hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
光による神経細胞の解析と操作を目指した低分子プローブの開発

本研究は精神・神経疾患の克服を最終目標として,神経細胞研究用の新規な分子プローブの開発を目的とした。その結果,(1)神経細胞の活動電位を可視化できる新規な色素を開発できた。(2)クロロフィルやポルフィリンの選択的ヨウ素化反応を開発した。(3)研究例の少ないピリジルピロール類について,分子設計の指針を確立した。さらに,(4)強い環境応答性をもつ新規な蛍光色素を合成できた。本研究の最終目標は心の健康のための精神・神経疾患の克服に貢献することであり,そのために助成期間内に神経細胞研究用の新規な低分子プローブを開発することを目的とする。特に,従来よりも感度の高い膜電位感受性蛍光色素(VSD)の開発を目指しており,その目標性能は1 mVあたりの蛍光強度変化が1%以上であることである。25年度は,電子移動を利用した膜電位感受性蛍光色素の開発と,新規な蛍光発色団の開発を中心に研究を行った。クロロフィル類縁体を蛍光発色団とし,フェニレンエチニレンを分子ワイヤーとする新規な蛍光プローブを合成できた。この化合物の吸収極大波長は692 nm,蛍光極大波長は700 nmであった。連携研究者にこの蛍光プローブを用いた神経細胞可視化試験をしていただくことができた。その結果,弱いながら膜電位に応答した蛍光変化を観測することができた。細胞膜だけでなく細胞質にも分散してしまう欠点があることから,これを抑えるために両親媒性をより強化した類似化合物を合成した。この化合物の性能については現在試験中である。合成・試験・改良のサイクルを回すことができており,研究は順調に進行している。研究例の少ないピリジルピロール類や,光退色に強く,二光子吸収法にも利用可能なレゾルフィン類,光異性化の期待できるオキサゾロンやイミダゾロンを蛍光発色団とする新規な蛍光プローブの合成も進めている。特に,ピリジルピロール類およびそのホウ素錯体はストークスシフトが大きく,FERT型蛍光プローブ等として有望であることを見い出したことは成果である。昨年度に引き続き,クロロフィル類縁体を蛍光発色団とし,フェニレンエチニレンを分子ワイヤーとする新規な蛍光プローブを合成している。昨年までは細胞膜だけでなく細胞質にも分散してしまう欠点があったが,親水基を増やす改良によって細胞膜に局在化させることができた。この色素についてリポソームを利用したモデル系で膜電位を検出できるか評価したところ,既存の色素よりもやや高い感度で膜電位を検出できた。そこで,実際の神経細胞(neuro A細胞)を用いた試験を連携研究者に行っていただいたところ,同様に膜電位を検出することができた。しかし,予想以上に褪色が速く,すぐに感度が低下してしまうことがわかった。また,より長い分子ワイヤー部をもつ誘導体についてリポソームモデル系で検討したところ,膜電位はほとんど検出できなかった。以上のことから,より褪色しにくい蛍光発色団を用いること,適切な長さの分子ワイヤー部を持たせることの2点を中心に,さらに分子設計を改良し,合成を行っているところである。別種の蛍光発色団としてピリジルピロール類も検討しており,カリウムイオン応答性の誘導体を合成することができた。神経細胞は細胞内外のカリウムイオン濃度を変化させることによって膜電位を変化させているので,神経細胞の活動を膜電位とは別の角度から検出するプローブを手に入れることができたことになる。このように合成・試験・改良のサイクルを回すことができており,研究は順調に進行している。昨年度の課題は,1より褪色しにくい蛍光発色団を用いること,2適切な長さの分子ワイヤー部を持たせることの2点であった。今年度はキノリルピロール類,ピリジルピロール類,レゾルフィン類を中心に検討を行った。キノリルピロール類では顕著な成果を挙げることができた。キノリン環,ピロール環,フェニレンエチニレン分子ワイヤーの配置を理論計算を元に検討し,新たな分子設計を行った。数種の誘導体を合成して分光特性を測定したところ,溶媒の極性(誘電率)に応答して青から赤までの広い色調範囲で蛍光色を変化させることがわかった。誘電率に対して応答することから,膜電位の変化に対しても応答すると期待される。また,強い環境応答性があるという点でも応用範囲が広いと期待される。神経細胞での膜電位測定は未検討だが,有望な色素であり,まずモデル系での膜電位測定を計画している。ピリジルピロール類については,蛍光に対する官能基効果を初めて明らかにすることができた。

電子豊富なピロール側に電子求引基,電子欠乏のピリジン側に電子供与基がある場合に蛍光強度が強くなった。ピリジルピロールに長鎖アルキル基を複合化し,細胞膜に挿入されやすい分子を合成することもできた。レゾルフィン類については,比較的強い赤い(長波長域)蛍光を示す,両親媒性の新規な色素を得ることができた。以上のように,本研究の目的である新規な膜電位感受性の開発に向け,有望な新規色素を合成するとともに,官能基効果を明らかにして分子設計の指針を確立することができた。本研究は精神・神経疾患の克服を最終目標として,神経細胞研究用の新規な分子プローブの開発を目的とした。その結果,(1)神経細胞の活動電位を可視化できる新規な色素を開発できた。(2)クロロフィルやポルフィリンの選択的ヨウ素化反応を開発した。(3)研究例の少ないピリジルピロール類について,分子設計の指針を確立した。さらに,(4)強い環境応答性をもつ新規な蛍光色素を合成できた。昨年度までの欠点を改良したな蛍光プローブを合成でき,これによって細胞膜への局在,モデル系での膜電位検出,実際の細胞での膜電位検出を実現できた。現在は,同様の性質をもち,且つより褪色しにくい化合物を設計し,合成している。種々の蛍光発色団の合成と光物性の検討も順調に進んでいる。このように合成・試験・改良のサイクルを回すことができた。生物有機化学引き続き、膜電位感受性蛍光色素の選択性と感度の向上を図る。蛍光発色団としてはピリジルピロール・ホウ素錯体やジピロメタン系色素などを,分子ワイヤーとしてはフェニレンエチニレンの他,オキサゾリン等の複素環を用い,これらを組み合わせた蛍光プローブを合成する。これらの蛍光プローブと脂質などとの複合化も検討する。光異性化を利用して膜のイオン透過性などを変化させるためのプローブとしては,ジピロメタン系色素などを開発していきたい。クロロフィル類縁体を蛍光発色団とする新規な蛍光プローブを合成でき,これを細胞試験したところ,弱いながらも膜電位に応答した蛍光変化を観測することができた。欠点を抑えた化合物を合成し,評価試験を行っている。また,研究例の少ないピリジルピロール類をはじめ,他の蛍光発色団をもつ膜電位感受性色素の合成も順調に進んでいる。計画通り消化したが,ごく小額な残額(309円)が生じた。引き続き、膜電位感受性蛍光色素の選択性と感度の向上を図る。様々な蛍光発色団と様々な電子ワイヤーの組み合わせた蛍光プローブを合成する。電子移動を利用するものだけでなく,励起エネルギー移動などの他の膜電位感受原理の検討も行う。また,様々なオキサゾロン類を合成し,それらの光異性化を検討する。これらの蛍光プローブとペプチドとの複合化も検討する。なお,ジャイアントリポソームに顕微鏡下で電場をかけて膜電位を生じさせるような,細胞を用いない膜電位アッセイシステムの構築ができないか検討したい。翌年度分に合わせて,ただちに消化した。
電気化学マイクロ培養デバイスによる細胞微小環境の制御と定量解析

我々はこれまでに、ベータ・ガラクトシダーゼ(βGAL)およびアルカリホスファターゼ(AP)をレポーター酵素とし、遺伝子発現のon/offにより制御されるシグナル伝達の電気化学的追跡が可能であることを示した。本課題では、単一細胞レベルでの酵素活性検出を目標とする。これを実現するために、分泌型酵素を利用しレポーター酵素を膜外に分泌させ、大幅な感度の向上を目指す(分泌型APの適用)。電極・ウェルデザインの最適化により酵素反応生成物が効率的に電極に到達するよう検討を加える。ポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロウェルアレイにベータ・ガラクトシダーゼ遺伝子を導入した酵母を閉じ込め、蛍光発色性基質に基づく酵素活性イメージングに成功した。走査型電気化学顕微鏡(SECM)の探針である微小電極をPDMSアレイ上部に押当て密閉空間を形成すると、酵素反応生成物であるp-アミノフェノールがウェル内部に蓄積され、電気化学応答の増幅が観測された。即ちSECMイメージング法と異なる高感度・密閉系電気化学測定法を確立した。動物細胞系において、アルカリホスファターゼ(AP)遺伝子を有するプラスミドを形質導入したところ、HeLa細胞株で最も発現効率が高く、電気化学応答を1細胞レベルで検出可能であることを見出した。電気泳動や誘電泳動に基づく1細胞操作により30μm径のマイクロウェルイに配列し電気化学応答を追跡した。AP遺伝子の上流に転写因子結合配列を有するプラスミド8種類について、発光測定/電気化学に基づき、レポーター活性が最大となるよう刺激因子の種類と濃度を最適化した。ステンシル法により異種細胞をパターニングした細胞チップを用いて、細胞シグナル伝達に基づく環境応答センシングシステムを構築した。電気化学測定法の利点であるリアルタイムモニタリングと定量性に着目し、遺伝子-蛋白質発現過程を詳細に追跡する。レポーターとしてベータ・ダラクトシダーゼ(βGAL)とアルカリホスファターゼ(AP)を用いる。プラスミドDNAアレイを作製し、微生物系および動物細胞系において遺伝子導入をチップ上で行い、実用を踏まえた電気化学レポーターセンシングシステムを構築する。これを実現するために、分泌型酵素を利用しレポーター酵素を膜外に分泌させ、基質および反応生成物の細胞内への取込み過程を省き、大幅な感度の向上を目指す(分泌型APの適用)動物細胞系において、ウェルのサイス、深さ、素材を検討し1細胞アレイを構築した。自然沈降に基づくランダムな配列化技術に加え、誘電泳動力-、電気泳道力-に基づく1細胞配列を検討し、全てのケースで成功した。アルカリホスファターゼ(AP)遺伝子を導入したHeLa細胞株を用い、電気化学顕微鏡(SECM)により、1細胞電気化学イメージングに成功した。一細胞ごとの応答を統計的に解析し、遺伝子導入細胞一非導入細胞間で有意差を確認した。NFκB経路応答性のプラスミドを用いてサイトカイン刺激有無の比較で有意差を確認した。即ち本研究の目的は達成された。電気化学アレイデバイスでは10×10のウェルアレイに1細胞づつランダムに播種し、100検体の電気化学応答を僅か22秒で取得することができた。
NO吸入療法離脱時のリバウンド現象の発現機序

40ppmのNO(NO群,n=5)又は室内気(対照群,n=5)に2日間曝露したラットより摘出灌流肺を作成し、アンギオテンシン(ANGII,0.05μg肺動脈内注入)-低酸素換気(5%CO2+95%N2,5分間)を4回繰り返し、3,4回目の低酸素収縮反応のピークにそれぞれ100nMのブラジキニン(BK)または1μMのソジウムニトロプルシッド(SNP)をリザーバー内に投与し肺血管の反応性を比較した。BKまたはSNPの血管拡張反応は、拡張反応(mmHg)/低酸素収縮(mmHg)x100(%)で表した。ANGIIおよび低酸素に対する収縮反応はNO群で著名に増強されていた[ANGII:2.8【+-】0.3mmHg(対照群)対8.7【+-】1.1mmHg(NO群),低酵素:2.9【+-】0.4mmHg(対照群)対11.4【+-】1.7mmHg(NO群),それぞれp<0.05]のに対し、BKの拡張反応は有意に抑制されていた[37【+-】5%(対照群)対5【+-】2%(NO群),p<0.05]。一方、SNPに対する拡張反応は両群間で有意差を認めなかった[83【+-】7%(対照群)対70【+-】8%(NO群)]。つまりNO群の肺循環において、収縮反応は著明に増強されEDNO依存性の拡張反応(BK)が抑制されているのに対し、EDNO非依存性の拡張反応(SNP)は維持されていることが示された。さらに、これらの反応性の変化について種々のNO濃度(10,5,1ppm)について検討したが、全て同様の傾向を示し、濃度依存性は認められなかった。これらの結果はNO曝露後ラット肺循環においては、たとえNOが低濃度(1ppm)であってもEDNO活性が低下していることを示唆し、我々の仮説に矛盾しないものであると考えた。この内因性NO活性の低下が、NO吸入療法中止時のリバウンド現象発現のメカニズムに相当するものと思われた。
位置特異的にラベルした研究用光学活性アミノ酸製造法の開発

1.アミノアルキルマロン酸の脱炭酸反応における高選択性発現の要因の解明と重水素化アミノ酸錯体の合成-Λ-β特異性を示す二種の四座配位子(5R,7R-【Me_2】-2,3,2-tetと1,5R,7R,11-【Me_4】-2,3,2-tet)合成し、それらのCo(【III】)錯体を用いてα,α-アミノメチルマロン酸(AMM)の脱炭酸反応について検討した。その結果、四座配位子の末端にN-メチル基の無い場合【(+)_(577)-〔Co(AMM)(5R,7R-Me_2-2,3,2,-tet)〕^+】(【II】)と有する場合【(-)_(546)-〔Co(AMM)(1,5R,7R,11-Me_4-2,3,2,-tet)〕^+】(2)とでは得られるアラニン錯体の生成比に大きな差が観測された。(R/S=34/66(【II】)83/17(2)。この差の生じる要因を明らかにするため、両錯体の構造をX線解析により決定した。その結果、両者の構造はよく似ており、AMMは分子内水素結合を含む三点結合により、プロキラル中心が高度に識別された配位をしていることが明らかとなった。以上の事実から脱炭酸反応における選択性は、前駆体のAMMの配位様式には依存せず、【H^+】の攻撃の方向により決定され、四座配位子の末端のN-メチル基は選択性の向上に対して極めて有効であることが判明した。さらに【II】と2の錯体について重水中でDClによる脱炭酸反応を試みたところ、HClによる場合と変らぬ不斉選択性でα位が重水素化されたアラニン錯体が生成していることがNMRスペクトルにより確認された。2.コバルト(【III】)に配位した【NH_2】,NHの部分的重水素化による【^(13)C】NMRシグナルの分裂-HをDに置換すると、その近傍の炭素原子の【^(13)C】シグナルがわずかに高磁場側にシフトすることが知られている。交換可能な水素原子(NH,OH等)を半分だけ重水素に置換した状態で【^(13)C】NMRの測定を行うと、H型とD型とに対応して、注目している炭素の近傍の官能基の種類に応じて特徴的に分裂した多重線が観測できる。この手法が配位化合物に応用できることを初めて明らかにした。
食品中のポリフェノ-ル化合物の抗酸化能とフリ-ラジカル生成抑制作用

活性酸素による生体膜構成脂質の過酸化は、成人病や老化現象の成因の一つであると考えられている。このような生体内脂質の過酸化に対する抗酸物質として、種々の野菜、果物に含有されるポリフェノ-ル化合物の一種であるクロロゲン酸に着目した。まず最初に、分取用高速液体クロマトグラフィ-を用いて、食用野草の一種であるヨモギの葉からクロロゲン酸を単離精製し、白色の粉末を得た。^1HーNMR分析の結果、その構造を3,5ージカフェイルキナ酸と同定した。つぎに、不飽和脂肪酸のラジカルのモデルとして用いた安定なラジカルである1,1ーdiphenylー2ーpicryhydrazyl(DPPH)ラジカルに対するクロロゲン酸類のラジカル消去活性を調べた。その結果、5ーカフェイルキナ酸(コ-ヒ-に多く含有されているクロロゲン酸の一種)と3,5ージカフェイルキナ酸(ヨモギから単離したもの)は、共にDPPHラジカルを5μMから100μMの濃度範囲内で用量依存的に消去することを明らかにした。また、それらの抗酸化能は、アスコルビン酸及びビタミンEとほぼ同じか、または、それらよりやや優れていることも判明した。つぎに、クロロゲン酸類によるフリ-ラジカルの生成抑制作用をキサンチンオキシダ-ゼ系を用いて調べた。基質(アセトアルデヒト)の酸化の際生成した酸素が、鉄錯体の存在下で活性化されて生じたス-パ-オキシドアニオンラジカル或いはそれより派生したヒドロキシラジカルは、クロロゲン酸類によって効果的に補足されること、従って、その結果としてリノ-ル酸ラジカルの生成は抑制されることを明らかにした。
トロイダルモーメントを内包する金属磁性体における電流誘起磁気効果の検証

本研究の目的は、電子スピンの渦状配置に対応する「トロイダルモーメント」が秩序した金属磁性体に関して予言された新奇な電気磁気効果を実験で検証することにある。現実の強的トロイダル秩序系の候補である層状ウラン化合物UNi4Bの単結晶について電流下での精密磁化測定を行った結果、電流強度に比例して一様磁化が生じることを観測し、理論予想が本質的に正しいことを証明した。一方で電流方向に対する磁化の応答方向が理論予想と単純には合致しない結果も得られ、本系の結晶および磁気構造を精密に再検討する必要があるという新たな課題も提起した。また、同様の電流誘起磁化現象を示す二つの反強磁性体を新たに見出した。奇パリティ拡張多極子の一つであるトロイダルモーメントが整列した系において理論的に予想された新奇な電気磁気効果を実験で検証することが本研究の目的である。現実の強的トロイダル秩序系として最有力候補である層状ウラン化合物UNi4Bの単結晶を用い、層に垂直にトロイダルモーメントが整列した低温秩序相において、相内に流した電流によって、電流とトロイダルモーメントに垂直な方向に磁化が発生すること、また、ゼロ磁場において同じく相内の電流に対してホール電圧が発生し、ホール電圧が電流の2乗に比例するという理論予想を検証するのが本年度の主たる目的であった。これらの実験を行った結果、先ず電流誘起磁化については、幾つかの異なる試料形状を用いた慎重な測定において再現性が確認され、確かにこの現象が生じていることがわかった。また、誘起される磁化が電流密度に比例して増大することを確認し、電流誘起磁化の感受率を定量的に明らかにした。しかしながら、同時に、誘起される磁化が電流の方向にほとんど依存しないことがわかり、電流と磁化の異方的な相関を予想する理論とは単純には一致しないことがわかった。この原因を解明するのが次年度の課題である。次にホール効果の実験では、実験の精度内でホール電圧に電流の2乗に比例する寄与は観測されなかった。今後、オフセット電圧を除去し、S/Nを向上する工夫を施して再実験に望む計画である。さらに、同様の現象の典型例となり、ウラン系より扱いやすい希土類金属でのトロイダル秩序物質の探索を行い、幾つかの候補を見いだした。また、中性子散乱実験を行うために国外での試料を合成し、国外の施設を利用して実験を行う国際連携体制の構築を行い、実際にUNi4B単結晶の作製に着手した。電流磁気効果の測定は概ね予定通りに進んでいるが、研究の進展に伴い、電流と磁化の異方性について理論予想では説明できない振る舞いがあることがわかった。このため、先ず構造解析を進める必要が生じている。異常ホール効果の検証実験についても計画に沿って研究が進んでいるが、さらに実験精度に改善の余地がある。現実の強的トロイダル秩序系として最有力候補である層状ウラン化合物UNi4Bの単結晶を用い、層に垂直にトロイダルモーメントが整列した低温秩序相において電流によって磁化が誘起される現象、およびゼロ磁場で電流の自乗に比例してホール電場が発生する現象の理論予想に関する検証を進めてきた。2015年度の実験から確かに電流誘起磁化現象が本系で生じることを確認したが、電流方向と誘起磁化の異方性に理論と整合しない事実があることがわかった。そのため、本系のトロイダル秩序構造を先ずしっかり確認する必要があることがわかった。そこで、2016年度は放射光X線回折を用いた精密結晶構造解析および中性子回折実験を用いた磁気構造解析に着手した。X線回折の結果、本系の結晶構造は、過去に2例報告されている構造のうち対称性の低い直方晶構造である可能性が高まった。しかし、実験結果は構造がさらに低対称化している可能性も示しており、現在、よりよい条件下で実験を継続している。中性子回折実験については、日本国内では規制によって実施できないため、国際共同研究を進め、海外にて大型単結晶を作製することに成功した。フランスとドイツの中性子実験施設の共同利用に採択され、2017年度に実験を開始する予定である。2016年度は、更に別の希土類化合物2種についても新たに電流誘起磁化の測定を行った。その結果、これらの系においても同様の現象が生じていることが明かとなった。特に一方の物質では、温度変化によって生じる磁気秩序構造の変化に対応して電流誘起磁化が変化する振る舞いが明らかになり、同現象の起源を探る上で重要な物質となり得ることを示した。概ね予定通りに進展している。UNi4Bの電流誘起磁化については、試料依存性も含めて同現象が確かに存在することを明かにした。放射光X線を用いたUNi4Bの結晶構造の同定はあと一歩のところにあり、また日本国内では現在、実施不可能なウラン化合物の中性子散乱実験について国際協力体制を構築してこれを進めることができた。さらに、興味深い電流磁気効果を示す物質を発見し、次の展開を導いた。

現実の強的トロイダル秩序系として最有力候補である層状ウラン化合物UNi4Bの単結晶を用い、層に垂直にトロイダルモーメントが整列した低温秩序相において電流によって磁化が誘起される現象、およびゼロ磁場で電流の自乗に比例してホール電場が発生する現象の理論予想に関する検証を進めてきた。2015年度の実験から確かに電流誘起磁化現象が本系で生じることを確認したが、電流方向と誘起磁化の異方性に理論と整合しない事実があることがわかった。そのため、本系のトロイダル秩序構造を再検証する必要があることがわかった。そこで、放射光X線回折を用いた精密結晶構造解析および中性子回折実験を用いた磁気構造解析に着手した。X線回折実験の結果、本系の結晶構造は、過去に2例報告されている構造のうち対称性の低い直方晶構造であることを明らかにした。このことより理論と実験の差違がトロイダルモーメントの傾きによって説明できる可能性が示唆され、さらに考察を進めている。中性子回折実験については、国内では規制によって実施できないため、チェコ共和国カレル大学、ドイツ・ブラウンシュヴァイク大学との国際共同研究を進め、海外にて大型単結晶を作製することに成功し、実験を進めている。また、実験の信頼性を検証するため、同程度の転移温度を持つ別の反強磁性体2つを用いて対照実験を行った。その結果、これらの系においても同様の現象が生じていることが明かとなった。特に一方の物質では、温度変化によって生じる磁気秩序構造の変化に対応して電流誘起磁化が変化する振る舞いが明らかになり、実験の信頼性の確証を得ると同時に、同現象の起源を探る上で重要な物質となり得ることを新たに提示した。本研究の目的は、電子スピンの渦状配置に対応する「トロイダルモーメント」が秩序した金属磁性体に関して予言された新奇な電気磁気効果を実験で検証することにある。現実の強的トロイダル秩序系の候補である層状ウラン化合物UNi4Bの単結晶について電流下での精密磁化測定を行った結果、電流強度に比例して一様磁化が生じることを観測し、理論予想が本質的に正しいことを証明した。一方で電流方向に対する磁化の応答方向が理論予想と単純には合致しない結果も得られ、本系の結晶および磁気構造を精密に再検討する必要があるという新たな課題も提起した。また、同様の電流誘起磁化現象を示す二つの反強磁性体を新たに見出した。・チェコ共和国、カレル大学にてUNi4Bの単結晶を作製し、基礎物性の確認を行った後、フランスもしくはイギリスにおいて、中性子散乱実験を行う。・ホールプローブを用いた表面磁化測定システムを作製し、電流誘起磁化の異方的性質を明らかにする。・他の希土類化合物について同様の研究に着手する。・論文を執筆する。・UNi4Bの精密結晶構造解析を完成させる。磁気構造を再評価し、結晶構造と合わせて本系のトロイダル秩序構造を同定する。・ホールプローブを用いた表面磁化測定システムを完成し、新たに発見した系も含めて電流誘起磁化の異方的性質を明らかにする。・昨年度に引き続きホール効果異常の理論予想の検証実験を進める。・トロイダルモーメントを内包する物質の探索を行う。数物系科学実験の進展に伴い、物性の結晶異方性をさらに詳しく調べる必要があることがわかり、本研究の対象物質であるUNi4Bの単結晶を新たに作成する必要が2016年2月に生じた。在庫の元素材料を用いてこれを行ったが、よい結晶性のものが結局得られなかった。
勅撰和歌集と古代礼楽思想の和漢比較研究

平安から室町時代にかけて編まれた21代にわたる勅撰和歌集編纂を支える思想基盤には,中国を中心とする東アジア儒教文化圏に共通する古代儒教による「礼楽」思想が一貫して存在し,この礼楽思想の日本的展開,我が国固有の変容の成果として勅撰和歌集が編纂され続けたこと,さらに,この「礼楽」の思想的基盤(特に,中国古代音楽論)への認識を深めることが,勅撰和歌集研究に不可欠の要件であること等の諸点を明らかにした。(1)1和歌文学会7月例会に於いて科研課題に関わる「古今集序を読むために」の研究発表を行い、仮名序・真名序の文体的特色に関し、それぞれの典拠材源の位相差を明示することを通じ、読者層の相違及び両序の成立論議に新たな論点を提示した。これにより、後続の勅撰和歌集序の仮名・真名両序の文体を分析するうえでの今後の留意点がより明確化された。(2)青島大学に出張し、『古今和歌集と礼楽思想』の著者尤海燕氏と科研課題に係る諸問題を論じるとともに、関連資料の収集に努めた。これにより、当該課題に関わる研究姿勢として、従来の専門分野や学会を横断した幅広い見地からの和漢比較研究の必要性をさらに強く確信することができた(平成25年7月29日8月3日の6日間)。(3)ポーランド共和国ヤゲェウォ大学東洋学研究所日本学科に於ける、1第7回ワルシャワ大学日本祭「平成の日本ー日本的伝統からの離反と回帰」に於いて「草創期の仮名文についてー古今集仮名序をめぐって」と題する講演(ワルシャワ大学図書館・10月14日)、2ヤギェオ大学主催国際会議・古典部門研究発表会参加(クラクフ市マンガ博物館・11月15日)、3学生・院生および社会人向けの「日本文学・文化と自然」と題する講演(クラクフ市マンガ博物館附属日本文化センター・12月13日)等の、研究交流・講演等を行い、西洋、キリスト教文化圏における日本文学・文化理解の様相をつぶさに実見することを通じ、儒教文化圏における文学現象及びその理解の特殊性(普遍性)・問題性を明確化することにより、現今の研究課題を推進する上での有意義な成果を得た(平成25年9月30日同年12月19日の81日間)。(4)当該科研課題に関わる和漢比較研究上、重要と思われる中国語論文2点の翻訳をまとめ、それらを含めた成果の一部を、著書(単)『和歌の詩学ー平安朝文学と漢文世界ー』として公刊する準備を整えた。(1)本研究課題の中間報告として、「和歌勅撰の思想」と題する、「第六章和漢比較のなかの古今集両序ー和歌勅撰の思想」以下「第十章仮名散文の創出ー古今集両序をめぐって」及び、関連する翻訳として聞一多「歌与詩」、朱光潜『詩論』(抄訳)を、「和漢比較研究の視角」と題する章下にまとめた拙著『和歌の詩学ー平安朝文学と漢文世界』(561総頁・勉誠出版)を刊行した(6月)。(2)勅撰和歌集に附属する奏上文の意義を有する真名序の公的な漢文章としての特質の評価については、『本朝文粋』等をはじめとする序の語彙・文体との関連を意識する必要があること、及び、これと位相的な落差をみせる仮名序の語彙・文体レベルでの関係性の解明のためには、フォーマルな仮名ぶみの特色の明確化に留意すべきことを認識するに至った。(3)本研究課題の推進とともに明晰化され得たことは、それぞれの基底にある思想や、ものごとの捉え方の型、枠組みへの共時的・通時的理解なくして作品表現の解読は不可能に近いということであり(拙著と時を前後して刊行された、工藤重矩『平安朝文学と儒教の文学観』も同様の理解を示す)、これらは、礼楽思想(儒教的文学観)のみならず、作品の創造・受容過程における面的・層的なテキスト群の共有が必須であることを示すものであり、本研究から発展的に継続されるべき新たな課題を導くものである。(4)その他、講演・学会活動等としては、1北京日本学研究センターに於いて、「草創期の仮名文についてー奏上時に「仮名序」は無かった」と題する招待講演を行うとともに、「嵯峨朝文学の謎」と題する発表を行った同招待講演者Wiebke Deneke・ヴィーブケ・デーネーケ氏(ボストン大学准教授・日中比較文学)と日中(和漢)比較文学の研究手法に関する共同討議を行った(5月10日15日)ほか、学会参加2回、資料収集・研究交流・情報交換等3回。1、これまでの3年間に亘る儒教的な「礼楽」の思想的背景基盤・思考の枠組みへの着目が、新たな研究視界を開き、この研究手法の重要性が再認識されることに伴い、(1)古典研究には、テキストの分析者側に、作品成立当時の思考法(暗黙の前提的思想基盤)の復元的共有が不可欠であること、(2)従来の研究手法上の限界であった、明示的に典拠を指摘しがたいもの、典拠・素材論では届かぬ受容論にどう向き合うかという課題解決のため、前近代の思考の枠組みの通時的・共時的復元理解を俟っての、古典テキストの注釈・解読のための基礎研究の重要性がより明晰に浮かび上がって来た。

そこで、(3)フォーマルな勅撰和歌集のケースとは対照的な、より通俗的な物語文学の領域に対象範囲を広げ、出典・材源の個別的・書承的な検出だけでは克服できない古典テキスト解釈上の困難を克服するためには、本研究で推進してきた手法が極めて有効かつ不可欠のものであるとの確信を強めた。その試論の一端は「『竹取物語』を読みなおすー神仙ワールドの復元的共有ー」(2015年度和漢比較文学会大会)で述べた。2、『古今集』真名序を規範とする和歌勅撰の思想的背景解明のための歴代真名序の注解作業のうち、これまで不十分であった『新古今和歌集』『新続古今和歌集』真名序注の第二次手稿を作成(未定稿)。このほか、3.(1)和歌表記と密接な関係をもつ仮名文字の成立過程に関し、新出の「なにはづ」木簡(9世紀後半)を実見し平安前期の仮名文字の使用様態に関する新たな知見を得(京都市埋蔵文化財研究所)、(2)清涼殿及び紫宸殿の内部等を実地に拝見し、専門官から詳細な説明をうけるとともに、他分野の研究者との討議を通じ、宮廷儀礼や政務の在り方について、貴重な知見を得た(京都御所)ほか、(3)平安朝漢詩文に関する研究会等に参加し、和漢比較分野における研究交流及び資料調査等を行った。所期の目標のおおよそを達成しているが、なお、補完的に調査確認すべき点、及び一部真名序の注釈作業等の遅れがある。と同時に、古典テキストと思想の問題を扱うには、勅撰和歌集のみならず、その他のジャンルに関しても考察を広く及ぼす必要性を痛感してきており、本課題の発展形としてのあらたな研究手法の開拓のための試論的検証を開始した。礼楽思想に基づく勅撰的な詩歌集の存在の可能性については、東アジア圏における近似の類例を他に見出すには至らなかったが、『古今集』真名序を規範とする和歌勅撰の思想的背景解明のための歴代真名序の注解作業のうち、これまで不十分であった『新古今和歌集』『新続古今和歌集』真名序注の第二次手稿を作成した(未発表)。これまでの検証結果から、本研究で推進してきた手法が有効で不可欠のものであるとの確信を強めるとともに、(ア)古典研究には、テキストの分析者側に、作品成立当時の思考法(暗黙の前提的思想基盤)の復元的共有が不可欠であること、(イ)フォーマルな文学領域だけでなく、より通俗的な作品群に対象範囲を広げての検討が必要であるとの認識のもと、研究期間の1年延長を許可された機会を生かし、これをさらに推進した。(1)平安前期における集団表象としての「神仙ワールド」の復元による初期物語文学の成立のプロセスやテキスト解釈に新生面を拓く成果として、「方術の描かれる物語ー『竹取物語』を読みなおす」、「『竹取物語』の漢文世界ー物語文学における典拠・材源論に向けてー」の論文を発表。(2)「国風研究会」に参加し、高麗史、古代法制史、仏教美術史等の隣接諸分野の研究者との討議を経て、外来文化の摂取・受容における自国文化の変容動態についての学際的な知見を広めた。(3)招待講演「日本古典研究における昭和50年60年代」(国際会議「戦争と平和ー昭和天皇の日本」ワルシャワ大学図書館)、「日本古典研究の方法」(北京日本学研究センター)に参加し、国外の日本古典研究者との研究交流をおこなった。(4)中央欧州における日本学の国際会議の企画に参画し、外来文化との接触を通じたナショナリティーの創出に関する総合的な国際会議の準備に協力した(国際交流基金の支援を受け、本年10月にワルシャワ大学にて開催する運びとなった)。平安から室町時代にかけて編まれた21代にわたる勅撰和歌集編纂を支える思想基盤には,中国を中心とする東アジア儒教文化圏に共通する古代儒教による「礼楽」思想が一貫して存在し,この礼楽思想の日本的展開,我が国固有の変容の成果として勅撰和歌集が編纂され続けたこと,さらに,この「礼楽」の思想的基盤(特に,中国古代音楽論)への認識を深めることが,勅撰和歌集研究に不可欠の要件であること等の諸点を明らかにした。
活性酸素種を利用した新たな骨格筋肥大増強法の開発

活性酸素種および活性酸素種とレジスタンス運動の組み合わせが筋タンパク質合成に関与するシグナル伝達応答に及ぼす影響について検討した。その結果、活性酸素種の投与は、安静時の骨格筋におけるmTORC1を活性化することがわかった。しかしながら、活性酸素種投与はレジスタンス運動により惹起されるmTORC1活性化を亢進させなかった。骨格筋量の維持・増加は、スポーツパフォーマンスの向上のみならず、加齢に伴う筋力低下防止や生活習慣病予防に重要である。我々はこれまでに、活性酸素種を除去する作用を有する抗酸化物質を用いた実験により、活性酸素種も骨格筋肥大の一因子である可能性を明らかにしてきた(Makanae et al. 2013)。このことから、活性酸素種を活用することで、骨格筋肥大を増強出来る可能性が考えられた。本研究の目的は、レジスタンス運動時に薬理的に活性酸素種を増加させることで、筋タンパク質の同化作用を亢進し、骨格筋肥大を増強することが出来るか検証することである。今年度は、レジスタンス運動と活性酸素種投与の併用効果を検討するための予備的実験として、活性酸素種投与そのものが筋タンパク質合成関連シグナル伝達応答に及ぼす効果について検討した。はじめに、C2C12培養筋細胞を用いた実験を行ったが、有益な結果が得られなかった。そこで、動物を用いた実験を行った。11週齢のSprague-Dawley系雄ラットの右後肢腓腹筋に対し、1mMの過酸化水素を筋注射にて投与した。偽薬投与群には、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を筋注射にて投与した。その結果、過酸化水素を投与した群では、筋タンパク質合成関連シグナルのリン酸化が、偽薬投与群に比較して有意に亢進した。以上の結果から、活性酸素種の投与により、筋タンパク質合成が亢進する可能性があることが明らかとなった。骨格筋量の維持・増加はスポーツパフォーマンスの向上のみならず、高齢者の転倒予防や生活習慣病予防の観点からも重要である。我々はこれまでに、活性酸素種を抑制する物質である抗酸化物質を投与することにより、骨格筋肥大が抑制されることを報告した(Makanae et al. 2013)。このことから、活性酸素種が骨格筋肥大の因子の一つであることが示唆された。本研究では、レジスタンス運動時に活性酸素種を薬理学的に増加することで、骨格筋肥大を増強できるか検証する。昨年度の研究により、活性酸素種の一種である過酸化水素の添加によって筋タンパク質合成に関わるシグナル伝達経路が活性化することがわかった。そこで、本年度はレジスタンス運動後に過酸化水素を添加し、活性酸素種投与がレジスタンス運動によるシグナル伝達応答を亢進するか検討した。11週齢のSparague-Dawley系雄ラットの右後肢腓腹筋に電気刺激を与え、筋収縮を惹起した(3秒間のアイソメトリック収縮を10回、5セット)。5セットの運動終了直後、右後肢腓腹筋に1 mMの過酸化水素を投与した。偽薬群にはリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)を投与した。投与1時間後、3時間後に筋サンプルを採取した。その結果、レジスタンス運動によって筋タンパク質合成関連シグナル伝達経路の活性化が確認された。しかしながら、どの時点においても過酸化水素の添加による筋タンパク質合成関連シグナル伝達経路の増強効果は確認されなかった。昨年度の結果から、活性酸素種投与がレジスタンス運動の効果を増強できるものと予想されたが、仮説とは異なる結果が得られたため。また、所属先の変更により、実験系のセットアップに時間がかかっているため。骨格サイズの維持・増加は、スポーツパフォーマンスの向上のみならず、加齢に伴う筋力低下や生活習慣病予防に重要である。我々は、活性酸素種を除去する作用を持つ抗酸化物質を用いた実験により、活性酸素種も骨格筋肥大の一因である可能性を見出した。このことから、活性酸素種を活用することで、骨格筋肥大を増強できる可能性が考えられた。本研究では、レジスンタンス運動時に薬理的に活性酸素種を増加させることで、筋タンパク質合成を高めれらるのか検討する。昨年度までの研究により、活性酸素種の一種である過酸化水素の添加は、安静時の筋タンパク質合成シグナル応答(p70S6K, rpS6のリン酸化)を亢進させるものの、レジスタンス運動後の筋タンパク質合成シグナル応答を増強しないことが明らかとなっていた。本年度は、過酸化水素がレジスタンス運動後のp70S6K, rpS6の上流因子および関連因子の応答に及ぼす効果について検討した。11週齢のSparague-Dawley系雄ラットの右後肢腓腹筋に電気刺激を施すことで筋収縮を惹起した(3秒間のアイソメトリック収縮を10回、5セット)。運動終了直後に右後肢腓腹筋に1mMの過酸化水素を投与した。投与1、3時間後に筋サンプルを採取した。その結果、測定したすべての因子(7因子)において、活性酸素種の有意な効果は認められなかった。本研究の結果から、活性酸素種の投与は、安静時の筋タンパク質合成シグナル応答を亢進するが、レジスタンス運動後のシグナル応答には影響をもたらさないことが示唆された。

しかしながら、活性酸素種投与はレジスタンス運動により惹起されるmTORC1活性化を亢進させなかった。当初予定していた、細胞を用いた実験では有益な結果が得られなかったが、動物実験を前倒しして行うことで、活性酸素種そのものが筋タンパク質合成関連シグナル伝達応答に影響を及ぼすことが明らかとなったことから、おおむね順調であると考えられる。今後は、用いる活性酸素種の種類を変更するなどの方策を行う。あるいは、細胞を用いた実験に立ち返ることで、詳細に検討し直すことも考えている。運動生理学今後はレジスタンス運動と活性酸素種投与を組み合せた運動を行い、活性酸素種の増加がレジスタンス運動により引き起こされるタンパク質合成亢進に及ぼす効果について検討する。また、その詳細なメカニズムについても検討を行う。転属した所属先の会計システム上、研究者の取得した見積もりと実際の物品購入価格等に差が生じるため。当初は細胞実験を予定していたが、動物実験に切り替えたため、物品購入費に差が生じた。不十分な実験試薬等を揃えるために用いる。主に動物実験及び得られたサンプルの解析に必要な物品購入費として使用する予定である。また、必要に応じて再度細胞実験に取り組むことも考えている。
骨髄由来抑制細胞(MDSC)による頭部外傷後神経炎症の抑制効果に関する研究

外傷患者の治療において合併症発生はしばしば重篤な転帰をもたらす。特に頭部外傷患者では感染症が合併(髄膜炎、肺炎)することで脳圧が亢進し、その治療に難渋する事が多い。骨髄由来抑制細胞(Myeloid-Derived Suppressor Cells: MDSCs)は免疫反応を抑制する作用をもつ骨髄由来の細胞であり、敗血症などの慢性期にMDSCsが獲得免疫を抑制し、感染合併症を生じやすくなりICU滞在日数が長期化することが報告されている。MDSCsは免疫分野で注目されている細胞であるが、免疫特権の臓器と呼ばれる中枢神経分野でのMDSCsの役割は十分に解明されていない。本年度は、前臨床研究として、MDSCsの外傷後神経炎症に対する影響を組織学的・機能学的に評価した。頭部外傷マウスモデルを用いてMDSCsは外傷により破綻した血液脳関門を通過し、挫傷脳に浸潤していることが示し、また、MDSCsは頭部外傷後の亜急性期における神経炎症を抑制する役割を担うことを世界に先駆けて見出した。今後は臨床研究として、頭部外傷患者におけるMDSCsの経日的な変化と感染合併症の発生率を検討し、バイオマーカーおよび治療対象としてのMDSCsの役割を証明していく課程にある。損傷脳の免疫・ギムザ染色を用いた形態評価では、Grー1+細胞が血腫および損傷側大脳皮質に局在し、これらの細胞は幼弱・成熟好中球や単球を含むheterogeneousな細胞集団であることが確かめられた。損傷大脳皮質のフローサイトメトリー解析では、CD11b+Gr-1+は、損傷後1日目をピークに減衰し、5日目にはsham群と有意差がなくなった。損傷脳から細胞分離したGrー1+細胞を、健常マウス脾臓から採取したCD4+細胞と共培養すると、細胞濃度勾配に従って、より強い増殖抑制効果が認められた。TSPO-PET画像は、損傷後1週目において、コントロール群では、損傷部位である大脳皮質に強いTSPO集積と、損傷側視床に弱い集積が認められた。Grー1抗体投与群では、大脳皮質から視床にかけての広範囲なTSPO集積が認められた。損傷後6週目では、両群ともに、損傷した皮質は空洞を形成しており、TSPO集積は損傷側視床にのみ認められた。脳全体のTSPO集積を定量評価し両群を比較すると、コントロール群に比して、Grー1抗体を投与したMDSCs除去群は、損傷後1週目は有意に高かった(p=0.03: 0.033±0.0064 vs 0.078±0.0121 ccm)が、6週目は有意差を認めなかった。以上の結果が得られたので、英文論文として発表した。本研究により、前臨床研究として良好な結果を得られたので、現在、臨床研究へと移行していく過程にある。予備検査として、頭部外傷患者におけるMDSCの関与を検討した。ヒトにおけるMDSCのマーカーはCD11b+ CD14-CD33+と報告されている。脳挫傷を受傷した患者の末梢血液と健常人の末梢血液のMDSCの発現を比較した。健常人では認められなかったCD11b+ CD14- CD33+細胞が、脳挫傷患者の血液中には存在することがわかった。つまり、頭部外傷患者の血液中でのMDSCsの存在することを証明しており、今後は、MDSCsの動向と感染合併症との関連を想定し、バイオマーカーおよび治療対象としてのMDSCsの役割をさらに検討していく予定である。

Grー1抗体投与群では、大脳皮質から視床にかけての広範囲なTSPO集積が認められた。損傷後6週目では、両群ともに、損傷した皮質は空洞を形成しており、TSPO集積は損傷側視床にのみ認められた。脳全体のTSPO集積を定量評価し両群を比較すると、コントロール群に比して、Grー1抗体を投与したMDSCs除去群は、損傷後1週目は有意に高かった(p=0.03: 0.033±0.0064 vs 0.078±0.0121 ccm)が、6週目は有意差を認めなかった。以上の結果が得られたので、英文論文として発表した。本研究により、前臨床研究として良好な結果を得られたので、現在、臨床研究へと移行していく過程にある。予備検査として、頭部外傷患者におけるMDSCの関与を検討した。ヒトにおけるMDSCのマーカーはCD11b+ CD14-CD33+と報告されている。脳挫傷を受傷した患者の末梢血液と健常人の末梢血液のMDSCの発現を比較した。健常人では認められなかったCD11b+ CD14- CD33+細胞が、脳挫傷患者の血液中には存在することがわかった。つまり、頭部外傷患者の血液中でのMDSCsの存在することを証明しており、今後は、MDSCsの動向と感染合併症との関連を想定し、バイオマーカーおよび治療対象としてのMDSCsの役割をさらに検討していく予定である。
ビタミンD_3代謝酵素の分子生物学的研究(25-ヒドロキシビタミンD_323-水酸化酵素の同定)

ラットでは,25-ヒドロキシビタミンD_324-水酸化酵素は活性型ビタミンD_3(1,25(OH)_2D_3)により著しく誘導される。そのメカニズムとして,1,25(OH)_2D_3がビタミンDレセプター(VDR)に結合した後,RXRとダイマーを形成し,それがプロモーター領域にあるビタミンDレスポンスエレメント(VDRE)に結合し転写を活性化することを明らかにした。この24-水酸化活性はラット,マウスで顕著であり,モルモットなどの動物種では23-水酸化活性が認められ24-水酸化活性は非常に低い。しかし,2つの酵素の誘導,生理的役割と,チトクロムP-450の酵素の性質を考え合わすと,2つの酵素は同じファミリーである可能性が高い。そこで,24-水酸化酵素のcDNAを用いて23-水酸化酵素cDNAライブラリーをスクリーニングした。4週齢のモルモットに2.5μg/日の1,25(OH)_2D_3を2日連続投与し,腎臓からmRNAを調製した。ラットのcDNAのコーディング領域をプローブとしnorthernblottingを行った結果,ラットより僅かに小さい3.2kbのバンドが検出できた。したがって,モルモットにもラットの24-水酸化酵素と相同性を持つ遺伝子が存在することが明らかとなった。さらに,このmRNAは活性型ビタミンD投与により誘導されることから,モルモットの24-,または23-水酸化酵素であることが期待される。そこで,クローニングためにmRNAのサイズ分画を行い,oligo(dT)プライマーによりcDNAを合成しλgt10を用いライブラリーを作製した。およそ30万のプラークをスクリーニングしたところ,6つのポジティブシグナルが得られた。しかし,これらのクローンのインサートサイズは0.91.2kbpとnorthernblottingから予想されたものより小さかった。現在,この6つのロリーンの塩基配列の決定,新たにランダムプライマーを用いたcDNAライブラリーの作製,5 ́-RACE法を進めている。
細菌性腹膜炎に対するマイクロバブル生理食塩水による腹腔内灌流洗浄の有効性

生理食塩水洗浄群(S)、マイクロバブル生理食塩水洗浄群(M)にわけて腹腔内洗浄を行った。洗浄のタイミングは30分後、60分後洗浄量については10ml 20mlにて検討したところ、いずれもS群、M群で生存率に有意な差は認められかった。生存率に一番違いのあった条件は以下であった。(30分後20mlの洗浄での生存率(S)群55%、(M)群80% (n=9) Log-rank検定P=0.28)また洗浄液中にグラム陰性桿菌が線維組織とともに集塊を形成している像が認められ、集菌作用の可能性が示唆された。本研究はラットの細菌性腹膜炎モデルに対して、マイクロバブル生理食塩水で腹腔内を洗浄し、腹腔内の洗浄効果、生存率の改善に影響を及ぼすかどうかを検証した。ラット腹膜炎モデルは盲腸(小腸バウヒン弁を温存して)をsilkで結紮したのち、18G針で2回盲腸を穿刺し盲腸を圧迫して作成する。ラットの2回穿刺モデルでは2PODまでに約60%の生存率であった。4回穿刺モデルを作成し、その生存率は020%で安定した腹膜炎モデルを作成することができるようになった。当初の計画どおり長時間の腹膜潅流をすると、生食群での生存率も上昇し、マイクロバブルでの洗浄との比較が困難となる。腹腔鏡下での洗浄では少量でも洗浄効果が有利となるため、生存率に差ができる洗浄量について検討した。洗浄のタイミングは30分後、60分後洗浄量については10ml、20mlにて検討したところ、いずれも生理食塩水洗浄群、マイクロバブル生理食塩水洗浄群で生存率に有意な差は認められなかった。また、マイクロバブルの細菌凝集作用の可能性について検討した。マイクロバブルで腹腔内を洗浄すると白色の浮遊物が出現(生理食塩水での洗浄群ではみられない)し、洗浄液のグラム染色でグラム陰性桿菌が線維組織とともに集塊を形成している像が認められた。in vitroでの検証をすべく、ratの糞塊1gに対し生食3mlで作成した懸濁液に、それぞれ生理食塩水とマイクロバブル生理食塩水を注入し、凝集作用があるかを検討したが、凝集物は両者の群において観察されず、検鏡にても両群に差は確認できなかった。マイクロバブル生理食塩水での洗浄にて生存率の改善が見られなかったため、オゾンナノバブル水での洗浄を施行した。洗浄タイミング、洗浄量については同様にして検討したところ、いずれも生理食塩水洗浄群、オゾンナノバブル水生理食塩水洗浄群で生存率に有意な差は認められなかった。1.腹膜炎モデルの作成→自然経過(生存率):盲腸(小腸、バウヒン弁を温存して)をsilkで結紮したのち、18G針で2回盲腸を穿刺し盲腸を圧迫して便を絞りだす。腹腔内に腸管を戻し、腹壁をモノフィラメント1層で閉腹した。200250gのラットの2回穿刺モデルでは2PODまでに約60%の生存率があり(他の文献上では025%の死亡率)、4回穿刺モデルを作成し、その生存率が020%で安定した腹膜炎モデルを作成することができるようになった。2.生理食塩水、マイクロバブルでの洗浄量・タイミングの決定:当初の計画どおり長時間の腹膜潅流をすると、生食群での生存率も上昇し、マイクロバブルでの洗浄との比較が困難となる。腹腔鏡下での洗浄では十分な洗浄が困難で少量でも洗浄効果があることを証明できればよいので、生存率に差ができる洗浄量について検討した。【研究成果】1.洗浄タイミング・量:洗浄のタイミングは30分後、60分後で、洗浄量については10ml、20mlにて検討したところ、いずれも生理食塩水洗浄群(S)、マイクロバブル生理食塩水洗浄群(M)で生存率に有意な差は認められなかった。(30分後20mlの洗浄での生存率(S)群55%、(M)群80% (n=9) Log-rank検定P=0.28)2.マイクロバブルの細菌凝集作用の可能性:マイクロバブルで腹腔内を洗浄すると白色の浮遊物が出現し(生理食塩水での洗浄群ではみられない)、洗浄液のグラム染色でグラム陰性桿菌が線維組織とともに集塊を形成している像が認められた。2群の生存率に差が認められず、マイクロバブルの洗浄効果の優意性を証明するに至っていない。しかし、マイクロバブルに細菌の凝集作用がある可能性が高く、客観的データでそれを示せれば有効性を証明できる可能性がある。

マイクロバブル生理食塩水だけでは洗浄効果が弱く、生理食塩水との差が証明できなかった。しかし、細菌凝集作用を利用することで洗浄効果は期待できると考える。マイクロバブルの洗浄効果を高めるため、マイクロバブルの安定化(マイクロバブルは短時間で消失する性質がある)を図る必要がある。少量の添加剤(Palozens R-004大豆から精製した界面活性剤)を使用し、マイクロバブルの安定化ができる報告があり(Characterization of asoybean oil-based biosurfuctant and evaluation of its ability to form microbubbles, Bioresource Techno.101 3711-3717.2010)これを使用して再実験を試みる予定である。実験用動物はSDラット1匹2,300円程度と考え、年間100匹程度は必要と考えられる。飼育費などと併せて1年間で50万を計上する。また、研究成果を国内、海外で発表を行うための旅費、投稿料などに30万円を計上する。