hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
老人痴呆症発症に関与する生体分子の診断用酵素免疫測定法の開発

本研究は老人痴呆症に関与すると考えられる生体成分の酵素免疫測定法(EIA)を確立し本法を用いて老人痴呆患者の早期診断法として活用することを目的としたものである。その結果,(1)ビオチンと抗体間にスペーサーを導入した複合体を用いることにより6FGFに対するEIA系を高感度化した。本法の感度は約1pg/ml(約0.1pg/assaytube)と以前の系より約30倍高感度であり再現性やヒト血清からの添加回収率も良好であった。ヒト血中には16KDa6FGFのほか高分子量6FGFの存在が認められた。(2)遺伝子工学の手法で作製したNT-3を抗原として抗体を調製した。(3)NT-3に対するEIA系は固相に抗NT-3ポリクローナル抗体を結合させ試料中のNT-3をビオチン標識二次抗NT-3モノクローナル抗体でサンドイッチする方法で0.51pg/mlの検出感度で10ng/mlまで測定可能な特異性再現性にも優れた方法を開発することに成功した。(4)神経栄養因子(NTF)が神経系の構築に如何に関与しているかを知る目的でラット中枢,末梢のNGF,NT-3量の経時的変動について検討し,出生後NGF量は中枢で皮質,中隔,海馬,基底核のレベルが増大するのに反して,NT-3は減少することがわかった。NTFの生合成は神経系の発達時期および部位特異的に制御されていることがわかった。(5)老人痴呆症(Ab)発症とNGF、NT-3量の変動についてはADと正常老人の脳脊髄液および末梢血中のNGF、NT-3量に有意な差は認められなかった。また脳内の生合成部位である皮質や海馬でレベルの差異は認められなかった。これらの成果は今後のNTFの研究に多くの示唆を与えるものと考える。本研究は老人痴呆症に関与すると考えられる生体成分の酵素免疫測定法(EIA)を確立し、本法を用いて老人痴呆患者の早期診断法として活用することを目的したものである。その結果、(1)本年度はビオチンと抗体間にスペーサーを導入した複合体を用いて申請者らがすでに報告しているbFGFするEIA系を更に高感度化した。すなわち組換え型ヒトbFGFと抗ヒトbFGFモノクローナル抗体を材料としてまずビオチン化抗体を調整しポリスチレンビーズに試料中のbFGFを固定化後ビオチン化抗体とペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンで増幅する方法に従った。確立したEIA系の感度は約1pg/ml(約0.1pg/assay tybe)と以前の系より約30倍高感度であり再現性、ヒト血清からの添加回収率も良好であった。ヒト血清中には16KDa bFGFのほか高分子量bFGFのほか高分子量bFGFの存在が認められた。(2)ヒトNT-3に対するEIA系は固相に抗NT-3ポリクローナル抗体を結合させ試料中のNT-3をビオチン標識二次抗体でサンドイッチする方法に従った。最少検出量0.5-1.0pg/ml、相同性の高い他の神経栄養因子(NTF)であるNGF,BDNFとは300ng/mlまで反応しない特異性の高い測定系で、再現性にも優れていた。(3)ヒトNGFに対するEIA系はマウスNGFの場合と同様組換え型ヒトNGFに対するポリクローナル抗体を調製した後、上記のNT-3と同様two-siteEIA系により高感度(0.3-1.0pg/ml)で再現性(変動係数2.1-8.2%)、特異性に優れた測定系で生理的NGF量を定量するには充分であった。

(4)老人痴呆症のNGF,NT-レベルの変動について上記のEIA系を用いて検討した結果、脳内各部位、脳脊髄液および抹消血中のNGF、NT-3レベルに有意な差は認められなかった。今後は病態とこれらのNTFレベルの変動についても詳細に検討することを予定している。
キラルイオン液体-超臨界二酸化炭素による光学異性体の連続分離プロセスの開発

イオン液体相と超臨界CO_2相の2相系を用いた抽出、分離システム開発を目的としている。その基礎的知見として、イオン液体-CO_2-芳香族化合物3成分系における無限希釈分配係数の測定を行い、溶質種、イオン液体種依存性の検討を行った。Sanchez-Lacombe状態式による相関では異種分子間においても温度、圧力変化も推算可能であることを示した。光学異性体の分離に関して、超臨界クロマト法により分離係数の評価を行った。光学分割を示すキラルイオン液体の構造の同定には官能基の相互作用に着目した構造探索が必要であることを明らかにした。医薬品などで重要となる光学異性体の新規分離技術として、近年注目されているイオンのみからなる液体『イオン液体』および『超臨界CO2』を用いた連続分離技術の開発を行い、光学異性体の高速かつ高純度分離を達成することを目的とする。本分離プロセスは、イオン液体に光学活性な官能基を持つキラルイオン液体を用いることで、R体、S体の一方と強い相互作用を形成することを想定し、CO2相に一方を選択的に分配されるプロセスである。現在主流であるジアステレオマー法による光学異性体分離技術と比較すると、分離溶媒の再利用が可能であることが挙げられ、環境調和かつ低コストの分離が可能となる。新規光学異性体分離技術の確立を目指し、以下に示す2つのアプローチを進めており、結果を合わせて報告する。(1)超臨界クロマト法による光学異性体のCO2相、イオン液体相への分配係数の測定。超臨界クロマト法を用いることで光学異性体のCO2相とキラルなイオン液体相への分配の違いを測定し、相互作用の違いの解明を進めている。その際に必要となるCO2ポンプ、背圧弁、高圧対応のUV検出器を本補助金より購入した。これまでの結果から1-phenyl-1-propanolや2-phenylpropionic acidなど芳香環に水素結合基を有する光学異性体に関して分離が可能であることを確認した。(2)状態式による相図の構築。現在進めている光学異性体の分離は、相平衡の概念を利用したものである。CO2-イオン液体-光学異性体からなる3成分系高圧相平衡を状態式で表現することが可能となれば、分離に優位となる温度、圧力条件を推算していくことが可能となる。現在までに、CO2-イオン液体-芳香族化合物系よりなる3成分系相平衡をSanchez-Lacombe状態式により良好に表現できることを確認した。本研究の目的は、イオン液体相と超臨界CO2相の2相系を用いた抽出、分離システム開発を目指すものであり、基礎的知見となるイオン液体-CO2-芳香族化合物3成分系に関する相平衡測定および相関式開発を行った。相関には状態方程式を用いることにより分配係数、分離係数の温度、圧力効果の推算を目指した。イオン液体-CO2-芳香族化合物3成分系に関する相平衡は、超臨界クロマト法による無限希釈分配係数の測定で行われた。イオン液体に関しては4種類、溶質としては芳香族化合物系に関し系統的に構造変化をさせた5種を用いた。溶質種の依存性に関しては、溶質の蒸気圧にしたがって変化することが確認された。イオン液体種の依存性に関しては[BF4]アニオンは[PF6]アニオンと比較して極性物質と高い親和性を示し、アニオンの表面電荷の違いにより親和性に違いが生じたと考えられる。続いて、前章までで決定されたパラメータを用いて状態式による相関を行った。Sanchez-Lacombe状態式による相関の結果は無限希釈分配係数の温度、圧力の傾向を良好に表現可能であることが示された。また、本相関式を用いることによって異種分子間における分離係数の温度、圧力変化も推算可能であることが示された。応用研究として、キラルイオン液体による光学異性体の分離に関する研究を行った。測定手法は上記と同じ超臨界クロマト法により、分離係数の評価を行った。現段階においては光学分割を示すキラルイオン液体の構造の同定はできず、今後、官能基の相互作用に着日した構造探索が必要である。
ダイオキシン等高精度での実験が困難な溶質に対するナノろ過・逆浸透法での阻止率の予測手法の開発

揮発性有機化合物約20種類の溶質のナノろ過・逆浸透膜10種類による分離実験を行い各溶質の阻止率を求めた。まず,実験手法の検討として,マイクロ固相抽出・ガスクロマトグラフ質量分析法(SPME-GCMS)による膜分離系での微量揮発性有機化合物の定量方法を確立した。この結果を利用し,多くの膜における阻止率を実験的にしかも簡易に精度良く求めることが可能であった。その結果,最も緻密な低圧逆浸透膜を用いた場合であっても,クロロホルムのように阻止率が50%以下の溶質があることがわかった。約20の溶質について得られた結果を昨年までに行った半揮発性物質の結果と合わせて分子量にかわる分子幅コンセプトで結果を比較検討した。その結果,すべての膜において,分子幅の方が分子量よりも良い説明変数となることがわかった。特に,揮発性物質の中でも,ベンゼン・キシレンなどの疎水性の強い平板構造の溶質と臭素系のトリハロメタン類の阻止率の予測で,分子幅によるアプローチが一般に言われる分子量による予測よりも良い結果を与えることが明らかになった。しかしながら,大きさだけでは説明できない因子が残ることがわかり,逆浸透での解析に広く用いられている溶解度パラメーターと細孔内拡散速度などを合わせたアプローチが必要であることがわかった。移流と拡散項に分けて障害因子を加味したモデルを用いて,特に0.3MPa以下での低圧での逆浸透・ナノろ過法の溶質阻止特性についてシミュレーションを行った。
骨酷似形態・組成を有する水酸アパタイト系複合コーティング膜の作製と生体活性評価

世界的規模で急速な高齢化が進む中,整形外科的・歯科的病巣の確実な治療法が望まれている.現在この目的でTi等が使用されているが,埋入後,新生骨が積極的には表面に生成せず,病巣の治癒に長時間を要している.申請者は,水溶液中でのコーティング技術「水中熱基板法」を提案し,HAp中のCa^<2+>をK^+,Mg^<2+>等で置換ならびにPO_4^<3->をCO_3^<2->で置換すると同時に,コラーゲン等の有機成分をも複合化させた「有機-無機複合水酸アパタイト系皮膜」を作製し,その生体適合性を評価することを目的とした.前年度の結果を踏まえ,本年度は,作製した各種複合膜コーティング材をラット脛骨に埋植し,その生体活性評価(in vivo)を行った.具体的な成果は以下のとおりである.【1.無機複合化HAp膜の作製と評価】炭酸置換型Apならびに炭酸置換型ApとCaCO_3の複合膜を作製しin vivo評価を行った.炭酸を複合化することによって,骨誘導性の向上が認められた.しかし,ラットの健常骨に含まれる炭酸量を超える量を複合化した場合には,その効果が徐々に失われることもわかった.【2.有機-無機複合化HAp膜の作製と評価】炭酸置換型Apとコラーゲンあるいはコラーゲンを変性させたゼラチンの複合膜を作製しin vivo評価を行った.コラーゲン添加によって,骨誘導性の向上が認められた.しかし,ゼラチンには骨誘導性を低下させる働きはないものの,機能向上にも寄与は認められなかった.さらに,炭酸と同様に,コラーゲンもラットの健常骨に含まれる量を超えて複合化した場合には,その効果が徐々に失われることもわかった.世界的規模で急速な高齢化が進む中,整形外科的・歯科的病巣の確実な治療法が望まれている.現在この目的でTi等が使用されているが,埋入後,新生骨が積極的には表面に生成せず,病巣の治癒に長時間を要している.一方,人骨の無機主成分「水酸アパタイト(Ca_<10>(PO_4)_6(OH)_2,以下HApと略す)」を埋入すると,金属に比べ病巣の高速治癒が確認されてはいるが,HApの脆弱性により,強度を要する部位への単独埋入はできない.さらに人骨は純粋HApではないため,埋入後,異物反応を示すなど,現行HApの使用により十分な治癒速度が実現しているとは言えない.強度と生体活性を併せ持つ材料として,金属上へのHApコーティング材が注目されてきたが,従来法による複雑形状のインプラント材への均一なHApコーティングが困難であった.そこで申請者は,水溶液中でのコーティング技術「水中熱基板法」を提案し,HAp中のCa^<2+>をK^+,Mg^<2+>等で置換ならびにPO_4^<3->をCO_3^<2->で置換すると同時に,コラーゲン等の有機成分をも複合化させた「有機-無機複合水酸アパタイト系皮膜」を作製し,その生体適合性を評価することを目的としている.このうち,本年度は,【1.無機複合化HAp膜の作製と評価】【2.有機-無機複合化HAp膜の作製】に取り組んできた.【1.無機複合化HAp膜の作製】人骨は純粋なHApではなく,HApを構成するCaの一部がKならびにMgと,PO_4の一部がCO_3と置換して存在している.本研究では,HApを構成するCaとKならびにMg,PO_4とCO_3を置換析出させ,K,Mg,CO_3を含有する「無機複合膜」の作製に成功し,すでに生体活性評価も終了している.【2.有機-無機複合化HAp膜の作製】無機複合化HAp膜の作製で用いた水溶液に,コラーゲンを添加し,「無機-有機ハイブリッド複合膜」の作製に着手している.世界的規模で急速な高齢化が進む中,整形外科的・歯科的病巣の確実な治療法が望まれている.現在この目的でTi等が使用されているが,埋入後,新生骨が積極的には表面に生成せず,病巣の治癒に長時間を要している.申請者は,水溶液中でのコーティング技術「水中熱基板法」を提案し,HAp中のCa^<2+>をK^+,Mg^<2+>等で置換ならびにPO_4^<3->をCO_3^<2->で置換すると同時に,コラーゲン等の有機成分をも複合化させた「有機-無機複合水酸アパタイト系皮膜」を作製し,その生体適合性を評価することを目的とした.前年度の結果を踏まえ,本年度は,作製した各種複合膜コーティング材をラット脛骨に埋植し,その生体活性評価(in vivo)を行った.具体的な成果は以下のとおりである.【1.無機複合化HAp膜の作製と評価】炭酸置換型Apならびに炭酸置換型ApとCaCO_3の複合膜を作製しin vivo評価を行った.炭酸を複合化することによって,骨誘導性の向上が認められた.しかし,ラットの健常骨に含まれる炭酸量を超える量を複合化した場合には,その効果が徐々に失われることもわかった.【2.有機-無機複合化HAp膜の作製と評価】炭酸置換型Apとコラーゲンあるいはコラーゲンを変性させたゼラチンの複合膜を作製しin vivo評価を行った.

コラーゲン添加によって,骨誘導性の向上が認められた.しかし,ゼラチンには骨誘導性を低下させる働きはないものの,機能向上にも寄与は認められなかった.さらに,炭酸と同様に,コラーゲンもラットの健常骨に含まれる量を超えて複合化した場合には,その効果が徐々に失われることもわかった.
台湾における住民主導の地域づくり実践を通じた市民社会形成に関する研究

台湾では戒厳令解除後の1990年代から、政府は市民社会形成の一つの方途として、住民主導による地域づくりを推進する政策を始動した。地域づくりを住民主導で進めるにあたり、住民の学習とそれを通じた意識育成のあり方が問われる必要がある。本研究は、台北市における社区大学と社区発展協会での住民の学習、地域づくり実践の現場に着目し、住民の学びを通じた地域づくりの実態を明らかにし、これを通じて台湾の新たな市民社会形成の理論構築を行う。
マルチボディダイナミクスに基づく全身運動の解析方法の確立と応用

両手で行うゴルフスイング運動の逆動力学解析を行うために,左右のグリップに作用する力とモーメント,力の作用点を分離して計測するための計測方法と道具を開発した.この方法によって力ベクトルがどの方向に,また左右のグリップのどの位置に作用しているか明らかにすることによって,地面反力をどのように生成し,さらにそれをクラブにどのように伝達しているか明らかにし,スイング時のクラブの回転のメカニズムを明らかにした.この計測結果から腕の閉ループ構造を利用し,クラブのシャフト軸周りの回転には直接寄与しない内力を積極的に利用して,運動を行っていることを明らかなった.スポーツのような多くの全身運動,例えば走行などの移動運動では大きな床反力を生成すること,投擲運動では床反力を手や道具などに伝達することが運動の物理的な目的となっている.ところが,このような全身運動の逆動力学解析を目的とした多体系の運動方程式を構築する際,ニュートン・オイラー法を用いることで解析は容易になるが,運動方程式に内力(拘束力)を陽に含むことから動力学的な冗長性が生じ,さらには漸化式表現によって解くことからも,運動方程式の物理的な意味が捉えにくい.そこで,マルチボディダイナミクスに基づいて全身運動の逆動力学問題に適した運動方程式の導出方法を検討した.具体的には,仮想パワーの原理に基づいて多体系の運動方程式を整理した.これにより,身体のリンク機構の構造を定めれば機械的に多体系の運動方程式を導出でき,姿勢の変化によって地面反力をどのように目的とする部位に伝達できるかなどの,動力学的貢献度の理論的な整理を行った.また,効率よく力やエネルギーを伝達するための全身運動のメカニズムを明らかにするために,野球やゴルフなどのスイング運動における両手の力の使い方を理解するために,グリップに作用する左右の力とモーメントを分離して計測する道具を開発した.これと先ほどの多体系の運動方程式による解析によって,上半身(左右の腕)における,左右の動かし方の役割を解明することが期待できる.しかし,機器の構造設計に問題が見つかったため,引き続き改良を行っていく予定である.グリップ力計測の機器の構造設計に問題が見つかったため,引き続き計測機器の改良を行っていく予定である.ゴルフスイングでは,両手でゴルフクラブを扱うため右腕と左腕は閉ループ構造を構成する.閉ループ構造はパラレルリンク構造と類似しており,下肢や体幹の力を素早く伝達するために効率のよい機構である.この閉ループ機構の力学解析,すなわち左右の腕に作用する力とモーメントを同定するような逆動力学解析を行うためには,右手と左手で独立に,力計測を行う必要がある.そこで,本年度は,ゴルフクラブのグリップ内に力覚センサを搭載し,モーションキャプチャまたはモーションセンサで計測した情報と合わせて,右手と左手の力とモーメントを分離する計測理論の構築を行い,さらに,これらの力情報から左右の各グリップに作用する力の作用点を算出する理論構築を行った.また,実際に力覚センサ搭載クラブを製作し,ゴルフスイング実験を行い,理論の検証を行ったところ,おおよそ合理的な計測値が得られていることを確認した.しかしながら,使用した力覚センサの精度が悪く,実用上さらなる精度向上を図る必要があった.この新しい計測方法によって,初めてゴルフスイングの左右の力と作用点を同定することができた.また,まだ精度が十分に得られていないが,グリップには手の中で強く握らず,すなわち片手内では強いモーメントを作用させずに,左右の各手の並進力を中心にクラブを制御していることが明らかになった.また,特にインパクト直前には左右のグリップ間に大きな内力を作用させながら,クラブのシャフト回りの回転力を獲得していることが明らかになった.両手の力を分離するところまでは理論構築,実験による検証を行ったが,さらにその情報を利用した全身運動の解析まで十分に行うことができなかった.両手で行うゴルフスイング運動の逆動力学解析を行うために,平成28年度までに,左右のグリップに作用する力とモーメントを分離して計測するための計測方法と道具を開発した.この方法を用いて,左右の各腕に作用する力とモーメントを含めて,スイング運動時の腕の逆動力学解析を行い,地面反力をどのように生成し,それをクラブにどのように伝達しているか理論と実験の解析データによって明らかにし,グリップに作用する力の作用点の計測を可能とした.しかしながら,計測精度に問題があったため,平成29年度は構造と力覚センサの選定を見直し改良した力覚センサ搭載クラブを製作した.新しい力覚センサ搭載クラブを用いて実験を行ったところ計測精度が向上し,特にグリップに作用する左右の手先力とモーションキャプチャから得られたデータから算出された左右の力の作用点の計算では,合理的な計測値を得られるようなった.また,この計測結果から腕の閉ループ構造を利用し,クラブのシャフト軸周りの回転には直接関係の無い内力を利用して,シャフト軸回転を行っていることを明らかにした.また,全身運動の解析によって,腕と同様に下肢でも両脚が構成する閉ループ構造が,下肢のモーメント発生に寄与し,さらに上肢の回転運動の生成に寄与するように,エネルギーを伝達していることを明らかにした.特に,腰の部分では,体幹の長軸(鉛直軸)周りの回転よりも,体幹に対して前後方向の軸周りの回転力の伝達が,上肢へのエネルギー伝達に大きく寄与し,解剖学的な拘束から,必然的に腰の鉛直軸周りの回転が発生しているが,この前後軸周りの回転自体がエネルギー伝達には寄与していないことも示唆された.

両手で行うゴルフスイング運動の逆動力学解析を行うために,左右のグリップに作用する力とモーメント,力の作用点を分離して計測するための計測方法と道具を開発した.この方法によって力ベクトルがどの方向に,また左右のグリップのどの位置に作用しているか明らかにすることによって,地面反力をどのように生成し,さらにそれをクラブにどのように伝達しているか明らかにし,スイング時のクラブの回転のメカニズムを明らかにした.この計測結果から腕の閉ループ構造を利用し,クラブのシャフト軸周りの回転には直接寄与しない内力を積極的に利用して,運動を行っていることを明らかなった.グリップ力計測の機器の構造設計に問題が見つかったため,引き続き改良を行い,それを用いた実験後に解析を進める予定である.全身の運動解析を十分に進めることができなかったため,平成29年度のできるだけ早いうちに行いたい.その上で,全身運動のエネルギー伝達方法の理論的解明を行う.29年度が最終年度であるため、記入しない。スポーツバイオメカニクス,スポーツ工学29年度が最終年度であるため、記入しない。
再生シルクタンパクを原料とする高タフネスシルク素材の創製

本研究の目的は、絹糸(シルク)を溶解させて得られるシルクタンパク溶液(再生シルク)から天然シルクの力学特性を凌駕する強くタフな再生シルク繊維を創製するための構造制御技術を確率することにある。目的達成に向けて、課題1:様々な天然のシルク繊維について、その構造と力学特性との因果関係を調べ、シルクの強くタフな性質の鍵となる構造的な要因を明らかにし、課題2:カイコや他の絹糸昆虫がシルクタンパク質を糸として吐糸する過程で、1で明らかにした構造がどのように形成されるのか、その構造形成機構を明らかにし、課題3:2で明らかとなった構造形成機構を人工的に再現するための紡糸装置を考案する。課題1:初年度(平成30年度)は、特徴の異なる力学特性を与える4種類の絹糸昆虫(カイコ、野蚕(ムガ蚕とエリ蚕)、およびミノムシ)のつくる糸について、構造と力学特性との関係を明らかにした(学会発表6件、論文発表2件)。課題2:それぞれの構造形成機構を解明するため、シルクタンパク溶液内でのタンパクの振舞い、ならびに構造形成機構を調べる研究についても着手し、異なるシルク間での、構造形成機構の共通点と相違点が分かり始めてきた(未発表)。引き続き、各種シルクの構造形成機構について調べ、強くタフなシルクの力学特性の鍵となる構造ならびにその形成機構を明らかにする。課題3:再生シルクから強くタフな繊維を造るための紡糸装置の設計ならびに製作を開始した。ただし、初年度の製作状況としては、紡糸装置としての基本的なセットアップに留まっており、強度とタフネスの向上に直結する構造制御技術については、初年度に1および2の課題より得られた知見、ならびに次年度以降で得られてくる知見に基づき、随時改良・更新する。課題1:特徴の異なる力学特性を与える4種類の絹糸昆虫(カイコ、野蚕(ムガ蚕とエリ蚕)、およびミノムシ)のつくる糸について、構造と力学特性との関係を調べた。X線構造解析により、階層構造を解析し、ムガ蚕とミノムシについては、タンパクのアミノ酸配列と階層構造との関係までを定量的に明らかにした。また、繊維を引張った際に生じる階層構造の変形挙動を、放射光X線を用いた時分割解析により追跡し、力学挙動と階層構造の変化との因果関係の解明に成功した(学会発表6件、論文発表2件)。課題1の進捗は順調である。課題2:カイコや野蚕、ミノムシなどの絹糸昆虫が、シルクタンパクの水溶液を糸として吐糸する過程で、タンパクがどのように構造を形成するのか、その過程を調べた。異なるシルク間での、構造形成機構の共通点と相違点が分かり始めてきた。課題2の進捗は順調である。当初の計画通り、有機溶媒であるHFIP(1,1,1,3,3,3-hexafluoro-isopropanol)を溶媒とする紡糸系となっている。溶媒にHFIPを用いる理由は、カイコシルクタンパクにヘリックスを形成させるためである。課題1、2より、カイコ以外のシルクでは、アミノ酸配列にポリアラニン連鎖領域を有し、水溶液系でヘリックスを形成し、さらにヘリックス鎖の自己組織化により秩序性配列構造を形成することが明らかとなった(未発表)。この、自己組織化秩序構造形成こそが、その後の吐糸過程における高配向βシート結晶構造形成の鍵であると考えられることから、HFIP溶媒による強制的なヘリックス形成と、自己組織化秩序構造形成の誘導を通し、強くタフな繊維構造の制御が可能となる紡糸機構を組み上げているところである。課題3の進捗は概ね順調である。課題1については初年度でほぼ目標が達成されており、2年目以降は、課題2と3を重点的に進める。とくに、課題2では、シルクタンパクがどのように繊維構造を形成するのか、構造形成機構の解明に近づきつつあるため、2年目は、課題2の達成に力を入れる。シルクタンパクの構造形成は、静置場での構造形成と、延伸場での構造形成に分けて考える必要がある。後者の延伸時構造形成機構解明において、放射光X線を用いた時分割追跡が有効であると考えており、2年目の後期での測定を目指し、放射光X線施設利用のための課題申請を積極的に進める。課題2の遂行と平行して、課題2で得られる知見を課題3の紡糸装置デザインに随時フィードバックし、構造制御の精度向上を目指す。

課題2:それぞれの構造形成機構を解明するため、シルクタンパク溶液内でのタンパクの振舞い、ならびに構造形成機構を調べる研究についても着手し、異なるシルク間での、構造形成機構の共通点と相違点が分かり始めてきた(未発表)。引き続き、各種シルクの構造形成機構について調べ、強くタフなシルクの力学特性の鍵となる構造ならびにその形成機構を明らかにする。課題3:再生シルクから強くタフな繊維を造るための紡糸装置の設計ならびに製作を開始した。ただし、初年度の製作状況としては、紡糸装置としての基本的なセットアップに留まっており、強度とタフネスの向上に直結する構造制御技術については、初年度に1および2の課題より得られた知見、ならびに次年度以降で得られてくる知見に基づき、随時改良・更新する。課題1:特徴の異なる力学特性を与える4種類の絹糸昆虫(カイコ、野蚕(ムガ蚕とエリ蚕)、およびミノムシ)のつくる糸について、構造と力学特性との関係を調べた。X線構造解析により、階層構造を解析し、ムガ蚕とミノムシについては、タンパクのアミノ酸配列と階層構造との関係までを定量的に明らかにした。また、繊維を引張った際に生じる階層構造の変形挙動を、放射光X線を用いた時分割解析により追跡し、力学挙動と階層構造の変化との因果関係の解明に成功した(学会発表6件、論文発表2件)。課題1の進捗は順調である。課題2:カイコや野蚕、ミノムシなどの絹糸昆虫が、シルクタンパクの水溶液を糸として吐糸する過程で、タンパクがどのように構造を形成するのか、その過程を調べた。異なるシルク間での、構造形成機構の共通点と相違点が分かり始めてきた。課題2の進捗は順調である。当初の計画通り、有機溶媒であるHFIP(1,1,1,3,3,3-hexafluoro-isopropanol)を溶媒とする紡糸系となっている。溶媒にHFIPを用いる理由は、カイコシルクタンパクにヘリックスを形成させるためである。課題1、2より、カイコ以外のシルクでは、アミノ酸配列にポリアラニン連鎖領域を有し、水溶液系でヘリックスを形成し、さらにヘリックス鎖の自己組織化により秩序性配列構造を形成することが明らかとなった(未発表)。この、自己組織化秩序構造形成こそが、その後の吐糸過程における高配向βシート結晶構造形成の鍵であると考えられることから、HFIP溶媒による強制的なヘリックス形成と、自己組織化秩序構造形成の誘導を通し、強くタフな繊維構造の制御が可能となる紡糸機構を組み上げているところである。課題3の進捗は概ね順調である。課題1については初年度でほぼ目標が達成されており、2年目以降は、課題2と3を重点的に進める。とくに、課題2では、シルクタンパクがどのように繊維構造を形成するのか、構造形成機構の解明に近づきつつあるため、2年目は、課題2の達成に力を入れる。シルクタンパクの構造形成は、静置場での構造形成と、延伸場での構造形成に分けて考える必要がある。後者の延伸時構造形成機構解明において、放射光X線を用いた時分割追跡が有効であると考えており、2年目の後期での測定を目指し、放射光X線施設利用のための課題申請を積極的に進める。課題2の遂行と平行して、課題2で得られる知見を課題3の紡糸装置デザインに随時フィードバックし、構造制御の精度向上を目指す。
非特異的感染防御における内毒素結合蛋白の役割:内毒素の無毒化機構の解析

感染症,とくにグラム陰性菌感染症においてはエンドトキシン(LPS)が,内毒素血症やエンドトキシンショック,さらに播種性血管内血液凝固(DIC)など凝固障害の発現に大きく関与している。これらの発症を抑制するためには抗生剤投与などに加え,LPSを直接無毒化ないし中和することが最も重要と考える。我々は,ウサギ顆粒球からLPSと結合しこの活性を中和する新しい18kDa蛋白(CAP-18)を精製し,cDNAクローニングによって全一次構造を決定した。この蛋白のC-末端37個のアミノ酸からなる7kDaのペプチド(CAP-7)は,グラム陰性菌およびグラム陽性菌に対して抗菌活性を示した。また、in vitroでのLPS刺激によるマクロファージからの組織因子,一酸化窒素(Nitric Oxidel)およびTumor necrosis factor(TNF)の産生を抑制した。さらに、in vivoでのLPSの致死作用をもブロックした。このペプチドの一次構造上の特徴として、ヘパリン結合ドメインを持っており、これがLPSとの結合、その中和および抗菌活性発現に重要であることを見いだした。この合成ペプチドは抗凝固活性をも有しており、抗凝固はX因子の活性化およびプロスロンビンからスロンビンへの活性化に対する阻害作用によることが明かとなった。ウサギ由来のCAP-18の一次構造に基づきヒト顆粒球からCAP-18とホモロジーの高いcDNAを単離することに成功した。ウサギのペプチドと同様、ヒトでもC末端32残基がLPS結合ドメインであった。しかし、抗菌活性はウサギのペプチドの1/5-1/10程度と弱かった。ヒトのペプチドには完全な形のヘパリン結合ドメインが欠けており、一部のアミノ酸をウサギのペプチドの配列と置換したキメラペプチドは抗菌活性、LPS中和活性さらに抗凝固活性がより高くなった。従って、この実験からも、種々の活性発現におけるヘパリン結合ドメインの重要性が支持された。これらのペプチドについて2次あるいは3次構造の比較から、ヒト由来のものをもとに、より活性の高いものを合成しこれの臨床応用を目指している。感染症、とくにグラム陰性菌感染症においては内毒素(リポ多糖=LPS)が、内毒素血症や内毒素性ショック、さらに播種性血管内血液凝固(DIC)など凝固障害の発現に大きく関与している。これらの発症を抑制するためには抗生剤投与などに加え、LPSを直接無毒化ないし中和することが最も重要と考える。我々は、ウサギ顆粒球からLPSと結合しこの活性を中和する新しい18kDa蛋白(CAP-18)を精製し、cDNAクローニングによって全一次構造を決定した。この蛋白のC-末端37個のアミノ酸からなる7kDaのペプチド(CAP-7)は、LPS刺激によるマクロファージからの組織因子(TF)、一酸化窒素(Radical nitrogen)、およびTNFの産生を抑制した。CAP-7と同一構造をもつ合成ペプチドはE.coli、S.typhimurium、Ps.aeruginosa、K.pneumoniaeなどのグラム陰性菌にIC_<50>=40-70nMで、グラム陽性菌であるS.aureus(メチシリン感受性および耐性菌)に対してIC_<50>=150-200nMで抗菌活性を示した。LPSとガラクトサミンをマウス腹腔内に投与し、5分以内にペプチドを静脈内に投与した結果、LPS対照群では85%のマウスが死亡したが、ペプチド投与群では死亡率が43%と有意に減少した。

このペプチドはin vivoにおいてもLPSと結合しこの致死活性を中和することが観察された。ペプチドは脳組織由来のトロンボプラスチン(TP)によるin vitroでのプラスマの凝固を抑制した。また、TP静脈注射で100%のマウスが死亡したが、ペプチドの同時投与で57%が生残し、坑凝固活性をもつことが認められた。種々の合成ペプチドを用いて検討した結果、LPSとの結合能の高いペプチドほど抗菌活性やLPS中和活性が高く、ペプチドの構造と活性とに相関がみられた。このペプチドは細胞由来の生理的物質であり、種々の感染に対する防御蛋白として機能していることが示された。感染症や内毒素性ショックの予防、治療薬へと応用したい。我々は、ウサギ顆粒球からエンドトキシン(LPS)と結合しこの活性を中和する新しい18kDa蛋白(CAP-18)を精製し、cDNAクローニングによって全一次構造を決定した。この蛋白のC-末端37個のアミノ酸からなる7kDaのペプチド(CAP-7)が、LPS結合ドメインであることを種々の合成ペプチドをもちいて明らかにした。このペプチドの一次構造上の特徴として、ヘパリン結合ドメインを持っており、これがLPSとの結合、その中和および抗菌活性発現に重要であることを見いだした。この合成ペプチドは抗凝固活性をも有しており、その機序を解明するため凝固因子(プロテアーゼ)に対する合成基質を用いて解析した。その結果、抗凝固はX因からXaへの活性化およびII因子(プロスロンビン)からIIa(スロンビン)への活性化に対する阻害作用によることが明かとなった。影響を与えないことなどから、リン脂質が介在しない系をも阻害することや、過剰のリン脂質添加が抗凝固活性に影響を与えないことなどから、抗凝固の機作としてペプチドの凝固因子に対する直接作用などが考えられた。ウサギ由来のCAP-18の一次構造に基づきヒト顆粒球からCAP-18とホモロジーの高いcDNAを単離することに成功した。ウサギのペプチドと同様、ヒトでもC末端32残基がLPS結合ドメインであった。しかし、抗菌活性はウサギのペプチドの1/5-1/10程度と弱かった。ヒトのペプチドには完全な形のヘパリン結合ドメインが欠けており、一部のアミノ酸をウサギのペプチドの配列と置換したものは抗菌活性、LPS中和活性さらに抗凝固活性がより高くなった。従って、この実験からも、種々の活性発現におけるヘパリン結合ドメインの重要性が支持された。これらのペプチドについて2次あるいは3次構造の比較から、より活性の高いもの合成し臨床応用を目指している。これらのペプチドは生理的物質であり、感染に対する防御蛋白として機能していることが示され、生体防御機構を研究する上でも興味深い。
抗アレルギー作用を有する大豆イソフラボンの免疫疾患病態制御に関する基盤的研究

大豆中に含まれるイソフラボンは、これまで血清脂質低下作用、骨粗鬆症予防およびホルモン依存性の悪性腫瘍予防に関わることが明らかにされている。今回の研究では、大豆イソフラボンが免疫機能にどのように作用するか検討を行った。大豆イソフラボンの一種であるエクオールは、血中の抗原特異的IgE抗体を上昇させた。また、マウスでの実験的大腸炎の系では、炎症を増強することが明らかとなった。アレルギニ疾患をはじめとする免疫疾患では、B細胞からの抗体産生、ウイルス感染や抗腫瘍免疫応答を司る細胞傷害性T細胞の応答等をコントロールするTh1/Th2反応のバランスが崩れることが疾患発症に緊密に関連していることが明らかにされている。これまで、我々は、卵白アルブミン(OVA)免疫マウスおける抗原特異的免疫誘導をゲニステインが抑制することを明らかにしているが、その詳細なメカニズムについては不明な点が多い。そのため、その分子機構を明らかにする目的で基本的なマウスにおけるTh1/Th2分化モデルを用い検討を行った。OVA_323-339ペプチド特異的T細胞レセプタートランスジェニックマウスに大豆イソフラボン(ゲニステイン)を4および8週間経口投与し、その後、脾臓よりリンパ球を分離しin vitroにおいてOVA_323-339ペプチドで刺激し、サイトカイン産生(IFN-γ、IL-2、IL-4)をELISA法にて測定を行った。その結果、ゲニステイン投与マウスにおいては、OVA_323-339ペプチド刺激によるIFN-γおよびIL-4産生が高まることが明らかとなった。また、細胞内サイトカイン染色を蛍光標識した抗マウスIFN-YおよびIL-4抗体を用い、CD4^+T細胞における発現をフローサイトメトリーにより解析を行ったところ、サイトカイン陽性細胞の割合には差を認めなかった。そのためゲニステインによる抗原特異的サイトカイン産生の上昇は、細胞当たりのサイトカイン産生量の上昇が関与していることが明らかとなった。大豆イソフラボンはこれまでの研究で、骨粗鬆症、心血管疾患及び悪性腫瘍の発症を抑制する作用があることが明らかになっている。また、免疫系に対する大豆イソフラボンの作用としては主としてゲニステインで解析が進められており、腫瘍増殖抑制、抗原特異的免疫応答の抑制、さらに抗アレルギー作用があることが動物モデルで証明されている。今回は、免疫に対する影響が解析されていないエクオールおよびダイゼインが免疫機能にどのように影響をおよぼすのか、検討を行った。マウスを無処置群、1日体重1kg当たり4または20mgのエクオールを投与する群、そして1日体重1kg当たり4または20mgのダイゼインを投与する群の5群に分け、それぞれの量のイソフラボンを毎日経口投与を行った。投与開始1週間後に、10μgのOVAをアジュバントと共に腹腔内免疫を行い、同様の操作を投与開始3週間後に再度行い、投与開始5週目に解析を行った。リンパ球増殖反応は、脾細胞をin vitroにてOVA刺激を行いトリチウム標識チミジンの取り込みにより検討を行った。リンパ球サブセットの解析は、脾細胞を蛍光標識した特異抗体で染色した後、フローサイトメトリーにて解析を行った。抗OVA抗体の測定は,ELISA法にて行った。OVA特異的IgE抗体に関しては、エクオール投与群はコントロール群に比べ高値を示し、統計的にも有意な差が観察された。また、OVA特異的リンパ球増殖反応も上昇傾向を示した。これまでの報告で、ゲニステインは抗原特異的抗体産生および増殖反応を抑制することが報告されている。今回の結果よりエクオールは抗原特異的抗体産生を上昇させる作用を有することが明らかとなり、ゲニステインとは異なる免疫調節作用があることが示された。現在、アレルギーは国民病とされ、実に日本人の3人に1人は何らかのアレルギー症状を訴えているとされる。そのアレルギー発症の原因の一つとして細胞性免疫応答を担う1型ヘルパーT細胞(Th1)応答と体液性免疫応答を担う2型ヘルパーT細胞(Th2)応答のバランスが崩れ、Th2応答が有意になると抗原特異的IgE反応が過剰となりアレルギーの発症につながることが示唆されている。大豆製品は日本の食生活上欠かせない食品であり、その大豆製品中に存在するイソフラボンの免疫機能に対する影響を明らかにすることは興味深いことと考えられる。本申請研究では、これまで我々が明らかにしてきた大豆イソフラボンの免疫調節作用が、様々な免疫疾患の病態制御にいかに関わるか免疫疾患モデル動物を用い解析をすると共にその作用機序を明らかにし、ヒトにおける臨床応用の基盤的データーを提供することを目的とする。大豆イソフラボンの中でも,daidzeinの代謝産物であるequolについての研究報告が少ない。本研究では,DSS誘発潰瘍性大腸炎モデルを用いて大豆イソフラボン特にequolの影響についての検討を行った。

DSS溶液をマウスに自由飲水させることで大腸炎を誘発し,各種イソフラボンを経口投与することでその影響を観察したところ,equol投与群において顕著な体重減少が見られ,大腸粘膜組織の損傷が著しかった。投与するequolの量について検討したところ,20mg/kg投与群は2及び10mg/kg投与群を比べ著しい体重減少が認められた。サイトカイン産生量に関しては,20mg/kg/dayのequol投与群では,投与後6日目においてT細胞から産生される抗炎症性サイトカインであるIL-10産生が有意な低下を示した。
タウオパチー脳のタウ・アイソフォーム組成に関する生化学的・免疫組織化学的研究

皮質基底核変性症(CBD)3例、進行性核上性麻痺(PSP)3例、ピツク病(PiD)3例、神経原線維変化型痴呆(SDT)2例、argyrophilicgrain disease(AGD)2例、アルツハイマー病(AD)3例、正常対照例3例を対象とした。これらの疾患の凍結悩より抽出した可溶性タウを脱リン酸化し、6種類のアイソフォームを含むリコンビナントタウとともにSDS電気泳動後、リン酸化非依存性抗タウ抗体を用いてイムノブロットを行い、そのアイソフォーム組成を同定した。その結果、検討した全ての疾患において、4リピートタウと3リピートタウの比はほぼ1:1であった。以上から、CBD、PSP、PiDにおいても各アイソフォームの発現レベルには異常がないことが示唆され、これらの疾患において不溶性タウのアイソフォーム組成に偏りが生じる機序についてはさらに検討を要することが明らかとなった。次に、AD、PiD、CBD、PSPの脳を各種の界面活性剤への可溶性で分画後、各画分について抗タウ抗体を用いてWestern blotを行い、各疾患脳に蓄積したタウの分解・修飾様式について比較検討した。その結果、蓄積タウのアイソフォーム組成が同一であるCBDとPSPにおいて、その主要なカルボキシル末端側断片の分子量が異なること、およびアミノ末端側が切断されたタウで構成されるスメアタウの量が異なることが判明し、両疾患間において蓄積タウの分解・修飾様式に違いがあることが判明した。さらに、ADとPiDに比べ、CBDとPSPでは、蓄積タウの分解・修飾が進行していないことが明らかとなった。以上から、蓄積タウの分解・修飾様式の違いが、各タウオパチーに疾患特異的な病理像形成に関与していることが示唆され、リン酸化部位の違いといったタウの分解・修飾様式に影響を及ぼす要因の検索が、各タウオパチーの病態解明に重要であると考えられた。FTD-K(イントロン+12変異のFTDP-17)1例、皮質基底核変性症(CBD)3例、進行性核上性麻痺(PSP)3例、ピック病(PiD)3例、神経原線維変化型痴呆(SDT)2例、argyrophilicgrain disease(AGD)2例、アルツハイマー病(AD)3例、正常対照例3例を対象とした。これらの疾患の凍結脳より抽出したサルコシル不溶性タウを脱リン酸化し、6種類のアイソフォームを含むリコンビナントタウとともにSDS電気泳動後、リン酸化非依存性抗タウ抗体を用いてイムノブロットを行い、そのアイソフォーム組成を同定した。同時に、これらの生化学的解析に用いた凍結脳組織の隣接部位を切り出して解凍した小ブロックを70%エタノール固定後、凍結マイクロトームで30μm厚の浮遊切片を作成し、当施設で作成した4リピートタウ特異抗体(Ex10)を用いた免疫組織化学染色を行い、神経細胞およびグリア細胞内に蓄積したタウのアイソフォームを確認した。FTD-K、CBD、PSPのサルコシル不溶性タウは4リピートタウのみで構成されていた。ピック病の不溶性タウは、3リピートタウと4リピートタウの両方を含むが、3リピートタウ優位であった。SDTとAGDの不溶性タウは、3リピートタウと4リピートタウをほぼ同じ割合で含み、ADと同様のパターンを示した。免疫染色では、CBDとPSPの全ての神経細胞およびグリア細胞内封入体が4リピートタウ陽性であった。ピック病では、アストロサイト内封入体が4リピートタウ陽性であったが、大部分のピック球とオリゴデンドロサイト内封入体は4リピートタウ陰性であった。以上から、神経細胞とオリゴデンドロサイトにおけるタウのアイソフォーム特異的蓄積過程は、CBD/PSPとピック病とでは異なっており、疾患特異的であることが示唆された。

以上から、蓄積タウの分解・修飾様式の違いが、各タウオパチーに疾患特異的な病理像形成に関与していることが示唆され、リン酸化部位の違いといったタウの分解・修飾様式に影響を及ぼす要因の検索が、各タウオパチーの病態解明に重要であると考えられた。
筋シナジーの診断に基づく下肢運動のニューロリハビリテーション

現在,下肢のロボット療法は黎明期にある.本研究では効果的な介入の探索を目的として,サドル支持型体重免荷装置,左右分離型トレッドミル,機能的電気刺激を用いた新しい歩行訓練環境を開発した.本環境は神経筋骨格系に障害を持つ患者の歩行再建に向けて,3つの運動機能(a.バランス機能,b.腰関節伸展,c.足関節蹴り出し)を支援/訓練する.即ち,サドル支持型体重免荷装置と左右分離型トレッドミルによる端点介入によってaとbの機能を,足関節底背屈筋群への電気刺激介入によってcの機能を支援/訓練する.ここでは筋シナジーの指標を用いて,脳卒中リハビリテーションの評価/診断/介入における手法の可能性を検証した.本研究は、研究代表者らの筋シナジー抽出/予測/解析技術とロボット技術の融合により、脳卒中リハビリテーションの新展開を図るロボット療法の研究基盤を確立することを目的とする。ここでは、「歩行再建のための運動介入とロボットトレーニング」に焦点を当て、身体協調性(筋シナジー)に基づく身体の平衡点と剛性の調整訓練が脳卒中患者の下肢リハビリテーションに効果的であることを、臨床試験を通じ実験的に実証する。具体的には、以下の3つの小課題を克服することにより、課題の達成を目指す。1.診断ー異常な筋シナジーの定量評価2.治療ー正常な筋シナジーの再獲得を促進する運動介入プロトコルの開発3.効果ー臨床試験による運動介入効果のエビデンスの獲得初年度は、日常生活における様々な下肢運動(足漕ぎ運動、歩行運動、坂道運動、階段運動、走行運動)を対象に、被験者の身体協調性を解析するとともに、身体の平衡点及び剛性の推移を同定した。本結果は、脳卒中患者の異常な筋シナジーの定量評価に用いることができる。また、上記診断より明らかとなる身体協調性の差異に基づき、適切な身体協調が実現されるように身体の平衡点と剛性の調整訓練を行うロボットトレーニングシステムを現在、開発している。これらの技術に関連する研究成果は、学術論文誌(4件)、学会発表(10件)、書籍(1件)にまとめられている。また、関連技術について米国特許(1件)を取得した。現在のところ、研究遂行する上で大きな問題を生じていないため。本研究は、研究代表者らの筋シナジー抽出/予測/解析技術とロボット技術の融合により、脳卒中リハビリテーションの新展開を図るロボット療法の研究基盤を確立することを目的とする。(1)診断ー異常な筋シナジーの定量評価(2)治療ー正常な筋シナジーの再獲得を促進する運動介入プロトコルの開発(3)効果ー臨床試験による運動介入効果のエビデンスの獲得本年度は、上記(1)診断、(2)治療の課題に対し、特に「臨床応用へ向けたシナジー診断技術の洗練化」と「ロボット介入による歩行訓練システムの開発」に注力し、研究を遂行した。前者では、最大随意収縮時の筋電位を測定することなしに高い精度で筋シナジーと平衡点の推定を可能にする新しい診断法を開発した。また、後者では、ロボット制御されたトレッドミルと部分体重免荷、及び機能的電気刺激の3つの介入を組み合わせた新しい歩行訓練環境を開発し、シナジー診断による歩行訓練評価を行った。これらの成果と一連の関連技術は、学術論文1件、学会発表14件(国外6件(内4件受理決定)、国内8件)、特許出願5件(国外3件、国内2件)にまとめられた。また、国内外の学会発表で2件受賞した。(1)診断ー異常な筋シナジーの定量評価(2)治療ー正常な筋シナジーの再獲得を促進する運動介入プロトコルの開発(3)効果ー臨床試験による運動介入効果のエビデンスの獲得本年度は、上記(2)治療、(3)効果の課題に対し、ロボット介入による歩行訓練システムの開発と、健常者および脳卒中患者を対象とした訓練効果の検証を行った。運動学、運動力学及び生体情報に基づく体系的な評価により、ロボット制御されたトレッドミルと部分体重免荷、及び機能的電気刺激の3つの介入を組み合わせた新しい歩行訓練環境が効果的であることが示唆された。一連の成果と関連技術は、学術論文1件、学会発表12件(国外4件、国内8件)にまとめられている。現在,下肢のロボット療法は黎明期にある.

本研究では効果的な介入の探索を目的として,サドル支持型体重免荷装置,左右分離型トレッドミル,機能的電気刺激を用いた新しい歩行訓練環境を開発した.本環境は神経筋骨格系に障害を持つ患者の歩行再建に向けて,3つの運動機能(a.バランス機能,b.腰関節伸展,c.足関節蹴り出し)を支援/訓練する.即ち,サドル支持型体重免荷装置と左右分離型トレッドミルによる端点介入によってaとbの機能を,足関節底背屈筋群への電気刺激介入によってcの機能を支援/訓練する.ここでは筋シナジーの指標を用いて,脳卒中リハビリテーションの評価/診断/介入における手法の可能性を検証した.本年度に得られた成果に基づき、来年度も計画どおり研究を進めていく予定である。本年度までに得られた成果に基づき、来年度も計画通り研究を進めていく予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。ロボット工学29年度が最終年度であるため、記入しない。
抗HIV活性を有する海洋産ペプチドパプアミド類の全合成

Papuamide類は1999年パプアニューギニアの海綿からBoydらにより単離構造決定された一連の化合物であり,非常に強い抗HIV活性を有することが知られている。我々はこれら化合物の相対ならびに絶対立体化学を決定し,さらに薬理サンプルに必要な物質量を提供する目的でその全合成研究に着手した。Papuamide類の構成異常アミノ酸である3,4-ジメチルグルタミン((3,4-DiMe)Gln),β-メトキシチロシン(β-OMe Tyr),β-ヒドロキシロイシン(β-OH Leu)の合成法を独自な方法論で確立することに成功し,国際誌に報告した。またPapuamideの構造上の特徴である環状デプシペプチド部分の構築に取り組んだ。すなわちGlyとβ-OMe Serを縮合し,得られたこのジペプチドに対してβ-OH LeuとHprからなるジペプチドをカップリングすることで,エピメリ化を伴なうことなく目的とするテトラペプチドを得た。なお本法によるテトラペプチドの構築は極めて重要であり,ジペプチドGly-β-OMe Serに対して段階的にβ-OH Leu,Hprを導入した場合には,Hpr導入の際,著しいHprのエピメリ化が進行するという知見も併せて得ている。β-OMe Tyrに関しては立体化学が不明であることから,理論上存在する4種の立体異性体をそれぞれ導入した。このとき(2R,3R)の立体化学を有するβ-OMe TyrのみはHATUを用いる必要があるが,その他3つの異性体に関してはFDPP法がよいことを見出した。残りの2つのアミノ酸はThr-Alaのジペプチドをあらかじめ調製後,FDPPを用いてペンタペプチドと縮合した。GlyとAlaの保護基の脱保護は弱酸性リン酸緩衝液中,亜鉛粉末を用いることで行なうことができた。合成の最終段階となるマクロラクタム化反応は,EDC-HOAtを用いて行なうことで低極性物質を主生成物として得ることに成功している。現在,Massスペクトルを用いた最終的な構造決定を行なっている。本年度までに全合成の鍵となる構成異常アミノ酸3,4-ジメチルグルタミン((3,4-DiMe)Gln),β-メトキシチロシン(β-OMe Tyr),β-ヒドロキシロイシン(β-OH Leu)の独自の合成ルートを確立することに成功し,国際学術誌に報告した。(3,4-DiMe)Glnはグルタミン酸より得られるキラル双環状ラクタムに対するジアステレオ選択的なMichael反応ならびにメチル化反応,続く速度論的なプロトン化反応を鍵段階として合成した。β-OMe TyrはGarnerアルデヒドへの4-ベンジルオキシフェニルアニオンの付加反応とK-Selectrideによる立体選択的な還元反応により,すべての立体異性体の合成をおこなった。β-OH Leuは野依らのRu-BINAPによるα-アミノ-β-ケトエステルの動的速度論的分割に基づく触媒的不斉還元反応と分子内S_N2反応を組み合わせることでβ-OH Leuの4種の光学活性体の一般的合成を提供することに成功した。また構造上の特徴でもある環状へプタデプシペプチドの構築にも取り掛かっており,すでに環化前駆体の合成を完了しており,現在グリシン残基とアラニン残基間での閉環反応について検討を行なっている。その立体化学が未決定である側鎖Dhtdaに関してはSharplessの不斉エポキシ化反応ならびに立体選択的なアルキニル化と還元反応を用いることにより,考えられる8つの立体異性体のうち最初に4つを合成することを目的にその合成を進めている。

GlyとAlaの保護基の脱保護は弱酸性リン酸緩衝液中,亜鉛粉末を用いることで行なうことができた。合成の最終段階となるマクロラクタム化反応は,EDC-HOAtを用いて行なうことで低極性物質を主生成物として得ることに成功している。現在,Massスペクトルを用いた最終的な構造決定を行なっている。