hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
糖鎖抗原ＲＭ２に基づく糖蛋白を指標とした新規前立腺癌診断マーカーの探索

前立腺癌の糖鎖抗原RM2は、免疫組織学的解析の結果、前立腺癌特異的で悪性度を反映し、新しいマーカーとなり得る。しかし、この抗原を持つ前立腺癌特異的な糖蛋白は未だ明らかとなっていない。我々は、RM2抗体が強く認識する50kDaの糖蛋白を中心にアミノ酸解析を行い、各標的蛋白の診断マーカーとしての有用性を解析した。前立腺癌の免疫組織学的解析により、この標的蛋白はグリーソンスコアと相関し、悪性度を反映した。また、その他の臨床病理学的所見とも相関し、診断補助因子となり得ることが示唆された。標的糖蛋白の一つは、前立腺癌患者において尿中蛋白量が減少し、体外診断マーカーとなり得ることが示唆された。我々はこれまでに、前立腺癌特異的な新規糖鎖(RM2抗原)を同定し、そのRM2抗原に対する糖鎖抗体(RM2抗体)を作成した。このRM2抗原は、免疫組織学的解析の結果、前立腺癌細胞特異的に発現し、病理学的な悪性度と相関するため新しいマーカーとなり得る。また、前立腺癌細胞株によるウエスタンブロット解析の結果、RM2抗体は特定の分子量の蛋白を強く認識することが明らかになっている。しかし、未だその糖蛋白は同定されていない。そこで、この糖蛋白を明らかにし診断マーカーとしての有用性を評価することを目的とした。前立腺癌細胞株と正常前立腺由来細胞株とを用いたRM2のウエスタンブロット解析の結果、発現量に差が認められた蛋白をアミノ酸解析し、複数の候補蛋白を同定した。更に、これらの候補蛋白に対する抗体を用いたウエスタンブロット解析を行い、候補蛋白の中から、より腫瘍特異性の高い蛋白を決定した。現在、病理組織検体および血液検体を用いて、この候補蛋白の発現量および局在等を解析している。今後、この候補蛋白を用いて、組織検体および血清検体における診断マーカーとしての有用性の検討を進める。これにより、前立腺癌の悪性度との関連性や診断において、特異性に問題のあるPSAの欠点を補う新たなマーカーが見いだされる可能性がある。これまでのRM2抗体を用いた免疫組織学的解析から、RM2糖鎖は前立腺癌特異的に発現し、癌の悪性度を示すGleason scoreと相関することが明らかになっている。そのため、このRM2糖鎖を持つ糖蛋白は癌の新規診断マーカーとなり得る。本研究において、我々は前立腺癌細胞株および正常由来細胞株に対するアミノ酸解析を行い、新規診断マーカーの候補蛋白を複数同定した。更に、これらの候補蛋白に対する抗体を用いた前立腺癌細胞株のウエスタンブロット解析によって、腫瘍特異性の高い蛋白を決定している。そこで本年度は、病理組織検体および血液検体を用いて、これら候補蛋白の腫瘍組織における発現量や局在解析、血液中への分泌量を解析した。免疫組織学的解析の結果、腺上皮細胞において発現が確認された候補蛋白の内3つの糖蛋白では、高悪性度の癌で強く発現する傾向が見られた。そこで、さらに検体数を増やした解析を進め、悪性度等臨床病理学的所見との関連性を解析している。また、この解析から腺上皮細胞での発現が確認され、その局在から細胞外への分泌の可能性が推察される糖蛋白も明らかになった。そこで、前立腺癌患者の血液中における各糖蛋白量を測定し悪性度との関連性を明らかにすることを試みた。現在、ELISA解析において十分な検出感度が得られていない蛋白もあり、検出感度の向上が課題となった。RM2抗体が認識する糖蛋白の中から、前立腺癌の診断に有用と思われる候補蛋白は既に決定している。まだ少数例ではあるが前立腺癌組織における免疫組織学的解析により、悪性度と相関する傾向がある蛋白を同定している。更に、血液検査への発展が期待される分泌蛋白の解析も進んでいる。検出感度に問題が見られる蛋白もあるが、当初より計画していた当該糖蛋白の抗体とRM2抗体とのサンドイッチELISAの構築へと変更し、検出感度の向上を試みている。糖鎖抗体RM2を用いた免疫組織学的解析から、RM2糖鎖は前立腺癌特異的に発現し、癌の悪性度の指標の一つであるGleason scoreと相関することが報告されている。この結果は、RM2糖鎖を持つ糖蛋白が癌の新規診断マーカーとなり得ることを示す。そこで、本研究では前立腺癌特異的な糖鎖抗体が強く認識する50kDaの糖蛋白の解明を目的とし、臨床病理学的所見や悪性度およびホルモン療法抵抗性との関連性等を明らかにすることを計画した。昨年度までに、前立腺癌細胞株および正常由来細胞株に対するアミノ酸解析を行い、新規診断マーカーの候補蛋白を複数同定した。更に、これらの候補蛋白に対する抗体を用いた分子生物学的な解析から、腫瘍特異性の高い蛋白を選択し、腫瘍組織における免疫組織学的解析および血液・尿検体を用いた解析を進めて来た。免疫組織学的解析の結果、3つの糖蛋白は悪性度の高い前立腺癌においてより強く発現することが明らかになった。さらに、簡便な診断への応用を目的とし、本年度は血液中・尿中における当該糖蛋白レベルと悪性度およびホルモン療法抵抗性との関連性を解析した。糖蛋白の一つは良性疾患において尿中蛋白レベルの増加が明らかとなり、現在癌と良性疾患との鑑別に向けた解析を進めている。一方、当該糖蛋白の血清中レベルと悪性度等との関連性は現在のところ明らかに出来ていない。

これは、本解析がRM2搭載糖蛋白ではなく当該蛋白レベルを測定しており、腫瘍特異性を反映していないためと考えられた。現在、RM2搭載糖蛋白レベルの定量を試みており、今後、血清診断マーカーとしての有用性評価へと展開する。前立腺癌の糖鎖抗原RM2は、免疫組織学的解析の結果、前立腺癌特異的で悪性度を反映し、新しいマーカーとなり得る。しかし、この抗原を持つ前立腺癌特異的な糖蛋白は未だ明らかとなっていない。我々は、RM2抗体が強く認識する50kDaの糖蛋白を中心にアミノ酸解析を行い、各標的蛋白の診断マーカーとしての有用性を解析した。前立腺癌の免疫組織学的解析により、この標的蛋白はグリーソンスコアと相関し、悪性度を反映した。また、その他の臨床病理学的所見とも相関し、診断補助因子となり得ることが示唆された。標的糖蛋白の一つは、前立腺癌患者において尿中蛋白量が減少し、体外診断マーカーとなり得ることが示唆された。RM2抗体が認識する約50kDaの候補蛋白の同定は既に終了し、細胞株を用いた特異性の解析も終えており、計画通りに進捗している。また、細胞株を用いたRM2ウエスタンブロット解析の結果、50kDa以外にも発現量の異なる糖蛋白が認められ、これらについてもアミノ酸解析によってその候補蛋白を同定した。しかし、臨床病理学的な悪性度との関連性の評価等、臨床的・病理組織学的な診断マーカーとしての有用性の評価が残されている。また、増殖促進機能やシグナル伝達機構等、候補蛋白の生物学的な機能等についても今後解析する必要がある。今回診断標的候補とした蛋白について、前立腺癌病理組織上における発現量および特異性を明らかにし、臨床病理学的な悪性度との関連性を解析する。また、同糖蛋白に対して前立腺癌患者の血中蛋白量を測定し、臨床所見等との関連性を解析する。これらの解析結果を基に血清診断マーカー・組織診断マーカーとしての有用性を評価する。一方で、今回標的候補とした糖蛋白の前立腺癌における生物学的機能を解明する。当該糖蛋白によって活性化される細胞内シグナルカスケードを明らかにし、前立腺癌細胞株を用いた阻害実験・添加実験等を行うことで、その細胞内機能を明らかにする。この解析から、増殖シグナルとの関連性が明らかとなるため、治療標的としての有用性を検討する。医歯薬学今解析から明らかとなった候補蛋白について、診断標的としての有用性の確認と、生物学的な機能解析による治療標的としての有用性を検討する。候補蛋白に対する抗体を用いて、腫瘍組織における当該糖蛋白の発現量および特異性を明らかにし、臨床病理学的な悪性度等との関連性を評価する。また、患者血清における当該糖蛋白の血中濃度と臨床所見等との関連性を解析し、組織診断マーカーおよび血清診断マーカーとしての有用性を評価する。また、これまでの解析から癌細胞特異的に発現する糖鎖には増殖促進や浸潤能などの機能を持つことが考えられる。そのため、当該糖蛋白が関わるシグナル経路を明らかにし、増殖および治療抵抗性との関連性を解析する。これらの解析から明らかとなるシグナル経路が新たな治療標的となり得るか検討する。当該年度購入予定の消耗品の中で、残額4187円で購入出来る物品が無かったため。購入予定の消耗品等の中で、残額109円で購入できる物品が無かったため。
超臨界流体による低石炭化度炭からの炭素材料用原料の抽出分離に関する研究

石炭を炭素材料用原料として捉えた場合、低品位炭の利用技術はコークス用原料炭と比較してかなり立ち遅れているのが現状である。これは一般に低石炭化度炭は熱溶融性を示さず、炭素材用原料に不可欠な芳香族ラメラの再配列による光学的異方性構造が発現しないためであり、水添液化等の熱流動性を付与する処理が必要となる。しかしながら低品位炭といえども熱溶融性を示し得るマセラルが石炭中に散在しており、その分離が可能であれば低品位炭の炭素材用原料としての価値も向上する。そこで本研究では超臨界ガスにより石炭中の軟化溶融成分の抽出を試み、さらに抽出物の炭素化特性を検討した。試料炭として太平洋炭,イリノイNo.6炭,サフコ炭,ヤルーン炭の4種を選定した。これらはいずれも熱溶融性を示さず、加熱による光学的異方性構造の発現は認められない。抽出は、半回分式装置により行い、溶剤としてトルエンおよびトルエンにテトラリン、エタノールを050vol%の範囲で添加した混合溶剤を用いた。温度・圧力条件は350380°C、1030MPaで行った。その結果、炭種や抽出条件により異なるが無水無灰基準で2050wt%程度の比較的高い抽出収率を得た。次にこれらの抽出物を窒素雰囲気下、400500°Cで13hr熱処理し、生成したセミコークスを常法に従い偏光顕微鏡により観察した。その結果すべての抽出物に微細なモザイク状(<0.1μm)の光学的異方性組織が認められた。なおエタノールとの混合溶剤による抽出物からは、他の場合の10倍程度の大きさの異方性構造が認められた。この抽出物は他の条件下でとものと比べ低い融点を有しており、その高い熱流動性が異方性構造の発達を促進させた原因と考えられる。また抽出物の熱流動性及び異方性構造の発生は含まれるプレアスファルテン量に大きく依存し、この量の調節が重要であり、最適な光学的異方性構造の発現には超臨界ガス抽出法は極めて有効であることがわかった。
腸管特異的Notch標的遺伝子の探索による粘膜再生療法の開発

本研究では炎症性腸疾患、特に潰瘍性大腸炎患者の炎症部に於ける上皮分化制御の分子機構と粘膜再生メカニズムに焦点をあて、粘膜再生促進につながる分子標的の探索を行った。我々が独自に樹立したヒト腸管上皮培養細胞株及び患者臨床検体を用いた分子生物学的探索により、炎症性腸疾患患者の粘膜上皮に於ける再生促進に寄与する主たる分子シグナルとしてNotchシグナルを同定した。同シグナルは炎症性腸疾患に特徴的な上皮分化様式を決定するシグナル経路であるのみならず、細胞増殖を介した粘膜再生に積極的に関与し、同シグナル活性化の欠如が即ち粘膜再生不全につながることを明確に示した。さらに、ヒト腸管上皮細胞におけるNotch活性化により制御される遺伝子群の網羅的探索により、粘膜再生応答における腸管上皮細胞トランスクリプトームを明らかとし、粘膜再生治療に於ける新規標的分子探索の基盤を構築した。これらの成果は炎症性腸疾患における難治化の主たる要因である粘膜再生不全の機序を分子レベルで解明した画期的知見であるのみならず、特定のシグナル活性化を誘導することにより粘膜再生を促進する新規治療法の開発に重要な分子基盤を確立したものである。本研究では炎症性腸疾患炎症部に特異的な上皮分化様式を端緒に、同疾患にける腸管上皮再生の分子機構の解析を遂行している。1)腸管炎症粘膜におけるNotchシグナルの重要性:潰瘍性大腸炎病変部の免疫組織学的解析によりa)ヒト腸管粘膜に於いて、活性型Notch及びその標的遺伝子Hes1は陰窩内の上皮細胞に限局して発現が確認された。b)潰瘍性大腸炎病変部の陰窩においては杯細胞の著しい減少と一致して同部位の上皮におけるNotchの広範な活性化が確認された。2)ヒト腸管上皮細胞における活性型Notch1の分子機能の解明:ヒト大腸癌由来培養細胞株に於ける誘導発現系を用いてNotchシグナル活性化がヒト腸管上皮細胞分化に与える影響を解析した。その結果、a)ヒト大腸癌由来細胞株に強制的にNotch活性化を誘導する事により、杯細胞特異的遺伝子MUC2発現の著しい減少が誘導され、粘液分泌能も著しい低下が確認された。b)同様のNotch活性化を誘導する事によりバネート細胞特異的遺伝子PLA2G2Aの発現及び分泌の亢進が誘導された。3)腸管粘膜再生におけるNotchシグナルの重要性の解明:デキストラン硫酸投与による大腸炎誘導モデルマウスにNotchシグナル阻害薬を投与し、その効果を組織学的に解析した。その結果、a)Notchシグナル阻害薬によりデキストラン硫酸誘導腸炎の著しい増悪と個体死亡率の上昇が誘導された。b)Notchシグナル阻害薬は非炎症部腸管に於ける杯細胞分化を促進する効果を有する一方、炎症部腸管に於いて細胞増殖を著しく抑制する効果を有していた。同効果により、炎症により傷害された粘膜上皮の再生反応は著しく抑制された。これらの成果は、難治性炎症性腸疾患における上皮再生機構を分子レベルで解明した画期的知見であり、同疾患における粘膜再生治療の開発に重要な基盤を提供するものである。本研究では炎症性腸疾患炎症部に於ける特異的な上皮分化様式の分子機構の解明を通して、同疾患に於ける上皮再生の分子機構の解明と粘膜再生治療への応用を最終的な目的としている。1)腸管粘膜再生におけるNotchシグナルの意義:潰瘍性大腸炎患者の腸管粘膜における免疫組織学的解析によりa)腸管粘膜に於いて、Notchシグナル活性化は陰窩内の上皮細胞に限局して観察された。b)潰瘍性大腸炎病変部の陰窩における杯細胞の減少と一致して、同部におけるNotchシグナル活性化の誘導が観察された。2)ヒト腸管上皮細胞における活性型Notch 1の分子機能の解明:ヒト大腸癌由来培養細胞株に於ける誘導発現系を用いてヒト腸管上皮細胞におけるNotchシグナル活性化が遺伝子発現制御に与える影響を網羅的に解析した。その結果、a)杯細胞特異的遺伝子MUC2発現の著しい減少が誘導されると同時に、著しい粘液分泌能の低下が観察された。b)パネート細胞特異的遺伝子PLA2G2Aの発現及び蛋白分泌の亢進が誘導された。c)上記を加えた複数の遺伝子群が腸管上皮に於けるNotch標的遺伝子の候補として同定された。

3)腸管粘膜再生におけるNotchシグナル活性化の意義:デキストラン硫酸投与による大腸炎誘導モデルマウスにNotchシグナル阻害薬を投与し、その効果を組織学的に解析した。その結果、a)同阻害薬投与により腸炎の著しい増悪と個体死亡率の上昇が確認された。b)同阻害薬は非炎症部腸管に於ける杯細胞の増加を誘導する一方、炎症部腸管に於ける細胞増殖を著しく抑制した。c)炎症性サイトカインの発現には影響を与えなかった。結果として、粘膜上皮の再生応答を著しく抑制した。これらの成果は、難治性炎症性腸疾患における粘膜再生治療を目指す上で具体的な分子標的としてNotch受容体を提示した画期的知見を提供するものである。
淡水化のための新規透過膜の構造に関する分子論的研究

細胞の内外を分ける細胞膜内に存在するタンパク質であるアクアポリンは,水分子のみを透過する特殊な分子である.この分子の特徴を研究し,カーボンナノチューブを用いて淡水化のための新規透過膜について研究を行った.アクアポリン内部のアミノ酸間の距離のゆらぎを解析した結果,1/fゆらぎであることを示した.またカーボンナノチューブを用いた系においては,電場を印可することにより水のみの系ではカーボンナノチューブ内に螺旋状の氷構造ができることがわかった.水/アルコール混合系に電場を印可した際には,水分子のみがカーボンナノチューブ内に存在し,水とアルコールの分離を行うことに成功した.アクアポリンの水分子透過メカニズムを分子レベルで解明するために,アクアポリン/細胞膜/水分子の系について分子動力学シミュレーションを行った.アクアポリンの水分子の取り込み口の機構に着目した.アクアポリンの入り口付近の水分子のダイナミクスを水分子の回転緩和時間や拡散係数を計算することで解析した.本系は10万原子以上,100 ns以上の計算を行った.また,アクアポリンの穴の内を水分子は一列になって透過するが,透過の駆動力については解明されていない.前後に存在する水分子から受ける熱揺動であるという考えもあるが,アクアポリンが持っているゆらぎから受ける力が重要であると考えた.そこで,アクアポリンの穴を構成しているアミノ酸基の距離の時系列からアクアポリンの穴の内部に存在するゆらぎを解析した.具体的には,得られた時系列をフーリエ変換する方法と時系列を傾きの分散から求める方法(Detrended Fluctuation Analysis(DFA))を用いる.いくつかのタンパク質では,残基のゆらぎが1/fゆらぎになっていることが知られているので,アクアポリン内の残基のゆらぎが1/fスペクトルになっているかについて明らかにした.また,アクアポリン内の残基のゆらぎが,そこを透過する水分子に与える影響を調べるために,水分子が穴の中の特定の場所を透過する時間間隔の分布を調べた.これらのことを理論的に明らかにするために,一次元のポテンシャルモデルとLangevin方程式を用いてシミュレーションを行い,ポテンシャルの高さが1/fでゆらぐ際に,ある分子がポテンシャルの井戸を出るまでの時間の分布を調べ,アクアポリンのシミュレーションの結果と整合性があるのかどうかを検証した.当初の計画では,淡水化を行う方法として水分子のみを透過させる親水基付加型カーボンナノチューブを用いて,同時に研究を進めて来ているにアクアポリンの解析から得られる揺らぎに関する情報を付加した方法を検討していた.しかし他の研究グループでも親水基付加型カーボンナノチューブに着目している研究があったため,揺らぎの効果は後ほど取り入れて行くこととして,カーボンナノチューブを使用した新規の淡水化の方法を検討することとした.そこで本研究では電場を付加することでより簡便に淡水化できる方法を検討した.水/メタノール混合系において,電場を付加した予備計算を行ったところ,淡水化の傾向がみられた.そこで,水分子のみの系について電場を付加した計算を行い,電場の強さを変えるとカーボンナノチューブ内で結晶構造のような構造ができることを確認した.電場がない系において温度を低くした際に見られる構造と同様のものもあるが,ヘリカルな構造も観察することができた.次に,水/メタノール混合系においても同様の計算を行い,電場の強さを変えると水分子のみがカーボンナノチューブ内に存在するようになることを確認した.これは,カーボンナノチューブのサイズを変えても同様に見ることができ,これまで報告されて来ている似たような系での研究と比較して,淡水化の効果が高いことが分かった.水分子のみの系については,J. Chem. Phys.誌に論文として発表された.本研究の目的は,水分子のみ透過させるアクアポリン(膜タンパク質)の水分子透過メカニズムを分子レベルで解明し,海水淡水化技術に応用できる新しいカーボンナノチューブ構造を提案することである.まずアクアポリンの分子動力学シミュレーションを行い,アクアポリンの入り口構造がアクアポリン内への水分子の取り込みに与える影響,水分子以外の物質透過を阻害するフィルタメカニズムの解明を行った.次に,得られた知見から,疎水性のカーボンナノチューブに親水基を埋め込んだ親水基付加型カーボンナノチューブ構造を考え,分子シミュレーションを行う予定でいたが,同時期に世界的に同様の研究がなされたため,生体内に存在する電場による効果を検討し,電場を付加したシミュレーションを行った.水分子のみの系においてカーボンナノチューブの長さ方向に電場をかけた場合,氷Ihなどの通常見られる氷とは異なる螺旋状の氷の構造をとることがわかった.水/メタノール系において同様のシミュレーションをしたところ,電場をかけない場合はメタノールが優先的にカーボンナノチューブの内部に介在するが,電場をかけると水分子のみが螺旋状の構造をとることによりカーボンナノチューブ内に介在することを見いだした.この結果から,水/メタノール混合系において水とメタノールを分離するできることを示したことになる.最終年度は,水/エタノール,メタノール/エタノール混合系に応用した.水/エタノールの場合は,水/メタノールと同様に電場を印加後は水分子のみが螺旋状構造を作ることがわかった.また,メタノール/エタノール混合系においても電場を印加前はエタノールが,印加後はメタノールがそれぞれ介在することを見いだした.

これらの結果から,淡水化のみに限らず,2つの物質の分離において応用が可能であることを示した.細胞の内外を分ける細胞膜内に存在するタンパク質であるアクアポリンは,水分子のみを透過する特殊な分子である.この分子の特徴を研究し,カーボンナノチューブを用いて淡水化のための新規透過膜について研究を行った.アクアポリン内部のアミノ酸間の距離のゆらぎを解析した結果,1/fゆらぎであることを示した.またカーボンナノチューブを用いた系においては,電場を印可することにより水のみの系ではカーボンナノチューブ内に螺旋状の氷構造ができることがわかった.水/アルコール混合系に電場を印可した際には,水分子のみがカーボンナノチューブ内に存在し,水とアルコールの分離を行うことに成功した.当初の計画では,淡水化を行う方法として水分子のみを透過させる親水基付加型カーボンナノチューブを用いて,同時に研究を進めて来ているにアクアポリンの解析から得られる揺らぎに関する情報を付加した方法を検討していた.しかし他の研究グループでも親水基付加型カーボンナノチューブに着目している研究があったため,揺らぎの効果は後ほど取り入れて行くこととして,カーボンナノチューブを使用した新規の淡水化の方法を検討することとした.その結果,当初考えていたよりは淡水化の効果がある方法を提案することができたので,おおむね順調であるとした.熱工学揺らぎと淡水化の関係については,昨年度アクアポリンを用いて研究を進めて来ており,揺らぎの利用について今後も検討を進めて行く.一方,本年度行った電場を付加する方法については一定の成果が出て来ているので,水/エタノールや水/イオンなどの系にも拡張して,淡水化の可能性について研究を進めて行く.計画していたアクアポリン/細胞膜/水分子の大規模系の計算を行うことができ,その解析から新しい現象を見いだすことに成功した.本年度の成果を国際会議にて発表する計画を立てていたが,より良い結果が出てきたため論文を投稿してから更なる新しい結果を国際会議にて発表することとしたため11万ほどを次年度への使用としたため,次年度使用額がでた.アクアポリンに関する知見が得られてきたので,引き続き解析を行う.また,親水基を付加したカーボンナノチューブのモデルを作成して,アクアポリンの系で得られた知見を元に淡水化に関するシミュレーションを行う.既に論文を投稿し,5月のカルガリーでの国際会議に発表を申し込んでおり,次年度使用額と次年度助成金50万を会わせて,国際会議での発表,論文投稿費用などとして使用する予定である.消耗品を購入する予定にしていたが,既存のもので計画通り進めることができたこと,新しいモデルを購入するために製品が出るのを待っていたが年度内に手に入らなかったことが理由である.ただし,計画は順調に進んでいる.次年度に今年度購入する予定であったものを購入し,研究を加速させる.
歯根膜における荷重・部位依存的な破骨細胞誘導機構の解析

メカニカルストレスは歯根膜線維芽細胞や骨芽細胞における破骨細胞誘導因子の発現を調整し、歯周組織での破骨細胞の分化・誘導に関わる重要な因子として考えられている.本研究では我々の開発した荷重量,頻度をコントロールできる繰返し荷重装置を用いて,ラット臼歯に繰り返し荷重を付与し,破骨細胞誘導に関わるシグナルリングカスケードの解析を行った.荷重量の増加に伴い,歯槽骨内に破骨細胞数の増加が認められたものの,歯根膜内に破骨細胞の誘導は認められなかった.また免疫組織学的検討により歯根膜のRANKL/OPG比の増加が観察されたことから,歯周組織において,メカニカルストレス由来の歯周組織の破壊が生じる可能性が示唆された.メカニカルストレスは歯根膜線維芽細胞や骨芽細胞における破骨細胞誘導因子の発現を調整し、歯周組織での破骨細胞の分化・誘導に関わる重要な因子として考えられている.本研究では我々の開発した荷重量,頻度をコントロールできる繰返し荷重装置を用いて,ラット臼歯に繰り返し荷重を付与し,破骨細胞誘導に関わるシグナルリングカスケードの解析を行った.荷重量の増加に伴い,歯槽骨内に破骨細胞数の増加が認められたものの,歯根膜内に破骨細胞の誘導は認められなかった.また免疫組織学的検討により歯根膜のRANKL/OPG比の増加が観察されたことから,歯周組織において,メカニカルストレス由来の歯周組織の破壊が生じる可能性が示唆された.メカニカルストレスは歯根膜線維芽細胞や骨芽細胞における破骨細胞誘導因子の発現を調整し,歯周組織での破骨細胞の分化・誘導に関わる重要な因子として考えられている。メカニカルストレスによる破骨細胞誘導経路の検索は、in vitroにおいては細胞伸展装置などを用いて荷重を付与し、その際の遺伝子、タンパク質の発現を分析する方法による。しかしながら歯周組織には多種多様な細胞が混在し、in vivoの複雑な歯周組織の環境を再現することは困難であり、in vitroの結果を検討するための実験動物モデルも存在しなかった。そこで、我々はラット臼歯に咀嚼力を想定した規格化された繰り返し荷重を付与するための装置を開発し、異なる荷重が歯周組織の破骨細胞誘導に与える影響を検討した。荷重量の基準はラット咀嚼力を推定し、第一臼歯に100、150、200%の荷重量を付与し、荷重の頻度はラット咀嚼時のサイクルを想定し、5.8Hzとした。荷重付与後、1日目、3日目、7日目の組織切片を観察したところ150%、200%荷重付与した群において3日目、7日目に歯周組織に著明な破骨細胞の誘導を認めた。したがって我々の開発したシステムを用いて、メカニカルストレスが破骨細胞を誘導する際の反応をin vivoにて観察できる可能性を示唆している。本年度は、破骨細胞が誘導する初期の反応をより詳細に検討するために荷重付与後2日目の実験群を加え、遺伝子、タンパク質の発現を観察する予定である。観察部位は、根間中隔歯根膜と根間中隔歯槽骨内部に分けて観察し、破骨細胞誘導に寄与する細胞を同定し、そのメカニズムを解明することを目的とする。メカニカルストレスは歯根膜線維芽細胞や骨芽細胞における破骨細胞誘導因子の発現を調整し,歯周組織での破骨細胞の分化・誘導に関わる重要な因子として考えられている。さらに我々は,破骨細胞誘導初期を検討するために,荷重付与後2日目の組織学的検討を加え,歯周組織に破骨細胞の誘導を認めた.次いで,破骨細胞誘導に関わるシグナリングカスケードを解明するために,荷重付与後1日目,2日目に対象歯を抜歯,歯根膜を回収し,遺伝子の解析を行っている.
動脈硬化形成における小腸由来リポタンパクに関する発生工学的研究

リポタンパクリパーゼ(LPL)を過剰に発現するLDLレセプターノックアウトマウス(LPL/LDLRKO)とLPLを過剰に発現するアポEノックアウトマウス(LPL/APOEKO)を樹立した。まずLPL/LDLRKOのリポタンパク代謝をLDLRKOと比較したところ、血中の中性脂肪値の著名な低下が観察された。また、総コレステロール値も約半分に低下していた。変化のあったリポタンパクをHPLCも用いて比較すると、IDL/LDL分画のうち、大粒子のリポタンパクの減少が観察された。高コレステロール高脂肪食で飼育して、リポタンパク代謝を比較した場合も同様であり、総コレステロール値の低下が認められ、そのほとんどは大粒子のIDL/LDL分画であった。この分画は小腸由来リポタンパクであるカイロミクロンのレムナント(ChR)に相当する考えられた。即ち、LPLの過剰発現はChRの蓄積を抑制することが明らかにされた。大動脈洞の連続横断面にて評価した動脈硬化の進行は、LPL/LDLRKOはLDLRKOの約1/20に抑制されており、ChRがLDLRKOにおける動脈硬化の主要進展因子であり、LPLはその増加の抑制を介して抗動脈硬化的に作用すると考えられた。LPL/APOEKOのAPOEKOと比較したリポタンパク代謝の変化は、LPL/LDLRKOの場合よりも軽微であり、血中の中性脂肪値の低下は観察されるが、総コレステロール値の有意な低下は観察されなかった。HPLCで見た場合も、軽度の小粒子化が観察されたが、総体的変化はわずかであった。このことは、LPLのChR低下作用にはアポEの存在は必要であることを示唆する。LPL/APOEKOはAPOEKOと比較して、動脈硬化の抑制傾向が認められたが、その差はLPL/LDLRKOにおいて認められた差に比較して小さかった。
エストロゲンとタモキシフェンの生物学的差異を利用した、子宮体癌モデルマウス作成

C57/B6マウスを用いてタモキシフェン(4-HT)のマウス子宮に対する影響を検討した。タモキシフェン投与により、コントロール群に比べて有意に子宮重量が増加した。4-HT投与マウスにおいては、著明な内膜腺の拡大および増加、間質組織の浮腫化が確認された。Steroid sulfataseについて、Ishikawa細胞において発現を検討し、その阻害剤投与で増殖が抑制された。本研究はタモキシフェン投与下に子宮内膜腺で特異的に発現するプロモーターを同定しその下流で酵素Creを発現するトランスジェニックマウスを作成することを第一の目標とし、さらにこのマウスをCre-loxP systemでCre発現部位でのみ癌抑制遺伝子PTEN欠失するマウス(PTEN^<lox/lox>)と交配し、タモキシフェン投与下で子宮内膜癌が発生するマウス発癌モデルを作成する事を最終目標としている。初年度計画ではタモキシフェン投与下に子宮内膜腺で特異的に発現するプロモーターを同定し、その下流で酵素Creを発現するトランスジェニックマウスを作成することを第一の目標としている。初年度計画に従い、我々は実験(1):タモキシフェン投与時の特異的遺伝子発現の確認、と実験(2):Creトランスジェニックマウスの作成について集中的に実行した。実験(1)については去勢した8-12週齢のメスC57/B6マウスを用いてタモキシフェン投与群とコントロール群に分けて子宮内膜をそれぞれレーザーキャプチャーマイクロダイセクション法で分離し、RNAを抽出し、マイクロアレイを行った。現在統計的機能的解析を行い候補分子を取捨選択中である。実験(2)については並列で部分的に進行しており、すでにCre遺伝子フラグメントはすでにクローニングベクターに組み込まれていることから実験(1)で候補に挙がった子宮内膜特異的発現プロモーターが有望であれば速やかにサブクローニング可能と考える。さらにCreの発現確認用のROSA26レポーターマウスも既に調達済みである。本研究はタモキシフェン投与下に子宮内膜腺で特異的に発現するプロモーターを同定しその下流で酵素Creを発現するトランスジェニックマウスを作成することを第一の目標とし、さらにこのマウスをCre-lox PsystemでCre発現部位でのみ癌抑制遺伝子PTEN欠失するマウス(PTENI^<lox/lox>)と交配し、タモキシフェン投与下で子宮内膜癌が発生するマウス発癌モデルを作成する事を最終目標としている。初年度計画に引き続き、実験(1):タモキシフェン投与時の特異的遺伝子発現の確認、および実験(2):Creトランスジェニックマウスの作成について集約的に実行した。前年度は実験(1)として去勢した8-12週齢のメスC57/B6マウスを用いてタモキシフェン投与群とコントロール群に分けて子宮内膜をそれぞれレーザーキャプチャーマイクロダイセクション法で分離し、RNAを抽出し、マイクロアレイを行った。統計的解析を行い候補分子を検索したが、有意なものが得られなかったため、再度実験を継続中である。実験(2)については前年度にCre遺伝子フラグメントをクローニングベクターに組み込み済みであり、実験(1)で候補に挙がった子宮内膜特異的発現プロモーターが有望であれば速やかにサブクローニング可能な状態である。Creの発現確認用のROSA26レポーターマウスも既に調達済みで動物施設にて繁殖中である。本研究の第一の目標はタモキシフェンを投与した際に、子宮内膜腺で特異的に発現するプロモーターを同定し、その下流で酵素Creを発現するトランスジェニックマウスを作成することである。さらにこのマウスをCre-loxP systemでCre発現部位でのみ癌抑制遺伝子PTEN欠失するマウス(PTEN^<lox/lox>)と交配し、タモキシフェン投与下で子宮内膜癌が発生するマウス発癌モデルを作成する事を最終的な目標としている。これまでの計画通り、タモキシフェン投与下に子宮内膜腺で特異的に発現するプロモーターを同定し、その下流で酵素Creを発現するトランスジェニックマウスを作成することが当初の目的であるため以下に示すような手順で実験を継続している。実験(1):タモキシフェン投与時の特異的0遺伝子発現の確認、および実験(2):Creトランスジェニックマウスの作成について集約的に実行している。実験(1)としては去勢した8-12週齢のメスC57/B6マウスを用いてタモキシフェン投与群とコントロール群に分けて子宮内膜をそれぞれレーザーキャプチャーマイクロダイセクション法で分離し、RNAを抽出し、マイクロアレイを行った。統計的解析を行い候補分子を検索している段階である。実験(2)についてはすでにCre遺伝子フラグメントをクローニングベクターに組み込み済みであり、実験(1)で候補に挙がった子宮内膜特異的発現プロモーターが有望であれば速やかにサブクローニング可能な状態にはなっている。Creの発現確認用のROSA26レポーターマウスも動物施設にて繁殖中である。

本研究の第一の目標はタモキシフェンを投与した際に、子宮内膜腺で特異的に発現するプロモーターを同定し、その下流で酵素Creを発現するトランスジェニックマウスを作成することである。さらにこのマウスをCre-loxP systemでCre発現部位でのみ癌抑制遺伝子PTEN欠失するマウス(PTENlox/lox)と交配し、タモキシフェン投与下で子宮内膜癌が発生するマウス発癌モデルを作成する事を最終的な目標としている。これまでの計画通り、タモキシフェン投与下に子宮内膜腺で特異的に発現するプロモーターを同定し、その下流で酵素Creを発現するトランスジェニックマウスを作成することが当初の目的であるため以下に示すような手順で実験を継続している。去勢した8-12週齢のメスC57/B6マウスを用いてタモキシフェン投与群とコントロール群に分けて子宮内膜をそれぞれレーザーキャプチャーマイクロダイセクション法で分離し、RNAを抽出し、マイクロアレイを行って候補分子を検索している。これと並行して、同じエストロゲン依存性疾患である乳癌で検討されているSteroid sulfataseについて、Ishikawa細胞において発現を検討し、その阻害剤投与で増殖が抑制されることを確認した。タモキシフェン投与群とコントロール群に分けてマウスの子宮内膜をそれぞれレーザーキャプチャーマイクロダイセクション法で分離し、RNAを抽出し、マイクロアレイを行っていたが有望な特異的プロモーターの探索に時間がかかった。24年度が最終年度であるため、記入しない。タモキシフェン投与時の特異的遺伝子発現の確認、およびCreトランスジェニックマウスの作成について集約的に実行することが可能なように、Cre遺伝子フラグメントをクローニングベクターに組み込み済みであり、候補に挙がった子宮内膜特異的発現プロモーターが有望であれば速やかにサブクローニング可能な状態になっている。
行政保健師への市民からの暴言・暴力に関する研究：実態と行政機関の対応方針の分析

本研究は、地域保健機関の行政保健師等への市民からの暴言・暴力に関する実態(経験)を、刑法上の犯罪の構成要件を基準として、明らかにすることを目的とし、全国の地域保健機関を対象に、平成30年2月に無記名自記式の質問紙調査を実施した。保健師等の地域保健従事者の生命・身体への侵害について、少なからぬ地域保健機関が、犯罪の構成要件にも該当するような暴言・暴力を経験していることが明らかになった。本研究は、全国の地域保健機関を対象として、1暴言・暴力の実態、2機関の対応方針の存否、ある場合には、その内容を調査する。前者では、刑法上の犯罪の構成要件等を基準として実態を把握する。また、後者では、暴言・暴力発生時の対応だけではなく、予防、早期発見の点にも着目する。上記の結果を踏まえて、暴言・暴力の予防、早期発見、発生時の初期対応のための方策を検討し、地域保健機関での安全確保対策について具体的な提言をすることを目的とする。今年度は、主に、保健師等の地域保健従事者に対する暴言・暴力の問題について検討している過去の論文について、1)理論研究、及び2)調査研究に関する文献の精査を行った。1)については、法学者と弁護士から助言を得、刑事上の犯罪の成立、民事上の不法行為責任の成立に言及している研究論文を中心に精査した。2)については、1暴言・暴力の実態(存否、存在する場合はその態様)や、2暴言・暴力の問題に関する対応方針(予防、早期発見、発生時の初期対応の各問題についての対応方針)について検討している論文について精査した。また、研究者が既に実施した質問紙調査の2次解析を行った。その結果、市民の健康状態、並びに行政機関の提供するサービスに対する満足度には、社会経済的側面が大きく関連していることが明らかとなった。上記の結果は、関連国際学会で報告済である。次年度は、今年度の文献研究等の知見を基に、日本における実態調査を進めて行く予定である。本研究は、全国の地域保健機関を対象として、利用者による暴言・暴力について、1刑法上の犯罪の構成要件との関係から、その実態を調査すること、及び2未然防止に関する取り組み方針や、暴言暴力が発生した際の対応方針について、その存否と、方針がある場合にはその内容を調査すること等を目的とするものである。上記の目的を踏まえて、平成27年度は、地域保健機関の関係者に対して、1および2に関する聞き取り調査を行った。その結果、例えば調査対象とする問題行為について、暴言・暴力のみではなく、ストーカーなども現場では対応に苦慮する行為であり、また、暴言・暴力にも関連する重大な問題行為であるため、調査の対象とすべきであることなど、1に関して質問紙内容を検討する上で、貴重な示唆が得られた。また、平成27年度には、当初の計画を発展させ、地域保健機関の関係者だけではなく、医療機関の関係者に対して、関連する聞き取り調査を行った。その結果、例えば、警察官OBである職員の活動について、同職員が現場で果たすことができる役割は大きいにも関わらず、実際には、活動内容は医療機関間で大きな違いがあることがわかった。そして、その原因は、職務内容に関する組織の方針が明確になっていないことなどにあることが推察された。このことからは、地域保健機関でも、未然防止や、問題事象が生じた場合の対応方針を明確にしておくことの重要性について示唆が得られた。市民からの暴言暴力に関する、地域保健機関の1)実態把握、及び、2)暴言暴力の問題に関する対応方針に関する聞き取り調査の結果をもとに、法学者、弁護士らと検討した。その結果、地域保健機関だけでなく医療機関との比較を行うことで、より有益な知見が得られることが期待された。このことから、当初の計画を発展させ、医療機関の関係者にも、同様の聞き取り調査を行い、地域保健機関と医療機関の実態を比較検討した上で、質問紙調査の原案を作成した。上記の目的を踏まえて、前年度に引き続き、地域保健機関の関係者に対して、1および2に関する聞き取り調査を行い、その結果をもとに、法学者、弁護士、疫学・統計の研究者らと検討を重ねた。検討の結果、平成27年度に作成した原案から、主に下記1.4.について変更・加筆を行い、各地域保健機関(1)保健所、2)市町村/政令市保健センター、3)精神保健福祉センター、4)児童相談所)の詳細の実態把握ができるよう、当初の計画を発展させて実施することとなった。今年度は、下記1.4.の追加・変更点を踏まえて、質問紙を完成させ、本学研究倫理委員会の承認を得た後、予備調査、及び予備解析を実施した。1.上記1)4)の各地域保健機関に対し、それぞれの保健福祉相談・対応分野の詳細内容を尋ねる質問項目を設けた。2.刑法上の犯罪の構成要件の内、特に暴行に関しては、ケースの詳細の状況(暴行の加害者、暴行を受けた場所とケース区分等)について、質問項目を設けた。3.各地域保健機関の管轄人口について、質問項目を設けた。4.当初、各地域保健機関から無作為抽出して調査を実施する計画であったが、悉皆調査へ変更した。

平成28年度は、研究実績の概要に示す通り、当初の計画を発展させ、質問紙を完成させた。また、予備調査及び予備解析まで実施した(本学研究倫理審査の承認済)。この結果を踏まえて、次年度の本調査を進めている。本研究は、全国の地域保健機関を対象として、利用者による暴言・暴力について、1刑法上の犯罪の構成要件との関係から、その実態を調査すること、及び2未然防止に関する取り組み方針や、暴言暴力が発生した際の対応方針について、その存否と、方針がある場合にはその内容を調査すること等を目的とするものである。上記の目的を踏まえて、これまで、地域保健機関の関係者に対して、1および2に関する聞き取り調査を行ってきた。また、その結果をもとに、法学者、弁護士、疫学・統計の研究者らと検討を重ね、質問紙を作成し、前年度は、プレテストを実施した。今年度は、プレテストの結果をもとに、質問紙を加筆・修正し最終版を完成させ、各地域保健機関1)保健所、2)市町村/政令市保健センター、3)精神保健福祉センター、4)児童相談所)を対象とした悉皆調査を実施した。回収率は、(1)保健所46.1%、2)市町村/政令市保健センター25.9%、3)精神保健福祉センター56.5%、4)児童相談所39.7%(平成29年3月30日時点)であった。今年度は本調査の結果をもとに報告書の作成を行った。本研究は、地域保健機関の行政保健師等への市民からの暴言・暴力に関する実態(経験)を、刑法上の犯罪の構成要件を基準として、明らかにすることを目的とし、全国の地域保健機関を対象に、平成30年2月に無記名自記式の質問紙調査を実施した。保健師等の地域保健従事者の生命・身体への侵害について、少なからぬ地域保健機関が、犯罪の構成要件にも該当するような暴言・暴力を経験していることが明らかになった。文献調査および、法学者・弁護士への聞き取り調査等を、当初の計画より丁寧に行うことにした。このため、地域保健機関の関係者への聞き取り調査を次年度に実施することにした。このこと以外は、本研究は、当初の計画通り、順調に進行している。なお、文献調査および、法学者・弁護士への聞き取り調査等を、当初の計画より丁寧に行うことにしたことについては、そのようにするほうが、その後に実施する、地域保健機関の関係者への聞き取り調査をはじめ、本研究において、より有益な知見が得られると判断したためである。平成27年度の成果を基に、質問紙を完成させ、全国の地域保健機関を対象とした無記名自記式質問紙調査を実施する。また、調査結果をまとめ、適宜、学会、研究会での発表、国内外の学術雑誌への論文投稿を行う。計画を推進するために、平成27年度と同様、法律家・弁護士等の専門家に助言及び協力を依頼する。また、データ収集及び入力を行う研究補助者を雇用する。また、必要があれば、データ入力を委託する。全国の地域保健機関を対象とした無記名自記式質問紙調査を実施する。公衆衛生看護学平成24年度の成果を基に、地域保健機関の関係者へ、1)実態把握、及び2)暴言暴力の問題に関する対応方針に関する聞き取り調査を行う。その成果を基に、1)質問紙(案)の作成、予備調査、2)無記名・自記式質問紙調査を実施する。
情報社会に対応したコミュニケーション力育成のための実践支援・評価システムの開発

情報活用能力の一側面であるコミュニケーション能力を育成するための実践・評価手法の開発を試みた。その結果、1)国語科・社会科を横断したメディア制作と交流学習を取り人れたモデルプランを開発、2)評価手法としてコミュニケーション場而における評価指標(ルーブリック)の開発及びパフォーマンス評価による険証、3)教師の授業設計・交流支援を行うWebサービスの構築を行うことができた。平成20年度は次の3つの目的に対し、以下のような取り組みを行った。A)情報教育の視点からコミュニケーション能力の構成要素の明確化:宮城県の教員を中心とした研究会「情報活用型授業を深める会」を組織し、児童の発表場面におけるICTを用いた伝え方、情報教育に関する映像教材、学級経営とコミュニケーションカの関係について討議を行った。その結果、言語表現、メディア活用、関係性の3つの構成要素を抽出した。B)評価手法の開発:テレビ会議場面に着目し、宮城け・山形間の交流学習の実践について分析を行った。その結果、発表、討論、打ち合わせの3場面における期待されるパフォーマンスとそこでの関係性、メディア特性の影響についてモデル化することができた。一方で、電子黒板を児童が利用して説明する場面の行動を分析し、教室内のコミュニケーションにおけるメディアの影響についても検討を行った。C)コミュニティサイトの構築:オープンソースのSNSであるOpne PNE、CMSのJoomlaを用いたサイト構築と運用テストを行った。学習者向けにはグループウェア的な利用ニーズが高いがその一方で、教員にとってはメール主体の連絡調整に加えてWeb上で行うことの負荷が高く、支援方法を再検討する必要があることが確認された。また、システム上で実践支援を行うために、小学校高学年を対象とした国際交流モデルカリキュラムの開発を行った。以上の結果をもとに、次年度では評価指標のプロトタイプモデルを構築し、フィールド調査においてその指標の妥当性と有効性について検証を進めていくことを予定している。本研究では、A)情報教育の視点からコミュニケーション能力の構成要素の明確化、B)評価手法の開発、C)コミュニティサイトの構築の3つを目的としている。平成22年度に取り組んだのは以下の通りである。1)コミュニケーション力の育成に着目した情報モラル教育のモデル開発→仙台、横浜、大阪、徳島の4つの小学校において情報モラル教育の授業モデルの開発を行った。各地の携帯電話やインターネットの使用状況に照らし、適切なコミュニケーションを図るための授業モデルを開発し、効果検証を行った。2)言語活動の充実を図るための学校間交流学習の授業モデルの開発→仙台、石川、宮崎、愛媛の4つの小学校において、国語(4年、6年)、社会科(4年)の8つの単元を対象にしたモデルプランの開発と効果検証を行った。3)国際交流学習のマネジメント支援のためのWebツールの活用→協同の壁画制作を行うプロジェクト「アートマイル」を対象に、モデルカリキュラムに基づいた月ごとの進捗状況を報告・共有するためのWebサービスの活用方法の検討と運用を行った。以上の取り組みの結果、目標A),B)については、取り組み1),2)を通して情報教育の視点から児童のコミュニケーション活動を支えるスキルと態度と、実際のパフォーマンスを規定する教科単元や学習活動の場の設定との関連を検討し、授業場面に即したいくつかの評価手法を実施することができた。また、目標Cについては、2)において共有ホワイトボード型のグループウェアにより様々なコミュニケーション活動と評価・振り返り活動を支援できることを検証し、3)では教師を支援する枠組みとしてWebサービスの運用を行った。最終年度である次年度に向けて多くの実証データを蓄積することができた。本研究では、教科横断的な情報活用能力の一側面であるコミュニケーション能力を育成する理論的前提と手法について取り組んだ。事後的な対処としての情報モラル指導や、危険性の認識に留まらず、情報社会に正しく参加していくための核となる学習体験としての交流学習の学習評価の方法と、カリキュラム上の位置づけ、教員への支援体制を明らかにするため、A)情報教育の視点からコミュニケーション能力の構成要素の明確化、B)評価手法の開発、C)コミュニティサイトの構築を行った。最終年度である本年度の成果は以下の通りである。A)情報教育の視点からのコミュニケーション能力の構成要素の明確化:国語科・社会科を横断したモデル単元の整理をもとに、メディア制作を取り入れた交流学習に関するコミュニケーション場面を位置づけたリーフレットを開発した。B)評価手法の開発:鹿児島県・宮城県内の研究協力校におけるフィールド調査により、A)で明らかにした交流場面に対する評価指標(ルーブリック)を開発し、パフォーマンス評価を行った結果、交流相手と相互評価の視点を共有することによる効果、相互評価を取り入れる際の授業展開の工夫等を明らかにすることができた。C)コミュニティサイトの構築:交流学習における教師の授業運用状況を支援する目的として特に国際交流学習を対象にした、Webサービスの運用を行った。また、他のサービスに対する訪問調査を実施し、Webサービスによる交流学習運営支援の可能性について分析を試みた。さらに、これらの成果をもとにポータルサイトを改修し、知見の整理追加と、インターフェースの改善等を行った。
高齢児要養護児童に対する処遇プログラムの効果測定尺度の作成及び実用化について

本研究は、1)高齢児養護児童に対する処遇プログラムの効果測定調査2)養護施設における進路指導の実態調査(A施設調査B児童調査)、そして3)家庭相談員・児童相談員調査の三つに分けられて実施された。1)の効果測定調査は、尺度の作成と尺度の検証など複雑な作業のもとに進められたが、ほぼ成功裡に終了し詳細な分析がなされている。効果測定は、実験群(Aグループ-養護施設退所後、職業訓練を受けた者)と統制群(Sグループ-施設退所後、職業訓練を受けない者)との間の比較でなされたが、その結果は、第一に、全体としてAグループがSグループに比べて社会的自立の準備の度合が高い。第二に、Aグループのような社会的処遇を受けないで、個人の資質に任せる余地の比較的に多いSグループに高い自立を示した者もいる。第三に、両群に共通していえることは、この年齢のこの時期に何らかのケアを受けることが社会的自立の準備に大きくプラスしている。2)の養護施設における進路指導調査のなかで、A調査は、施設における進路指導体制に関する調査で、その内容は、施設の概況、処遇体制一般、通学校と地域の概況、進路指導の体制・方針、学習指導、進学指導、就職指導、中途退園後の指導、高齢児の養護、進路状況などあり、B調査は、個々の児童について進路指導のあり方をみたものであり、その内容は、児童の状況、指導方針、進路確定の経過と予後、評価などであるが、調査結果は、A調査、B調査ともに回収率が85%以上の高率のもと、多くの知見がえられた。その主なものは、進路指導に対する関心はきわめて高いが、現実には進学率は一般生徒に比べて著しく低い。その原因が学力の低さにあるか、どうかが問題である。3)の相談員調査においては、養護児童問題は家庭の養護機能の低下にあるが、そうしたなかで親の離婚や家出などの家庭崩壊、親の疾病異常などによる保育能力の喪失が目立ってきている。
腎臓特異的薬物輸送蛋白OATP-Rのノックアウトマウスの作製と生体内機能の解明

研究の目的研究代表者が単離したOATP-Rは腎尿細管上皮細胞の血管側に発現する有機アニオントランスポーターであり、腎臓での薬剤や腎不全物質の排泄を担う分子である。本研究では、OATP-RノックアウトマウスをCre recombinnaseを用いたconditional gene targetingで作製し、機能喪失モデルでOATP-Rの生体内機能の解析を行い、さらに腎不全モデル、薬剤性腎障害モデルをノックアウトマウスで作製し、その病態における変化を検討することを目的とする。ノックアウトコンストラクトの作製マウスOATP-Rはマウス第一染色体上に13個のexonが約50kbに渡って分布している。この第4番目のexon(以下Ex4)をノックアウトするためのGene Targeting vectorの作製を行った。Gene Targeting vectorの構造はEx4を挟み、その5'側のintronにloxP配列を、3'側のintronにES細胞への導入時のpositive selectionのためのneomycin耐性遺伝子の両端にloxP配列を配置してある、loxP-neo-loxpカセットを挿入し、Cre recombihaseによるEx4のdeletionを行うようにし、また相同組換えのために5'側に約8.8kbのlonga arm、3'側に1.2kbのshort armとなるマウスOatp-Rのgenomic DNAを配置する設計とした。実際にノックアウトマウスを作製する系統である、129SVJ mice strainのgenomic libraryをEx4を含むDNAプローブを用いた方法でスクリーニングしEx4の5'側、3'側とも約10kbを含むgenomic DNAのクローンを単離し、さらに適切な制限酵素で切り出した断片をpBluescript-SK(+) plasmidへサブクローニングした。loxP配列の挿入上問題となる、intron上のcis elementを避けるため、同部位のintronの塩基配列をsequenceで確認の上(NIH等のマウスゲノムDNAのデータベースにあるC57BL/6 strainと比較すると、129SVJ strainではintron部分の塩基配列はsequenceを行った約3000bpの部位のみでも全体の1.4%程で塩基の置換や欠失等の相違があった)、loxP配列挿入部位を決定した。本研究では、OATP-RノックアウトマウスをCre ricombinnaseを用いたconditional gene targetingで作製し、機能喪失モデルでOATP-Rの生体内機能の解析を行い、さらに腎不全モデル、薬剤性腎障害モデルをノックアウトマウスで作製し、その病態における変化を検討することを目的とする。ノックアウトコンストラクトの作製マウスOATP-Rはマウスの第一染色体上に13個のexonが約50kbに渡って分布している。Gene Targeting vectorの構造はEx4を挟み、その5'側のintronにloxP配列を、3'側のintronにES細胞への導入時のpositive selectionのためのneomycin耐性遺伝子の両端にloxP配列を配置してある、loxP-neo-loxPカセットを挿入し、Cre recombinaseによるEx4のdeletionを行うようにし、また相同組換えのために5'側に約8.8kbのlong arm、3'側に1.2kbのshort armとなるマウスOatp-Rのgenomic DNAを配置する設計とした。実際にノックアウトマウスを作製する系統である、129SVJ mice strainのgenomic libraryをEx4を含むDNAプローブを用いた方法でスクリーニングしEx4の5'側、3'側とも約10kbを含むgenomic DNAのクローンを単離し、さらに適切な制限酵素で切り出した断片をpBluescript-SK(+) plasmidへサブクローングした。loxP配列の挿入上問題となる、intron上のcis elementを避けるため、同部位のintornの塩基配列をsequenceで確認の上(NIH等のマウスゲノムDNAのデータベースにあるC57BL/6 strainと比較すると、129SVJ strainではintron部分の塩基配列はsequenceを行った約3000bpの部位のみでも全体の1.4%程で塩基の置換や欠失等の相違があった)、loxP配列挿入部位を決定した。