hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝子改変マウスにおける痛覚反射と運動反射の定量的解析

α2受容体作動薬デクスメデトミジンとキシラジンは,脊髄の運動及び痛覚反射電位を抑制した.α2A受容体機能的欠損D79Nマウスでは,両薬物の痛覚反射電位の抑制は減弱したが,運動反射電位の抑制は変わらなかった.α2作動薬の鎮痛効果にはα2A受容体が,運動反射の抑制にはそれ以外の機序が関与していると考えられる.脊髄神経活動に影響を与えるアデノシンは,アデノシン代謝酵素阻害薬によってアストロサイトから放出されること,またCa2+除去ではATPが放出されアデノシンに代謝されることが示された,一方,硫化水素はニューロンに発現する合成酵素CST/MPSTで産生され,神経活動に影響を与えることが示唆された.α2受容体作動薬デクスメデトミジンとキシラジンは,脊髄の運動及び痛覚反射電位を抑制した.α2A受容体機能的欠損D79Nマウスでは,両薬物の痛覚反射電位の抑制は減弱したが,運動反射電位の抑制は変わらなかった.α2作動薬の鎮痛効果にはα2A受容体が,運動反射の抑制にはそれ以外の機序が関与していると考えられる.脊髄神経活動に影響を与えるアデノシンは,アデノシン代謝酵素阻害薬によってアストロサイトから放出されること,またCa2+除去ではATPが放出されアデノシンに代謝されることが示された,一方,硫化水素はニューロンに発現する合成酵素CST/MPSTで産生され,神経活動に影響を与えることが示唆された.遺伝子改変マウスでの摘出脊髄標本からの反射電位測定実験系を確立するために、まず正常のマウス(C57BL)を用い実験を行った。新生マウスを安楽殺後、脊髄を摘出し、人工脳脊髄液で還流し、約27°Cに保った実験漕内に摘出脊髄を固定した。人工脳脊髄液は常に95%O_2+5%CO_2で通気することで、標本への酸素供給を維持した。脊髄後根を刺激電極内に吸引し、電気刺激することにより、脊髄前根を吸引した記録電極より反射電位を測定する実験系を確立した。反射電位として、潜時の短い単シナプス反射電位(MSR)と潜時が長い遅発性後根電位(sVRP)が記録された。これらの反応は、ラットから記録されるものと電気生理学的性質が類似していたが、刺激強度-反応関係は、ラットと比較して左にシフトしていた(より弱い刺激で反応が最大に達した)。また、ラットと同様に、マウスにおいても出生後1週間までは、本実験系を用いて反射電位を測定することが可能であることが示されたが、1週間を超えると反射電位の振幅は著しく減少し、実験に供することが極めて困難であることもわかった。これは、ミエリン鞘の発達と、低酸素条件に対する耐性が加齢に伴い減少することが原因と考えられる。マウス脊髄に鎮痛薬であるモルヒネを適用すると、MSRには影響を与えずに、sVRPだけが濃度依存性に抑制された。sVRPは脊髄で痛覚を伝える侵害受容経路の神経活動を反映していると考えられており、モルヒネがマウス脊髄の他の神経経路には影響を与えずに、痛覚だけを選択的に抑制することが電気生理学的に示された。α2A受容体欠損マウス(D79N)マウスを用いて,α2受容体作動薬デクスメデトミジン(DEX)とキシラジン(XYL)の痛覚反射と運動反射に対する効果を,摘出脊髄標本から反射電位を痛覚反射として遅発性前根電位(sVRP),運動反射として単シナプス反射電位(MSR)を記録することにより定量的に解析した.また,神経活動に影響を与える伝達物質である硫化水素とアデノシンの産生機構について,培養神経及びアストロサイトを用いて検討し,以下の結果を得た.1D79Nマウスにおいて,DEXによるsVRP抑制はα2受容体拮抗薬アチパメゾールで回復したが,XYLによる抑制は回復しなかった.さらに,XYLによるこのsVRP抑制は,α2C受容体拮抗薬JP1302やイミダゾリンI1受容体拮抗薬efaroxan,I2受容体拮抗薬idazoxanによっても回復しなかった.以上の結果から,XYLのsVRP抑制には,α2受容体やイミダゾリン受容体を介さない機序が関与していると考えられる.2PC12細胞と知覚神経細胞の硫化水素産生は,pH依存性を示し,細胞質pH(7.0付近)よりもミトコンドリアpH(8.0付近)での方が,産生能が高かった.硫化水素産生酵素であるMPSTは,ミトコンドリアに局在していることが示された.3低Ca2+条件下で,脊髄アストロサイトからギャップジャンクションヘミチャネルを介して放出されたATPは,細胞外で分解されアデノシン蓄積を生じることが示された.α2A受容体サブタイプ欠損(α2A-/-)マウスを用いて,α2作動薬デクスメデトミジン(DEX)とキシラジン(XYL)の脊髄反射電位に対する効果を検討した.また,脊髄アストロサイトからのアデノシン放出作用を検討するために,培養分離アストロサイトを用いて検討を行い,以下の結果を得た.1野生型マウスでは,DEXとXYLは濃度依存性に単シナプス反射電位(MSR)と遅発性前根電位(sVRP)を抑制した.両薬物ともMSRよりもsVRPを強く抑制し,DEXの力価はXYLよりも約1000倍強かった.α2受容体拮抗薬

アチパメゾールは,DEXのsVRP抑制だけを回復させた.2α2A-/-マウスでは,野生型マウスと比較してDEXのMSR抑制効果には差がみられなかったが,sVRP抑制効果は著しく減弱した.一方,XYLによる抑制効果には差は見られなかった.α2A-/-マウスで見られたDEXによるsVRP抑制効果は,アチパメゾールで回復した.3アストロサイトをアデノシン代謝酵素(アデノシンキナーゼ及びデアミナーゼ)阻害薬で処置すると,細胞外アデノシン量が増加した.この反応は,平衡ヌクレオチドトランスポーターENT2の阻害で抑制された.4アストロサイトを細胞外Ca除去液で処置すると,細胞外アデノシン量が増加した.この反応は,ecto-ATPase阻害薬及びギャップジャンクション阻害薬で抑制された.以上の結果から,DEXのsVRP抑制にはα2A受容体が重要であるが,DEXのMSR抑制及びXLYの反射電位抑制効果は,α2A受容体以外の受容体を介して生じていることが示唆された.また,脊髄アストロサイトにおけるアデノシン代謝酵素阻害薬によるアデノシン増加は,ENT2を介していること,一方Ca2+除去によるアデノシン増加は,ギャップジャンクションを介したATP放出が関与していることが示唆された.本年度の主要な目的である新生マウスを用いた反射電位測定実験系を確立する目的が十分に達成されたため。25年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の主要な目的であった,α2受容体サブタイプ欠損マウスを用いた解析を行うことができた.また,脊髄アストロサイトからのアデノシン放出反応からも,新たな知見を得ることができたため.α2Aノックアウトマウスを用いた検討をすでに始めており、さらに他の受容体サブタイプ欠損マウスの解析にも順次着手する予定である。脊髄スライス標本を用いたイメージング法による実験系の確立のため、新生動物から摘出した脊髄を用い、反射電位との反応性を比較検討する計画である。α2A受容体サブタイプ欠損マウスにおいて,α2作動薬デクスメデトミジンとキシラジンの作用に違いがみられたことから,両薬物の作用点をさらに検討する.関与が疑われる他のα2受容体サブタイプ(2B,2C)やイミダゾリン受容体について検討するとともに,in vivo痛覚試験を行い,脊髄侵害受容経路と痛覚に関与する受容体について検討する予定である.また,細胞外Ca2+除去によるアストロサイトからのATP放出経路をさらに検討するため,各種ギャップジャンクション阻害薬の効果や,ギャップジャンクションタンパクサブタイプの発現解析を行い,その放出メカニズムを明らかにする計画である.
高速液中周波数変調AFMによる原子スケールでの結晶成長メカニズムの解明

高速観察可能な液中FM-AFMを用いて、固液界面で起こる結晶成長プロセスを原子スケールで捉え、そのメカニズムを解明することを目的とし、以下の成果を得た。1高速に動作する液中FM-AFMの立ち上げを行い、2sec/frameで観察できることを示した。2FM-AFMによる3次元力分布計測によるイオン結晶表面上の水和構造の可視化メカニズムを、シミュレーションと比較することによって明らかにした。3結晶成長プロセス観察の対象としフッ化バリウムを取り上げ、液中原子分解能観察が可能な溶液条件を明らかにした。4準安定形から安定形へと相転移するアセトアミノフェンの液中原子分解能観察条件を明らかにした。本研究の目的は、高速動作可能な液中周波数変調原子間力顕微鏡(FMーAFM)を用いて、結晶成長の様子を原子スケールで直接観察することで、結晶成長メカニズムを根本から理解することである。平成26年度は、研究代表者の異動に伴い、液中FMーAFM装置を一から立ち上げることに多くの時間を要した。装置立ち上げ後、残りの期間で実験系の再現およびフッ化カルシウム以外の最適な結晶試料の探索を行った。一方で、液中FMーAFMによる水和構造計測の実験結果を理論シミュレーションと比較することで、液中FMーAFMによる水和構造計測メカニズムを議論した。フッ化カルシウム/水溶液および炭酸カルシウム/水界面での水和構造計測の実験結果とシミュレーション結果はほぼ一致することが分かった。そこから、探針先端原子直下で生じる水和構造変化や水の閉じ込めによって探針先端原子に直接作用する力が、原子スケールのコントラストの形成に支配的に寄与することも分かった。本研究は、高速かつ原子分解能で表面構造を観察できる周波数変調原子間力顕微鏡を用いて、結晶成長のプロセスを原子レベルで高速に捉え、成長メカニズムを原子レベルで理解することを目的としている。研究代表者が異動したために、初年度から最終年度途中にかけて、高速周波数変調原子間力顕微鏡を一から立ち上げた。自作の周波数変調原子間力顕微鏡装置をベースに、市販の高速周波数シフト検出器(位相ロックループ回路)を用いるなどして、10nmx10nmサイズの原子像(100点x100点)を1枚あたり2ー3秒で取得できるようにした。また最終年度には、フッ化バリウム(111)表面を、未飽和溶液や過飽和溶液など様々な溶液中で観察した。未飽和溶液中では表面が溶解する様子が見られたが、その中でも高いpHでは水酸化物の析出が見られ、低いpHでは水素吸着がみられた。フッ化物イオンを多く含む溶液では、水酸化物の析出が抑制され、ステップエッジからの溶解が見られ、テラスの上では結晶構造を反映した原子像が得られた。また過飽和溶液中では過飽和度によって結晶成長が2次元的もしくは3次元的に起こることがわかった。一方で、準安定形結晶が安定形へと相転移するプロセスを高速周波数変調原子間力顕微鏡で捉えるための基礎的実験として、アセトアミノフェン結晶の安定形・準安定形の原子分解能観察に成功した。今後、これらの結晶表面で高速周波数変調原子間力顕微鏡イメージングを行い、結晶成長メカニズムや相転移現象のダイナミクスを原子レベルで調べていきたい。当初の計画は、26年度はフッ化カルシウムをはじめとした結晶の成長過程の原子スケール観察に取り組む予定であった。しかしながら、研究代表者の異動に伴い、液中AFM装置を一から立ち上げる必要が生じたため、現状復帰までに相当時間を要した。そのため、目標の時点までは到達しておらず、現時点での達成度は「やや遅れている」と自己評価した。平成27年4月現在、AFM装置は順調に稼働しており、これまでの遅れを取り戻すべく、当初の計画を推進している。走査型プローブ顕微鏡今後は当初平成26年度の予定であった、ステップエッジにおける結晶成長の様子と、そこでの水和構造を液中FMーAFMを用いて原子スケールで観察することを中心に取り組んでいく。また、観察対象として当初はフッ化カルシウムを予定していたが、フッ化バリウムといった他のアルカリ土類フッ化物との比較や、ステップエッジでの成長機構の理解が、良質な結晶作製に重要なタンパク質結晶を対象にすることも考えている。
リフトガンマ線リピーターの形成過程とそのガンマ線発生過程の研究

我々は、γ線バーストのモデルとして磁気波動砲を提出した。シュワルツシルド時空での解析で、中性子星程度の重力崩壊の場合は、この磁気波動砲の電磁波の振動数は【similar or equal】c^3/2GM【similar or equal】10^5s^<-1>程度になることが明らかになっている。周囲にプラズマが少し残っているとプラズマ振動数(4πne^2/m)^<1/2>【similar or equal】9000n^<1/2>s^<-1>より低い振動数の電磁波は反射、吸収されてしまうので、n>10^2cm^<-3>のプラズマがあれば、最終的には、そのプラズマに大部分のエネルギーを渡してしまう。これが磁気波動砲の過程である。しかし、その詳細を理解するには、励起された電磁プラズマ波中での粒子加速過程を数値シミュレーションの手法を用いて調べる必要がある。現在、相対論的粒子プラズマの実空間1次元速度空間3次元コードにより、粒子と波の相互作用と粒子加速過程を調べた。これまでの準備的計算から定常波的なAlfven波が励起される環境では、順伝搬、逆伝搬、右偏光、左偏光の波が混じり合うことで、緩和過程がすみやかにすすみ、高いエネルギーの粒子を生成しやすい事が明らかになりつつある。
地衣類の単離培養を基盤とした新規有用物質の探索と二次代謝の制御に関する研究

地衣類は地衣菌と地衣藻が共生した複合生物であるが,地衣菌を単離培養すると本来の地衣成分とは異なる二次代謝物を生産することがある.従って地衣菌の単離培養は新たな薬用資源として活用しうると考え,日本国内各地で採集した地衣類から胞子由来の地衣菌を単離培養し,その成分検索を行った.Grephis属の地衣菌からは,クロモン類,ベンゾキノン類,ステロールを,Lecanora属の地衣菌からは,ジペンゾフラン類,キサントン類,およびカルボン酸類を,Pyrenula属の地衣菌からは,イソクマリン類を単離した.そのうち計13種は新規化合物であったので,それらの構造決定をおこなった.またGraphis,LecanoraおよびPyrenula属の地衣菌の代謝物の生合成を調べる目的で,^<13>Cで標識した酢酸を地衣菌培養に投与し,ナフトピロンおよびキサントン生合成における酢酸の取り込みとポリケタイド鎖の閉環様式を明らかにした.これら単離地衣菌から得られた多様な代謝物は,共生状態の地衣類の地衣成分とは異なり,菌代謝物と構造的に類似した化合物が多かった.これは「地衣菌は自然界においては共生という生活形態をとるため,地衣藻にとって好ましくない代謝物の生合成の発現は抑制されている.しかし,単離培養条件下では共生を脱したことにより,本来持っていた地衣菌の二次代謝関連遺伝子が発現した」との仮説のもとに,代謝物の地衣藻Trebouxia ericiの成長におよぼす影響を検討した.その結果,単離地衣菌の生産する代謝物が地衣藻の成長を阻害する場合もあるが,必ずしも地衣藻にとって不都合とはいえないことが明らかとなった.さらに代謝物の生物活性の評価として,ヒト膀胱ガン細胞に対する増殖抑制活性についても検討を加えた.地衣類は地衣菌と地衣藻が共生した複合生物であるが,地衣菌を単離培養すると本来の地衣成分とは異なる二次代謝物を生産することがある.従って地衣菌の単離培養は新たな薬用資源として活用しうると考え,日本国内各地で採集した地衣類から胞子由来の地衣菌を単離培養し,その成分検索を行った.Grephis属の地衣菌からは,クロモン類,ベンゾキノン類,ステロールを,Lecanora属の地衣菌からは,ジペンゾフラン類,キサントン類,およびカルボン酸類を,Pyrenula属の地衣菌からは,イソクマリン類を単離した.そのうち計13種は新規化合物であったので,それらの構造決定をおこなった.またGraphis,LecanoraおよびPyrenula属の地衣菌の代謝物の生合成を調べる目的で,^<13>Cで標識した酢酸を地衣菌培養に投与し,ナフトピロンおよびキサントン生合成における酢酸の取り込みとポリケタイド鎖の閉環様式を明らかにした.これら単離地衣菌から得られた多様な代謝物は,共生状態の地衣類の地衣成分とは異なり,菌代謝物と構造的に類似した化合物が多かった.これは「地衣菌は自然界においては共生という生活形態をとるため,地衣藻にとって好ましくない代謝物の生合成の発現は抑制されている.しかし,単離培養条件下では共生を脱したことにより,本来持っていた地衣菌の二次代謝関連遺伝子が発現した」との仮説のもとに,代謝物の地衣藻Trebouxia ericiの成長におよぼす影響を検討した.その結果,単離地衣菌の生産する代謝物が地衣藻の成長を阻害する場合もあるが,必ずしも地衣藻にとって不都合とはいえないことが明らかとなった.さらに代謝物の生物活性の評価として,ヒト膀胱ガン細胞に対する増殖抑制活性についても検討を加えた.地衣菌を単離培養すると本来の地衣成分とは異なる二次代謝物を生産することがある.これは「地衣菌は自然界においては共生という生活形態をとるため,共生藻にとって好ましくない代謝物の生合成の発現は抑制されている.しかし,単離培養条件下では共生を脱したことにより,本来持っていた地衣菌の二次代謝関連遺伝子が発現した」ためと考えることが出来る.そこで数種のTrebouxia属の共生藻の単離培養を行い,このうち最も成長の良好であったTrebouxia ericiを用いて,これまでに地衣菌培養から単離した二次代謝物および既知の地衣成分が,藻類の成長におよぼす影響を検討した.その結果,地衣成分emodinやusnic acid,とくにemodinがより強く共生藻の成長を阻害することが明らかとなった.しかし,地衣菌代謝物の1,8-dihydroxy-5-methoxy-3-methylxanthoneやgraphenoneは予想に反して,共生藻の成長阻害を示さないか,あるいは弱い阻害しか示さなかったことから,単離地衣菌の生産する代謝物が必ずしも共生藻の成長にとって不都合とはいえないことを明らかにした.またGraphis属の地衣菌の代謝物graphenoneの生合成を調べる目的で,^<13>Cで標識した酢酸およびメチオニンを地衣菌培養に投与し,それらの取り込み様式を明らかにした.一方,新たにGraphis属の地衣菌培養を行い,新規化合物を含む数種の二次代謝物を単離し,合成的にその構造決定をすべく現在検討している.地衣類は地衣菌と地衣藻が共生した複合生物であるが,地衣菌を単離培養すると本来の地衣成分とは異なる二次代謝物を生産することがある.

従って地衣菌の単離培養は新たな薬用資源として活用しうるとのコンセプトのもとに,日本国内各地で採集した地衣類から胞子由来の地衣菌を単離培養し,その成分検索を行った.Graphis属の地衣菌からは,クロモン類,ベンゾキノン類,ステロールを,Lecanora属の地衣菌からは,ジベンゾフラン類,キサントン類,およびカルボン酸類を,Pyrenula属の地衣菌からは,イソクマリン類を単離した.そのうち計13種は新規化合物であったので,それらの構造決定をおこなった.またLecanoraおよびPyrenula属の地衣菌の代謝物の生合成を調べる目的で,^<13>Cで標識した酢酸を地衣菌培養に投与し,ナフトピロンおよびキサントン生合成における酢酸の取り込みとボリケタイド鎖の閉環様式を明らかにした.これら単離地衣菌から得られた多様な代謝物は,共生状態の地衣類の地衣成分とは異なり,菌代謝物と構造的に類似した化合物が多かった.これは「地衣菌は自然界においては共生という生活形態をとるため,地衣藻にとって好ましくない代謝物の生合成の発現は抑制されている.しかし,単離培養条件下では共生を脱したことにより,本来持っていた地衣菌の二次代謝関連遺伝子が発現した」との仮説のもとに,代謝物の地衣藻Trebouxia ericiの成長におよぼす影響を検討した.その結果,単離地衣菌の生産する代謝物が地衣藻の成長を阻害する場合もあるが,必ずしも地衣藻にとって不都合とはいえないことが明らかとなった.さらに代謝物の生物活性の評価として,ヒト膀胱ガン細胞に対する増殖抑制活性についても検討を加えた.
多糖体ワクチン接種による特異的IgGサブクラス抗体産生能に関する研究

反復性肺炎、難治性中耳炎、ステロイド依存性喘息、原発性免疫不全症候群、悪性腫瘍、慢性副鼻腔炎などの小児を対象にIgGサブクラスの検討と肺炎球菌多糖体抗体の測定を行った。1.対象は易感染傾向のある小児117名で、そのうち31名にIgGサブクラス異常を認めた。IgG_1欠乏症:5例、IgG_2欠乏症4例、IgG_3欠乏症9例、IgG_1+IgG_2欠乏症4例、IgG_1+IgG_3欠乏症7例、IgG_2+IgG_3欠乏症1例、IgG_1+IgG_2+IgG_3欠乏症1例であった。このうち免疫グロブリン値が正常でIgGサブクラス異常を示したのは14例であった。2.肺炎球菌多糖体抗体の測定方法はpneumovaxを抗原としたELISA法によった。この抗原に階段希釈した被検血清を加え、次いでマウス抗ヒトIgG_1及びIgG_2モノクローナル抗体を加え、更にヤギ抗マウスIgGペロキシダーゼ抗体を加えた後、0-フェニレンジアミンで発色し、492nmの吸光度で測定した。標準血清はpneumovaxを免疫した健康人血清をCL4Bで吸収しpneumovax特異免疫グロブリンを精製した。健常人のIgG_2特異抗体価は接種後3週間後に最も上昇した。その平均抗体価は420.8μg/mlであった、反復性中耳炎に罹患し易い患児の中で特に難治例6例を対象にIgG_2特異抗体価を検討した。その結果、難治例6例中2例にIgG_2欠乏症を認め、IgG_2正常例4例中例にpneumovax投与後の抗体反応が低値であった(0.22-14.4μg/ml)。臨床的にガンマグロブリンの補充療法が有効であった。平成5年度は、反復性肺炎、ステロイド依存性難治性喘息、原発性免疫不全症候群、悪性腫瘍等の疾患を対象にしてIgGサブクラスの検討を進めている。IgGサブクラスの低値を認めた疾患には以下の患児がいた。1)IgG_1欠損:白血病4例,ネフローゼ1例,CVI1例2)IgG_2欠損:白血病4例,反復性肺炎2例,難治性喘息2例,CVI1例3)IgG_3欠損:反復性肺炎2例,難治性喘息2例,CVI1例更に我々は肺炎球菌ワクチンPneumovaxを抗原としたElisaを用い、前記10例、並びに難治性喘息児等を対象にPneumovax接種によるIgGサブクラス抗体反応を検討する。方法はElisaにする予定だが、初めにスタンダートとなる特異抗体の精製をした。カラムはCNBr活性化セファロース4BにPneumovaxをカップリングさせて作製した。このカラムにワクチン接種後の50%硫安カット血清を通過させた後、吸着した特異抗体をNaSCNで溶出した。硫安カット血清とeffluentのサブクラス組成は、ほぼ同じでeluateではIgG_115%、IgG_285%、IgG_31%以下、IgG_4は測定感度以下であった。この溶出液をスタンダートとして特異的IgGサブクラスの定量を行う予定である。平成6年度は反復性肺炎、ステロイド依存性難治性喘息、原発性免疫不全症候群、悪性腫瘍、慢性副鼻腔炎、反復性副鼻腔炎などの疾患を対象にIgGサブクラスの検討をすると共に、肺炎球菌多糖体抗体の測定を行った。

1.対象117名中31名にIgGサブクラスの異常が認められた。2.肺炎球菌多糖体抗体の測定方法は肺炎球菌ワクチン(pneumovax)を抗原としたELISA法で行った。この抗原に段階希釈した被検血清を加え、次いでマウス抗ヒトIgG_1及びIgG_2モノクローナルを加え、ヤギ抗マウスIgGペロキシダーゼ抗体を加えた後、0-フェニレンジアミンで発色し492nmの吸光度で測定した。標準血清はpneumovaxを免疫した健常人血清をCL4Bセファロースを用いpneumovax特異免疫グロビリンを精製した。健常人のIgG_2特異抗体価の上昇は接種後3週間後に強くみられ、その平均抗体価は420.8μg/mlであった。対象は反復性中耳炎に罹患し易い患児の中で特に難治例について検討した。難治例6例中2例にIgG_2欠乏症を認めたが、他の4例は正常であった。Pneumovax投与後の抗体価の上昇は4例に低反応(0.22μg/ml-14.4μg/ml)がみられた。臨床的にはガンマグロブリン補充療法が有効であった。
新しい社会価値を追求するWi-Fi利用シミュレーション教材の開発と実践

本研究の目的は、子どもが企業活動のシミュレーションを通して新しい社会価値を追求する教材を開発し、それをどの教室においても実践できるICTシステムとして提供することである。具体的には、利益至上主義を越えた新たな企業価値を追求する経営シミュレーション・ゲームを開発し、それをパソコン室だけでなく普通教室や集会室など様々な教室で実行できるようWi-Fi環境下で動くシステムとして構築するとともに、教育の情報化に対応して電子黒板等のICT機器と連動させ、より実効性のあるシステム構築を図る。研究3年目の平成28年度は、研究計画書通り、(1)教材の完成に向けての最終調整と(2)ICT機器類と連動したシステム構築を行った。(1)については,前年度の試行実践の結果改良された教材を長崎県内の中学校の社会科授業の一環として実践した。その際に,生徒のワークシートの記述内容から生徒の意思決定結果を分析し、教材としての妥当性を最終的に判断した。また,本教材を使用して授業が展開できるよう授業のねらいや授業展開例、評価問題等の指導解説書、教師用マニュアル、生徒のゲーム中の意思決定を分析する分析シートなど関連付属資料を開発・整備し,その一部をゲームの実行システムのあるウェブページ上に試験的に掲載した。(2)については,タブレットとインタラクティブプロジェクターの連動を構築し,本ゲームを用いた授業における有効な活用法について実験的に検討した。研究計画書通り、(1)教材の完成に向けての最終調整と(2)ICT機器類と連動したシステム構築を実施し,計画した通りの実績をあげているため。平成29年度は、ICT機器等と連動した環境下で教材の実行状況の検証を行い、研究の最終まとめをする。そのために,さらに広範に実証実践を展開していく必要がある。本研究の学校教育現場への普及・展開を一層図り,なおかつ開発教材のより一層の信頼性の向上を得るために,様々な地域・校種の学校に実践を拡大をする。そのための旅費を確保したい。具体的には、利益至上主義を越えた新たな企業価値を追求する経営シミュレーション・ゲームを開発し、それをパソコン室だけでなく普通教室や集会室など様々な教室で実行できるようWi-Fi環境下で動くシステムとして構築するとともに、教育の情報化に対応して電子黒板等のICT機器と連動させ、より実効性のあるシステム構築を図ることである。研究初年度の今年度は、研究計画書通り、(1)教材開発のための基礎準備と(2)Wi-Fi環境での実行システムのテスト準備を行った。具体的には、次の通りである。(1)については、1教材化する事例の選定を行い、2事例の調査と研究を進め、3モデル化を行った。その結果、数種類のゲーム化候補事例が得られたが、それらの事例に共通するモデルの同型性により、「ResortIsland2015」をプロトタイプモデルのゲームとして開発した。(2)については、Wi-Fi環境での実行システムのテスト準備に着手した。その結果、学校内にWi-Fiがある環境、LANのみがある環境、いずれもない環境の3パターンで対応できるシステムを構築した。使用端末として信頼性の高いiPadを揃えた。そのシステムを用い、学会で実験を兼ねたゲームのデモンストレーションを実施した。研究2年目の平成27年度は、研究計画書通り、(1)シミュレーション教材の開発に注力し、仮完成した教材のチューニングを行い、実践提供できるレベルにまで煮詰めていくこと、(2)Wi-Fi環境での実行システムのテストを行った。具体的には次の通りである。(1)については、前年度仮完成した「Resort Island 2015」を大学生、社会人、高校生を対象に実践テストを行い、ゲーム内のパラメータ等の微調整を行った。またゲーム実施に際して必要となるワークシートなどの整備も試行的に行った。その結果をもとに、中学校の正規授業において実践投入することができた。(2)については、学校内にWi-Fiがある環境、LANのみがある環境、いずれもない環境の3パターンで実践テストを実施した。離島においてもテストを実施した。いずれのテストにおいてもシステムは安定して稼働した。研究計画書通り、(1)シミュレーション教材の開発に注力し、仮完成した教材のチューニングを行い、実践提供できるレベルにまで煮詰めていくこと、(2)Wi-Fi環境での実行システムのテストを行うことの2点を実施し、期待通りの成果をあげているため。

研究3年目の平成28年度は、研究計画書通り、(1)教材の完成に向けての最終調整と(2)ICT機器類と連動したシステム構築を行った。(1)については,前年度の試行実践の結果改良された教材を長崎県内の中学校の社会科授業の一環として実践した。その際に,生徒のワークシートの記述内容から生徒の意思決定結果を分析し、教材としての妥当性を最終的に判断した。また,本教材を使用して授業が展開できるよう授業のねらいや授業展開例、評価問題等の指導解説書、教師用マニュアル、生徒のゲーム中の意思決定を分析する分析シートなど関連付属資料を開発・整備し,その一部をゲームの実行システムのあるウェブページ上に試験的に掲載した。(2)については,タブレットとインタラクティブプロジェクターの連動を構築し,本ゲームを用いた授業における有効な活用法について実験的に検討した。研究計画書通り、(1)教材の完成に向けての最終調整と(2)ICT機器類と連動したシステム構築を実施し,計画した通りの実績をあげているため。研究計画書通り、本年度計画の(1)教材開発のための基礎準備と(2)Wi-Fi環境での実行システムのテスト準備を行い、期待通りの成果をあげているため。平成28年度は、(1)教材の完成に向けての最終調整と(2)ICT機器類と連動したシステム構築を行う。平成29年度は、ICT機器等と連動した環境下で教材の実行状況の検証を行い、研究の最終まとめをする。そのために,さらに広範に実証実践を展開していく必要がある。平成27年度は、(1)シミュレーション教材の開発に注力し、仮完成した教材のチューニングを行い、実践提供できるレベルにまで煮詰めていくと同時に(2)Wi-Fi環境での実行システムのテストを行う。また、プロトタイプモデルとして開発した「ResortIsland2015」を実戦投入し、出来ればICT活用の必要性の高い離島部の学校等で実験を展開したい。今年度は、仮完成したゲームとWi-Fi環境下でのゲームシステムのテストを中心に行い、その他のICT機器を組み合わせた学習環境の構築については調査段階に留め、次年度にまとめて実施しようとしたため。本研究がWi-Fi環境下におけるモバイル性を重視した学習環境を構築することを前提とするため,電子黒板を当初計画していた大型の液晶タイプのものから,移動に便利なインタラクティブプロジェクターにしたこと,さらに固定式のインタラクティブモニターについてはその活用法を検討するため比較的小型のものを購入したため。Wi-Fi活用のゲームシステムで使用端末をiPadとし、ゲーム実施に必要な機能を搭載した機種に限定して購入したため若干の余裕が出た。教材の完成に向けての最終調整のための実験旅費とICT機器類と連動したシステム構築のために有効活用する。本研究の学校教育現場への普及・展開を一層図り,なおかつ開発教材のより一層の信頼性の向上を得るために,様々な地域・校種の学校に実践を拡大をする。そのための旅費を確保したい。
小脳神経回路網形成の分子基盤の解明

脳におけるシナプス形成・維持はシナプス間の細胞接着分子によって担われている。小脳平行線維ープルキンエ細胞間シナプスにおいては、ポストシナプスのGluRδ2が分泌蛋白Cbln1を介してプレシナプスのNrxnと結合することでシナプス形成が調節されている。小脳神経回路網形成におけるNrxnsの役割を解明するために、小脳顆粒細胞特異的にNrxn1,2,3を欠損させた遺伝子改変マウスを作成した。小脳顆粒細胞特異的Nrxns欠損マウスは小脳顆粒細胞数と小脳シナプス数が減少し、重篤な運動失調を示すことが観察された。これらの結果は、Nrxnが小脳回路網形成に重要な役割を担うことを示唆している。本年度は、小脳神経回路網形成におけるNRXNsの役割を明らかにするために、小脳顆粒細胞(平行線維)、下オリーブ核(登上線維)でNRXNsを特異的に欠損する遺伝子改変マウスの樹立を行なった。Nrxn1,2,3の細胞膜貫通領域をコードする領域をloxP配列で挟み、Cre組換え酵素依存的にこれらの領域を欠損させるマウスを作製した。作製したマウスは小脳顆粒細胞でCreリコンビナーゼが発現しているマウス系統および下オリーブ核でCreリコンビナーゼが発現しているマウス系統との交配を実施した。本年度までに小脳顆粒細胞選択的Nrxn1,2,3欠損マウスが少数得られた。これらのマウスは重篤な運動失調を示すことから、間接的ではあるがloxP間のCre依存的欠損が確認された。脳部位特異的Nrxn1,2,3欠損マウスが樹立の成功は、小脳神経回路網形成の分子基盤を明らかにする上で極めて重要な研究進展であると考える。また、本年度は併せてGluRδ2-Cbln1-NRXN三者複合体を介したシナプス前終末分化誘導に関わる細胞質内分子複合体の同定を行なった。GluRδ2のN末端細胞外領域をFc融合タンパク質として精製し、磁気ビーズに結合させた後、培養小脳顆粒細胞に添加した。磁気ビーズ上にプレシナプスを誘導させた後、膜透過性クロスリンカーで処理し、複合体を単離した。質量分析装置を用いて網羅的に解析した結果、GluRδ2のN末端細胞外領域を結合させた磁気ビーズから細胞質内タンパク質が35種類位程度同定された。結合候補分子の発現ベクターを構築し、質量分析でスコアの高い候補分子についてGST pull-downアッセイを行なった。現在までに、NRXN1の細胞質内領域結合タンパク質として4種類の新規結合分子が同定されており、独自に開発したスクリーニング法により下流シグナル分子が効率良く単離できることが示された。脳神経回路網形成におけるNRXNsの役割を明らかにするために、小脳顆粒細胞(平行線維)特異的にNrxn1,2,3を欠損する遺伝子改変マウスの樹立と解析を行なった。小脳顆粒細胞選択的Nrxn1,2,3欠損マウスは重篤な運動失調を示し、ローターロッドテストを用いて運動協調を評価した結果、コントロール群に比べNrxn1,2,3欠損マウスは著しく運動協調が低下していることが明らかとなった。また、免疫組織学的解析から小脳顆粒細胞特異的Nrxn1,2,3欠損マウスは生後発達に伴い小脳顆粒細胞が欠落していき、11週令においては大多数の小脳顆粒細胞が消失していることが明らかとなった。これらの結果は、NRXNsが小脳神経回路網形成・維持に必須の分子であることを示しており、脳におけるNRXNsの役割を解明する上で重要な知見となると考えられる。さらに、GluRδ2-Cbln1-NRXN三者複合体の受容体下流シグナルをスクリーニングし、GST pull-downアッセイにより複数の下流シグナル候補分子を得ることができた。今後、候補分子のノックダウンまたは結合阻害実験等で結合の生理的意味を解析していくことでシナプス形成、機能制御のメカニズムの全貌が明らかになっていくものと考えている。本年度は、小脳顆粒細胞特異的Nrxn1,2,3欠損マウスの解析を中心に研究を進めた。下オリーブ核(登上線維)特異的遺伝子欠損マウスについては、遺伝子欠損の効率が著しく低いことが明らかとなり、これらについては下オリーブ核にウイルスをもちいてCreを発現させることを検討した。小脳顆粒細胞特異的Nrxn1,2,3欠損マウスの運動協調をローターロッドを用いて解析を行い、この遺伝子改変マウスが重篤な運動失調を示すことが明らかとなった。小脳顆粒細胞特異的Nrxn1,2,3欠損マウスの小脳の解剖学的解析を行なった。遺伝子改変マウスの小脳は野生型のマウス小脳に比べて極端に小さくなっていることが観察された。さらに、神経細胞特異的なNeuN抗体およびDAPI染色での解析から、8週令の遺伝子改変マウスにおいては小脳顆粒細胞がほぼ消失していることが明らかとなった。3ー4週令の遺伝子改変マウスの小脳をTUNEL染色法を用いて解析したところ、小脳顆粒細胞はアポトーシスによる細胞死により消失していくことが示唆された。さらに、電子顕微鏡を用いた解析を行い、遺伝子改変マウスにおいては平行線維-プルキンエ間シナプスがほぼ消失していることが明らかとなった。この結果は、光学顕微鏡で観察された小脳顆粒細胞の消失によるものと考えられた。

解析に用いる遺伝子改変マウスが重篤な運動失調を示し、予定していた解析の週令に達する前に死亡してしまうことが頻発し、解析が当初の予定よりやや遅れていたが、給水瓶の位置を下方に設置させ、エサを床に直接置くことで解析に必要な遺伝子改変マウスの個体数を得られるようになっている。その他についてはおおむね順調に進展している。高次の脳機能を支える複雑かつ精巧な脳の神経回路網は、発達期におけるシナプス形成とその再編を経て構築されるが、脳神経回路網構築を担うシナプス形成機構は依然として不明な点が多い。本研究は、小脳平行線維ープルキンエ細胞間シナプスの形成を担うGluRδ2-Cbln1-neurexin三者複合体の機能を解析することで、小脳シナプス形成機構の全貌を明らかにすることを目指した。小脳平行線維(小脳顆粒細胞)および登上線維(下オリーブ核)においてneurexin (Nrxn1,2,3)を欠損させ、neurexinが小脳神経回路網構築に果たす役割の解析を試みた。Nrxn1,2, 3の細胞膜貫通領域をコードする領域をloxP配列で挟み、Cre組換え酵素依存的にこれらの領域を欠損させる遺伝子改変マウス系統を樹立し、下オリーブ核特異的Creリコンビナーゼ発現マウスおよび小脳顆粒細胞特異的Creリコンビナーゼ発現マウスと交配を行なった。下オリーブ核においては遺伝子欠損の効率が著しく低いことが明らかとなったため、小脳顆粒細胞特異的Nrxns欠損マウスを中心に解析を行なった。小脳顆粒細胞特異的Nrxns欠損マウスは重篤な運動失調を呈し、ローターロッドテストにおいて有為な運動協調低下が認められた。小脳顆粒細胞特異的Nrxns欠損マウスの小脳は野生型のマウス小脳に比べサイズが極端に小さくなっており、NeuN抗体、DAPI染色による解析から、8週令のミュータントマウスにおいては小脳顆粒細胞がほぼ消失していることが明らかとなった。これらの結果は、シナプス間細胞接着分子neurexinの新たな機能を示唆するものであり、シナプス間細胞接着分子機能異常により引き起こされる脳神経回路網構築過程の異常や機能低下の解明に重要な知見になると考えられる。脳におけるシナプス形成・維持はシナプス間の細胞接着分子によって担われている。小脳平行線維ープルキンエ細胞間シナプスにおいては、ポストシナプスのGluRδ2が分泌蛋白Cbln1を介してプレシナプスのNrxnと結合することでシナプス形成が調節されている。小脳神経回路網形成におけるNrxnsの役割を解明するために、小脳顆粒細胞特異的にNrxn1,2,3を欠損させた遺伝子改変マウスを作成した。小脳顆粒細胞特異的Nrxns欠損マウスは小脳顆粒細胞数と小脳シナプス数が減少し、重篤な運動失調を示すことが観察された。これらの結果は、Nrxnが小脳回路網形成に重要な役割を担うことを示唆している。遺伝子改変マウスの出産数が少数な上、食殺による産仔喪失が重なり、再度交配が必要となり遺伝子欠損マウスの解析が当初予定よりやや遅れていたが、当初予定よりも大きい規模で交配を行い、解析に必要なマウスの個体数を作出できるようになっている。遺伝子欠損マウスは重篤な運動失調を示すことから野生型マウスに比べ生存率が低く、遺伝子欠損マウスの解析が当初予定よりやや遅れている。受容体の下流シグナルの探索につては本年度までに複数の候補分子が得られておりおおむね順調に進展している。
電子スピン共鳴装置を利用した細菌の抗生物質耐性の解析

細菌に抗生物質が作用した時のフリーラジカル挙動を明らかにするため、ESRの測定条件を検討した。スピントラッピング剤は大腸菌に対して殺菌的な効果は示さなかった。菌懸濁液にメナジオンおよびCYPMPOを加え、中心磁場3,524G、測定磁場範囲200G、マイクロ波強度6mWで測定した条件では最も高感度でESRスペクトルが得られた。抗生物質で処理した場合、薬剤耐性の有無はESRスペクトルのピーク強度に影響を及ぼす可能性が示唆された。しかしながら、信号が微弱であることから更なる検証が求められる。ESR-スピントラッピング法を細菌体内のフリーラジカル解析に適用した例は少なく、分析条件も未確立である。したがって、菌体内のフリーラジカルを捉えるのに最適な条件を明らかにすることを行った。スピントラッピング剤として、5-(2,2-dimethy-1,3-propoxycyclophosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (CYPMPO)、5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide (DMPO)、N-tert-Buthyl-α-phenylnitrone (PBN)を使用し、大腸菌の生存性に及ぼす影響を検討した結果、いずれのスピントラッピング剤も大腸菌に死滅的な影響を与えなかった。ESR分光器にはEMX-plusを使用し、中心磁場3524 G、測定磁場範囲200 G、マイクロ波強度6 mWで測定を行った。大腸菌の懸濁液にスピントラッピング剤の濃度が10 mMとなるように加え、経時的にESRスペクトルを観測した。大腸菌の懸濁液から得られるスペクトル強度は非常に小さいことが判明した。懸濁液の濃度を3 log CFU/mLと8 log CFU/mLの2段階に設定してスペクトルを観測した結果、懸濁液中の菌数はスペクトル強度に影響をほとんど及ぼさなかった。大腸菌数を3 log CFU/mLに調整した懸濁液にアンピシリンおよびカナマイシンを作用させ、その際のESRスペクトルを観測した。時間経過とともに信号強度が増加する傾向が示唆されたが、スペクトル強度が自体は非常に小さく、細菌由来のスペクトルであるかを精査する必要がある。今年度については、抗生物質耐性菌におけるフリーラジカル挙動を検討した。グラム陰性菌の大腸菌およびグラム陽性菌の黄色ブドウ球菌のそれぞれに関して、カナマイシン(細胞壁合成阻害剤)およびアンピシリン(タンパク質合成阻害剤)に耐性を有した突然変異株を作成した。作成した抗生物質耐性菌について、TSA培地を使用して37 °Cで24時間培養した後、リン酸緩衝生理食塩水に懸濁し、これに25 μg/mLの濃度になるようにカナマイシンまたはアンピシリンを添加した。これらを37 °Cで2時間静置した後、適量のメナジオンおよびスピントラッピング剤としてCYPMPO(5-(2,2-dimethyl-1,3-propoxy cyclophosphoryl)-5-methyl-1- pyrroline N-oxide)を20 mMの濃度になるように加え、10分間反応させた。また、アンピシリンおよびカナマイシンに感受性をもつ菌株についても同様の操作を行った。このようにして得た溶液について、ESRスペクトルの測定を行った。測定条件は前年度と同様であり、ESR分光器にはEMX-plus(ブルカーバイオスピン株式会社)を使用し、中心磁場3,524 G、測定磁場範囲200 G、マイクロ波強度6 mWで測定を実施した。その結果、大腸菌および黄色ブドウ球のいずれについても、これらの抗生物質に耐性を有する場合には、感受性をもつ場合と比較して酸素系のフリーラジカルに由来するピークが強く観測される現象が観測された。この結果から、ESRスペクトルのピーク強度から抗生物質耐性の有無を判別できる可能性が示唆された。今年度についてはこれまでに検討していない細菌を対象として、抗生物質耐性とフリーラジカル挙動の関係を調査した。リファンピシン耐性を獲得した大腸菌O157:H7を作成し、これを実験に使用した。リファンピシンを加えたTSA培地を使用して37°Cで24時間培養した後、リン酸緩衝液(pH 7.2)に懸濁し、その後リファンピシンを加えた。最終的に、リファンピシンの濃度は25μg/mLとなるように調整した。このようにして作成した菌懸濁液を37°Cの環境下で2時間保存した後、メナジオンを適量加えた。さらに、CYPMPO(5 -(2, 2-dimethyl-1, 3-propoxy cyclophosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline N-oxide)をスピントラップ剤として添加し、濃度は20 mMとなるように調整した。その後、ESRスペクトルの測定を行った。測定条件については前年度までと同様であり、分光器としてEMX-plus(ブルカーバイオスピン株式会社製)を使用した。大腸菌O157:H7のリファンピシン耐性株は感受性株と比較してピークが高くなる傾向が示唆された。このことから、大腸菌O157:H7に関しても、ESRで得られるピークの強度を利用して抗生物質耐性の有無を識別できる可能性がある。しかしながら、微生物由来の信号は微弱であり、ノイズの影響も無視できないため、今後の更なる精査が必要である。

菌懸濁液にメナジオンおよびCYPMPOを加え、中心磁場3,524G、測定磁場範囲200G、マイクロ波強度6mWで測定した条件では最も高感度でESRスペクトルが得られた。抗生物質で処理した場合、薬剤耐性の有無はESRスペクトルのピーク強度に影響を及ぼす可能性が示唆された。しかしながら、信号が微弱であることから更なる検証が求められる。これまでに、細菌懸濁液を分析するためのESR測定条件を明らかにし、その条件に基づいて大腸菌および黄色ブドウ球菌のESRスペクトルを測定した。その結果、抗生物質耐性を有する場合には、酸素系ラジカルに起因するピークが強く出現することを観測し、ESRスペクトルから抗生物質耐性を判別できる可能性を示した。これらの結果は、おおむね当初の計画通りであり、順調に研究計画を進めているものと判断している。食品微生物学平成27年度では当初の計画通り、フリーラジカル挙動をインジケーターとして抗生物質耐性を有するか否かを判別する技術の開発を試みる。前年度までに、アンピシリンおよびカナマイシンが細大腸菌および黄色ブドウ球菌に作用した際のフリーラジカル挙動を検討した結果、これらの抗生物質に耐性をもつ細菌では酸素系のラジカルに由来するESR信号が強く観測されることを観測した。これを逆に利用して、細菌の抗生物質耐性は調べる開発を目的とする。前年度までに使用した抗生物質以外のものを試験対象に加えて、判別可否を調べる。具体的には、リファンピシンおよびテトラサイクリンを試験する。あらかじめ、抗生物質に感受性をもつ細菌と耐性を有する細菌を用意し、対象の抗生物質を作用させ、その後のESRスペクトル情報からフリーラジカル種の挙動を評価することにより、抗生物質耐性の迅速判別が可能であるか否かを検討する。また、ESRの使用のみならず、簡易な発行測定等を利用した迅速判別法の可能性を探索する。ESR-スピントラッピング法により細菌体内のフリーラジカル挙動を解析するための分析条件を明らかにすることを目的としてきた。その結果、各種のスピントラッピング剤が大腸菌に死滅的な作用を及ぼさないことを明らかにし、これらのスピントラッピング剤を大腸菌に使用するうえで支障がないことを示した。また、大腸菌の懸濁液をESR分光器で測定するための条件を得られた。一方で、大腸菌の懸濁液から得れらるスペクトル強度は想定よりもかなり小さく、より高精度の解析を行うために、測定条件の更なる適切化を引き続き行う必要が発生した。当所の見通しよりも実験等を効率的に進めることができたため、試薬・消耗品にかかる支出が予定よりも少なくなったため、次年度使用額が発生した。細菌懸濁液から得られるESRスペクトルの強度が想定よりも小さいことを踏まえ、より高精度の解析を行うために、測定条件の一層の適切化を今年度の前半に行う。その後は当初の計画通り、抗生物質を薬剤耐性菌に作用させた際のフリーラジカル挙動を解析する予定であり、抗生物質の感受性とフリーラジカル挙動の関連について明らかにする。抗生物質の試験対象範囲を拡げるにあたり、スピントラッピング剤などの試薬・消耗品が大量に必要となるため、それらの経費とする。また、研究成果の情報発信等を積極的に行うため、校閲費・旅費等に使用する。
根の成長プログラムの分子基盤の解明

植物は環境ストレスを受けると、根端メリステムを縮小させ、細胞分裂を停止させることで根の成長を抑制する。そこで、環境ストレスによる根端メリステムサイズとの関係を調べたところ、植物はDNA損傷ストレスを受けると、サイトカイニン生合成遺伝子が根の移行領域で特異的に誘導されることで、メリステムサイズの縮小を引き起こしていることを見出した。さらに、サイトカイニンシグナルの活性化にともない、オーキシン輸送に関わるPINs遺伝子の発現が低下することや、DNA損傷に応じてオーキシンシグナルの抑制に働くAUX/IAA遺伝子が、根の幹細胞付近で発現誘導されることから、根の幹細胞でのオーキシンシグナルの低下が引き起こされていることが示唆された。そして、植物はDNA損傷を受けると、幹細胞で特異的に細胞死が引き起こされるが、根端でのオーキシンシグナルの低下が幹細胞の細胞死の誘導に関わっていることを見出した。また、細胞死を起こした根の幹細胞を再生するために、通常ほとんど分裂を行わない静止中心(以下、QC)細胞が、分裂を活性化させることで新しい幹細胞を生みだすことを発見した。以前までの研究で、ブラシノステロイドがQC細胞の分裂に関わっていることが報告されていたが、幹細胞の再生時には、ブラシノステロイド受容体がQC細胞付近で特異的に発現することにより、QC細胞でのブラシノステロイドシグナルを活性化させていることを見出した。そして、ブラシノステロイドシグナルの活性化に伴い、QC細胞の分裂が誘導されることを明らかにした。27年度が最終年度であるため、記入しない。現在までに、サイトカイニンの初期応答に関わる転写因子Type-B ARRs (Arabidopsis Response Regulators)が根の移行領域で発現することで、根端メリステムサイズを決定していると考えられている。しかしながら、ARRsがどのように空間的に発現制御され、どのような下流イベントを統合的に制御しているのかは不明である。そこで本研究では、根端メリステムのサイズを制御する分子機構を明らかにすることで、外部環境に応じた根の成長プログラムを理解しようとしている。初めに、Type-B ARRの分解制御に関与するF-boxタンパク質について解析を行なったところ、Type-B ARRと同様に根の移行領域で蓄積することを明らかにした。さらに、サイトカイニンを処理することで移行領域でのF-box遺伝子の発現が低下したことから、このタンパク質はサイトカイニンの量的増減に応じて移行領域でのサイトカイニンシグナルを鋭敏に変化させる重要な役割を担っていることが明らかになった。次に、環境に応じた根端メリステムサイズの制御機構を探るため、DNA損傷剤を用いてその分子機構を調べたところ、DNA損傷シグナルの情報伝達系を介してサイトカイニン生合成遺伝子の発現が誘導され、移行領域でサイトカイニンが高蓄積することが明らかになった。この結果から、環境ストレスに応じた根端メリステムサイズの制御に、根の移行領域でのde novoのサイトカイニン合成が重要な役割を果たしていることが明らかになった。Type-B ARRsの空間的発現制御にタンパク質分解との関連性が見えてきたので、24年度以降の展開が非常に興味深くなってきている。また、環境ストレスに応じた根端メリステムサイズの制御にもサイトカイニンが重要な役割を果たしていることを新たに見出したことから、おおむね順調に進行している。現在までに、根の移行領域におけるType-B ARRの標的遺伝子は、SHY2(オーキシンシグナルの抑制)とCCS52A1(細胞周期の進行阻害)しか知られていない。根端メリステムサイズの決定機構を包括的に理解するためには、ARRsの標的遺伝子を網羅的に同定し、細胞分裂から分化への移行を制御する各種イベントを分子レベルで捉える必要がある。そこで、ARRsの直接の標的遺伝子をマイクロアレイ、ChIP-seq解析により明らかにし、根端メリステムでの発現パターンや欠損株での根端メリステムの表現型解析を進めていく。

さらに、ARRs遺伝子の空間的な発現制御機構を明らかにするために、ARRの遺伝子発現を制御するシス領域を同定し、転写制御因子を明らかにする。27年度が最終年度であるため、記入しない。
複雑構造固体としての近似結晶の塑性変形機構

本研究は複雑構造を有する金属間化合物である準結晶とその近似結晶中の格子欠陥に関する知見を得ることを目的としている。今年度は昨年度に引き続き、固体中に存在する種々の格子欠陥ダイナミクスに関する情報を得る上で有用である内部摩擦測定を行った。試料として、ブリッジマン法により作製したAl-Pd-Mn系正20面体単準結晶、その一部を粉砕しプラズマ活性化焼結を用いて作製した焼結体、Al-Pd-Mn-Si系2/1近似結晶および1/1近似結晶を用いた。内部摩擦測定には強制振動法を用い、曲げモードで室温から600°Cの温度範囲で実施した。本研究によって、準結晶および近似結晶の内部摩擦の温度依存性が大きく異なることが明らかとなった。Al-Pd-Mn系正20面体準結晶においては、100°C近傍および550°C近傍に内部摩擦ピークを観測した。こららのピークは1/1近似結晶では観測されず、2/1近似結晶では非常に弱い強度として観測された。高温側ピークの熱活性化解析から、活性化エネルギーE4eV、前指数因子τ0=10-20sが得られ、このピークに対応する緩和過程は多数の原子の集団的な運動であることが示唆される。このような緩和過程としては、転位の運動あるいは大域的なフェイゾン緩和が挙げられる。同様の活性化パラメータが種々のフェイゾン自由度の動的観測と対応しており、このピークの起原は集団的に相関を持ったフェイゾンジャンプであることが示唆される。このようなフェイゾン自由度に起因したダイナミクスの存在は、準結晶および近似結晶における塑性変形の微視的機構に寄与するはずであり、本研究の成果は上記課題の解明への足がかりとなることが期待される。本研究は複雑構造を有する金属間化合物である準結晶とその近似結晶中の機械的性質、特に転位の挙動、塑性変形に関する知見を得ることを目的としている。今年度は固体中に存在する種々の格子欠陥ダイナミクスに関する情報を得る上で有用である内部摩擦測定を行った。Al-Pd-Mn系正20面体準結晶母合金60gをアーク溶解により作製後、アルミナ坩堝に詰め、ブリッジマン法を用いておよそ5cmの単準結晶を育成した。試料は背面反射ラウエ法、粉末X線回折およびSEM/EDSにより評価した。内部摩擦測定には強制振動法(室温600°C)および片持ち共振法(室温800°C)を用いた。高温内部摩擦測定結果から、Al-Pd-Mn系正20面体準結晶は100°C近傍および550°C近傍に内部摩擦ピークを示すことが確認した。高温側のピークの熱活性化解析から、活性化エネルギーE=3.6eV、前指数因子τ0=10-20sが得られ、このピークは多数の原子の集団的な運動が寄与する緩和過程であることが示唆される。理論的には、フェイゾン自由度に起因する緩和過程は異方的な内部摩擦を生じることが予測されているが、本研究ではそのような異方性は観測されなかった。この試料を塑性変形することによる転位を導入し、転位密度による内部摩擦の変化を測定することにより、この高温側ピークがフェイゾン自由度に起因するものか、転位の運動によるものかが明らかになると考えられる。また、準周期性の効果、フェイゾン自由度の効果が明らかにするために、近似結晶の内部摩擦測定を行い、準結晶と比較する予定である。