hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
環境に関する情報と政策的課題の対称性を担保する仕組みとしての意思決定支援システム

複数の主体(国家、中央官庁、地方自治体など)に間で、共有する資源と環境を巡る係争を回避するためには「狭義の政策決定者」であるこれらの主体と「広義の政策決定者」である一般市民の間で「情報」と「政策的課題」の共有を担保することも「意思決定支援システム」が果たすべき機能であるとの認識に立脚して、本研究では「意思決定支援システム」の構築に際して,交渉の当事者間と一般市民が「情報」と「政策的課題」を円滑に共有するための方法論を探求することを志向した。複数の参加者による議論に於いて「政策的課題の対称性」を数量化するための方法論として、テキストマイニングにより得られる発言者の発言量、発言のやりとりのネットワーク、各指標の時間経過におけるダイナミクスから、議論の進捗に於ける各段階について指数として得る為の方法論を開発し、現実の事例に適用することでその有用性を明らかにした。また、開発された方法論をWeb上で公開可能なシステムとしてインプリメントすることで、誰でも自分が関心を有する議論に適用することが可能な「開かれた意思決定支援システム」に成り得ることを示した。また、複数の国家が関与する政策課題について、当事者である一国の国営通信社が打電するニュース(外電)に関して、政策課題に関わるキーワード相互の「近さ」である「コサイン距離(類似度)」をテキストマイニングにより時系列的に把握することにより、当該国の政策が変化する過程を把握し得ることを明らかにした。このように本研究で開発・検証された方法論は「狭義の政策決定者」と「広義の政策決定者」との間に於ける「情報」と「政策的課題」の共有を推進し得ることから、その方法論をインプリメントした「意思決定支援システム」を構築することの可能性が示唆された。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。国家や地方自治体のような「狭義の政策決定者」と「広義の政策決定者」である一般市民の間での「情報」と「政策的課題」の共有を担保することも「意思決定支援システム」が果たすべき機能であるとの見解に本研究は立脚している.本研究では,「意思決定支援システム」を構築するための方法論を開発し,交渉の当事者間と一般市民に提供される「情報」と「政策的課題」の共有(対称性の担保)に関する情報が,交渉を進展させる為に有用であることを明らかにすることを志向している.「情報」と「政策的課題」が共有されている(対称性が担保されている)度合いを,マスメディアでの報道等の公開されている情報から指標化する手法を確立することを本研究では目指している.事例研究として想定していた「福島県の中間貯蔵施設建設」に加えて,同県での避難者による元の居住地への「帰還」を事例研究とする事を検討した.また,複数の「国内外での送電事例」について,その問題の所在と構造を明らかにし,4報の学術論文として公刊した.また,「政策的課題の対称性」を数量化する手法について検討を行い,テキストマイニングによる対応分析より,議論に参加する当事者の見解が「どの程度近いか」について数量化する可能性について検討した.その一環として,福島県に於ける避難者の「帰還」に関わる議論と,電力貿易に関わる一事例について,数量化を試行した.更に,二つの文章の類似度を数量化する方法論に関する既存研究を概観し,本研究への適用性を検討した.複数の国際河川での水資源を巡る国家間での係争について,事例としての妥当性を検証する為に,問題の所在と構造の解析を行った.「政策的課題の対称性」について,福島県での「中間貯蔵施設」建設計画を含めて複数の事例について,対象事例としての妥当性について検討した結果,同県における「避難者の帰還」に関する議論が「政策的課題の対称性」を数量化する事例として適していることが明らかになった.数量化の方法論として,テキストマイニングによる対応分析の結果から,議論を行っている二者の見解について,その「近さ」を数量化する手段について検討を行った.電力の国内外での貿易に関わる議論については,アイスランドから英国への送電計画,タジキスタンからパキスタンおよびアフガニスタンへの送電計画,米国ハワイ州での島嶼間での送電計画など,幾つかの事例について,その問題の所在と議論の構造について分析を進めた.「情報の対称性」を数量化する為の方法論については,幾つかの国際流域での実例を調査すると共に,専門家からのヒアリングを重ね,適切な方法論を構築する為の手掛かりを得る事に努めた.「情報」と「政策的課題」の共有を,例えば国家や地方自治体のような「狭義の政策決定者」と「広義の政策決定者」である一般市民の間での「担保することは,「意思決定支援システム」が果たすべき主要な機能の一つであるとの見解に本研究は立脚している.本研究では,「意思決定支援システム」を構築するための方法論を開発し,交渉の当事者間と一般市民に提供される「情報」と「政策的課題」の共有(対称性の担保)に関する情報が,交渉を進展させる為に有用であることを明らかにすることを志向している.「情報」と「政策的課題」が共有されている(対称性が担保されている)度合いを,マスメディアでの報道等の公開されている情報から指標化する手法を確立することを本研究では目指している.東日本大震災に起因する福島県での避難者による元の居住地への「帰還」を,同県広野町を対象事例として解析を進め,それから得られた知見を3報の学術論文として公刊した.

「政策的課題の対称性」を数量化する手法について検討を行い,word2vecアルゴリズムを適用したテキストマイニングにより,議論に参加する当事者の見解が「どの程度近いか/遠いか」について数量化する可能性について検討し,複数の単語を個々にベクトル化した場合のコサイン距離が指標として有用であることを明らかにした.複数の国際河川での水資源を巡る国家間での係争について,メコン川流域でのサヤブリ・ダム建設が事例として妥当であることを検証する為に,問題の所在と構造の解析を行った.また,電力貿易に関わる事例についても,米国ハワイ州での島嶼間での送電計画を事例とする数量化を試行した.前年度の研究で,東日本大震災に起因する福島県における「避難者の帰還」に関する議論が「政策的課題の対称性」を数量化する事例として適していることが明らかになったことから,その議論に関する分析を進めた.方法論に関する研究として,議論を行っている二者の間での「政策的課題の対称性」をテキストマイニングにより指標値として得る為の方法論として,word2vecアルゴリズムを適用し,ベクトル化した2つの単語のコサイン距離(コサイン類似度)を指数として用いる可能性について検討を進め,学術論文として公刊した.具体的には,福島県での被災者の「帰還」について,行政と被災者の間で「政策的課題の対称性」を担保する手段として地方紙(新聞)が機能していることを,地方紙での報道に於ける「帰還」に関してword2vecアルゴリズムにより解析し,その結果が現地でのヒアリングにより得られた状況と整合することを確認した.また,「政策的課題の対称性」が地元での行政の担当者間で成立しているか否かを可視化する方法論として,テキストマイニングによる対応分析が有用であることを福島県に於ける事例研究より明らかにし,学術論文として公刊した.また,「情報の対称性」を数量化する為の方法論については,福島県での事例に関する観察から,地元の住民と自治体の間で「地元紙」を通じて共有されている情報が,当該地方の自治体と中央政府との間でも共有されているか否かを検証する為に,「地方紙」と「全国紙」の間での「情報の対称性」をテキストマイニングにより指標化することが有用であるとの知見を得た.更に,方法論を適用する事例として,米国ハワイ州での島嶼間での送電計画等の事例について,その問題の所在と議論の構造について分析を進めた.複数の主体(国家、中央官庁、地方自治体など)に間で、共有する資源と環境を巡る係争を回避するためには「狭義の政策決定者」であるこれらの主体と「広義の政策決定者」である一般市民の間で「情報」と「政策的課題」の共有を担保することも「意思決定支援システム」が果たすべき機能であるとの認識に立脚して、本研究では「意思決定支援システム」の構築に際して,交渉の当事者間と一般市民が「情報」と「政策的課題」を円滑に共有するための方法論を探求することを志向した。複数の参加者による議論に於いて「政策的課題の対称性」を数量化するための方法論として、テキストマイニングにより得られる発言者の発言量、発言のやりとりのネットワーク、各指標の時間経過におけるダイナミクスから、議論の進捗に於ける各段階について指数として得る為の方法論を開発し、現実の事例に適用することでその有用性を明らかにした。また、開発された方法論をWeb上で公開可能なシステムとしてインプリメントすることで、誰でも自分が関心を有する議論に適用することが可能な「開かれた意思決定支援システム」に成り得ることを示した。
南アジアにおける日本からの直接投資と貿易構造変化のモデル分析

この研究は,南アジア諸国と日本との投資・貿易構造を分析し,南アジアと日本の将来の国際分業構造を予測することを目的とした実証研究である.我々は,まず,OECDのSITC5桁の貿易細分類データを,日本とアメリカについて抽出し,これを47産業分類に統合した.この47分類のやり方は,阿部の「日米の産業内貿易」などでとられたものである.この分類に従って,貿易のあり方が,グルーベル=ロイド指標を計算して,垂直貿易型であることを,そして東南アジアと比べると明らかな違いがあることを示した.次にどの分野に日本からの直接投資が南アジアに行ったかを,東洋経済の『海外進出企業総覧』のデータを抽出して,この47分野別に時系列で分析した.東南アジアの場合と同じように,産業内分業の進展や,新しい比較優位産業の進展は,日本からの直接投資の動きに大きく左右されていることが統計数値で示せた.東アジアから東南アジアへ,そして中国・ベトナムとともに,南アジア諸国へと世界の資本が流れ,かつその比較優位構造も,東アジアから,東南アジアへと,そして南アジアへと,労働集約財の比較優位が移行している.上記に述べた事実は大量のデータを要約する形で,すでに分析を終えている.こうした統計分析を基礎に,東アジア,東南アジア,南アジアを含めた,いわゆる「雁行形態論」を中心においたマクロ計量モデルを,現在,作成の途上にある.完成は1-2カ月後を予定している.同時進行の関連研究で「日本の製品輸入をめぐって」では,アジアからの製品輸入比率のまだまだ低いことを指摘したが,その中身が,すでに韓国・台湾・シンガポールなどは,欧米との構造に近づきつつあるが,マレーシア・インドネシアなどは少し遅れ,南アジアの場合ははるかに遅れていることが実証できた.この研究は,南アジア諸国と日本との投資・貿易構造を分析し,南アジアと日本の将来の国際分業構造を予測することを目的とした実証研究である.我々は,まず,OECDのSITC5桁の貿易細分類データを,日本とアメリカについて抽出し,これを47産業分類に統合した.この47分類のやり方は,阿部の「日米の産業内貿易」などでとられたものである.この分類に従って,貿易のあり方が,グルーベル=ロイド指標を計算して,垂直貿易型であることを,そして東南アジアと比べると明らかな違いがあることを示した.次にどの分野に日本からの直接投資が南アジアに行ったかを,東洋経済の『海外進出企業総覧』のデータを抽出して,この47分野別に時系列で分析した.東南アジアの場合と同じように,産業内分業の進展や,新しい比較優位産業の進展は,日本からの直接投資の動きに大きく左右されていることが統計数値で示せた.東アジアから東南アジアへ,そして中国・ベトナムとともに,南アジア諸国へと世界の資本が流れ,かつその比較優位構造も,東アジアから,東南アジアへと,そして南アジアへと,労働集約財の比較優位が移行している.上記に述べた事実は大量のデータを要約する形で,すでに分析を終えている.こうした統計分析を基礎に,東アジア,東南アジア,南アジアを含めた,いわゆる「雁行形態論」を中心においたマクロ計量モデルを,現在,作成の途上にある.完成は1-2カ月後を予定している.同時進行の関連研究で「日本の製品輸入をめぐって」では,アジアからの製品輸入比率のまだまだ低いことを指摘したが,その中身が,すでに韓国・台湾・シンガポールなどは,欧米との構造に近づきつつあるが,マレーシア・インドネシアなどは少し遅れ,南アジアの場合ははるかに遅れていることが実証できた.
放射減衰を考慮した相対論的プラズマシートの動力学と粒子加速

相対論的高温プラズマ中での磁気リコネクションは、超高温プラズマシートを閉じ込めるために強磁場領域で存在するので、リコネクションの時間発展に伴って作られる相対論的高エネルギー粒子は、シンクロトロン減衰を受ける。輻射減衰効果を取り入れた相対論的電磁粒子コードでリコネクションの粒子加速を調べた。その結果、輻射減衰によってプラズマシートとガス圧が下がり、高速リコネクションが起きることがわかった。また更に、孤立系でのリコネクションだけでなく、複数のプラズマシートが相互作用する複数の磁気島が相互作用する系についても研究し、粒子加速の効率が著しく向上することを見出した。本年度は、2次元および3次元粒子コードを用いた乱流磁気リコネクションの電磁粒子シミュレーションを行った。リコネクションによって作られた沢山の磁気島の間を荷電粒子がランダムに散乱されることで加速されるフェルミ過程について調べた。従来の予想とは異なり、加速時間がアルフベン速度と光速の比の1次オーダーの加速過程であることが分かってきた。具体的に行った計算は、(1)乱流リコネクションの非線形過程を調べるために、初期条件として8枚の電流シートが存在する系をとり、その時間発展を調べた。まず線形段階ではそれぞれの電流シートから沢山の磁気島が形成され、そして非線形段階では、それらの磁気島が電流層を超えて合体しながら乱流状態へと変化する乱流リコネクションの計算に成功した。そしてその非線形発展に伴い、全体の数パーセント程度の粒子がプラズマシートの熱エネルギーの10倍以上に加速されることを確認した。(2)次に非熱的粒子の加速効率について考察した。荷電粒子が磁気島と相互作用するときは、リコネクションのX点への流入領域ではなく、X点から噴き出すジェット領域であることを見出した。この選択的散乱課程が加速効率の向上に貢献していることを突き止めた。またエネルギースペクトルについても調べたが、高エネルギー側のスペクトルは予測した冪型分布ではなく、2温度のマックスウェル分布に近いものが得られた。粒子数が少ないためエネルギー空間の分解能がよくないことも考えられるので、粒子数を増やした計算を試みながら、加速効率の考察を行った。太陽圏終端衝撃波やパルサー風星雲の終端衝撃波では、多数の電流層が形成されることが理論的に予想されており、このような系で生じる磁気リコネクションは多数の磁気島を伴う磁気リコネクション過程が進行することが想定される。このような系での高エネルギー粒子加速を2次元粒子コードを用いた計算を行った。本年度は以下の成果を得た。昨年度は、相対論的温度を持ったプラズマシートでの乱流リコネクションについての研究であったので、それを発展させて非相対論的温度についても計算を行った。加速効率は、初期温度にはほとんど依存せずに、べき則に従う非熱的粒子が形成されることを大規模数値計算で確かめた。また、プラズマシートに対して縦磁場(ガイド磁場)の有無についても考察を行った。今回は空間2次元の計算であるので、リコネクションの構造には若干の非対称性があらわれるが、粒子加速の効率の観点では、縦磁場の有無にかかわらず、高効率の粒子加速が進行することが確かめられた。以上の結果から、少なくとも2次元系においては、多数の磁気島を伴う乱流リコネクションにおいては、乱流的散乱により高効率の粒子加速過程が起きることが示された。パルサー磁気圏やマグネター(超強磁場天体)などの天体からは、高エネルギー粒子によるシンクロトロン輻射が観測されるが、高エネルギー粒子の起源については、しばしば磁気リコネクションによる可能性が指摘されている。しかし、その物理的メカニズムは理解が乏しく未解決問題が山積している。本研究課題では、よく発達したプラズマシートで期待できる乱流的な磁気島合体に着目した磁気リコネクションの粒子加速の研究を、相対論的電磁粒子コードを用いて進めた。特に、本年度はこれまでに行ってきた3次元性について集中的に研究を行った。まず、3次元粒子計算を始めるに当たり、計算機コードを、MPIとOpenMPを適宜用いたハイブリッドアルゴリズムに改良し、並列計算効率を高める工夫を行った。次に、3次元乱流リコネクションの計算を、縦磁場のある相対論的プラズマシードに対して行った。3次元計算では、磁気島が空間的に局在化した構造をもつが、粒子加速は2次元計算と同様に起きることが確かめられた。また、べき分布のエネルギースペクトルはソフトになるが、熱的分布から非熱的分布へと変わるエネルギー帯が低エネルギー側にシフトするので、全非熱的エネルギーのエネルギー密度は熱的エネルギーと同程度もしくはそれを凌駕するまで加速することが分かった。3次元では、リコネクションジェットの相互作用による粒子加速効率は下がるが、加速域に注入する効率が上がるためと考えられる。また当初の研究目標にしていた輻射減衰との競合過程は、輻射減衰が磁気散逸率を促進することは、我々が既に発表した論文(Jaroschek and Hoshino, PRL, 2009)と同様な効果があることを確認できたが、粒子加速への効果は限定的であった。

以上より、乱流磁気リコネクションの粒子加速が高効率で起きるという重要な結果を得た。我々が提案している多数の磁気島合体による磁気リコネクションの粒子加速過程は、プラズマシートの初期温度や磁場配位などにあまり依存せず、高効率の粒子加速が幅広いプラズマ現象に応用できることが分かっていきたのは予想以上の成果である。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでは空間2次元の計算に留まっていたが、粒子の輸送過程は空間次元に大きく左右される。3次元の粒子コードを用いた大規模計算により、空間3次元性によって加速効率がどの程度修正を受けるか調べる。
電子・陽子衝突による素粒子物理学の研究

世界で初めての電子・陽子衝突装置としてDESYに建設中のHERAにおいて,国際協力実験ZEUSを行なうための予備調査研究である.主たる目的は,国際協力によって,高精度ハドロンカロリーメーターの基礎開発を行ない,物理反応に適した本実験用の測定装置を設計し,かつ建設準備を進めることであった.予備研究の目的は十分に果され, ZEUS測定器のための基礎開発,設計が完了した.本格的測定器建設準備もほぼ整った.予備研究も国際協力によって進められたが,具体的に我々が関与した成果は次のとおりである.1.高性能シンチレーターの開発研究と量産体制における性能検査法の確立2.光電子増倍管の比較検討と性能試験3.透過型光電子増倍管の性能試験4.カロリーメーターのe/n比測定のためのテストカロリーメーター建設と測定5.劣化ウラニウム利用のプロトタイプカロリーメーターの性能測定6.カロリーメーターにシリコン検出器を挿入したe/π分離の研究以上の研究のうち,一部は国内で,一部はDESY(西ドイツ)やCERN(スイス)へ出かけて推行した.また一部に継続中の試験(3,6)もあるが,大半は終了し,建設に向けての量産体制が軌道に乗ろうといている.今後は,信号処理,トリガー等のエレクトロニクス系の開発を同じく国際協力によって進める一方,測定器建設に着手する.世界で初めての電子・陽子衝突装置としてDESYに建設中のHERAにおいて,国際協力実験ZEUSを行なうための予備調査研究である.主たる目的は,国際協力によって,高精度ハドロンカロリーメーターの基礎開発を行ない,物理反応に適した本実験用の測定装置を設計し,かつ建設準備を進めることであった.予備研究の目的は十分に果され, ZEUS測定器のための基礎開発,設計が完了した.本格的測定器建設準備もほぼ整った.予備研究も国際協力によって進められたが,具体的に我々が関与した成果は次のとおりである.1.高性能シンチレーターの開発研究と量産体制における性能検査法の確立2.光電子増倍管の比較検討と性能試験3.透過型光電子増倍管の性能試験4.カロリーメーターのe/n比測定のためのテストカロリーメーター建設と測定5.劣化ウラニウム利用のプロトタイプカロリーメーターの性能測定6.カロリーメーターにシリコン検出器を挿入したe/π分離の研究以上の研究のうち,一部は国内で,一部はDESY(西ドイツ)やCERN(スイス)へ出かけて推行した.また一部に継続中の試験(3,6)もあるが,大半は終了し,建設に向けての量産体制が軌道に乗ろうといている.今後は,信号処理,トリガー等のエレクトロニクス系の開発を同じく国際協力によって進める一方,測定器建設に着手する.
矯正学的歯の移動におけるLIPUS及びPRPの効果について

本研究はLIPUS(超音波)による骨代謝活性効果に着目し、歯の移動の迅速化について検討した。同時に既に歯の移動の迅速化が報告されている多血小板血漿(PRP)を併用し、比較検討した。LIPUS、PRPは組織の代謝活性を高め、歯の移動を迅速化する可能性が示唆されたが、両者の歯の移動の組織変化は異なることがわかった。LIPUS、PRPは組織の代謝活性を高め、歯の移動を迅速化する可能性が示唆されたが併用について注意が必要である。目的】低出力超音波(low-intensity-pulsed ultra-sound=LIPUS)は副作用の殆どない骨形成の促進法として骨折やインプラント治療に利用されているが、矯正治療への応用は殆どない。本研究はLIPUSによる骨代謝活性効果に着目し、歯の移動の迅速化について検討した。【資料および方法】11週齢のWistar系ラット(雄)を使用。上顎切歯・第一臼歯間にNi-Ticlosed coil(トミー)を装着し、矯正力約10gにて第一臼歯を移動した。移動モデルをControl群(C群)、PRP群(P群)、LIPUS群(L群)、LIPUS+PRP群(LP群)の4群にわけ、P群、L群には0.05ml/100gのPRPを、C群、L群には同量の生理食塩水を装置装着時に口蓋に局所投与した。その後L群、LP群は、LIPUS照射(伊藤超短波)15min/dayを行った。歯の移動1、3、7日後にラットを固定し、μ-CT撮影後、脱灰、包埋し切片を作成、光顕にて骨吸収形成動態の観察を行った。【結果】全群とも歯の移動距離は経時的に大きくなり、LP群、L群、P群、C群の順に移動した。7日例はP群、L群、LP群がC群に比べて有意に歯が移動し、LP群はP群、L群間でも有意差が認められた。骨量は同日例でグループ問に有意差は認められなかったが、C群及びL群が経時的な骨量の減少が見られたのに対しP群及びLP群は3日から7日例にかけて急激な骨量の減少を示した。またLP群は有意な歯の移動と同時に顕著なアンキローシス、歯根吸収像も認められた。【考察】以上の結果よりLIPUS,PRPとも骨吸収を促進し歯の移動を迅速化する可能性があるが、骨形態の経時的変化の違いより両者の迅速化のメカニズムは全く異なることが考えられる。またLP群において有意な歯の移動著明な骨吸収像を示したことは、LP群において本矯正力は過剰であり、骨代謝の変化により至適矯正力も変化する可能性が考えられた。低出力超音波(LIPUS)は矯正治療への応用は殆どない。本研究はLIPUSによる骨代謝活性効果に着目し、歯の移動の迅速化を検討した。更に歯の移動の迅速化ができる多血小板血漿(PRP)を併用し、比較検討した。【資料と方法】11週齢のWistar系ラット(雄)を使用。上顎切歯・第一臼歯間にNi-Ti coil(トミー)を装着し矯正力約10gにて第一臼歯を移動した。移動モデルをControl群(C群)PRP群(P群)LIPUS群(L群)LIPUS+PRP群(LP群)の4群にわけ、P群、L群には0.05ml/100gのPRPをC群L群には同量の生理食塩水を装置装着時に口蓋に局所投与した。歯の移動1、3、7日後にラットを固定し、μ-CT撮影後、脱灰、包埋し切片を作成、光顕にて骨吸収形成動態を観察した。全群とも歯の移動距離は経時的に大きくなり、LP群、L群、P群、C群の順に移動した。骨量は同日例でグループ間に有意差はなかったが、C群及びL群が経時的な骨量の減少が見られたのに対しP群及びLP群は3日、7日例にかけて急激な骨量の減少を示した。またLP群は有意な歯の移動と同時に骨癒着、歯根吸収像も認められた。以上よりLIPUS,PRPとも骨吸収を促進し歯の移動を迅速化する可能性があるが、骨形態の経時的変化の違いより両者の迅速化のメカニズムは全く異なると考えられる。

またLP群が有意な歯の移動著明な骨吸収像を示したことは、LP群において本矯正力は過剰であり、骨代謝の変化により至適矯正力も変化する可能性が考えられた。LIPUS、PRPは組織の代謝活性を高め、歯の移動を迅速化する可能性が示唆された。
mRNA trans-splicingを応用した表皮水疱症モデルマウスの治療

本研究では、先天的に皮膚が脆弱で外的刺激により容易に水庖を形成する遺伝病である表皮水庖症(EB)のモデルマウスであるCol17KOマウスを用い、mRNAのスプライシング過程で遺伝子変異を修復する治療法について検討した。Col17KOマウスは、エクソン2がPGK-neoに置換されており、治療用分子として、正常なCol17 exon2, 3を含みイントロン4に相補的に結合するmRNA発現ベクターを作成した。その際、イントロン4との結合部位(バインディングドメイン: BD)を、(1)313bp(エクソン4寄り)、(2)313bp(エクソン3寄り)、(3)BD1, 2がオーバーラップした511bpの3種作成した。その結果、いずれのBDを有する治療法分子においても、スプライシングの過程で外的に導入発現した正常なCol17 exon2, 3が組み込まれ、正常のCol17 mRNA、そしてCOL17タンパクが発現したことが確認できた。3種のBDの中では511bpのBD2が最も効率が良かった。Spliseosome-Mediated RNA Trans-splicing(SMaRT)として近年報告されている本手法は、全長のcDNAを導入する古典的な遺伝子治療に比較して(1)治療用分子が小さくてよい、(2)導入遺伝子(RNA)過剰発現されても正常以上にタンパクが産生されることがない、(3)優性遺伝性疾患にも有用である、などの利点がある一方、(1)治療効率が劣ることが多い、(2)これまでの報告は主に3'側の変異による検討が主である、という問題点が挙げられる。本研究で用いたCol17KOマウスでは、エクソン2がPGK-neoに置換されているため、これまで報告が少なかった5'側のtrans-splicingの有用性について検討でき、5'側においても治療効果がある事が示された。しかし、今後の臨床応用には、正常のCOL17タンパク発現量を増やすなど更なる改良が必要である。今後、EBに対する新規治療法開発に向けて治療効果改善について検討していきたい。
腱板断裂モデルラットにおける棘下筋の代償性筋肥大

腱板断裂モデルラットを作成し,その構成筋の重量変化,筋肉での筋肥大関連遺伝子の発現を調査した結果,腱断裂を免れた腱板構成筋の一部では腱断裂によって生じた機能的喪失を代償するために筋肥大関連遺伝子,タンパクの発現が上昇する事が判明した.この現象は断裂が広範囲に及ぶことでより顕著となり,特に棘上筋・棘下筋腱と肩甲上神経を切離した場合には残存筋である小円筋の代償性筋肥大は著明に認められた.本研究の結果は,腱板断裂症例において経験的に言われていた,リハビリテーションを通じた残存筋のトレーニングによる腱板機能の再獲得という治療コンセプトを科学的に裏付けるものであることが判明した.肩腱板断裂において,手術治療が不能な症例,希望しない症例では残存した腱板構成筋に機能を代償させることを目的としたリハビリ治療が行われることがあるが,残存した腱板構成筋における機能代償の結果としての筋肥大が生じたとする報告はない.本研究の目的は腱板断裂モデルラットの腱板構成筋の形態学的,生化学的変化を調査することで残存腱板構成筋の筋肥大メカニズムがどのように機能しているかを調査することである.我々は全身麻酔下に棘上筋腱断裂を施したモデルラットを作成し,経時的に屠殺,腱板構成筋を採取し,棘上筋,棘下筋について時間経過での重量変化および筋肥大関連遺伝子(IGF-1,Akt)の発現をPCR,ウエスタンブロッティングを行い調査した.棘上筋腱断裂後,棘上筋重量は時間経過と共に減少を続け,本モデルの妥当性が示された.残存した棘下筋については棘上筋腱断裂後早期には一時的に重量の減少を認め,その後は上昇傾向を示すものの,有意な重量の上昇は認めなかった.IGF-1およびその受容体の遺伝子発現は時間経過と共に有意に上昇し,筋肥大における再母内シグナルであるAktのリン酸化(活性化)については術後14日までに一時的な低下を認めたが,その後は上昇傾向を示していた.これらの結果から,棘上筋腱断裂後の棘下筋では,棘上筋の機能代償のために筋肥大関連遺伝子の発現が促進しており,臨床における残存筋に対するリハビリが合目的であることが推測された.腱板断裂モデルラットを作成し,その構成筋の重量変化,筋肉での筋肥大関連遺伝子の発現を調査した結果,腱断裂を免れた腱板構成筋の一部では腱断裂によって生じた機能的喪失を代償するために筋肥大関連遺伝子,タンパクの発現が上昇する事が判明した.この現象は断裂が広範囲に及ぶことでより顕著となり,特に棘上筋・棘下筋腱と肩甲上神経を切離した場合には残存筋である小円筋の代償性筋肥大は著明に認められた.本研究の結果は,腱板断裂症例において経験的に言われていた,リハビリテーションを通じた残存筋のトレーニングによる腱板機能の再獲得という治療コンセプトを科学的に裏付けるものであることが判明した.肩腱板断裂において,手術治療が不能な症例,希望しない症例では残存した腱板構成筋に機能を代償させることを目的としたリハビリ治療が行われることがあるが,残存した腱板構成筋における機能代償の結果としての筋肥大が生じたとする報告はない.本研究の目的は腱板断裂モデルラットの腱板構成筋の形態学的,生化学的変化を調査することで残存腱板構成筋の筋肥大メカニズムがどのように機能しているかを調査することである.我々は全身麻酔下に棘上筋腱断裂を施したモデルラットを作成し,経時的に屠殺,腱板構成筋を採取し,棘上筋,棘下筋について時間経過での重量変化および筋肥大関連遺伝子(IGF-1,Akt)の発現をPCR,ウエスタンブロッティングを行い調査した.棘上筋腱断裂後,棘上筋重量は時間経過と共に減少を続け,本モデルの妥当性が示された.残存した棘下筋については棘上筋腱断裂後早期には一時的に重量の減少を認めるも,その後は上昇傾向を示し,術後28日以降は有意な重量の上昇を認めた.IGF-1およびその受容体の遺伝子発現は時間経過と共に有意に上昇し,筋肥大における再母内シグナルであるAktのリン酸化(活性化)については術後14日までに一時的な低下を認めたが,その後は上昇傾向を示していた.これらの結果から,棘上筋腱断裂後の棘下筋では,棘上筋の機能代償のために筋肥大関連遺伝子の発現が促進しており,臨床における残存筋に対するリハビリが合目的であることが推測された.肩腱板断裂において,手術治療が不能な症例,希望しない症例では残存した腱板構成筋に機能を代償させることを目的としたリハビリ治療が行われることがあるが,残存した腱板構成筋における機能代償の結果としての筋肥大が生じたとする報告はない.本研究の目的は腱板断裂モデルラットの腱板構成筋の形態学的,生化学的変化を調査することで残存腱板構成筋の筋肥大メカニズムがどのように機能しているかを調査することである.肩関節これまでの研究結果から,棘上筋腱断裂モデルラットでは棘下筋での筋肥大関連遺伝子の発現増加は認めるものの,棘下筋自体の肥大現象は認められなかった.このため,実験の発展型として予定していた棘上筋腱断裂モデルラットに対する運動負荷実験の計画を変更し,棘上筋腱および棘下筋腱の切離による腱板大断裂モデルにおける残存する小円筋の肥大現象の調査実験を開始している.この実験の結果,残存する小円筋では有意な筋肥大を確認することが出来た.

現在までに安静状態での腱板断裂モデルラットでの残存筋の代償性筋肥大の存在が確認されており,2年目以降の運動負荷による筋肥大促進実験に向けておおむね順調に伸展していると考えている.腱板大断裂モデルラットにおける小円筋の肥大現象について,筋肥大関連タンパクの発現解析を行い,筋肥大現象に対する遺伝子・タンパク発現の関与を調査する.早急に腱板断裂+運動負荷モデルラットを作成し,同様の実験を行うことで実験を進めていく.研究用試薬などの購入を行ったが,年度末に使用困難な端数が生じたため平成26年度の物品購入費として当てる予定である.実験試薬,機器等の購入に使用し,一部残存した研究費については平成25年度請求分と合わせて引き続き実験試薬,機器購入に充てる予定である.
助産ケアの可視化－ケア実践と教育の視点から

対象の身体変化と助産ケアを可視化する観点から研究を実施した。早産で出産した褥婦の進行性変化を観察とサーモグラフィにより可視化した。産褥3日までに皮膚表面温とその高温領域が緩やかに上昇拡大し、1か月に下降縮小していた。乳房皮静脈への血流を促し、分泌を促すケアが重要である。また、助産師のケア過程を語りから質的に分析し、その視跡を可視化した。助産師は、助産観と対象特性を基にケアを行ない、気持ちを共有し関係性を強めていた。ケアと同時に観察を実施している様相が視跡により可視化された。腰背部痛に関する研究は進行中であり、学生と熟練者とのケアの比較は、学生の視跡を捉えた段階で比較に至っていない。1.22名の早産事例の乳房進行性変化を、乳汁分泌、乳房表面皮膚音、乳房状態に関する主観および観察情報により分析した結果を「早産褥婦の進行性変化」と題し、報告した。2.上記結果を2例の正常産の早期に乳房の緊張が強くなった褥婦の早期ケアに活用し、苦痛の緩和に繋げた。22名の早産事例の乳房の進行性変化を、乳汁分泌、乳房表面皮膚温、乳房の主観および観察情報によりテータを収集し分析した。[対象の背景]年齢は2243歳、初産婦、経産婦各11名で、経腟分娩5、帝王切開17例で、超早産7、後期早産4名であった。[結果]1乳汁分泌量は、1か月では454.5mlと、正期産より少なかったが、19例が産褥1日から1か月までの搾乳量の増加を認め、搾乳回数を1日7回の維持ができ、児の必要量を満たすことができていた。2Riordanが推奨しているように1日8回の搾乳を実施できていたのは、1か月では23.5%であったが、7回以上維持できていたのは94.1%でああった。産褥7日までに1日乳汁分泌量が300ml以上あれば、母乳育児が継続できる目安になる。3乳房緊張は、正期産同様に産褥3日に上昇し、3日から5日にかけて乳汁分泌量の増加を認めた。4乳房表面皮膚温は、1日から3日へと広がり、1か月には75%を維持していた。乳汁分泌量の良否で比較したところ、産褥1日の乳房皮膚高温領域が80%を超え、前胸部全体に広がりを認める場合は、乳汁不良となる可能性が高い。5後期早産事例は、児が効果的な吸着を行えまま退院することが多く、1か月の時点で分泌量や分泌感、催乳感も減少を認めた。また、6母児分離状態の事例には、児からの直接的空腹感を訴えられることがないので、エモーショナルなサポートや催乳を促す働きかけが必要であることが示唆された。7サーモグラフィの画像で褥婦自身の乳房の状態を共有することにより、安心と継続の動機づけができた。平成26年度実施予定は「学生、新人などの初学者とベテランの腰痛・乳房・産痛のケア技術を可視化し、ケア技術の改善点を記述的に明らかにし、技術教育への示唆を得る」であった。現在大幅に実施が遅れ、ベテラン助産師の産痛ケア技術の可視化のための研究計画が倫理委員会に承認を得られた段階である。計画を当初から若干変更し、ベテラン助産師の分娩第1期のケアについて、参加観察と合わせ、そのアセスメントおよびケアの意図、ケアの実施評価についての認識を面接により、把握する。また、ゴーグル式のアイカメラにて視線分析を近々に行う予定である。現在プレテストの実施を計画し、その後、どうように学生、新人と進める予定である。熟倫理委員会の承認(2015-019)を得て、練助産師2名に分娩第1期のケア(実施したケアおよびその判断情報、意図、評価)について半構成的面接より聴取し、修正版GTAにより質的に分析を行った。さらに客観性を高めるため参加観察をし、アイカメラによりそのケア状況と助産師の視跡を撮影し、口述内容との照合を行った。その結果、11のカテゴリー(以下<>)と、26のサブカテゴリーが得られた。<診断・ケアの根幹である助産観>に基づいて、<助産師が捉えた産婦像>に対し、<陣痛と産婦の表情・反応の見極め><産婦を見て分娩経過を感じ取る>ことをしながら、<分娩になると判断する>。また、<同僚・医師との相談>をしながら<産婦の痛みの表出を見逃さないケアの提供><家族への適切な助言と希望を叶えるケアの提供>を行っていた。さらに(必要時)、<対象と分娩進行の見極め直し>を行い、産婦と<分娩に向けて気持ちを共有>し、分娩後には<ケアと分娩後の振り返り>をしていた。動画・視線軌跡の分析から助産師の語りが裏付けられ、また、必要なケアを判断し、ケアを提供しながらも常にモニターなどの観察を続けている、ハイリスク施設のケアの様相が捉えられた。P.Bennerのいう熟練看護者の様相と類似する、助産師の助産護観に基づいて、産婦との相互作用のなかで五感をおよび直観により産婦と、その分娩経過を捉え、ケアを提供し、振り返るというケア過程を展開していた。

また、そこにはM.Newmanのいう援助関係の発展として気持ちの共有が伺えた。対象の身体変化と助産ケアを可視化する観点から研究を実施した。早産で出産した褥婦の進行性変化を観察とサーモグラフィにより可視化した。産褥3日までに皮膚表面温とその高温領域が緩やかに上昇拡大し、1か月に下降縮小していた。乳房皮静脈への血流を促し、分泌を促すケアが重要である。また、助産師のケア過程を語りから質的に分析し、その視跡を可視化した。助産師は、助産観と対象特性を基にケアを行ない、気持ちを共有し関係性を強めていた。ケアと同時に観察を実施している様相が視跡により可視化された。腰背部痛に関する研究は進行中であり、学生と熟練者とのケアの比較は、学生の視跡を捉えた段階で比較に至っていない。他事業のため研究に取り組めず、27年度まで延長を依頼している。新たに研究協力者を得て再開する予定である。医歯薬学計画を当初から若干変更し、ベテラン助産師の分娩第1期のケアについて、参加観察と合わせ、そのアセスメントおよびケアの意図、ケアの実施評価についての認識を面接により、把握する。また、ゴーグル式のアイカメラにて視線分析を近々に行う予定である。現在プレテストの実施を計画し、その後、どうように学生、新人と進める予定である。合わせて、産痛を強く訴える産婦、微弱陣痛・遷延気味産婦の下半身の皮膚温の変化をサーモグラフィにて明らかにする。他の業務を優先し、研究に取り組む時間をとらなかった。正常な経過をたどる褥婦の乳房の変化と、ケアの効果を測定することは、先行研究の知見を活用し、実施しなかった。補助事業をおよそ2年中断した。よって次年度に予算を使用したい。速やかに研究を再開する。1.早期から乳房表面皮膚温が上昇する褥婦のサーモデータを取りつつ、適切なケアを実施し、主観情報と観察情報を得る。2.産痛を強く訴える産婦、微弱陣痛・遷延気味な産婦の腹部および下肢の皮膚表面温の変化を明らかにする。3.ベテラン助産師と学生、新人などの初学者の産痛ケア技術を、VTRおよびメガネカメラにより可視化し、ケアの思考と技術の改善点を記述的に明らかにし、教育への示唆を得る研究を進める。正常な経過をたどる褥婦の乳房の変化と、早産事例の知見と合わせ、ケアの効果を測定する。また、ペインスコアなど主観情報と合わせ産婦の下肢などの皮膚温の測定を開始し、基礎データを収集する。簡易サーモグラフィ500,000計画通り実施ができなかったため。アイカメラ、簡易サーモグラフィ等必要な機材、学会発表等計画通り進める。1「早産褥婦の進行性変化」について国内外の学会発表する。2産婦の皮膚温の測定については、特別なケアを提供しない事例には、謝金(図書カードなどにより)を支払う。3簡易のサーモグラフィを購入する。
ＴＤＰ－４３コンディショナルノックアウトマウスを用いたＡＬＳ／ＦＴＤの病態解明

FTD/ALSの原因タンパクTDP-43による神経変性の機序解明のため、神経特異的かつタモキシフェン誘導性TDP-43コンディショナルノックアウトマウスを作出し、その表現型を解析した。マウスの週齢に関わらず、TDP-43のノックアウト後、約2週間から運動異常が顕在化し、次いで認知機能の低下を認め、約5週間で衰弱死した。病理学的には海馬、脊髄の神経細胞脱落と高度のグリオーシスを認めた。以上から、TDP-43のloss-of-functionがTDP-43による神経変性の一機序を担うと考えられる。前頭側頭葉型認知症/筋萎縮性側索硬化症(FTLD/ALS)の原因タンパクの一つとしてTDP-43が同定されたが、TDP-43による神経変性の機序が、toxic gain-of functionあるいはloss-of-functionによるものかは未だ判然としていない。そこで、本研究では、TDP-43のloss-of-functionによる神経変性の機序解明のため、神経特異的かつタモキシフェン誘導性TDP-43コンディショナルノックアウトマウスを作出し、その表現型を解析した。TDP-43 floxホモマウスとThy1.2-Cre-ERT2マウスの交配によって、Thy1.2-Cre-ERT2/TDP-43 floxホモマウスを作出し、5μモル/kgのタモキシフェンを5日間経口投与することで、任意のタイミングで内因性のTDP-43のノックアウトを行った。体重、生存率、運動機能(Rotarod、Wire hanging)、病理学的解析を1週間毎に試行した。認知機能(営巣、open field、NORT)は3週目に試行した。すると、マウスの週齢に関わらず、TDP-43のノックアウト後、約2週間から振戦、claspingといった運動異常が顕在化し、次いで認知機能の低下を認めた。4週目からは麻痺と筋萎縮が顕著となり、約5週間で衰弱死した。病理学的には海馬、脊髄の軽度の神経細胞脱落と高度のグリオーシスを認めた。本モデルがFTLD/ALSの表現型を再現することから、TDP-43のloss-of-functionがTDP-43による神経変性の一機序を担うと考えられた。本研究では、家族性および孤発性の筋萎縮性側索硬化症(ALS)/前頭側頭葉型認知症(FTD)の原因タンパクであるTDP-43に対する神経特異的コンディショナルノックアウトマウスを作出することを通じて、TDP-43の機能喪失による神経変性の詳細なメカニズムを明らかにし、ALS/FTDに対する新たな診断・治療への展開を目指すことを目的としている。これまでの報告で、古典的手法によるノックアウトマウスが胎生致死であり、また、単純な薬剤誘導性コンディショナルノックアウトマウスは脂肪代謝障害にて致死となることが判明している。これらの問題を回避しつつ、また、成人の疾患であるALS/FTDの病態を再現するために、成熟期以降のマウスにおいて任意のタイミングでTDP-43の機能喪失を検討する必要があることから、薬剤誘導性・神経特異性コンディショナルノックアウトマウスの作出を試みた。マウス内因性TDP-43遺伝子のエクソン34を挟む形でloxP配列を挿入したTDP-43 floxホモマウスとタモキシフェン誘導性・神経特異性Cre(Thy1.2-Cre-ERT2)トランスジェニックマウスと掛け合わせることで、最終的に、タモキシフェン誘導性・神経特異性TDP-43コンディショナルノックアウトマウスThy1.2-Cre-ERT2/TDP-43 floxホモマウスを得た。このマウスの発育は、タモキシフェンが投与されない限り野生型マウスに比して異常は認めなかった。0.5μモル/g体重のタモキシフェンを5日間連続経口投与することで、成熟期以降のマウスにおけるTDP-43ノックアウトを試みたところ、任意の週齢のマウスにおいて神経細胞のみのTDP-43ノックアウトが成功した。投与後4ー5週間で異常行動、振戦、運動麻痺を呈し、衰弱死を呈した。TDP-43がFTLD/ALSの原因タンパクの一つとして同定されてきたが、TDP-43による神経変性の機序として、toxic gain-of functionあるいはloss-of-functionによるものかは未だ判然としていない。TDP-43 floxホモマウスとThy1.2-Cre-ERT2マウスの交配によって、Thy1.2-Cre-ERT2/TDP-43 flox

ホモマウスを作出し、5μモル/kgのタモキシフェンを5日間経口投与することで、任意のタイミングで内因性のTDP-43のノックアウトを行った。体重、生存率、運動機能、病理学的解析を1週間毎に試行した。認知機能は3週目に試行した。マウスの週齢に関わらず、TDP-43のノックアウト後、約2週間から振戦、claspingといった運動異常が顕在化し、次いで認知機能の低下を認めた。4週目からは麻痺と筋萎縮が顕著となり、約5週間で衰弱死した。病理学的には海馬、脊髄の軽度の神経細胞脱落と高度のグリオーシスを認めた。本モデルがFTLD/ALSの表現型を再現することから、TDP-43のloss-of-functionがTDP-43による神経変性の一機序を担うと考えられる。神経内科当初の予定通り、神経特異的かつタモキシフェン誘導性TDP-43コンディショナルノックアウトマウスを作出し、その表現型が前頭側頭葉型認知症/筋萎縮性側索硬化症の症状を呈することが明らかとなった。当初の予定通り、成熟期以降のマウスにおいて任意のタイミングでTDP-43の機能喪失を可能とする、薬剤誘導性・神経特異性TDP-43コンディショナルノックアウトマウスの作出が成功した。今後、本モデルを用いて新規の診断・治療法の開発を進める予定である。作出したTDP-43ノックアウトマウスの表現型について、1臨床的な病勢経過の観察や、活動量の変化や運動機能検査、記憶テストなどの行動解析2脳内マイクロダイアリシス-リアルタイムHPLCによる神経伝達物質の変化量の直接解析3MRIによる中枢神経系の経時的な器質的変化の解析4免疫学的手法を用いた生化学的、組織学的評価、などを用いて総合的かつ詳細に判定する。また、TDP-43ノックアウトマウスから、大脳皮質、海馬、脊髄をトータルRNAを採取し、発現プロファイルの変化を定量比較することで、TDP-43機能喪失のダウンストリームを解析し、神経変性のメカニズムを明らかにする。上記の研究計画を遂行するに当たり、細胞培養およびマウス管理に対する消耗品費、RNA発現プロファイルの網羅的解析の外注委託費として主に使用する。
細胞チップを用いた抗原特異的T細胞の迅速・高効率な検出・作製法の開発

近年、がんの免疫療法が注目を集めているが、治療の有効性を評価するよいシステムがないことが問題となっている。本研究では、金らが確立した画期的なリンパ球マイクロチップ法(Jin A. et al., Nature Medicine ; 15 : 1088-1092, 2009)を応用し、がん特異的T細胞を迅速にかつ高精度で検出し、癌特異的T細胞を迅速に作製することができる基盤技術を開発することを目的としている。これまでに、抗原特異性が既知のTCRトランスジェニックマウスのT細胞を用い、細胞チップ上で抗原ペプチドで刺激することにより、抗原ペプチド刺激特異的なT細胞のサイトカイン産生を検出できることを示してきた。平成25年度は、この結果を踏まえ、ヒトのT細胞を用い、細胞チップ上で抗原特異的T細胞が検出できるかを検討した。抗原として、ほとんどの日本人が不顕性感染しているEBウイルスのペプチドを用いた。まず、ドナーの末梢血リンパ球をEBウイルスペプチドで刺激し、フローサイトメータを用いて解析し、EBウイルスペプチドに反応しサイトカインを産生するリンパ球が存在するかを確認した。次に、EBウイルスペプチドに反応するリンパ球を含むリンパ球を細胞チップに播種し、1個1個の細胞をマイクロウェルに格納した。チップにEBウイルスペプチドを添加し、細胞を刺激したところ、6時間後に、EBウイルスペプチド刺激特異的にサイトカインを産生する細胞を検出することができた。抗原刺激特異的にサイトカインを産生したT細胞を1個ずつ回収し、回収したリンパ球より、TCR c DNAをRT-PCRにて増幅した。TCRの配列を解析した結果、EBウイルスの特異的なTCRが取得されたことを確認した。以上より、細胞チップを用いることで、抗原に特異的なTリンパ球を、短時間に、非常に高感度に検出できることを示すことができた。今後、この技術をがん免疫治療の効果の評価、及び、がん免疫治療に有効なTCRの取得に応用したい。(抄録なし)近年、抗癌剤が無効な癌を対象として、癌抗原ペプチドを用いて患者の体内の癌特異的T細胞を活性化し癌細胞を傷害する癌ペプチドワクチン療法や、癌特異的T細胞を用いて癌細胞を傷害する免疫細胞療法などの免疫療法が注目を集めている。本研究では、申請者が確立した画期的なリンパ球マイクロチップ法(Jin A. et al., Nature Medicine, 15: 1088-1092;2009)を応用し、癌特異的T細胞を迅速にかつ高精度で検出し、癌特異的T細胞を迅速に作製することができる基盤技術を開発することを目的とする。平成23年年度の研究成果は以下のとおりである。(1)マイクロウェルアレイチップ上にてサイトカイン分泌細胞を検出する条件の検討した。サイトカイン(IL-2,IL-4,IFN-γ)に対する抗体をチップ上にコートし、各マイクロウェルにTリンパ球を播種し、PMAとCa2+ionophoreでリンパ球を活性化しサイトカイン産生を検出するシステムを確立するために、1)チップにコートする抗サイトカイン抗体の種類と量、2)検出に用いる蛍光標識抗サイトカイン抗体の種類と量、3)細胞を刺激し、サイトカインを分泌させる時間等について検討した。(2)MHC/peptidetetramerを用いた抗原特異的T細胞の検出した。刺激条件を検討するために、ニワトリ卵白アルブミン(OVA)由来のペプチドがH-2Kb分子上に結合したMHC/ペプチドを認識するTCR(OT-1 TCR)を発現しているトランスジェニックマウスのTリンパ球を、抗サイトカイン抗体をコートしたマイクロウェルアレイチップに播種し、市販されているOT-1/H-2kb tetramerで刺激しサイトカインの分泌を検出するシステムを確立するために、1)刺激に用いるOT-1/H-2Kb tetramerの量と刺激時間、2)CD28抗体などの副刺激の種類および刺激量について検討した。平成24年度は、MHC/ペプチドテトラマーを用いずに、細胞チップ上で抗原特異的CD8^+T細胞を検出する方法の開発を行った。CD8^+T細胞は、MHCクラスI分子に抗原ペプチドが結合したものをT細胞表面のT細胞受容体を用いて認識し、活性化される。細胞間の相互作用に関わる、細胞膜上の受容体と細胞膜上のリガンドは、本来、別個の細胞表面に受容体とリガンドが発現しており、細胞間の相互作用により、細胞膜上のリガンドと細胞膜上の受容体が相互作用し、受容体よりシグナルが伝達され、細胞が活性化される。近年、このような細胞膜上の受容体とリガンドが1個の細胞上に同時に発現し、1個の細胞上で相互作用する可能性が示されている。CD8^+T細胞の細胞表面には、T細胞受容体が発現しているが、同時にMHCクラスI分子も発現している。これまでに、1個のT細胞の膜表面でT細胞受容体とMHCクラスI分子が相互作用をするという報告はない。そこで、1個のT細胞上で、T細胞受容体と抗原ペプチドが結合したMHCクラスI分子が結合しT細胞を活性化するかを細胞チップを用いて検討した。すなわち、細胞チップにT細胞を播種し、1個1個の生きた細胞をマイクロウェルに格納することで、細胞間の相互作用が起こらない状況を作出した。このような状態で、抗原ペプチドをチップ上の細胞に添加し、数時間の培養後、T細胞が活性化され、サイトカインの分泌が誘導されるかを検討した。

その結果、ペプチド刺激に特異的にサイトカインの産生を誘導できることが示された。これらの結果は、1個のT細胞膜表面において、T細胞受容体と抗原ペプチドが結合したMHCクラスI分子が相互作用できる可能性を示している。現在、実験の再現性、およびT細胞活性化のメカニズムについて、さらに詳細な解析を行っている。近年、がんの免疫療法が注目を集めているが、治療の有効性を評価するよいシステムがないことが問題となっている。本研究では、金らが確立した画期的なリンパ球マイクロチップ法(Jin A. et al., Nature Medicine ; 15 : 1088-1092, 2009)を応用し、がん特異的T細胞を迅速にかつ高精度で検出し、癌特異的T細胞を迅速に作製することができる基盤技術を開発することを目的としている。これまでに、抗原特異性が既知のTCRトランスジェニックマウスのT細胞を用い、細胞チップ上で抗原ペプチドで刺激することにより、抗原ペプチド刺激特異的なT細胞のサイトカイン産生を検出できることを示してきた。平成25年度は、この結果を踏まえ、ヒトのT細胞を用い、細胞チップ上で抗原特異的T細胞が検出できるかを検討した。抗原として、ほとんどの日本人が不顕性感染しているEBウイルスのペプチドを用いた。まず、ドナーの末梢血リンパ球をEBウイルスペプチドで刺激し、フローサイトメータを用いて解析し、EBウイルスペプチドに反応しサイトカインを産生するリンパ球が存在するかを確認した。次に、EBウイルスペプチドに反応するリンパ球を含むリンパ球を細胞チップに播種し、1個1個の細胞をマイクロウェルに格納した。チップにEBウイルスペプチドを添加し、細胞を刺激したところ、6時間後に、EBウイルスペプチド刺激特異的にサイトカインを産生する細胞を検出することができた。抗原刺激特異的にサイトカインを産生したT細胞を1個ずつ回収し、回収したリンパ球より、TCR c DNAをRT-PCRにて増幅した。TCRの配列を解析した結果、EBウイルスの特異的なTCRが取得されたことを確認した。以上より、細胞チップを用いることで、抗原に特異的なTリンパ球を、短時間に、非常に高感度に検出できることを示すことができた。今後、この技術をがん免疫治療の効果の評価、及び、がん免疫治療に有効なTCRの取得に応用したい。計画に沿って研究を行ない、期待されるデータを蓄積してきている。細胞チップ上で、抗原特異的T細胞を検出する方法として、世界で初めて、1個のT細胞上でT細胞受容体と抗原ペプチドMHC複合体が相互作用することで、T細胞が活性化される可能性を示した。今後、そのメカニズムを明らかにすることができれば、画期的な抗原特異的T細胞の検出法に発展する可能性がある。マイクロチップを用いたがん特異的T細胞の検出には、TCRに結合するMHC/pをどのような形にするかが課題であり、MHC/ペプチド・テトラマーを含め、多くの手法を試みる必要がある。(抄録なし)