hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨髄系細胞で内因性に産出される過酸化水素(H_2O_2)の生物学的役割

穎粒球や単球等の骨髄系の細胞では、過酸化水素H_2O_2の産生が他の細胞に比べて多く、殺菌などその役割は重要である。今回の研究では、ヒト前骨髄性白血病細胞株HL60とこの亜株でH_2O_2抵抗性のsubcloneであるHP100を用い、これら細胞のcharacterizationの比較と放射線、紫外線や腫瘍壊死因子(TNF)に対する感受性を検討した。HL60とHP100における抗酸化関連遺伝子の発現の比較では、HP100細胞にcatalaseの発現量が多いが、myeloperoxidase(MPO)、TNFは全く発現が見られず、glutathione peroxydase(GSH-PX)のレベルには差が認められなかった。これらの刺激に対する感受性をapoptosisについて調べたところ、HP100細胞はHL60と比較していずれの刺激にも抵抗性であった。この機序を調べるためにこれらの刺激後H_2O_2の産生を測定したところ、HL60細胞では放射線、紫外線TNFによりその産生が増加した。一方、HP100細胞では紫外線照射時のみその産生がみられた。また、遺伝子発現・転写因子の1つNFkBの活性化を調べたところ、HP100細胞はHL60細胞に比べactivityが高く、IRに対してはどちらの細胞もNFkBの活性化が認められたが、TNF,H_2O_2に対しては、HL60細胞のみが増加を示した。これらのことは、HP100細胞がこれらの刺激に対して抵抗性である機序には、H_2O_2直接以外の機構が存在することを示しており、現在検討中である。また、HL60、HP100におけるこれらの刺激により誘導されるapoptosisついてapoptosis関連遺伝子であるBC12、Baxのレベルを調べた。HP100細胞ではHL60細胞に比べて、BCl2の発現が高くBaxのレベルに差はなかった。これらの刺激に対しては、どちらの細胞もそのレベルに変化が見られず、これらの細胞における放射線、紫外線やTNFによるapoptosisは、BCl2/Baxに依存しないことも明らかにされた。顆粒球や単球等の骨髄系の細胞では,過酸化水素H2O2の産生が他の細胞に比べて多く、殺菌などその役割は重要である.今回の研究では、ヒト前骨髄性白血病細胞株HL60とこの亜株でH2O2抵抗性のsubc1oneであるHP100を用い、これら細胞のcharacterizationの比較と放射線、紫外線や腫瘍壊死因子(TNF)に対する感受性を検討した.HL60とHP100における抗酸化関連遺伝子の発現の比較では,HPl00細胞にcatalaseの発現量が多いが、mye1operoxidase(MPO)、TNFは全く発現が見られず、glutathione peroxydase(GSH-PX)のレベルには差が認められなかった.これらの刺激に対する感受性をapoptosisについて調べたところ,HPl00細胞はHL60と比較していずれの刺激にも抵抗性であった.この機序を調べるためにこれらの刺激後H2O2の産生を測定したところ、HL60細胞では放射線もしくは紫外線によりその産生が増加したが、TNFでは変化が見られなかった.一方、HP100細胞では紫外線照射時のみその産生がみられた.これらのことは,HP100細胞がこれらの刺激に対して抵抗性である機序には、H2O2直接以外の機構が存在することを示しており、現在検討中である。

また、HL60、HPl00におけるこれらの刺激により誘導されるapoptosisついてapoptosis関連遺伝子であるBCl2、Baxのレベルを調べた.HPl00細胞ではHL60細胞に比べて、BCl2の発現が高くBaxのレベルに差はなかった.これらの刺激に対しては、どちらの細胞もそのレベルに変化が見られず、これらの細胞における放射線、紫外線やTNFによるapoptosisは、BCl2/Baxに依存しないことも明らかにされた.顆粒球や単球等の骨髄系の細胞では、過酸化水素H_2O_2の産生が他の細胞に比べて多く、殺菌などその役割は重要である。今回の研究では、ヒト前骨髄性白血病細胞株HL60とこの亜株でH_2O_2抵抗性のsubcloneであるHP100を用い、これら細胞のcharacterizationの比較と放射線、紫外線や腫瘍壊死因子(TNF)に対する感受性を検討した。HL60とHP100における抗酸化関連遺伝子の発現の比較では、HP100細胞にcatalaseの発現量が多いが、myeloperoxidase(MPO)、TNFは全く発現が見られず、glutathione peroxydase(GSH-PX)のレベルには差が認められなかった。これらの刺激に対する感受性をapoptosisについて調べたところ、HP100細胞はHL60と比較していずれの刺激にも抵抗性であった。この機序を調べるためにこれらの刺激後H_2O_2の産生を測定したところ、HL60細胞では放射線、紫外線、TNFによりその産生が増加した。一方、HP100細胞では紫外線照射時のみその産生がみられた。また、遺伝子発現・転写因子の1つNFkBの活性化を調べたところ、HP100細胞はHL60細胞に比べactivityが高く、IRに対してはどちらの細胞もNFkBの活性化が認められたが、TNF,H_2O_2に対しては、HL60細胞のみが増加を示した。これらのことは、HP100細胞がこれらの刺激に対して抵抗性である機序には、H_2O_2直接以外の機構が存在することを示しており、現在検討中である。また、HL60、HP100におけるこれらの刺激により誘導されるapoptosisついてapoptosis関連遺伝子であるBC12、Baxのレベルを調べた。HP100細胞ではHL60細胞に比べて、BC12の発現が高くBaxのレベルに差はなかった。これらの刺激に対しては、どちらの細胞もそのレベルに変化が見られず、これらの細胞における放射線、紫外線やTNFによるapoptosisは、BC12/Baxに依存しないことも明らかにされた。
新規機能性多糖によるドラッグキャリアの開発

本研究は大環状多糖であるサイクロアミロース(CA)を基盤とした新規ドラッグキャリアの開発を目的とする。CAは生分解性の多糖であることや、水溶液中においてらせん構造を形成し、環状内部への物質包接能を有する特性より、バイオマテリアルとしての応用と高機能化が期待できる。本研究ではこれまでに、核酸のデリバリーシステムの構築を行ってきた。核酸や細胞と相互作用し得るようにCAにカチオン性基を修飾した(catCA)、およびcatCAに疎水基を部分的に導入したナノゲルがsiRNAおよびpDNAデリバリーキャリアとしての有用であることを報告した。しかしながら核酸の機能発現効率には課題があった。そこで本年度は、複合体のエンドソームから細胞質への移行促進機能の付与、すなわち、リン脂質分解酵素(ホスホリパーゼA_2,PLA_2を使用)と機能化CAを複合化させた新規ナノキャリアを設計し、機能化CAとPLA_2との複合化による遺伝子発現効率への効果について検討した。疎水基としてヘキサデシル基を導入したカチオン性CAナノゲル(C16-catCAナノゲル)はPLA_2と複合化し30-40nmの複合体ナノ粒子を形成した。これをpDNA(5.2kbp,ルシフェラーゼをコード)と混合し調製した複合体をサル腎臓細胞(COS7)にトランスフェクションした。その結果、PLA_2を複合化させた場合、PLA_2の複合化濃度上昇に伴い導入したpDNAの遺伝子発現効率が上昇した。一方、疎水基を導入していないcatCAとPLA_2との複合体についてはPLA_2添加による遺伝子発現に違いはなかった。またC16-catCAナノゲルと複合化したPLA_2は赤血球の溶血活性を維持していることを確認した。PLA_2の酵素反応により膜が一部破壊されることでpDNAのエンドソーム脱出が促進し、その結果遺伝子発現効率が上昇することが示唆された。キャリアと生体高分子(pDNAとPLA_2)を化学結合によらず分子間力を利用したシンプルな複合化法により細胞内へ同時にデリバリーし、かつpDNAの遺伝子発現効率が向上する新たな核酸キャリアが開発できた。本研究は大環状多糖であるサイクロアミロース(CA)のドラッグキャリアの開発を目的とする。CAは重合度9-数百に及ぶ環状グルコースである。生分解性を示すこと、水溶性が直鎖アミロースよりも高いこと、物質包接能を有する等の特徴が挙げられ、バイオマテリアルとしての応用展開が期待される材料である。本年度は機能化CAによるプラスミドDNA(pDNA)キャリアの開発を試みた。pDNAや細胞と相互作用させるために、カチオン性基としてspermineを修飾したCA(CA-spermine)を用いた。複合体のサイズおよびゼータ電位を動的光散乱光度計により測定したところ、CA-spermineとpDNAとの複合化比によってサイズ制御が可能であり、約250-300nmの正電荷を有する複合体粒子が調製できた。次に複合体をCOS7(サル腎臓由来細胞)に導入した。導入48時間後のpDNAの遺伝子の発現効率を評価したところ、直鎖アミロース-spermine/pDNA複合体に比べ有意に高い発現効率を示した。また、細胞内のエンドソーム脱出促進剤として知られる低分子薬剤との作用により遺伝子発現効率が向上し、高い発現効率を示すカチオン性ポリマーであるPEIに匹敵した。さらに、CAの分子量やspermine修飾率によって発現効率が異なり、複合体の物理化学的性質と遺伝子発現効率との関係が見出された。複合体導入細胞の毒性試験を行ったところ、高い遺伝子発現効率を示した条件で約90%以上の高い細胞生存率であった。以上のことから、CA-spermineは新規遺伝子キャリアとして機能することが明らかになった。また機能化CAはpDNAに限らずsiRNA等の種々の核酸キャリアとしての有用性も示唆され、核酸キャリアとしての応用展開において重要な知見が得られた。本研究は大環状多糖であるサイクロアミロース(CA)によるドラッグキャリアの開発を目的とする。CAは直鎖アミロースから生成されるα-1,4グルコースである。らせん構造を形成し環状内部への物質包接能を有すること、生分解性を示すことから、CAのバイオマテリアルとしての応用が期待できる。本研究ではこれまでに、機能化CA(カチオン性CA,catCA)がプラスミドDNAキャリアとして機能することを報告した。そこで本年度は、近年核酸医薬としての応用が注目されるsiRNAに着目し、機能化cAによるsiRNAデリバリーシステムの開発を目指した。カチオン性基としてスペルミンを修飾したCA(catCA)および、新たにcatCAに疎水基としてコレステリル基を導入した機能化CA(CH-catCA)を用いた。catCAおよびCH-catCAとも、21塩基対のsiRNAと相互作用し、約20-40nmの正電荷を有するナノ複合体粒子を形成した。この複合体をルシフェラーゼを恒常発現するマウス頭頸部癌細胞(SCC7-GL3)に導入し、複合体導入によるRNA干渉(RNAi)効果を検討した。その結果、catCAまたはCH-catCA/siGL3(ルシフェラーゼ発現抑制配列)複合体の導入24時間後において大きな毒性は示さず、かつ導入したsiRNAによるルシフェラーゼの発現抑制がみられた(siGL3終濃度:50nM)。また、コレステリル基を導入しナノゲル化させた(CH-catCA)はcatCAに比べて有意に発現抑制されることが分かった。

siRNAがCH-catCAナノゲルのマトリックス内に安定に複合化され、siRNAの酵素分解からの保護やキャリアからのリリース挙動に効果を及ぼしたと考えられる。さらに、機能化CAはsiRNAに限らず種々の機能性RNAデリバリーにも適用可能であることが示唆され、今後の応用展開が期待できる。本研究は大環状多糖であるサイクロアミロース(CA)を基盤とした新規ドラッグキャリアの開発を目的とする。CAは生分解性の多糖であることや、水溶液中においてらせん構造を形成し、環状内部への物質包接能を有する特性より、バイオマテリアルとしての応用と高機能化が期待できる。本研究ではこれまでに、核酸のデリバリーシステムの構築を行ってきた。核酸や細胞と相互作用し得るようにCAにカチオン性基を修飾した(catCA)、およびcatCAに疎水基を部分的に導入したナノゲルがsiRNAおよびpDNAデリバリーキャリアとしての有用であることを報告した。しかしながら核酸の機能発現効率には課題があった。そこで本年度は、複合体のエンドソームから細胞質への移行促進機能の付与、すなわち、リン脂質分解酵素(ホスホリパーゼA_2,PLA_2を使用)と機能化CAを複合化させた新規ナノキャリアを設計し、機能化CAとPLA_2との複合化による遺伝子発現効率への効果について検討した。疎水基としてヘキサデシル基を導入したカチオン性CAナノゲル(C16-catCAナノゲル)はPLA_2と複合化し30-40nmの複合体ナノ粒子を形成した。これをpDNA(5.2kbp,ルシフェラーゼをコード)と混合し調製した複合体をサル腎臓細胞(COS7)にトランスフェクションした。その結果、PLA_2を複合化させた場合、PLA_2の複合化濃度上昇に伴い導入したpDNAの遺伝子発現効率が上昇した。一方、疎水基を導入していないcatCAとPLA_2との複合体についてはPLA_2添加による遺伝子発現に違いはなかった。またC16-catCAナノゲルと複合化したPLA_2は赤血球の溶血活性を維持していることを確認した。PLA_2の酵素反応により膜が一部破壊されることでpDNAのエンドソーム脱出が促進し、その結果遺伝子発現効率が上昇することが示唆された。キャリアと生体高分子(pDNAとPLA_2)を化学結合によらず分子間力を利用したシンプルな複合化法により細胞内へ同時にデリバリーし、かつpDNAの遺伝子発現効率が向上する新たな核酸キャリアが開発できた。
軟体動物有肺類マルティドメインヘモグロビンの構造解析

本研究は,軟体動物有肺類インドヒラマキガイのヘモグロビン(Hb)の構造解析を目的としている。本種のHbの構成単位は,ほぼ10個のドメインが直列につながったマルティドメインポリペプチド鎖である。DNA塩基配列からの全構造解析に必要なオリゴヌクレオチドプローブ(プローブ)作成のため,まずペプチドの部分アミノ酸配列決定から始めた。1.native Hbをsubtilisin処理後Sephacryl S-200ゲル濾過によりモノドメイン画分を分離し,Mono Qイオン交換カラムでさらに純化を進め,1成分に関して20残基分のN末端アミノ酸配列を決定することができた。2.全組織からmRNAを抽出し,cDNA libraryを作成した。3.N末端側から111および1117のアミノ酸配列をもとに,2組のプローブIpglob-1,Ipglob-2を作成し,うちいずれかとベクタープライマーとを組み合わせてcDNA libraryからPCRによりHb cDNAのスクリーニングを試みた。その結果いくつかのサイズの異なるPCR産物が得られた。塩基配列を決定したところ,いずれもHbのものではなかった。4.本種Hbが同一ないし同様ドメインの繰り返し配列であることを想定してIpglob-1,Ipglob-2のそれぞれに対するantisenseプローブIpglob-1a, Ipglob-2aを作成し,プライマー組み合わせ1aと2,1と2aでPCRによるスクリーニングを試みた。その結果この方法ではPCR産物を得ることができなかった。5.ウサギ抗Hb抗体を作成し,この抗体でcDNA libraryのスクリーニングを試みたが特異的シグナルを得ることができなかった。6.今後1のsubtilisin分解ペプチドとは別に,大きな10ドメインペプチド鎖のN末端アミノ酸配列を決定し,その情報から作成したプローブにより3,4と同様にしてcDNA libraryからHb cDNAのスクリーニングを行う。本研究は,軟体動物有肺類インドヒラマキガイのマルティドメインヘモグロビン(Hb)の構造解析を目的としている。本種のHbの構成単位は,ほぼ10個のドメインより成る長いポリペプチド鎖であることが著者らの研究により既にわかっている。従来のタンパク質からの一次構造決定法では、このような長いポリペプチド鎖の構造解析は著しく困難な場合が多いため,DNA塩基配列からの解析の足がかりとなるペプチド断片を得ることから始めた。1.Hbを直接スブチリシン処理して大まかに切断し,ゲル濾過によりモノドメイン画分とオリゴドメイン画分を分離した。最も効率良くモノドメイン画分を分離できるゲル濾過担体の選択のためにSephacryl 100HR,200HR,300HRの3種類のプレパックカラムを試みたところ、Sephacryl 200HRが最も適していることがわかった。またドメイン分離の全体のパターンを見るには300HRが良いことがわかった。300HRカラムによりスブチリシン処理の最適なHb/酵素比条件、最適な処理時間を吟味したところ,22°C下で50/1200/1,2時間がモノドメイン画分の収率が最も高く、これ以上の時間延長はノンヘムペプチド断片を増やす結果となる。Sephacryl 200HR調製用カラムにより分離したモノドメイン画分のSoret/260nm光吸収比は2.8で,native Hbでの同比2.6に近かった。2.この画分は電気泳動で少なくとも10以上の成分に分離されたので,各成分の単離をMono Qイオン交換カラムを用いて試みたところ4つの成分が比較的純粋に単離された。3.4つの成分のうち純度の高い2つのN末端アミノ酸配列を決定、そのうちの1つについては20残基分のアミノ酸配列が決定できた。

4.その配列のうちで適当な部分を2箇所選び,それぞれに対応するオリゴヌクレオチドプローブを合成した。この合成プローブを以後のHbcDNAのスクリーニングに供する。本研究は,軟体動物有肺類インドヒラマキガイのヘモグロビン(Hb)の構造解析を目的としている。本種のHbの構成単位は,ほぼ10個のドメインが直列につながったマルティドメインポリペプチド鎖であることが既にわかっている。DNA塩基配列からの全構造解析に必要なオリゴヌクレオチドプローブ(プローブ)作成のため,まずペプチドの部分アミノ酸配列決定から始めた。1.native Hbをスブチリシン処理後Sephacryl 200HRゲル濾過によりモノドメイン画分を分離し,MonoQイオン交換カラムでさらに純化を進め,1成分について20残基分のN末端アミノ酸配列を決定することができた。2.全組織からmRNAを抽出し,cDNA libraryを作成した。3.N末端側から111および1117のアミノ酸配列をもとに,2組のプローブIpglob-1,Ipglob-2を作成し,うちいずれかとベクタープライマーとを組み合わせてcDNA libraryからPCRによりHb cDNAのスクリーニングを試みた。その結果いくつかのサイズの異なるPCR産物が得られた。4.本種Hbが同一ないし同様ドメインの繰り返し配列であることを想定してIpglob-1,Ipglob-2のそれぞれに対するantisenseプローブIpglob-la,Ipglob-2aを作成し,プライマー組み合わせlaと2,1と2aでPCRによるスクリーニングを試みた。その結果この方法ではPCR産物を得ることができなかった。5.ウサギを用いて抗Hb抗体を作成し,この抗体でcDNA libraryのスクリーニングを試みたが特異的シグナルを得ることができなかった。6.現在3で得たPCR産物について塩基配列を決定し,その真偽を確認中である。7.今後,1のスブチリシン分解ペプチドとは別に,大きな10ドメインペプチド鎖のN末端アミノ酸配列を決定し,その情報から作成したプローブにより3,4と同様にしてcDNA libraryからHb cDNAのスクリーニングを行う。
出芽酵母の胞子形成時におけるRNAエピジェネティクス

真核生物のmRNAには、いくつかの転写後修飾が含まれており、これらの修飾が転写後の遺伝子発現調節において重要な役割を演じている。我々は、出芽酵母の胞子形成時に出現するmRNA上のN6メチルアデノシン(m6A)修飾の役割を明らかにすることを目的とし、m6A部位の探索を行った。抗m6A抗体を用いた免疫沈降と次世代シークエンス解析を組み合わせたm6A-seqにより、約3,000遺伝子中に8,000か所以上のm6A候補領域を見出した。また、RNAの高感度質量分析法(RNA-MS)により、IME1 mRNA中にm6A修飾部位を特定した。しかしこの位置はm6A-seqでは確認できなかった。抗m6A抗体の特異性および免疫沈降の条件を検討するために、大腸菌のトータルRNAに対し、免疫沈降を行ったところ、37位にm6A修飾を持つtRNAValが特異的に沈降することを確認し、回収率や精製度から抗体量や洗浄の条件などの検討を行った。次に酵母SK1株を用いて、胞子形成を誘導後、m6A修飾酵素であるIME4の発現量が最大になる3時間後にtotal RNAを回収して、オリゴdTビーズによるpolyA(+)RNA画分の濃縮を二回行った。RNAの断片化の条件検討を行い、ポリアクリルアミドゲルで分離したのちに50-100塩基長のRNA断片を切り出し抽出した。ScriptSec v2 RNA-seq (Epicentre)を用い、Strand-specificなcDNAを作成した。cDNAの品質をバイオアナライザーで確認後、イルミナ社のシーケンサーで解析した(国立遺伝研の豊田敦先生との共同研究)。得られたリードをSK1のゲノムに張り付けたところ、リードの張り付き方にむらがあることが判明し、cDNAを再調製することになった。in vitroにおけるm6A修飾の再構成を行うために、メチル化酵素であるIme4pとそのパートナータンパク質であるMum2pおよびSlz1pの組換えタンパク質の発現と精製を行っている。さまざまなタグと発現系を検討したところ、SUMOタグを用いた大腸菌の発現系で可溶性が大幅に向上した。本研究では、出芽酵母の胞子形成時にのみ出現するmRNA上のm6A修飾の役割を明らかにすることを目的とし、m6A部位の探索を行う。胞子形成初期段階に特異的に増加するm6A修飾部位を網羅的に特定するために、抗m6A抗体を用いた免疫沈降法と次世代シークエンス解析を組み合わせたm6A-seqによる解析を行っている。実際に、feasibility studyにおいて、3,000遺伝子中に8,000か所以上のm6A候補領域を特定することに成功した。しかし、cDNAライブラリ調製の過程で転写産物の方向の情報が失われることや、解析した平均cDNA長が300塩基と長く検出したピークがブロードでありため、修飾部位の特定には至らなかった。より精度の高いデータを得るためには、RNAの断片化、免疫沈降、Strand-specificなcDNAライブラリの調製など、各ステップについて条件検討を行い最適化する必要がある。また本研究の過程において、市販されている抗m6A抗体の特異性が低いことが明らかとなった。今後は、より特異性の高い抗m6Aモノクローナル抗体の取得をめざし、m6A-seqを最適化する予定である。分子生物学Strand-specificなcDNA化が予想外に難航することが判明した。また、m6A-seqの解像度を向上させるためにはcDNAの平均長を短くすることが重要であるが、その際に生じるバイアスも結果に影響していると考えている。
脊髄空洞症発症に関わる髄内微小循環の解明と新たな治療法の開発

脊髄空洞症の成因に関して、実験的および臨床例での検討を行い、脊髄内の微小循環と組織間液の動態が重要な役割を果たしていることを確認した。脊髄空洞症では、組織間液の増大が空洞周囲の実質に存在し、中心管周囲から後索下部など、中央部から周囲へ拡大するように分布していた。これらの髄内浮腫は、治療による空洞の縮小とともに消失した。髄内の静脈系からの組織間液の吸収障害が、空洞形成の本態であると考えられた。脊髄空洞症モデルの作成:Sprague-Dawleyラットによる脊髄空洞症モデル作成のための基礎実験を行った。ラット脊髄の人工硬膜による全周性のクモ膜下腔ブロックは、脊髄の浮腫性変化(前空洞症性変化)とともに、重篤な脊髄機能の障害が発生することが明らかとなった。また、脊髄内薬物注入による空洞モデル作成と脊髄空洞完成後の空洞内溶液の動態研究のための、脊髄ならびに脳の定位固定装置の標準化を行った。ヒト脊髄空洞症の後方視的検討:キアリ奇形に合併する脊髄空洞症は、自然環境ではヒトと一部のdogにのみ発生するため、ラットモデルを作成するにあたり、ヒトのキアリ奇形に伴った脊髄空洞症の詳細な画像解析を行った。これは、当大学病院で治療を行った症例の後方視的検討である。結果として、キアリ1型奇形では従来報告されてきたような小脳扁桃の大孔部からの下垂のみならず、下部脳幹の下垂が合併すること、空洞の周囲には必ず組織間液の増大した浮腫性変化を伴うこと、中心管の拡大と灰白質への空洞の進展がみられることが明らかとなった。このようなヒトにおける脊髄空洞症の解析は、動物モデル作成における重要な基礎データとなり得る。研究成果の意義:現段階での成果からは、脊髄内の組織間液の増大、髄内の微小血液循環の障害による虚血、空洞発生による機械的圧迫が、本病態における脊髄機能障害に関与していることが推測される。また、最も頻度の高いキアリ奇形に伴った脊髄空洞症においても、脊髄組織間液の増大が病態生理の最初の段階に発生し、中心管の機能障害がさらに関与することが考えられた。脊髄空洞症の発生機序と症状発現機序はこれまで解明されておらず、本研究は基礎的な病態解明と治療手段の開発に貢献すると考える。ヒト脊髄空洞症の後方視的検討:キアリ奇形に伴う脊髄空洞症モデルの作成と分析を進めるため、ヒトにおける本疾患の分析を行った。これは、本疾患に対する適切な動物モデルはこれまで存在しなかったためである。臨床症例のMRI画像を用いて、ヒト脊髄空洞症における脊髄内の空洞の分布と、髄内の浮腫性変化の定量的解析を行った。その結果、空洞周囲、中心管周囲、脊髄後索下部に中心から末梢へ広がる形で浮腫(組織間液の増大)がほぼすべての症例で存在していた。これらは、脊髄背側静脈系のコンプライアンスの低下による組織間液の吸収障害が原因と考えられた。ラット脊髄空洞症モデル作成:C8-T1レベルのクリップ圧迫による脊髄の不全損傷とクモ膜下腔の癒着作成が髄内の微小血管系に与える影響について、微小血管造影および組織学位的検討を行った。脊髄後索下部には、細静脈を中心とした血管構造の破綻が観察された。研究成果の意義:脊髄空洞症の病態生理は、これまで髄液がどのようにして脊髄内に入るかという仮説・研究がなされてきた。しかし、本研究でのヒト脊髄空洞症の解析からは、脊髄空洞症に関して、まったく新しい発生機序が考えられた。ラットモデルを使用した病態の分析は、この病態機序を裏付けるものと考えられる。ヒト脊髄空洞症の成因の分析:自然環境で発生する脊髄空洞症は動物では極めて少なく、ヒトにおける脊髄空洞症の成因に関して、MRIによる分析を行った。キアリ1型奇形では、空洞周囲の脊髄実質に組織間液の増加があり、これは中心部の白質と灰白質に認められた。その髄内の分布より、中心管および髄内静脈からの吸収障害がその原因と考えられた。また、同様の浮腫性変化は、頚椎症性脊髄症にも認められた。灰白質とH質を主体とした組織間液の増大が約3%の症例にあり、白質内の静脈還流の局所的障害による脊髄血管関門の破綻が重要な役割を果たすと考えられた。さらに、脊髄周囲の髄液還流障害が浮腫性変化を増長させると考えられた。除圧術後には浮腫性変化は一時的増加がみられるが、これは圧迫レベルの頭側へ進展する傾向がみられた。これらは、脊髄における組織間液の流れが頭側へ向かう傾向があることを示している。ラットモデルでの検討:C8-T1レベルのクリップ圧迫によるラット脊髄損傷における髄内変化と微小血管損傷を組織学的に引き続き検討した。また、外傷による脊髄白質障害が脊髄伝導に及ぼす影響について、未梢神経刺激による脊髄誘発電位を用いて基礎的データを得た。

研究成果の意義:ヒトおよびラットの研究からは、脊髄内には髄内血管系が関与する血液循環の他に、組織間隙と中心管が関与する髄内組織間液の循環があり、これらは相互に密接に関与している。さらに組織間液は髄液と比較的自由な交通があり、髄液腔あるいは静脈系の還流障害は組織間液の増大、中心管の拡大、脊髄空洞への発展につながることがわかってきた。このような組織間液の循環障害が、どのような機序で白質伝導障害や灰白質での神経細胞障害につながるのかは今後の課題となる。
中枢の腸炎増悪因子を標的とした潰瘍性大腸炎治療薬の探索

潰瘍性大腸炎(UC)は活動期と緩解期を繰り返す難治性の病気であり、特定疾患に指定されている。また、現在の治療薬では根治は難しく、これまでにない作用機序を持った新規治療薬の開発が望まれている。近年、マクロファージに存在するα7型ニコチン性アセチルコリン受容体(α7nAChR)の刺激を介した抗炎症作用機序(Nature, 2003)が発見され、中枢神経系-迷走神経を介した抗炎症機序が注目されている。一方で、疫学的な研究からUC患者ではうつ病を合併するケースが報告されているが、末梢の炎症と中枢の疾患との因果関係、相互の影響については不明である。そこで本研究では、中枢神経系-迷走神経を介するコリン作動性抗炎症経路に着目し、UCと中枢神経系の関連の検討および新規UC治療薬の探索・検討を行っている。昨年度の本助成により我々は7日間プロトコールである急性期DSS腸炎モデル(代表的なUCの実験動物モデル)を用いて検討を行い、DSS腸炎を発症することにより、うつ症状を呈することを見出し、UCを発症すること自体がうつ病のリスク因子であることが示唆された。そこで本年度の本助成により、ヒトの病態により近い慢性DSS腸炎モデルを作成し、検討を行った。まず最初に、慢性DSS腸炎を惹起し、コントロール群に比べてうつ症状を呈するモデルを作成した(Tail suspension testで確認)。このような条件下において、脳内の細胞死(アポトーシス)に着目し、TUNEL染色を行った。その結果、コントロール群に比べ、慢性DSS腸炎を惹起した群では、海馬およびその周辺において、TUNEL陽性細胞(アポトーシスを起こしている細胞)が増加していることを見出した。このことから、慢性DSS腸炎モデルによるうつ症状において、脳内の細胞死が関与している可能性が示唆された。今後は、どのような細胞が細胞死を起こしているのか、また細胞死が起こるメカニズム(炎症性サイトカイン、モノアミンの関与)などについて、Real-time RT-PCR法などを用いて解析を行い、UCと中枢神経系の関連について引き続き検討を行う予定である。
「規格による統治」を通じた農業食料システムの変容：フランスを事例に

フランスにおいて、規格化に基づいたガバナンス手法が食品安全政策の他、地理的表示、有機認証、農村振興政策等で普及している。近年、量販店PB商品がますますテロワールを謳い、食品安全・環境にかかる独自の規格を増殖しつつある。本研究課題は、農業農村振興における規格による統治の普及と、地域の「資源としてのアイデンティティ」を構成している親密空間との相克が、いかなるイノベーションをもたらすかを、フランスの「テロワール」産品と地域食料システムの構築を事例に解明する。本研究が依拠する理論はフランスにおいて展開されている、L.テヴノーらのプラグマティック社会学を中心とし、アクターネットワーク理論を適宜活用する。
ヒトパピローマウイルスのローリングサークル型DNA複製の分子機構の解明

ヒトパピローマウイルス(HPV)のゲノムDNAの複製機構を明らかにする目的で、HPVの複製に影響を及ぼす宿主細胞のチロシンキナーゼを2つの方法で検索した。HPV E1タンパク質との試験管内での結合を指標として、上位10個のチロシンキナーゼを候補として得た。また、ペプチドのリン酸化を指標として、上位7個のチロシンキナーゼを候補として得た。現在、これらの候補キナーゼとの細胞内結合や、HPV DNA複製への影響を検討している。ヒトパピローマウイルス(HPV)のDNA複製には、θ構造型とローリングサークル(RC)型の2つの複製様式がある。RC型複製については、その分子機構と生理的意義は明らかにされていない。本研究ではまず、HPV DNAのRC型複製に必要な宿主細胞のタンパク質を同定し、その分子機構を明らかにすることを目的としている。申請者は既にRC型複製を検出する無細胞複製系を構築している。この系を用いると、HPV DNAは上皮細胞抽出液ではRC型で複製され、293胎児腎細胞抽出液ではθ構造型で複製される。当初、上皮細胞抽出液にはRC型複製を誘発する因子が存在すると考えていた。しかし、上皮細胞抽出液に293細胞抽出液を加えると、HPV DNAのRC型複製反応が阻害された。このことから、上皮細胞抽出液にはRC型複製を誘発する因子が存在するという可能性より、むしろ、293細胞抽出液にはRC型複製を阻害する因子が存在する可能性が新たに考えられた。(これらの結果は雑誌論文Genes to Cellsに発表した。)RC型複製反応では、複製装置が同じ鋳型DNA上を何周もしており、θ構造型複製との違いは、複製起点の反対側で複製装置がDNAから解離しないことであると考えられる。現在、293細胞抽出液から複製装置をDNAから解離させるような阻害因子の同定を試みている。また、HPV DNAの複製に必要であるHPVのE1、E2タンパク質が細胞内でどのような修飾をうけているか検討している。ヒトパピローマウイルス(HPV)のDNA複製様式は、宿主上皮細胞の分化によりθ構造型からローリングサークル(RC)型へと切換わる。本研究課題ではRC型複製機構の解明を目的としている。前年度の結果から、θ構造型様式でのHPV DNA複製時に、HPV DNAから複製装置を解離させるような阻害因子がHEK293細胞には存在し、その因子を制御することがRC型複製において重要であると考えられた。また、HPVがコードするE1ヘリケースは細胞の様々な複製因子と相互作用し、HPV複製機構を調節していることが知られている。そこで、E1ヘリケースと細胞の複製装置との相互作用に影響を及ぼすような16型E1タンパク質の修飾を検索した。まず、チロシンホスファターゼ阻害剤を用いて、HEK293細胞で過剰発現させたFLAG-E1のチロシンがリン酸化されていることを確認した。次に、FLAG-E1と結合するキナーゼを、小麦胚無細胞タンパク質合成法を用いて検索し、得られた候補キナーゼ(FRK, FES, TYK2, CSK, EphA3, EphA7INSR, HCK, Lynα)はいずれも、in vitroでE1をリン酸化することを確認した。また、チロシンキナーゼの基質ペプチドのスクリーニングにより、HEK293細胞で強制発現したFLAG-E1にはRet, EphA5, CSK-1-R, ZAP-70, Epo-R, toroponin T, cdk2をリン酸化するチロシンキナーゼが結合している可能性をみいだした。これらのキナーゼを、RNAi法を用いてHEK293細胞よりノックダウンし、E1のリン酸化やE1と細胞の複製因子との相互作用、およびHPV DNA複製様式の変化について検討を行っている。24年度が最終年度であるため、記入しない。
高In組成InGaNおよび高Al組成AlGaNの輻射・非輻射再結合過程の解明と制

高In組成InGaNについては,とくに半極性{11-22}面の利用を提案し,InGaN量子井戸における高い輻射再結合確立を実証した.さらに,この面を利用した青から赤色の発光ダイオードを試作した.また,評価装置として2本の独立したプローブを用いる近接場光学顕微鏡を開発し,InGaN量子井戸におけるキャリアダイナミクスを可視化した.高Al組成AlGaNについては,高品質な薄膜結晶をサファイア(0001)面上に作製するための結晶成長法を確立した.(0001)面から強い発光を得るための量子構造の設計指針を明らかにし,さらに,それを利用して,電子線励起によるAlGaN量子井戸からの高効率(最大40%),高出力(最大100mW)発光を深紫外域(240nm)で達成した.本研究は,高In組成InGaNおよび高Al組成AlGaNの輻射・非輻射再結合過程を時間・空間分解分光法によって解明し,局在中心などの発光局在中心の人為的導入やマクロ線欠陥やナノ点欠陥に起因した非発光中心を抑制するための知見を得ることを目標にしている。これまで,無極性・半極性基板や擬似格子整合基板の探索,三次元加工基板への再成長,界面制御や低温エピ成長技術などについて色々なアプローチが試みられている。そこで,申請者らが開発したマルチモード近接場光学顕微鏡技術を駆使して,上記手法によって作製された各試料のナノ空間における発光と非発光のダイナミクスを詳細に評価する。空間分解能として30nm,時間分解能として10psが可能であり,測定すべき波長域に対応した励起光源・光学素子・受光素子を整備することで,局在発光中心の量子構造や振動子強度,マクロ・ナノ欠陥の起源や密度および非輻射再結合中心の捕獲断面積に関する知見を得ることが可能となる。このことによって,最適な成長法や成長条件についてポジティブなフィードバックが加えられ,緑から赤外(0.51.8μm)や紫外(0.3μm以下)の窒化物半導体における未踏の波長領域において高効率発光・受光デバイスの実現に寄与するものと期待される。高In組成InGaNについては,とくに半極性{11-22}面の利用を提案し,InGaN量子井戸における高い輻射再結合確立を実証した.さらに,この面を利用した青から赤色の発光ダイオードを試作した.また,評価装置として2本の独立したプローブを用いる近接場光学顕微鏡を開発し,InGaN量子井戸におけるキャリアダイナミクスを可視化した.高Al組成AlGaNについては,高品質な薄膜結晶をサファイア(0001)面上に作製するための結晶成長法を確立した.(0001)面から強い発光を得るための量子構造の設計指針を明らかにし,さらに,それを利用して,電子線励起によるAlGaN量子井戸からの高効率(最大40%),高出力(最大100mW)発光を深紫外域(240nm)で達成した.本年度は,InGaN系ナノ構造における(1)結晶再成長技術による多波長発光制御,(2)半極性面マイクロファセットでの近接場光学分光,(3)半極性基板上への発光ダイオード(LED)作製と基礎物性評価について成果があった。具体的には,以下の通りである。(1)有機金属気相成長法(MOVPE)をベースとした結晶再成長技術を用いて複数の微小な結晶面(マイクロファセット)で構成された三次元的なGaNが形成し,その上に発光層となるInGaN/GaN量子井戸(QW)を結晶成長することで,白色を含む多彩な発光色を実現することを実証した。(2)半極性(11-22)面マイクロファセット上のInGaN/GaN QWからのフォトルミネッセンス(PL)を近接場光学顕微鏡(SNOM)を用いて評価した。その結果,従来の(0001)面QWと比較して,発光効率が可視全域において(11-22)面QWの方が優れていることを実証した。さらに,内部量子効率の最高値を与える波長が,(0001)面QWの460nmから(11-22)面QWでは520nmに長波長化しており,この波長域での室温内部量子効率が,50%に達していることを明らかにした。(3)GaN(11-22)バルク単結晶基板上に,MOVPEによってInGaN/GaN単一量子井戸(SQW)を発光層としたLEDを作製し,緑色発光波長域で比較的高い効率を得た。この(11-22)面基板上LEDは特徴的な偏光特性を示す。偏光は(11-22)面の結晶の形に由来しており,k・p法を用いて理論的に検討したところ,GaNでは強度偏光度0.56,InGaNではIn組成に依存するものの0.8以上の強度偏光度が見込めることが明らかになった。本年度は,InGaN系ナノ構造における(1)結晶再成長技術による多波長発光LED,(2)極性面LDの光利得測定,(3)半極性基板上量子井戸の誘導放出の基礎光物性について成果があった。(1)有機金属気相成長法(MOVPE)をベースとした結晶再成長技術を用いて複数の微小な結晶面(マイクロファセット)で構成された三次元的なGaNが形成し,蛍光体フリー多色発光LEDを作製した。

マイクロファセットの面積比や形を制御することで,色温度として400020000K程度の白色LEDを作成することに初めて成功した。(2)極性面上のInGaN量子井戸LDの光学利得スペクトルを400nm470nmにわたる広い波長範囲で実測した。さらに,この結果を量子閉じ込めシュタルク効果(QCSE)のクーロン遮蔽を考慮した計算結果と比較することで,470nmで発振するInリッチInGaN LDの光学遷移確率や光学利得がQCSEによって3割程度にまで抑制されていることを明らかとした。これらの知見から,非極性面上の結晶成長がInGaN LDの動作波長の長波長化に有利であることを実証した。(3)非極性面InGaN量子井戸LDの誘導放出を405475nmの波長範囲で観測し,その光学利得スペクトルにおいて異方性を伴った強い偏光特性を観測した。また,非極性面InGaNの光学利得を理論計算することに成功し,実験結果を説明する手法を確立した。(2)AlGaN/AlN量子井戸からの深紫外域高効率フォトルミネッセンス(PL)、(3)上記の深紫外PLの歪や量子効果依存性について成果があった。具体的には、以下の通りである。(1)有機金属気相成長(MOVPE)において、III族原料(TMAとTMG)とV族原料(NH3)の同時供給と交互供給を周期的に繰り返すModified MEE法を開発し、サファイア基板(0001)面上に高品質AlNおよびAlリッチAlGaNを成長した。AlNエピ膜,(膜厚: 600nm、基盤温度: 1200度)は原子レベルで平坦な表面を持ち、X線回折半値幅は(0002)対称ωスキャンで43秒、(10-12)非対称ωスキャンで250秒と非常に狭い線幅を示した。(2)高品質AlNエピ膜テンプレート上に高Al組成AlGaN/AlN量子井戸構造をコヒーレント成長し、220260nm域の深紫外域において室温PLを実現し、最高内部量子効率として約30%を実現した。(3)AlGaN/AlN量子井戸のAl組成を91%から69%と減少させたとき、Al組成82%において、偏光方向が[0001]軸平行から垂直にスイッチすることがわかった。これは、従来予想されていた臨界Al組成60%よりも大きい。この効果は、CHバンドの正孔の質量は, HHバンドのそれに比べて著しく軽く(0.26mO vs. 3.57mO)、AlGaN井戸に加わった三角ポテンシャル(自発分極による)による量子閉じ込め効果によって、バンドの入れ替わりが生じやすくなったために生じることが明らかにされた。本研究は,高In組成InGaNおよび高A1組成A1GaNの輻射・非輻射再結合過程を時間・空間分解分光法によって解明し,局在中心などの発光局在中心の人為的導入やマクロ線欠陥やナノ点欠陥に起因した非発光中心を抑制するための知見を得ることを目標にしている。近年,InGaN系の発光ダイオード(LED)では,高電流駆動させたときに,注入キャリア数に対して発光強度が線形に増加しなくなるという「Droop」現象と呼ばれる問題が,固体照明応用における高出力化の阻害要因として顕在化している。これまで,その原因として,(i)オージェ再結合,(ii)電子の活性層からのリーク,(iii)活性層でのホールの欠如,(iv)局在中心からのキャリアのリーク等が挙げられてきた。しかしながら,統一的な理解には至っていないのが現状である。そこで,平成21年度は,InGaN量子井戸活性層からのフォトルミネッセンス(PL)の強度や波長分布が,高キャリア注入時にどの様に変化するかに着目して,青色発光および緑色発光の試料について,近接場光学顕微鏡(SNOM)による詳細な評価を行った。
腸管免疫系の恒常性維持におけるレチノイン酸産生酵素の役割とその発現制御機構の解明

本研究課題において、マウス骨髄細胞から分化誘導した樹状細胞におけるレチノイン酸産生酵素RALDH2遺伝子の発現がGM-CSFにより誘導され、その誘導がレチノイン酸自身により増強されることを報告した。RALDH2遺伝子の発現制御領域はグアニン-シトシンに富むGCリッチ領域を形成しており、GM-CSFとレチノイン酸の作用は、このGCリッチ領域上における転写因子Sp1と、GCリッチ領域近傍のRA応答配列(Retinoic acid responding element:RARE)ハーフサイトに結合したRA受容体(RAR)/レチノイドX受容体(RXR)の相互作用によることを明らかにした。ビタミンAの代謝産物であるレチノイン酸(RA)は、腸管免疫系の恒常性維持に極めて重要な役割を果たしていることが明らかになっている。我々のグループは、腸間膜リンパ節に存在する樹状細胞(DC)の一部にビタミンAからRAを合成する酵素、retinal dehydrogenase 2(RALDH2)が特異的に発現していること、また、その発現に顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)やRA自身が重要な役割を果たしていることを報告したが、その発現制御機構の詳細は明らかではなかった。今回、RALDH2遺伝子の発現制御機構を検討するため、マウスRALDH2遺伝子のプロモーター領域近傍を解析した結果、CpG配列に富む遺伝子配列が存在することが判明したことから、RALDH2遺伝子の発現にCpG配列のメチル化によるエピジェネティックな制御機構が関与していることを想定し、研究を進めた。その結果、このCpG配列には転写因子Sp1が結合し、RALDH2遺伝子の転写活性を促進することを見出した。また、このCpG配列のin vitroにおけるメチル化により、Sp1の転写活性化は顕著に抑制された。しかしながら、RALDH2遺伝子を発現していないDCやT細胞などの正常細胞でも、このCpG配列のメチル化は観察されず、一部の細胞株でのみメチル化が観察されたことから、RALDH2遺伝子の特異的発現制御はメチル化以外の機構による制御であることが判明した。一方、このCpG配列に富む領域に、RA応答配列ハーフサイトが存在するのを発見し、実際に、この配列にRA受容体(RAR)/レチノイドX受容体(RXR)が結合し、RAに応答してRALDH2遺伝子の転写を活性化することを明らかにした。さらに、このRA応答配列ハーフサイトを介する転写活性はSp1と協調的に作用することを明らかにした。腸管免疫系の恒常性維持(T細胞の分化、ホーミング)にはビタミンAの代謝物であるレチノイン酸が極めて重要な役割を果たしている。我々は腸の組織に存在する樹状細胞(DC)の一部にビタミンAからレチノイン酸を産生する酵素Retinal dehydrogenase 2 (RALDH2)遺伝子を発現する特異的なサブセットが存在し、レチノイン酸を介してT細胞を小腸組織に特異的に配備させる能力を持つことを明らかにしているが、その特異的発現機構は不明であった。本研究では、RALDH2遺伝子のプロモーター領域にはCpG配列に富むCpGアイランドが存在することを見出し、このCpGアイランドのメチル化の状態が、特異的なサブセットにおけるRALDH2発現の要因になっている可能性を想定し、そのメチル化の状態を種々の細胞間で比較検討した。その結果、RALDH2遺伝子の特異的な発現におけるCpGイランドのメチル化の寄与は限定的であり、別の機構がRALDH2遺伝子の特異的な発現に関与していることが示唆された。一方、我々はDCにおけるRALDH2遺伝子の発現には顆粒球マクロファージ分化因子(GM-CSF)が主要な働きをしており、Toll-like receptor (TLR)シグナルやレチノイン酸自身が補助的な役割を果たしていることを明らかにしているが、その詳細な分子機構は不明であった。本研究では、RALDH2遺伝子のプロモーター領域に存在するCpG配列に転写因子Sp1がGM-CSFやTLR刺激に応答して結合することを見出した。またCpG配列に隣接した部位に、レチノイン酸受容体(RARα)の結合する配列が存在し、RARαが結合することを発見した。レポーターアッセイにより、これらの転写因子が、実際にALDH2遺伝子のプロモーター活性を亢進させることを確認した。腸の所属リンパ節に存在する樹状細胞(DC)の一部は、ビタミンAを代謝してレチノイン酸(RA)を合成する酵素retinal dehydrogenase 2(RALDH2)を特異的に発現し、産生されたRAは、腸における免疫反応の制御に極めて重要な働きをしていることが知られているが、樹状細胞におけるRALDH2遺伝子の発現制御機構は殆ど不明であった。本研究課題において、マウス骨髄細胞から分化誘導した樹状細胞におけるレチノイン酸産生酵素RALDH

2遺伝子の発現がGM-CSFにより誘導され、その誘導がレチノイン酸自身により増強されることを見出し、マウスRALDH2遺伝子のDNA配列を解析した結果、プロモーター領域近傍にCpGに富むCpG配列と、そのCpG配列中にRA応答配列(Retinoic acid responding element:RARE)ハーフサイトが存在することを見出した。このCpG配列には転写因子Sp1が結合し、RALDH2遺伝子の転写活性を促進した。また、RARアンタゴニストLE540やSp1の阻害剤であるMithramycin Aは樹状細胞におけるRALDH2の発現を顕著に阻害した。一方、RAREハーフサイトは、ヒト、マウスをはじめ広く種を超えて保存されており、実際、このRAREハーフサイトにRA受容体(RAR)/レチノイドX受容体(RXR)が結合すると、RA存在下、転写因子Sp1と協調してRALDH2遺伝子の転写を活性化することを明らかにした。免疫学生化学分子生物学RALDH2遺伝子の細胞特異的な発現は、当初予想したDNAメチル化による制御ではなく、それ以外のエピジェネティックな分子機構による制御であることが判明したが、マウスRALDH2遺伝子プロモーター領域の解析により、その発現に転写因子Sp1が関与すること、また、レチノイン酸応答配列ハーフサイトが存在するのを発見し、RALDH2遺伝子発現のレチノイン酸依存性の分子機構の一端を明らかにした。これらの成果をまとめ、原著論文として学術雑誌に発表した。RALDH2遺伝子の発現に関与する、転写因子の同定、活性化機構についてはおおむね順調に進展している。しかしながら、特定の樹状細胞にRALDH2遺伝子が発現する分子制御機構は、当初想定した、RALDH2遺伝子のプロモーター領域近傍に存在するCpGアイランドのメチル化の影響は限定的で、他の分子機構の存在が想定され、現在探索中である。前者の成果を中心に、後者の成果も含め、現在、論文の作製を進めている。正常マウスDCにおけるRALDH2遺伝子発現のDNAメチル化以外のエピジェネティックな制御機構を明らかにするため、RALDH2遺伝子プロモーター近傍を中心にヒストンのアセチル化やメチル化の状態を検討し、クロマチン構造の変化による遺伝子発現制御の可能性について検討する。さらに、これまでの研究で明らかになったRALDH2遺伝子発現に関与する転写因子の役割解明、DNAアレイ法による、RALDH2遺伝子発現制御に関与する転写因子の探索を計画している。樹状細胞におけるRALDH2遺伝子の特異的な発現の分子機構を明らかにするため、DNAメチル化以外のエピジェネティックな制御機構の可能性を探索する。具体的には、RALDH2遺伝子の調節領域におけるクロマチン構造の変化を検出し、ヒストンタンパク質のメチル化、アセチル化等の状態を比較検討することを計画している。また、既に明らかにしたSp1等の転写因子以外にRALDH2遺伝子発現に関与する転写因子、シグナル関連分子を探索するため、新たにDNAアレイを導入し、網羅的な解析を行うことを計画している。