hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ダイナミック パラトグラフィーによる舌運動の解析

しかし、正常咬合者や不正咬合者における発音や嚥下にともなう舌運動については、いまだ明確ではない。そこで平成5年度にひきつづき、舌運動を口蓋に装着した電極への舌の接触・非接触で見るダイナミックパラトグラフィーを用いて、舌運動と顎顔面形態との関連性について臨床的指針を得るため、以下の研究を行った。本学学生より種々の咬合を有する51名(男25、女26、平成5年度分も含む)を選出し、平成5年度と同様の記録方法に従って、側方頭部X線規格写真の撮影、歯列模型の作製、および、ダイナミックパラトグラムの記録を行った。それをもとに、顎顔面形態とどのような関連性があるかを単相関分析、および重回帰分析で調べた。その結果、舌の口蓋接触時間と下顎の回転に関する計測項目(下顎角、下顎下縁平面と大臼歯のなす角など)間、および、上顎前歯の唇舌側傾斜間に有意な単相関が認められた。また、舌の口蓋接触時間を従属変数、角度、距離計測数項目を独立変数とする重回帰式を得た。このことは、嚥下時の舌運動に伴う舌の口蓋への接触時間の相違が骨格形態と深い関わり合いがあることを示唆するものである。今後も例数を増やしさらに検討していく予定である。また、発音に伴う舌運動に関してはパラトグラフ上で視覚的に個体差は認められるが、有意か否かの判定は行っていないので、その客観的な判定方法の選択も今後の課題である。歯科矯正臨床において、不正咬合の改善の補助的手段として、舌の機能訓練が行われている。そこで平成6年度にひきつづき、舌運動を口蓋に装着した電極への舌の接触・非接触で見るダイナミックパラトグラフィーを用いて、舌運動と顎顔面形態との関連性について臨床的指針を得るため、以下の研究を行った。本学学生より種々の咬合を有する71名(男35、女36、平成5、6年度分も含む)を選出し、平成6年度と同様の記録方法に従って、側方頭部X線規格写真の撮影、歯列模型の作製、および、ダイナミックパラトグラムの記録を行った。その結果、舌の口蓋接触時間と下顎の回転に関する計測項目(下顎角、下顎下縁平面傾斜角、下顎下縁平面と大臼歯のなす角など)間、および、上顎前歯の唇舌側傾斜間に有意な単相関が認められた。また、舌の口蓋接触時間を従属変数、角度・距離計測数項目を独立変数とする重回帰式を得た。また、発音に伴う舌運動に関してはパラトグラフ上で視覚的に個体差は認められるが、有意か否かの判定は行えなかった。その客観的な判定方法の選択も今後の課題である。
多糖類及び多糖類混合物の構造と機能特性

ヘパリンは決まった組成を持つ化学種ではなく分子量や硫酸基含量の異なる不均一な混合物であ究から低分子量ヘパリンが種々のすぐれた生化学的特性を示すことが明らかになり、分子量や分子量る。ヘパリンは抗血液凝固活性剤として広く臨床で用いられている。ヘパリン活性は分子量や硫酸基含量と関係しているが、複雑な構造と物性との関係は未だ充分明らかにされていない。近年臨床的研分布の特性化が特に重要な研究課題となっている。本研究では、(1)電子線照射量と照射ヘパリンの分子量及び多分散性、(2)in vivoに近いAPTT活性及び人血漿中のアンチトロンビンIIIとの反応から求めたAT-III活性と照射線量との関係、及び(3)ヘパリン中のフリーなアミノ基及び糖残基のC_6位に存在する水酸基の量と照射線量との関係について検討し、電子線照射によるヘパリンの構造変化と活性との関係について究明した。試料はナトリウムヘパリン613(藤川株式会社)を用いた。電子線照射はカスケード型電子加速器(原研高崎)を用い照射速度10kGy/pass、全照射線量502500kGyで固体状態で行った。ヘパリンの分子量(Mn=8000)は照射線量の増加と共に、最初急激に低下して500kGyでは4500となり、以後徐々に減少し、2500kGyでは3220となった。多分散性の指標、Mw/Mn値は照射線量に対して未照射ヘパリンの値1.52からほぼ直線的に減少し、2500kGyで1.22を与えた。フリーなアミノ基及び水酸基の数は500kGyまでは、ほとんど変化しなかった。その後、線量の増加に伴い徐々に増加した。このことから、電子線照射によりヘパリンの低分子化が進むとともに、ヘパリン糖鎖の脱硫酸が起こることが示唆された。APTT活性は、50150kGyの僅かな照射で、未照射ヘパリンの活性(166u/mg)より、最高で約30%増加した。これに対して、AT-III活性はほぼ同じ活性を示した。線量の増加に伴ってAPTT活性は急激に減少し、2500kGyではほとんど失活したが、AT-III活性は未照射ヘパリンの70%に相当する活性を保持していることがわかった。これらのことから、(1)低線量照射ではヘパリン主鎖の切断が優先して起こり、引き続いて高線量では、脱硫酸が起こること、(2)抗血液凝固活性には分子量効果があり、50150kGyの僅かな照射で活性が30%上昇すること、及び(3)高照射線量での活性の減少は、脱硫酸化に起因することがわかった。ヒアルロン酸(HA)は哺乳動物の結合組織などに存在する、等モルのN-アセチル-D-グルコサミンとD-グルクロン酸よりなる直鎖状の保水性に富んだ高分子量の多糖類で、人口硝子体など医用材料や化粧品の保湿剤として用いられている。また、アラビアゴムはアカシアセネガル(A.senegal)の樹脂から抽出された、ガラクトピラノースよりなる複雑な構造をした架橋性電解質多糖類で、食品の乳化剤などとして広く利用されている。本研究では、ヒアルロン酸をホルムアルデヒドで架橋した水溶性のハイランと、ジビニルスルホンで架橋したハイランゲルの水和特性を示差走査熱量計(DSC)により調べた。また、アラビアゴムの収着水と比較検討し、架橋多糖類中の収着水の状態を究明した。DSCによる水の相転移測定より、ハイラン-水及びアラビアゴム-水系には、不凍水、凍結束縛水、及び自由水の存在が確かめられた。系中の凍結束縛水の一部は、凍結融解の過程を繰り返すと自由水に転移した。しかし、試料を室温で半日放置するとこれら水は可逆的に束縛水に復帰した。これは、架橋多糖類中にはポリマーとの相互作用の程度が異なる2種類の凍結束縛水が存在することを示唆する。自由水に可逆的に変化する束縛水は、架橋ポリマーの網目構造中に存在し、ポリマーに弱く束縛された水と推定される。一方、自由水に変化しない束縛水は、多糖の親水性基と強く相互作用している水と考えられる。アラビアゴムはハイランに比べ、凍結束縛水、特に、ポリマーと強く相互作用した束縛水の保持量が少なかった。これはハイランが架橋剤により、強固な分子間架橋を形成し、水を網目構造中にしかりと保持しているのに比べ、アラビアゴムでは分子鎖の絡まり合いが少なく、緩い網目構造を形成しているためと考えられる。しかし、架橋剤を変化し調製した水溶性ハイランとハイランゲルでは、不凍水や束縛水量に相違が認められなかった。

本研究では、(1)電子線照射量と照射ヘパリンの分子量及び多分散性、(2)in vivoに近いAPTT活性及び人血漿中のアンチトロンビンIIIとの反応から求めたAT-III活性と照射線量との関係、及び(3)ヘパリン中のフリーなアミノ基及び糖残基のC_6位に存在する水酸基の量と照射線量との関係について検討し、電子線照射によるヘパリンの構造変化と活性との関係について究明した。試料はナトリウムヘパリン613(藤川株式会社)を用いた。電子線照射はカスケード型電子加速器(原研高崎)を用い照射速度10kGy/pass、全照射線量502500kGyで固体状態で行った。ヘパリンの分子量(Mn=8000)は照射線量の増加と共に、最初急激に低下して500kGyでは4500となり、以後徐々に減少し、2500kGyでは3220となった。多分散性の指標、Mw/Mn値は照射線量に対して未照射ヘパリンの値1.52からほぼ直線的に減少し、2500kGyで1.22を与えた。フリーなアミノ基及び水酸基の数は500kGyまでは、ほとんど変化しなかった。その後、線量の増加に伴い徐々に増加した。このことから、電子線照射によりヘパリンの低分子化が進むとともに、ヘパリン糖鎖の脱硫酸が起こることが示唆された。APTT活性は、50150kGyの僅かな照射で、未照射ヘパリンの活性(166u/mg)より、最高で約30%増加した。これに対して、AT-III活性はほぼ同じ活性を示した。線量の増加に伴ってAPTT活性は急激に減少し、2500kGyではほとんど失活したが、AT-III活性は未照射ヘパリンの70%に相当する活性を保持していることがわかった。これらのことから、(1)低線量照射ではヘパリン主鎖の切断が優先して起こり、引き続いて高線量では、脱硫酸が起こること、(2)抗血液凝固活性には分子量効果があり、50150kGyの僅かな照射で活性が30%上昇すること、及び(3)高照射線量での活性の減少は、脱硫酸化に起因することがわかった。ヒアルロン酸(HA)は哺乳動物の結合組織などに存在する、等モルのN-アセチル-D-グルコサミンとD-グルクロン酸よりなる直鎖状の保水性に富んだ高分子量の多糖類で、人口硝子体など医用材料や化粧品の保湿剤として用いられている。また、アラビアゴムはアカシアセネガル(A.senegal)の樹脂から抽出された、ガラクトピラノースよりなる複雑な構造をした架橋性電解質多糖類で、食品の乳化剤などとして広く利用されている。本研究では、ヒアルロン酸をホルムアルデヒドで架橋した水溶性のハイランと、ジビニルスルホンで架橋したハイランゲルの水和特性を示差走査熱量計(DSC)により調べた。また、アラビアゴムの収着水と比較検討し、架橋多糖類中の収着水の状態を究明した。DSCによる水の相転移測定より、ハイラン-水及びアラビアゴム-水系には、不凍水、凍結束縛水、及び自由水の存在が確かめられた。系中の凍結束縛水の一部は、凍結融解の過程を繰り返すと自由水に転移した。しかし、試料を室温で半日放置するとこれら水は可逆的に束縛水に復帰した。これは、架橋多糖類中にはポリマーとの相互作用の程度が異なる2種類の凍結束縛水が存在することを示唆する。自由水に可逆的に変化する束縛水は、架橋ポリマーの網目構造中に存在し、ポリマーに弱く束縛された水と推定される。一方、自由水に変化しない束縛水は、多糖の親水性基と強く相互作用している水と考えられる。アラビアゴムはハイランに比べ、凍結束縛水、特に、ポリマーと強く相互作用した束縛水の保持量が少なかった。これはハイランが架橋剤により、強固な分子間架橋を形成し、水を網目構造中にしかりと保持しているのに比べ、アラビアゴムでは分子鎖の絡まり合いが少なく、緩い網目構造を形成しているためと考えられる。
レックリングハウゼン病由来筋線維芽細胞の機能解析とケロイド新治療法の開発

レックリングハウゼン病(neurofibromatosis type 1、以下NF-1と略す)では、手術後の傷跡が非常にきれいになることが知られていることから、NF-1由来の筋線維芽細胞の機能を重点的に解析し、新たな観点から瘢痕形成機構を解明することによりケロイドに対する新治療法の開発を目指して研究を行った。まずは、NF-1の機械的伸展刺激受容機構に関する解析を行った。これまでの研究により、機械的伸展刺激に対してNF-1由来の皮膚線維芽細胞では、正常の皮膚線維芽細胞で見られる筋線維芽細胞への分化亢進が認められなかったが、同様の結果が、NF-1の原因遺伝子産物であるNeurofibrominのsiRNAを用いた実験においても確認された。機械的シグナル伝達経路の代表的な1つに、Rho/ROCK/LIMK/Cofilin/Actin経路がある。過去の文献によると、NeurofibrominはRhoAの下流にあたるLIMKのリン酸化(活性化)に対して抑制的に作用することが報告されている。すなわち、Neurofibrominの機能的異常を来しているNF-1においては、LIMKおよびその下流のCofilinが過剰にリン酸化状態にあると予想した。そこで、機械的伸展刺激前後におけるそれらのリン酸化タンパク質発現の変化をウエスタンブロッティングにて解析したところ、正常線維芽細胞では伸展刺激によりLIMK2およびCofilinのリン酸化が亢進するのに対し、NF-1由来線維芽細胞では伸展刺激前からリン酸化タンパク質が多く、伸展刺激を加えてもその増加は見られなかった。以上の結果から、NF-1における機械的刺激に対する筋線維芽細胞への分化能低下は、Neurofibrominの機能的異常によるLIMKおよびCofilinの過剰なリン酸化による可能性が考えられた。もう1つのアプローチとして、NF-1由来筋線維芽細胞では正常由来筋線維芽細胞と機能発現に相違があると想定した解析も行っているが、コラーゲンなどの細胞外マトリックス産生能やTGF-βなどのサイトカイン産生能に関する結果が安定せず、アッセイの再現性を獲得するために様々な工夫を繰り返し試す必要があり、そこに時間を要している。今後は、NF-1の機械的伸展刺激受容機構に関する解析をさらに深めていくとともに、NF-1由来筋線維芽細胞の機能発現についても様々なアプローチから研究を進めていく予定である。他の財源があり、特に物品購入に関しては、優先的にそちらを使用していたので、次年度使用額が生じた。次年度に関しては、大学院生のみでなく、テクニシャンも使って、さらに強化的に実験を行う予定である。また、皮膚線維芽細胞への遺伝子導入効率が悪く、ウイルスベクターを使用する予定であるが、効率化をはかるため、外部委託する予定であり、そちらの物品費として、次年度学を使用する予定である。
近代日本幼稚園論史研究

本研究は、近代日本における幼稚園教育の展開とその特質を、1900年代以降に欧米のフレーベル主義幼稚園批判の影響を受けて展開された幼稚園論の検討を通して明らかにしようとするものである。明治末期から大正・昭和初期にかけて、欧米のフレーベル主義幼稚園批判の影響を受けて日本でも幼稚園論がさまざまに展開された。それは幼稚園教育の目的や方法、さらには幼稚園自体の存在意義を問うものまで多岐にわたるが、この時期の幼稚園論が幼稚園関係者のみならず、教育学者や文部当局者までも巻き込み、日本の幼稚園そのもののあり方に再考を迫るものであったことは注目される。幼稚園令における社会政策的立場からの幼稚園機能の拡大などは、そうした過程をへて選択されたものであり、その意味では、この時期の幼稚園論の展開はその後の日本の幼稚園教育のあり方を方向付ける重要な役割を果たしたということができる。そこで、本研究では1900年代以降の幼稚園論のうち、とくに幼稚園改革、幼児教育制度改革論に焦点をあてて検討を行った。なかでも、その中心的人物であった森岡常蔵や倉橋惣三らの幼稚園論については、ドイツ、アメリカの幼稚園論との比較検討を通してその性格を考察し、そこで提起された日本の幼児教育改革の方向性とその理念を明らかにした。また、戦時下の国民幼稚園論には幼保の一元化や幼稚園教育の義務性の主張も含まれており、それは戦後の幼児教育改革ともつながる内容を有していた。本研究ではそうした戦時下と戦後の連続・非連続の問題にも着目しながら、戦時下の幼児教育論の検討を行った。そして戦後の幼児教育制度改革についていえば、それは新たな理念のもとでの戦時下制度改革構想の実現であったことが明らかとなった。本年度は、20世紀初頭のドイツ、アメリカにおける幼稚園論争の検討、および明治末期大正期における幼稚園論の整理・検討を行い、以下の2編の論文にまとめた。1.「森岡常蔵の幼稚園認識-W.ラインの影響を中心に-」19世紀末から20世紀初頭にかけてドイツ、アメリカではフレーベル主義幼稚園をめぐる厳しい批判が展開された。それは幼稚園制度や内容、方法の改善の動きへとつながっていくが、とくにドイツでは統一学校運動との関連で幼稚園の制度的位置づけが論議され、それは日本にも影響を与えた。そこで本稿では、ラインら統一学校運動推進者の幼稚園制度論の検討を行い、ついでその影響を受けて「幼稚園令」の制定に尽力した森岡常蔵の幼稚園認識について考察した。その結果、森岡におけるラインの影響は多大であり、森岡は当時根強く存在した幼稚園不要論に対して、ラインの幼稚園論に依拠して社会政策的・国民教育的見地から幼稚園の必要性を説き、幼稚園令制定を推進したことが明らかとなった。2.「大正期における幼稚園発達構想-幼稚園令制定をめぐる保育界の動向を中心に-」大正期の日本ではドイツ、アメリカの幼稚園論争の影響を受けて、幼稚園論がさまざまに展開された。そうしたなかで、保育界においては幼稚園制度改革の必要性が強く主張されるようになる。本稿では、とくに1925年に開かれた全国保育者代表協議会において作成された幼稚園令内容案に着目し、大正期の保育界における幼稚園発達構想の検討を行った。その結果、代表協議会作成の幼稚園令内容案には幼稚園教育の特色を示した目的規定や、新教育の原理に基づく幼稚園カリキュラムの提示、小学校教員と同等の幼稚園教員の資格・待遇規定、幼保一元化の提案など、保育界の幼稚園発達構想が具体的に示されていたこと、そしてそれは戦後の幼児教育改革につながるものであることが明らかとなった。本年度は、大正期から戦後にいたる幼稚園論・幼児教育制度論を取り上げ、検討を行った。とりわけ、この時期の幼稚園改革を推進した倉橋惣三については、その「国民幼稚園」論に焦点をあてて研究を進めた。

まず、倉橋の保育論の背景にいかなるフレーベル理解、幼稚園教育理解があったのかを明らかにするために、彼のフレーベル研究の検討を行い、それが倉橋の保育論の展開にいかなる意味を有していたのか、その関連性への考察を行った(「倉橋惣三のフレーベル理解-フレーベル研究から国民幼稚園論へ-」)。その結果、1,倉橋はフレーベルの根本精神に学びながら、幼児の生活を体位とする保育論(誘導保育論)を構築していったこと、2,戦時下における倉橋の国家主義的幼稚園論(国民幼稚園論)の背景に、シュプランガーのフレーベル研究の影響が認められること、などが明らかになった。さらに、倉橋における戦中・戦後の幼稚園制度論の展開とその性格について明らかにするために、倉橋の「国民幼稚園」論の検討を当時の教育改革の動きを視野に入れながら行った(「倉橋惣三における国民幼稚園論の展開」〔教育史学会にて報告〕)。その結果、1,倉橋の国民幼稚園論は従来の幼稚園を国民教育を担う「国民幼稚園」として再編するとともに、教育改革の動きに乗じて保育界の年来の課題であった幼稚園の制度的確立(幼稚園教育義務制と幼保一元化)とその普及を図ろうとするものであったこと、2,戦後の倉橋の幼児教育改革の主張は、そうした戦時下の改革構想を引き継ぐものであり、その意味では、倉橋にとって戦後の幼児教育制度改革は新たな理念のもとでの戦時下教育改革構想の実現であったこと、などが明らかになった。
細胞内シグナル応答型遺伝子制御分子システムによるがんイメージング法の開発

本研究では、がんの病態機能に密接に関連する細胞内キナーゼの活性をイメージングできる分子システムを開発した。その結果、がんの増殖活性を担っているプロテインキナーゼCαに応答してレポーター遺伝子を発現できる制御剤の開発に成功し、種々のがんを可視化することに成功した。また、レポーター遺伝子の代わりに蛍光標識ポリアニオンを用いたり、蛍光基と基質ペプチドを標識したPAMAMデンドリマーと、消光基を標識したコンドロイチン硫酸からなる複合体が標的キナーゼの分子プローブとして使用できることを見出した。また、制御剤(キナーゼ応答材料)の高分子主鎖をポリエチレンイミンにすることで、シグナル応答性を劇的に改善することにも成功した。さらに、種々のがん病低機能に関わるキナーゼに対する新規基質の開発にも成功した。本研究では、これまで開発してきた、ペプチドと高分子のコンジュゲートを利用した、細胞内シグナルに応答して遺伝子発現を活性化できる分子システムを利用して、がん細胞で特異的に亢進する細胞内シグナルに応答するシステムを構築し、これによりレポーター遺伝子をがん細胞特異的に発現させることの可能な分子システムを開発することを目的としている。20年度は、多くのがん細胞で異常亢進しているシグナルとして、プロテインキナーゼCα、Srcに関して、遺伝子制御ポリマーの開発を行った。プロテインキナーゼCα(PKC α)に特異的な新規に開発した基質Arphatomegaを用いて、PKC αに応答する遺伝子制御ポリマーを合成し、ペプチド導入率を挙げたところ、エレクトロポーレーションによらずとも、培養がん細胞に遺伝子を導入でき、実際に、PKC αに応じたレポーター遺伝子の発現を引き起こし、がん細胞のイメージングに成功した。また、担がんマウスにおいても、B16メラノーマを始め、ヌードマウスに移植した種々の人由来がん組織においても、顕著なレポーター遺伝子の発現を実現し、がん組織のイメージングが可能であった。この遺伝子制御システムを正常皮下組織に投与しても発現は認められず、また、制御剤ポリマー中の基質ペプチドのリン酸化部位であるセリンをアラニンに置換したネガティブコントロールポリマーでは、がん組織であっても遺伝子の発現を認めず、本概念による完全ながん特異的レポーター遺伝子(ルシフェラーゼ)制御に成功した。Rhoキナーゼ特異的な基質の探索に関しては、前年度見出した配列を元に再設計し、ROCK2(Rhoキナーゼ)に対する優れた基質配列を見出した平成21年度は、まず、プロテインキナーゼCα応答型遺伝子制御系を用いて、マウスのがんのみではなく、種々のヒト由来のがん細胞を移植した担がんマウスにより、がんの増殖活性のイメージングの手法を確立した。また、in vivoで用いるために、より遺伝子との複合体が凝集し、細胞での発現効率と標的キナーゼ応答性が優れた遺伝子制御剤の開発を目指し、主鎖がポリカチオン性の制御剤の開発を行った。得られた制御剤は、標的キナーゼが亢進している場合、従来型に比べ20倍の遺伝子発現を認め、従来、数倍であった標的シグナル応答性は、最大で500倍に改善した。そのメカニズムを検討したところ、エンドソームからの離脱能の向上が主たる原因であることが分かった。この制御剤では、新規な合成法を確立したため、ペプチドの導入率を自由に制御することも可能になった。また、制御剤にPEG鎖を導入して、遺伝子との複合体を安定化することにも成功した。これらの成果は、in vivoへの適用に重要なものである。また、遺伝子の代わりに蛍光標識したポリアニオンを用いて、キナーゼ活性の蛍光プローブシステムを開発することにも成功した。この場合、複合体形成時に、凝集に伴い蛍光が消光し、キナーゼによるリン酸化に伴う複合体の崩壊で、蛍光の回復を認めた。このシステムは、新規なキナーゼイメージング法として期待できる。さらに、癌診断に重要なキナーゼに対する新規基質の探索を独自に開発したペプチドアレイを用いて実施した。その結果、これまで存在しなかったALK、METなどに対する有効な基質ペプチドを見出すことにも成功した。前年度開発した主鎖がポリカチオン型のプロテインキナーゼCα応答型遺伝子制御剤の主鎖の分子構造、及びペプチドの導入率を種々変化させて最適な構造を検討した。その結果、主鎖の分子量が大きい場合には遺伝子の抑制は問題ないが、リン酸化に伴う遺伝子発現の回復が弱くなる傾向があった。また、ペプチド導入率についてもある含量までは多いほどよいが、それ以上導入すると逆に遺伝子の抑制が悪くなる傾向が分かった。これは、ペプチドの導入が過剰になると、主鎖の柔軟性が低下し、遺伝子との絡み合いが悪くなることが原因であると考えられる。最適化したことで、シグナルによる遺伝子発現は、最大で1000倍にまで向上させることに成功した。

PEG鎖の導入に関しても同様の理由で、導入率を上げすぎると遺伝子を抑制できないことが分かり、今後、導入サイトを最小限にしつつ、遺伝子との複合体の被覆率を上げる様な導入法の検討が必要であることが分かった。キナーゼ蛍光プローブに関しては、前年度開発したプローブでは、細胞やin vivoに適用した場合複合体の安定性が不足しており、蛍光が回復したり細胞への導入が起こらないという問題が生じた。そこで、さらに安定な複合体を形成できる分子システムを構築するために、種々のポリイオンの組み合わせを検討し、デンドリマーに基質ペプチドと蛍光基を標識し、コンドロイチン硫酸に消光基を導入した組み合わせが最適であり、細胞への導入も可能であること見出した。
外液Ca除去下で現れたA類似電流の生理・薬理学的性質の解明とその発生学的研究

単離モルモット心室筋細胞において、外液からCa^<2+>を除去すると、内向き整流K電流は全く影響を受けなかったが、脱分極側で一過性の外向き電流が発生した。このCa^<2+>除去下で発生する電流は、濃度依存性にquinidine及びD-600で抑制された。Cd^<2+>(0.1mM)は+50mVよりマイナス側の膜電位でこの一過性の外向き電流を抑制したが、60mVよりプラス側では膜電位依存性に電流が励起された。一価の陽イオンをN-D-methyl-glucamine(NMG)で置換したCa^<2+>除去液中で、150msの脱分極パルスで誘発される外向き電流は、一過性成分とプラトー成分より構成される。これらの成分はNMGをTEAで置換しても影響されなかった。4-APで置換すると一過性成分はかなり抑制されたが、プラトー成分は変化しなかった。一過性成分は、0mVへの条件付けパルスが3msから100msへ長くなるに従い徐々に抑制されたが、プラトー成分は全く影響を受けなかった。300msの条件付けパルスにより一過性成分は完全に消失し、プラトー成分は約10%抑制された。一過性成分の不活性化の時間経過は、膜電位依存性を示さず時定数35msの指数関数で表された。また、定常状態での不活性化の膜電位依存性は、Boltzmannの式で表現できそのV_<1/2>とslope factorは-33.5mVと7.5mVであった。β受容体刺激は一過性成分には全く影響を及ぼさなかったが、プラトー成分を約2.7倍増加した。この増大は、150msパルス中に不活性化されるCa電流値のと一致した。以上の結果より、Ca^<2+>除去下で電位依存性に誘発される外向き電流の一過性成分は、Caチャネルを通るK^+の外向き電流でなくA電流または類似のK電流であることが示唆された。このことは、モルモットではAチャネルの機能発現が発生過程で修飾される可能性を示唆する。細胞外液からCa^<2+>を除去しても、内向き整流K電流は全く影響を受けなかったが、脱分極側で一過性の外向き電流が発生した。quinidine及びD-600はこの一過性の外向き電流を抑制した。また、両薬物存在下では一過性外向き電流の不活性化の時間経過が促進された。そこで、一過性成分の面積(電荷量)を求めて、抑制の濃度依存性を調べた。この目的のためインターフェース(ITC 16)を購入した。インターフェースによりデータのA-D変換を行い、コンピューターを用いて面積を求めた。0.1mM Cd^<2+>は+50mVよりマイナス側の膜電位でこの一過性の外向き電流を抑制したが、60mVよりプラス側では膜電位依存性に電流が励起された。0.5mM Cd^<2+>存在下ではこの閾値が20mVプラス側に移った。

このことは、大きいプラスの電位勾配によってCd^<2+>がそのbinding siteからはじき出され、チャネル抑制がとれることを示唆する。一価陽イオンをN-D-methylglucamine(NMG)で置換したCa^<2+>除去液で、150msの脱分極パルスで誘発される電流は、一過性成分とplateau成分より構成されている。これらの2つの成分はNMGをTEAで置換しても影響されなかったが、4-aminopyridineで置換すると一過性成分はほとんど消失し、plateau成分のみが残った。一方、細胞内のK^+をTEAで置換すると両成分は全く消失した。次にdouble pulse法により両成分の不活性化の時間依存性を検討した。OmVに保持する期間が3msから100msへ長くなるに従い、徐々に一過性成分は抑制されたが、plateau成分は全く影響を受けなかった。300msのconditioningpulseにより一過性成分は完全に消失したが、plateau成分は約10%抑制されるだけだった。一過性成分の不活性化の時間経過は膜電位依存性を示さず、時定数35msの指数関数で表された。また、膜電位依存性の不活性化はBoltzmannの式で表現でき、そのV_<1/2>とslope factorは-33.5mVと7.5mVであった。細胞外Ca^<2+>除去液中で脱分極により誘発される一過性外向き電流の一過性成分は、電気生理学的及び薬理学的性質からA類似Kチャネルの活性化によることが考えられた。しかし、L型Caチャネルを通るK^+の外向き電流の可能性も考慮する必要性がある。そこで、cell-attached patchを用いて単一チャネル記録を試みた。パッチ電極にCa欠除細胞外液を充填して、電極の電位を0mVから-130mVまで変えたが、単一チャネルの事象は観察することが出来なかった。このことは、単一チャネルコンダクタンスは非常に小さいことを示唆する。そこで、現在集合雑音解析法を用いて単一チャネルコンダクタンス測定を試みている。この目的のため低域通過フイルタを購入した。次に、beta受容体刺激の効果を検討した。Ca電流は保持電位-50mVから0mVへ150msのテストパルスを与えて誘発した。パルス中に不活性化されるCa電流値は、beta受容体刺激により288±26%に増加した。一方、Ca除去下でパルス中に不活性化される外向き電流の一過性成分は、+60mVでbeta受容体刺激前の値の75±19%であった。このことは、Ca除去下の一過性の外向き電流はCaチャネルを通るK^+の外向き電流でないことを強く示唆する。次に、一過性外向き電流のプラトー成分のイオン機構について検討した。この成分も細胞内のK^+をTEAに置換すると、一過性成分とともに全く消失したが、外液の一価陽イオンをTEAに置換しても、ほとんど影響を受けなかった。又、Cd^<2+>により一過性成分と同様に抑制された。心筋培養については、Bern大学のWeingart博士との協同研究によって開始した。ようやくラット心筋培養に習熟したところである。これから難しいモルモット心筋培養に取り掛かろうとしている。
非対称標識した脂質小胞を用いた小胞輸送経路での脂質の動態の解析

生体膜では脂質二重層の外層と内層で脂質は非対称に分布しており、一般に糖脂質やホスファチジルコリンはルーメン側(形質膜では外層)に、アミノ基を含むリン脂質であるホスファチジルエタノールアミンやホスファチジルセリンは細胞質側に分布している。小胞輸送は膜の出芽、輸送、融合という一連のステップの組合せであり、これらの反応におけるコートタンパク質の結合やオルガネラの認識はすべて脂質二重層の細胞質側での反応に依存していること、また脂質輸送タンパク質が細胞質に存在していることから細胞質側の脂質の動態に興味が持たれるが、細胞質側の脂質の動態はわかっていない。そこで平成5年度は細胞質側の脂質の動態を知るための実験系の開発を行い、インフルエンザウイルスの膜融合活性を有するタンパク質、ヘマグルチニンを高頻度に細胞表面に発現している3T3細胞を用いて、ヘマグルチニンレセプターである糖脂質依存的に蛍光標識脂質を含む脂質小胞を細胞に融合させることができるようになった。またニトロセルロースフィルターを用いて形質膜を透過性にしたMDCK細胞のゴルジ体に蛍光標識した脂質小胞を融合させ、形質膜への脂質の輸送を追跡する実験も可能になった。このような系で表側あるいは裏側だけを蛍光標識脂質で非体称標識した脂質小胞を細胞に導入しその動態を見る実験は現在進行中だが、膜の表側と裏側では脂質の動態は非常に異なっているという予備的な結果が得られている。平成6年度は平成5年度の研究結果を踏まえ、小胞輸送における脂質の動態を決めている細胞内因子の同定を試みる。このためにバクテリアのトキシンやニトロセルロースフィルターを用いて透過性にした細胞を調製し、蛍光標識脂質をプローブとして用い脂質の動態を制御している細胞質因子の同定を行う。また脂質輸送タンパク質の抗体を用い、動物細胞での脂質輸送タンパク質の小胞輸送と脂質の動態への影響を測定する。
Cキナーゼ阻害剤で誘導した免疫寛容樹状細胞を用いた抗原特異的免疫抑制療法の研究

樹状細胞(DCs)は、自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、アレルギー疾患の分野では、自己反応性T細胞を標的とし免疫寛容に導く樹状細胞,免疫寛容樹状細胞(tDCs)を用いた抗原特異的な治療が注目されている。以前我々は、Cキナーゼ阻害剤を(PKCI)を用いて、安定性のあるtDCsが誘導できることを報告し、6種類の既報の誘導物質で誘導されたtDCsとの比較検討を行い、Cキナーゼ阻害剤(PKCI)-tDCsが最も良いことを明らかにしてきた。また、臨床応用に向けて関節リウマチ患者、シェーグレン症候群の患者からPKCI-tDCsを誘導することが出来た。また、さまざまな細胞において炎症反応を制御するmiRNAに注目し、未熟DCs、成熟DCsおよびPKCI-tDCsから全RNAを抽出し、miRNA arrayにて比較解析を行った。SS患者末梢血からPKCI-tDCsが誘導できるか検討し、症例を増やし20名すべてのSS患者から、PKCI-tDCsの誘導は可能であった。また、miRNA arrayを再検し、未熟、成熟DCsおよびPKCI-tDCsから全RNAを抽出し、miRNA arrayにて比較解析を行い、PKCI-tDCsに発現の高いlet-7c, miR-15a, miR-130a, miR-192など12種類のmiRNAをスクリーニングした。それぞれのmiRNA mimicsをリポフェクタミンを用いてDCsに導入し、PKCI-tDCsと同様の表現型を誘導するmiRNAを検討している。また、引き続いてシェーグレン症候群(SS)を対象として、自己抗原のHLA-DRB1拘束性のT細胞エピトープの解析を行い、抗原特異的免疫抑制療法の確立を目指している。樹状細胞(DCs)は、自己免疫疾患、臓器移植後の拒絶反応、アレルギー疾患などの発症制御に大きく関わっており自己免疫性T細胞を標的とした免疫寛容を導くDCsを用いた抗原特異的な治療が注目されており、我々は研究を進めている。以前我々はヒトの未熟樹状細胞の成熟過程において、Cキナーゼ阻害剤(PKCI)を用いて、炎症環境下でも安定性のある強い免疫寛容能を持つ免疫寛容樹状細胞(tDCs)が誘導出来ることを報告した。続いて、PKCI-tDCsと他のtDCsを誘導する物質の比較により、PKCI-tDCsが臨床応用可能なtDCsとして優れていることを示し報告をした。さらなる臨床応用に向けて、関節リウマチとシェーグレン症候群の患者検体から、PKCIを用いてtDCsが誘導できるかを確認した。結果、関節リウマチ9例、シェーグレン症候群10例の患者すべてからPKCI-tDCsを誘導することが出来た。また上記結果を適宜、学会にて発表した。関節リウマチ患者、シェーグレン症候群患者の検体を増やし、合計19例の検体でPKCI-tDCsの誘導が確認できた。シェーグレン症候群の患者においてT細胞エピトープの同定をすすめている。引き続いてシェーグレン症候群患者においてM3RT細胞エピトープの解析を進め、ヒト抗原特異的制御性T細胞の誘導を目指す。また、顕微鏡的多発血管炎の患者においてもMPO-ANCAのT細胞エピトープの解析を進めていく。(理由)

引き続いて、シェーグレン患者のM3Rエピトープの解析を継続していき、顕微鏡的多発血管炎の患者についてもT細胞エピトープの解析をすすめていく予定であり、解析をすすめていくため一部の研究費を次年度に繰り越す(使用計画)次年度も引き続いて、研究計画書に沿って、研究を遂行していく予定である、繰り越した研究費は試薬や培養に充当予定(理由)引き続いて、シェーグレン症候群についてのエピトープ解析を継続し、PKCI-DCsについてmiRNAを用いた解析をすすめていくため一部の研究費を次年度に繰り越す(使用計画)次年度も引き続いて、研究計画書に沿って研究を遂行していく予定である。繰り越した研究費は試薬や培養に充当予定である。
古典文学作品におけるテクスト・談話研究

本研究の目的は、これまで積み上げられてきたテクスト・談話研究の成果を、中古から近世までの古典文学作品に応用することである。研究の結果、現代語を中心に発展してきたテクスト・談話分析理論が、古典文学作品を対象としても有効であり、古典文学作品を対象とした研究に、新たな可能性を示すことができた。なお、対象とした作品のジャンルは、物語文学、随筆、説話、演劇と多岐に渡り、分析観点は談話構造、会話表現、接続表現、オノマトペ、引用形式など多様である。研究成果は冊子にし、web上でも公開する予定である。本研究は、これまで積み上げてきたテクスト・談話研究の成果を古典文学作品に応用し、日本古典文学や日本語学の研究における新たな方法論を構築・提案することを目的としている。研究初年度である平成22年度に行った研究は以下の通りである。・先行研究を読み込み、これまでの研究成果をまとめた。・分析材料となる資料の選定や収集を行い、その資料をテクストとして用いる妥当性を検討した。今年度扱った作品例:うつほ物語、源氏物語、平家物語、お伽草子類、浄瑠璃、歌舞伎・各研究者の分担を設定し、その分担にしたがって個人で分析を進めた。・定期的に報告会を行い、個人の研究の進捗状況を発表し、議論した。報告会の内容の一例:「古典文学作品における談話分析」「古典文学における会話研究」「乙姫の会話引用・描写の変遷と意味」「画中詞とは何か」「『平家物語』諸本(読み本系・語り本系)に見るオノマトペの使用状況」「『うつほ物語』における説得の方略」「浄瑠璃・歌舞伎のオノマトペについて」また、研究代表者高崎みどりの指導のもと、研究協力者である井之浦茉里が表現学会第114回東京例会(平成22年7月24日)にて「歌舞伎におけるオノマトペ」を発表し、『お茶の水女子大学大学院『人間文化創成科学論叢』第13巻に「浄瑠璃における会話文について-引用形式、感動詞に着目して-」を投稿し掲載された。研究2年目である平成23年度はデータ整理と分析が主な活動だった。具体的に行ったことは以下の通りである。・昨年度の研究の進捗状況をもとに、新たに講読の必要性が生じた先行研究を収集した。・収集したデータを整理し、その妥当性を議論したのち、分担者同士でデータを共有した。・各研究者の分担を設定し直し、その分担にしたがって分析を進めた。・定期的に報告会を行い、個人の研究の進捗状況を発表した。・報告会での発表をもとに、各自の研究の、今後の方向性を検討した。・各自の進捗状況から予測される全体的な成果について議論し、仮説を立てた。<報告会での発表内容の一例>「画中詞と物語中の会話文-『福富草子』二系統の本文を比較して-」「『平家物語』覚一本と延慶本の文頭比較」「古典随筆における性差について:枕草子を題材に」「お伽草子の接続詞」「古浄瑠璃の冒頭表現「さてもそののち」について」「古浄瑠璃における冒頭・結尾表現について」「うつほ物語「国譲」における接続表現「かくて」」「源氏物語の漢語について」また、研究代表者高崎みどりの指導のもと、研究協力者である井之浦茉里(お茶の水女子大学院生)が『人間文化創成科学論叢』第14巻(お茶の水女子大学大学院人間文化創世科学研究科)に「古浄瑠璃における冒頭・結尾表現」を投稿し、掲載された。本研究は、これまで積み上げてきたテクスト・談話研究の成果を古典文学作品に応用し、日本古典文学や日本語学の研究における新たな方法論を構築・提案することを目的として行った。最終年度である平成24年度は、各自の分析結果を報告し合い、成果を報告書の形にまとめることが主な活動であった。春と秋の2度に渡って報告会を行い、個人の研究の進捗状況を発表し、議論した。その作業を通じて成果を共有し、それぞれの研究にフィードバックさせた。研究成果をまとめた学会や論文での発表内容も報告会で再検討し、改善を行った。3年間の各自の研究成果から全体的な成果を議論し、最終的な方向性を決定した。各自の分担から報告書の目次を設定し、フォーマットを定めた。年度末にそれぞれの原稿を仕上げた。現在、報告書の内容をTeaPot(お茶の水女子大学教育・研究成果コレクション)に掲載するために編集中である。〈報告会での発表内容の一部〉「御伽草子の文章における、語句の談話構成語化現象と接続詞」

「『枕草子』テクストに関する小考」「古浄瑠璃における冒頭・結尾表現」「「お伽草子」の文章・談話的研究」「覚一本平家物語の文頭語に見る文章の展開ー延慶本との比較からー」「『枕草子』日記的章段における引用「と」「など」の使い分けー「淑景舎、春宮にまゐりたまふほどの事など」「『うつほ物語』の「国譲り」における「かくて」「かかるほどに」」定期的に報告会を開催して各研究者の進捗状況を報告し合ったところ、各自が当初の計画通りに分析を進めていることを確認できた。現在は、各研究者が本研究における成果を着実に積み上げている最中である。24年度が最終年度であるため、記入しない。24年度の研究の方策は以下の通りである。・定期的に報告会の開催をする。・データの精緻化を行い、情報の質を上げる。・各分担者と密に連携し、分析の共有を行い、各自の研究にフィードバックさせる。・論文投稿や口頭発表を行い、研究成果を発信する。・研究の最終年として、成果をまとめる。
ヒト胚子の組織標本とそれに対応する系統的な水平断肉眼立体的永久標本の作製

研究目的:ヒト胚子(妊娠約3ヶ月、頂殿長:30mm迄)標本を用いて、学生実習及び研究者への供覧を目的とした発生段階に沿う系統的な組織標本、肉眼立体永久標本を作製する。研究方法:ヒト胚子標本を用いた本研究の実施は、島根大学医学部・医の倫理委員会で承認されている。組織標本は、胚子の連続切片組織標本を作製した。脱水・パラフィン包埋後、薄切切片(矢状断・水平断組織標本、形態計測用連続切片)を作製し、基本的にヘマトキシリン・エオジン染色を施した。肉眼立体永久標本作製は、胚子標本を、従来の作製法を種々検討した標本作製法をほぼ確立したが、微調整や改善を行った。ホルマリン固定標本は常温にて水洗、ブアン固定標本は脱色後水洗し、冷蔵庫内で前処理し、-25°Cの冷凍庫内で、アセトン脱水・脱脂を経て、シリコンゴム液を入れたポリ袋に移し含浸させ、室温で真空ポンプ減圧操作を経て、室温下放置にて硬化させ、標本を作製した。研究成果:ヒト胚子組織標本を作製し、学生が成人の組織標本と比較し、発生の仕組み、構造と機能の形成・発現過程を理解することが容易になり、また研究用材料としても使用された。肉眼立体永久標本は、ヒト胚子という小さな標本作製に、従来の標本作製法に前処理や、脱水・脱脂方法、シリコンゴムの浸透時間や方法等、種々検討改変し、標本の収縮が比較的少なく、細部の観察も可能な標本作製に成功した。特に組織標本との比較検討のため、肉眼立体永久標本に関しては、組織標本と対応する系統的な水平断(頭部、体部を輪切りにする)の標本を作製した。組織標本の観察時に、この水平断の標本観察との比較により、多くの臓器の同定を容易にして組織標本による理解を助けた。非常に貴重なヒト胚子標本を用いて、取り扱い易く半永久的に保存可能な標本の作製手技を確立し、系統的な標本を作製した事は、学生実習のみならず発生学研究上も非常に有益であった。
アポトーシスの分子解析とその癌治療への応用

近年、癌に対する分子レベルの研究は長足の進展をみせ、全く不明であった癌における様々な異常(増殖:細胞死:分子)の分子基盤が少しずつ明らかになってきた。しかしながら、これらの進展が癌治療の概念及び実体に対して大きく変革をもたらしていると言える状況には依然として至っておらず、新しい治療戦略の模索が行われているのが現状である。本研究は、アポトーシスの誘導を癌治療の基本戦略に位置付け、これまでに研究されてきたアポトーシス誘導分子が引き起こす分子メカニズムを詳細に解析することによって、これまで明らかになっていないアポトーシス誘導の作用点を検索し、癌の新しい治療に結びつく基礎研究を行うことを目的とし、本年度は以下の成果を得た。(1)ポリグルタミンの核内細胞死シグナル励起部位としてのPML bodyの同定。ポリグルタミンが細胞死を誘導するときに核内で凝集しSEK1-JNKの細胞死シグナルを活性・伝達している部位がPML bodyであることを明らかにした。PML bodyは、以前に我々が急性前骨髄球性白血病(APL)の原因となるPLM-RARの細胞内標的部位として同定した核内のサブドメインである。(2)亜砒酸によるPML bodyでのSEK1の活性化。APL細胞を亜砒酸で処理するとそれまで分散していたPML bodyが再構成され、続いてAPL細胞は細胞死におちいる。この過程で、ポリグルタミンの場合と同様に再構成されてPML bodyでSEK1が活性化されていることを明らかにした。(3)ドロソフィラの遺伝学を用いたポリグルタミンが誘導する細胞死に関わる遺伝子群の検索。ポリグルタミンを複眼特異的に発現するトランスジェニックフライと染色体の種々の領域に欠損をもつ変異体と交配し、欠失により表現型(rough eyes)を憎悪または抑制する10数箇所の染色体領域を同定した。近年、癌に対する分子レベルの研究は長足の進展をみせ、全く不明であった癌における様々な異常(増殖・アポトーシス・分化)の分子基盤が少しずつ明らかになってきた。1.非内在性物質タモキシフェンによる細胞死誘導システムの構築。これまでに作り出したFas-エストロゲン受容体融合遺伝子のエストロゲン結合部位に変異を導入し、エストロゲンには反応せず合成エストロゲン類似物質タモキシフェンにのみ反応してFasからの細胞死シグナルをOnにするシステムを構築した。2.細胞死シグナル伝達系の解析。広範な細胞に細胞死を誘導するポリグルタミンの細胞死を解析し、核内に凝集したポリグルタミンがSEKlを活性化し、細胞死を引き起こしていることを明らかにした。3.ドロソフィラの遺伝学的手法を用いた細胞死関連遺伝子の解析。ドロソフィラの複眼細胞に特異的に伸長したポリグルタミンを発現させ、複眼の変性を示すドロソフィラの作成に成功した。続いて、染色体上に種々の欠失した領域をもつ変異体約150系統との遺伝的交差を行い、複眼の変性を増強する系統と抑制する系統をそれぞれ複数系統得た。現在これらの責任遺伝子の同定を行っている。
高生体融合性レジンを用いた骨組織再生に関する実験的研究

申請者は本年度、BMP含有メンブレンタイプレジンを用い、ウサギ大腿骨に作成した骨欠損に蓋をするような形での移植実験をメインに行った。骨の再生およびその増生を想定した実験を行いコーンビームCTによりその解析を行った。しかし、今回設定した条件では予想されたような有意な骨再生は確認できなかった。また予備実験的に同時に行っていた、3次元CTによるBMP骨誘導機序の解明実験では、異所性誘導骨の発生部位は、ほぼ空隙の範囲内に起こり、BMPは、異所性に骨誘導した場合は、初期に形成された小さな骨が外側方向に成長していくのではなく、最初から最終系の形に形成され、骨が融合していく。誘導骨が既存の骨と反応した場合,骨の添加を引き起こし増生していくことが分かった。以上のように、本年度実験では、残念ながら申請者が当初の目指したような水平性骨欠損に対する垂直方向への新整骨誘導を確認することは出来なかった。しかし、BMPによる新生骨誘導の形態学的機序の解析がマイクロCTを使って可能であったこと、開発したメンブレンタイプレジンのin vivoでの操作性、骨組織に対する生体親和性が大変良好であることが確認出来たことから、今後、条件を変えての追加実験を継続して行うことにより、当初目指したBMP含有メンブレンによる新整骨の誘導は実現可能であることを確信した。申請者は、高生体融合性レジンを用い骨組織再生に応用することを目的とし、移植時における賦形性の確認、成長因子保持を目的とした生体吸収性キャリアー剤との複合化、人工体液中での成長因子保持および徐放能力の検討を行った。その結果、賦形性は良好でありレジンを光重合型とすることにより移植時その場で形態付与・硬化が可能であった。成長因子のキャリアーとしてデキストリンとの複合化にも成功。その徐放能力も人工体液中で確認された。徐放性に関しては、デキストリンの割合を変えることにより2週間以上の徐放を確認することが出来た。次に、成長因子として骨誘導蛋白(BMP)を、上記レジン複合体に用いることによりin vivoにて実際に骨を誘導できるか確認するための実験を行った。すなわち長径5mm短径3mmの紡錘形に調整したレジンーデキストリンーBMP複合体をマウス大腿部に移植した。移植後4週間後、マイクロCTによる撮像と本年度科研費によって購入したコンピュータにより立体構築を行い、解析を行った。その結果、紡錘形の移植体表面沿って、骨が新生していることを確認した。今後は、新整骨を誘導するためのより効率的な形態の模索と実際の骨欠損に対する新整骨誘導実験を動物実験により検討していきたいと考える。
血管内皮細胞の選択的インスリン抵抗性を介した動脈硬化発症メカニズムの解明

肥満・2型糖尿病の血管内皮細胞では、「血管内皮細胞の選択的インスリン抵抗性」が惹起され、その結果動脈硬化症を発症すると考えられているが、その詳細なメカニズムは不明である。そこで本研究では、第一にリゾフォスファチジルコリン(16:0)がどのように血管内皮細胞のIRS-2の発現を調節しているのか、またそれによって「血管内皮細胞の選択的インスリン抵抗性」を発症するのかどうか検討する。第二に血管内皮細胞でIRS-2が低下すると、本当に動脈硬化症を発症するのかどうかについて血管内皮細胞特異的IRS-2欠損マウスを作成し、粥状動脈硬化とそのメカニズムについて検討する。
組換えシアノバクテリアによるCO2を資源とする高効率なバイオエチレン創製

本研究課題は、光合成細菌の光合成産物をバイオエチレンとして回収する研究である。さらに、嫌気性微生物のバイオマス分解系を模倣した酵素複合体化技術により、エチレン生合成酵素を光合成細菌で効率よく機能させる基盤技術の開発を行い、これを展開させた。本年度では単位時間当たりのバイオエチレン生産量増加を目的に、菌体再利用による単位培養液あたりの細菌密度を高めたバイオエチレン連続生産プロセスの検討を行った。具体的には、624時間のエチレン生成後の菌体を回収し、624時間のバブリング培養による回復培養後、再度エチレンを生成させ、その生産量をGCで分析した。結果、最適なエチレン連続生成プロセスは、12時間のエチレン生成と24時間の回復培養のサイクルであり、かつ、その上限は7サイクルであることを明らかにした。また、上限回数を制限する要因として、都度の回復培養により菌密度が1.1倍ずつ増加し、これがエチレン生産量の低下に影響したと考えられる。すなわち、培養液の希釈によるシアノバクテリア濁度の低減によって、再度、連続生産プロセスに供することが可能であることが示唆された。いっぽう、エチレン合成に関わる2段階の連続反応のうち、ACOは律速段階であり、かつ、その発現量は少ない。そこで、ACOの発現効率を向上させることを目的として、以下の試みを行った。(1)ポリシストロニックmRNA中のACOをプロモーター直下に配置した発現ベクターpUC303-SOC2B-P0を構築した。(2) ACOを構成する触媒ドメインとドックリンドメインの位置を逆転させたN末ドックリンコンストラクトを構築した。以上の成果から、酵素複合体の拡大とACOの高発現によって効率的なバイオエチレン生産効率が見込める結果となり、CO2を資源としたバイオエチレンの生産の社会実装に必要な基盤技術を確立した。平成30年度以降に計画した、光合成細菌の培養最適条件を確保することを目的に、菌体再利用によるバイオエチレン生産を検討した。これによって、バイオエチレン生成後の菌体を再利用することが可能となり、その培養の都度要するコストを省くことができる。いっぽう、ACOの発現効率を向上させることを目的として、ACO高発現プラスミドコンストラクトを構築した。現在、当該プラスミドを保持した組換え体を確保し、そのバイオエチレン生産効率を測定している。以上より、当初の計画通り、おおむね順調に進めていると判断した。令和元年度は、(1)構築したACO高発現株を用いて、バイオエチレンの生産効率を測定する、また(2)さらなる単位時間当たりのバイオエチレン生産量増加を目的に、光合成細菌内でのACO活性回復に必要と考えられる抗酸化剤、例えばグルタチオンやアスコルビン酸と同一の標準電極電位を持つ金属などを培養液中へ添加し、バイオエチレン生産量を観察する、などの条件検討を行い光合成細菌の培養最適条件を確保する。さらに、これら酵素複合体シリーズを持つ光合成細菌の培養最適条件を検討し、より成果を上げるために精力的に研究を展開する。本年度では酵素複合体の酵素組成および酵素モル比の変更によるバイオエチレン生産の効率化を目的に新規キメラ骨格タンパク質Cip4の構築を行った。具体的には1ヶの1-アミノシクロプロパン-l-カルボン酸(ACC)合成酵素(ACS)、1ヶのメチルチオアデノシン(MTA)分解酵素(MTAN)および2ヶのACC酸化酵素(ACO)を保持する骨格タンパク質であるところのCip4を構築した。次にこれを保持する発現ベクターを用いてSynechococcus elongatus PCC7942 (R2-Pc株)を形質転換させ、得られた組換え体をSOC4株とし、バイオエチレン生産量をガスクロマトグラフィーで定量した。結果、既存のSOC2株と比較して、2.4倍高いバイオエチレン生産量増加を示した。また、ウェスタンブロッティング解析の結果、ポリシストロニックmRNA中のCip4を含む各ORFのタンパク質発現を観察した。よって、酵素の組成およびモル比変更によるバイオエチレン生産効率の上昇理論値を得た。いっぽう、バイオエチレン合成反応によって、宿主細菌から供給される基質S-アデノシルメチオニン(SAM)が不足すると考えられる。そこで、細胞内SAM供給量を増やすため、E. coli由来SAM合成酵素遺伝子をClostridiumthermocellum typeII由来のドックリンと遺伝子工学的に連結しSAM-Docを新規に構築した。以上より、光合成細菌で発現させたエチレン生合成酵素が複合体化によって効率よく機能し、二酸化炭素から光合成的にバイオエチレンを生産させる技術の確立が期待される。当初の計画通り、平成29年度においては、(1)コヘシンCjを1ヶ、コヘシンAcを2ヶ、コヘシンCtを1ヶ連結したキメラ軸タンパク質(Cip4)の新規構築と発現を行った。その結果、酵素複合体の酵素組成と酵素モル比を変更した新たな複合体を得た。しかし、Cip4の構築する際、コヘシンAcの繰り返し配列によるミスアニールによってプラスミドの構築が困難となった。そこで、人工遺伝子合成によるシアノバクテリア・大腸菌へのコドン最適化をコヘシンAcへ行い、繰り返し配列を除去し、これを用いてCip4を構築した。(2)SAM-Docの新規構築と発現を行った。