hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
顔面骨格と顎運動パターンの発達に関する研究

研究の目的従来,顎運動は,咬合によって強く影響を受けると考えられてきた.しかし,研究代表者および研究分担者らのこれまでの研究によれば,顎運動はむしろ顔面骨格と密接な関連のあることが示唆されている.そこでこれを裏付けるために,顔面骨格と顎運動パターンの発達を幼稚園児から大学生まで横断的に解析し,各年齢群における両者の相互関係を比較してその推移を明らかにすることを目的とした.実施経過初年度は,ボランティア大学生100名について,顔面骨格の生体計測,顔面規格写真と咬合模型を採得し,新たに購入した顎運動解析装置を用いてチューインガム咀嚼時の顎運動を記録した.対象の一部については,咀嚼筋の筋電図も記録した.次年度は,上記データの解析を継続するかたわら,幼稚園児,小学生,中学生,高校生の集団について同様のデータを採得し,各年齢群ごとに解析し,顔面骨格と顎運動パターンの発達の推移を明らかにした.研究成果の一部は,関連学会に発表した.研究の目的従来,顎運動は,咬合によって強く影響を受けると考えられてきた.しかし,研究代表者および研究分担者らのこれまでの研究によれば,顎運動はむしろ顔面骨格と密接な関連のあることが示唆されている.そこでこれを裏付けるために,顔面骨格と顎運動パターンの発達を幼稚園児から大学生まで横断的に解析し,各年齢群における両者の相互関係を比較してその推移を明らかにすることを目的とした.実施経過初年度は,ボランティア大学生100名について,顔面骨格の生体計測,顔面規格写真と咬合模型を採得し,新たに購入した顎運動解析装置を用いてチューインガム咀嚼時の顎運動を記録した.対象の一部については,咀嚼筋の筋電図も記録した.次年度は,上記データの解析を継続するかたわら,幼稚園児,小学生,中学生,高校生の集団について同様のデータを採得し,各年齢群ごとに解析し,顔面骨格と顎運動パターンの発達の推移を明らかにした.研究成果の一部は,関連学会に発表した.本研究の目的は,顔面骨格と顎運動パターンの発達を横断的に解析し,各年齢群における両者の相互関係とその年齢推移を明らかにすることである.本年度は研究方法の確立を行った.大学生男子25名,女性25名の限界運動,ガム咀咽時の切歯の運動を記録した.また頭部X線規格写真を分析し,以下の結論を得た.1.正面像の開口路では中間型と非水平型が53.4%と43.9%,閉口路では中間型が86.8%,回転方向では順回転が66.4%と多かった.側面像の開口路は凹型が74.6%,閉口路では凸型が63.7%,回転方向は交叉回転が53.5%と多かった.定量的変数の平均値は垂直距離23.2mm,側方幅4.3mm,前後幅1.4mm,側方傾斜角9.9°,後方傾斜角16.6°であった.2.定性的変数による顎運動パターンには,側面像の開口路の形と正面像の回転が深く関与し,P13群に分類された.P1群は標準的な顎運動で,80%以上の者が側面像開口路は凹型優勢型,正面像回転方向は順回転優勢型であった.P2群は側面像開口路,P3群は正面像回転方向において優勢な形と回転がなく,混在型であった.3.定量的変数による顎運動パターンには開閉口路の垂直距離,側方幅,後方傾斜角が深く関与し,M13群に分類された.M1群は標準的,M2群は開閉口路の側方幅が狭くて後方傾斜角が大きく,M3群は開閉口路の垂直距離と後方傾斜角が小さかった.4.定性的変数による顎運動パターンと顎顔面形態の関連では,P3群は他の2群に比べて下顎枝が前傾し,下顎骨は前方位でOverjetが小さかった.5.定量的変数による顎運動パターンと顎顔面形態の関連では,M2群はSkeletal class III open biteで顔面,歯列幅径は小さく,正常咬合,上顎前突が少なく,反射咬合,前歯部開咬,臼歯部交叉咬合の者が多かった.M3群はSkeletal deep biteで,顔面,歯列幅径が大きかった.研究の目的従来,顎運動は,咬合によって強く影響を受けると考えられてきた.しかし,研究代表者および研究分担者らのこれまでの研究によれば,顎運動はむしろ顔面骨格と密接な関連のあることが示唆されている.そこでこれを裏付けるために,顔面骨格と顎運動パターンの発達を幼稚園児から大学生まで横断的に解析し,各年齢群における両者の相互関係を比較してその推移を明らかにすることを目的とした.実施経過初年度は,ボランティア大学生100名について,顔面骨格の生体計測,顔面規格写真と咬合模型を採取し,新たに購入した顎運動解析装置を用いてチューインガム咀嚼時の顎運動を記録した.対象の一部については,咀嚼筋の筋電図も記録した.次年度は,上記データの解析を継続するかたわら,幼稚園児,小学生,中学生,高校生の集団について同様のデータを採取し,各年齢群ごとに解析し,顔面骨格と顎運動パターンの発達の推移を明らかにした.研究成果の一部は,関連学会に発表した.
生体構成アミノ酸を骨格にもつモノマーの象牙質接着への応用とそのメカニズムの解析

本研究では、生体組織の構成単位であるアミノ酸を骨格とする分子構造の異なる数種のモノマーを新規に合成して、歯牙硬組織へのレジン系材料の接着促進効果を調べ、接着有効性と分子構造との関連を検討した。まず、アスパラギン酸とアクリルクロライドからN-acryloyl aspartic acid(N-AAsp)を合成した。N-AAspは水に25wt%まで溶解し、この水溶液をセルフエッチングプライマーとして使用したところ、20wt%水溶液が象牙質、エナメル質へのレジンの接着に有用で、引張り接着強さはともに16MPaを示した。次で、カルボキシル基を1つもつグリシンのアクリルモノマー(N-acryloy Glycine ; N-AGly)とカルボキシル基を2つもつN-AAspとで象牙質接着有効性を検討したところ、N-AAspはN-AGlyよりも有意に接着に有効であった。これは、セルフエッチングプライマーは酸性であることが必要であるが、カルボキシル基を2つもつモノマーは解離していないカルボキシル基が存在する確立が1つしかもたないモノマーに比べて高く、それによってコラーゲンと相互作用を示す可能性が考えられた。さらに、N-AAspと同じく2つのカルボキシル基を有するが主鎖の構造は同じで側鎖の構造のみ異なるN-acryloyl Glutamic acid(N-AGlu)を合成し,N-AAspと象牙質接着効果を比較検討した。その結果,研削象牙質への接着強さでは,N-AGlu処理は効果がなく,N-AAsp処理は効果が認められた。一方,スミヤー層除去後にN-AGlu処理するとN-AAsp処理と同等の効果があった。以上より研削象牙質では、カルボキシル基が1つのN-AGlyよりも2つ有するN-AAspの方が、また2つ有してもpKaが低く解離しやすいN-AAspが有利であるが,ある程度の脱灰前処理を行えば、コラーゲンとの相互作用に寄与する非解離状態のカルボキシル基が存在しやすいN-AGluが有利となると考えられた。本研究より、これらのアミノ酸骨格モノマーは象牙質と合成有機高分子材料との接合材としての機能発揮が期待できることおよびカルボキシル基を2つもち、その解離のバランスが歯質接着性の発現に重要であることが示唆された。本年度は、2つのカルボキシル基を有し主鎖の構造は同じで側鎖の構造のみ異なる2種のアミノ酸誘導体モノマー,N-acryloyl aspartic acid(AAsp)およびN-acryloyl Glutamic acid(AGlu)を合成し,その水溶液をセルフエッチングプライマーとして象牙質に作用させ,これらのモノマーの分子構造と歯質接着性との関連について検討した。合成したアミノ酸誘導体の化学構造はFT-IR,^<13>C-NMRおよびCHN測定で確認した。また,NMRでこれらのモノマー構造中のカルボキシル基の化学シフトを測定し,pH-

化学シフト曲線からpKaを求めたところ,両者の主鎖でのpKaは3.67と同じだったが,側鎖カルボキシル基のpKaは異なりAGluではpKa=4.53でAAsp(pKa=4.19)より解離しにくい状態であった。次に,モノマーを1.1m mol/Lの濃度で蒸留水に溶解して研削牛歯象牙質を処理し,市販ボンディング材を併用して修復用レジンとの接着強さを測定した。また,象牙質を前もってEDTA処理した場合の接着強さも測定した。その結果,研削象牙質への接着強さでは,AGlu処理は効果がなく,AAsp処理はEDTA処理や無処理より有意に高かった。一方,EDTAでスミヤー層除去後にAGlu処理すると無処理,EDTA,AGlu単独処理と比べ有意に高くなり,その値はAAsp処理よりも高かった。両者のモノマーで研削およびEDTA処理象牙質に対する接着性能の傾向が異なったが,これは研削象牙質ではスミヤー層を除去しなければモノマーが浸透しコラーゲンとの相互作用が発現できないため,酸性度の高いAAspが有利であるが,EDTAでスミヤー層が除去されれば,コラーゲンとの相互作用に寄与する非解離状態のカルボキシル基が存在しやすいAGluが有利となるためと考えられた本研究では、生体構成単位であるアミノ酸を骨格とする分子構造の異なる数種のモノマーを新規合成して、その水溶液をセルフエッチングプライマーとして象牙質に作用させコンポジットレジンとの接着強さを調べ、モノマーの分子構造と象牙質接着性との関連を検討した。まず、カルボキシル基を1つもつグリシンのアクリルモノマー(N-acryloy Glycine ; AGly)およびカルボキシル基を2つもつアスパラギン酸モノマー(N-acryloyl aspartic acid ; AAsp)を合成し象牙質接着性能を調べたところ、象牙質接着界面の形態学的観察では差は認められず両者の象牙質脱灰能はほぼ同等と考えられるものの、N-AAspはN-AGlyよりも高い接着性能を示した。これは、カルボキシル基は水中で解離して酸性を示すが、過去の報告にあるように非解離カルボキシル基が象牙質のコラーゲンと相互作用するため、カルボキシル基を複数もつAAspが有利であると考えられた。次いで、AAspと同じく2つのカルボキシル基をもち主鎖の構造は同じで側鎖の構造のみ異なるN-acryloyl Glutamic acid (AGlu)を合成し、AAspと接着効果を比較した。その結果、研削象牙質への接着強さではAGlu処理は効果がなく、AAsp処理は効果を認めた。一方、スミヤー層除去後にAGlu処理するとAAsp処理と同等の効果があった。以上より研削象牙質では、カルボキシル基を2つ有してもpKaが低く解離しやすい構造のものが有利であるが、前処理としてある程度の脱灰を行えば非解離状態のカルボキシル基が存在しやすい構造が有利となると考えられた。本研究より、これらのアミノ酸骨格モノマーは象牙質とレジンとの接合材としての機能発揮が期待できることおよびカルボキシル基を2つもち、その解離のバランスが歯質接着性の発現に重要であることが示唆された。
軟骨肉腫に対する自殺遺伝子を用いた遺伝子治療の研究

軟骨肉瞳の培養細胞株あるHCS-TGにたいして、ヘルペスのチミジンキナーゼ遺伝子(HSV-tk)を挿入したレトロウイルスベクターを用いて遺伝子導入した。それらの細胞を用いて以下の検討を行った。3次元培養はCellmatrix Type1-Aを用いたコラーゲン・ゲル包埋培養法を用いて培養を行った。1.抗ウイルス薬であるガンシクロビール(GCV)を各濃度で作用させその殺細胞効果をMTT溶液を加えcell countを行い検討した。2.コントロールとしてβガラクトシダーゼ遺伝子(lacZ)を導入した軟骨肉腫細胞を用意した。その発現を見るために、X-gal染色を行った。それらを用いてbystander effectの検討を行った。HSV-tk遺伝子、lacZ遺伝子の導入された軟骨肉腫を1:0,5:1,2:1,1:1,1:2,1:5,1:10の割合でコラーゲン・ゲル包埋培養法を用いて共培養し10日間GCVを投与した。全細胞数に対しての致死割合を用いてその効果を判定した。3.サイトカインの影響をみるために、IGF 10ng/mlの存在下でbystander effectの検討を行った。GCVの濃度が1μMで97%の殺細胞効果が認められ、10μMでは99%の殺細胞効果が認められた。bystander effectの検討では、1:5までの割合ではその80%以上の細胞に細胞死が認められた。3.2次元、3次元の培養でも85%以上の効率で細胞死が認められた。また、TNFを用いた実験において、オクタノールを用いたところ、gap jurctionはブロックされるも、約50%の割合で、bystander effectを認められた。
大動脈解離の革新的な治療法開発：mTOR経路を標的とした病態制御戦略

大動脈解離研究を発展させるため、再現性の高いマウスモデルを開発した。このモデルにおいて様々な分子介入を加え、ベイジアン・ネットワーク解析を行った結果、約850遺伝子からなる解離関連遺伝子ネットワークが得られた。密接に関連して制御される遺伝子群の発現クラスターがさらにネットワークを形成しており、各発現クラスターは細胞周期、炎症応答、細胞遊走、細胞サイズ、細胞外マトリックス、筋細胞分化制御に関わる遺伝子群で構成されていた。解離易発症性であるヒト大動脈2尖弁患者の大動脈における遺伝子発現を正常3尖弁の大動脈と比較した。解離易発症大動脈ではチロシンキナーゼ/mTOR経路活性化を示唆する遺伝子発現パターンが認められた。正常大動脈ではmTOR経路の主要分子AKTの活性化は認められなかったが、解離易発症大動脈では中膜外側でAKTが活性化していた。マウス解離モデルにmTOR複合体1 (TORC1)の阻害薬ラパマイシンを投与したところ、解離発症は完全に抑制され、細胞周期遺伝子群の発現クラスターが選択的に抑制された。解離発症後のラパマイシン投与では大動脈壁破壊は抑制された。これまでに我々が同定した解離関連シグナル経路(JNK、JAK/STAT、TGFβ/Smad、サイクリン/CDK)の活性を検討したところ、ラパマイシンはサイクリン/CDKを選択に抑制し、平滑筋細胞選択的にJAK/STAT経路を活性化した。以前我々は平滑筋STAT経路が大動脈保護的に働くことを明らかにしており、その活性化がラパマイシンによる大動脈解離阻止メカニズムに一つであることが示唆された。以上より、mTOR経路(TORC1)は解離発症および破壊進行の双方で重要な役割を果たしており、その阻害は細胞周期抑制と平滑筋保護メカニズム活性化により解離を阻止することが示された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。大動脈解離は致死的な成人大動脈疾患であり、中高年男性に好発し突然死を来すため社会的影響が大きい。解離の分子病態は不明で、発症を予測することはできない。一旦発症すると安静と降圧以外の内科的治療法はない。スタンフォードA型では外科手術が行われるが、多くは遠位部解離が残存する。A型術後およびB型のいずれでも、解離大動脈壁の破壊進行による合併症が予後を増悪させるが、積極的な治療法はない。この現状を打開するためには、大動脈解離の発症と進行を再現する動物モデルが必要である。申請者らは、野生型マウスにエラスチン・コラーゲン架橋阻害薬(BAPN)とアンジオテンシンII(AngII)を投与することにより、解離を発症し2週間の経過で進行増悪するモデルを開発した。解離モデルの解析から、解離発症前の大動脈壁ではIGF-1およびAktが活性化することが示された。IGF-1/Akt下流のmTOR系は栄養状態とエネルギー代謝を感知し、タンパク代謝調節を介して細胞形質を制御する分子経路である。驚くべきことに、選択的mTOR阻害薬ラパマイシンは大動脈解離を完全に阻止した。本研究では、βアミノプロピオニトリル(BAPN)とアンジオテンシンIIを持続的に投与し、2週間の経過で解離を発症するマウスモデルにおいて発症経過の詳細な分子解析を実施した。また、解離病態の中心と目される炎症病態について、ヒト大動脈解離組織において蛍光免疫染色と定量的細胞画像解析手法により検討した。本研究では、発症時におけるmTOR系の役割解明により病態の本質に迫る。mTOR系の制御機構を解明することで、より有効で副作用が少ない治療戦略の開発を可能にする。既に多くのmTOR作動薬が臨床で使用中または開発中であり、mTOR系への介入による大動脈壁安定化など革新的な治療法への発展が期待される。マウス解離モデルにおいて、発症に先立って起こる1,221遺伝子の発現変化について、トランスクリプトーム解析データからベイジアンネットワークに基づく発現制御ネットワークを同定した。ネットワークでは細胞周期、炎症関連、細胞遊走、筋細胞分化に関わる遺伝子群が、それぞれ発現クラスターを形成することを見出した。解離刺激は細胞周期、炎症関連遺伝子発現を促進し、細胞遊走、筋細胞分化に関わる遺伝子群を抑制した。mTOR阻害薬であるラパマイシンは細胞周期関連遺伝子群の増加を抑制し細胞遊走、筋細胞分化関連遺伝子をさらに抑制する一方、炎症応答には大きな影響を与えなかった。ヒト解離組織において、炎症応答を司るNFkBとSTAT3の活性を定量的細胞画像解析手法により検討した。NFkBは解離の有無にかかわらず内膜側で高い活性を示したが、STAT3は解離部と非解離部の境界領域におてい外膜側で高い活性を示した。そのため、NFkB活性とSTAT3活性の双方が高い細胞は中膜外側に多く認められた。偽腔開存型(偽腔内に血栓を認めない)組織では特に中膜のNFkB/STAT3活性が高かった。近年、NFkBとSTAT3が相互に活性化するポジティブ・フィードバック機構である「炎症アンプ」の概念が提唱されている。偽腔開存型解離では炎症アンプの作用で過剰な炎症応答が惹起されることが示唆された。マウスモデルにおいてラパマイシンの前投与は大動脈解離の発症を完全に阻止した。さらに、大動脈壁の脆弱性が既に惹起された後からラパマイシンを投与すると解離の進展は抑制された。

このことから、mTOR経路は解離の発症および進展のいずれでも重要な役割を果たすことが示された。マウス解離モデルにおいて、解離発症に際して発現が変化する遺伝子について発現制御ネットワークを同定した。ネットワークでは細胞周期、炎症関連、細胞遊走、筋細胞分化に関わる遺伝子群が、それぞれ発現クラスターを形成することを見出した。解離刺激は細胞周期、炎症関連遺伝子発現を促進し、細胞遊走、筋細胞分化に関わる遺伝子群を抑制した。mTOR阻害薬であるラパマイシンは細胞周期関連遺伝子群の増加を抑制し細胞遊走、筋細胞分化関連遺伝子をさらに抑制する一方、炎症応答には大きな影響を与えなかった。解離病態におけるmTOR経路の役割をさらに明らかにするために、大動脈サンプルのウェスタンブロットによりタンパクレベルの発現解析を行った。解離刺激は、細胞周期を司るG1サイクリン(Cyclin D3)の発現、炎症制御因子JnkおよびStat3の活性、細胞外マトリックスおよび平滑筋細胞文化を制御するSmad2の活性、そしてmTORの活性を亢進させた。ラパマイシンは解離刺激によるCyclin D3発現およびmTOR活性化を抑制したが、炎症経路であるJnk活性を抑制しなかった。興味深いことにStat3活性はラパマイシン投与でさらに亢進した。平滑筋細胞分化マーカーであるミオシン重鎖アイソフォームSM2の発現は解離刺激では明らかな変化を示さなかったがラパマイシンで増加し、mTOR経路が平滑筋分化に関与することを示唆した。計画に沿ってmTORを中心とする解離病態の解明を進めた。mTORが解離発症に果たす役割とともに大動脈壁の破壊進展に果たす役割を検討し、発症、進展双方に関与することを明らかにした。mTORによる解離病態制御を遺伝子発現ネットワークの観点から解析し、病態に関与する発現モジュールを同定した。さらにタンパク発現の双方から検討し、遺伝子発現ネットワークから得られた結論を支持するデータを得た。マウス解離モデルにおけるトランスクリプトーム・ネットワーク解析の結果は、細胞増殖、筋肉細胞分化が解離病態の根幹であるという予想外の可能性を示唆する。タンパク発現解析もこのトランスクリプトーム解析の解釈を支持する結果を示した。これらのデータから、炎症を中心とする現在の解離病態理解のパラダイムを変える可能性がある重要な知見が得られた。大動脈解離研究を発展させるため、再現性の高いマウスモデルを開発した。このモデルにおいて様々な分子介入を加え、ベイジアン・ネットワーク解析を行った結果、約850遺伝子からなる解離関連遺伝子ネットワークが得られた。密接に関連して制御される遺伝子群の発現クラスターがさらにネットワークを形成しており、各発現クラスターは細胞周期、炎症応答、細胞遊走、細胞サイズ、細胞外マトリックス、筋細胞分化制御に関わる遺伝子群で構成されていた。解離易発症性であるヒト大動脈2尖弁患者の大動脈における遺伝子発現を正常3尖弁の大動脈と比較した。解離易発症大動脈ではチロシンキナーゼ/mTOR経路活性化を示唆する遺伝子発現パターンが認められた。正常大動脈ではmTOR経路の主要分子AKTの活性化は認められなかったが、解離易発症大動脈では中膜外側でAKTが活性化していた。
EBNに基づくメタボリックシンドローム改善のための新栄養教育法の効果の評価

無作為化比較試験に基づくメタボリックシンドローム(MetS)のための食事をベースにした生活習慣改善プログラム(PSMetS)の効果の評価を目的とした。研究仮説はMetSおよび同予備群を対象としたPSMetSに基づく介入群は、対照群に比べ1年後における生活習慣病リスク要因の個数が1つ以上減少する者の割合が高いとした。これに基づいて研究プロトコルを策定した。目標症例数180名に対し2013年3月現在、登録者は166名(男性2564歳)である。本対象のベースライン調査結果の分析を行った。1.研究目的特定検診受診者における保健指導レベルの分布状況を調査し、(1)メタボリックシンドローム(以後、MetSと記載)改善のための栄養教育プログラムの開発、(2)無作為化比較試験(以後RCT)に基づく栄養教育効果の評価のための研究プロトコル作成とした。2.研究方法:2007年、職域健診受診者男性1983名(2474歳)、女性664名(2474歳)を対象に、MetS診断基準(厚生労働省)に基づき保健指導レベルの分布を検討した。3.研究結果(1)保健指導レベル分布状況:40歳以上75歳未満での男性(n=1766)のうち、積極的支援該当者446名(25.3%)、動機付け支援該当者262名(14.8%)情報提供支援該当者196名(11.1%)、女性は同20名(3.5%)、35名(6.1%)、24名(4.2%)であった。(2)栄養教育プログラム:食物摂取頻度調査票(FFQW82)を用い、MetSのための個別支援栄養教育法(以後、PSMetSと記載)を管理栄養士が6ヶ月間に面接2回と電話支援4回を行い、9ヶ月目に電話支援を行う方式である。(3)研究プロトコル:(1)研究デザイン:PSMetSに基づく介入群と対照群の栄養教育法の評価を非盲検並行群間無作為化比較試験に基づいて行う介入研究である。(2)研究仮説:PSMetSに基づく介入群は対照群に比べ、生活習慣病リスク要因の個数が1つ以上減少する者の割合が高いである。(3)登録者の割付;無作為化割付試験に基づき登録者から順次、予定登録看総数(180人)とし、健診順に積極的、動機付け支援群別に介入群と対照群に割り付ける。4.考察欧米ではRCTに基づくMetSの改善効果が報告(Weiss, 2006)されており、EBNの観点から介入研究で実証的に栄養教育効果の評価を検討することは重要である。研究デザイン本研究はMetS、同予備群改善のためのPSMetSに基づく介入群と対照群という2つの介入方法の評価を、非盲検並行群間無作為化比較試験に基づいて行う介入研究である。研究仮説MetSおよび同予備群を対象としたPSMetSに基づく介入群は、対照群に比べ、厚労省(確定版,2007)に示す生活習慣病リスク要因の個数が1つ以上減少する者の割合が高い。生活習慣改善教育前調査(1)同意書、(2)臨床検査結果表、(3)FFQW82、(4)特定健診問診票、(5)意識・行動に関するステージチェック票。研究対象選択基準;同意取得時の年齢2564歳の男性。特定健診受診者で積極的・動機づけ支援者。除外基準1)同意なしの者。2)冠動脈性疾患発症者。3)糖尿病等で服薬を新たに服用3ヶ月未満者。4)臨床データ無き者。5)FFQW82回答無き者。登録者割り付け:登録者から順次、層別(積極的支援群、動機付け支援群の2層)の置換ブロック法による無作為割付を行う。予定登録者総数(180人)。試験アウトライン:研究対象者の研究参加予定期間は1年間とする。管理栄養士が6ヶ月間に面接2回と電話支援6回を行い、初回面談時より9ヶ月目にフォローアップの電話支援を行う方式である。研究結果無作為化比較試験に基づくメタボリックシンドロームのための生活習慣改善プログラム効果の評価に関する研究プロトコルを確定した。現在、研究対象者の選択基準に該当する特定健診受診者を順次、登録中である。(昭和女子大学倫理委員会認証番号:08-02)。本研究は、無作為化比較試験に基づくメタボリックシンドローム、同予備群を対象に、各対象が保有する生活習慣病のリスク要因の数を減少させるための同プログラム効果の評価を目的とした。

本研究デザインはメタボ及び同予備群改善のための同プログラムの介入効果を介入群、対照群の2種類の評価を非盲検並行群間無作為化比較試験に基づき評価する介入研究である。研究仮説はメタボおよび同予備群を対象とした同プログラムに基づく介入群は、対照群に比べ、厚労省(確定版,2007)に示す生活習慣病リスク要因の個数(リスク個数)が1つ以上減少する者の割合が高い、とした。研究対象は選択基準に基づき選択し、目標症例数180人とした。介入試験アウトラインは、研究対象者の研究参加予定期間は1年間。管理栄養士が6ヶ月間に面接2回と電話支援6回を行い、初回面談時より9ヶ月目にフォローアップの電話支援を行う方式である。平成24年度3月時点での研究対象者は目標症例数180名に対し、登録者は167名(積極的支援群:112名、動機づけ支援群55名)であり、残る13名の登録も予定されている。以上のように、当該年度の研究成果は、研究プロトコル、メタボリックシンドローム(メタボ)改善のための生活習慣改善プログラムを確定し、研究対象の登録者順に保健指導を逐次遂行し、保健指導経過を含むデータベースを作成した。内外において、リスク要因が複合しているメタボへの介入効果の評価は確立していない。さらに、無作為化試験に基づく介入研究で実証的に生活習慣改善教育そのものの評価を検討したものは殆ど無く、科学的根拠に基づいた効果的な生活習慣改善プログラムの確立とその評価法の研究は、わが国の生活習慣病蔓延に対し意義があり、極めて重要である。(昭和女子大学倫理委員会認証番号:08-02, UMIN R000010061)24年度が最終年度であるため、記入しない。24年度が最終年度であるため、記入しない。
アンチセンスによる白血病細胞の増殖抑制

白血病の治療は数種類の抗腫瘍剤を組み合わせた多剤併用療法が主体である。しかしながらこれらの抗腫瘍剤は副作用が強力で、しばしば治療を中断しなければならないこともあるほどである。アンチセンス法は癌特異的な抗腫瘍効果と分化誘導効果が期待できるため、今後の発展が望まれる治療法である。今回、まず癌遺伝子のうちc-mycに対するアンチセンスオリゴマー(5′d(AAC-GTTGAGGGGCAT)3′)を合成した。さらにコントロールとして(5′d(TTGGGATAA-CACTTA)3′の2種類のオリゴマーを合成した。これらを培養中の白血病細胞株(HL-60)に作用させ、その効果を見た。c-mycがコードしているp65蛋白の合成をウェスタンブロッティング法にて確認したところ、コントロールオリゴマーでは蛋白合成に何らの作用も及ぼさなかったが、アンチセンスオリゴマーではp65蛋白の合成低下が見られた。アンチセンスオリゴマーの濃度が10muMのときおおよそp65蛋白合成が半減した。一方、アンチセンスオリゴマー存在下でのHL-60細胞の増殖は濃度依存的に抑制され、10muMのアンチセンスオリゴマー存在下で増殖も約50%抑制された。これらの増殖抑制効果は、コントロールオリゴマーでは見られなかった。このように、アンチセンスオリゴマーは白血病細胞の増殖を抑制することがわかった。今回、実際の白血病患者より得られた癌細胞を用いて、アンチセンス遺伝子の効果を検討するまでは至らなかったが、急性、慢性骨髄性白血病などの遺伝子異常が見られる細胞や、成人T細胞性白血病、多発性骨髄腫などその増殖に関与するサイトカインが知られている細胞に対しては有効な結果が期待できると思われる。
新しいスパッタ堆積モードによる強誘電体(PZT)薄膜の低温形成とその機構解明

同位体酸素(^<18>O_2)ガスを用いてPZT(Pb(Zr,Ti)O_3)薄膜を作製し,膜に含まれる酸素の質量をSIMSを用いて測定ることにより膜中酸素の起源を調べた.金属モードでPZT薄膜を作製すると,膜中酸素のうち90%はPbOからきた酸素であり,残り10%が流した酸素ガスからきたものであることが判明した.従って,この場合PbOが主要な酸素源ということになる.一方酸化物モードの場,合PbOから供給される酸素は30%であり,流した酸素ガスが主要な酸素源であることをはじめて明らかにした.つぎに、PbのZr+Tiに対する比率の定量的検討を行ったところその比率が3以上のときペロブスカイト構造になりやすいことが判明した。この結果は、ちょうどPZTの化学量論比を満足するようにPbOから酸素が供給されたときペロブスカイト構造が生じたと理解される。Pbの蒸気圧が高く、単にそれを補うために過剰なPbOが必要なのではない。これは新しい着眼点であるといえる。最後に本研究では、得られた結果を基に、準金属モードスパッタ堆積におけるターゲットの設計指針を与えいる。平成9年度は,同位体酸素(^<18>O_2)ガスを用いてPZT薄膜を作製し,膜に含まれる酸素の質量をSIMSを用いて調べた.酸素ガス流量2.1%と14%の2種類のPZT膜を作製し比較した.2.1%の場合Zr-Tiターゲット表面は酸化せず,金属原子がスパッタされ基板表面へ供給され(金属モード),14%の場合酸化が起こり(酸化物モード)金属酸化物が供給されることになる.この実験の結果,金属モードでPZT薄膜を作製すると,膜中酸素のうち90%はPbOからきた酸素であり,残り10%が流した酸素ガスからきたものであることが判明した.従って,この場合PbOが主要な酸素源ということになる.ここで酸素の輸送のされ方には2通りあると考えられる.すなわち,PbOがスパッタされるときに,PbとOに分離して原子状酸素の形で供給される場合と,PbO分子でスパッタされ基板に到達し,PbOはTiおよびZr金属に還元され,Pbは蒸発するという2通りが考えられる.現状ではこの過程のどちらであるかは分かっていない.今後解明すべき課題である.一方酸化物モードの場,合PbOから供給される酸素は30%であり,流した酸素ガスが主要な酸素源であった.酸化したターゲット表面からTiO_2やZrO_2の形で基板表面に供給され膜形成が起こっていると考えられる.以上のように,スパッタリングのモードの違いにより酸素の起源が異なることが明らかとなった.さらに,この酸素の起源の違いは,結晶性の違いにも影響を与えていると考えられる.この現象は新しい酸素の供給法に応用できると期待される.平成10年度は、本研究で提案している準金属モードというこれまでにない新しいスパッタ堆積モードによるPb(Zr,Ti)O3(PZT)薄膜の成長機構についてさらに詳しく調べた。まず、どのような条件のときペロブスカイト型の結晶構造が現れるであろうかということを探った。それによると、一つの重要な帰結として、Pbが過剰に供給される必要があるという事実が浮かび上がった。通常Pbは蒸気圧が高く、成長膜表面から蒸発しやすいので過剰に供給する必要があるというのが一般的な理解である。ところが、PbのZr+Tiに対する比率の定量的検討を行ったところその比率が3以上のときペロブスカイト構造になりやすいことが判明した。この結果に対次のような見解を持つことができる。すなわちPZTの化学量論比を考えるとPbはZr+Tiの量に対し等量であればよいが、Oに着目するとそれは3倍の量が必要となる。従って、丁度化学量論比を満足するようにPbOからOが供給されたときペロブスカイト構造が生じた。さらに、この結果は、昨年度行った同位体酸素を用いたPZT膜中の酸素の起源の結果とよく符合している。
環境圧力の変化を受ける生体組織中の気泡生成と気泡塞栓に関する研究

環境の圧力変化を受ける生体組織中においては、しばしば気泡が発生し、気泡塞栓症の要因となる。本研究では、潜水病などの減圧症及び人工弁装着者の合併症(塞栓症)等に関わる流体力学的解明を目的とし、実験的研究を行った。(1)管内径1.15mmの細管中を過飽和ガス(酸素、二酸化炭素、ヘリウム)が溶解した液体が流動する際には、気泡サイズ0.06mm0.84mmの気泡が発生し、気泡の連鎖的流れ、合体現象なども生ずる。これらの気泡流動は細動静脈の閉塞を誘発する要因になるものと考えられた。二酸化炭素が溶解した液体中においては、酸素、ヘリウムに比べて、発生する気泡の大きさ、気泡数は大となる。(2)擬似筋肉モデル及び擬似脂肪モデルなどの生体軟組織中においても、高圧ガス環境下においては気泡が生成される。擬似脂肪モデル中においては二酸化炭素気泡が発生しやすく、擬似筋肉モデル中ではヘリウム気泡の数密度が高値を示す。(3)人工弁周りの高速拍動流れに伴ってキャビテーション現象が発生することが明らかにされた。大動脈弁及び僧帽弁の閉鎖時には弁背後に爆発的にキャビティが発生する。気泡の大きさ0.2mm0.5mmであり、人工弁近傍の気泡移動速度は0.46m/s01.2m/sである。これらの微細気泡は、気泡塞栓症、HITSなどの要因になり得るものと考えられた。潜水病、潜函病に代表される減圧症は、高圧環境下から常圧に戻る際、高圧下の生体組織中で溶解した呼吸器系ガスが環境圧の低下により気泡化し、血液循環系の閉塞する疾病とされている。しかし、これまで、減圧症への対応は対症療法が中心であり、その根源的な究明が期待されている。本研究は、減圧症発生機構を流体力学的に解明することを目的としている。始めに、既設の高液圧・ガス過飽和液体作成装置に、2つのローラーポンプ、管内オリフィス、分岐管等を取り付けた流動型試験装置を作成した。次に、水道水に、高圧供試ガスとしてヘリウムを溶解させたガス過飽和液体を作成した。この液体が管内オリフィスを流動する際に発生する気液二相流を管内径0.46mmの細管に分岐し、流動する気泡の運動を、高速ビデオカメラにて観察、解析を行った。実験条件としては、ガス加圧力は0.53.5MPa、オリフィス部の平均流速は0.311.45m/s、細管内の平均流速は0.10.64m/sである。本実験より、以下のことが明らかにされた。(1)細管内におけるヘリウムガス過飽和液流中では、0.10.84mmの微細な気泡が観察される。ガス加圧力が増加するほど、気泡サイズが大きくなり、流動する気泡数も増加傾向を示す。(2)管内径より大きい気泡は、流動抵抗および気泡後端に剥離を伴った流れが生ずるため、気泡流動速度が減じ、管内平均液流速の約40%程度となる。(3)高ガス加圧力の条件下では、ヘリウムガス気泡の合体現象や複数気泡の連鎖的挙動が観察され、血管塞栓の原因となり得る。潜水病および潜函病に代表される減圧症の発生機序を解明するために、ヒト血管モデル(内径0.46mm,1.15mm)を測定部とするガス過飽和液体流動装置を用いて、高速ビデオによる生成気泡の観察、計測を行った。その結果、以下のことが明らかにされた。(1)ヘリウム、酸素および二酸化炭素が溶存する細管内液流中においては、2個乃至数個の気泡が連なった現象および気泡の合体等、非定常性の強い気泡流動現象が生ずる。(2)細管内で観察される気泡の大きさおよび気泡数は、二酸化炭素の場合が最も大きく、次いで、酸素、ヘリウムの順になる。

(3)細管内で観察される0.1mm以上の気泡は、細動静脈を閉塞する要因となる。管内における気泡の連鎖的流動や気泡の合体は血管閉塞の要因となる。(4)ヘリウムは、酸素、二酸化炭素と比べて、潜水時の呼吸器系ガスとして安全性が高い。人工弁近傍で発生する気泡と気泡塞栓症、HITSとの関係を明らかにすることを目的として、SJM人工弁を測定部とする拍動型流動試験装置を作成した。本装置は、試作した空気圧式拍動型血液ポンプ、血圧トランスデューサ、血圧測定用アンプ、拍動制御装置などから構成されている。本装置を用いた人工弁まわりのキャビテーション気泡の観察を高速ビデオにより解析した結果、以下のことが明らかにされた。(1)大動脈弁の弁葉の側方からは、0.150.07mm程度の微細気泡が発生し、気泡は移動速度0.530.66m/sで流出する。(2)大動脈弁の中央部流出路には0.07mm程度の気泡が観察され、成長速度0.06m/sで成長する。気泡の移動速度は約2.3m/sとなり、大動脈弁近傍の平均流速の約1.7倍となる。潜水病の発症メカニズムの解明に関連して、これまで、血液や水中での気泡生成に関する成果を得てきたが、筋肉や脂肪などの生体軟組織中での気泡生成に関する知見は未だ不十分である。よって、今年度は、環境圧力の変化を受けた生体軟組織中の気泡生成の解明を目途して、以下の実験研究を行った。筋肉擬似モデルとして、アガロースおよびアガロースLE(低電気浸透性)および脂肪擬似モデルとして、粘度計校正用標準液(JS1000、JS160000)を採用し、高圧制御実験装置を用いて、これら生体軟組織モデル中で発生する気泡の数密度の計測および気泡形状等の観察を行った。実験条件は、供試高圧ガスとして二酸化炭素、空気、ヘリウム、ガス加圧力P=0.21.0MPa、加圧時間14時問である。気泡の観察には、実体顕微鏡とデジタルカメラ等からなる微細気泡観察装置を用いた。得られた結果は、次のようである。(1)アガロース、アガロースLE、脂肪中で生成する気泡の数密度は、ガス加圧力が大きいほど、また、加圧時間が長いほど増大する。(2)アガロースおよびアガロースLE中におけるヘリウムの気泡数密度は、二酸化炭素および空気の場合と比べて高値を示す。(3)アガロースおよびアガロースLE中で生成する気泡の大きさは、二酸化炭素気泡が最も大きくなり、次いで、空気、ヘリウムの順となる。(4)潜水時の呼吸系混合ガスとしてヘリウムが推奨されている。しかしながら、生体軟組織中に溶解するヘリウムの場合は、その気泡サイズは比較的小さいものの、気泡数密度は高値を示すことから、ヘリウム潜水の安全性には疑問が残る。生体組織中における気泡生成の問題に関連して、人工弁まわりで発生する気泡の動的特性について検討した。ここでは、試作した開放式拍動流型試験装置を用いて、大動脈弁および僧帽弁まわりで発生するキャビテーション現象を実験的に明らかにした。本試験装置は、高圧タンク側および真空ポンプ側の両圧力制御弁の弁開度、加圧・減圧電磁弁の解放時間を各々400msおよび600msに設定することにより、流量Q=5L/min、拍動周期1Hz,最高血圧160180mmHgの好適な圧力波形が再現され、ヒト心臓の生理的拍動条件を十分満足することが確認された。その拍動流条件下で、臨床使用例の多い機械式2葉弁であるSJM弁まわりのキャビテーション気泡の発生現象を高速ビデオで観察・検討した。その結果、以下のことが明らかにされた。(1)僧帽弁上流および大動脈弁上流において、弁閉鎖時にキャビティが上流側に向かって爆発的に発生する。そのキャビティは、瞬時に微細な気泡群となって分散し、逆流する。
サンゴ群集の大規模白化からの再生になわばり性藻食スズメダイが果たす役割

なわばりを持つ藻食性スズメダイ類は、サンゴ礁生態系において主要な一次消費者であり、そのなわばりは底質の1170%を占めるほど高密度に存在するため、キーストーン種としての役割を持つ。2016年に海水温の上昇による世界的サンゴ大規模白化が発生し、国内最大のサンゴ礁である沖縄県石西礁湖においても約97%が白化、約56%が死滅した。この攪乱に対するサンゴ群集の復元力には、サンゴと競合する藻類を食べる藻食者が貢献するが、なわばりを持つ藻食性スズメダイ類の影響は謎である。本研究では、沖縄のサンゴ礁域で、白化前の2015年から観察しているスズメダイ6種のなわばり内外を追跡し、大規模白化からのサンゴ群集の初期再生の過程にスズメダイのなわばりが果たす役割を明らかにすることを目的としている。2017年9月と2018年3月、9月、2019年3月に、沖縄本島周辺の瀬底島、恩納村、大度浜において6種のなわばり性スズメダイについて野外調査を行った。その結果、サンゴの大規模白化後に、サンゴの被度は、キオビスズメダイとクロソラスズメダイのなわばり内のみで有意に増加し、なわばり外では減少傾向にあることがわかった。また、なわばり内には、なわばり外に比べ高い頻度で出現する特徴的なサンゴ種が生育していること、大規模白化後に、これらのサンゴはなわばり外では消失したが、なわばり内では被度に変化が見られず維持されることが分かった。白化の影響を受けやすいとされるサンゴ種では、その被度は、大規模白化前ではなわばり外で高く、なわばり内ではほとんど見られなかったが、白化後はなわばり外で減少し、なわばり内で増加した。このことは、スズメダイのなわばり内が白化の影響を受けやすいサンゴ種の回復のための場所として機能している可能性を示唆した。それにより、サンゴの大規模白化の影響はなわばり内外で異なることが分かってきた。例えば、サンゴの被度は、大規模白化後は、なわばり外では減少したが、一方キオビスズメダイとクロソラスズメダイのなわばり内では逆に有意に増加していた。なわばり内には、なわばり外に比べ高い頻度で出現する特徴的なサンゴ種が生育していることが分かってきたが、大規模白化後に、これらのサンゴはなわばり外では消失したが、なわばり内では被度に変化が見られず維持されることが分かった。これらのことから、なわばり内はサンゴにとって定した環境であり、大規模白化の影響をあまり受けなかったことが示唆された。このことは、スズメダイのなわばり内が白化の影響を受けやすいサンゴ種の回復のための場所として機能している可能性が示唆され、今後、さらに追跡調査を行い検証を進める必要性が示された。一方で、2019年には、これまで白化を免れていた世界最南端のロードハウ島周辺のサンゴ礁で白化が確認され、日本のサンゴ礁でも夏季の白化が強く危惧される。度重なる撹乱と、そこからの回復の過程を今後も継続して追跡する必要がある。平成31年度には、2015年より調査地としている沖縄本島周辺の3地点(瀬底島、恩納村、大度浜)において、高密度でみられるなわばり性スズメダイ6種(集約的な種から粗放的な種の順にクロソラスズメダイ、キオビスズメダイ、ルリホシスズメダイ、ハナナガスズメダイ、フチドリスズメダイ、アイスズメダイ)を対象とし、スズメダイのなわばり内外におけるサンゴ群集の回復過程を続けて追い、またサンゴ群集の遷移に影響を及ぼすスズメダイの干渉、競合する藻類の遷移、スズメダイによる藻食者、サンゴ食者の排除の観察を続ける。同時に、夏季にサンゴの大規模な白化がこれらの調査地で生じればその撹乱の影響を調べられるよう、なわばり内外のサンゴ群集について白化直後と、冬季に調査を行う。得られた結果についてまとめ、学会発表を行う。

2017年9月と2018年3月に、沖縄本島周辺の瀬底島、恩納村、大度浜において6種のなわばり性スズメダイについて野外調査を行った。その結果、サンゴの大規模白化後に、サンゴの被度は、キオビスズメダイとクロソラスズメダイのなわばり内のみで有意に増加し、なわばり外では減少傾向にあることがわかった。また、なわばり内には、なわばり外に比べ高い頻度で出現する特徴的なサンゴ種が生育していること、大規模白化後に、これらのサンゴはなわばり外では消失したが、なわばり内では被度に変化が見られず維持されることが分かった。これらのことから、なわばり内はサンゴにとって定した環境であり、大規模白化の影響をあまり受けなかったことが示唆された。白化の影響を受けやすいとされるサンゴ種では、その被度は、大規模白化前ではなわばり外で高く、なわばり内ではほとんど見られなかったが、白化後はなわばり外で減少し、なわばり内で増加した。このことは、スズメダイのなわばり内が白化の影響を受けやすいサンゴ種の回復のための場所として機能している可能性を示唆した。それにより、サンゴの大規模白化の影響はなわばり内外で異なることが分かってきた。例えば、サンゴの被度は、大規模白化後は、なわばり外では減少したが、一方キオビスズメダイとクロソラスズメダイのなわばり内では逆に有意に増加していた。なわばり内には、なわばり外に比べ高い頻度で出現する特徴的なサンゴ種が生育していることが分かってきたが、大規模白化後に、これらのサンゴはなわばり外では消失したが、なわばり内では被度に変化が見られず維持されることが分かった。このことは、スズメダイのなわばり内が白化の影響を受けやすいサンゴ種の回復のための場所として機能している可能性が示唆され、今後、さらに追跡調査を行い検証を進める必要性が示された。なわばりを持つ藻食性スズメダイ類は、サンゴ礁生態系において主要な一次消費者であり、そのなわばりは底質の1170%を占めるほど高密度に存在するため、キーストーン種としての役割を持つ。2016年に海水温の上昇による世界的サンゴ大規模白化が発生し、国内最大のサンゴ礁である沖縄県石西礁湖においても約97%が白化、約56%が死滅した。この攪乱に対するサンゴ群集の復元力には、サンゴと競合する藻類を食べる藻食者が貢献するが、なわばりを持つ藻食性スズメダイ類の影響は謎である。本研究では、沖縄のサンゴ礁域で、白化前の2015年から観察しているスズメダイ6種のなわばり内外を追跡し、大規模白化からのサンゴ群集の初期再生の過程にスズメダイのなわばりが果たす役割を明らかにすることを目的としている。2017年9月と2018年3月、9月、2019年3月に、沖縄本島周辺の瀬底島、恩納村、大度浜において6種のなわばり性スズメダイについて野外調査を行った。
慢性肝障害と肝癌におけるmet癌原遺伝子・tpr-met癌遺伝子の発現

肝癌の発癌と肝細胞増殖因子(HGF)のレセプター遺伝子であるc-metについて関連を明かにする目的で、c-met遺伝子の発現の状態、c-met遺伝子の増幅の有無、再編成によるc-metのactivation(Tpr-met)の検出そしてHGFレセプター発現の状態について検討を行った。c-met遺伝子の発現は、肝硬変では正常に比較して軽度増加し、前肝癌病変、肝癌病変では1.5-2倍に増加していた。c-met遺伝子の増幅は、肝硬変と前肝癌病変では認められなかったが、肝癌病変では2/3のラットにおいて2-7倍の増幅が認められた。tpr-metは各病変とも認められなかった。HGFレセプターは、肝硬変と前肝癌病変では発現の増加は見られなかったが、肝癌では一部の組織において発現の増加が見られた。以上の成績より、3′-Me-DAB誘発肝癌の発癌機構にc-met遺伝子の増幅が関与している可能性が示唆され、今後、HGFレセプターのチロシンリン酸化状態の検討が必要と考えられた。肝細胞癌は慢性肝障害とりわけ肝硬変に発症することが多く、また、肝硬変では血中肝細胞増殖因子(HGF)が高いことより、多段階発癌過程の1つとしてHGFの関与が推察されている。本研究ではHGFのレセプター遺伝子c-metについて、実験的慢性肝障害ならびに肝癌発癌過程において発現が増幅しているかどうか検討を行った。更に、肝癌発癌過程におけるc-met遺伝子とHGFによるDNA合成能についても検討を行った。慢性肝障害はラットに四塩化炭素を投与して肝硬変を作製し、前肝癌病変はラットにDENを投与し、また、肝癌は3′-Me-DABを投与して作製した。肝組織よりmRNAを抽出し、RT-PCR法にて得たラットc-met cDNAをプローブとして、Northern blot解析を行った。前肝癌病変、肝癌病変では肝細胞を初代培養し、HGF(10ng/ml)を培地に添加して、二重免疫染色法にてGST-P陽性細胞[(前)肝癌細胞]におけるDNA合成細胞(5BrdU陽性)の比率(labeling index:LI)を求めた。また、DNAを抽出し、上記プローブにてSouthern bolt解析を行った。肝硬変ではc-met mRNAは正常に比較して軽度増加し、前肝癌病変、肝癌病変では1.5-2.0倍に増加していた。また、前肝癌細胞ではHGF添加によりLIは76%と非添加の18%に比較して著明にHGFに応答してDNA合成を示した。肝癌においてはより低い応答であった。Southern bolt解析ではc-met遺伝子の増幅は認められなかった。以上の成績より、肝癌発癌過程においてc-met遺伝子の増幅は認められなかったが、c-met遺伝子の発現は増加し、また、DNA合成能に及ぼすHGFの作用は顕著で、前肝癌病変の進展にHGFの関与が示唆された。肝癌の発癌と肝細胞増殖因子(HGF)のレセプター遺伝子であるc-metについての関連を明かにする目的で、平成5年度には、c-met遺伝子の発現を検討したところ、肝硬変と前肝癌病変、肝癌病変において増加している成績を得た。そこで、平成6年度は、このc-metの発現増加の機序を明かにする目的で、c-met遺伝子の増幅の有無ならびに再編成によるc-metのactivation(tpr-met)の検出と、HGFレセプターの発現について検討を行なった。tpy-metの検出は、上記障害ラット肝よりRNAを抽出し、tpy-met breakpointを含む205bpについてRT-PCRにてcDNAを増幅し、^<32>Pで標識したinternal probeで、Southern blot法でtpy-metの検出を行ったが、各病変とも検出されなかった。c-met遺伝子の増幅の解析は、上記障害ラット肝よりDNAを抽出し、制限酵素にて切断後、c-met cDNAを^<32>Pで標識してprobeとし、Southern blot法にてc-met遺伝子の増幅を解析し、c-met遺伝子の増幅は、肝硬変と前肝癌病変ではみられなかったが、肝癌病変では2/3のラットにおいて2-7倍の増幅が認められた。HGFレセプターの検出は、肝組織の凍結切片を蛍光抗体法にて観察し、肝硬変と前肝癌病変では発現の増加は見られなかったが、肝癌では一部の組織において発現の増加が見られた。

以上の成績より、3'-Me-DAB誘発肝癌の発癌機構にc-met遺伝子の増幅が関与している可能性が示唆され、今後、HGFの結合なしに既にチロシンリン酸化しているかどうかの検討が必要と考えられた。
大動物肝切除モデルにおける肝のトランスポーター発現解析とその制御に関する研究

豚肝切除術後にLPSを投与した感染症併発モデルを作成し、そのメカニズムとプロテアーゼインヒビター投与による肝障害抑制効果を検討した。実験群I.肝門部血流遮断+25%肝切除、実験群II.実験群I+微量LPSを6時間持続静注、実験群III.実験群II+メチル酸ナファモスタット(NM)投与。肝切除後感染症併発モデルでは肝組織にnecrosisやapoptosisによる肝組織障害を惹起し、NM投与による肝保護効果を認めた。胆汁うっ滞に対する肝トランスポーター発現の関与は、本研究では結論は見いだせなかった。(研究の目的と重要性)肝臓外科において臨床的に解決すべき問題点は術後黄疸に代表される胆汁うっ滞の予防と治療である。ビリルビンの輸送に関してはMultidrug resistance protein 2(MRP2)が関与することが報告されているが、肝切除後の術後胆汁うっ滞におけるMRP2の発現動態の解析は充分に行われていない。本研究では解剖学的にもヒトに近い豚を用いて肝切除モデルならびに肝切除術後にLPSを投与した感染症併発モデル(two hit theory)を作成し、これらのモデルにおける肝組織MRP2の発現の動態解析を行うことに加え、血液生化学的変化や組織学的変化との関連性を検討することを目標とする。さらに、プロテアーゼインヒビター投与による肝障害抑制効果とMRP2発現との関連性について検討を行う。(方法)本年度は、作成したモデルに従い、肝切除などの手術実験とそれら侵襲による血液生化学的肝障害の変化について検討を行った。本研究における実験群は、以下の通りとした。実験群I.体重約20kgの豚を用いてプリングル法としての肝門部血流遮断(15分間遮断、5分間開放)を計8回(総阻血時間120分)併用する25%肝切除を施行して一次侵襲とする。実験群II.実験群Iに加えて、術後にLPS(0.05μg/kg/min)を6時間微量持続静注して二次侵襲とする。実験群III.実験群IIに加えて、メチル酸ナファモスタット(NM)投与群として、肝切除開始時から手術終了まで持続静注する。(結果)これまでの成果のうち、各実験群間での比較では、(1)肝逸脱酵素(AST)値、総ビリルビン値は実験群IIでは実験群Iに比べ高値を示した。(2)実験III群では、NM投与による血液生化学的肝障害に対する抑制効果を認めた。次年度では、それぞれn=5を目標に手術実験を継続し、各実験群でのMRP2の経時的発現について、免疫組織学的検討と得られた結果の考察を行う予定である。(研究の目的と重要性)肝臓外科における問題点として、大量肝切除後胆汁うっ滞の予防と治療がある。本研究では解剖学的にヒトに近い豚を用いて肝切除モデルならびに肝切除術後にLPSを投与した感染症併発モデル(two hit theory)を作成し、プロテアーゼインヒビター投与による肝障害抑制効果について検討を行うとともに、肝組織Multidrug resistance proteln2(MRP2)の発現の動態解析、血液生化学的変化や組織学的変化との関連性を検討することを目標とした。(方法)肝切除などの手術実験とそれら侵襲による肝障害の変化について検討を行った。(結果)各実験群間での比較では、(1)AST値、はNM投与群で低値を示し、(2)総ビリルビン値はNM投与群では上昇を認めなかった。(3)TNF-a, IL-6,HMGB-1はNM投与群で低値を示した。(4)12時間後の肝組織はNM投与群で肝組織壊死による障害が軽度であった。(5)12時間後のアポトーシス陽性細胞はNM投与群で低値を示した。(6)MRP-2染色では群間に違いを認めなかった。(まとめ)肝切除後感染症併発モデルでは、末梢循環不全や高サイトカイン血症により肝組織にnecrosisやapoptosisによる肝組織障害を惹起すると考えられ、NM投与による肝保護効果を認めた。胆汁うっ滞に対しては肝トランスポーター発現低下の関与が疑われたが、本研究では結論は見いだせなかった。