hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
活性化肝類洞リンパ球を用いた転移性肝癌の免疫化学療法の臨床応用

転移性肝癌における、癌転移を制御するメカニズムを、肝類洞リンパ球のT細胞、NK細胞から分析し、IL2の受容体などの発現を解析し、IL2などを利用した免疫化学療法の可能性を探ることが目的であった。転移性肝癌手術例で、切除肝より肝内リンパ球を分離し、MTTアッセイなどで各リンパ球分画における活性を解析した。また同時に末梢血リンパ球(PBL)の機能変化をミトコンドリアの膜電位(MMP)の変化,細胞のアポトーシスは細胞膜損傷により解析した。具体的には、肝臓切除後第1,3,7病日に採血。リンパ球を分離、シアン色素DiOC_6(3)、抗リンパ球表面抗原抗体(CD56,CD3)を用い、NK細胞およびT細胞分画aにおけるMMPをフローサイトメトリー法により測定した。また採血後24時間培養したリンパ球のアポトーシスはAnnexin Vを用い、フローサイトメトリー法により解析した。結果:大膓癌肝転移例で1亜区域以上の肝切除を施行した25例(H群)、腹腔鏡下胆嚢摘出術施行例(LC群)7例と健常者コントロール10例の計22例。H群において、第1,3病日でのリンパ球のMMPが有意に低下した(それぞれ術前値の62.7%、91.5%)。それらの低下はCD56陽性細胞(NK細胞分画)に認められ、CD3陽性細胞(T細胞分画)では認めなかった。LC群にてはMMPの変化は有意ではなかった(第1病日97.7%第3病日97.3%)。またH群においては24時間後にアポトーシスが認められた。以上より、肝臓切除後には理由は不明であるが、NK細胞のミトコンドリア機能が破綻し、アポトーシスに陥ることが示唆された。転移性肝癌の切除後の免疫療法を考える際には、このような手術侵襲による免疫機能の変化を考慮すべきであると考えられた。転移性肝癌を有する大腸癌患者に対して、肝動脈からIL-2,MMC,5-FUの注入を施行する予定であったが、近年のIL-2の動脈注入による副作用の報告、またその有効性に対する懐疑的な報告、十分なインフォームドコンセントを得ることの困難さ等の理由により、この免疫化学動注療法をみあわせている状況である。我々は当該年度は癌の肝転移の予防に重要な役割を持つと考えられる末梢血NK細胞の新たな機能評価を以下のごとく行った。1、末梢血NK細胞のミトコンドリア膜電位(NKΔψm)を測定し、これがNK細胞の生物学的活性の新たな指標となりうるかを検討した結果、末梢血NK細胞活性と、NKΔψmには相関が認められた。2、末梢血リンパ球を脱共役剤(CCCP)にて処理した際のNKΔψmの低下とNK細胞活性の減衰には強い相関が認められた。さらに、NK細胞をIL-2,IL-12で活性化させた際のNKΔψmの上昇、CD16抗体によるアポトーシス刺激によるNKΔψmの低下が確認された。以上よりNKΔψmの測定により、NK細胞の機能を簡便に評価できると考えられた。今後肝内リンパ球に関してもNKΔψmを測定し、大腸癌肝転移との関連を調べる予定である。また転移巣の微細環境の重要性に関して、以下の知見を得た。HCV感染患者においてNK細胞活性は低下しているにもかかわらず、HCV感染肝における大腸癌の肝転移頻度は正常肝に比較し優位に低い傾向が認められている。

そこでHCV感染患者と一般健康人のNKΔψmを比較検討したところHCV感染患者のNKΔψmは、一般健康人に比較し低い傾向が認められた。この事象は癌の肝転移は免疫担当細胞の機能低下のみにて規定されるのではなく、転移巣(肝臓)の微細環境の影響を受ける可能性があることを示唆させるものである。転移性肝癌における、癌転移を制御するメカニズムを、肝類洞リンパ球のT細胞、NK細胞から分析し、IL2の受容体などの発現を解析し、IL2などを利用した免疫化学療法の可能性を探ることが目的であった。転移性肝癌手術例で、切除肝より肝内リンパ球を分離し、MTTアッセイなどで各リンパ球分画における活性を解析した。また同時に末梢血リンパ球(PBL)の機能変化をミトコンドリアの膜電位(MMP)の変化、細胞のアポトーシスは細胞膜損傷により解析した。具体的には、肝臓切除後第1,3,7病日に採血。リンパ球を分離、シアン色素DiOC_6(3)、抗リンパ球表面抗原抗体(CD56,CD3)を用い、NK細胞およびT細胞分画aにおけるMMPをフローサイトメトリー法により測定した。また採血後24時間培養したリンパ球のアポトーシスはAnnexin Vを用い、フローサイトメトリー法により解析した。結果:大腸癌肝転移例で1亜区域以上の肝切除を施行した25例(H群)、腹腔鏡下胆嚢摘出術施行例(LC群)7例と健常者コントロール10例の計22例。H群において、第1,3病日でのリンパ球のMMPが有意に低下した(それぞれ術前値の62.7%、91.5%)。それらの低下はCD56陽性細胞(NK細胞分画)に認められ、CD3陽性細胞(T細胞分画)では認めなかった。LC群にてはMMPの変化は有意ではなかった(第1病日97.7%第3病日97.3%)。またH群においては24時間後にアポトーシスが認められた。以上より、肝臓切除後には理由は不明であるが、NK細胞のミトコンドリア機能が破綻し、アポトーシスに陥ることが示唆された。転移性肝癌の切除後の免疫療法を考える際には、このような手術侵襲による免疫機能の変化を考慮すべきであると考えられた。
金属アート型塩基の持つ反応選択性の起源の解明と機能性芳香族構築化学への展開

物質合成において有機金属試薬の持つ反応選択性(官能基選択性や位置・立体選択性など)は最も大事な要素の一つであり,その詳細に関する深い理解は革新的な有機合成に不可欠です。本研究課題では理論と実験の両面から特に「アート型塩基」と呼ばれる有機金属試薬の持つ特異な反応性の起源を明らかにすると同時に,この塩基を応用することで重要な芳香族化合物の効率的合成法の開発を行いました。有機金属試薬の持つ反応選択性(官能基選択性や位置・立体選択性など)の制御は効率的な有機合成反応を考える上で最も大事な要素の一つです。しかし、反応選択性が生じる起源(相互作用)の詳細には不明な点が多く残されています。従って、この多核金属試薬の持つ反応性の違いの起源を明らかにできれば、あらゆる副反応を抑えて望みの反応選択性だけを示す試薬の設計・開発が可能になると期待できます。こうした考えのもとに本研究課題において私は、理論化学計算および実験化学的手法を用いて「金属アート型塩基の持つ反応選択性の起源の解明と機能性芳香族構築化学への展開」を行います。平成19年度において私は、X線,DFT計算を用いた直接観測や計算化学的手法により、アルミニウムアート型塩基・反応中間体の構造と、反応メカニズムの解明に取り組みました。その結果アルミニウムアート型塩基が官能基を有する芳香族化合物に対して、効率的に水素引き抜き反応を進行させる理由が、類似の亜鉛錯体(TMP-zincate)と同様に高い反応性と自由度を持つ窒素リガンドの性質に起因していることを明らかにしました。さらに、予想外なことにアルミニウムアート型塩基はそのメタル化後の反応経路において亜鉛アート型塩基とは全く異なる反応性を示し、その結果生成している真の中間体がそれぞれ異なる種類の中間体を与えていることが明らかとなりました。この実験結果により、金属(アルミニウムか亜鉛か)を使い分けることによって、それぞれ速度論的に制御された中間体、熱力学的に最も安定な中間体の両方の発生と制御が可能になることが示唆されました。また、これらの研究で得られた反応選択性に関する知見および概念をフォスファゼン塩基化学に適用して検討を行ったところ、新しい複素芳香環構築法および不斉反応の開拓への糸口が示されました。こうした考えのもとに本研究課題において私は、理論化学計算および実験化学的手法を用いて「金属アート型塩基の持つ反応選択性の起源の解明と機能性芳香族構築化学への展開」を行っています。平成20年度は、アルミニウムアート型塩基・反応中間体の構造と反応メカニズムについて、NMR等のスペクトル手法を組み合わせて用いた検討を行いました。その結果、類似の亜鉛試薬であるTMP-zincateとの反応選択性の類似点・相違点についてその詳細を明らかにすることができました(J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 16193-16200.)。この過程でアルミニウムアート型塩基のアルミニウムが配位飽和になっていることが高い反応選択性を発現する要因どなっていることを明らかにしました。同時に、有機強塩基が意外にもアート型塩基と同様に高い官能基共存性を示しつつ、環生成を伴いながら触媒的な機能性芳香族の構築を可能とすること(Adv. Synth. Catal. 2008, 350, 1901-1906.)、アート型塩基と有機強塩基のコンセプトを同時利用することで全く異なる触媒反応の開発が可能となること(Chem. Eur. J. 2008, 14, 5267-5274.)を明らかにしました。平成21年度は前年度で得られた知見をふまえ、実際に分子触媒を設計することで有機金属試薬の持つ反応選択性の制御を試みました。その結果、フォスファゼン塩基触媒を用いる位置および官能基選択的な有機亜鉛試薬の求核置換反応を見いだしました(Chem. Eur.J. 2009, 15, 9805-9809.)。塩基試薬であるフォスファゼン塩基をルイス酸である有機亜鉛試薬と組み合わせることで、その塩基性は抑えたまま求核性のみを向上させた反応系を開発できた点は特徴的です。従ってこの概念に基づき、フォスファゼン塩基触媒を用いたヨウ素-亜鉛交換反応による芳香族亜鉛化合物の効率的合成法を開発しました。この反応は穏和な条件下で多様な官能基を損なうことなく、複雑な多置換芳香族化合物や非対称縮環型芳香族化合物を精密に合成できる有用な手法です(New, J. Chem. 2010,掲載決定)。

また前年度までに得られた理論化学的な知見をふまえ、有機分子への位置および官能基選択的なヘテロ原子直接導入反応の開発を試みたところ、コバルト触媒を用いた末端アセチレン化合物の官能基選択的な水和反応を見いだしました(論文投稿準備中)。本反応は官能基を有するメチルケトン化合物の新しい効率的合成法になりうると期待できます。以上の成果は理論と実験による反応選択性についての研究から、実用的な合成反応開発へと展開した点で学術的な重要性が高いと考えられます。
ワーキングメモリ理論に基づくメタ認知の質的向上に資する理科授業開発

本研究課題の目的は、近年、特に教育心理学の文脈において、新しい知的能力として位置づけられているワーキングメモリ(Working Memory:以下、WM)に着目し、WMへの負荷を抑制しながら、メタ認知の活動促進やその能力育成を実現するための理科授業を開発し、その教育的効果について実践的に検討することであった。本目的を実現するために、2019年度(1年目/4年間計画)は、主として、以下の2点について検討した。【1点目】中学生のWMと理科の学力との関係について検討した。なお、WMについてはHiroshima University Computer based Rating of Working Memory(HUCRoW)による課題得点を、理科の学力については全国学力・学習状況調査(中学校理科)(以下、全国学調)の調査問題の得点を用いた。その結果、WMは「物理的領域」、「化学的領域」、「生物的領域」、「地学的領域」のすべての領域と有意な相関があることが確認された。また、WMは全国学調の枠組みにおける「知識」と「活用」ともに有意な相関があること、さらに「活用」における「分析・解釈」では,特に言語性WM容量に依存されることが確認された。【2点目】中学生のメタ認知と理科の学力との関係について検討した。なお、メタ認知についてはメタ認知測定尺度の自己評価得点を、理科の学力については全国学調の調査問題の得点を用いた。その結果、全国学調で測定される理科の学力と実質的な相関が確認できなかった。一方、メタ認知は自尊心や自己愛傾向との相関が見られたことから、メタ認知測定尺度の自己評価得点には自己に対する誇大な感覚が反映される可能性がある。このことから、質問紙への自己評価といったオフライン・メッソドによるメタ認知測定には課題があることも確認された。2019年度(1年目/4年間計画)は、中学生を対象に、WM、メタ認知、理科の学力のデータ収集を行い、得られたデータに対して、WMとメタ認知を独立変数、理科の学力を従属変数とする因果モデルを構成し、メタ認知の調整効果について検討する予定であった。しかし、質問紙への自己評価(オフライン・メッソド)によるメタ認知測定では、理科学習におけるメタ認知を正しく測定できていないことが確認されたため、オンライン・メソッド等によるメタ認知測定の手法を新たに開発する必要が生じた。そのため、当該年度については、「やや遅れている」と判断した。2020年度(2年目/4年間計画)は、主として、以下の2点について検討していく予定である。【1点目】課題解決場面におけるメタ認知の測定方法について検討する。具体的に、中・高校生を対象にして、理科の観察・実験や科学的探究活動における自己・他者評価用ルーブリックの開発、発話思考法等のオンライン・メッソドによる測定方法を開発し、データ収集を行う予定である。このことを推進するために、中・高等学校の現職理科教員との連携・協力を図る。特に、科学的探究活動におけるメタ認知測定については、スーパーサイエンスハイスクール指定校との連携・協力を図り、推進していく。【2点目】WMの負荷を抑制しながらメタ認知活動を促進するための理科授業を開発し、その教育的効果について実践的に検討する。なお、2019年度に得られた研究成果については学術論文としてまとめ、2020年度の国内の理科教育関連学会において発表していく予定である。

しかし、質問紙への自己評価(オフライン・メッソド)によるメタ認知測定では、理科学習におけるメタ認知を正しく測定できていないことが確認されたため、オンライン・メソッド等によるメタ認知測定の手法を新たに開発する必要が生じた。そのため、当該年度については、「やや遅れている」と判断した。2020年度(2年目/4年間計画)は、主として、以下の2点について検討していく予定である。【1点目】課題解決場面におけるメタ認知の測定方法について検討する。具体的に、中・高校生を対象にして、理科の観察・実験や科学的探究活動における自己・他者評価用ルーブリックの開発、発話思考法等のオンライン・メッソドによる測定方法を開発し、データ収集を行う予定である。このことを推進するために、中・高等学校の現職理科教員との連携・協力を図る。特に、科学的探究活動におけるメタ認知測定については、スーパーサイエンスハイスクール指定校との連携・協力を図り、推進していく。【2点目】WMの負荷を抑制しながらメタ認知活動を促進するための理科授業を開発し、その教育的効果について実践的に検討する。なお、2019年度に得られた研究成果については学術論文としてまとめ、2020年度の国内の理科教育関連学会において発表していく予定である。
未刊行資料の解読によるフレーベルの学校教育学の研究

フレーベルの学校教育学の中心を形成するものはヘルバ・プラン(Helbaer Plan)であるがそれは、以下の6つの相に区分される。(1)ヘルバ・プラン概念形成期(1827年12月28年4月)、(2)潜在期(1828年5月10月)、(3)凝縮期(マイニンゲン候との合意)(1828年10月29年3月)、(4)加速期(ヘルバ・プラン公表)(1829年3月5月)、(5)停滞期(1829年5月30年代迄)、(6)断念期(1833年)。上記の発展相をチューリンゲン州立所有の未刊行資料23点〔一般にマイニンゲン資料(MA)と呼称されている〕の解読を通じ解明した。また、バ-ド・ブランケンブルクの「フレーベル博物館」の資料も考察の対象として、館長のM・ロックシュタイン(Rockstein)女史を広島に召聘し、その解読と解釈に多大の協力をいただき、多くの知見をいただいた。資料の多くは、今日、ドイツ側の協同研究者であるH・ハイラント(ドウイスブルク大学フレーベル研究所長)教授編『フリードリヒ・フレーベルの学校教育学』に収録されているが、なお不明の点が多い。その為には今後、(1)カイルハウ遺稿、(2)ベルリン遺稿の解読と併せて考察する必要がある。それによって、学校教育学者フレーベルの全体像が示され、古典的教育学者Fr.フレーベルの視野がいかに大きなものであるかが示される。
電気生理学的ライブセルイメージングシステムの構築

走査電気化学顕微鏡(SECM)において,解像度向上のため,微細な電極を再現性良く,簡便に作成する必要性に迫られている.また,細胞等の呼吸活性を評価する場合には,酸素流束のイメージングが必要である.単一細胞の呼吸活性をイメージングするためには,ナノメートルオーダーの白金電極を作成することが必要である.当該年度は,平成28年度において作成法を確立したポリジメチルシロキサン(PDMS)熱分解生成物に炭素を析出させたカーボン微小電極をベースとした白金微小電極の作成が可能であることを見出した.熱分解PDMSカーボン微小電極の先端外側には熱分解PDMS層が形成されており,このカーボン微小電極に白金メッキを施すと,先端から数十数百ナノメートルの範囲が薄い白金層に覆われ,ニードル型白金微小電極となることがわかった.この電極では安定した酸素還元電流を測定することができた.また,ディスク型白金微小電極を作成する場合には,微小炭素電極の先端外側にある熱分解PDMS層を取り去ったのち,白金メッキを行う必要がある.このためには,微小電極先端を研磨(数十数百ナノメータ)する手法を確立する必要がある.そこで,次の二つの研磨法を考案した.一つ目は,音叉型水晶振動子に粒度0.05ミクロンのラッピングフィルムを取り付け,ピエゾ素子駆動のステージを用いて先端をラッピングフィルムに押し当てて研磨する方法である.水晶振動子の出力電圧をモニターすることで先端とラッピングフィルム表面が接触していることが確認できるため,研磨する長さを制御することができる.また,アルミナ研磨剤を懸濁させたグリセリン中に約60100 kHzで振動させたカーボン微小電極を数分間浸漬させることで先端外側を研磨することができる.これらの研磨法により微小炭素電極先端を研磨した後,白金メッキを施し,サブミクロンの白金ディスク電極を作成した.細胞近傍における局所酸素濃度のイメージングのためにはサブミクロンサイズの微小白金電極を用い,電極と試料間距離を制御しつつイメージングするためには白金微小電極とイオン電導度測定を同時に行えるSECM/SICMデュアルプローブのが必要である.当該年度は,H28年度に作成法を確立した熱分解PDMS炭素微小電極の作製を応用し,白金電極を作製するため,様々な手法を試みたところ,白金メッキをすることで容易に酸素還元電流を安定して測定することが可能な白金電極を作成できることがわかった.また,先端から数十数百ナノメートルにわたり薄い白金層が形成されるという当初予想されなないユニークな形状の電極が得られた.また,ディスク状の白金微小電極も必要である.これを作成するためには,ナノメートルオーダーで電極先端を研磨する新たな手法も必要となり,この研磨法を確立することができた.また,電極の作成法を模索している過程で,熱分解PDMSは多孔質であり,これのみを微小ガラスキャピラリにつめたSICMプローブを作成した.このプローブのイオン伝導度は十分に大きく,SICM形状イメージングが可能であることがわかった.これらのことに注力したため,当初予定していたデュアルプローブの作成およびこれを用いたイメージングに取りかかることができなかったため,1年間の期間延長を申請した.当該年度での検討により確立した白金微小電極の作成法,電極先端のナノメートルオーダーでの研磨法など.デュアルプローブの作成に有用である技術が得られたのは大きな成果と考えられる.当該年度まで検討を続けてきた熱分解PDMSを用いた微小電極の作成法を用いてSECM/SICMデュアルプローブとした場合には,SICM側のバレル先端部分にも熱分解PDMSが詰まった状態となる.しかし,当該年度の検討により,熱分解PDMSは多孔質でイオン伝導性が高く,これが先端に存在する状態でもSICMイメージングが可能となることがわかった.このため,これまでに得られた白金微小電極の作成法を活用し,白金微小電極をSECMプローブ,多孔質熱分解PDMSをつめたSICMプローブからなるデュアルプローブの作成を試みる.イオン選択性電極にも多孔質である熱分解PDMSを活用することで,安定な応答を有するイオン選択性電極が作成できる可能性がある.そこで,多孔質熱分解PDMSを用いたカリウムイオン選択性電極をSECMプローブ,多孔質熱分解PDMSをつめたSICMプローブからなるデュアルプローブの作成も試みる.また,これらのプローブを用い,細胞近傍の局所酸素・イオン流束イメージングを試みる予定である.我々は,これまで,試料ー電極間の距離制御にシアフォースを用いた走査型電気化学顕微鏡・走査イオンコンダクタンス顕微鏡システムの構築を行ってきてた.しかし,細胞など柔らかい試料にプローブを近接させた時のシアフォース変化の挙動は明らかになっていない.そこで,これを明らかとするため,水溶液中での油滴を細胞モデルとし,この油滴へガラスキャピラリを近接させた時のプローブの振動とイオン電流の変化を測定することによりシアフォースが試料に与える影響を詳細に検討した.プローブを試料表面と水平に振動させながら試料に近接させた時,ごく近傍で探針/試料表面間でシアフォースが働くため振動が減少する.油滴や細胞など極めて柔らかい試料表面に近接させた場合には,振動は緩やかに減少することを見い出した.

これは,プローブ先端が試料表面を押し下げ,試料が変形するためであることが明らかにした.また,振動の大きさを変化させた時の挙動から,振動が大きいとき,より遠い距離から試料表面に相互作用を及ぼしていることを明らかにした.また,様々な粘度の有機溶媒を用いた油滴での挙動から,有機溶媒の粘度が大きいほど振動の減少量が大きくなることが明らかにした.これらの検討結果から細胞を走査する際に,シアフォースを用いた距離制御法では,プローブ先端と柔らかい試料表面との相互作用が無視できないことが示唆された.そこで,これに代わるものとして,イオン電導度プローブとイオン選択性プローブを組み合わせたデュアルプローブを試作し,イオン電導度により距離制御,イオン選択性プローブにより局所カリウムイオン流束を測定できるような走査プローブ顕微鏡システムの開発を試みた.イオン電導度を距離制御に使用できるよう走査プローブ顕微鏡の制御ソフトウェアの改造を行った.培養条件下,長時間に渡ってこのようなイメージングできるような培養チャンバーの試作を試みた.本研究課題の第一の目的は,培養条件下で生細胞近傍のイオン電導度,酸素・イオン流束のイメージングが可能な走査プローブ顕微鏡システムを開発することである.微小イオン選択性電極,微小炭素電極や微小白金電極の先端と細胞表面の距離を一定に保ち,プローブを走査しつつこれらの電極で局所領域のイオンや酸素の流束をイメージングする必要がある.当初は,この距離制御にシアフォースを用いて細胞表面の局所カリウムイオン流束のイメージングを予定していた.しかし,当該年度における検討により,細胞や液液界面などの極めて柔らかい試料を走査する際,距離制御可能ではあるもののプローブ先端と試料表面の相互作用が条件によっては無視できないことが明らかとなってきた.そこで,イオン電導度を距離制御に用いるシステムの構築を優先させ,イオン電導度プローブとイオン選択性プローブを組み合わせたデュアルプローブを試作した.それぞれのプローブでカリウムイオン流束およびイオン電導度が同時に測定できることを確認した.当初予定していたシアフォース距離制御による生細胞イメージングを予定していたが,新たな距離制御法を導入することにより,従来よりも非侵襲な制御法を確立可能であることが確認された.現在細胞表面の走査の検討を行い始めたところである.走査電気化学顕微鏡(SECM)において,シアフォースやイオンコンダクタンスを利用することによりプローブ試料間距離のナノメートルオーダーの制御が可能となってきており,SECMの解像度向上のため,微細な電極を再現性良く,簡便に作成する必要性に迫られている.当該年度は,細胞近傍の酸素や電極活性な物質の流束イメージングを行うことを目的とした微小電極の作成を試み,作成した微小電極の基礎的な電気化学的特性の評価を行った.SECM用微小電極には白金や炭素電極が広く用いられている.SECM用のプローブとして用いる微小電極には,電極径が小さいだけでなく,絶縁層も含めた全体径が小さい必要がある.我々は,ポリジメチルシロキサン(PDMS)を微小石英キャピラリ内に詰めたのち,これを水素雰囲気で熱分解させることで電極微小電極を作成する新たな作成法を確立し,電極半径が1001000nm,RG(電極全体径/電極径)が1.11.5の微小電極を作成した.この電極でのフェロセン誘導体などのメディエータの酸化挙動や酸素還元反応に関して検討を行い,これらの酸化還元電流は極めて安定であることを明らかにした.
アフリカツメガエルHP1の姉妹染色体接着における機能

正確な染色体分配には姉妹染色体の接着が必須である。接着はコヒーシン蛋白質が担っており、コヒーシンの染色体結合にはScc2-Scc4複合体が必須である。我々はツメガエルを脊椎動物のモデル系として用い、ツメガエルScc2が染色体の構造に重要な機能を持つHP1蛋白質と相互作用することを見いだした。この結果から、姉妹染色体の接着と染色体の機能構造は、HP1を介して密接に関係すると考えられる。姉妹染色体の接着は、複製された姉妹染色体のペアを同定し、正確な染色体分配を行うために必須である。姉妹染色体はコヒーシン複合体によりDNA複製と共役して接着される。染色体の正確な分配には、動原体の形成されるセントロメア領域の接着が特に重要であると考えられ、セントロメアでの接着を保証するメカニズムが複数報告されている。コヒーシンの染色体結合にはScc2-Scc4複合体が必須であるため、コヒーシンはScc2-Scc4の染色体結合部位から染色体に呼び込まれると考えられる。しかしながら、特に高等動物においてはScc2-Scc4の染色体上での局在や染色体結合メカニズムはほとんど分かっておらず、セントロメア領域へのコヒーシンの結合がどのように保証されているかも不明である。HP1はヘテロクロマチンの構造維持に必須の蛋白質であり、セントロメア領域などのヘテロクロマチン領域に局在する。高等動物HP1には三つのアイソフォーム、α、β、γが存在し、それぞれ異なる染色体局在パターンを示すが、それらの機能分担についてはよく分かっていない。脊椎動物Scc2にはHP1との相互作用モチーフが存在し、Scc2-Scc4の染色体結合にHP1が関与する可能性が予想される。本研究ではこの仮説を検証するため、染色体複製と接着を試験管内で再現できるツメガエル卵抽出液をモデル系に用いてHP1の機能解析を行っている。本研究者はこれまでにツメガエルHP1α、β、γに対する抗体を作成し、卵抽出液中でScc2とHP1の全てのアイソフォームが物理的に相互作用することを見いだした。間接蛍光抗体標識を用いた顕微鏡観察では、ツメガエルHP1は染色体上でスポット上に局在し、セントロメアなどの特定領域への結合が示唆された。卵抽出液からHP1を免疫除去することにより、HP1のScc2-Scc4染色体結合に果たす役割が明らかになると期待される。姉妹染色体の接着は、姉妹染色体のペアを同定し正確な染色体分配を行うために必須である。姉妹染色体はコヒーシン複合体により接着され、接着はDNA複製と共役して成立すると考えられている。コヒーシンの染色体結合にはScc2-Scc4複合体が必須である。我々はこれまでツメガエル卵抽出液をモデル系に用いて、Scc2-Scc4の染色体結合がDNA複製開始と共役していることを示してきた。一方、ツメガエル以外の生物種ではScc2-Scc4の染色体結合機構は明らかにされていない。また分裂酵母ではセントロメア領域にコヒーシンが優先的に局在するが、ツメガエルを含む脊椎動物で同様の機構が存在するかどうかはわかっていない。脊椎動物HP1には三つのアイソフォーム、α、β、γが存在し、それぞれ異なる染色体局在パターンを示す。脊椎動物Scc2にはHP1との相互作用モチーフが存在し、Scc2とHP1の間に機能的なつながりが予想される。我々はツメガエルHP1α、β、γに対する抗体を作成し、Scc2とHP1の相互作用を解析した。ツメガエル卵抽出液中では、HP1の全てのアイソフォームがScc2と相互作用していた。一方、染色体上ではHP1αが優先的にScc2と相互作用していた。間接蛍光抗体標識を用いた顕微鏡観察では、ツメガエルHP1αは染色体上で特定の領域にドット状に結合していた。これらの結果は、Scc2とHP1αは染色体上の特定領域で相互作用していることを示唆する。HP1αはセントロメア領域のヘテロクロマチンに局在することが予想されるため、HP1αはScc2との相互作用を介してセントロメア領域の接着に機能する可能性が考えられる。
ジュラ紀古・中世放散虫化石の群集解析

本研究において、西南日本内帯の美濃帯に位置する4地域の下・中部ジュラ系中のマンガンマイクロノジュ-ル5試料((1)NJー12:Pliensbachian後期Toarcian前期;185Ma、(2)HKー140:Aalenian;176Ma、(3)GHー1:Bajocian前期;172Ma、(4)Inー7:Bajocian;168Ma、(5)INー1:Bathonian;165Ma)を主たる研究試料として用い、それより産する放散虫化石群の種オ-ダ-での群集組成を詳細に解析した。なお、秩父累帯や外国(ヨ-ロッパアルプス)の試料についても検討を進めたが、上記5試料と同等に比較できるほど保存良好なものは得られなかった。平成2年度および3年度の研究成果は次のようにまとめられる。(1)各試料の化石群集を構成する種数は、200300種であり、各群集とも多数の種で構成される。(2)各群集の構成種数と各群集間の共通種数にもとづいて類似度を算出すると、隣接層準間の類似度は高く、層準が離れると低くなる傾向を示し、特微種から判断した各試料の新旧関係に調和的である。(3)群集変遷パタ-ンは、短期間に新種の放散があり、数百万年以内にその半数が消滅する一方、残りの半数は千数百万年をこえる長期間生存していたことを反映すると考えられる。(4)各層準間の百万年あたりの種の出現率・消滅率を計算すると、出現率はジュラ紀古世末からジュラ紀中世初頭に急激に高くなりその後次第に低下したが、消滅率は徐々に高くなったことがわかる。以上の群集解析の結果からジュラ紀古・中世放散虫化石の群集変遷は、各群集を構成する各種の生存期間の長短や出現率・消滅率の高低などに規制されていると考察される。今後の研究課題として、生存期間の長短や出現・消滅率の高低などは何に規制されるのかを明らかにすることが重要である。本研究は、日本の各地帯の下・中部ジュラ系から産する保存良好な放散虫化石を形態学的・分類学的に検討して種オ-ダ-での群集組成を詳細に解析し、その組成特性を明らかにすることを主目的にしている。この目的にそって、本年度(平成2年度)は美濃帯に位置する4地域のマンガンマイクロノジュ-ル5試料(福井県南条郡河野村菅谷[NJー12]、岐阜県加茂郡川辺村上麻生[HKー140]、郡上郡八幡町小間見[GHー1]、各務原市鵜沼[INー7,INー11])を検討した。検討試料は、放散虫化石の特徴種からNJー12が最も古く(Pliensbachian後期Toarcian最前期)、ついでHKー140(Aalenian)、GHー1(Bajocian前期)、INー7(Bajocian)と若くなり、INー1が最も新しい(Bathonian)と推定され、下部ジュラ系中部から中部ジュラ系中部に至る5層準のものである。各試料の化石群集を構成する種数は、NJー12:199,HKー140:188,GHー1:271,INー7:287,INー1:262であり、各群集とも多数の種で構成されることが明らかになった。

さらに、各群集の構成種数と各群集間の共通種数にもとづいて類似度を算出した。その結果は、隣接層準間の類似度は高く、層準が離れると低くなる傾向を示し、特徴種から判断した各試料の新旧関係に調和的である。各層準の固有種は、各層準の種数の2432%とかなり高い数値を示す。2層準間のみで共通な種は511%と少なく、一方、3層準以上にわたって共通な種は3260%であり、高い数値を示す。これらの結果から読み取れる放散虫化石群集の組成変遷は、ジュラ紀古世中期ー中世中期における進化過程を示唆するものと考えられる。つまりこれらの群集変遷パタ-ンは、短期間に新種の放散があり、数百万年以内にその半数が消滅する一方、残りの半数は千数百万年をこえる長期間生存していたことを反映すると考えられる。本研究において、平成2年度に引き続いて、日本の各地帯の下・中部ジュラ系から産する保存良好な放散虫化石を形態学的・分類学的に検討して種オ-ダ-での群集組成を詳細に解析した。用いた試料は、美濃帯に位置する4地域のマンガンマイクロノジュ-ル5試料((1)NJー12:Pliensbachian後期Toarcian前期、(2)HKー140:Aalenian、(3)GHー1:Bajocian前期、(4)INー7:Bajocian、(5)INー1:Bathonian)である。なお、秩父累帯や外国(ヨ-ロッパアルプス)の試料についても検討を進めたが、上記5試料と同等に比較できるほど保存良好なものは得られなかった。本年度は、平成2年度に明らかにした各試料から産出した群集構成種数、各群集間の類似度、生存期間の長短などにかんするデ-タにもとづいて、群集変遷過程の検討に重点をおいた。用いた試料の年代を、(1)185Ma、(2)176Ma、(3)172Ma、(4)168Ma、(5)165Maと見積もった。それ故、最下位層準((1))と最上位層準((5))との間の年代幅は約二千万年であり、この年代幅の中での全群集構成種数は685種である。試料(1)から(5)までの群集構成種の出現種数と消滅種数から、各層準間の百万年あたりの種の出現率・消滅率(種数/百万年)を計算した。その結果、出現率は、(1)ー(2):15、(2)ー(3):41、(3)ー(4):30、(4)ー(5):23であり、一方消滅率は、(1)ー(2):12、(2)ー(3):16、(3)ー(4):28、(4)ー(5):46である。このことから出現率はジュラ紀古世末からジュラ紀中世初頭に急激に高くなりその後次第に低下したが、消滅率は徐々に高くなったことがわかる。以上のような群集解析の結果として、各種の生存期間の長短や出現率・消滅率の高低などが、群集変遷パタ-ンを規制していることが考察される。
小児がん患児の親に対するスマートフォンによる問題解決療法の開発と有用性の検証

小児がん患児の親の心理的負担は大きく、心理・社会的支援体制の構築が喫緊の課題となっている。スマートフォンアプリケーションを用いた問題解決療法が小児がん患児の親における心理的負担の軽減に有用か有用性の検証を行う。具体的には、小児がん患者の親に対してスマートフォンアプリケーションを用いた問題解決療法を用いて予備的に適用し、プログラム内容の妥当性を検証した上で、小児がん患者の親における心理的負担の軽減のために本介入プログラムを実施し、プログラムの実施可能性、および有用性を対照群のない一群前後比較試験において明らかにする。
ミトコンドリア制御による造血幹細胞制御機構の解明

新生児期HSCsは、成体HSCsに比べ分裂速度が早いがHSCsの幹細胞性はよく保たれている。我々は新生児期HSCsにおいてミトコンドリアの代謝位活性が高いがミトコンドリア内のROS産生量が低く保たれているなど、ミトコンドリアの質が保たれていることを明らかにしてきた。これらの新生児期HSCsミトコンドリアの特徴を維持する機構、環境を解明し、ex-vivoでの質の良いHSCsの増殖法の開発を目指す。
敗血症によるエンドトキシン血症が筋力に及ぼす影響に関する研究

当院ICUに入室した敗血症患者について入院時の酸化ストレス(d-ROM/BAP)を測定し、基礎疾患、重症度スコア、臓器不全、初発感染巣、血液培養結果を調整して、入院日数と転帰について比較したが相関関係は明らかではなかった。プロジェクト2基礎的病態研究・敗血症モデル動物による分子病態・病理的研究Cecal Ligation Punctureモデルや熱傷モデルによる、高サイトカイン状況下でのICU-AWモデルの作成は困難であり、リポポリサッカライド(LPS)の腹腔内投与により作成した敗血症マウスモデルを用いることとした。早期の生存率、及び各病期での運動能力、及び代謝能力を測定することで敗血症モデルマウスにおける早期リハビリテーション介入の運動強度を明らかにした。我々の敗血症モデルマウスにおいては、LPS投与後約24時間で75%の死亡率であり、代謝ゲージによる二酸化炭素排出量(VCO2)及び酸素排出量(VO2)は24時間で最も低下しており、その後徐々に回復してくることが明らかになった。このことから本モデルにおいてはLPS投与後24時間が最も重篤な状況であり、その後は侵襲の影響から回復傾向に転じると示唆された。これに対する代謝トレッドミルを用いた運動能力の推移に関しても、LPS投与後約24時間に向かって運動能力が低下していく事を観測し、投与6、12、24、36、48、60、72時間後における嫌気性呼吸が生じない低強度運動の運動強度が明らかとなった。これにより、現在臨床試験で報告されている人間における敗血症の発症後において早期リハビリテーションとして行われている歩行程度の低強度運動を動物モデルにおいても再現が可能となったプロジェクト2基礎的病態研究・敗血症モデル動物による分子病態・病理的研究9-10週齢のラットを使用して、Cecil ligation Puncture(CLP)による敗血症モデルラットを作成し、CLPを施行した群で一過性の筋力低下のが起こることをタイムコースで確認した。合わせて病理組織学的にはtype IIの筋線維優位に萎縮が起こり、先行研究と同様の結果が得られた。これらをもって敗血症によるICU-AW発症のラットモデルは概ね作成できつつあると考えられる。シグナル遺伝子の検索・同定。ROS関連分子、炎症性サイトカイン、血管新生因子のタイムコースでの測定を行い、モデル成立の確認を行う必要がある。プロジェクト2基礎的病態研究・敗血症モデル動物による分子病態・病理的研究Cecil ligation Puncture(CLP)による敗血症モデルラットを作成し、CLPを施行した群で筋力低下が起こることを確認した。合わせて病理組織学的にもで筋の萎縮が起こることを確認した。プロジェクト2基礎的病態研究・敗血症モデル動物による分子病態・病理的研究CLPによるモデルマウスの作成を試みたが、長期生存が可能だが、重度な後遺症を残しうるような状況とし、安定した状態で筋力低下を来す事が出来なかった。LPSの投与でも同様に、長期生存可能かつ重度な後遺症を残すモデルを安定して作成することが困難であった。そのためマウスの背部に熱傷を作ることで敗血症と同様のサイトカインストームを引き起こし、ICU-AWモデルを再現できるという仮定の下、新たなモデル作成に取り組んでいる。プロジェクト2基礎的病態研究・敗血症モデル動物による分子病態・病理的研究CLPによるモデルマウスの作成を試みたが、安定した状態で筋力低下を来す事ができず、LPSの投与でも同様の結果であったため、背部に熱傷を作ることで敗血症と同様のサイトカインストームを引き起こし、ICU-AWを作れるという仮定の下、新たなモデル作成に取り組んでいる。

これにより、現在臨床試験で報告されている人間における敗血症の発症後において早期リハビリテーションとして行われている歩行程度の低強度運動を動物モデルにおいても再現が可能となった平成29年度も継続して、自施設での敗血症患者のデータを集積するとともに、筑波大学附属病院(ICU20床:総病床数800)、茨城県立中央病院(ICU6床:総病床数500)、水戸協同病院(ICU6床:総病床数401)、水戸医療センター(ICU4床:総病床数500)で、年間100例を目標にoxidative stress、炎症性因子などの危険因子をカルテベースで把握し、リスク層別化をして検討を加えられるようにする。プロジェクト2基礎的病態研究・敗血症モデル動物による分子病態・病理的研究平成30年度も継続して、自施設での敗血症患者のデータを集積する。プロジェクト2基礎的病態研究・敗血症モデル動物による分子病態・病理的研究プロジェクト1で施行予定だった他施設のデータを含めた疫学研究の進行の遅延のため、データベースに関わる費用などが使用できなかった。さらに、プロジェクト2で予定していた、ICU-AWのモデル動物の作成が遅れており、デクスメデトミジンなど介入薬物などの購入を行わなかったため。次年度の予算に加えてモデルマウスの購入に充てる予定である。平成29年度に、28年度に行う予定で計上していた、プロジェクト1の他施設データを含めたデータベースの構築や、プロジェクト2で予定してたICU-AWのモデルに対するデクスメデトミジンなどの介入薬物の投与を開始する予定である。
ブレインモデルの構築とその宇宙論的な観測可能性について

前年度に引き続き、ブレーン宇宙における宇宙論的摂動の振る舞いをしらべ、宇宙論的観測からブレーン宇宙モデルを検証する基礎を与える研究を行った。特に初期宇宙における揺らぎの生成に対する、余剰次元の影響を解析的に調べた。その解析によると、インフレーションが高エネルギーに起こった場合、揺らぎの生成は余剰次元に伝播する重力波の影響を強く受けることが示された。この結果は、今まで行われてきた、4次元理論を単純に拡張した初期揺らぎのスペクトルの計算の正当性に疑問を投げかけるものである。余剰次元の影響を定量的に予言するためには、バルクの重力場と結合する、ブレーン上のインフラトン揺らぎを量子化する手法が不可欠になる。この解析に向けて、バルクの場に結合するブレーン上の場を記述する簡単なモデルを構築し、量子化の方法を探った。また、数値的に重力波の伝播を解析する研究も引き続き行った。高次元への重力波の伝播による、ブレーン上の重力波の進化に対する影響の初期条件依存性などを詳細に調べた。また今年度は、ブレーン宇宙モデルに基づくダークエネルギー問題にも取り組んだ。現在、宇宙の膨張は加速していることが分かっている。この加速膨張を、宇宙定数を導入することなく説明できるブレーン宇宙モデルに注目した。このブレーンモデルでは、ブレーン上にアインシュタイン・ヒルベルト作用が励起されることが仮定されている。この作用が、非対称なブレーンを持つモデルで、自然にブレーンに励起されることを示した。また、このモデルではスピン2の重力子が質量を持つことを示した。さらに、ブレーン上に宇宙定数があるとゴーストが現れ、時空が不安定になることが分かった。このことは宇宙定数問題に深い示唆を与えるものだと期待される。ブレインモデルは、我々が高次元時空中の4次元膜に存在すると考えるモデルである。このモデルでは重力だけが高次元時空中を伝播することができる。4次元面内でのインフレーションで生成された初期揺らぎの進化は、重力が高次元を伝播することができるため、4次元理論とは異なったものになる可能性がある。従ってこの揺らぎで生成される宇宙背景輻射(CMB)の温度揺らぎによって、このモデルにおける高次元の存在を観測的に実証する可能性が生まれる。4次元膜上の揺らぎは、高次元時空に存在する重力揺らぎと結合するため、一般に解析が難しく、定量的評価を与えるのが非常に難しい。本年度はこの問題に対して様々な角度から解析を試みた。一つは摂動が解析的に扱えるようなインフレーションモデルの構築である。このモデルの下で、ブレイン宇宙特有の初期揺らぎの性質を調べた。またCMBの温度揺らぎを計算するのに必要な、宇宙のエネルギーが低い時期における揺らぎの進化を近似的に求める手法を構築した。この手法を用いれば、ブレイン上での4次元有効方程式を閉じた形で求めることができる。この手法を用いて、初めてCMBのスペクトルに対する高次元重力の影響を定量的に調べることに成功した。バルクの重力場はブレイン上に輻射のように振舞う揺らぎを誘起し、この揺らぎは等曲率揺らぎを励起する。この重力場はまた、非局所的な非等方ストレスをブレイン上にもたらす。この非等方ストレスにより、CMBのスペクトルは、通常の4次元理論における等曲率揺らぎモデルの予言とは、非常に異なったものとなることを示した。WMAPなどの高分解能のCMBの観測を用いれば、ブレインモデルを通常の4次元理論から、観測によって区別することが可能になることを示した。またインフレーションで生成される背景重力波のスペクトルにも高次元の影響が現れ、将来観測によってこのスペクトルから余剰次元の情報が得られる可能性がある。本年度も昨年度に引き続き、解析的、数値的手法を駆使して、ブレイン宇宙における宇宙論的観測を定量的に与える研究を行った。はじめに、数値的手法によって5次元の重力波の進化を解析し、余剰次元がブレイン上の重力波の進化に与える影響を定量化した。その結果、宇宙のエネルギーが高い初期宇宙ではブレイン上の重力波の振幅が、余剰次元に重力波が伝播する影響により減衰することを定量的に示した。次に、宇宙論的摂動が解析的に解けるモデルを提唱し、バルクのブラックホールがブレイン上の揺らぎに与える影響を解析した。ブレインモデルは超弦理論におけるDブレインの存在に基づいている。そこで、Dブレインにもとづくブレインモデルを構築し、Dブレイン上での重力場の振る舞いを調べた。

この結果は、今まで行われてきた、4次元理論を単純に拡張した初期揺らぎのスペクトルの計算の正当性に疑問を投げかけるものである。余剰次元の影響を定量的に予言するためには、バルクの重力場と結合する、ブレーン上のインフラトン揺らぎを量子化する手法が不可欠になる。この解析に向けて、バルクの場に結合するブレーン上の場を記述する簡単なモデルを構築し、量子化の方法を探った。また、数値的に重力波の伝播を解析する研究も引き続き行った。高次元への重力波の伝播による、ブレーン上の重力波の進化に対する影響の初期条件依存性などを詳細に調べた。また今年度は、ブレーン宇宙モデルに基づくダークエネルギー問題にも取り組んだ。現在、宇宙の膨張は加速していることが分かっている。この加速膨張を、宇宙定数を導入することなく説明できるブレーン宇宙モデルに注目した。このブレーンモデルでは、ブレーン上にアインシュタイン・ヒルベルト作用が励起されることが仮定されている。この作用が、非対称なブレーンを持つモデルで、自然にブレーンに励起されることを示した。また、このモデルではスピン2の重力子が質量を持つことを示した。さらに、ブレーン上に宇宙定数があるとゴーストが現れ、時空が不安定になることが分かった。このことは宇宙定数問題に深い示唆を与えるものだと期待される。
網膜視細胞発生に関わる分子の網羅的解析

我々は網膜の発生の中でも、網膜視細胞の発生機構の解明を目指している。我々は以前、視細胞の運命決定の鍵をにぎる因子がOtx2であることを明らかにした。我々はOtx2 CKOマウスの網膜(視細胞がまったく形成されない)と正常の網膜の遺伝子発現をマイクロアレイによって発現比較解析し、視細胞の分化、視細胞の形態形成、シナプス形成ならびに機能に重要な遺伝子群をまとめて同定し、視細胞発生のメカニズムの解明を目指している。今年度までの研究から、実際我々は生後12日目、1日目、胎生17.5日目でのマイクロアレイを行い、281遺伝子がOtx2ノックアウト網膜において有意義に低下していることを見いだした。その中の一つ、視細胞特異的な発現を示し、ラミニンドメインを持つ細胞外マトリックス蛋白質をコードする新規遺伝子pikachurinについて、ノックアウトマウス(KO)を作成し生体レベルでの機能解析を行った。Pikachurinは視細胞リボンシナプスのアクティブゾーンに局在し、KOマウスでは双極細胞樹状突起のリボンシナプスへの陥入が有意に減少していた。網膜電位図では、優位な遅延が認められ、シナプス伝達の遅れが観察された。これらの結果からpikachurinは視細胞-双極細胞の特異的シナプス形成に重要な役割を果たす細胞外マトリックスタンパク質であることが示された。さらに、我々はpikachurin KOの網膜電位図が筋ジストロフィー患者の示す網膜の電気生理学的異常と似ていることから、pikachurinとDystroglycanとの相互作用について検討した。実際、我々はpikachurinのラミニンドメインがalpha-Dystroglycanと糖鎖部分で結合することを見出した、つまりpikachruinはDystroglycanの新たなリガンドであることを示した。これらの結果から、我々はpikachurinとalpha-Dystroglycanの結合が網膜における精密なシナプス形成に重要であることが明らかとなり、さらに筋ジストロフィー患者の網膜生理異常の分子メカニズムの一端も解明された。現在、これらの結果についての論文投稿中である。脊椎動物の網膜は、中枢神経系発生の良いモデルとして知られている。我々は網膜の発生の中で、特に網膜視細胞の発生機構の解明を目指している。我々は以前、視細胞の運命決定の鍵をにぎる因子がOtx2であることを、視細胞特異的コンディショナルノックアウトの系を用いて明らかにした。我々はOtx2コンディショナルノックアウトマウスの網膜(視細胞がまったく形成されない)と正常の網膜の遺伝子発現をマイクロアレイによって発現比較解析し、視細胞の分化、視細胞の形態形成、シナプス形成ならびに機能に重要な遺伝子群をまとめて同定し、視細胞発生のメカニズムの解明を目指している。実際、我々は生後12日目でのマイクロアレイの結果、281遺伝子が再現性を持ってOtx2ノックアウト網膜において有意に低下していることを見いだした。これらの遺伝子の中から、我々は興味深い発現を示す遺伝子を数個ピックアップし解析を行っている。その中の一つ、視細胞特異的な発現を示し、アグリンにホモロジーのある細胞外マトリックス蛋白質をコードする新規遺伝子pikachurinについて、ノックアウトマウスを作成し生体レベルでの機能解析を行っている。網膜電位図では、b波伝達の優位な遅延が認められ、視細胞から双極細胞へのシナプス伝達の遅れが観察された。これらの結果からpikachurinはリボンシナプス形成に重要な役割を果たす細胞外マトリックスタンパク質であることが示唆された。我々は、生後0日、胎生期17.5日でのOtx2ノックアウト網膜のマイクロアレイも行い、生後12日目の解析で単離した他の遺伝子群と合わせ引き続き解析を行っている。

これらの結果から、我々はpikachurinとalpha-Dystroglycanの結合が網膜における精密なシナプス形成に重要であることが明らかとなり、さらに筋ジストロフィー患者の網膜生理異常の分子メカニズムの一端も解明された。現在、これらの結果についての論文投稿中である。
マウスにおける実験的自己免疫性ぶどう膜炎モデルの確立と免疫遺伝学的研究

自己免疫性ぶどう膜炎の発症機構の理解を深める目的で、マウスにおける実験的自己免疫性ぶどう膜炎(EAU)を確立し、疾患感受性遺伝子について検討した。マウスにおいては、通常のアジュバント(完全フロイトアジュバント)ではなく、クレブシエラ菌のLPS(K03LPS)をアジュバントとして用い、網膜特異抗原(S抗原または視細胞間レチノイド結合蛋白)との混合溶液を、マウス大腿部皮下に、24週間間隔で3回以上繰り返し免疫すると、再現性高くEAUを惹起できた。この方法で、B10系congenic mouseと、他のいくつかのstrainのマウスを用いて、EAUのHー2拘束性について検討した。その結果、B10系congenic mouseでは、B10.BR、B10.A、B10.MBR、B10.A(4R)の各strainが、S抗原あるいはIRBPによるEAUに対してhigh responderであり、B10.A(5R)がnonーresponder(S抗原に対し)あるいはlow responder(IRBPに対し)であった。このことから、S抗原によるEAUもIRBPによるEAUもいずれも、MHCによる拘束を受けており、IーA^kの領域の遺伝子がEAUの疾患感受性遺伝子として重要であると考えられた。一方、B10系congenicでなくて、しかもB10.BRとHー2ハプロタイプが同一のAKR/Jマウスは、EAUに対してはlow responderであった。したがって、EAUの疾患感受性には、IーA^k領域のMHC遺伝子に加えて、nonーMHC遺伝子も弱いながら関与していることも示唆された。実験的自己免疫性ぶどう膜炎(EAU)を下記の方法によりマウスに惹起することができた。S抗原20μgとK03LPSをマウス大腿部皮下に注射し、これを4週間毎に3回繰り返すと両眼性のEAUが惹起された。免疫回数が2回以下ではEAUは惹起されず、また免疫間隔が2週間以下でも発症率は低かった。マウスに惹起されたEAUの病理所見は網膜周囲のリンパ球浸潤と網膜視細胞の破壊が主な病変であり、ラットにおけるEAUの病理像と大きく異なっていた。すなわちラットにおいては好中球が主な浸潤細胞であり、非常に強い炎症所見が認められるが、マウスではこれに比べ、炎症所見は軽微であった。また、前眼部の炎症はマウスにおいては極めて軽微であり、病理組織検査によりはじめてぶどう膜炎の所見が判別できた。S抗原免疫によるEAUの発症率は、BIO.BR83%,BIO.A70%、BIO.MBR57%、BIO.A(4R)63%、BIO.A(5R)0%であった。またAKR/Jでは33%であった。これらのことからS抗原免疫により惹起されるマウスのEAUはHー2拘束性が認められ、主にIAKおよびIAの領域の遺伝子により支配されているものと考えられた。しかしながらBIO.BRと同一のHー2HaplotypeをもつAKR/Jの発症率が低かったことから、Hー2遺伝子以外の要因によってもEAUの発症率は影響を受けているものと考えられた。初年度は、B10系congenic mouseで、S抗原によるEAUのHー2拘束性を検討したので、本年度は、同一のマウスで、他の網膜抗原である視細胞間レチノイド結合蛋白(IRBP)によるEAUのHー2拘束性について研究した。その結果、EAU発症率は、B10.BRで100%、B10.Aで100%、B10.A(4R)も100%であったが、B10.A(5R)は25%であった。また、B10.BRと同一のHー2haplo typeをもちB10congenic mouseではないAKR/JのIRBPによるEAUの発症率は50%であった。

EAUを発症したマウスの眼内炎症の病理学的に各種strainで比較すると、発症率と同様にB10.BR、B10.A、B10.A(4R)が強い病理変化を呈し、次いでAKR/Jで、B10.A(5R)は最も軽い炎症を呈した。これらのことから、IRBPによるEAUは、マウスのHー2に拘束されており、IーA^kのハプロタイプをもつB10系congenicマウスはEAUに対してhigh responder、IーA^kをもたないB10.A(5R)がlow responderである結果から、IーA^kが重要な働きをする疾患感受性遺伝子そのもの、あるいはその近くに疾患感受性遺伝子があると考えられた。以上の結果は、初年度に行なったS抗原によるEAUの実験とほぼ同じ結果である。したがって、マウスにおけるEAUは、分子量が異なり免疫原性も異なる2つの網膜特異抗原(S抗原とIRBP)が、ほぼ同一のMHCもコ-ドされる免疫応答遺伝子による支配をうけていると考えられた。