hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
バイオフォトンで捉える木質生分解とスペクトル解析

木材腐朽菌の種類によって化学発光量が異なること、腐朽のフェーズによって発光位置が異なること、ある種のリズムパターンが生じていることを見出した。特に一部の白色腐朽菌が強いバイオフォトンを生じていた。これは腐朽メカニズムの違いに由来すると考えられる。バイオフォトンの起源としてはリピッドペルオキシデーションなどによって生じた有機ラジカルの生成が考えられた。これを分析するため、高分解能質量分析法による分泌代謝物の分析を行った。また安定同位体標識脂質代謝物を独自に調製し、これを培養系に添加することでその動態観測を行った。以上に関連した研究成果を含めて、国内・国際学会、講演等において発表を行った。また、国際論文誌への発表を予定している。木材腐朽菌は、自然界において、木質成分の主要な分解者である。特に難分解性のリグニンの分解機構は重要な課題である。これまでリグニン分解酵素、メディエーターによる研究、分解化合物の同定による研究が行われてきた。しかしながら、木材腐朽菌が木質成分を分解するアクティビティーをリアルタイムにモニタリングする手段は限られていた。本研究では分解時に生じる微弱なバイオフォトンを可視化、イメージングし、経時的に追跡した。また生分解時に生じる二次代謝産物について分光学的解析を行った。このように、本研究は木材腐朽菌による木質成分の分解機構を動的に捉える新しい展開につながった。木材腐朽担子菌を木片培地に接種し、培養過程におけるバイオフォトンを光電子倍増管を用いて経時的にリアルタイムで観測することに成功した。また蛍光プローブアッセイを併用して観測することができた。フォトン生成のメカニズムと起源について明らかにするため、フォトン生成反応の再構築と生成フォトンのスペクトル解析を行う予定である。また、腐朽木材の質量分析を行い、リグニンフラグメントイオンのマッピング観測を行い、フォトンイメージングの結果と合わせて解析を実施する予定である。温度制御時に生じるアーティファクトのバイオフォトン検出に対する影響を回避するため、装置調整を行うとともに固体培養における培地調製に工夫を加える。これにより、これまで以上に安定的、良質のフォトンスペクトルを取得できると期待される。また、質量分析法によるマスイオン検出によるケミカルマッピングによる観測について、腐朽過程における、経時的なデータ取得を行う。以上のデータを統合して木材腐朽メカニズムに関する新しい知見を得る。成果は研究論文としてとりまとめる。木質生分解学木質分解におけるバイオフォトン生成起源解明を進めるため、26年度に用いた担子菌と異なる腐朽パターンの菌株においても経時的にバイオフォトンイメージングを行い、その発光パターンと分解状況を木質組成分析により明らかにする。過酸化物検出のための蛍光イメージングを行い、共通点と相違点を明らかにする。
マクロマシンにおける付着・摩擦低減に関する研究

マイクロマシンにおいては、製作途中や使用中に水の表面張力により部品同士が引き寄せられそのまま付着するというstictionと呼ばれる問題が発生する。本研究は表面エネルギーの最も小さい材料であるテフロン系膜をマイクロマシンに堆積させて付着や摩擦を低減させる研究を行った。本研究ではテフロン系膜の製膜にドライプロセスで製膜が可能で膜質が優れているプラズマ重合法を採用した。このプラズマ重合装置では、プラズマ放電により活性化した材料ガスが拡散によりウェハ表面へ到達して重合反応を起こすため、プラズマ衝撃の影響を受けず良質の膜が形成できる。テフロン系膜の重合ではCとFの比(F/C比)が小さい方が堆積速度が向上する事が知られており、本研究では最も小さいF/C比を持つC4F8ガスを材料ガスとして用いた。また、テフロン系膜の耐熱性の向上させるため、基板加熱を行いかつ添加ガスとしてメタンCH4を加えた。CH4は材料ガスのF/C比を減少させる効果があり堆積速度の向上が図れる。CH4/C4F8比と基板温度を変化させながらテフロン系膜の堆積速度を測定したところ、基板温度が50°C、200°Cの両方においてCH4の添加により堆積速度が向上し、特に200°Cの場合では10倍近く堆積速度が向上する事が確認された。基板温度200°C、CH4/C4F8比=0.2の条件で製膜した膜は、空気中350°C20分の熱処理に対しても十分な耐熱性を持ち、熱処理後の水の接触角に関しても熱処理温度350°Cまでは110°Cの接触角を持つ良好な撥水性を有していた。これより付着の理論からこの膜が付着防止に有効であることがわかる。実際にこの膜をマイクロマシニング技術により製作された加速度センサに堆積して付着の評価を行ったところ、2000Gに相当する静電引力により構造体を基板に100回接触させたにもかかわらず付着は生じておらず、本方法がマイクロマシンの付着防止に有効であることが確認できた。摩擦低減の効果に関しては、テフロン系膜が摩擦低減にも有効であることが米国Sandia National Laboratoryの研究グループから報告されており、本研究がマイクロマシンの信頼性向上と長寿命化に有効であることが確認された。平成10年度はマイクロマシンの表面にテフロン系膜を堆積させる事を目的として、保有するプラズマ重合装置の改造を行った。改造点は、l)より均一な膜を得るために装置真空度を向上、2)基板加熱をしながら成膜するために基板ヒーターの取り付け、3)液状材料源からガス状材料源への変更、4)正確なガス流量を得るためにマスフローコントローラの取り付け、5)添加ガスラインの追加等である。それらの改造後各種条件出しをした結果、従来プラズマテフロン系膜の問題点であった耐熱性と成膜速度を大幅に改善できた。しかしながら均一性に関してはそれほどの改善は見られず、特にアンダーカットを有する構造体への成膜に関してまだ問題を有している。この膜による付着防止の効果を確認するため本学の固体機能デバイスセンターの半導体製造設備を用いてシリコン加速度センサの試作を行い、この試料に対してテフロン系膜の製膜を行い付着防止の効果を確認した。また、このテフロン系膜は良好な撥水性を有しており、各種センサや工学部品の耐湿度対策に有効だと考えられ、現在各種センサにテフロン系膜の堆積を行いその効果を評価している。一方、単分子膜形成法に関しても従来報告されている材料とは異なる材料を用いて単分子層膜の形成を行った。その結果、撥水性の膜の形成に成功したが、膜の均一性や品質がプラズマ重合法より劣っている事が判明したため、現在は研究を中断している。また、物理的に表面を凸凹にして表面エネルギーを減少させ付着や摩擦を減少させる方法に関しては、陽極化成法によりシリコン表面に微細穴を形成することにより撥水性が向上する事を世界で始めて発見した。その後、本学の半導体製造設備を用いて、シリコンウェハを加工して付着の程度を評価する試料の作成を行い、試料表面を凸凹にして付着防止の効果を確認した。

基板温度200°C、CH4/C4F8比=0.2の条件で製膜した膜は、空気中350°C20分の熱処理に対しても十分な耐熱性を持ち、熱処理後の水の接触角に関しても熱処理温度350°Cまでは110°Cの接触角を持つ良好な撥水性を有していた。これより付着の理論からこの膜が付着防止に有効であることがわかる。実際にこの膜をマイクロマシニング技術により製作された加速度センサに堆積して付着の評価を行ったところ、2000Gに相当する静電引力により構造体を基板に100回接触させたにもかかわらず付着は生じておらず、本方法がマイクロマシンの付着防止に有効であることが確認できた。摩擦低減の効果に関しては、テフロン系膜が摩擦低減にも有効であることが米国Sandia National Laboratoryの研究グループから報告されており、本研究がマイクロマシンの信頼性向上と長寿命化に有効であることが確認された。
次世代シナプスモデルを用いた発達期プレシナプスの選択的強化・除去機構の研究

ニワトリ毛様体神経節におけるプレシナプスの発達過程は、ブートン状から杯状に成熟するシナプス前終末の選択過程と、それ以外の余分なシナプス前終末および軸索側枝の除去過程に大別できる。本研究では、プレシナプス特異的な最先端の光遺伝学プローブの導入と関連分子の過剰発現・機能阻害を通じて選択的強化・除去過程の分子機構の解明を目指すとともに、その病態生理学的な側面についても検討を行うことを目的とする。採用第2年度目である25年度は、プレシナプスニューロンの形態的評価法を確立した。直径約700umの神経節内において密に絡み合った軸索走行を評価するには、1.サンプル調整、2.イメージング、3.トレーシング、4.定量解析という4ステップを踏む必要がある。1.については透明化試薬ScaleA2、まばら発現を実現させるThylSプロモーター、発現量を向上させるWPRE配列などを組み合わせることで最適化した。2.については2光子顕微鏡AIR MP+に高性能水浸対物レンズを組み合わせることで表面から裏面までの高精細な画像取得を実現した。3.・4.について、汎用性の高い商用ソフトは高額で特別研究員の研究費では購入できなかったが、複数のフリーウェアを組み合わせることで達成できた。現在これら一連の手法を用いて、軸索走行発達の定量解析を進めている。また、K^+チャネルKir2.1を導入し神経活動を低下させたところプレシナプス発達に異常が見られたことから、神経活動の影響についての解析も進めている。本実験系を用いた研究成果は、和文総説として商業誌に2報掲載された他、国際研究会にて1回、国内学会・研究会にて2回ポスター発表され、また国内研究会にて2回口頭発表された。このうち第45回東北生理談話会での口頭発表において、日本生理学会から東北日本生理科学奨励賞を授与された。(抄録なし)ニワトリ毛様体神経節におけるプレシナプスの発達過程は、ブートン状から杯状に成熟するシナプス前終末の選択過程と、それ以外の余分なシナプス前終末および軸索側枝の除去過程に大別できる。採用第1年度目である24年度は、シナプス前終末の機能的評価法の確立を達成した。赤色蛍光カルシウムセンサーR-GECO1を導入してシナプス前終末のカルシウムイメージングを行うことで、単発刺激に対するカルシウム応答を高い検出能で計測することができた。また、R-GECO1と共にキメラ型光感受性陽イオンチャネルChRFRを導入し、シナプス前終末を451nmレーザーで直接光刺激することで、任意のシナプス前終末で活動を引き起こし、それによって生じたカルシウム応答を計測することに成功した。オプトジェネティクスツールの同時導入による同時導入によるシナプス前終末の光刺激-カルシウムイメージングは世界初の試みである。これによって任意の発達期プレシナプスの機能評価を行うことが可能となり、シナプス前終末の活動と選択過程の関連を解明する道が開けた。上記に関連する成果は学術誌PLOSONEにて掲載された他、国際研究会にて1回、国内学会・研究会にて3回ポスター発表され、また国内研究会にて2回口頭発表された。これらの発表の中で、ポスター発表賞を2回、口頭発表賞を1回獲得した。軸索側枝の定量的な発達解析がネックとなったが、組織透明化技術を適用することで深部観察が可能となり、それによって神経節内部の軸索走行の全追跡が可能となり解決の目途が立った。

また、分子メカニズムの解明に向けたいくつかの過剰発現・ノックダウンプラスミドも完成した。以上より当初の計画はおおむね順調に進展している。蛍光タンパク質を発現させた毛様体神経節を透明化し、広域高精細の深部観察を行って軸索の枝分かれを発達に沿って定量的に評価することで、軸索刈込の基盤原理にアプローチする。またここにいくつかの標的分子の過剰発現・ノックダウンを組み合わせることで軸索刈込の分子メカニズムやその病理学的な側面についても明らかにする。(抄録なし)
前立腺癌のアンドロゲン非依存性の機序の解明

【背景】前立腺癌における神経内分泌細胞は周囲の腺癌細胞の増殖を促進することが推測されているが、その証拠は限られている。我々は、LPB-Tag 12T-10 transgenic mouse前立腺より樹立したマウス前立腺神経内分泌癌(NE-10)と細胞株(NE-CS)がヒト前立腺癌LNCaPに及ぼす影響を検討した。【方法】ヌードマウス背部皮下に移植したLNCaPの増殖と肺転移がNE-10アログラフトの存在下によってどのような影響を受けるかを検討した。また、LNCaP細胞のin vitro浸潤能・運動能および遺伝子発現がNE細胞の影響でどのように変化するかを、それぞれboyden chamber assayおよびmicroarrayを用いて検討した。【結果】NE-10はLNCaPの増殖に影響を及ぼさなかった。LNCaPの肺転移はNE-10存在下では有意に促進された。また、NE-CSとのco-incubationおよびNE-CSの上清の添加によりLNCaPの浸潤能と運動能は有意に増加した。NE-CSの培養上清内でLNCaPを培養すると、アクチン結合蛋白であるgelsolinのmRNAの発現亢進が認められた。【結論】以上の結果より、マウス前立腺神経内分泌癌(NE-10/NE-CS)から分泌される何らかの因子が、LNCaPのgelsolin遺伝子の発現をup regulationして遊走能を増加させ、これにより浸潤能が増加して肺転移促進に関与していると考えられた。マウス前立腺神経内分泌癌(NE10:ヌードマウスで継代可能なアログラフト、NE-CS:NE10より樹立したin vitro細胞株)によるヒト前立腺癌(LNCaP)の転移促進の機序の詳細を、細胞生物学的手法を用いて検討した。これまでに、NE10がLNCaPのin vivoでの肺転移を促進することを明らかにしてきた。一般的に、癌の転移の前段階として浸潤が重要であることはよく知られた事実である。NE-CSがLNCaPの浸潤に及ぼす影響をin vitro invasion assaysystemを用いて検討したところ、NE-CSとのco-incubationおよびNE-CSの上清の添加によりLNCaPの浸潤能はコントロールに比較して有意に増加した。さらに、NE-CSが浸潤能を規定する重要な段階であるLNCaPの接着および遊走に及ぼす影響を、それぞれcell attachment assay、haptotactic migration assayを用いて検討した結果、NE-CSはLNCaPの遊走能を有意に増加させたが、LNCaPの接着能には影響を及ぼさなかった。LNCaPの遊走能の増加に関与する遺伝子を探索する目的でmicroarray解析を行ったところ、NE-CSの上清の添加によりアクチン調節蛋白であるgelsolin mRNAの発現増加が認められ、Northern blot解析でも同様の所見が得られた。以上の結果より、マウス前立腺神経内分泌癌(NE10/NE-CS)から分泌される何らかの因子がLNCaPのgelsolin遺伝子をup regulationして遊走能を増加させ、これにより浸潤能が増加して肺転移促進に関与していると考えられた。
種特異的ケモカインの分子生物学的解析

CCケモカインLEC(Liver-Expressed Chemokine/CCL16)はヒトにのみ存在するケモカインで、マウスでは偽遺伝子である。このケモカインの発現細胞種を調べると肝実質細胞でおもに発現しており、MIP-1αなどの炎症性ケモカインを発現するクッパー細胞などでは発現がほとんど認められなかった。血清中の濃度を調べてみると、個人差があるが、0.3-4nMの高い濃度で存在していた。またLECはおもに受容体CCR1とCCR2に結合し、作用ことがわかった。しかし、それら受容体への親和性はかなり低いものであった。LEC以外にも肝臓で発現し、CCR1などをおもに認識する低親和性ケモカインが最近いくつか報告されているが、これらの遺伝子はいずれも遺伝子クラスター中で隣接して存在していた。血流中でのLECなどの機能はまだ不明であるが、以上のことから、我々はこれらをプラズマケモカインと呼ぶことを提唱した。またマウスCCケモカイン遺伝子クラスターのMIP領域122kbの配列を決定し、CCケモカイン遺伝子5個の構造を明らかにした。このMIP領域とゲノム計画で決定されているCCケモカイン遺伝子クラスターのMCP領域の配列をヒト配列と比較・解析した。その結果、新規遺伝子は存在しなかったが、ヒトとマウスが分岐した後もDNA再編成が繰り返し起こり、ヒト特異的LECなどの種特異的ケモカイン遺伝子や偽遺伝子が形成されたことが明らかとなった。またケモカイン遺伝子はヒトとマウス遺伝子の対応関係が不明の場合が少なくなかったが、本研究により明確にその対応関係が決定された。CCケモカインLEC(Liber-Expressed Chemokine)はヒトにのみ存在するケモカインで、マウスでは偽遺伝子となっており、発現していない。このケモカインの発現細胞種を調べると肝実質細胞でおもに発現しており、MIP-1αなどの炎症性ケモカインを発言するクッパー細胞などでは発現がほとんど認められなかった。肝臓で構成的に発現していることから、血清中の濃度を調べてみると、個人差が大きいが、0.3-4nMの濃度で存在していた。またLECはおもに受容体CCR1とCCR2に結合し、遊走や細胞内フリーカルシウムイオン濃度上昇作用を示すことがわかった。しかし、それら受容体への親和性はMIP-1αやMCP-1(それぞれCCR1およびCCR2に高親和性)に比べるとかなり低いものであった。またCCR5にも非常に弱く結合するが、高濃度でもR5タイプHIVの感染は阻害しなかった。LEC以外にも肝臓で発現し、CCR1などをおもに認識する低親和性ケモカインが最近いくつか報告されているが、これらの遺伝子はいずれもCCケモカイン遺伝子クラスターの中で隣接して存在していた。ケモカインは炎症反応や、リンパ球のホーミング、細胞増殖に関与する一群のサイトカインである。ヒトとマウスを比べてみると、マウスでは明らかにケモカイン遺伝子の数が少ない。したがってヒトとマウスでは異なるケモカイン遺伝子セットを保持しており、それぞれの生物に特有のケモカインはその生物を特徴づける遺伝子の1つと考えられる。本研究ではヒトとマウスのケモカイン遺伝子クラスター構造を解析し、ケモカイン遺伝子が進化の過程で形成・維持され、あるいは破棄された理由を探り、生物の多様性形成機構を解明することを目的とする。そこで、まずマウスCCケモカイン遺伝子クラスターのMIP領域を含むBACクローン122kbの配列を決定し、CCケモカイン遺伝子5個の構造を明らかにした。このMIP領域とゲノム計画で決定されているCCケモカイン遺伝子クラスターのMCP領域の配列をドットプロットやPIP (percentidentity plot)法によりヒト配列と比較・解析した。

その結果、新たな新規遺伝子は存在しなかったものの、ヒトとマウスが分岐した後も重複や欠失などの多くのDNA再編成が起こり、ヒト特異的LECなどの種特異的なケモカイン遺伝子や偽遺伝子が形成されたことが明らかとなった。またケモカイン遺伝子は進化速度が非常に速いことからヒトとマウス遺伝子の対応関係が不明の場合が少なくなかったが、本研究のゲノム配列比較や系統樹解析により明確にその対応関係が決定された。
DNA修復酵素遺伝子欠損マウスを用いた発癌抑制機構の解析

G : C→T : Aトラスバージョン突然変異の原因となるDNA中の8-オキソグアニンは8-オキソグアニン-DNAグリコシラーゼ(OGG1蛋白質)によって認識され塩基除去修復の過程を経て修復される。このDNA修復酵素が個体レベルで発癌抑制に果たす役割を評価するためにOGG1+/-マウス同士の交配で得られたOGG1-/-マウスとOGG1+/+マウスを,自然観察(6976週)の後解剖して発生した腫瘍の種類や頻度を比較した。C57BL/6Jx129Sv(ES細胞)の遺伝的背景を持つOGG1-/-マウスでは11匹中6匹(55%)に肺の腫瘍が観察されたが,OGG1+/+マウスでは20匹中3匹(15%)だった。次に,酸化ヌクレオチドを分解することで複製過程におけるDNAへの8-オキソグアニンの取込みを抑制していると考えられているMTH1を欠損させることで,さらにDNA中の8-オキソグアニン含量が増加することを期待してMTH1,OGG1二重欠損マウスを作製した。野生型(TTGG),MTH1欠損マウス(ttGG),OGG1欠損マウス(TTgg),MTH1,OGG1二重欠損マウス(ttgg)を用いて自然発癌実験を行ったところTTggマウスでは肺腫瘍が発生したが,予想に反してttggマウスでは肺腫瘍は観察されなかった。DNA中の8-オキソグアニンの含量を調べたところ,ttggマウスではTTggマウスと同程度の蓄積が見られた。以上の結果から,OGG1遺伝子が発癌抑制遺伝子であること,MTH1遺伝子欠損によってOGG1遺伝子欠損によって生じる肺腫瘍が抑制されることが明らかになった。
分子系統からさぐる原生生物のシリカ細胞外被形成能の進化

一般に,生きている放散虫類は共生藻をもっている.それらは黄緑色ないし黄褐色の微小な球状で,そのサイズは310マイクロメータの大きさである.共生体を持っている現生の放散虫類の大部分が共生体から光合成によって固定された炭素の供給をうけ,貧栄養環境下でその共生関係を維持している.この研究では、Euchitonia elegans (Ehrenberg), Dictyocoryne truncatum (Ehrenberg),およびSpongaster tetras Ehrenbergの分子系統および超薄切片観察により,Dinoflagellates、chlorophytes、およびhaptophytesなどの藻類がこれらの放散虫に共生していることを特定した.そのうえ,これまで共生藻をもたないとされていたDictyocoryne profunda Ehrenbergの表面に,数多くのシアノバクテリアが共生していることを明らかにした.本研究の結果,異なった種の放散虫は異なった共生体を持ち,それらは強い特異性もつことを示した.もし,仮に同じ放散虫が異なった藻類を複数,共生体として持つならば,それは選択の柔軟性があることを示すかもしれない.しかしながら,現在の結果はこの仮説を否定する.これらの間の柔軟性の欠如は,放散虫に共生体の認識と選別ための一般的なメカニズムがある事を示すものと考える.一般に,生きている放散虫類は共生藻をもっている.それらは黄緑色ないし黄褐色の微小な球状で,そのサイズは310マイクロメータの大きさである.共生体を持っている現生の放散虫類の大部分が共生体から光合成によって固定された炭素の供給をうけ,貧栄養環境下でその共生関係を維持している.この研究では、Euchitonia elegans (Ehrenberg), Dictyocoryne truncatum (Ehrenberg),およびSpongaster tetras Ehrenbergの分子系統および超薄切片観察により,Dinoflagellates、chlorophytes、およびhaptophytesなどの藻類がこれらの放散虫に共生していることを特定した.そのうえ,これまで共生藻をもたないとされていたDictyocoryne profunda Ehrenbergの表面に,数多くのシアノバクテリアが共生していることを明らかにした.本研究の結果,異なった種の放散虫は異なった共生体を持ち,それらは強い特異性もつことを示した.もし,仮に同じ放散虫が異なった藻類を複数,共生体として持つならば,それは選択の柔軟性があることを示すかもしれない.しかしながら,現在の結果はこの仮説を否定する.これらの間の柔軟性の欠如は,放散虫に共生体の認識と選別ための一般的なメカニズムがある事を示すものと考える.分担者の琉球大学の竹村明洋,および海外共同研究者であるノルウェーオスロ大学のBjorklund教授とともに2回の調査で計5回の琉球大学(沖縄ステーション)でのサンプリングを行った.当初の計画に示したように,放散虫Polycystineaについて,宿主の放散虫だけではなく共生体(寄生体・共生体)数種の18S rDNAの解析に成功した.これらを基に,真核生物全体の中でのそれらの系統上の位置や,共生体の獲得が単なる偶然によるものなのか,それとも世代を超えて受け継がれたものなのかといった寄生や共生の成立についての新しいデータを得ることができた.すでに公表した高緯度(ノルウェーのソグネフィヨルド)のデータと合わせて,それぞれの地域の放散虫の共生の多様性や遺伝子の差異についての検討を行なったところ,共生体はホストに対して種特異的な分布はしておらず,逆にホストは,その環境において種特異的な共生体を獲得していることがわかった.これについては引き続き検討を行う予定である.また,採取した放散虫の飼育実験から,放散虫のリプロダクションを観察し,そのピコサイズの遊走子の18S rDNA解析に成功した.これは当初の計画にはなかったことだが,Lopez-Garcia et al.(2001)などで,ピコサイズの環境サンプル中の遺伝子ライブラリになぜ放散虫の遺伝子が数多く混じっているのかという疑問に,ある答えを出すことができたものと考える.放散虫にもさまざまな藻類が共生している.もつともよく見られ,また研究されている放散虫の共生体は渦鞭毛藻類であり,プラシノ藻,黄金色藻類なども共生体として報告されている(Anderson, 1983; Gast and Caron, 1996).しかしながら,これら共生体の多様性についてはまだあまり詳しくはわかっておらず,固有の共生藻が固有の種に共生しているのか,それとも宿主による共生体の選択が自由に行われているのかどうかも明らかになっていない.そこで,これらを明らかにするため放散虫4種の超薄切片による電子顕微鏡観察を行い,これまで分子系統解析より得ていた結果と照らし合わせ,放散虫に共生する藻類の同定を試みた.2009年5月11日16日, 6月8日13日, 10月5目10日, 11月27日3日の4回,琉球大学瀬底実験所沖合で,同大学実験船から採取した放散虫Euchitonia elegans (Ehrenberg), Dictyocoryne truncatum (Ehrenberg), Spongaster tetras Ehrenberg,およびDictyoc oryne profunda Ehrenbergとその共生体の分子系統解析および超薄切片による電子顕微鏡観察を行った結果, E. elegans, D. truncatum,およびS. tetrasのそれぞれから渦鞭毛藻,ハプト藻,緑藻の特徴を持つ共生体が確認できた.

分子系統解析の結果からは, D trunc atumの共生藻は,浮遊性有孔虫の持つ共生藻類と近縁であったが, E. elegansに共生している渦鞭毛藻は,これまでサンゴやシャコガイから報告されているスエシア目(Suessiales)の種ではなく, Daugbjerg et al. (2000)で定義された狭義のGymnodinium属の種であることが明らかになった.また,これまで藻類は共生していないと考えられていたD. profundaの超薄切片を観察した結果,殻表面に数多くのシアノバクテリアが共生していることが確認された.放散虫4種の超薄切片による電子顕微鏡観察を行い,これまで分子系統解析より得ていた結果と照らし合わせ,放散虫に共生する藻類の同定を試みた.また,これまで藻類は共生していないと考えられていたD.profundaの超薄切片を観察した結果,殼表面に数多くのシアノバクテリアが共生していることが確認された.
急性前骨髄球性白血病（APL）に対するセレブロンモジュレーターの作用機構の解明

セレブロンはサリドマイドなどのリガンドが結合することで、新たに基質を認識して分解する特殊なユビキチンリガーゼとして知られる。リガンドはセレブロンモジュレーターと今では総称される。急性前骨髄球性白血病(APL)の発症の病因のひとつに異なる遺伝子が融合したキメラ遺伝子が関与することが分かっており、その融合タンパク質がセレブロンモジュレーターにより破壊できることがわかってきた。本研究では、最新の生化学・分子生物学的手法、トランスクリプトーム解析を組み合わせ、セレブロンモジュレーターによるキメラタンパク質分解とそれに応答する下流の遺伝子発現を網羅的に解析し、APLの新しい治療法の確立をめざす。
効率の高い遺伝子修復法を利用した造血系遺伝病の治療法の開発

本研究では、ウイルスベクターを利用した相同組換えにより染色体遺伝子を修復する究極の遺伝子治療法の開発を目的とする。1、アデノウイルスベクターヘルパー依存型アデノウイルスベクター(HDAdV)によるヒト細胞での相同組換え効率を検討するため、正常ヒト繊維芽細胞においてHPRT遺伝子座を標的とし、細胞あたり10^<-5>から10^<-6>の頻度で遺伝子ノックアウトを達成した。また、相同組換えによってファンコニ貧血A群(FANCA)遺伝子変異を修復する頻度を測定するために、正常FANCA遺伝子座の一部をコードするHDAdVを作製し、患者由来B細胞株(BCL)に感染させた。しかし、相同組換えによるFANCA遺伝子の修復も、染色体上のランダムな位置へのベクターの組み込みも、いずれも検出できなかった。2、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターHDAdVと同様に、HPRTノックアウトベクターとFANCA修復ベクターを構築した。宿主域の異なる各種AAVベクターを調製し、正常BCLを感染させたところ、1 x 10^<-5> - 6 x 10^<-6>の頻度で染色体に組み込まれた。そのうち、AAV2とAAV8由来のベクターで、細胞当たり1 - 2 x 10^<-6>の頻度でHPRTノックアウトを達成したFANCA患者由来細胞BCLに対しても、3 x 10^<-5>の頻度でHPRTノックアウトを得た。ヒト造血細胞における遺伝子ノックアウトは初めての例である。さらに、FANCA修復ベクターを用いて遺伝子修復を試みたが、修復細胞は検出されなかった。3、相同組換えの促進と非相同組換えの抑制の試みマウスHprt相同領域をコードするプラスミドDNAをマウスES細胞へエレクトロポレーションし、UV damage endonuqleaseの強制発現またはPARP1阻害剤での細胞処理による相同組換えの促進と、DNA-PKcs阻害剤の細胞処埋による非相同組換えの抑制を検討したが、いずれの場合も顕著な効果は認められなかった。4、今後の展望HDAdVに関しては、long PCRで相同配列をクローニングした際にエラー(変異)が入って相同組換えを阻害した可能性があるので、BACから直接クローニングする方法でベクターを再構築し、実験を行う予定である。また、FANCA陽性細胞の検出法の精度を改善して、AAVを用いて再実験を行う。1、HPRT遺伝子座を標的にしたモデル実験ヘルパー依存型アデノウイルスベクター(HD AdV)によるヒト細胞での相同組換え効率を検討するためのモデル実験として、男性由来正常ヒト繊維芽細胞における変異HPRT遺伝子を標的とした相同組換えによる遺伝子修復効率を検討した。その結果、感染細胞あたり10^<-5>から10^<-6>の頻度で遺伝子が修復されたが、これは以前に我々が得ていたマウスES細胞での効率に比して1桁以上低かった。理由の一つとして、long PCRで相同領域(約20キロ塩基対)を増幅したために変異(ミスマッチ)が多く入ったことが考えられるため、ファージの相同組換えを利用する方法(Red/ET法)で、BACクローンより直接HD AdVベクタープラスミドを再構築中である。

2、相同組換えの促進と非相同組換えの抑制の試みマウスHprtと6.7kbの相同領域をコードするプラスミドDNAをマウスES細胞へエレクトロポレーションし、UV damage endonucleaseの強制発現またはpoly(ADP-ribose) polymeraseの阻害剤での細胞処理による相同組換えの促進と、DNA-PKcs阻害剤であるWortmanninでの細胞処理による非相同組換えの抑制を解析した結果、いずれの場合も顕著な効果は認められなかった。3、FANCA修復ベクターの構築と調整上記のRed/Er法を用いて、BACクローンより、ヒトEANCA遺伝子座と約30kbの相同領域を持つHD AdVのプラスミドを構築した。相同領域以外に、ネガティブ選択法のための単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子と、力価測定用のVenusマーカー遺伝子をコードする。現在ベクターウイルスを調整中であり、次のステップとして、FANCA患者由来のB細胞への感染実験を計画している。1、FANCA患者由来B細胞株でのFANCA遺伝子修復相同組換えによってファンコニ貧血A群(FANCA)遺伝子変異を修復する頻度を測定するために、平成17年度に作製したFANCA遺伝子修復アデノウイルスベクターを増殖・精製した。このベクターは患者で変異のあるエクソン27の正常配列を含む約27kbの相同領域をコードする。相同組換えによりFANCA遺伝子が正常になった細胞は、マイトマイシンC(MMC)耐性になり、相同領域の外にネオマイシン耐性遺伝子発現カセットを持つため、染色体上のランダムな位置ヘベクターが組み込まれた細胞はネオマイシン耐性となる。このベクターを種々の濃度でFANCA患者由来B細胞株(BCL)に感染させたが、ネオマイシン耐性コロニーもMMC耐性コロニーも得られなかった。2、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いた造血細胞での相同組換えAAVベクターを用いて相同組換えを試みた。ヒトHPRT遺伝子座由来約3kbの配列のエクソン3にネオマイシン耐性遺伝子を挿入して、AAV-hHPRT-neoを作製した。FANCA修復AAVベクターは、FANCAのエクソン27を含む4.4kb配列をAAVベクターに挿入して作製した。宿主域の異なるAAV1、AAV2、AAV7、AAV8由来の各AAV-hHPRT-neoベクターを、細胞当たり1x10^2-6x10^3コピーの濃度で正常男性由来BCLに感染させたところ、それぞれ感染細胞当たり5x10^<-6>、6x10^<-6>、1x10^<-5>、4x10^<-6>の頻度でネオマイシン耐性コロニーを得た。そのうち相同組換えによりHPRT遺伝子座が破壊されたコロニーを6チオグアニンの存在下で選択した結果、AAV2由来ベクターで細胞当たり2x10^<-6>、AAV8ベクターで1x10^<-6>の頻度で耐性細胞クローンが得られた。FANCA患者
「医療ケア者へのケア」を考える学際協働研究－終末期の全人的ケアを展望して－

本研究では、終末期医療に取り組む「医療ケア者へのケア」を学際協働的に考える。中長期的には患者一人一人の全人的ケアおよび家族の支援を展望するが、そのためにこそ、まずはもっとも患者の身近に寄り添う看護師をはじめとして「ケアする者」へのケアを目指す。とくに患者が抱える「4つの痛み(ペイン)」とそれに対応した「4つのケア」に着目し、終末期ケアの意味を、哲学・法学・医学・倫理学の見地から学際的に探究する。その成果は、栃木県内の医療者との密なる連携の元、その都度現場へと還元し、現場と双方向的に再検討を重ねることで、実践的な価値ある研究を目指す。
インテグリンと細胞外基質が前立腺癌の増殖、骨転移に果たす役割とその制御因子の検討

本年度は本研究課題の最終年である。androgen-sensitiveあるいはandrogen-insensitiveLNCaP細胞を用いたintegrin α_6 mRNAの分離、発現様式を調べる実験もほとんど終了した。成果のひとつとして、Dihydrotestosterone(DHT)がandrogen receptorと結合し、その後にα_6integrinのgenomic DNAのpromotor,androgen response elementに結合してα_6 integrin遺伝子発現をdown-regulateすることが判明した。さらに、DHT-androgen receptor complexが蛋白合成を介してα_6 integrinの遺伝子発現をup-regulateすることも分かった。前立腺癌のandrogen-insensitivityはDHT-androgen receptor complexを介しておこる蛋白合成と考えられる。androgen-insensitive前立腺癌細胞では、andorogenにより修飾を受ける遺伝子群のメカニズムがandrogen-sensitiveな時と変らず、そのままinsensitiveとなっても表現されていると考えられた。前立腺癌の1,25-dihydroxyvitamin D_3(1,25(OH)_2D_3)療法では1)1,25(OH)_2D_3は前立腺癌細胞株LNCaPで前立腺特異抗原の産生を増加させる、2)1,25(OH)_2D_3は前立腺癌細胞株LNCaPを増殖させるという問題点が過去に提起されており(Cancer Res 52:515-520,1992)、これらの点が1,25(OH)_2D_3を前立腺癌の治療に用いるのを妨げていた.したがって、この問題の解決が前立腺癌での1,25(OH)_2D_3療法の前提となった.まず、PSA増加の説明では1,25(OH)_2D_3によりLNCaPは細胞増殖が抑制され、その結果、細胞あたりの培地より得られる栄養が対照に比べ増大することがわかった.第二の問題点では1,25(OH)_2D_3を用いる場合、培養に用いる血清をCharcol処理する.この操作で細胞培養培地中のlipidsが失われる.この条件下では1,25(OH)_2D_3はlipidsとして細胞増殖に利用されることが判った.以上の結果は1,25(OH)_2D_3もしくはその誘導体は前立腺癌の治療に十分利用されうることを示している.平成8年度は、1,25(OH)_2D_3が前立腺癌でintegrinsの発現をいかにmodulationするのかを検討する.このための分子生物学的な方法についてはすでに平成7年度に終了しており、1,25(OH)_2D_3で発現がmodulationされる前立腺癌のintegrinsをscreeningしているところである.またbone marrow stroma cellsとのco-cultureで骨転移を起こすLNCaPのsublineおよびAndrogen-insensitive LNCaPも開発中で、これらの細胞でのインテグリンの発現の差異について検討可能と思われる。前立腺癌の臨床ではアンドロゲン非依存性前立腺癌が問題になる。その定義としては癌細胞の増殖がアンドロゲンに依存しないことであるが、その状態でのアンドロゲンで調節される遺伝子発現についての明確な研究成果はいままでに得られていない。本研究では前立腺癌細胞株でのα_6インテグリンの発現調節は比較的短時間の場合はアンドロゲンはα_6インテグリンの遺伝子発現を抑制する。しかし、アンドロゲン依存性、非依存性の細胞株LNCaP cell lineでは比較的長時間、アンドロゲンを作用させるとα_6インテグリンの遺伝子発現が刺激されることがわかっており、その条件ではそれらの細胞の胞基底膜への浸潤が亢進することも解明された。このアンドロゲンによるα_6インテグリンの遺伝子発現の刺激作用はcycloheximideで阻害されることよりアンドロゲンによる蛋白合成を介した経路であると推定される。細胞がアンドロゲン不応性になった場合で、アンドロゲンで作動する遺伝子の発現機構が刺激される場合ではその刺激がアンドロゲンによるのかまたはアンドロゲン不応性の原因になる増殖因子によるのかは明らかになりにくい。しかし、アンドロゲンで抑制がかかる遺伝子発現を調べることでその問題は解決する。これらの背景でこの研究で得られた結果ではアンドロゲンで抑制がかかる遺伝子発現を調べることで前立腺癌細胞がアンドロゲン不応性になってもアンドロゲンで作動する遺伝子発現機構は温存され、アンドロゲンレセプターが免疫組織学的に確認できないPC-3 cell lineでもそれが観察できた。前立腺癌細胞が細胞外基質により十分に細胞増殖、転移を行うにはアンドロゲンの存在が必要であり、このことは細胞増殖のアンドロゲン依存性に関係しないことがわかった。
アイルランド語文献と音声資料による近代アイルランド言語文化の多角的研究

今年度の研究実績として、二本の柱がある。三年間継続して行ってきたジェフリー・キーティング(Geoffrey Keating)が著したForas Feasaar Eirinn(以下Foras Feasa)の解読と、2014年秋に開いたタイグ・オドゥーラニャ氏を講師とするセミナーである。また、今期科研費を使用していないものの、掲げたテーマ「アイルランド語文献と音声資料による近代アイルランド言語文化の多角的研究」に含みうる活動として、梨本邦直をプロジェクト代表とするブライアン・メリマン著『真夜中の法廷』の解説付き訳書の編集・出版がある。これは、英訳を除けば、世界で二例目の業績となった。ジェフリー・キーティング(Geoffrey Keating, Seathrun Ceitinn)が著した『アイルランド史』(Foras Feasa ar Eirinn)は、アイルランドの文化研究において、必読の書のひとつである。特徴的な物語的歴史記述は、言語的には、以降の近代的散文の範となったとされる。歴史的には、宗教改革前にブリテンからアイルランドに移り住んだオールド・イングリッシュと呼ばれる人々の存在意義を高めようとしたとされる。文学の上では、のちにケルトの名で一括される物語群に素材を提供したとされる。すなわち、近現代のアイルランドを構成する諸要素が17世紀の時点でいかなるものであったかを、この著作は明らかにしうる。このことは、この著作を一次資料として、すなわちアイルランド語で読み解くことの重要性を示す。訳者の介在は、彼による編集の時点の地政学的状況をテキストに加えてしまうからである。原典にあたれば、アイルランドのみならずヨーロッパ全体を見渡す視座から、宗教改革期を再考することが可能になる。研究代表者、研究分担者、本研究の前身であるブライアン・メリマンの読解に共にあたった者たちは、さらに二名の新たなメンバーを加えて、「京都アイルランド語研究会」として、この『アイルランド史』を、オズボーン・バーギンによる教科書版とパトリック・ディニーンによる定本とを対照しつつ、読み解く作業を続けている。メリマン研究のやり方を踏襲し、原語テキスト、英訳、日本語訳を蓄積中である。参加者が学問的拠り所としているのは言語学、歴史学、文学等々幅広い。この研究は、それだけの学際性を必要としている。なお、10月に、キーティング研究者として知られるタイグ・オドラーニャ氏を講師として招聘し、セミナーを開くことが決定している。本研究の特長は、アイルランド語による第一次資料を研究対象とする点、および高度な学際性を求める点に著しい。平成24年度から同26年度に至る3か年計画においては、予定通り、アイルランド語による物語的歴史記述の白眉とされるジェフリー・キーティング(Geoffrey Keating,アイルランド名Seathrun Ceitinn)著『アイルランド史』(Foras Feasaar Eirinn)を研究対象として選択した。初年度、準備期として、本研究の前身であるブライアン・メリマン(Brian Merriman)の『真夜中の法廷』(Cuirt an Mheon-Oiche)にあたった時の方法に倣い、この素読を始めた。現在、オズボーン・バーギン(Osborn Bergin)編の教科書版抄本を目安にして、そのおよそ3分の1まで読了したところである。成果の公開を前提とする以上、底本の選定がきわめて重要であった。具体的には、新しい研究成果を活かしているが青少年にふさわしくない内容がところどころカットされている前記バーギンの教科書版抄本を用いるか、いささか古いが歴史的に重要で、なおかつ電子版としてアクセス可能なパトリック・ディニーン(Patrick Dinneen)の完本を用いるか、が問題であった。両本を用いて読解を進めながら、教科書版に含まれる章を、完本をもとに読み解くことに落ち着いた。実績と言えるほどのものはまだない。が、取り上げた章の原語テキスト、英訳、日本語訳、および注釈のセットは、確実に蓄積されつつある。合計11章分、上記の通り教科書版の約3分の1に相当する量である。本研究のような学術分野においては、この種の基礎資料こそが重要であると考える。また、今期科研費を使用していないものの掲げたテーマ「アイルランド語文献と音声資料による近代アイルランド言語文化の多角的研究」に含みうる活動として、ブライアン・メリマン著『真夜中の法廷』の訳書の編集・出版がある。Foras Feasaの解読は予定より遅れがちではあったが、言語学的、文学的、神学的、歴史的、民俗的その他の視座から精緻な検討を加えつつ進められた。

若手研究者二名の渡英、あるいは一時離脱が痛手ではあったが、この書物の原題「アイルランドに関する知識の基礎」が示す通り、この解読がアイルランド理解の基となってきた知の正体を問い直す作業そのものになることは疑いなく、京都アイルランド語研究会の仕事として今後も継続していきたい。オドゥーラニャ氏からは、10月10日から21日の滞在中、京都アイルランド研究会のみならずわが国のアイルランド研究者に多大の知恵を頂戴することになった。京都でのセミナーは18日、19日の両日、いずれも午後いっぱいを使い、ホテルコープイン京都にて開かれ、成功裡に終わっている。ブライアン・メリマン著『真夜中の法廷』の翻訳・編集・出版は、Foras Feasaの解読と並行して、京都アイルランド語研究会の科研プロジェクトを前期まで担っていた梨本邦直を代表として行われた。結果として生まれたのは、英語以外への翻訳としては世界で二例目、ドイツ語への翻訳から135年ぶり、語彙集や多様な視点からの解説、さらには文法構造を示す英訳まで加えた画期的な三言語版であった。W. B. Yeatsを入り口として、アイルランド文学、文化達成度は、残念ながら、予定通りではない。昨年も報告した通り、テキストForas Feasaar Eirinnが難しい。ただし、昨年とやや異なり、文体や語彙の問題は克服しつつある。現在、難しさの因は、テキストの背景に対する各人の解釈の相違に変化しつつある。そして、これは研究会の参加者それぞれの学問的立脚点の相違に関わることがらである。量をこなすという点では、物足りない。しかしながら、考察すべき点が見えるようになってきて一定の議論を経ずに読了とは言えなくなっている点を思えば、活動の質としては断然向上しつつある、と言えるかもしれない。研究の達成度は予定通りでない。しかし、その理由は、テキストForas Feasaar Eirinnが予想以上に難しいテキストであった、というただ一点にあり、研究会の成員が減少したわけでも、頻度が落ちたわけでもない。さらにまた、難しさの要因は、文体、語彙への慣れ、テキストの背景の理解という避けがたくはあるが、時間とともに克服可能な種類のものである。実際、克服しつつある。特に変更すべきところはない、と考える。年に数回、京都アイルランド語研究会として集まり、ひとりが担当箇所の読解を示し、他の者が批評し、全員で改訂する。英訳、日本語訳を成果として残す。言語、文学、歴史等の研究者が集まっている利点を最大限に生かしつつ、愚直に作業を続けていく。秋10月に、タイグ・オドラーニャ氏を講師として招き、研究会の作業から浮かび出てきた四つの演題で講義をしていただくことがすでに決まっている。特に変更すべき点はない、と考える。この愚直な作業の繰り返しである。
ブタ劇症肝炎モデルの確立と人工肝補助療法による治療効果の検討

研究代表者らはバイオ人工肝臓への応用を目的として、多孔質樹脂を細胞固定化用の担体とする充填層型リアクタを開発した。本年度はこのリアクタを用いて肝不全のブタへの体外灌流を行い、治療効果を透析を行った群と検討した。[方法]培養体積1Lの充填層型リアクタを用いた。ブタから遊離した肝細胞100gを固定化し、このリアクタシステムを用いて灌流培養を行った。培地の酸素濃度とpHをそれぞれ40%と7.4に調節した。体重912kgのブタの門脈内にα-amanitine(0.15mg/kg)とlipopolysaccharide(1μg/kg)を注入し、劇症肝不全モデルを作成した。薬剤注入後22hから8hの体外灌流を行い、hollow-fiber dialyzerを用いてブタの血液をリアクタの灌流液にて透析した。コントロールとして、肝細胞を含まないリアクターを用いて灌流を行った。[結果]薬剤投与により、22h後の血中AST値は10000IU/L以上となり、劇症肝不全の病態を示した。血中アンモニア濃度は急激に上昇し、22hの時点で305μg/dLとなったが、肝機能補助群では灌流開始後減少に転じ、8hの灌流終了時点では225μg/dLであった。しかし、灌流停止後には再び上昇した。一方、肝細胞を含まない装置に灌流した群では灌流開始直後に希釈による一過性のアンモニア濃度の低下を認めたものの、その後は再び上昇した。対外灌流を行わないブタは薬剤の投与後平均44時間で死亡したのに対し、肝細胞を含まない装置に灌流したコントロール群では38時間に短縮し、治療群において51時間と延長傾向を認め、8時間の肝機能補助でも生存時間の延長効果があることが示された。さらに、22h以降、継続して人工肝臓への灌流を行う事により、最長73hの生存時間を記録した。[結語]充填層型バイオ人工肝臓の肝機能補助効果がin vivoの灌流実験によって実証された。【緒言】バイオ人工肝臓による治療効果を評価するためには大動物の肝不全モデルの作成が不可欠である。キノコ毒であるα-amanitineとlipopolisaccharide(LPS)を用いてブタに肝不全を引き起こせることが報告さている。本年度は、α-amanitineの投与量と肝不全の重症度の関係について検討した。【実験方法】被検動物として体重9-12kgの去勢ブタを用いた(n=10)。ブタを全身麻酔下に開腹し、門脈内にα-amanitine(100,150 or 200μg/kg)およびLPS(10μg/kg)を投与した。外頸動脈にカテーテルを挿入して動脈圧を測定した。頭蓋内硬膜下にカテーテル先端型圧トランスデューサを挿入して脳圧を計測した。外頸静脈に挿入したカテーテルからブドウ糖加電解質液を持続的に投与した。投与前と投与後12時間おきに外頸動脈のカテーテルから採血した。動物の死亡後、肝臓、腎臓、心臓、肺をフォルマリンにて固定し、組織学的検索を行った。【結果】α-Amanitineの投与量100μg/kgでは4匹とも1週間の観察期間中には死亡せず、150および200μg/kgではそれぞれ平均54および36時間後に死亡した。どの群においても生存中には血圧と血糖値は正常に保たれた。投与量150μg/kgの群では死亡の34時間前から脳圧の急激な上昇が観察されたが、200μg/kgの群では腎不全を合併して脳圧の上昇を示さずに死亡した。全例において薬剤投与22時間後をピークに顕著な血中asparateaminotransferase活性の上昇を認めた。血中アンモニア、ビリルビン値、プロトロンビン時間は著明に上昇し、肝不全の病態を示した。生存例ではこれらの値は72時間以降低下し、肝不全から回復した。死亡例において肝組織は広範な出血性壊死像を呈し、肝細胞をほとんど認めなかった。一方、生存例では中心静脈周囲に壊死像を認めた。他の臓器に組織学的な異常を認めなかった。以上の結果から、α-amanitineとLPSの門脈内投与により、劇症肝不全モデルを作成できること、肝不全の重症度はα-amanitineの投与量に依存することが示された。本モデルは、バイオ人工肝臓の性能評価に有用であると考えられる。

コントロールとして、肝細胞を含まないリアクターを用いて灌流を行った。[結果]薬剤投与により、22h後の血中AST値は10000IU/L以上となり、劇症肝不全の病態を示した。血中アンモニア濃度は急激に上昇し、22hの時点で305μg/dLとなったが、肝機能補助群では灌流開始後減少に転じ、8hの灌流終了時点では225μg/dLであった。しかし、灌流停止後には再び上昇した。一方、肝細胞を含まない装置に灌流した群では灌流開始直後に希釈による一過性のアンモニア濃度の低下を認めたものの、その後は再び上昇した。対外灌流を行わないブタは薬剤の投与後平均44時間で死亡したのに対し、肝細胞を含まない装置に灌流したコントロール群では38時間に短縮し、治療群において51時間と延長傾向を認め、8時間の肝機能補助でも生存時間の延長効果があることが示された。さらに、22h以降、継続して人工肝臓への灌流を行う事により、最長73hの生存時間を記録した。[結語]充填層型バイオ人工肝臓の肝機能補助効果がin vivoの灌流実験によって実証された。
生体内樹状細胞に対するインビボ抗原導入のための超音波用バブルリポソームの開発

バブルリポソームと超音波照射の併用により抗原送達された抗原のDC内における抗原提示経路の解析および抗腫瘍メカニズムの検討を行った。その結果、本抗原導入方法でDC細胞質内に導入された外来性抗原は、通常のDCにおける内在性抗原と同じ経路を通りMHCクラスI分子上に抗原提示されることが明らかとなった。このようにバブルリポソームと超音波照射の併用で細胞質内に直接導入された外来性抗原は、あたかもDCの内在性抗原として認識されたものと考えられた。抗腫瘍メカニズムをCTL欠損マウスを用い解析した結果、CTL欠損により抗腫瘍効果の消失が認められた。このことから、本抗原送達法を適用したDC免疫では主にCTLがエフェクター細胞として機能していることが明らかとなった。バブルリポソームと超音波照射による抗原送達効率をさらに向上させていくためには、バブルリポソームのDCへのアクティブターゲティングが重要である。そこで本研究では、DCのFcγレセプターに積極的に結合するIgG修飾バブルリポソームを調製し、DCへの結合性評価を行った。その結果、IgG修飾バブルリポソームは未修飾バブルリポソームより効率よくDCに接着した。バブルリポソームと超音波を利用したDCがん免疫療法による肺転移抑制効果について、メラノーマ細胞膜由来抗原を送達したDCを免疫することでメラノーマ細胞の肺転移抑制効果が得られた。このような有効な肺転移抑制効果が得られたのは、DCがん免疫療法に本抗原送達法を適用することでメラノーマ細胞に対するCTLが誘導されたためと考えられた。したがって、本抗原送達法はDCがん免疫療法におけるがん転移予防にも適用可能な抗原送達法であることが示唆された。バブルリポソームのGMP製造を確立する点について、リポソーム調製にエタノールのみを用いたGMP製造法を検討した。その結果は、まだ改良の余地があるものの8割方完成した。バブルリポソームと超音波を併用しin vitroにおいてマウスプライマリーDCへの蛍光ラベル標識したOVA導入を行い、顕微鏡で細胞内挙動を観察し、ex vivoでの導入条件(リボソーム量と抗原量比、照射強度・時間など)を評価したところ、エンドサイトーシスを止めた条件での導入を確認することが出来た。同時に、MHCクラスIへの抗原提示効率を確認した。これらの検討で得られた結果を踏まえて、DCへの抗原デリバリーに最適なバブルリポソームおよび超音波照射条件を検討中である。実用化を考慮した場合、癌ワクチンの創製、予防はもちろん簡便性および患者への負担の観点からDCを用いたex vivo法ではなく、直接in vivoに抗原を免疫する方法の開発が望まれる。現在、モデル抗原として卵白アルブミン(OVA)、モデル腫瘍細胞としてOVA発現細胞(EG7-OVA細胞)を用い、EG7-OVA担癌マウスモデルに対して、バブルリポソームとOVAの混合溶液を皮内注射し超音波照射して、検討中である。リポソーム量と抗原量比、照射強度・時間などの最適な条件を検討している。