hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経可塑性におけるCaMキナーゼIIリン酸化カスケードの分子遺伝子的解析

カルモデュリン依存症プロテインキナーゼII(CaMキナーゼII)の脳神経系特異的発現はその正常の機能発現に必須であると考えられること、また、LTP成立後にCaMキナーゼIIメッセンジャーが増加するという報告を考え合わせ、本年度はCaMキナーゼIIの転写調節メカニズムを中心に解析し、神経系の可塑性の分子メカニズムを明らかにするための出発点とした。まず、CaMキナーゼII遺伝子の転写開始点を決定した。次に、5'上流4kbpおよび第1エクソン、第1イントロを含む領域をβ-ガラクトシダーゼ(lac Z)遺伝子に繋いだコンストラクトを作成し、これを導入したトランスジェニックフライの胚における発現パターンをin situ hybridization法によって調べた。lac Z mRNAの発現は、CaMキナーゼIIのものと同様に胚発生後期の脳神経系で非常に強かった。この結果から、CaMキナーゼIIの脳神経系特異的発現パターンは、mRNAの安定化によるのでなく、転写レベルで制御されており、この領域に組織特異性を決めるために必要な配列が存在するものと考えられた。さらに、CaMキナーゼII遺伝子5'上流とイントロンを様々に欠失したDNA断片をlac Z遺伝子に繋いだコンストラクトを作成し、これを導入したトランスジェックフライにおけるlac Zの発現パターンを調べた。その結果、5'側がmRNAの転写開始点より0.5kbp上流、または3'側は143bp下流までに脳神経系特異的発現の転写制御領域が存在するものと考えられた。今後さらに、この領域の脳神経系特異的発現に関与するシスエレメントを同定することによって、CaMキナーゼIIの脳神経系特異的発現の転写制御機構を明らかにしたいと考えている。
高圧ジェット装置を用いた活性汚泥減量化機構の解明

排水処理施設から排出される余剰汚泥削減のために、高圧ジェット装置を開発した。この装置による細菌細胞の損傷メカニズムの解明を行った。原子間力顕微鏡による1細胞観察により、摩擦・衝突・圧壊の中で、圧壊が細菌細胞の損傷に最も効果を示した。高圧ジェット装置を循環式硝化・脱窒法に適用した結果、最大で73%の余剰汚泥の削減が達成された。また、高圧ジェット装置の導入による処理水の水質悪化や沈降性の低下は見られなかった。16S rRNA遺伝子のアンプリコンシーケンス解析を行った結果、高圧ジェット装置を導入した活性汚泥中には、糸状性細菌の割合が減少しており、バルキング抑制に寄与する可能性を示した。高圧噴射装置による細菌細胞の損傷後の運命を明らかにするため、グラム陰性および陽性細菌としてEscherichia coliとBacillus subtilisを用い、細菌損傷試験を行った。細胞損傷を促進させる因子は高圧噴射装置の配管内の圧力であり、装置適用の繰り返し回数よりも細菌の損傷する割合は大きくなった。また、細胞損傷の程度はグラム陽性・陰性が有する細胞膜・細胞壁の構造の違いにより大きく異なり、グラム陽性細菌であるB. subtilisの損傷にはより多くのエネルギーを必要とすることが明らかになった。また、細菌損傷後の溶出成分を同定・定量したところ、トリプトファンとチロシンなどのアミノ酸を有する有機化合物が多く溶出することが明らかになった。次に、活性汚泥内に雑多に棲息する細菌が、細胞膜・細胞壁の構造に基づき高圧噴射装置により選択的に破壊されるかを検証するための試験を行った。活性汚泥を高圧噴射装置に適用させ、細胞破壊により溶出されるDNAを抽出し、16S rRNA遺伝子に基づくアンプリコンシーケンスにより損傷した細菌を同定する新しい手法を開発した。この手法を用いることにより、高圧噴射装置の適用により細胞損傷もしくは非破壊の細菌群を同定することが可能になった。この結果、活性汚泥中のグラム陽性・陰性細菌の選別は起こらず、活性汚泥フロック内に存在する細菌の空間配置やその他の物理化学的特性等がトリガーとなって活性汚泥中の細菌の破壊が起こることが示唆された。高圧噴射装置の実用化に向け、高圧噴射装置の運転条件の検討を行った。また、槽容積2.3 m3のパイロット排水処理装置を設計・作製・改良し、平成27年度の実証試験に向けて実下水処理施設内に設置した。細胞破砕による余剰汚泥削減に向けた高圧ジェット装置の最適化に向け、細胞破砕のメカニズム解明に向けた基礎検討を行った。Escherichia coliとBacillus subtilisをグラム陰性・陽性細菌のモデルとして用い、高圧ジェット装置に適用し、細菌の破砕状況を原子間力顕微鏡によりシングルセルレベルで確認したところ、細胞壁・細胞膜の構造の違いにより、細胞破砕のパターンが2つの細菌群で大きく異なることを明らかにした。高圧ジェット装置による細胞破砕の要因となる、圧壊・摩擦・衝突のそれぞれの効果を検証するために、装置の改良を行った。改良した装置を用いて細菌破砕の評価を行ったところ、圧壊が細菌細胞の破砕にとって最も影響を及ぼす因子であることを実証した。活性汚泥を用いた高圧ジェット装置の微生物の選択的破砕が可能かどうかを、バルキングの要因となる糸状性細菌をターゲットとして評価を行った。高圧ジェット装置が糸状性細菌の破砕に効果を示し、活性汚泥の沈降性の向上に寄与する可能性を示唆した。高圧ジェット装置をパイロットスケールの循環式硝化脱窒法の排水処理システム(総容積2.3 m3)に組み込んで、活性汚泥の余剰汚泥減溶化効果の検証を行った。第一沈殿池後の下水をシステムに流入し、排水処理性能および汚泥生成量の評価を行ったところ、余剰汚泥の排出量を8割削減しても高圧ジェット装置を組み込まないコントロールのシステムと比較して、同等の汚泥沈降性および排水処理性能が得られることを示した。これまで蓄積した基礎的知見を最大限に利用することにより、計画通りに実験を進めることができた。グラム陰性細菌であるEscherichia coliとグラム陽性細菌であるBacillus subtilisの懸濁液を改造した高圧ジェット装置に適用し、圧壊・摩擦・衝突のそれぞれの物理的影響が細胞の損傷にどのように影響を及ぼすか、原子間力顕微鏡による1細胞レベルで評価を行った。グラム陰性細菌であるEscherichia coliはどの影響に対しても細胞破砕が確認された。一方、グラム陽性細菌であるBacillus subtilisは摩擦や衝突では細胞の破砕が見られなかったが、圧壊のみに対して細胞破砕が観察された。高圧ジェット装置が有する圧壊が細胞壁の厚いグラム陽性細菌にも有用であることを1細胞レベルで証明した。次に、高圧ジェット装置を総容積2.3 m3の高度処理用の硝化液循環活性汚泥法の濃縮汚泥返送ラインに組み込み、実生活排水を連続通水することで排水の高度処理および汚泥減容化の双方が達成できるかの評価を行った。ポンプによる活性汚泥の送液が問題なく行える場合、窒素除去および汚泥減容化の双方が達成できることを示した。さらに、高圧ジェット装置を組み込んだ活性汚泥システムにおいて、原核生物叢解析として16S rRNA遺伝子に加え、真核生物をターゲットとした18S rRNA遺伝子に基づく微生物叢解析を行った。高圧ジェット装置を活性汚泥システムに組み込むことにより、真核生物叢が対照系である活性汚泥システムと比べて大きく異なることを明らかにした。

以上より、活性汚泥システムに組み込まれた高圧ジェット装置は、細菌および高次な真核生物の双方の微生物叢に大きく影響をもたらすことが明らかになった。原子間力顕微鏡に関して、専門家と密なコミュニケーションが図れたことで計画通りに研究を進めることができた。また、実生活排水の処理および汚泥減容化試験においては、メンテナンス頻度を上げることにより、これまでの問題点を解決することができ、遅延無く研究を進められた。有機物・窒素除去を考慮した硝化液循環活性汚泥法を導入したパイロットスケールシステムを実生活排水処理施設に2基設置した。一方のシステムの余剰汚泥返送ラインに高圧ジェット装置を導入し(実験系)、他方のシステムは高圧ジェット装置を導入しないシステム(対照系)とした。これら2つのシステムに実生活排水を約4ヶ月間連続通水することにより、積算余剰汚泥排出量、処理水質、微生物叢の変遷を比較調査した。実験系の積算余剰汚泥排出量は、対照系の積算余剰汚泥排出量の27%であり、73%の削減効果が得られた。また、ベルトプレス脱水機での脱水性評価試験の結果、実験系の余剰汚泥の脱水性能は一般的な余剰汚泥の脱水性と同等であることが分かった。沈殿槽から越流する処理液中の有機物、窒素および懸濁物質濃度は、実験系と対照系で有意な差は見られなかった。さらに、実験系の曝気量を対照系に対して最大で45%削減しても、システムの排水処理性能の悪化は見られなかった。これらの結果を考慮して、高度処理を行う施設に高圧ジェット装置を導入したことを想定してコスト試算を行った。運転コストは高圧ジェット装置を導入しない既存の処理施設と比較して23%削減可能と試算された。次に、高圧ジェット装置による微生物叢の変遷を明らかにするために、16S rRNA遺伝子を対象とした次世代シーケンサーによる解析を行った。その結果、システムの運転終了時点で実験系の活性汚泥のみ大きく微生物叢が変化していることが明らかになった。特に、ChloroflexiやThiothrixなどの糸状性細菌として知られる種類が実験系において大幅に減少している傾向が見られた。このことから、高圧ジェット装置の導入が活性汚泥のバルキング抑制に役立つ可能性が示唆された。排水処理施設から排出される余剰汚泥削減のために、高圧ジェット装置を開発した。この装置による細菌細胞の損傷メカニズムの解明を行った。原子間力顕微鏡による1細胞観察により、摩擦・衝突・圧壊の中で、圧壊が細菌細胞の損傷に最も効果を示した。高圧ジェット装置を循環式硝化・脱窒法に適用した結果、最大で73%の余剰汚泥の削減が達成された。また、高圧ジェット装置の導入による処理水の水質悪化や沈降性の低下は見られなかった。16S rRNA遺伝子のアンプリコンシーケンス解析を行った結果、高圧ジェット装置を導入した活性汚泥中には、糸状性細菌の割合が減少しており、バルキング抑制に寄与する可能性を示した。これまでの高圧噴射装置に関する基礎的検討とノウハウを活用することで遅延なく計画にしたがった成果を挙げることができた。高圧ジェット装置を用いた活性汚泥の余剰汚泥減溶化の実用化を目指し、細胞破砕のメカニズム解明に基づく装置の最適化を行う。
表面筋電図逆解析を中心とした神経筋機能形態の加齢変化に関する新たな分析手法の開発

表面筋電図から活動運動単位の解剖学的・生理学的情報,すなわち,活動運動単位の位置(深さ),強度,サイズ,筋線維密度,活動参加,発火頻度等を抽出する逆解析について検討した.表面運動単位活動電位(MUAP)計測と,逆解析により,(1)活動運動単位の深さは0.57.7mm,強度は0.1230.9nAmであることが分かった.また,(2)推定した深さと強度の関係から,運動単位の半径は1.45.4mm,筋線維密度は0.49.3fiber/mm^2と推定された.さらに,拡張型電極列を開発し,新たな逆解析手法を開発した.一方,運動単位の解剖学的・生理学的および力学的パラメータを有するモデルを構築し,表面筋電位波形をシミュレートすることにより,(3)最大随意収縮時より発揮力の小さい急激な収縮時には筋電位振幅の割に運動単位の活動参加数が少ないことが推測された.(4)発火頻度などの発火統計については,今後,モデルの拡張により明らかにする必要があることが示唆された.また,(5)有限要素法による大規模シミュレーションを通して,表皮,真皮および皮下組織などの不均質層や運動単位の筋線維密度の影響を検討した.その結果,深さの推定値は条件の変化に対して頑強で,安定して推定できることが明らかになった.この逆解析手法には,現実的に計測不可能な過程,例えば,活動運動単位の位置や強度,広がりや筋線維密度,干渉条件下における運動単位の発火頻度や活動参加などの,解剖学的・生理学的過程を推定できる利点がある.今後,さらに計測手法とモデルおよびシミュレーション手法を拡張すると同時に,本研究で十分実施できなかった高齢被験者への適用を進める必要がある.それにより,神経筋に関する,より詳細で有効な知見が得られると期待できる.表面筋電図から活動運動単位の解剖学的・生理学的情報,すなわち,活動運動単位の位置(深さ),強度,サイズ,筋線維密度,活動参加,発火頻度等を抽出する逆解析について検討した.表面運動単位活動電位(MUAP)計測と,逆解析により,(1)活動運動単位の深さは0.57.7mm,強度は0.1230.9nAmであることが分かった.また,(2)推定した深さと強度の関係から,運動単位の半径は1.45.4mm,筋線維密度は0.49.3fiber/mm^2と推定された.さらに,拡張型電極列を開発し,新たな逆解析手法を開発した.一方,運動単位の解剖学的・生理学的および力学的パラメータを有するモデルを構築し,表面筋電位波形をシミュレートすることにより,(3)最大随意収縮時より発揮力の小さい急激な収縮時には筋電位振幅の割に運動単位の活動参加数が少ないことが推測された.(4)発火頻度などの発火統計については,今後,モデルの拡張により明らかにする必要があることが示唆された.また,(5)有限要素法による大規模シミュレーションを通して,表皮,真皮および皮下組織などの不均質層や運動単位の筋線維密度の影響を検討した.その結果,深さの推定値は条件の変化に対して頑強で,安定して推定できることが明らかになった.この逆解析手法には,現実的に計測不可能な過程,例えば,活動運動単位の位置や強度,広がりや筋線維密度,干渉条件下における運動単位の発火頻度や活動参加などの,解剖学的・生理学的過程を推定できる利点がある.今後,さらに計測手法とモデルおよびシミュレーション手法を拡張すると同時に,本研究で十分実施できなかった高齢被験者への適用を進める必要がある.それにより,神経筋に関する,より詳細で有効な知見が得られると期待できる.本研究では,表面筋電図(表面運動単位活動電位)逆解析により運動単位の構造推定を試みた.表面運動単位活動電位(表面MUAP)は筋周囲方向に並べた多点表面電極列を用いて計測した.計測した表面MUAPから,逆解析により等価電流双極子の深さと強度を推定した.逆解析は,MUAPモデルによる表面電位と,計測した表面MUAPとの差を最小にするパラメータ(深さ,強度など)を探索することにより実行した.逆解析により推定された双極子数は1個のMUAPにつき38個であった.推定された深さの範囲は,0.57.7mmで,6mm以下の推定値が90%を占めた.また,推定された強度の範囲は,0.1230.9nAm(nano ampere meter)で,10nAm以下が80%を占めた.深さ推定値と強度推定値の平均は,それぞれ3.0±1.8mm,13.8±32.0nAmであった.あてはまりの良さの平均は81.4±8.6%であった.次に,半径と筋線維密度をパラメータとする運動単位モデルを用いて表面電位を生成し,その逆解析により,深さと強度の推定値と運動単位の半径と筋線維密度の関係を明らかにした.この数値シミュレーションで得られた運動単位の構造と逆解析推定値との関係を,表面MUAPの逆解析結果に適用することにより活動運動単位の領域サイズと筋線維密度を推定した.皮膚表面から運動単位領域までの距離を0.5mmとした場合,推定された半径の平均は5.39±6.46mm,筋線維密度の平均は0.40±0.72fiber/mm^2であった.18年度の主な実績は、神経筋機能評価手法の開発の一端としての、急激な収縮時の表面筋電図(sEMG)解析と歩行時の運動学解析であった。

急激な筋収縮時には、発揮力の割に大きなsEMG振幅が記録される。そこで、上腕二頭筋を被験筋として、肘関節の急激な等尺性屈曲運動時のsEMGを記録した。比較対象として、等尺性最大随意収縮(MVC)時のsEMGも記録した。急激な筋収縮は収縮速度が大きいため、MVCに比べ発揮力は小さくなる。しかし、sEMG振幅はMVC比で約40%大きかった。発揮力が小さいのは、活動参加する運動単位(MU)数が少ないためであり、sEMG振幅が大きいのは、活動参加数が少なくても、活動MUの位置が筋表層に多い、あるいはMUのdouble dischargeと呼ばれる発火や同期などが原因と考えられる。一方、両者の発揮力の差が大きいにも関わらず、筋線維伝導速度に差がなかった。筋線維伝導速度は力に比例することから、急激な筋収縮時に活動参加するMUは、Fastタイプに偏っていると考えられる。しかし、急激な収縮においてもサイズの原理は守られていると言われるため、シミュレーションによる検討も行っている最中である。また、歩行時の運動学情報を分析することで、神経筋系の機能評価を行う可能性を模索するために、センサによる歩行計測を行った。45×65×25mmのプラスチックケースに、三軸まわりの角速度が計測できるように小型ジャイロセンサ3個配置した計測器を、それぞれ大腿側面と下腿側面に貼付して計測を行った。運動域が最も大きい矢状面内の運動において、角速度が大きく相対的なばらつきも小さかった。前頭面内、水平面内の運動は、大腿や下腿というセグメントの関節運動というより、身体全体の回転運動の反映であると考えられ、この意味において、歩行時の運動バランスを知る手がかりになると考えられる。ヒトを用いた実際の計測ではなかなか知り得ない、機能、構造の表面筋電図への影響について、シミュレーションにより検討した。急激な力発揮時には、MVC(最大随意収縮)に比べ、筋電位振幅が発揮力の割に大きくなることがある。また、発揮力がMVCより小さくても、筋線維伝導速度は同程度である。このような現象を、シミュレーションにより運動単位の活動参加、発火頻度、発火タイミングの点から検討した。その結果、急激な力発揮時の活動参加数はMVCより少ないこと、発火タイプとして同期発火あるいは二重発火のグループとランダム発火グループの両タイプに分かれる可能性が示唆された。また、急激な力発揮時における筋線維伝導速度推定に、活動参加数の影響が十分反映されていないかもしれない。また、逆解析に際して、解に影響を与える構造の条件、すなわち、境界、異方性の影響を明らかにするために有限要素法によるシミュレーションを行った。真皮と表皮の表面筋電位への影響を検討するために、三層と四層構造をもつ半径40mm、長さ360mmの円筒モデルを用いた。三層モデルは筋、皮下組織および皮膚から成る。四層モデルは筋、皮下組織、真皮および表皮から成る。シミュレーションでは、三層モデルの皮膚の厚さと導電率、四層モデルの真皮の厚さと導電率、および表皮の厚さと導電率を変化させて表面電位を計算した。その結果、三層モデルでは、層の厚さより導電率の方が表面電位への影響が大きかった。四層モデルにおける、表皮の層の厚さ、導電率ともに表面電位への影響は小さかった。そして、四層モデルと三層モデルでは、その表面電位ピーク値に平均で約20%の誤差が生じる可能性が示唆された。これらの知見は、シミュレーションをさらに充実させることにより、加齢による筋機能の変化を、表面筋電図を通して今まで以上に具体的に推定できる可能性があることを示している。
薬剤評価モデルとしてのヒト型造血因子受容体遺伝子導入マウスとその造血幹細胞動態制御

本研究は大別して、IL-3受容体の遺伝子導入(「卜」)マウスの交配・系統維持、同「卜」マウスの造血幹細胞/前駆細胞の機能アッセイ、同「卜」マウスの諸臓器におけるpleiotropismの解析、等から構成されており、以下に実績の概略を示す。1.交配と系統維持(平林・梅村・井上):既に作製されたヒトIL-3受容体の各サブユニット遺伝子導入マウスのうち、α鎖とβ鎖のマウスの交配により双方の遺伝子導入マウスを得、以下の解析に供した。尚、それぞれの「ト」マウスはホモ化して維持する計画だったが、現在までにホモ個体を確認するには至らなかった。また、IL-3分泌マウスとの交配実験については、まとまった結果を得るに至らなかった。2.造血幹細胞/前駆細胞の機能アッセイ(平林・横田・井上):(1)α鎖マウスの遺伝子発現:新規市販品の2次抗体を用いることで、骨髄・脾・胸腺細胞の導入遺伝子発現分画をセルソーターで従来より明瞭に示すことが出来た。(2)αβマウス骨髄細胞の反応性:α鎖とβ鎖のマウスの交配により作成した双方の遺伝子導入マウス骨髄細胞は、ヒトIL-3に農度依存性に反応してln vitroコロニーを形成した。形成されたコロニーの約1/4はcompactな形態を示し、表面分化抗原をセルソーターで解析したところ、B220及びCD19が陽性のB細胞系列であることが解った。(3)compactcolonyの性状:このcompactcolonyはヒトIL-3添加によって二次性コロニーを形成するが、マウスIL-3添加では全く増殖しない。ヒトIL-3にマウスIL-7を添加して二次性コロニーを形成させるとCD43陽性分画が減少し分化傾向が認められた。3.諸臓器におけるpleiotropismの解析(高木・平林・井上):受容体「卜」マウスの諸臓器での導入遺伝子発現をRT-PCR等で観察し、小脳や精巣等にも導入遺伝子の増幅産物を認めた。尚,必要な備品類はほぼ揃っており、「卜」マウスの選別のための遺伝型決定などの効率向上のため卓上微量高速遠心機を充当した。また頭目的のためにアルバイトも依頼した。
強皮症モデル動物における皮膚キマーゼ発現解析およびキマーゼ阻害薬の治療効果判定

強皮症のモデル動物であるTskマウスを用い、皮膚の病態と肥満細胞数、キマーゼ酵素活性との相関を経時的に解析した。さらに、皮膚、皮下のキマーゼmRNA発現レベルを競合的RT-PCR法で定量した。1.背部皮膚は下床との可動性が制限され、組織学的には、真皮に加え皮下線維組織層の肥厚がみられた。特に皮下線維組織層は、5週齢より対照マウスに比べ有意に肥厚しており、さらに週齢を増すごと厚みを増し、その差は著明となった。対照群では加齢の影響は受けず、各週齢で変化がなかった。真皮ヒドロキリプロリン濃度は、10週齢以降のTskマウスで有意に増加し、生化学的にも真皮のコラーゲン増加が示された。2.これらの病変部では5週齢より肥満細胞数が対照マウスに比べ増加し、キマーゼ酵素活性の有意な上昇を伴っていた。3.10週齢Tskマウスの皮膚を用い、キマーゼサブタイプのmRNA発現を定量した。皮膚肥満細胞に特異的なマウスマストセルプロテアーゼ(MMCP)-4および未分化肥満細胞型であるMMCP-5の発現が示されたが、粘膜肥満細胞型のMMCP-2は検出されなかった。対照に比べ、MMCP-4mRNAは有意に高い発現レベルを示した。一方、MMCP-5 mRNAの発現は、MMCP-4に比べて少なく、また対照との間に有意な変化はみられなかった。皮膚の線維性増生とその病変局所での肥満細胞数、キマーゼ酵素活性の上昇に相関があることが証明された。ヒトキマーゼは結合組織の肥満細胞のみに発現するため、皮膚肥満細胞に特異的なMMCP-4の発現量と特に相関があったことは強皮症の病態生理に重要な意味を持つと考えられた。さらに、経口投与により正常マウス皮膚のキマーゼ活性を抑制する阻害薬をスクリーニングした。12年度はこのキマーゼ阻害薬の治療効果を検討していく。
自己組織化能によるバイオナノプロセスとナノ構造体構築

生体内で鉄を貯蔵するタンパク質であるフェリチンを、単分子層レベルで固定化した金およびシリコン基板上を、大気下で400°C、1時間の熱処理を行い、フェリチンのタンパク質部分を酸化除去した。熱処理後の金基板およびシリコン基板上には、フェリチンコア由来の酸化鉄ナノ粒子(直径5nm)の存在が原子間力顕微鏡(AFM)測定より観察された。金基板上に固定化されたフェリチンを定電位電解すると、鉄イオンの放出によりそのコアサイズは小さくなることが予想された。電解後、熱処理によってタンパク質を酸化除去すると、電解処理してないフェリチンの場合は(本研究では約3千個の鉄イオンを有する)、基板上にコア由来の酸化鉄ナノ粒子、5(±1)nmを観察できた。-0.5Vで20分間の電解後ではその粒子サイズは1.5(±0.5)nmになった。この結果は、電解時間によってフェリチンのコアサイズを制御可能であることを示す。電気炉中の石英チャンバー内に、得られた酸化鉄ナノ粒子を触媒に用い、メタンを炭素源として600-900°Cでカーボンナノチューブの作製を試みた。基板上にカーボンナノチューブが生成されたことがAFM観察およびラマン分光測定からわかった。興味深いことに、金基板上ではカーボンナノチューブは金(111)表面に沿って成長し、その成長方向は基板の結晶面の影響を受けることが示された。これは、カーボンナノチューブの成長方向の制御の可能性を示しており、カーボンナノチューブを用いたナノ回路作製のヒントになると考えられる。一方、シリコン基板上では、高密度で垂直に配向成長したカーボンナノチューブが観察された。また、いずれの基板上においても、フェリチンのコア鉄の直径サイズに比較的よくそろったカーボンナノチューブの生成が確認された。白金基板上にもカーボンナノチューブを作製できた。白金基板上のカーボンナノチューブにグルコースオキシダーゼを浸漬法によって吸着固定化したところ、カーボンナノチューブとグルコースオキシダーゼとの直接的な電子移動反応が観測され、優れた酵素センサーとして機能することが明らかとなった生体内で鉄イオンをフェリハイドライト形態で貯蔵する機能をもつフェリチンを、アミノ基を末端に有するチオール単分子膜で修飾した金基板(単結晶電極もしくは天然マイカ上に蒸着した金フィルム電極)上に単分子レベルで修飾した。フェリチンが単分子レベルで修飾されたことを、原子間力顕微鏡(AFM)、電気化学法および水晶振動子を用いたマイクロバランス法で確認した。フェリチンが単分子レベルで修飾された金基板を大気下、400°Cで1時間熱処理を行うたところ、フェリチンのタンパク質およびチオール分子が除去され、フェリチンコア由来の酸化鉄ナノ粒子のみが、基板上のフェリチンが固定化されていた位置に残されていることがAFM観察、赤外反射分光測定およびXPS測定により確認された。この熱処理を施した基板を石英チャンバー内に入れ、メタンと水素の混合ガス中で600°Cに加熱したところ、フェリチンコア由来の鉄ナノ微粒子を触媒として、カーボンナノチューブが生成したことがAFM観察およびラマン分光測定からわかった。生成したカーボンナノチューブの直径は、鉄ナノ粒子の直径の大きさを反映することもわかった。このことは、フェリチンのコア鉄の直径を制御することで、カーボンナノチューブの直径をコントロール可能であることを示す。また、(111)結晶面をもつ金基板を用いたところ、カーボンナノチューブの成長方向は、(111)の結晶面を反映して成長することがわかった。アミノ基を末端に有する有機単分子膜を修飾した金およびシリコン基板上に、生体内で鉄貯蔵機能を有するフェリチンを静電的に固定化した。原子間力顕微鏡(AFM)、電気化学法および水晶振動子を用いたマイクロバランス法で、フェリチン分子は基板上に単分子レベルで固定化されていることを確認した。フェリチンを単分子層レベルで固定化した有機単分子膜修飾金基板およびシリコン基板を、大気下で400°C、1時間の熱処理を行い、フェリチンのタンパク質部分を酸化除去した。熱処理後の金基板およびシリコン基板上には、フェリチンコア由来の酸化鉄ナノ粒子(直径5nm)の存在がAFM測定より観察された。電気炉中の石英チャンバー内に、得られた酸化鉄ナノ粒子基板を設置し、メタンを炭素源として600-900°Cでカーボンナノチューブの作製を試みた。カーボンナノチューブの直径サイズ制御のためのフェリチシ鉄コアサイズの電気化学的制御を目指して、フェリチン固定化ポリペプチド修飾電極を作成し、固定化フェリチンの鉄コアサイズの電気化学的制御が可能であることを確認した。

生体内で鉄を貯蔵するタンパク質であるフェリチンを、単分子層レベルで固定化した金およびシリコン基板上を、大気下で400°C、1時間の熱処理を行い、フェリチンのタンパク質部分を酸化除去した。熱処理後の金基板およびシリコン基板上には、フェリチンコア由来の酸化鉄ナノ粒子(直径5nm)の存在が原子間力顕微鏡(AFM)測定より観察された。金基板上に固定化されたフェリチンを定電位電解すると、鉄イオンの放出によりそのコアサイズは小さくなることが予想された。電解後、熱処理によってタンパク質を酸化除去すると、電解処理してないフェリチンの場合は(本研究では約3千個の鉄イオンを有する)、基板上にコア由来の酸化鉄ナノ粒子、5(±1)nmを観察できた。-0.5Vで20分間の電解後ではその粒子サイズは1.5(±0.5)nmになった。この結果は、電解時間によってフェリチンのコアサイズを制御可能であることを示す。電気炉中の石英チャンバー内に、得られた酸化鉄ナノ粒子を触媒に用い、メタンを炭素源として600-900°Cでカーボンナノチューブの作製を試みた。基板上にカーボンナノチューブが生成されたことがAFM観察およびラマン分光測定からわかった。興味深いことに、金基板上ではカーボンナノチューブは金(111)表面に沿って成長し、その成長方向は基板の結晶面の影響を受けることが示された。これは、カーボンナノチューブの成長方向の制御の可能性を示しており、カーボンナノチューブを用いたナノ回路作製のヒントになると考えられる。一方、シリコン基板上では、高密度で垂直に配向成長したカーボンナノチューブが観察された。また、いずれの基板上においても、フェリチンのコア鉄の直径サイズに比較的よくそろったカーボンナノチューブの生成が確認された。白金基板上にもカーボンナノチューブを作製できた。白金基板上のカーボンナノチューブにグルコースオキシダーゼを浸漬法によって吸着固定化したところ、カーボンナノチューブとグルコースオキシダーゼとの直接的な電子移動反応が観測され、優れた酵素センサーとして機能することが明らかとなった
雑音の混入を前提とした脳波解析手法に関する研究

装置や環境を十分に整備して脳波を測定しても,また,測定後に信号処理を施しても,雑音を除去することは不可能である.そこで本研究では,測定した脳波には雑音が混入することを前提に,言語処理の分野で研究してきた言葉の連想技術を応用し,連想構造を脳波に適用することで雑音に頑健な脳波解析手法を提案した.今回は,推定する感情を4種類とし,被験者本人の脳波データを使用しない最も厳しい条件下での評価実験の結果,感情推定精度は34.7%となった.また,本人の脳波データも利用することで,55.5%の精度になることも同時に確認した.このことから,実環境でも利用できる技術にできる知見を得ることができた.本研究では,測定した脳波には雑音が混入することを前提とし,雑音を除去するのではなく,有効な脳波データを抽出・利用できる仕組みを提案し,脳波に基づくユーザの感情推定システムに利用することで提案する雑音に頑健な脳波解析手法の有効性を検証することを目的としている.本年度は,研究の2年目として,昨年度に実施予定であった実際の脳波概念ベースで必要となる脳波データの測定実験を行った.脳波概念ベースの構築には,様々な感情状態下における大量の脳波データが必要になる.そのため,脳波測定装置(EEG)を装着しながら映画を視聴すると共に,各シーンで抱いた感情を記録する被験者実験を行った.映画を利用することにより,自然で多様な状態下での脳波の取得が可能となり,また,被験者への心身的負担の軽減にもつながった.また,昨年度に作成した脳波の概念化アルゴリズムを用いて,脳波概念ベースを構築した.言語における概念ベースと同様に,脳波概念ベースにおいてもTf・Idfなどの技術により重み付けを行い,雑音の影響を排除した.しかし,これらの重み付けだけでは雑音の影響を完全に排除することは難しく,一度構築した概念ベースを再度精錬する必要がある.特に,国語辞書というある程度の品質が確保されたデータにより構築する言語の概念ベースに比べ,個人の影響を大きく受ける脳波データを基に構築する脳波概念ベースにおいては,この精錬作業は非常に重要な作業になる.この作業に関しては,次年度も継続して行う必要があると考えている.さらに,言語における概念ベースを利用した単語間の関連性を数値として算出するアルゴリズムを応用し,脳波概念ベースを利用した脳波間の関連性算出プログラムを作成した.なお,本研究に関する成果として,投稿論文5件,国際発表5件,国内発表14件,著書1件を行った.本研究では,測定した脳波には雑音が混入することを前提とし,雑音を除去するのではなく,有効な脳波データを抽出・利用できる仕組みを提案し,脳波に基づくユーザの感情推定システムに利用することで提案する雑音に頑健な脳波解析手法の有効性を検証することを目的としている.具体的には,言語処理分野で既に実績のある言葉の連想を可能とする言語の概念ベース構築手法を参考に脳波の概念化を行う.そこで本年度は,研究の初年度として,これまでに既に測定してある脳波データを参考に,脳波の概念化のために必要なデータ整理アルゴリズム,ならびに概念化処理アルゴリズムを構築した.また同時に,実際の脳波概念ベースで必要となる脳波データの測定実験を行う予定であった.脳波概念ベースの構築には,様々な感情状態下における大量の脳波データが必要になる.そのため,脳波測定装置(EEG)を装着しながら映画を視聴すると共に,各シーンで抱いた感情を記録する被験者実験を行う予定であった.映画を利用することにより,自然で多様な状態下での脳波の取得が可能であり,また,被験者への心身的負担の軽減にもつながると考えていた.しかし,被験者実験のための予備実験において,多くの問題があることはが判明した.脳波の測定には長期間を有し,失敗は避けたいとの考えから,被験者実験は次年度に繰り越し,万全を期して行うこととした.なお,本研究に関する成果として,投稿論文3件,国際発表4件,国内発表18件を行った.本研究では,測定した脳波には雑音が混入することを前提とし,雑音を除去するのではなく,有効な脳波データを抽出・利用できる仕組みを提案し,脳波に基づくユーザの感情推定システムに利用することで提案する雑音に頑健な脳波解析手法の有効性を検証することを目的としている.具体的には,言語処理分野で既に実績のある言葉の連想を可能とする言語の概念ベース構築手法を参考に脳波の概念化を行う.本年度は,研究の3年目として,昨年度に実施した脳波概念ベースで必要となる脳波データの測定実験により取得した脳波データを整理・加工し,脳波概念ベースの再構築を行った.また,再構築した脳波概念ベースと昨年度に作成した脳波概念ベースを利用した脳波間の関連性算出プログラムをベースに,脳波に基づく感情推定アルゴリズムを構築した.今回は,推定する感情を4種類とし,ある被験者に対する感情を推定する際には,その本人の脳波データは感情推定の際に一切使用しないという,個人差の影響を大きく受ける脳波データにおいては最も厳しい条件下での評価実験を行った.結果としては,30.8%となり,ランダムに回答した場合の25.0%の正答率に比べて優位に精度が向上した.しかし,まだまだ課題は多く,次年度は,この結果を踏まえてさらなる精度向上に向けた研究・開発を行う必要がある.なお,本研究に関する成果として,投稿論文2件,国際発表4件,国内発表15件を行った.

本研究では,測定した脳波には雑音が混入することを前提とし,雑音を除去するのではなく,有効な脳波データを抽出・利用できる仕組みを提案し,脳波に基づくユーザの感情推定システムに利用することで提案する雑音に頑健な脳波解析手法の有効性を検証することを目的としている.具体的には,言語処理分野で既に実績のある言葉の連想を可能とする言語の概念ベース構築手法を参考に脳波の概念化を行う.本年度は,研究の最終年度である4年目として,昨年度に構築した脳波に基づく感情推定アルゴリズムの改良を行った.昨年と同様に,推定する感情を4種類とし,ある被験者に対する感情を推定する際には,その本人の脳波データは感情推定の際に一切使用しないという,個人差の影響を大きく受ける脳波データにおいては最も厳しい条件下での評価実験を行った.結果としては,34.7%となり,昨年に比べ約4%の精度向上を実現した.また,本人の脳波データも感情推定に利用することにより,55.5%の精度になることも同時に確認した.このことから,個人への適応技術の導入により,実環境でも利用できる技術にすることができるのではないかとの知見を得ることができた.なお,本年度,本研究に関する成果として,投稿論文1件,国際発表5件,国内発表21件を行った.装置や環境を十分に整備して脳波を測定しても,また,測定後に信号処理を施しても,雑音を除去することは不可能である.そこで本研究では,測定した脳波には雑音が混入することを前提に,言語処理の分野で研究してきた言葉の連想技術を応用し,連想構造を脳波に適用することで雑音に頑健な脳波解析手法を提案した.今回は,推定する感情を4種類とし,被験者本人の脳波データを使用しない最も厳しい条件下での評価実験の結果,感情推定精度は34.7%となった.また,本人の脳波データも利用することで,55.5%の精度になることも同時に確認した.このことから,実環境でも利用できる技術にできる知見を得ることができた.脳波概念ベースとそれに基づく脳波間の関連性算出プログラムをベースにした脳波に基づく感情推定アルゴリズムを構築し,その評価を滞りなく実施することができた.また,研究成果も発表することができ,ほぼ満足できる成果であったと感じている.感性情報学本年度に引き続き,脳波概念ベースとそれに基づく脳波間の関連性算出プログラムをベースにした脳波に基づく感情推定アルゴリズムの開発・改良ならびにその評価を行う.次年度は本研究課題の最終年度であるため,着実に開発を進め,早い段階から研究成果の発表ができるようにする.脳波概念ベースの精錬作業に関しては,次年度以降も継続して行う必要があるが,本年度に予定していた脳波データの取得ならびにそれらのデータを用いた脳波概念ベースの構築,脳波間の関連性を算出するプログラムの作成を滞りなく実施することができた.また,研究成果も発表することができ,ほぼ満足できる成果であったと感じている.実際の脳波概念ベースで必要となる脳波データの測定実験を行う予定であった.しかし,被験者実験のための予備実験において,多くの問題があることはが判明した.
アジア・太平洋域における大気エアロゾルの有機物組成と粒径分布

インド、北京など中国の主要都市、札幌、東京、海洋にて採取したエアロゾル試料を有機溶媒(塩化メチレン:メタノール=2:1)にて抽出したのちガスクロマトグラフ・質量分析計(GC/MS)により分析し、主要有機成分(n-アルカン、PAH,脂肪酸、アルコール、糖など)の分子組成を明らかにした。特に、ビスフェノールAに焦点をあて、そのグローバルな分布を明らかにするデータセットを作成した。その結果、インド、次に中国で最高濃度、海洋では一端に低く、南極で最低濃度を示した。この結果は、Environmental Pollution誌に掲載された。また、植物起源イソプレンおよびα-ピネンの酸化生成物である、2-methylthreitol, pinonic acid, norpinic acid, pinic acid等を測定し、植物からの揮発性有機物が二次有機エアロゾルの生成にどう関与するかを汚染の強い影響を受ける中国・インドおよびその影響下にある海洋大気中で明らかにした。その結果、植物起源のVOCの酸化生成物の有機エアロゾルへの寄与が最大で30%であることを見いだした。北極大気中で冬から初夏にかけて採取したエアロゾル粒子中に、イソプレン、モノテルペン、セスキテルペンの酸化生成物をGC/MSにより検索した。その結果、12種の生物起源VOCの酸化生成物を検出した。イソプレン酸化生成物はマイナーな成分であり、a-ピネンなどモノテルペンのそれ(ピノン酸など)が主要な成分であることがわかった。しかし、海氷が後退する6月初めにはイソプレン酸化生成物が増加した。海氷が融けて海洋の生物生産が増大するのに伴いイソプレンの海洋から大気へのエミッションが増えたと考えられた。有機エアロゾルに占める生物起源VOCの寄与は最大で12%であった。エアロゾルは、太陽光を直接反射・吸収するとともに、雲の形成に深く関与し地表を冷却する効果を持つことから、地球温暖化の中で、気候変動に重要な影響を与える物質である。中国の急激な経済発展にともなう化石燃料の使用の増大は、アジア・太平洋域での微粒子(エアロゾル)濃度を大きく増大させ、その大気質を著しく変える原因となっている。これまで無機物に関する研究は多いが、有機物組成に関する研究は少なく、また、その粒径分布はよくわかっていなかった。本研究の目的は、アジア太平洋域の大気エアロゾルに含まれる有機物の組成を明らかにし、有機物の起源と光化学的変質の情報を入手することである。平成20年度の研究では、中国・華北平原の泰山(1534m)山頂で採取した大気エアロゾルを有機溶媒で抽出の後、BSTFAをもちいて誘導体化した後にガスクロマトグラフィー・質量分析計にてn-アルカン、多環芳香族炭化水素、糖、アルコール、脂肪酸など100種以上の有機化合物を測定した。発生源毎に有機物を分類したところ、陸上植物に由来するワックスが全体の30-34%、バイオマス燃焼起源が25-27%、土壌粒子が15-18%、光化学反応起源が8-10%、プラスチック起源が3-10%、海洋・微生物起源が6%、工業域からの排出が4%であることがわかった。泰山の山頂は多くの場合、接地境界層の上に位置し自由対流圏の影響を強く受けていることが明らかとなった。北京など中国の主要都市および札幌にて採取したエアロゾル試料を有機溶媒(塩化メチレン:メタノール=2:1)にて抽出したのちガスクロマトグラフ・質量分析計(GC/MS)により分析し、主要有機成分(n-アルカン、PAH,脂肪酸、アルコール、糖など)の分子組成を明らかにした。特に、ビスフェノールA、プラスチックの燃焼生成物(1,3,5-トリフェニルベンゼン、テレフタル酸など)の測定を行い、家庭などからの廃棄物の燃焼起源および廃棄物の野焼きからの寄与を評価した。インド南部で採取したエアロゾル試料の有機物分析を行い、有機物トレーサーより、化石燃料・バイオマス燃焼・光化学反応など異なる起源の寄与を議論した。また、植物起源イソプレンおよびα-ピネンの酸化生成物である、2-methylthreito I. pinonic acid, norpinic acid, pinic acid等を測定し、植物からの揮発性有機物が二次有機エアロゾルの生成にどう関与するかを汚染の強い影響を受ける中国・インドおよびその影響下にある海洋大気中で明らかにした。また、エアロゾル試料中の有機炭素(OC)および黒色炭素(EC)をSunset Lab製のOC/ECメーターにて測定した。更に、水溶性有機炭素(WSOC)濃度を、有機炭素計にて測定し、エアロゾルに占める炭素の濃度、および有機炭素に占める各有機成分の割合を計算した。札幌で採取した粒径別エアロゾル試料の有機物組成を詳細に分析し、各種の有機成分の起源と生成過程を考察した。

また、植物起源イソプレンおよびα-ピネンの酸化生成物である、2-methylthreitol, pinonic acid, norpinic acid, pinic acid等を測定し、植物からの揮発性有機物が二次有機エアロゾルの生成にどう関与するかを汚染の強い影響を受ける中国・インドおよびその影響下にある海洋大気中で明らかにした。その結果、植物起源のVOCの酸化生成物の有機エアロゾルへの寄与が最大で30%であることを見いだした。北極大気中で冬から初夏にかけて採取したエアロゾル粒子中に、イソプレン、モノテルペン、セスキテルペンの酸化生成物をGC/MSにより検索した。その結果、12種の生物起源VOCの酸化生成物を検出した。イソプレン酸化生成物はマイナーな成分であり、a-ピネンなどモノテルペンのそれ(ピノン酸など)が主要な成分であることがわかった。しかし、海氷が後退する6月初めにはイソプレン酸化生成物が増加した。海氷が融けて海洋の生物生産が増大するのに伴いイソプレンの海洋から大気へのエミッションが増えたと考えられた。有機エアロゾルに占める生物起源VOCの寄与は最大で12%であった。
L-リシン誘導体の光触媒変換による高純度L-ピペコリン酸の合成

白金,ロジウム,あるいはパラジウムなどの貴金属触媒を含浸法などの手法で担持した酸化チタンを用いてL-リシンからのピペコリン酸への光触媒環化反応を行い,ピペコリン酸の生成速度,選択率,および光学純度にあたえる貴金属や酸化チタンの影響を調べた.一般的な傾向として,ピペコリン酸選択率あるいは生成速度が上がると光学純度が低下したが,高結晶性酸化チタンであるHyCOM (Hydrothermal Crystallization in Organic Media)を用いると比較的高い選択率と光学純度を保ったままで高い速度が得られた.生成するピペコリン酸の光学純度は,原料のリシンのαとω位のどちらのアミノ基が正孔によって酸化されるかによって決まると考えられる.すなわち,前者ではラセミ体,後者ではL体となる.この酸化選択性は,担持金属ではなく,光触媒である酸化チタンそのものの性質による.一方,生成物の選択率は,リシンの酸化とそれに続く加水分解,脱水縮合によって生じた2種類の環状シッフ塩基の還元効率により決まる.高性能の担持金属は,この還元効率が高いために選択率が向上するが酸化段階で決まる光学純度に近づくことになる.α-15N-L-リシンを原料として用い,副生するアンモニアおよびピペコリン酸中の窒素同位体分布から,リシンのαおよびω位の酸化反応量および環脈状シッフ塩基の還元効率を求めると,1,2-イミンをもつ環状シッフ塩基の方が1,6-イミンをもつものより還元されやすく(右スキーム),このためにピペコリン酸選択率が低い場合に高い光学純度が得られることが明らかになった.半導体に光を照射したときに生じる励起電子と正孔による還元、酸化反応を光触媒反応とよぶ。酸素の存在下では、これが励起電子と反応して酸化活性種を生じるため、酸化反応が主体となるが、無酸素下では、酸化と還元の両者を利用することができる。ジアミンを基質とするとアミノ基の正孔による酸化、および励起電子による還元の複合プロセスがOne-Potで進行し、水溶液中、室温という温和な反応条件下で環状2級アミンが得られることを見いだした。これを、比較的安価な光学活性原料であるL-(S)-リシンおよびその誘導体に応用すると、ピペコリン酸類を合成できることを報告してきた。しかし、光触媒そのものには立体選択性がない。ここでは、キラル選択性を期待して、不斉な結晶構造をもつ硫化水銀を光触媒とするピペコリン酸合成を試みた。辰砂(cinnabar)として知られる硫化水銀の天然鉱物(単結晶あるいは双晶)を試料とし、光触媒環化反応によるピペコリン酸の生成系について、その活性を調べたところ、きわめて低いものの光触媒活性をもつことが明らかになった。種々の天然鉱物、あるいは市販硫化水銀粉末を用いてDL-リシンを出発原料とする光触媒反応を行い、反応系に残存するリシンと生成したピペコリン酸の光学純度をキラルカラムを備えたHPLC、あるいは反応後の試料から単離したピペコリン酸を円偏光二色性スペクトルによって分析したところ、誤差範囲を超える光学活性は見いだせなかった。反応速度がきわめて小さく、変化量と生成物量が極端に少ないことがひとつの原因である。一般に天然鉱物は多くの不純物を結晶内に含み、このために光触媒反応の初期活性種である光励起電子と正孔の再結合が速く、実質の化学反応が遅いことが知られている。実際に、使用した硫化水銀鉱物試料の不純物を分析した結果、不純物の総量が多い試料ほど光触媒活性が低いことが明らかになった。白金,ロジウム,あるいはパラジウムなどの貴金属触媒を含浸法などの手法で担持した酸化チタンを用いてL-リシンからのピペコリン酸への光触媒環化反応を行い,ピペコリン酸の生成速度,選択率,および光学純度にあたえる貴金属や酸化チタンの影響を調べた.一般的な傾向として,ピペコリン酸選択率あるいは生成速度が上がると光学純度が低下したが,高結晶性酸化チタンであるHyCOM (Hydrothermal Crystallization in Organic Media)を用いると比較的高い選択率と光学純度を保ったままで高い速度が得られた.生成するピペコリン酸の光学純度は,原料のリシンのαとω位のどちらのアミノ基が正孔によって酸化されるかによって決まると考えられる.すなわち,前者ではラセミ体,後者ではL体となる.この酸化選択性は,担持金属ではなく,光触媒である酸化チタンそのものの性質による.一方,生成物の選択率は,リシンの酸化とそれに続く加水分解,脱水縮合によって生じた2種類の環状シッフ塩基の還元効率により決まる.高性能の担持金属は,この還元効率が高いために選択率が向上するが酸化段階で決まる光学純度に近づくことになる.α-15N-L-リシンを原料として用い,副生するアンモニアおよびピペコリン酸中の窒素同位体分布から,リシンのαおよびω位の酸化反応量および環脈状シッフ塩基の還元効率を求めると,1,2-イミンをもつ環状シッフ塩基の方が1,6-イミンをもつものより還元されやすく(右スキーム),このためにピペコリン酸選択率が低い場合に高い光学純度が得られることが明らかになった.
重症不整脈を引き起こす心Naチャネル変異における新生児型バリアントの影響

初年度は、研究1「Nav1.5発現細胞を用い変異によるNa電流の変化を検討」を進めるため、Nav1.5野生型及び変異を恒常的に発現する哺乳類細胞の作製を実施した。野生型のSCN5A遺伝子のコード領域にc.4868G>A (R1623Q)変異導入した発現ベクター(PSF-CMV-UB-HYGRO-SV40-FLAG-SCN5A, WT又はR1623Q変異)を作製した。またヒト胎児トータルRNA(市販品)から胎仔・新生児型のSCN5Aエクソン6aを含む塩基配列をクローニングし、野生型のSCN5Aにはめ込んだ新生児型エクソンを持つSCN5Aコード領域を作製し、野生型と同様にR1623Q変異を導入した。これらの4種類のSCN5Aを挿入した哺乳類発現プラスミドについて、そのSCN5A塩基配列をシークエンスにより確認した。これらの発現プラスミドをそれぞれ293T細胞に導入し、ハイグロマイシン選択により、現在、Nav1.5を恒常的に発現する複数のクローン株を作製している。野生型Nav1.5発現細胞株用い、オートパッチクランプ法により典型的なNa電流を測定することができた。研究2の「疾患iPS細胞分化心筋細胞を用いた機能解析」に関しては、当該研究室に凍結保存されていた不死化B細胞株を用いて、R1623Q変異をもつLQT3患者1名並びに複数の健常者のiPS細胞を調製した。研究1「Nav1.5発現細胞を用い変異によるNa電流の変化を検討」に必要な野生型、新生児型のSCN5A遺伝子並びにターゲット変異(c.4868G>A)導入した哺乳類発現ベクター4種類を作製できた。これらの発現プラスミドを293T細胞に導入し、抗生剤選択により、Nav1.5恒常発現クローン株を作製し、その手法を確立した。オートパッチクランプ法によりNa電流の測定を始めることができた。また、研究2の「疾患iPS細胞分化心筋細胞を用いた機能解析」を実施するために、R1623Q変異をもつLQT3患者1名並びに複数の健常者のiPS細胞を調製できた。初年度は、本研究に必要な細胞(野生型と変異型をそれぞれ発現するNav1.5恒常発現293T細胞株とR1623Q変異をもつLQT3患者1名と複数の健常者のiPS細胞)をほぼ調製することができた。よって、概ね順調な進捗状況と考える。次年度は、研究1の「Nav1.5発現細胞を用い変異によるNa電流の変化を検討」を完成させるため、Nav1.5発現細胞株の複数を用いて、オートパッチクランプ法によるNa電流の測定を進める。これにより、野生型と新生児型のSCN5A遺伝子におけるR1623Q変異の特徴を電気生理学的に明らかにする。研究2の「疾患iPS細胞分化心筋細胞を用いた機能解析」のために、健常者とR1623Q変異をもつLQT3患者のiPS細胞から心筋細胞への分化を実施する。iPS細胞由来の分化心筋細胞を用いて、マルチ電極アレーシステム(MED64)を用いた電気生理学的特性の評価を行う。心電図のQT間隔に該当する細胞外電位や拍動頻度を計測し、チャネルの変異によるQT間隔延長などの評価を行う。薬理学的研究にもMED64システムを用い、分化心筋細胞に様々なβ遮断薬・Na遮断薬を種々の濃度で添加し細胞外電位等を測定し、その効果から患者に有効な治療薬の選択のための資料とする。これらの発現

プラスミドを293T細胞に導入し、抗生剤選択により、Nav1.5恒常発現クローン株を作製し、その手法を確立した。オートパッチクランプ法によりNa電流の測定を始めることができた。また、研究2の「疾患iPS細胞分化心筋細胞を用いた機能解析」を実施するために、R1623Q変異をもつLQT3患者1名並びに複数の健常者のiPS細胞を調製できた。初年度は、本研究に必要な細胞(野生型と変異型をそれぞれ発現するNav1.5恒常発現293T細胞株とR1623Q変異をもつLQT3患者1名と複数の健常者のiPS細胞)をほぼ調製することができた。よって、概ね順調な進捗状況と考える。次年度は、研究1の「Nav1.5発現細胞を用い変異によるNa電流の変化を検討」を完成させるため、Nav1.5発現細胞株の複数を用いて、オートパッチクランプ法によるNa電流の測定を進める。これにより、野生型と新生児型のSCN5A遺伝子におけるR1623Q変異の特徴を電気生理学的に明らかにする。研究2の「疾患iPS細胞分化心筋細胞を用いた機能解析」のために、健常者とR1623Q変異をもつLQT3患者のiPS細胞から心筋細胞への分化を実施する。iPS細胞由来の分化心筋細胞を用いて、マルチ電極アレーシステム(MED64)を用いた電気生理学的特性の評価を行う。心電図のQT間隔に該当する細胞外電位や拍動頻度を計測し、チャネルの変異によるQT間隔延長などの評価を行う。薬理学的研究にもMED64システムを用い、分化心筋細胞に様々なβ遮断薬・Na遮断薬を種々の濃度で添加し細胞外電位等を測定し、その効果から患者に有効な治療薬の選択のための資料とする。