hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
過酷照射した3d遷移金属合金の磁化及び磁気・構造変態挙動のコンビナトリアル研究

本研究では照射環境下で利用される機器構造物の照射損傷現象を念頭に置き、種々の鉄基3d遷移金属合金の構造および磁気特性に与える照射効果を高効率・高精度に調べるコンビナトリアル型の研究手法を提案している。それらのデータを収集して、照射効果のメカニズムを解明することを目的としている。初年度は、特に試料作製装置の改造・強化に重点的に取り組むとともに、幾つかの試料を作製して重イオン照射し、構造・磁気特性に与える影響を調べた。装置の改造では、2元電子ビーム蒸着装置(独Tectra社製)を新規に導入して既存の超高真空蒸着装置に接続し、基本性能の確認を行った。それと並行して、薄膜作製時の下地基板として用いるMgO(001)の酸素雰囲気中での高温熱処理条件を最適化した。さらに超高真空成膜後の試料の、赤外線ランプ加熱炉による高温熱処理条件を再検討して最適化した。具体的な合金として初年度はFe-Ni系に着目し、Ni組成を16から36%まで系統的に変えたFe-Ni合金薄膜をエピタキシャル成長させて、室温で重イオン照射し、構造と磁気特性を調べた。その過程で、成膜後の高温熱処理の有無で照射影響に違いがあることを確認した。熱処理が無い場合は照射による保磁力の減少傾向が、熱処理がある場合は増加傾向が見られることがわかった。特に29%Ni合金薄膜の熱処理材で照射影響が顕著に現れることがわかり、fcc-bccの相変態と磁化の増大を確認し、原因をFeNi合金の電子状態を考慮し推察した。また、FeNiCr合金(ステンレス鋼)の構造と磁気特性に与える熱時効およびGa照射の影響を、相安定性の観点から整理することができた。装置改造の点では2元電子ビーム蒸着装置の新規導入と基本性能の確認ができた。一方で、FeとNiを同時蒸着する場合、電子ビーム照射時のNiロッドの溶融落下という予期せぬ問題が発生したが、それを解決する方法について見通しを立てた。全体の研究計画とイオン照射の年度内のマシンタイムを考慮した結果、初年度の試料作製では同時蒸着型の試料作製は実施せず、合金ターゲットを用いた薄膜作製を行い、重イオン照射実験を実施した。その結果、FeNi2元合金の構造と磁気特性に与える照射効果のNi組成依存性を初年度に明らかにすることができた。また、FeNiCr合金のGa照射による構造変態では、これまでの研究報告と異なる結果も得られ興味深い成果が得られつつある。以上の理由から、研究は概ね順調に進展していると考えている。初年度に予期せぬ問題として生じた、2元電子ビーム蒸着装置のNiロッドの溶融落下については、特殊形状のるつぼを導入することで対処する予定である。それらを含むエピタキシャル合金薄膜の作製方法の改良と最適化をさらに進めた上で、鉄系3d遷移金属合金の良質な合金薄膜の系統的な作製を実現し、構造と磁気特性に与える照射影響の解明研究を加速させたい。

以上の理由から、研究は概ね順調に進展していると考えている。初年度に予期せぬ問題として生じた、2元電子ビーム蒸着装置のNiロッドの溶融落下については、特殊形状のるつぼを導入することで対処する予定である。それらを含むエピタキシャル合金薄膜の作製方法の改良と最適化をさらに進めた上で、鉄系3d遷移金属合金の良質な合金薄膜の系統的な作製を実現し、構造と磁気特性に与える照射影響の解明研究を加速させたい。
自己組織性蛋白質と脂質二重膜のダイナミックな相互作用の直接観察と動力学的解析

細胞や細胞内小器官は、脂質二重膜を基本構造に持つ生体膜によって区画されその機能を維持している。生体膜の形態調節や変形、移動運搬は膜と相互作用する細胞骨格線維をはじめとする蛋白質によって制御されると考えられているが、その詳しい機構はまだ分かっていない。本研究では、神経シナプスのスパインや細胞分裂時の分裂溝に存在するセプチンを膜小胞に添加すると激しい膜突起形成が生じることを明らかにした。以上のように新たに発見されたセプチンの様な蛋白質による膜突起形成機構を理解するために、線維形成といった異方性を持つ蛋白質の膜への結合の効果を組込んだ膜弾性モデルを使用して、膜小胞の形状変化過程を解析した。膜の曲げエネルギーが、結合した蛋白質の密度およびその配向に応じて決定されるモデルから計算された結果は、膜周囲の溶液中に充分量の蛋白質が存在すると、突起が小胞から伸長することを示し、実験結果を良く再現した。ところで、細胞分裂時に膜変形力を発生する細胞膜直下の蛋白質ネットワークのうち、これまではアニリンが膜に直接会合すると考えられていた。この仮説を検証するために、人工リン脂質膜と組み換え蛋白質を用いた実験を行った結果、セプチンとは異なりアニリンは直接膜とは相互作用しないことが明らかとなり、細胞膜-セプチン-アニリンという分子構築が示唆された。アニリンは細胞骨格アクチンおよび分子モーターのミオシンへの連結を担うと考えられる。細胞や細胞内小器官は、脂質二重膜を基本構造に持つ生体膜によって外界から区画されることによりその機能を維持発揮している。生体膜の形態調節や変形、移動運搬は脂質二重膜と相互作用する細胞骨格線維をはじめとする蛋白質によって制御されると考えられているが、その詳しい機構はまだ分かっていない。本研究では、真核生物のSeptinや、細菌の細胞分裂装置の1つ、Z-ringを形成するTubulin類似蛋白質FtsZを巨大リポソームに添加すると激しい膜突起形成が生じることを明らかにした。この過程をリアルタイムイメージングし、さらに変形した巨大リポソームを電子顕微鏡で観察した結果、同様な膜変形が生じているのにも関わらず、膜突起上で形成されたSeptin線維とFtsZ線維の配向が全く異なっていた。Septin線維はリング状もしくは螺旋状に膜突起を取り巻くように重合するのに対し、FtsZは突起の長軸方向に沿って線維を形成し、さらにそれらの線維が側面で互いに作用することで管状の構造を構築していた。以上の結果は、同じ様な膜突起形成が見られる場合でも、原因蛋白質の種類によって膜突起誘導機構が違っている可能性を明らかにした。このことは生体内には多様で複雑な膜のネットワークを構築するために、異なる膜突起誘導機構が存在している可能性を示している。現在、本研究で観察されたような、リポソーム膜の表面で蛋白質が重合・自己組織化することによって起きる膜突起形成の機構に関して、膜弾性モデルに基づいた理論的研究に着手している。
食後代謝動態に影響を及ぼす栄養成分の分子基盤の解明と疾病予防に対する役割

食後の高血糖は生活習慣病の発症に大きく関与し、砂糖の異性体であるパラチノースが食後高血糖を抑止できる栄養成分であることを同定したが、その生体利用については不明な点が多い。負荷試験を行い、代謝動態を観察した結果、パラチノース負荷群ではシュクロース負荷群に比較して、緩やかな血糖上昇に伴う、肝臓での代謝反応および遺伝子の発現を有することが明らかになった。吸収が緩慢な栄養素は、疾病の治療や予防の上で、極めて重要であることが示唆された。食後高血糖は生活習慣病の発症に大きく関与している。これまでにシュクロースの異性体であるパラチノースが食後高血糖を抑止できる栄養成分であることを同定したが、パラチノースの生体利用については不明な点が多い。各臓器における栄養素の代謝は、栄養素の吸収速度や容量およびそれに伴う内分泌物質の産生・作用によって制御されていることが示唆されている。そのため吸収が緩慢な栄養素(低GI成分)の代謝動態は通常食に比して作用は異なるが、その分子基盤は十分には解明されていない。そこで本研究は、食後代謝動態に影響を及ぼすパラチノースの分子基盤の解明と疾病予防および健康長寿に対する効果について解明することを目的とし、研究を遂行した。今年度、^<13>Cにて標識したパラチノースまたはシュクロースを合成し、投与後における呼気中へのCO_2排泄量について経時的に評価した結果、パラチノース群はシュクロース群に比して、CO_2の排出量は徐々に増加してピークを迎えた。興味深いことに、排泄量AUC∞(経時反応における推定のAUC)においても、パラチノース群は有意に高値を示した。このことから、パラチノース群は、糖の吸収は緩慢であるが、糖の利用は、体内への蓄積に動員(脂肪貯蔵)されるのではなく、効率的に燃焼(酸化)反応が行われた可能性が示唆された。次年度、詳細な機序を解明するために、同実験の組織を用いて、遺伝子発現およびタンパク発現などを解析し、代謝の詳細を同定する。昨年度、パラチノースの摂取がシュクロースの摂取に比し、呼気中へのCO_2排泄量が緩やかに増加してピークを迎えるとともに、排泄量AUC∞(経時反応における推定のAUC)においても、パラチノース群が有意に高値を示した。そこで今年度、その詳細な機序を解明するために、投与試験後の肝臓における代謝に寄与する遺伝子の発現およびタンパク発現について精査を試みた。その結果、食後23時間までに種々の遺伝子の発現に変化が見られ、中でもフルクトース代謝に寄与する遺伝子において、発現が顕著に変化することを見いだした。フルクトースは肝臓で主に代謝されるが、フルクトースの代謝速度が細胞内での栄養素の代謝動態を変化させることに寄与すると考えられた。また興味深いことに、飢餓や摂食に応答することが報告されている繊維芽細胞増殖因子(FGF21)遺伝子の発現変化が著しいことから、本因子が食後の代謝動態の中心的なレギュレータである可能性が示唆された。今後、FGF21に関係する因子および発現調節機構を解明することが可能になることで、疾病との関係性だけでなく、健康長寿を目指す食事療法の開発および貢献に寄与できると考えられる。
睡眠・覚醒(意識)の脳内制御機構の解明と臨床睡眠医学の諸症例との関連性の追究

プロスタグランジン(prostaglandin : PG)E_2は、吻側前脳基底部脳底あるいはその近傍で、主にEP_4受容体の活性化を介して徐波睡眠を促進し、EP_2及びEP_4受容体の活性化を介してレム睡眠を促進することがラットで示された。その他、ナルコレプシーとの関連で注目されているhypocretin-1(orexin A)のラット脳内における日内リズムを明らかにした。さらに研究分担者である渡部のグループは、新規PGE合成酵素の単離・精製に成功し、同酵素が脳内に存在することも明らかにした。他方、臨床睡眠医学的研究においては、研究分担者である黒田、江村らが着々と症例を積み重ねている。今後、臨床や日常生活における人間での所見と、ラットにおける実験データとを比較検討することで、睡眠・覚醒障害や意識障害の病態生理の解明や、健全な睡眠・覚醒に役立つ生活術といったものを見つけ出していくことが可能となると期待される。今回の睡眠に関する基礎的研究においては、(I)吻側前脳基底部脳底の睡眠促進機構、及び(II)間脳領域におけるレム睡眠制御系の追究を行っている。まず(I)については、以前、プロスタグランジン(PG)E_2を吻側前脳基底部の脳底に接するクモ膜下腔内に持続注入した際に、主に徐波睡眠が大きく増加したことに基づき、今回はPGE_2の各種アゴニストを同クモ膜下腔内に持続注入して、その睡眠・覚醒に対する作用を検討した。PGE_2の受容体はEP_1、EP_2、EP_3、及びEP_4の4種類に分類される。各受容体に選択的なアゴニストを投与したところ、EP_4アゴニストで、生理的に生じ得る最大量の徐波睡眠を引き起こすことができた。また興味深いことに、投与量を小さくすると、徐波睡眠の増加量は減少したが、他方レム睡眠の有意な増加が認められた。さらに同領域への投与では、EP_2アゴニストでもレム睡眠の有意な増加が認められている。以上から、吻側前脳基底部脳底あるいはその近傍においては、PGE_2は主にEP_4受容体の活性化を介して、徐波睡眠そして条件によってはレム睡眠をも促進するよう機能し得ることが示された。さらに、同領域には、EP_2及びEP_4受容体の活性化を介して、レム睡眠を促進する機構も存在する可能性が出てきた。次に(II)については、ガス状の細胞間シグナル伝達物質である一酸化窒素(NO)の供与剤の間脳領域への投与がレム睡眠を抑制し、NO合成酵素阻害剤の同領域への投与がレム睡眠を増加させることを見出しているが、さらにこれら投与によるレム睡眠の増減に連関して活動を変化させる神経細胞群の局在をc-Fos免疫組織化学を用いて明らかにしつつある。これにより、視床や視床下部領域に存在して、かつレム睡眠の制御に関与する可能性の高いニューロン群が同定されつつある。今回の研究においては、主に(i)吻側前脳基底部脳底領域における睡眠促進機構と、(ii)間脳領域におけるレム睡眠制御系に注目しつつ、検討を行っている。
インターエレメント結合による自己組織化インターフェースの高次機能化

本研究では、分子内に複数のチオール基を有する多価チオール体で金表面を修飾する多点吸着による多次元有機表面の形成について検討したところ、以下に要約する研究成果を得た。尚、多点吸着による自己集合単分子層に関する研究例はほとんどない。酸化還元活性基としてテトラチアフルバレン(TTF)を用い、分子内に4個のチオール基を有するテトラチアフルバレン誘導体(1)を合成し、多点吸着による自己集合単分子層の形成について検討した。多点吸着による自己集合単分子層の形成は、化合物(1)の1mMジクロロメタン溶液に金電極を浸漬して行った。自己集合単分子層の性質については、電気化学的手法により解析した。即ち、作成したTTF-単分子層修飾金電極の酸化還元挙動をサイクリックボルタンメトリーにより調べた。その結果、ジクロロメタン中におけるTTF-単分子層修飾金電極のサイクリックボルタモグラムからは、TTF骨格に基ずく段階的な2電子移動のピークが観測され、単分子層修飾電極に特有の波形を示した。更に、繰り返し測定を行っても、そのサイクリックボルタモグラムには、ほとんど変化が見られず、テトラチオール(1)が金表面上に修飾されていることが明かとなった。一方、同様にモノチオール単分子層金電極を作成し、サイクリックボルタンメトリーを用い多重走査を行ったところ、モノチオール単分子層の方が不安定であることが判明した。即ち、テトラチオール(1)単分子層は非常に安定であり、テトラチオールの金表面上への多点吸着に起因することが判明した。
肝内胆汁酸イメージングによるBSEP内在化に起因する薬剤性肝障害の解明

薬剤性肝障害を惹起する25化合物のうち9化合物において、BSEPの内在化を引き起こす事が新たに明らかとなり、BSEP内在化という新規阻害機序により肝障害が惹起される可能性が明らかとなった。またラット細胞Sandwich培養肝細胞において、胆汁酸の蓄積に依存した肝毒性を評価するためのスクリーニング系の構築を行い、胆汁酸の蓄積に依存した肝障害の増悪が確認された。肝臓の毛細胆管側膜に発現するBSEP(Bile salt export pump)は胆汁酸を濃縮的に胆汁中に排泄することで胆汁流の生成に寄与している。BSEPの阻害は、毒性の高い胆汁酸が肝細胞内に蓄積することで肝障害が惹起されるため、医薬品候補化合物のBSEP阻害能を評価するためのスクリーニング系が構築されている。しかし、既存の評価系では、輸送体の局在性の低下や代謝物が毒性の要因の場合にはその影響を評価し難い。そこで本研究では、ラット、ヒト遊離肝細胞を用いた、新たなBSEP機能評価系の構築を目的として、薬剤性肝障害を起こす薬物について、BSEPの局在性と輸送機能への影響の検討を行った。BSEPの局在に対する影響を評価するため、BSEP-GFP発現MCARh7777細胞株の構築に成功した。またBSEPの内在化を惹起することが報告されているCyclosporinA(CsA)に加えて胆汁うっ滞を伴う肝障害を誘発する医薬品についても構築したBSEP-GFP評価系を用いた検討を行ったところ、胆汁うっ滞型肝障害を惹起する多くの医薬品において、CsAと同様にBSEPの内在化を引き起こす事が新たに明らかとなった。また、グラム陰性細菌の毒素であり、胆汁うっ滞のモデルとして用いられるLiopopolysachalide(LPS)の投与を行い、胆汁排泄輸送体の局在変化に関わる因子として膜裏打ちタンパク質であるRadixinとの結合が重要な因子であることを明らかとし、更ヒト及びラット肝スライスを用いて、酸化ストレスがヒトにおいても胆汁輸送体の局在に影響を与えていることを明らかとした。これらのことから、本研究を遂行することで得られる検討結果をヒトに対して応用する際の重要な知見となることが期待され、今後に発展性のある研究結果が得られた。肝臓の毛細胆管側膜に発現するBSEP (Bile salt export pump)は胆汁酸を濃縮的に胆汁中に排泄することで胆汁流の生成に寄与している。前年度において構築したBSEP-GFP発現MCARh7777細胞株において、Molecular Probe社の協力のもとハイコンテントスクリーニングを用いて、肝障害を誘発することが既知の化合物(25化合物)について、評価を行った結果、CyclosporinAに加えて胆汁うっ滞型肝障害を惹起する9化合物において、BSEPの内在化を引き起こす事が新たに明らかとなり、BSEP内在化という新規阻害機序により肝障害が惹起される可能性が明らかとなった。更に、ラット肝臓より単離したSandwich培養肝細胞において、胆汁酸の蓄積に依存した肝毒性を評価するためのスクリーニング系の構築を行い(特許出願準備中)、前検討において内在化を惹起する化合物において検討を追加した結果、胆汁酸の蓄積に依存した肝障害の増悪が確認され、内在化に伴う胆汁酸の蓄積が、肝障害の増悪因子となることが本研究の遂行により明らかとなった。
低栄養環境下の腫瘍細胞におけるマクロピノサイトーシスの機能解析

腫瘍細胞は低栄養環境へ適応することにより、悪性化が進展することが知られている。その適応機構の解明は、抗がん剤の新たな標的分子を探索する上で重要な課題であるものの、未だ不明な点が多い。本研究では、腫瘍細胞で特徴的に観察されるマクロピノサイトーシスという細胞外液の取り込み現象が、低栄養環境への適応に寄与するものと予測し、その分子機構の解明を試みた。その結果、ある種の腫瘍細胞では、細胞栄養環境の悪化に伴い、細胞外栄養成分の取り込むために、マクロピノサイトーシスを利用していることを明らかにした。腫瘍細胞の低栄養環境への適応は、癌細胞の悪性化へと繋がることから、その適応機構の解明が期待される。研究代表者は2012年にムチン型糖鎖の合成開始酵素であるppGalNAc-T17が、ヒト胎生腎臓由来HEK293T細胞において、細胞の栄養状態の指標である細胞外N-アセチルグルコサミン濃度に依存して発現調節を受け、マクロピノサイトーシスを制御していることを報告した。古くから腫瘍細胞では、正常細胞ではみられない活発なマクロピノサイトーシスにより、恒常的に細胞外液の取り込みを行うことが知られているが、その生理的な意義は不明であった。2013年5月に悪性腫瘍細胞がマクロピノサイトーシス経路により細胞外タンパク質を積極的に取り込み、アミノ酸の獲得に活用していることがNature誌上で報告され、マクロピノサイトーシス調節因子の解明は抗腫瘍薬の標的因子の探索に繋がる可能性を有している。そこで本研究では、ppGalNAc-T17を含むムチン型糖鎖によるマクロピノサイトーシスの調節機構の解明を目的として研究を行った。モデル細胞として引き続きHEK293T細胞を利用し、マクロピノサイトーシスの解析を行った結果、N-アセチルグルコサミンの他、N-アセチルガラクトサミンやアルブミンの培地中への添加によりマクロピノサイトーシスの抑制効果が見られた。一方で、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミンの添加ではppGalNAc-T17の転写誘導が見られたのに対し、アルブミンの添加では見られなかったことから、マクロピノサイトーシスの調節機構にはppGalNAc-T17依存的な経路と非依存的な経路の存在が示唆された。腫瘍細胞の低栄養環境の適応は、癌細胞の悪性化へと繋がることから、その適応機構の解明が期待される。研究代表者はこれまでにムチン型糖鎖の合成開始酵素の一つであるppGalNAc-T17が、ヒト胎生腎臓由来HEK293T細胞において、細胞の栄養状態の指標である細胞外N-アセチルグルコサミン濃度に依存して発現調節を受け、細胞外液成分の細胞内への取り込み機構であるマクロピノサイトーシスを制御していることを報告した。2013年にある種の悪性腫瘍細胞がマクロピノサイトーシス経路により細胞外タンパク質を積極的に取り込み、アミノ酸の獲得に活用していることが報告され、腫瘍細胞特有のアミノ酸獲得経路として注目された。研究代表者はいくつかの株化細胞や悪性腫瘍細胞におけるマクロピノサイトーシスの定量化を行ったが、細胞種間におけるマクロピノサイトーシス能の有無には明確な法則性を発見することはできなかった。一方で、HEK293T細胞に対して種々の糖類やアミノ酸を添加することによりマクロピノサイトーシスへの影響を測定したところ、N-アセチルグルコサミン以外にも、高濃度のグルコースやN-アセチルガラクトサミン、アルブミンの添加によりマクロピノサイトーシス活性が上昇することを明らかにした。このうち、N-アセチルグルコサミンやN-アセチルガラクトサミンの添加ではppGalNAc-T17の転写誘導がみられたのに対し、アルブミンの添加ではみられなかったことから、マクロピノサイトーシスの調節機構にはppGalNAc-T17依存的経路と非依存的経路が存在するが示唆された。糖鎖生物学本研究の申請段階では、腫瘍細胞におけるマクロピノサイトーシスの生理的意義は全く不明であったが、研究開始初期に他の研究グループからアミノ酸獲得手段としてのマクロピノサイトーシスの生理的意義の報告がNature誌上にあり、本研究の目的の一つは達成された。そこで本課題ではマクロピノサイトーシスの調節機構の解析へと次に焦点を当て、研究を進めてきた。そのなかで、マクロピノサイトーシス調節経路にはppGalNAc-T17遺伝子の転写を介する経路と、独立した経路の異なる2種類の機構が作用していることを見いだすことに成功している。これまでの研究により、マクロピノサイトーシスの調節にはppGalNAc-T17依存的な経路と非依存的な経路の存在が示唆されたことから、特にppGalNAc-T17依存的経路の解析を進めていく。

その際、ppGalNAc-T17による糖鎖修飾タンパク質の探索を行うことにより、分子レベルでのマクロピノサイトーシス調節機構の解明を試みる。
多重項動的平均場を考慮したＸ線分光理論解析枠組の新規構築と強相関電子系への応用

本研究は,3d遷移金属化合物などの強相関電子系に対する内殻X線分光実験で近年観測されているスペクトル微細構造の定量解析から,微視的電子状態に関する新規知見を獲得しうる理論解析枠組の構築を目標としている.この枠組みは現実的な結晶構造のもとで動的平均場(DMF)を考慮するもので,従来のスペクトル解析に用いられてきたクラスタ模型などの不純物模型では考慮できなかった,物性に直結する多電子状態を有効的に取り込んだ解析ができることが大きな特徴である.今年度は(1)新規枠組を用いて,応用よりの物質の内殻X線光電子分光(XPS)の解析を進めつつ,(2)共鳴X線発光分光(RXES)など種々の分光過程で観測されている微細構造解析に枠組を適用した.(1)巨大磁気抵抗や多彩なスピン・軌道・電荷秩序を示すことで知られるLa1-xSrxMnO3(LSMO)のMn 2p XPSでは,キャリアドーピングや温度変化に敏感な主ピーク微細構造が観測されている.DMFを考慮した枠組でこの主ピーク構造を解析し,LSMOが示す軌道・スピン秩序との関係を微視的立場から初めて明らかにした.この成果は,Mn 2p XPSが長距離秩序のパターンやMn間のスピン・軌道の相関を調べる有効な手段となることを示す意義があるものと考える.また,前年度に引き続きスピンクロスオーバー現象で知られるLaCoO3のCo 2p XPSの解析を進め,終状態における非局所電荷移動遮蔽がCo間のスピン状態に強く依存することを見出し,Co 2p XPSがスピン状態を調べる有効な手法になることを提案した.(2)LSMOや3d遷移金属酸化物の典型物質であるNiOやCoOに対する高分解能RXES(L端)実験スペクトルを新規枠組で定量的に再現し,RXES過程においても従来の一不純物模型では考慮できない3dバンドの効果が本質的に重要であることを示した.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、3d遷移金属化合物などの強相関電子系に対する新たな微視的知見の獲得を目指し、近年の内殻X線分光実験で観測されているスペクトル微細構造の定量解析を可能とする理論枠組を構築する.この枠組は現実的な結晶構造のもとで動的平均場を考慮するもので、従来のスペクトル解析で用いられてきた不純物模型では考慮できなかった、物性に直結する結晶中の多電子状態を有効的に取り込んだ解析ができることが大きな特徴である.今年度は、(1)新規枠組の構築を進め、(2)遷移金属化合物の典型物質や応用寄りの物質を対象に内殻X線光電子分光(XPS)の微細構造解析に行った.(1) 3d系を中心とする物質群での定量的な解析を可能にするには、3d電子の軌道自由度をフルに考慮した上で不純物Anderson模型から自己エネルギーを高精度かつ効率良く計算する必要がある.そこで今年度は連続時間モンテカルロ法を用いた不純物Anderson模型の計算コードを開発し,3d系全般への適用を念頭に計算環境を整えた.(2)典型物質であるCoOなどのMO系や応用よりの幾つかの物質の解析に適用し、2pXPSのスペクトル微細構造が物性に直結する価電子帯情報を強く反映している事を示した.例えば、巨大磁気抵抗で知られるLa1-xSrxMnO3 (LSMO)のMn2pXPSでは、主ピーク微細構造の温度変化やキャリアドーピング依存性が注目されているが、本研究ではそれらスペクトルの特徴がLSMOの示す多彩な長距離秩序と密接な関係にあるスピン・軌道選択的な終状態遮蔽効果に起因することを示した.また、スピンクロスオーバー現象で知られるLaCoO3の解析ではCo2pXPSでスピン選択的な非局所遮蔽効果が生じる事を示し、Coスピン状態の転移を調べる良いモニターになり得ることを指摘した.本年度得られた成果に関する論文を現在執筆中である.本研究は,3d遷移金属化合物などの強相関電子系に対する内殻X線分光実験で近年観測されているスペクトル微細構造の定量解析から,微視的電子状態に関する新規知見を獲得しうる理論解析枠組の構築を目標としている.この枠組みは現実的な結晶構造のもとで動的平均場(DMF)を考慮するもので,従来のスペクトル解析に用いられてきたクラスタ模型などの不純物模型では考慮できなかった,物性に直結する多電子状態を有効的に取り込んだ解析ができることが大きな特徴である.今年度は(1)新規枠組を用いて,応用よりの物質の内殻X線光電子分光(XPS)の解析を進めつつ,(2)共鳴X線発光分光(RXES)など種々の分光過程で観測されている微細構造解析に枠組を適用した.(1)巨大磁気抵抗や多彩なスピン・軌道・電荷秩序を示すことで知られるLa1-xSrxMnO3(LSMO)のMn 2p XPSでは,キャリアドーピングや温度変化に敏感な主ピーク微細構造が観測されている.DMFを考慮した枠組でこの主ピーク構造を解析し,LSMOが示す軌道・スピン秩序との関係を微視的立場から初めて明らかにした.この成果は,Mn 2p XPSが長距離秩序のパターンやMn間のスピン・軌道の相関を調べる有効な手段となることを示す意義があるものと考える.また,前年度に引き続きスピンクロスオーバー現象で知られるLaCoO3のCo 2p XPSの解析を進め,終状態における非局所

電荷移動遮蔽がCo間のスピン状態に強く依存することを見出し,Co 2p XPSがスピン状態を調べる有効な手法になることを提案した.(2)LSMOや3d遷移金属酸化物の典型物質であるNiOやCoOに対する高分解能RXES(L端)実験スペクトルを新規枠組で定量的に再現し,RXES過程においても従来の一不純物模型では考慮できない3dバンドの効果が本質的に重要であることを示した.「研究実績の概要」にも述べたように3d系全般への適用を目指し、当初予定していなかった連続時間モンテカルロソルバーのコードを独自に組み上げ、計算環境を整えた.これにより、MO系などの典型物質の2pXPSスペクトル微細構造と電子状態の関連性について新たな知見を獲得をしつつ、2年目に予定していた幾つかの応用寄りの物質のスペクトル微細構造解析にも着手した.La1-xSrxMnO3をはじめとする物質の解析結果は、スペクトル微細構造と物性を特徴付ける価電子状態の密接な関連を示しており、またその背後には、当初の予想を大きく超える豊富な物理的内容が含まれていることがわかった.これにより、本研究で構築し新規枠組の有効性を強く再確認した.27年度が最終年度であるため、記入しない。3d系全般に対して適用可能となった新規枠組を用いて、2pXPSで広く報告されている特徴的な主ピーク微細構造解析を継続し、スペクトル微細構造と非自明な多体3dバンドとの関連性を微視的立場から系統的に明らかにする.並行して当初の予定通り、高分解能X線共鳴非弾性散乱(RIXS)など他の分光過程の解析を行い、枠組みの有効性を多角的に検証するとともに、選択則の異なる分光過程からの新たな知見の獲得を目指す.具体的には今年度までの解析で、2pXPSにおける非自明な3dバンド効果の影響を明らかにしたNiO, CoO, La1-xSrxMnO3などの物質を対象にL端RIXSの解析を行う.これらの物質ではクラスタ模型などの従来の理論枠組では説明できない微細構造の存在が知られており、本研究課題での解析で新たな知見が得られるものと期待される.27年度が最終年度であるため、記入しない。
大規模ネットワーク動的システムのロバスト分散協調制御

ネットワーク上に散在する複数のエージェントの局所的な相互作用により,系全体として同期やフォーメーション等の協調的なタスクを達成するシステムをネットワーク動的システムという.本研究課題では,エージェントモデルのゲイン有界な不確かさ及びネットワーク構造の確率的変動の下で,ネットワーク動的システムのロバスト性解析を行い,ロバストに同期を達成するための十分条件を導出した.また,これらの解析に基づき,上述の不確かさ・変動に対してロバストに同期を達成する分散協調制御系の設計法を提案した.以上の研究成果は,大規模ネットワーク上のロバスト分散協調制御システムの構築のための理論的基盤の一翼を担うものである.本研究の目的は,大規模ネットワーク動的システムにおいて,各エージェントのモデル変動及びネットワーク構造の変動の下で,システムのロバスト性を解析することにより,ネットワーク構造とロバスト性・制御性能との関係を解明し,ロバスト分散協調制御系を構築するための理論的基盤を構築することにある.今年度の成果の概要は,以下の通りである.1.加法的モデル誤差を有する線形エージェントからなるネットワーク動的システムに対して,オブザーバ型分散制御器により各エージェントの状態同期をロバストに達成するための必要十分条件を導出し,許容可能なモデル誤差の限界を評価した.2.受動的な非線形エージェントからなる離散時間ネットワーク動的システムに対して,ネットワーク構造が確率的に変動する状況下での同期制御について検討し,同期を達成する相対出力フィードバック則が存在するための十分条件をグラフラプラシアンの期待値を用いて導出した.3.入力飽和を有する線形エージェントからなるネットワーク動的システムに対して,飽和非線形要素をセクター有界なモデル誤差とみなすことにより,同期を達成する相対状態フィードバックゲインを設計するための線形行列不等式条件を導いた.4.小型移動ロボットe-puckを購入して検証実験の環境を整備した.また,e-puckを用いて,フォーメーション制御の予備実験を行なった.ネットワーク上に散在する複数のエージェントの局所的な相互作用により,系全体として同期やフォーメーション等の協調的なタスクを達成するシステムをネットワーク動的システムという.本研究課題では,エージェントモデルのゲイン有界な不確かさ及びネットワーク構造の確率的変動の下で,ネットワーク動的システムのロバスト性解析を行い,ロバストに同期を達成するための十分条件を導出した.また,これらの解析に基づき,上述の不確かさ・変動に対してロバストに同期を達成する分散協調制御系の設計法を提案した.以上の研究成果は,大規模ネットワーク上のロバスト分散協調制御システムの構築のための理論的基盤の一翼を担うものである.本研究の目的は,大規模ネットワーク動的システムにおいて,各エージェントのモデル変動およびネットワーク構造の変動の下で,システムのロバスト性を解析することにより,ネットワーク構造とロバスト性・制御性能との関係を解明し,ロバスト分散協調制御系を構築するための理論的基盤を構築することにある.今年度の成果の概要は,以下の通りである.1.エージェント間の通信が非対称である(双方向でない)ようなネットワークは有向グラフを用いてモデル化できる.有向グラフ上の非線形ネットワーク動的システムにおいて,エージェントのノミナル動特性が受動的であるという仮定のもとで,エージェント動特性の加法的変動に対してロバストな同期制御を達成するための条件を導出した.2.線形時不変なエージェントからなるネットワーク動的システムにおいて,エージェントの動特性の非均一性を加法的モデル変動として表現し,各エージェントの状態をロバストに同期させる問題を検討した.オブザーバ型分散制御則によりロバスト同期が達成されるための必要十分条件を,グラフ・ラプラシアンの固有値とエージェント動特性に関連するリカッチ方程式の解を用いて導出し,同期のために許容可能なモデル変動の大きさの限界を評価した.3.受動的とは限らない非線形エージェントからなるネットワーク動的システムにおいては,ネットワークのグラフ・ラプラシアンの固有値を適切な領域内に配置することによって各エージェントが同期することが知られている.制御理論における領域極配置の手法を援用しすることにより,同期を達成するようなエージェント間結合重み(分散フィードバックゲイン)を設計する方法を提案した.本研究の目的は,大規模ネットワーク動的システムにおいて,各エージェントのモデル変動およびネットワーク構造の変動の下で,システムのロバスト性を解析することにより,ネットワーク構造とロバスト性・制御性能との関係を解明し,ロバスト分散協調制御系を構築するための理論的基盤を構築することにある.今年度の成果の概要は,以下の通りである.○確率的に変動するネットワーク上の非線形エージェント群において,エージェントモデルのゲイン有界な加法的不確かさに対してロバストに同期を達成するための十分条件を導出した(SSS'14で口頭発表).○双方向のエージェント間通信が可能なネットワーク(無向グラフ)上で,入力端にセクター有界な不確かさを有する線形エージェント群に対して,数値的凸最適化によりエージェント数に依らない効率的な同期制御系設計法を提案した(論文投稿中).○入力飽和を有する線形エージェント群が同期を達成するための十分条件を線形行列不等式を用いて導出した(MTNS2014及び第57回自動制御連合講演会で発表).また,大規模複雑ネットワークモデルの一つであるスモールワールドネットワークにこの同期条件を適用し,ネットワーク密度と同期可能性との関係を数値的に検討した(論文投稿中).○関連研究として,障害物回避を考慮したリーダーレスフォーメーション制御手法を提案し,数値シミュレーション及び小型移動ロボット群を用いた実験でその有用性を検証した(ICCAS2014で口頭発表).制御理論本年度はまず,非均一なエージェント群またはネットワーク構造の変動の下でのロバスト協調制御に関する研究を行なう予定であった.非均一なエージェントモデルに関しては受動性の仮定の下で,また,ネットワーク変動については確率的な変動の下で,協調・同期を達成するための条件を導出した.

この研究成果は,45th ISCIE SSS'13にて発表を行なった.なお,均一なノミナルモデルを持つ線形エージェント群のロバスト協調制御についても前年度に引続き研究を行い,その成果はIEEE Trans. on Automatic Controlにて論文掲載された.ロバスト協調制御の特別な場合として,入力飽和を有する線形エージェントからなるネットワーク動的システムに対して,エージェント間通信が双方向との仮定の下で,飽和非線形要素をセクター有界なモデル誤差とみなすことにより,ロバスト協調制御の枠組みで,同期を達成する相対状態フィードバックゲインを設計するための線形行列不等式条件を導いた.この結果は,第1回SICE制御部門マルチシンポジウムで発表し,これに関連する研究も第56回自動制御連合講演会で発表した.もう一つの研究項目として,通信路制約の下でのロバスト協調条件の検討があったが,これに関しては未着手であり,次年度に取り組むことにする.また,実システムを想定した検証実験・シミュレーションでは,小型移動ロボット群のフォーメーション制御の実験・シミュレーションを進めており,次年度に国内学会等で発表予定である.以上のように,未着手の研究項目もあるが,概ね順調に研究を進めている.本年度の研究計画は,先行研究の結果を調査・整理した上で,モデル変動を有するネットワーク動的システムのモデリング及び均一なノミナルモデルと時不変ネットワークに対するロバスト協調条件に関する研究を行うことになっていた.「研究業績の概要」で述べた通り,本年度の研究では,ゲイン有界な加法的モデル変動を有するエージェントモデルがロバスト分散協調制御において有用であると考え,有向グラフで定義される時不変ネットワーク上でのロバスト協調(同期)の条件を導出した.この条件は,受動性の仮定の下で非均一なノミナルモデルにも適用可能である.また,この条件は,ネットワークのグラフ・ラプラシアンに関する線形行列不等式として与えられるため,ロバスト性とネットワーク構造との関係を調べることが可能である.以上のことから,本年度の研究目標はおおむね達成できていると考える.1【エージェントモデル不確かさとネットワーク変動の両方にロバストな分散協調制御】前年度の結果を踏まえて,時変ネットワーク上でエージェントモデルの不確かさに対してロバストな分散協調制御系の設計を検討する.2.【複雑ネットワーク上の分散協調制御】社会システム,インターネット,電力網を表現するモデルとして広く用いられているスモールワールドネットワークやスケールフリーネットワーク上での分散協調制御について,グラフの次数分布,平均頂点間距離,クラスタ係数などと協調・同期のし易さ・ロバスト性との関連を検討する.
セルフ・コントロールの活性化に影響を及ぼす状況要因の検討

本研究では、調整型と改良型という2つのセルフ・コントロール(以下、それぞれ調整型SC、改良型SCと表記)が、どのような状況でもっとも活性化するのか、加えて、その学習過程に影響を及ぼす諸要因を明らかにすることを目的とした。被験者は大学生579名(平均年齢19.5歳)であり、授業クラス単位の集団法により質問紙調査を実施した。被験者は、まず最初に、状況の困難度(2水準)と行動結果の明確さ(2水準)を要因とする4つの状況についての呈示分を読み、各状況における2つのセルフ・コントロールの実行度を評定した。状況要因の背景場面としては、試験の準備期間をとりあげた。おもな結果は、以下の通りである。1.調整型SC(短期的な状況で発生したストレス事態に対処し、情動的・認知的な妨害要因の影響を低減)では、設定した4つの状況における実行度に有意は変化は認められなかった。調整型SCは状況の困難度や行動結果の明確さといった状況要因の影響を受けにくいことが示唆される。しかしながら、調整型SCのほとんどが内潜的な行動(例えば、自己教示や気そらし)であるため、改良型SCに比べて習慣化されやすく、かつ、その変化を自覚しにくいという可能性がある。この点に関しては、さらに検討を要する。2.改良型SC(より自発的な問題設定にもとづき、目標志向的な行動が実行された結果、比較的長期にわたり基準値以上の水準で標的行動を維持)では、「困難度が高くかつ行動結果が明確な状況」から、以下、「困難度高-結果不明確」、「困難度低-結果明確」、「困難度低-結果不明確」の順で実行度が高かった。この結果から、調整型SCに比べ、改良型SCは状況要因の影響を受けやすいことが明らかになった。本研究で得た結果をもとに条件統制を行い、詳細な実験データを蓄積した上で、より適切なセルフ・コントロールを学習するための条件を明らかにしたい。
グリオスタチンによる慢性関接リウマチ滑膜炎発症の分子機構の解明

そこで平成9年度はまずグリオスタチンの滑膜炎発症作用をin vivoにて検討するために必要な大量のグリオスタチンを精製した.グリオスタチンcDNAを組み込んだ発現ベクター(pET-His)をE.Coliにトランスフェクトしグリオスタチンを発現させ,グリオスタチン組換体を調製した.E.Coli由来のLPSを除去するため,ポリミキシンBを用いた.こうして得られたグリオスタチン組換体を雌日本白色ウサギの膝関節腔内に注入し,膝滑膜を組織学的に検討した.10μg/週,4週間投与群では滑膜への単核球,好中球などの炎症細胞浸潤があり,滑膜表層細胞の肥厚と微小血管増生が認められた.20μg/週、4週間投与群ではさらに炎症細胞浸潤が著明となり,間質の浮腫も亢進した.10μg/週、3カ月投与群ではリンパ球集簇さらに胚中心を伴ったリンパ濾胞形成も認められ,絨毛状滑膜を呈したものもあった.滑膜表層細胞の肥厚と微小血管増生は,短期投与群と比べて増強していた.平成10年度には,RA疑い、早期臥患者の血清グリオスタチン濃度の推移、RA滑膜切除術前後の血清グリオスタチン濃度の推移を酵素免疫測定法にて測定した.滑膜切除術後の血清グリオスタチン濃度は,前と比べて明らかに低下した.そこで本年度はまずグリオスタチンの滑膜炎発症作用をin vivoにて検討するために必要な大量のグリオスタチンを得るために、グリオスタチンcDNAを組み込んだ発現ベクター(pET-His)をE.Coliにトランスフェクトしグリオスタチンを発現させ、グリオスタチン組換体を調製した。E.Coli由来のLPSを除去するため、ポリミキシンBを用いた。こうして得られたグリオスタチン組換体を2.5kgの雌日本白色ウサギの右膝関節腔内に5-20μgを1週間に1度、計4週から3ヶ月間注入した。コントロールとして反対側の膝関節内に同量のウシ血清アルブミンを注入した。最終関注7日後に屠殺し、膝滑膜の組織標本を組織学的に検討した。10μg/週、4週間投与群では滑膜への単核球、好中球などの炎症細胞浸潤があり、滑膜表層細胞の肥厚と微小血管増生が認められた。20μg/週、4週間投与群ではさらに炎症細胞浸潤が著明となり、間質の浮腫も亢進した。10μg/週、3ヶ月投与群ではリンパ球集簇さらに胚中心に伴ったリンパ瀘胞形成も認められ、絨毛状滑膜を呈したものもあった。滑膜表層細胞の肥厚と微小血管増生は、短期投与群と比べて増強していた。コントロール群ではいずれも正常像かもしくはごく軽度の滑膜炎像を示すのみであった。そこで平成9年度はまずグリオスタチンの滑膜炎発症作用をin vivoにて検討するために必要な大量のグリオスタチンを精製した.グリオスタチンcDNAを組み込んだ発現ベクター(pET-His)をE.Coliにトランスフェクトしグリオスタチンを発現させ,グリオスタチン組換体を調製した.E.Coli由来のLPSを除去するため,ポリミキシンBを用いた.こうして得られたグリオスタチン組換体を雌日本白色ウサギの膝関節腔内に注入し,膝滑膜を組織学的に検討した.10μg/週,4週間投与群では滑膜への単核球,好中球などの炎症細胞浸潤があり,滑膜表層細胞の肥厚と微小血管増生が認められた.20μg/週、4週間投与群ではさらに炎症細胞浸潤が著明となり,間質の浮腫も亢進した.10μg/週、3カ月投与群ではリンパ球集簇さらに胚中心を伴ったリンパ濾胞形成も認められ,絨毛状滑膜を呈したものもあった.滑膜表層細胞の肥厚と微小血管増生は,短期投与群と比べて増強していた.平成10年度には,RA疑い、早期臥患者の血清グリオスタチン濃度の推移、RA滑膜切除術前後の血清グリオスタチン濃度の推移を酵素免疫測定法にて測定した.滑膜切除術後の血清グリオスタチン濃度は,前と比べて明らかに低下した.
食事パターンとアディポネクチン関連遺伝子多型の交互作用に関する分子疫学研究

日本人の代表的な食事パターンが生体指標(アディポネクチンや肝機能)に与える影響について検討した結果、これらの関連には、男女差がみられた。また、その他の生活習慣(運動、飲酒、喫煙)との交互作用が認められた。日本人の代表的な食事パターンとアディポネクチン関連遺伝子多型(ADIPOQ G276T)の交互作用がHbA1cに与える影響について検討を行った。TT群では、Seafood patternにおいてHbA1cの有意な低下傾向が認められた。一方、TG+GG群ではこれらの関連は認められなかった。これらの関連に統計学的有意な交互作用は認められなかった。脂肪細胞から分泌される生理活性物質の一つであるアディポネクチンは、肥満に伴い低下し、低アディポネクチン血症が生活習慣病と密接に関わることが報告されている。肥満の原因には食習慣が大きく関与しているが、食習慣がアディポネクチンに与える影響は明らかではない。日本人の食事パターンと血中アディポネクチンとの関連を検討するため、正確でバイアスの少ない大規模コホート研究において検討を行った。日本多施設共同コーホート研究(J-MICC Study)佐賀地区のベースライン調査参加者4069歳の男女約12,000名の総アディポネクチン、高分子アディポネクチンを測定し、食事パターンとの関連を検討した。食事調査は食物摂取頻度調査(46食品)を用いて行い、因子分析(主成分法)を用いて、バリマックス法による因子回転を行い5つの食事パターン(healhy, Western, seafood, bread, dessert)を抽出した。男性では、seafoodにおいて、総アディポネクチンで有意な低下傾向(P=0.02)が認められたが、高分子アディポネクチンでは関連が認められなかった(P=0.11)。breadおよびdessertにおいて,総アディポネクチン(それぞれ、P<0.001、P=0.002)または高分子アディポネクチン(それぞれ、P=0.002、P=0.03)で有意な上昇傾向が認められた。女性では、breadおよびdessertにおいて,総アディポネクチン(それぞれ、P=0.009、P=0.004)または高分子アディポネクチン(それぞれ、P=0.05、P=0.02)で有意な上昇傾向が認められた。日本人における食事パターンと血中アディポネクチンとの間に関連が認められたことから、さらにアディポネクチン関連遺伝子多型との交互作用を検討するため文献的検討を進めた。血中アディポネクチン濃度は内臓脂肪蓄積に伴い低下し、低アディポネクチン血症は、糖尿病、脂質異常のリスク因子であることが報告されている。本研究は、アディポネクチン遺伝子多型ADIPOQと日本人の代表的な食事パターンが血中脂質に与える影響についてJ-MICC Study参加者約500人のデータを用いて横断解析を実施した。また、近年、肥満者における血中アディポネクチンの低下は肝機能低下の独立した危険因子であることも疫学的に明らかにされており、文献的検討を行った。その結果、日本人における肝機能と食事パターンとの関連についての報告はほとんどないことが明らかになったことから、J-MICC Study佐賀地区のベースライン参加者12,000人のデータを用いてこれらについて追加解析を実施した。疫学申請時の研究目的を達成するため、約12,000名の血中アディポネクチン(総アディポネクチン、高分子アディポネクチン)測定を計画的に実施し、データ解析を行った。また、追加項目として、酸化ストレスマーカーである尿中8OHdGの測定を実施している。地域住民コーホートに参加した対象者の尿サンプルを用いて測定した8OHdGを用いて、食事パターンとの関連を横断的に検討する。さらに、アディポネクチン関連遺伝子多型との交互作用の関連について検討を行う。平成25年度に、血中アディポネクチンの分析後、解析のためのデータセット作成が予定より時間を要したため、当初計画していた学会発表を行うことができなかったため。データ解析により得た知見についての学会発表を次年度に行うこととし、未使用額はその経費に充てることとしたい。
TGF-βによるイヌ破骨細胞形成調節：マウス破骨細胞形成モデルと異なる機構の解明

イヌ骨髄細胞から再現性良く破骨細胞を分化させることができた。イヌ破骨細胞形成機構は、マウスの機構とオーバーラップする点があるもののTGF-βの役割はマウスとイヌとで異なり、イヌ細胞ではTGF-βは破骨細胞を負に制御した。この理由の一つは、破骨細胞分化促進活性を有するMitf-Eの発現抑制による。本研究の結果は、特定の動物種の破骨細胞形成に影響を及ぼす要因を同定するためには、その動物種の細胞を使って検討する必要性があることを明示する。長寿化に伴い、イヌの(潜在的)骨疾患は増加傾向にある。破骨細胞は骨吸収の責任細胞なので、破骨細胞の数と機能の制御破綻は骨代謝異常に繋がる。本研究では、イヌ骨髄細胞を破骨細胞に分化させる際にTGF-βが果たす役割、ならびに作用機構を明らかにすることを第一の目的とする。また、イヌ末梢血単核細胞が破骨細胞に分化する方法の確立、ならびに、血中骨代謝関連因子濃度と分化能との関連の明確化を第二の目的とする。これらの解析を通して、イヌ破骨細胞活性化を介した骨疾患惹起に関する基礎的理解が研究全体の目的である。1.イヌ骨髄細胞から破骨細胞形成過程におけるTGF-βの役割2.イヌ破骨細胞形成過程を促進するMitf-EとTGF-βの関係3.イヌ末梢血単核細胞から破骨細胞分化法の確立4.イヌ血中TGF-β濃度、骨代謝マーカー濃度と破骨細胞分化能の関係を明らかにする。平成27年度はイヌ骨髄細胞の入手が困難だったため、破骨細胞形成において課題3である、末梢血単核細胞からの破骨細胞分化法の確立に向けた基礎検討を行った。比較的容易に多量の末梢血液の入手が可能なウシを用いて検討したところ、5mL程度の末梢血液由来の単核細胞からM-CSFとRANKLの誘導で良好な破骨細胞に分化できることがわかった。課題2に対応するため、イヌの各種組織由来RNAからcDNAを作製し、イヌMitf-E, -A, -H, -Mの各アイソフォームのcDNA発現ベクターを構築した。また、Mitfの標的遺伝子群であるTrap, CtsK, Oscarのイヌ由来プロモーター領域の配列情報を確認し、これらのプロモーター領域を組み込んだレポーターコンストラクト作製の準備を整えた。平成27年度に予定していた課題1のイヌ骨髄細胞から破骨細胞形成過程におけるTGF-βの役割において、イヌ生体からの骨髄細胞の入手が困難だったため、骨髄からの分化実験が対応できなかった。しかし、課題3であるイヌ末梢血単核細胞から破骨細胞分化法の確立において、ウシ末梢血を用いた予備実験で、梢血単核細胞から良好な破骨細胞分化に成功した。課題2において、イヌ破骨細胞形成過程におけるMitfアイソフォームやそれらの標的遺伝子群を評価するための系を概ね作製することができた。第一の目的に関わる分子機序を明らかにするため、H27年度に引き続き、イヌ破骨細胞形成過程を促進する各種転写因子(NFATc1, PU.1, AP-1, NFkB)の発現ベクターや破骨細胞分化関連遺伝子(IntgαV, DC-STAMP, CTR, Intgβ3)のプロモーター領域を組み込んだレポーターコンストラクトを新たに作製した。H27年度に作製したプラスミドコンストラクトも利用して、予備的なルシフェラーゼアッセイを実施した。イヌの各種組織由来のRNAを入手し、cDNAを作製して各種遺伝子発現の測定に対応できるようにした。また、第二の目的であるイヌ末梢血単核細胞からの培養を試みた。マクロファージ系細胞の単離と長期間の生存は維持できるものの破骨細胞分化実験に必要な細胞数を増殖させるには至らなかった。凍結保存したイヌ骨髄由来単核細胞ではGM-CSFとIL-4を用いることにより、長期間の培養は必要なものの、十分な増殖細胞数を得ることができた。ウシ末梢血液から増殖培養した単核細胞から確立した方法により、再現性良く破骨細胞へ分化できることを確認した。イヌの骨髄由来単核細胞を用いての破骨細胞形成までの分化培養法と破骨細胞形成過程におけるMitfやTGF-βの関わりについて一部データをまとめて、国際英文雑誌へ投稿した。イヌ破骨細胞形成過程における分子機序を評価するための一連の転写因子発現ベクターやそれらの標的遺伝子群のレポーターコンストラクトを構築することができた。イヌ末梢血単核細胞からの破骨細胞形成方法の確立に至っていないが、ウシ末梢血を用いて血単核細胞から良好な破骨細胞への分化の再現性は確認できた。

本研究では、イヌ骨髄細胞を破骨細胞に分化させる際にTGF-βが果たす役割、ならびに作用機構を明らかにすること、またイヌ末梢血単核細胞が破骨細胞に分化する方法の確立、ならびに、血中骨代謝関連因子濃度と分化能との関連の明確化を目的とする。これらの解析を通して、イヌ破骨細胞活性化を介した骨疾患惹起に関する基礎的理解が研究全体の目的である。破骨細胞分化において必須のサイトカインであるRANKLは、細胞膜上のRANKと結合すると、その下流でNFκBを活性化してNFATc1の転写活性を誘導する。産生されたNFATc1は他の転写因子と協働して破骨細胞分化関連遺伝子を発現する。そこで、NFκBの構成分子であるイヌのRel A、Rel B、p50、p105のCDS領域を組み込んだ発現系ベクターを構築した。また、RANKの発現系コンストラクトの構築も試みた。RANKL誘導のイヌ破骨細胞分化過程に関与すると推測される、これまでに作製した各種転写因子や細胞内情報伝達因子の発現系ベクター(NFATc1、AP-1、MITFなど)と破骨細胞形成関連遺伝子のプロモーター領域を組込んだコンストラクト(Trapなど)を用いて、MDCK細胞やHela細胞においてレポーターアッセイを行なった。いくつかの組合せで期待する反応は得られたものの、分子機序を解明するには至らなかった。マウスと同様にイヌ破骨細胞形成過程においてMitf-E isoformの発現誘導が重要であったが、マウスと異なりイヌではTGF-β刺激により破骨細胞形成が抑制された内容を国際雑誌へ論文発表した。これまでに確立した、ウシ末梢血単核細胞からの破骨細胞形成過程におけるTGF-βの果たす影響を調べている。イヌ骨髄細胞から再現性良く破骨細胞を分化させることができた。イヌ破骨細胞形成機構は、マウスの機構とオーバーラップする点があるもののTGF-βの役割はマウスとイヌとで異なり、イヌ細胞ではTGF-βは破骨細胞を負に制御した。この理由の一つは、破骨細胞分化促進活性を有するMitf-Eの発現抑制による。本研究の結果は、特定の動物種の破骨細胞形成に影響を及ぼす要因を同定するためには、その動物種の細胞を使って検討する必要性があることを明示する。イヌ生体からの骨髄細胞の安定した入手はあまり期待できない。平成27年度の成果として、ウシではあるが、5mL程度の比較的少量の末梢血からでも十分な破骨細胞分化が誘導できることがわかった。従って、今後はイヌ末梢血を対象として本手法を応用し、イヌ破骨細胞分化を誘導し、課題1の破骨細胞形成過程におけるTGF-βの役割を調べる。イヌ末梢血液からのマクロファージ系細胞の十分な増殖方法を検討するとともに、ウシ末梢血液から破骨細胞分化は再現性良く誘導できたため、この系を用いてのTGF-βの作用を検討する。凍結保存したイヌ骨髄由来単核細胞をH28年度で確立した方法で増殖させ、破骨細胞分化を誘導する。この培養系を用いて、破骨細胞形成過程での各種遺伝子発現やTGF-βの役割を調べる。これまでに構築した転写因子発現ベクターとレポーターコンストラクトを駆使してレポーターアッセイを行い、また必要に応じてゲルシフトアッセイも利用して、イヌ破骨細胞分化における遺伝子発現の分子機序とTGF-βがそこに果たす役割を明らかにする。分子生物学