hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
慢性低酸素に対する生体恒常性維持の分子機構

慢性貧血により全身性の慢性低酸素を呈する遺伝子改変マウスの肝臓において著しく高発現する遺伝子Xを同定した。この遺伝子は、低酸素誘導性因子HIFを過剰発現するマウスや急性低酸素曝露マウスにおいても発現誘導されていたが、慢性貧血マウスにおける発現は、さらに10倍以上の高レベルであった。この遺伝子Xは酵素活性を有する分泌タンパク質をコードしており、慢性低酸素状態で何らかの役割を担っていることが示唆された。現在、この酵素を阻害する薬剤を慢性貧血マウスに投与し、その影響を解析している。これまでのエリスロポエチン(Epo)遺伝子に関する研究成果をもとに、マウスEpo遺伝子改変マウスを作出し、慢性貧血を成獣で発症する実験モデルの開発に成功した。このマウスは、成体の造血に必要な量のEpoをつくることができないため、出生後2週間から貧血を呈した(Yamazaki et al Nature Commun 2013)。本マウスの臓器酸素分圧を測定したところ、野生型マウスに比べて酸素分圧が著しく低い状態であった。また、多くの臓器で低酸素誘導性転写因子HIFが活性化しており、全身性に慢性的な低酸素状態に陥っていることが明らかとなった。本マウスは生存率や寿命、繁殖能に異常を認めないことから、慢性低酸素環境に適応していると考えられた。次に、低酸素状態から回復した際の生体反応を解析する目的で、慢性低酸素マウスにEpo製剤を投与した。その結果、貧血状態が著しく改善されると同時に、高発現していた低酸素誘導性遺伝子群の発現が正常マウスと同等のレベルにまで低下した。また、貧血により代償性に肥大していた心臓も有意に縮小した。貧血回復時の鉄動態を解析したところ、貧血時には過剰に蓄積していた鉄がEpo製剤投与により、速やかに赤血球産生に利用されることが示された。さらに、本マウスを用いて、網羅的な代謝産物および遺伝子発現の解析を行ったところ、急性低酸素状態の対照サンプルとして2日間低酸素曝露した野生型マウスと似たプロファイルを示した。現在、慢性低酸素応答に特異的なメカニズムの解明を目指して、網羅的解析結果を詳しく解析している。慢性的な組織低酸素状態は、様々な病態の悪性化に関わる。これまでに、急性期の低酸素負荷のに対する細胞応答機構に関しては多くの知見が得られているが、数ヶ月以上の慢性的な低酸素に対する応答機構については、ストレス環境を再現する解析系の構築が困難であり、明らかにされていない。本研究では、造血因子エリスロポエチンの減少により慢性貧血状態に陥るマウスを慢性低酸素環境応答解析モデルとして用いて、本マウスが生存・繁殖するために獲得する慢性低酸素適応機構の探索と解析に取り組んでいる。初年度は、実際に貧血マウスが重篤な慢性低酸素状態に陥っているにもかかわらず、寿命や繁殖力に異常を認めないことを確認した。また、急性の低酸素負荷によって誘導される遺伝子群の発現が亢進していること、血糖値が上昇していることを明らかにした。2年目の本年度は、貧血マウスにエリスロポエチン製剤を投薬し、貧血から回復した状態を3週間維持したマウスの解析を行い、貧血マウスと比較した。その結果、低酸素誘導性の遺伝子発現は正常マウスと同レベルにまで低下していたものの、高い血糖値と低い肝グリコーゲン量は変化しないことがわかった次に、低酸素誘導性転写因子HIFの関与を調べるため、肝臓特異的にHIF抑制因子PHDを欠損させた遺伝子改変マウスの解析を行った。その結果、急性期の低酸素応答と同様に、慢性低酸素応答においてもHIFが中心的役割を担うことが明らかとなった。様々な病態において、慢性的な組織低酸素状態が病態の悪性化に関与していることが指摘されている。本研究では、造血因子エリスロポエチンの遺伝子改変により、成獣で重度の貧血を発症するマウスが全身性の慢性低酸素のモデル実験系として有効であることを見いだした。そこで、本マウスが生存・繁殖するために獲得する慢性低酸素適応機構の探索と解析にとりくんだ。まず、貧血マウスの遺伝子発現様式について網羅的な解析を行い、貧血マウスの肝臓で特異的に高発現する遺伝子を同定した。この遺伝子発現は、造血因子エリスロポエチンを投与して貧血状態を回復させることにより消失した。また、6%酸素環境で2日間飼育した(急性低酸素曝露)野生型マウスでは軽度の発現上昇にとどまった。現在、本遺伝子の慢性低酸素適応における役割について、阻害剤などを用いた解析を進めている。さらに、貧血マウスの代謝経路を明らかにするために、メタボローム解析を行ったところ、腎臓においてグルタチオン産生量が低下していること見出した。以上の変化が低酸素誘導性転写因子HIFを介しているか否かを確認するために、肝臓および腎臓でHIFを強制活性化させた遺伝子改変マウスを樹立し、解析を行った。その結果、肝臓における貧血マウスの遺伝子発現様式が一部再現され、HIFが急性期の低酸素応答だけでなく、数ヶ月におよぶ慢性的な低酸素状態に対する生体応答においても大きく貢献することが示された。

現在、この酵素を阻害する薬剤を慢性貧血マウスに投与し、その影響を解析している。当初の計画通りに慢性貧血マウスへのエリスロポエチン投与実験で成果を得た。また、肝臓特異的に低酸素誘導性転写因子HIFが恒常活性化したマウスの樹立と解析を行い、慢性低酸素応答におけるHIFの役割を明らかにした。成果の一部を論文投稿し、現在、リバイス対応中である。分子生物学最終年度の3年目は、これまでに明らかとなった貧血マウスのエネルギー代謝と遺伝子発現制御機構について、貧血回復モデルおよび肝臓特異的HIF恒常活性化マウスとの比較を詳細に行い、慢性低酸素応答の制御メカニズムに迫る。また、制御の分子メカニズムを明らかにする目的で、培養細胞におけるノックダウンおよび過剰発現解析を行う。計画通りにマウス実験系を確立し論文発表した。また、マウスを用いて網羅的解析を開始することができた。さらに、慢性低酸素負荷を解除する解析系も確立することができた。慢性低酸素の実験モデルを確立することができたので、これまでの網羅的解析結果を詳細に検討する。とくに、急性期と慢性期の低酸素応答系の相違点に着目する。また、代謝経路の変化が遺伝子発現制御に影響を及ぼすメカニズムを明らかにするために、エピゲノム制御系の変化を明らかにする。
可変型遺伝子トラップによる挿入突然変異マウス作製とそのカタログ化

現在のトラップベクターpU-Hachiをさらに改良するため、loxPとは組換えを起こさないペーサー部分に変異を持つlox配列も併用した新しいトラップベクターpU-17を完成した。このベクターではレポーター遺伝子入れ替えの際、5'側の部分との融合遺伝子を作ることも、3'側の部分と融合遺伝子を作ることも出来、pU-Hachiより広い応用範囲を持つ。pU-Hachiを用いて109のトラップクローンを単離した。サザンブロットでトラップベクターの挿入パターンを調べたところ、約7割が1コピーのみの挿入であり、この1コピーのみ挿入のクローンについて、未分化及び胚様体でのβ-geo遺伝子の発現を調べ、パターンにより分類を行った。その結果、ほぼ全てのクローンでいずれかの時期に染色がみられ、このベクターでのトラップ効率は大変良いことがわかった。約5割のクローンは分化後に発現の上昇を示し、分化後に発現が下降するものは非常に少なかった。pU-17では、現在までに89クローンを樹立した。今後、これらのクローンの解析を同様にして進めていく予定である。次に、puU-Hachiトラップクローンを用いての遺伝子置換の効率の検討を行ったところ、6-8割にも達する高い効率で置換に成功した。さらに、置換された遺伝子がもとのレポーター遺伝子と同様の発現を示すことを、胚様体で特異的発現パターンを示すクローンを用いて証明した。pU-Hachiなどで得られたクローンから現在までに26の変異マウスラインを樹立した。それぞれのラインでのX-Gal染色パターン解析も行っているが、胎生期では全身が、成体では脳と心臓(特に心房)が染色されるものが多いようである。現在集めたデータをHTML文書及びJPEG形式の写真として、ネットスケープ等のブラウザソフトで見れる形に編集している所である。
感温フェライトを発熱素子として用いる癌の局所温熱療法に関する研究

感温フェライトと非磁性金属環よりなる複合発熱体を2050KHzの低周波数磁界で非接触的に加温し、癌の局所温熱療法に応用するための研究を行った。結果1)発熱体は2050KHzで強度510KA/mの磁界内で、設定上限温度に対し、±0.2°C以内の優れた自己温度制御能を発揮した。結果2)設定できる上限温度は約0.2°Cきざみで可能であっ。結果3)印加磁界が低周波であるため発熱体が生体のいかなる部位にあっても磁界強度の減衰等による発熱特性の変化は認められなかった。結果3)組織内加温用小型発体(直径2mm、長さ10mm)を開発し、小動物を使って実験したところ発熱体一本当りの温度支配領域は1cm^3弱であった。このため脳腫瘍等に本方式を応用する場合は複数個の発熱体を使用する必要があると考えられた。また発熱体を小型にしてもその自己温度制御能は優秀であり、熱的損傷を組織に与えることなく極限まで高温の治療が可能と考えられた。結果4)組織内加温用発熱体に対しては特殊シリコンコーティングを施し、小動物内に長期間埋め込んだが、正常組織には致命的な障害は認められなかった。結果5)子宮頸癌等治療のため膣内過疎温用アプリケーターを試作、開発した。実際の臨床に使用したがほぼ満足すべき結果が得られた。(附規)今後、発熱体を数十μmの微粒にして組織内に注入し加温するため現在研究を行っている。本年度の研究により以下のことが明らかになった。1.)磁界強度が一定ならば、発熱素子の自己温度調節は0.1゚C以下で行なわれる。2.)磁界強度により発熱素子の基準温度は変動するが、素子の改良により、その変動域を10Gaussあたり0.2゚C以下におさえることができた。3.)発熱素子の出力は、直径4mm、長さ30mmの円柱状のもので現在のところ345ワット程度である。4.)1%NaCl寒天ファントムによる実験では、磁界強度の減衰率は1cmあたり0.5%以下で無視できる程度である。5.)発熱素子の基準温度を更に厳密に規定するためにはフェライトそのものの温度特性を改良する必要がある。C3Hマウスの移殖腫瘍に直径2mm,長さ10mmの小型発熱体を埋め込み,ソフトヒィーティング法による癌の局所温熱療法に関する実験的研究を行い以下のことが明らかになった.1, )周波数41.6KHz,最大中心磁界強度10KA/mの印加磁界にて加温したところ,腫瘍内の発熱体は大気中と同様の良好な発熱特性,自己温度制御能を発揮した.2, )腫瘍内に刺入した発熱体による有効加温領域は当初予想された,発熱体長軸方向と一致する長径10mm,短径510mmの楕円体よりやや小さめの領域と考えられた.従って,臨床的に複数個の発熱体を使用する場合,その間隔は78mm以内にする必要があると考えられた.3, )熱の腫瘍内へのより有効な拡散を期待して,発熱体表面にシリコンコーティングを施さないものを刺入した場合,約2週間で発熱体表面の蒸着銅環は溶解流出してしまい実際の使用には耐えられないことが明らかになった.またラットの正常皮下に埋め込んだものは約2週間後に組織を調べたところ強い炎症反応が認められた.一方,発熱体表面にシリコンコーティングを施こしたものでは約2週間後にもそのような炎症反応は認められなかった.従って臨床的には,組織内加温に際して発熱体のシリコンコーティングは必要不可欠と考えられた.

また直腸癌,子宮頚癌等を対象とした腔内加温を目的として犬の実験を行った.体重15kgの成犬の肛門より上方10cmの腸管内に直径4mm長さ30mmの大型発熱体を留置し,周波数43.7KHz,印加磁界強度3KA/mで加温し,発熱特性を調べたが,印加磁界の反射,減衰による発熱特性の変化は認められず,腔内加温の臨床応用にもきわめて有望であると考えられた.
循環型社会システム実現のための法的手法の評価

本研究の目的は、地球本位型社会システム実現にむけてのもっとも根幹的な課題である環境低負荷型・循環型社会への転換を促す法的手法のあり方を考察することであり、そのために次のような研究を実施した。1昨年度より引き続いて、地球温暖化防止のための国際的取り組みのあり方について、本研究メンバーを中心に検討を行い、提言した。この点に関する今後の研究テーマは、国内法・国内法政策のあり方である。2本年度においては、新たに廃棄物リサイクルの促進に関する法制度の一つである容器包装廃棄物リサイクル法(略称)を中心に取り上げ、次のような検討を行った。(1)外国の制度、特に、ドイツのDSD、フランスのエコ・アンバラージュの研究(2)わが国における国および自治体の新たな取り組みの調査、たとえば、国が関与する各種のゼロ・エミッション計画および新たな制度としての家電リサイクル法案、自治体の取り組みとして、東京ルール、自治体のゼロ・エミッション計画(屋久島など)、エコ・インダストリアル・パーク構想(群馬)、東京の中央卸売市場の野菜屑有機肥料化計画、ごみ有料化の推進(伊達市など)などの調査、研究。(3)産業界の自主的なリサイクルヘの取り組み、たとえば、キリンビール、アサヒビール、JR貨物、富士ゼロックス、ソニーなどについての実態調査、研究。3以上につき、国、自治体の包括的なゼロ・エミッション計画はいまだ具体性に乏しいこと、具体的な計画は経済的インセンティブのある分野に限られていること、産業ごとのリサイクルについては、その促進のための法整備が必要なこと、などが明らかにされ、今後の研究課題が明らかになった。
高血圧性心不全における細胞内情報伝達系の役割と心不全治療への応用に関する研究

高血圧性心不全モデルであるDah1食塩感受性高血圧ラットを用いて心肥大期と心不全期に心臓と腎臓の細胞内情報伝達系を調べた。次いでこれらラットにβ遮断薬、ACE阻害薬あるいは特異的アルドステロン拮抗薬などを投与し、心機能と細胞内情報伝達系に及ぼす影響を調べ、心機能改善における細胞内作用機序を検討した。1.心肥大ラット心臓ではeNOS発現の抑制とLOX-1発現の亢進がみられ心肥大ラットにβ遮断薬(ベタキソロール)とACE阻害薬(キナプリル)を投与すると心肥大の改善と共に、eNOS発現の亢進とLOX-1発現の抑制がみられ、β遮断薬とACE阻害薬はeNOS産生や酸化ストレス抑制を介して心保護作用を示すことが示唆された。また、心肥大ラットでは腎皮質のLOX-1と接着因子の発現が亢進しているが、選択的アルドステロン拮抗薬であるエプレレノンは糸球体硬化指数や蛋白尿の改善と共にPKC-MAPK-p90RSK経路およびRho-kinase経路を介してこれらの発現を抑制することが示唆された。2.心不全ラットでは腎障害が認められるが、p38MAPK阻害薬であるFR167653が腎障害の改善と腎臓のIL-1βやTNF-α発現を抑制したことより、心不全時の腎障害にはp38MAPKを介したサイトカインの発現が関与していると思われた。心不全ラットにエプレレノンを投与すると心機能やリモデリングは改善するが、エプレレノンの細胞内作用機序として、Akt/PKBを介したeNOSの活性化、酸化ストレスから転写因子NF-κBを介したiNOSの抑制、PKC/Src/ERK/p70S6K経路の抑制などの細胞内情報伝達系が関与していることを示唆する成績が得られた。高血圧性心疾患モデルであるDah1食塩感受性心肥大ラットと心不全ラットを用いて心臓や腎臓における細胞内情報伝達系を調べ、新しい心不全治療の可能性を検討した。1.心肥大ラットに選択的Rho-kinase阻害薬Y-27632を投与すると、降圧とは独立した機序により心血管リモデリングが改善し、Rho-kinase発現やミオシン軽鎖リン酸化は抑制された。またY-27632の投与はeNOS発現の亢進やROS産生源であるNAD(P)H oxidase p22phox、p47phox、gp91phoxおよびLOX-1発現を抑制し、心保護作用の機序としてeNOSおよび酸化ストレス-LOX-1経路が関与していることが示唆された。また選択的β1遮断薬であるベタキソロールを投与して同様の検討を行うことにより、ベタキソロールの心保護作用にはeNOSやVEGF発現の亢進やLOX-1発現の抑制が関与していることが示された。さらに選択的アルドステロン受容体拮抗薬であるエプレレノンの投与により、心肥大ラットで亢進した腎皮質のLOX-1、VCAM-1、ICAM-1、P-selectin、Rho-kinase発現やPKCε、ERK、p90RSK活性は抑制され、障害された糸球体硬化指数や蛋白尿の改善が認められたことより、エプレレノンの腎保護機序としてLOX-1-接着因子、PKCε-MAPK-p90RSKおよびRho-kinase経路が関与している可能性が示唆された。2.心不全ラットでは腎障害も認められるが、MAP kinase familyであるp38MAPKを介したIL-1βやTNF-α発現の抑制が腎障害を改善するか否かを、p38MAPK選択的阻害薬FR167653の投与により検討した。心不全病態で亢進した腎臓のIL-

1β・TNF-αmRNA発現やp38MAPK活性はFR167653の投与により抑制され、また腎障害や蛋白尿の改善が認められたことより、p38MAPKを介したサイトカインの抑制が心不全時の腎保護作用に関与している可能性が示唆された。高血圧性心疾患モデルであるDahl食塩感受性心肥大ラットと心不全ラットにACE阻害薬およびアルドステロン拮抗薬を投与して諸機能の改善ならびに細胞内情報伝達系の変化を検討した。1)Dahlラット心肥大モデルを用いてACE阻害薬quinaprilおよびbradykinin B2受容体拮抗薬FR172357を5週間投与し検討した。微小冠血管リモデリングは心肥大期で障害され、quinaprilで改善し、quinaprilにFR172357を併用投与すると改善はみられなかった。eNOS発現は心肥大期で抑制され、quinapril投与により発現が増強し、quinaprilにFR172357を併用投与すると発現は低下した。同モデルにNADPHoxidase阻害薬apocyninを単独投与するとquinaprilと同程度の心保護効果とeNOS発現を認め、quinaprilとapocyninを併用投与するとリモデリングはcontrolレベルまで改善し、eNOS発現はquinapril単独投与に比べ有意に増加した。以上よりquinaprilの心保護効果はbradykininを介したeNOS産生や酸化ストレスの抑制を介した可能性が示唆された。
機能分子を有するオリゴヌクレオチド誘導体の合成と性質

オリゴヌクレオチド誘導体をDNAあるいはRNAに対する塩基配列特異的な認識分子として利用し、特別な遺伝子発現を識別することや特定の遺伝子を制御する試みは近年活発に行われている。遺伝子識別や遺伝子発現制御の効率を上げるためには、それぞれの目的に応じてオリゴヌクレオチド誘導体を適当に機能化する必要がある。すでにわれわれは、新しいタイプのオリゴヌクレオチド合成中間体としてヌクレオシドホスホロビスアミダイトを開発し、このものが背骨格および糖部に機能分子を導入したオリゴヌクレオチドの化学合成に有用であることを見いだしてきた。すなわち、トリアミノホスフィンやビスアミノクロロホスフィンをリン酸化試薬として新たに開発し、これらリン酸化試薬によりヌクレオシドホスホロビスアミダイト中間体が簡便に得られ、このものは単離精製することなく直ちにオリゴヌクレオチド固相合成に適用可能であることを示した。上記方法は、糖部を修飾したヌクレオシドに対しても適用可能である。すでに、リボヌクレオシドの糖部2'位にインタ-カレ-タ-(アントラキノン)を導入した分子から容易にビスアミダイト中間体に誘導できることを明かにした。これを通常のオリゴヌクレオチド合成試薬と適宜組み合わせて用いることによりインタ-カレ-タ-を任意の糖部2'位に共有結合で導入したオリゴヌクレオチド誘導体を合成できることを明かにした。得られる誘導体は、相補鎖と2本鎖を形成しその安定性がインタ-カレ-ションにより著しく増大することを示した。一方、上記方法を有効に活用することによりピレンを特定の糖部2'位に有するオリゴヌクレオチド誘導体が簡便に得られることを示した。さらに、このものが中性水溶液中相補的なポリヌクレオチドと容易に会合し、これにともない蛍光量子収率、寿命とも著しく増加することを明かにした。ここで明かにしたピレンーオリゴヌクレオチド誘導体の蛍光特性は、ピレンをオリゴヌクレオチドの糖部2'位に比較的短いリンカ-で導入した誘導体に特有のものである。さらに、アミノ基選択的な蛍光試薬を2'ーアミノウリジンに導入したのちビスアミダイト中間体とし、これをもとに蛍光分子で機能化したオリゴヌクレオチド誘導体の新しい合成法を開発しつつある。
海外子会社の製品開発活動における成果生成プロセスに関する研究

本研究課題は,海外子会社の製品開発活動が,グローバルな成果を生成するまで進展するプロセスの全容を詳細に解明することを研究目的としている。具体的には, (1)内部環境要因と外部環境要因の各構成要素が製品開発活動に及ぼす影響, (2)その過程において生じる構成要素間の相互作用,(3)海外子会社内部の要因,(4)それらの影響に基づく製品開発活動が成果に及ぼす影響を分析した。事例研究および事例間と産業間の比較分析の結果,(1)内外環境要因の各構成要素が,海外子会社の製品開発活動と成果に及ぼす多様な影響,(2)構成要素間の相互作用が,海外子会社の製品開発活動と成果に及ぼす多様な影響,(3)海外子会社の製品開発成果の生成に重要な影響を及ぼす(海外子会社)内部の要因等が明らかになった。本研究は,海外子会社の製品開発活動がグローバルな成果を生成するまで進展するプロセスの解明を目的に,2ヵ年計画で実施される.初年度にあたる平成22年度は,以下の研究を行った.9月11月事例研究の実施に向けた予備調査を行った.事例研究の対象企業の選定および在日外資系企業(海外子会社)における製品開発活動の概況の把握を目的に,「外資系企業総覧(各年版)」をはじめ外資系企業に関連する文献について,広範な調査と検討を行った.その結果,事例研究の対象として適切な産業および企業を選定するとともに,在日外資系企業における製品開発活動の概況(現状・沿革・動向等)を把握した.12月3月先行研究のレビューと並行し,海外子会社(在日外資系企業)および本国親会社の事例研究を行った.事例研究の一層の精緻化を目的に,広範かつ多面的に先行研究のレビューを展開した.このレビューと並行し,予備調査によって決定した海外子会社(在日外資系企業)とその本国親会社の事例研究を行った.広範な先行研究のレビューの結果,分析枠組の一層の精緻化と事例研究の対象企業の多面的な調査が可能となった.以上に基づき事例研究を行った結果,対象企業の製品開発活動の進展プロセス等が明らかになった.平成23年度では,平成22年度に行った予備調査,先行研究のレビュー,事例研究の結果と課題を踏まえ,より詳細な事例研究ならびに新たな企業の事例研究等に着手する予定である.本研究は,海外子会社内部の要因を詳細に分析し,海外子会社の製品開発活動が,グローバルな成果を生成するまで進展するプロセスを解明することを研究目的としている。本研究は2か年計画で実施され,最終年度にあたる平成23年度では,おおむね「研究実施計画」に沿って以下の研究を実施した。第1に,昨年度に実施した在日外資系企業の製品開発活動に関する概況調査および事例研究の結果を踏まえ,化学産業に属する在日外資系企業2社を対象に事例研究を行った。第2に,対象企業固有の要因を統制するために,上述した2社の事例間の比較分析を行った。第3に,産業固有の要因を統制するために,これまでの研究成果と上述の事例研究の結果との比較分析を行った。以上の事例研究および比較分析においては,長期に及ぶ史的観点から対象企業の製品開発成果の生成プロセスを分析した。また,「研究の目的」および分析枠組にしたがって,(1)内部環境要因,(2)外部環境要因(現地環境要因),(3)海外子会社内部の要因に関して検討・分析を行った。第4に,上述の事例研究および比較分析と並行して,分析枠組の精緻化および最新の研究動向に関する情報収集を目的に,昨年度に引き続き先行研究のレビューを実施した。以上の先行研究のレビューによって得た知見は,事例研究および比較分析にいかされた。なお,本研究課題の研究成果の一部は次頁の通り研究論文および学会発表の形で発表され,以降も順次論文等の形で発表する予定である。
無蛋白培養系を用いた口腔癌細胞によるサイトカインの産生

われわれの開発した口腔扁平上皮癌細胞の無蛋白培養系を用いて、ヒト歯肉癌由来無蛋白培養細胞株Ca9ー22PFが何らかのサイトカインを産生しているか否かをBALB3T3細胞のDNA合成促進活性を指標に検討した。その結果Ca9ー22PF培養上清中には静止期のBALB3T3のDNAを促進することのできる活性が少なくとも2種類存在することが明らかとなった。1つは、ゲルクロマトにて分子量約20kから15k付近に溶出され熱に対して不安定な画分であり、ラジオイムノアッセイによりILー1αであることが明らかとなった。他の1つは、35k付近に溶出され熱に対しても抵抗性を示した。この画分は、抗体による中和試験によりPDGFーAAであることが明らかとなった。口腔癌細胞がPDGFーAAを産出していることを蛋白レベルで証明したのは、われわれが初めてであると思われる。また、既知のサイトカイン産生の可能性をスクリ-ニングする目的にて、サイトカイン遺伝子の発現をPCR法にて検討した。口蓋部扁平上皮癌の頚部転移巣由来の無蛋白培養株ZAPFよりmRNAを分離し、このmRNAをテンプレ-トとしてMoーMLV Reverse Transcriptaseにより一本鎖cDNAを合成した。これを検体としてPCR法により目的の遺伝子の増幅を行い、アガロ-スゲル電気泳動(AGE)により目的の大きさのバンドが認められるか否か検討した。今回目的としたサイトカイン遺伝子として、GーCSF,MーCSF,GMーCSF,ILー3及びILー6の5種類を選んだ。PCR反応後の各サンプルをAGEにて分析したところ、GーCSF,ILー3,ILー6を目的とした場合には、予想されるバンドを検出することはできなかった。しかし、GMーCSFを目的とした実験では、遺伝子配列から予想される630base pairs(bp)のバンドが検出された。また、MーCSFを目的の遺伝子とした実験では、予想される450bpのバンドが検出された。さらに、このDNAサンプルをMung Bean Nucleaseにより消化し、制限酵素Stu Iによる切断を行いAGEにて解析したところ、遺伝子の制限酵素切断地図より予測される150bp及び300bpのバンドが検出された。これらの結果は、ZAPF細胞が少なくともmRNAレベルではGMーCSF及びMーCSFの遺伝子を発現していることを示している。今後さらに、GMーCSF及びMーCSFが蛋白レベルにおいても構成的に産生されているのかをわれわれの開発した無蛋白培養系を用いて検索する必要があるものと思われる。我々は、新しい完全合成無蛋白培地(PF86ー1およびPF88ー10)を開発し、現在までに5種類の口腔癌由来および1種類の外陰部由来の計6種類のヒト扁平上皮癌細胞株の長期継代培養を可能とした。

この培地は、共にアミノ酸、ビタミン、無機塩類の他に核酸前駆物質及び少量の不飽和脂肪酸より構成され、ペプチドホルモンを含め、一切の蛋白成分を含んでいない。このためこの培地を用いたヒト扁平上皮癌細胞の無蛋白培養系では、培養上清中に含まれる蛋白成分はすべてヒト扁平上皮癌細胞の産生したものと考えられることができる。以上の特徴を踏まえて研究を行い、以下の成果を上げた。1.口腔癌の大部分を占める扁平上皮癌由来細胞株の長期継代培養を支持することのできる新しい完全合成無蛋白培地(PF86ー1およびPF88ー10)を開発した。2.6種類のヒト扁平上皮癌細胞が、何らかの生理性物質を産生しているか否かをresting BALB/3T3細胞のDNA合成を指標に検索した。その結果、これらすべてのヒト扁平上皮癌細胞がBALB/3T3のDNA合成促進物質をその培養上清中に分泌していることが明らかとなった。この中で、歯肉癌由来細胞Ca9ー22PFの産生しているものに関して、現在精製を進めている。3.口腔癌の顎骨吸収機序を解明する目的で、マウス頭頂骨の器官培養系を用いて骨吸収促進物質の検索を行った。その結果、Ca9ー22PFの培養上清中の骨吸収促進物質として、PG E_2,ILー1 α,PDGFーAA,PTHrPが関与していることが示唆された。口腔癌の特性を無蛋白培養系を用いてサイトカイン産生の面から研究することの重要性が示唆された。昨年度までの研究により、口腔癌の大部分を占める扁平上皮癌細胞の無蛋白培養系を完成させた。この系を用いることにより、ヒト歯肉癌由来無蛋白培養細胞株(Ca9ー22PFがILー1α及びPDGFーAAを構成的に産生していることを見いだした。しかし、口腔癌細胞によるサイトカインの産生をバイオアッセイ系のみで検索することは、多くの費用と労力を必要とする。そこで本研究年度においては、無蛋白培養口腔扁平上皮癌細胞の産生するサイトカインをスクリ-ニングする目的にて既知のサイトカイン遺伝子の発現をPolymerase Chain Reaction(PCR)法を用いて検索した。口蓋部扁平上皮癌の頚部転移巣由来の無蛋白培養株ZAPFよりNonidet Pー40を用いてcytoplasmic RNAを抽出した後に、OligoーdTカラムを通してmRNAを分離した。このmRNAをテンプレ-トとしてMoーMLV Reverse Transcriptaseにより一本鎖cDNAを合成し、これを検体としてPCR法により目的の遺伝子の増幅を行い、アガロ-スゲル電気泳動(AGE)により目的の大きさのバンドが認められるか否か検討した。今回目的としたサイトカイン遺伝子として、GーCSF,MーCSF,GMーCSF,ILー3及びILー6の5種類を選んだ。PCR反応後の各サンプルをAGEにて分析したところ、GーCSF,ILー3,ILー6を目的とした場合には、予想されるバンドを検出することはできなかった。しかし、GMーCSFを目的とした実験では、遺伝子配列から予想される630base pairs(bp)のバンドが検出された。また、MーCSFを目的の遺伝子とした実験では、予想される450bpのバンドが検出された。
「住民主導の教育と医療」を軸とした地域づくり

「住民主導による教育・医療」を軸とした地域コミュニティ活性化の可能性を、当事者との協同的実践を推進、貴重な実例をつくりつつ検討した。同時に、「閉鎖的な専門的組織・専門家集団への依存」を前提に運営されてきた教育・医療制度を、住民の主体的参加を前提にした制度へと転換する方途について、Y.Engestromの活動理論(activity theory)を理論的枠組みにして考察した。具体的なフィールドには、(1)住民主導の教育実践として、大阪府寝屋川市で展開されている「寺子屋Neyagawa」の活動(毎週土曜に学校を舞台に住民が手作りの教育をする活動)、(2)住民主導の医療実践として、京都市小野郷地区における「地域医療の拠点づくり」の活動(無医地区に住民主体で診療所を設営・運営する活動)をとりあげた。いずれにおいても、研究者が当事者と共に活動を推進しつつ、その経過を追尾し、問題点や失敗経験をも含めて発信した(著書「コミュニティのグループ・ダイナミックス」)。とくに、(1)に関しては、学校側の抵抗に抗して敢えて学校を活動の場とすることによって、学校そのもののあり方を問い直し、地域の教育機能を復権させる可能性を指摘した。(2)に関しては、「医者と患者(住民)の上下関係を是認した上で、医者が患者重視の医療サービスを提供すること」をもって理想的な医療とみなす風潮の中、「住民主体の地域医療」という理念に理解を得ること自体が、最初に乗り越えるべき大きな壁として立ちはだかっていること、また、高齢化した地域における住民主体の診療所運営は、医療以外の領域でも住民が地域活性化に積極的に取り組み出す起爆剤になりうることを指摘した。本研究は、「住民主導による教育システム・医療システムの構築」を通じた地域(コミュニティ)活性化に関して、研究者が当事者と共同的な実践を展開しながら研究しようとするものである。具体的には、(1)住民主導の教育システムづくりの実践として、大阪府寝屋川市で展開されている「寺子屋Neyagawa」の活動、(2)住民主導の医療システムづくりの実践として、京都市小野郷地区における「地域医療の拠点づくり」の活動をとりあげる。(1)「寺子屋Neyagawa」(大阪府寝屋川市)当事者とともに日常的な活動に携わりながら、(a)「寺子屋」に対する子どもと親のニーズや、参加の動機と経緯、(b)運営に携わる住民たちの参加の動機と経緯、および、活動に対する現状認識、(c)場所を提供している学校、および、教育委員会の「寺子屋」活動に対する反応を、時系列的に追尾した。それを通じて、子どもや親、運営に参加する住民、学校・教育委員会それぞれの規範がどのようにぶつかり、どのように変化していくかを検討した。また、教育の専門家として活動に参加する教師が、通常の学校教育とは異なる、住民主導の教育の中でいかなる役割を発揮すべきか、という点についても、教師のナラティブを分析することによって明らかにした。(2)「地域医療の拠点づくり」(京都市小野郷地区)小野郷における活動を、住民ボランティア、協力する医師、一般住民とともに推進しながら、その経緯と問題点を時系列的に追尾した。とくに、「地域のホームドクター」という理念が、どのようなプロセスをへて地域に浸透するかを検討した。伝統的な集合体の規範と、住民ボランティアに象徴される新しい規範がどのように相克してくのか、この点についても重点的に検討した。本研究は、「住民主導による教育活動・地域医療」を通じた地域(コミュニティ)活性化に関して、研究者が当事者と協同的実践を展開しながら研究しようとするものである。具体的には、(1)住民主導の教育活動の実践として、大阪府寝屋川市で展開されている「寺子屋Neyagawa」の活動、(2)住民主導の地域医療の実践として、京都市小野郷地区における「地域医療の拠点(診療所)づくり」の活動をとりあげている。(1)「寺子屋Neyagawa」(大阪府寝屋川市)一応の安定期に入ったことに鑑み、これまでの経緯を整理し、ある程度の理論的考察を行った。

すなわち、(1)この活動は、あくまでも学校を活動の場としつつも、関心のある市民はだれでも気軽に参加できる「軽さ」を特徴としているが、この軽さによって、学校という閉鎖空間を打破しうる可能性を秘めていること、(2)教師-生徒、親-子といった縦の関係ではなく、地域のおじさん、おばさんが地域の子どもたちを教育するという「ななめの関係」による教育機能の復活に結びつきうることを、Y.エンゲストロームの活動理論(activity theory)の観点から考察した。(2)「地域医療の拠点(診療所)づくり」(京都市小野郷地区)以下のような推移を活動を共にしながら追尾した。すなわち、近い将来に計画している「住民が設立、運営する診療所」づくりの準備段階として、医師の一人が個人開業の形で医療を開始した。この準備期間の間に、当地における医療ニーズの実態を把握するとともに、住民が診療所運営に必要なノウハウを学習することが意図されている。当初、1年と予定されていた準備期間は約2年になろうとしている。しかし、住民リーダーの姿勢は明らかに能動的になっており、住民による診療所の再立ち上げに向かって進みつつある。本研究は、(1)住民主導の教育システムづくりの実践として、大阪府寝屋川市で展開されている「寺子屋Neyagawa」の活動、(2)住民主導の医療システムづくりの実践として、京都市小野郷地区における「地域医療の拠点づくり」の活動をとりあげ、「住民主導による教育システム・医療システムの構築」を通じた地域(コミュニティ)活性化に関して、その可能性を検討しようとするものである。今年度は、上記の(1)、(2)ともに現場の動きが一応の安定状態に入ったこともあり、主として、前年度までの(当事者と研究者の)協同的実践の成果を理論的に考察し、3年間の総括をすることに重点を置いた。具体的には、エンゲストロームの活動理論(activity theory)を援用し、(1)、(2)の活動が、現在主流となっている学校教育活動と医療活動を脱構築する活動(脱構築的活動、エンゲストロームの言うlearning activity)であることを明確にした。その成果は、「コミュニティのグループ・ダイナミックス」(京都大学学術出版会)の第3章と第4章に詳述した。さらに今年度は、(1)、(2)の活動をさらに進展させるヒントを得るために、鳥取県智頭町で20年にわたって展開されている先駆的な地域活性化運動を検討し、同運動が住民主導の教育・医療システムづくりに持つ含意を検討した。その結果、とくに(2)については、診療所経営の住民主導化のみを進めるよりも、「地域の高齢者を地域の人々が支える」仕組みを構築する過程の一部に、住民主導の診療所を位置づけるという新しい方途が示唆された。
植物ウイルスの共通分子パターンを認識する新規広域抵抗性機構の解明

植物ウイルスは化学農薬による防除が不可能なため、その防除は抵抗性遺伝子の利用に大きく依存している。従来用いられてきた種特異的gene for gene抵抗性遺伝子は、対応するウイルス種に特異的なウイルスタンパク質を認識し抵抗性を発揮すると考えられている。しかし、こうした抵抗性はウイルスの変異によりたびたび打破されてしまう点が問題であり、持続性が高く、より広域な抵抗性を発揮しうる遺伝子の探索が喫緊の課題であった。本研究は植物が持っていると考えられる、ウイルスの共通分子パターンを認識して発現する広域抵抗性反応の探索、さらにその機構の解明を目的としている。本年度は当研究室で単離した抵抗性遺伝子JAX1の抵抗性に着目して研究を進めた。JAX1はPotexvirus属ウイルスのplantago asiatica mosaic virus (PlAMV)に対する抵抗性遺伝子としてシロイヌナズナエコタイプBay-0から単離された。その後の解析でJAX1抵抗性はPotexvirus属に属する多数のウイルスに対して有効であることが示され、非常に広域なウイルスに対する抵抗性であると考えられた。JAX1抵抗性がウイルス感染過程のどの段階を阻害しているかを明らかにするために、in vitro解析を行った。その結果、複製を阻害していることが示された。しかし、具体的に複製のどの段階を阻害しているかまでは明らかにすることができなかった。26年度が最終年度であるため、記入しない。今年度はATCCより種々のウイルスを取り寄せ、そこから抵抗性誘導ウイルス因子候補ライブラリを構築した。まず、35Sプロモーターの下流にplumpox virus-GFP(PPV-GFP)とRFPを搭載したプラスミドを作出した。RFPの下流には35SプロモーターとTOPO配列を挿入した。次に、取り寄せたウイルスに対し、NCBIのウイルス配列情報をもとにプライマーを設計し、ウイルスのタンパク質コード領域、非コード領域をPCRにより増幅した。得られた増幅産物を先に作出したプラスミドのRFP配列下流にTOPOテクノロジーを用いてクローニングし抵抗性誘導ウイルス因子候補ライブラリとした。得られたライブラリはNicotiana benthamianaとアグロバクテリウムを用いた一過的発現系により、発現を確認した。本研究成果で得られたライブラリを、今後シロイヌナズナプロトプラストに導入することでウイルス抵抗性誘導因子を探索できる。また、PPV配列を他のウイルス配列に入れ替えることで様々なウイルスに対する抵抗性を検討することができる。JAX1はPotexvirus属ウイルスのplantago asiatica mosaic virus (P1AMV)に対する抵抗性遺伝子としてシロイヌナズナエコタイプBay-0から単離された。JAX1によるウイルスの認識機構を明らかにするため、JAX1抵抗性を打破するウイルスの単離を試みた。通常の接種法では抵抗性打破ウイルスは出現しなかったが、接ぎ木を用いた非常に強い接種圧での接種法により打破ウイルスを獲得した。この打破株の配列中の変異部位を調べた結果、複製酵素中の1アミノ酸の変異のみでJAX1抵抗性を打破していることが示された。さらに、この1アミノ酸はPotexvirus属内で広く保存された共通のアミノ酸であることがウイルス配列の解析により示された。よってJAX1はこの共通のアミノ酸を認識してPotexvirus属に対する広域な抵抗性を発揮していると考えられた。

本年度は当研究室で単離した抵抗性遺伝子JAX1の抵抗性に着目して研究を進めた。JAX1はPotexvirus属ウイルスのplantago asiatica mosaic virus (PlAMV)に対する抵抗性遺伝子としてシロイヌナズナエコタイプBay-0から単離された。その後の解析でJAX1抵抗性はPotexvirus属に属する多数のウイルスに対して有効であることが示され、非常に広域なウイルスに対する抵抗性であると考えられた。JAX1抵抗性がウイルス感染過程のどの段階を阻害しているかを明らかにするために、in vitro解析を行った。その結果、複製を阻害していることが示された。しかし、具体的に複製のどの段階を阻害しているかまでは明らかにすることができなかった。26年度が最終年度であるため、記入しない。ウイルス抵抗性誘導因子候補ライブラリの構築を終え、実験の準備を整えた。これは申請した研究実施計画の通りであるため、現在のところ研究はおおむね順調に進展していると判断する。本年度はウイルスに対する広域抵抗性を誘導する共通分子パターンの探索を目的としており、達成できている。抵抗性誘導ウイルス因子候補ライブラリをシロイヌナズナプロトプラストに導入し、PPV-GFPの蛍光を蛍光プレートリーダーで測定する。ウイルス因子をクローニングしていないプラスミドによるPPV-GFPの蓄積量と比べて、GFP蛍光が弱いものを特定する。さらに、特定した抵抗性誘導ウイルス因子の塩基配列やアミノ酸配列、モチーフ、機能ドメイン、修飾などに共通のパターンがないかをweb上のデータベースなどを用いて比較解析する。次年度はプロトプラストを用いて引き続き新規抵抗性を探索すると同時に、すでに発見された抵抗性の共通分子パターン認識後の抵抗性機構を解明していき、広域抵抗性の機構を解明していく予定である。
クライオジェニック用高分子材料の分子設計と開発

本研究においては、通常の材料の使用温度よりはるかに低い温度領域(クライオジェニック領域)において所定の物性あるいは性能を示す高分子材料を分子設計し開発することを目的として、関連する知見の集積を行った。具体的には、(1)クライオジェニック用ポリマーおよびマトリックス材料、(2)クライオジェニック用複合材料、の2班に分かれて、それぞれの分担課題について調査を行い、全体会議および班会議を各2回開催して、研究の現状把握と解析および今後の展望に関して専門的な立場から検討を加えた。現在のところ、ポリマーの化学構造と低温特性の関係についてはほとんど知られていないので、既存のポリマーの諸特性の温度依存性について調査を行い、クライオジェニック用ポリマーを設計するための基本的条件を検討した。また、複合材料については、ポリマーと補強材の組み合わせや調製方法によって、それらの低温特性に著しい影響があらわれることが確認された。さらに、低温領域におけるポリマーの物性測定は、手段が限られるうえに測定技術が難しくまだほとんど進んでいないことが明かになったので、ここでは現在行われている測定方法の長所と短所を慎重に検討し、高分子材料の低温特性を正確に判断し得る評価方法について調査した。これらの検討課題について討論を重ねた結果、高分子材料や複合材料に限定することなく広い意味での有機材料を対象として、クライオジェニック領域で用いることのできる材料を設計・合成し、またそれらの特性と機能を正確に解析するためには、基礎科学の立場で統一した観点から検討し、この分野における学術の体系化を計ることが重要であるという結論に達し、「クライオジェニック有機材料の科学」の申請領域名で平成7年度発足重点領域研究として申請することとなった。
補体を介した妊娠高血圧症候群の病態解明と新たな治療薬の開発

我々は、ヒト検体で補体活性がPreeclampsiaの病態に関与しているか調べるとともに、これまで開発してきたヒト臍帯血管内皮細胞を用いたPreeclampsia母体血管内皮モデルを生かして、sFlt-1が血管内皮障害を起こす新たなメカニズムを解明、新たなPreeclampsiaモデルを確立する。また、既存薬ライブラリーをそのモデルに添加することで、補体抑制作用を介して血管内皮障害を改善することができる、妊娠中に使用可能な新規薬剤を網羅的にスクリーニングすることを目的としている。初年度はin vivoにおける検討として、補体がPreeclampsiaの予知・予後予測マーカーになり得るかの検討を行った。血清および尿中おける補体マーカーの検索を行い、Preeclampsia発症について、補体の短期予後予測性能を評価することを目的とした。産科婦人科外来において妊婦健診を行っている妊婦を対象として、Preeclampsia発症のリスクが高い患者を対象とし、補体活性とPreeclampsia発症状況の相関を検証した。新規の高血圧・蛋白尿を認める妊婦における血清および尿を経時的に集積した。また、Preeclampsia発症時にも収集した。血液は血清分離用採血管に収集、尿はクリーンキャッチもしくはフォーリーカテーテルで収集したものを用いた。検体は-4°Cで遠心分離したのちすぐに-80°Cで保存した。補体活性はC3a/C3a desArg (C3a)、C5a/C5a desArg (C5a)、C5b-9をELISA法(BD Biosciences)にて測定した。また、同じく血清および尿中のsFlt1やPlGF濃度をELISA法(R&D Systems)で測定し、補体活性との相関性を調べている。補体活性がPreeclampsiaの早期発見のマーカーになりえるのかを検討を行っている。データの集積中であり、今後検討を進めていく。補体活性と母児の予後についても比較検討を追加していく。血圧や24時間蛋白尿、その他の生化学検査(肝機能、腎機能)、子癇、肺水腫、常位胎盤早期剥離といった妊娠合併症についてのデータは診療録から抽出する。
遺伝子組み換えツェツェバエの創出―アフリカトリパノソーマ症制圧を目指して

アフリカトリパノソーマ症を媒介するツェツェバエの新たなコントロール法の構築を行うことを目的として、以下の解析を行った。ツェツェバエのコロニーを確立し麻酔システムの検討を行った。さらにGlossina palpalis defensin(GpDef)分子の抗アフリカトリパノソーマ原虫活性プロファイルを明らかにした。当初予定していた、貯精嚢へのインジェクションは困難であったため、アフリカトリパノソーマ原虫の動き、エキソソーム関連分子解析、ツェツェバエゲノム上のポリドナウイルス類似配列解析を行い、遺伝子組換えシステム構築の可能性検討を行った。アフリカトリパノソーマ症はアフリカトリパノソーマ原虫により引き起こされ、ツェツェバエにより媒介される。本疾患はサブサハラのアフリカで人々の健康とタンパク源となる家畜に甚大な被害を与えている。このような背景の下、本研究は未だ世界中で成功していないツェツェバエの遺伝子組換えを行い、トリパノソーマを伝播しないツェツェバエの作製を目指すものである。本年度はガーナで、研究協力者のDr. Yawsonと詳細なディスカッションを行い、Glossina palpalis種のコロニーを本研究用に確保した。さらに、メンブレンフィーディングにより吸血させるシステムを確立した。またインジェクション用のDNAの調製を行った。しかし、DNAのインジェクションを行うために当初計画した氷上5分の麻酔では十分でないこと、さらに解剖の際のオリエンテーションが難しいことが明らかになった。また、長時間の停電のためコロニー維持が難航し、十分な数のツェツェバエを確保できなかったが、インジェクションの試行を開始した。本疾患はサブサハラアフリカで人々の健康とタンパク源となる家畜に甚大な被害を与えている。現在アフリカトリパノソーマ症の主要なコントロール方法はツェツェバエの殺虫剤によるものが主流であり、遺伝子組換え昆虫による制御は成功していない。このような背景をもとに、本研究は遺伝子組換えツェツェバエの創出を目指すものである。本年度から所属機関、研究拠点が変更となったため、研究協力機関であるGhana Atomic Energy Commissionとの物理的距離が問題となったが、以下の解析を進めた。2.遺伝子組換え技術の基盤整備を行い、ノックインCrisprシステムの確立を進めた。3.農林水産省の許可を得てアフリカトリパノソーマ原虫の輸入を行い、培養系のセットアップを行った。4.FLynapによる昆虫Anophelesの麻酔方法について検討を行い、論文発表を行った。平成27年度に現所属に異動した。そのため、新たに研究環境のセットアップを行う必要があった。また、国内においてツェツェバエの維持を行っている機関がなく、また輸入に際しても厳しい条件があるため、国外の機関との連携を行う必要があるが、上記により、出張のための十分な時間が取れなかったため。アフリカトリパノソーマ症の主要なコントロール法はツェツェバエに対するものが主流であり、このような背景をもとに本研究では昆虫の遺伝子組換えの分子基盤の確立により、ツェツェバエの新規コントロール法を探索するものである。しかしながら昨年度から所属機関が変更となり、研究協力機関であるGhana Atomic Energy Commissionとの物理的距離が問題となった。そのため昨年度より代替システムの検討を始め、さらに今年度は以下の遺伝子組換えの分子基盤整備とエフェクター候補分子の解析を行った。1.遺伝子組換え技術としてCrisprノックインシステムの構築を行い、CHO-K1細胞への遺伝子導入システム構築を行った。2.ツェツェバエDefensin分子の培養系での抗アフリカトリパノソーマ原虫活性、抗菌活性解析を行った。推定マチュア部位、推定活性部位ともに、培養アフリカトリパノソーマ原虫(ツェツェバエ感染型)に対して、500μM以上の濃度で増殖を抑制したが大腸菌、黄色ブドウ球菌に対しては、推定マチュア分子、推定活性部位いずれも2mMでも増殖阻害はかからず、ツェツェバエDefensin分子の抗微生物活性は種によって特異的スペクトルがあることが明らかになった。昨年度から所属機関が変更となったため、研究協力機関であるGhana Atomic Energy Commissionとの物理的距離が問題となった。国内においてツェツェバエの維持を行っている機関がなく、また輸入に対しても厳しい条件があるため、ツェツェバエのコロニーを用いての研究が難しい状況となった。このため、エフェクター分子の解析を先に進めてきたが、ツェツェバエ代替システムの構築にはさらに検討が必要であると考えられた。本研究では昆虫の遺伝子組換えの分子基盤の確立により、ツェツェバエの新規コントロール法を探索することを目指した。しかし平成27年度から所属機関が変更となり、研究協力機関であるGhana Atomic Energy Commissionとの物理的距離が問題となったため、昨年度より代替昆虫システムの検討を行った。しかしアフリカトリパノソーマ原虫の制圧を目的とするため、代替昆虫を用いるのは難しく、将来的にツェツェバエの遺伝子改変につなげられる基盤解析を行った。ツェツェバエのエフェクター分子、ディフェンシンの抗菌活性を再度解析したが、大腸菌、黄色ブドウ球菌には2mMの濃度でも抗菌効果が無いと判定された。

またシナハマダラカの中腸でディフェンシン分子の発現を行ったが、マラリア原虫(Plasmodium berghei)の感染に対して、再現性のある増殖抑制効果は観察されなかった。アフリカトリパノソーマ原虫に対しては500μM以上の濃度で増殖を抑制した。本ディフェンシン分子の推定マチュア部位に弱い相動性を示す分子としてDufourea novaeangliae、Cotesia vestalis、Zeugodacus cucurbitaeのディフェンシン分子が見出された。これらの種はツェツェバエ同様に単一のホスト(食餌)に依存しており、生存に必須な体内の共生微生物に影響を与えないような形に進化してきている可能性が考えられた。アフリカトリパノソーマ原虫自身をDNA導入ベクターにできないか?という着想に基づき、まずは動きを遅くする(狙った場所に留まらせる)ことを試みた。動き関連分子TbUNC119BPの一部領域のover expressionで動き抑制効果があり、また本分子に相互作用する分子の探索を行った結果Glycerol kinaseとtubulin分子が見出された。アフリカトリパノソーマ症を媒介するツェツェバエの新たなコントロール法の構築を行うことを目的として、以下の解析を行った。ツェツェバエのコロニーを確立し麻酔システムの検討を行った。さらにGlossina palpalis defensin(GpDef)分子の抗アフリカトリパノソーマ原虫活性プロファイルを明らかにした。当初予定していた、貯精嚢へのインジェクションは困難であったため、アフリカトリパノソーマ原虫の動き、エキソソーム関連分子解析、ツェツェバエゲノム上のポリドナウイルス類似配列解析を行い、遺伝子組換えシステム構築の可能性検討を行った。停電が頻発し、ジェネレータの調子が悪い状況で、ツェツェバエのコロニー維持が難しかったこと。また、ツェツェバのオリエンテーションが難しかったことによる。ツェツェバエコロニーを有しているGhana Atomic Energy Commissionとの共同解析をさらに進める。併せて応用昆虫学の専門家らとの連携を図り、代替昆虫を使用しての解析方法を探索する。またツェツェバエ共生細菌を介しての組換え方法の検討を行う。本研究は研究期間を1年間延長した。平成29年度はツェツェバエの遺伝子組換えを行う上での技術的問題点を再検討し、その解決にどのような代替システムの開発が必要かを明らかにしながら研究を推進していく。分子細胞生物学インフラの問題の早急な解決は難しいので、ジェネレータが確保されている研究室にツェツェバエコロニーを持ち込んでの解析が可能かを検討する。あるいは、解剖のオリエンテーションを理解するためには、ある程度数こなすことが優先させれるので、このまま試行を繰り返すとともに、麻酔に試薬Flynapが有効であるかを検討する。これらの事項に関してDr. Yawsonと緊密にディスカッションを行いながら進める。