hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
校内研修プログラムとしての体育授業研究の開発と海外への紹介

そして、その調査結果に応じて、中国の状況に適合するように我々の校内研修プログラムを修正した。また、3年次の紹介活動に備え、中国から研究協力者の林楠氏とスコットランドのエジンバラ大学において体育教師教育を専門とするMike Jess氏を招聘し、校内研修プログラムの観察をしていただき、プログラムを理解していただいた。そして、日本・中国・スコットランドの体育の授業研究の実態を世界授業研究学会大会(名古屋大学)において、シンポジウムを開催して報告した。さらに、齊藤がJICAの白旗氏の協力のもと、海外へ現職研修として授業研究を紹介するための事前指導として、青年海外協力隊の補完研修で体育の模擬授業を指導し、その成果と課題を発表した。木原と久保が中国の北京市と杭州市の校内研修の実態を調査し、中国の校内研修における授業研究において、日本の授業研究のプロセスとの比較を行い、中国の状況に適合するように我々の校内研修プログラムを修正し、3年次の中国へ教師の省察を促す授業研究の方法を紹介する準備を整えることができたため。また、3年次の紹介活動に備え、中国、スコットランドから研究協力者の林楠氏とスコットランドのエジンバラ大学において体育教師教育を専門とするMike Jess氏を招聘し、日本・中国・スコットランドの体育の授業研究の実態を世界授業研究学会大会(名古屋大学)において、シンポジウムを開催して報告したことにより、各国の授業研究の実態についてお互いの理解が深まったため。3年次の平成30年度は、中国、スコットランドへ我々の校内研修プログラムを紹介し実施した。そして、研究協力者を介して参加者教員に対しインタビューを実施して、これらを分析し、海外で我々の校内研修プログラムを実施することの意義を検討した。中国杭州市の体育教師のための校内研修として、「リフレクションシート」を用いた校内研修プログラムを実施した。この「リフレクションシート」を分析し、杭州市の小学校体育教師の体育授業に関する省察能力を把握した。この研究の実施と資料の分析には杭州市の浙江大学講師の林楠氏に協力を依頼し実施した。同様に、スコットランドでも校内研修を実施した。そして参加者にインタビュー実施し分析して、スコットランドの小学校学級担任教師の省察の実態を把握した。この研究の実施と資料の分析にはエジンバラ大学のMike Jess氏に協力を依頼した。また、齊藤が2年次から継続的に、JICAの白旗氏の協力のもと、日本での青年海外協力隊派遣者の補完研修で模擬授業を実施し、受講者の体育授業に関する省察能力の変化を分析した。そして、これらの研究の成果をエジンバラ大学で開催されたAIESEP2018と北京師範大学で開催されたWALS2018で発表し海外に発信した。AIESEP2018の発表は木原と研究協力者の林楠及びMike Jessが担当し、WALS2018での発表は海外総括担当の岩田が担当した。研究協力者の林楠に依頼し、中国杭州市の体育教師のための校内研修として、「リフレクションシート」を用いた校内研修プログラムを実施し参加者の省察能力を把握した。
英語学習者のスピーキング能力向上に関する研究：認知的負荷軽減の方略

英語母語話者(native speaker, NS)と英語非母語話者(non-native speaker, NNS)の定型的言語表現(formulaic sequence, FS)の使用頻度及び使用タイプを調べるために、インタビュー形式(ダイアローグ)とスピーチ形式(モノローグ)で発話を録音し、調査した。その結果、ダイアローグの場合、会話のコントロールが難しく、定型的言語表現(formulaic sequence, FS)の分析を行うことが難しかった。その反面、モノローグの場合、被験者(NNS)が皆一つのテーマに沿って発話するためFSの使用頻度とタイプの比較がしやすいことが分かった。NSとNNSを比較すると意見を述べるモノローグの場合NSはNNSに比べInstitutionalized expressionやsentence buildersなどのLexical phraseの使用頻度が多く、それが原因で、より流暢に話すことができるということが分かった。先行研究からもNSはよく使うFSを相当数記憶しており、それらを使いまわすことで、言語処理にかかる認知的負荷を軽減し、流暢でかつ正確に話すことができることがわかっている。本研究のデータからもそのような傾向が見受けられるものの現時点では、モノローグのデータを数多く録音していなかったため、言い切るにはこれからも今後データ収集が必要である。当初は30年度中に日本人英語学習者がどのようなFSをスピーキングにおいて使用するかを調べるはずだったが、パイロットで録音したデータからわかったことは、スピーキングの課題によって学習者が使用するFSは大きく異なるということである。よって、スピーキングの種類をモノローグ形式(1つのテーマに沿ったスピーチ)に限定することにし、令和1年度前半に録音を取り直すことにした。取り直しが必要となったため、研究はやや遅れてはいるが、研究デザイン、発話参加者、評価者が備わっているため今年度中に遅れた分は追いつく予定である。令和元年度(2年目)は、(1)様々英語習熟度の学習者を対象に意見を述べるモノローグを収録し(2)その録音を英検などの面接委員経験者に評価してもらう。FS使用頻度及び使用タイプがどのようにスピーキング評価へ貢献するかを分析する。その結果を研究論文にまとめる予定である。具体的計画:4月ー6月:英語学習者(n=100)から意見を述べるモノローグに協力してもらい録音する。7月ー8月:録音データを評価者(n=10)に評価してもらう。9月:録音を書き起こす10月ー11月:FS使用タイプ・頻度とスピーキング評価との関係を分析:。12月ー3月:学会発表および論文執筆。今年度は謝礼が発生しなかったため次年度使用額が生じました。
形質細胞様キラー樹状細胞の製造技術に関する研究

能動免疫療法である樹状細胞療法はあらゆる癌に適用されるが,自家の単球由来で作製される成熟型の樹状細胞と腫瘍抗原によりがんワクチンとして機能する。臨床応用では樹状細胞作製技術,腫瘍抗原の選択,免疫モニタリング法の確立,抗がん剤や放射線治療との最適化が重要となる。既評価の作製法とは異なるインターフェロンを用いた新規の樹状細胞作製技術を構築した。こうした成果は本邦のがん免疫療法に発展に寄与すると考える。樹状細胞(DC)ワクチン製造工程において,余剰として廃棄となる単球を用いてキラーDCワクチンを小スケールで10ロット分(1ロットに1×E7相当の樹状細胞を含む)を作製した(信州大学医学部医倫理委員会承認,臨床研究承認番号2107)。新規の樹状細胞ワクチンでは,4日間培養により免疫賦活剤の中で,がん細胞殺傷力(キラー活性)を約2倍から3倍に増強する免疫賦活剤Xを見いだした。ヒト膵臓癌細胞株(Mia Paca2)を用いた担癌モデルマウス(NOD.CB17-Prkdcscid/J)を作製する予備試験を行い(信州大学動物実験計画承認,承認番号No. 250052),腫瘍増殖曲線によりMia Paca2接種後7日目から作製キラーDCワクチンを投与とした。MiaPaCa-2をNOD.CB17-Prkdcscid/Jマウスの腹部皮下に移植後,キラー樹状細胞ワクチン投与群および無処置群を対照として,それぞれ1群を10匹に設定した。1回1×E6細胞のキラーDCワクチンをマウスの腋窩部,鼠径部の皮下に投与し,投与間隔は毎週とした。本学動物実験等実施規程に従い,人道的に腫瘍径2cmをエンドポイントとした前向き本試験を実施した(信州大学動物実験計画承認,承認番号No. 250078)。ワクチンの抗腫瘍効果を判定するために,腫瘍体積の増減,生存割合,完遂率を評価項目として,35週間を観察期間とした。観察期間終了後,全ての動物は炭酸ガス吸入により安楽死処置し,腫瘍の摘出を行なった。無処置群と比較して,キラーDCワクチン投与群では有意に腫瘍増殖を抑制する事が判った。ワクチン投与累計57回において,動物に目立つ異常は認めなかった事から,ワクチン自体の安全性を支持する有用な結果が得られた。古典的IL-4+GM-CSFを用いた接着法による樹状細胞(IL-4-DC)ワクチンの製造工程に関しては、後方視的臨床分析により、アフェレーシス(成分採血)の1618時間前に少量のG-CSF(75μg filgrastim)を使用した場合、原料となる単球数は1.5倍に増加、作製DCでは特徴としてCD11c+CD14-CD80+の表現型が増加した。PCRアレイを用いた接着因子群の遺伝子解析によりMMP-9が有意な増加を示し、MMP-9の阻害薬を添加した培養により、作製DC数が有意に低下した。以上のことからMMP-9を介した接着因子の活性化によるIL-4-DCの製造効率が有意に増加することを見出した。特願:2013-028118特許名称: G-CSFを用いた樹状細胞の調製方法の知財化を行い、本特許に関する学術論文の報告は現在進行中である。DC製造工程の細胞分離に関しては、単球の分離を目的とした分離装置(出願番号:特許2012-086514,特願2012-086515)の技術の改良を進め、DCの精製に適用できる評価を進めた。また、分離装置に関しては、米国の国際特許申請(出願番号:13/849,045および13/849,116)を行った。臨床試験に使用できる新規DCワクチンを製造するために、がんを殺傷する力、即ちキラー活性を有するDC作製技術の構築を推進した。免疫賦活剤の中で、使用期間、濃度、細胞調製試薬との組み合わせなどを検証し、キラー活性を約2倍から3倍に増幅し得る免疫賦活剤を見出した。また、従来のIL-4-DCの培養工程より23日間短縮することが確認された。その免疫賦活剤を用いた作製法によるキラーDCの機能解析をNK活性、ELISPOT法、抗原提示能、貪職能の分析を含め詳細に評価している。NK活性を有する(樹状細胞)DCワクチンの製造工程を確立するために,非臨床試験として,単球から非接着法による培養系により従来の7日間から4日間に培養期間が短縮でき,IFN(Interferonα)およびGM-CSF(顆粒球単球コロニー刺激因子)の至適サイトカイン濃度を確定させ,免疫賦活剤(OK-432)との最適化を検証した。K562を標的とした細胞傷害活性(キラー活性)として,30%の機能を有するキラーDCの調製方法を構築し,その活性はCD56抗原と相関し,OK-432添加によりさらにキラー活性は増強した。

古典的な接着法によるIL-4を用いたIL-4-DC(キラー活性5%未満)に比較して,抗原提示能および貪食能は同等,非接着法により単球からの樹状細胞改変率は有意に向上し,生細胞率も改善した。古典的なIL-4-DCを用いた「樹状細胞及び腫瘍抗原を用いたがんワクチン療法(先進医療A,公知番号26)」の細胞作製工程では,DC数は成分採血で回収される原料の単球数に依存しているが,G-CSF(顆粒球コロニー刺激因子)が,DC作製数に有意な影響を与えていたことが判った。そこで接着因子のDNAマイクロアレイの検討により,成分採血の1618時間前に低用量G-CSF (Filgrastim 75μg)を投与することにより,単球数は1.5倍に増加,単球のMatrix metalloproteinase-9 (MMP-9)を増幅させ,DC作製数およびHLA関連機能分子を高める薬効があった。さらに後方視的な臨床評価により成分採血1618時間前に低用量G-CSF(Filgrastim 75μg)が投与された群では非投与群に比較して,WT1を腫瘍抗原とする特異的能動免疫の誘導割合が有意に高かった。がん免疫療法ヒト膵臓癌細胞株(Mia Paca2)を用いた担癌モデルマウス(NOD.CB17-Prkdcscid/J)を作製する予備試験を行った。臨床検体であるがん患者の末梢血単球を用いてキラーDCワクチンを小スケールで10ロット分作製した。MiaPaCa-2を移植した担癌モデルマウスにキラーDCワクチン投与群および無処置群をそれぞれ10匹に設定した。毎週1×E6細胞のキラーDCワクチンを投与し,人道的に腫瘍径2cmをエンドポイントとした前向き本試験を実施した。有効性および安全性を評価するin vivoの基礎研究の成果として,キラーDCワクチンは有意に腫瘍増殖を抑制する事が判った。ワクチン投与累計57回において,肉眼的に有害事象はなく,ワクチン自体の安全性が確認されたので,非臨床試験につなげることが可能となった。樹状細胞製造ワクチンの工程において、G-CSFを用いた接着因子の活性化による製造効率が有意に増加することを見出し、知財化した。単球の分離を目的とした分離装置の技術の改良を進め、DCの精製に適用できる改良を進めた。臨床試験に使用できる新規樹状細胞ワクチンを製造するために、がんを殺傷するキラー活性を有する樹状細胞の作製技術の構築を推進した結果、キラー活性を約2倍から3倍に増幅し得る免疫賦活剤を見出した。免疫賦活剤Xを用いた作製し,動物実験に適用したキラーDCのロットに関して,HLA型拘束性の有無,機能解析としてNK活性,ELISpot法,抗原提示能,貪職能を含め詳細に評価する。腫瘍組織内浸潤のDCの有無,周辺臓器への浸潤,肝臓,肺,骨,脳転移の有無を病理学的に診断する。また,免疫不全マウスでみられる悪性リンパ腫の自然発生の有無に関して,その発症抑制効果があったか副次的な評価を行う。これらの基礎研究の成果に基づき新規DCワクチンの有効性,安全性を科学的に総括する。また,免疫賦活剤Xを用いたキラーDCワクチンの製造方法を知財化し,有用なDCワクチンとして学術報告を行う。特許を得ている分離装置を組み込んだ閉鎖系培養工程を確立し,独自の調製技術により作製されたGMP適合(医薬品グレード)のDCワクチン製剤の非臨床試験を実施する。キラーDCワクチンに対して,標的となるがん抗原としてsurvivin,WT1ペプチドをパルスして最適化させ,臨床応用のために必須となる免疫モニタリングとしてELISpot法の簡便化,最適条件の検討を進める。
子どもの共同注意と他者の経験理解に関する研究

14か月児と18か月児が2名の女性の大人と2つの新奇な玩具で遊んだ。3つ目の玩具では、一人の大人が退室したので、子どもは残りの大人と遊んだ。その後、退室していた大人が部屋に戻り、トレーに並べられた3つの玩具を見て、驚いた表情で「それ、ちょうだい」と言った。その大人が欲しい玩具を渡すためには、子どもは(1)他者は注意を玩具に向けており、見なかった玩具を見ると驚くこと、(2)自分は知っているが他者には目新しい玩具を理解すること、ができなければならない。18か月児では可能であったが、14か月児では不可能であった。本研究は、1歳児を対象に「実験者不在パラダイム」を適用し、共同注意場面での他者の情動表出が子どもによる他者の経験知の理解に果たす役割を検討しようとするものである。研究初年度の本年度(平成22年度)では、研究開始準備を整え、早稲田大学の「人を対象とする研究に関する倫理審査委員会」から実施承認を得て、パイロット実験を経て本実験に着手するという計画を交付申請書に記載した。この計画を以下のように実施した。1.研究開始準備実験で使用する器材を購入し、実験時に使用する3種類の玩具を作製した。実験場面での2名の実験者の行動を決定し、自然でかつ定型的な振舞いができるように訓練した。研究参加を呼びかけるポスターとチラシを作成し、幼稚園や保育園、保健センターなど母親が集まりやすい箇所に対して公募依頼を行った。また現在、近隣の区役所の保育課に対して、公立保育園への公募情報提供が可能になるよう依頼中である。幼児が実験に参加するため、万が一の事故対策用に、実験に参加する子どもに対して普通傷害保険契約を東京海上日動火災保険会社との間で結んだ。2.倫理審査委員会への研究実施申請2010年12月10日に、本研究に関する倫理審査申請書を「人を対象とする研究に関する倫理審査委員会」に提出し、2011年2月8日付で実施承認を得た。3.実験実施上記の実施承認を経て、早稲田大学文学学術院36号館赤松記念室4においてパイロット実験を実施し、現在本実験に着手している。3月11日の大地震と原発事故の影響で一時実験への参加協力が途切れたが、再び参加者が現れており、この災害が終息に向かえば実験の継続は可能だと考えられる。東京近郊に住む1歳児とその母親106組を対象に、「実験者不在パラダイム」を用いて、実験者との玩具を介した共同注意的関わりが1歳児の他者の経験知理解に果たす効果を検討した。子どもの機嫌の悪さなどの理由から分析除外された対象は34組となり、残りの72組の母子を分析対象にした(14か月24組、18か月48組)。実験場所は早稲田大学文学学術院発達心理学研究室であった。実験は最初に、実験者の要請に対する子どもの玩具選択能力を確認するため<プレテスト>を行い、玩具選択が可能であった者を<本実験>の対象とした。<本実験>では3種類の手製の抽象的な玩具を使用し、【実験条件】と、【統制条件】を設定した。【実験条件】では、実験者が最初の2つの玩具を1つずつ子どもと共同注意しながら遊んだ(遊びの時間はいずれの玩具も約1分間)。3つ目の玩具は補助実験者が子どもと一緒に遊び、その間、実験者は退室した。補助実験者がこれら3つの玩具をトレーに置き、子どもの前に提示した。そこへ実験者が戻り、乳児の目を見ながら驚いた様子で「それ、ちょうだい」と言って手を差し出し、手渡すように要請した。【統制条件】では、実験者は3つの玩具すべてで子どもと共同注意しながら遊んだ。3つ目の玩具での遊びが終了したら退室し、補助実験者が3つの玩具をトレーに置いた時点で、部屋に戻り、実験条件と同様に玩具の手渡しを要請した。その結果、14か月児が手渡した3種類の玩具には偏りがなかった。しかし、18か月児では実験者が見ていない第3番目の玩具を手渡すことが有意に多かった。この結果から、14か月児では共同注意経験の有無が実験者(他者)の経験知(内容)の理解に有効な効果をもたないが、18か月児では有効になることが示唆された。他者の心的状態の推測は、34歳で可能になると想定されてきた。しかし、近年、共同注意場面では、1歳前半の子どもでも可能だとの知見が欧米で報告されている。本研究では、この他者の心的状態の推測、すなわち他者が経験によって獲得した知識(他者の経験知)の理解を実験的に検討した。実験協力者は14か月児群24組、18か月児群48組の母子。

実験場面は早大文学学術院発達心理学研究室である。子どもと母親が実験室に入室後、室内や実験者と実験補助者(2名の女性)に慣れるため自由遊びを設定した。その後、プリテストと本テストを行った。プリテストでは、実験者の要請に対する子どもの玩具選択能力を確認した。玩具選択が出来なかった子どもは、本実験のデータから除外した。本実験では、3つの手製の抽象的な玩具を用いた。実験条件と統制条件を設けた。実験条件では、2名の実験者が2つの玩具を別々に子どもと共同注意しながら遊んだ。その後、1名の実験者が退室した。3つ目の玩具は、子どもともう一人の実験者だけで遊んだ。統制条件では、3つの玩具すべてで、2名の実験者と子どもが共同注意しながら遊んだ。どちらの条件でも、3つの玩具での遊びが終わると、部屋にいる実験者が3つの玩具をトレーに並べた。そこへ、退室していた実験者が入室し、子どもの目を見て、穏やかに「それちょうだい」と言い、両手を差し出して手渡すように要請した。その結果、実験群では18か月児だけが、子どもだけが見て知っており、実験者は見ていない3番目の玩具を、実験者に手渡すことが有意に多かった。14か月児群では玩具の選択に有意な差はなかった。従って、18か月児は実験者の知らない玩具選択ができており、他者の経験知の理解が出来ることが示唆された。14か月児には困難であった。実験に参加する母子の数が予想を上回り、実験が予定より早く進行したためである。これは、東京都各区の保育関係課や、幼稚園、保育園への参加者募集依頼が予想以とに有効に働いたことによる。24年度が最終年度であるため、記入しない。上記のように、予定より早く課題が達成されている。本実験はわが国では初の実験であり、従来の欧米での研究結果と共通する知見と相違する知見が得られている。こうした興味深いデータから、1歳児の他者の経験知の理解に影響する要因について、自己感や他者感の発達研究や比較文化的な研究の視点から考察を深め、仮説を見出し、今後の研究への展開への糸口を見出していきたい。
生活習慣病におけるアルドステロンによる治療抵抗性高血圧の発症機構の解明

糖尿病は慢性的な高血糖状態から血管障害をきたすが詳細な分子機構は不明である。本研究では、高血糖はミネラルコルチコイド受容体(MR)のN末端領域の糖鎖修飾(O-GlcNAc修飾)を介してユビキチンープロテアソーム系による蛋白分解を抑制するためにMR蛋白発現レベルが上昇することにより、MR転写活性化をきたすことが明らかとなった。糖尿病における治療抵抗性高血圧や臓器障害がMR拮抗薬により改善することが知られているが、本研究の結果、高血糖によりアルドステロンレベルとは独立して、MR蛋白の安定化による発現レベルの上昇が糖尿病の腎障害に関わることが示唆された。1.高グルコースおよびO-GlcNAc修飾とMR発現レベルへの影響5mMから30mMは培地中グルコース濃度を上昇させた時や、O-GlcNAc transferase (OGT)プラスミドの強制発現を行うと、MRのO-GlcNAc修飾が明らかに増加することが免疫共沈降にて確認された。さらに、MRのO-GlcNAc修飾が増加すると、MR蛋白レベルが増加を認め、O-GlcNAcase(OGA)を強制発現して、MRのO-GlcNAc修飾をキャンセルすると、MR蛋白レベルが著明に減少を認めた。2.MRのO-GlcNAc修飾残基の同定MRのO-GlcNAc修飾部位を同定するために、MR(1-670)とMR(671-984)変異体を用いてO-GlcNAcの結合を免疫共沈降法で検討した結果、MR(1-670)のN末端に結合することが示された。次に、MRのN末端をAF-1a(1-170), ID(171-450), AF-1b(451-600)に分割した欠失変異体をFLAGタグとの融合蛋白として発現するプラスミドを作成した。HEK293細胞にこれらの発現プラスミドを強制発現し、FLAG抗体で免疫沈降後に、O-GlcNAc抗体を用いてWesternブロットを施行して、O-GlcNAcとの結合を検討した。その結果、MRのN末端の中で、AF-1a, AF-1bではなく、その中間部分のID(171-450)に結合することが示された。本結果をふまえて、MRのN末端ID領域(171-450)のO-GlcNAc部位を2014年度に同定していく予定である。1.高グルコースおよびO-GlcNAc修飾とMR発現レベルへの影響HEK293細胞にMRを強制発現させた培養細胞系にて、5mMから30mMへのグルコース濃度の上昇により、MRのO-GlcNAc修飾およびMR蛋白レベルの増加を認めた。また、O-GlcNAc transferaseまたはO-GlcNAcaseの強制発現によりMRのO-GlcNAc修飾を増加または減少を誘導した際に、MR蛋白レベルも増加または減少を認めたが、MR mRNAレベルは変化しなかったことから、MRのO-GlcNAc修飾はMR蛋白分解が抑制された可能性が示唆された。2.MRのO-GlcNAc修飾残基の同定MRのN末端をN末端側からMR-AF1a, MR-ID, MR-AF1bの3つの部位に分けた欠失変異体プラスミドを作成した結果、MRのO-GlcNAc修飾残基は主にMR-IDに存在することが示された。次に、GST-MR-IDまたはGST-MR蛋白をbaculovirusに産生させたものを用いて、in vitro O-GlcNAc反応を行い、生成物をLC-MS/MSにて分析した結果、MR-(295-307)部位にSer残基のclusterを認め、そこがO-GlcNAc部位であることが示された。さらに、各Ser残基のAla残基へのsite-directed mutagenssisにより点突然変異体を作成して検討した結果、どのSer残基の変異体もO-GlcNAc修飾の減少を認め、特に、S298A, S299Aはbasal levelからMR発現レベルが低下した。また、S295A/S296A/S298A/S299AMR変異体では、ユビキチン化が増加し、MR蛋白レベルの減少を認めた。以上より、これらのSer残基のO-GlcNAc修飾により、ユビキチン化が減少し、MR蛋白レベルが増加することが示された。糖尿病モデルマウスにおけるミネラルコルチコイド受容体(MR)の糖鎖修飾とMR活性化の検討(1)体重、血糖値、血圧、MRおよびMRシグナルの検討の検討さらに、O-GlcNAc修飾におけるGFAT阻害薬DONを用いて、1db/+, 2db/+ + DON, 3db/db, 4db/db + DONの4群に分けて検討した。すると、3db/db群では、1、2と比べて明らかにMR蛋白レベルが増加し、4db/db+DON群にてMR蛋白レベルが1、2と同レベルまで減少した。さらに、MR標的遺伝子のsgk1/beta actin蛋白レベルも並行した変化を認めた。以上より、糖尿病モデルマウスでは高血糖により腎組織においてMRのO-GlcNAc修飾が増加し、MR蛋白分解の抑制により発現レベルが増加することが、MRシグナル活性化をきたし、特にsgk1の発現が選択的に誘導されることが示され、糖尿病における腎障害の分子機構の一部が個体レベルでも明らかとなった。

本研究では、高血糖はミネラルコルチコイド受容体(MR)のN末端領域の糖鎖修飾(O-GlcNAc修飾)を介してユビキチンープロテアソーム系による蛋白分解を抑制するためにMR蛋白発現レベルが上昇することにより、MR転写活性化をきたすことが明らかとなった。糖尿病における治療抵抗性高血圧や臓器障害がMR拮抗薬により改善することが知られているが、本研究の結果、高血糖によりアルドステロンレベルとは独立して、MR蛋白の安定化による発現レベルの上昇が糖尿病の腎障害に関わることが示唆された。高グルコースにより、ミネラルコルチコイド受容体(MR)がO-GlcNAc修飾を受けて、蛋白レベルが増加することを見いだし、さらにMRのO-GlcNAc修飾部位としてN末端の4つのSer残基を同定できた。さらに、そのSer残基のAlaへの点突然変異体がユビキチン化の亢進により蛋白が不安定化することを見いだした。以上より、高グルコースはMR蛋白のO-GlcNAc修飾により安定化し、MR蛋白レベルの増加とMR標的遺伝子の発現亢進を誘導することを明らかとした。内分泌代謝学昨年度までの結果をふまえて、糖尿病モデル動物を用いて、高血糖下でMR発現レベルやMR標的遺伝子発現が亢進するか否かをin vivoにて検討して論文化する。高グルコースにおけるMRのO-GlcNAc修飾部位をLC-MS/MSの導入により同定に成功した。慶應義塾大学から大分大学へ異動し、研究室の立ち上げに時間がかかり、研究の進行が遅れたため。in vitroやほ乳類培養細胞で観察した事象を、個体レベルでマウスを用いて実証していきたい。平成27年度の最終年度は、モデル動物におけるミネラルコルチコイド受容体の糖鎖修飾とその機能解析を加えて、論文発表として仕上がる予定である。2014年6月1日付けで慶應義塾大学から大分大学へ異動があり、研究体制の立ち上げなどの準備期間からただちに研究継続が困難であった。本年度から当初の予定にしたがって、進められる予定である。2013年度にMRのN末端ID領域がO-GlcNAc修飾を受けることが明らかとなった。本年度は、その領域の組み替え蛋白を精製して、in vitroでO-GlcNAc化反応を起こして、LC-MS/MSにて修飾残基を同定していく予定である。
林木成長曲線の剰換えと育林作業

平成2年8月6日より11日にかけて,名古屋営林支局管内新城営林署125い林小班において,ヒノキを5本伐倒し,幹材積成長解析のための円板を採取した。本林分は過去1974年および1986年に,それぞれ材積にして30%の間伐をうけた58年生の林分である。5本のサンプル木のうち,2番目に大きい木の幹材積成長曲線をuーw図を用いて解析した。その結果,この木は,過去2回の間伐によって、明らかに成長曲線の乗り換えを行っていることが,uーw図上で確認できた。ただし,ベルタランフィ式の係数への影響はまだ十分行っていない。しかし,幹材積の上限値への影響は確実であって,間伐を行えば,必ず上限値が増加する傾向をみとめることができた。また,uーw図へおよぼす間伐の影響の仕方にも若干興味のある事実がみとめられた。それは,間伐後2ー3年を経過して始めてuの値の増加がみとめられることである。この事実の生物学的解釈には,さらなる研究が必要であろう。暫定的な解釈としては,間伐後一ヶ個体あたりの成長空間が増加し,これに対応した光合成系(葉量・枝量)の増大が起こり,このため光合成量が増大し,これがひいては林木の材積成長を増大させるというものである。しかしこの解釈の妥当性については吟味を必要としよう。また成長曲線の乗り換えを起す要因としては,間伐以外のものが考えられる。というのは上記した間伐に伴う乗り換え以外に,23回の乗り換えがみとめられるからである。この点については今のところどの要因が乗り換えを生じさせたのか,特定ができていない。将来の興味ある問題であろう。
ヘリコバクター・ピロリ菌感染を起点とする胃癌発症の分子機構に関する研究

Helicobacter pylori感染は様々な胃粘膜病変発症の原因とされ、中でも病原因子cagA遺伝子陽性株の感染は疫学的研究より胃癌発症との強い相関が知られている。cag4遺伝子産物CagAは胃上皮細胞に直接進入する菌体由来のタンパクで、細胞内での生物学的役割が注目されている。CagAは細胞内でチロシンリン酸化を受け、細胞内チロシンホスファターゼSHP-2とリン酸化依存的に複合体を形成し、活性化する。高いSHP-2活性化能を持つCagAを産生する菌株の感染は、より激しい胃粘膜傷害性を示すことから、CagA-SHP-2複合体による細胞内情報伝達系の撹乱は各種胃粘膜病変発症に深く関与していることが示唆されている。このCagAによるSHP-2を介したシグナル異常により、胃上皮由来AGS細胞においてhummingbird表現型と呼ばれる特殊な細胞形態が誘導される。申請者は、このhummingbird表現型を指標としてCagA-SHP-2複合体により異常が惹起される細胞内シグナル経路の解明を目指し、昨年度までにCagA依存的なhummingbird表現型の誘導は、Ras、PI3K、p38、JNKには非依存的である一方、MEK-Erk経路に依存していることを明らかにした。本年度は、CagAがSHP-2の活性化を介して、細胞接着の制御に重要な役割を果たしているチロシンキナーゼFAKの脱リン酸化を亢進することを明らかにし、脱リン酸化に伴うFAKキナーゼ活性の抑制はhummingbird表現型の誘導に際し重要な役割を担っていることを示した。さらに、細胞内においてFAKがSHP-2の細胞内基質分子であることを示し、近年発癌との関連が報告されているSHP-2活性化に依存した情報伝達機構の解明に重要な知見を得た。また、分子構造の異なる複数のCagAの機能解析を行い、CagAと胃上皮細胞内標的分子の相互作用におけるCagAの分子多型の意義を解明した。これらの研究成果はいずれも権威ある国際学術雑誌に発表されている。Helicobacter pylori (H.pylori)の感染は様々な胃粘膜病変の原因とされ、病原因子cagA遺伝子陽性株は疫学的研究より胃癌発症との強い相関が知られている。cagA遺伝子産物CagAは胃上皮細胞に直接進入する菌体由来のタンパクで、細胞内での生物学的役割が非常に注目されている。CagAは細胞内チロシンホスファターゼSHP-2と複合体を形成、活性化することにより、胃上皮由来AGS細胞においてhummingbird phenotypeと呼ばれる特殊な細胞形態を誘導する。申請者はこの細胞形態変化を指標としてCagAによりシグナル伝達異常が惹起される細胞内シグナル経路の解明を目指した。その結果、CagAによる細胞形態変化の誘導は、Ras、PI3K、p38、JNKには非依存的である一方、MEK-Erk経路に依存していることが明らかとなった。さらに、CagAはSHP-2を介して、血清刺激に対するErkの持続的な活性化を亢進させていることが明らかとなった。以上より、CagAはRas非依存的な経路を介してMAPキナーゼカスケードを活性化し、宿主細胞の形態変化を惹起していることが示唆された。MAPキナーゼカスケードは細胞増殖及び細胞運動に重要な役割を果たしており、発癌との関連が指摘されていることから、H.pylori感染から引き起こされる胃癌発症においてCagAによるSHP-2活性化を介したMAPキナーゼカスケードの脱制御が重要な役割を果たしていることが推察される。Helicobacter pylori(H.pylori)の感染は様々な胃粘膜病変の原因とされ、その中でも病原因子cagA遺伝子陽性株の感染は疫学的研究より胃癌発症との強い相関が知られている。CagAは細胞内でチロシンリン酸化を受け、細胞内チロシンホスファターゼSHP-2とリン酸化依存的に複合体を形成、活性化する。このCagAによるSHP-2を介したシグナル伝達異常により胃上皮由来AGS細胞においてhummingbird phenotypeと呼ばれる特殊な細胞形態が誘導される。申請者はこの細胞形態変化を指標としてCagAによりシグナル伝達異常が惹起される細胞内シグナル経路の解明を目指し、昨年度までにCagAによる細胞形態変化の誘導は、Ras、PI3K、p38、JNKには非依存的である一方、MEK-Erk経路に依存していることを明らかとした。本年度はCagAによるシグナル伝達異常の細胞接着系への影響を重点的に検討し、その結果、CagAはSHP-2の活性化を介して、細胞接着の制御に重要な役割を果たしているチロシンキナーゼFAKの脱リン酸化を亢進することが明らかとなった。さらに、脱リン酸化に伴うFAKキナーゼ活性の不活化はhummingbird phenotypeの誘導に際し重要な役割を担っていることを明らかにした。結果の詳細については現在投稿中である。

CagAは細胞内でチロシンリン酸化を受け、細胞内チロシンホスファターゼSHP-2とリン酸化依存的に複合体を形成し、活性化する。高いSHP-2活性化能を持つCagAを産生する菌株の感染は、より激しい胃粘膜傷害性を示すことから、CagA-SHP-2複合体による細胞内情報伝達系の撹乱は各種胃粘膜病変発症に深く関与していることが示唆されている。このCagAによるSHP-2を介したシグナル異常により、胃上皮由来AGS細胞においてhummingbird表現型と呼ばれる特殊な細胞形態が誘導される。申請者は、このhummingbird表現型を指標としてCagA-SHP-2複合体により異常が惹起される細胞内シグナル経路の解明を目指し、昨年度までにCagA依存的なhummingbird表現型の誘導は、Ras、PI3K、p38、JNKには非依存的である一方、MEK-Erk経路に依存していることを明らかにした。本年度は、CagAがSHP-2の活性化を介して、細胞接着の制御に重要な役割を果たしているチロシンキナーゼFAKの脱リン酸化を亢進することを明らかにし、脱リン酸化に伴うFAKキナーゼ活性の抑制はhummingbird表現型の誘導に際し重要な役割を担っていることを示した。さらに、細胞内においてFAKがSHP-2の細胞内基質分子であることを示し、近年発癌との関連が報告されているSHP-2活性化に依存した情報伝達機構の解明に重要な知見を得た。また、分子構造の異なる複数のCagAの機能解析を行い、CagAと胃上皮細胞内標的分子の相互作用におけるCagAの分子多型の意義を解明した。これらの研究成果はいずれも権威ある国際学術雑誌に発表されている。
環境化学物質の制御性T細胞機能抑制を介したアレルギー疾患増悪作用の検討

近代社会の発展に伴い意図的・非意図的に環境中に放出された化学物質(環境化学物質)が、近年のアレルギー疾患患者急増に関与している事が懸念されている。そこで本研究では環境化学物質のCD4+CD25+制御性T細胞機能に及ぼす影響を解明し、過剰Th2型免疫応答に起因するアレルギー疾患の増悪に関与している可能について検討した。その結果、1.環境化学物質トリブチル錫(TBT)投与による気道過敏症の増悪に伴って、脾臓、腸管膜リンパ節に酸化ストレス状態が誘導された。一方、炎症局所である肺には酸化ストレスは酸化ストレス状態を誘導しなかった。2.TBT投与マウスの抗原提示細胞はナイーブCD4 T細胞からのTh2細胞への分化を促進した。3.TBT投与マウスにアレルゲン特異的Th2細胞を移入し、アレルゲンで曝露した場合に誘導される気道炎症の程度は、未投与マウスのそれと比較して優位には増悪されていなかった。以上の結果から、環境化学物質TBTは酸化ストレス作用を介して、抗原提示細胞のTh分化誘導作用を修飾しナイーブT細胞からのTh2細胞へ分化を促進すること、その際にナイーブT細胞の活性化を抑制するCD4+CD25+制御性T細胞の機能を抑制することで、Th2分化を更に促進している可能性が示唆された。即ち環境化学物質はアレルゲン感作期におけるTh2型免疫の成立に寄与することで、アレルギー疾患の増悪に関与していることが示唆された。[目的]近代社会の発展に伴い意図的・非意図的に環境中に放出された化学物質(環境化学物質)が、近年のアレルギー疾患患者急増に関与している事が懸念されている。我々は複数の環境化学物質が酸化ストレス作用を介してTh2型免疫を増強し、アレルギー性疾患の増悪に関与していることを明らかにしてきた。この様なTh2型免疫の増強は、免疫応答を負に制御するCD4+CD25+制御性T細胞の機能低下によってさらに増幅される事が考えられる。そこで本研究では環境化学物質のCD4+CD25+制御性T細胞機能に及ぼす影響を解明し、アレルギー疾患の増悪に関与している可能について検討する。[現在までの研究成果]1.環境化学物質トリブチル錫(TBT)を6umol/kg経口投与することにより、気道過敏症が増悪された。この投与量で脾細胞、腸管膜リンパ節細胞、末梢血細胞の細胞内グルタチオン(GSH)レベルは有意に低下していたことから、酸化ストレスを誘導していることが示唆された。一方、気道局所の酸化ストレスは気道炎症を増悪することが知られているが、この投与量では肺のGSHレベルは低下していなかった。2.TBT投与マウスの脾細胞を回収し、抗原提示細胞としてOVA特異的TCRトランスジェニックマウス由来のナイーブCD4T細胞を刺激するとTh2細胞への分化が促進されていた。[目的]近代社会の発展に伴い意図的、非意図的に環境申に放出された化学物質(環境化学物質)が酸化ストレス作用を介してTh2型免疫を増強し,アレルギ-性疾患の増悪に関与していることをマウスモデルを用いて示してきた。

本年度は,平成18年度に明らかにした環境化学物質TBTの経口投与による気道炎症増悪作用が,CD4+CD25+制御性T細胞の機能抑制によるTh2型免疫の制御不全を介しているかを検討し,環境化学物質のCD4+CD25+制御性T細胞機能抑制が,アレルギ-疾患の増悪に関与している可能について検討した。[平成20年度研究成果](1)C57BL/6マウスに,総量6umol/kgのTBTもしくは6mmol/kgのDEMを経ロ的に投与し,最終投与後24時間目に脾臓(Spleen),腸管膜リンパ節細胞(MLN),末梢血細胞(PBMC),ならびに肺(Lung)から細胞を調製した。Cychrome標識抗CD4抗体,FlTC標識抗CD25抗体で細胞表面を染色,固定した後に,PE標識抗Foxp3抗体を用いて細胞内染色を行い,FACSにて解析した結果,CD4+CD25+制御性T細胞の選択的な減少は認められなかった。これらの結果から,環境化学物質はTh2型免疫応答を負に制御しうるGD4+CD25+制御性T細胞のactivation-induced cell deathを誘導し,アレルゲン特異的CD4+CD25+制御性T細胞機能抑制を介して気道炎症を増悪している可能性が示唆された。
王朝漢詩漢文の電子化テキスト作成とその方法についての研究

1,データベース作成の準備と方法(1)基本となる底本を定め校本を作る。王朝漢詩は、日本詩紀国刊行会本を底本に、内閣文庫本、川口文庫本を参考とした。漢文は本朝文粋註釈本を基礎に身延山本を参考とした。(2)王朝漢詩データに、後藤昭雄編「日本詩紀拾遺」を加えた。(3)基本入力はOCRによることとし、Vzエディタを用いるデータベース作成システムを構築した。(4)外字の処理は、「今昔文字鏡」(文字鏡研究会)を用いてユニコード番号で表示した。2,作成データベース(1)王朝漢詩(日本詩紀)電子化テキストデータベース(2)王朝漢文(本朝文粋)電子化テキストデータベース(3)王朝漢詩(日本詩紀)については、出典となる各別集での作品番号を示し、また日本詩紀の巻・作者・作品の順に7桁から成る作品番号でコード化した。3,公開方法(1)石川工業高等専門学校情報処理センターサーバによるオンライン公開(2)王朝漢詩電子化テキストのプリント版による公開4,今後の課題(1)テキストデータベースについて、さらにより良質で使用の便宜のよいファイルに向上させること。(1)電子版テキストの検索等の利用が困難な利用者向けに、王朝漢詩総索引を作成すること。王朝漢詩漢文の電子化テキストの作成にあたり、本年度は『日本詩紀』を対象に本文研究とその電子化テキストの作成を行った。以下の手順である。1,底本とする本文について、川口文庫本『日本詩紀』と内閣文庫本『日本詩紀』を中心に検討。どちらも同系統の善本であるが、市河寛斎自筆本である内閣文庫本(影印本)を基盤にすることとし、新たな校定本文を電子化テキスト本文とした。2,電子化にあたり、第一次入力は、国書刊行会本『日本詩紀』からのスキャナ入力とOCRによる変換により行った。これは入力作業の省力化の便宜によるものである。次に内閣文庫本等との照合により校定本文を定めながら、「電子化テキスト版『日本詩紀』」を作成した。3,電子版は『日本詩紀』各巻別にファイルを作成し、ファイル名siki00.txtからファイル名siki51.txtまで52ファイルのテキストデータベースとして整理保存している。従ってこのファイルへの検索はgrep等従来からのMS-DOS汎用ツールの利用が可能である。なお情報交換漢字規格は、JIS X 0208-1990によっている。(今後の研究展開と課題)1,『日本詩紀』データベースについて、JIS規格外漢字の処理方法の研究と漢詩作品の作品別番号の決定。2,『本朝文粋』の電子化テキストの作成。3,王朝漢詩文テキストデータベースのオンライン公開。王朝漢詩漢文の電子化テキストのうち、年度は次の電子化テキストの作成を行った。1,昨年度作成した「電子化テキスト版『日本詩紀』」の本文データに加えて、新たに「電子化テキスト版『日本詩紀拾遺』」を作成した。2,『日本詩紀拾遺』は、後藤昭雄氏「『日本詩紀』拾遺(-)」から同(九)(いずれも『大阪大学教養部論集』所収)の本文に拠るものであり、電子化にあたってこれを許可いただいた後藤昭維氏に感謝する。3,以上によって、現在把握されている王朝漢詩について、最大限の作品の電子化が完了したことになる。4,新たに加わった「電子版『日本詩紀拾遺』」の本文は、便宜後藤氏の掲載誌別に合わせて、ファイル名syuui01.txtからsyuui09.txtまでの9ファイルのテキストデータベースとして整理保存している。5,今年度は、新たに漢文データベースの作成を開始した。王朝漢文の代表的テキストである『本朝文粋』の基本的電子化テキストを作成した。ファイルは巻別にmonxui01.txtからmonzui14.txtまでの14ファイルとして整理保存している。(今後の研究展開と課題)

1,『日本詩紀』データベースについて、『拾遺』を含めての漢詩作品の作品別番号の決定とJIS規格外漢字の処理方法の研究(ユニコードへの対応)。2,『本朝文粋』の電子化テキストの「データ化」(データ単位の問題)。3,王朝漢詩文テキストデータベースのオンライン公開。『日本詩紀』『日本詩紀拾遺』『本朝文粋』の電子化テキストをデータベース化し、テキスト及びデータ作成に至る方法のまとめを実施した。1.『日本詩紀』『日本詩紀拾遺』『本朝文粋』の電子テキストの本文の校訂した。2.電子化テキストのJIS外文字(非互換漢字)の処理について、一つのデータベースファイルに対して、ISOコード(いわゆるUNIコード)番号表記による汎用テキストデータファイルと、ATOK13のTrueタイプフォントによるWINDOWS版アプリケーション対応ファイルとを複層的に備える方法をとった。その際、文字鏡研究会版「今昔文字鏡」による漢字情報を参考とした。3.『日本詩紀』電子化テキストの作品番号を付した。番号は、巻番号(2桁)・巻内作者番号(2桁)・作者別作品番号(3桁)から成る都合7桁とした。4.『日本詩紀』の作品の出典となっている別集の作品番号を、電子化テキストの各作品に、別集名の略号付で付載し、利用の便宜を図った。その際、各別集の今日最も参考とすべき各注釈書を参考とした。5.『本朝文粋』の作品番号の確認と決定及び行単位データの確認と決定をすすめた。6.王朝漢詩漢文の電子化データのオンライン化のための準備を進めた。(今後の課題)1.以上のテキストデータベースについて、さらにより良質で使用の便宜のよいファイルに向上させるべく、本文のバージョンアップを図る。2.電子版の利用が困難な利用者向けのプリント版の索引化を図る。
糸状菌の化合物生産能を解放するアンロッカー物質の探索

申請者はユニークな構造を有する大村天然化合物ライブラリーを利用し、糸状菌(Talomyces属糸状菌)の分生子形成と色素産生およびLC/ESI-MSデータを指標に糸状菌の化合物生産能の制限を解除する低分子化合物(アンロッカー)の取得および取得したアンロッカーを利用し、糸状菌二次代謝能の解放することで生産する天然有機化合物を単離、構造決定することを目的とした。研究は1stスクリーニング、2ndスクリーニングを行い、2ndスクリーニングを通過した化合物を添加試験を行い濃度依存的に二次代謝プロファイルを変化させた化合物をアンロッカーとした。1stスクリーニングの結果、大村天然化合物ライブラリー794化合物を申請者が開発したペーパーディスク法を基にした評価系で評価したところ76化合物が色素円や分生子の過剰増加がみられた。これらの中にはアクチノマイシンDやオリゴマイシンなどの抗真菌作用を示しかつ阻止円の外側に色素円や分生子の過剰増加が確認できた化合物も含まれている。またヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるトリコスタチンAなどケミカルエピジェネティクスにも用いられる化合物も確認できた。2ndスクリーニングは1stスクリーニングを通過した76化合物を用いて液体培養での評価を行なった。化合物を終濃度10 μg/mL、1 μg/mL、0.1 μg/mLの3つの濃度で培養した。培養6日後、等量のEtOHで培養を止め、上精をLC/ESI-MSなどで分析した。濃度依存的に二次代謝プロファイルが変化した化合物をアンロッカーとした。1stスクリーニングを通過した76化合物のうち、1stスクリーニングで抗菌を示さず化合物の保有量の多い12化合物を評価した。その結果、cyclosporinを添加した時に新たなピークを確認した。また確認したピークはcyclosporinの濃度依存的に減少した。申請者の当初の予定ではすでにアンロッカー決定し、アンロッカー添加時にのみ生産される化合物の特定まで終わっている予定であったが、アンロッカー添加時にのみ生産される化合物の取得が困難であるため現在生産条件の検討を急いでいる。検討課題としてはアンロッカーの添加量の調整が困難であることがあげられる。すでに4回培養をおこなっているが、アンロッカー添加時に新たに生産される化合物が条件検討時のアンロッカーの量では生産しなくなってしまったことがあげられる。これらのことから当初の予定からはやや遅れてしまっている。しかし菌株の安定性と同時に他の菌株での汎用性を検討するとともに新たに産生された化合物の取得を試みることとした。1)アンロッカー添加時にのみ生産される化合物を安定的に生産させる培養条件の検討および菌株を安定させるための培地検討などを行う。2)他の菌株での汎用性を検討するとともに新たに産生された化合物の取得を試みる。3)昨年度の研究結果で得られたアンロッカーの作用メカニズムの解明を検討する。

しかし菌株の安定性と同時に他の菌株での汎用性を検討するとともに新たに産生された化合物の取得を試みることとした。1)アンロッカー添加時にのみ生産される化合物を安定的に生産させる培養条件の検討および菌株を安定させるための培地検討などを行う。2)他の菌株での汎用性を検討するとともに新たに産生された化合物の取得を試みる。3)昨年度の研究結果で得られたアンロッカーの作用メカニズムの解明を検討する。
大腸菌におけるFfh/4.5S RNAに依存したタンパク質膜挿入経路の完全再構成

大腸菌において膜内在性タンパク質は、その合成に共役して膜挿入することが知られている。疎水性の強い膜貫通領域はシグナル認識粒子(SRP)とSRP受容体(SR; FtsY)により膜にターゲットされ、タンパク質膜透過装置(SecYEG)上で膜挿入が進行すると考えられている。SRPは細菌から動物細胞に至るまで、すべての生物に保存されている。大腸菌においては、SRPはFfhタンパク質と4.5S RNAにより構成されている。前年度までの研究により、膜タンパク質MtlAの膜挿入はSRP/SR、SecYEGおよび膜挿入新因子により再構成できることを示し、さらに新因子はlipidA誘導体であることを報告した(J.Biol.Chem.,2006)。この再構成系と、前年度構築した4.5S RNAの枯渇株から調製したタンパク質合成系を組み合わせて、4.5S RNAの機能解析を開始し、4.5S RNAに依存した膜挿入再構成系を確立した。この過程で、4.5S RNAを枯渇した株でSecYEGを大量生産させると生育が回復することを見出した。これまで4.5S RNAは、tRNAやrRNA以外では大腸菌で生育に必須な唯一のスモールRNAであると考えられていたが、本研究により膜挿入部位の増加により4.5S RNAの必要量は大幅に減少することが明らかとなった。4.5S RNAとSecYEGの機能的関連を強く支持する結果である。また、4.5S RNA枯渇株でFfhやFtsYを大量生産させても生育は回復しなかったため、4.5S RNA枯渇株の生育の回復はSecYEGに特異的であることも判明した。これらの成果については、現在論文準備中である。疎水性の強い膜貫通領域はシグナル認識粒子(SRP)とSRP受容体(SR)により膜にターゲットされ、タンパク質膜透過装置(SecYEG)上で膜挿入が進行すると考えられている。我々はMtlA(膜を6回貫通)を膜挿入基質として膜挿入反応の再構成系を確立した。その結果、MtlAの膜挿入にはSRP/SRとSecYEGのみでは不十分であることが判明した。膜挿入反応に関与すると考えられているYidCの添加によってもMtlAの膜挿入は観察されなかった。再構成系を利用してMtlAの膜挿入に必要な因子を検索・精製したところ、SDS-PAGE上で約8kDaの因子を細胞質膜から得ることができた。すなわち、MtlAの膜挿入はSRP/SR、SecYEG、本因子により再構成することができた。この因子はペプチド、糖、脂質を含む化合物であることが判明し、現在構造解析中である。膜挿入反応における4.5S RNAの詳細な機能解析を行うため、まず4.5S RNAをコードするffs遺伝子破壊株を構築した。プラスミド上でffs遺伝子をアラビノースプロモーター支配下に連結し、染色体上のffs遺伝子破壊を行ったところ、生育はアラビノース依存であった。このことは、報告されている通りffs遺伝子は生育に必須であることを示している。この菌を用いて4.5S RNAを枯渇した試験管内タンパク質合成を構築し、再構成系をもちいた4.5S RNAの機能解析を行っている。
遺伝子工学を応用した硝化脱窒過程の解析と高効率化

遺伝子工学を応用して窒素除去を好気的な硝化過程と嫌気的な脱窒過程を同時に行うことを目指して、亜硝酸還元酵素の遺伝子のクロ-ン化を試みている。前年度までにP.denitrificans由来の亜硝酸還元酵素を精製後、亜硝酸還元酵素遺伝子を含むDNA断片をクロ-ン化したが、N末端アミノ酸配列部位およびプロモ-タ-を含む5'ーflanking領域が欠失していた。本年度は、亜硝酸還元遺伝子全体をクロ-ン化して活性のある亜硝酸還元酵素を得るとともに、遺伝子があると期待される他の脱窒に必要な酵素遺伝子をクロ-ン化することを試みた。P.denitrificansの染色体DNAをXhoIで完全消化およびSa1Iで部分消化しλファ-ジを用いたXhoI、Sa1Iライブラリ-を作成し、クロ-ン化された遺伝子の隣接領域のDNAの分離を図った。λファ-ジ上にクロ-ン化したP.denitrificans染色体のXhoIライブラリ-中から、pNO1上のSa1IーHind III 200bpのプロ-ブとハイブリダイズするクロ-ンλーH1、λーX2、またλファ-ジSa1Iライブラリ-から同様にハイブリダイズするクロ-ンλーS1、λーS2、λーS3、λーS4が得られた。一方、P.denitrificansの染色体DNAをXhoIおよびSa1Iで消化したパタ-ンよりこのプロ-ブに対応するXhoI断片は15kb、Sa1I断片は3kb程度と決定した。獲得した6種類のクロ-ンを、Sa1IおよびXhoIで完全消化してサザンハイブリダイゼイションを行ったところ、プロ-ブとハイブリダイズする5種類のXhoI断片およびSa1I断片のクロ-ン化DNAは目的DNAを保持していることを示していた。この5種類のクロ-ン化DNAの制限酵素パタ-ンを調べたところ、Hind IIIーSa1I断片以外が少しずつ異なっており、Hind IIIーSa1I断片を中心として前後に散らばっていることが明かとなり、既にクロ-ン化されている遺伝子の上流に最大3Kbの遺伝子が今回クロ-ン化された。