hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ドーパミンの時空間的分泌ダイナミクス

マウスDA作動性ニューロンの分散培養系の確立と、さらに本培養系において腹側被蓋野(VTA)由来のDAニューロンと、黒質緻密部(SNc)由来のDAニューロンとをcalbindinの染色により分別し、それぞれの部位特異的なCAPS2分布を明らかにした。さらに野生型マウスとCAPS2 KOマウスからDAニューロンの培養を行い、それぞれのニューロンからDA分泌をタイムラプスイメージングにより定量解析したところ、CAPS2 KOマウス由来のDAニューロンにおいて、有意にDAの分泌活性が低下していることを明らかにした。本研究の目的はドーパミン(DA)の分泌制御機構について、有芯小胞の分泌制御に関与していると考えられているタンパク質CAPS2がどのように寄与しているか、という側面から研究を行うものである。これまでの研究において、まず我々はマウスのDA作動性ニューロンの分散培養系の確立を行った。現時点ではDAニューロンを主要に含む形での分散培養系は確立できていないが、少数のDA作動性ニューロンを含む培養系についてCAPS2とDA含有小胞の細胞内分布について免疫組織化学により同定した結果、内在性CAPS2とDA含有小胞特異的に発現するモノアミントランスポーターvMAT2が一定の確率で共局在するということを明らかにした。さらにこの共局在の分布はシナプス上に多く見られるが、シナプス外にも散見されることが確認された。さらに、DA含有小胞はDA作動性ニューロンの軸索のみならず樹状突起においても分泌されることが知られているため、軸索、樹状突起それぞれにおける分布について、それぞれのマーカータンパク質であるTau及びMAP2との共染色を行った結果、DA含有小胞とCAPS2の共局在性については軸索、樹状突起双方で存在することが確認された。一方でCAPS2と共局在していないvMAT2免疫陽性小胞群も一定数見られ、これが「CAPS2と共役しない分泌機構を有するDA含有小胞」なのか、「未だCAPS2と共役していない(最終的には共役する)DA含有小胞」なのかは現時点ではなおはっきりしていない。本年の成果としては、昨年度実現できなかったDA作動性ニューロンの培養系の確立を行い、さらに同一培養系内において腹側被蓋野(VTA)由来のDAニューロンと黒質緻密部(SNc)由来のDAニューロンとをcalbindinの染色により分別し、それぞれの部位特異的なCAPS2の分布を明らかにした。さらに、野生型(WT)マウスとCAPS2 KOマウスからDAニューロン分散培養を行い、それぞれのニューロンからのDA分泌をFFNという蛍光試薬を用いてタイムラプスイメージングにより定量的に解析したところ、CAPS2 KOマウス由来のDAニューロンにおいて、有意にDAの分泌活性が下がっていることを明らかにした。神経科学当初の計画にあったDA含有小胞とCAPS2の細胞内局在について、マウスDA作動性ニューロンの分散培養を行い、その軸索・樹状突起及びシナプス内外の分布を明らかにできた点において、計画は順調に進展していると考える。しかしながら、DA含有小胞の分泌イメージングについては、pH感受性蛍光タンパク質を使用した系においても、DA含有小胞ラベル蛍光物質FNN511を使用した系においても現時点では完全に確立しておらず、当初の計画以上に進展しているとは言えない。これまでの研究ではある程度計画通りに進展していると思われるが、マウスDA作動性ニューロンの分散培養系の確立について、現時点で大量のDA作動性ニューロンを含む培養系が確立できておらず、その原因もありDA含有小胞の分泌イメージング系の確立も完全には達成されていないことから、本年度はこの部分について集中的に検討実験を行い、早急に系を確立し、DA含有小胞の分泌イメージングアッセイによってCAPS2の有無が与える影響を検討する必要がある。また、アンペロメトリを用いた解析は現状ではセットアップができておらず、この系の確立についても早急に行う必要がある。本年度は研究代表者が所属する研究室において準備できる機材、設備によって研究を遂行することが可能であったため。本年度に必要な経費としては、通常の消耗品費用に加えてアンペロメトリの導入を計画している。
尾部再生に必要な基部-先端パターン形成のメカニズム

アフリカツメガエル幼生尾部の再生には、再生芽の先端で強く発現するXwnt-5aが重要な働きを持つ。Xwnt-5aの作用機構を明らかにすることを中心として、尾部再生における基部一先端パターン形成のメカニズムを明らかにしようとした。その結果、Xwnt-5は幼生尾部組織に直接作用すること。Canonical Wntシグナル経路ではなく、JNKシグナルを経由すること。再生芽の伸長やパターン形成にはWntシグナルに加えてFGFやhedgehogシグナルも重要であることなどがわかった。アフリカツメガエル幼生尾部を完全に切断した場合には、尾部を再生するが、背側かち半分まで切り込みを入れた場合には、同じ種類の細胞が増殖・分化するにも関わらず、傷の治癒しかおきない。我々は、尾部再生過程だけで発現するXwnt-5aを、異所的に作用させることにより、治癒を尾部再生へと変化させることに成功した。再生芽の先端部分で強くXwnt-5aの発現が誘導され、そのシグナルにより再生組織中に基部-先端軸方向のパターンが形成され、再生尾部が伸長するものと推定されるが、どのようなメカニズマによりXwnt-5aが発現するのか、またXwnt-5aのシグナルを受けた細胞が実際どめように変化して再生過程が進行ずるのか明らかにしようと研究をおこなった。切断面では背側と腹側の細胞が一過的に接触することにより直接あるいは間接的にXwnt5aの発現が誘導されると推定される。このとき、腹側で強く発現するBMPのシグナルがその引き金となる可能性が、BMPシグナ所特異的な抗SMAD抗体を用いた解析から示唆された。また、再生芽の最も先端部に位置する多層の表皮でxHES1が特異的に発現上昇することがわかり、この遺伝子の発現が基部-先端パターン形成において重要な役割を持つと示唆された。アフリカツメガエル幼生尾部を完全に切断した場合には、尾部を再生するが、背側から半分まで切り込みを入れた場合には、同じ種類の細胞が増殖・分化するにも関わらず、傷の治癒しかおきない。再生芽の先端部分で強くXwnt-5aの発現が誘導され、そのシグナルにより再生組織中に基部-先端軸方向のパターンが形成され、再生尾部が伸長するものと推定されるが、どのようなメカニズムによりXwnt-5aが発現するのか、またXwnt-5aのシグナルを受けた細胞が実際どのように変化して再生過程が進行するのか明らかにしようと研究をおこなった。このとき、このときに表皮細胞がどのような形態変化と移動をおこなうかを解析した。エレクトロポーレーション法により表皮細胞を標識したところ、尾部切断面に近い領域から順次切断面に向かって細胞が、伸長しながら移動することがわかった。また、この過程で通常二層ある表皮細胞層が単層可することも明らかになった。
公共投資の競合とその影響-兵庫県南部の地域開発を事例に-

平成21年度は、兵庫県による播磨工業地帯の開発とそれを後背地とする姫路港、東播磨港の大規模化を事例として、公共投資の累積・集中が進められることによって、それが当該地域のみならず他の地域にどのような形で影響が波及するのかについて解明することに取り組んだ。これについては、播磨地域の臨海部が工業地帯として開発されたことに伴って、原材料・製品の搬出入口である港湾(姫路港、東播磨港)の整備ならびに大規模化が進められたことを一次資料などを用いながら確認した。そのうえで、それが隣接する阪神工業地帯のそれと比べて5倍以上のギャップがあったことや工業地帯の盛衰に決定的な影響を与えていたことを明らかにした。それから、1967年に運輸省と地方自治体の共同出資によって設立され1982年に廃止・解体された外貿埠頭公団(京浜外貿埠頭公団、阪神外貿埠頭公団)を事例として取り上げ、地方自治体が実施してきた港湾整備に中央政府が関与し、整備主体である行政が多元化することによって、それが政策決定過程にどのような影響を与えるのかについて明らかにすることにも取り組んだ。これによって、港湾を整備・管理する主体は地方自治体であり、それらが自律的かつ戦略的に行動していること、港湾整備をめぐる中央政府と地方自治体の関係が垂直的とは必ずしも言えず、前者についても省庁間で軋轢があり一枚岩ではないこと、港湾施設のユーザーである海運業界の意向が港湾整備に反映されやすいことが明らかになった。これらの研究成果と、平成20年度の研究成果をあわせて、博士論文「港湾整備における行政の多元化とその影響-大阪湾の港湾整備に関する分析-」を執筆・提出し、2010年3月に博士の学位を取得した。平成20年度は、1960年代から1980年代にかけての大阪湾一帯の港湾整備に関する政治経済的分析に取り組んだ。1960年代初頭に全国各地の主要港湾では、大量の船舶が入港し「船混み」が社会問題化した時期がある。この結果、各地の主要港湾では大規模化が図られ、コンテナ埠頭やフェリー埠頭が整備された。神戸港と大阪港は、その最たる例であった。これにより「船混み」の問題は解決へと至り、取扱貨物も大幅に拡大することになった。ところが、このような状況は、当時、両港と同様に大規模化をめざしていた尼崎西宮芦屋港の整備事業を見直しへと追い込む動因にもなった。本研究が注目したのは、神戸港、大阪港の港湾整備のプロセスを概観した上で、それが両港の間に位置する尼崎西宮芦屋港とどのような相関関係にあったのかについてである。これらを明らかにし、政府間関係論、あるいは港湾整備をめぐる議論に新たな知見を加えるべく、主に当時の港湾計画書、統計、白書類、議会議事録、新聞など一次資料を中心に調査した。港湾計画書、白書類、新聞などについては、主に国立国会図書館や各地(大阪府内、兵庫県内)の図書館、資料館で調査を行った。調査の結果、港湾整備をめぐる中央政府の権限は、それほど大きくないことが明らかとなり、地方自治体、利益団体の意向が港湾整備に反映される傾向が観察された。そして、各地方自治体の自律的で競争的な行動が港湾管理の一元化を妨げ、アンバランスな港湾整備をもたらす背景になった一方で、港湾の大規模化の促進要因であった。
ゲノムワイド関連解析に基づく重症敗血症の個別化医療に関する研究

重症敗血症の転帰には遺伝的素因が影響していることが知られている.個々の遺伝的素因として遺伝子多型が知られている,しかし未だどの遺伝子のどの遺伝子多型が重症敗血症の遺伝的素因に影響を与えているか判然としない.そこで全ゲノム(ゲノムワイド)を関連解析した.この探索的解析では,SVEP1という遺伝子の遺伝子多型が重症敗血症の転帰と関連することが示唆された.重症敗血症の転帰には遺伝的素因が影響していることが知られている.個々の遺伝的素因として遺伝子多型が知られている,しかし未だどの遺伝子のどの遺伝子多型が重症敗血症の遺伝的素因に影響を与えているか判然としない.そこで全ゲノム(ゲノムワイド)を関連解析した.この探索的解析では,SVEP1という遺伝子の遺伝子多型が重症敗血症の転帰と関連することが示唆された.1.Lymphoblasoidcellsを用いたGWAS(Stage 1)のデータ収集と解析2.重症敗血症日本人コホートのサンプル収集重症敗血症コホートの患者サンプルおよび臨床データの収集中である.1.Lymphoblasoidcellsを用いたGWAS(Stage 1)のデータ収集と解析2.重症敗血症日本人コホートのサンプル収集重症敗血症コホートの患者サンプルおよび臨床データの収集中である.26年度が最終年度であるため、記入しない。救急医学26年度が最終年度であるため、記入しない。計画通り,行えている.計画通り,行えている.26年度が最終年度であるため、記入しない。収集したサンプルおよび臨床データの解析を行う.また、引き続きサンプルおよび臨床データの収集を継続して行う.収集したサンプルおよび臨床データの解析を行う.また、引き続きサンプルおよび臨床データの収集を継続して行う.26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度同様、サンプル解析のための試薬購入や人件費に充てる予定である.遺伝子解析をまとめて次年度に行うため.遺伝子解析に使用する予定である.
インドネシア産薬用植物に含まれる抗寄生虫活性物質の研究

本研究は,インドネシアで薬用に用いられている植物から抗寄生虫活性をもつ植物を探索し,その有効成分を抽出して構造決定を行うことを目的として計画された。昨年度の研究により,ニガキ科のBrucea javanica (L..)Merr.の乾燥種子の抽出物のなかでクアシノイドであるbruceine Aがイヌ・バベシア症の病原体であるBabesia gibsoniのin vitroにおける赤血球内増殖を強く抑制したことから,今年度はB.gibsoniを感染させたビーグル犬におけるbruceine Aの治療効果を判定した。その結果,6.4mg/kg6日間の経口投与によって貧血,発熱など犬バベシア症に特徴的な臨床症状を改善させることができたが,血液内原虫数の抑制効果は不十分であり,投与方法,投与期間などについてさらなる検討が必要であることが判明した。また,同種子抽出物のその他の寄生虫に対する活性を調べるため,非ツェツェバエ性トリパノソーマ症の病原体であるTrypanosoma evansiのin vitroにおける増殖抑制効果を検討した。その結果,この抽出液には,抗トリパノソーマ症の治療薬として用いられているantrycide, suramin, berenilよりも低濃度で原虫の増殖を抑制する化合物がふくまれていることが明らかになり,Brucea javanicaは広域抗寄生虫薬として開発する価値のある有望な薬用植物であることが示された。世界の国々では今なお寄生虫症によって多くの人々と家畜が苦しめられており,とりわけ,細胞内寄生性原虫に対する有効な治療薬を開発することは先進国に課された重要な使命である。本年度は,獣医学領域で問題となっているイヌ・バベシア症の病原体であるBabesia gibsoniを標的として,インビトロにおける赤血球内増殖を抑制する植物を探索した。その結果,インドネシア産薬用植物29種類の抽出物について検討を行ったところ,ニガキ科のBrucea javanica (L.)Merr.の乾燥種子の抽出物が最も強い活性を有することが明らかとなった。この抽出物には,抗バベシア活性をもつ有効成分として2種類の新規のクアシノイド(bruceantinol Bとbruceine J)と,既知のクアシノイド6種類(bruceantinol, yadanziolide A, bruceine A, B, C, D)が含まれていた。とくに,bruceine Aとbruceanitolは,抗バベシア症の治療薬として用いられているガナゼックよりも低濃度で原虫の赤血球内増殖を抑制した。なお,これらの成分については,核磁気共鳴,赤外スペクトル,質量スペクトルなどの各種スペクトルデータを解析して構造決定を行った。
イトカワ粒子から探る太陽系小天体の硫黄の挙動と表面進化

S型小惑星の表面では、普通コンドライトに比べて硫黄の量が少ないことが観察されている。これは硫化鉄から硫黄が選択的に失われたことが原因であると推定されている。ひとつの原因は陽風を構成するHやHeイオンの照射であると考えられているが、硫化鉄はイオン照射に対して変質を受けにくいと予想されていた。本年度は、はやぶさが回収した小惑星イトカワの微粒子に含まれる硫化鉄を観察し、長期にわたり太陽風に暴露された硫化鉄の変化を分析した。そして硫黄の消失過程の有無やそのメカニズムを解明することを目的とした。透過型電子顕微鏡でイトカワの微粒子を観察した結果、硫化鉄の表面には金属鉄のひげ結晶が分布していた。ひげ結晶は最大で3マイクロメートル程度の長さで表面の広い範囲を覆っていた。ひげ結晶が成長している根元の硫化鉄表面は多数の穴が空いており、50nm程度の深さまで発達していた。この深さは太陽風のHeの貫入深さ程度であり、この空隙は太陽風に暴露されたことで形成したと推定した。金属のひげ結晶は鉄化合物や銀化合物表面に形成することが知られている。これらの金属化合物が水素ガスなどによって還元された際に、過剰となった金属イオンが固体中の電子と結びつき、金属のひげ結晶が析出すると考えられている。イトカワ表面の硫化鉄においては、太陽風による硫黄原子の選択的なスパッタリングや、硫化鉄内部に溜まった太陽風由来の水素ガスが還元作用を引き起こし硫黄が気相に失われることに伴い、金属鉄のひげ結晶が成長すると推測した。イトカワ粒子の硫化鉄の表面に分布しているひげ結晶を対象に透過型電子顕微鏡を用いた観察を行なった。観察によって、ひげ結晶は金属鉄の多結晶で構成されることが明らかとなった。ひげ結晶の根元の硫化鉄の表面は泡が多数分布しており、その周囲の硫化鉄の結晶は歪んでいた。この硫化鉄の特徴は太陽風の貫入によって引き起こされたイオン照射損傷と考えることができる。こうした観察と先行研究との比較によって、ひげ結晶は太陽風の照射によって、硫化鉄から硫黄が失われたことで形成したと推定できた。本研究の主要な目標はひげ結晶の成長機構を調べることであり、本年度の研究でおおむね目標を達成できた。これまで研究から、ひげ結晶の形成メカニズムをイトカワ粒子の観察から推定することができた。今後は、太陽風によるイオン照射を模擬した水素・ヘリウムイオンの照射実験を行なって、ひげ結晶の成長を再現できるか否かを確かめることを計画している。予備実験を行なった結果、水素やヘリウムイオンの打ち込みだけではひげ結晶が形成しないことがわかった。これは実験期間において、室温の硫化鉄中での鉄原子の拡散が非常に遅いからであると考えている。そこで照射サンプルの加熱実験も加えることで、鉄の拡散を早めた状態でひげ結晶が成長するかどうかについて検討する。また、イトカワ以外の天体のサンプルである月レゴリスやレゴリス角礫岩隕石に含まれる硫化鉄を観察して、どのような変成組織が存在するかを分析し、異なる天体間での違いについて比較することを計画している。

今後は、太陽風によるイオン照射を模擬した水素・ヘリウムイオンの照射実験を行なって、ひげ結晶の成長を再現できるか否かを確かめることを計画している。予備実験を行なった結果、水素やヘリウムイオンの打ち込みだけではひげ結晶が形成しないことがわかった。これは実験期間において、室温の硫化鉄中での鉄原子の拡散が非常に遅いからであると考えている。そこで照射サンプルの加熱実験も加えることで、鉄の拡散を早めた状態でひげ結晶が成長するかどうかについて検討する。また、イトカワ以外の天体のサンプルである月レゴリスやレゴリス角礫岩隕石に含まれる硫化鉄を観察して、どのような変成組織が存在するかを分析し、異なる天体間での違いについて比較することを計画している。
免疫グロブリン可変領域遺伝子よりみた潰瘍性大腸炎病変粘膜内自己抗体産生細胞の特性

1.抗大腸抗体産生B細胞クローンの樹立潰瘍性大腸炎患者病変部大腸粘膜より抗大腸抗体産生B細胞クローンの樹立した。LPLおよびPBLより樹立した抗大腸抗体産生B細胞クローンの検討では、リミティングダイリューション法より、その存在頻度はLPLでは細胞100万個あたり12.51.5個、PBLでは0.50.1個の頻度であることが計算上示された。2.PCR法によるVH遺伝子ファミリーの発現の検討抗大腸抗体産生B細胞クローンよりRNAを抽出し、RT-PCR法により各クローンのVH遺伝子ファミリーの発現を検討した。健常人の末梢血より樹立したIgG産生(抗大腸抗体非産生)B細胞クローンではさまざまなVH遺伝子を発現していたのに対して、潰瘍性大腸炎患者より樹立した抗大腸抗体産生B細胞クローンではLPLの3個、PBLの7個のクローンがすべてVH3ファミリーを発現していた。3.抗大腸抗体産生B細胞におけるVH遺伝子の塩基配列の解析VH3ファミリーを発現していた抗大腸抗体産生B細胞クローンのうち、LPLの2個、PBLの3個のクローンについてVH領域の遺伝子の塩基配列を解析したところ、検討した5個のクローンでフレームワーク領域の塩基配列は非常に保たれていたが、相補性決定領域(complementarity denermining region,CDR)で多様性を認めた。胚細胞上の遺伝子と塩基配列の相同性を検討すると、同一患者のLPLの2個クローンでは同一の遺伝子(VH26)より由来していると考えられたが、PBLの3個のクローンは、それぞれ異なる胚細胞上の遺伝子に由来していると考えられた。体細胞突然変異の出現頻度については、これまでに報告されている他の自己免疫疾患と比べて胚細胞上の遺伝子と塩基配列の相同性が低いため、未知の遺伝子に由来する可能性をも含め今後の検討課題である。
東部ドイツ農業の構造再編と企業形態

東部ドイツ経済の市場経済対応は94年末の信託庁の任務完了をもって、国営企業の民営化の第一段階を終了し、新規企業の設立という第二段階に入った。農業においては91年末にLPGが解体され、92年はじめからは登記協同組合・有限会社等の法人経営、家族経営・人的会社等の自然人経営が中心となる新たな生産構造に転換した。また92年には信託庁が旧人民所有農地の私有化に関する基本方針を発表し、さしあたり94年末までに長期的な借地関係の形成が着手された。さらに94年には土地改革によって農地を没収された旧所有者の補償に関する法律が成立して、統一に伴う第一段階の再編期間が終了し、市場経済の下での長期的な再編段階に入った。こうした再編を通じて東部ドイツ農業においては以下のような構造が形成された。1.借地制農業の支配。土地取引と地代決定の自由の下で、借地に基づく法人経営が支配的な経営構造(借地率77.5%)。2.法人経営の優位。自然人経営の増加は個人経営主導から人的会社主導へとシフトしつつあり、LPGから転換した法人経営では登記協同組合が中心であるが、有限会社が急増して両者が接近しつつあり、法人経営自体の企業的性格が深化しつつある。3.大規模経営の優越。1000-3000haを中心とした登記協同組合や有限会社が農地の過半を集積する構造は当面の間継続する。急増する人的会社経営は200-500ha、個人専業経営は100-200haが中核。個人専業経営から人的会社への再編が進行している。100ha未満層は一部に専業経営の形成がみられるが、主力は20ha未満の個人副業経営で、失業の長期化の下でこうした傾向が続くだろう。4.専門化の進んだ経営形態への再編。零細な園芸経営、大規模な穀作・果樹作経営、土地利用と切断された酪農・畜産経営等、作目・蓄種により著しい差違をはらんだ零細経営と大規模経営の併存が特徴的である。2.法人経営の優位。
ダストは惑星を動かすか

一般的に惑星は、固体粒子(ダスト)を含むガス円盤の中で形成される。その際、惑星はガス円盤からのガス抵抗によってその軌道を大きく変える。本研究の目的は、この軌道変化の様子をより詳細に理解することである。従来の研究ではガス円盤と惑星との間の相互作用しか考えていなかったが、本研究ではこれらにダストの効果を含めた惑星・ガス・ダスト3体間の相互作用を考慮した。その結果、ダストの存在は従来予想されていた軌道変化率を変えうることがわかった。本研究では、地球質量程度まで成長した天体がガス円盤とダストそれぞれの重力相互作用によってどのような影響を受けるのかについて調べる。特に、天体の軌道変化の様子に着目して研究を進めている。質量を持つ物体同士は重力を介して角運動量を交換し、その軌道を変化させる。地球軌道付近上にある円盤のガス量は地球質量程度であり、地球質量程度の天体はガス円盤ともっとも強く重力相互作用を起こす。一方で、ダストは今まで天体が成長した時期にはほとんど円盤内に残っていないだろうと考えられ、重力相互作用の要素から無視されてきた。しかし、最近の研究は円盤外側からのダスト移動によって内領域にダストが供給される可能性を指摘している。ダストを考慮すると、ダストそれ自身が天体に与える直接的な効果と、ガスとダスト間の摩擦によってガス密度分布が変化し、天体とやり取りするトルク量が変わる間接的な効果が発生する。これら2つの効果が、ダスト量やダストサイズでどのように変わるのかを明らかにしていく。上述の角運動量のやり取りは天体周りのガス・ダストの密度分布と密接に関係しており、その関係は非線的である。そのため、本研究では数値計算法を使い、ガスとダストに関する流体方程式を解くことでこの角運動量のやり取りの様子を見ていく。平成25年度は計算に入り込む人工的なエラー、すなわち、計算分解能や計算領域の広さに起因するエラーについてチェックを行い、その影響を評価した。また、計算効率を上げるコードの開発も同時に進めた。領域の広さについては、角運動量のやり取り量に対して最大で10%未満の変化を与えることがわかった。次に、トルク量推定に対するメッシュ数の影響は領域の広さよりも影響が大きいことがわかった。現在、大規模計算でもある程度の時間で終わるように計算コードをバージョンアップしているところである。地球質量程度の惑星は円盤ガスとの重力相互作用によってその軌道長半径が変化する。この物理過程は惑星移動として知られている。惑星移動の向きと速度は、リンドブラッドトルクと共回転半径付近で生じる共回転トルクの2つの和によって支配されている。先行研究から、温度分布が固定されている、もしくは、輻射が強く、即座に平衡温度に落ち着く場合(光学的に薄い円盤)ではリンドブラッドトルクが共回転トルクよりも卓越して、惑星は高速で中心星方向に動くことがわかっている。一方で、断熱的な円盤(光学的に厚い円盤)ではガス円盤の温度構造がある条件を満たすと、共回転トルクがリンドブラッドトルクを凌駕して、惑星移動が逆向きになる。しかし、このよう状態はパラメータ空間において非常に狭い領域しか存在せず、大部分は基本的に内向きの惑星移動である。惑星移動の振る舞いはその後の惑星の進化過程に大きな影響を与えるため、惑星移動に影響する効果をそれぞれ精査することは重要な仕事である。共回転トルクの大きさは渦度およびガス密度と密接な関係がある。ガス密度は温度分布によって変化する。一方で、渦度はガス流れ、つまり力学的な状態で大きく変化する。本研究ではガスとダストとの間の相互作用による渦度変化に起因したダストの惑星移動への影響に注目したものである。今までの研究ではガスと惑星との間の相互作用のみを考えていたため、惑星重力以外に渦度を変化させるものはなかったが、本研究ではダストがガスの渦度を変え得る要素として存在する。したがって、ダストによる渦度変化を通した共回転トルクの変化幅を見積もる。本年度は、ダストサイズとガスダスト比を変えて、惑星にかかるトルク量の変化を系統的に調査した。その結果、それらのパラメータが増加すると、ガスからの共回転トルクが若干増加することがわかった。惑星質量が地球質量よりも大きくなると、惑星は周りにある原始惑星系円盤ガスと重力的に相互作用して、密度波を励起する。この密度波の構造は惑星を挟んで非対称であるため、その非対称性によって生じた重力は中心星重力の下で公転していた惑星軌道に擾乱を与える。さらに、惑星前面と後面の惑星の公転周期とほぼ同じ周期をもつガスも惑星接近時に重力相互作用を起こす。これらの重力は惑星にトルクを発生させて、結果として惑星の軌道長半径が変化する。これは地球型惑星がスノーラインを越えて移動した可能性を示唆しており、惑星それだけでなく惑星系形成全体に関わる重要なプロセスである。先行研究は、この重力相互作用によって円盤寿命よりもかなり短い時間間隔で惑星の軌道長半径が小さくなることを指摘していた。しかし、近年流体計算の精密化や理論的な発展により、惑星移動が内向き一辺倒ではなく、逆向きになるような場合もあることがわかってきた。このような状態を実現するパラメータ空間は非常に狭い領域であり、大部分は基本的に内向きの惑星移動である。そのため、惑星の移動パスは基本的に中心星に落ちるというようなものである。これは、我々太陽系および系外惑星系で観測されている様々な軌道長半径に惑星が存在することと矛盾する。ゆえに、惑星移動を止める機構を色々と探し出すことは惑星系の多様性を説明することにおいて重要である。

本研究は、円盤外側から降ってくるダストが惑星移動にどのような影響を与えるのかに注目して行っている。昨年度および今年度は数値計算を完成させ、26年度から少しずつガスダスト比やダスト量、惑星質量、輻射の効果などを入れた計算を行ってきたが、一部でインプットパラメータの不備が判明したためやり直しの計算を今年度後半から開始した。今のところダスト量やダストの大きさが増加すると、惑星移動が外向きになることがわかった。当初予定したパラメータサーベイはおおよそ終了した。計算は問題なく進んでいるが、申請者の研究環境が大幅に変化したため、それらを解析する所で滞っている。惑星移動は、ガスが惑星にかけるトルク(ガストルクという)とダストが惑星にかけるトルク(ダストトルクという)の和によって決まる。しかし、ここでガスとダストの相互作用によって、ガスの密度分布が変わる。そのため、ダストなしの場合に比べて、ガストルク量が変わる。現在、ガストルクの変化がダストの存在によってどのように影響されるのかを明示的に説明した研究はない。昨年度の速報的な解析では、ダストサイズやガスダスト比が増加すると、共回転トルク(惑星とほぼ同じ周期をもつガスとの重力相互作用)が大きくなることがわかっていた。その後の解析によって、密度波から惑星にかかる片側トルク(絶対値)はダストなしの場合と比較して大きくなっており、ピーク点が惑星側に寄っていることがわかった。一方で、それぞれの片側トルクは、符号は逆でほぼ同じ値を示すようになり、結果として打ち消し合って惑星に大きな擾乱を与えなくなっている。この効果は、共回転トルクの重要性を高める結果となる。しかし、なぜダストがあると、惑星周りの密度波の構造が対称的になるのかはよくわからない。一つの仮説として、密度波は周りよりもガス密度が高いため、ダストが密度波にトラップされやすくなる。この時ダストとガスとの間の運動量交換により、サブケプラーで回っていたガスがケプラー速度に近づいた可能性がある。ケプラー円盤の解析では、トルクを惑星に与える点が惑星側にあることは指摘されている。したがって、ダストが入ったことでガスの公転速度が上がり、片側トルクのピーク点がずれた可能性がある。しかし、対称性が良くなったこと、片側トルクが大きくなったことはまだ十分に解明できていない。原始惑星系円盤にある原始惑星は、惑星周りのガスの流れを変化させるだけの重力を有している。この変化により、惑星の両側にガス密度の濃い腕状の密度波が生じる。密度波からの重力は惑星の軌道速度にブレーキをかける方向に働き、その結果遠心力が弱まり中心星重力によって惑星の軌道は内側へ変化する(これをタイプ1惑星落下という)。内側への移動速度は地球質量程度の時にもっとも大きいことが過去の研究から評価されている。この内側移動は“原始惑星は誕生後中心星に落ちて消える“可能性を意味しており、惑星がどこで作られ、今の軌道はいつ決まったのかという惑星系形成問題とリンクしている。
ペプチドの高効率合成法の開発と抗ウイルス作用を有する内因性生体防御ペプチドの合成

ペプチドの化学合成も近年の固相合成法の進歩に伴い比較的低分子のペプチドであるならば容易に合成出来るようになってきた。しかし長鎖あるいはジスルフィド結合含有ペプチドの合成では未だ数多くの問題がある。すなわち長鎖ペプチドの合成では最終品に多数の欠陥ペプチドが含まれ、またジスルフィド結合形成ではS-S形成の位置選択性やS-S-結合形成時におけるペプチドの溶解性等解決しなければならない問題がある。そこで固相合成ペプチドの精製法、効率的S-S結合形成法の確立を行い、得られた知見を基に分子内に複数のS-S結合を有する内因性生体防御ペプチド(デフェンシン、プロテグリン)の合成を行うことを目的に以下の研究を遂行した。1.固相合成法の欠点を改良すべく固相法により合成したペプチドの一段階精製法を開発した。すなわち精製法にAvidin-Biotin系によるアフィニティークロマトグラフィーを用いることとし、塩期処理により精製ペプチドを遊離する新規Biotin化試薬の開発と、これを用いたモデルペプチドの合成を行った。2.生体防御ペプチドは一般にそのS-S結合形成時における水性溶媒に対する溶解性が悪いものが多いので有機溶媒中でS-S結合形成可能な新規システインS保護基として2-キノリニルメチル基を開発した。3.DMSOが難溶性ペプチドのS-S結合形成に有用な酸化剤ならびに溶媒であること明らかにしているが、さらに複数のS-S結合を有するペプチドにDMSOを酸化剤として用いた場合のS-S結合形成の位置選択性に検討を加えるとともに、AgOTf-DMSO/HCI系を用いた新規S-S結合形成反応を開発した。4.これらの知見を基に生体防御ペプチドであるプロテグリン(18アミノ酸、S-S2本)、デフェンシン(29-34アミノ酸、S-S3本)の合成を行い、これらの抗菌並びに抗ウイルス作用について検討を加えた。ペプチドの化学合成は、生理活性ペプチド、タンパク質の作用と機能の研究、ペプチド性医薬品の開発研究など医学、生化学の分野において無くてはならない基礎技術の一つとなっている。近年固相合成法の発展と固相合成機の開発に伴い低分子ペプチドならば比較的容易に合成が可能となってきた。しかしながら固相法を用いた場合、最終生成物には構造が類似した多数の欠陥ペプチドが含まれる。そのため最終目的物の精製には多大な労力と時間を要するのが現状である。このような固相合成法の欠点を改良すべく申請者らは、固相法により合成したペプチドの一段階精製法の開発を進めてきた。先ず精製法に関し本年度は改良Avidin-biotin系アフィティークロマトグラフィーによる固相合成ペプチドの精製法の確立をめざし以下の研究を行なった。1)塩基処理により精製ペプチドを遊離する新規biotin化試薬の開発2)新規biotin化試薬のモデルペプチド合成への応用また改良Avidin-biotin系アフィティークロマトグラフィーによる精製法を用いる合成のターゲットとしてデフェンシンに着目した。デフェンシン(29-34アミノ酸残基)は分子内に3本のジスルフィド結合を有し、抗菌、抗ウイルス作用を有する高等動物由来の生体防御ペプチドとして注目されている。改良Avidin-biotin系アフィティークロマトグラフィーを用いたデフェンシンの効率的合成法の確立の基礎研究として、本年度は先ず、従来の固相法を用い保護ペプチド鎖を構築した後、最終脱保護条件、ジスルフィド結合形成条件に検討を加え、デフェンシンを得ることに成功した。ペプチドの化学合成は、医学、生化学の分野に於いて無くてはならない基礎技術の一つとなっている。

近年の固相合成法の進歩により低分子ペプチドならば比較的容易に合成可能であるが長鎖ペプチドあるいはジスルフィド含有ペプチドの合成については改善すべき問題点が残されている。前年度はAvidin-Biotin系アフィニティークロマトグラフィーによる固相合成ペプチドの精製法の開発を行ったので今年度はジスルフィド結合形成法について検討を加えた。特に内因性生体防御ペプチドは分子内に複数のジスルフィド結合を有し、かつ難溶性のものが多く、これらのペプチドを効率よく合成するには難溶性ペプチドへも適用可能なジスルフィド結合形成法の開発が不可欠である。そこで本年度はこのような点に留意し以下の研究を行った。1通常のジスルフィド結合形成反応は水系溶媒中で行うことが多いが、生体防御ペプチドの合成には適用不可能な場合が多々あるので有機溶媒(DMF)中でジスルフィド結合形成が可能な方法論として新規システイン保護基(2-キノリニルメチル基)の開発とそのジスルフィド結合形成への応用について検討した。2 DMSOがジスルフィド結合形成の酸化剤として有用であることをすでに明らかにしているが、本年度はさらに複数のジスルフィド結合を有するペプチドにDMSOを酸化剤として用いた場合のジスルフィド結合形成の位置選択性について検討を加えるとともに、AgOTf-DMSO/HCl系を用いた新規ジスルフィド結合形成反応を開発した。3上述の知見を基にブタ白血球より見いだされた生体防御ペプチド、プロテグリン(18アミノ酸、ジスルフィド結合2本)、の3種類のジスルフィドアイソマ-の合成を行うとともにこれらの抗菌並びに抗HIV活性について検討を加えた。
2次元polynomial skew productsの力学系の研究

C2のAxiomApolynomialskewproductsに対し、危点集合の軌道の振る舞いとsaddlebasicsetsの安定多様体と不安定多様体の交叉との関係を解析することにより、危点集合の通常の集積点集合A、点別集積点集合Apt及び連結成分別集積点集合Accに関する種々の性質を、saddlebasicsetsを用いることによって特徴づけた。更に、これらの性質がhyperboliccomponentsの中で保たれることを示した。また、次数が高い場合に特有な性質を持つ写像の例を構成した。この問題を考察する中で、危点集合の各連結成分がどれかひとつのsaddle basic setの安定多様体に含まれることがApt=Accとなるための必要十分条件であることを示すことができた。同様の議論によって、危点集合と各saddle basic setの安定多様体との交わりがコンパクトであることがApt=Aとなるための必要十分条件であることが証明できると期待される。DeMarco-Hruskaでは既にApt=Aのひとつの特徴づけが与えられているが、われわれの特徴づけはApt=AccとApt=Aの特徴づけを、saddle basic setsの性質によって統一的に与えらるという利点がある。同様の議論によろて、危点集合と各saddle basic setの安定多様体との交わりがコンパクトであることがApt=Aとなるための必要十分条件であることが証明できた。DeMarco-Hruskaでは既にApt=Aのひとつの特徴づけが与えられているが、われわれの特徴づけはApt=AccとApt=Aの特微づけを、saddle basic setsの性質によって統一的に与えられるという利点がある。その応用として、Apt=AccおよびApt=Aという性質がhyperbolic component内で保たれることが同時に証明できた。Saddle basic setsの間には、その安定多様体と不安定多様体の交わりの存在により関係が定義されるが、上記のような議論の中で、いろいろな関係によりAxiom A polynomial skew productsの力学系を分類するという興味深い問題も得られた。この方向では、ふたつのsaddle basic setの関係の存在を危点集合の性質によって特微づけることができた。1.A=Apt及びAcc=Aptという性質のsaddle basic setsによる特徴づけ、3.A=Apt及びAcc=Aptという性質の安定性等を示すことができた。その中で、Jp上のsaddle basic setsの間のrelationsが存在するための危点集合による特徴づけを与えることもできた。このような事実は知られておらず、意味のある結果と思われる。23年度には、それらを論文にまとめたものを雑誌Ergodic Theory and Dynamical Systemsに投稿し、最近になって掲載が決定した。これまではbase Juliaset Jp上のsaddle basic setsのみを考察していたのだが、base sink set Ap上のsaddle basic setsも考慮して、ある条件の下でJP上のsaddle setとAp上のsaddle setの間にrelationsが存在しないことを証明することができた。また、性質がよくわかっている写像をうまく摂動することにより、solenoidをsaddle basic setとして持つような写像の例をいくつか構成することができた。24年度は、Axiom A polynomial skew product: f(z,w) = (p(z),q(z,w))が連結でpの危点がすべて周期的ならば、pの吸引的周期点の集合Ap上のsaddle setとJp上のsaddle setの間にはrelationsが存在しないことを証明した。その条件のもとで、pのFatou componentsで定義されたAp上のsaddle setのholomorphic motionが、その境界まで連続に延長されること、従って、すべてのinternal raysが第2 Julia集合に連続的に着地することも示すことができた。更に、同じ条件のもとで、fがpの充填Julia集合Kp上vertically expandingであることも示すことができた。その系として、fiberwise充填Julia集合Kzと、fiberwise逆Boettcher座標がbase変数zの関数として連続であることも示された。その過程で、上のholomorphic motionがfiberwise逆Boettcher座標を用いて表せることも分かった。当初は1次元複素力学系の研究で培った方法を使って問題を解こうと考えていたが、21年度に、saddle basic setsを考慮する必要があることがわかり、高次元実力学系の理論を勉強してその方向で考察することにより、いくつかの問題を解決することができた。その結果をまとめた論文を23年度に投稿し、掲載が決定した。以上の経過から、研究は順調に進展していると思われる。24年度が最終年度であるため、記入しない。

Ap上のsaddle setとJp上のsaddle setの間のrelationの非存在に関する結果を用いて、Ap上のsaddle setのstable set上のexternal raysがsecond Julia setに着地することを示す。その際にはBedford-Jonssonの理論が役に立つ。Ap上のsaddle setのholomorphic motionが大域的に存在しない場合に、relationの有無を含めて、どういう現象が起こるのかを解明する。Jonssonの例がAxiomAでないが奇妙な性質を持っていて示唆的であり、この例の性質をさらに解析することは重要である。Saddle set上での写像の次数とsaddle setの断面のHausdorff次元の関係を調べたMihailescuの結果も興味深く、今後の研究課題として、もっと解析する必要があると思われる。24年度が最終年度であるため、記入しない。
潰瘍性大腸炎合併大腸癌に対するp53抗体を用いた新しいサーベイランス法の確立

本研究は、血清抗p53抗体に着目し、潰瘍性大腸炎(UC)患者および大腸癌合併UC患者の血清抗p53抗体をELISA法により測定し、種々の臨床的因子との関連性について検討した。コントロールとしての健常人に対して、UC患者群で血清抗p53抗体陽性率が有意に高く、またcolitic cancer群8例中6例(75.0%)、dysplasia群5例中2例(40.0%)が抗p53抗体陽性であった。これらの結果より、ELISA法を用いた血清中抗p53抗体の測定は、UCに伴う大腸癌の高危険率群の絞り込みに有用である可能性が示唆された。潰瘍性大腸炎(ulcerative colitis, UC)は長期経過例で大腸癌発癌のリスクが増加するため、早期発見のためにはsurveillance colonoscopyが重要である。しかし、背景粘膜に炎症性変化や再生性変化を伴い、内視鏡診断は容易ではない。慢性炎症粘膜から前駆病変であるdysplasiaを経て発癌する過程は散癸性の大腸癌発生メカニズムであるadenoma-carcinoma sequenceとは異なる発癌経路を有すると考えられており、UCに合併する大腸癌は散発性大腸癌に比べて比較的早期に、すなわちdysplasiaの段階でp53遺伝子の異常が関与するといった特徴を持つ。より効率的なサーベイランスシステムの構築のために高危険群の絞り込みなどが可能となるマーカーが切望されている。そこで最近その臨床的有用性が各種の癌で報告されている血清抗p53抗体に着目した。UC患者および大腸癌合併UC患者の血清抗p53抗体をELISA法により測定し、種々の臨床的因子との関連性を検討した。健常人では63例中1例(1.6%)のみが血清抗P53抗体陽性であった。一般大腸癌では82例中43例(52.4%)が陽性であった。286例の潰瘍性大腸炎患者群では43例(15.0%)が陽性で、陽性率では健常人に比し有意に高く、dysplasiaやcolitic cancer例を除いた評価でも有意に陽性率は高かった。さらに、colitic cancer群8例中6例(75.0%)、dysplasia群5例中2例(40.0%)が抗P53抗体陽性であり、colitic cancer群における抗P53抗体陽性率はそれ以外の潰瘍性大腸炎患者群の陽性率とくらべ有意に高かった。また抗体価においても同様に有意な上昇を認めた。これらの結果からUC合併大腸癌の早期発見における有用性が示唆された。潰瘍性大腸炎(ulcerative colitis,UC)の長期経過例に大腸癌が高率に合併することが知られており、癌化例の早期発見のためにはサーベイランス内視鏡が必須であるが、高危険群とされるサーベイランス対象症例数は年々増加しており、その絞り込みが可能となるマーカーが切望されている。慢性炎症粘膜から前駆病変であるdysplasiaを経て発癌する過程は散発性の大腸癌発生メカニズムであるadenoma-carcinoma sequenceとは異なる発癌経路を有すると考えられており、UCに合併する大腸癌は散発性大腸癌に比べて比較的早期に、すなわちdysplasiaの段階でp53遺伝子の異常が関与するといった特徴を持つ。健常人では63例中1例(1.6%)のみが血清抗p53抗体陽性であった。さらに、colitic cancer群8例中6例(75.0%)、dysplasia群5例中2例(40.0%)が抗p53抗体陽性であり、colitic cancer群における抗p53抗体陽性率はそれ以外の潰瘍性大腸炎患者群の陽性率とくらべ有意に高かった。現在、p53遺伝子変異部位の解析を進めており、これらの結果からUC合併大腸癌の早期発見における抗p53抗体の有用性が示唆された。潰瘍性大腸炎(ulcerative colitis,UC)は長期間経過するとともに大腸癌の合併が高くなり、散発性の大腸癌とは異なる臨床病理学的な特徴を有することが知られている。

癌化例の早期発見のためにはサーベイランス内視鏡が必須であるが、高危険群とされるサーベイランス対象症例数は年々増加しており、その絞り込みが可能となるマーカーが切望されている。UCに合併する大腸癌は散発性大腸癌に比べて比較的早期に、すなわちdysplasiaの段階でp53遺伝子の異常が関与するといった特徴を持つ。我々は、より効率的なサーベイランスシステムの構築のために高危険群の絞り込みなどが可能となるマーカーを開発することを目的として、最近その臨床的有用性が各種の癌で報告されている血清抗p53抗体に着目し、UC患者および大腸癌合併UC患者の血清抗p53抗体をELISA法により測定し、種々の臨床的因子との関連性について検討し、さらには精度の高いサーベイランス法の確立を目指した。まず最初にコントロールとして健常人において検討したところ、63例中1例(1.6%)のみが血清抗p53抗体陽性であった。一般の散発性大腸癌では82例中43例(52.4%)が陽性であった。286例の潰瘍性大腸炎患者群では43例(15.0%)が陽性で、陽性率では健常人に比し有意に高く、dysplasiaやcolitic cancer例を除いた評価でも有意に陽性率は高かった。さらに、colitic cancer群8例中6例(75.0%)、dysplasia群5例中2例(40.0%)が抗p53抗体陽性であり、colitic cancer群における抗p53抗体陽性率はそれ以外の潰瘍性大腸炎患者群の陽性率とくらべ有意に高かった。また抗体価においても同様に有意な上昇を認めた。現在、これらのp53遺伝子変異部位の解析を進めている。狙撃生検を用いたサーベイランス法がランダム生検による従来のサーベイランス法と遜色のない癌・dysplasia検出率を示すこととあわせ、UC合併大腸癌の早期発見における抗p53抗体の有用性、および効率的なサーベイランス法への有用性が示唆された。
核局在性の分泌性ペプチドと分泌性の転写因子の生物学的・進化的意義の解析

分泌性タンパク質と核内で機能する転写因子とは関連性がなさそうであるが、生化学的な類似点性に加え、ある種の分泌性タンパク質は核へ移行したり、転写因子が分泌されたりする例が幾つか報告されている。そこで本研究は分泌して作用する転写因子として知られるOtx2について解析した。シグナルペプチドと検出のための蛍光タンパク質VenusをOtx2に結合してアフリカツメガエル胚に発現させたが、細胞外間隙へのOtx2の分泌は検出されなかった。理由の1つとして考えられたのがOtx2の修飾である。解析の結果、C末端領域の3箇所のセリンがリン酸化されていることを見出した。今後分泌との関連で解析するのが重要である。今年度、緊急性の高いものを重点的に行ったため、当初の予定とは少し異なるが、転写因子Otx2の翻訳後修飾について解析した。Otx2は通常は転写因子として機能するが、網膜の視神経の視覚野への選択的軸策投射において分泌されて機能することが報告されている。最近我々が見出したOtx2の翻訳後修飾がもしリン酸化ならば、膜の透過性が下がり、分泌性に対して影響すること考えられた。そこでOtx2における翻訳後修飾の同定をまず行った。その結果、ホメオドメインのC末側領域の3箇所のセリンがリン酸化修飾を受けることを見出した。次に修飾の意義を検討するため、その上流のAktキナーゼ部位のスレオニンも含め、これら4箇所の修飾部位に変異を入れ、アラニン置換の非リン酸化コンストラクト4Aと、グルタミン酸置換の擬似リン酸化コンストラクト4Eを作成した。それらをアフリカツメガエル胚に発現させたところ、4Eは野生型の表現型である眼の縮小の活性が増強されたのに対し、4Aでは逆に網膜領域の拡大が認められた。細胞増殖に対する影響では、4Eは増殖を促進する一方、4Aは増殖を抑制した。このことは、Otx2はC末領域のリン酸化修飾により活性を変化させることが示唆された。Otx2のリン酸化酵素を探索した結果、cyclin A/Cdk1とcyclin B/Cdk1を同定した。従ってOtx2は細胞分裂期のS期からM期にリン酸化を受け、それが細胞記憶として次の細胞周期に対して正に働くことを予想させる。事実、Otx2はCdk阻害因子の発現を抑制することが知られており、Otx2の転写抑制にはリン酸化が関わることを我々は見出している。つまり、「リン酸化Otx2 --| Cdk阻害因子--| Cdk1 --> Otx2のリン酸化」という正のフィードバック機構が示唆された。一般にリン酸化修飾はイオン化により膜の透過性を下げることが予想されるので、分泌型Otx2は非リン酸化型と予想される。今後、4Aが分泌するか否かを検討することが重要である。転写因子を分泌させて細胞間隙での動態を解析するため、目的の転写因子をシグナルペプチド(SP)と蛍光蛋白質Venusの下流に融合させるためのプラスミドヴェクターとしてpCS107-SP-Venus-mTを構築した。そのヴェクターに、Xenopusのホメオドメイン転写因子Otx2を組み込み、Otx2のN末端側にシグナルペプチドと蛍光蛋白質Venusが融合したコンストラクト(SP-Venus-Xotx2)を作成し、mRNAを合成して、Xenopus胚の4細胞期の1つの割球の動物極側に顕微注入した。顕微注入された細胞のトレーサーとして赤色蛍光蛋白質mRFPのmRNAを共注入した。これによりmRFP発現細胞の周辺の細胞間隙にVenus-Otx2の蛍光が観察されることが期待される。しかしmRFPとVenusの蛍光が検出された細胞の周りの細胞間隙にはVenusの蛍光が検出されず、予期せぬ結果となった。原因としては、Venus-Otx2が細胞毒性を持つ可能性、Venus-Otx2が分泌していない可能性などが考えられた。そこで種々の実験条件を検討する必要性が生じた。まず細胞外への分泌を確認するためにHAタグを付け、かつ単量体Venus(mVenus)を用い、さらにRNAポリメラーゼの転写終結配列を除いたシグナルペプチドSP5aを組み込んだ新しいヴェクターpCS107-SP5a-mVenus-mTを構築した。現在、種々の転写因子のDNA結合ドメインをこのヴェクターに組み込んでいるところである。並行して分泌性蛋白質を細胞内に発現させて、核への移行の有無を検討するためのコンストラクトを計画中である。転写因子Otx2を細胞外に分泌させるコンストラクトを作成して実験したが、細胞外への分泌が確認されず、実験条件の検討が必要になったため。現在新しいヴェクターが完成したところであり、これからこのヴェクターを用いて、これまでの実験計画を遂行する。