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光回復酵素の修復機構の解明とそれを利用した紫外線損傷DNA人工修復系の創成

地球上で生活を営む生物は太陽光を様々な生命現象に用いることで活動を続けることができる一方、遺伝情報の本質であるDNAは太陽光中に含まれる紫外線に晒されると化学構造の変化が誘発され、突然変異・癌化の一因となる。フラビン蛋白質の一種である光回復酵素は、太陽光中の短波長可視光を利用してDNA上に生成した紫外線損傷を認識し、光依存的電子移動により修復するユニークな酵素であり、様々な生物種で確認されている。しかし、ヒトはこの酵素を持っていないので、細胞中でこの酵素と同等の機能を有する低分子化合物を開発できれば、紫外線損傷修復系欠如由来の遺伝的疾患の改善、ひいては皮膚がん予防薬の創成が見込まれる。そこで、生体内で生成する化学構造を持った2本鎖中の紫外線損傷DNAの人工修復系の創成を最終目標とした上で、依然明らかになっていない光回復酵素の基質認識および反応機構について調べることを企図した。申請者は本年度の研究として、紫外線損傷DNAの中でも変異原性の高い、(6-4)光産物を修復できる(6-4)光回復酵素の反応機構を調べることを目的に、反応に関与すると考えられる官能基の水素結合能を変換した(6-4)光産物アナログを有するオリゴヌクレオチドを調製し、本基質アナログに対する酵素の修復能および結合能について調べた。その結果、(6-4)光回復酵素はこの基質アナログに結合できるものの、修復反応が進行しないことが明らかとなり、着目した官能基が修復反応に関与する可能性が示唆された。この成果は雑誌論文に投稿し、現在審査・改訂中である。申請者は本年度の研究として、紫外線損傷DNAの中でも変異原性の高い、(6-4)光産物を修復できる(6-4)光回復酵素の反応機構を調べることを目的に、酵素-損傷間での水素結合に関与していると推定される窒素原子を同位体置換した(6-4)光産物を合成し、その窒素原子上における水素結合の可能性について調べた。その結果、予想よりも1pKaユニット分プロトン化が起こりにくいことを明らかにし、これまでに想定されていた反応機構から鑑みると、その損傷は修復されにくい性質を持っていることを明らかにした。この成果は雑誌論文に発表を行った。
光学的マッピングを用いた左心房容量負荷心房細動モデルの電気生理学的検討

本研究の目的は、ヒトの慢性心房細動と同様の血行動態的条件で心房細動が発生かつ維持される実験モデルを作成し、その電気生理学的検討を行うことである。平成16年度は実験モデルの確立を行った。平成17年度は前年度にひきつづき、確立された実験モデルを多数作製し心表面マッピングを行うことにより詳細な電気生理学的検討を行った。雑種成犬10頭に対して全身麻酔、気管内挿管下に左開胸を行い、左鎖骨下動脈・左肺動脈吻合を行う。さらに、左心耳にペーシング電極を縫着し、高頻度刺激ペースメーカーに接続した。術後5週間でほとんどすべての雑種成犬は心房細動に移行した。これに対して256チャンネルマッピングシステムを用いて心房心外膜の電気的マッピングを行い、心房表面全体の興奮伝播の観察を行った。マッピング所見では、すべての雑種成犬において複数の起源をもつ興奮波が観察された。さらに全例において左上肺静脈より出現する巣状興奮がみられたことは興味深い。これは左房容量負荷による心房筋の伸展に起因するものと思われる。また右房を旋回するリエントリーを2例に認めた。原因として心膜切開に伴う心外膜炎や左右シャントによる肺高血圧の影響もあると思われる。平成18年度は電気的マッピングに加えて光学的マッピングを行なう予定であった。光学的マッピングは標本に電位感受性色素を灌流し、暗室で単一波長光を照射することにより心房興奮波を直接描出することが出来る。これを特殊冷却装置付きの高解像度CCDカメラを用いてコンピューターに記録、同時に動画として表示する。しかしながら体重30kgの雑種成犬の摘出心臓は大きく、実際のデータ解析は困難であると思われた。今後さらなる改良および実験方法の検討を要すると考えられる。雑種成犬(30-40kg)5頭に対して全身麻酔、気管内挿管下に左開胸を行い、左鎖骨下動脈を剥離。これを左肺動脈に吻合した。併発するうっ血性心不全に対しては、利尿剤を中心とした治療を行い心不全をコントロールを行った。さらに、左心耳にペーシング電極を縫着し、動物実験用高頻度刺激ペースメーカーに接続し、ジェネレーターは背部皮下に埋没留置した。また電位記録用双極電極を両心耳に縫着し、体表より電位計測が可能なように皮膚に誘導固定した。術後一週より刺激周期100msにて左房高頻度刺激を開始し、高頻度刺激停止後に観察される心房細動の持続時間と両心房の興奮周期を計測した。全頭において高度のうっ血性心不全および左心房の拡大が認められ、うち2頭は心不全のため死亡した。残る3頭は心房細動持続時間が徐々に延長し、術後4週目には持続性の心房細動となった。マッピング所見では、左右の上肺静脈より出現する反復性巣状興奮および右房を旋回するリエントリーが観察された。また下肺静脈を起源とする巣状興奮は見られなかった。得られた知見は2005年米国心臓学会議(ACC)にて発表した。術後一週より刺激周期100msにて左房高頻度刺激を開始し、高頻度刺激停止後に観察される心房細動の持続時間を計測した。全頭において高度のうっ血性心不全および左心房の拡大が認められ、うち3頭は心不全のため死亡、1頭はペーシング不全を生じた。残る6頭は心房細動持続時間が徐々に延長し、術後4週目には持続性の心房細動となった。今後光学的マッピングを行うことで心房全体の解析を行う予定である。得られた知見は2005年米国心臓学会議(ACC)、2005年日本胸部外科学会、2005年アジア太平洋心房細動シンポジウム(APAFS)にて発表した。

本研究の目的は、ヒトの慢性心房細動と同様の血行動態的条件で心房細動が発生かつ維持される実験モデルを作成し、その電気生理学的検討を行うことである。平成16年度は実験モデルの確立を行った。平成17年度は前年度にひきつづき、確立された実験モデルを多数作製し心表面マッピングを行うことにより詳細な電気生理学的検討を行った。雑種成犬10頭に対して全身麻酔、気管内挿管下に左開胸を行い、左鎖骨下動脈・左肺動脈吻合を行う。さらに、左心耳にペーシング電極を縫着し、高頻度刺激ペースメーカーに接続した。術後5週間でほとんどすべての雑種成犬は心房細動に移行した。これに対して256チャンネルマッピングシステムを用いて心房心外膜の電気的マッピングを行い、心房表面全体の興奮伝播の観察を行った。マッピング所見では、すべての雑種成犬において複数の起源をもつ興奮波が観察された。さらに全例において左上肺静脈より出現する巣状興奮がみられたことは興味深い。これは左房容量負荷による心房筋の伸展に起因するものと思われる。また右房を旋回するリエントリーを2例に認めた。原因として心膜切開に伴う心外膜炎や左右シャントによる肺高血圧の影響もあると思われる。平成18年度は電気的マッピングに加えて光学的マッピングを行なう予定であった。光学的マッピングは標本に電位感受性色素を灌流し、暗室で単一波長光を照射することにより心房興奮波を直接描出することが出来る。これを特殊冷却装置付きの高解像度CCDカメラを用いてコンピューターに記録、同時に動画として表示する。しかしながら体重30kgの雑種成犬の摘出心臓は大きく、実際のデータ解析は困難であると思われた。今後さらなる改良および実験方法の検討を要すると考えられる。
シアル酸代謝酵素の逆遺伝学的および生化学的解析によるシアル酸の機能探索

27年度が最終年度であるため、記入しない。シアル酸は糖タンパク質のN型糖鎖やO型糖鎖、糖脂質の非還元末端に位置する単糖である。シアル酸は結合様式や修飾基の多様性が知られていること、またそれらが発生段階や組織特異的な発現をすることから多様な生物学的意義が推定されている。しかし、シアル酸の構造多様性や時空間特異的発現の真の生物学的意義は未だに解明されていない。本研究はその意義の解明を目指して、以下の目的を掲げて推進してきた:(1)メダカを動物の個体モデルとして用いて、シアル酸の発生段階特異的および組織特異的な発現の生物学的意義を解明すること;(2)脊椎動物とは性質の異なる昆虫由来CMP-シアル酸合成酵素(CSS)を用いることによって、CSSの細胞内局在およびCSSの未知領域であるC末端ドメインの存在における重要性を明らかにする。まず、(1)については、CMP-シアル酸合成酵素(CSS)に着目して、その発現抑制メダカ(ノックダウン(KD)メダカ)の作出をTILLINGという逆遺伝学的技術を用いて行った。その結果、2種類のCSS変異体酵素で酵素活性が低下する遺伝子の存在が見出された。現在、個体レベルでの表現型を探索できる段階になりつつある。また、(2)については、3種類の昆虫(コクヌストモドキ、カ、ハエ)からCSSをクローニングすることに成功し、組換え体酵素の多様なシアル酸種に対する速度論的解析と細胞内局在解析を行った。その結果、全ての昆虫由来CSSは弱いながらも酵素活性を有することがわかった。一方、細胞内局在については、ハエCSSはゴルジ装置に局在するのに対して、コクヌストモドキCSSとカCSSは主にERに局在するという興味深い違いがあることをつきとめた。この昆虫種によるCSSの局在性の違いは新しい発見であり、今後さらに検証する予定である。これまでにCSSノックダウンメダカを作出するために、TILLINGライブラリーを探索して、CSS活性の低い2種類の変異体メダカを作出することができた。また、3種類の昆虫CSSのクローニングと活性測定と細胞内局在の解析をほぼ終了することができた。予定された内容を達成することができた。今年度作出したCSSノックダウンメダカの表現型を明らかにして、個体レベルでの時空間特異的シアル酸の役割を探索する。また、臓器特異的にCSSノックアウトしたメダカの作出と解析を行う。昆虫CSSの活性と細胞内局在性については、昆虫細胞での発現系を利用して、組換え体酵素を調製してシアル酸種特異性を調べる。また、細胞内局在性の違いの原因を究明して、その生物学的意義を解明する。
全身用ポジトロンCTの消化器癌進展度診断と抗腫瘍薬剤の効果評価への応用

ポジトロンC-T(PET)は陽電子放出核種の存在部位を断層表示する装置で、各種トレーサーを用い生体の代謝を画像表示することができ為腫瘍の生理学的特性には糖要求性があり、これを利用して腫瘍の診断には主として、糖代謝薬剤Fluorine-18-2-deoxy-2-fluoro-D-glucose(FDG)が使われる。このFDG-PET腫瘍画壕は各種の癌腫診断に利用されているが胃癌、特に転移を有する進行胃癌の進展度診断への応用の報告はなく、今回の研究ではFDG-PET腫瘍画像の進行胃癌進展度診断に用いることができないかを主として検討した。PET931(7mm幅で7断面同時断層、主に上腹部のみの画像を収集)で20例、SET2400W(3.3mm幅66断面向時断層全身用装置)で22例の進行・再発胃癌のFDC-PET像を収集しvisual analysisを行った。sensitivity・specificity・accuracyは、PET931で46.9%,79.3%,61.8%、SET2400Wで71.2%・74.4%・72.7%だった。部位別に見ると、原発巣・肝転移・リンパ節転移・肺転移では診断精度は高かったが、癌性腹膜炎・腹水・癌牲胸膜炎・骨転移の検出力は極めて低かった。SET2400Wで検索した症例中未治療例19例で、原発巣におけるFDGの集積性を高・中化型群と低分化・signt cell型群で比較したところ、前者の方がFDG高集積を示した。これは後者にびまん型が前者に腫瘤形成型が多いためと解釈された。また、分子標的薬の効果判定にPETが利用出来ないか基礎的検討も平行して進めたが結果を出すには至らなかった。ポジトロンCT(PET)は陽電子放出核種の存在部位を断層表示する装置で、適当なトレーサーを用いることで、生体の代謝を画像表示することができる。腫瘍の診断には主に、腫瘍の生理学的特性の糖要求性を利用して糖代謝薬剤であるFluorine-18-2-deoxy-2-fluoro-D-glucose(FDG)が使われる。このFDG-PET腫瘍画像は各種の癌種で応用されているが胃癌、特に転移を有する進行胃癌への報告はない。本年は、FDG-PET腫瘍画像の進行胃癌進展度診断に用いることができないか精力的に検討した。PET931(7mm幅で7断面同時断層で切る装置で主に上腹部のみの画像を収集で)で20例、SET2400W(3.3mm幅66断面同時断層装置で全身をカバー)で22例の進行・再発胃癌のFDG-PET像を収集しvisual analysisを行ったところ、sensitivity・spesificity・accuracyは、PET931で46.9%・79.3%・61.8%、SET2400Wで71.2%・74.4%・72.7%だった。部位別に見ると、原発巣・肝転移・リンパ節転移・肺転移では診断精度は高かったが、癌性腹膜炎・腹水・癌性胸膜炎・骨転移の検出力は極めて低かった。更に定量的検討も行い、結果を2001年日本癌治療学会で報告、更に2002年米国核医学会に報告を予定、論文としても提出準備中である。基礎的には、ポジトロンCTが抗腫瘍薬剤として注目されている分子標的薬剤の効果判定に応用できないか検討の予定で、具体的にはepidermal growth factor(EGF)receptor antagonist(Herceptin)に注目し実験を計画している。現在EGF receptor高発現ヌードマウス移植可ヒト乳癌株BT-474を入手し、安定成長を確認しているところである。

ポジトロンCT(PFT)は陽電子放出核種の存在部位を断層表示する装置で、適当なトレーサーを用いることで、生体の代謝を画像表示することができる。腫瘍の診断には主に、腫瘍の生理学的特性の糖要求性を利用して糖代謝薬剤であるFluorine-18-2-deoxy-2-fluoro-D-glucose(FDG)が使われる。このFDG-PET腫瘍画像は各種の癌腫で応用されているが胃癌、特に転移を有する進行胃癌への報告はなく、FDG-PET腫瘍画像の進行胃癌進展度診断に用いることができないか検討した。PET931(7mm幅で7断面同時断層で切る装置で主に上腹部のみの画像を収集で)で20例、SET2400W(3.3mm幅66断面同時断層装置で全身をカバー)で22例の進行・再発胃癌のFDG-PET像を収集しvisual analysisを行ったところ、sensitivity・specificity・accuracyは、PET931で46.9%・79.3%・61.8%、SFT2400Wで71.2%・74.4%・72.7%だった。部位別に見ると、原発巣・肝転移・リンパ節転移・肺転移では診断精度は高かったが、癌性腹膜炎・腹水・癌性胸膜炎・骨転移の検出力は極めて低かった。SET2400Wで検索した症例中未治療例19例で、原発巣・肝転移巣・リンパ節転移巣におけるFDGの集積性を高分化型・中分化型群と低分化型・signet cell型群の間で比較したところ、高分化型・中分化型群の方がFDGは高集積を示した。この結果を2002年米国核医学会で口頭発表する機会を得、投稿した論文はJournal of Nuclear Medicineの2003年3月号に掲載される予定である。基礎的には、ポジトロンCTが抗腫瘍薬剤として注目されている分子標的薬剤の効果判定に応用できないか検討中だが、結果はまだ出ていない。
逆遺伝学的手法による食用担子菌の子実体関連遺伝子の解析

食用担子菌シイタケの子実体関連遺伝子の機能解析を目的に、特定の遺伝子発現を抑制する道具(遺伝子発現抑制ベクター)の作成(構築)に関して検討を行った。遺伝子発現抑制ベクターとして、遺伝子発現を制御する配列(プロモータ)2種類で発現抑制遺伝子配列を挟む形のベクターを構築した。これにより、発現抑制遺伝子のセンス鎖とアンチセンス鎖を同時に発現させ、RNA干渉(遺伝子発現抑制を引き起す減少)を誘導できる。このベクターにより子実体関連遺伝子の解析が期待できる。本研究では、逆遺伝学的手法による遺伝子機能解析技術が確立されていない食用担子菌シイタケに関して、RNAi法による遺伝子発現抑制技術を確立することと、確立された方法による特定遺伝子の機能を解析することを目的とする。また、本研究では、これまでに申請者らが単離しているシイタケ子実体の成熟と老化に関与する4種類の遺伝子exg2(エキソグルカナーゼ遣伝子をコードし、抗癌性多糖レンチナン分解活性がある)、tlg1(エンドグルカナーゼ遺伝子をコードし、レンチナン分解活性がある)、exp1(ウシグソヒトヨタケで子実体の開傘に関与することが明らかになっている遺伝子の相同性遺伝子)、eln3(ウシグソヒトヨタケで子実体の柄の伸長に関与することが明らかになっている遺伝子の相同性遺伝子)に着目し、その機能を解析する。本年度は、exp1遺伝子とexg2遺伝子に関して、約40 bpの短い長さのinvertedrepea配列が発現するようにデザインした配列をpChG'ベクターに組込んだRNAiベクターの構築を試みたが、想定したベクターの構築はうまくいかなかった。一方、別途作成したtlg1遺伝子のアンチセンス鎖を発現するベクターpChG-tlg1a導入シイタケ菌について、子実体形成させて子実体の保存試験を行ったが、少なくとも宿主株と比較して視覚的な相違は認められなかった。これまでシイタケでは、アンチセンス発現では、RNAiよりも発現抑制が弱いことが示唆されていることから、本結果もそれを反映している可能性が考えられる。そこで、構築しやすいRNAiベクターの改良に取り組み、シイタケ由来の2つのプロモータ(シイタケgpd遺伝子とras遺伝子プロモータ)で抑制遺伝子配列を挟むタイプのRNAiベクターをデザインした。現在、これに基づき構築を試みており、今後目的遺伝子の発現抑制解析を行う予定である。本研究では、逆遺伝学的手法による遺伝子機能解析技術が確立されていない食用担子菌シイタケに関して、RNAi法による遺伝子発現抑制技術の確立と、その方法による特定遺伝子の機能解析を目的とする。また、特定遺伝子としては、これまでに申請者らが単離しているシイタケ子実体の成熟と老化に関与する4種類の遺伝子exg2(エキソグルカナーゼ遺伝子をコードし、抗癌性多糖レンチナン分解活性がある)、tlg1(エンドグルカナーゼ遺伝子をコードし、レンチナン分解活性がある)、exp1(ウシグソヒトヨタケで子実体の開傘に関与することが明らかになっている遺伝子の相同性遺伝子)、eln3(ウシグソヒトヨタケで子実体の柄の伸長に関与することが明らかになっている遺伝子の相同性遺伝子)に着目し、その機能を解析する。本年度は、RNAiベクターとして、2種類のプロモーターで目的遺伝子を挟み、それぞれのプロモーターでセンス鎖とアンチセンス鎖を発現させるベクターの構築を試みた。pChGベクター(キチン合成酵素遺伝子-chs-プロモーターで薬剤耐性遺伝子を発現し、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子-gpd-プロモーターで異種遺伝子発現を行うベクター)を基にして、gpd遺伝子プロモーターの下流に逆方向になるように2つ目のプロモーターの挿入を試みた。2つ目のプロモーターとして、gpd遺伝子、chs遺伝子(キチン合成酵素遺伝子)、及びras遺伝子プロモーターに関して検討した。その結果、これら3種のプロモーターに関しては、うまく挿入できなかった。理由としては、前2種については、pChGベクターに既に存在しているプロモーターであることなどが考えられる。そこで、現在、新規のプロモーターとして、コハク酸脱水素酵素遺伝子プロモーターのpChGベクターへの挿入を行っており、プロモーター断片の増幅まで終了した。本年度は、RNAiベクターとして、2種類のプロモータで目的遺伝子を挟み、それぞれのプロモータでセンス鎖とアンチセンス鎖を発現させるベクターの構築を試みた。

pChGベクター(キチン合成酵素遺伝子-chs-プロモータで薬剤耐性遺伝子を発現し、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子-gpd-プロモータで異種遺伝子発現を行うベクター)を基にして、gpd遺伝子プロモータの下流に逆方向になるように2つ目のプロモータの挿入を試みた。2つ目のプロモータとして、chs遺伝子(キチン合成酵素遺伝子)、sdc-ip遺伝子(コハク酸脱水素酵素遺伝子)プロモータに関して検討した。その結果、chs遺伝子プロモータに関しては、ベクター(pSilent-Le1)が構築できた。また、sdc-ip遺伝子プロモータに関しても構築が確認できた(pSilent-Le2)。現在、これらのベクターに上記の子実体関連遺伝子の挿入断片の調製を行っており、今後、目的のRNAiベクターを構築する予定である。
全三畳系海洋イベントの解析-繰り返される深海無酸素事変-

三畳紀は、古生代末の大量絶滅後に海洋環境が大きく中生代型へと変換した時代と考えられている。本研究では、本邦とニュージーランドにおける三畳系の深海堆積物を検討し、従来提唱されている数より多くの海洋貧酸素事変(OAE)が起こっていたことを突き止めた。それらは、三畳紀初期では少なくとも3回、三畳紀後期に1回、発生していた事が明らかになった。また、OAEの発現と持続期間は、同じ海洋でも場所によって異なり、炭素同位体比に記録された炭素循環変動と関係がある事が判明した。平成19年度においては、以下のような成果が得られた。1)日本の深海堆積層より、三畳系上部(特に三畳系/ジュラ系境界付近)の詳細な有機炭素同位体層序を明らかにすることができた。従来の検討課題だったNorian/Rhaetian境界には明確な同位体比の変動がない可能性が高くなった。これは、ヨーロッパにおける検討結果と調和的であり、グローバルな傾向である事が示唆される。また、上部三畳系の漸進的な炭素同位体比の負へのシフトと、三畳系/ジュラ系境界直下における著しい正への変動がより明確になった。この同位体比の正のスパイクの要因は、C/N比等の検討から、起源物質の混合比率の変化ではなく、グローバルな炭素循環の変動を表していることが明らかになった。このような正のスパイクは南米チリでも報告されており、パンサラッサ海域での生物生産量の増加または大規模な火山噴火(LIPs)などが原因として考えられ、他の同位体分析による要因解明を平成20年度に行う予定である。2)古地磁気層序学的解析は、現在検討中である。上記同位体比層序が明確になった層準および下部三畳系OAE層準の試料の採取をおこなった。現在分析のための試料加工中である。平成20年前半に測定を行う予定。3)ニュージーランドの下部三畳系の試料において、放散虫およびコノドント微化石層序の検討から、新たな下部三畳系OAE深海堆積物が発見された。この発見により、古地磁気測定から少なくとも南緯34度の海山裾の深海に無酸素海域がひろがっていたことが明らかになった。今後、本新セクションにおける同位体比層序を検討し、南半球深海に記録された同位体比変動を総合的に明らかにする予定である。平成20年度においては、以下のような成果が得られた。1)日本の深海堆積層の三畳系/ジュラ系(T/J)境界からジュラ系最下部における有機炭素同位体比変動が明らかになり、T/J境界においては無酸素事変が識別されず、むしろOxygen-rich eventが示唆された。一方、ジュラ系下部SinemurianにおけるOAEが深海堆積物中に識別され、世界的なイベントである可能性が高まった。2)また上部三畳系のCarnian下部/中部境界から中部にかけての著しい有機炭素同位体比変動が検出された。チャートの微量元素分析に基づくと、Carnian下部/中部境界にはこれまで識別されてこなかったOAEが発現した可能性が考えられる。以上の1),2)の成果により、深海堆積層に記録された三畳紀新世からT/J境界を挟んでジュラ紀古世に至る全炭素同位体比変動が明らかとなった。4)ニュージーランドのワイヘケ島において新たに発見されたOAEを含む最下部三畳系深海堆積層の有機炭素同位体比の予察検討の結果、本層序断面においてもP/T境界が存在する可能性が示され,さらに詳細な調査・追加サンプリングを行った。今後は、南半球の同層準データを検討しグローバルな変動について考察する予定である。3)一方、層状チャートの古地磁気解析は、データの検討段階にある。我々の検討によって、従来磁力が弱く検討されてこなかったT/J境界層から、詳細なデータ古地磁気データが得られる事が明らかとなった。現在、測定データが初生磁化を示しているかどうかを検討中である。平成21年度においては、以下のような成果が得られた。1,三畳紀前期の世界的なOAE(海洋貧酸素事変)は、ニュージーランドの2層序断面での検討の結果、その発現と持続時間には明らかな地域差がある事が判明した。南緯34°と北半球低・中緯度域では、OAEαがP/T境界からSpathianまで継続しているが、南半球のArrow Rocks sectionの堆積場では、長期間のOAEは発現せず、3度の短期OAEが繰り返し訪れている事が判明した。現在、Arrow Rocksの堆積場を古地磁気学的アプローチで再度検討中である。ArrowRocks堆積場の緯度が確定できれば、より精度の高い海洋環境の復元が可能になると思われる。

2,三畳紀のOAEの発達は、前期のみにとどまらず、三畳紀後期Carnian前期と中期の境界において顕著なOAEがパンサラッサ域で起こっている事が明らかとなった。遠洋堆積物の詳細な微量元素および有機炭素同位体比変動の検討により、その原因は、海洋表層域での生物生産量の急激な増加が考えられる。有機物の多量供給によって、溶存酸素の消費が促進され海洋酸欠状態になった可能性が高い。三畳紀後期のOAEは、これまで報告されておらず世界ではじめての知見となる。今後、このCarnian OAEが世界的規模での現象がどうかを、様々な地域における同年代の地層で検討し、報告論文にまとめる予定である。3,三畳紀末期のOs同位体比変動をJAMSTECの黒田氏との共同研究で検討した。その結果、三畳紀末期に大西洋のオープニングに伴う洪水玄武岩の大規模な噴火の記録が遠洋堆積物中に記録されている事が明らかになった。また、そのピークは、海洋生物の絶滅層準と一致せず先行していることが判明した(投稿中)。
品種改良にともなう根-菌根菌共生系の進化解明

昨年度までに採取したトウモロコシ根サンプルからDNAを抽出し、菌根菌のrRNA遺伝子に特異的な複数のPCRプライマーセットを用いてNested-PCRを行い、当該遺伝子を増幅した上で、DNA増幅物をアガロースゲルで電気泳動した。その結果、理論的は単一の長さのDNA増幅物が得られるところが、多くのプライマーセットで、長さが異なる複数のDNA増幅物が得られたことから、これら増幅物を直接、制限酵素断片長多型解析やDGGE解析に供することはできなかった。そのため、アガロースゲルで電気泳動した異なる長さのDNA増幅物の中から、rRNA遺伝子配列情報から推定される長さのDNA増幅物を切出し、精製して、幾つかの制限酵素を用いて制限酵素断片長多型解析を行った。その結果、断片長多型は観察されて、多様性の存在が推定されたものの、ゲルからの切出しと精製を経ているため、DNA量の低下により、断片化したDNAバンドの明瞭性が十分でなく、より正確な多様性の解析のためには実験手法の更なる改良が必要と思われた。今年度までの調査結果を用いて、トウモロコシ遺伝資源の菌根菌感染率と育成履歴、特性データ(耐病性等)、形態形質との間の関連性を解析した。この解析では、大量のデータを処理できる統計ソフト・SASを用いて、高度な分散分析をおこなった。その結果、幾つかの遺伝資源グループにおいて、菌根菌感染率と地上部生育との間に正、又は、負の相関が観察されたことから、菌根菌感染を遺伝的に制御することで、トウモロコシの生育を改良できる可能性が考えられた。解析結果は英語論文に取りまとめ中であり、投稿予定である。トウモロコシは、根にリン酸吸収を補助するアーバスキュラー菌根菌が共生(感染)する。根の菌根菌感染率は、トウモロコシの系統、品種間で異なることから、品種改良にともなって、根-菌根菌共生系が変化(進化)した可能性がある。本研究は、減化学肥料型の栽培体系や品種の開発に向けて、品種改良にともなう根-菌根菌共生系の変化の解明を目指している。本年度は、トウモロコシ遺伝資源を栽培して、根内に形成された菌根を染色し、一部の植物サンプルの菌感染率を計測するとともに、次年度以降の歯相解析のために、別途、根サンプルを凍結保存した。昨年度までの試験結果と合わせて統計解析したところ、トウモロコシの近代F_1雑種(品種)、日本在来品種及び自殖系統(F_1雑種の作成に利用される親)のそれぞれで、生育初期の菌根菌感染率には品種・系統間差が認められた。近代F_1雑種と在来種の感染率を比べた結果、近代F_1雑種の値が高いことから、化学肥料依存型の近代トウモロコシ育種によって菌根菌の感染性は低下していないと推察された。近代F_1雑種の親を含む自殖系統では、一部の地域で育成された系統群が、他地域の系統群と比べて、高い感染率を示す傾向にあったことから、特定の遺伝資源には感染を促進する遺伝的要因が存在すると思われた。これらの結果から、品種改良によりトウモロコシの菌根菌感染性は変化(進化)していると推測されるが、変化の方向性は、従来の予測とは異なっていた。本年度は、昨年度までに栽培し、採取したトウモロコシ遺伝資源の根を供試して、根内に形成された菌根を染色して、菌感染率を計測し、遺伝資源における感染能力の変動を解析した。また、感染した菌根菌の菌相を解析するために、採取した根サンプルからDNAを抽出し、このDNAを鋳型にして菌根菌のリボゾームRNA遺伝子のPCR増幅を試みた。昨年度までの菌根菌感染率のデータと合わせて統計解析したところ、トウモロコシの近代F_1品種、日本在来品種及び自殖系統(F_1品種の親)のそれぞれで、生育初期の菌根菌感染率に品種・系統間差が認められた。F_1品種と自殖系統の菌根菌感染率を比べたところ、F_1品種の値が高いことから、他の形態形質と同様に、感染率にも雑種強勢が現れる可能性がある。過去に報告された実験手法に基づいて、菌根菌のリボゾームRNA遺伝子のPCR増幅を試みたが、増幅が極めて弱い場合や、増幅産物に期待されるDNA以外のDNAが多数含まれる場合があった。そのため、増幅産物の電気泳動により菌根菌相を推定、解析するためには、PCRプライマー等の増幅条件の更なる検討や増幅産物の精製が必要と考えられた。

そのため、アガロースゲルで電気泳動した異なる長さのDNA増幅物の中から、rRNA遺伝子配列情報から推定される長さのDNA増幅物を切出し、精製して、幾つかの制限酵素を用いて制限酵素断片長多型解析を行った。その結果、断片長多型は観察されて、多様性の存在が推定されたものの、ゲルからの切出しと精製を経ているため、DNA量の低下により、断片化したDNAバンドの明瞭性が十分でなく、より正確な多様性の解析のためには実験手法の更なる改良が必要と思われた。今年度までの調査結果を用いて、トウモロコシ遺伝資源の菌根菌感染率と育成履歴、特性データ(耐病性等)、形態形質との間の関連性を解析した。この解析では、大量のデータを処理できる統計ソフト・SASを用いて、高度な分散分析をおこなった。その結果、幾つかの遺伝資源グループにおいて、菌根菌感染率と地上部生育との間に正、又は、負の相関が観察されたことから、菌根菌感染を遺伝的に制御することで、トウモロコシの生育を改良できる可能性が考えられた。解析結果は英語論文に取りまとめ中であり、投稿予定である。
空中マイクロ液滴プロセスによる構造化ソフトデバイスの高速生成

本研究では微小液滴の高速射出ならびに空中での飛翔制御の要素技術を用いて、複数の液滴の衝突融合により高次の内部構造と機能を有する複合マイクロ構造を作製する技術の開発を行った。研究により複合液滴を毎秒10万個以上生成する高速プロセスを作製し、実際に蛍光分子を含む溶液を用いてその内部構造を可視化することに成功した。さらに具体的な生成物としてヒト赤血球程度の大きさを有するソフトマイクロカプセルの生成を行った。本研究ではμm径のカプセル構造を持つ機能粒子を高速生成し、かつそのマイクロ構造を安定化させる技術を構築することを目的とする。さらにマイクロカプセル構造を長期に渡って安定的に保持・保存できるプロセスを開発し、一連の空中造形プロセスの最終モデルを完成させる。最終的に生成される安定したマイクロ粒子はその構造の分布や歩留まり、径時変化や外的環境に対する安定性などを容易に観察、評価することが可能である。このため、微小液滴空中造形プロセスの将来の工業化に向けての定量的な評価基準を与えることになる。本研究では「微小液滴空中造形プロセスによるマイクロカプセル生成」という象徴的かつ具体的な成果を結果として明示し、この技術の「ものづくり手法」としての優越性を学界並びに産業界に示すことが最終的な目標である。今年度は、高分子ナノ薄膜コーティングによる安定化ソフト粒子の高速生成を目指して研究を継続して行った。これまでに開発した各要素技術を組み合わせた空中微小液滴プロセスラインを構成し複数液滴の衝突・融合による複層構造液滴を作製した。この中で、従来はお互いに不溶の性質を持つ異なる液体の液滴を用い、その界面張力差を利用してカプセル構造を形成していたものを、可溶性異種液滴の融合による複層構造の発現を目指して材料の探索を行った。この結果、純水とある種のアルコール水溶液との組み合わせにより、有効にカプセル構造が形成されることを見出した。これによりプロセスに使用可能な液体の組みあわせが飛躍的に広がり、かつ有害な有機溶媒を用いないマイクロ液滴プロセスの可能性を見出すことができた。本研究ではμm径のカプセル構造を持つ機能性粒子を高速生成し、かつそのマイクロ構造を安定化させる技術を構築することを目的とする。さらにマイクロカプセル構造を長期にわたって安定的に保持・保存できるプロセスを開発し、一連の空中造形プロセスの最終モデルを完成させる。最終的に生成される安定したマイクロ粒子はその構造の分布や歩留まり、経時変化や外的環境に対する安定性などを容易に観察、評価することが可能である。このため微小液滴空中造形プロセスの将来の工業化に向けての定量的な評価基準を与えることになる。本研究では「微小液滴空中造形プロセスによるマイクロカプセル生成」という象徴的かつ具体的な成果を結果として明示し、この技術の「ものづくり手法」としての優越性を学界ならびに産業界に示すことが最終的な目標である。今年度は、互いに相溶する異種液体の液滴の融合により、高次のカプセル構造を作製する新しい手法について、その可能性を実験的に検証した。例えば純水とエタノールは、マクロな大きさと時間スケールにおいては互いに溶け合うことが常識であるが、一方それぞれは異なる表面張力を有し、かつ分子レベルでお互いが拡散しあって均一な水溶液を構成するためには相応の時間を要する。微小液滴の生成時間は表面張力ならびに粘性と粒子サイズで決まるが、μm領域にあってはこの時間スケールは数10μ秒であり、これは上記の拡散時間に比べて非常に小さい。この時間的に非相溶な系を用いてカプセル構造を形成すれば、材料の選択肢はこれまでに比べて飛躍的に広がる。このため実際にエタノール水溶液と水が衝突融合する状態のモニタリングを行った。ここでは透明な二つの層の構造を立体的に可視化するために、蛍光発光と光吸収を組み合わせる工夫を施し、両者が良好な同心球構造を形成することを確認した。27年度の研究において、互いに相溶する異種の材料を用いてカプセル構造を形成させる可能性を見出し、かつこれを実験的に確認することができた。これにより当初計画段階での材料の選択肢が大幅に広がり、例えば生体適用性についても対応が容易になるなど大きな成果を得た。この技術は微小液滴プロセスのみならず高速のマイクロフルイディクスにも応用可能であるため、本研究においてこれを高精度化する試みを計画に加えることとした。さらにマイクロカプセル構造を長期にわたって安定的に保持。保存できるプロセスを開発し、一連の空中造形プロセスの最終モデルを完成させる。今年度は、複数の液滴の衝突により自然界では存在しない高表面密度の表面吸着膜を作製しその物性計測を試みた。二つの液滴が衝突融合する場合、形成後の液滴の表面積は衝突前に比べてその総量は減少する。

界面活性剤分子を溶融する液体を用いて液滴衝突を行うと、衝突前にすでに飽和状態の吸着膜が液滴表面に形成されているために、衝突により過飽和の表面吸着状態が生じる。通常の界面活性剤溶液では、バルク中にミセルなどの分子集合体を形成してしまうため、高濃度領域においてもこのような過飽和状態の表面吸着膜は形成されないが、マイクロ液滴プロセスを用いることで人工的に分子の高密度状態を作り出すことができる。衝突後の液滴振動から、平衡状態よりさらに表面エネルギーが小さい状態が過渡的に形成されること、さらにこの状態が数0.1m秒のオーダーで平衡状態へと緩和していく様子が実験的に観測できた。このような過飽和吸着状態の観察は、より界面活性の高い両親倍性分子を設計する上で重要な知見お与える。本年度の研究により、自然界には存在しない高密度の表面吸着膜の形成とその物性測定が可能になった。これにより当初計画段階での材料の選択肢が大幅に広がり、いわば過渡的ではあるが非常に界面活性の高い吸着状態を観察することができるという大きな成果を得た。この技術は今後の界面活性剤の分子設計上、重要なツールとなるものであり、本研究においてこれを高精度化する試みを加えることとした。本研究ではμm径のカプセル構造を持つ機能性粒子を高速生成し、かつそのマイクロ構造を安定化させる技術を構築することを目的とする。さらにマイクロカプセル構造を長期にわたって安定的に保持。保存できるプロセスを開発し、一連の空中造形プロセスの最終モデルを完成させる。最終的に生成される安定したマイクロ粒子はその構造の分布や歩留まり、経時変化や外的環境に対する安定性などを容易に観察、評価することが可能である。このため微小液滴空中造形プロセスの将来の工業化に向けての定量的な評価基準を与えることになる。本研究では「微小液滴空中造形プロセスによるマイクロカプセル生成」という象徴的かつ具体的な成果を結果として明示し、この技術の「ものづくり手法」としての優越性を学界ならびに産業界に示すことが最終的な目標である。今年度はより長いプロセス時間の確保を目指して、液滴の搬送距離を拡張しかつその位置再現精度を向上させる要素技術の開発を行った。これまでの研究により液滴が飛翔する空間の雰囲気圧力を低下させると、流れのレイノルズ数が減少する効果により飛跡が安定化するという現象を見出している。この効果を定量的に評価するために雰囲気圧力と位置再現性の関係を詳細に分析した。この結果、飛翔の安定化があるレイノルズ数近傍において相転移的に生じることが明らかとなった。さらに安定化の要因として雰囲気流れの安定化に要する時間の短縮の効果を見出した。動粘性係数は運動量の輸送係数であり、低圧においては気体の動粘性係数は増加する。これにより液滴射出開始から周囲の雰囲気流れが定常となるまでの時間は、運動量の輸送係数が増加することに伴って短縮される。実際に1/100気圧程度の減圧に伴って気流の安定化に要する時間は10分のオーダーから数10秒へと飛躍的に短縮され、工学プロセスとしての迅速性を確保することが可能になった。本研究では微小液滴の高速射出ならびに空中での飛翔制御の要素技術を用いて、複数の液滴の衝突融合により高次の内部構造と機能を有する複合マイクロ構造を作製する技術の開発を行った。
学生(中・高・大学生)の社会人に対するイメージが与える心理的影響に関する研究

1,研究目的日本の若年層が、将来をどのようにとらえているのかという進路意識について実証的に検討を行った研究は希少である。そこで、本研究では、中学校段階から大学段階の学生の社会人に対するイメージの変容とその心理的影響について研究を進めた。特に本研究では、心理療法などで広く活用されている深層心理に迫る投影法性格検査として知られる描画法を用いて中学生の社会人に対するイメージについて探索的に検討した。2,研究方法(1)予備調査中学生233名を対象に質問紙調査法による集合調査を実施し、描画法による「社会人イメージ尺度」の概観を探索的に検討した。(2)本調査予備調査の結果をもとに、中学生427名、高校生277名、大学生305名対象に質問紙調査法による集合調査を実施し、各発達段階の社会人に対するイメージの変容について検討した。3,研究成果(1)社会人に対するイメージは、描画されたモデルの表情及び発話から読み取ることができ、4つの特色(ポジティブ・能動ネガティブ・受動ネガティブ・不明瞭)があることが明らかになった。(2)社会人に対するイメージの描画は、中学生・高校生・大学生の発達段階に応じて、描画に登場する人の数、表情、背景、モデルの外見、描画のヒント、モデルの性別が変化し、性別によって、モデルの年齢、表情、発話、背景、モデルの外見、描画のヒント、モデルの性別に相違があることが認められた。特に、表情及び発話においては、発達段階が進むにつれ、ポジティブなイメージが減少し、不明瞭なイメージが増加することが明らかになった。(3)進路成熟度は、中学生・高校生・大学生の発達段階に応じて、向上することが認められ、社会人に対するイメージによる違いは見られなかった。社会人に対するイメージ及び進路成熟度は中学生・高校生・大学生の発達段階に応じて変化することが認めたれた。しかし、社会人に対するイメージと進路成熟度の関連性は認められなかった。以上のことから、従来の量的尺度では測定できなかった、価値観やイメージなどの質的側面を測定する場合、描画法が有効な尺度となる可能性が示唆された。
宗教の社会貢献活動に関わる比較文化・社会学的研究

社会貢献活動を行う宗教団体・宗教文化の特徴を比較宗教・比較社会論的視点から明らかにする調査活動を実施し、共生・思いやり・社会的互恵性・公共性の諸理念を形成することに宗教の果たす役割があることを明らかにした。その成果の一部は稲場圭信・櫻井義秀編『社会貢献する宗教』世界思想社、2009年で明らかにされ、分担・協力研究者たちの研究により、宗教と社会貢献の関連を研究する研究分野を宗教社会学に確立した。初年度は各自の調査研究と本科研の包括的研究課題とのすりあわせを行うことに重点を置きながら、次の研究活動を行った。1)研究会の開催。2007年5月22日、8月7日、11月23日、2008年3月22日の3回にわたり研究会を行った。分担研究者4,5名が研究計画・構想を発表し、研究協力者を中心に話題提供を行った。以下、発表者とタイトルを記述し、本研究会の活動状況を示す。なお、研究協力者になるものの発表も含める。黒崎浩行「地域づくりにおける再帰的スピリチュアリティの活用-熊本県人吉市における神社祭礼の事例をもとに-」森葉月「現代における『脱宗教の宗教』の可能性を考える-インドネシアの事例から」玉置充子「タイ華人の民間宗教系慈善団体の社会活動とネットワーク」岡光信子「イスラム社会におけるキリスト教修道会の社会奉仕-インドネシアを手がかりに-」中西尋子「韓国におけるキリスト教系信者の諸相」濱田陽「戦争と日本宗教の軋轢の彼方へ-『東アジアの終戦記念日』吉野航一「外来宗教と土着化と信者たちの宗教実践-沖縄本島都市部を事例に-」松島公望「プロテスタント・キリスト教に関わる青年の「宗教性」および援助行動の発達とその関連」2)次年度は「宗教と社会」学会において宗教と社会貢献に関わる基礎理論の成果発表を行い、日本宗教学会において、各地の諸宗教による社会貢献活動の事例報告を行う予定であり、その準備を各自進めているところである。2年度は各自の調査研究と本科研の包括的研究課題とのすりあわせを行いながら、次の研究活動を行った。1)研究会の開催。2008年6月1日、9月6日、11月14日、12月27日、2009年3月21日の3回にわたり研究会を行った。稲場圭信「宗教の社会貢献活動の諸相」藤本頼生:「神社神道の社会貢献活動について」ランジャナ・ムコパディヤーヤ:「慈悲と智慧のネットワーク-グーロバル化における『社会参加仏教』」白波瀬達也「沖縄におけるキリスト教系NPOの野宿者支援の事例報告」板井正斉「ボランティア活動動機から見る神道的価値観」奥村みさ:「19世紀フランス女子修道会の女子教育への貢献-幼きイエス会のフランス・マラヤ・日本での教育活動を事例に-」泉経武「タイのスピリチュアリティと社会開発」濱田陽「賀川豊彦の社会事業群とその相互連関性」高尾賢一郎「宗教と社会貢献活動ということの意味について」矢野秀武「宗教の社会貢献論の手前で考える」金子昭「台湾社会における宗教福祉の現在と未来」2)「宗教と社会」学会において宗教と社会貢献に関わる基礎理論の成果発表を行い、日本宗教学会において、各地の諸宗教による社会貢献活動のテーマセッションを4部会編成することができた。最終年度として、本年は研究成果をまとめるために研究会を開催し、著作をまとめた。1)研究会の開催。2009年7月2日、2010年2月6日3)成果の刊行。稲場圭信・櫻井義秀編『社会貢献する宗教』世界思想社、2009年12月目次は次の通りである。はじめに櫻井/1宗教に社会貢献がなぜ問われるか櫻井/2宗教的利他主義の可能性稲場/3宗教は和解を促せるか(文明間の相剋)濱田/4神道神社神道と社会貢献の動向藤本/5仏教法華系教団と社会変革運動大谷/6情報化社会における宗教の社会貢献黒崎・吉野・寺択/7宗教団体による社会貢献調査吉野・寺沢/8各教団の社会貢献活動約20教団1頁ずつ・解説猪瀬/今後、さらに成果報告の研究書を刊行する予定で、原稿集約を行っているところである。
神経障害性疼痛に対する加工ブシの緩和作用とその有効成分の作用メカニズム

ハナトリカブトの根を減毒処理のために加熱加工した生薬である加工ブシの有効成分としてneolineを同定し、その神経障害性疼痛に対する有用性を明らかにしようと試みた。前年度までに、加工ブシ熱水抽出エキスのラットへの投与後の血中において、指標成分であるbenzoylmesaconine (BM)とneolineをほぼ同程度、存在していること、修治前のウズを減毒のために加熱加工処理しても、neolineの含量は変化しなかったこと、paclitaxicelによるマウス神経障害性疼痛に対して、加工ブシ末およびneolineは有意な緩和作用を示したものの、BMは有意な緩和作用を示さなかったこと、neolineの作用機序の1つとして、Nav1.7に対するアンタゴニスト作用が認められたことを示した。本年度は、マウスの坐骨神経部分結紮による神経障害性疼痛モデルにおいて、加工ブシ熱水抽出エキスの有効性を認め、その有効成分としてneolineにも有意な緩和作用を認めたのに対して、BMは有意な緩和作用を示さなかった。また、Oxaliplatinをマウスに投与した時に生じる神経障害誌疼痛に対しても、同様にneolineは緩和作用を示したのに対して、BMは示さなかった。以上のことから、加工ブシの神経障害性疼痛に対する有効成分は、指標成分であるBMではなく、neolineである可能性が高まった。トリカブト根を減毒のために加熱加工処理しても、その有用性が失われないという臨床経験の科学的な裏付けが得られたと考える。Neolineは、加熱加工により変化しない化合物であったことから、今後は根におけるneolineの含量の高いトリカブトの品種の探索や栽培方法の確立により、よりよい加工ブシ製剤の開発が期待できるであろう。これまで我々は、オキサリプラチンをマウスへ腹腔内投与したときに誘導される神経障害性疼痛の症状、機械的アロディニアと冷痛覚過敏それぞれに対して、加工ブシエキスが抑制作用を示すことを明らかにし、その有効成分としてneolineを単離した。Neolineは、既知のブシ含有成分であるが、これまで薬理活性は報告されておらず、ブシの神経障害性疼痛緩和作用における有効成分である可能性が高い。そこで、neolineを新規神経障害性疼痛治療薬として開発すること、またneoline高含有加工ブシの開発を目的にした研究を行った。マウスにパクリタキセルを投与した後に生じる神経障害性疼痛をvon Frayテストにより評価したところ、neolineは有意な緩和作用を示した。次に、一般的な神経障害性疼痛モデルであるSeltzerモデルによる評価を行うべく、神経部分結紮の手技の習得を目指したが、現在のところまだモデル作りに成功しておらず、薬物の評価以前の段階である。次に、日本で市販されている加工ブシ製剤全種類中のneolineの含量をLC/MS/MSを用いて定量した。その結果、その含量にはメーカー間で約3倍の差があることが明らかになった。Neolineは非エステル型のアルカロイロであり、修治方法による違いでは日本薬局方ブシ2で低値を示す傾向があった一方で、修治前後での含量の差は認められなかったことから、neolineはもともとトリカブト根に含まれている化合物であり、修治により生じる化合物ではないことが推定される一方で、ブシ2での修治方法では分解してしまう可能性が示唆された。Seltzerモデルの作成技術習得に時間がかかり、まだneolineの評価が出来ていない。ハナトリカブトの根を減毒処理のために加熱加工した生薬である加工ブシの有効成分としてneolineを単離し、その神経障害性疼痛に対する有用性を明らかにしようと試みた。加工ブシ熱水抽出エキスは、指標成分であるbenzoylmesaconine (BM)を0.042%と最も多く含み、次いでneoline 0.026%、benzoylaconine (BA) 0.010%を含んでいた。この加工ブシをラットに経口投与後、経時的に採血し、各アルカロイドの血中濃度を測定したところ、15分後の血中からはその順で高濃度に検出された。一方、9時間におけるBM、neoline、BAの血中濃度曲線下面積は、それぞれ64、65、32 ng/mL・hrと、neolineとBMは同等の値を示したことから、BMと比較してneolineの生物学的利用能は比較的高いことが推測された。市販されている13種類の加工ブシ製剤中のneolineの含量は、0.042 ±0.016%と高いバラツキがあり、また修治前のウズを減毒のために加熱加工処理しても、neolineの含量は変化しなかった。以上のことから、neolineのトリカブトの根中の含量は、加熱加工(修治)によるものではなく、トリカブトの栽培条件によることが推測された。Paclitaxicelによるマウス神経障害性疼痛に対して、加工ブシ末およびneolineは有意な緩和作用を示したものの、BMは有意な緩和作用を示さなかった。Neolineの作用機序の1つとして、Nav1.7に対するアンタゴニスト作用が認められた。以上のことから、加工ブシの神経障害性疼痛に対する有効成分は、指標成分であるBMではなく、neolineである可能性が示唆された。抗がん剤の副作用を利用した神経障害性疼痛モデルに対するNeolineの作用については、当初の計画以上に進展していると言えるが、末梢神経部分結紮による神経障害性疼痛モデルに対する作用の検討が計画よりもやや遅れている。

ハナトリカブトの根を減毒処理のために加熱加工した生薬である加工ブシの有効成分としてneolineを同定し、その神経障害性疼痛に対する有用性を明らかにしようと試みた。前年度までに、加工ブシ熱水抽出エキスのラットへの投与後の血中において、指標成分であるbenzoylmesaconine (BM)とneolineをほぼ同程度、存在していること、修治前のウズを減毒のために加熱加工処理しても、neolineの含量は変化しなかったこと、paclitaxicelによるマウス神経障害性疼痛に対して、加工ブシ末およびneolineは有意な緩和作用を示したものの、BMは有意な緩和作用を示さなかったこと、neolineの作用機序の1つとして、Nav1.7に対するアンタゴニスト作用が認められたことを示した。本年度は、マウスの坐骨神経部分結紮による神経障害性疼痛モデルにおいて、加工ブシ熱水抽出エキスの有効性を認め、その有効成分としてneolineにも有意な緩和作用を認めたのに対して、BMは有意な緩和作用を示さなかった。また、Oxaliplatinをマウスに投与した時に生じる神経障害誌疼痛に対しても、同様にneolineは緩和作用を示したのに対して、BMは示さなかった。以上のことから、加工ブシの神経障害性疼痛に対する有効成分は、指標成分であるBMではなく、neolineである可能性が高まった。トリカブト根を減毒のために加熱加工処理しても、その有用性が失われないという臨床経験の科学的な裏付けが得られたと考える。Neolineは、加熱加工により変化しない化合物であったことから、今後は根におけるneolineの含量の高いトリカブトの品種の探索や栽培方法の確立により、よりよい加工ブシ製剤の開発が期待できるであろう。Seltzerモデルの確立とneolineの評価を急ぐ。また、neolineのNav1.7阻害作用の確認、neolineの体内動態パラメーターの測定を行う。末梢神経部分結紮による神経障害性疼痛モデルに対するneolineの作用を検討する。また、その作用機序について、マウスの神経節による関連タンパク質の発現量の変化を計測することにより推定する。また、一般的な神経障害性疼痛モデルであるShelzerモデルに対するneolineの作用が期待される。一部、少額ではあるが研究費が残ったので、次年度に継続させることとした。