hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
スイッチ機能を有する人工遺伝子デリバリーシステムの創製

遺伝子デリバリーシステムが標的細胞とinteractiveに情報交換を行い、細胞の協力を得ながら遺伝子発現効率を飛躍的に促進できるシステムを開発することを目的とした。本研究ではこれをスイッチ機能と呼び、KALA修飾リポソームをモデルとして、スイッチ機能を担う遺伝子群の探索と同定を行った。さらに、スイッチ機能を搭載した人工遺伝子デリバリーシステムを開発し、invivoで機能するシステムへと展開した。DNAワクチンを開発する上で、樹状細胞への遺伝子導入法の確立は重要な課題である。我々は、遺伝子送達を可能とするための基盤技術として、遺伝子とポリカチオンからなる凝集体コアを脂質エンベロープによって封入した多機能性エンベロープ型ナノ構造体(MEND)を構築してきた。その中でも、pH依存的に膜融合性を示すKALAペプチドを修飾したMEND(KALA-MEND)は、従来から開発してきたオクタアルギニン(R8)修飾MEND(R8-MEND)と比較して極めて高い遺伝子発現を示した。細胞内動態比較の観点から、細胞内への取り込み量や核移行量をリアルタイムPCRを用いて解析を行ったが、両者の間に大きな違いは認められなかった。このことから、KALAには、樹状細胞の細胞膜表面上の何らかの分子に相互作用し、スイッチを押すことで、細胞内シグナルパスウェイを活性化し、最終的に転写過程を活性化するのではないかと考えた。マイクロアレイを用いてKALA-MEND及びR8-MENDトランスフェクション時のmRNA発現変動を解析した結果、KALA-MENDトランスフェクション群において遺伝子発現レベルの大きな変動を示すことが明らかとなった。また、転写に関連する遺伝子群に着目した結果、KALA-MENDにおいては、STAT1やNKkBなどの遺伝子が促進しており、また、使用しているプラスミドDNAのプロモーター配列にこれらの結合配列が含まれるため、KALAは細胞に何らかの刺激を加え、転写活性化を誘起することが示唆された。平成22年度の解析の結果、KALA修飾MEND(KALA-MEND)のトランスフェクションは、樹状細胞に対して劇的なシグナル活性化を引き起こし、結果として転写因子の発現が促進することが明らかとなった。平成23年度には、遺伝子発現の促進における、これら発現促進転写因子の寄与について解析を行った。マイクロアレイの結果より、KALA-MENDによる遺伝子導入時にはSTATあるいはNFkBなどの免疫応用に関わる転写因子群も含まれることが明らかとなった。本遺伝子発現変動は、KALA非修飾型MENDでは認められないことから、修飾したペプチドは、細胞表面あるいは細胞内の何らかの因子を刺激する『スイッチ』として機能し、樹状細胞における内因性遺伝子の発現変動を誘起することが示唆される。JAK/STST系の阻害剤存在下における遺伝子発現活性を解析した結果、その活性は、濃度依存的に劇的に阻害されることから、本シグナル経路の活性化が、遺伝子発現の上昇と密接に関わる現象であることが示唆された。また、これらの免疫応答に関わる転写因子の活性化に伴い、各種サイトカインの産生も優位に高く上昇することが示されたことから、本ペプチド修飾MENDは、細胞内シグナルの活性化を介して遺伝子導入効率を促進するのみでなく、同時に樹状細胞を活性化することも明らかとした。KALA-MENDのうち、どの要素が活性化に関わるのかを明らかとするため、遺伝子を除いたKALA-リポソームあるいは、KALAペプチド単独の活性化能を評価した結果、遺伝子、KALAペプチド、脂質エンベロープすべてがそのアジュバント活性に重要な因子であることが明らかとなった。平成24年度までの研究により、KALA修飾MEND(KALA-MEND)のトランスフェクションは、樹状細胞に対して劇的なシグナル活性化を引き起こし、さらにはNF-kBやSTATなどの活性化を介した樹状細胞の活性化を行うことが明らかとなってきた。また、本細胞の活性化過程において、KALA修飾MENDの構成成分のうち、内封した遺伝子、KALAペプチド、脂質エンベロープすべてが重要な因子であることが明らかとなった。本年度は、そのメカニズムについて詳細に解析を試みた。各種toll様受容体の欠損マウスから単離した樹状細胞においても、同様な活性化が引き起こされることも明らかとなった。また、本細胞の活性化には、遺伝子を封入する脂質膜の融合性も重要であることも示された。これらのことから、遺伝子の細胞質への輸送が免疫活性化の引き金となることが示唆された。活性化により産生されるサイトカインのプロファイルを解明した結果、IL1&#61538;やI型インターフェロンなどの産生が高く、これは、既存のアジュバント(LPSやCpG配列含有オリゴヌクレオチド)により活性化された場合と比較しても大きく異なるものであった。さらに、これらKALA-MEND特有のサイトカイン類の産生プロファイルより、インフラマソームやSTING経路などの活性化がその機構として考えられた。本仮説を検証するために、各種経路に対する阻害剤を用いた際のサイトカイン産生量を測定した結果、共に劇的な抑制が認められた。これらの結果より、KALA-MENDによる免疫活性化には、外来遺伝子の細胞質輸送が極めて重要であり、さらにその経路には、長鎖DNAに対する細胞質センサーが関与することが明らかとなった。

研究開始当初は、一般的な培養細胞を用いた解析研究を想定していたが、現在は樹状細胞というDNAワクチンという具体的なアウトプットを見据えた細胞種の選定が出来ていることや、細胞のシグナル経路を実際にコントロールし、さらに薬理効果が期待できるナノ粒子を開発出来ている点で、当初の目的以上の結果が得られていると判断している。24年度が最終年度であるため、記入しない。実際のin vivoにおけるKALA-MENDの薬理効果の検証や、本システムのタンパクワクチンへの応用可能性の追求が、実用性を目指した今後の推進方策となる。また、KALA-MENDの細胞表面あるいは細胞質内の、具体的なスイッチに相当するタンパクの同定は、本研究の価値並びにインパクトを高める上で極めて重要な課題である。自然免疫に関する最先端の研究者と議論を開始しながら、本課題に取り組んで行く予定である。
大脳皮賛感覚野における高次領野からの逆行性入力の機能とその分子・細胞機構

マウスの経頭蓋的フラビン蛋白蛍光イメージングを用いて以下の研究成果を得た。1.一定の高さの音に幼若期より曝したときの聴覚野可塑性について解析した結果、曝した音と同一の周波数の音刺激に対する聴覚野応答が特異的に増強されていた。また動物を防音室で飼育すると聴覚野の反応が有意に小さくなった。皮質切片を作製し、フラビン蛋白蛍光法で解析した結果、皮質の深さ方向への興奮の伝搬が防音室で飼育したマウスで有意に抑えられることが判った。2.Missing fundamentals(F0)によると思われる聴覚野神経活動の画像化に成功した。簡単な整数比からなる振動数の音を同時に聞かせるとき、その最大公約数の音が(F0)聞こえる。20kHzと25kHzといった比較的高音を組み合わせて聞かせると、本来応ずるはずのない5kHzの領野が反応することを見つけた。ちなみに19kHzと26kHzのように、周波数比が単純でない場合はこのような現象は出現しない。さらにこの応答がどのような脳内機構で生ずるのか、解析を進めたところ、聴覚野に情報が達した後、皮質内経路によって高音側から低音側ヘシナプス入力が収束し、F0応答が生ずることが判った。3.単眼遮蔽によって引き起こされる視覚野の眼優位可塑性の研究は精力的に行われている。経頭蓋的フラビン蛋白蛍光イメージングで調べたところ、視覚野では単眼の遮蔽により、遮蔽眼の応答が弱まることが判った。4.マウスに光路変化をおこす片眼プリズムを装着させ、斜視と同じような視覚刺激による可塑的変化について解析したところ、プリズム装着眼の視覚野応答が抑圧されることが判った。ところが予めヒゲを切ったマウスにプリズムを装着させたところ、視覚野応答の抑圧は消失した。以上の結果から、空間認知におけるヒゲ入力と視覚入力が食い違うと視覚野応答が抑圧されるという可能性が示唆された。マウスの頭蓋骨は透明度が高いので麻酔マウスの大脳皮質の光学的なイメージングを頭蓋骨を介して行うことができる。今年度はこの経頭蓋的フラビン蛋白蛍光イメージングを用いて幾つかの研究成果を得た。1)覚醒マウス大脳皮質感覚野の活動を記録した。通常麻酔動物では神経活動に対応するフラビン蛋白蛍光応答にやや遅れて脳血流の増加が起こり、両者の分離は容易であるが、覚醒動物では血流変化が非常に速く起こり、両者の分離が困難であることが判った。恐らく何らかの方法で血流反応を抑圧することが必要である。一方、神経活動と血流反応増加を結ぶメディエータを色々検索したが、NOが重要であることが判明した。この両者の結果を合わせると、神経型NO合成酵素の欠損マウスを用いれば、無麻酔での神経活動が、血流変化に干渉されずに解析できる可能性が浮上した。現在この可能性について検討中である。2)特定の周波数(10キロヘルツ)の音に幼若期より曝したときの聴覚野可塑性について解析した。その結果、10キロヘルツの反応は有意に増強されるが、5キロや20キロヘルツに対する反応は必ずしも増強されなかった。また動物を防音室で飼育すると聴覚野の反応の振幅や持続時間が有意に小さくなった。様々な音環境で飼育した動物から皮質切片を作製し、上顆粒層に連発電気刺激を加えて、興奮パターンをフラビン蛋白蛍光法で解析した。その結果、皮質の深さ方向への興奮の伝搬が防音室で飼育したマウスでは有意に抑えられた。

3)視覚野では単眼の遮蔽により、遮蔽眼の応答が弱まることが判った。また性感覚野では尾の切断に伴って、周辺の皮膚刺激に対する皮質応答部位が可塑的に改変されることが判った。マウスの経頭蓋的フラビン蛋白蛍光イメージングによってMissing fundamentals(F0)によると思われる聴覚野神経活動の画像化に成功した。幾つかの比較的簡単な整数比からなる振動数の音を同時に聞かせるとき、その最大公約数の音(F0)が聞こえることはこれまで心理学的な解析から判っていたが、それが如何なる脳内機構で聞こえるのか、不明であった。ところが最近聴覚野においてF0に応するニューロンが存在することが電気生理学的な解析により明らかにされた。我々は聴覚野が音の高さによって異なる領野が応答することに着目し、20kHzと25kHzといった比較的高音を組み合わせて聞かせると、本来応ずるはずのない5kHzの領野が反応することを見つけた。ちなみに19kHzと26kHzの組み合わせのように、単純な整数比で表せない場合はこのような現象は出現しない。さらにこの応答がどのような脳内機構で生ずるのか、解析を進めた。可能性としては(1)蝸牛から聴覚野に至る聴覚伝導路で高音側から低音側にシナプス入力が収束し、F0に対する応答が形成される、(2)聴覚野に情報が達した後、皮質内経路によって高音側から低音側へシナプス入力が収束し、F0応答が生ずる、の二つである。このうち、我々は(2)の仮説を支持する結果を得た。則ち20kHzと25kHzの反応を示す領域にフラビン蛋白の励起光を長時間当てることによってエネルギー代謝を不活化した。このように励起光を長時間当てることによってシナプス伝達が抑えられることは予めスライスを用いた実験によって確認している。この状態でさらに20kHzと25kHzの組み合わせを聞かせると、5kHzの領域に活動が出現しなかった。しかし直接5kHzの音を聞かせたときには活動が見られた。これらの実験結果は(2)の仮説、則ち皮質内回路によってF0に対する応答性が生ずるという可能性を支持するものである。大脳皮質の経験依存性可塑性の中でも、単眼遮蔽によって引き起こされる視覚野の眼優位可塑性の分子・細胞メカニズムを解明する研究は種々の遺伝子改変マウスを用いて精力的に行われている。一方、視覚野に可塑性を引き起こす操作として、単眼遮蔽のほかに斜視がある。しかし、マウスの斜視を作る外科手術は困難なので、斜視に伴うマウス視覚野可塑性の解析は殆どなされていない。そこでプリズム眼鏡を作製し、マウスに約30°の光路変化をおこす片眼プリズムを装着させ、斜視と同じような視覚刺激による可塑的変化について解析した。生後1ヶ月のマウスにプリズム眼鏡を1週間装着させ、眼鏡を取り去った後に、プリズム装着眼と健常眼を介する視覚野応答を経頭蓋フラビン蛋白蛍光イメージングによって測定した。その結果、プリズム装着眼の視覚野応答が対側・同側の両眼視領域で抑圧され、さらに単眼視領域の応答も抑圧されていることが判った。この現象のメカニズムについて我々は三つの仮説を考えた。第一にプリズムによって装着眼の視界がぼけ、単眼遮蔽と同様の眼優位性可塑性が生じた可能性がある。しかし単眼遮蔽の場合は単眼視領域の抑圧は見られないので、この可能性は否定される。第二に両眼視領域への入力が左右で食い違ったので、プリズム装着眼の応答が抑圧されたと考えられる。
慢性腎臓病患者の予後予測スコアリングシステムの樹立

世界的な規模でCKD患者が増加し、末期腎不全に至ることで重大な健康問題となっている。現在のスクリーニング検査としてのアルブミンやクレアチニンの測定では、相当数の患者の診断が正しく行うことができない。我々はまず、さまざまなCKD患者の尿からエクソソームを単離した。次いで、タンパク尿の多い患者尿より、ポドサイト由来のエクソソーム内タンパク質(PDETFs)の発現を調べた。PDETFsの検出された患者では、糖尿病性腎症などの進行性の腎障害であることが判明した。尿中のPDETFsの発現量は糸球体内での同タンパク質の発現量の減少と相関していた。PDETFの評価・解析はCKDとCVDの関係理解に有用である1.尿中バイオマーカーの選定および経時的な評価とパネル化各種腎障害モデル動物の尿サンプルを用いたエクソゾーム解析により、候補分子となってた腎構成細胞障害特異的でヒト尿サンプル測定に有用な尿中バイオマーカーを用いて、さまざまな腎疾患において比較解析を行った。また、特異的な抗体が入手できたものからELISAを用いた測定システム樹立を進めている。2.各種腎疾患患者の尿・腎組織サンプルのバンク化ならびにCKD治療の結果を用いた治療過程におけるバイオマーカーの測定・解析腎生検により、確定診断の得られた腎疾患患者尿サンプルのバンク化、ならびにその背景となる臨床データを匿名化・バンク化を行い、腎生検にて得られた病理組織学的な病期、重症度、活動性と、各マーカー候補分子の組織内での発現量との相関を解析した。病勢・治療内容・治療への反応性などを反映するマーカーの同定を進め、尿タンパク、尿潜血、腎機能、糸球体内圧上昇など、腎構成細胞障害を反映するマーカーの特定を行った。特に、糸球体上皮細胞であるpodocyte由来のpodocyte-derived signal transduction factors (PDSTFs)の発見により、腎機能低下を早期に予測する尿中マーカーを同定し、ヒト各種腎障害において、3年後の腎機能低下を予測しうることを統計学的に示すことができた。個々のCKD患者に適応可能な尿中バイオマーカーパネルの基盤を作成できた。PDETFの評価・解析はCKDとCVDの関係理解に有用である1.尿中バイオマーカーの選定これまでに行った、ネフローゼ症候群、腎不全モデルマウス(ICGNマウス)、メサンギウム増殖性腎炎モデル(Thy1ラット)、ループス腎炎モデル(MRL/lprマウス)などの尿サンプルを用いたエクソゾーム解析により、候補分子となっているNephrin、Podocin、CD2AP(CD2-associated protein)、Tpbg、Afadin、Synaptopodinなどのポドサイトに特異的な分子、メサンギウム障害のマーカーであるSmad1、内皮細胞障害に関してALK1, Id1など、尿細管障害に対してSnail、AQP2などのCKD患者尿での発現の有無をWestern blotによって確認した。また、CKD患者の腎生検組織において、これらタンパク質の発現部位を免疫組織学的解析によって原疾患ごとに特定しており、予後予測スコアリングシステムに有用な候補タンパク群の選定を進めている、また、特異的な抗体が入手できたものからELISAを用いた測定システム樹立を進めている。2.簡易尿中バイオマーカー測定法の確立:外来の随時尿などの少量(10-20ml)の尿を用いた簡便かつ迅速な測定法として、尿の採取法・保存法・添加するプロテアーゼの選択、測定にもちいる抗体量の調整などの最適化を行い、従来法で得られたサンプルとの比較によっても、エクソゾーム内のタンパク発現に差異がないことを確認した。3.各種腎疾患患者の尿・腎組織サンプルのバンク化:腎生検により、確定診断の得られた腎疾患患者尿サンプルのバンク化、ならびにその背景となる臨床データを連結可能な匿名化を行い、個人同定ができないようにして収集し、バンク化を行っている。尿中バイオマーカーの選定、簡易尿中バイオマーカー測定法の確立、各種腎疾患患者の尿・腎組織サンプルのバンク化の3本の柱となる計画は予定通り進行しているが、唯一、動物モデルの尿サンプルが少ないため、動物購入を予定したが、25年度初めの搬入となった。しかしながら、尿中バイオマーカーのパネル化にむけた候補分子の選定は予定通りに進んでおり、25年度中には予定通りに計画を遂行できる。前年度に選定した、腎構成細胞障害特異的でヒト尿サンプル測定に有用な尿中バイオマーカーを用いた、さまざまな腎疾患における解析を行う。腎生検にて得られた病理組織学的な病期、重症度、活動性と、われわれがすでに樹立している病理組織画像解析システムIPAPを用いた組織内での発現量との相関を統計学的に解析し、ELISAを用いた測定システムが樹立した候補マーカーを順次用いて、病勢・治療内容・治療への反応性などを反映するマーカーの同定を進める。

尿タンパク、尿潜血、腎機能、酸塩基異常など、腎構成細胞障害を反映するマーカーの特定も行い、予後予測に直接影響を及ぼす因子を抽出する。一方で、年齢・性別による影響を加味するなど、個々のCKD患者に適応可能な尿中バイオマーカーパネルの基盤を作成する。尿サンプル数の不足していたマウス尿は、マウスの搬入にあわせて採取を進め、候補分子の尿中への排泄を確認する。腎構成細胞としてのメサンギウム細胞、内皮細胞、ポドサイトの障害にそれぞれ特異的な分子をヒト尿サンプルでの測定値を基に同定を進める。腎生検で得られた腎組織を用いて、それらの発現部位の確認と、病期における発現の変化を明らかにし、経時的な発現の推移が、原疾患の重症度、活動性と一致するかどうかを見極める。ELISAを用いた定量測定システムの樹立を進め、尿タンパク、尿潜血、腎機能、酸塩基異常などを反映するマーカーの特定も行う。次年度への繰越額968,827円は、マウスの購入・維持費に使用する予定である。
細菌性コラゲナーゼのコラーゲン結合ドメインに基づく機能性薬物の設計と応用-細菌性毒素の新しい応用を目指して-

Clostridium histolyticumクラスIコラゲナーゼのC末端には二つのコラーゲン結合ドメイン(CBD)が存在する。Caイオンの存在下、非存在下でC末端側ドメインのX線回折による構造決定を行った。Caイオンの結合によりN末側リンカーの構造がαヘリックスからβシートに変化し、βサンドイッチ構造の安定化と基質結合能の向上に寄与する事が明らかとなった。(米国University of Arkansas, Joshua Sakon博士らとの共同研究)基質への結合様式を推定するため、ドメイン表面に配向する種々のアミノ酸残基の部位特異的変異体を得た。コラーゲン様ペプチドを固相化したセンサー・チップを用いた表面プラズモン共鳴法を用いて、基質結合能(Kd)を測定したところ、サンドイッチの片面に基質結合性残基が集中している事が明らかとなった。I型以外のコラーゲンを豊富に含む腎臓・軟骨・動脈壁などの組織を固定・包埋後、ポスト法によりCBDを結合させ、免疫組織染色を行って、光顕的、電顕的にCBDの結合を検討した。CBDは種々の組織に結合し、結合には周期性が認められなかった。またin vitroでCBDは種々の型のコラーゲンに結合した。以上よりCBDは基質の三重螺旋構造を認識して結合することが示唆された。3種のゼラチン分解性Clostridium属細菌からコラゲナーゼを精製し、その構造遺伝子をクローン化して塩基配列を決定した。予想一次構造の比較から、これらは互いに異なるセグメント構造を有していることが明らかとなった。CBDの一次構造の比較から、CBDは歴史的に重複を繰り返してきたことが示された。1.CBD内の基質結合部位の同定(担当:松下)CBD(ColG S3b)のセレノメチオニン誘導体をDoblieらの培養条件により生産・精製した後、X線結晶学的解析(MAD法)により立体構造の決定(分解能1.5Å)を行った。CBDは、5本および4本のストランドよりなるβシートが重なったベータ・サンドインチ構造を有していた。CBDのアミノ酸配列を比較したところ、予想される8本の両親媒性βストランドの親水面側に配向すると考えられる残基のうち10残基が保存されていた。これらのアミノ酸残基を部位特異的にアラニンに置換し、変異タンパク質の結合能(Kd)を、Gly-(Pro-Pro-Gly)_8を固相化したセンサー・チップを用いた表面プラズモン共鳴法を用いて定量した。変異により結合能が低下したアミノ酸残基は、いずれもベータ・サンドイッチの片面に集中して存在していたので、この部位が基質結合部位であると考えられる。2.基質特異性の検討I型以外のコラーゲンを豊富に含む腎臓、軟骨、動脈壁などの組織を固定・包埋後、ポスト法によりCBDを結合させた。アフィニティー精製した抗CBD家兔抗体を用いて免疫染色を行い、光顕的、電顕的にCBDの結合を検討した。CBDはいずれの組織の結合組織にも良く結合した。in vitroの結合実験でもCBDが認識する基質スペクトルは同様の結果であったので、CBDの認識部位は種々の型のコラーゲンに共通の領域、すなわちcollagenous domainであることが示唆された。3.新規コラーゲン結合ドメインの検索3種のClostiridium属細菌からコラゲナーゼを精製し、N末端アミノ酸配列を決定した。degenerateprimerを用いて、これらの酵素の構造遺伝子の一部をクローン化し、塩基配列を決定した。現在、構造遺伝子全長のクローン化に着手したところである。Caイオンの存在下、非存在下で,C末端側ドメインのX線回折による構造決を行った。

Caイオンの結合によりN末側リンカーの構造がαヘリックスからβシートに変化し、βサンドイッチ構造の安定化と基質結合能の向上に寄与する事が明らかとなった。(米国University of Arkansas, Joshua Sakon博士らとの共同研究)基質への結命様式を推定するため、ドメイン表面に配向する種々のアミノ酸残基の部位特異的変異体を得た。コラーゲン様ペプチドを固相化したセンサー・チップを用いた表面プラズモン共鳴法を用いて、基質結合能(Kd)を測定したところ、サンドイッチの片面に基質結合性残基が集中している事が明らかとなった。I型以外のコラーゲンを豊富に含む腎臓・軟骨、動脈壁などの組織を固定・包理後、ポスト法によりCBDを結合させ、免疫組織染色を行って、光顕的、電顕的にCBDの結合を検討した。CBDは種々の組織にに結合し、結合には周期性が認められなかった。またin vitroでCBDは種々の型のコラーゲンに結合した。以上よりCBDは基質の三重螺旋構造を認識して結合することが示唆された。3種のゼラチン分解性Clostridium属細菌からコラゲナーゼを精製し、その構造遺伝子をクローン化して塩基配列を決定した。予想一次構造の比較から、これらは互いに異なるセグメント構造を有していることが明らかとなった。CBDの一次構造の比較から、CBDは歴史的に重複を繰り返してきたことが示された。
タンパク質相互作用が関与する多価不飽和脂肪酸ヒドロペルオキシドの消去機構

平成15年度に作成したtwo-hybrid systemを用いてラットおよびヒトのFABPとGSTT2とのタンパク質相互作用の解析を行った。その結果、ラットではFABPとGSTT2を含むベクターで大腸菌をトランスフォームした場合においてのみコロニーの形成が認められ両タンパク質が相互作用していることが確認された。しかしながら、このタンパク質相互作用はコロニー形成能から評価すると弱いものであると推測された。ヒトの場合も同様にFABPとGSTT2との間で弱いタンパク質相互作用が認められた。HepG2細胞を用いてヒトGSTT2安定発現株(HepG2/GSTT2)を樹立した。本細胞株に対して酸化的ストレスを誘導し、コントロール細胞と比較することにより酸化的ストレスに対するGSTT2の役割を評価した。HepG2およびHepG2/GSTT2に対し種々の濃度の過酸化水素を暴露した場合、濃度依存的に細胞死の増加が認められた。しかしながら、HepG2/GSTT2はHepG2と比較して優位に過酸化水素による酸化的ストレスに対して耐性を示した。さらにクメンヒドロペルオキシドによる酸化的ストレスに対しても同様の検討を行った結果、過酸化水素の場合以上にHepG2/GSTT2はクメンヒドロペルオキシドによる酸化的ストレスに対して耐性を示した。以上の結果から、GSTT2は酸化的ストレスに対する防御機構として重要な役割を担っていることが明らかとなった。今後、HepG2/GSTT2にFABPを共発現させた細胞系の樹立を行い、酸化的ストレスに対してGSTT2およびFABPが協調的に働くことにより酸化的ストレス防御能が増強されるか否かについて検討する予定である。Two-hybrid systemを用いたラット(r)fatty acid binding protein(FABP)とglutathione S-transferase(GST)T2-2によるタンパク質相互作用を解析するために下記の実験を行った。すなわち、rFABP cDNAの塩基配列を基に、ラット肝より調製したmRNAを用いてRT-PCRを行い、rFABP cDNAの増幅・クローニングを行った。次いで、既に我々の研究室で単離しているrGSTT2サブユニットをコードしているcDNAの翻訳領域をpBT baitベクターに、rFABP cDNAの翻訳領域をpTRG targetベクターにそれぞれ組み込んだ。今後、得られたプラスミドでE.coliをトランスフォームしtwo-hybrid systemによりタンパク質相互作用を解析する。ヒト(h)FABPとhGSTT2-2のタンパク質相互作用の解析を行うために下記の実験を行った。すなわち、HepG2細胞より単離したmRNAを用い、それぞれの塩基配列を基にRT-PCRによりcDNAの増幅・単離を行った。得られたcDNAの翻訳領域を、pBT baitおよびpTRG targetベクターにそれぞれ組み込んだ。今後ラットの場合と同様に、two-hybrid systemによりタンパク質相互作用を解析する。hGSTT2およびhFABP cDNAの翻訳領域を大腸菌発現ベクターpET14bに組み込み発現プラスミドの構築を行った。現在両タンパク質の発現実験および酵素精製条件について検討中である。予備的な検討として、発現タンパク質のサイトゾールを用いてPUFAのヒドロペルオキシドに対する還元活性をhFABPの在不在下において行った。その結果、hGSTT2-2単独の場合、その還元活性はPUFAのヒドロペルオキシドにより強い基質阻害を受けた。一方、hFABP共存下ではhGSTT2-2のglutathione peroxidase活性は基質による阻害を全く受けないことが明らかとなった。
オリゴDNAを用いたタンパク質発現を促進させる新手法の開発

本研究では、mRNAの高次構造を形成する領域に相補的なオリゴDNAをハイブリダイズしmRNAの局所的な高次構造を解消させることで、タンパク質の翻訳を促進させる新手法の開発を目指して研究を進めている。前年度までに、mRNAにオリゴDNAをハイブリダイズさせ、mRNA中の高次構造を解消することで翻訳を促進させることが可能であることを明らかにしたことから、平成30年度はタンパク質をコードするmRNAにオリゴDNAをハイブリダイズさせ翻訳させることで、タンパク質の発現促進が可能かどうか検証した。まず、タンパク質の発現と構造形成を簡単に評価できる緑色蛍光タンパク質(GFP)をモデルタンパク質として用い、GFP mRNAの様々な領域にオリゴDNAをハイブリダイズさせ無細胞翻訳系でGFPを発現させたところ、特定のmRNA領域にオリゴDNAをハイブリダイズさせることでGFP蛍光強度の増大が確認された。また、翻訳された蛍光性・非蛍光性を含む全GFP量をウェスタンブロットで定量したところ、オリゴDNAのハイブリダイズによるGFPの構造形成への影響はほとんど無く、GFP発現量そのものが向上したと考えられた。さらにこのオリゴDNAによる翻訳促進法を、バイオ医薬として期待されているインターフェロンα8(IFNα8)の発現に適用した。その際、IFNα8の検出を容易にするために、アンバーサプレッション法を用いてIFNα8のN末端領域に蛍光標識アミノ酸を導入しIFNα8発現量を定量したところ、GFP同様に特定のmRNA領域にオリゴDNAをハイブリダイズさせることでIFNα8の発現量の向上が確認された。このように、オリゴDNAを用いた本手法は、タンパク質の発現効率を向上させる新手法として有用であることが実証された。オリゴDNAを作用させて発現させたタンパク質の発現量と活性(構造形成)の相関については更なる検証が必要であるが、タンパク質をコードしたmRNAの特定の領域に相補的なオリゴDNAをハイブリダイズさせ翻訳することで、タンパク質の発現効率を向上させることが可能であることを実証できたことから、おおむね順調に進展していると判断した。本手法は非常にシンプルでありながら世界的に類を見ないタンパク質の発現促進技術であることから、引き続き様々なタンパク質に対して実証を重ねていく。また、このオリゴDNAを用いた翻訳促進法がリボソームのヘリカーゼ活性によってmRNA/オリゴDNA二重鎖が解かれて翻訳が促進しているかどうかを検証するために、オリゴDNAの一部をヘリカーゼ活性を受けにくい人工核酸に置換したキメラオリゴ等を用いて検証することで、翻訳促進のメカニズムについての研究も進める。さらに、無細胞翻訳系のみならず細胞内におけるタンパク質発現への適用についても検討を行う。本研究では、mRNAの高次構造を形成する領域に相補的なオリゴDNAをハイブリダイズさせることで、mRNAの局所的な高次構造を解消させ、タンパク質の翻訳を促進させる新規手法の開発を目指して研究を進めている。平成29年度は、オリゴDNAを用いてmRNAの高次構造を解消させることが翻訳効率の促進に寄与するか検証した。まずは、オリゴDNAをハイブリダイズさせることで翻訳促進が確認されているmRNA中の高次構造形成領域を、高次構造を形成することが知られている他の塩基配列に置換したmRNAを複数作製した。そして、mRNA中の高次構造領域にオリゴDNAをハイブリダイズさせ、無細胞翻訳系で翻訳を行った。この際、N末端領域にアンバーサプレッション法を用いて蛍光標識非天然アミノ酸を導入し翻訳産物の発現量を蛍光強度で定量したところ、新たに作製したmRNAにおいては予想される翻訳促進効果が得られなかった。そこで、翻訳促進が確認されているmRNAの高次構造領域以外の塩基配列に変異を導入し同様の実験を行ったところ、高次構造配列が他の塩基配列と相互作用することで翻訳効率が低下し、高次構造領域に相補的なオリゴDNAをハイブリダイズさせることで翻訳効率が向上することが確認された。さらに、翻訳産物を質量分析で解析したところ、mRNAのみでは途中で翻訳が停止した断片ペプチドが主に得られ、オリゴDNAをハイブリダイズさせることで完全長の翻訳産物が主に得られることが確認された。これらの結果から、オリゴDNAを作用させてmRNA中の高次構造を解消することで、翻訳を促進させることが可能であることを実証した。また、翻訳促進効果を示す塩基配列の探索を継続して進めたところ、mRNAにオリゴを作用させることで翻訳効率の向上に影響を与えると考えられる新たな塩基配列を見いだした。オリゴDNAを作用させることでmRNA中の高次構造を解消して翻訳促進させることが可能であることを実証し、質量分析を用いることで翻訳促進効果の作用部位およびメカニズムについて新たな知見が得られている。さらに、翻訳効率に影響を与えると考えられる新たな塩基配列を見いだせたことから、おおむね順調に進展していると判断した。

まず、タンパク質の発現と構造形成を簡単に評価できる緑色蛍光タンパク質(GFP)をモデルタンパク質として用い、GFP mRNAの様々な領域にオリゴDNAをハイブリダイズさせ無細胞翻訳系でGFPを発現させたところ、特定のmRNA領域にオリゴDNAをハイブリダイズさせることでGFP蛍光強度の増大が確認された。また、翻訳された蛍光性・非蛍光性を含む全GFP量をウェスタンブロットで定量したところ、オリゴDNAのハイブリダイズによるGFPの構造形成への影響はほとんど無く、GFP発現量そのものが向上したと考えられた。さらにこのオリゴDNAによる翻訳促進法を、バイオ医薬として期待されているインターフェロンα8(IFNα8)の発現に適用した。その際、IFNα8の検出を容易にするために、アンバーサプレッション法を用いてIFNα8のN末端領域に蛍光標識アミノ酸を導入しIFNα8発現量を定量したところ、GFP同様に特定のmRNA領域にオリゴDNAをハイブリダイズさせることでIFNα8の発現量の向上が確認された。このように、オリゴDNAを用いた本手法は、タンパク質の発現効率を向上させる新手法として有用であることが実証された。オリゴDNAを作用させて発現させたタンパク質の発現量と活性(構造形成)の相関については更なる検証が必要であるが、タンパク質をコードしたmRNAの特定の領域に相補的なオリゴDNAをハイブリダイズさせ翻訳することで、タンパク質の発現効率を向上させることが可能であることを実証できたことから、おおむね順調に進展していると判断した。引き続き、オリゴDNAをハイブリダイズさせることで翻訳促進効果が得られる塩基配列の探索および翻訳促進のメカニズムについて研究を進める。その後、オリゴDNAを用いた翻訳促進技術を、実際にタンパク質の翻訳促進に適用することを試みる。まず、緑色蛍光タンパク質(GFP)を用いて、実際のタンパク質における翻訳促進効果を検証する。その際、発現した蛍光性GFP量とともに、フォールディングしていない非蛍光性GFPを含めた全GFP発現量を定量し、mRNAの高次構造の解消がフォールディングに与える影響も評価する。さらに、GFP以外のタンパク質を用いて同様の実験を行うことで、オリゴDNAを用いたタンパク質翻訳促進技術の汎用性を検証するとともに、細胞内におけるタンパク質発現への適用可能性についても検討する。本手法は非常にシンプルでありながら世界的に類を見ないタンパク質の発現促進技術であることから、引き続き様々なタンパク質に対して実証を重ねていく。また、このオリゴDNAを用いた翻訳促進法がリボソームのヘリカーゼ活性によってmRNA/オリゴDNA二重鎖が解かれて翻訳が促進しているかどうかを検証するために、オリゴDNAの一部をヘリカーゼ活性を受けにくい人工核酸に置換したキメラオリゴ等を用いて検証することで、翻訳促進のメカニズムについての研究も進める。さらに、無細胞翻訳系のみならず細胞内におけるタンパク質発現への適用についても検討を行う。試薬の使用量が当初の見込みより少なく、さらに使用する消耗品や遺伝子などの受託合成の見直しにより費用を抑えられたため、物品費に差額が生じた。旅費は所属機関の経費を利用したため使用しなかった。人件費・謝金は、本年度は研究代表者のみで研究を遂行したため使用しなかった。
転移性肝癌に対する経皮的マイクロウェーブ凝固療法の検討

現在、手術不可能な肝腫瘍の治療として、肝動脈塞栓術、PEITが広く行われている。しかし、転移性肝腫瘍や硬化型肝癌のように線維成分に富む腫瘍は、これらの治療法では治療剤が十分腫瘍に広がらず、コントロールできないことが多い。そこで転移性肝癌の治療成績の向上をはかるため、術中肝切除などに使用されているマイクロウェーブ発生装置を経皮的に応用し、転移性肝腫瘍をはじめとする治療困難な肝腫瘍の治療を行うことを考えた。そこで基礎研究としてニュージーランドホワイトラビットを用い、超音波ガイド下で肝臓に電極を刺入しマイクロウェーブによる凝固を行った。電極周囲の温度に関しては電極から3mmの部位では90°C前後、電極から10mmの部位まで50°C以上となり、温熱療法に必要とされる42.5°Cより高い温度を呈した。凝固時間と凝固範囲の関係の検討では、範囲は60秒で一定となり、凝固範囲は2cm前後となった。なお、超音波上確認される高エコー領域派、実際の凝固範囲より大きくなることが判明し、実際の凝固範囲は高エコー領域の70%前後だあった。組織学的変化では、凝固直後には、HE染色上は変化は見られず、3日後に辺縁部から変性が始まり、1ヶ月後では、変色範囲は完全に凝固壊死となっていた。以上のことより、経皮的マイクロウェーブ凝固療法は温熱療法としての有効性が確認され、繊維性肝腫瘍に対する硬化も示唆された。さらに、実際に臨床の場でも応用されるようになり、現在良好な治療成績をあげている。
エリザベス朝市民喜劇に関する研究

シェイクスピアの『ウィンザーの陽気な女房たち』の4幕1場は本筋とは無関係なラテン語文法レッスンの場であり、Q版には存在しなかったことから、その存在意義についてこれまで様々な憶測を呼んできた。だが、この場面を作品全体に見られる多様で特異な言語スタイルとの関連で見直すと、この芝居の新たな面が見えてくる。本研究では、4幕1場とその前後にある二つの洗濯籠の場を中心に取り上げ、その特異な言語スタイルを、葛藤が起きてもすぐ脱線しいつのまにか立ち消えになってしまうアクションと絡めて考察した。特に、本作品の主人公フォールスタッフが洗濯籠に入れられ運搬されて河に放り込まれる喜劇的場面は、舞台化されずにフォールスタッフ本人の語りで処理されるのだが、ここには「運搬、移動、窃盗、翻訳」に関するこの作品のテーマが集約されている。結局、この作品は、洗濯籠の場と4幕1場を境にして喜劇の質が変わっているように思われる。最終幕では、フォールスタッフ一人に贖罪を負わせるのではなく、むしろ芝居の構造と言語のあり方そのものに自浄作用が働いており、それがこの喜劇の質を決定している。本作品は広い意味での「移動・運搬・翻訳」を根幹に据え、Aの世界からBの世界への移行のズレや拡散をプロットの起動力に仕立てながら、通常の市民喜劇に見られる陰謀喜劇でも祝祭喜劇でもアリストファネス型喜劇でもない新しい形の喜劇形態へのシェイクスピアの実験的散文劇と考えられる要素が見られるのではないか。シェイクスピアの『ウィンザ-の陽気な女房たち』はどの喜劇群にも属さない異色作だと考えられている。もちろん、それには、『ヘンリー四世・二部作』における喜劇的人物フォールスタッフの再登場をエリザベス女王が要請したことから急遽書き上げられのではないかと推測される、創作時の事情も絡んでいる。しかしながら、シェイクスピア作品のほとんどは、外国に舞台を据えるか過去の時代を取り扱っており、また主人公も王侯貴族である場合が多いのに対し、この作品が同時代の英国を舞台とし、しかも登場人物を中産階級市民としている点で、異彩を放っているとも言える。一方プロットの面からこの作品を眺めると、様々な陰謀の計画が芝居の核を作っており、そうした陰謀によって力と力の衝突が起こる寸前に、別の計略が持ち上がることで衝突が回避されるというパターンが繰り返されている。陰謀の約束が引き延ばされ、解決が後回しにされことで、作品が悲劇につながらずに、喜劇へと傾斜していくのである。本研究では、歴史劇や外国を舞台とした作品に見られるあからさまな権力の葛藤が、同時代の市民階級を扱ったこの作品の中では、引き延ばし戦略を通じてはっきりとした決着を見ず、その権力構造は曖昧なまま宙吊りにされていることに注目し、そうした特徴をアリストファネス以来の喜劇的類型たるフォールスタッフの考察、当時の放蕩貴族ウィリアム・コンプトンとエリザベス・スペンサーの結婚と作品の関わり、オヴィディウス以来の変容のテーマ、ジェンダーと階級というイデオロギー的問題などに触れながら、異色市民喜劇としての本作品の新たな位置づけを試みようとしたものである。
新たな水・電解質代謝調節ホルモングアニリンファミリーの細胞生理・分子生物学的研究

(1)ヒトとラットのguanylinとuroguanylinに対する特異抗体と高感度測定法を開発し、両ペプチドの体内分布と細胞局在を明らかにした。guanylinは主として下部腸管の上皮細胞に存在し、一方uroguanylinは胃と上部小腸の内分泌細胞に存在していた。ヒト,ラット,マウスのuroguanylin cDNAのクローニングを行い、塩基配列を世界に先駆けて決定した。またguanylinとuroguanylinの産生細胞を同定した。(2)GC-Cのノックアウトマウスを開発し、消化管におけるguanylin familyの水・NaCl代謝調節作用を解析した。両ペプチドは経口NaCl負荷により、消化管での生合成と分泌が増加した。(3)ヒトguanylinとuroguanylin遺伝子の全塩基配列を決定した。FISH法により、両遺伝子が第1染色体短腕に連結して存在することを報告した。(4)ヒトとラットの消化管よりguanylinとuroguanylinの分子種を単離し、全一次構造を決定した。前駆体蛋白から成熟ペプチドへのprocessing過程を明確にした。さらに哺乳動物細胞を用いて、リコンビナントによるguanylin前駆体蛋白の合成系を確立した。(5)guanylinとuroguanylinの血漿濃度と尿中排泄量は、NaCl摂取量に相関して増加した。uroguanylinの血漿濃度は、Zollinger Ellison症候群やカルチノイドで増加していた。(6)guanylin familyは、大腸癌由来培養細胞に対し、10^<-8>Mから濃度依存性に増殖抑制効果を示した。uroguanylinとその受容体は胃のECL細胞に存在し、uroguanlinはECL細胞からのヒスタミン分泌を濃度依存性に促進した。本研究課題に関し、下記の研究を行い、成果を明らかにしてきた。(1)ヒトおよびラットのguanylinとuroguanylinに対する特異的抗体と高感度のラジオイムノアッセイを作製し、両ペプチドの体内分布を初めて明らかにした。guanylinは十二指腸以下に存在し、その含量は下部消化管ほど増加していた。uroguanylinは胃と腸に加え、腎臓、副腎、膵臓、肺,下垂体にも存在していた。(2)guanylinとuroguanylinは、腸管の内分泌細胞,吸収上皮細胞に存在することを免疫組織化学的に証明した。uroguanylinは腎臓の遠位尿細管上皮にも存在していた。(3)ヒトとラットのguanylin遺伝子が腸管で発現し、その含量は下部消化管ほど高いことを証明した。(4)ヒトとラットのuroguanylin cDNAのクローニングを行い、それらの塩基配列を世界に先駆けて決定した。uroguanylin遺伝子は胃,腸,腎臓,副腎,膵臓,肺に発現していた。(5)ヒトとラットの消化管粘膜よりguanylin分子種を単離し、アミノ酸配列解析と質量解析により全一次構造を決定した。guanylin分子は、115アミノ酸のpreproguanylinとして合成され、21アミノ酸のシグナルペプチドが切断されたproguanylinとなり貯蔵される。分泌時にpreaspartate deavaging enzymeによりmature guanylin分子が切断され、生成される。(6)uroguanylinは、86アミノ酸よりなるprouroguanylinとして貯蔵され、活性型のuroguanylinは分泌時に前駆体からのprocessingにより生成される。(7)guanylinとuroguanylinの血漿濃度は、それぞれ正常人で30fmol/mlと4fmol/mlであり、両ペプチドとも心不全と腎不全の患者で増加し、その増加率は心・腎機能の障害の程度によく相関していた。(8)GC-C受容体を発現しているヒト大腸癌細胞株(T84 cell line)を用いて、cyclic GMP産生量を指標としたguanylin peptidefamilyの生物活性の測定系を確立した。
潰瘍性大腸炎を惹起する初期血管透過性亢進のメカニズムの解明

再燃と寛解を繰り返す炎症性腸疾患(IBD)は、長期間の寛解維持がQOLの向上に直結するが、現行の治療法で再燃防止を長期維持できている症例は少ない。申請者は、潰瘍性大腸炎のモデルマウスにおいて、粘膜内の血管障害が粘膜上皮障害を誘発し,その後の腸炎悪化に神経細胞の過剰興奮が関与していることを報告した。このことは血管、上皮、神経の恒常性の保持により長期間の寛解が維持できることを示唆している。このような背景から本研究では、特に血管構造の安定化に関与する特異的な遺伝子を探索することで、大腸粘膜の恒常性維持機構および炎症制御メカニズムを解明し、将来的にIBDにおける寛解維持療法への応用を目指す。
テロメア隣接領域の未知なる機能の解明

染色体末端テロメアに隣接するサブテロメア、特にサブテロメア相同(SH)配列の機能はほとんど明らかになっていない。そこで我々は分裂酵母においてすべてのSH配列を削除した株の作製を行った。その株の解析を行った結果、SH配列は通常の細胞増殖やテロメアDNA長制御には必要ないことがわかった。しかし、SH配列はヘテロクロマチン形成を緩衝することにより、サブテロメア領域の遺伝子発現の維持に重要であり、テロメア欠損時には危険な異染色体間末端融合を防ぐといった、複合的防御機構を備えていることがわかった。真核生物の線状染色体末端のテロメアに隣接して、サブテロメアと呼ばれる領域が存在する。近年、テロメアに関する知見は飛躍的に蓄積したが、サブテロメアを含むテロメア隣接領域の機能については、その領域を完全に細胞から取り除くことが困難であることなどから、不明な点が多く残されている。そこで本研究では、染色体を3本しか持たない分裂酵母を用いて、“実験生物史上初のサブテロメア完全欠失株"を作製し、サブテロメアDNA、サブテロメアに形成されるヘテロクロマチン構造、サブテロメア隣接領域の新規機能解明を行う。26年度はサブテロメア共通配列欠損株の表現型解析を中心的に行った。分裂酵母の第3染色体に存在するサブテロメアDNA配列を決定し、サブテロメア共通配列をすべて欠失させた株(SD5)を作製することに成功した。サブテロメア共通配列の生理学的意義を探るため、SD5株の表現型を解析した。SD5は致死ではなかったことから、サブテロメア配列は増殖に必須ではないことがわかった。また、減数分裂、胞子形成にも異常がなく、DNA損傷やDNA複製阻害、高温などのストレスにも高い感受性を示さなかった。一方、通常サブテロメア配列上に形成されるヘテロクロマチン構造が、サブテロメア配列に隣接する領域約50 kbに形成されており、その領域に存在する遺伝子の発現が抑制されていた。さらに、SD5株においてテロメラーゼ遺伝子を破壊したところ、サブテロメア配列以外の部位における組換え反応によって染色体の環状化が起こり、生育可能になる株が出現することがわかった。中には異染色体間で融合した株もあり、片方の染色体でセントロメアの不活性化が起こっていることが予想された。真核生物の線状染色体末端のテロメアに隣接するサブテロメアの機能や制御機構を解析した。3本しか染色体を持たない分裂酵母の特徴を活かして、すべてのサブテロメア共通配列を削除することによって、それらの生理学的機能を探ることにした。本研究で用いた分裂酵母株には、合計5つのサブテロメア共通配列が存在していることがわかったため、それらすべてを破壊した株、SD5株を作製した。これまでに、サブテロメア共通配列がサブテロメアヘテロクロマチンの領域決定に重要であることを示した。さらに、サブテロメア共通配列以外の領域も破壊したところ、サブテロメアとユークロマチン領域の境界でヘテロクロマチンの侵入がブロックされることがわかった。その境界ではヒストンのゲノムDNA局在が激減していたため、クロマチンのboundaryとして機能している可能性が示唆された。SD5株の他の表現型を見出すため、テロメアDNAも欠失させたところ、多くの細胞は致死となったが、生き残る細胞が見られた。それらの細胞の染色体状態を解析したところ、多くの場合、サブテロメア共通配列以外の部分で染色体自己環状化を起こしており、高頻度に異染色体末端融合が見られた。そのような染色体では、一方の染色体のセントロメアコア領域にヘテロクロマチンが侵入してセントロメア不活性化されていることがわかった。着実にデータが出ており、近いうちに論文にまとめる予定である。分裂酵母のサブテロメアにはテロメアに近いヘテロクロマチン領域と、それに隣接して非常に高度に凝縮しているknob領域がある。そのknob構造の形成にはSgo2タンパク質の局在が必須であることがわかっており、Sgo2はそれ以外にサブテロメア領域の遺伝子群の発現レベルの維持、サブテロメアのDNA複製タイミングの維持に重要であることがわかっている。しかし、その詳しいメカニズムは明らかにされていない。そこで、sgo2と同じ表現型を示す変異株のスクリーニングを行った。現在までに、サブテロメア領域のマーカー遺伝子の発現が異常になった約400株の変異株を取得し、その中でも強い表現型を示すものについて解析を進めた。変異部位を調べた結果、多くはsgo2自体に変異が入っていた。残りについて、変異部位の同定を進めている。一方、sgo2 ORFにランダムに変異を導入し、サブテロメア遺伝子発現に異常をきたすsgo2変異株ライブラリーを作製した。その結果、Sgo2のN末領域とC末領域にサブテロメア機能に重要なドメインが存在することが示唆された。さらに、Sgo2がDNA複製タイミングをどのように制御しているのかについても解析を進めた。Sgo2はセントロメアでは、PP2A脱リン酸化酵素を呼び込むことによってセントロメア領域の姉妹染色分体の接着を制御していることが知られているため、サブテロメアにおいても脱リン酸化酵素を呼び込むことによって、DNA複製の開始に必要なリン酸化反応を制御している可能性を解析中である。着実にデータが出ており、論文を投稿後、リバイス中である。他の論文についても投稿準備中である。真核生物の線状染色体末端のテロメアに隣接して、サブテロメアという領域が存在している。

近年、テロメアに関する知見は急激に蓄積したが、サブテロメアの機能の詳細については不明な点が多く残されている。なぜなら、サブテロメアは長大な共通配列を含むなどの実験的困難があるからである。そこで本研究では、染色体数が3本と非常に少ない分裂酵母を用いて、サブテロメア共通配列完全欠損株を作製することを試み、成功した。株が取得できたことから、サブテロメア共通配列は、生育に必須ではないことがわかった。また、サブテロメア共通配列を除くと、その隣接領域にヘテロクロマチンが侵入することがわかった。それにより、その領域の遺伝子発現が著しく減少し、高濃度塩ストレスに感受性を示すようになった。しかし、このヘテロクロマチンの染色体内部領域への侵入は、サブテロメア領域内に必ず収まっていたことから、サブテロメアの端には、ヘテロクロマチンのspreadingを阻止するboundary機能があることが示唆された。さらに、その株においてテロメラーゼを不活性化し、テロメアDNAを消失させると、通常では見られない異染色体間末端融合株が取得できた。その融合した染色体では、サブテロメア近傍のレトロトランスポゾンなどの配列においてSSA反応によって末端融合しており、片方のセントロメアが不活性化されていた。以上のことから、サブテロメアには遺伝子発現、染色体恒常性を維持するための複合的防御機構を備えていることがわかった。染色体末端テロメアに隣接するサブテロメア、特にサブテロメア相同(SH)配列の機能はほとんど明らかになっていない。そこで我々は分裂酵母においてすべてのSH配列を削除した株の作製を行った。その株の解析を行った結果、SH配列は通常の細胞増殖やテロメアDNA長制御には必要ないことがわかった。しかし、SH配列はヘテロクロマチン形成を緩衝することにより、サブテロメア領域の遺伝子発現の維持に重要であり、テロメア欠損時には危険な異染色体間末端融合を防ぐといった、複合的防御機構を備えていることがわかった。サブテロメア全欠失株の作製に成功し、表現型解析もかなり進んだ。現在、論文投稿に向けて仕上げの実験をしているところである。今後は、サブテロメアとユークロマチンのバウンダリーの機構をさらに調べていく予定である。また、サブテロメア共通配列に含まれていると思われるバウンダリー配列についても、詳細に解析していく予定である。今後は、サブテロメア機能異常を示す変異株の変異部位を決定し、その原因遺伝子の機能を明らかにする。Sgo2との関係についても解析する。さらに、Sgo2自体の機能ドメインやDNA複製タイミング制御における分子機能についても解析を進める。29年度が最終年度であるため、記入しない。分子生物学サブテロメアに間期のみ局在することがわかっているセントロメアタンパク質Sgo2の機能解析を進める。また、サブテロメアヘテロクロマチンの境界を決定している分子メカニズムについても解析を行う。現在、サブテロメア領域の遺伝子発現を指標にした変異株の解析を進めている。