hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
持続可能な医療・介護保険財政と効率的なサービス提供体制の設計

世代間の負担格差を生じさせない政策に焦点を当てる根拠として,技術進歩があるもとで世代間の所得再分配をおこなわないことが望ましい条件を特定化した。保険料平準化方式に属する財政方式のなかで終期をスライドさせる保険料平準化方式が負担平準化を図る政策に近い帰結をもつ結果を用い,終期スライド方式の制度設計の考察を深めた。福井県での国保・介護保険レセプトデータと特定健診データを接合した総合パネルデータを用いた研究では,通所リハサービスの提供体制の整備が65歳以上の要介護の住民の健康度に与える影響に関する分析について,前年度の研究から対照群の設定を改善し,通所リハサービス以外の提供事業所の有無が処置群と同じにするように定式化の見直しをおこなった。分析の結果,女性に関して,要介護度が軽くなる効果が見られた。分析は論文にまとめ,学会発表した。今年度の新しい研究として,児童の医療費に対する助成制度が医療サービス利用に与える影響を分析し,その結果をまとめ,学会発表をおこなった。福井県下の児童の医療費助成制度は市町ごとに導入時期や対象者,給付内容やその他の制限が異なるため,その地域的・時間的な差異を自然実験として因果効果の推定に利用している。分析の結果,以下のことが示された。適用者の医療費・受診率・日数は,非適用者のそれらに比べて有意に大きい。また,入院外および調剤の一部で確認され,入院・歯科では確認されない。そして,医療費助成とともに設けられている自己負担の存在が,入院外の医療費を有意に減少させることが確認された。社会保障財政の議論では2025年度までの予測が使われているが,今世紀前半ではまだ高齢化のピークに達していないことから,人口高齢化の問題を扱うにはより長期の時間的視野が必要である。この研究では,急増する医療・介護費用をどのように財源調達するかを検討し,将来世代の負担を軽減するため保険料を長期にわたり平準化する財政方式の比較をおこなった。そして,そのなかで,世代間の負担を平準化する目的に合致した,実務上,合理的な実現方式を同定した。計画されていた医療・介護保険財政に関する研究では,積立金を一部もつ修正賦課方式(あるいは部分積立方式)が世代間の負担格差を平準化する効果を考察した論文が,査読付き学術雑誌に公刊された。さらに後続研究として負担を平準化する方式の同定と修正賦課方式の対比をおこなった論文をまとめ,研究会での報告をおこなうなど,当初の計画に沿い,研究は着実に進展している。さらに確率シミュレーションの改良を施した論文を最終年度に学会発表,雑誌投稿する予定である。介護事業者の立地状況が住民の健康度に与える影響に関する研究では,成果を来年度に論文にとりまとめ,学会発表する予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。公共経済学医療・介護保険財政モデルにおける研究では,モデルの改良課題として残されていた要素価格の内生化をおこなう。積立金を保有する財政方式の場合には,積立金をどこに投資できるのか,金利が低下するのではないか,という問題が指摘されている。要素価格の内生変数化によって,積立金規模の増加にともなう運用困難をとらえ,その政策的含意を検討する。要素価格の決定
ヒトP450によるダイオキシン,ダイベンゾフランの変異原性活性化

2,3,7,8-四塩化ダイベンゾ-p-ダイオキシン(TCDD)の標準サンプルおよび^3Hラベル標品を購入し,チトクロームP450による代謝実験を行った。チトクロームP450の供給源としてはワクシニアウイルス法により遺伝子工学的に合成された12分子種および正常人の肝ミクロゾーム画分を利用した。ヒトHepG2細胞内でヒトP450を発現後,細胞を回収し,超音波処理してlysateを得た。ここに^3HラベルのTCDDを加えてインキュベーションし,酢酸エチル抽出物をHPLCにて分析した。基質およびその分解物以外には顕著なピークは認められず,TCDDは合成ヒトP450により代謝されなかった。ヒト肝ミクロゾームおよびラット肝ミクロゾームとインキュベーションした場合も同様の結果が得られ,TCDDはヒトP450によりほとんど代謝されないことが明らかとなった。しかし,不安定な中間代謝物が形成された可能性が残っているため,クロモゾームDNAに対するアダクト形成能についても調ベた。この方法はHep G2細胞内で発現されたP450が細胞内でTCDDを代謝活性化し,その中間体が同じ細胞内のクロモゾームDNAに結合する程度をみるものであり,既存のアダクト形成能測定法の内で最もすぐれた方法であり,極めて検出感度が高いことが特徴である。この測定を試みたところ,クロモゾームDNAへの^HH-TCDDの結合はいずれのP450分子種においても極めて低く, ^3H-ベンツピレンや^3H-アフラトキシンB1を用いた時のバックグラウンド程度であった。以上の結果から,初期の予想に反してTCDDはP450により代謝されないものと判断された。TCDDの毒性は別の発現機構によるものと考えられる。
言語を語る主体の生成の解明…ハイデガー哲学の批判的改訂の試み

初年度以来、我々は、"言語主体としての<私>もまた動物的生命との連続を欠いては生成しえない"という原始的事実の意味を明らかにし、そのことによって、"人間存在と動物存在との絶対的断絶"を語るハイデガー的思考の枠組みを流動化することを目指してきた。昨年度、日本現象学会編『現象学年報20』に発表した論文において、我々は、こうした問題意識のもと、後期ハイデガー哲学におけるラチオ(ratio=理由)概念の批判に学びつつ考察を展開し、いわゆる「理由の空間」の生成こそは、「ニヒリズム」と「Gestell」の結実を準備し、「戯れ」としての本来的「自然」の概念を切り捨てて、我々の「生」と「死」の意味を空洞化した存在史の展開点であったと推察するに至った。今年度、我々は、上記のラチオ概念の批判を承けつつ、1936年から38年に成立した『哲学への寄与論稿』におけるハイデガーのロゴス論の帰趨を検討することを試み、そこにおいて「存在者トシテノ存在者on he onを一者henとするギリシア的な解釈」(GA65,459)へと向けられた彼の批判が、畢竟、いわゆる「共同体」概念を脱構築することを狙うものとして了解しうることを見出した。ギリシア的に根源的なロゴス概念の基底を掘り崩しつつ、彼が狙っていたのは、別言すれば、「我々」という表象を繋ぎとめている「一ニシテ共通ノ世界」(ヘラクレイトス断片89)を、むしろ本質的に「各自的」で「固有ナモノidion」へと一旦散乱させ、その錯綜的多様体の力動性のうちに「存在」の要求を反復させることであったと解釈される。ハイデガー自身の意図を超えて、この洞察を拡張すれば、それはまた、人間的生(bios)と動物的生命(zoe)の差異が再流動化するさなかにおいて、我々の意味の秩序と自然の秩序との差異の根源が反復され、ある「底無しの没根拠Abgrund」としての「時間」の根源が闡明されることを意味している。『山口大学哲学研究』第13号に発表した拙論「時の過ぎ去り-人称的世界の時間的構造の探究のための準備的考察-」において、私は、この最後の時間論的観点を、狭義のハイデガー解釈の枠組みにはとらわれない仕方で、一般的に展開し、「時の過ぎ去りVergehen」の重層的経験のうちに、我々の「生」と「死」の意味あるいは無意味を、照らし出すことを試みた。ハイデガーの1929/30年講義『形而上学の根本諸概念』は、「存在者としての存在者」を開示する原的ロゴスの「として構造」こそは,動物的存在から人間的な現存在への飛躍と断絶をもたらすものであるとしている。そうして言語の構造こそが、人間存在と動物存在との絶対的断絶を、背後には溯源し得ない原始的事実として決定してしまったのだと主張され、そうした言語の生成を自然史的過程として問おうとする思考は封印されてしまっていると思われる。こうしたハイデガー的思考の枠組みを流動化し、"言語主体としての<私>もまた動物的生命との連続を欠いてはそもそも生成しえない"というもうひとつの原始的事実を究明することが本研究の目標であるが、その最初の課題として本年度は、上記講義において「石は無世界的であり、動物は世界に乏しく、人間は世界形成的である」というテーゼによって反復されるアリストテレス的な霊魂論の見取り図を、人間的な自己の生成の追究へと向けて批判的に検討した。動物的な世界の「乏しさ」を特徴づけるにあたりハイデガーは、動物の行動はその都度「何か」へと外向するものではあるが、決してその「何か」へと自己を「対置」する対象志向的な態度に媒介されておらず、それは、「として」構造に分節された人間の「振る舞い」とは異なる「行動」にすぎないと論考している。こうした論考は、人間の対象志向的な知の次元が、常に既に、身体能力それ自身の直接的存在の次元に基づけられていることを過小評価し、そもそも"私の身体それ自身は<私>の努力によって制御可能になったのではない"という原的な過去が、"心身結合体=心身分離体"としての人間の「自己」意識の生成にとって有する意義を看過していると言わざるをえまい。西日本哲学会誌に発表した論文において、私は、この論点の詳述と解明を、メルロ=ポンティとヘーゲルの試みを参考にして行った。我々は、"言語主体としての<私>もまた動物的生命との連続を欠いては生成しえない"という原始的事実の意味を明らかにし、そのことによって、"人間存在と動物存在との絶対的断絶"を語るハイデガー的思考の枠組みを流動化することを目指してきた。しかしながら、この我々の探究の方向性は、いわゆる「自然主義」や「認識論の自然化」等の動向からは、厳密に区別されなければならない。なるほど、言語的に分節される人間存在の構制は、ある意味において、動物的身体の次元における原初的記号交換や、さらには生命以前の物質的エネルギーの交換の次元へと依存すべく差し向けられていると言わねばならないが、この事実を思考するにあたって、「近代」におけるヒト・モノ一斉の技術的徴発の構制(いわゆるGestell)は、ハイデガーの述べるとおり、「自動的な機械と生物の区別」を消去し、「生物」を「情報の無差別的過程へと中性化」する「サイバネティックス」へと向かおうとしている(Denkerfahrungen, 1983, S.141.)。

しかし、そのようなサイバネティックスによる算定可能性・制御可能性にもとづいて表象された世界地平のうちに、我々は、どのような我々自身の「生」と「死」の意味を見出すことができるだろうか。我々は、ここに垣間見える「ニヒリズム」の歴史的文脈のうちにおいて、自らの探究の針路をあらたに決断し直さねばならないだろう。日本現象学会編『現象学年報20』に発表した論文において、我々は、こうした問題意識のもと、後期ハイデガー哲学におけるラチオ(ratio=理由)概念の批判に学びつつ考察を展開し、いわゆる「理由の空間」の生成こそは、「ニヒリズム」と「Gestell」の結実を準備し、「戯れ」としての本来的「自然」の概念を切り捨てて、我々の「生」と「死」の意味を空洞化した存在史の展開点であったと推察するに至った。初年度以来、我々は、"言語主体としての<私>もまた動物的生命との連続を欠いては生成しえない"という原始的事実の意味を明らかにし、そのことによって、"人間存在と動物存在との絶対的断絶"を語るハイデガー的思考の枠組みを流動化することを目指してきた。昨年度、日本現象学会編『現象学年報20』に発表した論文において、我々は、こうした問題意識のもと、後期ハイデガー哲学におけるラチオ(ratio=理由)概念の批判に学びつつ考察を展開し、いわゆる「理由の空間」の生成こそは、「ニヒリズム」と「Gestell」の結実を準備し、「戯れ」としての本来的「自然」の概念を切り捨てて、我々の「生」と「死」の意味を空洞化した存在史の展開点であったと推察するに至った。今年度、我々は、上記のラチオ概念の批判を承けつつ、1936年から38年に成立した『哲学への寄与論稿』におけるハイデガーのロゴス論の帰趨を検討することを試み、そこにおいて「存在者トシテノ存在者on he onを一者henとするギリシア的な解釈」(GA65,459)へと向けられた彼の批判が、畢竟、いわゆる「共同体」概念を脱構築することを狙うものとして了解しうることを見出した。ギリシア的に根源的なロゴス概念の基底を掘り崩しつつ、彼が狙っていたのは、別言すれば、「我々」という表象を繋ぎとめている「一ニシテ共通ノ世界」(ヘラクレイトス断片89)を、むしろ本質的に「各自的」で「固有ナモノidion」へと一旦散乱させ、その錯綜的多様体の力動性のうちに「存在」の要求を反復させることであったと解釈される。ハイデガー自身の意図を超えて、この洞察を拡張すれば、それはまた、人間的生(bios)と動物的生命(zoe)の差異が再流動化するさなかにおいて、我々の意味の秩序と自然の秩序との差異の根源が反復され、ある「底無しの没根拠Abgrund」としての「時間」の根源が闡明されることを意味している。『山口大学哲学研究』第13号に発表した拙論「時の過ぎ去り-人称的世界の時間的構造の探究のための準備的考察-」において、私は、この最後の時間論的観点を、狭義のハイデガー解釈の枠組みにはとらわれない仕方で、一般的に展開し、「時の過ぎ去りVergehen」の重層的経験のうちに、我々の「生」と「死」の意味あるいは無意味を、照らし出すことを試みた。
アフリカにおけるタイレリア原虫媒介性マダニに対するワクチン開発と野外応用への展開

本研究ではマダニの免疫学的制御、すなわちマダニワクチンの開発を目指している。Ripicephalus appendiculatusのserpinについては既にワクチン効果が報告されていることから、アジュバントとして免疫増強効果が期待できるサイトカインの効果を検証した。(1)低用量インターフェロンα(IFNα)経口投与効果IFNαは細胞の抗原提示能を変化させるため、アジュバントとしての効果が期待できる。また低用量で経口投与した場合、タイレリア感染症に効果があったと報告されている。そこで黒毛和種子牛にIFNαを経口投与(1IU/kg 5日間)し、末梢血液単核細胞からmRNAを精製し、発現が変化する遺伝子を牛DNAマイクロアレイを用いて解析した。IFNαで誘導された遺伝子のうち、約1800個の発現が少なくとも2倍以上上昇し、300個は逆に減少した。発現上昇した遺伝子の中には自然免疫関連、白血球遊走、リンパ球活性化、アポトーシスなど免疫現象と深く関連する遺伝子が存在した。(2)形質転換細胞増殖因子(TGFβ)の投与効果TGFβ経口投与でNK細胞活性化などを起こすことが報告されていることから、非特異的な免疫増強作用があると考えられる。そこで原虫感染症に対するTGFβ投与効果を検討した。a)トキソプラズマ、マラリア原虫、バベシア(Babesia rhodhaini)に対する効果TGFβを投与の効果は認められなかった。10-20ng、3回投与で寄生率および死亡率を改善する顕著な効果が認められた。c)トリパノソーマに対する効果本原虫に対しては5-20ngの一回腹腔内投与で明らかな効果(寄生率の減少、貧血改善)が認められた。3回投与では原虫の完全な消失が見られた。作用機序について明らかにするため代表的なサイトカイン(IFNγ、TNFα、IL12、IL10、TGFβ)mRNA発現レベルをRT-PCR法で検査したところ、前3者では増強、後2者では減少が認められ、type Iサイトカイン発現が増強されることが確認された。この成績はtype Iサイトカインがトリパノソーマ感染症に効果的であるとの知見と一致する。既に当研究グループではRhipicephalus appendiculatusのからセリンプロテアーゼcDNAを得ていることから(Mulenga A et al.2003)、同様のプライマーを設計し、Haemaphysalis qinhaiensisのgenomicDNAからセリンプロテアーゼ遺伝子の増幅を試みた。陽性バンドをプラスミドベクターにクローニングし、塩基配列を決定したが、既知のダニ由来セリンプロテアーゼ遺伝子と相同性を示すクローンは得られなかった。さらに、Haemaphysalis Iongicornis由来の唾液セメント物質(p29、HLp34)遺伝子配列を基にプライマーを設計し、各種増幅条件でPCRを行い、増幅産物の解析を行ったが、目的とする遺伝子断片は得られなかった。さらに、Haemaphysalis qinhaiensiscDNAライブラリーを構築し、ダニで頻回吸血させたウサギ血清を用いたイムノスクリーニングを実施し、いくつかの陽性クローンを得て、現在塩基配列を解析している。また、ワクチンを開発する上で使用するアジュバントとしてサイトカイン分子を利用できないかと考え、TGFβならびにインターロイキン1の経口投与効果を測定している。前者では原虫感染をある程度抑制し、非特異的な免疫反応を誘導できる可能性が示されたことから、その機序を探るため、Th-1,Th-2系のサイトカイン動態を解析する実験を進めている。この成績はtype I
ミトコンドリアの母性遺伝:雄性mtDNAの選択的分解機構の可視化とその分子機構

申請者らは、同形配偶子生殖の真正粘菌Physarum polycephalumを用いて、接合子内で片親由来のミトコンドリア核(mt核,DNAタンパク質複合体)が選択的に分解され、mt核を消失した片親由来のミトコンドリアは、30時間以上を経過してようやく分解されることを15年度に明らかにしている。ミトコンドリア母性遺伝機構を解明するために、1)mt核の選択的消失に直接関わるヌクレースを単離し、2)片親のミトコンドリアあるいやmtDNAに対するその選択性がいかにして発揮されるのかを調査した。ミトコンドリアの崩壊が先だとすれは、母性遺伝の選択性は、雄性ミトコンドリア崩壊を選択的に誘起する酵素群にあることになる。その意味で、mt核の消失が先か,ミトコンドリアの崩壊が先かは極めて重要な問題であり、多くの生物を用いて詳細に検討する必要がある。mt核が容易に観察できる真正粘菌に加え、ヒラアオノリUlva compressaやヒロハノマンテマSilene latifeliaを用いて、mt核消失とミトコンドリア崩壊の時期を特定した。16年度は、ミトコンドリアの遺伝様式ともに雄性ミトコンドリアの排除機構の変遷を分子細胞形態学的に解析するために、1)従来用いられていたmtDNAのRELPの他に定量PCR法によってミトコンドリアの遺伝様式を詳細に再検討し、2)配偶子形成と接合子過程における雌雄ミトコンドリアの挙動(mt核の選択的消失)とミトコンドリア崩壊の時期的関係を蛍光抗体染色法で詳細に観察した。また、3)真正粘菌でmt核の選択的消失に直接関わると予測されるヌクレースとその選択性をアッセーするシステムを、雌雄の単離ミトコンドリアやmt核あるいはmtDNAを用いて構築した。特に、真正粘菌のミトコンドリアの片親遺伝を誘発するMn^<2+>要求性のヌクレースの単離精製をめざした。また、ミトコンドリア核タンパク質(Glom)の挙動に注目して、mt核消失とヌクレース活性、ヌクレースの選択性と出現時期、mt核消失ミトコンドリアの細胞内分布などを調べた。申請者らは、同形配偶子生殖の真正粘菌Physarum polycephalumを用いて、接合子内で片親由来のミトコンドリア核(mt核,DNAタンパク質複合体)が選択的に分解され、mt核を消失した片親由来のミトコンドリアは、30時間以上を経過してようやく分解されることを明らかにした。ミトコンドリアの母性遺伝機構を解明するためには、1)mt核の選択的消失に直接関るヌクレースを単離し、2)片親のミトコンドリアあるいはmtDNAに対するその選択性がいかにして発揮されるのかを調査すべきであろう。ミトコンドリアの崩壊が先だとすれば、母性遺伝の選択性は、雄性ミトコンドリア崩壊を選択的に誘起する酵素群にあることになる。その意味で、mt核の消失が先か,ミトコンドリアの崩壊が先かは極めて重要な問題であり、多くの生物を用いて詳細に検討する必要があろう。

15年度は、mt核が容易に観察できる真正粘菌に加え、緑藻網からヒラアオノリEnteromorpha compressaと高等植物としてヒロハノマンテマSilene latifoliaを用いて、原始的な同型配偶子生殖から、異型配偶子生殖を経て、花粉生殖の高等植物へ至る進化過程で、mt核消失とミトコンドリア崩壊の時期を特定し、ミトコンドリアの遺伝様式ともに雄性ミトコンドリアの排除機構の変遷を分子細胞形態学的で解析した。1)従来用いられていたmtDNAのRFLPの他に定量PCR法によってミトコンドリアの遺伝様式を詳細に再検討した。また、2)配偶子形成と接合子過程における雌雄ミトコンドリアの挙動、特に、mt核の選択的消失とミトコンドリア崩壊の時期的関係を、蛍光抗体染色法などを用いて詳細に観察した。また、3)真正粘菌でmt核の選択消失に直接関ると予測されるヌクレースとその選択性をアッセーする雌雄の単離ミトコンドリアやmt核あるいはmtDNAを用いたシステムを構築した。15年度は、真正粘菌のミトコンドリアの片親遺伝を誘発するMn^<2+>要求性のDNaseの単離精製を最優先し、mt核消失とDNase活性、DNaseの選択性、出現時期、細胞内分布などを中心に調べた。申請者らは、同形配偶子生殖の真正粘菌Physarum polycephalumを用いて、接合子内で片親由来のミトコンドリア核(mt核,DNAタンパク質複合体)が選択的に分解され、mt核を消失した片親由来のミトコンドリアは、30時間以上を経過してようやく分解されることを15年度までに明らかにしている。ミトコンドリア母性遺伝機構の解明には、1)mt核の選択的消失に直接関るヌクレースを単離し、2)片親のミトコンドリアあるいはmtDNAに対するその選択性がいかにして発揮されるのかを調査すべきであろう。ミトコンドリアの崩壊が先だとすれば、母性遺伝の選択性は、雄性ミトコンドリア崩壊を選択的に誘起する酵素群にあることになる。その意味で、mt核の消失が先か,ミトコンドリアの崩壊が先かは極めて重要な問題であり、多くの生物を用いて詳細に検討する必要があろう。mt核が容易に観察できる真正粘菌に加え、ヒラアオノリUlva compressaやヒロハノマンテマSilene latifoliaを用いて、原始的な同型配偶子生殖から、異型配偶子生殖を経て、花粉生殖の高等植物へ至る進化過程で、mt核消失とミトコンドリア崩壊の時期を特定した。16年度は、ミトコンドリアの遺伝様式ともに雄性ミトコンドリアの排除機構の変遷を分子細胞形態学的に解析するために、1)従来用いられていたmtDNAのRFLPの他に定量PCR法によってミトコンドリアの遺伝様式を詳細に再検討し、2)配偶子形成と接合子過程における雌雄ミトコンドリアの挙動(mt核の選択的消失)とミトコンドリア崩壊の時期的関係を蛍光抗体染色法などを用いて詳細に観察した。また、3)真正粘菌でmt核の選択消失に直接関ると予測されるヌクレースとその選択性をアッセーするシステムを、雌雄の単離ミトコンドリアやmt核あるいはmtDNAを用いて構築した。特に、真正粘菌のミトコンドリアの片親遺伝を誘発するMn^<2+>要求性のDNaseの単離精製をめざした。また、ミトコンドリア核タンパク質(Glom)の挙動に注目して、mt核消失とDNase活性、DNaseの選択性と出現時期、mt核消失ミトコンドリアの細胞内分布などを調べた。
ヒト心筋分化誘導因子の同定－再生医療との複合戦略の創成－

本研究では、効率よく多量の分化心筋細胞を獲得するための技術開発を行った。未分化細胞特異的に蛍光を発現するiPS細胞を作製した。この細胞を用いることで、分化心筋細胞の純度を定性的、定量的に評価することができる。また、ヒト体細胞の増殖は阻害せず、未分化ヒトiPS細胞特異的に強い増殖抑制作用を示す薬剤Aを選出した。この薬剤を用いることで、iPS由来の分化心筋細胞に混在する残存未分化細胞の除去が可能となり、純度の高い心筋細胞の製造が可能となる。申請者は、平成23年度からの科学研究費補助金・若手研究Bを受け、その研究課題のもとに、ヒト心筋分化誘導因子の同定に向けた研究に取り組んでいる。今年度は、心筋細胞への分化誘導因子を同定するための実験系確立、そのバリデーションを引き続き行った。また、胚性癌細胞、間葉系幹細胞、血管平滑筋細胞を利用した網羅的遺伝子解析によって、心血管系の発生、機能に関わる可能性のある候補遺伝子の探索を行った。その結果得られたいくつかの候補遺伝子について、モデル細胞(間葉系幹細胞、平滑筋細胞)を用いた検証を行った。心筋細胞への分化誘導因子を同定するための実験系確立として、心筋分化誘導因子のスクリーニングに利用できる細胞の作出を行っている。これまでに、心筋細胞のマーカー遺伝子であるαミオシン重鎖(αMHC)のプロモーターによって緑色蛍光蛋白遺伝子(GFP)を発現するようなプラスミドベクター、レンチウイルスベクターを作成し、マウスES細胞、ヒトiPS細胞へ導入、安定発現株の単離に成功した。これらの細胞を用い、ヒト心筋分化誘導因子の探索を今後試みていく。心血管系の発生、機能に関わる可能性のある候補遺伝子として、弾性繊維の蛋白質をコードする遺伝子がマイクロアレイの結果から得られた。また、これらの蛋白質は甲状腺ホルモンによって調節を受けることが分かった。低甲状腺機能は、心筋梗塞のリスク要因としても知られていることから、弾性繊維の蛋白質が心機能調節に関与している可能性が考えられた。そのメカニズム解明を現在進めている。胚性癌細胞、間葉系幹細胞、血管平滑筋細胞を利用した網羅的遺伝子解析によって、心血管系の発生、機能に関わる可能性のある候補遺伝子の探索を行っているが、現在のところ、心筋分化に関わるような新規の遺伝子の同定には至っていない。本年度は、ヒト心筋分化誘導に関わる因子をこれまでと異なる観点から探索することにした。ヒト多能性幹細胞を比較的高率良く心筋細胞へ分化誘導する実験系をこれまでに確立してきたが、分化細胞の純度をさらに高めるには、分化誘導を促進させるとともに、分化したものだけを選別し未分化なものを取り除くことも重要と考えた。未分化なヒト多能性幹細胞は、移植後に腫瘍形成する可能性をはらんでいる。このことは、ヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞を臨床使用する場合の安全性において大きな懸案事項となっている。未分化な多能性幹細胞を除去する方法としては、薬剤処理を考えている。多能性幹細胞は、胎児期の発生を阻害するような催奇形性を持つ薬剤に対し、成熟細胞に比べ感受性が高いことが知られていることから、現在、催奇形性を持つことが知られ、さらに多能性幹細胞特異的に毒性を持つような薬剤のスクリーニングを進めている。表皮繊維芽細胞、ヒトiPS細胞、ヒト間葉系幹細胞、ヒト胚性がん細胞などを用い、各種薬剤による増殖性への影響を評価した結果、ヒトiPS細胞、ヒト胚性がん細胞に対し高い増殖抑制作用を持つ薬剤が1種類認められている。今後、iPS細胞の別ラインでも検証し、さらに、初代培養系心筋前駆細胞への影響も評価していく。また、未分化細胞特異的に蛍光を発現するようなiPS細胞の作出も進めており、この細胞を用いた心筋細胞分化の純度を評価する系も確立する。申請者は、平成23年度からの科学研究費補助金を受け、その研究課題のもとに、ヒト心筋分化誘導因子の同定に向けた研究に取り組んできた。今年度は、ヒト細胞の培養法確立、さらにヒト細胞を心筋細胞へ分化誘導させる方法の検討を行い、また、それらと並行して、心筋細胞への分化誘導因子を同定するための実験系確立を行った。本研究では、心筋細胞への分化能を持つヒト細胞として、ヒト間葉系幹細胞、ヒトiPS細胞の利用を想定しているが、これらの幹細胞は株によって分化能などの特性が異なることが知られているため、実験に適した(ここでは分化能の高い)細胞の選択は今後の研究を左右する重要な課題となる。そこで、まず京都大学から提供されているヒトiPS細胞株2株について、フィーダー細胞無しでの安定した培養法を確立し、続いて心筋細胞への分化誘導法を検討した。

心筋細胞への分化誘導法は、他研究グループの手法を参考にし、複数の方法を検討した。その結果、接着培養にActivin A, BMP4, DKK1といったサイトカインを添加する方法で、比較的短期間(10日前後)でiPS細胞が心筋細胞へ分化することを確認できている。一方、心筋細胞分化誘導因子の同定に向けた研究として、心筋分化誘導因子のスクリーニングに利用できる細胞の作出を行っている。まず、心筋細胞のマーカー遺伝子であるαミオシン重鎖(αMHC)のプロモーター領域を、市販のヒトゲノムDNAからPCRで増幅・単離し、プロモーターレスの緑色蛍光蛋白遺伝子(GFP)を持つプラスミドにサブクローニングした。このベクターをヒトiPS細胞に導入し、心筋細胞への分化誘導を行ったところ、分化に伴ってGFP蛋白が発現してくることを確認できた。今後、複数のiPS細胞株、間葉系幹細胞株にこのベクターを導入し、安定発現株を単離していく予定である。申請者は、ヒト心筋分化誘導因子の同定という研究課題の下、本年度はヒトiPS細胞から心筋細胞への分化誘導法における、分化の効率化、分化細胞の高純度化のための技術開発を行った。まず、発生毒性を持つ薬剤を中心に行ったスクリーニングにより得られた、未分化多能性幹細胞に強い毒性を示す薬剤Aについて、その至適効果が得られる投与量、投与期間の検討を行った。心筋細胞、繊維芽細胞、間葉系幹細胞に対し、増殖抑制作用をほとんど示さない濃度の薬剤Aは、ヒトiPS細胞に対しては顕著な増殖抑制作用を示し、90%以上の細胞を3-5日間で死滅させる効果が認められた。尚、薬剤Aによるこれらの作用は、複数のiPS細胞株で確認できている。ヒトiPS細胞由来の心筋細胞中に残存する未分化細胞を、薬剤Aで選択的に除去する方法の確立を見据え、初代培養系心筋細胞に一定量の未分化iPS細胞を混入させた細胞試料に対し、薬剤Aを作用させる試験を現在進めている。また、未分化細胞特異的に蛍光を発現するiPS細胞の作出も進めており、現在までに、複数の未分化マーカー遺伝子の結合配列を組み込んだ人工プロモーターによって、蛍光蛋白を発現するようなコンストラクトをレンチウイルスでiPS細胞に導入することに成功している。この細胞を用い、蛍光発現を指標とした残存未分化細胞の評価を今後行っていく。これまでの成果によって、ヒトiPS細胞からの心筋細胞分化における、分化の効率化、分化細胞の高純度化させる技術、及びその純度を定性的、定量的に評価する系が確立できている。これらの系を応用し、未分化細胞と高純度な分化細胞の発現遺伝子を比較し、心筋分化誘導因子を効率的に探索できることが期待される。本年度までの研究では、計画当初の目的であったヒト心筋分化誘導因子の同定までには至らなかったが、今後の伸展、発展が大いに期待できる新たな道筋を築くことができた。幹細胞生物学本年度、心筋分化誘導因子のスクリーニングに利用できる細胞を数株作出することができた。しかしながら、これらの細胞は、現時点ではGFPの発現が不安定であり、細胞の継代によるGFPの消失という問題も出てきていることから、実用性にはまだ少し遠い状態である。良い状態の細胞を選別し、大量のストックを確保しておくことで、スクリーニング系への利用(バリデーション)を試みていくことに加え、導入遺伝子の再構成を試み、より遺伝子発現の安定した細胞の作出も試みる。
BOECを用いたvon Willebrand病の細胞科学的的解析と治療への応用

30年度は、29年度に引き続き、9例のVWD患者より採取した末梢血ゲノムDNAを用いてエクソーム解析を実施し、以下の変異を同定した。これらの結果についてはサンガーシークエンスでも確認作業中である。解析した症例の中にはミスセンス変異でありながら、type 3(重症型)の表現型(臨床症状)を示し、血液中にVWF抗原、活性が検出できない症例がある。これらの症例を中心にその病因を探るべく、末梢血中の遊離血管内皮前駆細胞を培養して得られる血管内皮細胞(BOECs)による病態解析を進めた。まずは健常人の検体を用いて、BOECsの安定的培養条件の設定とVWFによる免疫染色の至適条件の設定を行った。BOECsの培養条件については様々な試行錯誤を繰り返しているところであるが、症例によりBOECsの培養ができない症例がある事を見いだし、その原因(背景)について探索中を継続する。VWFの免疫染色についてはHUVECを用いて条件設定を行ったのち、作成したBOECsに対しても実施し、安定的な結果が得られている。予定よりもやや遅れは認められるが、新規変異が複数同定され、遺伝子レベルでの新たな知見が得られた。BOECsを用いた病態解析についても課題が明確になってきており、研究の完遂は十分可能であると考えられる。病態解析の一環として、作成したBOECsに対しDDAVP添加試験を行いVWF放出能の検討を実施した。目下DDAVPの至適濃度設定を行っている段階であるが、今後の結果によってはVWD病態解析の有用なツールとなる可能性を秘めている。当教室で行ったType 3に対する詳細な解析(附属病院検査部三田らASH2014)にひきつづき、方法を確立しつつ計画的に開始した。VWF抗原量またはVWF活性が低下しVWDが疑われる患者5名から書面によるインフォームドコンセントを得た後、末梢血ゲノムDNAを抽出しエクソーム解析を行った(大学院生三田・松下)。この方法ではエクソン領域のみを濃縮して解析することにより、効率的にエクソン上の変異を検出する。エクソームはヒトゲノムのわずか2%未満にしか相当しないが、そこに既知の疾患原因変異の約85%が含まれていることから、全ゲノムシークエンスの欠点を補う費用効率の高い選択肢である。しかしながら精度の改善の余地はまだ残っており、現状当教室でも必ずサンガーシークエンスを行って確認している。本年度はSureSelect XT Human All Exon V5+UTRsキット(アジレント社)を用いてライブラリの調整を実施後、次世代シーケンサHiSeq (illumina)にてPaired Endに100塩基/リードを読み取り、3000万リードペア(6000万リード)を取得(取得データ量:6Gb/サンプル)した。しかしながらHiSeqカスタムシークエンスサービスとの契約が整い、対象とした10名中全員の検討が完了せず4名のみに以下のmutationを検出している。解析結果(No、VWD type、塩基置換部位、アミノ酸変異部位、hetero/homo、異常exon部位の順に記載)exome sequencingについては外注契約が整い、Runは終了したが、データ解析については対象10名中先行4名のみ完了した。残りの生データは得られているが解析が完了していないため今年度の執行予算を繰り越して支払うこととしてる。細胞学的には今年度はすでにBOECの試作を正常血液により開始している。それ以外には大きな遅延はない。シークエンシングにて同定されたVWD mutationの生物学的意義はこれまでmutant DNAのtransfectionによる発現実験にて行われてきた。しかしながら、VWFは内皮細胞という培養系では再現の難しい細胞種から分泌され、さらにWPBという特徴的な小胞体に貯留され、刺激に応じて分泌されるという特徴を有する。BOECは、血管内皮細胞環境を患者由来として直接構築できる特徴がある。本研究では従来のTransfectionによる発現検討と組み合わせ、優性遺伝形式を取るVWDにおけるDominant-negative effectの細胞学的な機構を詳細に検討を行う。平成30年度以降は細胞培養を主体にBOECsを用い、免疫蛍光染色法やELISA法で遺伝子変異によるVWF発現の影響を調査して分子病態解析を行っていく。

病態解析の一環として、作成したBOECsに対しDDAVP添加試験を行いVWF放出能の検討を実施した。目下DDAVPの至適濃度設定を行っている段階であるが、今後の結果によってはVWD病態解析の有用なツールとなる可能性を秘めている。exome sequencingについては外注契約が整い、Runは終了したが、データ解析については対象10名中先行4名のみ完了した。残りの生データは得られているが解析が完了していないため今年度の執行予算を繰り越して支払うこととした。今年度物品費が節約できたので残額は次年度の細胞培養試薬購入(引き続きBOECsの培養を行う)のために使用予定である。
毒ヘビ神経毒を標的とした咬傷治療薬創製の基盤研究

本研究では、毒ヘビ血液由来毒素阻害タンパク質群の標的毒素の認識機構および阻害機構を明らかにすることを目的としている。主な成果は、以下に示す3つである。(1)ハブ毒中のイオンチャネルブロッカーの標的イオンチャネルを同定し、毒ヘビ血清タンパク質がその毒素の生理活性を阻害することを明らかにした。(2)ファージディスプレイ法および化学合成法を用いて、阻害タンパク質の毒素結合領域のペプチド合成を行った。(3)数種のヘビ粗毒を用いて、ヘビ血液成分との結合毒素を同定した。本研究では、毒ヘビ血液由来毒素阻害タンパク質群(SSPs)の標的毒素分子認識機構および阻害機構を明らかにすることを目的としている。平成28年度の研究成果を以下に示す。1、ハブ神経毒(triflin)と内在性阻害剤(SSP)の調整:ハブの粗毒または血液中から組換え体の活性評価に使用する天然triflinと天然SSPを精製した。また、大腸菌発現系を用いて組み換え体SSPとtriflinの合成を試みた。S-S結合に富むtriflinおよびSSPは不溶性分画として得られたため、両者ともに希釈法でリフォールディングを行った、その結果、巻き戻し効率約20%程度で調製に成功している。現在、NMR測定に可能な量を調整するため、合成条件を検討している。2、神経毒素triflinの標的イオンチャネルを同定:パッチクランプ法による生理学実験よりL型Ca2+チャネルの発現量が多い正常細胞(平滑筋細胞A7r5)およびL型Ca2+チャネルを過剰発現させたHEK293細胞を用いて、triflinがL型Ca2+チャネルの電位依存性チャネル活性を阻害することを明らかにした。さらに、そのtriflinのチャネル阻害活性をSSPが抑制することを証明した。3、コブラ科毒ヘビ由来の神経毒素とSSPとの相互作用解析:シンガポール国立大学KINI教授研究グループとの共同研究により、世界でも咬傷被害が多い毒ヘビのサンプル入手が可能となった。我々がクサリヘビ科(ハブ・マムシ)の血液中から見出したSSPが他の毒ヘビの毒素と相互作用するのかどうかをSSPを固定化したアフィニティクロマトで調べた。その結果、インドコブラ、タイコブラの粗毒中にSSPと特異的に結合する分子が存在を確認した。現在その毒素の同定を行っている。ジスルフィド結合が多いヘビ毒素(triflin)および毒素阻害タンパク質(SSP)の組換え体調整法確立には予定以上に時間を費やした。ドメイン別発現の検討、また封入体のリフォールディング効率を上げるための条件検討が必要だったため、変異体解析がやや遅れている。一方、平成28年度には2つの毒素関係の国際学会に参加し、当該研究の成果発表を行った結果、ヘビ毒素研究を網羅的に行っている研究グループが興味を示し、国際的共同研究の機会を得ることができた。そのため、日本では入手しにくい毒ヘビの粗毒および血液のサンプルを取り扱って研究することが可能となった。予備実験より本研究対象のヘビ毒阻害タンパク質SSPが世界でも咬傷被害が多い毒ヘビ(コブラ、ガラガラヘビ)に対しても応用できることが示唆された。以上のことより申請書に記載した研究計画も含めて本研究の進捗状況はおおむね順調であり、平成29年度は申請書に記載した計画に沿って円滑に研究を推進でき、さらに国際的な共同研究により蛇毒阻害剤SSPの治療薬としての波及性が期待できる。本研究期間内(平成28ー29年度)の研究成果を以下に示す。1、ハブ神経毒および内在性阻害剤(SSP)の調整:ハブの粗毒または血液中から天然のtriflinとSSPを精製した。また、大腸菌発現系を用いて組み換え体triflinとSSPの合成を試み、両者ともに希釈法を用いたリフォールディングより調製する方法を確立した。2、神経毒素triflinの標的イオンチャネルを同定:パッチクランプ法による生理学実験からL型Ca2+チャネルの発現量が多い平滑筋細胞A7r5およびL型Ca2+チャネルを過剰発現させたHEK293細胞を用いてtriflinがL型Ca2+チャネルの電位依存性チャネル活性を阻害することを明らかにした。3、SSPを利用したコブラ科由来の神経毒素の単離:クサリヘビ科の血液中から見出したSSPが他の毒ヘビ由来の毒素と相互作用するのかをSSPを固定化したアフィニティクロマトを作成して調べた。そのSSPカラムにインドコブラ、タイコブラの粗毒から特異的に神経毒素が結合し、単離できることを証明した。4:ファージディスプレイ法によるペプチドライブラリーの作成と変異体解析:T7ファージを用いて毒素認識に関与するSSPのN末端領域をランダマイズしたライブラリーを作成し、毒素と特異的に結合するファージの単離を行った。引き続き、毒素との結合親和性とその阻害能評価を行う予定である。5:阻害活性ペプチドのデザインと合成:5種類のSSPsのアライメントよりそれぞれ標的毒素との相互作用領域を考慮したペプチドを合成した。その合成ペプチドの阻害評価を行ったが、天然SSPと比較して阻害活性は低かった。

(2)ファージディスプレイ法および化学合成法を用いて、阻害タンパク質の毒素結合領域のペプチド合成を行った。(3)数種のヘビ粗毒を用いて、ヘビ血液成分との結合毒素を同定した。本研究では、SSPの機能性を活かしたペプチドまたは低分子化合物をデザインし、毒ヘビ咬傷に対する新薬開発の基盤を確立することを目標としており、平成29年度の研究計画の内容を下記に示す。1、神経毒阻害薬開発のための候補分子(ペプチド)のデザインとスクリーニングファージディスプレイ法を用いて、変異体解析の情報より得られた結合及び阻害に必須な残基をランダマイズしたライブラリを作製する。この実験では、そのファージライブラリから、ヘビ毒神経毒素と結合するファージをパンニング法で単離する。結合能がより高いものやより強い阻害活性を示すものが単離できることが期待される。ファージはT7ファージおよびM13ファージを、宿主細胞にはプラスミドpAR5403を含む大腸菌Origami, SHaffleなどを用いる。2、安定同位体ラベルSSPのNMRケミカルシフト解析を行う。変異体の構造安定性の評価や毒素と阻害剤の溶液状態の相互作用について情報を得るために、NMRを用いて特定残基のケミカルシフトを測定する。具体的には平成28年度の研究成果を参考に、大腸菌発現系を用いて希釈法によるリフォールディングを行い、13C, 15N標識阻害タンパク質SSPを調製し、天然ハブ毒triflinやハブ血液中の相互作用分子HSFの添加実験を行う。生化学
モチーフ探索のための三次元構造特徴探索アルゴリズムに関する研究

本研究は、タンパク質の高次構造特徴解析のための基礎となる三次元共通構造特徴探索のためのアルゴリズムの開発と三次元モチーフ探索の自動化手法の確立を目指すものである。本研究では、タンパク質の三次元構造を各アミノ酸残基をそれぞれ一つのsuper atomと見なし、対応するCa原子の座標を用いて近似することにより、構造表現の簡略化並びに、処理の高速化を図った。こうしたタンパク質三次元構造の簡略化表現をもとに、与えられたタンパク質の構造を三次元空間上のsuper atom(アミノ酸残基)に対応する点の集合として取り扱う。また、これらの点の集合を距離行列で記述し、これに対応する辺重み付きグラフを考える。すなわち、三次元幾何情報も含めタンパク質の構造情報をその構成アミノ酸残基を頂点とする重み付きグラフとして表現し、構造特徴探索をグラフのマッチング問題としてグラフ論的なアプローチのもとに検討を行った。三次元部分構造検索については、有機低分子を対象としたテストデータベースを作成し、その試行実験を通じて本法の有用性を確認した。また、PDB中に含まれる543タンパク質をテストデータベースとしたトロポニンC中のEF-ハンドモチーフを質問構造とした検索実験の結果、同様なモチーフ部位を有することが知られているタンパク質の対応部位を正しく検出することができた。このことは、タンパク質の三次元モチーフ探索における本法の有用性を示すものである。
スプライシング調節を応用した脊髄性筋萎縮症の治療法の開発

1 (SMN遺伝子エクソン)脊髄性筋萎縮症(SMA)の責任遺伝子はSMN1遺伝子である。SMN2遺伝子はSMN1遺伝子とほとんど同一配列を有する相同遺伝子であるが、その主たる産物はエクソン7をスキップしたmRNAである。今回の研究の目的は、エクソン7がmRNAに取り込まれるスプライシング機構、取り込まれないスプライシング機構を解明することにある。2 (mRNA前駆体結合蛋白の単離・同定)研究者らは、SMN1(もしくはSMN2)mRNA前駆体エクソン7の配列に特異的に結合するスプライシング関連蛋白を単離するために、各種蛍光RNAプローブとHeLa細胞核蛋白を結合させてゲルシフト解析を行い、SMN1mRNA前駆体に強く結合する蛋白を得た。質量分析法で蛋白の分子種を同定したところ、hnRNP C1/C2蛋白であることが判明した。エクソン6、イントロン6、SMN1(もしくはSMN2)エクソン7の配列を有するミニ遺伝子を作成し、HeLa細胞核抽出液を用いるin vitroスプライシング・アッセイ系を確立した。抗hnRNP C1/C2蛋白抗体の添加実験を行ったところ、SMN1ミニ遺伝子のスプライシング効率は低下したが、SMN2ミニ遺伝子のスプライシング効率は変化しなかった。このことは、hnRNP C1/C2がSMN1エクソン7スプライシングに特異的に関与していることを示している。4 (ペプチド核酸添加実験)SR蛋白と類似構造を有するペプチド核酸を合成し、前述のin vitroスプライシング・アッセイ系に添加したところ、SMN2ミニ遺伝子のスプライシング効率は著しく改善した。これは、SMA患者のSMN2遺伝子のスプライシング制御の可能性を示すものであり、SMAの治療法の開発につながるものである。脊髄性筋萎縮症(SMA)の責任遺伝子は染色体5q13領域に存在するSMN1遺伝子である。SMN2遺伝子はSMN1遺伝子とほとんど同一配列を有する相同遺伝子であるが、その主たる産物はエクソン7のないmRNAであるため、十分な機能を持たない。エクソン7がmRNAに取り込まれるか否かを決定する機構を解明することは、SMAの治療法の開発につながる。研究者らは、SMN1(もしくはSMN2)mRNA前駆体エクソン7の配列に特異的に結合するスプライシング関連蛋白を単離するために、SMN1(もしくはSMN2)エクソン7の塩基配列を有する各種蛍光RNAプローブとHeLa細胞核蛋白を結合させてゲルシフト解析を行った。この実験によって、SMN1mRNA前駆体に強く結合する蛋白と、その結合に必要なシス因子が同定できた。次いでSMN1型RNAプローブ特異的に結合した蛋白を分取し、質量分析法で分子種を同定したところ、hnRNP C1/C2蛋白であることが判明した。さらに、エクソン6、イントロン6、SMN1(もしくはSMN2)エクソン7の配列を有するミニ遺伝子を作成し、HeLa細胞核抽出液を用いるin vitroスプライシング・アッセイ系を確立した。RNAプローブに結合した蛋白がスプライシングに関与しているか否かを確認するために、シス因子の配列を持つRNAプローブを添加してアッセイを行ったところ、SMN1型ミニ遺伝子のみならず、SMN2型ミニ遺伝子のスプライシング効率も低下した。このことは、シス因子に結合する核蛋白のうち、hnRNP C1/C2以外のものもスプライシングに関与していることを示している。以上、SMN1mRNA前駆体に特異的に結合する核蛋白質を同定し、その結合に関与するシス因子がスプライシングに関与していることを示した.1 (SMN遺伝子エクソン)脊髄性筋萎縮症(SMA)の責任遺伝子はSMN1遺伝子である。

SMN2遺伝子はSMN1遺伝子とほとんど同一配列を有する相同遺伝子であるが、その主たる産物はエクソン7をスキップしたmRNAである。今回の研究の目的は、エクソン7がmRNAに取り込まれるスプライシング機構、取り込まれないスプライシング機構を解明することにある。2 (mRNA前駆体結合蛋白の単離・同定)研究者らは、SMN1(もしくはSMN2)mRNA前駆体エクソン7の配列に特異的に結合するスプライシング関連蛋白を単離するために、各種蛍光RNAプローブとHeLa細胞核蛋白を結合させてゲルシフト解析を行い、SMN1mRNA前駆体に強く結合する蛋白を得た。質量分析法で蛋白の分子種を同定したところ、hnRNP C1/C2蛋白であることが判明した。エクソン6、イントロン6、SMN1(もしくはSMN2)エクソン7の配列を有するミニ遺伝子を作成し、HeLa細胞核抽出液を用いるin vitroスプライシング・アッセイ系を確立した。抗hnRNP C1/C2蛋白抗体の添加実験を行ったところ、SMN1ミニ遺伝子のスプライシング効率は低下したが、SMN2ミニ遺伝子のスプライシング効率は変化しなかった。このことは、hnRNP C1/C2がSMN1エクソン7スプライシングに特異的に関与していることを示している。4 (ペプチド核酸添加実験)SR蛋白と類似構造を有するペプチド核酸を合成し、前述のin vitroスプライシング・アッセイ系に添加したところ、SMN2ミニ遺伝子のスプライシング効率は著しく改善した。これは、SMA患者のSMN2遺伝子のスプライシング制御の可能性を示すものであり、SMAの治療法の開発につながるものである。
小胞体から核への細胞内情報伝達機構の解析

分泌タンパク質や膜タンパク質の高次構造形成と品質管理の場である小胞体の機能に齟齬が生じ、小胞体内に高次構造の異常なタンパク質が蓄積すると、小胞体から核への細胞内情報伝達を伴う転写誘導機構Unfolded Protein Response(UPR)が活性化され、小胞体の恒常性が維持される。代表者は哺乳動物UPRに、ATF6経路とIRE1-XBP1経路が重要な役割を果たしていることを明らかにしてきた。ATF6は、プロテオリシスにより活性化される小胞体膜結合性転写因子である。一方、XBP1はIRE1依存的なmRNAスプライシングにより制御される転写因子である。ATF6とXBP1の活性化の時間差とDNA結合特異性の差を元に,異常タンパク質の小胞体内蓄積に対して哺乳動物は、内在性の小胞体シャペロンが対処する相(修復のみ)→ATF6経路によって転写誘導された小胞体シャペロンが対処する相(修復のみ)→IRE1-XBP1経路によって転写誘導された小胞体シャペロンと小胞体関連分解構成因子の両方が対処する相(修復と分解の両方)へと相を経時的に移行させながら巧妙かつ多段階的に対応していると提唱した。抗体産生に特化した形質細胞のように、タンパク質を大量に分泌する細胞では小胞体膜が拡充している。XBP1を過剰発現させると、小胞体膜の主成分であるフォスファチジルコリンやフォスファチジルエタノールアミンの合成量が亢進することを見いだし、XBP1がタンパク質の品質管理とオルガネラ形成の接点をなす重要な因子であることを明らかにした。小胞体内に高次構造の異常なタンパク質が蓄積すると、この情報は核へ伝えられて小胞体に存在する分子シャペロンや酵素をコードする遺伝子の転写が活性化され、誘導された小胞体シャペロンの作用により小胞体内の恒常性が維持される。哺乳動物ではこの転写誘導機構に、ATF6経路とIRE1-XBP1経路という2つの経路が関与していることを我々は明らかにしてきた。それぞれの経路に特異的な転写因子(活性型ATF6と活性型XBP1)のDNA認識様式の違いから、IRE1-XBP1経路が活性化されるとATF6経路では誘導されない遺伝子の転写が誘導され得る。このIRE1-XBP1経路に特異的な標的遺伝子を同定することは、小胞体におけるタンパク質の品質管理機構を理解する上で極めて重要と考えて検索した結果、EDEMという分子の転写誘導がATF6経路ではなくIRE1-XBP1経路により媒介されることを見いだした。EDEMは小胞体局在性の膜タンパク質で、小胞体において高次構造が異常になった糖タンパク質をユビキチン・プロテアソーム系を使って分解する過程に重要な働きをすることがすでに知られている。さらに、EDEMを転写誘導することができないIRE1ノックアウト細胞は、異常糖タンパク質を効率的に分解することができないことがわかった。上記の結果と、ATF6経路の主要な標的は小胞体シャペロンであること、並びに、活性化機構の違いからXBP1の方がATF6より遅れて活性化されることを考え併せて次の結論を導いた。小胞体内に高次構造の異常なタンパク質が蓄積すると、細胞はまずATF6を活性化してシャペロンを誘導し、異常タンパク質の巻き戻しを計る。それでは不十分な場合にはXBP1を活性化し、シャペロンを誘導して異常タンパク質の巻き戻しを計るとともにEDEMを誘導して異常タンパク質の分解を始める。このように哺乳動物の小胞体ストレス応答は階層制を有し、状況に応じて層を転移させていくことを初めて実証した。ATF6は、小胞体から核への細胞内情報伝達を担う小胞体膜結合性転写因子である。