hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
チェックポイント因子によるテロメア機能構造制御の分子機構

ATMファミリーはDNA構造異常を感知するチェックポイント経路の最上流で働くプロテインキナーゼである。出芽酵母のATMファミリータンパク質をコードするMEC1とTEL1の二重変異によるテロメア配列消失の分子機構を解明すべく、クロマチン免疫沈降法による両因子と内因性テロメアとの直接的結合を検討した。その結果、細胞周期のほとんどの時間帯ではTel1とテロメアが結合し、細胞周期のある時期にのみMec1とテロメアが結合していること、またTel1とMec1のテロメアへの結合が拮抗的であることが明らかになった。さらに、Mec1のテロメア局在化はCdc13、Est1からなる複製期テロメアクロマチンの形成に重要であること、またテロメア長の維持に必要な組み換えタンパク質複合体MRXが複製後期にテロメア局在性を示し、その局在はMec1のテロメアへの結合に必須であることを明らかにした。この実験結果は、MRXのテロメアへの局在化が引き金となってMec1、Cdc13-Est1が順次テロメアへと集積してくることを示す。この過程は損傷DNA末端におけるタンパク質集積の過程ときわめて類似している。これらの結果をもとに、細胞周期のある時期にテロメアが異常末端に似た構造へと変換され、その結果損傷修復に関与するタンパク質がテロメアへと集積し、それらの因子が末端で作用して作り出す環境を利用してテロメア複製が進行する、というテロメア複製モデルを提出した。テロメアは真核生物線状染色体の末端を構成するDNA・タンパク質複合体であり、その構造維持は染色体の正常な機能にとって必須である。本研究では、出芽酵母を材料にテロメアDNA複製機構の解析を行った。本年度、テロメア関連タンパク質のエピトープタグ付加体を内在性プロモーターにより生理的レベルで発現する酵母細胞を構築し、さらにテロメア構造異常をもたらす遺伝的バックグラウンドでそれらのタンパク質を発現させ、その挙動をクロマチン免疫沈降法による高感度検出法により網羅的に解析した。本年度に得た知見は以下の通りである。(1)ATMファミリータンパク質Mec1pは細胞周期のS期後期に特異的にテロメアと結合するが、この結合にはMre11-Rad50-Xrs2 (MRX)複合体が必須である。MRXはS期後期特異的なテロメア末端プロセシングに関与するが、Mre11のヌクレアーゼモチーフはこの活性に必須ではない。(2)テロメラーゼ制御因子Est1およびcdc13の複製期特異的なテロメア局在化にはMRX複合体が必須である。(3)Mec1pのテロメア局在化はテロメラーゼ制御因子Est1、Cdc13のテロメアローディングに重要である。以上の結果から、複製時期のテロメアタンパク質の集積過程が階層的に制御されていることを初めて明らかにした。この階層性はRothsteinらが示した二重鎖切断末端におけるタンパク質集積の階層性と類似している。このことから、複製期のテロメア末端が一時的にDNA損傷末端として認識されていることが示唆される。本研究では、出芽酵母を材料にテロメアDNA複製とチェックポイント経路との相互連携機構の解明を目指している。昨年度、テロメア複製に関与する因子とテロメアとの結合のクロマチン免疫沈降法による網羅的解析により、テロメア複製がおきる時期にATMファミリータンパク質Mec1、修復関連因子複合体MRX(Mre11-Rad50-Xrs2)がテロメアに局在化すること、さらにMRXのテロメア局在化が引き金となってMec1、テロメラーゼ制御因子Est1、Cdc13が順次テロメアへとローディングされることを見いだした。このことは、複製期のテロメア末端ではDNA損傷末端でおきる反応と類似な反応がおきていることを示唆する。しかしながら、複製時期のテロメア末端はDNA損傷末端と完全には同等でなく、細胞周期チェックポイントを活性化することはない。

このことは、テロメアに存在する因子のいずれかにはチェックポイントの作動を抑制する機能があると考えられる。出芽酵母のテロメア因子からチェックポイントの作動を抑制する活性をもつ分子の検索を行った結果、Stn1がその活性を持つ候補として単離された。Stn1はMec1の下流で働くキナーゼRad53と相互作用しその活性化を抑制すること、またStn1が細胞周期においてリン酸化による制御を受けていることが明らかになった。現在、Stn1によるチェックポイント抑制の分子機構の解析を進めている。
フィブリン接着アッセイ系の開発とその糸球体腎炎の成因・病態解析への応用

現在でもfibrinogen(Fbg)とfibrinとの細胞に対する機能的差異については不明な点が多い。その為我々はfibrinの新しい細胞接着アッセイ系を開発に着手し、一年後、今迄にない精密なアッセイ系の開発に成功した。そしてこの系を用いることにより、Fbgが細胞接着活性を発現するためには、Fbgの中央E domainを被覆するAα鎖C末領域(αC)がE domainより遊離し、E domainに連続して存在する接着活性中心の露呈が必須あることを世界で初めて示した。さらに驚くべき事実として、fibrin-monomerはαvβ3Integrinのみでなく、fibronectin receptor(α5β1)をも認識するよう、receptorのselectionがかかることを発見した。この成果を論文として、J.Biol.Chem.に本年3月に発表予定である。さらに我々は、fibrin-monomerに特異的に反応するモノクロナール抗体の作製に成功した。これらを用いて、腎臓内科と協同研究で、メサンギウム細胞のvitronectin receptor(αvβ3)との反応様式についてのin vitroの実験や糸球体腎炎患者の腎生検組織について、予後との比較を検討している。
作用素環上の離散郡作用と不変量の研究

作用素環のエントロピーの研究を行った。(1) Linによって定義されたTAF環に対して、自己同型写像のエントロピーをVoiculescuの方法に従って新しく定義し、そのエントロピーの性質や例について研究を行った。(2) PimsnerとPopaによって定義された作用素環とその部分環の組に対する相対エントロピーとM. Chodaによって定義された2つの部分環の組に対する相対エントロピーの研究を行った。作用素環上の2種類のエントロピーについて研究を行った。ひとつはVoiculescuによって定義されたAF環上の自己同型写像に対するエントロピーをLinによって定義されたTAF環上の自己同型写像に対するエントロピーに定義の拡張をし、この新しく定義されたエントロピーについての諸性質について調べた。多くの性質は同様に証明することが可能であり、期待されたものは得ることができた。最も興味があったAF環ではない、TAF環の例である無理数回転環上でのエントロピーについても調べたが、期待された結果を得るまでには至らなかった。ふたつめはPimsnerとPopaによって定義された相対的エントロピーと不変量についての研究である。エントロピーに関しては、長田まりゑによって新たな相対的エントロピーが定義された。長田まりゑによって得られた行列環での結果を一般のvon Neumann環上の設定まで拡張することに成功した。まだ、2つの有限次元可換環がPopaの意味で直交するかどうかの必要十分条件を与えることもできた。しかし残念ながらこの結果は非可換に拡張することができないことも同時に確認できた。一方で、PimsnerとPopaの不変量についても可換の設定がうまく利用できて、値を求めることができた。作用素環のエントロピーについて研究を行った。まずはLinによって定義されたTAF環に対して、その上の自己同型写像のエントロピーをVoiculescuの方法に従って新しく定義し、そのエントロピーの性質や例について調べてた。これらについては、論文「Entropy for C*-algebras with tracial rank zero」にまとめ、既に掲載されている。もう一方で、pimsnerとPokaによって定義された作用素環と部分作用素環の組に対する相対的エントロピーと長田まりゑによって導入された二つの部分作用素環の組に対する相対的エントロピーについての研究も行った。これらについては論文「Relative entropy for abelian subalgebras」にまとめ、既に掲載されている。また直接不変量とは関係ないが、Nicaによって定義された擬格子順序群からできる作用素環の従順性についても調べた。群の一般化としてみたとき、群の正則性の側面からLacaとRaeburnが調べたものを群の従順作用の側面から見直してそれらの関係性について調べた。これらについては現在まとめの作業に入っている。N.P.Brown(Penn State University)とE.Guentner(University of Hawaii)によって導入された群環のC*-完備化についての研究を行った。まず可算離散群の有界関数全体からなる可換なC*-環の代数的なイデアルを考える。元の離散群が関数に両側から自然に作用しているので、両側作用不変なイデアルのみを扱う。彼らは両側作用不変なイデアルに付随した新しい群C*-環を定義した。両側不変作用なイデアルは必ず有界な台をもつ関数全体を含むことに注意する。最大のイデアルは自分自身である有界関数全体であり、普遍的群C*-環が対応している。また最小のイデアルは有界な台をもつ関数全体であり、被約群C*-環が対応している。更に彼らは離散群の性質とイデアルの性質の対応関係についてもいくつかの結果をだしており、大変興味深い。私は彼らの提示した以下の予想について完全な解答を与えることができた。有限生成自由群と両側作用不変なイデアルであるp乗総和可能関数全体からなるイデアルを考えたとき、対応する群C*-環はpに対して互いに非同型であることを証明した。この結果は群C*-環の状態についての特徴付け定理の副産物として得られる。また群C*-環はただのつのトレース状態をもつこともわかる。ここですべてのp乗総和可能関数全体を含むイデアルとして、無限遠で消える関数全体が考えられるが、対応する群C*-環は普遍的群C*-環と同型になることに注意する。これより、無限遠で消える関数全体よりも小さなイデアルが考えるべき対象となる。最も基本的な例がp乗総和可能関数全体である。また固定したpに対して、p〈qとなるすべてのq乗総和関数全体の共通部分やq<pとなるq乗総和関数全体の和集合を考えても、対応する群C*-環は同型となる。よって、p乗総和可能関数全体が本質的な違いを与えていることがわかるoN.P.BrwonとE.Guentnerによって新しい群C*環の構成方法が与えられた。これは可算離散群上の有界関数全体からなる可換C*環の代数的なイデアルに付随して定義されている。

私は彼らの提示した未解決問題を完全に解決した。即ち、有限生成自由群を考え、p乗総和可能関数全体からなるイデアルに付随する自由群C*環は、pの値が異なれば、互いに非同型であることを証明した。更にこれら互いに非同型な自由群C*環はトレース状態を唯一つ持つことも証明した。研究集会やセミナーに参加し、他の出席者との活発な議論を通して、研究は期待通りの結果を得ることができている。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後の研究も基本的な進め方は変更しない。積極的に研究集会やセミナーに参加し、他の出席者との情報交換や討論をすることは最も効率的かつ効果的な研究手段である。
育成子牛の放牧時エネルギー代謝推定とその変動要因

放牧草地の植物・家畜・土壌系におけるエネルギーの流れの数式モデルを作成する目的で、オーチャードグラスの草地とトールフェスクの草地で植物生産量、地下部量、枯死物量、放牧牛による採食量、体重増加量の季節的推移を年間にわたって追跡した。春2回と夏と秋各1回の輪換放牧をした牛群について、放牧牛の増体と、牛体蓄積エネルギーの草地投下光エネルギーに対する比(二次生産の光利用効率」を季節間で比較するとともに、その草種による違いを明らかにした。結果(1)光エネルギー利用効率:二次生産における効率は、2年間の平均で、春季0.070.08%、夏季・秋季は0.020.03%であった。春季に比べて夏季と秋季に光利用効率が1/2以下に低下したことは、植物生産速度の季節変動の反映であると部分的には見なされるが、放牧牛の採食量は必ずしも減少しておらず、放牧牛のエネルギー代謝の季節変動、それによる増体の変動に起因していると考えられた。(2)増体:1頭あたり1日あたり増体は、春季には1kg前後となり、夏季と秋季には春季の1/2以下となった。この季節変動は一部は採食量に依存しているが、その寄与率は大きくない(R^2=0.18)。むしろ供給される牧草の消化率とそれ以上に放牧牛の生産効率(NEg/DE、消化エネルギーが増体として蓄積される効率)が増体の変動と高い相関を示した。生産効率は、牧草の消化率とも関連する牧草の質的因子(消化率以外の)に影響を受けていることと、動物側の因子、すなわち放牧牛の採食行動、エネルギー消費とも関係していることが示唆された。
塩基配列の不規則性に着目した類似度判定とそのイントロン進化解明への応用

DNA塩基配列には、進化の痕跡が蓄積されているのではないかと考えられ、多くの研究が行われてきたが、研究手法の主流は何らかの意味でパターンマッチングである。しかし、有意なスキームの大半が分かっている場合が多いとは思えない。また、化石とかサンプルが少ない時は、その種自体が不明なため、種についての解析情報がある程度はあるという前提は成り立ちにくい。そうであれば、たとえ精度は低くても、不十分な情報のもとでも生物種間の比較が出来る方法が欲しくなる。そのための、配列の不規則性を相互比較するという方法は採れないかと考えた。この方法ならば既知の特徴量を使わないので、あらかじめ○○遺伝子とかという予備知識を必要としないわけである。一方、不規則性の尺度が同じであっても、種が同じとは言えない。いくつかの不規則性の尺度から配列を見る必要がある。私は今回の研究で、出現頻度など統計量、1/fゆらぎ、情報エントロピー、量子統計力学の長距離秩序度など様々な物理的、統計的な量に関し調べてみた。その結果、これらの量で系統樹を作ることはできないが、生物種が比較的近いか遠いかは分かるという結果を得た。0)実験用ゲノムデータの入手(実験準備)・細胞性粘菌データは、筑波大学・漆原教授のDB構築を共同研究者の安永教授が協力し、入手できた。・また、生物種を比較するためのリボソームたんぱく質の塩基配列データは、本学、フロンティア研究センタの剣持助教授のDB作成を、当研究室の学生たちが協力し、入手できた。1)遺伝子配列の数量化と乱れ尺度の創案・DNA塩基配列A, C, G, Tを3つ組(コドン)として読み、数量化し、各3つ組の出現頻度を、特徴量として自己組織化マップ(SOM)を作成し、生物種ごとに領域分けできることを見出した。・また主成分分析をSOMに付加すると領域分けの再現性が高い分析ができることが判明した。2)遺伝子配列のカオス性からの解明・配列の乱雑さを1/f^αゆらぎのαを尺度として調べた。細胞性粘菌のステージごとの遺伝子発現量に差があることを見出した。・この解析のために2,3,5を基数とする混合基底のFFTプログラムを創作した。3)遺伝子配列の類似度判定法の考案・DM塩基配列を固体量子論の一次元格子に見立てて、長距離、短距離のポテンシャルエネルギーを定義すると、それが生物種を概分類する尺度として使えることを示した。・このためボルツマン分布関数を含む連立非線型方程式を解くプログラムを創作した。1)H17年度の成果を引きつぎ、塩基列を6個まで(2コドン読み)を単位として読み、SOMにかけ生物種のパターン分けを行ったが、コドン読みと特に変わるところはなかった。従って現在までの検討結果では、塩基読みまたはコドン読みでよいといえる。また、1/fゆらぎに関しては、データ長(塩基列の長さ)25-279bpの部分列に対し、転写開始点から上流側に行くに従いどれだけα値が変わるかを調べた。上流側700-800塩基あたりと、転写開始点付近で変化が大きいことが分かり、これは統計的解析結果Gスコアなどと一致する。2)H18年度新たに行ったのは、情報エントロピーを尺度とする解析である。H17年度と同じ10種の生物種のエントロピーを求め、進化系統樹と比べた。現状では、エントロピーだけで進化の樹は作れないが、既存の樹の解釈の補助になるようである。ところで情報エントロピーは本来、アンサンブル平均にわたり定義されるマクロな量であるが、本研究では塩基配列を適当な長さで切り出し、その部分列に対し情報エントロピーを定義する方法を考案した。この情報エントロピーは位置依存である。細胞性粘菌では、転写開始点の上流側700-800塩基での変動が大きいという他の手法と同様の結果得られたが、とくに4ステージ共通に転写開始点直前で大きく落ち込むことが分かった。この結果から、位置情報エントロピー(仮称)は、転写開始点判定に有用と思われる。成果発表は、主にH17年度までの内容でだしており、合計6件ある。情報エントロピーについては9月の国際会議で報告の予定であるが、まだ採否は決まっていないので、リストには入れていない。

1)H17年度H18年度にわたり、SOM(自己組織化マップ)、情報エントロピー、1/fゆらぎ、データ圧縮率、長距離秩序度等の指標が、DNA塩基配列の特徴点(たとえば転写開始点、Exon/Intron境界)に対応して変化するか否かという基本的性質を調べることにより、各手法の適用可能性を探った。2)H19年度においては、このうち有力と思われた情報エントロピーと1/fゆらぎを選び、これらを指標として進化の足跡を追ってみた。具体的には、10種類のモデル生物(ヒト、マウス、ショウジョウバエ、ゼンチュウ、出芽酵母、分裂酵母、マラリア原虫、メタン性古細菌、大腸菌、シロイヌナズナ)を選び、これらに含まれる28種のリボソームたんぱく質遺伝子の塩基配列間の類似性を調べ、進化系統樹を作った。その結果、情報エントロピーを用いた系統樹では、ヒトとマウスのように近接関係にある近いものは同じような結果になるが、ある程度離れた種を表す木構造はCLUSTAL-Wの木とはかなり違うことが分かった。一方、1/fゆらぎに関しては、やはり木全体の一致度はあまりよくないが、アラインメントをかけないシーケンスの方がアラインメントをかけたシーケンスより、むしろ良い結果が得られた。このことは、まったく未知生物の遺伝子比較をする場合、1/fゆらぎが有利な方法であることを示唆している。
ヒト側頭骨内知覚神経節におけるウイルス潜伏感染、再活性化機構に関する分子生物学的研究

まず研究の一つの骨格であるヒト側頭骨の検索について、平成5年度、平成6年度共に開頭許可を承諾して頂いた剖検症例が、ここ数年に比べて少なかった事を記さなければならない。了解の得られたヒト成人剖検症例のラセン神経節、顔面神経膝神経節、前庭神経節においてわれわれは既にPCR法でHSV-1核酸の検出を確認している。このことは突発性難聴、ベル麻痺、前庭神経炎の病因の1つとしてのウイルス説を一歩前進させたと考えられた。しかし潜伏感染ウイルスの指標となるlatency-associated transcript(LAT)の発現をRT-PCR,ISH法にて検索したところでは、顔面神経膝神経節、前庭神経説においてはLATの発現が認められたが、ラセン神経節においてはLATの発現が認められなかった。このような結果の相違の一つの原因として、ラセン神経節においては潜伏感染コピー数が極めて少ないことが予想された。そこで、同様のprimer対で増幅される既知量のDNAと競合的にPCRを行い、アガロースゲル電気泳動後、神経節間の相対的なLAT量を算定した。三叉神経節、膝神経節でのHSV-1DNAあるいはLATのコピー数は前庭神経節のコピー数の約1010^2倍であった。またISH法にて、三叉神経節、顔面神経膝神経節ではそれぞれ平均1.2%,6.2%にLATの発現が認められたが、前庭神経節においては1症例1側のみLATの発現が見られ、神経節細胞の平均LAT発現率は0.1%以下であった。これに比しラセン神経節では検索した症例では確認できなかった。成人剖検例の側頭骨内知覚神経節においてPCR法でHSV-1核酸の検出が確認されたことは、突発性難聴、ベル麻痺、前庭神経炎の病因の1つとしてのウイルス説を一歩前進させたと考える。しかし潜伏感染ウイルスの指標となるLATの発現が顔面神経膝神経節では明らかに認められたものの、前庭神経節においては1症例1側のみに、ラセン神経節では検索した症例では確認できなかった。当初に述べた様な理由を背景に検索症例数が未だ足りないのか、HSV-1の潜伏感染コピー数が少ないのか、これら神経節細胞とHSV-1の親和性の差異に依るものなのかは更に検討を要する処である。まず開頭許可を承諾して頂いた剖検症例がここ数年に比べて非常に少なかった事を記さなければならない。これは家族の了承を経て得られるものであるのは当然であるので、異論をはさむ余地は全くない。了解を得られたヒト成人剖検症例のラセン神経節、顔面神経膝神経節、前庭神経節においてPCR法でHSV-1核酸の検出が確認された。潜伏感染ウイルスの指標となるlatency-associated transcript(LAT)の発現をRT-PCR,ISH法にて検索したところ、膝神経節、前庭神経節においてはLATの発現が認められたが、ラセン神経節においてはLATの発現が認められなかった。また同様のprimer対で増幅される既知量のDNAと競合的にPCRを行い、アガロースゲル電気泳動後、神経節間の相対的なLAT量を算定したがやはりラセン神経節、前庭神経節では感染コピー数が三叉神経節、膝神経節に比し少なかった。

成人剖検症例のラセン神経節、顔面神経膝神経節、前庭神経節においてPCR法でHSV-1核酸の検出が確認されたことは、突発性難聴、ベル麻痺、前庭神経炎の病因の1つとしてウイルス説を1歩前進させたと考えられた。しかし潜伏感染ウイルスの指標となるLATの発現が顔面神経膝神経節では明らかに認められたものの、前庭神経節においては1症例1側のみに、ラセン神経節では検索した症例では確認できなかった。症例数が未だ足りないのか、HSV-1の潜伏感染コピー数が少ないのか、これら神経節細胞とHSV-1の親和性の差異に依るものなのかは、更に検討を要する処である。まずもって、この研究の一つの大きな骨格であるヒト側頭骨の検索について、昨年度同様に開頭許可を承諾して頂いた剖検例がここ数年に比べて非常に少なかった事を記さなければならない。既にラセン神経節、膝神経節、前庭神経節においてPCR法でHSV-1核酸の検出が確認されていたが、潜伏感染ウイルスの指標となるlatency-associated transcript(LAT)の発現をRT-PCR、ISH法にて検索したところでは、膝神経節、前庭神経節においてはLATの発現が認められたが、ラセン神経節においてはLATの発現が認められなかった。このような結果の相違の一つの原因として、ラセン神経節においては潜伏感染コピー数が極めて少ないことが予想された。そこで、既知量のDNAと競合的にPCRを行い、神経節間の相対的なLAT量を算定した。三叉神経節、膝神経節でのHSV-1DNAあるいはLATのコピー数は前庭神経節のコピー数の約1010^2倍であった。またISH法にて、三叉神経節、膝神経節ではそれぞれ平均1.2%、6.2%にLATの発現が認められたが、前庭神経節においては1症例1側のみLATの発現が見られ、神経節細胞の平均LAT発現率は0.1%以下であった。これに比しラセン神経節では検索した症例では確認できなかった。成人剖検例の側頭骨内知覚神経節においてPCR法でHSV-1核酸の検出が確認されたことについて、突発性難聴、ベル麻痺、前庭神経炎の病因の1つとしてのウイルス説を1歩前進させたと考えた。しかしLATの発現が膝神経節では明らかなものの、前庭神経節においては1症例1側のみに、ラセン神経節では検索した症例では確認できなかった。当初に述べた様に症例数が未だ足りないのか、HSV-1の潜伏感染コピー数が少ないのか、これら神経節細胞とHSV-1の親和性の差異に依るもなのかは、更に検討を要する処である。
創傷治癒と骨形成を促進するチタンインプラントの表面処理

インプラント表面での酸素供給は創傷治癒に大きく貢献するが,金属材料でこれを達成することは容易でない.一方,漂白剤に用いられる過炭酸ナトリウムを表面に分散させた高分子膜が細胞内酸化ストレスを抑制し,in vivoで創傷治癒を促進する作用が近年報告された.我々はリン酸二水素ナトリウム溶液中で放電用陽極酸化処理したチタン表面がヒドロキシラジカルを発生し,表面疎水性炭化水素の吸着を防止することから優れた生体適合性を長期間持続することを報告した.またチタンインプラントの放電陽極酸化処理は,ヒドロキシラジカル発生により周囲軟組織細胞の酸化ストレスを抑制すると同時に骨形成能を向上させる可能性が示唆された.インプラント埋入時の創傷治癒に関連する血管内皮細胞,歯肉上皮の基底細胞さらにマクロファージは,酸化ストレスの影響により再生能力が低下することが報告されている.酸素供給ができない金属チタン表面では接着細胞の酸化ストレスが上昇するため,インプラント埋入後の創傷治癒が遅延される.これは細胞内ミトコンドリアの呼吸抑制により細胞内で活性酸素が発生し,接着細胞の抗酸化物質が減少するためと考えられている.したがってチタンインプラントでは表面改質により接着細胞への酸素供給を行い,酸化ストレス抑制による創傷治癒を促進することが重要である.リン酸二水素ナトリウム溶液中で放電用陽極酸化処理したチタン表面がヒドロキシラジカルを発生し,表面疎水性炭化水素の吸着を防止することから優れた生体適合性を長期間持続することを報告した.電解液中でのチタン陽極酸化処理は,アモルファスのアナターゼ型チタン酸化膜を成長させる.このチタン酸化膜内にはTi4+とO2-の正孔電子対が残存しており,大気中の酸素や水分と反応することで,ヒドロキシラジカルと親水基が維持される.申請者らは,放電陽極酸化チタンプレートを脱イオン水中に浸漬すると,表面ヒドロキシラジカルの分解により,経時的な溶存酸素濃度が上昇することを見出した.放電陽極酸化処理チタンは加熱により結晶性を向上させることで,表面微細構造を変化させることなく,ヒドロキシラジカルの発生のみを抑制することができる.ヒドロキシラジカル発生を抑制したネガティブサンプルでは,溶存酸素濃度の上昇が見られない.したがって,酸素供給のできる放電陽極酸化処理チタン表面は,接着細胞の酸化ストレスを抑制する効果が期待できる.インプラント表面での酸素供給は創傷治癒に大きく貢献するが,金属材料でこれを達成することは容易でない.一方,漂白剤に用いられる過炭酸ナトリウムを表面に分散させた高分子膜が細胞内酸化ストレスを抑制し,in vivoで創傷治癒を促進する作用が近年報告された.我々はリン酸二水素ナトリウム溶液中で放電用陽極酸化処理したチタン表面がヒドロキシラジカルを発生し,表面疎水性炭化水素の吸着を防止することから優れた生体適合性を長期間持続することを報告した.またチタンインプラントの放電陽極酸化処理は,ヒドロキシラジカル発生により周囲軟組織細胞の酸化ストレスを抑制すると同時に骨形成能を向上させる可能性が示唆された.インプラント表面での酸素供給は創傷治癒に大きく貢献するが,金属材料でこれを達成することは容易でなく,研究報告は見られない.一方,漂白剤に用いられる過炭酸ナトリウムを表面に分散させた高分子膜が細胞内酸化ストレスを抑制し,in vivoで創傷治癒を促進する作用がある.これはチタンインプラント表面でのラジカル発生が,周囲軟組織の酸化ストレス抑制に効果的である可能性を示唆している.リン酸二水素ナトリウム溶液中で放電用陽極酸化処理したチタン表面がヒドロキシラジカルを発生し,表面疎水性炭化水素の吸着を防止することから優れた生体適合性を長期間持続する.電解液中でのチタン陽極酸化処理は,アモルファスのアナターゼ型チタン酸化膜を成長させる.このチタン酸化膜内にはTi4+とO2-の正孔電子対が残存しており,大気中の酸素や水分と反応することで,ヒドロキシラジカルと親水基が維持される.本研究では,放電陽極酸化チタンプレートを脱イオン水中に浸漬すると,表面ヒドロキシラジカルの分解により,経時的な溶存酸素濃度が上昇することを見出した.放電陽極酸化処理チタンは加熱により結晶性を向上させることで,表面微細構造を変化させることなく,ヒドロキシラジカルの発生のみを抑制することができる.ヒドロキシラジカル発生を抑制したネガティブサンプルでは,溶存酸素濃度の上昇が見られない.したがって,酸素供給のできる放電陽極酸化処理チタン表面は,接着細胞の酸化ストレスを抑制する効果が期待できる.チタンインプラント表面の石灰化能向上にはヒドロキシラジカルによる骨基質やマトリクスタンパクの架橋構造促進が必要であると考えられる.チタンインプラントの放電陽極酸化処理は,ヒドロキシラジカル発生により周囲軟組織細胞の酸化ストレスを抑制すると同時に骨形成能を向上させる可能性が示唆された.インプラント埋入時の創傷治癒に関連する血管内皮細胞,歯肉上皮の基底細胞さらにマクロファージは,酸化ストレスの影響により再生能力が低下することが報告されている.酸素供給ができない金属チタン表面では接着細胞の酸化ストレスが上昇するため,インプラント埋入後の創傷治癒が遅延される.これは細胞内ミトコンドリアの呼吸抑制により細胞内で活性酸素が発生し,接着細胞の抗酸化物質(還元型グルタチオン)が減少する(=酸化ストレス上昇)ためと考えられている.したがってチタンインプラントでは表面改質により接着細胞への酸素供給を行い,酸化ストレス抑制による創傷治癒を促進することが重要である.リン酸二水素ナトリウム溶液中でのチタン放電陽極酸化処理は,アモルファスのチタンマトリクスを成長させる.このチタン酸化膜内にはTi4+とO2-の正孔電子対が残存しており,大気中の酸素や水分と反応することで,ヒドロキシラジカルと親水基が維持される.放電陽極酸化チタンプレートを培養液に浸漬すると,表面ヒドロキシラジカルの分解により,経時的な溶存酸素濃度が上昇する.

酸素供給が回復した結果,表面に接着した細胞の還元型グルタチオン減少は,細胞培養用カルチャープレート上の細胞と同等に改善された.放電陽極酸化処理したチタン表面では,体液中の水分と接触することにより,親水性官能基とヒドロキシラジカルを発生する.親水性官能基は骨芽細胞の接着と分化を促進し,石灰化組織をチタン表面に形成する.ヒドロキシラジカルはチタン表面に限局した酸化作用により,天然の酸化酵素であるリシルオキシダーゼと同様にコラーゲンマトリクスの架橋を促進し,石灰化組織の物理的特性(硬さ・弾性係数)を向上せることが判明した.歯科理工学当初の研究計画通り,セルラインで購入できる内皮細胞,マクロファージ,上皮基底細胞をチタン試料表面で培養し,前年度に用いた方法で,総グルタチオン量を定量した.また接着細胞の細胞内活性酸素を蛍光色素で染色できた.さらに,in vitro共存培養系で,内皮細胞・マクロファージのサイトカイン発生と骨芽細胞の石灰化マーカー遺伝子の発現をチタンサンプル上で測定した.当初の研究計画通り,表面研磨チタン,放電陽極酸化チタン,大気加熱チタンおよび陽極酸化処理後に大気加熱したチタンをX線回折,X線光電子分光で表面分析した.ddYマウスの頭蓋骨から採取した骨芽細胞をチタン試料表面で培養し,回収した細胞内総グルタチオン(還元型+酸化型)を測定する方法を確立した.一方で,mRNA発現(Ho1, NRF2)をリアルタイムPCR法により定量し,チタン試料表面の化学構造と細胞内酸化ストレスの関係を明らかにすることができなかった.In vitroでチタン試料表面に析出した石灰化組織を,ナノインデンターやレーザーラマン分光法を用いて分析した.このためおおむね順調に進展していると考えられる.表面研磨チタン,放電陽極酸化チタン,大気加熱チタンおよび陽極酸化処理後に大気加熱したチタンをX線回折,X線光電子分光で表面分析する.ddYマウスの頭蓋骨から採取した骨芽細胞をチタン試料表面で培養し,回収した細胞内総グルタチオン(還元型+酸化型)を測定する.またmRNA発現(Ho1, NRF2)をリアルタイムPCR法により定量し,チタン試料表面の化学構造と細胞内酸化ストレスの関係を明らかにする.チタンサンプル上で培養骨芽細胞のmRNA発現量をリアルタイムPCRで定量すると同時に,in vitroでチタン試料表面に析出した石灰化組織を,ナノインデンターやレーザーラマン分光法を用いて分析する.カルチャープレート上でBMP2, lysyl oxidaseを添加して骨基質タンパクの発現と架橋構造を促進した石灰化組織を培養し,同様に物理化学的特性を評価する.ルラインで購入できる内皮細胞,マクロファージ,上皮基底細胞をチタン試料表面で培養し,前年度に用いた方法で,総グルタチオン量を定量する.
翼突下顎隙近位注射による下歯槽神経伝達麻酔法における局所麻酔薬分布解析と臨床評価

従来行われている下顎孔を刺入目標とする下歯槽神経伝達麻酔法(従来法)では、下歯槽神経や下歯槽動静脈、静脈叢あるいは筋の損傷などの合併症発現の危険を常に伴う。われわれはこれらの危険性を回避する目的で、下顎孔より前方の大きな神経血管の存在しない翼突下顎隙内への局所麻酔薬を注射する下歯槽神経伝達麻酔法(近位法)を考案し、放射線学的な麻酔機序の検討と臨床評価を行った。近位法は、翼突下顎ヒダの外側を刺入点として対側の第一大臼歯方向より1cm刺入する手技により行った。1.日本歯科大学歯学部附属病院に保存していた頭頸部のCT画像(男性27名、女性38名)の下顎孔付近の高さでの断層画像を用いて近位法と従来法の刺入角度を計測した結果、内側翼突筋前縁外側と下顎枝内側の側頭筋付着部の遠位を結ぶ直線と正中矢状面とのなす角度は60.1±7.1°であった。2.18人のボランティアに対してリドカインを混合した造影剤を用いて、X線透視下に近位法と従来法を行って拡散過程を観察し、CTにより水平分布を検討した結果、近位法での造影剤の拡散は従来法と同様に迅速であり、下顎孔周囲に分布した。以上より、近位法においても局所麻酔薬は迅速に下歯槽神経まで拡散し、従来法と同等な麻酔効果が得られる伝達麻酔法であり、手技が容易で、より安全な下歯槽神経伝達麻酔法として推奨できると考えられた。翼突下顎隙近位注射法における局所麻酔薬拡散のX線学的評価本年度は,近位注射法(近位法)における局所麻酔薬の翼突下顎隙内での拡散過程を明らかにすることを目的に,経時的な局所麻酔薬分布を放射線学的に検討した.健康成人ボランティア25名を対象として,1名に対して下顎孔注射法(従来法),25名に対して近位法を行った.被検者を坐位として,造影剤オプチレイ350と静注用10%リドカインを4:1で混合した溶液1.8mlを,27G,19mm針を装着した2.5mlディスポ-ザブル注射筒を用い,翼突下顎ヒダのやや外側,咬合平面の1cm上方を刺入点として,従来法では対側の犬歯方向より約20mm,近位法では対側の第1大臼歯の近心方向より約10mm刺入した.X線TV撮影を行い,針先が目的の位置にあることを確認した後,側面造影X線写真を撮影,続いて,X線TV撮影を継続しながら造影剤1,8mlを約30秒間で注射,閉口させた後,造影X線写真を撮影した.X線TV画像はビデオカメラレコーダにより記録し,撮影終了後,ビデオキャプチャ装置ならびにグラフィックプリンタにより造影剤注射時より閉口時までの動画と10秒間隔の静止画を記録した.X線TV撮影終了後,下顎頭より下顎下縁まで5mm間隔でCT撮影を行い,各横断面での造影剤分布の観察を行い,翼突下顎隙の形態と薬剤分布を解析した.この結果,従来法と同様に近位法でも造影剤は迅速に翼突下顎隙内を拡散することを確認し,CT画像において造影剤が下歯槽神経まで到達することを確認した.また,下歯槽神経に造影剤が拡散した症例における自覚的所見として口唇,オトガイ皮膚の麻痺が生じ,内側翼突筋あるいは側頭筋に拡散した症例では,口唇の麻痺は生じなかった.以上より,近位法においても局所麻酔薬は下歯槽神経に到達し,伝達麻酔効果が生じると考えられた.日本歯科大学歯学部附属病院麻酔科あるいは口腔外科外来で下顎臼歯の抜歯を予定した患者100名を対象に近位法による下歯槽神経伝達麻酔を行った。

患者を水平位(水平位群、47名)あるいは座位(座位群、53名)として、30G、21mmディスポーザブル注射針を装着した歯科用カートリッジ注射器、1/80,000エピネフリン含有2%リドカイン1、8mlを用いて近位法を行った。舌、下唇の知覚鈍麻が発現し、さらにピンセット刺激による下唇の無痛を確認した後、頬側歯肉への浸潤麻酔を行い、抜歯を開始した。近位法による伝達麻酔の終了時から患者の申告による舌、下唇の知覚鈍麻時間、下唇の無痛発現時間ならびに手術開始時間ならびに追加投与の有無を記録した。麻酔効果の判定はDobbs and De Vierの評価法により行い、Grade A、Grade B、Grade Cに分類した。Dobbs and DeVierの麻酔評価法によるGrade Aは64%、Grade Bは12%、Grade Cは24%(1例は全く麻酔効果が得られなかった)で、奏効率は76%であった。麻酔効果が得られたGrade AとBにおける知覚鈍麻発現時間は、舌が2分20秒±1分35秒、下唇が3分39秒±2分47秒で、下唇の無痛発現時間は5分14秒±3分54秒で、手術は10分35秒±6分00秒後に開始された。また、体位の違いによる差は認めなかった。以上の臨床評価の結果は、翼突下顎隙の前方部に刺入する近位法の奏効率、奏効時間は、下顎孔を刺入目標とする従来法と差はなく、解剖学的刺入部位の違いを考慮すると、近位法は同等な効力をより安全な方法で行うことのできる下歯槽神経伝達麻酔法であると考えられる。
ジョン・キ-ツにおけるギリシア・ローマ文化の影響の研究

ジョン・キ-ツの詩における古代ギリシア文化の影響を、アポロン、エンデュミオン、プシュケという3古代神にまつわる作品を中心に研究した。その概要は以下の通りである。1.まず、キ-ツの初期のアポロンに関する詩(“Ode to Apollo,"“Sleep and Poetry,"“On first looking into Chapman's Homer,“To a young lady who sentmea laurel crown,"“God of the goldenbow"等)を取り上げ、当時のキ-ツにとってアポロンは文字通り詩神として生きており、それゆえ詩の世界は「黄金の国」に他ならなかったこと、アポロンの音楽が此の世の自然(とりわけ夕暮れ時の)音楽と結び合わされていること、アポロンの姿が黄金の御者として描かれていること、そして月桂冠をめぐるエピソードがキ-ツのアポロンへの真剣な帰依の思いの証拠であること等を論文にまとめた。2.エンデュミオン神については、『エンデュミオン』をキ-ツによる新たな愛の神話の創造として読み解きながら、その中に登場するアレトゥサやグラウコスといった神々もまた、愛とその再生というテーマにそって新たな意味を与えられていることを解明し、論文にまとめた。3.“Ode to Psyche"をキ-ツによる古代ギリシア世界への自覚的な態度表明として、つまり古代の神(この場合はプシュケ)を内面化することによって新たに己の心の奥深くに再生させることへの決意表明として、読み解いた。これに関する論文は、本年8月に発行される『神戸英米論叢』に投稿する予定である。
ナノポーラス担体への固定化による酵素の有機溶媒中での安定性と反応特性の改変

本研究では、水溶液中では困難な反応を可能にせしめる有機溶媒中での酵素反応を実用化するために問題となる基礎を確立することを目的とした。サーモライシン(EC3.4.24.4)により触媒されるアスパルテーム前駆体Z-L-Asp-L-PheOMe(Z-;N-(Benzyloxycarbonyl),-OMe;Methyl ester)合成反応(縮合反応)を取り上げ、酵素をサブミクロンオーダーの細孔径を有する種々の多孔性担体に固定化した。固定化酵素の有機溶媒中での安定性に及ぼす諸因子の把握とその機構の解明を行った。固定化酵素の安定性に関しては、特に水難溶性有機溶媒中での失活速度について検討を行い、1)固定化酵素の失活は主として担体内部での自己消化によるものであること、2)自己消化の程度は有機溶媒の種類、水分濃度、担体の種類に影響されるが、これは固定化されている酵素分子周囲の水相の状態が異なるためであることを明らかにした。一方、合成速度を定量的に推定するために、水/有機溶媒二相系での分配挙動及び有機溶媒飽和の水溶液中での合成初速度に関して解析を行った。基質の酸成分と塩基成分間のイオンペア形成を考慮した分配モデルと有機溶媒飽和緩衝液中での合成初速度から、固定化酵素の有機溶媒中でのジペプチド合成初速度の推定を行ったが、酢酸エチル中では酵素の有効利用度の低下を考慮することにより精度良く推定できることを示した。有機溶媒中での酵素反応を実用化するための鍵は、酵素の反応特性と安定性をいかに良好な状態に保てるか否かという点にある。本研究では、ペプチド合成などへの応用が有望視されるプロテアーゼ、サーモライシンをモデル酵素としてとりあげ、サブミクロンオーダーの細孔径を有する種々の担体に固定化した場合の反応特性と安定性について検討した。反応系として、甘味料であるアスパルテ-ムの前駆体N-(benzyloxycarbonyl)-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester(Z-AspPheOMe)を含むジペプチド前駆体の合成反応を検討の対象とした。まず、サーモライシンをAmberlite系樹脂や多孔性ガラス担体に吸着後、グルタルアルデヒドを用いた架橋処理によって固定化し、各々の熱安定性を種々の条件下で比較した。その結果、Amberlite XAD7を担体として用いた場合に最も多量に酵素が固定化され、しかも熱安定性が最も高いことが明らかになった。さらに、活性低下の初期過程が二次反応速度論に従うこと、活性低下の程度に応じて担体上に固定化されているタンパク質量も低下すること、等が明らかとなり、固定化酵素の失活が主としてサーモライシンの自己消化によることが示された。なお、この自己消化の程度は溶媒中の水分含量にも依存した。また、固定化酵素の基質特異性について検討を行うとともに、反応速度論的検討を行った結果、Z-AlaとPheOMeを基質とした場合に反応速度がZ-Alaの濃度に依存しないことが判明した。この現象の解析を行うため、固定化酵素内の微視的な酵素反応場(緩衝液)と反応溶媒との間の分配平衡を想定した速度論的な反応モデルを現在構築しつつある。反応場と溶媒の間の基質の分配特性に関しては、Z-Ala等のN-置換アミノ酸とPheOMeとの間にpHに依存して形成されるイオンペアが分配平衡に大きな影響を与えることを明らかにした。本年度は、サーモライシン(EC3.4.24.4)により触媒されるZ-L-Asp-L-PheOMe(Z-;N-(Benzyloxycarbonyl),-OMe;Methyl ester)前駆体合成反応(縮合反応)を取り上げ、安定性と反応特性の改変のために必要な有機溶媒中での固定化酵素の安定性に及ぼす諸因子の把握とその機構の解明を行うとともに合成速度と平衡関係の定量的予測方法について実験的ならびに理論的検討を加えた。

基質の分配モデルに基づいて、有機溶媒系でのジぺプチド合成初速度の推定を試みたが、1)水/有機溶媒二相系での遊離酵素を用いた場合の合成初速度は分配モデルと飽和バッファー中での速度式を用いることにより推算可能であること、2)有機溶媒中で固定化酵素を用いた場合の合成初速度は、酵素の有効利用度の低下を考慮することにより酢酸エチル中では精度良く推定できること、3)t-アミルアルコール中では、担体内部の水相の状態の違いにより実験結果は計算結果と傾向が若干異なることを示した。固定化酵素の安定性に関しては、特に水難溶性有機溶媒中での失活速度について検討を行い、1)固定化酵素の失活は主として担体内部での自己消化によるものであること、2)自己消化の程度は有機溶媒の種類、水分濃度、担体の種類に影響されるが、これは固定化されている酵素分子周囲の水相の状態が異なるためであることを明らかにした。
ツメナガウミグモ(節足動物門;ウミグモ網)の後胚発生に関する研究

材料のツメナガウミグモは、全て伊豆・下田近海より春季にドレッジにより採集し、雄成体が抱える受精卵及び初期幼生を、過去の方法に従い20°Cの恒温器内で、アルテミア幼生を餌として止水飼育し、得られた各後胚発生段階(9令まで)の幼生を組織切片及び走査型電子顕微鏡用試料とした。飼育中途で死亡する個体が、予想以上に多く出たため、8令以降の後期幼生は、数個体づつしか得られなかったため、冬季に追加採集を行い、補填した。このウミグモについては、成体における雌性生殖器官系の形態が、他のウミグモのそれと大きく異なっていることが、研究代表者により既に観察されていたが(宮崎,投稿準備中)、今回の研究によって、後期幼生の段階で、他のウミグモで普通にみられる形態を経ることがわかり、成体における特殊な形態が、二次的に変形したものであることが、明確に示された(宮崎,投稿準備中)。その他、ウミグモ類の系統進化的観点より特に注目していた、頭部付属肢と合体節の形成過程については、それぞれ3令から4令にかけて、外部形態、内部形態ともに劇的に変化することがわかったが、変化があまりにも急激なため、現時点ではその過程を追跡しきれておらず、現在、該当する時期の幼生の組織切片を順次作成して、解析を行っている。以上のように、研究期間の短さから、解析が不十分な点も残ったが、いくつかの新知見とともに、今後更に詳しい観察を行うための基礎的なデータを、得ることができた。
胎児胎盤羊膜系の母児連関に関与する因子と作用機構の解明

表題の候補因子として胎児特異的に発現するmidkine(MK)に着目し以下の結果を得た。1MK蛋白は妊娠初期の合胞体及び絨毛外栄養膜細胞に局在する、2BeWo細胞で細胞融合に関与するSyncytin-2のmRNA発現をMKは用量依存性に増加し、syncytinsと同様にMKもcAMPの発現制御下にある、3MK発現抑制とMK添加した絨毛細胞株の網羅的解析でMKが制御する遺伝子候補を同定した、4ヒト胎児副腎皮質細胞モデル(NCI-H295A)では、MK添加で初代培養細胞と同様の増殖促進が見られたが、HSD3B2発現は抑制されず、これらの細胞でのMKシグナル経路の差異を反映していると考えられた。本研究の目的は胎児胎盤羊膜系の母児間のクロストークに関わる分子の機能と作用機構の解明であり、平成25年度はこれまでに解析の進んでいるmidkine(MK)について、まずヒト胎盤におけるMKと受容体候補蛋白の発現と局在の検討、関連因子の発現プロファイルやMKによる発現調節の検討を行った。その結果、MK染色性は妊娠初期>中期>後期の発現パターンを示し、これまでに明らかにしたmRNAレベルの推移と同様の結果を得た。MK局在はvillous trophoblastsを中心とするが、extravillous trophoblastsにおける局在も認められた。胎盤組織におけるMK受容体候補蛋白の発現については、RT-PCR法による検討で、少なくともsyndecan-1, syndecan-4, LRP1の発現は認められた。しかしLRP6, NCAM1の発現は明らかではなかった。またMK局在の特徴から関連性が疑われる因子として、新たなextravillous trophoblastマーカーであるNOTCH2に着目した。ヒト胎盤におけるNOTCH2発現プロファイルは妊娠初期>後期の発現パターンを示しており、extravillous trophoblastのin vivoにおける活動性に矛盾しない結果であった。MKがNOTCH2発現を調節する可能性については、JEG3細胞を用いたこれまでの検討では否定的である。またMK投与により発現が増減する遺伝子(群)について、JEG3細胞株をモデルにDNAマイクロアレイチップを用いて網羅的に解析して抽出した。今後これら遺伝子の産物について検討を進める計画である。また胎児副腎に関しては、モデル系であるNCI-H295A細胞と初代培養細胞とのMK作用に対する反応性の異同について明らかにした。今後さらに詳細な検討を行う予定である。本研究の目的は胎児胎盤羊膜系の母児間のクロストークに関わる分子の機能と作用機構の解明である。母児間のクロストークに関わる分子候補であるmidkine(MK))について、胎児側のinterfaceである胎盤絨毛においてその局在は主として妊娠初期のsyncytiotrophoblasts(STB)に見られることが判明した。STBは隣接する細胞性cytotrophoblast(CTB)が細胞融合により多核化し分化することにより形成される。そこでMKがSTBに主に発現することから隣接するCTBに影響を与えているのではないかと考え、CTBのモデル細胞であるBeWo細胞を用いて検討した。近年Syncytinー1、Syncytin-2がCTBの細胞融合には、key regulatorとされている。そこでまずMKがSyncytinー1やSyncytin-2の発現調節をしている可能性について検討した。BeWo細胞を培養しrhMKを添加すると、Real-time RT PCRによる解析で、MKはSyncytin-2のmRNA発現を用量依存性に増加させたが、Syncytin-1 mRNAは変化させなかった。現在、Western-blot法を用いて蛋白レベルでも同様の調節があるか検討している。またBeWo細胞においてはcAMP添加により細胞が融合し多核化することが知られ、STB形成のモデルとして多くの研究で利用されている。またこの過程で、cAMP添加はSyncytinー1とSyncytin-2の発現を増強させていることが知られ、cAMPの細胞融合作用の一部はSyncytinー1とSyncytin-2の発現増強を介しているものと考えられている。今回、cAMPアナログである8-Br-cAMPをBeWo細胞に添加してみると、MKもsyncytinsと同様にcAMPの発現制御下にあることが判明した。したがって、我々はMKの妊娠初期絨毛における役割の一つの可能性に、MKがSyncytin-2の発現増強を介してCTBがSTBへと細胞融合・多核化するプロセスを促進することがあるのではないかと考えている。母児間のクロストークに関わる分子候補であるmidkine (MK)について、これまでの検討の結果からMK局在はvillous trophoblastsの他、extravillous trophoblastsにおける局在も認められた。これらの細胞でのMKの機能は不明でありその手がかりを得るため、絨毛細胞株であるBeWo細胞、JEG-3細胞を用いてMK添加実験、一過性MK発現抑制実験を行い、次世代シークエンサーを用いたRNAseq解析により網羅的解析を行った。BeWo細胞にMK(100ng/uL)を添加した群とコントロール群で2倍以上のRNA量変動があったのはmicro RNAを含む18の遺伝子であり、産物が重金属解毒や抗酸化作用に関わる遺伝子が含まれていた。

またJEG-3細胞においてsiRNAによりMK蛋白発現を20%に発現抑制すると、MK発現抑制群とコントロール群で2倍以上のRNA量変動があったのは、MKとmicro RNAを含む11の遺伝子であり、前述のBeWo細胞におけるMK添加実験で2倍以上のRNA量変動を示した二つの遺伝子が含まれ、BeWo細胞実験とRNA量は逆の挙動を示していた。以上のように、trophoblastにおけるMKの機能解明の手がかりとなる基礎的知見が得られた。表題の候補因子として胎児特異的に発現するmidkine(MK)に着目し以下の結果を得た。1MK蛋白は妊娠初期の合胞体及び絨毛外栄養膜細胞に局在する、2BeWo細胞で細胞融合に関与するSyncytin-2のmRNA発現をMKは用量依存性に増加し、syncytinsと同様にMKもcAMPの発現制御下にある、3MK発現抑制とMK添加した絨毛細胞株の網羅的解析でMKが制御する遺伝子候補を同定した、4ヒト胎児副腎皮質細胞モデル(NCI-H295A)では、MK添加で初代培養細胞と同様の増殖促進が見られたが、HSD3B2発現は抑制されず、これらの細胞でのMKシグナル経路の差異を反映していると考えられた。概要に示すように母児間のクロストークに関わる分子候補であるmidkineについて、局在から機能を推定し、現在まで順調に解析が進んできている。周産期医学、胎児内分泌学胎盤に関連した実験については、今後、BeWo細胞におけるMK強制発現や細胞融合モデルを利用した実験などを通じて、MKのCTB/STBにおける役割について解明していきたいと考えている。またMKが母体ー胎児間のクロストークの主役の一人であるextravillous trophoblasts(EVT)にも発現していることから、EVTモデル細胞株を用いたMKの機能解明も行いつつある。羊膜や肺についても主にMKに関連した解析を進めており、preliminaryな結果を得ている。今後、研究の進展にしたがって計画の細かなmodificationを行い、当初の目的達成にむけて研究を推進していく。網羅的解析や、これまでの実験結果から、検討のターゲットを絞り順調に解析を進めている。当該年度では研究に必要な新規や追加の試薬購入が安価で済んだこと、前年度からの繰越金があったこと、また次年度に実施予定の実験に必要な試薬購入などについて慎重に吟味する手順を踏んだことで、結果的に次年度使用額が生じた。胎盤に関連した実験については、網羅的解析等の結果から検討候補遺伝子を抽出できており、今後これら遺伝子の産物について順次検討を進めていく。また今後、羊膜や肺についても、先に進行している胎盤の実験結果などを参考に、網羅的解析と個々の因子の機能同定の試みを、当初の研究計画の細かなmodificationを行いながら推進していく。研究の進展に合わせ様々なassayを予定しており、相応の調達資金が必要である。また成果発表に要する費用も発生する。今後とも効率的に無駄のない支出を行っていく。