hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
電子管集積回路用MIS型トンネル冷陰極へのダイヤモンド薄膜の応用

この研究では、ダイヤモンド系薄膜を用いてMISトンネル冷陰極の低電圧動作化と電子放射効率の向上を試みている。ダイヤモンド薄膜の低い仕事関数をもつ性質を利用すると、素子電圧が低くても大きな電子放射(エミッション)を得ることができ、トンネル冷陰極の高効率化が可能となる。またダイヤモンドは物理的、化学的に極めて安定であり、この薄膜は高信頼度のトンネル絶縁膜としても期待できる。本年度は、昨年度に引き続きダイヤモンドと良く似た物理的性質を持つDLC(Diamond Like Carbon)膜のトンネル型冷陰極への応用の可能性について検討を行った。DLC膜はSi基板上にRFスパッタリング法により形成した。その結果10-50nmの範囲で、厚さをスパッタ時間により精度よく制御できることがわかった。また昨年度の結果より、スパッタリング条件、特に基板温度と水素ガスの放電Arガス中への混合比によって、得られた膜の電気的性質が変化することがわかった。そこで、今年度は堆積中に直流バイアスを印加し、水素イオンを加速して膜表面で相互作用させることにより水素が取り込まれる効果について調べ、できるだけ薄い膜でグラファイト含有量の少ない耐電圧の高いDLC膜の形成を試みた。バイアスを0Vから-60Vまで変化させた結果、-10Vでも膜質の変化があり、グラファイト含有量の少ない透明なDLC膜が得られた。このDLC膜を用い、MIS素子としたときの絶縁破壊の起こる電界強度を調べたところ、基板バイアス0Vでは、5.2×10^6V/cmであるのに対して、-20Vのバイアスを加えることにより1.2×10^7V/cmまで大きくなり、絶縁耐圧が改善された。これは、バイアス電圧により活性化された水素のDLC膜中への取り込み量に関係しているものと思われる。ダイヤモンド薄膜は負性電子親和力をもつため、これを用いて低いダイオード電圧で高い電子放射(エミッション)効率が得られるトンネル冷陰極の実現が可能である。さらに、この膜は物理的にも化学的にも極めて安定であり、高信頼度のトンネル絶縁膜としても期待できる。今年度は、ダイヤモンド系薄膜の中でスパッタリング法で容易に形成できるDLC(Diamond Like Carbon)膜の冷陰極への応用の可能性について検討を行なった。その結果をまとめると次のようになる。1.ダイヤモンド系薄膜の形成ダイヤモンド系薄膜は作製法および形成条件によって、ダイヤモンド結晶膜からDLC、グラファイトまで、様々な状態の薄膜が得られる。ここでは、DLC膜をSi基板上にRFスパッタリング法により形成した。その結果10-100nm範囲で厚さをスパッタリング時間で精度よく制御できることがわかった。2.ダイヤモンド系薄膜の絶縁膜としての評価Si基板上に形成したDLC薄膜を、トンネル冷陰極のトンネル絶縁膜としての評価を行なった。スパッタリング条件、特にRFパワー、基板温度、ArガスとH_2ガスの混合比によって得られた膜の性質が変化することが知られており、膜の抵抗率および絶縁耐圧の測定、赤外線吸収の測定等により堆積条件の最適化を行なった。室温でH_2を0.5%加えたとき1.3×10^9Ω-cmの抵抗率が得られた。この絶縁膜を用いてMIS型冷陰極を作製したところ、ダイオード電圧7.5Vで105pA/mm_2の真空中へのエミッション電流が得られた。3.エミッション測定用真空チャンバの改良ターボ分子ポンプの制御系からのパルス性雑音が電流測定時に問題となっていた。今回は排気系をイオンポンプに代え、さらにエミッションを測定するコレクターの位置を真空微動装置で変化できるように改善した。
GABAによる知覚神経節細胞体の興奮性修飾を介した痛み刺激伝達の抑制作用

一次知覚神経の末梢からの興奮は細胞体を介さず、軸索を介しそのまま中枢側の終末に伝わり、シナプスの存在しない知覚性神経節では神経伝達制御に関与しないと考えられている。しかしパルス刺激により三叉神経細胞体でNa^+の流入を認めた。このことは神経細胞体へも興奮伝導が伝わる可能性がある。また細胞外のCl_-濃度を下げる事によりそのNa^+の流入がほとんど無くなった。三叉神経節ではシナプスは存在しないが、細胞体周囲はsatellite cellによって取り囲まれている。細胞外ホメオスタシスはグリア細胞が担っており、ここ三叉神経節においても、グリア-ニューロン間でGABA_Bを介した動的な神経伝達制御が行われていると考察する。またGABA_B受容体R1およびR2サブユニットが神経細胞体において発現していた。三叉神経節におけるGABA_B受容体R2の機能解析においてGABA_B受容体R2KOマウスではわずかなSP(i.v.)刺激においても硬膜血漿漏出を引き起こしたが、R2を三叉神経節で発現しているwild typeは硬膜血漿漏出を認めなかった。これらの結果はGABA_B受容体R2は片頭痛の病態である血管漏出を抑制することを示唆する。我々はこれまでラット三叉神経節の神経細胞体においてGABA_A受容体の発現を免疫組織学的、電気生理学的に証明した。また、高K^+条件下で神経節からGABAが放出されることも報告した。これらの結果から神経細胞体に興奮が伝わることによりGABAがGABA_A受容体を介して何らかの作用を引き起こす可能性を見出した。GABA受容体にはGABA_A受容体の他にGABA_B受容体がある。近年、痛みの軽減や侵害刺激の制御にGABA_A受容体以外にGABA_B受容体も関係するという報告がある。そこで今回我々はGABA_B受容体の発現を組織学的、電気生理学的に示した後に、GABA_B受容体の作用について検討した。In situ hybridizationによるGABA_B receptor subunitsの発現を検討しました。その結果検討した1a,1b,R2subunitは、ほとんどの神経細胞に発現していた。またそれぞれのsubunitの染色強度を小型、大型細胞ごとに測定した。その結果、全てのsubunitにおいて小型の細胞の方が大型の細胞よりもmRNAの発現が優位に高かった。免疫染色の結果も同じ結果となった。組織学の結果からは小型の細胞にGABA_B receptorが発現している可能性が高い。そこでパッチクランプ法を用いて、小型の神経細胞のbaclofenに対する効果について検討した。その結果、小型の細胞においてbaclofenは電位依存的なNa^+currentとK^+currentに影響を与えた。baclofenの作用は神経細胞体によって異なり、spikeに対して増幅に作用するものと減少に作用するものがあった。(目的)片頭痛は三叉神経血管説により発生すると考えられている。その機序は三叉神経に何らかの刺激が加わり硬膜血管周囲に存在する三叉神経終末よりサブスタンスP(SP)などの神経ペプチドが放出され、硬膜血管拡張反応とともに血漿成分漏出が生じることによると考えられている。Baclofenは片頭痛の予防薬としても用いられているがGABAB受容体アゴニストとしても知られている。そこで我々はGABAB受容体R2KOマウスを用い片頭痛メカニズムの解明のための検討を行った。(方法)GABAB受容体KOマウスとWild typeの三叉神経節の神経細胞体について光顕を用いて形態学的に検討するとともに免疫染色法にてSPの局在を観察した。SP(i.v.)により硬膜血漿漏出を促し、エバンスブルー(i.v.)にてKOマウスとWild typeの硬膜血漿漏出量を比較検討した。(結果と考察)アロデニア(本来痛みを引き起こさない触覚刺激によって発生する痛み)は感覚性神経細胞体の大きさの変化が報告されている。今回の結果ではKOマウスは大型細胞の比率が低く中・小型の細胞数が高かった。疼痛モデル動物の神経細胞の大きさに変化があることはいくつかの報告がある。この結果はKOマウスの神経伝達メカニズムが変化してる可能性を示唆する。

またSP陽性細胞数と血漿漏出量についてはKOマウスがwild typeより高い結果となった。以上の事からGABAB受容体の欠損は従来の正常な神経細胞の感覚伝導の役割を変異させ過剰なSP産生を抑えきれず神経性炎症を引き起こす可能性があることが示唆された。
フラックス法による窒化ガリウム単結晶の育成

GaNのバルク単結晶をNa-Ga融液の出発組成γ_<N_a>(Na/(Ga+Na)モル比)を変化させ、700850°C、窒素圧力15MPaの条件で作製し、得られた単結晶の特性を評価した。750°C、窒素圧5MPa、γ_<N_a>=0.60、360時間の条件で約10.0×5.0×0.1mm^3の六角板状の無色透明の結晶が得られたが、多数のステップエッジやヒルロックが底面に存在した。800°C、N_2圧力3MPa、γ_<N_a>=0.60、250時間の条件で1.0×0.5×0.5mm^3を越える大きさのプリズム状単結晶が得られた。また、750°C、N_2圧力5MPa、γ_<N_a>=0.54、450時間の条件においても、1.0×0.5×0.5mm^3サイズのプリズム状単結晶を合成することができた。上述したように,温度と圧力条件を低温で高圧側から高温で低圧側にシフトさせるにつれて、GaN単結晶の形態は板状からプリズム状に変化する傾向があることが判明した。また、出発融液Na-Ga組成におけるNaの割合を減少させても、結晶形態は板状からプリズム状に変化する傾向があり、本研究において、GaNバルク単結晶の形態を育成条件で制御することを見出した。(0004)面で測定したX線ロッキングカーブの半値幅は1mmサイズの板状結晶で25arcsec、5mmサイズの板状結晶で32arcsecであった。van der Pauw法により1mmサイズの板状結晶のホール効果を測定した結果、この結晶のキャリア濃度が1-2×10^<18>cm^<-3>、移動度が100cm^2V^<-1>s^<-1>のn型半導体であった。無色透明のプリズム状単結晶について、室温でカソードルミネッセンススペクトルの測定を行った。バンド端付近からの発光が365nm(3.40eV)で観察され、この発光以外のピークはみられなかった。これらの測定結果から、本研究で作製したGaN単結晶の品質が高いことがわかった。本研究成果を基にして、15mm大の板状単結晶作成の条件を見出すとともに、種結晶育成の最適条件探索が今後の課題である。GaNのバルク単結晶をNa-Ga融液を用いることにより、700850°C、窒素圧力15MPaの条件下で作製し、得られた単結晶の特性を評価した。出発原料の調整に際しては、本科研費で購入した高純度Ar雰囲気のグローブボックス内において、金属Ga18mmolと金属Na1836mmolを秤量し、BNルツボに入れ、これをSUS316ステンレスチューブ内に封入し、電気炉を用いて所定の温度まで加熱後、窒素ガスを導入した。

単結晶育成は、700850°C、窒素圧力15MPa、200450時間の実験条件で行った。温度、圧力条件およびNa-Ga融液の出発組成γ_<Na>(Na/(Ga+Na)モル比)を変化させて合成したGaN単結晶の形態を観察した結果、5×3×0.1mm^3の無色透明な六角板状単結晶が、750°C、窒素圧力5MPa、γ_<Na>=0.6の条件で成長した。一方、窒素圧力3MPaで800°Cでは、1×0.5×0.5mm^3を越える大きさの無色透明なプリズム状単結晶が得られた。また、750°C、窒素圧力5MPaでγ_<Na>=0.54の条件においても1×0.5×0.5mm^3のプリズム状単結晶を合成することができた。温度と圧力条件を低温、高圧から高温、低圧ヘシフトさせるにつれてGaN単結晶の形態は板状からプリズム状に変化する傾向にあることが判明した。また、出発融液におけるNaの割合を減少させても板状からプリズム状に変化することがわかった。得られた板状単結晶の0004面で測定したX線ロッキングカーブの半価幅は25arcsecで、この結晶の2θ角からc軸長を算出すると5.1877Åであった。この結晶はキャリア濃度が約2×10^<18>cm^<-3>、移動度が100cm^2V^<-1>s^<-1>のn型半導体で発光端近傍のバンドギャップは3.4eVであり、本実験で得られたGaN単結晶の品質は高いことがわかった。今後は、本研究で得られた実験条件を基にして、5mmサイズ以上の板状とプリズム状単結晶作製条件を探索し、得られた結晶の評価を行う予定である。GaNのバルク単結晶をNa-Ga融液を用いることにより、700850°C、窒素圧力15MPaの条件下で作製し、得られた単結晶の特性を評価した。出発原料の調整に際しては、本研究費(平成12年度)で購入した高純度Ar雰囲気のグローブボックス内において、金属GaとNaを秤量し、BNルツボに入れ、これをSUS316ステンレスチューブ内に封入し、電気炉を用いて所定の温度まで加熱後、窒素ガスを導入した。単結晶育成は、700850°C、窒素圧力15MPa、200450時間の実験を行なった。光学実体顕微鏡と走査型電子顕微鏡を用いて結晶形態を観察し、MoKα線により単結晶X線回折強度を測定した。X線回折強度に対して解析的形状吸収補正を行い、X線異常分散を利用して絶対構造を決定した。温度、圧力条件およびNa-Ga融液の出発組成γNa(Na/(Na+Ga)モル比)を変化させて合成したGaNバルク単結晶の形態を観察した結果、10×5×0.1mm^3の無色透明な六角板状単結晶が、750°C、窒素圧力5MPa、γNa=0.6の条件で成長した。六角板状単結晶の板面の片方は平滑な鏡面となっているが、その裏面上には多数のステップエッジやヒルロックの存在が観察された。板状単結晶についてX線回折強度を測定し、形状吸収補正後のデータを用いて構造解析を行なった。信頼度因子(RI)は約2%、フラックパラメータはほぼ0となり、絶対構造が適切に決定された。その結果、平滑な鏡面が(0001)で表されるN面であり、スクテップエッジやヒルロックの見られる凹凸面が(0001)で表されるGa面であることが判明した。今後は、本研究で得られた成果を基にして、10mm以上の板状単結晶作製条件を探索し、GaN単結晶成長機構の解明と異種元素ドーピングによるP型単結晶育成を試み、得られた単結晶について半導体光学評価を行なう予定である。出発原料の調整に際しては、本研究費(平成12年度)で購入した高純度Arガス雰囲気グローブボックス内において、金属GaとNaを秤量し、BNルツボに入れ、これをSUS316チューブ内に封入し、電気炉を用いて所定の温度まで加熱後、N_2ガスを導入した。単結晶育成は、700850°C、N_2ガス圧力15MPa、200450時間の実験を行なった。結晶形態は育成条件によって変化し、低温、高N_2圧力条件になるにつれてプリズム状結晶から板状結晶になることが判明した。
亜鉛原子を含む特異なフェレドキシンの構造と機能に関する研究

古細菌のフェレドキシンはエネルギー代謝において重要な役割を担う。我々はpH3,75°Cを生育至適条件とする好酸好熱性古細菌Sulfolobusのフェレドキシンを単離精製し、29位リジンのモノメチル化を確認し、分光学的解析から、2個のクラスター([3Fe-4S][4Fe-4S])の役割を推定した。また、X線結晶構造解析を完成した。本フェレドキシンは1原子の亜鉛を、N末端側37残基の構造するドメインの中の3残基のヒスチジンと、鉄硫黄クラスターを保持する66残基のコア・ドメインのアスパラギン酸とによって保持していることを発見した。これと平行して、遺伝子の単離・構造決定を行い、発現系を確立した。本フェレドキシンの特異な亜鉛原子の役割を調べる目的で、天然フェレドキシン、組換えフェレドキシン、さらにN末端側37残基の一部ないし全部を欠失した変異型フェレドキシンを作成し比較した。すなわちN末端から順に0,11,16,22,37残基を欠失したものをG1,V12,S17,G23,V38と名づけた。すべての組換え体は2個の鉄硫黄クラスターを含み29位リジンはメチル化されていなかった。蛋白1モル当たりの亜鉛含量はG1,V12では1、S17,G23,V38では0原子であった。クラスターの変性温度Tmは、G1と天然フェレドキシンでは100°C以上であるのに対し、V12では約98°C、S17とG23では約89°C、V38では約83°Cであった。以上の結果から、本フェレドキシンのクラスターの熱安定性にとって、亜鉛およびN末端37残基の配列は極めて重要な役割を担っていると結論した。
深海生底生有孔虫類の地理的分布と生物多様性

有孔虫の多様性に関する統合的な見方を得るために、最新の遺伝子解析技術であるイルミナ(Illumina)massive sequencingを用いて、環境サンプル(堆積物)からDNAとRNAを抽出した。塩基配列のうち、SSU rDNAの中で、37/fに注目して解析を行った。a)massive sequencing手法による環境サンプル中の有孔虫の多様性:世界の5つの海域から得られた堆積物試料についてmassive sequencingを行い、50万通りの異なったDNA遺伝子断片を得、1643OTUs(Operational Taxonomic Units)に区分できた。OTUsの半分は上科のレベルで同定することができ、それらの大半は早い時期に分化した軟質殻有孔虫グループであった。同様の手法を用いて、マリアナ海溝チャレンジャー海淵の堆積物の93の試料のDNAおよびRNAについて3500万の遺伝子断片を得た。30--40cmの深さの試料からも、非常に多くのOTUsグループが得られた。この事実は、DNA断片は生物そのものが死んだ後も「長時間、堆積物中で保存される」という考え方を支持している。b)小笠原海溝域のゼノフィオフォアXenophyophoresの分類と生態系における役割:小笠原海溝域から採取した3個体のゼノフィオフォアの形態は平行あるいは互いに組み合った小板の集合から形成されており、類似した形態的な特徴を持っていた。これらは、いずれもステルコマータというペレットを内包するチューブが殻内にある細胞質に分布する。分子分類と形態分類から、これらの3つの形態的に類似したゼノフィオフォアはいずれもおなじ属に所属する。このグループをタイプとする新属を提唱する。ゼノフィオフォアの軟体部にはステルコマータが分布し、そこにはPb210などの重金属濃度が高い。このグループは、重金属を濃集する性質を持つことが示唆される。底生有孔虫類は深海のバイオマスの50%近くを占めており、深海の物質循環において大きな役割を果たしている。このことは、深海に生息する底生有孔虫の個体群や多様性の時空間変動は、物質循環に影響を与える可能性があることを示している。しかし、深海生有孔の多様性とその時空間変動についてはいまだに情報が少ない。本研究では、深海生底生有孔虫の多様性変動について、1.Massive Sequencing手法を用いて堆積物中の環境遺伝子解析を行い、集団としての深海生有孔虫の遺伝子多様性を検討する。2.時系列サンプルを用いたデータ解析を行い、遺伝子多様性の時系列変動を明らかにし、それと環境変動との相関を議論する。3.代表的な種について種レベルでの変異を明らかにし、集団としての有孔虫の多様性との相違を検討する。平成22年度は、マリアナ海溝チャレンジャー海淵から世界最深部に生息する原始的な有孔虫を採集し、メタゲノム解析と種レベルの伝統的な遺伝子解析を行うべく、資料処理をおこなった。また、相模湾深海の有孔虫についても分析を試みている。試料処理にあたっては、DNAのみならず、RNAの検出を試みることにした。検出は、MOBIO PowerMax Soil DNA extraction kitおよびRNA kitsを用い、DNAは18Sおよびpartial COI領域の増幅を試みた。全球的なメイオベントスの解析には、8bp MIDでタギングをおこない、ロシュ454次世代シーケンサーを用いて解析を行った。シーケンスデータは、バイオインフォーマティックスデータベースを用いて、断片の同定を行った。平成23年度は、小笠原沖の深海平原に生息する原始的な有孔虫Xenophyophoreを採集し、massive sequencingと種レベルの伝統的な遺伝子解析を行うべく、資料処理をおこなった。平成22年度に依頼した遺伝子解析結果は平易な遺伝子断片については同定ができたものの、機能領域あるいは種ごとの性質を明らかにするには至らなかった。平成23年度に開始したXenophyophoreの解析は、遺伝子解析は海溝サンプルの処理と同様な方法をとった。Xenophyophoreは細胞内にステルコマータという、食べ残しの難分解性有機物が存在するが、そこに重金属が濃集することが知られており、それの同定と分布様式を確認するために、分析透過電子顕微鏡、および走査型電子顕微鏡を用いた。a)massive sequencing手法による環境

サンプル中の有孔虫の多様性:世界の5つの海域から得られた堆積物試料についてmassive sequencingを行い、50万通りの異なったDNA遺伝子断片を得、1643OTUs(Operational Taxonomic Units)に区分できた。OTUsの半分は上科のレベルで同定することができ、それらの大半は早い時期に分化した軟質殻有孔虫グループであった。同様の手法を用いて、マリアナ海溝チャレンジャー海淵の堆積物の93の試料のDNAおよびRNAについて3500万の遺伝子断片を得た。30--40cmの深さの試料からも、非常に多くのOTUsグループが得られた。この事実は、DNA断片は生物そのものが死んだ後も「長時間、堆積物中で保存される」という考え方を支持している。b)小笠原海溝域のゼノフィオフォアXenophyophoresの分類と生態系における役割:小笠原海溝域から採取した3個体のゼノフィオフォアの形態は平行あるいは互いに組み合った小板の集合から形成されており、類似した形態的な特徴を持っていた。これらは、いずれもステルコマータというペレットを内包するチューブが殻内にある細胞質に分布する。分子分類と形態分類から、これらの3つの形態的に類似したゼノフィオフォアはいずれもおなじ属に所属する。このグループをタイプとする新属を提唱する。ゼノフィオフォアの軟体部にはステルコマータが分布し、そこにはPb210などの重金属濃度が高い。このグループは、重金属を濃集する性質を持つことが示唆される。当初の計画通り、massive sequencing techniqueを用いて、深海有孔虫の遺伝子多様性解析を行い、特徴を把握する。
モリブデンおよび銅からなる集積型一酸化炭素酸化酵素機能モデルに関する研究

金属酵素の反応を範とする新たな触媒機能の開拓を目指した有機-無機ハイブリッド型触媒系の展開を行う。より具体的には、一酸化炭素を二酸化炭素に酸化するCOデハイドロゲナーゼの機能モデルとなり得るモリブデンと銅の混合金属錯体を用いた触媒系の構築を目的とする。本研究では2核モリブデンクラスターと銅を組み合わせた混合金属錯体の構築法としてホスフィン配位子を有するモリブデンクラスターをメタロリガンドとした単核銅錯体との錯体形成反応を行った。2核モリブデンクラスター錯体に用いる配位子としては、リン・窒素・酸素を有する多座配位子を用い、窒素・酸素部位が2核錯体に配位することでリン周りが多金属に配位可能なメタロリガンドの合成に成功した。また、得られたモリブデンクラスター錯体と銅イオンの反応により、二つのモリブデン、および、一つの銅からなる混合異種金属クラスター分子の合成に成功した。モリブデン・銅3核錯体の反応性として銅イオン周りの配位子置換反応の検討を行い、導入する配位子、また、用いる溶媒によって3核錯体の構造が大きく変化し、メタロリガンド部位がシス型とトランス型のそれぞれをとりうることが明らかとなった。それぞれの構造はX線結晶構造解析により同定し、二つのモリブデン原子、また、一つの銅原子が直線状に並んだ構造であることを見出した。さらに、一酸化炭素との反応を行い、一酸化炭素の配位を確認するとともに、酸化剤を加えることで一酸化炭素から二酸化炭素への酸化反応に関する検討を行った。本研究ではモリブデンと銅を組み合わせた混合金属錯体の構築法としてジチオレン部位でモリブデンと配位し、カルボキシレート部位で銅と配位する構造体構築法を想定して、分子内にジチオレン、カルボキシラートの両方を有するハイブリッド配位子の合成を行っている。ジチオレン配位子を有するモリブデン錯体は金属酵素のモデル系として広く研究されており、その機能を銅-カルボキシラートクラスターへ取り込むことで、金属酵素類似機能を有するクラスター反応場という、これまでに無い新しい触媒系を構築することができる。現在のところ、ジチオレン配位子へのカルボン酸部位の導入方法を種々検討した結果、ベンゼンジチオエーテルのヨウ素化とそれに続く芳香族カルボン酸エステルのホウ素化合物との鈴木カップリング反応によリ、チオエーテルとエステルの二つの官能基を有する配位子前駆体を合成し、さらに、エステル部位とチオエーテル部分の加水分解によってジチオレンとカルボン酸の両方の部位を有する配位子のアルカリ金属塩の合成に成功した。現在、合成した配位子のジチオレン部位へのモリブデンの導入方法に関して検討を行っている。一酸化炭素を二酸化炭素に酸化する金属酵素にはモリブデンと銅という異なる金属が働く反応場が存在している。本研究ではモリブデンからなる2核コアに他の金属への配位部位を導入したモリブデン含有メタロリガンドを合成し、さらにそこへ銅をはじめとする第一遷移周期の金属を導入することで異種金属を含有する反応場の構築を行う。具体的には、異種金属への配位が可能な3座配位子として、配位元素に酸素・窒素・リンを有するモノアニオン性配位子であるpyphos配位子を用いてモリブデン2核錯体の合成を行い、残るリン部位を他の元素(銅など)への配位に用いる。こうして得られる異種金属含有錯体は中心のモリブデン2核コア部位に多くの電子が存在するため、触媒反応をする際の活性中心となる銅の電子的環境を非常に柔軟にコントロールすることが可能であり、異種金属間の電子的複合効果を利用したこれまでにない新しい触媒系を構築することができる。現在のところ、モリブデン2核、銅2核からなる異種金属錯体の合成に成功しており、触媒反応への利用を検討し始めているところである。また、反応中心である銅の電子的柔軟性を増す目的で、酸化還元活性な配位子と銅イオンとを組み合わせた錯体の合成を行っており、実際に一酸化炭素雰囲気にさらすことで銅に一酸化炭素が配位したと考えられる錯体を確認し、さらに酸化剤との反応に研究を展開しているところである。このように、金属酵素の活性部位に複数の金属が、また、反応を行う上で異なる金属が働いている点に注目し、温和な条件下における一酸化炭素酸化触媒の合成に取り組んでいる。

モリブデン・銅3核錯体の反応性として銅イオン周りの配位子置換反応の検討を行い、導入する配位子、また、用いる溶媒によって3核錯体の構造が大きく変化し、メタロリガンド部位がシス型とトランス型のそれぞれをとりうることが明らかとなった。それぞれの構造はX線結晶構造解析により同定し、二つのモリブデン原子、また、一つの銅原子が直線状に並んだ構造であることを見出した。さらに、一酸化炭素との反応を行い、一酸化炭素の配位を確認するとともに、酸化剤を加えることで一酸化炭素から二酸化炭素への酸化反応に関する検討を行った。
微小管端ダイナミクスとナノレベルの構造からみた陸上植物の微小管形成機構の進化

動物は微小管形成の制御装置として中心体を持つが、植物は中心体なしで微小管形成を行っている。本研究では、微小管の重合開始に必要なγチューブリン分子とγチューブリンが作る微小管端のキャップ構造に注目して、植物特有の微小管形成システムは何かを調べた。その結果、被子植物ではキャップ構造が不安定なことが示唆できた。また、コケ・シダ・裸子植物で保存され、被子植物で変化するγチューブリン分子表面に存在する十数個のアミノ酸が見つかった。キャップ構造の安定性とγチューブリン構造の変化との関係は今後の課題となった。動物は中心体を持つのに、なぜ植物は中心体を持たないのか?この古典的な細胞学の問題は未に解決していない。中心体は中心粒とその周りの物質から構成される細胞内構造で、中心粒周辺にγチューブリンを含む数種類の分子で構成される微小管形成の種になる構造(γチューブリンリング複合体)が多数存在し、微小管形成中心(MTOC)として機能する。植物でもγチューブリンが存在し、MTOCとして機能していると考えられるが、植物のMTOCは分散して分布する。本研究では、微小管の両端に存在しそのダイナミクスを制御しているナノマシンが陸上植物の進化の過程でどの様に変わって行ったかを、加圧凍結・電子線トモグラフィー法を使ったナノレベルの構造解析と、本申請で導入する蛍光プローブを使ったライブイメージング法を使い解析し、"なぜ陸上植物は中心体なしの微小管形成システムを構築するようになったのか"という疑問に解答することを目的としている。本年度は、ライブイメージングのための顕微鏡装置構築の準備として、共焦点レーザー顕微鏡を購入し、共焦点による観察とライブイメージングを組み合わせ可能な光学システムの構築のためのカメラ、フィルター等の検討を行った。一方、タマネギを使った加圧凍結・電子線トモグラフィー法によるナノレベルの構造解析の結果、γチューブリンリング複合体と思われる微小管端がキャップされているものは、間期表層微小管で10%弱、分裂準備帯ではほとんどなく、大部分の微小管端は開裂端であった。これは、植物微小管は両端で重合・脱重合しながら移動するという考えと一致していた。また、γチューブリンリング複合体が陸上植物でどのように変化していったか考える第一歩として、中心体を持つ最も高等な植物である裸子植物イチョウのγチューブリン遺伝子の解析も開始した。中心体は中心粒とその周りの物質から構成される細胞内構造で、中心粒周辺にガンマチューブリンを含む数種類の分子で構成される微小管形成の種になる構造(ガンマチューブリンリング複合体)が多数存在し、微小管形成中心(MTOC)として機能する。植物でもガンマチューブリンが存在し、MTOCとして機能していると考えられるが、植物のMTOCは分散して分布する。本年度は、共焦点レーザー顕微鏡とTIRF光学系システムを使って微小管のダイナミクスを観察するシステムを構築し、昨年タマネギを使った加圧凍結・電子線トモグラフィー法で見つけた、間期表層微小管の重合開始状態とライブイメージングでの観察結果を比較することを試みた。現在、高倍観察によるフォーカスのずれの対策がうまくいっておらず、来年度の課題として残った。一方、ガンマチューブリンリング複合体が陸上植物でどのように変化していったか考える第一歩として、中心体を持つ最も高等な植物である裸子植物イチョウのガンマチューブリン遺伝子を解析し、イチョウのガンマチューブリンでは被子植物とコケ・シダ植物で異なっている15個のアミノ酸部位の大部分がコケ・シダ型であることが判明した。この意義について今後検討が必要である。中心体は中心粒とその周りの物質から構成される細胞内構造で、中心粒周辺にガンマテユーブリンを含む数種類の分子で構成される微小管形成の種になる構造(ガンマチユーブリンリング複合体)が多数存在し、微小管形成中心(MTOC)として機能する。

本研究では、微小管の両端に存在しそのダイナミクスを制御しているナノマシンが陸上植物の進化の過程でどの様に変わって行ったかを、加圧凍結・電子線トモグラフィー法を使ったナノレベルの構造解析と、本申請で導入する蛍光プローブを使ったライブイメージング法を使い解析し、"なぜ陸上植物は中心体なしの微小管形成システムを構築するようになったのか"という疑問に解答することを目的としている。微小管のダイナミクスを観察する月的で、昨年度までに導入した共焦点レーザー顕微鏡とTIRF光学系システムを一つのソフトで制御するシステムの構築を試み、個々の制御、解析ソフトの試運転を行った。一方、昨年度、中心体を持つ最も高等な植物である裸子植物イチョウのガンマチューブリン遺伝子を解析し、イチョウのガンマチュースリンでは被子植物とコケ・シダ植物で異なっている15個のアミノ酸部位の大部分がコケ・シダ型であることを明らかにした。そこで、中心体を持たない裸子植物ではどうか調べるため、ヒノキのガンマチューブリンを解析し、目的の15個のアミノ酸がどうなっているか調べた結果、イチョウと同様にシダ・コケ型に近かった。現在これら陸上植物のガンマチューブリンの機能を比較する方法を検討中である。動物は中心体を持つのに、なぜ植物は中心体を持たないのか?この古典的な細胞学の問題は未に解決していない。動物の中心体には、微小管形成の種になる構造(γチューブリンリング複合体)が存在し、微小管形成中心(MTOC)として機能する。植物でもγチューブリンがMTOCとして機能していると考えられるが、植物は中心体がなく、MTOCは分散している。本研究では、電子線トモグラフィー法とライブイメージング法での微小管ダイナミクスの解析と、微小管形成中心に存在する重要なタンパク質のひとつであるγチューブリンの構造解析を行い、“なぜ陸上植物は中心体なしの微小管形成システムを構築するようになったのか"という疑問を解明することを目標に研究を行った。陸上植物、特に、進化の過程で中心体が消失する時期に当たる裸子植物に注目して、γチューブリンの構造変化が陸上植物の微小管構築システムの変遷と関連あるのかどうか調べた結果、中心体のない植物(ヒノキ、マオウ)も中心体のある植物(イチョウ、ソテツ)も、γチューブリンのアミノ酸配列ではともに被子植物よりもシダ・コケ植物に近いことが分かった。一方、分裂酵母のγチューブリン遺伝子を高等植物シロイヌナズナのγチューブリン遺伝子と入れ換えた形質転換分裂酵母を作製すると、温度条件によってその生育速度と形態以上が異なってくるため、高等植物のγチューブリンは完全には分裂酵母のγチューブリンの機能を相補することができないことが分かっている。そこで、この手法を用いて、裸子植物イチョウと緑藻のシャジクモのγチューブリンが分裂酵母のγチューブリンの機能を相補できるかどうか調べた。その結果、分裂酵母のγチューブリン機能の一部が一部、陸上植物の進化の過程で徐々に失われて来たことが分かった。これと、陸上植物の微小管端の構造変化については現在解析中である。
自閉症スペクトラムを併せ持つ聴覚障害児の言語的特徴と支援方法の検討に関する研究

聴覚障害に自閉症スペクトラムを併せ有する児童の言語的特徴を明らかにし、継続的介入を行うことで効果的な指導方法を検討した。抽出事例は非言語性知能は正常範囲内であったが、全体的な言語発達の遅れに加え、感情や状況の理解が難しい、語用論の誤り、注意・集中の課題等の特徴が指摘された。各自の言語及び認知発達を評価した上で、ヘルプブックや表情イラスト等の補助教材、パターンを活用した会話練習、動画によるSSTによる指導では一定の効果が見られた。一方、文法や語用論の学習には難しさも見られ、正しい日本語だけでない広義でのコミュニケーション力を伸ばすとともに、周囲がその特徴を理解していくことも必要であると考える。本研究では自閉症スペクトラムを併せ持つ聴覚障害児の言語的特徴を分析し、効果的な指導方法について検討した。26年度は2事例について取り上げ、1年間の継続指導を行った。1事例目a児はろう学校5年生男児であり、自閉症スペクトラムの診断がある。主たるコミュニケーション手段は身振りを含んだ手話である。WISC-3ではVIQ61に対しPIQ99と正常範囲であり、知覚統合107と視覚優位であった。知的な遅れはないものの言語を介したコミュニケーションに課題があり、こだわりや興味の偏りもあるため、ルールを守れる一方、集中すると途中で止められない様子もあった。PVT-R、J.COSS、日常の行動観察からコミュニケーションの前提となるソーシャルスキル、注意記憶を向上させること、ことばのイメージを豊かにしながら語彙を増やすことを指導目標とした。b児もろう学校5年生男児であり、自閉症スペクトラムの診断を持つ。コミュニケーション手段は手話であるが、年度中に人工内耳埋め込み手術を行い、現在リハビリ中であり予後は順調である。WISC-3ではVIQ79、PIQ83で注意記憶、処理速度は100を超えていた。PVT-R、J.COSS、日常の行動観察から語彙のイメージを豊かにすること、一問一答形式の会話になりがちであることから、5W1Hを意識して会話のキャッチボールを行えるようにすることを指導目標とした。また、併せて個別指導とともに、集団遊び活動も行った。2人は共に集団遊び自体にはスムーズに参加できるものの、自分の意見を言えなかったり逆に無理に意見を通そうとしたりするといった様子が見られた。そこでリーダーシップを発揮しながらチームで楽しむことができるように支援した。本研究では、自閉症スペクトラムを併せ有する聴覚障害児の言語的特徴を分析し、効果的な指導方法を検討した。27年度は26年度から継続して同様の2事例について継続的介入を行った。ろう学校6年生となったa児には、文法的な正しさを求めると他者へ働きかける意欲を失う様子や、様々な状況下、手話の通じる人がいない環境であっても問題解決を図ろうとしてほしいという保護者の願いがあった。そこで文法的に正しい日本語でないとしても、補助的な手段を用いながら状況に合わせたコミュニケーションを自ら図ろうとすることをねらいとした。生活の中で想定される困難場面を設定し、「誰に」「どのように」助けを求めるのかをロールプレイ等で確認し、ヘルプブックを作成していった。a児もイラストを自ら書いたり、単語の羅列であっても筆談をしたりと積極的に関わろうとするようになっていった。生活場面での般化も見られた。同じく6年生のb児は、昨年度までの指導で定型文を活用した会話はスムーズになっていた。一方で自分の気持ちの表現、相手の気持ちの理解が不十分で、友達との関係がスムーズにいかない様子が見られた。気持ちを表す語彙自体が習得、整理されておらず、ASD特有の困難さがことばの獲得に特徴的な偏りを生じさせている事が示唆された。そこで気持ちを表す語彙の拡充、それを用いたSSTを行った。ターゲット語をテーマとしたロールプレイをあらかじめ録画しておき、タブレットを用いて見せた。当初は実際にロールプレイを見せていたが、画面上の方がより適切な状況で演じられること、注目させたい場面で止めたり、拡大したりできること、情報が限られて集中しやすいことなどからタブレットの活用の方が有効であった。今まであいまいな理解であった語彙についても整理することができ、特に自分の気持ちの表現が豊かになり、ストレスを溜めてしまい突如暴れてしまうようなことはなくなった。26年度に引き続き、2事例について継続的な介入ができ、効果的な介入方法について検討することができた。a児については、保護者との相談の元、文法的な正しさに拘らない、より広義での言語コミュニケーションについて検討することができた。聴覚障害児教育において書き言葉の習得は非常に重要な課題であるが、対人関係の困難さを示すASDを併せ持つ彼らに対しては、まず相手とコミュニケーションを取ろうとする積極的な意欲を育てること、また本人が使うことのできる補助的な手段を有効活用することが効果的であったと考える。a児は生活の中でも自ら指導の中で作成したヘルプブック(イラストやホワイトボードをまとめたもの)を使おうとする場面が認められ、行動の般化も見られた点が有意義であった。b児については、自ら手話表現があり、理解しているように見えた「感情を表す言葉」について取り上げた。丁寧に確認すると理解がずれていたり、曖昧であったものも多く、他者との相互理解が十分に成立していなかったことが分かった。

感情語を代表とする抽象語については、聴覚障害児が苦手とすることはこれまでも指摘されているところであるが、心情理解に苦手さを示すASDを併せ持つ場合、それがさらに顕著となることが示された。また、指導の際に単なるロールプレイを使うのではなく、あらかじめ録画したものをタブレットで見せることも効果的な指導方法であった。情報の取捨選択や注意の焦点化に困難のあるものについてはICT機器の活用も効果的であるかもしれない。指導後には介入前に見られた、突然ストレスを爆発させるような行動はほとんどなくなった。代わりに自分の気持ちをb児なりに相手に伝えようとしたり、帰宅後保護者に話をすることでストレス回避をしている様子が見られるようになった。以上の成果より、おおむね順調に研究が進捗していると考える。28年度は3名のASD児について取り上げた。なお、2627年度に報告した児童(a児、b児)とは異なる事例である。ここでは特にろう学校5年生に在籍するc児について報告する。c児は高度中等度難聴があり両耳補聴器装用、言語聴取に困難があるため手話等の視覚的手段が必要であるが、本人からの表出は主に音声に手話を併せたものが多い。WISC-4の言語理解では72と低下が見られるが、会話には積極的であり状況が伴えば短く簡単な文でコミュニケーションが成立する。PARSでは16点で強い自閉傾向が示された。人と関わることは好きであるが、関わり方が一方的になってしまったり、注意の焦点がずれたり、持続が難しい面もある。ASDを併せ有するc児が「語用・談話」にどのような言語的特徴があるのかを明らかにしつつ、有効な支援方法を検討した。方法としては状況絵を用いての一人語り、支援者との会話形式での語りを行った。結果、「語用・談話」の特徴として、部分的エピソードのみに注目していること、動作主に関する説明が不明確であること、事実のみを説明すること、人物の心的状況への言及が少ないこと、順を追って説明したり、情報の取捨選択が困難であることが挙げられた。年間を通した指導の中で明確な成績の向上は難しかったが、事実のみの羅列が占める割合は減少し、表情イラストを用いることで感情に関する発言が適切になっていく傾向が見られた。「語用・談話」の基となる語彙や文法にも弱さがあること、すでに小学部6年生であり、本人なりに積み重ねてきた手段があることなどから1年間の継続的介入の中では明確な成績向上にまで至ることはできなかったが、これまで周囲が感じてきた「伝わりにくさ」を分析できたことは大きな結果であった。今後、c児の言語力を伸ばしていくと同時に、周囲がc児の言語的特徴について共通理解を持ち、対応していくことが必要であると考える。聴覚障害に自閉症スペクトラムを併せ有する児童の言語的特徴を明らかにし、継続的介入を行うことで効果的な指導方法を検討した。抽出事例は非言語性知能は正常範囲内であったが、全体的な言語発達の遅れに加え、感情や状況の理解が難しい、語用論の誤り、注意・集中の課題等の特徴が指摘された。各自の言語及び認知発達を評価した上で、ヘルプブックや表情イラスト等の補助教材、パターンを活用した会話練習、動画によるSSTによる指導では一定の効果が見られた。
歯の移動時の歯槽骨変化に与えるセルサイクルファクターの影響に関する研究

歯科矯正治療は、(1)圧迫側における破骨細胞による骨吸収、(2)牽引側における骨芽細胞による骨形成、この両者のバランスを制御することで成立している。したがって、これらの制御メカニズムを解明することは、歯科矯正学の究極目標である、安全で効率良い歯の移動を実現する一助となる。ところで、骨吸収を担う破骨細胞と骨形成を担う骨芽細胞の分化あるいは、その機能制御機構を包括的に説明しうる候補因子のひとつとして、セルサイクルファクターが想定される。そこで、本研究では、歯科矯正力が作用した部位での骨芽細胞・破骨細胞におけるG1期で機能するセルサイクルファクターの発現変動パターンの検討、ならびにそれらを利用した新規歯科矯正治療法開発のための基礎的検討を行った。今年度は、主に、歯の移動実験モデルの確立を試みた。当初は(1)生後8週齢のマウス上顎左側第一臼歯(M1)と第二臼歯(M2)間にWaldo法に準じてゴム片を挿入し、相反的な歯の移動を行なう方法を試行したが、この方法によって発生する力は、本来の歯科矯正力とは異なる可能性が高いことが推察されたため、(2)生後8週齢のマウス上顎切歯を固定源とし、クローズドコイルスプリングにより、M1を近心に移動させる方法により解析することとした。現在安定的な実験結果を得るための実験動物モデルの確立を目指している。また、矯正力を作用させていない生理的状態でのセルサイクルファクターの発現およびその局在の変化を、マウスを用いて観察した。検討項目としては、細胞分化の起こるG1期に機能するセルサイクルファクター(Cdk2、Cdk4、Cdk6、サイクリンA、サイクリンD1、サイクリンD2、サイクリンD3、サイクリンEなど)を検討し、遺伝子発現量はReal time RT-PCR法で、タンパク発現量はWestern blotで評価した。(769字)歯科矯正治療は、(1)圧迫側における破骨細胞による骨吸収、(2)牽引側における骨芽細胞による骨形成、この両者のバランスを制御することで成立している。(769字)
導電性高分子強誘電性液晶の作製と電子・光物性および新機能性発現の研究

導電性高分子強誘電性液晶の実現手法のうち、スメクチックC液晶性導電性高分子にカイラルドーパントを添加することによって強誘電性を発現せしめる方法を採用し、スメクチックC相を呈する導電性高分子の分子設計および合成と、光異性化や大きな非線形光学効果の発現が期待できるように機能性を付与したカイラルドーパントの合成および機能性に関する研究を主として進めた。置換ポリパラフェニレンのモノマーとして、スメクチックC相が発現しやすいと考えられる末端にアルコキシ基を有するビフェニル-フェニル-エステルをコア構造として含むメソゲン基を導入した化合物を合成し、等方相-カイラルネマチック相-スメクチックC相の発現とこの相系列に特徴的な二種類のドメイン構造を持つbroken fan textureを確認した。さらに、この液晶にカイラルドーパントを数%添加することによりカイラルスメクチックC相(強誘電相)の発現を確認した。一方、機能性カイラルドーパントとしては、末端にニトロ基とカイラル側鎖を含むアゾベンゼンを採用し、その光異性化による光吸収スペクトルの変化を溶液状態、液晶状態で確認した。さらに、スメクチックCホスト液晶との混合時における光異性化による自発分極への影響を調べ、光異性化により自発分極の大きさが変化することを確認し、誘起される自発分極の大きさに対してはカイラルドーパント内の永久双極子、コア、不斉炭素の相対的位置が極めて重要であることが明らかとした。
抗体の分子認識を契機とする補体系の活性化を活写する

抗体が標的細胞の膜表面に集合すると、それを皮切りに補体系が活性化され、最終的に細胞膜を侵襲し破壊する。免疫学の教科書には必ず記載されているこのスキームも、その一連の過程の分子科学的実体は驚くほど明らかとなっていない。その理由として、補体活性化カスケードが膜を舞台として分子が不均一に集合した状態で起こり、かつ各因子が過渡的に複合体を形成する不安定でダイナミックな性質を持つため、一連の過程を観測することが困難であることが挙げられる。本研究では、この過程を明らかにするためには、超分子計測のための試料と手法のそれぞれを工夫することで、抗体による抗原の認識を契機として異物を排除するに至る分子集団の振る舞いを活写することを目指した。今年度は抗原を含む脂質膜上での免疫グロブリンG(IgG)の6量体リング構造形成のメカニズム解明に取り組んだ。高速原子間力顕微鏡を用い、マウス抗体やキメラ抗体、還元アルキル化抗体など様々な抗体での6量体の形成率を求めた。また、抗体に対して特異的に結合する分子を用いて6量体形成の阻害を試みた。その結果、抗体のヒンジ領域がもたらすIgGの柔軟性が6量体の形成に影響を及ぼすことが明らかとなった。また、抗体のFc領域と相互作用するプロテインAを添加することで6量体の形成が阻害されたことから、リング形成にはFc領域が関わっていることも示された。一方、NMR計測においてはガングリオシドGM1などの抗原と抗体の相互作用解析を行い、抗原のエピトープを決定した。さらにIgGの柔軟性な構造についての理解を深めるべく、MDシミュレーションに着手した。MDシミュレーションによって得られた構造空間を実験計測によって裏付けるため、量子ビーム溶液散乱を行なった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。抗体が標的細胞表面の抗原と結合して膜表面上に集積すると、補体系が活性化して、最終的に膜に孔をあけて破壊する。本研究では、この一連の過程について高速原子間力顕微鏡(AFM)を利用して可視化し、NMR分光法がもたらす構造情報とあわせて補体活性化機構を理解することを目指している。今年度は、脂質膜上の補体活性化モデル系構築するため、糖脂質合成と安定同位体標識技術を駆使し、計測に必要な試料調製を行なった。抗体の標的となる糖脂質として、LewisXセラミド誘導体およびガングリオシドGM1を合成した。抗体については、それぞれの糖脂質を認識するIgGとIgMの産生系を構築し、これらモノクローナル抗体を大量に調製した。そこで、得られた試料を用いて高速AFM観測に取り組み、抗原を含む脂質膜上でIgGが規則的な6量体構造を形成する明瞭な像を得ることができた。さらには、IgGの6量体構造上における補体因子C1qの結合解離の様子を観測することに成功した。一方、NMR計測のために、安定同位体標識を施した抗体の調製を行い、抗体のFc領域について血清中での観測に取り組んだ。その結果、Fc領域に対して血清中のポリクローナル抗体が相互作用することが明らかとなった。IgGの分子量は15万と大きく、13C/15N標識のみでスペクトル解析を実施するのは困難である。そのため、ロイシン残基選択的に立体整列同位体標識を施したサンプルを取得し、そのスペクトルを観測した。その結果、全長のIgGを対象とし、すべてのロイシンのメチル基シグナルを観測することに成功した。今年度に行う計画であった、試料調製が予定よりも早く進行し、抗体の標的となる糖脂質(LewisXセラミド誘導体およびガングリオシドGM1 )と抗体(糖脂質を認識するIgGとIgM)について、順調に合成および産生系を立ち上げることができた。その結果、当初の計画以上に進展し、得られた試料を用いてAFM観測を行うことが出来た。AFM観測の結果、抗原を含む脂質膜上でIgGは規則的な6量体構造を形成し、その上に補体因子が結合する描像を明らかにすることができ、計画以上の成果を得ることが出来た。

一方、NMR計測においてはガングリオシドGM1などの抗原と抗体の相互作用解析を行い、抗原のエピトープを決定した。さらにIgGの柔軟性な構造についての理解を深めるべく、MDシミュレーションに着手した。MDシミュレーションによって得られた構造空間を実験計測によって裏付けるため、量子ビーム溶液散乱を行なった。当初の計画を更に推進し、得られた試料を用いてAFM観測に取り組む。これまで観測されているIgGの規則的な6量体構造と補体因子の相互作用について詳細な解析を行うとともに、他の糖脂質と抗体の相互作用についても観測を行う。またNMR計測についても得られた試料を用いて抗体と糖脂質との相互作用の解析を行う。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
Tob 蛋白質を介するCCR4-NOTデアデニレース作用の分子構造基盤

TobがmRNAの安定性を制御するメカニズムを確立するために、以下を進めた。1)前年度に引き続き、Tobとpoly(A)結合タンパク質(PABP)、CNOT7デアデニレースの3者複合体の結晶構造解析を目指し、それらを大腸菌で発現させることを試みている。2) Tobは、mRNAの3'UTRに存在するpoly(A)付加シグナルを認識するCPEBと会合すること、更にTob/CPEB複合体はCNOT7と会合し、特定のmRNAを不安定化することが報告されている。そこでTobとCPEBの結晶構造解析を計画した。その為にCPEBと結合するTobの領域(198Ser-236Ser)に含まれるペプチド断片を合成した。今後、このペプチド断片のNMR解析を進めるとともに、全長CPEBを発現させ、Tobペプチドとの結合状態を結晶構造解析する。3) CPEB/Tob/CNOT7複合体の共結晶解析が進まないことも想定し、Tob/CNOT7が別の3'UTR結合タンパクを探索した。Tob/CNOT7が、特定のmRNA分解に寄与していることを調べる中で、CNOT7欠損マウスが高脂肪食下では肥満になりにくいことを見出した。高脂肪食下CNOT7欠損では、一部の白色脂肪組織(WAT)で熱産生が亢進し、脂肪が蓄積しにくくなっていることがその原因であることが分かった。さらに栄養源からのATP産生を熱産生に代えるUCP1(uncoupling protein 1)の発現が上昇していることを明らかにした。その分子機構を探る中で、CNOT7のみならずTobを欠損するマウスのWATにおいてもUCP1 mRNAが安定化し、発現上昇していることが分かった。さらにUCP1 mRNAの3' UTRに存在するAU-rich配列に結合するBRF-1がTobと会合しCNOT7を標的mRNAにリクルートすることを見出した。BRF1とTobの結合領域を決めながら結晶構造解析を進めている。26年度が最終年度であるため、記入しない。CCR4-NOTデアデニレースが、poly(A)結合タンパク質(PABP)やTobと協調して働く仕組みを構造生物学的に解析する目的で、Tob、PABP、CNOT7デアデニレースの会合体の精製を試みた。2. PABPのC末端側139アミノ酸残基(PABC)内にTobのPAM2モチーフとの結合領域が有ることから、PABCを調製しin vitroでTob293と混合しSize-exclusion chromatographyによりTob-PABC複合体を得た。しかし共雑物を除く精製段階で複合体が容易に解離した。TobがCNOT7とN端側で会合することが分かっているので、Tob、PABC、CNOT7の三者を大腸菌内で共発現させ、三者複合体として精製することを試みている。3.一方、CNOT7-Tob138会合を阻害する化合物(#1と#6)とTob138との共結晶を得た。X線構造解析の結果、#1化合物がCNOT7との会合部位のW93に、また#6化合物がTobモノユビキチン化部位K63に結合することが分かった。

本研究は、「CCR4-NOTデアデニレースが、poly(A)結合タンパク質PABPやTobと協調して働く仕組みを構造生物学的に解析し、デアデニレース反応/mRNA分解反応へのTobの寄与を明らかにする」ことを目的としているので、TobとPABPとCNOT7(CCR4-NOTのサブユニット)が会合している状態を構造解析することを計画した。そこでTobとPABPとCNOT7の三者を大腸菌で発現・精製し、複合体を作らせようとした。TobについてはC端欠失体Tob293を用いた。Tob293とCNOT7は、単独精製可能であったが、PABPについては量的に不十分であり、Tob会合モチーフを持つPABCを用いた。精製タンパク質が凝集しやすい、量的に不十分などで、条件検討に予想以上の時間を要した。これまでTob293とPABCの会合体の調整まで進んでいるが、精製過程で解離しやすいことが分かった、同時にCNOT7を共精製することではこの問題を克服できると考え現在その実験が進行中である。従って順調に進行しているとは言い難いが、問題点を克服して来ており、遅れを取り戻せると考えている。