hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生物医学研究推進のためのマーモセットＭＨＣ情報の総合的理解と研究基盤の開発

さらに、Real-time PCRによるサイトカイン・CD抗原等の発現解析系を充実させると伴に、TCRレパトア解析を次世代シケンシングによる系に移行した。その系を用いてデングウイルス感染モデル(マーモセット)系で、T細胞の挙動および炎症性サイトカインの変動について解析を行った。26年度が最終年度であるため、記入しない。免疫遺伝学26年度が最終年度であるため、記入しない。良質なRNAサンプルを入手できたこと、また早期に次世代シークエンシングによるDNAタイピング法を開発できたことから、今後のMHC発現解析や機能解析に移行する目途がついたためマイクロキメリズムによるMHC遺伝子の混入によりMHCハプロタイプの推定が困難であると思われたが、この問題を克服することができたことから、今後のハプロタイプ情報に基づくMHC発現解析や機能解析に移行する目途がついたため26年度が最終年度であるため、記入しない。マイクロキメリズムに関する知見を得るとともに、主要臓器におけるCaja遺伝子発現量の組織間、親子間およびCajaハプロタイプ間の差異を明らかにするために、CajaクラスII遺伝子を含めた次世代シークエンサーを用いたマルチプレックスDNAタイピング法の開発に取り組む。また、各Caja:遺伝子における発現解析(マイクロキメリズムに関する知見を得るとともに、主要臓器におけるCaja遺伝子発現量の組織間、親子間およびCajaハプロタイプ間の差異を明らかにすること)、機能解析(機能不明なCajaクラス1遺伝子の機能を同定すること)の3項目を実施することにより、多面的にコモンマーモセットのMHC情報を理解し、研究基盤を整備することを目指す。今後は10家系、計40個体の多型解析を行い、これまでに得られた血縁個体や非血縁個体を含む計45個体を含めて各MHC遺伝子の多型性やMHCハプロタイプ構造を明らかにする。またMHCタイピングシステムを完成させ、多検体のスクリーニングからMHCホモ接合体系統を確立するための方法論を開発するとともに、タイピングされた個体を用いてリンパ球混合培養(MLC)を行い、MHCハプロタイプ間の相違を見いだす。さらには、機能不明なMHCクラスI遺伝子であるCaja-B, Caja-E, Caja-Gについての遺伝子座特異的なモノクローナル抗体作製やトランスフェクタントの樹立、および胎盤形成に関連した遺伝子発現調節機構の解析を行い、これら遺伝子の機能を明らかにすることを目指す。次年度以降では、MHC多型解析のためのPCR関連試薬、シークエンシング関連試薬、DNAタイピング関連試薬、MHC機能解析のための細胞培養関連試薬、各種抗体、およびMHC機能解析のための抗体作製関連試薬、免疫学的機能解析関連試薬の購入、また関連学会参加に使用する国内旅費、マーモセット個体の購入に充当する。本年度に受理された論文の投稿料と別刷代、および10家系計40個体の多型解析に必要な試薬代の支払いが本年度の使用期日までに間に合わなかったため直接経費を次年度使用額から、受理された論文の投稿料と別刷代(243,404円)
ADHDを伴う自閉症の小脳シナプス病態の解明とそれに基づく治療法についての検討

(1)発達過程、及び成獣の小脳において、抗Kirrel3抗体とシナプスや軸索マーカーに対する抗体を用いて二重免疫染色を行った結果、Kirrel3蛋白の発現が、生後14日齢から成獣にかけて顆粒細胞糸球体シナプス部のNMDAR1陽性の顆粒細胞の樹状突起末端に、生後21日齢から成獣にかけてPSD95陽性の小脳バスケット細胞の軸索終末部(ピンスーシナプス)に認められた。(2)ピンスーシナプスのマーカーであるPSD95を用いた免疫染色法とウェスタンブロット法により、成獣Kirrel3欠損マウスの小脳を検討した結果、野生型と比べてPSD95陽性ピンスー領域の面積、及びPSD95の発現レベルの有意な増加を認めた。PSD95陽性ピンスー領域の面積とPSD95の発現の増加は、1バスケット細胞軸索終末の軸索同士の接着異常、2バスケット細胞軸索終末のプルキンエ細胞軸索初節部への投射異常、3バスケット細胞軸索の分枝過剰等の可能性が考えられることから、1の可能性を透過電子顕微鏡を用いて、2の可能性をプルキンエ細胞の軸索初節部のマーカーであるAnkyrinGの免疫染色により、3の可能性をNF200の免疫染色とゴルジ染色により検討中である。(3)成獣の野生型、及びKirrel3欠損マウスの前頭前皮質、視床、小脳、中脳、線条体等のセロトニン濃度やドーパミン濃度を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した結果、いくつかの領域に異常をみいだしており、現在、個体数を増やして解析中である。ピンスーシナプスはプルキンエ細胞の軸索初節部の活動電位を電気的に抑制していることから、Kirrel3欠損マウスのピンスーシナプス構造異常が小脳プルキンエ細胞の活動電位抑制を障害し、自閉症様行動を惹起している可能性が示唆された。成獣Kirrel3欠損マウスの小脳神経回路において、ピンスー構造異常を見いだしており、ピンスー構造異常が小脳プルキンエ細胞の活動電位抑制を障害し、自閉症様行動を惹起している可能性が示唆された。発達過程のKirrel3欠損マウスの小脳神経回路の解析は、次年度に変更したが、次年度に行う予定であったKirrel3欠損マウスの脳内各部位におけるセロトニン量、ドーパミン量の測定を先に行っており、おおむね順調に進展している。(1)現在、発達過程と成獣の小脳におけるピンスーシナプスの詳細な解析を行っており、さらに、Kirrel3蛋白の発現が強く認められた生後14日齢前後の顆粒細胞糸球体シナプスやプルキンエ細胞の投射先である小脳深部核・前庭神経核の詳細な組織学的・生化学的解析(神経伝達物質やその受容体、及びシナプス足場蛋白の発現レベルや局在の変化の有無の検討)を行う。(2)発達過程、及び成獣の野生型、及びKirrel3欠損マウスの前頭前皮質、視床、小脳、中脳、線条体等のセロトニン濃度やドーパミン濃度を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した結果、異常を見いだしており、さらに個体数を増やして検討する。異常のみられた領域と小脳シナプス部構造異常との関連性も含めて、発達過程、及び成獣におけるKirrel3欠損マウスの神経回路・シナプス部の組織学的・生化学的・分子生物学的解析を行う。(3) Kirrel3欠損マウスで認められるASD・ADHD様行動異常(超音波発声回数の異常やオープンフィールドテストにおける多動を伴う常同行動、ロータロッドによる運動学習や常同行動の亢進)により活性化、もしくは抑制される脳部位を、神経活動依存的に発現の認められるc-fos蛋白を指標として、野生型、及びKirrel3欠損マウスで比較する。(4)野生型、及びKirrel3欠損マウスにADHD治療薬(メタンフェタミン)、双極性障害の躁症状治療薬(リチウム)等を腹腔内投与し、ASD・ADHD様行動異常の改善と活動依存的に発現の認められるc-fosの発現レベルや局在の変化を免疫染色法を用いて検討することにより、ASD・ADHD様行動異常の原因となっている神経伝達障害を明らかにする。

(3)成獣の野生型、及びKirrel3欠損マウスの前頭前皮質、視床、小脳、中脳、線条体等のセロトニン濃度やドーパミン濃度を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した結果、いくつかの領域に異常をみいだしており、現在、個体数を増やして解析中である。ピンスーシナプスはプルキンエ細胞の軸索初節部の活動電位を電気的に抑制していることから、Kirrel3欠損マウスのピンスーシナプス構造異常が小脳プルキンエ細胞の活動電位抑制を障害し、自閉症様行動を惹起している可能性が示唆された。成獣Kirrel3欠損マウスの小脳神経回路において、ピンスー構造異常を見いだしており、ピンスー構造異常が小脳プルキンエ細胞の活動電位抑制を障害し、自閉症様行動を惹起している可能性が示唆された。発達過程のKirrel3欠損マウスの小脳神経回路の解析は、次年度に変更したが、次年度に行う予定であったKirrel3欠損マウスの脳内各部位におけるセロトニン量、ドーパミン量の測定を先に行っており、おおむね順調に進展している。(1)現在、発達過程と成獣の小脳におけるピンスーシナプスの詳細な解析を行っており、さらに、Kirrel3蛋白の発現が強く認められた生後14日齢前後の顆粒細胞糸球体シナプスやプルキンエ細胞の投射先である小脳深部核・前庭神経核の詳細な組織学的・生化学的解析(神経伝達物質やその受容体、及びシナプス足場蛋白の発現レベルや局在の変化の有無の検討)を行う。(2)発達過程、及び成獣の野生型、及びKirrel3欠損マウスの前頭前皮質、視床、小脳、中脳、線条体等のセロトニン濃度やドーパミン濃度を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した結果、異常を見いだしており、さらに個体数を増やして検討する。異常のみられた領域と小脳シナプス部構造異常との関連性も含めて、発達過程、及び成獣におけるKirrel3欠損マウスの神経回路・シナプス部の組織学的・生化学的・分子生物学的解析を行う。(3) Kirrel3欠損マウスで認められるASD・ADHD様行動異常(超音波発声回数の異常やオープンフィールドテストにおける多動を伴う常同行動、ロータロッドによる運動学習や常同行動の亢進)により活性化、もしくは抑制される脳部位を、神経活動依存的に発現の認められるc-fos蛋白を指標として、野生型、及びKirrel3欠損マウスで比較する。(4)野生型、及びKirrel3欠損マウスにADHD治療薬(メタンフェタミン)、双極性障害の躁症状治療薬(リチウム)等を腹腔内投与し、ASD・ADHD様行動異常の改善と活動依存的に発現の認められるc-fosの発現レベルや局在の変化を免疫染色法を用いて検討することにより、ASD・ADHD様行動異常の原因となっている神経伝達障害を明らかにする。当該年度は、成獣のKirrel3欠損マウスの解析を行い、発達過程のKirrel3欠損マウスの解析は、まとめて行った方が効率がよいため、それらの使用予定額を次年度に繰り越した。高速液体クロマトグラフィーを用いてKirrel3欠損マウスの脳各部位のセロトニン濃度やドーパミン濃度を測定した結果、いくつかの領域に異常をみいだしており、これらの領域の異常と小脳シナプス部構造異常との関連性も含めて、発達過程、及び成獣におけるKirrel3欠損マウスの神経回路・シナプス部の組織学的・生化学的・分子生物学的解析を、次年度に新たに行う予定であり、これらの資金に使用する。また、来年度中に投稿を予定している論文の校正や論文掲載費用に使用する。
ピレスロイド系農薬は本当に安全か？インスリン抵抗性誘導の分子メカニズムの解明

癌細胞は、主に嫌気的解糖系に依存してエネルギーを産生し、増殖する。酸素を利用するミトコンドリア内電子伝達系やクエン酸回路に比較して解糖系はエネルギー産生効率が非常に低い。それで、癌細胞ではグルコースの取り込みと解糖系の活性化が非常に重要である。環境汚染物質は体内の活性酸素増加や脂肪組織の炎症などに関与し、糖代謝のバランスに影響することが報告されている。ピレスロイド系農薬は家庭用あるいは果実や野菜の農業生産用に利用される殺虫剤である。実験動物等において神経系や生殖ホルモン系統への悪影響が報告されているが、糖代謝に及ぼす影響については不明な点が多い。本研究では、II型ピレスロイド系農薬であるフェンバレレートががん細胞の糖代謝とストレスの応答能力に及ぼす影響について解析した。ヒト肝癌由来細胞株であるHepG2細胞をII型ピレスロイド系農薬であるフェンバレレートにより48時間前処理するとグルコーズの取り込みが顕著に増加された。また、無処理群に比較してフェンバレレート処理群は細胞内乳酸とATPの産生が有意に増強した。インスリンのシグナル伝達経路を解析した結果、フェンバレレートはインスリンレセプターのエンドサイトシースを増強し、さらにその下流のPI3K-AKT経路の活性化の増強が明らかになった。現在、フェンバレレートが誘導する異常な糖代謝によるがん細胞のストレス応答能力の変化とその詳細な分子メカニズムについて解析している。フェンバレレートががん細胞の糖代謝に影響することを認めることができた。フェンバレレートが細胞のグルコースの取り込みを増強し、乳酸とATPの産生の増加するだけではなく、インスリンレセプターのエンドサイトシースの増強とPI3K-AKT経路の活性化に寄与することを見出し、インスリンのシグナル伝達経路に及ぼす影響の分子メカニズムの一部を解明した。また、異常な糖代謝によるがん細胞のストレス応答能力の変化も確認でき、その上流のキーになる分子について順調に解析しており、論文の作成に取り組んでいる。今後、フェンバレレートがインスリンのシグナル伝達経路に及ぼす影響の分子メカニズムをさらに詳細に解析する。具体的には、インスリンレセプターのエンドサイトシースに影響するキーになる分子を同定する。また、異常な糖代謝によりがん細胞がどのような環境ストレスに耐性を持ち、どのような分子メカニズムにより制御されるかを明らかにする。それらのデータに基づいて、フェンバレレートの曝露から健康を守るための対策を確立する。ピレスロイド系農薬は天然除虫菊有効成分(ピレトリン)類のI型とそのシアノ基修飾類のII型がある。I型に比べてII型はより強い殺虫力と残効性を示す。哺乳類・鳥類の受容体に対する作用は弱く、比較的安全性の高い殺虫剤として認識されていた。しかし、II型ピレスロイド系農薬は実験動物等において神経系や生殖ホルモン系統への悪影響が報告されている。しかも、II型は安価で残効性の高いため農業生産者がII型を良く使用する傾向にある。また、ピレスロイド系農薬は農産物の収穫前日までの使用が認められており、長期間の摂取は微量でもヒトへの生理学的・衛生学的問題が懸念されている。最近、ピレスロイド系殺虫剤を生産する労働者に糖代謝異常と糖尿病患者が有意に増える疫学的研究が報告されているがその詳細は不明である。本研究では、ヒト肝癌由来細胞株であるHepG2細胞を用いて、II型ピレスロイド系農薬であるフェンバレレートを培地に添加して48時間前処理を行った。Dulbecco's Modified Eagle Mediumのみにより培養したHepG2細胞を対照群として用いた。それぞれの培養液を回収して、グルコーズの取り込みを比較検討した結果、フェンバレレートにより長期培養したHepG2細胞によるグルコースの取り込みが対照群に比べて顕著に増強していることが判明した。また、フェンバレレートの前処理が細胞内の糖代謝とATPの生成に影響することを見出した。ヒト肝癌由来細胞株であるHepG2細胞を用いて、フェンバレレートを培地に添加して48時間培養し、培養液中のグルコースを測定した結果、フェンバレレートの曝露がHepG2細胞のグルコースの取り込みを増強することが判明した。また、フェンバレレートの処理が細胞内の糖代謝とATPの生成及び細胞の増殖と生存に関与するタンパク質の発現に影響することを見出した。

インスリンのシグナル伝達経路を解析した結果、フェンバレレートはインスリンレセプターのエンドサイトシースを増強し、さらにその下流のPI3K-AKT経路の活性化の増強が明らかになった。現在、フェンバレレートが誘導する異常な糖代謝によるがん細胞のストレス応答能力の変化とその詳細な分子メカニズムについて解析している。フェンバレレートががん細胞の糖代謝に影響することを認めることができた。フェンバレレートが細胞のグルコースの取り込みを増強し、乳酸とATPの産生の増加するだけではなく、インスリンレセプターのエンドサイトシースの増強とPI3K-AKT経路の活性化に寄与することを見出し、インスリンのシグナル伝達経路に及ぼす影響の分子メカニズムの一部を解明した。また、異常な糖代謝によるがん細胞のストレス応答能力の変化も確認でき、その上流のキーになる分子について順調に解析しており、論文の作成に取り組んでいる。現時点での研究成果に踏まえて、フェンバレレートの曝露によるHepG2細胞糖代謝の変化が肝臓細胞に及ぼす病理学的な影響を詳細に検討する予定である。多くのがん組織では糖の取込みと代謝が亢進しており、がん細胞の増殖や生存に有利に働いていることが報告されている。そこで、今後フェンバレレートの曝露による細胞のグルコーズの取り込みとエネルギー代謝の変化ががん治療の成績に及ぼす影響とその分子メカニズムを解析し、有効ながん治療の対策を確立するために有用な情報を提供したいと考えている。今後、フェンバレレートがインスリンのシグナル伝達経路に及ぼす影響の分子メカニズムをさらに詳細に解析する。具体的には、インスリンレセプターのエンドサイトシースに影響するキーになる分子を同定する。また、異常な糖代謝によりがん細胞がどのような環境ストレスに耐性を持ち、どのような分子メカニズムにより制御されるかを明らかにする。それらのデータに基づいて、フェンバレレートの曝露から健康を守るための対策を確立する。研究費を計画的に節約して使用したため次年度の使用額が生じた、平成30年度研究の消耗品の購入に使用する。最終年度の研究のため節約して使用したため
母子合葬が疑われる2体合葬人骨についての遺伝学的、形態学的、考古学的血縁鑑定

北海道伊達市・有珠モシリ遺跡における1985年度から1988年度の調査で発掘された2体合葬人骨(若年者2体合葬の3A・3B号および成年女性2体合葬の16A・16B号)について、遺伝学的、形態学的、考古学的手法を用いて血縁推定を試みた。出土した遺物から、3A・3B号は続縄文期、16A・16B号は縄文時代晩期のものと推定された。また、埋葬の状況からこれら2組の合葬人骨はともに同時埋葬と考えられた。3A・3B号は若年者の合葬であり、16A・16B号の上肢にはともに南海産のオオツタノハ製の貝輪が装着されていたことから、これら2組の合葬人骨の間には密接な血縁関係があった可能性が考えられた。そこで、ミトコンドリアDNAの高多型領域IおよびIIのうち、特に多型性の高い部位の塩基配列を解析したところ、3A・3B号では検査した部位が完全に一致し、母系の血縁関係が示唆されたが、16A・16B号では両者の塩基配列は全く異なっており、母系の血縁関係は完全に否定された。さらに、これら人骨の永久歯歯冠計測値のQ-モード相関係数をみると、3A・3B号ではいずれの歯種の組み合わせにおいても非常に高く、両者の血縁関係が支持されたが、16A・16B号ではいずれの歯種の組み合わせにおいても低いか、あるいは負の値を示し、形態学的見地からも両者の血縁関係の存在は否定的であった。遺伝学的、形態学的検査の結果を併せ考えると、3A・3B号は密接な母系の血縁者であり、16A・16B号には血縁関係は存在しない可能性が高いものと推定された。北海道茅部郡南茅部町・臼尻B遺跡における昭和53年度の第3次調査で、第10号住居址床面から掘り込まれた、いわゆるフラスコ状ピット内に合葬されていた、成年女性(1号)および小児(2号)の2体合葬人骨について、遺伝学的、形態学的、考古学的手法を用いて血縁推定を試みた。埋葬の状況および両者の推定年齢(1号は壮年、2号は約7歳位と推定された)から両者の間には母子関係などの非常に近い血縁関係があったものと考えられたが、形態学的所見からは両者の血縁を積極的に示唆する所見は得られなかった。そこで、ミトコンドリトアDNAの高多型領域Iのうち、特に多型性の高い部位(No.16209-16402)の塩基配列を解析し、両者間の母系の血縁関係の存否を検証した。第1号人骨については右下第1大臼歯、右下第2小臼歯、右大腿骨の一部を、第2号人骨については右下および左下第2乳臼歯を試料として用いた。第1号人骨については、右下第1大臼歯を試料とした3セットのPCR産物をそれぞれクローニングし、塩基配列解析すると、Cambridge Reference Sequence(CRS)に一致する塩基配列が共通してみられた。また、この塩基配列は右下第2小臼歯、右大腿骨を試料としたPCR産物のクローンにもみられたが、これらの試料においてはこの塩基配列は2セット中1セットのPCR産物のクローンにしか出現しなかった。第2号人骨についても、CRSに一致する塩基配列が右下および左下第2乳臼歯を試料としたPCR産物のクローンにみられた。しかし、この塩基配列は2セット中1セットのPCR産物のクローンにしか出現しなかった。

以上より、試料本来の塩基配列を確実に決定するには至らなかったものの、第1号および第2号人骨は検査した範囲内においてCRSに一致する塩基配列を共有している可能性があり、両者が同じ母系に属する可能性が考えられた。北海道伊達市・有珠モシリ遺跡における1988年度の第4次調査で発掘された、岩塊の間に掘り込まれた墳墓(16号墓)に合葬されていた成年女性人骨2体(16A号および16B号)について、遺伝学的、形態学的、考古学的手法を用いて血縁推定を試みた。埋土中の土器の形式(大洞A式)から、これらの人骨は縄文時代晩期のものと推定された。埋葬の状況からこの2体は同時埋葬と考えられ、また、両者の上肢には南海産のオオツタノハとベンケイガイ製の貝輪が装着されており、両者の間には密接な血縁関係があった可能性が考えられた。そこで、ミトコンドリアDNAの高多型領域Iのうち、特に多型性の高い部位(No.16209-16402)の塩基配列を解析したところ、両者の塩基配列は全く異なっており、両者の母系の血縁関係は完全に否定された。さらに、両者の永久歯歯冠計測値のQ-モード相関係数は、いずれの歯種の組み合わせにおいても低いか、あるいは負の値を示し、形態学的見地からも両者の血縁関係の存在は否定的であった。遺伝学的、形態学的検査の結果を併せ考えると、この両者の間に血縁関係は存在しない可能性が高いものと推定された。
神経芽腫アポトーシス誘導療法に関する基礎的検討

【方法】NB摘出組織(ホルマリン固定パラフィン包埋材料)42例に抗Fas,FasL,pro-caspase3およびpro-caspase8抗体を用いた免疫組織染色を行った。一部の症例では,抗p17subunit抗体による活性型caspase3の組織内検出を行った。10例の腫瘍凍結材料を用いFas,FasL,pro-caspase3およびpro-caspase8ウエスタンブロットを施行し,さらに,18例の凍結材料を用いカスパーゼ9のウエスタンブロット解析も行った。また,Asp-Glu-Val-Asp(DEVD),Ile-Glu-Thr-Asp(IETD)基質を用いてcaspase3,-8様活性を各々測定した。【結果】大部分のNB(免疫染色:86%,ウエスタンブロット:100%)はFas発現を欠くか微弱発現に留まり,Fas陽性細胞の局在もアポトーシス部と一致しなかった。一方,FasL,pro-caspase3およびpro-caspase8は腫瘍の多く(免疫染色:7076%,ウエスタンブロット:50100%)で高発現し,また,pro-caspase3発現は予後良好群で有意に強かった。ウエスタンブロット法でpro-caspase3を強発現した腫瘍はDEVD水解活性も高値を示したが,pro-caspase8発現腫瘍の殆どはIETD水解活性を欠いていた。また,p17免疫染色により,活性型caspase3のアポトーシス細胞への局在が示された。さらに,ウエスタンブロット法では18例全例にpro-caspase9(p47)の発現がみられ,うち7例にactive caspase9と思われるp37/p35バンドが確認された。【考案】NBはFasLを強発現するがFasを殆ど発現せず,また,Fasによるcaspase8活性化も欠いていた,従って,NBでは何らかの非Fas性シグナル-例えば,NGF枯渇あるいはBcl-2低発現-がcaspase9およびcaspase3の活性化を惹起し,これによりcaspase3-activated DNase(CAD)を初めとする種々の細胞内基質が分解されアポトーシスに至る,と推測された。【目的】神経芽腫(NB)におけるアポトーシス発生機構を検討した.【方法】NB42例のパラフィン切片に抗ヒトFas,Fasリガンド(FasL),プロカスパーゼ3モノクローナル抗体を用いた免疫ペルオキシダーゼ染色を施行した。また,10例のNB凍結材料を用いウエスタンブロット解析とDEVD水解活性測定を行った。【結果】42症例の神経芽細胞腫原発巣の組織についてFas,Fas ligand(FasL)およびcaspase3の発現様式を調べた。Fas免疫発現は29例中4例(14%)にのみ認められたが,FasL/プロカスパーゼ3は42例中30/29例(約70%)に強く発現し,また,プロカスパーゼ3の発現強度は臨床病理学的予後因子と有意に相関していた。ウエスタンブロットでもFasバンドは10例全例でみられず,一方,FasLは全例で,プロカスパーゼ3は5例(4例:予後良好型,1例:予後不良型)で特異的バンドが確認された。

さらに,DEVD水解カスパーゼ3様活性は予後良好型腫瘍で高値を示した。【結語】NBはFasLを高発現するがFas発現に乏しく,この腫瘍におけるアポトーシスはなんらかのFas非依存的経路を介したカズパーゼ3活性化に基づくと考えられた。【目的】神経芽腫には腫瘍細胞のアポトーシスにより自然消退を示す一群が存在する。これまでの研究で私たちは,神経芽腫におけるアポトーシスはFas非依存経路によるカスパーゼ3活性化に基づくことを明らかにした(J.Pathol.,189:410-415,1999)。本研究では,カスパーゼ3の上位調節因子としてミトコンドリア刺激を起点とするカスパーゼ9を候補に挙げ,その神経芽腫組織における発現様式を検討した。【方法】神経芽腫凍結組織20例より蛋白を抽出し,ウエスタンブロット法によりカスパーゼ9の発現を調べた。また,ホルマリン固定パラフィン包埋材料を用い,免疫ペルオキシダーゼ染色により活性型カスパーゼ9の局在を検索した。【結果】ウエスタンブロット法では全例に前駆型カスパーゼ9(p47)の発現がみられ,うち8例に切断(活性)型カスパーゼ9と思われるp37/p35バンドが確認された。免疫染色では,腫瘍内アポトーシス細胞の一部に活性型カスパーゼ9の局在が認められた。【結語】神経芽腫には前駆型カスパーゼ9が恒常的に発現し,一部の腫瘍では自己切断により活性化しアポトーシスを誘導していると考えられた。
Ｇｅｍｉｎｉｎ発現量を標的とした白血病幹細胞制御法の開発への基盤研究

これまでの本研究にける助成金にて、Gemininの発現を可視化することのできるGeminin-EYFPノックインマウスの骨髄細胞を用いた様々な血液学的解析方法を確立し、それを発展させた。特に、造血幹細胞分画であるCD34-KSL (c-Kit+Sca1+Lin-)細胞の中にGeminin-high細胞群を見つけ、その細胞の中には致死的放射線照射を施したマウスに移植すると長期骨髄再構築能を示す細胞が存在することを明らかにし、このノックインマウスを使うことで自己複製中の造血幹細胞を同定することが可能であることを示した。さらにCD34-KSL (c-Kit+Sca1+Lin-)細胞からCD150-high細胞を分画し、より自己複製中の造血幹細胞をエンリッチした集団を分画することに成功した。この実験系は、自己複製中の白血病幹細胞の同定にも使用できるものと考えられる。また、MLL-AF9、Hoxa9 (+Meis1a)、BCR-ABLなどマウスに実験的白血病を引き起こすことのできる遺伝子群を、各種赤色蛍光(RFP; DsRed Express2、tandem Tomato (tdTomato)、humanized Kusabira Orange (hKO)など)をマーカーに持ったレトロウイルスベクターにつなぎ、従来使用していたGFPマーカーと異なりノックインマウスのEYFPと容易に区別が可能なRFPをマーカーとして持った白血病細胞及び白血病幹細胞をGeminin-EYFPノックインマウス由来の骨髄細胞から作製することが可能になり、白血病幹細胞におけるGemininの発現動態を詳細に解析できるようになった。また、ヒト白血病幹細胞の活性解析を行うために免疫不全マウス(BRGS)を九州大学より入手し、その繁殖を行い、それを用いたヒト白血病幹細胞の解析を行うための基礎実験を完了した。26年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度の本研究において助成金を受け、Gemininの発現を可視化することのできるGeminin-EYFPノックインマウスの骨髄細胞を用いた様々な血液学的解析方法を確立した。また、ヒト白血病幹細胞の活性解析を行うために免疫不全(BRGS)マウス九州大学より入手し、その繁殖に取りかかった。上記のごとくGeminin-EYFPノックインマウスを用いたRFPをマーカーとしたマウス実験白血病モデル系を確立し、Gemininの発現動態と白血病幹細胞活性との相関を詳細に解析する実験系を確立することができた。

しかしながら、MLL-AF9、Hoxa9 (+Meis1a)を導入して白血病を発症させ、充分な再現性のあるデーターを回収するには至っていないから。BCR-ABLを導入した細胞を移植した一次レシピエントマウスが、骨髄増殖性疾患を発症した後、イマチニブを2週間投与し寛解に導入する。この寛解導入マウスの白血病幹細胞分画(KSL分画)にある細胞をGeminin-EYFPの発現強度により亜分画に分け二次レシピエントに移植し再発率を見ることで、白血病幹細胞を静止期に留め置きイマチニブ耐性白血病幹細胞を維持するために最適なGemininの発現量を同定する。また、この寛解導入マウスの骨髄細胞の白血病幹細胞分画におけるGemininの発現量を、レトロウイルスベクターを用いて操作し二次レシピエントに移植し再発率の変化を見ることで、Gemininタンパク質発現量と白血病幹細胞のイマチニブ耐性との関係を明らかにする。レトロウイルスベクター系と同様にGemininの発現を操作できるレンチウイルスベクター系を確立させる。次いで、患者由来のヒト白血病細胞におけるGemininの発現を操作し免疫不全(BRGS)マウスに移植して、マウス実験白血病モデルで確かめられたのと同様に、白血病幹細胞の活性を制御することができるかを検討する。
バイオインフォマテックスを用いたT/NK細胞リンパ腫新分類策定を目指した国際研究

平成15年度までの計画、1)新訂WHO分類に基づく悪性リンパ腫の地理病理学的検討、および2)悪性リンパ腫の臨床病理学的検討について、Hans Konrad Muller-Hermelink教授(University of Wuerzburg, Germany)、Chul Woo Kim教授(Seoul University, Korea)と緊密に協議し、相互の診断の検証を行なった。その過程で、診断の再現性などWHO分類に大きな問題点が認識された。新たなT/NK細胞リンパ腫新分類が必要との共通の認識を得るに至り、現在、鋭意研究を遂行中である。本研究の目的は日本・韓国・ドイツ国におけるT/NK細胞リンパ腫1,000例以上の臨床病理学的、免疫学的情報を網羅し、バイオインフォマテクスBio-informaticsを用いたcase clustering解析を通じて、より普遍的な分類を画定することにある。解析に際しては、T細胞functional subsets (naive, central memory and effector memory cells)の概念を取り入れ、T/NK細胞リンパ腫分類の新たなパラダイムの提案を目指す予定である。研究協力者としてドイツ国2名、韓国7名、日本3名(研究代表者を含む)の病理学者の参加の合意が得られた。平成15年度内の当面の目標として、これら施設において日本(300例)、韓国(100例)、およびドイツ国(100例)の症例登録を施行しつつある。T/NK細胞腫瘍の病理学的および免疫組織学的性状の評価、さらに予後を含む臨床データを鋭意集積中である。相互の診断の検証につては、年度内に日独で1回、日韓で2回の会合をもつことが出来た。今後のcase clustering解析に際しての問題点の抽出と今後の方向性の確認、必要に応じてのデータ項目の微調整を計るために、平成16年内に基盤データの形成を目指す予定である。
細胞骨格相互結合タンパク質ＡＣＦ７の興奮性シナプス後部における機能解析

ACF7はアクチン繊維と微小管の両方に結合し、2つの細胞骨格の動態を協調させる機能を持つ。昨年度までの研究により、細胞骨格相互結合タンパク質であるACF7が興奮性シナプスの発達を制御することを明らかにしてきた。今年度はACF7がシナプス後部を制御する分子メカニズムを明らかにすることを目的として研究を実施した。1)ACF7にEGFPを融合させたプローブを海馬分散培養に遺伝子導入し、神経細胞の発達に伴ったACF7の局在変化を経時観察した。数秒おきの速い分子イメージングを行ったところ、線維芽細胞と同様に、突起形成期の神経細胞ではACF7が微小管先端に局在して細胞質中を動く様子が見られた。シナプス形成期の神経細胞ではこの速い動きは見られず、ACF7は樹状突起からスパインへ比較的長い時間をかけて局在変化した。2)ACF7のドメイン欠損変異体の発現実験を海馬分散培養に遺伝子導入し、神経細胞の発達に伴ってACF7がスパインに集積する分子メカニズムを調べた。ACF7のN末端ドメインの有無によって神経細胞の発達に伴った分子局在の変化が起こり、またこのドメインがスパインへの集積に必要であることが分かった。蛍光消退法と薬理学的実験を行ったところ、ACF7はスパインにおいてアクチン繊維だけでなくシナプス後部タンパク質とも結合していることが示唆された。3)ACF7と結合する候補タンパク質をクローニングし、ACF7と共に線維芽細胞に発現させた。ACF7を過剰発現させることによって結合候補タンパク質の局在が変化したことから、これらの分子が細胞内で結合することが支持された。26年度が最終年度であるため、記入しない。樹状突起スパインにはシナプス後肥厚部(PSD)や細胞骨格が存在し、これらが互いに作用しあうことで興奮性シナプスの機能を調節している。アクチンはスパインの形態を直接的に制御し、またPSDタンパク質の足場となる重要な細胞骨格である。もう一つの主要な細胞骨格である微小管は、その先端が一部のスパインに一過的に侵入することで興奮性シナプスの発達を促進すると言われている。しかしスパインへ侵入する微小管とシナプスの発達を結びつける分子メカニズムはよく分かっていない。申請者はこれまでの研究で、細胞骨格相互結合タンパク質であるACF7が興奮性シナプスの発達を制御することを明らかにしてきた。この結果を更に発展させ、ACF7がスパインの形態を制御する分子メカニズムの解明を目指している。スパインにおいてもACF7が微小管とアクチンの相互作用を制御するかを検証するために、全反射顕微鏡を用いた微小管先端のタイムラプスイメージングを行った。新たに温度・CO2制御ステージシステムを導入することで観察条件を改善し、先行文献で報告されている、微小管の先端が一部のスパインに侵入する様子が観察出来た。現在は、ACF7の発現量を亢進または抑制した際にスパインへ侵入する微小管の動態が変化するかを検証している。ACF7タンパク質を急速に分解・形成させることで、微小管とアクチンがACF7によって相互結合された際にシナプスで起こる変化を経時的に明らかにすることが可能になる。薬剤依存的にタンパク質分解を誘導する実験系に低発現プロモーターを応用することで効率的なタンパク質分解が可能になった。全反射顕微鏡を用いたタイムラプスイメージングが確立された。人為前にタンパク質分解を誘導する実験条件が改善された。非神経細胞を用いて全長のACF7の形成を誘導する実験の予備検討を進めた。

本年度の研究によって、スパインにおける微小管の動態を高い時間解像度でイメージングする系が確立され、またACF7タンパク質の分解・形成を人為的に操作する実験系の構築が進んだ。次年度はこれらの手法を組み合わせ、スパイン増大のどのタイミングでACF7が必要とされるかを解明する。
モレキュラーインプリンティング法による新規バイオマーカー検出法の創案

HPLC,MSあるいはELISA法等の分析手法に頼ることなく迅速かつ簡便なバイオマーカー検出システムを構築するため、アクリルアミドゲルテンプレートの最適化とジペプチド捕捉性を検討した。2)同ゲルをPVDF膜を装着したマイクロプレート(孔径:0.45μm)内で作製し、20mg/wellのテンプレート形成wellを作製した(室温、24時間)。ゲル硬化後、吸引と脱イオン水による繰り返し洗浄(×3)を行い、蛍光強度として1000以下のテンプレート担体を作製することができた。3)0-100μg/ml濃度の各種5(6)-carboxyfluoresceinを調製し、テンプレートwellに対して自然落下方式により蛍光溶液を浸潤させた。その後、脱イオン水による未吸着成分を脱離処理後、蛍光分析(Ex:485nm、Em:535nm)に供したところ、10μM濃度以上で蛍光強度として10000以上の値を得ることができた。すなわち、本シート材には5(6)-carboxyfluoresceinに対して十分な捕捉領域を有するporeがポリアクリルアミドゲル架橋構造内に形成されていることを示唆しており、テンプレート機能を有した機能担体として活用可能なことを示すことができた。4)Val-Tyr共存、上記最適条件下でアクリルアミドによる重合包摂を行い、Val-Tyr濃度10μMのテンプレートゲルを作製した。遠心処理、吸引して得られたペプチド捕捉性テンプレートに対してVal-Tyrを40nmolまでのスケールで負荷したところ、220nm検出レベルでは十分な捕捉活性が認められなかった。これは、作製ゲルの捕捉容量が10nmolであったことに起因しており、捕捉後のペプチドの蛍光誘導体化等の高感度検出化が必要なことが示唆された。HPLC,MSあるいはELISA法等の分析手法に頼ることなく迅速かつ簡便なバイオマーカー検出システムを構築するため、まず合成高分子ポリマーによるマーカー分子特異的テンプレート体の作製を試みた。1)鋳型ポリマー形成の有無を簡便に検出可能とするため、マーカー分子として水溶性蛍光試薬である5(6)-carboxyfluoresceinを選択した。また、テンプレート用合成樹脂として種々検討した結果、アクリルアミドを用いて各種の包摂試験を行った。その結果、5(6)-Carboxyfluoroscein (1.2mg)、acrylamide (269mg)、N,N'-methylenebisacrylamide (30mg)、10% APS (10μl)、5% N,N,N',N'Otetramethylethyldiamine (1μl)混合組成において5(6)-carboxyfluoroscein存在下でのアクリルアミドの重合と特異的捕捉が認められた。2)次いで、同ゲルをPVDF膜を装着した96穴マイクロプレート(孔径:0.45μm)内で作製し、20mg/wellのテンプレート形成wellを作製した(室温、24時間)。ゲル硬化後、サクションフィルターによる吸引と脱イオン水による繰り返し洗浄(×3)を行い、蛍光強度として1000以下のテンプレート担体を作製することができた。3)0-100μg/ml濃度の各種5(6)-Carboxyfluoresceinを調製し、テンプレートwellに対して自然落下方式により蛍光溶液を浸潤させた。その後、脱イオン水による未吸着成分を脱離処理後、蛍光分析(励起波長:485nm、検出波長:535nm)に供したところ、50μg/ml濃度以上で蛍光強度として10000以上の値を得ることができた。
中世フランス語版『テンプル騎士団会則』の言語地理学的・文献学的語彙研究

研究実施計画に基づき、本年度は以下の研究をおこなった。1260年頃に聖地で作成された中世フランス語版『テンプル騎士団会則』(Regle du Temple de Jerusalem)に関して、パリのフランス国立図書館所蔵のフランス語写本第1997番の写真版と、1886年にHenri de Curzonが上梓した校訂版(Paris, Renouard)と、2009年にGiovanni Amatuccioがイタリア語の翻訳と注釈を添えて出版した校訂版(Galatina, Congedo)とを比較検討し、確実なテキストを作成する作業に着手した。その過程で、既存の2点の校訂版が誤って解釈している箇所を発見し、彼らの誤読が幽霊語、すなわち存在しない語を生み出したことを指摘しながら、写本に基づいて、より妥当な解釈と思われる仮説を提示する論文"Sur un mot fantome dans La Regle du Temple : lecas del'oine"をPhilologica Jassyensia誌に発表した。また、パリのフランス国立図書館に出張し、上記写真版では不鮮明な箇所を写本にあたって確認した。他方、各種辞書および先行研究における中世フランス語版『テンプル騎士団会則』の引用を再検討し、それらの解釈の妥当性を文献学的に調査する作業にも着手した。さらに、中世フランス語版『テンプル騎士団会則』に含まれる、歴史的・地理的に注目すべき単語・表現を収集し、この作品の意義を裏付ける点を強調し、フランス語史ならびに言語地理学における従来の知見を補完する作業を開始した。また、関連するラテン語の作品ならびにフランス語の作品を収集し、それらを批判的に検討して、そこに含まれる問題点と意義を明らかにしつつ、補足的な情報を収集する作業もおこなった。1260年頃に聖地で作成された中世フランス語版『テンプル騎士団会則』のパリ、フランス国立図書館所蔵のフランス語写本第1997番の写真版および、1886年にHenri de Curzonが刊行した校訂版と、2009年にGiovanni Amatuccioがイタリア語の翻訳と注釈を添えて出版した校訂版はすでに入手しており、照合を予定通り進めている状況である。聖地で同じ時期に書かれた中世フランス語の文献に関しても、収集を始めており、それらの作品の言語的特徴を調査している。このように当初の研究実施計画に従って進めている段階である。当初の研究実施計画に従い、2019年度および2020年度に以下のような研究を推進する予定である。2019年度においては、中世フランス語版『テンプル騎士団会則』の確実なテキストの作成作業を、パリ、フランス国立図書館所蔵フランス語写本第1997番の写真版と、Henri Curzonが1886年に刊行した校訂版と、Giovanni Amatuccioによる2009年の校訂版とを比較検討する作業を通して続行する。また、各種辞書および先行研究における『テンプル騎士団会則』の引用の再検討作業も継続しておこない、関連するラテン語作品ならびにフランス語作品を収集し、それらを批判的に検討して問題点と意義を明らかにしつつ、歴史的・地理的に注目すべき単語・表現を研究する作業をおこなう。パリのコレージュ・ド・フランス名誉教授Michel Zink氏と、この中世フランス語版『テンプル騎士団会則』の文献学的な視点からの研究打ち合わせをするためにパリに出張する。2020年度においては、前年度の研究に基づき、中世フランス語版『テンプル騎士団会則』のテキスト確定の作業を、パリ写本と校訂版との比較検討に基づいて完成させる。他方、各種辞書・先行研究における中世フランス語版『テンプル騎士団会則』の引用再検討の作業を完成させ、それらの解釈の妥当性を文献学的に調査し、従来の知見がいかに補足できるかをまとめつつ、『テンプル騎士団会則』に含まれる、フランス語史および言語地理学の観点から興味深い単語・表現の収集をまとめ、それらの語彙の意義を明確にする。また、関連するラテン語作品・フランス語作品の収集ならびに批判的検討を続け、その問題点と意義を明らかにしつつ、従来の語彙研究への補足をおこなう。

また、関連するラテン語の作品ならびにフランス語の作品を収集し、それらを批判的に検討して、そこに含まれる問題点と意義を明らかにしつつ、補足的な情報を収集する作業もおこなった。1260年頃に聖地で作成された中世フランス語版『テンプル騎士団会則』のパリ、フランス国立図書館所蔵のフランス語写本第1997番の写真版および、1886年にHenri de Curzonが刊行した校訂版と、2009年にGiovanni Amatuccioがイタリア語の翻訳と注釈を添えて出版した校訂版はすでに入手しており、照合を予定通り進めている状況である。聖地で同じ時期に書かれた中世フランス語の文献に関しても、収集を始めており、それらの作品の言語的特徴を調査している。このように当初の研究実施計画に従って進めている段階である。当初の研究実施計画に従い、2019年度および2020年度に以下のような研究を推進する予定である。2019年度においては、中世フランス語版『テンプル騎士団会則』の確実なテキストの作成作業を、パリ、フランス国立図書館所蔵フランス語写本第1997番の写真版と、Henri Curzonが1886年に刊行した校訂版と、Giovanni Amatuccioによる2009年の校訂版とを比較検討する作業を通して続行する。また、各種辞書および先行研究における『テンプル騎士団会則』の引用の再検討作業も継続しておこない、関連するラテン語作品ならびにフランス語作品を収集し、それらを批判的に検討して問題点と意義を明らかにしつつ、歴史的・地理的に注目すべき単語・表現を研究する作業をおこなう。パリのコレージュ・ド・フランス名誉教授Michel Zink氏と、この中世フランス語版『テンプル騎士団会則』の文献学的な視点からの研究打ち合わせをするためにパリに出張する。2020年度においては、前年度の研究に基づき、中世フランス語版『テンプル騎士団会則』のテキスト確定の作業を、パリ写本と校訂版との比較検討に基づいて完成させる。他方、各種辞書・先行研究における中世フランス語版『テンプル騎士団会則』の引用再検討の作業を完成させ、それらの解釈の妥当性を文献学的に調査し、従来の知見がいかに補足できるかをまとめつつ、『テンプル騎士団会則』に含まれる、フランス語史および言語地理学の観点から興味深い単語・表現の収集をまとめ、それらの語彙の意義を明確にする。また、関連するラテン語作品・フランス語作品の収集ならびに批判的検討を続け、その問題点と意義を明らかにしつつ、従来の語彙研究への補足をおこなう。
湿潤変動帯における台風頻度が斜面崩壊の規模－頻度と土砂生産に与える影響の評価

本研究では、20012011年に降雨に起因して発生した4,744件の斜面崩壊を対象とし、斜面崩壊の規模ー頻度と雨量との関係、および台風の影響を解析した。その結果、累積雨量250 mm、最大時間雨量35 mm/h、平均雨量強度4 mm/hを超えると、規模の大きな斜面崩壊の頻度が高くなり、台風の寄与率は最大で約40%であった。また、現在の気候下において斜面崩壊の頻度とそれによる総侵食量を最大にする降雨イベントが存在し、それらの再現期間は約40年以下であることが示唆された(Saito et al., 2014, Geology)。研究目的を達成するために平成25年度に行った研究は、以下のようにまとめられる。湿潤変動帯に位置する日本列島では、降雨に起因する斜面崩壊が頻繁に発生している。これまで、雨量強度-降雨継続時間などの雨量指標と斜面崩壊の発生との関係を解析する研究は数多く行われてきたが、斜面崩壊の規模ー頻度との関係に着目した研究は多くない。そこで本研究では、斜面崩壊の発生と降水量との関係を、斜面崩壊の規模に着目して解析した。具体的には、2001年2011年に降雨で発生した4,744件の斜面崩壊を対象とした。一連の降雨の開始から斜面崩壊が発生するまでの、累積雨量(mm)、最大時間雨量(mm/h)、平均雨量強度(mm/h)、降雨継続時間(h)を解析雨量(気象庁)より計算した。本研究において、一連の降雨は、24時間の無降水継続時間で区切られる降雨イベントである。その結果、規模が大きい斜面崩壊ほど、累積雨量、最大時間雨量、平均雨量強度が大きくなることが明らかになった。特に、累積雨量205270 mm、最大時間雨量3345 mm/h、平均雨量強度4 mm/hを超えると、規模の大きな斜面崩壊の頻度が大きくなる傾向が明らかになった。さらに、台風の寄与は最大で約40%であった。また、雨量が増加するほど斜面崩壊の頻度と総崩壊量が増加するが、その関係は非線形であり、両者は一致しないことが示された。つまり現在の気候下において、斜面崩壊の頻度・総侵食量を最大にする降雨が存在することが示唆された。(Saito et al., 2014,投稿中)1.湿潤変動帯に位置する日本列島では、降雨に起因する斜面崩壊が多数発生している。本研究では、20012011年に発生した4,744件の斜面崩壊を対象とし、斜面崩壊の規模ー頻度と雨量との関係、および台風の影響を解析した。その結果、累積雨量250mm、最大時間雨量35mm/h、平均雨量強度4mm/hを超えると、規模の大きな斜面崩壊の頻度が高くなり、台風の寄与率は最大で約40%であった。また、雨量が増加すると斜面崩壊の頻度と総崩壊土量が増加するが、それらの関係は非線形であり、両者は一致しないことが示された。現在の気候下において斜面崩壊の頻度とそれによる総侵食量を最大にする降雨イベントが存在し、それらの再現期間は約40年以下であることが示唆された(Saito et al., 2014, Geology)。2.平成24年7月九州北部豪雨により多数の斜面崩壊が発生した阿蘇山周辺を対象として、斜面崩壊地の地形的特徴の解析と土砂生産量を推定した。特に本研究では、小型UAV(無人航空機)とSfM/MVS写真測量の技術を用いて、高精細の空中写真とDSMを取得した。また、異なる時期のデータを用いて解析をおこなった。その結果、空間解像度4 cmのオルソ画像と、10 cmのDSMが得られた。阿蘇・仙酔峡では、約300箇所で斜面崩壊(投影面積1010,000m2)が発生した。2004年と2014年の地形を比較したところ、推定される土砂生産量は1.11.5×100000 m3 / km2であった。斜面崩壊は平均傾斜約40 °の斜面で多数発生し、その平均深は1m程度であった。また地形条件に加え、過去の斜面崩壊発生履歴が、斜面崩壊の発生に影響した可能性が示唆された(齋藤ほか、2015、日本地理学会春季学術大会)。26年度が最終年度であるため、記入しない。自然地理学26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、湿潤変動帯である日本列島と台湾を対象として、台風頻度が斜面崩壊の規模ー頻度と山地における土砂生産に与える影響を、広域的に明らかにすることである。

現在までに、日本列島全域を対象として、斜面崩壊の規模ー頻度と降水量との関係を、台風頻度に着目して解析中である。よって、おおむね順調に進展していると言える。今後は、斜面崩壊の規模ー頻度と降水量、台風頻度との関係を、より詳細に解析する計画である。具体的には、地域性、季節性などの解析である。また台湾も対象とし、土砂生産量との関係も解析する計画である。
学習障害児の視覚記憶の評価と促進プログラム

本研究は、読み書きの困難を伴う学習障害児に対する支援を、視覚記憶をはじめとした種々の情報処理機能との関連で検討した。具体的には、文字の形の視覚的な分析、単語を読む際の視覚と聴覚の情報処理過程、漢字を書く際の視覚記憶と運動の過程等について、学習障害児の特徴と、その促進要因について明らかにした。これらの結果に基づいて、学習障害児の認知の個人差を考慮した指導を行い、得意な力を用いた学習の有効性を検証した。1.ワーキングメモリ評価課題の開発と援助要因の検討事物集合の個数判断課題を用い,ワーキングメモリの特徴を,使用方略と構音抑制効果との関連から検討した.健常成人を対象とした実験を行い,カウンティング方略による個数判断に作業記憶の音韻ループが関与するという先行研究の知見を追認した.その上で,サビタイジング方略による個数判断の過程には,音韻ループの関与が極めて小さいことを検証する実験に成功した.これにより,音韻情報処理の弱さが指摘される児童における,発達初期の数量判断の援助要因として,サビタイジングの有効性を指摘できた.2.健常児基準データの収集小児の初期発達の特徴を明らかにする必要から,健常幼児を対象に集合数の同一判断課題を検討した.5より大きな数を判断する課題に比べ,小さな数を二種類同時に判断する課題を容易とする段階が,幼児期に存在することを明らかにした.この点は,課題の成績とともに,反応時間の測定,および一部事例における心拍反応による緊張状態の変動の分析によって確かめた.3.学習障害児の書字指導教材の開発とプロファイリング読み書きの困難を伴う学習障害児に対する漢字書字の指導用教材群の開発を行った.教材は対象児の視覚記憶および聴覚記憶の特性に応じて選択できるように構成し,計45種類を作成した.その上で,特性の異なる典型事例2名を抽出し,指導効果を測定した.聴覚記憶の弱さが指摘された事例では,イラストによる視覚的援助と,文または語句を材料とした意味論的情報の利用の有効性を確認した.視覚記憶と視覚的注意の弱さが指摘された事例では,漢字の視覚的成分のチャンキング(例:「親」の立,木,見への分解),および形態的特徴の恒常性(方向・大きさの異なる漢字の同一判断)に関する指導の有効性を確認した.1.ワーキングメモリを考慮した教科学習支援教材の開発国語と算数について,ワーキングメモリを考慮した教材開発と研究を行った。国語に関しては,漢字の形の弁別,構成,読み,書きのそれぞれについて,マッチング課題を中心に課題を整備し,教材のラインアップに関して当初計画をほぼ達成した。効果検証の基礎的研究として,各課題に要するワーキングメモリの性質と対象児の認知特性,および誤書字の発生メカニズムとの間の関連を,事例に基づいて明らかにした。漢字の形態に関する情報抽出過程について明らかにし,論文発表した。算数に関しては,健常成人を対象として,事物の個数判断の方略のひとつであるサビタイジングには,ワーキングメモリの音韻ループの関与が小さいことを明らかにした。その上で,知的障害児を対象に,小さな数をサビタイジングに基づいて2種類同時にマッチングすることが,それらの和に相当する1種の数のマッチングと比べて容易なことを明らかにした。これにより,大きな数の指導における,数の合成・分解操作の導入方法を検討可能となった。2.生理的指標のモニタリングによる学習プロセスの評価に関する検討課題遂行時の心拍反応をパルスオキシメータを用いて測定することにより,学習効果検証法の基礎的検討を行った。具体的には,脈波と心電図との同時計測に行い,脈波伝播時間が心拍反応波形に及ぼす影響を調査した。対象は健常成人とし,安静時とクレペリン施行時の持続的心拍変動,および2桁の足し算問題を用いた期待反応パラダイムを検討した。その結果,脈波と心電図とで極めて一致した結果を得るとともに,課題に伴う注意状態の変動を的確に検出できた。脈波測定は非侵襲かつ身体的拘束が極めてわずかなので,上記結果から,実際の臨床指導効果の測定に,脈波に基づく心拍反応測定を応用することの妥当性が確かめられた。前年度の実績に基づき、漢字の書字学習に関する学習支援方法と具体的教材を、認知特性のタイプに応じて呈示する教材群の開発を行った。具体的には、漢字の学習過程を文字の視覚的弁別、語の音韻操作、漢字の意味処理、書字の運動出力の各段階に分類した。それぞれの過程について、サンプルマッチング課題とプライミングによる対連合学習課題、および書字の運動系列学習課題を作成した。対象児の各種評価結果をプロファイリングできるようにした上で、研究協力校における定期的な個別指導を実施した。その結果、語の音韻操作段階に困難を示すLD児においては、サンプルマッチングとプライミングの効果が特徴的に認められた。書字の運動出力段階に困難を伴う児では、音刺激を手がかりに書字運動の学習を行う課題で、著明な効果を認めることができた。これらの結果については、単純な反復練習による学習経過との比較において、その効果が有意であることを確かめた。