hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
3Dソリットモデルを用いた顎機能評価システムの開発研究

顎関節症などの顎機能障害に対する診断に際し、顎運動の解析は不可欠なものとなっている。しかしその解析方法の多くは運動軌跡の定性的な評価にとどまっており、運動機能の障害部位を正確に抽出したり、その程度を定量的に評価するにはいたっていないのが現状である。さらに、顎機能の障害は付着筋群の複雑なメカニズムを介してして現れるため、障害の発生機序を明らかにするためにはバイオメカニカルな解析を必要としている。一方、CTデータより生体の三次元立体モデル(3Dソリッドモデル)を作成することが可能となり、整形外科、形成外科領域においては、広く実際の臨床に応用されている。しかし、それらの多くは単なる観察のみに用いているものが多く、運動機能の評価等には、全く応用されていないのが現状である。そこで本研究では、3Dソリッドモデルに運動軌跡や咬合圧などの運動情報、機能情報を付加することによって被験者個有の顎口腔機能と形態の2つの側面から顎機能、顎運動の定量的な評価を行うものである。本研究による形態と機能による顎運動のバイオメカニクス(生力学)的な解析はいまだ行われておらず、本研究が始めて行うものである。日本での3Dソリッドモデルを用いた研究を最初に開始し、現在は実際の手術を想定したシュミレーションに応用し、臨床にフィードバックしてきた(下顎変形症の診断・治療におけるコンピューターシュミレーション、コンピューターシュミレーション外科)。本研究では機能的要因を考慮した顎機能、顎運動評価システムにより、運動機能にたいする障害部位の断定および、障害程度の定量的な評価、障害の発生機序のバイオメカニクス的な解析の第一歩を踏むことができた。また、本研究に用いた装置は歯科領域のみならず医科領域にも十分利用価値があると考えられ、3Dソリッドモデルをもちいたシュミレーション技術の発展に対し寄与するものと考えられた。
セルラーゼとキシラナーゼのキメラ酵素構築とその構造と機能の解析

糸状菌A.aculeatus由来のセルラーゼおよび細菌B.pumilus由来のキシラナーゼは進化的にも遠いと考えられ、両酵素蛋白質間の一次構造上の相同性は低い。しかしながら、それらの立体構造はβ-サンドイッチ構造と呼ぶホールディング形式を持ち非常に高い類似性を示す。このことは、セルロース関連の不溶性糖質加水分解酵素の構造と機能を解明する上で、、必須と考えられる酵素蛋白質分子のホールディングと酵素機能の関係を理解するための非常に良い題材であると考えられる。そこで不溶性糖質加水分解酵素の構造と機能を蛋白質工学的手法により解析するため、両酵素間のキメラ酵素蛋白質を遺伝子操作技術を用いて作製し、得られたキメラ酵素の立体構造と活性発現の関係に関する基礎的知見を検討することを目的とした。両者とも2枚のβ-シートの間にはさまれたクレフトと考えられる領域に活性部位が存在し触媒活性を直接担っていると考えられている。両酵素のα,β領域とβ,β領域を連結するヒンジ部分でそれぞれの領域が分断できる構造のため、両酵素遺伝子のこれらヒンジ部分近傍の塩基配列に部位特異的変異操作により新たに制限酵素部位を付加し、両遺伝子の各領域に相当する間を合成リンカーで連結するか、または制限酵素部位を付加する場合が不可能な場合はPCRによって増幅した各遺伝子のDAN断片を連結することで2種類のキメラ遺伝子[XCX,CXCと仮称]を構築した。それらの遺伝子構造は塩基配列から確認した。さらに大腸菌発現ベクターに挿入した両キメラ遺伝子を保持する各形質転換株の全蛋白質をSDS-PAGEで分析したところ、予想された分子量に相当する蛋白質バンドの存在が確認された。さらに、これら蛋白質は両酵素に対する抗血清と反応することがウェスタンブロッティングにより確認されたことから、両キメラ蛋白質の発現していることが確認された。
ヒト細胞を用いた慢性関節リウマチのin vivo病態モデルの確立と応用

慢性関節リウマチ(RA)患者滑膜組織由来の滑膜浸潤細胞を用いて、in vitroでパンヌス様炎症組織を形成する実験系と、滑膜浸潤細胞をSCIDbg.マウスやRag-2欠損マウス関節内に移入してパンヌス形成や関節破壊を高率に惹起する実験系を独自に開発した。このin vitroおよびin vivoヒト細胞モデルを用いて、パンヌス形成に関与する細胞や分子の同定と、このモデルを応用した新しいRAの治療戦略の確立を目指した。過去2年間の研究において、以下の成績が得られた。1)in vitroおよびin vivoヒト細胞モデルにおけるパンヌス形成は、二重盲験比較対照試験で抗リウマチ作用が証明されている薬剤(メトトレキサート(MTX)、金塩、ステロイド、抗TNF-a抗体、シクロスポリン、レフルノマイド)で用量依存的に抑制されるが、抗リウマチ作用のない薬剤(Cox阻害薬、抗CD4抗体)では抑制されない。これは、病態モデルとしての有用性を裏付ける成績である。2)MTXの抗リウマチ作用は未だ明らかでないが、このモデルを用いた検討により、MTXは滑膜異種細胞間の相互作用によるIL-6の発現を特異的に抑制することが明らかとなった。3)滑膜組織に浸潤するT細胞の多くは、in vitroおよびin vivoヒト細胞モデルにおけるパンヌス形成を抑制した。RA滑膜炎の制御機構の一翼を担っているものと考えられた。4)一方、ヒト細胞モデルにおけるパンヌス形成には滑膜マクロファージと線維芽細胞との相互作用が必須であることが明らかとなった。5)パンヌス形成は、内因性PGE2産生を阻害するCox阻害薬により増強され、PGE1やペントキシフィリンなど細胞内cAMP上昇を惹起する薬剤により顕著に抑制された。さらに両者を併用すると相乗的にパンヌス形成が抑制された。この成績をもとに、lipo-PGE1とペントキシフィリン併用療法を臨床試験により検討した結果、その有用性が明らかとなった。我々は、慢性関節リウマチ(RA)患者滑膜組織由来の滑膜浸潤細胞を用いて、in vitroでパンヌス様炎症組織を形成する実験系と、滑膜浸潤細胞をSCID bg.マウス関節内に移入してパンヌス形成や関節破壊を高率に惹起する実験系を独自に開発した。このin vitroおよびin vivoヒト細胞モデルを用いて、パンヌス形成に直接関与する細胞の同定と、このモデルを応用した新しいRAの治療戦略の確立を目指した。RA滑膜組織由来滑膜浸潤細胞は、種々の細胞の混成である。滑膜浸潤細胞からT細胞を除去すると、in vitroでのパンヌス形成や炎症性サイトカイン産生、およびSCID bg.マウス関節内でのパンヌス形成や関節破壊は増強された。従って、滑膜組織浸潤T細胞は、RA滑膜炎におけるパンヌス形成の制御機構の一翼を担っているものと考えられた。一方、滑膜浸潤細胞から単球/マクロファージを除去すると、in vitroでのパンヌス形成や炎症性サイトカイン産生、およびSCID bg.マウス関節内でのパンヌス形成や関節破壊は完全に抑制された。さらに,継代培養した滑膜線維芽細胞単独ではin vitroおよびin vivoにおいてパンヌスは形成されないが、滑膜線維芽細胞に滑膜組織由来マクロファージを添加するとパンヌス形成が再現された。以上より、パンヌス形成には、マクロファージと線維芽細胞との相互作用が必要であることが明らかとなった。

in vitroにおけるパンヌス形成は、内因性PGE2産生を阻害するインドメタシンやその他のシクロキシゲナーゼ阻害薬により増強され、PGE1やペントキシフィリンなど細胞内cAMP上昇を惹起する薬剤により顕著に抑制された。さらに両者を併用すると相乗的にパンヌス形成が抑制された。この成績をもとに、PGE1とペントキシフィリン併用療法の有用性を検討する臨床試験を開始した。慢性関節リウマチ(RA)患者滑膜組織由来の滑膜浸潤細胞を用いて、in vitroでパンヌス様炎症組織を形成する実験系と、滑膜浸潤細胞をSCIDbg.マウスやRag-2欠損マウス関節内に移入してパンヌス形成や関節破壊を高率に惹起する実験系を独自に開発した。このin vitroおよびin vivoヒト細胞モデルを用いて、パンヌス形成に関与する細胞や分子の同定と、このモデルを応用した新しいRAの治療戦略の確立を目指した。過去2年間の研究において、以下の成績が得られた。1)in vitroおよびin vivoヒト細胞モデルにおけるパンヌス形成は、二重盲験比較対照試験で抗リウマチ作用が証明されている薬剤(メトトレキサート(MTX)、金塩、ステロイド、抗TNF-a抗体、シクロスポリン、レフルノマイド)で用量依存的に抑制されるが、抗リウマチ作用のない薬剤(Cox阻害薬、抗CD4抗体)では抑制されない。これは、病態モデルとしての有用性を裏付ける成績である。2)MTXの抗リウマチ作用は未だ明らかでないが、このモデルを用いた検討により、MTXは滑膜異種細胞間の相互作用によるIL-6の発現を特異的に抑制することが明らかとなった。3)滑膜組織に浸潤するT細胞の多くは、in vitroおよびin vivoヒト細胞モデルにおけるパンヌス形成を抑制した。RA滑膜炎の制御機構の一翼を担っているものと考えられた。4)一方、ヒト細胞モデルにおけるパンヌス形成には滑膜マクロファージと線維芽細胞との相互作用が必須であることが明らかとなった。5)パンヌス形成は、内因性PGE2産生を阻害するCox阻害薬により増強され、PGElやペントキシフィリンなど細胞内cAMP上昇を惹起する薬剤により顕著に抑制された。この成績をもとに、lipo-PGElとぺントキシフィリン併用療法を臨床試験により検討した結果、その有用性が明らかとなった。
超高速吸収変化スペクトル測定の高精度化と高機能な色素複合体光化学系への応用

過渡吸収スペクトル測定装置について改良を加え、ノイズレベルは±1x10^<-4>吸光度を光合成タンパクを損傷しない程度の積算で達成した。この改良は、サファイア窓材を用いた白色光発生の安定化、および、低速光チョッパーを用いたデータ取得系の精密化によって達成されたと考えられる。初年度、光合成関連では、クロロフィルa以外の色素を用いて植物型光合成を行うAcaryochloris marinaの光化学系1で植物の光化学系に見られない特異な電子移動が起きていることを世界で初めて見出した。写真化学関連では、電子注入速度と電子励起エネルギー移動の速度を和周波生成蛍光検出法で明確に区別することに世界で初めて成功した。第二年度には、高等植物の電子移動系を高い割合で含む光化学系1標品について、過渡吸収測定を再実施し、かつ対照実験として、有機溶媒中のクロロフィルの過渡吸収スペクトルについても測定し、精密な比較を行った。これにより、クロロフィル分子単独で示す振動緩和による過渡吸収変化と、光合成系で見られるような分子間電子状態遷移過程による過渡吸収変化の間を区別する基準が確立されたと考えられる。さらに、当初予定した研究対象ではないが、前任地(北陸先端科学技術大学院大学)から継続している共同研究を推進した。通常よりも低温で成長させたガリウム砒素量子井戸構造における励起電子・ホールの緩和過程を従来に無い精密、広範は過渡吸収測定で解析し、制御された成長過程により、緩和時間が制御できることを確認できた。過渡吸収スペクトル測定装置自体の高精度化は次のように達成した。吸収変化を検出するための白色光の発生にあたっては800nmのレーザー基本波を使って、単一フィラメント状態の発生を達成し、安定化に成功した。また、励起光パルス列を5Hzから8Hz程度の周波数の光チョッパーで変調した。その光チョッパーの周波数の第二高調波で、光チョッパーに同期して白色光強度をフォトダイオードアレイから読み込んだ。こうすることで、過渡吸収測定のノイズレベルの低減に成功した。この測定システムを、最近発見されたクロロフィルdからなる光化学系1色素タンパク複合体(Acaryochloris marina(A. marina)、光合成依存シアノバクテリアの一種)の研究に応用した。励起エネルギーの流れと電子移動の素過程を世界で初めて観測することに成功した。通常のクロロフィルaからなる光化学系1光化学系1色素タンパク複合体(ホウレンソウ由来)と比べると両者の差異は非常に大きかった。特に電子移動の素過程は他に例の無い様式で進行している可能性が大きいことがわかった。電子供与体クロロフィルの光酸化よりも見かけ上早く電荷分離が進行しているように見えるのである。この電子移動のメカニズムを解明することは今後の課題である。銀塩写真の基礎光化学として重要な臭化銀上の色素会合体については、蛍光和周波生成時間分解法で、励起エネルギー移動と電子注入の両面にわたって理解を進めることができた。特に蛍光の偏光異方性の観測はこれまで知られていなかった励起エネルギーの素過程を顕在化させた。一方、蛍光を発する状態だけでなく、電子注入後の無蛍光性状態のダイナミクスがどうなっているのかは、ピコ秒以下の時間領域で十分な観察が為されておらず、これも継続して取り扱っていくべき問題点として残されている。
コオロギのダイナミックな細胞移動を伴った胚形成に関与する細胞動態制御機構の解明

動物の胚発生では、受精卵から分裂、移動により胞胚期を経て初期胚が形成される。現在までに私はトランスジェニックコオロギを利用して、非常にダイナミックな細胞移動を伴った胚発生過程を、ライブイメージング技術を用いて詳細に明らかにしている。本研究では、コオロギ初期胚形成過程における特徴的な細胞の挙動に着目して「個々の細胞の動きと胚形成」に関わる遺伝子群の働きを明らかにすることを目的としている。まず、GFP発現トランスジェニックコオロギをもちいたライブイメージングにより、コオロギの発生過程における細胞動態を詳細に観察した。その結果、受精後20時間において一様に卵上層に存在する細胞が、受精後24時間までに急速に後方に移動し将来の初期胚原基を形成する細胞となることが分かった。そこで、この移動に関わる分子メカニズムを詳しく解析するため、受精後20時間と24時間の初期胚からmRNAを取得しトランスクリプトーム解析により両者のmRNA発現量に差のある候補遺伝子を探索した。この解析から、Wntシグナル経路に含まれる多数の因子が影響を受けていることが分かった。そこで、Wntシグナル経路の負の調節因子として知られているaxin遺伝子の機能抑制を行った。その結果、axin遺伝子の機能抑制によるWntの過剰発現胚ではコオロギの頭部形成に関わる細胞移動の異常が観察された。さらに、頭部領域のマーカー遺伝子であるorthodenticleの発現上昇が認められた。また、BMPシグナル経路のリガンドであるDppとaxinのダブルノックダウン胚では、Dpp RNAi胚で見られる腹側化が著しく抑制されていた。これらのことから、コオロギ胚では後部端においてWntシグナルとBMPシグナルの協調的な作用が後部伸長に関わる細胞移動に重要であると示唆された。これらの研究成果はまとめて論文として発表予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。コオロギ初期胚形成過程における特徴的な細胞の挙動に着目して「個々の細胞の動きと胚形成」に関わる遺伝子群の働きを明らかにし、新規の細胞動態制御機構を解明する。本年度は、1、ダイナミックな細胞動態が観察される時期由来のcDNAライブラリーを構築し、2、それを用いたトランスクリプトーム解析を行い、3、各発生段階で発現量の異なる遺伝子を探索した。さらに、微小管に結合するGFPを発現するトランスジェニックコオロギを作成し、細胞移動の際に見られる詳細な細胞骨格や形態を観察した。その結果、コオロギにおいて将来胚を形成する領域と胚体外領域を形成する領域に含まれる細胞群で、細胞移動が行われる際にその形態が大きく変化している行ことが分かった。特に、胚を形成する領域に含まれる細胞では、移動が開始される際にその形態が仮足様構造を有していた。また、細胞移動に先立って、胚体外領域を形成する細胞では細胞分裂が停止していた。これらのことは、コオロギの領域に応じた細胞移動は、細胞周期と密接に関わっている可能性を示唆する。次に、候補遺伝子の一つであるWntシグナル経路を構成するaxin1についてRNAi法とライブイメージング解析を組み合わせて細胞動態にいかに関与しているか調べた。その結果、卵の腹側に細胞が集まりコオロギ胚を形成する際の移動が前方にシフトし、大きな胚が形成されることが分かった。さらに、より詳細に機能解析を行うために、TALEN法を用いた遺伝子ターゲッティング法を確立した。その技術を利用していくつかの遺伝子においてノックアウトコオロギを樹立できた。この技術は、モデルでない動物においても容易で、簡便に遺伝子改変が行えるために非常に有用な解析ツールとなる。当初の計画通り、各発生段階での遺伝子の発現量の比較により、候補遺伝子を取得できた。

さらに、RNAiとRNAi法とライブイメージング解析を組み合わせて細胞動態のより詳細な解析を行うことができた。また、解析ツールとして、新たなトランスジェニックコオロギを作成し解析に利用した。そして、新規の遺伝子改変技術であるTALEN法塗コオロギに応用できたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。各発生段階での遺伝子の発現量の比較により、候補遺伝子についてさらなる解析を行う。具体的には、in situ hybridization法などにより発現部位を特定し、RNAi-ライブイメージング法を用いてより詳細に細胞動態を解析する。その際、昨年度設定した細胞移動距離、時間、速度、方向、細胞移動の追跡による系譜などのパラメーターを利用し定量的な解析を行う。また、TALEN法を用いてノックインコオロギを作成しより詳細な解析を行う。そして、上記の解析を行うことで得られた実験結果を統合し、胚発生過程における新規の細胞動態制御機構についてのモデルを構築する。
子宮体癌における腫瘍微小環境プロファイルに基づく新規分子標的治療の探索

私たちは子宮内膜癌において、腫瘍微小環境と予後との関連性を明らかにすることとした。221例の子宮内膜癌の手術検体において、腫瘍微小環境のバイオマーカーであるPD-L1、CD8、CD68、VEGFの免疫組織化学的染色にて、その蛋白発現の評価を行い、腫瘍微小環境プロファイルと予後との関連性を統計学的に解析した。腫瘍細胞におけるPD-L1の高発現は、良好な全生存期間と相関する傾向であった。腫瘍細胞周囲におけるPD-L1の高発現は、CD8陽性腫瘍浸潤性リンパ球数、CD68陽性腫瘍関連マクロファージ数、マイクロサテライト不安定性と有意な関連性を示した。腫瘍細胞周囲におけるPDL1の高発現は、より短い無治療期間である傾向を示した。全生存期間に関する単変量解析では、腫瘍細胞におけるPD-L1の高発現が予後良好因子、腫瘍細胞周囲におけるPD-L1の高発現、高齢、進行癌、非類内膜腺癌、深い筋層浸潤および脈管侵襲陽性が予後不良因子であった。全生存期間の有意な予後因子で行った多変量解析では、腫瘍細胞におけるPD-L1の高発現、高齢、進行期、非類内膜腺癌、および脈管侵襲陽性が独立した有意な予後因子であった。PD-L1を介した免疫チェックポイント機構が、子宮内膜癌における腫瘍微小環境の調節に関与し、その予後に影響を及ぼす可能性が示唆された。子宮体癌手術検体の腫瘍組織において、ヘルパーT細胞のマーカーであるCD4についての解析を追加した。高密度のCD4陽性腫瘍周囲免疫細胞は、全生存期間に関する予後因子の単変量・多変量解析において、有意で独立した予後良好因子であることがわかった。更に、高密度のCD4陽性腫瘍周囲免疫細胞は、より長い無治療期間(Treatment-free interval)と有意に関連することがわかった。従って、腫瘍組織におけるCD4陽性ヘルパーT細胞の高密度の存在は、化学療法感受性を増強することにより、予後良好因子となっている可能性が示唆された。子宮内膜癌における腫瘍微小環境プロファイルと臨床病理学的因子や予後との関連性についての検討結果を論文化し、投稿中である。手術検体から抽出したDNAやRNAの解析がやや遅れている。腫瘍微小環境におけるCD4を含めた各因子の相互作用についても、解析を進めてゆく予定である。また、各症例手術検体のパラフィン包埋ブロックから腫瘍および辺縁組織のそれぞれからDNA・RNAを抽出する。抽出した腫瘍組織DNAを使用して次世代シークエンサーによる解析を行い、遺伝子変異の網羅的解析から各症例において同定された遺伝子変異の数と、MSI、MMR不全および腫瘍微小環境プロファイルとの関連性を統計学的に検討する。子宮内膜癌手術検体のパラフィン包埋ブロックから、腫瘍とその辺縁組織のそれぞれにつきマイクロダイセクションによりtotal RNAを抽出したのち、Cy3でラベルしたcDNAを合成し、マイクロアレイにハイブリダイゼイションさせ、遺伝子発現レベルを網羅的に解析する。まず腫瘍およびその辺縁組織それぞれに関して、免疫染色による腫瘍微小環境発現プロファイルの蛋白レベルでの結果と、マイクロアレイ解析による転写レベルでの結果との間の相関性を調べ、既に得られた腫瘍微小環境発現プロファイル・データの強化を図る。次にマイクロアレイ・データを使用し、HeatmapからClustering解析、さらにGene Ontology解析、Pathway解析を行い、腫瘍微小環境プロファイルにおいて治療反応性・予後などと統計学的に有意な関連性の認められた分子とその関連分子に関し、腫瘍微小環境プロファイルが治療反応性・予後に関与するその詳細な分子機序の解明を目指す。免疫チェックポイント機構を含む腫瘍微小環境が種々の悪性腫瘍の予後と関連することがこれまでに報告されている。腫瘍細胞におけるVEGFの高発現は、不良な全生存期間と相関していた。腫瘍細胞周囲におけるPD-L1の高発現は、CD8陽性腫瘍浸潤性リンパ球数、CD68陽性腫瘍関連マクロファージ数、およびマイクロサテライト不安定性と有意な関連性を示した。また、腫瘍細胞周囲におけるPD-L1の高発現は、より短い無治療期間である傾向を示した。子宮内膜癌の臨床検体において、腫瘍微小環境で機能する分子を免疫組織学的染色において評価することができた。また、明らかとなった腫瘍微小環境プロファイルと臨床病理学的因子や予後との関連性についても検討することができた。

私たちは子宮内膜癌において、腫瘍微小環境と予後との関連性を明らかにすることとした。221例の子宮内膜癌の手術検体において、腫瘍微小環境のバイオマーカーであるPD-L1、CD8、CD68、VEGFの免疫組織化学的染色にて、その蛋白発現の評価を行い、腫瘍微小環境プロファイルと予後との関連性を統計学的に解析した。腫瘍細胞におけるPD-L1の高発現は、良好な全生存期間と相関する傾向であった。腫瘍細胞周囲におけるPD-L1の高発現は、CD8陽性腫瘍浸潤性リンパ球数、CD68陽性腫瘍関連マクロファージ数、マイクロサテライト不安定性と有意な関連性を示した。腫瘍細胞周囲におけるPDL1の高発現は、より短い無治療期間である傾向を示した。全生存期間に関する単変量解析では、腫瘍細胞におけるPD-L1の高発現が予後良好因子、腫瘍細胞周囲におけるPD-L1の高発現、高齢、進行癌、非類内膜腺癌、深い筋層浸潤および脈管侵襲陽性が予後不良因子であった。全生存期間の有意な予後因子で行った多変量解析では、腫瘍細胞におけるPD-L1の高発現、高齢、進行期、非類内膜腺癌、および脈管侵襲陽性が独立した有意な予後因子であった。PD-L1を介した免疫チェックポイント機構が、子宮内膜癌における腫瘍微小環境の調節に関与し、その予後に影響を及ぼす可能性が示唆された。子宮体癌手術検体の腫瘍組織において、ヘルパーT細胞のマーカーであるCD4についての解析を追加した。高密度のCD4陽性腫瘍周囲免疫細胞は、全生存期間に関する予後因子の単変量・多変量解析において、有意で独立した予後良好因子であることがわかった。更に、高密度のCD4陽性腫瘍周囲免疫細胞は、より長い無治療期間(Treatment-free interval)と有意に関連することがわかった。従って、腫瘍組織におけるCD4陽性ヘルパーT細胞の高密度の存在は、化学療法感受性を増強することにより、予後良好因子となっている可能性が示唆された。子宮内膜癌における腫瘍微小環境プロファイルと臨床病理学的因子や予後との関連性についての検討結果を論文化し、投稿中である。手術検体から抽出したDNAやRNAの解析がやや遅れている。各症例手術検体のパラフィン包埋ブロックから腫瘍および辺縁組織のそれぞれからDNA・RNAを抽出する。抽出した腫瘍組織DNAを使用して次世代シークエンサーによる解析を行い、遺伝子変異の網羅的解析から各症例において同定された遺伝子変異の数と、MSI、MMR不全および腫瘍微小環境プロファイルとの関連性を統計学的に検討する。子宮内膜癌手術検体のパラフィン包埋ブロックから、腫瘍とその辺縁組織のそれぞれにつきマイクロダイセクションによりtotal RNAを抽出したのち、Cy3でラベルしたcDNAを合成し、マイクロアレイにハイブリダイゼイションさせ、遺伝子発現レベルを網羅的に解析する。まず腫瘍およびその辺縁組織それぞれに関して、免疫染色による腫瘍微小環境発現プロファイルの蛋白レベルでの結果と、マイクロアレイ解析による転写レベルでの結果との間の相関性を調べ、既に得られた腫瘍微小環境発現プロファイル・データの強化を図る。
公園砂場の原虫ならびに細菌汚染調査

1.砂場の原虫類汚染かつてクリプトスポリジウムの砂(土壌)からの検出の試みは全く行われていなかったが、我々は蔗糖液を用いた遠心沈殿浮遊法を行うことによって新しい検査法を確立した。すなわち、土壌中のオーシストはその周囲に微粒砂を付着させており、通常の遠心沈殿浮遊法は適用できなかったが、ゼラチンを0.1%添加することによって共沈を防ぎ、高い回収率を得ることが可能となった。この方法を用いて砂(土壌)からのクリプトスポリジウムのオーシストの検出を試みた。予備的に、あらかじめ汚染の確認されている牛舎周辺の砂を検査した場合、その全てからオーシストが検出され、この方法の有効性が明らかとなった。現在公園砂場のクリプトスポリジウム汚染の調査を実施中である。トキソプラズマの場合はクリプトポリジウムと異なり、砂中のオーシストを形態的に同定することは不可能である。そこでPCR法を用いた検査方法を検討した。すなわち、150μmのメッシュでろ過した微粒砂約2gをゼラチンを含む蔗糖液5mlに懸濁して遠心沈殿浮遊法を行う。上清を45mlの蒸留水にて懸濁後、遠心分離した沈渣を1.5mlのチューブに回収する。これらに1%SDS,1%PVPを含むTNE buffer 400μlに懸濁させ、常法に従ってDNAを抽出しPCRするという方法である。2.砂場の細菌汚染調査した144ヶ所の砂場中、120ヶ所(80%)から大腸菌が検出された。同時に行った寄生虫卵汚染の陽性率は43ヶ所(30%)であった。120ヶ所の陽性砂場における大腸菌の砂100グラムあたりの平均菌数は3,400個であった。調査に用いた検査法の最高検出限界は160,000個であったが、調査した砂場の10ヶ所がこれを上回っていた。砂場の大腸菌検査は未だに砂場として使用していない砂からも40-80個/の大腸菌が検出されており、砂場の大腸菌検査は必ずしも糞便汚染の指標とはなり得ないことが明らかとなった。本年度の研究活動は,(1)兵庫県下の公園砂場を対象とした犬・猫蛔虫卵ならびに大腸菌の汚染状況の比較と,(2)犬・猫蛔虫症に関する啓発活動の2点について行った。(1)では兵庫県下の114ヶ所の砂場を調査し,その34ヵ所(30%)から犬・猫蛔虫卵を,120ヵ所(83%)から大腸菌を検出した。犬・猫蛔虫卵の汚染に関係する因子は,(1)小さな砂場,(2)小さな公園に併設された砂場,および(3)市街地の住宅密集地にある砂場,でありこれらの因子を多く有する砂場の汚染度が高かった。砂場用として使用予定の砂(対照)を検査したところ,犬・猫蛔虫卵は陰性であったものの,大腸菌は陽性であった。このことは砂場汚染の指標として大腸菌ではなく犬・猫蛔虫卵の有無を調べる方法が有効であることを示唆している。

(2)犬・猫蛔虫症の生物学ならびに診断・治療法等に関する啓発活動の一環としての解説書を記した。本年度の研究活動は以下に示す3課題について行った。すなわち,(1)従来砂場の原虫類の検出法として採用していた蔗糖液による遠心沈殿浮遊法に変わる新しい検出方法の検討,(2)砂場に含まれる微生物のうち,昨年までに検討した犬・猫蛔虫や大腸菌に加えて,下痢症の原因原虫(Cryptosporidium parvum)の検出法の検討,そして(3)砂場の衛生管理に関する啓発活動である。(1)に関してはPCR法を用いる方法を検討し,その予備実験の成績を報告した。その結果,PCRによるDNAの増幅を2度繰り返すことにより少量の虫卵の検出が可能であること,さらにこの実験に用いたプライマーは他の原虫や線虫類などと,本研究で用いた大蛔虫とを明確に区別出来ることが明らかとなった。(2)に関しては近年水系感染症の原因原虫として注目されているクリプトスポリジウムによる砂場汚染の可能性が考えられたため,この原虫の検査法を検討・報告した。この方法は河川水からの本原虫の回収法を検討したものであるが,砂場の砂を懸濁した後の懸濁液からクリプトスポリジウムを回収するのに非常に有効な手段となることが考えられる。現在砂場の砂を用いた検討を行っている。さらに(3)に関しては犬・猫蛔虫症の症状と砂場の衛生管理に関する最新の知見を啓発すべく一般の商業誌に解説文を載せた。本年度の研究活動は以下に示す2課題について行った。すなわち,(1)免疫磁気ビーズ方などを用いた公園砂場からのクリプトスポリジウムのオーシストの検出法の検討と、(2)砂場に含まれる微生物のうち,大腸菌、特にO-157を対象とする調査である。(1)に関しては、オーシスト回収のための基礎的な諸条件の検討がほぼ終了した。それらは、砂を洗浄した懸濁液では微粒砂とオーシストの共沈現象が認められたため、分散剤の一種でもあるゼラチンを0.1%の割合に添加してこの現象を阻止した。ショ糖浮遊法で一旦集めたオーシストはその後の免疫磁気ビーズ法の回収率に影響を与えるため、蒸留水を用いた希釈が不可欠であり、ショ糖濃度を50%以下におさえる必要があった。最終的な同定は蛍光染色で行ったが、予備実験で用いた正常オーシストに、全く蛍光染色で染まらないものが散見されてたため、微分干渉顕微鏡観察を併用することとした。(2)大腸菌検査のためには大腸菌ベロトキシン検出用キットを用いて行った。予備的に行ったウシの糞尿からは多数のO-157が検出された。そこでこれらの検査法を応用して県下の25ヶ所の砂場のO-157検査を行ったが、砂場からはこれらは検出されなかった。(3)さらにこれら以外にも砂場からのトキソプラズマの検出のためのPCR法を検討している。砂の(土壌中)中に存在する阻害物質がPCR反応を阻止したが、現在ではほぼその問題点も解決し、野外調査に適応できるまでになっている。
遷移金属系パイロクロア型物質における構造相転移機構と物性の相関の解明

本課題研究において合成法を確立した当該物質の合成(遷移金属系パイロクロア型物質)を行うと共に、物性測定を行い、試料評価を行った。加えて、SPring-8 NIMSビームラインに設置されている高分解能粉末回折計を用いて構造相転移機構の解明に向けて当該物質ならびに関連物質の回折実験を行った。結果、関連物質の成果をも含め数々の成果を上げる事が出来た。近年、組成式A_2B_2O_7またはA_2B_2O_6として表わされる遷移金属系パイロクロア型結晶構造物質が示す超電導・金属-絶縁体転移・強誘電特性など数々の興味深い物性が非常に注目されている。これら物性の起源として、超電導や金属-絶縁体転移に関しては“結晶格子-電子軌道-電荷"が互いに強く相互し合う、いわゆる“強相関"がその起源として起きており、誘電特性に関しては、主として遷移金属元素サイトの配位子場において分極化が生じ、その誘電性が発現しているものと考えられている。しかしながら、それら物性の発現起源の解明には十分に至っていないのが現状である。そこで本研究では、放射光X線回折実験を利用して、パイロクロア型物質の結晶構造・電子密度の詳細を比較検討する事により、本物質系が示す構造相転移機構のメカニズムや超電導や強誘電性などの物性起源に迫ろうとするものである。今年度においては主として当該物質の合成を行い、純良な試料(Cd_2T_2O_7 ; T=Nb and Ta)の合成に成功し、それら試料の物性測定を行い、試料評価を行った。今後は当該物質を用いてSPring-8NIMSビームラインに設置されている回折計を用いて構造相転移機構の解明に向けた実験を遂行する予定である。これら物性の起源として、超電導や金属-絶縁体転移に関しては"結晶格子-電子軌道-電荷"が互いに強く相互し合う、いわゆる"強相関"がその起源として起きており、誘電特性に関しては、主として遷移金属元素サイトの配位子場において分極化が生じ、その誘電性が発現しているものと考えられている。今年度においては昨年度合成法を確立した当該物質の合成を継続的行うと共に、物性測定を行い、試料評価を行った。加えて、SPring-8NIMSビームラインに設置されている回折計を用いて構造相転移機構の解明に向けて当該物質ならびに関連物質の室温回折実験を行った。近年、組成式A2B207またはA2B206として表わされる遷移金属系パイロクロア型結晶構造物質が示す超電導・金属-絶縁体転移・強誘電特性など数々の興味深い物性が非常に注目されている。加えて、SPring-8 NIMSビームラインに設置されている回折計を用いて構造相転移機構の解明に向けて当該物質ならびに関連物質の回折実験を行った。
太陽光発電によるエネルギー自立型ＩＣＴを用いた新形質植物生産システムに関する研究

(1)パイロットプラントにおける透光性太陽電池による発電電力は、44V,2.2A、96.8Wであった。本来の最大動作電力は54.5V,3.96A,215.8Wであった。この電力を12V,50AHの容量の蓄電池に蓄えておき、LED、ベルトコンベヤー、シーケンス制御等の電源として用いた。(2)植物にLEDを補光として照射する点灯制御装置を作成し、自然光で育成する技術的基礎を開発した。(3)指向性アンテナによる無線ラン構築により研究室で、遠隔地における収穫物の生育状況を把握できることがわかった。(1)透光性太陽電池による発電電力は年間通じて、現地設置場所においては、季節により変動があるが44V,2.2A程度、96.8Wの電力が得られた。この電力を12V,50AHの容量を持つ蓄電池に蓄えておき、LED点灯、ベルトコンベヤーの各運転電源、シーケンス制御用電源として利用できた。本来の性能として電流3.96A,電圧54.5Vで電力として215.8Wであった。(2)この蓄電池を電源として、無線ラン用アンテナ系統用電源、植物生育状況のインターネットカメラ用電源に使用するので、これらの選定に当たって消費電力も考慮に入れて選定を行った。これによりエネルギー自立型の植物生育制御が可能となった。(3)植物にLEDを補助光として照射し自然光で育成を行うために作成した点灯制御装置を用いて貝割れ大根を20本ほどの広がりで苗から約10cmの高さ迄照射し、非照射区よりも効果があることがわかった。(4)無線ラン機器を設置するにあたって、温室側と学内ラン側で直進で見通せる場所の選定で各種関係機関との了解を得なければならず具体的な場所の選定に時間を必要とした。したがって、まだアンテナ設置用ポールは立てられていない。予備試験で実際のアンテナを現場で対向して仮設置し試験電波を発することにより十分信号伝達が行えることを確認した。(5)太陽光から得られるエネルギーの電力への変換によって、その電気を利用してLEDという光源の点灯制御を行い、植物の丈や色付きならびに味覚を改善することができることを示した。(6)指向性アンテナによる無線ラン構築により遠隔地における収穫物の成育状況を現場まで行かずともわかるようになり若年農業従事者や高齢者の労働時間短縮に大いに貢献できることになる。(7)携帯端末を利用して、この研究にアクセスすることにより生育状況を世界中のどこでも計測制御できるよう改善を図っていく。(1)植物にLED照射を行うための点灯制御装置の製作;LEDを光源にしてパルス状の点灯消灯が行える回路をPICマイコンを用いて製作した。PICにタイマー機能を持たせてリレー回路につないでLEDユニットの電源をON・OFFすることにより点灯制御を行った。(2)ベルトコンベヤーの運転制御とLED点灯制御の統合化:植物育成室が設置されている場所での日の出および日の入りに関する時刻は経度、緯度を入力することにより国立天文台のホームページから入手できる。シーケンサーを用いて1年分のデータをテーブルにまとめて、格納しておき日の出、日の入り時刻、LED作動時刻、作動時間をモニター画面で入力する。自動モードにしておくと、上記の日の入り、日の出時刻が更新され各時刻にベルトが動作するように作成している。(3)パイロットプラントの設置場所から研究室までの遠隔計測ならびに制御システムの構築について:LAN通信を用いて、植物育成室の作物の生育状況、室温、太陽電池、蓄電池等の電力、電圧等はインターネットに接続された研究室のサーバーを介して閲覧できるようフローチャートや全体のプランを作成した。育成室と学内LANの間は直線距離で約700mあり、無線電波の進行を妨げる小高い丘が存在している。無線通信でLAN設置場所までデータを送受信することとし、指向性アンテナの設置場所ならびに工事方法について検討を行った。学内VLANに接続するために電算センター運営委員会に申請し許可を得た。(1)植物にLED照射を行うための点灯制御装置の製作:おおむね順調に進展している。理由:小規模50個のLEDパネルを作成し、その点灯に必要な電圧、電流を求め電源を用意した。したがって、もっと大規模のLEDパネルの点灯制御できるようにする必要がある。(2)ベルトコンベヤーの運転制御:おおむね順調に進展している。理由:LED点灯装置の回路を変更しベルトコンベヤーが日の出時刻前にLEDの点灯制御が行えるようにできていないため。(3)パイロットプラントの設置場所から研究室までの遠隔計測ならびに制御システムの構築について:やや遅れている。理由:アンテナの学内設置場所の選定およびハードウエア、ソフトウェアの構想、機種選定について検討を繰り返し行ったため。(1)平成24年度に得られた結果を基にして、パイロットプラントの設置場所への制御、計測器具の設置、アンテナ設置、無線LANの試験的運用により電波の取得状況の確認調整を行う。遠隔計測ならびに制御システムの構築を行う。

(2)植物育成室の作物の生育状況、室温、太陽電池、蓄電池等の電力、電圧等はインターネットに接続された研究室のサーバーを介して閲覧できるようシステムのソフトならびにハードの両面で実施する。パイロットプラント全体の性能について評価し、画像から高齢者でも収穫時期を判断できる情報を提供できるようなユニバーサルデザインの面などについて端末表示に考察と改善を行う。研究成果活用のために収穫面積とそこに必要なLED点灯回路の面積、そのために必要な太陽電池の面積、育成した植物の付加価値を考慮に入れて収益性について検討する。得られた結果を取りまとめ、成果の発表を行う。(1)研究室:PC設置(バックアップHDD,パトライト).(2)無線ラン:送受信指向性アンテナのためのポールならびに取り付け(到達距離1kmを準備している。設置テストを行う).(3)育成室:PC設置入出力インターフェースボード、計測制御信号中継BOX(入力、出力用各8点最大16点まで増設)センサー(室温、太陽電池、蓄電池等の電力、電圧、日射量、植物育成状況観察カメラ等).(4)ベルトコンベヤー、LED点灯制御の統合ソフト.(5)計測・制御ソフトウェア、見える化ディスプレイ表示ができるように作成。予算に余裕があれば小出力の風力発電装置の設置を行い風の音の影響、発電量の大きさ、太陽電池の発電量との比較を行い太陽風力各発電特性を把握して、中山間地にエネルギー独立型植物育成装置を設置するための風力、太陽電池の設置規模について考察し基準を定める。
歯周病原因菌の歯肉溝における病原性

歯周病関連菌の宿主への付着は,歯周疾患の発症の第一のステップと考えられている。申請者は,歯周病関連の紡錘菌に着目し,その歯肉溝あるいは歯周ポケット局所での病原性を,細菌,特にFusobacterium nucleatumなどの他の細菌の代謝産物に栄養源を求めているBacteroides forsythusを宿主細胞との相互作用の観点から検討し,以下の知見を得た。1)F. nucleatumのL-Arginine感受性赤血球凝集素(A-HA)に対する抗体を用いたELISA法による検討の結果,この菌の液体培地と寒天平板培地での培養による赤血球凝集の差は,菌体の疎水性や静電価などの非特異的因子の変化によるものではなく,A-HAなど特異的因子の変化によるものである可能性が示唆された。2)B.forsythus19菌株を用いてヒト細胞への付着を検討したところ,この菌のヒト細胞への付着には複数の因子が関与しており,ヒト細胞の酵素処理により付着が変化していることが明らかになった。このことから,この菌が有する多種の酵素により宿主細胞を修飾し,付着に有利な条件を作っていることが示唆された。3)B.forsythus3菌株を用いて,ウサギ背部皮下での膿瘍形成能について検討したところ,B.forsythus単独ではごく短期間で菌体が排除されたが,F. nucleatumやPorphyromonas gingivalisと同時に移植したものは,長時間菌が生存し,場合によっては,2週間後に膿瘍形成をするものも観察された。以上の結果より,歯周病関連の紡錘菌は、それ自身,複雑な付着機構を有して宿主に付着し,定着していること,また,その宿主防御に対向して生存し,病原性を発揮するために,他種の紡錘菌や,それ以外の菌と共生している可能性があることが示唆された。
自由曲線・曲面の美的特徴空間の解明

本研究は,曲線・曲面の持つ様々な幾何的特徴量に着目し,各々の曲線・曲面のクラスが表現しうる特徴空間や,特徴量間の相互関係を総括的に解析することにより,位置制御と美的制御を両立した新しい曲線・曲面生成方法を構築するものである.それより,CGや意匠デザインの効率化や品質向上と,美的曲線・曲面形状理論の新体系構築を目指している.本年度は主に,各種曲線・曲面の特徴量間の相互関係の定式化と美的表現能力の解明を進めた.特に,自由度の大きい新型美的曲線の開拓を進め,位置制御と美的制御とを両立する枠組みの一つを構築した.以下に成果を示す.1.各種曲線の特徴量間の相互関係の定式化と美的表現能力の解明:B-spline曲線の制御点間隔と曲率変化とを勘案し,デザイナの感覚に沿った曲線再構築手法を提案した.また,曲線の次数や制御点配置と幾何学的特徴量との関連性を,デザイナにわかりやすく解説する方法ついて,検討を行った.2.自由度の大きい新型美的曲線の開拓:位置制御と曲率制御とを両立できる新しい曲線群として,方向角パラメータ(TAP)曲線および弧長パラメータ(ALP)曲線を提案している.本年度は,曲線のバリエーションを増やすとともに,複数セグメントの接続など様々な制御方法を開拓した.また,曲面への拡張について検討を開始した.3.形状と美的な見栄えに関連した種々の研究:美的な曲線・曲面に関する研究として,深層学習を用いた自動車の車型形状の特徴抽出,などの成果を得た.また,コンピュータグラフィックス,可視化,形状処理,映像制作の種々の問題に関し,美的な見栄えを考慮した研究成果が多数得られた.当初計画のうち,各種曲線の特徴量間の相互関係の定式化と美的表現能力の解明に関しては,一定の成果は出ているものの,組織的な解明には至っていない.一方,自由度の大きい新型美的曲線の開拓に関しては,当初の想定以上に進展しており,今後も研究の発展が期待できる.また,形状と美的な見栄えに関連した各種研究において,多くの成果が出ている.研究の方向性としては,おおむね当初計画に沿った方針で進める.ただし,自由度の大きい新型美的曲線の開拓が想定以上に進んでおり,さらなる発展が見込めることから,これをより重点的に推進する.特に,実用的な対話制御技術の確立と,曲面への拡張の実現を目指す.また,各種応用分野への適用とその評価を進める.本研究は,曲線・曲面の持つ様々な幾何的特徴量に着目し,各々の曲線・曲面のクラスが表現しうる特徴空間や,特徴量間の相互関係を総括的に解析することにより,位置制御と美的制御を両立した新しい曲線・曲面生成方法を構築するものである.それより,CGや意匠デザインの効率化や品質向上と,美的曲線・曲面形状理論の新体系構築を目指している.本年度は,研究を進めるうえでの基礎的な分析として,各種曲線・曲面の特徴量間の相互関係と特徴空間の解析,アニメーションにおける曲線の動きの解析などを行った.また,これと並行して,自由度の大きい新型美的曲線の開拓を進めた.以下に成果を示す.1.各種曲線・曲面の特徴量間の相互関係と特徴空間の解析:B-spline曲線,有理Bezier曲線,対数美的曲線・曲面などにおいて,制御点間隔,ウエイト,曲率対数グラフの傾き,その他各種パラメータと,曲率変化との関係を解析する環境を構築した.2.自由度の大きい新型美的曲線の開拓:位置制御と曲率制御とを両立できる新しい曲線群として,方向角パラメータ(TAP)曲線および弧長パラメータ(ALP)曲線を提案し,その基本的な部分において,性質,定式化,計算アルゴリズムなどを解明した.3.形状と美的な見栄えに関連した種々の研究:美的な曲線・曲面に関する研究として,完全対数美的曲面の制御方法,上眼瞼形状の性質分析,デザイナの感性を考慮した曲線再構築方法の改善,などの成果を得た.また,コンピュータグラフィックス,可視化,形状処理,映像制作の種々の問題に関し,美的な見栄えを考慮した研究成果が多数得られた.当初計画のうち,各種曲線・曲面の特徴量間の相互関係と特徴空間の解析に関しては,散発的な取り組みは各種進めているが,組織的な枠組みの構築には至っていない.一方,自由度の大きい新型美的曲線の開拓に関しては,当初の想定以上に進展している.また,形状と美的な見栄えに関連した各種研究において,多くの成果が出ている.本研究は,曲線・曲面の持つ様々な幾何的特徴量に着目し,各々の曲線・曲面のクラスが表現しうる特徴空間や,特徴量間の相互関係を総括的に解析することにより,位置制御と美的制御を両立した新しい曲線・曲面生成方法を構築するものである.それより,CGや意匠デザインの効率化や品質向上と,美的曲線・曲面形状理論の新体系構築を目指している.本年度は,研究を進めるうえでの基礎的な分析として,各種曲線・曲面の特徴量間の相互関係と特徴空間の解析,アニメーションにおける曲線の動きの解析などを行った.また,これと並行して,自由度の大きい新型美的曲線の開拓を進めた.以下に成果を示す.1.各種曲線・曲面の特徴量間の相互関係と特徴空間の解析:B-spline曲線,有理Bezier曲線,対数美的曲線・曲面などにおいて,制御点間隔,ウエイト,曲率対数グラフの傾き,その他各種パラメータと,曲率変化との関係を解析する環境を構築した.

2.自由度の大きい新型美的曲線の開拓:位置制御と曲率制御とを両立できる新しい曲線群として,方向角パラメータ(TAP)曲線および弧長パラメータ(ALP)曲線を提案し,その基本的な部分において,性質,定式化,計算アルゴリズムなどを解明した.3.形状と美的な見栄えに関連した種々の研究:美的な曲線・曲面に関する研究として,完全対数美的曲面の制御方法,上眼瞼形状の性質分析,デザイナの感性を考慮した曲線再構築方法の改善,などの成果を得た.また,コンピュータグラフィックス,可視化,形状処理,映像制作の種々の問題に関し,美的な見栄えを考慮した研究成果が多数得られた.当初計画のうち,各種曲線・曲面の特徴量間の相互関係と特徴空間の解析に関しては,散発的な取り組みは各種進めているが,組織的な枠組みの構築には至っていない.一方,自由度の大きい新型美的曲線の開拓に関しては,当初の想定以上に進展している.また,形状と美的な見栄えに関連した各種研究において,多くの成果が出ている.本研究は,曲線・曲面の持つ様々な幾何的特徴量に着目し,各々の曲線・曲面のクラスが表現しうる特徴空間や,特徴量間の相互関係を総括的に解析することにより,位置制御と美的制御を両立した新しい曲線・曲面生成方法を構築するものである.それより,CGや意匠デザインの効率化や品質向上と,美的曲線・曲面形状理論の新体系構築を目指している.本年度は主に,各種曲線・曲面の特徴量間の相互関係の定式化と美的表現能力の解明を進めた.特に,自由度の大きい新型美的曲線の開拓を進め,位置制御と美的制御とを両立する枠組みの一つを構築した.以下に成果を示す.1.各種曲線の特徴量間の相互関係の定式化と美的表現能力の解明:B-spline曲線の制御点間隔と曲率変化とを勘案し,デザイナの感覚に沿った曲線再構築手法を提案した.また,曲線の次数や制御点配置と幾何学的特徴量との関連性を,デザイナにわかりやすく解説する方法ついて,検討を行った.2.自由度の大きい新型美的曲線の開拓:位置制御と曲率制御とを両立できる新しい曲線群として,方向角パラメータ(TAP)曲線および弧長パラメータ(ALP)曲線を提案している.本年度は,曲線のバリエーションを増やすとともに,複数セグメントの接続など様々な制御方法を開拓した.また,曲面への拡張について検討を開始した.3.形状と美的な見栄えに関連した種々の研究:美的な曲線・曲面に関する研究として,深層学習を用いた自動車の車型形状の特徴抽出,などの成果を得た.また,コンピュータグラフィックス,可視化,形状処理,映像制作の種々の問題に関し,美的な見栄えを考慮した研究成果が多数得られた.当初計画のうち,各種曲線の特徴量間の相互関係の定式化と美的表現能力の解明に関しては,一定の成果は出ているものの,組織的な解明には至っていない.
ペプチド核酸の分子認識能を用いた不斉転写に関する研究

1991年Nielsenらによって初めて合成されたPNAは、側鎖として核酸塩基を有するアミノエチルグリシンが縮合した全く新しい型の化合物である。このPNAは相補的な塩基配列を持つDNAやRNAの配列を認識し特異的に結合することが明らかにされており、生体高分子の分子認識能研究のツールや遺伝子レベルでの治療薬開発の可能性を秘めた化合物として注目を集めている。今回申請者は、PNAを用いた不斉反応場構築の基礎研究として、アデニンとチミンを塩基として有するビルディングブロックの合成とこれらの固相合成の条件を検討した。従来PNAの固相合成は、ペプチド合成の手法を応用し、最終的な固相樹脂よりの切り出しを強酸を用いて行う手法が一般的であったが、この方法では収率に関して問題があった。筆者は固相樹脂よりの切り出しを温和なアンモニア水溶液で行うWillらの手法を踏襲しつつ改良を加え、ビルディングブロックの大量合成法の確立を行なった。PNAの骨格となる2-アミノエチルグリシンはエチレンジアミンとグリオキシル酸より合成した。このもののC末端をメチルエステルとして、1級アミノ基をメトキシトリチル基で保護した。次いでp-メトキシベンゾイルアデニル酢酸を2級アミノに縮合した後pHをコントロールしながらメチルエステルを加水分解し塩基としてアデニンを有するビルディングブロックの合成を行った。また、同様にチミニル酢酸を2級アミノに縮合しチミン単位の合成を行った。今後これらビルディングブロックを用いたPNAの固相合成法の確立とキラルなキラルなPNA合成への応用を検討する予定である。
セルラーゼはセルロースミクロフィブリルを修復する酵素である

セルロース合成菌(Acetobacter xylinum)の膜画分をUDP-[^<14>C]グルコースとインキュベートすることにより、ビトロでのセルロース合成を試みた。セルラーゼ遺伝子が破壊された変異株は、野生株に対して、約3分の1の合成量を示すことが認められた。合成酵素反応系にリコンビナントセルラーゼを加えて取り込みをみたところ、約2倍量の増加が認められた。この反応物を電気泳動に供したところ、Nativeゲルでも、[^<14>C]グルコースの取り込みとウェスタンブロットによるセルラーゼの挙動は一致していた。このことから、セルラーゼがセルロース生合成のプライマーとして機能していることが示された。次に、UDP-[^<14>C]グルコースからセルロースを合成して反応生成物をSDS/PAGEに供した。^<14>Cラベルはオートラジオグラフィで、セルラーゼはウェスタンブロットで検出した。その結果、一部のラベル(反応生成物)はゲルの中に入った。反応液中にセルラーゼを添加すると、ラベルがセルラーゼ(46kDa)と同じ挙動を示した。すなわち、セルラーゼが[^<14>C]グルコースでラベルされることを発見した。セルラーゼのシグナルがスミヤーになることから、グルコース部分は重合度が高いことが推察された。現在、最適条件でリコンビナントセルラーゼをプライマーとして初発反応を行い、反応生成物(セロオリゴ糖/セルラーゼ複合体)を抗体カラムによって単離するとともに、得られた複合体をゲルろ過カラム及び電気泳動に供してセルラーゼとセロオリゴ糖が同じ挙動であることを示し、セロオリゴ糖の重合度をメチル化分析によって決定している。セルロース合成菌(Acetovacter xylinum)のセルロース合成酵素オペロンの上流にある、セルラーゼ遺伝子をマーカエクスチェンジ法によって遺伝子破壊するとセルロースが生産されなくなった(変異株)。合成初発反応のためにセロオリゴサッカライドをプライマー分子として与えたが効果は無かった。そこで、この菌のセルラーゼ遺伝子を発現ベクターpSA19に構築し、変異株を形質転換すると、再びセルロースの生産を開始した。同時に、ポプラのセルラーゼ(PopCell)をこの変異株で発現させると、同様にセルロースを生産した。電気泳動によって分離したセルラーゼのバンド(36kDa)はカルコフローで染色されなかったが、細胞内タンパク質で抗体と反応するものはカルコフローで染色された。この変異株に水素結合解除タンパク質(CBD部分及びエクスパンシン)を発現させたが、効果は無かった。膜結合型セルラーゼ(KORRIGANセルラーゼ)の発現も効果がなかったが、膜結合部分を除くと少量のセルロースを生成した。変異株が生育しつつある固体培地にウェルを作り、そこに様々な添加物を与えて効果をみるアッセイ法を開発した。そのウェルにペプチドグルカンを分解するリゾチームを与えてもセルロースは生成されなかったが、Outer membraneを溶かすEDTAを与えるとセルロースを生成した。このことから、Outer membraneのサイズが小さく、そこからミクロフィブリルを分泌するためにセルラーゼが必要とされることが推察された。そこで、これら細胞壁全体を溶解するSDSを用いたところ強いセルロース生産が認められた。