hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
3D活性サイト制御による高性能ナノ分子触媒の創製

平成30年度の研究成果の概要は以下の通りである。従来触媒で困難な、低歪みの環状オレフィンの開環メタセシス重合に、高温で高活性を発現する高性能バナジウム錯体触媒を開発した。オレフィンやスチレン重合における各種チタン触媒溶液のXAFS(XANES, EXAFS)測定を検討した(班内及び公募班との共同研究、SPring-8)。MAO助触媒存在下、1-ヘキセンの重合では触媒溶液の価数変化は見られないものの、スチレンを添加すると系内で3価のチタン種が生成し、EXAFS解析よりTi-O結合を有する中性の3価種が生成することが示唆された。従って、スチレンの立体特異性重合(シンジオタクチックポリマーの合成)には、中性の3価チタン種が活性種となることを明らかにした。Pd錯体触媒によるフタル酸ジメチルの脱水素アレーンカップリングの反応機構解析を目的に、触媒溶液のXAFS測定(SPring-8)とFEFFフィッティングによる構造解析、単結晶X線構造解析、DFT計算、推定中間体の合成に取り組んだ(学術論文掲載済)。酸化的カップリング機構による置換アルケンの鎖状交差二量化の触媒となる配位不飽和Ru(0)錯体の合成と反応化学に取り組み、共役ジエンとアクリル酸メチルの交差二量化に従来触媒より高活性を示す高性能触媒を創製した。メソポーラス担体の細孔内にPdビスホスフィン錯体と有機分子を三次元的に近接・共存させた触媒を開発し、ケトエステルのアリル化反応において、細孔径の小さな触媒ほど協奏効果により高活性を示すこと、ビスフェノールAのダブルアリル化反応によりエポキシ樹脂前駆体のモノマーを収率98%で効率よく合成することを明らかにした。水のみを副生成物とするアリルアルコールを用いる反応にも適用可能で、従来触媒を凌駕する触媒回転数(TON=4500)で反応が進行した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本計画班は、正確かつ多角的な3D活性サイトイメージングに立脚した触媒設計という次世代型触媒開発における新機軸を打ち出し、その理論体系を基盤とした革新的触媒の創製を指向している。特に、(i)反応性の異なる各種有機金属錯体の合成・単離法の確立や関連の反応化学や(ii)特異な触媒作用が発現する多くの界面活性サイトを有する新規ナノ粒子触媒や協奏機能触媒表面の開発と活性発現因子に関する知見に加えて、本新学術の連携による多面的な解析結果を基に、従来にはない革新的触媒の創製を指向している。平成26年度の成果概要は以下の通りである。有機金属錯体の素反応における活性中間体の構造と電子状態に関する情報の取得を目的に、(測定班での)XPSによる放射光施設での条件設定・予備検討向けのモデル錯体・単結晶(モリブデンやバナジウム錯体)を合成した。関連の有機バナジウム錯体(アルキル、アルキリデン錯体)の合成と反応化学、酸化的カップリング機構による鎖状交差二量化の触媒となる配位不飽和な12電子ゼロ価ルテニウム錯体の合成と反応化学などに有用な基礎的成果を得ている。金属ー担体の界面の電子状態の解析を目的に、光電子分光により界面金属原子を測定(金属側からの情報)、及び軟X線により界面の酸素の発光測定(担体側からの情報)を計画している。測定用に向けて、ハイドロタルサイトと同等の触媒活性を示す、(入手可能な)Al2O3やMgAl2O4単結晶上に金ナノ粒子を担持した触媒を調製した。固体表面で協同触媒作用を発現する二つの活性点間の(構造や電子状態に関する)情報を得ることを目的に、SiO2(0001)基板(単結晶表面)にモデル触媒構造を構築し、サンプル調製を検討し、XPS測定で有機分子の導入を確認した。今後反射率法測定、CTR測定、AFM測定等により、金属錯体と基板との距離を求めることを計画している。本計画班はナノ触媒の局所的活性サイトの3Dイメージングの実現やその方法論・学理の確立を目的に、正確で多角的な3D活性サイトイメージングに立脚した触媒設計という次世代型触媒開発における新機軸を打ちだし、その体系を基盤とした革新的触媒の創製を指向している。平成27年度の成果の概要は以下の通りである。環状オレフィンの開環メタセシス重合に、従来触媒よりも耐熱性に優れ、高活性を示すバナジウム錯体触媒、及び高cis特異的な重合を可能とする錯体触媒を創製した。光電子分光測定に向けたMoなどの錯体・単結晶を用いた予備検討(超高真空中で試料清浄化後にXPS計測)では、照射ダメージは少なく、再現性に優れる結果を得た。Pd(II)錯体による不飽和化合物のカップリング反応や電子不足不飽和化合物に対するヒドロシリル化や脱水素アレーンカップリング反応の活性中間体の単離などに成功した。金ナノ粒子をセリアナノ粒子で包み込んだコアーシェル型ナノ構造触媒の合成に成功し、金属ー担体との接合界面において協奏的触媒作用が発現することを明らかにした。また、パラジウムナノ粒子を銀ナノ粒子で包み込んだコアーシェル型ナノ構造体を合成し、ナノ構造体イメージング班との共同研究により本構造体のイメージングに成功した。

シリカ表面にRh錯体と第三級アミンを固定した触媒が、フェニルホウ酸の不飽和ケトンへの1,4-付加反応に高活性を示すこと、Pd錯体と有機強塩基を固定した触媒表面で求核剤のアリル化反応が効率よく進行することを見いだした。手法班との連携でモデル触媒表面の反射率測定を試みた結果、固定化錯体は表面に対しておよそ60度傾いて存在し、協奏機能効果の発現が示唆された。この知見を基によりPd錯体と有機分子が込み合った状態の触媒表面の開発・構造解析に成功し、アリル化反応に極めて高い触媒回転数を達成した。研究代表者及び分担者は、目的に向けた所定の成果を得ており、測定班との連携の成果も学術論文として一部受理・掲載に至っている。また、関連化学で非常に重要・有用な知見を数多く得ており、その成果は学術論文や国際会議での招待講演等を通じて高い評価を得ている。平成28年度の研究成果の概要は以下の通りである。光電子ホログラフィー班と共同で、Ru(0)錯体の単結晶のXPS測定を行ない、SPring-8に導入したグローブボックスシステムで実測定に向けた準備を行った。イミド配位バナジウム錯体触媒によるエチレン二量化において、モデル錯体の合成と反応化学、各種NMR, ESR測定、及びSPring-8での溶液XAFS測定の結果を基に、触媒系では基本の配位構造や酸化状態を保持し、5価のアルキルカチオンが活性種として機能することを明らかにした(班内及び公募班・山添先生との共同研究)。またSPring-8での溶液XAFS測定などから、Pd錯体触媒による脱水素アレーンカップリング反応ではPd(II)錯体が触媒活性種となることを確認した(班内共同研究)。環状オレフィンの開環メタセシス重合に、従来触媒を超える高活性・高立体特異的を発現し、高温でも高性能を発現するバナジウム錯体触媒を創製した。界面活性剤や有機溶媒などの添加剤を一切用いず、水中でコアーシェル型ナノ粒子を一段階合成する簡便かつ環境調和性の高い手法を確立した。金ナノ粒子がセリアによって覆われた、ハイドロタルサイト上に高分散に担持されたコアーシェル型ナノ粒子触媒(TEMやSTEM像で確認)が種々の化学選択的水素化反応を高効率に進行させることを見出した。また、高機能金ナノ粒子触媒により、工業廃棄物のヒドロシランTMDSと水から水素を高効率に取り出すことに成功した。表面・界面ホログラフィー班との連携で、SiO2単結晶表面上に構築したモデル固定化錯体表面の反射率測定を試み、固体表面上で固定化した錯体が隣り合う有機分子に接近し、協奏的に触媒反応を促進する可能性が示唆された。この知見を基に、より高性能Pd錯体触媒表面の開発・構造解析に成功し、アリル化反応において10万回を超える触媒回転数を達成した。研究代表者及び分担者は、目的に向けた所定の成果を達成し、手法班との連携による成果も一部は学術論文として受理・掲載に至っていることから、スケジュール通りに推移していると判断している。一方で、この知見を基にした革新的高性能触媒の創製の課題はスケジュールよりも早期に取り組み、既に所定の有用かつインパクトの高い成果が得られている。平成29年度の研究成果の概要は以下の通りである。分子結晶・触媒活性種の合成と反応化学:有機Al助触媒の存在下でエチレン重合に高活性を示すイミド配位バナジウム触媒の活性種構造解析(溶液XAS測定)に取り組み、NMRやESRスペクトルでは解析できない、バナジウム3価種の生成を直接観察した(班内及び公募班との共同研究)。光電子ホログラフィー班と共同でRu(0)錯体単結晶のホログラフィー測定を試みた。
経済学者としての早川三代治を通した日本近代経済学発展史の研究

本年度は,早川が帰国後に取り組んだ研究のうち,パレート研究を基礎として,所得格差の問題をテーマとした論文を執筆するに至る経緯とその研究が格差社会の研究史においてどのように位置づけられるのかについて分析を行った。(1)本研究では,早川三代治の経済学における功績を整理するとともに,彼の格差研究とその位置づけを解明することが課題であった。早川は,ワルラスやパレートをはじめとした数理経済学の基礎文献について邦訳を進めてきたが,その後パレートの実証研究へと移行する。そこでは,パレート法則が普遍的な経済法則として成り立ち得るかという問題について,北海道274市町村中108の町村を抽出し,個人所得のデータ収集および分析が行われた。結論として,彼は,パレート分布では免税点以下(低所得層)を著しく圧縮しており,免税点以上の所得に焦点を当てたパレート係数では所得分布の形態を正確には示すことができないことを明らかにした。早川はパレートを理論的かつ批判的に乗り越えようと実証研究を試みたが,最終的にはパレートの均衡論的な考え方に依拠しており,安定的な所得分布が存在することを証明することに注力していたと考えられる。(2)上記の研究と併行して,昨年度と同様に未整理資料の確認を行い,目録作成ならびに資料の電子化作業を進めた。本年度は,2度にわたり現地を訪問し,未整理資料の目録作成を進めたが,年度末に図書館の改修工事が始まったため,その作業は一時中断している。今後の目録作成と電子化の作業については,図書館職員と相談しながら,作業を進めていくこととする。これまでの研究成果は,「早川三代治による格差研究の視点」(経済社会学会第54回全国大会)において報告した。早川三代治の経済学における功績を整理するとともに,彼の格差研究とその位置づけについて報告した。本年度は,当初の計画どおり「日本における近代経済学の応用に関する研究」に着手した。まだ,いくつか継続的な課題が残されているものの,早川三代治の格差研究をまとめることによって,彼がパレートの法則ならびにその実証的な研究をどのようなかたちで引き継ぎ,どの点を批判的に乗り越えようと考えていたのかが明らかにされた。さらに,ピケティをはじめとした近年の格差研究と早川の研究との関係やその後の展開などについても概観することができた。この成果は,現在執筆している論文においてもしっかり議論を整理して,きちんと成果と課題を明らかにしたい。一方で,懸念事項としては,未整理資料の目録作成と電子化作業については昨年度からの遅れのみならず,年度末に図書館の改修工事が始まったことにより,次年度にさらなる遅れが心配される。今後は,図書館とも相談して,できる範囲で作業を進めていくこととする。最終年度は,昨年度に未完の学術論文の執筆と投稿を確実に進めていく。さらに,早川文庫の未整理資料の大まかな目録を作成するとともに,最終年度は北海道大学文書館等への現地調査も予定している。まずは,最終目標である学術論文の執筆と投稿を確実に進めていくことが必要である。さらに,小樽商科大学のみならず早川の出身かつ勤務していた北海道大学でも資料収集を行い,彼の近代経済学研究の基板形成とのつながりを補強していく。小樽商科大学附属図書館の改修工事が終了した後,再び現地を訪問し,可能な限り早川文庫の資料整理と目録作成,さらには電子化の作業に取り組みたい。本研究は,研究計画調書の計画にしたがい,早川三代治を対象とした日本における近代経済学の発展史を解明することに主眼がある。そこで,本年度は,(1)日本における近代経済学の受容と展開に関する研究,(2)早川三代治に関する資料の目録作成と電子化作業,を進めた。(1)本研究では,経済学者としての早川三代治を構成するうえで基礎となる重要人物との関係を明らかにすることが課題であった。先行研究などを通じて,早川が経済学者としての礎を築くうえで重要な人物のひとりとしてシュンペーターを挙げることができる。早川とシュンペーターとの直接的な出会いは,ビーダーマン銀行の頭取時代に,ちょうどウィーンに滞在中の早川がシュンペーターに面会を申込み,それが実現したことが最初であった。そこでどのようなことを学び,それが早川の研究と具体的にどのようなかたちで結びつき,その後の学説史や実証の研究に至ったかは,継続的な調査が必要となる。(2)上記の研究と併行して,本年度は早川文庫の未整理資料を確認し,目録作成ならびに資料の電子化作業を進めることがもうひとつの課題であった。平成27年度以降,継続的に手稿類などの資料が寄贈されており,それらが未整理のまま保管されている。そこで,本年度は2度にわたって現地を訪問し,目録作成と電子化の作業を進めたが,資料の分量の多さや保存状態の問題にも直面した。次年度も引き続き目録作成などの作業は進めて行くが,電子化などは図書館職員と相談しながら,作業の進展を図りたい。これまでの研究成果は,「『言葉』の経済学者早川三代治の功績」(経済学史学会東北部会2018年度例会)にて報告を行った。本報告では,学会でもあまり知られていない早川三代治の功績(生涯・研究業績)を紹介し,3つの論点を提示した。学会参加者からいただいたコメントやアドバイスを参考に,今後は論文執筆を進めていきたい。本年度は,当初の計画どおり「日本における近代経済学の受容と展開に関する研究」に着手した。

まだ,いくつかの継続的な課題が残されているものの,早川三代治の生涯と研究業績をまとめることによって,彼が近代経済学をどのようなかたちで受容してきたのか,さらにそれをどのように研究や教育へ展開したのか,を概観することができた。この成果は,次年度に予定していた「日本における近代経済学の応用に関する研究」とも関わりを持っており,早い段階で早川の人物像を整理することができたことは非常に大きな進展である。同時に,次年度に予定したいた学術論文の執筆に向けても重要な準備作業であった。一方で,懸念事項としても指摘していたことだが,未整理資料の目録作成や電子化作業はやや遅れが見られる。原因としては,追加寄贈によって資料が想定よりも増えたこと,資料の劣化が激しく,作業が難航していることが挙げられる。今後は,図書館と密な連携を図り,改善および効率化を図っていきたい。また,必要に応じて,アドバイスや研究支援をいただけそうな関係者にも協力を依頼したい。本年度は,早川が帰国後に取り組んだ研究のうち,パレート研究を基礎として,所得格差の問題をテーマとした論文を執筆するに至る経緯とその研究が格差社会の研究史においてどのように位置づけられるのかについて分析を行った。(1)本研究では,早川三代治の経済学における功績を整理するとともに,彼の格差研究とその位置づけを解明することが課題であった。早川は,ワルラスやパレートをはじめとした数理経済学の基礎文献について邦訳を進めてきたが,その後パレートの実証研究へと移行する。そこでは,パレート法則が普遍的な経済法則として成り立ち得るかという問題について,北海道274市町村中108の町村を抽出し,個人所得のデータ収集および分析が行われた。結論として,彼は,パレート分布では免税点以下(低所得層)を著しく圧縮しており,免税点以上の所得に焦点を当てたパレート係数では所得分布の形態を正確には示すことができないことを明らかにした。早川はパレートを理論的かつ批判的に乗り越えようと実証研究を試みたが,最終的にはパレートの均衡論的な考え方に依拠しており,安定的な所得分布が存在することを証明することに注力していたと考えられる。(2)上記の研究と併行して,昨年度と同様に未整理資料の確認を行い,目録作成ならびに資料の電子化作業を進めた。本年度は,2度にわたり現地を訪問し,未整理資料の目録作成を進めたが,年度末に図書館の改修工事が始まったため,その作業は一時中断している。今後の目録作成と電子化の作業については,図書館職員と相談しながら,作業を進めていくこととする。これまでの研究成果は,「早川三代治による格差研究の視点」(経済社会学会第54回全国大会)において報告した。早川三代治の経済学における功績を整理するとともに,彼の格差研究とその位置づけについて報告した。本年度は,当初の計画どおり「日本における近代経済学の応用に関する研究」に着手した。まだ,いくつか継続的な課題が残されているものの,早川三代治の格差研究をまとめることによって,彼がパレートの法則ならびにその実証的な研究をどのようなかたちで引き継ぎ,どの点を批判的に乗り越えようと考えていたのかが明らかにされた。さらに,ピケティをはじめとした近年の格差研究と早川の研究との関係やその後の展開などについても概観することができた。
汗腺内の色素幹細胞の同定と悪性黒色腫の発生機序の解明

これまで数多くの種類の悪性黒色腫(メラノーマ)モデル遺伝子改変マウスが開発されてきたが、末端黒子型悪性黒色腫を再現できるモデルは未だ存在していないのが実情である。申請者は、タモキシフェンによってチロシナーゼプロモーター領域下において特異的に活性型変異BRAF (V600E)が発現しPTEN遺伝子が欠失するモデルマウスを使って実験を行ってきたが、本モデルマウスでは足底掌蹠部に腫瘍病変が形成される以前に、体幹に発生した腫瘤によって腫瘍死してしまう。そこでドナーとなるタモキシフェン誘導型メラノーマモデルマウスを投与の足底部を採取し、免疫不全マウスの背部に移植する手法を考案し実施した。その結果、1か月以内に全てのレシピエントの背部において腫瘍が形成された。病理組織学的に汗腺導管部が伸長したような構造が多数認められた。腫瘍を構成する細胞集団は渦巻き状の構造を呈しており、表皮内には個別性増殖も認められ一部ではシート状に増殖していた。一方で、ヒトの悪性黒色腫の典型的な病理組織像はやや萎縮性の表皮下層部にメラノサイトが主として胞巣を形成して増殖していることが知られている。汗腺の導管に由来すると考えられる構造の顕著な伸長はヒトの病理像とは乖離していたが、間葉系の腫瘍細胞が胞巣状かつ渦巻き状に増殖している点は酷似していた。免疫不全マウスに移植することで微小環境やニッチ因子がartificialになることを考慮し、7週齢のタモキシフェン誘導型メラノーマモデルマウスの腫瘍組織像をケラチン5で免疫染色したところ、汗腺分泌部の基底層に沿ってケラチン5の発現が減弱していた。汗腺分泌部の基底膜が破綻して悪性転化した悪性黒色腫の起源細胞が真皮を中心に増生するパターンを示唆する本結果は、汗腺導管を経由して表皮直下で異型メラノサイトが増生するヒトの末端黒子型悪性黒色腫モデルとは相異なるものであり注目に値する。29年度が最終年度であるため、記入しない。申請者は本年度、毛包の存在しない掌蹠(足底、手掌)に存在する色素幹細胞の幹細胞としてのふるまいや悪性黒色腫の発生との関連性に関して遺伝子改変マウスを用いて実験検証した。1.末梢神経は掌蹠の色素幹細胞ニッチである汗腺分泌部に豊富に分布する:近年、造血幹細胞のニッチ因子として神経細胞の重要性が報告されている(Cell. 2011 ;147:1146-58.など)。そこで今回申請者は、汗腺を同定するために上皮細胞のマーカーケラチン5、末梢交感神経を同定するためにニューロンのマーカーTuj1に対する抗体を用いて蛍光組織免疫染色を行った。その結果、汗腺の導管よりもむしろ分泌部(secretory portion)に優位な神経細胞分布を認めた。また、坐骨神経遮断をした際に末梢神経の数だけでなく汗腺分泌部の色素幹細胞の数が減少する傾向にあることを証明した。以上より、色素幹細胞のニッチである汗腺分泌部における神経分布が、幹細胞プールの維持に関わっていることが強く示唆された。2.ゲノムストレスは異所性分化を促進、あるいは、汗腺導管・表皮直下の色素前駆細胞を増加させる:加齢や紫外線、化学物質暴露などによるゲノムストレスは、細胞休眠状態で未分化性を維持している幹細胞の形質を変化させうると考えられている。そこで、Dct-H2B-GFPノックインマウス足底部に、発がんモデル実験でイニシエーション(DNA突然変異を誘発)として汎用されるDMBAの連続局所塗布(4回/週、1月後回収観察)を施行した。その結果、コントロールと比較して顕著に、汗腺導管および表皮直下にGFP陽性細胞が増加した。汗腺分泌部と表皮を解剖学的に連続させる導管の中にも多数のGFP陽性細胞が認められたことから、汗腺分泌部に存在するGFP陽性細胞が刺激を受けて細胞周期がオンとなり増殖した可能性が高い。末端黒子型悪性黒色腫(acral lentiginous melanoma)モデルマウスについては5-6種類の遺伝子改変マウスを複雑に交配させており現在も準備段階である。そのため、実際に解析に値する遺伝子改変マウスが樹立できるまでに長期間のマウスの掛け合わせ、PCRによる遺伝子型解析の繰り返しといった根気強い実験姿勢が必要とされる。加えて、組織幹細胞やがん幹細胞の特徴の一つである細胞死抵抗性について実験を進めている。「新しい細胞死メカニズム」ともいわれる、活性変異型RAS(NRAS, HRAS, KRAS)を有する腫瘍細胞に特異的な細胞死についても並行して解析中であり、かなりの新規データを蓄積できつつある。このように、動物実験と細胞実験を組み合わせながら、悪性黒色腫をはじめとする難治性の変異RAS陽性腫瘍(脳腫瘍、膵がん、大腸がんなど)の新規治療戦略に結びつく観点から、がん幹細胞の特異的形質である細胞死抵抗性やニッチ因子の重要性について実験を進めることができている。申請者は2016年度の研究において、毛包の存在しない掌蹠(足底、手掌)の汗腺分泌部に存在する色素幹細胞の創傷治癒プロセスにおける増殖能や分布動態の変化、および、悪性黒色腫モデル遺伝子改変マウスの足底(footpad)を免疫不全マウスに移植した際に形成される腫瘍病変について解析を行った。

創傷部位の皮膚組織が再上皮化する過程において、GFP陽性細胞がどのような挙動を呈するのか検証を行ったところ、表皮のerosionが顕著である一方で、真皮に存在する汗腺分泌部においてGFP陽性細胞の増生や導管への移行は予想に反して確認されなかった。さらに、末端黒子型悪性黒色腫を発症する前に腫瘍死してしまう従来のがんモデルマウスの足底部を採取し、免疫不全マウスの背部に移植した結果、1か月以内に全てのレシピエントの背部において病理組織学的にヒトの悪性黒色腫に酷似した腫瘍が形成された。汗腺の導管に由来すると考えられる構造の顕著な伸長はヒトの病理像とは乖離しているが、間葉系の腫瘍細胞が胞巣状かつ渦巻き状に増殖している点は酷似していた。また、新規細胞死であるフェロトーシスの分子機序の解明は、恒常的にRAS-MAPキナーゼが活性化している悪性黒色腫の治療標的として期待できる研究課題である。先行研究で報告されているフェロトーシス誘導剤(エラスチン、アーテスネイト)がxCTノックアウトMEFやHRAS(G12V)-MEFで特異的に細胞死を誘導するわけではないことが確認された。また、鉄貯蔵タンパク質であるフェリチンが選択的オートファジーによって分解されることがフェロトーシスに関与しているという報告もあるが、フェロトーシスを起こした細胞だけに特異的なp62/SQSTM1の減少やLC-3 conversionは認められなかった。既にわれわれは、未分化な色素細胞が汗腺分泌部というニッチ(至適微小環境)に存在しており悪性黒色腫形成における起源細胞となりうることを報告している(Pigment Cell Melanoma Res.2014;27:1039-50.)。一方で、創傷治癒は悪性黒色腫の浸潤・転移能を高めることが臨床医学的にも以前から指摘されている(Cancer Res.1991;51:4853-8, Exp Dermatol.2012;21:437-42.)。今回、申請者は掌蹠の創傷治癒過程における正常色素幹細胞の増殖能、動態について検証をすることができた。また、これまで数多くの種類の悪性黒色腫モデル遺伝子改変マウスが開発されてきたが、足底部に腫瘍病変が形成される前に既に体幹に発生した腫瘤によって腫瘍死してしまう。そこでドナーとなる7週齢のTyrCreERT2;BRAF(V600E);PTENにタモキシフェンを投与し3週間後に足底部を採取し、免疫不全マウスの背部に移植した結果、1か月以内に全てのレシピエントの背部において腫瘍が形成することを確認し病理組織学的に解析することに成功した。掌蹠部のみに特異的に悪性黒色腫を発生する新規メラノーマモデルマウス樹立については、新たに着目しているRAS-MAPキナーゼ抑制作用を示すSPRED1をノックアウトしたマウスを従来の悪性黒色腫モデルマウスと交配することで樹立を試みている最中である。また、新規細胞死として着目されているフェロトーシスに関して、シスチン輸送体xCTおよびがん遺伝子HRAS(G12V)との関連性について、ノックアウトマウス由来の線維芽細胞を樹立したり野生型MEFにがん遺伝子を過剰発現させることで検証を行うことができた。これまで数多くの種類の悪性黒色腫(メラノーマ)モデル遺伝子改変マウスが開発されてきたが、末端黒子型悪性黒色腫を再現できるモデルは未だ存在していないのが実情である。申請者は、タモキシフェンによってチロシナーゼプロモーター領域下において特異的に活性型変異BRAF (V600E)が発現しPTEN
脈絡膜血管新生におけるＲＮＡ結合蛋白リン酸化酵素ＳＲＰＫの役割

加齢黄斑変性(AMD)は先進国における中途失明の主要な原因となっている疾患である。近年の研究は血管内皮細胞増殖因子(VEGF)がAMDにおける脈絡膜血管新生(CNV)に重要であることを示している。VEGF mRNA前駆体における選択的スプライシングはserine/arginine-rich (SR)proteinによって制御されること、また同蛋白はSR protein kinase (SRPK)によって活性化されることが知られている。本検討において、我々はレーザー誘導CNVモデルにおけるSRPKの特異的阻害剤SRPIN340のCNV抑制効果を明らかとした。結果として、SRPIN340によってICAM-1やMCP-1の発現量は減少し、それとともにCNV領域に対するマクロファージ浸潤も低下した。これらの分子に対する抑制作用が、SRPIN340によるCNV抑制機序の一端を担っていると考えられた。しかしながら、興味深いことにVEGFの発現量は総量として低下していた。本検討における仮説は、血管新生誘導型アイソフォームVEGF164aの低下と血管新生誘導型アイソフォームVEGF164bの増加が生じて全体量としては大きな変化が生じないというものであったが、予想と反する結果となった。また、複数回の検討によっても血管新生誘導型アイソフォームVEGF164bを検出することができなかった。前年度までの結果を受けて、SRPIN340投与により血管新生抑制型アイソフォームVEGF164bが増加するかどうかを詳細に検討したが、mRNAレベルおよび蛋白レベルのいずれにおいても同アイソフォームを確認することはできなかった。以上の結果から、SRPIN340によるCNV形成の抑制メカニズムは、炎症関連分子VEGF, ICAM-1, MCP-1の発現を抑制すること、またその結果としてマクロファージ浸潤を抑制することを介していると考えられた。上記検討結果を今年度molecular vision誌(査読あり)に投稿し、論文として公表した。脈絡膜血管新生(choroidal neovascualization, CNV)を伴う滲出型加齢黄斑変性(age-related macular degeneration, AMD)は、先進国における中途失明の主要な原因となっている。近年、生物学的製剤を用いた治療法の開発によってその治療予後は改善してきているが、現行の製剤には反復投与の必要性や全身あるいは局所合併症のリスクなどがあるため、現在もさらに適切な分子標的の探索が続けられている。本研究計画では、VEGF選択的スプライシングに関与するSR protein kinase (SRPK)に着目し、その特異的阻害剤SR protein phosphorylation inhibitor (SRPIN)340にCNV形成を抑制する効果があるかについて検討を行っている。平成23年度はレーザー誘発型CNVモデルマウスに対してSRPIN340を硝子体内投与し、そのCNVサイズを計測するという実験をおこなった。すなわち、レーザー照射によるCNV誘発直後にSRPIN340硝子体内投与群(0.2μM, 2μM, 20μM)と基剤投与群(0.1% DMSO)を作成し、1週間後にそのCNVサイズを測定した。結果として、誘発1週間後のCNVサイズは0.2μM SRPIN340投与群(21741±5237μm2)、2μM SRPIN340投与群(19442±4054μm2)、20μM SRPIN340投与群(16438±2779μm2)となり、基剤投与群(30737±5520μm2)と比較して縮小していた。特に、2μMおよび20μM投与群では統計学的有意差があった。これらの結果より、SRPIN340は用量依存性にCNV形成を抑制することが明らかとなった。以上より、研究計画はおおむね順調に進行していると自己評価している。本研究計画はおおむね順調に進展していると自己評価する。理由は以下の通りである。平成23年度の研究計画は、1)レーザー誘発型CNVモデルマウス作成、2)SRPIN340単独投与によるCNV形成抑制実験の2つであった。1)は本研究計画開始前より予備実験としてシステム確立に着手していたため、比較的順調に安定したCNV誘導が可能となった。また、2)は薬剤あるいは基剤の硝子体内投与時に硝子体出血を生じて評価不能になる例がまれにある以外は特に実験遂行に支障を来す事象もなく、こちらも比較的順調に進行した。研究開始初年度に「SRPIN340が用量依存性にCNV形成を抑制する」ことを示す結果が得られたことは非常に望ましい状況で、次年度はそのメカニズムを探索する実験に移行できる。これらのことより、進捗状況としては当初の計画目標を達成していると考えている。今年度の検討において生じた当初計画との乖離は、血管新生誘導型アイソフォームVEGF164bが検出できなかった点である。

近年、血管新生誘導型アイソフォームVEGF164bは生体内には存在しないとする報告[PLoS One. 2012;7(5):e35231]もなされているため、SRPIN340によるCNV抑制機序は全く別の経路を介している可能性がある。そのため、今後はSRPIN340ならびに他のSRPK阻害薬による抗血管新生作用をDNAチップなどを用いた網羅的解析で検討する予定である。平成24年度の研究計画は、1)SRPIN340によるVEGFアイソフォーム発現変化の確認実験および2)SRPIN340によるVEGF165b発現誘導以外のCNV形成抑制機構の探索である。前年度の実験結果よりCNV形成抑制効果を得るためのSRPIN340至適投与量は20μMと想定されるため、以降の実験は全てその投与量を20μMとしておこなうこととする。1)では、SRPIN340による網膜組織および脈絡膜組織におけるVEGFアイソフォームの発現変化を確認する。すなわち、レーザー非照射眼に対して上記20μMのSRPIN340を硝子体内投与して、投与6時間ならびに24時間後の網膜組織および脈絡膜組織を摘出する。同組織におけるVEGF165およびVEGF165bの発現バランスをRT-PCR法などを用いて、SRPIN340非投与眼のそれと比較検討する。また、同様の実験をレーザー照射(CNV誘発)眼に対しても施行し、実際にSRPIN340によるVEGF165bの発現誘導が眼内でもおこなわれていることを確認する。2)では、SRPIN340投与によって接着分子ICAM-1や炎症性サイトカインTNF-α、IL-6、MCP-1などのCNV形成に関連する炎症関連分子の発現変化が生じるかを確認する。すなわち、レーザー照射およびSRPIN340単独投与24時間後、3日後、7日後に眼球摘出をおこない、RPE-脈絡膜複合体における上記炎症関連分子のmRNAおよび蛋白レベルの発現を非投与群におけるそれらと比較検討する。上記のごとく、次年度はSRPIN340ならびに他のSRPK阻害薬による抗血管新生作用をDNAチップなどを用いた網羅的解析で検討する予定である。そのため、次年度の研究費はそれらの解析費用に使用する。平成23年度の実験計画は、SRPIN340単独投与による脈絡膜新生血管(CNV)形成抑制実験あった。薬剤投与群3群(投与量は0.2μM, 2μM, 20μM)とコントロール群2群(非投与群および0.1%DMSO投与群)の計5群で比較検討を行い、当初各群15匹程度の動物を使用する予定であった。しかしながら、実験が順調に進行して少ない匹数で実験が完了したために、動物および試薬の購入に想定していた予算分が未使用額として発生した。そのため、当該未使用予算を次年度の研究費として有効利用することとした。同繰越分は平成24年度に予定している実験で使用する動物および試薬の購入費用として使用する予定である。
歯周病原性細菌の産生するトリプシン様プロテアーゼの生物学的・免疫学的特徴

P.gingivalisの培養上清中に3種類のトリプシン様酵素(Pase-B,C,S)が存在したので,これらの酵素の精製を行い,性質を明らかにした.Pase-BとPase-Sは基質特異性に関して類似点が多く,阻害剤の傾向も同じで,チオール依存性プロテアーゼであった.Pase-Cは上述酵素の示す活性の他にBL_pNAとタイプIコラーゲンの分解活性を示し,赤血球凝集活性も有していた.Pase-Sに対する抗体を用いて,3種の酵素の反応性をみたところ,Pase-Cは反応しなかったが,Pase-Bは反応した.Pase-SはN末端アミノ酸配列を解析した結果,Pase-Bと共通配列を認めたため,Pase-Bのアイソザイムとしての可能性が示唆された.B.forsythus,T.denticolaの大量培養の方法を確立し,B.forsythusの産生するトリプシン様酵素のついては,部分精製まで行い,性質を検討した.この酵素はジチオスレイトール(DTT)及びSH基ブロッカーの影響はなかったが,TLCK,アンチパイン,ロイペプシンに阻害された.基質特異性に関して,BA_pNAよりもBL_pNAの方が親和性が高いことが明らかとなった.またインスリンB鎖と反応させるとペプチド鎖内部のアルギニンをカルボキシル基側で切断したことから,エンドペプチダーゼであると考えられた.P.gingivalisとB.forsythusの酵素の性質を比較すると,TLCK,アンチパイン,ロイペプシンで阻害を受けること,血中プロテアーゼインヒビターでは阻害されないことは共通した性質であるが,B.forsythus由来の酵素の場合,DTT非依存性で,ペプチダーゼであり,P.gingivalis由来の酵素は,DTT依存性のプロテアーゼであることが大きく異なる点である.B.forsythus由来の酵素は,基質特異性では,ペプチドのカルボキシル基側のアルギニンよりはリジンの方をよく分解するという点が特徴的である.P.gingivalisの培養上清中に3種類のトリプシン様酵素(Pase-B,C,S)が存在したので,これらの酵素の精製を行い,性質を明らかにした.Pase-BとPase-Sは基質特異性に関して類似点が多く,阻害剤の傾向も同じで,チオール依存性プロテアーゼであった.Pase-Cは上述酵素の示す活性の他にBL_pNAとタイプIコラーゲンの分解活性を示し,赤血球凝集活性も有していた.Pase-Sに対する抗体を用いて,3種の酵素の反応性をみたところ,Pase-Cは反応しなかったが,Pase-Bは反応した.Pase-SはN末端アミノ酸配列を解析した結果,Pase-Bと共通配列を認めたため,Pase-Bのアイソザイムとしての可能性が示唆された.B.forsythus,T.denticolaの大量培養の方法を確立し,B.forsythusの産生するトリプシン様酵素のついては,部分精製まで行い,性質を検討した.この酵素はジチオスレイトール(DTT)及びSH基ブロッカーの影響はなかったが,TLCK,アンチパイン,ロイペプシンに阻害された.基質特異性に関して,BA_pNAよりもBL_pNAの方が親和性が高いことが明らかとなった.またインスリンB鎖と反応させるとペプチド鎖内部のアルギニンをカルボキシル基側で切断したことから,エンドペプチダーゼであると考えられた.P.gingivalisとB.forsythusの酵素の性質を比較すると,TLCK,アンチパイン,ロイペプシンで阻害を受けること,血中プロテアーゼインヒビターでは阻害されないことは共通した性質であるが,B.forsythus由来の酵素の場合,DTT非依存性で,ペプチダーゼであり,P.gingivalis由来の酵素は,DTT依存性のプロテアーゼであることが大きく異なる点である.B.forsythus由来の酵素は,基質特異性では,ペプチドのカルボキシル基側のアルギニンよりはリジンの方をよく分解するという点が特徴的である.Pase-BとPase-Cは,以前に報告した方法で分離精製した.Pase-Sは,培養上清からアセトンにより抽出し,ゲル濾過により分離を行った.活性が認められた画分を濃縮し,DEAE-イオン交換及びゲルろ過を用いたHPLCにより精製を行った。精製したPase-SはSDS-PAGEの結果より,約44kDaの単一バンドを認めた.精製したPase-Sの酵素学的性状を調べた結果,ジチオスレイトールにより活性上昇し,プロテアーゼ阻害剤のN-エチルマレイミド,ロイペプチン,アンチパイン,トシルL-リジンクロロメチルケトンにより阻害された.基質特異性については,タイプIVコラーゲンの分解を認め,タイプIコラーゲンは熱処理変性を行ったものにかぎり分解した.以上の結果から,今回精製したPase-Sは,すでに報告しているPase-Bと酵素学的によく似た性質であることが明らかとなった.さらにPase-Sに対するマウスのポリクロナール抗体を作製し,Pase-BとPase-Sの免疫学的性状をImmunoblotting法で調べた結果,今回精製したPase-SはPase-Bと抗原として共通部分をもつことが示唆された.引き続き,Bacteroides forsythusについては培養方法を確立しているので,本酵素の抽出,精製を行っている.またTreponema denticolaについては培養条件を検討中である.

各々の酵素タンパク構造を調べるため,N-末端アミノ酸配列についても検索する予定である.P.gingivalisの産生するトリプシン様酵素のなかで,Pase-SとPase-Bとは,前年度に報告したように酵素学的性質,生物活性,免疫学的性質に類似点を多く認めた.そこで,各々の酵素タンパク構造の相同性を調べるため,N末端アミノ酸配列の解析を行った.その結果これらの酵素のN末端アミノ酸配列は10番目は検出できなかったが,7から12番目までのアミノ酸配列が同一で,高い相同性をもつことが明らかとなった.B.forsythusの産生するトリプシン様酵素については,大量培養が可能となったので,菌体から可溶化剤,オクチルグルコピラノシドを用いてトリプシン様酵素を抽出し,部分精製を行い,性質を検討した.最終的に得られた本酵素の回収率は14%,精製度は43倍であった.SDS-PAGEでは約91,76,72KDaの3本のバンドが認められ,酵素活性部位を解析するアフィニティーブロティングを行うと,この3つに対応したバンドが認められた.さらに,それぞれのバンドのゲルを切り出し活性の確認を行ったところ,91KDaのバンドにのみ活性を認めたが,他のバンドに活性を検出できなかった.本酵素の至適pHは8.2-8.6で,至適温度は35-40°Cであった.本酵素はジチオスレイトール及びSH基ブロッカーの影響はなかった.アンチパイン,ロイペプチン,TLCKにより阻害された.基質特異性に関してBApNAよりもBLpNAの方が親和性が高いことが明らかとなった.基質としてカゼインを用いた場合,ほとんど分解しなかったが,インスリンB鎖と反応させるとペプチド鎖内部のアルギニンをカルボキシル基側で切断したことから,エンドペプチダーゼであることが示唆された.T.denticolaについては大量培養方法は確立したが,トリプシン様酵素の精製までは至っていない.
人工原子″スーパーアトム″の作製と評価

平成9年度は、人工原子′′スーパーアトム′′の作製に関する基礎検討として、分子線エピタキシャル成長方を用いた微細構造形成の検討、また、そのネットワーク化に向けた検討を行うとともに、自己形成量子ドットの作製および光学的評価を行ない、以下のような結論を得た。(1)InP基板表面に正方形のメサ(台地状の構造)に線状のメサが結合した構造を加工により形成し、この上に分子線エピタキシ(MBE)法によりInAlAs/InGaAs/InAlAs構造の成長を行った。詳細な構造観察の結果、適切な成長条件下で、正方形メサ上にInGaAs量子ドットが、線状メサ上にInGaAs量子細線が形成され、InAlAs/InGaAs系の材料を用いた選択成長が人工原子構造の作製、およびその多数個連結した素子の作製に関して今後有用であることが示唆された。(2)詳細な光学的測定によって、上記のInGaAs量子細線・量子ドットの結合部分には高さ100meV程度のポテンシャル障壁が存在することが明らかとなった。また、初期加工基板形状・成長条件等を様々に変えて形成した細線・ドット結合構造の構造観察から、ドット・細線・ポテンシャル障壁のサイズが、初期基板形状・成長条件により精密に制御可能であることが明らかとなり、InAlAsを核とする人工原子およびネットワークの形成手法に関する重要な知見を得た。(3)また、格子不整合系の人工原子作製の可能性に関する基礎検討として、GaAs/InAs自己形成量子ドットの形成、および光学的評価を行い、ウェット層とドットのクーロン相互作用が光学的特性に影響を及ぼすことが判明した。平成8年度は、有機金属気相成長(MOVPE)法による選択成長、あるいは微傾斜基板上のMOVPE成長を利用し、人工原子“スーパーアトム"の形成を試みると同時に、その電気的特性の評価を行った。まず、種々のGaAsパターン基板上に選択成長を行うことにより、スーパーアトム・量子ドット構造、およびそれらが結合した構造等の作製を試みた。その結果、複雑な形状を持つパターン基板においても、良好なファセット構造を持つ量子構造が形成可能であることを明らかにした。さらに、スーパーアトムの電子状態を実現するため、GaAs中にn-AlGaAsドープ層を埋め込んだ構造の形成を試みた結果、形状やド-ピング濃度などの最適化が不十分であるものの、比較的良好にAlGaAsドープ層が埋め込み可能であることが明らかとなった。次に、GaAs(001)微傾斜表面上の多段原子ステップを利用した、表面超格子型の電子波干渉素子を作製し、その電気的特性の評価を行った。その結果、ゲート電圧-相互コンダクタンス特性に振動が複数の素子で観測され、特に比較的多段原子ステップの周期性が比較的良い素子においては、それらが周期ポテンシャルの形成に伴う電子波干渉効果であることを確認した。さらに、この電子波干渉素子に対し、電子の横方向閉じ込め導入することにより、スーパーアトムに類似した人工原子が多数連結した素子の試作およびその特性の評価を行った。その結果、素子のゲート電圧-ドレイン電流特性にも大きな振動が現れることを見いだした。
スペースVLBIによる若い電波銀河の研究

本研究の目的は、コンパクトで若い電波銀河のサイズとスペクトルを観測して、進化初期段階にある電波銀河の環境を統計的に調べることである。自由-自由吸収(FEA)という現象を利用して低温・高密度のプラズマの分布を調べるという手法を、スペースVLBIを用いた高い空間分解能の観測に応用した。計18個の若い電波銀河について5つの周波数で観測を行った結果、電波銀河では自由-自由吸収の光学的厚みが二つの電波ローブ方向で比較的対称であるのに対して、クェーサーでは非対称であるという、有意な差が見られた。これは、電波銀河ではジェットの軸が視線に対して垂直に近いのに対して、クェーサーではジェットの軸が視線となす角が小さい、という傾向で説明ができ、Barthel(1989)ApJ,336,606による電波銀河とクェーサーの統一モデルを支持している。この成果については、Kameno et al.(2003),PASAに投稿中である。電波銀河はGHz帯より低い周波数で吸収を受けたようなスペクトルを示すが、これが電波ローブを取り巻くプラズマで発生する自由-自由吸収(FFA)に起因するものであることが分かっていたが、その空間分布などは不明だった。そこで、スペースVLBIやVLBAを用いて若い電波銀河を多周波で観測することによって、FFAの光学的厚みの空間分布を調べ、電子温度や密度,サイズを調べるという手法を考案した。本研究では18個の若い電波銀河について5つの周波数で観測を行った。観測結果について、現在解析を進めている段階である。そのうちNGC1052の観測結果からは、FFAの原因となる低温(10^5K)・高密度(10^4cm^-3)のプラズマが半径0.7pcのトーラス状に中心核を取り巻いているという構造が明らかになった。この結果は、等方的に降着してきた物質が0.7pc付近の領域で回転によって支えられるという力学的な遷移を示唆している。本結果はKameno et al. 2001,PASJ53,169で出版済みである。また、吸収がシンクロトロン自己吸収ではなくFFAによって起こっているということを、偏波観測を多数の若い電波銀河について行うことによって示した。偏波角がスペクトルのピークをまたいでもジャンプしないということを統計的に明らかにしたもので、この結果はMutoh et al. 2002,PASJ54,131に出版済みである。本研究の日的は、コンパクトで若い電波銀河のサイズとスペクトルを観測して、進化初期段階にある電波銀河の環境を統計的に調べることである。自由-自由吸収(FFA)という現象を利用して低温・高密度のプラズマの分布を調べるという手法を、スペースVLBIを用いた高い空間分解能の観測に応用した。
糖尿病ラットにおける糖尿病性神経因性膀胱についての研究

基礎実験の結果からストレプトゾトシン(STZ)の投与量、方法は70mg/kg生理食塩溶液、腹腔内投与とした。ウレタン麻酔(1.5g/kg,SC)下にratを仰臥位とした。膀胱を露出し、一側の尿管を結紮し、他方の尿管に細経カテーテルを挿入し生理食塩水の注入経路とした。経尿道的に3Frマイクロチップトランスデューサを膀胱内におき膀胱内圧を測定した。コントロールrat(12週齢)において、膀胱収縮が誘発される膀胱容量(閾値膀胱容量)は0.3-0.5mlで、その後膀胱内圧の律動的な収縮が認められた。STZ投与8週後の糖尿病rat(12週齢:糖尿病未治療群)では閾値膀胱容量は著しく増加し、またそのあとに出現する律動性収縮の発現頻度は低下傾向を示した。STZ投与とともにプロスタグランヂンE1アナログ300ug/kg/day,p.o.投与群、アルドース還元酵素阻害剤100mg/kg/day,p.o.投与群、プロスタグランヂンE1アナログ300ug+アルドース還元酵素阻害剤100mg/kg/day,p.o.投与群においてSTZ投与後8週における膀胱内圧所見の変化を検討した。プロスタグランヂンE1アナログ、アルドース還元酵素阻害剤投与群においては明らかな変化を認めなかった。糖尿病未治療群と比較し、プロスタグランヂンE1アナログ+アルドース還元酵素阻害剤併用群においては閾値膀胱容量の減少、律動性収縮の回復傾向を認めたが、いずれも有意な差を認めなかった。現在の時点では実験rat数が少なく推計学的検討に充分なデータが得られていないこと、糖尿病の罹病期間が比較的短期であることから、更なる実験データの集積と、長期糖尿病罹患ratにおける検討が必要である。
ミクログリアのイオンチャネルを基盤とした慢性疼痛の新規評価法とその応用による創薬

オピオイドの頻用によって生じる疼痛過敏がミクログリアに発現するBKチャネルに起因する事が明らかとなった。これらのBKチャネルの活性化はμ受容体を介したアラキドン酸合成が促進される事で引き起こされており、直接チャネルを開口していた。BKチャネルの役割を解析した結果、疼痛に重要とされるP2X4受容体の膜輸送への関与が認められた。更にミクログリアでBKチャネルの欠損した動物ではオピオイドの頻用により生じる疼痛過敏は認められなかった。これらの知見によりBKチャネル阻害剤のオピオイドの補助薬としての開発の可能性が期待できる。慢性疼痛時に使用される強力な鎮痛薬であるモルヒネは継続的に使用することにより、逆に鎮痛効果の減弱あるいは疼痛が生じる。この時、脊髄ミクログリアが活性化されているのだが、その制御機構が不明であった。本研究により、モルヒネの作用点であるμ受容体を介して、cytosolic PLA2の発現が亢進することが明らかとなった。これはアラキドン酸を合成するのであるが、ミクログリアに存在するBKチャネルを選択的に活性化した。一方で神経でのBKチャネルには影響がなかった。アラキドン酸カスケードにかかわる種々の阻害剤(NS398、インドメタシン、Zileuton、Baicalein)の存在下ではモルヒネによるミクログリアでのBKチャネルの活性化は有意に抑制された。動物モデルにて脊髄腔内へのBKチャネル阻害剤を投与することで鎮痛耐性あるいは疼痛が著明に抑制された。モルヒネによる鎮痛耐性あるいは疼痛におけるミクログリアのBKチャネルの特異性を検討するため、モルヒネで刺激したミクログリアを脊髄に移植し、その後モルヒネを経日的に動物へ投与した。その結果、正常ミクログリア移植群に比べ、モルヒネ刺激ミクログリア移植群では鎮痛耐性あるいは疼痛がより早期に生じることが明らかとなった。一方、BKチャネル阻害剤存在下でモルヒネ刺激をした場合、前述の現象を遅延した。BKチャネル阻害剤によるミクログリアに対する作用を検討したところ、モルヒネ投与後に発現上昇する炎症性サイトカインであるIL-1bをBKチャネル阻害剤が有意に抑制した。以上の事からミクログリアのBKチャネルがミクログリアの活性化状態のon-offに関わっているのではないかと示唆される。上記の結果により、疼痛だけでなくミクログリアの関与する種々の脳疾患に対してミクログリアBKチャネルへのターゲットが有用性を示すことを示唆する基盤的成果となった。慢性疼痛におけるミクログリアの役割を明らかにする目的でミクログリアと神経のインターラクションを解析検討した。現段階では未だ、互いにどのようなインターラクションを有するのか不明であるため、正常時の状態での検討を行った。ミクログリアは夜間に向けて突起を著しく進展させる事が明らかとなった。これらはミクログリア内に存在する時計遺伝子によって制御されていた。更にこれらはミクログリアに存在するP2Y12受容体の発現を司っていた。興味深いことにP2Y12受容体阻害剤の慢性投与によりミクログリアの突起進展の抑制が認められた。この時、ミクログリアとシナプス部位の接触が著名に抑制された。シナプス部位とミクログリアの接触によりシナプス数およびシナプス活動の減弱が生じたのだが、P2Y12受容体阻害剤により、これらの現象が阻害された。ミクログリアの突起がどのようにしてシナプス部位へと到達するか検討したところミクログリア特異分子であるカテプシンSが細胞外マトリクスを分解していた。さらにはこのカテプシンSはP2Y12受容体と同時に時計遺伝子により制御を受け、シナプス強度の調節を担っていた。以上の結果よりミクログリアに存在する時計遺伝子が神経活動を調節する事が示唆された。慢性疼痛時において、脊髄のみならず大脳皮質においても機能的変化が生じていることが数多く報告されている事から、疼痛時でのミクログリアによる神経回路組み替えが生じている事を示唆する基盤的成果となった。モルヒネに代表されるオピオイドは強力な鎮痛薬として臨床的に使用されている。現在では非ガン性の慢性疼痛においても適用が広がっているが、長期的な投与により副作用及び依存性についての問題が指摘されている。代表的な副作用に薬効が減弱する鎮痛耐性がある。適切な鎮痛効果を得るために投与量の漸増が必要となり、便秘や嘔吐といった副作用のリスクの増大に繋がるため適切なモルヒネの使用法の確立が必要である。これまで、低用量のケタミンがモルヒネ鎮痛耐性を抑制することがケースレポートで報告されているが、そのメカニズムは不明である。我々はケタミンの新たな作用部位としてミクログリアのBKチャネルを報告してきた。そこでモルヒネによる鎮痛耐性がミクログリアBKチャネルに由来しているか検討を行った。モルヒネの連投により生じる鎮痛耐性はBKチャネル阻害剤の髄腔内投与により改善した。

この際、脊髄ミクログリアにおけるBK電流は耐性の抑制程度と相関を示した。またBKチャネル阻害剤によりモルヒネ誘発性痛覚過敏も有意に抑制した。モルヒネで刺激したミクログリアを髄腔内投与したところ鎮痛耐性および痛覚過敏の形成が促進された。これらの現象はBKチャネル阻害剤処置群あるいはBKチャネル欠損ミクログリア投与群では消失した。BKチャネル活性化メカニズムを解析したところ、μ受容体を介したアラキドン酸カスケードにより生じる脂質によりBKチャネルが活性化されていることが明らかとなった。更にBKチャネルの役割を解析した結果、疼痛に重要とされるP2X4受容体の膜輸送への関与が認められた。以上の結果よりミクログリアBKチャネルが鎮痛耐性および痛覚過敏の形成に重要な役割を担う事が明らかとなった。これらの知見によりオピオイドの補助薬としての開発の可能性が期待できる。神経薬理学当初の計画としていた三叉神経痛モデルとは少々動物モデルが異なるものの、当該研究課題であるミクログリアにおけるイオンチャネル解析の面で、疼痛に関与する因子およびそのメカニズムを明らかにすることができた。そのため研究としては順調に成果を出しているものと考える。平成24年度は新規動物の作成ならびにミクログリア機能の異常化の原因解析を計画していたが、ミクログリア機能の解析を行うにあたり正常のミクログリアの理解が必要であった。そのため平成24年度実験計画に先行してミクログリアの新たな機能を捉える事に成功した。当該成果は平成25年度以降に実施するミクログリアとシナプス部位のインターラクションの内容を一部含んでいる。今後遂行する慢性疼痛時におけるミクログリア機能の解明にあたり、正常のミクログリア機能を解明する事は非常に意義のある事である。更に慢性痛時でのミクログリアの時計遺伝子の関与の可能性も示唆する重要な結果となり、研究課題の解明に大きな前進をもたらしたと考える。そのため、多少計画に前後はあるものの、当初計画していたものに比べ、大いなる成果が得られたものと考える。これまでの研究にて大きな疑問点が一点ある。通常、BKチャネルが活動するためには1)細胞内のカルシウム濃度、2)細胞の脱分極が必要である。しかしながら、興味深い事に活性化ミクログリアは細胞内カルシウムfreeの条件にてもBKチャネルを介した電流の活性化を生じる。一方で、正常状態ではこれらは認められない。そこで、これらの反応様式がどこから生じるのかまた、どのように制御されるのか解析を行う。これを解決する方策として、BKチャネルのsplice variantの観点から、電気生理学的に解析する予定である。当該研究成果によりミクログリアの動きがシナプス活動の制御に多大な影響をもたらすことが明らかとなった。更にはこのようなミクログリアの動きが時計遺伝子により制御されている事が明らかとなった。慢性疼痛時にはこのようなミクログリアの動きが破綻する事で神経活動の異常化が生じている可能性が考えられる。そのため、今後は慢性疼痛時におけるミクログリアの動きに着目して検討を進めていく。