hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
トンネル分光法を用いたエキゾチック超伝導体のナノ電子構造の解明

近年、銅酸化物超伝導体において、低温STM/STSによる興味深いナノメートルレベルでの電子構造が注目されている。これらの現象は、他の様々なエキゾチック超伝導体においても観測が期待されているが、清浄表面の得難さから、一部の劈開性の強い銅酸化物超伝導体に観測が限られている。それらの状況を踏まえ、STM/STS観測に重大な影響を与えている表面におけるミクロな仕事関数(局所障壁高さ,LBH)について注目し、清浄表面を持つBi系銅酸化物超伝導体における、ナノスケールでのLBH分布の詳細な研究を本年度も引き続き行った。LBH実空分布においては、STM像と同様にBi原子に対応するとみられる明瞭な原子像が観測された。また、表面格子の変調構造と同周期でやや逆位相のLBH変調もみられた。それらの起源を解析し、LBH値は表面原子の充填密度に比例することを見出した。このことは、同じ金属でも配向の異なる面では、仕事関数が若干異なるというマクロな性質が、原子が数個の集合でも同じであることを示唆している。(これらの結果はJournal of Physical Society of Japan誌に掲載予定である。)以上のようなSTM/STS観測やLBH観測の知見を生かし、本年度は銅酸化物と異なる、層状窒化物超伝導体KドープTiNClにおける低温STM/STS観測も試みた。本物質群は最高でTc=25Kを示し、非従来型のエキゾチック超伝導体の一つとしてその超伝導発現機構に大きな興味がもたれている。KドープTiNClにおけるSTM観測により、X線解析により報告されている格子定数とほぼ同一の周期構造を持つ、明瞭な原子像観測に初めて成功した。今後は、本研究課題での成果を生かし、高分解能STS観測,LBH像観測等により原子種の特定や電子状態の実空間分布観測等を行い、その詳細な物性解明を行っていく。近年、エキゾチックな超伝導体の代表格ともいえるBi系酸化物超伝導体において、ナノメートルレベルでの電子構造不均一性が注目されている。この不均一構造が何に由来しているのかを探るため、走査トンネル顕微鏡装置を用いて、STM像や、dI/dV、dI/dZスペクトルを原子分解能で可視化する必要がある。そのような原子分解能を持っ究極的な観測には、極低温、超高真空中(-10乗torr台)での観測が必須であるが、本年度は新たにそれが可能となるSTM装置を、様々な要素技術の開発と改善により安定稼動させることを実現させた。具体的には、液体窒素冷却による安定した低温環境での単結晶ヘキ開、高電圧処理による探針の最適化、電子回路系のノイズの大幅低減、振動を極力抑制するコンディションの条件出し等を行った。dI/dZスペクトル観測により、Bi系超伝導体において、ナノレベルこえた原子スケールでの実空間仕事関数(局所障壁高さ、LBH)分布の可視化に初めて成功した。LBH像は、界面における各原子位置での波動関数の染み出しの減衰係数に由来しており、その中にキャリア濃度の情報も含まれていると考えられる。観測されたLBH像から、原子構造と特有の変調構造に起因する縞状構造が観測されたが、超伝導ギャップの不均一性との関連性は、現時点では見出されていない。この結果は、超伝導不均一性がキャリア濃度に強く起因するものではないことを示唆するが、今後、多くの物質での観測との比較やデータの精査によって、より詳細な情報が得られると思われる。これらの成果は日本物理学会第62回年次大会等において発表された。
振動を用いた組織再生能の刺激に関する研究

本研究では,様々な物理環境が荷重組織の再生に及ぼす影響を調べ,再生医療工学の具体的指針を得ることを目的として行われた.1)フィブロインスポンジにウサギ軟骨細胞を播種して振動刺激を加えたところ,細胞の増殖制に及ぼす垂直振動と水平振動の刺激効果に差異が見られた.また,振動の軟骨機能や分化に及ぼす効果,細胞の材料表面への接着に及ぼす影響を定量評価した.まず大まかな縦振動場を設定し,その振動場において細胞を培養すると,一方では細胞接着の促進が示され,もう一方では細胞接着は阻害され,細胞凝集体(スフェロイド)の形成が確認された.この現象をより詳細に調べるために,振動の不均一性の小さな振動場を設計し,細胞接着の定量評価を試みた.振動制御により得られた細胞凝集体は単体の細胞よりも実際の組織に近い機能を有しており,また接着性も高く,臨床応用に大きな可能性が示唆された.しかし,振動刺激の効果には多くの誤差が測定されてしまい,そのメカニズムは明白とならなかった.2)In vivo及びin vitroにて,滑り刺激が再生軟骨組織構造に及ぼす影響を調べた.In vivoにて曲げ滑り刺激を加えるとでは平滑な滑り面を有する硝子軟骨様組織の新生が認められた.この組織は正常軟骨と同等の表面および層状構造を有していた.3)再生軟骨の摩擦摩耗特性評価,細胞の接着性の定量評価を行った.その結果,細胞,組織の機能発現に細胞接着性の時間変化が大きな影響を及ぼしている事実が見いだされた.以上の物理環境設定実験を通して,生体の機能を設計するのではなく,生体の環境を設計することによって生体機能を「育てる」ための「生体環境設計」なる,方法論と設計論が確立し,その内容は書籍「機能設計から生体環境設計へ,富田直秀著(序論:「生命」を基本に置く医療を求めて--生命誌との関わり,中村桂子(JT生命誌研究館館長):丸善)」に紹介された.本研究では,様々な物理環境が荷重組織の再生に及ぼす影響を調べ,再生医療工学の具体的指針を得ることを目的として行われた.1)フィブロインスポンジにウサギ軟骨細胞を播種して振動刺激を加えたところ,細胞の増殖制に及ぼす垂直振動と水平振動の刺激効果に差異が見られた.また,振動の軟骨機能や分化に及ぼす効果,細胞の材料表面への接着に及ぼす影響を定量評価した.まず大まかな縦振動場を設定し,その振動場において細胞を培養すると,一方では細胞接着の促進が示され,もう一方では細胞接着は阻害され,細胞凝集体(スフェロイド)の形成が確認された.この現象をより詳細に調べるために,振動の不均一性の小さな振動場を設計し,細胞接着の定量評価を試みた.振動制御により得られた細胞凝集体は単体の細胞よりも実際の組織に近い機能を有しており,また接着性も高く,臨床応用に大きな可能性が示唆された.しかし,振動刺激の効果には多くの誤差が測定されてしまい,そのメカニズムは明白とならなかった.2)In vivo及びin vitroにて,滑り刺激が再生軟骨組織構造に及ぼす影響を調べた.In vivoにて曲げ滑り刺激を加えるとでは平滑な滑り面を有する硝子軟骨様組織の新生が認められた.この組織は正常軟骨と同等の表面および層状構造を有していた.3)再生軟骨の摩擦摩耗特性評価,細胞の接着性の定量評価を行った.その結果,細胞,組織の機能発現に細胞接着性の時間変化が大きな影響を及ぼしている事実が見いだされた.以上の物理環境設定実験を通して,生体の機能を設計するのではなく,生体の環境を設計することによって生体機能を「育てる」ための「生体環境設計」なる,方法論と設計論が確立し,その内容は書籍「機能設計から生体環境設計へ,富田直秀著(序論:「生命」を基本に置く医療を求めて--生命誌との関わり,中村桂子(JT生命誌研究館館長):丸善)」に紹介された.本年度はin vivo及びin vitroにて,滑り刺激を加えた場合の軟骨組織構造に及ぼす影響を調べた.in vivoにて再生中の組織に運動刺激を加え、かつ動物に与えるストレスを低減した動物モデル及び装置を考案している。これらの実験モデルを用いてラットの尾椎骨切り部に4週間の曲げ滑り及び純粋滑り運動刺激を加えた結果、曲げ滑り刺激では滑り面を有する硝子軟骨様組織の新生が認められた。この組織はSafranin-OおよびToluidine Blue染色に強く染色性を示し、免疫染色においてはtype II collagenに陽性を、type I collagenに陰性を示した。また、その組織は関節軟骨と類似した表面および層状構造を有していた。このことから、組織内層状構造の構築にはすべり運動にもとづく力学刺激が強く影響していると考えられた。しかし,凸面接触部のない純粋滑り刺激時には,このような層状構造は得られなかった.軟骨の深さ方向の構造が高度の潤滑機能と深い関係があることから,凸面接触による深さ方向の応力分布とその移動が再生軟骨の機能構築には不可欠であることが示唆された.平成14年度前半までの実験結果として、フィブロインスポンジに播種したウサギ軟骨細胞に振動刺激を加えたところ、垂直振動と水平振動の刺激効果に差異が見られた。現在までのところ差異の生じた原因は明らかになっていない。平成14年度よりは、従来の分化促進の効果に加えて細胞の材料との接着性に関しても定量測定を開始した。現在までのところ細胞接着数とその分化を測定するのみであるが、マイクロマシンを用いる顕微鏡下力学試験の準備を進めている。

細胞と材料との接着は、播種率の上昇のみならず細胞の分化機構の解明と制御にかかわる重要な要素である。振動刺激効果の臨床応用に関しては未だその目処が立っていない。つまり、振動による軟骨細胞の分化刺激効果はみとめられるものの、臨床に用いうるほどの際だった効果ではなく、また、前述のようにそのメカニズムも明白ではない。再生軟骨の力学的評価に関しては順調に研究が進んでいる。特に再生軟骨の摩擦摩耗評価は未だ海外においても例が無く、基礎から応用にわたる新しい知見が多数得られている。研究全体を通しての反省点としては、細胞の力学応答や軟骨の機能に関する力学モデルの構築が未だ定まっていない点である。細胞や組織に加わっている力学環境の評価が不十分であることも反省点である。平成15年度にはこの二点に関してさらに努力を続ける所存である。平成15年度は学部生,大学院生らの活躍により新たな展開を見ることができた。従来は,軟骨細胞に振動刺激を加える刺激効果に着目していたが,平成15年度は細胞の接着性に着目しその定量評価を主に行った。まず大まかな縦振動場を設定し,その振動場において細胞を培養すると,一方では細胞接着の促進が示され,もう一方では細胞接着は阻害され,細胞凝集体(スフェロイド)の形成が確認された。この現象をより詳細に調べるために,振動の不均一性の小さな振動場を設計し,細胞接着の定量評価を試みた。また,マイクロマシンを用いる顕微鏡下力学試験が開始され,細胞と材料との接着現象がより定量的に把握された。早期の細胞接着は、播種率の上昇のみならず細胞の分化機構の解明と制御にかかわる重要な要素である。本研究にて振動制御により得られたスフェロイドは単体の細胞よりも実際の組織に近い機能を有しており,臨床応用に大きな可能性が示唆された。平成16年度は,細胞の接着性を定量的に測定する装置を開発した.本装置を用いて,骨髄間葉系細胞,軟骨細胞の培養担体への接着挙動を定量的に測定した.また,細胞凝集体の形成条件を様々な実験系で追求した.未だその成因は明らかになっていないが,フォトリソグラフィーを用いて作製した培養基材表面を用いることにより,間葉系細胞より様々な大きさの細胞凝集体を作製することが可能となった.基材表面に播種後48時間で比較的均一な凝集体が形成され,その接着性や伸展速度,分化度などを評価している.総じて,振動の組織再生能に及ぼす影響には多くの不定要素が観測され,その効果の確実な記述には至らなかった.しかし,平成15年度以降にはその細胞接着との関連性が見いだされ始めている.また,その結果を得て細胞接着性及び接着力の定量評価を開始した結果,細胞,組織の機能発現に細胞接着性の時間変化が大きな影響を及ぼしている事実が見いだされた.特にフィブロインを担体として用いた軟骨再生における表面接着性の設計が,再生軟骨の機能制御に有用であることが示された.これら一連の研究結果を通じて,様々な物理環境設定により生体機能を育てる,「生体環境設計」なる方法論と設計論が見いだされ,その内容は書籍「機能設計から生体環境設計へ,富田直秀著(序論:「生命」を基本に置く医療を求めて-生命誌との関わり,中村桂子(JT生命誌研究館館長):丸善)」に紹介された.
生物時計ナノ装置の原子レベルでの解明

藍色細菌の時計タンパク質KaiCを生化学的、遺伝学的に解析し、KaiCが極めて微弱なATPase活性を有することを発見した。KaiCはN末端ドメインとC末端ドメインの2つのドメインからなり、共に一セットのATPaseモチーフを持っているので、ATPase活性の存在が推測されていたが、あまりに活性が微弱なため、これまでその存在は証明することができなかった。今回、好熱性藍色細菌Thermosynechococcus elongatus由来のKaiCを極めて高度に精製することに成功し、KaiCの2つのドメインが共に極微弱なATPase活性を有すること明らかにした。この活性が大腸菌由来のATPaseの混入によるものでないことは、ATPaseモチーフにアミノ酸置換変異を導入したKaic変異体ではその活性が完全に消失することで確認した。極めて興味深いことにKaiC ATPase活性は反応温度を変えても変化しなかった(温度非感受性)。生物時計の周期(速度)は温度に依存せず温度補償されているので、時計のこの特性の少なくとも一部はATPase活性の温度非感受性(温度補償性)で説明できるのかも知れない。アミノ酸置換変異を導入してリン酸化サイトをつぶしたKaiC変異体では、この温度非感受性が失われた。藍色細菌の生物時計分子装置は、主に3つの時計タンパク質、KaiA、KaiB、KaiCから構成されている。これらの3つのタンパク質は、ATP存在下の試験管内で24時間周期の自律振動を生み出す。3つのタンパク質が互いに複合体形成、生化学的修飾を行い、構造変化、状態変化することによって時計発振が起こると考えられているが、その分子機構は明らかでない。我々は、NMR(核磁気共鳴)やESR(電子スピン共鳴)を用いて、Kaiタンパク質の時間発振にともなう分子構造の変化を明らかにしようとしている。また、時計タンパク質の1つKaiCの活性を生化学的に解析し、KaiCが弱いATPase活性を有することを明らかにした。この活性は、時計タンパク質KaiAによって促進される。KaiCの2つの活性、ATPase活性と自己リン酸化活性を持っている。我々は自己リン酸化によってKaiCのATPase活性が抑制される関係にあることを示した。このようなKaiC自身による活性制御機構は、KaiCの持つ温度補償性などを説明することができる。時計関連タンパク質PexおよびSasAの解析も進めている。外部環境の変化を生物時計に伝達するインプット経路を担うタンパク質、Pexは、結晶構造解析よりPexがPadRファミリーに属するwinged-helix proteinであることを明らかにした(投稿中)。そして、遺伝学および生化学的解析によりPexがkaiA遺伝子の上流域に結合し、kaiAの発現量を制御していることを明らかにした。したがってPexはKaiA量を調節することで、周期を制御していると考えられる。
ヒト白血病発症における,癌抑制遺伝子WT1の役割の解析

ヒトの骨髄細胞及び臍帯血細胞から、FACSソーティングにより、CD34^+CD38^<+/->,CD34^+CD33^<+/->,CD34^+HLA-DR^<+/->などの造血幹細胞分画を分離し、WT1発現レベルを測定したところ,どの細胞分画でも、WT1発現レベルは、白血病細胞でのWT1発現レベルの1/10以下であり、白血病細胞と同程度にWT1を発現する細胞分画を検出できなかった。このことは、白血病細胞では、WT1がaberrant overexpressionしていることを示唆した。2. WTlは、造血幹細胞では、oncogenicな機能を果たす(1) WT1遺伝子をmyeloid progenitorcell lineである32D細胞に導入し、WT1をconstitutiveに発現させると、32D細胞は、G-CSFの刺激に対して、分化をを起こさなくなり、逆に、増殖をはじめた(WT1を発現していない32D細胞は、G-CSFの刺激で、完全に好中球にまで分化する)。この時、Stat3αとstat3βの両者の活性化が見られた。(2) WT1遺伝子を、レトロウイルスベクターを用いて、マウスの骨髄細胞に導入し、G-CSFの存在下で、コロニーアッセイを行ったところ、コントロールに比し、有意により多くのCFU-G,CFU-M,及びCFU-GMコロニーが形成された。(1)(2)の結果は、WT1は、造血幹細胞では、癌抑制遺伝子というよりも、むしろ、がん遺伝子様の機能を果たしていることを示した。myeloid progenitor cellである32Dc13細胞は、G-CSFの存在下で、顆粒球に完全に分化することができる。この細胞にWT1遺伝子を導入し、WT1遺伝子を持続的に発現させたところ、G-CSFの刺激によって、分化することができなくなり、分化が止まって増殖を起こすようになった。この時、Stat3αとStat3βの両者のconstitutiveな活性化が見られた。このことは、WT1遺伝子は、造血細胞では、がん抑制遺伝子としてではなく、むしろ、がん遺伝子として機能していることが示唆され、leukemogenesisにおけるWT1遺伝子の重要な役割が示唆された。また、WT1アンチセンスオリゴマーにより、白血病細胞の増殖が抑制されることを以前報告したが、そのメカニズムについて解析した。細胞周期を同期させた後、WT1アンチセンスオリゴマー存在下で細胞分裂を再開させたところ、G_2/M期で細胞周期がストップし、WT1は、G_2/M期をovercomeするのに重要な働きをしていることが示唆された。ヒトの骨髄細胞及び臍帯血細胞から、FACSソーティングにより、CD34^+CD38^<+/->,CD34^+CD33^<+/->,CD34^+HLA-DR^<+/->などの造血幹細胞分画を分離し、WT1発現レベルを測定したところ、どの細胞分画でも、WT1発現レベルは、白血病細胞でのWT1発現レベルの1/10以下であり、白血病細胞と同程度にWT1を発現する細胞分画を検出できなかった。2. WT1は、造血幹細胞では、oncogenicな機能を果たす(1) WT1遺伝子をmyeloid progenitorcell lineである32D細胞に導入し、WT1をconstitutiveに発現させると、32D細胞は、G-CSFの刺激に対して、分化をを起こさなくなり、逆に、増殖をはじめた(WT1を発現していない32D細胞は、G-CSFの刺激で、完全に好中球にまで分化する)。(2) WT

1遺伝子を、レトロウイルスベクターを用いて、マウスの骨髄細胞に導入し、G-CSFの存在下で、コロニーアッセイを行ったところ、コントロールに比し、有意により多くのCFU-G,CFU-M,及びCFU-GMコロニーが形成された。(1)(2)の結果は、WT1は、造血幹細胞では、癌抑制遺伝子というよりも、むしろ、がん遺伝子様の機能を果たしていることを示した。
多角化企業における本社組織の国際比較研究

日本企業の組織構造は事業部制組織構造が一般的であるが,固定的なものではなく,変化していた。また国によっても異なり,事業部長への権限移譲は遅れていた。日本企業は既存主力事業への投資を維持・強化しつつ,事業数は縮小させる傾向にあったが,イギリス企業はより積極的に市場関連領域へ進出を行っていた。ただ経営成果の分析を見ると,既存主力事業を強化しながら事業数を拡大する「コア多角化型」が好業績であることが明らかとなった。本年度は日本企業に対しての質問票調査と、イギリス企業の調査にむけての準備のためのインタビュー調査を行った。質問票調査の調査対象企業は東京・大阪・名古屋の各証券取引所に上場している鉱業ならびに製造業企業1、306社であり、各企業の代表取締役あてに質問票を送り、111社から回答を得た。有効回答回収率は8.50%である。調査の結果、次のことが明らかになった。日本企業の組織構造は事業部門制組織構造が一般的であるが、マトリックス制組織と純粋持ち株会社が増加傾向にあること、ただこれらの組織構造はそれほど固定的なものではないことである。111社中40社(36.0%)の企業が何らかの組織構造の変更を2005年2007年の間に行っており、組織構造は流動的である。事業部は主に製品別に分かれており、混合形態を採用している企業も比較的多く存在する。特に増加しているのが職能別事業部制である。さらに事業部門の本社によるコントロールをみると、事業部長の業績評価では、売上高や貢献利益が重視されることが多いが、事業部長への権限移譲は進んでいないことも分かった。特に事業部長は人事に関して大きな権限は持っていない。全社戦略の方向性を見ると、既存主力事業への投資を維持・強化しつつ、事業数は維持あるいは縮小させるというのが一般的な傾向であることが明らかとなった。今後は、既存事業数を維持しながら既存主力事業の維持・強化に向かうとみられる。イギリスにおける事前聞き取り調査では、イギリスにおける大企業調査における質問票調査の有効性、定量的調査と定性的調査を併用することの有効性、ならびにコントロール変数の重要性を確認した。本年度は多角化企業の動向,組織構造と経営成果の関係について,分析を行った。調査の結果,次のことが明らかになった。多角化企業の組織構造としては,事業部制組織が一般的だが,日本においては職能別組織も依然として重要な位置を占めいていることが明らかとなった。また日本的な混合型組織構造も多くみられ,国による多様性も確認された。組織は戦略に従うというChandler(1962)の命題は支持されるが,組織構造は戦略だけではなく,外部環境の変化に対応して変化することも明らかとなった。これらの結果は組織構造の普遍的な変化ではなく,組織変化の多様性を示している。組織変化は,国によって異なったパターンを示すことが明らかとなった。経営戦略と組織構造の日英比較では,イギリス企業日本企業に比べて,より分権的な組織構造であることが明らかとなった。日本企業には職能別組織も多く,事業部制組織であっても分権化の程度は低かった。戦略を見ると,イギリスの企業は日本企業よりも積極的に新規事業へ進出を行い,その進出先が日英で異なっていた。イギリス企業は市場関連型多角化を重視するのに対し,日本企業は技術関連型多角化を重視していた。しかしながら,近年は,日本企業も市場関連型へと移行している。これらの違いが生まれる両国の企業の発展プロセスの分析が今後必要である。多角化戦略と経営成果の分析では,既存主力事業を強化しながら事業数を拡大する「コア多角化型」が好業績であること,逆に既存主力事業への投資を縮小しながら多角化を展開する企業が低業績であることが明らかとなった。
胸腺癌における新規治療標的遺伝子異常の探索

胸腺癌は全胸腺腫瘍の15%前後を占める極めて予後不良な胸部悪性疾患である。近年、非小細胞肺癌をはじめとした複数の癌腫において、治療標的となる遺伝子異常が同定され、中でもチロシンキナーゼ(Tyrosine kinase; TK)遺伝子異常は、非小細胞肺癌患者の予後を飛躍的に改善させている。しかし、胸腺癌は症例解析数の少なさや生存期間の短さから有望な治療標的の同定や薬剤の開発は遅々として進んでいない。本研究の目的は、胸腺癌患者の腫瘍組織を用いて網羅的なmRNAベース・スクリーニング解析を行い、新規治療標的となりうる遺伝子異常の同定および治療法を開発することである。現在、申請者らは臨床検体におけるチロシンキナーゼ(TK)遺伝子の網羅的解析を行っている。現在までに、申請者らは患者臨床検体におけるチロシンキナーゼ(TK)遺伝子の網羅的mRNAベース・スクリーニングの解析システムを確立している。ひきつづき症例を蓄積し、解析症例数を増やし、胸腺癌におけるチロシンキナーゼ(TK)遺伝子の網羅的解析を継続してゆく。そして同定された候補遺伝子については、機能解析を進めてゆく。当初の予定よりも臨床検体の収集が遅れてしまい、次年度に解析を行うため。
骨・血管石灰化におけるＦＧＦ２３／ｋｌｏｔｈｏ軸とＴＮＡＰ／ＥＮＰＰ１の作用機序

正常の骨基質石灰化と、疾患としての血管石灰化における細胞分化・機能および各酵素活性や膜輸送体の発現・機能について、特に、全身的なFGF23/klotho軸と局所的なTNAP/ENPP1系におけるリン酸制御機構が骨および血管石灰化にどのように作用しているのかということを明らかにする目的で、下記の2つの研究を遂行した。我々は、klotho遺伝子変異(kl/kl)マウスで生じる血管石灰化の原因が、αklothoが主体をなすFGF23/klotho軸の破綻による血中リン濃度の上昇にあると推測した。そこで、αklotho KOマウス大動脈の組織学的解析を行った。αklotho KOマウスでは血中リン濃度が上昇しており、顎骨周囲組織などの異所性石灰化が亢進しているにも関わらず、大動脈にはほとんど石灰化物が認められなかった。このことから、単に血中リン濃度が上昇しただけでは血管石灰化を誘導することは難しいと推測した。そこで、現在、野生型マウスとkl/klマウスのパラバイオーシス実験を行い、kl/klマウスの血管石灰化が抑制されるか否か解析を行っている。(2)骨芽細胞特異的TNAP Tgマウスの石灰化異常におけるENPP1/ANK/Pit1の機能解析骨芽細胞に特異的なtype I collagena1 promoterにhuman TNAP遺伝子を組み込んだcDNAを作製した後、マウス胎仔頭蓋骨より単離した骨芽細胞にこれらの遺伝子を導入し、タンパク発現を確認した。その結果、これらの細胞にてTNAPタンパクの過剰発現が確認されたため、同cDNAをマウス受精卵へmicroinjectionし、胎仔Tgマウスを取得した。現在、これらの骨組織において組織学的検索を進めている。26年度が最終年度であるため、記入しない。
成人T細胞白血病の発がん機構の分子機序

成人T細胞白血病(adult T-cell leukemia : ATL)はhuman T-cell leukemia virus type I (HTLV-I)の感染により発症するヘルパーT細胞の悪性腫瘍であり、極めて予後不良の疾患である。その発症機序において宿主ゲノムの変化が多段階に蓄積することが必須であると考えられている。しかしながら、現時点ではATL細胞におけるgeneticな異常は十分には解明されていない。一方、様々な癌細胞においてDNAメチル化などのepigeneticな異常が、その発癌に影響を及ぼすことが知られている。我々はこのDNAメチル化に着目し、まずATL細胞に特異的に異常メチル化を来しているDNA領域のスクリーニングをMethylated CpG island amplification (MCA)/representative difference analysis (RDA)法を用いて試み、53領域のDNA断片を単離した。単離した断片ではHTLV-1キャリア→慢性型ATL→急性型ATLと病態が進むにつれてメチル化の程度が強くなる傾向があることが判明した。また単離した断片の近傍に位置する遺伝子で、DNAメチル化により発現抑制を受けているものを7種類同定した(KLF4、EGR3、Versican、PTGDR、ADRB2、KRML、ADAMTS2)。これらの中で、KLF4およびEGR3をATL細胞株に強制発現させるとapoptosisを誘導することが判明した。EGR3の強制発現はFas ligand (FasL)の発現を誘導し、結果としてFas-FasLシグナルを介してapoptosisを誘導すると考えられた。これらの分子はATLにおける癌抑制遺伝子の候補と考えられ、現在さらに解析を進めている。
TSLP依存性アトピー性皮膚炎の分子免疫・病理学的な解析

近年、アトピー性皮膚炎の患部表皮角化細胞においてThymic Stromal Lymphopoietin (TSLP)が高産生されることが知られるようになり、病態形成との関わりが注目されている。平成24年度に我々はアトピー性皮膚炎の表皮角化細胞のin-vitroモデルおよび病理組織検体を用いて、TLR3リガンドがdeltaNp63の発現抑制を介して表皮の炎症環境を増幅するTSLP自己分泌・傍分泌経路を制御しうることを明らかとした。平成25年度は表皮ケラチノサイトにおいてdeltaNp63の制御を受ける分子のさらなる探索とdeltaNp63とともに他のp53ファミリー転写因子がアトピー性皮膚炎においてTSLP産生に果たす役割について検討を行った。RNA干渉法を用いたin vitroにおける検討で、deltaNp63は上皮バリアを構成するある種のバリア関連蛋白を制御することが分かった。また、アトピー性皮膚炎の表皮では健常表皮と比較してこの蛋白が広範に発現していることが病理組織検体を用いた免疫染色から明らかとなった。これはアトピー性皮膚炎の表皮においてdetaNp63の発現が低下しているとする我々のこれまでの検討と合致するものである。さらに、アトピー性皮膚炎の表皮から採取された病理組織検体を我々が作成したある種のp53関連転写因子を特異的に染色する抗体を用いて染色した結果、アトピー性皮膚炎の表皮において当該転写因子が健常表皮と比して広く発現する傾向にあった。また、初代培養ケラチノサイトに対するTLR3リガンド刺激はTSLPの発現を増強すると同時に当該転写因子の発現増強を誘導した。以上より、この転写因子がTSLPの発現調節に関わっている可能性を考え、in vitroにおける強制発現系を用いた検討を進めている。本研究によって、表皮においてp53ファミリー転写因子が自然免疫経路によって発現調節され、表皮におけるサイトカイン環境およびバリア機能を規定しうることが示唆された。deltaNp63をはじめとするp53ファミリー転写因子が表皮ケラチノサイトの生体防御機能にかかわる幅広い遺伝子の発現を調節する可能性を示した点については予想通りの進行である。アトピー性皮膚炎におけるその機能的意義の詳細についてはいまだ検討中であるが、総合的にはおおむね順調と考える。p53ファミリー転写因子がTSLPの発現に与える影響について検討を進めていく。p53ファミリー転写因子はアポトーシスに関連する分子であることから、強制発現が困難な可能性がある。さまざまな強制発現の方法を検討するとともに強制発現が困難な際にはRNA干渉法を用いた遺伝子ノックダウンを用いることも考慮される。近年、アトピー性皮膚炎の患部のケラチノサイトがthymic stromal lymphopoietin(TSLP)を高産生することが知られるようになった。TSLPはTSLP受容体(TSLPR)を発現する樹状細胞を介してTh0細胞をTh2細胞へと分化させることで、アトピー・アレルギー疾患の病態形成に中心的役割を果たすと考えられている。しかし、TSLPが表皮細胞自身に対する作用は明らかではなかった。そこで今回、表皮におけるTSLPの自己分泌・傍分泌経路の存在を仮定し、検討を行った。ヒト表皮ケラチノサイト初代培養細胞および表皮細胞株HaCaT細胞にRNA干渉法を用いたdeltaNp63ノックダウンおよび種々の自然免疫受容体リガンドを用いた刺激を行い、分子生物学的あるいは形態学的手法により性状を解析した。さらに生検されたアトピー性皮膚炎の病理組織検体を用いた免疫組織化学染色を行い、解析を行った。まず、これまで知られていなかったヒト表皮角化細胞におけるTSLPRの存在を表皮組織に対する免疫組織化学染色によって明らかとした。また、deltaNp63をノックダウンしたケラチノサイトにおいて、TSLPRの発現は表皮幹細胞因子deltaNp63を介した自然免疫経路によって制御されていた。興味深いことに表皮に対するTSLP刺激は更なるTSLP産生を惹起し、その他の炎症性サイトカインの発現も促進していた。抗体を用いてTSLPを中和したところ、これらの炎症性サイトカインの発現は低下した。さらにアトピー性皮膚炎の生検検体をdeltaNp63に対する免疫染色を施行したところ、健常皮膚と比較して有意に発現が低下しており、TSLPRの分布にも異常が見られた。これらの結果からTSLPはケラチノサイト自身にも作用する自己分泌・傍分泌経路を形成し、アトピー性皮膚炎患部表皮の炎症環境の形成、維持に関与していると考えられる。このループを遮断することが、保湿やエフェクター細胞の抑制など、従来のアトピー性皮膚炎の治療に加えられる新規の治療ターゲットとなり得ると考えられた。

これはアトピー性皮膚炎の表皮においてdetaNp63の発現が低下しているとする我々のこれまでの検討と合致するものである。さらに、アトピー性皮膚炎の表皮から採取された病理組織検体を我々が作成したある種のp53関連転写因子を特異的に染色する抗体を用いて染色した結果、アトピー性皮膚炎の表皮において当該転写因子が健常表皮と比して広く発現する傾向にあった。また、初代培養ケラチノサイトに対するTLR3リガンド刺激はTSLPの発現を増強すると同時に当該転写因子の発現増強を誘導した。以上より、この転写因子がTSLPの発現調節に関わっている可能性を考え、in vitroにおける強制発現系を用いた検討を進めている。本研究によって、表皮においてp53ファミリー転写因子が自然免疫経路によって発現調節され、表皮におけるサイトカイン環境およびバリア機能を規定しうることが示唆された。上記「研究実績の概要」に記載した内容を英文論文としてまとめ、投稿中であることによる。deltaNp63をはじめとするp53ファミリー転写因子が表皮ケラチノサイトの生体防御機能にかかわる幅広い遺伝子の発現を調節する可能性を示した点については予想通りの進行である。アトピー性皮膚炎におけるその機能的意義の詳細についてはいまだ検討中であるが、総合的にはおおむね順調と考える。アトピー性皮膚炎におけるケラチノサイトの役割については当初の計画通りに一定の成果が得られたものと考えられる。さらに表皮ケラチノサイトと同様にdeltaNp63およびTSLPを発現する扁桃あるいは胸腺の上皮細胞が免疫学的に果たす役割について検討していきたい。これらの上皮に関しては、実験遂行に必要な初代培養細胞を入手できる頻度が低い可能性があり、hTERTを用いた延命化を行い長期間の培養が可能になるよう処理する必要があると考えられる。p53ファミリー転写因子がTSLPの発現に与える影響について検討を進めていく。p53ファミリー転写因子はアポトーシスに関連する分子であることから、強制発現が困難な可能性がある。さまざまな強制発現の方法を検討するとともに強制発現が困難な際にはRNA干渉法を用いた遺伝子ノックダウンを用いることも考慮される。
薬剤抵抗性口腔扁平上皮癌におけるSTAT3の腫瘍抑制系ネットワークへの関与

細胞死誘導抵抗性に関わるSTAT3を腫瘍の薬剤抵抗性に関わる標的因子として解析した。口腔扁平上皮癌症例におけるIL-6高発現症例はリン酸化STAT3発現を認め、リンパ節転移、術前化学放射線療法抵抗性や予後不良等との相関性を示した。抗癌薬剤として注目されるV-ATPase阻害剤に対する口腔扁平上皮癌細胞株の抵抗性について検討した処、薬剤抵抗性細胞株を認めた。腫瘍の薬剤抵抗性を解除するといわれるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を薬剤抵抗性細胞株に併用すると、細胞増殖抑制効果が確認され、STAT3のリン酸化にも変化が認められた。口腔扁平上皮癌症例の治療抵抗性にはSTAT3発現の関与が示唆された。平成25年度の研究結果は以下の通りであった。CMA抵抗性SQUU-Bに対してSAHAを併用すると、細胞増殖抑制効果が確認された。SAHAを併用されたSQUU-Bでは、BaxやBcl-2の発現変化がみられ、Bcl-2の上流因子STATのリン酸化にも変化が認められた。また、Bcl-2阻害剤やsiRNA処理下におけるCMAによるSQUU-Bの細胞増殖抑制効果もみられた。口腔扁平上皮癌に対してCMAの抗癌効果がある程度認められるものの、CMA抵抗性口腔扁平上皮癌に対してはSAHA併用による有用性が示唆され、その抵抗性の解除にはSAHAによるBcl-2発現抑制が影響していることが示された。平成26年度の研究結果は以下の通りであった。これらの効果を検討した処、HSC-2とSASは細胞死が誘導され、薬剤感受性を示した。一方、SQUU-B株は抵抗性を呈した。そこで、癌細胞の薬剤抵抗性に関与が注目され、細胞内ストレスに関係するGlucose-related Protein 78 (GRP78)が介する細胞死誘導の解明を試みた。まず、未処理細胞内のGRP78発現量と細胞内局在部位をwesternblotting法や免疫蛍光細胞染色法を用いて各々検索した。検索した細胞株によってGRP78発現量は異なっていた。予想とは反し、検索した細胞株の中でSQUU-B株が最もGRP78発現量は低かった。細胞内局在部位はいずれの細胞株においても細胞質内にびまん性の陽性像を認めた。また、共焦点レーザー顕微鏡にて核内に局在するGRP78も確認した。cisplatin、SAHA処理による癌細胞株の細胞死誘導における関連因子発現変化とGRP78発現量変化について検討した。また、口腔扁平上皮癌症例における炎症性サイトカインであるIL-6とリン酸化STAT3の発現を検索し、それらの発現と臨床所見他を検討した。IL-6高発現症例は、全症例にてリン酸化STAT3発現を認め、リンパ節転移、術前化学放射線療法抵抗性や予後不良等との相関性を示した。口腔扁平上皮癌症例の治療抵抗性にはSTAT3発現が関与していることが示唆された。平成27年度に展開した実験で成果の得られた結果は以下の通りである。1STAT3は、口腔扁平上皮癌(OSCC)細胞株に対して様々な扁平上皮分化マーカーの発現に影響を及ぼした。種々のサイトケラチンは、発現に影響を受けたマーカーに含まれる。また、そのサイトケラチンの発現制御には、Hedgehogシグナル経路が関与しているという。われわれはこのHedgehogシグナル経路に注目し、口腔扁平上皮癌の癌形質に対するHedgehogシグナル経路の関与を検討した。また、そのサイトケラチンの癌形質への影響を検討した。Hedgehogシグナル経路に対するある阻害薬を添加すると、OSCC細胞株の細胞残存数が非添加群と比較して阻害薬濃度依存的に減少していた。Annexin-V染色、TUNEL法やDNA ladderの確認により、Hedgehogシグナル経路に対するある阻害薬によるアポトーシスが誘導され、OSCCにおけるHedgehogシグナル経路阻害が新たな癌の標的となる可能性が示唆された。また、種発現に影響を受けたサイトケラチンの発現調節を行うと、細胞増殖や扁平上皮分化マーカーである他のサイトケラチンの発現にも影響し、癌形質への関与が示唆された。2口腔扁平上皮癌の骨への浸潤破壊はしばしば認められ、治療法や手術範囲や予後を左右する。骨粗鬆症治療の第一選択薬であるビスフォスフォネート(BP)は、癌による骨量減少に対する有効な治療法としても注目されている。ところが、抜歯などの外科的侵襲を契機に顎骨壊死を引き起こす、ビスフォスフォネート関連顎骨壊死が知られ、原因としてBPによる破骨細胞の分化抑制が考えられる。そこで、BPによる破骨細胞の分化抑制とBPの効果調節を検討したところ、in vitroおよびin vivo実験にて薬剤添加にてBPによる破骨細胞の分化抑制の回避する可能性が示唆された。

研究課題に関連する研究成果一部を英文誌上にて発表した。外科系歯学臨床腫瘍学研究計画や予算に関しては申請書に準じて進める。また、これまでに得られた研究結果を踏まえ、詳細な検索を要すると判断した項目について追究する。計画の一部を前倒しにして研究成果を英文誌上で発表を行った。研究計画や予算に関しては申請書に準じて進めるが、計画を変更して平成26年度に移行させた“1)薬剤抵抗性口腔扁平上皮癌細胞株の樹立"を併せて展開する。また、平成25年度に得られた結果を踏まえて、さらに詳細な検索を要すると判断した箇所についても追究する。研究成果発表が国内の学会のみで行われたために学会出張旅費が計画より少額となった為。平成26年度は研究成果発表を国際学会で行うために学会出張旅費の一部として26年度分として請求する。
魚類の間腎腺における卵成熟誘起ステロイド産生機構

インドネシアナマズClarias batrachusは飼育条件下では排卵が起こらないが,外部からヒト絨毛性生殖腺刺激ホルモン(HCG)を投与することにより,人為的に排卵を起こすことができる.成熟雌にHCG(0.8IU/gB.W.)を投与後約14時間後の個体(3尾)および対照群から卵巣と間腎腺を摘出し,HCHを加えた培養液および加えていない培養液で各組織を12時間培養し,培養液中の17,20β,21-trihydroxy-4-pregnen-3-one(20β-S),17,20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one(17,20β-P),および17,20α-dihydroxy-4-pregnen-3-one(17,20α-P)を酵素免疫測定法で測定した.前もってHCGを投与した群では卵巣と間腎腺いずれの組織も20β-Sおよび17,20β-Pを産生したが,産生量は後者に比べ前者がはるかに多かった.培養液中へのHCGの添加は卵巣による両ステロイドの産生を増加させ,一方,間腎腺による産生を抑制した.17,20α-Pは間腎腺組織で産生が認められたが,卵巣組織では検出できなかった.以上から,本種の間腎腺は生殖腺刺激ホルモンの前処理により,通常のコルチコイド産生型から20β-S,17,20β-P,17,20α-Pなどの卵成熟誘起ステロイド産生型へ転換する可能性が示唆された.前二者のステロイドは卵巣においても産生されるが,外部からのHCG投与に対する反応性は間腎腺のそれとは異なっていた.本研究においては得られた間腎腺組織量が少なかったため,ステロイド産生系の変化が代謝系のどのレベルで起こっているかを確かめるには至らなかった.今後は充分な組織量を集めて間腎腺におけるステロイド代謝系,およびそれに対する生殖腺刺激ホルモンおよび副腎皮質刺激ホルモンの影響を詳細に調べる必要がある.インドネシアナマズと類縁関係がかなり離れたマコガレイとウミメダカにおいても排卵の前後で血中20β-S濃度の上昇が確かめられた.2β-Sは一種のコルチコイドでもあるため,これらの種でも卵成熟誘起ステロイド産生に間腎腺の関与が考えられる.インドネシアナマズClarias batrachusは飼育条件下では排卵が起こらないが,外部からヒト絨毛性生殖腺刺激ホルモン(HCG)を投与することにより,人為的に排卵を起こすことができる.成熟雌にHCG(0.8IU/gB.W.)を投与後約14時間後の個体(3尾)および対照群から卵巣と間腎腺を摘出し,HCHを加えた培養液および加えていない培養液で各組織を12時間培養し,培養液中の17,20β,21-trihydroxy-4-pregnen-3-one(20β-S),17,20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one(17,20β-P),および17,20α-dihydroxy-4-pregnen-3-one(17,20α-P)を酵素免疫測定法で測定した.前もってHCGを投与した群では卵巣と間腎腺いずれの組織も20β-Sおよび17,20β-Pを産生したが,産生量は後者に比べ前者がはるかに多かった.培養液中へのHCGの添加は卵巣による両ステロイドの産生を増加させ,一方,間腎腺による産生を抑制した.17,20α-Pは間腎腺組織で産生が認められたが,卵巣組織では検出できなかった.以上から,本種の間腎腺は生殖腺刺激ホルモンの前処理により,通常のコルチコイド産生型から20β-S,17,20β-P,17,20α-Pなどの卵成熟誘起ステロイド産生型へ転換する可能性が示唆された.前二者のステロイドは卵巣においても産生されるが,外部からのHCG投与に対する反応性は間腎腺のそれとは異なっていた.本研究においては得られた間腎腺組織量が少なかったため,ステロイド産生系の変化が代謝系のどのレベルで起こっているかを確かめるには至らなかった.今後は充分な組織量を集めて間腎腺におけるステロイド代謝系,およびそれに対する生殖腺刺激ホルモンおよび副腎皮質刺激ホルモンの影響を詳細に調べる必要がある.インドネシアナマズと類縁関係がかなり離れたマコガレイとウミメダカにおいても排卵の前後で血中20β-S濃度の上昇が確かめられた.2β-Sは一種のコルチコイドでもあるため,これらの種でも卵成熟誘起ステロイド産生に間腎腺の関与が考えられる.
水架橋エラストマーの開発

1.エピクロロヒドリンゴム(ECO)の水架橋アミノプロピルトリエトキシシラン(APS)と触媒としてのジラウリン酸ジn-ブチル錫(DBTDL)を配合したECOは、70°C水中6時間で、網目鎖密度が5×【10^(-4mol)】/【cm^3】に達し、水架橋が可能であることが判明した。また、最大7.0MPaの引張強さという優れた力学強度を示した。この水架橋エラストマーの他に見られない特性は、高いECOの親水性による、44%にも達する吸水性にある。2.塩素化ポリエチレン(CPE)の水架橋CPEに含まれる塩素の反応性の低さのため、DBTDLを配合してもなお、架橋効率が低く、この系では十分な網目鎖密度、力学強度を得ることはできなかった。3.クロロプレンゴム(CR)の水架橋APS及びDBTDLを配合したCRは、3×【10^(-4mol)】/【cm^3】の網目鎖密度、10MPaの引張強さを与え、水架橋によりCRエラストマーを得ることが可能であることが分った。しかしながら、この系では、水によらないCRとAPSの初期加硫が避けられず、強度低下の原因となっている。4.水架橋の総合的評価多種のハロゲンを有する高分子、1-クロロブタジエン-ブタジエン共重合体、塩素化ブチルゴム、臭素化ブチルゴム、クロロスルボン化ポリエチレン、エピクロロヒドリンゴム、クロロプレンゴムについて、APSを反応させることにより、水架橋が可能となり、従来の熱加硫架橋体に匹敵する強度の水架橋高分子エラストマーを与えることが判明した。それらの水架橋反応の詳細な検討によって、それぞれの高分子に最適の反応条件を与えることが可能となり、更に、シリカを配合することによって、化学結合性の強い補強効果を得た。以上の結果、水架橋は、熱加硫によらぬ容易な加工手段を提供する方法として実用化され得るという結論を得た。
アルツハイマー病におけるアポEの役割の解明：アポEノックアウトウサギを用いた研究

本研究では、血中の高コレステロール血症に伴う、脳の脈絡叢への泡沫細胞の蓄積と、脳内の神経原線維変化の進行がどのように変化するかを検討した。様々な高コレステロール血症の度合いの異なるウサギを用いて大動脈の動脈硬化を測定すると、高コレステロール暴露の期間が長い個体ほど動脈硬化の亢進が見られ、この程度と呼応して、脳の脈絡叢で、コレステロールを蓄えた泡沫細胞の蓄積と重度の個体ではコレステロール結晶の形成が見られた。また、アルツハイマー病の病理像をビルショウスキー染色により検討したところ、高コレステロール血症の程度の低いものから高いものにかけて、神経原線維変化が陽性の神経細胞が増加と、神経細胞の萎縮が、初期段階のアルツハイマー病と関連性の高い脳の部位、臭内皮質や海馬では進んでいたが、関連性の低い脳の部位、鼻周囲皮質や脳梁膨大後部皮質では進んでいないことがわかった。また、脈絡叢の泡沫細胞の蓄積と臭内皮質や海馬での神経原線維変化の間には正の相関があった。この研究の結果から、脈絡叢での泡沫細胞蓄積をアルツハイマー病の早期診断に役立てられる可能性がある。アルツハイマー病(AD)は高齢者に発病する進行性の病気で、治療法は確立されておらず、今後、高齢化社会においてその発病のメカニズムの解明や治療薬の開発は大変重要な課題である。高脂血症とADの相関が指摘されており、コレステロール食によく反応するウサギは高脂血症とADの関係を解明するのに適するモデルと考えられる。我々は、近年CRISPR-Cas9によって可能になった遺伝子改変技術を利用し、アルツハイマー病の危険因子と目されるアポE遺伝子をノックアウトしたウサギを用いて、コレステロール食によって誘発される脳内の病理像を解析した。まず、野生型のウサギにおいて、コレステロール食を摂取させると、脂質を内包したマクロファージである泡沫細胞が脈絡叢内に蓄積することを観察した。さらに、この泡沫細胞の蓄積はコレステロールの濃度依存的に増加することを定量した。野生型とアポE欠損を比べると、アポE欠損ウサギの脈絡叢で泡沫細胞がより増加する傾向にあった。これは、ADの病理像である神経原線維変化の増加が、コレステロール摂食下のアポE欠損ウサギで上昇していたことと関連していると思われる。脂質代謝とアポE,およびADの関係を今後も検討していきたい。また、in vitroでのAD解析法の開発をめざし、生後1日のウサギ脳からの神経細胞の分離、培養を試みた。その結果、ウサギ海馬からの神経細胞培養は、マウス海馬からの手法を応用して、ほぼマウス神経細胞と同等に培養に成功した。培養日数もほぼマウス神経細胞と同様であり、培養7日目には多数の錐体細胞およびシナプスと思われる構造が確認できた。動物舎内でウサギに感染症が発生したため、全頭処分となった。ノックアウトウサギの精子を凍結保存したものから現在、最初のF1動物4羽が生まれたところである。現在genotypingを行っている。本年度は、このF1世代から繁殖を行う予定。ウサギの脳において、アルツハイマー病の指標となる組織障害を半定量的に計測した。具体的には、ビルショウスキー染色を行い、アルツハイマー病に関連するとされる部位である海馬(歯状回、CA1領域、CA3領域)、嗅内皮質、脳梁膨大後部皮質における神経細胞核の長さを計測することにより、血中コレステロールに長期間暴露された個体では、神経細胞萎縮が促進することを明らかにした。これまで、疫学的には中年世代での高コレステロール血症と高齢になってからの認知症の発症の関連は言われてきたが、実験的に血中コレステロールの上昇と認知症、特にアルツハイマー病の病理学的組織障害像との関連は詳しく調べられていなかったが、今回の研究により、実験的な評価への道筋が示されたことは、上記の関連性を調べる上で重要だと考えられる。平成28年度に発生したウサギの感染症により、全頭屠殺とした経緯がり、平成29年度は保存していたApoEヘテロノックアウトウサギ精子から、野生型との交配を進め、さらにヘテロノックアウト同士の交配からホモノックアウトの実験群作製に勤めてきたが、個体数が確保できていないことから実験に至っていないため、当初の予定よりも遅れている。このため、平成29年度は、アッセイ法を確立し、精度を高める目的で、野生型にコレステロール食を与えた群や遺伝的にlow density lipoprotein受容体(LDLR)が欠損しているために血中コレステロールが上昇するWHHLウサギを用いて、ウサギ脳の評価を行った。

また、脈絡叢の泡沫細胞の蓄積と臭内皮質や海馬での神経原線維変化の間には正の相関があった。この研究の結果から、脈絡叢での泡沫細胞蓄積をアルツハイマー病の早期診断に役立てられる可能性がある。実験に使用できるノックアウトウサギが繁殖するまでには9か月ほどかかるが、その間、若年齢ノックアウトウサギの体重増加、摂餌量、血清コレステロール、中性脂肪、high density lipoporotein cholesterol (HDLC)などの基礎データを収集する。また、すでに解析中の野生型およびアポEノックアウトウサギ脳について、AD病理像となるAbeta1-42およびpTauの免疫染色を行う。さらに、脳内の脂質動向を明らかにするため、アポE、アポCIII、アポAIの免疫染色を行う。また、in vitroモデルを完成させるために、ウサギ脳からのアストロサイト初代培養を試みる。今年度はウサギApoEホモノックアウト(ApoEKO)の個体数の確保が見込まれる。まず、3か月齢に達した野生型およびApoEKOをグループ1野生型0%コレステロール食群、2野生型0.3%コレステロール食群、3 ApoEKO0%コレステロール食群、4 ApoEKO 0.3%コレステロール食群に分ける(雄、雌の数を各群一定になるように、かつ一群10羽となるように分ける)。各群、設定された食事を10週にわたり行う。血液を一週間ごとに採取し、総コレステロール値、中性脂肪値、high-density lipoprotein (HDL)値の測定、および肝機能のマーカーATL, AST, gammaGTP, LDH, ALPを測定する。餌の摂取量(24時間ごと)および体重(週ごと)を測定する。10週目には、脳サンプルの採取を行い、脳組織でのアルツハイマー型の病理変化の評価を行う予定である。