hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物の成長制御に関わる生理活性物質の構造と機能解明

前年度までの研究にて、細胞接着促進化合物アドヘサミンの作用機構について調べ、その応用可能性について検討した。本年度はさらに、この化合物を利用して、人工フィブロネクチンの設計を試みた。アドヘサミンは細胞表面の糖鎖の一つであるヘパラン硫酸に結合して、細胞接着促進活性および細胞増殖促進活性を発現する。一方で、生体由来の細胞接着促進タンパク質、フィブロネクチンは細胞表面にある接着タンパク質であるインテグリンとヘパラン硫酸両方に結合して、細胞の接着および増殖を促進する。アドヘサミンにインテグリン結合モチーフを結合させれば、人工フィブロネクチン模倣体が作製できるはずである。幸いにもアルギニンーグリシンーアスパラギン酸ーセリン(RGDS)というテトラペプチドがフィブロネクチン内のインテグリン結合モチーフとして同定されている。そこで、もしアドヘサミンにこのテトラペプチドを結合させれば、細胞接着促進活性や細胞増殖促進活性の向上が期待される。予想された通り、合成した人工フィブロネクチンはオリジナルのアドヘサミンの100分の1の濃度で、アドヘサミンと同等の生物活性を発現することが分かった。さらにインテグリンおよびヘパラン硫酸に対する抗体を用いた実験から、この人工フィブロネクチンは天然のフィブロネクチン同様、インテグリンとヘパラン硫酸のクラスタリングを引き起こして、細胞外シグナル調節キナーゼや接着斑キナーゼのリン酸化といった下流シグナルの活性化を通じて、生物活性を発現していることが明らかになった。哺乳類細胞の表現系の変化を指標として化合物ライブラリーのスクリーニングを行った。その結果、HepG2細胞を用いたスクリーニングにてプレート底面への接着を促進する化合物を見つけた。本化合物の添加によって付着性細胞であるHepG2細胞のみならず、浮遊細胞であるJurkat細胞をもプレート底面に接着させることができると分かった。本化合物の蛍光プローブ化体の顕微鏡観察の結果と化合物の化学的性質を併せて考え、標的分子をグリコサミノグリカンであると推測した。これを確認するため、各種グリコサミノグリカンを用いて競合試験を行ったところ、化合物の活性はグリコサミノグリカンのうち、ヘパリン・ヘパラン硫酸・ケラタン硫酸によって競合的に阻害されることが明らかになった。また等温滴定カロリメトリーによって化合物とヘパリン・ヘパラン硫酸・ケラタン硫酸との結合を確認し、両分子の結合定数・化学量論比を算出した。これらの結果より、本化合物は細胞表面の特定の糖鎖に結合し、細胞接着促進活性を発現しているものと考えられ、細胞表面糖鎖の定量や機能解析さらに培養細胞のプレートへの接着の機構解明のツールとして利用できる可能性がある。また天然の植物抽出液より生物活性物質の探索研究を行った。その結果、植物成長を抑制する新規ポリアセチレン化合物を見つけた。本化合物は植物の成長制御に関わる重要なホルモンの一種であるインドール酢酸と特定の高等植物にのみ含まれる二次代謝産物であるポリアセチレンのエステル結合体であった。このような化学構造は天然物においても合成品においても未だ報告されておらず、特定の植物のインドール酢酸の代謝経路における重要な中間体である可能性がある。さらに本化合物の植物成長抑制活性は種特異的であり、選択的な植物成長制御剤として利用できる可能性がある。前年度、化合物ライブラリーのスクリーニングから見出した細胞接着促進化合物アドヘサミンの活性発現機構および応用利用の可能性探索に関してさらに研究を進めた。具体的にはヘパラン硫酸分解酵素にて細胞表面のヘパラン硫酸を選択的に除去することでアドヘサミンの細胞接着促進作用が阻害されることを示した。さらにヘパラン硫酸の欠損した変異細胞株を用いた実験も行い、アドヘサミンの細胞接着促進活性は細胞表面のヘパラン硫酸を介して誘導されることを示した。またアドヘサミンによって誘導される細胞接着が生理的なものか非生理的なものかを細胞骨格の形態や細胞骨格重合阻害剤等によって調べた。その結果、アドヘサミンはフィブロネクチンなどの細胞外マトリックス同様、細胞内のシグナル伝達系の活性化を伴う生理的な接着を誘導することが分かった。これは既存の合成試薬であるポリリジンが単に静電的相互作用でプレート表面への細胞接着を促すのとは対照的である。一方、アドヘサミンの応用として細胞へのマイクロインジェクション用試薬としての利用価値を調べた。その結果、アドヘサミンを利用することで、既存の細胞培養用試薬では不可能であった浮遊細胞へのマイクロインジェクションが可能となることが分かった。他方、植物の光屈性制御の候補物質とされる天然の生理活性物質、4-メチルチオー3-ブテニルグルコシノレート(4-MTBG)の合成研究も行い、本化合物の全合成にはじめて成功した。その結果、4-MTBGを化学的に標識するために必要となる誘導体のいくつかを合成することができた。

幸いにもアルギニンーグリシンーアスパラギン酸ーセリン(RGDS)というテトラペプチドがフィブロネクチン内のインテグリン結合モチーフとして同定されている。そこで、もしアドヘサミンにこのテトラペプチドを結合させれば、細胞接着促進活性や細胞増殖促進活性の向上が期待される。予想された通り、合成した人工フィブロネクチンはオリジナルのアドヘサミンの100分の1の濃度で、アドヘサミンと同等の生物活性を発現することが分かった。さらにインテグリンおよびヘパラン硫酸に対する抗体を用いた実験から、この人工フィブロネクチンは天然のフィブロネクチン同様、インテグリンとヘパラン硫酸のクラスタリングを引き起こして、細胞外シグナル調節キナーゼや接着斑キナーゼのリン酸化といった下流シグナルの活性化を通じて、生物活性を発現していることが明らかになった。
キメラ後代で得られたオグラ型細胞質雄性不稔ミトコンドリアゲノムの構造と機能解析

以下の成果が得られ、新たな細胞質雄性不稔制御の可能性を示した.1.雄性不稔ゲノム種のミトコンドリア構造であるorf138およびその周辺にある構造を含めた3分子種の特徴をあきらかにした。これら成果は.国内外の学期で発表され、論文として一部公表されている。2.ミトコンドリアの誘導メカニズムに関して、すでにゲノム間の組換えで生じたのではなく、すでに分化過程で存在していた異種分子種の存在としに量的変動調節変異である点を明らかにし、公表した.3.このミトコンドリアゲノムの量的変動によるゲノム種の変動と雄性不稔発現はキメラ合成だけで起こるのではなく、細胞融合によっても起こることを比較研究から明らかにした.4.この過程で、オグラ型、あるいはオグラ類似の雄性不稔ゲノムに塩基配列多型やマイナーな構造変異が存在することや従ってそれらをあたらな雄性不稔誘導のソースにし得ることを示し、新たな雄性不稔誘導メカニズムの存在する可能性を示した.5.これまで、細胞質雄性不稔がミトコンドリアゲノム構造に寄ること示してきたが、一方で良く知られているクロローシスの発現は葉緑体ゲノム構造と関係があることを示唆し,細胞質ゲノムの全体的な解析とメカニズムや制御の理解が必要なことを明らかにした.6.以上を頼詳細に明らかにするためには、B.rapaにもB.oleraceaにもないオグラあるいは類似の細胞質雄性不稔型細胞質の回復系の導入が必要であり,そのための材料や系の確立が求められる.以下の成果が得られ、新たな細胞質雄性不稔制御の可能性を示した.1.雄性不稔ゲノム種のミトコンドリア構造であるorf138およびその周辺にある構造を含めた3分子種の特徴をあきらかにした。2.ミトコンドリアの誘導メカニズムに関して、すでにゲノム間の組換えで生じたのではなく、すでに分化過程で存在していた異種分子種の存在としに量的変動調節変異である点を明らかにし、公表した.3.このミトコンドリアゲノムの量的変動によるゲノム種の変動と雄性不稔発現はキメラ合成だけで起こるのではなく、細胞融合によっても起こることを比較研究から明らかにした.4.この過程で、オグラ型、あるいはオグラ類似の雄性不稔ゲノムに塩基配列多型やマイナーな構造変異が存在することや従ってそれらをあたらな雄性不稔誘導のソースにし得ることを示し、新たな雄性不稔誘導メカニズムの存在する可能性を示した.5.これまで、細胞質雄性不稔がミトコンドリアゲノム構造に寄ること示してきたが、一方で良く知られているクロローシスの発現は葉緑体ゲノム構造と関係があることを示唆し,細胞質ゲノムの全体的な解析とメカニズムや制御の理解が必要なことを明らかにした.6.以上を頼詳細に明らかにするためには、B.rapaにもB.oleraceaにもないオグラあるいは類似の細胞質雄性不稔型細胞質の回復系の導入が必要であり,そのための材料や系の確立が求められる.実験計画に従い、キメラ後代で認められた細胞質雄性不稔のゲノム構造およびその回復系統の探索と制御メカニズムについて研究を行なってきた。この間、半田等により西洋ナタネのミトコンドリアゲノム構造(221,853bp)が明らかにされ、従来のイネ、タバコ、アラビドプシスおよび西洋ナタネを参考にすることができた。これまでのPCRやRFLPのデータよりこの新しいオグラ型類似のCMSは3つのヘテロゲノム分子を持つことがわかったので、オグラ型指標遺伝子であるorf138PCR断片のPCRより得て、それらのより上流および下流へ伸張させ、こら等3つのゲノム分子の構造や特性を明らかにする実験を進めた。CMSの主ゲノムはtrnfM-orf138-、サブゲノムは約1000分の1コピーで存在し、構成と順序はこの通りで、主ゲノムでは3つの遺伝子が1,828bpの大きさで存在し、CMSダイコンと極めて高いホモロジーを示す(99.1%,ナタネとは98.7%)こともわかった。ただし、ナタネではさらに上流のatpAとは10万bpも離れているが、雄性不稔ゲノムではこないだはかなり近く、この2つは近くにあり、この周辺でナタネゲノムに組換えが起こっているものと推定された。現在さらにゲノム構造について、伸張やlong PCRナタネからの相同性と構造の解析などを続けている。本雄性不稔ゲノムは少なくともオグラに似ているが、それとも異なり、新しい安定したCMSといえる。従って、できるだけ早く、この3構造、機能を解析したい。これと平行して、オグラ型CMSの起源に関わるアブラナ科での根拠を見いだすために、orf138の遺伝子探索を行った。その結果、いくつか種で同一配列ないしは塩基置換のある系統を広く見いだすことができた。このことより、オグラ型細胞質はかなり広く分化し、幾つかの種に潜在しているものと思われる。それが、ソースとなり、未知の刺激や制御の影響を受け、発現したものと思われる。このことは、細胞融合で見いだされたキャベツのCMSゲノムでもほとんど同じ結果を得ているので、この制御変異メカニズムは共通であると思われる。それだけに、育種におけるメカニズム解明と利用が望まれる。さらの、ミトコンドリアと平行して調べている葉緑体ゲノム解析の結果も、ミトコンドリアときわめて一致した結果をえており、オルガネラの制御に向け、メカニズム解明と利用の両側面から重要な内容を持っている。

これらの結果は、一部発表され、今後の論文や国際学会での発表として行う予定である。1.雄性不稔ゲノム種の構造、orf138を中心とするミトコンドリアゲノム分子種の塩基配列決定し,3種がダイコンCMSと極めて類似していることを確認した.2.葉緑体のイネクローンにもとづく20K領域の塩基は配列の決定と解析を行う。さらに、その中で見いだされている、二種の異なる分子種の確定を行い。葉緑体のヘテロプラズミーの存在を確認した。さらに、他の領域の構造決定と塩基列決定を進めている。これらはミトコンドリアの存在様式と極めて一致している.3.ヘテロプラズミーの存在はミトコンドリアで既に示したが、アブラナ科の野生種を含む多くの種や品種でorf138の分化をさらに明らかにし、その存在と、塩基配列多型なども見られているので、ヘテロプラズミーの分子的,分化的基礎も見いだした。さらに、この間明らかにしてきた葉緑体のMATK(マチュウレースK)遺伝子などを指標として葉緑体でもアブラナ科の中で分化多様性が起こっていることを示しつつある.4.なお、可能なら秋以降再度メカニズムの一つの可能性となる回復系はかなり多数の系統を調べたが,B.rapaおよびB.oleraceaにおける回復系はみられなかった.これと平行して、メカニズム解析のため、ダイコン品種コメットと雄性不稔コマツとの雑種に戻し交雑を行い、回復系遺伝子を戻し交雑により導入を試みている。5.この間,これらの新知見に関して,いくつかの発表を国内外で行った.以下の成果が得られ、新たな細胞質雄性不稔制御の可能性を示した.1.雄性不稔ゲノム種のミトコンドリア構造であるorf138およびその周辺にある構造を含めた3分子種の特徴をあきらかにした。これら成果は.国内外の学期で発表され、論文として一部公表されている。2.ミトコンドリアの誘導メカニズムに関して、すでにゲノム間の組換えで生じたのではなく、すでに文化過程で存在していた異種分子種の存在としに量的変動調節変異である点を明らかにし、公表した.3.このミトコンドリアゲノムの量的変動によるゲノム種の変動と雄性不稔発現はキメラ合成だけで起こるのではなく、細胞融合によっても起こることを比較研究から明らかにした.4.この過程で、オグラ型、あるいはオグラ類似の雄性不稔ゲノムに塩基配列多型やマイナーな構造変異が存在することや従ってそれらをあたらな雄性不稔誘導のソウースにし得ることを示し、新たな雄性不稔誘導メカニズムの存在する可能性を示した.5.これまで、細胞質雄性不稔がミトコンドリアゲノム構造に寄ること示してきたが、一方で良く知られているクロローシスの発現は葉緑体ゲノム構造と関係があることを示唆し,細胞質ゲノムの全体的な解析とメカニズムや制御の理解が必要なことを明らかにした.6.以上を頼詳細に明らかにするためには、B.rapaにもB.oleraceaにもないオグラあるいは類似の細胞質雄性不稔型細胞質の回復系の導入が必要であり,そのための材料や系の確立が求められる.
人工格子堆積式スパッタ法による強磁性ホイスラ合金膜の磁気光学特性向上に関する研究

C1b型結晶構造を持つPtMnSbホイスラ合金は極めて大きな磁気光学力ー回転角θkを示すことで有名であり、その磁気特性は理論上の興味を持たれているのみならず、これをうまく薄膜化できればそれらは高性能の光磁気記録媒体として非常に有望である。最近、スパッタリングや真空蒸着によって大きなθkを持つPtMnSb薄膜の作製に関する研究がいくつか実施された。しかしながら、それらは未だ光磁気記録媒体のような実際上の応用に供しうるほどの十分な垂直磁気異方性を持っていなかった。他方、満足できるほどの垂直磁気異方性を実現できるかどうかの可能性を検討する研究もここ数年精力的に行われた。例えば、多層膜において強磁性層と非磁性層の界面近傍の数原子層において識別できるほどの垂直磁気異方性が誘起されることを見い出した。そこで、本研究ではさらに、プラズマフリー対向ターゲット式スパッタ装置を用いて、Pt層とMnSb層から成り顕著な垂直磁気異方性を持つPt/MnSb多層膜の作製が試みられ、それらの結晶学的および磁気的特性が系統的かつ詳細に調べられた。特に、温度200°Cのスライドガラス基板上にPt層とMnSb層を交互に堆積しながら大きな磁気光学力ー回転角θkを持つ膜の垂直磁気異方性については詳しく研究した。それらの飽和磁化Msおよび保磁力HcはPt+MnSbの2層分厚さに対するPt層厚の比に強く依存した。熱処理膜のMsはバルクと同じ550emu/ccの最大値を示した。真空中400°Cで150分間熱処理した膜のあるものは十分に大きな垂直磁気異方性を示した。例えば、厚さ約13AのPt層と厚さ50AのMnSb層で構成された厚さ2000AのPt/MnSb多層膜は4×10^5erg/cc程度の大きな垂直磁気異方性を持ち、新しい大出力信号が得られる光磁気記録媒体として有望であることが確かめられた。PtMnSbホイスラー合金はC1bの結晶構造を持ち,現在知られている材料の中でも最大のカー回転角を有するものである.この巨大なKerr回転角を利用すれば, S/N比の良好な光磁気記録媒体を作成することができる.我々はこの材料の薄膜化と垂直磁気異方性を誘起させることを目的として実験を行った.まず対向ターゲート式スパッタ装置においてMnターゲット上にSbチップ, Ptチップを配置した複合ターゲット構造とし膜を堆積した.この場合,膜中結晶子の配向面は基板温度が100°Cから400°Cに上昇するにしたがい, (111)→(220)→(111)→(111)+(400)と複雑に変化するが,基板温度200°C,膜堆積速度250PtMnSbの組成を持つホイスラー合金は現在までに報告された光磁気材料の中で最大の力ー回転角を持つので、高いS/N比を示す書き込み、消去繰返し可能な光記録媒体への応用が強く要望さている。我々はこの2年間でこの材料の薄膜化と膜面垂直磁気異方性を達成することを目的として作成、解析、評価、応用にわたって系統的な研究を行なった。

前年度は、MnSb層50A、Pt層12、5Aで作成した人工格子膜を適温で熱処理することにより、均質膜では誘起不可能な垂直磁気異方性が出現し、しかもCIB相結晶子の(111)面が配向した膜を形成することが出来た。本年度は前の成果を与えたスパッタ装置において更にプラズマ拘束性に優れた磁界発生装置に画期的な改良を加え、基板および成長しつつある膜の表面を完全プラズマフリーによることによって数原子層(310A)の交互堆積を可能にした。このようにして作製されたPtとMnSbの超薄層の多重膜を試料として電子顕微鏡による切断面の観察、X線小角散乱による人工格子の長周期構造の解析を行ないながら、作製条件と積層構造の関連性を系統的に調べ、きわめて薄い層を堆積しても界面の乱れがなく十分な周期構造が形成できることを明らかにした。また磁力計による飽和磁化、保磁力、トルクメータによる垂直磁気異方性定数、マイクロ・カー効果測定装置よる微小領域力ー回転角の測定を行ないながら、それらが最大となる最適作製条件を明らかにした。これらの結果をふまえ、規格寸法(3.5、14インチ径)の光磁気ディスクを作製して実用特性を評価したところノイズレベルに問題が残るものの十分大きな出力が得られ、本方式のスパッタ法によりPtとMnSbの超薄膜を交互堆積した人工格子形多層膜は光磁気記録媒体として十分実用に供しうる可能性を有していることが確認された。
頑健なネットワークの設計に向けた組合せ最適化理論の研究

本年度の主要な成果の1つは,最小スパナー問題と呼ばれる,与えられたネットワークから距離を近似的に保ちつつ辺を減らす問題についてのものである.より正確には,指定された正整数tに対してどの2点間の距離も元の距離の高々t倍にしかならない,という制約の下でできる限り多くの辺を取り除く問題が最小スパナー問題である.この問題は様々なアルゴリズムの前処理として重要であるだけでなく,現在の規模のネットワークが維持できないときにどのようにネットワークを縮小するかをモデル化しているという意味でも重要である.この問題は一般にはNP困難であることが古くから知られていたが,平面グラフ上の問題の複雑度に関しては部分的な結果のみしか知られていなかった.本研究では,平面グラフ上の最小スパナー問題の計算複雑度をすべて明らかにし,非自明なケースではすべてNP困難であることを示した.また,一般グラフ上の最小スパナー問題に対して,取り除く辺数をパラメータとして固定パラメータアルゴリズムを提案した.これは,取り除く辺数が少ないときには提案アルゴリズムが効率的に動くことを意味している.また,2点素パス問題の拡張に対する効率的アルゴリズムを提案した.点素パス問題とは,グラフ上で指定されたいくつかの頂点対を互いに頂点を共有しないパスで繋ぐ問題であり,交通網やVLSIのモデル化を動機として理論・応用の両面から盛んに研究されている問題である.本研究では,選ぶパスに長さの制約を課した点素最短パス問題を扱い,ある種の問題に対する多項式時間アルゴリズムを与えている.また,点素パス問題の拡張である多品種流問題に対しても,近似アルゴリズムを与えている.その他に,電力供給をモデル化した最大供給率問題に対する効率的なアルゴリズムの提案も行った.最小スパナー問題に対して,長らく未解決であった計算複雑度を解明したことは重要な成果であるといえる.それ以外にも,最短点素パス問題,多品種流問題,最大供給率問題など,実社会の問題のモデル化として現れる様々な最適化問題に対してアルゴリズムの設計および解析に成功しており,研究課題はおおむね順調に進展していると判断する.特に,多品種流問題を扱った論文"All-or-nothing multicommodity flow problem with bounded fractionality in planar graphs"は,アルゴリズム設計のトップジャーナルであるSIAM Journal on Computingに採録されており,その評価の高さを示している.ネットワークの頑健性をモデル化することで生じる様々な組合せ最適化問題に対してアルゴリズム設計を行う.特に,最小スパナー問題に関連しより現実に即しているモデルとして,得られたネットワーク上での距離と元の距離との差に制約を加えた下でできる限り多くの辺を取り除く問題である加法的最小スパナー問題を扱う.また,2017年度に会議録として出版された成果である重み付き線形マトロイドパリティ問題について,引き続きアルゴリズムの研究を深め,各種問題への応用を探る.本年度の研究成果である"Covering Intersecting Bi-set Families under Matroid Constraints"では,有向木詰込み問題の拡張に関する結果を与えている.有向全域木は,根から各頂点へ向かう方向に枝を向き付けした全域木であり,1点から各頂点への情報の伝搬経路や,各地点から避難所への経路などの数学的なモデル化にあたる.有向グラフで表されたネットワークにおいて情報の伝搬経路や避難所への経路を設計する際に,ネットワークがどのくらい頑健かを表す指標として,複数の有向全域木を辺を共有しないように詰め込む問題が自然に考えられる.この有向木詰込み問題に対しては,1970年代にEdmondsによって,互いに辺を共有しない有向木の最大個数がある種の最小カット値と等しいことが示されており,最大数を効率的に計算するアルゴリズムも与えられている.この最大最小定理は組合せ最適化における古典的かつ重要な結果であり,近年では様々な拡張が研究されている.我々の成果はこれらの問題の更なる拡張に対するものであり,本研究成果は離散数学の代表的な論文誌であるSIAM Journal on Discrete Mathematicsに採択されている.論文"An improved approximation algorithm for the edge-disjoint pathsproblem with congestion two"においては辺素パス問題の亜種に対する近似アルゴリズムを与えている.扱っている問題はネットワーク中にパスを詰め込む問題であり,これはネットワークの頑健性を評価していることに相当する.本研究ではこの問題に対して既存の近似比を改良する結果を与えている.有向木の詰込み問題は組合せ最適化における古典的かつ重要な問題である.本研究では,1970年代のEdmondsの最大最小定理から始まる一連の定理すべてを一般化する最大最小定理を与えており,この分野における重要な貢献であると考えられる.ネットワークの頑健性のモデル化として解釈できる有向木詰込み問題の理論を発展させていることから,本研究課題はおおむね順調に進展していると言える.本年度の主要な研究成果である"A weightedlinear matroid parity algorithm"では,重み付き線形マトロイドパリティ問題と呼ばれる組合せ最適化問題に対して初めての多項式時間アルゴリズムを与えている.線形マトロイドパリティ問題は,マッチング問題と線形マトロイド交叉問題の共通の一般化として提案された問題であり,1970年代にLovaszによって多項式時間アルゴリズムが与えられた.マッチング問題やマトロイド交叉問題については,各要素に「重み」の付いた問題に対しても多項式時間アルゴリズムが知られていることから,重み付きの線形マトロイドパリティ問題に対しても同様に多項式時間アルゴリズムが存在するのではないかと長い間予想されていた.本成果は30年以上未解決だったこの問題を肯定的に解決するものである.本成果は多項式時間で解ける問題の限界を推し進めるものであり,ネットワーク上の最適化問題を含む様々な組合せ最適化問題に対する多項式時間アルゴリズムの設計に繋がり得るものである.

この成果は,国際的に高く評価されており,理論計算機科学のトップ会議であるSTOCでBest Paper Awardを受賞している.また,"Tight approximability of the server allocationproblem for real-time applications"と"Complexity of the multi-service center problem"ではそれぞれある条件下で最適な施設配置を求める問題を扱っており,アルゴリズムの提案と問題の困難性の証明を行っている.これらの問題は,実問題のモデル化として生じた問題であるため,ある種の施設配置を決定する際の基礎となる成果であると考えられる.30年以上未解決であった重み付き線形マトロイドパリティ問題に対する多項式時間アルゴリズムを与えたことは紛れもなく重要な成果である.本成果は多項式時間で解ける問題の限界を推し進めるものであると同時に,ネットワーク上の最適化問題を含む様々な組合せ最適化問題に対する多項式時間アルゴリズムの設計に繋がり得るものである.また,サーバーの最適配置を求める問題に対する近似アルゴリズムの設計や,有向点素最短パス問題に対するアルゴリズム,複数種類の施設配置問題に対するアルゴリズムなど,その他の組合せ最適化問題に対する成果も複数得られており,本研究課題は順調に進展していると判断する.本年度の主要な成果の1つは,最小スパナー問題と呼ばれる,与えられたネットワークから距離を近似的に保ちつつ辺を減らす問題についてのものである.より正確には,指定された正整数tに対してどの2点間の距離も元の距離の高々t倍にしかならない,という制約の下でできる限り多くの辺を取り除く問題が最小スパナー問題である.この問題は様々なアルゴリズムの前処理として重要であるだけでなく,現在の規模のネットワークが維持できないときにどのようにネットワークを縮小するかをモデル化しているという意味でも重要である.この問題は一般にはNP困難であることが古くから知られていたが,平面グラフ上の問題の複雑度に関しては部分的な結果のみしか知られていなかった.本研究では,平面グラフ上の最小スパナー問題の計算複雑度をすべて明らかにし,非自明なケースではすべてNP困難であることを示した.また,一般グラフ上の最小スパナー問題に対して,取り除く辺数をパラメータとして固定パラメータアルゴリズムを提案した.
洞房結節ペースメーカー細胞における全身麻酔薬による不整脈発生機序解明に関する研究

全身麻酔薬による不整脈発生機序として,活動電位の持続時間延長が指摘されている。この活動電位の延長は,主としてHERG(Human Ether-a-go-go Related Gene)チャネルの抑制による再分極相の遷延によるものと考えられている。本研究において、モルモット単離心房筋を用い吸入麻酔薬であるセボフルラン,および静脈麻酔薬であるプロポフォールについて心電図変化、遅延整流性カリウム電流に対する影響、およびHERGチャネル電流に及ぼす影響について検討を行った。モルモットによる心電図解析において,セボフルランは臨床使用濃度においてQT時間の延長を来した。この変化は濃度依存性であり,また投与中止により速やかに回復した。一方,プロポフォールは臨床使用濃度においてQT時間に変化を来さなかった。遅延整流性カリウム電流に対してはセボフルランはプロポフォールと比較してより強い抑制を示した。さらに,HERGチャネルに対するこれら全身麻酔薬の影響を検討するために,アフリカツメガエルの卵母細胞を用い,HERGチャネルのcRNAを注入し発現させた後,whole-cell voltage clamp法によりチャネル電流を測定した。その結果,セボフルランは細胞膜脱分極時に発生するHERGチャネル電流に対しては高濃度においてのみ抑制したが,再分極時のtail currentに対しては低濃度時より大きな抑制が見られた。一方,プロポフォールは,高濃度においてのみ双方の電流を抑制したが,再分極時に抑制が大きくなることはなかった。これらの結果から,セボフルランはHERGチャネルが不活性になっている時に主として作用することが示唆され,これにより活動電位の再分極相,ペースメーカーに影響を及ぼすものと考えられた。全身麻酔薬の心電図における効果を観察するために、モルモットを用い、全身麻酔薬であるセボフルランおよびプロポフオール投与下にて主にQT間隔の変化について観察した。セボフルランは気化濃度14%の範囲において、濃度依存性にQT間隔を延長させた。この延長効果は、セボフルランの投与を中止することで速やかに回復した。一方、プロポフォールは0.22mg/Kgの単回投与においてはQT間隔に影響を及ぼさなかった。したがって、セボフルランによるQT間隔延長が、不整脈発生において何らかの役割を果たしているものと推察された。また、アフリカツメガエル卵母細胞にQT延長の原因と考えられるHERG(Human Ether-a-go-go Related Gene)チャネルのcRNAを注入することでこのチャネルを発現させ、膜電位固定法によりHERGチャネル電流を測定し、これら全身麻酔薬(セボフルラン・プロポフォール)の影響について検討した。その結果、セボフルラン適用下においてHERGチャネル電流が抑制されることを観察した。この抑制は、定常状態(steady state)での電流においてより、細分極時のTail電流において、より強い抑制効果が確認された。一方、プロポフォールにおいては臨床使用濃度の範囲内においてはこのような抑制効果は確認することはできなかった。したがって、全身麻酔薬による不整脈の発生に関して、HERGチャネルが何らかの役割を果たしているものと考えられた。全身麻酔薬による不整脈発生機序として、活動電位の持続時間延長が指摘されている。この活動電位の延長は、主としてHERG(Human Ether-a-go-go Related Gene)チャネルの抑制による再分極相の遷延によるものと考えられている。本研究において今年度は、モルモット単離心房筋を用い吸入麻酔薬であるセボフルラン、および静脈麻酔薬であるプロポフォールについてHERGチャネル電流に及ぼす影響について検討を行った。方法は、1:モルモット(200-250g)よりペントバルビタール麻酔下にて心臓を摘出し、大動脈よりカニューレを留置し酵素(コラゲナーゼ、トリプシン)を灌流させ、単離心房筋細胞を作成し、2:Whole-cell voltage clamp法を用い細胞に脱分極パルスを加えることにより電流を記録した。HERGチャネル電流は特異的阻害薬であるE-4031にて分離した。

3:セボフルランは灌流液にバブリングすることで溶解させ、プロポフォールはDMSO(Dimethyl Sulfoxide)に溶解させ適用した。結果として、1:HERGチャネル電流はセボフルランにより抑制されたが、2:臨床使用濃度のプロポフォールでの抑制は非常に小さかったことが分かった。心房筋は心室筋に比べて、HERGチャネルの発現が多いことが知られており、ペースメーカー細胞においても同様の機序により、全身麻酔薬により影響を受ける可能性が示唆された。全身麻酔薬による不整脈発生機序として,活動電位の持続時間延長が指摘されている。この活動電位の延長は,主としてHERG(Human Ether-a-go-go Related Gene)チャネルの抑制による再分極相の遷延によるものと考えられている。本研究において今年度は、モルモット単離心房筋を用い吸入麻酔薬であるセボフルラン,および静脈麻酔薬であるプロポフォールについてHERGチャネル電流に及ぼす影響について検討を行った。モルモットによる心電図解析において,セボフルランは臨床使用濃度においてQT時間の延長を来した。この変化は濃度依存性であり,また投与中止により速やかに回復した。一方,プロポフォールは臨床使用濃度においてQT時間に変化を来さなかった。さらに,HERGチャネルに対するこれら全身麻酔薬の影響を検討するために,アフリカツメガエルの卵母細胞を用い,HERGチャネルのcRNAを注入し発現させた後,whole-cell voltage clamp法によりチャネル電流を測定した。その結果,セボフルランは細胞膜脱分極時に発生するHERGチャネル電流に対しては高濃度においてのみ抑制したが,再分極時のtail currentに対しては低濃度時より大きな抑制が見られた。一方,プロポフォールは,高濃度においてのみ双方の電流を抑制したが,再分極時に抑制が大きくなることはなかった。これらの結果から,セボフルランはHERGチャネルが不活性になっている時に主として作用することが示唆され,これにより活動電位の再分極相,ペースメーカーに影響を及ぼすものと考えられた。
植物葉緑体のマグネシウムイオン膜輸送チャネルファミリータンパク質の分子機能解析

シロイヌナズナのMg2+膜輸送を担うと考えられるタンパク質AtMRS2-1、10および11を大腸菌で発現し、界面活性剤を用いて単一に精製し、人工脂質二重層膜に組込んだ。リポソームに再構成したAtMRS2-10は、Mg2+をリポソーム内に輸送し、その輸送は、Co2+、Ni2+、Al3+によって阻害された。AtMRS2-1および11によるMg2+輸送も、リポソーム再構成系で、世界ではじめて観察された。シロイヌナズナArabidopsis thaliana由来のCorAファミリータンパク質AtMRS2-1および11を大腸菌で発現し、精製した。AtMRS2-11は、大腸菌での発現量が低く、今後、分子シャペロン過剰発現大腸菌の使用等による、高発現系の開発が課題となる。2 Mg^<2+>膜輸送タンパク質活性測定システムの構築Recombinantタンパク質をリポソームに組み込み、外液にMg^<2+>を加えて一定時間インキュベーションしたのち、リポソーム内のMg含量を原子吸光分析法を用いて、また、遊離Mg^<2+>濃度を蛍光指示薬mag-fura-2を用いて測定した。リポソームに再構成したAtMRS2-10を用いて、Mg^<2+>膜輸送活性測定系を確立した。これにより、AtMRS2-10によるMg^<2+>の輸送反応は20秒以内に平衡に達し、また、AtMRS2-10によるMg^<2+>の輸送反応はAl^<3+>によって強く阻害されることを見出した。3 Mg^<2+>要求性大腸菌Mg^<2+>膜輸送タンパク質遺伝子多重変異株の作成corA、mgtA、yhiDの三つの遺伝子を欠失させたMg^<2+>要求性の大腸菌多重変異株を作成した。この変異株の生育には、外液に100mM Mg^<2+>が必要であり、今後、この三重変異大腸菌株は、植物のMg^<2+>膜輸送タンパク質を発現させることにより、膜輸送活性解析ツールとして活用することが期待できる。シロイヌナズナArabidopsis thaliana由来のCorAファミリータンパク質AtMRS2-1、10および11を大腸菌で発現、精製し、以下の解析を行った。1 AtMRS2-10のキャラクタリゼーションAtMRS2-10を組み込んだプロテオリポソーム内のMg^<2+>含量を、原子吸光分析法を用いて測定した。AtMRS2-10は、外液Mg^<2+>濃度に依存してリボソーム内にMg^<2+>を取り込んだが、その取り込みは、pH5-9の範囲では外液のpHに依存しなかった。Mg^<2+>の取り込みは、外液のCo^<2+>、Ni^<2+>、Al^<3+>によって阻害され、AtMRS2-10は、これらの金属イオンを輸送する可能性が示唆された。2 AtMRS2-10部位特異的変異体の機能解析CorAファミリータンパク質に保存されている共通配列GMNモチーフのMet残基をIle残基に置換したM400I置換体では、Mg^<2+>の取り込み活性は、大きく減少し、AtMRS2-10における本Met残基の重要性が示された。シロイヌナズナのCorAファミリータンパク質であり、AtMRS2-10と相同性が高い(89%)AtMRS2-1、および、AtMRS2-10と相同性が低い(19%)AtMRS2-11を、それぞれ大腸菌で発現し精製した。プロテオリポソームに組み込み、蛍光指示薬mag-fura-2によるMg^<2+>輸送活性測定系を確立した。今後、AtMRS2-10との輸送活性の違いを明らかにしていく計画である。シロイヌナズナ由来のCorAファミリータンパク質AtMRS2-1、10および11を大腸菌で発現、精製し、以下の解析を行った。1 AtMRS2-10のキャラクタリゼーション: AtMRS2-10をリポソームに再構成した。AtMRS2-10を組み込んだプロテオリポソーム外液にMg2+を添加し、リポソーム内のMg2+含量を、蛍光指示薬を用いて測定した。AtMRS2-10は、外液Mg2+濃度に依存してリポソーム内にMg2+を取り込んだ。輸送反応は、外液にMg2+を添加後停止したが、さらにMg2+を加えると再び輸送反応が起こり、リポソーム内部のMg2+濃度は、階段状に上昇した。一方、Co2+の輸送が観察され、AtMRS2-10は、比較的幅広い陽イオン輸送タンパク質である可能性が示された。2 AtMRS2-10部位特異的変異体の機能

解析: CorAファミリータンパク質に保存されている共通配列GMNモチーフのMet残基を置換したM400I置換体では、Mg2+の取り込み速度、および輸送反応が停止するMg2+レベルともに大きく減少し、AtMRS2-10における本Met残基の重要性が示された。3 AtMRS2-1及び11のMg2+輸送能解析: AtMRS2-10と相同性が高い(89%)AtMRS2-1、および、相同性が低い(19%)AtMRS2-11を、それぞれ大腸菌で発現、精製し、Mg2+輸送活性を測定した。共に、単独でリポソーム内部にMg2+を輸送することが示され、AtMRS2-10と同様な時間経過を示した。Mg2+添加後リポソームの外液中にCo2+あるいはAl3+をあらかじめ添加しておくと、リポソーム内部へのMg2+輸送は阻害され、AtMRS2ファミリータンパク質は、これらの金属イオンを輸送する可能性が示唆されたシロイヌナズナの3つのCorAファミリータンパク質AtMRS2-1、10および11について、交付申請書に記載した通り、最も研究が進展しているAtMRS2-10は、部位特異的変異体の機能解析まですすみ、AtMRS2-1および11は、Mg^<2+>輸送活性測定系を確立した。24年度が最終年度であるため、記入しない。シロイヌナズナにおいて、主なMg^<2+>輸送タンパク質としてはたらいている、と考えられる3つのCorAファミリータンパク質AtMRS2-1、10および11について、当初目的に従って、分子機能解析をすすめていく。解析法として、これまで用いてきた原子吸光分析法に加え、蛍光指示薬mag-fura-2によるMg^<2+>輸送活性測定を行い、3つの膜輸送タンパク質の金属イオン輸送活性の違いに加えて、輸送活性の時間的な違いについても解析している計画である。
白血病関連発がん遺伝子産物によるBim/Dlc複合体機能抑制メカニズムの解明

慢性骨髄性白血病(CML)の病態を検討する目的で体内の白血球の総数を調節する機構を解析した。マウス骨髄初代培養細胞系を用いて、正常マウスからSca1+cKit+Lin-細胞(初期造血前駆細胞)とSca1-cKit+Lin-細胞(後期造血前駆細胞)を増幅・単離した。サイトカイン非存在下では初期前駆細胞では終末分化することなく24時間以内に死滅するのに対し、後期前駆細胞では終末分化を伴い48時間以上細胞が生存した。そこでサイトカイン非添加時の初期、および後期前駆細胞におけるBc1-2ファミリーメンバーの発現変化を検討したところ、Bc1-xLの発現レベルは不変、Bc1-2は速やかな減弱を見たが、Bimの発現レベルは5倍程度に誘導された。またBc1-2とBc1-xLの発現が後期前駆細胞では初期前駆細胞の510倍の高いレベルであることが、サイトカイン欠乏時のアポトーシス誘導感受性の相異の一因であると考えられた。一方細胞株を用いた実験ではBcr-Ab1キナーゼがBimの発現を抑制した。またCMLモデルマウス(Bcr-Ab1トランスジェニックマウス)由来の初期造血前駆細胞では正常同胞マウス由来の細胞に比較してサイトカイン非存在下での著明な生存期間の延長が認められ、この効果はSTI571により抑制されたが、後期造血前駆細胞では明らかな相異は認められなかった。これらの細胞ではサイトカイン欠乏によるBc1-2の発現低下は認められたが、Bimの発現誘導は認められず、STI571存在下でBimの発現誘導が認められた。以上の結果よりBcr-Ab1がサイトカイン欠乏時のBimの発現誘導抑制を介してアポトーシスを抑制していることがCML発症の一因であることが示唆された。
面状軌跡の振動を用いた新たな超音波接合法への挑戦

本研究は,線状軌跡の振動を組み合わせた面状軌跡の振動を用いた超音波接合法の実用化を目的とし,面状軌跡を発生させる振動源の開発,及びAl板とCu板の接合特性の検討を行った。その結果,まず,面状軌跡を発生させる振動源の開発は,縦振動子とねじり振動子を用いた振動源を用いることで成功した。次に,面状軌跡による接合は,直径4.2 mmの接合チップを用いた接合特性より,接合試料の設置角度に依らず0.6 sで約600 Nの接合強度を得られることがわかった。一方,縦振動やねじり振動の直線軌跡の振動は,設置角度により接合強度が異なり,接合が出来ない角度もあることがわかった。薄板の異種金属を接合する有効な方法の一つとして超音波接合法が挙げられる。超音波接合法は,接合対象に均等な静圧力と振動源により超音波振動を加えることによって接合する方法である。超音波接合法は,熱を用いない方法であるため融点の異なる異種金属の接合が容易に行える方法である。しかし,従来の超音波接合方法では,接合部に対して加えられる振動エネルギーが小さく,接合強度が弱い点が問題であった。本研究では,振動エネルギーが増大し,接合強度の向上が考えられる縦振動とねじり振動を組み合わせた面状軌跡の振動を用いた超音波接合法の開発を目的としている。平成27年度の研究実績は以下の通りである。1.面状の振動軌跡が得られる振動源の作成縦振動とねじり振動を組み合わせた面状の振動軌跡が得られる振動源の作成及び振動特性の測定を行なった。振動源は,縦振動を発生させる振動子とねじり振動を発生させる振動子の2つを組み合わせることで作成した。振動源の作成においては,FEM解析ソフトにて設計を行い,本学の工作技術センターの協力を得て作成を行なった。2.振動源の振動特性作成を行なった振動源の振動特性の測定を行なった。その結果,作成した振動源より,矩形の面状振動軌跡が得られること,また縦振動とねじり振動を個々に制御可能であることを明らかにした。具体的には,縦振動を発生させる振動子に加える信号の大小で縦振動の制御,ねじり振動を発生させる振動子に加える信号の大小でねじり振動を制御し,正方形,長方形の矩形の面状振動軌跡を発生させられることを明らかにした。当初の平成27年度の研究計画は,振動源に対して接合対象に振動を加えるための接合チップを装着した状態での振動特性の測定を最終目的としていた。しかし,現状としては,振動源の作成は行えたが,接合チップの設計が行えず,結果,接合チップが装着されていない状態での振動源の振動特性の測定となった。平成27年度は,本提案手法に用いる振動源の作成を行い,その振動源の基礎的な振動特性について検討し,面状振動軌跡を得られることを明らかにしている。平成28年度の研究実績は下記の通りである。1.接合チップを装着した振動源の作成及び振動特性まず,接合対象に対して面状振動軌跡を加えるために必要な接合チップの作成を行なった。接合チップは,接合対象への損傷を低減するため,球面形状(SR50)で直径10 mmを採用した。接合チップを昨年度に作成した振動源に装着し,振動特性の測定を行なった。その結果,30 kHz程度の縦振動と20 kHz程度のねじり振動を個別に制御出来ることを明らかにし,また100平方μm程度の面状振動軌跡が得られることを明らかにした。2.面状振動軌跡による異種金属の接合特性ここでは,異種金属として銅板とアルミニウム板の接合を行い,種々の条件による接合特性の検討を行なった。その結果,面状振動軌跡を用いることにより,接合強度が向上することを明らかにした。また,接合強度は,面状振動軌跡を用いることで,従来の線状振動軌跡より低い静圧力で大きな値を得られることがわかった。また,接合強度は,面状振動軌跡の面積が大きいほど,大きくなることが明らかになった。面状振動軌跡による接合強度は,静圧力500 N,接合時間3秒間において,約700 Nとなった。平成28年度の研究計画としては,面状の振動軌跡による接合原理に解明を目的として,種々の条件による接合特性を明らかにすることであった。しかし,接合原理を明らかにするまでの測定を行なうことが出来なかった。その理由としては,接合時の振動制御を行なうための装置等の準備に遅れが生じたためである。しかしながら,測定を行った範囲の異種金属の接合特性より,面状振動軌跡の有意性を明らかにし,また本年度明らかにした結果をまとめたものを論文として投稿し,2件の掲載が決定している。そのため総合的に見て順調に進展していると考える。

超音波接合法は,熱を用いない方法であるため融点の異なる異種金属の接合が容易に行える方法である。しかし,従来の超音波接合法は,一方向の直線の振動のみを用いていたため,振動エネルギーが小さい。また,直線の振動は,方向性があるため,接合対象の設置方向により接合強度にばらつきが生じる。そこで,申請者は,振動エネルギーが増大し,接合強度の向上が考えられる縦振動とねじり振動を組み合わせた面状軌跡を提案し,その振動を用いた超音波接合法の開発を目的としている。平成29年度の研究実績は下記の通りである。まず接合中の静圧力を安定させるために,加圧機構にスプリングを用いた接合装置の開発を行った。そして,その接合装置にて,直径4.2 mmの刻み目のついた接合チップを用いて,銅板とアルミニウム板の接合を行い,種々の条件による接合特性の検討を行なった。その結果,平成28年度に用いた球面形状の接合チップと同様に,接合強度は,面状振動軌跡を用いることで向上することを明らかにした。面状振動軌跡による接合強度は,静圧力500 Nで,接合時間0.6秒間において,約650 Nとなった。なお,同条件において,一方向の直線の振動を用いた場合の接合強度は,約550 Nとなった。また,接合対象の設置方向を変化させた場合の接合強度の検討を行った。その結果,一方向の直線の振動を用いた場合,接合強度は,設置角度の変化に伴い変化した。また,接合が不可となる角度も確認された。一方,面状振動軌跡を用いた場合の接合は,全ての設置角度にて接合が可能で,接合強度は,角度によらずほぼ一定の値となった。本研究は,線状軌跡の振動を組み合わせた面状軌跡の振動を用いた超音波接合法の実用化を目的とし,面状軌跡を発生させる振動源の開発,及びAl板とCu板の接合特性の検討を行った。その結果,まず,面状軌跡を発生させる振動源の開発は,縦振動子とねじり振動子を用いた振動源を用いることで成功した。次に,面状軌跡による接合は,直径4.2 mmの接合チップを用いた接合特性より,接合試料の設置角度に依らず0.6 sで約600 Nの接合強度を得られることがわかった。一方,縦振動やねじり振動の直線軌跡の振動は,設置角度により接合強度が異なり,接合が出来ない角度もあることがわかった。本研究の最終的な目標は,面状の振動軌跡を用いた超音波接合装置の実用化である。その目標のために,平成28年度は以下の検討を行なう予定である。1.接合チップを装着した振動源の作成・振動特性まず,接合チップのFEM解析ソフトを用いて設計を行ない,本学の工作技術センターの協力を得て作成を行なう。そして,接合チップを装着した状態での振動源において振動特性の測定を行なう。そして,矩形の面状振動軌跡が得られること,また縦振動とねじり振動を個々に制御可能である接合チップを装着した振動源を目指す。2.面状の振動軌跡を用いた異種金属の接合特性面状の振動軌跡を用いた超音波接合による異種金属(アルミニウム板と銅板)の接合特性は,基礎的な特性は明らかにされている。しかしながら,未だに面状の振動軌跡を用いた接合原理については明らかにされていない。また,接合原理の解明が行われていない状態では実用化は困難と考える。そこで,面状の振動軌跡による接合原理の解明を目的として,種々の条件による接合特性の検討を多角的に行う。
ビル風害をもたらす非定常乱流場の3次元空間構造に関する実験的数値解析的研究

本研究では、ビル風害の原因となる瞬間的突風の3次元的な空間構造を、風洞実験による風速の多点同時計測と乱流の数値シミュレ-ション手法を用いて解析するとともに、その防止対策に関して検討した。昭和63年度はまず、多点同時計測風速計を用いた風洞内乱流の同時計測・解析システムを開発した。又、本システムにより得られた測定結果とLarge Eddy Simulationによる数値予測結果を比較し、その精度を検討した。平成1年度はLarge Eddy Simulationによる数値予測結果を基に、強風発生の原因となる建物コ-ナ-部での剥離渦に関して詳細に検討した。又、これと並んで単独建物モデル及び、街区モデルを用いた風洞実験により、最大瞬間風速の分布に及ぼす建物高さ、街路幅の影響について風速のスペクトル、ガスト・ファクタ-、ピ-ク・ファクタ-等の分布を算出し、詳細に検討した。又、樹木の設置による最大風速の低減効果に関して調べ、多くの成果を得た。多点同時計測風速計を導入し、これを用いた風洞内乱流の同時計測、解析システムを開発した。又、多点風速計による解析のためにデータ処理プログラム及び空間相関、スペクトル頻度分布の算出を始めとする種々の乱流統計量解析用プログラムを開発するとともにセンターの信頼性データの再理性に関する予備的チェックを行った。又、これと並んで、Large Eddy Simulationを用いた数値シミュレーション結果を基に、瞬間的突風の空間構造の詳細な検討を行うために必要とされる各種統計量算出用ルーチンやコンピュータグラフィック用ソフトの開発を行った。本年度はまず、昨年導入した多点風速計システムとの比較を踏えて、Large Eddy Simulationを用いた数値シミュレ-ションによる予測手法の改良を行なった。又、数値予測結果を基に、強風発生の原因となる建物コ-ナ-部での剥離渦に関して詳細に検討した。又、これと並んで単独建物モデル及び街区モデルを用いた風洞実験により、最大瞬間風速の分布に及ぼす建物高さ、街路幅の影響について風速のスペクトル,ガスト・ファクタ-,ピ-ク・ファクタ-等の分布を算出し、詳細に検討した。又、樹木の設置による最大風速の低減効果に関して調べた。
侵略的外来種におけるボトルネック後の遺伝的多様性維持と低温適応機構解明

世界各地で外来種が生態系を破壊する問題が深刻化しているが、他の地域から持ち込まれた生物種の全てが新しい環境に定着できるわけではない。北米原産のアメリカザリガニは、赤道地域から高緯度地域に至るまで世界中の様々な環境に適応し、現在も生息範囲を広げている。近年、高温水性である本種が寒冷地においても定着確認されるようになり、侵略的外来種の中にでも環境適応能力の高さが際立っている。本研究の目的は、少数個体からでも生息分布拡大が可能で、短期間で過酷な寒冷地にも侵入したアメリカザリガニの高い環境適応能力の遺伝的基盤を明らかにすることである。本研究で得られる成果は、アメリカザリガニが持つ高い侵略性の基盤を解明するだけでなく他の外来種にも応用が可能で、外来種全体の侵入メカニズムの理解に繋がる。アメリカザリガニの低温耐性に関わる領域の同定を目指したQTL-seq実施に向けて、沖縄集団と札幌集団のそれぞれからサンプリング個体を掛け合わせを行った。抱卵した雌のうち3個体からF1個体を取得できた。低温に応答する遺伝子を推定するため、低温に1週間暴露した沖縄と札幌の個体からRNAを抽出してRNAseqを実施した。同一条件でRNAを抽出した個体がPCA解析でクラスタを形成しなかったため、解析方法の見直しが必要となったが、低温に暴露した札幌個体の遺伝子発現は、明確に他条件と異なるパターンを示し、統計的に有意に低温に応答する遺伝子を多数得た。RNAseqデータを用いたPCA解析の結果、同一条件のサンプルがクラスターを形成していない個体が複数観察された。RNAseq解析の条件を見直し、PCA解析およびクラスター解析により同一条件のサンプルがクラスタを形成することを確認する。問題が解消されない場合には、低温暴露実験とRNAseqの追試を行う。寒冷地集団で特異的に自然選択が働いた遺伝子領域、および、低温に応答する遺伝子の候補が、実際に低温に関与するかの機能を調査するため、遺伝子ノックダウン、遺伝子ノックアウトの実施を行う。日本国内の複数地点、および、原産の北米由来のアメリカザリガニ個体のゲノムリシークエンス解析を行った。それぞれの集団から取得した多型情報に基づき、PhyloSNPにより系統解析を行った結果、北米集団と日本集団は明確に分岐しており、日本への移入は1度のみで日本集団が単系統であることが支持された。一方で、日本国内の地理的な距離と遺伝的な距離には相関がいことも明らかになった。これはアメリカザリガニが日本国内に移入後、人為的に全国に拡散したためだと考えられる。また、各集団のSNP頻度情報を用いて寒冷地集団特異的に自然選択の働いている領域の探索を行い、複数の候補領域を得た。RNAseq解析に向けたF1個体取得ため、札幌と沖縄でサンプリングを行なったアメリカザリガニ個体の交配実験を行った。2個体の雌で産卵を確認したが、いずれも無精卵でありF1個体を取得するに至らなかった。

寒冷地集団で特異的に自然選択が働いた遺伝子領域、および、低温に応答する遺伝子の候補が、実際に低温に関与するかの機能を調査するため、遺伝子ノックダウン、遺伝子ノックアウトの実施を行う。来年度の産卵期である春から夏にかけて交配させる個体数を大幅に増やすことにより交配実験でF1個体を取得し、低温耐性実験および遺伝子発現量解析(RNAseq)を実施する。