hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肺傷害におけるクララ細胞の役割

1)傷害抑制因子の発現が肺傷害に関与するか肺傷害動物モデルにおける肺組織のCCSPやCGRPの発現を調べた。シリカを2mg気管内注入したラットを、3日から6ヶ月の観察期間の後、肺組織におけるCCSP発現を検討した。急性期のみならず慢性期においてもCCSPの発現が低下した。CGRPにおいても、数種の化学物質で同様の検討を行ったところ、肺傷害性が強いシリカやクロシドライトでは、急陸期に発現が低下し、傷害性が強くない人造繊維では逆に発現が亢進した。両遺伝子の発現低下が肺障害の進行に関与することが示唆された。2)CGRPは、アポトーシスの抑制作用を介して相対的に細胞増殖を行うかA549細胞にクリソタイル、ブレオマイシンを曝露し、tunnel染色にてアポトーシスを検討したところ、強制発現したCCSPやCGRPはブレオマイシンやクリソタイルで認められた肺胞上皮細胞のアポトーシス亢進作用を抑制したことを認めた。これらの遺伝子が、アポトーシスの抑制を介して相対的に上皮細胞増殖能を亢進させることが示唆された。3)CGRPが動物モデルにおいて肺胞上皮増殖作用を有するかCGRPを組み込んだアデノウィルスベクター(力価1×10^9)をラットに気管内注入し、3日後に解剖を行った。肺胞上皮細胞の増殖が認められ、PCNA染色では、特に肺胞上皮細胞に陽性細胞が認められた。よって動物試験においてもCGRPによる肺胞上皮細胞増殖作用を有することが認められた。CCSPを強制発現した肺胞・気道上皮細胞におけるアポトーシスの抑制作用を検討A549細胞がアポトーシスを誘導するか確認するためにA549細胞にクリソタイル、ブレオマイシンを曝露し、24時間-48時間後にtunnel染色にてアポトーシスを検討した。ブレオマイシン、クリソタイルは各々250ug/ml、50ug/mlをピークにアポトーシスを有意に亢進させた。また、シグナルトランスダクションとしてカスパーゼ、JUNKのインヒビターを投与すると亢進は抑制された。次にブレオマイシン、クリソタイルにアデノウィルスに組み込んだCCSPを加えて、アポトーシスの生成を確認した。CCSPが10^7でブレオマイシン、クリソタイルのアポトーシスを抑制した。また、LacZを組み込んだ群では、両者のアポトーシスの抑制は認められなかった。さらに、JUNKの活性を観察したが、CCSPによる活性の低下は認められなかった。CCSPの上皮細胞のアポトーシス抑制の機序として、JUNK以外の機序、カスパーゼなどの活性化が関与するか検討する予定である。アポトーシスと石綿による酸化的ストレスの関与を検討するため、A549細胞における8ヒドロキシデオキシグアノシンの測定を行った。クリソタイルを曝露により8ヒドロキシデオキシグアノシンの生成が亢進した。今後は、CCSPが酸化的ストレスを介してアポトーシスの抑制に関与するかも検討していく。CCSP遺伝子導入したブレオマイシンまたは石綿、シリカ曝露による肺線維症ラットモデルの検討in vivoではCCSP及びLac-Zベクターを大量に使用するため、293細胞にベクターを加え培養を繰り返し、力価の高いウィルスベクターの作成を行った。ブレオマイシンを気管内注入し、短期の線維化モデルを完成した。よって、来年度は、動物モデルにウィスルベクターを曝露し、CCSPの機能を評価する予定である。CGRP遺伝子を組み込んだアデノウィルスベクター(力価1x10^9)とブレオマイシン(2mg/kg)をウィスター系雄性ラットに気管内注入し、2週間後に解剖を行った。肺組織を定圧固定した。ヘマトキシリンエオジン染色にて肺組織の評価を行った。CGRP遺伝子を組み込んだブレオマイシン投与ラットとブレオマイシン投与ラットにおいてどちらも肺胞腔内に単核球を中心とした炎症細胞浸潤が認められた。

また、上皮細胞増殖に関しても同様にほとんど差を認めなかった。ブレオマイシンによる線維化モデルにおいては、CGRPの炎症や線維化抑制作用は不明であった。病態の異なる他の線維化モデル(結晶質シリカ等)についても検討を行う予定である。肺の線維化モデルとして結晶質シリカ注入ラットモデルを用いてCCSPの遺伝子発現を検討した。シリカを2mg気管内注入したラットを、3日、1週間、1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月後に解剖し肺組織におけるCCSP発現をRT-PCR、Westerblotにて検討した。RT-PCRでは、3日後から6ヶ月後まで2相性の低下を示し、WEsternblotでは、3日後から3ヶ月後まで低下を示した。これらのことからシリカによる肺傷害においてCCSPは抑制的に作用することが示唆される。よって、CCSP導入ラットモデルにシリカ曝露を行い、CCSPの役割を検討する予定である。1)CGRPを強制発現させたラット肺組織における肺胞上皮細胞増殖に関する検討CGRPを組み込んだアデノウィルスベクター(力価1x10^9)をラットに気管内注入し、3日後に解剖を行った。肺組織は4%パラホルムアルデヒドによる定圧固定後、肺組織標本を作成した。細胞増殖能を評価するためPCNAの免疫染色を行った。HE染色では肺胞上皮細胞の増殖が認められた。但し、リンパ球浸潤も併せて認められた。PCNA染色では、特に肺胞上皮細胞に陽性細胞が認められた。よって動物試験においてもCGRPによる肺胞上皮細胞増殖作用を有することが認められた。2)CGRPを強制発現した肺胞上皮細胞におけるアポトーシス抑制作用を検討A549細胞を、1%FCSを含むRPMI溶液にて5×10^5 cellsに調整し、一晩、CO2 incubatorにて培養した。細胞にlacZ, CGRPのアデノウイルスベクターを投与し,それぞれにブレオマイシン100μg/mlまたはクリソタイル50μg/cm^2を曝露した。24時間後TUNEL染色にてアポトーシス細胞数をカウント、およびそのシグナル伝達としてJNK/SAPKのリン酸化活性を検討した。A549細胞にクリソタイル、ブレオマイシンを曝露し、Tunel染色にてブレオマイシンは250ug/mlをピークに、クリソタイルも50ug/mlをピークに、アポトーシスを誘導した。ブレオマイシン、クリソタイルにアデノウィルスに組み込んだCGRPを加えると10^7で両者のアポトーシス誘導を抑制した。さらに、JUNKの活性を観察したが、CGRPによる活性の低下は認められなかった。よって、CGRPは、JUNK以外のシグナル伝達経路でアポトーシスを抑制することが示唆された。
超短インパルスを用いた多帯域マイクロ波反射計測法の開発

核融合炉を目指した高温プラズマ中の電子密度の空間分布や揺動を計測することを目的として、超短インパルスを光源としたパルスレーダー計測法の開発を行った。本手法はプラズマに入射した電磁波がその波長に対応した電子密度層において反射する現象を利用し、超短インパルスから広帯域な周波数の電磁波を抽出して、広範囲な密度層の計測を行うというものである。実験では、大型ヘリカル装置に適用し、密度分布計測に成功した。本研究の目的は、新しいマイクロ波反射計のシステムを開発し、これを用いてプラズマ電子密度および揺動の空間構造を計測しプラズマ閉じ込めの研究を行うことである。本研究で開発を行っているマイクロ波反射計はプラズマによる電磁波のカットオフ現象を利用した計測法であり、プラズマ内部の局所的な位置での計測ができるという特長をもっている。周波数の異なる電磁波をプラズマ中に入射し、それぞれの波がプラズマ中から戻ってくるまでの飛行時間をレーダ計測することによりその対応するカットオフ層の位置を知ることができ、この情報より電子密度の空間分布を再構成することができる。また密度揺動はカットオフ層の変動を引き起こすためマイクロ波の飛行時間の変化量を計測することにより、密度揺動を計測することも可能である。プラズマ中の広い空間を高分解能で計測するためには、周波数の広帯域化と多チャンネル化を達成することが不可欠である。そこで本研究では特に、広周波数帯域成分を持つ超短インパルスを信号源とし、多帯域マイクロ波反射計システムを構築することを目指している。平成18年度は、まず実際のプラズマに適用する前にシステムの性能を確実に把握するための開発試験を行った。パルス幅16psの超短インパルスから所望するマイクロ波成分が、確実に抽出できることを確認した。そしてプラズマ計測に必要なレベルまでマイクロ波アンプによって増幅できることを確認した。この多帯域に渡るマイクロ波成分を結合あるいは分離して導波路に導くための広帯域ミリ波合成器を設計製作した。これは、マルチレイヤ・メッシュフィルタという新しいテラヘルツ波コンポーネントをマイクロ波帯に適応したものである。このフィルタの特性をベクトルネットワークアナライザ等を用いて調べ、設計した性能が達成されていることを確認した。これらの成果により次年度のLHDプラズマ実験への適用の見通しを得た。平成19年度は、前年度開発を行った新しい周波数フィルタ付きマイクロ波結合器を活用する、多帯域マイクロ波成分を用いた大型ヘリカルプラズマへの適用を行った。発振超短パルスからマイクロ波成分を抽出した後、パワー増幅器で信号増幅し、新しくUバンド帯周波数成分のプラズマからの反射信号を得ることができ、計測可能な密度領域を拡大することができた。また局所的な密度勾配の平坦化現象を発見し、これに対応するTOF計測手法の開発を行った。強ノイズ環境下における信号処理手法を改良し、より安定な信号解析が可能となった。平成20年度は、本研究で開発を行った新しい周波数フィルタ付きマイクロ波結合器を活用し、多帯域マイクロ波成分を用いた大型ヘリカルプラズマへの適用を行った。

発振超短パルスからマイクロ波成分を抽出した後、パワー増幅器で信号増幅し、新しくKバンド周波数成分のプラズマからの反射信号を得ることができ、計測可能な密度領域を拡大することができた。また局所的な密度勾配の平坦化現象を発見し、このような環境下における新しいTOF計測手法の開発を行い、より安定な信号解析が可能となった。
外来植物ナガエツルノゲイトウの茎断片化増殖様式の研究と効果的駆除・肥料化法の開発

本研究の実験材料は、特定外来生物に指定されている水生植物のナガエツルノゲイトウである。ナガエツルノゲイトウの茎は回収駆除の過程で容易に断片化して流失し、やがて芽・根を発生させ、漂着先で再び個体群を形成してしまう。このようにしてナガエツルノゲイトウは河川や水田等で繁殖域を広げ、日本のみならず世界で生態系および農水産業に悪影響を与えている。平成30年度は実際の駆除に先駆けて、ナガエツルノゲイトウに対する除草剤の効果を検証した。検証では、薬剤が植物体(主に葉)の色や茎断片からの芽・根の発生といった外観に及ぼす影響だけでなく、葉での光合成活性とクロロフィル含量に及ぼす影響も調べた。研究は特定外来生物による生態系等に係る被害の防止に関する法律(通称、特定外来生物法)に則し、環境省から特定外来生物の飼養等の許可を受けて行った。グリホサートイソプロピルアミン塩(以下、グリホサート)を標準(1x)濃度で含む処理区の他、10x、3x、0.3x、0.1x濃度の処理区と、コントロールとしてグリホサートを含まない処理区の、合計6つの処理区を設けた。各処理区でナガエツルノゲイトウの茎断片を連続明所・25°Cの条件下で培養したところ、1週間後のコントロール茎断片では色の変化もなく、節部から芽と根の発生が観察された。これに対し、グリホサートを含む処理区ではいずれも培養開始1週間後には茎断片の白色化が見られ、芽・根の発生は2週間たっても確認できなかった。また、光合成活性、クロロフィル含量のいずれもコントロールでは培養前後でほぼ変化がなかったのに対し、グリホサート処理区では顕著な低下が見られた。平成27年度は当初の年次研究計画通り、ナガエツルノゲイトウの茎の断片化と個体再生の詳細に関して研究を行った。まず、各種植物ホルモンおよびその阻害剤を添加した培養液で茎切片を培養した結果、一部の処理区において芽の発生を確認することができた。次に、茎断片以外からの個体再生の可能性を検証した結果、根からも個体が再生することが明らかになった。しかし、葉からの個体再生は現時点では確認されていない。さらに、ナガエツルノゲイトウの茎断片を明暗の各条件で培養した。明所では茎断片は緑色を維持するのに対し、暗所では光合成ができなくなるためか、褐変した。この褐変した茎断片を暗所に放置し続けても、個体再生は見られなかった。従って、現在一部でナガエツルノゲイトウの駆除に使われている遮光シート法は、確かに有効な手段になりうることが証明された。これらの生理学的な研究とは別に、平成28年度に行う予定であった茎断片からの個体再生に関わる遺伝子群の単離の計画を前倒しして、研究に着手した。まず、ナガエツルノゲイトウからの全RNAの抽出方法、大型極薄のアクリルアミドゲルでの電気泳動方法と、電気泳動後のゲルの銀染色の手法など、ディファレンシャルディスプレイ(DD)法を行うにあたって必要となる基礎的な技術・手法を確立した。そして次に、改良DD法を行った。通常のDD法では全RNAにゲノムDNAがわずかでも混入していた場合、それらが「ノイズ」として検出されてしまうが、改良DD法ではゲノムDNAが混入していても影響を受けにくい利点がある。しかし現在までのところ、PCRでバンドを検出するには至っていない。平成27年度は、ナガエツルノゲイトウの茎の断片化と個体再生の詳細に関して研究を行った。様々な植物ホルモン、およびその阻害剤を添加した培養液で茎断片を培養する実験や、茎以外にも根・葉からの個体再生の可能性を検証する実験、あるいは、遮光シートによる駆除に見立てて暗所で茎断片を培養する実験は、当初から平成27年度の研究計画に含まれていたものである。従って、これらの内容に関しては、計画通りに実行することができたといえる。これに対して、当初平成27年度の研究計画に入れていた、自然界での茎断片化の箇所の調査や、自然界で生じた茎断片からの個体再生の可能性に関しては、野外調査に行った時期が悪かったために良い状態の植物体を見つけ出すことができず、実験に着手することができなかった。この点において、平成27年度の研究計画として申請していた内容は一部実施することができず、「マイナス」といえる。一方で、当初は平成28年度に行う予定であった茎断片からの個体再生に関わる遺伝子群の単離の計画を、平成27年度に前倒しして着手することができた。残念ながら、現在までのところPCRでバンドを検出するには至っていない。しかし、ナガエツルノゲイトウからの全RNAの抽出方法、大型極薄のアクリルアミドゲルでの電気泳動方法と、電気泳動後のゲルの銀染色の手法など、DD法を行うにあたって必要となる基礎的な技術・手法を確立することができた。この点は、当初の計画以上の「プラス」である。従って、上記の内容を総合的に考えると、現在までの達成度は当初の年次研究計画内容とは入れ替わりがあるものの、成果においては「プラスマイナスゼロ」で、「おおむね順調に進展している」と判断した。本研究の材料は、特定外来生物に指定されている水生植物のナガエツルノゲイトウである。ナガエツルノゲイトウの茎は中空であるために自然界でも容易に断片化するが、そこから個体再生して繁殖してしまうという問題をもっている。平成28年度はまず、平成27年度に行った茎断片からの個体再生と光との関係に関してさらに研究を深めた。

明暗条件や培地に添加する薬剤の条件をいろいろ変えてナガエツルノゲイトウの茎断片を培養した結果、茎断片からの個体再生には光が必要であることが確認された。本研究の成果は、ナガエツルノゲイトウの駆除で使われている遮光シート法の有効性に対して学術的裏付けを与えるものとして評価できる。次に、ナガエツルノゲイトウの茎断片からの個体再生がどのような遺伝子により制御されているのかを明らかにするための手段として、ある条件で発現が増加あるいは減少している遺伝子を探索するのに適した、ディファレンシャルディスプレイ法を用いた解析を行った。ナガエツルノゲイトウの植物体から人為的に切り出した直後の茎断片、あるいはそれを培養した後の茎断片からそれぞれ全RNAを抽出し、これらの全RNAを用いてディファレンシャルディスプレイ法を行った。全RNAからmRNAを精製したり、ゲノムDNAの混入の可能性を排除するためにDNaseI処理も行うなどの工夫をこらしたが、現時点では前述の2つの条件の間で濃さの異なるバンドを検出するには至っていない。平成27年度、28年度の合計2年間の研究により、特定外来生物に指定されているナガエツルノゲイトウは茎からだけでなく根からも個体が再生すること、そして、茎断片からの個体再生には光が必要であることを明らかにすることができた。近年ナガエツルノゲイトウを駆除するための方法の1つとして、植物体を遮光シートで覆い光を遮断する方法が注目されているが、この遮光シート法の有効性に関してはこれまで明確な学術的裏付けがなかった。そのため、本研究ではこの点を明らかにすることを目的の1つとして掲げていたが、上記のように目的を達成できたことは一定の評価に値すると考えている。しかしその一方で、ナガエツルノゲイトウの茎断片からの個体再生がどのような遺伝子により制御されているのかを明らかにするため、ディファレンシャルディスプレイ法を用いた解析を行うことも予定していたが、こちらに関しては全RNAからのmRNAの精製や、DNaseI処理によるゲノムDNAの除去などの工夫をこらしたが、現時点では候補となる遺伝子を単離するには至っていない。従って、これまでの2年間で得られたこれらの研究成果の内容を総合的かつ客観的に考えると、根からの個体発生の可能性の確認や、茎断片からの個体再生における光の役割を明らかにできたという「プラス」よりも、ディファレンシャルディスプレイ法で発現量に差のある遺伝子を単離できていないという「マイナス」の方が大きいと考えられ、現在までの達成度は「やや遅れている」と判断した。本研究の実験材料は、特定外来生物に指定されている水生植物のナガエツルノゲイトウである。ナガエツルノゲイトウの茎は中空であるため、回収駆除の過程で容易に断片化して流失する。問題なのは、ナガエツルノゲイトウは茎断片からの個体再生力が非常に高いことである。この強い繁殖力によりナガエツルノゲイトウは河川や水田等で繁茂し、日本のみならず世界で生態系および農水産業に悪影響を与えている。本研究ではナガエツルノゲイトウを用いて、これまでに主に茎断片からの個体再生における光の役割に関して研究を行ってきた。平成29年度は、茎断片からの個体再生がそもそもどのような仕組みにより引き起こされているのかという疑問を解決するため、植物において形態形成や発生、環境応答、遺伝子発現など様々な現象に関わる重要な因子である植物ホルモンが、茎断片からの個体再生において果たす役割を調べた。
結婚相談サービスに内包された成婚メカニズムの実証的解明

本研究の目的は、結婚相談サービスに内包された成婚メカニズムを実証的に解明することである。本研究では日本最大手の結婚相談サービス事業者であるX社の全面的な協力を得て、X社の会員および事業者のスタッフを対象にした質問紙調査とインタビュー調査、そしてWeb調査を行い、それらの分析結果を複合的に解釈することで当該メカニズムの解明に迫る。
曲走路疾走における加速局面のメカニズム

最終年度はまず、陸上競技場曲走路上からスタートした場合に運動学的左右差がどの時点で出現するかを明らかにすることから始めた。陸上競技大会において100m走と200m走をハイスピードカメラにて撮影した。両種目に出場し、且つ1歩目が右足であった男子17名と女子9名について、スタート後1歩目から12歩目までの足部接地時間と滞空時間を算出した。結果を示す際は100m走を直走路走、200m走を曲走路走としている。曲走路疾走時の右足接地時間は直走路のそれに比べて短く、曲走路疾走時の左右滞空時間は直走路のそれに比べ長かった。また曲走路疾走時の左右を比較すると、右(外)足接地時間は左(内)足のそれより短く、9歩目以降で右滞空時間は左のそれよりも短くなった。以上のことから曲走路上からスタートした場合、9歩目以降で左右差が顕著に現れることが明らかとなった。その後、男子陸上競技短距離選手に曲走路上からスタートダッシュを行わせる実験を実施した。その動作とスタートブロックを蹴る力をモーションキャプチャシステムと昨年度作成したフォースプレートを用いて測定した。撮影範囲は約10mとし、スタートから6歩目のつま先離地までを画角に収めることが出来た。ブロックを蹴る力は直走路上からのスタートダッシュに関する研究と似た結果であった。左足支持中の進行方向変化量が右のそれに比べて大きかった。3歩目と4歩目を比べると、右足滞空距離(右足離地から左足接地までに身体重心が進行方向前方へ移動した距離)は左のそれに比べて長った。特に滞空期の長さは垂直方向の身体重心速度で決まる。垂直速度を高めるために右脚は左脚よりも大きな力を発揮して可能性がある。このように内側となる左脚は方向転換を、外側となる右脚は推進力獲得に貢献しているかもしれない。初年度は、曲走路疾走における加速局面の特徴を明らかにする研究を行う予定であったが、予想以上にフォースプレートの作成と測定精度の検証に時間を要したため、計画を変更せざるを得なかった。以下に初年度の実施状況を記する。走者のブロッククリアランス時の力を測定するために、フォースプレート[移動式FP]を特注し製作する必要があったが、仕様について何度も業者と打合せを行う必要が生じ、完成予定が大幅に遅れた。また特注品のため、その測定精度の検証を慎重に行った。完成した移動式FPの測定精度を以下の方法により検証した。プラットフォームに固定したフォースプレート[固定式FP]の上に、移動式FPを設置し、被検者にその上から片足ジャンプを行わせた。その際の床反力データを1000Hzで取得した。取得した床反力データの垂直成分について移動式FPと固定式FPの一致度を検証した。検証には1計測した全試技の加算平均と標準偏差の時系列グラフの重ね合わせ、2散布図、単相関および単回帰式、3Bland-Altmanプロットを用いた。その結果、特注した2枚の内1枚で床反力垂直成分が約10%程度小さく計測されてしまうことがわかった。原因を調査した結果、移動式FPを取り付けるスターティングブロックのフットプレートの接地面が水平ではなく、測定結果に強く影響していることが疑われた。そこでフットプレートを水平加工することにした。加工終了後、同様の検証を行い、移動式FPと固定式FPの測定値の一致度が向上したことが認められた(相関係数、加工前:0.9930;加工後:0.9982)。この精度検証により、ブロッククリアランス時の床反力を精度良く評価することが可能であることが示された。計画は変更せざるを得なかったが、研究課題遂行のために必要な変更であったと考えている。

特に滞空期の長さは垂直方向の身体重心速度で決まる。垂直速度を高めるために右脚は左脚よりも大きな力を発揮して可能性がある。このように内側となる左脚は方向転換を、外側となる右脚は推進力獲得に貢献しているかもしれない。フォースプレートの完成が大幅に遅れ、また精度の検証に時間が掛かっってしまったため、初年度に予定していた実験の予備実験までしか行うことが出来なかった。予定していた実験を簡略化するために、実際の競技会の映像を撮影し、曲走路疾走時の運動学的左右差が出現する地点を明らかにする予定である。スタート後50m地点では既に接地時間や滞空時間に左右差が出現していることから、スタートからの接地時間と滞空時間をハイスピードカメラから算出することでいつ左右差が出現するか明らかにする。これにより、2回に分けて実験を行う予定を1回で済ますことが出来るため、研究の遅れを取り戻すことが可能である。研究計画変更により、購入予定であった消耗品を購入しなかったため。次年度は、主に消耗品の購入とアルバイトへの謝金支払いが主な支出となる。また研究発表のための旅費などに使用する予定である。
語りの経験ともの語りの修辞学

文学作品を模範例に、人間の経験が「語り」というのものに編成されるにあたって、いかなる形式をとるかを、物語論の枠組みにおいて、語りの修辞という面から考察する際に、どのような用語法にしたがって記述できるのかを、具体的に検証することができた。一人称語りの特質と、語りにおける聞き手の重要性などが再確認され、「読者論」に接続する「聞き手論」の構想の地平を開くことができた。対象となったのは、日本近代文学、中国近代文学、をはじめ、日本や朝鮮を語る学術的研究における「語り」のスタイルなどにも踏み込むことができた。本年度は、研究計画の初年度として、はじめに研究体制の構築・整備を図った。研究代表者のもとで「語り」に関する研究会を立ちあげ、代表者の指導大学院生をふくむメンバーで、「語り」に関する理論的研究の枠組みを構築すべく努めた。「語り」に関する理論は、G・ジュネット以来のフランス派、リモン=ケナンらに代表されるイスラエル派、さらにはNarrative Theoryとして語りの研究の拡大を図ったJ・フェランらのアメリカ派、さらにはシュタンツェル以来の伝統に連なりモニカ・フルダーニクらが活躍するドイツ派等があるが、これら諸学派の理論的立場の整理に時間を注いだ。日本語で論じうる語りの理論の構築に向け、叙上の諸理論を整合的に活用しうるまでには、猶時日を要するとの見通しを得た。なお「語り」の研究会に属する大学院生のイギリスでの学会発表の旅費援助を行った。また、関連資料の集積に努めた。さらには、R・A・モース氏の編になる英文論文集を『世界の中の柳田国男』として翻訳刊行したが、これにより、柳田国男という特異な思想家・民俗学者が英語圏においてどのように論じられているか、ひいては日本近代の固有文化がいかに語られうるのかを知る上で、貴重な知見が得られた。研究分担者である劉岸偉は、中国近代における重要な思想家周作人に関する長年の研究にさらに新たな展開を示した。もう一人の研究分担者である李建志は、植民地時代の朝鮮、在日朝鮮人、および北朝鮮といった苦難の歴史、経験が語られることの多い対象、論題について、幅広い研究を展開した。1.語りに関する理論的研究の進化を図るべく、大学院生等をも交えて、文学の語りに関する研究会を行った。やや規模の大きなものとしては平成25年9月30日(月)の研究発表会(於東京大学駒場キャンパス18号館コラボレーションルーム2)がある。2.ICLA(国際比較文学会)の会長、理事等と国内の比較文学研究者を招聘して、平成25年11月29日に「比較文学の未来」を全体テーマとする国際コロキアムを東京大学駒場キャンパス18号館コラボレーションルーム1で開催した。使用言語は英語とし、5本の研究発表に続く討議を行った。ICLA会長ハンス・ベルテンス氏(ユトレヒト大学教授)はホロコーストの語りと比較文学研究のあり方について研究発表を行い、日本比較文学会会長大嶋仁(福岡大学教授)は、南島の口承伝承とその語りに関する研究発表を行い、盛んな議論を惹起したのが特記される。このほか、ユージン・オーヤン(インディアナ大学教授・香港浸会大学教授)、橋本順光(大阪大学教授)、山中由里子(国立民族学博物館准教授)が研究発表し、佐藤光東京大学准教授、上垣外憲一大妻女子大学教授、及び本研究代表者菅原克也が討議に参加した。3.ICLA世界大会に大学院生を派遣し、文学の語りに関する研究発表の機会を提供した。4.研究代表者菅原は、語りに関する文学理論的研究の本の執筆を進めた。5.「語り」一般、及び「苦難の語り」に関する資料の収集を継続した。1.「語り」について日本語で了解される記述を準備するための作業を行った。これについてては、平成28年秋に東大出版会から刊行の予定である菅原克也の単著『小説の語り』(約350ページ)でその成果がまとめられている。2.平成26年12月5日(金)に日韓学術交流シンポジウム「日本を語る、韓国を語る」を韓国外国語大学校との緊密な協力のもとに、東京大学駒場キャンパスで開催した。招待者として朴容九と姜素英、研究分担者として李建志と菅原克也が研究発表し、これに徐戴坤、金鍾徳、崔在喆、佐藤光、前島志保、徳盛誠が討論者として加わった。3.研究代表者菅原克也のもとで、文学の語りに関する研究会に参加していた元大学院生の伊藤由紀と金志映が東京大学で開催されたコロキアム「みずからを語る声ー独白と告白」において研究発表した。4.研究分担者の劉岸偉が、周作人研究をさらに進展させ、イギリス人東洋学者であるアーサー・ウェリーの中国についての語りのついて研究を発表した。5.研究分担者の李建志が、「住まう」ことに関する生活の場の語りについて、実体験にもとづく著書を発表した。27年度が最終年度であるため、記入しない。

人文学当初目論んでいたモニカ・フルダーニク教授の招請が、御本人のご都合で実現しなかったため、計画していた講演会、研究会が実現しなかった。そのため、研究計画の実現はやや遅れることになった。1.平成25年度には、台湾大学、韓国外国語大学、高麗大学等の研究者を招請して国際シンポジウムを開催する予定であったが、ICLA(国際比較文学会)の動きを呼応するかたちで、ICLA関係者による国際コロキアムに切り替えた。このため、東アジアの研究者との交流、共同研究はやや遅れることとなった。27年度が最終年度であるため、記入しない。「語り」の研究会の定期的開催を通じて、語りの理論の整理を推進する。また、海外の研究者の積極的招請や、学会・シンポジウム等での発表を通じ、論点を深め、研究の深化をはかる。1.平成26年度に、韓国外国語大学の研究者を招請して国際研究集会を行うことがすでに決まっているので、これを「苦難の語り」に関する国際コロキアムへ拡大する。2.研究代表者菅原克也を中心に「語り」に関する研究会の開催を引き続き行う。同じく、研究基盤の強化を目指した資料の収集を続ける・3.研究代表者菅原克也による「語り」の理論に関する本の出版を準備する。4.「苦難の語り」に関する研究成果の集成を図る。当初24年度に予定していた外国人研究者の招請が実現しなかったため、計画の変更を余儀なくされ、当該助成金が生じた。25年度は、積極的に海外との交流を図り、研究の進展を期す。平成25年度に東アジア三国国際共同シンポジウムの開催を予定していたが、これがICLA(国際比較文学会)との国際コロキアムに切り替わったため。平成26年秋に、東アジア三国国際シンポジウムを行う。
神経特異的蛋白失HPC-1の機能調節に関する解析

神経細胞間での情報の受け渡しは、開口放出に伴う神経伝達物質の放出により行われていることが知られている。この過程に影響を与える要因の一つとして、Aキナーゼ等を初めとした蛋白質リン酸化酵素の活性化が知られている。これらの酵素は、近年多数同定されてきた開口放出関連蛋白質に対して直接的あるいは間接的に働きかけ、伝達物質の放出過程を調節すると推測される。本研究は開口放出関連蛋白質の中で、形質膜に結合するHPC-1/syntaxin1A蛋白質のリン酸化について検討することを目的として行った。そこで、神経組織においてHPC-1蛋白質のリン酸化が認められるか調べた。そのためHPC-1の他のFamilyとクロスしない特異的な抗体を作成した。これを用いてaffinity colomunを作成し、ラットの脳からHPC-1の精製をおこなった。ここで得られたHPC-1分画を用いて、リン酸化アミノ酸を特異的に認識するモノクローナル抗体によりそのリン酸化の有無を検討した。その結果、HPC-1のSer残基がリン酸化を受けていることが明らかになった(Kushima et al.'97 J.Mol.Neurosci.)。また、PC12h細胞においても、Ser残基のリン酸化が認められた。この蛋白質はカゼインキナーゼ「にリン酸化されるとの報告がある。現在、その他のリン酸化酵素の基質になりうるか調べるために、そのリン酸化部位の同定を試み、そのリン酸化酵素について検討している。また、HPC-1のリン酸化に伴い、SNAP-25、VAMP、synaptotagmine等の結合蛋白質に対する親和性に変化が認められるか検討を行ったが、現在のところ顕著な変化は見いだせていない。今後、培養細胞を用いた免疫沈降によりこの点について明確にしていく予定である。
アラブ世界における教育的地域連携―人的・教育機関の国境を越える展開に着目して―

本研究はアラブ地域で国境を越える教育的な連携がどの程度形成され、どのような機能を備えているのかを明らかにすることを目的としている。結果としてこの地域における高等教育制度の展開状況を広く明らかにするとともに、UAEにおける、他のアラブ諸国から進出した外国大学分校の特質として、地域共通の言語的・文化的・社会的基盤により展開していることを考察した。また、エジプト高等教育質保証における国家機関の役割として、高等教育機関のガバナンスを強化する側面がみられること、またアラブ・オープン大学が、分校が立地する国ぐにの高等教育制度と適合しながら展開し、緩やかな地域的なネットワークを構築しているという知見を得た。本研究は全体として、中東アラブ地域において国境を越える教育的な連携がどの程度形成され、どのような役割や機能を備えているのかを明らかにすることを目的としている。その中で本年度は、主としてエジプトやヨルダン、サウジアラビア、パレスチナなどのアラブ地域の国々の高等教育部門に焦点を当て、これらの国々においてどのような高等教育の制度的枠組みが形成されているのかを、各国の高等教育法を分析することを通して検討した。また、アラブ首長国連邦の外国大学分校に焦点を当て、レバノンやモロッコといったアラブ地域から進出している分校が、ほかの国々から進出してきた外国大学分校とはどのような異なる特質をもっているのかを明らかにした。これらの研究成果の公表は、『アジアの「体制移行国」における高等教育制度の変容に関する比較研究』の中で、「[資料]高等教育委員会と大学に関する法令及び規則(サウジアラビア大学法)」、「[資料]ヨルダン大学法(ヨルダン・ハシミテ王国大学法」、「[資料]高等教育に関する1998年法令(パレスチナ大学法)」などを刊行することを通して行われた。また、論文「「アラブ首長国連邦における国民と外国大学分校ー教育ハブの中の「アラブ基盤型」発展論理ー」は日本比較教育学会の機関紙である『比較教育学研究』に研究論文として掲載された。以上の研究では、中東アラブ地域における高等教育の展開状況を広く明らかにするとともに、アラブ首長国連邦における、他のアラブ諸国から進出した外国大学分校の特質として、欧米諸国等からの外国大学分校とは異なり、アラブ地域共通の言語的・文化的・社会的基盤によって展開していることを明らかにした点から、アラブ地域の緩やかな教育的連携の紐帯を指摘した点に意義がある。本研究は全体として、中東アラブ地域において教育的な連携がどの程度形成されているのか、それらの連携がどのような役割や機能を備えているのかを明らかにすることを目的としている。その目的の中で、今年度は主として教育部門及び高等教育部門の各国状況に焦点を当て、それらの国々において、特に高等教育部門がどのように制度的に展開しているのかを明らかにし、研究全体の目標を達成するための基盤を形成することができたと考えられる。一方で、アラブ地域の教育部門に焦点を当てた先行研究は非常に少なく、基礎的情報を収集・分析することに時間を費やしたため、アラブ地域全体の教育的連携という、国境をを越えた枠組みには踏み込むことができなかった点については、今後の課題として挙げることができる。こうした点については、平成28年度には具体的な分析・検討まで進むことはできなかったものの、資料の収集は進み、今後の調査に必要な人脈は形成することができている。以上の状況から、現在までの進捗状況について「おおむね順調に進展している」と評価することができる。本研究は全体として、中東アラブ地域において、国境を越える教育的な連携がどの程度形成され、どのような役割や機能を備えているのかを明らかにすることを目的としている。その中で本年度は、主としてエジプトの高等教育質保証において国家が果たす役割に焦点を当て、文献資料を渉猟するとともに、アズハル大学およびアインシャムス大学において現地調査を実施し、大学教員や質保証関係者に対してインタビュー調査を行った。同時に、アラブ地域の高等教育機関のネットワーク化の事例として、クウェイトに本部を構えるアラブ・オープン大学を訪問し、アラブ地域において国境を越えて展開する高等教育機関の組織構造や教育内容についてインタビュー調査を実施した。これらの研究成果は、日本比較教育学会第53回大会における口頭発表「エジプト高等教育質保証における国家教育質保証・適格認定機構(NAQAAE)の役割・機能と課題」として報告した。また、アラブ・オープン大学に関する調査については、次年度に『大阪大谷大学紀要』等において論文として公表する予定である。その他、アラブ地域の高等教育国際化について、日本学生支援機構の機関紙である『留学交流』において「アラブ諸国における高等教育国際化ーUAE、カタール、エジプトを事例としてー」の中で最新の状況を紹介した。以上の研究では、中東アラブ地域における高等教育の展開状況を広く明らかにするとともに、エジプトにおける高等教育質保証における国家の役割として、高等教育機関のガバナンスを強化しようとする側面がみられること、また、アラブ・オープン大学が、ブランチが立地する国ぐにの高等教育制度と適合しながら展開することによって、緩やかな地域的な高等教育ネットワークを構築しているという知見を得た。

今後の研究の推進方策については、平成28年度までは主として教育部門・高等教育部門の各国状況を明らかにすることに焦点を当てて研究を進めてきたが、平成29年度については前年度までに明らかになった制度的状況を基盤として、アラブ地域において国境を越えてどのような教育的連携が行われているのかを明らかにすることに焦点を当てる。平成28年度までに形成することができた、エジプトやヨルダン、アラブ首長国連邦、カタールなどの国々における人脈をたどり、主として文献調査とインタビュー調査によって、国境を越えてどのように教育的な連携が形成されているのか、その役割や機能を明らかにする。同時に、高等教育のみではなく、初等・中等教育に焦点を当て、教員へのインタビューや学校観察などを通して、国民に限定するのではなく、「アラブ人」という枠組みにおいて、それらの学校でどのような教育が提供されているのか、またアラブ地域における人の国境を越えた移動についても実体的に明らかにする。29年度が最終年度であるため、記入しない。比較教育学29年度が最終年度であるため、記入しない。
侵入地と原産地のマツノザイセンチュウの比較ゲノムと生態的特性の解明

日本におけるマツノザイセンチュウの進化史を明らかにするため,侵入地である日本と原産地である北米のマツノザイセンチュウについて、集団遺伝学的解析と全ゲノムの比較を行った。マイクロサテライトまたはSNPによる解析の結果,国内産のマツノザイセンチュウの多様性が高く,これまでに北米から日本へ複数回の侵入イベントがあったことが示唆された。マツ材線虫病(マツ枯れ)の病原体であるマツノザイセンチュウは、病原性等の生態的特性や集団遺伝学的に高い種内変異を持っている。また、原産地である北米では形態的に異なる系統(M型とR型)の存在が知られているが、その詳細な研究例は少ない。本研究では、1)マツノザイセンチュウの原産地である北米大陸産の複数の系統の株を対象に、それらの生態的特性・分類学的位置を明らかにし、ゲノムレベルで日本産の株と比較することにより、その種としての進化史・病原性獲得の要因を明らかにすること、2)日本国内に蔓延している系統の集団遺伝学的特徴を明らかにすることを目的としている。本年度は、カナダおよびアメリカ合衆国産マツノザイセンチュウの形態的観察、ゲノムおよび集団遺伝学的解析のための生物材料の準備を行った。研究室に保存されている北米産マツノザイセンチュウを顕微鏡で観察した結果,カナダ産1株とアメリカ合衆国産1株がM型であることが判明した。複数遺伝子の解析の結果、北米産M型は日本産の株(全てR型)とは異なる系統であった。現在、北米産M型および北米産R型の株を単雌化培養することにより純系株の作出を進めており、これらを用いて全ゲノムシークエンス解析を行う予定である。また、日本国内の集団遺伝学的解析に供するため、これまで所有株が少なかった地域である沖縄よりリュウキュウマツ枯死木を採集し、マツノザイセンチュウ39株を樹立した。線虫の純系作出が進んでいること、集団遺伝学的解析のための線虫株も樹立できたことから、おおむね順調にすすんでいるものと考えている。本研究では、1)マツノザイセンチュウの原産地である北米大陸産の複数の系統の株を対象に、それらの生態的特性・分類学的位置を明らかにし、ゲノムレベルで日本産の株と比較することにより、その種としての進化史を明らかにすること、2)日本国内に蔓延している系統の集団遺伝学的特徴を明らかにすることを目的としている。本年度は、ゲノム解析に用いる国内の株を選択するために、マツノザイセンチュウの集団遺伝学的解析を行った。研究室で保存されているマツノザイセンチュウの株についてすでに開発されているマイクロサテライトマーカー16座について多型性を調べたところ、うち13座で27個の対立遺伝子座が認められた。そのうちヌルアリルが多いなど解析に不適なものを除く9座について解析したところ、材線虫病被害の歴史の古い西日本の方が東・北日本よりも多様性が高い傾向があった。また、沖縄島を対象に新たに分離されたマツノザイセンチュウについて同様な解析を行ったところ、沖縄島という一つの島においても過去に複数回のマツノザイセンチュウの侵入があった可能性が示唆された。これらの結果を元に、地理的・遺伝的に多様になるように国内株28株を選択し、これらと北米株6株の全ゲノムシークエンスを実施した。保有している機器(DNAシークエンサー)の故障のため全ゲノム解析に供する線虫株の絞り込み(選択)が遅れたことから、本年度の研究期間を延長した。その結果,マツノザイセンチュウの国内株のマイクロサテライトマーカーによる解析が終了し,その結果を元に全ゲノム解析に供する国内株を選択することが出来た。これらと北米産の株の1回目の全ゲノムシークエンスが完了したことから、おおむね順調に進んでいるものと考えている。マツノザイセンチュウの国内株と北米産M型2株,R型4株について,全ゲノムシークエンスを実施し,昨年度に得られたデータと合わせて解析したところ、リファレンスの国内株のゲノムに対して8398%のマップ率のゲノムデータを取得した。リファレンスゲノムに対して34200万のSNPが認められ,それらを元に系統樹を作製したところ,北米株はM型とR型両方を含む一つのクレードを形成し,国内株では、それぞれ九州と近畿、沖縄、日本全国の株からなるクレードにおおまかに分けることが出来た。以上のことから,マツノザイセンチュウのM型とR型(日本産も含む)との間には系統的な分化は認められないこと、国内のマツノザイセンチュウが遺伝的に多様であり,これまでに北米から複数回の侵入があった可能性があることが示唆された。

しかし、本データから日本産のマツノザイセンチュウの起源を推定することは出来なかった。起源を明らかにするために,北米の広範な地域からマツノザイセンチュウを収集して解析する必要がある。日本におけるマツノザイセンチュウの進化史を明らかにするため,侵入地である日本と原産地である北米のマツノザイセンチュウについて、集団遺伝学的解析と全ゲノムの比較を行った。マイクロサテライトまたはSNPによる解析の結果,国内産のマツノザイセンチュウの多様性が高く,これまでに北米から日本へ複数回の侵入イベントがあったことが示唆された。次年度は、交配試験と分子系統解析により北米産マツノザイセンチュウM型の分類学的位置を明らかにするとともに、作出された北米産純系株について全ゲノムシークエンスを実施する。次年度は、ゲノムデータの精度を高めるために、マツノザイセンチュウの一部の株について全ゲノムシークエンスを実施してデータを追加しする。得られた全ゲノム配列からSNP等を探索して系統解析を実施し、国内株と北米株を比較することにより国内株の起源などを推定する。保有している機器の故障のために本年度の研究期間を延長したが、次年度はおおむね計画に沿って遂行する予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。森林病理学29年度が最終年度であるため、記入しない。
DNA鎖の損傷とその修復能の促進に関する研究

ヒトリンパ球におけるNAD含料とDNA修復に及ぼすナイアシンの影響について検討した。種々の濃度のニコチン酸またはニコチンアミドを添加した培地とともにリンパ球をインキュベートした。5μMのニコチン酸または10mMのニコチンアミドとリンパ球をインキュベートすることによって、リンパ球中のNAD含料は、23倍に上昇した。このようなNADレベルを上昇させた条件下で、リンパ球をN-メチル-N′-ニトローN-ニトロソグアニジン処理し、DNA修復に及ぼすナイアシンの影響を調べた。その結果、興味深いことに、損傷DNAの修復は、ニコチン酸によって促進されたが、ニコチンアミドによって阻害された。ニコチン酸によって細胞内NADレベルを上昇させた後にMNNG処理をした場合には、劇的なNADの分解が見られたが、ニコチンアミドの場合には、そのようにならなかった。以上のような結果は、DNA修復に対するポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼの関与を示唆するものである。健常成人男性から採血した静脈血を、Ficoll-Paqueを用いた比重遠心法により分画し、得られた単核白血球をリンパ球区画として本研究に用いた。DNA損傷の手段としては、X線と発ガン剤のニトロソグアニジン(MNNG)を用い、これらによるDNA修復や細胞内NAD量、PARP活性に及ぼす影響を検討した。その結果、いずれの場合も、DNAが損傷すればPARP活性が上昇し、細胞内NADレベルが低下するという従来の結果を指示するものであった。細胞内NADレベルがDNA修復に及ぼす影響の検討において、今回は細胞内NADレベルを上昇させた場合について調べることにした。そこでまず、培地にNADの前駆体であるナイアシンを添加して、効果的にNADレベルを上昇させる濃度、および培養時間等について検討した。その結果、ニコチン酸添加では、その終濃度が10μM付近においてNADレベルが最高値となり、その値はコントロールに比べて約3.5倍の上昇が見られたが、ニコチン酸をそれより高濃度にするとNADレベルの上昇率は大きく低下した。一方、ニコチンアミドの場合は、濃度依存的にNADレベルが上昇し、10mMの高濃度で、コントロールの約2倍の上昇が見られた。このような条件で、ヒトリンパ球のNADレベルを上昇させ、それぞれにおけるDNA修復に及ぼす影響について検討した。その結果、MNNGの低濃度処理条件(0.5μg/ml)において、ニコチン酸によってNADレベルを上昇させた場合には、DNA修復は促進されたが、ニコチンアミドの場合には、DNA修復は阻害的であった。細胞にDNA損傷処理を施すと、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(以下PARPと略す)活性が上昇して細胞内NAD含量が著しく低下し、ポリ(ADP-リボース)合成が上昇することから、特にDNAの損傷、修複時に関与することが確実視されている。そこで、細胞内NADレベルの維持が機能発現に重要であると考え、今年度はPARP活性および細胞内NADレベルとDNA修復との関連に重点を置いて研究した。1.MNNG処理に伴う細胞内NADレベルの変化ナイアシン添加培地によるリンパ球の細胞内NADレベルの上昇がDNA修復に及ぼす影響について、まず、MNNG処理に伴う細胞内NADレベルの変化について調べた。その結果、MNNG処理(1時間)の間に、細胞内NAD量の著しい減少が観察された。2.細胞内NADレベル枯渇リンパ球についてリンパ球のNADレベルを枯渇させて、その状態におけるDNA修復を調べるために、GIBCO社のRPMI1640セレクトアミンキットを用いて、ナイアシン欠乏培地を調製した。この培地でリンパ球を培養し、細胞内NAD量の変化について調べた。その結果、通常用いている血清の場合、NAD量にはほとんど変化はなく、透析した血清を用いたときに、若干の低下が見られた。3.FACSによるポリ(ADP-リボース)の同定末梢血リンパ球のポリ(ADP-リボース)量について調べた。また、蛍光抗体法についても検討した。好中球とリンパ球の分離は、ヘパリン処理した静脈血をデキストランT500溶液に懸濁し、20分静置して赤血球を除去した後、Ficoll-Paqueに重層して比重遠心することで、1サンプルから同時に得られる。FACS(フローサイトメ-夕-)は細胞周期解析の他に、リンパ球のサブセット解析にも多用され、現在では、各成分について散乱光のドットプロットから判断することができる。

その結果、それそれの分画については、おおむね良好であった。ポリ(ADP一リボース)量に関しては、好中球では陰性コントロールとの差がほとんどなかった。一方、リンパ球については、蛍光を発する細胞の数自体は増加していることがわかった。
抗体分子の細胞内発現による機能解析法の確立

6種のGタンパク質共役型受容体キナーゼ(GRK)機能的な違いを解析するために、細胞内免疫法の確立を試みた。細胞内免疫法は、モノクローナル抗体を細胞内に発現させることによりなされる。はじめに、GRK2(βARK1)のカルボキシル末端とグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質を用いて、モノクローナル抗体を作製した。得られたモノクローナル抗体はβARK1のみを認識し、GRK3とGRK5およびGRK6を認識しないことがウェスタンブロットの結果から明らかとなった。ハイブリドーマの培養上清から、硫安沈殿、プロテインGカラムにより精製したモノクローナル抗体はβARK1のbasalおよびアゴニスト刺激のリン酸化活性を抑制した。モノクローナル抗体は三量体Gタンパク質のβγサブユニットのカルボキシ末端への結合も抑制した。βARK1のカルボキシ末端とGSTとの融合タンパク質がβARK1を活性化することから、モノクローナル抗体はカルボキシ末端に結合することでβARK1の活性化を抑制していることが分かった。また、心筋細胞にモノクローナル抗体を注入し内在性のβARK1を不活化することにより、β1アドレナリン受容体によるL型Ca^<2+>チャネルの活性調節にβARK1が関与していることを示した。一本鎖抗体を作製するために、ハイブリドーマのmRNAより重鎖と軽鎖の可変領域をPCRにより増幅した。大腸菌に発現させた一本鎖抗体はβARK1を認識した。さらにリコビナントのアデノウイルスを作製するために、一本鎖抗体のcDNAをコスミドベクターに導入した。我々は、一本鎖抗体のアデノウイルスによる発現が種々のGタンパク質共役型受容体の脱感作におけるβARK1の役割を明らかにすると考えている。遺伝子クローニング技術の進展は、受容体を含む多くのタンパク質がいくつかのサブタイプから成っていることを明らかにした。しかしながら、個々のタンパク質が細胞内でどのような機能を果たしているのかについては従来の方法では明らかにされない。本研究では、個々の遺伝子産物を認識する単クローン抗体を細胞内に発現させ、目的とするタンパク質の活性を不活化させ、そのタンパク質の機能を細胞レベルで解析できる系を確立することを目的としている。まず、マウスを免疫するために、受容体キナーゼの間で相同性の低いカルボキシ末端とグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質を作製した。受容体キナーゼIIのカルボキシ末端より約100アミノ酸をPCR法により増幅し、GSTとの融合タンパク質を大腸菌に発現させた。しかし、予期しなかったことにほとんど全ての融合タンパク質は不溶性画分にあった。不溶性画分より可溶化するいくつかの方法を試みたが、収量を増加させることはできなかった。次に、カルボキシ末端より約200アミノ酸をPCR法により増幅しGSTとの融合タンパク質を作製した。この融合タンパク質は可溶性画分に回収されたので、アフィニティークロマトグラフィーにより精製することができた。この融合タンパク質を用いてマウスに免疫し、ミエローマ細胞との融合を行った。ハイブリドーマをスクリーニングした結果、一つのクローンが得られた。このモノクローナル抗体の抗原決定部位は、カルボキシ末端より100から200アミノ酸部分に存在することが明らかになった。現在、このモノクローナル抗体が受容体キナーゼIIの作用を抑制するのかどうか解析している。受容体キナーゼ2のカルボキシ末端約200アミノ酸とグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質を抗原としてマウスに免疫した.スクリーニングの後,一つのハイブリドーマが得られ,単一のミエローマとなるまでクローニングを繰り返した.

このようにして得られたミエローマは受容体キナーゼ2を認識するモノキロ-ナル抗体を産生していた.受容体キナーゼのうち受容体キナーゼ2,3,5および6は多くの組織で発現している.これらをそれぞれ発現させた標品を用いてウエスタンブロットを行うと受容体キナーゼ2のみを認識した.受容体キナーゼ2と3の抗原として用いたカルボキシ末端の領域は相同性がかなり高い.この2種を区別するモノキロ-ナル抗体は受容体キナーゼ2のみの発現,翻訳後修飾などを調べるときに非常に有益である.ハイブリドーマを大量に培養し,培養上清より硫安沈殿,カプリル酸処理,さらに透析後ふたたび硫安沈殿し濃縮された標品を得た.しかしながら,このモノクローナル抗体は受容体キナーゼ2によるロドプシンのリン酸化に何ら影響しなかった.したがって,特異性は非常に高いが,活性を抑制しないことから本研究の目的には使えないことが明らかになった.現在,いくつかのカルボキシ末端部分とGSTとの融合タンパク質を再び免疫し,ハイブリドーマをスクリーニングしているところである.免疫に使用したカルボキシ末端部分は受容体キナーゼ2が作用を発揮する際の細胞膜への移行に必須の部分であり,得られるハイブリドーマは受容体キナーゼ2の作用を抑制する確率が高い.しかし,抗原として使用した部分が短いためハイブリドーマの得られる確率は低くなると予想される.受容体キナーゼは、活性化された受容体をリン酸化し、受容体の脱感作に関与するタンパク質リン酸化酵素である。現在までに6種の遺伝子がクローニングされており、そのうち酵素学的解析の進んでいるのは受容体キナーゼ2である。受容体キナーゼ2のカルボキシ末端50または71アミノ酸を抗原として免疫し、モノクローナル抗体を作製した。得られたモノクローナル抗体は、アゴニスト依存性の受容体キナーゼ2によるm2ムスカリン受容体のリン酸化を抑制した。また、m2ムスカリン受容体の細胞内第3ループを基質としたときのマストパランによる活性化および三量体Gタンパク質のβγサブユニットによる活性化を抑制した。さらに、何ら活性化因子を加えないときのリン酸化活性も抑制した。受容体キナーゼ2の全長は689アミノ酸よりなっており、モノクローナル抗体はカルボキシ末端の640番目のLeuと689番目のLeuの間を認識した。この部分を含むペプチドは受容体キナーゼ2を活性化したことから、作製したモノクローナル抗体は活性化に必要な部位に結合することで受容体キナーゼ2を抑制していることが明らかになった。次に、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマより抗体遺伝子の可変領域V_HとV_LをPCR法によりクローニングし、リンカー(Gly_4Ser)_3でつないだ(V_Hーリンカー-V_L)。さらに発現を確認するためにE-タグをカルボキシ末端に付加し大腸菌に発現させた。スクリーニングの結果、抗原を認識するクローンが得られたのでその塩基配列を決定した。今後、in vitroでのリン酸化実験を行い、作製した一本鎖抗体が受容体キナーゼ2の活性を抑制することを確認した後、アデノウイルスに組み込む。