hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リプログラミング技術を用いた骨髄異形成症候群の腫瘍内遺伝的・機能的多様性の解明

当初の研究計画に沿って、平成2830年度に下記の進捗があった。2)MDS/sAMLの病態再現:sAML症例由来MDS-iPS細胞から分化した造血前駆細胞では、正常iPS細胞と比較して顆粒球・単球系コロニー形成能の有意な亢進が見られ、免疫不全マウスに生着し致死性のAMLを引き起こした。さらに移植したマウスの骨髄内にpseudopelger核異常など、MDS/sAMLに合致した形態異常の所見が認められた。3)MDS/sAML特異的原因因子の探索:樹立したMDS-iPS細胞のうち、sAML症例由来MDS-iPS細胞の全エキソンシークエンスを行い、FLT3変異を含むいくつかのMDS-iPS特異的遺伝子変異を同定した。平成30年度にはsAML症例由来MDS-iPS由来造血前駆細胞の網羅的遺伝子発現解析を行い、疾患で特異的に変動している遺伝子群を同定した。元の症例の腫瘍内多様性を反映してMDS-iPS細胞にはFLT3変異株とFLT3野生型株が認められた。iPS由来造血前駆細胞をマウスに移植しところ、FLT3変異株でより早期にAML様病態を呈し死亡した。4)新規薬剤スクリーニング:平成30年度にsAML症例由来MDS-iPS細胞から分化した血液細胞株を用いて化合物スクリーニングを行い、細胞増殖を抑制するような化合物をいくつか同定した。今後候補化合物の絞り込みを行う予定である。5)候補因子の機能解析:当該sAML症例においては、MDSからAMLへの進展にFLT3変異の寄与が示唆されたため、FLT3野生型iPS株より誘導した造血前駆細胞に変異型FLT3を遺伝子導入しマウスに移植したところ、白血病化が著明に促進された。当初の研究計画に沿って、平成28年度に下記の進捗があった。2)MDS/sAMLの病態再現:MDS症例由来のMDS-iPS細胞から再分化した造血前駆細胞は、同一患者由来の正常iPS細胞から再分化した造血前駆細胞と比較して、コロニー形成能及び赤血球系分化能の有意な低下が見られた。一方、sAML症例由来のMDS-iPS細胞から再分化した造血前駆細胞では、同一患者由来の正常iPS細胞と比較して、顆粒球・単球系(GM)コロニー形成能の有意な亢進が見られ、免疫不全マウスに生着し致死性のAMLを引き起こした。3)MDS/sAML特異的原因因子の探索:樹立したMDS-iPS細胞のうち、sAML症例由来MDS-iPS細胞と同一患者由来の正常iPS細胞を再誘導して得られた造血前駆細胞分画(CD34+CD38-CD45+Lineage-)をソーティングにより選別して、網羅的遺伝子発現解析を行ったところ、MDS-iPS細胞に特異的な遺伝子発現異常が認められた。MDS/sAML症例の血液単核細胞及びMDS-iPS細胞のゲノムDNAを材料に、同一患者から樹立した正常iPS細胞を対照として全エキソンシークエンスを行い、網羅的に遺伝子変異を探索し、いくつかのMDS-iPS特異的遺伝子変異を同定した。平成28年度は、上記のように1)MDS-iPS細胞の作製、2)MDS/sAMLの病態再現、3)MDS/sAML特異的原因因子の探索、を計画していた。1)と2)についてはほぼ達成できた。3)については、平成28年度中に行う予定であった網羅的DNAメチル化解析などのエピゲノム解析を平成29年度に行い、すでに得られている網羅的遺伝子発現解析及び遺伝子変異解析の結果と組み合わせることで、候補因子の絞り込みを進める。以上のように、当初検討していた実験計画に関しておおむね順調に進展していると考えている。当初の研究計画に沿って、平成29年度に下記の進捗があった。1)MDS-iPS細胞の作製:引き続き、複数のMDS及びMDSから移行したsecondary AML症例(MDS/sAML)患者の末梢血及び骨髄の細胞から、MDS/sAML細胞由来iPS(MDS-iPS)細胞株と正常細胞由来iPS細胞株の樹立を行った。2)MDS/sAMLの病態再現:sAML症例由来のMDS-iPS細胞から分化した造血前駆細胞では、同一患者由来の正常iPS細胞と比較して、顆粒球・単球系コロニー形成能の有意な亢進が見られ、免疫不全マウスに生着し致死性のAMLを引き起こした。さらに移植したマウスの末梢血及び骨髄内に芽球や好中球の過分葉、pseudo-pelger核異常など、MDS/sAMLに合致した形態異常の所見が認められた。3)MDS/sAML特異的原因因子の探索:樹立したMDS-iPS細胞のうち、sAML症例由来MDS-iPS細胞の全エキソンシークエンスを行い、網羅的に遺伝子変異を探索し、いくつかのMDS-iPS特異的遺伝子変異を同定した。元の症例の腫瘍内多様性を反映して、MDS-iPS細胞にはFLT3変異を有する株(FLT3変異株)とFLT3変異を有さない株(FLT3野生型株)が認められた。各々から誘導した造血前駆細胞をマウスに移植したところ、FLT3変異株由来細胞を移植したマウスでは早期にAML様病態を呈し死亡した。4)新規薬剤スクリーニング:分化誘導系としては、血液前駆細胞を効率良く作成できる胚様体形成法を選択した。

さらにスクリーニングの効率を上げるために、血液前駆細胞を大量に得られるよう細胞密度、サイトカインコンビネーションや分化誘導時間などの分化誘導方法の最適化を行った。5)候補因子の機能解析:3)により当該sAML症例においては、MDSからsAMLへの進展にFLT3変異が関わっている可能性が高いと考えられたため、FLT3野生型iPS株より誘導した造血前駆細胞にretrovirus vectorを用いて変異型FLT3を導入しマウスに移植したところ、白血病化が著明に促進された。平成29年度は、上記のように1)MDS-iPS細胞の作製、2)MDS/sAMLの病態再現、3)MDS/sAML特異的原因因子の探索、4)新規薬剤スクリーニング、5)候補因子の機能解析を計画していた。1)、2)、3)についてはほぼ達成できた。4)については、薬剤スクリーニングの効率を上げるために、平成29年度は血液前駆細胞の大量培養・分化誘導法の確立を行った。5)については、iPS細胞技術を用いて腫瘍内多様性に伴う様々な異常クローンの病態解析を行い、3)で同定したMDS-iPS特異的遺伝子変異のうちFLT3変異が当該sAMLの進展に関わる重要な因子の一つであることが確認された。以上のように、当初検討していた実験計画に関しておおむね順調に進展していると考えている。当初の研究計画に沿って、平成2830年度に下記の進捗があった。2)MDS/sAMLの病態再現:sAML症例由来MDS-iPS細胞から分化した造血前駆細胞では、正常iPS細胞と比較して顆粒球・単球系コロニー形成能の有意な亢進が見られ、免疫不全マウスに生着し致死性のAMLを引き起こした。さらに移植したマウスの骨髄内にpseudopelger核異常など、MDS/sAMLに合致した形態異常の所見が認められた。3)MDS/sAML特異的原因因子の探索:樹立したMDS-iPS細胞のうち、sAML症例由来MDS-iPS細胞の全エキソンシークエンスを行い、FLT3変異を含むいくつかのMDS-iPS特異的遺伝子変異を同定した。平成30年度にはsAML症例由来MDS-iPS由来造血前駆細胞の網羅的遺伝子発現解析を行い、疾患で特異的に変動している遺伝子群を同定した。元の症例の腫瘍内多様性を反映してMDS-iPS細胞にはFLT3変異株とFLT3野生型株が認められた。iPS由来造血前駆細胞をマウスに移植しところ、FLT3変異株でより早期にAML様病態を呈し死亡した。4)新規薬剤スクリーニング:平成30年度にsAML症例由来MDS-iPS細胞から分化した血液細胞株を用いて化合物スクリーニングを行い、細胞増殖を抑制するような化合物をいくつか同定した。今後候補化合物の絞り込みを行う予定である。5)候補因子の機能解析:当該sAML症例においては、MDSからAMLへの進展にFLT3変異の寄与が示唆されたため、FLT3野生型iPS株より誘導した造血前駆細胞に変異型FLT3を遺伝子導入しマウスに移植したところ、白血病化が著明に促進された。上記1)、2)、3)の課題は引き続いて行う。4)新規薬剤スクリーニング利用可能な化合物を、上記2)のMDS/sAML病態再現系でスクリーニングして、分化異常の改善や異常クローンの増殖抑制などの効果を認めるような薬剤/化合物の選定を目指す。
植物細胞におけるストレス化合物の生成誘導に関する研究

ニンジンのファイトアレキシンは6ーメトキシメレイン(6MM)であるが、從来このようなイソクマリン化合物の生成経路は明かでなかった。われわれはニンジン培養細胞の無細胞抽出物を用い、この物貭のin vitroでの生合成に成功した。反応はアセチルCoAとマロニルCoAの縮合に始り、中間産物として6ーヒドロキシメレイン(6HM)を生じた。6HMはさらに特異的なメチル化酵素によって6MMに変換される。これらの反応に関係する酵素の活性は健全なニンジンには認められず、微生物の感染やオリゴウロン酸をエリシタ-として与えたときのみ誘導された。エリシタ-活性はエチレンや重金属イオンにも認められた。6HMの生成反応には補酵素としてNADPHを必要とする。NADHはNADPHの40%の活性しか示さない。NADPHを添加せずに反応させると異状代謝物としてtriacetic acid lactoneを生した。この物貭はアセチルCoAにマロニルCoAが2分子縮合して出来たものと考えられ、還元反応がこの段階でおこっていることを示している。ニンジンではこと外に微生物感染等のストレスに対応してキチナ-ゼの誘導的生成がみられる。この場合は糸状菌の菌糸壁の外、培養滬液にもエリシタ-活性が認められたが、エリシタ-の種類によって誘導されるキチナ-ゼの分子種が異り、ゲル滬過によって分子サイズの異る多くのイソ酵素が分離された。糸状菌の菌体成分によって誘導されるキチナ-ゼはすべてendo型であったが、エチレンで誘導される酵素にはexo型のものも含まれていた。タバコ等ではこの外にβー1,3ーグルカナ-ゼの生成誘導が報告されている。ニンジンのグルカナ-ゼは細胞壁酵素で、抽出、精製して電気泳動的に単一バンドを示す2種のイソ酵素を得た。どちらも分子量約63kDの糖蛋白で、ラミナリンに対しexoーグルカナ-ゼとして作用した。しかし、タバコ等と異り本酵素はconstitutiveで、各種のストレスによっても影響されなかった。1.ニンジン細胞は細胞壁由来のオリゴウロン酸やエチレン等をエリシター(誘導物質)として、そのファイトアレキシンである、6-メトキシメレインを生成するがその生合成経路は明らかでなかった。われわれは予めエリシターで処理したニンジンの根の組織片より無細胞抽出液を調整し、それにアセチルCoAとマロニルCoAを与えて6-ヒドロキシメレインを生成させることに成功した。この反応はポリケタイド経路を通るものと考えられ、NADPHが補酵素として必要で、生成物はニンジンのO-メチル転移酵素の作用で最終産物である6-メトキシメレインに変換された。両酵素とも正常なニンジンには存在せず。適当なエリシターで前処理した場合にのみ活性が現れた。酵素の性質等についてはなお研究を継続して検討中である。2.ニンジンでは菌の感染等のストレスを受けた時、ファイトアレキシンの外に各種のフェノール性化合物の生成が促進される。この場合、まずニンジン細胞にキチナーゼが誘導され、その作用によってエリシターとなるキチンオリゴマーが糸状菌の細胞壁から遊離される。ニンジンの培養細胞は通常ほとんどキチナーゼ活性を示さないがエチレンまたはその前駆物質を与えると急速に活性上昇がおこった。

酵素の大部分は細胞外に放出されるので、培養液中の酵素をゲル濾過法で精製したところ活性は4つの区分に分れた。そのうちの2種の酵素はエキソ型で、キチンを分解してキトビオースのみを生成した。それに対し、他の2種はエンド型の酵素でいろいろな大きさのキチンオリゴマーを生じた。ニンジンに誘導されるキチナーゼはストレスの種類によっても異り、糸状菌の細胞壁や培養濾液等を与えた場合に生成されるキチナーゼはすべてエンド型でエキソキチナーゼは誘導されなかった。1.ニンジン細胞は適当な誘導物質(エリシタ-)が与えられたときにはイソクマリン骨格を持つファイトアレキシン,6-メトキシメレイン(6MM)を生成する。植物でのイソクマリン生成系は明らかでなかったが,エチレンまたはオリゴウロン酸でエリシタ-処理をしたニンジンの根の無細胞抽出物はアセチルCoAとマロニルCoAよりポリケタイドル-トを経て6-ヒドロキシメレイン(6HM)を生成し,それは更にメチル化されて6MMとなることを明らかにした。6HMの生成反応にはNADPHを必要とするが,部分精製した酵素を用い,この補酵素を与えない時に生ずる異常代謝物を調べた所,アセチルCoAと2分子のマロニルCoAが縮合した所で反応が停止していることがわかった。つまり6HMの3,4位の二重結合のNADPHによる還元はポリケタイド鎖の伸長の途中でおこることが確かめられた。2.ニンジンは菌の感染の際6MMの外にキチナ-ゼ等を誘導生成する。ニンジンの培養細胞に糸状菌chaetomium globosumを接種し,生成したキチナ-ゼをゲル濾過法で分析すると、分子サイズの異なる少くとも7種のイソ酵素が見出された。これに対し同菌の培養濾液をエリシタ-として与えた場合は5種類の酵素が生成された。酵素反応の生産物を分析した結果からこれらの酵素はいずれもendo-型酵素と考えられる。菌の感染によってニンジンはエチレンを生じ,このエチレンは既報のようにエリシタ-となってキチナ-ゼを誘導する。しかし,そのキチナ-ゼの性質は糸状菌が誘導する酵素と明らかに異り,両者の作用は同一でないことが明らかになった。タバコ等では菌感染によってβ-1,3-グルカナ-ゼが誘導される。ニンジン細胞のβ-1,3-グルカナ-ゼは主として細胞壁に存在することがわかったが菌の感染によってほとんど影響をうけなかった。なお,同酵素はマンノ-スを含む糖鎖を有する糖蛋白であった。ニンジン細胞は微生物の感染等のストレスによってイソクマリン骨格を持つファイトアレキシン,6ーメトキシメレイン(6MM)を生成する。ニンジンの場合、その誘導物貭(エリシタ-)はオリゴウロン酸であるがエチレンや重金属イオンも同様の効果を示した。6MMは酢酸ーマロン酸経路で合成されることがわかったが、その中間産物として6ーヒドロキシメレイン(6HM)の生成が認められた。この6HM合成酵素を部分精製し、各種の物理化学的性貭を調べた。至適PHは8.5で、マロニルCoAに関するみかけ上のKm値は6.6μMであった。また、各種の阻害剤の作用を調べ、酵素の性貭を検討した。βー1,3ーグルカナ-ゼは各種の植物でストレスに対応して生成することが知られている。ニンジンのβー1,3ーグルカナ-ゼは主として細胞壁に局在する糖たん白貭であった。
制震ダンパーによる動的挙動が複雑な鋼橋の耐震補強に関する研究

大地震時に複雑な動的挙動を示す鋼橋(アーチ橋,トラス橋など)の耐震性向上あるいは耐震補強に資するために,大地震3回程度に耐えられ,ライフサイクルに渡って取り替え不要な鋼およびアルミニウム合金製高機能制震ダンパーの開発を行った.さらに,かかる制震ダンパーをアーチ橋,トラス橋等に設置したときの制震効果に関する実験的,解析的研究を行い,大きな効果があることを実証した.大地震後短期間に機能回復が可能な鋼橋の耐震補強法を開発するためにライフサイクルに渡って取り替え不要な高機能制震ダンパーを開発する。大地震時に複雑な動的挙動を示す鋼橋(アーチ橋,トラス橋など)の耐震性向上あるいは耐震補強に資するために,大地震3回程度に耐えられ,ライフサイクルに渡って取り替え不要な鋼およびアルミニウム合金製高機能制震ダンパーの開発を行った.さらに,かかる制震ダンパーをアーチ橋,トラス橋等に設置したときの制震効果に関する実験的,解析的研究を行い,大きな効果があることを実証した.本研究は,地震工ネルギーを吸収・消散する部材(制震ダンパー)を橋梁構造物内部に設置し,大地震による主構造の塑性変形を副次的な範囲に収め,損傷した部材を地震終了後に速やかに取り替える,あるいは橋梁のライフサイクルに渡って取り替え不要な制震ダンパーを設置することにより修復性向上をねらう,即ち鋼橋の制震構造化による新しい耐震補強法を開発しようとするものである.対象橋梁は,動的挙動が複雑な連続橋,トラス橋,アーチ橋,斜張橋,吊橋とする.研究の目標として,中央防災会議:首都直下地震大綱(平成17年9月27日)が推進する「1日以内に緊急車両の通行機能を確保する橋梁の耐震化」実現を目指す.本年度は,橋梁のライフサイクル(約100年)に渡って取り替え不要な制震ダンパー(高機能制震ダンパーと称する)として,座屈拘束ブレース(BRB)の開発を目的とした実験的研究を行った.すなわち,アーチ橋を対象とした数値計算から大地震3回に耐えられる制震ダンパーを高機能制震ダンパーとみなし,BRBに要求される変形性能(軸ひずみ)は3%,累積塑性変形は70%とし,それらの性能を満たすBRBの開発研究を行った.そのために,ブレース材として100x10mmの平型鋼,拘束材として種々のウェブ高さの5種類のT形鋼を持つBRB供試体を製作して繰り返し引張り-圧縮荷重下での性能実験を行った.その結果,BRBが全体座屈しないように設計した供試体は所要の性能を満たすという重要な結果を得た.これによって,高機能座屈拘束ブレースの設計が可能となり,実用化への目処が立った.本研究は,地震エネルギーを吸収・消散する部材(制震ダンパー)を橋梁構造物内部に設置し,大地震による主構造の塑性変形を副次的な範囲に収め,損傷した部材を地震終了後に速やかに取り替える,あるいは橋梁のライフサイクルに渡って取り替え不要な制震ダンパーを設置することにより修復性向上をねらう,即ち鋼橋の制震構造化による新しい耐震補強法を開発しようとするものである.対象橋梁は,動的挙動が複雑な連続橋,トラス橋,アーチ橋,斜張橋,吊橋とする.研究の目標として,中央防災会議:首都直下地震大綱(平成17年9月27日)が推進する「1日以内に緊急車両の通行機能を確保する橋梁の耐震化」実現を目指す.本年度は,橋梁のライフサイクル(約100年)に渡って取り替え不要な制震ダンパー(高機能制震ダンパーと称する)として,せん断パネルダンパー(SPD)の開発を目的とした実験的研究を行った.すなわち,アーチ橋を対象とした数値計算から大地震3回に耐えられる制震ダンパーを高機能制震ダンパーとみなし,SPDに要求される変形性能(せん断ひずみ)は12%,累積塑性変形は280%とし,それらの性能を満たすSPDの開発研究を行った.また,鋼橋の崩壊に至るまでの進行性破壊の追跡法に関する新しい手法を開発し,この手法のトラス橋への適用に関する研究を行った.1.軽量化した座屈拘束ブレース(BRB)を試作し,変動変位および定振幅引張一圧縮試験を実施した.目的は,(1)高機能制震ダンパーの目標性能(限界軸ひずみ=3%,限界累積塑性ひずみ70%)が確保出来るかどうか,(2)低サイクル疲労強度を求め,累積塑性ひずみによる低サイクル疲労照査の妥当性を検証する,(3)研究代表者らによる修正2曲面モデルを用いた複合非線形準静的解析による実験結果の検証を行う,ことである.得られた知見は次のようである.1)全体座屈が生じないBRB供試体は高機能BRBの目標性能を満足する.2)誘導した全体座屈防止条件式で,3.0の安全係数を確保することにより全体座屈は防止できる.3)累積塑性ひずみによる低サイクル疲労照査は安全側にある.4)数値解析手法によりBRBの挙動を精度よく模擬できる.上の研究は,新設橋梁,あるいは既設橋梁のブレース材の取り替え用BRBを対象としているが,既設ブレース材に拘束材を被せ,BRB化する研究も進行している.2.断層モデルにより地震動を発生させる手法により,サイトの影響を取り入れた地震動を用いて,震源断層近傍における上路式鋼トラス橋の進行性破壊のシミュレーションを行った.これは,広域的な地震応答解析による鋼橋の安全性照査手法の開発の基礎となる.1.アルミニウム合金制震ダンパーの開発研究A5083P-O

アルミニウム合金を取り上げ,繰り返し弾塑性構成則の開発,およびBRBの性能実験を実施した.得られた主要な知見は次ぎのようである.1)繰り返し引張-圧縮試験より,鋼材の弾塑性挙動との相違点を明らかにし,アルミニウム合金用構成則を開発した.2)鋼製BRBで用いた全体座屈防止条件式(安全係数〓3.0)はアルミニウムBRBにも適用できる.3)全体座屈が生じないBRBは目標性能に達する前に端部リブ溶接止端部の低サイクル疲労により破断した.これは,アルミニウム合金はひずみ硬化が大きく,繰り返し載荷により素材の引張強度近くに達してしまうことによる.BRBの地震時応答ひずみが2%以内で,レベル2地震1回程度に対して耐えうる性能は十分保持しているので,配置場所を限定することにより実構造物に使用可能である.2.制震ダンパーを付与したトラス構造の耐震実験ガセットを介して高力ボルトで接合された5体の鋼トラス構造模型に,繰り返し水平荷重が作用する状態で実験を行い,どのような部材・部位の順に破壊が進行していくかを調べた.パラメータとしては,斜材断面(3種類で,1体は座屈拘束ブレース),鉛直荷重の大きさ,および載荷パターンである.次に,実験トラス構造を適切にモデル化し,初期横荷重を与えて繰り返し弾塑性有限変位解析を実施して実験結果を再現出来るかを調べたところ,妥当な結果が得られている.
網膜電気刺激による神経保護の臨床応用

(1)網膜色素変性モデル動物に対する、経角膜電気刺激の神経保護効果。経角膜電気刺激が視細胞に対して神経保護効果があるかどうか、遺伝的に視細胞が変性するRCSラットを用いて検討した。網膜電位図(ERG)を用いて、電気生理学的に検討したところ、生後3週から1週間に1回計4回電気刺激を行った群の網膜は、電気刺激していない群の網膜に比べて、光に対する反応が大きく、網膜機能の低下が遅延していた。また、視細胞の核が存在する外顆粒層(ONL)の厚みを電気刺激群と非電気刺激群で比較した結果、電気刺激群の網膜のONL厚は、有意に厚かった。以上の結果から、経角膜電気刺激は視細胞に対しても神経保護効果があることがわかった。(2)視神経症の症例に対する経角膜電気刺激の臨床研究。経角膜電気刺激治療を行った、虚血性視神経症12例13眼、外傷性視神経症7例7眼、視神経萎縮群8例8眼に対して、擬似光覚(phosphene)閾値、電気刺激に対する瞳孔反応の起こる閾値電流量(縮瞳閾値)、視野の面積(V/4)および視力の関係を検討した。その結果、中心部におよぶphosphene閾値は視力と相関し、周辺および中心phosphene閾値は縮瞳閾値と相関した。周辺phosphene閾値は視野の面積と相関した。また、視力の改善と中心phosphene閾値は相関した。これらの事実から、視力には中心phosphene閾値に反映される中心部の網膜機能が関係し、視野の広さには、周辺phosphene閾値に反映される周辺部の網膜の機能が反映されることを示された。また、他覚的な指標として、縮瞳閾値はphosphene閾値と相関することから、自覚的応答が不明確な場合、瞳孔反応検査は有用と考えられた。当該研究により、網膜電気刺激による神経保護の基本的mechanismが解明され、Invest OphthalVis Sciに受理された。また、経角膜電気刺激の臨床応用が開始され、一部の症例で有効性が確認された。以下各論1.経角膜電気刺激による網膜神経節細胞の神経保護の分子機構:経角膜電気刺激により、軸索切断された網膜神経節細胞の生存率が向上した。免疫組織化学による検討で、ミュラー細胞の内境界膜側に限局しているIGF-1が、電気刺激により徐々に網膜内層に拡散していく像が示された。以上の結果から、電気刺激によりIGF-1のミュラー細胞からの産生が増強し、網膜神経節細胞の細胞死が抑制されることが示唆された。2.視神経症の症例に対する経角膜電気刺激の臨床研究:非動脈炎性虚血性視神経症(NAION)、視神経管骨折(TON)の症例に対して、コンタクトレンズ型電極を用いて経角膜電気刺激を行った。視力は、刺激3ヶ月後にNAION2眼(67%)、TON4眼(80%)で改善が見られた。軽度の表層性角膜症以外に合併症は見られなかったことから、経角膜電気刺激は安全で、症例によっては視力回復に有効であることが示された。3.網膜色素変性の動物モデルに対する経角膜電気刺激:網膜色素変性のモデル動物であるRCSラットに対して、経角膜電気刺激を行い、視細胞の変性に対する影響を調べた。

生後3週より週1回ずつ経角膜電気刺激を行った群では、対照群と比較して、網膜の内顆粒層の厚みは、7週目で有意に減少が軽度であった。また網膜電図においても、7週目でSTR(暗所閾値反応)が、刺激群において有意に保たれていることが示された。これらの結果から、経角膜電気刺激は、神経節細胞のみでなく、視細胞の障害に対しても、細胞死を抑制する効果があることが示された。(1)網膜色素変性モデル動物に対する、経角膜電気刺激の神経保護効果。経角膜電気刺激が視細胞に対して神経保護効果があるかどうか、遺伝的に視細胞が変性するRCSラットを用いて検討した。網膜電位図(ERG)を用いて、電気生理学的に検討したところ、生後3週から1週間に1回計4回電気刺激を行った群の網膜は、電気刺激していない群の網膜に比べて、光に対する反応が大きく、網膜機能の低下が遅延していた。また、視細胞の核が存在する外顆粒層(ONL)の厚みを電気刺激群と非電気刺激群で比較した結果、電気刺激群の網膜のONL厚は、有意に厚かった。以上の結果から、経角膜電気刺激は視細胞に対しても神経保護効果があることがわかった。(2)視神経症の症例に対する経角膜電気刺激の臨床研究。経角膜電気刺激治療を行った、虚血性視神経症12例13眼、外傷性視神経症7例7眼、視神経萎縮群8例8眼に対して、擬似光覚(phosphene)閾値、電気刺激に対する瞳孔反応の起こる閾値電流量(縮瞳閾値)、視野の面積(V/4)および視力の関係を検討した。その結果、中心部におよぶphosphene閾値は視力と相関し、周辺および中心phosphene閾値は縮瞳閾値と相関した。周辺phosphene閾値は視野の面積と相関した。また、視力の改善と中心phosphene閾値は相関した。これらの事実から、視力には中心phosphene閾値に反映される中心部の網膜機能が関係し、視野の広さには、周辺phosphene閾値に反映される周辺部の網膜の機能が反映されることを示された。また、他覚的な指標として、縮瞳閾値はphosphene閾値と相関することから、自覚的応答が不明確な場合、瞳孔反応検査は有用と考えられた。
シアストレス作動性新規低分子量G蛋白による血管内皮バリア機能強化作用機構の解明

私共は、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)におけるShear Stress応答遺伝子群の中で、Rhoに相同性を持つ新規遺伝子RECS28に着目して、まず全長cloningとGTPγS結合実験からRECS28はG蛋白質であると証明した。さらに変異導入によりdominant active(DA)、negative(DN)を作成、GFP蛍光標識したplasmidsを構築した。また抗ヒトRECS28特異的ポリクローナル抗体を作製し、RECS28野生型を一過性発現させたコントロール細胞で、抗体がRECS28を認識できることを確認した。(1)血管内皮barrier機能:DA、DNを一過性発現させたHUVECsをFACSで回収、単層培養した。DextranをFITC標識してHUVECsを通過させ、通過量を定量し、内皮barrier機能の検定とした。この際、生理的透過性亢進因子であるVEGFやTPA刺激下でのDextran通過量も定量した。その結果、DNはbarrier機能を低下、DAはbarrier機能を増強させた。以上から、RECS28は細胞骨格再編成を通して細胞間接着装置と連動し、血管内皮barrier透過機構を制御し抗動脈硬化に作用することが示唆された。これらの成果について現在論文投稿中である。
乳酸菌由来抗菌ペプチドエンテロシンAの活性発現に関与する糖鎖構造の解析

乳酸菌の中には、近縁種に抗菌活性を示すペプチド(バクテリオシン)を生産するものの存在が知られている。我々の研究室では、乳酸菌Enterococcus faeciumN15株を糠床より分離しており、それが生産するバクテリオシンはアミラーゼ処理によって失活するので、糖鎖が活性に関与していることが考えられた。また、本菌はバクテリオシン生合成遺伝子entAを有していることがわかっていることから、本研究ではバクテリオシンEntAをN15株において発現・精製し、その解析を行うことを目的とした。entA遺伝子とその上流部分とを含む断片をPCRにより取得し、大腸菌と乳酸菌とのシャトルベクターに挿入した発現ベクターを構築した。それをN15株にエレクトロポレーションを用いて導入し発現を試みた。発現が検出できなかったことから、乳酸菌で強力に発現することが知られているP32プロモーター下での発現を試みるため、P32プロモーター配列をPCRで増幅し、その下流にentA遺伝子を連結させた。それをシャトルベクターに挿入した強力な発現ベクターを構築後、N15株に導入するべくエレクトロポレーションを行った。一方、修飾されていないEntAタンパク質の特性を調べるため、大腸菌において発現させた。得られたタンパク質について熱耐性、溶液pHを変化させたことによる影響を調べたところ活性を保持しており、N15株から粗精製したエンテロシンと同様な特性を有していたが、α-アミラーゼ処理をしても活性を保持している点においては異なっていた。この結果より、N15株より粗精製しているエンテロシンと、entA遺伝子産物とは異なるタンパク質である可能性が考えられた。発酵食品に由来する乳酸菌は長年人が摂取してきたことから安全である、つまりGRAS(Generally Regarded As Safe)と位置づけられており、その菌が生産するバクテリオシンは食品保存料としての応用が期待されている。当研究室では、乳酸菌Enterococcus faecium N15株を糠床より分離しており、それが生産するバクテリオシンはアミラーゼ処理によって失活することから、糖鎖が活性に関与していることが考えられた。本研究では、糖鎖を有するバクテリオシンを精製し、その解析を行うことを目的とした。糖鎖を有するバクテリオシンの簡易精製を行うために、既にN15株からクローニングしているバクテリオシン生合成遺伝子を利用した発現系の構築を試みた。バクテリオシンのC末端にヒスチジンタグを結合させたタンパク質をコードするDNA断片をPCR法により増幅後、pGEM-Tベクターに挿入し、プラスミドpKU202を得た。次に、pKU202と乳酸菌Lactococcus lactis由来のプラスミドpIL253をSmaIサイトを使って結合させ、大腸菌と乳酸菌間のシャトル発現ベクターpKU205を構築した。これをエレクトロポレーション法によりE.faecium N15株に導入し、E.faecium N15株の形質転換体を得ることができた。我々の研究室では、乳酸菌Enterococcus faecium N15株を糠床より分離しており、それが生産するバクテリオシンはアミラーゼ処理によって失活するので、糖鎖が活性に関与していることが考えられた。

発現が検出できなかったことから、乳酸菌で強力に発現することが知られているP32プロモーター下での発現を試みるため、P32プロモーター配列をPCRで増幅し、その下流にentA遺伝子を連結させた。それをシャトルベクターに挿入した強力な発現ベクターを構築後、N15株に導入するべくエレクトロポレーションを行った。一方、修飾されていないEntAタンパク質の特性を調べるため、大腸菌において発現させた。得られたタンパク質について熱耐性、溶液pHを変化させたことによる影響を調べたところ活性を保持しており、N15株から粗精製したエンテロシンと同様な特性を有していたが、α-アミラーゼ処理をしても活性を保持している点においては異なっていた。この結果より、N15株より粗精製しているエンテロシンとentA遺伝子産物とは異なるタンパク質である可能性が考えられた。
小学校におけるICT音楽学習環境の整備と『21世紀型音楽室』構想

本研究は、小学校音楽室のICT化を目指す研究であり、音楽室のデジタル環境をハード/ソフト両面で示すものである。具体的には、パッド型電子打楽器やタブレットPC(音楽アプリ)を活用した合奏、ネット上の動画コンテンツを使った指導を提案し、また、リコーダー学習のためのデジタル教材による実践を行った。さらに、指導者用デジタル教科書の内容分析および問題点の抽出も実施した。特に、リコーダーの学習は、“児童一人1台端末"を視野に入れた、日本で初めての音楽科「反転学習」事例となり、今後のデジタル教材開発に示唆を与えるものである。本研究の目的は、現在、最も「情報化」が進まない教科である音楽科において、デジタル音楽教科書とICT機器を組み合わせたデジタル学習環境の整備、および『21世紀型音楽室』の構築を実現することである。初年度の平成26年度には、音楽科でICT化が進まない原因の調査(文献)と、ICT(無線LAN、タブレットPC、電子機器、音楽系ソフトウェア等)を活用した「音楽インフォーマルラーニング」実践を行った。実践発表は、平成26年7月に、「ICT Music Session Vol.1」として開催し、音楽アプリの活用性、ロイロノートを使用した音楽学習のプレゼンテーション、遠隔レッスン、電子打楽器・スマートフォンによる演奏を通じたその教育的可能性の提示を行った。聴取メディアの変化、ポップス教材や構成主義学習理論等の、「音楽インフォーマルラーニング」の実践と密着に関連する動向把握にもつとめた。また、平成27年4月の発売に先行して公開された、小学校版指導用デジタル音楽教科書サンプル版の分析を行い、デジタル教科書の本質的な強みを生かしたコンテンツとはどのようなものであるか、CD等の既存メディア、教育クラウド等との望ましい併存の在り方について探った。『21世紀型音楽室』構築の第一歩として、“児童一人一台端末"環境にある東京都の小学校において、教員のリコーダー模範演奏映像を小学校5年生全員のタブレットに入れて家庭学習を促し、教育効果を図る実験をした。タブレットPCによる、視覚情報と聴覚情報を一体化させた学びであり、音楽科における「反転授業」といえるこの実験については、平成27年夏から秋にかけ学会で発表するために分析・考察中である。本研究の目的は、全教科のうち最も「情報化」が進んでいないとされる音楽科(小学校)において、デジタル音楽教科書とICT機器を組み合わせたデジタル学習環境の整備、および『21世紀型音楽室』の構築を実現することである。2年目の平成27年度には、前年度に引き続き、ICT(タブレットPC、電子楽器、音楽系アプリ、YouTube等)を活用した「音楽インフォーマルラーニング」実践を行うとともに、平成27年春に発売された小学校版指導者用デジタル音楽教科書(2社、教育芸術社・教育出版)のコンテンツ分析をした。また、『21世紀型音楽室』構築の足がかりとして、前年度に“児童一人1台端末"環境にある東京都の公立小学校の5年生児童に対して実施した「リコーダー演奏反転学習」実践結果を分析し、反転学習の効果について口頭発表を行った。その後、論文にまとめた(2016年5月4日現在、修正条件付採択および投稿中)。このリコーダー実践は、日本で初めての音楽科反転学習事例となった。実践の成果発表としては、2015年7月に、子どもたちによる電子楽器とiPad(音楽アプリ=未就学児童が担当)演奏を行った(神楽坂セッションハウス)。また、。2016年1月には、「ICT Music Session Vol.2」(早稲田大学法学部)を開催し、電子打楽器、電子鍵盤楽器を使ったアンサンブル、ウェブページによる演奏発表、YouTube、ニコニコ動画を活用したレッスン、上記のリコーダー実践などを報告した。以上の他に、SNS、アクティブラーニング、学習者用デジタル教科書に関する動向把握にもつとめると同時に、デジタル教科書の本質的な強みはどこにあるのかを考えつつ、紙の教科書、CD、DVD等の既存メディアとデジタル教材や教育クラウドとの望ましい共存について考察を深めている。1.平成27年度に実施予定だった項目の中で、当初の計画どおりに進まなかったのは、ICTを活用した「音楽インフォーマルラーニング」実践の蓄積であった。これは2015年9月に工事業者の加害によって実践場所のひとつが浸水し、電子楽器が使用不可となったことに原因がある。2.小学校版指導者用デジタル音楽教科書の分析については、教科書会社の協力により、当初の計画より順調に進行した。3.タブレットPCを活用した実践として、今後さまざまに応用が可能である「リコーダー演奏反転学習」については、詳細な分析を行うことができたが、さらに厳密な条件設定下での実践を行う小学校がみつからなかった。最終年度である平成28年度には是非実現したい。本研究の目的は、全教科のうち最も「情報化」が進んでいないとされる音楽科(小学校)において、デジタル教科書とICT機器を導入したデジタル学習環境の整備、および『21世紀型音楽室』の構築を実現することである。最終年度の平成28年度には、過年度に引き続き、音楽科におけるICT活用の動向把握をするとともに、無線LAN、タブレットPC、電子楽器、音楽系アプリ、YouTube等を活用した「音楽インフォーマルラーニング」実践を行った。また、小学校指導者用デジタル音楽教科書に対する改善提案を行い、学習者用デジタル音楽教科書に向けた研究として、歌唱制作アプリの創作教材としての可能性、授業場面での活用について探った。このように、デジタル音楽教材の研究は予想以上に進んだ。

過年度より持ち越していた“児童一人1台端末"環境における「リコーダー演奏反転(家庭)学習」実践については、2つの学術雑誌に掲載され、音楽科での反転(家庭)学習教材の活用へ先鞭をつけたが、採択時期が遅れたため、さらに厳密な条件設定下での(家庭)学習実践を実現することはできなかった。実践の成果発表としては、楽器演奏と映像コンテンツを組み合わせた実演(2016年7月に神楽坂セッションハウス、2017年2月に北野保育園)等を行い、ICT Music Sessionウェブページにて研究成果を随時公表している。従来の音楽科の資産と、電子楽器/機器・指導者用デジタル教科書・デジタル教材・クラウド等を共存させる『21世紀型音楽室』構想は、ハード面のみならず、理念としても明確になった。本研究は、小学校音楽室のICT化を目指す研究であり、音楽室のデジタル環境をハード/ソフト両面で示すものである。具体的には、パッド型電子打楽器やタブレットPC(音楽アプリ)を活用した合奏、ネット上の動画コンテンツを使った指導を提案し、また、リコーダー学習のためのデジタル教材による実践を行った。さらに、指導者用デジタル教科書の内容分析および問題点の抽出も実施した。特に、リコーダーの学習は、“児童一人1台端末"を視野に入れた、日本で初めての音楽科「反転学習」事例となり、今後のデジタル教材開発に示唆を与えるものである。1.平成26年度に実施予定だった項目の中で、実現できなかったのは、小学校教員へのヒヤリング調査であった。これは、小学校音楽科においてICT活用が進まない原因を把握することを目的とするものであるが、諸条件が整わなかった。2.他方、予定より進んだことは、小学校版指導用デジタル音楽教科書の分析、および実際の小学校現場での実践であった。3. ICTを活用した「音楽インフォーマルラーニング」実践については、概ね予定通りであるが、音楽アプリの教育的検証に関しては、音楽(教育)関係アプリが多く発売され、“玉石混交"の状態であること、かつ、音楽教育に有益かどうかを検証するマンパワーが不足していることが原因となり、少々難航している。どのような検証システムを作っていくかが課題となっている。1.研究自体は比較的順調に進んでいるので、大幅な研究計画の修正は必要ない。2.「音楽インフォーマルラーニング」の実践、厳密な条件設定下での「リコーダー演奏反転学習」は平成28年度に必ず行いたい。3.『21世紀型音楽室』構築については、多くの小学校が実践可能な内容を提案したいと考えている。(1)2016年1月24日早稲田大学法学部8号館B107教室(2)(3)2016年7月24日神楽坂セッションハウス(4)はヤマハ株式会社の支援を受けた。(5)「小学校版音楽デジタル教科書の内容分析と改良に向けた提案」は研究代表者の所属研究機関による研究成果発表であるが、本研究と関連するために掲載している。音楽教育・教育工学1.研究自体は比較的順調に進んでおり、大幅な研究計画の修正は必要ないと考える。2.「21世紀型音楽室」構想の提案に関して、できる限り多くの実践を積み重ねたいと思っている。
都市直下型活断層の再評価と都市震災危険度の再検討

この研究では,特にフィリピン地震(1990年7月16日,M=7.8)を特にとりあげ詳細な調査・研究を行た。フィリピン地震は自然災害研究の上で驚くべき資料を残した。断層は長さ150Km,ずれの量5mにおよぶ大規模な地震であったが,断層沿いの構造物にはほとんど被害を与えず,断層から30ー50Kmも離れたバギオ市やアゴウ市に甚大な被害を与えた。これらの都市の地盤条件は比較的良く,1989年ロマプリエタ地震の被害とは異なり,地盤条件は大きな要因ではなかった。断層,地盤条件,被害が従来の知識から解明できない点があった。この謎を解くために,この研究では,余震観測と強震動解析を行い,副次断層が被災都市直下に存在していたことをつきとめた。フィリピン地震の際に,本断層はそれほどの強震動を引き起こさず,都市直下に現れた副次断層が典型的な直下型の被害を与えたと判断できる。この研究では,次の3点に注目してフィリピン地震の活断層・震源過程・強震動の再検討も行った。(1)余震分布の再検討,(2)断層と強震動の関連,(3)被害と強震動との関連,(4)活断層分布と強震動との関連。この結果,以下のような成果が得られた。(1)大断層の周辺には数多くの副次断層が分布する可能性が高い。(2)主断層と副次断層では強震動発生様式が異なる可能性が高い。(3)強震動の発生様式は活断層の形状に密接に結びついている可能性が高い。上記の成果は日本の主要活断層の研究にも適用できるものと考えられ,得られた成果は貴重である。
膵管胆道合流異常における胆道癌発生に関する実験的研究

本研究では共通管の著しく長いハムスターを用いBOPを投与し胆道癌の発癌を検索し、これにヒト膵液を胆嚢内に注入することにより胆道癌がより誘発されるかを検討した。更に胆嚢内にヒト膵液の代わりに各種膵酵素を注入し胆道系を検索した。又BOPの投与方法を直接胆嚢内に注入することにより胆道系を検索した。これら胆道上皮の変化についてPCNA,Ki67及びP53蛋白、Kras蛋白、Erb-2蛋白についてその癌遺伝子蛋白の発現を検討した。1.BOP+ヒト膵液投与群はBOP単独群に比し有意に高い胆道癌、腺腫の発生をみた。2.ヒト膵液のみの投与では癌腫は発現しなかったが肝外胆道系に過形成の高い発生をみた。3.ヒト膵液の代わりに単一の膵酵素投与群では癌腫の発生はなかったが、肝外胆道系の腺腫の発生が高率であった。4.BOPの胆道内注入では胆道癌の発生はなかったが同様に肝外胆道系に腺腫の発生が多く認められた。本実験はヒトの膵胆管合流異常の胆道発生癌モデルとして有用で核心をついた実験モデルである。膵管胆道合流異常における胆道発癌の成因・病態を解明すべく、生理的に長い共通管を有するハムスター、山羊、ラットの膵液酵素組成をヒトと比較検討した。次に、その結果に基づき、胆道癌を誘発する発癌剤(BOP)を投与したハムスターに、胆嚢瘻よりヒト膵液を注入するモデルを作成し、10週及び15週後のハムスター胆道の病理組織学的変化を観察し、以下の結果を得た。2)胆道系の腺腫及び癌の発現頻度が、ハムスターに発癌剤(BOP)を投与し、胆嚢瘻よりヒト膵液を注入した群では、それぞれ82%、64%であるのに対し、発癌剤を投与し生食を注入した群と比較して、有意に高値を示した。3)ヒト膵液のみを注入した群では、総胆管は円筒状の拡張を呈し、経時的に粘膜上皮の過形成性変化の増強を見るが、10週までの観察では腺腫および癌の発生は見られなかった。以上、ヒト膵液は胆道癌の発癌促進に強い影響を与えることを示し、本実験は膵管胆道合流異常モデルの発癌実験として有用な、また、本質をついた実験モデルと考える。本研究では共通管の著しく長いハムスターを用い、膵・胆道系の発癌剤であるN-nitrosobisamine(BOP)を投与し、胆道系を病理組織学的に検討すると共に、更にヒト膵液をハムスターの胆嚢内に注入することにより胆道系の発癌がより誘発されるかについて検討を行った。更に、市販のトリプシン、エラスターゼの蛋白分解酵素を同様にハムスター胆嚢内に投与し、胆道発癌誘発に関与するかを検討した。【結果】(1)ヒト膵液投与のみでは胆管癌は見られなかったが、肝外胆管のhyperplasiaが全例見られた。ヒト胆汁の投与では少数例にhyperplasiaを認めるのであった。(2)BOPのみでは、肝内胆管癌は見られたが、肝外胆管癌は見られなかった。(3)BOPとヒト膵液投与では47%に胆管癌の発生を示し、BOPのみと比し有意に高率であり、38%が肝外胆管癌であった。(4)トリプシン及びエラスターゼ投与例では未だ発癌例は得られなかった。【結論】ヒト膵液は胆道発癌の誘発に促進効果を示し、本実験モデルは膵管胆道合流異常の胆道発癌モデルとして有用であり、今後酵素製剤での癌誘発とK-ras及びp53遺伝子の経時的変化を追求したい。本研究では共通管の著しく長いハムスターを用い、膵胆管系の発癌剤であるN-nitrosobisamine(BOP)を投与し、胆道癌の発癌を招来させ、更にヒト膵液を胆嚢内に注入することにより胆道系の発癌がより誘発されるかを検索し膵胆管合流異常の胆道発癌モデルとして有用であるか否か検討した。

更に、胆嚢内にヒト膵液のかわりに各種膵液酵素(トリプシン、エラスターゼ1等)の注入、またBOPの皮内投与の代わりに直接胆嚢内注入することにより胆道粘膜にいかなる変化を生じるかを検討した。結果(1)BOP+ヒト膵液投与群ではBOP単独投与群に比べ有意に高率に胆道癌及び腺腫の発生をみた。またBOPのみでは肝外胆道癌の発生はみられなかったがBOP+ヒト膵液注入群では肝外胆道癌の発生をみた。(2)ヒト膵液のみの投与ではhyperplesiaはみられたが胆道癌はみられなかった。人胆汁のみの投与では殆ど変化をみなかった。(3)BOP+トリプシン+エラスターゼ1投与では発癌率はBOP投与群と有意差はなかったが肝外胆管に腺腫の発生が有意に上昇していた。(4)BOPの胆道内注入では胆道癌の発生はみなかったが、肝外胆道系に腺腫の発生が高率に認められた。
水溶性一酸化炭素発生剤を用いた新規毒性機序の探索

本課題の計画第二年度に当たる本年度は、主にCORM-3による高分子p62の生成機構について詳しく調べた。CORM-3による高分子p62分子種はマウス線維芽細胞のみならず、ヒト肺胞由来細胞(A549)やラット心筋由来細胞(H9c2)でも確認され、細胞種特異的な現象ではなくかなり普遍的な現象であることが判明した。更に、単離精製したp62タンパク質を用いて、試験管内でCORM-3とp62を反応させたところ、やはり高分子p62分子種の生成が確認された。即ち、CORM-3とp62は直接的に相互作用しており、細胞内で別のタンパク質等を介して間接的に相互作用している訳でではない、ということが証明された。p62はオートファジーの遂行、特にユビキチン化されたタンパク質のオートファジーによる分解に関与する分子であることを鑑み、蛍光免疫染色によりp62、Ub、及びオートファゴソームのマーカーであるLC3の細胞内局在へのCORM-3の影響を調べた。Atg5欠損マウス線維芽細胞において、CORM-3曝露により生じた高分子p62分子種は、ユビキチン凝集体と共局在を示した。一方で、高分子p62分子種はLC3とは共局在を示さず、Atg5欠損マウス線維芽細胞においてはオートファジーが進行しないことと合致する結果であった。また、高分子p62分子種とユビキチン凝集体が共局在を示したことより、p62の高分子化はユビキチン結合領域で生じているのではなく、むしろLC3結合領域で生じている可能性が高いと考えられた。これら実験結果は国際英文誌に受理された。中心元素ルテニウムにカルボニルが配位した構造を持つCORM-3には、細胞内外のタンパク質と結合し、そのタンパク質を高分子化してしまうという予想外の作用を持つことがわかった。しかしながらこの効果は、CORM-3をかなり高濃度で使用した時に観察されるもので、実用上さほど問題になるものではないかもしれない。しかしながら、別の一酸化炭素発生剤であるCORM-A1にはこのような作用は認められず、少なくとも本課題における一酸化炭素の毒性作用の研究にはより適していることが判明したことは、一定の進展と考えている。今後はCORM-A1を一酸化炭素発生剤として選択し、動物投与実験を行い心・肺・肝・脳等の主要臓器の障害を調べる。GC-MSを用いた代謝産物の網羅的解析に目処が立ったので、メタボロミクス解析も行う予定である。当初の予定通り、マイクロアレイを用いたトランスクリプトミクスとMALDI-TOF-MSを用いたプロテオミクス解析も用いる。本年度は当課題の計画初年度に当たり、一酸化炭素発生剤CORM-3を用いて細胞毒性について検討した。マウス胎児線維芽細胞に高濃度(1mM)のCORM-3を曝露すると48-72時間後にアポトーシスによる細胞死に至ることが判明した。この過程における細胞内外のタンパク質の変動を調べたところ、分子量250kDa前後のタンパク質に大きな変動を認め、MALDI-TOF-MS解析に供したところフィブロネクチンと同定された。CORM-3によりフィブロネクチンが分子間で架橋され高分子化し、線維芽細胞との結合能を喪失していることがわかった。フィブロネクチン不含培地ではCORM-3の細胞毒性が軽減したことから、高分子化したフィブロネクチンは細胞との結合能失うのみならず、積極的に細胞死誘導に関与しているものと考えられた。更に、オートファジーに関与するアダプタータンパク質であるp62もフィブロネクチン同様にCORM-3により高分子化することがわかった。RNA干渉を用いてp62の発現量を低下させると細胞死も抑制されたことから、フィブロネクチン同様にp62の高分子化も細胞毒性に関与していることがわかった。次に敗血症モデルラットへの一酸化炭素発生剤CORM-3の投与効果を調べたところ、30mg/kgでの腹腔内投与では敗血症に伴う種々の病態を軽減することがわかった。心機能の低下、肺・心における炎症などが抑制された。一酸化炭素発生剤CORM-3の臓器・動物毒性を検討するためには30mg/kg以上の投与量が必要と思われる。一酸化炭素発生剤CORM-3による細胞障害の際に細胞外のタンパク質であるフィブロネクチン、細胞内のタンパク質であるp62が高分子化することを発見した。これらは電気泳動とウエスタン分析を用いて容易に検出可能で、マーカータンパク質として有用である。課題初年度で細胞内外で一つづつマーカータンパク質候補を同定できたことから、計画は順調に進行していると考える。これらの高分子化分子種はメルカプトエタノールなどの還元剤にも耐性で、また強力な変性剤によっても単量体化しないことも判明した。すなわち、極めて安定な分子種でありこの点でもマーカータンパク質としての要件を満たしている。一酸化炭素発生剤の毒性発現機序に関しても順調に研究は進展している。すでに、種々の遺伝子欠損株が入手可能であるというマウス胎児線維芽細胞の利点を生かし、オートファジー遂行の必須分子であるAtg5欠損株と野生株の比較検討を進めているが、Atg5欠損株は野生株よりCORM-3による細胞死の進行が早いことから、オートファジーが一酸化炭素毒性に抗して細胞ホメオスタシスを維持する役割を果たしていることが判明している。具体的なオートファジーの役割も判明した。

すなわち、高分子化したp62は野生株よりAtg5欠損株において顕著に蓄積しており、高分子化p62の除去にオートファジーが関与していることがわかった。また、単離精製したp62とCORM-3を試験管内で反応させても高分子化p62が生成することも確認した。以上からp62はCORM-3の直接の標的であることになる。これらの結果から、計画は予想以上に順調に進行していると判断している。本課題の計画第二年度に当たる本年度は、主にCORM-3による高分子p62の生成機構について詳しく調べた。CORM-3による高分子p62分子種はマウス線維芽細胞のみならず、ヒト肺胞由来細胞(A549)やラット心筋由来細胞(H9c2)でも確認され、細胞種特異的な現象ではなくかなり普遍的な現象であることが判明した。更に、単離精製したp62タンパク質を用いて、試験管内でCORM-3とp62を反応させたところ、やはり高分子p62分子種の生成が確認された。即ち、CORM-3とp62は直接的に相互作用しており、細胞内で別のタンパク質等を介して間接的に相互作用している訳でではない、ということが証明された。p62はオートファジーの遂行、特にユビキチン化されたタンパク質のオートファジーによる分解に関与する分子であることを鑑み、蛍光免疫染色によりp62、Ub、及びオートファゴソームのマーカーであるLC3の細胞内局在へのCORM-3の影響を調べた。Atg5欠損マウス線維芽細胞において、CORM-3曝露により生じた高分子p62分子種は、ユビキチン凝集体と共局在を示した。一方で、高分子p62分子種はLC3とは共局在を示さず、Atg5欠損マウス線維芽細胞においてはオートファジーが進行しないことと合致する結果であった。また、高分子p62分子種とユビキチン凝集体が共局在を示したことより、p62の高分子化はユビキチン結合領域で生じているのではなく、むしろLC3結合領域で生じている可能性が高いと考えられた。これら実験結果は国際英文誌に受理された。中心元素ルテニウムにカルボニルが配位した構造を持つCORM-3には、細胞内外のタンパク質と結合し、そのタンパク質を高分子化してしまうという予想外の作用を持つことがわかった。しかしながらこの効果は、CORM-3をかなり高濃度で使用した時に観察されるもので、実用上さほど問題になるものではないかもしれない。しかしながら、別の一酸化炭素発生剤であるCORM-A1にはこのような作用は認められず、少なくとも本課題における一酸化炭素の毒性作用の研究にはより適していることが判明したことは、一定の進展と考えている。今後もマウス胎児線維芽細胞を中心とした培養細胞による毒性発現機序の更なる研究を進める一方で、動物個体を用いた一酸化炭素の毒性機構にも研究対象を広げて行く。一酸化炭素発生剤CORM-3は金属錯体であり、中心のルテニウムにカルボキシル基が配位する構造となっている。一方CORM-A1は非金属の一酸化炭素発生剤である。高分子化p62はCORM-3とCORM-A1の両方で生成が確認されたが、高分子化