hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
絶滅危惧種レブンアツモリソウの保全生態遺伝学に関する研究

昨年度の研究の進展としては、1)去年採取できなかったレブンアツモリソウの種子サンプルを採取し、調査地の個体マッピングを完了した、2)レブンアツモリソウ種子サンプルからのゲノムDNAPCR法を確立した、以上2点が挙げられる。1)に関しては、昨年の天候不順によるレブンアツモリソウの不稔によるサンプル不足を補うことができた。また調査地の全個体の位置をマッピングし、二世代分析に用いる準備は整った。2)に関しては、Thomson & Henry(1995)によるDNA分離法とShimura & Koda(2004)による種子休眠打破法を組み合わせて用いることによって、ラン科種子のゲノムDNAからPCRを行うことに成功した。ラン科の種子は非常に微細なため、これまでリボソームDNAでの成功例はあったものの、ゲノム全体を対象としたPCRに成功したのはおそらく世界で初めての例である。これにより、ラン科における遺伝学的な研究に弾みがつくことを期待している。現在、論文をまとめている最中で、早ければ本年5月中には投稿できる予定である。残念ながら、昨年度から取り組んでいたマイクロサテライトマーカーを開発することはできなかった。さまざまな試行を繰り返し、試作したプライマーは数百に及ぶが、マーカーとして使用できたものはなかった。マイクロサテライトマーカーを作成することができれば、その後の二世代分析に用いるサンプルおよびデーターが揃っていただけに、マーカー作成の失敗が悔まれる。昨年度の研究の進展としては、A)必要なサンプルを確保し、そのうち葉サンプルに関してはDNA抽出が完了したB)種子サンプルからのDNA抽出において、一応の成功を見た。以上2点が挙げられる。A)に関しては、ミスを犯すことなく必要なサンプルを確保、処理できた。B)に関しては、まだ完璧とはいえないが、ラン科種子からのDNA抽出は、おそらく初めての試みである。今後、成功率と作業効率をより高めるため、プロトコルの改善に努める予定である。昨年度は思うように研究が進まず、目標のうちおよそ3割しか達成できていないのが現状である。研究が進まなかった主な原因としては、1)レブンアツモリソウの結実率が例年を大幅に下回り、予定していたサンプリングが不可能だったこと2)マイクロサテライトマーカーの開発が思うように進まなかったこと。以上2点があげられる。1)に関しては、予定していた全数調査が不可能なため、やむなく調査地を変更、個体を選抜しての抽出調査に切り替えた。幸いなことに、この調査地では研究に十分なサンプルを集めることができた。2)に関しては、理由は不明だが従来のマイクロサテライトマーカー開発法ではうまくいかないため、現在新たな開発法を試行中である。今年度の予定としては、すでに必要なサンプルは揃っているため、野外調査には極力行かず、ラボワークと論文執筆に集中する。最優先課題であるマイクロサテライトマーカーの開発と並行して、種子からのDNA抽出法の改善を行い、5月中にはこれらを終了させたい。その後、2世代分析に向けた実験と解析を行い、投稿論文を執筆するのと並行して博士論文を准める予宇である。
ベトナム北部山地の農業発展の多様性:山地部の新しい環境開発戦略を求めて

GISソフト(Arcview)を利用し、昨年度までに収集した統計資料・地図資料を地図化する作業をおこなった。(1)県レベルベースマップの作成ベトナム全土を対象に、省の下のレベル(県)バウンダリーを入れたベースマップを作成した。県バウンダリーには細かな変更が毎年なされるが、2004年度の境界線をベースマップとして画定した。(2)県レベルデータベースの作成全省の県別統計データをエクセルを利用して入力し、データベースを作成した。入力した項目のうち、多くの県でデータが揃い、全国レベルでの比較に耐える項目は、順不同で次の通りである。気温、日射量、湿度、降水量、面積、人口(2002年12月31日時点)、収入、支出、第二次産業からの収入、主要工業製品、収入指数、消費指数、第一次産業が経済全体に占める割合、第一次産業の増加率(1994年を1とする)、作物別作付面積、種子植物生産量(コメ換算)、コメ作付面積、コメ収量、コメ生産量、作期別のコメ作付面積・収量・生産量、トウモロコシ作付面積・収量・生産量、野菜類作付面積、工芸作物作付面積、家畜飼育(ブタ・水牛・ウシ)の飼養頭数、林業生産額、水産業生産額、教育関連データ。(3)県レベルGISの作成上の(1)と(2)をあわせ、GISソフト(Arcview)を利用し、県レベルのデータを図化する作業をおこなった。以上のデータをもとに、現在、ベトナム北部山地の農業生態区分を作成している。また、その区分をもとに農業発展プロセスに関するフィールド調査をおこなう予定である。(4)環境関連政策分析1950年代以降に省・県・社レベルで実施されているさまざまな環境関連政策(農業開発政策を含む)をレビューし、実際の開発におよぼした影響について考察した。平成16年7月13日から8月1日にかけてベトナムを訪問し、ハノイで地図・統計・図書などの研究関連の各種資料を収集したほか、北部山地のラオカイ省バオタン県とソンラー省モックチャウ県にてフィールド調査を行った。ラオカイ省では都市一農村関係に関する調査を目的として、県都から距離の異なる3社にて、社レベルの経済活動における県都の役割に関する調査を行った。その結果、省一県一社といった行政上のヒエラレキーが農村一都市関係におよぼす影響は、人びとの活動によって異なることがわかった。たとえば、農村レベルの主要な現金収入源は、条件の違いにかかわらずどの社でも家畜飼育と農業生産に特化していた。それらの農産物の販売はおおくの場合、社レベルで行われるが、その流通先は多様で、かならずしも県から省に集中するわけではなかった。非農業生産活動では、小物の販売や日雇い労働といった不定期の肉体労働と、行政機関での定期的な給料による収入が、収入源のほとんどを占めていた。後者は社によってほとんど変化はみられなかったが、日雇いの肉体労働については県都から遠方の社ほど、省や他の町での労働に従事する傾向が見られた。そして、肉体労働は、公式のルートというよりはむしろ、個人的なネットワークで紹介されていることがわかった。また、通常、行政上のヒエラレルキーと対応すると考えられる公共福祉関連の活動(病院や郵便など)も、人びとは病気の程度に応じて、使い分けていることがわかった。モックチャウ県での調査では、自然環境条件の異なる3箇所に設置した気象ステーションのメインテナンスを行った。本データを用いて、傾斜地での微気象が、農村発展の違いにどのような影響を与えるのかについて、調査する課題が残った。
磁気アルキメデス浮上法を利用した液液界面における非線形化学反応の研究

本研究では、磁場を利用した物質浮上法である磁気アルキメデス浮上法を、汎用性の高い安価な永久磁石を用いたシステムに応用する。具体的には、ある液体を別の液体中に浮上させることで、容器の壁などと接触していない純粋な液液界面を作り、界面化学反応に付随した非線形現象を解明することを目的としている。昨年度、最大磁場強度0.4テスラのNd-Fe-B系の永久磁石(穴の開いた円筒型)を用いて、約1mlのニトロベンゼンを濃度の濃い塩化マンガン水溶液中に浮上(磁気アルキメデス浮上)させることに成功した。その結果、液体界面の様々な点から円状に広がる対流のような運動が不規則に表れることが観測された。本年度は、この対流に着目し、界面活性剤としてタンパク質分子を用いて、その吸着挙動を観測した。また、その応用として分子の自己組織化現象についても研究を行った。界面での対流は吸着分子の輸送を促進する重要な要素である。そこで、希薄なタンパク質溶液を用いて気液界面に吸着した分子の三相接触線方向への輸送に界面での対流を利用して、タンパク質の二次元的な結晶成長を行った。その結果、これまでに報告されている他のどんな二次元結晶よりも大きなサイズを持ち、且つ結晶性の高い二次元分子結晶を得ることに成功した。今回用いたタンパク質は、外径12nm球形のタンパク質であるフェリチンを用いたが、フェリチンは、内部に金属化合物や半導体の微粒子を保持することが出来るタンパク質としてよく知られた物質であり、本手法によって、数10mm四方にも及ぶ酸化インジウムの量子ドットアレイの作製が可能であることが示された。この結果は、分子の特異的・非特異的相互作用の研究や、タンパク質の電子顕微鏡構造解析・機能解析、高密度ナノエレクトロニクスへの応用研究において、有益な情報を与えるものである。本年度は、最大磁場強度0.4テスラのNd-Fe-B系の永久磁石(穴の開いた円筒型)の磁場分布測定、ならびに磁場強度の3次元分布から計算された液体浮上条件の計算を行い、約1mlのニトロベンゼンを濃度の濃い塩化マンガン水溶液中に浮上させることに成功した。本手法により、ニトロベンゼンは塩化マンガン水溶液を入れてある容器の壁には全く接触することなく、ほぼ完全な球形で浮上させることが可能となった。これまで、界面活性剤を含む油と水の界面では、しばしば非線形吸着脱離現象や界面の運動などが観測されているが、特に液体の運動現象については、容器壁への界面活性剤の吸着脱離過程が原因である、といった説明がなされている。ところが、今回、水溶液中で油を浮上させた状態で同様の実験を行ったところ、固液界面が存在しないにもかかわらず、液体界面の様々な点から円状に広がる対流のような運動が不規則に表れることが観測された。このことは、液液界面の運動には、必ずしも固液界面における分子の吸着脱離が必要ではないことを強く裏付けるもので、界面非線形現象における新しい知見を与える重要な結果である。
内皮由来過分極因子(EDHF)による循環器・糖尿病治療の創薬に向けての基盤研究

アラキドン酸カスケードの産物であるEpoxygenase由来のEpoxyeicosatrienoic acid(EET)は抗動脈作用を有する。我々は冠動脈疾患群で、EET産生酵素であるCYP2J2のSNPを明らかにしている。同じP450ファミリーであるCYP4Aにより20-HETEが産生されるが20-HETEはEETに比し血管収縮作用、炎症誘導作用を有する。したがってCYP4A、20-HETEは動脈硬化や高血圧・糖尿病の発症・進展に関わっている可能性がある。正常血圧者でCYP4A遺伝子のプロモーター領域のAAtype、AA+AGtypeの頻度が、それぞれ54.1%、45.9%、高血圧患者で65.6%、34.4%と優位にAAの頻度が高いことが明らかになった。またルシフェラーゼアッセイにてCYP4A11(-533AAtype)のプロモーター活性がCYP4A11(-533AGtype)に比べて高いことも明らかになった。腎血管内皮細胞にてアンジオテンシンIIやH202の処理にて、CYP4A11のmRNAの発現が増加することから、腎臓でのCYP4Aからの20-HETE産生が高血圧の進展に関与している可能性が示唆された。CYP 2J2の発現は静脈内皮に比して動脈内皮において有意に高いことが示されており、動脈系内皮細胞におけるEPAのCYP 2J2発現促進作用とシグナル伝達機構の解析を行っている。EETsは不安定で速やかにsoluble epoxide hydraseにより代謝されることから測定が困難であったが、ELISA法により安定代謝産物であるdihydroxyeicosatrienoicacids(DHETs)を測定することによりEET産生の評価が最近可能となった。今後EPAが血管内皮細胞からのEET産生を促進する可能性につき検討する予定である。血管内皮細胞により制御される血管透過性は動脈硬化初期から亢進することや血管透過性の維持が動脈硬化進行を抑制する可能性が示唆されている。また血管透過性の亢進は虚血再灌流による臓器障害に重要な役割を果たすことが知られている。この測定系を用いてangiotensin II、lysophosphatidic acidが低分子量G蛋白質rhoを活性化することによりアクチン細胞骨格の再構築を生じ内皮透過性を亢進させることを見出した。これに対してEPAはアクチン細胞骨格の再構築を抑制したがDHAは同様の作用を示さなかった。大阪大学、佐賀大学で、インフォームドコンセントのとれた高血圧患者と健康人の血液サンプルからDNAを摘出し、CYP4Aの全てのエクソンと上流領域をダイターミネーター化学法にてPCRでシークエンスを行い、転写開始点は5'RACE法で決定し、それによりSNPの領域を決定した。ゲルシフト法にてそのSNPの場所で変異体をオリゴヌクレオチドとして用いSP1との結合能力を検討する。
巨大地震に先行する広域地震群の解析と分類

研究目的:巨大地震に先行する広域での地震活動を定量的に解折し,巨大地震発生予測に必要な基礎的情報である地震群の特性を明らかにする.研究成果:成果は次の14の項目に大別される.なお研究成果については討論会(62年11月17・18日,阿蘇)を開き全員で発表討議した.1.規模の大きい地震に先行する地震群の特性大地震に先行して地震活動が低下する現象が, M8級では80%, M7級では40%,大地震と関係ない場合41%と求められた.小地震の場合にも同様に山崎断層で地震活動に静穏期があった.また1944年の東南海地震の前兆として地震活動の南下が見いだされた.2.地震活動の地域的特性と時間的変化東南アジア地域・近畿地方・中部地方の地震活動;長野県西部地震の余震と群発地震・伊豆半島東方沖群発地震;北海道沼田付近の地震;函館群発地震など種々の広さの地域での活動を定量的に解折し,それぞれの地域における地震活動の特性及び時間的変化をとらえることができた.3.火山地域の地震群・火山噴火に先行する地震群の特性火山地域では超低周波地震や群発地震のような特異な型の地震が発生しており,またダブルカップルでは説明できない発震機構の地震も発見された.これらの地震群は広域応力場の状態に敏感に反応しているようである.更に北海道では火山活動と浅発地震活動が共に広域応力場に支配されている.4.地震活動と広域応力場との相互関係広域応力場に支配される発震機構のデータベースを3000個の地震について作成し考察を始めた.各地域の主な地震についての時系列を比較した結果,長期間にわたる地震活動の盛衰は広域での応力の解放・蓄積とほぼ同じ時期に起こっていたことが判明した.研究目的:巨大地震に先行する広域での地震活動を定量的に解折し,巨大地震発生予測に必要な基礎的情報である地震群の特性を明らかにする.研究成果:成果は次の14の項目に大別される.なお研究成果については討論会(62年11月17・18日,阿蘇)を開き全員で発表討議した.1.規模の大きい地震に先行する地震群の特性大地震に先行して地震活動が低下する現象が, M8級では80%, M7級では40%,大地震と関係ない場合41%と求められた.小地震の場合にも同様に山崎断層で地震活動に静穏期があった.また1944年の東南海地震の前兆として地震活動の南下が見いだされた.2.地震活動の地域的特性と時間的変化東南アジア地域・近畿地方・中部地方の地震活動;長野県西部地震の余震と群発地震・伊豆半島東方沖群発地震;北海道沼田付近の地震;函館群発地震など種々の広さの地域での活動を定量的に解折し,それぞれの地域における地震活動の特性及び時間的変化をとらえることができた.3.火山地域の地震群・火山噴火に先行する地震群の特性火山地域では超低周波地震や群発地震のような特異な型の地震が発生しており,またダブルカップルでは説明できない発震機構の地震も発見された.これらの地震群は広域応力場の状態に敏感に反応しているようである.更に北海道では火山活動と浅発地震活動が共に広域応力場に支配されている.4.地震活動と広域応力場との相互関係広域応力場に支配される発震機構のデータベースを3000個の地震について作成し考察を始めた.各地域の主な地震についての時系列を比較した結果,長期間にわたる地震活動の盛衰は広域での応力の解放・蓄積とほぼ同じ時期に起こっていたことが判明した.
渡り鳥の飛来する湖沼底泥の農業用肥料としての利用可能性に関する研究

渡り鳥の飛来によって富栄養化が進んでいる農業用溜池では、糞尿由来の栄養塩が蓄積された底泥の処理が重要な問題となる。一方で、この底泥を農業用肥料あるいはメタンガス発酵の基質として活用することができれば底泥処理や農業生産活動のコスト軽減化につながる。上記の2点について山形県鶴岡市の大山上池・下池の底泥を使用した室内実験を行った。結果として、底泥を重量換算で約7%混入することによって慣行の化学肥料とほぼ同等の効果が得られることが判った。また、メタン発酵では温度環境を調整することにより、最大で約30%のメタンガスが回収可能であるという結果が得られた。本研究では、富栄養化の進んだ溜池水質保全策の一環として、湖沼底泥の除去後の再利用を目指し、農業肥料化やメタン発酵に関する知見を得ることを目的とした。研究対象とした溜池では、特にその要因として冬季に飛来する渡り鳥の糞尿が考えられたため、底質の季節変化性なども考慮して検討を行った。まず平成24年度は、季節による底質の変化を調査すると共に、溜池底泥を肥料とした水稲とコマツ菜の生育についてポット実験によって検証した。その結果、底質の栄養塩類濃度が最も高くなるのは水生植物(ヒシ、スイレンなど)が繁茂する前の初夏であることが明らかとなった。ポット試験では、水稲、コマツ菜ともに生育指標(草丈、葉色、茎数)について化学肥料を用いた対照区とほぼ同様の結果が得られ、底泥の肥料としての利用可能性が示唆された。平成25年度は、引き続き水稲の生育についてポット試験によって検証し、溜池灌漑用水の受益地農家や周辺住民などとの意見交換を行い、実用可能性について検討した。生育試験では、やや緩行性の傾向が見られたが、初期の底泥投入量を増やすことによって前年同様に化学肥料区とほぼ同様の結果が得られた。また、意見交換では鳥インフルエンザ等による影響を懸念する農家が多く、風評被害の対策についても考慮しなければならないと考えられた。次に、他の底泥の利用可能性として、メタン発酵処理について検討を行った。還元剤や酢酸ナトリウムの添加による影響、温度環境による影響について室内実験を行い、結果として、研究対象とした溜池底泥から約14%の利用可能なレベルのメタンガス発生が可能であること、25°C30°C程度の培養温度と酢酸ナトリウムの添加が有効であることが明らかになった。以上のように、本研究では溜池底泥の利用可能性について多角的に検討し、いずれも実用化が可能なレベルであることを明らかにすることができた。本研究では、富栄養化湖沼の底泥を農業用肥料として利用することを目指している。特に大量の渡り鳥が飛来する農業用ため池(大山下池)を対象として、水質汚濁の要因となる底泥の除去と肥料としての利用可能性に着目した。平成24年度は、水稲、コマツナのポット栽培による生育比較、土壌分析により、大山下池の底泥に蓄積した鳥の糞を含む土壌が肥料として有用かどうかを検討した。大山下池からの採泥は5、7、10月に行った。水稲の品種はササニシキを用い、1/5000aワグネルポットに底泥の施用割合をかえた試験区計7区を作成し、各3反復とした。生育調査は1日おきに草丈、茎数、葉色を測定した。コマツナの品種はトーホク交配の早どり小松菜を用いた。試験区は、1/5000aワグネルポットに園芸用土壌を入れ、化成肥料を入れた慣行区、慣行区の化成肥料と同等の窒素量になるように調節した試験区、無肥区の計3試験区各3反復とした。また、コマツナについては作物体分析を行った。土壌分析の項目は窒素、リン、カリウム、有機物である。水稲を用いた実験については草丈、茎数、葉色の全ての項目で、各試験区に有意差は出なかった。水稲実験の土壌分析については全窒素が5月0.951%、7月1.050%、10月0.858%であり、有機物は5月33.1%、7月37.3%、10月28.1%であった。各項目に差がなかったことから、底泥に含まれている窒素が緩行性、あるいは水田土に残留していた肥料分で出穂前までは成長できることが考えられる。土壌成分については全窒素、有機物ともに10月採取分が低い値を示した。これは夏季において、ヒシやハスなどが繁茂したことによって底泥から栄養分が供給されたと考えられる。研究計画では、平成24年度は以下の研究を行う予定であった。1底泥内に含まれる栄養塩含有量と阻害成分を計測し、肥料成分としての利用可能量を求める。

2肥料として利用するために必要な前処理について検討する。3水稲を対象として室内及び室外ポット試験によって成育への影響を調査する。これに対し、1底泥を時期別に採取して栄養塩含有量等を分析した結果、渡り鳥の飛来する秋季および翌年春季に栄養塩類が多量に含まれており、代替肥料として用いることができることが明らかになった。2前処理については、生土、自然乾燥土、炉乾燥土を比較した結果、炉乾燥土(60°C)が最も適していることが明らかとなった。3水稲およびコマツナを用いてポット実験により成育調査等を行った結果、最適な施用量を明らかにすることができた。当初の研究計画では、平成25年度は、以下の研究を行う予定であった。1現地水田への施用によって成育への影響を調査し実用性を検討する。2実際の流通可能性について検討し、研究全体のまとめを、行う。しかし、1に関しては、鳥インフルエンザの流行により、渡り鳥の糞尿の含まれる湖沼底泥を実際の水田に施用することは困難となった。そのため引き続きポット試験によって実地研究を行う。特に平成24年度に一部明らかにできなかった成育阻害成分の含有について検討を進める。また2に関しては、コスト計算と共に、JA、農家等からも聞き取りを行い、流通可能性について検討する。大量データを処理可能な情報処理システム(パーソナルコンピュータおよび附属機器)を購入する。また引き続き水、土壌、作物体の分析を行うため、前年度と同様に、標準液、試薬、ガラス器具等を購入する。また、調査旅費、実験補助謝金の他に、成果発表のための旅費を使用する予定である。
外国籍児童青年に対する複合的な文化的基底に立つメンタルヘルス支援モデルの開発

第一段階研究:平成28年度実施調査の成果である、日本に在住する外国人児童において日本語能力によって、ウェルビーイングに相違があることや、保護者調査からは、多くの保護者が日本での高等教育を期待していることや外国人児童の義務教育から高校への繋ぎが課題であること、また特に日本語能力の低い児童にとって学校生活における教員の存在が、ウェルビーイングに重要であることなどの成果を学会誌(査読)に発表した。第二段階研究:第二段階として、外国人児童の主観的幸福について、質的なアプローチを試みた。具体的には、平成28年度から29年度に実施収集した日本人児童、日本在住の外国人児童、モンゴル人児童、フィンランド人児童計1000名を対象として、より質的なウェルビーイングの現状解明を行うために、主観的幸福感について質的調査(国際比較)を行った。方法は、大山ら(2010)の主観的幸福感(sense of happiness)のSCTを参考として児童版を作成し、各国言語に翻訳実施した。これらの調査は名古屋大学教育発達科学研究科研究倫理委員会の承諾を得て実施した。成果は、平成31年3月の国際公開セミナー(「日本とフィンランドの子どもにおける主観的幸福を語る夕べ」、名古屋大学)で一部公表、他成果は平成31年7月の国際児童青年精神医学会において発表後論文投稿、公表予定である。その後、本科研における最終報告をまとめる予定である(科研期間延長承認済み)概ね順調に進展しているが、海外調査において、質問紙翻訳、バックトランスレーション作業、データ収集作業等モンゴルおよびフィンランドでの作業が時間を要したため、2018年度後半において全4群の分析が可能になった。その後統計的分析に相当なエフォートを費やした結果、最終の一部成果公表を趣旨とした国際セミナーを名古屋大学において開催することができた(2019年3月)。最終的な成果公表は、2019年6月の国際学会(ヨーロッパ児童青年精神医学会)発表、その後の学術誌投稿において実施する予定である。2019年7月2日にヨーロッパ児童青年精神医学会において、本研究の主調査成果を発表し、その後、国内外学術誌に論文投稿予定、その後本研究成果を基盤として、特に日本在住の外国人児童青年のウェルビーイング向上を目指して、継続して研究発展させていきたいと考えている。平成28年度実績1.外国人児童のウェルビーイングに関する調査:外国人小学生高学年児童訳300名、日本人児童訳800名、保護者約900名を対象として、ウェルビーイング質問紙(KINDL),動的学校画、対人葛藤解決方略質問紙と保護者質問紙を実施した。その結果、外国人児童は日本人児童に比較して全体にウェルビーイングが低得点であること、特に「友だち」「学校」において低いことが明らかになった。また特に日本語能力が低い児童においてその傾向が顕著であることや外国人児童の在籍率によって、学校間の特徴の相違があることが明らかになった。また、保護者については、90%近くの保護者が日本の定住を希望しており、子育てにおいて重要と思う事柄は、日本の高校や大学へ進学すること、であることが示された。本結果は、平成29年度国内外学会において発表予定である。2.海外調査:研究者が一貫して日本の学校環境、日本人児童生徒のウェルビーイングの比較研究を行っているフィンランドにおいて、フィンランドの外国人児童に対する教育や社会支援システムについて観察、インタビューを行った。その結果、フィンランドでは母国とフィンランドの両国を尊重する教育姿勢が徹底していることが明らかになった。また母国語での教育についても、国家全体で保障されていることが明らかになり、これらは外国人児童のウェルビーイングにおいて重要な視点であることがうかがわれた。本結果についても平成29年度に学会発表予定である。初年度において、一連の調査を計画実施することができ順調に進んでいる。また海外調査も同時に実施でき、全体の進捗状況は良好である。平成28年度に実施した、日本人児童および日本在住の外国人児童のウェルビーイングに関する多面的調査の成果を日本学校心理学会第19回大会(筑波大学)において、日本における外国人児童のウェルビーイング(1)(4)として4演題発表を行った。また同時に国内学会誌に現在投稿中である。本成果では、日本に在住する外国人児童において日本語能力によって、ウェルビーイングに相違があることや、保護者調査からは、多くの保護者が日本での高等教育を期待していることが示された。これらの成果から、外国人児童の義務教育から高校への繋ぎが課題であること、また特に日本語能力の低い児童にとって学校生活における教員の存在が、ウェルビーイングに重要であることが示唆された。これらの成果を踏まえ、より質的なウェルビーイングの現状解明を行うために、第2段階の調査として、主観的幸福感について質的調査を行った。方法は、大山ら(2010)の主観的幸福感(sense of happiness)のSCTを参考として児童版を作成し、日本人児童、日本在住の外国人児童、モンゴル、フィンランドにおける児童の4群を対象として、実施した。これらの調査は名古屋大学教育発達科学研究科研究倫理委員会の承諾を得て実施している。平成30年度にかけて、分析、成果を順次発表する予定である。また平成29年度には、青年期の大学生(母国外で学生生活を送る留学生、海外で学生生活を送る日本人学生)に関する、メンタルヘルスについて、研究協力者の鈴木健一教授(名古屋大学)が、米国での学生相談における留学生問題について研修会に参加、情報を収集した。科研助成開始年度に第一段階調査、翌平成29年度に分析、成果報告、続いて第二段階調査を実施し終えることができ、予定以上に順調に遂行している。

第一段階研究:平成28年度実施調査の成果である、日本に在住する外国人児童において日本語能力によって、ウェルビーイングに相違があることや、保護者調査からは、多くの保護者が日本での高等教育を期待していることや外国人児童の義務教育から高校への繋ぎが課題であること、また特に日本語能力の低い児童にとって学校生活における教員の存在が、ウェルビーイングに重要であることなどの成果を学会誌(査読)に発表した。第二段階研究:第二段階として、外国人児童の主観的幸福について、質的なアプローチを試みた。具体的には、平成28年度から29年度に実施収集した日本人児童、日本在住の外国人児童、モンゴル人児童、フィンランド人児童計1000名を対象として、より質的なウェルビーイングの現状解明を行うために、主観的幸福感について質的調査(国際比較)を行った。方法は、大山ら(2010)の主観的幸福感(sense of happiness)のSCTを参考として児童版を作成し、各国言語に翻訳実施した。これらの調査は名古屋大学教育発達科学研究科研究倫理委員会の承諾を得て実施した。成果は、平成31年3月の国際公開セミナー(「日本とフィンランドの子どもにおける主観的幸福を語る夕べ」、名古屋大学)で一部公表、他成果は平成31年7月の国際児童青年精神医学会において発表後論文投稿、公表予定である。その後、本科研における最終報告をまとめる予定である(科研期間延長承認済み)概ね順調に進展しているが、海外調査において、質問紙翻訳、バックトランスレーション作業、データ収集作業等モンゴルおよびフィンランドでの作業が時間を要したため、2018年度後半において全4群の分析が可能になった。その後統計的分析に相当なエフォートを費やした結果、最終の一部成果公表を趣旨とした国際セミナーを名古屋大学において開催することができた(2019年3月)。最終的な成果公表は、2019年6月の国際学会(ヨーロッパ児童青年精神医学会)発表、その後の学術誌投稿において実施する予定である。平成29年度には、平成28年度成果を国内外学会で発表、論文化作業を進める。また青年期の文化的相違によるウェルビーイングに関しては、海外留学する日本人大学生の現地でのウェルビーイングに関する調査を実施予定である。国内では、平成28年度の調査結果を社会発信する方法について検討し、実施する予定である。平成30年度中に、第2段階調査を実施し、分析、成果の積極的発信に努める。また共同研究国であるフィンランドの共同研究者との研究打ち合わせ、北欧(フィンランド、スゥエーデン)における外国人児童に対する学校でのウェルビーイングに関する支援等について情報を収集する予定である。2019年7月2日にヨーロッパ児童青年精神医学会において、本研究の主調査成果を発表し、その後、国内外学術誌に論文投稿予定、その後本研究成果を基盤として、特に日本在住の外国人児童青年のウェルビーイング向上を目指して、継続して研究発展させていきたいと考えている。
位相幾何学的手法による力学系の代数的表現およびその応用

本研究は力学系の構造を位相幾何学的手法により代数化する方法と,それを用いた分岐現象の解析を目的として行なわれたが,とくにホモクリニック接触という重要な分岐について,それを解析する手法を確立することに成功した.また,この手法を応用して,Henon写像族におけるホモクリニック接触の発生を具体的なパラメータ値において示すことができた.本研究により確立された理論では,与えられて力学系での接触現象を,その力学系から導かれた射影バンドル上でのconnecting orbitの存在に結び付ける議論と,connecting orbitの存在を証明するために用いるConley指数という位相幾何学的な不変量を用いた議論が本質的である.一方,具体例においてConley指数を計算するために,区間演算による精度保証付き数値計算や,計算ホモロジー理論などもこの手法に導入された.また,この手法によって存在が証明された接触について,それが非退化であることも証明することができた.非退化なホモクリニック接触がNewhouse現象やストレンジアトラクターの存在を帰結することが既に知られていることから,この手法によってHenon写像族におけるそれらの現象の発生を結論することができた.さらなる応用として,偏微分方程式や生物学由来のKot-SchafferモデルなどにおけるNewhouse現象やストレンジアトラクターの存在も同様の議論で証明できると期待され,現在その研究が進行中である.本研究は力学系の構造を位相幾何学的手法により代数化する方法と,それを用いた分岐現象の解析を目的として行なわれたが,とくにホモクリニック接触という重要な分岐について,それを解析する手法を確立することに成功した.また,この手法を応用して,Henon写像族におけるホモクリニック接触の発生を具体的なパラメータ値において示すことができた.本研究により確立された理論では,与えられて力学系での接触現象を,その力学系から導かれた射影バンドル上でのconnecting orbitの存在に結び付ける議論と,connecting orbitの存在を証明するために用いるConley指数という位相幾何学的な不変量を用いた議論が本質的である.一方,具体例においてConley指数を計算するために,区間演算による精度保証付き数値計算や,計算ホモロジー理論などもこの手法に導入された.また,この手法によって存在が証明された接触について,それが非退化であることも証明することができた.非退化なホモクリニック接触がNewhouse現象やストレンジアトラクターの存在を帰結することが既に知られていることから,この手法によってHenon写像族におけるそれらの現象の発生を結論することができた.さらなる応用として,偏微分方程式や生物学由来のKot-SchafferモデルなどにおけるNewhouse現象やストレンジアトラクターの存在も同様の議論で証明できると期待され,現在その研究が進行中である.
新しいＭＲ　Ｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙパルスシーケンスの開発研究

本研究の目的はMR Elastography:MRE(核磁気共鳴画像法による組織弾性イメージング法)にて使用される新しいMREパルスシーケンスの開発評価を行うことである.我々は従来法の欠点を見出し,改善を施したMREパルスシーケンスの開発を達成した.また,開発したパルスシーケンスを用いて下腿部骨格筋の特性評価を行い,骨格筋運動機能による硬さの変化を評価,骨格筋線維そのものの形態による硬さの異方性評価の確立を行った.本年の計画はMREシステムの構築,新しいパルスシーケンスの設計・実装,また,そのパルスシーケンス評価の試みである.MREを撮像するための重要なシステムの一つに振動機がある.本研究では幾種類か振動機序があるなか音圧を利用したシステムとその制御装置を作成した.また,前年度パルスシーケンス開発の環境構築とパルスシーケンスの基礎評価を行ったが,これをもとに,パルスシーケンスの改良開発,調整を行った.パルスシーケンスの特性評価,MREシステムの特性評価として,アガロース等方性ファントムと下腿部骨格筋を対象として骨格筋における硬さの異方性を評価した内容を日本磁気共鳴医学会にて報告した.また,関連パルスシーケンスの特性をシミュレートした内容を日本放射線技術学会にて報告した.また,前年度の研究を論文とし執筆した.平成25年度の推進方策は関連パルスシーケンスの改善や精度向上を行う.開発したシステムを用いることにより骨格筋機能評価を行う.また,本データを国内,国外の学会や講演会等にて報告すること.論文を執筆することである.MR Elastographyパルスシーケンスをより最適化することにより,本研究における初期段階に比べ,生体内を伝搬する振動波の検出効率を向上させることを達成した.最適化の内容としてはMotion Sensitized Gradientのダイアグラム変更や印可タイミングをより骨格筋組織に適したデザインとした.また,精度向上したシステム系にて骨格筋機能を評価した.骨格筋の線維において硬さに異方性が存在し,下腿部骨格筋の線維異方性では機能差を有することを見出した.国内外への発信としてはScientific Meeting &ExhibitionISMRM,日本放射線技術学会,日本磁気共鳴医学会などの当分野において代表的な学会のみならず,地域性のある講演会でも広く発信を行った.本研究の目的はMR Elastography:MRE(核磁気共鳴画像法による組織弾性イメージング法)にて使用される新しいMREパルスシーケンスの開発評価を行うことである.我々は従来法の欠点を見出し,改善を施したMREパルスシーケンスの開発を達成した.また,開発したパルスシーケンスを用いて下腿部骨格筋の特性評価を行い,骨格筋運動機能による硬さの変化を評価,骨格筋線維そのものの形態による硬さの異方性評価の確立を行った.本年の計画は新しいMREパルスシーケンスの設計と開発である.従来用いられているパルスシーケンスでは多くの欠点・問題点が存在する.これらをより把握するため,当初予定していなかった従来のパルスシーケンスの欠点をまず追及調査した.これにより,臨床用MRI装置での問題点・欠点の把握を達成した.その問題点には,磁化率の影響が大きい,TEの著しい延長によるMR信号減衰,低周波加振による分解能の低下が存在する.MREにおいて,現時点で有効とされている臓器には肝臓・骨格筋等が挙げられる.これらの臓器のT2値は非常に短くshort-TEとする必要がある.また,健常ボランティアに対し下腿部骨格筋のMREを施行し運動機能の評価を試みた.その結果,定性的ではあるが,骨格筋機能評価の可能性が示唆された(JSMRM, 2011).これらの新しい評価をより定量的なものにするためにも新しいMREパルスシーケンスの設計・開発が必要だと考えられる.次に新しいMREパルスシーケンスの開発を行うための環境構築を試みた.環境構築には装置とのネットワーク環境構築,ソフトウェアのインストール等の作業が必要となる.本ソフトウェアはLinux下のみでの動作となる.このため,Linux操作における勉強をまず実践した.その知識を元にパルスシーケンス開発に必要な環境の構築を行った.当初の予定とは異なったが今後新しいMREパルスシーケンスの開発にあたり順当な実績であるといえる.平成24年度の研究計画はMREシステムの構築,新しいパルスシーケンスの設計・実装,また,そのパルスシーケンス評価の試みとした.MRE撮像システムの環境構築には振動システムと制御システムの作成が必要となる.振動システムは音圧利用そ対象に振動を加える装置の作成を行った.前年度パルスシーケンス開発の環境構築とパルスシーケンスの基礎評価を行ったが,これをもとに,パルスシーケンスの改良開発,調整を行った.パルスシーケンスの特性評価とし,アガロース等方性ファントムと骨格筋を対象として骨格筋における硬さの異方性を評価した内容を日本磁気共鳴医学会にて報告した.また,関連パルスシーケンスの特性をシミュレートした内容を日本放射線技術学会にて報告した.また,前年度の研究を論文とし執筆した.これらの研究内容により当該年度はおおむね順調に進展したと考える.平成23年度の研究計画として,パルスシーケンスプログラミングによる新しいMREパルスシーケンスの設計と開発を行い,臨床機への実装を行う.また,MRE撮像システム環境の構築を行う.また,MRE撮像システムの環境構築には振動システムと制御システムを作成が必須となるため,振動システムは音圧利用し対象に振動を加える装置の作成を行う.制御システムはMRI装置のパルスシーケンスと振動システムとを同期させるソフトウェアの作成を行う計画であった.本年度ではパルスシーケンス環境の構築まで達成した.

また,当社は予定していなかった,従来パルスシーケンスでの追加研究を行い.加え来年度予定していた健常ボランティアによる特性評価も試みた.平成25年度は前年度にした関連パルスシーケンスの特性評価,骨格筋機能評価への特性を学術大会にて報告する.また,論文を執筆する.加え前年度に評価しきれなかった範囲,またパルスシーケンスの改善を行う方策とする.平成24年度は前年度に達成できなかったMREシステムの構築,新しいパルスシーケンスの設計・実装を試みる.MRE撮像システムの環境構築には振動システムと制御システムを作成が必須となる.振動システムは音圧利用し対象に振動を加える装置の作成を行う.制御システムはMRI装置のパルスシーケンスと振動システムとを同期させるソフトウェアの作成を行う.また,新しいパルスシーケンスの設計としてはStimulated EchoやSpin EchoをベースとしMREパルスシーケンスの改良・調整,MREパルスシーケンスの特性評価を行う方策である.次年度の研究費に使用計画とし,パルスシーケンス開発環境更新のためのコンピュータに充てる.また,学術大会にて研究報告を行うための旅費,論文作成のための印刷費等に充てる計画である.次年度の研究費の使用計画としてはMREシステム構築にあたる材料,工具,コンピュータを使用する.また前年度の成果を発表・論文とするための費用を計画している.
ヒト肺肥満細胞の増殖と分化に関する研究

1.ヒト気管支肺胞洗浄液中肥満細胞の培養に対するT細胞因子,インタ-ロイキン(IL)ー3,ILー4,線維芽細胞の効果をみたところ,これら因子によるsurvivalの延長が認められ,線維芽細胞共存ではphenoーtypic changeも一部の例でみられた。2.ヒト好塩基球性白血病細胞株KU812Fを用いてヒスタミン合成酵素ヒスチジン脱炭酸酵素(HDC)の誘導,部分精製,cDNAクロ-ニングを行なった。HDCはphorbol myristateAcetate(PMD)で誘導され,大量培養により62nmol/minの活性をもつHDC蛋白961mg得られた。5段階のカラム操作で350倍の精製標品が得られ,PAGEで分子量110kdと判明しラットのHDCと同様の値であった。報告されたラットのcDNAをもとにprobeを作成し,KU812FのcDNAlibraryをスクリ-ニングしたところpTNー1とpTNー2の2つのクロ-ンが得られ,誘導実験でpTNー2の方ら活性が認められた。pTNー2は2.4Kbase painで塩基配列よりヒトHDCはアミノ酸662よりなる分子量74,178の蛋白でラットとマウスとは85%の相同性があった。KU812FのNorthern analysisにより活性の誘導はtranslationのレベルで起る事が分った。3.ラット好塩基性白血病細胞株RBLー2H3,ラットおよびヒト切除肺を用いて腫瘍壊死因子(TNF)の産生および遺伝子発現を検討した。抗原(Ovalbumin,DNP,抗IgE)でIgE受容体を刺激すると12時間後にヒスタミン,TNEαの産生およびTNEmRNAの発現が認められた。マウス肥満細胞腫P815はPMA刺激でのみTNF産生がみられ,KU812FではPMAおよびCaイオノフォア刺激ILー1の産生が認められたがTNF産生は認められなかった。以上,培養細胞および肺組織を用いてアレルギ-性呼吸器疾患における肥満細胞および各種サイトカインの後割を追求していく方針である。以上、BALMCの培養と種々の因子に対する反応性、培養細胞株のHDC活性、TNF活性などを追究することにより、ヒト肺MCを含めたMC/好塩基球系の増殖と分化に関する解析を進めていく方針である。1.ヒト気管支肺胞洗浄液中肥満細胞培養に対するT細胞因子、インタ-ロイキン(IL)-3、IL-4、線維芽細胞ではphenotypic changeも一部の例でみられた。2.ヒト好塩基球性白血病細胞株KU812Fよりヒスタミン合成酵素histidinedecarboxylase(HDC)を精製する目的でセルマスタ-を用いて大量培養を行った。添加血清濃度を12%と低量におさえ、pHを7.27.4にすると、顆粒を含有する細胞が増加し、ヒスタミン含量も上昇、これらの培養より62nmol/minのHDC活性を有する961mg proteinが得られた。5段階のクロマトグラフィ-操作により350倍の精製標品を得た。PAGEでは分子量110Kdの一本のベンド,SDS-PAGEでは分子量60Kdのところに4本のバンドが得られた。この分子量は先に精製されたラットのHDCとほぼ一致する値であった。3.KU812FからのIL-Iとtumor necrosis factor(TNF)αの産生及び遺伝子発現をみた。

KU812FをPMA、Ca ionophoreA23187、LPSで30分間刺激すると上清中にIL-1α、βが検出されたが細胞障害活性は認められなかった。刺激のあるなしにかかわらずIL-1βMRNAの発現が認められたが、TNFαmRNAの発現はみられなかった。4.先にラット好塩基性白血病細胞株RBL-2H3からIgE受容体刺激によりTNFαの産生及び遺伝子発現のあることを示した。今回はexvivoでのIgE受容体刺激による肺組織TNFαの産生と遺伝子発現を検討した。切除肺を抗DNPモノクロ-ナルIgE抗体で感作しDNP-OVAで刺激するとヒスタミンとともにTNFα活性の産生が認められ、TNFαmRNAの発現も検出された。現在、ヒト切除肺を用いて同様の検討を行っており,アレルギ-性呼吸器疾患における肥満細胞および各種サイトカインの役割を追求していく方針である。1.前年度までにヒト好塩基球性白血病細胞KU812Fにヒスタミン合成酵素histidinedecarboxylase(HDC)が存在し,phorbol myristate acetate(PMA)により誘導されること,大量培養により部分精製を行い,分子量約11万でラットのHDCと同様であることを示した。本年度はヒトHDCのcDNAクロ-ニングを試みた。すなわち,報告されたラットHDCのcDNAをもとにoligonucleotideを合成し,それをprobeとしてKU812FのcDNAライブラリ-をスクリ-ニングしたところpTNー1とpTNー2の2つのクロ-ンがとれ,COS誘導実験によりpTNー2の方に活性が認められた。pTNー2は2.4Kbase painのinsertを有し,塩基配列を沢定したところ662のアミノ酸よりなり分子量74.178であった。ラットとマウスのHDCとは85%の相同性があった。PMA刺激後のKU812FのRNAを経時的に分離し今回クロ-ニングしたcDNAをprobeとしてNorthern analyeisを行ったところ、無刺激でも2種のHDCmRNAを発現しており,経時的変化はなく,活性の誘導はtranslationのレベルでおこることが示唆された。2.前回までにラット好塩基球性白血病細胞株RBLー2H3および切除肺を抗原刺激するとtumor necrasis factor(TNF)_<ーα>の産生と遺伝子発現のあることを示した。今回はヒト切除肺を用いて同様の検討を行なった。切除肺を細切後,ヒトモノクロ-ナルIgEで受動感作し,マウス抗ヒトIgE抗体で刺激して上清中および組織中のヒスタミンとTN下活性を測定するとともにRNAを抽出しNorthern blot analysisを行なった。ヒスタミンは刺激後1時間,TNF2時間後,TNFmRNAは1時間後から検出され4時間まで上昇した。現在,TNF産生細胞を免疫組織学的,電顕的およびin situ hybridization法により検討中である。
未分化大細胞性リンパ腫細胞の増殖・細胞死に関与する因子の解析

未分化大細胞性リンパ腫(anaplastic large cell lymphoma:以下ALCL)細胞の増殖・細胞死に関与する因子を明らかにし、その知見に基づき、小児ALCLに対する至適治療の確立を目標として検討を行っている。本年度の実績は以下である。(1)前年度に開始した国内の再発小児ALCL例の解析を終了し(対象例数を拡大)、再発時期が予後に関連すること、同種造血幹細胞移植が行われた例の予後は化学療法のみ・自家造血幹細胞移植例と比較し良好であることを報告した(Br J Haematol. 2006;132:594-7)。本研究の成果から、ALCLに対する同種造血幹細胞移植後にgraft versus lymphoma effectが生じる可能性、再発ALCLに対しては大量化学療法よりもvinblastineの長期投与など持続的な治療が効果的である可能性が考察された。(2)前述の対象集団でALCL細胞の免疫表現型と治療反応性、予後の関連の検証を試みた。ALKは85%の例に陽性であり転帰との関連は明らかでなかった。T-cell/null-cell表現型、CD3の発現の有無と治療反応性の関連の検討は解析に十分な標本が得られず困難であった。(3)成人ALCL例において、apoptosis阻害分子であるsurvivinのALCL細胞における発現と予後の関連を示す報告が存在する。小児ALCL例におけるsurvivin、および関連分子の発現頻度と、転帰との関連について解析を行っている。未分化大細胞性リンパ腫(anaplastic large cell lymphoma:以下ALCL)細胞の増殖・細胞死に関与する因子を明らかにし、その知見に基づき、ALCL治療における分子標的療法など新規治療法の確立を最終目標として検討を行っている。(1)本邦における小児ALCL症例の病理組織像、臨床像、治療、および転帰の解析を行った。これまでに報告された小児ALCLに関する知見はいずれも欧米の症例に関するものであり、本邦小児におけるALCLの実態を初めて報告した(Br J Hematol. 2003:121:94)。解析対象の病理組織、および臨床像は欧州からの報告と同様であった。CD30は全例に陽性で、anaplastic large cell lymphoma kinase(以下ALK)の発現は88%の症例に認められた。ALKの発現、lineage関連細胞表面抗原、病理組織像亜型分類と臨床像、転帰の関連は明らかでなかった。(2)ALCL例では頻度が低い中枢神経再発例の経過、および診断時ALCL細胞および中枢神経浸潤細胞の免疫組織染色像を報告した(J Pediatr Hematol Oncol. 2003:25:975)。(3)Ewing肉腫細胞を免疫原としで樹立されたマウスモノクローナル抗体5C11(Br J Cancer :1989:60:875)を用いた免疫組織染色で、ALCL症例の一部に陽性所見が得られることが明らかにした。5C11が認識する抗原蛋白は現時点で不明である。同抗原の同定、機能解析、臨床的意義についての検討を予定している。(1)治療抵抗性ALCLの特徴を検出するため、国内の再発小児ALCLの臨床像、病理像に関する後方視的調査・解析を行った。早期再発例の予後が不良である傾向を認めた。第2寛解期に同種造血幹細胞移植が行われた例の予後は、化学療法のみ・自家造血幹細胞移植例と比較し良好であった。対象症例の一部の病理診断情報は不十分なものであり、病理組織と予後の関連の評価は困難であった。(第66回日本血液学会、第46回日本小児血液学会:投稿準備中)(2)骨粗鬆症などの治療に用いられるbisphosphonate製剤であるZoledronic acidは細胞内刺激伝達分子であるRasの活性を阻害し、一部の腫瘍の増殖を抑制することが報告されている。ALCL細胞においては染色体転座により活性化したチロシンキナーゼALK(anaplastic lymphoma kinase)がRasの活性化に関与する。そこでALCL細胞株Karpas299、SU-DHL-1に対するZoledronic acidの効果を検討した。培地にZoledronic acidを添加し抗腫瘍効果を観察したが、培養細胞に対する増殖抑制、アポトーシス誘導は明らかでなかった。

ALKは85%の例に陽性であり転帰との関連は明らかでなかった。T-cell/null-cell表現型、CD3の発現の有無と治療反応性の関連の検討は解析に十分な標本が得られず困難であった。(3)成人ALCL例において、apoptosis阻害分子であるsurvivinのALCL細胞における発現と予後の関連を示す報告が存在する。小児ALCL例におけるsurvivin、および関連分子の発現頻度と、転帰との関連について解析を行っている。
NF-YA欠損によるユビキチン蓄積病態の解析

転写因子NF-Yは、ハンチントン病、球脊髄性筋萎縮症などのポリグルタミン病モデルにおいて、様々な中枢神経系領域で機能阻害されることが見出されてきた。しかしながら、異なる神経細胞種での機能阻害が同様の変性病態を引き起こすかについては不明であった。転写因子NF-YAに関してシャペロン系との関係を報告(EMBO J2008)するとともに、最近神経細胞においてノックアウトすることによりユビキチン、p62の集積を認めながら、線維性病変を伴わず、小胞体膜、核膜異常を伴う新規病変を見出した(Nat Comm2014)。今回我々は、NF-Yのノックダウンが線条体や小脳では大脳皮質と同様にユビキチン・p62蓄積病態を示すのに対し、脊髄運動神経細胞ではこれらのタンパク質蓄積を示さないことを見出した。運動神経細胞では前者の神経細胞群とは異なり、小胞体シャペロンGrp78(Bip)の発現が抑制されていた。Grp78の選択的発現抑制が、神経細胞種に特異的な変性病態に関わっていることが示唆された。本研究は細胞の異なる反応性が細胞特異的変性のメカニズムに関与していることを示唆している。(Yamanaka et al. Sci Rep 2016)。一方、大脳皮質でのユビキチン蓄積病態のメカニズムを解明すべく生化学的解析を進め、プロテアーゼ処理によるいわゆる「蓄積コアタンパク質」の同定を試み、Proteinase K処理抵抗性のユビキチン抗体に染まるバンドを見出した。この成分を質量分析により解析し、いくつかの候補タンパク質を同定した。28年度が最終年度であるため、記入しない。我々は最近、転写因子NF-Yをマウス大脳の錐体神経細胞で機能欠損させると、ユビキチン、p62が小胞体に蓄積し、神経変性を引き起こすことを報告した(Yamanaka T et al. Nat Commun 2015)。NF-Yが様々な神経細胞で広範に発現していること、またハンチントン病やSBMAなど病変部位が異なるポリグルタミン病で封入体への取り込みが示されていることから(Yamanaka T etal. EMBO J 2008, Katsuno M etal. J Neurosci. 2010)、NF-Yは中枢神経系で普遍的に神経細胞の維持・変性に関わっていることが予想される。これを明らかとするため、ノックアウト・ノックダウン法を用いて、部位・細胞特異的なNF-Yの機能欠損とその影響について検討した。その結果、線条体の中型有棘ニューロンや小脳のプルキンエ細胞では錐体細胞とほぼ同様にユビキチン、p62が蓄積したが、興味深いことに、脊髄や脳幹の運動ニューロンでは、神経脱落を示すもののユビキチン、p62の蓄積は観察されなかった。詳細な解析から、運動ニューロンでは主要な小胞体シャペロンであるGrp78とGrp94の両方の発現が消失していることがわかり、これが特有の神経変性病態に関わっていると示唆された。以上のことから、NF-Yは中枢神経系で普遍的に神経細胞維持に関わっていること、しかしその阻害はおそらく細胞独自の遺伝子発現システムを阻害して、異なる神経変性病態を引き起こすことが示唆された。概ね当初の計画通り進行しているが、運動神経特異的細胞変性に関しては現在投稿中であり、その対応にしばらく時間がかかると思われる。1)ユビキチン化蛋白質の検討。コンディショナルノックアウトマウスとコントロールマウスからユビキチン結合蛋白質由来のユビキチン結合ドメインを結合したビーズ、抗ユビキチン抗体結合ビーズなどを用いてユビキチン化蛋白質を濃縮する。これを電気泳動し、ゲルからの抽出蛋白質を質量分析によって同定する。コンディショナルノックアウト特異的に増加している分子を同定し、これに対する抗体によってその分子がコンディショナルノックアウトマウスの分画において増加していることを確認する。

同定された蛋白質の分布をコンディショナルノックアウトマウスにおいて時間経過を追って検討する。2)伝播実験分画法でコントロールと差がある不溶性分画に関して、同量を正常マウスの大脳基底核に注入する。3ヶ月後にユビキチンを指標に異常蛋白質の伝播が認められるかを抗ユビキチン抗体や小胞体のマーカー抗体を用いて検討する。28年度が最終年度であるため、記入しない。