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ケモテクノロジーの分子基盤を創出するユビキチン構造生物学

計画研究6(内藤班)との共同研究では、キメラ化合物SNIPERを介して結合するユビキチンリガーゼ(E3)と基質との相互作用を調べるための三者複合体の構造解析を、また、計画研究7(吉田班)との共同研究では、神経変性疾患に関わるE3に選択的に結合する化合物スクリーニングを開始した。Npl4-K48鎖複合体やTAB2-K6鎖複合体の立体構造を決定して、鎖タイプ選択的な新たな認識機構を明らかにしたのに加えて、プロテアソーム分解を制御するE6-AP-RPN10複合体の立体構造解析の結果に基づいて、複合体形成の阻害を目的としたステープルペプチドの設計を行うなどの領域内共同研究も進展した。酵素の改変はやや難航しているが、機能性化合物の研究は想定よりも進んでいる面もあるので、全体的には概ね順調であると判断した。Npl4は六量体ATPase Cdc48/p97の補因子であり、もう一つの補因子であるUfd1とヘテロ二量体を形成して、ユビキチン化基質を膜や複合体から引き抜く役割を担う。この反応はATPの加水分解やユビキチン鎖認識と共役しており、Npl4はユビキチン鎖認識を担う。これまでに立体構造を決定しているNpl4-K48鎖複合体では、ジユビキチンを用いているが、完全な活性化にはより長い鎖が必要であることが知られているので、トリユビキチンからペンタユビキチンまでの鎖との複合体の構造決定を目指す。計画研究1(佐伯班)との共同研究で行っているプロテアソーム関連因子E6-AP-RPN10複合体の研究については、構造情報に基づいた阻害ステープルペプチドの開発を進める。また、計画研究6(内藤班)との共同研究では、キメラ化合物SNIPERを介して結合するユビキチンリガーゼ(E3)と基質との相互作用を調べるための三者複合体の構造解析を引き続き進める。計画研究7(吉田班)との共同研究で行っている神経変性疾患に関わるE3に選択的に結合する化合物探索では、候補化合物の効果を分子間相互作用解析やE3活性測定を利用して測定し、in vitroおよびin vivoでのE3活性のモニターや薬剤としての可能性を検討する。
日・中・韓における会社法・証券取引法の比較研究

社会主義国中国では、1993年末に会社法が制定されたが、そこで用いられるテクニカルタームは、主要資本主義国の会社法と同じ術語を用いているが、そこに込められている概念・構成および効力には中国独自のものが散見される。その意味において、従来のいずれの法系にも属さない。従って、中国会社法を理解するに際しては、在るがママに受容することが肝要である。さらに、中国会社企業を取り巻く法的インフラの整備も着実に進んでおり、民法通則の制定に続き、契約法草案が政府筋で検討中であり、また証券取引についても、法律と言う形ではないが、条例として「株券の発行および取引の管理に関する暫行条例」が制定されるなど、市場経済の道を一歩一歩前進していることが確認された。これに対して、日本と同じ資本主義国である韓国では、同時進行的に経済発展を遂げつつあり、その事もあってか、両国は互いに合い前後しながら、会社法の一部改正を行っている。例えば、最低資本金制度は韓国が先に採用したが、ストック・オプション制度導入は日本がやや早いと言った具合である。とは言え、両国間の政治経済状況の違いから、それら改正の間には微妙な相違が存在することは、留意する必要がある。なお、遅ればせながら、社会主義国ベトナムでもドイモイ政策の採用により、ここ二三年の間に民法・商業法を制定し、1999年には会社法も大改正が予定されており、中国会社法ともまた異なった、どの様な内容が盛り込まれるかが、大いに注目される。I.95年度の研究の成果発表i)まず、1995年7月15・16日の両日に立命館大学で開催されたシンポジュウムの報告書(後述))を上梓。ii)1995年11月30日に「商法中改正法律案」が韓国国会を通過したのを受け、1995年12月20日に韓国・成均館大学校李範教授・慶南大学校高平錫教授および両大学院院生等からなる「日本研修団」との共同研究会を開催し、同研修団が帰国後まとめた報告と日本商法とを比較した論文(後述)を発表。II.A)研究会の開催(2月末日現在)1)5月17日(金)於修学館第三研究会室[研究報告]中華人民共和国に於ける紛争と紛争解決立命館大学高見沢磨2)12月9日(月)於修学館第二研究会室[研究報告]中国近代法史の試み立命館大学高見沢磨3)12月20日(金)於修学館第一研究会室[研究報告]韓国における議決権なき優先株式成均館大学李範[研究報告]日本における議決権なき優先株式立命館大学志村治美4)1月14日(火)於修学館第一研究会室[研究報告]アジア法の試み-持続的成長と地域統合名古屋大学安田信之5)1月19日(日)於末川記念館第一会議室[研究報告]中国証券取引法立法の現状と課題北京大学以寧6)1月23日(木)於修学館第一研究会室[研究報告]アジア法の試み北海道大学鈴木賢7)2月15日(土)於末川記念館第三会議室[研究報告]中国法における会社管理機構について北京大学張紅B)海外での報告19097年1月68日の三日間、北京で中国社会科学院研究所催による「日中契約法現代化研討会」に、日本側報告者の一人として志村治美が日本学術振興会の派遣研究者に指定され、本研究会の成果である「中国契約法における危険負担の規定をめぐって」のテーマで比較法的視点から報告した。III.現時点での知見と今後の研究課題最近、市場経済化を図りつつあるアジアの社会主義国、ヴェトナム、ミャンマー、モンゴル、ラオス等の会社法を研究対象に加え、同じ社会主義国である中国との異同を明らかにしたい。ii)中国、韓国は勿論のこと

東南アジアの諸国を含めた地域の法として、果してアジア法と言う概念・枠組みが成立しうるのか、するとすればその要件・範囲は何か、について検討を始めている。つまり、単一国家間の会社法・証券取引法の比較研究からその領域を拡げ、より普遍的な概念枠組みの構築を目指す必要性が認識され、着手された。1997年度の課題は、前年度からの継続的研究の成果を公表することと、それらの成果の上に立って、さらなる研究の進展を図ることにあった。1)中国関係の成果は-中国社科院法学研究所の王家福、王保樹、崔勤之と志村との共著『中国会社法論』(晃洋書房1998年7月)を上梓したが、その最終章で、上記学者の中国会社法の論述および立法過程の示唆を受けて、中国会社法を日本会社法と平面的に比較検討してこと足れりとする従来の日本の学者の見解に対し、中会社法の根本基盤に立ち入って普遍性と特殊性を明らかにし(志村「日本法との比較で中国法を読む」志村・奥島編『中国会社法入門」所収も同一視点より記述)、世界の会社法の中での位置づけを行った。それと赤字経営に悩む中国国営企業の再建に資する志村著・李凌燕訳「実物出資研究」が、中国社会科学院法学研究所商事法中心編『商事法論集第I巻』に掲載された。2)韓国関係では-成均館大李範燦教授と共著「韓国商法の大改正-日本法と比較して」を国際商事法務に掲載するとともに、日・中・韓における会社概念の異同を成均館大学で講演し、東アジアにおける会社概念の構築の必要性とその可能性を論じた。この講演の延長線上に立って、3)ドイモイ政策進展のため-1999年に現行会社法の改正を目指して作業中のヴェトナムに対し、98年1月4日よりハノイ国家大学、ホ-チミン市マーケッテング大学等を訪問し、ベトナムのドイモイ政策と中国社会主義市場経済政策との相違点、会社制度運用の実態さらには会社主義国での民営化、株式化についてレビューを受けた。特に、ベトナムについては、会社法解説書は勿論のこと関係法令すら充分に出版がなされていない現状において、大きな成果をあげることができた。
動的ハイブリッド実験による支承部の進行性破壊過程の解明

本研究では、橋梁を想定した構造物モデルの応答解析と支承部の載荷試験を結合し、支承部と橋梁との動的相互作用を再現する動的ハイブリッド実験システムを構築するとともに、分散支承を有する橋梁を想定した2自由度系動的ハイブリッド実験を行った。その結果、構築した実験システムにより、桁と橋脚の動的相互作用下における支承の動的特性を直接実験により把握しモデル化を行うことが可能となった。本年度は,まず過去の大規模地震において被災を受けた支承構造について調査を行い,地震時における支承の損傷モードや破壊性状を把握した.また,支承の載荷実験にそなえて,油圧ジャッキを用いたハイブリッド実験システムを構築した.このハイブリッド実験システムの構築に当たっては,構造物の応答計算をいかに精度よく高速に行うか,および指令信号に対して油圧ジャッキをいかに精度よく追従させるかの2点について主に検討を行った.このうち,応答経産に関しては,高速演算が可能なデジタルシグナルプロセッサ(DSP)を用い,あわせて繰り返し計算を必要としないOperator-SplittingをこのDSP上に実装することで,高速かつ精度の良い応答計算を行うことが可能なった.載荷装置の追従性改善に関しては,油圧ジャッキへの指令変位に対する時間遅れを補償するためのDSP内部に補償回路を設け,指令値に対して載荷装置が忠実に動作するようなシステムを構築した.以上のように構築したシステムの成立性を検証するため,弾性鋼製フレームを用い,油圧ジャッキに負荷をかけた状態で2自由度ハイブリッド実験を実施し,システムの安定性や成立性を検証した.その結果,構築したシステムを用いることで,運動方程式計算部と油圧ジャッキの載荷とが良好に連動・追従することを確認した.これにより準静的ハイブリッド実験を実施することが可能となった.本システムに接続する装置を振動台や高速アクチュエータに変更することで実時間ハイブリッド実験を実施することも可能である.本年度は,振動台を用いた支承のハイブリッド実験を行うための一連のシステム構築を実施した.このハイブリッド実験システムの構築に当たっては,昨年度実施した油圧ジャッキを用いたシステムを参考に,高速演算が可能なデジタルシグナルプロセッサ(DSP)および繰り返し計算を必要としないOperator-Splitting法を実装することで,高速かつ精度の良い応答計算を行うシステムを新たに構築した.次に,上記のように構築したハイブリッド実験システムの検証シミュレーションを実施した.すなわち,既往の実験結果をもとに,指令加速度と実際にテーブルに生じた加速度の関係(動特性)をモデル化し,鉄道総研が所有する大型振動台を模擬したモデルを構築した.このモデルに上記で構築した実験システムを接続し,2自由度構造物のハイブリッド試験を想定した数値解析を行い,実験部と解析部を分離しない2自由度応答計算の結果と比較したその結果,振動台の動特性の影響で若干の違いはあるが、ハイブリッド実験システムにより得られた応答値は概ね2自由度動的解析の結果と整合しており,構築したシステムにより動的ハイブリッド実験を実施することが可能であることを確認した.さらに,本システムを実際に大型振動試験装置に接続し,桁およびゴム支承からなる振動模型を振動台上に上載して加振試験を行い,構築したシステムの動作確認および振動台の動的特性の測定を実施した.また,ゴム支承模型を対象とした動的実験を行い,平成22年度に実施する鋼製支承を対象とした試験のための予備検討についても実施した.本研究では、橋梁を想定した構造物モデルの応答解析と支承部の載荷試験を結合し、支承部と橋梁との動的相互作用を再現する動的ハイブリッド実験システムを構築するとともに、本実験システムを用いて地震時の動的相互作用下における支承部の非線形挙動を把握することを目的とする。このため、まず動的ハイブリッド実験の基礎理論を構築するとともに、実験システムを鉄道総研が所有する大型振動台に適用するため、高速信号処理システム(DSP)を用いた計測・制御ソフトウエアを実装した。次に、橋梁の桁が下部工に剛結された状態を想定し、計算部である線形1自由度系、および桁模型を振動台上に剛結した実験部から構成される2自由度構造系を対象として動的ハイブリッドシステムの検証実験を行った。その結果、実験部のベースシアを計算部にフィードバックする機構が有効に機能し、計算部に実験部の質量が加算された1自由度系の振動応答が得られ、構築した動的ハイブリッド実験システムが有効に機能することを確認した。これを受けて、実験部の桁支持条件を剛結からゴム支承に置換し、分散支承を有する橋梁を想定した2自由度系動的ハイブリッド実験を行った。
高高齢アスリートの身体能力とライフスタイル―第2次継続研究―

本研究は、1999年に1回目の測定を行った超高齢エリートアスリートに対し、2001、2002及び2003年と測定を継続し、身体活動能力はどこまで維持できるかを検証することを目的として実施した。被験者は全国各種マスターズ大会や世界ベテランズ大会等で活躍している80歳以上(一部女性は70代を含む)の超高齢エリートアスリート33名(男性18名、女性15名)及びコントロール31名(男性9名、女性22名)、合計64名であった。測定項目は全身持久力、等速性下肢筋力、筋横断面積、骨密度、文部省新体力テストおよびライフスタイルに関する調査であった。その結果、この5年間で、文部省新体力テスト(高齢者用)においては、男性は筋力・柔軟性敏捷性は10%以内の低下率であったが、歩行能力は-20%以上、バランス能(開眼片足立ち)は-50%以上と最も高い低下率を示した。女性も同様の傾向であったが、低下率は男惟よりも小さく体力がよく保たれていた。等速性筋力では、男女とも高速(180deg/sec)における膝関節屈曲筋力の低下が著明で、これは筋横断面積において大腿四頭筋よりも屈筋であるハムストリングの低下率が大きいことと符合していた。VO2maxは20-25ml/kg/minで、5年間で約-20%を示し,男女とも同様の傾向を示した。骨密度の減少は数%に止まった。また、調査から多くのシニアエリートアスリートは、80歳代でも週2-3回、1回1-2時間の練習またはトレーニングを行い、年間数回の国内・国際大会に出場し、常に積極的に前向きに生きている様子が伺えた。これらの被験者の中には50歳代・60歳代になってからスポーツを始めた者も多く、高齢化社会にあって「スポーツも生きがいに足るものである」こと示す、よい参考例になるものであると考えらる。本研究は、2年前に測定を行った高高齢エリートアスリートを再度測定し、身体活動能力はどこまで維持できるかを検証することを目的とした。被験者は1999年(一部1998年を含む)に測定を行った全国各種マスターズ大会で活躍している80歳以上(一部女性は70代を含む)の高高齢者エリートアスリート(男性10名、女性13名)であった。測定項目は全身持久力測定(VO2peak)、等速性下肢筋力測定、MRIを用いた筋横断面積測定、DEXA法を用いた骨密度測定、文部省新体力測定、その他の体力測定、および歩数計を用いた一週間の日常活動量測定(歩行数・時間・距離、行動調査)であった。VO2peakは、男性において2年前に比べ低下する傾向が見られ、高年齢になるほど年間低下率が大きくなる傾向にあった。膝関節伸展および屈曲筋群横断面積は、男女ともに2年前に比べ有意に低下し、女性において膝関節屈曲筋群横断面積の年間低下率が高年齢になるほど大きくなった。等速性下肢筋力および各種体力テストの結果は、男女ともに全体的に低下する傾向であった。骨密度は、腰椎および右大腿骨頸部において男女ともに有意な変化は見られなかった。これを標準偏差を用いて若年者と比較をすると、女性は両部位とも全員マイナスとなったが、同様に年齢補正を施した比較では、男女ともにプラスとなる傾向にあった。活動量の指標として測定をした歩行数は、厚生省が報告した一般高齢者の歩行数よりも多かった。

特に女性は、体力測定や筋力測定の結果と高い正の相関関係が認められ、歩数が多いものほど身体能力が高いことがわかった。日常の活動量が多く、さらに専門的なトレーニングを行う高高齢エリートアスリートであっても、2年間で身体能力やパフォーマンスが低下することが示された。しかし、トレーニングを含めた日常の活動を活発に行うことで体力は高く保つことができることが示唆された。本研究は、3年前に測定を行った高高齢エリートアスリートを昨年に引き続き測定し、身体活動能力はどこまで維持できるかを検証することを目的とした。被験者は1999年に測定を行った全国各種マスターズ大会で活躍している80歳以上(一部女性は70代を含む)の高高齢エリートアスリート(男性11名、女性12名)であった。測定項目は全身持久力測定(VO2peak)、等速性下肢筋力測定、MRIを用いた筋横断面積測定、DEXA法を用いた骨密度測定、文部省新体力測定、その他の体力測定、および歩数計を用いた一週間の日常活動量測定であった。体脂肪率は男性16.4%(前回比+2.0%)、女性22.7%(-2.0%)、VO2peakは、男性において3年前に比べ13.2%、女性は8.8%の低下、高年齢になるほど低下率が大きくなる傾向にあった。各種体力テストの結果は、男女ともに全体的に低下する傾向にあり、文科省新体カテストの総得点は、男性-17.2%、女性-8.7%であったが、体力水準は実年齢と比べて15-20歳若い水準にあった。骨密度は、腰椎および右大腿骨頸部において男女ともに有意な変化は見られなかった。これを若年者と比較すると、男性の殆どは30歳前後と同様の高い骨密度を示した。女性は両部位とも全員マイナスとなったが、同様に年齢補正を施した比較では、男女ともにプラスとなる傾向にあった。日常の活動量が多く、さらに専門的なトレーニングを行う高高齢エリートアスリートであっても、3年間で身体能力やパフォーマンスが低下することが示された。本研究は、5年前に1回目の測定を行った高高齢エリートアスリートに対し、一昨年、昨年に引き続き測定を継続し、身体活動能力はどこまで維持できるかを検証することを目的とした。被験者は1999年に測定を行った全国各種マスターズ大会で活躍している80歳以上(一部女性は70代を含む)の高高齢エリートアスリート20名(男性8名、女性12名)及びコントロール14名(男性5名、女性9名)、合計34名であった。測定項目は全身持久力測定(VO2max)、等速性下肢筋力測定、MRIを用いた筋横断面積測定、DEXA法を用いた骨密度測定、文部省新体力テスト、その他の体力測定および、ライフスタイルに関する調査であった。文部省新体力テスト(高齢者用)においては、男性は筋力・柔軟性・敏捷性は10%以内の低下率であったが、歩行能力は-20%以上、バランス能(開眼片足立ち)は-50%以上と最も高い低下率を示した。女性も同様の傾向であったが、低下率は男性よりも小さく体力がよく保たれていた。等速性筋力では、男女とも高速(180deg/sec)における膝関節屈曲筋力の低下が著明で、これは筋横断面積において大腿四頭筋よりも屈筋であるハムストリングの低下率が大きいことと符合していた。VO2maxは20-25ml/kg/minで、5年間で約-20%を示し,男女とも同様の傾向を示した。骨密度の減少は数%に止まった。また、調査から多くのシニアエリートアスリートは、80歳代でも週2-3回、1回1-2時間の練習またはトレーニングを行い、年間数回の国内・国際大会に出場し、常に積極的に前向きに生きている様子が伺える。
農村地場産業の育成と推進主体に関する研究-安定成長期を中心として

本研究では1.農村地場加工業開始の地域的事情の分析、2.農村地場加工業の推進主体の育成と行政対応、3.農村地場加工業の流通・販売対応の解明を主要な課題として調査研究を2カ年にわたって進めてきた。その結果、新たに得られた実績の概要は、課題に即していえば以下のようである。1.農村地場加工業開始の地域的事情についてわれわれが調査した北海道内の3市町村については、それぞれの立地にもとづく農業・農村の地域的展開に即応するものとして成立しているのが特徴としてあげられる。富良野市のワイン製造は、石礫の多い傾斜地へのブドウ栽培と観光が結合して始まっているし、東藻琴村のチーズ製造は畑作・酪農地帯の牛乳過剰生産に端を発している。士幌町のポテト食品加工は大規模畑作大量栽培のポテト処理から始っている。2.推進主体の育成と行政対応について調査対象地のいずれもが独自の事業主体をとっていることが注目される。富良野では市の条例にもとづく振興公社と農協の結合、東藻琴では村の条例にもとづく乳製品加工研究所を中心にして農協はあまりタッチしていない、士幌は農協の完全主導型である。3.流通・販売対応について富良野のワインは、地域の観光開発と結合した地場消費中心、東藻琴村のチーズは生産を限定してデパート(札幌・東京)・空港などで販売。士幌のポテト製品は、大手製菓会社・冷凍食品企業が販売を担当している。4.以上のように地域特産品を生産する農村地場加工業の育成と推進主体は様々であるが、地域特産品づくりとしては限定された生産で品質と地域内販路を掌握するほうが安定性という点では将来性が大きいと考えられる。
酸素を基軸とする生物リズムの分子基盤に迫る

概日時計の自律的な発振や外界シグナルへの時刻同調メカニズムにおいて、時計タンパク質の翻訳後修飾は極めて重要な役割を果たす。我々は、時計タンパク質CLOCKとBMAL1が時刻依存的なリン酸化制御を受け、DNA結合能や安定性が巧妙に制御されていることを明らかにした。最近では、CLOCK-BMAL1複合体をリン酸化するキナーゼとしてJNKとCaMKIIを同定し、いずれも概日時計の環境適応に必須なシグナルセンサーとして働く可能性を報告した。本研究ではMAPKシグナルの上流因子ASKファミリーに着目した研究を展開した。ASK1-3遺伝子の3重欠損マウス(TKO)を利用し、初年度にはTKOマウスの輪回し行動測定を行い、夜間の光照射に対する行動リズムの位相や周期の制御に異常が見られることを報告した。さらに、ASKを介した細胞内シグナルは生物時計に強い影響を与える可能性が考えられたため、ASK-TKOマウス由来のマウス線維芽細胞を樹立した。この実験では、細胞リズムの可視化を目的として時計タンパク質PER2にルシフェラーゼが融合したPER2::Lucマウスを利用し、このマウスとASK-TKOマウスとを交配して細胞を樹立した。本年度には、この細胞株を利用して、ASKの活性変化が実際に培養細胞の時計振動に対して強い影響を与えるか否かを観察した。まず、レドックス状態の変化を模倣して培養培地の浸透圧を変化させると、ASK活性の上昇または下降に伴って、細胞時計のリズム位相が変化した。さらに、ASK活性を恒常的に上昇または下降させると、細胞時計のリズム周期が短周期化または長周期化することが判明した。実際に、細胞のレドックス状態を変化させた場合にも同様な時計の周期と位相の変化が観察された。さらに重要なことに、これらの刺激に伴う細胞時計への影響は、ASK-KO細胞では見られなくなることを示した。28年度が最終年度であるため、記入しない。概日時計の自律的な発振や外界シグナルへの時刻同調メカニズムにおいて、時計タンパク質の翻訳後修飾は極めて重要な役割を果たすと考えられている。ASK1-3遺伝子の3重欠損マウス(TKO)を利用し、マウスの輪回し行動リズムを測定した。マウスの自発的な行動リズムは体内の時計振動に由来すると考えられており、一定の飼育条件においても安定した周期で寝たり起きたりを繰り返す。マウスの飼育環境の光照度を変化させると、照度の上昇に伴って行動リズム周期が延長することが知られている。今回、ASK-TKOマウスを様々な光照度の環境で飼育して行動周期を測定した結果、恒明条件下での行動周期の延長が有意に減弱することを見出した。光照度の上昇に伴う体内時計の乱れは、夜間でも光に溢れる現代社会における睡眠パターンの異常や、時計振動の異常に伴うメタボリックシンドロームや気分障害などの現代病の根源であると考えられている。今回のASK-TKOの表現型は、現代病の治療に対して新たな創薬ターゲットを提案するものである。ASKを介した細胞内シグナルは生物時計に強い影響を与える可能性が考えられたため、ASK-TKOマウス由来のマウス線維芽細胞を樹立した。この細胞株を利用して今後、ASKを介した細胞内シグナルが細胞時計の振動に与える影響を観察したい。生物リズムとの関連が報告されていない分子ASKに注目して、その機能を解析するというチャレンジングなテーマ設定であったが、マウス個体の行動レベルでの表現型を見つけることができた。さらに2年目の研究に向けて、細胞レベルの研究を展開するための準備は整った。

まず、レドックス状態の変化を模倣して培養培地の浸透圧を変化させると、ASK活性の上昇または下降に伴って、細胞時計のリズム位相が変化した。さらに、ASK活性を恒常的に上昇または下降させると、細胞時計のリズム周期が短周期化または長周期化することが判明した。実際に、細胞のレドックス状態を変化させた場合にも同様な時計の周期と位相の変化が観察された。さらに重要なことに、これらの刺激に伴う細胞時計への影響は、ASK-KO細胞では見られなくなることを示した。マウス個体で見出した表現型の背景にある分子シグナルを細胞レベルで追求する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
大規模区間データの高速解析処理アルゴリズムの研究

本研究では,幾何データおよび幾何的特徴を持つグラフに対するアルゴリズムの開発およびZDDを用いた列挙アルゴリズムの開発を行った.幾何的特徴を持つグラフに対して,区間グラフを拡張したクラスに対する新たな知見の獲得や部分表現拡張問題に対するアルゴリズムの開発,また省領域アルゴリズムの開発に成功した.また,ZDDを用いた実用的なアルゴリズムの開発,特に系統樹の列挙や避難所割当の列挙,パズルソルバーに対するアルゴリズムの開発を行った.これらに対する研究成果は査読付き論文誌および査読付き国際会議や国内研究会などで発表した.本研究では,大きく2つの列挙アルゴリズムにおける研究成果および1つの理論的な研究成果を挙げることができた.列挙アルゴリズムに関する研究成果の1つ目は,有向二値完全系統樹の列挙である.従来の列挙アルゴリズムでは,ZDDと呼ばれるデータ構造を用いた手法であった.しかし,従来のZDDを用いた手法では,計算途中でZDDが爆発に巨大化してしまい,計算できない,ということが多々あった.それに対し,近年,ZDDを用いた新な列挙手法がKnuthによって提案された.本研究では,その手法を拡張し,有向二値完全系統樹を列挙する高速なアルゴリズムを開発した.列挙アルゴリズムに関する研究成果の2つ目は,避難所割当問題に対する高速なアルゴリズムの開発である.避難所割当問題は,震災発生時に誰をどこの避難所に割り当てるか,という問題である.しかし,避難所割当問題は,避難所までの距離や避難所の予想される混雑度など,様々な目的関数を考慮する必要があり,複数の目的関数を考慮したパレート最適な解の抽出が重要となる.本研究では,様々な列挙アルゴリズムを駆使することにより,パレート最適な解のみを列挙するアルゴリズムを開発した.理論的な成果として,区間二部グラフを中心としたグラフクラスに対する特徴を与えることに成功した.区間二部グラフとは,二部グラフでかつ区間表現を持つグラフである.区間表現は区間の集合で,グラフの各頂点は区間と対応し,異なる部集合に含まれる頂点間に辺がある必要十分条件は対応する2つの区間に重なりがあること,である.こうした区間表現を持つグラフの特徴を与えることで,大規模な区間データを処理する有用なアルゴリズムを考えることができる.区間グラフは区間表現と呼ばれる区間の集合を持つグラフである.グラフの各頂点は区間表現の区間と対応し,頂点間に辺がある必要十分条件が,対応する区間に重なりがあるときである.本研究では,区間グラフおよび区間表現に対する効率のよいアルゴリズムの開発を行っている.区間グラフの認識問題はグラフが与えられたとき,そのグラフが区間グラフかどうかを判定する問題で,古くから研究が行われ,高速なアルゴリズムがいくつも知られている.この問題を拡張した問題として区間グラフの部分表現拡張問題がある.区間グラフの部分表現問題は区間グラフとその区間グラフの区間表現の一部が与えられたとき,その区間表現を拡張して,与えられた区間グラフの区間表現を構築する問題である.この問題に対する多項式時間アルゴリズムが知られていたが,本研究ではより高速なアルゴリズムの開発に成功した.また,この問題に対し,各区間が離散的であるときについても考え,いくつかのバリエーションについて,計算困難性の証明や高速なアルゴリズムを与えることに成功した.これらのアルゴリズムは区間表現の各区間をDNAの断片や時間と見なすことで,バイオインフォマティクスやスケジューリングへの応用が期待される.また,本研究は国際会議ISAAC2012に採択された.また,バイオインフォマティクスへの応用として,ZDD(Zero-suppressed Binary Decision Diagram)を用いた有向二値完全系統樹を列挙する高速なアルゴリズムの開発に成功した.ZDDとは組合せ集合を表現するデータ構造で膨大な数の解を効率よく表現することができる.本成果は国際会議SEA2012に採択された.本研究では,区間上の独立集合問題,区間上の支配集合問題の3つの問題に対して,省領域でかつ効率的なアルゴリズムの開発を行った.既存研究においては,十分な計算領域を持ったアルゴリズムが多く,さらにアルゴリズムの計算時間は入力サイズのみに依存することがほとんどである.それに対し,開発したアルゴリズムは単に省領域で動作するというだけでなく,任意の領域サイズで動作するため,時間と領域のトレードオフを与えることができる.つまり,アルゴリズムを適用することで,計算資源から計算時間の見積もりをより精細に行うことができるのである.また,アルゴリズムの計算時間は出力サイズに依存したものであり,出力サイズが小さい場合には,アルゴリズムは非常に効率的に動作する.特に近年注目を集めているビッグデータに対しては,入力サイズが膨大であるため,入力サイズに依存しない計算時間を持つアルゴリズムが極めて重要である.本研究では,そうした実用的にも優れた有用な研究成果を得ることに成功した.近年,様々な幾何データがビッグデータとして現れ,それらに対する効率的なアルゴリズムの開発に迫られている.幾何データの1つに区間データがあり,作業工程図やスケジューリングなど区間データは様々な実応用の場面で扱われる重要な幾何データの1つである.本研究では,区間データおよびそれをグラフとして表現した区間グラフに対する効率的な処理アルゴリズムの開発のための研究を行った.本研究成果は大きく3つに分類できる.まず1つ目は区間グラフおよびそれに関連するグラフクラスに対する数学的な特徴づけを与えることができた.こうした理論的な成果はアルゴリズムの開発を助ける重要な手がかりとなる.2つ目は区間データ拡張問題と呼ばれる問題に対する効率的なアルゴリズムの開発を行った.この問題は部分的に区間データが確定しているときに,その区間データを拡張し,適切な区間データを構築できるか,という問題であり,バイオインフォマティクスへの応用が知られている.本研究では,この問題に対する数多くの知見を得ることに成功した.

3つ目は,近年,グラフ列挙アルゴリズムとして注目を集めているデータ構造ゼロサプレス型二分決定グラフ(Zero-Suppressed Binary Decision Diagram: ZDD)を用いたアルゴリズムを開発した.開発したアルゴリズムを避難所割当問題に適用し,効率的により避難所への割当パターンを列挙するアルゴリズムの開発および実装に成功した.本研究では,幾何データおよび幾何的特徴を持つグラフに対するアルゴリズムの開発およびZDDを用いた列挙アルゴリズムの開発を行った.幾何的特徴を持つグラフに対して,区間グラフを拡張したクラスに対する新たな知見の獲得や部分表現拡張問題に対するアルゴリズムの開発,また省領域アルゴリズムの開発に成功した.また,ZDDを用いた実用的なアルゴリズムの開発,特に系統樹の列挙や避難所割当の列挙,パズルソルバーに対するアルゴリズムの開発を行った.これらに対する研究成果は査読付き論文誌および査読付き国際会議や国内研究会などで発表した.当初の目的とは方向性が若干変わったものの,優れた研究成果を得ることができている.特に,ビッグデータはすべてのデータをメモリ空間に格納することはできないため,区間データを処理するための省領域アルゴリズムは,巨大な区間データを処理する上で,必要不可欠なテーマである.2014年度はこのテーマに着目し,極めて効率的なアルゴリズムの開発に成功したのである.これらの研究以外にも,ソーティングネットワークや競争的施設配置問題に対する研究を行い,優れた研究成果を挙げることができた.また,ZDDと呼ばれるデータ構造を用いた高速なグラフアルゴリズムについて,本の1つの章の執筆を行った.このように様々な角度から本問題について挑戦していることで,相乗効果が得られている.アルゴリズム現在,開発した省領域アルゴリズムを,計算機科学における基礎的な問題である,ソーティングに適用できることがわかっている.具体的には,同じ要素が複数存在するデータに対してソーティングを行うとき,本アルゴリズムではそのデータの種類の数に依存する計算時間で問題を解くことができている.しかし,一方で,本問題に対する下界,つまり,少なくともこの問題を解くために必要な計算時間がどれほどのものか,ということが現時点ではわかっていない.そのため,本年度はマルチセットソーティングに対する下界の証明に挑戦する.また,本研究で得られた研究成果を国際会議および論文誌に発表するとともに,本研究により得られた人脈を活かして研究議論を引き続き行っていく.本研究は,少し方向性を変えながら,着実に実用的な問題に対するアルゴリズムの開発に成功している.列挙は目的とする対象をすべて出力することで,データマイニングなどで用いられている.
腫瘍細胞とナリンパ球の遺伝子導入法を応用した悪性神経膠腫に対する免疫療法の開発

悪性グリオーマの新しい根治療法として期待できる腫瘍ワクチン療法の臨床応用へ向け、グリオーマ手術材料からサイトカイン発現腫瘍ワクチンの作製が実施可能かどうかを検討した。レトロウイルスベクターMFGを基に、より安全性を高めたベクターGK,Rxを作製し、lacZ,GM-CSF,IL-4を発現するレトロウィルスベクターを各種構築した。グリオーマ6症例(grade2 : 1,grade3:2,glioblastoma:3例)の手術材料から初代培養を行った。培養細胞はGFAPに対する免疫染色によりグリア由来であることを確認した。レトロウイルスベクターを用いて初代培養グリオーマ細胞に対し遺伝子導入を行い、導入効率、サイトカイン発現量を検討した。6例全例で初代培養樹立に成功し、8週間以内に最終10^9個以上の細胞増殖を得ることができた。マーカー遺伝子lacZを組み込んだベクターGKlacZを用いて、65%以上(71.8【.+-゚】4.1%)の高効率遺伝子導入が可能であった。さらに感染を繰り返すことで、95%まで導入効率を高められた。GM-CSFとIL-4の両方を発現するワクチンの作製には、GM-CSF,IL-4の各単独発現ベクターを続けて感染させることで両者を高発現させられた。両者のdouble expression vectorの場合には内部プロモーターまたはIRESに続く下流遺伝子の発現量が上流遺伝子のそれの約1/10であった。100Gyの放射線照射後も14日間in vitroで遺伝子発現が維持された。以上の結果から、高力価レトロウイルスベクターを用いてグリオーマ手術材料から腫瘍ワクチンの作製が実際に行いうることを示した。GM-CSFを発現する腫瘍ワクチンが抗腫瘍免疫を誘導することを我々は既に報告している。この腫瘍ワクチンを上回る強い免疫をもたらすワクチンを開発する目的で、GM-CSFに加えもう一種類のサイトカインを併せて発現するワクチンの効果を検討する。実験モデルは、皮下腫瘍よりも免疫が及びにくいため治療が困難な移植脳腫瘍モデルを用いた。レトロウイルスベクターを用いてマウスメラノーマ細胞B16にサイトカイン遺伝子を導入し、放射線照射してワクチンを作製、マウス腹部皮下に接種した。ワクチン接種の後(予防モデル)、または前(治療モデル)にB16細胞を脳内に移植し、マウスの生存期間を調べた。12種類のサイトカインについて、GM-CSFとの併用効果を検討した。その結果、予防モデルにおいてはIL-4またはTNFαを発現するワクチンが、GM-CSF単独発現ワクチンと比較して有意に生存期間延長、治癒率向上をもたらした。より臨床の状況に近いと思われる治療モデルを用いた検討では、IL-4を併せ発現するワクチン接種群でGM-CSF単独発現ワクチン接種群より高い治癒率が得られた。GM-CSFプラスIL-4発現ワクチンの接種で誘導されるエフェクター細胞を、モノクロナル抗体のin vivo投与によるリンパ球分画排除の系で検討した。ワクチン効果発現にはCD4,CD8,asialoGM1陽性細胞が必要であった。組織学的検討からは、ワクチン接種部位だけでなく、脳の細胞移植部位にも免疫細胞の浸潤が認められ、細胞性免疫の関与が強く示唆された。以上の結果は、GM-CSFプラスIL-4発現ワクチンが悪性脳腫瘍の新しい根治的治療法として有望であることを示している。グリオーマ6症例(grade2:1,grade3:2,glioblastoma:3例)の手術材料から初代培養を行った。

レトロウイルスベクターを用いて初代培養グリオーマ細胞に対し遺伝子導入を行い、導入効率、サイトカイン発現量を検討した。6例全例で初代培養樹立に成功し、8週間以内に最終10^9個以上の細胞増殖を得ることができた。マーカー遺伝子lacZを組み込んだベクターGKlacZを用いて、65%以上(71.8±4.1%)の高効率遺伝子導入が可能であった。さらに感染を繰り返すことで、95%まで導入効率を高められた。GM-CSFとIL-4の両方を発現するワクチンの作製には、GM-CSF,IL-4の各単独発現ベクターを続けて感染させることで両者を高発現させられた。両者のdouble expression vectorの場合には内部プロモーターまたはIRESに続く下流遺伝子の発現量が上流遺伝子のそれの約1/10であった。100Gyの放射線照射後も14日間in vitroで遺伝子発現が維持された。以上の結果から、高力価レトロウイルスベクターを用いてグリオーマ手術材料から腫瘍ワクチンの作製が実際に行いうることを示した。
コンディショナルノックアウト技術を活用したヤギの排卵制御メカニズムの解明

本研究では、エストロジェン受容体(ER)の発現をコンディショナルにノックアウトできる遺伝子改変ヤギの作出に向けた基盤的知見を集積することを目的とし、RACE法によりヤギERをコードする遺伝子(ESR1)のmRNA塩基配列および推定アミノ酸配列の同定を行った。また、去勢オスヤギの視索前野にエストロジェン結晶を微量留置したところ、黄体形成ホルモン(LH)サージ様の濃度上昇が誘起された。このことから、エストロジェンは視索前野に作用してサージ様のLH分泌を誘起することが示唆されたとともに、視索前野への微量投与法を確立することができた。エストロジェンは脳内において性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)および黄体形成ホルモン(LH)のサージ状分泌の制御に第一義的役割を果たす。本研究では、新規ゲノム編集技術とアデノ随伴ウィルス(AAV)ベクターを活用する新たなアプローチにより、エストロジェン受容体(ER)の発現をコンディショナルにノックアウトする遺伝子改変ヤギを作出し、反芻家畜の排卵を制御する神経機構の局在を同定することを目的とする。ゲノム編集技術(TALEN法またはCRISPR/Cas9システム)を用いて、ヤギER遺伝子(ESR1)座にloxP配列を導入した遺伝子改変ヤギ(ESR1-floxedヤギ)を作出するため、ヤギESR1プロモーター領域およびESR1転写調節因子の探索を目的としてヤギESR1のゲノム構造を明らかにすることに着手した。シバヤギ血液から採取したゲノムDNAサンプルを用いて、ゲノムウォーキング法によりヤギESR1上流域の解析を続けている。また、AAVベクターを用いた遺伝子改変技術に適用するため、ヤギ脳内局所にAAV-Creを投与する手法の開発を行った。脳定位固定装置と、X線撮影による脳室造影画像を用いて、ERが発現する視索前野、視床下部腹内側核、視床下部弓状核などをターゲットとして、微量投与用のガイドカニューレを留置する条件検討を行った。この手法により、オスヤギの両側の視索前野にエストロジェン結晶を微量留置したところ、サージ様のLH分泌が誘起されたことから、視索前野への微量投与法についてはおおよその手法を確立することができた。さらに、AAV-Creをヤギ脳組織に導入するために最適なAAV血清型について検討を続けている。本年度の研究計画では、ヤギ胎仔繊維芽細胞を用いてTALEN法またはCRISPR/Cas9システムによる相同組み換えを利用して、ESR1遺伝子座にloxP配列を導入した細胞系の樹立を行うことを予定していた。しかし、ヤギESR1のゲノム構造情報を取得するのに時間を要していることから、細胞系の樹立には至らなかった。さらに、AAV-Creを導入するために最適なAAVベクターの血清型の同定まで到達できなかったが、他の遺伝子導入に際して導入効率が良いことを確認している血清型(AAV-1、AAV-5、AAV-DJなど)の情報を活用し、次年度には同定をめざす予定である。また、AAV-Creを脳内微量注入するためのヤギ脳内局所に投与する手法の開発はおおむね順調に推移したと考えている。ゲノム編集技術(TALEN法またはCRISPR/Cas9システム)を用いて、ヤギER遺伝子(ESR1)座にloxP配列を導入した遺伝子改変ヤギ(ESR1-floxedヤギ)を作出するため、ヤギESR1プロモーター領域およびESR1転写調節因子の探索を目的として、ヤギESR1のゲノム構造を明らかにすることを試みた。シバヤギ血液から採取したゲノムDNAサンプルを用いて、ゲノムウォーキング法によりヤギESR1上流域の解析を引き続き行っている。また、この技術を用いて、去勢オスヤギの両側の視索前野にエストロジェン結晶を微量留置したところ、サージ様のLH分泌が誘起された。このことから、エストロジェンが視索前野に作用してサージ様のLH分泌を誘起することが示唆されたとともに、視索前野への微量投与法を確立することができた。現在は、AAV-Creをヤギ脳組織に導入するために最適なAAV血清型についての検討を引き続き実施している。本年度の研究計画では、ヤギ胎仔繊維芽細胞を用いてTALEN法またはCRISPR/Cas9システムによる相同組み換えを利用し、ESR1遺伝子座にloxP配列を導入した細胞系の樹立を行ったのち、これらの細胞系を用いてESR1-floxedヤギを作出することを予定していた。現在のところ、ヤギESR1のゲノム構造情報を取得するのに時間を要していることから、ESR1遺伝子座にloxP配列を導入した細胞系の樹立には至っていない。

しかし、当件研究室ではTALEN法を用いてヤギキスペプチン遺伝子(Kiss1)座にCre遺伝子を導入したヤギ胎仔繊維芽細胞株を作出できていることから、この知見を適用してESR1遺伝子座にloxP配列を導入した細胞系の樹立をめざす。さらに、AAV-Creを導入するために最適なAAVベクターの血清型の同定まで到達できなかったが、他の遺伝子導入に際して、ヤギ視床下部組織において遺伝子導入効率が良いことを確認している血清型(AAV-1、AAV-5、AAV-DJなど)の情報を活用し、最適なAAVベクターの血清型の同定をめざす。AAV-Creを脳内微量注入するためのヤギ脳内局所に投与する手法の開発については、ヤギの両側の視索前野にエストロジェン結晶を微量留置してエストロジェンの作用部位を同定できたことから、おおむね順調に推移したと考えている。エストロジェンは脳内において性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)および黄体形成ホルモン(LH)のサージ状分泌の制御に第一義的役割を果たす。本研究では、新規ゲノム編集技術とアデノ随伴ウィルス(AAV)ベクターを活用する新たなアプローチにより、エストロジェン受容体(ER)の発現をコンディショナルにノックアウトする遺伝子改変ヤギを作出し、反芻家畜の排卵を制御する神経機構の局在を同定することを目的とする。本研究では、ゲノム編集技術(TALEN法またはCRISPR/Cas9システム)を用いて、ヤギER遺伝子(ESR1)座にloxP配列を導入した遺伝子改変ヤギ(ESR1-floxedヤギ)を作出することを試みた。その端緒として、ヤギESR1プロモーター領域およびESR1転写調節因子を探索するために、ヤギESR1のゲノム構造を明らかにする必要がある。本年度は、RACE法によりヤギESR1mRNAの塩基配列および推定アミノ酸配列の同定を行った。その結果、ヤギESR1mRNAには少なくとも2つのバリアント(3,836および4,353塩基)が存在することが明らかとなった。また、AAVベクターを用いた遺伝子改変技術に適用するため、ヤギ脳内局所にAAV-Creを投与するための手法の開発を行った。脳定位固定装置とX線撮影による脳室造影画像を用いて、ERが発現する視索前野、視床下部腹内側核、視床下部弓状核などをターゲットとして、微量投与用のガイドカニューレを留置する条件検討を行った。また、この技術を用いて、去勢オスヤギの両側の視索前野にエストロジェン結晶を微量留置したところ、サージ様のLH分泌が誘起された。このことから、エストロジェンが視索前野に作用してサージ様のLH分泌を誘起することが示唆されたとともに、視索前野への微量投与法を確立することができた。本研究では、エストロジェン受容体(ER)の発現をコンディショナルにノックアウトできる遺伝子改変ヤギの作出に向けた基盤的知見を集積することを目的とし、RACE法によりヤギERをコードする遺伝子(ESR1)のmRNA塩基配列および推定アミノ酸配列の同定を行った。また、去勢オスヤギの視索前野にエストロジェン結晶を微量留置したところ、黄体形成ホルモン(LH)サージ様の濃度上昇が誘起された。このことから、エストロジェンは視索前野に作用してサージ様のLH分泌を誘起することが示唆されたとともに、視索前野への微量投与法を確立することができた。
次世代-分散型-人工心臓の開発に関する基礎的研究

人工心臓は心臓手術後の循環補助や心臓移植への繁ぎとして多くの臨床例に用いられ患者の救済に役立っている。しかし、現在の人工心臓は形態的にも機能的にも生体心臓の模倣を目標に開発されてきたため、健康を維持する能力はあっても病気に陥った臓器を積極的に治療・回復させたり目的に応じて特定の臓器や組織の機能を昴進させる能力がないなどの限界を有している。本研究はいままでの人工心臓と180度発想を転換した場合、10-20年後を指向した次世代型人工心臓としてどのような人工心臓を開発すべきかについてその基本構想を述べ、それに対する基礎的実験を行なうことを目的とした。3年間の研究成果は以下の通りである。1次世代型人工心臓として分散型人工心臓を提唱してその開発の意義や可能性について考察した。2システムの小形化の研究を行ない、(1)人工心臓用Jellyfish弁の小形化、(2)新しい方式の人工心臓の開発とその小形化の研究、(3)新しい方式の補助循環装置の開発、(4)マイクロマシンの技術による人工筋肉の開発とその理論解析などで新しい知見を得た。3新しい計測法の研究として、(1)材料表面に吸着するタンパクの動的挙動の測定、(2)血中カテコラミン測定センサの開発、(3)微小循環の長期間実時間観察法の開発などこれまで不可能であった計測法の研究開発を行なった。4新しい制御方法の研究の結果、人工心臓を装着した生体自身に自己の人工心臓を制御させるという全く新しい制御方法(1/R制御方法)を考案し、ヤギを360日間生存させることに成功した。本研究は今までと180度発想を転換して、生体心臓より優れた機能を有する人工心臓を開発することを目標とするもので、その一つのアイデアとして分散型人工心臓を取り挙げ、その開発のための基礎的研究を行った。本年度は以下の研究成果を得た。1)種々のサイズの人工併の設計試計人工心臓を生体内に分散さすためには、種々のサイズの血液ポンプとそれに使用する人工弁の開発が重要である。本研究ではわれわれが研究を行ってきた高分子膜製人工弁(Jelly fish弁)に関し、どこまで小型のサイズができるかを追求した。弁の型の切削にはコンピュータ制御の小型フライス盤を用い、切削したワックス型をシリコーンゴムで形取りし、真空成型機中でポリウレタンを注型して弁座を作った。弁膜はカルディオサンをテフロン型に注型して製作した。この結果,最小4mm径の弁まで製作することができた。in-vitroでの性能試験では毎分1.3リットルの流量を記録した。2)腎臓潅流用モータ駆動の小型血液ポンプの開発腎臓に接続することを目的に、1回拍出量4mlのプッシャープレート型血液ポンプを設計試作した。ポンプハウジングはアクリル樹脂を切削し、ポリウレタン製のダイアフラムを接続し,プッシャープレートは二液硬化型ポリウレタンの円盤をダイアフラムに接着した。このポンプを小型のリニアステッピングモータで駆動して性能試験を行った。その結果,後負荷が100mmHg以上でも200250ml/分の拍出量が得られ、腎臓を潅流するのに十分な性能を有することが確認できた。現在急性の動物実験を行うことを計画中である。本研究は、今までと180度発想を転換して、生体心臓よりす優れた機能を有する人工心臓を開発することを目標とするもので、その一つのアイデアとして分散型人工心臓をとり挙げ、その開発のための基礎的研究を行うこと直接の目的としている。1腎虚血モデルの作成と小型ポンプの性能評価昨年度開発した1回拍出量2mlの小型プッシャープレート型ポンプを用いて腎循環を含めた左心系模擬循環モデルを作成した。

空気圧駆動サック型ポンプを左心ポンプとし、大動脈コンプライアンス-末梢抵抗-左房タンクからなる基本回路を作り、それに大動脈より分岐した腎循環を付加した。小型ポンプは大動脈と腎コンプライアンスの間に挿入した。左心ポンプの拍出量を減少させ、腎循環が低流量、低血圧の虚血状態に陥るようにした後、小型ポンプを駆動した。この結果、小型ポンプをフル稼働することによって、腎循環は正常に復することが示され、開発した小型人工心臓が腎循環補助用に使用可能なことが示唆された。この結果をもとに、現在動物実験を進めている。2人工心臓の基本的な自動制御方法の検討人工心臓をそれを装着した生体自身が制御しうる可能性について、実際にヤギを用いた慢性実験を行った。ヤギの血管末梢抵抗に応じて心拍出量を変化させる制御関数を与えておき、ヤギ自身がその時点での最適の心拍出量を得るために自己の末梢抵抗を調節することができるか否かを調べるのがその目的であった。実験の結果、完全人工心臓ヤギは最長360日(空気圧駆動人工心臓の動物実験では世界最長)生存した。また、これらのヤギでは従来の制御方法で観られた軽度の貧血、高血圧、静脈圧上昇、甲状腺ホルモンの減少などの病態はみられず、運動時も含めて極めて正常に生存した。本制御方法は循環系の人工的制御の一つの本質に迫るものであることが示唆され、分散型人工心臓にも適用可能であることが明らかになった。本研究は、今までと180度発想を転換して、生体心臓より優れた機能を有する人工心臓を開発することを目標とするもので、その一つのアイデアとして分散型人工心臓を取り挙げ、種々の基礎研究を行ない、その実現のための必要条件を明らかにすることを直接の目的としている。本年度は以下の研究を行なった。1.新しい方式の人工心臓ポンプの研究分散型人工心臓には小形化可能な血液ポンプと弁が必要である。血液ポンプに関しては小形容積型連続流血液ポンプと流れ変換型拍動流完全人工心臓の二つのシステムの基礎開発と評価を行なった。前者は、モータの回転によって揺動運動する円盤によって血液を吸引・拍出しようとする新しい原理のポンプであり、試作したポンプの流れの解析、動物実験による溶血の試験を行なった。後者は連続流ポンプの流入・流出口に三方切り替え弁を置き、単一のポンプで左右両心を拍動流で駆動するものであるが、その切り替え弁の方式と血液の混合率に関して種々の検討を行なった。弁に関しては、すでに開発したJellyfish弁の膜厚と性能の関係を明らかにした。。2.評価のための基礎的研究分散型人工心臓の評価のために、(1)表面プラズモン顕微鏡を開発し、材料表面に吸着するタンパクの挙動を調べた。(2)血中カテコラミンを連続計測するためのマイクロセンサの開発を行ない、その感度や抗血栓性について検討した。(3)微小循環を覚醒状態で長期・連続的に観察する新しい原理のプローブの開発を行なった。3.人工心臓の制御方法の研究昨年に引き続いて1/R制御方法の研究をヤギを用いて行なった。現在、この制御方法下でヤギは260日を越えて元気に生存中であり、本制御方法の妥当性が証明された。
臍帯血幹細胞の生物学的特性の解明とヒト造血幹細胞のIn vivo測定法の確立

平成11年度臍帯血から分離した単核球を各種の単一クローン抗体を使用しCoulter社のEPICS HyPerSort SystemのFACSでclone sortingを行いその増殖、分化能について解析した。その結果、CD34+細胞にIL-3、IL-6、可溶性IL-6受容体、SCF、Thrombopoietinの組み合わせにより未分化造血前駆細胞の増幅が得られた。NOD/SCIDマウスに移植しヒト臍帯血が生着する事をCD45+細胞の発現で確認しており、ヒト臍帯血細胞のin vivo測定が可能である事を確認した。臨床面ではムコ多糖症(typeIIA・B, typeIV)に臍帯血幹細胞,移植を行い成功した。平成12年度臍帯血中の造血幹細胞と血管内皮細胞の共通祖先細胞であるヘマンジオブラストを同定することを目標としてFACSでヒト臍帯血中のCD34+細胞を種々の表面マ-カーで分離し造血細胞と血管内皮細胞へのin vitroでの分化能をコロニーアッセイ法と血管内皮培養法で検討した。抗ヒトCD34抗体、抗TIE抗体、抗TEK抗体を用いて、CD34陽性細胞上のTIEおよびTEKの発現を検討したところCD34陽性細胞のうち、50.7±7.5%(n=12)にTIEの発現を、26.5±4.5%(n=16)にTEKの発現を認めた。Lin-CD34+細胞をTIEまたはTEKの発現強度によりCD34+TIE+細胞・CD34+TIE-細胞分画、CD34+TEK+細胞・CD34+TEK-細胞分画に分け、各々の細胞分画をFACSにて分離し、有血清メチルセルロースクローナル培養をSCF, IL-3,1L-6,G-CSF, EP0存在下で行った。両者間でコロニー形成の差はなかった。平成13年度同定されたヘマンジオブラスト分画をNOD/SCIDマウスに移植し、ヘマンジオブラストのin vitroでの造血再構築および血管内皮培細胞への分化能を検討した。TEKの発現強度によりCD34+TEK+細胞・CD34+TEK-細胞分画に分け、それぞれ1.0×10^4個の細胞を大腿動静脈を結紮したNOD/SCIDマウスに移植した。移植6週後に各々のマウスの結紮側下肢から筋肉を採取し、ヒト血管内皮表面抗原を免疫染色した。さらに、同マウスの肝臓の類洞内皮細胞を培養し、ヒト血管内皮表面抗原の発現を調べた。TEK+細胞移植群では虚血部平滑筋内に血管様構造をとる免疫染色陽性細胞がみられた。肝類同内皮細胞にもヒト血管内皮表面抗原の発現が認められ、TEK+細胞が血管内皮分化能をもつことが示された。