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中国・四国地方出土の朝鮮系瓦に関する研究

本年度、伯耆、因幡、備前、備後、安芸、讃岐、伊予などの現地に赴き、朝鮮系瓦を実際に見学し、実測図作成、拓本採取、写真撮影などを行った。また出土遺跡も現地に訪ね、周辺の遺跡との関係などを実際に見て確認した。一方、関連する資料を調査するため東京や九州、さらに韓国へも出かけた。このような基礎的な作業の中で、これまでの図録や報告書だけでは知り得なかった多くの事柄を知ることができた。まず、中国・四国地方の瓦はかなりのものが朝鮮系瓦であること、その系譜は高句麗系、百済系、新羅系と多様であること、実際の伝幡においては朝鮮半島から直接工人が来て製作したと考えられるもの、畿内経由のものの両方があることなとが確認できた。そしてその畿内経由の例も、畿内大和政権の中枢部にいた蘇我氏などとの関わりで伝えられたもの、大和政権の周辺部にいた渡来系の氏族たちとの関わりで伝えられたものの両方があることも明らかにできた。つまり地方への瓦の伝幡は、一般的に政権中枢部から地方豪族へ伝えられたと考えられがちであるが、少なくとも中国・四国地方のほとんどの地域の瓦は大和政権中枢部との関係は少なく、朝鮮半島直通のものと大和政権周辺部の渡来系氏族など中小豪族との関わりが深いものが多いことが明らかになった。ただこれは主に7世紀代のことであり、8世紀に入るとまさに政権中枢部の平城宮系の瓦が各地に展開するようになる。しかしその中にあっても独自性を残した地域が山陰各地域の備後北部である。以上のように一般的に考えられていた「中央から地方へ」という流れが、中国・四国地方の朝鮮系瓦の検討によって実際には単純ではないことが明らかになったことは今回の研究の大きな成果の一つである。最後に、今回の調査においては資料の見残しも多数ある。近い将来近畿地方の資料も含めて合せて検討したい。
固相中ブの元素の拡散

鉱物結晶中での原子の拡散現象は地球内部における物質移動と変化のうちでは、もっとも微視的で基本的な過程である。本研究では単に造岩鉱物中の元素のバルク拡散係数を測定するというだけのアプローチでなく、従来研究の困難であった二,三の分野について重点的に研究を進めた。その1つは地球深部での物質移動に関連した、高圧下のマントル物質中での地球化学的に重要な元素の拡散係数を、高圧下でin situに強度データを測定し、精密化した結晶構造データより、コンピューターシミュレーションの手法を使って測定することを試みた。このためには拡散径路にそってポテンシャルエネルギー図をつくり、そのSaddle部の値より活性化エネルギーを求めることが必要である。この計算には反撥エネルギー項としてのイオン圧縮率が必要である。今年はこのイオン圧縮率の圧力依存性をみるためダイアモンドアンビルを用いた単結晶4軸自動回折計による高圧実験で、鉄カンラン石について140kbまで、ルチルについて80kbまでの精密構造を決定した。これよりイオン圧縮率はエネルギー最小化法(WMIN)で求め、その圧力依存性のないことを確かめ、また鉄カンラン石の拡散の活性化エネルギーの圧力変化より拡散の活性化体積を推定することに成功した。これらの情報は地球内部での固体流動を考えるのに役立つものである。第2のテーマとして天然の鉱物における拡散に重要な影響を与える転位、小傾角粒角にそっての原子の高速拡散をしらべるため、カンラン石および石英の拡散実験に使用する試料の転位組織を試べた。今年購入したガタン社のイオンミリング装置により分析電顕観察用のイオン研磨した定方位の薄片試料を能率よく作成することができた。またコンピュターによる鉱物中の元素の拡散プロファイルよりその冷却速度を推定するプログラムの開発およびホタル石型構造を持つ結晶中でのイオン電導と拡散の関係に関する研究も行った。
「誤った保健認識」の形成過程に着目した高校生の健康リテラシーの分析と改善

日本の高等学校における保健科の教科書の重要用語・語句のうち、19個が10年間に亘って一度も新聞紙上に登場していない。また、新聞に頻繁に登場する健康の用語・語句が全く教科書には掲載されていない。フィンランドでは保健科が大学入学資格試験の入試科目になっている。この試験問題を収集し演繹的に分析した結果、試験で検証しているのは健康に関する「1理論的な知識、2技能的な知識、3批判的思考、4情報分析能力、5自己管理能力、6市民性・公民性」の6類型に分類できた。これら6類型は、単独あるいは組み合わされた形式で出題されていた。フィンランドの保健科では、社会に十全に参加するための能力の形成が目標となっている。2年目は、「研究の目的」、「研究実施計画」に照らして、以下の3つを遂行した。1)フィンランドが高等学校卒業までに形成しようとしている健康リテラシーは、この国の保健科の教育課程、担当教員養成、高等学校の保健科の授業、大学入学資格試験の採点組織と評価基準等を背景にした基盤の上に成立している。そこでこれらに関わる資料等を収集し分析した。2)1年目の末に実施した予備調査を分析した結果から、保健科領域における「誤概念問題(多肢選択問題)」、「フィンランド型問題(批判的思考を含む論述型の1理論的な知識問題2技能的な知識問題3情報分析能力問題)」と「日本型問題(教科書・新聞の上位頻出重要語句を含み日本学校保健会(2004,2010)調査で正解率50%以下の多肢選択問題)」と「語彙能力問題(標準化された多肢選択問題)」の調査票を作成した。3)前述の調査票を使って、日本の10都道府県(北海道、青森、宮城、福島、東京、千葉、福井、大阪、岡山、熊本)の高等学校10校の2年生、720名を対象に、保健学習が修了する2月中旬3月上旬にかけて本調査を実施した。1年目は、「研究の目的」、「研究実施計画」に照らして、以下の3つを遂行した。1)社会に十全に参加するために必要な保健領域の能力水準を設定するために、T社高等学校保健教科書3冊の索引にある全重要語句が、全国紙A社の過去10年間(20022012年)の健康関連記事に登場する個数を数え分類した。その結果、「がん・タール・飲酒・ストレス・インフルエンザ・交通事故・骨折」、「体力」、「ごみ・水道・下水道・リサイクル・エネルギー、介護・医療機関・保健所・医療費」の語句が上位を占めた。分類結果は疫学の「疾病発生の三要因」とも一致した。また、教科書の19個の重要語句が、10年間に一度も全国紙上には登場していないことも判明した。2)一方、PISAで好成績を上げ続けているフィンランドでは、保健科目が主要教科に位置づけられており、そのことが世界的にも注目されている。保健科目は大学入学資格試験にも課されており、高等学校卒業段階で身に着けさせておきたい保健科の学力を、「問題」という形式で具現している。この試験問題11回分(2007年春から開始・年2回)を収集し演繹的に分析した結果、健康に関する「1理論的な知識、2技能的な知識、3批判的思考、4情報分析能力、5自己管理能力、6市民性・公民性」の6類型に分類された。3)前述の二つの調査をもとに、「多肢選択型問題(教科書・新聞の上位頻出重要語句を含み日本学校保健会(2004,2010)調査で正解率50%以下の問題)」と「フィンランド型問題(批判的思考を含む健康に関連する1情報リテラシー問題2理論的な知識問題)」を作成し、保健学習を終えたO市内のK高等学校(進学校)の2年生40名に対して予備的調査を実施した。最終年度は、「研究の目的」「研究実施計画」に照らして、以下の2つを遂行した。1)標準化された「語彙能力問題」と(財)日本学校保健会(2005)の「選択式問題」とを比較分析した結果、保健の問題には「問題の難易度」「問題文の難解度」の存在が明らかになった。作問経験の蓄積が解決の一助と成り得る。2)授業を構想する場合、子どもが新しい教育内容についてどの程度の学力や生活経験を保持しているかを事前に把握することは重要である。中でも「素朴概念」の存在は、子どもの科学的な認識形成の中核的概念(R.オズボーン・P.フライバーグ,1985;細谷,1996;森・秋田,2002)と言われ、診断的評価の対象となる。得られた診断的評価の情報をもとに、発問や探究課題が工夫されたり「つまずき」が組み込まれたりして授業は構想される。

ところがこの「素朴概念」は、保健学習ではほとんど検討されていない。本研究では保健学習の一つの事例として「心臓の位置」を提起した。(財)日本学校保健会(2005)の全国調査では「心臓の位置」は小5高3までの8割以上が正しく回答した。この結果は「心臓は左胸にある」という「素朴概念」に最も近い選択肢を選んだだけと解釈することもできる。この点について選択肢の布置を変えた作問を行った。全国17校の高校2年生男女701名の回答を分析した結果、新たに作成した「心臓の位置」問題では正答率が36.9%で、全国調査版問題の94.1%よりも有意に少なかった。正答よりも左に選択肢があるとそれが選択されやすいことから、「心臓の位置」は保健学習における「素朴概念」の一つの事例といえる。従来、保健科教育学では、授業づくりにおいて、学習者(子どもはどう学ぶか)のレベルの研究の遅れが指摘(森,1987)されており、今回の研究は、この課題レベルを意識した、保健科教育学の分野で初の全国的な実証調査となった。応用健康科学予定では、本調査の分析は2年目で終えるはずであるが、高等学校における保健科の教育課程の修了を待って年度末に本調査を実施したため、結果の分析が最終年度にずれ込んでいる。それ以外はおおむね順調に進展している。本来なら、予備的調査の分析は1年目に終えているはずであるが、高等学校保健科の教育課程の修了を待って年度末に予備的調査を実施したため、結果の分析が2年目にずれ込んでいる。それ以外は、おおむね順調に進展している。最終年度は、「研究の目的」「研究実施計画」に照らして、大きくは次の3つに研究費を使用する計画である。1)高校生を対象とした調査結果入力及び翻訳等の人件費(外注)...200千円。2)研究成果の学会発表等の旅費(岩手、金沢、東京、京都他)...200千円、3)研究報告書他の印刷費(外注)...200千円。2年目は、「研究の目的」、「研究実施計画」に照らして、以下の3つを推進する。1)前年度の予備的調査の分析し、「誤った保健認識」と「批判的思考」の関連性を探索し、仮説生成を行う。一方で「誤った保健認識」の形成過程の仮説モデルと健康領域固有の「批判的思考」の概念枠組みを作成する。2)1「批判的思考」の構成概念の分析(調査1):1)で作成した健康領域固有の「批判的思考」の概念枠組みに基づき項目を作成し、高校生200名程度を対象に質問紙調査を実施する。それに併せて、フィンランドの批判的思考を含む健康に関連する問題の評価基準を入手・分析し、構成概念の探索と測定尺度の構成を行う。2「批判的思考」測定尺度の妥当性と信頼性の検討(調査2):調査1で構成した測定尺度を用いて、高校生200名程度を対象に質問紙調査を実施し、構成概念の検証と測定尺度の妥当性と信頼性の検討を行う。3)「批判的思考」が「誤った保健認識」の形成に及ぼす影響の検証(調査3)・・・平成24年度に作成した「誤った保健認識」テスト問題と調査1、2で開発した「批判的思考」測定尺度を用いて高校生400名程度を対象に調査を実施し、両者の相関分析から、今年度に構築した仮説モデルの検証を行う。2年目は、「研究の目的」、「研究実施計画」に照らして、大きくは次の3つに研究費を使用する計画である。1)高校生を対象とした調査旅費(大阪・栃木・福島・宮城各府県で2回)...300千円(内訳@150、@50、@30、@20)。
カルシウム透過性AMPAレセプターの強制発現がシナプス機能に与える影響

ウイルスベクターを用いてCa^<2+>透過性AMPAレセプターを海馬ニューロンに強制発現させて、AMPAレセプターのCa^<2+>透過性のもつ機能的意義を明らかにすることを計画した。まず、非編集型GluR2(以下GluR2Qと略す)cDNAを組換えたアデノウイルスを作製し、ラット培養海馬ニューロンにGluR2Qを強制発現させ、外来性に導入されたCa^<2+>透過性AMPAレセプターが興奮性シナプス伝達を担うようになるか否かについて調べた。GluR2Qの強制発現のために、2種類の組換えアデノウイルス、AxCALNLGluR2Q、AxCANCreを作製した。前者はアデノウイルス作製用コスミドカセットのクローニングサイトに、CAGプロモーター、両端にloxP配列をもつ介在遺伝子(stuffer gene)およびGluR2Q cDNAを組込んだものである。後者は、stufferの切り出しに必要なCre recombinaseを発現させるための組換えアデノウイルスである。ラット培養海馬ニューロンをこれらのウイルスで感染させたところ、2日後には、外向き整流、Ca^<2+>不透過性AMPAレセプターを発現しているはずの錐体形ニューロンで、大部分のAMPAレセプターが、内向き整流、Ca^<2+>透過性を示すようになった。さらに、海馬ニューロン間のシナプスで記録される速い時間経過の興奮性シナプス電流も、内向き整流、Ca^<2+>透過性AMPAレセプターにより担われるようになることが明らかになった。従って、GluR2Q受容体がウイルスベクターにより過剰に産生され、短時間でシナプス下膜に存在する本来のAMPAレセプターと置き換わることが結論された。この結果は、シナプス下膜の受容体は速やかに代謝されるものであり、シナプスの伝達特性は受容体遺伝子を外来性に導入することにより、容易に変え得ることを示している。
１９世紀蝦夷地における和人・アイヌの接触・交流に関する研究―北海道有珠郡の歴史－

本研究は、19世紀に北海道へ集団移住した武家家臣団(亘理伊達家家臣団を中心に仙台伊達家家中を対象とした)に関する基礎的な資料調査を実施するとともに、資料群の目録化作業を行った。また、有珠郡をモデルに移住者と先住者(アイヌ民族・先住和人)との接触と軋轢に関して、蝦夷三官寺の一つである有珠善光寺の果たした役割、及び有珠郡の領主権力としての亘理伊達家の果たした役割について明らかにした。2013年度は亘伊達家家臣団資料調査として、北海道伊達市及び登別市における資料調査(2013年8月1日5日)、宮城県亘理町及び仙台における資料調査(2013年11月14日16日)、北海道札幌市における資料調査(2013年12月15日18日)を実施した。伊達市での調査では、伊達市噴火湾文化研究所が所蔵する亘理伊達家中関係資料の調査・撮影、及び登別市郷土資料館所蔵が所蔵する片倉家家臣団関係資料の調査を行なった。札幌市での調査では、北海道大学付属図書館北方資料室が所蔵する伊達市及び登別市に関する古地図の調査・撮影、及び北海道立文書館が所蔵する亘理伊達家関係資料の調査・撮影を行なった。宮城県亘理町での調査では、亘理町郷土資料館が所蔵する亘理伊達家関係資料(渡邉家文書、及び亘理二階堂家文書)の調査・撮影を行なった。また、2012年度に撮影を終了した文書群(1羽田家文書・亘理時代の文書類が中心・92レコード、2伊達二階堂家文書・任免状や知行宛状が中心・34レコード(枝番含まず)、3加藤家文書・任免状や知行宛状(詠句短冊を含む)・28レコード(枝番含まず)、4半沢家文書・手習い本や写本が中心・91レコード、村木家文書・移住後の資料を含む・212レコード)の目録化作業を完了した。さらに、亘理二階堂家文書に関して、その活用方法を亘理町郷土資料館と協議した。当該資料群は、亘理町の旧家二階堂家の解体作業に伴って襖の下貼りから発見された文書約600点であり、資料保存形態としては下貼りであるため、「二階堂家」の記録のみではなく、古書業者等から購入した多様な史料から構成されると想定される。資料内容は、概ね近世の一枚物からなる600点の一枚物群である。2013年度には当該資料の撮影を完了するとともに、「いろはの会」と協力して翻刻作業を進めた。2012年度は亘理伊達家家臣団資料調査として、北海道伊達市における調査を2回(2012年7月21日30日、2012年12月21日26日)、北海道札幌市における調査1回(2012年9月10日12日)、宮城県亘理郡亘理町における調査1回(2013年3月16日17日)を実施した。伊達市での調査では、伊達市噴火湾文化研究所での亘理伊達家中関係資料の調査、及び大臼山善光寺ほか関連史料の調査を行った。札幌市での調査では、北海道立文書館での開拓使資料(亘理伊達家関係資料)の調査、及び札幌市琴似屯田兵関連史料の調査(亘理伊達家家臣で屯田兵へ参加した清野家資料等)を行った。亘理町での調査では、亘理町郷土資料館所蔵亘理伊達家中関係資料の調査を行った。特に伊達市での調査においては、以下の資料群について封筒詰め作業、及び撮影を完了した。1田村家文書(田村家所蔵)、移住時当主;常盤新九郎(田村顕允)、資料全体で14群・695レコード、8628コマ撮影。2羽田家文書(大雄寺所蔵)、亘理時代の任免状など家格・由緒を示す史料などが中心、92レコード、648コマ撮影。3二階堂家文書(大雄寺所蔵)、亘理時代の史料が主で、任免状や知行宛行状が中心、34レコード(枝番含まず)、204コマ撮影。4加藤家文書(大雄寺所蔵)、亘理時代の史料が主であるが、任免状や知行宛行状、書状や詠句の短冊など、28レコード(枝番含まず)、135コマ撮影。5半沢家文書(大雄寺所蔵)、手習本や写本を多く含む、91レコード、1093コマ撮影。6村木家文書(大雄寺所蔵)、亘理時代と移住後の史料が主・亘理時代の史料は任免状や知行宛行状などのほか書状なども含む、212レコード、1258コマ撮影。2014年度は亘理伊達家家臣団資料調査として、北海道伊達市における資料調査(伊達市噴火湾文化研究所、2014年10月17日20日)、北海道札幌市における資料調査(北海道大学附属図書館・北海道立文書館、2014年12月20日23日)を実施した。

2012年度以来実施した、大雄寺(伊達市内、亘理伊達家菩提寺)が所蔵する亘理伊達家家臣団資料の目録化作業を完了し、その成果を『亘理伊達家文書調査研究会成果報告書I北海道伊達市大雄寺所蔵亘理伊達家中諸家文書目録』(2014年10月18日)を刊行した。この目録には大雄寺所蔵資料のうち、羽田家文書(協力者・工藤航平担当)、加藤家文書(協力者・清水詩織担当)、二階堂家文書(協力者・石田七奈子担当)、村木家文書(協力者・三野行徳担当)、半沢家文書(協力者・磯部孝明担当)、星家所蔵野馬追図屏風(分担者・伊達元成担当)が含まれる。刊行した目録は、北海道内の各大学・公立図書館、及び宮城県内の図書館等に配布し、研究成果の共有を図った。また、研究成果を調査対象地域に対して広く還元するためのシンポジウムを開催した。2014年10月18日に開催した「武家文書シンポジウム海を渡った武士たちー移住者の記録から地域を考えるー」では、第一に亘理伊達家文書の具体的内容について、協力者・工藤が「亘理伊達家家臣団諸家文書の世界」を、協力者・磯部と石田が諸家文書に関する報告を行った。第二に、亘理伊達家家臣団資料の比較史的検討を行うため、分担者・伊達とともに登別・片倉家の事例を平塚理子(登別市学芸員)・近世亘理伊達家関連資料に関する紹介を菅野達雄(宮城県亘理町学芸員)が、それぞれ報告した。第三に、亘理伊達家資料の普遍化の試みとして、代表者・檜皮が「比較史研究の射程」を報告し、さらにパネルディスカッション「移住者たちの記録から地域を考える」を実施した。日本史本研究では、蝦夷地(北海道)の先住民族であるアイヌ民族と、和人移住者との接触と交流、その際に生じたConflictとReconciliationの解明を目的とする。その基礎作業として、和人移住者に関する資料調査と、移住後のアイヌ民族を含めた地域社会の再編成のプロセスに関する分析が不可欠である。2013年度には、亘理伊達家家臣団資料の目録化作業を実施した。亘理伊達家家臣団資料はこれまで存在そのものが不明確であり、新出資料群の目録化は当該研究プロジェクトの推進に資するのみならず、広く当該研究テーマの発展に寄与することとなる。目録化作業は2013年度に完了し、2014年度に印刷・刊行を予定している。また、北海道大学付属図書館北方資料室が所蔵する古地図類は、亘理伊達家家臣団の地域社会形成を示す資料であり、アイヌ民族との接触・交流を可視的に分析するための格好の素材でもある。これら古地図類に関しては、2013年度に高解像度での撮影を完了した。本研究では、蝦夷地(北海道)の先住民族であるアイヌと、和人移住者との接触・交流の歴史を明らかにすることを目的とする。その基礎的作業として、和人移住者に関係する資料の調査が必要とされる。これは、アイヌ民族が文字資料を残さなかったことから、和人移住者が残した資料からの分析が不可欠となるためである。2012年度は1870年代に集団移住した亘理伊達家家臣団資料の調査・撮影を行い、総計で1152レコード、11966コマ撮影を完了した。特に、1の田村家文書は、亘理伊達家の家老職として北海道移住時に中心的役割を果たした田村顕允に関する資料を中心とするため、本資料の整理と分析は19世紀半ばにおける和人移住者と先住民族アイヌとの接触・交流を解明するうえで重要な資料となる。また、和人移住者やアイヌ民族に関する資料は、彼等を管理した開拓使に関する資料群にも多く含まれるため、2012年度は北海道立文書館での資料調査を行った。開拓使史料のなかの亘理伊達家関係資料、及び19世紀の有珠郡・胆振郡支配関係資料の確認・撮影、屯田兵に参加した亘理伊達家家臣の資料の調査・撮影、開拓使によるアイヌ統治政策関係資料の所在調査を完了した。(今後の推進方策)2014年度の研究活動は、1調査・撮影済み資料の目録化、2収集資料を活用した研究成果の公開、という二つの作業を推進していく。1の目録化については、大雄寺所蔵文書目録を印刷・刊行する。
マルチスケールな神経振動子協調による脳内情報統合メカニズムの解明

エピソード記憶に代表される海馬記憶を実現するための動的な皮質間ネットワークが創発するメカニズムを解明することを目的として,脳波とfMRIの同時計測を実施した.海馬記憶に関連する課題として風景写真を観察中の脳波とfMRIの同時計測にもとづき,海馬記憶に関連する皮質ネットワークを同定し,前頭からのシータ波の発生タイミングにおいて,前頭前野内側面,前頭眼野,高次視覚領野および海馬傍回場所領域の反応が発生することを示した.また,神経の振動子ダイナミクスの協調により認知処理に必要な皮質ネットワークが動的に形成されていることを示すために, fMRIの空間分解能で特定した皮質位置での脳波時系列データを再構築する技術を開発した.エピソード記憶に代表される海馬記憶を実現するための動的な皮質間ネットワークが創発するメカニズムを解明することを目的として,脳波とfMRIの同時計測を実施した.海馬記憶に関連する課題として風景写真を観察中の脳波とfMRIの同時計測にもとづき,海馬記憶に関連する皮質ネットワークを同定し,前頭からのシータ波の発生タイミングにおいて,前頭前野内側面,前頭眼野,高次視覚領野および海馬傍回場所領域の反応が発生することを示した.また,神経の振動子ダイナミクスの協調により認知処理に必要な皮質ネットワークが動的に形成されていることを示すために, fMRIの空間分解能で特定した皮質位置での脳波時系列データを再構築する技術を開発した.エピソード記憶に代表される海馬記憶を実現するための動的な皮質問ネットワークが創発するメカニズムを解明することを目的として,脳波とfMRIの同時計測を実施する.平成21年度においては,海馬記憶に関連する課題として風景写真を観察中の脳波とfMRIの同時計測にもとづき,海馬記憶に関連する皮質ネットワークを同定した.その結果,前頭からのシータ波の発生タイミングにおいて,前頭前野内側面,前頭眼野,高次視覚領野および海馬傍回場所領域の反応が発生することが明らかになった.研究代表者らの実施した従来の脳波研究において,前頭からのシータ波の特定の位相において前頭眼野付近および高次視覚領野付近のガンマ波パワーが増大することが示されており,前頭前野内側面のシータ波により,前頭眼野および高次視覚領野の情報統合が実現されることで,海馬傍回での場所記憶が実現されていることを示唆している.さらに本研究課題では,神経の振動子ダイナミクスの協調により認知処理に必要な皮質ネットワークが動的に形成されていることを示すために,特定の神経活動が発生している際の皮質活動を数百ミリ秒の精度の実時間で妨害する技術を開発する.本年度においては,脳波とfMRIの同時計測にもとつく実時間干渉型計測システムの開発を開始した.脳波とfMRIの同時計測においては,MRIの高磁場に由来するアーチファクトが計測する脳波に重畳する問題が発生する.従来の脳波とfMRIの同時計測においては,fMRIの撮像に由来するアーチファクトを事後的に除去することにより,脳波の時系列データを復元する方法を用いている.本研究ではfMRIと同時計測している最中の脳波から,実時間でアーチファクトを除去することで,特定の脳波成分が発生した際に妨害刺激を呈示するシステムを目指している.そこで,実時間でのアーチファクト除去を実現可能なシステム構築を実施した.エピソード記憶に代表される海馬記憶を実現するための動的な皮質間ネットワークが創発するメカニズムを解明することを目的として,脳波とfMRIの同時計測を実施する.これまでに,海馬記憶に関連する課題として風景写真を観察中の脳波とfMRIの同時計測にもとづき,海馬記憶に関連する皮質ネットワークを同定し,前頭からのシータ波の発生タイミングにおいて,前頭前野内側面,前頭眼野,高次視覚領野および海馬傍回場所領域の反応が発生することを示している.また,神経の振動子ダイナミクスの協調により認知処理に必要な皮質ネットワークが動的に形成されていることを示すために,特定の神経活動が発生している際の皮質活動を数百ミリ秒の精度の実時間で妨害する基礎技術として,実時間でのアーチファクト除去を実現可能なシステム構築を開発している.平成22年度においては,この実験システムを用いて海馬記憶が神経振動子ダイナミクスの協調により実現されていることを示すための実験課題を構築するとともに,脳波とfMRIの同時計測を開始した.構築した実験課題は,ヴァーチャルリアリティを用いた物-場所課題であり,この課題を遂行中の脳波とfMRIの同時計測を実施した.その結果,構築した課題を用いることで海馬傍回場所領域と呼ばれる側頭葉内側面を含めて,頭頂皮質,前頭皮質などの広範な活動部位が現れることが示された.今後,この課題を用いて所期の目的を実現する予定である.ヒトは時々刻々と変化する複雑な環境の中で,創発的に状況依存的な判断を実現している.我々の脳内には特定の機能を司る部位が局在しているものの,どこか一つの皮質部位のみの活動により機能が創発するわけではない.単純な作業をする際においても複数の脳部位の協調活動を必要としている.神経の振動子ダイナミクスの協調により認知処理に必要な皮質ネットワークを動的に形成していると考えられているものの,従来の脳機能イメージング技術では,特定の神経活動が発生している際の皮質活動を数百ミリ秒の精度の実時間で妨害する技術は開発されていない.そのため,数百ミリ秒の動特性を有する過渡的な神経の振動子ダイナミクスに関連して真に情報統合がされているか否かの検証は残された問題である.

そこで,特定の皮質において脳波活動が発生した際に妨害刺激を呈示するシステムを目的として,その基幹技術となる特定の皮質活働に対応した頭皮脳波分布を決定する手法を,脳波とfMRIの同時計測にもとづき構築することを目指した.平成22年度までに,fMRIと同時計測中のMRI撮像由来のアーチファクトをリアルタイムに低減する技術を確立したとともに,「振動子ダイナミクスによる脳内情報統合メカニズムの解明」を目指した心理実験課題を構築した.平成23年度においては,目標とするシステムの基幹技術として,特定の皮質部位における脳波活動を再構築する技術の開発を実施した.この技術においては,頭皮上で計測した脳波活動をもとにして,fMRIで同定した皮質の空間位置で脳波活動を再構築する技術である.さらに,平成22年度までに構築したヴァーチャルリアリティを用いた物-場所記憶課題遂行時の脳波とfMRIの同時計測を実施した.これらの研究成果は,目標とするシステムの基幹をなす技術である.
働く更年期女性の睡眠に着目した就労生活の質を改善するケアの検討

更年期女性を対象に勤務日と休日の睡眠の状況を把握し、睡眠を主観的評価、自律神経系の反応及び、唾液ホルモンから検討した。1日8時間程度、勤務している4555歳の女性9名を対象とし、自宅での睡眠状態を調べるために、眠りSCAN(Paramount Bed社製)と睡眠日誌を用いた。入眠前にその日の活動状況を記載し、唾液を採取し、心拍を測定するモニター(MyBeat, Union Tool社製)を胸部に貼用し、就寝した。翌朝、起床時に唾液を採取し、前日の睡眠状況について、OSA睡眠感調査票(MA版)*と自記式の睡眠日誌を記述した。採取した唾液でコルチゾール濃度(Salimetrics社製)とメラトニン濃度(Salimetric社製)を測定した。自律神経系の変化は心拍モニターで測定したRR間隔を用いて、ローレンツプロット法で解析を行った。眠りSCANでの勤務日と休日の睡眠時間と入眠潜時はそれぞれ337.5±68.0分と375.2±56.1分、10.5±3.9分と9.9±2.6分で、休日の睡眠時間は勤務日のものより長い傾向が見られた。VASによる睡眠評価は勤務日で58.7±21.4、休日で59.6±24.7で有意な差は認められなかった。唾液ホルモンは勤務日と休日での違いは認められなかった。勤務日における入眠時のRR間隔は休日のものよりも有意に短く、入眠後2時間30分時点でも同様の傾向が認められたが、ローレンツプロット法による自律神経反応には影響が認められなかった。睡眠時間と睡眠の質との相関は休日では有意な正の相関(r=.554, p<.05)が認められたが、勤務日では相関(r=.001, p>.05)は認められなかった。勤務日と休日の睡眠評価には違う因子が影響していると考えられる。*山本他:脳と精神の医学, 10:401-409,1999.更年期女性の勤務日と休日の睡眠を日常生活の中で評価するために、主観的評価などの質問紙調査に加え、ストレスホルモン指標と心拍変動解析を用いた自律神経系指標を自宅での測定において検討した。働く更年期女性の睡眠を総合的に捉え、女性が抱えている健康問題を明らかにすることを目的とした。対象者3名に、勤務の日と休日での睡眠について、測定項目をRR間隔及び唾液内のホルモン、睡眠に関する主観的評価を含む睡眠パラーメータとし、質問紙調査を行った。勤務日は一人あたり35日、休日が一人あたり24日の計測であり、全体として、20夜(勤務日11夜、休日9夜)が分析対象となった。入床時の室内環境は勤務日と休日共に違いはなかった。睡眠日誌による入床時間及び睡眠時間は20夜で384.9±53.1分及び370.5±54.3分で、その中でも勤務日は410.6±30.0分及び394.9±33.2分、休日は353.3±57.9分及び340.6±59.9分で、休日は勤務日に比べ、入床時間及び睡眠時間が少なかった。眠りSCANで計測した全体、勤務日及び休日の入床時間は362.3±67.5分、402.1±47.9分及び313.7±54.8分で、睡眠時間は336.5±66.7分、377.5±45.1分及び286.3±53.2分で、勤務日よりも休日の入床時間及び睡眠時間が少なかった。入眠潜時及び夜間覚醒回数は全体、勤務日及び休日では、10.9±7.3分及び1.55±0.86回、9.5±1.2分及び1.73±0.96回、12.7±10.8分及び1.33±0.67回で、入眠潜時は休日が悪く、夜間覚醒回数は両日で違いはなかった。主観的評価は全体で62.8±13.9、勤務日は66.4±6.8、休日が58.3±18.4で、休日の方が低い結果であった。QOL尺度などの質問紙RR間隔及び唾液ホルモンに関しては分析中である。3名の対象者の測定及びその結果の検討を行うことができた。RR間隔や唾液ホルモンの解析を行い、今回の結果をもとに、質問紙等の見直しを行い、対象者数を10名程度に増やす予定である。働く更年期女性を対象に勤務日と休日での睡眠状態を明らかにすることを目的とした。今年度は4555歳の女性3名を対象とし、自宅での睡眠状態について、自記式睡眠日誌とOSA睡眠感調査票(MA版)を記述してもらった。自記式の睡眠日誌は入床時刻、入眠時刻、目覚めた時刻、起床時刻、夜間覚醒回数及び前晩の睡眠評価の項目であった。更年期症状については日本産科婦人科学会生殖・内分泌委員会が作成した更年期症状評価表を用いた。さらに睡眠状態を客観的に調べるために、パラマウントベッド社製の眠りSCANで就床時刻、起床時刻などの測定を行い、睡眠時間と在床時間を算出した。身体状態を調べるために、睡眠前後で唾液を採取するとともに、睡眠中の心電図の計測を行った。心電図の情報はRR間隔から自律神経活性を、唾液に関しては、ストレスホルモンであるコルチゾール及び睡眠に関係するメラトニンを測定する予定である。

解析に関しては、昨年度の3名に今年度の3名の結果を加え、6名の結果として解析を行った。各対象で48夜の測定がなされ、勤務日で19夜、休日で16夜、全体で35夜が分析対象となった。勤務日及び休日の睡眠時間は、日誌で351.3±45.6分及び377.4±39.8分で、休日の睡眠時間が勤務日よりも有意に長かったが、マットでは346.0±81.6分及び368.1±49.7分で、休日の睡眠時間は長かったものの有意差は認められなかった。日誌での休日の入眠潜時は勤務日のものより長く、休日の夜間覚醒回数は勤務日のものより多かった。しかし、勤務日と休日の更年期症状の評価、VASによる主観的評価及びOSAによる睡眠感には違いが認められなかった。今後、主観的評価と各睡眠パラメータとの関連、自律神経活性及び唾液中のホルモンに関して分析を行う予定である。職場の移動及び自律神経活性を行うためのコンピュータの不具合に伴い、年度末に計画していた分析が遅れている。コンピュータは現在、解析できる目途がつき、また、移動した職場でも解析ができるように準備をしているため、今年度で調整ができると考えている。45-55歳の働く更年期女性の日常生活における勤務日と休日の睡眠の変化を自宅での睡眠で検討することである。昨年度までに6例の対象で検討したが、更に3例を加えて検討を行った。この調査の間、対象者は通常の生活を行った。測定項目は心拍モニターにより心電図を、睡眠パラメータはねむりSCANを用いて測定した。実験の日の寝る前と起床時に唾液を採取し、唾液コルチゾールとメラトニン濃度を後日測定した。起床時に睡眠の質をVASにて記録し、OSA質問紙に記載した。自律神経系の変化は入眠度から150分をローレンツプロット法もしくはRR間隔の時間領域によって評価した。勤務日と休日の在床時間は359.9±67.9分、388.8±52.0分、睡眠時間は340.9±65.5分、365.4±47.1分で、睡眠潜時は10.2±3.2分と9.7±2.5分で、休日の方が在床時間と睡眠時間が長く、睡眠潜時は少なかった。VASで評価したそれぞれの睡眠の主観的評価は57.8±19.5分と60.3±21.7分で、休日の方が良かったが、睡眠効率は勤務日が94.0%であったが、休日は93.4%でほぼ同程度であった。入眠前のRR間隔は勤務日の方が休日より高かった。150分間のRR間隔の経時的変化は両日ともに入眠後延長した後、短縮し、再度、延長するという類似した経過を示した。勤務日の入眠後のSDNNは休日のものより低く経過した。交感神経系の指標であるL/Tは勤務日も休日も入眠後の経時的変化に違いはなかった。唾液ホルモンで測定したメラトニンとコルチゾールの変化に関しては、勤務日と休日で大きな違いは認められなかった。今後、睡眠の主観的評価と唾液中ホルモン濃度や自律神経系の詳細な検討に関して、さらに分析を行う予定である。平成29年度、異動したことで、研究環境を整えるなどに時間を要した。課題であったコンピュータの不具合は解消されたため、心拍変動などの解析は行える環境となっている。唾液ホルモン濃度の解析に関しては、年度末に解析環境を整えることが出来たため、解析ができるようになった。更年期女性を対象に勤務日と休日の睡眠の状況を把握し、睡眠を主観的評価、自律神経系の反応及び、唾液ホルモンから検討した。1日8時間程度、勤務している4555歳の女性9名を対象とし、自宅での睡眠状態を調べるために、眠りSCAN(Paramount Bed社製)と睡眠日誌を用いた。入眠前にその日の活動状況を記載し、唾液を採取し、心拍を測定するモニター(MyBeat, Union Tool社製)を胸部に貼用し、就寝した。翌朝、起床時に唾液を採取し、前日の睡眠状況について、OSA睡眠感調査票(MA版)*と自記式の睡眠日誌を記述した。
組織マイクロダイセクション法による前癌病変、背景病変の遺伝子異常の解析

はじめにマイクロマニュピュレーターを改良した組織マイクロダイセクション法の有効性を確認する目的で採取する細胞と得られるDNA量を調べた。ホルマリン固定パラフィン包埋材料を4ミクロンの厚さで薄切し、我々の方法を用いて組織マイクロダイセクションを行った場合、200-400個の細胞を採取することによって2-3ngのDNAを抽出することができた。理論的に1つの細胞の持つDNA量は12-15pgと推定されるから、上記の採取、抽出量は推定値をもとにした概算と大きな矛盾はない。また数十個程度の細胞数で十分PCRの解析が可能であることもわかった。この方法で採取したヒトがんのDNAを用いて以下に示す解析を行った。(1)肺腺がん94例のDNAを組織マイクロダイセクション法を用いて採取し、その染色体欠失をpolymerase chain reaction-loss of heterozygosity(PCR-LOH)法にて2p、3p、9p、17p、17qのかくlocusについて解析した。その結果、小型ながら進行がんと考えられる腫瘍では26.8%の割合でLOHが見つかったが、生物学的に非常に予後の良い、上皮内がんとでもゆうべき腫瘍にも19.8%の割合でLOHが認められ、染色体の欠失は肺腺がんの発がんの非常に早期から起こっている遺伝子異常であることが明らかになった。(2)開発した組織マイクロダイセクション法を用いて採取したメタノール固定肺がんDNAについてarbitrarily primed PCR(AP-PCR)法を行い、スクリーニング的に個々の肺がんに存在する遺伝子異常を解析した。すると肺腺がんでは染色体7番で欠失が41.7%に認められ、1、8、13番で増幅が40%以上に認められた。扁平上皮がんでは染色体2番の増幅が63.3%に認められた。興味あることに小細胞がんでは染色体22番の欠失が非常に高頻度(84.6%)に認められたので、このPCR産物をクローニングしてさらに詳細にその染色体部位を解析すると、このPCR産物は22q13.3に位置することが明らかとなった。次に我々の組織マイクロダイセクション法を用いない場合と用いた場合でのloss of heterozygosity(LOH)の発見し易さのちがいを調べる目的で肺腺癌を用いて3p(D3S966),9p(D9S157),17p(TP53),17q(D17S791)の各locusのPCR-LOHを解析した。17個のinformativeなlocusが得られ、そのうち10個は我々の組織マイクロダイセクション法を用いないでもLOH陽性で5個は陰性であった。残りの2個は我々の方法で陽性であったが、通常の組織マイクロダイセクション法ではLOHを確認できなかった。

以上の結果よりマイクロマニュピュレーターを応用した組織マイクロダイセクション法が微小で正常細胞が混入した組織を用いたPCR解析に有効であることが示された。現在この方法を使って、肺癌のarbitrarily primed PCR(AP-PCR)法を行っており、特に肺小細胞癌では22qのテロメア側に共通した欠失部分があることがわかった。前年度に詳細に解析し、十分に有効な組織マイクロダイセクションが行えることが確かめられたので、この方法で採取したヒトがんのDNAを用いて以下に示す解析を行った。(1)肺腺がん94例のDNAを組織マイクロダイセクション法を用いて採取し、その染色体欠失をpolymerase chain reaction-loss of heterozygosity(PCR-LOH)法にて2p,3p,9p,17p,17qのかくlocusについて解析した。その結果、小型ながら進行がんと考えられる腫瘍では26.8%の割合でLOHが見つかったが、生物学的に非常に予後の良い、上皮内がんとでもゆうべき腫瘍にも19.8%の割合でLOHが認められ、染色体の欠失は肺腺がんの発がんの非常に早期から起こっている遺伝子異常であることが明らかになった。また一葉(左上葉)内に100個以上のatypical adenomatous hyperplasia(AAH)が認められた症例を用いて、肺腺がんの前がん状態と考えられるAAHについても組織マイクロダイセクションにて採取したDNAを用いて染色体の欠失を解析した。するとAAHの中にも欠失を認めるものが見つかり、上記の推測が正しいことが確かめられた。(2)開発した組織マイクロダイセクション法を用いて採取したメタノール固定肺がんDNAについてarbitrarily primed PCR(AP-PCR)法を行い、スクリーニング的に個々の肺がんに存在する遺伝子異常を解析した。すると肺腺がんでは染色体7番で欠失が41.7%に認められ、1,8,13番で増幅が40%以上に認められた。扁平上皮がんでは染色体2番の増幅が63.3%に認められた。興味あることに小細胞がんでは染色体22番の欠失が非常に高頻度(84.6%)に認められたので、このPCR産物をクローニングしてさらに詳細にその染色体部位を解析すると、このPCR産物は22q13.3に位置することが明らかとなった。
楕円型Artin群のmonodromy表現と楕円型Lie環の幾何学的構成

山田は、A.B.Giventalの局所系を係数とするホモロジー群を用いたtwisted Picard-Lefschetz理論を援用し、単純楕円特異点の普遍変型空間からdiscriminant集合を除いた空間の基本群=楕円型Artin群の構造とq-変形されたmonodromy表現を調べた。具体的には、消滅サイクルから定まる楕円型Dynkin図形の言葉を用いて楕円型Artin群の生成元と関係式を与えた。更に、q-変形されたmonodromy表現のデータから楕円型Hecke環なる概念を定義し、その有限次元表現を得た。P.Slodowyは、楕円曲線上の主G-束のモジュライ空間の幾何を援用し、loop群の言葉で単純楕円特異点を構成した。このことは、単純特異点と単純代数群の関係、Grothendieck-Briskorn理論、の拡張であり、特筆すべきことである。この理論は、数理物理における共形場理論との関係で重要な位置を占めるであろう。また彼は、単純特異点と複素鏡映群との関係も調べている。楕円型単純特異点の普遍変形空間からdiscriminant setを除いた空間の基本群を楕円型Artin群と呼ぶ。このArtin群の構造を楕円型Dynkin図形(vanishing cycle)の言葉で表現することが、この研究の目的である。まず、A.B.Giventalのtwisted Picard-Lefschetz理論を用いて、楕円型Artin群のq-変形されたmonodromy表現を考える。このdataをもとにして生成元と関係式を楕円型Dynkin図形の言葉で表すことが出来た。また、副産物として楕円型Hecke環なる概念が定義出来、I.Cherednikのdouble affine Hecke環の部分環と成ることが示される。更に、楕円型Hecke環の有限次元既約表現が、A.B.Giventalのq-変形されたmonodromy表現として得られた。楕円型Artin群の概念は、斉藤恭司氏の楕円型ルート系の研究によりさらに一般化されている。即ち、楕円型Cartan部分環(楕円型Lie環がある)から無限枚の超曲面を除き、それを無限群であるWeyl群でわった空間の基本群を楕円型Artin群と呼ぶのである。この一般化された楕円型Artin群に対しても、affine Dynkin図形に1個頂点を付け加えた楕円型Dynkin図形の場合、同様の事実が成り立つことが分かっている。Slodowyは,Helmke(京大数理研)と伴に,単純楕円特異点をloop群を用いて構成し,Kac-Moody Lie群を特異点理論との深い関係を明らかにした.さらに,楕円形リー環と,単純楕円特異点の関係が気になるが,、このことは,現在Slodowy-山田により研究されている。
グライコミクスを革新する新たな分析基盤の構築

腫瘍や幹細胞などの新規マーカー探索および感染や免疫反応の分子病理学的解明において、迅速簡便な糖鎖解析技術であるグライコミクスは必須の技術となりつつある。しかし現在のグライコミクスは主にN-型糖鎖を対象としており、もう一つの糖鎖種であるO-型糖鎖の分析については40年以上進歩しておらず新たな技術革新が切望されている。最近、研究代表者はO-型糖鎖の新規遊離法を発見し、従来より格段に微量な分離検出を可能とした。これをグライコミクスへ応用するためには分離したO-型糖鎖の簡便な同定法の開発が必須である。そこで本研究では、O-型糖鎖の大規模ライブラリーを作成し、HPLC, CEおよびタンデム質量分析における各糖鎖の分析固有値を蓄積して糖鎖同定のための新たな技術基盤を構築することを目的としている。平成30年度は、酵素合成によるO-型糖鎖ライブラリーの充実を図るべく、平成29年度に調製したFmocコア4スレオニンを基質として糖転移酵素固定ビーズによる糖鎖伸長反応を検討した。糖転移反応は問題なく進行したが、糖鎖伸長された生成物から糖鎖を遊離しようとしたところ、最近開発したO-型糖鎖の新規遊離法では糖鎖が遊離できないことが判明した。そこで、グリコシル化されたスレオニン誘導体から糖鎖を温和な条件で遊離させる新たな反応スキームについて検討を行った。また、簡便迅速にライブラリーを得るためには生成物をTLCで分取できることが望ましい。微量の試料の検出には目的化合物に蛍光性を付与することが好ましいが、Fmoc基の蛍光波長は紫外部であり肉眼ではTLC上のバンドを蛍光検出できないこともスキーム変更の理由の一つとなった。種々検討の結果、紫外線照射により肉眼で蛍光を確認できる蛍光性基をグリコシル化スレオニンのアミノ基に導入し、酵素による糖鎖伸長後に温和な反応による糖鎖遊離を可能とする新たな方法論を確立した。平成29年度は、独自に開発したO-型糖鎖の新規遊離法を利用して市販の糖タンパク質であるフェツイン、ウシ顎下腺ムチンおよびブタ胃ムチンからO-型糖鎖を遊離後、蛍光標識して分離精製した20種類のO-型糖鎖ライブラリーを構築した。さらに、各種糖転移酵素を用いたO-型糖鎖合成によりライブラリーを拡充するため、産総研ヒト糖鎖遺伝子ライブラリーを利用した糖転移酵素固定化ビーズの作成を開始した。これまでにライブラリーの基幹構造の合成に必要な、3ガラクトース転移酵素、β4ガラクトース転移酵素、およびシアル酸を還元末端のGalNAc6位に転移させるST6GalNAc1の固定化ビーズを作成している。ライブラリー合成のための基質としてN末端をFmoc化したコア4(GlcNAcβ1-3(GlcNAcβ1-6)GalNAc)スレオニンを調製した。平成30年度は、この基質を用いた糖鎖ライブラリー合成を進める予定であったが、開発した糖鎖遊離反応がFmoc基を分解する結果、糖鎖が遊離できないという問題があることが判り、酵素合成は中断した。一方で、新たな糖鎖遊離反応スキームを確立すべく種々検討を行い、中性条件で糖鎖を遊離する方法を確立した。この方法は蛍光性を利用して目視でTLCから生成物を単離することができる方法であり、迅速なライブラリー構築が可能であると考えられる。以上のようにスキーム変更により計画はやや遅れたものの、それを挽回できる新たなスキームを確立できたことから計画はおおむね順調に進展していると判断した。今後は、引き続きO-結合型糖鎖ライブラリーの充実を図るとともに、ライブラリー内の各O-結合型糖鎖についてキャピラリー電気泳動および多段階タンデム質量分析による固有値の蓄積を進める。具体的には1各種リコンビナント糖転移酵素固定化ビーズの調製、2ムチン型母核(コア1コア4)スレオニンを出発原料とするグリコシル化スレオニンライブラリーの作成、3グリコシル化スレオニンライブラリーから蛍光標識O-結合型糖鎖ライブラリーへの変換、4蛍光標識O-結合型糖鎖ライブラリーのHPLC、キャピラリー電気泳動、多段階タンデム質量分析のデータ取得を進めていく。質量分析についてはO-結合型糖鎖ライブラリーの各糖鎖を完全メチル化し、完全メチル化した糖鎖の多段階タンデム質量分析スペクトルについてもデータを取得する。しかしながら現在のグライコミクスは主にN-型型糖鎖を対象としており、もう一つの糖鎖種であるO-型糖鎖の分析については40年以上進歩しておらず新たな技術革新が切望されている。そこで本研究では、O-結合型糖鎖の大規模ライブラリーを作成し、HPLC, CEおよびタンデム質量分析における各糖鎖の分析固有値を蓄積して糖鎖同定のための新たなグライコミクスの技術基盤を構築することを目的としている。平成29年度は、フェツイン、ウシ顎下腺ムチンおよびブタ胃ムチンからO-型糖鎖を遊離後、蛍光標識した後、HPLCにて分取、質量分析計にて構造を確認し、20種類のO-型糖鎖ライブラリーを構築した。

さらに、各種糖転移酵素を用いたO-型糖鎖合成を行いライブラリー化するため、ライブラリーの基幹構造の合成に必要なβ4ガラクトース転移酵素およびβ3ガラクトース転移酵素を調製した。具体的には、産総研ヒト糖鎖遺伝子ライブラリーを利用して、酵素活性領域を発現ベクターに組換え、ヒト培養細胞で可溶性酵素として発現させたものをビーズに固定化した。また、ライブラリー合成のための基質としてN末端をFmoc化したコア4(GlcNAcβ1-3(GlcNAcβ1-6)GalNAc)スレオニンを調製した。これを基質とすることにより酵素反応生成物を蛍光検出によりHPLCで分取することが容易になる。このFmocスレオニン糖鎖と糖転移酵素固定ビーズを用いたO-型糖鎖の合成検討を開始した。市販糖タンパク質からのO型糖鎖ライブラリーの構築、糖転移酵素の調製、糖アミノ酸を基質とした糖鎖アミノ酸の酵素合成など、ほぼ計画どおりに進捗している。腫瘍や幹細胞などの新規マーカー探索および感染や免疫反応の分子病理学的解明において、迅速簡便な糖鎖解析技術であるグライコミクスは必須の技術となりつつある。しかし現在のグライコミクスは主にN-型糖鎖を対象としており、もう一つの糖鎖種であるO-型糖鎖の分析については40年以上進歩しておらず新たな技術革新が切望されている。最近、研究代表者はO-型糖鎖の新規遊離法を発見し、従来より格段に微量な分離検出を可能とした。これをグライコミクスへ応用するためには分離したO-型糖鎖の簡便な同定法の開発が必須である。そこで本研究では、O-型糖鎖の大規模ライブラリーを作成し、HPLC, CEおよびタンデム質量分析における各糖鎖の分析固有値を蓄積して糖鎖同定のための新たな技術基盤を構築することを目的としている。平成30年度は、酵素合成によるO-型糖鎖ライブラリーの充実を図るべく、平成29年度に調製したFmocコア4スレオニンを基質として糖転移酵素固定ビーズによる糖鎖伸長反応を検討した。糖転移反応は問題なく進行したが、糖鎖伸長された生成物から糖鎖を遊離しようとしたところ、最近開発したO-型糖鎖の新規遊離法では糖鎖が遊離できないことが判明した。そこで、グリコシル化されたスレオニン誘導体から糖鎖を温和な条件で遊離させる新たな反応スキームについて検討を行った。また、簡便迅速にライブラリーを得るためには生成物をTLCで分取できることが望ましい。微量の試料の検出には目的化合物に蛍光性を付与することが好ましいが、Fmoc基の蛍光波長は紫外部であり肉眼ではTLC上のバンドを蛍光検出できないこともスキーム変更の理由の一つとなった。種々検討の結果、紫外線照射により肉眼で蛍光を確認できる蛍光性基をグリコシル化スレオニンのアミノ基に導入し、酵素による糖鎖伸長後に温和な反応による糖鎖遊離を可能とする新たな方法論を確立した。平成29年度は、独自に開発したO-型糖鎖の新規遊離法を利用して市販の糖タンパク質であるフェツイン、ウシ顎下腺ムチンおよびブタ胃ムチンからO-型糖鎖を遊離後、蛍光標識して分離精製した20種類のO-型糖鎖ライブラリーを構築した。さらに、各種糖転移酵素を用いたO-型糖鎖合成によりライブラリーを拡充するため、産総研ヒト糖鎖遺伝子ライブラリーを利用した糖転移酵素固定化ビーズの作成を開始した。これまでにライブラリーの基幹構造の合成に必要な、3ガラクトース転移酵素、β4ガラクトース転移酵素、およびシアル酸を還元末端のGalNAc6位に転移させるST6GalNAc1の固定化ビーズを作成している。
マウス胎仔顎下腺の器官培養下での上皮-間充織相互作用におけるマトリックスメタロプロテアーゼの関与

マウス胎仔顎下腺の上皮形態形成は上皮が細胞塊として間充織側に侵入することから始まり、Bud状の上皮細胞塊が形成され、様々な細胞増殖・分化調節を受けながら器官形成が行なわれる。この一連の現象は唾液腺固有のものではなく、毛包、乳腺の上皮形成にも共通して見られる。我々はこの上皮細胞塊の形成や性質を理解することが外胚葉系器官形成のメカニズムを理解する上で重要であると考え、マウス胎仔顎下腺の器官培養下での上皮-間充織相互作用における細胞外基質分解機構の関与を解明する目的で研究を進めた。妊娠12日目のICR系マウス胎仔顎下腺組織の器官培養法にて以下の知見を得た。培養液中に1.10-phenanthoroline(活性型マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤)を10μg/ml添加すると48時間後にはマウス胎仔顎下腺の上皮形態形成は全く観察できなかった。このことは上皮が間充織に侵入する際にマトリックスメタロプロテアーゼ(MMPs)活性化機構が重要な働きをしているのことを示唆している。さらにマウス胎仔顎下腺の器官培養組織をゼラチンを基質とするザイモグラフィーで検索すると培養12時間後より活性型マトリックスメタロプロテアーゼ-2(MMP-2)が発現し、その発現量は培養48時間ピークとなり培養60時間以降はその発現が見られなかった。MMP-2はマウス胎仔顎下腺の器官形成初期において重要な働きをしている事が明らかとなった。我々はこの上皮細胞塊の形成や性質を理解することが外胚葉系器官形成のメカニズムを理解する上で重要であると考え、マウス胎仔顎下腺の器官培養下での上皮-間充織相互作用における細胞外基質分解機構の関与、特に活性型マトリックスメタロプロテアーゼー2(active MMP-2)の関与を解明する目的で研究を進めた。妊娠12日目のICR系マウスから実体顕微鏡下で胎仔顎下腺組織片を分離し、無血清合成培地BGjb(GIBCO)を増殖培養液として37°C・5%CO_2気相下でポアーサイズ0.4μmのcell culturemembrane上で器官培養を行った。この器官培養組織を経時的に採取し、ホモジナイズしたサンプルを0.1%ゼラチンを基質とする。10%SDS-ポリアクリルアミドゲルを用いたザイモグラムに展開し、活性型MMP-2の同定を行なった。さらにin situ zymography法を用いて検索を行った。【結果】マウス胎仔唾液腺器官形成において培養組織中においてMMP-2は唾液腺器官上皮側に発現していることが明らかとなった。さらに活性型MMP-2は培養2日目にピークとして漸減していくことも明らかとなった。平成12年度はマウス胎仔顎下腺器官培養組織におけるMT1-MMPとTIMP-2の発現を検索する予定である。