hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
並列計算環境におけるメッシュレス法の為の高性能・高安定・低コストな形状関数の開発

2016年度は「delta function propertyを満たす形状関数の数学的特徴の精査」および「メッシュレス法の応用の現状調査」として論文・著書サーベイや会議聴講により情報収集を実施した.2017年度は上記に基づき"delta function property"を満たすものを抽出し,FDTDMに応用を試みた.結果として,計算精度および安定性の向上は確認できたが,計算コストが増加した.これらの知見のまとめを試みたが,期間終了前(2018年2月末)に所属(理化学研究所計算科学研究機構)を退職することとなり,研究を打ち切ることとなった.研究課題「並列計算環境におけるメッシュレス法のための高性能・高安定・低コストな形状関数の開発」では「並列計算環境」を考慮した「高精度・高安定・低コスト」な新たなメッシュレス法を提案する.2016年度は「delta function propertyを満たす形状関数の数学的特徴の精査」および「メッシュレス法の応用の現状調査」を行うため,論文・著書サーベイや会議聴講を行った.これらより得られた知見を2016年度内にレビュー論文等としてまとめる予定だったが,それには至らなかった.2017年度は「2016年度に行った調査等のまとめの論文執筆」と「様々な形状関数をMTDMへ応用した場合の計算精度・安定性・計算コスト等を様々なシステム上で比較・評価し,MTDMおよびメッシュレス法全般の発展に生かす.2016年度は「delta function propertyを満たす形状関数の数学的特徴の精査」および「メッシュレス法の応用の現状調査」を行うため,論文・著書サーベイや会議聴講を行い,得られた知見を2016年度内にレビュー論文等としてまとめる予定だったが,それには至らなかったため.2017年度は上記に基づき多々ある形状関数の中で"delta function property"を満たすものを抽出し,FDTDMに応用を試みた.結果として,計算精度および安定性の向上は確認できたが,計算コストが増加した.これらの知見のまとめを試みたが,期間終了前(2018年2月末)に所属(理化学研究所計算科学研究機構)を退職することとなり,研究を打ち切ることとなった.結果,論文等の執筆に至らなかった.2016年度は「delta function propertyを満たす形状関数の数学的特徴の精査」および「メッシュレス法の応用の現状調査」として論文・著書サーベイや会議聴講により情報収集を実施した.2017年度は上記に基づき"delta function property"を満たすものを抽出し,FDTDMに応用を試みた.結果として,計算精度および安定性の向上は確認できたが,計算コストが増加した.これらの知見のまとめを試みたが,期間終了前(2018年2月末)に所属(理化学研究所計算科学研究機構)を退職することとなり,研究を打ち切ることとなった.2016年度に行った調査等のまとめの論文執筆を予定している.また,様々な形状関数をMeshless Time-Domain Method (MTDM)へ応用した場合の計算精度・安定性・計算コスト等を様々なシステム上で比較・評価を行い,並列計算環境におけるMTDMを用いた数値シミュレーションに対する最適な形状関数を選定する.数値シミュレーション申請時には計算用として50万円程度のワークステーションを2台購入予定だったが,採択後に購入が不要になったため100万円程度の差額が生じた.同じく申請時に数学ソフトウェアMathematicaのライセンス20万円程度を購入予定だったが,採択後に購入が不要になったため20万円程度の差額が生じた.来年度は研究成果発表のため国内および国外旅費,国内および国外学会参加費,論文投稿費(英文校正費含む)として使用する
小児の安全な鎮静は可能か？合併症の網羅的アンケート調査とリスクスコアの開発

近年小児MRIの鎮静に伴う合併症は社会的にも注目され、3学会共同提言も出されている。しかしながら、鎮静実施、鎮静後帰宅の可否を判断する明確な指針は無く、結果として過剰な入院管理をせざるを得ない現状がある。またこれらの煽りを受け人手やベッドなど潤沢な資源を持たない医療機関では、鎮静を必要とする小児MRIを制限せざるを得なくなり、患者が不利益を被っている側面もある。本研究はこれらの現状に対し、1鎮静早期から帰宅後の晩期まで含めた網羅的アンケート調査の実施により、潜在的な合併症発生リスク因子を抽出、2集計後に統計学的処理を行いリスクスコアとして完成させ、3小児MRI鎮静の安全性の向上、根拠のない入院および期間の延長を減らし医療資源・医療費の節約へ貢献することで社会・国民に還元する事を目的とする。1年目は前方視的研究のため、その前段階として当院倫理委員会を申請する必要があるため、申請書を作成している。同時に多施設共同研究を目指していることもあり、他院と共同で患者同意書・アンケート調査表を作成した。昨今、倫理違反の研究が話題となり、当院倫理委員会において認可を得ることが難しくなってきている。完全に匿名で行う事はアンケート調査のため難しく、またリスクスコアを見積もるために、その項目も洗練されなければならない。その点で倫理委員会提出書類を作成しなおしているため遅れている。また前方視的調査のため、多施設共同でおこなうとなると、協力を得られる施設とも、患者説明同意書として確認を得なければならない。倫理委員会に同意書を含めて申請する必要があり、なかなか進展し辛い状況であったことが原因である。同意書が完成したため、次のステップとしては倫理委員会の認可を得るため、書類を作成している。倫理委員会の認可を得た後より、アンケート調査を開始とし、ある程度症例が集まった段階で、統計処理をおこない一次評価を集計する。学会発表をその段階で予定し、同時に論文も作成していく予定である。計画が遅れているため、1年目ではアンケート調査を開始することが出来なかった。そのため費用として多くを占める謝金・統計処理等は行わず、費用を使用することがなかったため。倫理委員会の認可が確認された後に、アンケート調査は開始となるため、そこで謝金が発生する。2年目なるべく早くからアンケート調査に取り組むよう計画していく。
機械的人工換気システムを用いた横隔膜の筋萎縮メカニズムの解明

械的人工換気システムによるラット横隔膜萎縮モデルを用いて,横隔膜の筋萎縮メカニズムを明らかにするとともに,温熱負荷が横隔膜萎縮に及ぼす影響について明らかにすることを目的とした.Wistar系ラットを対象に12時間の機械的人工換気を行い,組織化学および生化学的分析を行った.また,摘出筋の張力測定を行った.温熱負荷は人工換気24時間前に1時間実施した.その結果,機械的人工換気により横隔膜が15%程度萎縮するが,温熱負荷によりその萎縮が軽減されることが示された.熱ショックタンパク質発現量の増加やアポトーシス系の関与が考えられた.一方,温熱負荷は筋張力の低下を抑制しないことが示された.四肢骨格筋と同様に,健康で活動的に過ごすために重要な筋である横隔膜は,主に速筋線維で構成される骨格筋である.横隔膜は人工呼吸器の装着などによりその活動を軽減すると急激な萎縮を呈す.そのため,医療現場において人工呼吸器の装着期間の決定は難しい課題となっている.これまでの廃用性萎縮に関する研究により,熱ストレス負荷が遅筋線維を主とした下肢骨格筋の筋萎縮に対する抑制効果を持つことが知られている.しかしながら,速筋線維を主とした筋萎縮に対しても同様の効果を示すか否かは不明である.さらに,筋の機能低下に対する熱ストレス負荷の影響についても明らかではない.本年度は主として一過性の熱ストレス負荷が,機械的人工換気によって引き起こされるラット横隔膜萎縮筋へ及ぼす影響を明らかにすることを目的として研究を進めた.Wistar系雄性ラットをコントロール(CT,n=9),熱ストレス負荷(HS,n=10),人工換気(MV,n=10),熱ストレス負荷+人工換気(HM,n=9)の4群に分け,HSおよびHM群には41°Cで60分の温熱負荷を,MVおよびHM群には12時間の機械的人工換気を行った(HM群は熱ストレス負荷から24時間後に実施).横隔膜摘出後直ちに等尺性筋張力測定(in vitro)を行った後,免疫組織化学法およびウェスタンブロット法を用いて分析を行った.HM群とCT群の筋線維横断面積に差は見られず,本研究で実施した一過性の温熱負荷は,ラット横隔膜筋萎縮に対する形態的な抑制効果を持つことが示された.しかしながら,HM群の等尺性張力はCT群に比べ低下し,その程度は人工換気群と同程度であったことから,機能特性には影響を及ぼさないことが示された.本研究の結果,温熱負荷はカスパーゼ3を介したアポトーシス系に関与して横隔膜萎縮を抑制することが示唆され,横隔膜萎縮の軽減のための新たな知見を得た.これまでの研究結果において,単回および複数回の温熱負荷は横隔膜萎縮の抑制する効果を持つことを示した.しかしながら,これは人工換気前に処置を施すものであり,事故などで急に人工換気を行う必要が出た場合には応用することが難しい.応用性を高めるためには人工換気後の回復期を対象とした処置を検討することが必要であると思われるが,従来のラットを用いた人工換気実験は侵襲度が高いため回復期を設けることが困難であった.本年度取り組むテーマ3は,侵襲度が低く回復期の設定が容易な改良型人工換気システムの構築を検討するものであり,これまでの研究成果をふまえた発展的な研究内容となる.気管切開を伴わない人工換気システムとして,研究計画ではマスクを用いた経口式もしくは胸郭に陰圧を負荷する方式を想定していたが,共同研究者や他の研究者との情報交換の結果,本研究では経口の気管挿管を用いる方式を採用することとした.しかしながら,気管内での挿管固定法を検討する必要があった.そこで,気管は切開せず皮膚切開のみを行い,経口挿管したチューブを気管ごと結紮して固定する方法をとることで,安定した換気を確保できることを確認した.なお,人工換気後に縫合することで,皮膚切開の影響は数日でほぼ解消される.人工換気の侵襲度を下げ,回復期を確保するためには,従来行ってきた頸動静脈へのカテーテル挿入に替わる方法が必要である.そこで,血ガス測定に替わり,質量分析装置を用いて呼気ガス分析を行うこととした.人工換気中に呼気ガスを常にサンプリングできるよう,従来用いていたベンチレータと挿管チューブの結合部を改良した.血ガスと同様,人工換気中の重要なパラメータとなる血圧に関しては,非侵襲型の小動物用血圧測定装置の購入を検討することとした.なお,麻酔の維持には,頸静脈へのカテーテル挿入に替わり脚部の血管に滴下する方式を採用することで解決した.械的人工換気システムによるラット横隔膜萎縮モデルを用いて,横隔膜の筋萎縮メカニズムを明らかにするとともに,温熱負荷が横隔膜萎縮に及ぼす影響について明らかにすることを目的とした.Wistar系ラットを対象に12時間の機械的人工換気を行い,組織化学および生化学的分析を行った.また,摘出筋の張力測定を行った.温熱負荷は人工換気24時間前に1時間実施した.その結果,機械的人工換気により横隔膜が15%程度萎縮するが,温熱負荷によりその萎縮が軽減されることが示された.熱ショックタンパク質発現量の増加やアポトーシス系の関与が考えられた.

一方,温熱負荷は筋張力の低下を抑制しないことが示された.四肢骨格筋と同様に,健康で活動的に過ごすために重要な筋である横隔膜は,主に速筋線維で構成される骨格筋である.横隔膜は生命維持のため常に活動している筋であるが,人工呼吸器の装着などによりその活動を軽減すると急激な萎縮を呈す.そのため,医療現場において人工呼吸器の装着期間の決定は難しい課題となっているが,横隔膜の萎縮は主に速筋線維で起こるため,遅筋線維で盛んに行われてきたこれまでの筋萎縮の予防・軽減についての研究成果をそのまま応用することはできない.速筋線維の萎縮モデルを用いた研究は世界的にも少なく,新たな取り組みが必要とされている.本研究は,横隔膜の萎縮および回復メカニズムを解明し効果的な萎縮予防法のための基礎資料を得ることを目的とするものである.本年度は主として機械的人工換気システムによるラット横隔膜萎縮モデルを用いて横隔膜の萎縮筋を作成し,タンパク質分解経路を中心に分析を進め,横隔膜萎縮メカニズムを明らかにすることについて取り組んだ.麻酔下のラットに対し,気管切開後に人工呼吸器を用いた12時間の人工換気を行った.横隔膜の横断切片を作成し,免疫組織化学法を用いて筋線維の同定を行い,萎縮の程度を評価した.また,ウェスタンブロット法を用いてタンパク質分解経路について分析を行った.その結果,人工換気後の横隔膜の筋断面積は15%程度減少し,その減少はType IId/x線維の萎縮によるものであった.骨格筋の分解経路の一つであるアポトーシス経路に着目し,その指標である活性化カスパーゼ3および7について分析したところ,人工換気後にそれぞれ67倍増加していた.また,リソソーム系の指標であるカテプシンLも2倍程度増加した.本研究の結果,横隔膜萎縮に関与する筋タンパク質分解経路の分析項目がある程度絞られ,メカニズムの解明について新たな知見を得ることができた.申請当初の計画通り単回または複数回の温熱負荷を与えたのち機械的人工換気を実施して横隔膜萎縮サンプルを得た.単回温熱負荷に関しては既に学会発表を行い,現在論文執筆中である.また,来年度に渡り実施する予定である改良型横隔膜萎縮モデルの検討にも着手し,現在準備中である.申請当初の計画通り機械的人工換気を実施して横隔膜萎縮サンプルを得た.ベンチレータの入手が遅れたため得られたサンプルに対する分析は未だ途中であるが,ほぼ計画通りに進んでいる.また,来年度に渡り実施する予定である温熱負荷を用いた実験群の作成にも着手し,予定の半数のサンプルを得た.申請当初の計画に従い,本年度で得た横隔膜サンプルの分析を引き続き実施するとともにこれまでの研究成果の発表を積極的に行う.また,着手した人工換気からの回復期の観察を行うためのシステム作りを進め,回復期のデータを得るとともに分析を進める.申請当初の計画に従い,本年度で得た横隔膜サンプルの分析を引き続き実施する.また,温熱負荷を施す実験を完了し,組織化学的・生化学的な分析を行う.さらに,人工換気からの回復期の観察を行うためのシステム作りに着手する.該当なし実験動物および人工換気・分析に要する消耗品が研究費の主たる使途になる.継続的な温熱負荷を施す群を設けるほか,新たに人工換気からの回復期を観察するための群を設ける.新たな試みを行うため,実験動物は60匹程度を予定している.また,本年度および次年度の研究成果を発表するべく,国内外での学会発表および論文投稿のための費用を計上する.
メタエンザイム法の開発

酵素は、高い反応性と特異性をもつ生体触媒としてバイオセンサー、医薬品生産、日常生活などに有効利用されている。これまで、より優れた性質をもつ酵素が自然界の多種多様な微生物細胞において探索され、産業や医療に有効利用が図られてきた。そのなかで、産業利用に優れた酵素は、伝統的な手法として自然界から単離、培養した微生物を純粋培養した細胞を用いて生産されてきたが、環境に存在する多種多様な微生物のうち純粋培養可能なものは1%以下と言われ、大部分が難培養である。そのために酵素遺伝子資源の探索において単離、培養できる微生物のみに頼ることには限界がある。そこで難培養微生物を酵素遺伝資源として有効利用し、新たな酵素を得る新たな手法として、全く新規なメタエンザイム法を開発し、新規酵素探索の道が開拓すること本研究の目的とした。すなわち、環境土壌中の微生物から直接酵素を精製し、決定したその部分アミノ酸配列をもとに目的酵素をコードする遺伝子を土壌から取得する。その遺伝子を大腸菌で発現後、発現産物を精製し、生化学的特徴を解析する。これにより新規酵素を取得することを目的とした。まず、自然環境から得た土壌を試料として酵素探索を行った。まず、土壌試料から細胞集積の後抽出した粗酵素液を用いてアミノ酸脱水素酵素の活性を調べた。環境酵素源として、あらかじめ高温、高pH/低pH、高塩濃度などの選択圧の掛っているコアや高温温泉などの極限環境下における特定の微生物集団を対象とした、その1つとして高温の温泉泥を採取し、0.5%ペプトンを主成分とする培養液(pH 6.8)を用い、70°Cで泥ごと振とう培養後(約4日間)、得られた菌体を細胞破砕し、各種クロマトグラフィーにて、ロイシン脱水素酵素(LeuDH)を高度に精製し、N-末端アミノ酸配列の決定に成功した。この酵素は、既知の最も耐熱性がLeuDHよりも高い耐熱性を示したので、この新規酵素遺伝子の大腸菌の発現系の構築を今後、進めメタエンザイム法の開発を達成する予定である。自然界に存在する多種多様な微生物から有用酵素や新規酵素を見出すことは、酵素の新しい産業利用を図る上で、極めて重要である。本研究では、自然界の膨大な微生物遺伝子資源の有効な活用法として、微生物の培養過程を省略して、より有用性が期待できる酵素や新規な酵素を発見し、産業的応用への展開を可能にする新規メタエンザイム法を開発する。初年度は、60°C以上の高温環境である温泉土壌からのNAD依存性のD-乳酸、L-グルタミン酸、L-セリン、L-ロイシン、メゾジアミノピメリン酸などを基質とする脱水素酵素の検索をモデルとして、新規なメタエンザイム法の基本を確立することを目指し、次のような実験・研究を主に行い、次年度につながる成果を得た。(1)環境酵素源としての大分県九重町小松地獄や長崎県雲仙市小浜温泉の源泉の6095°Cの高温環境から土壌や泥試料の採取し、その土壌や泥にペプトンなどの栄養成分を加えた培養液で予め複数の微生物を混合培養し、それを酵素源とする方法を検討した。その結果、80°Cで10mML-バリンを10g/Lペプトンに誘導剤として添加し、振とう培養して得た菌体は活性染色法でロイシン脱水素酵素を有することを見出した。この酵素は80°C以上の高温でも熱失活しないこれまで見出されていない最も耐熱性の高いロイシン脱水素酵素であることが期待できる。そこで、この酵素をイオンクロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、電気泳動法などで迅速に精製する方法を検討し、部分精製酵素を得ることに成功した。この精製された酵素のN-末端アミノ酸配列と内部ペプチドのN-末端アミノ酸配列の決定とその情報に基づく目的遺伝子のPCR増幅のためのプローブの調製法について基本的な方法を明らかにできた。それゆえ、今後は、増幅遺伝子の大腸菌でクローニングと遺伝子の塩基配列の決定を進める予定である。(2)その他の酵素として、小松地獄の泥から耐熱性の新規NAD依存性L-セリン活性を同様に見出した。これも本メタエンザイム法開発の有効な候補酵素となることが判明した。

環境酵素源として、あらかじめ高温、高pH/低pH、高塩濃度などの選択圧の掛っているコアや高温温泉などの極限環境下における特定の微生物集団を対象とした、その1つとして高温の温泉泥を採取し、0.5%ペプトンを主成分とする培養液(pH 6.8)を用い、70°Cで泥ごと振とう培養後(約4日間)、得られた菌体を細胞破砕し、各種クロマトグラフィーにて、ロイシン脱水素酵素(LeuDH)を高度に精製し、N-末端アミノ酸配列の決定に成功した。この酵素は、既知の最も耐熱性がLeuDHよりも高い耐熱性を示したので、この新規酵素遺伝子の大腸菌の発現系の構築を今後、進めメタエンザイム法の開発を達成する予定である。
歯肉増殖症におけるカテプシンの役割の解明～多様なカテプシンKOマウスを用いた検討

我々のこれまでの研究によって、歯肉増殖にはカテプシンが関与することを示してきた。そして、カテプシンLとカテプシンBを比較した場合、カテプシンLの方が、より強く歯肉増殖症に強く関与することを明らかにた。カテプシンL活性の抑制効果が特異的に高いことが近年報告された、spock1に注目し,本分子が病変局所において過剰発現することで,歯肉増殖が惹起されるのではないかとの仮説を設けた。ヒト歯肉線維芽細胞に歯肉増殖症発生の副作用をもつ代表的な薬剤を作用させると,spock1のmRNAの発現が亢進することを明らかにした。本研究は、申請者らがこれまでに継続的に検討を続けてきたカテプシン活性と薬物性歯肉増殖症の研究成果をさらに発展させ、歯肉増殖に特に関与するカテプシンを特定し、それらの活性を促すことで、歯肉増殖症発生抑制や治癒促進に繋がるとの仮説を設け、各種カテプシンの歯肉組織における機能を明らかにし、歯肉増殖症との関連を検証しようとするものである。研究期間内に各カテプシンのloss of functionで病変が惹起されるかどうか確認し、2影響を受ける分子(コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなど)を明らかにし、将来的に歯肉増殖症発生抑制や治療方法確率へつなげることを目指すものである。本年度実施した概要に関しては、下記のとおりである。1.カテプシンBのノックアウトマウスの維持管理を行った。2.試験群としてカテプシンBのノックアウトマウス、コントロール群としてその野生型マウス、いずれも8週齢を研究に用いた。まず、口腔内を観察し、安楽死させた後に、歯周組織の血液を可及的に除去し、実体顕微鏡にて形態学的に組織観察を行った。その後上記マウスの歯肉組織をホルマリン固定後パラフィン包埋し、組織切片を作成した。その後HE染色を行い、組織形態の確認を行った。先行研究で得たカテプシンLのノックアウトマウスの実態顕微鏡での組織形態と組織標本の組織像を、今回得られたカテプシンBノックアウトマウスのものと、比較検討を行った。当初、カテプシンSノックアウトも実験に用いる計画であったが、産子が得られないため、カテプシンSノックアウトマウスを用いた実験が遅れている。本研究は、申請者らがこれまで継続的に検討を続けてきたカテプシン活性と薬物性歯肉増殖症の研究成果をさらに発展させようとするものである。つまり、歯肉増殖に特に関与するカテプシンを特定し、それらの活性を促すことで、歯肉増殖症発生抑制や治癒促進に繋がるとの仮説を設け各種カテプシンの歯肉組織における機能を明らかにし、将来的に歯肉増殖症発生抑制や治療方法確立へ繋げることを目指すものである。これまでに、in vitroではヒト歯肉線維芽細胞やマウス歯肉線維芽細胞、上皮細胞といった種々の細胞に歯肉増殖症を惹起しやすいニフェジピンやフェニトイン、サイクロスポリンを添加し、種々の遺伝子発現の変動を確認した。また、in vivoでじゃカテプシンLノックアウトやカテプシンBノックアウトマウスを用いて組織像の確認等を行った。これらの結果、これらのカテプシン間で比較すると、カテプシンLノックアウトにおいて、より歯肉増殖が惹起されることが明らかとなった。引き続いて、当初の研究計画では、カテプシンSノックアウトマウスを用いての動揺の研究内容の実施を予定していたが、産子が得られないため、これまでのin vitroの実験結果や世界的な最新の知見を参考に研究計画を変更し、カテプシンLを特異的に阻害することが知られているプロテオグリカンの1種を過剰発現させた、トランスジェニックマウスを作製した。このトランスジェニックマウスin vivoでの歯肉の形態や組織学的評価、歯肉組織における遺伝子発現などを解析するカテプシンSノックアウトマウスの産子が計画どおりに得られなかったため。我々がこれまでに行ってきた研究によって、歯肉増殖には、システインプロテアーゼの1種である、カテプシンが関与することを示してきた。そして、数種類あるカテプシンの中で、カテプシンLとカテプシンBを比較した場合、カテプシンLの方が、より強く歯肉増殖症に強く関与することを明らかにしてきた。そこで、カテプシンL活性の抑制効果が特異的に高いことが近年報告された、プロテオグリカンの1種であるspock1 (SPARC/osteonectin, cwcv and kazal like domains proteoglycan 1) (Bocock JP. et al.,Eur J Biochem, 2003)に注目し,本分子が病変局所において過剰発現することで,歯肉増殖が惹起されるのではないかとの仮説を設けた。これを受け,歯肉増殖症を惹起する薬剤がin vitroでspock1の発現に及ぼす影響を調べる実験を行った。in vitroにおける検討では,ヒト歯肉線維芽細胞に歯肉増殖症発生の副作用をもつ代表的な薬剤(シクロスポリンA,フェニトイン,ニフェジピン)を作用させると,spock1のmRNAの発現が亢進することを明らかにした。このmRNAの発現の程度は、上記の3つの条件下ともにコントロール群と比較して、約1.5倍であった。さらに、spock1過剰発現マウスを作成し、種々の解析を行う準備を整えてきた。

カテプシンL活性の抑制効果が特異的に高いことが近年報告された、spock1に注目し,本分子が病変局所において過剰発現することで,歯肉増殖が惹起されるのではないかとの仮説を設けた。ヒト歯肉線維芽細胞に歯肉増殖症発生の副作用をもつ代表的な薬剤を作用させると,spock1のmRNAの発現が亢進することを明らかにした。カテプシンLとカテプシンBを特異的に阻害するモデルを作成し、歯肉増殖にどのような影響を与えるか検討する。カテプシンLを特異的に阻害することが知られているプロテオグリカンの1種を過剰発現させたトランスジェニックマウスを用いて、歯周組織を野生型マウスと比較する。また、それぞれの歯肉組織をホモジナイズして,コラーゲン,プロテオグリカン,接着性糖タンパクなどをウェスタンブロッティングでその分子量や分解の程度を検討する。各種マウス間でのそれぞれの分子量の違いからどの基質が影響を受け蓄積する結果,歯肉増殖症が発生するのかを解明する。歯周病学産子が得られなかったため、一部研究が遅延した。実験計画の一部変更のためカテプシンLとカテプシンBを特異的に阻害するマウスモデルを作成し、研究を行う。マウスの飼育費として使用する。
乳酸菌起源のリン酸化多糖の免疫賦活化能の解明とその利用

[目的]我々は乳酸菌が生産するリン酸化多糖の機能性について研究を遂行している.この研究ではリン酸化デキストラン(P-Dex)が免疫調節作用特性についてin vitroならびにin vivoにおける効果を検証した.とくに,P-Dexのアレルギ予防作用に着目し,オボアルブミン(OVA)感作マウスを用いてアレルギーの抑制効果を解析した.また自然免疫におけるリン酸化多糖の認識について検討し,機能性食品への応用性を模索した.[方法および結果]デキストランのリン酸化条件を検討した結果,pH5.0,160°Cで24時間加熱することにより,最大リン含量(6.8%)のP-Dexが調製できた.リン酸基の導入によりマウス脾臓細胞に対する幼若化活性が有意に誘導され,リン含量と幼若化活性の間に相関関係が認められた.またP-DexはB細胞マイトジェンであることが判明した.OVA感作マウスにP-Dexを経口投与したところ,Th1系サイトカインのmRNA発現が増強され,またTh2系に偏向した場合でもTh1系免疫応答を強く誘導した.また樹状細胞(CD11c^+CD8α^-細胞)においてCD86発現を増強し,IL-10のmRNA発現も誘導された.これらの結果より,P-Dexはアレルギー反応を抑制し,免疫寛容を誘導することが示唆された.さらに,ブタ腸管のバイエル板からRP105およびMD-1をコードしているcDNAをクローン化し,リン酸化多糖がRP105とMD-1を介して一連の免疫反応を活性化させていることを解明した.以上より,多糖はリン酸基を導入することによってアレルギー改善作用を高めることが証明され,また免疫反応誘導機構の一部を解明することができた.[目的]我々は乳酸菌が生産するリン酸化多糖の機能性について研究を遂行している.この研究ではリン酸化デキストラン(P-Dex)が免疫調節作用特性についてin vitroならびにin vivoにおける効果を検証した.とくに,P-Dexのアレルギ予防作用に着目し,オボアルブミン(OVA)感作マウスを用いてアレルギーの抑制効果を解析した.また自然免疫におけるリン酸化多糖の認識について検討し,機能性食品への応用性を模索した.[方法および結果]デキストランのリン酸化条件を検討した結果,pH5.0,160°Cで24時間加熱することにより,最大リン含量(6.8%)のP-Dexが調製できた.リン酸基の導入によりマウス脾臓細胞に対する幼若化活性が有意に誘導され,リン含量と幼若化活性の間に相関関係が認められた.またP-DexはB細胞マイトジェンであることが判明した.OVA感作マウスにP-Dexを経口投与したところ,Th1系サイトカインのmRNA発現が増強され,またTh2系に偏向した場合でもTh1系免疫応答を強く誘導した.また樹状細胞(CD11c^+CD8α^-細胞)においてCD86発現を増強し,IL-10のmRNA発現も誘導された.これらの結果より,P-Dexはアレルギー反応を抑制し,免疫寛容を誘導することが示唆された.さらに,ブタ腸管のバイエル板からRP105およびMD-1をコードしているcDNAをクローン化し,リン酸化多糖がRP105とMD-1を介して一連の免疫反応を活性化させていることを解明した.以上より,多糖はリン酸基を導入することによってアレルギー改善作用を高めることが証明され,また免疫反応誘導機構の一部を解明することができた.[目的]我々のこれまでの研究成果から,乳業用乳酸菌由来の菌体外多糖(EPS)の生理活性発現にはリン酸基の存在が重要であることが立証された.そこで本研究ではデキストラン(Dex)の安全かつ効率的なリン酸化の方法を確立するとともに,リン酸化デキストラン(P-Dex)の免疫調節作用特性について解析し,とくにP-Dexのアレルギー予防・改善作用について検討した。[方法および結果]Dexのリン酸化はリン酸緩衝液法により化学的に行った.pHと温度条件を検討した結果,pH5.0,160°Cで24時間加熱することにより,最大リン含量(6.8%)のP-Dexが調製できた.Dexはリン酸基の導入により,マウス脾臓細胞に対する幼若化活性が有意に誘導された.また,各種リン含量の異なるP-Dexにおいて活性が異なったことより,リン含量と幼若化活性との間に相関関係があることが示唆された.さらに,オボアルブミン(OVA)感作マウスにおいて,感作期間内もしくは終了後にP-Dexを経口投与し,抗原刺激に対する細胞増殖活性や細胞表面抗原発現の増強ならびにサイトカイン発現変動について解析し,P-Dexの効果を評価した.その結果,P-Dex投与群では,in vitroでOVA再刺激をした際に,樹状細胞におけるCD86発現を低下させ,Th1系サイトカインのmRNA発現を増強した.一方,Th2系サイトカインのmRNA発現は,P-Dex非投与群と比較して低下した.また,P-Dex投与によりIL-10mRNA発現が増強され,in vitroにおけるOVA再刺激に対する細胞増殖活性を低下させた.以上より,マウスモデルにおいて,P-Dexは,Th1系細胞およびレギュラトリー細胞の両者を活性化することで,アレルギーの改善性を発揮することが示唆された.[目的]我々はリン酸化多糖の免疫賦活化機構を解明し,その応用性を検討することを目的とし,本年度はオボアルブミン(OVA)

感作マウスによるアレルギーモデル実験を行い,in vivoにおける効果の検証を行うことで,リン酸化デキストラン(P-Dex)のアレルギー低減作用を評価することを目的とした.また,その作用機構の詳細を解明する目的で,自然免疫におけるリン酸化多糖の免疫細胞による認識と,一連の免疫応答機序についても検討した.[方法および結果]マウスは昨年同様の投与スケジュールにより,OVAで感作し,P-Dexの改善効果ならびに予防効果を評価した.その結果,両実験系で,P-Dex投与によりTh1系サイトカインのmRNA発現が誘導され,また改善効果実験ではTh2系サイトカインのmRNA発現が低下し,相対的にTh1系を活性化したことが示唆された.またP-Dexは,Th2系を誘導するCD8α-DCのCD86の発現の低下,さらにはIL-10mRNA発現誘導により,Th1/Th2バランスを改善するのみならず,種々の作用によりアレルギーを改善する作用があることが明らかとなった.また,ブタのパイエル板からToll-like receptor(TLR)のホモログであるRP105ならびに共発現分子のMD-1をクローニングし,そのトランスフェクタントを用いてリン酸化多糖の細胞認識機能特性について解析したところ,リン酸化多糖はNF-κBを刺激し,RP105を介して様々なサイトカインの発現を誘導していることが明らかとなった.以上より,乳酸菌起源の菌体外リン酸化多糖のアレルギー低減作用が考えられ,その活性発現機構の一端が解明できた.
血管内皮細胞由来マイクロパーティクルによるＤＩＣ病態早期診断法の研究

マイクロパーティクル(MP)による樹状細胞(DC)活性化能を検討した。トロンビン・レセプター刺激ペプチド(TRAP)で刺激した血小板は、DC亜群の成熟活性化度合いを示す各種マーカーの発現を増強した。またこれらの増強の程度は、MPの追加によってさらに顕著であった。次に、造血器腫瘍に合併したDIC患者を対象に、HMGB1とサイトカイン・ケモカイン・血管内皮由来MP(EDMP)を測定したところ、それぞれに有意な相関関係がみられた。さらにrTM療法により、HMGB1とEDMPの有意な改善が観察された。DIC早期診断法として、HMGB1とEDMPの測定は重要であると考えられた。今回用いたEDMPは、組織因子と活性化プロテインCを発現した2種類のEDMPである。いずれのEDMPもDCの活性化マーカーの発現を増強させたが、2種類のEDMPの間で増強効果に有意な差は認められなかった。さらに、上清中に動因されてサイトカインとしてはIFN-α,IL-12,IL-6, IL-10,TNF-αの遊離が認められ、これらの変化は、それぞれのEDMPを組織因子および活性化プロテインCに対する抗体で前処理しても効果に変化は認められなかった。以上の結果より、組織因子と活性化プロテインCを発現した2種類のEDMPは、いずれも組織因子および活性化プロテインCとは異なったEDMP上の分子に依存した形で、DCを活性化する能力を有している可能性が示唆された。今後は、DICの初期マーカーとしての意義をさらに明確にする予定である。DICでは凝固促進物質である血管内皮細胞由来マイクロパーティクル(EDMP)が増加し、HMGB1とともにDICの病態形成のメカニズムにおいて重要な役割を果たしていると考えられる。本年度の研究は、造血器腫瘍に合併したDIC患者38例を対象とした臨床研究を実施した。内訳は、非急性白血病症例27例および急性白血病症例11例である。血小板数・CRPはいずれの群においてもリコンビナントトロンボモジュリン(rTM)治療後に有意な改善がみられた。PT・APTTも治療後に有意に改善したものの、両群の間で相違はみられなかった。一方、フィブリノゲンは、非急性白血病群では治療後に低下したのに対し、急性白血病群では治療後に上昇傾向を示した。しかしいずれの群も、治療後にフィブリノゲンはほぼ正常範囲内に回復した。またFDP・D-dimerおよびATIIIに関しても、いずれの群も治療後に有意な改善が認められた。血小板数の改善に関しては、rTM投与前に比べて投与後に血小板数が1万以上増加した症例が、非急性白血病群では27例中12例、急性白血病群では11例中9例であった。一方、出血症状に関しては、非急性白血病群では12例中7例、急性白血病群では9例中6例であった。さらに、これら造血器腫瘍患者を対象に、HMGB1とサイトカイン・ケモカイン・EDMPを測定したところ、これらの測定値に有意な相関関係がみられ、造血器腫瘍DICにおいては、HMGB1とEDMPが重要な役割を果たしていると考えられた。またrTM療法により、HMGB1を含めサイトカイン・ケモカイン・EDMPの有意な改善が観察された。以上より、DIC早期診断法として、HMGB1とEDMPの測定が極めて重要であるという結論に至った。培養血管内皮細胞(EC)を用いて、EDMPの構造解析を行った。炎症性サイトカイン(TNFα)と菌体外毒素(LPS)を用いてECを刺激し、EDMPの作成を行った。生成されたEDMPは8,000g×30minの遠心操作により培養液より分離した。EDMPの表面抗原解析は、内皮細胞膜糖蛋白関連抗原(CD31, CD51, CD54, CD62E, CD10, CD144, CD146)をPE標識抗体で染色し、FITC-Annexin VおよびFITC-TFとの2 color解析を行った。またEDMP表面におけるTFの発現をFCMで測定した。今回検出されたEDMPの特徴は、CD144の発現が強く、またTF陽性MPとの相関性が認められた。FCM上でのEDMPのサイズは0.52.0μと定義した。EDMP標的細胞の検討としては、単球系培養細胞のTHP-1を用いた。EDMPはTHP-1上のL-selectinとMac-1の発現を誘導した。これらのメカニズムを解明する目的でPKCおよびMAPKの検討を行った。PKCは、Western blottingとkinase activityの検出により、PKC isozymeを解析し、MAPKは、p42/p44 MAPK、p38 MAPK、およびJNKについてphosphorylationとtotal volumeについてimmunoblotting法で検出した。

結果としては、EDMPはPKC・MAPKの系を活性化することにより接着分子であるL-selectinとMac-1の発現を誘導したと結論づけられた。以上より、EDMPは高サイトカイン血症下での血管障害を連鎖反応的に拡大する可能性が考えられた。今後、DICの初期マーカーとしての意義をさらに明確にする予定である。組織因子と活性化プロテインCを発現した2種類のEDMPが、DCを刺激活性化する能力を有していることが判明したので、DIC特に炎症が深く関わった敗血症型DICにおけるEDMPの初期マーカーとしての意義が明確にできる可能性が強くなってきたと考えられる。FCMによるEDMPのサイズの定義化ができたことと、EDMPによる単球の接着分子発現のメカニズムを明確にすることができたので、本研究の最終目的であるDICの初期マーカーとしての意義を明確にできる可能性が強くなってきたと考えられる。今後の推進方策:当初の計画がほぼ順調に進行しているので、このまま研究を推進していけるものと考えている。当初の計画が順調に進行しているので、このまま研究を進めていけると考えている。DIC患者におけるEDMP・HMGB1・サイトカイン・可溶性接着分子の測定を行う予定である。DICの患者血漿を用いて、EDMPを測定するが、血管病変の程度の差によるEDMPの関与について検討するため、SIRS関連分子も同時に測定する予定である。特にHMGB1、サイトカイン、可溶性接着分子をELISA法で測定し、EDMP値との相関性を検討することを計画している。平成25年度の研究における最重要事項は、本研究テーマの最終目標であるDIC早期診断法の具体的な方法論にどこまで迫ることができるかという点である。その観点から、25年度はDIC治療法とバイオマーカーとの関連性を明確にする必要がある。治療法は従来から実施されているヘパリン療法と新規DIC治療薬である遺伝子組み換え型可溶性トロンボモジュリン(rTM)の影響を検討する予定である。また、23・24年度に達成できなかった基礎研究に関しては、25年度の臨床研究と並行して実施する予定である。EDMPのDC免疫誘導に関する検討を計画している。健常人ヒト末梢血単核球よりミエロイド系CD11c+DCおよびリンパ球系pDCを単離し実験に用いる。また末梢血単球、血小板、ならびに血管内皮細胞株よりMPを抽出し、実験に供する。純化した2種類のヒトDC亜群と3種類のMPを組み合わせ、それぞれを培養する。刺激活性化物質として、ミエロイド系DCに対し、poly IC(TLR3 ligand)、LPS(TLR4 ligand)およびR848(TLR7/8 ligand)を、pDCに対しては、R848(TLR7/8 ligand)、CpG(TLR9 ligand)、およびSendai virusを使用する。各DC亜群の成熟活性化度合いをCD40, CD80, CD86, CD83, HLA-DRの発現を指標としフローサイトメーターで解析する。また細胞上清におけるサイトカインの量をELISA法にて測定する。サイトカインとしてはIFN-α,IL-12,IL-6, IL-10,TNF-αを選定し、ELISA関連試薬として計上した。
残存歯根膜と成長因子を利用した意図的トランスプラントによる歯周組織再生療法の確立

重度慢性歯周炎の罹患により生ずる、大臼歯における貫通型の根分岐部病変に対する治療法はいまだ確立されていない。本研究でこのような根分岐部病変に対し、近遠心根を入れ替え再植することにより、残存する健全歯根膜の誘導による骨再生を確認することができた。また、アンキローシスや歯根吸収を抑制する目的で、成長因子であるエナメルマトリックスタンパク(エムドゲイン)を併用したが本研究では効果は認められなかった。しかし、再植の際に適切な歯根間距離、離開度を確保することでさらに効果的で確実な骨再生を期待できることが示唆された。来年度の本実験に備えて、12ヵ月齢のビーグル犬2頭を使用し予備実験を行った。研究計画書における実験Aとして、上顎左右第三前臼歯(P3)を使い、再植後に歯周組織再生を促進しアンキローシス、歯根吸収を抑制することが期待されるエムドゲインの、再植歯に対する作用を確認する実験を行った。分岐部側の歯根膜をセメントーエナメル境(CEJ)から深さ5mm、隅角から隅角の幅で除去し、近遠心根を入れ替え再植し、歯根膜のない面を骨面に向けた。実験群は再植の際、根面にエムドゲインを塗布し、コントロール群はそのまま再植を行った。その結果、実験群では歯根膜の存在する歯根面ではアンキローシスは認められなかったが、歯根膜のない歯根面では歯頚部付近にアンキローシスが見られた。コントロール群では歯根膜の有無に関わらず、いずれの面でもアンキローシスが認められた。また両群で根尖付近に歯根吸収が見られた。これにより、歯根膜の存在しない歯根面ではエムドゲインを使用してもアンキローシスが起こりうることが示唆された。次に実験Bとして、下顎左右第三、第四前臼歯(P4)の分岐部に3度の根分岐部病変(幅5mm深さ5mm)(4欠損/頭)を外科的に作製し、実験群としてI)処置なし、II)近遠心根入れ替え再植法、III)近遠心根入れ替え再植法+エムドゲイン、IV)エムドゲインのみの4処置を設定し、無作為に処置を行った。通法に従い脱灰薄切標本を作製し組織学的評価を行ったところ、2頭のうちの1頭では実験群III)で、もう1頭では実験群II)で他群と比較し、根分岐部に有意に骨再生が認められた。実験群III)では分岐部側ではアンキローシスが少ないものの、歯根膜のない歯槽骨側ではアンキローシス、歯根吸収が認められた。実験群II)ではアンキローシス、歯根吸収が分岐部側、歯槽骨側のいずれの側でも認められた。重度慢性歯周炎の罹患により生ずる貫通型の根分岐部病変に対する治療法は、切除療法が主であり、再生療法は適応外のことが多い。そこで、本研究ではこのような分岐部病変に対して、歯周組織再生を担うポテンシャルを有する歯根膜を利用し、意図的再植法を応用することで、歯根膜誘導による歯周組織再生療法を確立することを目的とする。実験動物は12ヵ月齢のビーグル犬4頭を使用した。前年度の予備実験をふまえ、下顎左右第三前臼歯(P3)、第四前臼歯(P4)の分岐部に3度の根分岐部病変(高さ5mm深さ5mm)(4欠損/頭)を外科的に作製し、実験群としてI)歯根分割、II)近遠心根入れ替え再植法、III)歯根分割+エムドゲイン(EMD)、IV)近遠心根入れ替え再植法+EMDの4処置を設定し、P 3、4に対して無作為に処置を行った。通法に従いMMA樹脂包埋によるトルイジンブルー染色標本を作製し、組織学的評価を行った。実験群I)では、根分岐部にはほとんど骨再生は認められなかった。実験群III)ではI)よりは骨再生が認められたが有意差はなかった。実験群II)ではI)、III)と比較し有意に骨再生が認められたが、既存骨との間にアンキローシスが認められた。実験群IV)では骨再生量はII)と有意差はないが、I)、III)と比較すると有意に骨再生が認められた。また、アンキローシスが一部で認められるものの、II)と比較し有意に減少していた。骨再生量は歯根の離開度、歯根間距離にも影響を受けると考えられる所見が見られた。

したがって、貫通型根分岐部病変に対して、意図的再植法を利用した歯根膜誘導骨再生療法は有用であることが示唆された。歯周病学分野平成25年度の研究計画は実験Aと実験Bである。実験Aでは上顎左右P3を使い、再植の際にエムドゲインを併用することにより、歯周組織再生の促進やアンキローシス、歯根吸収の抑制効果が見られるかを検証し、歯根膜の存在する面でのエムドゲインの効果を確認できた。実験Bでは下顎左右P3、P4を使い、垂直性骨欠損を伴う根分岐部病変3度の実験モデルの確立と近遠心根入れ替え再植法の術式の確立を目的に実験を行った。その結果、観察期間8週に対しての骨欠損のクリティカルサイズを決定することができ、近遠心根入れ替え再植法は初めての試みであるにも関わらず、骨欠損部において歯周組織再生を確認することができた。さらに当初、再植後の歯の固定方法が不確定要素であったが、隣在歯にグルーブを作製し、そこにワイヤーを埋め込みエナメルボンドシステムで固定したところ、観察期間中も脱離することはなく再植歯の固定方法も問題ないことが確認できた。これらの実験結果を基に、平成26年度に頭数を増やした本実験を計画している。本実験として、下顎左右P3、4の分岐部に3度の根分岐部病変(幅6mm深さ5mm)(4欠損/頭)を外科的に作製し、実験群としてI)歯根分割、II)近遠心根入れ替え再植法、III)近遠心根入れ替え再植法+エムドゲイン、IV)歯根分割+エムドゲインのみの4処置を設定し、無作為に処置を行う。予備実験と違いI)、IV)で歯根分割としたのは定量分析をする際に、分岐部におけるCEJからの計測を容易にするためである。分岐部病変については、クリティカルサイズとして幅5mm、深さ5mmで問題ないが、幅を6mmにすることで、サイズの違う近遠心根の入れ替えを簡単にすることができる。また、再植の際に、歯槽骨と歯根が密接することでアンキローシスや歯根吸収が起こる可能性が高まるため、そこに余裕を持たせるという意図もある。組織学的評価項目は新生骨量、歯冠歯根長比、アンキローシス量、歯根吸収量などを予定している。本実験を行うにあたり、実験動物数を増やすため実験動物の購入、飼育費用に充てる
増殖型アデノウイルスを用いた甲状腺癌遺伝子治療の基礎的検討

甲状腺癌に対する増殖型アデノウイルスの治長効果を、それぞれ甲状腺分化癌、未分化癌で検討した。(1)甲状腺分化癌に対する遺伝子治療:甲状腺特異的プロモーター(サイログロブリンプロモーター)でアデノウイルスの増殖に必須のE1A遺伝子が発現するウイルス(ただしE1B19Kはウイルスプロモーターで発現し、E1B55Kは欠失している)を作成した。このウイルスをサイログロブリンを発現する分化型甲状腺癌とサイログロブリンを発現しない他の癌細胞に感染させると、in vitroとin vivoにおいてサイログロブリン発現癌細胞特異的なE1A発現・ウイルス増殖・細胞変性効果が認められた。さらにそのウイルスと他の遺伝子療法-殺細胞遺伝子やサイトカイン発現アデノウイルスによる腫瘍免疫-との併用治療の効果を検討したところ、殺細胞遺伝子療法との併用では、同時投与の場合プロドラッグによる細胞死のため充分なウイルスの増殖がみられず併用効果は顕著でないが、増殖型ウイルスを遅らせて投与することにより明らかな併用効果が認められた。また免疫療法との併用では、in vitroで増殖型アデノウイルスによるE1A発現がサイトカイン発現非増殖型アデノウイルスの増殖を誘導しサイトカイン発現の著明な上昇が観察された。in vivoではヌードマウスによる実験のためNK細胞しか誘導されないが、このような条件でも明らかな併用効果がみられた。免疫が正常な場合にはより強い併用効果が期待される。(2)甲状腺未分化癌に対する遺伝子治療:甲状腺未分化癌は高頻度に腫瘍抑制遺伝子p53に変異を持つ。よってp53反応性プロモーターでCre recombinaseが発現するアデノウイルスと、2つのloxPで挟まれたアデノE1A遺伝子がウイルスプロモーターで発現するウイルス(ただしE1B19Kはウイルスプロモーターで発現し、E1B55Kは欠失している)とを作成した。これらのウイルスをp53に変異を持つ甲状腺未分化癌細胞とp53正常癌細胞に共感染させると、in vitroにおいてp53遺伝子変異細胞特異的なE1A発現・ウイルス増殖・細胞変性効果を認められた。しかしin vivoでは共感染の確率が低く効果が不十分であった。そこでこの2種類のアデノウイルスの1本化を試みたが、p53反応性プロモーターがウイルス増殖に用いる293細胞において完全にsilentではないため、293細胞内でウイルス遺伝子の組換え・欠失が起こり、1本化は不可能であった。甲状腺分化癌と未分化癌に特異的な増殖型アデノウイルスを作成し、その効果をin vitroとin vivoにて検討した。1、分化癌に対しては、甲状腺特異的プロモーター(サイログロブリンプロモーター)でアデノウイルスE1A(アデノウイルス増殖に必須)が発現するウイルス(ただしE1B19Kはウイルスプロモーターで発現し、E1B55Kは発現しない)を作成した。このウイルスをサイログロブリンを発現する分化型甲状腺癌とサイログロブリンを発現しない他の癌細胞に感染させ、in vitroとin vivoにおいてサイログロブリン発現甲状腺癌特異的なE1A発現・ウイルス増殖・細胞変性効果を確認した。

今後は、殺細胞遺伝子や腫瘍免疫との併用療法の可能性を探るため、自殺遺伝子発現アデノウイルスや、サイトカイン発現アデノウイルスとの併用効果を検討する。2、未分化癌に対しては、この種の癌は高頻度に腫瘍抑制遺伝子p53に変異を持つので、p53反応性プロモーターでCre recombinaseが発現するウイルスと、2つのloxPで挟まれたアデノE1A遺伝子がウイルスプロモーターで発現されるウイルス(E1B19Kは他のウイルスプロモーターで発現するように組み込まれているが、E1B55Kは発現しない)とを作成した。これらのウイルスをp53遺伝子に変異を持つ甲状腺未分化癌細胞とp53が正常な癌細胞に共感染させ、in vitroにおいてp53遺伝子に変異を持つ甲状腺未分化癌細胞特異的なE1A発現・ウイルス増殖・細胞変性効果を認めた。しかし、in vivoでは、in vitroに比較して共感染の確率が低いため、p53正常細胞においてもかなりの影響が見られた。よって、次はこの2つのウイルスを1本化し、in vivoでの効果選択性及び細胞変性効果の増強を試みる。(1)甲状腺分化癌に対する遺伝子治療:12年度にサイログロブリンプロモーターでアデノウイルスの増殖に必須のE1A遺伝子を発現させることにより、サイログロブリン発現甲状腺分化癌で特異的に増殖するアデノウイルスを作成し、その単独での有用性を報告した。13年度には、そのウイルスと他の遺伝子療法-殺細胞遺伝子やサイトカイン発現アデノウイルスによる腫瘍免疫療法-との併用療法の効果を検討した。(a)殺細胞遺伝子療法との併用では、同時投与の場合プロドラッグによる細胞死のため充分なウイルスの増殖がみられず併用効果は顕著でないが、増殖型ウイルスを遅らせて投与することにより明らかな併用効果が認められた。(b)免疫療法との併用では、in vitroで増殖型アデノウイルスによるE1A発現がサイトカイン発現非増殖型アデノウイルスの増殖を誘導しサイトカイン発現の著明な上昇が観察された。in vivoではヌードマウスによる実験のためNK細胞しか誘導されないが、このような条件でも明らかな併用効果がみられた。免疫が正常な場合にはより強い併用効果が期待できるであろうことが推測された。(2)甲状腺未分化癌に対する遺伝子治療:高頻度に腫瘍抑制遺伝子p53に変異がみられる甲状腺未分化癌に対して、p53反応性プロモーターとCre-loxP systemを用いて正常p53を持たない細胞でのみ増殖するアデノウイルスを作成した。しかしこの方法は2種類のアデノウイルスを用いるので、in vivoでは共感染の確率が低く効果が不十分であった。そこでこの2種類のアデノウイルスの1本化を試みたが、p53反応性プロモーターがウイルス増殖に用いる293細胞において完全にsilentではないため、293細胞内でウイルス遺伝子の組換え・欠失が起こり、1本化は不可能であることが判明した。
ドーパミン刺激薬反復投与禁断時における行動薬理学的特性

CocaineおよびMethamphetamineのようなドーパミン刺激薬の反復投与離脱時初期(1-7日)にD_1受容体遮断薬のSCH23390によるマウスのカタレプシ-の反応は減弱(D_1受容体の感受性は増強)し、D_2受容体遮断薬のHaloperidolによるそれは増強(D_2受容体の感受性は減弱)した。離脱後期(14-21日)にはSCH23390カタレプシ-は逆に増強した。また、反復投与量の増加およびその期間の延長に従って後期のSCH23390カタレプシ-の増強効果は強力であった。これらの薬物の離脱所期に見られるSCH23390カタレプシ-の減弱はMethamphetamine反復投与の方が、また離脱後期の増強効果はCocaineによる方が強力であった。したがって,間接的ドーパミン刺激薬の反復投与によって生ずる逆耐性現象がカタレプシ-反応(抑制作用)の抑制に対応するならば、逆耐性現象は主にD_1受容体の活動を介して発現することが考えられる。SCH23390カタレプシ-の減弱およびHaloperidolカタレプシ-の増強がSCH23390あるいはHaloperidolの同時併用投与によっていずれも回復されたことから副作用(tardive dyskinesiaなど)の少ない抗精神病薬としてD_1受容体遮断薬を使用に供することが出来るかもしれない。しかしながら、後期に見られるSCH23390およびHaloperidolカタレプシ-の増強をいずれも悪化させた。また、Gi-蛋白質を百日咳毒素によってADP-リボシル化した場合、両者のカタレプシ-反応を共に延長した。したがって、D_2受容体の感受性の低下とは関連するようであるがD_1受容体の興奮には関与しないから、離脱初期の逆耐現象には特にGi-蛋白質のADPリボシル化の関与は考えられない。後期に見られるD_1受容体の感受性の増強に関与する可能性があるかも知れないので更なる研究が必要である。Cocaineおよびmethamphetamineのようなドーパミン刺激薬の反復投与離脱時初期(1-7日)にD_1受容体遮断薬のSCH23390によるマウスのカタレプシ-反応は減弱(D_1受容体の感受性は増強)し、D_2受容体遮断薬のhaloperidolによるそれは増強(D_2受容体の感受性は減弱)した。離脱後期(14-21日)にはSCH23390カタレプシ-は逆に増強したが、haloperidolカタレプシ-では、初期に見られた増強効果が後期には回復された。また、反復投与の期間が長いほど後期のSCH23390カタレプシ-の増強効果は強力であった。これら薬物の離脱初期に見られるSCH23390カタレプシ-の減弱はmethamphetamine反復投与の方が、また、離脱後期の増強効果はcocaineによる方が強力であった。Methamphetamine反復投与の離脱初期に見られるSCH23390カタレプシ-の減弱およびhaloperidolカタレプシ-の増強効果が、SCH23390あるいはhaloperidolの同時併用投与によっていずれも回復された。