hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
刷り込み記憶の分子基盤の解明

一方、臨界期に特定の匂いを提示した所、この個体は成体になった後もその匂いに愛着を示すようになった。そこで本研究では、臨界期に脳内で何が起きているのか、嗅覚神経回路形成を中心にその分子基盤を明らかにする事を目指した。まず、臨界期に特定の匂いを嗅がせ、Sema7Aシグナルによるシナプス形成を積極的に促進した場合、何が起こるかについて解析を行った。その結果、嗅がせた匂いに反応する嗅細胞と僧房細胞間のシナプス形成が増強され、検出感度も上昇していた。また驚いたことに、嗅がせる匂いの質感が先天的に中性や忌避性であっても、臨界期に嗅がせて刷り込むことで、成長後のマウスはその匂いに対して誘引性の行動をとるようになることを見出した。そこで、匂い刷り込みによって特異的に活性化されるようになる脳領野がないかを、嗅皮質、扁桃体、海馬など脳全体に渡って、神経活動依存的に発現するEgr1を指標に免疫染色を行った。その結果、臨界期に嗅がせて刷り込んだ場合にのみ、その匂いで扁桃体内側前部が活性化され、誘引行動を誘導することが明らかとなった。更に、この刷り込み記憶の誘引的な価値付けに、臨界期に脳内での発現濃度が上昇するオキシトシンの関与が疑われたので、オキシトシン分泌異常マウス(CD38 KO)を調べたところ、匂い刷り込みによる誘引的価値付けがなされないことを見出した。研究は概ね順調に進み、計画していた以上に実験を行うことができた。しかし、研究成果を論文としてまとめるに当たり、査読者からの指摘で追加実験を行う必要が生じ、研究期間を延長するに至った。鼻腔閉塞というloss-of-function実験から、マウス嗅覚系の臨界期(生後一週間)において、Sema7A-PlxnC1シグナルが嗅細胞軸索と僧房細胞樹状突起間のシナプス形成を促進することを見出した。今後は逆にgain-of-function実験として、臨界期に特定の匂いを嗅がせた時に、マウス嗅覚系にどのような影響が出るかを解析する。予備実験では、嗅覚受容体MOR29Aのリガンドの一つvanillinを臨界期に嗅がせると、MOR29Aを発現する嗅細胞特異的にSema7Aの発現量が上昇し、MOR29Aの糸球体形成時期が数日早まるという結果を得た。また、vanillinを嗅いで成長したマウスは、vanillin臭に対し好奇心や愛着行動を示すようになる示唆を得ている。そこでまず、臨界期に特定の匂いを嗅がせることで、嗅覚神経回路にどのような変化が起きているのかについて、糸球体内におけるシナプス形成を中心に解析を行う。また、予備実験では、臨界期に中性の匂いvanillinを嗅がせた場合にマウスはその匂いに愛着を示すようになることが示唆されたが、代わりに生来嫌いな匂いを嗅がせた場合、成長したマウスはその匂いに対しどの様な反応を示すかについて、行動実験などを行い詳細に解析する。もし臨界期に嗅いだ匂いが、4MTのようにマウスにとって生来嫌いな匂いであっても好きになってしまうような、匂いの質感に変化が起きるのであれば、脳内でダイナミックな変化が起きていると考えられるので、可塑的に変化した神経回路がないかを詳細に調べる。具体的には、臨界期に刷り込まれた匂いを嗅いだ時に、特異的に活性化されるようになる脳領野がないかを、嗅皮質、扁桃体、海馬など脳全体に渡って、c-Fosなどのimmediate early geneの発現を指標に免疫染色法によって解析する。研究成果をまとめ、論文を現在投稿中である。
植物同士の傷害情報交換機構に関する研究

1.植物葉面で観測される対傷害防御または応答シグナルの観測系(下記)を本研究に駆使できるように構築・整備完了した。(1)葉面極微弱生物フォトン発光計数システム(2)葉面微弱クロロフィル発光計測システム(3)自発性微弱AE(超音波放出)信号計測系(4)葉面電位信号計測系統並びに(5)2室分離型カプセル状シャッタ/遮光暗室を製作した。2.上記(1)と(2)について、フォトン発光、クロロフィル発光の葉面2次元分布(イメージング)画像構成プログラムの立ち上げ調整を完了した。これにより、同一個体の任意の葉に加えた冷熱刺激が、冷熱刺激を加えていない同一個体の別の葉に伝達している兆候をクロロフィル蛍光強度変化により検出できることを突き止めた。3.植物個体内部の対傷害防御指令に対応するmRNAの発現を検知するための遺伝子解析システムの導入と同システムの立ち上げ、調整を完了した。このシステムを用いて害虫の加害を受けた稲と受けていない稲のそれぞれのmRNAの検出手法を確立した。この手法により、加害を受けた稲と受けていない稲のそれぞれのmRNAに有意差が確認された。上記2.3の結果から、植物個体内部の情報伝達機構や情報の内容を探知できる可能性が裏付けられた。植物同士の情報交換機構についても把握できる見通しが得られた。(1)葉面極微弱生物フォトン発光計数システム(2)葉面微弱クロロフィル発光計測システム(3)自発性微弱AE(超音波放出)信号計測系(4)葉面電位信号計測系統並びに(5)2室分離型カプセル状可変シールド・遮光暗室を製作した。2.上記(1)と(2)について、フォトン発光、クロロフィル発光の葉面2次元分布(イメージング)画像構成プログラムの立ち上げ調整に着手した。3.植物個体内部の対傷害防御指令に対応するmRNAの発現を検知するための遺伝子解析システムの導入手配を完了し、同システムの立ち上げ、調整に着手した。4.上記システム・機器から得られるデータの統計処理のため、有意差判定、信頼性検定、多変量解析のためのプログラムの導入、改修・整備を実施し完了した。また、害虫飼育や遺伝子解析過程で必要とされる安全対策、手順の取り決めを行った。1.植物葉面で観測される対傷害防御または応答シグナル並びに遺伝子の観測・発現検出系(下記)を本研究に駆使できるように構築・整備完了した。(1)葉面極微弱生物フォトン発光計数システム(2)葉面微弱クロロフィル発光計測システム(3)自発性微弱AE(超音波放出)・葉面電位信号計測系並びに(4)遺伝子(mRNA)発現検知システムを構築し、同検知・解析機能を検証した。上記2.3の結果から、植物個体内部の情報伝達機構や伝達ルートと情報の内容の一端を探知することに成功した。また、植物同士の情報交換機構を把握できる見通しが得られた。
生細胞内におけるＵＧＴ分子種の発現量比変動時の抱合活性および基質特異性変動の評価

本研究では,薬物代謝酵素であるUGTのin vitro活性評価時みられるin vivo活性との乖離の要因を明らかにするため,生細胞(in vivoに近いモデル)内のUGT活性を評価する系として,LLC-PK1細胞を利用し,基質を氷上で2時間インキュベートした後,37°Cに戻し,細胞外へ排出された代謝物を定量することで代謝活性を測定可能な系を構築した。更に,HeLa細胞にUGT1A9を導入した安定細胞を作成し,この細胞に一過性にUGT2B4を導入・発現させたところ,UGT2B4導入時にUGT1A9活性が低下し,UGT-UGT蛋白質間相互作用の影響が示唆された。生細胞内のUGT活性を評価する系として,LLC-PK1細胞にヒトUGT2B7遺伝子を導入して安定発現細胞を作製したが,UGT活性がMockの2倍程度にしか上昇しなかったため,LLC-PK1細胞そのものを評価系に用いた。種々条件を検討した結果,生細胞内のUGT代謝活性は,以下の条件で行った。7-HCをメディウムに添加後,氷上で2時間平衡化することで,細胞内の代謝および排出系が働かない状態で細胞内の基質濃度を上げ,その後37°Cで代謝,排出系を機能させた。このとき,細胞内の代謝物(7-HCG)の蓄積はほとんどなく,細胞外の7-HCGを定量することで,生細胞のUGT活性を評価できることが明らかとなった。初期の細胞内7-HC存在量と細胞内容積から細胞内の初期濃度を算出し,代謝クリアランスを算出することでミクロソーム代謝系との比較を可能とした。また,排出蛋白質の阻害剤存在下で,同様に検討したところ,抱合体の総生成量が有意に低下したことから,抱合体によるUGTの阻害が生じていることが示された。一方,UGT-UGT蛋白質間相互作用の影響を解明のためのツールとして,UGT活性のほとんどないHela細胞にUGT1A9を導入した安定細胞を作成した。この細胞にProteo tuner shield systemのpTUNER vectorを用いて,UGT2B4を導入しUGTの発現量を制御したときの活性を評価した。現在まで,UGT2B4発現量が少ない方が多い方よりもUGT1A9活性が高く,UGT2B4共存時にUGT1A9活性が低下することが示唆された。現在,安定発現系で再現性の確認およびモノマーやヘテロマーなど複合体形成の種類とその割合の評価を継続している。今年度は,UGT活性評価のためのモデル薬物の一つとして,生細胞内でチトクロームP450での代謝を受けないため,生細胞内でのUGT活性のみを評価しやすく,また多くのUGT分子種の基質となる7-ヒドロキシクマリンを用いることにした。この薬物について,未変化体およびそのグルクロン酸抱合体の細胞内濃度を測定できる感度で,定量法を確立した。次に,生細胞内のUGT活性を評価する系として,ブタ腎臓細胞由来LLC-PK1細胞にヒトUGT2B7遺伝子を導入して安定発現細胞を作製した。この系で7-ヒドロキシクマリンをメディウム中に添加して,経時的に細胞内外の未変化体および抱合体濃度を測定した結果,未変化体の取込,UGTでの代謝,排出蛋白質を介した抱合体の細胞外への排出の一連のプロセスの中で,UGTによる代謝過程が律速であることを確認し,細胞外中の抱合体の測定により簡便に生細胞のUGT代謝活性の評価できることを明らかにした。この生細胞系で排出蛋白質の阻害剤存在下で,同様に検討したところ,抱合体の総生成量が有意に低下したことから,抱合体によるUGTの阻害が生じており,代謝活性に大きな影響を与えることを示した。現在,この系でProteo tuner shield systemを用いて,UGTの発現量を制御したときの活性およびオリゴマーの割合の評価に入るところである。また,並行してヒト子宮頸がん由来HeLa細胞にヒトUGT2B7およびUGT1A9遺伝子を導入し,発現スクリーニング時にmRNA発現量の大きく異なる株をいくつかピックアップして培養中である。タンデムのベクターを使用して,発現量を調整する前の簡易的な系として用いられないか検討している。本研究の目的は,ミクロソームなどの細胞画分によるUGT代謝活性とin vivo活性との間に認められる乖離の要因を明らかにすることである。その要因として,UGTにより産生された抱合体によるUGT阻害効果とUGT-UGT(CYP)蛋白質間相互作用の影響を仮説として挙げている。その解明のためのツールとして,生細胞での評価系としてLLC-PK1細胞にヒトUGT2B7遺伝子を導入して安定発現細胞を作製した。この系ではLLC-PK1細胞が有している排出系蛋白質の作用のため,肝細胞における抱合反応と同様に抱合体が細胞外に排出されるため,細胞内に蓄積しない。

また,今回の検討によりUGTによる抱合反応が律速であることが明らかになったので,細胞外に排出された抱合体を定量することで,簡便にUGT代謝活性を評価できる。またメディウム中に排出系の阻害薬を共存させて,抱合体を蓄積させ,抱合体がUGTを阻害するか否かの評価も可能である。この系を用いて,抱合体による阻害が認められるものと認めらないもので,in vivoでの活性を比較することで,抱合体による阻害がin vivoとin vitro活性の乖離の要因か否かが判別できる。また,HeLa細胞にヒトUGT2B7およびUGT1A9遺伝子を導入し,その発現量の異なる株の安定細胞も作成しており,二つ目の仮設であるUGT-UGT間の蛋白質相互作用を評価するための基盤の一つはできている。以上のことから研究の進捗は概ね順調であると考えている。現在培養中のヒトUGT2B7を導入したHeLa細胞を用いて,細胞破砕液および生細胞系での代謝実験を行い,両者の代謝活性を比較する。また,発現量に大きな差のある細胞株を複数用いてUGTの発現量と抱合活性の間に比例関係が認められるか検証する。さらに,ヒトUGT2B7導入HeLa細胞にUGT1A9遺伝子を翻訳シグナルとプロモーターを改変した種々の組み合わせのベクターまたはProteotuner shield systemに対応したベクターを用いて導入する。後から導入したUGT1A9の発現量の違いとモノマーやヘテロマーなど複合体形成の種類とその割合を評価し,UGT1A9およびUGT2B7の活性変動との関係性を生細胞系と細胞破砕系の両者で明らかにしていく。また,このとき基質として当研究室で光学異性体間相互作用が観察されたカルベジロールを用い,この相互作用が細胞内のタンパク質相互作用が生じる系でどのように変動するか否かを検証する。カルベジロールはUGT1A1の基質とならないので,相互作用の結果UGT2B7に対する親和性,光学異性体選択性の変動がより明確になるものと思われる。また,UGT1A9の良好な基質であるミコフェノール酸を用いて抱合活性を評価することにより,UGT2B7と1A9の相互作用に及ぼすUGT1A9の活性変化を評価する。一方,HeLa細胞系では代謝物が細胞外に排出される系が存在しなく,細胞内に蓄積されていくため,その点を解消したUGT2B7導入LLC-PK1細胞を用いて,種々の基質の抱合活性における細胞破砕系と生細胞系での違いを明らかにする。さらにこの評価系に排出蛋白質の阻害剤を添加して実験することにより,抱合体の阻害の影響を定量化する。また,現在最もヒトのin vivoを反映すると考えられる,ヒトヘパトサイト系での代謝実験を行い,細胞培養系と比較する。平成25年度の研究費は,研究継続に必須なUGT蛋白質の定量のための抗体や細胞培養に必要なメディウム,血清,試薬類,分析用HPLCカラムなどの消耗品にその多くを充填する。また,培養細胞系とヒト組織の比較のために,ヒト浮遊凍結肝細胞の購入を予定している。なお,一部前年度分が繰越されているが,そのほとんどが年度末に購入した消耗品や試薬類であり,支払が翌年度になったための見かけ上のもので,実質上予定通り使用している。
分子シャペロンによるG1サイクリン依存キナーゼ(cdK4)の機能制御

サイクリンDとサイクリン依存性キナーゼ(CDK)-4からなるタンパクキナーゼ複合体は、高等動物細胞のG1期制御に中心的役割を果たす。われわれは、CDK4と特異的に会合する分子として、K4-1(新規DnaJ様蛋白質)とCDC37を単離した。K4-1はHsp40/DnaJファミリーに属する新規蛋白質としてHsp70ファミリーと協調して作用すると推定され、CDC37はHsp90と会合して働く分子シャペロンであることが判明している。CDK4の細胞内機能に、Hsp90/CD37複合体とDnaJ様K4-1蛋白質が、分子シャペロンとして果たす役割を解明するために、HAtagを付加したそれぞれの蛋白質を発現できるベクターや、大腸菌にて組み替え蛋白質を発現、精製し、in vitro、in vivoにて実験を行った。その結果、K4-1とCDC37はin vitroにおいてCDK4と特異的に会合し、他のCDK(CDC2、CDK2、CDK6)との結合は認められなかった。K4-1に比べ、CDC37の方がCDK4とより強い(安定な)結合を示した。K4-1あるいはCDC37とCDK4との結合は、COS細胞中でも認められた。この場合もCDC37の方がK4-1と比べてより強い結合を示した。K4-1とCDC37は、ともに細胞質に局在していることから、両分子シャペロンとCDK4との相互作用の場が核外であると予想された。組み替え蛋白質を用いた試験管内再構成系を用いた実験から、K4-1がサイクリンD/CDK4複合体を活性化しうることが判明した。この条件下ではCDC37は、ほとんど効果はなかった。ウサギを用いて、それぞれの分子に対する特異的抗体を作製した。現在、K4-1とCDC37の細胞内における挙動、機能についてより詳細に検討中である。
生態学と疫学の統合による節足動物媒介感染症制御に向けた警戒システムの共創

本研究では研究代表者をはじめ日本人研究者が、海外共同研究者の研究拠点であるトルコ・エーゲ大学に直接出向き実施する研究活動および現地調査が中核をなす研究計画である。両国の研究機関の昆虫学者、医学者、獣医学者、地理学者、生態学者が緊密な連携を構築し、サシチョウバエが媒介するリーシュマニア症と、蚊が媒介するウエストナイル熱をモデル感染症として、気候・生態系変動の予測・影響評価を行い、それら技術、知識、情報の統合により感染症制御のための早期警戒システムを共創する。
数値流体力学における動的解適応格子形成法と三次元非定常衝撃波境界層干渉への適用

本課題の目的は、流れ(解)の性質に対応して、流れの急峻なところでは密に、流れの穏やかな領域では粗となるように自動的に格子を形成する解適応格子形成法および流れの数値計算法両者からアプローチすることにより、効率的な動的解適応格子形成法を確立することである。またその方法を3次元の衝撃波境界層干渉問題に適用し流れの物理を解明することである。本課題において、以下の研究実績を挙げることができた。まず解適応格子形成法に関して、研究代表者が考案した楕円型偏微分方程式を用いた解適応格子形成法に、従来以上に効果的に格子分布の制御が可能となるように新しい擬似圧力分布の概念を導入した。その結果衝撃波部分における格子制御は従来より容易に且つ効率的に行えるようになった。その新しい方法を2次元衝撃波干渉問題で確立した後、3次元管内の衝撃波・衝撃波干渉問題に適用しその有効性を示した。次に計算スキームの面から、任意時間精度を持つ3次元有限体積法計算コードの検証を3次元衝撃波・境界層干渉問題を例に行い、実験値との比較、他者の計算法との比較により行い、有効性・妥当性を確認した。次に本コードを大迎角で壁に設置された翼型周りの流れに適用し境界層と衝撃波の3次元干渉現象を解析し流れの場の詳細を明らかにした。動的な解適応格子形成法と流れの計算法との動的な結合は確立したものの、非定常現象の数値計算は、予算の関係でスパコンが使用できずしたがってワークステーションで計算したため、メモリおよびCPU能力が不足し十分な計算ができないことがわかった。したがって本課題では定常現象に限定せざるを得なかった。そこで、解決策として解適応格子形成法に重畳格子法を組み合わせる新しい方法を考案しその方法の確立を行った。現在、本方法は非常に有効であることが明らかとなり、当初の非定常干渉現象へ応用を行っている。
運動中突然死の発生機序としての心臓疲労に関する研究

過激な運動による心臓への影響をサロマ湖100Kmマラソンにおいて検討した。昨年の報告に示したように、100Kmマラソン後には一過性の心機能の低下を認めるが、それが運動中の突然死の原因となり得るかは不明である。本年度は、100Kmマラソン後の一過性の心機能低下が疲労によるものか否かを骨格筋障害と鑑別することを目的として検討を行った。従来、心筋逸脱酵素の変動は、骨格筋障害と交差を有することから判別できなかったが、トロポニンTにより心筋障害の診断制度は高まった。本年度は、骨格筋障害に特異性の高い炭酸脱水素酵素III型とトロポニンTとの対比により、骨格筋障害と分離した心筋障害の有無を検討した。トロポニンTは79名、炭酸脱水素酵素III型は49名でマラソン前及び直後において測定した。マラソン直後に於てトロポニンTが正常値以上に増加した例は、79例中51例(65%)であり、最高は正常値の26倍に達した。一方、骨格筋障害に特性の高い炭酸脱水素酵素III型は、マラソン直後では全例で正常値以上に増加し、骨格筋障害が生じたと推定された。両者を測定した49名に於てトロポニンT増加量と炭酸脱水素酵素III型の増加量との間の相関関係は乏しく、特に心筋障害の指標であるトロポニンTが正常値の3倍(0.75ng/ml)以上に増加した17例に於いてはr=0.371と相関を認めず、両者の増加が別の機転によるものと推察され、トロポニンTの増加は心筋障害に基づくものと考えられた。以上より、過激な心臓負荷となる100kmマラソンにおけるトロポニンTの増加は、骨格筋障害ではなく心筋障害を反映していると考えられ、過激なスポーツにより心筋障害が生じると推定された。過激な運動の心臓に対する影響をサロマ湖100kmマラソン参加者を対象検討した。心臓超音波検査により、マラソン前後において収縮能の低下を認め特にハンドグリップ負荷に対する反応性の低下をマラソン後に認め、翌日には復することを明らかにした。次いで、血液・生化学検査の酵素変動を検討した心筋逸脱酵素(ミオグロビン、CPK、CPK-MB、ミオシン軽鎖、トロポンT)は、マラソン直後で上昇し、CPKは翌日さらに増加を認めた。心筋特性の高いトロポニンTは、マラソン前では全例正常範囲であったが、マラソン後では、42例中20例(48%)に異常高値を認め、最高は正常値の13倍達した。骨格筋と交差するトロポニンT以外の酵素は、マラソン直後には全例昇するのに対し、トロポニンTは約半数の者にしか上昇を認めなかったことはトロポニンTの出現は、骨格筋からの酵素逸脱とは別の機転ないしは臓器が考られ、特異性が高いことから、心筋由来と考えた。従来、過激な運動後の心機低下は、短時間で回復することから心臓疲労との考えも提唱されているが、本究からは、過激な運動による軽度の心筋障害が発生し、それに伴って一過性の機能が低下することが示唆された。
粒界の弾塑性変形を解明に基づくその応力腐食割れにおける決定的な役割

288°C純水中の182合金溶接金属を対象とし、き裂進展方向をT-SならびにT-Lとした場合のき裂進展速度を溶存酸素並びに溶存水素濃度毎に求めた。供試材においては、高傾角のランダム粒界が主であった。両方向の試験片において得られたき裂はデンドライド境界に沿っていた。T-S方向におけるき裂進展速度はT-L方向に比べて著しく速かった。T-S方向におけるき裂においては、応力負荷方向に対して垂直に進展しているものも観察できた。また、溶存酸素濃度の低下に伴い、き裂進展速度は遅くなった。一次冷却水中環境下におけるNi基合金の応力腐食割れ(PWSCC)の応力拡大係数(K)依存性について、き裂先端力学と酸化動力学に基づく理論モデルにより定量化した。き裂進展データは、米国機械学会ボイラ・圧力容器規格(ASME Section XI)に規程のき裂進展速度線図から採用した。またそれらに加え、他に提案されている600合金線図(EPRI MRP55)ならびに82/182/132合金線図(EPRI MRP155)との比較検討を行った。MRP55ならびにMRP155ではK値、温度ならびに活性化エネルギーの値が記載されているため採用した。またMRP55、MRP115はいずれも工学的見知に基づく線図となっている。理論モデルでは、き裂先端動力学は擬固相酸化を仮定しており、き裂先端速度のK値依存性について決定論的方法を与えると考えられる。その評価のため、実験室で得られたき裂進展速度と実機PWSCC進展速度に対して理論モデルを適用した。理論モデルから得られた進展速度のK値依存性は指数関数依存であり、その指数はMRP155にて提案されている値とおおむね一致した。600合金ならびに690合金の熱影響部での材料因子と応力腐食割れ挙動については、粒界性格分布に着目した解析を行っている。供試材となるSUS316Lステンレス鋼および600合金のランダム粒界と低シグマ対応粒界(CSLB)といった粒界の種類、粒界近傍の結晶方位差とその分布、予変形の影響の調査における参照データとした。微視組織中の不一致または不均一性を評価時に見出すとともに、粒界における弾塑性の本質を示す適切なパラメータを選択した。SUS316L鋼と600合金の圧延による予変形、および微視組織観察.ひずみの局在化を、Kernel Average Misorientation(KAM)値または方位差角の分布で評価した。予変形のレベルの影響と同様に、酸素富化水および水素添加水の両方を水化学の影響として検討するための試験を実施した。表面および断面の観察から活性な割れ経路を明らかにした。結晶粒界変形、局所酸化、および応力集中の相互作用を、応力腐食割れ進展試験と、側面および破面からの割れ経路解析を通じた破壊力学試験片、およびその場観察を通じた割れ動力学を通じて検討した。供試材となるSUS316Lステンレス鋼および600合金のランダム粒界と低シグマ対応粒界(CSLB)といった粒界の種類、粒界近傍の結晶方位差とその分布、予変形の影響の調査における参照データとする。微視組織中の不一致または不均一性を評価時に見出すとともに、粒界における弾塑性の本質を示す適切なパラメータを選択する。SUS316L鋼と600合金の圧延による予変形、および微視組織観察.ひずみの局在化を、Kernel Average Misorientation(KAM)値または方位差角の分布で評価する。予変形のレベルの影響と同様に、酸素富化水および水素添加水の両方を水化学の影響として検討するための試験を実施する。表面および断面の観察から活性な割れ経路を明らかにする。結晶粒界変形、局所酸化、および応力集中の相互作用を、応力腐食割れ進展試験と、側面および破面からの割れ経路解析を通じた破壊力学試験片、およびその場観察を通じた割れ動力学を通じて検討する計画通りに進んでいる。計画通りに進んでいる。き裂先端力学については新たに弾塑性変形を取り扱っていくこととする。応力腐食割れ発生・進展以前の変形履歴の役割について検討を進める。割れ経路と速度に対し、これまで得られた材料の微視組織

ならびに弾塑性挙動の結果を用いてその影響を明らかにしていく。また、粒界近傍での応力/ひずみ分布とそれらにおける酸化動力学を粒界変形挙動を表現するパラメータとして導出することにより、理論モデルと併用し、予測精度の向上を図る。微視組織と結晶方位差を評価したSUS316Lステンレス鋼とニッケル基合金のSCC試験片を試験する。溶存水素濃度と局所結晶粒界変形の影響に重点をおく。次年度使用額は、今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額であり、平成25年度請求額と合わせ、計画している研究の遂行に使用する予定である。次年度使用額は、今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額であり、平成24年度請求額とあわせ、次年度に計画している研究の遂行に使用する予定である。
超高速時間分解誘導ラマン分光法による超臨界水中での分子内電荷移動反応機構の解明

今年度は前年度にひき続き、フェムト秒分解誘導ラマン分光(FSRS)測定の実現が期待できる反応系として選定したジスルフィド化合物の光解離・再結合反応ダイナミクスについて、過渡吸収分光法で調べた。粘度の高いエチレングリコールやイオン液体中においては、光解離ラジカルは速い時間で吸光度の大きな減少を示し、溶媒のかご効果によるラジカルのgeminate再結合が促進されていることが分かった。しかし粘度の大きく異なるイオン液体間でラジカルの量子収率の差がほとんどないことから、粘度によるかご効果はある程度において飽和するということがわかった。このようなダイナミクスの初期過程を、CollinsとKimballによる拡散律速モデルに基づいて解析した。geminate再結合の速度定数は溶媒によらず一定という仮定のもとで評価したイオン液体中の溶質の拡散係数は、SE則から予測された値よりも2から3倍大きかった。したがってイオン液体中の溶媒かご中において光解離ラジカルはSE則よりも速く拡散し、その結果再結合が促進されると考えられる。DMAPTラジカルの溶媒和ダイナミクスはクマリン153のような分子と同様、再結合過程に先行する速い成分が確認された。イオン液体中でのこのようなダイナミクスは溶媒の慣性的な運動に起因するものと考えられており、このような溶媒和が光解離ラジカルペアの周りに慣性的な運動で凝集することによって再結合が促進されていると考えられる。上記の反応系を誘導ラマン測定に適用するに当たり、昨年度に構築したFSRS測定システムの改良に取り組んだ。光路を整備し、光路長が0.5mmと短いセルを用いることによって、ラマンシグナルののS/Nを向上させることに成功し、以前は溶媒の信号に比べ弱かったメタノール中におけるpNAの振動モードの、強いラマンシグナルを観測することができた。また、アクチニックポンプを光学遅延をかけて入射することにより、振動モードの強度が変化していく様子を確認することができた。本研究では、超臨界水・アルコール中での電荷移動反応における、局所的な溶質-溶媒間相互作用ダイナミクスを調べ、特異な反応性の機構を探ることを目的として、フェムト秒分解誘導ラマン(FSRS)分光法のためのシステム構築を行った。まず回折格子、スリット、ミラー等の光学部品を利用し、FSRS分光法に必要な周波数幅の狭いラマンポンプ光を生成することに成功した。生成したラマンポンプ光を、既存の過渡吸収システムの白色プローブ光と同軸上、同タイミングでセルに入射することにより、水中でのp-ニトロアニリン(pNA)の振動モードを誘導ラマン信号として観測することができた。つぎに、電子状態を励起するためのアクチニックポンプを光学遅延をかけて入射することにより、電子励起による分子内電荷移動反応ダイナミクスを観測しようと試みたが、思いの外pNAの誘導ラマン信号の変化が小さく、現在のシグナル・ノイズ比では詳細な時間変化を観測することが出来なかった。超臨界状態へ向けてよりノイズの増える高温高圧な条件での測定を行うには、誘導ラマンスペクトルがより顕著に変化する反応系が必要と考え、その探索を行う過程で、ビス(p-ジメチルアミノフェニル)ジスルフィドの光解離反応に着目した。まずイオン液体中での過渡吸収分光法を行い、光解離により生成するp-ジメチルアミノフェニルチイルラジカルの再結合過程や、溶媒和ダイナミクスに関する情報を得ようと試みた。粘度の異なる2つのイオン液体[P1,3][NTf2]、[Pp1,3][NTf2]中での観測結果から、イオン液体中でのトリヨウ化イオンの光解離反応についての結果と同様、溶媒のかご効果の粘度依存性は小さかったが、その効果の大きさは比較的弱いということわかった。また溶媒和ダイナミクスについては、同じイオン液体中でのクマリン153分子と同じようなダイナミクスを示すということが明らかになった。今後は、超臨界流体中での測定にむけてシステムの構築を行なっていく予定である。

上記の反応系を誘導ラマン測定に適用するに当たり、昨年度に構築したFSRS測定システムの改良に取り組んだ。光路を整備し、光路長が0.5mmと短いセルを用いることによって、ラマンシグナルののS/Nを向上させることに成功し、以前は溶媒の信号に比べ弱かったメタノール中におけるpNAの振動モードの、強いラマンシグナルを観測することができた。また、アクチニックポンプを光学遅延をかけて入射することにより、振動モードの強度が変化していく様子を確認することができた。ターゲット分子であるp-ニトロアニリンの誘導ラマン信号の変化が予想外に小さかったため、熱や密度揺らぎによるノイズが大きくなることが予想される高温高圧下での測定に適した、より信号が強く観測される反応系を模索する必要が出てきた。観測の対象をp-ニトロアニリンの分子内電荷移動反応からビス(p-ジメチルアミノフェニル)ジスルフィドの光解離反応に変更し、現在進めているイオン液体中での過渡吸収測定を、現在の数ピコ数百ピコ秒の時間スケールに加え、反応初期段階を追うためのサブピコ秒スケールから、再結合過程が完結するナノ秒までの長い時間領域で行い、総合的なダイナミクスを評価した上で、超臨界流体中の測定へと移行していく。二酸化炭素やトリフルオロメタン中での超臨界領域において、圧力に依存した密度変化に対してダイナミクスがどのように変化するかを調べ、超臨界流体に特徴的な局所密度増加の影響などを調べる。
核酸塩基の求電子的アミノ化反応:N-アミノ体を中間体とする新規修飾塩基類の合成

生体内DNAに対する発癌、突然変異誘発に関連する反応として、求電子的アルキル反応、求電子的アリールアミノ化反応、ラジカル反応、およびラジカル的酸化反応等があげられる。このうちアルキル化反応については、これまでに多くの研究がなされてきているが、アミノ化反応についての知見は少ない。我々は発ガン性4-hydroxyaminoquinoline 1-oxideの核酸に対する反応性を検討してきたが、なぜ主生成物グアニン残基C8位のアリールアミノ体であるかに興味を持ち、それを解明する事を目的とし、核酸塩基に対する単純な求電子的アミノ化反応についての基礎実験を始めた。反応試薬としてNH20S03H(HAOS)やNH20-(2,4-dinitrophenyl)(DNPA)を用い、種々の条件下、A、G、C、T、U誘導体に対する反応を検討してきた。その結果、環上窒素にアミノ基を導入したすベてのN-NH2体を合成できた。またグアニンのC8位へのアミノ体もHAOSとの反応で得られ、その生成機構がN7-アミノ体を経由することを明らかにした。その他、N-NH2基は官能基であるため、N-CH3基とは異なり、種々の興味ある反応性を示すことも明らかにしてきた。今回は我々の一連の仕事の中で、N-NH2基の塩基性、および環に及ぼす電子的効果、更にはNaNO2処理による脱アミノ化機構について詳しい検討を行なったので報告する。N-NH2基の塩基性はC-NH2基のそれに比べ著しく弱く、N-aminouracilやN-aminothymineはpKa-1.7-0.2であった。また3-アミノ体の方が1-アミノ体より若干強い塩基性を示した。N-aminocytosineではN-NH2基のプロトネーションはジカチオンとなるにも拘らず、pKa値はN-aminouracilとほぼ同じ値を示した。他の部位のpKa値の比較より、N-NH2基は電子吸引的に働いていることが示された。N-aminooyrimidineのUVスペクトルは対応するN-methylpyrimidineのそれと全く同一であり、N-NH2基の芳香環のπ電子に与える電子的摂動はN-CH3基が超共役により芳香環に与える電子的効果と同一であることが分かった。強酸性におけるN-NH3^+体のUVは対応するN-Hのそれと同一であり、プロトネーションにより、もはやN-NH2の寄与は無くなる事が示された。N-aminopyrimidineのN-NH2基はNaNO2処理による瞬時に脱アミノ化されたがN-methylaminoprimidineではN-NHCH3基は脱アミノメチル化されず、安定なニトロン体となった。N-methylaminopyridineではNaNO2処理により脱アミノメチル化が進行し、その機構は、まず脱メチル化が進行し、引き続き脱アミノ化が進行することが明かとなった。その他、3-aminothymidineがhuman T-cell acute lymphoblastoidleukemia cellに対し強い殺細胞性を示すことが明かとなり、N-NH2基の生物に及ぼす効果について興味が持たれた。

強酸性におけるN-NH3^+体のUVは対応するN-Hのそれと同一であり、プロトネーションにより、もはやN-NH2の寄与は無くなる事が示された。N-aminopyrimidineのN-NH2基はNaNO2処理による瞬時に脱アミノ化されたがN-methylaminoprimidineではN-NHCH3基は脱アミノメチル化されず、安定なニトロン体となった。N-methylaminopyridineではNaNO2処理により脱アミノメチル化が進行し、その機構は、まず脱メチル化が進行し、引き続き脱アミノ化が進行することが明かとなった。その他、3-aminothymidineがhuman T-cell acute lymphoblastoidleukemia cellに対し強い殺細胞性を示すことが明かとなり、N-NH2基の生物に及ぼす効果について興味が持たれた。
異種遺伝子産物を高生産する宿主酵母の育成

酵母は異種遺伝子産物を生産させる宿主として優れているが、導入された異種遺伝子の発現が不安定で、遺伝子の発現にともなって生育が抑制される場合が多い。本研究は異種遺伝子産物を安定して生産する宿主酵母を育成する研究に関するものである。本研究では、kluyveromyce marxianus由来のポリガラクチュロナ-ゼ(PG)遺伝子の発現を指標にして、異種遺伝子を高発現する菌株の育成を行い次の結果を得た。1.S.cerevisiae(DKDーKDーH)にK.marxianus由来のPG遺伝子を含むDNA断片を挿入したプラスミドを導入すると宿主はPGを生産した。しかし、その発現は極めて不安定で、その原因の1つが宿主内でPG遺伝子に組換えが起こることにあることを明かにした。2.人工変異によってPG遺伝子を安定に発現する菌株(SSM5ー2)を誘導した。SSM5ー2株は、一種のCDC変異株で、PG遺伝子の組換え能が劣化し、細胞内のプロテア-ゼ活性も低下していた。また、親株に比べて細胞膜のステロ-ルと不飽和脂肪酸の含量が高く、KU法でのプラスミドによる形質転換能が低下していた。3.SSM5ー2株の形質転換法を検討し、細胞をLiClと2ーmercaptoethylamineの存在下で、40°Cで処理してcompetent化することにより、親株と同様に形質転換出来ることを明らかにした。4.SSM5ー2株がPG遺伝子を発現するとG2 arrestを誘発すること、また、これがCa^<2+>によって回復することを見出した。さらに、G2 arrestを誘発すると考えられる遺伝子をPG遺伝子の上流の見出し、その塩基配列を明らかにして分子量約6000のペプチドをコ-ドしているであろうことを明かにした。申請者は、先にKluyveromyces Marxianus(KM菌)のプロトペクチナーゼ(ppase)遺伝子をSaccharomyces cerevisiae DKD-5D-H(SC菌)を宿主としてクローニングした。しかし、SC菌中でのppaseの発現は低く、ppaseの生産は極めて不安定であった。本年度は、ppase遺伝子を高発現する宿主の育成について検討し、次の結果を得た。(1)ppase遺伝子のサブクローン化とSC菌内での安定性:KM菌の染色体よりクローン化したppase遺伝子を含む6kbpのDNA断片を2kbpの断片に縮小した。このDNA断片でもSC菌内では不安定であった。(2)クローン化したppase遺伝子のSC菌内での発現が不安定である原因の検討:ppase遺伝子を挿入したベクターを導入すると、SC菌はppaseを生産するが、細胞はG1アレストを起して生育が抑制される。一方、ppaseを生産しない細胞が急速に出現する。この原因を調べたところ、ppase遺伝子のプロモーターの領域に組換えが起こり、そのためにppase遺伝子が発現しなくなっていることが明らかになった。(3)ppase遺伝子を高発現する菌株の育成:ppase遺伝子の組換えを起こさない菌株を誘導すれば、ppaseを高生産するものと考えた。そこで、SC菌をEthylmethanesulfonateで処理して変異を誘導し、ppaseの生産能が親株の約30倍に高まった変異株(SSM-5)をえた。SSM-5の性質を調べたところ、ppase遺伝子の組換え能が低下した菌株であることが明らかになった。また、SSM-5はSaccharomyces diastaticusのグルコアミラーゼなど、異種遺伝子に由来する分泌タンパク質を高生産する変異株であることも明らかになった。

先年度に、K.marxianusのポリガラクチュロナ-ゼ(PG)遺伝子の発現をモデルにして、異種遺伝子産物を高生産するS.cerevisiaeの変異株SSM5を取得した。本年度は、この菌株から自然変異によって、さらに異種遺伝子産物の生産能のすぐれた変異株SSM5-2を誘導し、その性質および異種遺伝子産物を高生産させるための要因について検討し、次の結果を得た。(1)SSM5-2は、細胞膜中の脂質やステロ-ルの含量が親株と異っていた。また、従来の手法では形質転換であった。そこで、新しい手法について検討し、LiClとでメルカプトエタノ-ルアミンでコンピ-テント化して形質転換する方法を確立した。このことにより、SSM5-2を組換え遺伝子の宿主として利用出来るものになった。(2)SSM5-2は、温度感受性変異株で37°CではG_2期で生育が停止するG_2アレストの状態とることが見出された。また、3°Cでも、PG遺伝子が高発現すると、G_2アレストが誘発されることが見出された。(3)異種遺伝子の発現によって誘発されるG_2アレスは、培地中にCa^<2+>を添加することによって解除されることを見出した。すなわち、Ca^<2+>を10mM以上添加するとG_2アレストは解除され、PGの生産も著しく増加した。Ca^<2+>を100mM添加した場合、生育は抑制されたが、PGの生産は無添加の場合の約30倍に増大した。一般に、ベクタ-に挿入した遺伝子の発現はCa^<2+>の添加によって増大したが、SSM5-2の染色体支配の酵素の生産はむしろ抑制された。このような事実から、ベクタ-に挿入した遺伝子が発現する際には多量のCa^<2+>を必要とし、そのために細胞の増殖は抑制されるものと考えた。現在、Ca^<2+>がpG遺伝子の発現を制御する機構について検討を進めている。本研究では、先にKluyveromyces marxianusのポリガラクチュロナ-ゼ(PG)遺伝子の発現を指標にして、異種遺伝子産物を高生産する酵母(S.cerevisiae SSM5ー2)を育成した。SSM5ー2株は、異種遺伝子が発現すると生育が抑制されることを見出した。本年度は、この生育抑制に検討を加え、次の結果を得た。(1)SSM5ー2株は30°Cで培養すると正常な形態を示したが、37°Cでは細胞は異常増殖し、母細胞から出芽した細胞は分離せず連なった形で伸長した。また、娘細胞には核が形成されないことから、SSM5ー2株はcdc(cell division cycle)変異株で、37°Cで誘発される生育抑制はG2arrestであると考察した。(2)K.marxianus由来のDNA断片(PG遺伝子の上流を含む2KbのDNA断片で、この部分にはPGの構造遺伝子は含まれていない)を挿入したプラスミド(YPP4ー90)を作製し、これで形質転換したSSM5ー2株は、30°Cで培養してもG2arrestを誘発することを見出いだした。このことから、K.marxianusの染色体由来のDNA断片中にGarrestを誘発する機能が存在すると推測した。また、その遺伝子について検討し、分子量約6000のペプチドをコ-ドしているものと推定される結果を得た。
ニューログロビンの細胞死抑制機構の解明と蛋白質工学的改変

ニューログロビン(Ngb)は酸化ストレスに応答しシグナル伝達過程を制御することにより、神経細胞死を防いでいる可能性が高い。本研究では、この仮説を検証することを目的とした。その結果、神経細胞死抑制活性にヒトNgbの「GDP解離抑制蛋白質」としての活性が極めて重要であることを実証した。また、魚のNgbが「細胞膜貫通特性」を持つことを発見し、さらに、蛋白質工学的手法を駆使することにより、培地に加えるだけで細胞内に導入され細胞を保護する新規人工蛋白質の創製にも成功した。最近、脳内に可逆的な酸素結合が可能な蛋白質「ニューログロビン(Ngb)」が報告された。このNgbを過剰に発現させると脳虚血・再潅流に伴う細胞死が減少し、逆に、Ngbの発現量を低下させると細胞死が増加することから、酸化ストレスに伴う細胞死を抑制する働きがNgbにあることが示唆された。しかし、その神経細胞死の抑制メカニズムはまだ明らかになっていない。我々は、以前、酸化ストレスにより生じる酸化型Ngbがシグナル伝達蛋白質であるヘテロ三量体G蛋白質のαサブユニット(Gα)と特異的に結合し、「GDP/GTP交換反応抑制蛋白質(GDI)」として機能することを明らかにした。また、通常の酸素結合型NgbはGαと結合できないことも明らかにした。今回、我々はNgbのGDI活性の重要性について明らかにするために、Ngb変異体をPC12細胞に導入し、酸化ストレス下での細胞死抑制能について検討した。具体的には、GDI活性を持たないヒトのNgb変異体(E53Q, R97Q, E118Q, E151N)、及び、GDI活性を持つヒトNgb変異体(R47A, K102N, K119N, D149A)を精製し、Chariotを用いてそれぞれ細胞内に導入した。そのうえで、まず低酸素環境(1%O2,94%N2,5%CO2)で24時間、続いて通常酸素濃度環境下で24時間培養して酸化ストレスを誘導し、細胞死の割合を解析した。その結果、GDI活性を持つ変異体は全てヒト野生型Ngbと同様に細胞死を大きく抑制した一方、GDI活性を持たない変異体ではいずれも細胞死抑制の程度が著しく低下することが明らかになった。以上の結果はNgbによる細胞死の抑制とGDI活性の間に密接な関係があることを示しており、細胞死の抑制はNgbの持つGDI活性によって細胞内のシグナル伝達を制御することにより引き起こされていると考えられる。近年、神経細胞に特異的に発現し、可逆的に酸素を結合できる「ニューログロビン(Ngb)」が報告された.このNgbを過剰に発現させると虚血・再潅流に伴う細胞死が減少し、逆に発現を抑制すると細胞死が増加することから、酸化ストレスによる細胞死を抑制する働きがNgbにあることが示唆されている.我々は以前、酸化ストレス下で生じる酸化型ヒトNgb(HNgb)がシグナル伝達タンパク質であるヘテロ三量体Gタンパク質のαサブユニット(Gα)と特異的に結合し、「GDP解離抑制タンパク質(GDI)」として機能することを示した.また最近、タンパク質細胞内導入試薬Chariotを用いて、GDI活性のあるHNgbを導入すると細胞死が抑制される一方、GDI活性のないゼブラフィッシュNgb(ZNgb)を導入しても細胞死は殆ど抑制されないことを示した.さらにNgbを構成する4個のモジュール(構造単位)M1M4のうち、ZNgbのモジュールM1とHNgbのモジュールM2M4からなる融合タンパク質であるキメラNgb(CNgb)を作製し、CNgbがGDI活性をもち、Chariot存在下で細胞死を抑制することも明らかにした.今回、驚いたことに、このCNgbがChariotの非存在下でも細胞死を抑制することが明らかとなった.これはCNgbが単独で細胞内に導入されることを示唆している.そこでHNgb,ZNgb,CNgbを各々FITCで蛍光標識し、Chariot非存在下で培地に添加して一定時問培養後、蛍光顕微鏡により観察した。その結果、ZNgbとCNgbが共に細胞外から細胞内に移行する細胞膜貫通特性をもつことが明らかとなった.ZNgbとCNgbはZNgb由来のモジュールM1を共通して含むことから、ZNgbのモジュールM1が細胞膜貫通特性に重要なはたらきをしていることが考えられる.
社会における協調と情報ネットワークの関係についての理論的研究

本年度は、社会の一モデルとしての繰り返しゲームにおける協調の達成可能性について、2つの異なる情報ネットワークのモデルを中心に研究した。以下の2つのプロジェクトについて成果を得た。(1)費用観測モデルの繰り返しゲームにおける一般的なフォーク定理の証明通常の繰り返しゲームのモデルから離れて、各プレーヤーは各期末にコストを払えばその期の他のプレーヤーの行動を誤差なく観測できるようなモデルを構築した。観測費用を払わなかったときも、相手の行動に関する不完全な情報を受け取る可能性を含めているので、このモデルは研究者の関心を近年集めている私的観測モデルの一拡張でもある。このクラスの繰り返しゲームにおいて、ほとんど全てのステージゲームについてフォーク定理が成立することを示した。観測費用のレベルの如何を問わず、しかも無費用で受け取ることができるシグナルの精度の如何を問わず成立する命題ということで、社会における協力の達成やカルテルの形成可能性などに強い含意を持つ成果といえる。(2)不完全(私的)観測の有限回繰り返しゲームにおける協調不可能性命題の特徴付けプレーヤーが他のプレーヤーの行動に関する不完全情報のみを受け取るような有限回繰り返しゲームを考え、そのようなゲームで協調が全く不可能であるための条件、つまり短期的な均衡の繰り返しのみが長期的関係の均衡となるようなケースの特徴付けを試みた。均衡ミニマックスという、純粋戦略均衡や定和ゲーム均衡が満たす性質が、この否定的命題の十分条件と密接に関連することが明らかになった。更に、均衡ミニマックスに似ているがより弱い性質の下では、不可能性命題が成立しないことも示した。以上の分析を通じて、期限付きの組織における協調の可否についての見通しをよくすることができた。本年度は、不完全観測の繰り返しゲームについて、プレーヤーが相手の過去の行動に関する私的情報を受け取るという私的観測のケースを中心に分析を行った。特に、以下のような成果を得た。1.私的観測の一例として、そのままでは相手の行動についての情報を何も得ることができないが、コストを払えば行動を正しく観測できるモデルを考えた。この観測費用モデルは、コストなしで過去が観測できる標準的なモデルとは大いに異なる。というのは、観測費用がある限り、プレーヤーはなるべく相手を観測しないで済ませようとするインセンティブを持つからである。しかしそのようなインセンティブを所与とすれば、均衡からの逸脱はもはや見破られず、結果として協調達成は困難になる。このような環境においても、プレーヤーに観測するインセンティブを与え、結果として様々な行動を均衡として達成できることを証明した。特に、プレーヤーの戦略空間が十分広い場合に、観測費用が小さい限り任意の協調レベルを均衡として近似できるという近似フォーク定理を得た。同時に、このアイデアを有限回繰り返しゲームや、一度の観測で多くの期間の行動がわかるような多期間観測モデルに応用するための準備的分析を蓄積した。2.一般的な不完全(私的)観測の有限回繰り返しゲームを考え、そのようなゲームで協調が全く不可能であるための条件、つまり短期的な均衡の繰り返しのみが長期的関係の均衡となるようなケースの特徴づけを試みた。均衡ミニマックスという、純粋戦略均衡や定和ゲーム均衡が満たす性質が、この否定的命題の十分条件になることが明らかになった。この種のゲームの協調的な均衡の特徴づけはまだ十分には進んでおらず、ゆえに協調的な均衡が存在しないケースを明らかにすれば協調が可能なケースの理解の手がかりになる、と期待している。本年度は、観測費用のある繰り返しゲーム(観測費用モデル)について、集中的に分析した。このモデルでは、プレーヤーは各期にコストを払えば他のプレーヤーの実際の行動を誤差なく観測することができる。観測費用を払わなかったときも、相手の行動に関する不完全な情報を受け取る可能性を含めているので、このモデルは近年研究の対象になっている私的観測モデルの一拡張でもある。主要な結論は以下の通りである。(1)1期間観測モデルにおけるフォーク定理ある期に観測費用を払えば、その期の他のプレーヤーの行動のみが完全観測可能になるケースが、1期間観測モデルである。このとき、任意の観測費用レベルの下で、実行可能な個人合理的利得が全て均衡と整合的になる(つまり、いわゆるフォーク定理が成立する)ための条件を考察した。かなり一般的なクラスのゲームについて、フォーク定理の成立を証明することができたが、それ以外のケースについてはフォーク定理の可否を明確に判定することはできなかった。違うアイデアの構築を用いることで、一般的なステージゲームをカバーするような結論を出せるかどうかについて、現在検討中である。(2)多期間観測モデルにおける一般的なフォーク定理ある期に観測費用を払えば、その期を含む過去数期の他のプレーヤーの行動が完全観測可能になるケースが、多期間観測モデルである。このケースでは1期間観測モデルとは異なり、任意のステージゲームおよび任意の観測費用レベルの下で、フォーク定理の成立が証明できた。比較的簡明な構築のアイデアで、全てのケースを統一的にカバーできており、この結果は私的観測下での人々の協調や寡占企業の結託の可能性などについて強い含意を持つといえる。

このクラスの繰り返しゲームにおいて、ほとんど全てのステージゲームについてフォーク定理が成立することを示した。観測費用のレベルの如何を問わず、しかも無費用で受け取ることができるシグナルの精度の如何を問わず成立する命題ということで、社会における協力の達成やカルテルの形成可能性などに強い含意を持つ成果といえる。(2)不完全(私的)観測の有限回繰り返しゲームにおける協調不可能性命題の特徴付けプレーヤーが他のプレーヤーの行動に関する不完全情報のみを受け取るような有限回繰り返しゲームを考え、そのようなゲームで協調が全く不可能であるための条件、つまり短期的な均衡の繰り返しのみが長期的関係の均衡となるようなケースの特徴付けを試みた。均衡ミニマックスという、純粋戦略均衡や定和ゲーム均衡が満たす性質が、この否定的命題の十分条件と密接に関連することが明らかになった。更に、均衡ミニマックスに似ているがより弱い性質の下では、不可能性命題が成立しないことも示した。以上の分析を通じて、期限付きの組織における協調の可否についての見通しをよくすることができた。