hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
低温プラズマ・イオン注入法による新規ナノ構造制御材料の研究開発

本研究では、平成17年度と平成18年度に低温プラズマ処理法による酸化チタンナノ粒子の表面形態構造と表面化学組成のナノ構造制御を検討し、かつ、酸化チタンナノ粒子への種々イオン(Nなど)のイオン注入法を検討し、表面バンド構造制御技術を確立することを検討した。平成19年度は低温プラズマ・イオン注入法の両手法の最適化を検討した。(1)低温プラズマ処理(2)イオン注入処理の実験から得られた知見を元に、低温プラズマ処理法・イオン注入法の連続処理を検討した。前者と後者の処理の順番を入れ替えたりすることも検討した。処理条件の最適化を検討した。(Arプラズマ/窒素イオン注入)複合処理を行ったTiO_2電極を用いて作製した太陽電池セルは、未処理のセルと比較して、短絡光電流(Jsc)が増大する傾向にあることが確認された。これは、チタニア内に形成される酸素欠陥が増大し、その酸素欠陥から生成する電子の余分な電子がN_<2p>軌道から形成される準位に入り、残りが伝導電子になる事により、キャリア数が増大し、Jscが増大したと考えられる。また、光電変換効率(η)は100及び200WでArプラズマ処理を行った場合では増大したが、50WでArプラズマ処理を行った場合では僅かながら減少する結果となった。(低温プラズマ/イオン注入)複合処理ではイオン注入単独処理とは異なる原因でJsc及びηの増大が起こったと考えられる。本研究で得られた結果をまとめると、(低温プラズマ/イオン注入)複合処理したチタニア表面バンド構造と太陽電池特性の関係を解明し、色素で光励起された電子のチタニアへの注入効率を促進し逆電子移動過程を起こさない表面バンド構造の構築技術を開発する指針を得た。現在、従来の無機シリコン太陽電池と比較して大幅な低コスト化の可能性を持つ次世代の環境調和型太陽電池として、色素で光を吸収し電気エネルギーとして利用する色素増感太陽電池が注目されている。本研究では、物理的手法である低温プラズマ修飾法とイオン注入法を併用して光電変換効率10%を達成する新規色素増感太陽電池を開発することを目的としている。本年度で得られた成果を列挙する。1.低温プラズマ修飾法でチタニア表面形態および化学組成を変化させ色素の吸着量を増大させるナノ構造制御技術の開発を検討した。アルゴン低温プラズマ修飾法によってチタニア表面への色素の吸着量を増大させる方法を確立した。その結果として短絡光電流(Jsc)の増大と太陽電池の光電変換効率の向上を確認した。2.チタニアの表面をナノ構造制御することにより、表面構造と表面バンド構造との関係を解明し、ナノ表面構造制御による表面バンド構造改善技術の開発を検討した。さらに、アニオン(窒素)イオン注入したチタニア表面バンド構造と太陽電池特性の関係を解明した。イオン注入量の増加に従って短絡光電流(Jsc)の増大が確認された。これは、チタニアへのイオン注入量の増加に伴い、チタニア電極の電子密度状態が変化したからと考えられる。イオンドープチタニアの電子密度状態の理論計算から、イオンのドープ量が少ない場合は酸化チタンの価電子帯の上に新たな軌道が形成され、またドープ量の増加によりその軌道と酸化チタンの価電子帯が混成しバンドギャプの狭窄が起きることが予見される。イオン注入法は色素増感太陽電池の光電変換の高効率化に有効であることを確認した。現在実用化されている太陽電池にはシリコン太陽電池が使用されているが、製造コストが高いことが普及の障害になっている。一方で、色素増感太陽電池は低価格で次世代の環境調和型太陽電池として注目されている。しかしシリコン太陽電池と比較して光電変換効率(η)が低く、実用化には至っていない。

本研究では、物理的手法である低温プラズマ修飾法とイオン注入法を併用して光電変換効率10%を達成する新規色素増感太陽電池を開発することを目的としている。本年度は、色素増感太陽電池の半導体電極である酸化チタン(TiO_2)への侭温プラズマ処理とイオン注入処理の連続処理によって光電変換の高効率化を検討した。本年度で得られた成果を列挙する。1.各基板温度でイオン注入処理を行ったセルは未処理のセルと比較して短絡光電流Jsc及び光電変換効ηが増大する傾向にあることが確認された。2.窒素イオン注入の単独処理と(Arプラズマ/窒素イオン注入)連続処理の処理温度依存性について比較検討した結果、293Kで連続処理した場合、光電変換効率ηの最大を示した。また、Jscの最大値は473Kで連続処理した場合であり、単独処理の場合とは異なる傾向があることが確認された。これらの酸化チタン電極のX線光電子分光(XPS)分析より、(低温プラズマ/窒素イオン注入)連続処理ではTi-N結合が形成されることが確認された。そのため、未処理のセルと比較した場合、Jscや光電変換効率の増大が起こったと考えられる。また、処理温度の増加とともに窒素有機物に起因するピークが発現することも確認された。これは光電変換効率の減少と対応しており、関連性があると考えられ、射温度の増加に伴うTi-N結合の増加が光電変換効率の増大に結びつかなかった原因と考えられる。本研究では、平成17年度と平成18年度に低温プラズマ処理法による酸化チタンナノ粒子の表面形態構造と表面化学組成のナノ構造制御を検討し、かつ、酸化チタンナノ粒子への種々イオン(Nなど)のイオン注入法を検討し、表面バンド構造制御技術を確立することを検討した。平成19年度は低温プラズマ・イオン注入法の両手法の最適化を検討した。1.(Arプラズマ/窒素イオン注入)複合処理を行ったTiO_2電極を用いて作製した太陽電池セルのI-V曲線測定結果より、未処理のセルと比較して、複合処理を行ったセルの場合は短絡光電流(Jsc)が増大する傾向にあることが確認された。これは、チタニア内に形成される酸素欠陥が増大し、その酸素欠陥から生成する電子の余分な電子がN_<2p>軌道から形成される準位に入り、残りが伝導電子になる事により、キャリア数が増大し、Jscが増大したと考えられる。2.光電変換効率(η)は100及び200WでArプラズマ処理を行った場合では増大したが、50WでArプラズマ処理を行った場合では僅かながら減少する結果となった。この50WでArプラズマ処理を行ったセルはJscの増大が僅かであり、さらにフィルファクター(ff)が未処理のセルに対して著しく低いため、このような結果になったと考えられる。また、X線光電子分光分析(XPS)測定結果からffの減少はプラズマによって表面に出来た活性点がその後のイオン注入時の窒素ガスと反応した結果、表面に窒素不純物が形成し、抵抗となったためであると考えられる。そのため、(低温プラズマ/イオン注入)複合処理ではイオン注入単独処理とは異なる原因でJsc及びηの増大が起こったと考えられる。
毛細血管の有窓形成を調節する細胞外マトリクス分子の同定と制御メカニズムの解明

毛細血管は内皮細胞からなる管腔の外周を基底膜が裏打ちするシンプルな構造であり、物質交換の場として機能する。とりわけ、物質交換が盛んな内分泌器官などに分布する有窓型毛細血管の壁には“窓"が存在し、物質の移動路として働く。また、基底膜は多様な細胞外マトリクス分子からなり、その分子構成は血管型ごとで異なることから、基底膜を構成する分子が窓の形成に関わることが予想される。本課題では、内分泌器官の中枢である下垂体に焦点を当て、そこに分布する有窓型毛細血管に特徴的に発現する細胞外マトリクス分子に着目し、窓の形成における役割とその調節機序を明らかにする。
宇宙大規模構造を用いた初期宇宙の探査

3年目の計画は2年目までに開発した宇宙磁場断層解析法を、これまでの単純銀河モデルよりも現実的な銀河モデルへ適用し、銀河モデルの再現性を見積もることであった。2年目までに使用してきた単純銀河モデルは、一様分布している自由電子/相対論的電子と一様磁場しか考えてこなかったが、今回は電子分布にはガウス関数型分布関数を仮定し、磁場成分は一様磁場に加え、乱流磁場の効果も考慮に入れた。その結果、宇宙磁場断層解析法によって得られるファラデー分散関数と呼ばれる関数が、従来の単純銀河モデルから見積もられたものと比べ、極めて複雑な構造を持つことが新たにわかった。また、ファラデー分散関数の分散、歪度、尖度などの統計量から、銀河磁場強度や電子分布幅などの重要な物理量を推定できる可能性も示された。さらにこれらの重要な物理量を、将来の観測計画であるSquare Kilometer Array (SKA)を用いてどの程度の精度で見積もれるかを調査した。その結果、分散以外の統計量は理想的な状況とほぼ同程度の信頼度で見積もることができることがわかった。また、宇宙磁場断層解析法を応用した銀河間磁場測定手法を考案し、この手法で検出可能な銀河間磁場強度を様々な電波望遠鏡を想定して調査した。その結果、SKA先行機と呼ばれる望遠鏡を用いれば、数μG程度の宇宙磁場にまで感度があることを見積もった。この強度は銀河・銀河団磁場を測定するのに十分な感度である。また、SKA先行機の組み合わせ及び、SKAを用いれば、数nGという感度にまで到達することを示した。この強度は未だ測定されていないフィラメントと呼ばれる構造に付随する磁場を測定できる可能性を示唆している。これらの研究成果はいくつかの論文にまとめられ、すでに出版されている。また、この3年間で進めてきた研究を学位論文としてまとめ、SKAグループに対しても提言を行っている。26年度が最終年度であるため、記入しない。1年目の計画は、宇宙マイクロ波背景放射温度ゆらぎの方向依存性を調べる研究を完成させること、及び電波干渉計による偏波観測を用いた宇宙磁場断層解析法の理解であった。宇宙マイクロ波背景放射温度ゆらぎ方向依存性の研究については、既存の衛星観測WMAPの7年目のデータを用いた解析を行い、銀河面に対して南西方向に特徴的なシグナルが見られることを発見した。このシグナルは十分な統計的優位性、さらに新規性もある非常に興味深い発見であった。この結果は査読付き論文雑誌Physical Review Dへ投稿し、今年度中に受理された。また、中国・北京で行われた国際的な宇宙論会議などにおいて、この結果の発表、議論を行った。これは申請書類に書いた年次計画通り順調に進んでいる。さらに2013年4月現1在、WMAP 9年目のデータに加え、新たな衛生観測Planckのデータも公開された。これらのデータについても同様の解析を行い、他の独立な観測においても特徴的なシグナルが見えるかどうかを確認するなど、次に繋がる研究になった。宇宙磁場構造断層解析法についても、計画通りかそれ以上に進んでいる。この方法を提起した論文の理解、さらに初めて実用化した論文の理解を進めた。これらについては数学的・物理的双方からの理解が済んでいる。さらに磁場構造断層解析法の理解が計画以上に進んだため、磁場構造断層解析法のコード化とそのコードを用いた単純モデルでのシミュレーションを行った。磁場構造断層解析法は銀河や系外銀河の磁場構造の探査にはよく使われているが、銀河間磁場構造の探査には未だ応用されていない。そのため、応用の可能性を探るために、実在の大型電波干渉計、さらに将来的に計画されている超大型電波干渉計を想定したシミュレーションも行った。シミュレーションにより擬似観測を行い、磁場構造断層解析法の応用可能性を探った。この研究によって、次世代超大型干渉電波望遠鏡群SKAで得た偏波観測データに対し磁場構造断層解析法を用いた場合、銀河間磁場のRotation Measureが10rad/m^2程度あれば、十分見積もりが可能であることが明らかになった。この結果についても論文にまとめ、Astrophysical Journalへ投稿済みである。また、このシミュレーション結果を国内で行われた複数の研究会議において発表を行い、有意義な議論を行った。以上のように、1年目の研究は当初の計画どおりかそれ以上に進んでいる。2年目の計画は、銀河間磁揚測定のための宇宙磁場断層解析法の確立であった。1年目において構築したコードとそれを用いて行った単純銀河モデルでのシミュレーションをさらに発展させるために、Australian Square Kilometer Array PathfinderプロジェクトのPOSSUMチームが主催するベンチマークテストに参加した。このベンチマークテストにおいて、Compressive sampling法やQU Fitting法などの多種多様な手法の長所・短所を洗い出し、手法のさらなる理解を深めることができたeその中で、我々の手法に今まで知られていなかった不確定性があることがわかった(RM ambiguity)。そのため、との不確定性にっいて精査し、不確定性が発生する条件を詳しく調べた。その結果、非常に限られた条件でしか発生しないものの、将来の大規模観測においても重大な磁場構造推定ミスを招く可能性を見出し、警鐘を鳴らした。この結果をまとめた論文をPASJ投稿し、今年度中に受理された。さらに、このベンチマークテストでの成果をもとに、伝統的な方法をさらに高める手法(Faraday tomography法+Phase RMC CLEAN法)の開発に成功した。

この手法を用いれば、前述した不確定性の一部を取り除くことができ、さらに磁場情報の抽出精度を高めることができると期待されている。この成果も現在論文としてまとめている最中である。これらの成果を鑑みると、今年度も計画通りに研究は進んでいると評価することができる。加えて来年度の計画の準備段階として、単純銀河モデルでのシミュレーションではなく、現実的な銀河モデルを用いた磁場構造のシミュレーションデータを用い、我々の手法で複雑な構造をどれだけ精度よく抽出できるかを調査した。精度向上の定量的な評価は、計画通り来年度中に行う予定である。また、前年度からオランダ・フローニンゲン大学にて行ってきた、電波干渉計観測データ較正アルゴリズムの誤差評価の研究も引き続き行った。現在Low Frequency Arrayプロジェクトの再電離グループによって採用されているSAGE較正法を用いれば、系外銀河や系内の電波源を望遠鏡の性能で決まる観測誤差以下のレベルという非常に高い精度で除去することができることがわかった。さらに同研究内で、同じSAGE較正法を用いながら、その適用順を工夫することで精度の向上が認められることを初めて示した。これらの結果は現在論文執筆中である。これらの研究成果は、複数の国内外研究会議で発表を行い、非常に有意義な議論も同時に行った。以上のように、2年目の研究も1年目の研究に引き続き、当初の計画通りか、それ以上に進んでいる。3年目の計画は2年目までに開発した宇宙磁場断層解析法を、これまでの単純銀河モデルよりも現実的な銀河モデルへ適用し、銀河モデルの再現性を見積もることであった。2年目までに使用してきた単純銀河モデルは、一様分布している自由電子/相対論的電子と一様磁場しか考えてこなかったが、今回は電子分布にはガウス関数型分布関数を仮定し、磁場成分は一様磁場に加え、乱流磁場の効果も考慮に入れた。その結果、宇宙磁場断層解析法によって得られるファラデー分散関数と呼ばれる関数が、従来の単純銀河モデルから見積もられたものと比べ、極めて複雑な構造を持つことが新たにわかった。また、ファラデー分散関数の分散、歪度、尖度などの統計量から、銀河磁場強度や電子分布幅などの重要な物理量を推定できる可能性も示された。さらにこれらの重要な物理量を、将来の観測計画であるSquare Kilometer Array (SKA)を用いてどの程度の精度で見積もれるかを調査した。その結果、分散以外の統計量は理想的な状況とほぼ同程度の信頼度で見積もることができることがわかった。また、宇宙磁場断層解析法を応用した銀河間磁場測定手法を考案し、この手法で検出可能な銀河間磁場強度を様々な電波望遠鏡を想定して調査した。その結果、SKA先行機と呼ばれる望遠鏡を用いれば、数μG程度の宇宙磁場にまで感度があることを見積もった。この強度は銀河・銀河団磁場を測定するのに十分な感度である。また、SKA先行機の組み合わせ及び、SKAを用いれば、数nGという感度にまで到達することを示した。
術後癌患者の新たなせん妄予防運動プログラムの開発－睡眠－覚醒サイクルに着目して－

〈平成24年度研究計画〉本研究では、術前身体活動量と術後の睡眠-覚醒サイクルおよびせん妄症状の重症度を縦断的に評価し、これらの関連性について検証した。対象者は、食道切除術を予定している食道癌患者とし、入院時に入院前の身体活動量に関する調査を国際標準化身体活動質問票(International Physical Activity Questionnaire : IPAQ)を用いて行った。睡眠-覚醒サイクルの測定にはアクチウォッチを使用し、活動時間と睡眠時間を睡眠-覚醒パラメーターとして算出した。術後せん妄の重症度評価はDelirium Rating Scale-Revised-98日本語版(DRS-R-98-J)を使用して行った。〈結果〉術前の身体活動量(IPAQ)および術後の睡眠-覚醒パラメーター(アクチウォッチ)と術後せん妄の重症度(DRS-R-98-J)と関連をSpearmanの順位相関係数を用いて検討した結果、DRS-R-98スコアと日中の睡眠時間が有意な正の相関(r=0.59, p<0.01)を,日中の活動量が負の相関を認めた(r=-0.40, p<0.05)。術前の身体活動量はDRS-R-98スコアと有意な相関を認めなかった。〈考察および展望〉まず始めに、アクチウォッチを使用することで、術後早期の睡眠-覚醒サイクルを測定することは可能であった。そのため、術後患者がどのような睡眠-覚醒パターンをしているかを客観的データで示すことができた点は本研究の第一の特徴である。次に、術前身体活動量と術後の睡眠-覚醒サイクルおよびせん妄症状の重症度との関連性についてだが、術後せん妄の重症度は日中の活動量および睡眠状況と密接に関連していると考えられた。早期離床や運動療法などにより、日中の活動量を増やし、覚醒を促すことがせん妄の重症度の軽減につながる可能性が示唆された。
精子幹細胞におけるポリ（ＡＤＰーリボース）代謝の役割

精子幹細胞の長期培養系は、GS細胞と呼ばれている。GS細胞は2年間培養し続けても、増殖速度、形態、核型、DNAメチル化パターン、精子形成能が維持された安定な細胞である。これまでの研究から、GS細胞のポリ(ADP-リボシル)化反応を阻害することによって、細胞増殖が抑制され、細胞死が誘導されることを明らかにした。今回の研究から、ポリ(ADP-リボシル)化反応を阻害することによって、p53の下流で働く複数の遺伝子の発現が変化することがわかった。また、この阻害によってp53のリン酸化が促進された。これらの結果は、GS細胞におけるp53の活性化にポリ(ADP-リボシル)化が関与していることを示唆した。前年度までの研究から、ポリ(ADP-リボース)合成酵素(PARP)の阻害剤によってポリ(ADP-リボシル)化を抑制したマウス精子幹細胞の培養系(GS細胞)では、p53の下流で働く複数の遺伝子の発現に変化があり、その増殖能の低下もしくは細胞死が起こっている可能性が考えられた。今年度は、shRNAによるポリ(ADP-リボシル)化の合成および代謝に関わる酵素の発現抑制系を用いて、精子幹細胞の増殖能および遺伝子の発現変化について解析した。その結果、ポリ(ADP-リボース)合成酵素の発現抑制によって、酵素阻害剤を作用させたときと同様の遺伝子の発現変化が見られた。このことは、精子幹細胞の増殖に与える変化が、用いた阻害剤の副作用によるものではなく、ポリ(ADP-リボシル)化が関与していることを示唆した。また、PARP阻害剤によるポリ(ADP-リボシル)化阻害がp53にどのように影響しているかを調べるため、種々のリン酸化抗体を用いたウエスタンブロット法を用いた解析を行った。コントロールとして用いた神経幹細胞において(ポリ(ADP-リボシル)化阻害によって同様に増殖が抑制されることを明らかにしている)p53のリン酸化に変化が生じることを明らかにし、精子幹細胞についても、同様に解析を進めている。さらに、p53の関与の証明するために、shRNAによるp53の発現を抑制した精子幹細胞の培養系を構築した。この細胞に対して、ポリ(ADP-リボシル)化阻害が与える影響を次年度に解析する。前年度までの研究から、ポリ(ADP-リボース)合成酵素(PARP)の阻害剤およびshRNAによるPARP-1の発現抑制によってポリ(ADP-リボシル)化を抑制したマウス精子幹細胞の培養系(GS細胞)では、p53の下流で働く複数の遺伝子の発現に変化があり、その増殖能の低下もしくは細胞死が起こっていることを明らかにした。さらに、組織幹細胞の比較対象として神経幹細胞(ポリ(ADP-リボシル)化阻害によって同様に増殖が抑制されることを明らかにしている)を用いた実験から、ポリ(ADP-リボシル)化がp53のリン酸化に関与していることがわかった。今年度は、精子幹細胞および神経幹細胞の培養系を用いて、ポリ(ADP-リボシル)化によるp53のリン酸化制御機構についてさらに詳細に解析した。p53の関与を明らかにするために、shRNAによるp53の発現抑制またはp53ノックアウトマウス由来のこれらの幹細胞のポリ(ADP-リボシル)化を抑制した場合、増殖能の低下や細胞死が軽減された。また、ポリ(ADP-リボース)親和性レジンを用いたプルダウンアッセイから、p53のリン酸化酵素がポリ(ADP-リボシル)化されている可能性が示唆された。以上の結果から、幹細胞の培養系においてはp53の活性化にポリ(ADP-リボシル)化が関与し、その上流分子の活性制御にポリ(ADP-リボシル)化が直接関与している可能性が考えられた。組織幹細胞の1つである精子幹細胞は、試験管内でゲノム安定性を維持したまま長期間培養することが可能である一方、低頻度ではあるもののES細胞と同様な性質をもった多能性幹細胞に変化することが知られている。精子幹細胞がもつ特徴の1つ、ゲノム安定性に着目した今までの研究によって、DNA修復、染色体の安定性などとの関連が知られているタンパク質翻訳後修飾、ポリ(ADP-リボシル)化を阻害することで、精子幹細胞の増殖が抑制されるという実験結果を得た。本研究の目的は、精子幹細胞の増殖に直接関与する、ポリ(ADP-リボシル)化タンパク質の同定、さらにはポリ(ADP-リボース)分解酵素(PARG)の影響についても解析し、精子幹細胞におけるポリ(ADP-リボース)代謝の役割の実態を解明することである。まず、精子幹細胞に関わるポリ(ADP-リボシル)化タンパク質を明らかにするため、ポリ(ADP-リボシル)化タンパク質として知られているp53に着目した。

ポリ(ADP-リボシル)化を担う酵素、PARPの活性を阻害したマウス精子幹細胞の培養系(GS細胞)では、p53の下流で働く複数の遺伝子の発現に変化があることがわかった。このことから、ポリ(ADP-リボシル)化阻害による精子幹細胞の増殖抑制に、p53が関与している可能性が示唆された。また、次年度以降、ポリ(ADP-リボース)分解系の役割についても解析する目的で、遺伝子発現ベクター、shRNAを用いた、ポリ(ADP-リボース)分解酵素(PARG)の発現を制御したGS細胞の構築を行った。精子幹細胞の増殖にポリ(ADP-リボシル)化が関与することを、その合成酵素の阻害剤だけではなく、shRNAによる発現抑制系でも確認できた。また、ポリ(ADP-リボシル)化の抑制がp53の活性化に影響を与えていることを示唆する結果や、今後それを証明するための、shRNAによるp53の発現制御系精子幹細胞を構築できたので、研究目的に沿っておおむね順調に進展していると考えられる。精子幹細胞の増殖に関与するポリ(ADP-リボシル)化タンパク質の候補を見つけ、ポリ(ADP-リボース)分解酵素(PARG)の影響について解析するための発現制御系をマウス精子幹細胞の培養系(GS細胞)でほぼ構築できたので、研究目的に沿っておおむね順調に進展していると考えられる。ポリ(ADP-リボシル)化阻害による精子幹細胞の増殖抑制にp53が関与している可能性について、さらに詳細に解析する。構築したshRNAによるp53の発現制御系精子幹細胞に対して、ポリ(ADP-リボシル)化阻害が与える影響について解析し、野生型の精子幹細胞で見られた増殖抑制などの変化がレスキューされるかを調べる。同時に、エピジェネティック修飾の変化についても解析する。また、構築できているshRNAによるポリ(ADP-リボシル)化の合成および分解酵素の発現抑制系精子幹細胞を用い、ポリ(ADP-リボシル)化の阻害および亢進が、p53のポリ(ADP-リボシル)化やリン酸化に与える影響を、免疫沈降、ウエスタンブロット法および免疫染色法などによって解析する。これらの解析を総合的に評価し、精子幹細胞におけるポリ(ADP-リボース)代謝の役割について、とくにp53について着目し明らかにする。その知見をまとめ、学会および論文発表する。まず、ポリ(ADP-リボシル)化阻害による精子幹細胞の増殖抑制にp53が関与している可能性について、さらに詳細に解析する。これまでと同様、ポリ(ADP-リボシル)化を担う酵素、PARPの活性を阻害したマウス精子幹細胞の培養系(GS細胞)を用い、p53のポリ(ADP-リボシル)化の状態を、免疫沈降、ウエスタンブロット法および免疫染色法などによって解析し、野生型のGS細胞の場合と比較する。また、shRNAを用いたPARPの発現を抑制したGS細胞、ポリ(ADP-リボース)分解酵素(PARG)の発現を制御したGS細胞について、増殖能の変化や、免疫染色法、フローサイトメトリーおよびRT-PCRを用いた解析によって表現型の変化を調べる。さらに、各種のメチル化およびアセチル化ヒストン抗体による免疫染色またはウエスタンブロットによるヒストン修飾の解析や、細胞のDNAを抽出しCOBRA法によってインプリンティング遺伝子のメチル化状態の解析によって、エピジェネティック修飾の変化について調べる。これらの解析を総合的に評価し、精子幹細胞におけるポリ(ADP-リボース)代謝の役割を明らかにする。
皮膚免疫応答におけるＣＯＸ阻害薬の薬理作用の検討およびプロスタノイドの役割の解明

昨年度までの研究により、シクロオキシゲナーゼ(COX)阻害薬であるインドメタシンは抗炎症作用を持つにもかかわらずTh2型皮膚免疫反応においては炎症を増強すること、そのメカニズムとして、PGE2-EP2を介し、ケラチノサイトからの胸腺間質性リンパ球新生因子(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)産生の増強がかかわっていることが示唆された。In vitroでケラチノサイトをPGE2-EP2アゴニストを用いて刺激すると、細胞膜上のPAR-2が細胞膜から細胞内へ移動する(internalization)という現象が誘導された。また、インドメタシンを塗布したマウス耳介皮膚ではケラチノサイト細胞膜上のPAR-2の発現が増強していた。以上より、PGE2-EP2シグナルはケラチノサイト細胞膜上のPAR-2のinternalizationを誘導することでTSLP過剰産生に対して抑制的に働くと考えられた。さらに、in vitroでの検討で、EP2アゴニストによってPAR-2がリン酸化され、PAR-2はcAMPでもリン酸化された。クラスリン阻害剤を添加すると、この現象が阻害された。さらに、PGE2-EP2刺激で細胞表面のPAR-2の発現が抑制され、クラスリン阻害剤を添加すると、PGE2-PE2刺激の効果は観察されなかった。以上から、ケラチノサイトにおいて、PGE2-EP2刺激によってcAMPを介してPAR-2リン酸化を生じ、PAR-2 internalizationが誘導されること、この現象はクラスリン依存性であることが示された。以上から、NSAIDsによるアトピー増悪のメカニズムの一つとして、NSAIDsによりPGE2産生が阻害され、EP2を介したPAR-2 internalizationが抑制されて、Th2型反応が促進されるという機序が考えられた。28年度が最終年度であるため、記入しない。2014年度の研究実績は主に、(1)Th1型皮膚免疫反応におけるCOX阻害薬の作用の検討、(2)Th2型皮膚免疫反応におけるCOX阻害薬の作用の検討、(3)Th2型皮膚免疫反応を増強する機序の解明の3つの内容である。(1)マウス耳介皮膚における接触過敏反応モデルを用い、Th1型皮膚免疫反応に対するCOX阻害薬の作用を検討した。ハプテン塗布群とハプテン+インドメタシン塗布群で比較したところ、後者で有意に皮膚炎が抑制された。これより、Th1型皮膚免疫反応においてCOX阻害薬は炎症を抑制する方向に作用することが示された。(2)マウス耳介皮膚におけるハプテン反復塗布モデルで、Th2型皮膚免疫反応に対するCOX阻害薬の作用を検討した。ハプテン反復塗布群とハプテン反復塗布+インドメタシン塗布群では、後者で有意に皮膚炎が増強した。また、血清IgE濃度は後者で有意に高かった。以上からCOX阻害薬はTh2型皮膚免疫反応を増強することが示された。(3)(2)の機序を解明するため、炎症の主座である耳介皮膚の細胞をフローサイトメトリーで解析し、上記2群で比較した。耳介あたりのIL-4産生細胞数が後者で有意に多かった事から、IL-4産生細胞に着目した。近年新しい免疫細胞サブセットとして発見された自然リンパ球2型(Innate Lymphoid Cell,以下ILC2)は大量のIL-4を産生することで知られているため、COX2阻害薬がTh2型皮膚免疫反応を増強する現象においても、ILC2が関わっている可能性があると考えた。そこでマウス耳介のILC2細胞数を、フローサイトメトリーを用いて、上記2群で比較したところ、ILC2細胞数は後者で有意に多かった。このことから、ILC2がCOX阻害薬によるTh2型免疫反応の増強に関わっている可能性が示された。1COX阻害薬はケラチノサイトのTSLP産生を増強するアトピー性皮膚炎におけるケラチノサイト胸腺間質性リンパ球新生因子(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)の過剰産生メカニズムとして、kallikrein 5 (KLK5)が直接proteinase-activated receptor 2 (PAR2)を活性化し、核内因子κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)を介したTSLPの過剰発現が誘導されるという経路が知られる。申請者は、ハプテン反復塗布モデルの耳介皮膚のKLK5およびTSLPのmRNAをリアルタイムPCR法により定量した。KLK5の発現はインドメタシン投与によって増強されず、TSLP産生は有意に増強された。このことから、インドメタシンはKLK5産生には関与せず、PAR2以降の細胞内シグナルに関与する事が示唆された。2COX阻害薬によるTSLP産生増強はPGE2-EP2を介する正常ヒト表皮角化細胞(Normal Human Epidermal Keratinocytes, NHEK)のTSLP産生を培養上清の酵素結合免疫吸着法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)にて定量した。ハプテン刺激でNHEKからのTSLP産生は増加、インドメタシンにより産生はさらに増強された。この実験系にプロスタグランジンE2(PGE2)の受容体である、EP受容体の各サブタイプ(EP1,EP2, EP3, EP4)のantagonistをさらに添加したところ、EP2 antagonistによってハプテン刺激によるTSLP産生は増強され、EP2 agonistによってインドメタシンによるTSLP産生増強作用はキャンセルされた。

このことから、インドメタシンによるTSLP産生増強はPGE2-EP2を介していることが示唆された。申請者は、申請内容である皮膚免疫応答におけるCOX阻害薬の薬理作用およびプロスタノイドの役割について研究を進めた。昨年度、COX阻害薬によってTh2型皮膚免疫反応が増強することが観察できる実験系を確立し、その現象にILC2という免疫細胞サブセットがかかわっている可能性があることを示した。本年度はさらに、COX阻害薬がケラチノサイトからのTSLP産生を増強し、それがPGE2-EP2を介しているという新たな知見を見いだした。そのため、申請書に記載した今年度の目標とした研究項目を達成しており、おおむね期待どおり研究が進展したと評価した。昨年度までの研究により、シクロオキシゲナーゼ(COX)阻害薬であるインドメタシンは抗炎症作用を持つにもかかわらずTh2型皮膚免疫反応においては炎症を増強すること、そのメカニズムとして、PGE2-EP2を介し、ケラチノサイトからの胸腺間質性リンパ球新生因子(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)産生の増強がかかわっていることが示唆された。In vitroでケラチノサイトをPGE2-EP2アゴニストを用いて刺激すると、細胞膜上のPAR-2が細胞膜から細胞内へ移動する(internalization)という現象が誘導された。また、インドメタシンを塗布したマウス耳介皮膚ではケラチノサイト細胞膜上のPAR-2の発現が増強していた。以上より、PGE2-EP2シグナルはケラチノサイト細胞膜上のPAR-2のinternalizationを誘導することでTSLP過剰産生に対して抑制的に働くと考えられた。さらに、in vitroでの検討で、EP2アゴニストによってPAR-2がリン酸化され、PAR-2はcAMPでもリン酸化された。クラスリン阻害剤を添加すると、この現象が阻害された。さらに、PGE2-EP2刺激で細胞表面のPAR-2の発現が抑制され、クラスリン阻害剤を添加すると、PGE2-PE2刺激の効果は観察されなかった。以上から、ケラチノサイトにおいて、PGE2-EP2刺激によってcAMPを介してPAR-2リン酸化を生じ、PAR-2 internalizationが誘導されること、この現象はクラスリン依存性であることが示された。以上から、NSAIDsによるアトピー増悪のメカニズムの一つとして、NSAIDsによりPGE2産生が阻害され、EP2を介したPAR-2 internalizationが抑制されて、Th2型反応が促進されるという機序が考えられた。申請者はこの1年の間、申請内容である皮膚免疫応答におけるCOX阻害薬の薬理作用およびプロスタノイドの役割について研究を進めた。まず申請者は、COX阻害薬でTh1型皮膚免疫反応が減弱する実験系、およびTh2型皮膚免疫反応が増強することが観察できる実験系を確立した。これによって、COX阻害薬はTh1型反応を抑制する一方でTh2反応を増強することから、COX阻害薬による炎症の増強はTh2型に特異的である事を示すことができた。
ベトナムにおける小児肺炎発症の社会環境的リスク因子の量的・質的探究

ベトナム中南部の都市ニャチャンにおいて、呼吸器感染症で入院した5歳未満児の保護者に対し発症から治療までの行動に関する聞き取り調査、および医師、薬剤師などに対する抗菌薬処方、販売等に関する聞き取り調査を実施した。保護者200名に対する調査の結果、医療へのアクセスは迅速で判断も適切であるが、処方された抗菌薬の使用については自己判断での中止など不適切な点があることが分かり、医師や薬剤師への調査でも同様であった。本研究の目的は、ベトナムにおける小児肺炎発症の危険因子を住民の日常生活行動パターンから量的・質的に検証し、明らかにすることである。平成21年度は、1112月頃にカンホア県保健プロジェクト(長崎大学熱帯医学研究所臨床医学部門研究チーム:代表有吉紅也教授)が構築した住民データベースを利用して、コホートの構築および調査の開始を予定していた。しかし対象地域の台風被害等のため、調査は22年度に繰り越しとした。平成21年度は、以下の通り調査に向けた情報収集と準備を行った。1)日本国際保健医療学会(8月)、ヨーロッパ熱帯医学会(9月)、日本熱帯医学会(10月)の各学術大会に参加し、小児肺炎に関する、また東南アジアにおける感染症コントロールに関連した研究の動向や最新の情報を収集した。2)文献検索および文献による予備研究を実施した。3)調査準備:文献整理用ソフト(Endnote13)解析用ソフト(STATA11)、調査用機材(GPS,電池、文房具等)を購入した。22年度、情報収集、研究計画および質問内容等の検討後、本調査実施のための現地予備調査を実施した。質問紙を作成し、カインホア県病院小児科病棟に入院した5歳未満児の母親10名、病院勤務医2名、保健所職員2名、薬局2か所にて聞き取り調査を行った。結果から質問項目の検討、選択肢を設定し直し、本調査での実施人数を算定した。発展途上地域における小児肺炎の高い死亡率は世界的に大きな課題であるが、その実態はまだ十分に把握されていない。特に環境因子が発症に強く影響すると考えられている小児肺炎の場合、文化的、社会経済的要因を背景とした、母親あるいは保護者の受療行動が小児肺炎の症状や予後に大きな影響を及ぼすと考えられるが、詳細な実態はいまだ明らかでない。本研究は、ベトナム中南部カンホア県都市部における小児呼吸器感染症の社会的・経済的・文化的リスク因子を明らかにすること、小児呼吸器感染症の医療機関受診行動パターンを明らかにすることおよび家庭における、小児呼吸器感染症に対する疾病理解と、疾病行動を規定する社会的、文化的因子を明らかにすることを目的として実施した。本年度は予備調査結果を踏まえて聞き取り項目・内容を検討し、本調査にてベトナム・カンホア県ニャチャン市のカンホア県病院小児科に急性呼吸器疾患で入院した児の母親あるいは保護者200名に対する受療行動を中心とした聞き取り調査、および地域の病院、保健所、薬局の医療スタッフ10名に対する小児の呼吸器疾患の治療方針、使用薬の詳細等に関する聞き取り調査を実施した。患者の約半数は15カ月の乳児であり、直接世話をするのは母親がほとんどであった。児の呼吸器症状発症時はクリニックなど医師のいる医療機関を受診していたが、1か所目で適切な治療を受けられず、2または3か所目で県病院を受診し、その間に重症化してしまっているケースも散見された。抗生物質を自宅に保管したり自己判断で使用する者は少なかったが、費用がかかるために十分な期間服用できておらず、重症化の要因になっていると考えられた。一方抗生物質の供給側である地域の医療従事者への聞き取り調査では、ガイドラインに従った治療を実施しているという回答がほとんどであったが、これについてはより詳細な調査が必要であると思われた。
ポリマーミセルを利用した高屈折・透明性無機/有機ハイブリッドの作製とその応用

無機酸化物ナノ粒子をポリマーマトリックス中へ分散させて,高屈折・透明性ハイブリッド材料の作製に関する基礎研究を行った。疎水性溶媒中で両親媒性ブロックポリマーの逆ミセルを形成させ,その親水性コア内で金属酸化物(TiO2, ZrO2, ZnO)ナノ粒子を合成し,この逆ミセル溶液とポリマーを含む溶液からキャスト法によって,簡便で効率よい透明で高屈折のハイブリッド材料作製法を開発した。1.トルエン中で形成したポリアクリル酸とポリメタクリル酸メチルのブロックコポリマーの逆ミセルの親水コア中で、チタニナナノ粒子を合成し、それをポリメタクリル酸メチルへ組み込むことによって、高透明なハイブリッドフィルムを得ることができた。その屈折率は、チタニア含有量とともに増大し、計算値と一致した。2.上記ブロックコポリマーの逆ミセルを用いて、Zn(NO_3)_2と塩基から粒子径20-50nmのZn(OH)_2粒子の合成が可能であった。しかし、PMMAとの複合フィルムは吸湿性のために低透明性になった。3.この方法を改良するために、ブロックコポリマーミセルを用いて、Zn(C_2H_5)_2からZn(OH)_2の合成を行ったところ、10-20nmの粒子の合成は可能となったが、低い可視光透過性のフィルムが得られた。今後、製膜条件の最適化必要であることがわかった。4.同様にして、ZrO_2ナノ粒子のハイブリッド化を行い、ミセル内で20nm程度のZr(OH)_4が生成することを確認した。この場合、前駆体合成時の反応速度の制御が重要であることが明らかになった。5.本手法による高透明・高屈折材料の作製において、ポリマーマトリックスをポリカーボネート(PC)へ拡張するために、PCオリゴマーからビスフェノールAを骨格成分にもつブロックポリマーの合成経路を確立した。1.トルエン中で形成したポリアクリル酸とポリメタクリル酸メチルのブロックコポリマーの逆ミセルの親水コア中で、ジエチル亜鉛の加水分解を経て、1520nmの酸化亜鉛ナノ粒子を合成することに成功した。その粒子とポリメタクリル酸メチルの複合化によって、比較的に透明性の高いハイブリッドフィルムを得ることができた。その屈折率は、チタニア含有量とともに増大し、計算値と一致したが、酸化亜鉛を10wt%以上含有するフィルムの可視光透過性は著しく低下した。2.上記ブロックポリマーを用いて、同様に酸化ジルコニウムナノ粒子り合成における最適化を行ったところ、テトラ(アセチルアセトナト)ジルコニウムの加水分解を経る反応によって、1520nmのナノ粒子を合成することができた。この粒子とポリメタクリル酸メチルの複合化によって得られたフィルムの屈折率は計算値と一致したが、この場合も10wt%の酸化ジルコニウム粒子を含むフィルムの400nmにおける可視光透過率は低下した。3.これらのナノ粒子を含有するハイブリッドフィルムの可視光域での低透過性は、キャスト法によるフィルム作製時における粒子間凝集に起因することが明らかになった。前年度の研究結果において、酸化ジルコニウム/ポリ(メタクリル酸メチル)ハイブリッドフィルムは高透明であったが、その屈折率が計算値よりも低くなったので、酸化ジルコニウム粒子の結晶性を高めるために、この酸化物前駆体を含有したポリ(メタクリル酸メチル)とポリ(アクリル酸)のコポリマーの逆ミセルのトルエン溶液を超臨界二酸化炭素中で加熱して結晶化を向上させる手法を着想した。このミセル溶液を15 Mpaでの二酸化炭素加圧下、170°Cで加熱して、ミセル形成状態が維持される最適条件を見出した。また、20 nmサイズの結晶性酸化ジルコニウムナノ粒子の分散溶液を入手して、これをポリ(メタクリル酸メチル)とポリ(アクリル酸)のコポリマーの逆ミセルのトルエン溶液へ取り込ませて、ハイブリッド化を実施した。この方法によって作製したハイブリッドフィルムの屈折率は計算値とほぼ一致した。前年度の研究結果より、フィルム作製時の酸化亜鉛ナノ粒子の凝集を防ぐために、このナノ粒子とブロックポリマーのポリアクリル酸部位間の共有結合を形成させることを意図して、その前駆体を含む逆ミセルのトルエン溶液を超臨界二酸化炭素中、170 °Cで加熱する手法の応用を実施し、ナノ粒子が凝集しない最適な条件を確立した。ブロックポリマーの逆ミセル溶液を超臨界二酸化炭素中で加熱する上記方法は、銀ナノ粒子/ポリ(メタクリル酸メチル)ハイブリッドフィルム作製に応用できることを見出した。本代表者は、平成23年3月に九州工業大学から長崎大学へ異動した。そのために、異動に伴う研究の停止と異動先での実験準備に時間がかかり、研究の進展がやや遅れている状態である。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに、ブロックポリマーの逆ミセル親水コア内での酸化チタン、酸化亜鉛および酸化ジルコニウムのナノ粒子の合成に関しては、目標を達成している。

最終目的の高屈折・透明なフィルムを作製するには、フィルム調製時の微粒子の凝集を阻止するために、キャスト法の最適化およびナノ粒子を含む逆ミセル溶液の加熱処理による粒子表面とブロックポリマー中のカルボキシル基の結合または相互作用を促進する方策と実施する予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。
過栄養性脂肪肝の進行に対する栄養成分の機能性

非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)は、メタボリックシンドロームの肝臓における表現型であり、肥満や糖尿病を合併する患者が多い。さらに肝線維化の進展は、その病態を非アルコール性脂肪肝炎(NASH)へと悪化させる。本研究では、ゼラチン加水分解物(gelatin hydrolysate: GH)の摂取が四塩化炭素連続投与による慢性肝障害モデルラットの肝線維化を抑制すること、ならびにストレプトゾトシン投与による糖尿病モデルラットの血糖値上昇を抑制することを見出した。GHはメタボリックシンドロームや脂肪肝の進展を抑制する機能性成分として有効かもしれない。初年度、四塩化炭素投与による慢性肝障害モデルラットに対し、ゼラチン加水分解物(gelatin hydrolysate: GH)の摂取が肝線維化抑制作用を示すことを見出した。本年度はメタボリックシンドロームや2型糖尿病モデルとして使用されるOLETF (Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty)ラットの病態発現に及ぼすGH摂取の影響を検討した。7週齢のOLETFラットを20%カゼイン(蛋白質)・5%脂肪含有飼料で維持する対照群、16%カゼイン・4%GH・5%脂肪含有飼料で維持するGH群、20%カゼイン・25%脂肪・5%コレステロール含有飼料で維持する高脂肪高コレステロール群、および16%カゼイン・4%GH・25%脂肪・5%コレステロール含有飼料で維持するGH高脂肪高コレステロール群の4群に分けた。それぞれの飼料で13週間飼育したのち、深麻酔により安楽死させ、血液と肝臓を採取した。解析の結果、GHの添加にかかわらず、高脂肪高コレステロール含有飼料で維持した2群では、肝臓への顕著な脂肪蓄積と線維化が確認された。OLETFラットは過食を示すことが特徴の1つであり、さらに25%脂肪・5%コレステロールという極端な食事組成を用いた結果、GHの効果が検証しきれなかった可能性を考えている。また、脂肪肝から脂肪性肝炎への進展にインスリン抵抗性が影響している可能性が示唆されている。そこでインスリン作用とGH摂取の関連を検討する目的で、ストレプトゾトシン投与による糖尿病モデルラットにGHを摂取させ、その病態に及ぼす影響を検討した。ストレプトゾトシン投与後からGH添加飼料を摂取させたところ、1週間後の血糖値がGH濃度に依存して低下することを見出した。しかしその作用機構に関しては、現在のところ明らかではなく、現在検討中である。初年度は、脂肪性肝疾患の病態進行に大きな影響を及ぼしている肝臓の線維化に着目して検討をおこなった。肝線維化の病態モデルとして広く使用されている四塩化炭素投与による慢性肝障害モデルラットに対する栄養成分の影響を検討したところ、ゼラチン加水分解物を摂取させることで、有意に肝線維化を抑制する可能性を見出した。本研究で用いたゼラチン加水分解物は、非代償性肝硬変患者の肝性脳症改善用に使用される経腸栄養製品に含有されている成分であり、肝疾患患者の血漿で増加している芳香族アミノ酸がゼラチンにはわずかしか含まれていないという特徴がある。さらに加水分解物ということで、ペプチドによる未知の効果も期待できる成分といえる。今年度の研究結果では、既に肝疾患患者の栄養管理における有効性が認知されている分岐鎖アミノ酸と比較して、ゼラチン加水分解物摂取で、より効果的な線維化抑制効果が認められた。さらに肝疾患患者の病態栄養学的問題の1つとされるエネルギー栄養不良に対する影響を検討する目的で、肝臓におけるグリコーゲン貯蔵量を検討したところ、対照群と比較して、分岐鎖アミノ酸摂取群と同様、ゼラチン加水分解物摂取群で有意な増加が認められた。今後の研究では、過栄養性肥満モデルラットの脂肪性肝疾患の発症に対するゼラチン加水分解物摂取の影響を検討する予定である。なお、これらの研究で用いたゼラチン加水分解物は、既に栄養製品の材料として使用されている成分であり、脂肪性肝疾患患者への応用も比較的容易と考えられるため、その実用性に関する意義は大きいと考えている。最終年度に至るまでの研究期間において、ゼラチン加水分解物(gelatin hydrolysate: GH)の摂取が四塩化炭素連続投与による慢性肝障害モデルラットの肝線維化を抑制すること、ならびにストレプトゾトシン投与による糖尿病モデルラットの血糖値上昇を抑制することを見出した。最終年度、まず活性成分を探索する目的で、GHのアミノ酸組成に準ずるアミノ酸混合物を調整し、糖尿病モデルラットの血糖値上昇に及ぼす影響をGHと比較検討した。しかしながらアミノ酸混合物の供与では、血糖値上昇抑制作用が認められなかったことから、GHの活性はペプチド成分に由来するものと考えられた。糖尿病モデルラットに対するGHの機能性について検討を続けたところ、血糖値同様、血漿中トリグリセリド、遊離脂肪酸、総コレステロールなどの脂質マーカーの上昇もGH摂取により抑制されることを見出した。また、ストレプトゾトシン投与後、GH添加飼料で1週間飼育したラットを1晩絶食し、経口糖負荷試験を実施した。

対照飼料で飼育したラットと比較して、GH摂取ラットは糖負荷90分後および120分後の血糖値が有意に低値を示した。さらに本試験中の血漿インスリン濃度を検討したところ、GH摂取ラットで高値を示した。そこで糖尿病モデルラットの膵臓に関する病理組織学的検討をおこなったところ、顕微鏡下1視野あたりのランゲルハンス島の数、面積ともにGH摂取ラットで高値を示すことを見出した。本研究期間において、過栄養性脂肪肝の発症をGH摂取が抑制するという結果を得るまでには至らなかった。しかしながらインスリン作用の低下は、メタボリックシンドロームの発症やその肝臓の表現型である脂肪肝の発症にも大きな影響を及ぼしている。すなわちGHには、メタボリックシンドロームや脂肪肝を抑制する機能性食材としての効果が期待できると考えられた。病態栄養学高脂肪、高コレステロール食を使用した動物実験系では明確な作用は検出できなかったが、糖尿病モデル動物において有効性を示唆するデータが得られたことは、機能性成分の同定および作用機構の解明に大きく進展する可能性が考えられる。過栄養性脂肪肝モデルを用いた検討には至らなかったが、脂肪肝の進行抑制作用が期待できる新規栄養成分として、ゼラチン加水分解物を見出せたことは非常に大きな進展と考えている。糖尿病モデルを利用して、活性成分の同定を試みる。すなわち加水分解により生じたペプチドに由来する機能なのか、構成アミノ酸による機能なのかを検討し、さらに活性本体の同定を進める。そして同定された成分を添加した飼料を用い、過栄養性脂肪肝の発症、進展への影響を検討する予定である。過食に起因する肥満を呈し、さらに長期間飼育によりインスリン抵抗性ならびに糖尿病を発症することが知られている病態モデルラットに対し、高脂肪および高コレステロール食を給餌することで、脂肪肝を誘発させる。この過栄養性脂肪肝の発症および進展に対するゼラチン加水分解物摂取の影響を検討する予定である。今年度当初に実施した動物実験において、予想していた効果が認められなかったことから、その後に計画していた実験を変更した結果、次年度使用金が生じた。本年度、新たに見出した糖代謝異常に対する作用機構の解明を継続して進めるとともに、これらの結果を考慮した実験条件を再構築し、当初の計画と同様の実験を遂行する。該当なし
受精に関与するヒト精子・卵細胞表面分子の解析

先体反応終了後にヒト精子上に存在するCD46の受精分子としての機能を明らかにした。CD46の各short consensus sequence(SCR)に対する抗体による受精阻害実験よりSCR3に受精レセプターとしての働きが判明した。またこの部位は卵結合レセプターではなく細胞融合に関与することが判明した。麻疹ウイルスのfusion receptorとしてのCD46の作用部位はSCR2であり、補体制御作用はSCR1に存在することより、SCR3はCD46の新しい作用部位であることが考えられる。ついで精子の受精レセプターであるCD46の異常が不妊と関連するかについて検討を行った。まず受精に関与すると考えられる機能的な先体反応(functional acrosome reaction)と細胞障害による先体損傷(acrosomal damage)を鑑別する方法として、レクチンと抗CD46抗体による精子二重染色法を確立した。この測定方法によりCD46の発現の有無による先体反応の機能的な鑑別が可能となった。アルブミン存在下のヒト精子では機能的な先体反応は先体損傷に比べて時間経過とともに急速に増加していくことが判明した。また不妊カップルの男性では健常男性に比較して先体損傷率が高く、この現象は従来のレクチン染色では検出できなかった。さらに体外受精症例で通常の精液検査では正常であったにもかかわらず受精が見られなかった症例においては、先体損傷率が有意に高率であることが示された。ヒト精子と透明帯除去ハムスター卵を用いた受精系(ハムスターテスト)にCD46の各short consensus repeat(SCR)に対する抗体を作用させた。その結果、SCR3を中心に受精に関与することが判明した。またこの部位は精子と卵の結合ではなく、細胞融合に関与することも判明した。この部位はCD46の麻疹ウイルスのfusion receptorとしての働きをつかさどるものであり、今回の結果は合目的であると考えられる。次いで精子CD46の精製を抗CD46抗体を用いたアフィニティーカラムで行った。その結果、血管内皮細胞などに発現する43KdのCD46とは違い、35KdのCD蛋白を分離した。この結果は従来の報告と一致するものである。分離したCD46をFITCでラベルし、ハムスター卵ならびにヒト卵表面のCD46結合部位について共焦点レーザー顕微鏡で検討予定である。現在さらにCD46抗体とFITC-PSAを用いた二重染色による精子先体機能評価を行っている。FITC-PSA染色では精子先体外膜の欠如は同定できるが、受精現象につながる生理的な反応であるかについての評価はできない。この問題を解決すべく抗CD46抗体による先体反応の評価法を開発し、現在その有用性を体外受精症例を用いて検討中である。CD46の各short consensus sequcnce(SCR)に対する抗体による受精阻害尖験よりSCR3に受精レセプターとしての働きが判明した。さらに体外受精症例で通営の精液検査では正常であったにもかかわらず受精が見られなかった症例においては、先体損傷率が有意に高率であることが示された。