hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
絶滅危惧種ウケクチウグイの生息実態調査、遺伝的多様性解析に基づく保全法の検討

本年度は最上川、阿賀野川の上流域でウケクチウグイの生息実態調査を行った。最上川上流1ヶ所では秋に未成魚2個体の生息を確認したが、その他の季節には確認できなかった。阿賀野川上流1ヶ所では周年、成魚2,3個体の生息を確認した。以上のように、生息確認個体数が少なすぎて季節的消長を推察できるほどではなかったので、次年度も調査を継続する。産卵場については、以前から知られている最上川上流1ヶ所を除き、最上川、阿賀野川水系で産卵場を確認することはできなかった。そこで、産卵場の探索も継続する。最上川上流域の1ヶ所で採集した未成魚2個体からDNAを抽出し、ミトコンドリアD-loopの塩基配列多型とマイクロサテライトDNA多型を検出し、これまでのデータと比較した。これら2個体のD-loopハプロタイプは、これまでに調べた最上川中・下流の個体の1ハプロタイプと一致した。同様に、これら2個体のマイクロサテライトDNA型は、最上川中・下流の個体の対立遺伝子型と一致した。しかし、このように少ない個体数では、今後集団の遺伝的構造の解析ができないので、両水系に関わる県水試、漁協、自然保護団体関係者に連絡を取り、サンプル確保の協力要請をした。18年度はウケクチウグイ解析サンプルがあまりなかったので、同属近縁種でウケクチウグイとの交雑のおそれがあるウグイ、エゾウグイ、マルタのマイクロサテライトDNAとタンパクの分析を行った。その結果、どちらの分子マーカーでも種特異性が明確に示され、これらの分子マーカーを用いて、種の同定が困難な仔稚魚や交雑個体の親魚の種判別ができることが明らかになった。しかし、タンパク分析は生体か凍結サンプルでなければできないので煩雑であり、逆にDNAマーカー分析はエタノール固定サンプルでも可能である。そこで、以後タンパク分析は中止し、DNAマーカーだけで種判別を行うことにした。本年度は最上川上・中流域、阿賀野川上・中流域で、関係する漁協や保護活動家などの協力を得ながら、ウケクチウグイの生息と産卵に関する情報収集と現場での実態調査を行った。前年度は記録的暖冬で降雪が異常に少なかったせいで、ウケクチウグイの動態も異常であった。すなわち、最上川水系で唯一知られている上流の産卵場では、春の産卵期になってもウケクチウグイが全く集まらず、産卵行動が観察できなかった。最上川中流では、たまにウケクチウグイが少数採捕される場所で、本年度は全く採捕されなかった。本年度は、ウケクチウグイだけでなく同じ場所に生息するアユなどの他の魚類でも異常な動態が観察された。温暖化はウケクチグイのような冷水系の絶滅危惧種には特に大きく影響し、その絶滅を加速するおそれがあると考えられた。一方、国交省関連の阿賀野川の生物調査を行った保護活動家から、この2,3年間に上・中流域で採捕されたウケクチウグイ25個体のサンプルを供与された。そこで、これらの個体からmtDNA調節領域配列およびマイクロサテライトDNA多型を検出し、ウケクチウグイと同所的に多数の個体が生息するウグイとともに、最上川と阿賀野川の標本群で比較解析した。2つの異なるDNAマーカーの解析結果から、両水系のどちらの標本群でもウグイに比べてウケクチウグイの遺伝的多様性が桁違いに低く、集団内で近親交配が進んでいることが示唆された。また、両水系は隣接しているが、両水系のウケクチウグイは大きく遺伝的に分化しており、異なる集団として古くから進化してきたことが明らかになった。
９年一貫型の地域連携で取り組む品格教育への理論とエビデンスに基づく提案型研究

よい行為の習慣形成を目指す品格教育(character education)は,小中連携の9年一貫で,学校・家庭・地域で連携して子どもの規範意識を育む生徒指導体制の確立を可能にする。本研究では,米国の品格教育優秀校の視察を通して,品格教育の実践に関わる具体的な手立てだけでなく,単なる徳の提示にとどまらない品格教育の本質について論考した。加えて,小中学校へのアンケート調査で,品格の構成要素を示した。さらに,品格教育は,1,2年くらいで成果が出るような教育でなく,5,6年目かかること,また特に中学生で大きな成果が見られることを示した。よい行為の習慣形成を目指す品格教育(character education)は,小中連携で9年一貫で,学校・家庭・地域で連携して子ども達の規範意識を育む生徒指導体制を可能にする。全国で,150校以上が品格教育に取り組む中,実践に必要な具体的な工夫はまだよく知られていない。そこで本研究は,品格教育の発祥地,「アメリカのcheracter education優秀表彰校を訪問して視察し,(2)問題行動の指導,道徳教育と倫理学,特別支援,小中の接続,地域連携のためのツールの活用の視点からまとめ,(3)日本での各学校の取り組みを同じ視点でまとめ,(4)米国の専門化を招いてセミナーを開き,(5)教育効果の測定を認知理論に基づく方法,(5)縦断的な方法を使ってデータに基づいて検証し,小中学校の接続,教育課程への位置づけ,学校・家庭・地域への連携の具体的な方策について提案する研究を行うことである。本年度は,(1)米国のcharacter education優秀校の視察を,問題行動の指導,特別支援教育,教育評価,道徳教育,倫理学,そして,家庭や地域と連携するための情報伝達の工夫という観点でまとめた。次に,(3)の日本の取り組みを調べるため,日本の学校を訪問したり,地域の教育委員会から状況をうかがったりした。さらに,認知理論に基づく効果を検討するため,教育委員会と連携して,よい習慣作りに,研究指定校として1年早く取り組み始めた学校とその他の学校について,品格のテーマについての再認テスト,テーマに対する態度を比較検討し,ある程度の効果が見られることを確認した。さらに,縦断研究を行うための質問紙づくりや教育委員会との交渉を行った。平成25年度は,心理学的なエビデンスに関する研究は,成果を測定する指標がようやくまとまり,井邑・青木・高橋・山田・野中(2013)として心理学研究に掲載された。また,ヨーロッパ心理学会で尺度の開発過程を発表するとともに,教育心理学会のシンポジウムで,この指標を基に,ある学校区で7年間取り組んだ年次経過の結果を発表した。その際,現在の品格教育の第一人者,ミズーリー大学のバーコビッツ教授を招聘することができ,話題提供をして頂いた。加えて,上記の我々の取り組みに対して,学会会員の前でコメントを会員の前で頂くことができた。また,この招聘に関しては,品格教育を研究する他大学とも連携することで,他大学でのバーコビッツ教授のセミナーの開催にも繋がった。品格教育を知る研究としては,昨年度の視察を青木・川合・山田・宮﨑・新(2013)としてまとめた。これは,品格教育の拠点,セントルイスを視察し,生徒指導,教育評価,特別支援,道徳教育,プラグマティズムの観点から考察してものである。この視察の結果,品格教育は,児童生徒個々人が自分自身の人生の主人公であり続けることができるように支援するような教育であること,問題行動の指導にも直接関わっていること,特別支援の観点からも示唆が大きいこと等を示した。また,児童生徒は,モデルがある方が学びやすいため,よりよい学校風土を作るためにも力を入れており,教師がよいモデルとなれるような教員研修にも力を入れていることを示した。徳の用い方について,米国では教師が生徒を評価するのではなく,児童生徒自身が自分たちを振り返る視点として用いていた。この点,道徳教育の領域は,教師の指導の視点と言えるだろう。これのことから,品格教育で用いる徳は,教師の指導の視点と言うよりは,児童生徒が自分自身の人生を歩いて行ける羅針盤として機能するような教育であることがわかった。よい行為の習慣形成を目指す品格教育(character education)は,小中連携の9年一貫で,学校・家庭・地域の連携で児童生徒の規範意識を育む生徒指導体制を可能にする。本研究では,9年一貫のための小中の接続,教育課程への位置づけ,学校・家庭・地域の連携の具体的方策を,教育心理学,教育評価,道徳教育,倫理学,特別支援教育,視覚伝達デザインの側面から提案する研究を行うことを目的としている。本年度は,全米で最も古くから品格教育に取り組んでいる米国セントルイスのミズーリー大学にある品格教育と市民教育センターを訪問して,センター主催の品格教育の教員研修会への参加,品格教育優秀校の視察等を行ない,各方面からの視察を行った。

また,エビデンスに基づいた評価を可能にするための研究も行った。そこでは,日本で品格教育を行っている学校について,取り組み2年目の学校と3年目の学校で,品格の徳目に関する記憶テストを行うことで,品格教育の客観的効果の測定を試みた。その結果,3年目の学校の方が記憶テストの成績がよいことが示唆され,繰り返すことで,確かに児童生徒の記憶に定着していることが窺えた。加えて,品格教育が人格形成に及ぼすポジティブな影響を検討することを目的として,ポジティブ心理学の知見を応用して,よい行為の習慣で培われる人格のポジティブな側面について明確にする測定尺度の開発を行った。この結果,4つの側面がポジティブな要素として抽出された(「根気・誠実」「勇気・工夫」「寛大・感謝」「フェア・配慮」)。今後は,この4側面の教育的効果,年齢による教育効果の違いなどを検討することにした。本年度は,1米国の専門化を招いたセミナーを行うとともに,昨年までの視察をベースにして,2学会の講演等を利用して,品格教育の具体的な紹介を行って内容をまとめる活動を行った。加えて,3日本で品格教育に取り組む学校での縦断的な教育成果を分析し,一部は学会で発表した。また,5特別支援活動への応用についてもまとめ,研究成果を論文化した。26年度が最終年度であるため、記入しない。社会科学26年度が最終年度であるため、記入しない。おおむね,予定通りに進んでいるから。全米の第一人者と交流し,品格教育の現状を理解することができた。加えて,我々の取り組みに直接コメント頂くことで,さらに一層,品格教育について知ることができた。たとえば,お招きした際,SELとの関係,品格教育の情報収集の仕方をお尋ねすることができた。これらの結果,品格教育とは,学問の領域や新しいテクニックではなく,道徳教育,倫理学,健康教育,スキルトレーニング,教員研修等,多くの領域が関わる「教育運動(movement)」であることが納得できた。また,今まで,どこにアクセスすれば最先端の知見が得られるのかが,なかなかわからなかったが,昨年度の視察を通して,また,招聘を通して,こちらの実績を紹介できたので,交流を深めることができ,日本にいても,新しい情報を入手する方法のきっかけを掴むことができた。品格の尺度の開発に成功することができた。これで,ある学校区6年分の取り組みを分析したら,中学校で特に成果があがってることがわかった。来年度は,これを論文にまとめたいと思っている。米国の品格教育とはどのようなものかをしるため,セントルイスの品格と市民センターを訪問するとともに,このセンターを介して品格教育優秀校を紹介して頂き,視察を行った。同センター主催の教員研修会にも参加させてもらった。この米国の視察は充実したもので,多くの知見を得られた。この視察に関する報告論文は,教育心理学,教育評価,道徳教育,倫理学の視点からまとめ,もうすぐ印刷される完成する予定である。品格教育を広めるためには,品格教育が有効性を示すエビデンスが必要がある。そこで品格のテーマに関する記憶テストを実施した。その結果,品格教育に長く取り組んでいる学校の方が,品格のテーマを再生しやすいことがわかった。
包括的遺伝子発現情報を基にした悪性脳腫瘍に対する新たな診断学、治療学の展開

我々は平成14年から16年まで基盤研究B(2)課題番号14370428により、悪性脳腫瘍100症例のマイクロアレイを用いた解析から、遺伝子発現プロファイル情報からなるデータベースを作成した。今回はこのデータベースをもとに、悪性神経膠腫でuniqueな遺伝子のうちで治療の標的となりうる新たな遺伝子30個が選択された。さらに悪性神経膠腫患者の予後と相関する遺伝子として、22種類の遺伝子が選択された。これらの新たな標的分子から分子標的薬、ペプチドワクチン、siRNAの開発に向け研究を進めている。たとえば、EpherinA 4,Kinesin, PTTG1などの遺伝子は悪性神経膠腫で高発現し、患者の予後との1相関が認められ、神経膠腫細胞でsiRNAを用いてその発現を抑制すると、細胞増殖能、浸潤能が抑制される事が明らかとなった。さらにKinesinのコンピューター解析からHLA-A24分子に結合能を持つエピトープ候補ペプチドを作成し、in vitroにおける細胞傷害性T細胞(CTL)の誘導を試みた。このCTLがHLA-A24分子を持つグリオーマ細胞に対しても高い細胞傷害性を証明でき、抗原エピトープである事がわかった。神経膠腫に対する新たなペプチドワクチンとなりうる事が示された。さらに、Epherin A4を阻害する標的薬のスクリーニングを進め、分子標的薬の開発に向け研究を展開している。さらに、他の遺伝子についても解析を進め、標的分子となりうる事を確認し、分子標的薬、ペプチドワクチン,siRNAの開発に向け研究を進める予定でいる。我々は平成14年から16年まで基盤研究B(2)課題番号14370428により、悪性脳腫瘍100例のマイクロアレイを用いた解析から、遺伝子発現プロファイル情報からなるデータベースを作成した。これらの新たな標的分子から分子標的薬、抗体、ペプチドワクチンの開発に向け研究を進めている。たとえば、Epherin A4,KLC,PTTGなどの遺伝子は悪性神経膠腫で高発現し、患者の予後との相関が認められ、神経膠腫細胞でsiRNAを用いてその発現を抑制すると、細胞増殖能、浸潤能が抑制される事が明らかとなった。さらにKLCのコンピューター解析からHLA-A24分子に結合能を持つエピトープ候補ペプチドを作成し、in vitroにおける細胞傷害性T細胞(CTL)の誘導を試みた。このCTLがHLA-A24分子を持つグリオーマ細胞に対しても高い細胞障害性を証明でき、抗原エピトープである事がわかった。神経膠腫に対するあらたなペプチドワクチンとなりうる事が示された。さらに、遺伝子についても解析をすすめ、標的分子となりうる事を確認し、分子標的薬、抗体、ペプチドワクチンの開発に向け研究を進める予定でいる。さらに、それらの遺伝子からなる簡易マイクロアレイを作成し、悪性神経膠腫をprosopectiveに検討し、その遺伝子発現プロファイル情報から最も有用と考えられる治療方法を選択し、期待通りの治療生成が得られるか検討する。テーラーメイド型治療開発に向け研究を進める。

たとえば、Epherin A4, Kinesin, PTTG1などの遺伝子は悪性神経膠腫で高発現し、患者の予後との相関が認められ、神経膠腫細胞でsiRNAを用いてその発現を抑制すると、細胞増殖能、浸潤能が抑制される事が明らかとなった。さらにKinesinのコンピューター解析からHLA-A24分子に結合能を持つエピトープ候補ペプチドを作成し、in vitroにおける細胞傷害性T細胞(CTL)の誘導を試みた。このCTLがHLA-A24分子を持つグリオーマ細胞に対しても高い細胞傷害性を証明でき、抗原エピトープである事がわかった。神経膠腫に対する新たなペプチドワクチンとなりうる事が示された。さらに、Epherin A4を阻害する標的薬のスクリーニングを進め、分子標的薬の開発に向け研究を展開している。さらに、他の遺伝子についても解析を進め、標的分子となりうる事を確認し、分子標的薬、ペプチドワクチン,siRNAの開発に向け研究を進める予定でいる。
血液凝固系タンパク質のEGF様ドメインに特徴的な糖鎖の合成酵素の精製

Xylα1-3Xylα1-3Glcは血液凝固系タンパク質のEGF様ドメインに特徴的に存在する糖鎖である。その生合成に関与するUDP-D-キシロース: βーD-グルコシドα-壱,3-D-キシロシルトランスフェラーゼ(G-酵素)の存在が予想された。そこで,ウシ肝臓をホモナイズし,遠心分離による細胞分画を行い,各画分のG-酵素活性を調べた.各画分をUDP-キソロース(UDP-Xyl)とアクセプター2-[(2-ピリジル)アミノ]エチルβ-D-グルコピラノジシド(Glcβ-EPA)とともにインキュベートし,生成物を高速液体クロマトグラフィーで分析した.糖転移生成物Xylα1-3GlcβEPAがミクロソーム画分反応混合物中に検出され,G-酵素はミクロソーム画分に存在することが明らかになった.ミクロソーム画分を1%Triton X-100中,4°Cで1時間処理し,酵素を可溶化し,粗酵素液とした.DEAE-セファセルカラム,セファロースCL-6Bカラム,Mono-Qカラム,UDP-ヘキサノールアミンカラムによるクロマトグラフィーを順次行った.これらの4段階のクロマトグラフィーで比活性は3800倍に上昇した.ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果より,まだ完全に単一な酵素タンパク質には精製できていないことが分かった。基質特異性や性質を調べる目的には十分利用できる酵素標品と考えられる.ゲル濾過の結果より,分子量は約65,000と推定される.示適pHは7.2で,活性の二価カチオン依存性を調べた結果,Mn^<2+>で活性が高かった.UDP-Xyl,Glcβ-EPAに対するKm,app値はそれぞれ62μM,18mMであった.ポリアクリルアミドゲル電気泳動でG-酵素活性を示すバンドより酵素を抽出し,一部のアミノ酸配列は決定できる.遺伝子工学の手法を使って,酵素遺伝子を破壊したノックアウトマウスを作成することは可能であり,本研究の成果はXylα1-3Xylα1-3Glc構造の生理的役割を解明する基礎となる.Xylα1-3Xylα1-3Glcは血液凝固系タンパク質のEGF様ドメインに特徴的に存在する糖鎖である。基質特異性や性質を調べる目的には十分利用できる酵素標品と考えられる.ゲル濾過の結果より,分子量は約65,000と推定される.示適pHは7.2で,活性の二価カチオン依存性を調べた結果,Mn^<2+>で活性が高かった.UDP-Xyl,Glcβ-EPAに対するKm,app値はそれぞれ62μM,18mMであった.ポリアクリルアミドゲル電気泳動でG-酵素活性を示すバンドより酵素を抽出し,一部のアミノ酸配列は決定できる.遺伝子工学の手法を使って,酵素遺伝子を破壊したノックアウトマウスを作成することは可能であり,本研究の成果はXylα1-3Xylα1-3Glc構造の生理的役割を解明する基礎となる.ウシ肝臓をホモジナイズし,遠心分離による細胞分画を行い,各画分のUDP-D-キシロース:β-D-グルコシドα-1,3-D-キシロシルトランスフェラーゼ(G-酵素)活性の存在を調べた。各画分をキシロースドナーUDP-キシロース(Xyl-UDP)とアクセプター2-[(ピリジル)アミノ]エチルβ-D-グルコピラノシド(Glcβ-EPA)とともにインキュベートし,生成物を高速液体クロマトグラフィーで分析した。糖転移生成物Xylα1-3Glcβ-EPAがミクロソーム画分反応混合物中に検出され,G-酵素はミクロソーム画分に存在することが明らかになった。ミクロソーム画分はゴルジ膜の断片を含んでいると考えられ,膜からの可溶化の条件をTriton X-100の濃度を変えて検討した。その結果,1% Triton X-100中,4°Cで1時間の処理が適当であった。105,000xgで1時間遠心分離し,その上清(可溶化画分)を粗酵素液とし以下の精製を行った。

まず,セファロースCL-6Bカラムでゲル濾過を行い,つぎにUDP-ヘキサノールアミンカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーを行った。この2段階の精製で200倍精製された。ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果より,まだ単一な酵素タンパク質でなかったが,この段階で可能な性質を調べた。ゲル濾過の結果より,分子量は約65,000と推定される。示適pHは7.2で,活性の二価カチオン依存性を調べた結果,Mn^<2+>で活性が高かった。Xyl-UDP,Glcβ-EPAに対するKm_<app>値はそれぞれ100μM,18mMであった。前年度,ウシ肝臓をホモジナイズし,遠心分離による細胞分画を行い,ミクロソーム画分にUDP-D-キシロース:β-D-グルコシドα-1,3-D-キシロシルトランスフェラーゼ(G-酵素)が存在することを明らかにし,それを可溶化した.セファロースCL-6Bカラムによるゲルろ過とUDP-ヘキサノールアミンカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製をおこなったが,約200倍に部分精製にとどまった.本年度,引き続き精製を進めた.酵素が不安定なため,精製倍率を向上させるには過程の迅速化と精製の効率化を計る必要があると考え,精製の方法や分離モードの異なったクロマトグラフィーをどのように組み合わせて行うかを検討した.まずミクロソーム画分から可溶化したG-酵素を含む粗酵素液をDEAE-セファセルカラムにチャージし,陰イオン交換クロマトグラフィーを行った.酵素活性のある画分を限外ろ過で濃縮し,セファロースCL-6Bカラムを用いてゲルろ過を行った.ついでMono-Qカラムを用いた陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー,UDP-ヘキサノールアミンカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーを順次行った.これらの4段階のクロマトグラフィーで比活性は3800倍に上昇した.ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果より,まだ完全に単一な酵素タンパク質には精製できていないことが分かったが,基質特異性や性質を調べることや,またG-酵素の活性を示すバンドをゲルより抽出して,そのアミノ酸配列の一部分を決定し,DNAプローブを作成する目的には十分利用できる酵素標品と考えられる.
ディ-ゼル機関用超高圧噴射システムの開発

ディ-ゼル機関はきわめて高い熱効率をもち現代社会に欠かすことはできない原動機であるが,排出される微粒子(黒煙ならびに青白煙)および窒素酸化物は環境保全上憂慮されており,緊急にそれらの低減を図らねばならない。この種の機関では高温の圧縮空気中に液体燃料を噴射し,周囲空気と混合しつつ燃焼が進行するが,燃焼に許される時間がきわめて短いため,不完全燃焼に陥って微粒子が生成されやすい.そのため噴射圧力を格段に高め,噴霧内での混合と燃焼を迅速にして排出微粒子の低減を図る方法が望まれている.しかし,通常のジャ-クポンプによる噴射では燃焼の内部リ-クや異常噴射発生などのため高圧化はむずかしく,また,断面積の違いを使って圧力を高める増圧ピストン方式やプランジャとノズルを一体にしたユニットインジェクタ方式などの新方式も内部リ-クやコストの点で困難がある.本研究では,これらの欠点を除くため流体の慣性を利用する新しい形式の噴射方法を考案した.この方法は管路入口を太く先端に行くにしたがって細くなる縮小管を使うことを特徴とするもので,管路入口の機械インピ-ダンスを低く保つことによってプランジャの加速を容易にし,先端において高い油圧を発生させる.すなわち,流体の慣性を利用しポンプ側の圧力上昇を先端で大幅に拡大する.本研究では,まず縮小管の圧力増大効果について特性曲線法により詳しく検討し,噴射の高圧化に役立つ可能性を示した.ついで,縮小管内の燃料を加速するポンプとして自由ピストン型の可動部分をもつ2形式を考案した.いずれも可動部に働く力を油圧で釣り合わせておき,少量の油を電磁制御弁によって逃がすことによって起動させる.この噴射システムの動特性を計算機シミュレ-ションによって詳細に調べ,この噴射装置は従来よりも優れた特性をもっており,実用化の可能性があることを明らかにした.ディ-ゼル機関はきわめて高い熱効率をもち現代社会に欠かすことはできない原動機であるが,排出される微粒子(黒煙ならびに青白煙)および窒素酸化物は環境保全上憂慮されており,緊急にそれらの低減を図らねばならない。この種の機関では高温の圧縮空気中に液体燃料を噴射し,周囲空気と混合しつつ燃焼が進行するが,燃焼に許される時間がきわめて短いため,不完全燃焼に陥って微粒子が生成されやすい.そのため噴射圧力を格段に高め,噴霧内での混合と燃焼を迅速にして排出微粒子の低減を図る方法が望まれている.しかし,通常のジャ-クポンプによる噴射では燃焼の内部リ-クや異常噴射発生などのため高圧化はむずかしく,また,断面積の違いを使って圧力を高める増圧ピストン方式やプランジャとノズルを一体にしたユニットインジェクタ方式などの新方式も内部リ-クやコストの点で困難がある.本研究では,これらの欠点を除くため流体の慣性を利用する新しい形式の噴射方法を考案した.この方法は管路入口を太く先端に行くにしたがって細くなる縮小管を使うことを特徴とするもので,管路入口の機械インピ-ダンスを低く保つことによってプランジャの加速を容易にし,先端において高い油圧を発生させる.すなわち,流体の慣性を利用しポンプ側の圧力上昇を先端で大幅に拡大する.本研究では,まず縮小管の圧力増大効果について特性曲線法により詳しく検討し,噴射の高圧化に役立つ可能性を示した.ついで,縮小管内の燃料を加速するポンプとして自由ピストン型の可動部分をもつ2形式を考案した.いずれも可動部に働く力を油圧で釣り合わせておき,少量の油を電磁制御弁によって逃がすことによって起動させる.この噴射システムの動特性を計算機シミュレ-ションによって詳細に調べ,この噴射装置は従来よりも優れた特性をもっており,実用化の可能性があることを明らかにした.ディ-ゼル機関からの排出微粒子を低減する最も有望な対策として高圧噴射が検討されているが、通常用いられるジヤ-クポンプおよび増圧ピストンによる方法では機構の複雑さや内部の燃料もれのため実用化は困難を伴う。そこで本研究では、流体の慣性を利用した新しい形式の噴射方法を開発するとともに、それらによる微粒子低減効果を確認する。本年度は、通路断面積が入口からしだいに減少する縮小管を用いると大きな増圧作用が得られることを確かめるとともに、高圧噴射の効果ならびに可能性を明らかにし、主につぎの事項について研究を実施した。1.増圧ピストン方式により噴射圧力を高めた条件で単筒機関の運転試験を行い、従来の噴射圧力に比べ微粒子および窒素酸化物が同時に低減できること,中負荷域の可溶有機成分が減少することを示した。2.圧力波発生部、縮小管による高圧ブ-スタ、およびホ-ルノズルから構成される噴射系を考案し、動的圧力増幅の効果を非粘性一次元微少振幅波の理論に基づく特性曲線法によって考察した。それによって、縮小管を用いると先端では入口よりもはるかに高い圧力が瞬間的に発生できることを明らかにした。縮小管を試作し、単発の打撃をプランジャに与えた場合について実験的に調べ、高圧が発生することを実証した。3.特性曲線法による解析により、送油波形、流量、時間、および噴射管形状等の影響を調べた。その結果、管内圧力波伝播よりも短時間に燃料送入を終えると圧力変化が噴射管先端で拡大することがわかった。4.3の結果に基づいて送油率の高い燃料噴射ポンプを考案した。これは、噴射管路内の流体の動的作用を利用するものであり、噴射時期の制御を容易にするとともに低回転速度での噴射圧力の低下や異常噴射の発生を避けることが出来る。このポンプを含む噴射系全体の作動状況を数値シミュレ-

ションによって検討し、その実用性を確認した。ディ-ゼル機関からの排出微粒子を低減する最も有望な対策として高圧噴射が検討されているが,通常用いられるジャ-クポンプおよび増圧ピストンによる方法では内部の燃料もれや異常噴射の発生などのために実用化困難である.そこで本研究では,これらの欠点を除くため流体の慣性を利用した新しい形式の噴射方法を考案した.この方法は管路入口を太く先端に行くにしたがって細くなる縮小管を使うことを特徴とするもので,管路入口の機械インピ-ダンスを低く保つことによってプランジャの加速を容易にし,先端において高い油圧を発生させる。すなわち,流体の慣性を利用しポンプ側の圧力上昇を先端で大幅に拡大する.前年度までに,縮小管の圧力増大効果について特性曲線法により詳しく検討するとともに,単行程試験装置を用いてその効果を実証し,本方式が噴射の高圧化に役立つ可能性を示した.これらの結果に基づき今年度は,縮小管による圧力増幅効果を有効に活用するための高圧燃料噴射ポンプを考察した.この噴射ポンプの特徴は,ばねもしくはアキュムレ-タに貯えられた弾性エネルギ-を一気に解放してプランジャ-を加速するもので,可動部に働く力を油圧で釣り合わせておき,少量の油を電磁制御弁によって逃がすことによって起動し高速運動させる.この噴射システムの動特性を計算機シミュレ-ションによって詳細に調べた結果,この噴射装置ではポンプの負担を軽くして高圧が得られること,ノズル側の圧力降下が早いので噴射の切れがよいこと,管路部はすべて正圧で作動するためキャビテ-ションの心配が少ないこと,および全電子油圧制御のため噴射特性が機関回転数に依存しないことなど従来よりも優れた特性をもっており,実用化の可能性があることを明らかにした.
新しい免疫電顕法を用いた基底膜抗原蛋白が皮膚水疱症の発生に果たす役割についての研究

皮膚基底膜には、数多くの抗原タンパクが存在する。私共はこれまで、immunoblotや分子生物学的手法を用いた研究により、類天疱瘡抗原などいくつかの基底膜抗原タンパクの生化学的特徴、あるいはcDNAシークエンスを解明してきた。しかしこのように生化学的にはかなり研究が進んでいるこれら基底膜抗原タンパクも、正常あるいは患者皮膚基底膜におけるその正確な局在部位に関しては、種々の困難な免疫電顕における技術的問題点のために未だ十分解明されていなかった。この理由は、従来まで皮膚免疫電顕の研究で主に使用されてきたペルオキダーゼ標識抗体を用いたpreembedding免疫電顕法では、皮膚の微細構造の保持が十分できず、また巨大なペルオキシダーゼ反応産物が沈着部位の微細構造までもマスクしてしまうなどの要因によるものであった。今回私共は“全く化学固定を用いず、凍結固定・凍結置換のみで組織を超低温樹脂に包埋して行うpostembedding免疫電顕法"に金コロイデをマーカーとして応用した。その結果、230kD類天疱瘡抗原はヘミデスモゾームの細胞内のみに、170kD類天疱瘡抗原はヘミデスモゾームの細胞質膜にそって細胞の内外にわたり、それぞれ別の部位に局在することを解明し得た(J Clin Invest:in press)。また、イメージアナライザーを併用することにより、これら基底膜抗原の局在をより正確に、しかも定量的に解析する方法を開発することができた(J Histo chem Cytochem41:123-128,993)。本研究の成果は、今後の皮膚水疱症の発生機序の解明に大きな貢献をし得たものと考えられる。1.VII型コラゲンについて:VII型コラゲンのカルボキシ末端に対するモノクロ-ナル抗体であるLH7.2と、VII型コラゲンのコラゲン部分に対するポリクロ-ナル抗体をそれぞれ用いて、その局在部位をpreーembeddingおよびpostーembeddingを用いた金コロイド免疫電顕法にて検索した。その結果、正常人皮膚の基底膜に存在するanchoringfibrilでは、fibrilの両端にVII型コラゲンのカルボキシ末端が存在し、anchoring fibrilの中央線維部分はコラゲン本体に対する抗体と反応性を示すことがわかった。また、日本人の後天性表皮水疱症患者血清中に存在する抗皮膚基底膜抗体と、LH7.2モノクロ-ナル抗体との正常皮膚に対する反応性を見たところ、両者ともanchoring fibrilの両端のみとの反応性を示した。以上の結果から、VII型コラゲンにより構成されるanchoring fibrilのより明らかな構造、および後天性表皮水疱症抗原との関係が明確となった。2.猿天疱瘡抗原について:類天疱瘡抗原蛋白は主に分子量230kd,及び170kdという2種の異なった分子量の蛋白により成り立っているが、正常皮膚において両者の微細局在部位に差があるのか否かについては明らかにされていなかった。我々は、類天疱瘡患者血清よりそれぞれ、230あるいは170kdの蛋白に対する自己抗体を免疫ブロット法を応用してaffinity purifyした。金コロイドを用いたpostーembedding免疫電顕により、それぞれの抗体と正常人皮膚との微細反応部位を観察したところ、230kdに対する抗体は皮膚基底膜ヘミデスモゾ-ムの細胞内側に、170kdに対する抗体はより外側の細胞膜に近い部分と反応性を示す可能性が示唆された。さらにより詳細な検討を今後行う予定である。本年度私達は昨年の結果を基盤に,自己免疫性水疱症である類天疱瘡患者血清中の抗皮膚基底膜自己抗体が認識する抗原についての研究を主体に行ったimmunoblotや分子生物学的手法を用いた研究により、類天疱瘡抗原などいくつかの基底膜抗原タンパクの生化学的特徴、あるいはcDNAシークエンスを解明してきた。

しかしこのように生化学的にはかなり研究が進んでいるこれら基底膜抗原タンパクも、正常あるいは患者皮膚基底膜におけるその正確な局在部位に関しては,種々の困難な免疫電顕における技術的問題点のために未だ十分解明されていなかった。この理由は、従来まで皮膚免疫電顕の研究で主に使用されてきたペルオキシダーゼ標識抗体を用いたpreembedding免疫電顕法では、皮膚の微細構造の保持が十分できず、また巨大なペルオキシダーゼ反応産物が沈着部位の微細構造までもマスクしてしまうなどの要因によるものであった。今回私共は“全く化学固定を用いず、凍結固定・凍結置換のみで組織を超低温樹脂に包理して行うpostembedding免疫電顕法"に金コロイドをマーカーとして応用した。その結果、230kD類天疱瘡抗原はヘミデスモゾームの細胞内のみに、170kD類天疱瘡抗原はヘミデスモゾームの細胞質膜にそって細胞の内外にわたり、それぞれ別の部位に局在することを解明し得た(J Clin Invest:in Press)。また,イメージアサライザーを併用することにより、これら基底膜抗原の局在をより正確に、しかも定量的に解析する方法を開発することができた(J Histochem Cytochem 41:123-128,1993)。本研究の成果は、今後の皮膚水疱症の発生機序の解明に大きな貢献をし得たものと考えられる。
動脈硬化の発症・進展と酸化ステロール分子種の解析

前年度,酸化ステロールをGC-MSを用いて分析する方法を確立した.この方法を用いて,アポE欠損マウスとその野生型であるC57BL/6マウスの血清,肝臓及び動脈の酸化ステロールを分析し,アポE欠損マウスはその野生型と比較して,血清並びに動脈に多量の酸化ステロールが沈着していることを明らかにした.また,コレステロール酸化物を調製してアポE欠損マウスに給餌すると,血清と肝臓にコレステロール酸化物が蓄積すること,しかし,動脈へのその蓄積は僅かであることを観察した.本年度は,コレステロール酸化物のリンパへの輸送を胸管リンパカニュウレーションラットを用いて検討するとともに,食用油脂の摂取と動脈におけるコレステロール酸化物着との関係ならびに植物ステロール酸化物の吸収について検討した.その結果,コレステロール酸化物は,摂食後6時間でいずれもリンパ液中で回収されること,特に,α-エポキシコレステロールの回収率はコレステロールにほぼ匹敵し,次いで,7-ケトコレステロール,コレステタントリオール,7β-,7α-ヒドロキシコレステロールの順に回収されることを明らかにした.これらの結果から,食事に含まれるコレステロール酸化物は程度の差はあるがいずれも吸収され,体内へ輸送されることが実証された.一方,摂取油脂の違い(リノール酸およびα-リノレン酸に富む油脂)は動脈における酸化ステロールの沈着量に影響しなかった.食品中には植物ステロール酸化物が含まれることから,代表的な植物ステロールであるβ-シトステロールとカンペステロールの酸化物を有機合成し,それらの吸収・輸送ならびに動脈硬化への影響について現在検討中である.前年度,酸化ステロールをGC-MSを用いて分析する方法を確立した.この方法を用いて,アポE欠損マウスとその野生型であるC57BL/6マウスの血清,肝臓及び動脈の酸化ステロールを分析し,アポE欠損マウスはその野生型と比較して,血清並びに動脈に多量の酸化ステロールが沈着していることを明らかにした.また,コレステロール酸化物を調製してアポE欠損マウスに給餌すると,血清と肝臓にコレステロール酸化物が蓄積すること,しかし,動脈へのその蓄積は僅かであることを観察した.本年度は,コレステロール酸化物のリンパへの輸送を胸管リンパカニュウレーションラットを用いて検討するとともに,食用油脂の摂取と動脈におけるコレステロール酸化物着との関係ならびに植物ステロール酸化物の吸収について検討した.その結果,コレステロール酸化物は,摂食後6時間でいずれもリンパ液中で回収されること,特に,α-エポキシコレステロールの回収率はコレステロールにほぼ匹敵し,次いで,7-ケトコレステロール,コレステタントリオール,7β-,7α-ヒドロキシコレステロールの順に回収されることを明らかにした.これらの結果から,食事に含まれるコレステロール酸化物は程度の差はあるがいずれも吸収され,体内へ輸送されることが実証された.一方,摂取油脂の違い(リノール酸およびα-リノレン酸に富む油脂)は動脈における酸化ステロールの沈着量に影響しなかった.食品中には植物ステロール酸化物が含まれることから,代表的な植物ステロールであるβ-シトステロールとカンペステロールの酸化物を有機合成し,それらの吸収・輸送ならびに動脈硬化への影響について現在検討中である.まず、酸化ステロールの分析法について、GC-MSを用いて検討した。内部標準物質として5α-コレスタンを選定し、イオン選択法によって8種類の酸化ステロールを同定、定量する方法を確立した。この方法を用いて、酸化ステロールを含む食事あるいは含まない食事をアポE欠損マウスとその野生型のC57BL6マウスに与え、血清、肝臓、大動脈の酸化ステロールを分析した。酸化ステロールは、コレステロールを加熱することによって調製した。アポE欠損マウスではC57BL6マウスと比較して、食事に磁化ステロールを与えない場合にも、血清と肝臓、大動脈で2倍以上の量の酸化ステロールが検出された。この実験から、アポE欠損マウスでは生体内過酸化反応が亢進しており、このことが動脈硬化病変の進展と関係していることが推定された。酸化ステロールを含む食事をアポE欠損マウスに与えた場合には、血清と肝臓で各種の酸化ステロールの蓄積が観察された。血清および肝臓の酸化ステロールの組成と食事のそれとは異なることから、酸化ステロールの吸収はその種類によって異なることが推定された。動脈中の酸化ステロール量は、アポE欠損マウスに酸化ステロールを含む食事を与えてもそれほど顕著に増加しなかった。また、食事への酸化ステロールの添加は動脈硬化の進展に影響しなかった。これらの結果から、食事の酸化ステロールよりもむしろ生体内で生じる酸化ステロールが動脈硬化の進展に関係していることが示唆された。前年度,酸化ステロールをGC-MSを用いて分析する方法を確立した.この方法を用いて,アポE欠損マウスとその野生型であるC57BL/6マウスの血清,肝臓及び動脈の酸化ステロールを分析し,アポE欠損マウスはその野生型と比較して,血清並びに動脈に多量の酸化ステロールが沈着していることを明らかにした.また,コレステロール酸化物を調製してアポE欠損マウスに給餌すると,血清と肝臓にコレステロール酸化物が蓄積すること,しかし,動脈へのその蓄積は僅かであることを観察した.本年度は,コレステロール酸化物のリンパへの輸送を胸管リンパカニュウレーションラットを用いて検討するとともに,食用油脂の摂取と動脈におけるコレステロール酸化物着との関係ならびに植物ステロール酸化物の吸収について検討した.

その結果,コレステロール酸化物は,摂食後6時間でいずれもリンパ液中で回収されること,特に,α-エポキシコレステロールの回収率はコレステロールにほぼ匹敵し,次いで,7-ケトコレステロール,コレステタントリオール,7β-,7α-ヒドロキシコレステロールの順に回収されることを明らかにした.これらの結果から,食事に含まれるコレステロール酸化物は程度の差はあるがいずれも吸収され,体内へ輸送されることが実証された.一方,摂取油脂の違い(リノール酸およびα-リノレン酸に富む油脂)は動脈における酸化ステロールの沈着量に影響しなかった.食品中には植物ステロール酸化物が含まれることから,代表的な植物ステロールであるβ-シトステロールとカンペステロールの酸化物を有機合成し,それらの吸収・輸送ならびに動脈硬化への影響について現在検討中である.
近位尿細管ナトリウム輸送と鉱質コルチコイドシグナルにおけるSGLT2の意義

新しい糖尿病治療薬SGLT2阻害薬は、腎近位尿細管でグルコースとナトリウムの再吸収を抑制する薬であり、大規模臨床試験で心血管イベント抑制作用や腎保護作用が認められ、注目されている。しかしその効果発現の機序については不明な点も多く残っている。SGLT2を介したインスリンによる情報伝達はミネラルコルチコイド受容体依存性の高血圧発症に深く関与することが示唆されており、一方で近位尿細管ナトリウム再吸収のマスターレギュレーターはWNK/OSR1が担うことが考えられている。この研究では、SGLT2の降圧作用の機序を明らかにするとともに、ミネラルコルチコイド受容体による近位尿細管障害の詳細も明らかにする。
水晶体型超音波式高速応答レンズの開発とマイクロ光デバイスへの応用

本研究では,超音波の放射力を利用した高速応答レンズと,それを応用したマイクロ光デバイスの開発を行った.提案するレンズは,人間の眼の水晶体の様にレンズ自身の形状が変化して焦点位置を変化可能な可変焦点レンズである.高速で伝搬する超音波の放射力を利用し,従来技術である機械式と比較して1桁程度速い応答速度が期待できる.また本技術を応用したマイクロレンズアレイ,光スキャナなどのマイクロ光デバイスの開発を行った.さらに液晶材料と超音波を組み合わせた従来にない光制御技術を発案し,超音波の放射力による液晶の配向制御技術について検討した.より単純な構造で温度安定性を有する透明ゲルを用いた超音波駆動式可変焦点レンズを開発した.開発したレンズは,径30 mmのアニュラ型超音波振動子の片端にPETフィルムを接着し,中心部にレンズの役割を果たす透明粘弾性材料であるシリコーンゲルを充填する構造である.ゲルに流動性はなく,レンズを傾けてもその形状はほとんど変化しない.レンズ外形,駆動周波数,振動モードは有限要素解析により決定し,共振周波数222 kHzの径方向振動モードを用いた.レンズを電気的に駆動すると音響放射力がレンズ表面に働きレンズは静的に変形し,その変位は入力電圧に伴い増加する(21 V入力時の変位はおよそ150 μm).レンズ変形時の光学的焦点位置を光線追跡によって算出した結果,入力電圧値の増加に伴い透過光が集束し,焦点距離は短くなることがわかった(21 V入力時の焦点距離は24 mm).開発したレンズと市販のレンズ付高速度カメラを組み合わせ光学画像を撮影した結果,焦点位置を10 mmから23 mmの位置へ変化する際の応答時間は0.3秒であった本技術を応用した可変焦点レンズアレイを開発した.レンズアレイは4つの矩形超音波振動子,ガラス基板,シリコーンゲル膜で構成される.超音波振動子を駆動すると,ガラス基板に格子状たわみ振動モードが励振され,ゲル膜に働く音響放射力によってレンズアレイが形成される.レンズピッチは基板たわみ振動の半波長と一致し,周波数が高いほど小さい.単一レンズの場合と同様に,駆動電圧の増加により焦点距離は減少し,電圧によって焦点距離を制御でき,レンズピッチと焦点距離を同時に制御可能なレンズアレイの作製に成功した.本年度はまず,紫外線硬化樹脂と超音波振動を利用した,これまでに報告されていないレンズアレイ作製技術について検討した.提案するレンズアレイ作製技術は,複数の超音波圧電振動子付ガラス基板と厚さ数100 μmの紫外線硬化樹脂膜を用いる.超音波振動子に電気信号を入力すると,ガラス基板にはその共振周波数のいくつかにおいて,格子状のたわみ振動モードが発生する.これにより基板上の樹脂膜には音響放射力が働き,基板振動モードと相関の高い形状に変形し,レンズアレイを作製することができる.音響放射力による樹脂膜の変形を保った状態で,紫外線を照射することにより樹脂を硬化し,レンズアレイを作製することに成功した.基板の共振周波数を選択することにより,離散的にレンズピッチを選択でき,高い共振周波数を選択すると,レンズピッチを小さくすることが可能である.また樹脂の効果過程において,振動子の電気的インピーダンス特性を観測することにより,樹脂の硬化状況を予測可能であることがわかった.前年度に開発したレンズアレイは,電圧振幅値によって焦点距離を,駆動周波数によってレンズピッチをそれぞれ制御することが可能である.本年度は第2項目として,レンズの面内移動について検討した.レンズの面内移動技術と前年度の技術を組み合わせることにより,レンズ透過光分布を3次元的に制御することができる.試作機では,基板に接着した複数の振動子への入力電圧位相差を制御することにより,ガラス基板に発生するたわみ定在波を直線的に移動することができた.定在波の移動により,形成されるレンズアレイの面内移動を実現した.レンズ移動技術の光デバイスへの応用として,光スキャナとしての動作特性について検討した結果,最大屈折角4.9°を実現した.本研究では,超音波の放射力を利用した高速応答レンズと,それを応用したマイクロ光デバイスの開発を行った.提案するレンズは,一般的な機械式カメラモジュールの様に焦点合わせの際にレンズ位置を動かすのではなく,人間の眼の水晶体の様にレンズ自身の形状が変化して焦点位置を変化可能な可変焦点レンズである.高速で伝搬する超音波の放射力を利用し,従来技術である機械式と比較して1桁程度速い応答速度が期待できる.高速応答レンズの実現により,これまで撮影困難とされてきた画面奥行き方向に高速移動する弾丸や,顕微鏡視野下での微生物の実時間3次元運動などの観測が可能となる.また本技術を応用したマイクロレンズアレイ,高速光スキャナなどの高速マイクロ光デバイスの開発を行った.最終年度では特に超音波を利用したマイクロレンズアレイおよび光スキャナの開発を行った.レンズアレイに関して,圧電基板上に発生する数10MHz帯域の高周波弾性表面波を利用することにより,数100マイクロメートルオーダのレンズピッチを有する,可変焦点型レンズアレイの実現に成功した.光スキャナに関して,入力信号によって基板の振動モードを制御することにより,1次元的にその位置を制御可能なレンズアレイを開発し,これをスキャナに応用することによりレーザ光走査が可能となった.また液晶材料と超音波を組み合わせた従来にない光制御技術を発案し,超音波の放射力による液晶の配向制御技術について検討した.今後本技術を利用した高速光デバイスの開発を行う予定である.

本研究では,超音波の放射力を利用した高速応答レンズと,それを応用したマイクロ光デバイスの開発を行った.提案するレンズは,人間の眼の水晶体の様にレンズ自身の形状が変化して焦点位置を変化可能な可変焦点レンズである.高速で伝搬する超音波の放射力を利用し,従来技術である機械式と比較して1桁程度速い応答速度が期待できる.また本技術を応用したマイクロレンズアレイ,光スキャナなどのマイクロ光デバイスの開発を行った.さらに液晶材料と超音波を組み合わせた従来にない光制御技術を発案し,超音波の放射力による液晶の配向制御技術について検討した.申請時に予定していた,紫外線硬化樹脂製レンズアレイの作製技術を開発した.さらに作製技術のみならず,電気的に樹脂硬化状況をモニタリング可能であることを明らかにした.また当初の計画通り,レンズの面内移動を実現し,超音波駆動による光スキャナを作製することができた.上記の研究成果の他に,今年度同時に進行している,弾性表面波を利用したマイクロレンズアレイについては実現できておらず,今後圧電基板の電気的特性を考慮に入れて,ゲルの材質を検討する必要がある.アクチュエータ工学,計測工学,超音波工学1高分子の配向分布による光の屈折を利用した単一レンズを開発する.これまでに開発したゲルの変形を利用したレンズと比較し,応答速度の高速化と薄型化が期待できる.2直径100マイクロメートル程度の光ファイバ先端にマイクロレンズを作製し,光デバイスとして応用する.例えばレンズ焦点位置を3次元的に制御することにより,血管内内視鏡ヘッドとして用いる.3圧電基板上に発生する弾性表面波を利用することにより,レンズピッチ100マイクロメートル程度のマイクロレンズアレイを開発する.特に,櫛形電極形状やレンズ材料について検討を行う.申請時に計画していた想定する使用環境に耐えうる可変焦点レンズの開発に成功した.温度安定性を有するシリコーンゲルをレンズ材料に用いることにより,従来型の2液性可変焦点液体レンズに比べて温度安定性は格段に向上した.しかしながら目標の一つである応答速度の高速化については,さらなる改善が必要である.これはレンズの応答速度がレンズ材料の粘弾性に大きく依存するためであり,今後レンズ材料の開発を含めて新たに材料を選定する必要がある.レンズ挙動の数値解析に関して,有限要素解析によりレンズ内の音場分布を計算し,レンズ変形形状の算出を試みた.計算結果より定性的な変形形状は推定できるものの,定量的に変形形状を算出するためには,レンズ界面変位,音場,音響放射力との練成解析が必要である.現在用いている有限要素解析ソフトではこれらの計算が困難であるため,今後他手法による数値解析について検討する必要がある.レンズアレイの開発について,当初の計画から前倒しになったものの概ね計画通りの成果を挙げることができた.しかしながら単一レンズの場合と同様に,応答速度の高速化に関しては今後の改善が必要である.研究分担者との共同実験および研究打合せを,2回行う必要がなくなったため.1単一レンズについて,レンズ径を1/10に小型化することにより小型・高速化を狙う.また応答速度向上のため,ゲル材料の開発を含めて再選定を行う.振動子電極を分割し,入力信号を制御することにより,ゲルを非軸対称に変形し,径方向への焦点位置制御を試みる.
イネのカドミウム輸送の分子機構解明と利用

イネのOsHMA3は細胞の中の液胞膜に存在し、そこで液胞内へカドミウム(Cd)を輸送していることを明らかにした。通常、イネはOsHMA3の働きにより吸収したCdを根に蓄積させているが、OsHMA3の機能喪失により多量のCdが茎葉部に輸送されCdを高蓄積する仕組みを明らかにした。また、OsHMA3を用いて植物組織のCd蓄積を制御できる可能性が示されるとともに、タンパク質の改変によるCd輸送活性の制御の可能性が示された。カドミウム(Cd)は人体に有害な重金属で農耕地に蓄積している。Cd汚染土壌の浄化法として、植物を利用してCdを除去するファイトレメディエーションが注目されている。この方法にはCdを多量に蓄積できる植物の育成が不可欠であるが、植物がCdを吸収、蓄積する機構は明らかでない。本研究では、イネの地上部へのCd移行に関与する遺伝子として同定したOsHMA3の機能解析を行うことによりイネのCd蓄積機構を解明することを目的としている。本年度は、OsHMA3の発現解析と酵母発現系によるOsHMA3のCd輸送機能の解析を行った。OsHMA3はイネの葉と根で発現し、根でより発現量が高かった。さらに、レポーター遺伝子(GFP)を用いて細胞内のどこにOsHMA3が存在するかを解析したところ、OsHMA3が液胞膜に局在していることが明らかとなった。OsHMA3は2価の重金属の膜輸送体に分類されることから、OsHMA3が2価の重金属を液胞内へ輸送する役割を担っており、Cdの地上部への輸送にも関与しているものと考えられた。次に、酵母変異株を用いてOsHMA3のCd輸送機能を解析した。液胞にCdを輸送するYCF1が機能喪失したCd感受性変異株において、OSHMA3はYCF1の機能を相補し変異株のCd感受性を低下させた。このことからOsHMA3がCdを液胞内へ輸送する膜輸送体であることが明らかになった。一方、Cdの高移行イネから単離した変異型のOsHMA3はCdの液胞への輸送機能が喪失または著しく低下していた。すなわち、OsHMA3はCdの液胞への膜輸送体であり、その機能喪失によりCdが根の液胞に輸送されず地上部へと移行して高蓄積するという、イネのCd蓄積機構の一端が明らかとなった。(1)シロイヌナズナおよび酵母を用いた(OsHMA3)機能解析イネのOsHMA3)cDNAを高発現させたシロイヌナズにおいて、OsHMA3がCdを液胞内に輸送することを明らかにした。その一方で、ZnやCo、Ni、Pbは輸送しない、あるいは輸送活性が著しく低いことが明らかとなった。これはOsHMA3の重金属の輸送能がオーソログであるシロイヌナズのAtHMA3とは異なりユニークであることを示している。OsHMA3の重金属の輸送能の解析をさらに進めるため、C末端領域の構造を変化させたOsHMA3のcDNAを複数作成してシロイヌナズナへ形質転換を行った。それらのCd輸送活性の解析から、OsHMA3のC末端領域がCd輸送には不可欠であることが示唆された。さらに、シロイヌナズの形質転換体め解析を通じて、OsHMA3を高発現させることにより植物のCd耐性を向上できることも明らかとなった。(2)OsHMA3によるCd移行能の制御技術の開発組織特異性および発現誘導可能なプロモーターと連結したOsHMA3を日本晴に導入した形質転換体を作成した。TO世代を用いて水耕栽培でCd移行能を予備的に評価した結果、全草で発現する35sプロモーターでOsHMA3を発現させた場合、Cdは根に残留し、地上部へのCd移行が著しく制限された。これに対し、光で誘導されて葉において発現させるcabおよび根で発現させるAMT1-1プロモーターを用いた場合には、地上部へのCd移行に変化は認められなかった。今後、Cd耐性の付与も組み合わせることで、Cd蓄積を制御した植物の開発が期待される。(1)OsHMA3の機能解析:C末端領域の長さを変化させたOsHMA3を導入したシロイヌナズナのCd耐性を指標としてOsHMA3のCd輸送活性を解析し、昨年度までにOsHMA3のC末端領域がCd輸送に不可欠であることが推測されていた。今年度、詳細な解析により膜貫通領域に続く105残基を欠失させた場合、Cd耐性が向上しないことを明らかにした。さらに、このC末端領域を欠失させたOsHMA3は液胞膜に局在することから、この領域が植物におけるCd輸送に必須であることが明らかとなった。