hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脂肪組織の光受容体Opsin3によるエネルギー代謝機構および脂肪・骨連関の解明

Comprehensive Lab Animal Monitoring Systemの結果では呼吸商、熱産生量に変化は見られなかった。しかしOPN3ノックアウトマウスでは白色脂肪が有意に増加していることから、褐色脂肪の機能低下を筋肉もしくは肝臓で補填している可能性がある。マウス脂肪組織への光暴露実験に関しては、LEDライトをマウス体表面にとりつけることが困難であることから、Meurolux社のワイヤレスオプトジェネティクスシステムを利用した実験を現在セットアップ中である。マウス飼育環境の悪化により代謝測定実験を停止しているが、その間に脂肪組織特異的にOPN3をノックアウトするべくOPN3 flox/floxマウスとAdiponectin creを交配したマウスを作成中であった。飼育環境が改善したら、これらのマウスも含めて代謝測定実験を行う。LEDライトをマウスにとり付ける実験では、装置の改良に加え、より効率よく褐色脂肪のOPN3を刺激できる光波長を同定も重要である。また、これはin vitro実験で、より効率的な波長の光で細胞を光照射する際にも重要である。そのため、ヒドロアミンブリーチ法によるOPN3の吸光度測定実験を行う。その他のin vitro実験は、ミトコンドリアの活性がOPN3 KOまたは光照射によって変化するか否かを調べるためにcytochrome cの測定を行う。また、光刺激がOpsin3/cAMP/PKAシグナルを介しているかを調べるためにPKAシグナル分子の変化を(p38、pCREBなど)をWestern Blottingにて調べる。さらに、細胞への光刺激が神経刺激となりうるかどうかを調べるために、光暴露した細胞の細胞内カルシウム濃度をFura-2AMによる蛍光測定により確かめる。
H. pyloriの原生動物を介した環境への分布に関する研究

Helicobacter pyloriはAcanthamoeba castellaniiの体内では、培養7時間までその生存性を確認したが、培養24時間後では検出できなかった。アメーバ共培養系内では、培養24時間後においても細菌単独培養系と比較してH. pyloriの生存性が向上した。共培養系内のH. pyloriの形態を観察した結果、単独培養系においてはほとんどの菌体が球状化したが、共培養系においては螺旋状の菌体が確認された。共培養時と単独培養時にてのH. pyloriの発現遺伝子に差が見られた。以上より本菌がA. castellaniiを利用して環境中に生存している可能性が示唆された。Helicobacter pyloriが原生動物を利用して環境に分布していることを明らかにするため、本研究を行った。平成26年度は本研究のうち、「共培養系の構築」と「H. pyloriの分子生物学的な生存戦略解析」に焦点を絞り、H. pyloriと原生動物の共培養系の構築と、SDS-PAGEによる蛋白質解析、RNA-seqによるmRNA発現差解析を行った。H. pyloriと原生動物の共培養系の構築に関しては先行研究で確立済みであり、H. pyloriは微好気条件下の原生動物共培養において生存性が向上する。本年度はこの共培養系にアレンジを加え、タンパク質吸着能を持つメンブレンフィルターを組み込んで検討したところ、フィルターを使った培養では生存性の向上が制限され、本現象にタンパク質の関与が示唆された。また、密度勾配遠心を用いて、共培養系から原生動物と細菌をそれぞれ分離して採取する方法を確立し、分子生物学的解析に用いた。H. pylori 原生動物の共培養系とH. pylori単培養系においてそれぞれ発現する蛋白質を解析するため、SDS-PAGEを行ったところ、発現蛋白質に差が見られた。蛋白質は共培養系で強発現するもの、単培養系で強発現するものがそれぞれ存在し、今後質量分析器によって同定する見込みである。また、RNA-seqを行ったところ、125個の遺伝子が解析され、H. pylori 原生動物の共培養系とH. pylori単培養系ではH. pyloriのmRNA発現に差が見られた。今後、特に分子生物学的解析に関してはタイムポイントを変えて検討するなど詳細な解析が必要であり、平成27年度も実験を継続する。本研究ではHelicobacter pyloriが原生動物を利用して環境中に分布している可能性を検討した。先行研究及び前年度の研究成果により、本菌が原生動物との共培養系において自身の生存性を向上させることが培養法によって明らかになった。また、この培養系においてメンブレンフィルターや蛋白質吸着フィルターを用いて本菌と原生動物の接触を阻害すると生存性の向上は制限されることも明らかになった。更にH. pylori単独培養系と共培養系においては本菌のmRNA発現に差が見られた。最終年度においてはmRNA発現をBagglaleyの方法により統計解析したところ、単独培養系内のH. pyloriは共培養系と比較して157の遺伝子に発現増強を認めた。一方で共培養系内のH. pyloriは単独培養系と比較して286の遺伝子に発現増強を認めた。これらの遺伝子の機能的な解析を行ったところ、共培養系においては「翻訳・リボソーム構造および生合成」に関わる遺伝子が34遺伝子と最も多く発現増強し、次いで「エネルギーの産生と変換」に関わる遺伝子が多く発現増強していた。またH. pylori単独培養系と共培養系内の本菌の形態を走査型電子顕微鏡で観察したところ、単独培養系においてはほとんどの菌体が球状菌化した一方で共培養系においては正常な螺旋状の菌体が確認された。本菌の球状菌化は生きているが培養できない状態(viable but non-culturable:VBNC)で、生育環境要因の悪化に伴い誘導されるサバイバルフォームであると考えられている。従って共培養と比べて単独培養で球状菌が多く見られたことは本菌が生存にとって不利な条件下におかれていることを示すと考えられた。これらの結果より、in vitroの実験において、H. pyloriが原生動物を利用して生存性を向上させていることが明らかになった。実験計画に記載した内容の半分を終え、半分が未着手である。また、終えた実験についても詳細な検討が必要な部分を残しており、全体の進行具合は約40%程度である。微生物学分子生物学的解析で差が見られており、論文化する上でもこのデータの詳細な検討が最重要である。平成27年度上旬は蛋白質およびmRNA発現差の更なる解析を最優先で行う。

本学に次世代シークエンサーが導入され、予定していた旅費のかかる研究よりも分子生物学的解析を優先したため。シークエンスに必要なキットなど、さらに分子生物学的研究にかかる費用が肥大する可能性がある。それにより他の実験にかかる予算が圧迫された場合は採水地を疫学的先行研究により絞り込むなどして、スリム化を図る。
組織能力を高めるネットワーク特性の研究

本年度は、定量的調査と定性的研究を行った。定量的研究として、社会ネットワーク分析の手法を用いながら、医薬品の既存の特許データの分析を行った。研究目的で示したように、組織内と組織外のつながりがいかに組織の成果に影響してくるのかを明らかにするためである。その結果、組織内のつながりが重要であること(特に、他者同士をつなぐ度合いを示す媒介中心性指標や、他者からの自律性の度合いを示す構造的拘束度といった指標が有意に成果に効果を持っていた)、また組織外のつながりが成果に有意に効果があることも示された。つまり、戦略的に外部の資源を活用することが組織の成果に効果をもたらすということが示されたのである。第二に理論研究として、戦略的提携領域における過去からの変化について包括的な先行研究の分析を行い、日本経営学会にて発表を行った。戦略的提携研究の分析単位の変化が明らかに現れていることを示した。つまり、これまで分析単位は、提携単位として研究がなされてきた。社会ネットワーク分析の手法を用いた研究も提携単位の分析視角を元にした研究であるが、近年では個々の企業を分析単位にした研究が蓄積されつつあることを明らかにした。これまで戦略的提携は外部との関係をいかにマネジメントすべきかという観点から研究が進められてきたが、外部の関係をマネジメントするためには内部の組織体制を整え組織能力を蓄積する必要があるという視点の大きな変化である。そこで、第三に、定性的調査も進めたが、企業を分析単位にした調査を実施した。定性研究については、組織内に、提携を扱うための新しいグループや部門が設立される過程を追うものである。質的データであるため、現在サンプル数は少ないため、理論構築のための基盤としてのみ利用しているが、今後さらに追加し論文発表を行う予定である。本研究の目的は、組織能力を高めるネットワーク構造の特性を明らかにすることである。より具体的には、提携に関する組織能力(提携能力)を高める要因を探ることである。提携能力に関する研究は、一般的な学習能力論に還元されてしまうことによって、十分に検討されてきたと言い切れないのが現状である。そこで、本年は、研究手法・分析概念とフィールド調査の二面で以下のように研究を進めた。社会ネットワークの観点と分析手法・概念は、非常に注目されている。しかし、それらを導入した日本の研究において、手法と・概念について十分に検討が進んでいないと思われる。そのため、研究手法の問題点と今後の可能性を考える研究を行った。第一に、経営学の研究が考える説明方法とネットワーク研究を応用した経営学が考える説明図式の違いを明らかにした。すなわち、主体の行為によって成果変数を説明するという立場と、主体の埋め込まれているネットワーク構造によって成果変数を直接説明するという立場、の違いである。第二に、既存研究の実証部分の検討によって、社会ネットワーク構造によって起こされる行為の相関性は理論的に想定しているほど高いとは言えないことを明らかにした。ここから、行為を介した説明を狙うのであれば、行為との相関を十分に検討する必要があることが示唆された。フィールド調査については、インタビュー調査を実施した。また、来年度以降の質的な調査を行うために、国内の提携管理団体の協力を得る努力をした。というのも、現在、提携管理者は、提携の成功要因としてきわめて集まっているため重要であるからである。以上で述べた本年の成果は、論文2本と発表6本などとしてまとめ、社会に還元した。
高頻度中性子環境下における比例計数型ガス検出器の安定動作に関する研究

本年度は、5月と8月の2回にわたり、日本原子力研究機構FNSにおける大強度中性子ビームラインにおけるビームタイムを、合計2週間得ることができた。これにより、主に以下の二つのテーマに大別される検出器の試験を行うことができ、高頻度中性子環境化におけるワイヤー型検出器の挙動について、理解を深めることができた。1.2.5MeV中性子源を用いた検出器の特性テスト重水素ターゲットに対して重水素ビームを衝突させることにより得られる2.5MeVの単色中性子を用いて、薄型の比例計数型ガス検出器の特性調査を行った。昨年度は、三重水素ターゲットを用いることにより14MeVの単色中性子を用いたが、本年度行った試験によって、MeV領域での検出器の挙動に対するエネルギー依存性を知ることができる。測定項目は、中性子による信号の発生確率、放電確率、及び信号電荷の分布である。このうち信号の発生確率については、昨年度行った14MeV中性子の場合と比較し1/5程度の値である0.02%程度の値が得られた。本研究では、入射中性子と検出器の相互作用について計算機シミュレーションも行っており、2.5MeVの中性子に比べて、14MeVの場合の方が、検出器構造体による反跳原子核が5倍程度出やすいという結果を得ており、これはこの実験結果とも良い一致を見せている。2.ATLAS実験用大型TGCを用いた信号の測定比例係数型の検出器の特徴の一つとして、大型化しやすいということが挙げられるが、本研究においては、LHC実験におけるATLAS検出器で実際に用いられるものと同じタイプの検出器(Thin Gap Chamber)を用いて、信号測定を行った。この測定においては、確実に中性子由来の信号を捉えるために、中性子ビームをパルス状に出し、飛行時間測定法による信号測定時間の制限をかけた。この結果、中性子由来の大きな信号を受けた場合、多くの場合信号線間や、検出器間のクロストークが観測され、本検出器をATLAS実験で用いる際の問題点や、改善すべき点を提示することができた。なお、本研究の成果については、物理学会年会/分科会で適宜報告しており(本年度は4件)、投稿論文についても現在作成中である本年度は日本原子力研究所FNSにおける大強度中性子ビームラインにおけるビームタイムを2回(4週間)に渡って得ることができたため、当初来年度を想定していた大強度中性子場における検出器の特性試験について、一部の研究を前倒しで行うことができた。本年度行った研究は、主に以下の2つのテーマに大別される。1.CF4ベースのガスを用いた大強度中性子場における検出器の信号強度及び放電確率の測定これまで高エネルギー実験に用いられてきた大型のMWPCにおいては、CO2をベースとしてイソブタンやペンタンなどのクエンチャーガスを添加しているものが多かったが、中性子が添加ガスの水素原子を反跳させることにより生じる数MeV単位の局在化したエネルギーデポジットが引き起こす放電が問題になっていた。この大きなエネルギーデポジットと放電を抑制する効果の見込まれるCF4ガスをベースガスとして用い、FNSの中性子ビーム(単色14MeV,10^6n/cm^2/s)照射下における検出器の出力信号、及び放電レートを測定した。この結果、同様な動作条件においてCO2ベースとCF4ベースでは中性子に起因する出力信号の大きさが数十%抑えられ、さらに放電確率については、CF4によるものが10^2以上抑制されることがわかった。一方で神戸大学において宇宙線による検出器の検査設備を用いてμ粒子の通過に伴う信号(MIPによる信号)を測定したところ、これらの2つのガスによる信号の大きさに大差は無かった。以上のことから、CF4ベースのガスにおける中性子場での動作特性は、極めて安定したものであることがわかった。2.大強度中性子場における検出器の劣化試験原研FNSの中性子ビームラインを用い、単色14MeV、2.5×10^12n/cm^2の中性子を、検出器に照射し、特性の変化を調べた。なお今年度行った劣化試験では、CO2ベースのガスのみを用いている。結果はまだ解析中であるが、通常実験で用いる検出器の動作条件において、2×10^12n/cm^2の照射量を超えたあたりで信号の低下が見られている。この結果は、来年度に行う予定のCF4ベースガスによる劣化試験と合わせて評価する必要がある。

本研究では、入射中性子と検出器の相互作用について計算機シミュレーションも行っており、2.5MeVの中性子に比べて、14MeVの場合の方が、検出器構造体による反跳原子核が5倍程度出やすいという結果を得ており、これはこの実験結果とも良い一致を見せている。2.ATLAS実験用大型TGCを用いた信号の測定比例係数型の検出器の特徴の一つとして、大型化しやすいということが挙げられるが、本研究においては、LHC実験におけるATLAS検出器で実際に用いられるものと同じタイプの検出器(Thin Gap Chamber)を用いて、信号測定を行った。この測定においては、確実に中性子由来の信号を捉えるために、中性子ビームをパルス状に出し、飛行時間測定法による信号測定時間の制限をかけた。この結果、中性子由来の大きな信号を受けた場合、多くの場合信号線間や、検出器間のクロストークが観測され、本検出器をATLAS実験で用いる際の問題点や、改善すべき点を提示することができた。なお、本研究の成果については、物理学会年会/分科会で適宜報告しており(本年度は4件)、投稿論文についても現在作成中である
京都の都市景観のデザイン原理とその評価システムに関する記号学的研究

歴史都市・京都の都市景観は、20世紀の環境破壊により重大な危機に直面している。そこで、京都らしい景観の創生をめざして、(1)個々の要素よりも要素間の関係に注目して、多様な要素を巧みに関係づけ、美しい眺めを育んできた京都の都市景観のデザイン原理を明らかにするとともに、(2)3次元景観シミュレーションシステム及び総合的な景観評価システムを構築し、(3)さらに、それらを活用して街並みの景観デザインを展開する方法論を提示した。本研究の目的は、20世紀の環境破壊により重大な危機に直面している歴史都市・京都の景観に焦点を結び、関係性のデザインの視点から、多様な要素を巧みに関係づけ、美しい眺めを育んできた京都の都市景観のデザイン原理を明らかにし、景観の評価システムを構築することである。そのために本年度は次の研究を実施した。(1)関係性のデザインの定式化都市景観のデザイン原理を関係性のデザインの視点から明らかにする際の課題を抽出した。(2)景観という現象の多層性の解読景観の魅力は豊かな意味を伝える媒体であるところから生じる。本研究では、記号論の視点から(1)イメージ・身体性に根ざした景観、(2)環境・人間行動を写し出す景観、(3)テクストとしての景観という景観現象の多層性に注目し、それらが歴史都市・京都においてどのような現れ方をしているかを解読した。(3)関係性のデザインの視点からみた京都らしい景観のデザイン原理の解明山紫水明の豊かな自然環境に恵まれ、1200年を超える様々な時代の洗練された文化を蓄積してきた京都の都市景観に組み込まれたデザイン原理を探求した。具体的には、(1)類似と差異のネットワーク、(2)ミクロとマクロの相互作用、(3)自然と人工の関係、(4)モザイク都市としての京都の景観構造の分析を進めた。(4)3次元景観シミュレーションシステムの整備GIS(地理情報システム)、CAD・CG等を活用した3次元景観シミュレーションシステムの開発を進めた。マクロな景観からミクロな景観まで、多元的な景観をシームレスに扱うことができるシステムを整備するとともに、京都市の地形データ、住宅地図データ、建物等の高さデータ、都市計画データを統合したベースマップを作成した。(1)3次元景観シミュレーションシステムの開発・整備都市景観は、視点の位置や視線の方向によって、これとあれ、近くと遠く、私と公共、建築と都市、人工と自然、伝統と現代を一瞬にして切り結び、思いがけない姿として立ち現れる。京都には、豊かな景観資源があり、それらを有機的に関連づけ、美しい都市景観を生成する叡智が蓄積されている。こうした都市景観のダイナミックな様相を把握するために、GIS、CAD・CG、建築・都市・地形模型等を活用した3次元景観シミュレーションシステムの開発を進めた。このシステムには、景観の構成要素である記号を操作する機能、可視・不可視分析の機能、地形・街並み・建物といった異なるスケールの景観をシームレスに扱う機能、動画像を扱う機能等を組み込んでいる。(2)総合的な景観評価システムの構築景観法では、「良好な景観」の具体的な内容については地方自治体に委ねている。各地方自治体は、何がその土地で好ましい景観なのかについて議論し、形態意匠の認定、景観協議の場で特定の地点からの景観の評価を行うことが求められており、そのための評価システムの開発が急務となっている。本研究では、景観という現象の多層性に焦点を結び、(1)イメージ・身体性に根ざした景観、(2)環境・人間行動を映し出す景観、(3)テクストとしての景観、という各層の景観を評価すると共に、それらを重ね合わせて総合的な景観評価システムの構築をめざして研究を推進した。本研究課題の目的は、20世紀の環境破壊により重大な危機に直面している歴史都市・京都の景観に焦点を結び、関係性のデザインの視点から、多様な要素を巧みに関係づけ、美しい眺めを育んできた京都の都市景観のデザイン原理を明らかにし、景観の評価システムを構築することである。3年間の研究計画の最終年度に当たる本年度は、2年間にわたって進めてきた「京都の都市景観のデザイン原理」の研究成果をふまえて、総合的な評価システムをするとともに、具体的な景観デザインの実践においてケーススタディを展開した。(1)総合的な景観評価システムの構築景観という現象の多層性に焦点を結び、(1)イメージ・身体性に根ざした景観、(2)環境・人間行動を写し出す景観、(3)テクストとしての景観の多層に及ぶ情報を組み込んだ総合的な景観評価システムの可能性を検討した。特に、ワークショップや景観協議の場における個別評価の仕組みを考案した。(2)ケーススタディ本研究で構築した景観のシミュレーション・評価システムを活用して、多層に及ぶ都市景観の関係性をデザインすることにより、美しい景観、良好な景観が形成されることを示す。

具体的に、京都都心部の修徳学区及び三条通りにおける景観まちづくりにおいて、現実の景観及び代替案について、様々な人々に評定実験を行ってもらい、街並み景観のデザイン原理やシミュレーション・評価システムの妥当性を検証した。(3)報告書の作成・研究成果の発信以上を総合化することにより、(1)京都の都市景観のデザイン原理、(2)景観シミュレーションシステム、(3)景観評価システム、(4)ケーススタディを報告書にとりまとめを行った。その成果をふまえて、シンポジウムやホームページ等を介して、市民、行政、企業、専門家等に広く研究成果を発信する予定である。
カルシウムチャネル、カルシウムATPaseおよびリアノジン受容体の機能協関

骨格筋においてカルシウムチャネルとリアノジン受容体は興奮収縮連関の中心的役割を果たしている。この2つの分子は細胞内で直接カップリングし情報伝達を行っている。本研究では骨格筋型リアノジン受容体(RyR-1)遺伝子を人工的に破壊したマウス(dyspedic mouse)から骨格筋細胞を単離・培養し、心筋型リアノジン受容体(RyR-2)cDNAをこの細胞に発現させて、RyR-2が興奮収縮連関に及ぼす影響とカルシウムチャネルのチャネル活性に及ぼす影響をパッチクランプ法と蛍光カルシウム測定法を用いて調べた。RyR-2を発現した細胞では自発性の収縮が見られ,収縮にともない細胞内カルシウムの増加が観察された。RyR-2を発現した細胞をwhole-cellパッチクランプ法により電位固定しカルシウム電流と細胞内カルシウムの同時測定を行った結果、カルシウム電流密度は低く、RyR-1の発現で見られるようなカルシウム電流の増加はRyR-2では見られなかった。またこのときdepolarization-induced calcium releaseは観察されなかった。L型カルシウムチャネルのキメラであるCSk3(リピートIIとリピートIIIの間の細胞内ループにのみ骨格筋型のアミノ酸反列を持つ)をRyR-2とともに発現させると,もカルシウム電流を生成しcalcium-induced calcium relaseが認められた。さらに電子顕微鏡写真を撮影し解析したところ、RyR-2が横管と筋小胞体の間のjunctionに発現していることが確認された。以上のことから、RyR-2はcalcium-induced calcium releaseによる興奮収縮連関を起しうるが、RyR-1が持つ相互情報伝達機能つまりカルシウムチャネル活性を増加させる機能と骨格筋型の興奮収縮を媒介する機能のいずれも持たないことが明らかとなった。
磁気力顕微鏡を利用した局所電流計測

磁気力顕微鏡(MFM)を利用した測定系の空間分解能を明らかにすべく,幅0.5μmの電流路を0.2μmの間隔で平行に配置させた試料に160μA_<rms>の電流を流し,その周囲に作られる磁場勾配分布を観察した.得られた磁気力信号の特徴は数値計算で確かめた磁場勾配分布と良く一致した.これより測定系の空間分解能が0.2μm以下であることを明らかにした.一方で,MFMではカンチレバーを励振させつつ試料表面を走査し,探針先端が感じる磁気力の高さ方向依存性を平均化させていることを考慮すると,高さ方向の磁場勾配の違いをまるめこんでいるおそれがある.そこで,磁場勾配に高さ方向変化がほとんどない領域内にカンチレバーの励振を制御した場合(振幅約60nm)と磁場勾配に変化のある領域をまたいで励振させた場合(振幅約120nm)でそれぞれ磁場勾配検出を試みた.その結果,励振振幅を約60nmすると磁気力信号のコントラストが明瞭化することを確かめた.より定量的に評価すべく磁気力信号をFFT変換したところ,振幅が約60nm場合に信号の周期性(電流間隔)に相当する位置に周波数成分が集中することを確かめ,磁場勾配検出におけるカンチレバーの励振振幅制御の有効性を実証した.測定系による電流評価の定量性を検討すべく,『田の字』構造の分岐を持つ幅0.5μmの電流路を作製した.電流路の幅を一定としつつ分岐を設けることで,1:2:4という強度比の電流を観察可能な構造とした.また,長さを1:5と変えた平行電流路を試料構造内に設けることで,I_1:I_2=1:5(I=I_1+I_2)という電流比も観察可能とした.I=4μA_<rms>を流したときの磁場勾配観察を行った結果,各電流路上で検出される磁気力信号は平均値に対して±3μV程度のバラツキを持つが,いずれの電流比も磁気力信号比として33%以下のばらつきの範囲内で検出できることを確かめた.磁気力顕微鏡(MFM)を利用した測定系の空間分解能を明らかにすべく,幅0.5μmの電流路を0.2μmの間隔で平行に配置させた試料に160μA_<rms>の電流を流し,その周囲に作られる磁場勾配分布を観察した.得られた磁気力信号の特徴は数値計算で確かめた磁場勾配分布と良く一致した.これより測定系の空間分解能が0.2μm以下であることを明らかにした.一方で,MFMではカンチレバーを励振させつつ試料表面を走査し,探針先端が感じる磁気力の高さ方向依存性を平均化させていることを考慮すると,高さ方向の磁場勾配の違いをまるめこんでいるおそれがある.そこで,磁場勾配に高さ方向変化がほとんどない領域内にカンチレバーの励振を制御した場合(振幅約60nm)と磁場勾配に変化のある領域をまたいで励振させた場合(振幅約120nm)でそれぞれ磁場勾配検出を試みた.その結果,励振振幅を約60nmすると磁気力信号のコントラストが明瞭化することを確かめた.より定量的に評価すべく磁気力信号をFFT変換したところ,振幅が約60nm場合に信号の周期性(電流間隔)に相当する位置に周波数成分が集中することを確かめ,磁場勾配検出におけるカンチレバーの励振振幅制御の有効性を実証した.測定系による電流評価の定量性を検討すべく,『田の字』構造の分岐を持つ幅0.5μmの電流路を作製した.電流路の幅を一定としつつ分岐を設けることで,1:2:4という強度比の電流を観察可能な構造とした.また,長さを1:5と変えた平行電流路を試料構造内に設けることで,I_1:I_2=1:5(I=I_1+I_2)という電流比も観察可能とした.I=4μA_<rms>を流したときの磁場勾配観察を行った結果,各電流路上で検出される磁気力信号は平均値に対して±3μV程度のバラツキを持つが,いずれの電流比も磁気力信号比として33%以下のばらつきの範囲内で検出できることを確かめた.
GABAの神経発生・可塑性における役割のGAD遺伝子ノックアウトマウスによる研究

哺乳類中枢神経系の抑制性神経伝達物質であるγアミノ酪酸(GABA)の発生過程における役割と脳内各部位における特異的機能を明らかにするため、GABAの合成酵素であるグルタミン酸脱炭酸酵素(GAD)の遺伝子ノックアウトしてGABAが消失または減少したマウスを作成し、その構造と機能の変化をしらべた。GADには2種類のアイソフォームGAD65とGAD67があるので、各々の遺伝子ノックアウトマウスを作成した。GADの両アイソフォームの役割は不明であったが、GAD67ノックアウトマウス脳ではGABAが数パーセントに激減しているのに対し、GAD65ノックアウトマウスでは脳内GABA量および脳構造は正常であり、小脳シナプス伝達および一般的動物行動も正常であった。すなわちGAD67で合成されるGABAによって神経機能はほぼ維持できることがわかった。GAD67ノックアウトマウスは脳の発生は正常に進行して誕生するが、予想外の変化として口蓋裂が必発して誕生後生存できない。したがってGABAが激減したマウスの生後の脳機能についてしらべることができない。現在、口蓋形成やその他の非神経組織の発生におけるGABAの役割の解析と生後にGAD67をノックアウトしてGABAを激減させるマウスの作成を行っている。またGAD65ノックアウトマウスにもけいれんの起こりやすさ、向精神薬に対する感受性などに差がみられるので、個々の脳機能の詳しい解析を進めている。γ・アミノ酪酸(GABA)は哺乳類中枢神経系における抑制性神経伝達物質であるが、近年、それ以外に神経系の発生や可塑性への関与が示唆されている。GABAをグルタミン酸から合成するグルタミン酸脱炭酸酵素(GAD)には分子量65及び67キロダルトンのGAD65及び67があるが、各々の役割は未だ明らかにされていない。本研究の目的はこれらの問題を解明するため、GAD65及び67遺伝子のノックアウトマウスを作成して解析することである。マウスES細胞TT2に各GAD遺伝子の相同組み替えを起こさせ、8細胞胚に注入してキメラマウスを得た後、交配によりGAD変異マウスを作成した。GAD65変異マウスは重大な傷害もなく生育し、脳内のGABA含量、GAD67蛋白良、総GAD活性は正常であった。一般行動や水迷路学習は正常であるが、ピクロトキシン及びペンチレンテトラゾールによるけいれんが起こりやすかった。、GAD67ノックアウトマウスは誕生後半日ですべて死亡した。原因は重度の口蓋裂による。誕生当日の大脳皮質の分析では、GABAは7%、GAD活性は20%に減少しており、脳機能の傷害が予想される。従来の研究からGAD65が重要と予想されたが、本研究で、1)脳内GABA合成にはGAD67が主に関与すること、2)非神経組織の発生にもGABAGABAが関与することがわかった。次年度は、1)GAD65及び67をダブルノックアウトした場合の神経発生異常、2)口蓋裂を防止したGAD67ノックアウトマウスの作成とその脳機能、3)口蓋裂の発生機序、4)GAD65ノックアウトマウスにおけるけいれん発生の機序を研究する。

したがってGABAが激減したマウスの生後の脳機能についてしらべることができない。現在、口蓋形成やその他の非神経組織の発生におけるGABAの役割の解析と生後にGAD67をノックアウトしてGABAを激減させるマウスの作成を行っている。またGAD65ノックアウトマウスにもけいれんの起こりやすさ、向精神薬に対する感受性などに差がみられるので、個々の脳機能の詳しい解析を進めている。
ストリップ型シリコン検出器と超伝導磁石を用いたミュオンラジオグラフィーの新展開

宇宙線ミュオンを用いて火山などの構造物の内部構造を透視するミュオンラジオグラフィーが著しく発展している。ミュオンラジオグラフィーのための検出器技術として原子核乾板、シンチレーション検出器、ガス検出器が開発されてきた。本プログラムではストリップ型シリコン検出器と超電導磁石をミューンラジオグラフィーに初めて導入することを目的とする。ストリップ型シリコン検出器はシンチレーション検出器やガス検出器よりも1桁以上高い位置分解能を持ち、原子核乾板にはないリアルタイム測定を可能とする。その一方で高価であるために検討が進められてこなかった。申請者はスイスのジュネーブ郊外にある欧州原子核研究機構(CERN)においてATLAS実験に取り組み、特にSCTと呼ばれるストリップ型シリコン検出器の運転に取り組んできた。このSCTは60m2の面積を持ち、約10%に相当する6m2をスペアモジュールとして保存してきたが、これらを交換に使用しないことを2017年に決定した。そのため、このSCTのスペアモジュールの一部をミュオンラジオグラフィーに応用することを着想した。ストリップ型シリコン検出器の汎用性に着目し、同じくSCTのスペアモジュールが使用できる未知粒子の探索を目的としたFASER実験との共同開発を開始した。特にGeneve大学と協力してストリップ型シリコン検出器の支持構造及び冷却系の設計、読み出しエレクトロニクスの開発を進めている。そして精華大学と協力してモニタリング及びインターロックシステムを開発している。私は、ストリップ型シリコン検出器の電源及びインターフェースの開発を担当している。また、SCTのスペアモジュールの性能を評価するシステムを立ち上げ、既に約1m2について健全に動作していることを確認した。これは小規模な対象物に対するミュオンラジオグラフィーとして十分な面積である。FASER実験の共同研究者らとの議論の過程で、ストリップ型シリコン検出器の開発要素について個別に仕様書を執筆し、SCTのモジュール開発者らをはじめとする専門家からからレビューを受ける過程を経ることを決めた。SCTは約15年前に製作されたため、当時の開発者らはまだ研究活動を続けており、ATLAS実験以外に応用する際の検討について協力を得ることができた。極めて有益なアドバイスが得られ、検出器設計に反映させている。FASER実験は0.6テスラのソレノイド磁石の設計を進めており、当初使用を予定していた高エネルギー加器研究機構(KEK)が保有する0.9テスラのソレノイド型超伝導磁石の代替として使用が可能である。ストリップ型シリコン検出器のプロジェクトリーダーとして、FASER実験の共同研究者らと支持構造、冷却系、読み出しエレクトロニクス、モニタリングインターロックシステムの開発を推進しており、平成31年度以降も継続する。現在、個別の開発要素についての仕様書がほぼ完成し、発注に移行できる段階にある。それぞれのプロトタイプは7月頃に納品する予定である。基礎性能及び長期安定性のテストを平成31年度秋までに終了させ、その過程で発見した修正項目を反映させた実機を平成31年度冬に作成する。FASER実験のソレノイド磁石も平成31年度冬の完成を見込めるため、ストリップ型シリコン検出器との統合運転を行い宇宙線ミュオンの運動量測定に取り組む。

ストリップ型シリコン検出器のプロジェクトリーダーとして、FASER実験の共同研究者らと支持構造、冷却系、読み出しエレクトロニクス、モニタリングインターロックシステムの開発を推進しており、平成31年度以降も継続する。現在、個別の開発要素についての仕様書がほぼ完成し、発注に移行できる段階にある。それぞれのプロトタイプは7月頃に納品する予定である。基礎性能及び長期安定性のテストを平成31年度秋までに終了させ、その過程で発見した修正項目を反映させた実機を平成31年度冬に作成する。FASER実験のソレノイド磁石も平成31年度冬の完成を見込めるため、ストリップ型シリコン検出器との統合運転を行い宇宙線ミュオンの運動量測定に取り組む。
自治体のたばこ対策の推進に関する保健師のコンピテンシー評価尺度の開発

本研究では、自治体のたばこ対策の推進に関する保健師のコンピテンシーの構成を解明し、尺度試案、尺度案の作成を経て、信頼性・妥当性の検証を行い、一般化できるコンピテンシー評価尺度を開発することを目的としている。2018年度は、先進自治体でたばこ対策を担当している保健師等の個別インタビューによって収集したデータ(全国11か所の自治体の保健師12名、事務職2名、歯科衛生士2名、栄養士1名)のうち、保健師12名のデータの分析を継続した。分析は、氷山モデルに基づき質的記述的に分析し、他職種5名のデータと比較検討した。分析の結果、自治体のたばこ対策の推進に関する保健師のコンピテンシーとして、【たばこ対策の開拓と変革への強い動機づけ】を含む3つの「動機」があった。また保健師は、【パートナーシップ志向でたばこ対策の開拓と変革を成し遂げる姿勢】を含む3つの「態度」を示した。これらは、【たばこ対策の必要性を気づかせるためのアドボカシーを実践する】を起点とした8つのスキルの土台となっていた。コアコンピテンシーとして、たばこ対策の開拓と変革に向けた強い動機と態度を基盤として、たばこの害のない地域を目指してアドボカシーを実践し、調整・交渉術を駆使しながらパートナーシップ志向の効果的なたばこ対策を展開し、マネジメントする能力を同定した。分析結果は、6名の研究参加者に提示し、内容の妥当性(確実性)について確認を求めた。また、研究者間で協議し、厳密性を確保した。研究成果は論文化し、国際ジャーナルに投稿中である。また、国内学会においてポスター発表を行った。なお、研究全体の進行状況の遅れを鑑み、今後の研究計画を見直すとともに、研究期間を1年延長することとした(補助事業継続の承認済み)。今後は、質的研究で解明したコンピテンシーの全容に基づき、尺度試案および尺度案を作成し、最終段階の全国調査の実施を目指す。本研究におけるたばこ対策に関するコンピテンシー評価尺度の開発手順は、先進自治体の保健師へのインタビューによる質的研究に基づき、その後の量的研究(尺度案作成、全国調査での検証)を行う計画である。2018年度までに、全国11か所の先進自治体の17名のたばこ対策担当者を対象にインタビュー調査を行った。そのうち保健師12名のデータに基づき、他職種との比較検討を行いながら、氷山モデルに基づき質的記述的分析を行い、自治体のたばこ対策の推進に関する保健師のコンピテンシーを同定した。しかし、質的研究で収集したデータ量の増加に伴い、分析に予想外の時間を要し、当初計画に比べて研究全体の進行が遅れていることから、「やや遅れている」と評価した。この研究の遅れは、実践現場に密着したデータに基づく尺度開発を重視した結果であり、やむを得えないと考える。今後、この質的研究結果に基づき、尺度試案を作成することで、自治体の現場で展開されるたばこ対策の特徴を捉えた評価尺度の開発が期待できる。なお、質的研究の結果は、研究成果として学会発表および論文化した。論文は、国際ジャーナルに投稿中である(査読対応中)。今後は、研究計画の見直しに伴い、研究期間を1年延長し、2019年度を最終年度として研究を進める(補助事業継続の承認済み)。具体的には、尺度試案、尺度案作成ののち、全国調査による信頼性・妥当性の検証を行い、研究目的の達成を目指す。研究の進行状況にやや遅れが生じているため、当初計画を一部見直し、2019年度は以下の計画のとおり進める。2019年度の前半を目途に、尺度試案および尺度案を作成する。はじめに、これまでの質的研究の成果に基づき、研究者間で協議を行い、尺度試案を作成する。次に、専門家レビューにより内容的妥当性を検討し、尺度案を作成する。具体的には、自治体のたばこ対策に関する各分野(受動喫煙防止、禁煙支援、喫煙防止など)の研究者、母集団を代表する自治体の保健師(自治体種別と経験年数などのバランスを考慮)各35名を対象とする。専門家レビューの方法は、尺度試案について、質問項目の重要性、内容の妥当性、表現や項目数の適切性、現場での活用可能性等について質問紙調査(自由記述を含む)を行う。この結果に基づき、研究者間で協議を行い、修正を加え、2019年度の後半(2019年10月頃)を目途に最終段階の全国調査(本調査)を行う。全国調査の結果に基づき、信頼性・妥当性を検証し、自治体のたばこ対策の推進に関する保健師のコンピテンシー評価尺度を完成させ、一般化をめざす。なお、今後の量的研究の実施に際し、再度所属大学の倫理審査・承認を得て進める。また、本年度が最終年度となるため、研究の総括、研究成果の公表も並行して行う。

初年度(28年度)は、第1段階として、自治体のたばこ対策の推進に関する保健師のコンピテンシーの構成の解明を目的に、国内外の先行研究をレビューしたうえで、たばこ対策の専門家(3名)の推薦に基づき、全国各地の先進自治体でたばこ対策を担当している保健師等への個別インタビュー(行動結果面接法Behavioral Event Interview;BEIを参考にインタビューガイドに基づいた半構成的面接)と参加観察(取り組みに関する計画書や報告書等の文書資料、啓発用媒体等の入手・撮影)を行った。この第1段階でコンピテンシーの全容を明らかにすることは、次の段階の尺度試案作成のベースとなるため重要である。先進自治体の選定基準は、「たばこ規制・対策の自己点検票-市町村版」の5領域において望ましいレベルの対策を体系的に推進し、目標値の設定と効果評価を実施し、対策の成果が顕著である(あるいは先進的な取り組みを積極的行っている)こととした。結果、11自治体の保健師12名、事務職2名、歯科衛生士2名、栄養士1名の合計17名からデータを収集した。一方、3自治体からは、業務多忙等を理由にデータ収集はできなかった。現在は、得られたデータに基づき、卓越した保健師等が示す特徴を識別し、具体的な行動言語で定義し、質的記述的に分析を行っている。分析の際は、研究者間協議を重ね、たばこ対策と公衆衛生看護および質的研究に詳しい研究分担者と連携研究者からスーパーバイズを受けながら進めている。なお本研究は、岐阜医療科学大学ならびに金沢大学の倫理審査・承認を得た。初年度である28年度の当初の計画では、個別インタビューと参加観察のデータに基づいて尺度試案の作成までを行う予定であったが、実際にはデータ収集を概ね完了したものの、その質的分析の段階にとどまっている。この理由として、第1に、関係する2機関の倫理審査の手順を踏んだことにより審査結果が出るまでに時間がかかり、データ収集に着手するのが遅れた。第2に、幅広くデータを収集するため、研究対象者を全国各地から選定したことに加え、研究対象者数が予定より多くなったことから、調査日程の調整を含めデータ収集にかかる期間が予定より延長した。第3に、研究対象者の増加に伴い収集したデータ量も相対的に増加したことから、分析に時間を要している点があげられる。尺度開発までの研究プロセスの全体を踏まえた上で、初年度(28年度)の計画に含めた自治体のたばこ対策の推進に関する保健師のコンピテンシーの構成を質的記述的に解明することは、最終的に開発する評価尺度のもととなる尺度試案を作成するための重要な研究段階である。よって、この質的分析は時間をかけて丁寧に行う必要があり、現時点での研究計画からの遅れはやむを得ず、現在の進捗状況に応じて今後の研究計画を変更していく予定である。本研究では、自治体のたばこ対策の推進に関する保健師のコンピテンシーの構成を解明し、尺度試案、尺度案の作成を経て、信頼性・妥当性の検証を行い、一般化できるコンピテンシー評価尺度を開発することを目的としている。29年度は、収集した先進自治体でたばこ対策を担当している保健師等の個別インタビュー(行動結果面接法に基づく半構成的面接)と参加観察(文書資料、啓発用媒体等の入手)に関するデータを質的帰納的に分析した。11自治体の17名(保健師12名、事務職2名、歯科衛生士2名、栄養士1名)からデータ収集し、そのうち保健師12名のデータからコンピテンシーを抽出し、他職種5名のデータと比較検討した。保健師12名のインタビュー平均時間は66.8分であり、39の事例が語られた。録音内容とメモから逐語録を作成し、自治体のたばこ対策の推進に関する内容に注目して意味のある一文ごとでコード化した。次に、たばこ対策の推進に関するコンピテンシーと考えられるコードを類似性に基づいて整理し、コンピテンシーを構成する能力要件毎にサブカテゴリの下位概念を生成した。
環境計画策定支援システムの研究開発

いくつかの自治体を訪問し、環境情報システムの現状システムの現状と課題について検討するとともに、環境計画立案のために求められているデ-タおよび情報について整理した。また、環境管理や計画推進のための、総合的な目標設定や環境質の総合的解釈を支援するような手技法、すなわち環境を総合的に評価する指標について検討した。これら環境情報システムと環境指標に求められている多様な要求に答えることのできるような、環境計画策定支援システムの構築を最終目標としつつ、以下のようなサブシステムと、関連する技術の研究開発を行った。(1)イベントやトレンドに関する命題のファイリングと関連図表示、およびファジィ理論の適用による質的なシミュレ-ションを支援する知識ベ-スシステムをサンワ-クステ-ション上に開発した。また、数値デ-タファイリングとグラフィック表示を主要なタスクとする環境情報システムと連動して用いる環境を整えた。(2)様々なタイプやレベルの異なる部分領域モデルを統合的に用いて環境計画策定を支援できるようなモデルベ-スシステムの概念設計を行った。部分領域モデルの開発を待ってシステム化する予定である。(3)モデル構築を支援する対話型モデリング支援システムの開発・改良を行った。これはデ-タ解析部、構造モデリング部および統計モデリング部よりなり、人間が対象に対して持つ心理的イメ-ジを、コンピュ-タとの対話により徐々に確固としたものとしていき、各部分領域問題に対する構造および統計モデル構築を支援するものである。(4)ファジィ理論を応用した環境予測モデル構築手法を開発し、環境計画策定のためには不可欠でありながら、理論や統計的手法だけでは構築困難な予測や評価モデルの開発が容易にできるようになった。現在、個別領域問題に対する予測・評価モデルを順次構築中である。
不凍糖タンパク質による水の結晶化抑制機構の分子動力学研究

不凍糖タンパク質による水の結晶化抑制機構を分子レベルで明らかにすることを目的として分子動力学シミュレーションおよび結晶成長実験を実施し、それらの結果を比較・検討することにより結晶化抑制機構の物理的本質を考察した。本研究により得られた成果の概要は次の通りである。1.シンプルな構造を持つ代表的な不凍タンパク質が吸着した氷-水界面の大規模分子動力学シミュレーションを実施し、氷ピラミッド界面に安定吸着したタンパク質周辺において起こった氷の成長抑制機構を解析した。成長抑制は、吸着タンパク質周辺に成長した氷が曲率を持つことに起因した融点降下によるものであることがわかった。2.不凍タンパク質の氷界面吸着の安定性は、吸着の相互作用エネルギーの大きさだけでなく、タンパク質の構造と周辺に成長した氷の構造とのマッチングにも強く依存することがわかった。また、タンパク質と周辺水分子間に働く疎水性相互作用も安定吸着に大きく寄与していることがわかった。3.不凍糖タンパク質水溶液からの氷の結晶成長実験により、不凍糖タンパク質がシンプルな不凍タンパク質と同様に氷ピラミッド面の成長を強く抑制することがわかった。4.シミュレーション結果と実験結果より、不凍糖タンパク質による水の結晶化抑制の本質は氷ピラミッド界面に安定吸着したタンパク質周辺に成長する氷の融点降下によるものであると結論付ける。本研究のシミュレーションによりその詳細な機構が分子レベルで初めて明らかになったものと結論付ける。1.不凍タンパク質分子による成長抑制効果が大きい氷界面({1010}界面)および成長抑制効果が小さい氷界面({0001}界面)の分子レベル構造を分子動力学シミュレーションにより調べた。構造解析の結果より、{1010}界面の構造は{0001}界面に比べて不凍糖タンパク質分子の吸着サイトがフィットしやすいと考察された。このことは、氷{1010}界面方向の成長が不凍糖タンパク質により抑制されやすいというマクロな実験結果を定性的に説明する。2.不凍タンパク質分子を構成する単位ポリペプチド(アラニン-スレオニン-アラニン+糖)のポテンシャルパラメータ、および6サイト水分子モデルとの相互作用パラメータを決定した。決定したポテンシャルパラメータを用いて、単位ポリペプチドに含まれるスレオニン残基への水分子の吸着エネルギー・吸着構造、またスレオニン残基の氷界面への吸着状態をシミュレーションにより解析した。特にスレオニンのOH基周辺やアミノ基周辺への水分子の吸着がエネルギー的に安定であった。また、氷界面上への吸着もOH基やアミノ基が氷界面側に向いた状態がエネルギー的に安定であることがわかった。しかし、氷界面による吸着エネルギーの違いは小さく、マクロな成長抑制の界面方位依存性を説明するためにはポリペプチドの長さや糖鎖の影響を考慮することが重要であると考察される。3.不凍糖タンパク質水溶液からの氷の結晶成長実験を行い、成長速度の氷結晶面方位依存性・成長ステップ移動ダイナミクス・界面における不凍タンパク質分子の濃度分布などを解析した。4.平成18年度は、ポリペプチドの長さや糖の効果を考慮した不凍糖タンパク質分子モデルを用いた大規模なシミュレーションを実施する予定である。不凍糖タンパク質による氷の成長抑制に関する大規模分子動力学シミュレーションおよび不凍糖タンパク質水溶液からの氷の結晶成長実験を実施し、それらの結果を比較・検討することにより不凍糖タンパク質による水の結晶化抑制機構の物理的本質を考察した。具体的な研究成果は次の通りである。1.不凍糖タンパク質のモデルとしてシンプルな構造を持つ代表的な不凍タンパク質を用い、それが吸着した氷-水界面の大規模分子動力学シミュレーションを実施した結果、氷ピラミッド界面に安定吸着したタンパク質周辺においてのみ氷の成長抑制が起こった。これは、吸着タンパク質周辺に成長した氷が曲率を持つことに起因した融点降下によるものであることがわかった。また、タンパク質の氷界面吸着の安定性は、吸着エネルギーだけでなくタンパク質の構造と周辺に成長した氷の構造とのマッチングにも強く依存することがわかった。2.不凍糖タンパク質周辺で氷が成長する際の構成ペプチド疎水基周辺の水分子の秩序配列化過程が、疎水性ガス分子周辺の水分子のクラスレート構造化過程と定性的に類似していることが分子動力学シミュレーションによりわかった。

3.不凍糖タンパク質水溶液からの氷の結晶成長実験により、不凍糖タンパク質が氷ピラミッド面の成長を強く抑制することがわかった。また、不凍糖タンパク質は氷界面においてシンプルな不凍タンパク質と類似した吸着構造をとる可能性があることもわかった。4.シミュレーション結果と実験結果を総合的に比較・検討し、不凍糖タンパク質による水の結晶化抑制の物理的本質を検討した。不凍糖タンパク質による水の結晶化抑制は氷ピラミッド界面に安定吸着したタンパク質周辺に成長する氷の融点降下によるものであり、本研究のシミュレーションによりその詳細な機構が分子レベルで初めて与えられたものと結論付ける。
PVAカプセルの調整条件と生体触媒の固定化に関する研究

申請者らは最近、冷却したメタノール中にPVA溶液を滴下することによって、PVAカプセルが作製できることを見出し、PVAカプセル中に酸素を固定化し、活性、安定性等に対するカプセル調整条件の影響を検討した。(Arigaら,J、Ferment.Bioeng.78,74-78(1994)カプセルはタンパク質などの分子量の大きな分子の物質移動に対して、ゲル状固定化担体に比べ有利であり、これまで様々に研究されてきた。しかしながら、PVAカプセルについてはこれまで、その調整の試みさえ報告がない。本研究ではPVAカプセルの調整を与え、最適調整条件を検討するとともに、酵素の固定化条件を酵素の初期活性および安定性という見地から検討した。PVAカプセルはメタノール浸漬温度、浸漬時間を種々に変えることにより、希望の膜厚を持たせることができ、酵素の固定化担体として有用であると思われる。酵素の固定化によるMichaelis定数、最大反応速度に変化が生じ、その主な原因はPVAの共存にあることが分かった。PVAが酵素と基質の親和性に障害をきたしているのでPVAの固定化担体としての有用性が問われるかもしれない。しかし、安価で、毒性が無いので総合的には固定化担体として有望であるといえる。さらに、本研究ではPVAカプセルへの生細胞の固定化を試み、有用物質生産を検討した。冷却したメタノール中でのカプセルの作製により、カプセルの表面に付着もしくは存在する細胞はメタノールにより殺菌され、カプセルを無菌的に扱うことにより菌体の漏出のない、固定化細胞となった。これにより有用産物だけを得ることのできる新しい生産プロセスが期待できる。実際の実験においては、耐熱性α-アミラーゼを生産する遺伝子組み換え大腸菌およびβ-ガラクトシダーゼを生産する遺伝子組換え大腸菌の固定化を行ない、培地へのグリシンの添加によりPVAカプセルから酵素タンパクの生産が可能であった。また、酵素タンパクを菌体外に生産するBacillus属細菌の固定化を試み、グリシンを添加せずに長期連続培養を行なうことが可能であった。さらに培養条件の検討を行ない、培養条件の制御によりより菌体増殖を高める可能性を示した。本研究の目的はビニロンの原料として大量生産されているポリビニルアルコール(PVA)を用いて、PVAカプセルを作製し、その調製条件を調べると共に、生体触媒として酵素の固定化を行い、固定化条件を検討することである。また、これをタンパク質の拡散から調べることであるが、本年度は調製条件の検討と生体触媒の固定化を検討した。メタノール温度、メタノール浸漬時間、メタノール浸漬温度等を種々変えてPVAカプセルを作製し、最適作製条件を見出した。PVAカプセルの膜厚を画像解析処理装置にて測定し、メタノール浸漬時間の影響を調べたところ、メタノール浸漬時間の増加の共に膜厚の増加が見られた。生細胞として大腸菌の固定化を行い、菌体増殖及び酵素生産を検討した。本固定化法により、カプセル外に菌体増殖なしにカプセルを培養できることが分かった。このことから、カプセル外への菌体増殖なしに有用産物を生産するプロセスが構築できるものと期待できる。一方、菌体の増殖はメタノール浸漬時間により影響を受け、メタノール浸漬時間の長いほど、増殖開始までの時間が長いことが分かった。これはメタノールによる菌体の死滅によるものと考えられる。

また、グリシンを培地に添加することにより、酵素をカプセルより遊離生産することを試みた。2種類の分子量の異なる酵素系について検討したところ、遊離菌体と異なって、高いグリシン濃度において酵素の遊離が見られた。今後、タンパク質の拡散からこの実験結果の検討が必要である。申請者らは最近、冷却したメタノール中にPVA溶液を滴下することによって、PVAカプセルが作製できることを見出し、PVAカプセル中に酵素を固定化し、活性、安定性等に対するカプセル調製条件の影響を検討した。(Arigaら,J.Ferment. Bioeng., 78,74-78(1994))カプセルはタンパク質などの分子量の大きな分子の物質移動に対して、ゲル状固定化担体に比べ有利であり、これまで様々に研究されてきた。しかしながら、PVAカプセルについてはこれまで、その調製の試みさえ報告がない。本研究ではPVAカプセルの調製を与え、最適調製条件を検討するとともに、酵素の固定化条件を酵素の初期活性および安定性という見地から検討した。PVAカプセルはメタノール浸漬温度、浸漬時間を種々に変えることにより、希望の膜厚を持たせることができ、酵素の固定化担体として有用であると思われる。酵素の固定化によりMichaelis定数、最大反応速度に変化が生じ、その主な原因はPVAの共存にあることが分かった。PVAが酵素と基質の親和性に障害をきたしているのでPVAの固定化担体としての有用性が問われるかもしれない。しかし、安価で、毒性が無いので総合的には固定化担体として有望であるといえる。さらに、本研究ではPVAカプセルへの生細胞の固定化を試み、有用物質生産を検討した。冷却したメタノール中でのカプセルの作製により、カプセルの表面に付着もしくは存在する細胞はメタノールにより殺菌され、カプセルを無菌的に扱うことにより菌体の漏出のない、固定化細胞となった。これにより有用産物だけを得ることのできる新しい生産プロセスが期待できる。実際の実験においては、耐熱性α-アミラーゼを生産する遺伝子組換え大腸菌およびβ-ガラクトシダーゼを生産する遺伝子組換え大腸菌の固定化を行ない、培地へのグリシンの添加によりPVAカプセルから酵素タンパクの生産が可能であった。また、酵素タンパクを菌体外に生産するBacillus属細菌の固定化を試み、グリシンを添加せずに長期連続培養を行なうことが可能であった。さらに培養条件の検討を行ない、培養条件の制御によりより菌体増殖を高める可能性を示した。