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胎盤機能の分化に関与する分化誘導因子の役割に関する研究

この事実はレチノール酸の分泌(産生)促進作用は、レチノール酸添加後早期に誘導される蛋白質によると考えられた。2)更にレチノール酸の核receptorが甲状膜ホルモンの核receptorのDNA responsive elementに結合するという報告(Evansら,1989)により、甲状腺ホルモンがレチノール酸のhCG産生促進作用に影響を与えるか否かについて検討した。その結果、T_3単独ではhCGの産生をわずかに抑制したが、レチノール酸との同時添加ではレチノール酸のhCG分泌促進作用は抑制されなかった。以上より、レチノール酸のhCG産生促進作用は蛋白合成を介していると推測され、また甲状腺ホルモンとは異なるpathwayで作用すると考えられた。本年度は,カルシウム調節因子であり局所においての分化誘導物質でもある副甲状腺ホルモン関連蛋白(PTHrP)の胎盤、子宮内膜における産生、局在についても検討した。さらに、妊婦、産褥婦、胎児血中におけるPTHrP値について検討したところ、妊娠初期にやや高値、胎児、産褥婦では高値であることが明らかとなった。すなわち、これらの妊娠、産褥における血中PTHrPの変化は前者は胎盤性のPTHrPの、後者は乳腺より産生されるPTHrPの関与が考えられた。絨毛細胞の子宮内膜に着床する際関与している子宮内膜のplasminogen activator(PA)systemについても子宮内膜癌細胞を用いて検討したところ、プロテインキナーゼCの刺激物質であるphorbol ester、EGFがPA systemの調節因子であるt-PA,PAI-lの分泌(産生)に関与しているがレチノール酸、サイロキシンは影響を与えないことを明らかにした。また、子宮内膜癌細胞の産生するt-PA,PAI-lの分子的性格をウエスタンプロッティングにより明らかにした。今後、絨毛細胞、子宮内膜細胞との相互のサイトカイン、成長因子、ホルモンなどを介した局所環境の調節が課題であると考えられた。
翻訳後修飾によるLrp4シグナル制御機構とその破綻

Lrp4は骨形成や神経筋シナプス(NMJ)形成などに重要な受容体分子であり、その異常は硬結性骨化症やCenani-Lenz合指症の原因となる。他方、代表者らは重症筋無力症の新規の病原性自己抗体として抗Lrp4抗体を発見すると共に、当該分子の細胞表面への局在制御に関わる糖鎖修飾と会合分子、並びに細胞内領域の複数のリン酸化修飾部位の解明に成功した。そこで、本研究では、Lrp4分子の翻訳後修飾の解明と、それらの翻訳後修飾に制御されるシグナル経路の同定や統合的な理解を通じて骨化症、合指症や筋無力症等の疾患におけるLrp4分子の修飾異常シグナルの解明を目指した。初年度の研究においては、Lrp4結合分子として独自に発見したMesdc2の機能解析を進め、それがLrp4の糖鎖修飾と筋管細胞の細胞膜表面での発現に不可欠の因子であることを解明した。さらに、Lrp4が運動神経由来因子であるAgrinとの結合を介して、NMJの後シナプス分化に必須の役割を担っていることを勘案し、当該分化誘導系におけるMesdc2の役割を検討した。その結果、Mesdc2のノックダウンがAgrin刺激による後シナプス分化を有意に阻害することを解明した。そこで、本年度の研究では、Lrp4の糖鎖修飾部位の同定と各修飾部位のシグナル伝達時における意義、並びにLrp4関連疾患におけるMesdc2の異常に関する研究を進めた。すでに、Lrp4の複数の糖鎖修飾部位(候補部位を含む)の欠失変異体を作成し、それを発現する培養筋管細胞を樹立するとともに、NMJの後シナプス分化誘導に重要と思われる修飾部位を絞り込んだ。引き続き、それらの詳細に及ぶ検証実験と、硬結性骨化症やCenani-Lenz合指症との関連に関する研究を進めている。27年度が最終年度であるため、記入しない。そこで、本研究では、1)Lrp4分子の翻訳後修飾と会合分子の全貌の解明、2)Lrp4分子の翻訳後修飾に制御される個々のシグナル経路の解明、3)構造生物学的解析や数理科学的解析によるLrp4分子の翻訳後修飾シグナルの統合的な理解、4)骨化症、合指症や筋無力症等の疾患におけるLrp4分子の修飾異常シグナルの解明、を目指す。以上の経緯を踏まえ、本年度の研究においては、Lrp4結合分子として独自に発見したMesdc2の機能解析を進め、それがLrp4の糖鎖修飾と筋管細胞の細胞膜表面での発現に不可欠の因子であることを解明した。Lrp4が運動神経由来因子であるAgrinとの結合を介して、NMJの後シナプス分化の誘導と維持に必須の役割を担っていることを考えると、Mesdc2はAgrin刺激による筋管細胞上での後シナプス分化に必須であることが予想される。実際、Mesdc2のノックダウンはAgrin刺激による後シナプス分化を有意に阻害した。現在、Lrp4の糖鎖修飾部位と、各修飾のシグナル伝達時における意義、並びに、Lrp4関連疾患におけるMesdc2の異常に関する研究を進めている。

「研究実績の概要」にも記載の通り、本年度はLrp4の糖鎖修飾と結合分子に関する研究を中心として進めた。その結果、Lrp4会合分子として独自に同定したMesdc2が、Lrp4の糖鎖修飾や機能の場である細胞表面での発現、並びに、NMJの後シナプス分化に重要であることを発見した。これは、Lrp4関連疾患におけるMesdc2の異常に関する研究にも繋がる重要な知見と言える。以上の成果を踏まえ、上記の通り2と評価する。27年度が最終年度であるため、記入しない。上記の通り、本年度の研究は順調に進展している。そこで、当初の計画に沿って、Lrp4の翻訳後修飾、特に糖鎖修飾部位の同定とその意義の解明に注力する。また、Mesdc2については、先天性筋無力症等の遺伝性のLrp4関連疾患におけるMesdc2の遺伝子変異を中心に、Lrp4を含めた糖鎖修飾異常シグナルとの関連について研究を進める。
高階パンルヴェ方程式及びリジッド方程式の差分化

今年度は昨年度に引き続き,一般化q-パンルヴェVI系の代数構造について研究を行い,次の結果を得た。以下の結果は全て大久保(青山学院大)との共同研究によるものである。(a) Inoue-Lam-Pylyavskyyによる先行研究(Publ. RIMS, to appear)に基づいて,ある4n+4個の頂点を持つトーラス上の箙を不変に保つような変異と置換の合成を系統的に構成した。このようにして得られた合成はクラスター係数についての双有理変換となるが,それらのなす群がA_{2n+1}+A_1+A_1型拡大アフィン・ワイル群と同型になることが本研究で明らかにされた。更に,この群の平行移動変換を具体的に書き下すことで,既知の3種類(坂井のq-ガルニエ系,津田によるq-UC階層の相似簡約,研究代表者によるq-DS階層の相似簡約)を含む4種類の一般化q-パンルヴェVI系を導出した。上記の3種類の方程式は,線形q-差分方程式系の差分両立条件として提唱されていたが,今回の結果によりカッツ・ムーディー・ワイル群の平行移動としても導出されたことになる。(b) (a)で得られた結果を拡張して,A_{mn-1}+A_{m-1}+A_{m-1}型拡大アフィン・ワイル群の双有理表現を与えた。この結果はKajiwara-Noumi-Yamada(Lett. Math. Phys 2002)によるA_{n-1}+A_{m-1}型の拡張となっている。mが3以上の場合に平行移動変換を明示的に書き下すことが出来れば,新たなq-差分方程式系のクラスが得られるであろう。(c) q-DS階層の相似簡約はハイネのq-超幾何関数を特殊解として持つことが研究代表者(Comtemp. Math. 2015)によって既に明らかにされているが,この超幾何関数解の条件を(a)で得られた結果を用いてクラスター係数における条件として書き直すことが出来た。この結果を(b)の結果と合うように拡張出来れば,様々なq-超幾何関数及びリジッド系のq-類似が箙における変異から系統的に得られるであろう。本年度は,A型アフィン・リー代数に付随する無限次元可積分系に由来する高階パンルヴェ方程式の研究を行い,いくつかの成果を得ることが出来た.一般超幾何函数を特殊解に持つものについては,そのq-離散化が既に定式化されてはいたが,この方程式は可約であり発展方程式にはなっておらず,また方程式へのワイル群の作用は掛算ではなく足算型の公式であったため,ポワソン構造や量子群との関係が見えにくいものであった.従って,方程式のより適切な表記を与えることが今後の研究を推進する上で急務であったが.本年度はこの懸念事項を解決することが出来た.すなわち,既知のq-パンルヴェ方程式を既約な発展方程式の形に書き直し,更に方程式へのワイル群の作用として掛算型の公式を得た.この研究結果は今年3月の日本数学会年会において発表し,また論文はプレプリントとして既に公開済みであり,現在学術雑誌に投稿中である.また,高階パンルヴェ方程式へのワイル群作用から,特殊解として現れる一般超幾何函数のある種の隣接関係式を得ることが出来た.新たな関係式を発見するには至らなかったが,ここで得られた手法は他の超幾何函数の場合においても有効であると期待される.当初計画していた楕円差分化の研究には至らなかったが,代わりに研究対象である高階のq-パンルヴェ方程式の新たな表記を得ることが出来た.これにより,ポワソン構造や量子群との関係といった方程式の代数的な構造がより明確となることが期待出来る.今年度は,Nagao-Yamadaによるq-ガルニエ系の研究や,Ormerod-Rainsによる楕円ガルニエ系の研究など,本研究課題と関連する分野において大きな進展があった.それに伴い,当初予定していた楕円差分化の研究からは方針を転換して,タウ関数・ワイル群・クラスター代数といった高階q-パンルヴェ方程式の代数的な構造に関する研究を進めていった.今年度に得られた研究成果は次の通りである.(a) q-パンルヴェ方程式の解に付随するタウ関数を,A型ルート格子上において定式化し,それらの満たす広田・三輪型の双線形関係式を導出した.これにより,ハイネのq-超幾何関数によって記述されるq-パンルヴェ方程式の特殊解のJacobi-Trudi型行列式表示を得ることが出来た.(b)大久保(東大数理)との共同研究によって,津田によってq-UC階層の相似簡約として定式化されたq-パンルヴェVI方程式のある一般化を,箙の変異として記述することに成功した.新たな方程式の発見には至らなかったが,ここで得られた手法は方程式の代数的な構造を調べる上で有効であると期待される.当初の研究計画からは多少の変更を余儀なくされたが,その結果として,長年の懸念事項であったA型高階パンルヴェ方程式の解に付随するタウ関数の定式化という問題を解決することが出来た.

これにより,方程式の代数的な構造がより明確となること,更には「高階q-パンルヴェ方程式がどのくらい存在するのか?」という問題の解決への手掛かりとなることも大いに期待できる.今年度は前年に引き続き,一般化q-パンルヴェVI系の代数的構造,特にワイル群やクラスター代数との関連について調べた.また,A型ドリンフェルト・ソコロフ(DS)階層の相似簡約のポワソン構造やハミルトン系表示についても調べた.今年度に得られた研究成果は次の通りである.(a)前年の研究では,津田の一般化q-パンルヴェVI系を箙の変異として記述したが,その際に用いた手法は「箙を不変に保つような変異と置換の合成を探す」というものであった.今年度は前年の研究を更に推し進めて,箙を不変に保つような変異と置換の合成からクラスター変数についての双有理変換群を構成し.その平行移動作用から前年に得られたものとは異なる方程式系を導くことに成功した.更にこの研究の副産物として,坂井による2階q-パンルヴェ方程式の退化構造が箙の頂点の合流操作から導かれることを示した.以上の結果は全て,大久保(青山学院大)との共同研究によるものである.(b)3成分KP階層の(n,n,n)-周期簡約に相当するA型DS階層について,その相似簡約を2変数(6n-4)階多項式ハミルトン系として記述するような正準座標系を与えることに成功した.またこのハミルトン系の特殊解として,シンプソンのEven4超幾何微分方程式を含むリジッド系のあるクラスが現れることが,併せて明らかになった.現在q-パンルヴェVI方程式の一般化として,坂井のq-ガルニエ系,津田によるq-UC階層の相似簡約,増田のq-笹野系,研究代表者によるq-DS階層の相似簡約の4種類が知られている.このうち,q-ガルニエ系とq-DS階層の相似簡約とは本質的に等価であることが長尾・山田によって明らかにされたが,残りの2種類との関係は未だ不明である.上記(a)の結果は,q-DS階層とq-UC階層との関係を明らかにし,更にこれら3種類の方程式系の由来となるワイル群の構成という問題を解決する手掛かりとなることが十分に期待できる.研究代表者はこれまでの研究において,様々な型のDS階層の相似簡約を多項式ハミルトン系として記述してきたが,その際に用いた手法は発見法的なものであり,良い正準座標を与えるような一般的なアルゴリズムは未だ存在しない.上記(b)の結果は,この長年の懸念事項を解決する手掛かりとなることが期待できる.今年度は昨年度に引き続き,一般化q-パンルヴェVI系の代数構造について研究を行い,次の結果を得た。以下の結果は全て大久保(青山学院大)との共同研究によるものである。(a) Inoue-Lam-Pylyavskyyによる先行研究(Publ. RIMS, to appear)に基づいて,ある4n+4個の頂点を持つトーラス上の箙を不変に保つような変異と置換の合成を系統的に構成した。このようにして得られた合成はクラスター係数についての双有理変換となるが,それらのなす群がA_{2n+1}+A_1+A_1型拡大アフィン・ワイル群と同型になることが本研究で明らかにされた。更に,この群の平行移動変換を具体的に書き下すことで,既知の3種類(坂井のq-ガルニエ系,津田によるq-UC階層の相似簡約,研究代表者によるq-DS階層の相似簡約)を含む4種類の一般化q-パンルヴェVI系を導出した。上記の3種類の方程式は,線形q-差分方程式系の差分両立条件として提唱されていたが,今回の結果によりカッツ・ムーディー・ワイル群の平行移動としても導出されたことになる。(b) (a)で得られた結果を拡張して,A_{mn-1}+A_{m-1}+A_{m-1}型拡大アフィン・ワイル群の双有理表現を与えた。
作物圃場形質の次世代マッピングスキームの開発

作物の形状は、食感や成長速度、耐病性等に関わる重要な形質である。しかし、それを支配する遺伝子についてはほとんど明らかにされておらず、多くの作物の品種改良は表現形を指標に育種家の努力と経験によって進められている。着目する形質とその原因遺伝子座の関係を明らかにするためには、大きな分離集団を作成し多大な時間と手間を掛けて評価と解析を行う必要がある。そこで本研究では、指標の設定と評価の効率化を目標として、圃場のドローン撮影と機械学習(とりわけディープラーニング)を遺伝子探索に用いる試みを行う。
卵胞発育過程における卵巣内局所調節因子の意義に関する研究

本研究の目的は、卵巣内局所調節因子としてサイトカインを想定し、ゴナドトロピンの作用を受けにくいと考えられる初期の卵胞形成過程におけるサイトカインの作用、およびサイトカインのおもな産生源と考えられる免疫系細胞と細胞構成細胞との関係、卵巣構成細胞相互の関係を形態学的に明らかにすることであった。胎児期から性成熟にいたるまでのマウスの卵巣を、パラフィンの連続切片、HE染色によって光学顕微鏡を用いて観察すると、原始卵胞の形成は早いもので胎児16.5日から観察され、出生時には殆どの卵母細胞が原始卵胞になっていた。生後1日で一次卵胞となり、莢膜細胞が出現している。生後10日で前胞状卵胞、生後14日で胞状卵胞、生後21日でグラーフ卵胞が形成され、一方では閉鎖卵胞も観察された。黄体は生後21日ごろから観察され、ゴナドトロピンの周期的な分泌が始まり排卵が起こっていることが推察された。各時期で卵巣内での各発達段階の卵胞の出現頻度から第一回目の卵胞の発達の波は出生直後から、第二回めの発達の波は生後10日頃からと思われた。成熟個体と考えられる生後8週以後の卵巣では各発達段階の卵胞が観察された。赤血球を含む免疫系細胞は生後1日頃から細胞の周囲に観察され始め、卵胞発育とのなんらかの関与が暗示された。サイトカインの卵胞形成に対する作用、免疫細胞と卵胞形成細胞との関与についてはいまだ検討を続けている。当初の目的は十分には果たせなかったが、初期卵胞形成過程について将来形態学的に検討していく基礎が築かれたことは大きな収穫であったと考えられる。また、研究代表者がこれまでin vitroで検討してきた実験系とあわせるとこれからの大きな飛躍が期待される。さらに神崎らによって、子宮内膜・胎盤においてサイトカインの作用に対して新しい知見が得られた。
腸内細菌-皮膚ネットワークの構築を目指して；皮膚機能分子の新規制御機構の解明

本研究では、腸管内の事象である「腸内細菌」と体の最外層である「皮膚」に発現している機能分子AQPとの関係を明確にする中で、腸内細菌が皮膚機能に影響を及ぼす新たな分子メカニズムを明らかにし、皮膚疾患に対する新規治療戦略を構築する。具体的には、腸内細菌変動モデル動物やノトバイオートシステムにより、腸内細菌と連動する皮膚AQPを同定する。また、AQP制御分子を腸内細菌ならびに皮膚常在菌の代謝産物から見出し、新規発現制御メカニズムを明らかにする。最終的に、制御分子の活性化剤(抑制剤)を用いて、皮膚疾患に対する治療効果を確認する。
ロシアの権力構造をめぐる総合的研究

まず、「「権力関係」の分析方法」について考えた。「権力」を「実体」としてとらえるのではなく、「関係」としてとらえる立場から、「権力構造」を分析する必要性を示すものだ。ついで、「ロシアの行政改革と「現実」」として、プーチン政権下で行われている行政改革そのものを明らかにした。いわゆるグローバリゼーションとよばれる地球規模で広がる潮流のなかで、マクロレベルでは、行政改革が、ミクロレベルでは、企業統治が問題になっている。そこで、この2点について、現状分析をすることにしたわけである。このため、「ロシアの企業統治と「現実」」についてもまとめた。ロシアの企業統治に関する文献は多くあるが、その「現実」に鋭く肉薄した論考は少ない。こん研究はは重要な研究成果を示している。「ロシアのマスメディアと「権力関係」」として、マスメディアそのものの現状分析も行った。「第4の権力」の「現実」を詳細に考察したものである。ここでは、今後の展望をかねて、試論として「権力関係」についても分析してみた。「ロシアの軍産複合体と「現実」」として、軍産複合体も詳しく分析した。軍産複合体は「軍」、「産」にかかわる重要な企業体だから、今後の「権力分析」のうえでも重要であると考えている。「ロシアのレントと課税をめぐる諸問題」として、いわゆる「自然レント」にかかわる問題を課税と関連させながら論じてみた。「権力関係」を考察するうえで、重要な視角をあたえてくれるからだ。レント問題を課税と関連させることで、今後行う「権力関係」の分析に役立てたい。「クラスノヤルスク地方の知事選をめぐる「権力関係」」とおいて、2003年に同地方に出張した成果をとりまとめた。1.ロシアのシベリアに位置するクラスノヤルスク地方における2002年秋の知事選をめぐる権力構造を研究するための資料を入手するとともに、要人へのインタヴューを行った。これをもとに、地域のケーススタディーとしてすでにまとめ、明治学院大学国際平和研究所で報告した。最終報告に取り入れる予定。2.モスクワで有力経済学者にインタビューを行うとともに、多くの政治・経済にかかわる文献を取得し、それを拙著『現代ロシアの経済構造』(2004年4月刊行)に反映させた。3.権力構造を分析するうえで重要な「第四の権力」としてのマスコミについて、資料収集を行い、そのとりまとめを行っている。4.軍産複合体に関係する資料を収集し、軍事面からみた権力関係を考察している。防衛庁委託研究(平成15年度)に一部活用した。ロシアの「権力構造」を分析するに際し、まず「権力」を分析するための方法論についてまとめた。そのうえで、「権力関係」が錯綜としているいくつかの局面について、その実態を詳しく分析した。第一に、グルーバリゼーションの一環として生じている「行政改革」をめぐるマクロレベルにおける分析を行った。ついで、ミクロレベルにおいて、「企業統治」にかかわる問題を考察した。いずれも、「権力関係」を分析するための準備作業ということになる。ついで、「マスメディアと「権力関係」」について、分析した。第四の権力ともよばれるマスメディアがロシアにおいて、他の権力とどうかかわっているかについて考察したことになる。さらに、軍産複合体の現状分析を行い、「権力関係」を考えるための準備を行った。軍産複合体は国防省や経済発展貿易省にかかわるだけでなく、武器輸出を通じて、国際的な「権力関係」とも密接に関係している。こうした組織の分析は権力問題を考えるうえで、きわめて重要である。「ロシアのレントと課税をめぐる諸問題」では、レントと課税にかかわる「権力関係」について分析するための視角を得た。最後に、クラスノヤルスク地方における知事選において、「権力関係」がどのように作用していたのかについて分析した。付論として、各国別の行政改革の動向をまとめた。

さらに、拙著『現代ロシアの経済構造』(慶應義塾大学出版会、2004年、北海道大学から学術博士号取得)をつけた。本研究の成果の一部を公刊したものだからである。以上の分析を通じて、ロシアにおける「権力構造」のいったんを明らかにできたと考えている。
多発性口腔扁平上皮癌におけるDNAメチル化に関する研究

鹿児島大学病院口腔外科で2001年から2010年の期間に口腔癌(上皮内癌含む)の治療を受けた症例は、438症例であった。そのうち、同時性及び異時性多発の扁平上皮癌は27例に認められた。この27例の内訳は、男性11例、女性16例で、初発時年齢は55歳から92歳で、平均年齢は71.5歳であった。発生部位の数は2から7で、平均は3.2部位であった。これらのうち、3例は浸潤癌の治療のために放射線照射を受けており、照射野に含まれた粘膜由来の扁平上皮由来と考えられた。これらの症例について領域発がんの観点から、癌組織におけるDNAのメチル化について検索中である。本研究は、口腔内に同時性、異時性に発生した多発(重複)性扁平上皮癌において、各病変部および非病変部組織でのepigenetic変化(DNAメチル化)を解析し、多発性口腔扁平上皮癌発生メカニズムを解明することを目的とする。今年度は、本研究の実施に当たり本学倫理委員会の承認を受け、2001年から2010年の10年間に鹿児島大学病院で口腔扁平上皮癌と診断された480例(多発例25例)を選択し、Tumor IDを振り分け匿名化し、年齢、性別、組織分化度、病期などを含むデータベースを構築した。対象症例からのDNA抽出作業を開始し、これまで口腔扁平上皮癌発生に関連すると報告されている遺伝子を選択しプロモーター領域のprimerを設計した。本研究は、口腔内に異時性あるいは同時性に発生した多発(重複)性扁平上皮癌における、病変部と非病変部組織でのepigenetic変化(DNAメチル化)を解析し、多発性口腔扁平上皮癌の発生メカニズムを解明することを目的としている。口腔扁平上皮癌の発生は、多因子によるものとされており、原因、責任遺伝子についての報告は多数ある。これまで、口腔扁平上皮癌に関連するとされてきた癌抑制遺伝子のメチル化について定量的PCR法により解析する。本学倫理委員会の承認を受けて、2001年から2010年間に鹿児島大学歯学部病院で、口腔扁平上皮癌の病理組織診断を得た症例480例のうち、口腔内に異時性あるいは同時性に発生した多発(重複)性扁平上皮癌において、25例を抽出した。そのうち、病理診断に用いた病変部のパラフィンブロックを10umの厚さに薄切し、Bisulfite処理DNA抽出を行い、上記の遺伝子のメチル化について検索中である。これらのメチル化を数値化、定量化し、分布を検証してcut off値を設定後、大腸癌で報告されているような、CIMP-low, CIMP-highグループに分類し、生存分析によって予後の比較を行う。その際、年齢、性別、組織分化度、病期を加えた、多変量解析を行う予定である。昨年度までに構築した口腔扁平上皮癌のデータベースの中から、口腔粘膜上皮内病変症例を抽出し、その構造異型や細胞異型形態学的特徴の解析、遺伝子変異、epigeneticな変化を反映する、病変部でのcytokeratin13 (CK13)の発現減弱、cytokeratin 17 (CK17)の発現増加および両者の発現境界形成の有無、Ki-67の基底細胞層での発現あるいは基底細胞層以上での多層に渡る発現の増加、病変部と正常粘膜部でのTP53の発現変化(増加あるいは減弱)について評価し、HE所見の構造異型、細胞異型および境界形成と比較検討した。結果は、上皮内癌では、CK13, 17の発現境界形成、Ki-67の発現変化、TP53の発現変化を認める症例の割合が、上皮異形成症例に比べ多く、両者には差が認められた。同部位からの再発症例だけでなく、同時性、異時性に多発癌を認めた症例では、各マーカーの発現変化は同様に認められ、field cancerization(領域発癌)であると考えられ、本研究の仮説で考えられたような、口腔粘膜上皮全体に発生過程でのepigenetic変化が生じている可能性、病変での遺伝子変異のmonoclonalな拡散をsupportするようなepigenetic変化が生じている可能性があると考えられた。研究は大幅に遅れている。その理由は、所属部局の人事異動に伴い、他業務へのエフォートが著しく増加し、本研究のエフォートがほとんど達成されたかったためである。また、症例の予後調査の段階で、治療歴とその後の経過観察が不十分な症例が多数、存在することが判明したため、生存分析が行えないことが分かったためである。口腔病理学上記理由の改善は新年度には見込めないため、計画を変更し、症例数と検索遺伝子を削減することで対応する。

また、研究協力者として申請はしていないが、技術職員のテクニカル面でのサポート部分を増加してもらう。予後調査については、可及的にリコールをかけてもらうが、それでも見込めないときは、臨床データと合わせた多変量解析のみで、生存分析は行わない形でまとめる。また、倫理委員会への提出書類の訂正が必要となるが、2000年以前の症例についても遡って、データベースに加える予定である。本学倫理委員会での承認を得るのに、時間を要した。また、多数の臨床検体を取り扱うための、クリーンルームの整備、ステーションの設置に当たっての設備の改装などに時間を取られた。引き続き、選択した症例全例からBisulfite処理DNA抽出を行うとともに、口腔癌関連遺伝子のメチル化についてRT-PCRで定量的に解析する。また、DNA繰り返し配列領域についての検索も行う。
立体化学的に反転したキラルポリマー材料の生合成

化学重合研究において、光学活性モノマーの立体化学を精密制御できる触媒を開発し光学純度の高いポリマーを合成することは、基礎・応用の両面において重要な課題である。一方、微生物産生ポリマーであるP(3HB)は、(R)体モノマーからなる超高光学純度ポリマーであり、細胞システム(関連酵素群の厳密な立体認識選択性)の特質が生かされている。「本来(R)体モノマーにしか反応選択性を示さない重合酵素を、(S)体モノマーを認識しポリマー鎖内に取り込めるように人工的に改変できないか?」というのが、本研究の中心課題である。この研究を通じて得られることは、重合酵素の基質認識を立体化学の視点から明らかにできることにある。
日本仏画における皆金色技法の成立と表現史に関する基礎的研究

最終年度となる本年度は、ベルリン国立東洋美術館の「山越阿弥陀図」「春日曼茶羅図」「十王図」について現地調査を行った。なかでも「山越阿弥陀図」は皆金色による尊像表現が特色で、その具体的な技法の分析が必要な作品であったが、阿弥陀如来と諸聖衆はともに、肉身部は丹具地に金泥としていること、着衣部は金泥を薄く掃く手法と截金文様を併用するタイプであることがわかった。13世紀末ころの制作と判断されるが、すでに確認している二種の皆金色方法の枠内で解釈できることが重要な成果である。「春日曼茶羅図」は皆金色ではないが、金泥を多用する作例で、とくに参道と境内には、丹具地に金泥を掃いて聖域をシンボライズしていることが知られた。以上の作例についてはデジタル撮影を行い、データを保存した。また従来の調査で収集した画像もCDに焼いて整理した。3年間におよぶ調査で収集した資料・情報を総合して分析した結果、重点的な作例から判断される皆金色技法の成立と展開について、おおよその概観をつかむことができた。大きくIII期くらにいわけて考えるのが妥当で、第I期(12C末から13C初)は発生と試行錯誤、第II期(13C前半)は形成、第III期(13C後半から末)は完成と定着に当てることができる。また、本研究テーマによる調査を続行するなかで、はからずも従来まったく気付くことのなかった仏画における雲母使用の可能性が浮かび上がってきたことも、本研究の副産物である。もの問題については本研究の成果の一部として「光輝表現法の一異種-仏画における雲母使用-」という論文を『美術史学』27号に掲載予定である。平安時代末期から鎌倉時代にかけての国内所在の仏画のうち、皆金色の成立に関係する作品を調査した。阿弥陀を本尊とする来迎図作品が主要部分を占めると考えられるため、その領域を中心に取り上げた。対象となった作品は、金戒光明寺蔵「山越阿弥陀図」、京都国立博物館蔵「山越阿弥陀図」、西来寺蔵「阿弥陀四尊来迎図」、清涼寺蔵「二河白道図」などである。また皆金色ではないが関連作品として、修理中の禅林寺蔵「山越阿弥陀図」、および石清水八幡宮蔵の「黒漆地金銀泥絵八角宝珠箱」も調査する機会に恵まれた。調査の方法は実作品に接し、拡大鏡による観察および、35ミリのカラー・スライド撮影を行った。拡大鏡による観察では、皆金色風の着衣文様が金泥なのか截金なのかを判断し、また地の部分が彩色なのか、あるいは金泥地なのかという点について特に注意した。海外所在作品のうちでは、皆金色仏画の早い時期の成立と想定される重要な作品、シカゴ美術館蔵「阿弥陀三尊来迎図」等を調査した。精査した結果、このひとつの作品のなかで、截金文様を着衣に施す場合、地の部位を彩色地とするものと、金泥地とするものとの二種類を併用していることが観察された。皆金色の形成過程では、技法上の試行錯誤が行われているものと想定していたが、このように一つの作品の中で、用いる場所によって二つの技法を使い分ける例のあることが確認できた意味は大きい。なお、撮影した35ミリカラー・スライドは可能な限りフォトCDに焼き付けて画像を保存した。本年度は、皆金色技法と関連のある金銀泥を用いた仏画等の重要作品の調査を行った。皆金色表現が確立する鎌倉時代の作品のうちから浄土教絵画を取り上げ、清涼寺ほかの阿弥陀浄土図関係作品および興聖寺蔵の兜率天曼茶羅図の精査を行い、仏身表現の金泥地の有無を調べると同時に、浄土の加飾された地の表現にも着目した。また皆金色技法は東アジアの美術史の視点からも捉える必要があるため、韓国の高麗時代の金泥技法を用いた高麗仏画の調査を国立中央ソウル博物館、リーアム美術館でも行なった。高麗仏画においても、素材と画題との関係に応じて、描く対象全体を金彩で覆うという発想があることが知られる。しかしその技法への展開は日本の鎌倉時代とは別の途を辿ったとみなされ、やはり金泥地に截金という総金地の皆金色は日本だけに現われた表現といっていいことが、ほぼ確認できた。鎌倉時代仏画においての皆金色の成立に向けた展開状況はさらに多くの作品調査を待たなければならない。ただ今年度の調査研究を通じて新たに浮かんできた問題がある。それは金泥地に截金という皆金色技法は、仏身・仏衣の連結体に用いられる以前に、阿弥陀浄土などの地の表現に先行して用いられていたという可能性である。清涼寺蔵の阿弥陀浄土図はそうした例のひとつであるが、制作年代の位置づけが皆金色仏画の早い例と相前後するため、他の類例の調査を含めてさらに検討する必要があるものと思われる。

13世紀末ころの制作と判断されるが、すでに確認している二種の皆金色方法の枠内で解釈できることが重要な成果である。「春日曼茶羅図」は皆金色ではないが、金泥を多用する作例で、とくに参道と境内には、丹具地に金泥を掃いて聖域をシンボライズしていることが知られた。以上の作例についてはデジタル撮影を行い、データを保存した。また従来の調査で収集した画像もCDに焼いて整理した。3年間におよぶ調査で収集した資料・情報を総合して分析した結果、重点的な作例から判断される皆金色技法の成立と展開について、おおよその概観をつかむことができた。大きくIII期くらにいわけて考えるのが妥当で、第I期(12C末から13C初)は発生と試行錯誤、第II期(13C前半)は形成、第III期(13C後半から末)は完成と定着に当てることができる。また、本研究テーマによる調査を続行するなかで、はからずも従来まったく気付くことのなかった仏画における雲母使用の可能性が浮かび上がってきたことも、本研究の副産物である。もの問題については本研究の成果の一部として「光輝表現法の一異種-仏画における雲母使用-」という論文を『美術史学』27号に掲載予定である。
運動時の循環反応に関する研究―個人差に着眼した新たな研究法によるアプローチ―

平成29年度は、運動時の循環反応やその個人差に赤血球由来の局所性血管調節がどのように関与するか、また、持久的トレーニングにより高まる体力指標や循環調節機能の指標が循環反応の個人差とどのように関係するか検討することを目的とし、末梢部位への血管作動薬投与や各種運動モデルを用いた実験を行った。1.健康な若年男性6名を被験者とし、赤血球由来の血管拡張反応を模してアデノシン三リン酸(ATP)の大腿動脈投与を行い、運動時と同様の下肢血流量増加を引き起こした時の中心循環動態を調べた。その結果、ATP投与時には下肢血流量の増加の程度に依存して心拍出量が増加すること、また、この反応は左心室拡張末期容積の増加に伴う1回拍出量の増加によって起こること示された。このことから、赤血球由来の血管拡張反応による左心室充満血液量の変化は、運動中の心拍出量応答を決定する主な要因の一つである可能性が示唆された。2.鍛錬者と非鍛錬者を含む健康な若年男女30名を対象とし、静的ハンドグリップ運動を行ったときの循環反応の個人差と、全身持久力の指標(最大酸素摂取量)との関係性を調べた。その結果、ハンドグリップ運動中の循環反応の個人差は最大酸素摂取量との間に関係がみられなかったことから、本被験者集団における全身持久力の差は小筋群運動での循環反応の個人差の主な決定要因ではないことが示唆された。一方、動脈圧受容器反射機能(大腿部カフを用いて運動中に一過性の血圧低下を引き起こした際の循環反応により評価)との関係性も調べたところ、動脈圧受容器反射による心拍調節機能が高い者ほど心拍出量の増加が小さく、動脈圧受容器反射による血管調節機能が高い者ほど末梢血管抵抗が大きく増加するという関係性がみられた。このことから、運動中における動脈圧受容器反射機能の差は、運動に対する心拍出量や末梢血管抵抗の反応の個人差に関与することが示唆された。29年度が最終年度であるため、記入しない。各個人に最適な運動トレーニングを考える上で、運動に対する生体反応の個人差を深く理解することが重要であると考えられるが、運動時の循環反応の個人差についてはほとんど研究されておらず、明らかではない。本年度においては、動的運動時における血圧上昇要因(心拍出量および末梢血管抵抗の反応)の個人差の程度や、その個人差に関連するメカニズムを検討することを目的として実験を行った。これまでの研究において用いてきた静的運動から動的運動への発展を図るうえで、まずは運動様式の違いによる影響を明確にすることが重要な課題として挙げられたことから、同一筋群が動員されるが運動様式が異なるモデルである静的ハンドグリップ運動(HG)と動的HGを用いた実験を行った。健康な男女30名を被験者とし、最大発揮張力の50%での静的HGおよび動的HGをそれぞれ疲労困憊まで行うこととした。筋内代謝産物の蓄積を感知して交感神経活動亢進を引き起こす反射性循環調節(筋代謝受容器反射)の作用を調べるため、各HG後に前腕阻血を4分間行った。得られた主な結果は、1)静的HG時に心拍出量および総末梢血管抵抗が大きく増加する者ほど、動的HG時にもそれらが大きく増加するという関係性がみられたこと、また、2)筋代謝受容器反射に対して心拍出量および総末梢血管抵抗が大きく増加するものほど、静的HGおよび動的HGの疲労困憊付近においてそれらのパラメーターが大きく増加するという関係性がみられたことであった。これらの結果から、ハンドグリップ運動時における血圧上昇要因(心拍出量および末梢血管応答)は、その運動様式が異なる場合でも(静的vs.動的)同一個人内では同様となること、また、それらの運動の疲労困憊付近での血圧上昇要因の個人差には筋代謝受容器反射に対する反応の違いが関与することが示唆された。運動様式の違い(静的運動と動的運動)による影響を明確にすることの必要性から、これまで用いてきた実験モデル(静的ハンドグリップ運動)と活動部位が同一である動的ハンドグリップ運動を用いた実験となったが、同一個人内では運動中の血圧上昇要因が運動様式間で同様となることや、その個人差は筋代謝受容器反射に対する反応の違いと関連することを明らかにできたため。平成28年度は運動に対する筋血流反応に注目し、中心循環動態との関連性やそのメカニズムを検討することを目的として、活動筋血流量を非侵襲的に測定可能な運動モデルである動的膝伸展運動を用いた2つの実験を行った。1.健康な男女15名を被験者とし、直立座位での低強度の動的膝伸展運動の直後において、仰臥位へと姿勢を変化させ中心部の血液量を変化させたときの、心拍出量動態と下肢血流(活動筋血流)動態との関係を調べた。その結果、運動後の姿勢変化時に心拍出量が大きく増加する者ほど、下肢血流量も大きく増加するという関係性が見られた。このことから、少なくとも動的膝伸展運動直後に姿勢変化を行ったときの活動筋血流反応の差は心拍出量の反応と関連があることが示唆され、これには中心血液量の変化に応じて血管の調節を行う自律神経性のメカニズム(心肺圧受容器反射)が関与する可能性が示唆された。

2.低強度の動的膝伸展運動中に大腿カフにより活動筋血流量を通常運動時の70-80%程度にまで減少させ、この時に中心循環動態がどのような影響を受けるかを健康な男性3名において調べた(今後の追加実験により被験者数を増やす予定である)。その結果、運動中の活動筋血流量の減少により、(1)心拍出量と1回拍出量は低下するが心拍数は変化しないこと、また、(2)左心室の拡張末期容積は低下するが収縮末期容積は変化しないことが示された。なお、これらの反応には高い再現性が確認できている。これらの結果から、動的膝伸展運動中の活動筋血流動態は中心循環動態と関連し、活動筋血流量が減少すると心拍出量が減少すること、また、その心拍出量の減少は左心室充満血液量の減少に伴う1回拍出量の減少によって起こることが示唆された。このことから、動的運動中の活動筋血流反応の違いは、心拍出量の反応の程度を決定する要因の一つである可能性が示唆された。運動時の筋血流反応と中心循環反応との関連性やそのメカニズムに関する2つの実験を行い、追加実験により被験者数を増やすことが最終年度でもある平成29年度の課題として残ったもののほぼ予定通り進捗している。また平成29年度に向けての予備実験も順調に進んでいるため。平成29年度は、運動時の循環反応やその個人差に赤血球由来の局所性血管調節がどのように関与するか、また、持久的トレーニングにより高まる体力指標や循環調節機能の指標が循環反応の個人差とどのように関係するか検討することを目的とし、末梢部位への血管作動薬投与や各種運動モデルを用いた実験を行った。1.健康な若年男性6名を被験者とし、赤血球由来の血管拡張反応を模してアデノシン三リン酸(ATP)の大腿動脈投与を行い、運動時と同様の下肢血流量増加を引き起こした時の中心循環動態を調べた。その結果、ATP投与時には下肢血流量の増加の程度に依存して心拍出量が増加すること、また、この反応は左心室拡張末期容積の増加に伴う1回拍出量の増加によって起こること示された。このことから、赤血球由来の血管拡張反応による左心室充満血液量の変化は、運動中の心拍出量応答を決定する主な要因の一つである可能性が示唆された。2.鍛錬者と非鍛錬者を含む健康な若年男女30名を対象とし、静的ハンドグリップ運動を行ったときの循環反応の個人差と、全身持久力の指標(最大酸素摂取量)との関係性を調べた。その結果、ハンドグリップ運動中の循環反応の個人差は最大酸素摂取量との間に関係がみられなかったことから、本被験者集団における全身持久力の差は小筋群運動での循環反応の個人差の主な決定要因ではないことが示唆された。一方、動脈圧受容器反射機能(大腿部カフを用いて運動中に一過性の血圧低下を引き起こした際の循環反応により評価)との関係性も調べたところ、動脈圧受容器反射による心拍調節機能が高い者ほど心拍出量の増加が小さく、動脈圧受容器反射による血管調節機能が高い者ほど末梢血管抵抗が大きく増加するという関係性がみられた。このことから、運動中における動脈圧受容器反射機能の差は、運動に対する心拍出量や末梢血管抵抗の反応の個人差に関与することが示唆された。平成28年度では,9月頃から英国のブルネル大学において研究活動を行い、動的運動時における循環反応の個人差の程度やその成因についてさらなる検討を加える予定である。平成29年度は、英国のブルネル大学を主な拠点として研究活動を行い、運動時の循環反応の個人差に関連するメカニズムや運動トレーニングによる影響についてさらなる検討を加えるとともに、3年度分の実験データをとりまとめ、最終年度の成果発表を行う予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。
虚血心筋ターゲティング微小バブル超音波療法の確立:冠微小血管三次元構築への効果

虚血性心疾患患者の新規の非侵襲的治療法として超音波と微小バブルを用いた冠血管新生療法を目指すために本研究を行った。虚血領域の冠血管内皮に発現する標的蛋白に対する抗体を結合させた分子ターゲティング微小バブルを作成し、標的局所に集積した微小バブルを体外から非侵襲的に照射する超音波によってこれを破壊し、微小血管への機械的刺激がトリガーとなって冠血管新生・側副血行路発育が促進されるという作業仮説を立て、これを検証すべく研究をすすめた。対象は(心筋梗塞には至らない)反復的虚血刺激法により次第に心機能低下が進行する独自の慢性ラットモデルを用いた。本モデルの標的領域の標的局所の冠血管内皮には炎症性タンパクiNOS、MCP1、IL6などが発現していた。これらを標的とする抗体を結合させた微小バブルを作成し、これを本モデルに静注して経胸壁的超音波刺激で標的虚血領域に存在する微小バブルを破壊する刺激を繰り返した。その結果、我々の仮説に反して、いずれの抗体バブルの処理においても心機能低下予測回帰直線を改善しなかった。冠微小血管構造のイメージングそのものには成功したが、本モデルにおいてバブル/超音波治療による変化を見出す事は困難であった。微小バブルの作成を行う過程の中で、バブルのサイズのフィルタリングの必要性、標的抗体結合の確実性、バブルの局所への結合能力と集積密度の検討など、さらなる確認作業が必要であることが今後の課題として明らかとなった。また、摘出灌流心の実験系で観察された所見とは異なって、生体心では現在臨床利用可能な超音波エネルギーと周波数帯域の条件下では、おそらく減衰による効果の減弱が関与していると推測された。本研究は虚血性心疾患の治療戦略として微小バブルの超音波破壊刺激が有効であるか、動物実験により検証している。そのために、以下の項目について実験を遂行している。1)本研究室が独自に開発する虚血性心筋症の動物モデル(意識下反復的心筋虚血再灌流心)を確立する。2)静脈投与微小バブルに対して経胸壁的超音波刺激による心筋内バブル破壊刺激を行う方法論を確立する。3)心筋虚血領域に可及的微小バブルを集積させるために虚血領域冠血管内皮に発現する蛋白に対する抗体を修飾させた微小バブルを作成する。これらを統合して、虚血性心筋症の低下した心機能が虚血領域内微小バブル超音波破壊刺激によって改善しうるか、さらにこの時、冠微小血管の有効な再構築がおこるのかを検討することである。研究目的を達成するための平成18年度の研究計画は動物モデルの作成・プロトコール・パラメータの設定であった。このための6つの課題を遂行した。#1.反復心筋虚血刺激用バルーンオクルーダの植え込み術:ラットに施行するこの新技術は完成した。#2.虚血性心機能障害を誘発するプロトコールの選択:#1の結果、意識下で10分間虚血を繰り返すプロトコールと30分間虚血を繰り返す(48時間毎)プロトコールを行った。前者は途中で高率に心室細動により死亡するため続行を断念した。後者で検討をすすめた。#3.心機能の評価:#2の後者において心エコー図法により進行性の心機能低下を検証した。#4.冠側副血行路発育の評価:冠微小循環構築三次元イメージング:#2の心サンプルのマイクロCT撮像・解析を行い、冠微小血管の容量分画が減少すること確認した。#5.冠血管新生の評価:SPring8(2006B期課題番号2006B1495と2007A期課題番号2007A1748、共に研究代表者:豊田英嗣)にて心臓サンプルの放射光microCT撮像を行い

6ミクロンの分解能で冠微小循環を三次元画像化する方法論の確立を目指した。これまでに前例のない技術のため放射光撮像の条件設定からの検討となった。高分解能ゆえのサブミクロンオーダのサンプルのプレが画像の再構築に大きな支障を来す問題が明らかとなり、これを克服するためには十分な固定が必要であることが判明した。#6.心筋繊維化(梗塞巣)の評価:#2の心筋には不均一な線維化と残存心筋を呈した。これらより、現段階で最も有効と思われる動物モデルを完結したので論文(次項に示す)を発表した。平成19年度はこれにどのようなプロトコールの微小バブル超音波破壊治療が有効であるか否かを検討していく予定である。虚血性心疾患患者の新規の非侵襲的治療法として超音波と微小バブルを用いた冠血管新生療法を目指すために本研究を行った。虚血領域の冠血管内皮に発現する標的蛋白に対する抗体を結合させた分子ターゲティング微小バブルを作成し、標的局所に集積した微小バブルを体外から非侵襲的に照射する超音波によってこれを破壊し、微小血管への機械的刺激がトリガーとなって冠血管新生・側副血行路発育が促進されるといレう作業仮説を立て、これを検証すべく研究をすすめた。対象は(心筋梗塞には至らない)反復的虚血刺激法により次第に心機能低下が進行する独自の慢性ラットモデルを用いた。本モデルの標的領域の標的局所の冠血管内皮には炎症性タンパクiNOS、MCP1、IL6などが発現していた。これらを標的とする抗体を結合させた微小バブルを作成し、これを本モデルに静注して経胸壁的超音波刺激で標的虚血領域に存在する微小バブルを破壊する刺激を反復した。その結果、期待に反して、いずれの抗体バブルの処理においても心機能低下予測回帰直線を改善しなかった。冠微小血管構造のイメージングには成功したが、本モデルと治療による変化を見出す事は困難であった。微小バブルの作成を行う経過の中で、バブルのサイズのフィルタリングの必要性、標的抗体結合の確実性、バブルの局所への結合能力と集積密度の検討など、さらに確認作業が必要であることが今後の課題となった。また、摘出灌流心の実験系と異なって、生体心では現在利用可能な超音波エネルギーと周波数帯域の条件下では(おそらく減衰による)効果の減弱が関与している可能性が考えられた。
遺伝子の微生物生態系内水平伝播を利用した新規環境浄化技術に関する研究

細菌が持つ環境浄化に有効な遺伝子を、最近が本質的にもつ遺伝形質伝播機構を利用して汚染環境中の土着細菌群集に伝播させる「新規環境浄化法」開発のための基礎的知見の提供を目的に研究をおこない、以下のような知見を得ることができた。1.Bacillus属細菌がもつ有機水銀分解能をコードしている可動性遺伝子(トランスポゾン:TnMERI1)を対象に、TnMERI1の転移能力の検証をおこなった。その結果TnMERI1が実際に転移能力を有しており、伝達性プラスミドを介して細菌間で伝播されることを実験的に再現できた。またTnMERI1の転移は、紫外線照射やヒートショック等による細菌へのストレス付加に影響されにくい現象であることも分かった。これらの知見は論文としてまとめ、FEMS Microbiology Letters誌に発表した。2.上記TnMERI1様トランスポゾンを持つBacillus属細菌を、世界各地の土壌より発見する事ができた。さらに詳細な菌株の同定やトランスポゾン近辺の塩基配列解析をおこなった結果、TnMERI1様トランスポゾンを持つ同一菌株が広く世界中に拡散されている事がわかった。また自然環境中の細菌間では、TnMERI1様トランスポゾンが水平伝播され、拡散していることもわかった。以上の結果から、TnMERI1様トランスポゾンの水平伝播は世界中で起きている普遍的な現象であり、TnMERI1を有機水銀汚染環境の土着細菌に伝播させて、細菌による有機水銀汚染の浄化を促進させる事は、安全かつ有効な浄化方法であると考えられる。これらの知見は現在論文としてとりまとめており、成果の一部は2006年度の国際学会(国際微生物生態学会)にて発表予定である。有機水銀分解能のように細菌が本来的に持つ環境浄化に有効な遺伝子を、細菌の遺伝形質伝播機構を利用して汚染環境中の土着細菌群集に伝播させる新規環境浄化技術開発のための基盤提供を目的に、以下の点について検討を行った。1.細菌による細胞外DNAの取り込み(形質転換)は、原生動物による細菌の捕食活動によって抑制されることを、二生物培養系を用いて実験的に示した。このとき捕食による直接的な影響だけでなく、代謝産物を介した間接的な影響によっても形質転換が抑制されることを同時に明らかにした。生態系において生物間相互作用が遺伝子の水平伝播に関与しているかどうかについては、実験デザインが立てにくい事からこれまで明らかにされていなかったが、ここでは安定して形質転換が起こる実験系の確立に成功し、生物間相互作用の影響評価を可能にした。成果はFEMS Microbiology Ecology誌にて発表した。2.水環境中には生物の細胞外にもDNAが存在し、生態系における遺伝情報のプールとして注目されはじめている。しかし細胞外DNAの回収および定量には大量の水サンプルと一週間前後の日数を要するため、あまり研究が進んでいない。そこで感度の高い蛍光染色剤と遠心フィルターを用いた細胞外DNAの定量方法を検討し、一日でこれまでの1/10量の水サンプルから細胞外DNAの定量を可能にする方法を開発した。成果はAquatic Microbial Ecology誌にて発表した。3.水銀耐性能をコードしている可動性遺伝子(トランスポゾン: TnMERI1)に着目し、トランスポゾンが実際に転移能力を保持している事と伝達性プラスミドを介して細菌間で伝播されることを明らかにした。また次年度以降に生態系でのトランスポゾンの伝播現象を追跡するための、マーカー遺伝子を組み込んだミニトランスポゾンの検討と作製を行った。有機水銀分解能のように細菌が本来的に持つ環境浄化に有効な遺伝子を、細菌の遺伝形質伝播概構を利用して汚染環境中の土着細菌群集に伝播させる新規環境浄化技術開発のための基盤提供を目的に、以下の点について検討を行った.1.細菌細胞から細胞外へ放出されるDNAの質は、細菌の増殖状態によって大きく変化することを大腸菌を用いた実検より明らかにした.成果はFEMS MicrobiologyLetters誌にて発表した.2.細菌間で遺伝形質伝播がおこる野外環境としてアオコが発生する富栄養化水域を想定し、アオコ(Microcystis aeruginosa)が細菌間の接合による遺伝形貧伝播を高める事を実検的に示した.またアオコから出される代謝産物が、遺伝形質の伝播に関与していることも明らかにした.以上の事から富栄養化によるアオコの発生は、細菌間の遺伝子伝播を促進する副次的な効果も持つことが想定される.成果はFEMS Microbiology Ecology誌にて発表した。3.水銀耐性能をコードしている可動性遺伝子(トランスポゾン: TnMERI1)に着目したところ、世界各地より分離された菌株が同一のトランスボソンを保持していた事から、水銀耐性トランスポゾンが世界規模で拡散している可能性が考えられた.またこのトランスポゾンは実際に転移能力を持っている事.さらに伝達性プラスミドを介して細菌間で伝播されることを実験的に証明した.さらにトランスポゾンの転移は、紫外線照射やヒートショック等による細菌へのストレス付加に影響されにくい現象であることも分かった.成果の一部はFEMS Microbiology Ecology誌にて発表した。また本年度の学会(ISEB,日本微生物生態学会)においても得られた成果を発表した.細菌が持つ環境浄化に有効な遺伝子を、最近が本質的にもつ遺伝形質伝播機構を利用して汚染環境中の土着細菌群集に伝播させる「新規環境浄化法」開発のための基礎的知見の提供を目的に研究をおこない、以下のような知見を得ることができた。

1.Bacillus属細菌がもつ有機水銀分解能をコードしている可動性遺伝子(トランスポゾン:TnMERI1)を対象に、TnMERI1の転移能力の検証をおこなった。その結果TnMERI1が実際に転移能力を有しており、伝達性プラスミドを介して細菌間で伝播されることを実験的に再現できた。またTnMERI1の転移は、紫外線照射やヒートショック等による細菌へのストレス付加に影響されにくい現象であることも分かった。これらの知見は論文としてまとめ、FEMS Microbiology Letters誌に発表した。2.上記TnMERI1様トランスポゾンを持つBacillus属細菌を、世界各地の土壌より発見する事ができた。さらに詳細な菌株の同定やトランスポゾン近辺の塩基配列解析をおこなった結果、TnMERI1様トランスポゾンを持つ同一菌株が広く世界中に拡散されている事がわかった。また自然環境中の細菌間では、TnMERI1様トランスポゾンが水平伝播され、拡散していることもわかった。以上の結果から、TnMERI1様トランスポゾンの水平伝播は世界中で起きている普遍的な現象であり、TnMERI1を有機水銀汚染環境の土着細菌に伝播させて、細菌による有機水銀汚染の浄化を促進させる事は、安全かつ有効な浄化方法であると考えられる。これらの知見は現在論文としてとりまとめており、成果の一部は2006年度の国際学会(国際微生物生態学会)にて発表予定である。