hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ナチュラルキラーT細胞を活性化して抗腫瘍活性を誘導する新規糖脂質の創製

糖脂質KRN7000は、ナチュラルキラーT細胞を活性化して抗腫瘍活性を誘導する。ガルバガラクトース類縁体RCAI-56は、免疫細胞に対して多量のIPN-gammaの産生を誘導する。そこで、CD1d-KRN7000-TCR複合体のX線結晶構造に基づいて更なる構造活性相関研究を行ったところ、5a-デオキシシクリトール類縁体RCAI-59等が、さらに強力にIPN-gammaを産生誘導することを見出した。キリンビール(株)によって開発されたKRN7000は、免疫細胞の一種ナチュラルキラーT(NKT)細胞を活性化させて抗腫瘍活性を誘導する糖脂質である。2007年に報告されたX線結晶構造解析の結果、KRN7000(alpha-GalCer)のガラクトース部位の6-位の水酸基は、何れのアミノ酸残基とも水素結合を形成していないことが明らかとなった。これまでに数多くの類縁体の合成研究が報告されているが、水素結合を形成している水酸基を他の官能基へと変換した類縁体は、その殆どが活性の低下を招いている。従って、水素結合を形成していないKRN7000の6-位水酸基は、修飾可能であると考えた。6-位水酸基に関して種々の類縁体を合成して構造活性相関研究を行ったところ、6-O-メチル化体,(RCAI-61)など、6-位水酸基部位を疎水性官能基に変換した類縁体は、mouse in vivo試験において強力にIFN-gammaを産生誘導することが明らかとなった。なかでもRCAI-61は、これまでに報告されているどの類縁体よりも強力にIFN-gammaを産生誘導する活性を有している。また、非常に低濃度においてもKRN7000よりも強い活性を示すことから、患者への負担の少ない、新規抗腫瘍薬としての応用が期待される。ドッキングモデルを計算した結果、KRN7000の場合では6-位水酸基は糖脂質の提示蛋白質であるCD1d蛋白質の外坤こ提示されているのに対して、RCAI-61においては、6-位のメトキシ基はCD1dの疎水性結合サイトに深く潜り込んでいることが明らかとなった。この結合様式の違いがIFN-gammaの産生量の差を生んでいる可能性が示唆された。また、我々は既に、KRN7000のガラクトース部位をカルバガラクトースへと変換した類縁体RCAI-56(alpha-carba-GalCer)が、KRN7000よりも強力にIFN-gammaの産生を誘導することを明らかにしている。そこでRCAI-56に対して、6-位水酸基をメチル化した誘導体を合成して活性を評価したところ、mouse in vivo試験においてKRN7000よりも強力にIFN-gammaを産生誘導することが明らかとなった。しかしRCAI-56よりも強力な活性は示さなかったことから、RCAI-56をリード化合物として選定した。RCAI-56の詳細な活性を調査したところ、IFN-gammaを大量に産生誘導するという活性以外にも、[1]RCAI-56はKRN7000よりも強いアジュバント効果を示すこと、[2]Biacore実験により、提示蛋白であるCDldとの複合体CDld/RCAI-56はCDld/KRN7000よりもNKT細胞のT細胞受容体との親和力が強いこと、[3]肝ミクロソームアッセイから、RCAI-56はKRN7000よりも代謝されにくいことが明らかとなった。これらの結果より、RCAI-56が多量のIFN-gamma産生を誘導する理由として、生体内での安定性とNKT細胞に対する結合力の向上が鍵となっていることが示唆された。
イヌでの骨髄間葉系幹細胞移植した血管柄含有チューブ内での神経再生

血管含有チューブ内に骨髄間葉系幹細胞を移植して作成した神経管で、イヌの尺骨神経3cmの神経欠損を架橋した。神経管と3cmの自己神経移植内での神経再生を比較検討した。その結果神経管内での神経再生速度は、自己神経移植に劣るが、24週後には、神経管内での神経再生は、自己神経移植片内での神経再生80%以上まで回復した。またCM dye-Iで標識した骨髄間葉系幹細胞を移植したところ、再生神経内のCM dye-I陽性細胞の一部にS100, GFAPが陽性であった。以上よりチューブ内に移植された骨髄間葉系幹細胞の一部は、シュワン細胞様に分化し、末梢神経再生を促進させていると考えられた。我々はラットで、血管含有チューブ内に移植した骨髄幹細胞はシュワン細胞様に分化し、それらが神経再生を促進させた可能性を示唆した(T. Yamakawa et al. Cell transplant 2007)。今回、より高等動物であるイヌを用いて3cm gapのある骨髄幹細胞移植血管含有チューブ内での神経再生を検討する実験を行っている。現在ビーグル犬6頭に手術を行った。内5頭ですでに12週、24週の電気生理学的検索と神経標本の組織形態学的検索が終わっており、残りの1頭も12週の電気生理学的検索を終了している。電気生理学的検索によれば、12週で、骨髄幹細胞移植血管含有チューブ内再生神経の運動神経伝導速度は、対側肢に行った3cmの自己神経移植の48%、小指球筋のM波の振幅は27%であったが、術後24週では、運動神経伝導速度は72%、小指球筋のM波の振幅は61%まで回復した。また移植後24週で採取した骨髄幹細胞移植血管含有チューブ内での再生神経片と対側肢の尺骨神経に作成した自己神経移植片のそれぞれの横断切片を組織形態学的に観察して、再生神経有髄軸索総数、平均有髄軸索直径、平均有髄軸索密度を測定した。骨髄幹細胞移植血管含有チューブ内再生神経片の有髄軸索総数は6744、平均有髄軸索直径1.64μm、平均有髄軸索密度10274/mm2であった。対側肢に行った自己神経移植片の再生神経有髄軸索総数は7614、平均有髄軸索直径1.86μm、平均有髄軸索密度7712/mm2はであった。骨髄幹細胞移植血管含有チューブ内での再生神経は、自己神経移植には及ばないが、良好な神経再生を示していた。さらに1頭追加し、電気生理、組織学的検索を進める予定である。また2頭を用いて移植した骨髄幹細胞がチューブ内の再生神経内に留まっているかの検索を行う予定である。(1)本研究では、ビーグル犬8頭を用いた。神経チューブ移植実験の約3週間前に、両腸骨より骨髄液を採取し、骨髄間葉系幹細胞(BMC)を分離培養した。内7頭では、イヌ右前肢の尺骨神経に3cmのgapを作成し、培養したBMC3X107個を血管含有チューブ内に移植して架橋した。左尺骨神経には、自己神経移植モデルとして、3cmの尺骨神経を採取し、中枢と末梢を入れ替えて採取部に再移植した。血管含有チューブは、polylactic acidとpolycarprolactoneを7:3で配合して作成し、そのなかに尺骨動静脈を挿入した。移植後12週と24週で血管含有チューブと自己移植神経内での神経伝導速度、小指球筋でのM波振幅を測定した.また24週後で、血管含有チューブまたは自己神経移植片の遠位1cmで神経組織を採取し、組織形態学的解析を行った。残りの1頭では、CM-dye Iで前処置したBMCを血管含有チューブ内に移植し、再生神経をS-100, GFAPで免疫染色した。(2)12週で、BMC移植血管含有チューブ内の再生神経の運動神経伝導速度は、対側肢に行った3cmの自己神経移植の52±35%、小指球筋のM波の振幅は28±30%であったが、術後24週では、運動神経伝導速度は自己神経移植の88±34%、小指球筋のM波の振幅は49±12%まで回復した。また術後24週でのBMC移植血管含有チューブ内の平均再生軸索直径は、自己神経移植の84±13%、平均再生軸索総数は、94±63%、小指球筋の筋湿重量は、84±21%であった。BMC移植血管含有チューブ内での神経再生速度は、自己神経移植に劣るが、チューブ内の24週での神経再生は、ほぼ自己神経移植に匹敵した。CM-dye I陽性細胞の一部にS100、GFAP陽性細胞があり、移植したBMCの一部はシュワン細胞に分化したと考えた。

以上よりチューブ内に移植された骨髄間葉系幹細胞の一部は、シュワン細胞様に分化し、末梢神経再生を促進させていると考えられた。数種類の人工神経は、米国ではFDAの許可を得て、臨床の場ですでに使用されている。しかし人工神経を使って良好な神経再生を獲得するには、神経欠損距離が短いことや知覚の再建にのみ使用するなどの制約があり、まだまだ自己神経移植の成績を凌駕できるものではない。骨髄間葉系幹細胞は、その置かれた環境により、骨、軟骨、脂肪、神経系細胞に分化することが知られており、増殖も早く、培養も比較的簡単である。我々の開発した血管含有チューブ内は、血流に富み、かつその両端に縫合された神経断端より様々な神経好性、栄養因子が分泌されている。そのような環境に骨髄間葉系幹細胞を移植すれば、細胞はその豊富な血流と神経因子により、神経系細胞に分化、増殖し、神経再生を促進させるのではないかと仮説を立てて実験を立案した。チューブ内に骨髄間葉系幹細胞を移植した論文は散見できるが、本実験のように神経チューブ内に移植された細胞の細胞外環境を考慮し、血管含有させたチューブを用いた実験はない。本年移植を行った4頭の結果のうち、再生神経の組織学的検索はまだ完成していないが、電気生理学的検索によれば、12週で、骨髄間細胞移植血管含有チューブ内の再生神経の運動神経伝導速度は、対側肢に行った3cmの自己神経移植の48%、小指球筋のM波の振幅は27%であったが、術後24週では、運動神経伝導速度は72%、小指球筋のM波の振幅は59%まで回復した。骨髄間細胞移植血管含有チューブ内での再生神経は、自己神経移植には及ばないが、良好な神経再生を示していた。イヌからの骨髄液の採取、骨髄幹細胞の抽出、培養、イヌの麻酔、イヌ尺骨神経3cm欠損を尺骨動静脈含有骨髄幹細胞移植チューブで架橋する手術、術後12, 24週での電気生理学的解析、術後24週での再生神経の採取とその組織学的解析に関しては、ほぼ完全に達成する事が出来た。骨髄幹細胞移植血管含有チューブ内の再生神経にどれだけの骨髄幹細胞由来細胞が残っているかを検索する為、LacZ recombinant adenovirusを予め感作させた骨髄幹細胞を血管含有チューブに移植(H. Miwa J Neuropatho Exp Neuro 2001)する実験を計画したが、予備実験として行なったラットの場合と比較して、イヌでは、LacZ recombinant adenovirusで感作できる骨髄幹細胞が極端に少ないため、現在難航している。今後、骨髄幹細胞をCMdyeIで標識する方法に変更し、CMdyeI(インビトロジェン)で標識した骨髄幹細胞を上記の血管含有チューブに移植し、6週間後のチューブ内の再生神経内に残存するCMdyeIで標識された骨髄幹細胞由来細胞の検索を行なうことを検討している。我々はラットを用いて、血管含有チューブ内に移植した骨髄幹細胞は、シュワン細胞様に分化し、それらが神経再生を促進させた可能性を示唆した(T. Yamakawa et al. Cell transplant 2007)。今回ラットより高等動物である犬を用いて3cmのgapのある骨髄間細胞移植血管含有チューブ内での神経再生を検討した。現在ビーグル犬4頭に手術を行った。内3頭ですでに24週の電気生理学的検索と神経標本の採取が終わっており、1頭も12週の電気生理学的検査を終了している。再生神経の組織学的検索はまだ完成していないが、電気生理学的検索によれば、12週で、骨髄間細胞移植血管含有チューブ内の再生神経の運動神経伝導速度は、対側肢に行った3cmの自己神経移植の48%、小指球筋のM波の振幅は27%であったが、術後24週では、運動神経伝導速度は72%、小指球筋のM波の振幅は59%まで回復した。
ニュートリノ事象の即時電磁波フォローアップ観測による放射天体の同定と宇宙線の起源

南極の氷床中に建設されたIceCubeニュートリノ観測所で捕らえられるsub-PeVPeVのエネルギーを持つ高エネルギー・ニュートリノが、どういった天体現象を起源とするのかは永らく謎のままであったが、一昨年よりニュートリノ検出の即時アラートが流れるようになったことから、電磁波対応天体のフォローアップ観測が可能となり、起源の探査に向けて、我々はニュートリノ放射天体の同定観測を進めてきた。我々は、高エネルギーニュートリノが活動銀河核ジェット(ブレーザー)を起源とする可能性を追求するため、ニュートリノ・アラートの位置誤差円(典型的には半径1°)内に存在するブレーザー候補をいち早くピックアップできるように、電波観測カタログをベースとして独自のブレーザーカタログ(Blazar Radio and Optical Suevey, BROSカタログ)を構築した。そして、2017年9月22日にIceCubeで検出されたニュートリノ・イベントに関して、広島大学1.5mかなた望遠鏡を用いて可視光・近赤外線による追跡観測を実施し、その位置誤差円内に存在するBROSカタログ内のブレーザーの測光を行うことにより、増光したブレーザーを見出した。その後、フェルミ・ガンマ線衛星の観測等でもこのブレーザーが増光していることが判明し、高エネルギー・ニュートリノ天体に対して史上初めての対応天体の同定に大きく貢献することができた。また、かなた望遠鏡以外にも、国立天文台ハワイ観測所すばる望遠鏡や、光赤外大学間連携による多地点観測も実施し、可視光・近赤外線域における測光・分光、偏光観測を重点的に実施した。
咀嚼刺激による記憶増強時の皮質間回路の可視化

誰もが日常的に行える「咀嚼」を認知症予防策として活用するために,ヒト脳機能計測により咀嚼刺激時の脳内情報伝達経路を検討した。記憶活動時には,運動前野,縁上回などの皮質部位が,認知機能を制御する前頭前野と協調した活動を行っていることがわかった。記憶活動時のガムチューイングはこの前頭前野機能を活性化させ,認知機能を維持する有力な手段であることが見出された。誰もが日常的に行える「咀嚼」が,超高齢化社会を迎えた我が国の認知症予防法として注目されている。高齢化に伴い衰える認知機能が咀嚼により改善されることは既に多くの報告があるが,その神経機序は未だ不明である。本研究は,脳活動の正確な位置情報を観察するfMRI,皮質間の神経走行を描出するDSI,時間分解能が高いMEG,の3種類のヒト脳マルチモダリティ計測を用いて記憶活動に伴う脳内情報伝達経路の可視化手法を開発し,咀嚼刺激が認知機能改善に与える効果を脳科学の観点から定量的に抽出することを目的とした。研究初年度の本年は,健常ボランティア被験者による短期記憶課題遂行時のMEGデータを計測し,(1)脳内神経活動の時空間変化を抽出するAdaptive Beamformer法を用いた記憶関連脳活動の可視化(2)SPMによる個人脳MRI画像の標準脳座標系への変換とブロードマンエリア同定による記憶関連脳活動の機能的同定(3)ガムチューイング効果の行動指標解析を行った。この結果,(a)過去のfMRI研究で報告のある複数の記憶関連皮質部位の活動がMEGによっても確認され,これらの脳部位が80%以上の高い時間相関を持って協調活動していること,(b)ガムチューイングにより長時間の記憶課題試行を行っても記憶負荷に依存するα波帯域脳活動が増大せず,円滑な記憶課題の遂行が促進されていることを明らかにした。特に(a)の時間的に協調した脳活動は時間分解能に乏しいfMRIでは観察できないものであり,時間分解能に優れたMEGとのマルチモダリティ計測によって初めて明らかになった結果である。これらの成果はInternational Journal of Bioelectromagnetism, Journal of Oral Rehabilitationなど脳科学・歯科医学系の国際雑誌へ発表した。誰もが日常的に行える「咀嚼」が認知機能を改善する脳内のメカニズムを解明し,超高齢化社会を迎えた我が国の認知症予防策として活用するために,ヒト脳マルチモダリティ計測によって脳内情報伝達経路を可視化する手法を検討した。研究二年目の本年は,前年度に計測が完了した短期記憶課題遂行時のMEGデータからの(1)Adaptive Beamformer法による脳内神経活動の時空間変化の抽出(2)SPM解析による活動部位のブロードマンエリア同定に加え,新たに(3)光トポグラフィ装置による脳血流量変化のガムチューイングによる効果の検討を行った。MEGデータ解析から,言語課題による記憶活動を行っているときには,前頭連合野,運動前野,縁上回などの皮質部位が80%以上の高い時間相関を持って協調活動していることが明らかになった。これらは言語情報処理における「中央実行系」,「リハーサルプロセス」,「短期記憶」にそれぞれ関連していることが示唆される。さらに,光トポグラフィで同様の実験を行った結果,中央実行系にあたる前頭連合野のOxy-Hb増加量がガムチューイングにより増大することが明らかになり,昨年度のMEG研究で示された咀嚼による中央実行系の活動促進を裏付ける結果が得られた。これらの成果はJournal of Oral Rehabilitation,Journal of Prosthodontic Researchなど歯科医学系の国際雑誌へ発表したほか,脳神経科学関連の内外学会にて口演・ポスター発表した。
「いじめ」生成過程の分析を基にした予防・解消プログラムの開発

学校でみられる「いじめ」を,攻撃の方法(直接的か非直接的)と,対象(学級内の不特定多数からか,特定の仲間集団内の者からか)を組み合わせ, 4タイプに分類し,発生頻度等を調査した。その結果,年齢が上がるほど非直接的な方法による「いじめ」が増加し,校種により「いじめ」のタイプが異なることが示唆された。また,高校生の「いじめ」被害感覚に関連する出来事には性差がみられ,「いじめ」が学級適応感に与える影響は女子の方が大きいことなどが示唆された。こうした基礎的な調査研究の結果をふまえ,「いじめ」予防・解消プログラムの試案を作成して試行した。学級内における児童の排他性が、親しい友人間にみられる「いじめ」と関連することが先行研究により示唆されており、児童の排他性を低減することが親しい友人間にみられる「いじめ」を予防する手だての一つとなる可能性がある。そこで、教師が行うグループ編成の方法により、児童の排他性が変化するのかどうかを検討した。小学校高学年児童約500名と担任教師を対象にした調査を年度はじめと年度末に実施した。その結果、女子児童に関しては、既存の仲間集団以外の者とのかかわり合いが深まるようなグループ編成を教師が行った学級の児童の方が、そうしたグループ編成を行わなかった学級の児童に比べて、排他性をより低下させることを示唆する結果が得られた。グループ編成の方法を教師が工夫することにより、女子児童の排他性を低減させ、親しい友人間にみられる「いじめ」の発生を抑える可能性がある。高校生の「いじめ」の実態について調査するために、大学生6名を対象にして、高校生のころ、身近でどのような「いじめ」が起きていたのかをPAC分析と呼ばれる面接法により調査し、高校で起きる「いじめ」に該当する行動を分類・整理した。この結果をもとにして22項目からなる「いじめ」被害尺度の原案を作成し、高校生約600名を対象にした調査を実施した。22項目の評定値を因子分析した結果、「広範ないじめ」因子・「仲間からのいじめ」因子という2因子構造がみられた。2つの因子の尺度得点を算出し、学年・性別の2要因による分散分析を行うなどして、調査対象となった高校における「いじめ」問題の特徴を整理した。その結果、男女間および学年間で生徒の「いじめ」被害体験にはちがいがみられた。この調査結果をふまえ、具体的な「いじめ」予防策を、調査対象校の教職員と共に検討し、次年度は、「いじめ」防止に向けた活動を展開する。「いじめ」の生成過程を分析し,予防・解消に向けた基本的な枠組みを作成するために,学校でみられる「いじめ」を,形態と内容により分類することを試みた。具体的には,攻撃の方法が,直接的な方法か,あるいは非直接的な方法かによる分類と,学級内の不特定多数からの攻撃か,あるいは特定の仲間集団内の者からの攻撃かによる分類とを組み合わせ,「いじめ」を4つのタイプに分類した。次に,それぞれのタイプの「いじめ」が,小学校から高等学校までのどの校種でより顕著にみられるのかを明らかにするために,女子大学生を対象にした回想的な手法による調査を実施した。その結果,年齢が上がるに従って,直接的な方法による「いじめ」から,非直接的な方法による「いじめ」へと内容が変化していく可能性があることや,校種によって顕著な「いじめ」のタイプが異なる可能性があることが示唆された。以上の結果を参考にして,高校生を対象にした予防・解消プログラムを作成するために必要な基礎的な資料を収集した。具体的には,高校生にみられる「いじめ」に関連する出来事を,大学生を対象とした調査を行って抽出した。その後,そうした出来事と,「いじめ」被害感覚との関連について,高校生を対象とした調査を行って検討した。さらに,「いじめ」被害感覚と,友人関係の在り方や学級適応感との関連についても,高校生を対象にした同調査の結果をもとにして検討した。その結果,高校生の「いじめ」被害感覚に関連する出来事には性差がみられることや,「いじめ」が学級適応感に与える影響は女子の方が大きいことなどが示唆された。こうした基礎的な検討をもとにして,高等学校入学前の学校適応感等の調査や,「人権」に関連する授業内容の工夫,さらには「いじめ」被害状況の定期的な調査と調査結果の統一的な活用などからなる「いじめ」予防・解消プログラムの試案を作成した。
プロテオーム解析に基づいた新規３次元培養モデルによる口腔癌浸潤能の検討

口腔癌の浸潤メカニズムを明らかにする為,正常細胞から癌化の各過程について,発現タンパクを網羅的に解析し,癌の浸潤に関連する因子として,コラーゲナーゼ、細胞骨格関連タンパクおよび細胞増殖因子を検出した。癌浸潤初期の様子を,ヒト口腔癌細胞株筋腫の板状ディスクの上にヒト口腔癌細胞株を播種する3D癌浸潤モデルを新たに作製し,3次元的な観察を行った。さらに、口腔癌(CA9)のタンパク分解酵素インヒビター(SLPI)遺伝子を欠損させた変異株(NUSD-1)を作製、初期浸潤能を検討し,癌浸潤の関連因子としてコラーゲナーゼ(MMP2、MMP9)およびインヒビターを検証し,癌浸潤制御の可能性を示した。腫瘍細胞が浸潤や転移を起こす際のメカニズムや,この作用の調節機能蛋白などの検討は活発に検討されているが未だ全容は明らかでない。その理由の一つとしてヒト癌細胞の組織浸潤を再現するモデルがないことが考えられる。申請者らはヒトmyoma diskを用いて腫瘍細胞の浸潤機構の解明を試みた。本研究において株化癌細胞のCa9-22と,Ca9-22のSLPIをhomologus recombinationによりknock downsした癌細胞NUSD-1では,その組織浸潤能が顕著に異なることを明らかにした.ヒトmyoma diskに播種したCa9-22は浸潤能を示すのに対し,NUSD-1はmyoma diskの表層で重層化するものの組織内への浸潤が認められなかった。このモデルでNUSD-1の培地にSLPIを添加すると,NUSD-1はCA9-22と同様にmyoma disk内に浸潤能を示す様になった。このとき,癌組織浸潤に際してECMを分解するMMPの産生を両培養細胞について免疫染色,遺伝子発現解析,プロテオー-ム解析などで検討を行ったが、その発現レベルに大きな相違は認められなかった.しかし, myoma diskに播種したCa9では,組織内に浸潤する細胞でMMP-2やMMP-9の発現の増加がみとめられた。この結果から腫瘍細胞で浸潤に必要なMMPの発現は、ECMとの接触により増強されると考えられた。また、NUSD-1においても両MMPsの一定の発現が見られたことからこの現症については,他のMMPsをも検討する必要がある。また,株化Ca9-22やNUSD-1をSLPやTGFを加えて培養後,サイトスピン標本を作製してplectin, desmoplakin ,LaminA/Cの発現を免疫染色で検討した結果,陽性細胞の減少を認めた。この結果からSLPIは上皮細胞間の接着性を減少し,浸潤能を促進するように働くことが示唆され、今後myoma systemでの検証が必要と考えた。新たな展開として,腫瘍の組織内浸潤とchemokine-chemokine receptor interactionsの検討をおこなっている。口腔癌はこれまでの病理組織学的検討により,正常粘膜上皮が異形成をおこし,上皮内癌のステージを経て,浸潤癌へと進行することが分かっている。申請者らは各ステージにおける上皮細胞層のプロテオーム解析をおこない,浸潤癌へと進行する過程での発現タンパクを比較検討した。正常上皮から異形成をおこすと,Keratin13,Keartin17,Heat-shock-proteinなどが有意に変動することが明らかとなった。また,浸潤癌ではLamin A/C, desmoplakin,plectin-1などの発現が上昇していた。これらの分子は,腺癌では癌の浸潤や予後との相関がみられることが報告されている。しかし,扁平上皮癌である口腔癌においては,これらの分子の働きが明らかでないことから,浸潤癌診断のマーカーとしての有意性の検討をおこなった.申請者らは,口腔浸潤癌評価の方法に付いて,従来の免疫組織化学,分子生物学的手法に加え,ヒト子宮筋腫ディスク上に腫瘍細胞を播種して浸潤能を評価する3次元的浸潤モデルを開発して検討をおこなった.現在までに免疫組織化学により,上皮内癌への進展には上皮異形成の進行に伴い,上皮有棘層におけるKeratin13が消失,Keartin17の新たな出現がみられること,HSP27.HSP90の発現亢進がみられることを明らかにした。そこで,3次元浸潤モデルの開発を研究年次を前倒しして検討をおこなった。現在までに,HSC-3,HSC-3,Ca9および申請者の研究室で開発したCa9のserin proteinaseinhibitorを発現抑制したHSC-1を用いて,各細胞の浸潤動態のサの検討をおこなっている。

未処理の癌細胞(HSC-3,HSC-3,Ca9)は,筋腫ディスク内へ浸潤を示すことが明らかであったが,筋腫表層での重層化が口腔粘膜とは異なるという問題点も明らかになった。癌の制御は,初期浸潤癌を制御することにある。とくに口腔癌では,病変を直視できるにも関わらず,制御が困難となることも多い。癌の増殖および浸潤のメカニズム未だ不明な点が多い。本研究では、ヒト正常粘膜上皮、上皮異形成、CISおよび浸潤癌の,各組織から上皮成分を切除してプロテオーム解析を行い,癌への進行に伴い変動する412因子のデータベースを構築した。それらの中で今回は特に、ケラチン、HSP、ラミン/ C、デスモプラキン、MMPおよびプレクチン-1に注目した。これらは、いずれもタンパク質レベルで上昇していた。ついで癌の初期浸潤癌における因子を検証するために、口腔扁平上皮癌細胞株Ca9およびヒト筋腫組織を使用して3Dの癌浸潤モデルを開発した。癌の初期浸潤を制御することを考え,Ca9のserin protease inhibitor遺伝子をノックダウンした細胞株NUSD-1を作製した。このNUSD-1はは,Ca9と異なり筋腫内に浸潤を示さなかった。この口腔癌浸潤モデルをつかって,proteome解析で変動が大きく,癌浸潤をコントロールすると考えられるMMPの発現を検討したところ,Ca9にはMMP2,9の発現をみたが,NUDSD-1では発現が見られなかった。さらにTIMPの発現はCa9ではTIMP-1がわずかに発現するのみで,NUDSD-1ではTIMP-1,-2,-4が強発現していた。さらにMMPインヒビターを加えると浸潤が見られないことも確認した。ついでケラチンについて,観察するとCaではCK17が高発現していたが,NUSD-1では発現が見られなかった。NUSD-1は未刺激では浸潤能を示さないが,SLPIあるいはTGFβで刺激し長期間培養すると,わずかに浸潤を示した。この時の両細胞のケラチン発現に変化を認めなかった。以上の結果、口腔癌初期浸潤における応答性の要因としてMMP2、MMP9およびTIMP考えられ,これらの因子の発現パターンは、腫瘍の浸潤を制御することを示した。口腔病理学申請者らはHSC-2, HSC -3, HSC -4,Ca9-22,Ca9-22から作成したNUSD-1などの株化細胞をmyoma disk上に播種して培養後,細胞の重層化が不安定などの問題があったが,播種方法を改良することで,現在では本法により安定した結果が得られ、従来のゲル上に癌細胞を播種して浸潤能を評価する方法とは異なった、ヒト癌細胞のin vitro浸潤モデルを確立した.myomadisk使用し上記株化細胞の浸潤能を比較検討した結果,myoma組織内への浸潤能は細胞間で相違が認められた。特に, Ca9-22とNUSD-1の両細胞間で浸潤能の差は顕著であり,Ca9-22は早期にmyoma diskに浸潤するのに対し,NUSD-1では浸潤せずにmyoma disk表面で重層化した.しかし,NUSD-1の培養液にSLPIを添加することで,NUSD-1が浸潤能を獲得することを見いだした。腫瘍細胞の組織浸潤に関与するとされるMMPsについて,株化細胞の解析では浸潤能の有無で発現に差は見られなかったが、myoma disk内へ浸潤する細胞では発現が上昇していた.
免疫チェックポイント阻害剤を用いたH. suis感染胃リンパ腫抑制効果の検討

本研究計画では、H. suis感染胃MALTリンパ腫発症マウスモデルを用いて、胃MALTリンパ腫を構成している各々の細胞上の免疫チェックポイント関連遺伝子、ならびに、そに付随する関連遺伝子発現の詳細を明らかにする。また、リンパ腫細胞株を用いた組換えIFN-γの刺激実験により、リンパ腫細胞上の免疫チェックポイント関連遺伝子の発現について評価し、これら関連遺伝子の発現と胃MALTリンパ腫発症との関連性を明らかにする。さらに、H. suis感染胃MALTリンパ腫発症に対する抗PD-L1抗体、ならびに、抗PD-1抗体の抗腫瘍効果の有効性を明らかにする。
痛みの定量的評価のための複数の生理情報の計測と多変量的処理

本研究は、整形外科領域でのCPMによる治療中など、臨床の場で使用可能な、客観的痛みモニタを開発することを最終目標とするが、痛みの定量的評価への基礎的段階として、先ず健常者を対象とし、痛みと生理情報の関係をより一般的に調べ解明するための実験を行った。痛み刺激を定量的に与えうる装置を試作し、(1)前腕部に鞭打、(2)肘関節に打撲、(3)前腕筋への電気刺激による痛みを健常被験者に与えたときの反応を調べるため、心電図、心拍数、脳波、呼吸、GSR(皮膚電気反射)、筋電図、体温等の生理情報を同時計測・記録した。現在までに得られた結果は以下の通りである。(1)表面的には痛み刺激の種類による相違は見られないが、なお詳しい検討を要す。(2)心電図波形自身には変化がない。(3)筋電図には痛みの反応が見られる部位がある。(4)GSRは一般によく反応するものの注意力や精神動揺に左右され、反応に個人差や状況依存性が大きい。(5)心拍数変動も個人差が大きいが、一般にはGSRよりも痛み刺激によく対応する。(6)脳波の反応は極めて複雑で、表面的には開眼時に殆ど変化がないものの閉眼時には痛みによりα波が誘発される傾向がある。(7)体温には刺激に応ずるほどの速い変化が見られない。以上の生理情報の多変量的処理によりデータ間の相互関係が明らかになりつつあるが、個人差や複雑な状況依存性のため、単一の生理情報のみに集約して痛みを評価することは不可能で、個人差を伴うある程度の主観を含めた痛みの程度を、複数の生理情報から多変量的に抽出処理せざるを得ないことが明確になった。整形外科での治療に伴うものに近い痛みで、正常者で模擬的な実験が可能なよう、前腕部に鞭打様の衝撃を再現性よく印加する専用の痛み付加装置を作成し、数名の正常被験者に対し、痛み刺激の印加中に自律脳波、胸部心電図、鼻孔サーミスタによる呼吸波形、痛み印加と反対側の前腕部或いは顔面の表面筋電図、皮膚電気反射(GSR)等を無侵襲的に同時計測し、後の処理のため、刺激系列とともに多チャネルのデータレコーダに記録した。脳波については主に周波数解析を行った。また、タコグラムと逆数回路を用い、心電図より瞬時心拍数およびその平均的トレンドを求めた。脳波については、電気的環境条件を考慮してテレメトリによったが、なお、交流雑音の混入が多く、現在の時点では、基礎律動の解析から有意な結論が得られていない。また、痛みによる誘発脳波を調べるべきだが、痛み刺激の繰り返し印加回数を、人道上、あまり多くできないため、明確な結果を導くことが困難であった。GSRについては痛みに同期して大きな反応がみられるが、なお、被験者の個性及び心理状態により同一の刺激条件でも全く出現しないこともあり、GSR単独では痛みの程度を評価できないことが知られた。心電図波形そのものは痛みにより変化がないが、心拍数のトレンドにはGSRと同様、明確な反応が見られることがあるものの、やはり個人差等が多く、かつ、GSRの出現とも、必ずしも一致しない。従って、これらの情報に筋電図や呼吸数の変動パタンを含めて、複数の生理情報を総合的に解析し、より定量性のある評価を行うべきことが示唆された。次年度には、より臨床の現実に近い痛みの印加方法の検討とともに、痛みの反応が潜む生理情報を選別し総合評価する解析手法を導出する予定である。

本研究は、整形外科領域でのCPMによる治療中など、臨床の場で使用可能な、客観的痛みモニタを開発することを最終目標とするが、痛みの定量的評価への基礎的段階として、先ず健常者を対象とし、痛みと生理情報の関係をより一般的に調べ解明するための実験を行った。痛み刺激を定量的に与えうる装置を試作し、(1)前腕部に鞭打、(2)肘関節に打撲、(3)前腕筋への電気刺激による痛みを健常被験者に与えたときの反応を調べるため、心電図、心拍数、脳波、呼吸、GSR(皮膚電気反射)、筋電図、体温等の生理情報を同時計測・記録した。現在までに得られた結果は以下の通りである。(1)表面的には痛み刺激の種類による相違は見られないが、なお詳しい検討を要す。(2)心電図波形自身には変化がない。(3)筋電図には痛みの反応が見られる部位がある。(4)GSRは一般によく反応するものの注意力や精神動揺に左右され、反応に個人差や状況依存性が大きい。(5)心拍数変動も個人差が大きいが、一般にはGSRよりも痛み刺激によく対応する。(6)脳波の反応は極めて複雑で、表面的には開眼時に殆ど変化がないものの閉眼時には痛みによりα波が誘発される傾向がある。(7)体温には刺激に応ずるほどの速い変化が見られない。以上の生理情報の多変量的処理によりデータ間の相互関係が明らかになりつつあるが、個人差や複雑な状況依存性のため、単一の生理情報のみに集約して痛みを評価することは不可能で、個人差を伴うある程度の主観を含めた痛みの程度を、複数の生理情報から多変量的に抽出処理せざるを得ないことが明確になった。
ダイズ塩誘導性遺伝子群の機能解析を通した塩ストレス応答性代謝・生合成系の解明

100mM塩化ナトリウム水耕液によるストレス処理を72時間施したダイズのRNAに対して、未処理のダイズRNAを用いたAFLP-based mRNA fingerprinting法(cDNA・AFLP法)の比較分析によって、106種類の塩ストレス特異的増幅断片(G__-alycine m__-ax T__-ranscript-d__-erived f__-ragment、以下GmTDF)をクローニングした。各GmTDFクローンの塩基配列と既知遺伝子とのBLAST相同性検索の結果、クエン酸関連酵素、ヒートショックタンパク質やジャスモン酸誘導性タンパク質といったストレス誘導性タンパク質、転写制御やシグナル伝達に関与するタンパク質など、これまで植物の塩ストレス応答性遺伝子として報告された遺伝子産物と高い相同性を示すGmTDFクローンが多数存在していた。一方、配列未知、機能未知なESTと相同性を示すGmTDFクローンも全体の約40%を占めており、(1)植物には未だ明らかとなっていない塩ストレス応答メカニズムが存在すること、(2)cDNA-AFLP法がダイズの環境ストレス応答性機構を解析する有用な方法であることが明らかとなった。さらに未解明なダイズ塩ストレス応答性機構を明らかとするため、既知未知なESTクローンと相同牲を示した44クローンについて、ノーザン法およびリバースノーザン法によって転写応答性の強いGmTDFクローンを選抜した。ESTクローンの由来などを考慮して群細に分類した結果、マメ科由来のESTとのみ高い相同性を示し、ストレス処理由来の情報があるカテゴリーができ、5クローンがそこに分類された。このカテゴリーに属する遺伝子はマメ科独自に存在する塩ストレス応答性機構に関与すると予想される。現在、これらのクローンについて、全長cDNAの単離、トランスジェニック植物を用いた機能解析を進めている。ダイズ由来の塩ストレス応答遺伝子群を単離するため、100mM NaClで3日間処理したダイズと未処理個体から抽出したRNAを鋳型サンプルとしてAFLP- based mRNA fingerprinting(cDNA-AFLP)法によるスクリーニングを行った。256通りのプライマー組み合わせによる解析の結果、塩処理、未処理個体共に約11,000本の増幅cDNA断片を検出し、両処理区間で増幅性の異なるcDNA断片を約5,000本得ることができた。そこで、このcDNA断片の中からNaCl処理個体でのみ特異的に増幅している106断片をプラスミドベクターにサブクローニングし、ノーザン解析による塩ストレス誘導性を再確認した後、塩基配列の決定及びBLASTによる既知遺伝子との相同性検索を行った。BLAST検索の結果、高等植物のクエン酸回路関連酵素、ヒートショックタンパク質やジャスモン酸誘導性タンパク質といったストレス誘導性タンパク質、転写制御やシグナル伝達に関与するタンパク質等、これまで塩ストレス応答性遺伝子として報告されたタンパク質(遺伝子)と高い相同性を示すcDNA断片をクローニングしていることがわかった。また、解析したクローンの約30%は機能未知なESTクローンと高い相同性を示したことから、ダイズ新規塩ストレス応答性遺伝子を単離した可能性が高い。現在、クローン化したcDNA断片の発現特異性、機能を詳細に理解するため、組織、経時性、各種ストレスへの応答性をノーザン解析及び定量RT-PCRによる解析、形質転換植物を利用した機能解析に向けて全長cDNA配列の単離を進めている。以上の結果は、第23回日本分子生物学会(神戸大会)で報告した。
広汎な画像データから太陽系小天体を検出するソフトウェアの開発

近年広視野CCDカメラが開発されて以来、大量に蓄積されつつある天体サーベイの画像データから太陽系小天体を検出するソフトウェアの開発を試みた。天文データアーカイブには様々な露出時間・時間間隔で取得された画像データが保存されており、そのようなデータの中から、偶然映り込んでいる様々な速度で天球上を運動している太陽系小天体を見つけて、同定していくのは容易なことではなかった。我々が作成した検出プログラムには、撮像の時間間隔がまちまちな同一視野の画像で移動天体を探す方法、及び同一視野の連続撮像画像で移動天体検出する方法の二通りがある。この研究は平成23ー24年度に行ったパリ天文台の研究者とのソフトウェア開発が基礎になっている。平成25年度には日本からパリ天文台へ出向き、すばるのSuprime-Camの画像データに適用する移動天体検出ソフトウェアの開発を行う予定であったが、パリの研究者が来日の資金を得たので、国立天文台に来てもらい、国立天文台のコンピューターにソフトウェアの移植を行った。これにより、セミオートで、天体の検出から天体の位置と明るさの測キャリブレーションが可能になった。研究代表者はこのソフトウェアを使って、すばる望遠鏡のアーカイブデータから、2002年9月に撮られた単一視野を連続観測した100数十枚の画像を解析し、112個の移動天体のキャリブレーション済みの光度変化のデータを得た。現在そのデータから、個々の移動天体の自転周期の決定を行っているところである。現在の天体検出ソフトウェアでは、多くの場合うまく移動天体を検出できるが、Suprime-Camのある特定のCCDチップでは、目で見てそこに移動天体があることは明らかなのに、まったく検出できなかった。これはおそらく個々のCCDチップの感度特性と関係すると推測され、現在原因特定を行っているところである。また、平成23ー24年度にはパリ天文台の研究者との共同研究とは独立して、國立中央大学(台湾)の研究者ととも移動天体の測光ソフトウェアの開発を進めていたが、本年度はその測光ソフトウェアを2005年8月に撮られたSuprime-Camの多バンドのデータに適用してみた。このソフトウェアは天体形状にフィットしたアパーチャー測光を行うので、小惑星のような長期露出の間に延びた形に写る天体の測光精度は、研究代表者が従来使用してきた円形のアパーチャーを使うソフトウェアより向上した。平成26年度は、平成25年度から引き続いてパリ天文台の研究者の作成したソフトウェアの改良を行い、すばる望遠鏡のSuprime-Camで撮られた画像を使って太陽系小天体を検出を試みた。また、台湾の國立中央大学の研究者とともに、天体カタログを使った別の検出方法で太陽系小天体を検出する方法も開発した。2002年9月年に撮られた画像セットは同じ視野を長時間にわたって撮像したもので、開発したソフトウェアで太陽系小天体の検出を行い、各天体の光度変化を測定して自転周期を推定した。この結果はフィンランドのヘルシンキで2014.6.30-2014.7.4に開催された国際会議ACM2014で発表し、現在論文にまとめている最中である。2005年8月に撮られた画像セットは同じ視野を短時間だけ数枚撮ったデータセットだったので、これまでの我々のソフトウェアでは自動検出が難しかった。そのため、台湾の國立中央大学の研究者の協力を得て、画像から天体カタログを作成し、検出された天体の位置情報に基づいて移動天体を検出するプログラムを考案した。この方法で検出された移動天体のカラーを測定した結果はU.S.A.のアリゾナで2014.11.9-14の開催された46th Annual Meeting Division for Planetary Sciencesで発表し、次の論文にまとめた。2014年3月に本格的なHyper Suprime-Cam(HSC)を使ったサーベイが始まってからは、HSCの画像データから太陽系小天体を検出することを始めた。現在、様々な移動速度の天体をより正確に測光できるような手段を構築中である。太陽系内の小天体は太陽からの距離や軌道の形にしたがって、また地球から見る方向によって、様々な速度で天球上を運動している。一般に地球に近いものは速く動き、地球から遠い天体の動きは遅い。天文データアーカイブに数分角以上の領域を撮像した画像データを探すと、太陽系の小天体は恒星よりずっと手前にあるため、観測でその画像を取得した研究者が意図してなくても太陽系小天体が紛れ込んでいることは多々ある。研究代表者はこのような天文データアーカイブ画像に眠っている太陽系小天体を探し出して、研究に使えないかという試みをこの研究課題を通して行った。しかも年ごとにアーカイブのデータ量は増し、新しい観測装置によって撮られたデータが追加されていく。最終年度は最新かつ最大の視野をもつHyper Suprime-Camで取得されたデータを使って、どのように太陽系小天体を検出できるかを検討した。2枚の画像を比較して検出できた移動天体から移動速度を算出して、その天体の仮軌道を決め、その軌道に沿って天体の位置を予測するように天体を追跡しながら移動天体を検出していくソフトや、バラバラに検出された移動天体群からもっともらしい軌道が成り立つかどうかを判断して、移動天体を同定するソフトの原型を作った。

天文データアーカイブには様々な露出時間・時間間隔で取得された画像データが保存されており、そのようなデータの中から、偶然映り込んでいる様々な速度で天球上を運動している太陽系小天体を見つけて、同定していくのは容易なことではなかった。我々が作成した検出プログラムには、撮像の時間間隔がまちまちな同一視野の画像で移動天体を探す方法、及び同一視野の連続撮像画像で移動天体検出する方法の二通りがある。いろんな画像データセットがあるので、あらゆるパターンのデータセットで様々なグループの太陽系小天体の検出を行える統一したソフトウェアを作るのはかなり難しいことがわかった。そのため、利用可能な画像データセットのパターン分けを行い、現在は2種類のソフトウェアでおよそすべての太陽系小天体グループの天体が検出できるようになり、開発は概ね順調に進展している。惑星科学現在はまだステップごとに手動でinputファイルを指定する箇所があるため、今後は一連の作業をできる限り自動化できるようにつとめたい。また、移動天体の形に合わせたアパーチャーを用いて、測光精度の向上を目指したい。国立天文台のコンピューターに開発されたソフトウェアを移植し、本格的にSuprime-Camデータの解析が可能になった。まだセミオートでしか解析が進まないので、今後どこまで自動化できるかが、作業効率化の鍵となる。平成26年度は、台湾から研究者を招聘して、いっしょに太陽系天体の検出プログラム作成に取り組んだが、この招聘旅費を別の予算枠から出すことができたため、差額が生じている。また、HSCの画像解析用のコンピューターを購入する予定であったが、HSC画像の解析には予想よりかなり高性能のものが必要であり、予定していた金額での購入は難しかった。いろいろ探した結果、他のプロジェクトから譲り受けたコンピューターを活用することができたので、これも差額の原因になっている。今後は、パリ天文台の研究者と協力して開発をすすめたソフトウェアと、國立中央大学の研究者の協力で開発された測光ソフトウェアの良いところを合体させ、さらにより広範囲で自動化を可能にする。そして、Suprime-Cam以外の画像データにも適用できるよう、開発を進めていきたい。なおこの差額は、これから太陽系小天体検出をメインで行うHSCで取得したデータ解析用の画像を置いておくハードディスクを購入する予定である。HSCの画像は1ショットの容量が185MBで、一晩のデータ量が30GBと大きいので、大量のハードディスクが必要となる。また、HSCの画像処理は大量の画像を一気に処理するため、メモリの増強も考えている。そのため差額をメモリのの購入にも充てたい。平成25年度にはこちらからパリ天文台に出向いて、ソフトウェア開発および、国立天文台のコンピューターへソフトウェア移植を行う予定であったが、幸運にもパリ天文台の研究者が独自に訪日する資金を得たため、3人の研究者が来日し、日本で打ち合わせ且つ開発等を行うことができた。
ジェネラリストナースのノンテクニカルスキルの評価指標の開発と組織支援の検討

社会の要請に応えられる安全で質の高いケアを提供していくためには、あらゆる対象者に対して質の高い看護を提供するジェネラリストナースの育成とともに、ジェネラリストナースの能力を生かすことのできる組織支援が必須である。本研究では、ジェネラリストナースのノンテクニカルスキルを主観的・客観的に評価する指標を開発し、ジェネラリストナースがいきいきと働ける組織的人材育成の方策を検討することを目的として、ジェネラリストナースのノンテクニカルスキル獲得および向上に関する効果的な組織支援のあり方の検討を行う。
尿路生殖器腫瘍におけるKip2遺伝子の異常

16例のWilms腫瘍と10例の泌尿生殖器腫瘍についてIGF2遺伝子及びKIP2遺伝子について,genomic imprintingの状態,遺伝子のメチル化について検討を行いました。IGF2のimprintingの状態はそれぞれの腫瘍で正常が7例と5例,ヘテロ接合性の喪失が4例と2例,relaxationが5例と3例に認められました。KIP2のimprintingの状態は解析できた症例7例全てで正常に保たれており,これらの遺伝子は非常に近い遺伝子座にあるにも関わらず,異なった機構で調節されていることが示唆されました。次いで,imprintingと遺伝子のメチル化について検討しました。IGF2遺伝子36kbp全長にわたって13のDNA断片をプローブとして用い,メチル化感受性のHpaIIと非感受性のisoschizomerであるMspIによって消化したWilms腫瘍DNAに対してサザン解析を行った所,genomic imprintingと相関するメチル化はプロモーターの2kbp上流に認められ,これはimprintingによって抑制された母方由来のアレルに特異的でした。IGF2他の部位は全て低メチル化状態であり,この知見はマウスで既に報告されているものとは異なっており,ヒトにおいてはマウスとは異なったimprinting調節機構の存在を示唆する結果であり,Wilms腫瘍発生のメカニズムとIGF2遺伝子のgenomic imprintingの異常との関わりが示唆されました。KIP2遺伝子においては解析した全症例において遺伝子全体にわたって低メチル化状態を示しimprinting特異的なメチル化は認められませんでした。この結果も2つの遺伝子が近傍に(11p15.5)存在するにも関わらず,genomic imprintingに関して異なった調節を受けていることを示唆するものです。KIP2遺伝子の変異については研究を継続中で未だ一定の見解が得られていません。1.膀胱癌25例,前立腺癌20例,精巣腫瘍5例についてパラフィン包埋標本及び新鮮手術標本からDNAを抽出しました。同時に正常組織(主に血液)からもDNAを抽出し以下の検討を行いました。2. 11番染色体短腕末端部(11p15)に存在するkip2,TH,IGF2,H19について遺伝子多型をPCRで検討したところ,各遺伝子座におけるヘテロの割合はそれぞれ15/50,40/50,12/50,10/50で,少なくとも一つの遺伝子座でペテロであったのは45/50でした。3.ヘテロの症例45例のうちへテロ接合性の喪失(LOH)は5症例で認められました。LOHの証明された遺伝子座はkip2,TH,IGF2,H19でそれぞれ1/5,5/5,1/5,2/5でした。4. kip2遺伝子の変異についても検討を行っており,30症例について10対のPCRプライマーでkip2遺伝子を数百bpずつ増幅してkip2遺伝子全体について正常と腫瘍をSSCP法で比較しました。30例中10症例に少なくとも1カ所で腫瘍に特異的なパターンを認め,これらについてはDNAシークエンスを行って詳しく検討しているところです。5. kip2インプリンティングについては新鮮手術標本が得られ且つkip2におけるヘテロが証明された1症例について検討いたしましたが,2つのアレルの一方からのみの発現が認められ腫瘍においてもインプリンティングが保たれていました。ただ,両親の遺伝子型が得られず発現アレルの由来については結論できませんでした。6. kip2遺伝子のメチル化についてメチル化感受性制限酵素を用いたサザン解析で検討しました。kip2の5'領域をプローブとして用いた結果では腫瘍組織,正常組織いずれにおいても低メチル化状態と考えられる結果を得ました。腫瘍特異的なメチル化の変化は現在の所検出されていません。

1.膀胱癌30例,前立腺癌23例,精巣腫瘍6例についてパラフィン包埋標本及び新鮮手術標本からDNAを抽出しました。同時に正常組織(主に血液)からもDNAを抽出し以下の検討を行いました。2.11番染色体短腕末端部(11p15)に存在するkip2,TH,IGF2,H19について遺伝子多型をPCRで検討したところ,各遺伝子座におけるヘテロの役割はそれぞれ17/59,45/59,14/59,11/59で,少なくとも一つの遺伝子座でヘテロであったのは49/59でした。3.ヘテロの症例49例のうちヘテロ接合性の喪失(LOH)は7症例で認められました。LOHの証明された遺伝子座はkip2,TH,IGF2,H19でそれぞれ2/7,6/5,2/7,3/7でした。4.kip2遺伝子の変異についても検討を行っており,30症例について10対のPCRプライマーでkip2遺伝子を数百bpづつ増幅してkip2遺伝子全体について正常と腫瘍をSSCP法で比較しました。30例中10症例に少なくとも1カ所で腫瘍に特異的パターンを認めました。DNAシークエンスを行ったところ,特定の部位に変異がおこっているということは観察されませんでした。5.kip2インプリンティングについては新鮮手術標本が得られ且つkip2におけるヘテロが証明された1症例について検討いたしましたが,2つのアレルの一方からのみの発現が認められ腫瘍においてもインプリンティングが保たれていました。ただ,両親の遺伝子型が得られず発現アレルの由来については結論できませんでした。6.kip2の5'領域をプローブとして用いた結果では腫瘍組織,正常組織いずれにおいても低メチル化状態と考えられる結果を得ました。腫瘍特異的なメチル化の変化は検出されていませんでした。
異常蛋白質蓄積によるASK1シグナルを介した神経変性細胞死の分子病態の解明

神経変性疾患の「引き金」としての「異常蛋白質の蓄積」が最終的に神経機能異常や細胞死に繋がる分子メカニズム、特にシグナル伝達については明らかでない。本研究では、ストレス応答MAP3キナーゼASK1が異常蛋白質の蓄積によって活性化し、神経機能異常および細胞死を誘導するシグナル伝達機構及び分子メカニズムについて解明することを目的とした。これまで我々は、ASK1がポリグルタミン凝集による小胞体ストレス誘導性アポトーシスに必須であることを証明してきた。今回、様々な神経変性疾患において、このようなASK1依存的神経細胞死が普遍的に存在するか否かについて、まず筋萎縮性側索硬化症(ALS)のモデルマウスを用いて検討した。その結果、(1)ALS原因蛋白質である変異型SOD1の神経細胞への過剰発現よるASK1の活性化、(2)ASK1欠損マウスの運動神経細胞での変異型SOD1過剰発現による神経細胞死の軽減、(3)変異型SOD1を過剰発現させたALS発症モデルマウスとASK1欠損マウスとの掛け合わせによる生存期間の延長、という興味深い結果を得た。現在、小胞体ストレスとの関連性を詳細に検討している。また、アルツハイマー病の原因蛋白質アミロイドβによる神経細胞死へのASK1の関与についても検討し、(1)アミロイドβによる活性酸素産生を介したASK1活性化、(2)ASK1欠損神経細胞でのアミロイドβ誘導の下流キナーゼJNKの活性化の低下及び神経細胞死の著しい抑制、が観察された。この系では、小胞体ストレスの寄与は低いと考えられる。「異常蛋白質の蓄積」によって、小胞体ストレスの誘起や活性酸素産生など、それぞれの神経変性疾患の病態で原因となるターゲット分子やメカニズムにも多様性が見られる。それら個々のメカニズムとASK1の関与について、さらに分子レベルでの検討を進めたい。
近代日本仏教と戒律――宗教言説史におけるプラクティスの再検討

本研究は、近年の宗教概念研究において蓄積されてきた「ビリーフの重視/プラクティスの後退」という構図を再考すべく、伝統的な仏教者の実践である「戒律」に焦点に当てるものである。より具体的には、言説研究の手法を採用しつつ、近代を代表する多様な仏教者の営為と思想運動に焦点を当てることで、そこに「戒律」が如何に応用され、また「乗り越えられて行った」のかを考究する。