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口蓋裂の骨欠損部への骨移植と咬合誘導に関する研究

結果は以下の通り。1)骨架橋形成が良好であったのは、60.9%,不良例は39.1%であった。2)骨架橋形成の良否には,裂型,年齢,および顎裂の大きさをという要因が係わっていた。しかし,性,および犬歯萌出の有無はこれには関与していなかった。3)骨架橋形成の良否に係わっていた3つの要因のうち,最も関連が深かった要因は裂型であった。すなわち,片側を口唇顎裂で骨架橋形成良好例が最も多く,ついで両側性口唇顎裂,さらに片側性口唇口蓋裂であり、両側性口唇口蓋裂で良好例が最も少なかった。2.術後2年および5年のX線写真があり,しかも術後5年の臨床所見がある症例を対象として,形成された骨架橋が変化するか否か,また,術後5年でどのような臨床上の問題があるかを検討した。1)形成された骨架橋には,術後5年でも変化は見られなかった。2)顎裂歯槽部歯肉に切れ込みのある例が47.6%であった。また,歯槽の高さが健常部よりも低い例が24.4%であった。3.術後4年を経過した口唇・口蓋裂成人例を対象として,二次骨移植を成人に適応した場合の予後と矯正治療上の問題について検討した。1)術後4年を経過しても移植骨の改造変化が完了していないものが30%余りあることが明らかとなった。2)移植骨部へ歯を移動して歯根吸収が認められた例があった。これには,顎裂に隣接する歯の歯周組織が術前すでに障害されていること,また,海綿骨細片が歯の移動に十分な程度顎裂に充填されていない上に,骨改造が遅いことが係わっていると考える。本年度に新たに得られた知見は、以下の通りである。1.骨移植後5年以上を経過し、咬合形成がほぼ終了した症例を対象とし、経時的に採得した石膏模型のモアレ写真を撮影して、骨移植後の歯槽堤の変化を観察した。その結果、術後矯正治療を行うことで、術前よりも歯槽堤の形態が改善し、良い場合の者のそれと類似した状態となった例、逆に矯正治療が進むにともなって形態が悪くなった例があることが判明した。前者では、顎製部で歯を隣接させて排列していた。一方、後者では、移植骨を被覆するのに類粘膜弁を使用している上に、顎製相当部には補綴物を装着する計画で、その部位の空隙を広げていた。2.8ないしは9歳で顎製への新鮮自家腸骨海綿骨細片移植を行い、長期観察ができた例を対象として、上顎骨の成長変化を見た。同じ時期に骨移植を行っても、上顎骨の成長が悪い例と良い例とがあった。これは、初回手術の影響の差と考えられ、骨移植の影響は小さいと言える。3.術前および術後1年でX線CTを撮影できた24症例について、骨架橋の3次元形態を把握した。それによれば、ほとんどの例で、骨架橋は、顎製近心側が細く、鼻腔側に十分高くは形成されていなかった。したがって、術式の改良を要する。すなわち、これまでよりも広い範囲にわたって顎製周囲の粘膜骨膜を剥離して、大きい移植母床を形成し、そこに移植骨を十分に充填する必要がある。また、中切歯の口蓋例にも骨欠損がある例では、ここにも海綿骨細片を移植しなければならない。4.過去20年間にわたって口唇・口蓋製に対して行われてきた手術の種類とその頻度を調査した。その結果、顎製への骨移植の頻度が次第に高くなり、昨年は、約半数を占めていたことが明かとなった。これは、顎製への新鮮自家腸骨海綿骨細片移植を行うことで咬合形成が容易となるので、咬合管理を行っているほぼすべての者に施行した結果である。
UBL3ケモテクノロジーによる、エクソソーム輸送に対するユビキチン関連分子の解析

がん転移などに関与しているエクソソームは、ほぼ全ての細胞種から細胞外に放出されるナノサイズの小胞であり、タンパク質やmiRNAを内包し標的細胞に再び取り込まれることで新たな細胞間コミュニケーションとして働く。しかし、特定タンパク質のエクソソームへの輸送機構の全容は不明であった。申請者は、ユビキチン様タンパク質(UBL3)が、新規翻訳後修飾を担うこと、この修飾がエクソソームへのタンパク質輸送を制御することを見出した(Ageta et al., Nature Commun 2018)。本研究では、UBL3を活用したケモテクノロジーにより、エクソソーム輸送に対するユビキチン関連分子の影響を精査する。
マメ科植物における水およびリン利用効率の遺伝的改良

(抄録なし)スリマンモハメドサアド博士は、平成24年11月に理化学研究所植物科学研究センター発現調節研究ユニットでの研究を開始しました。彼が従事している研究課題はMedicago truncatula(タルウマゴヤシ)およびGlycine max(ダイズ)においてリン欠乏が生長および根粒形成にもたらす影響です。窒素固定を効率的に行うマメの品種を開発することを最終的な研究目標としています。彼は前職での研究成果に加え、本研究ユニットにおいて新たな発見をしています。マメ科植物の生長を制限する主な環境ストレスは土壌中のリン(P)の欠乏です。博士の現在の研究目的は、リンが制限された土壌で育てられたMedicago truncatulaおよびMedicago sativa(ムラサキウマゴヤシ)の窒素固定の共生効率を比較し特徴づけることです。リン欠乏条件の下で、Medicago truncatulaは著しく高い窒素固定率を示しました。根粒での窒素固定は、Medicago sativaと比較しMedicago truncatulaにおいてはるかに高いことを発見しました。またMedicago sativaに比べ、Medicago truncatulaは根粒中のリンゴ酸塩量が増加していたことから、共生システムとリン欠乏条件下でのリンゴ酸塩増加能力の関連性が博士の研究から示唆されています。本研究は事前に計画された通り温室で2品種を使った実験を開始しました。現在までの結果は論文での発表が決定しています。今後の研究の推進方策リン欠乏条件下で育成したダイズの生理学的測定を行います。その後、マイクロアレイ分析を用いて網羅的遺伝子発現解析を行います。本研究成果は、水およびリンの利用効率上昇を可能にするための、重要な候補遺伝子(エリート遺伝子)同定に役立つと考えています。(抄録なし)
Gnotobioteを用いた根尖病巣の成因に関する細菌学的および免疫学的研究

1.無菌飼育ラットにBacteroidesを経口感染させ、その定着性について、嫌気グロ-ブボックスあるいはアネロレ-タ-を用いた嫌気性培養試験により検討を加えている。その際、最適な検出方法(釣菌方法、移送方法、培地の種類)を見い出し、システム化しようとしている。また、オクタロニ-法により、無菌ラットのBacteroidesに対する血中抗体価の上昇を調べている。2.無菌飼育ラット臼歯を露髄させ、歯冠歯髄腔にBacteroides浮遊液を貼付し、仮封を行う。一定期間後、屠殺し歯髄あるいは、根尖歯周組織の変化を病理組織学的に調べる。同様の実験を、経口投与したBacteroidesで感作された動物においても行う。この実験は、現在準備中である。以上の研究は、始まったばかりであるので、論文として発表できるような成果を得るには今しばらくの日月が必要である。
金属酸素の分子解離とX線構造解析

固体酸素の金属化や分子解離といった現象の解明は固体物性論や化学結合論の見地からだけでなく惑星科学の立場からも重要なテーマである。最近、高圧下95GPaで反射スペクトルにDrude型の金属的振る舞いが観測され、金属酸素の存在が確実になってきている。我々は高エネルギー物理学研究所(KEK)と欧州放射光研究所(ESRF)の高輝度放射光源を用い固体酸素の粉末X線回折実験を116GPaまで行い、金属化が報告されている圧力で構造転移を初めて観測した。観測された構造転移は単原子固体への分子解離において予想される構造変化としてはあまりにも小さく、この結果から新高圧金属相はまだ分子性がかなり強い、つまり、酸素分子:O_2像を残していることを提案した。また、この転移前後の高圧相の精密構造解析のために、KEK及びESRFで粉末回折の再実験、さらにO_2分子の伸縮振動(ビブロン)の圧力依存性の測定と分子解離の探索のために、高圧ラマン散乱の実験を110GPaまで行った。この実験からビブロンのピークが構造相転移に対応して検出できなくなること、格子フォノン(リブロン)もこの構造転移が完結する110GPaで消え、なんらの新しいラマンバンドも観測されなくなることを明らかにした。我々はこの結果からこの構造転移が金属化を伴うことを結論した。ビブロン波数は15GPaから94GPaまで直線的に増加し分子内結合が圧縮により強められる事が明らかになった。高圧側でソフトニングを起こすH_2、D_2、N_2と比べO_2の圧力依存性は特異で、この事はO_2の三重項状態を成す反結合電子π^*の非局在化に由来することを提案した。この研究で得られた結果は、固体酸素の新高圧相が分子間相互作用の働きにより新しい化学結合状態を創っていることを示唆するもので、この高圧相に新奇な電気磁気物性が予測られる。
船舶操船者のヒューマンエラーのモデル化について-ワークロードとパフォーマンス-

日本近海では、一年に700件の衝突・乗揚海難が発生しており、その殆どが操船者のヒューマンエラーによるものと裁定されている。現在、操船者のヒューマンエラー抑止に向けて、知能化機器、ジョイスティック操船装置等の操船を支援する機器類の導入が試みられているが、それらの有効性、どのような操船支援をすべきか等についての調査・研究はなされていない。また、操船者の労働環境とヒューマンエラーの因果関係についても、同様に、調査・研究の実績が無い。このような操船実態において、確率論等のマクロ的な安全性評価だけでは、適切なヒューマンエラー防止策を構想する事はできない。操船者の実施しなければならないミッション(任務)・タスク(仕事)、操船者のワークロード(肉体的・精神的負担)、操船者のパフォーマンス(遂行性能)等の関係を明らかにし、パフォーマンス低下がエラーを発生すると考える解析的なアプローチが必要と考える。本研究は、この考え方に基づき、海上事故の主因とされるヒューマンエラーに着目し、船舶操船者のヒューマンエラー発生メカニズムの解明とヒューマンエラーモデルの構築を試み、最終的に、ヒューマンエラーの効果的防止法の構想を目指したものである。3年に渡る研究により、当初計画した研究目的をほぼ満たす成果が得られたと考える。操船者ヒューマンエラーの発生メカニズムに関する調査・解析により、操船者ヒューマンエラーの基本的な構造モデルを開発する事ができた。また、調査・解析により得られた知見に基づき、有用で新しい操船者ヒューマンエラー防止策を提案するに至った。I.平成7年度研究実施状況(1)会議及び打合せ4回実施(2)実船実験(2-1)富山商船高専練習船若潮丸出入港実験3回実施(2-2)フェリー乗船観測実験1回実施(3)シミュレータ実験被験者2名計6回実施II.上記の具体的な討議,実験等に基づき,次記する内容の研究実績を得た。(1)操船者の生理的情報計測導入した多チャンネル生体情報ロガーにより,操船者の心拍数,皮膚電位等の計測を実船(練習船・フェリー)シミュレータで実施できた。(2)操船シミュレータ実験1995年11月に世界最新鋭の操船シミュレータを導入した。この操船シミュレータを用いて,操船者の制御解析,生理情報計測を実施できた。(3)操船者ヒューマンパフォーマンスモデルの推定実船及びシミュレータ実験,海難事故統計解析から操船者パフォーマンスを一航海に恒って表現できるモデルの原型を求めた。これらIIの(1),(2),(3)の成果を幾つかの学会等で発表(予定含む)する。(4)次年度以降研究計画の立案,修正結論(まとめ)平成7年度に計画された実験は全て実施され,ヒューマンエラーの原型モデルを構築された。又,成果を幾つかの学会に発表申請し,許可された。平成8年度の研究として,以下のものを実施した。(1)操船シミュレータの改良と操船シミュレータ実験リアスクリーンシステムへの改良に着手し,本校練習船船長と小型フェリー船長による操船シミュレータ実験を行なった。(2)操船者の生理情報計測他機関を含む6回程度の心拍数,血圧の計測を行ない,ストレスとの相関を調査した。(3)操船者のヒューマンエラーに基づく海難の解析海難統計資料と船会社へのアンケートから,ヒューマンエラーによる海難の動態別発生率を求めた。(4)操船者のパフォーマンスモデの構築(Performance=Ability/Task)方式で操船者のパフォーマンスが表現できるとした。パフォーマンスが低下した際に,エラーが発生する。パフォーマンスの低下はAbilityの低下又はTaskの困難度増が生み出すと促えた。このモデルの検証を実施している。以上(1)(4)について,4種以上の論文として発表した。本研究は海難の主因であるヒューマンエラーの効果的防止法の構想を目指し,ヒューマンエラーの整理とそのモデル化を試みたものである。

研究対象を内航貨物船及びその操船者の出港から入港・荷役までの一航海に絞り,各タスクにおけるワークロードに基づくパフォーマンス変動を表現するモデルの構築を最終目標とした。結果的には,最終的なヒューマンエラーモデル(確定的な)を得ることはできなかったが,ヒューマンパフォーマンスが次式で表現され,高Taskによるエラー(パフォーマンス低下),低Abilityによるエラーの2種が存在し,各エラーに対する対応策のあり方について,その方向性も示した。
Gas Hydrateを利用した気体の海底貯蔵に関する研究

本研究は水深6000m以上の海底に於ける天然地形を利用して高圧流体の貯蔵を行うことを最終目的とする基礎研究である。本研究では、第一歩としてCO_2・hydrate・水三相共存下でのhydrateの熱力学的物性と生成・分解速度を実測する。また電子顕微鏡察に基づき、hydrate結晶の成長機構を明らかにする目的で、水溶液からの溶質結晶構造を考察する。それらの結果を利用して、CO_2の海洋拡散に関するシュミレ-ションを行い、hydrate屋根の安定性と有効性を明らかにする。研究成果の概要(1)水溶液構造と結晶成長機構水溶液を重力場に長時間静置しておくと重力方向に密度勾配が生じることを実験的に確認した。この現象は溶液中に分子の凝集体が存在し、かつそれらが重力場でブラウン運動をしているとして説明できた。またUVスペクトルでも光の散乱が確認され、凍結しプリカの電子顕微鏡観察でも大きな凝集体が確認された。溶液の不均一性と同時に凝集体が結晶成長にどう係わっているのかを明らかにするのにはこれからの課題である。(2)hydrateの物性・反応・結晶成長新たに温度サイクル法と呼ぶ測定法を提案し、CO_2・hydrate・水三相共存状態での温度・圧力関係を実測した。同時にhydrate反応がCO_2濃度に関して擬一次反応として取り扱えることを確認した。hydrate結晶構造は、水溶液から成長した結晶と類似の二重構造であった。(3)hydrate膜の成長過程とシュミレ-ションこれらの結果を基に、貯蔵庫起ち上げにおけるhydrate屋根の生成機構をシュミレ-トした。hydrate分解によって生じるCO_2の拡散が仰制されることが示された。
線虫感染に対する植物免疫応答に関する研究

農業上、植物寄生性線虫の被害は極めて大きく、その防除は、農薬、輪作、抵抗性品種の利用が欠かせない。中でも抵抗性昂種の利用は経済的に極めて有効であり、環境保全防除技術としても優れている。将来、抵抗性誘導や抵抗性品種育成に有効となる基盤的知見を得ることを目的として、線虫に対する植物の抵抗性(免疫性)を詳細に解析することにした。材料は、最近発見した高度抵抗性トマト品種と感受性トマト品種を用い、それら品種の比較から抵抗性機構を明らかする。昨年までにマイクロアレイ解析および特徴的な防御関連遺伝子の発現とサリチル酸系とジャスモン酸系のPR遺伝子の発現を解析した。その結果、抵抗性品種ではサリチル酸(SA)系のシグナル伝達が強く関わっていることが推測された。今年度は、高度抵抗性品種が抵抗性遺伝子Hero-Aを持つことを突き止めた。次に感受性品種と抵抗性品種の線虫感染時の植物体内のSA量をGC-MSで定量した。すると、感受性品種と抵抗性品種は同じように線虫感染でSAを誘導していることが認められた。そこで植物体内のSAを分解するnahGトマトを用いて交配よって抵抗性遺伝子を持つが植物体内にSAが蓄積しないトマトを作成し、ジャガイモシストセンチュウを感染させたところ、抵抗性遺伝子があるにもかかわらず、SAが蓄積しないトマトは線虫が増殖して線虫感受性になった。この現象から考察して、線虫抵抗性遺伝子Hero-Aは、SAを強く要求することが明らかになり、さらに感受性品種において、線虫感染はSAのシグナル伝達をブロックするような作用があると強く示唆された。これは世界で初めて、線虫抵抗性とSAの関係を証明した事例であり、今後の線虫抵抗性植物有効利用に強く貢献できる成果となった。中でも抵抗性品種の利用は経済的に極めて有効であり、環境保全防除技術としても優れている。材料は、最近発見した高度抵抗性トマト品種と感受性トマト品種を用い、それら品種の比較から抵抗性機構を明らかにしていく。当該年度は、マイクロアレイ解析で、抵抗性と感受性を詳細に比較した。その結果、抵抗性品種では、線虫接種後、いわゆる植物の抵抗性に関わると考えられる多数の遺伝子がダイナミックに誘導されていることが明らかになった。興味深いことに、抵抗性品種では線虫感染後フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)やMYB関連遺伝子の誘導が起こるが、逆に感受性品種では、それら遺伝子の抑制が起こっており、感受性品種における線虫感染は植物の抵抗性反応を抑制しているようであった。次に植物の抵抗性に関連していると言われる、サリチル酸(SA)とジャスモン酸(JA)と線虫抵抗性の関係を探るため、SAとJAの遺伝子マーカーと使われるPR遺伝子の挙動を確認した。その結果、抵抗性品種はSA系のPR1が強く誘導する傾向にあり、感受性品種はJA系のPR6が強く誘導する傾向にあった。抵抗性品種ではSAシグナル伝達により誘導され、感受性品種では線虫感染がSAシグナル伝達を乱しているのではないかと推測している。
新規キラル光増感剤による立体選択的光誘起電子動及びエネルギー移動のダイナミクス

(1)キラルルテニウム(II)錯体、△-[Ru(menbpy)_3]^<2+>(menbpy=4,4'-bis{(1R,2S,5R)-(-)menthoxycarbonyl}-2,2'-bipyridine)、△-[Ru(phenebpy)_3]^<2+>(phenebpy=4,4'-bis(1-phenethylaminocarbonyl)-2,2'-bipyridine),キラル銅(I)錯体、[Cu(tmdcbpy)(PR_3)_2]^+(tmdcbpy=4,4',6,6'-tetramethyl-5,5'-bis(S)-(-)-l-phenylcarbamoyl-2,2'-bipyridine)を新たに合成した。(2)△-[Ru(menbpy)_3]^<2+>についてエタノール中、パルスラジオリシスを行ったところ、1電子還元体が生成した。これはRu(I)錯体ではなく、配位子のmenbpyのアニオンラジカルのRu(II)錯体であることが、過渡吸収スペクトルより明かとなった。△-[Ru(menbpy)_3]^+による[Co(acac)_3]の立体選択的還元反応を行ったところ、選択性は2.7(∧体優先)であった。(3)[Cu(tmdcbpy)(PPh_3)_2]^+は近紫外光照射下で[Co(edta)]^-の立体選択的光還元反応をこれまでに無い高い選択性で行うことに成功した。特に後者では、転化率10%時でエナンチオマー過剰率は60%に達した。しかし、△-[Ru(menbpy)_3]^<2+>は[Co(edta)]^-の還元反応は行わなかった。(4)[Ru(bpy)_3]^<2+>によるカチオン性メチルビオローゲン、アニオン性ビオローゲン誘導体、4,4'-bis(3-carboxyethyl)-1,1'-bipyridinium(dcbpyと略称)、の光還元反応を行ったところ、dcbpyの還元は速やかに行われ、静電効果が電子移動に大きく影響していることが示された。(5)この反応をマーカス理論に従って解析し、電子カップリング項H_<rp>が電子移動速度の相違に影響していることを明かにした。(6)△-[Ru(menbpy)_3]^<2+>により[Co(acac)_3]の逆ラセミ化反応がアセトニトリル-水中、塩基存在下、可視光照射下で進行した。この反応は[Ru(menbpy)_3]^<2+>の励起状態の[Co(acac)_3]による酸化的消光により進行することを明かにした。(7)分子力場計算から[Co(acac)_3]は[Ru(bpy)_3]^<2+>へC_<3V>軸に沿って接近することが示された。(5)この反応をマーカス理論に従って解析し、電子カップリング項

H_<rp>が電子移動速度の相違に影響していることを明かにした。(6)△-[Ru(menbpy)_3]^<2+>により[Co(acac)_3]の逆ラセミ化反応がアセトニトリル-水中、塩基存在下、可視光照射下で進行した。この反応は[Ru(menbpy)_3]^<2+>の励起状態の[Co(acac)_3]による酸化的消光により進行することを明かにした。(7)分子力場計算から[Co(acac)_3]は[Ru(bpy)_3]^<2+>へC_<3V>軸に沿って接近することが示された。4,4′-ジカルボキシ-2,2′-ビピリジンに光学活性な1ーメントールをエステル結合で導入することにより光学活性な2,2′-ビピリジン配位子を合成し、そのルテニウム(II)ビピリジン誘導体,[Ru(menbpy)_3]^<2+>を得ることに成功した。この錯体は可視域にモル吸収係数の大きなMLCT(Metal to Ligand Charge Transfer)を持ち、その三重項励起状態の寿命が長く、しかも、励起状態酸化還元電位は-0.7V(vs.SCE)であり、光化学反応の検討に適した優れた光増感剤であることを確かめた。この光増感剤を用いて、[Co(acac)_3]及び[Co(edta)]^-の立体選択的光化学的還元反応を行い、そのダイナミクスを検討した。(1)(1)[Ru(menbpy)_3]^<2+>を光増感剤に用いた場合、[Co(acac)_3]はエタノール/水混合溶媒、アセトニトリル/水中いずれも効率良く還元された。いずれの還元でもΔ-[Co(acac)_3]が優先的に還元され、光化学的に反応例の稀な立体選択的な還元反応の進行が認められた。(2)[Ru(menbpy)_3]^<2+>をパルスラジオリシスにより還元した1電子還元体[Ru(menbpy)_3]^+を始めて生成させ、その過渡吸収を測定することに成功した。(3)その電子状態は不対電子がmenbpy上に局在しているRu(II)錯体であることを明かにした。(4)[Ru(menbpy)_3]^+による[Co(acac)_3]の還元も立体選択的に進行することを明かにした。(5)[Ru(menbpy)_3]^<2+>の消光過程の立体選択性とパルスラジオリシスにより生成した[Ru(menbpy)_3]^+による反応の選択性は大きく異なり、前者の反応にはエネルギー移動が含まれていることが示唆された。光学活性置換基を有する2,2'-ビピリジンを持つキラル銅(I)錯体を新しく合成し、分子不斉を有する各種コバルト(III)錯体の光還元反応を行った。[Co(edta)]^-はΛ-体優先で立体選択的に還元反応が進行した。enantiomer excess(e.e.)はメタノール/水中、5°Cでは66%に到達し、これまでにない高い選択性が得られた。これは、この種の反応では最高に近い値である。更に、DMSO中で還元反応を試みたところ、反応は全く進行しないにもかかわらずΛ-[Co(edta)]^-に対応するCDスペクトルが観測された。これは、光照射によりderacemization(ラセミ体から光学活性化合物が生成する)が進行していることを示している。この反応は極めて稀なものであり、遷移金属光増感剤の応用として興味深い。更にこの反応を利用して、CoX_2(X=OAc,Cl,or NO_3)とL_4edta (L=H or Na)から[Co(edta)]^-の不斉光合成反応に成功した。
ニューロンにおけるゲノム増幅機構の解明

軟体動物腹足類の脳には、巨大なニューロンが多数存在し、それらのゲノムDNAは大幅に増幅(倍数化)していることが知られている。こういったDNAの倍数化は、体の成長や肥満に伴って、ニューロンがより広い領域を神経支配できるようにするために起こっている適応的な応答であると考えられている。本研究では、腹足類の一種であるナメクジを用い、(1)脳のニューロンがどのように自身のDNA増幅の必要性を感知しているのか、(2)DNA全体が倍数化した結果、そこから読み出されて作られるmRNAの量についても一様に増加するのか?、という2つの問題について明らかにした。ナメクジを含む、軟体動物腹足類本研究課題の目標は、(1)DNA増幅に対する神経投射の必要性の有無の決定、(2)DNA増幅の可逆性の有無の決定、および(3)DNA増幅を引き起こす因子の同定、の3つである。H25年度は、このうち主として(1)の課題に取り組んだ。飽食状態で体が成長しつつある状態のとき、自身の体が大きくなっていることを、脳のニューロンがどのように感知しているのであろうか?研究代表者は、次の2つの可能性を考えた。(A)脳の周囲の液性環境中に含まれる、栄養状態を反映するような因子(グルコースやインシュリンなど)に対してニューロンが直接的に反応し、自身のDNAを増幅させている、(B)運動ニューロンや感覚ニューロンなどが、大きくなりつつある末梢臓器への神経投射を介して、そこから何らかの逆行性シグナルを受け取ることでDNA増幅を起こしている、という2つの可能性である。これら(A)、(B)の可能性を調べるため、研究代表者らは「脳まるごと移植法」を利用した。ここでは、ナメクジ個体から摘出した脳を他の個体の体腔内に移植し、ホスト側のナメクジを飽食状態にして太らせた際に、移植脳でもDNA増幅の頻度が亢進するかどうかを調べた。つまり、もし(A)のように、脳の周囲の液性環境のみでDNA増幅が引き起こされるのであれば、栄養状態の良いホストの体腔に移植された場合は、移植脳においてもDNA増幅の頻度が高くなることが予想される。しかし、もしニューロンのDNA増幅に臓器などへの神経投射が必要なのであれば、移植脳では変化が無く、ホスト脳のみでDNA増幅が亢進することが予想される。果たして実験の結果、移植脳におけるDNA増幅の頻度はホストの栄養状態と無関係であることが分かった。したがって、DNA増幅の亢進には末梢臓器への投射が必要であることが示唆された。本年度は、ニューロンのゲノム倍数化に伴い、そこから転写されてできるRNA産物の量が、果たしてゲノムと同じように一様に増えているのか?という問題に取り組んだ。ナメクジ等の軟体動物腹足類の脳では、成長に応じてニューロンのゲノムが一様に増幅することが知られている(Yamagishi et al. 2012)。この際、転写産物も一様に増えるのかどうかを知るためには、単一のニューロンでのRNA発現プロファイルを調べるか、あるいはまったく同じpopulationのニューロン群で発現する複数の遺伝子の発現量を調べることが必要である。本年度、代表者らは偶然にも、ニューロペプチドをコードする2種類の遺伝子であるnuf (neuropeptide up-regulated in the fatslug)と、lyc (light-yellow cell peptide)が、右のparietal ganglioの同じニューロン集団で発現することを見出した。そして、nufのmRNAはナメクジの成長に伴って発現量が増加するのに対し、lycのmRNAは減少することを見出だした。これはつまり、倍数化したニューロンから発現する産物が、その種類によってそれぞれに異なる転写制御、あるいは転写後制御を受けていることを意味する。引き続き現在、ナメクジの脳に存在する巨大ニューロンVGC (visceral giant cell)のみを用いたスクリーニングを行い、成長を促進したナメクジのVGCと抑制したナメクジのVGCとの間で、それぞれの細胞における相対発現量が大きく変化するような遺伝子産物がないかを探索している。ナメクジやアメフラシなど、軟体動物腹足類の中枢神経系には、巨大なニューロンが多く存在する。申請者らはこれまでに、ニューロンのDNA増幅が体の成長、肥満により促進され、同時にニューロンのサイズそのものも大きくなること見出している。さらにDNA増幅の結果、ある種の転写産物の増加も認めている。また、DNAの増幅は、ゲノム全体の一様な増幅(つまり倍数化)であることも示している。しかしながら、DNAを倍数化させて物質合成を高めることの必要性を、ニューロンがどのように感知しているのか、および倍数化の結果、あらゆる転写産物が一様に増えるのかどうかも明らかではなかった。そこで本研究では、摘出した脳を他個体の体腔に移植する「脳まるごと移植技術」を用いて、投射先を持たない移植脳はホストナメクジの栄養状態にかかわらず一定のレベルのDNA増幅しか起こさないことを示すことで、投射先からのフィードバック情報によりDNA増幅に結び付けていることを示唆する結果を得た。さらに、内在性の脳において手術により神経投射を切断すると、切断された側の脳にあるニューロンでDNA増幅の頻度が低下したことからも、DNA増幅には末梢臓器への投射が必要であることが分かった(Matsuo et al. 2013)。次に代表者らは、全く同じ大型のニューロン群で発現する2種類のニューロペプチド遺伝子を同定した。

そして、これらのmRNA量が、ナメクジの肥満に伴い一方は増加を、他方は減少するということを見出した。つまり、同一のニューロンにおいて、倍数化に合わせて発現量が増える遺伝子と減少する遺伝子が存在することが明らかになった。このことは、鋳型DNAが倍数化により一斉に増えても、そこから読みだされる転写産物の量は個々に厳密に制御されているということが示唆された(Nakamura and Matsuo、投稿中)。軟体動物腹足類の脳には、巨大なニューロンが多数存在し、それらのゲノムDNAは大幅に増幅(倍数化)していることが知られている。こういったDNAの倍数化は、体の成長や肥満に伴って、ニューロンがより広い領域を神経支配できるようにするために起こっている適応的な応答であると考えられている。本研究では、腹足類の一種であるナメクジを用い、(1)脳のニューロンがどのように自身のDNA増幅の必要性を感知しているのか、(2)DNA全体が倍数化した結果、そこから読み出されて作られるmRNAの量についても一様に増加するのか?、という2つの問題について明らかにした。ニューロンに倍数化を引き起こす、神経投射先の臓器からのシグナル分子の同定については予定より遅れているものの、倍数化したニューロンにおける転写後調節機構の存在を示唆するデータが得られたことは幸運であった。分子神経生物学本年度、東京大学新領域創成科学研究科・鈴木穣教授らの協力(新学術領域研究「ゲノム支援」、H26)を得たので、VGCにおいて特徴的な発現変化を示す遺伝子の同定・解析の結果も含めた形で論文にまとめたい。特に、倍数化したひとつのニューロンにおいて、発現量が増加するもの、減少するものの両方が存在するらしいことが明らかになりつつある。この点について詳細な解析を進めたい。本研究課題の目標は、上述の通り(1)DNA増幅に対する神経投射の必要性の有無、(2)DNA増幅の可逆性の有無、(3)DNA増幅を引き起こす因子の同定、の3つであるが、H25年度はこのうち(1)を完了し、(2)の一部を実施した。(3)については現在、関連候補遺伝子をRNAseq等を利用してスクリーニングを進めているところである。このため、概ね予定通りの進捗であると言える。「物品費」および「その他」については、民間財団からの資金調達に成功したため、共通して使用できる物品について、そちらから賄うことができた。「旅費」および「謝金」については概ね計画通りの金額を使用した。H26年度、H27年度は、現在スクリーニング中である、肥満に伴って末梢臓器および脳で発現増強される遺伝子の同定と単離、およびそれらの発現解析を進める予定である。また、テーマ(2)の、DNA増幅の可逆性については、H25年度に観察された脳内total DNA量の減少がグリア細胞やミトコンドリアの減少によるものである可能性を検討する予定である。さらに、体壁などの末梢臓器で発現している遺伝子の中に、神経栄養因子のファミリーに属するものがないかも検索する予定である。最終年度であるH27年度は、海外での発表や論文投稿にかかる費用が見込まれるため、昨年度よりも支出額が増えることが見込まれる。
日本人の基礎的動きの標準値およびデータベースの構築

本研究では,Aeら(2007)の方法により,成人の前転,後転,走,立幅跳,遠投,捕球動作,プレースキック動作,ハンドドリブルの標準動作を作成してデータベースを構築し,標準動作モデルの配信システムを開発した.また,幼児については,前転,走,立幅跳の3種類,小学校2年生および4年生については,前転,後転,走,け伸びおよびバタ足,遠投,プレースキック動作の7種類の基礎的動きの標準動作を作成した.本研究の結果から,標準動作を基準にして動作変動度などを検討することによって,動作を指導する際の着目点の抽出が行えることがわかった.本研究では,Aeら(2007)の方法により,成人の前転,後転,走,立幅跳,遠投,捕球動作,プレースキック動作,ハンドドリブルの標準動作を作成してデータベースを構築し,標準動作モデルの配信システムを開発した.また,幼児については,前転,走,立幅跳の3種類,小学校2年生および4年生については,前転,後転,走,け伸びおよびバタ足,遠投,プレースキック動作の7種類の基礎的動きの標準動作を作成した.本研究の結果から,標準動作を基準にして動作変動度などを検討することによって,動作を指導する際の着目点の抽出が行えることがわかった.本研究の目的は,日本人の基礎的動きの標準値(標準動作)をバイオメカニクス的方法により作成するとともに,評価や指導のための観点や動作の要点を明らかにし,標準動作のデータベースを構築することである.そのため,成人男女については,10種の基礎的動き(前転,後転,走動作(全速疾走),立ち幅跳び,走り幅跳び,水泳のけ伸びおよび浮き身,遠投,捕球動作,プレースキック,ボールドリブル)の,幼少年(一部)については前転,後転,立幅跳のバイオメカニクス的データを収集し,標準動作を作成する.本年度(初年度)には,幼少年および成人の基礎的動きのデータ収集を以下のように行った.1)幼児の動作:幼稚園児68名を対象に,20m走,立幅跳,ゆりかご立ち(3歳児),前転(4,5歳児)の4動作をVTR撮影した.2)小学生児童の動作:小学生男女16年生230名を対象に,50m走,立幅跳,前転,後転の4動作をVTR撮影した.3)成人の動作:1925歳の男子成人(体育専攻の学生および大学院生)35名を対象に,前転,後転,立幅跳,走動作,ドリブル,捕球,遠投,プレースキックの8動作データをViconを用いて収集した.また,け伸び,バタ足については,予備撮影を行った.現在,得られたVTR画像についてはデジタイズしたり,Viconデータについては3次元座標に変換しているところである.また,本研究で用いる標準動作の作成,およびそれを用いた動作の評価法についても研究を進め,その正課の一部を「体育の科学」(2009年5月および2010年3月)に発表した.本研究の目的は、日本人の基礎的動さから主要な10種を選択し、その標準値(標準動作)をバイオメカニクス的方法により作成するとともに、評価や指導のための観点や動作の要点を明らかにし、標準動作のデータベースを構築することである。本年度は、昨年度と同様に、幼少年および成人に関する動作データの収集を継続するとともに、成人男女について8種の基礎的動き(前転、後転、走動作、立ち幅跳び、遠投、捕球動作、プレースキック、ボールドリブル)の標準動作を作成することとした。概要は下記のとおりである。1)成人の動作:1925歳の女子成人(体育専攻の学生および大学院生)35名を対象に、前転、後転、立幅跳、走動作、ドリブル、捕球、遠投、プレースキックの8動作のデータをViconを用いて収集した。そして、昨年度に収集した成人男子31名のデータとともに、Ae et al.(2007)の方法によりこれらの基礎的動きの標準動作を作成した。2)小学生の動作:男女小学校16年生(各学年男子1530名,女子1525名で総数230名)について、前転、後転、50m走、立ち幅跳びの動きをビデオ撮影した。現在、これらのデジタイズを行っているところである。3)幼児:幼稚園児73名(3歳児22名、4歳児25名、5歳児26名)を対象として、20m走、立幅跳、ゆりかご立ち(3歳児のみ)、前転(4,5歳児のみ)の動きをビデオ撮影した。4)成人のハンドドリブルを例にして、上位者と下位者の比較、動作の評価法の検討などを行った。その結果、標準動作モデルを用いることにより技能(動き)の相違が明確に示せることがわかった。しかし、評価や指導の観点を明らかにする手がかりとして用いた変動係数については、ゼロ除算問題を解決するために修正変動係数(標準偏差/(平均+C)*100)などを考案したが、適切に評価できない測定変数があり、今後新しい係数を導入する必要があることがわかった。本研究の目的は、日本人の基礎的動きから主要な10種を選択し、その標準値(標準動作)をバイオメカニクス的方法により作成するとともに、評価や指導のための観点や動作の要点を明らかにし、標準動作のデータベースを構築することである。本年度は、幼少年に関する動作データの収集を中心に行うとともに、成人男女について8種の基礎的動き(前転、後転、走動作、立ち幅跳び、遠投、捕球動作、プレースキック、ボールドリプル)の標準動作を作成することとした。

1)成人男女の標準動作の作成:平成22年度および今年度に収集した男女成人(体育専攻の学生および大学院生、男子31名、女子35名)について、前転、後転、立幅跳、走動作、ドリブル、捕球、遠投、プレースキックの基礎的動きの標準動作をAe et al.(2007)の方法により作成した。2)小学生の動作:男女小学校2および4年生(2年生:計74名、男子37名、女子27名、4年生:計75名、男子36名、女子39名)について、遠投動作およびプレースキック動作を2台の高速度カメラを用いて撮影し、DLT法により3次元分析した。3)昨年度にビデオ撮影した園児73名(3歳児22名、4歳児25名、5歳児26名)を対象として、20m走、立幅跳、ゆりかご立ち(3歳児のみ)、前転(4,5歳児のみ)のデジタイズなどの動作分析を行った。4)昨年度に課題として残されていた「動作変動度算出の際のゼロ除算問題」について、様々な係数を検討した結果、二乗平均平方(Root Mean Square,RMS)を用いて動作変動度(SD/RMS*100)を算出することにより、ゼロ除算問題を解決できることがわかった。5)2)で収集した遠投動作およびプレースキック動作に関する成果の一部を国際スポーツバイオメカニクス学会大会(2012年7月)において発表することになった(2012年3月採択)。平成24年度(最終年度)には、体育授業等において動きの指導が適切に行えるように教員が標準動作モデルのデータを取得できるデータベースを構築し、標準動作モデルデータを配信できるシステム(以下、標準動作配信システム)の開発を行うことを最終的な目的とした。最終的には、成人男女(男子31名、女子35名、前転、後転、走動作、立ち幅跳び、遠投、捕球動作、プレースキック、ボールドリブル)、小学生の動作:男女小学2および4年生(計76名、前転、後転、遠投、プレースキック、けのび、バタ足)、園児(2148名、20m走、立幅跳、前転)の動作データを収集することができた。開発した標準動作配信システムは、Aeら(2007)の方法で作成した基礎的動きの標準動作モデルを、座標データおよびスティックピクチャーの形でデータベース化し、必要に応じて静止画スティックピクチャー、動画スティックピクチャー、VTR比較データなどでインターネットで配信し、標準動作モデルと学習者のVTRと比較したりなどして、基礎的動きの評価や指導に活用しようとするものである。平成25年6月には筑波大学バイオメカニクス研究室に設置したサーバーを用いて試行的運用を開始する予定である。標準動作配信システムの機能は以下のようなものである。1)標準動作の静止画像(電子ファイル(PDF)としてダウンロード可能)、2)標準動作の動画、スティックピクチャーを動画で配信したり、ダウンロードして再生可能とする、3)生徒の動作を撮影したVTRと比較可能な標準動作の提供(提供した標準動作(スティックピクチャー)と比較し重ね合わせが可能で、生徒が自分の動作における問題点などを理解可能な映像として利用できる、日本ナレッジ社、MVP-2000簡易版を使用)、4)データ提供者や管理者によるデータ及び資料ファイルの処理状態の維持管理成人の標準動作の作成については、ほぼ終了したが、幼少年に関するデータ収集および標準動作の作成については、やや遅れている。これは、幼少年のデータ収集に関して当初に計画した3次元座標自動収集システム(Vicon)が計測条件の制約(学校での計測)により実際には使用できないために、ビデオ撮影に頼らざるを得なくなり、座標データの算出に時間と労力を要しているためである。
フィラリア症原因寄生虫由来プロテアーゼと阻害剤に関する分子生物学的・生化学的研究

ヒト寄生性フィラリアの各種プロテアーゼの性状と機能を解明し、フィラリア制圧薬の開発に寄与することを目的として、マレー糸状虫(Brugia malayi)の数種プロテアーゼのクローニングと発現に関する研究を行った。まず、アスパラギン酸プロテアーゼについて、2種の完全長cDNAと1種の部分長cDNAを得、全一次構造を推定した、分子系統樹解析から前2者は異なるアスパラギン酸プロテアーゼに属する事、また、抗体による組織内分布から、一方は腸と食道に局在し、栄養物の消化に関与すること、他方は腸、食道のほか、体壁や生殖器等にも広く分布し、細胞内タンパク分解に関与することが推定された。次いで、システインプロテアーゼについて、3個の完全長cDNAと4個の部分長cDNAを得、それぞれについて一次構造を推定した。また、1種の金属プロテアーゼの全長鎖cDNAと4種の部分長cDNAを得、これらの一次構造を解明した。前者はミトコンドリアのプロセシングプロテアーゼの非触媒サブユニットと高い相同性を示した。さらに、脱ユビチキン化プロテアーゼのクローニングを行い、2種のcDNAを得た。これらのプロテアーゼについて、大腸菌およびB.brevisの発現系を用いて発現を検討した。大腸菌では大量発現は可能であったが、発現産物は封入体を形成し、これからのリフォールディングが困難であり、十分量の活性型酵素を得るには至らなかった。B.brevisでは発現量が低く、同様に目的達成に至っていない。これらの研究と並行して、非寄生線虫C.elegansのプロテアーゼ系について比較解析を行い、生理的に特に重要ないくつかのプロテアーゼの同定とクローニングを行った。今後、これらの研究結果も参照しつつ、活性型プロテアーゼの発現・調整をさらに進める必要がある。ヒト寄生性フィラリアが持つ各種のプロテアーゼの性状と機能を解明し、フィラリア制圧薬の開発につなげようとする研究の一環として、Brugia malayi(マレー糸状虫)について、数種のプロテアーゼのクローニングを進めた。この結果、アスパラギン酸プロテアーゼとして2種の完全長cDNAが得られ、塩基配列解析から比較的ペプシンに近いタイプとカテプシンDに近いタイプが存在することが判明した。カテプシンDに近いタイプの酵素は通常のリソソーム移行シグナルとなる糖鎖結合部位を持たず、カテプシンEに特異的な糖鎖結合部位を持つという興味ある知見が得られた。システインプロテアーゼとしては、3個の完全長cDNAと4個の部分長cDNAが得られ、それぞれ塩基配列を決定した。また、脱ユビキチン化プロテアーゼとして4種の部分長cDNAを得、塩基配列を解析した。この結果、10種以上のシステインプロテアーゼの存在が示されたシステインプロテアーゼについては、さらに代表的な1種について大腸菌による発現を試みたところ、大部分のタンパク質が封入体として発現された。各種の条件下で、封入体タンパクのリフォールディングを検討したところ、pH4.55.5でのリフォールディングで若干の酵素活性の出現が観察された。比較の目的で、線虫(C.elegans)の金属プロテアーゼのクローニングを行い4種の部分長cDNAを得た。このうちの1種について大腸菌による発現を試み、封入体として発現産物を得た。現在、上記各種プロテアーゼの部分長cDNAについては完全長cDNAを得るべく検討を行っており、また、これらの機能解析の予備的実験を進めつつある。ヒト寄生性フィラリアの各種プロテアーゼの性状と機能を解明し、フィラリア制圧薬の開発につなげようとする研究の一環として、マレー糸状虫(Brugia malay:)のプロテアーゼのcDNAクローニングと発現の試みを続行した。

ESTデータベース検索により得た線虫(C.elegans)金属プロテアーゼ様部分配列より合成プライマーを用いるPCRにより1種の金属プロテアーゼの全長塩基配列を決定し、一次構造を推定した。本酵素は476残基からなり、ミトコンドリアのプロセシンブプロテアーゼと相同性を示した(58-66%同一)。また、金属プロテアーゼ特有の活性部位配列を持つことが判明した。また、この他に4種の金属プロテアーゼの部分配列を同様な方法で得た。さらに、脱ユビキチン化ペプチダーゼのクローニングも同様に行い、2種のクローンを得た。一つは199残基からなり、線虫の同種酵素と顕著な相同性を示した。マレー糸状虫由来の数種のアスパラギン酸プロテアーゼとシステインプロテアーゼについて、大腸菌およびB.bvevisによる発現を試みたが、まだ大量発現には成功していない。比較の目的でマラリア原虫由来のシステインプロテアーゼであるファルシパインの大腸菌による発現を試み、活性のある酵素を得たが、量的にはまだ検討の余地がある。発現酵素について若干の酵素的性状を検索した。線虫の各種プロテアーゼについても比較の目的で、cDNAのクローニング,大腸菌による発現,RNA inteference法による機能検索等を並行して進めた。ヒト寄生性フィラリアの各種プロテアーゼの性状と機能を解明し、フィラリア制圧薬の開発に寄与することを目的とする本研究の一環として、マレー糸状虫(Brugia malayi)のアスパラギン酸プロテアーゼについて研究を進めた。すでに得た、2種の完全長cDNAについて塩基配列決定を完了し、2種のアスパラギン酸プロテアーゼ(BmAsp-1および2)の全一次構造を推定した。BmAsp-1は393残基、BmAsp-2は452残基のプレプロ体として生合成され、アミノ酸配列の同一性は22%であった。また、他のアスパラギン酸プロテアーゼを含む分子系統樹解析から、両者はまったく異なる二つのグループにそれぞれ属することが推定された。両者のプロ体を大腸菌で発現されることを試み、20mg/lの収量で発現することができたが、いずれも封入体を形成し、これからリフォールディングを試みたが、活性の発現はまだ微弱であり、純粋な活性分子種の大量調製には成功しなかった。さらに今後の検討が必要である。一方、両酵素について、抗体を調製した。これらの抗体は酵素間で交叉反応を示さず、両酵素の組織内分布の検索に有効であった。この結果、BmAsp-1は腸と食道に局在し、BmAsp-2は腸、食道のほか、体壁、生殖器等にも広く分布することが判明した。これから、BmAsp-1は主に消化による栄養物の摂取に関与し、BmAsp-2は細胞内におけるタンパク分解やプロセシングに関与することが推定された。なお、上記の研究と並行して、他のプロテアーゼ類のcDNAクローニングと発現の実験、および比較の目的で線虫(C.elegans)のプロテアーゼに関する同様な研究を進めた。
有糸分裂阻害剤ーチュ-ブリン分子間の精密構造認識の解析

リゾキシンの部分構造変換においては、6員ラクトン部分のカルボニルを還元してテトラヒドロピラン構造に変換したものが、チュ-ブリンへの活性および抗カビ、抗腫瘍活性などの生物活性を全て失ったことから、この部分がチ-ブリンとの極性結合に関与していると考え、この部分とチュ-ブリンの非可逆的な結合を行わせるための誘導体造りを試みたが未だ成功していない。6員環状ヘミアセタ-ル(5bーアルデヒド)体は活性を保持している。一方、リゾキシン誘導体をチュ-ブリンに選択的且つ非可逆的にチュ-ブリンに結合させるための、光アフィニティ標識用の誘導体を側鎖の修飾により合成し、検出プロ-ブとしては、環境衛生上問題のある放射標識を避け、蛍光プロ-ブとした。光照射によるチュ-ブリンへの結合実験では、αー,βー両サブユニットへの結合が認められ、現在、結合した蛋白の酵素加水分解を行っている。強い抗チュ-ブリン活性を示し、そのチュ-ブリンへの結合がビンカアルカロイドによる阻害されるという報告のあったフォモプシンについて、チュ-ブリンに対する作用を詳細に検討した。ブタ脳より精製した微小管蛋白の重合阻害活性は、多数ある既知有糸分裂阻害剤中最もつよく(IC_<50>=2.5μM)、チュ-ブリン上のこの薬剤の結合部位は2ヵ所あると結論されたが、その解離定数は、Kd_1=1x10^<-8> Kd_2=3x10^<-7>と計算され、最強の結合力を示す。更に、各種阻害剤との結合拮抗試験では、強結合部位はリゾキシン/メイタンシン部位と一致すると結論された。
核酸系うまみ物質の新規生成経路の探索とその利用

食べ物のおいしさの要素のひとつである「味」に関する物質のうち、「核酸系うまみ物質」の生成機構について調べた。きのこ類、魚類、野菜類の代表として、シイタケ、アジ、ダイコンの3食品を選び研究試料とした。うまみ物質(イノシン酸とグアニル酸)はプリンヌクレオチドであるので、最初にプリンヌクレオチド代謝経路の概要を明らかにした。次に、うまみ物質が一旦分解された後、再度生成される代謝経路(サルベージ経路)に注目し、この経路に関与する酵素の性質を調べた。最後に、これらの経路が調理・加工・保存条件下で機能する可能性を示した。動物性核酸系うまみ物質の代表である5'-イノシン酸(5'-IMP)は、ヌクレオチド(5'-AMP)の酵素的変換により、シイタケに含まれるうま味物質である5'-グアニル酸(5'-GMP)は加熱過程での核酸(RNA)の酵素的分解により、それぞれ生成されるとされている。しかし、動植物や菌類のヌクレオチド代謝経路全体を見渡すと、様々な食品において、これら以外の経路によりうまみ物質が生成される可能性も考えられる。本研究では、動物性食品(魚介類)と植物性食品(キノコ類、野菜類)の加工中の核酸系うまみ物質生成において、これまでに考慮されてこなかったうまみ物質生成経路の関与の有無を明らかにし、うまみを最大限に引き出す実用的な調理・加工条件を提案することを最終目的とする。本年度は、いくつかの未加工の食品について、^<14>C標識したプリン代謝関連物質のトレーサー実験により、うまみ物質生成経路の概要を把握した。その結果、即殺直後の鯵では、5'-AMPの分解により生じるアデノシンやアデニンを再利用して再び5'-AMPとする活性は強いが、アデノシンの脱アミノ反応や5'-IMPの分解により生じるイノシンやグアニル酸の分解により生じるグアノシンを再び5'-IMPや5'-GMPにする活性は弱いこと、シイタケで見られるような60°C付近での加熱中のRNAからのヌクレオチド生成量は極めて少ない事が明らかとなった。一方、大根においては、イノシンやグアノシンを再び5'-IMPや5'-GMPにする活性が認められ、加熱中にRNAから少量のヌクレオチドが生成した。これらの基礎知見を基にして、今後は塩蔵や乾燥などの加工中の各代謝経路の消失や発現について調べ、加工中のうまみ物質生成量の調節に関わる経路の把握を試みる。昨年度の結果から、鯵ではRNAの分解によるヌクレオチド生成は少ないことが明らかとなった。本年度はプリンヌクレオチドの分解により生じるヌクレオシドや塩基を再度ヌクレオチドに合成するサルベージ経路のうまみ生成への関与を探るため、サルベージ酵素の存在や酵素の性質を中心について調べた。即殺直後の鯵の筋肉では、ヌクレオチドから5'-nucleotidaseの作用により生じるヌクレオシド(イノシン/グアノシン)をヌクレオチド(5'-IMP/5'-GMP)に変換するkinaseやnon-specificなphosphotransferaseの活性は検出されなかった。しかし、ヌクレオシドを塩基のヒポキサンチン(Hx)及びグアニンに分解するphosphorylase活性と塩基をヌクレオチドに再変換するphosphoribosyltransferase(PRT)活性が検出され、ヌクレオチドがヌクレオシドを経て一旦塩基に分解されても、再度、呈味性のヌクレオチドを合成する能力を有することが明らかとなった。イノシンphosphorylase活性は100-150mMのNaCl存在下では非存在下の約1.3倍に、HxPRT活性は同様に50-150mM存在下で1.5から3倍になり、食塩により5'-IMPの再合成系が活性化される可能性が示された。粗酵素液のHxPRTの最適温度は70°C付近にあり、60°C・10分間の熱処理によっても活性の約75%は保持されるという特徴が見られた。これらの結果から、鯵のような魚類を塩蔵品に加工する際にある程度高温で処理しても、5'-IMPを生成するサルベージ経路が働き得る可能性が示された。これらの知見を基にして、今後は魚類の塩蔵加工を中心に、実用的条件においてサルベージ経路の利用によりうまみ物質生成の調節が可能かどうかについて検討する。本年度は、最初に大根のサルベージ酵素を中心に、酵素の存在と性質を調べた。次に、鯵、シイタケ、大根について、実際の調理・加工を想定して、塩処理や乾燥処理を行った後の、サルベージ酵素の活性変化を把握し、実用条件におけるサルベージ経路を利用したうまみ物質生成調節の可能性を検討した。大根にも、シイタケや鯵で検出された、ヌクレオチドの分解により生じるヌクレオシドや塩基をヌクレオチドに変換するサルベージ酵素の存在が認められた。

しかし活性値を生重量あたりで比較すると、鯵やシイタケに比べて非常に低かった。サルベージ酵素のうち、塩基のグアニン(G)やヒポキサンチン(Hx)を基質とするphosphoribosyltransferase(PRT)の最適温度は5060°C付近の高温にあり、昨年度調べた鯵の酵素の性質と類似していた。鯵の干物加工を想定して、20%食塩水・30分、続いて27°C乾燥・2時間の処理の後、5°C・4日間冷蔵すると、4日後にも5'-IMPの分解により生じるイノシンをHxに分解するphosphorylaseと、Hxを5'-IMPに変換するHxPRT活性が生とほぼ同レベルで検出された。また、干しシイタケ加工や大根の漬物を想定した50°C乾燥処理や10%食塩処理を施しても、シイタケのGPRT活性や大根のHxPRT活性は処理前に比べて大幅には低下していなかった。以上の結果から、酵素活性から考えると、動物性食品の鯵、植物性食品のシイタケ、大根のいずれにおいても、加工・調理のプロセスや保存中にサルベージ経路を介してうまみ物質(ヌクレオチド)が生成される可能性が示された。サルベージ酵素の反応には、ヌクレオシドや塩基以外に、基質としてリン酸基を含む化合物や5-phosphoribosyl-1-phosphateが必要なため、今後、これらが十分に供給される調理・加工条件を探る。