hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
「総合的な学習の時間」のための表現教育のカリキュラム開発研究

総合的学習における表現教育として、芸術教科である美術のなかで基礎的な造形の言語を造形の要素としてとらえ、教材開発とカリキュラムの考察を行った。光を造形素材としたライトパターンを基に造形の要素の視点から、発光機器の検討、色彩表現システムの開発、理念的な形の分類、色彩の配色調節、移動方法の多様化などを探求することによって、新たな視覚的造形を表現することができた。また演習の方法においても、基本的な学習から発展的な学習への系統性を図ることが可能となった。美術科をはじめとする芸術教科でも教科内容の充実と共に、総合的学習の観点からも表現教育の可能性が探求されている。本年度においては、芸術教科である美術科を表現教育として捉え、その大きな基盤の一つとなる「色彩」の要素を取り入れ有機的調和を可能とする教材、カリキュラムを検討することを目的として研究を行った。色彩教育は教育課程のなかの美術教育では、主にデザインの分野で行われている内容である。そして、構成(基礎造形)は本来デザインの分野だけでなく、造形全般を対象とした表現の基礎的内容を意味している。そして、その教育方法は体系的で分析的な特徴と、その上に直観的方法を持っている。これらを踏まえ、本年度は構成(基礎造形)の分野でも特に体系的な組織を形成している色彩を取り上げ、配色による表現感覚を育成するために日本色研配色体系(PCCS=Practical Color Co-ordinate System)を活用した教材とカリキュラムに関して研究を行った。PCCSは、配色調和を目的として開発された色彩体系である。PCCSの色相環は心理4原色を基本とした心理補色色相環であり、色料の3原色などを含み24色相で組み立てられている。この24という数字は、2、3、4を約数として含んでおり、2、3、4色の配色が規則的に選択できるようになっていることを把握した。そして、本年度においては、これらの学術調査および研究資料の収集、それらから得た知見および研究成果に基づき、各種の全国公募展、国際作品展、学会等にて作品発表を行った。総合的な学習の時間における表現教育として、芸術教科である美術表現のなかで重要な造形言語である「色彩」に関して、昨年度に引き続き教材開発およびカリキュラム研究を深めた。色彩構成において重視される内容は配色であり、美的表現・機能的表現などの表現が目的とされる。この配色の表現を通じて色彩についての学習が行われるのであるが、PCCSを用いた色彩構成の有効性として次のことが考えられた。先ず、芸術やデザインの表現では、独自の色彩感覚による主観的で個性的な配色の型をもつことも大切である。しかし総合的学習における表現教育のような幅広い表現を必要とする段階では、好みとする特定の色ばかりを使った配色や、特定の色関係ばかりに偏るのではなく、いろいろな配色を習得する必要がある。特にPCCSは配色調和を目的として編纂されており、色の関係を知り広い色域をベースに、偏りのない幅広い配色演習が可能であり色彩表現の幅を広げることができた。また、色の3属性で色を捉えると3つの要素(3次元空間)が必要であるが、色相とトーンなら2つの要素(平面上)であり、要素が少なく組み合わせを考える上で簡易であった。さらに、それぞれのトーンは言葉による固有のイメージをもっており、それを端緒として色彩計画を行うことができた。評価においても、良し悪しという感覚的なものだけでなく、客観的な理由付け(例えば、その色彩を選択決定した根拠等)が必要であり、色相・トーンの系統性や言葉によるトーンのイメージによって、その説明も可能となった。本年度においては、これらの学術調査および研究資料の収集、それらから獲得した知見および研究成果に基づき、各種の全国公募展、国際作品展、学会などにて教材開発およびカリキュラム研究としての作品発表を行った。総合的学習における表現教育の観点から、芸術教科である美術表現の中で「光」を活用した教材開発及びカリキュラム研究を行った。光は、形態や色彩、材質などと同様に重要な造形要素の一つである。色料の混色は減法混色であり、色光の混色は明度が高くなる加法混色である。造形素材としての光は、輝度の高い鮮やかな発色性という視覚的効果を持っている。光による研究では、今回はライトピクチャーを行った。ライトピクチャーの技法は、20世紀初頭の写真技術の普及や進展に伴い、また光が造形要素の一つとして認識されるようになってから、その造形的可能性が探究されてきた。例えば、バウハウスのモホリ=ナギ、またG.ケペッシュ、K.ゲルストナーがいる。日本では、高橋正人や山口正城により紹介され、万膳寛や太田順造などによってその作品が制作されている。そして、現代グラフィックデザインの分野においても、光が持つ美しさや変化などの視覚的効果に着目して、ポスターやエディトリアルなどの図版に採用されている。本研究では、ライトピクチャーの技法を実験することにより手法の一端を明らかにし、表現教育における造形要素の新しい方法を創作するための端緒とすることにあった。本年度では研究資料の収集及び学術調査、そこから得た知見及び実験制作に基づき、各種の全国公募展、国際学術大会作品展、学会などにて教材開発及びカリキュラム研究としての作品発表を行った。ライトピクチャーの本実験を開始する前に、予備実験を調査した。基本的な原理は、暗闇の中で光の軌跡を記録することである。この前提で、下記の方法を考察した。1動的な光源を撮影する方法=夜景や自動車のライトなどの動きを記録するものである。

撮影場所によって、光源の大小や様々な色彩表現や動きを記録することができ、意外な効果を獲得することができる。しかし、偶然性に因る、表現が類似する、輝度等がコントロールできないなどの課題がある。2花火による方法=小さい点、細い線、有機的な曲線などによるいろいろな色彩や動きがあり、意外な視覚的効果がある。しかし発火点と消火点が一定しないこと、ピントや適性露出を適合できないことなどの課題があった。3カメラを固定し、暗室の中での発光器の動きを記録する。動きを持つ機材(例えば玩具類)や人体に発光器を装着して、その動きや動作を点光源の流れで記録する方法である。この表現では、視覚的印象が限定されやすい傾向がある。4ペンライトによる方法=発光器の形状や移動方法によって、多様な変化が生まれ、躍動感のある美しいパターンを作成することができる。また同様の方法にて、具象的表現を行うことも可能であり、様々な形象を得ることができる。このような実験考察を行った結果、本研究課題である総合的学習における表現教育について、おおむね順調に進展しているといえる。総合的な芸術表現である美術教育のなかで、光を造形素材とした教材の検討とカリキュラムの考察を行った。ライトピクチャーは発光する光を活用した表現である。その多くは、これまで継時した発光による機器を用いることがほとんどであった。今回は、形や移動などを分明して検討する見地から、非連続による発光器を活用したライトピクチャーを実施した。先ず非連続による発光器の図形として、最も効果的なラインによる光の形を実験した。ラインでは、直線の組立と数的な規則を持った曲線の2つに大別した。次に矩形では正四角形、正三角形、正円を基本とした。それぞれに矩形は独立した印象を与えるものである。また矩形相互の組合せも行った。ドットについては、同じ大きさの編成によるものと大小のサイズによる編成の二つを実施した。本年度では研究資料の収集や学術調査、そしてそれらに基づく実験制作を行い各種の全国公募展、国際企画招待展などにて教材の開発及びカリキュラム研究の成果としての作品の発表を実施した。設定した光の形の移動については、画面の天部と底部に集中する移動、画面の天部あるいは底部に集中する移動、天部から底部に流れていく移動、右寄りあるいは左寄りから逆方向に流れていく移動、画面の真ん中から周辺部あるいは周辺部から真ん中に回っていく移動、さらに移動の向きを限定せずに自由に移動するなどを実施した。なお光の形は不規則形体や無機的形体は用いなかった。そして光の形において横への移動は平坦な感じとなり落ち着いた印象と持ち、その力が強いと圧縮となる。また鉛直の移動は天部あるは底部への向きが強くなり、その力が強いと中核となる。傾斜の移動は変位の感じとなる。また光の形が細かく簡潔であった場合は、特有な図形も現れた。以上のようなライトピクチャーにおける形と移動に関する考察を行ったが、色光については実験することができなかったため順調に進展しているとはいえない。
食物によるアルミニウムの経口摂取量

平成7年度科学研究費補助金では、アルミ鍋からのアルミニウム溶出に及ぼす溶液の影響について調べ、溶出量は酸性溶液で多くなり、酸の種類にも影響されることを明らかにした。2%の酢酸、リンゴ酸、及びクエン酸のそれぞれの溶出量は、100cm^2当たり4.2mgと酢酸が最も多く、リンゴ酸、クエン酸では少なかった。また、酢酸の場合、溶出量は試料温度とともに指数関数的に増えることがわかった。さらに、標準的な食物の調理にアルミ鍋を使用した場合に、鍋から溶出する量も含めて、1人1食分に含まれるアルミニウムの量を調べた。その結果、米飯185g、ポ-クビーンズ163g及び五目豆244gを1食分とした場合、3.4mgのアルミニウムを摂取することになることがわかった。また、食品原材料の中には、鶏の手羽肉のように、100g当たり1.3mgものアルミニウムを含んでいるものがあることも明らかになった。このことを踏まえて、平成8年度科学研究費補助金では、食物の他にも、日常の食物によく使用される食品に含まれるアルミニウムの量の測定に重点をおいた。食品30種について測定した100g当たりのアルミニウム含量を畜肉、魚類、農産物それぞれに分けて平均すると、畜肉の平均アルミニウム含量は2.2mg、魚類では2.4mg、農産物では、葉菜類の平均含量が5.3mgと最も多く、次いで大豆の4.5mg、果菜類0.93mg、根茎菜類0.63mgであった。昨年度は、アルミ鍋からのアルミニウム(Al)の溶出に及ぼす溶液の影響について調べ、Alは酸性溶液で多くなり、酸の種類により影響されること明らかにした。本年度は、アルミ鍋を用い標準的なメニューの食物を調理することで、鍋からAlがどれだけ食物に溶出するかを調べた。今回調理した食物は、米飯、ポ-クビーンズ、五目豆で、市販の材料を用い、標準的な方法により調理した。アルミ鍋は直径16cmの市販の片手鍋を調理別に使用した。Alの測定試料の調製は、それぞれの原料および調理した食物を液体窒素で凍結粉砕し、粉末試料を550°Cで灰化した。トマトケチャップ、しょうゆ、砂糖は、そのままルツボに入れ灰化した。灰化試料は、塩酸(6N)、塩化ランタン(1.5%)溶液に溶かし分析試料として、直接ICP(セイコ-SPS 1500 VR)で分析定量した。以下に結果を簡単に記す。使用した原材料でAlを最も多く含有していたのは、とり手羽肉の1,262μg/100g f.wt.、最も少ないのは大豆の22.6μg/100g f.wt.であった。調理した食物中のAl含量は、米飯の22.3μg/100gf.wt.五目豆の544μg/100gf.wt.ポ-クビーンズの1,245μg/100g f.wt.と、トマトケチャップのような酸性調味料で調理した食物にAlの多く含有することがわかった。これは、前年度の結果からも明らかなうに、アルミ鍋からのAlが溶出したことによるものであるが、鍋からのAlは大豆や豚肉への移行はほとんど見られず、煮汁中に留まっていた。また、材料中のAlも調理によりあまり溶出されないことも明らかになった。これらの結果から、1人当りの食物の摂取量に含まれるAlは、米飯の41μg、ポ-クビーンズの2,029μg、五目豆の1,327μgで、1食当りの総摂取量は3,397μgであることがわかった。平成6年度には、アルミ鍋からのアルミニウム(Al)溶出に及ぼす溶液の影響について調べ、Al溶出量は酸性溶液で多くなり、酸の種類にも影響されることを明らかにした。

これを基礎データとして、平成7年度には、標準的な食物の調理にアルミ鍋を使用した場合に、鍋から溶出する量も含めて、1人1食分に含まれるAlの量を調べた。その結果、米飯185g,ポ-クビーンズ163g及び五目豆244gを1食分とした場合、3.4mgのAlを摂取することになることがわかった。また、食品原材料のなかには、とりの手羽肉のように、100g当たり1.3mgものAlを含んでいるものがあることも明らかになった。このことを踏まえて、平成8年度には、食物の他にも、日常の食物によく使用される食品に含まれるAlの量の測定に重点をおいた。100g当たりのAl含量で表すと、肉類では、鶏肉と牛肉がほぼ同じ2.8mg、豚肉が0.7mgとやや少なかった。魚類では、メザシが4.5mg、養殖ハマチが3.0mgであったが、塩鯖は0.5mgと少なかった。沿岸漁業の産物にAl含量が高いのは、餌によるものと考えられるが、この点は今後の課題である。植物性食品については、根菜類では、ニンジン、サトイモが1.5mg、サツマイモ、ダイコン、ゴボウ、カブラは0.70.2mgと一桁小さくなり、ジャガイモでは0.01mgとさらに小さくなった。また、タマネギ、タケノコでは検出限界以下であった。葉菜類の測定したものの中では、ホウレンソウの17.1mgが最も高く、ついで、ミズナ7.0mg、コマツナ5.7mg、ネギ2.9mg、ダイコン葉1.5mg、カブラ葉0.6mgの順であった。果菜類では、多いものからキュウリ1.9mg、トマト1.6mg、ナス0.2mgの順であった。植物性食品では、地中に成育する根菜類よりも、ホウレンソウなどの葉菜類にAl含量の高いもののあることが明らかになった。
センシングデバイスとしてのロボットフィンガ「センシングフィンガ」の開発

多数のセンサが埋め込まれた「センシングマネキン」および「センシングフィンガ」試作機を開発し,実験の結果から腱張力が人の感じる持ちやすさを定量評価する指標として有効であることを発見した.また拇指と示指の腱骨格モデルを構築し,腱張力を推定できるシミュレータを開発し,腱張力推定に基づく持ちやすさ評価指標を提案した.実験の結果,提案指標が人のアンケート結果とよく一致することを確認した.多数のセンサが埋め込まれた「センシングマネキン」および「センシングフィンガ」試作機を開発し,実験の結果から腱張力が人の感じる持ちやすさを定量評価する指標として有効であることを発見した.また拇指と示指の腱骨格モデルを構築し,腱張力を推定できるシミュレータを開発し,腱張力推定に基づく持ちやすさ評価指標を提案した.実験の結果,提案指標が人のアンケート結果とよく一致することを確認した.1.センシングマネキンの製作市販の関節可動型模型を骨格として利用し,指関節を腱を模したワイヤにより駆動することが可能なセンシングマネキンのプロトタイプを製作した.腱にはモータが接続されており,モータのトルク計測機能を用いることで物体を把握したときの腱張力を計測することが可能である.実験では20mm100mmの幅を持つシリンダをセンシングマネキンにより把持させ,指の姿勢によってどのような腱張力が発生しているのかを調べた.実験の結果, 60mm付近の物体を把持したときに腱張力の合計が最も小さくなる傾向を確認した.2.異なる幅のシリンダを把持したときの感性アンケート20100[mm]の異なる幅をもつシリンダを被験者に把持してもらい,どの把持幅がもっとも持ちやすいと感じるかをアンケート評価した.実験の結果,重さによらず60mm付近の幅を最も持ちやすいと判断する傾向を確認した.またそのときの筋電値を計測したところ,筋電積分値の合計が60mm付近のシリンダを把持したときに最も小さくなる傾向を確認した.3.シミュレーションによる姿勢と腱張力の関係簡単な指の腱骨格モデルを製作し,指姿勢と腱張力の関係を考察した.実験の結果, 60mm付近の幅の物体を把持したとき,腱張力の合計値がもっとも小さく傾向を確認した.これはセンシングマネキンおよび感性アンケートの結果と一致しており,腱張力が人の感じる持ちやすさを定量評価する指標として有効であることが示唆された.1.拇指と示指の腱骨格モデルの構築示指はMP関節2自由度,PIP関節1自由度,DIP関節1自由度の計4自由度,拇指はCM関節2自由度,MP関節2自由度,IP関節1自由度の計5自由度を持ち,人の生理学的知見を元に示指は7つ腱,拇指は9つの腱によって駆動されるとした.2.腱張力推定に基づく持ちやすさ評価指標の検討指先力6自由度を示指7,拇指9の腱張力で制御するため,指先力から腱張力を決定する問題は不良設定問題となる.そこでCrowninshieldらの提案する筋力最適化計算の条件式を用いて腱張力を計算した.またこれまでの知見などから,計算された腱張力を用いて筋力の発揮割合の平均値が少ないほど人にとって持ちやすい姿勢であると考え,持ちやすさを定量的に示す指標を提案した.3.シミュレーション結果とアンケート結果比較による指標妥当性の評価20mmから100mmまでの円筒形物体を示指と拇指でつまむ動作を通じて,人の感じる主観的な持ちやすさの感覚と,提案手法によって出力される持ちやすさ定量化のスコア値の間に関連性について評価した.被験者の筋電計測とアンケート評価の結果,60mm付近が持ちやすい姿勢と人が感じることが明らかになったのに対し,シミュレーション実験により定量化指標も同様の結果を示したことから,提案手法の妥当性が示された.4.センシングフィンガ試作機の設計・製作指先力,関節トルクなどといった,定量化指標を求めるために必要となるセンサ情報を計測できる人間サイズのセンシングフィンガ試作機の設計および製作を行った.試作機は2本指により構成され,つまみ動作が可能な形状を持つ.センサを付加することにより力やトルク,指の姿勢を計測可能であり,実験の結果明らかになった定量化指標を算出するのに必要な情報をセンシング可能である.
在宅と施設における高齢者介護に従事する者の介護負担に関する要因の分析

1対象者週5日以上勤務する、山口県内の6市1町のヘルパーと3か所の特別養護老人ホームの寮母にそれぞれ調査票を送り、郵送で個人ごとに回収した。有効回答はヘルパー91名(以下H群)、寮母60名(同R群)で、全員女性であった。H群では40歳代が53名と最も多く、つぎに50歳代(21名)であった。R群では20歳代が多く(25名)、次が50歳代(17名)であった。平均年齢はH群45.5±6.7、R群37.3±13.3とH群が高い。2結果(1)「自覚症状しらべ」ではH群では作業前の訴え率が9.8%、作業後が20.8%であったが、R群では作業前19.3%、作業後32.6%とR群がH群より高い。訴えのパターンはH群ではI>II>IIIで精神作業型を示した。また、R群ではI>III>IIで一般型を示した。(2)「蓄積的疲労徴候調査(以下CFSI)」ではH群は越河のいうところの「慢性疲労」項目の訴えが高く34.6%であり、「一般的疲労感」「身体不調」「抑うつ感」「気力の減退」がそれぞれ31.7%、30.0%、26.3%、24.6%であった。R群では「慢性疲労」項目の訴え率が44.5%で、「一般的疲労感」「抑うつ感」「不安感」「気力の減退」が44.1%、31.4%、31.3%、28.3%と続いた。H群では回答者の年齢がR群に比べて高いにも関わらず、CFSIの訴え率が低いことは、ヘルパーという職業での作業負担は作業全体では寮母に比べて軽いことを示している。(3)ヘルパーの職業に対する満足度を60%以下と答えたヘルパーをH1群(37名平均年齢44.5±6.0)、70%以上と答えたヘルパーをH2群(49名、同46.4±6.4)として検討してみると、自覚症状しらべ、CFSIともにH2群に比べてH1群で訴え率が高く、H1群では、I>II>IIIの精神作業型を示す一方で、「慢性疲労」「一般的疲労」「抑うつ感」「気力の減退」「不安感」の項目の訴え率が30%を越えており、R群とほぼ同じ程度の疲労を持つことがわかった。
肝の発生および病体における類洞内皮細胞の機能変化

肝は類洞と呼ばれる特殊な機能毛細血管構造を有しており、このような構造が肝の機能の発現に密に関連している。本研究では、われわれの作製したラット肝類洞内皮細胞を特異的に認識するSE-1抗体を用い、肝の発生過程における類洞の形成機構、および低酸素状態による肝障害の発生と類洞内皮の変化について解析した。1.肝発生過程における類洞形成体勢3日目から21日目までのラット胎孔肝を用い、蛍光抗体法によりSE-1の発現を検討した。SE-1陽性細胞は体勢5日目の肝で初めて認められ、その後、胎齢の進展に伴い陽性蛍光はその数や長さが増加し、互いにつながり、胎生20日目以降では成熟ラット肝とほぼ同様の陽性パターンを示した。発生初期肝の血管系として、肝には太い卵黄嚢静脈が認められる。SE-1陽性の初期類洞は、このような卵黄嚢静脈との関連ははっきりせず、未熟な肝実質内に独立して形成されることが示唆された。免疫電顕による観察では、胎生14日目の肝で既にSE-1弱陽性の未分化な類洞内皮が存在することが確認された。また肝細胞の成熟や直接的な関連によりSE-1の発現がより強くることから、SE-1の発現が肝細胞により直接的に調節されている可能性が考えられた。2.病態における類洞内皮の機能変化低酸素状態における肝機能障害発生の機序について明らかにする目的で、SE-1抗体とTunel法を組み合わせて内皮細胞のアポトーシスを検討した。実験的な低酸素下条件では、肝細胞内に活性酸素が形成され、それにより類洞内皮細胞が選択的にアポトーシスに陥ることが示された。したがって、低酸素状態における肝障害の発生には類洞内皮のアポトーシスが関与している可能性が考えられる。ラット胎仔肝(妊娠13日目から21日目まで)を用い、肝発生過程における類洞構造の形成と類洞内皮の機能分化について検索した。類洞内皮の機能分化のマーカーとして、われわれの開発したラット類洞内皮特異的SE-1抗体、およびFactor VIII関連抗原(FVIII)抗体を用い、それらの発現を蛍光抗体法、免疫電顕により観察した。胎齢13日目の肝では、卵黄静脈に由来する血管網が認められるが、それらの内皮細胞はSE-1抗原、FVIIIいずれも陰性であった。SE-1抗原の発現は、胎齢1415日目にかけて類洞様構造の形成にほぼ一致して散在性に認められた。免疫電顕によっても、15日目で一部にSE-1抗原陽性を示す類洞内皮細胞の存在が認められた。SE-1の陽性蛍光は胎齢の経過に伴い伸展かつ連続し、21日目では成熟ラット肝とほぼ同様の発現を示した。一方、FVIIIは15日目の肝で卵黄静脈由来と思われる太い血管内皮に発現しており、SE-1抗原陽性の類洞内皮との直接的な連続は認められなかった。肝類洞構造の形成が、いつ、どのように起こるかについては現在まではほとんど報告されておらず不明の点が多いが、以下の2つの可能性が考えられる。1)卵黄静脈から内皮細胞が肝実質内に伸展することにより形成される可能性。2)肝実質内に未分化な内皮細胞が造血細胞とともに存在し、既存の卵黄静脈とは独立して形成される可能性。今回のわれわれの結果からは2)の可能性がつよく示唆されるが、さらに詳細な免疫電顕的検索が必要と思われた。

また、SE-1抗体による免疫電顕により、SE-1抗原陽性の内皮は肝細胞と密に接していることが示され、類洞内皮細胞の機能分化には肝細胞との相互作用が重要であることも示唆された。肝は類洞と呼ばれる特殊な機能毛細血管構造を有しており、このような構造が肝の機能の発現に密に関連している。本研究では、われわれの作製したラット肝類洞内皮細胞を特異的に認識するSE-1抗体を用い、肝の発生過程における類洞の形成機構、および低酸素状態による肝障害の発生と類洞内皮の変化について解析した。1.肝発生過程における類洞形成胎生13日目から21日目までのラット胎仔肝を用い、蛍光抗体法によりSE-1の発現を検討した。SE-1陽性細胞は胎生15日目の肝で初めて認められ、その後、胎齢の進展に伴い陽性蛍光はその数や長さが増加し、互いにつながり、胎生20日目以降では成熟ラット肝とほぼ同様の陽性パターンを示した。発生初期肝の血管系として、肝には太い卵黄嚢静脈が認められる。SE-1陽性の初期類洞は、このような卵黄嚢静脈との関連ははっきりせず、未熟な肝実質内に独立して形成されることが示唆された。免疫電顕による観察では、胎生14日目の肝で既にSE-1弱陽性の未分化な類洞内皮が存在することが確認された。また肝細胞の成熟や直接的な関連によりSE-1の発現がより強くることから、SE-1の発現が肝細胞により直接的に調節されている可能性が考えられた。2.病態における類洞内皮の機能変化低酸素状態における肝機能障害発生の機序について明らかにする目的で、SE-1抗体とTunel法を組み合わせて内皮細胞のアポトーシスを検討した。実験的な低酸素下条件では、肝細胞内に活性酸素が形成され、それにより類洞内皮細胞が選択的にアポトーシスに陥ることが示された。したがって、低酸素状態における肝障害の発生には類洞内皮のアポトーシスが関与している可能性が考えられる。
ダイヤモンド中の単一ＮＶ中心による量子系の初期化と量子標準限界を超えた測定の実証

ノイズの影響を抑えた量子系の確立は微小磁場の検出において非常に重要な意味を持つ。課題の実現へ向け我々は電子スピンと核スピンとの量子ハイブリッド系に着目した。核スピンは外界との相互作用が非常に弱く、電子スピンに比べ桁違いに長い量子状態の保持時間を持つことから量子メモリーとしての役割が期待される。一方で核スピンは外界との相互作用の弱さから量子制御に要する時間(ゲート時間)が非常に長いという課題があった。これに対し我々は、電子スピンの操作性と核スピンの量子メモリーとしての特性を利用した核スピンの高速制御法を理論的に提案している。この手法では電子スピンと核スピンとの量子力学的な相関を利用することで、制御の際に電子スピンが獲得した情報を核スピンへ移すことが可能である。現在投稿中の論文の内容では、この高速制御法による核スピンのゲート時間は原理的には既存の手法に比べ桁違いに短いことを示している。この手法を応用することで、電子スピンを介して微小磁場の信号を核スピンの量子状態に高速で反映させることが可能である。また、現在は上記の理論提案の実証に向けた初期段階の実験について投稿準備中である。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では単一格子欠陥(nitrogen-vacancy (NV)中心)中の電子スピンと核スピンを用いた微小磁場測定を目指している。このような量子系を用いた測定において量子系の初期化、周囲からのノイズを抑えた測定は共に重要な意味を持つ。前年度の研究ではこれらの課題に実験、理論の両面から取り組んだ。以下にその報告をする。(1)量子系の初期化に向けた実験不完全な量子系の初期化は「測定に使う初状態が確率的にしか得られない」という問題の他に「制御や検出の操作にもエラーが生じる」といった問題を起こす要因となる。そのため量子系の初期化は本研究において重要な位置づけにある。NV中心の電子スピンは光励起により容易に実現できるのに対し、核スピンの初期化には電子スピンを介したスピン状態の初期化が必要である。前年度は制御性の良さから電子スピンと核スピンとの結合が比較的大きな量子系を用いたが十分な成果は上がらなかった。これは結行強度が強すぎるため電子スピンを初期化する際に核スピンにノイズが入ったことが原因と考えられる。今後は電子スピンと核スピンとの結合を抑えた量子系での実証を試みる。(2)周囲からのノイズを抑えた微小磁気測定の理論提案ノイズを抑えた測定手法の確立は微小磁場の信号が周囲からのノイズの信号強度以下の場合非常に重要な意味を持つ。このノイズの原因には「測定時間と測定対象の持つ信号の間の不確定性」といった量子系の性質からくる要因や「測定器の機械的な動き」等の技術的な要因などが考えられる。前年度の理論研究では、これらのノイズがたとえ微小磁場からの信号よりも大きなものであったとしても電子スピンと核スピン間の量子力学的な干渉を用いることで実効的に抑えることが可能なことがわかった。今後の研究では本手法の実証を目指す。本研究では単一格子欠陥(nitrogen-vacancy(NV)中心)中の電子スピンと核スピンを用いた微小磁場測定を目指している。(1)量子系の初期化に向けた実験は不完全な量子系の初期化は量子制御や検出操作の際にエラーが生じる要因となる。NV中心の電子スピンは光励起により容易に初期化できるのに対し、核スピンの初期化には電子スピンを介したスピン状態の初期化が必要である。先行研究では電子スピンを初期化する際に起こる核スピンへのノイズの影響を抑えるため高磁場下で電子スピンとの結合が弱い核スピンを用いた実験が必要と報告されている。前年度は新たに高磁場での実験装置の立ち上げを行った。今年度は研究室内で電子スピンとの結合が弱い核スピンを用いて量子系での初期化の実証を試みる。(2)周囲からのノイズを抑えた微小磁気測定の理論提案理論研究としては微小磁場の高感度測定手法の提案を行っている。ノイズを抑えた測定手法の確立は微小磁場の信号が周囲からのノイズの信号強度以下の場合非常に重要な意味を持つ。我々の新たに提案する手法では量子力学特有のゆらぎの効果を利用することで、環境の微小な変化からくるノイズが測定感度の上限を決めている場合に、その上限を超えた測定が可能となる。また、上記の理論提案の成果は論文投稿へ向け現在執筆を進めている。

現在投稿中の論文の内容では、この高速制御法による核スピンのゲート時間は原理的には既存の手法に比べ桁違いに短いことを示している。この手法を応用することで、電子スピンを介して微小磁場の信号を核スピンの量子状態に高速で反映させることが可能である。また、現在は上記の理論提案の実証に向けた初期段階の実験について投稿準備中である。研究課題の実現に向けた進展として、量子系初期化の実験は現状では十分な成果はないが先行研究との比較から対策は練られているため実現に向け大きな課題はないと考えられる。また理論面での研究においては、外部の研究者との活発な議論を通し研究課題の実現に向けた新しい実験手法を提案した。今回新たに提案した手法は電子スピンを用いた磁気測定では前例がなく十分な成果と言える。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は量子系の実験と初期化と微小磁気測定に関する理論の執筆を目指す。実験的検証では前年度に立ち上げた高磁場での実験装置を用いて量子系での初期化の実証を試みる。ノイズ磁場下での磁気測定の理論提案に関しては現在投稿へ向けた準備を行っている。量子系初期化の実験は現状では十分な成果はないが、先行研究との比較から対策は練られているため実現に向け大きな課題はないと考えられる。また理論面での研究においては、今回新たに提案する手法は電子スピンを用いた磁気測定では前例がなく十分な成果と考えられる。本年度は量子系の初期化と前年度に理論提案した磁気測定の定証を目指す。研究計画書では本年度はノイズ磁場を用いた量子系の初期化を行うとあったが、新たに理論提案した磁気測定の実現を目指すため、まずは先行研究で挙げられた手法での量子系の初期化を行う。また、従来の手法で得た量子系初期化の知織は次年度に行うノイズ磁場を用いた量子系の初期化の実現に向け重要な意義を持つ。
高度の縮合構造を有するリグニンの機能性物質への化学的変換に関する研究

高度の縮合構造を有するリグニンとして硫酸リグニン(Sulfuric acid lignin:SAL)を選出し、機能性物質としてのリグノスルホン酸への化学的変換を検討した。リグノスルホン酸は高度の分散性と粘結性を有し、現在最も利用されているリグニンケミカルズである。SALは活性な官能基量の少ない高分子リグニンである。それ故に、SALを機能性物質に変換するためには、低分子化による溶解性の向上と活性化が必要である。SALの低分子化と活性化のためにフェノール化を行い、フェノール化SALを得た。次いで、スルホン化に対して活性なベンジルヒドロキシル基を導入するためにホルムアルデヒドによるヒドロキシメチル化を行った。最終段階として、中性サルファイト処理により定量的に可溶性リグノスルホン酸を調製した。市販品との分子量分布やスルホン酸基量の比較から、今回新たに調製したリグニンスルホン酸はほぼ同程度の機能を有するものと期待される。上記における種々の反応の反応機構および副反応について詳細に検討するために、β-アリールエーテル結合を有するリグニンモデル化合物を用いて検討した。その結果、以下のことが明らかになった。(1)縮合型構造の優先的なフェノール化、(2)高温(120°C)でのヒドロキシメチル化における二次的なジアリールメタン構造の生成、(3)ヒドロキシメチル化におけるグアヤシル核のパラ-ヒドロキシフェニル核より高い反応性、(4)高収率のスルホン化反応である。縮合構造の多いリグニンとしては圧縮あて材リグニン、アルカリリンニン、酸リグニンなどが代表的であるが、本研究では最も高度の縮合構造を有する硫酸リグニン(SAL)を試料として選んだ。SALは一般的な無機、有機溶剤に不溶であり、その主な理由は酸処理による高分子化と極性官能基の減少による。SALを均一な反応条件のもとで他の物質へ化学変換するためには、リグニンの活性化を伴った低分子化による可溶化が必要である。モデル化合物を用いた基礎研究からフェノール化が有望であると考えられた。事実、硫酸触媒によるSALのフェノール化により、有機溶媒に可溶な物質(フェノール化SAL)に変換可能であった。現在、リグニンケミカルスとして最も利用されている物質は、分散性や粘結性に優れた性質をもつリグノスルホン酸である。この物質はリグニン側鎖α位をスルホン化することにより製造されている。フェノール化SALは側鎖α位の水酸基がフェノールで置換されているために、スルホン化を行うためには反応生に富む官能基の新たに導入が必要である。本研究ではホルムアルデヒドによるヒドロキシメチル化を行った。次いで、中性サルファイト処理により定量的に可溶性リグノスルホン酸を得た。市販品との分子量分布やスルホン酸基量の比較から、ほぼ同程度の機能が期待される。また、フェノール化SALは接着剤や樹脂などのフェーノル原料としても利用可能であろう。ヒドロキシメチル化およびスルホン化についての反応機構は、簡単なリグニンマデル化合物を用いて検討した。高度の縮合構造を有するリグニンそれ自体の機能性物質であるリグノスルホン酸への変換が可能であることが、前年度の研究で明らかにされた。本年度はそれらの反応中における生成物の種類や反応機構を明きらかにするために、縮合型リグニンモデル化合物を用いて検討した。リグニンスルホン酸のNMRスペクトルは、通常そのメチル化体について測定されるが、スルホン酸塩の状態で測定の可能性およびスルホン化物の精製についての知見を得るために、初めにより簡単な化合物をモデルとした。その結果、スルホン化前の段階で単一の化合物を用いれば単離が容易であり、またスルホン酸塩でのスペクトル測定でも構造について期待する情報が得られることが明らかになった。リグニンモデル化合物としてグアヤシルグリセロール-β-グアヤシルエーテルを合成し、そのフェノール化物(P-SAL)を用いて実験を行った。P-

SALのホルムアルデヒドによるヒドロキシメチル化は3種の化合物を与え、当然のことながらより高温での反応や反応時間の延長は3置換体の増加をもたらした。さらなる強い反応条件下では、二次的な縮合物であるジアリールメタン構造の生成が示唆された。ヒドロキシメチル化物の中性サルファイト処理は高収率で対応するスルホン化物を生成することが明きらかになった。
両生類切断肢再生組織における発現遺伝子の時系列解析:切断足再生のための基礎的検討

申請者らは、足切断患者の足を再生させること、すなわち足部切断面の幹細胞を活性化して骨、軟骨、靭帯、筋、腱、神経をそれぞれ誘導し、各組織を再構築することにより機能する足を再建する方法の確立を究極の目的としている。本申請における研究では、そのための基礎的検討として、切断肢の再生能力を持つ両生類に着目し、切断肢断端における組織再生過程におけるたんばく質発現様式を詳細に解析することを目的とした。平成19年度は、平成17、18年度に確立された実験システム、麻酔を用いての切断方法、その組織片の採取方法およびその変化を記録するプロトコールをもとに、切断実験を行った。イモリの四肢に冷却麻酔を施し、後に、後肢の切断術を施行した。術直後、24時間後、4日後にイモリに対して過量麻酔薬吸入で安楽死をさせた。こののち、切断端に形成された再生肢を採取した。得られた再生肢から、その切断端から2mmごとに組織を抽出してその細胞に対してin situハイブリダイゼーションを行い、トランスフェリン、TGFβ1、FGF(Fibroblast growth factor)がどの程度発現が行われているのかを検討した。その結果、トランスフェリンは、術直後に1.14mg/Lであったものが24時間後、4日後には0.06mg/L以下であった。TGFβ1は、いずれも0.50ng/mL以下であった。これに対して、FGFは、切断直後に10pg/mL以下であったものが、24時間後に15pg/mL、4日後に16pg/mLと増量してきていた。このことから、有尾両生類の切断肢組織再生過程の初期において、FGFが重要な働きをしていることが示唆された。本申請における研究では、そのための基礎的検討として、切断肢の再生能力を持つ両生類に着目し、切断肢断端における組織再生過程における遺伝子発現様式を詳細に解析することを目的とする。両生類の切断肢組織再生過程で発現する遺伝子を同定した後、哺乳類(マウス、ラット)の切断肢の断端におけるそれら遺伝子の発現様式を観察するとともに、それら遺伝子を強制発現させるための方策を検討すること目的とした。平成17年度においては、有尾目両生類(イモリ)の下肢を切断し、切断端に形成された再生芽の中で増殖因子として中心的役割を担っていると考えられるapical epidermal capのDNAを注目した。すなわち、成熟イモリを対象とし、エーテル吸入による全身麻酔下あるいは四肢冷却による局所麻酔下で前肢あるいは後肢の切断を行った。切断の直後、6時間後、12時間後、24時間後、2、3、4、5日後、1週後、2週後、3週後の各ステージにおいて、イモリを過量麻酔薬吸入で安楽死させた後、下肢断端部の組織を採取し、その変化を記録するプロトコールに従い、実験を実施中である。まず、四肢切断前イモリの飼育における最適な条件(水質、温度、餌、水槽あたりの固体数)、切断方法、切断端への感染防止対策について徹底した検討を行った。その結果、これら飼育条件、切断方法、切断端への感染防止法を確立しえたので、現在は、切断後の各ステージにおける切断端部の変化の記録(四肢運動能力のデジタルビデオ記録、それらのコンピュータでの記録・解析も含む)、組織採取の実験を実施・継続中である。本申請における研究では、そのための基礎的検討として、切断肢の再生能力を持つ両生類に着目し、切断肢断端における組織再生過程における遺伝子発現様:式を詳細に解析することを目的とする。平成18年度は、平成17年度に確立された実験システム、麻酔を用いての切断方法、その組織片の採取方法およびその変化を記録するプロトコールをもとに、切断実験を行った。イモリの四肢に冷却麻酔を施し、後に、前肢および後肢の切断術を施行した。術後、6時間後、12時間後、24時間後、2日後,3日後,4日後、5日後、1週後,2週後,3週後、1ヶ月後、2ヶ月後、3ヶ月後、4ヶ月後、5ヶ月後、6ヶ月後にイモリに対して過量麻酔薬吸入で安楽死をさせた。得られた再生肢から、その切断端から2mmごとに組織を抽出し、どの部位でいかなる様式で組織の再生が起こっているかを詳細に検討した。

本申請における研究では、そのための基礎的検討として、切断肢の再生能力を持つ両生類に着目し、切断肢断端における組織再生過程におけるたんばく質発現様式を詳細に解析することを目的とした。平成19年度は、平成17、18年度に確立された実験システム、麻酔を用いての切断方法、その組織片の採取方法およびその変化を記録するプロトコールをもとに、切断実験を行った。イモリの四肢に冷却麻酔を施し、後に、後肢の切断術を施行した。術直後、24時間後、4日後にイモリに対して過量麻酔薬吸入で安楽死をさせた。こののち、切断端に形成された再生肢を採取した。得られた再生肢から、その切断端から2mmごとに組織を抽出してその細胞に対してin situハイブリダイゼーションを行い、トランスフェリン、TGFβ1、FGF(Fibroblast growth factor)がどの程度発現が行われているのかを検討した。その結果、トランスフェリンは、術直後に1.14mg/Lであったものが24時間後、4日後には0.06mg/L以下であった。TGFβ1は、いずれも0.50ng/mL以下であった。これに対して、FGFは、切断直後に10pg/mL以下であったものが、24時間後に15pg/mL、4日後に16pg/mLと増量してきていた。このことから、有尾両生類の切断肢組織再生過程の初期において、FGFが重要な働きをしていることが示唆された。
TIMP-2遺伝子導入後の腫瘍増殖能抑制に関与する遺伝子の検索

ヒトグリオーマの外科摘出標本でのTIMP-2のNorthern blottingで、alternative splicingの可能性を示唆する複数のmRNAが認められた。ヒトグリオーマ組織由来RNAから作成したcDNAを対象としたPCR法によって、TIMP-2遺伝子DNA配列を増幅したところ、使用したプライマーの位置から予想されるTIMP-2由来産物のサイズよりも小さいPCR産物の存在を認めた。その塩基配列は、TIMP-2遺伝子DNA塩基配列と比べてExon1の3'末端で266bpが存在しない配列であった。このalternative splicingによるTIMP-2cDNAを発現ベクターpRC/CMVに組み込み、ヒトグリオーマ細胞株U-87MGに導入、ネオマイシンアナログであるG418に耐性のクローンから同遺伝子を発現するものを選別した。これと、コントロールのベクター群との間で細胞増殖能を比較したところ、顕著な抑制を示すクローンを確認した。TIMP-2に対するポリクローナル抗体を用いたWestern blotting法および免疫沈降によって、Alternative splicingにより生じた核酸の配列で検索したopen reading frameより予想されるアミノ酸残基配列に相当するタンパクを捉えることはできなかった。従って、この遺伝子を導入したことにより、腫瘍増殖能に関与する遺伝子の発現に影響を及ぼしている可能性が高いと考えられた。増殖能抑制が生じたグルオ-マ細胞の遺伝子発現の変化を検索しグリオーマの増殖能に関与する遺伝子を同定するため、コントロールベクター導入細胞、遺伝子低発現細胞および高発現細胞を用いたdifferencial displayを行い、現在、増殖能に関与すると予想されるDNA断片の塩基配列決定を施行している。
エピジェネティックな遺伝子調節タンパク質に基づく発達障害疾患の創薬基盤の構築

【本研究の目的】代表的な発達障害疾患であるRett症候群の病態は、遺伝子発現調節タンパク質(MeCP2)の異常に起因する遺伝子の異常発現と理解されている。これをふまえ、本研究の目的は、脳細胞内の異常発現遺伝子を特異的に是正する化合物を本症の治療候補化合物として見いだすことである。【具体的な実施内容】平成26年度に実施した研究成果は以下の2つである。1.病態モデルiPS細胞と正常対照iPS細胞の発現差異遺伝子の同定[担当:久保田]Rett症候群の患者(すべて女性)は正常MECP2遺伝子を有するX染色体が活性化する細胞(正常X活性化株)と変異MECP2遺伝子を有するX染色体が活性化する細胞(変異X活性化株)の2種で構成され、iPS細胞株はそれぞれの細胞に由来するモノクローナルな株として樹立された。2つの株の遺伝的背景に同一であることから、変異株に特異的な異常が病態に関わる所見と解釈できる。このような背景の下、両株間で網羅的遺伝子解析結果を比較した。その結果、変異株では特異的にアストロサイト関連遺伝子が異常に発現していた(Mol Brain 2015)。2.MeCP2複合体タンパク質を標的とする化合物探索とその効果の検証[担当:福西、久保田]MeCP2タンパク質複合体を形成している酵素タンパク質(HDACおよびSin3)に特異的に結合する既存薬物と新規化合物を見いだし、これらはBDNF等のRett症候群や自閉症に関連する遺伝子の発現を回復させる作用があることが、神経培養細胞による実験で明らかになった(論文準備中)。【本成果の意義と重要性】本成果の意義は、疾患モデルとなる変異株で異常発現していたアストロサイト関連遺伝子の是正が本症候群の治療につながることであり、その重要性は、アストロサイト関連遺伝子の異常発現に関わるタンパク質の同定とその阻害が治療につながる重要なコンセプトになることである。平成26年度の研究課題として「病態モデルiPS細胞と正常対照iPS細胞の発現差異遺伝子の同定」、新技法によるRett症候群iPS細胞の再構築」、「既知のMeCP2で活性化される遺伝子領域の結合タンパク質の探索と同定」の3つを掲げていた。このうち、実行できたのは「病態モデルiPS細胞と正常対照iPS細胞の発現差異遺伝子の同定」だけであった。一方、平成27年度の研究課題としていた「MeCP2複合体タンパク質を標的とする化合物探索とその効果の検証」を前倒して実施した。したがって、予定通りに実施できなかった課題と予定を早めて実施した課題があることから、「おおむね順調に進展している」と評価した。上記のような平成26年度の研究進展状況を鑑み、平成27年度は研究を以下のように推進させる。1.新技法によるRett症候群iPS細胞の再構築:正常者由来の皮膚線維芽細胞からは当初予定のエピソーマル技法を用いた新技法でiPS細胞を作製することはできた。この技法を用いて平成27年度内にRett症候群患者のiPS細胞の作製を完了させる。2.MeCP2の標的遺伝子領域の結合タンパク質の同定:平成26年度実施課題であった「enChIP法を用いてMeCP2によって発現活性化されている遺伝子に結合する新規タンパク質の解明」を平成27年度に実施する。合わせて、異常発現を呈したアストロサイト関連遺伝子にMeCP2欠乏下で結合するタンパク質をenChIP法を用いて把握する。3.MeCP2の標的遺伝子領域の結合タンパク質に結合する化合物の探索:上記2で同定した結合タンパク質への結合が予測される化合物を、創薬支援ソフトウェアを用いて探索する。その結果に基づき化合物を合成し、特異的遺伝子発現制御の効果を検証する。【本成果の意義と重要性】

本成果の意義は、疾患モデルとなる変異株で異常発現していたアストロサイト関連遺伝子の是正が本症候群の治療につながることであり、その重要性は、アストロサイト関連遺伝子の異常発現に関わるタンパク質の同定とその阻害が治療につながる重要なコンセプトになることである。平成26年度の研究課題として「病態モデルiPS細胞と正常対照iPS細胞の発現差異遺伝子の同定」、新技法によるRett症候群iPS細胞の再構築」、「既知のMeCP2で活性化される遺伝子領域の結合タンパク質の探索と同定」の3つを掲げていた。このうち、実行できたのは「病態モデルiPS細胞と正常対照iPS細胞の発現差異遺伝子の同定」だけであった。一方、平成27年度の研究課題としていた「MeCP2複合体タンパク質を標的とする化合物探索とその効果の検証」を前倒して実施した。したがって、予定通りに実施できなかった課題と予定を早めて実施した課題があることから、「おおむね順調に進展している」と評価した。上記のような平成26年度の研究進展状況を鑑み、平成27年度は研究を以下のように推進させる。1.新技法によるRett症候群iPS細胞の再構築:正常者由来の皮膚線維芽細胞からは当初予定のエピソーマル技法を用いた新技法でiPS細胞を作製することはできた。この技法を用いて平成27年度内にRett症候群患者のiPS細胞の作製を完了させる。2.MeCP2の標的遺伝子領域の結合タンパク質の同定:平成26年度実施課題であった「enChIP法を用いてMeCP2によって発現活性化されている遺伝子に結合する新規タンパク質の解明」を平成27年度に実施する。合わせて、異常発現を呈したアストロサイト関連遺伝子にMeCP2欠乏下で結合するタンパク質をenChIP法を用いて把握する。3.MeCP2の標的遺伝子領域の結合タンパク質に結合する化合物の探索:上記2で同定した結合タンパク質への結合が予測される化合物を、創薬支援ソフトウェアを用いて探索する。その結果に基づき化合物を合成し、特異的遺伝子発現制御の効果を検証する。
魚類における成長と成熟のダイナミクス

ゼブラフィッシュ初期胚を低酸素にさらすと、正常酸素濃度と比較して胚の発生と成長が著しく遅滞する。その際のIGFシステムの動態を検討したところ、低酸素下においてIGFBP-1の遺伝子発現とタンパク量が特異的に増加した。そこで、IGFBP-1が低酸素に起因する胚発生と成長遅滞にどのように関与しているかを明らかにするために、遺伝学的手法を用いて検討した。まず、IGFBP-1に特異的なアンチセンスモルフォリノオリゴを微量注入し、正常酸素下ならびに低酸素下において内因性IGFBP-1をノックダウンした。正常酸素下では、IGFBP-1のノックダウンによる明らかな表現型は観察されなかったが、低酸素下においてIGFBP-1をノックダウンすると、低酸素により惹起される発生と成長の遅滞がおよそ60%改善された。次に、低酸素下で内因性IGFBP-1をノックダウンした胚に、外因的にIGFBP-1を過剰発現させると発生と成長が遅滞した。さらに、IGFBP-1の過剰発現は正常酸素下においても発生と成長の遅滞を誘起することから、IGFBP-1はゼブラフィッシュ胚の低酸素による発生と成長の遅滞を誘起する重要な因子であることが示唆された。次にゼブラフィッシュ初期胚由来の細胞株を用いて、IGFBP-1の細胞増殖能に及ぼす影響を検討した。IGF-1,-2(100ng/ml)の添加により、zf4細胞株の細胞増殖は有意に増加したが、IGFsと等モル量のIGFBP-1を加えると、IGFsによる細胞増殖はおよそ60%抑制された。このIGFBP-1によるIGF依存的な細胞増殖能の抑制は、過剰量のIGFsを加えることにより濃度依存的に消失し、IGFBP-1のみの添加では細胞増殖能に有意な変化は観察されなかった。以上の結果から、低酸素環境により特異的に誘導されるIGFBP-1はIGFと複合体を形成し、IGF依存的な細胞増殖を抑制することで低酸素に起因する発生と成長遅滞に関与すると考えられた。初回性成熟とは生命が初めて生殖能力を獲得するという非常に重要な現象である。本研究では初回性成熟、特に初回性成熟過程の卵黄蓄積開始前後の個体において発現の変動する遺伝子を同定し、その誘起機構に新たな知見を得ることを目的とした。実験魚として環境要因による性成熟への影響が少ないティラピアを用い、発現に差のある遺伝子の同定方法としてSSH(Suppression Subtractive Hybridization)法を用いた。同程度の体サイズでありながら成熟段階が卵黄蓄積開始前後と異なるティラピアの肝臓からtotal RNAを抽出し、cDNAを合成した後、SSH法に供した。次に卵黄蓄積開始前、開始後の肝臓から得られたそれぞれのcDNAライブラリーに対してスクリーニングを行い、得られた陽性クローンの塩基配列を解析したところ、候補遺伝子として卵黄蓄積開始前の肝臓に特異的に発現しているとされるものが8クローン、卵黄蓄積開始後の肝臓に特異的に発現しているとされるものが4クローン得られた。さらにRT-PCRにより各成熟段階ごとのそれらのクローンの発現動態を調べたところ、卵黄蓄積開始後の個体の肝臓に特異的な遺伝子としてfatty acid binding protein遺伝子、quinone reductase遺伝子、B-cell translocation gene 4遺伝子とそれぞれ高い相同性を有するクローンが得られた.

今後、これらのクローンの発現動態をより詳細に調べることにより、肝臓に着目した新たな初回性成熟のモデルが得られることが期待される。ゼブラフィッシュ初期胚を低酸素にさらすと、正常酸素濃度と比較して胚の発生と成長が著しく遅滞する。その際のIGFシステムの動態を検討したところ、低酸素下においてIGFBP-1の遺伝子発現とタンパク質が特異的に増加した。そこで、IGFBP-1が低酸素に起因する胚発生と成長遅滞にどのように関与しているかを明らかにするために、遺伝学的手法を用いて検討した。まず、IGFBP-1に特異的なアンチセンスモルフォリノオリゴを微量注入し、正常酸素下ならびに低酸素下において内因性IGFBP-1をノックダウンした。正常酸素下では、IGFBP-1のノックダウンによる明らかな表現型は観察されなかったが、低酸素下においてIGFBP-1をノックダウンすると、低酸素により惹起される発生と成長の遅滞がおよそ60%改善された。次に、低酸素下で内因性IGFBP-1をノックダウンした胚に、外因的にIGFBP-1を過剰発現させると発生と成長が遅滞した。さらに、IGFBP-1の過剰発現は正常酸素下においても発生と成長の遅滞を誘起することから、IGFBP-1はゼブラフィッシュ胚の低酸素による発生と成長の遅滞を誘起する重要な因子であることが示唆された。次にゼブラフィッシュ初期胚由来の細胞株を用いて、IGFBP-1の細胞増殖能に及ぼす影響を検討した。IGF-1,-2(100ng/ml)の添加により、zf4細胞株の細胞増殖は有意に増加したが、IGFsと等モル量のIGFBP-1を加えると、IGFsによる細胞増殖はおよそ60%抑制された。このIGFBP-1によるIGF依存的な細胞増殖能の抑制は、過剰量のIGFsを加えることにより濃度依存的に消失し、IGFBP-1のみの添加では細胞増殖能に有意な変化は観察されなかった。以上の結果から、低酸素環境により特異的に誘導されるIGFBP-1はIGFと複合体を形成し、IGF依存的な細胞増殖を抑制することで低酸素に起因する発生と成長遅滞に関与すると考えられた。