hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＭＯＳＡＩＣ：　自然で双方向的な対話処理モデル

本研究は土台となる伝達意図の処理に注目し、どのように音声処理を行うかに関して取り組む。我々は発話から、状況により変わる話し手の意図の予測、あるいは解釈の支援のために、発話のノンバーバル情報の解釈を組み込んだシステムを開発することを目的としている。自然対話の内容は、発話の意味を伝達することと同時に、社交的なつながりにも大いに寄与している。このような社交的な交流を認識することには、音声情報や話し方(対話中では何を言ったかよりも最重要な単位)といったものが必要不可欠である。我々は音声処理に、発話内容と並んで、話し方情報を含めることにより、より価値のある発話の表現と理解を実現することを目標としている。平成12年から18年、独立行政法人科学技術振興機構(JST)の助成による研究「表現豊かな発話音声のコンピュータ処理システム」において世界一音声大規模コーパスの収録を行った。このコーパスから対話インタラクション情報の分析を可能にした。本分析結果は語彙的情報のみではなく、ノンバーバルコミュニケーションの重要性、詳細な声の使い方等の利用をモデル化可能にし、発話者の対話意図・参加程度等のセンシング技術の開発を可能にした。平成16年から平成18年の総務省戦略的情報通信研究開発推進事業(SCOPE)の助成により「ヒューマンコミュニケーションの「場」が読めるロホットの研究開発(041307003)」の研究において、マルチモーダルつまり音声+ビデオを収録し、音声対話コーパスを作成し、声の調子と共に微妙な動作情報を含めて分析を行った。今回その研究の延長として本研究課題において、発話者・参加者の心理的情報を具体的に計るため、音声やビデオと共にバイオメトリックセンサーを利用した。ans(Autonomic nervous system)情報とは、ガルバニック皮膚反応による物理的データである。アイルランドのダブリン大学と共同で、"d-ans"データの収録を、Italian Institute of Technologyの研究者シャノン・ヘニング氏と行った。"d-ans"コーパスの解析はイタリアのItalian Institute of Technology、アイルランドのダブリン大学とNAIST(奈良先端科学技術大学院大学)で行われ、コーパスの分析・モデル化の結果を論文に発表した。またその論文はLREC会議(Language resources and evaluation conference)で発表することになった。平成16年から平成18年の総務省戦略的情報通信研究開発推進事業(SCOPE)の助成により「ヒューマンコミュニケーションの「場」が読めるロホットの研究開発(041307003)」の研究において、マルチモーダルつまり音声+ビデオの収録し、音声対話コーパスを作成し、声の調子と共に微妙な動作情報を含めて分析を行った。今回その研究の延長として本研究課題において、発話者・参加者の心理的情報を具体的に計るため、バイオメトリックセンサーを利用した。ans(autonomic nervous system)情報とは、ガルバニック皮膚反応による物理的データである。これまで参加者の参加態度(心理情報等)を手動でアノテーションしデータを構築していたが本研究では、バイオメトリックセンサーにより同様な結果が得られるかどうかの確認をするためデータ収集・分析を行った。米国マサチューセッツ工科大が開発したQセンサーの技術を導入し、対話インタラクションをマルチモーダル技術に収録しながら、発話者のバイオメトリックセンシングを同時に行った。本研究は発話の言語的内容のみならず、土台となる伝達意図の処理に注目し、どのように音声処理を行うかに関して取り組む。本研究課題において、発話者・参加者の心理的情報を具体的に測るため、バイオメトリックセンサーを利用した。ANS(autonomic nervous system)情報とは、ガルバニック皮膚反応による物理的データである。

アイルランドのダブリン大学と共同で、"D-ANSデータの収録を、Italian Institute of Technologyの研究者シャノン・ヘニング氏と行った。これまで参加者の参加態度(心理情報等)を手動でアノテーションしデータを構築していたが本研究では、バイオメトリックセンサーにより同様な結果が得られるかどうかの確認をするためデータ収集・分析を行った。米国マサチューセッツ工科大が開発したQセンサーの技術を導入し、対話インタラクションをマルチモーダル技術に収録しながら、発話者のバイオメトリックセンシングを同時に行った。最終年度にあたる本年は、その収録したDANSバイオメトリックデータを含む音声収録を分析し、対話化や参加情報を付与し対話音声コーパスという形で公開した。それとともにコンピューターによる音声対話システムの開発のため新たなソフト(アルゴリズム)を開発した。言語科学ダブリンのトリニティカレッジより中国人研究員をNAISTに招聘し、本研究に対するアイデアやコーパス利用についての意見を交換した。また、8月にイタリアのフィレンツェで開催されたInterspeech international conferenceで結果を発表し、セッションに招かれ、Prosody and Emotionで音声合成のサテライトワークショップを行った。このような学術的成果が示すように国際的に研究がすすみ、音声コミュニケーションの社交性が明らかになりつつあり達成度は高い。研究者の国際交流、共同収録・分析作業と出版を可能にした。本研究により多くの国際的な学会で発表する事により、国際的に日本の研究の知名度を広めることに貢献した。また、自身の国際的な研究プロファイルが大幅に進歩した。現在のGoogle Scholar(*1)の評価はh-index(h指数*2): 32(20), i10-index: 102(54), based on Citations(引用): 4499(1689)となっている。発話者・参加者の心理的情報を具体的に計るため、バイオメトリックセンサーを利用した。ans(autonomic nervous system)情報とは、ガルバニック皮膚反応による物理的データである。アイルランドのダブリン大学と共同で、"d-ans"データの収録を8月、Italian Institute of Technologyの研究者シャノン・ヘニング氏と行った。これまで手動によるアノテーション情報により参加者の参加態度(心理情報等)を手動でアノテーションしデータを構築していた。本研究では、バイオメトリックセンサーにより同様な結果が得られるかどうかの確認をするためデータ収集・分析を行った。
「信頼」概念に関する国際比較研究：応用倫理・実験哲学的アプローチ

本研究は、現代社会における「信頼」概念が果たす役割について、哲学、倫理学、心理学などの複数領域の立場から横断的に検討を行い、よりよい信頼理解が人々のよき生に向けて果たしうる役割について提言することを目指す。このため以下の三グループに分けてそれぞれ研究活動を行なった。グループA)信頼の規範理論的分析を通じた信頼概念の包括的理解、グループB)信頼の思想史・宗教的分析による文化による違いの検討、グループC)実験哲学の手法にもとづく信頼の実証的分析。2018年度においては、各グループのこれまでのサーベイや研究成果を基に、下記の通り成果を論文や学会報告等で発信した。特にグループA)では「ロボット、信頼、不信頼」(笠木雅史、第36回日本ロボット学会学術講演会、2018年)、グループB)信頼の思想史・歴史的研究では『東アジア・キリスト教研究とその射程無教会キリスト教を中心に』(芦名定道著、2019年、三恵社)を、またグループC)信頼の実証的研究では『信頼を考える:リヴァイアサンから人工知能まで』(小山虎編、2018年、勁草書房)等を上梓した。加えて、研究プロジェクト全体の成果報告の場として2019年3月に信頼概念に通暁する倫理学者と社会心理学者を招へいし、公開シンポジウムを京都大学で開催し、識者をはじめ一般市民との意見交換や情報発信を行った。これらを通じて社会に対して本研究の信頼概念に関する検討結果を問うことができた。平成30年度内に台湾および欧州での信頼概念についての調査を行い、その結果を分析し論文を執筆する予定であったが、調査研究の準備段階で概念整理の不備が露呈し、研究を予定通りに進行させることができなかった。基本的な研究体制や海外派遣、文献のサーベイなどは前年度と同様とする。各研究グループおよび研究計画全体での成果発表も同様に実施する。今年度は、前年度に到達できなかったグループC)の海外での調査と分析を実施し、信頼概念の文化比較研究の達成を目指す。本研究では、現代社会において「信頼」が果たす役割について、哲学・倫理学・心理学などの複数領域の立場から横断的に検討を行い、その意義を明確にするとともに、よりより信頼理解が人々のよき生に向けて果たしうる役割を提言する。このため以下三グループに分けてそれぞれ研究活動を行なった。グループA)信頼の規範理論的分析、グループB)信頼の思想史・宗教的分析、グループC)信頼の実証的分析。平成28年度は、信頼概念や安心、信仰、不信などの関連する諸概念に関する国内外の文献を収集し包括的なサーベイを行った。グループAでは主に情報倫理や生命倫理といった応用倫理分野における信頼概念を検討し、インターネット上のコミュニケーションにおける信頼の役割、医師患者関係における信頼関係の重要性などを検討した。グループBでは、信頼の認識論の先行研究について、分析哲学・宗教哲学の視点から調査した。グループCでは、実際に信頼概念の規範的内容や「安全」「信用」「信仰」といった関連概念との関係がどの程度一般に共有されているかを検討するため、大学生を対象とするパイロット版調査の準備を進めた。上記の各グループごとの研究成果を共有するため、研究協力者を含めて2016年8月3日および12月12日に研究集会を開き、議論を深めた。こうした研究成果を発信、海外研究者との連携や国際的な研究上の交流と意見交換を促進するため、海外の研究機関や学会に研究者を派遣した。平成28年度は、信頼および関連する諸概念について各グループが応用倫理、分析哲学・宗教哲学、社会心理学それぞれの観点からサーベイを行い、また国内外の学会等での発表を通じて知見を深めることができた。こうして得られた意見交換や研究討議の蓄積をもとに、今後さらに研究や調査を進め、その成果をアウトプットし、共有する基盤が整った。

平成30年度内に台湾および欧州での信頼概念についての調査を行い、その結果を分析し論文を執筆する予定であったが、調査研究の準備段階で概念整理の不備が露呈し、研究を予定通りに進行させることができなかった。平成29年度以降は、前年度同様の研究体制のもとで信頼概念の関連文献のサーベイを続けるとともに、これまでの調査結果に基づいて選定したこの分野に通暁した研究者一名もしくは二名を海外から短期招へいし、意見交換を行うとともに共同研究体制の構築を図る。また、今年度からは研究計画全体お呼び」各グループでの研究成果を順次公表し、国内外の幅広い研究者にわれわれの研究成果を討論・検討してもらう。各グループでは平成29年度に以下のことを実施する。グループA(信頼の規範理論的分析):前年度の研究を引き続き行うとともに、ビジネス倫理や環境倫理における信頼概念の検討に着手する。この研究の実施にあたっては、論点の多様性と議論の十分さを保証するために主にビジネス倫理や経営倫理の研究者や、環境倫理の主要な研究者を数名招へいして研究会を開催する。グループB(信頼の思想史・宗教的分析):前年度の研究を引き続き行うとともに、本グループが蓄積した知見やネットワークの他のグループの研究との連携を進める。また平成29年度以降本格化する信頼に関する実験哲学的研究との関連では、信頼するという倫理的思考が心理学的にどう位置付けられるかという道徳心理学の知見について、分担者の海田を中心に考察を進める。研究成果は他のグループと連携して日本科学哲学会などの諸学会で発表を行う。グループC(信頼の実証的分析):前年度の研究を引き続き行うとともに、信頼に関する実験哲学的な調査を実施する。具体的には、大学生を対象にしたパイロット調査に関して、今年度以降は一般成人を対象に拡大する。加えて、文化比較的調査については、研究協力者とんる台湾精華大学や韓国ソウル大学、スウェーデン・ウプサラ大学の学生や一般サンプルを対象にしたデータ収集をおこない、信頼について文化を越えた普遍性と社会構造の文化差について検討を進める。基本的な研究体制や海外派遣、文献のサーベイなどは前年度と同様とする。各研究グループおよび研究計画全体での成果発表も同様に実施する。今年度は、前年度に到達できなかったグループC)の海外での調査と分析を実施し、信頼概念の文化比較研究の達成を目指す。
社会的・経済的事実としての商標の研究―江戸期・明治期を中心として―

本研究は、明治期に登録された商標を、形態面と機能面から分類し、江戸の商人によって使用された屋号や商品に付加された標識と比較することによって、近代デザインの受容過程にある日本人の造形感覚を明らかにすることを目的としている。平成14年度は国立科学博物館が所蔵している商標公報資料を整理し、現存する商標に関する資料及び先行研究の調査を行った。さらに先行研究をふまえて、商標デザインの分類指標を作成し、商標登録制度が開始時から現在に至るまでの変遷を明らかにした。平成15年度は、年代別及び産業分野別の視点から以下の研究内容を実施した。14年度の研究結果において、明治現在の商標デザインにおいて、江戸までの文化的影響、海外からの文化的影響が認められたこと、経済状況が商標デザインの構成要素の複雑性に関係していることから、これらの点についてさらに詳細に分析を進めた。一つは造形要素の変遷を詳しく見るために、文字商標をのぞいた商標を用いて、商標の「複雑性」「抽象性」について時系列に分析し、明治から現代に至る造形意識の変化を明らかにした。もう一つは、西洋の影響を大きく受けたと予想される化粧品に関する分類を取り上げ、明治期における江戸までの影響、海外の影響について社会的・経済的背景から、その商標デザインとの関係について調査した。本研究は、明治期に登録された商標を、形態面と機能面から分類し、江戸の商人によって使用された屋号や商品に付加された標識と比較しすることによって、近代デザインの受容過程にある日本人の造形感覚を明らかにすることを目的としている。これまで国立科学博物館が所蔵している商標公報資料を整理し、現存する商標に関する資料および先行研究の調査をおこなった。さらに先行研究をふまえて、商標の造形的変遷とその分類指標を独自に作成するため、商標登録制度が開始時から現在に至るまでの形態の変遷を明らかにした。その方法としては(1)1885年から1999年までに登録された商標から5年ごと各100サンプルを無作為抽出し、(2)抽出した商標(合計2300点)から、造形デザインの特徴を分類するための指標を作成し、(3)集計したデータを加重移動平均法によって時系列分析した。その結果(1)商標構成形式による分析(「単一構成商標」と「複数構成商標」の比率の推移等)(2)使用された「シンボル」の図像の抽象化推移(3)「欧米風」「和風」「アジア風」等の地域イメージの出現推移(4)「家紋」「文字記号」「既成記号」「幾何図形」等の抽象イメージの出現推移(5)使用された「ロゴ」の欧文と和文の推移(6)「ロゴ」における表記形式の推移、等において各時代・カテゴリ別のデータを得ることができた。本年度はこれらの結果を、経済的要因、文化的要因から分析し、さらに西洋美術(デザイン)の影響についても検討を加えた。これらの研究から、商標の造形性を研究するために有効なカテゴリ分類を得ることができ、さらにその変遷を明らかにすることで、明治期の商標の造形的な特徴を明らかにすることができた。また現在、これらの知見をふまえ、明治期の商標デザインの産業別の検討、江戸期の家紋・看板などの機能および造形意識との比較をおこなっている。
4'-thioRNAによるRNA干渉の基礎研究とがん遺伝子治療への展開

本研究では,RNA干渉(RNAi)をがん遺伝子治療法として開発するための基礎研究として4-thioRNAによるRNAi効果を系統的に検討し,modification-activity相関を明らかにしin vivoでの使用可能な修飾siRNAの開発を目差す.平成15年度の研究において申請者はまず,様々な修飾に対応できる4'-チオリボヌクレオシドユニットの合成を完了した.続いて得られたヌクレオシドユニットを用いてpGL2ルシフェラーゼ遺伝子をターゲットとした各種修飾RNA (4'-thioRNA)を化学的に合成し,modification-activity相関を検討した.ウリジンユニットの修飾(19残基中5残基)ではセンス,アンチセンスさらに両鎖の修飾に対して許容であった.それに対してシチジンユニットの修飾(19残基中5残基)では修飾数が同じであるにも関わらず,両鎖の修飾においてRNAi効果が全く観察されなかった.これにより修飾体の導入部位もRNAi効果に極めて重要であることが明らかになった.さらに修飾数を増やしてゆくと(19残基中10残基および全修飾)効果は減少し,特にアンチセンス鎖の修飾でその現象は顕著に観察された.siRNAによるRNAi効果の発現には5'末端のリン酸化にはじまりヘリケースによる2本鎖の解離,続くRISC形成など非常に複雑な経路を必要とする.そこで検討したsiRNA数種について5'末端をリン酸化したものについてもRNAi効果を評価した.その結果,RNAi効果の増強,回復は見られず5'末端のリン酸化が重要なステップではないことが示された.続いてヘリケースによる2本鎖の解離の重要性を考察する目的で2本鎖RNAの熱的安定性を測定した.その結果,修飾数に比例して2本鎖RNAは熱的に安定になることが明らかとなり,RNAi効果の減少の原因の一つとして2本鎖RNAの熱的安定性が関わっていることが示された.これについては現在,ミスマッチ配列を導入することにより,より詳細な考察を行うための実験を行っている.現在,核酸医薬品として臨床使用されているものにアンチセンス核酸がある.この核酸分子ではgapmerと呼ばれる修飾法が一般に用いられている.そこでsiRNA分子についてもその修飾法を検討した.すなわち3'末端および5'末端6残基を修飾体とし,切断部位と予想される中央7残基を天然型とした各種siRNAを合成した.これらについても現在,RNAi効果ならびに効果の持続性の両面について検討中である.本研究では,RNA干渉(RNAi)をがん遺伝子治療法として開発するための基礎研究として4-thioRNAによるRNAi効果を系統的に検討し,modification-activity相関を明らかにしin vivoでの使用可能な修飾siRNAの開発を目差す.平成15年度の研究において申請者はまず,様々な修飾に対応できる4'-チオリボヌクレオシドユニットの合成を完了した.続いて得られたヌクレオシドユニットを用いてpGL2ルシフェラーゼ遺伝子をターゲットとした各種修飾RNA (4'-thioRNA)を化学的に合成し,modification-activity相関を検討した.ウリジンユニットの修飾(19残基中5残基)ではセンス,アンチセンスさらに両鎖の修飾に対して許容であった.それに対してシチジンユニットの修飾(19残基中5残基)では修飾数が同じであるにも関わらず,両鎖の修飾においてRNAi効果が全く観察されなかった.これにより修飾体の導入部位もRNAi効果に極めて重要であることが明らかになった.さらに修飾数を増やしてゆくと(19残基中10残基および全修飾)効果は減少し,特にアンチセンス鎖の修飾でその現象は顕著に観察された.siRNAによるRNAi効果の発現には5'末端のリン酸化にはじまりヘリケースによる2本鎖の解離,続くRISC形成など非常に複雑な経路を必要とする.そこで検討したsiRNA数種について5'末端をリン酸化したものについてもRNAi効果を評価した.その結果,RNAi効果の増強,回復は見られず5'末端のリン酸化が重要なステップではないことが示された.続いてヘリケースによる2本鎖の解離の重要性を考察する目的で2本鎖RNAの熱的安定性を測定した.その結果,修飾数に比例して2本鎖RNAは熱的に安定になることが明らかとなり,RNAi効果の減少の原因の一つとして2本鎖RNAの熱的安定性が関わっていることが示された.これについては現在,ミスマッチ配列を導入することにより,より詳細な考察を行うための実験を行っている.現在,核酸医薬品として臨床使用されているものにアンチセンス核酸がある.この核酸分子ではgapmerと呼ばれる修飾法が一般に用いられている.そこでsiRNA分子についてもその修飾法を検討した.すなわち3'末端および5'末端6残基を修飾体とし,切断部位と予想される中央7残基を天然型とした各種siRNAを合成した.これらについても現在,RNAi効果ならびに効果の持続性の両面について検討中である.
ザリガニの嗅覚探索行動を模倣した高感度水中化学探査ロボットの開発

ザリガニは口元にある3対の顎脚を動かし、自ら水流を起こす。小触角にある嗅覚受容細胞に向けて周囲から匂いを集めることにより、水の流れが淀んだ環境でも高感度に餌の存在を検知する。昨年度は、顎脚を模倣したアームを2対備えた水中ロボットを作製し、水流で引き寄せた化学物質を辿って発生源の位置を突き止める実験に成功した。しかし、実際のザリガニの歩行速度に比べ、ロボットの移動速度を遅くしなければ、化学物質源の探知に成功しなかった。そこで今年度は、餌を探して歩き回っているザリガニが実際にどのような流れを作っているか、海外共同研究者であるハル大学(イギリス)のThomas Breithaupt講師と共に再調査した。餌を探すザリガニの行動をビデオカメラで撮影して観察した結果、ロボットに搭載したセンサに比べてザリガニの嗅覚の方が高感度であるだけでなく、ザリガニは状況に応じて顎脚の振り方を変えている可能性があり、その効果を検討する必要があるとの結論に至った。しかし、ザリガニの顎脚と同程度の大きさで、高い自由度を有するアームを作製するのは困難である。そこで、ポンプで生成した水流を様々な方向へ噴出し、ザリガニが作る水流を模倣することを目指した。数値流体力学シミュレーションを行って噴流の噴出方向を検討し、水平方向および斜め45度後方に噴流を生成できる装置を実際に作製した。噴流の向きを変えると、噴流に引き込まれて形成される流れ場が変化する。これにより、化学物質を引き寄せてくる方向や速さを制御できることが示された。さらに、流れがある環境でも化学物質源の探知が可能となるようにロボットを改良することを試みた。ザリガニは、流れがある環境で餌の匂いを検知すると、流れを遡る方向に向かい餌の所在を突き止める。この行動を模倣するため、化学物質を含む流れの方向を判定可能な電気化学センサを開発した。ザリガニは、顎脚と呼ばれる扇状の付属肢を口元に3対持つ。顎脚を動かして能動的に水流を起こすことにより、小触角にある嗅覚受容細胞に向けて周囲から匂いを集め、水の流れが淀んだ環境でも高感度に餌の存在を検知する。本年度は、ザリガニの顎脚を模倣したアームを自律水中走行ロボットに取り付け、静水中で化学物質の発生源の位置を突き止める実験を行った。昨年度までに製作した試作機は顎脚アームを1対備えており、化学物質を前方から集めて検出することができた。しかし、発生源から放出された化学物質の比重が大きく、水底に沈んでしまった場合、これをセンサまで引き寄せて検出することはできない。ロボットが化学物質源の真上を通過しても、センサ応答が全く得られなかった。そこで今年度は、ロボットに2対目の顎脚アームを取り付けた。1対目のアームで前方に向かう斜め下向きの水流を作り、水底に沈んだ化学物質を巻き上げる。2対目のアームを上向きに振って、周囲からアームに集まる水の流れを作り、巻き上げた化学物質を化学センサに引き寄せる。このように改良を施したロボットを用い、海外共同研究者であるハル大学のThomas Breithaupt講師と共に実験を行うため、8月20日から16日間、イギリスに赴いた。実験では、大型実験水槽の中にアスコルビン酸水溶液を放出し、これをロボットに搭載したアンペロメトリック電気化学センサで検出して、発生源位置を突き止めることを試みた。その結果、顎脚を動かした場合は発生源の探知に100%成功したのに対し、顎脚を動かさない場合は探知が全て失敗に終わり、能動的に水流を起こすことの効果を実証することに成功した。この実験の模様は、BBCテレビのローカルニュースでも取り上げられた。

ザリガニは、流れがある環境で餌の匂いを検知すると、流れを遡る方向に向かい餌の所在を突き止める。この行動を模倣するため、化学物質を含む流れの方向を判定可能な電気化学センサを開発した。
分子間相互作用に基づくペプチド生成反応を利用した溶液系リガンド探索法の開発

溶液系での新規リガンド探索法の開発を目的とし、リガンド-タンパク質間の近接効果を利用したペプチド連結反応と、ペプチド鎖の情報を酵素活性に変換する方法の開発を試みた。本手法が有効に働くかを具体的に調べるために、モデル化合物を利用して「リガンドー標的タンパク質間相互作用に依存したペプチド断片連結反応」と「生成したペプチド鎖を用いた酵素再構成系」の構築を試みた。モデル系としてコイルドコイルペプチドおよび、酵素再構成系としてリボヌクレアーゼSを用いた実験により、本手法が溶液系での分子間相互作用検出に利用できることが分かった。本研究では、溶液系での新規リガンド探索法の開発を目的とした。具体的な原理として、リガンド-タンパク質間相互作用により、リガンド側と標的側のそれぞれに担持したペプチド鎖間が共有結合を形成し、共有結合で生成したペプチド鎖と酵素再構成系をカップルさせ、分子間相互作用を酵素活性に変換する方法を考案した。最初に、本手法の基盤となる「リガンドー標的タンパク質間相互作用に依存したペプチド断片連結反応」と「生成したペプチド鎖を用いた酵素再構成系」の構築を試みた。ここでは、ペプチド断片間の連結反応として、N断片C末端チオエステルとC断片N末端CysのSH基がチオエステル交換およびS →Nアシル基転移によるアミド結合生成を利用することとした。断片間の連結により生成するペプチド配列として、リボヌクレアーゼAのフラグメントであるSペプチド配列を基に2種類のアナログペプチドを設計した。各アナログペプチドとも2つに分断したペプチドを設計し、それぞれの断片ペプチドに担持したリガンドー標的タンパク質間の相互作用により、断片ペプチドが共有結合する系の構築を行った。リガンドー標的タンパク質間相互作用のモデルとして、特異的に相互作用することが知られているコイルドコイルペプチドを用いた。合成した化合物を用いてコイルドコイルペプチド間の相互作用に基づく断片ペプチド間の連結反応を検討したところ、相互作用と連結反応に顕著な相関が見られた。アナログ2では、約2時間で、原料の3040%の生成物が生じることが確認できた。また、得られた生成物とリボヌクレアーゼA由来のSタンパク質の相互作用により、リボヌクレアーゼSが再構成し、ヌクレアーゼ活性を示すことが確認され、酵素活性を指標として生成したペプチドの量を概算できることが分かった。これにより、溶液系での相互作用検出として本方法が利用可能であることが示唆された。本研究では、溶液系での新規リガンド探索法の開発を目的としている。具体的な原理として、リガンド-タンパク質間相互作用により、リガンド側と標的側のそれぞれに担持したペプチド鎖間が共有結合を形成し、共有結合で生成したペプチド鎖と酵素再構成系をカップルさせ、分子間相互作用を酵素活性に変換する方法である。H24年度は、本手法の基盤となる「リガンドー標的タンパク質間相互作用に依存したペプチド断片連結反応」と「生成したペプチド鎖を用いた酵素再構成系」の構築を試みた。ここでは、ペプチド断片間の連結反応として、ペプチド断片のC末端のチオエステルとN末端のシステインのSH基がチオエステル交換反応およびS →Nアシル基転移に基づくアミド結合生成反応を利用することとした。断片間の連結により生成するペプチド配列として、リボヌクレアーゼA(RNase A)のフラグメントであるSペプチド配列を基にアナログペプチド1(KETAAACFERQHMDS)を設計した。アナログペプチド1を6ー7残基間で切断した2種類のペプチド(Nフラグメント、Cフラグメント)それぞれに担持したリガンドー標的タンパク質間の相互作用により、フラグメント間が共有結合する系の構築を行った。リガンドー標的タンパク質間相互作用のモデルとして、特異的に相互作用することが知られている(KVAALKE)3と(EVAALEK)3のコイルドコイルペプチドを用いた。実際に合成した化合物を用いてコイルドコイルペプチド間の相互作用に基づくフラグメントペプチド間の連結反応を検討したところ、相互作用と連結反応に顕著な相関が見られた。また、得られた生成物とリボヌクレアーゼA由来のSタンパク質の相互作用により、リボヌクレアーゼSが再構成し、ヌクレアーゼ活性を示すことが確認された。最初に設定した課題である「リガンドー標的タンパク質間相互作用に依存したペプチド断片連結反応」と「生成したペプチド鎖を用いた酵素再構成系」の構築は、当初の計画通り概ね順調に進行している。1つ目の鍵となるペプチド断片間の連結反応は、ペプチド断片のC末端のチオエステルとN末端のシステインのSH基がチオエステル交換反応およびS →Nアシル基転移に基づくアミド結合生成反応を利用することで、低い副反応率でSペプチドアナログ1の配列が生成することなどを確認することができた。また、生成したSペプチドアナログ1が基のSペプチド配列と同様にSタンパク質と相互作用して、ヌクレアーゼ活性を示すことも確認することができた。以上から、本研究は順調に進展していると評価した。

H24年度の研究成果から、リガンドー標的タンパク質間相互作用のモデルとして用いた(KVAALKE)3と(EVAALEK)3のコイルドコイルペプチドの相互作用により、Sペプチドアナログ1のNフラグメントとCフラグメント間の連結反応が生じることが確認されている。そこで、H25年度は、種々の大きさ(分子量)のモデルタンパク質を選定し、モデルタンパク質に結合する既知のリガンドとタンパク質間の相互作用を本手法で検出できることを確認する。さらに、構築した反応系で得られたSペプチドアナログ1配列を含む生成物とSタンパク質との相互作用によりヌクレアーゼ活性が生じることを確認する。以上について、種々の実験条件で検討し、リガンドスクリーニング法として実際に利用可能な系の構築を目指す。H25年度の研究費使用計画として、実験で必要となるペプチドやタンパク質試料を調製するための各種試薬類、精製用HPLCカラム、ゲルろ過カラムなどを購入する。また、酵素活性測定のための蛍光測定用セルや各種ガラス器具類などの消耗品も順次購入し、円滑に研究を進める。
フロンティア環境における植物育成法の研究

(1)イネおよびオオムギにおける新規の重力形成とともに、ウリ科植物の形態形成が重力によってネガティブに制御されていることを発見し、微小重力下におけるオーキシン制御遺伝子(CS-IAA1)の発現解析から、その機構をオーキシン閾値説によって説明した。そのためのオーキシン局在性の誘導にかかわるオーキシンキャリア遺伝子をクローニングし、その発現解析から、オーキシンによる重力形態形成の制御機構に関するモデルを構築した。さらに新たにキュウリ主根およびアラビドプシスの根を用いた水分屈性実験系を確立し、遺伝子発現および突然変異体の解析から、水分屈性におけるオーキシン動態、カルシウムイオン、アブシジン酸、エンド型キシログルカン転移酵素の重要性とともに、水分屈性超感受性突然変異体を見出した。(2)深播きされても出芽が可能なコムギ品種(紅芒麦)の第一節間の伸長が、ジベレリンによって顕著に促進されること、ジベレリンにより発現が誘導される転写因子のGAMyb遺伝子の発現や内生ジベレリン量などの解析から、紅芒麦がジベレリンに超感受性であることを発見した。また、紅芒麦のジベレリンによる第一節間伸長にはカリウムイオンが不可欠であること、第一節間中のカリウムチャンネル遺伝子の発現がジベレリンによって誘導されること、ジベレリンにより第一節間の細胞のカリウムの取り込みが促進されることを明らかにした。(3)オオムギを用いて、人工的に高温ストレスにより不稔を誘導する系をはじめて確立し、異常となる生殖器官・細胞の形態的特性を明らかにした。また、カルシウム依存性タンパク質リン酸化酵素遺伝子が高温耐性に関与している可能性を示した。さらに、高温処理区と対照区のオオムギの幼穂から抽出したmRNAを用いて、Serial Analysis of Gene Expression(SAGE)法による解析を行い、cDNA由来のTag配列の塩基配列を決定し、非処理区と高温処理区で発現の明らかに異なる遺伝子群を見出した。宇宙や砂漠などのフロンティア環境に適応可能な新植物の開発,フロンティア環境で有用な植物成長制御法の開発に資するための基礎的実験を行い,今年度は以下の成果を得た。植物がストレス環境を回避する機構を解明するために,水分屈性と重力屈性の発現機構について突然変異体を用いて解析した。今回,エンドウ突然変異体の根から新しいタイプのエンド型キシログルカン転移酵素(EXGT)遺伝子の全長を得ることに成功し,その発現パターンを解析した。また,水分屈性の発現とオーキシン・微小管の関係も,新たに購入した画像解析装置を用いた解析によって明らかにされた。浸透圧計を用いた実験からは,根の水分ストレスと水分屈性・EXGT遺伝子の発現の関係を定量化する見通しができた。さらに,重力屈性のメカニズムを解明するため,オオムギの重力屈性突然変異体と野生型の芽ばえに重力刺激処理を行い,それぞれからcDNAライブラリーを作成し,サブトラクト法を行った。その結果,発現量に差のあるクローンとして3種を単離したが,それらの発現と重力反応の関係は明らかでなかった。今後、植物ホルモンによって制御される遺伝子発現の解析や微小重力下での植物生育の模擬実験から,ストレス回避のための姿勢制御機構を明らかにする。半乾燥地に適応した紅芒麦の深播きとエチレンによる第1節間伸長を解析した結果,エチレンが第1節間の伸長に不可欠であり,深播きによって増大するエチレン生成が第1節間伸長を促進するものと考えられたが,深播き耐性の品種間差異をエチレン生成量およびエチレン感受性(エチレン受容体遺伝子の発現)で説明することはできなかった。この深播き耐性は,交雑によって選抜し得る形質であることも判明し,耐性コムギの作出に向けて貴重な知見を得た。

さらに,遺伝的変異および生殖成長に対する環境ストレスと宇宙環境の作用を解析するための実験系を確立するための研究にも着手した。宇宙や砂漠などのフロンティア環境に適応可能な新植物の開発、フロンティア環境で有用な植物生長制御法の開発に資するための基礎研究を行ない、今年度は以下の知見を得た。植物がストレス環境を回避するために機能する根の水分屈性に新たなタイプのエンド型キシログルカン転移酵素(EXGT)遺伝子が関与することを、EXGTの間接蛍光抗体法に世界ではじめて成功し、タンパクレベルでも証明した。種々の外部環境ストレス要因が生殖細胞(配偶子)形成に及ぼす影響を分子レベルで明らかにすることを目的とし、オオムギを人工環境制御装置の中で育成し、花粉母細胞の減数分裂過程を明らかにして実験系を確立した。次に環境制御装置の温度を30°C(明期16hr)、25°C(暗期8hr)に5日間だけ上昇させた高温ストレスによる生殖生長への影響を、その生育ステージごとに調べた結果、オオムギの生殖生長においては、高温に感受性を示し雄性不稔を引き起こす時期が、幼穂の分化初期から減数分裂期以降の比較的長い期間に渡って存在することが明らかになった。また、これらの高温障害は、減数分裂の時期によって異なるメカニズムによって生ずることも明らかになった。半乾燥地に適応した紅芒麦の深播き耐性にはエチレンによって促進される第1節間の伸長が重要な役割を果たすことを見いだしたが,その品種間差異をエチレン生成量およびエチレン感受性だけで説明することはできなかった。そこで、第1節間伸長に対するジベレリンの作用を解析した結果、深播き耐性にはジベレリンが不可欠で、とくに紅芒麦におけるジベレリンの作用が大きいことがわかった。さらに、紅芒麦は、光合成能力が高く、蒸散量が少なく、弱光・強光下における種子生産能力が高いこと、水中発芽能力が高いことを発見し、各種のストレスに耐性機構を持つ遺伝子資源として有用であることが示された。宇宙や砂漠などのフロンティア環境に適応可能な新植物の開発、フロンティア環境で有用な植物生長制御法の開発に資するための基礎研究を行った。宇宙実験の結果、ウリ科植物の形態形成が重力によってネガティブに制御されていることを発見し、微小重力下におけるオーキシン制御遺伝子の発現解析から、その機構をオーキシン閾値説によって説明した。また、微小重力下で発達した根が水分屈性を顕著に発現することがわかり、水分屈性と重力属性の関係を、宇宙環境下で初めて証明した。乾燥ストレスを回避する目的で土壌深く播種されても出芽が可能な深播き耐性品種が、ジベレリンに超感受性であることを発見した。このとき、ひとつのジベレリン結合タンパクの発現量に差異があり、ジベレリン処理によって、感受性品種ではタンパク量が増大することが明らかになった。一方、内生ジベレリン量には品種間差異が見いだされなかった。また、ジベレリンによる第1節間伸長には細胞壁分解酵素活性と浸透物質の著しい増大を伴い、それが感受性品種では非感受性品種に比較して常に高いことがわかった。
機能分担型ナノ複合粒子の酸素貯蔵能を活用した排ガス浄化技術の開発

機能分担型ナノ複合粒子とこれを触媒とする排ガスなど環境浄化技術の開発をめざした研究を行った。まずセリア系の酸素貯蔵能(Oxygen Storage Capacity: OSC)を活かした触媒などで、成分配置により複合構造とする粒子形態制御、複合ナノ粒子触媒の作製方法を研究した。種々の条件検討によって複合形態(コアシェル型)で制御できることがわかった。また展開として、異なる元素間の相互作用をねらい、鉄ーセリア系複合触媒、複合TiO2系光触媒、さらには貴金属ナノ粒子の合成と複合化についても研究を行い、機能分担型複合化を通じて環境触媒の微細構造制御と性能向上の確立に向けた成果を得た。機能分担型ナノ複合粒子の開発とこれを触媒とする排ガス浄化技術の開発をめざした研究を行った。これらの材料の物性と浄化活性向上等の関係、排ガス浄化反応の基礎研究を踏まえた、触媒性能の最適化、さらには排ガス浄化触媒としての高性能化を目指している。第一に、セリウム酸化物(セリア)系の酸素貯蔵能(OSC)触媒で各成分配置により複合構造とするための粒子形態制御、複合ナノ粒子触媒等の作製方法を検討した。形態制御されたセリア粒子合成の検討では、均一沈殿法の条件によって球状からロッドの形態で作製できることを明らかにした。この中で球状ナノ粒子のセリアは触媒材に向けた複合化において有用な材料と判断された。そこでさらに水熱条件下でナノ結晶状のセリア粒子(10ナノメーター未満)を比較的容易に合成する手法を検討し、安定な生成条件ならびに粒径制御手法を見出した。これらの合成手法を複合化触媒の作製に活かして研究を展開してゆく。第二に、異なる元素間の相互作用を検討するなかで、鉄ーセリウム酸化物複合化触媒を取りあげ、昇温還元法による酸素放出挙動を調べた。セリウム複合酸化物を作製し、その成分間の相互作用から低温で酸素生成が観測される効果を見いだした。複合化の効果とともに耐熱性等に関連した熱処理による組織形成と酸素放出の関係を調べた。相互作用の最適化によって組織制御の観点から、ナノ粒子の界面の影響による酸素放出挙動が示唆された。さらには、貴金属ナノ粒子の合成とその担体への複合化についても研究を行い、白金やパラジウムの10ナノメーター未満の粒子の安定な合成手法を検討した。以上、ナノ材料の複合微細構造制御の確立に向けて成果があった。機能分担型を担うことができるナノ粒子の集合化・複合化した触媒材を作製し、その大気環境浄化、排ガス浄化への応用を目ざした研究を推進した。とくに、浄化に必要な酸化活性を発現する酸素種の活性化において、酸素貯蔵能の活用することで、効率のよい酸化浄化触媒を開発することを目標として行った。今年度の成果として、セリアジルコニア系ナノ粒子触媒の合成、その構造中の酸素の移動過程、さらには酸化鉄等との複合化やアルミナ担持系での触媒活性評価などを行い、他成分の添加効果について研究を展開した。酸素貯蔵能の評価では、機能分担を判別するため昇温還元法での精度向上を検討し、複合した酸素放出挙動を観測した。排ガス浄化機能では、アルミナセリアジルコニア系の白金触媒では、白金のシンタリングにもかかわらず、セリア系での酸素貯蔵能によって模擬排気中のCOならびにNO浄化活性が過渡期においても高く保たれることを明らかにした(Ozawa et al, Catal today 2015)。このほか、各種担体系に拡張した触媒における機能分担型浄化活性発現の研究を行った。エンジン・燃焼排ガスやVOC等の処理技術では触媒材料を利用してその高度化を図ることが実用および学術上、有用で先進性を有する。そのような浄化作用の設計にあたり、その機能で分担させることで高性能化をはかる研究を行った。とくに高効率浄化のための貴金属高分散担持状態(相互作用の最適化)と燃焼条件を最適化する格子酸素の高効率利用(特に酸素貯蔵能(OSC)の向上)の活用について研究した。これらの機能を活かせる最適化構造として機能分担型ナノ複合粒子の開発する研究を行った。組成系としてセリアジルコニア(CeO2-ZrO2)系のコアシェル類似構造、ナノ粒子分散アルミナ系(コート層)、さらにはTiO2ー層状化合物系までを広く検討し、複合化による効果を検討した。これらを触媒とする大気・排気の浄化技術の開発をめざしてその性能を評価した。セリアジルコニア系のOSC触媒では、各成分配置をコアシェル構造とすると、複合ナノ粒子ならびにその貴金属担持触媒において、複合担体の表面層での貴金属/セリウム相互作用の精密制御できる可能性を見出した。OSC作用を高度に利用できるような、複合微細構造制御、浄化反応の基礎研究とその最適化による排ガス浄化触媒の高性能化を検討し、さらに機能分担型触媒の三元活性等を評価した。

セリアジルコニア系を中心にアルミナやその他の希土類との複合化など、系を拡大しながら研究を展開できており、研究の進捗は順調である。成果発表の論文口頭発表については別リストのように行い広く成果を発信している。27年度が最終年度であるため、記入しない。環境触媒無機材料酸素貯蔵能機能分担型複合材の研究をさらに展開するとともに、応用的な観点からは開発触媒材料を基材上へ作製するプロセスや微粒子を安定化する担体材との組み合わせ等についても検討する。一連の実験で得られた内容を検討して、口頭等の学会発表ならびに論文発表を行うなど、計画に沿った成果を挙げている。自作装置改良、設計と軽微な補修により、研究遂行を行ってきたため。セリア系複合材料における複合化と機能、高い酸素貯蔵能の発現を関係づけて、機能分担を利用した浄化作用の応用面で性能を発現できると考えており、本研究の次の段階で検討してゆく予定である。さらに微細構造を制御した触媒での研究を進め、複合化触媒の合成を精密化するとともに物性、触媒基本特性、排ガス浄化活性を調べ、ナノ構造の構築と機能分担による排ガス浄化性能の向上にむけ研究を推進する。これまでの検討を活かして行う予定であり、装置の改修と付属部品等に使用し、これらを用いて性能評価を行う。自作装置の作製をする費用で今年度はその設計等を慎重に進めてきたため。順次使用してゆく。
細胞障害性キラーT細胞による肝障害とプロスタグランディンの影響-PGE_1の肝障害防御能の検索

肝炎の発症、進行には免疫的機序が強く関与している事は良く知られている。我々は純系C57BL/6(B6)マウスにsyngeneicな肝抗原を免疫する事によりマウス肝炎モデルの作製に成功した。更にこの肝炎モデルマウスの脾細胞を攻撃細胞とし、正常B6マウスの単離肝細胞を標的細胞とし、microcytotoxic testを用い検索したところ、肝炎マウスにおける肝細胞障害性の発生には、肝細胞膜表面抗原により感作されたcytotoxic killer Tcellが強く関与している事が明らかとなった。この肝炎マウスにおけcytotoxic killer Tcellは肝細胞を特異的に認識して攻撃破壊し、一方、腎糸球体細胞、EL-4 cell (B6 thymoma cell)は破壊せず、一方抗thy12抗体の処理により攻腎能が失われる事等により、肝細胞を特異的に破壊する障害性キラーT細胞である事が明らかになった。そこで、この肝細胞特異的障害性キラーT細胞の肝細胞破壊の機序を抑制し、肝炎の道片を止める薬物としてprostaglandinE_1(PGE_1)に注目し検索してみた。上述の様に肝炎マウスの脾細胞を攻撃細胞としたmicrocytotoxic assay系においては、肝炎マウス脾細胞にによる肝細胞障害はPGE_1 UD阻止され、一方その拮抗剤であるIndonethacinを加えたところ、肝障害は逆に増強された。このPGE_1の肝細胞障害性キラーT細胞の肝細胞破壊抑制能は、PGE_1がCytotoxic assay系の全過程に存在した時のみ効果があり、肝細胞のみのPGE_1処理、攻撃細胞のみのPGE_1処理では肝炎マウスの肝障害性キラーT細胞の破壊能を抑制できず、破壊過定のほぼ全過定にPGE_1が存在する必要性が明らかとなった。以上の様にPGE_1は少なく共、肝細胞を障害する機序の諸因子のうちでも肝特異障害性キラーT細胞を抑制する作用のある事が分かった。この事実より、ヒト肝炎において同機序による肝障害の進展、悪化にPGE_1を用いる事により、治療薬の一助となり得る可能性があるものと思われる。肝細胞障害には免疫的機序の関与している事は良く知られている.我々は純系C57BL/bマウスに同系マウス肝抗原を免疫する事により,肝組織内に単核細胞の浸潤を認める実験肝炎モデルの作製に成功した.更に,正常マウスの肝細胞を標的細胞とし,肝炎マウス脾細胞を攻撃細胞とするin vitroにおけるmicrocytotoxicity assay法により,肝細胞を障害する細胞が攻撃細胞内に含まれており,また抗Thy1.2抗体処理,他の標的細胞として同系腎系球体曲来細胞, EL-4fhymomaを用い,更にglass dish, Fc fraction coated plastic dish等を用いて検索する事により,この標的肝細胞を破壊する肝炎マウス脾細胞中の集団は, cytotoxic killer Tcell(CTL)である事が分かった.このCTLは,肝細胞の表面膜抗原のみを特異的に認識し破壊する能力を持つ.このCTLをコントロールしているのがsuppresson T細胞であり,このコントロールが不良であるとCTLによる諸臓器障害が発生するものと考えられる.

我々は肝障害成立の一因としてのCTLを防御する手段はないか思考し,最近話題になってきているプロスタグランディンに着目した.標的肝細胞と攻撃細胞をmicrocytotoxic assayで反応させる時に同時に10^610^7のPGE_1を一緒に投与したところ, CTLによる肝細胞障害はPGE_110^6及び10^7mvl/lにて有意に阻止された.一方PGE_1の拮抗剤であるインドメザシンを同様にmicrocytotoxic assayに投与したところ3.肝細胞障害は増強された.これらの事実よりPGE_1はCTLによる肝細胞障害を阻止し得る事が分った.このPGE_1による阻止能力はPGE_1がCTLによる反応の全経過中存在しないと有効でなく,途中からあるいは遅れて投与したのでは障害細胞抑制効果を示さない.このPGE_1のCTL抑制作用は肝疾患患者における肝細胞障害の防御に役立つものと思われ,今後,動物実験等を通して,ヒト肝疾患におけるPGE_1の役割を検索したいと思う.肝炎の発症・進行には免疫的機序が強く関与している事は良く知られている。我々は純系C57BL/6(B6)マウスにsyngeneicな肝抗原を免疫する事により、マウス肝炎モデルの作製に成功した。更にこの肝炎モデルマウスの脾細胞を攻撃細胞とし、正常B6のマウスの単離肝細胞を標的細胞としmicrocytotoxic testを用い検索したところ、肝炎マウスにおける肝細胞障害の発生に、肝細胞膜抗原により感作されたcytotoxic killer Tcellが強く関与している事が明らかとなった。この肝炎マウスにおけるcytotoxic killer Tcellは肝細胞を特異的に攻撃破壊し、腎系球体細胞、EL-4cell(B6 tbymomacell)は破壊せず、一方抗Thy1、2抗体の処理により攻撃能が失われる事等により、肝細胞を特異的に破壊する障害性キラーT細胞である事が明らかになった。そこでこの肝細胞障害性キラーT細胞の肝細胞破壊の機序を抑制し、肝炎の進行を止める薬物としてprostaglandinE_1(PGE_1)に注目し検索してみた。上述の様に肝炎マウスの脾細胞を攻撃細胞としたmicrocytotoxic assay系においては肝炎マウス脾細胞による肝細胞障害はPGE_1において阻止され、一方その措抗剤であるIndomethacinを加えてみたところ肝障害は逆に増強された。このPGE_1は肝細胞障害性キラーT細胞の肝細胞破壊抑制力は、PGE_1がcytotoxic assay系の全過程に存在した時のみ効果があり、肝細胞のみのPGE_1処理、攻撃細胞のみのPGE_1処理では肝炎マウスの肝障害性キラーT細胞破壊を抑制できず、破壊過定のほぼ全過定にPGE_1が存在する必要な事が明らかとなった。以上の様にPGE_1は少なく共肝細胞を障害する機序の諸因子のうちでも、肝特異障害性キラーT細胞の肝障害性を阻止する作用のある事が分かった。この結果より、PGE_1をヒト肝炎の患者の臨床に応用する事により、肝細胞障害性キラーT細胞の関与する肝炎の進展及び劇症化の防止に役立つ可能性があると思われ、今後の臨床応用での効果が期待される。
光誘起電子移動反応に於けるヘテロ原子効果の総合評価

生態系には金属元素を含めた種々のヘテロ原子が含まれていることが知られているが、光合成に於けるこれらの役割については全ったく未知である。本研究では、上記の事象を明らかにすることを目的とし、化合物14の分子設計、及びその合成を行なった。これらの化合物の鍵となる中間体7は、5と6とから、満足すべき収率で得ることができた。現在までに14の前段階の化合物の合成が完了しており、最終化合を導く反応の条件の検討を行なっている。又、予備的な実験結果より、ヘテロ原子が24の分子軌道に興味ある摂動を与えていることが見出された。
赤痢菌の宿主細胞への侵入および炎症惹起能のメカニズム

1.赤痢菌の病原性因子の分子遺伝学的解析:(1)C群赤痢菌のもつ大型プラスミドが細胞侵入性に関与していることは他の赤痢菌種のDNAプローブによる実験などにより予想されていたが,今回我々は伝達実験などにより病原性に関与していることを直接的に証明した.(2)D群赤痢菌の大型プラスミド上にあるI相抗原遺伝子のクローニング;D群赤痢菌のプラスミド上のI相抗原合成遺伝子をコスミドベクターを用いてクローニングを行い,大腸菌K12で発現させた.得られたプラスミドpJK1137(36Kb)について制限酵素地図を作製し,またトランスポゾンを挿入して得られた挿入変異株を解析した.その結果, I相抗原合成に関与する遺伝子領域はEcoRI, SalI, HindIIIで切断した断片ESH-AおよびH(約13Kb)に存在することが明らかになった.現在このフラグメントのサブクローニングおよびこの遺伝子がコードするペプチドの解析を行っている.2.赤痢菌感染に対する宿主の生体防御機構:(1)赤痢菌のヒト血清に対する感受性;ヒト血清に対する感受性が赤痢菌種間で差異が認められ,感受性はA群>B群>C群, B6>D群の順に高かった.この現象は赤痢患者血清についても起因赤痢菌種には関係なく認められた.種々の実験結果により,このような感受性の差は各菌種の外膜の構造に対する補体殺菌たん白の作用効率の差によるものと考えられた.(2)赤痢菌感染に対するヒトの液性免疫応答;赤痢菌LPSを抗原としてELISA法により赤痢患者血清中の各免疫グロブリンクラスの抗体価を測定し,その結果IgA, IgMが発症後7日目, IgGでは12日目頃に健常人と比較して有意に高い抗体価を示した.しかし, IgA抗体がIgG, IgM抗体よりも交差反応が少なかった.しょ糖密度勾配遠心法により血清を分画して解析した結果,これらの赤痢回復初期の血清IgA抗体は多量体が主であった.1.赤痢菌の病原性因子の分子遺伝学的解析:(1)C群赤痢菌のもつ大型プラスミドが細胞侵入性に関与していることは他の赤痢菌種のDNAプローブによる実験などにより予想されていたが,今回我々は伝達実験などにより病原性に関与していることを直接的に証明した.(2)D群赤痢菌の大型プラスミド上にあるI相抗原遺伝子のクローニング;D群赤痢菌のプラスミド上のI相抗原合成遺伝子をコスミドベクターを用いてクローニングを行い,大腸菌K12で発現させた.得られたプラスミドpJK1137(36Kb)について制限酵素地図を作製し,またトランスポゾンを挿入して得られた挿入変異株を解析した.その結果, I相抗原合成に関与する遺伝子領域はEcoRI, SalI, HindIIIで切断した断片ESH-AおよびH(約13Kb)に存在することが明らかになった.現在このフラグメントのサブクローニングおよびこの遺伝子がコードするペプチドの解析を行っている.2.赤痢菌感染に対する宿主の生体防御機構:(1)赤痢菌のヒト血清に対する感受性;ヒト血清に対する感受性が赤痢菌種間で差異が認められ,感受性はA群>B群>C群, B6>D群の順に高かった.この現象は赤痢患者血清についても起因赤痢菌種には関係なく認められた.種々の実験結果により,このような感受性の差は各菌種の外膜の構造に対する補体殺菌たん白の作用効率の差によるものと考えられた.(2)赤痢菌感染に対するヒトの液性免疫応答;赤痢菌LPSを抗原としてELISA法により赤痢患者血清中の各免疫グロブリンクラスの抗体価を測定し,その結果IgA, IgMが発症後7日目, IgGでは12日目頃に健常人と比較して有意に高い抗体価を示した.しかし, IgA抗体がIgG, IgM抗体よりも交差反応が少なかった.しょ糖密度勾配遠心法により血清を分画して解析した結果,これらの赤痢回復初期の血清IgA抗体は多量体が主であった.今年度の研究の経過は当初の計画とは多少前後することはあったが、目的とした研究実績を得ることができた。今年度の結果をさらに発展させ、次年度には当初の計画のすべてを完了することができると考える。【I】.D群赤痢菌の大型プラスミド上にある【I】相抗原遺伝子のクローニングに関しては、プラスミドDNAを制限酵素で切断しcosmid vectorにクローニングして大腸菌K-12で【I】相抗原遺伝子を発見させることができた。しかし、クローニングしたDNA断片は分子量約40Mdalとまだ大きく、さらにプラスミドvectorを用い、より小さなDNA断片のクローニングを試みている。【II】.ヒト血清に対する赤痢菌の感受性に関する研究はほぼ終了することができた。正常人血清に対する感受性が赤痢菌種間で差異が認められることはすでに報告した(日本細菌学雑誌39:482,1984)が、25人の赤痢患者の血清についてもその患者の起因赤痢菌種とは関係なく、正常人血清と同様の殺菌が認められた。このような菌種間の感受性の相違は補体系のclassical path-wayが主に関係していることが示唆された。【III】.D群赤痢菌(【I】相菌)のLPSを抗原としてELISA法により赤痢患者血清中の各免疫グロブリンクラスの抗体価を測定した。