hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒトiPS細胞へのゲノム改変によるダウン症候群の病態モデルの確立とその解析

そこで本研究では、疾患特異的ヒトiPS細胞の作成・分化誘導技術と遺伝子改変技術を組み合わせ、GATA-1と21番染色体の形態によりGATA-1の遺伝子型の3タイプ(null / short form / full length)×21番染色体の核型2種類(ディプロイド/トリソミー)に基づいて6種類のiPS細胞ラインの樹立を行うことができた。目標としているTAMの細胞モデルを作成するに当たり、必要としていたTAM症例からの検体を得ることができた。そして健常児・21トリソミー+GATA1変異あり/なしの3種類のiPS細胞を樹立することができた。さらにゲノム編集技術をもちいることによって、遺伝子ノックアウトを行うことができ、予定通りの進捗状況であると思われる。作成したiPS細胞株を血球系へ分化誘導することにより、病態の解明につなげたいと考えている。幹細胞研究目標としている6種類のヒトiPS細胞の残るひとつを樹立するために、染色体除去技術を用いることによって21ダイソミーGATA1短縮型のモデルを作成したいと考えている。染色体除去技術はマウスES細胞では成功されているが、ヒトでは報告がないため、セレクションマーカーをもちいてぜひ成功させたいと考えている。
介護休業制度、介護保険に関する実証分析

本研究では、介護と仕事の両立に着目し、以下の3つの研究を行った。まず、仕事を持つ介護者のうち、どのような介護者が休業を取得するのか、どんな休業形態を利用するのかを明らかにした。次に、介護保険実施前後で介護場所にどのような変化がみられるのかについて分析した。最後に、療養病床には医療保険適用の医療療養病床と介護保険適用の介護療養病床の2タイプがあるが、どんな患者がどちらの入院サービスを受けているかを、ある療養病床を有する病院のデータを用いて検証した。平成19年度の研究では、介護保険と医療保険の選択に関する分析において、データ入手、データ加工、実証分析、論文執筆を行った。まず、ある県のA病院に入院している患者の1999年4月から2006年3月までの個票データを入手し、実証分析を行う。データからは、性別、入院時の年齢、入院回数、寝たきり度、痴呆度、要介護度、身体障害者の障害程度(等級)などの情報が得られる。よって、これらを説明変数に用いて、入院患者の生存率、入院患者の入院日数分析、介護保険と医療保険の選択要因を実証分析した。我が国では「社会的入院」が高齢者医療における大きな課題であり、実に30年以上にわたり、取り組んできた。こうした背景を踏まえて、厚生労働省は2006年7月から本格的に療養病床の再編を決定した。再編では、介護保険適用の療養病床(介護療養病床)が廃止され、医療保険適用の療養病床(医療療養病床)が削減される。この再編の目的の一つとして、医療療養病床では医療の必要性が高い患者を受入れ、医療保険で対応することをあげている。療養病床への入院は、介護老人保健施設をはじめとする福祉施設に入院した場合と比較して、入院患者一人あたりに支出する保険給付費が高額になる。よって厚生労働省は、今回の療養病床の再編で、医療の必要性が高い患者を医療療養病床へ、そして医療の必要性が低い患者は介護療養病床ではなく、在宅やその他の福祉施設で対応するように促す政策を行ったのである。平成19年度の研究においては、入院患者の現状、介護療養病床と医療療養病床の患者の属性などを実証分析し、現段階での療養病床の実情を明らかにした。さらに、今後実施される療養病床再編により、介護・医療の現場に起こりうる状況を予測した。平成20年度の研究では、家族に介護が必要となったときの休業形態の選択を明らかにするため、被説明変数に「休まない」を0、「介護休業制度を利用」を1、「年休を利用」を2、「欠勤」を3とする変数を用いて多項ロジットモデルによる推定を行った。推定の結果、以下のことが明らかとなった。(1)若い世代では業績評価にマイナスの影響を及ぼす可能性が高い介護休業や欠勤といった休業形態の取得が抑制される。また、収入が多いほど介護の機会費用が高くなり、欠勤が抑制される。(2)就業時間関連の措置を利用した場合において欠勤が促進され、残業関連の措置を利用した場合において年休が促進される。(3)配偶者の労働時間が長い場合、本人が何らかの休業形態を利用することで介護と就業の両立を図る傾向がある。(4)要介護者が一般病院、老人病院に入院している場合、介護休業制度、年休を有意に促し、欠勤に関してもわずかに有意ではないが、同様に促す。以上、介護のための休業形態を選択する要因を明らかにしたが、ここで明らかになったことは、今後、介護と就業の両立を可能にするための制度や政策を提案する上で、とても重要であると考える。また、上記の研究以外に、平成19年度の研究として執筆を進めていた「介護療養病床と医療療養病床の選択に関する実証分析」は、平成20年6月に行われた日本経済学会で報告を行った。そのとき、ちょうだいした貴重なコメントに沿って改訂を行い、現在、雑誌に投稿中である。平成21年度の研究では、家族に介護が必要となったときの休業形態の選択について分析を行った。20年度の研究で多項ロジットモデルによる推定を行い、雑誌に投稿を行ったとにろ、レフェリーからモデルが適切でない旨のアドバイスをちょうだいした。よって21年度は、介護のために仕事を休んだことがあるを1、ないを0とする変数を被説明変数にしたプロビット分析を行い、さらに介護休業制度、年休、欠勤のそれぞれを利用したを1、しないを0とする3つの変数を被説明変数としたプロビット分析を行った。分析の結果、以下が明らかになった。(1)介護を主担するほど休業を取得し、欠勤する。(2)配偶者の労働時間が長いほど休業を取得し、配偶者が正社員、非正社員、無配偶の場合、1日単位の休業が選択される。(3)介護対象者が入院していると休業を選択し、介護休業制度と年休利用が促される。(4)介護者の年収が低いほど欠勤する。今後は、以上の結果を踏まえて、介護と仕事の両立を可能にする制度や政策を提案したい。

一方、介護保険実施前後で介護場所にどのような変化がみられるのか、分析結果をもまとめた。「介護サービス実態調査」を用いて、在宅介護の場合を1、病院・施設の場合を0とする変数を用いてプロビット分析を行い、さらに実施前後ともに在宅を0、実施前は在宅で実施後は病院・施設が1、実施前に病院・施設で実施後に在宅が2、実施前後ともに病院・施設が3の変数を用いて多項ロジット分析を行った。結果から、実施前は女性の方が在宅介護を促していたが、実施後は性別では有意な結果が得られていない。実施後は年収が高いほど病院・施設が促されているが、実施前は有意ではない。また、人口密度が低い地方ほど実施前は在宅で実施後は病院・施設が促されていることなどがわかった。
スペースプレーン用空気吸込式エンジンに関する風洞実験

再使用型スペースプレーン用の空気吸い込み式エンジンに関して、エアインテーク等の主要要素を実際の飛行環境で模擬試験する手法を調査、研究した。第1に、連続的に飛行環境の変化するエアインテークに関して、その形状を変化させることによって常に最適な状態に制御する方式を確立した。この制御方式を、フランスONERAのマッハ数スイープ風洞を用いた試験によって確認するとともに、圧縮形態の変わる飛行速度での非定常な制御方法を確立し、数値解析と比較することで制御における問題を明確にした。現在は、これを応用し、コアエンジンとインテークを統合したサブスケール模型を超音速風洞内に入れて、インテークの不始動、再始動に関する動特性および制御方法を確立する試験を計画中である。第2に、エンジンシステム全体に関しては、エア・ターボラムジェットエンジンの地上燃焼試験を実施した。この試験の中で予冷却器の着霜問題について検討し、液体酸素またはメタノールを噴霧する着霜低減システムを提案し、要素基礎試験および燃焼試験で確認した。第3に、水素を燃料とするラム燃焼器に関して、触媒反応による点火器をフランスのポアチエ大の研究者と開発し、小型燃焼器を用いた試験によって性能を確認した。また、NASA、ONERA等、国内外の風洞設備、計測システムを調査し、研究者との情報交換を行うことによって、将来実施する予定の空気吸い込み式エンジンを極超音速気流の風洞内で試験する手法を検討した。完全再使用型二段式スペースプレーンに用いられる空気吸い込み式エンジンに関して、主要なコンポーネントを実際の飛行環境で試験する手法を調査、研究し、エンジンの性能および機能を確認することを目的とし研究を行った。飛行中に変化する大気をエンジンに効率よく取り入れるためのエアインテークの実験がまず必要となるが、今年度はそのための基礎試験、本実験の打ち合わせ、欧州におけるスペースプレーン研究(FESTIP計画)の調査を行った。エアインテークの基礎実験では遷音速、超音速域における全圧回復、流量捕獲等の空力性能を数値計算と実験によって比較し、良い一致を得た。このデータを元に来年度はONERAのマツハ数スイープ風洞によって、非定常的な制御に関する実験を行う予定である。将来的にはエンジンの性能を確認する一方で、ターボ機械から成る空気吸込式推進エンジンを極超音速気流の風洞内で試験する手法を研究することも大きな目標であり、ONERAの研究チームとその方法について密接な打ち合わせを行った。また、宇宙科学研究所内では予冷却器付のエア・ターボ・ラムジェットエンジンの地上・静止状態における燃焼試験を実施した。その結果予冷却器の冷却性能は確認できたものの、着霜による大きな圧力損失が問題となった。この実験にONERAの研究者を招聘し、実験方法、解析結果、今後の研究方法に対して討論を行い、夕一ボラムジェットエンジンに関する知見を深めた。定温触媒線を用いて燃焼器内の流れ場を計測し、混合度を評価することに成功した。完全再使用型宇宙輸送機(スペースプレーン)に用いられるエア・ターボ・ラムジェットエンジン(ATREXエンジン)および関連する主要なコンポーネントを実際の飛行環境をシミュレートした風洞装置を用いて試験する手法を研究し、ターボラムジェットの性能及び機能を確認することを目的として研究を行った。具体的にはまず、軸対称型エアインテークをONERAのマッハ数スイープ風洞装置に入れ、非定常的な制御に関する実験を行った。このとき、エアインテークの制御に関する新たな知見を得るだけでなく、運転操作、計測等に関しても習熟した。さらに、この結果を基にエンジンシステムの制御方法を確立した。また、欧州におけるスペースプレーン研究の調査を行い、ONERAの研究者と討論をすることで、再使用型スペースプレーンシステムの開発方法、超音速燃焼エンジンに関する試験方法の知見を深め、ATREXエンジンシステムの超音速風洞実験に関する検討を行った。また、宇宙科学研究所ではプリクーラ付きエア・ターボ・ラムジェットエンジンの燃焼実験を行い、予冷却器での着霜を軽減し、エンジン推力を向上させた。また、東京大学等ではスクラムジェットエンジン内の水素燃焼に関する実験等を行い、その内容および結果について相互に討論し、技術を深めた。二段式

スペースプレーン用の初段エンジンとして候補に挙がっている、エア・ターボ・ラムジェットエンジン(ATREX)に関して、エンジンシステムおよび関連する主要コンポーネントを風洞試験によってシミュレートする手法を研究した。具体的には、軸対称型エアインテークの制御に関して、昨年度マッハスイープ風洞で行った制御試験結果を元に、現代制御理論を用いたエアインテークとエンジンの統合制御ロジックを構築し、超音速風洞を用いたサブスケールモデルでの試験を行った。宇宙科学研究所の高温空気供給設備を用いた、水素燃料ラム燃焼器のダイレクトコネクト試験においては、点火システムを簡単化するために白金触媒反応を利用した点火器を試験した。この点火器は、フランスのポアチエ大学の研究者によって開発されたもので、スクラムジェットエンジンの自発着火に使用される。ポアチエ大学から研究者を招聘し、点火器の内容について情報を入手するのみならず、実際に点火器を試作試験してもらい、自発着火温度よりもはるかに低い温度での着火に成功した。また、宇宙科学研究所では、予冷却器における着霜問題を軽減することを目的とした基礎試験を行い、メタノールを少量混入することで着霜を大幅に低減することができることを確認した。また、この方式を実際のエンジンに応用する方法について検討した。これらの研究は、国内外の学会において報告するとともに、関連する諸外国の研究に関して情報を収集し、結果について相互に討論した。
脱細胞化骨髄を用いた造血ニッチに関する研究

造血幹細胞は骨髄内の細胞と細胞外マトリックスが構成する微小環境(ニッチ)との相互作用により、自己複製や分化、細胞周期のバランスを維持していると考えられている。近年、このニッチを人工的に構築しようとする研究が報告されている。人工的な造血ニッチが実現されれば、生体外での血液産生をはじめとし、造血幹細胞移植の効率の改善、白血病の制御機構の解明などの臨床医学研究の発展にも大きく貢献できると考えられる。実体が明らかでないニッチを構築するためには、まずは本来の環境に類似した細胞外マトリックスを用いることが最良と考えた。以上の背景をもとに、人工的な造血ニッチの開発を目的として、骨髄の脱細胞化について検討した。高静水圧処理法を用いて調製した脱細胞化骨髄をラット皮下に移植した際、本来は造血がなされない皮下にて、赤色骨髄の再構築が観察された。サンプル内に生着した細胞のコロニーアッセイ評価を行った結果、脱細胞化骨髄では移植初期の炎症反応から、移植後期になると造血へ変化する可能性が示された。また、造血幹細胞の脱細胞化骨髄への生着を評価するため、EGFP発現マウス皮下に脱細胞化骨髄を移植後、野生型マウスに再細胞化後のサンプルを再移植し、その後そのマウスの骨髄細胞を用いて長期骨髄再構築評価を行った。その結果、脱細胞化骨髄に長期骨髄再構築能を有する造血幹細胞が生着していることが示され、埋植された脱細胞化骨髄が異所性の造血巣として機能する可能性が示唆された。以上より、脱細胞化骨髄が造血幹細胞の生着環境の構築や異所性の造血を導くことが明らかになった。これは、生体外での造血には細胞同士の相互作用やサイトカインだけではなく、三次元構造を有する材料も必須の要素であることを示している。したがって、脱細胞化骨髄を用いた異所性造血環境の構築により、献血の代替となる生体外血液産生システム構築への応用可能性が示された。26年度が最終年度であるため、記入しない。人工的な造血ニッチの開発を目的として脱細胞化組織に着目し、骨髄の脱細胞化について検討した。これまでに、高静水圧処理法を用いることで、生体骨髄に類似した構造を有する脱細胞化骨髄の調製を行った。調製した脱細胞化骨髄をラット皮下に移植した際に、本来は造血がなされない皮下において、赤色骨髄のような現象が観察された。これは脱細胞化骨髄が血液系細胞を誘導し、そこで血液産生を引き起こした可能性があると考えている。本年度は、血球系に分化する能力を有する幹細胞の脱細胞化骨髄への生着を評価した。第一段階としてEGFP発現マウスに脱細胞化骨髄を移植し、脱細胞化骨髄を赤色骨髄化させた。その後、致死量X線照射(8Gy)によって造血機能障害を与えたマウスに、EGFP陽性細胞を含有する脱細胞化骨髄を再度移植し、EGFP陽性細胞によって致死量X線照射マウスの造血能が再構築されるかどうかを長期的に評価した。遺伝子発現解析により、赤色骨髄化した脱細胞化骨髄の移植1週目において、致死量X線照射マウスの末梢血中にEGFPの発現が観察された。さらに、フローサイトメトリーにより、致死量X線照射マウスの末梢血中にEGFP陽性細胞が確認された。また、同マウス大腿骨の骨髄細胞にてもEGFP陽性細胞が確認された。これは、第一段階で皮下に移植した脱細胞化骨髄に造血細胞が生着しており、さらにその造血細胞が致死量X線照射マウスの末梢血中を循環していることを意味している。また、末梢血を介して、致死量X線照射マウス本来のニッチである大腿骨の骨髄にも生着していることが示された。以上より、脱細胞化骨髄に造血細胞の生着が確認され、脱細胞化骨髄の人工的な造血ニッチとしての応用可能性が示された。今後、生着した造血細胞が自己複製能を有する造血幹細胞を含有しているかどうかも評価する予定である。人工的な造血ニッチの開発を目的として、脱細胞化組織に着目し、骨髄の脱細胞化について検討した。これまでに、高静水圧処理法を用いることで、生体骨髄に類似した構造を有する脱細胞化骨髄の調製を行い、調製した脱細胞化骨髄をマウス皮下に移植した際に、本来は造血がなされない皮下において、脱細胞化骨髄が血液系細胞を誘導し、そこで血液産生を引き起こした可能性があることを明らかにした。また、EGFP発現マウスへ埋植した脱細胞化骨髄を、X線照射して造血能を失わせたB6マウスに再度埋植することで、脱細胞化骨髄への造血細胞の生着を確認した。本年度は、脱細胞化骨髄へ生着した造血細胞について、長期骨髄再構築能の評価を行った。EGFP発現マウスへ埋植した脱細胞化骨髄を、X線照射して造血能を失わせたB6マウスに再度埋植し、一定期間後その埋植されたX線照射B6マウスの骨髄細胞および血液細胞を、別のX線照射B6マウスへ二次移植(静脈注射)した。一定期間経過後にマウス骨髄細胞および血液細胞のフローサイトメトリー解析を行ったところ、EGFP陽性細胞が確認された。

これは、EGFP発現マウスへの脱細胞化骨髄埋植時に生着した造血細胞が長期骨髄再構築能を有するLT-造血幹細胞であることを示している。また、二次移植時には、マウスの骨髄および血液細胞のみを移植したことから、脱細胞化骨髄内に生着した細胞が全身の末梢血中を遊走する、あるいは脱細胞化骨髄内で血球細胞へと分化して全身に遊走されることがわかった。さらに、造血幹細胞の支持細胞と考えられている間葉系幹細胞を予め播種し、マウスへの皮下埋植を行った結果、造血がより早期に引き起こされることが明らかとなった。以上より、脱細胞化骨髄への長期骨髄能を有する造血幹細胞の生着が確認され、造血ニッチとして機能し、人工的な血液産生の場として応用できる可能性が示された。今後、生着した造血幹細胞についてさらに詳細に評価する予定である。造血幹細胞は骨髄内の細胞と細胞外マトリックスが構成する微小環境(ニッチ)との相互作用により、自己複製や分化、細胞周期のバランスを維持していると考えられている。近年、このニッチを人工的に構築しようとする研究が報告されている。人工的な造血ニッチが実現されれば、生体外での血液産生をはじめとし、造血幹細胞移植の効率の改善、白血病の制御機構の解明などの臨床医学研究の発展にも大きく貢献できると考えられる。実体が明らかでないニッチを構築するためには、まずは本来の環境に類似した細胞外マトリックスを用いることが最良と考えた。以上の背景をもとに、人工的な造血ニッチの開発を目的として、骨髄の脱細胞化について検討した。高静水圧処理法を用いて調製した脱細胞化骨髄をラット皮下に移植した際、本来は造血がなされない皮下にて、赤色骨髄の再構築が観察された。サンプル内に生着した細胞のコロニーアッセイ評価を行った結果、脱細胞化骨髄では移植初期の炎症反応から、移植後期になると造血へ変化する可能性が示された。また、造血幹細胞の脱細胞化骨髄への生着を評価するため、EGFP発現マウス皮下に脱細胞化骨髄を移植後、野生型マウスに再細胞化後のサンプルを再移植し、その後そのマウスの骨髄細胞を用いて長期骨髄再構築評価を行った。その結果、脱細胞化骨髄に長期骨髄再構築能を有する造血幹細胞が生着していることが示され、埋植された脱細胞化骨髄が異所性の造血巣として機能する可能性が示唆された。以上より、脱細胞化骨髄が造血幹細胞の生着環境の構築や異所性の造血を導くことが明らかになった。これは、生体外での造血には細胞同士の相互作用やサイトカインだけではなく、三次元構造を有する材料も必須の要素であることを示している。したがって、脱細胞化骨髄を用いた異所性造血環境の構築により、献血の代替となる生体外血液産生システム構築への応用可能性が示された。26年度が最終年度であるため、記入しない。当初交付申請書に記載した計画通りに実験が進んでおり、順調に研究が進展している。今後は生着した造血細胞が自己複製能を有する造血幹細胞を含有しているかどうかを評価する予定である。同時に、脱細胞化骨髄を用いた細胞培養実験を行う。脱細胞化骨髄に造血支持細胞である可能性が指摘されている細胞を脱細胞化骨髄にin vitroで播種・培養する。脱細胞化骨髄への細胞接着性を組織学的で評価し、細胞分化能を酵素活性染色および遺伝子発現解析を用いて経時的に評価する。
魚類の浸透圧調節におけるコルチコイド産生制御機構の解明

コルチコイドの標的細胞において、哺乳類では1型と2型ステロイド代謝酵素の一つである11β-水酸基脱水素酵素(11β-HSD)が存在しコルチゾルの標的器官で相互に作用しあうことにより、コルチゾル量を必要に応じて最適化する働きがあることが分かっている。そこで本研究では、真骨類においても2種類の11β-HSDが存在し、海水・淡水適応時にコルチゾルを必要に応じて鰓にて局所的に調節することにより、浸透圧調節機能を制御しているとの仮説を検証した。コルチコイドは浸透圧調節、ストレス応答あるいは性成熟などにかかわる多機能なステロイドホルモンでもあるが、その生理学的機能の詳細については未解明な点が多く残されている。これまでの研究からコルチコイドの標的細胞においてはステロイド代謝酵素の一つである11β-水酸基脱水素酵素(11β-HSD)の働きがコルチコイド調節に重要であることが分かっている。哺乳類では1型と2型11β-HSDが存在しコルチゾルの標的器官で相互に作用しあうことにより、コルチゾル量を必要に応じて最適化する働きがあることが示唆されている。そこで本研究では、ニジマスを用いてサケ科魚類には哺乳類と同様に2種類の11β-HSDが存在し、海水・淡水適応時にコルチゾルを必要に応じて鯉にて局所的に調節することにより、真骨類の浸透圧調節機能を制御しているとの仮説を検証している。ニジマスでは哺乳類2型11β-HSDオーソログの単離が完了しているが、1型11β-HSDのオーソログはまだ単離されていない。しかしながら、ゲノムデータベース上では真骨類に3型11β-HSDという遺伝子が存在することが明らかになっており、遺伝子配列の系統解析により3型は1型の祖先型の可能性が高いことが分かっている。そこで本研究では平成19年度にニジマスより3型11β-HSD遺伝子のクローニングを試み、3型11β-HSD様遺伝子の全長を単離することに成功した。次に3型11β-HSD様遺伝子の組織分布を解析したところ、鯉で特異的に発現していることが明らかになった。さらに小麦胚芽無細胞タンパク質合成システムを用いて3型11β-HSD様遺伝子の合成を行い、その酵素活性の解析を試みたが得られたタンパク質に酵素の活性が見られなかった。そこで平成20年度は動物性培養細胞を使い、3型11β-HSD様遺伝子を発現させることにより酵素活性の解析を継続して行う予定である。真骨類において哺乳類2型11β-HSDオーソログが単離されているが、1型11β-HSDのオーソログはまだ単離されていない。真骨類のゲノムデータベース上に3型11β-HSDという1型に配列が似た遺伝子が存在することが明らかになっていることから、本研究ではニジマスより3型11β-HSD遺伝子のクローニングを行い、3型11β-HSD様遺伝子の機能解析を行った。まず、小麦胚芽無細胞タンパク質合成システムを用いて3型11β-HSD様遺伝子の合成を行い、その酵素活性の解析を試みたが得られたタンパク質に酵素の活性が見られなかった。そこで次に動物性培養細胞を用いて3型11β-HSD遺伝子を発現させることにより酵素活性の解析を行ったが、この発現系においてもコルチコイドに対する代謝活性は見られなかった。しかしながら、3型11β-HSD遺伝子は鰓で特異的に発現し、異なる塩分環境において発現変化をしていることから、浸透圧調節に関わっている可能性は高い。今後、さらにノックダウン等の方法を用いて3型11β-HSDの生理学的機能を解析する必要があると考えている。
選択的基質を用いたアセチルコリンエステラーゼ測定の臨床応用に関する研究

【目的】アセチルコリンエステラーゼ(AChE)は、神経伝達物質であるアセチルコリンを分解し神経伝達系を制御する重要な酵素である。今回、選択的基質と自動分析装置を用いた簡便で臨床応用可能な全血中AChE測定法の開発を目的とした。測定機器は日立社製Labospect 008を使用した。【結果】1)同時再現性(CV)は、溶血試料を10回同時測定した場合0.7%(平均1858U/L)、溶血操作を10回行い測定した場合1.3%(平均1842UIL)と両者とも良好であった。2)直線性は電気ウナギ由来のAChE(シグマ社)を用いて636UILまで確認した。10倍希釈の溶血試料では6360UlLまで測定可能となる。3)健常者25名(男9、女16、平均41.7±11.4歳)の測定結果は1667.6±234.3U/Lであった。4) AchE阻害剤(1,5-bis (4-allyldlmethylammoniumphenyl)pentan-3-one、BW284c51)添加による健常者5名の洗浄赤血球と全血の平均阻害率は、97.3%、96.2%と両者ともほぼ完全に阻害され、本法のAChE特異性を確認した。【まとめ】本法は全血を用いて簡便で特異的にAChEを測定可能な方法であり、一般的な自動分析装置に適用可能であるため今後の臨床応用が期待される。
自己反応性T細胞に対するDC-HILの抑制的制御機構の解明

本年度は、樹状細胞を介した抗原特異的なT細胞の増殖および抑制について検討した。前年度は動物を用いた遅延型過敏反応を評価したが、それのみでは特異的なリンパ球増殖抑制が評価できないため、in vitroにおける評価系を確立した(Tamura, et. al. Journal of Veterinary Medical Science 2007)。このin vitroの評価系をもちい、T細胞の増殖あるいは抑制を引き起こす樹状細胞、すなわち悪性黒色腫抗原あるいはリンパ腫の抗原を負荷した樹状細胞におけるDC-HILの発現を検討した。その結果、T細胞の増殖抑制を引き起こす樹状細胞ではDC-HILの発現が高く、逆にT細胞の増殖を引き起こす樹状細胞では低い事が明らかとなった。従来の研究でDC-HILはT細胞の増殖抑制を引き起こす事を示してきた。従って本実験結果は樹状細胞を介した抗原特異的なT細胞の増殖および抑制の制御にDC-HILが密接にかかわっている事を示していると考えられた。本年度は申請計画の基盤的なアッセイ系を確立するため、まずイヌの骨髄前駆細胞から樹状細胞の分化誘導法を検討した。これにより、イヌでは骨髄前駆細胞に対してGM-CSFに加えてIL-4を作用させる事で、きわめて効率的に樹状細胞を誘導できる事が明らかとなった(Isotani et al. 2006)。また、樹状細胞を安定的に供給できるよう、樹状細胞の悪性腫瘍であるイヌの組織球性肉腫の組織から樹状細胞の株化を行った(Azakami et al. 2006)。骨髄より誘導した樹状細胞および組織球性肉腫から樹立した樹状細胞は、いずれもアロT細胞の著しい増殖を引き起こす事が明らかとなった。次いで樹状細胞により特異的に増殖するリンパ球クローンを同定するため、T細胞の遺伝子再構成パターンがPCRにより検出可能なアッセイ系の確立を試みた。これには、まずイヌTCRをコードする遺伝子群の塩基配列を同定し、配列の特長により各遺伝子群をサブグループに細分し、サブグループ特異的なプライマーを作製した。これにより、樹状細胞に特異的に反応したリンパ球クローンの同定が可能になった(Yagihara et al. 2007)。今回、上述の結果をベースとして、まず樹状細胞が抗原に対し特異的に引き起こすポジティブなリンパ球反応の実験系を確立し、抑制シグナルの解析を行うための対照とした。ポジティブなリンパ球反応を引き起こす典型例として、イヌの悪性黒色腫の株化細胞(CMM2)を用いた。In vitroでCMM2抗原を樹状細胞に与え、特異的なリンパ球反応をin vivoで評価した。骨髄から誘導した樹状細胞および株化樹状細胞はいずれもin vivoで抗原に対する免疫反応(遅延型過敏反応:ツベルクリン型)を引き起こした(Tamura et al. 2007 in press)。さらに抗原に対しリクルートされてきたリンパ球は腫瘍蛋白に対し特異的に反応するT細胞クローンであることが明らかとなった。一方、リンパ腫・組織球性肉腫の抗原に対しては特異的なリンパ球の増殖・リクルートは引き起こされず、樹状細胞-T細胞の相互作用において抑制的な分子機構が存在すると考えられた。本年度はこれらの腫瘍細胞を用いてリンパ球反応の差から抗原特異的な免疫不応答性の分子機構を解明する。
口腔内温度時効硬化性金合金のレーザー溶接に関する研究

本研究では口腔内温度時効硬化性金合金を板状に鋳造した後に中央で切断し,切断した2つを付き合せ,金型で固定し,レーザー溶接した.レーザー溶接にはNd:YAGレーザー(TLL7000,Tanaka Laser)を使用した.レーザー溶接の条件を出力320A,パルス幅10ms,スポット径1.0mmに固定した.レーザー溶接は幅3.0mmの試験片の片方からレーザーのスポット径(1.0mm)が重ならないように3回のレーザーを切断線上に垂直に照射した.また,Controlとして切断していない板状鋳造体も用意した.各試験片には以下の3つの熱処理を施し,熱処理を施さないAs-castのままの試験片も用意した.1)ST:溶体化処理(700°C,5分間)2)HA:高温時効処理(ST後250°C,15分間)3)IA:口腔内温度時効処理(ST後37°C,3日間)熱処理後の試験片は硬さの測定を行った後に接合強度試験に供した.破断時のFracture force(Ff;N)を求めた.また,破断面のSEM観察を行った.熱処理後の硬さ(VHN)はそれぞれ,As-cast:224±6,ST:148±5,HA:279±8,IA:248±11であった.溶体化処理後の口腔内温度の時効でこの金合金の硬さは高温で時効した時の硬さに近づいた.Controlの試験片でST後に口腔内温度で時効させた試験片(IA)のFf値は高温で時効させた試験片(HA)のFf値と有意な差(p>0.05)は認められなかった.レーザー溶接したIA試験片のFf値はHA試験片のFf値には及ばなかったが,As-cast試験片およびST試験片のFf値に比較して有意に高い値を示した.As-cast試験片とST試験片のFf値に有意差は認められなかった.SEM観察ではレーザー溶接部位の結晶粒が微細化していることがわかった.本研究での予備的実験において,レーザーを口腔内時効硬化性金合金へ照射した場合の金合金に対する溶解深度がレーザー照射条件(電流量:160-300 A,パルス幅:1-13 ms,スポット径:0.4-1.8 mm)によりどのように変化するかを調べた。その結果レーザーの電流量を上げた場合とスポット径を小さくした場合に金合金に対する溶解深度は深くなった。また,パルス幅が1 ms以上では金合金に対するレーザーの溶解深度は深くなるが,パルス幅が1 ms以外では溶解深度に有意な差は認められなかった。予備実験で得られたデータをもとにレーザーの溶接条件を決めてから口腔内時効硬化性金合金のレーザー溶接強度の測定を行った。溶接強度測定は引張試験によって行った。引張試験片は2種類の厚さ(0.5mm,1.0mm)の板状鋳造体(40mm×3.0mm)を口腔内時効硬化性金合金により作製し,中央を切断後にレーザー溶接を行った。レーザー溶接は幅3.0 mmにスポット径(1.0 mm)が重ならないようにレーザーを垂直に照射した。レーザー溶接した試験片は口腔内時効を含む4種類の熱処理(As-cast,溶体化処理,硬化熱処理,口腔内温度時効)を施し,引張り試験に供した。硬化熱処理と口腔内温度時効を施した試験片はAs-castや溶体化処理を施した試験片より有意に高い引張り強度を示した。レーザー溶接した口腔内時効硬化性金合金は口腔内温度時効により硬化熱処理した試験片に劣らない溶接強度を示した。本研究では口腔内温度時効硬化性金合金を板状に鋳造した後に中央で切断し,切断した2つを付き合せ,金型で固定し,レーザー溶接した.レーザー溶接にはNd:YAGレーザー(TLL7000,Tanaka Laser)を使用した.レーザー溶接の条件を出力320A,パルス幅10ms,スポット径1.0mmに固定した.レーザー溶接は幅3.0mmの試験片の片方からレーザーのスポット径(1.0mm)が重ならないように3回のレーザーを切断線上に垂直に照射した.また,Controlとして切断していない板状鋳造体も用意した.各試験片には以下の3つの熱処理を施し,熱処理を施さないAs-castのままの試験片も用意した.1)ST:溶体化処理(700°C,5分間)2)HA:高温時効処理(ST後250°C,15分間)3)IA:口腔内温度時効処理(ST後37°C,3日間)熱処理後の試験片は硬さの測定を行った後に接合強度試験に供した.破断時のFracture force(Ff;N)を求めた.また,破断面のSEM観察を行った.熱処理後の硬さ(VHN)はそれぞれ,As-cast:224±6,ST:148±5,HA:279±8,IA:248±11であった.溶体化処理後の口腔内温度の時効でこの金合金の硬さは高温で時効した時の硬さに近づいた.Controlの試験片でST後に口腔内温度で時効させた試験片(IA)のFf値は高温で時効させた試験片(HA)のFf値と有意な差(p>0.05)は認められなかった.

レーザー溶接したIA試験片のFf値はHA試験片のFf値には及ばなかったが,As-cast試験片およびST試験片のFf値に比較して有意に高い値を示した.As-cast試験片とST試験片のFf値に有意差は認められなかった.SEM観察ではレーザー溶接部位の結晶粒が微細化していることがわかった.
ラボCDベース1細胞アッセイ用ハイスループットスクリーニングシステム

ラボCDはマイクロ流路をシリコン基板に反応性イオンエッチング(Deep-RIE)により形成させて作製した。流路はディスクの中心から外側に向けてジグザグ形に作成した。一枚のディスク上に24本の流路があり、一本の流路に313個のμチャンバーが付いている。チャンバーのサイズは300μm×200μm×46μmのU字型である。チャンバー一つあたりに分離される溶液の体積は約1.5nlである。このラボCDのインレット部分にPCR試薬とサルモネラ菌の混合溶液を1μl入れ、5000rpmで30秒間回転させる事によって細胞単離を行った。その後、連続的にthermal cyclerを用いて95°Cで2分の溶菌、続けて95°Cで5秒、55°Cで10秒、72°Cで10秒のサイクルで反応させる事によってPCRを行い、サルモネラ菌固有遺伝子であるinvA遺伝子を増幅し、イメージングアナライザーで蛍光強度を確認した。細胞一個からのPCRが可能か調べるために、PCR試薬中に400cells/μlの濃度でサルモネラ菌を入れ、細胞単離を行った後、溶菌し、PCRを行い、その蛍光強度を確認してみた。その結果、ボアソン分布に依存した細胞数に従った蛍光強度の分布を確認する事ができた。Table1には、それぞれの濃度でのボアソン分布による各μチャンバーに入る細胞の数の確率を示した。このことから、細胞数に応じた蛍光強度になる事が確認された。また、今後の研究においては蛍光強度が2500を越えたものをポジティブとすることに決めた。さらに、大腸菌とサルモネラ菌を100cells/μlの濃度でPCR試薬中に入れたものでもPCRを行った。その結果、200cells/μlのサルモネラ菌のみを入れたPCR試薬の結果よりも、少ない細胞数が確認された。200cells/μlの大腸菌のみを入れたものでは全く蛍光強度が上がらなかったため、大腸菌とサルモネラ菌との間でサルモネラ菌に対しての選択性が確認された。本研究では、大掛かりな装置を必要とせず、さらに動力源としてマイクロポンプなどを使わずに、単純にデバイスを回転させることで、ハイスループットに細胞懸濁液からの単一細胞分離を行うことができる手法を確立することを目的とし、マイクロ流路および集積化したチャンバーを設けたdiskを作製した。さらにdiskの用途を展開させるため、単一細胞分離した後に、真核細胞のon-diskでの単一細胞からの培養とPCRの可能性についても検討を行った。Disk上に中心から周縁に向かって遠心力で液体が流れるようにジグザグ型の流路を設け、この流路に沿って1流路あたり、512個のチャンバーを配置したものを、PDMSで作製した。1枚のdisk上に24流路を設けてあるため、12288チャンバーに一度に細胞懸濁液を流すことができる。このdiskを用いて大腸菌、パン酵母、Jurkat cell(ヒト急性白血病T細胞)および、NIH3T3 cell(マウス胎児性線維芽細胞)などの細胞懸濁液を流路に遠心力(3000rpm)で流した。分離後このdisk上でそのまま培養を行った。送液の動力源として遠心力を採用したデバイスであるdisk上流路を使って、簡便に大腸菌、パン酵母、Jurkat cell、NIH3T3 cellという異なる細胞のシングルセル分離を行うことができた。さらに、水を入れて飽和水蒸気圧にした密閉容器に単一細胞分離したままdiskを入れて、それをインキュベーターに入れるだけで単一細胞からの培養も行えることがわかった。また、PCRについてPDMSで作製したdiskで試みたが、PDMSの気体透過性のため、水が蒸発してしまい、この材質では困難であった。このため、diskの材質をシリコンにかえ、蒸発を防ぎ、また、PCRの時の熱伝導をよくしたところ、遺伝子のみのサンプルについては、PCRの結果、確認できることが示唆された。

このことから、細胞数に応じた蛍光強度になる事が確認された。また、今後の研究においては蛍光強度が2500を越えたものをポジティブとすることに決めた。さらに、大腸菌とサルモネラ菌を100cells/μlの濃度でPCR試薬中に入れたものでもPCRを行った。その結果、200cells/μlのサルモネラ菌のみを入れたPCR試薬の結果よりも、少ない細胞数が確認された。200cells/μlの大腸菌のみを入れたものでは全く蛍光強度が上がらなかったため、大腸菌とサルモネラ菌との間でサルモネラ菌に対しての選択性が確認された。
南米在住日系人のがん罹患の実態とその要因に関する疫学的研究

1.サンパウロ在住日系人のがん実態調査(1)死亡:1979年より81年迄の3年間に死亡した日系人の死亡票、男性2107名(内、日本生まれの1世1313)女性1561名(同、1033)分を収集し、死因別に日本およびサンパウロ市とのがんによる死亡率の比較を一世についてSMRを用いて行った。日本との比較において、全部位(男)、食道(男)、直腸(男)、肝臓、胆のう(男)、肺(女)が有意な低値を示す一方、前立腺が高値であった。また、サンパウロとの比較では、全部位、食道(男)、乳房、前立腺が有意な低値を、胃(男)、膵臓が高値を示す結果を得た。(2)罹患:1969年より10年間についてサンパウロがん登録において収集した罹患票より、日系人と思われる男性1684名、女性1394名、ポルトガル系の名前を持つ男性1844名、女性2114名を収集し、部位別の比率についての検討を行った。4079歳の年齢に限り解析すると、最も頻度の高い部位は、男性の日系人・ポルトガル系人と女性の日系人では胃がんであったが、女性のポルトガル系人は子宮がんであった。また、日本の部位別罹患割合をもとに、年齢標準化罹患比を算出すると、ブラジル日系人では皮膚、前立腺、乳房が有意な高値を、肝臓、直腸、胃において有意な低値を示した。2.B型肝炎ウィルス(HBV)、成人T細胞性白血病/リンパ腫ウィルス(HTLVーI)の感染調査ボリビアのサンタクルスおよびブラジルのサンパウロに居住する、日系人および現地住民1856名より血清を採取し、HBVについてはHBsの抗原・抗体を、HTLVーIについては抗体を測定した。HBs抗原の保有率は、成人においてはサンタクルスの日系人が約5%、サンパウロの日系人が約2.5%と日系人に高かったが、サンタクルスのボリビア人は約0.5%と低値であった。また、HTLVーIについては、その抗体陽性率は出身母県に依存し、沖縄や長崎県出身者で約20%に認められたが、他県出身者は殆ど0%であった。一方、ボリビア人においても少なからずHTLVーI抗体の保有者が存在する事が明らかになった。今後は、サンパウロ在住日系人において認められたがん罹患様式が、どのようなライフスタイルに由来するのかを明らかにできるような研究に展開してゆきたい。
ヘッジホッグ関連因子STILによる浸潤突起を介した膵臓癌浸潤機構の解明

膵臓癌をはじめとする多くの癌細胞では、浸潤突起(invadopodia)と呼ばれる構造体を形成し細胞外マトリックスを破壊し浸潤すると考えられている。しかし、浸潤突起の形成機構は大部分が明らかなっていない。これまでの浸潤突起形成過程におけるSTILの局在の経時的解析により、STILは浸潤突起の形成初期に起こるとされる骨格形成に関与していると考えられる知見が得られた。そのため、浸潤突起骨格形成に関連する因子とSTILとの関係について検討を行い、STILノックダウン細胞ではアクチン結合タンパク質Cortactinのリン酸化物(Y421)が減少していることを見出した。さらに、Proxymity ligation assay(PLA法)により、浸潤突起におけるSTILとCortactinの複合体形成を膵臓癌培養細胞で確認した。膵臓癌病理組織においても、PLA法を施行し、STILとCortactinの複合体シグナルを確認した。以上よりSTILはCortactinを介し浸潤突起形成に関与していると考えられ、今後STILとCortactinリン酸化の関係について解析を進めたいと考えている。STILは浸潤突起の骨格が形成される段階に関与していると考えられる知見が得られたため、細胞底面の浸潤突起骨格形成に関連する因子とSTILとの関係について検討を行った。具体的には蛍光免疫細胞染色やウエスタンブロッティングにより、浸潤突起関連因子(Src, Integrin Beta-1, Pyk2, FAK, Cortactin等)の分布や発現量について、STILノックダウン細胞とコントロール細胞で比較を行った。その結果、STILノックダウン細胞ではリン酸化Cortactin(Y421)が減少していることを見出した。in situでSTILとCortactinの複合体形成を確認するため、膵臓癌培養細胞でPLA法を施行し、浸潤突起形成部におけるSTILとCortactinの複合体形成シグナルを確認した。さらに膵臓癌病理組織においても、PLA法を施行し、STILとCortactinのシグナルを確認した。また、本研究ではこれまで膵臓癌培養細胞Panc-1を使用してきたが、BxPC-3などPanc-1以外の膵臓癌培養細胞でもSTILノックダウンにより浸潤突起が減少することを確認した。さらに乳癌培養細胞MDA-MB-231でも、同様の現象を確認した。研究は進展しているものの、Cortactinは当初STILと共同して浸潤突起形成に関与していると予想した分子とは異なり、その検索に時間を要した。そのため研究はやや遅れていると判断した。次年度は、1STILがCortactinのリン酸化をどのようにして制御しているかを明らかにすること及び2病理組織における検討を予定している。1ではCortactinやそのリン酸化に関わる分子(Src, Arg)及びSTILとの結合を、タグ付きタンパク質を用いた免疫沈降法やPLA法により解析することを予定している。2では、膵臓癌外科病理検体(パラフィン包埋切片)を多数症例用い、PLA法により非癌部と前癌病変部、浸潤癌部でSTILとCortactinの結合を検討することを予定している。膵臓癌をはじめとする多くの癌細胞では浸潤突起(invadopodia)と呼ばれる構造体を形成し細胞外マトリックスを破壊し浸潤すると考えられている。しかし浸潤突起の形成機構は大部分が明らかなっていない。申請者は膵臓癌で発現が上昇しているヘッジホッグ関連因子であるSTIL(SIL, SCL/TAL1 Interrupting Locus)に対する特異的siRNAにより浸潤突起が消失するという予備的知見を得ており、本課題では浸潤突起形成におけるSTILの分子機能について分子細胞生物学及び病理組織学的手法によりに解明し、もってSTILを介した膵臓癌浸潤機構の解明ならびに膵臓癌新規治療標的開発への基盤的知見を得ることを目的とし研究を行っている。本年度は、膵臓癌培養細胞でSTILノックダウン細胞内局在の変化する浸潤突起関連タンパク質の探索、STILの生細胞内におけるイメージングシステムの確立および、膵臓癌外科病理手術検体におけるin situでのSTILと浸潤突起関連蛋白の結合の検討を行った。STILノックダウン膵臓癌細胞では、STILと共局在しているという知見を得ている浸潤突起関連因子fascin1やcortactinの局在が変化し、接着斑の形成が低下することを見出した。即ちSTILは、cortactinやfascin1を介して浸潤突起形成に関与していると考えられる。また、本年度はマウスSTILベクターを導入により、タグ付きSTIL組み換え体の細部内局在解析を可能にするシステムを確立した。外科病理検体においては、膵臓癌では正常部位と比較し、STIL-fascin1がより共局在していることを症例を増やし確認した。STILを過剰発現細胞は生存が困難であり、膵臓癌培養細胞におけるSTILの蛍光ライブセルイメージングに至っていない。本年度はヒト特異的STILsiRNAによるSTILノックダウン細胞及びタグ付きマウスSTILの導入によりSTILを過剰発現させることが可能になった。次年度はこの系を用い蛍光付きSTILを導入を考えている。免疫沈降法による浸潤突起関連因子の結合性解析も予定していたが、蛍光免疫染色による検索により見出したcortactinのタグ付き組み換え体も作成中である。

申請者は膵臓癌で発現が上昇しているヘッジホッグ関連因子であるSTIL(SIL, SCL/TAL1 interrupting locus)に対する特異的siRNAにより浸潤突起が消失するという予備的知見を得ており、本課題では浸潤突起形成におけるSTILの分子機能について分子細胞生物学及び病理組織学的手法によりに解明し、もってSTILを介した膵臓癌浸潤機構の解明ならびに膵臓癌新規治療標的開発への基盤的知見を得ることを目的とし研究を行っている。本年度は、STILノックダウン膵臓癌培養細胞を用い、浸潤突起連因子の細胞内における時空間的変化、および浸潤突起の軸となる細胞骨格の形成との関連を解析するとともに、免疫沈降法によるSTILと浸潤突起形成因子の結合性の検討、膵臓癌外科病理手術検体におけるin situでのSTILと浸潤突起関連因子の結合の検討を引き続き行った。浸潤突起形成過程を時空間的に解析した結果、STILノックダウン細胞では細胞底部のアクチン骨格構造形成が乏しく、浸潤突起形成部においてアクチン骨格構造の形成が認められなかった。このアクチン骨格形成は浸潤突起形成の初期段階に起こると考えられたため、浸潤突起形成初期の細胞底面の細胞骨格形成に関連する因子にも検索の幅を広げ、STILとの関連について検討を行った。その結果、それまでSTILと関連があると考えられた浸潤突起関連因子であるcortactinやfascin1に加え、Focal adhesion kinase(FAK)をはじめとする細胞骨格関連因子も関連が示唆されたため、今後STILとの関連を検討する予定である。本年度、浸潤突起の形成過程と浸潤突起関連因子の局在や細胞骨格の形成について解析を行った中で、STILノックダウン細胞では浸潤突起が形成される細胞底面においてもアクチンによる細胞骨格形成が乏しく、浸潤突起の軸となるアクチン骨格形成を認めなかった。そのため当初STILが関与すると予想された浸潤突起形成段階より初期の段階においてSTILが浸潤突起形成に関与している可能性が生じた。そのため、STILノックダウン細胞で蛍光免疫染色等を行い、候補となる因子を検索したが、そのために多くの時間を要した。膵臓癌をはじめとする多くの癌細胞では、浸潤突起(invadopodia)と呼ばれる構造体を形成し細胞外マトリックスを破壊し浸潤すると考えられている。しかし、浸潤突起の形成機構は大部分が明らかなっていない。これまでの浸潤突起形成過程におけるSTILの局在の経時的解析により、STILは浸潤突起の形成初期に起こるとされる骨格形成に関与していると考えられる知見が得られた。そのため、浸潤突起骨格形成に関連する因子とSTILとの関係について検討を行い、STILノックダウン細胞ではアクチン結合タンパク質Cortactinのリン酸化物(Y421)が減少していることを見出した。さらに、Proxymity ligation assay(PLA法)により、浸潤突起におけるSTILとCortactinの複合体形成を膵臓癌培養細胞で確認した。
植物由来化合物ピペロングミンによる活性酸素種代謝異常と腫瘍細胞特異的致死の解析

メトフォルミンによるDNA損傷修復機構について詳細な解析を行うため、損傷の特定を試みた。ファンコニー経路欠損細胞群とTDP1欠損細胞が、メトフォルミンに対する強い感受性を示すことから、タンパクーDNAクロスリンク損傷(DPCs)とトポイソメラーゼDNAトラッピングの2つに焦点を絞り、実験を行った。薬剤処理した細胞をセシウム密度勾配遠心にかけることによりDNAを分離精製し、DNA分解酵素による処理後にFITC標識(DPCs定量)、または抗トポイソメラーゼ抗体で標識することで、それぞれの損傷量の確認と定量する実験系を立ち上げた。この一年においては、少なくともメトフォルミン処理ではDPCsは生じないことは確認できた。トポイソメラーゼDNAトラッピングについては新規採択課題に引き続いて解析を継続する。27年度は、ピペロングミン同様に腫瘍細胞特異的微小環境下で致死効果をもたらす試薬の解析に進捗があり、これら試薬による作用機序の解析に重点をおいた。そのうち、低酸素下で細胞致死効果をもたらすチラパザミンについて、ニワトリDT40由来の様々なDNA修復遺伝子破壊細胞を用いて解析した。チラパザミンの低酸素下特異的によるDNA損傷については、以前から予想されていたTopoisomerase-DNA複合体によるものであることを確認し、さらにDNA-Ligase反応における異常中間体、5'-AMP-DNAによる損傷の可能性も示唆された。この結果を基に、酸素濃度依存的なチラパザミン誘発DNA損傷のスペクトルに関する論文の投稿を進めている。さらに、腫瘍細胞特異的微細環境の一つである低栄養については、無グルコース培地で強い感受性を示すビグアナイド薬であるメトフォルミンとペンフォルミンについて、同様な系を用いた解析を進めている。この2つの薬剤は非常に類似した化学構造であるにも関わらず、メトフォルミンだけがDNA二重鎖に架橋を形成する損傷を生じること、さらにその損傷がファンコニ経路で修復されることを見出した。これら分子レベルでの架橋形成機構とその修復機構について、トリDT40細胞のみならず、ヒト由来細胞を用いた系を新たに立ち上げて解析を始めている。細胞内微細環境の一つである低栄養状態で特異的に致死効果をもたらすビグアノイド薬剤の致死効果をDNA損傷誘導という今まで未知の領域からの成果が得られた。今後のビグアノイド薬剤によるDNA損傷とその修復機構の解析に大きな進捗が期待できるため。27年度は腫瘍細胞微細環境のうち、低酸素下特異的に致死効果を与えるチラパザミンに焦点を当てた解析を行い、その一連の知見についてChem. Toxicol. Res.に投稿し、28年度に受理された。また今年度は、腫瘍細胞微細環境の一つである低栄養下(無グルコース下)特異的に致死効果を示す2種類のビグアノイド薬剤、メトフォルミンとフェンフォルミンについて、DNA修復に関わる機能に焦点を当てた解析を進めた。今年度から、ニワトリBリンパ細胞株DT40のDNA損傷修復遺伝子欠損細胞と共に、ヒトリンパ細胞由来細胞TK6の遺伝子編集変異細胞パネルの使用を始めた。メトフォルミンとフェンフォルミンはいずれも無グルコース下で致死効果が増大するが、低酸素下では致死効果の増加は見られない。DT40細胞を用いた解析ではグルコース枯渇下で、DNA-topoisomerase I-DNA complex修復に携わるtdp1欠損株が、これら薬剤に対して強いグルコース枯渇下感受性を示した。また、DNA鎖間架橋修復に関わるfanc経路欠損細胞群、特にfanc core complexに関わるfancc, fancl欠損細胞が、メトフォルミンに対してのみ強いグルコース枯渇下感受性を示した。以上より、両薬剤は共にグルコース枯渇下処理でDNA損傷を生じさせること、特にメトフォルミンはfanc経路に依存したDNA損傷を引き起こすことが明らかになった。また、両薬剤によるグルコース枯渇下で生じるDNA損傷は異なることが示唆された。2種類のビグアノイド薬剤のうち、メトフォルミンについては解析が順調に進み、臨床利用されている細胞濃度においても、特にfanc欠損下では細胞死をもたらすことが示された。fanc経路抗がん剤として利用されているシスプラチンはDNA架橋修復に関わることが知られていることから、メトフォルミンとの併用療法への基礎データを得ることができたと考えられることから、この点に焦点を当てた研究成果の投稿準備を進めている。平成29年度は、腫瘍細胞微細環境の一つである低栄養下(無グルコース下)特異的に致死効果を示す2種類のビグアノイド薬剤、メトフォルミンとフェンフォルミンについて、DNA修復に関わる機能に焦点を当てた解析を進めた。特にメトフォルミンは糖尿病治療薬として広く使用されていることから、臨床面からも注目を集めている。ニワトリDT40細胞を用いた系におけるDNA架橋損傷の修復に関わるfanc経路遺伝子群欠損細胞に対し、この薬剤が無グルコース下特異的に強い感受性を示すこと、さらにfanc遺伝子群の中でも特にメトフォルミン感受性を示すfannc, fanclの欠損細胞では、臨床治療濃度以下でもDNA損傷が起こることを染色体断裂の発生頻度から証明した。これらは同年度にPlos Oneに投稿し、受理、発表された。さらに28年度にDT40細胞を用いたグルコース枯渇下解析で、DNA-topoisomerase I-DNA complex修復に携わるtdp1欠損株が、メトフォルミン、フェンフォルミン共にグルコース枯渇下で強い感受性を示すことを見いだした。このことから、致死原因損傷の一つとしてTDP1が修復に関与するDNA-topoisomerase I-DNA complex(topo-DNA complex)の可能性が考えられた。