hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
口腔扁平苔癬の病態形成に関する免疫学的検索

口腔扁平苔癬(OLP)は粘膜直下のT細胞の浸潤を特徴とし、細胞性免疫の異常が関与していると示唆されているが、その病因については不明な点が多い。本申請では、OLPの病態形成解明の一助として、OLP疾患部の免疫組織学的検索を行うと共に、OLP患者のHLA型のタイピングを行った。1.免疫組織学的検索〈方法〉OLP19例、対照として健常歯肉5例を通法に従いパラフィン包埋、4mmの切片を作製、各種抗体を用いてLSAB法にて染色を行った。〈結果および考察〉OLP患部では上皮直下に多数のリンパ球の浸潤が認められた。OLP患部でも基底膜が不明瞭な部位ではPan-T、Pan-B、CD68、HLA-classII陽性細胞が有意に上昇していた。次に、Ki-67にて染色を行ったところ、基底膜が不明瞭な部位では明瞭な部位よりもKi-67陽性細胞は減少していた。よって、基底膜不明瞭部位では、細胞性免疫の亢進と細胞増殖能の低下が示唆された。2.HLA型の検索〈方法〉OLP患者17名とOLP,LPの既往のない健常人17名のヘパリン加血液よりマイクロビーズ法により単核球を分離し、リンパ球障害試験法にてHLA-I、IIのタイピングを、また、ヘパリン加血液よりDNA抽出キットによりDNAを抽出し、PCR-RFLP法によりDRB1,DQB1,DPB1遺伝子型を検索した。〈結果および考察〉健常者に比べてOLP患者で上昇傾向にあるHLA型は、classIでは、A-2、A-11、B-35、Cw-1、Cw-7であった。classIIでは、DR-4、DQ-4であった。遺伝子型では、DRB1^*0405、DQB1^*0301、DQB1^*0401であった。また、OLP患者で減少傾向にあるのは、A-33、B-44、DR-6、遺伝子型では、DRB1^*1302であった。以上の結果ついてFisherの直接確率法によりOLP患者と健常者間で群間比較を行ったところ、有意な差を示したHLA型はなかった。今後、更に検体数を増やして検討する必要があると示唆される。口腔扁平苔癬(OLP)の病態形成解明の一助として、OLP疾患部の免疫組織学的検索を行った。また、近年、自己免疫疾患とHLA型の相関が注目されていることからOLP患者のHLA型の検索を行った。1.免疫組織学的検索〈方法〉OLP20例、対照として健常歯肉5例を通法に従いパラフィン包埋し、4mmの切片を作製、各種抗体を用いてLSAB法にて染色を行った。〈結果および考察〉OLPでは上皮直下に多数のリンパ球の浸潤が認められた。浸潤リンパ球は主としてTリンパ球であった。OLPでは上皮直下および上皮内にMHC class IIの陽性細胞が有意に多かった。よって、OLP患部では細胞性免疫が亢進しているものと示唆された。

また、OLPでは健常部に比して上皮直下にCD40の陽性細胞が多かった。CD40はT細胞によるB細胞活性化やApoptosisに関連しているといわれており、OLPとCD40の関連について更に検討が必要と示唆された。2.HLA型の検索〈方法〉OLPと診断された患者のヘパリン加血液よりマイクロビーズ法により単核球を分離し、リンパ球障害試験法にてHLA-Iのタイピングを行った。ヘパリン加血液よりDNA抽出キットによりDNAを抽出し、PCR-RFLP法によりDRB1,DQB1,DPB1を検索した。〈結果〉HLA型で日本人の出現頻度に比してOLP患者で高い型は、class Iでは、A-2(57.1%)、A-26(28.6%)、B-7(28.6%)、B-39(28.6%)、Cw-7(57.1%)であった。class IIでは、DR-4(57.1%)、DR-1(28.6%)、DR-6(28.6%)、DQ-1(85.7%)であた。遺伝子型では、DRB1で0101(28.6%)、0403(28.6%)、0405(28.6%)、0803(28.6%)、DPB1で0601(42.9%)、0501(28.6%)、0302(28.6%)、0301(28.6%)、DQB1で0501(57.1%)、0402(28.6%)、0201(28.6%)、0202(28.6%)であった。今後、更に検体数を増やして検討する必要があると示唆される。口腔扁平苔癬(OLP)は粘膜直下のT細胞の浸潤を特徴とし、細胞性免疫の異常が関与していると示唆されているが、その病因については不明な点が多い。本申請では、OLPの病態形成解明の一助として、OLP疾患部の免疫組織学的検索を行うと共に、OLP患者のHLA型のタイピングを行った。1.免疫組織学的検索〈方法〉OLP19例、対照として健常歯肉5例を通法に従いパラフィン包埋、4mmの切片を作製、各種抗体を用いてLSAB法にて染色を行った。〈結果および考察〉OLP患部では上皮直下に多数のリンパ球の浸潤が認められた。OLP患部でも基底膜が不明瞭な部位ではPan-T、Pan-B、CD68、HLA-class II陽性細胞が有意に上昇していた。次に、Ki-67にて染色を行ったところ、基底膜が不明瞭な部位では明瞭な部位よりもKi-67陽性細胞は減少していた。よって、基底膜不明瞭部位では、細胞性免疫の亢進と細胞増殖能の低下が示唆された。2.HLA型の検索〈方法〉OLP患者17名とOLP,LPの既往のない健常人17名のヘパリン加血液よりマイクロビーズ法により単核球を分離し、リンパ球障害試験法にてHLA-I、IIのタイピングを、また、ヘパリン加血液よりDNA抽出キットによりDNAを抽出し、PCR-RFLP法によりDRB1,DQB1,DPB1遺伝子型を検索した。〈結果および考察〉健常者に比べてOLP患者で上昇傾向にあるHLA型は、class Iでは、A-2、A-11、B-35、Cw-1、Cw-7であった。class IIでは、DR-4、DQ-4であった。遺伝子型では、DRB1^*0405、DQB1^*0301、DQB1^*0401であった。また、OLP患者で減少傾向にあるのは、A-33、B-44、DR-6、遺伝子型では、DRB1^*1302であった。以上の結果ついてFisherの直接確率法によりOLP患者と健常者間で群間比較を行ったところ、有意な差を示したHLA型はなかった。
抗原タンパク質細胞内導入法を用いた腫瘍ワクチン療法の検討

Protein transduction domain(PTD)を含むリコンビナント融合タンパク質(rPTD-protein)は、細胞外より迅速かつ効率的に細胞内への導入が可能であるため、この特性を利用して、我々は樹状細胞(DC)へのPTD含有タンパク抗原導入法が、ワクチン療法として利用できることを2種類のマウスモデル(OVA抗原、melanoma Trp2抗原)を使って証明した。この方法で宿主を免疫すると、タンパク抗原がDC内でプロセス処理されMHC class I及びclass II上に効率よく発現することにより、抗原特異的CTLおよびCD4^+helper T細胞の活性化を同時に誘導することが可能となる。当初我々は、TAT-PTDを用いて腫瘍ワクチン療法の効果を検討し、in vivoにおける腫瘍塊の縮小を確認した。一方、最近TAT-PTD以上に細胞導入効率のよいPTDがいくつか報告された。そこで次に我々は、アミノ酸配列の異なる3種類のPTDをN末に含有するリコンビナントOVA融合タンパク質を作製、精製し、in vitroにおけるDCへの導入効率、プロセス処理された上でのMHC class I, class II上への提示効率、及び抗原特異的CD4+,CD8+ T cell活性化能を比較検討した。その結果、DCに導入した場合、各PTDには導入効率に基づく抗原特異的免疫反応の差異が認められ、またTAT-PTD以上にCD4+,CD8+ T細胞両者を活性化しうるPTD(polyarginine ; R9)が確認された。以上の結果を基にin vivo tumor treatment studyを行ったところ、R9-PTD-OVA-DCで2回免疫した群は、TAT-PTD-OVA-DCと比較し有意な腫瘍縮小効果が認められ、また免疫時にadjuvantであるLPS, OK432を共投与したところ、腫瘍塊は全てのマウスにおいて完全に拒絶された。本法はペプチド療法では期待できないhelper T細胞の活性化を強力に惹起するため、有力なワクチン療法であると考えられ、また臨床応用した場合の有効性も期待できると思われる。我々は、抗原提示細胞である樹状細胞(DC)へのrTAT-PTD protein導入法によるワクチン療法が新たな抗腫瘍治療として利用できるかを検討した。抗原タンパクにはマウスメラノーマ抗原として広く用されているtyrosinase-related protein 2 (Trp2)をTAT-PTDの有無で2種類作製、使用した。また樹状細胞はマウス骨髄細胞をIn vitroにてGM-CSF+IL-4(10ng/ml)で6日間培養し使用した。最初に我々は、TAT-PTD-Trp2タンパクがDC細胞内へ導入されていることを共焦点レーザー顕微鏡により確認した。次に導入されたrTAT-PTD-Trp2タンパクがDC内でプロセス処理され、抗原ペプチドとしてMHC class I及びclass II上に発現され、かつCD8陽性T細胞ならびにCD4陽性T細胞を活性化することを確認した。次にrTAT-PTD-Trp2を導入したDCをin vivo皮下投与したマウスを解析した結果、強力な抗原特異的CTLの誘導および腫瘍細胞からの拒絶効果が認められた。しかしながらこれらの効果はTAT-PTDを含まないTrp2タンパクでは認められなかった。またrTAT-PTD-Trp2導入DCワクチン療法は、(MHC class I)抗原ペプチド(Trp2_<180-188>)処理したDCと比較した場合、より強力なCTL誘導とメモリー効果及び治療効果が認められた。このようにDCを用いた腫瘍ワクチン療法にTAT-PTD含有腫瘍抗原導入法は有用であると思われる。

HIV TATタンパク質内に存在するprotein transduction domain(PTD)(YGRKKRRQRRR)を含むリコンビナント融合タンパク質(rTAT-PTD protein)は、細胞外より迅速かつ効率的に殆どの細胞内へ導入されることが知られており、過去に我々は、樹状細胞(DC)へのrTAT-PTDタンパク抗原導入法が、ワクチン療法として利用できることを2種類のマウスモデルを使って証明した。この方法を用いると、導入されたタンパク抗原はDC内でプロセス処理されMHC class I及びclass II上に発現されること、また導入したDCをin vivo皮内投与したマウスを解析した結果、強力な抗原特異的CTLの誘導および腫瘍細胞の縮小効果が確認された。しかし担癌マウスの腫瘍塊を完全拒絶することはできなかった。近年、TAT-PTD以上に細胞導入効率のよいPTDがいくつか報告されている。今回我々は、アミノ酸配列の異なる3種類のPTDをN末に含有するリコンビナントOVA融合タンパク質を作製、精製し、in vitroにおけるDCへの導入効率、プロセス処理された上でのMHC class I,class II上への提示効率、及び抗原特異的CD4+,CD8+ T cell活性化能を比較検討した。その結果、DCに導入した場合、各PTDには導入効率に基づく抗原特異的免疫反応の差異が認められ、またTAT-PTD以上にCD4+,CD8+T細胞両者を活性化しうるPTD(polyarginine; R9)が確認された。以上の結果を基にin vivo tumor treatment studyを行ったところ、R9-PTD-OVA-DCで2回免疫した群は、TAT-PTD-OVA-DCと比較し有意な腫瘍縮小効果が認められ、また免疫時にadjuvantであるLPS,OK432を共投与したところ、腫瘍塊は全てのマウスにおいて完全に拒絶された。本法はペプチド療法では期待できないhelper T細胞の活性化を強力に惹起するため、有力なワクチン療法であると考えられ、また臨床応用した場合の有効性も期待できると思われる。
地域高齢者の介護予防に向けた社会関係の構築についての支援に関する研究

要介護状態発生状況と社会関係の特性との関連を明らかにすることを目的として、地域高齢者の調査データを解析した結果、高齢者が十分な社会的役割(友達の家を訪ねること、家族や友達の相談に応じること、病人を見舞うこと、若い人に自分から話しかけること)を有していることが、将来の要介護状態を予防することが示唆された。また、夫婦のみの高齢者世帯については、同居家族以外からの情緒的支援がないことが、将来の要介護状態発生に関連していた。高齢者の社会関係の構築には、社会的役割が重要な要因の一つである。そこで、社会的役割の程度と要介護状態発生状況との関連を明らかにすることを目的として、追跡観察中の地域高齢者コホートのデータを解析した。2004年と2005年に健康診断を実施し、2010年まで追跡した地域高齢者1291人を対象として、社会的役割の程度と要介護認定の関連について分析した。社会的役割の測定は、老研式活動能力指標の下位尺度の社会的役割4項目とした(「友達の家を訪ねることがありますか」「家族や友達の相談にのることがありますか」「病人を見舞うことができますか」「若い人に自分から話しかけることがありますか」)。傾向スコア(年齢、性別、手段的日常生活動作)でマッチングした群間で比較した結果、社会的役割の4項目のうち3項目以下を「はい」と回答していた群(n=234)の方が、全てを「はい」と回答していた群(n=271)よりも、要介護認定発生が統計的に有意に1.6倍(信頼区間1.6-2.0)であった。この結果から、高齢者が十分な社会的役割を有していることが、将来の要介護認定発生を抑制することが示唆された。地域高齢者の社会的支援と要介護状態発生状況との関連について、家族構成別に明らかにすることを目的として、追跡観察中の地域高齢者コホートのデータを解析した。2004年と2005年に健康診断を実施し、2011年3月まで追跡した地域高齢者1084人を対象として、社会的支援と要介護認定の関連について家族構成別に分析した。社会的支援は同居家族以外からの手段的支援4項目、情緒的支援4項目、合計8項目とし、4項目全ての支援がない人を支援なしとして2群に分類した。家族構成は、三世代同居、子どものみと同居、夫婦のみ、一人暮らしの4区分とした。要介護状態の発生割合は、三世代同居の高齢者20.4%、子どものみと同居の高齢者28.7%、夫婦のみ世帯高齢者14.5%、一人暮らし高齢者27.8%であった。年齢と性別を調整したコックス回帰分析の結果、夫婦のみ同居の高齢者で、情緒的支援(支援なし=1/支援あり=0)のリスク比は3.2(95%信頼区間1.03-9.97)であった。その他の家族構成では統計的な有意差はなかった。この結果から、夫婦のみの高齢者世帯については、同居家族以外からの情緒的支援がないことが、将来の要介護認定発生に関連することが示唆された。次に、支援を必要とする高齢者の実態を検討するために、地域包括支援センター(以下センター)看護職を対象とした質問紙調査データの二次分析を行った。都市部に所在するセンター看護職104人が把握している孤立傾向にある高齢者461人の状態は、生活機能の低下(52.7%)、認知機能の低下(44.5%)、身体機能の低下(40.8%)などであった。また、家族構成としては一人暮らしの対象が最も多かった。以上のことから、高齢者の社会関係を構築するために、身体・精神機能の評価とともに、家族構成を考慮した支援が必要であることが示唆された。高齢者の家族構成別にみた要介護状態発生状況と社会関係の特性との関連を明らかにすることを目的として、追跡観察中の地域高齢者コホートのデータを解析した。2004年と2005年に健康診断を実施し、2010年まで追跡した地域高齢者1290人について、三世代世帯、その他同居世帯、夫婦のみ世帯、一人暮らし世帯の4区分に分類した。平均年齢は、三世代世帯77.9歳(標準偏差5.4)、その他同居世帯78.2歳(標準偏差5.8)、夫婦のみ世帯76.1歳(標準偏差4.5)、一人暮らし世帯78.8歳(標準偏差5.8)であり、男性の割合は、それぞれ順に40.7%、42.3%、50.4%、29.6%であった。これらの4群で要介護認定発生のリスクを検討した結果、三世代世帯と比較して、その他同居世帯のリスク比1.28(95%信頼区間:1.01-1.63)、夫婦のみ世帯リスク比0.71(95%信頼区間:0.45-1.12)、一人暮らし世帯リスク比1.34(95%信頼区間:0.83-2.16)であった。

また、年齢と自立度を調整したコックス回帰分析の結果、三世代世帯、その他同居世帯、夫婦のみ世帯については、友人を訪問しないことが要介護認定の発生に関連していた。また、地域包括支援センターの看護職の支援方法に関する項目を探索するため、地域包括ケアに関する文献を検討した結果、地域包括ケアは、高齢者に関する相談・支援を包括すること、地域の住民への社会サービス、介護サービスを包括すること、地域における予防から急性期ケアを提供することなどの多様な視点が明らかとなった。このことから、高齢者が住み慣れた地域で生活し続けることを支援する地域包括ケアの実態を明らかにすることの必要性が示唆された。今年度の研究計画として、追跡観察中の地域高齢者コホートの社会関係に着目したデータを解析し、知見が得られた。これらのコホート研究の成果については、国際学会での発表を登録し、論文執筆を進めている。地域包括ケアについては、地域高齢者コホートの新たなデータの追加と解析のため、文献検討の結果を中心に整理し統合することとした。今年度の研究計画として、追跡観察中の地域高齢者コホートの家族構成・社会関係に着目したデータは解析し、地域包括支援センターの看護職を対象とした面接調査の質問項目は検討できた。しかし、面接調査は実施できなかった。また、コホート研究の成果は投稿中であるが、まだ採択はされていない。学会発表は1回のみであった。従って、当初の計画よりはやや遅れていると判断した。平成25年度は、地域高齢者コホートのデータをさらに追加し、社会関係の要因について分析を進める。社会関係の要因については、これまでの分析経過でデータを新たに追加し、一定の結果が得られる見込みがあるため、地域包括ケアの看護職の支援については文献検討の結果と統合して整理する。また、検証できた成果については国内外の学会で発表する。平成24年度は、地域包括支援センターの看護職を対象とした面接調査とデータ分析を行う。また、面接調査の結果を検討し、地域包括支援センターの看護職を対象とした質問紙調査を準備する。調査については、24年度後半、または25年度前半に実施する予定である。25年度の研究費の使用計画として、これまでの資料を整理するためスキャナー等を物品費として計上した。また、調査と国外での学会発表のための旅費を計上した。次年度の研究費の使用計画として、複数の研究分担者・研究協力者と連携して効率的に調査を実施するため、デスクトップ型コンピューターとレーザープリンタ、統計ソフトウエア等を物品費として計上した。
太平洋赤道域における海洋CO2 の長期変動メカニズムに関する研究

海水中の炭酸系測定の技術を向上させながら、太平洋熱帯域の表面海水と海洋内部の炭酸系観測を行った。また、国内外の多くの研究者らと連携して、太平洋の炭酸系・化学データのデータベースPACIFICAを完成させた。これを使って、太平洋熱帯域でも海水中のCO_2が顕著に増加しており、海洋酸性化が進んでいることを明らかにした。原因は、大気から南太平洋と北太平洋の亜熱帯域に吸収された人為起源CO_2が、海洋内部の赤道潜流などを経由して熱帯域に輸送されているためと考えられる。1海水中の全アルカリ度の高精度分析の品質管理手法を向上させ、海洋CO_2の蓄積動向とそれに伴う海洋酸性化の動向をより正確に評価するため、分析に使用する0.5N塩酸の濃度を1/2000以下の繰り返し精度で検定する電量滴定装置を設計し、製作した。2赤道域や太平洋広域における海洋内CO_2の増加傾向を評価し、大気CO_2増加に対する海洋の役割を理解するため、主に1990年代以後に太平洋で取得された海洋内部の炭酸系や酸素濃度などの海洋化学観測データを含むデータセットおよそ300航海分を収集した。書式をWHP Exchange Formatに統一した後、異常値などを慎重に除去した(一次品質管理)。6月と10月に、東京と米国オレゴン州ポートランドで、データの系統誤差補正に関するワークショップを開催し、国内外の研究者やデータセンターの担当者と、品質管理の諸問題と補正方法やについて議論し、個々の観測航海・観測パラメーターを対象に系統誤差の検討を開始した(二次品質管理)。3プリンストン大学のK.Rodgers博士による海洋物質循環モデルの数値実験の結果から、赤道表層における海洋CO_2の10年スケールの増加速度の変動が、赤道域における風速場の変化によって発生する可能性のあることが分かった。数値シミュレーション結果の妥当性を検討し、同時にIPCC AR5に向けた国際的なRegional Carbon Cycle Assessment and Processesの活動に貢献するため、同博士と協力して、赤道域の東西や南北太平洋の広域における大気・海洋間CO_2フラックスの大きさや年々変化について、海洋CO_2観測に基づく診断モデル、海洋物質循環モデル、海洋CO_2インバージョン、大気CO_2インバージョンなど手法のさまざまなモデリング結果の比較・検討を開始した。・塩酸電量滴定装置の性能試験を進めた。分析精度をさらに高めるためには,滴定終点付近のパルス電流制御をさらに高精度化する必要のあることが分かった。・海洋CO_2分圧の観測データに基づく診断モデル,海洋大循環・物質循環モデルによる数値シミュレーション,大気CO_2濃度変動のインバージョン法,海洋内炭酸系データのインバージョン法など,多様な手法で評価されてきた太平洋全域の大気・海洋間CO_2フラックスの評価結果を収集・解析・比較し,赤道域の評価結果の特徴や問題点を考察した。こうした総合的な比較は過去に例がなく,個々の手法を改善し,より確からしい評価値を得る上で,有意義な情報を発信できた。・太平洋内部の炭酸系データセットおよそ200航海分を収集し,クロスオーハー解析に基づく系統誤差評価・補正を行い,データベースPACIFICAを完成させた。系統誤差補正前のデータセットと補正係数表は,海洋情報研究センターと米国の二酸化炭素情報解析センターから公開した。また,2011年12月2012年2月の白鳳丸KH11-10次航海にて,赤道域のCO_2分圧観測と炭酸系データ分析のための約700試料の海水試料の採取に成功し,赤道域表層から中層における海洋CO_2長期変化の解析に目途が立った。・米国プリンストン大学のKeith Rodgers博士と,太平洋赤道域における海洋CO_2増加過程について議論を深めた。すべての地球システムモデルの予測結果に見られる海洋CO_2分圧の季節変化幅の増加は,CO_2増加に伴う海水のCO_2緩衝能の低下に起因し.生物活動の変化や鉛直混合の変化の寄与は小さいことが分かった。1.電量滴定装置の滴定終点付近のパルス電流を変更することで、1%CO2標準ガスによる繰返し測定では、0.03%以下の高い繰返し精度を達成し、性能を向上させることができた。2.学術研究船白鳳丸KH11-10・KH12-1両航海により、太平洋熱帯域と南北太平洋亜熱帯域の広域で行った観測の結果をまとめ、全炭酸濃度、全アルカリ度、酸素センサーによる酸素濃度の鉛直分布および大気・海洋表面水のCO2分圧の水平分布のデータセットを作成した。3.太平洋内部の炭酸系・化学データベースPACIFICAの系統誤差補正済みデータベースを作成した。これを使って、太平洋の西部熱帯域や亜熱帯域の海洋表層で全アルカリ度に長期変化がないことを立証した。この結果をSOCATv1.5の海洋表層

CO2分圧データと組み合わせて炭酸系計算を行い、サンゴ礁が発達した生物多様性の宝庫である太平洋西部熱帯域において、海洋表層の全炭酸濃度の平均速度+0.77micro-mol/kgの顕著な増加と、それに伴う海洋酸性化の進行を立証した。4.赤道潜流内の全炭酸濃度の過去約15年間の変化を評価し、亜熱帯域表層が起源のポテンシャル密度25.5より上層では、人為起源CO2の蓄積によって、全炭酸濃度が+0.41+0.62micro-mol/kgの範囲で増加していることが分かった。このことから、亜熱帯域で大気から海洋に吸収された人為起源CO2の海洋循環による熱帯域への輸送が、熱帯域における全炭酸濃度増加と海洋酸性化に強く影響していることが分かった。5.プリンストン大学のK. Rodgers博士らの協力により、2.の観測結果と海洋物質循環の数値予測モデルの結果を比較した。数値モデルの結果は、熱帯域のCO2増加メカニズムに関する3.及び4.の仮説と整合した。しかし、数値モデルは赤道域の海洋CO2増加速度を過大評価していると考えられた。平成23年度に計画した赤道域の海洋表面水と海洋各層における海洋CO_2観測と海水試料の採取を順調に実施できた。また,過去の海洋観測で取得した海洋表面と内部のCO_2データもデータベース化し,赤道域の表面水と亜表層のCO_2トレンド評価の準備が整いつつある。海洋循環・物質循環モデルによる数値シミュレーションとの連携も着実に進んでいる。塩酸電量滴定装置の開発は,試行錯誤の最中でまだ完成は見えないが,性能試験と,それに基づく改良作業は着実に進捗している。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成22年12月平成23年2月の観測航海において太平洋赤道域などで採取したおよそ800検体の海水試料のCO_2分析を,派遣研究支援員の支援によって促進し,その最新の観測データと,平成23年度までに作成したデータベースによって,太平洋赤道域におけるCO_2の長期トレンドの評価を推進する。プリンストン大のロジャース博士らの協力を引き続き得ながら,海洋物質循環モデルとの連携やCO_2トレンド解析の高度化,そして赤道域周辺のCO_2循環過程の解明を促進する。塩酸電量滴定装置については,早期に滴定電流電源の改良作業を終え,性能評価と改善作業を着実に進めてゆく。
フレスコ画技法から学ぶ焼かない透明釉薬の開発とその形成機構の解明

フレスコ画の短時間再生を試みた。フレスコ画とは水酸化カルシウムと水からなるスラリーを壁などに塗り込み、その上に顔料で絵を描くと、空気中の炭酸ガスと反応して顔料が炭酸カルシウムで覆われ、顔料が長期的に安定化する画法である。まず我々が以前に開発したウォームプレス法という、熱と圧力を同時に印加する方法で水酸化カルシウム板および炭酸カルシウム板を作製した。その板の上に顔料で彩色し、再度のウォームプレス処理を行うことで顔料を生地に固定化した。この場合、より顔料の生地との接着性を高めるためにあらかじめ顔料と水酸化カルシウムまたは炭酸カルシウム粉末とを混合させる方法も検討した。その後、磁器の釉薬のように顔料表面を炭酸カルシウムで被覆することで、焼成による磁器の釉薬による表面光沢のような焼かない釉薬を形成させるために超臨界二酸化炭素処理を行った。水酸化カルシウムを用いた場合には、超臨界二酸化炭素処理後の顔料表面には均質な炭酸カルシウム被覆が生じず、美観のある光沢は観察されなかった。一方炭酸カルシウムを出発原料に用いた場合、さらに超臨界二酸化炭素処理を施す前に試料を含水処理よりすることで、その後の超臨界二酸化炭素処理時に溶解性の炭酸水素カルシウムの生成量が増えたとみられ、炭酸カルシウムが顔料を被覆したような組織を得た。蛍光灯による光の反射による適度な光沢も発現された。つまり、自然には数十年から百年かかっていたフレスコ画の安定化を短時間で再現することに成功した。この方法は、焼成による陶磁器の釉薬着色を得ないで、焼かない釉薬を施した雑器を作製できる可能性があり、陶磁器のありかたに一石を投じる開発に成功したと言える。一般的に市販されているフレスコ画画材一式を購入した。水酸化カルシウムを主成分とする出発原料粉末に水を混ぜてペースト状に調製し、基材の陶板の上にそれを塗り、乾く前にそのペースト上に黄土色の単色で絵を描いた。6か月室温で保持した(経過した)現在においても、表面状態は描いた当初のままであり、目視で観察される炭酸化に伴う色成分を覆うような大きな組織変化は起こっていない。短時間で彩色した色成分を炭酸カルシウムの透明保護膜(釉薬とみなせる)で覆うフレスコ画の完成のために、彩色の基材(画板)となる水酸化カルシウム板の作製を、当該研究室で開発し、既に論文として発表したウォームプレス(WP)という方法で作製した。まだ得られた水酸化カルシウム板には彩色を施さず、ウォームプレスによって作製された水酸化カルシウム板自身の空気中における炭酸化挙動について調べた。ウォームプレスという熱と圧力を同時に印加して作製された水酸化カルシウム板の表面の炭酸化速度は、室温で加圧のみで成形された水酸化カルシウム板よりも炭酸化のスピードが速いことが明らかとなった。ウォームプレスにより作製された緻密な水酸化カルシウム板は、その後水を溶媒とする絵具の彩色過程において濡れ性が悪く、彩色を施すことが極めて難しいことが分かった。そのため彩色はウォームプレス処理前に施す必要がある。これらの実験の結果から、短時間フレスコ画の完成においては、水酸化カルシウム板への彩色条件および本ウォームプレス条件、加えてその後の炭酸化処理方法の重要性を再認識した。2016年7月-9月に名古屋市美術館で開催されたポンペイの壁画展(フレスコ画展)に参加し、2000年前に描かれた世界遺産のフレスコ画を観察した。斜めから蛍光灯の反射を交えて観察すると、ところどころ部分的にではあるがうっすらと光沢があることが分かった。これが天然の炭酸カルシウムによる皮膜の形成であると推察された。彩色顔料(絵具)をうまく炭酸カルシウムで被覆できれば、数千年の歴史が証明する安定した絵画、彩色技術とすることができると考えられる。同時に子供フレスコ画教室の作品が展示されていたが、我々がフレスコ画画材一式として購入して作製した絵とほとんど変わらなかった。その表面は彩色した色成分は彩色直後のままで、炭酸化反応による色成分の変化は起こっていないようであった。自然の炭酸化は数十年、百年の単位が必要であることが実感された。今回の研究テーマは、そのフレスコ画を短時間で作製することである。達成のため水酸化カルシウムのウォームプレス(WP)による基材(絵を描くタイル基材)の作製を行った。条件を250°C, 240MPa,保持時間を60分とした場合、水酸化カルシウムは高緻密化し、その後の彩色において絵具がはじかれ、絵が描けないことが判明した。そこでウォームプレス処理する前に彩色する必要性のあることが判明した。現在まで、ウォームプレス処理を施した水酸化カルシウムはその後の炭酸化が促進されることが分かってきた。炭酸カルシウムと水酸化カルシウムの平衡関係にキネティックの要因が影響を及ぼしていることが推察される。よって今後は、水酸化カルシウム板の作製のためのWP条件、彩色条件さらにこれからの炭酸化条件(導入超臨界二酸化炭素環境作製装置)の条件を明らかにしていきたい。昨年、購入した市販のフレスコ画材セットを通じフレスコ画の基本的な作製法を学んだ。それを基に、本年度は「短時間でフレスコ画を完成させる技術的な条件の確立」を行った。本目的の達成のために2つの技術を投入した。その1つ目が「ウォームプレス法」という本研究室で確立した新技術による基材(油彩のキャンバスに相当)である水酸化カルシウム板の作製である。

ただし比較的緻密な基材を用いた場合、顔料粉末の塗布(彩色)が難しい。そこで塗料粉末顔料が基材に付着しやすくするために基材の相対密度は60-70%と低くした。水で溶いた顔料で基材へ彩色後、ウォームプレス処理して顔料と水酸化カルシウムを定着させ、2つ目の技術である超臨界二酸化炭素処理による炭酸化を試みた。しかし24時間の超臨界二酸化炭素の処理後、顔料上に炭酸化カルシウムの皮膜層は形成されず、指圧摩擦により顔料が簡単にはがれた。そこで顔料を基材に固着させるために2つの新たな方法を試みた。まず初めに顔料で彩色後、顔料表面に水酸化カルシウム粉末を薄くふりかけ、再度ウォームプレス処理して顔料を薄い水酸化カルシウム膜で覆うという方法である。その後の超臨界二酸化炭素処理によりその皮膜は炭酸化し、顔料を覆う層の形成に成功した。しかし、指圧摩擦など外力により容易に炭酸カルシウム被覆層がはがれ落ちた。また被覆層により顔料の色の発色が悪いという欠点もあった。そこで2つ目の方法として、顔料に直接水酸化カルシウム粉末を混合する方法を試みた。ウォームプレスによる水酸化カルシウムでの顔料の定着、さらに超臨界二酸化炭素処理により顔料は炭酸カルシウムで固定化した。つまり、顔料と水酸化カルシウム粉末とを混ぜ合わせた混合顔料を用い、ウォームプレスおよび超臨界二酸化炭素処理技術を用いることにより短時間フレスコ画の再現は可能となった。適切な基材である水酸化カルシウム固化体の密度の選定(基材作製のためのウォームプレス条件)、着色顔料と水酸化カルシウム粉末の混合、その顔料の定着のための適切なウォームプレス処理および超臨界二酸化炭素処理を施すことで、フレスコ画の短時間再現という当初の目的はほぼ達成できる見込みが得られた。歴史的なフレスコ画の炭酸化カルシウム層の厚さは2ー120μmであるので、開発材料の炭酸化カルシウム層の厚さはその範囲内の値を目標とした。相対密度65%の水酸化カルシウム板を基材にすると超臨界二酸化炭素処理時間が60分で表面から1mm深さまで90%以上の炭酸カルシウム化が確認できた。具体的には顔料粉末に直接水酸化カルシム粉末を1:100(重量%)で混ぜた塗料でその水酸化カルシウム基材上に彩色した。顔料の定着のためウォームプレス処理(250°C、40MPa、60分間保持)し、その後の超臨界二酸化炭素処理においても顔料の剥離は見られず、炭酸カルシウムによって顔料が強固に固着した組織となった。その試料断面の元素分析による解析から、顔料と炭酸カルシウム層の厚さは70μm程度であり、当初目標とした顔料を保護する炭酸カルシウム層が形成されていることが判明した。フレスコ画の短時間再生を試みた。フレスコ画とは水酸化カルシウムと水からなるスラリーを壁などに塗り込み、その上に顔料で絵を描くと、空気中の炭酸ガスと反応して顔料が炭酸カルシウムで覆われ、顔料が長期的に安定化する画法である。まず我々が以前に開発したウォームプレス法という、熱と圧力を同時に印加する方法で水酸化カルシウム板および炭酸カルシウム板を作製した。その板の上に顔料で彩色し、再度のウォームプレス処理を行うことで顔料を生地に固定化した。この場合、より顔料の生地との接着性を高めるためにあらかじめ顔料と水酸化カルシウムまたは炭酸カルシウム粉末とを混合させる方法も検討した。
ゲームエンジンを用いた都市空間シミュレーションシステムによる環境デザインの評価

本研究は,ゲームエンジンを用いた都市空間シミュレーションシステムを開発し,これを評価するものである.建築物や都市施設などの3次元形状モデルを正確に配置し,ユーザーが自由に移動可能な一人称視点のウォークスルーを実装した.また,建築高,位置,外壁の色と素材,商業サインや電柱の割合等,景観条件が変更可能なものとした.さらに歩行者や車両などの動的な要素の再現や,オブジェクトに光源を持たせることによる夜間景観の再現を行った.開発したシステムはユーザーの注視行動によって評価され、その評価に基づいた改良を行った.結果,都市景観評価のためのツールとして,低廉で操作性の高いシステムを開発することが可能であった.本研究は,ゲームエンジンを用いて安価で高品質な3次元都市空間シミュレーションシステムを開発するものである.平成25年度は次の項目について実施した.1:湘南台駅西口円行西大通り周辺地区及び茅ケ崎駅北口エメロード周辺地区の実地調査を行い,建築物・サイン・ストリートファニチャー・樹木等の空間構成要素を実測,撮影を行った.この実測データからモデリングのベースとなる連続立面図を作成した.また,撮影データに画像処理を行いテクスチャデータを準備した.2:対象地区の実測データから,ソリッドモデリングによるCAD(Form-Z)によって空間構成要素ごとにモデリングを行った.モデリングされた形状データは3ds形式で統合型3DCG開発環境(Blender)へとパーツごとに書き出した.また,樹木などCADでのモデリングに適さない空間構成要素については,サーフェイスモデラー(Metasequoia)によって低ポリゴンでモデリングを行い,mqo形式で統合型CG開発環境(Blender)へと引き渡した.CG開発環境(Blender)上では,マテリアル処理を行い,空間構成要素を街区単位で組み合わせ,obj形式でゲームエンジン(Unity Pro)へ取り込んだ.ゲームエンジン上では,C#を用いてインタラクションに必要な設定を行った.視界を一人称視点に設定し,マウス及びキーボード操作での移動を可能にするとともに,ゲームパッドへの対応を行った.また,各空間構成要素及び対象エリア全域に対して衝突判定の処理を行い,移動制限を設けた.3:本システムでは,景観を評価するための注視モードを実装した.ここでは,画面中央にカーソルを表示し,気になる要素をクリックすることで,カーソルの延長線上に位置するポリゴンを持つモデルの識別子をログとして保存する.この評価システムを用いて,景観評価実験を,被験者233名を用いて実施した.本研究は,ゲームエンジンを活用することで安価で高品質な都市空間シミュレーションシステムを開発し,その評価を行うものである.平成26年度は次の項目に関して実施した.1:ゲームエンジンを用いることで可能になる表現について検討し,ここでは夜間時のシミュレーションが可能なものとした.大規模モデリングを実施した都市空間モデルの平行光源による照明データを再設計し,街灯や自立発光するサイン等に対して新たに点光源を加え,太陽光を削除することで夜間都市空間モデルの作成を行い,システム画面上のメニューから光源環境の切り替えが可能なものとした.また,昼間空間と同じく夜間空間における注視行動についても測定可能なシステムを作成し,時間帯による空間構成要素の注視傾向の差を明らかにした.2:システムが提示する都市空間モデルへの没入感を高めるため,頭部搭載型ディスプレイ(HMD)による環境提示システムの開発と評価を行った.没入型(非透過型)のHMDを,魚眼レンズとゲームエンジン上で画像処理を施すことによって,水平方向視野角110度,垂直方向視野角90度と,従来の情報提示環境と比して高視野角の視界を持たせることが可能であった.本システムでは,都市モデルのスケールに対する人体の視差を用いた立体視環境を用意した.また,3軸回転加速度センサを用いることで回頭行動の値を測定し,頭部の回転によって視線の方向を変化させるようインタフェース設計を行った.HMD環境において,回頭行動による回転移動とゲームパッドによる平行移動は,より直観的な操作を可能とし,ユーザビリティ調査においてユーザが支障なく動作させることを確認した.本研究は,ゲームエンジンを用いて安価で高品質な3次元都市空間シミュレーションシステムを開発するものである.平成27年度は次の項目について実施した.1:都市景観の中で,多くの注視を促す空間構成要素として景観評価実験から確認された人物や車両などのテンポラリーな動的空間構成要素について,3次元モデルに動きを持たせたアニメーションを付加することで再現し,あらかじめ定められた行動をAIによって自律的に再現するNPC(Non Player Character)モデルとして実装を行った.2:仮想空間内の照明を切り替えることによる夜間景観の再現と,1.で実装した動的な空間構成要素で現されるシーンにおいて,注視を促す構成要素の特定を景観評価実験を通じて実施した.景観を連続継起的なシークエンスとして捉え,街路の往路・復路シークエンスの昼間時・夜間時における注視行動を解析した.結果,同じ空間構成要素で構成されているシークエンス街路であっても,歩行の方向や昼夜間時で注視傾向が異なる空間構成要素が確認されたとともに,景観イメージを形成する空間構成要素の特定を行った.3:本システムでは,注視モードと景観モードの二つの環境を用意した.注視モードでは,マウスクリックによってオブジェクト識別子のログを記録することが可能であり,2.の景観評価が可能なものである.景観モードでは,屋外広告物や電柱などの都市設置物について,そのパラメータを変更できるようにした.既存建築物に対し,マウスクリックによって,建築物モデルの入れ替えによる建て替えや,外壁テクスチャの変更による大規模修繕のシミュレーションを行うことができるものとした.

さらに,タッチパネル型のディスプレイを用いることで,配置した建築物などの空間構成要素をドラッグアンドドロップ可能なインタラクションを設け,リアルタイムで建物高さ,セットバックの検討が可能となった平成27年度は,計画に基づき研究対象地区の大規模モデリングを行った.また,モデルの大規模化に伴い,システムの動作を軽量化するよう設計を見直し,これを実装した.この改良した都市空間シミュレーションシステムを用いて,ユーザの注視行動から環境デザインの評価を実施し,景観イメージに大きな影響を与える空間構成要素の特定とその条件に付いて明らかにした.また,景観計画の際,自由に空間構成要素の条件を変更可能なよう,新しいインタフェースについて検討した.本研究は,都市の空間構造情報をわかりやすく伝えるため,ゲームエンジンを用いた3次元都市空間シミュレーションシステムを開発するものである.本システムによって,都市空間の注視を促す空間構成要素とその特質から景観計画を評価するとともに,その評価の妥当性から本システムの有用性を明らかにする.平成28年度は次の項目について実施した.1:建築物の状態遷移をリアルタイムで再現することとした.ここでは,建築物モデルの入れ替えによる建て替えや,外壁テクスチャの変更による大規模修繕のシミュレーションが,マウスクリックやゲームパッドのアクションボタンによって簡易に操作可能となるよう改良を施した.2:注視を促す動的な空間構成要素である歩行者や車両などのモデルを,簡易なAIによって指定された範囲内を自律的に行動するNPCとして,仮想空間上に配置した環境を用意し,注視実験を実施し,景観分析と評価を行った.3:システムで再現される都市空間の対象範囲拡大とモデル精緻化,レンダリングアルゴリズムの見直しをはかった.また,インタフェースについても,HMDやゲームパッドを用いた入出力環境に最適化をはかるようユーザビリティテストを行った.4:本システムを基盤とし,津波災害時における避難行動シミュレーションシステムと地域の歴史的文化景観シミュレーションシステムのプロトタイプ作成と評価を実施した.5:本研究で得られた成果について,論文,国際会議,学会発表等で公表するとともに,市民や地方自治体,企業などに対して展示会や地域イベント等を通じて公開し,フィードバックを得た.本研究は,ゲームエンジンを用いた都市空間シミュレーションシステムを開発し,これを評価するものである.建築物や都市施設などの3次元形状モデルを正確に配置し,ユーザーが自由に移動可能な一人称視点のウォークスルーを実装した.また,建築高,位置,外壁の色と素材,商業サインや電柱の割合等,景観条件が変更可能なものとした.さらに歩行者や車両などの動的な要素の再現や,オブジェクトに光源を持たせることによる夜間景観の再現を行った.
細胞内膜系の動態:オルガネラ内およびオルガネラ間の膜輸送の分子機構

真核生物の細胞内は、緻密に分化した膜系(オルガネラ)で満たされ、その多くがダイナミックな膜の流れ"メンブレントラフィック"によって結ばれている。本研究では植物細胞のダイナミックな膜の動態を可視化することにより、メンブレントラフィック機構の解明を目指してきた。本年度の成果は、以下の通りである。1、SNARE分子は、小胞輸送において特異的な膜融合を担うタンパク質であり、アミノ酸の相同性から5種類(Qa-SNARE,Qb-SNARE,Qc-SNARE,R-SNARE,SNAP-25)に分類されている。それぞれのSNAREタンパク質が特異的なオルガネラに局在することで膜融合の特異性を決定していると考えられているが、SNARE分子が特異的なオルガネラに局在する機構についてはほとんど知られていない。そこで、SNARE分子の細胞内局在機構を明らかにすることを目的として、アミノ酸の相同性が高いにもかかわらず細胞内局在が異なるR-SNARE分子をモデルとして、細胞内局在が異なる分子間の様々なドメインをシャッフルさせたキメラ分子を用いて特異的なオルガネラへの局在に必要なドメインの単離を行った。その結果、SNAREモチーフのN末端側に存在するlonginドメインとlinker領域が液胞膜への局在を制御していることを明らかにした。2、SYP41/AtTlg2a(Qa-SNARE)の細胞内局在から、高等植物のトランスゴルジネットワーク(TGN)は動物のようなゴルジ体とひと続きになったオルガネラではなく、ゴルジ体とは独立したオルガネラであることを明らかにした。また、TGNの動態を明らかにするためGFP-SYP41融合タンパク質を発現する遺伝子組み換え植物を作成した。現在、詳細な膜動態を解析中である。本研究計画では、モデル植物であるシロイヌナズナを用いて、膜輸送における各オルガネラ膜の動態を明らかにすることを目指してきた。本年度は以下のような成果を得た。(1)高等植物はその細胞内に高度に発達したオルガネラ(細胞内小器官)を持ち、小胞輸送によりたえず物質交換が行われている。小胞輸送において輸送小胞と標的オルガネラ膜との膜融合は非常に重要な反応の一つであり、SNARE分子が特異的な膜融合を担うタンパク質として知られている。シロイヌナズナのゲノム中から54種類のSNARE分子をコードする遺伝子を単離し、RT-PCR法によりそれらの遺伝子の組織的発現を解析した。その結果、1遺伝子を除く53種類の遺伝子がほとんどすべての組織で発現していた。次に、細胞内局在を調べるために、それぞれのSNARE分子とGFPとの融合タンパク質を発現するプラスミドを構築し、それらをシロイヌナズナ培養細胞に導入後、共焦点レーザー顕微鏡により観察した。その結果、6種類の小胞体に局在するSNARE分子、9種類のゴルジ体に局在するSNARE分子、7種類のトランスゴルジ網に局在するSNARE分子、2種類のエンドソームに局在するSNARE分子、21種類の細胞膜に局在するSNARE分子、9種類の液胞膜に局在するSNARE分子を明らかにした。これらの結果は、植物細胞における複雑な小胞輸送経路とその機能を理解する上で非常に重要な成果と考えられる。(2)細胞内小胞輸送に伴うオルガネラ膜の動態は、近年、蛍光タンパク質とレーザー顕微鏡等の開発により明らかになりつつあるが、ポストコルジ・ネットワークにおいてはほとんど知られていない。そこで、上記(1)の成果から得られたトランスゴルジ網、細胞膜、エンドソームに局在するSNARE分子とGFPとの融合タンパク質を発現する遺伝子組み換え植物を作成した。
コピペ時代のプログラミング学習方法の開発

本研究では、プログラムに対する俯瞰的な理解力を涵養するための学習方法を開発することを目的にする。本研究で行う学習方法の基本は、比較的似通ったプログラムによって作成された2つあるいはそれ以上ののビジュアルコンテンツ(静止画、動画、マウス操作によって変化する画像)を閲覧し、その違い考えることによりをプログラミング技術を学習しようというものである。表示された画像を見ながらグループで議論をする過程を通じてプログラミング技術・技法を相互学習する方法、個人学習を行う方法を開発する。
葉緑体チラコイド内腔におけるレドックス制御機構の解明

葉緑体のストロマでは,カルビンサイクルの酵素をはじめとして、デンプン合成、タンパク質のフォールディングなど様々な反応に関わる酵素がチオレドキシン(Trx)によって制御さている。このように葉緑体ストロマではTrxによるタンパク質のレドックス制御の重要性が証明されている。近年、葉緑体ストロマ側だけではなくチラコイドルーメンにもTrxタンパク質を介したタンパク質の制御があることが明らかになってきた。これまでの研究から、CcdA, HCF164タンパク質がチラコイドルーメンに局在する標的タンパク質の制御に関与することが証明されている。またin vitroの実験からm型TrxがCcdA, HCF164の上流で働く(還元力を伝達する)ことが示唆されている。本年度は、還元力伝達システムの下流で働くと示唆されているSOQ1タンパク質のレドックス制御解析をおこなった。SOQ1はルーメンにTrx様ドメインを持つタンパク質で非光化学的クエンチング(NPQ)の制御に関わっていることが明らかになっているがその詳細なメカニズムはわかっていない。そこで、チラコイド内腔への電子伝達を担うと考えられているm型Trxの欠損株、過剰発現株を用いて様々な光条件下でのSOQ1の酸化還元状態を調べたが、野生株と違いは見られなかった。また、soq1で誘導される高いNPQの制御メカニズムを明らかにするためにNPQの誘導に必要なPGR5タンパク質を欠損する変異株、pgr5との二重変異株の解析をおこなった。その結果、pgr5soq1変異株はpgr5と比べて高いNPQを示した。この結果から、soq1で誘導されるNPQはΔpHの形成に依存しないことが示唆された。この結果は、脱共役剤を用いておこなわれた以前の報告と一致した。葉緑体ストロマでの研究に加え、チラコイド内腔での酸化システム還元システムを含めたレドックス制御に関する研究に注目が集まっている。酸化システムに関してはLTOタンパク質が関与することがわかっており、その標的タンパク質が同定された。しかし、還元システムに関してはCcdAとHCF164がチラコイド内腔への還元力伝達に関与することが明らかとなっただけで、その詳細な分子機構、CcdA、HCF164による標的タンパク質のレドックス制御の生理学的な意義はわかっていない。本年度はccda、hcf164変異株の表現型の回復実験から、チラコイド内腔でのレドックス制御の重要性を明らかにすることを目的に実験をおこなった。HCF164のクラミドモナスのホモログであるCCS5の欠損は生育阻害を引き起こすが、還元剤であるDTTを生育培地への添加することよって生育の回復を示すことが明らかになっている。そこで、生育阻害を示すシロイヌナズナのccda変異株の表現型が回復する条件を検討した。その結果、ccda変異株ではDTTでは表現型の緩和は見られなかったが、別の還元剤であるTCEPを生育培地へ1mM添加することによって生育が部分的に回復することを明らかにした。さらに、単離チラコイドを用いたin vitroの系でCcdA、およびHCF164を特異的に還元するTrxを特定することを目的としてタンパク質の還元アッセイをおこなった。シロイヌナズナには少なくとも5グループ10種類のストロマ局在のTrxアイソフォームが存在する。しかしどのアイソフォームがチラコイド内腔への還元力伝達に関与しているのかわかっていない。そこで精製したTrxタンパク質と単離チラコイドを用いてCcdAとHCF164が還元される条件を検討し、Trx f1とTrx m1によってCcdAが還元される条件を明らかにした。本年度の研究実施計画であげていた通り、シロイヌナズナのccda変異株の表現型回復実験から、還元力の添加によってccdaの生育阻害が軽減することを示し、チラコイド内腔でのレドックス制御の重要性を明らかにすることが出来た。さらに単離チラコイドを用いたin vitroの系でCcdAがTrx f1とTrx m1によって還元される条件を決定することが出来た。他の8種類のTrxアイソフォームについても既に精製タンパク質は準備できている。本年度に得られた結果をもとに、次年度では、添加するTrxの濃度などの様々な実験条件をふることによって、どのチオレドキシンンが効率的なCcdAへの電子供与体であるかを調べることが出来る。また最近、HCF164と同様にチラコイド内腔にチオレドキシンドメインを持つタンパク質としてSOQ1が同定された。SOQ1は植物のストレス防御機構である熱散逸に関与することが示唆されているがタンパク質の詳細な機能はわかっていない。しかし、SOQ1はCcdAとHCF164から還元力を受けていると考えられており、チラコイド内腔でのレドックス制御の研究において重要なタンパク質である。単離チラコイドを用いたin vitroの系でSOQ1の還元を見ることによってCcdAからSOQ1への電子の伝達を調べることが出来る。還元力の伝達実験に必要なSOQ1の抗体を本年度に作製し、特異的にSOQ1と反応する抗体を得ることが出来た。またsoq1変異株を単離し、作製した抗体を使ってSOQ1タンパク質の蓄積を欠くことを確認した。またCcdAとHCF164のもう一つの標的タンパク質と考えられているPSINの抗体とシロイヌナズナの変異株についても取得済みである。

当初の予定に加えて、新たな標的タンパク質の解析も加わり研究計画はおおむね順調に進んでいると考えている。高等植物の葉緑体では、ストロマだけではなく、チラコイド膜を隔てた内腔にもレドックス制御システムが存在することがわかってきた。チラコイド膜内腔には少なくとも80のタンパク質が局在し、そのうちの30を超えるタンパク質がジスルフィド結合を持ち、レドックス制御受ける可能性が示唆されている。これの研究からLTO1とHCF164タンパク質がそれぞれチラコイド内腔に局在するタンパク質の酸化と還元を担うと考えられてきている。変異体の解析からチラコイド内腔におけるレドックス制御の重要性は明らかになったが、その詳細な分子機構はこれまでのところわかっていない。本年度はLTO1とHCF164およびHCF164の上流で機能すると考えられているCcdAの遺伝子の発現解析をおこなった。LTO1、HCF164、CcdAと遺伝子の発現パターンが類似している遺伝子を選択し、タンパク質がルーメンに局在すると予測されるタンパク質を候補とした。これらのタンパク質の解析をおこなうためにそれぞれのT-DNA挿入株を取得した。その結果、ジェノタイピングをおこなうことによって変異体を単離することが出来た。さらに野生株とのバッククロスを終了し、次年度に表現型の解析をする準備が完了した。さらに、HCF164の下流で働くと示唆されているSOQ1タンパク質の解析をおこなった。SOQ1はルーメンにTrx様ドメインを持つタンパク質で非光化学的クエンチング(NPQ)の制御に関わっていることが明らかになっているがその詳細なメカニズムはわかっていない。そこでSOQ1がレドックス制御を受けるかを明らかにするためにin vivoでのSOQ1のレドックス状態を調べた。またCcdAとHCF164に還元力を寄与するTrxを明らかにするためにTrx fとTrx mの過剰発現株を作製し、過剰発現株を取得することが出来た。研究実施計画にあげていた通り、Trxの過剰発現株を取得することが出来た。Western Blottingによってタンパク質の蓄積量が増加していることも既に確認している。この過剰発現株を用いて次年度にすぐに解析が出来る状態である。本年度、SOQ1のレドックス状態を調べるために暗条件と明条件で処理した植物の解析をおこなったが、レドックス状態を明らかにすることが出来なかった。SOQ1は分子量が104kDaと大きいため、これまでタンパク質のレドックス状態を調べるために用いていた方法では検出できない可能性が考えられる。次年度はSOQ1のレドックス状態を明らかにするために他の方法を用いておこなうこととした。新たな方法をおこなうための準備を進めている状況である。またLTO1の解析をおこなうために抗体を作製したが、LTO1を特異的に認識する抗体を作製することは出来なかった。抗体の作製は次年度に改めておこなう。そのため、当初の計画を変更し遺伝子の発現解析からチラコイド内腔に局在するレドックス制御を受けるタンパク質の同定を目指すこととした。チラコイド内腔のレドックス制御に関与するHCF164、CcdA、LTO1は共発現し、その標的と考えられるSOQ1も同様の発現パターンを示すことを見つけた。そのためその他の標的タンパク質も同様の発現パターンを示すと考えられる。