hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アミロイド形成速度の位置効果

2009年-アミロイド線維の破砕における位置効果:初年度では、試験管内で統制された条件下において、アミロイド線維をつくるためにペプチドとポリペプチドに関する一連のモデルが用いられた。これらの線維は、剪断力(音波の流れもしくはパルス)の使用もしくは線維の分解を好む溶媒の状態で熱することにより破砕された。破砕された線維はその後透過電子顕微鏡(TEM)により分析され、長さの分布が記録された。分析結果の解釈とアミロイド線維の破砕パターンを予測する基本段階として、コンピューターを用いてモデルを構築した。2010年-ペプチドからアミロイドを形成する性質における位置効果:研究2年目は、より大きなポリマー連鎖におけるペプチド断片の位置が、アミロイドの成長速度に対して、どのような効果をもつかについて調べることを目的とした。大きさの分布の特徴づけを行うための手続きを分析、改良するための時間を設けた。我々は、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)と透過電子顕微鏡(TEM)および従来のSDSゲル電気泳動(GE)のデンシトメトリー実験に基づき新たな分析のフォーマット、および時間依存型のリガンド結合分析に基づいて表面での化学反応を測定する機能的な分析方法を開発した。我々は、未だ重要視されていない、アミロイドの形成や解離の速度とそれが起こる位置との関係を調べる研究計画を提示しました。最初に我々は、アミロイドの形成過程におけるその速度を求める手段として、アミロイド原性タンパク質が形成されるのを助長するような構造的要因の解明を試みました。研究計画において、我々はその構造的要因を調べるために、実験的なモデルと理論的なモデルを組み合わせることを提案し、実際に当該年度では、これら両方のモデルの構築を良好に進めることができました。理論的、あるいはコンピューターを用いたモデルに関しては、小線維の成長と破砕に対する簡単なモデルを構築することに成功しました。そして、このモデルを用いて病気に関連したアミロイドの新たな仮説について論文発表をすることができました。また、小線維内部で起こる断片化の割合がアミロイドの長さや構造に与える影響についても調べることができ、これについても近々論文で発表する予定です。実験的なモデルの開発に関しては、Aβペプチドのペプチド断片やインシュリン、アミリンからアミロイド線維を作製することに成功しました。現在、我々は2つの方法を確立してこれらのアミロイド線維の成長速度を調べています。1つは小線維に結合するリガンド量を経時的に測定することで生成したアミロド線維量を求める方法で、もう1つは電気泳動を用いて時間ごとに生成されたアミロイド線維量を求める方法です。これらの基本的なモデルが十分に機能することを確認したのち、次の段階として、ペグ化された薬品を用いたペプチド実験用にこれらのモデルを改良していく予定です。研究2年目は、より大きなポリマー連鎖におけるペプチド断片の位置が、アミロイドの成長の割合に対して、どのような効果をもつかについて調べることを目的とした。2年目の研究の目的が、アミロイド線維の大きさの分布を特徴づけられるか否かに左右されることから、この特徴づけを分析し改良するための時間を設けた。(A1)サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いて、アミロイドの成長の範囲と大きさの分析を行った。本手続きは、SEC実験においてアミロイドを使用するという新しい実験のプロトコルと理論の開発を含んでいる(現在投稿中)。(A2)透過電子顕微鏡グリッドに吸収され陰性染色されたアミロイド線維の大きさと幅を測定するための半自動化した手続きを開発した(投稿準備中)。(A3)従来のSDSゲル電気泳動実験のデンシトメトリーに基づいて、アミロイド内のたんぱく質量を測定する大量処理が可能な動的な分析方法を開発した(投稿準備中)。(A4)時間依存型のリガンド結合分析に基づいて表面での化学反応を測定する機能的な分析方法を開発した(投稿準備中)。(A5)顕微鏡プレート上の線維の蛍光イメージングに基づいて、半自動的にアミロイド線維の大きさの分布を測定する方法について研究した。
Innate Immunity系の菌体表層成分認識機構 -特にToll-like receptorの役割について-

侵襲微生物をパターン認識して生体防御を担当するinnate immunity(自然免疫)系、特にToll-like receptor(TLR)系の解明が急速に進んでいる。申請者らは各種菌体成分の自然免疫系による認識機構、特に歯周組織構成細胞による認識機構を研究し、口腔粘膜疾患との係わりを探ろうとした。主な研究成果は次の通りである。(1)歯周病原菌と目されるPorphyromonas gingivalisが産生する3種のシステインプロテアーゼ(gingipain)はヒト単球上の膜CD14(mCD14)を分解して、同細胞のリポ多糖(LPS)応答を喪失させる。これは、P.gingivalisの自然免疫回避機構と考えられる。(2)ヒト好中球酵素エラスターゼはヒト歯肉線維芽細胞のmCD14を溶解して、同細胞のLPS応答を喪失させる。これは過剰な自然免疫応答を抑えるフィードバック機構と考えられる。(3)一般にmCD14を欠く上皮系細胞は遊離型CD14(sCD14)存在下ではTLRを介して各種菌体成分に応答する。しかし、口腔上皮細胞はsCD14存在下でもLPS、ペプチドグリカン(PGN)ならびにその活性中心に当たる合成ムラミルジペプチド(MDP)、グラム陽性菌のリポタイコ酸(LTA)に不応答である。(4)Staphylococcusepidermidis PGNを酵素処理して調製した可溶性PGN、SEPSはTLR2を介して細胞を活性化するが、SEPSのグリカン鎖を界裂させたフラグメントやMDPにはそのような作用が認められない。(5)MDPはヒト単球系細胞をCD14,TLR2および4非依存的に作用してMyD88発現を増強し、LPSやLTA(いずれもTLR4依存的活性を示す)と相乗的なサイトカイン誘導作用を発揮する。(6)インターフェロンγで処理された歯肉線維芽細胞ではmCD14ならびにMyD88発現が上昇して、LPS高応答性を示すようになる。今後、さらに多くの菌体成分と自然免疫系との係わりを解明し、新しい視点から歯周病研究に資したいと考えている。広範な細菌種に共通する細胞表層成分を認識して応答する宿主の自然免疫機構の解明が急速に進んでいる。グラム陰性菌に普遍的な内毒素性リポ多糖(LPS)、グラム陽性菌のリポタイコ酸(LTA)、マイコプラズマを除く全ての細菌種に分布するペプチドグライカン(PGN)等は、いずれもCD14分子によって認識される。細胞内ドメインを欠くCD14と共同(?)してシグナル伝達を担うのが、Toll-like receptor(TLR)で、10種以上が確認されている。そして、LPSはTLR4とMD-2の複合体により、PGNはTLR2によって、それぞれシグナル伝達されることが明かにされている。さらに、TLRのアダプター分子として機能するMyD88が菌体成分応答に必須である。本研究では、様々な菌体表層成分が歯周組織構成細胞や炎症性細胞によってどのように認識されるかを解明して、歯周病の発症機序解明を目指した。これまでに、以下の成績を得ている。1)歯周病原菌と目されているPorphyromonas gingivalisの産生する3種のタンパク分解

酵素ジンジパインはいずれもヒト単球のCD14分子を分解して、単球のLPS応答を喪失させた。2)ヒト好中球の産生するエラスターゼは、ヒト歯肉線維芽細胞のCD14分子を分解して、LPS応答を喪失させた。3)議論の分れていたLTA応答は、TLR4を介している。4)Micrococcusluteus細胞壁に特有の成分であるタイクロン酸も、CD14/TLR4で認識される。5)PGNの要構造に当たる合成MDPはヒト単球系細胞に対して、CD14およびTLR2/4非依存的に作用し、LPSやLTAと相乗的に作用する。その際、MyD88遺伝子発現の著しい増強が認められる。今後、歯周組織構成細胞のCD14/TLR系の動態と細菌応答の関係をさらに解明して、歯周病の病因論に新しい視点を提示したいと考えている。侵襲微生物をパターン認識して生体防御を担当するinnate immunity(自然免疫)系、特にToll-like receptor(TLR)系の解明が急速に進んでいる。申請者らは各種菌体成分の自然免疫系による認識機構、特に歯周組織構成細胞による認識機構を研究し、口膣粘膜疾患との係わりを探ろうとした。本年度論文発表した主な成果は次の通りである。(1)一般に膜CD14(mCD14)を欠く上皮系細胞は遊離型CD14(sCD14)存在下ではTLRを介して各種菌体成分に応答する。しかし、口膣上皮細胞はsCD14存在下でもリポ多糖(LPS)、ペプチドグリカン(PGN)ならびにその活性中心に当る合成ムラミルジペプチド(MDP)、グラム陽性菌のリポタイコ酸(LTA)に不応答である。これは、常に多量の細菌に晒されている口膣上皮細胞にあっては合理的な仕組みと考えられる。(2)MDPはヒト単球系細胞をCD14,TLR2および4非依存的に作用してMyD88発現を増強し、LPSやLTA(いずれもTLR4依存的活性を示す)と相乗的なサイトカイン誘導作用を発揮する。(3)インターフェロンγで処理された歯肉線維芽細胞はmCD14ならびにMyD88発現が上昇して、LPS高応答性を示すようになる。(4)Micrococcusluteus細胞壁ダイクロン酸はCD14およびTLR4依存的な活性を示す。申請者らは研究対象をさらに広げて、(4)innate immunityのもう一つの重要な担い手である補体系特にレクチン経路が、マンノースホモポリマーを有するLPSによって強力に活性化され、マウス肺での血小板崩壊惹起してマウスをショック死に導くことを明らかにした。今後、さらに多くの菌体成分と自然免疫系との係わりを解明し、新しい視点から歯周病研究に資したいと考えている。
シナプスオーガナイザーの機能破綻から神経発達障害の発症に至るシナプス病態の解明

X連鎖型知的障害・自閉症の原因遺伝子産物である膜分子Interleukin-1 receptor accessory protein-like 1 (IL1RAPL1)とそのリガンド、受容体チロシン脱リン酸化酵素PTPδの相互作用からシナプス前部、後部が誘導される分子シグナルネットワークを明らかにするとともに、シナプスオーガナイザーの機能欠損が引き起こす神経発達障害におけるシナプス病態と回路構築病態を明らかにすることを目的として研究を進めた。IL1RAPL1とPTPδの相互作用によってPTPδの細胞内領域に形成されるシナプス前終末誘導複合体の構成タンパク質の網羅的解析から、シナプス形成に関わる神経発達障害関連分子ネットワークが明らかとなった。また、IL1RAPL1-PTPδ複合体のX線結晶構造解析及び構造モデルに基づく両タンパク質の変異体の解析からIL1RAPL1とPTPδの結合様式及びシナプスの分化誘導シグナル伝達に関わる重要な領域を同定した。更にIL1RAPL1の欠損が脳機能に及ぼす影響について、網羅的行動テストバッテリーを用いて検証した。IL1RAPL1欠損マウスでは大脳皮質2/3層及び海馬CA1領域において興奮性シナプスが10%程度減少しており、空間の参照記憶や作業記憶、恐怖記憶の遠隔記憶が障害され、行動の柔軟性も野生型マウスに比べると減少していることが明らかになった。また、IL1RAPL1欠損マウスは自発的活動が亢進し、広い空間や高さに対する不安が軽減していることも明らかになった。これらの結果は脳の興奮性シナプス形成を制御するIL1RAPL1の欠損が興奮ー抑制のバランスを崩し、様々な脳機能に影響を及ぼしていることを示唆している。26年度が最終年度であるため、記入しない。知的障害及び自閉症原因遺伝子産物IL1RAPL1及びそのリガンドPTPδの相互作用からシナプス前部、後部が誘導される分子シグナルのネットワークを明らかにするとともに、シナプスオーガナイザーの機能欠損が引き起こす神経発達障害におけるシナプス病態と回路構築病態を明らかにすることを目的として研究を行った。IL1RAPL1の細胞内領域をベイトとしたアフィニティークロマトグラフィーにより、多数の結合因子を同定した。興奮性シナプス後部に局在するIL1RAPL1の細胞内領域にはRhoグアニンヌクレオチド変換因子であるMcf2Lが結合し、ROCK等を介してシナプス後部スパイン形成を担うことを明らかにした。また、IL1RAPL1-Mcf2L-ROCK経路はAMPA型グルタミン酸受容体の膜移行を調節して、興奮性シナプス成熟にも関与することを明らかにした。一方、IL1RAPL1欠損マウスの行動学的解析から、参照記憶、作業記憶の異常、行動の柔軟性の異常、社会性の異常等の神経発達障害に関連する行動表現型を見出してる。IL1RAPL1及びそのリガンドPTPδのインターラクトーム解析について、当初の予定通りスクリーニングがほぼ完了し、神経発達障害関連シナプスタンパク質のリストが出来上がったため。L1RAPL1及びそのリガンドPTPδのインターラクトーム解析から得られた神経発達障害関連シナプスタンパク質のリストの中からシナプス形成調節の鍵分子をノックダウン法によってスクリーンする。
脳血管構成細胞間の液性および電気的シグナリングに関する研究

本研究は脳血管の血流動態を新たな視点から追求するために企画されたものである。一般に動脈血管は支配交感神経と血管内皮から遊離される生理活性物質(情報伝達物質)がその効果器である平滑筋に作用して収縮・弛緩を調節することにより営まれているが、ここでは各種動物の血管の多用な働きを明らかにした。実験にはハムスター、ラットおよびニワトリ・ウズラの脳血管や腸間膜動脈を用いた。(1)生体から摘出した標本の内、各種動物の脳底動脈と家禽の腸間膜動脈の一部は自発的なslow waveが電気生理学的に導出され、それに連動した機械的収縮を有していることが明らかになった。また、セロトニン、AChあるいはATPなどの候補伝達物質や神経刺激に応じて非常に時間経過の緩徐な脱分極とそれに引き続いた収縮が誘発された。この様に血流の調節が電気的あるいは液性のシグナリングにより仕組まれていることを示している。(2)免疫組織学的に脳底動脈の支配神経は、主にセロトニン或いは一酸化窒素含有ニューロンあるいはグリア細胞が豊富に観察された。一方、腸間膜動脈ではタッキニンおよび一酸化窒素含有ニューロンに加え、家禽ではコリン・アドレナリン作動性神経線維に富んでいた。さらに機械的反応を指標にした実験では、プリン作動性ニューロンの存在が顕著であった。(3)電気生理学的・薬理学的検索により、脳底動脈ではこれまでに未だ証されていない支配神経以外の細胞間の液性および電気的シグナルによる興奮伝導・伝達が派生していることが明らかとなった。これらの事象には神経毒や細胞内へのCa取り込み阻害薬に抵抗する興味ある知見が得られた。一般に血管支配神経はC線維であり、電気刺激応答には比較的強い電気刺激(300-1500μs・20-30V)のパルスを必要とするが、脳底動脈では1/30-100程度の微弱な電流パルスに応答する神経機構が存在し、血流調節を巧妙に仕組んでいることを明らかにした。また、腸間膜動脈では、プリン作動性神経から遊離した伝達物質が内皮細胞に作用して平滑筋を直接・間接的に収縮・弛緩に関与して血流の調節を司っていることも明らかにした。これらの発見はこれからの血流調節や血圧調節などの新規治療薬の開発に新たな知見を与えるものと思われる。本研究ではハムスターおよびラットの脳血管(脳底動脈-細動脈-毛細血管)を用いて、以下のような成績と途中結果を得た。(1)脳底動脈における神経支配様式を血管平滑筋の収縮弛緩反応を指標に検索すると、脳底動脈標本は、自動能を有する末梢動脈では通常観察されない固有の自発性運動を生じた。血管支配神経の電気的刺激に応じて血管は収縮し、交感神経遮断薬の処置後、この収縮は影響されなかったが、セロトニンおよびプリン受容体拮抗薬を併用した後では神経刺激効果は消失した。(2)脳底動脈を免疫組織化学的に観察すると、セロトニン作動性神経線維および一酸化窒素作動性神経線維が高密度で血管を支配していることが明らかになった。

(3)脳血管の主要な構成細胞である平滑筋あるいは内皮細胞の機能を電気生理学的視点から解析すると、内臓支配血管の電気刺激パルは500-2000μsと30-70Vの刺激強度を必要とするが、脳血管標本にあっては、電気刺激パルスは20-50μsと前者の1/25-1/40であり、電圧も5-10Vと僅かな電流密度により興奮する特異的なあ興奮細胞であり、従来の神経線維興奮閾値とは相違が甚だしい。また、外液の低濃度Caイオンに耐性であるなどの興味ある結果が得られつつある。これらの成果は、脳血管系治療薬への新創薬への手がかりを提供する可能性を強く示唆するように思われる。本研究は、ラット・ハムスターおよびニワトリの脳血管や腸間膜血管を用いて、液性あるいは電気的(情報物質や細胞間伝導)シグナリングを解明することを目的に実施された。(1)生体から摘出した材料標本(脳・腸間膜動脈)の内、脳底動脈およびニワトリ腸間膜動脈の一部分は自発的な運動機能を有していた。また、セロトニン・AChの適用や電気刺激に応じて収縮・弛緩した。血流の調節が液性・電気的に巧妙に仕組まれていることも明らかになった。(2)脳底および腸間膜動脈を免疫組織学的に観察すると、前者ではセロトニン作動性や一酸化窒素作動性神経あるいはグリア細胞などに富んでいた。一方後者では、主に一酸化窒素作動性神経とアドレナリンおよびコリン作動性神経線維の一部が血管の周囲に観察された。(3)電気生理学的・機能学的手法により、脳底動脈ではこれまでに証されていない非神経性の興奮伝達が存在し、神経毒や細胞内へのCa取り込み阻害効果に抵抗する極めて重要な発見が得られた。一般に血管支配神経はC繊維であり、電気刺激応答は500-2000μs・30・50Vのパルスであるが、脳底動脈では、1/30-50の20-30μsの特殊な興奮膜であることを初めて明らかにした。腸間膜動脈では、主にプリン作動性神経が支配し、その終末から遊離したATPが血管機能を調節し、その効果側の受容体はP2Y_2のGタンパク質共役型であることも明らかにした。これらの発見は脳あるいは腸血流調節への新規治療薬開発の新知見を与えるものと思われる。
初期地球でのアミノ酸生成とペプチド化プロセスの解明

隕石海洋衝突を模擬した衝撃実験を行いオリビンの蛇紋石化に世界で初めて成功し、アミノ酸を含めた多種の有機物生成に成功した。衝突蒸発雲を想定した実験では、アンモニアやシアン化物の生成に成功した。アミノ酸重合実験では最大5GPaという圧力でアラニンとグリシンの重合に成功した。この成果に対して2011年国際生命起源と進化学会から最優秀成果発表賞を受賞した。複数アミノ酸混合系実験でもユニークなペプチドが生成される事が分かった。本研究課題は、生命起源に関するアミノ酸生成とその重合の問題を地球科学的手法で取り組む課題である。第一の目的として、(1a)隕石海洋衝突を模擬した衝撃実験と、(1b)衝突蒸発雲を想定したガス-鉱物反応実験を行う。第二の目的として(2a)単一アミノ酸だけの系と(2b)複数アミノ酸混合系、(2c)そこに鉱物を加えた混合系において高温高圧実験を行う。それにより、アミノ酸からタンパク質に移り変わる過程を解明する。第一の目的を果たすのは(1a)衝撃圧縮実験装置を用いた衝突再現実験と(1b)衝突蒸発雲内部を想定したガス固体反応実験であり、様々な改良を加えて実験が行われた。ここでの生成物はLC-MS(本年度予算で改良)とGC-MSなどを用いて分析され、グリシン以外にもPAH系の有機分子が多種類生成されることを世界で初めて示した。またガス反応によってアンモニアやシアン化物の生成が確認された。ハーバーボッシュ反応以外でのアンモニア生成確認は、やはり世界的にも稀である。第二の目的を果たすために、高温高圧状態でのアミノ酸の重合実験を展開した。それには物質材料研究機構のベルト型高圧発生装置、東北大学のオートクレーブおよびピストンシリンダー高圧発生装置(本年度予算で購入)を用いた。その結果、複数アミノ酸混合系では、単純系で生成されなかったペプチドが高温高圧状態で生成されること、超高圧環境(最大5GPa)でもペプチドが生成されることを示した。圧力を用いたペプチド生成としては世界記録である。これらの成果は積極的に国際学会(Goldschmidt会議など)などで公表された。ここでの生成物はLC-MSとGC-MSなどを用いて分析され、前年度以上に多種の低分子有機分子が生成されることを示した。またガス反応によって水素の生成に伴いアンモニアやシアン化物の生成量がコントロールされることを示した。衝突蒸気雲内部での反応がより詳細に解明され国際学会でも公表してきている。それには物質材料研究機構のベルト型高圧発生装置、東北大学のオートクレーブおよびピストンシリンダー高圧発生装置を用いた。その結果、複数アミノ酸混合系(アラニンーグリシンやメチオニンーグリシン)では、単純系で生成されなかったペプチドが高温高圧状態で生成されること、超高圧環境(最大5GPa)でも難生成ペプチド(アラニンの3量体など)が生成されることを示し論文として投稿した(受理予定)。これらの成果は積極的に国際学会(AbSciConやGoldschmidt会議など)などで公表された。第一の目的として、(1a)限石海洋衝突を模擬した衝撃実験と、(1b)衝突蒸発雲を想定したガスー鉱物反応実験を行う。第二の目的として(2a)単一アミノ酸だけの系と(2b)複数アミノ酸混合系、(2c)そこに鉱物を加えた混合系において高温高圧実験を行い、アミノ酸からタンパク質に移り変わる過程を解明する。それには物質材料研究機構のベルト型高圧発生装置、東北大学のオートクレープおよびピストンシリンダー高圧発生装置を用いた。その結果、複数アミノ酸混合系では、単純系で生成されなかったペプチドが高温高圧状態で生成されること、超高圧環境(最大5GPa)でも難生成ペプチド(アラニンの4量体など)が生成されることを示し、Astrobiology誌に公表し、生成物に対する安定同位体分析の有効性も示すことができた。

反応を促進させるために1GPa,350°Cという極限状態を作り出した中で、アラニンやグリシンが重合しペプチドを形成したことを確認した。本来なら全て炭化する温度であるが、それを制御した圧力の効果は絶大であった。この成果に対して2011年国際生命起源と進化学会において最優秀成果発表賞を受賞した。
癌細胞の増殖および接着シグナルの収斂プロセスにおけるスフィンゴ糖脂質の役割

本研究では、癌細胞の増殖シグナル関連分子および接着分子が、細胞膜周囲で分子複合体を形成して、両者のシグナルが収斂・増強する過程において、GD3などのガングリオシドが果す機能を明らかにすることを目的とする。現在までに私達は、GD3発現ヒトメラノーマ細胞において、FCS刺激によりFAK、p130Casおよびpaxillinの活性化が増強され、その結果、細胞増殖および浸潤性の亢進などの癌性形質が促進されることを明らかにしてきた。本研究では、更に、接着シグナルの役割を明らかにするために、GD3発現メラノーマ細胞の悪性形質形成におけるインテグリンの役割について分子レベルで検討した。その結果、インテグリンβ1とGD3の相互作用が、細胞の増殖および浸潤性の亢進に重要であることが示唆された。また、GD3発現細胞ではI型コラーゲンに対する顕著な接着性の増強が認められ、I型コラーゲンの接着刺激により、FAK、p130Cas、およびpaxlllinのリン酸化レベルの増強が認められた。更に、GD3発現細胞の癌性形質におけるSrc family kinaseの関与について検討した結果、Yesが細胞増殖および浸潤性の増強に関与していることが明らかになった。以上の結果より、GD3発現細胞では、細胞膜周囲において、細胞増殖因子受容体および接着分子を介するシグナルが収斂し、FAK、p130Cas、paxillin及びYesなどのシグナル分子群の活性化の増強が惹起されることが示された。今後、GD3による細胞膜近傍でのシグナル収斂の惹起メカニズムについて分子レベルで明らかにする。平成18年度は、GD3発現によるメラノーマの悪性形質形成におけるインテグリンの役割について主に検討した。GD3安定発現ヒトメラノーマ細胞株およびGD3非発現コントロール細胞株について、インテグリンα2β1、α3β1の発現を確認した。インテグリンβ1をノックダウンして、約80%の発現抑制を行った結果、GD3発現細胞において細胞増殖能および浸潤性の顕著な低下を認めた。コントロール細胞では、インテグリンβ1のノックダウンによる細胞増殖能の低下は認められなかった。浸潤性については、低下は認められたがGD3発現細胞ほど著明ではなかった。GD3発現細胞のインテグリンを介した接着性については、リアルタイム細胞計測システム(RT-CES)、および96 well plateに細胞外基質をコーティングした細胞接着実験により検討した。その結果、RT-CESにおいて、GD3発現細胞は、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、およびファイブロネクチンに対する接着性がコントロール細胞に比して増加していた。接着実験においては、I型コラーゲンとIV型コラーゲンに対する接着性がGD3発現細胞で増加していた。ファイブロネクチンとラミニンに対する接着性は検討中である。また、IV型コラーゲンの接着刺激によるシグナル伝達分子の活性化については、GD3発現細胞においてFAK、p130Cas、およびpaxillinのリン酸化レベルの増強が認められた。更に、GD3発現細胞の癌性形質におけるSrc family kinase(SFK)の関与について検討するために、GD3発現細胞株に発現しているSFKを検討した結果、Yes、Src、FynおよびLynの発現が認められた。現在、GD3発現細胞の癌性形質に関与しているSFKを各々のsiRNAにより検討中である。平成19年度は、GD3発現によるメラノーマの悪性形質形成におけるインテグリンの役割について分子レベルで検討した。GD3安定発現ヒトメラノーマ細胞株およびGD3非発現コントロール細胞株は、インテグリンα2β1、α3β1の発現が認められる。

インテグリンβ1をノックダウンして発現抑制を行った結果、GD3発現細胞において細胞増殖能および浸潤性の顕著な低下を認めた。コントロール細胞では、インテグリンβ1のノックダウンによる細胞増殖能の低下は認められなかった。浸潤性については、低下は認められたがGD3発現細胞ほど著明ではなかった。GD3発現細胞のインテグリンを介した接着性は、96well plateに細胞外基質をコーテイングした細胞接着実験により検討した。その結果、GD3発現細胞では、I型コラーゲンに対する顕著な接着性の増強が認められた。IV型コラーゲン、及びファイブロネクチンに対する接着性もコントロール細胞に比して増加していた。ラミニンIでは、コントロール及びGD3発現細胞ともに、ラミニンIに対する接着性が非常に低かった。また、I型コラーゲンの接着刺激によるシグナル伝達分子の活性化については、GD3発現細胞においてFAK、p130Cas、paxillin、およびAktのリン酸化レベルの増強が認められた。更に、GD3発現細胞の癌性形質におけるSrc family kinase(SFK)の関与について検討した。本細胞株では、Yes、Src、FynおよびLynの発現が認められたが、siRNAによりGD3発現細胞の癌性形質に関与しているSFKを検討した結果、Yesが細胞増殖および浸潤性の増強に関与していることが明らかになった。
鉄欠乏に応答する小胞体由来ムギネ酸顆粒の形成

ムギネ酸分泌トランスポーター候補遺伝子の解析。オオムギ、イネの鉄欠乏根でのマイクロアレイ解析によりムギネ酸の分泌のトランスポーターの候補遺伝子がいくつか上がってきている。これらのうちでもっとも可能性の高そうな遺伝子A(遺伝子についての詳細は記述しない)を用い、そのイネでの鉄欠乏による発現パターンの変化、抗体の作成、過剰発現体、RNAiによる発現抑制体の作成を行った。作成したイネを鉄欠乏、鉄十分条件下で栽培し、その分泌するムギネ酸量、あるいは根中のムギネ酸、ニコチアナミン量を測定することによりこの遺伝子がムギネ酸分泌に関わっているのかどうか検定を行った。鉄欠乏処理により存在量の変化するタンパク質の検索。鉄欠乏処理をしたイネとコントロールとして鉄十分で栽培したイネの根からタンパク質、特に膜タンパク質に注目して単離を行った。SDSを含むバッファーで抽出することにより、膜成分をリッチに含む画分を調整した。これを奈良先端科学技術大学院大学の深尾陽一朗先生が開発したSDSを含むバッファーを用いても等電点電気泳動できる手法を用いて二次元電気泳動を行った。鉄欠乏とコントロールの根での二次元電気泳動パターンを比較することで、それぞれに特徴的なスポットを切り出し、いくつかのタンパク質については同定することができた。ムギネ酸生合成の鍵酵素の一つであるニコチアナミン合成酵素の遺伝子OsNAS2をGFPタンパク質との融合タンパク質としてOsNAS2遺伝子のプロモーターの制御下で発現する遺伝子導入イネを作成した。作成したイネを鉄欠乏栽培してその根を蛍光顕微鏡で観察したところ、GFPの蛍光が顆粒状に存在することが分かった。イネから日周性、細胞内小胞輸送に関与する新たな遺伝子の検索を行った。イネを鉄欠乏処理し、その根と葉から経時的にサンプリングを行い、これらからRNAを抽出して特に鉄欠乏初期での日周性に関するマイクロアレイ解析を行った。アレイは、近年開発された特異性の高い約44,000のプローブがのっているイネオリゴアレイ(44kアレイ)を用いた。結果については現在解析中であるが、特に、小胞輸送に関与すると考えられる新たな遺伝子の検索、そして、日周性の遺伝子発現に関与すると考えられる転写因子の検索を重点的に行う。これらについてさらにノーザン解析、GFP解析、遺伝子導入植物の作成を行い、ムギネ酸分泌との関連を検討する。
腫瘍血管の生理的成熟化分子機構を応用した新規がん治療法の開発

我々のこれまでの研究により、LPA(Lysophasphatidic acid)が腫瘍血管網を制御する因子であることを明らかとしてきた。そこで引き続きLPAの臨床応用を目的として、その分子機構の解明、及びその臨床応用への可能性の検討を行った。LPAを投与することで腫瘍血管のネットワークが正常に誘導されるが、LPA4ノックアウトマウスを用いた担癌マウスにLPAを投与しても、腫瘍血管の正常化は誘導されなかった。このことからLPA-LPAR4シグナルが腫瘍血管の正常化に寄与していることが明らかとなった。またLPAR4に選択的に機能する化合物を投与した結果、LPAと同様に腫瘍血管のネットワークの正常化が観察された。更に、in vitroにおける正常化機構の解析において、LPAR4を内因性に発現している血管内皮細胞の培養細胞であるMS-1細胞を用いた検討を行った。その結果、LPAの濃度依存的に血管内皮細胞同士のバリア機能が亢進した。またsiRNAを用いた検討により、LPAR4を介した血管内皮細胞のバリア機能が亢進していることが明らかとなった。以上の結果より、in vitro、in vivoにおいてLPAには血管内皮細胞のバリア機能亢進を誘導することにより、血管透過性の正常化などを誘起し、腫瘍血管を正常化するという新たな機構の発見に至った。またLPAR4の選択的なアゴニストが今後、腫瘍血管制御標的としての有用性を見出すに至った。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、腫瘍血管の成熟化分子機構を解明するために、腫瘍血管の成熟化を誘導する分子の探索とその分子の腫瘍血管に対する機能評価を行った。腫瘍細胞を移植したマウスに候補となる分子を投与した後、腫瘍を回収し、腫瘍血管を共焦点レーザー顕微鏡により解析を行った。その結果、形態的に脆弱で走行もいびつな腫瘍血管が正常に近い血管に誘導するような分子の探索に成功した。さらに血管の機能的な解析を行うと、未投与群では血管透過性が亢進しており、腫瘍組織内の間質圧が高く、抗がん剤などの薬剤送達効率が低いが、正常化を誘導する分子を投与した群では、腫瘍内の血液還流性も顕著に改善され、腫瘍内への抗がん剤の到達性も顕著に改善されていることが明らかとなった。このような投与型の正常化因子は、未だどのグループも同定できておらず、この発見は、薬剤としての臨床応用の点で大変意義のある研究であることが明らかである。また、腫瘍血管の正常化を誘導する分子のレセプターの解析を行った。現在までに、レセプターとなりうる候補が複数個存在する。血管正常化に関わるレセプターを特定するために、担がんモデルマウスから腫瘍を回収し、フローサイトメトリーを用いて、プライマリーの腫瘍血管内皮細胞(CD31+,CD45-)をソーティングした。回収した腫瘍血管内皮細胞のRNAを抽出し、定量的PCRによりレセプターの発現を解析した結果、腫瘍組織において内皮細胞特異的に発現している分子を同定した。本研究では、血管形成の制御により効率的な癌治療を行うために、腫瘍血管の成熟化を誘導するような新規分子の探索、及びその機能評価を目的とする。現在行われている腫瘍血管の破綻よりも、脆弱で未成熟であるという特徴を持つ腫瘍血管の成熟化を誘導して抗癌剤の透過性を促進させることが重要ではないかという概念がある。そこで、in vivoにおいて免疫染色法により腫瘍血管を血管内皮細胞の膜タンパク質マーカーであるCD31 (PECAM-1)で染色し、血管の形態(走行・分岐数)・血管の機能(血液還流・漏出性)に着目し、共焦点レーザー顕微鏡を用いた解析により、Xが腫瘍血管を成熟化する新規分子であることを発見した。そして、Xと抗癌剤を併用投与した群では、抗癌剤単独に比べ、抗癌剤の腫瘍内送達量が増加することにより顕著な抗腫瘍効果が得られた。この効果は、蛍光を発する特徴を持つ抗癌剤であるドキソルビシンが、Xを併用することにより腫瘍内への送達量が顕著に増加したことからも、Xが腫瘍血管を成熟化することにより、併用する抗癌剤の腫瘍への送達量が増加したと考えられた。また、腫瘍血管は未熟で透過性が亢進していることから癌細胞が血管内に浸潤し、遠隔転移しやすい環境となっています。そこで、腫瘍血管の成熟化を誘導することにより、転移を抑制できるのではないかと考え、転移能が高くGFPを導入した癌細胞を皮下に移値し、Xが腫瘍の転移を抑制できるかどうかを検討した。その結果、Xを投与した群では皮下から肺への転移が顕著に抑制された。さらに、担癌マウスの腫瘍から初代腫瘍血管内皮細胞をFACSAriaを用いて回収して、RNA抽出・cDNA合成を行い、定量的PCRを行うことで、初代腫瘍血管内皮細胞に発現しているXの受容体を特定することに成功した。このことからLPA-LPAR

4シグナルが腫瘍血管の正常化に寄与していることが明らかとなった。またLPAR4に選択的に機能する化合物を投与した結果、LPAと同様に腫瘍血管のネットワークの正常化が観察された。更に、in vitroにおける正常化機構の解析において、LPAR4を内因性に発現している血管内皮細胞の培養細胞であるMS-1細胞を用いた検討を行った。その結果、LPAの濃度依存的に血管内皮細胞同士のバリア機能が亢進した。またsiRNAを用いた検討により、LPAR4を介した血管内皮細胞のバリア機能が亢進していることが明らかとなった。以上の結果より、in vitro、in vivoにおいてLPAには血管内皮細胞のバリア機能亢進を誘導することにより、血管透過性の正常化などを誘起し、腫瘍血管を正常化するという新たな機構の発見に至った。またLPAR4の選択的なアゴニストが今後、腫瘍血管制御標的としての有用性を見出すに至った。26年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究において、腫瘍血管の成熟化遺伝子は数種同定されているが、マウス等の実験動物に投与して、実際に腫瘍血管の正常化を誘導できる分子は未だに発見されていない。しかし、我々はこれまでの研究により、担癌マウスに投与して、腫瘍血管の正常化を誘導可能な因子の同定に成功した。これは、薬剤への応用という点において有意義な研究が進行していることが明らかである。平成25年度の研究では、当初予定していたX受容体欠損マウスを共同研究により解析を行うことで、腫瘍血管正常化誘導機構の解明をさらに進めた。腫瘍血管正常化機構に関する受容体の同定は本研究を進めていく上で非常に重要な進展である。以上のような状況をふまえると、本研究は「おおむね順調に進展している」と自己判断するに値すると思われる。これまでに、我々が同定した腫瘍血管正常化因子を用いた血管形態・機能の検討を行ってきた。さらに、抗がん剤との併用療法により、抗腫瘍効果を著しく高めることが示された。そこで今後は、腫瘍血管の詳細な正常化メカニズムの解明を行う必要があると考え、腫瘍血管の正常化前後における、血管内皮細胞の遺伝子変化を解析し、さらに、細胞内伝達の解析を行う予定である。今後は、Xによる腫瘍血管正常化の血管内皮細胞における細胞内伝達を解析する予定である。解析法としては、X受容体発現血管内皮細胞にXを刺激し、細胞同士の接着を解析する。さらに、腫瘍環境を同様にVEGFが高濃度な条件におけるX刺激による細胞接着を観察する。Xによる細胞の反応が観察できれば、細胞内伝達を解析し、新規の腫瘍血管正常化機構を解明する。
仮想３Ｄマージン法による早期肺癌区域切除術シミュレーションの臨床応用

早期肺癌に対する手術療法として肺機能をできるだけ温存する肺区域切除術が普及しつつある。区域切除術は標準的術式である肺葉切除術と比べて切除範囲が狭いため術後の呼吸機能を温存できるというメリットがあるが、過去の研究結果では切除断端を含めた局所再発率が肺葉切除術よりも高いことが指摘されている。申請者は切除マージンを必要かつ十分に確保する術式を選択するための3D-CTを用いた肺癌の区域切除術の術前シミュレーション法(仮想3Dマージン法)を考案した。本研究課題の目的は、この仮想3Dマージン法による肺区域切除術シミュレーションに基づいた早期肺癌手術の臨床的有用性・安全性を検討することであり、本年度は、前年度に行ったthin-section CT上でスリガラス影を主体とするnon-solid typeの腫瘍に加え、スリガラス影を含まないsolid typeの腫瘍についても検討した。2011年4月から2012年7月に名古屋大学医学部附属病院において仮想3Dマージン法に基づいて区域切除術を行った原発性肺癌について、術前CT画像および仮想3Dマージン法による手術シミュレーションレポートと手術記録、カルテ、病理所見を比較検討した。径2cm以下の腫瘍について抽出を行ったところ17症例が合致した。最低限の切除マージンを2cmとする仮想3Dマージン法で計画された術式と実際に行われていた術式はほぼ一致しており、いずれの症例についても病理組織学的に切除断端陰性であることを確認することができた。本研究結果については2014年3月の第5回計算解剖学国際シンポジウムにて発表した。また英文雑誌Lung Cancerに査読付き論文として掲載された。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題の目的は、この仮想3Dマージン法による肺区域切除術シミュレーションに基づいた早期肺癌手術の臨床的有用性・安全性を検討することであり、本年度は過去症例について後向きに検討した。径2cm以下で、thin-section CT上でスリガラス影を主体とするnon-solid typeの腫瘍について抽出を行ったところ6症例(男性3名、女性3名)が合致した。本研究結果については医学雑誌に現在論文投稿中である。仮想3Dマージン法による肺癌区域切除術の後向きの初期的検討でその手法の安全性を確認することができ、今後の研究継続が可能となり、おおむね順調に進展していると考えられる。過去に当施設で行われた肺区域切除術症例(約20症例)について仮想3Dマージン法でシミュレーションした結果と対比し、シミュレーション通りに区域切除術を行うことで腫瘍の残存・再発を防止することが可能であったかどうかをレトロスペクティブに検討する。

本年度対象としたスリガラス影を主体とするnon-solid型の肺癌だけでなく、悪性度の高いとされる充実型肺癌についても対象に加える。ワークステーションとタブレット型コンピュータ(iPad)を無線LANで結び、術者が手術室においてワークステーション上の3D-CT画像をiPadのタッチパネル画面で自由に動かして観察できるシステムを構築する。25年度が最終年度であるため、記入しない。
ホスホマイシンの生合成に関与する新規ラジカルSAM酵素の機能と生合成経路の解明

C-P化合物とは、C原子とP原子との単結合を有する化合物の総称である。その有用性にも関わらずC-P化合物の生合成経路に未知の点が多い。これは、生合成中間体の調整が困難であること、C-P化合物が極性物質のため、分析が困難であることが理由である。本研究課題では、C-P化合物の生合成を大腸菌生体内で再構築することにより、C-P化合物の生合成研究のプラットホームを構築することを目的とした。我々は、FR-900098の生合成クラスターを大腸菌において発現させ、大腸菌の各種遺伝子破壊株においてFR-900098の生産に成功した。シチジン一リン酸エステル体がホスホマイシンの生合成中間体であることを証明するため、Fom1(N末端にシスチジルトランスフェラーゼドメインを有する)をS. wedmorensisからクローニングし、大腸菌で発現した。また、ネガティブコントロールとして、シスチジルトランスフェラーゼドメインを有さないPEPムターゼ、FrbD(FR900098の生合成クラスター由来)を発現した。組換えFom1およびFrbDをそれぞれ精製し、ホスホマイシンの中間体であるPEP、PnPy、PnAA、HEP、またはHPPを基質としてCTPとin vitro反応を行った。31P NMR解析を行った結果、HEPとCTPを基質とした反応液にのみ、二つの新しいシグナルが検出された。一方、ネガティブコントロールのFrbDによる反応では31P NMR解析で新規なシグナルは検出できなかった。2)構造決定上記反応の生成物の構造決定のため、イオン交換樹脂、Sephadexカラム及び逆相HPLCを用いて精製し、NMRおよびHR-ESI-MS解析を行った。その結果、目的のシグナルおよびMSスペクトルを得ることができ、Fom1反応の生成物の構造が推定できた。3)生合成ブロックミュータントを用いたHEP-CMPの投与実験Fom2破壊株はPnAAを生産できないため、ホスホマイシンを生合成しない。私は、Fom2破壊株をTSB培地に30度で24時間培養し、回収した菌体を100mM HEPES緩衝液に懸濁した。上記実験で得られたHEP-CMP、HEPまたはHPPをそれぞれFom2破壊株の懸濁液に投与した結果、ホスホマイシンの生産が回復した。C-P化合物は抗生物質、抗マラリア剤、除草剤として産業利用されている化合物群である。しかしながら、C-P化合物の生合成経路には不明な点が多いため、異種発現による大量生産は実現されていない。また、C-P化合物の前駆体がホスホエノールピルビン酸(PEP)であることも発酵生産の障壁になっている。本研究では、C-P化合物のひとつホスホマイシンの生合成機構の解明およびC-P化合物の生産系の構築を目的とした。ホスホマイシンの生合成に関与する酵素群は前年度までほぼ解明できた。そこで、本年度は大腸菌においてPEPを消費する因子の破壊株を作製し、C-P化合物の微生物生産系の基盤構築を行った。PEPはピルビン酸の前駆体であり、pykF、pykAはピルビン酸をPEPに変換する酵素である。我々は、pykAの破壊株を作製した。その結果、pykA破壊株ではC-P化合物の一種、FR900098の生産量が増加していた。また、PEPはオキサロ酢酸の前駆体であり、ppcはオキサロ酢酸をPEPに変換する酵素である。我々は、ppcの破壊株を作製した。その結果、ppc破壊株ではFR900098の生産量が増加していた。26年度が最終年度であるため、記入しない。生合成26年度が最終年度であるため、記入しない。私は、ホスホマイシンの全生合成経路を解明するため、25年度にはシチジン一リン酸エステル体がホスホマイシンの生合成中間体であることを証明するため、1)Fom1が触媒するHEPとシチジン一リン酸のエステル化反応によるHEP-CMPの生成反応、2)反応の生成物の構造決定、3)生合成ブロックミュータントを用いたHEP-CMPの投与実験を計画した。25年度には三つの計画した通り成果を見せることができた。1)新規ラジカルSAM酵素Fom3が触媒するHEP-CMPのメチル化によるHPP-CMP生成反応Fom3は鉄硫黄クラスター[4Fe-4S]を含む鉄硫黄蛋白質であるため、活性型の調製には嫌気性条件で行う。Fom3、適当な基質、メチルコバラミン、Sodium dithionite(SAMを電子伝達系の代わりになる)と共に嫌気性条件下反応させる予定である。2)FomDの機能解明

Fom4によるHPPのエポキシ化反応によりホスホマイシンが生成することは、in vitro、in vivoで示されている。そのため、HPP-CMPは加水分解され、HPPに変換される必要がある。しかしながらHPPの生成を司る酵素は明らかになっていない。ホスホマイシンの生合成クラスター中からHPPの生成を司る酵素の候補を探索し、そのin vitro反応を試験する予定である。また、Fom3遺伝子破壊株を作製しその蓄積物を確認する。以上により、1) -2)の実験により、申請者はホスホマイシンの全生合成経路を解明する。
慢性疾患をもちながら生活する子どもと家族への支援に関する研究

平成19年度は、文献検討と面接調査を行った。先行研究では、慢性疾患をもちながら生活する患児や家族において、特に思春期にストレスや不安が高まること、療養行動が乱れやすいことなどが報告されていた。これらを参考に慢性疾患をもちながら思春期を過ごす患児をもつ家族の体験を明らかにするために研究協力に承諾を得た6名の対象者に面接を行い、内容を分析した結果、以下のような共通事項が見出された。学校生活に関して、子どもが中学校に入学するときには病気に関連したいじめに遭遇しないか全員が心配していた。実際いじめに遭遇した場合には病気のことをクラスメイトに説明をして対処していた。高校では病気で欠席することによる単位取得への影響をもっとも心配していた。単位取得に影響が出ないよう患児・家族も治療計画に参与したケースでは学校生活や治療に対しても満足感が得られていた。これらのことから慢性疾患をもちながら思春期を過ごす患児をもつ家族に対して以下のような支援の必要性が示唆された。特に中学・高校入学などの新たな環境に患児がスムーズに適応するためには患児の病気に対する学校やクラスメイトの理解を得ることが重要であり、患児または家族が学校やクラスメイトに対して理解を求めることができるよう支援する必要がある。そして、学校生活や治療に対する満足感を高めるために患児または家族へ病気や治療に関する知識を提供し、ともに治療計画に参与できるよう支援する必要がある。一方、将来に関して、学校とは異なる社会生活では病気のことを理解してもらえるかという不安や、結婚や出産に対する不安を抱いていた。また、病状が悪化しても幼い頃のように手を貸すことはできないと葛藤している家族の心理なども見出された。以上のような慢性疾患をもちながら思春期を過ごす患児をもつ家族の心理を踏まえた看護介入方法や時期について検討していくことが今後の課題である。
悪性腫瘍、神経変性疾患でのスフィンゴシンキナーゼの発現異常の解析と病態での意義

1.骨髄異形成症候群(MDS)および急性白血病(AL)におけるスフィンゴ脂質代謝酵素発現量を定量RT-PCRを用いて解析し、これらの疾患ではスフィンゴシンキナーゼ1(SPHK1)の過剰発現と中性スフィンゴミエリナーゼ2(NSMase2)の発現低下が特徴であることを明らかにした。さらにこれらの変化が実際にスフィンゴ脂質代謝産物に影響を与えうるか、またそれが細胞の特性に影響しうるかを抗がん剤ダウノルビシンへ(DA)の感受性について解析を行った。16種の白血病細胞株におけるSPHK1の発現は多様性があったが、SPHK1メッセージ、タンパク、酵素活性にはよい相関が有り、これらの発現レベルの高いものがダウノルビシンへのIC50が高い傾向が認められた。一方、NSMase2には同様の所見は認められなかった。スフィンゴ脂質代謝産物の解析はLC/MS-MSを用いて行った。解析の結果、DAの耐性とSPHK1の発現レベルに有意の相関が認められた。代謝産物ではDA処理によりセラミド量の増加、スフィンゴシン1リン酸の減少がそれぞれのIC50レベルに応じて認められ、またSPHK阻害剤はDAと相加効果があることも明らかとなった。これにより造血系の細胞においてもSpiegelらの提唱するsphingolipid rheostat modelが当てはまることが明らかとなった。また、これらの結果はSPHK1阻害剤がSPHK1高発現腫瘍細胞においてよい治療標的薬剤となることを示唆している。2.神経芽細胞腫の検討では増殖刺激因子であるGDNFがSPHK1の発現を増加させることが明らかとなり、さらにGDNFの受容体であるRETの変異したMEN2A型の悪性種世ではSPHK1の過剰発現を認め、それがその悪性化の原因の一部を担っていることをin vitroの実験により明らかにした。これらの結果もSPHK1阻害剤の臨床的有用性を示唆するものである。1.骨髄異形成症候群(MDS)および急性白血病(AL)骨髄におけるスフィンゴ脂質代謝酵素発現量の解析定量RT-PCRを用いてMDSおよびAL骨髄における各種スフィンゴ脂質代謝酵素の発現量を定量した。同時に多剤耐性遺伝子(MDR)および抗アポトーシス遺伝子BCL-2の発現も測定した。内部対照としてはABL遺伝子を用いた。2.神経系のサイトカインであるGDNF反応性神経芽細胞株TGWを用いてGDNFおよびその受容体RETの下流にSPHK1が素材すること、またRETの変異しておこるMEN2 type腫瘍においてSPHK1が腫瘍化機序に一定の役割を果たしていることをMEN2 type変異RET遺伝子を導入した細胞株において解析した。解析の結果、RETからのシグナルはERK、PI3K pathwayを経由してSPHK1 messageの発現を増加させることを明らかにし責任プロモーター部位を同定した。またTGW細胞においてGDNF刺激による神経系の細胞分化にSPHK1が必須であることも証明した。MEN2A typeの腫瘍ではSPHKl発現が恒常的に上昇しそれが腫瘍化にポジティブに働いていることを明らかにした。1.骨髄異形成症候群(MDS)および急性白血病(AL)におけるスフィンコ脂質代謝酵素発現量を定量RT-PCRを用いて解析し、これらの疾患ではスフィンゴシンキナーゼ1(SPHK1)の過剰発現と中性スフィンゴミエリナーゼ2(NSMase2)の発現低下が特徴であることを明らかにした。

16種の白血病細胞株におけるSPHK1の発現は多様性があったが、SPHK1メッセージ、タンパク、酵素活性にはよい相関が有り、これらの発現レベルの高いものがダウノルビシンへのIC50が高い傾向が認められた。一方、NSMase2には同様の所見は認められなかった。スフィンゴ脂質代謝産物の解析はLC/MS-MSを用いて行った。解析の結果、DAの耐性とSPHK1の発現レベルに有意の相関が認められた。代謝産物ではDA処理によりセラミド量の増加、スフィンゴシン1リン酸の減少がそれぞれのIC50レベルに応じて認められ、またSPHK阻害剤はDAと相加効果があることも明らかとなった。これにより造血系の細胞においてもSpiegelらの提唱するsphingolipidrheostat modelが当てはまることが明らかとなった。また、これらの結果はSPHK阻害剤がSPHK1高発現腫瘍細胞においてよい治療標的薬剤となることを示唆している。2.神経芽細胞腫の検討では増殖刺激因子であるGDNFがSPHK1の発現を刺激することが明らかとなり、さらにGDNFの受容体であるRETの変異したMEN2A型の悪性腫瘍ではSPHK1の過剰発現を認め、それがその悪性化の原因の一部を担っていることをin vitroの実験により明らかにした。これらの結果もSPHK阻害剤の臨床的有用性を示唆するものである。