hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
重粒子線を用いた致死性心室性不整脈の新規治療開発

本研究の目的は,イヌMIモデルを用いてTHIRによる急性期の心室遅延電位(LP)、慢性期の不整脈抑制効果の有無を検討することである。対象は体重9-10kgのビーグル犬16匹(MI群, MI+THIR群,コントロール群,コントロール+THIR群, 4匹ずつ)。経皮的カテーテルによるマイクロスフェアー注入法により冠動脈左回旋枝を閉塞し,前側壁梗塞を作成した。THIRは理化学研究所においてMI作成後2週間で施行した。MI作成およびTHIR施行前後で、12誘導心電図による経時的なLPの計測を行った。慢性期の心室性不整脈に関しては,MI作成1年後に電気生理学的検査を行い,プログラム刺激によるVT/VFの誘発性を評価した。結果LPは,MI作成前,急性期(2週間)、慢性期(1年)で測定し、MI+THIR群がMI群に比し有意に陰性率が高値であった(MI作成前:0% vs 0%, p<n.s, 2週間:100% vs 25%, p<0.01, 1年:100% vs 25%, p<0.01)。慢性期の誘発性VT/VFはMI群で全例出現したが,MI+THIR群では1例のみであった。コントロール群(Cont)におけるLPは,THIR施行前,施行後(2週間)、慢性期(1年)で測定し、Cont群とCont+THIR群では有意さは認めなかった。慢性期のVT/VFはいずれの群においても誘発されなかった。重粒子線照射は梗塞後のLPを改善し、慢性期における致死性心室性不整脈を抑制した。健常心に対する重粒子線照射に伴う催不整脈作用は認められなかった。計画された実験は順調に進展し、実験はほぼ終了した。今年度は最終年度になるため、発表論文作成のため努力する。実験の遂行ならびに得られた実験データの解析状況はおおむね順調に進展している。今年度はイヌMIモデルを用いてTHIRによる急性期の心室遅延電位(LP)、慢性期の不整脈抑制効果の有無を検討を行った。大型動物を用いた生体実験ではあるが、現時点で予期せぬ合併症や問題点は認めない。実験から得られた、心筋MRI検査、12誘導心電図、遅延電位、免疫染色、電気生理学検査、心機能検査の全ての結果を検証する。今回得られた実験データの解析をさらに詳細に進める必要があり、解析におよそ6か月程度を見込んでいる。その後、サクリファイスしたイヌの心筋病理および免疫染色の検討を行い、さらには研究成果の学会発表・論文化を予定しており、次年度内にはいずれも行えるように努力する。該当なし初年度に行った実験で、慢性期の心室性不整脈に関しては,MI作成1年後に電気生理学的検査を行い,プログラム刺激によるVT/VFの誘発性を評価した。次年度の研究費はサクリファイスしたイヌの心筋病理および免疫染色の検討を行う費用に使用予定である。また研究成果の学会発表・論文化を行った際の、出張旅費および論文掲載料等などに使用する目的である。
疎結合スピングラスモデルにおけるレプリカ対称性の破れに関する研究

本研究の目的は,平均場型の疎結合スピングラス模型に対して,i)レプリカ対称解の局所的不安定化を意味するde Almeida Thouless(AT)条件の一般的な条件を与えること,また,ii)その結果得られるレプリカ非対称解に関する知見を得ることである.確率伝搬法(BP),ベーテ近似ならびにマルコフ連鎖モンテカルロ法に基づく解析により,以下の結果を得た.これらの結果は,スピングラス問題,また,情報科学の問題に現れるレプリカ対称性の破れを解析する際に有用な知見となることが期待される.1. BPに基づきスピングラス帯磁率を評価することで,疎結合模型に対するAT条件を評価する手法を与えた.また,AT条件が大偏差統計によって定まることを指摘し,大偏差を特徴付ける指数を数値的に求める方法を与えた.2.ベーテ近似解を効率的に探索するアルゴリズムを開発した.更にこのアルゴリズムを用いてヘシアン解析を行い磁場がそれほど大きくない領域では比較的小さな系に対しても疎結合モデルに対して予想されるスケーリング関係が成立することを示唆する結果を得た.3.上記の結果とMCMC法による直接実験との比較を行った.AT条件の臨界点を数値的に評価する際の指標として,帯磁率行列およびスピングラス帯磁率行列の第1固有値Λ, Λ_<SG>,ならびにスピングラス帯磁率χ_<SG>のそれぞれを用いた場合の評価法の特徴を明らかにした.4.レプリカ法に基づき絶対零度極限でのレプリカ対称性の破れの構造を調べた.その結果,全結合系とは異なり,基底状態が1段階レプリカ非対称解で記述されることを示す結果を得た.本研究の目的は,平均場型の疎結合スピングラス模型に対して,i)レプリカ対称解の局所的不安定化を意味するde Almeida Thouless(AT)条件の一般的な条件を与えること,また,ii)その結果得られるレプリカ非対称解に関する知見を得ることである.確率伝搬法(BP),ベーテ近似ならびにマルコフ連鎖モンテカルロ法に基づく解析により,以下の結果を得た.これらの結果は,スピングラス問題,また,情報科学の問題に現れるレプリカ対称性の破れを解析する際に有用な知見となることが期待される.1. BPに基づきスピングラス帯磁率を評価することで,疎結合模型に対するAT条件を評価する手法を与えた.また,AT条件が大偏差統計によって定まることを指摘し,大偏差を特徴付ける指数を数値的に求める方法を与えた.2.ベーテ近似解を効率的に探索するアルゴリズムを開発した.更にこのアルゴリズムを用いてヘシアン解析を行い磁場がそれほど大きくない領域では比較的小さな系に対しても疎結合モデルに対して予想されるスケーリング関係が成立することを示唆する結果を得た.3.上記の結果とMCMC法による直接実験との比較を行った.AT条件の臨界点を数値的に評価する際の指標として,帯磁率行列およびスピングラス帯磁率行列の第1固有値Λ, Λ_<SG>,ならびにスピングラス帯磁率χ_<SG>のそれぞれを用いた場合の評価法の特徴を明らかにした.4.レプリカ法に基づき絶対零度極限でのレプリカ対称性の破れの構造を調べた.その結果,全結合系とは異なり,基底状態が1段階レプリカ非対称解で記述されることを示す結果を得た.1)単一サンプル系に対するレプリカ法の拡張(主に樺島)従来,凍結されたランダムネスに関する配位平均を評価する手法として用いられていたレプリカ法を,配位平均を評価する前の1つのサンプル系に対して拡張した枠組み「レプリカ拡張」を与えた.この枠組みを平均場近似の一種であるベーテ近似に当てはめるとMezardらにより提唱されているサーベイ伝搬(SP)が導出されることを示した.この成果はJPSJ74,2133-2136,(2005)に発表されている.また,レプリカ拡張の枠組みでは,レプリカ非対称解とは本来統計的に独立であるべきレプリカ間に相関が生じた状態として特徴付けられる.この特徴付けに沿って,1つのサンプル系に対しレプリカ対称解周りでの1段階レプリカ非対称解方向への安定性解析が可能となることを示した.SKモデルに対してはこの解析が熱力学的極限においていわゆるAT解析と一致することを確認した.この成果は平成18年3月第61回日本物理学会年次大会で発表される.2)モンテカルロ法に基づくレプリカ対称性の破れの解析(主に福島)SPでは空孔場の分布と有効場の分布がある有効指数を含む関係式で結ばれる.この有効指数は1段階のレプリカ非対称性を特徴づけると考えられるが,それがどのような原理で定まるのか未だ明らかにされていない.そこで,SPの結果とモンテカルロ法の結果を比較することにより,有効指数を定める原理について考察した.この成果は平成17年9月パリで開催された日仏セミナー「Recent progress in glassy physics」で発表された.3)疎結合モデルにおけるループの除去法についての研究(主に井上)数値解析の精度を向上させるための予備的な工夫を行なった.これまでの研究により,数値解析が可能なスピン数が千程度の疎結合モデルに対しては,ナイーブに生成したサンプルでは自己ループの影響が強く,精度の高いデータを得るのが難しいということがわかっている.

そこで,短いループを効率的に除去し比較的小さなシステムに対して精度の高いデータが採取できるようなアルゴリズムを開発した.また,その効果を疎結合スピングラスモデルの一種と見なすことができる低密度パリティ検査符号に適用し,アルゴリズムの有効性を確認した.これに関連した小システムに対する復号法の成果は平成17年9月アデレードで開催された国際会議ISIT2005にて発表された.疎結合スピングラスモデルのレプリカ対称性の破れに関する知見を得るために以下の研究を行った.(1)疎グラフ上の誤り訂正符号におけるサーベイ伝搬の解析(主に樺島)疎なグラフで表現される誤り訂正符号は強磁性結合にバイアスのかかった疎結合スピングラスモデルと解釈できる.実際このモデルでは低温で強磁性ながらレプリカ対称性の破れた混合相が存在する.最近,この相に対応する条件では,サーベイ伝搬と呼ばれる1段階レプリカ非対称仮定に基づいた平均場近似が従来の近似的復号法を凌ぐという実験結果が先行研究によって報告されている.本研究では,その振る舞いの理由を理論的ならびに数値的な方法を併用して解析した.その結果,性能改善の起源はAT条件が破れた際にはレプリカ対称性を破って構成した解の方がより大きな磁化を示す傾向にあるためである,という結論を得た.この成果はJ.Phys A 39 10659-10672(2006)として公表されている.(2)スピングラス帯磁率行列の固有値解析によるAT不安定性(主に樺島・福島)疎結合スピングラスも含めた一般のスピングラス模型のAT不安定性は,スピングラス帯磁率行列の第一固有値の特異性として自然に定式化されることがわかった.そこで全結合モデルをテストケースと調べ,磁場中の相転移温度で発散傾向を示すことがわかった.疎結合模型への展開を試みている.この成果は日本物理学会(西千葉,2007)にて発表された.(3)疎結合モデルの主成分分析による解析(主に井上)低密度パリティ検査符号を用いて,疎結合スピングラスモデルの振る舞いを解析した.主成分分析による解析では,全結合モデルと同じく,スピングラス相にて特徴的な三角形形成が見られた.また,磁場の大きさに依存して,この三角形の大きさが変化するということが新たに分かった.この成果はInterdisciplinary Information Sciences(2007)にて公表される予定である.本研究の目的は磁場あり疎結合平均場SG模型に関するレプリカ対称性の破れの知見を深めること,特にそれを検知するためde Almelda-Thouless(AT)条件を実際的に評価する方法を多角的に検討することである.最終年度にあたる今年度は取りまとめを念頭におき以下の研究を実施した.(1)ケーリー木上のBPに基づくAT線の評価ケーリー木上の信念伝搬(BP)の振る舞いを解析することによりAT線の評価を行った.ボンド数C=4の2体相互作用の±Jスピングラス模型(|J|=1/√4=1/2に規格化した模型)に対し,外部磁場h=0,0.1,0.2に対してAT条件の破れる温度の予想値T_<AT>=0.759(理論解),0.72(数値解),0.62(数値解)をそれぞれ得た.
X線偏光顕微鏡の開発

X線領域における偏光顕微鏡を観察できるX線偏光顕微鏡を開発し、物質の直線二色性(LD)、円二色性(CD)、直線服屈折(LB)、円服屈折(CB)をイメージングすることが本研究の目的である。X線を用いたX線偏光顕微鏡を実現すれぱ,可視光偏光顕微鏡では観察することのできないエネルギー領域での物質のミクロ構造の異方性を観察することができ、広い分野で応用され得る有用な測定手段となると考えられる。本研究は、(1)高分解能CCD型X線検出器の開発、(2)X線自然直線二色性(NLD)偏光コントラストの観測、(3)X線磁気円二色性(MCD)偏光コントラストの観測、の3つの段残に分けて進めた。(1)X線偏光顕微鏡の検出器部分である高分解能CCD型X線検出器の開発を行った。その際に、空間分解能を決める大きな要因となるX線蛍光体について、発光効率、発光の場所的不均一性、空間分解能の特性を最適化するために蛍光体の材質、厚さ、塗布方法、塗布する基板などの条件を変えて約30種類の蛍光体の性能評価を行った。その結果、ガラス基板に厚さ10μmで沈殿塗布したGd_20_2SiTb(P-43)で、8μmの空間分解能が得られた。さらに、CCD型X線検出器に非対称反射型Si(111)完全結晶によるX線像拡大機能を組み合わせた結晶拡大器付き高分解能CCD型X線検出器を開発し、空間分解能を1.2μmまで向上させた。(2)(1)で開発した高分解能CCD型X線検出器を移相子付き波長可変型X線ポラリメーターに組み合わせて、コバルト単結晶のX線自然直線二色性(NLD)偏光コントラストの観測に成功した。この偏光コントラストは、結晶の異方性による吸収率の差をコントラストにしたもので、この波長領域では、世界で初めてのことである。(3)コパルト多結晶のX線磁気円二色性(MCD)偏光コントラストの初めて観測した。本研究では、X線偏光顕微鏡の開発を行うことが目的である。我々が提案するX線偏光顕微鏡は、X線ボラリメータと高分解能X線検出器を組み合わせるものである。X線ポラリメータは、我々のグループが世界に先駆けて開発したもので、X線偏光子、X線位相子、X線検光子よりなり、波長が変化しても高い消光比(10^6以上)を有する。このX線ポラリメータには、従来、ビーム拡大機能がなかったが、これに新たにビーム拡大機能を付加する設計を行い、1681倍の拡大率を実現する。X線検出器には高分解能(分解能:1ミクロン)で2次元の位置分解能を有するものを開発する予定である。今年度は、主に高分解能X線検出器の設計と製作を行った。X線検出器には冷却型CCDを用いた。画素サイズ12ミクロン角、画素数1024×1024のCCD(浜松ホトニクス製)を採用した。CCDの前部にとりつける拡大光学系は、光ファイバーと光学レンズの両方を比較して検討した。その結果、光学レンズを採用することとした。その理由は、倍率が変化できること、高倍率が実現できることである。倍率は1倍20倍で変化できる。

X線を可視光に変換する蛍光体は、Gd_2O_2S:TbとCslを検討した。感度を上げるために蛍光体の厚さを1020ミクロンに保ったまま、12ミクロンの高分解能を如何に実現するかが今後の課題である。今後、LIGA技術を用いてコラム状に蛍光体を塗布する技術に挑戦する予定である。また、位置合わせのために、X線検出器の位置を微調できるメカニズムを取り付けることが必要である。現在、X線検出器の性能を評価するために実験を行っている。本研究の目的は、これまで開発してきた移相子付き波長可変型X線ボラリメータに高分解能CCD型X線検出器を組み合わせたX線偏光顕微鏡を開発し、X線波長領域における物質の誘電率異方性の空間分布を観測することである。本年度は、X線偏光顕微鏡の実現に向けて不可欠である結晶拡大器付き高分解能CCD型X線2次元検出器の開発と性能評価を行った。先ず、拡大光学レンズとCCD撮像素子で構成されるCCD型2次元検出器の空間分解能評価を行った。すべてのレンズ倍率(×2.5、×5、×10、×20)について空間分解能はCCD撮像素子上で約2.3ピクセルであり、倍率を上げた分だけ実像の空間分解能が向上した。従って、拡大光学レンズによる空間分解能の低下はないということがこの実験からわかった。次に、このCCD型2次元検出器にX線蛍光体を組み合わせたCCD型X線検出器を開発し、空間分解能評価を行った。CCD型X線検出器の開発においてX線蛍光体は空間分解能低下の最大の要因となる。そこで我々は、発光効率、発光不均一性、空間分解能を最適化するために蛍光体の材質、厚さ、塗布方法、塗布する基板などの観点から蛍光体の選定を行った。予備的実験を通して、現在の段階では、3mmのガラス基板に厚さ10μmで沈殿塗布したGd202S:Tb(P-43)が、拡大光学レンズのレンズ倍率が×10で、空間分解能は7.9μm、発光効率、発光不均一性の面からも最適であると結論した。さらに、CCD型X線検出器に非対称反射型Si(III)完全結晶によるX線像拡大機能を組み合わせたX線検出システムの開発とその空間分解能評価を行った。その結果、結晶拡大率を上げるにしたがって、空間分解能が約1.3μmまで向上した。我々は現在、さらに最適な蛍光体の選定をしつつ、この結晶拡大器付き高分解能CCD型X線2次元検出器のX線偏光顕微鏡への応用を進めている。X線領域における偏光顕微像を観察できるX線偏光顕微鏡を開発し、物質の直線二色性(LD)、円二色性(CD)、直線服屈折(LB)、円服屈折(CB)をイメージングすることが本研究の目的である。X線を用いたX線偏光顕微鏡を実現すれば、可視光偏光顕微鏡では観察することのできないエネルギー領域での物質のミクロ構造の異方性を観察することができ、広い分野で応用され得る有用な測定手段となると考えられる。本研究は、(1)高分解能CCD型X線検出器の開発、(2)X線自然直線二色性(NLD)偏光コントラストの観測、(3)X線磁気円二色性(MCD)偏光コントラストの観測、の3つの段階に分けて進めた。(1)X線偏光顕微鏡の検出器部分である高分解能CCD型X線検出器の開発を行った。その際に、空間分解能を決める大きな要因となるX線蛍光体について、発光効率、発光の場所的不均一性、空間分解能の特性を最適化するために蛍光体の材質、厚さ、塗布方法、塗布する基板などの条件を変えて約30種類の蛍光体の性能評価を行った。その結果、ガラス基板に厚さ10μmで沈殿塗布したGd_2O_2S:Tb(P-43)で、8μmの空間分解能が得られた。さらに、CCD型X線検出器に非対称反射型Si(lll)完全結晶によるX線像拡大機能を組み合わせた結晶拡大器付き高分解能CCD型X線検出器を開発し、空間分解能を1.2μmまで向上させた。
単分散マイクロカプセルおよびナノカプセルの作出と機能発現特性の解明

マイクロカプセルおよびナノカプセルの作出と機能発現特性の解明に関する研究を進めて、下記の結果を得た。(1)マイクロカプセルおよびナノカプセルのもととなるマイクロ粒子とナノ粒子作出の基礎検討として、ヘキサンを分散相としたマイクロチャネル乳化による単分散水中油滴型エマルションの作製を試み、液中乾燥法と併用することにより、比較的粒径の揃った脂質マイクロ粒子やナノ粒子を調製することに成功した。(2)シリコンチップに加工された微細貫通孔である貫通型MCを用いた貫通型MC乳化では、単分散液滴の最大作製速度は現在5mL/h程度であったが、スケールアップを行い、一桁高い生産速度を達成できた。(3)マイクロチャネル乳化により、ゼラチンの界面活性効果を利用した単分散油滴を作製し、アカシア水溶液を利用して、コアセルベートを形成させることにより、単分散のマイクロカプセルを開発した。(4)貫通孔からの液滴作製現象を数値流体力学(CFD)的手法により解析した。円形貫通孔(直径10μm)と楕円形貫通孔(長軸40μm、短軸10μm)を有するCFDモデルを作成し、実験結果と一致するモデルの開発を行うことができた。(5)新規な単分散エマルション作製用デバイスとして、スリットとチャネルからなる二層構造の貫通孔のアレイである非対称貫通型マイクロチャネル(MC)が加工されたシリコン基板を開発した。(6)タンパク質の乳化作用を利用した、ナノ粒子作製法の開発を行い、機能性成分のナノサイズ包括法を提案した。本研究は、マイクロチャネル乳化技術を中心として、新たに脂質、多糖類やタンパク質を用いるマイクロカプセルやナノカプセルの作成技術の確立を図り、細胞の包括化とその利用、各種食品機能性成分のカプセルへの包括とその生理機能について検討するものである。従来のカプセル化技術では、500μm以上のものを作成するのにとどまっている。本研究では、サブミクロンから数100μmの広範囲にわたって、必要なサイズで、しかも均一性の高い単分散カプセルの作成およびその特性を詳細に検討し、作製システムの構築を試みる。今年度は、マイクロチャネルを用い、ヘキサンを分散相としたMC乳化による単分散水中油滴型(O/W)エマルションの作製と、エマルションの液中乾燥による脂質マイクロ・ナノ粒子の調製を行った。マイクロチャネル乳化により、数ミクロンのエマルションを作製し、さらに液中乾燥により平均粒径が5001μm程度の比較的粒径の揃った脂質マイクロ粒子やナノ粒子を調製することに成功した。また、シリコンチップに加工された微細貫通孔である貫通型MCを用いた貫通型MC乳化では、単分散液滴の最大作製速度は現在のところ5mL/h程度である。スケールアップとして、矩形貫通型MCが約21万個程加工されているシリコン貫通型基板およびモジュールの開発を行い、O/Wエマルションの作製を試みたところ、平均液滴径約30μmで変動係数4%以下の単分散O/Wエマルションを作製することができた。従来より一桁高い生産速度を達成できた。以上、マイクロカプセルおよびナノカプセルのもととなるマイクロ粒子とナノ粒子作出の基礎を確立した。

マイクロチャネル乳化により、数ミクロンのエマルションを作製し、さらに液中乾燥により平均粒径が5001μm程度の比較的粒径の揃った脂質マイクロ粒子やナノ粒子を調製することに成功した。また、シリコンチップに加工された微細貫通孔である貫通型MCを用いた貫通型MC乳化では、単分散液滴の最大作製速度は現在のところ5mL/h程度である。スケールアップとして、矩形貫通型MCが約21万個程加工されているシリコン貫通型基板およびモジュールの開発を行い、O/Wエマルションの作製を試みたところ、平均液滴径約30μmで変動係数4%以下の単分散O/Wエマルションを作製することができた。従来より一桁高い生産速度を達成できた。以上、マイクロカプセルおよびナノカプセルのもととなるマイクロ粒子とナノ粒子作出の基礎を確立した。新規な単分散エマルション作製用デバイスとして、スリットとチャネルからなる二層構造の貫通孔のアレイである非対称貫通型マイクロチャネル(MC)が加工されたシリコン基板を開発した。作製された基板の大きさは24mm四方であった。基板中央部の10mm四方に非対称貫通型MCが加工されており、約1万個の非対称貫通孔が一定間隔で配置されていた。製作された非対称貫通孔は均一なサイズのスリット(長辺104μm、短辺11μm、深さ21μm)と円形チャネル(直径9.5μm、深さ5.4μm)を有していた。従来の矩形断面(長辺43.4μm、短辺12.7μm、深さ200μm)の対称貫通孔では、分散相として低粘度のデカンを用いた場合に液滴作製が不安定で単分散エマルションを作製することが困難であった。一方、分散相として大豆油に加えてデカンを用いた場合でも、12kPaで非対称貫通孔を通過した分散相は連続相(1.0wt%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)水溶液)中で均一なサイズの微小液滴へと安定的に変形する様子が観察された。作製された水中油滴型(O/W)エマルションは、平均液滴径は3541μm、変動係数は2%以下と単分散であることが示された。分散相圧力の増加に伴って個々のチャネルからの液滴の作製速度は増加していき、最大で大豆油系で約10個/s、デカン系で約50個/sの単分散液滴がチャネルから安定的に作製された。従って、非対称貫通孔は液滴材料の物性に依存せずに単分散エマルションを安定かつ効率良く作製できる優れた乳化デバイスであることが示された。
細胞分子挙動観察のための蛍光性シリコンナノ結晶の開発と応用

蛍光顕微鏡観察、特に1分子蛍光観察の限界は、蛍光プローブにあった。とりわけ、以下の3つの問題、(1)大きい(量子ドットとGFP)、(2)退色する(量子ドットでさえ数分)、(3)点滅する(特に、GFPと量子ドット)の早急な解決が必要であった。本研究では、生物医学の分野ではほとんど注目されてこなかったシリコンナノ結晶に注目し、300分以上退色もブリンクもせず、大きさも14nm程度に収まる生医学応用のためのシリコンナノ粒子を開発した。表面親水化、1個のナノ結晶に1個のタンパク質を結合させる方法の開発にも成功し、細胞膜上の受容体1分子を今までより10倍以上長く追跡することが可能になった。現在の蛍光顕微鏡観察、1分子蛍光観察の最大の限界は、蛍光プローブにある。特に、以下の3つの問題、(1)大きい(量子ドットとGFP)、(2)すぐに退色する(量子ドットでさえ数分)、(3)ブリンキングする(点滅する;特に、GFPと量子ドット)の早急な解決が必要である。本研究では、蛍光性シリコンナノ結晶(SiNC)を基礎とした細胞観察用の蛍光プローブを開発し、上記の3つの問題を一気に解決することを目的とする。本年度の実績は以下の通りである。(1)昨年度の研究によって、SiNC表面を親水化し、それによってもプローブの特性(結合比、サイズ、光学的性質、細胞毒性)が悪くならないことが分かった。そこで、本年度はタンパク質(トランスフェリン)を結合させたSiNCを作製し、それを培養細胞に添加し、培養細胞上のトランスフェリン受容体を標識した。その結果、1分子追跡に成功した。1分子のトランスフェリン受容体を、ビデオ速度で、1分以上追跡することにも成功した。(2)さらに、SiNCで標識された受容体が、細胞内へとエンドサイトシスされる様子が観察された。すなわち、長期観察によって、今まで不可能であった、細胞膜上の受容体が、細胞膜上で拡散運動しているところから細胞質内に取り込まれるまでの追跡に成功した。これは、受容体の機能発現とその調節の機構の研究に大いに貢献するものと期待される。(3)3次元追跡については、装置の組み上げが終了し、観察できる態勢に入った。(4)SiNCの大量生産法の検討も進み、同じ程度の労力と時間で、従来の数十倍の生産ができる見通しが立った。(5)SiNCを用いた受容体の機能解明のパイロットプロジェクトも、順調に進んだ。昨年度までの研究によって、タンパク質(トランスフェリン)を結合させた親水化SiNCを作製し、それを培養細胞に添加して、培養細胞上のトランスフェリン受容体を1分子追跡できるようにした。(1)SiNCで標識したトランスフェリンと有機蛍光分子Cy3で標識したトランスフェリンの両方を用いて、トランスフェリン受容体の1分子追跡を行い、両者を比較した。両者で、拡散運動のモードも拡散係数も、非常に良い一一致を見た。Cy3標識では、1分子のトランスフェリン受容体分子の細胞内取込みは、蛍光退色のため観察できなかったが、SiNC標識では、1分子レベルでの取り込みが観察できた。(2)各々のトランスフェリン受容体1分子を長時間観察した結果、細胞膜には1ミクロンのスケールで、拡散速度の違う領域がパッチワークのようにつながっていることが分かった。今までも、このような観察は断片的にはされてきたが、SiNCの開発とそれを用いた標識に成功したため、1個の分子を長時間、細胞膜上で追跡することが可能になり、このような発見につながった。(1)(2)については、論文を、Jounal of Cell Biologyに出版した。(3)SiNCの1回のバッチあたりの生産規模の拡大に成功した。商業規模ではないが、国内外の研究者で興味を持つ方にSiNCを供給する目途が立った。現在の1分子蛍光観察の最大の限界は、蛍光プローブにある。特に、(1)大きい(量子ドットとGFP)、(2)すぐに退色する(量子ドットでさえ数分)、(3)ブリンキングする(点滅する)の早急な解決が必要である。

本研究では、蛍光性シリコンナノ結晶(SiNC)を基礎とした細胞観察用の蛍光プローブを開発し、上記の3つの問題を一気に解決することを目的としている。本年度は、以下の研究進捗があった。(1)青色発光するB-SiNCの産生法開発に成功した。B-SiNCの直径は0.8-1ナノメートル程度であることを、蛍光相関スペクトロスコピーによる拡散係数の測定、準弾性光散乱の測定、電子顕微鏡による観察で確認した。(2)表面親水化と生体分子への結合法の開発に成功した。表面の親水化の際に、同時に、親水化分子の端にスルフヒドリル基を結合させ、それと、生体分子のアミノ基を、マレイミド基とスクシニミド基の両者を持つクロスリンカーを用いて結合させた。このような結合が起こっていることは、高速液体クロマトグラフィー方によって確認した。また、これによりシェルフライフが非常に長くなり、3ヶ月間水中で保存しても機能するようなB-SiNCを産生することに成功した。(3)親水化し生体分子に結合させた状態でのプローブの特性(結合比、サイズ、光学的性質、細胞毒性)を解析した。これらの解析により、タンパク質を結合させたSiNCを培養細胞に添加し、培養細胞上の特定の分子を標識して、その分子の動態を追跡するという、大きな可能性があることが示された。(4)B-SiNCをカバーグラス上に置き、その上で、アクリルアミドゲルを重合させることによって、B-SiNCをカバーグラス上で固定し、全反射蛍光顕微鏡を用いて、ビデオフレーム速度で観察した。この方法により、B-SiNCを1粒子レベルで直接検出することに成功した。本研究の具体的目標は、SiNCを実用化し、特に1分子イメジングへの応用を進めることである。現在までに、以下の進展を見た。(1)赤色、青色のSiNCの作製に成功し、1粒子毎に長時間観察できることを示した。(2)SiNCの表面親水化と生体分子の結合法の開発に成功し、特に、タンパク質のトランスフェリン分子については、正確に1:1で結合させる方法(平均値が1:1ではなく・・この場合は、トランスフェリン上のSiNCの数は1を平均とするポアッソン分布を示す・・すべてのトランスフェリン分子が1個のSiNCで標識される方法)を確立した。(3)SiNCの表面処理によって、シェルフライフは、トルエンなどの有機溶媒中で、3ヶ月以上、全く変化がない状態を維持できるようにした。また、大量生産法も確立した。(4)トランスフェリンを結合させたSiNCを培養細胞に添加し、培養細胞上のトランスフェリン受容体を標識した。その結果、1分子追跡に成功した。1分子のトランスフェリン受容体を、ビデオ速度で、1分以上追跡することにも成功した。すなわち、本研究は、予定通り、おおむね順調に進展している。開発にはいくつもの困難があったが、細かく条件を検討することによって、所期の目標が達成できた。すなわち、B-SiNCの特性を調べるために、非常に多くの方法を試し、以下の方法が有効であることが分かった。蛍光相関スペクトロスコピーによる拡散係数の測定、準弾性光散乱の測定、電子顕微鏡による観察、高速液体クロマトグラフィー、全反射蛍光顕微鏡などである。多くの場合、既設の装置をそのまま使うのではなく、様々な改良を加えたり、B-SiNCの観察・測定に適したように改変する必要があった。昨年度までに、以下の進展を見ている。
アパタイトセメントにおける組織親和性発現機構の解明

本研究目的はアパタイトセメントが優れた組織親和性を発現する条件を解明することである.そこで従来型セメントが炎症反応を惹起した場合に摘出されたリン酸水素カルシウム(DCPA:アパタイトセメントの構成成分),アパタイトセメントの構成成分であるリン酸四カルシウム(TTCP),セメント粉末(TTCP+DCPA),硬化体粉砕物(組成はアパタイト,crushed set CPC)をラット皮下に埋入し,組織親和性を検討した結果,組織親和性に優れるアパタイトを含む全ての粉末がラット皮下組織に膿瘍を形成し炎症反応を惹起することがわかった.また膿瘍の大きさと粒径を比較すると,粒径の小さいDCPAが強い炎症を惹起することが判明した.さらに,ラット脛骨に作製した骨欠損部に各種アパタイトセメント(従来型,迅速効果型,非崩壊型)を充填しそれらセメントが血液と接することによる影響を組織学的に検討した結果,各種セメントは生体に埋入しても炎症を強く惹起せず親和性に優れていると考えられた.特に小さな顆粒状として存在する場合でも炎症反応ではなく異物反応が認められた.ただ従来型は,血液に触れると硬化しない欠点があり,そのために充填後セメントは一塊にならずその隙間に骨が新生してきたと考えられる.このため逆にセメント内部から骨芽細胞によってセメントを取り囲むように骨への置換が起こりやすくなっているのかもしれない.しかし生体内での安定性からいえば,血液に接触しても崩壊せず,硬化時間の早いセメントの方がよいと考えられる.以上の結果より,アパタイトセメントは生体親和性に優れ生体内において起炎物質とはなりにくいことが証明された.しかし,アパタイトセメントの組成成分の粉末を埋入した場合は炎症を惹起していることより臨床において使用する場合は,セメント埋入後に崩壊を起こさないようにする必要がありそのためには埋入部位の状態によってこれらアパタイトセメントを選択する必要がある.すなわち,十分な止血が得られる部位であれば従来型セメントで問題ないが,止血困難な部位であれば従来型は禁忌であり非崩壊型セメントの適応となりセメントの使い分けが必要である.本研究目的はアパタイトセメントが優れた組織親和性を発現する条件を解明することである.そこで従来型セメントが炎症反応を惹起した場合に摘出されたリン酸水素カルシウム(DCPA:アパタイトセメントの構成成分),アパタイトセメントの構成成分であるリン酸四カルシウム(TTCP),セメント粉末(TTCP+DCPA),硬化体粉砕物(組成はアパタイト,crushed set CPC)をラット皮下に埋入し,組織親和性を検討した結果,組織親和性に優れるアパタイトを含む全ての粉末がラット皮下組織に膿瘍を形成し炎症反応を惹起することがわかった.また膿瘍の大きさと粒径を比較すると,粒径の小さいDCPAが強い炎症を惹起することが判明した.さらに,ラット脛骨に作製した骨欠損部に各種アパタイトセメント(従来型,迅速効果型,非崩壊型)を充填しそれらセメントが血液と接することによる影響を組織学的に検討した結果,各種セメントは生体に埋入しても炎症を強く惹起せず親和性に優れていると考えられた.特に小さな顆粒状として存在する場合でも炎症反応ではなく異物反応が認められた.ただ従来型は,血液に触れると硬化しない欠点があり,そのために充填後セメントは一塊にならずその隙間に骨が新生してきたと考えられる.このため逆にセメント内部から骨芽細胞によってセメントを取り囲むように骨への置換が起こりやすくなっているのかもしれない.しかし生体内での安定性からいえば,血液に接触しても崩壊せず,硬化時間の早いセメントの方がよいと考えられる.以上の結果より,アパタイトセメントは生体親和性に優れ生体内において起炎物質とはなりにくいことが証明された.しかし,アパタイトセメントの組成成分の粉末を埋入した場合は炎症を惹起していることより臨床において使用する場合は,セメント埋入後に崩壊を起こさないようにする必要がありそのためには埋入部位の状態によってこれらアパタイトセメントを選択する必要がある.すなわち,十分な止血が得られる部位であれば従来型セメントで問題ないが,止血困難な部位であれば従来型は禁忌であり非崩壊型セメントの適応となりセメントの使い分けが必要である.従来型アパタイトセメントや我々が開発した迅速硬化型、非崩壊型アパタイトセメントはいずれも硬化するとアパタイトになり優れた組織親和性と骨伝導性を示す。しかし、ペースト状態でセメントに応力が負荷された場合には、迅速硬化型、非崩壊型アパタイトセメントでは問題がないにも関わらず従来型アパタイトセメントは炎症反応を惹起する。本研究はアパタイトセメントが優れた組織反応を示す条件、およびその機序を解明することを目的としたものである。従来型アパタイトセメントが炎症反応を惹起した場合に摘出されたセメント粉末成分からは迅速硬化型、非崩壊型の場合には検出されないリン酸水素カルシウム(DCPA:アパタイトセメントの構成成分)が検出されたため、アパタイトセメントの構成成分であるリン酸四カルシウム(TTCP)、DCPA、セメント粉末(TTCP+DCPA)、硬化体粉砕物(組成はアパタイト)をラット皮下に埋入し、組織親和性を検討した。その結果、組織親和性に優れるアパタイトを含む全ての粉末が炎症反応を惹起することがわかった。炎症反応の程度はDCPA>DCPA+TTCP>TTCP>硬化体粉砕物であり、粒径の小さいDCPAが強い炎症反応を惹起することがわかった。したがって、アパタイトセメントは硬化する条件で使用する必要があることがわかった。

本年度の研究目的は,ラット脛骨に作製した骨欠損部に我々が開発した各種アパタイトセメント(従来型,迅速効果型,非崩壊型アパタイトセメント)を充填しそれらセメントが血液と接することによる影響を組織学的に検討し,セメントが優れた組織親和性を発現する条件を解明することである.埋入2週目では,3種類のセメントとも骨欠損部内に充填されているのが確認できたが,従来型に関してはそのセメントの粒子が骨欠損面付近に散在していた.しかしどのセメントの周辺組織にも強い炎症反応は認められなかった.埋入4週目では,従来型や迅速硬化型では充填されたセメントの一部をを取り囲むように新生骨の増殖が認められるが,骨欠損部表面には一部散らばったセメントを取り囲むように多くの異物巨細胞が認められ強い異物反応を示していた.埋入8週目では,従来型において依然強い異物反応が残存していたが,骨断端や充填されたセメント内部からセメントを取り囲むように骨新生が認められた.一方,迅速硬化型や非崩壊型ではほとんど異物反応は消失していた.また従来型に認められたセメント内への骨の新生はなく,周りからセメントを取り囲むように新生骨ができていた.これら結果より,各種セメントは生体に埋入しても炎症を強く惹起せず親和性に優れていると考えられた.特に小さな顆粒状として存在する場合でも炎症反応ではなく異物反応が認められた.これはアパタイトが起炎物質にはなりにくいという意見に一致していた.ただ従来型セメントは,血液に触れると硬化しない欠点があり,そのために充填後セメントは一塊にならずその隙間に骨が新生してきたと考えられる.このため逆にセメント内部から骨芽細胞によってセメントを取り囲むように骨への置換が起こりやすくなっているのかもしれない.しかし生体内での安定性からいえば,血液に接触しても崩壊せず,硬化時間の早いセメントの方がよいと考えられる.
高齢者の複合的行動能力を特異的に鍛えるトレーニング法の開発

加齢によるヒトの生体機能の低下は止む得ないものの,その度合を軽減することは,ヒトとしての生活の質を保つ上で非常に重要であることは言うまでもない.体力医科学分野においては,その方策として,運動トレーニングを推奨し,最近では筋機能に加えて特に認知機能に関して,positive効果があることを数多く報告している.しかしながら,これらの研究対象となる運動形態,例えば鹿屋体育大学が推奨する「貯筋運動」のメニューに見られるような単純な膝の曲げ伸ばし(スクワット動作)などは,明らかに飽きが生じ,実際に高齢者の貯筋運動教室の離脱者は決して少なくはない.オーストラリアなどでは,少数の対象者に対して個人運動指導者を直接充てがい,手厚いケアを行うことにより,離脱者を少なくする方策が取られているが,一方でコスト面で問題がある.ヒトがスポーツにのめり込む場合は,その複合的な動作やゲーム性が組み込まれていることが多い.したがって,単純な動作ではなく複雑な動作を含んだ運動トレーニングを施せば,離脱者を少なくすることが可能であると考えられる.一方で,複雑な動作が認知機能に効果があるか生理学的検証をまず行うべきである.本研究では,複雑な運動動作中において認知機能の使用に関与する皮質脊髄路の興奮性を経頭蓋磁気刺激法により測定した.その結果,皮質脊髄路の興奮性を示すMEPは動作の難度が高い方が大きい結果を得た.したがって,動作の難度を高める運動をトレーニングに組み込むことにより,結果的に認知機能をより向上させる可能性が示唆された.高齢者を対象としたトレーニング実験にまで至っていない.高齢者のリクルートを地元紙などを介して,広く告知を行う.加齢によるヒト生体機能の低下の抑制を図る上で,特定の効果を得るためには,その目的に沿った方式でトレーニングを行うべき,という「特異性の原理」に基づき,通常,筋力=筋力トレーニング,巧緻性=力調節トレーニング,認知機能=脳トレーニングなど,それぞれが個別に行われる.一方,日常生活やスポーツでの動作は,これらの機能が同時に参画する複合的行動能力がその優劣を左右するため,複合的機能こそが,特異的に鍛えられなければならない.本研究では,筋力,巧緻性,認知機能の複合的行動能力を同時に高めるハイブリッド筋力トレーニング法の開発を目指す.本年ではまず,片側性の随意的筋収縮(活動)時に,反対側同名筋に不随意的に発生する筋活動(反対側投影)現象に着目し,片側性力調節課題の難易度が,反対側投影の発現の大きさに影響を及ぼすか明らかにすることを目的とした.健常若齢者9名を対象に,左手にて随意的な等尺性示指外転動作を行った.発揮する力の目標値の強度は,最大随意収縮力(MVC)の20から80%とした.対象者は,目前に提示された目標値および許容範囲を目視しながら,発揮する力を許容範囲内に可能な限り合わせるよう努力した.その際,許容範囲を各目標強度の±2%(難課題),または±7%(易課題)とした.右手の第一背側骨間筋より導出した筋電図から,力調節課題中のRMS値(aEMG)を算出し,反対側投影の度合を評価した.その結果,aEMGは,難課題が易課題よりも大きかった.したがって,反対側同名筋の不随意的筋活動は,力調節課題の難度が高い方が増加することが明らかとなった.課題難度と大脳の興奮性について,基礎的知見を蓄積できている.加齢によるヒトの生体機能の低下は止む得ないものの,その度合を軽減することは,ヒトとしての生活の質を保つ上で非常に重要であることは言うまでもない.体力医科学分野においては,その方策として,運動トレーニングを推奨し,最近では筋機能に加えて特に認知機能に関して,positive効果があることを数多く報告している.しかしながら,これらの研究対象となる運動形態,例えば鹿屋体育大学が推奨する「貯筋運動」のメニューに見られるような単純な膝の曲げ伸ばし(スクワット動作)などは,明らかに飽きが生じ,実際に高齢者の貯筋運動教室の離脱者は決して少なくはない.オーストラリアなどでは,少数の対象者に対して個人運動指導者を直接充てがい,手厚いケアを行うことにより,離脱者を少なくする方策が取られているが,一方でコスト面で問題がある.ヒトがスポーツにのめり込む場合は,その複合的な動作やゲーム性が組み込まれていることが多い.したがって,単純な動作ではなく複雑な動作を含んだ運動トレーニングを施せば,離脱者を少なくすることが可能であると考えられる.一方で,複雑な動作が認知機能に効果があるか生理学的検証をまず行うべきである.本研究では,複雑な運動動作中において認知機能の使用に関与する皮質脊髄路の興奮性を経頭蓋磁気刺激法により測定した.その結果,皮質脊髄路の興奮性を示すMEPは動作の難度が高い方が大きい結果を得た.したがって,動作の難度を高める運動をトレーニングに組み込むことにより,結果的に認知機能をより向上させる可能性が示唆された.高齢者を対象としたトレーニング実験にまで至っていない.負荷(筋収縮強度)は同一であるが難度は異なる動作時において,大脳興奮性の増加はどのレベルに起因するのか,経頭蓋磁気刺激法などを用いて詳細に明らかにする.高齢者のリクルートを地元紙などを介して,広く告知を行う.
超音波エラストグラフィを用いて測定した筋硬度に基づく筋のコンディション評価

本研究では、非侵襲的に組織の弾性(硬さ)を生体計測することができる超音波エラストグラフィを用いて骨格筋や腱膜の弾性を測定した。その結果、1)一般人に比べてスポーツ選手の大腿直筋は肥大しているが、その弾性には明確な違いが見られないこと、2)上腕二頭筋の弾性は筋損傷を引き起こす運動の翌日以降ではなく、運動直後に最も高い値を示すこと、3)足底腱膜の弾性を測定する際には適切なプローブと初期設定を選択することが重要であることが明らかになった。本研究の目的は超音波エラストグラフィを用いて測定した筋の組織弾性、すなわち筋硬度に基づいて筋のコンディションを評価する方法を確立し、筋硬度が筋コンディションの指標としてスポーツ競技者のコンディショニングやスポーツ傷害の予防に活用されるようにすることである。平成27年度は、日常的な競技動作の実施が筋硬度に及ぼす影響を明らかにするための測定を行なった。まずは超音波エラストグラフィを用いて一般男女の大腿直筋の筋硬度(せん断弾性率)を測定し、標準的な筋硬度の測定値を確認した。その結果、男性(33名)の筋硬度は5.2 ±1.7kPa、女性(33名)の筋硬度は4.7 ±1.0kPaであり、男性に比べて女性の方が低い筋硬度を示す傾向がみられた(P = 0.06)。その後、同様の方法を用いて一流スポーツ競技者を対象とした筋硬度の測定を行なった。今後は、取得した39種目499名の一流スポーツ競技者のデータをまとめて筋硬度の競技種目特性を検討し、日常的な競技動作が筋硬度に及ぼす影響を明らかにする。また、筋損傷や肉離れなどのスポーツ傷害は単一筋内にも起こりやすい部位が存在することが報告されていることから、そのようなスポーツ傷害の好発部位を対象とした筋硬度の測定を実施する。そのような測定から得られる結果に基づいて、筋コンディションとスポーツ傷害の関係について検討を行なう。さらに、実際の競技動作を実施することによって筋のコンディションを変化させ、その変化を超音波エラストグラフィによって測定した筋硬度を用いて評価する予定である。一般男女を対象とした筋硬度の測定は論文としてまとめることができ、国際誌に掲載されることが決まった。一流競技者を対象とした筋硬度の測定も実施することができたが、予定よりも多くのデータを取得することができたため、それらを論文としてまとめるところまでは至らなかった。スポーツ傷害の好発部位を対象とした筋硬度の測定は予備実験を済ませることができたため、来年度の早い時期に本実験を行うことが可能である。平成28年度中には「筋硬度の競技種目差の検討」および「スポーツ傷害の生じやすい部位における筋硬度の測定」を完了できる見通しであり、申請時の計画通りに研究が進むものと思われる。筋損傷や肉離れなどのスポーツ傷害は単一筋内に好発部位が存在することから、平成28年度は肉離れの好発部位である腓腹筋内側頭の遠位部に着目した測定を行なった。足関節底屈10deg(+10 deg)、中間位(0 deg)および背屈10deg(-10 deg)において、腓腹筋内側頭の遠位部および筋腹中央部の筋硬度を測定した。足関節角度と筋硬度の関係を曲線回帰し、得られた回帰曲線を微分して中間位および背屈10degにおける接線の傾きを求めた。遠位部および筋腹中央部の接線の傾きは、中間位において-0.62 ±0.19kPa/degおよび-0.77 ±0.21kPa/deg、背屈10degにおいて-1.44 ±0.48kPa/degおよび-1.48 ±0.48kPa/degであり、有意な部位差を示さなかった。次に、筋硬度が筋コンディションの指標として有用であるかを検討するため、伸張性肘屈曲運動を最大努力で30回実施させた前後の上腕二頭筋の筋硬度を測定した。上腕二頭筋の筋硬度は運度前(20.9 ±7.5 kPa)に比べて運動直後(58.5 ±21.4 kPa)に有意に高い値を示したが、運動前と運動1日後(36.7 ±20.0 kPa)、2日後(34.6 ±19.9 kPa)、3日後(28.2 ±14.3 kPa)の筋硬度には有意差が見られなかった。この結果から、超音波エラストグラフィを用いて測定した筋硬度は、筋力や血漿クレアチンキナーゼ活性値などの間接的筋損傷指標とは異なる経時変化を示すことが明らかになった。平成28年度の上半期に「スポーツ傷害の生じやすい部位における筋硬度の測定」の本実験、下半期に「筋硬度を指標とした筋コンディション変化の評価」の予備実験を実施することができた。しかし、「スポーツ傷害の生じやすい部位における筋硬度の測定」や平成27年度に本実験を終了していた「筋硬度の競技種目差の検討」を論文としてまとめ、公表することができなかった。よって、現在までの進捗状況は「やや遅れている」と自己評価した。下肢に見られるスポーツ傷害であるランニング障害は、ランニングの継続によって繰り返しの負荷が運動器にかかり、疲労が蓄積されることによって引き起こされると考えられている。

また、ランニング障害の一つである足底腱膜炎は、着地時の衝撃と牽引が足底腱膜に繰り返し課されることによって引き起こされると考えられている。足底腱膜の弾性を非侵襲的に生体計測する方法として、超音波エラストグラフィ(シアウェーブエラストグラフィ)が挙げられる。シアウェーブエラストグラフィはフォーカスされた超音波ビームによって組織内部にシアウェーブ(剪断波)を発生させ、その伝播速度に基づいて組織の弾性(剪断弾性率)を計測するものである。平成29年度は超音波エラストグラフィを用いて足底腱膜の弾性の計測を試みるフィジビリティスタディを実施した。415MHzリニアプローブと筋骨格系用の初期設定の組み合わせを用いて踵骨付着部周辺の足底腱膜を計測を試みたが、組織弾性の分布を示すカラーマップを取得することができなかった。そこで、210MHzリニアプローブと組織全般用の初期設定の組み合わせで同様の計測を実施したところ、足底腱膜は極めて低い弾性を示した。一方、210MHzリニアプローブと筋骨格系用の初期設定の組み合わせで計測を実施すると、足底腱膜は極めて高い弾性を示した。これらの結果から、超音波エラストグラフィを用いて足底腱膜の弾性を計測する際には、適切なプローブと初期設定を選択することが重要であることが明らかになった。本研究では、非侵襲的に組織の弾性(硬さ)を生体計測することができる超音波エラストグラフィを用いて骨格筋や腱膜の弾性を測定した。その結果、1)一般人に比べてスポーツ選手の大腿直筋は肥大しているが、その弾性には明確な違いが見られないこと、2)上腕二頭筋の弾性は筋損傷を引き起こす運動の翌日以降ではなく、運動直後に最も高い値を示すこと、3)足底腱膜の弾性を測定する際には適切なプローブと初期設定を選択することが重要であることが明らかになった。平成28年度の上半期は「筋硬度の競技種目差の検討」を論文としてまとめ、「スポーツ傷害の生じやすい部位における筋硬度の測定」の本実験を実施する。下半期には「スポーツ傷害の生じやすい部位における筋硬度の測定」を論文としてまとめ、「筋硬度を指標とした実際の競技動作による筋コンディション変化の評価」の予備実験を行う。平成29年度の上半期に本実験が終了している内容を論文としてまとめ、予備実験が終了している内容の本実験を行う。下半期には足底筋膜炎や回旋筋腱板損傷、アキレス腱断裂などのスポーツ傷害に対する超音波エラストグラフィの活用可能性を検討する予定であり、その後に本研究の総括を行う。健康・スポーツ科学一流競技者を対象とした筋硬度の測定に基づく「筋硬度の競技種目差の検討」を論文としてまとめるところまで至らなかったため、論文掲載のために必要な費用(英文校正費、投稿料および掲載料)が次年度使用額となってしまった。「筋硬度の競技種目差の検討」を論文として公表するところまで至らなかったため、論文の掲載料として残していた予算が次年度使用額となってしまった。次年度の上半期に「筋硬度の競技種目差の検討」を論文としてまとめる予定であることから、次年度使用額はその論文を掲載するための費用として使用する。翌年度分として請求した助成金は、主として「スポーツ傷害の生じやすい部位における筋硬度の測定」の遂行のために費やしたいと考えている。平成29年度の上半期に「筋硬度の競技種目差の検討」の論文が採択されるよう努め、その論文の掲載料として次年度使用額を使用する。翌年度分として請求した助成金は主として、論文掲載にかかる費用(英文校正費、投稿料、掲載料)
二重鎖RNAを投与した培養脳細胞系を用いた重度脳発達障害の発症機序の解明

研究代表者らは、愛知県コロニー中央病院で加療している(重度)知的障害の症例より新規病因遺伝子を同定し、機能解析を行っている。本年度は、我々が今までに同定した下記の3種類の新規病因遺伝子について、その発現を特異的にノックダウンするsiRNAをマウスとヒトについて同定した。さらに、同siRNAを過剰発現する細胞クローンをP19細胞より単離した。1)ZEHX1B(重度の知的障害と神経堤障害を呈する疾患の病因遺伝子)2)PLEKHA5(染色体6q16と12p12に相互転座の見られる最重度精神運動発達遅滞の症例の12p12転座断点部に局在する遺伝子)方法:ヒトとマウスの上記遺伝子(6種類)のcDNAの5'端のATGから600-800bpを含むsiCHECKベクターを作製し、各々の遺伝子に対するsiRNAを数箇所上記cDNA内より決定し、発現するベクター(pSUPER:蛍光蛋白質であるGFPを発現する遺伝子を含む)にサブクローニング後、293細胞にトランスフェクションした。その結果、目的の遺伝子を約70-80%ノックダウンする6種類のsiRNAを同定した。これらのSiRNAを過剰発現するベクターを293細胞にトランスフェクションし、各運伝子の発現量をRT-PCRで定量すると約40-50%に低下していた。遺伝子の導入効率を約80%と考えるとsiCHECKベクターを用いた時と同様の結果を得た。P19細胞を用いた機能解析:現在、マウスP19細胞にPlekha5とChd6を効果的にノックダウンするsiRNAを過剰発現するベクターをトランスフェクションし、G418を含んだ培地で培養後、薬剤耐性クローンを得た。今後、Zfhx1bについても同様のクローンを単離後、P19細胞をレチノ酸で処理し、神経細胞に分化させた後に、同細胞の機能を解析する予定である。研究代表者らは、重度知的障害の症例から新規病因遺伝子の同定を行っている。同定した遺伝子の異常が胎生期の脳発達にいかなる影響を与えるかを明らかにするために、その遺伝子の二重鎖RNAを培養脳細胞系に投与し、神経細胞の形態や機能の異常を検討する。本年度は重度知的障害の病因遺伝子であるZFHX1BとPEPP2の2種類の遺伝子のsiRNAを作成し、ヒト(HEK293,SH-SY5Y)あるいはマウス(Neuro-2A,F9)の細胞に投与し、同遺伝子のノックダウンの有無を確認した。研究結果1)マウスZfhx1bの機能ドメイン以外の領域より4箇所のsiRNA(21bp)を作成し、マウス細胞に投与し同遺伝子の発現量を解析したが、いずれからも50%以下にはノックダウンできなかった。2)Zfhx1bの5'側から600bpの二重鎖RNAを作成し、ダイサーで切断後、約20bpの同断片をマウス細胞に投与した。その結果、約60%の同遺伝子のノックダウンが見られた。従って、この600bpの領域に21bpのsiRNAの研究に使用できる候補配列があると考えられた。3)PEPP2の5'側から600bpの二重鎖RNAを作成して行った実験でも、同様に約50%のノックダウンが見られた。今後、遺伝子ノックダウンに使用できる21bpのsiRNA配列を決定し、蛍光で標識したり、psiRNA-hH1CFPzeo C2(プラスミド)に挿入したものを用いて、初代培養脳神経細胞に導入する。