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中華人民共和国成立直後の中国江南における土地改革の実証的研究

また上海の解放日報と華東政報、蘇北の蘇北日報等の新聞資料についてはマイクロフィルムを購入した。さらに日本及び中国に収蔵されている1950年代初期に発行された土地改革に関する文献の調査・収集にも努め、江南以外の地域の分を含めて50種をこえる関係資料を調査した。こうした資料及び夏井のこれまでの地主制研究から、次のような知見と課題が得られた。知見の第一は、江南の土地改革は日中戦争期・内戦期に行われた土地改革に比較すると和平的に行われ、その大きな要因として、城鎮の寄生地主である管業地主の所有地が約6割を占めていたことにあったと思われることである。戦時期に管業地主の土地及び佃戸への掌握力は低下し、地方政府の協力なしには収租不可能な状況に陥り、土地革命前に既に土地放棄の動きが出て、土地改革の阻礙要因にはもはやなり得なかった。それにも拘わらず地主批判、「江南無封建論」への批判言説が繰り返し行われたのは次の点にあった。保甲長への批判と保甲廃除、反黒田、生産救災運動、公糧徴収、減租減息等、さらには土地改革と不法地主との闘争を通じて、旧在地秩序の破壊と、農民協会による新秩序の建設が共産党政権にとって不可欠であったためであり、このため批判される「地主」は城鎮の管業地主ではなく、在地の旧保甲長、催甲等の存在であった。これが第二の知見である。課題としては、土地改革から集団化を考える上で、田面権等農民の土地所有権の歴史的再検討が必要であるという点である。経済史本研究計画は、地方档案館所蔵資料、新聞資料等を用いて中華人民共和国成立直後の中国江南地方の土地改革の実態を実証的に考察するものである。以下の点から、本研究計画はおおむね順調に遂行されている。第一に、一次資料の調査・収集において、中国江南の土地改革の基本文献である『蘇南土地改革文献』・『蘇南政報』・『華東政報』・『江蘇省農村調査』・『蘇南日報』等についいてはすでに調査・収集が終わっており、今後『蘇南大衆』・『解放日報(上海)』・『新蘇州報』等が残っているが、平成26年度には完了できる予定である。档案館資料については、呉江区档案館、常熟市档案館、蘇州市档案館、江蘇省档案館を訪問し、閲覧可能な資料についてかなりの分量を筆写、あるいは複写による収集を行っている。第二に、近代江南の地主ー佃戸関係の中で、土地改革を位置づけるという点においては、土地改革前、特に戦時期の実態と変化について、『中華民国期江南地主制研究』において考察を行い、土地改革時期の一次資料の分析において、その前提条件を確定することができた。第三に、江南の土地改革の特徴を捉えるため、他地域、特に蘇北と比較分析するという点に関して、蘇北については『蘇北土地改革文献』及び当該時期の新聞のマイクロフィルムによってその実態の考察を行っている。また、中南地区・華南地区についても、国内外の大学・図書館を訪問し、調査・収集を行っている。また日本及び中国での土地改革あるいは中華人民共和国成立時期の状況についての研究論文・著書についてもできるだけ網羅的に収集を行っている。平成24年度は本計画の第一年目として、当初次の4点の研究計画を立てていた。(1)江南土地改革に関する基本的文献の調査・収集。(2)蘇州市档案館等の所蔵資料の調査。(3)蘇北土地改革に関する新聞資料及び蘇北地方の実態調査資料の収集、(4)土地改革に関する文献の収集である。第一点に関しては、基本文献である『蘇南土地改革文献』・『蘇南土改情況』については、蘇州市档案館に所蔵され、『蘇南日報』は上海図書館に所蔵されていることが調査により明らかになったが、筆写による収集となるため、本格的収集は25年度に行うこととなった。
褐色森林土地帯における黒ボク土類縁土壌の火山ガラスの起源

東北地方のうち,秋田県,宮城県,岩手県における黒ボク土およびその近隣の褐色森林土地帯を対象として,土壌調査および土壌試料の採取と各種理化学性の分析を行った。秋田県においては昨年に引き続き,県北部中部の白神山地周辺,八郎湖の東部地域など7カ所において簡易土壌調査(030cm深)および土壌断面調査(0100cm)を行い,土壌試料を採取した。これらの試料の物理化学性,特にアンディック特徴である,酸性シュウ酸塩可溶アルミニウムおよび鉄,リン酸保持量などを調べた。その結果,これらの地帯には広く黒ボク土および類縁土壌(ばん土質褐色森林土)が分布することが確かめられた。土壌の中砂画分(0.050.2 mm)に含まれる火山ガラスをSEM-EDSを用いて一粒ずつ元素分析し,その起源を推定したところ,全ての地域で十和田a火山灰が含まれ,白頭山ー苫小牧火山灰(B-Tm)の影響もみられた。さらに,昨年までの調査で起源が不明であった日本海に近い土壌中の火山ガラスは、戸賀軽石(戸賀カルデラ由来、約40万年前)の可能性があることが明らかとなった。宮城県仙台市で実施した太白山東麓の黒ボク土および黒ボク土類縁土壌6カ所の土壌断面調査で採取した試料について,SEM-EDSを用いて中砂画分(0.050.2 mm)に含まれる火山ガラスの粒数割合と火山ガラス一粒ごとの元素分析を行った。その結果,本地域の火山ガラスは元素組成から3つのグループに分けることが可能であり,その1つは十和田a火山灰と推定することができた。また,表層から次表層では十和田a火山灰の含有率と黒ボク特徴の強弱は良く符合していたことから,本地域の黒ボク土の生成には同火山灰の混入が強く影響する可能性が明らかとなった。一方,残りの2つグループの火山ガラスの起源については既知試料の分析値からは推定できず,試料の拡充等の対応が必要であった。研究代表者は学内外の業務の増加により,野外調査や室内実験に費やす時間を十分に確保することができなかった。研究分担者による研究は順調に進行した。全体として満足できるとりまとめをするためには,もう1年の研究期間が必要と判断したため,研究期間延長の申請を行った。平成2830年度に引き続き,秋田県,宮城県および岩手県において調査範囲を拡大して森林地域の黒ボク土類縁土壌の調査と試料採取を行う。秋田県では,県南部も調査地域に含めて研究を進める。新たに採取する土壌については,火山灰土壌に特有な性質であるアンディック性質に関する分析項目を最初に行う。すなわち,酸性シュウ酸塩可溶アルミニウムおよび鉄,ピロリン酸塩抽出アルミニウムおよび鉄,リン酸保持量,仮比重などである。これに加えて,土壌の一般的な化学性の分析を行う。分析項目は次の通りである。全炭素・全窒素(乾式燃焼法,NCアナラーザーによる),pH(H2O)およびpH(KCl)(ガラス電極法),交換性塩基(Ca, Mg, K, Na)および陽イオン交換容量(CEC)(ショーレンベルガー法に基づく自動抽出装置を使用),交換性アルミニウム(Blakemore法)。また,土壌の粒径分析および各画分の前処理を行い火山ガラス分析の試料を得る。得られた中砂(0.2-0.05mm)部分について,偏光顕微鏡および実体顕微鏡を用いて一次鉱物の同定を行い,火山ガラス含量を求める。試料をポリエステル系樹脂包埋法で固定し,硬化後に表面を研磨して,電顕用試料台にマウントする。これを走査型電子顕微鏡(SEM)ーエネルギー分散型X線分光法(EDX)で多量元素(SiO2, TiO2,Al2O3,FeO,MnO,MgO, CaO, Na2O,K2O)の元素分析を行う。指標テフラ中の火山ガラスについても同様に元素分析を行い,土壌中の火山ガラスと比較する。指標テフラとしては十和田a火山灰(To-a),白頭山ー苫小牧火山灰(B-Tm)などの広域火山灰に加えて,戸賀軽石層などの地域的な火山放出物を加えて検討を行う。東北地方のうち,特に秋田県と宮城県における黒ボク土近隣の褐色森林土地帯を対象として,土壌調査および土壌試料の採取を行った。秋田県(および青森県)においては,白神山地周辺4地点(藤里町,青森県西目屋村),能代市2地点,男鹿市2地点,秋田市1地点,大仙市1地点,横手市1地点において予備的な土壌調査を行い,表層から約50cmまでの試料を集めた。これらの土壌のアンディック特徴(酸性シュウ酸塩溶液可溶アルミニウムおよび鉄,リン酸保持量,など)の分析はほぼ完了し,何れの地点においてもアンディック特徴を満たす,またはそれに近い性質をもつことがわかった。これらのことから,秋田県における褐色森林土地帯の土壌は何れかの火山の火山砕屑物の影響を受けており,その地域は限定的ではないことが示唆された。宮城県では,仙台市太白区茂庭の太白山東麓の丘陵地(仙台市太白山自然観察の森内)を対象に,地形等を考慮した計47地点から表層から約50cmまでの試料を採取し,アンディック特徴の強弱を分析した。この結果をもとに調査地を代表する6箇所を選定し,土壌断面調査を行なった。

その結果,一連の地形面においても,比較的地形の安定した小段丘面のみが淡色普通非アロフェン質黒ボク土に分類され,土層が浅い頂稜は岩盤質普通褐色森林土に,残りはアンディック特徴を弱く持つばん土質褐色森林土となり,褐色森林土地帯のアンディック特徴の強弱と地形との密接な関係が再確認された。土壌試料および指標テフラ試料の粒径分析,中砂(0.2ー0.05mm)部分についての一次鉱物の同定,火山ガラス含量の測定,ガラスの性質については,現在分析等を進めているところである。研究代表者が東北大学から秋田県立大学へ異動し,異動先の教育および管理業務のために時間を割く必要があり,その主な担当である秋田県地域の土壌調査(予備調査)は当初予定の3割程度しか実施できなかった。しかしながら,宮城県ではアンディック特徴の強弱が地形に応じて変化する仙台市近郊の褐色森林土地帯を事例調査地とすることができた。すでに土壌断面調査と試料採取を終えているので,以前に事例調査地とした宮城県大衡村および秋田県秋田市河辺の試料との対比を含めて火山ガラスの断面内分布の特徴や一粒毎の元素分析による起源推定を進めれば,当初の目的を達成することは可能であると考えている。東北地方のうち,秋田県,宮城県,岩手県における黒ボク土およびその近隣の褐色森林土地帯を対象として,土壌調査および土壌試料の採取を行った。秋田県では,県北部の鹿角・小坂地域,北秋田地域,能代・山本地域,男鹿地域にわたる30カ所において簡易土壌調査(030cm深)および代表地点4カ所での土壌断面調査(0100cm)を行い,土壌試料を採取した。これらの試料の物理化学性,特にアンディック特徴である,酸性シュウ酸塩可溶アルミニウム(Al)および鉄(Fe),ピロリン酸塩抽出AlおよびFe,リン酸保持量,仮比重などを調べた。その結果,これらの地帯には広く黒ボク土および類縁土壌(ばん土質褐色森林土)が分布することが確かめられた。土壌の中砂画分(0.050.2 mm)に含まれる火山ガラスを1粒ずつ元素分析してその起源を推定したところ,全ての地域で十和田a火山灰が含まれ,十和田湖に近い地域ではとくに強い影響を受けていた。また,ほとんどの地域で白頭山ー苫小牧火山灰(B-Tm)の影響を受けていることが明らかとなった。宮城県と岩手県においては,昨年採取した仙台市太白山東麓の土壌分析を進めるとともに,宮城県県中央部の鹿島台丘陵(大崎市鹿島台)を対象に28地点の簡易土壌調査(045cm深)と代表地点5カ所での土壌断面調査(0100cm),岩手県県中央部の佐比内丘陵(紫波町)を対象に40地点の簡易土壌調査と代表地点6カ所での土壌断面調査を新たに実施し,それぞれ土壌試料を採取した。新たに採取した土壌試料について,アンディック特徴に関係する理化学性を中心に調べた結果,両地域とも黒ボク土類縁土壌が地形の影響を受けて分布すること,鹿島台丘陵の一部の地形面では普通アロフェン質黒ボク土が,佐比内丘陵の一部の地形面では腐植質褐色非アロフェン質黒ボク土が確認された。平成28年度は研究代表者の勤務地の移動やそれに伴う業務量の増加により,進捗状況は「(3)やや遅れている」であったが,平成29年度では研究代表者および研究分担者ともに順調に研究を進めた。東北地方のうち,秋田県,宮城県,岩手県における黒ボク土およびその近隣の褐色森林土地帯を対象として,土壌調査および土壌試料の採取と各種理化学性の分析を行った。秋田県においては昨年に引き続き,県北部中部の白神山地周辺,八郎湖の東部地域など7カ所において簡易土壌調査(030cm深)および土壌断面調査(0100cm)を行い,土壌試料を採取した。
HTLV-Iのneurotropismに関する研究(特にATLとHAMの病態組織をもちいたin situ liybridization によるvirusの検索)

HAMの病変形成におけるHTLVーIの関わりについて検討し、これまでに、(1)剖検例中枢神経のHTLVーI proviral DNAをPCR法により検索し、HAM脊髄組織に存在を確認、延髄より上位の中枢神経では陰性で、脊髄とは明瞭に区別されること。(2)in situ hybridizationにより脊髄病巣に浸潤しているCD4陽性細胞の一部にHTLVーI proviral DNAが存在することを報告した。病巣でのHTLVーIの局在を明らかにするための、本年度はまず、HAM凍結標本よりDNAを抽出し、定量的PCR法によりproviral DNAのコピー数を検討した。その結果、脊髄病巣では細胞1000個あたり4コピー程度存在し、小脳では0.2コピー以下であった。現在、浸潤炎症細胞の数、特にTーcell subset、macrophage、glia細胞の数と比較しどの系統の細胞に存在しているかについて推定を試みている。また、蛍光色素標識によるin situ hybridization(FISH)法が確立し、さらに染色体標本においてスライド標本自体をPCR増幅する方法が開発できたので、HAM脊髄の凍結標本を用いて同方法を応用した。HTLVーIのPxをコードする領域をSK44・SK45プライマーを用いて凍結切片スライド上でPCR増幅し、あらかじめPCR増幅していたPxプローブをビオチンあるいはジゴキシゲニンで標識し、hybridization後、蛍光染色にてシグナルを観察した。その結果、血管周囲炎症細胞浸潤巣で、少数ではあるが明瞭に陽性の細胞が認められた。細胞マーカーによる二重染色や、コントロールを含む多数例での検討を進め、病巣における感染細胞の種類と動態を明らかにしたい。ATL剖検例の検索も進んでおり、中枢神経への著しい浸潤例と、全身臓器への浸潤にも関わらず神経組織へは殆ど入っていない例があり、HTLVーI感染ATL細胞には向神経性クローンとそうでないものとが存在することが示唆された。向神経性を規定している因子の解析特に感染T細胞、ATL細胞と神経組織間の接着因子について今後研究を進めたい。昨年はin situ hybridizationによりHAM患者の脊随病巣に浸潤しているCD4陽性細胞の一部にHTLVーI proviral DNAが存在することを報告した。その後、HAM剖検例は5例となり、その解析により脊随への浸潤細胞はリンパ球が主体で、病初期にはCD4陽性細胞が、時間の経過した病巣ではCD8陽性細胞が主体で、ミクログリアはDR抗原陽性となっており、HAMの臨床経過にともなって免疫反応のパタ-ンが変化することが示唆された。このHAM病変とHTLVーI感染細胞との関わりを検討するため、パラフィン切片からDNAを抽出、PCRを用いてHTLVーI proviral DNAをdot blottingで検索し病変脊随にその存在を確認した。一方、HTLVーI抗原の免疫組織学的証明は不成功のままで、神経組織固有の細胞へのHTLVーIの感染の有無は未だ明かではない。in situ hybridizationでの証明がkey pointであり、今回、nonーRI probeでHAMの脊随病巣において再検討を行った。また、技術上の問題を改善するために、carrierの末梢血リンパ球やMTー1 cellを用いHTLVーI proviralDNAの検出を検討した。probeとしてgagpol領域を認識するpATK32を用い、nick translationによりビオチン、ジゴキシゲニン^3Hの各々で標識。42°C、overnightでhybridizationをおこなった。

洗浄後、nonーRI probeは蛍光法で、RI probeはオ-トラジオグラフィ-を施行し鏡検した。その結果、脊随標本では蛍光法によるnonーRI probeを用いた方法はRIーprobeに比し、よりバックグランドが高く、細部における感染の検討には適切な方法ではなかった。リンパ球塗沫標本における検討ではビオチン標識probeによるものでMTー1細胞のみで30%程度に陽性であった。copy数が少ないにもかかわらずnonーRI標識にても陽性の所見を得たことにより、今後、より長い領域のprobeを用いる、RNA probeを用いる、RI標識として^<35>S、^<125>Iを用いる、組織におけるPCRの導入等を試み、病巣でのHTLVーI感染の実態を明らかにしたい。
大規模半構造データからの知織発見

計画初年度である平成15年度は,研究課題「大規模半構造データからの知識発見」に関して,以下の13の研究を行った.1.これまで我々が取り組んできた順序木パターン発見アルゴリズムFREQTを拡張して,より現実の半構造データに近いモデルであるラベルつき無順序木からの効率よい頻出パターン発見アルゴリズムUNOTを開発した.このアルゴリズムは,無順序木パターンの高速列挙技法と,パターンの出現の逐次更新手法を組み合わせることにより,1パターンあたりO(kb^2m)時間で,すべての頻出無順序木パターンを重複せずに計算する.ここに,kはパターンサイズ,bはデータの最大枝分かれ数,mはパターンの出現数である.この成果は,昨年10月に札幌で開催された第6回発見科学国際会議(DS'03)で発表した.2.本年度の科研費で購入したPCシステムを用いて,昨年度に開発した半構造データストリームからの高速マイニング手法StreamTの性能評価実験を行った.具体的には,複数の候補パターン管理戦略とオンラインマイニング戦略を組み合わせて知識発見実験を行うことにより,提案手法の有効性を実証した.この成果は,昨年6月に開催された2003年度人工知能学会全国大会で発表し,大会優秀論文賞を受賞した.さらに,人工知能学会主催の国際会議録に招待され,平成16年中にSpringer-VerlagのLNCSシリーズとして出版される予定である.3.これまでに開発された半構造データマイニング手法を分析し,木構造やグラフ構造データを対象にした組み合わせパターンに対する統一的なアルゴリズムを,列挙アルゴリズムの一般的な構成法である逆探索の枠組みで与えることに成功した.この成果は,昨年11月に福岡で開催された情報科学と電気工学国際ワークショップ(ISEE'03)で発表した.計画初年度である平成15年度は,研究課題「大規模半構造データからの知識発見」に関して,以下の13の研究を行った.1.これまで我々が取り組んできた順序木パターン発見アルゴリズムFREQTを拡張して,より現実の半構造データに近いモデルであるラベルつき無順序木からの効率よい頻出パターン発見アルゴリズムUNOTを開発した.このアルゴリズムは,無順序木パターンの高速列挙技法と,パターンの出現の逐次更新手法を組み合わせることにより,1パターンあたりO(kb^2m)時間で,すべての頻出無順序木パターンを重複せずに計算する.ここに,kはパターンサイズ,bはデータの最大枝分かれ数,mはパターンの出現数である.この成果は,昨年10月に札幌で開催された第6回発見科学国際会議(DS'03)で発表した.2.本年度の科研費で購入したPCシステムを用いて,昨年度に開発した半構造データストリームからの高速マイニング手法StreamTの性能評価実験を行った.具体的には,複数の候補パターン管理戦略とオンラインマイニング戦略を組み合わせて知識発見実験を行うことにより,提案手法の有効性を実証した.この成果は,昨年6月に開催された2003年度人工知能学会全国大会で発表し,大会優秀論文賞を受賞した.さらに,人工知能学会主催の国際会議録に招待され,平成16年中にSpringer-VerlagのLNCSシリーズとして出版される予定である.3.これまでに開発された半構造データマイニング手法を分析し,木構造やグラフ構造データを対象にした組み合わせパターンに対する統一的なアルゴリズムを,列挙アルゴリズムの一般的な構成法である逆探索の枠組みで与えることに成功した.この成果は,昨年11月に福岡で開催された情報科学と電気工学国際ワークショップ(ISEE'03)で発表した.
メカノストレスをトリガーとする分子集合法の開拓と機能性分子素子への応用

クリーンで遠隔操作可能な有機流体の流動性制御や物質配列による機能発現を目的として、メカノストレスを外部刺激として用いる洗濯ばさみ型パラジウムおよび白金錯体の分子集合の精密制御法の開拓を行った。環状二核パラジウム錯体を用いる分子集合において、超音波感受性のコントロール方法を検討し、溶媒、超音波照射時間及び構造異性体の添加等の因子により、ゲル化速度や構造のモルフォロジーを制御できることを明らかにした。さらに、対応する白金錯体の超音波応答性分子集合による発光増大現象において、超音波照射時間に依存する発光強度制御に成功した。メチレン鎖をスペーサに有するtrans-ビス(サリチルアルジミン)2核パラジウム錯体の長期に安定な希薄溶液が、1-3秒程度のきわめて短い、低強度の超音波照射によって瞬時にゲル化する新現象を見いだしている。本研究では、種々の超音波条件や濃度、溶媒条件におけるモルフォロジーの制御方法の検討を行い、溶媒によって分子集合様式やゲルの生成機構が変化することを明らかにした。さらに、syn-ビス(サリチルアルジミン)2核パラジウムなど構造異性体との混合系における新しい超音波応答性分子集合制御方法を見出した。trans-ビス(サリチルアルジミン)2核パラジウムと類似構造を有し、中心金属の配位部位として、剛直な配位平面を有するアミノトロポナト、イミノピロールを配位子とする錯体の合成をおこなった結果、剛直な配位部位は、超音波応答性分子集合の著しい阻害要因となり、サリチルアルジミン等の配位平面の高い柔軟性が機能発現には必須であること等が明らかになった。機能発現のための洗濯ばさみ構造の官能基化、機能化に向けての構造設計指針を確立した。サリチルアルジミン配位子を有する環状2核パラジウム錯体は、安定な有機溶液を短時間の超音波照射によって瞬時にゲル化する超分子ゲル化剤となることを見いだしている。本年度は、同様構造を有し、中心金属として白金を有する環状2核白金錯体について研究を行い、メカノストレス応答性分子集合に加えて、メカノストレスに依存した著しい発光強度増大現象を見出した。まず、種々のスペーサー長を有する環状2核白金錯体を設計し、シス、トランス異性体の合成、および、単結晶X線構造解析による各錯体の構造決定を行った。2種の異性体のうち、トランス体のみが、超音波照射で分子内、分子間のπ-スタッキングのスイッチングを起こすことによってゲルを形成することが明らかとなった。生成したゲルは紫外光照射下で、黄緑から黄色の発光を示す。また、発光強度は、超音波照射時間が長いほど増大することが明らかとなった。この現象は、超音波で発光強度を制御するはじめての例となる。一方、シス体は、ゲル形成よりも、結晶生成の方がエネルギー的に有利となる。シス体の結晶は、トランス体に比べて、発光強度が強いことが明らかとなった。特に低温で強い発光を示し、シス体の固体発光量子収率は、トランス体に比べて3倍も大きいことが明らかとなった。このように、環状2核白金錯体は、メカノストレスにより、溶液、固体、ゲルと様々な状態をとることができ、分子集合状態の違いを利用した新しい発光制御法となりうることが明らかとなった。本年度は、分子集合における開始反応、成長反応を含む反応解析を進め、ブロック集合、交互共集合などの精密集合制御法を開拓した。洗濯ばさみ型(+)-Pd錯体と(-)-Pt錯体の1:1混合物に短い超音波を照射すると、それぞれ単独の組成では進行しないゲル化が、瞬間的に起こる。これは、従来その報告すらなかった交互共集合をヘテロキラルかつヘテロメタリックな要素で行うことを示したもので、その新規性は高い。ラセミ体の集合研究では、Pt錯体でのゲル化がラセミ体のPd錯体の集合より数倍速いにもかかわらず、これらの混合でブロック集合を生起せず、交互共集合を起こす。この特異現象における必須条件のヘテロキラル会合とヘテロメタリック会合の優先度の高さを応用することで、様々な集合様式の制御を行った。たとえば、Pd錯体の光学純度とPd/Pt混合比の変化による、交互一ブロック共集合構築などの複合体の精密制御を行った。上述の集合精密制御で得られた集合体をプラットフォームとする高機能性ゲルを開拓した。
アジアにおけるEBウイルス関連腫瘍の民族疫学

対象としたのはEBウイルス陽性T細胞増殖症・リンパ腫(以下PTPD)患者100人に、対照群として同地域に住む健常者100人である。PTPD患者とEBウイルス陽性健常者における血漿中のEBVゲノムについてPCR法により検索した。健常者では全く検出されなかったウイルスゲノムが全ての患者血漿中で検出され、そのうち85.7%についてはそのDNA抽出方法からウイルス粒子由来であることが示唆された。患者と健常者の間に見られる明白な違いから、血漿中に存在するウイルスゲノムはPTPDを診断する上での指標の1つに成り得ることがわかった。PTPD患者の血中TNF-aレベルを測定した。その結果、患者においてTNF-α濃度は有意に高いこと、末梢CD3陽性細胞にEBVゲノム陽性の患者では、陰性の患者より有意にTNF-αレベルが高いことが判った。また、陽性者の中では、TNF-αレベルはLMP-1に欠失を持つEBV感染者の方が、野生型のLMP-1を持つ者より有意に低かった。TNF-aレベルと予後に関しては、死亡群で高いTNF-αレベルを示すことがわかり、経過のモニタにTNF-αレベルを取り入れることが考えられた。Il-10の血漿中レベルを測定したところ、患者の方が有意に高かった。
高速間欠燃焼場における燃料塊と乱流の相互スケールに関する研究

日本の基盤産業の一つである自動車技術を支える基礎研究として、燃焼場における燃料塊と周囲空気との拡散制御を目的とし、特に拡散状態の定量解析法の開発ならびに燃料塊と乱流とのスケールに着目した相互関係の解明に向けた研究を行った。まず、拡散混合過程における燃料塊の不均一性を定量的に表現する手法として、エントロピー法の提案を行った。本手法によると従来の二次元空間フーリエ変換やPDF法と比べて均一性の程度を単一のスカラー量で表現可能となり、均一性の比較や評価を簡単に行うことができた。また、エントロピーの時間変化を解析することにより、等価的な拡散係数を求められること、およびスケール対応度がピークを示す解析対象ウィンドウサイズから不均一流体塊のスケールを特定できることが示された。次に、本手法を用いて非定常噴流およびディーゼル噴霧中の拡散混合現象のミクロ構造解析を行った。その結果、拡散速度は噴流の上流で小さな構造で強い拡散が、また下流にいくにしたがって拡散強度は減少するほか、相対的に大きな構造の拡散が優勢となっていることが確認できた。また、拡散促進を目的として噴霧火炎に噴流を衝突させる実験を行った結果、衝突領域の周辺部で大きなスケールの拡散が、また衝突部では小さなスケールの拡散が顕著に促進され、燃焼期間の大幅な短縮が実現されることが確認された。一方、NO_xの低減には噴霧先端部近傍の非定常構造領域の急速混合が効果的であると考え、実験および数値シミュレーションにより先端部の高NO_x生成特性について確認実験を試みた。その結果、推測どおり噴流先端部で大量のNO_xが生成することが確認され、この先端部構造の早期拡散・消滅化と,定常火炎長さにいち早く到達させることが、NO低減の鍵であることが示された。以上、本研究により、拡散混合過程の定量解析法の開発と、非定常噴霧中の拡散混合特性をある程度明らかにすることができた。また、エントロピーの時間変化を解析することにより、等価的な拡散係数を求められること、スケール対応度がピークを示す解析対象ウィンドウサイズから不均一流体塊のスケールを特定できることが示された。これまで、拡散混合過程を研究する上で、均一化の程度を定量的に求める有効な手段はほとんどなく、本手法はこうした研究に有用な新たな定量解析法を提示したものと考える。その結果、噴流の上流では渦度が強く、下流にいくにしたがい渦度は弱く間隔もまばらとなっていたが、拡散速度はこの渦分布と対応しており、上流では小さな構造で強い拡散が、また下流にいくにしたがって拡散強度は減少するほか、相対的に大きな構造の拡散が優勢となっていることが確認できた。また、流体塊内部には階層的な不均一構造が認められ、下流にいくにつれて小さなスケールのものから順に不鮮明となり、大きな不鮮明な流体塊となっていく様子が、エントロピー法により示された。

この他、噴流軸方向上で、拡散の特に弱い領域が間欠的に存在することが確認された。以上、本年度の研究により、拡散混合過程の定量解析法の開発と、非定常噴霧中の基本的特性を一部明らかにすることができた。日本の基盤産業の一つである自動車技術を支える基礎研究として、燃焼場における燃料塊と周囲空気との拡散制御を目的とし、特に拡散状態の定量解析法の開発ならびに燃料塊と乱流とのスケールに着目した相互関係の解明に向けた研究を行った。昨年度の研究においてエントロピー概念を用いた不均一状態の定量表現法ならびに流体塊のスケールの特定法が確立されたので、本年度は噴霧中の混合・拡散現象に本手法を適用し、その構造解析を行った。まず、観察の容易な液・液体噴流の拡散構造を解析した結果、ノズル近傍から下流に移動するにつれて流体塊のスケールが増大するほか、小さなスケールの流体塊は均一化が進み不鮮明となっていくこと、また大きなスケールの流体塊は下流側でより鮮明に残留していることが確認された。次に高圧雰囲気中に噴射した液体噴霧の観察を行ったところ、液・液噴流で観察されたと同様な上述した特徴が観察された。また、小さなスケールの拡散強度は下流にいくにつれて徐々に減少するのに対して、比較的大きなスケールでは噴霧境界に見られる大規模な渦構造に対応した間欠的な強度分布となることが認められた。さらに、拡散促進を目的として噴霧火炎に噴流を衝突させる実験を行った結果、衝突領域の周辺部で大きなスケールの拡散が、また衝突部では小さなスケールの拡散が顕著に促進され、燃焼期間の大幅な短縮が実現されることが確認された。一方、拡散混合現象に関連した事象として、ディーゼル噴霧燃焼におけるNOx生成問題を取り上げ、その主要な発生は噴霧先端部近傍の拡散の弱い非定常構造領域によるものと推定して、実験および数値シミュレーションによる検証を試みた。その結果、推測どおり噴流先端部の非定常構造領域で大量のNOxが生成することが確認され、この先端部構造の早期拡散・消滅化と、定常火炎長さにいち早く到達させることが、NO低減の鍵であることが示された。
枯草菌コンピテントファクターに関する化学的研究

細菌は細胞密度の変化に対応して様々な現象を引き起こし,細胞密度依存的遺伝子発現制御機構はクオラムセンシングと呼ばれている。グラム陽性枯草菌(Bacillus subtilis)は、抗生物質生産、胞子形成、コンピテンス(形質転換能)の獲得などの特徴を有しており、コンピテンスの獲得はクオラムセンシングによって制御されている。枯草菌のコンピテンスの獲得を引き起こすペプチド性フェロモン(ComXフェロモン)のトリプトファン(Trp)残基は翻訳後修飾によってイソプレノイド(IPN)化されていると推定されていた。我々は正確なComXフェロモンの化学構造および翻訳後修飾の様式を明らかにすることを目的として、枯草菌RO-E-2株由来のComXRO-E-2フェロモンについて本研究を展開した。ComXRO-E-2フェロモンの化学構造は,Trp残基のインドール環の3位にゲラニル基が結合し、さらに新たに5員環を形成するという大変ユニークな化学構造であることを明らかにした。翻訳後修飾によるIPN化としてはシステイン残基に次ぐ2残基目、Trp残基上での翻訳後修飾としては5種類目の報告例である。このIPN化は疎水性を増大させるだけではなく、プロリン様の5員環を形成することから活性発現に重要なペプチドの3次元構造の変化を引き起こしていると考えられる。このことは未修飾のペプチドはもとより、別途合成した修飾Trp残基の立体異性体や、Trp残基のインドール環の各位にゲラニル基を付加させた類縁体では全く生物活性を示さないことからも強く示唆される。システイン残基のIPN化のように,Trp残基の場合も生物に普遍的な翻訳後修飾ではないかと期待される。すでに合成したトリプトファンの1位や4位にゲラニル基を導入した生物活性を示さないペンタペプチドを標品として、LC-MSにおけるComXフェロモンの分析条件を確立した。このLC-MSで天然ComXフェロモンの生産量をモニタリングすることにより、最適培養条件を確立した。精製に当たっては、本物質が酸性条件下で活性を失うことに配慮して、精製法を確立した。最終的にComXフェロモンを5リットルの培養濾液から精製し、約0.2mgの純粋なComXフェロモンを得ることに成功した。このフェロモンは、3nMで活性を示した。得られた天然ComXフェロモンの各種NMRスペクトルを測定したが、溶媒に対する溶解度が低いために13C NMRを測定することはできなかった。しかしながら、ComXフェロモン中のトリプトファン残基の構造として、トリプトファンの3位にゲラニル基が結合し、アルファー位アミノ基が2位に結合した3環性の特異な構造を持つことを決定することができた。さらに、立体化学についても検討を加え、絶対立体構造を決定することに成功している。次に提出構造を確定するために、化学合成を行い可能な立体異性体4種を合成した。これらのゲラニルトリプトファンを含むペプチドを合成し、NMR,LC-MSにより天然のComXフェロモンの構造が提出構造の通りであることを確認した。また天然ComXフェロモンと同一の構造を持つペプチドのみが、生物活性を示し、他の立体異性体は、生物活性を持たないことも明らかになった。本年度の研究により、枯草菌のクウォラムセンシングを制御するComXフェロモンの化学構造を世界に先駆けて明らかにすることができた。イソプレノイドによる翻訳後修飾は、システインの例に次いで2番目のものである。

グラム陽性枯草菌(Bacillus subtilis)は、抗生物質生産、胞子形成、コンピテンス(形質転換能)の獲得などの特徴を有しており、コンピテンスの獲得はクオラムセンシングによって制御されている。枯草菌のコンピテンスの獲得を引き起こすペプチド性フェロモン(ComXフェロモン)のトリプトファン(Trp)残基は翻訳後修飾によってイソプレノイド(IPN)化されていると推定されていた。我々は正確なComXフェロモンの化学構造および翻訳後修飾の様式を明らかにすることを目的として、枯草菌RO-E-2株由来のComX_<RO-E-2>フェロモンについて本研究を展開した。ComX_<RO-E-2>フェロモンの化学構造は,Trp残基のインドール環の3位にゲラニル基が結合し、さらに新たに5員環を形成するという大変ユニークな化学構造であることを明らかにした。翻訳後修飾によるIPN化としてはシステイン残基に次ぐ2残基目、Trp残基上での翻訳後修飾としては5種類目の報告例である。このIPN化は疎水性を増大させるだけではなく、プロリン様の5員環を形成することから活性発現に重要なペプチドの3次元構造の変化を引き起こしていると考えられる。このことは未修飾のペプチドはもとより、別途合成した修飾Trp残基の立体異性体や、Trp残基のインドール環の各位にゲラニル基を付加させた類縁体では全く生物活性を示さないことからも強く示唆される。システイン残基のIPN化のように,Trp残基の場合も生物に普遍的な翻訳後修飾ではないかと期待される。
遺伝性角膜変性症における原因遺伝子座の決定

1.非定型的重症型角膜変性症の遺伝子解析分子遺伝学的解析により、ケラトエピセリン変異のホモ接合体であることを確定診断し得た非定型的重症型の角膜変性症を報告した。5症例において124番目のアルギニンがヒスチジンに変異しており、臨床的には濃い敷石状の混濁が角膜に認められた。2.膠様滴状角膜変性症の原因遺伝子の単離日本人近親婚家系10家系13人の患者を対象としたホモ接合体マッピング法を施行し、疾患原因遺伝子座を第1番染色体短腕に同定した。さらに、家系においてはマーカーDIS220とその遠位に隣接する2つのマーカーDIS2648,DIS2752において疾患との間に有意な連鎖不平衡を認めた。ついで、この連鎖不平衡を認めた領域、約400kbにわたるコスミド、BACコンティグを構築し、ショットガン法でその塩基配列を決定し、コンピュータープログラムにより疾患原因遺伝子の検索を行った。その結果、単離した候補遺伝子の一つにおいて患者に特有な3つのナンセンス変異と1つのフレームシフト変異を同定した。3.膠様滴状角膜変性症の遺伝子変異迅速診断膠様滴状角膜変性症の日本人家系を対象とした。白血球よりGenome DNAを抽出し、PCR反応によりMISIの全翻訳領域を増幅した。センスプライマーにはあらかじめT7プロモーター配列、Kozac consensus配列、ATGコドンを付加しておき、これに基づきin-vitro転写/翻訳反応を行い、生成された蛋白をSDS変性アクリルアミドゲルにて泳動し、その長さを検定した。Protein Trunction Test(PTT)の結果、患者41人全てがこれらの変異のホモ接合体もしくは、複合ヘテロ接合体であり、この結果はPCR-RFLPもしくは、直接塩基配列決定の結果と完全に一致した。1.膠様滴状角膜変性症の原因遺伝子の単離ポジショナルクローニング法により膠様滴状角膜変性症の原因遺伝子の単離を目指した。まず、日本人近親婚家系10家系13人の患者を対象としたホモ接合体マッピング法を施行し、疾患原因遺伝子座を第1番染色体短腕に同定した。さらに、家系においてはマーカーD1S220とその遠位に隣接する2つのマーカーD1S2648,D1S2752において疾患との間に有意な連鎖不平衡を認めた。また、正常日本人100家系においてはこれらの変異を認めなかった。この結果より我々はこの遺伝子が膠様滴状角膜変性症の疾患原因遺伝子であると結論した。2.非定型的重症型角膜変性症の遺伝子解析顆粒状角膜変性症およびアベリノ角膜変性症の原因遺伝子としてケラトエピセリン(βig-h3)遺伝子の変異が報告されている。我々は、分子遺伝学的解析により、ケラトエピセリン変異のホモ接合体であることを確定診断し得た非定型的重症型の角膜変性症を報告した。1.ノックアウトマウスの作成マウスM1S1遺伝子の情報よりプライマーを設計し、マウスゲノムBACライブラリーをスクリーニングした。得られたクローンのM1S1遺伝子を含む断片をサザン法にて決定後、プラスミドベクターにサブクローニングし、現在、ES細胞に導入し、キメラマウスの作成を行っている。2.M1S1機能解析

酵母two-hybrid法による相互作用蛋白質のスクリーニングを行ったが、生理学的に意義のあると考えられるクローンを得るには至らなかった。膠様滴状角膜変性症の日本人家系、41人の患者を対象とした。白血球よりGenome DNAを抽出し、PCR反応によりM1S1の全翻訳領域を増幅した。センスプライマーにはあらかじめT7プロモーター配列、Kozac consensus配列、ATGコドンを付加しておき、これに基づきin-vitro転写/翻訳反応を行い、生成された蛋白をSDS変性アクリルアミドゲルにて泳動し、その長さを検定した。正常と異なるバンドを示したものについては予想される位置の塩基配列決定を行い、変異を確定した。PTTの結果、患者41人全てがこれらの変異のホモ接合体もしくは、複合ヘテロ接合体であり、この結果はPCR-RFLPもしくは、直接塩基配列決定の結果と完全に一致した。Q118X変異は病因染色体70本中63本(90.0%)を占めた。
在宅看取りに影響する同一地域病院の機能の解明：NDBレセプトと公開データ併用分析

日本は超高齢・多死社会を迎え、国民が希望する場所で最期を迎えるための条件整備が急がれる。国民の55%は自宅で最期を迎えることを希望する一方、死亡場所の74%は病院であり、がんによる病院死は83%とさらに高い。がん患者について、病院死症例を多く含む病床機能と終末期医療の実態は明らかにされておらず、在宅看取りが多い地域にはどのような病院機能があるか解明されていない。そこで本研究は、在宅看取りの高低に対し同一地域の病院機能が与える影響を明らかにすることを目的とする。目的達成のためNDBレセプトデータ、官公庁公開データを併用した分析を行い、地域で実現可能な在宅看取りの普及啓発のあり方を検討する。
網膜色素上皮細胞由来マルチプロテアーゼインヒビターの精製と生理機能解析

pP344は、ニワトリ網膜色素上皮細胞に特異的に発現している遺伝子として見いされたもので、分子転換の調節因子である可能性が示唆されている。そのcDNA配列から、pP344は、エラスターゼインヒビターであるエラフィン様ドメイン、免疫グロブリンン様ドメイン、2個のKunitzインヒビター様ドンメインなどを持つ分子量約70kDaの多機能性プロテアーゼインヒビター(PP344)をコードしていた。今回、われわれは、PP344の生理機能を明らかにする目的で、PP344を網膜上皮細胞培養土清から精製し、種々のプロテアーゼに対する阻害スペクトラムの解析を行った。PP344は、網膜色素上皮細胞の培養液中から、Kunitzドメインの合成ペプチドに対する抗体と反応する70kDaタンパクとして、Q-Sepharoseに続き、不溶化anhydrotrypsinカラムを用いて精製した。精製PP344のアミノ酸組成及びN末端配列分析の結果、成熟PP344は、31残基のシグナル配列後のLeu-32よりHis-570までの539残基よりなり、糖を含まない分子量は60,359と計算された。また、マミノ酸分析よりPP344の吸光係数は12.8と求められた。各種プロテアーゼに対する阻害活性をスクリーニングした結果、PP344はトリプシンを強く阻害するものの他のプロテアーゼ(キモトリプシン、エラスターゼ、組織性プラスミノーゲンアクチベタ-、ウロキナーゼ、プラスミン、血漿カリクレイン、顎下腺カリクレイン、トロンビン、凝固Xa因子、プロテインCなど)は、阻害せず、生理的にターゲットとするプロテアーゼの同定にはいたらなかった。また、トリプシンん対するPP344の阻害定数(Ki値)は5.6x10^<-8>Mであった。以上の結果、PP344のエラフィン様ドメイン及びKnitz-1に阻害活性はなく、Knitz-2の反応部位であるLys^<-392>-Ala^<-392>が重要であることが示唆された。また、PP344はプロテアーゼに対する阻害特性が強いと考えられる。
胎内低栄養環境における消化吸収機構のエピゲノム変化に関する分子形態学的研究

これまでの実験結果により、妊娠中に胎内で低栄養環境に暴露された胎児の消化吸収機構にエピゲノム変化が起こり、出生後の消化管(栄養補給系)および腎臓(排泄系)に影響を及ぼすことを示唆してきた。そこで、平成30年度もこれまでと同様の実験を行い、その結果を詳しく検討した。実験は雌ラットの妊娠初期、中期または後期に7日間低栄養飼育を行った。実験群と対照群は生後0(未授乳)、7、14、21日齢の小腸(空腸・回腸)、大腸(盲腸・結腸近位部・結腸遠位部)および腎臓を用いた。バイオイメージング法(光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、走査型電子顕微鏡、透過型電子顕微鏡、FIB/SEMなど)を用いて検索を行った。今年度の検索においても、これまでと同様、実験群では正常群と比較して、新生児期、乳飲期、離乳期のいずれの時期においても空腸の絨毛の長さと吸収上皮細胞に変化は見られなかった。しかし、実験群の回腸において、短い絨毛が多数認められた。日数を経る毎に両群の差は顕著になった。実験群の盲腸と結腸近位部の絨毛の消失時期が正常群より長くなった。これら実験群の回腸、盲腸および結腸近位部の絨毛と腎小体の変容はエピゲノム変化と考えられる。乳飲期の空腸において、両群の絨毛の吸収面積にあまり差がなく脂質の吸収機構には変化が無いと考えられる。一方、実験群の回腸は絨毛の長さが減少したことで吸収面積もかなり減少し、タンパクなど高分子物質の吸収も減少する。しかし、その結果、相対的に脂質の吸収が多くなり、生活習慣病を惹起させる要因の一つになることが示唆された。また、妊娠中に胎内で低栄養環境に暴露された乳幼児に対して脂質の栄養管理を行い生活習慣病発症の予防を行う必要がある。妊娠中の低栄養は胎児の様々な臓器の発育を抑制し、出生後の疾病の発症と関連すると言われている。本研究では、胎内低栄養環境がエピゲノム変化を惹起し、出生後の消化吸収機構に影響を及ぼすか否かについて分子形態学的に検索を行っている。平成28年度はこれまでの(助成金受領前)研究に加えて、栄養補給系(消化管)を走査型及び透過型電子顕微鏡等を用いて分子形態学的に検索を行った。正常ラットの新生仔を用いて新生児期から乳飲期・離乳期・成熟期の消化管、特に、胃、小腸(十二指腸・空腸・回腸)、大腸(盲腸・結腸近位部・結腸遠位部)を経時的に検索し、消化吸収機構の変容を検討した。その結果、成長の各時期、消化管の各部位によって消化吸収機構に形態的・機能的変容が認められた。胎内低栄養実験群では、妊娠初期低栄養群、妊娠中期低栄養群または妊娠後期低栄養群に分けて、それぞれ7日間低栄養環境に暴露させた。それらの低栄養妊娠ラットより出生した新生仔の消化管(胃、小腸:十二指腸・空腸・回腸、大腸:盲腸・結腸近位部・結腸遠位部)を用いて、胎内低栄養環境による(エピゲノム)変化が出生後の消化吸収機構に及ぼす影響について新生児期から乳飲期、離乳期、成熟期にかけて経時的に検索し胎内適正(正常)環境群と比較検討した。その結果、妊娠後低栄養群期、中期低栄養群、初低栄養群期の順で小腸絨毛および吸収上皮細胞に形態的変化が認められた。腎臓においても実験群と比較検討した。その結果、低栄養実験群の腎臓の糸球体は数と大きさの減少が認められた。胎内低栄養環境により生ずると思われるエピゲノム変化は、出生後の消化管及び腎臓に形態的・機能的変化を及ぼすことが考えられ、妊娠中の栄養管理の重要性が示唆された。胎児期に適切な栄養環境で育ったラットの新生仔を用いて新生児期(出生直後未授乳)から乳飲期・離乳期・成熟期の栄養補給系の消化管、特に、胃、小腸(十二指腸・空腸・回腸)、大腸(盲腸・結腸近位部・結腸遠位部)を経時的に検索し、各成長時期、消化管の各部位による消化吸収機構の形態的・機能的変容を光学顕微鏡による形態学的解析、走査電子顕微鏡による三次元的解析及び透過型電子顕微鏡による分子形態学的解析を行うことができた。これらの実験は当初の計画以上に進展していると思われる。胎内低栄養実験群では、妊娠初期低栄養群、妊娠中期低栄養群または妊娠後期低栄養群に分け、それぞれ7日間低栄養環境に暴露させた。それらの低栄養妊娠ラットより出生した新生仔を用いて、消化管(胃、小腸:十二指腸・空腸・回腸、大腸:盲腸・結腸近位部・結腸遠位部)を用いて、胎内低栄養環境による変化が出生後の消化吸収機構に及ぼすか否か新生児期から乳飲期、離乳期、成熟期にかけて経時的に検索し胎内適正(正常)環境群と比較検討を行うことができた。これらの実験はおおむね順調に進展していると思われる。腎臓においても、低栄養実験群の腎臓の糸球体は数と大きさの減少が認められたことから、この実験もおおむね順調に進展していると思われる。本年度は、消化管の中でも栄養補給系として最も重要な役割を演じている腸(小腸・大腸)を重点的に用いて、消化吸収機構のエピゲノム変化に関する実験、検索、解析を行った。胎内低栄養環境による変化が出生後の消化

吸収機構の変容について、新生児期、乳飲期、離乳期更に成熟期にかけて経時的に検索し、胎内適正(正常)環境群と詳しく比較検討することが出来た。その結果、胎内低栄養実験群の回腸では胎内適正(正常)環境群より絨毛が短く、さらにその管腔表面を覆っている吸収上皮細胞の変容も認められた。それらの変容は妊娠初期低栄養群よりも妊娠中期低栄養群さらに妊娠後期低栄養群と著明になった。また、新生児期、乳飲期、離乳期と時間の経過と共に、その差は顕著になった。新生児期(出生直後、未授乳)の回腸吸収上皮細胞をFIB走査型電子顕微鏡で断面作成と観察を繰り返し、取得した断面像(600800枚)から三次元構築し、細胞の立体構造を解明した。小腸上皮細胞の変容にエピジェネティックな修飾が関与するかを知る目的で、乳飲期マウス回腸のヒストン修飾解析を行った。その結果、陰窩形成に伴って生じるパネート細胞のヒストンH3K27番目リジンのトリメチル化が吸収上皮細胞の形態変化に関わる可能性があると考えられた。さらに、乳飲期マウスの小腸から単離した陰窩を用いてオルガノイドを作製し、メチル化阻害剤添加により、小腸の上皮形成におけるメチル化の役割ついて解析を行った。その結果、陰窩の形成と維持にメチル化が関与している可能性が示唆された。胎内低栄養環境により生ずると思われるエピゲノム変化は出生後の消化管、特に栄養補給系の重要な役割を担っている小腸吸収上皮細胞の吸収機構や腎機能に影響を及ぼすことが示唆された。これらのことから、妊娠中の栄養管理の重要性が示唆され、胎内低栄養環境に曝露された可能性がある場合は出生後の栄養管理も重要である。胎児期に適切な栄養環境で育ったラットの新生仔を用いて新生児期(出生直後、未授乳)から乳飲期・離乳期・成熟期の栄養補給系の消化管、特に、胃、小腸(十二指腸・空腸・回腸)、大腸(盲腸・結腸近位部・結腸遠位部)を経時的に検索し、各成長時期、消化管の各部位による消化吸収機構の変容を光学顕微鏡による形態学的解析、走査型電子顕微鏡による三次元的解析及び透過型電子顕微鏡による分子形態学的解析を行うことが出来た。胎内低栄養実験群では、妊娠初期低栄養群、妊娠中期低栄養群または妊娠後期低栄養群に分けて、それぞれ7日間低栄養環境に曝露させた。それらの低栄養妊娠ラットより出生した新生仔の消化管を用いて、胎内低栄養環境による変化が出生後の消化吸収機構に及ぼすか、否か、新生児期から乳飲期、離乳期、成熟期にかけて経時的に検索し胎内適正(正常)環境群と比較検討を行うことが出来た。これらの実験はおおむね順調に進展している。新生児期の回腸をFIB走査型電子顕微鏡で断面作成と観察を行い、新生児期(出生直後、未授乳)の回腸吸収上皮細胞の三次元的立体構築を明らかにした。これらの実験はおむね順調に進展している。小腸上皮細胞の変容にエピジェネティックな修飾が関与するかを知る目的で、乳飲期マウス回腸におけるヒストン修飾解析を行うことが出来た。さらに、乳飲期マウスの小腸から単離した陰窩を用いてオルガノイドを作製し、メチル化阻害剤添加により、小腸の上皮形成におけるメチル化の役割ついて解析を行うことが出来た。腎臓においても、胎内低栄養実験群の腎臓の糸球体を詳しく計測し、正常群と比較検討することが出来たのでこの実験もおおむね順調に進展している。これまでの実験結果により、妊娠中に胎内で低栄養環境に暴露された胎児の消化吸収機構にエピゲノム変化が起こり、出生後の消化管(栄養補給系)および腎臓(排泄系)に影響を及ぼすことを示唆してきた。そこで、平成30年度もこれまでと同様の実験を行い、その結果を詳しく検討した。実験は雌ラットの妊娠初期、中期または後期に7日間低栄養飼育を行った。
先天性トキソプラズマ症発症機序の解析

1)トキソプラズマ原虫感染防御分子と知られているIFNγ遺伝子、TNFα遺伝子、およびNKT細胞KOマウスを用いて先天性トキソプラズマ症の感染動物実験系を検討した結果、IFN-γKOマウスを用いることにより100%トキソプラズマ原虫に感染した新生仔を得る実験系の作成に成功した。なお、TNFα遺伝子およびNKT細胞はマウスのトキソプラズマ原虫感染に対する感受性・抵抗性には関与していなかった。2)母体マウスのトキソプラズマ原虫感染後の各臓器の感染感受性のQC-PCR解析の結果、胎盤は脳、肺、脾臓と同様に感受性の臓器であることが明らかになった。3)IFN-γは妊娠におけるトキソプラズマ原虫感染において抗トキソプラズマ原虫作用および流産誘導因子としてbi-functional機能をもつことが明らかになった。4)このIFN-γの両面の作用機序として、IFN-γはマクロファージのNO産生の増幅作用を持ち、NOは組織破壊性を示し起炎因子と共に抗トキソプラズマ原虫作用を示す。7)トキソプラズマ原虫毒性決定遺伝子としてTgHSP70のクローニングに成功した。先天性トキソプラズマ症は最も悲惨なトキソプラズマ症である。本研究では、1)先天性トキソプラズマ症の動物モデルの確立、2)トキソプラズマ原虫の胎児への感染経路および感染成立機序の解析、3)トキソプラズマ原虫の毒性決定機序の解析、を研究目的とした。その結果、1)に関しては、a)妊娠マウスにトキソプラズマ原虫の経口感染で100%の胎児感染が得られる実験系を1FN-γKOマウスを用いて確立することに成功した。b)胎盤における抗トキソプラズマ原虫機序にトキソプラズマ原虫感染細胞特異的Tc1細胞が主要な役割を演じており、胎盤感染防御,のエフェクター分子がIFN-γであることが明らかになった。c)Tcl細胞が産生ずるIFN-γが流産因子として機能し、先天性トキソプラズマ症における流産の発症機序を明らかにした。d)その一方で、感受性決定機序にIFN-γ以外の遺伝子が関与していることが示された。今後、TNF-αKOマウスの導入により先天性トキソプラズマ症におけるより詳細な感染統御遺伝子の解析と遺伝子発現機序に関する研究を進める予定である。2)に関しては、a)経口感染したトキソプラズマ原虫は胎盤でIFN-γにより急増虫体から緩増虫体に分化することが示された。b)急増虫体の感染において、トキソプラズマ感染細胞に特異的な細胞障害性T細胞は標的細胞を破壊するがトキソプラズマ原虫を殺さないことを明らかにした。このことから、平成11年度では緩増虫体が感染した標的細胞特異的細胞傷害性T細胞の誘導機序およびトキソプラズマ原虫の胎児への感染機序における役割に関して解析を進める。3)の病原性決定遺伝子の解析では、a)我々がクローニングに成功したHSP70が毒性発現に関与していることをIFN-γKOマウスを用いたinvivoの実験で明らかにした。今後、HSP70の遺伝子発現機序に関して分子レベルで解析を進める予定である。1) IFN-γは妊娠におけるトキソプラズマ原虫感染において抗トキソプラズマ原虫作用および流産誘導因子としてbi-functional機能をもつことを明らかにした。2)このIFN-γの両面の作用機序として、IFN-γはマクロファージのNO産生の増幅作用を持ち、NOは組織破壊性を示し起炎因子であると同時に抗トキソプラズマ原虫作用を示す。NO特異的インヒビターであるNMMA投与によりトキソプラズマ慢性感染において抵抗性マウスの生体防御能を抑制した。4) IFN-γは流血中のトキソプラズマ原虫Tachyzoiteが胎盤でBradyzoiteにステージ分化させる機能を持つことを明らかにした。IFN-γは急増虫体特異的発現遺伝子SAG1の発現を抑制し、一方、緩増虫体特異的発現遺伝子T.g.HSP30の発現を誘導することが分った。5)トキソプラズマ原虫毒性決定遺伝子としてTg HSP70のクローニングに成功した。6) Differential Display法による感受性統御遺伝子、および関連遺伝子を解析した結果、IFN-γ,TNFα,IL-4,IL-5,STAT-1,-2,IRF-1の他に、現在までに未知の12以上の遺伝子が関与していることが示され解析中である。