hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ブール関数の多項式表現を用いた回路計算量の解析

計算量理論Williams2010論文の結果を次のブレークスルーへと深化・拡張させるという研究コミュニティにおいてその重要性が明確に認識されている課題に対して,一定の意義をもつような結果をえることをめざしたい.Exponential Time Hypothesisの領域計算量における類似予想とその周辺の解析については,平成26年度に得ることに成功した深さ優先探索に関する解析結果をふまえて,グラフに関する別の問題に対しても解析を進める.Williams2010論文結果に対して,通信計算量との関連の解明が進み,また,領域計算量との関連について具体的結果を得つつ解明が進んでおり,研究はおおむね順調にすすんでいると言える.Williams2010論文の結果・手法に対する発展・深化・展開に取り組んでいる研究者は多い.今後,アプローチとしてオリジナリティがあると思われる研究を特に重視して進めていきたい.平成25年度の研究として上で説明した通信計算量および領域計算量との関連解析はかなりオリジナルな切り口だと思われるので,その意味でもこれらについてはさらに研究を深化させ展開させていきたい.
礁性三葉虫における形態型のニッチと機能的特性

該当年度においては,各形態型の機能的特性を推定する際に重要となる呼吸機能についての検討をおこなった。三葉虫が呼吸を行っていた場所については,ほぼ一世紀にわたり"外肢=鰓"仮説が通説となっているが,検討は全く行われてきていない。そこで,現生の海性節足動物で系統的に遠いカニとカブトガニを用い,鰓構造の形態的共通項を探り出し,それをもとに三葉虫の"外肢=鰓"仮説を検討した。その結果この仮説は誤りであることが明らかとなった。さらに,外肢の上方に位置する部位に血脈状構造を見出した。節足動物は開放血管系であるが,鰓には血脈が存在することがよく知られているため,この領域が呼吸部位である可能性が高いと踏まえ,現生の海性節足動物における様々な呼吸器官の特徴や,呼吸領域の循環系と消化系や筋肉系との構造的関係性を比較解剖学的に求めた。その結果を三葉虫に血脈状構造とその周辺との構造関係と比較すると,矛盾のない対応関係が認められることが明らかとなり,呼吸領域の特定に成功した。前後半それぞれを論文として国際誌に投稿しており,それぞれ受理と査読中。また,礁において特定のニッチパターンを持たない種が,隠棲的な生態であったことを示す埋積状態を新たに見出した。近縁種は特定の深度・底質・緯度分布を示さない特性を持つことが知られており,複眼構造は三葉虫のなかでも原始的な部類であることと併せて,夜行性である可能性が高いと解釈することができた。この結果は学会での口頭発表を行った。礁性三葉虫群集の生息場所を礁内に散点的に密集する化石個体群の構成種と礁における空間的位置との対応関係を検討する目的のもと、スウェーデン中部ダーラナ地方に散在する直径約1Kmのドーム状の礁性石灰岩のボーダ石灰岩にて夏期野外調査を行った.野外調査では、ボーダ石灰岩中に認められる準現地性の化石密集パッチ26箇所より計4859個体を採集した.その結果、ドーム状の岩体内にて同心円状の分布を示す形態種群、広範囲に分布する形態種群、特定の岩相に卓越する形態種群が存在する傾向を見出した.同心円状の分布を示す形態種群については、過去の機能形態学的研究にて定住性との解釈が導かれており、今回の結果はそれに同調的な傾向を示す世界初の結果になるであろう.現在、室内作業はほぼ終了し、野外調査の結果をもとにした統計学的解析を行っている.また、得られた多数の標本について種同定を行ってきた結果、既存の種分類に問題を見出すこととなり、それに関する論文準備、投稿を行い、うち一編が出版された.礁形成の終焉時に相当する層準においても、特定の化石三葉虫種群を二群見出した.化石密集パッチに見出される高多様性ではあるが礁固有の種群とは異なり、これらの種群は低い種多様性で形態的にも異質であり、さらに礁以外の底質環境下からも報告がある種が多数存在することが明らかとなった.礁形成が終焉へと向かう際には、比較的短時間での環境の変化が予想されうるが、このような環境下に底質への依存度が低い種群が多く適応していたことを意味すると考えられる.現在、この点についての議論とともに、礁形成の終焉時における種群の報告を兼ねた論文を作成中である.また、礁形成の終焉直後の層準から時代決定に有効な微化石を発見し、礁形成終焉の時代を特定する論文を出版した.該当年度においては,形態上に認められる機能的特性を把握する目的として,礁性三葉虫種群のの典型的な形態タイプのイレニモルフ種群の一種を検討対象とし,その呼吸領域の相対成長様式を検討した.三葉虫の頭部や尾部といった各体区分や、それらの体区分間において,ある生理的器官の成長率とその相違関係を定量的に求めた.また,三葉虫類と比較的近縁とされる現生力ブトガニ類についても,呼吸領域である鰓の総面積,鰓葉枚数,平均面積/1鰓葉と乾燥体重との相対成長様式を明らかにし,現生生物との比較検討対象とする準備を整えた.この結果については,過去に行われたカニ類での同様の研究と比較することで,現生の海生節足動物の呼吸領域に関する相対成長様式の一般化を行えたため,論文投稿を行った.イレニモルフ種は,その外骨格パーツがすべて連結した完全体の状態で産出することは極めて稀である.今回検討対象としたStenopareia oviformisについては,完全体21個体,体区分一部欠損5個体,保存良好の頭部および尾部のみ各40強の個体数を検討する機会を得る事ができ,生物体全体における形態の変化傾向を詳細に捉えられることが初めて可能となった.検討個体のサイズ範囲は,長さが3倍強の範囲をもつ.その結果,頭部中葉部の後端の幅に対して,尾部の呼吸領域の表面積は等成長,神経,筋肉,消化系が収まる尾部中葉の体積換算は劣成長,肺静脈に相当するダビュラーの体積は優成長となる結果を得た.この結果は,尾部の体区分においては,このイレニモルフ種の活発性が成長とともに減少傾向にあることを示唆するに至った.該当年度においては,各形態型の機能的特性を推定する際に重要となる呼吸機能についての検討をおこなった。

そこで,現生の海性節足動物で系統的に遠いカニとカブトガニを用い,鰓構造の形態的共通項を探り出し,それをもとに三葉虫の"外肢=鰓"仮説を検討した。その結果この仮説は誤りであることが明らかとなった。さらに,外肢の上方に位置する部位に血脈状構造を見出した。節足動物は開放血管系であるが,鰓には血脈が存在することがよく知られているため,この領域が呼吸部位である可能性が高いと踏まえ,現生の海性節足動物における様々な呼吸器官の特徴や,呼吸領域の循環系と消化系や筋肉系との構造的関係性を比較解剖学的に求めた。その結果を三葉虫に血脈状構造とその周辺との構造関係と比較すると,矛盾のない対応関係が認められることが明らかとなり,呼吸領域の特定に成功した。前後半それぞれを論文として国際誌に投稿しており,それぞれ受理と査読中。また,礁において特定のニッチパターンを持たない種が,隠棲的な生態であったことを示す埋積状態を新たに見出した。近縁種は特定の深度・底質・緯度分布を示さない特性を持つことが知られており,複眼構造は三葉虫のなかでも原始的な部類であることと併せて,夜行性である可能性が高いと解釈することができた。この結果は学会での口頭発表を行った。
ユーゴスラヴィア各民族語における標準語の成立と民族問題の研究

ユーゴスラヴイアにおける各民族語の標準語の成立と民族問題の研究を課題とする本研究は別添の研究成果報告書に示されているように次のような問題についての具体的な成果をもたらした。(1)セルビア・クロアチア語の標準語成立に国内・国外の政治的状況が密接にかかわっていること。とくにトルコとオーストリアの間の戦争の結果、セルビア人の移住が促進され、その結果、ハブスブルク帝国内のヴォエヴォディナがセルビア文語成立の揺籃となったことが明らかにされ、また、オーストリアによるセルビア人同化政策に反対するセルビア人のロシア領ウクライナへの移住の結果、ロシア教会スラヴ語およびロシア文語の影響が強まったこと、そして次期にはじまる真の意味でのセルビア文語の成立は、このロシア教会スラヴ語の影響を排除し、民衆の言葉、セルビアロ語との接近を通じて実現されることが明らかになった。今後に残された課題は、このセルビア文語の成立と、他方でのスロヴェニア語,ヌケドニア語の標準語成立との関連をより明確な形で明かにすることである。(2)ユーゴスラヴィア内では民族と言語の名称は必らずしも一致していない。広い意味でのクロアチア語圏に属しながら、ヘルツェゴヴィナおよびボスニア地方は特殊な政治・民族・宗教上の地位を占めている。このうち、ボスニア地方を中心に中世の教会、異端の運動に光をあて、のちにこの地方が特殊な民族地域として成立する起因が解明された。(3)ユーゴスラヴィアの南部は、北半分,中央部に比べて民族・言語の上で大きな特殊性を持つ。アルバニア人,ルーマニマ人の存在、マケドニア語とセルビア語の間の距離などがそれに含まれる。これらの特色をもたらした原因をスラヴ人の移住における二つの流れと関連して明らかにし得た。
膵癌、肝癌特異的分子マーカーの同定とその抗体

膵癌は自覚症状が乏しく早期発見が困難で、5年後の生存率は約5%と最下位である。膵癌における診断マーカーにCA19-9等が使用されているが、特異性が低く早期の検出も困難なため、新規マーカーが求められている。我々は、ヒト多能性細胞(iPS細胞やES細胞)から分化させた膵前駆体細胞が膵癌細胞と似ていることを利用し、新規の細胞表面マーカーGCTM-5を発見した。しかし、GCTM-5は一部の肝癌細胞も検出してしまうため、GCTM-5抗原複合体に含まれる分子群の解析によるより特的な分子の同定と新たなマーカー抗体の産生に挑戦した。その結果、膵癌・肝癌に特的な分子群の同定と新規抗体を作製出来た。平成25年度には、GCTM-5抗原複合体に含まれる分子群の同定を試みた。1膵癌GCTM-5抗原複合体の分子群の同定GCTM-5抗原陽性細胞と陰性細胞が混在する膵癌細胞株を複数見出し、陽性細胞のみをFACSで精製し、アフィニティーカラムによりGCTM-5抗原複合体を精製したところ800kDの巨大な複合体であることが分かった。このプロテオミクス解析を試みたが、計画に反しシグナルを得ることが出来なかった。このため、急遽計画を変更し、糖鎖アレイによる糖鎖解析、GCTM-5陽性細胞と陰性細胞の網羅的遺伝子発現解析を行った。その結果、GCTM-5抗原には、シアリル化された糖鎖や炭水化物が含まれていること、GCTM-5陽性細胞では約80の細胞表面に存在するタンパク質をコードする遺伝子が特異的に発現していることを見出した。2肝癌GCTM-5抗原複合体の分子群の同定様々な肝癌由来の細胞株を入手し、GCTM-5発現の検討を行った。その結果、ほとんど全ての細胞株でGCTM-5の発現が確認できなかった。しかし、生体から摘出した肝臓の細胞や、ヒトiPS細胞から肝細胞を誘導した細胞ではGCTM-5陽性細胞が検出できた。このため、これらの細胞を用いて解析を開始した。また、胆管由来の癌細胞株の入手も開始した。平成25年度は、膵癌特異的マーカー分子探索のため、GCTM-5陽性の膵癌細胞株を複数同定し、GCTM-5複合体のプロテオミクス解析と糖鎖アレイ解析を行ったが、十分なマーカー候補分子は得られなかった。またGCTM-5陽性細胞と陰性細胞間での網羅的遺伝子配発現析も行い、GCTM-5陽性細胞の表面に特異的な候補分子群を得たが、その数が多く、全てを検査するのは困難だった。この候補分子群から膵癌に特異的な分子を絞り込むため、GCTM-5陽性肝癌細胞での発現を調べることとした。様々な肝癌細胞株を入手・検査したが陽性株は得られず、ヒトiPS細胞から誘導した肝細胞についてもGCTM-5陽性細胞の出現が一定しなかった。平成26年度は、解析に十分な肝癌細胞を安定して得るため、胆管癌細胞株を世界中から入手し検討したところ、複数のGCTM-5陽性株を同定できた。これにより遺伝子発現解析を開始できた。一方で、GCTM-5抗体の膵癌検査能を確認するため、CA19-9抗体との比較も行った。その結果、GCTM-5とCA19-9抗体は、それぞれの精製抗原複合体を相互に認識することが分かった。しかし免疫染色では、ほぼ全てのCA19-9陽性細胞がGCTM-5陽性であるのに対し、GCTM-5陽性細胞にはCA19-9陰性の細胞があることが分かった。このことは、GCTM-5がCA19-9よりも多くの、あるいは早期の膵癌細胞種を認識できる可能性を示唆していた。また、新規マーカー候補分子の解析・同定を待たずに新規バイオマーカー抗体を得るため、精製したGCTM-5複合体をそのままマウスに免疫し、モノクローナル抗体作製を試みた。得られたハイブリドーマについては順次、GCTM-5複合体と細胞株を用いたスクリーンングを行い、これまでに3種のGCTM-5陽性膵および肝癌細胞株を認識する抗体を得ることに成功した。幹細胞生物学膵癌では、GCTM-5抗原複合体に含まれる分子を直接同定することは出来なかったものの、遺伝子発現や糖鎖アレイといった他の方法で候補分子群を特定できた。肝癌ではGCTM-5陽性細胞を得ることは出来なかったので解析が遅れたが、iPS細胞由来肝細胞等、他の細胞源を得て研究を進めることが可能となった。精製したGCTM-5抗原複合体の糖鎖ープロテオミクス解析を行う。同時に、本年度で既に得られた候補分子については、膵癌・肝癌細胞株、細胞アレイを用いて、膵癌特異的分子のスクリーニングを行う。

また必要に応じて得られた分子に対するモノクローナル抗体の作製も行い、膵癌特異的バイオーマーカーの単離・同定を目指す。GCTM-5抗原複合体を精製したところ800kDの巨大な複合体であることが分かった。このプロテオミクス解析を試みたが、計画に反しシグナルを得ることが出来なかった。このため、急遽計画を変更し、糖鎖アレイによる糖鎖解析、GCTM-5陽性細胞と陰性細胞の網羅的遺伝子発現解析を行った。また、様々な肝癌由来の細胞株でGCTM-5発現の検討を行ったが、ほとんど全ての細胞株でGCTM-5の発現が確認できなかった。しかし、生体から摘出した肝臓の細胞や、ヒトiPS細胞から肝細胞を誘導した細胞ではGCTM-5陽性細胞が検出できた。この陽性細胞発見の遅延により解析が遅れた。精製したGCTM-5抗原複合体の糖鎖ープロテオミクス解析を行う。同時に、本年度で既に得られた候補分子については、膵癌・肝癌細胞株、細胞アレイを用いて、膵癌特異的分子のスクリーニングを行う。具体的には以下によりバイオマーカーの同定を行う。1.精製GCTM-5抗原複合体の糖鎖ータンパク質解析。2.膵癌・肝癌細胞株によるスクリーニング。3.細胞アレイによるスクリーニング。4.病理サンプルによる陽性細胞の特徴づけ。
独自の遠心力細胞組織化誘導技術を用いた心筋パッチ・軟骨パッチ・角膜パッチ等の開発

1.ラット肋軟骨細胞を用いた中空糸/オルガノイド培養により軟骨細胞の組織化に関する検討を行った。組織学的評価の結果、培養経過とともに中空糸内部での細胞外マトリックスの占める割合が増大し、生体軟骨類似の組織様構造体の形成が確認された。さらに細胞外マトリックス成分に関してmRNAの発現解析を行った結果、関節軟骨が発現するII型コラーゲンとアグリカンの良好な発現が認められた。一方、線維軟骨が発現するI型コラーゲンも生体軟骨中に比べ発現が増大しており、この発現を抑制する工夫が必要であることが示された。2.ヒト臨床を想定した基礎的検討として、継代中のヒト関節軟骨細胞、ならびに軟骨細胞への分化能を有するといわれるヒト間葉系幹細胞に対し、中空糸/オルガノイド培養を用いた検討を行った。まずヒト関節軟骨細胞を用いた検討では脱分化が生じている培養0日目と比較してII型コラーゲンのmRNA発現を培養14日目まで高いレベルで発現可能であり、オルガノイド培養による軟骨細胞の再分化の可能性が示された。一方、ヒト間葉系幹細胞を用いた検討では、培養28日目よりII型コラーゲンの発現が見られるようになり、さらに長期的に培養を行うことにより軟骨細胞への分化誘導の可能性が示された。3.上記検討を基に、1.0cm×0.5cm程度の軟骨細胞オルガノイドシートの作製に取り組んだ。厚さの制御可能なスペーサーに2枚の多孔平膜を貼り合わせた軟骨オルガノイド用デバイスを作製し、遠心力により軟骨細胞を充填し、培養を行った。その結果、軟骨細胞はデバイス内でシート状のオルガノイドを形成した。形成されたオルガノイドシートはピンセットにより容易に回収可能であった。今回は小スケールでのオルガノイドシートの作製であったが、本手法は今後スケールアップを行うことにより欠損軟骨部位への移植が可能な軟骨パッチとしての利用が期待される。本年度研究成果概要を以下に示す。1.損傷軟骨修復用の移植用軟骨組織片(軟骨パッチ)開発の基礎検討として,軟骨細胞の組織化に関する基礎検討を行った。培養担体としてポリウレタン発泡体(PUF)を用いて検討を行った。その結果,疎水的表面特性を有するPUF(表面接触角約80度)を用いた場合,軟骨細胞はPUF表面に付着・伸展し,細胞は活発な増殖活性を示した。一方,親水的表面特性を有するPUF(表面接触角約50度)を用いた場合,軟骨細胞のPUF表面での細胞形態は球形となり,その結果細胞増殖活性は抑制された。さらに培養を継続させると軟骨細胞は直径150μm程の球状細胞組織体(スフェロイド)を形成することが示された。このように培養担体表面の濡れ特性を変化させることにより軟骨細胞の細胞形態の変化が見られ,その結果,細胞の増殖,機能発現を制御できる可能性が示された。2.PUF孔内において形成された軟骨細胞スフェロイドについて,各種染色法を用いて内部の組織化学的評価を行った。その結果,軟骨細胞スフェロイド内部において,生体軟骨組織中で観察されるコラーゲンやプロテオグリカンなどの細胞外マトリックスの分泌が確認された。すなわち,軟骨細胞スフェロイドは生体軟骨と同様の細胞外マトリックス分泌能を有している可能性が示された。以上の結果,移植用軟骨パッチ作製のための基礎的知見を得ることができ,軟骨細胞による組織体形成がパッチの作製において有望であることが示された。現在これらの知見を基にシート形状の軟骨細胞組織体の形成誘導に取り組んでいる。
ユズ種子オイルによるアトピー性皮膚炎症状緩和塗布剤の開発

培養細胞を用いた機能性試験では,P815細胞へのA23187刺激に伴うヒスタミン放出試験の結果,未精製オイルに顕著なヒスタミン放出阻害効果が認められた.Nc/Ngaマウスを用いたアトピー性皮膚炎モデルで検証した結果,皮膚スコア,耳介の腫脹,血清ヒスタミン量は,未精製,精製ともに塗布による抑制効果が認められた.ヒト介入試験では精製オイルの塗布でアトピー性皮膚炎患者7症例中3症例,老人性乾皮症患者16例の全症例が奏効し,有害事象は認められなかった.以上の結果より,ユズ種子オイルの塗布はアトピー性皮膚炎様症状に対して症状緩和効果を有していることが検証された.本研究の目的は,ユズ種子オイルを用いたアトピー性皮膚炎症状緩和塗布剤の開発のため,1培養細胞を用いた機能性試験を実施し,マウス肥満細胞(P-815細胞)のヒスタミン放出の検証.2Nc/Ngaマウスを用いたアトピー性皮膚炎(AD)モデルによるユズ種子オイル塗布剤の症状緩和効果の検証.3ユズ種子オイルをアトピー性皮膚炎患者および老人性乾皮症患者に塗布し,症状緩和効果および,有害事象の検証を行った.1にいては、P815細胞(マウス肥満細胞株)2×106 cells/200μlに対し2.5μlのユズ種子オイルを添加し16時間共培養を行った後,終濃度10 mMのA23187を添加し,15分間のヒスタミン放出量をELISA法で測定した.その結果,16hでは,対照群10.58±0.299nM,未精製0.02±0.172 nM,精製11.4±0.29 nMで,未精製に顕著なヒスタミン放出阻害効果があった.2に対しては,Nc/Ngaマウスに100mgのダニ抗原を2週間に6回塗布しADを発症させた.惹起と同時にオイルを4週間塗布した.ユズ種子オイルは未精製(以下、未精製)と,蒸留した精製(以下、精製)の2種類を用い,対照群にはオリーブオイルを塗布した.結果,皮膚スコア,組織化学的解析,耳介の腫脹,血清ヒスタミン量は,未精製,精製ともに抑制効果が認められたが,精製の効果が高い傾向にあった.3に対しては,アトピー性皮膚炎患者7名、老人性乾皮症患者16名の症状の出現している部位にユズ種子オイルを1日2回、28日間塗布した.結果,奏効例が確認でき、有害事象は認められなかった。これらの結果より,ユズ種子オイルは,かゆみの原因となるヒスタミンの放出阻害,つまりアトピー性皮膚炎の患部のかゆみを軽減する可能性が示唆された.培養細胞を用いた機能性試験では,P815細胞へのA23187刺激に伴うヒスタミン放出試験の結果,未精製オイルに顕著なヒスタミン放出阻害効果が認められた.Nc/Ngaマウスを用いたアトピー性皮膚炎モデルで検証した結果,皮膚スコア,耳介の腫脹,血清ヒスタミン量は,未精製,精製ともに塗布による抑制効果が認められた.ヒト介入試験では精製オイルの塗布でアトピー性皮膚炎患者7症例中3症例,老人性乾皮症患者16例の全症例が奏効し,有害事象は認められなかった.以上の結果より,ユズ種子オイルの塗布はアトピー性皮膚炎様症状に対して症状緩和効果を有していることが検証された.アトピー性皮膚炎は、痒みを伴う湿疹性変化を主な病変とし、軽快と増悪を繰り返す皮膚の炎症性疾患である。現段階で、アトピー性皮膚炎を完治させる治療方法は無い。アトピー性皮膚炎の主要な発症機序としては、皮膚のバリア機能障害と免疫機構の異常の二つが挙げられる。バリア機能障害により水分保持能が低下し、外部からの刺激、たとえばアレルゲンや細菌が侵入しやすい状態になっており、皮膚に炎症が起こりやすくなっている。また、免疫機構の異常としては、ヘルパーT細胞のアンバランス、つまり急性期ではTh1/Th2の比が上昇し、慢性期では低下することが原因と考えられている。治療の基本は、痒みのコントロールが中心となっている。皮膚炎を抑えるための局所療法としては、抗ヒスタミン軟膏、ステロイド軟膏、免疫抑制効果を有するタクロリムス軟膏の塗布が行われているが、どの薬剤にも副作用があるため、長期間の使用は難しい。他方、ユズは日本人が千年以上の食経験を有する素材であることに加え、我々の安全性試験からもユズ種子オイルの長期使用が可能であると考えられる。また、その効果は、マウス肥満細胞からのヒスタミン放出阻害(痒みの軽減の可能性)、正常皮膚線維芽細胞の増殖促進(病巣の再生促進の可能性)、活性酸素消去能(炎症の軽減の可能性)と多岐にわたっており、その結果、他種類の塗布剤の併用と同等以上の効果を発揮する可能性がある。本研究の目標は、アトピー性皮膚炎モデルマウスを用いて、ユズ種子オイルの塗布によるアトピー性皮膚炎に対する効果を検証し、ヒト介入試験を行うことである。そして我々の最終目的は、ユズ種子オイルを用いたアトピー性皮膚炎症状緩和塗布剤の開発である。アトピー性皮膚炎モデルマウスを用い、患部に未精製と蒸留精製したユズ種子オイルを塗布し、その効果の検証を行った。Nc/Ngaマウスにダニ抗原軟膏を背部及び耳介に塗布し、アトピー性皮膚炎モデルマウスを作製した。そのマウスに、ダニ軟膏による惹起と同時に、試験標品塗布群、無塗布群を各n=5で設定し、経時的に観察を行った。試験期間は、試験標品塗布後28日間とした。

効果は、皮膚スコア、患部腫脹、血清抗原特異的IgE量、患部のヒスタミン量など多角的に評価を行った。その結果、試験終了時に、有意にアトピー性皮膚炎症状の緩和効果が確認された。ネガティブコントロールのオリーブオイル塗布では、患部の明らかな肥厚、痒掻傷からの出血が認められた。それに対し、ユズ種子オイルの未精製群ではわずかな肥厚、出血が認められたが、明らかに症状は軽減していた。最も効果があったのは精製群で、わずかな肥厚だけで、出血は認められなかった。皮膚スコア、耳介厚、血清総IgE量、耳介ヒスタミン量とも、ユズ種子オイル群が有意に良好な結果であった。アトピー性皮膚炎モデルマウスに対してユズ種子オイルの塗布が効果的であった結果を踏まえて、ヒト介入試験に移行した。平成24年11月20日に医学部倫理委員会で承認され、臨床試験を開始した。オイル塗布前後に本研究費で購入したカメラで写真撮影を行い、皮膚状態をスコア化し評価をしている。また、ストレス評価をGHQ28で、QOL評価をskindex-16で行っている。細胞試験、動物実験により、ユズ種子オイルのアトピー性皮膚炎症状緩和効果が検証されたため、次にヒト皮膚での効果の検証を行う。ヒト皮膚での臨床試験は、すでに倫理委員会での承認を得て、現在数名に塗布を開始している。今後は、目標件数30名をめざし、介入試験を継続する。アトピー性皮膚炎に加え、同じヒスタミンで掻痒が引き起こされる老人性乾皮症も対象に加える。現在実施中のヒト介入試験では、患部の症状の変化に加え、患者のストレスに対する効果も検証する。アトピー症状の増悪には患者の社会的ストレスが要因の一つとなることが知られている。また、アトピー症状が増悪する事が更なるストレスとなるため、ストレスの観点から悪循環を繰り返す。動物実験では症状の評価を客観的に評価する事ができる半面、精神面の評価を行うことは難しい。そこで、ヒトで臨床症状に加え精神面に及ぼす効果を併せて検証する。ユズ種子オイルを患部に朝・夕の1日2回、4週間塗布してもらい、臨床評価は皮膚症状の変化と被験者の試験施行前後の写真撮影で行い、皮膚の状態をスコア化し評価を行う。精神面の評価は、GHQ28とskindex-16で行うとともに、有害事象の有無の検証を施行する。ヒト介入試験で副作用が無い事を確認後、次段階のヒト介入試験を計画している。次段階では、患者から皮膚サンプルや血液サンプルを採取し、臨床、精神的な両領域で、客観的評価を行う。臨床面の評価にはサイトカイン量やIgE量、病巣組織像を指標に、ストレスにはアンケートに加え血中コルチコイド量を指標として用いる計画である。昨年度得られたマウスの血液サンプルを用い、ヒトでの評価方法の確立を行う。ヒト介入試験で被験者に使用していただくための、ユズ種子オイルを購入する必要がある。皮膚炎患部にはブドウ球菌など雑菌が繁殖している。使用時に不潔にならないように、可能な限り小さな個包装とし、かつ被験者が使用しやすい小瓶での供給を計画している。ユズ種子オイル準備のための経費として10万円を予定している。次段階のヒト介入試験を行うための準備にも経費を要する。ヒトでのサンプルで評価を行うための条件付けをマウスのサンプルを用いて行う計画である。マウスアトピー性皮膚炎発症時の血液サンプル及び病巣組織は、昨年度のマウス実験の際に採取済みである。血液サンプルは-80°Cで組織サンプルはホルマリン固定を施し保存中で、本年度の試験に用いる事が出来る。
心因性発熱の治療法の確立に向けた基礎研究

心因性発熱に有効な薬物療法を確立することと、その奏効機序を明らかにするために以下の実験を行なった。(1)ウイスターラットに1日1時間の社会的敗北ストレスを21回、繰り返し加えると、ストレスに暴露しなくても、ストレスを加えていた時間帯の腹腔内温(Tc)が、ストレスを加えていないラットのTcより0.5°C高くなったが、選択的セロトニン再取り込み阻害訳であるフルボキサミンを連続投与すると抑制された。(2)急性ストレス性高体温はジアゼパムの単回投与により抑制される。そこでFosの発現が、ストレス性高体温時に上昇し、ジアゼパムによって抑制される脳内部位を調べ、感染症による発熱との違いについて検討した。平成23年度は、ラットを用いて、(1)繰り返しストレスによって慢性高体温が生じるか、(2)フルボキサミンの連続投与によって、繰り返しストレスによる慢性高体温が抑制されるか、検討した。具体的には、体温測定用発信器を体内に埋め込んだ雄ウイスターラット(200-250g)を、400-500gの雄ロングエバンスラットのケージに午前10:30から1時間(ロングエバンスラットから攻撃を受けたら、ついたてで仕切る)入れ、その後、ホームケージに戻すという社会的敗北ストレスをウイスターラットに加えた。このようなストレス負荷を6日連続して行い、1日休む、を4回繰り返し、その間の体温を連続測定した。第3週目から第4週目の14日間は、連日、午前9:30にフルボキサミン(選択的セロトニン再取り込み阻害薬)10mg/kg、もしくは生理食塩水を腹腔内投与した。(1)はじめて社会的敗北ストレスに暴露されたラットは、午前11時から午後1時にかけて、コントロールラットより高い体温を示した。体温上昇は11:30頃に最も顕著で、コントロールラットより約2°C体温が上昇した。社会的敗北ストレスの負荷を繰り返してゆくと、ストレス群の第21日目、第28日目(ストレスの負荷されていない日)の体温は、午前10:00-12:00の時間帯でコントロール群より有意に高い(約0.5°C)値を示した。(2)第21日目、第28日目の11時前後の体温を比較すると、生理食塩水を投与してストレスを負荷しなかった群では、午前9時の体温と変わりなかったが、生理食塩水を投与したストレス群では午前9時に比べ0.5°C上昇した。フルボキサミン投与したストレス群では、体温上昇の程度は軽度であった。このことから繰り返しストレスによって生じるストレス性高体温に対して、フルボキサミンの連続投与は有望な薬物療法と考えられた。平成25年度は、(実験1,2)ラットを用いて(1)繰り返しストレスが体温、活動量、体重にどのような影響を及ぼすか、(2)これらのストレス性変化がフルボキサミン(FLV,選択的セロトニン再取り込み阻害薬)の連続投与によって改善するかについて、平成24年度より引き続き検討し、結果の再現性を確認した。また、繰り返しストレス負荷期間終了後に強制遊泳試験を行い、抑うつ行動に及ぼす効果についても検討を開始した。さらに(実験3)急性ストレス負荷のよって生じる体温調節に関与する神経核でのFos発現が、ジアゼパム投与によってどのように変化するかに関する研究も開始した。結果:雄ウイスターラットを、午前10:30より雄ロングエバンスラットのケージの中に1時間入れるというストレス負荷を6日連続して行い、1日休む、ということを4回繰り返した。第3週目から第4週目の14日間は、連日、午前9:30にFLV 10mg/kg、もしくは生理食塩水(生食)を腹腔内投与し、(1)生食/ストレス群、(2)FLV/ストレス群(3)、生食/シャムストレス群、(2)FLV/シャムストレス群の4群間で、体温、活動量、体重を比較した。第21日目、第28日目(ストレスの負荷されていない日)の午前10:00-12:00の生食/ストレス群の体温は、生食/シャムストレス群、FLV/シャムストレス群および、FLV/ストレス群より高かった。この間の活動量は4群間で差はなかった。28日間の生食/ストレス群の体重増加は生食/シャムストレス群に比べて有意に低かったが、FLV/ストレス群では、体重増加抑制の程度はわずかであった。昨年度、このような結果を得たが、この結果は本年度も再現できた。(実験3)ストレスによって発現した視床下部背内側核のFosは、ジアゼパムにより抑制されることを見いだした。平成24年度は、ラットを用いて(1)繰り返し

ストレスが体温、活動量、体重にどのような影響を及ぼすか、(2)これらのストレス性変化がフルボキサミン(FLV,選択的セロトニン再取り込み阻害薬)の連続投与によって改善するか検討した。具体的には、体温測定用の発信器を体内に埋め込んだ雄ウイスターラット(200-250g)を、400-500gの雄ロングエバンスラットのケージに午前10:30から1時間(ロングエバンスラットから攻撃を受けたら、ついたてで仕切る)入れ、その後、ホームケージに戻すという社会的敗北ストレス、もしくは自分のケージに再度入れるというシャムストレスをウイスターラットに加えた。このようなストレス負荷を6日連続して行い、1日休むということを4回繰り返し、その間の体温と活動量を連続的に、また体重を毎週測定した。第3週目から第4週目の14日間は、連日、午前9:30にFLV 10mg/kg、もしくは生理食塩水(生食)を腹腔内投与し、(1)生食/ストレス群、(2)FLV/ストレス群、(3)生食/シャムストレス群、(2)FLV/シャムストレス群の4群間で、体温、活動量、体重を比較した。第21日目、第28日目(ストレスの負荷されていない日)の午前10:00-12:00の生食/ストレス群の体温は、生食/シャムストレス群、FLV/シャムストレス群および、FLV/ストレス群より高かった。この間の活動量は4群間で差はなかった。28日間の生食/シャムストレス群の体重増加量に比べて生食/ストレス群の増加量は有意に低く、FLV/ストレス群ではその中間であった。このことから繰り返しストレスによって生じるストレス性高体温と体重減少に対して、FLV連続投与は改善作用を持つことが示唆された。ストレス性体温上昇反応(stress-induced hyperthermia, SIH)に関与する脳内部位を明らかにするために、ラットを用いてSIH時に活性化する脳領域を調べた。具体的には、雄ウイスターラットを以下の四群に分けて腹腔内温を観察し、またストレス負荷終了30分後の脳切片を作成しFos(神経活動のマーカー)染色を行なった。(1)ジアゼパム(4 mg/kg, i.p.)投与1時間後にsocial defeat stress (SDS)(1時間)を加える。(2) vehicle投与1時間後にSDSを加える。(3)ジアゼパム投与1時間後にsham stress(ラットを持ち上げ、自分のケージに戻す)を加える。(4) vehicle投与1時間後にsham stressを加える。ウイスターラットの体温はSDS後、約2°C上昇したが、ジアゼパムの前処置によって有意に抑制された。Fosの発現がストレスによって増加し、ジアゼパムによって抑制された脳領域は大脳皮質(前頭前野、感覚および運動皮質)、中隔核、内側扁桃核、視床下部(内側および外側視索前野、室傍核小細胞性領域、背内側核、脳弓周囲核、結節乳頭核)、視床(連合核、正中核群、髄板内核)、内側および背側縫線核、淡蒼縫線核(VGLUT3陽性ニューロン)などであった。その一方で、リポポリサッカリド発熱時にFosの発現が増加する腹内側視索前野、終板器官、扁桃体中心核にはSDS後にFosは増加しなかった。この結果をもとに、研究代表者は、これまで関与が知られていなかった結節乳頭核のヒスタミン神経系がSIHに関与しているのではないかと考え、ヒスタミン受容体アンタゴニストをラットに前投与したところ、SIHが抑制されることを見いだした。
分泌素過程を制御する分子機構の解明

私達は環境変化に対応するため、ホルモンを分泌することにより体内の恒常性を一定に保っている。この機構の破綻は、アレルギー、糖尿病等の種々の疾患に直結する。本研究では、ホルモン分泌制御を行うタンパク質(ミオシン2)を同定し、その機能を生化学・生理学・バイオイメージングなど様々なアプローチで解析することにより、ホルモン分泌の仕組みを分子レベルで理解することが可能となった。ホルモン分泌反応は、分泌顆粒の輸送、細胞膜とのドッキング、開口放出準備段階、細胞膜との融合という4つの素過程からなる。近年、mRNAに転写されない多数のDNA配列がnon-cording RNA(ncRNA)として転写され、蛋白質発現制御に関与していると考えられている。中でもmiRNAは、標的mRNAに結合して遺伝子発現制御を行っている。しかしながら、ホルモン分泌の4つの素過程を制御する遺伝子及びそれら遺伝子の発現制御を行うmiRNAについては、未同定である。そこで本研究では、ホルモン分泌素過程を制御するmiRNA及び標的遺伝子を同定し、それらの生理機能の解析を試みた。平成21年度は、まず蛍光タンパク質標識したホルモン分泌顆粒(インスリン-緑色蛍光タンパク質(インスリン-GFP))を恒常的に発現するホルモン分泌細胞(インスリンを分泌するMIN6細胞(インスリン-GFP恒常発現MIN6細胞株)の作製を試み、その樹立に成功した。そこで、この新規樹立細胞を用い、これまでにホルモン分泌素過程の制御への関与が示唆されている30種類のmiRNAに対する特異的な阻害塩基配列を作製し、分泌刺激時のホルモン分泌への影響を生細胞イメージング法により解析した。解析の結果、これまでホルモン分泌との関与が示唆されていた2種類のmiRNA以外に、これまで全くホルモン分泌への関与が報告されていなかった1種類のmiRNAの存在が明らかになった。平成22年度は、これら3種類のmiRNAが4つのホルモン分泌反応の素過程のうちどの過程を阻害しているのかを明らかにすることを試みる予定である。ホルモン分泌反応は、分泌顆粒の輸送、分泌顆粒の細胞膜へのつなぎとめ(ドッキング過程)、ホルモン分泌への準備段階(プライミング過程)、細胞膜との融合(開口放出過程)という4つの素過程からなる。近年、mRNAに転写されない多数のDNA配列がノンコーディングRNAとして転写され、蛋白質発現制御に関与している。ノンコーディングの中でもマイクロRNA(miRNA)は、標的mRNAに結合して遺伝子発現制御を行う。しかし、ホルモン分泌を制御する遺伝子及びそれら遺伝子の発現制御を行うmiRNAについては、不明であった。そこで、ホルモン分泌の4つの素過程を制御するmiRNA及び標的遺伝子の同定を試み、それらの生理機能の解析を行った。解析の結果、3種類のmiRNA(miR-9、miR-124、miR-375)がホルモン分泌反応に関与していることを見出した。3種類のmiRNAの中でも、特にその機能が未解明であるmiR-9の標的遺伝子をリストアップしたところ、ホルモン分泌との関与が示唆されているミオシン2(MyoII)を見出した。そこで、MyoIIの活性状態がホルモン放出動態へどのような影響を与えるかを生細胞イメージング法により解析した。解析の結果、MyoIIは、分泌顆粒の輸送、ドッキング及び、プライミング過程には関与せず、ホルモン分泌顆粒と細胞膜との間の融合孔のサイズを制御し、分泌するホルモン量を制御していることを見出した。
新しい血圧降下薬に分類されるKーchannel openerの分子薬理学的研究

近年新しい抗狭心症薬や抗高血圧薬としてニコランジル(nicorandil)、クロマカリン(cromakalim)およびピナシジル(pinacidil)が報告され、これらの薬物はK開口薬(K channel opener)と総称され、Kイオン透過を増加しその結果膜の過分極をもたらし、筋弛緩により血管を拡張する作用があるとされていたが、その作用機序は詳細に研究されてなかったので、我々は電位固定法やパッチ固定法によって単離血管平滑筋を用いて研究した。また微小電極法をも併用した。Nicorandil,cromakalim,pinacidilは共に濃度依存性に膜を過分極し、Kイオン透過性を促進した。また静脈系で動脈系よりも強くかつ長い経過の過分極を示した。電位固定法によってこれらの薬物の効果を観察するといづれの薬物も濃度依存性に外向き電流を発生し、この電流はテトラエチルアンモニュウム(TEA)では僅かに抑性され4ーアミノピリジン(4ーAP)で著明に抑制された。電流ー電圧曲線を薬物投与前と投与後で比較すると両曲線はK平衡電位の近くで交差した。パッチ固定法で細胞内Caに依存する大小二つのK電流が記録された(280pSと30pS)。TEAは大きな振幅をもつK電流をより著明に抑制し、4ーAPは小さなK電流を著明に抑制した。またATPは小さな振幅をもつK電流を濃度依存性に抑制し、グリベンクラミドもこの小さなK電流を選択的に抑制した。Nicorandil,cromakalimとpinacidilはいづれも小さな振幅をもつK電流(Ca依存性ATP感受性ーグリベンクラミド感受性K電流)に作用することが明らかになった。このK電流の開口確率の増加と開口時間の延長がK開口薬の作用であると決論した。さらにnicorandilはニトロ化合物としてcyclic GMPを産生し、cromakalimは電位依存性Caチャネルを抑制し、pinacidilは1P_3の産生を抑制することも抗狭心症および抗高血圧作用薬としての作用に関与していることが明らかになった。高血圧治療薬としてCa拮抗薬、βー遮断薬αー遮断薬など種々の薬物が使用されている。近年高血圧治療薬としKchannel openerが導入されて来た。我国では亜硝酸薬に属しているnicorandilがKchannel openerとしての作用をもつ事が知られていたがその分子薬理学的作用機序については研究されていなかった。そこで本研究ではnicorandil、cromakalinやpinacidilの作用を解明し、臨床応用への指導を与える事を目的とした。本年度は主としてnicorandilとcromakalimの作用を研究した。実験方法は微小電極法、電位固定法、パッチ固定法、細胞内Ca測定法(Fura2法)を用いて行なった。Nicorandilは多くの血管平滑筋で過分極をもたらす。とくに門脈では自発放電が抑制される。NicorandilによりKー収縮は抑制され細胞内Caも減少するがこの作用は主として亜硝酸化合物として産生するcyclicGMPによる所が多い。電位固定法によって外向き電流を発生させてnicorandilの効果を観察するとCa依存性Kchannelを活性化することが明らかとなった。Ca依存性Kchannelは少なくとも3種類以上存在することがパッチ固定法によって測定したunit conductanceから明らかにされたが、nicorandilはいづれのChannelに対してま開口頻度を増加した。

現在更に精細な研究を続行している。Cromakalimは血管平滑筋膜を過分極し、活動電位を抑制する。この作用を電位固定法を用いて観察するとKー透過性の増加によるがCa依存性Kchannelの活性化と共に、それよりも高い閾値をもつCa非依存性Kchannelは抑制することがわかった。さらに電位依存性Cachannelの活性化によって抑制することがわかった。さらに電位依存性Cachannelの活性化によって発生する内向き電流に対してもcromakalimが抑制することがわかった。そこでcromakalimの血圧降下作用は主としてCa依存性Kchannelの活性化によると共に一部は電位依存性Cachannelの抑制も関与している事が明らかになった。来年度はpinacidilの作用機序について研究する予定である。初年度は主としてクロマカリン(Cromakalim)の効果について微小電極法及び電位固定法を用いて血管平滑筋におよぼす効果について観察したが本年度はニコランジル(nicorandil)とピナシディル(pinacidil)の効果について研究した。用いた標本はウサギ腸間膜動脈と門脈を用いた。微小電極法と収縮測定法によってPinacidilの効果を観察した結果、細胞膜は過分極し、30mM以上のK溶液存在下では過分極を発生しなかった。さらに過分極発生時には膜低抗値が減少した。またノルアドレナリン(nor-adrenaline,NAd)による収縮をKー収縮より著明に抑制した。Cromakalimはまたイノシト-ル三燐酸(IP_3)の合成を抑制した。電位固定法とパッチ固定法を用いてcromakalimとnicorandilの効果を観察した。電位固定法によって両薬物とも濃度依存性に外向き電流(out ward current)を発生し、この電流は細胞内Caを減少させることによってその振幅を減少させた。またCa依存性K電流抑制薬のテトラエチルアンモニウム(TEA)よりも4ーアミノピリジン(4-AP)によって外向き電流は強く抑制された。さらにATP感受性K電流の抑制薬であるグリベンクラミド(glibenclamide)によって完全に抑制された。パッチ固定法を用いて測定すると(inside-out)、大きな振幅をもつK電流(電極および環流液内共に高K液;280pS)そして小さな振幅(30pS)のK電流が記録され共に細胞内側(外液)のCaに依存性を示し大きな振幅をもつ電流はTEAに高い親和性をもち、小さい振幅のK電流は4-ATとATPに高い親和性をもち、この小さい振幅の電流はnicorandilやpinacidilで開口頻度をましglibenclamideで抑制された。この結果nicorandilやpinacidilによる膜の過分極はATP-感受性、Ca-感受性の小さな振幅をもつK電流を増強して発生することが明らかになった。また、nicorandilやpinacidilの抗狭心症作用と抗高血圧作用はKー開口薬としてのみならずその他の作用も関与することが明らかになった。
地方ソフトウェア業における工学的技法導入の経営に与える影響に関する研究

地方のソフトウェア産業は長引く需要低迷などで経営的に厳しい状況にあり、生産性の口上による収益構造の改善が課題となっている。開発管理技法の普及・適用状況と企業の収益性との関係について静岡県域を中心にアンケート調査を実施し、あわせて他県を含む業界団体、企業等にヒアリングを行った。それらの結果、1.技法適用は必ずしも生産性と関連を持たない、2.品質管理が収益性に影響を与える、3.人月契約を基本とする請負型開発から独自分野・市場に特化した製品開発へと移行する必要がある、などが明らかとなった。本研究の目的は、ソフトウェア工学分野で過去に研究開発され提唱されてきたさまざまな開発技法・管理手法が、地方に所在するソフトウェア開発企業においてどの程度普及し、その普及がソフトウェアの開発生産性や企業のパフォーマンスにいかなる影響を与えているかを明らかにすることである。そのために当該年度においては、1.過去に論及されてきた地方ソフトウェア企業の生産管理や開発方法に関する研究について収集・整理し、それぞれの特徴を整理した。2.対象地域(静岡県全域)のソフトウェア開発企業の経営者・プロジェクト管理者を対象とするアンケート調査をそれぞれ実施した。回答数は経営者が116、プロジェクト管理者が122であった。このアンケートによって、ソフトウェア開発に従事するうえでソフトウェア工学で研究・提唱されてきた各種の工学的技法・手法がどのくらい認知され、また、実際の開発プロジェクトにおいて導入、適用されているか、その実態を把握することができた。相対的に下流工程ではツールや開発方法の導入が進んでいるものの、上流工程、とりわけ要求仕様策定段階では導入、効果ともに課題があることが明らかとなった。これらの集計結果は、雑誌論文として公表するとともに、回答各企業に送付し、コメントをもらった。さらに、アンケート結果について他の研究者からのレビューを受けた。3.次年度の研究の準備として、個別のソフトウェア開発企業を対象としたヒアリング、事例研究となる企業の選定を行った。そのために二年目にあたる当該年度においては、1.前年度に引き続き、ソフトウェア産業の生産性と経営に関する各種データの収集を行なった。在京大手企業のデータとの比較を考慮し、IPA(情報処理推進機構)のSEC(ソフトウェアエンジニアリングセンター)のデータ活用説明会等に参加した。在京大手企業の類似調査のデータと地方(中小)企業では、かなりの違いがあることが想定されることとなった。2.前年度分として実施した静岡県下を対象として行ったアンケート調査結果のデータの分析を行い、生産性に影響を与える技法や要因を抽出し、その結果をもとに、他の研究者のレビューを受けた。3.前年度に選定した静岡県下の個別企業や業界団体を対象としてヒアリングを実施した。企業の業界内におけるポジションによって意識や体制にかなりのバラツキがあるとともに、受注している開発業務と発注者の関係、契約や業界慣行など、工学的技法以外の要因が様々な影響を与えていることが見えてきた。これらの点は次年度の課題としたい。4.前年度、当該年度に行った調査・研究をもとに、平成21年11月に開催された経営情報学会において中間的な報告を行った。そのために最終年度にあたる当該年度においては、おもに、これまで収集・蓄積したデータの分析、とりまとめと関係者によるレビューを実施し、研究成果のとりまとめを行った。具体的には、下記の諸点である。1.データを補足するため前年度に引き続き、ソフトウェア産業の生産性と経営に関する各種データの収集を行ない、比較のため情報処理推進機構のソフトウェアエンジニアリングセンターのデータ活用説明会等に参加した。2.昨年度までに実施したアンケート調査結果のデータの分析を継続し、生産性に影響を与える技法や要因を抽出し、その結果をもとに、他の研究者のレビューを受けた。3.静岡県下の個別企業や他県(宮城・広島・福岡)の業界団体を対象としてヒアリングを実施した。広域圏におけるその県の占める役割や業界内におけるポジションによってバラツキはあるが、いずれの事例においてもIT投資の減退や環境変化により経営的に厳しい状況にさらされ、収益構造の改善が課題となっていることが明らかになった。4.データ分析とヒアリング調査などの結果からは、(1)開発技法の導入・適用、生産性の測定は必ずしも生産性(利益率)と関連を持たない、(2)品質管理は収益性に影響を与える可能性が高い、(3)地方ソフトウェア企業が今後生き残っていくためには人月契約を基本とする請負型開発から独自分野・市場に特化した製品開発へと移行する必要がある、などが明らかとなった。
食道癌における新規14q12-21増幅の標的癌関連遺伝子の単離

浸潤や転移あるいは薬剤耐性といったの癌の特性に関わる遺伝子異常を解明するため、われわれはCGH(comparative genomic hybridization)法による癌ゲノム解析を推進してきた。CGH法は、複雑な染色体異常を呈する固形腫瘍でも、全染色体を鳥瞰して、染色体の特定領域の欠失、過剰、とりわけ新しい遺伝子増幅領域を探索することができる。本研究では、増幅の標的となり、癌の発生や進展に関与する新たな癌関連遺伝子の同定を行った。同様のアプローチで肝細胞癌と肺小細胞癌についても解析した。食道扁平上皮癌と肝細胞癌に共通して13q34領域に遺伝子増幅を認め、その標的遺伝子としてTFDP1,CUL4A, CDC16を同定した。転写因子DP-1をコードするTFDP1の発現亢進はその下流遺伝子であるサイクリンEを活性化して癌の進展に関与する可能性が示唆された(Hepatology,2002)。さらに、肺小細胞癌において高頻度に5p13に増幅を認め、同領域の標的遺伝子としてSKP2を同定した。SKP2の発現亢進はCDK(cyclin dependent kinase)インヒビターp27の分解を加速して、肺小細胞癌細胞の増殖を促進することを明らかにした(Am J Pathol,2002)。CGH法では複雑な染色体異常を呈する固形腫瘍でも、全染色体を鳥瞰して、染色体の特定領域の欠失、過剰、とりわけ、新しい遺伝子増幅領域を探索するには非常に有用である。われわれは食道扁平上皮癌細胞株のCGH解析から高頻度に14q12-21増幅を認めた。本研究では、14q12-13増幅の標的となり、食道扁平上皮癌の発生や進展に関与する新たな癌関連遺伝子の同定とその機能解析を目的としている。今年度は、14q12-13増幅領域の詳細な地図(amplion map)をBAC contig mapを基にFISH法で作製し、共通の増幅領域をマーカーD14S1034からL18528までの6.0Mbに限局化した。次いで、その共通増幅領域内の26個の遺伝子あるいはESTについて検討した結果、7個の遺伝子(BAZ1A, HNF3A, MBIP, SRP54, NFKBIAおよび2個の未知遺伝子)が増幅とそれによる発現亢進を示すことを明らかにした。さらに、これら標的遺伝子の増幅を食道扁平上皮癌の臨床例においても検証し、BAZ1AとHNF3Aが32例中3例(9%)において共増幅していることを確認した。また、転写因子HNF3A(hepatocyte unclear factor 3 alpha)は肝臓特異的に発現するが、HNF3Aの遺伝子増幅がある食道扁平上皮癌細胞株においてはHNF3 alphaタンパク質が異所性に発現することを認めた。本研究では、増幅の標的となり、癌の発生や進展に関与する新たな癌関連遺伝子の同定を目的とした。同様のアプローチで肝細胞癌と肺小細胞癌についても検索した。SKP2の発現亢進はCDK (cyclin dependent kinase)
雑種形成に着目した生物多様性の進化維持機構の理論的研究

外来種や生息環境の破壊がもたらす雑種形成が問題となっている。雑種形成により2種が融合して1種となる「種分化の逆転」が起こることもあるが、雑種が第3の種として新たな生息地で確立する「雑種種分化」が起こることもある。本研究ではコンピュータシミュレーションを用いて、生息環境の改変が近縁な2種の雑種形成をもたらした場合、雑種種分化ではなく種分化の逆転が起きてしまう可能性が高いことを明らかにした。本研究課題の目的は、雑種形成が生物多様性の進化・維持を駆動しているプロセスを明らかにすることである。雑種形成によって種の多様性は、増える場合も減る場合もある。近縁種が交雑し融合して「種分化の逆転(speciation reversal)」が起こると種多様性は下がるだろう。逆に、雑種個体群が第三の種として確立し「雑種種分化(hybrid speciation)」が起こると種多様性は上がるだろう。当該年度では、種分化の逆転と雑種種分化のどちらが起こるのかが、環境の異質性によって決まるという観点から研究をすすめた。まず、これまでに報告された野外研究のレビューを行い、(1)環境の異質性が低いところでは雑種形成により種分化の逆転が起こる傾向にあること、(2)環境の異質性が高いところでは雑種形成により雑種種分化が促進される傾向にあること、を見出した。さらに、このアイデアにもとづいた数理モデルを開発・解析し、種分化率と絶滅率および交雑率によって、地域の種数と環境の異質性の関係が変わることを見出した。これらの結果の社会的意義は大きい。世界の生物多様性の多くが交配後隔離の進化していない近縁種をもつことが明らかになりつつある。それらの種の同一性は、環境の異質性がもたらした分断型選択によって維持されている場合が多い。本研究の結果は、人間活動がもたらす生息環境の均質化は、雑種形成と種分化の逆転によって、生物多様性の減少を加速する恐れがあることを指摘している。これらの成果は、人為改変環境における進化に関する国際誌の特集号に掲載された。当該年度は、同所的に分化した起源をもつ親種の間で雑種形成があった場合に雑種種分化が起こる可能性を、個体ベースシミュレーションモデルを開発・解析することによって、理論的に検討した。同所的起源をもつ親種からの雑種種分化のシナリオとして次のようなものを考えた。(1)まず、分断型自然選択と同類交配により、異なるニッチに適応した親種が同所的に進化する。(2)その後、環境変動により親種のニッチの環境収容力が変化し、親種のニッチと比べてより極端な環境に別の新たなニッチが創出される。(3)環境収容力が低下し個体数の少なくなった親種は同種の交配相手と出会う機会が減り、もう一方の親種と交配し雑種を形成する。(4)新たなニッチで適応的な雑種個体が超越分離により出現し同類交配を進化させ、第3番目の種として確立する。シミュレーションモデルの解析の結果、同所的起源をもつ親種の間では(4)のプロセスが機能しないことがわかった。その理由は、同所的起源をもつ親種の間では、雑種をつくったときに超越分離が起こるような遺伝的分化が生じないためだと考えられた。この結果は、より近縁な種間での雑種形成ほど、超越分離による雑種種分化が起こりにくいということを示唆している。