×10^<-12.1>と、control(平均7.3×10^<-9.5>)に比しより低濃度のestradiol下でも反応するhormone receptorの存在が確認された。さらに本症患者由来の培養靭帯細胞は3,17β-estradiol添加刺激によって全例^3H-TdR up takeの増加を認めた。これに対しcontrolの細胞はほぼ不変か、むしろup takeが抑制された症例も見られた。3,17β-estradiol添加刺激によるBone Gla Protein産生能の変化では、controlの培養靭帯細胞はすべて測定限界値(1ng/ml)以下であったのに対し、本症患者由来靭帯細胞の中には極微量ではあるがBone Gla Protein産生の増加を来した症例もあり、controlとは異なるestrogen応答性を示した。[結語]以上の結果から、ヒト脊柱靭帯細胞内にestrogen receptorが存在することが確認され、脊柱靭帯骨化症患者の脊柱靭帯細胞には非骨化症患者に比し、よりestrogenに親和性の高いhormone receptorの存在が知られた。さらにestrogenはreceptorを介して靭帯細胞に直接作用し、細胞レベルでの代謝活性を促進させる可能性が示唆された。
細胞外α－シヌクレインによるＳ１Ｐ受容体シグナル伝達抑制機構の解析

αーシヌクレインはパーキンソン病の原因遺伝子として注目されており、神経細胞外にも存在することが知られていたが、その生理的・病理的意義は不明であった。今回の研究で、神経機能において重要な機能を担っていることが知られているS1P受容体とGタンパク質との共役を細胞外αーシヌクレインが阻害することが見いだされた。αーシヌクレインによる阻害作用はS1P1受容体に特異的なものであり、S1P2受容体とGタンパク質の共役は全く阻害されなかった。今回の結果は、今まで不明であった細胞外αーシヌクレインの特異的作用を初めて明らかにしたものであり、きわめて興味深いと考えられた。αーシヌクレイン(ASN)はパーキンソン病やLewy小体型認知症の原因タンパク質であるが、どのような機序でASNが神経死を引き起こすのかはわかっておりず、また、本来の生理的役割についても不明である。近年、脳脊髄液のような細胞外液にもASNが存在することが報告されている。我々はこの細胞外ASNがスフィンゴシン1ーリン酸(S1P)受容体と三量体型Gタンパク質のひとつであるGiとの共役を遮断することを初めて見いだした。その詳細なメカニズムをあきらかにするのが、本研究の目的である。今年度新たに、細胞外ASN処理によりS1P受容体が細胞のraft画分から非raft画分へ移動することが明らかとなった。スフィンゴ脂質やコレステロールが豊富なraft画分は、Gタンパク質を始めとする様々な情報伝達系のタンパク質が集積しており,細胞外から細胞内への円滑な情報伝達において重要な役割を担っていると考えられているため、細胞外ASNの存在によりS1P受容体がraft画分から消失するという事実はきわめて興味深いと考えられた。さらにS1P受容体の局在変化のメカニズムについて検討する中で、S1P受容体のパルミチン酸化が細胞外ASNの存在下では1時間以内という速い速度で激減することを見いだした。すなわち、細胞外ASNの存在によりS1P受容体の脱パルミチン酸化→S1P受容体ののraft画分からの消失→S1P受容体ーGタンパク質の共役遮断(アンカップリング)が引き起こされている可能性が高い。細胞外ASNによりS1P受容体の脱パルミチン酸化が引き起こされることを初めてあきらかにした。これにより、ASNの真のターゲットを同定するという当初の研究目的に、かなり近づくことができた。細胞外α-synuclein(ASN)によるスフィンゴシン1ーリン酸(S1P)受容体-Gタンパク質の共役阻害(アンカップリング)現象について、その詳細を検討した。ドパミン系神経細胞モデルとして広く用いられているSH-SY5Y細胞にはS1P受容体としてS1P1受容体とS1P2受容体が発現しているが、ASNはS1P1受容体とGタンパク質との共役のみを特異的に阻害し、S1P2受容体の情報伝達には全く影響しないことが明らかとなった。また、この特異的S1P1受容体遮断によって、増殖刺激時のSH-SY5Y細胞における低分子量Gタンパク質Racの活性化が強く抑制され、これにより細胞外ASNが細胞遊走を抑制することも明らかにした。以上の結果は2報の論文として発表した(Okada T, Hirai C, Badawy SM, Zhang L, Kajimoto T, Nakamura SI.さらに、S1P1受容体とGタンパク質の共役が阻害される現象について検討する中で、ASNがS1P1受容体のパルミトイル化に影響を与えていることが明らかとなった。すなわち、S1P1受容体をパルミトイル化する酵素が細胞外ASNのターゲット分子である可能性が高いと考えている。当初の計画通り、細胞外ASNによるS1P受容体の機能阻害について、その詳細について検討を行い、S1P1受容体に特異的な現象であることを見いだして論文として報告している。神経細胞においてS1P受容体が重要な機能を果たしていることは既に我々が報告していることから、今回の結果はパーキンソン病におけるASNの役割という点で、きわめて重要な知見であると考えられる。α-シヌクレイン(ASN)はパーキンソン病などの神経変性疾患の原因タンパク質であると考えられている。ASNは神経細胞内に蓄積してレビー小体と呼ばれる凝集体を形成するが、細胞外にも存在していることがしられており、この細胞外ASNの生理的・病理的意義は不明である。申請者らは細胞外ASNの作用について検討する中で、スフィンゴシン1-リン酸(S1P)受容体と3量体型Gタンパク質の共役がASNにより抑制される(アンカップリング)という極めて興味深い現象を見いだした。最終年度においては、この細胞外ASNの作用の特異性について検討を行い,S1P1受容体とGi蛋白質の共役が細胞外ASNで強く抑制されるのに対し、S1P2受容体とG12/13蛋白質の間の共役は影響を受けないことを示した。多くの受容体は細胞膜上でラフトと呼ばれるスフィンゴ脂質やコレステロールに富んだ領域に集中していることが知られている。神経細胞SH-SY5Y細胞を用いてS1P1受容体とS1P2受容体の局在について検討を行ったところ、両者ともにラフト領域に局在していることが確認された。そして細胞外ASNで細胞を処理することで、S1P1受容体の局在はラフト領域からラフト外へと移動した。S1P2受容体についてはこのような局在の変化は認められなかった。

細胞膜における受容体のラフト領域への局在は、その情報伝達において重要であると考えられている。今回の発見は、神経伝達物質放出において重要な機能を担っているS1P1受容体の局在が細胞外ASNにより変化し、その結果G蛋白質との共役が阻害されている可能性を示唆するものである。αーシヌクレインはパーキンソン病の原因遺伝子として注目されており、神経細胞外にも存在することが知られていたが、その生理的・病理的意義は不明であった。今回の研究で、神経機能において重要な機能を担っていることが知られているS1P受容体とGタンパク質との共役を細胞外αーシヌクレインが阻害することが見いだされた。αーシヌクレインによる阻害作用はS1P1受容体に特異的なものであり、S1P2受容体とGタンパク質の共役は全く阻害されなかった。今回の結果は、今まで不明であった細胞外αーシヌクレインの特異的作用を初めて明らかにしたものであり、きわめて興味深いと考えられた。細胞外ASNによりS1P受容体のパルミチン酸化が激減したことから、理論的には脱パルミチン酸化が亢進しているか、パルミチン酸化が阻害されている可能性がある。予備的検討にてパルミチン酸化の阻害薬である2BPが細胞外ASNと同じようなタイムコースでS1P受容体のパルミチン酸化減少を引き起こすことから、細胞外ASNはパルミチン酸化を阻害している可能性が高い。パルミチン酸化酵素であるDHHCは20種以上知られているが、予備的検討でS1P受容体をパルミチン酸化するのはDHHC5であることを突き止めている。そこで、DHHC5をASNが直接阻害するのかどうかについて検討する予定である。細胞外ASNによるS1P1受容体特異的なGタンパク質との脱共役について検討する中で、ASNがS1P1受容体のパルミトイル化に影響を与えることを見いだした。すなわち、細胞外ASNはパルミトイル化酵素を直接阻害している可能性がある。今後、S1P1受容体をパルミトイル化する酵素を同定し、その酵素に対するASNの作用を検討する予定である。細胞生物学追加での内定をいただいたため、使用開始が10月以降と遅かった。次年度の試薬購入費として使用予定である。
革新的ハイブリッド人工肺サーファクタントの標的ナノ創薬の展開

新規人工調製型肺サーファクタント(PS)におけるモデルペプチドは、肺胞運動を模倣した圧縮・拡張過程に拘らず優先的にα-ヘリックス構造をとります。その系へ部分フッ素化両親媒性物質を肺サーファクタント薬剤に添加し、その薬効の増大の遂行をはかる基盤研究を行いました。部分フッ素化両親媒性物質の添加により全ての脂質が流動化(分散化)が観察されました。この本研究の成果は,新規肺サーファクタントへの寄与は勿論のこと、更に広範な呼吸器疾患(喘息, SARS, COPD等)への適用拡大へと貢献できる可能性を見出しました。卵黄レシチン(eggPC),大豆レシチン,長鎖アルコール及び生体模倣ペプチド類を組み合わせて人工調製型肺サーファクタントを創製した。生体模倣ペプチド類は両親媒性表面表在型,膜貫通型,また両方の性質を持つ3種のペプチドを新規に設計・合成した。表面張力ー面積ダイアグラム測定により,5種の調製物は既存薬Surfactenと同様のヒステレシス特性を示した。これら調製物をLS欠乏モデルラットに供したところ,肺コンプライアンス回復率の点において,既存薬よりも有意に優れていた。また喘息に対しても,有意に肺抵抗を抑制した。これらの人工調製型肺サーファクタントは廉価で調製でき,豚インフルエンザ(H1N1),SRAS,炎症性肺疾患,喘息等で併発的に引き起こされる呼吸困難症状への適用も可能で,多いに期待が持たれる。本研究の成果は,広範な呼吸器疾患(喘息, SARS, COPD,新型インフルエンザ等)への適用拡大へと多大に貢献できる可能性を見出している。人工調製型肺サーファクタント(LS)脂質の基本成分はDPPC(ジパルミトイルホスファチシルコリン)、PG(ホスファチジルグリセロール)、PA(ハルミチン酸)等があります。我々の研究より鎖長の短いフッ素化合物は、人工合成型のLS調製物の有効な添加剤で有る事が明らかと成りました。本研究では、親水部のない部分フッ素化アルカン(F10H16, F10H20)及びそのダイマー[di(F10H16), di(F10H20)]と生体膜モデルであるジパルミトイルフォスファチジルコリン(DPPC)との二成分相互作用及びその界面挙動をLangmuir単分子膜により精査した。全ての部分フッ素アルカンは典型的なordered膜を形成した。F10H16及びF10H20の極限面積は、共に0.35 nm2であり、炭化フッ素鎖の分子断面積を反映している。一方、di(F10H16)及びdi(F10H20)の極限面積は0.65 nm2であり、ダイマーにすることで膜の凝集性が向上した。二成分DPPC/部分フッ素化アルカン系の表面圧(π)ー面積(A)曲線の測定において、全ての系においてDPPCのLE/LC相転移圧から膜の崩壊圧の間に、組成に依存した屈曲点が現れた。この屈曲点は、部分フッ素化アルカンからなる表面ミセルの形成に起因すると考えられる。またこのミセルは、分子占有面積を考慮に入れるとDPPC単分子膜上に形成される可能性が高い。さらにこの表面ミセル形成は、蛍光顕微鏡画像によっても裏付けされた。現在表面電位の挙動から特異な表面ミセル形成を考えている。LS系で添加物としてフッ素化合物の役割が明らかになったことから、本研究成果は人工調製肺サーファクタントの開発研究に大きく貢献できると考えられます。本研究により我々が考案して人工肺サーファクタントの詳細な薬効・メカニズムが明確と成った。実際の市場化に向けては多くの問題があるが、本研究の目的は達成されたと判断出来る。部分フッ素化両親媒性物質を肺サーファクタント薬剤に添加し、その薬効の増大の遂行をはかる基盤研究の一環として、比較的鎖長の短いパーフルオロヘキシル(F6)鎖を有した部分フッ素化両親媒性物質(F6H9OH)と生体膜成分であるコレステロール(Ch)、ペンタデカノール(H15OH)、ジパルミトイルフォスファチジルコリン(DPPC)との二成分相互作用及びその界面挙動をLangmuir単分子膜手法により精査した。298.2 K、0.15M NaCl下相液の条件下で、F6H9OHは典型的なdisordered/ordered膜を形成した。二成分Ch/F6H9OH、H15OH/F6H9OH、DPPC/F6H9OH系にて二次元の相図を作製したところ、全ての三系は正の共沸混合物型を示すことが分かった。更にこれら二成分系の転移圧及び崩壊圧は、モル分率の関数として変化を伴った。これらの結果と、混合の過剰ギブスエネルギーの関係から、両成分の混和挙動が示唆された。また各種形態画像から、F6H9OHの添加により全ての脂質が流動化(分散化)が観察された。殊に、Ch/F6H9OH及びH15OH/F6H9OH系の高モル分率において、disordered/ordered相の転移圧変化を原子間力顕微鏡画像により捉えることに成功した。この結果は、純系F6H9OHがdisordered/ordered相転移を示すことを裏付けるものであり、更に高モル分率における各二成分系の混和性を支持する結果でもあった。