hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
SAGEを用いた新規の放射線応答遺伝子の探索

逐次遺伝子解析法(SAGE法)は、遺伝子を13-14塩基程度の短い配列(タグ)で代表させて、数千から数万種類の遺伝子発現を効率的に定量解析できる手法であり、低線量放射線影響を分子レベルで包括的に解明できる可能性をもっている。データベースの公開も進んでおり、既知遺伝子の放射線応答を解析するのにも適していると考えられる。一方、短い配列のためデータベースにない新規遺伝子を解析するのには難点があった。SAGE法で得られるタグの長さは、IIs型制限酵素とII型制限酵素の組み合わせにより決まるが、主としてIIs型制限酵素により決定される。我々は、グラム陰性菌の一種であるMethylophilus methylotrophusより、IIs型制限酵素の一つであるMmeI活性を簡便にかつ迅速に抽出する方法を開発した。過去の報告では不安定であり、応用例の報告はなかったが、抽出法の改良により安定な作用条件を検討することができた。このMmeIをSAGE法に応用することにより従来13-15塩基であったタグを、21-25塩基に延長することに成功した。21塩基のタグは、PCRプライマーとしてほぼ充分であり、PCRにより元のcDNAの遺伝子情報を容易に得ることが可能であることを示した。従来のSAGE法は、短いタグで遺伝子情報を代表させるため、既知の遺伝子情報が不可欠であった。しかし、本改良法を用いれば、簡易なESTデータベースを効率的に作成することができるため、従来データ解析が進んでいない真核生物の遺伝子解析をも容易にすることが期待できる(現在、投稿中)。これらの手法を用いて、新規放射線の応答遺伝子についてもSAGE法と合せて、検索中である。
心不全の交感神経活動に関する基礎的および臨床的研究

(1)本研究では拡張型心筋症や陳旧性心筋梗塞患者の中で心筋の収縮不全を伴った症例について自律神経機能を評価し重症不整脈の出現などの予後の判定を心電図を用いて検討した。対象は左室駆室率40%以下の慢性心不全患者でその内訳は特発性拡張型心筋症および陳旧性心筋梗塞患者である。これらの症例について、ホルター心電図を記録し、健常人と比較した。記録後に心拍変動の分析をCV値、SD値、R-R50の分析を行った。更に、1時間の中で安定した10分間を選び、フーリエ変換法により、スペクトル解析を行った。得られた周波数成分は高周波成分(HF)と低周波成分(LF)に分類し、自律神経活動の評価を行った。その結果、心不全患者は健常人に比し夜間の心拍数の上昇、日中のR-R50の低下、夜間のHF(副交感神経活動を表す), LF/HF(交感神経活動を表す)の低下を認めた。LFについては心不全患者では一日中低い傾向を示したが、有意差はなかった。以上より心不全患者は自律神経機能が障害され、特に、副交感および交感神経活動の低下が示唆された。また、アンギオテンシン変換酵素阻害剤の投与は上記の変化を改善する傾向を認めた。以上の結果は日本循環器学会九州地方会において発表し、現在論文作成中である。(2)冠動脈疾患において自律神経の異常によりその発作が発症する症例があり、中でも異型狭心症は種々のストレスによって心電図でのST上昇する発作が起こるとされている。我々は労作性狭心症と安静・早朝時にST上昇を伴う発作を特徴とする異型狭心症の症例について精神性発汗測定をおこない臨床的有用性について検討した。その結果、異型狭心症では精神性発汗は強く、労作性狭心症は正常人と変化はなかった。「1」対象は拡張型心筋症(3名)および陳旧性心筋梗塞(3名)の心不患者6名に対しホルター心電図の検査(日本光電社製)を行った。平均年齢は56.8歳であり、超音波検査にて左室拡張期経55mm以上、左室駆室率50%以下であった。また、対照として同齢の健康人4人について同様の検査を行った。ホルター心電図を分析し,以下に示す心拍変動の分析を行った。[1]24時間の平均RR変動の標準偏差(SD値)[2]5分間のR-R間隔の標偏差(SDindex)(SD値)[3]R-R間隔の変動が50msec以上を占める割合(RR50)について分析した。現在の所、症例数が少ないため明らかなことは言えないがSD値、SDindexは低下を認めた。一方、RR50は心不全群が対照群より減少傾向を認めた。また、[4]心拍変動の評価のため2分毎のFourier変換(0.0083Hz)にてスペクトル解析し、low frequency area(0.04-0.15Hz)high frequency area(0.15-0.4Hz)を計測した。心不全群はhigh frequency areaの減少を認めた。現在、心不全患者にアンジオテンシン変換酵素阻害剤の投与を試み上記[1]-[4]についてアンジオテンシン変換酵素阻害剤の投与前と投与後(3、6カ月後)の比較を検討している。「2」交感神経活動がその効果器である心臓において不整脈の発生に影響することから、右室ペーシング中の交感神経活動を精神性発汗記録法を用いて評価した。

発汗はペーシング度に依存すて生じ、この発汗検査により交感神経賦活化を観察することが出来た。精神性発汗記録法の日内変動について検討したところ、正常人では午前中にのみ増加を認めたが、心不全患者では正常人に比べ増加傾向を示した。現在精神発汗と心拍変動性について検討を行っている。(1)慢性心不全患者にホルター心電図検査を行い、心拍変動の分析を1時間毎にパワー・スペクトル解析し自律神経の評価を行った。また、従来のCV値、SD値、R-R50の分析をも行い比較検討した。その結果、心不全患者は健常人に比し夜間の心拍数の上昇と日中のR-R50の低下、夜間の高周波成分(HF),LF(低周波成分)/HFの低下を認めた。LFについては心不全患者では一日中低い傾向を示した。また、心不全患者にアンギオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤の投与は上記の変化を改善する傾向を認めた。従って、慢性心不全患者は副交感神経機能の低下をみとめ、ACE阻害剤の投与はこの低下を抑制する作用がみられる。以上の結果は日本循環器学会九州地方会において発表した。現在、論文作成中である。(2)冠動脈疾患において自律神経の異常によりその発作が発症する症例があり、中でも異型狭心症は種々のストレスによって心電図でのST上昇する発作が起こるとされている。我々は労作性狭心症と安静・早朝時にST上昇を伴う発作を特徴とする異型狭心症の症例について精神性発汗測定をおこない臨床的有用性ついて検討した。その結果、異型狭心症では精神性発汗は強く、労作性狭心症は正常人と変化はなかった。
水源安全性評価への水文解析・微生物解析の適用

将来の気候変動に伴う水循環の変化が水源の安全性に与える影響を予測するために、水循環を扱う水文学と微生物学とを融合させた新たな微生物水文学手法の開発を最終目的として、富士川流域やネパールカトマンズ盆地などを対象とした研究を行った。その結果、水文解析で用いるマルチスケール分布型流出モデル、および微生物解析で用いる水系感染症関与病原微生物の測定手法の開発を行った。また、これらの手法を実際の河川、地下水に適用して、DNAを用いた微生物群集解析と同位体解析の結果の関連性、降雨や土地利用が微生物の出現に与える影響などを明らかにした。本研究課題は、水文循環の変化が水源の安全性に与える影響を予測するために必要な微生物水文学手法の開発を目的とする。平成23年度の追加採択課題であることから、12月からの4ヶ月間に、方法論の検討を目的とした予備的研究を実施した。その結果、下記の実績を得た。1.降雨時の病原微生物流出機構の解析・微生物検出法最適化の目的で、新たに考案した陰電荷膜破砕型濃縮法の濃縮操作条件を検討し、水系感染症に関与する主要な3種類の病原微生物(ウイルス、原虫、細菌)の同時濃縮・検出を可能とした。・微生物流出解析に使うモデルの作成のために、対象地域について、高解像度数値地形情報に基づく擬河道網の作成、長期の水文・気象データの収集などの基盤情報の整備を行った。2.地下水微生物汚染の同位体水文学・水質統計学的解析・一般水質と同位体による地下水水文解析により、d値を用いた地下水涵養解析の有効性、Nの同位体と水の同位体を合わせて使う手法の有効性を示した。・地下水微生物汚染解析では、下水流入の影響を解析する手法を提案した。3.自然由来と人間由来の判別に役立つ微生物指標の開発(1)植物にとっての病原微生物の動態解析による森林・農地の微生物負荷の特性の解析・病原微生物の動態解析では、河川水試料から効率良くDNAを抽出できる方法の選定を試み、化学的溶菌法に基づいたDNA抽出試薬であるCellEaseの使用が効果的であることを見出した。(2)水の移流を伴う様々な植生系における微生物動態の解析・水耕栽培植生系の微生物動態の解析では、水生植物4種(ヨシ、ミソハギ、キショウブ、ホタルイ)の根圏微生物群集の解析を行い、すべての植物間で根圏に生息する微生物の群集構造が異なることを明らかにするとともに、それらの多くは系統的に新規な微生物で構成されることを示した。本研究では、水文循環の変化が水源の安全性に与える影響を予測するために必要な微生物水文学手法の開発を最終目的として、平成25年度は下記を行い、病原微生物解析と水文解析を融合する手法の可能性を示す成果を得た。1.降雨時の病原微生物流出機構の解析(担当:西田、石平、原本):水道水源河川水で、大腸菌や嫌気性芽胞菌等の指標微生物を多くの試料で検出し、これらの濃度変動への降水の影響を明らかにした。また、病原ウイルスは、これらとは異なり明確な濃度変動がないことを確認した。さらに、新たにマルチスケールの分布型流出モデルを構築し、富士川、ネパールカトマンズ盆地の河川においてその有効性を確認した。これにより、流域源頭部の小渓流から下流域の本川までの様々なスケールにおける流出現象の再現を可能にした。2.地下水微生物汚染の同位体水文学・水質統計学的解析(担当:坂本、西田、原本):複数年継続した調査結果を総合・整理し、糞便汚染指標微生物、安定同位体比、溶存化学成分等の多角的指標により、浸透現象と地下水微生物汚染との関係の解析ができることを示した。3.自然由来と人間由来の流出の判別に役立つ微生物指標の開発(担当:森、田中)1)森林・農地の微生物負荷特性の解析(担当:田中):渓流河川水から抽出したDNAをターゲットとし、PCR法により、農地からの流出の指標となりうるモモの植物病原菌の一種を検出した。また、細菌の遺伝子レベルの特徴と硝酸イオンの同位体比との関係を見出した。2)植生系根圏における微生物動態の解析(担当:森):ウキクサを対象に、葉圏と根圏の微生物解析を行い、根圏と葉圏では微生物群集が異なること、葉圏にも根圏と同様に分解菌が生息することなど、流出解析に役立つ植物関連微生物の特徴を明らかにした。本研究では、水文循環の変化が水源の安全性に与える影響を予測するために必要な微生物水文学手法の開発を最終目的として、平成24年度は下記を行い成果を得た。1.降雨時の病原微生物流出機構の解析(担当:西田、石平、原本):平水時および降雨出水時の河川水の微生物量を観測し、降雨出水イベントが与える影響を検討した。対象は、健康に影響する水源を有する荒川とした。

平水時および降雨出水時に経日的な採水調査を行った結果、降雨時には健康関連微生物の濃度が最大で25倍以上に上昇することを明らかにした2.地下水微生物汚染の同位体水文学・水質統計学的解析(担当:坂本、西田、原本):地下水の季節変化について、同位体と一般水質の両者を用いた解析が、汚染機構解析に有効であることを示した。また、ネパールのカトマンズ盆地地下水の微生物汚染について、大腸菌濃度と硝酸イオンの同位体比との関係、雨季の水文過程が大腸菌濃度を高めていること、下水設備からの距離の影響を明らかにした。3.自然由来と人間由来の流出の判別に役立つ微生物指標の開発(担当:森、田中、石平)1)森林・農地の微生物負荷特性の解析(担当:田中):農地が流域全体の0-3%となる渓流河川を対象に、森林域河川の微生物群集解析を行った。その結果、各微生物種の分布率を用いたクラスター分析の結果と硝酸イオンの同位体比との対応を見いだし、微生物群集解析と同位体分析を組み合わせることで、土地利用状況だけでは把握できない農地等からの微生物流出プロセスの推定が可能であることを示した。2)植生系根圏における微生物動態の解析(担当:森):季節により根圏に分布する微生物群集に変化が見られるかどうかを、公園内人工池のウキクサを対象に、遺伝子レベル(T-RFLP法)で解析し、微生物種の数と分布率を用いたクラスター分析により8月(夏)と10月(秋)とで微生物群集が異なることを示した。交付内定からの実質の研究期間は4ヶ月と短かったものの、研究対象としている3つの分野それぞれにおいて、次年度以降の本格的な研究の展開に必要となる基礎的な知見を得ることができた。このことから、当初の計画通りに、おおむね順調に研究を推進することができたと判断した。25年度が最終年度であるため、記入しない。地球温暖化の影響で世界の水文環境が変化することが予想されている。この変化に対し、洪水の頻発化などの治水面での影響の研究は多数行われているが、利水の質の面での影響の研究は多くはない。しかし、水文循環は物質の移動を駆動するシステムとしても重要であり、水文循環の変化は病原菌などの移動を通して水資源の質的変化を引き起こすおそれがある。そこで、本研究では、水源安全性評価の分野での水文学の応用範囲を広げるという全体構想の下で、同位体、分布型水文モデルなどを使った水文解析と病原微生物の解析を結合し、水文循環の変化が水源の安全性に与える影響を予測するために必要な微生物水文学手法の開発を目的とする。この、水の安全性の評価に必要な微生物解析を、水文学の応用分野として取り込むという目的に沿って、具体的には、1)河川への流出、地下水への浸透という水文過程とその過程による微生物の移動、2)水文過程の解析に役立つ新たな微生物指標の探索とその指標に及ぼす植物の影響を対象とした研究を行っている。その結果、いづれも、従来の水文解析にはないチャレンジングな研究ではあるが、貴重なデータを得ることができ、新たな発見も生まれている。この点で、おおむね順調に進んでいるといえる。ただし、それぞれ自然を相手にする研究で、かつ微生物には自然環境の相違が影響するために、さらに長い期間の調査によりデータを蓄積することと、そのデータを水文学の視点で整理することが必要であり、これらが研究期間の最終年度である次年度の課題といえる。
圧電素子を内蔵したＣＦＲＰ構造のスマートセンシング・アクチュエーション

将来の航空宇宙機用CFRP構造の安全性と信頼性の一層の向上を図るためには、圧電素子を内蔵したスマート複合材構造の適用により、衝撃荷重により発生する損傷を自動的に検知する構造ヘルスモニタリング法を確立することが重要となる。また、運航中の構造振動を軽減するためには、圧電アクチュエータによる効果的制振を行うことが必要となる。本研究では、圧電センサ・アクチュエータを内蔵したCFRP複合材構造について、運航中に実時間で自動的に損傷を検知する構造ヘルスモニタリング法を構築するとともに、圧電アクチュエータによる効果的振動制御法を発展させることにより、安全性と信頼性に優れたスマート構造を開発する。本研究では、圧電センサ・アクチュエータを内蔵したCFRP複合材構造について、安全性と信頼性に優れた航空宇宙機用スマート構造の開発を目的とする。本研究テーマは2つの研究項目からなり、本年度の研究成果は下記の通りである。(I)衝撃荷重同定に基づく構造ヘルスモニタリング1)弾性波を用いたCFRP補強パネルの衝撃荷重位置同定の高速化PZTを板表面に貼付したCFRP積層板について、高周波弾性波の到達時間差に基づく位置同定法を開発するとともに、CFRP補強パネルの弾性波伝播速度の繊維配向角およびスキン部・補強材部の板厚依存性を考慮した高速の衝撃荷重位置同定法を開発した。2)FRP複合容器の落錘衝撃試験データの取得FRP複合容器の落錘衝撃試験データを取得して、損傷の有無による荷重履歴特性の相違を調べ損傷と荷重履歴の関係を明らかにした。(II)セルフセンシング・セミアクティブ振動制御アクチュエータの電圧計測によるセルフセンシング・セミアクティブ振動制御則を構築し、CFRP積層板について、モード別多モード振動制御実験を行い本手法の有効性を検証した。(1)衝撃荷重同定に基づく構造ヘルスモニタリング1) CFRP積層板について、弾性波の各アクチュエータへの到達時間差に基づく高精度・高効率の衝撃荷重位置同定法を開発した。また、CFRP補強パネルについて繊維配向角およびスキン部・補強材部の板厚の影響を考慮した高精度・高効率の位置同定法を開発した。2) FRP複合容器の落錘衝撃試験データを取得して、損傷の有無による荷重履歴特性の相違を明らかにして、荷重履歴より損傷の有無および損傷の大きさを推定する方法を提案した。(2)セルフセンシング・セミアクティブ振動制御:アクチュエータの電圧計測によるセルフセンシング・セミアクティブ振動制御則と、ファジー理論による多モード振動制御則に基づき、CFRP積層板の振動制御実験を行い、本手法の有効性を検証した。(I)衝撃荷重同定に基づく構造ヘルスモニタリング1)衝撃荷重位置・履歴同定に基づくCFRP積層板・補強パネルの構造ヘルスモニタリング法の開発PZTを板表面に貼付したCFRP積層板および補強パネルについて、高周波弾性波の到達時間差に基づく衝撃荷重位置同定法を開発した。また、落錘衝撃時のCFRP積層板の衝撃荷重履歴同定結果に基づく実時間損傷同定法を開発し、損傷発生の有無により荷重履歴が大きく異なることを明らかにした。2) FRP複合容器の衝撃荷重同定に基づく衝撃損傷同定法の開発FRP複合容器の落錘衝撃時の衝撃荷重同定法を開発し、損傷発生の有無による荷重履歴が大きく異なることを明らかにした。

また、同定された荷重履歴により損傷の大きさを推定することが可能となった。(II)セルフセンシング・セミアクティブ振動制御アクチュエータの電圧計測によるセルフセンシング法を用いて、CFRP積層板のセミアクティブ振動制御則を構築した。フィルターによりモードを分離することにより、モード別多モード振動制御が有効に行えることを振動制御実験により検証した。当初予定していた主要な研究項目のうち、「弾性波を用いたCFRP補強パネルの衝撃荷重位置同定の高速化」および「セルフセンシング・セミアクティブ振動制御」については、当初計画通りに順調に研究成果が得られている。一方、「CFRP補強パネルの落錘衝撃試験データの取得」については試験片が高価で多数の試験を行うことが困難なため、同様の損傷形態を有するFRP複合容器について試験を行い、衝撃荷重履歴同定および損傷と荷重履歴の関係を明らかにした。25年度が最終年度であるため、記入しない。当初予定していた主要な研究項目のうち、「衝撃荷重同定に基づく構造ヘルスモニタリング」では当初CFRP補強パネルを対象としていたが、CFRP補強パネルは高価で多数の落錘衝撃試験を行うことが困難なため、CFRP積層板およびFRP複合容器について構造ヘルスモニタリング法を開発し、落錘衝撃試験時の同定した荷重履歴から容易に損傷を推定できることを明らかにした。一方、「セルフセンシング・セミアクティブ振動制御」については、当初計画通りに順調に研究成果が得られており、本年度はセルフセンシング法に基づくCFRP積層板のセミアクティブ振動制御則を構築し、フィルターによりモードを分離することにより、モード別多モード振動制御が有効に行える研究成果が得られた。なお、「CFRP補強パネルの振動制御データの取得」についてはPZTアクチュエータの作用力が不足しているため、次年度はより作用力の大きなアクチュエータで制御実験を行う予定である。「衝撃荷重同定に基づく構造ヘルスモニタリング」に関しては、CFRP補強パネルの衝撃荷重位置同定法について、さらに高精度化と高速化を図る。また、FRP・FW複合容器の落錘衝撃試験によりさらにデータ蓄積を進め、衝撃損傷特性(衝撃エネルギと最大衝撃荷重の関係、衝撃荷重と損傷面積の関係)を明らかにする。また、「セルフセンシング・セミアクティブ振動制御」では、CFRP積層板の多モード振動制御実験を行い、本手法の有効性を示すとともに、CFRP補強パネルでの振動制御実験でも検証する。「衝撃荷重同定に基づく構造ヘルスモニタリング」に関しては、前年度までのCFRP積層板に加え、CFRPサンドイッチパネルおよびアルミニウム表板サンドイッチパネルの衝撃荷重同定法を開発する。特にインパルスハンマ打撃時の損傷発生の有無による同定荷重の形状と損傷の関係を明らかにする。また、FRP・FW複合容器について様々な衝撃エネルギーでの落錘衝撃試験によりデータ蓄積を進め、サーモグラフィによる損傷面積の観察結果と衝撃エネルギーの関係を明らかにする。
動脈硬化症の初期病変における細胞接着分子の意義とその発現メカニズムの解明

過去2年間の研究から、(1)酸化LDL、糖化LDL、IgG結合型LDL、低酸素血症が内皮細胞にELAM-1を発現させること、(2)それに触れたマクロファージがTNFαを分泌し内皮細胞にVCAM-1を発現させること、(3)同時に接触自体が刺激となって内皮細胞上のICAM-1を接着準備状態に変化させること、などを明らかにした。なお動脈硬化症に固有の現象として、さらに未知の接着分子または機構の存在も考えられた。そこで研究最終年の平成9年度は、ディファレンシャルディスプレイハイブリダイゼーション法(DD法)を用い、内皮細胞におけるmRNAレベルの検索を重点的に行った。内皮細胞はヒト大動脈由来のものを用い、常法に従って作成した酸化LDLを0、30、60、90、240分作用させた。DD法は得られた全RNAを鋳型にし、3種類のアンカープライマーにてcDNAの合成を行った。ついで、このcDNAを鋳型にし、16種類の任意プライマーおよびそれぞれのアンカープライマーとの組み合わせでPCRを行った。増幅産物は非変性7%ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分離後、蛍光染色法にて解析した。その結果、反応時間に依存して発現量の変化するバンドが22種類、認められた。いずれも酸化LDLの作用後30分と60分のそれぞれで現れ一過性に消失した。その分子量は約400-1,200であった。これら遺伝子産物は、動脈硬化症の初期病変形成に何らかの役割を担っている可能性が考えられた。その詳細な解析については、将来の課題として新たな戦略の下に取り組みたいと考えている。動脈硬化症病巣の形成には、血管内皮における細胞接着分子の発現やマクロファージによる変性低比重リポ蛋白(LDL)の貧食などが初期変化として重要であることが知られている。しかし、初期病変発生の直接的な引き金となる要因が何であるのかという肝心な点がまだまったく分っていない。本研究では、ヒト大動脈内皮細胞を用い、動脈硬化症発生メカニズムにおける各種接着分子の発現機序および役割を分子生物学的、システム工学的に解明することである。平成7年度の実験では、接着分子の発現を促進する因子について以下の新しい知見を得た。まず、サイトカインに関して、IL-1とTNFαがELAM-1を著明に発現させることを確認した。ただし、前者は作用開始後1時間目から有意な増加を示し48時間後には消失、後者は30分後から急激に増加し、48時間以上作用が持続した。ICAM-1の場合は、刺激をしていない細胞においても発現しており、IL-1とTNFαによって僅かに増加する傾向が認められたが、両者の効果に有意な差はなかった。VCAM-1はTNFαによってのみ有意に発現した。なお、INFγは3種類の接着分子の発現に影響を与えなかった。次に、酸化LDL、糖化LDL、低酸素培地、Ig-G結合型LDL(本研究で新たに発見)を培養内皮細胞に作用させたところ、いずれもELAM-1を有意に発現させることが分った。内皮細胞上に発現する各接着分子の共通のリガンドがマクロファージ上のみに依存し、かつTNFαが同細胞から分泌される事実を考えると、次のような機序が考察される。まず、変性LDLが内皮下に貯まり、かつ低ずり応力が局所的に作用することにより、ELAM-1が発現する。これに接触したマクロファージは活性化されTNFαを分泌し、これが瞬時にICAM-1の形態変化を起こさせる(外国の報告より引用)。引き続いて、同じくTNFαの作用によりVCAM-1が発現し、3者のコンビネーションが選択的に作用しマクロファージだけを局所に引き寄せる。本研究の目的は、動脈硬化症初期病変の発生メカニズムにおける各種接着分子の役割を分子生物学的、システム工学的に解明することである。

平成8年度は、主に3つの問題について実験とデータの解析を行なった。第1は、単球/マクロファージと血管内皮細胞との関係についてである。従来は前者をアイソトープで標識し、接着した細胞数をカウントするという方法がとられていた。そこで本研究では、化学発光物質のアクリジニュムエステルを用いて非RIで接着細胞数を定量化する方法を検討し、再現性の高い実験手順を確立した。この方法により、まず0.062564ng/mlの濃度のIL-1を4時間作用させて、マクロファージの接着率の違いを調べた。その結果、10ng/mlで接着率が最大(14.3%)であった。次に、TNFαについても同様の検討を行ない、ほぼ同じ結果を得た。また、IL-1、TNFαの両者とも、0.5-1.0ng/mlの濃度でも接着率が極大値を示した。この現象の意味は現在のところ不明であり、次年度の検討課題としたい。一方、IFNγでは、このような傾向は認められず、濃度が高い程、接着率も大きかった。第2は、膜蛋白の検索である。IL-1による刺激前後の膜蛋白を常法に従って分離し、SDS-PAGEにより分析した。その結果、刺激前後で有意に変化する成分は確認できなかった。次年度以降、他の方法でこの問題を再度、検討したいと考えている。第3は、ディファレンシャルディスプレイハイブリダイゼーションによる細胞接着に関わる諸蛋白の解析である。今年度はマクロファージを対象として、10ng/mlのIL-1でそれぞれ1、2、3、4時間刺激した後、mRNAのスクリーニングを行なった。その結果、いくつかのバンドが刺激によって有意に出現することが確認できた。次年度は、ハイブリダイゼーションおよびクローニングを行なう予定である。過去2年間の研究から、(1)酸化LDL、糖化LDL、IgG結合型LDL、低酸素血症が内皮細胞にELAM-1を発現させること、(2)それに触れたマクロファージがTNFαを分泌し内皮細胞にVCAM-1を発現させること、(3)同時に接触自体が刺激となって内皮細胞上のICAM-1を接着準備状態に変化させること、などを明らかにした。なお動脈硬化症に固有の現象として、さらに未知の接着分子または機構の存在も考えられた。そこで研究最終年の平成9年度は、ディファレンシャルディスプレイハイブリダイゼーション法(DD法)を用い、内皮細胞におけるmRNAレベルの検索を重点的に行った。内皮細胞はヒト大動脈由来のものを用い、常法に従って作成した酸化LDLを0、30、60、90、240分作用させた。DD法は得られた全RNAを鋳型にし、3種類のアンカープライマーにおいてcDNAの合成を行った。ついで、このcDNAを鋳型にし、16種類の任意プライマーおよびそれぞれのアンカープライマーとの組み合わせでPCRを行った。増幅産物は非変性7%ポリアクリアミドゲル電気泳動法で分離後、蛍光染色法にて解析した。その結果、反応時間に依存して発現量の変化するバンドが22種類、認められた。いずれも酸化LDLの作用後30分と60分のそれぞれで現れ一過性に消失した。その分子量は約400-1,200であった。これら遺伝子産物は、動脈硬化症の初期病変形成に何らかの役割を担っている可能性が考えられた。
閃亜鉛鉱型Mn-IV族薄膜の安定合成法とハーフメタル特性

本研究の目的は、スパッタリング法によるMn-IV族膜の閃亜鉛鉱型構造安定作製法の確立とその強磁性について検討することにある。積層界面近傍での強磁性の発現とその電気伝導は、自在な電子スピン制御デバイスを実現するための基礎物理的現象であり、その主導原理の解明が強く求められている。磁性半導体の分野の研究から発見されたGaAs基板上での数原子層のハーフメタル強磁性の閃亜鉛鉱型CrAs,CrSb相の形成、ならびに強磁性材料の探査研究から発見されたMn-Si系積層構成膜による強磁性の発現を鑑みると、エピタキシャル成長を利用した閃亜鉛鉱型MnIV族相の実現の可能性、その磁性について、非常に興味がもたれる。今年度は、プロセス上界面設計の容易な低成膜速度スパッタ装置を用い、SiをIV族からVI族の半導体、半金属元素全般に拡張した材料系について閃亜鉛鉱型構造の実現可能性とその磁性に関して検討した。その結果、(1)Mn-VI族では周期に依存して、イオン結合性(MgO構造)、共有結合性(ウルツ鉱構造、閃亜鉛鉱構造)、金属結合性(NiAs型構造)の安定性が変化し、低周期ではイオン結合、高周期では金属結合が安定となること、(2)この指針に基づき第5周期のTeを選定しMnと同時スパッタ成膜したところ、室温成膜でもウルツ鉱薄膜が容易に得られること、(3)ウルツ鉱型MnTe薄膜は絶縁性であり、ネール温度60Kの反強磁性体であること、(4)ウルツ鉱と閃亜鉛鉱とは類似構造であるため、多層膜化により閃亜鉛鉱型構造を安定形成させ、元素添加により導電性をもたせることによりハーフメタル特性が発現する可能性があること等の知見が得られた。今年度は、プロセス上界面設計の容易な低成膜速度スパッタ装置を用い、ダイヤモンド構造型基板ならびに閃亜鉛鉱型基板上にMn-IV族エピタキシャル膜を作製し、準安定相である閃亜鉛鉱型相の形成条件について検討した。プロセス時の不純物混入を極力抑制すべく、装置内壁をCr_2O_3化処理した超高真空対応多元スパッタリング装置(到達真空度:5×10^<-10>Torr)を用い、閃亜鉛鉱型もしくはダイヤモンド構造の単結晶Si,Ge,InP基板上にMn-IV族膜を成膜し構造と磁性について検討した。その結果、(1)C保護膜を設けた300°C熱処理後のMnSi薄膜が室温で強磁性を示すこと(第27回日本応用磁気学会学術講演会(2003年9月,大阪大学)、第77回スピニクス特別研究会(2003年11月,秋田)にて発表)、(2)基板温度300°Cで作製したMnGe薄膜はキュリー点が°C程度の強磁性を示すこと(未発表)がわかった。ただし、薄膜中の形成相については、目的の閃亜鉛鉱型相を実現していないため、次年度は、基板原子の拡散を抑制しつつ四面体配位結合を促進させて、閃亜鉛型構造での強磁性の発現を目指す。その結果、(1)Mn-VI族では周期に依存して、イオン結合性(MgO構造)、共有結合性(ウルツ鉱構造、閃亜鉛鉱構造)、金属結合性(NiAs型構造)の安定性が変化し、低周期ではイオン結合、高周期では金属結合が安定となること、(2)この指針に基づき第5周期のTeを選定しMnと同時スパッタ成膜したところ、室温成膜でもウルツ鉱薄膜が容易に得られること、(3)ウルツ鉱型MnTe

薄膜は絶縁性であり、ネール温度60Kの反強磁性体であること、(4)ウルツ鉱と閃亜鉛鉱とは類似構造であるため、多層膜化により閃亜鉛鉱型構造を安定形成させ、元素添加により導電性をもたせることによりハーフメタル特性が発現する可能性があること等の知見が得られた。
遺伝子変異メチル化の定量的検出法の開発と子宮内膜癌発生予知への臨床応用

子宮体癌の発生には遺伝子不安定性(MSI : microsatellite instability)がハブ機能を有すると考えられる。MSI状態に導く遺伝子はDNAミスマッチ修復遺伝子の機能障害である。DNA修復遺伝子の機能障害は体癌ではMLH1の発現異常が重要で、MLH1蛋白発現の低下は遺伝子の変異ではなくプロモーターの過剰なメチル化が原因である。メチル化の検出にはmethylation specific PCR法およびbisulfite sequence法を用いた。これによるとMLH1の蛋白発現はプロモーターのCpGに富む領域のメチル化と極めて高い相関を示した。体癌組織の約30%の症例に80%以上の、50%以上の症例に10%以上のCpG領域でのメチル化が見られた。正常内膜ではメチル化は皆無であったが、過剰メチル化のある体癌周辺の正常内膜組織では約30%に過剰なメチル化が進行していた。内膜増殖症でも癌と同じ程度にメチル化がみられた。MLH1の過剰メチル化症例ではMSI及びTGF- βReceptor typeIIやPTENのフレームシフト変異が有為に高率であった。更に蛋白発現をみると癌周囲の正常内膜にも蛋白の消失が見られ,内膜の形態変化よりも早期にMLH1プロモーターのメチル化が進行すると考えられた。従って、MLHIプロモーターは発癌の過程では最も早期に起こる変化であると言える。このようなエピジェネチック変化を、特に子宮体癌ではMLHIプロモーターのメチル化を早期診断やリスク因子選別のための分子標的として捕らえることができる。MSIの結果として生じるPTEN, TGF-β-RII、p53、Ras等の遺伝子変異や発現も分子標的としてDNAチップなどで網羅的に検出し癌の診断に応用可能である。これらを総合的に診断することにより高リスクの個人や癌の早期診断に臨床応用の可能性が示された。その他の、癌の早期発見の分子標的としてテロメラーゼ活性も期待が持てる。すなわち、テロメラーゼ活性が95%以上の癌細胞に認められ、微量検体にて子宮体癌や頚部癌の診断に臨床応用可能である。癌の診断や術後の経過観察の腫瘍マーカー分子としても臨床応用可能である。子宮内膜癌発生過程に於ける初期変化としてDNAミスマッチ修復遺伝子の機能異常が指摘されている。特に、hMLH1プロモーターの過度のメチル化がその原因であると考えられる。臨床検体で検討し一部結果が得られた。正常内膜36例ではメチル化は3例、非メチル化は33例で、メチル化は高齢者に多い傾向があった。内膜癌32例ではメチル化は12例、非メチル化は20例でメチル化率は正常に比しきわめて高いことが示された。hMLH1プロモーターのメチル化とその影響を受けると判断されるPTEN遺伝子変異との関連は現在までの解析では見られなかった。他の発癌に関与する遺伝子群の変化とも検討中である。hMLH1プロモーターメチル化の定量化法を開発中である。標的プロモーターのCGを含まない領域にプライマーを設定し、bisulfite処理したゲノムDNAをPCRにて増幅し、sequenceを行うことにより、定量化に成功している。他の修復遺伝子プロモーターのメチル化定量も検討している。

同一臓器内における部位別・病変別・発癌段階別の詳細な検討を行う為に、microdissectionにより得られた組織におけるゲノムメチル化DNAの定量化の検討を行っている。現在の中間的な報告としては感度が低くさらに工夫が必要である。bisulfite処理法の改良等が期待される。平成14年度までに内膜癌由来細胞株や実際の内膜癌の臨床検体について発癌にはhMLH1のDNAミスマッチ遺伝子の発現異常が重要である事実を得た。さらに、蛋白発現の低下はhMLH1遺伝子の変異ではなくプロモーターの過剰なメチル化が原因であることも確認した。方法としては、基本的にはbisulfiteによるメチル化cytosineのuracilへの転換を利用した方法で、各遺伝子プロモーターにメチル化特異的なプライマーを設定し、PCRを基本にした定量的メチル化測定法を開発して検討した。この方法によると、hMLH1の蛋白発現はプロモーターのCpGに富む領域のメチル化と極めて高い相関を示した。子宮内膜癌を持たない正常内膜ではメチル化は皆無であったが、過剰メチル化のある内膜癌周辺の正常内膜組織では約30%に過剰なメチル化が進行していることが判明した。癌組織では約50%の症例に80%以上のCpG領域でメチル化が見られた。癌組織の免疫染色でも癌周囲の形態的に正常な内膜腺上皮に蛋白の発現消失が見られている。これらは形態変化よりも早期にメチル化が進行すると考えられ、hMLH1の機能低下が発癌の最も早い変化と考えられた。蛋白発現低下とMSIには相関見られ、hMLH1プロモーター過剰メチル化症例ではPTEN遺伝子のフレームシフト変異が有意に多いことが判明した。以上をまとめると形態変化に先立ち、hMLH1プロモーターの過剰メチル化が生じ、MMRとしての機能低下によりMSI状態となりPTEN因子の変異やその他P53,Ras遺伝子の変異をきたすと推定された。したがって、子宮内膜癌発生の予知としてhMLH1遺伝子プロモーターの過剰メチル化の検出が重要であることが示された。
木星雲層鉛直構造の観測的研究

本研究では,探査機データに基づいた木星雲層構造及び雲物理の理解を目的としており,具体的にはカッシーニ探査機の撮像データ(青色光:455nm,近赤外光:750nm)を用いて,表層雲の顕著な特徴である帯(Zone)と縞(Belt)における雲粒子の散乱特性(散乱位相関数)について調べた.1.散乱位相関数の導出アルゴリズムの開発:ミー散乱理諭を雲粒子に適用し放射伝違計算を行う事により,雲粒子の屈折率n_rと粒径rの最適解を求めた.まず近赤外画像を用いて,Zoneにおける雲粒子の散乱位相関数を調べたところ,高屈折率(n_r=1.85)物質からなる粒径の小さい雲(r=0.3nm)が最もデータを再現することが分かった.得られた屈折率は,表層雲候補であるアンモニア氷(n_r=1.42)のそれに比べ著しく高い値であり,アンモニア氷が分光的に見つかっていないという先行研究を支持する結果である.先行研究で提案されている「光化学物質によるアンモニア氷雲のコーティング説」に基づき,得られた屈折率は,この光化学物質の特性を示していると結論付けた.ここまでの結果は国際論文に投稿中である.2.ZoneとBeltにおけるエアロゾルの散乱特性の比較:1で得られた手法により,ZoneとBeltにおける雲粒子の散乱特性の比較を2波長で行ったところ,有意な違いは見られなかった.ZoneとBeltの模様の違いは,雲層における未知の吸収物質の量によってのみ説明可能であった.この吸収物質はZoneよりもBeltに多く存在し,近赤外光よりも青色光で吸収が顕著となる性質があることが分かった.3.得られた散乱位相関数の妥当性の検証:今回得られた散乱位相関数はパイオニア10号データを良く再現した.従ってこの散乱位相関数は,先験情報として将来の地上観測・探査機データの解析に広く利用することができるものである.木星大気ダイナミクスの解明には、詳細な大気鉛直構造の理解がその手掛かりとなる。昨年度までに開発した「放射伝達モデルと多変数パラメータを制約するフィッティング手法」の効率化を図り、2008年春に西はりま天文台・なゆた望遠鏡を利用して取得した「反射太陽光の多波長分光撮像観測データ」を再解析した。これにより、木星雲層上部構造の顕著な特徴である「帯」と「縞」の違いが、雲頂高度の差ではなく雲層の光学的特性(一次散乱アルベド)に起因することを見出した。更なる研究深化のため、以下に述べる2つの課題に取り組んだ。1.上記の放射伝達計算で必須となる雲粒子の光学散乱特性の精度向上のため、広い太陽位相角で高精度データを提供できるカッシーニ探査機の木星フライバイ観測データ(2000-2001年)の解析を進めた。これにより、従来利用されてきたパイオニア探査機データに基づく散乱位相関数に比べ、後方散乱が弱いという結果が得られた。さらに詳しく調べるため、現在ミー散乱理論を木星雲に適用したモデル計算を行っている。2.成層圏及び、雲層下部の鉛直構造を制約するため、それぞれ、メタンによる光吸収の強い2ミクロン帯と「大気の窓」である透過率の高い5ミクロン帯を用いた観測をNASA/IRTF赤外望遠鏡にて行った。現在解析途上ではあるが、成層圏では、ヘイズの水平分布が南北の極域で異なることは知られていたが、それだけではなく、鉛直構造にも非対称性を示唆する結果が得られた。一方対流圏下部では経度方向にも雲分布が不均一であることが確認された。しかし、5ミクロン帯は地球大気による吸収が想像以上に厳しく、マウナケア山頂といえども、分光観測には不適であることが分かった。今年度得られた研究成果は、国内外の学会において口頭・ポスター発表を行った。現在今年度までに得られた結果を論文にまとめる準備を進めている。本研究は、地上望遠鏡・探査機データに基づいた木星雲層鉛直構造及び雲物理の理解を目的としており、本年度は下記の研究を主に行った。1.液晶チューナブルフィルターを用いた可視光観測データによる雲層上部構造の研究:昨年度は、2008年5月に得られた多波長分光撮像観測データとこれを解釈する放射伝達モデルを用いて雲層上部構造の顕著な特徴である帯(Zone)と縞(Belt)の違いは、雲頂高度の差にその原因があるのではなく、雲層の光学的特性(一次散乱アルベド)に起因することを見出した。本年度も引き続き、2010年10月、2011年1月に西はりま天文台・なゆた望遠鏡を用いて観測を行い、雲層上部構造の経年変化を調べている。特に2010年には南赤道縞(SEB)の淡化現象が起こっており、水平・鉛直方向に大規模な擾乱があったと考えられている。現在解析途上であるが、定性的にはこの淡化現象の原因は雲頂高度の上昇・下降ではなく、雲層の光学的特性に起因すると考えている。2.カッシーニ探査機データを用いた雲粒子の散乱特性の研究:雲粒子の散乱特性を調べるため、広い太陽位相角で取得されたカッシーニ探査機の木星フライバイ観測データ(2000-2001年)の解析を行っている。本データは、同じく広い太陽位相角で観測を行ったパイオニア探査機のデータよりも多波長・高精度のデータであり、より詳細な雲粒子の散乱特性を理解することができる。

本年度はデータ校正について再度NASAのデータ提供者と議論を行い、Zoneについて、ミー散乱理論を木星雲に適用した放射伝達モデル計算を進めている。次年度はZoneとBeltの雲の散乱特性の比較、及び同じガス惑星である土星についても研究を進める予定である。本年度得られた研究成果は、国内外の学会において口頭・ポスター発表を行った。現在本年度までに得られた結果を論文にまとめる準備を進めている。本研究では,探査機データに基づいた木星雲層構造及び雲物理の理解を目的としており,具体的にはカッシーニ探査機の撮像データ(青色光:455nm,近赤外光:750nm)を用いて,表層雲の顕著な特徴である帯(Zone)と縞(Belt)における雲粒子の散乱特性(散乱位相関数)について調べた.1.散乱位相関数の導出アルゴリズムの開発:ミー散乱理諭を雲粒子に適用し放射伝違計算を行う事により,雲粒子の屈折率n_rと粒径rの最適解を求めた.まず近赤外画像を用いて,Zoneにおける雲粒子の散乱位相関数を調べたところ,高屈折率(n_r=1.85)物質からなる粒径の小さい雲(r=0.3nm)が最もデータを再現することが分かった.得られた屈折率は,表層雲候補であるアンモニア氷(n_r=1.42)のそれに比べ著しく高い値であり,アンモニア氷が分光的に見つかっていないという先行研究を支持する結果である.先行研究で提案されている「光化学物質によるアンモニア氷雲のコーティング説」に基づき,得られた屈折率は,この光化学物質の特性を示していると結論付けた.ここまでの結果は国際論文に投稿中である.2.ZoneとBeltにおけるエアロゾルの散乱特性の比較:1で得られた手法により,ZoneとBeltにおける雲粒子の散乱特性の比較を2波長で行ったところ,有意な違いは見られなかった.ZoneとBeltの模様の違いは,雲層における未知の吸収物質の量によってのみ説明可能であった.この吸収物質はZoneよりもBeltに多く存在し,近赤外光よりも青色光で吸収が顕著となる性質があることが分かった.3.得られた散乱位相関数の妥当性の検証:今回得られた散乱位相関数はパイオニア10号データを良く再現した.従ってこの散乱位相関数は,先験情報として将来の地上観測・探査機データの解析に広く利用することができるものである.
自死遺族を対象とした自助グループの構築に関する研究

我々は自殺対策の中でも自死遺族のケアに着目し研究を進めた。当事者へのインタビューを通して、自死遺族は様々な感情の中で悩み苦しんでいることが明らかになり、その支援として、まず安心して語れる場を作ることが必要であるという結果に至った。その形式には自助グループと支援グループがあるが、地域性を考慮し、我々は平成22年3月に自死遺族支援グループを立ち上げた。継続的に活動を実施し評価を繰り返す中で、初期の段階では語り合いの場よりも、個別対応が重視されるなどの課題が抽出された。本研究は、自死遺族が身内を目殺で亡くした苦しみを克服するために、どのような支援が必要か検討し、上越地域において先駆的な自助グループを構築することである。自死遺族へのケアは、その特殊性ゆえに情報が入りにくいという点、援助者自身も介入しにくい点が特徴としてある。そのため、まずはネットワーク作りに重点を置いた。平成20年度は主にフィールドリサーチを通して、NPO法人ライフリンクや新潟県の自助グループ「虹の会」とのネットワークを作り、上越地域において自助グループを構築していくための土台作りを行った。自死遺族へのインタビューを通しては、自死遺族の感情として、後悔の念がある一方で、なぜ自殺したのかという疑問や自殺者に対する憎しみの感情も交じっていることが明らかとなった。しかし自死遺族はこれらの思いを表出する相手や機会がなく、誰にも話せずに自分一人で苦しむという状況があり、これらの苦しみを軽減するには、自死遺族が共に分かち合い、安心して語れる場が必要であると考えられた。これらを踏まえ、今後はさらにフィールドリサーチを進め、現在活動をしている他の自助グループの状況を把握したうえで、自死遺族が安心して語れるための場の要素を見出し、自死遺族が安心して語れる自助グループ活動を構築していくことを目標としている。本研究は、自死遺族が身内を自殺で亡くした苦しみを克服するために、どのような支援が必要かを検討し、上越地域において先駆的な自死遺族支援グループを構築し、活動を継続していくことを目的としている。平成20年度および21年度までのフィールドリサーチを通して、各地域で実施されている自死遺族ケアには、主に自助グループと自死遺族支援グループがあり、それぞれの目的や役割を照らし合わせると、上越地域において我々が構築していくのは自死遺族支援グループが妥当であるとの考えに至った。それを踏まえ、これまでのフィールドリサーチやネットワークの構築を土台としながら、平成22年3月に上越地域において、自死遺族支援グループ「はじめの会」を立ち上げた。自死遺族支援として、自殺で大切な方を亡くされた人を対象に、現在も定期的に活動を行っている。これまでの参加者の意見やアンケート、スタッフの振り返りから見出された課題として、身内を自殺で亡くして苦しんでいる人たちに対して、会の存在や活動をいかに伝えていくかということがあった。これに対しては、広報に力を入れ会の存在を知ってもらうために、行政および医療機関とのネットワークを作ることが重要であった。また参加者に対しては継続的に支援をしていくことが重要であると考えられた。しかしその一方で、都会とは異なる地域的な問題として、身近な場所への参加のし辛さがあり、その他にも自殺という閉鎖性や支援グループ同士のネットワークの不足といった問題点も見出された。今後はこれらの課題を検証しながら活動を進めていき、はじめの会の活動が1年を経過した時点で活動状況をまとめ発表する予定である。これまでのフィールドリサーチを通して、全国各地で実施されている自死遺族ケアには、主に自助グループと自死遺族支援グループがあり、それぞれの目的や役割を照らし合わせると、上越地域において我々が構築していくのは自死遺族支援グループが妥当であるとの考えに至った。それを踏まえ、これまでのフィールドリサーチやネットワークの構築を土台としながら、平成22年3月に上越地域において、自死遺族支援グループ「はじめの会」を立ち上げ、現在まで活動を続けている。主な活動内容は、自死遺族を対象とした定例会や電話相談、個別面談のほかに、自死遺族に対する正しい理解の普及を目的に一般市民を対象とした講演会も実施した。自死遺族支援グループのスタッフは看護職で構成され、定例会時にプレミーティング、アフターミーティングを実施し、個別事例の支援策の検討、会の運営の話し合いや活動の振り返り、今後の課題の抽出を行った。課題については、設立当初にあげられた課題である会の存在をいかに伝えていくかということに関しては、新潟県内でネットワークを構築しながら、繰り返し新聞やテレビなどのメディアに取り上げてもらい、少しずつであるが地域に浸透してきた。また、現在の課題として継続的な参加があげられた。上越という地域性や都市の規模から、身近な場所への参加のし辛さがあり、これに対しては電話相談にも重点を置くことと、個別対応の必要性が確認され実施してきた。
Naked DNA Injectionによる表皮細胞への遺伝子導入法の開発

本研究の目的は、器官培養されたヒト皮膚へプラスミド発現ベクターをNaked DNAの形で皮下注し、表皮細胞での発現動態を解析し、表皮細胞への効率の良い遺伝子導入法を開発することにある。本研究により、Naked DNA Injection法の確立のために必要な試薬、遺伝子、ベクターを作成した。外来性遺伝子の発現動態を検討するために、その発現を簡便に発色剤を用いて検討できるガラクトシダーゼ遺伝子を発現するベクターを用意した。ガラクトシダーゼ遺伝子の発現レベル及び発現部位を、凍結切片を用いて免疫組織学的に検討した結果、ガラクトシダーゼは、注入後2時間から48時間まで発現が認められ、表皮ほぼ全層にわたり発現していることが確認された。さらに、表皮構成成分で細胞膜蛋白であるデスモグレイン3(Dsg3)を欠損させたDsg3ノックアウトマウスを遺伝性皮膚疾患のモデルマウスとして使用した。このマウスは、細胞間接着分子であるDsg3が欠損しているために、口腔内における水疱・びらんの形成、ならびに休止期(telogen)にある被毛の脱毛を生じる。このマウスに対する遺伝子治療として、発現ペクターに組み込んだマウスDsg3cDNAを表皮細胞にNaked DNA injection法により導入した。導入された遺伝子が、表皮ならびに毛嚢において発現されることを蛍光染色法にて確認した。外来Dsg3の発現により、表現型を元に戻すことは確認できなかった。さらに、外来Dsg3に対する抗体産生が、Naked DNA injection後1、2ヶ月で誘導されることを確認した。本研究により、表皮に対するNaked DNA injection法による遺伝子導入法が実現可能であることが示されたと同時に、導入した遺伝子産物による免疫反応が遺伝子治療実施の際の障害になることが確認された。従って、遺伝子治療における外来遺伝子産物に対する免疫寛容誘導法の開発が必要であることが示唆され、新たなる研究テーマの開拓となった。遺伝子治療は様々な領域で注目を集めている新しい治療法である。皮膚は、体の外表を覆い外界からのアクセスの簡単な臓器であり、遺伝子治療の最も優れた標的臓器のひとつである。皮膚を標的とした遺伝子治療は、皮膚科領域の遺伝性疾患のみならず、皮膚を内分泌臓器にみなす事により、様々な疾患に応用が可能である。本年度は、Naked DNA Injection法の確立のために必要な試薬、遺伝子、ベクターの作成を主として行った。また、実体顕微鏡下に、DNAを含むリン酸緩衝液を表皮下に注入する方法を確立した。注入する溶液の至適DNA濃度、さらに注入後の発現動態を経時的に検討した。また、ガラクトシダーゼ遺伝子の発現レベル及び発現部位を、凍結切片を用いて免疫組織学的に検討した。ガラクトシダーゼは、注入後2時間から48時間まで発現が認められ、表皮ほぼ全層にわたり発現していた。今後は、カドヘリンのドミナント-ネガティブ変異体あるいはサイトカインなどの生理活性物質をコードするcDNAを用いて、外来性遺伝子を導入することにより表皮細胞において機能している蛋白を制御する事が可能か検討する。
圧縮性乱流のトポロジー

直接シミュレーション(圧縮性LES法や擬スペクトル法によって計算された)による移流マッハ数M_c=0.3の混合層と乱流マッハ数M_t=0.6の一様等方性乱流の局所ながれ場をトポロジー的観点から研究を行なった。その結果、圧縮性混合層においては三次元大規模構造が形成されることによって形成されるひずみ場ではトポロジー的分類によってUnstable node/saddle/saddle流れが高散逸領域を形成し、大規模構造がヘリカルペアリング状態であるとき、渦集中領域においてUnstable focus compressing構造が高散逸領域を形成していることが明らかになった.一方、一様等方性圧縮性乱流においては、高散逸領域はUnstable node/saddle/saddleとStable focus/stretchingとUnstable focus/compressingの局所流れパターンが支配的であることが明らかになった。また、高エンストロフィー領域は、Stablefocus/stretchingとUnstable focus/compressingのトポロジーが卓越することが分った。平均シャー場を持つ混合層と一様等方性乱流について高散逸領域はUnstable node/saddle/saddleであることが共通し、一様等方性乱流ではStable focus/stretchingとUnstable focus/compressingのトポロジーが大きな分布を示すことが相違点である。さらに、高エンストロフィーと高散逸領域で支配的な一様等方性乱流のStable focus/stretchingの流れパターンは重要であることが推測される。また、第二不変量におけるS_<ij>S_<ji>と-R_<ij>R_<ji>の分布は混合層と一様等方性乱流の間では大きくかけ離れてはいないことも明らかになった。
一次性および二次性骨粗鬆症におけるカルシウム代謝関連遺伝子の多型性の検討

代謝性骨疾患の遺伝的素因に関する研究は、1994年Morrisonらによって、ビタミンD受容体遺伝子多型と骨密度との関係が報告されて以来各国で盛に研究されている。二次性骨量低下をきたす代表的疾患である原発性副甲状腺機能亢進症において、その骨密度とビタミンD受容体遺伝子多型が相関することを私たちは報告した。(Endocrne Joural,in press)今回は副甲状腺ホルモン(PTH)遺伝子多型と原発性副甲状腺機能亢進症(pHPT)での骨代謝について検討を行った。PTH遺伝子のintron2にあるBSTBIで認識される多型をBまたはb、exon3のDraIIの多型をD,dで表す。104例のpHPTの遺伝子型の頻度はBB82.3%Bb15.3%bb2.5%、またDD83.1%Dd15.6%、dd1.3%でコントロール群と差を認めなかった。腰椎骨密度(BMD)はコントロール群でBBが有意に高かったのに対し、pHPTではBBで低い傾向。またpHPTにおいてBB群で血清カルシウム値は有意に高かった。DraIIにおいては、その遺伝子型間でpHPTでDDでintactPTHが有意に高かった。以上からBB、DDはpHPTにおいて重症度と関係していると考えられた。遺伝子多型が、病態に及ぼすメカニズムは明らかではなく、今後の検討が必要と思われる。