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本邦の悪性リンパ腫の病因、病態解明のための分子病理学的研究

1.大阪リンパ腫研究会への症例登録は約2650例となっており、本邦の悪性リンパ腫研究のためデータソースとして充分な数に達している。内訳は非ホジキンリンパ腫が約10%である。非ホジキン腫のうち、B細胞性が76%、T, NK細胞性が24%である。2.上述の症例を用いて、かねてより我が国に多いと言われてきたNK細胞腫瘍の頻度を計算したところ、全リンパ腫中の3%を含めることが判明した。NK細胞腫瘍の内訳をみるとリンパ節原発が11%、他はリンパ節外原発である。とりわけ鼻腔を中心とする上気道原発が全体の60%と最も頻度が高かった。従来よりNK細胞腫瘍と蚊アレルギーの関係が注目されてきたが、本調査では2.5%の症例にみとめられるのみであった。3.慢性リュウマチ患者(RA)からは悪性リンパ腫が多く発生すると考えられてきた。又、近年リュウマチ治療への使用が一般化してきたメトトレキセート(MTX)がリンパ腫発生を促進しているとの説も出されている。これらの点を明らかにするために症例・対照研究が進行中である。尚、最近RA治療薬であるinfliximab投与中に発生した悪性リンパ腫症例を報告した(Int J Hematol,2005)。4.膿胸関連リンパ腫(PAL)はEBウィルス関連リンパ腫の1つである。EBウィルス潜伏感染遺伝子の1つであるEBNA-2の発現が患者予後と関連していることを示した。具体的には、EBNA-2発現PALは非発現のものに比べて予後が不良である。PALの予後因子を明らかにした意義があると同時に潜伏感染遺伝子発現パターンが予後と関連することを示した最初の文献上の記載となるものである(Int J Cancer, in press)。本研究は大阪リンパ腫研究会に登録される症例(これまでに3000例をこえている)を中心とした悪性リンパ腫症例についての疫学的、分子病理学的検討を通じて本邦の悪性リンパ腫の病因・病態の解明を目指したものである。平成18年度の主な実績としては以下のものがある。(1)鼻腔NK/T細胞リンパ腫発生における生活環境要因の関与を調べる目的で日本(大阪大、旭川医大、聖マリアンナ大、琉球大)、韓国(延世大)、中国(中国医科大)での症例・対照研究を実施した。その結果、農薬や化学溶媒への曝露が危険要因であることが示された(Int J Cancer 2006)。(3)関節リュウマチ(RA)患者にリンパ腫が発生することが知られている(RA-LPD)。RA-LPDの発生にはRAの治療に用いられる免疫制御剤であるMetroxate (MTX)の関与が指摘されている。そこでRA-LPDのうちMTX使用と非使用者のRA-LPDを比較したところ、両者には臨床病理学的な相違はないが、MTX使用群ではMTX投与を打ち切るとRA-LPDの自然消槌がみられることがある(J Rheumatol 2007)。(4)DNA二重鎖切断の修復遺伝子であるATM, ATR, MRE11の異常を50の白血病リンパ腫細胞株で調べたところ、TM, MRE11の異常がしばしば観察された。これにより、二重鎖切断修復の異常からゲノム不安定性が引き起され、腫瘍発生に寄与することが考えられた(Cancer Sci 2006)。(5)この他にHodgkin lymphomaの病理・疫学についてのレヴューを書いた(Int J Hematol 2006)。以上、悪性リンパ腫の発症要因
高難度酸化反応を可能とするヘム酵素の創成

長鎖脂肪酸の水酸化反応を過酸化水素のみで触媒するヘム酵素であるシトクロムP450_<BSβ>(P450_<BSβ>)に,構造が天然基質(長鎖脂肪酸)に良く似た擬似基質(デコイ分子)を基質として誤認識させて取り込ませることにより,様々な非天然基質の酸化が可能となることを見出した.そして,触媒活性やエナンチオ選択性が,デコイ分子の構造の違いにより変化することも明らかとした.デコイ分子が酸化されず,非天然基質が酸化される基質誤認識システムの反応メカニズムを理解するためには,基質の有無およびデコイ分子結合による構造変化と,それに付随する酵素機能のスイッチングメカニズムを明らかにする必要があった.そこで,基質の結合に伴う構造変化を明らかにするため,基質非結合型のP450_<BSβ>の結晶化とX線構造解析を行った.天然基質の除去と精製法ならびにその結晶化条件を確立し,基質非結合型の結晶を得た.構造解析の結果,分解能2.9Aで基質非結合型の構造を明らかにすることに成功した.反応場には,パルミチン酸に対応する電子密度が見られないことを確認した.基質非結合型の構造は既報のパルミチン酸結合型とほぼ同じで,基質の結合による構造変化が非常に小さいことを明らかとした.したがって,基質非結合の状態ですでに長鎖脂肪酸のアクセスを可能とするチャネルが存在し,構造の変化を伴わなくとも長鎖脂肪酸を取り込める構造をとっていることが明らかとなった.また,過酸化水素の取り込みと水の排出に関与していると考えられていたチャネルも基質の有無にかかわらず開いていることが確認された.今回得られた蛋白の構造情報は,P450_<BSβ>の酵素反応の全容を明らかとするためだけでなく,デコイ分子設計による酵素反応制御においても重要な情報と言える.本研究課題は,長鎖脂肪酸の水酸化反応を過酸化水素のみで触媒するヘム酵素であるシトクロムP450_<BSβ>(P450_<BSβ>)を様々な非天然基質の酸化が可能な人工酵素へと改変することを目的として行われた。P450_<BSβ>は、安価な過酸化水素のみで機能する魅力的な酵素であるが、基質である長鎖脂肪酸のカルボキシル基がプロトンの受け渡しを行う一般酸塩基触媒として酸化活性種生成に関与する独特の反応機構により,長鎖脂肪酸以外の基質を酸化することは通常できない。しかし,構造が天然基質に良く似たカルボキシル基を有する擬似基質をP450_<BSβ>に基質として誤認識させて取り込ませることにより酸化活性種が生成され、様々な非天然基質の酸化反応が可能となることを見出した。擬似基質は、長鎖脂肪酸に比べてアルキル鎖長の短い直鎖カルボン酸を用いた。アルキル鎖長の異なる一連のカルボン酸(炭素数210)を擬似基質として様々な酸化反応を行った結果、スチレンのエポキシ化反応やエチルベンゼンのベンジル位の水酸化反応が進行することが明らかとなった。初期酵素活性は、過酸化水素を利用可能な代表的なヘム酵素であるクロロペルオキシダーゼよりも高い活性を示した。さらに、触媒活性やエナンチオ選択性が、擬似基質のアルキル鎖長の違いにより変化することも明らかとなった。本手法は、従来から行われているアミノ酸の部位特異的置換を一切行わずに、野生型酵素の基質特異性を劇的に変換しておりこれまでに報告例のない新規酵素改変手法といえる。また、酵素自体を改変すること無しに、酵素活性ならびにエナンチオ選択性を外部添加物質により変更可能であることを示した点で注目に値する。添加する擬似基質を最適化することにより、更なる高活性やエナンチオ選択性を付与することが期待できる。長鎖脂肪酸の水酸化反応を過酸化水素のみで触媒するヘム酵素であるシトクロムP450_<BSβ>(P450_<BSβ>)に,構造が天然基質(長鎖脂肪酸)に良く似た擬似基質(デコイ分子)を基質として誤認識させて取り込ませることにより,様々な非天然基質の酸化が可能となることを見出した.そして,触媒活性やエナンチオ選択性が,デコイ分子の構造の違いにより変化することも明らかとした.デコイ分子が酸化されず,非天然基質が酸化される基質誤認識システムの反応メカニズムを理解するためには,基質の有無およびデコイ分子結合による構造変化と,それに付随する酵素機能のスイッチングメカニズムを明らかにする必要があった.そこで,基質の結合に伴う構造変化を明らかにするため,基質非結合型のP450_<BSβ>の結晶化とX線構造解析を行った.天然基質の除去と精製法ならびにその結晶化条件を確立し,基質非結合型の結晶を得た.構造解析の結果,分解能2.9Aで基質非結合型の構造を明らかにすることに成功した.反応場には,パルミチン酸に対応する電子密度が見られないことを確認した.基質非結合型の構造は既報のパルミチン酸結合型とほぼ同じで,基質の結合による構造変化が非常に小さいことを明らかとした.

したがって,基質非結合の状態ですでに長鎖脂肪酸のアクセスを可能とするチャネルが存在し,構造の変化を伴わなくとも長鎖脂肪酸を取り込める構造をとっていることが明らかとなった.また,過酸化水素の取り込みと水の排出に関与していると考えられていたチャネルも基質の有無にかかわらず開いていることが確認された.今回得られた蛋白の構造情報は,P450_<BSβ>の酵素反応の全容を明らかとするためだけでなく,デコイ分子設計による酵素反応制御においても重要な情報と言える.
下顎運動時に観察される頭部平衡運動を指標とした顎機能評価法に関する研究

【研究目的】下顎運動に協調する頭部運動の持つ機能的意義を、咬合、という観点から解明するために、健常者と顎機能異常者を対象として、下顎運動・頭部運動と咀嚼筋群・頸筋群活動とを同時記録、解析した。【研究結果】下顎タッピング運動と咀嚼運動の際には、頭部が下顎運動と等しい周期でリズミカルに上下的な運動をしており、運動量は下顎運動の10分の1程度で、開口量の二乗と比例関係にあることが確認された。この運動をさらに矢状面内で二次元的に解析したところ、外耳口のやや上方を中心として、開口時には後屈方向、閉口時には前屈方向へと回転運動していることが分かった。このとき、咀嚼筋だけでなく、浅層の頸部筋、とくに胸鎖乳突筋に筋活動が認められた。この筋活動は閉口時、咬合時に認められ、活動量はかみしめ強度に比例した。この活動は、半数のストロークにおいて咬合相に先行して生ずることから、予測的姿勢制御機構の一環として周期的頭部運動の発生に関連していることが示唆された。咬合負荷(咀嚼)時には、全身の姿勢動揺は安静時に比べ増加した。これは、下顎機能運動に伴う頭部の局期性運動の影響によるものと予測されたが、全身動揺の局期と頭部運動の周期は合致せず、関連性は明らかでなかった。さらに咬合に異常を持つ顎機能異常者では、健常者で見られる下顎運動と完全に対応したリズミカルな頭部運動の出現率が、約4分の3に減少した。この現象は顎機能異常の諸症状、特に開口障害との関連性が高く、下顎運動に協調する頭部運動の発生が下顎運動のメカニカルな要素に依存していることを示唆するものである。一方、咬合異常様相と、頭部運動様相に密接な関係は見いだされなかった。頭部運動は、様々な要素によって影響を受け、また様々な様式を介して全身に影響を与えており、その厳密な発生機構や影響を解明するためにはさらなる詳細な調査が必要である。下顎タッピング運動時に見られる頭部運動が,頭部の姿勢バランス保持のため存在すると考えると,バランスを崩す外乱が加わった場合には,頭部運動の存在は疑われる.その場合にも頭部運動が存在するならば,外乱に対抗する運動の存在が予想される.そこで頭部に外乱負荷を加えて,頭部の重心を変化させた状態で下顎運動に随伴する頭部運動を観察し,頭部運動の機能的意義の考察を行った.被験者は,顎口腔系に異常を認めない者11名とし,下顎運動と頭部運動の測定には6自由度顎運動測定装置トライメットを使用した.測定は,3種類の下顎開口量,3種類のタッピング頻度,および頭部に外乱負荷として1.5kgの錘負荷を加えた状態で頭部重心の変化が,頭部運動へ与える影響を検討する目的で下顎タッピング運動を記録し,以下の結果を得た.1.タッピング運動の開口量や頻度が低い状態では,頭部のバランスを取る必要性が低下した.2.頭部に外乱を負荷した場合は,頭部運動の出現率が低下した.

3.外乱負荷のない場合の回転中心は,顆頭点の後上方に頭部内に存在した.4.頭部上に直接外乱を負荷した場合,回転中心は頭部内に在ったが,頭部外前方に加えた場合は頭部外上方に存在した.この場合には,頭部外上方に回転中心を持つ振り子状の運動を行っていた.頭部運動が頭部内に回転中心を持つ回転運動,または頭部上方に回転中心を持つ振り子様の運動でも,頭部と体幹の連結部にあたる環椎後頭関節では,後頭顆が環椎の上関節窩に沿って,前後方向へのみ移動する運動となる.これにより頭部運動の方向が規制されつつ,下顎運動による頭部の重心の変化や下顎運動の速度による頭部のダイナミクスの変化に対抗して,頭部全体のバランスをとるために頭部運動が存在すると考えられる.【研究目的】下顎運動に協調する頭部運動の持つ機能的意義を、咬合、という観点から解明するために、健常者と顎機能異常者を対象として、下顎運動・頭部運動と咀嚼筋群・頸筋群活動とを同時記録、解析した。【研究結果】咬合負荷(咀嚼)時には、全身の姿勢動揺は安静時に比べ増加した。これは、下顎機能運動に伴う頭部の周期性運動の影響によるものと予測されたが、全身動揺の周期と頭部運動の周期は完全には合致せず、その関連性は明らかでなかった。さらに顎機能異常者の下顎機能運動時の頭部動態を観察し、咬合と頭部運動の機能的関連性を観察した。咬合に異常を持つ顎機能異常者では、健常者で見られる下顎運動と完全に対応したリズミカルな頭部運動の出現率が、約4分の3に減少した。この現象は顎機能異常の諸症状、特に開口障害との関連性が高く、下顎運動に協調する頭部運動の発生が下顎運動のメカニカルな要素に依存していることを示唆するものである。一方、咬合異常様相と頭部運動様相に密接な関係は見いだされなかった。このように、本研究から得られた結果は、顎機能異常患者の診断における頭部平衡運動測定の診断的価値を示唆するものである。しかしながら、頭部平衡運動は下顎運動と密接な関係を持ってはいるが、一方で他の様々な要素によって影響を受け、また様々な様式を介して全身に影響を与えており、その厳密な発生機構や影響を解明するためにはさらなる詳細な調査が必要であると考えられる。
貯蔵タンパク質の糖誘導性遺伝子発現と液胞集積

塊根遺伝子の糖誘導性発現に関わる2つの保存配列を含む断片を用いた酵母one-hybrid法で、2種の機能未知転写因子のクローンを得た。その一つはHD-Zip領域でBox3に結合してC末側に活性化ドメインを持つタンパク質を、もう一種は新奇クラスのbZIP因子をコードしていた。シロイヌナズナAtβ-Amyの糖誘導性発現が低下し、アントシアニン蓄積や花成にも異常を示すlba1変異をマップし、機能未知遺伝子にGly→Glu置換を伴う塩基置換を見出した。Spo^<min>::LUC導入シロイヌナズナ基本株から網羅的スクリーニングで得た55の糖応答性突然変異株のうち、hsi2の原因遺伝子を同定した。HSl2はB3DNA結合ドメインを持ち、種子形成に重要な既知転写因子と異なる機能未知遺伝子よりなるサブファミリーに属した。HSl2は核に局在し、ヌル変異株と強制発現株の解析からSpo^<min>のリプレッサーであることが分かった。Spo^<min>::LUC基本株のアクティベーションタギングにより、低糖濃度でも光る変異株を3つ単離した。それらでは機能未知のbZlP因子、CCTモチーフタンパク質、AP2ドメイン因子の遺伝子近傍にエンハンサーが挿入されて発現が高くなっており、前2者では内生の糖誘導性遺伝子の発現も高く、糖誘導性遺伝子の活性化因子と推定した。マイクロアレイで見出した糖で素早く誘導されるbZlP22は病害防御遺伝子の糖による誘導に関与し、素早くmRNAが消失するbZlP63は糖飢餓応答遺伝子の発現に関与していた。糖処理の早い時間では多くの細胞周期とリボソーム形成の因子の遺伝子が発現誘導を受けることを見出した。核小体のリボソーム形成制御因子ヌクレオリンの遺伝子発現の解析から、富栄蕎条件下で細胞が物質集積に転じるときの遺伝子発現変動機構とは異なる機構が、貧栄養条件下の細胞が栄養充足状況を検知して増殖を開始するときに働くことが示唆された。細胞が栄養貯蔵機能を発揮する統御系を理解するために、本研究では貯蔵タンパク質遺伝子を始めとする一群の糖応答性遺伝子の発現が協調的に制御される機構、および糖シグナル応答の他のシグナル応答系との関係を明らかにし、また液胞貯蔵タンパク質の活発な合成と液胞への選別輸送装置の発達との関係を明らかにする。サツマイモのスポラミンとβ-アミラーゼの遺伝子の発現は、糖に加えてABAによっても誘導され、スポラミン遺伝子の糖誘導性最小プロモーターとLUCとの融合遺伝子についても、形質転換シロイヌナズナにおいて糖の他にABAによる発現誘導も受け、さらにこの最小プロモーター中のTGGACGGエレメントの破壊によって糖誘導のみならずABA誘導も失われることを明らかにした。この糖誘導性最小プロモーターとLUCとの融合遺伝子の糖に応答した発現を指標にして、多数のEMS変異株から糖処理後のLUC活性が野生型株に比べて顕著に高いもの(hsi型)29ライン、逆にその低いもの(lsi型)28ラインを得た。これら変異株の多くが、LUC活性の糖に対する応答と同時にABAへの応答にも異常を示した。また、野生型植物の内生ABA量は糖の供与によって顕著に増加することが明らかになり、融合遺伝子の糖による発現誘導にはABAが中間シグナルの一つとして働いていることが示唆された。しかし、LUC活性の増加は糖を与えた場合の方がABAを与えた場合よりも早く見られ、糖とABAの両方を与えると発現レベルはそれぞれ単独の場合に比べ加算的になる。更に、融合遺伝子の糖に対する応答と異なりABAに対する応答性に異常を示さない変異株も同定され、融合遺伝子の糖による発現誘導にはABAを介さない経路も作用していることが示唆された。

核小体のリボソーム形成制御因子ヌクレオリンの遺伝子発現の解析から、富栄蕎条件下で細胞が物質集積に転じるときの遺伝子発現変動機構とは異なる機構が、貧栄養条件下の細胞が栄養充足状況を検知して増殖を開始するときに働くことが示唆された。細胞が種々の機能を統御して栄養貯蔵機能を発揮する機構を理解するために、貯蔵タンパク質遺伝子を始めとする一群の糖応答性遺伝子の発現が協調的に制御される機構、糖シグナル応答の他のシグナル応答系との関係、液胞貯蔵タンパク質の活発な合成と液胞への選別輸送装置の発達との関係を明らかにする。サツマイモ塊根貯蔵タンパク質のスポラミンの遺伝子の糖誘導性最小プロモーターとLUCとの融合遺伝子は、形質転換シロイヌナズナにおいても糖の他にABAによる発現誘導も受け、ABAは糖誘導の中間シグナルとして働くがABA非依存的経路も働くことが示唆された。この融合遺伝子の糖による発現誘導にはABl4,ABl5遺伝子は関与しないことが明らかになり、光合成系遺伝子の糖による発現抑制におけるABAの作用とは異なるメカニズムが働くことが示唆された。融合遺伝子の発現を指標にして単離した多数変異株の解析からも、融合遺伝子の糖による発現誘導にはABAが中間シグナルの一つとして働いているもののABAを介さない経路も作用していることが示唆された。シロイヌナズナの約8,000のcDNAよりなるマイクロアレイを用い、ショ糖に応答してmRNAレベルの変動する遺伝子を多数検出した。これらの糖応答性遺伝子を中心に選抜マクロアレイを作成し、野生型株やABA変異株での糖やABAに応答したmRNAレベル変動を解析し、ABAの関与の仕方によって糖誘導性遺伝子は幾つかのグループに分けられることが強く示唆された。糖応答性遺伝子の中に、新規の転写因子やシグナル伝達因子をコードすると推定されるものや、小胞輸送されるタンパク質のquality controlや小胞輸送系に関わる因子をコードすると思われるものが含まれており、これら遺伝子の発現パターンの詳細な解析と、興味深い挙動を示す遺伝子については破壊株のスクリーニングを開始した。細胞が種々の機能を統御して栄養貯蔵機能を発揮する機構を理解するために、貯蔵タンパク質遺伝子を始めとする一群の糖栄養シグナル応答性遺伝子の発現が協調的に制御される機構、糖栄養シグナル応答の他のシグナル応答系との関係を明らかにする。サツマイモ塊根貯蔵タンパク質であるスポラミン遺伝子由来の糖誘導性最小プロモーターとLUCとの融合遺伝子は、シロイヌナズナにおいても糖の他にABAによる発現誘導も受けるが、この融合遺伝子の糖誘導にはABAに依存的な経路と非依存的経路が働き、そのABAシグナル応答は光合成系遺伝子の糖による発現抑制と異なりABI4,ABI5に依存しないことを明らかにした。融合遺伝子の糖とABAへの応答が顕著に高くなった劣性突然変異hsi2の詳細なマッピングと塩基配列決定から、HSI2はB3DNA結合ドメインを持つ新規転写因子タンパク質をコードすることを明らかにした。シロイヌナズナのcDNAやオリゴDNAマイクロアレイを用い、12時間のショ糖処理によって水処理と比較してmRNAレベルが3倍以上の増減を示す遺伝子は全体の約12%であり、その一部だけがABAにも応答して変動を示すことを明らかにした。糖に応答した発現を示すbZIP転写因子が多く見出され、その多くがABAにも応答しABA依存的な糖シグナル応答において機能すると推定された。
未解明の細胞死様式である細胞脱落の分子機構の解明

上皮細胞は組織から脱落してその一生を終える。死ぬべき細胞は隣接細胞が生み出す力により押し出され、組織から脱落する。本研究では以下のアプローチを用いて脱落の分子機構を解析した。(A)網羅的解析により、脱落のタイミングを決定する機構を明らかにする。(B)脱落運命の決定された細胞はどのように隣接細胞に感知され、隣接細胞はどのように細胞を押し出すための作用を開始するかを、ショウジョウバエにおけるRNAiスクリーニングによって明らかにする。(C)細胞骨格のどのような動態変化が細胞を押し出すのか、その際細胞接着がどのように変化するかをライブイメージングによって解明する。(A)前年度までに、マウス小腸絨毛の基底、中間、頂端部における遺伝子発現の比較解析及び、樹立した、細胞脱落が減少する培養細胞のRNAseq解析を実施した。本年度は細胞脱落が減少するショウジョウバエの腸上皮のRNAseq解析を実施した。結果、細胞脱落に関与する可能性のある遺伝子を抽出し、様々な細胞脱落の解析系において検証を開始した。(B)前年度までに500遺伝子のスクリーニングを行い、本年度はさらに300遺伝子のスクリーニングを行った。結果、膜動態に関与する遺伝子が細胞脱落に重要であることがわかり、これら遺伝子をノックダウンした培養細胞では細胞脱落が妨げられることがわかった。(C)前年度までに、細胞脱落時の接着結合及び密着結合の動態を明らかにし、その際に各接着分子が細胞境界から消失する機構は、カベオリン依存エンドサイトーシスであることを示唆する結果が培養細胞を用いて得られたことを踏まえ、本年度は、ショウジョウバエ生体上皮でエンドサイトーシスを阻害したところ細胞脱落が妨げられることがわかった。また、培養細胞を用いてデスモソームの動態を解析し、デスモソームは脱落開始後の早い段階で消失することがわかった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、腸上皮のターンオーバーでの脱落を対象に、以下のアプローチを用いて脱落の分子機構の解明を行うものである。(A)時間経過が細胞にもたらす変容をオミクス解析により明らかにし、寿命を迎えた細胞に何がおこり脱落のタイミングが決定されるかを明らかにする。(B)脱落運命の決定された細胞はどのように隣接細胞に感知され、隣接細胞はどのように細胞を押し出すためのアクチンリングの形成を開始するかを明らかにする。ここではショウジョウバエにおいて新規RNAiスクリーニング系を用いる。(C)アクチンリングのどのような動態変化が力を発生して細胞を押し出すのか、その際細胞間接着がどのように喪失、再形成されるかをマウス腸培養組織、オルガノイドを用いたライブイメージングによって解明する。H26年度実績の内、特に(B),(C)について記載する。(B)私の樹立したシステムは上皮において優れたスクリーニングツールとなることを確認しているが、これが腸上皮においてもワークするかを検討した。腸ではクローンの誘導率が低いことが問題となったが、クローンを誘導するためのヒートショックを施すタイミング及び回数等を最適化することで十分なクローンの誘導率を達成した。双子クローンでの各GFP, RFPは、十分な輝度を持って検出され、各クローン内の細胞数が染色なしに測定出来るとわかった。(C)腸オルガノイドの系をたちあげ、初めてとなる脱落のライブイメージングに成功した。これにより脱落の開始から完了までの時間は数十分とわかった。この時、脱落する細胞はアポトーシスマーカー陰性であることが示され、細胞は生きたまま脱落すると考えられる。各種タンパク質(細胞骨格や細胞接着分子等)の分子動態を解析するため、蛍光タンパク質との融合タンパク質の発現株を樹立した。H27年度実績の内、特に(A),(B)について記載する。(A)マウス小腸の組織切片を用い、細胞脱落のおこる絨毛頂端部と、細胞脱落のおきないその下部においてマイクロダイセクションを行い、マイクロアレイによって遺伝子発現の比較解析を行った。現在、解析結果を精査し、脱落に関与する可能性のある候補分子の抽出を行っている。(B)私の樹立したシステムは優れたスクリーニングツールとなることをH26年度までに確認したが、行程に時間と労力がかかることを考慮し、H27年度では、一次スクリーニングに別法を用いることを計画した。

この方法は、腸上皮細胞で誘導した各RNAiの効果を細胞数や細胞の形態などの複数パラメーターで評価するもので、交配等にかかる時間と労力が初期案と比べて軽減する。この代替法を用いるのに必要な系統の構築及び検証実験を行い、実際にこの系がワークすることを確認した。続いてこれを用いて一次スクリーニングを開始した。研究実績の概要の欄に記載したように、研究計画(B)において一部計画を修正したため「(3)やや遅れている」の区分としたが、速やかに代替法の構築と検証を行い、一次スクリーニングを開始した。また、(A),(C)に関しては概ね順調に進展している。上皮細胞は組織から脱落してその一生を終える。死ぬべき細胞は隣接細胞が生み出す力により押し出され、組織から脱落する。本研究は、腸上皮のターンオーバーでの脱落を対象に、以下のアプローチを用いて脱落の分子機構の解明を行う。1時間経過が細胞にもたらす変容をオミクス解析により明らかにし、寿命を迎えた細胞に何がおこり脱落のタイミングが決定されるかを明らかにする。2脱落運命の決定された細胞はどのように隣接細胞に感知され、隣接細胞はどのように細胞を押し出すためのアクチンリングの形成を開始するかを明らかにする。そのためショウジョウバエにおいてRNAiスクリーニングを実施する。3アクチンリングのどのような動態変化が力を発生して細胞を押し出すのか、その際細胞間接着がどのように喪失、再形成されるかをマウス腸培養組織培養や培養細胞を用いたライブイメージングによって解明する。1前年度までに、マウス腸上皮を用いて行ったマイクロダイセクション及びマイクロアレイ解析から脱落に関与する可能性のある候補遺伝子の抽出を行った。本年度は各遺伝子の腸上皮での発現パターンをin situ hybridizationで解析し、脱落のおこる絨毛先端部で発現が上昇する遺伝子を複数同定した。2前年度までに、腸上皮細胞で誘導した各RNAiの効果を細胞数や細胞の形態などの複数パラメーターで評価する一次スクリーニング系を構築した。本年度はこれを用い、500系統(遺伝子)のスクリーニングを行い、約40系統の陽性結果を得た。3前年度までに、培養細胞を用いた細胞脱落の解析系を構築した。本年度はこれを用い、細胞接着分子と蛍光タンパクの融合タンパクを用いて細胞脱落時のこれらの動態解析を行った。その結果、細胞脱落の際、タイトジャンクションとアドヘレンスジャンクションは異なる挙動を取ることを明らかにした。研究実績の概要の欄に記載したように、研究計画1, 2, 3のいずれにおいても計画した研究の進展が見られ、特に3については、細胞脱落時の細胞接着の動態を明らかにできた。これらの理由より、「(2)おおむね順調に進展している」の区分とした。本研究では以下のアプローチを用いて脱落の分子機構の解明を行う。(A)時間経過が細胞にもたらす変容をオミクス解析により明らかにし、寿命を迎えた細胞に何がおこり脱落のタイミングが決定されるかを明らかにする。
骨形成因子シグナルに関与する伝達分子の単離

1.I型BMP受容体に会合するシグナル伝達分子の単離セリン/スレオニンキナーゼドメインを含むI型BMP受容体細胞内領域に会合する分子を酵母two-hybrid systemによってplacenta cDNAライブラリーから単離し、FKBP12をはじめ既知の分子2種、および新規の分子1種が得られた。これらを仮にBRAM1-4(BMP receptor associated molecule)と名付けた。これらのうち新規の分子BRAM2はI型BMP受容体細胞内領域のキナーゼ領域に結合することを酵母two-hybrid systemにより確認した。また、I型BMP受容体細胞内領域と会合分子の結合能を培養細胞を用いた系でも確認した。さらにBRAM2はI型TGF-β受容体とも会合しうることが明らかになった。2.BMPシグナルに呼応する標的遺伝子の単離Differential display法を用いることにより、BMP刺激により誘導される遺伝子を探索し、ホメオボックスを持つ既知の分子の他、新規の分子を含む多数の呼応遺伝子の単離に成功した。このうち、ホメオボックス遺伝子ラットDIx-3のマウス相同遺伝子cDNAの全長をクローニングした。今年度に入り、この遺伝子はDIx-5として他のグループにより報告された。BMP-4刺激によりDIx-5遺伝子の発現が誘導されることを確認した。また骨芽細胞株MC3T3-E1細胞にDIx-5を強制発現させることにより骨分化の促進が示唆された。1.BMP受容体に会合するシグナル伝達分子の単離セリン/スレオニンキナーゼドメインを含むBMP受容体細胞内領域に会合する分子を酵母two-hybrid systemによって単離することを試みた。即ち、マウスBMP受容体細胞内領域をコードするcDNAをGAL4-DNA結合領域をコードするcDNA(pGBT9)の下流に組み込んだプラスミドを構築し、GAL4活性化領域をコードするcDNAの下流に組み込んだヒトbrain及びplacenta cDNAライブラリーを用い、その結合分子を単離した。その結果、FKBP12をはじめ既知の分子2種、および新規の分子1種を得た。現在、BMP受容体細胞内領域と会合分子の結合能を培養細胞を用いた系で確認している。2.BMPシグナルに呼応する標的遺伝子の単離Differential display法を用いることにより、BMP刺激により誘導される遺伝子を探索した。即ち、BMP刺激およびレチノイン酸刺激により分化誘導される培養細胞(MC3T3)を用い、刺激前後のmRNAを調製しDifferential display法によりBMP刺激により特異的に発現が誘導もしくは著しく抑制される遺伝子のcDNAを単離した。その結果、ホメオボックスを持つ既知の分子の他、新規の分子を含む多数の呼応遺伝子の単離に成功した。このうち、ホメオボックスを持つ既知の分子cDNAの全長をクローニング中である。これらのうち新規の分子BRAM2はI型BMP受容体細胞内領域のキナーゼ領域に酵母two-hybrid systemにより確認した。このうち、ホメオボックス遺伝子ラットDlx-3のマウス相同遺伝子cDNAの全長をクローニングした。今年度に入り、この遺伝子はDlx-5として他のグループにより報告された。BMP-
細胞接着因子ギセリンの癌転移における機能解析

私達は鶏平滑筋より新規細胞接着分子ギセリンを発見した。これまでの研究でこの接着分子はイムノグロブリンスーパーファミリーに属すること、また、発生時、再生組織さらに一部の自然発症腫瘍例に過剰発現することを見い出している。本研究では、腫瘍細胞の転移と浸潤におけるギセリンの機能とその応用性を検討した。まず、GST融合ギセリン蛋白を作製しウサギに免疫後、抗体を作製した。この抗体を用いて自然発症腫瘍および細胞株におけるギセリンの発現パターンを解析した。その結果、悪性腫瘍(メラノーマ、肺癌、乳癌、大腸癌など)では過剰発現するが、良性の乳腺腫瘍や間葉系由来の腫瘍では陰性であることが判明し、将来腫瘍の診断マーカーとなることが期待された。次に、in vivoでの腫瘍細胞の転移や浸潤におけるギセリンの機能解明を目的とし、発育鶏卵及びマウス、ラットの実験系を用い腫瘍細胞の移植実験を行った。マウスL-929細胞および様々なラット由来細胞株にギセリン遺伝子を導入し、発育鶏卵の漿尿膜及びヌードマウスに接種したところ、腫瘍性増殖が促進し周囲組織への強い浸潤性も示した。長い細胞質内領域を持つギセリンアイソフォームを発現させた細胞では血管内皮細胞への接着と血管壁への浸潤能が促進され肺転移が高率に認められた。これらのことより、ギセリンが腫瘍の浸潤、転移を促進すること、特に細胞質内領域とそれを介した情報伝達が血行性転移を促進することが示唆された。現在、ギセリンの細胞質内領域に結合する分子やリン酸化の機能を検索中である。また、担腫瘍動物の末梢血にもギセリン蛋白が検出されることが判明し、腫瘍マーカーとなる可能性が期待された。現在、症例数を増やし腫瘍の大きさと血中ギセリンレベルの関連性を検討している。
スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子導入マウスの虚血性/外傷性脳損傷に対する保護効果

虚血性および外傷性神経損傷におけるsuperoxideの細胞障害機序の解明とその消去酵素であるsuperoxide dismutase(SOD)の保護効果の解明のため以下の検討をおこなった.1.in vivo脳虚血実験:SOD活性が3.1倍に増幅されたヒトSOD遺伝子導入マウス(Tgマウス)とコントロールマウス(nTgマウス)においてナイロン糸を経内頚動脈的に挿入するとにより中大脳動脈(MCA)を閉塞し、さらに糸を抜去することにより血流再開が可能な局所脳虚血モデルを用い、あらかじめラットにおいて確定した適正MCA閉塞時間の10分と60分の2群において血流再開後のimmediate early geneのc-fosと70kDa熱ショック蛋白(hsp70)の発現,誘導についてin situ hybridizationを用いて比較検討した.また近年,一酸化窒素(NO)がsuperoxideと反応しperoxynitriteを形成し,さらにhydroxyl radicalも生成することにより細胞障害をもたらすと言われており,60分のMCA閉塞後血流再開24時間の時点におけるNO合成酵素(NOS)阻害剤のL-NAME(神経細胞型と内皮細胞型のNOS阻害剤)および7-NI(神経細胞型NOSのみ阻害)の梗塞巣に及ぼす効果についても検討した.脳梗塞を形成しない10分虚血群ではTgマウスにおいてc-fosとhsp70の発現時間の延長および発現領域の拡大が認められた.しかしMCA閉塞60分群における梗塞巣,hsp70およびc-fosの発現領域は,マウスにおいてより縮小しており,保護効果が認められた.NOSの阻害剤の検討においては,L-NAME投与群ではTgマウスにおいてさえも梗塞巣が増大したが,7-NI投与ではnTgマウスにおいてのみ梗塞巣の縮小傾向が認められ,神経細胞型NOSにより産生されるNOはsuperoxide依存性に虚血神経細胞障害を惹起することが明らかとなった.2.in vivo神経外傷実験:マウスの頭頂部を開頭し,脳表に直径3mmのピストンを設置し、その上に15gの重りを10cmの高さから自由落下させることにより作成した脳挫傷モデルを用い,SOD活性が1.5,3.1,5.0倍に増幅されたTgマウスにおける外傷後の血液脳関門の透過性と脳浮腫の発生についてnTgマウスと比較するとともに,c-fosとhsp70の発現,誘導についても比較検討した.また外傷後15日間にわたる神経学的所見についても検討した。外傷後の脳浮腫はSOD活性依存性に減少し,その程度は血液脳関門の破綻の程度に相関した.また外傷後におけるc-fos mRNAの誘導はTgマウスにおいてより早期に消退し,hsp70mRNAの誘導もより限局していた.Beam balanceによる神経症状の検討ではTgで有意に改善を認めており外傷後早期からのsuperoxideの消去の有用性が示された.以上の結果はSODの脳虚血および神経外傷に対する保護効果を示すとともに,in vitroの特殊な環境下においてはSODの増加がhydroxy radicalの産生を促し、細胞障害性に働く可能性も示唆され、SODが保護効果を発揮するためには、SODにより産生された過酸化水素の消去系が十分に作動することが必須であると考えられた。

外傷後の脳浮腫はSOD活性依存性に減少し,その程度は血液脳関門の破綻の程度に相関した.また外傷後におけるc-fos mRNAの誘導はTgマウスにおいてより早期に消退し,hsp70mRNAの誘導もより限局していた.Beam balanceによる神経症状の検討ではTgで有意に改善を認めており外傷後早期からのsuperoxideの消去の有用性が示された.以上の結果はSODの脳虚血および神経外傷に対する保護効果を示すとともに,in vitroの特殊な環境下においてはSODの増加がhydroxy radicalの産生を促し、細胞障害性に働く可能性も示唆され、SODが保護効果を発揮するためには、SODにより産生された過酸化水素の消去系が十分に作動することが必須であると考えられた。
蛍光分子と表面プラズモンとの強結合

次世代のディスプレイや照明素子として期待されている有機EL素子では発光材料のすぐ近傍(100nm以内)に金属陰極が存在する。したがって電流注入によって生成された励起子のエネルギーはもちろん自由空間への輻射としても費やされるが、そのかなりの部分は表面プラズモンに散逸する。これは金属表面の表面プラズモンへのエネルギー移動速度が非常に大きいためである。通常の有機EL素子では金属陰極表面は平坦なので表面プラズモンに移動したエネルギーは熱として散逸する。しかしながら、表面プラズモンの寿命は比較的長いので、金属表面に微細構造を設けることにより、再輻射させることができる。我々は微細構造としてプラズモニック結晶と呼ばれる2次元の凹凸構造を金属陰極に導入することで、表面プラズモンを光として取り出すことができ、素子の外部発光量子効率を飛躍的に高めることができることを示した。さらに、プラズモニック結晶の振幅が外部発光量子効率に対してどのような影響を与えるかを実験および計算により求めた。実験では振幅(peak to peak)が40nmのときに最も発光効率の高い素子が得られた。一方、スーパーコンピュータ上で厳密結合波解析を用いてプラズモニック結晶に平面波を入射したときの反射率を計算した。ローレンツの相反則より、反射率が0となる振幅で表面プラズモンの輻射が最大になると考えられる。反射率が0となる振幅は20nmだった。この値は実験で得られた最適値の半分である。この違いは、反射率が0となるのは平面波が金属表面で直接反射された成分と、一旦、表面プラズモンになりそれが再輻射した成分との破壊的干渉のためだと考えることができるからである。金属表面近傍に励起蛍光分子が置かれた場合、その蛍光エネルギーは自由空間への輻射だけではなく表面プラズモンにも移動する。表面プラズモンの寿命は長いため、そのエネルギーは種々の応用に利用可能である。本研究はこのエネルギー移動の割合を金属表面に微細構造を導入することで増強することを目的とする。厳密結合波理論を応用した計算により、金属薄膜の両側界面に1次元に周期的な表面凹凸構造導入したプラズモニック結晶薄膜で、その割合が飛躍的に増強することを見いだした。さらに、溝の深さを大きくすることで、伝搬損失の大きい短距離伝搬型表面プラズモンの存在が禁止されることを発見した。しかしながら、1次元プラズモニック結晶では、格子の溝と垂直方向を中心とする限られた方向に伝搬する表面プラズモンへのみエネルギーの移動効率は増強する。このことにより移動の効率は制限される。それに対して、2次元プラズモニック結晶では面内の全ての方向に伝搬する表面プラズモンへのエネルギー移動効率の増強が期待される。2次元プラズモニック結晶におけるエネルギー移動効率を求めるため、昨年度開発した2次元周期構造に対する厳密結合波解析法をスーパーコンピュータ上で動作するようにした。さらに、それを用いて、円筒形状の凹凸が銀表面上に三角格子状に2次元に並んでいるプラズモニック結晶へ平面波が入射したときの反射率を計算した。この計算からは2次元プラズモニック結晶の分散関係、ならびに、平面波と表面プラズモン間の結合の様子が得られた。計算結果より、両者は形状の凹凸および円筒の直径に強く依存することがわかった。
新規塩素イオンチャネル、HCLCA1の喘息気道粘膜における局在と機能分析

気管支喘息における主要病態のひとつである気道内の粘液腺肥大・過形成に伴う分泌過剰は、重症化との関連も示唆されており、発病機序解明および治療標的の重要な鍵と考えられる。これまでに気管支喘息患者の気道粘膜における過剰分泌と関連してクロライドチャネル、hCLCA1の発現亢進していることを報告し、同分子の喘息気道粘膜における分泌異常病態との関わりが示唆された。さらにアレルギー性気道炎症との関連を確認するため、抗原感作動物を用いて、hCLCA1の相同分子mRNAの発現を確認した。[目的]感作マウスにける気道粘膜粘液細胞過形成、分泌過剰とhCLCA1相同分子mCLCA3の発現との関連を検討する。[方法]BALB/c雄マウスに、卵白アルブミン(OVA)腹腔感作を行い、一回OVA吸入暴露、7日間連日吸入暴露、および21日間連日暴露を行い、気管、気管支・肺組織を摘出、4%パラフォルムアルデヒド固定、10μm切片標本を作製した。好酸球検出のためにギムザ染色、粘液染色のためにPAS/AB染色、さらにタイラミド増感法による、mCLCA3 mRNAのDIG標識cRNAプローブを用いたinsitu hybridizationを行った。[結果]気道好酸球浸潤、気道粘膜粘液細胞は1回感作でも出現するが、有意な増加は7日感作以降であった(P<0.05)。同様にmCLCA3 mRNA発現も7日感作以降で有意な発現亢進が認められた(P<0.05)。またmCLCA3 mRNA陽性細胞数と粘液スコアとの間に有意な相関が認められた(p<0.05)。[結論]感作動物では、粘液過剰分泌およびmCLCA3の発現過剰が認められ、アレルギー性気道炎症病態における気道粘液過剰分泌病態へのmCLCA3の強い関与が示唆された。気管支喘息気道の病理形態学的変化の特徴として、気道粘液細胞の過形成ならびに過剰分泌があり、病態の慢性化、重症化の要因のひとつとして考えられる.近年新規Clチャンル,HCLCA1が、IL-9と関連において、発現が増強し、気道におけるムチン産生とも関連していることが示された。そこで喘息患者の気道において、このHCLCA1が特異的に発現増強しているか否か、またこれらがIL-9およびIL-9Rの発現、また粘液産生あるいは粘液細胞増殖と関連しているか否かを検討した。喘息および慢性気管支炎ならびにサルコイドーシス患者の経気管支鏡的気管支粘膜生検組織から、凍結薄切標本を作成、PAS/AB染色、MBP、CD3tおよびIL-9、IL-9Rを免疫染色により同定、かつHCLCA1 mRNAの発現は、in situ hybridizationにより検出を行い、IL-9およびIL-9R、また喘息における炎症細胞やサイトカインと、HCLCAIの発現や粘液分泌および粘液細胞増殖との関連を検討した。喘息患者の気道において、HCLCA1は、MBP、CD3、IL-9、IL-9Rとともに、健常人ならび、慢性気管支炎やサルコイドーシス患者と比較しても、顕著に発現が亢進した。HCLCA1mRNA発現は、PASおよびAB染色増強部位ならびにIL-9R陽性部位と併存し、HCLCA1mRNAの発現は、IL-9陽性、あるいはIL-9R陽性細胞数との高い相関を認めた。また喘息の気道において、上皮下にもHCLCA1の発現増強が認められた。喘息患者の気道において、IL-

9関連粘液分泌にHCLCA1が関与している示唆がえられた。現在動物モデルおよび培養上皮細胞系において、HCLCA1の機能解析を進展させている。気管支喘息気道の病理形態学的変化の特徴として、気道粘液細胞の過形成ならびに過剰分泌があり、病態の慢性化、重症化の要因のひとつとして考えられる。近年新規CIチャネル,HCLCA1が、IL-9と関連において、発現が増強し、気道におけるムチン産生とも関連していることが示された。そこで前年度は喘息患者の気道において、HCLCA1は、MBP、CD3、IL-9、IL-9Rとともに、健常人ならび、慢性気管支炎やサルコイドーシス患者と比較しても、顕著に発現が亢進した。HCLCA1mRNA発現は、粘液分泌細胞ならびにIL-9R発現部位と併存し、HCLCA1mRNAの発現は、IL-9陽性、あるいはIL-9R陽性細胞数との高い相関を認め、喘息患者の気道における、IL-9関連粘液分泌へのHCLCA1関与の示唆がえられた。今年度はさらに、喘息病態と同CIチャネルとの関連をさらに確定するため、動物モデルおよび培養上皮細胞系において、HCLCA1の機能解析を行った。BALB/cマウスを卵白アルブミン(OVA)で腹腔感作し、その後1%OVAにて反復吸入暴露により慢性喘息モデルを作成する。同モデルにおける気道・肺組織中、HCLCA1のマウスhomologueである、mCLCA3(gob-5)mRNAを、nonRI-ISH法による検出および組織病理形態学的評価ともに比較検討をおこなった。RNA-probeは、primerを合成、マウス肺組織whole-RNAより抽出、oligo-nucleotideからRT-PCRにより作成した。感作マウスにおいて、気道上皮下線維化、平滑筋過増生とともに、ムチン産生上皮の過形成に平行して、mCLCA3 mRNAの発現亢進と同時に、また気道反応性の亢進も認められた。よって、mCLCA3と、気道上皮粘液分泌細胞の過形成、分泌過剰他の気道リモデリング、さらに気道反応性亢進など喘息表現型との関連が示唆された。気管支喘息における主要病態のひとつである気道内の粘液腺肥大・過形成に伴う分泌過剰は、重症化との関連も示唆されており、発病機序解明および治療標的の重要な鍵と考えられる。これまでに気管支喘息患者の気道粘膜における過剰分泌と関連してクロライドチャネル、hCLCA1の発現亢進していることを報告し、同分子の喘息気道粘膜における分泌異常病態との関わりが示唆された。さらにアレルギー性気道炎症との関連を確認するため、抗原感作動物を用いて、hCLCA1の相同分子mRNAの発現を確認した。[目的]感作マウスにける気道粘膜粘液細胞過形成、分泌過剰とhCLCA1相同分子mCLCA3の発現との関連を検討する。[方法]BALB/c雄マウスに、卵白アルブミン(OVA)腹腔感作を行い、一回OVA吸入暴露、7日間連日吸入暴露、および21日間連日暴露を行い、気管、気管支・肺組織を摘出、4%パラフォルムアルデヒド固定、10μm切片標本を作製した。好酸球検出のためにギムザ染色、粘液染色のためにPAS/AB染色、さらにタイラミド増感法による、mCLCA3 mRNAのDIG標識cRNAプローブを用いたin situ hybridizationを行った。[結果]気道好酸球浸潤、気道粘膜
カンファーを炭素源としたカーボンナノチューブの効率的合成

平成18年度は、炭素源としてカンファー(樟脳)、触媒の鉄源としてフェロセンを用いたCVD法で、シリコン基板上に垂直に配向したCNTsを作製した。それは優れたフィールドエミウション特性を示した。一方、触媒の酢酸鉄と酢酸コバルトをゼオライト上に担持させて、大気圧中550°Cの低温中で多層カーボンナノチューブ(MWCNTs)を作製することに成功した。しかし、酢酸鉄は極端に高価な原料であり、CNTsの大量生産には向かない。そこで、本年度は酢酸鉄の経済的な代替品を見出し触媒濃度とCVD温度を最適化する条件を求めた。窒化鉄が極端に安価でしかも触媒効果としては、酢酸鉄とほとんど変わらないことを見出した。最適化された条件では、大気圧中650°Cゼオライトに担持したFe-Co触媒を用いて、原料のカンファーの50%もの質量のMWCNTsを作製することができた。その直径は10-15nmであり、できたままの状態でCNTsの純度は88%である。炭素原子のCNTsへの変換効率は実に61%にも達し、他の通常の炭素源では得られていない大きな数字である。よって、我々はこれをギガ成長と呼んでいる。樟脳を原料とし、ゼオライト上に支持されたFe-Co 2元触媒を用いて、高純度カーボンナノチューブ(CNTs)が高収率で作製された。さらに、異なる濃度のフェロセン触媒を用いて、よく配列したCNTsの3次元成長が達成された。平行板二極電極の中に作製したままのCNTsを置いてフィールド・エミッション測定を行うと、そのCNTsのturn-on fieldが1V/μm(電流密度10μA/cm^2あたり)で閾値電界が4V/μm(電流密度10mA/cm^2あたり)の有効なエミッターであることがわかる。再現性よく、電界5.6V/μmで最大電流密度20-30mA/cm^2が得られている。新しい様相として、CNTsの電子放出に触媒金属の存在が効いていることが明らかになった。それは、実際のデバイスにおいて、CNTsのフィールド・エミッション効率を改良するのに役に立つ応用であるかもしれないし、その商業化に一歩近づいたとも言える。フィールド・エミッション顕微鏡の冷陰極として孤立ナノチューブを使ったとき、5員環の電子放出サイトを確認することができた。それは、ナノチューブの先端に5員環が含まれていることを意味する。更なる研究や深さ方向のフィールド・エミッション顕微鏡解析は、CNTsに含まれるカイラリティーや直径に対するより詳細な情報を提供する。それは優れたフィールドエミッション特性を示した。一方、触媒の酢酸鉄と酢酸コバルトをゼオライト上に担持させて、大気圧中550°Cの低温中でMWCNTsを作製することに成功した。
アルツハイマー病の痴呆症状に関する臨床病理学的研究:3次元画像解析装置を用いた海馬病変の検討

本研究の目的はアルツハイマー病にみられる記憶障害を主とする痴呆症状の成因の解明であり、痴呆の程度や罹病期間の異なるアルツハイマー病脳の海馬体病変を形態計測学に検討し、その臨床病理学的関連を明らかにすることである。平成11年度の研究実施事項:対象として痴呆の罹病期間の異なるアルツハイマー病の22例と対照老人の6例の剖検脳が用いられた。神経病理学的診断のために、脳標本を作製し、神経特殊染色を行った。外側膝状体レベルの海馬前額断組織を抽出し、組織学的計測のために、Kluver-Barrera染色とGallyas-HE染色を行った。海馬体を解剖学的基準に基づき8ヶ所の亜野(CA4,CA3,CA2,CA1,prosubiculum,subiculum and presubiculum, parasubiculum, entorhinalcortex:内嗅皮質)に分割し、Gallyas-HE染色標本で神経細胞、細胞内源線維変化(i-NFT)および細胞外原線維変化(e-NFT)の密度を専用グラティクルを用いて計測した。結果:アルツハイマー病群では対照例と比べ、海馬各部位で神経細胞数の有意な減少(ただしCA4,CA3を除く)がみられ、i-NFT数およびe-NFT数の有意な増加がみられた。アルツハイマー病群では海馬皮質、とくにCA1と内嗅皮質において、神経細胞数とe-NFT数に強い相関がみられた。また、痴呆の罹病期間との関連では、CA1と内嗅皮質においては神経細胞数とe-NFT数ともに有意な相関がみられた。考察:今年度の検討ではアルツハイマー病の海馬皮質、とくにCA1と内嗅皮質において神経細胞の減少は神経原線維変化形成と強く関連していることが明らかになった。また、海馬CA1と内嗅皮質においては、痴呆の罹病期間と神経細胞の脱落および細胞外原線維変化形成との間に有意な関連が明らかになった。平成12年度は海馬体において、抗βアミロイド抗体、抗GFAP抗体などによる免疫組織染色を行い、罹病期間と神経細胞の脱落、神経原線維変化形成、老人斑形成、アストログリア増殖の程度とそれぞれの相関について検討する予定である。本研究の目的はアルツハイマー病にみられる記憶障害を主とする痴呆症状の成因の解明であり、痴呆の程度や罹病期間の異なるアルツハイマー病脳の海馬皮質病変を形態計測学に検討し、その臨床病理学的関連を明らかにすることである。平成12年度の研究実施事項:平成11年度に対象とした痴呆の罹病期間の異なるアルツハイマー病22例と対照老人6例の剖検脳のうち、予備的に何例かの海馬標本を用い、抗βアミロイド抗体を用いて免疫染色を行った。対照例の海馬皮質では老人斑は全くみられず、アルツハイマー病では、海馬近傍の側頭葉皮質と比べ、海馬CA1や内嗅皮質においても、老人斑の密度は低く、その分布が疎らであった。また、いくつかの亜野(CA2,CA3,Parasubiculum)においては全く存在しない症例もみられた。従って、前年度において神経細胞や神経原線維変化:NFTの計測で行ったような同様の連続視野での計測手法は困難で、罹病期間との定量的な関連の評価は行えなかったが、海馬皮質では老人斑と罹病期間との相関は乏しいと推測された。そこで、本年度も前年度に引き続き、海馬での神経細胞の脱落やNFT形成を詳細に解析、検討することとした。結果:アルツハイマー病群では対照例と比べ、海馬各部位で神経細胞数の有意な減少がみられ、細胞内、外のNFT数の有意な増加がみられた。アルツハイマー病群では海馬皮質、とくにCA1と内嗅皮質において、神経細胞密度と細胞外NFT数に強い相関がみられ、また、これらの両部位で痴呆の罹病期間と神経細胞数との間で有意な負の相関が、罹病期間と細胞外NFT数との間で有意な正の相関がみられた。考察:アルツハイマー病の海馬皮質のうち、記憶機能を司る最も重要な部位と考えられているCA1と内嗅皮質においては、痴呆の重症度を間接的に反映すると考えられる罹病期間が長くなるにつれて、神経原線維変化形成およびそれに関連した神経細胞の脱落が高度であった。従って、CA1と内嗅皮質におけるこれらの神経病理学的変化が記憶障害を主とするアルツハイマー病の痴呆症状の病理学的背景であることが明らかとなった。
脂肪細胞からのアディポネクチン分泌促進化合物の探索とその作用機構の解明

脂肪組織はアディポサイトカインと呼ばれる様々な内分泌因子を産生しており、糖・脂質代謝、動脈壁の恒常性維持に重要な役割を果たしている。中でもアディポネクチンはインスリン感受性・抗動脈硬化作用を有するアディポサイトカインであり、脂肪細胞からのアディポネクチン分泌は脂肪細胞の肥大化と共に低下するため、低アディポネクチン血症はメタボリックシンドロームの病態形成に中心的な役割を担っているものと考えられている。よってアディポネクチン濃度を上昇させる化合物はメタボリックシンドロームの病態を改善させる作用を有することが期待される。本研究では、脂肪細胞においてアディポネクチンの分泌を促進する天然物由来の化合物を探索した。ハダカホオズキ及びリンゴより抽出した化合物には3T3-L1脂肪細胞からのアディポネクチン分泌の総量、さらに、重合体アディポネクチン(high molecular adiponectin)の量も促進する効果がウェスタンブロット法で認められた。さらに収量の高いリンゴ抽出物を用いてアディポネクチンmRNAの発現増加をリアルタイムPCRで測定した結果、mRNAは添加した1時間から増加した。リンゴ抽出物を糖尿病モデルマウスであるKK-Ayマウスに投与した所、血糖値の低下作用が認められた。したがって、リンゴ抽出物には糖尿病を改善する作用を有する可能性が示された。糖尿病などの生活習慣病は日常の食習慣で改善できることが知られているが、本結果は身近な食材を用いて糖尿病の発症を予防及び改善できる可能性が示唆され、今後、ヒトでの応用性が期待される。