hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分岐型ユビキチン鎖が司る新たなシグナル伝達機構

ユビキチンの多彩な機能は、ポリユビキチン鎖の構造多様性を基盤としている。そこで本研究では、近年明らかになった分岐型ユビキチン鎖に着目し、分岐型ユビキチン鎖が司るシグナル伝達機構を解明する。そのために本年度は、分岐型ユビキチン鎖形成酵素の機能解析を行った。細胞内には複数の分岐型ユビキチン鎖形成酵素が存在する可能性が高いと考えられる。そこで、生化学的な手法により、分岐型ユビキチン鎖を形成する酵素および標的タンパク質を探索した。その結果、NEDD4型ユビキチンリガーゼITCHを見出した。ユビキチン鎖を質量分析技術により定量的に解析を行った結果、ITCHは細胞内で標的タンパク質TXNIPを分岐型ユビキチン鎖で修飾することが明らかとなった。ITCH自身はin vitroでK63ユビキチン鎖を形成することから、分岐を形成するのに必要な相互作用因子を探索した。その結果、3種のユビキチンリガーゼ(UBR5、HUWE1、UBR4)を同定した。ノックダウンによる検討の結果、これらユビキチンリガーゼがK63鎖に対してK48分岐を挿入することで、分岐型ユビキチン鎖を形成していることが示唆された。従来、K63型ユビキチン鎖はプロテアソーム非依存的な細胞内経路を制御することが報告されていた。本研究から、K63鎖が分岐鎖形成の種として機能することで、結果的にプロテアソーム依存的なタンパク質分解を制御することが明らかとなった。分岐型ユビキチン鎖形成酵素を見出し機能解析を行うことで、分岐型ユビキチン鎖の役割の一端を明らかにすることができた。分岐型ユビキチン鎖のさらなる細胞内機能、関連するユビキチンリガーゼについて解明していく。
ディルドリン汚染土壌に対するバイオレメディエーション技術の開発

殺虫剤ディルドリンに汚染された土壌で栽培されたウリ科野菜から残留基準値を超えるディルドリンが検出され、大きな社会問題になっている。これら汚染土壌を浄化する技術としてバイオレメディエーションの研究がされているが、実現していないのが現状である。我々は昨年度までの研究で、ディルドリン汚染土壌浄化技術を開発する為、1新種のディルドリン分解菌KSF27株を単離、2単離された分解菌の同定、3KSF27株を用いたディルドリン分解試験、4ディルドリンの新規分解代謝物の探索を行った。今年度はKSF27株によるディルドリンの新規分解代謝経路を推定する事を目的とした。水溶性代謝物の探索においてLC-Orbitrap MSを用いて、未知代謝物の精密質量から代謝物の構造を推定した。KSF27株はディルドリンをアルドリンジカルボン酸まで代謝するが、この他にも代謝物が存在すると考え、ディルドリンの初発代謝物として報告のあるアルドリンジオールを初期基質とした分解試験をおこなった。分解試験後の培養液をLC-Orbitrap MSにて測定した。結果、アルドリンジオール代謝物の特徴である6塩素化合物と思われるイオンが検出された。これら代謝物のMSフラグメントから、組成式に基づく精密質量の理論値と、ODSカラムにおけるアルドリンジオールや、アルドリンジカルボン酸など、既知の代謝物における溶出時間を比較することで構造を推定し、ディルドリンの新規分解代謝経路を明らかとした。ディルドリンにおける微生物分解代謝経路の報告は、アルドリンジオールまでしかなく、その下流の代謝物を明らかとしたのは本研究が初めてである。バイオレメディエーション技術確立の為には、分解生成物の毒性評価をおこなう必要がある。分解代謝物を明らかにする事により、実際の汚染土壌に対して微生物資材を投入する安全指標を作る事に貢献する事が出来た。(抄録なし)当該年度は単離に成功したKSF27株を用いて、「ディルドリン汚染土壌に対するバイオレメディエーション技術の開発」を目的として、研究全体を以下の2課題に分割して目的達成の為に検討を行った。Iディルドリン分解菌集積木質炭化素材の開発と評価・KSF27株を木質炭化素材へ集積KSF27株集積木質炭化素材を作成した。この集積炭化素材を用いて土壌中におけるディルドリンの分解試験を行ったところ30日間で5%減少させる事ができた。今回の試験において、KSF27株による土壌中でのディルドリン分解率に課題を残したが、今後は栄養源の投入や、各種資材の併用等によって分解効率を高める方法を検討する必要がある。IIディルドリンの分解メカニズムの解明・KSF27株による、分解代謝経路の推定KSF27株を用いたディルドリン分解における分解代謝物の探索を行い、ディルドリンを初期基質とした新規代謝物としてアルドリンジカルボン酸を同定した。また、LC/MSを用いたアルドリンジオールを初発とする長期分解試験において、新たな分解代謝物を検出する事に成功した。それにより、ディルドリンの新規分解代謝経路を推定する事ができた。ディルドリンにおける微生物分解の報告は過去に三例しかなく、その代謝物の報告も一例しか無かった。本研究は40年間明らかにされなかったディルドリン代謝物を特定した。その事により、新規分解代謝経路を提唱する事ができた。これらの結果を用いる事で、今後は分解酵素遺伝子の探索を行う事ができ、残留性有機汚染物質における生物分解のメカニズムが解明される。当初の計画通りディルドリン分解菌の分解代謝物が明らかとなった。これらの結果を利用して、今年度に行う予定である分解酵素遺伝子の特定をする。

土壌中における分解においては分解条件検討が必要となったが、おおよその目途も立ち、順調に研究が進んでいる。・KSF27株による、他農薬分解代謝物の探索KSF27株が分解するのはディルドリンだけではなく、エンドサルファンやヘプタクロル、DDT、PCB、クロルデコンなど様々な残留性有機塩素系化合物も分解する事ができる。この事から今年度はGC/MS,LC/MS/MS等を用いてこれら代謝物を同定しようと考えている。・KSF27株による、分解酵素遺伝子の探索Pseudonocardia属の分解酵素遺伝子については過去にジオキサンやテトラハイドロフランといった物質において酸化酵素遺伝子が単離されており、それに準じて行えば分解酵素遺伝子を特定する事が可能であると考える。(抄録なし)
ヨーロッパ統合における補完性原理の研究-ポスト・ナショナルな政治思想の可能性-

本研究は、1993年施行のマーストリヒト条約によって、いわばヨーロッパ連合(EU)の「立憲原理」となった補完性(サブシディアリティ)原理の分析をつうじて、ナショナルの枠と伝統的に結びついてきた政治学的諸概念を批判的に再検討し、ポスト・ナショナルな政治思想の在り方を探ることを目的とした。この作業は、根本的には、民主主義・市民権・公共性といった政治学の基本概念を多層的政体の中に位置づけ直し、そのことによって、それらを長らく呪縛しつづけたナショナルな枠から解放するという意味を持っている。まず平成11年度の前期(4-9月)では、民主主義理論や社会契約説に焦点を当て、いかなる意味でこれらがナショナルな枠に縛られてきたのか、あるいはそれを補強してきたのかを明らかにし、後期(10-3月)では、ナショナルな枠を前提としなかった、ないしはそれに対し対抗的であった思想家を取りあげ、対極にある思想軸を明示化した。そして、これらの理論家を取り上げながら、「補完性原理とその敵たち」というタイトルでラフな英文草稿を仕上げ、国際会議で発表した。平成12年度は、この成果をさらに進化拡大させ、英文著作の草稿を書きためることに専念した。またその際、従来の国際政治・ヨーロッパ政治研究者と異なる思想史系の先学との研究打ち合わせを札幌以外の土地で重ねることで、研究成果の含意の広さに気づかされ、その提示の方法に工夫をすることが可能になった。これらを近い(1年)内に完成させる予定の英文著作に取り入れたい。初年度である本年は、ヨーロッパ連合=EUにおける立憲原理である補完性(サブシディアリティ)を、重層的な政体を支持する原理として位置づけ、ポスト・ナショナルな政治思想の在り方を探った。これは、ナショナルの枠と伝統的に結びついてきた政治学的諸概念(民主主義・公共性・市民権)を批判的に再検討する事を意味した。民主主義がナショナルの枠の中でしか作動しておらず、公共空間は国境ごとに分断され、「市民」は「国民」とほぼ同義語化しているという現状にたいして、EUにおける補完性の考え方は、多層的政体を理念的に支持し、立ち上げることを目指しており、それに従えば、既成の政治学が依って立つ概念上の基盤が揺らぐという点に注目したわけである。もとよりこれらの再検討は時間のかかる作業であるが、当面今年度は、政治思想史・法哲学・憲法学、またヨーロッパ研究などの分野で開かれた研究会で、これまでの論考をぶつけ、そこでの反応を見ながら思索を深めることになった。なかでも、英ワオーリック大におけるシンポジウムにおいて発表の機会をもてたことは、幸いであった。さらに、そこで深められた成果の一部は公表され、なかでも「重層化する政治空間」『世界』論文(1999年658号)は、本研究プロジェクトの成果を要約的に世に問うたものとなった。次年度は、これらの論考をまとまった著作の草稿へと発展されることを目標としたい。
サービス分野の事業創出法　－　製造業におけるイノベーションの応用展開

製造業の研究開発事例。研究所の現代的意義の見直し、CTOの役割の再確認、情報の伝達必要な共通の文化・共通の目標・師弟関係、研究所から事業部への技術移管の最適タイミング。サービス分野における事業創出事例。課題解決(サービス)を優先、行政機関による産業振興施策にとらわれない、新事業にとって障壁となる規制に挑戦。ディスカウント店が描く国際観光客誘致の戦略は、不満足要因を取り除きながら同時に満足要因を高める。日本型サービスのグローバル対応。現地化して大市場(ペットボトル茶)、対面での交流や説明を重視して確実な顧客を確保(江戸前鮨)、両者の中間で中程度の市場(学習塾、お香)。ビジネスの特徴によって変化。本研究はサービス分野でのイノベーション創出に貢献することを目的としている。初年度すなわち平成22年度は、現代製造業でのイノベーション最新事例を調査した。今後、2年目(平成23年度)はサービス化する製造業の、3年目(平成24年度)はサービス業そのものの事例を調査する予定である。こうしてサービス分野の研究開発の事例を収集し、分析し、製造業の研究開発と対比することによってサービス研究開発の現在地を確認し、サービス分野における試作の位置づけなどの方向性を展望し、サービス分野でのイノベーション創出に寄与することを目指している。今年度の実績の一つは、三洋電機の研究開発体制の変遷の概観である。米国では中央研究所の終焉が言われているが、日本では以下のような点でまだ期待が持たれていると言ってよいだろう。1.中央研究所発のリニアモデル追求型(素材型や化学)の基礎研究例:二次電池など2.事業部とともに歩む連鎖モデル型(アセンブリ機器型)の応用研究例:デジカメなど3.オープンイノベーションの実質的な担い手としての役割(社外からの技術導入、その時の技術評価と知識統合、社内技術の価値評価)またCTO (Chief Technology Officer)の定義・役割について、CTOが強い権限とリーダーシップを持っていた頃には中央研究所が成果を出せていた時代でもあるということや、長期的視野に立つ基礎研究に軸足を置けと命ずるのか事業への直接的貢献を指示するのかといった舵取りの問題を浮き彫りにした。別の研究実績では、複数の製造会社の事例を収集し、組織内で技術情報の伝達が企図されたときに、どのような時に正確に伝わり、どのような時に伝達が失敗するのかを事例分析している。以上のような今年度の成果は、製造業に特有のもののようでいて、掘り下げるとサービス業の研究開発でも直面したり応用可能であったりする知見であり、次年度以降の研究との連携に大いに期待できるものであると考えている。研究の目的は、製造業におけるイノベーションを調査し、それを応用展開することでサービス分野の事業創出を目指すことである。そのために、まず現代製造業でのイノベーション最新事例を調査し、次いでサービス分野の研究開発の事例を収集・分析し、製造業の研究開発との対比においてサービス研究開発の現在地を確認して、サービス分野における試作の位置づけなどの方向性を展望する。昨年度までの本研究の成果、とくに製造業の研究開発に関するのものには、以下のようなものがある。1.米国などでは役割を終えたとされる企業内中央研究所が、日本では組織目標に工夫を凝らすなどして事業に貢献し続けている(前川ら「電機メーカにおける研究開発戦略の変遷事例一企業内研究所の存在意義を考える」平成22年9月・日本経営学会第84回全国大会)3.技術情報の伝達は、その情報に合理性さえあれば可能となるわけではなく、発信者と受信者の間で、次のどれかが共有されてるか成立していなければならない。共通の文化、共通の目標、師弟関係(前川「知の伝達の成否」平成23年3月・日本ナレッジマネジメント学会研究年報第10号)4.研究所から事業部への技術移管のフェーズにおいて、若手エンジニアを転出させながら、リーダー格を研究所に残すことで、事業化にまつわる諸問題を解決している例がある(前川ら「技術転換期における人事異動に関する一考察」平成23年3月・日本経営学会九州部会)製造業の研究開発に関する知見の例。1.企業内中央研究所が日本では事業に貢献し続けている、2.研究所長の役割はワンマン型合議型アドバイザー型へと変遷している、3.技術情報の伝達は発信者と受信者の間で次のどれかが共有されているか成立していなければならない:共通の文化、共通の目標、師弟関係、4.研究所から事業部への技術移管において、若手を転出させながらリーダー格を研究所に残すことで事業化にまつわる諸問題を解決している例がある。この14の運用は、そのままサービス分野の規模の大きな企業でのサービス事業開発にも適用可能である。

サービス分野の中小企業における事業創出で、まず製造業(ロボット)ながらサービス視点で目覚ましい業績を上げている企業では、1.ロボットを前提とするのではなく課題解決(サービス)を優先して設計する、2.行政機関による産業振興施策のあり方にとらわれずに自立すべきところは自立、3.新事業にとって障壁となる規制には挑戦すべきときは挑戦する、4.海外展開のプロセスでは大きな絵を描くよりもまずは先方の特定のニーズに徹底的に答えることから門戸を開く、などの教訓が得られた。次にディスカウント店(ドンキホーテ)が描く国際観光客誘致の戦略は、1.不満足要因を取り除きながら(外国語スタッフの充実、通貨やカードの利便性向上など)、2.同時に満足要因を高める(国ごとの土産品の提案、魅力的な品揃えとその陳列法など)、これらのどちらを欠くことなく推進している点が、学ぶべき点であると考えられる。日本型サービスでグローバル対応するには、A.製造業と同様、現地化して大きな市場を狙う(例:ペットボトル茶)、B.対面での交流や説明を重視して、小規模だが確実な顧客を確保する(例:江戸前鮨)、C.両者の中間で、中程度の市場を狙う(例;学習塾、お香)など、ビジネスの特徴によってねらいが変わる。当初予定では、1年目:製造業、2年目:製造業からサービス業へと転換した企業、3年目:サービス業をそれぞれ取材したのちに、目的に沿った結果をまとめる予定であった。しかし、製造業での知見が予想以上に広くかつ深く得られつつあったことと、製造業からサービス業への転換企業の実例がほとんどないことなどから、2年目も製造業の調査分析を充実させる方針とした。このことによる、3年目の計画遂行について遅れを出すことはなく、また全体のまとめの方針などに変更が必要となるわけでもない。全体に、おおむね順調に進展し、今年度末に計画に沿った結論を得られる予定である。25年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の研究計画の一つは、サービス産業には特有の研究開発の経験則が生きているのかどうかの調査となる。対象企業はこれまでに関係を築いてきた旅館業、商店街連合の連合、老舗製造小売り、地方自治体などである。この部分を本年度前半の計画とする。本年度後半すなわち本研究全体の総括の部分では、上のような製造業の研究開発での命題をサービス産業の研究開発へ転用するには、という提言をまとめる。具体的には上で述べたサービス業それぞれに適合的な方法を提案することを目指す。
痛風の原因となる関節液中の尿酸結晶構造の反磁性リアレンジメント

痛風等の原因物質である尿酸の結晶の磁気および光特性を調べることで,痛風の新しい治療・診断法の原理となり得る手法の検討を行った.尿酸結晶の形態に対する磁場作用を調べた.また結晶成長の光学的計測による医療診断を可能とするため,微結晶による光反射と磁場配向特性との関連も調べた.モデル実験系として,尿酸のアモルファス結晶の状態からpH変化で瞬時に板状結晶に構造変化させる手法を開発した.板状結晶が生成すると同時に磁場下での回転運動が起こることを500ミリテスラ磁場下で観測した.尿酸結晶の光反射の異方性は非常に強く,結晶成長および形状の遠隔計測評価のための有用な情報となる.H27年度は、痛風および尿路結石発症のモデル実験系の構築のため結晶作成条件の検討を進めた。磁場印加前の結晶形状をコントロールするため、尿酸の濃度、pH、温度等のパラメータを変化させた際の結晶化特性データを収集した。ここでは、密封した薄層ガラスチャンバー内に過飽和濃度の尿酸水溶液を浸透させ、温度ジャンプにより尿酸結晶析出の速度と結晶形状を制御することに成功した。また、作成した微結晶を薄層チャンバーに密閉した状態で、電磁石と組み合わせた顕微観察系で観測するための実験系の構築・改良も進めた。微結晶の反磁性の磁気異方性による回転の向き、および回転速度の解析を行った。特に、外見形状がほぼ球形である直径1ミクロン程度の尿酸結晶について、その磁場下での光散乱方向性について詳細なデータを収集し、ミクロンスケールでの反磁性的な磁気回転が生じないと考えられる条件において、ナノスケールでの結晶構造の磁気応答の挙動を高感度に検出することに成功した。開発した磁場下での微結晶サスペンションの光散乱の異方性計測手法を発展させ、尿酸結晶やシュウ酸結晶の結晶成長プロセスにおける形状変化・構造変化の評価が可能な手法も構築した。さらに、0.5Tの永久磁石からの磁力線の方向を周期的に変動させる装置を試作した。磁場をある速度で回転させ磁力線方向を変え続けることで,尿酸結晶成長の抑制の可能性を調べるための初期実験を行った。人体内で尿酸結晶が他の生体物質と複合化した状態での磁気回転挙動を観察するため、ガラス基板上に作製した幅数十ミクロンの間隙にあらかじめ炭酸カルシウム結晶の層を形成させ、その層の近傍に尿酸微結晶の成長層を導入したモデル実験系を構築した。このガラス基板に温度勾配を与えることで、微結晶成長層内での対流および外部磁場による勾配磁気力の効果を調べるための予備実験系も得ることができた。痛風に関係する微結晶の結晶化条件の設定、微結晶の光散乱特性を磁気的に制御する手法を確立し、初年度の研究計画での予定項目を順調に遂行することができた。H28年度の研究計画に向け、その解決が必須となる課題の検討はクリアできた。なお、当初予定していなかった外見形状がほぼ球形である直径1ミクロン程度の尿酸結晶に関し、ナノスケールでの結晶構造変化の磁気応答が検出できたため、H28年度は引き続き、この球状の尿酸結晶の光散乱・磁気特性についても取り組みたい。尿酸・シュウ酸カルシウムの微結晶が再結晶化する過程での磁場印加が,結晶の形状に及ぼす効果を顕微鏡観察で評価した。超伝導磁石(5テスラ)および最大500mTの強磁場を発生する電磁石を用い、磁場発生空間内部に設置した磁場中顕微鏡(1000倍の倍率)で磁気応答の検出を行った。ファイバーアタッチメントを用いた分光計測を用い、微結晶の形態変化過程をクロスニコル透過偏光(複屈折)で評価した。5Tあるいは500mT磁場の有無での、再結晶化した微粒子の形態および透過偏光の比較を行った。強塩基のNaOH水溶液に高濃度の尿酸を分散させミセル化した状態からpHを中性に移行させて、急速に板状結晶を形成させた。この結晶化過程に強磁場を印加することで、ミセル化水溶液が流動状態で且つ微結晶が凝集した状態でも、板状結晶の配向をそろえることが可能であった。また、透過偏光計測により微結晶の配向方向変化の検出に成功した。さらに、ミセル状態にある微結晶と板状(および針状)結晶化直後の結晶化浮遊サスペンションを磁場中でX線構造解析した。ミセル状態では微結晶はアモルファス化しており、再結晶化過程ではNa塩結晶を含みつつ磁場配向していることが明らかとなった。最後に微結晶の形態変化過程に変動磁場を与えた際の効果について検討を行った。再結晶化微粒子に対しNaOHを添加し、500mT磁場下で2Hzの振動を与えた場合と100mTー60Hz交流磁場を与えた場合の挙動観察を行った。微結晶の挙動を反射光測光で評価し、磁場変化に追従する動きが高感度検出できた。その挙動を高速度カメラで観察し、3つの結晶軸に沿った反磁性磁化率の分布を解析し、2つの磁化容易軸が存在することを考察した。痛風誘発微結晶の形態変化において、数100mT程度の磁場による微結晶配向検出が結晶化診断に有効であることが示唆された。痛風等の原因物質である尿酸の結晶の磁気および光特性を調べることで,痛風の新しい治療・診断法の原理となり得る手法の検討を行った.尿酸結晶の形態に対する磁場作用を調べた.また結晶成長の光学的計測による医療診断を可能とするため,微結晶による光反射と磁場配向特性との関連も調べた.

モデル実験系として,尿酸のアモルファス結晶の状態からpH変化で瞬時に板状結晶に構造変化させる手法を開発した.板状結晶が生成すると同時に磁場下での回転運動が起こることを500ミリテスラ磁場下で観測した.尿酸結晶の光反射の異方性は非常に強く,結晶成長および形状の遠隔計測評価のための有用な情報となる.H28年度の研究では、磁場中での結晶化による結晶形状変化の計測・解析を進める。尿酸・シュウ酸の結晶化過程での磁場印加が,結晶の形状に及ぼす効果をリアルタイムで顕微鏡観察する実験を行う。また、結晶の析出過程における強磁場の影響を実時間スケールで観察・解析する手法を開発する。H27年度に開発した磁場中光散乱による微結晶の構造解析法を適用することで、結晶化過程での結晶のナノスケールでの構造影響を調べる。各微結晶の磁気回転運動を解析して結晶の反磁性磁化率異方性の算出を行い、結晶軸に対し磁力線が変化し続けた際の結晶化速度の理論的な考察を行う。最後に、患部モデルによるマクロ評価システムを検討する。生体磁気工学作製する予定の磁場印加装置のうち永久磁石の導入は行ったが、磁石を回転させる装置の設計に時間を要したため、その装置の作製部品費が次年度へ繰越となった。痛風病変部位モデルに対し、永久磁石の回転による変動磁場を与えるための回転装置部品として使用する計画である。
グレリン活性化制御メカニズムの解明

食欲増進作用を有するグレリンは、アシルグレリン(活性型グレリン: AG)とデスアシルグレリン(不活性型グレリン: DG)が存在する。肝移植後早期の食欲不振や低栄養に、周術期のグレリン代謝の変化が関与していると仮説し、肝移植前後の患者サンプルを用いてAG値を測定した。また同患者血清を用いてin vitroでAG代謝について検討した。移植前はAG値が有意に上昇し、移植後にAG値が減少した。移植前患者の血清サンプル中では有意にAG代謝が低下していた。コリンエステラーゼ値がA/T比(アシル/トータルグレリン比)と逆相関しており、AG代謝に関わる酵素である可能性が示唆された。グレリンはペプチド中のSer3がアシル化(オクタン酸付加)された活性型として胃より分泌されるが、末梢血中での活性型は約10%に過ぎず、大部分は非活性型に代謝されている。我々の教室は六君子湯の投与により活性型グレリンが上昇するという報告をしているが(Takiguchi S et al. Gastric Cancer, 2012)、これはグレリンの脱アシル化(非活性化)の阻害作用が関与している。また少数ではあるが臨床検体から肝不全患者は高アシル(活性型)グレリン血症状態であるという知見を得ている。これらのことから、肝臓由来の脱アシル化を促す分解酵素阻が存在すると考え、臨床サンプルを用いて研究を行った。肝移植待機患者(重度肝機能障害)15例、肝移植後患者15例、肝硬変患者(Child A)10例、コントロール10例のサンプル血漿・血清を収集した。ELISAにより活性/非活性型グレリンを測定した。また、体重、栄養指標、肝機能指標も合わせて評価した。肝移植待機患者サンプル中の活性型グレリンは他の3群に比べ有意に上昇しており、活性型グレリン比率(活性型グレリン/活性型+非活性型グレリン)も有意に上昇していた。肝硬変患者(Child A)では活性型グレリンの上昇は認めなかった。肝移植後患者でも同様に、活性型グレリンの上昇は認めなかったが、肝機能指標はコントロール群とほぼ同程度まで改善を認めた。研究中に肝移植待機の状態から、実際に肝移植を施行した症例を認めたため、移植前後で継時的にサンプル集積を行っている。今後、継時的な変化を評価する予定である。また、代謝酵素について検討中であり、今後代謝酵素の同定、代謝酵素によるグレリン代謝、代謝酵素阻害によるグレリン代謝の変化を検討する予定である。前年度は集積したサンプル(肝不全患者(肝移植前患者)15人、肝移植後患者15人、コントロール10人)より肝不全患者は他の2群に比べ活性型グレリン(AG)と総グレリン(活性型+非活性型グレリン)中の活性型グレリンの割合(A/T比)が有意に高いことを確認し、グレリン代謝に肝臓が関与している可能性が示唆された。今年度は脱アシル化(代謝)酵素として肝臓由来のコリンエステラーゼ(ChE)に着目し、グレリン代謝を検討した。ChEは肝不全患者において他の2群に比べ有意に低値であり、さらにChEはAGやA/T比に逆相関を示した。また、肝移植前に比べ肝移植後にはA/T比は有意に低下し、ChEは有意に上昇していくという継時的な推移を示した。これらの結果から、肝不全患者では脱アシル化酵素であるChEが低下することでAGの脱アシル化が抑制されることが示唆された。これらの結果をふまえ、血中でのAGの脱アシル化作用(代謝)をin vitroで検討した。血清中に合成AGを加え、一定時間培養し、AGの脱アシル化割合を測定した。健常人血清に比べ、肝不全患者の血清中では脱アシル化が有意に抑制されていた。さらに、同様の実験系で、脱アシル化酵素阻害剤(ChE阻害剤)を用いてAGの安定性を検討した。健常人血清に比べ、ChE阻害剤を加えた健常人血清中では、AGの脱アシル化割合が有意に抑制されており、AGの安定性が向上したことを確認した。本研究から、肝不全患者は肝臓由来のChEが低下することでAGの代謝が抑制され、その結果AGやA/T比が上昇することが示唆された。またChEはグレリン代謝に関わる酵素の1つであり、酵素阻害剤によりAGの安定性が向上する可能性が示唆された。脱アシル化の阻害という観点から、外因性グレリンで行っていた治療(補充療法)から、内因性グレリンを用いた治療への転換・応用が可能となり、今後のグレリン関連治療の発展に進歩が期待でき、その医学的・社会的意義は大きいと考える。

消化器外科当初の計画通り、10例の移植待機患者(サンプル集積中に実際に肝移植を施行した患者を含む)のサンプルを集積し、ELISAにより活性型グレリン値を評価することができた。また、肝移植前後のサンプルも一部集積できており、今後もサンプルの継時的な集積を続けていく。肝臓由来のグレリン代謝酵素の同定と、その酵素を標的としたin vitroの実験を進めていく予定である。現在のところ、予定のサンプル集積は終了している。軽度な肝機能障害ではみられないが、肝移植待機患者のような重篤な肝機能障害状態においては活性型グレリンが上昇することが確認できた。今後、グレリン代謝酵素の候補を同定し、in vitroでの代謝、代謝阻害の検討を行う予定である。
ゴルジストレス応答性Syx5と低分子化合物によるAｂeta分泌調節と神経細胞保護

本課題申請時に立てた目標どおりにゴルジストレス応答性Syx5の発現誘導機構、およびゴルジストレスがもたらすSyx5発現変化とAベータ量比変化の機序に関して主に実験を行い知見が得られて来てた。ヒト株化細胞よりSyx5遺伝子の転写開始領域上流約2kbを単離して塩基配列を決定したところ、データベースの結果と一致して、Syx5遺伝子の転写開始領域上流には、いわゆるゴルジストレス誘導性の転写因子が結合するGASE (Golgi Apparatus Stress Element)配列が実際に存在した。これら配列を含むSyx5遺伝子の下流にルシフェラーゼを組み込んだレポーターベクターを構築し、細胞に導入してルミノメーターを用いたレポーターアッセイを行い、定常状態でプロモーター活性を有すること、加えてゴルジストレッサーMonensin, Nigericin負荷によりプロモーター活性が上昇することが確認できた。これらストレッサーはH+イオノフォアであり、他の酸性小器官(lysosome等)への作用が排除できないので、現在はGolgicideA (GCA)やExo2でストレス負荷を行っている。このうちGCAにおいては培養細胞および初代培養ニューロンにおいて顕著にSyx5の発現上昇を起こすことが分かった。このようにERストレスに伴う細胞死に対抗してSyx5はその発現量を増すだけでなく別の細胞内小器官のゴルジに端を発するストレスでも発現上昇すること、そして低分子化合物の探索によりERストレス下で上昇するAベータ42比率を下げる化合物の候補も見出した。目標に向けた3年間の研究計画は大きく下記の4つに分けられる。1)ゴルジストレス応答性Syx5のAベータ量比変化の機序の解明。2)ゴルジストレスがもたらすAベータ量比変化の機序の解明。3) Syx5と低分子化合物によるAベータ量比調節効果の検討。4)ゴルジストレスによる神経細胞死に対する保護効果の検討。現在初年度では上記計画の1および2を主に遂行しているが、並行して3および4の計画に必要な予備実験と実験手法の確立も進めているためおおむね順調に進んでいると考える。現在行っているゴルジストレス応答性Syx5の発現誘導機構の解析を進め、ゴルジストレス誘発からSyx5転写誘導に関わる転写因子と上流カスケードを同定して応答機構を明らかにする。ゴルジストレスがもたらすAベータ量とベータAPPからのプロセシングを、生成した各種フラグメントを、パルスラベル、ショ糖密度勾配遠心(SDG)-ウエスタンブロット(WB)で定量し、細胞内分布はSDG-WBや免疫組織化学などの系で調べる。セクレターゼの定量と安定性評価をIP-WB、パルスラベルを組み合わせて行う。細胞外AベータはELISA、細胞内Aベータはギ酸で可溶化してIP-WBやELISAで定量する。これによりゴルジストレスはベータAPPプロセシングに伴うAベータ40と42生成比をどこでどのように変化させるのかを明らかにする。それら結果を考察してからSyx5と低分子化合物によるAベータ量比調節効果の検討を行う。その目的のためにSyx5過剰発現、shRNAによる抑制、CRISPR/Cas9法を用いたノックアウト細胞、候補である低分子化合物を添加した細胞で、上記の系を用いて、ゴルジストレスによって起こるAベータ比の変化を軽減させることができるかを検討する。またゴルジストレスによる神経細胞死に対する保護効果の検討を次いで行う。上記細胞でのタイムラプスイメージングや生存率測定により、細胞死が出現する時間経過を比較して、Syx5発現量や低分子化合物に保護効果があるかを調べる。総括としてゴルジストレスから細胞死に至る過程のイメージングによる保護の時空間的の解析を行う。これによりゴルジストレスから神経細胞死に至る過程をモニターしながら同時にAベータ産生の動態をとらえ、ゴルジストレスがどのように細胞全体に波及し、いつどこでAベータが産生するかを可視化し、Syx5と低分子化合物の保護作用を総括できると考えている。

1)ゴルジストレス応答性Syx5のAベータ量比変化の機序の解明。2)ゴルジストレスがもたらすAベータ量比変化の機序の解明。3) Syx5と低分子化合物によるAベータ量比調節効果の検討。4)ゴルジストレスによる神経細胞死に対する保護効果の検討。現在初年度では上記計画の1および2を主に遂行しているが、並行して3および4の計画に必要な予備実験と実験手法の確立も進めているためおおむね順調に進んでいると考える。現在行っているゴルジストレス応答性Syx5の発現誘導機構の解析を進め、ゴルジストレス誘発からSyx5転写誘導に関わる転写因子と上流カスケードを同定して応答機構を明らかにする。ゴルジストレスがもたらすAベータ量とベータAPPからのプロセシングを、生成した各種フラグメントを、パルスラベル、ショ糖密度勾配遠心(SDG)-ウエスタンブロット(WB)で定量し、細胞内分布はSDG-WBや免疫組織化学などの系で調べる。セクレターゼの定量と安定性評価をIP-WB、パルスラベルを組み合わせて行う。細胞外AベータはELISA、細胞内Aベータはギ酸で可溶化してIP-WBやELISAで定量する。これによりゴルジストレスはベータAPPプロセシングに伴うAベータ40と42生成比をどこでどのように変化させるのかを明らかにする。それら結果を考察してからSyx5と低分子化合物によるAベータ量比調節効果の検討を行う。その目的のためにSyx5過剰発現、shRNAによる抑制、CRISPR/Cas9法を用いたノックアウト細胞、候補である低分子化合物を添加した細胞で、上記の系を用いて、ゴルジストレスによって起こるAベータ比の変化を軽減させることができるかを検討する。またゴルジストレスによる神経細胞死に対する保護効果の検討を次いで行う。上記細胞でのタイムラプスイメージングや生存率測定により、細胞死が出現する時間経過を比較して、Syx5発現量や低分子化合物に保護効果があるかを調べる。総括としてゴルジストレスから細胞死に至る過程のイメージングによる保護の時空間的の解析を行う。これによりゴルジストレスから神経細胞死に至る過程をモニターしながら同時にAベータ産生の動態をとらえ、ゴルジストレスがどのように細胞全体に波及し、いつどこでAベータが産生するかを可視化し、Syx5と低分子化合物の保護作用を総括できると考えている。課題申請時に国内学会参加のために申請していた旅費や外部委託解析費の支払いを他の研究費より支出したため、当初想定した金額より支出額が減った。その分については修理および調整が急遽必要となった計測機器などの交換部品の費用に充てる予定である。年度末である3月に発注した物品については新年度4月以降の納品のため次年度使用額として計上するため。
結核菌感染マクロファージをターゲットにした経肺結核治療法の開発

有効な結核治療法を確立するためには、抗結核薬を含有した微粒子製剤(基剤:乳酸とグリコール酸の共重合体PLGA)を調製し、結核菌感染肺胞マクロファージに貪食させる必要がある。微粒子製剤を結核治療に用いるに際しては、1)経肺投与された微粒子製剤が肺胞マクロファージに効率よく貪食されるか、2)効率的な貪食のために微粒子製剤が具えないといけない条件は何か、3)貪食された微粒子製剤が肺胞マクロファージの機能に対し悪影響を与えるかどうか、などを明らかにしないといけない。このために、以下のような研究を行った。(1)抗結核薬含有微粒子製剤のマクロファージによる効率的に貪食されるための条件微粒子製剤の被貪食性を支配する主たる要因は粒子径であり、3μmの粒子が最も個々のマクロファージによって貪食されやすいばかりか、多くの肺胞マクロファージによっても貪食される。(2)肺胞マクロファージの生理機能に対する微粒子製剤の影響PLGAの後粒子製剤は他の製剤とは異なり、マクロファージの生存率を全く低下させない。また、貪食に伴い、活性酸素(一酸化窒素)や腫瘍壊死因子(TNF-α)をマクロファージから放出させず、粒子貪食機能を活性化した。(3)経肺投与された微粒子製剤の肺胞マクロファージによる貪食空気圧によってラット肺胞へ微粒子製剤を投与することに成功した。投与されたPLGAの微粒子製剤は、肺胞内に良く分布し、肺胞内に存在するマクロファージの60%以上が微粒子製剤を貪食していた。また、貪食された製剤粒子は、マクロファージ内の結核菌(BCG)に対して抗菌作用を発現した。従って、抗結核薬を含有する微粒子製剤を経肺投与することによって、肺胞マクロファージ内に存在する結核菌を効率よく殺滅することが可能となった。今後は、本治療法を実用化するために努力する。肺胞マクロファージは、結核菌を貪食するが、これを消化することができない。肺胞マクロファージ内の結核菌はマクロファージを"培養器"として利用して、生育・増殖を続ける。結核の根治療法が無いのは、肺胞内マクロファージ内の結核菌に対して抗結核薬を有効に作用する方法がないことに起因している。このため、我々は、結核菌感染肺胞マクロファージをターゲットにする経肺結核治療薬の開発に取り組んだ。本研究の方略は、抗結核薬を経肺によって投与することにより、所期の目的を達成しようとするもので、このために新しい薬物送達システム(DDS)を構築するところにある。本研究の特徴は、1.本研究においては異物をトラップしやすい肺胞マクロファージをターゲットにするDDSを構築する。2.肺胞マクロファージに近接した肺胞をターゲットにするために、効果的にDDS製剤をマクロファージに送達することが可能である。3.このために、低い薬剤量でもって高い効果が得られることが期待されるので、薬剤の副作用を回避することが可能である。本年度においは、以下に示す結果を得ることができた。1.DDS製剤の基剤としてポリ乳酸グリコール酸共重合体(PLGA)を選択し、抗結核薬リファンピシン(RFP)を効率的に含有したRFP/PLGA粒子を調製した。2.ラット肺胞マクロファージ由来細胞株NR8383を用いて、RFP/PLGA粒子の貪食活性を測定したところ3マイクロメーターの粒子が最も効率よく貪食された。3.これらの粒子の特性(粒子表面の性質、荷電状態など)を決定した。

4.本粒子に含有されたRFPは粒子の貪食によって、効率的にマクロファージ内に取り込まれた。6.PLGA粒子はマクロファージの貪食能を活性化した。これらの結果により、本年度に予定していた計画が十分実行されたことになる。我々は、肺胞マクロファージに貪食されながらも、マクロファージ内で消化されずに生存し続けている結核菌に対して有効な製剤を開発し、その作用を明らかにすることを試みた。その結果以下の成果を得た。1)マクロファージに貪食されやすい製剤として、基剤にポリ乳酸グリコール酸共重合体(PLGA)を用い、これに抗結核薬であるリファンピシン(RFP)を含有させた微粒子をスプレードライ法にて調製した。2)この製剤粒子に対する肺胞マクロファージ(ラット肺胞マクロファージ由来細胞株NR8383)の貪食能を種々の条件下において調べた。その結果、貪食活性は、マクロファージ細胞当りの添加粒子数によって大きく変化したが、一般的には添加粒子数が多くなるに従って貪食活性は増加した。また、貪食活性は約4時間程度で最大値に到達した。さらに、マクロファージが貪食しやすい製剤粒子の大きさは約3μmであった。3)製剤粒子を貪食したマクロファージは、貪食することによってその活性を増大することが明らかになった。すなわち、一定時間RFP含有PLGA微粒子製剤をマクロファージに貪食させ、その後ポリスチレンラテックス(PLA)に対する貪食能を測定したところ、いずれの条件下においてもマクロファージのPLAに対する貪食能が増大した。この場合、PLGA微粒子製剤を貪食していないマクロファージのPLAに対する貪食能は、PLGA微粒子を貪食した他のマクロファージの影響を受けて、増大していることから、貪食に伴いマクロファージからある因子が放出され、これによって未貪食のマクロファージの貪食活性が増大したものと考えることができる。この因子に関しては同定中である。4)微粒子製剤のマクロファージ内への移行は、ファゴソームの形成、それに引き続くファゴソームのリソソームとの融合(ファゴリソソームの形成)のプロセスを経るはずである。PLGAに含有されたRFPがどのようにしてマクロファージ内の細胞質中に放出されるかの機構は、RFPの作用機構を知るうえで重要である。研究の結果、PLGAは、ファゴリソソーム内へ移行することが明らかになった。ファゴリソソームからのRFPの放出の機構を研究中である。以上の結果から、本年度に予定していた研究は計画に従って実行されたことになる。本年度は抗結核薬であるリファンピシン(RFP)を含有したPLGA微粒子製剤(microsphere,MS,以下RFP-PLGA MS)の肺胞マクロファージへの取り込みの機構およびマクロファージ内へ取り込まれたRFP-PLGA MSのマクロファージ内での挙動および抗結核作用に主たる焦点を当てて研究を行なった。すなわち、1)RFP-PLGA MSの肺胞マクロファージへの貪食は、基本的にMSの粒子径およびマクロファージ当りのMS数に依存しているので、貪食能を評価するに当たっては両者を厳密に規定した条件下で実験を行なう必要である。2)この様な条件下において貪食能を評価した結果、粒子径が1-5μm程度のMSがよくマクロファージによって貪食されるが、RFPをマクロファージ内へ効率的に送達するためには3μmのRFP-PLGA MSが最適であり、貪食はマクロファージ当りの粒子数が多いほどよく進行する。4)この貪食は結核菌などの細菌の貪食とは異なった経路による。
モノクローナル抗体をもちいたラット脳の成熟に伴うチューブリンの翻訳後修飾の探索

チューブリンのα-、β-サブユニットはアミノ酸配列の共通性が高く(相同性30%以上)、ポリグルタミン酸付加のように両サブユニットに共通に見られる翻訳後修飾が知られている。成熟脳チューブリンの両サブユニットの翻訳後修飾アイソフォームと反応するモノクローナル抗体K9は、胎児脳ではα-サブユニットとのみに反応する。この脳の発達に伴って反応性の変化する抗体のエピトープは、これまでの予備的研究から、既知の翻訳後修飾部位とは異なることが示されている。本研究の目的は、この抗体の認識部位が新たな翻訳後修飾であるのか、両サブユニット間共通部位であるのかを明らかにすることである。ラット成熟脳精製チューブリンをタンパク質分解酵素により切断し、HPLCで本抗体と反応するペプチドを分離した。分離した反応ペプチドのアミノ酸配列とマススペクトル分析および合成ペプチドとの反応性から、エピトープは翻訳後修飾部位ではなく、極めて相同性の高いα(A_<403>-E_<415>)とβ(A_<393>-E_<405>)であることが示された。以上の結果は、この相同部位のコンホメーション変化がポリグルタミン酸付加と予想される翻訳後修飾により誘起されることを強く示唆する。翻訳後修飾が両サブユニット相同部位のコンホメーションに影響を与えること、この部位がMAPs結合部位の近傍でもあることから、本抗体は翻訳後修飾の意義を考える上で有用な武器となると思われる。
COINS共通基盤のPTX向け拡張

本研究では,コンパイラ共通基盤COINSの中間表現LIRから,GPU用コードPTXを生成することによって,COINS上でGPU向けの低水準最適化を開発できる環境を実現することを目的としている.本目的達成に向けて,平成30年度では,次のことを行った.1.疎なコード移動(Sparse Code Motion,以下SCMと呼ぶ)と投機的移動を組み合わせた分岐発散低減手法の実現2.プログラム中の分岐発散を生じている分岐と生じていない分岐に対して,分岐発散低減手法と部分冗長除去を選択的に適用する手法の実現1については,部分冗長除去法の一種で,静的な式の数を減らすように式を減らす疎なコード移動が分岐後の式を分岐前に移動する効果と,分岐発散した分岐後のコードはすべて順番に実行される性質に着目し,疎なコード移動を投機的移動と組み合わせることによって,分岐内から分岐前に式を移動する効果を高めた手法(Speculative SCM,以下SSCMと呼ぶ)を提案した.2については,分岐発散していない分岐における投機的移動が,プログラムの実行効率を低減する可能性があることに着目し,分岐発散している分岐としていない分岐を,分岐発散解析によって解析し,分岐発散している分岐にはSSCMとして,分岐発散していない分岐にはSCMとして,選択的に適用できる手法を提案した.SSCMの選択的な適用について,一般的に使われるサンプルコードで評価を行ったところ,1.8倍の効率化を実現した.本成果は,第21回プログラミングおよびプログラミング言語ワークショップ(PPL2019)で発表済みである.本研究では,コンパイラ共通基盤COINSの中間表現LIRから,GPU用コードPTXを生成することによって,COINS上でGPU向けの低水準最適化を開発できる環境を実現することを目的としている.本目的達成に向けて,平成28年度では,次のことを行った.1.分岐発散を低減する従来手法の調査および,選択命令を含むGPU特有の命令の振舞いと対応するPTX表現の調査.2.大域値番号付けを用いたくくり出しに基づく分岐発散低減法の実現.1については,選択命令を積極的に利用する手法を中心に文献を調査した.2は,一度プログラムを走査するだけで多くの冗長な式を除去できる大域値番号付けという最適化手法に,if文内に存在する式を,if文の上方に移動する拡張を加えた手法である.大域値番号付けは,従来,if文内に存在する共通部分式を除去することによって,分岐発散を低減できる.本手法では,さらに,if文内の式を外に出すことによって,共通部分式を増加させる効果をもつので,より多くの分岐発散を低減できる.本手法は,if文のthenあるいはelse部のいずれかだけに存在する式でも,if文の上方に移動する可能性がある.このような場合,逐次実行では,式が存在しなかった側にも計算コストを導入することになるので,実行コストが増加する.一方,GPU上では,if文のthen部もelse部も1度ずつ実行されるので,たとえ片方からしか式が移動しなかったとしても,実行コストが増加しない点が重要である.研究実施計画では,平成28年度に,COINSのLIRにおいて, φ関数を任意の場所に挿入できるように拡張することになっていたが,最終的に実現する分岐発散低減の新しい手法を先に開発した.本手法は,φ関数の任意な位置への挿入を必要とする手法を補完する効果があり,順序は前後したが,おおむね順調に進展していると考える.本研究では,コンパイラ共通基盤COINSの中間表現LIRから,GPU用コードPTXを生成することによって,COINS上でGPU向けの低水準最適化を開発できる環境を実現することを目的としている.本目的達成に向けて,平成28年度では,次のことを行った.1. LIRの主要部分をPTXへ変換する変換器の実現2.プロファイリングに基づく部分冗長除去を用いた投機的移動と分岐発散低減の実現1については,LIRの配列を含む主要計算部をPTXへ変換する変換器をCOINSコンパイラ共通基盤に実現し,GPUで動作することを確認した.2については,プロファイリングに基づく部分冗長除去を,分岐発散している条件分岐に対して故意に偏ったプロファイルデータを設定することによって,選択的な投機的移動を実現する.本手法を適用することによって,if文のthen部もelse部も1度ずつ実行される分岐発散部に限って,if文の上に命令を巻き上げるので,実行コストを増加させることなくプログラム全体の冗長性を増加させることができる.増加した冗長性は,命令を挿入しながら多くの冗長な式を取り除く部分冗長除去の効果によって除去するが,プロファイルデータの偏った設定によって,分岐発散を増加させる挿入を生じることなく,冗長性を除去できる.研究実施計画では,平成29年度に,COINSのLIRにおいて, φ関数を任意の場所に挿入できるように拡張することになっていたが,LIRの主要部分のPTXの変換と最終的に実現する分岐発散低減の新しい手法を先に開発した.本手法は,φ関数の任意な位置への挿入を必要とする手法を補完する効果があり,順序は前後したが,おおむね順調に進展していると考える.本研究では,コンパイラ共通基盤COINSの中間表現LIRから,GPU用コードPTXを生成することによって,COINS上でGPU向けの低水準最適化を開発できる環境を実現することを目的としている.本目的達成に向けて,平成30年度では,次のことを行った.1.疎なコード移動(Sparse Code Motion,以下SCMと呼ぶ)と投機的移動を組み合わせた分岐発散低減手法の実現

2.プログラム中の分岐発散を生じている分岐と生じていない分岐に対して,分岐発散低減手法と部分冗長除去を選択的に適用する手法の実現1については,部分冗長除去法の一種で,静的な式の数を減らすように式を減らす疎なコード移動が分岐後の式を分岐前に移動する効果と,分岐発散した分岐後のコードはすべて順番に実行される性質に着目し,疎なコード移動を投機的移動と組み合わせることによって,分岐内から分岐前に式を移動する効果を高めた手法(Speculative SCM,以下SSCMと呼ぶ)を提案した.2については,分岐発散していない分岐における投機的移動が,プログラムの実行効率を低減する可能性があることに着目し,分岐発散している分岐としていない分岐を,分岐発散解析によって解析し,分岐発散している分岐にはSSCMとして,分岐発散していない分岐にはSCMとして,選択的に適用できる手法を提案した.SSCMの選択的な適用について,一般的に使われるサンプルコードで評価を行ったところ,1.8倍の効率化を実現した.本成果は,第21回プログラミングおよびプログラミング言語ワークショップ(PPL2019)で発表済みである.COINSのLIRをにおいて,φ関数を任意の場所に挿入できるように拡張し,PTXの選択命令を,LIR上で表現できるようにする.その後,LIRからPTXへの変換器を実現する予定である.COINSコンパイラ共通基盤に既に実現したLIRからPTXへの変化器を,LIRの主要部分以外についてもPTXに変換できるように拡張するとともに,φ関数を任意の場所へ挿入できるように拡張する.平成28年度に,3,000円強の残額が生じたが,本科研研究で有効に利用するには,少額すぎるので,次年度配分額とともに利用することにした.平成29年度は,成果を国際会議向けにまとめるのが間に合わず,旅費を中心に残金が生じたが,最終年度である平成30年度の成果発表に有効に利用する.平成29年度の配分額と合わせて,有効に利用する.
海産生物由来ホスホリパーゼA2の基質特異性発現機構の解明

1.イトマキヒトデPLA2の「膵臓ループ」部位付近に変異を導入した変異体のホスファチジルコリンに対する比活性は、ネイティブPLA2のものと比較して低く、ブタ膵臓PLA2により近い値となった。このことから、「膵臓ループ」部位付近の立体構造および電荷がPLA2の比活性および基質極性基特異性に影響を及ぼすことが推察された。2.イトマキヒトデPLA2アイソザイムおよび他のヒトデ類由来PLA2は、イトマキヒトデPLA2と同様にホスファチジルコリンを良く分解する傾向を示した。このことから、イトマキヒトデPLA2の基質極性基特異性はヒトデ類に共通の性質と推察された。3.イトマキヒトデPLA2の比活性は季節および地域によらず高く、イトマキヒトデに普遍的なものと考えられた。一方、イトマキヒトデの幼生の比活性は低く、高いPLA2比活性は成体になってから発現するものと考えられた。1.PLA2変異体発現ベクターの構築イトマキヒトデのホスホリパーゼA2(PLA2)をコードするcDNAのpancreatic loopに相当する部位の塩基配列はoligonucleotide-directed dual amber-long and accurate polymerase chain reaction (ODA-LAPCR)法により、Mutan-Super Express Kmキット(TaKaRa)を用いて変異させた。その結果、5'-末端から190-192塩基目にLysに対応するコドンAAGが挿入され、イトマキヒトデPLA2のCys62-Gly63間にLys残基を導入したPLへ2変異体をコードするcDNAが得られた。2.PLA2変異体の大腸菌による発現PLA2変異体をコードするcDNAを発現用プラスミドpET-16bにサブクローニングした。このプラスミドを用いて発現用大腸菌BL21(DE3)を形質転換した後、IPTG誘導によりPLA2変異体を発現させた。発現したPLA2変異体は不溶性の封入体を形成したため、8M尿素と10mM 2-メルカプトエタノールで可溶化した後、透析により再生し、活性型の粗PLA2変異体を調製した。3.粗PLA2変異体の基質極性基特異性粗PLA2変異体のホスファチジルエタノールアミン(PE)加水分解率は、イトマキヒトデPLA2と比較して高く、Cys62-Gly63間へのLys残基の導入はPE極性基に対する反応性を高める結果を示した。1.イトマキヒトデ幽門盲のう由来ホスホリパーゼA2(PLA2)アイソザイムの精製とその基質特異性イトマキヒトデ幽門盲のうから電荷の異なるPLA2アイソザイムを精製し、その基質特異性を測定した。その結果、精製されたアイソザイムは既に精製されているPLA2と同様の基質特異性を示した。このことから、イトマキヒトデ幽門盲PLA2の基質特異性はイトマキヒトデに特有のものではないかと推察された。2.タコヒトデ幽門盲のう由来PLA2の部分精製とその基質特異性タコヒトデ幽門盲のうからPLA2を部分精製しその基質特異性を測定した。その結果、イトマキヒトデ幽門盲のう由来PLA2の基質特異性と同様であった。このことから、イトマキヒトデ幽門盲のう由来PLA2の基質特異性はヒトデ類に共通の性質ではないかと推察された。3.イトマキヒトデ`PLA2の部分精製G54K変異体の基質特異性イトマキヒトデPLA2のN-末端から54番目のpancreaticループ部位のGlyをLysに置換した変異体を作製し、部分精製した。部分精製変異体はワイルドタイプのPLA2と同様の基質特異性を示したが,比活性が1/30と低かった。このことから、54番目のGlyは活性発現に重要な役割をはたすのではないかと推察された。1.ヤツデヒトデ幽門盲のう由来PLA2の部分精製とその基質特異性ヤツデヒトデ幽門盲のうからPLA2を部分精製しその基質特異性を測定した。2.イトマキヒトデPLA2のT57K変異体の作製とその酵素化学的特性の解明イトマキヒトデPLA2の「pancreatic loop」部位付近に存在するN-末端から57番目のトレオニン残基をリジン残基に置換した変異体(T57K変異体)を作製した。精製されたT57K変異体は最適