hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
サプライチェーンにおける知識統合プロセス・モデルの構築と教育システムの開発

4.SCMの教育システムについて、既存のマネジメント・ゲームのツールに関する文献調査を行った。5.上記の概念モデルに関する研究を踏まえて、サプライチェーンにおけるパフォーマンスのトレード・オフ関係やそれを克服するために、組織間で知識を統合するしくみを組み込んだ、SCMの教育システムのプロトタイプを開発した。6.中野、連携研究者(秋川卓也)、研究協力者(島津誠)による打ち合わせを計5回実施した。打ち合わせでは、文献調査、概念モデル、インタビュー調査、論文作成、学会発表およびシステム開発に関する検討を行った。また、次年度の方向性についても議論を行った。7.情報収集を目的として、組織学会(神戸大学)、管理会計学会(甲南大学)、日本物流学会(東海大学)、サプライチェーンカウンシルのセミナーに参加した。1.昨年度構築した、サプライチェーン・プロセスの変革の様子を記述する、概念的な状態遷移モデルの妥当性、有効性を検証するために、企業へのインタビュー調査を行った。対象業種・回数は、食品メーカー1回、化粧品メーカー1回、家電メーカー2社・2回、合計4社・4回である。あわせて、概念モデルの理論的な位置づけや貢献を検討するために、若干の文献調査を行った。2.上記の概念モデルと企業の事例による検証結果を、日本物流学会(愛知学院大学)にて発表した。また、研究成果について、米国出張し、米国研究者(テネシー大学、ライト州立大学)との情報交換を行った。これらの発表や情報交換で得たコメントを踏まえて、研究論文を作成した。3.SCMの教育システムについて、昨年度に引き続き、既存のマネジメント・ゲームに関する文献調査を行った。4.昨年度にプロトタイプを開発した、SCMの教育システムに改良を加えるとともに、効果測定とシステム評価をねらいとして、学生による運用実験を行った。あわせて、運用環境の整備を行った。5.中野、連携研究者(秋川卓也)、研究協力者(島津誠)による打ち合わせを計5回実施した。打ち合わせでは、概念モデル、インタビュー調査、論文作成、学会発表、システム開発、運用実験に関する検討を行った。また、SCMの研究に関する情報収集を目的として、経営情報学会(明治大学)、サプライチェーンカウンシルのセミナー(ライト州立大学)に参加した。
膀胱癌を用いたDNAチップ技術によるシスプラチン耐性遺伝子の同定とその臨床応用

以前我々が樹立したヒト精巣胎児性癌株:TTSC-3をヌードマウスに移植した後、ソスプラチンを投与し、シスフフチンの抗腫瘍効果とTTSC-3の遺伝子発現の変化をcDNAアレイにて検討した。シスプラチンの投与量が低容量では抗腫瘍効果は認められなかったが、高容量では著明な抗腫瘍効果が認められた。中等度の容量を用いると、腫瘍の大きさはほとんど変化せず、細胞分化が誘導されていた。その際の遺伝子発現変化をcDNAアレイを用いて検討したところ、アポトーシス誘導に関わっている因子であるTumor necrosis factor receptor 1、Caspase 8、Apaf 1の遺伝子発現の増強が観察された。以上の結果から、シスプラチンは精巣胎児性癌に対して分化を誘導し、Tumor Dormancyを誘導できることが明かとなった。その際に何らかの細胞におけるアポトーシス誘導がその分化誘導に関与している可能性が示唆された。シスプラチン耐性克服因子として癌細胞にのみアポトーシス誘導効果を有するTumor necrosis factor-related apoptosis-indudng ligand(TRAIL/Apo-2L)に関して検討した。標的細胞として、3種類の膀胱癌株化細胞(T24,J82,HT1197)と3人の膀胱腫瘍患者より手術時に採取した膀胱癌組織より作製した膀胱癌初期培養細胞を用いた。TRAILとシスプラチンとを併用したところ、T24細胞に対して相乗的殺細胞効果が認められた。シスプラチン耐性T24細胞、他の膀胱癌株化細胞であるJ82,HT1197細胞、膀胱癌初期培養細胞を標的細胞に用いても同様に相乗的殺細胞効果が認められた。以上の結果から、膀胱癌に対して、アポトーシス誘導によるTRAILとシスプラチンとの併用療法の可能性が示唆された。Cisplatin[CDDP]耐性克服因子としてTumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL/Apo-2L)に関して検討した。また、膀胱癌細胞のTRAIL、抗癌剤に対する感受性は24時間のMTT試験にて検討した。用いた膀胱癌細胞はTRAILに対して種々の感受性を示していた。TRAILとCDDPとを併用したところ、T24細胞に対して相乗的殺細胞効果が認められた。CDDP耐性T24細胞、他の膀胱癌株化細胞であるJ82,HT1197細胞、膀胱癌初期培養細胞を標的細胞に用いても同様に相乗的殺細胞効果が認められた。また、この際のCDDPの濃度は低濃度(0.1μg/ml)でも認められた。CDDPの誘導体であるCarboplatinとTRAILとの併用によってもT24細胞に対して相乗的な殺細胞効果が認められたが、Trans-DDPとTRAILとの併用によってはT24細胞に対して相反的な殺細胞効果が認めらなかった。以上の実験はTRAILとADRとで膀胱癌細胞を同時に処理したが、その処理の順序を変えても相乗的な殺細胞効果が認められるのかどうかを検討したところ、TRAILとCDDPとの同時処理、またはCDDP処理後TRAIL処理にて強い殺細胞効果が認められた。TRAILとCDDPとの併用時におけるT24細胞のアポトーシスをHoechst33258染色にて検討すると、TRAIL単独またはCDDP単独処理に比較して、明らかにアポトーシスを起こしている細胞が増加していた。以上の結果から、膀胱癌に対して、アポトーシス誘導によるTRAILと副作用の少ない低濃度CDDPとの併用療法の可能性が示唆された。以前我々が樹立したヒト精巣胎児性癌株:TTSC-

3をヌードマウスに移植した後、シスプラチンを投与し、シスプラチンの抗腫瘍効果とTTSC-3の遺伝子発現の変化をcDNAアレイにて検討した。シスプラチンの投与量が低容量(1mg/kg/week)では抗腫瘍効果は認められなかったが、高容量(5mg/kg/week)では著明な抗腫瘍効果が認められた。中等度の容量(3mg/kg/week)を用いると、腫瘍の大きさはほとんど変化せず、投与10週目には病理組織学的には軟骨、Teratomaが認められ、細胞分化が誘導されていた。その際の遺伝子発現変化をcDNAアレイを用いて検討したところ、アポトーシス誘導に関わっている因子であるTumor necrosis factor receptor 1、Caspase 8、Apaf1の遺伝子発現の増強が観察された。以上の結果から、シスプラチンは精巣胎児性癌に対して分化を誘導し、Tumor Dormancyを誘導できることが明かとなった。その際に何らかの細胞におけるアポトーシス誘導がその分化誘導に関与している可能性が示唆された。また、副作用の少ない中等度の容量のシスプラチン投与によるTumor Dormancy療法の可能性も示唆された。
ダイオキシンにより活性化されるシグナル伝達系とその標的遺伝子

ダイオキシンの生体に対する多様な毒性を説明する作用機構に関してはほとんど明かになっていない。そこで、標的遺伝子をチトクロームP-4501A1の転写活性化を指標として、ダイオキシンが引き起こす細胞内のシグナル伝達系を検討した。そこで、ダイオキシン投与によって各々の因子の活性が上昇するかどうかを調べた。たリン酸基の取り込みによって調べた。ヒトHepG2細胞において、TCDD投与後30分をピークとする一過性のERK1/2の上昇を検出した。また、ERK1/2のリン酸化チロシン特異抗体により、チロシン残基がリン酸化されたERK1/2の量をTCDD投与後30分のポイントで定量すると、ERK2が有意にリン酸化されていることが明かとなった。2)MEK阻害剤はTCDDによるCYP1A1の誘導を阻害したが、OPによりCYP1A1の誘導は阻害しなかった。PD98059は、MEK阻害剤として働くとともに、Ahレセプターのアンタゴニストとしても作用することが最近報告された。したがって、TCDDによるCYP1A1の誘導のMEK阻害剤による抑制は、PD98059によるAhレセプターのアンタゴニストとしての阻害効果で、ERK1/2の活性化の阻害によるものではないと考えられた。このことは、ERK1/2の活性化による標的遺伝子は、CYP1A1とは異なったものであろうと考えられた。3)免疫担当マウスB細胞CH12を用いて、ダイオキシンによって影響される遺伝子のカタログを作ることを目指した。B細胞CH12をダイオキシン処理して、LPS(リポ多糖)による免疫反応に関与する遺伝子群の発現がどのように変化するかを調べた。ダイオキシン処理によってB細胞に誘導される遺伝子をディファレンシャル・ディスプレイ法で検出できた。これらのことは、TCDDの生物毒性として、Ahレセプターを介した毒性と、介さない、細胞内シグナル伝達系を活性化して細胞内の情報伝達系を乱すことによる、TCDDの毒性発現の機構が存在していることを示唆している。都市ゴミの焼却炉を最大の発生源とするダイオキシンは、年々地球規模の汚染が広まってきているという報告がなされている。ダイオキシンの毒性は多様であり、免疫機能の低下、催倚性、ウェィスティング症候群、発癌のプロモーションなどであり、我々人類を含めた哺乳動物にとって大きな問題となりつつある。しかしながら、ダイオキシンの生体に対する多様な毒性を説明する作用機構に関してはほとんど明かになっていない。チトクロームP-4501A1のMEKを介した新しい誘導経路として、下記のような機構が考えられる。(I) MEKの上流にはRaf-1,Ras,などがあり、下流にはERK1/2があって、シグナルを伝達している。1) ERK1/2の活性上昇の検出には、basic myelin protein(BMP)を基質としたリン酸基の取り込みによって調べた。

また、ERK1/2のリン酸化チロシン特異抗体により、チロシン残基がリン酸化されたERK1/2の量をTCDD投与後30分のポイントで定量すると、ERK2が有意にリン酸化されていることが明かとなった。。このことは、TCDDの生物毒性として、Ahレセプターを介した毒性以外に、細胞内シグナル伝達系を活性化して細胞内の情報伝達系を乱すことによる、TCDDの毒性発現の機構が存在していることを示唆している。ダイオキシンの生体に対する多様な毒性を説明する作用機構に関してはほとんど明らかになっていない。そこで、標的遺伝子をチトクロームP-4501A1の転写活性化を指標として、ダイオキシンが引き起こす細胞内のシグナル伝達系を検討した。そこで、ダイオキシン投与によって各々の因子の活性が上昇するかどうかを調べた。1)ERK1/2の活性上昇の検出には、basic myelin protein(BMP)を基質としたリン酸基の取り込みによって調べた。ヒトHepG2細胞において、TCDD投与後30分をピークとする一過性のERK1/2の上昇を検出した。また、ERK1/2のリン酸化チロシン特異抗体により、チロシン残基がリン酸化されたERK1/2の量をTCDD投与後30分のポイントで定量すると、ERK2が有意にリン酸化されていることが明らかとなった。2)MEK阻害剤はTCDDによるCYP1A1の誘導を阻害したが、OPによりCYP1A1の誘導は阻害しなかった。PD98059は、MEK阻害剤として働くとともに、Ahレセプターのアンタゴニストとしても作用することが最近報告された。したがって、TCDDによるCYP1A1の誘導のMEK阻害剤による抑制は、PD98059によるAhレセプターのアンタゴニストとしての阻害効果で、ERK1/2の活性化の阻害によるものではないと考えられた。このことは、ERK1/2の活性化による標的遺伝子は、CYP1A1とは異なったものであろうと考えられた。3)免疫担当マウスB細胞CH12を用いて、ダイオキシンによって影響される遺伝子のカタログを作ることを目指した。B細胞CH12をダイオキシン処理して、LPS(リポ多糖)による免疫反応に関与する遺伝子群の発現がどのように変化するかを調べた。ダイオキシン処理によってB細胞に誘導される遺伝子をディファレンシャル・ディスプレイ法で検出できた。これらのことは、TCDDの生物毒性として、Ahレセプターを介した毒性と、介さない、細胞内シグナル伝達系を活性化して細胞内の情報伝達系を乱すことによる、TCDDの毒性発現の機構が存在していることを示唆している。
個人・評価対象・評価項目のすべてを記述する統合型プリファレンスマップの構築

本研究では、プリファレンスマップを構築するデータの各水準である「個人」「評価項目」「製品」のそれぞれを視覚的に表現するためのアルゴリズムを構築することで、それぞれを同一の地図上で表現することを可能にした。また、開発したアルゴリズムを発展させ「個人」の集合体である「グループ」を視覚的に表現するアルゴリズムの開発も行った。今後はデータのクラスタ構造の仮定を度の位置について生じる結果の違いを検討する。本研究の目的である「複数の消費者が複数の製品を複数の評価項目で判定した」というデータから消費者のニーズをより詳細に探索するために,本研究では,消費者・評価項目・評価対象のすべてが同一空間に配置され消費者の好みが個人やグループ単位で明らかになる,『統合型プリファレンスマップ(Synthetic Preference Map)』の作成技術の開発を行う。具体的には、3つのアルゴリズム1.製品と嗜好と個人差の同時マッピング,2.同一嗜好傾向・評価傾向のあるグループの同定,3.個人・グループの嗜好傾向のマッピング,の開発を行う.平成27年度に得られた成果としては、三相主成分分析法を用いることにより、1.嗜好の個人差の傾向をマッピングする手法を開発した。本手法では、従来無視されていた個人差について、各個人が各次元に対して特徴パラメータを持つことを仮定し、各個人の持つ特徴が低次元空間で表現される。人工データおよび実際の評価データに対して開発された統計モデルを用いて分析することで手法の効果検証を行った結果、個人差と刺激差の両方の存在を仮定することによって適切なデータに対しては従来法よりもデータ説明力が大幅に向上することが確認され、実データからも有用な知見が見いだされることを確認した。今回の成果から、個人やグループの位置関係や嗜好傾向が明らかになるという点でマーケティングにおける小規模市場の探索に寄与するとともに,従来は平均化され失われていた個人レベルのデータを活用することができ,書籍や車など個人によって需要の傾向が異なるような製品に対しての分析の有効性が見込まれる.また、特徴を用いて個人をクラスタリングすることにより、新たな購買層の発見や市場ニーズの探索にも用いられる可能性がある。これらのことから平成28年度の研究では、同一の嗜好傾向を持つグループの同定を目標にしている。本研究ではプリファレンスマッピングに適した三相主成分分析を用いた数理的統計モデルの開発を行った.具体的にはまず,既存の手法の拡張可能性について調査し,それらの数理的な背景に関しての知見を得、統計学的な多変量解析モデルを構築した.その後統計モデルから各個人・製品・評価項目に与えられるパラメータを推定するアルゴリズムを考案し,それらをマッピングするアルゴリズムを開発した.次に、コンピュータ上でアルゴリズムを実現した.そのためにまず,データと統計モデルとのずれを最小化する最小二乗基準を数理的に表現し、コンピュータプログラム上で表現した.これにより,分析の結果得られたパラメータがデータをどの程度説明できているのかが明らかにできた.次に、個人・製品・評価項目のそれぞれに与えられるパラメータをデータの反映がよりよくなるよう繰り返し更新する、反復最小二乗プログラムを作成した.多変量解析モデルの妥当性を確認するために,統計モデルに合わせたデータをパラメータの真値を定めたもとで人工的に発生させ,プログラムによるデータ説明率を測定した結果、真値を再現できていることが確認された。また、分析によって得られた結果と従来法で得られた結果の比較を行い,従来法では得られなかった個人のパラメータが適切に推定されていることを確認した。さらに,個人の差違を分析に取り入れることによる評価語と製品の位置関係の変化ついて考察するために、従来法で得られるマップと提案手法で得られるマップにおいて製品や評価項目の付置がどのように変化しているのかを計測した結果、製品の配置は維持されていることが確認できた。また同時に従来法とデータの説明率の面からも比較し、データの説明率が向上していることを確認した。本研究では,以下の2点を明らかにした。第一に,データの各水準である「個人」「評価項目」「製品」のそれぞれのパラメータを視覚的に明らかにするアルゴリズムを開発することによって以下のことを明らかにした。製品と評価項目と個人が同時に表現されることにより,それぞれを近接度によって評価することが可能になり,例えば「高級な」に近い製品は高級感が高いと評価されていることや,「高級な」に近い評価者は高級感を重視していること,また各評価者は近接している製品を好ましく思っているということを明らかにした。つまり,「個人」「評価語」「製品」の近接度を同一の地図上で判断することを可能にした。また,本研究内ではこれらの判断の妥当性を測定する指標の提案・検証も同時に行った。次に,開発したアルゴリズムを発展させることにより「個人」の合成体である「グループ」を視覚的に明らかにするアルゴリズムの開発を行うことで,個人とその価値判断と製品と嗜好を統合的に扱うことにより,個人を分類するための情報が飛躍的に増加し,より集団間の違いが表れるような個人の分類が明らかになることが分かった。つまり,データを統合的に扱うことにより,その集団内においては「価値判断の傾向」や「個人と製品との近接度の傾向」が類似していることがあらかじめ明らかである「集団」を同定することが可能である。また,分析と分類を同時に行うことは,複数の分析を組み合わせるTandem analysisの課題の解決にもつながっている。これらの研究の過程で,データからグループを同定するためにクラスタ構造を組み込む対象は,データの形式や分析法の違いにより,非常に多様性が大きく,本研究で行ったクラスタリングはその一つであることが分かった。

今後は,個人をクラスタリングするにあたりデータのどの部分にクラスタ構造を組みこむべきか比較検討を行うことを計画している。本研究では、プリファレンスマップを構築するデータの各水準である「個人」「評価項目」「製品」のそれぞれを視覚的に表現するためのアルゴリズムを構築することで、それぞれを同一の地図上で表現することを可能にした。また、開発したアルゴリズムを発展させ「個人」の集合体である「グループ」を視覚的に表現するアルゴリズムの開発も行った。今後はデータのクラスタ構造の仮定を度の位置について生じる結果の違いを検討する。平成28年度では平成27年度で得られた1.商品と嗜好と個人差の同時マッピングの多変量解析モデルを利用し,2.同一嗜好傾向もしくは評価傾向のあるグループの同定,3.個人・グループの嗜好傾向のマッピング,の手法の開発を行う新たなプログラムの開発と実装,評価を行う.具体的な手順は27年度と同一であり、モデリングにおける数理的性質の調査→数理的統計モデルの開発→最適化アルゴリズムの開発→マッピング技術の開発→コンピュータ上での実現→モデルを反映した人工データへの適用→その妥当性の判断→実際の製品評価データへの適用と妥当性・新規性の判断→全体的な手法の理論的・数理的な検証という順で開発を行う.グループの同定では、多変量解析的モデリングにおいて個人の所属クラスターを表すパラメータとクラスター平均を示すパラメータを導入し、刺激の特徴・個人の所属クラスタ・クラスタ中心の特徴・変数の軸への影響の各パラメータを同時に推定するアルゴリズムの開発・実装を行う.アルゴリズムには反復最小二乗表を用いる予定である。また、嗜好のマッピングでは、平成27年度で得られたマップをもとに,個人と製品との位置関係の測定を行い、その距離と好みとの関係を数理的にモデル化するとともに、三相コレスポンデンス分析のなどのマッピング方位も導入し、比較検討を行う.また、選好を説明変数、距離を目的変数として回帰式を立て、分析者が任意の基準を用いて、評価者の嗜好の範囲を低次元空間内にマッピングできるアルゴリズムを構築する.嗜好のマッピングと実際のデータとの整合性が取れなかった場合は、嗜好データのうち、評価項目で説明される部分のみをマッピングすることを考える.重回帰分析を用いて評価項目で予測可能な部分を計算し、その推定値を嗜好データとしてマッピングする。28年度が最終年度であるため、記入しない。多変量解析28年度が最終年度であるため、記入しない。
歯周病における細胞内グルココルチコイド活性化酵素11β-HSD1の役割の解明

メタボリックシンドロームにおいて脂肪組織における細胞内グルココルチコイド活性化酵素11β-HSD1(11β-hydroxysteroiddehydrogenasetype1)の活性化が重要な役割を担うことが近年明らかになってきた。メタボリックシンドロームは脂肪組織の慢性炎症状態と考えられており、歯周組織の慢性炎症状態である歯周病における11β-HSD1の役割について検討した。その結果、歯周病患者の歯肉組織においては健常者の歯肉組織に比して11β-HSD1の発現が有意に亢進しており、また、歯周ポケットの深さと11β-HSD1遺伝子発現との間には有意な正の相関関係が認められたことから、11β-HSD1発現亢進が歯周病発症に関与する可能性が示唆された。メタボリックシンドロームにおいて脂肪組織における細胞内グルココルチコイド活性化酵素11β-HSD1の活性化が重要な役割を担うことが近年明らかになってきた。メタボリックシンドロームは脂肪組織の慢性炎症状態と考えられており、他の組織の慢性炎症状態における11β-HSD1の関与も報告されてきている。本研究では、歯周組織の慢性炎症状態である歯周病における新たな治療ターゲットとして11β-HSD1の役割について解明し、メタボリックシンドロームの新規治療薬として期待されている11β-HSD1阻害剤による歯周病治療の可能性を探求する。本年度は、まず健常人および歯周病患者から歯周組織を採取し、11β-HSD1の発現についての比較検討を行った。健常人の歯周組織は矯正治療のために抜歯する際に付随して取れる歯周組織を利用し、歯周病患者の歯周組織は歯周病治療のために切除された歯周組織を利用した。歯周組織の採取に当たっては、患者に研究の必要性や意義についての十分な説明を文書で提示し、説明内容が十分に理解されたことを確認した上で同意を得てから行った。11β-HSD1の発現の検討には、RT-PCR法による11β-HSD1 mRNA発現量の測定を行った。今までに得られた結果では、健常人の歯周組織および歯周病患者の歯周組織において11β-HSD1 mRNAの発現が確認されたが、健常人と歯周病患者とで11β-HSD1 mRNA発現量に有意な差は認められていない。今後さらに症例数を増やして11β-HSD1 mRNA発現量の測定を行い、健常人と歯周病患者との間にどのような差異が見られるか検討するとともに、実験動物を用いて歯周病モデルを作製し歯周病における11β-HSD1の役割について検討を行う。今までに得られた結果では、健常人の歯周組織および歯周病患者の歯周組織において11β-HSD1 mRNAの発現が確認され、健常人と歯周病患者を比較すると歯周病患者の方が11β-HSD1 mRNA発現量が増加する傾向が見られた。今後さらに症例数を増やして11β-HSD1 mRNA発現量の測定を行い、健常人と歯周病患者との間に統計学的に有意差が見られるかどうか検討するとともに、実験動物を用いて歯周病モデルを作製し歯周病における11β-HSD1の役割について検討を行う。メタボリックシンドロームにおいて脂肪組織における細胞内グルココルチコイド活性化酵素11βーHSD1の活性化が重要な役割を担うことが近年明らかになってきた。

メタボリックシンドロームは脂肪組織の慢性炎症状態と考えられており、他の組織の慢性炎症状態における11βーHSD1の関与も報告されてきている。本研究は、歯周組織の慢性炎症状態である歯周病における新たな治療ターゲットとして11βーHSD1の役割について解明し、メタボリックシンドロームの新規治療薬として期待されている11βーHSD1阻害剤による歯周病治療の可能性を探究することを目的として行った。研究方法としては、健常人および歯周病患者から歯周組織を採取し、11βーHSD1の発現についての比較検討を行った。健常人の歯周組織は矯正治療のために抜歯する際に付随して取れる歯周組織を利用し、歯周病患者の歯周組織は歯周病治療のために切除された歯周組織を利用した。11βーHSD1の発現の検討には、RTーPCR法による11βーHSD1 mRNA発現量の測定を行った。その結果、歯周病患者の歯肉組織においては健常者の歯肉組織に比して11βーHSD1の発現が有意に亢進していることを見出した。また、歯周ポケットの深さと11βーHSD1遺伝子発現との間には有意な正の相関関係が認められた。これらの結果より、11βーHSD1遺伝子発現亢進が歯周病発症に関与する可能性が示唆された(平成24年秋季日本歯周病学会、アメリカ歯周病学会にて発表)。今後は、歯周病における11βーHSD1の役割をさらに明らかにし、メタボリックシンドロームの新規治療薬として期待されている11βーHSD1阻害剤を歯周病治療に応用するために、歯周病モデル実験動物を用いて11βーHSD1阻害剤の歯周病に対する効果を検討して行きたい。健常者および歯周病患者の歯肉採取症例数が予想していたよりも少なく、RT-PCR等の実験データがまだ十分に集まっていないため。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究分担者以外にも健常者および歯周病患者の歯肉採取に協力してもらい、RT-PCR等の実験データをさらに増やして、健常者と歯周病患者の11β-HSD1m RNA発現量に統計学的に有意な差があるかどうかを検討する。
光受容の分子機構

光生物学の目標は、光捕獲の量子過程から最終的な生物学的反応が現れるまでの長い反応鎖を一連の素過程に分けて解析し、生命現象に対する光の作用を統合的に理解することである。本重点領域研究では、光受容関連タンパク質、光受容膜、更には光受容細胞などの各階層的構造で起こる素過程について、分子生物学や細胞生物学で開発された新技術を導入して、光受容関連分子の構造のみならず、光受容膜の高次構造形成過程やその機能まで解析することを目的として、研究が推進されている。本総括班は、本重点領域研究の進展状況を常に正確に把握し、その成果の評価を厳正且つ的確に行い、計画研究及び公募採択による研究が所期の目標に向って効率よく展開するために、然るべき助言や指導を与え、且つ計画班間の連絡を緊密にして互いに新しい研究成果を得るように協力する道を拓くことを目的として活動している。本総括班は、研究代表者及び各計画研究班の代表者などから成る5名の班間研究連絡調整委員と、研究成果を評価する10名の成果評価委員とから構成されている。本年度は総括班会議を63年7月と10月、平成元年2月の三回開催し、第一回会議では本年度の事業計画を検討・決定した。第三回会議では、26名の計画研究分担者及び10名の公募採択者が行った研究報告を二日間にわたって受け、各班員について個別に厳正な採点を行い、次年度の研究計画に対して助言を与えた。10月には仙台で公開シンポジウムを開催し、進展の著しい6課題について班員が講演を行い、百余名が参加した。本年度より新しく、各計画班の枠を越えて研究交流を行うため、班間交流フォーラムを四回開催した。8月及び2月にはニュースレターLUMINIS3号及び4号を発刊し、また2月には昭和63年度研究成果報告書を発刊し、本重点領域研究関係者及び関連分野の研究者に配付した。
浮き上がり機構を持つ超高層免震建物の実挙動解明とそれを考慮した設計法の構築

近年は塔状比が高い超高層建物に免震構造を適用する例が増えている。その際、積層ゴムアイソレーターの引張破壊を避けるために浮き上がり機構を設ける場合があるが、その挙動の詳細は明らかになっていない。そこで、以下の検討を行った。(1)浮き上がり機構を有し、かつ多くの地震計が設置されている東京工業大学の超高層免震建物を対象とし、地震時の挙動を精度良く再現できる立体フレームモデルを作成した。(2)そのモデルを用いて、入力を様々に変化させた地震応答解析を行い、建物設計時の想定より危険側の応答となる可能性があることを把握した。普及が急速に進んでいる超高層免震建物では、その構造を成立させるために浮き上がり機構が採用されることがあるが、浮き上がり後の上部構造の挙動は、構造設計時に的確に考慮されていないことが多い。通常の免震構造のように浮き上がりを考慮しないせん断棒モデルの時刻歴応答解析と、その結果を用いた各部の静的解析を行うだけでは大きな誤差が生じると考えられる。しかし、浮き上がり後は上部構造が長周期化するため、免震層が持つ固有周期に近づくこととなり、適切な免震効果が得られない可能性がある。浮き上がり機構を免震構造の適用拡大のためのツールの一つとして位置づけるためには、既往の実務的な時刻歴応答解析モデル化や、免震周期・減衰および上部構造周期など動的特性に基づく応答評価法に、浮き上がりの影響を的確に加味する必要がある。そこで、1年目では浮き上がり挙動を正確に把握するために、東北地方太平洋沖地震で強震観測に成功した東京工業大学の超高層免震建物(J2棟)を対象とし、その観測記録を詳細に分析した。それにより、構造設計時の予測と実際の挙動が概ね一致していることや、浮き上がり前の動的特性の変動などを把握した。また、その観測された挙動をほぼ正確に再現できるフレームモデルを構築した。特に、U型鋼材ダンパー・オイルダンパーの履歴モデルを作成し、観測データとの比較を通して、解析精度を向上させた。本研究課題1年目として、十分な成果が得られたため、自己点検による評価では「(2)概ね順調に進展している」を選択した。以下にその理由について述べる。東北地方太平洋沖地震における東京工業大学の超高層免震建物の観測記録を詳細に分析し、超高層免震建物の地震時の実挙動を詳細に把握することができた。その成果は国際シンポジウムInternational Association for Bridge and Structural Engineering (IABSE 2015)で発表されている。また、次の研究ステージである詳細なフレーム解析モデルの構築についてはほぼ終わっており、そのモデルを用いた様々な検討結果と合わせ、その成果はEarthquake Spectraに投稿するべく準備中である。この状況は、これは計画時に想定したペースとほぼ同等である。よって、概ね順調に進展していると判断できる。普及が急速に進んでいる超高層免震建物では、その構造を成立させるために浮き上がり機構が採用されることがあるが、その浮き上がり挙動が、構造設計時に的確に考慮されていないことが多い。具体的には、通常の免震構造のように浮き上がりを考慮しないせん断棒モデルの時刻歴応答解析と、その結果を用いた各部の静的解析により検討される例がみられるが、それでは実際の挙動に対し大きな誤差を生じる可能性がある。すなわち、浮き上がり後は各部の剛性バランスが変化し、適切な免震効果が得られない可能性がある。浮き上がり機構を免震構造の適用拡大のためのツールの一つとして位置づけるには、既往の実務的な時刻歴応答解析モデル化に、浮き上がりの影響を的確に加味する必要があると考えられる。2年目では、1年目で構築した東京工業大学の浮き上がり機構をもつ超高層免震建物(J2棟)のフレームモデルを用いて様々な解析検討を行った。それにより、12方向の入力を考慮することで、設計時に想定されているよりも小さい入力で浮き上がりが始まること、2レベル2相当の極稀地震に対しては、設計で想定されているよりも大きい浮き上がり変位を生じる可能性があること、3浮き上がり後の全体応答への影響は比較的小さかった(入力の大きさと最大変位の関係は線形的であった)ものの、浮き上がり後は局所変形が大きくなり、それによって部材の一部が損傷する可能性があることなどがわかった。特に、一部のアイソレータが大きく浮き上がると、浮き上がり機構を持たない隣のアイソレータへと引っ張り力が伝達し、危険な状態になる可能性があることなどがわかった。本研究課題の今後の推進方策を以下にまとめる。1立体フレームモデルによる浮き上がり発生後の挙動解明作成した詳細のフレームモデルに直下型地震動や長周期地振動などの様々な地震動を入力し、最大加速度や最大変位、上部構造および建物全体としての周期・減衰の変動、各部材の応力などについて整理し、浮き上がり後の挙動を詳細に把握する。

外柱積層ゴム浮き上がり後における、内側積層ゴムの軸力変動、部材断面や構面の耐力負担率を変更し、異なる構造条件に対しても同様に考察する。2浮き上がりを考慮した非線形せん断モデルの提案立体フレーム解析の結果を非線形せん断モデルで極力正確に再現し、せん断系へのモデル化の手法を提案する。立体フレームモデルとの比較を通して、提案モデルの適用性と精度を明らかにする。工学
FTIRによる光合成酸素発生マンガンクラスターの構造の解明

閃光誘起フーリエ変換赤外(FTIR)法を用いて、植物の酸素発生反応を担う酸素発生系(光化学系II蛋白質複合体の一部として存在)の構造と反応を調べた。まず、基質である水分子のFTIRバンドを検出し、その構造の知見を得た。暗順応した酸素発生系のS_1状態から、250Kでの一閃光照射によって得られるS_2中間状態への遷移の際のFTIR差スペクトルを測定すると、3618/3585cm^<-1>に微分形のバンドが観測された。H_2^<18>O置換した試料で測定することにより、これは酸素発生系中の水分子のO-H伸縮振動であると同定された。さらに、D_2Oによるデカップリング実験から、観測された水分子は非対称的な水素結合状態を形成しており、S_1からS_2状態への遷移により、その非対称性が増すことが明らかとなった。また、常温において1s間隔で連続的に閃光照射を行い、その間のスペクトルを順次測定することにより、酸素発生系の反応サイクルにおけるすべての閃光誘起遷移(S_1→S_2,S_2→S_3,S_3→S_0,S_0→S_1)のFTIR差スペクトルを測定することができた。得られたスペクトルから、S_1→S_2→S_3遷移におけるタンパク質の構造変化(カルボキシル側鎖やタンパク質二次構造の変化など)が、S_3→S_0→S_1遷移において反転する様子が観測された。光誘起フーリエ変換赤外(FTIR)差スペクトル法を用いて、光合成酸素発生マンガンクラスターの構造を調べた。本年度は、マンガンのヒスチジン配位子に焦点をあて、そのプロトン化構造や水素結合状態などを調べた。酸素発生系のS2中間状態とS1状態間のFTIR差スペクトルにおけるヒスチジンのバンドを同定するため、ホウレンソウの全^<15>Nラベル及びラン藻Synechocystisを用いたイミダゾール基のみの選択的^<15>Nラベルを行った。これらの^<15>Nラベルによる波数シフトから、1113cm^<-1>のC-N伸縮振動バンド及び2500-2850cm^<-1>のN-H伸縮振動上のフェルミ共鳴ピーク群がヒスチジン由来であることが示された。ヒスチジン側鎖のモデル化合物を用いた実験から、l100cm^<-1>付近のC-N伸縮振動の振動数及び重水素化シフトとヒスチジン側鎖のプロトン化構造との間には、一定の相関関係があることを見い出した。この関係を用いることにより、S2/S1スペクトルの1113cm^<-1>のバンドを示すヒスチジンはNπ位のみがプロトン化されている構造をとっていることが示された。また、>2500cm^<-1>のピーク群は水素結合したイミダゾールN-Hに特有なものであり、これらのピーク群の存在から、ヒスチジン配位子のN-Hが水素結合を形成していることが明らかとなった。
シクラメンの花色育種における遺伝資源の開発

黄色花シクラメンと他品種との交雑においては、雑種第1代では黄色花は発現せず,雑種第2代において初めて黄色花株が観察され、その割合は全体の4分の1であった.このことから,シクラメンの黄色花形質は劣性の単一遺伝子に支配されていると考えられた.また,黄色花はすべてカルコンにより発現していた。また,シクラメン野生種の花色素,特にアントシアニジンの調査を行った結果,多くの野生種で,シアニジン,デルフィニジン,ペオニジンおよびマルビジンの計4種のアントシアニジンが認められた.この中でも,特にマルビジンが,他のアントシアニジンに比べて,多く含まれていた.ところで,本実験で検出されたデルフィニジンは,青色花の育種には非常に重要なアントシアニジンであり,これを有する種の育種への利用は,世界でまだみられていない青色花シクラメンの作出に大きく寄与する可能性がある.しかしながら,シクラメンには通常無色のロイコアントシアニジンの一種であるロイコデルフィニジンが存在し,これらは色素抽出過程での加水分解により,デルフィニジンに変化する.本実験でも,同様の現象が起きた可能性は強い.したがって,各野生種のロイコアントシアニンおよびアントシアニンの分析も必要となろう.シクラメンの花色および花色素については,研究があまり進んでおらず,中でも黄色花形質および近縁野生種の花色素については,あまり研究例がない.本実験の結果,シクラメンの黄色花形質の遺伝と近縁野生種の花色素についていくつかの知見が得られた.今後,さらに詳しい分析を行うことにより,シクラメンの花色育種の方向性が明らかになろう.黄色花シクラメンと他品種との交雑においては、雑種第1代では黄色花は発現せず,雑種第2代において初めて黄色花株が観察され、その割合は全体の4分の1であった.このことから,シクラメンの黄色花形質は劣性の単一遺伝子に支配されていると考えられた.また,黄色花はすべてカルコンにより発現していた。また,シクラメン野生種の花色素,特にアントシアニジンの調査を行った結果,多くの野生種で,シアニジン,デルフィニジン,ペオニジンおよびマルビジンの計4種のアントシアニジンが認められた.この中でも,特にマルビジンが,他のアントシアニジンに比べて,多く含まれていた.ところで,本実験で検出されたデルフィニジンは,青色花の育種には非常に重要なアントシアニジンであり,これを有する種の育種への利用は,世界でまだみられていない青色花シクラメンの作出に大きく寄与する可能性がある.しかしながら,シクラメンには通常無色のロイコアントシアニジンの一種であるロイコデルフィニジンが存在し,これらは色素抽出過程での加水分解により,デルフィニジンに変化する.本実験でも,同様の現象が起きた可能性は強い.したがって,各野生種のロイコアントシアニンおよびアントシアニンの分析も必要となろう.シクラメンの花色および花色素については,研究があまり進んでおらず,中でも黄色花形質および近縁野生種の花色素については,あまり研究例がない.本実験の結果,シクラメンの黄色花形質の遺伝と近縁野生種の花色素についていくつかの知見が得られた.今後,さらに詳しい分析を行うことにより,シクラメンの花色育種の方向性が明らかになろう.
臨床応用へ向けたヒト乳歯歯髄幹細胞を用いた肝再生医療の基盤整備

Xeno-free培養を行ったSHEDを、今度は肝細胞へ分化誘導を行い、その細胞を肝特異的遺伝子発現をRT-PCRで評価し、発現を認めた。よって、Xeno-free培養を行ったSHEDは間葉系肝細胞の能力を有し、また肝細胞への分化能も併せ持つことが分かった。次に、異なる10株のSHED株を用いて、継代を重ねていった。おおむねいずれの細胞株も20継代目で増殖が停止した。無限に増殖をすると、移植後に腫瘍化の危険性が生じるため、その危険性はクリアしたと思われた。計画書では15継代目の細胞を保存してさらなる実験に使用していく計画であったが、15継代までいかない細胞株があることや、10継代目まででも10000人の患者へ移植できるだけの細胞数が得られることを考慮して10継代目の細胞を凍結保存し、さらなる実験に使用していくこととした。10継代目の凍結保存したSHEDを解凍し、上記の間葉系肝細胞の定義と、肝細胞分化能を評価し、いずれも十分な結果を得ることができた。Xeno-free培養を行ったSHEDの品質、安全性、有効性の3本柱で研究を行っているが、品質に関してはすでに目的の実験は終了しており、安全性、有効性に関する実験もほとんど終了している。後は結果の評価・分析を行っていくため。10代目まで継代したSHEDの安全性の評価および、肝不全モデルマウスに移植してのin vivoでの有効性の評価を行っていく。次年度使用額が生じた理由:Xeno-free培養を行ったSHEDの安全性、有効性に関する実験を今年度から次年度にかけて継続するため。使用計画:実験動物や試薬、培地、抗体等に使用する。
パーキンソン病由来ｉＰＳ細胞を用いたα－シヌクレイン伝播機序の解明

パーキンソン病の原因タンパク質であるα-シヌクレインは細胞内で吸収,分解,分泌のバランスによって制御されており,そのバランスが崩れることで異常タンパク質蓄積につづく伝播の病態が惹起される.細胞内に取り込まれたタンパク質の細胞内輸送を制御するエンドソーム経路はタンパク質クリアランスに重要であり,プロテイノパチーの発症に関与している.エンドソームからゴルジ体への逆行性輸送を制御するレトロマーの構成因子であるVPS35(D620N)遺伝子変異を原因とするPARK17患者由来ヒトiPS細胞をレトロマー機能障害モデルとして用い,α-シヌクレインクリアランスにおけるレトロマーの役割に着目した.PARK17患者2例よりiPS細胞を樹立しドパミンニューロン(以下DAニューロン)へ分化誘導すると,疾患群で優位にDAニューロン陽性率が低下していた.患者由来DAニューロンが他のニューロンよりも脆弱である可能性を示し,パーキンソン病の臨床,病理所見と合致した.VPS35の下流にCFP,VPS29の下流にYFPの蛍光タンパクを結合させたプローブを作製し,FRET観察による分子間距離が極めて近い分子のみを検出する実験にてfreeのVPS35,29とレトロマー構成要因のVPS35,29を区別すると,発現するほぼ全てのVPS35,29がレトロマー構成要因であることがわかった.レトロマー,Early endosomeをVPS29-YFP,Rab5a-RFPのプローブを用いて同時にライブイメージングすると,レトロマーがEarly endosomeを取り囲みながら一緒に動く様子が観察された.さらに疾患群においてはEarly endosomeの移動速度が優位に低下していた.以上より患者ニューロンでレトロマー機能障害が起こっている可能性が極めて高く,今後引き続きα-シヌクレイン凝集,伝播過程を調査予定である.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究目的は,家族性パーキンソン病(以下PD)患者由来iPS細胞を用いドパミン(以下DA)ニューロンへ分化誘導し,in vitroでその疾患発症メカニズムに迫ることである.研究代表者はこれまでに,当大学附属病院に通院中の家族性PD患者(PARK8;1例,PARK17;2例)の協力を得,末梢白血球よりiPS細胞を樹立した.初年度は,iPS細胞から精度および効率よくDAニューロンへ分化誘導するための培養条件の確立と,作製したニューロンの組織・機能解析に注力した.ニューロンへの分化誘導は,CiRA(京都大学iPS細胞研究所)のプロトコルを改変した方法を用いた.研究目的のために,培養皿上でニューロンの細胞体,樹状突起,シナプスをより詳細に長期間観察する必要がある.分化段階で用いる試薬の選定,各試薬の添加期間,浮遊培養から培養皿に展開するタイミング,培養皿やフラスコの素材を条件検討し,培養皿上でneurosphereから遊走した細胞のひとつひとつが細胞体と樹状突起の境界が明瞭でより生理的なニューロンの形態に近い形になるよう,至適な条件を選定した.作製した疾患および健常由来iPS細胞より前述の方法でDAニューロンを培養し,DAニューロンの分化効率を評価した.成熟ニューロンのマーカーをMAP2,DAニューロンのマーカーをThyroshine Hydroxylase(TH)で染色し各培養皿上でTH陽性ニューロン数をカウントしたところ,いずれも約4割程度の陽性率を得ている.機能評価はカルシウムイメージングで行った.また,現在,α-シヌクレインの蓄積・分解機構評価として,蛍光蛋白融合型の野生型/変異型α-シヌクレイン発現ベクターをレンチウイルスを用いてDAニューロンへ導入し,観察を行っている.本年度の実施計画である(1)疾患由来iPS細胞からドパミン(DA)ニューロンへの分化誘導,(2)疾患由来iPS細胞から分化誘導したDAニューロンの組織・機能解析に関して当初の目標が達成された.これにより,次年度に家族性パーキンソン病由来iPS細胞から効率良くDAニューロンを作製,観察するための準備が整い,研究は計画通りに進展したといえる.パーキンソン病の原因タンパク質であるα-シヌクレインは細胞内で吸収,分解,分泌のバランスによって制御されており,そのバランスが崩れることで異常タンパク質蓄積につづく伝播の病態が惹起される.細胞内に取り込まれたタンパク質の細胞内輸送を制御するエンドソーム経路はタンパク質クリアランスに重要であり,プロテイノパチーの発症に関与している.エンドソームからゴルジ体への逆行性輸送を制御するレトロマーの構成因子であるVPS35(D620N)遺伝子変異を原因とするPARK17患者由来ヒトiPS細胞をレトロマー機能障害モデルとして用い,α-シヌクレインクリアランスにおけるレトロマーの役割に着目した.PARK17患者2例よりiPS細胞を樹立しドパミンニューロン(以下DAニューロン)へ分化誘導すると,疾患群で優位にDAニューロン陽性率が低下していた.患者由来DAニューロンが他のニューロンよりも脆弱である可能性を示し,パーキンソン病の臨床,病理所見と合致した.

VPS35の下流にCFP,VPS29の下流にYFPの蛍光タンパクを結合させたプローブを作製し,FRET観察による分子間距離が極めて近い分子のみを検出する実験にてfreeのVPS35,29とレトロマー構成要因のVPS35,29を区別すると,発現するほぼ全てのVPS35,29がレトロマー構成要因であることがわかった.レトロマー,Early endosomeをVPS29-YFP,Rab5a-RFPのプローブを用いて同時にライブイメージングすると,レトロマーがEarly endosomeを取り囲みながら一緒に動く様子が観察された.さらに疾患群においてはEarly endosomeの移動速度が優位に低下していた.以上より患者ニューロンでレトロマー機能障害が起こっている可能性が極めて高く,今後引き続きα-シヌクレイン凝集,伝播過程を調査予定である.現在,疾患由来ドパミン(DA)ニューロンを評価すべく,脆弱性の一因と考えられる細胞内小器官のイメージングを目的としたインディケーターを作製している.次年度はさらにDAニューロン内の異常蛋白の蓄積および小器官におけるその分解機構,最終的には細胞-細胞間での凝集蛋白の移行動態を蛍光顕微鏡下でイメージングし解析する予定である.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。現在H28年度の研究成果について投稿準備中です.
新しく見つかった線条体投射ニューロン群の関わる神経回路の構造と機能についての研究

2004年までの先行研究により、背側線条体のプレプロタキキニンB産生神経細胞は無名質にニューロキニンBを放出し、それによって促進的な影響を受けるNK3受容体発現細胞は大脳皮質に投射線維を送り、GABAを放出することによって大脳皮質の神経細胞の活動を調節しているという新たな系の存在を示してきた。線条体には運動に関わる背側線条体だけでなく情動などに関係すると考えられる腹側線条体もある。この腹側線条体の関わる回路においてもプレプロタキキニンB産生神経細胞から発する大脳皮質調節系が存在するのかどうか調べた。腹側線条体にもプレプロタキキニンB産生神経細胞は存在しており、クラスター状の分布を示すなど特徴的な性質があることがわかった。このクラスターはミューオピオイド受容体の分布とよく一致し、また、DARPP32の免疫反応が少ない領域とも一致していた。さらにはある切片では島状に見えるクラスターが三次元的には連続した構造であることがわかった。トレーサーを用いた実験では、プレプロタキキニンB陰性細胞がventral pallidumあるいは腹側被蓋野に投射するのに対し、プレプロタキキニンB産生神経細胞は無名質の前方および腹側部に投射することがわかった。以上の結果により、腹側線条体においてもプレプロタキキニンB産生神経細胞が最終的に大脳皮質の活動を調節する系に関わっていることが示唆された。無名質におけるNK3受容体発現細胞についての研究無名質に存在するNK3受容体発現神経細胞は抑制性(GABA作動性)の神経細胞であった。一方、無名質で発現することが知られているcholine acetyltransferaseやparvalbuminなどの神経細胞マーカーとNK3受容体の共発現率は低かった。逆行性トレーサーを大脳皮質に注入したところ、トレーサーで標識された神経細胞の中にNK3受容体陽性細胞があった、つまりNK3受容体発現細胞は大脳皮質に投射線維をおくることが示唆された。大脳皮質に投射する神経細胞を逆行性蛍光トレーサーによって標識し、パッチクランプ法によってその神経細胞の電気生理学的性質を調べたところ、トーニックに発火し過分極活性化型電流を示すType 1と散発的な発火を示すType 2に分類できた。このうちType 1のニューロンの一部にのみNK3受容体の免疫反応が見られた。さらに、これらの大脳皮質に投射する神経細胞にNK3受容体のリガンドであるsenktideを適応した時の電気生理学的反応を記録したところ、Type 1のニューロンの一部で膜電位は脱分極方向に変化し、それに伴い膜の電気抵抗が減少した。これはNK3受容体の反応が細胞にとって促進性に働くことを示す。以上の結果をまとめると、線条体のプレプロタキキニンB産生神経細胞は無名質にニューロキニンBを放出し、それによって促進的な影響を受けるNK3受容体発現細胞は大脳皮質に投射線維を送り、GABAを放出することによって大脳皮質の神経細胞の活動を調節していると考えることができる。
PCR-SSCP法による癌遺伝子をマーカーとした末梢血中癌細胞の検出

現在、消化器癌治療の際、リンパ行性転移に対しては、拡大手術などによってある程度対応できるが、血行性転移と腹膜播種は依然として外科手術の明らかな限界である。このうち、癌の血行性転移を早期に把握することは、癌の治療方針を決定し予後を改善するうえで非常に重要である。しかし、血中の癌細胞の検出は、これまで高感度の検出法がなかったことから非常に困難であった。本研究はPCR-SSCP法を用い、血中癌細胞を検出し、血行性転移の予測診断法を確率する事を目的とした。対象は胃癌および大腸癌症例とし、遺伝子マーカーとして、これらの癌で遺伝子異常が高頻度に認められている癌抑制遺伝子p53および癌遺伝子K-rasを用いた。血中の正常細胞に占める癌細胞の割合は非常にわずかであることから、採血部位はできるだけ癌細胞に富むと予想される腫瘍局所血管(胃静脈、下腸間膜静脈)から採血した。さらに白血球共通抗原(CD45)に対する抗体を用いたMagnetic cell separationにより、正常な白血球細胞をできる限り除去することにより、腫瘍細胞を約20倍に濃縮できた。また、通常のPCR後、Nested PCRを行い、検出感度を上昇させることにより腫瘍細胞1個でも点突然変異の検出が可能であった。またこれらの一連の手法を行うことにより、正常細胞1000個に対し、1.2個の腫瘍細胞があれば検出可能となった。この方法を用いて、胃癌および大腸癌症例5例の原発部組織および腫瘍局所血管の血液サンプルを用いて検討したところ、5例中1例の血液に、原発部と同様なSSCPの変異バンドを認めた。さらに検出された変異バンドの特異性を明確にすべく、サザンプロット、コロニーハイブリダイゼーション,ダイレクトシークエンス法を行ったところ、K-ras codon12のGly(GGT)からAsp(GAT)への変異が確認された。本方法は検出感度も高く、操作も簡便なことから、有用な血中癌細胞検出法であると考える。本年度は,PCR-SSCP法を用い、末梢血中癌細胞のP53およびK-ras癌遺伝子の変異を検出するための基礎的実験条件を確立することを目的とした。その結果,1.人由来胃癌および大腸癌細胞株10株中数株に,P53または,K-ras遺伝子の変異を確認した。2.これらの遺伝子異常を伴う細胞株を用いて,PCRの各実験条件を決定した。〓プライマーの配列〓PCRの温度とサイクル数94°C30秒→55°C30秒→72°C60秒これを30サイクル行なう。以上の条件でデーターの再現性が確認された。現在,最低何個位の癌細胞があれば測定可能か検討を進めている。我々はPCR-SSCP法を用いて消化器癌の末梢血中遊離癌細胞を検出し、血行性転移の早期診断を行うことを目的としている。これまでPCR-SSCP法の基礎的実験条件を確率し、胃癌および結腸癌細胞株を検討した。その結果、MKN-1(P53exon5)とSW-480(P53exon8,K-ras codon12)に点突然変異を認めた。この細胞を用いて検出可能な細胞数を検討したところ、十数個の癌細胞があれば検出可能であることが判明した。現在、in vivoの実験モデルとしてヌードマウスを用いて、さらに臨床検体(進行消化器癌患者の門脈血)を使用した検討を進めている。