hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グアニン４重鎖(G4)結合蛋白質を用いた機能的G4構造探索・制御技術の開発

グアニン4重鎖(G4)構造は代表的な非B型DNA構造でありヒトゲノム上に37万カ所以上も存在すると推定されているが、実際それがゲノム上にどのように分布し、どのような生物学的な意義を有するかは大部分未知である。本研究では、代表的な非B型DNA構造であるグアニン4重鎖構造を細胞内で網羅的に探索する新規な方法を開発し、ゲノム上での機能的グアニン4重鎖構造のプロファイル及び細胞内での局在を明らかにする。このために、まず分裂酵母と動物細胞のG4結合タンパク質Rif1のG4結合ドメインを限定した。その結果、Rif1は分裂酵母、動物細胞ともに1) N端、C端いずれのペプチドにもG4結合能力がある。2) C端はG4親和性がN端より高い。3)パラレル型のG4に高い親和性を示す。分裂酵母Rif1は、1) C末端90アミノ酸のみで多量体化(8, 16量体化)できる。2) N末端444のアミノ酸(1-444; HEAT repeat構造)もG4と結合できるが、特異性および親和性が低い。3) C端に近い保存配列を変異すると、DNA結合能が大きく低下するとともに、8, 16量体化形成能が喪失した。動物細胞Rif1は、1)中央に存在する天然変性タンパク質ドメインにはDNA結合能は存在しない。2)全長Rif1タンパク質のG4構造への親和性は、C端、N端ポリペプチドより1000倍ほど高い。同様に、DHX36およびFNACJ G4ヘリカーゼのG4結合ドメインも決定しつつある。これらを酵母あるいは動物細胞で発現し、ChIPSeqによりその結合部位を決定しようとしている。G4抗体BG4や、RNA-DNAハイブリッド結合プローブを用いたゲノムワイドG4やRNA-DNAハイブリッド部位と今回作製したG4結合プローブによるゲノム上G4プロファイルを比較し、細胞内機能的G4部位のゲノム上存在状態について推測する。グアニン4重鎖(G4)構造は代表的な非B型DNA構造でありヒトゲノム上に37万カ所以上も存在すると推定されているが、実際それがゲノム上にどのように分布し、どのような生物学的な意義を有するかは未知である。このために、まず分裂酵母と動物細胞のRif1のG4結合ドメインを限定した。分裂酵母Rif1については、1) C末端90アミノ酸のみで多量体化(8, 16量体化)できる。4)転写によりRif1BS(Rif1結合配列)上に形成されるG4構造にも、Rif1は結合できる。動物細胞Rif1は、1) C端およびN端HEATdomain構造は、両者ともG4構造に特異的に結合する。2)中央に存在する天然変性タンパク質ドメインにはDNA結合能は存在しない。3)全長Rif1タンパク質のG4構造への親和性は、C端、N端ポリペプチドより1000倍くらい高い。また、両者に共通な性質として、Rif1は一度に複数のG4に結合する能力を有する。また、Rif1はパラレル型のG4に高い親和性を有するが、アンチパラレル型のG4、テロメア由来のG4に対する親和性は低い。また、N端よりC端のほうがG4への特異性が高い。Rif1タンパク質のG4結合ドメインを限定することができた。またin vitroにおけるこれらのドメインのG4結合の特異性を確認できた。C端のG4結合ドメインは200アミノ酸ほどに限定できたので、これを用いて細胞内におけるChIP-seq解析に進める段階に到達できた。しかし、DHX36およびFANCJのクローニングが難航したので、タンパク質発現の段階に到達することができなかった。

動物細胞Rif1は、1)中央に存在する天然変性タンパク質ドメインにはDNA結合能は存在しない。2)全長Rif1タンパク質のG4構造への親和性は、C端、N端ポリペプチドより1000倍ほど高い。同様に、DHX36およびFNACJ G4ヘリカーゼのG4結合ドメインも決定しつつある。これらを酵母あるいは動物細胞で発現し、ChIPSeqによりその結合部位を決定しようとしている。G4抗体BG4や、RNA-DNAハイブリッド結合プローブを用いたゲノムワイドG4やRNA-DNAハイブリッド部位と今回作製したG4結合プローブによるゲノム上G4プロファイルを比較し、細胞内機能的G4部位のゲノム上存在状態について推測する。今後DHX36, FANCJ,最近大腸菌から見出した新規G4結合タンパク質のG4結合ドメインを限定する。これらのドメインおよびRif1のN端とC端ペプチドをもちいて、分裂酵母においてChIP-seqを行い、細胞内G4部位との相関関係を解析する。一部実験が予定どおり進行しなかったため、購入予定のタンパク質精製試薬の購入をしなかった。次年度に、DHX36やFANCJなど、単離に成功していないcDNAのcloningを再トライするために、単離済みのcDNAの購入およびタンパク質精製試薬の購入に使用する予定である。ゲノム動態プロジェクトHP
組織因子産生・放出に関与する血液細胞のシグナル機構の解明と遺伝子治療への応用

血液単球系細胞からのTissue Factor(組織因子)の放出にRaf-MEK-ERK1/2pathway及びその下流の転写因子Egr-1の関与がRNA干渉法による遺伝子ノックダウン手技を用いて示唆された。クロドロネート前処理することで、血液中の単球系細胞を抑制したマウスにこれらの遺伝子ノックダウン単球系細胞を注入後、肺梗塞モデルマウスを用いて、肺梗塞の重症度及び生存率を検討したところ、Tissue Factorの発現、炎症系が抑制されることで重症度と生存率が改善した。今年度は、PDEIII inhibitorによる血小板機能抑制に関与する細胞内シグナリングについて検討した。これらの研究は現在、欧米のジャーナルに投稿中である。目的PDE III InhibitorをTKA手術周術期の使用により、血小板機能を抑制することにより、血小板、白血球の相互作用が抑制され、その結果として単球からのTissue Factor産生、血液の凝固亢進状態が抑制されることを証明する事。PDE IIIInhibitorの血小板機能抑制のメカニズムをIn Vitroにおいて、血小板における細胞内シグナリングを中心に解析する事。結論PDE IIIinhibitorのTKA術中投与により周術期の血小板機能抑制、白血球との相互作用抑制、及び血液のHypercoaguabilityの抑制を確認した。周術期の静脈性血栓塞栓症発生予防に有用である可能性がある。PDE IIIinhibitorの血小板機能抑制のメカニズムとして新たに、PI3-Akt, P38MAPK, MEK/ERKPathway系の抑制が関与している事が示唆された。血液単球系培養細胞(THP-1),またはヒト単球にsiRNAを導入し、血小板との共培養でTissue Factor(組織因子)の発現の変動をみる実験ERK1, p38α, AKT, Egr-1を標的にし、Nucleofection法によるsiRNA導入を行い遺伝子ノックダウンを施行した。(In Vitro系)血小板と単球、又は単球系培養細胞の共培養実験。ヒト血小板と、1でノックダウンした培養細胞又は単球との共培養により以下の項目を確認。(Flow Chamberを用いた血小板、単球接着能の解析)倒立蛍光顕微鏡下に、Flow Chamberに共培養した溶液を流し、コラーゲン,ICAM-1, VCAM-1, Fibronectin加工ガラスにおける血小板、単球接着度を定量評価。(蛋白定量)培養液中Tissue Factor, CD40Ligand, TNFα, Microparticle定量(ELISA法)。(細胞内シグナリング解析)ERK, AKT, p38のリン酸化定量(ELISA法,フローサイト法)。(転写因子活性)結果として、ERK1または転写因子Egr-1をノックダウンした単球又は単球系培養細胞と血小板の共培養にてTissue Factor(組織因子),TNFα, Microparticleの放出、及び凝固反応の抑制が、またAKTのノックダウンによりその抑制が解除された。これらの結果は今年度予定の動物実験にも適用できると考える。動物モデルを用いた遺伝子ノックダウン単球(Monocyte)投与による静脈血栓塞栓症予防、治療への応用(In Vivo系)(代表者中嶋、分担者上野、橋本担当)(生存率)血小板凝集薬剤を投与してからの時間軸で見た生存率に関して、siRNAにより組織因子がノックダウンされた単球を注入した群とnegative controlのsiRNAを導入した単球を注入した群との、生存率の改善を検討した。(肺梗塞重症度の定量化)血小板凝集薬剤投与後一定時間(3-5min)に安楽死を行い採血及び肺組織の摘出を行う。肺組織は、気管より10%ホルマリン投与により固定し24時間後に5-6μmスライスのパラフィン切片を作りphosphotungstic acidにて血管内フィブリンを染色する。最低10視野程度の鏡検で視野中に存在する血管でフィブリンが栓塞している割合を確認する事で肺梗塞の重症度を定量化した。また平成20, 21年度にVitro実験で行った実験項目を測定し、Vivoに於いてもVitroと同じ実験結果が得られるか検討を行ったところ、組織因子をノックダウンした単球を注射したマウスにおいてコントロールの単球を注射した群に比べ、有意に肺梗塞の定量評価により、軽症化していることが分かった。
受容体チロシンキナーゼのポリユビキチン化を触媒する酵素群の同定とその機能解析

我々は、血小板由来増殖因子(PDGF)受容体をはじめとするモノマー構造を有する受容体チロシンキナーゼの多くが、リガンド刺激依存性にポリユビキチン化すること、ならびにポリユビキチン化された受容体は細胞内でプロテアソームにより速やかに分解されることを発見し、これが新しいタイプの受容体チロシンキナーゼのシグナル伝達抑制メカニズムの一つであることを提唱してきた。本研究は、これらの研究結果を踏まえ、受容体ユビキチン化のより詳細な分子メカニズムを解明する目的で、この反応を触媒する酵素群の同定を企図したものである。本年度の研究により、プロトオンコジーンCblが、PDGF受容体上に我々が以前同定していたC末端のユビキチン化酵素結合部位に結合し、この結合が受容体のユビキチン化に必須であることを発見した。さらに、v-Cblはc-Cblにドミナント・ネガティブに作用し受容体のユビキチン化を抑制することにより、受容体の増殖刺激活性を高めていることを明らかにした。この研究は、v-Cblのオンコジーンとしての作用発現メカニズムを明らかにした画期的発見であると自負している。さらにこの研究は、受容体ユビキチン化のメカニズムを分子レベルで明らかにする端緒となる研究成果と言える。今後は、おそらく複合体をなして機能していると想定されるユビキチン化酵素群の全容解明に向けて、Cblを足掛かりにさらに研究を進めて行く予定である。
運動条件に依存する大腿筋活動水準の階層性と生理応答との全身的協関

筋発揮張力と筋収縮頻度の変動による大腿筋群の部位別活動水準と全身的生理応答の関連性を検討した運動テストでは、大腿筋群の筋活動水準の総和が運動時の代謝ストレス(酸素摂取量:VO2、血中乳酸:La)に大きく影響した。一方、筋発揮張力一定条件での3水準の筋収縮頻度での運動テスト(6分間)において、各種生理変量と大腿筋群の筋電図の積分値(iEMG)を評価し、収縮頻度上昇に伴い外側広筋と内側広筋のiEMGが、他の3部位の大腿筋群よりも顕著に増加した。これらの結果から、収縮頻度条件のみの変化で誘発された筋発揮張力の増加が、大腿筋の表層部および深層部の活動水準にも差異を生じさせることが想定された。平成23年度の実験結果(自転車駆動運動時の筋収縮速度(筋収縮頻度漸増運動:FI)と筋発揮張力(筋発揮張力漸増運動:LI)の変化に対する代謝水準と大腿筋の5部位別の活動水準と階層性の検討)に基づいて、平成24年度においては、被験者10名を用いて、筋発揮張力を一定(負荷=1.0 kp)とし、筋収収縮速度(ペダル回転数)のみを変化(40 rpm、80 rpm、120 rpm)させる6分間の一定負荷運動テストの三試行を実施し、各種変量(ペダル踏力、外的および内的仕事量、酸素摂取量:VO2、血中乳酸濃度:La、大腿筋を構成する5部位(外側広筋、内側広筋、大腿直筋、大腿二頭筋、半腱様筋)の筋電図の積分値:iEMG、近赤外分光法:NIRSによる外側広筋の酸素化動態)を測定・評価し、筋発揮張力一定で、筋収縮速度の変化条件に対する大腿筋活動水準および大腿筋の表層部および深層部の活動水準の階層性について検討した。一定負荷運動時のVO2水準は、ペダル回転数増加に比例し増加した。40、80 rpmでは運動開始後上昇し、定常値を示すが、120 rpmのVO2は定常値を示さず、緩やかに増加する(VO2緩成分)ことが確認された。さらに、負荷(発揮張力)一定にも関わらず、ペダル踏力(kgf)は120 rpmにおいて他の二つのペダル回転数(40 rpm、80 rpm)と比較して、有意に高い値となった。Laは、40 rpmと80rpmでは殆ど増加を示さなかったのに対し、120 rpmでは顕著な上昇が確認された。このことから、筋発揮張力が一定の設定にも関わらず、筋収縮速度のみの変化でも、筋発揮張力を増加させるとともに、代謝水準にも大きく影響することが考えられた。さらに、筋収縮速度条件の変動に伴い筋活動水準が変化し、大腿筋の表層部および深層部の活動水準にも差異が生じていることが想定された。初年度では、自転車駆動運動時における二つの運動テスト1筋収縮頻度漸増運動(FI)、2筋発揮張力漸増運動(LI)を実施し、運動時の筋電図、酸素摂取量(VO2)および血中乳酸濃度(La)を測定した。FIとLIの外的仕事量(EP)に対するVO2を比較すると、LIのVO2は直線的に増加したのに対し、FIのVO2は指数関数的増加を示した。EPと内的仕事量(IP)を総計した総仕事量(TP)に対してVO2はLIおよびFIとも同一線上で直線的に増加した。5部位の大腿筋活動水準(外側広筋、内側広筋、大腿直筋、大腿二頭筋、半腱様筋)を積分筋電図の総計(iEMGtotal)で評価すると、FIとLIにおけるiEMGtotalがVO2に対して同一線上で直線的に上昇し、両負荷テストで個々の部位別の筋活動水準に個人差があったが、筋収縮速度漸増のFIと筋発揮張力漸増のLIに関わらず、大腿筋全体の筋活動水準が自転車駆動運動時の代謝ストレスに大きく影響することが確認できた。研究2年目には、3種類の運動条件(筋発揮張力一定で筋収縮頻度変化)の6分間の一定負荷運動テストでの脚発揮張力、5部位の大腿筋活動水準と全身的なVO2との関係を検討した。一定負荷運動時のVO2はペダル回転数に比例して増加した。40rpmと80rpmでは運動開始後上昇し、定常値を示したが、120rpmではVO2緩成分が確認された。発揮張力一定にも関わらずペダル踏力(kgf)は、120rpmの条件で他のペダル回転数と比較して、有意に高値となった。このことから、筋発揮張力一定の設定にも関わらず、筋収縮頻度変化に伴う筋発揮張力の増加は大腿筋活動水準や代謝水準にも差異が生じさせていることが想定された。最終年度(平成25年度)においては、2年間の実験結果の解析・まとめ、および国際学会発表(ヨーロッパスポーツ科学会議:ECSS2013)を行った。

これらの結果から、収縮頻度条件のみの変化で誘発された筋発揮張力の増加が、大腿筋の表層部および深層部の活動水準にも差異を生じさせることが想定された。研究初年度(平成23年度)においては、自転車駆動運動時の運動条件:筋収縮頻度と筋発揮張力の変化に対する大腿筋の5部位別の活動水準および階層性の標準化を研究目的とした。被験者は、健康な男子大学生10名とした。自転車駆動運動時の大腿筋活動水準の評価を行うために、自転車駆動における二つのストレステスト:(1)筋収縮頻度漸増運動(FI :ペダル負荷を0.5 kpの一定とし、ペダル回転数を40 rpmから120 rpmまで2分毎に20 rpmを漸増する)、(2)筋発揮張力漸増運動(LI:ペダル回転数を60 rpmの一定とし、ペダルへの発揮張力(Load)を0.5 kpから3.0 kpまで2分毎に0.5 kpを漸増する)を実施し、運動時の筋電図、筋赤外分光法による酸素化/脱酸素化動態、全身の酸素摂取量(VO2)および血中乳酸濃度(La)を測定した。FIとLIにおける外的仕事量(EP)に対するVO2応答を比較すると、LIのVO2は直線的に増加したのに対し、FIのVO2は指数関数的な増加を示した。また、EPと内的仕事量(IP)を総計した総仕事量(TP)に対してVO2はLIおよびFIとも直線的に増加し、両ストレステストのTPに対するVO2は同一線上にあることが確認された。一方、5部位(外側広筋、内側広筋、大腿直筋、大腿二頭筋、半腱様筋)の大腿筋活動水準を積分筋電図の総計(iEMGtotal)で両運動時の筋活動水準を評価すると、FIとLIにおけるiEMGtotalがVO2に対して直線的に上昇し、さらに同一線上にあることが確認された。以上のことから、両ストレステストで個々の部位別の筋活動水準には個人差があったが、筋収縮速度のみを漸増するFIと筋発揮張力のみを漸増するLIに関わらず、大腿筋全体の筋活動水準が自転車駆動運動時の代謝ストレスに大きく影響することが確認できた。本研究の研究主題である「運動条件に依存する筋活動水準の階層性と生理応答との全身的協関」を検討するために、平成24年度においては、予備実験として負荷漸増法による最大下および最大運動テスト(被験者の換気性閾値、最大酸素摂取量の測定は、主実験の代謝ストレス評価と運動強度の推定のために必要)を行なった後、主実験として自転車駆動運動における筋発揮張力を一定(負荷=1.0 kp)とし、筋収縮速度(ペダル回転数)変化条件(40 rpm、80 rpm、120 rpm)での6分間一定負荷運動を三試行実施した。なお、本実験は、生命体工学研究科の「ヒトを対象とする研究倫理委員会」で承認されている。主実験の三試行の一定負荷運動負荷テスト中においては、予定していた各種生理変量の測定(ペダル踏力、各種仕事量、酸素摂取量、血中乳酸濃度、大腿筋を構成する5部位の筋電図および外側広筋のNIRS信号波形)を行い、主実験は問題なく終了した。さらに、現在までのデータの解析では、ペダル踏力、外的仕事量および内的仕事量、VO2、血中乳酸濃度の解析・評価は終了し、筋収縮速度変化(ペダル回転数変化)条件との関係について検証中である。一方、大腿筋を構成する5部位のEMG解析とNIRSによる外側広筋における表層部と深層部の酸素化動態からの活動水準の階層性の解析についてはまだ残されてはいるが、平成24年度中に予定していた実験実施と実験の結果得られた基礎データ解析は概ね終了し、来年度(平成25度中)計画している残されたデータ解析・評価および国際学会発表予定としていることから、研究全体としては、「概ね順調に進展している」と判断した。研究初年度である平成23年度は、自転車駆動運動時の5部位の大腿筋活動水準と全身的な代謝水準(メタボボリックス・トレス)を反映する全身の酸素摂取水準の関係からの大腿筋活動水準の階層性の標準化を検討課題とした。
患者固有データを用いた流体シミュレーションによるオーダーメイド動注化学療法の開発

本研究の目的は流体解析を用いて口腔癌に対する逆行性動注化学療法における抗癌剤分配シミュレーションを行うことである.CTアンギオグラフィーのデータより頸動脈のモデリングを行い,モデル化したカテーテルを留置したうえで,流体シミュレーションを行い,頸動脈エコーと末梢血管モデルも用いてシミュレーションの精度を向上させた.舌動脈の下方にカテーテルを留置しても,舌動脈への血流の流入は限定されることが示された.本研究の目的は流体解析を用いて口腔癌に対する逆行性動注化学療法における抗癌剤分配シミュレーションを行うことである.CTアンギオグラフィーのデータより頸動脈のモデリングを行い,モデル化したカテーテルを留置したうえで,流体シミュレーションを行い,頸動脈エコーと末梢血管モデルも用いてシミュレーションの精度を向上させた.舌動脈の下方にカテーテルを留置しても,舌動脈への血流の流入は限定されることが示された.本研究の目的は口腔癌患者個々に最適なカテーテル留置法や抗癌剤投与量を治療前に決定するために,患者固有の画像データを用いた流体解析シミュレーションによるオーダーメイド動注化学療法を開発することである.本年度はH2123年度の科学研究費補助金基盤研究(B)にてわれわれが開発してきた動注化学療法のための外頸動脈とその分枝の高精度な血流シミュレーション手法を基盤として行った.まず,分岐の存在する腫瘍栄養動脈(舌・顔面動脈共通幹や顎動脈(下歯槽動脈)など)を有する口腔癌患者の頸動脈のCT angiography (CTA)データを用いて,ソフトウェア(Mimics)で具体的には頸動脈3Dモデルを作製し,流体解析可能な表面メッシュを3Dモデル上に作製(3-matic)した.次に,われわれが開発してきた外頸動脈の血流シミュレーション手法(末梢血管モデルの導入)を基盤とし,頸動脈エコーから得られた頸動脈の流速と画像構築した3D血管モデルを用いてソフトウェア(ANSYS)上で流体解析を行い,カテーテル未留置状態で腫瘍栄養動脈の分岐によりどのように血流が分配されるか血流シミュレーションを行った.さらに,カテーテルをソフトウェア上で構築して,カテーテルを留置した状態で血流シミュレーションを行った.本年度は1つの血管モデルで血流シミュレーションを行ってきたが,今後モデル数を増やして,その妥当性を検討する予定である.本研究の目的は口腔癌患者個々に最適なカテーテル留置法や抗癌剤投与量を治療前に決定するために,患者固有の画像データを用いた流体解析シミュレーションによるオーダーメイド動注化学療法を開発することである.本年度もH2123年度の科学研究費補助金基盤研究(B)にてわれわれが開発してきた動注化学療法のための外頸動脈とその分枝の高精度な血流シミュレーション手法を基盤として行った.まず,分岐の存在する腫瘍栄養動脈(舌・顔面動脈共通幹や顎動脈(下歯槽動脈)など)を有する口腔癌患者の頸動脈のCT angiography(CTA)データを用いて,ソフトウェア(Mimics)で具体的には頸動脈3Dモデルを作製し,流体解析可能な表面メッシュを3Dモデル上に作製(3-matic)した.次に,われわれが開発してきた外頸動脈の血流シミュレーション手法(末梢血管モデルの導入)を基盤とし,頸動脈エコーから得られた頸動脈の流速と画像構築した3D血管モデルを用いてソフトウェア(ANSYS)上で流体解析を行い,カテーテル未留置状態で腫瘍栄養動脈の分岐によりどのように血流が分配されるか血流シミュレーションを行った.さらに,カテーテルをソフトウェア上で構築して,カテーテルを留置した状態で血流シミュレーションを行った.本年度は複数の患者で血管モデルを構築し,さらにカテーテルの留置位置やカーテテル先端の角度によって血流シミュレーションがどのように変化するのかについて検討した.舌動脈分岐部より下方にカテーテルを留置しても,舌動脈へ流れる血流が少ないことが血流シミュレーションによって明らかになった.この結果は臨床的な治療効果に即しており,舌癌に対しては舌動脈へのカテーテルの超選択的な留置が必須であると思われた.口腔癌に対する超選択的動注化学療法は高い治療効果が期待できるが,必ずしも腫瘍栄養動脈にカテーテルを留置できるわけではない.その場合には,従来法による動注化学療法を行うが,腫瘍栄養動脈へ流入する抗癌剤の量は明らかではない.そのため,従来法による治療効果の低い舌癌患者における流体解析を用いた抗癌剤分配シミュレーションを行った.舌癌患者のCT angiographyのDICOMデータとSTLでデザインしたカテーテルを組み合わせて解析モデルを作製した.従来法を模擬し,カテーテル先端を頸動脈分岐部と舌動脈分岐点との中間点(Model 1),舌動脈分岐点(Model 6),舌動脈分岐点と顔面動脈分岐点との中間点(Model 11)にそれぞれ位置させた解析モデルを作製した.さらにModel1,6,11のカテーテル先端をそれぞれ前後左右に傾斜させてModel 25,710,1215とし,流体解析ソフトを用いて解析した.Model 115において腫瘍栄養動脈である舌動脈への抗癌剤の流入が見られたのはModel 4のみであり,他のmodelでは舌動脈への流入はほとんどみられなかった.また,舌動脈分岐点と顔面動脈分岐点との中間点にカテーテル先端を置いた場合には顔面動脈への流入は良好であった.本解析結果から従来法の動注化学療法において舌動脈分岐部より下方にカテーテルを留置したとしても,腫瘍栄養動脈である舌

動脈への抗癌剤の流入が不確実であることが示され,舌癌に対してはできる限りカテーテルを超選択的に留置すべきと思われた.さらに,顔面動脈や顎動脈を栄養動脈とする頬粘膜癌や歯肉癌であれば従来法でカテーテルを留置してもある程度の抗癌剤の流入が期待できると考えられた.26年度が最終年度であるため、記入しない。口腔外科学26年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに開発してきた血流シミュレーションをベースにソフトウェア上で作製したカテーテルを血管モデル内に留置し,抗癌剤の分配予測のための血流シミュレーションのベースが構築できつつあるため.これまでに開発してきた血流シミュレーションをベースにソフトウェア上で作製したカテーテルを血管モデル内に複数の条件にて留置し,抗癌剤の分配予測のための血流シミュレーションのベースが構築できつつあるため.26年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに開発してきた血流シミュレーションをベースにソフトウェア上で作製したカテーテルを血管内に留置したうえで,抗癌剤の分配予測のための血流シミュレーションを複数のモデルで行って,オーダーメイド動注化学療法を開発していきたい.これまでに開発してきた血流シミュレーションをベースにソフトウェア上で作製したカテーテルを血管内に留置したうえで,抗癌剤の分配予測のための血流シミュレーションを複数のモデルで行って,オーダーメイド動注化学療法を開発していきたい.26年度が最終年度であるため、記入しない。ソフトウェア購入費用や保守契約費用,成果報告の学会旅費,英文校正,論文別冊代などに研究費を使用する予定である.購入予定のソフトウェアなどが海外より年度内に購入できなかったことと,予定の国際学会への出張を取りやめたため,次年度への研究費の繰り越しが生じた.購入予定の機器やソフトウェアなどが海外より年度内に購入できなかったことと,予定の国際学会への出張を取りやめたため,次年度への研究費の繰り越しが生じた.ソフトウェアや機器購入費用や保守契約費用,成果報告の学会旅費,英文校正,論文別冊代などに研究費を使用する予定である.
中性原子のレ-ザ-冷却とトラッピング

本年度は、(1)前年度までに達成されなかった原子種のレ-ザ-冷却・トラッピングを試みること、(2)これまでに我々が開発してきた冷却技術を使った応用研究を進めることが目的であった。(1)に関しては我々が最も期待していたIV族原子のトラッピングには至らなかった。しかし、光源開発には見通しをつけることが出来たし、また、応用研究に対する必要性から新たにRbのトラッピングを試み、成功した。(2)は分光学的な研究と、原子の運動制御を主たる目標として研究を遂行してきたが、多彩な成果を上げることが出来た。分光学的応用では、まず、Ca三重項遷移の高分解能分光を行った。我々は、従来行われてきた方法と全く異なり、Caトラップから洩れ出て重力で落下してくる極低温基底状態のCa原子を使って超高分解能分光が出来ることを示した。また、寿命が数十秒に及びAr、Krの準安定状態の寿命を測定した。これはトラップ以外では全く不可能な研究である。トラップ中の原子は光電場と相互作用しているから、ただ減衰量を測定しただけでは準安定状態固有の寿命は得られない。我々は巧妙なタイミング方法により固有の寿命を得ることに成功し、その値が従来の理論値とかなり異なることを見つけた。さらに、Liトラップを使って超低速Li原子の衝突断面積の測定を行った。従来の予測ではアルカリ原子の中でLiだけが飛び抜けて断面積が小さく、したがって、非常に高密度の極低温Li原子気体を生成することが出来ると考えられてきた。我々の実験結果は必ずしもこれを支持していない。原子の運動操作に関しては、まず、極低温原子線の干渉実験に成功した。これは原子線輝度を高めるために我々が開発した光生成スリットによって初めて可能になった研究である。また、我々は極低温原子は電場を使って偏向、集光等の操作が出来ることを示した。東京大学で本年度購入したアルゴンレーザー励起色素レーザーで新たに始めたCaの冷却実験については、上記レーザー駆動のための電源、冷却水工事の遅れのため進行が遅れているが、他の中心課題であるNe、A、Krのレーザー冷却実験関係は順調に進行している。まず、Neについては自然界に存在する3つの同位体全てについて冷却・トラッピングに成功し、それらの準安定状態寿命、極低温における衝突断面積の測定実験を行った。また、同じくNeをサンプルにして行っているトラップ、低速原子線の制御に関しては凹凸球面反射鏡を用いた原子線コリメーターを開発し準安定Ne原子線の強度を2桁近く強くすることに成功した。また、4ビーム構成のトラップを開発し、Ne^<20>で10^8個という多数の原子をトラップすることに成功した。半導体レーザーを使ったレーザー冷却の研究では、同レーザーの発振周波数コントロール技術や安定化技術の改良によってAr原子をトラップすることに成功した。Caの研究は上記のようにレーザー待ちであるが、真空装置、エレクトロニクスなどは90%実験準備が完了している。アルカリ原子の冷却、衝突実験についても電気通信大学において進行中であり、Li原子線のレーザー冷却効果が確認されたほか、まだ常温原子線による実験ではあるが、Na_2とArの状態選別衝突断面積について新しい結果が得られつつある。本年度の最大目標は現在保有しているコヒ-レント光源を使って出来る限り多くの原子種について冷却・トラッピングを試み将来の研究に備えることにあった.この一年間で,以前に成功したネオンに加え,新たにアルカリ金属のリチウム,アルカリ土類のカルシウムとストロンチウム,希ガスのアルゴンとクリプトンの5種類,20同位体の冷却,トラッピングに成功した.この中には^6Liと^7Li, ^<87>Srを含む4つのストロンチウム等,偶数核と奇数核が全く同じ条件でトラップされた原子を含んでおり,超低温状態に置ける量子統計効果の研究に有用な材料を提供している.さらに4属原子冷却の鍵になる紫外コヒ-レント光の開発についても,シリコンの冷却を目標に250nm連続コヒ-レント光の約5mW出力に成功し,ほぼめどを立てることが出来た.冷却技術自体については以上の他,低温高密度ネオン原子線源を開発中である.以上の技術開発と平行して応用研究も進めている.ネオンに関してはトラッピング特性の詳細な解析を行うための技術開発を行った.冷却遷移の下準位から冷却に関係無い準位に励起し,1重項準安定状態や基底状態の落し,電子倍増管を用いて検出する種々の解析技術を開発した.また,低速準安定ネオン原子と金属表面との衝突実験も開始している.アルカリ土類については低速原子を使った超高分解能分光を行っている。これはトラップから自然にこぼれ落ちてくる基底状態原子を利用した分光で極めて簡単に高い分解能を得られるユニ-クな方法である.本年度は、(1)前年度までに達成されなかった原子種のレ-ザ-冷却・トラッピングを試みること、(2)これまでに我々が開発してきた冷却技術を使った応用研究を進めることが目的であった。

我々は、従来行われてきた方法と全く異なり、Caトラップから洩れ出て重力で落下してくる極低温基底状態のCa原子を使って超高分解能分光が出来ることを示した。また、寿命が数十秒に及びAr、Krの準安定状態の寿命を測定した。これはトラップ以外では全く不可能な研究である。トラップ中の原子は光電場と相互作用しているから、ただ減衰量を測定しただけでは準安定状態固有の寿命は得られない。我々は巧妙なタイミング方法により固有の寿命を得ることに成功し、その値が従来の理論値とかなり異なることを見つけた。さらに、Liトラップを使って超低速Li原子の衝突断面積の測定を行った。従来の予測ではアルカリ原子の中でLiだけが飛び抜けて断面積が小さく、したがって、非常に高密度の極低温Li原子気体を生成することが出来ると考えられてきた。我々の実験結果は必ずしもこれを支持していない。原子の運動操作に関しては、まず、極低温原子線の干渉実験に成功した。これは原子線輝度を高めるために我々が開発した光生成スリットによって初めて可能になった研究である。また、我々は極低温原子は電場を使って偏向、集光等の操作が出来ることを示した。
環境影響を考慮したコミュニケーションツールとしての 警笛の感性的デザイン

本研究では,車両の安全を確保するための機能性を維持しつつ,車外の人間にも配慮した警笛のデザインについて検討するため,聴取実験と社会調査を実施した。調査から,警笛が本来の目的である危険回避の目的以外で用いられたり,歩行者が使用対象になることも多いことが分かった。聴取実験では音響的特徴と印象の関係について検討した。これらの結果から,現在の警笛の使用状況を考慮すると,より低い周波数帯域に主要成分を持つ警笛が望ましいと考えられる。ドアや窓を閉じた自動車内に外部から透過する音は大きく減衰されるため,車外と車内で聴取される警笛の印象は異なると思われる。本研究では,この異なる聴取条件を考慮した上で警笛音のより良いデザインについて検討した。乗用車の警笛の周波数特性,刺激長,振幅特性(振幅エンベロープ)を変化させ,車外聴取条件の刺激とした。さらに普通自動車の車外から車内へ音が透過する際の伝達特性を実測し,この近似フィルタを刺激に適用して,車内聴取条件の刺激とした。二つの実験参加者グループに車外条件と車内条件の刺激をそれぞれ呈示し,音質評価実験と警笛の使用意図を判断する実験を行った。車外条件の刺激は車内条件の刺激に比べて騒音レベルが約40dB大きく,結果として不快感が強かった。一方,刺激長は長いほど,振幅特性は現状の警笛に相当する一定条件の方が減衰条件よりも不快感が強かった。また13kHzの周波数帯域に主な成分を持つ現状の警笛は,より低域に成分を持つ刺激よりも不快感が強かった。以上より,低域に主な成分を有し,振幅エンベロープが減衰する警笛は現状の警笛に比べ不快感が少ないと言える。一方,使用意図判断実験では,車外・車内条件ともに,刺激長が短い(100ms)と「挨拶」や「お礼」,より長いと(13s)「注意」「危険報知」「苛立ち」などと解釈されることが多かった。これらは現状の警笛と同じ一定振幅の刺激に対する結果だが,振幅特性が変化すると回答傾向も変化し,解釈がばらつく刺激が多く見られた。警笛のコミュニケーションツールとしての側面に着目すると,振幅特性を変更した場合,聴取者は警笛の使用者の意図を誤って解釈する場合もあることが示唆される。以上の結果や,車外から車内へ透過する音は高域ほど減衰量が大きいことを考慮すると,警笛のデザインの方向性として,主要成分を現状より低域にシフトするなど,周波数特性の変更が考えられる。国内の都市部における自動車の警笛使用の現状を把握するため,関東と闘西で意識調査を行った。参加者に調査票を配布し,警笛を使用したドライバーと,警笛を鳴らされたドライバーおよび歩行者の立場ごとに,警笛が使用された状況(場所,時間帯,吹鳴パターン,使用目的など)や警笛を鳴らされた時の心理状態,個人属性(年齢,性別,運転歴など)などについて回答を求めた。警笛音の特徴や使用目的と聴取者の心理の関連などを検討するため,回答のクロス集計を行った。ドライバーの警笛の使用状況については二つの地域で舷た傾向が見られた。さまざまな場所,かつそれほど危険を伴わない状況下で,挨拶や注意喚起のための短い警笛が多用されていた。一方,吹鳴時間の長い警笛は,頻度は少ないものの,交通量が多く危険度の高い状況で,注意喚起や危険報知のために用いられていた。警笛は歩行者に対しても頻繁に使用されており,鳴らされた歩行者のネガティブな心理的反応が多く見られた。関東の結果では,注意喚起や危険報知の警笛に対する「驚いた,うるさく感じた」などの回答が目立つ。関西の結果では,歩行者に対する危険報知のための警笛使用が関東ほど多くなかったが,注意喚起の警笛に対する「驚いた,うるさく感じた」などの反応が多数見られた。調査の結果,警笛に対するネガティブな反応はドライバーよりも歩行者で多く見られた。警笛は安全確保を目的として車両に装備されているが,車外の人間に対する影響を考えると,その音響特性や使用方法に検討の余地があると考えられる。以上の調査に加えて,警笛の吹鳴パターンが聴取印象に与える影響を実験により検討した。結果として,警笛の吹鳴時間が長いほど,また吹鳴回数が多いほど聴取者の不快感が強まる傾向が見られた。また,ドライバーの警笛の使用意図を判断する実験も行い,吹鳴回数の増加と共に意図不明の回答が多くなることが分かった。前年度までに得た調査結果などから,現行の警笛が特に車外の聴取者に心理的負担を与えていることが分かったが,この結果は調査に参加した回答者の経験に基づいたものであった。本年度は実際に道路周辺で発生する警笛を実測調査し,警笛の使用状況や音環境への影響について現状把握を試みた。調査は交通量が多い国道の交差点付近において,平日の延べ14日間,午前7時から午後8時までの間継続的に実施した。

このとき調査地点の道路端で騒音計による騒音レベルの測定と音の録音を行った。また同時に交差点付近で発生した警笛を含む音事象の記録も行った。特に警笛に関しては,調査員が目視により状況を確認し,警笛の使用目的(警笛を使用したドライバーの意図)を記録した。結果として1時間当たり36.5回,1日平均で59回(測定期間中では計812回)の警笛が確認された。また交差点付近で発生した警笛の調査地点における騒音レベルはおよそ6771 dBであり,周囲の音環境に比べて特に高いレベルではないことが分かった。警笛の使用意図に関しては,目視による確認ができず使用目的が不明であった事例も多く見られたが,確認された中では,何かを要求するため,注意喚起するため,危険報知のため,などの目的で使用された事例が多かった。一方,挨拶や感謝を表現するための警笛,腹立ちや苛立ちによると思われる警笛も少数ながら見られた。本調査では,先行調査で指摘された歩行者などへの使用はそれほど多く見られなかったが,交通量が多い道路における注意喚起,危険報知の警笛の使用が実際に確認された。申請時の計画では,1年目(平成22年度)に警笛に対する聴取印象の測定実験や使用意図の判断実験を行い,2年目(平成23年度)に警笛の使用状況を調べる国内での意識調査を計画していたが,おおむね計画どおり実施し,成果を得られたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画どおり,実際の警笛の使用状況を調べるため,幹線道路の交差点付近などで実測調査を実施する。警笛の発生状況をある程度の期間内(数日数週間)で記録・観察し,警笛使用の現状を把握する。この際,長時間にわたって騒音計で音響物理指標を記録すると共に,現場の音の録音や映像の録画なども行い,収録されたデータから警笛が使用された状況を分析する予定である。
カーボンチューブ及び高次フラーレンの電子物性

1.太さの異なる2つのカーボンチューブを接続する場合の立体構造を調べ、接続する部分の円錐形の構造は2つのカーボンチューブのそれぞれのカイラルベクトル(1つのカーボンチューブの構造を指定するベクトル)で1意に指定できることがわかった。2.また半導体チューブと金属チューブの接続は、金属-半導体ジャンクションとして、半導体ナノデバイスや磁気素子の可能性を持つ。半導体チューブと金属チューブの接続部の電圧電流特性を理論的に計算すると、半導体チューブ側のエネルギーギャップの領域では電流が流れないジャンクションとしての特性を得た。したがってこのような接続は、不純物が不要な高温でも動作可能な素子としての可能性を持つことがわかった。3.カーボンチューブの軸に垂直方向に磁場をかけた場合のエネルギーバンドの振動構造について詳細に調べ、昨年発表した内容の一部に関し数値計算に誤りがあることがわかった。これをErrataとして修正した。結論としてエネルギーバンドの振動自体は存在するが、バンド幅が著しく変化することはない。
ゼオライト層状前駆体をナノパーツとした新たなミクロ孔反応場の創製

10員環ミクロ孔をもつMWW型ゼオライトは,ヘキサメチレンイミン(HMI)を構造規定剤とした水熱合成で得られるMWW層状前駆体[MWW(P)]を焼成することで層間のシラノールの脱水縮合を経て得られる。このような層状前駆体-ゼオライトの関係は数種類知られており,新たなゼオライト触媒の調製法として注目されている。本研究ではおもにMWW(P)の層間へのシリル化を行い,MWW構造の層間が拡張した固体酸触媒を調製し,またその固体酸触媒特性について検討を行った。MWW(P)のシリル化条件を検討したところ,0.11.0Nの硝酸を溶媒として酸性条件下では層間シリル化が容易に進行することがわかった。いっぽう,弱塩基性であるアンモニア水溶液中ではほとんどシリル化が進行せず,また強塩基性である有機アンモニウム水酸化物の水溶液では,MWW構造が壊れてしまい,層間が拡張した構造を得ることができなかった。これは酸性条件においてのみ,MWW層間に存在するHMI分子を除去することができたことと相関していると考えられる。このようにして層間拡張して12員環ミクロ孔をもつ新規ゼオライト構造をinterlayer-expanded MWW(ILE-MWW)と名づけた。このILE-MWWを固体酸触媒として無水酢酸によるアニソールのアシル化を行った。MWWでは300分後でも10%の低い収率でありたのに対して,ILE・MWWでは収率35%に達し,12員環ミクロ孔を有するゼオライトベータに匹敵する活性を示した。この活性の向上は,シリル化した試料では拡張した層間内での反応物・生成物分子が拡散しやすくなったために起きたと考えられる。ほかのゼオライト層状前駆体としてPREFER,PLS-1,RUB-39のそれぞれについて,層間シリル化条件を検討したところ,各層状前駆体からミクロ孔が拡張した新規ゼオライト構造を調製できることを見出した。ただし,調製後の試料は必ずしも熱的安定性に優れていない場合もあり,さらなる処理条件の検討が必要である。
脳血栓症におけるプロスタノイド受容体の役割解明

脳梗塞の病態形成におけるPGE2-EP4系の役割を解明することを目的として、EP4欠損マウスを用いて脳虚血の病態を反映する永久中大脳動脈閉塞モデルを対象とした解析を行った。その結果、EP4欠損マウスにおける虚血後の脳浮腫の程度は、野生型マウスに比べて有意に軽減されることを見出した。ミクログリアの初代純培養系を用いた解析によって、脳内PGE2がEP4を介してミクログリアにおけるVEGFの発現を増強するように制御する可能性が示唆された。脳虚血状態において、虚血周辺部位でのプロスタグランジンE_2(PGE_2)の過剰産生が認められており、脳梗塞を含む脳血栓症の病態形成におけるPGE_2の役割が注目されている。しかし、脳に高発現するPGE_2受容体サブタイプのひとつであるEP_4の脳血栓症病態形成における役割については、これまで詳細な検討がされていない。本研究の目的は、脳梗塞の病態形成におけるPGE_2-EP_4系の役割を解明することである。本年度は、脳虚血の病態を反映する脳血栓症モデルのひとつである永久中大脳動脈閉塞モデルを対象とした解析を行ない、EP4欠損マウスと野生型マウスの表現系について比較検討することで、脳梗塞の病態形成におけるPGE_2-EP_4系の役割解明を目指した。虚血直後の中大脳動脈支配領域とその辺縁領域の血流量はともに野生型マウスとEP_4欠損マウスで同等に低下していた。また、虚血24時間後の中大脳動脈支配領域とその辺縁領域の血流量についても、野生型とEP_4欠損マウスで同等に低下しており、両群間に差異を認めなかった。虚血24時間後に摘出した脳をスライスしてTTC染色を施行することで脳梗塞サイズを評価したところ、EP_4欠損マウスの大脳全球のサイズに対する脳梗塞領域の割合は、野生型マウスと同程度であった。さらに、虚血24時間後における運動機能障害の程度をNeurological deficit scoreによって評価したところ、EP_4欠損マウスと野生型マウスの両群間に有意な差を認めなかった。一方、EP_4欠損マウスにおける虚血後の脳浮腫の程度は、野生型マウスに比べて有意に軽減された。そこで、脳梗塞進展過程を先導するような様式で順次活性化されて障害部位に集積するミクログリアの純培養系を用いて、脳浮腫関連分子の発現およびその産生に対するEP_4欠損ならびにEP4標的薬物の効果を解析中である。しかし、脳に高発現するPGE_2受容体サブタイプのひとつであるEP_4の脳血栓症の病態形成における役割については、これまで詳細な検討がされていないのが現状であった。前年度は、脳虚血の病態を反映する脳血栓症モデルのひとつである永久中大脳動脈閉塞モデルを対象とした本研究によって、EP_4欠損マウスにおける虚血後の脳浮腫の程度が、野生型マウスに比べて有意に軽減されることを見出した。そこで、本年度は、脳梗塞進展過程を先導するような様式で順次活性化されて障害部位に集積するミクログリアの純培養系を用いて、脳浮増強因子のひとつである血管内皮増殖因子(vascular endothelial growth factor:VEGF)の発現に対するEP_4欠損ならびにEP4標的薬物の効果を解析した。野生型マウス由来のミクログリアにおけるVEGFのmRNA発現は、EP_4アゴニスト(ONO-AE1-329:10-10-10-6M)による3時間の刺激で、その用量に依存して有意に増強されることを見い出した。この作用は、EP_4欠損ミクログリアならびにEP_4アンタゴニスト(ONO-AE3-208:10-6M)の共存下で培養した野生型ミクログリアでは認められなかったことから、EP_4を介した反応であると考えられる。本研究によって、脳内PGE_2が、EP_4を介してミクログリアにおけるVEGFの発現を増強するように制御する可能性が示唆された。
神経障害性疼痛発症におけるＧＰＲ１０３－２６ＲＦａ，ＱＲＦＰ系の役割

GPR103の内因性作動物質である26RFaを髄腔内・脳室内・脳内へ投与して、神経障害性疼痛・炎症性疼痛に対する効果を検討するとともに、神経障害の脊髄後根神経節におけるGPR103のもう一つの内因性作動物質であるQRFP発現に対する効果を検討した。26RFaは、髄腔内・脳室内のいずれに投与しても、坐骨神経部分結紮モデル後に発症したアロディニアを軽減することが出来た。脳内を作用部位を検討するために、26RFaをRVMに選択的に投与したが、良好な鎮痛効果が得られ、この効果はオピオイド受容体を介さないことが示された。免疫染色では、神経障害によりQRFP発現細胞数が増加することが示された。本年度は、本研究の準備のための基本的手技の充実にあてた。本研究を遂行するためには、ラットの中脳水道周囲灰白質(periaqueductal grey: PAG)、青班核(Locus coeruleus: LC)、吻側延髄腹側部(rostal ventromedial medulla: RVM)などの脳内神経核へ直接26RFa, QRFPを投与する必要がある。このために、ラットステレオ手術の方法を用いて、適切な部位にカニュラ先端を留置する必要がある。平成24年度は、ステレオ手術の技術の習得に加え、この技術を用いてマイクロダイアリシス用のカニュラを上記PAG, LC, RVMに留置する技術の確立を目指した。この技術を用いて26RFa, QRFPによりPAG, LC, RVMからのグルタミン酸・ノルアドレナリンなどの神経伝達物質の放出に対する影響も検討する予定としている。さらに、マイクロダイアリシスの技術確立とともに、高速液体クロマトグラフィーを用いてのグルタミン酸・ノルアドレナリンなど濃度測定技術の確立を行う必要があった。本年度は、マイクロダイアリシス法の確立と、高速液体クロマトグラフィーを用いた計測技術の向上に多くの時間を使用した。平成25年度は、これらの技術を用いて26RFa, QRFPを脳内へ選択的に投与しその鎮痛効果を検討すると共に、マイクロダイアリシス法を用いて神経伝達物質の放出に対する影響を検討する予定である。本年は、最初に、GPR7と8にも注目して研究を進めた。GPR7と8の内因性の作動物質であるneuropeptide W30とneuropeptide Bを用いて検討した。これらの内因性作動物質をPAG、RVM、LCにステレオ手術の技術を用いて投与した。特に、PAGはneuropeptide Wが多く発現している部位である。痛みのモデルとしては、ホルマリンテストを用いた。ホルマリン皮下注と同側のLCに投与するとホルマリンテストの第1相の反応を抑制した。RVMへの投与では、投与量依存性に第1相・第2相を抑制した。この効果は、ナロキソンにて拮抗された。次に、26RFaをRVMへ選択的に投与して、ホルマリンテストでの効果を検討した。26RFaを5ug選択的にRVMへ投与すると、ホルマリンテストの第1相・第2相を抑制した。この効果はneuropeptide W30と異なり,ナロキソンにより拮抗されることはなかった。このように、神経ペプチドにより鎮痛効果の発現機序は異なり、同じようにRVMに作用する神経ペプチドでもオピオイド受容体依存性の鎮痛を発揮する神経ペプチド(neuropeptide W30)とオピオイド受容体に依存しない鎮痛を発揮する神経ペプチド(26RFa)が存在することが分かった。GPR103-26RFa, QRFP系の侵害刺激伝達における役割を検討するために、本年はGPR103の内因性作動物質の1つであるQRFPのノックアウトマウスを用いた研究を行った。QRFPノックアウトマウスは、生理学研究所の山中章弘博士から提供を受けた。QRFPの神経障害性疼痛に対する影響を検討する前に、QRFPノックアウトマウスにおける侵害受容性疼痛と炎症性疼痛の反応性を検討した。侵害受容性疼痛として54.5°Cホットプレートテストを、炎症性疼痛としてホルマリンテストを用いた。ホルマリンテストは、1%ホルマリンを20&#61549;lマウス後肢の足背に皮下注して作成した。痛み行動を、ホルマリン皮下注直後の反応(侵害受容性疼痛の成分;phase 1)と後半の反応(炎症性疼痛の成分;phase 2)に分けて検討した。ホットプレートテスト、ホルマリンテストにおけるphase 1及びphase 2の反応ともに、ノックアウトマウスとwild typeマウスに差を認めなかった。今回の結果からは、侵害受容性疼痛と炎症性疼痛時にQRFPは重要な役割を果たしていないことが示唆された。

GPR103の内因性作動物質としては、QRFP以外に26RFaが存在している。以前の我々のラットホルマリンテストを用いた研究では、26RFaの髄腔内投与・脳室内投与により強力な鎮痛効果を確認した。この結果は、GPR103は炎症性疼痛において重要な役割を果たしている可能性を示している。今回の結果となった原因としては、26RFaがGPR103を活性化することによりQRFPの役割がマスクされてしまい、QRFPノックアウトマウスで鎮痛効果が見られなかったものと考えている。現在までに行えていることは、本実験を行うための基本的な技術の確立であった。技術確立に、予定していた以上に時間がかかってしまった。平成25年度は、今までに確立した技術を用いて、すぐに実験データをとることが出来る状態となっている。今後は研究のスピードをあげて、年度内に全ての実験を行い、成果を発表すると共に、学会誌に投稿する予定である。本年度の研究では、QRFPのノックアウトマウスを用いた研究のみを行った。結果として、QRFPノックアウトマウスにおける侵害刺激伝達はwild typeのマウスと差が見られなかった。ノックアウトマウスを用いた研究の限界があるものと考えている。この結果から、ラット脳内へQRFP・26RFaをマイクロインジェクションする研究を早急に始めるべきであった。しかしながら十分な準備が出来ず、研究を始めることが出来なかった。来年度はQRFP・26RFaのマイクロインジェクションによる研究を進めていく予定である。平成25年度は研究の最終年度であり、予定していた研究を全て行うことを目標としている。すでに技術的問題は全てクリアできており、障害となるものはない。ラットを用いて、26RFa・QRFPの役割を、ホルマリンテスト・神経障害性疼痛モデルラットを用いて行動学的、さらにマイクロダイアリシスを用いた検討をする。平成25年度は最終年度であり、予定していた研究を行う。ラットにステレオ手術の方法を用いて26RFa・QRFPをPAG, LC, RVMへ選択的に投与する。ホルマリンテスト・神経障害性疼痛モデルラットを用いて、痛みに対する効果を検討する。さらに、マイクロダイアリシスのカニュラをPAG, LC, RVMへ選択的に留置する。26RFa・QRFPを静脈内投与し、PAG, LC, RVMからのグルタミン酸・ノルアドレナリン放出に対する効果を検討する。来年度は、ラットを用いたマイクロインジェクションを行う研究を行う予定である。従って、研究費はラットの購入及び飼育の費用に充てる。またマイクロインジェクションを行うため、マイクロインジェクション用のカニュラを購入する。また手術を行うための麻酔薬などの経費も必要となる。さらに、QRFP及び26RFaが必要となる。これらのペプチドの購入経費も必要となる。