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暖地型マメ科牧草混播草地の管理方法の検討ならびに根粒菌及び菌根菌の貢献度の検討

南九州地域での暖地型マメ科牧草の生産と利用技術の開発を目標に,省力的な栽培管理利用法を確立するための基礎的知見を得る目的で,暖地型マメ科牧草ファジービーン(Pb),バーガンディビーン(Bb),サイラトロ(Si),センチュリオン(Ce),グライシン(Gl),グリーンリーフデスモディウム(Gd),カウピー(Cow),アメリカンジョイントベッチ(Aj)およびバタフライピー(Bp)の生産性の比較を行った。栽培試験は宮崎大学内圃場(S-1)および鹿児島県大隅半島の中山間地に位置する地域の農家圃場(S-2)で実施した。S-1において,Pb,Bb,Siの順に,乾物収量(DMY),可消化乾物収量(DDMY)および粗タンパク質収量(CPY)で高い傾向を示した。個体当たりの根粒数は,8月ではPbが,9月ではCeが最も高かった。S-2において,Cow,Aj,Si,Ceの順にDMY,CPYおよびDDMYで高い傾向を示した。個体当たりの根粒数および根粒重は,9月および10月においてAjが他の草種より有意に高かった。粗タンパク質含有率および乾物消化率については,生育の進行に伴い低下する傾向にある草種と8月から10月を通してほぼ同様の値を示す草種が認められた。両試験地共通草種のDMYについて試験地間の比較を行ったところ,ほとんどの草種においてS-1よりもS-2で高い値を示したが,気象条件や土壌条件が影響したものと考えられ,今後様々な栽培条件下での草種の比較検討を行い,南九州地域での栽培利用の有望な草種の選定を行う。九州・沖縄地域における暖地型マメ科牧草の利用状況を把握するため,関係者への聞き取り調査を行い,沖縄本島および石垣島の一部の草地の外縁部および草地近傍の道端等にのみ20-30年前に導入されたマメ科草種が存在し,草地での利用はほとんど見られないことが明らかとなった。圃場試験においては,2地域において新規導入暖地型マメ科牧草の特性,根粒形成状況を調査,検討することができ,ほぼ計画通りに実施できた。菌根形成状況については,確認はできたが現在詳細な調査を実施中である。暖地型マメ科牧草の利用状況の把握調査では,関係者への聞き取り調査が実施でき,状況を把握できた。圃場試験においては,平成30年度に造成したマメ科草地の越冬性について検討する。また,2地域において生産性に一貫性が見られなかったことから,本年度においても同様の試験を行い,生産性,根粒形成,菌根形成状況,家畜飼料としての栄養成分の評価などから,南九州地域での栽培利用の有望な草種の選定を行う予定である。ポット試験において,暖地型マメ科牧草(圃場試験で供試した草種)を用い,牧草の生育状況を調査すると共に,根粒形成,菌根形成,植物体内窒素およびリン含量等について詳細な調査を行い,植物と根粒,菌根の関係{マメ科植物と根粒菌(共生関係),マメ科植物と菌根菌(共生関係),根粒菌と菌根菌(光合成産物の分配バランス,土壌養分の変動による影響)}について検討する。圃場試験においては,2地域において新規導入暖地型

マメ科牧草の特性,根粒形成状況を調査,検討することができ,ほぼ計画通りに実施できた。菌根形成状況については,確認はできたが現在詳細な調査を実施中である。暖地型マメ科牧草の利用状況の把握調査では,関係者への聞き取り調査が実施でき,状況を把握できた。圃場試験においては,平成30年度に造成したマメ科草地の越冬性について検討する。また,2地域において生産性に一貫性が見られなかったことから,本年度においても同様の試験を行い,生産性,根粒形成,菌根形成状況,家畜飼料としての栄養成分の評価などから,南九州地域での栽培利用の有望な草種の選定を行う予定である。ポット試験において,暖地型マメ科牧草(圃場試験で供試した草種)を用い,牧草の生育状況を調査すると共に,根粒形成,菌根形成,植物体内窒素およびリン含量等について詳細な調査を行い,植物と根粒,菌根の関係{マメ科植物と根粒菌(共生関係),マメ科植物と菌根菌(共生関係),根粒菌と菌根菌(光合成産物の分配バランス,土壌養分の変動による影響)}について検討する。一部の調査(菌根形成状況についての詳細な調査)を年度内に実施できなかったため,次年度に実施予定で,調査に必要な試薬や器具等を購入する予定である。
多様なピア・サポート実践の相互対照群モデルによる評価

子どもたちの支えあいを育むピア・サポート実践が、海外の実践を参考にしつつ日本国内でも工夫され多様化している。本研究では、多様なピア・サポート実践の評価において、それぞれの実践群が互いに他の実践の対照群となることによって、対照群を設定する労力やためらいを低減する目的で案出した「相互対照群モデル」による評価を行った。最終結果は未公開のためにここには提示しないが、ピア・サポートを含む最先端のいじめ対策である、フィンランドのキヴァ・プログラムの実践導入を行うなかで、実践上の検討事項を明確にし、評価項目も新たに作成した。研究2年目は、より高度な実践導入の準備、評価研究のためのプログラミング、及び成果発表を行った。<実践導入>昨年度よりピア実践導入の協働をしている小中学校において、実践に関する理論面での研修会を行い、萌芽的実践についての学会発表を支援した。そのうえで、実践の方向性を模索し、並行導入する複数のピア実践のなかのピア・サポート実践について、いじめ被害者への支援だけではなく、いじめの予防や緊急対処を含むキヴァ・プログラムを導入することにした。10月に国際専門家会議のために来日したフィンランドのサルミヴァッリ教授を実践者に紹介し、実践導入を検討した。その際にキヴァ・プログラムを道徳の授業に位置づけるアイディアがだされ、11月の道徳性発達実践学会では発案した実践者がキヴァ・プログラムと道徳の徳目の関連性に関する発表を行い、学会の大会賞を受賞した。その後、キヴァ・レッスンの日本語マニュアルの作成、導入する学校や時期に関する検討、キヴァ・ゲームの日本移植の可能性の検討等を行った。<評価研究のためのプログラミング>夏に欧州の大学を訪問して統計の専門家と情報交換した。さらに冬にはその専門家を招き、相互対照群モデルのデータ分析の検討と、Rによるプログラミングを行った。<成果発表>鳴門教育大学の山崎勝之教授、法政大学の渡辺弥生教授との共編著で、『世界の学校予防教育』(金子書房)を出版した。これは、北米、欧州、豪州、アジア諸国の学校予防教育について、それぞれの国の研究者と共同で実践やその背景の理論を論述した高度な学術書であり、研究にも実践にも貢献すると思われる。いじめ対策実践の基礎となるネットいじめ関係の共同研究もすすめ、海外の書籍での分担執筆、国際学会での発表などを行った。国際学会では、実践の文化間移植に関する理論的研究を行っているスウェーデンの研究者と出会い、情報交換を行った。最終年度は、6月にフィンランドのトゥルク大学のミイア・サイニオ博士を招聘し、寝屋川市の池田小学校にて、ピア・サポートの要素を含むキヴァ・プログラムの実践紹介及び教員対象のトレーニングを実施した。約10名の教員が参加し、その中の中心的なメンバーで日本版キヴァ・レッスンの試行を行うグループを結成し、数か月に1回の研修の機会をもつとともに、メーリングリストを用いての日常的な情報交換や相談が可能な仕組みを整えた。9月には、研究代表者がスイスで行われた学会に参加し、いじめに関する基礎研究の成果を発表するとともに、サルミヴァッリ教授らに実践導入の経緯を報告し、その後の方向性について話し合った。10月にはキヴァ・レッスンなどの試行を開始し、その段階での評価研究の成果は、11月中旬には岐阜県での研究会で発表し、さらに11月末に行われた日本道徳性発達実践学会において実践者とともに発表した。その後も、実践を継続しており、その経過を3月に研究分担者に提示し、詳細な検討を行った。その議論もふまえ、今後も評価研究を継続していく予定である。上記の内容の一部を、Facebookを用いて広く発信した。平成23年度は、ピア・チューター実践をたちあげるための共同体制作りと、実践で涵養することを目指す資質についての実践モデル図の検討を中心に行った。まず、日本ピア・サポート学会に参加し、多様な実践を行っている実践者や研究者と交流し、次に、学校教育相談の卓越した実践者に会って指導を受けるため、ピア・チューター実践を共同構築する実践者とともに出張した。10月31日、11月21日・28日、12月6日・27日、1月5日・31日、2月7日・17日、3月26日・27日と計11回、寝屋川市立中学校1校及び小学校2校で授業見学等を行い、ピア・チューター実践の萌芽を見いだし、それを内容と学年の組み合わせで整理し(アソート)、なかでも、「仲間プリント」(クラス全員が仲間のための作問をし、全員で解くという実践)の手法について予備的な調査と結果の検討を行った。その結果は、平成24年度に学会で発表する予定である。これで、ピア・サポート、ピア・メディエーション、ピア・チューターという3つの実践の試みが一つの地域でそろったため、翌年度からの実践評価に移ることができる。

また、現段階での成果としては、これまで実践支援をしてきた経緯もふまえ、日本のいじめとピア・サポート実践等に関するまとめを、オーストラリアで発刊された本の中に、分担執筆というかたちで紹介できた。現在、世界の予防教育と日本の予防教育について紹介と比較、そして展望を行う本を共同編集しており、その中においても、ピア・サポートの現状と課題について執筆し、平成24年度中の刊行を目指している。その際に、英国のピア・サポート実践者にも分担執筆を依頼し、その原稿も編集中である。さらに、旅費等は別の予算から支出したが、いじめ対策に関する国際学会での発表、フィンランドのいじめ予防プログラム実践校の見学等を行い、本研究の展開に資する情報を収集した。社会科学相互対照群モデルによるピア実践の評価研究という目的を達するための前提の実践導入に大きな労力をかけており、研究計画よりも進捗状況は遅れているが、当初の想定の範囲内である。むしろ、既存の実践ではなく、最先端の実践を導入することに主眼をおいており、もしもキヴァを日本に移植することができたら、いじめ対策に大きく貢献することができると思われるため、この方向ですすめていきたい。ピア・チューター実践の導入に予想以上の労力がかかったが、現場に過度の負担をかけないかたちでの共同構築ができている。ただし、鳥取や高知での実践の評価軸に関するインタビューを、新たにすることができなかったため、今までの資料を活用するとともに、平成24年度に繰り越すこととした。6月下旬にフィンランドの研究者を招いて実践導入を行う。複数の小学校の46の学級で、道徳の時間に位置づけての試行実践である。なるべく実践者の主体性を重んじるため、細かい部分ではもともとのキヴァの内容に固執することなく、日本版のキヴァを創り上げていくような方向で進めていきたい。相互対照群モデルによる評価研究を最優先にして、実践の導入を拙速にすることで、評価研究のための実践にならないように、また、実践に即して広く利用可能なように、簡便に作成できる質問紙フォーマットと、実践と評価の共同実施手順の明確化を行う。また、事前事後モデルで調査をする際に匿名性を維持するための工夫をする。そのことで、現場で、子どもにも実践者にも過度の負担をかけることのない相互対照群モデルによる実践のエビデンス検討ができるように貢献したい。これは、キヴァ・プログラムを含んで行う可能性もあるが、種類の異なるピア・チューター実践のみで行う方が現実的であると考えられるため、その方針で行う可能性もある。10月には昨年度も招聘した統計の専門家を招き、実践者との協働がより容易にできる実践評価のためのプログラミングを依頼する。英文でのいじめに関する本の執筆や、ネットいじめに関する紀要原稿の執筆、いじめ研究の展望やいじめ対策に関する原稿依頼を多数受けているので、それらを期限までに、最先端の知見を含むかたちで仕上げていく。そのためにも、9月に行われる欧州発達心理学会に参加して、最新の情報について交流するとともに、そこで、ネットいじめを含むネット問題全般に関するシンポジウムを行う。様々なピア実践が、単に学級内の関係性をよくするためのものではなく学校全体をよくすることは以前より目指されているが、さらにはネット社会というコミュニティにおける関係性の改善に寄与するように、新たな実践のあり方を構想する機会としたい。
皮質脳波信号処理に基づく運動・言語の脳-コンピュータインターフェイスの開発

脳-コンピュータインターフェイス(BCI)は意図的な脳活動を情報としてコンピュータでとらえるシステムを総称する。本研究では、脳神経外科患者の協力を得て、運動課題時(3種の手運動)と言語(3母音黙読)課題時の皮質脳波を入力とするBCIの開発研究を行った。その結果、運動企図に関しては、患者がどの様な運動を企図しているか運動前に、86.6±5.8%の確率で予測できた。さらに言語企図に関しては、チャンスレベル(33%)を大きく超える53-63%の判別性能を得た。本年度、機能的脳神経外科疾患、特に、軽度脳虚血、てんかん手術対象患者を対象に、脳機能と頭皮脳波、皮質脳波、MEG、PETの解析を行った。とくに、難治性てんかんや機能領域の脳腫瘍手術患者を対象に標準的治療の一環として、インフォームドコンセントのもと、開頭手術で硬膜下にグリッド電極を設置し、運動・言語課題遂行時の皮質脳波信号を収集した。まず、難治性てんかんを対象とした研究では、神経回路異常との関係を解明しうるベンゾジアゼピンレセプターの分布を画像化するイオマゼニールによるPET解析を行った。さらに、64チャンネルの多電極システムを用い、標本として摘出したヒトの海馬や脳皮質スライスを対象に、微細多電極刺激・誘発電位を解析し、細胞構築と神経ネットワークの病態相関の検討を始めた。まだ予備的な結果であるが、海馬において、大きな誘発電位を示す細胞集団を認め、これとてんかん源性との相関を解析している(一部は解剖学近畿地方会で発表)。ついで、循環予備能の低下として捉えられ、安静時には脳血流低下を示さない程度の軽度の脳虚血状態において、MEGを利用した運動野皮質律動(β帯域脱同期)の異常を検討した。これは、麻痺などの神経症状を来さない、いわゆるサブクリニカルな脳虚血といえるが、運動課題を遂行させると、運動野において同側脳賦活など、皮質律動異常が認められた。脳血管形成など脳血流を正常化させるとこれら皮質律動異常は正常化した。脳律動を解析することで、サブクリニカルな脳機能障害をも診断できる可能性を明らかにした。治療のため脳表電極を設置された脳神経外科患者の協力を得て、運動あるいは言語賦活時の皮質電気活動を計測し、これらをデコードして脳皮質信号から運動や言語の企図が解読できるか試みた。(1)治療のため脳表電極を設置された5人の脳神経外科患者の協力を得て、運動賦活時の皮質電気活動を計測した。その結果、1次運動野に設置されたある電極からの運動関連皮質電位(sMCP)変動が統計的にも有意差が確認され、運動種類の判定に最も適していることが判った。さらに、数学手法であるSupport Vector Machineを応用すると、運動前でも86.6±5.8%の確率で患者がどの様な運動を企図しているかが予想できた。とくに、1次運動野の皮質脳波を用いると、運動開始1000msec前にはチャンスレベルであった運動種類の予想結果の正しさが、運動前後100msecには最大に達することが確認出来た。今後、解析方法の精緻化を進めていきたい。(2)治療のため脳表電極を設置された1人の脳神経外科患者の協力を得て、単語黙読時の皮質電気活動を計測し,その単語の推定を行った.入力特徴別のSupport Vector Machine (SVM)による黙読単語推定結果.15Hz未満のパワースペクトラムを入力特徴とした時に,RBFカーネルを用いたSVMにより最高の推定性能を得た.この場合に系統的に選択されていた電極は,解剖学的にウェルニケ野,そして電気刺激実験による復唱障害および言語停止を含むかその近傍に存在した.わずか4電極で良いため,侵襲性の低い脳-コンピュータインターフェイス(BMI)の実現に期待できる.今後は,単語数を増加させる.今後、解析方法の精緻化を進めていきたい。1.ヒト運動関連野の皮質脳波解析治療のため脳表電極を設置された脳神経外科患者の協力を得て、運動賦活時の運動関連野皮質電気活動(ECoG)を計測した。とくに皮質電位に注目し、運動前後1000msecの脳皮質電位(sMCP)解析対象とした。親指運動、握手、肘屈曲の3種類の運動をしたとき、1次運動野に設置された電極からのsMCP変動が統計的にも有意差が確認され、運動種類の判定に最も適していることが判った。さらに、Support Vector Machine (SVM)という数学手法を応用すると、sMCP時間経過の解読で、実際の運動直前においても86.6±5.8%の確率で患者がどの様な運動を企図しているかが予想できた。2.ヒト言語関連野の皮質脳波解析本研究では,3母音の黙読タスクについて,黙読母音をオフラインでSVMにより判別した。タスクの全試行数が少ないため,全電極のデータを判別に用いると過学習を起こす。

そのため,電極一つずつの判別性能を評価し,カラーマップを作成した。その結果から,判別性能が高い電極の集団を選択し,それらの電極の全組み合わせにおける判別性能を改めて評価した。その結果、全被験者において,チャンスレベル(33%)を大きく超える、53-63%の判別性能を得た。ヒトの企図の発現では、比較的同期的な電気活動を行う広い範囲の皮質領域と、企図判別性能が高い狭い皮質領域の存在が明らかになった。これは、運動企図の解析では一次運動野に相当し、言語企図の推定では、複数の独立性の高い言語関連領域、すなわち、運動性言語領域、舌・口の一次運動野、感覚性言語領域である。ヒトの高次脳機能がいかに発現するかは不明な点が多く、本研究によってこれを解き明かす革新的な成果が得られた。
放射光解析物性に基づいた新規Hfベース高誘電率ゲート薄膜の探索

平成20年度は,ジメチルアルミニウムハイドライドと酸素を原料とする酸化アルミニウム薄膜形成について検討を深めた。まず,薄膜の屈折率,残存炭素濃度,界面酸化膜形成状況などから,最適な製膜条件を検討した。放射光分析を用いた解析により,酸化アルミニウム薄膜のエネルギーギャップと,伝導帯・価電子帯のバンドオフセットを評価したところ,エネルギーギャップは7.2eV,伝導帯オフセットは2.8eV,価電子帯オフセットは3.3eVと求まった。これらの値は既往の報告と一致するが,価電子帯オフセットのみ異なる。これは,今回作製した薄膜に,原料ガスに添加されているプロピルアミンより窒素が混入したためであると考えられる。この窒素の含有量を制御できれば,価電子帯オフセットも制御可能と思われ,残る研究期間内に検討を深める予定である。また,最適条件にて作製した酸化アルミニウム薄膜のCV/IV特性の評価を行った。作製直後の薄膜は,CV測定にヒステリシスが現れ,可動イオンが薄膜中に存在する可能性を示唆した。水素を含むフォーミングガス雰囲気下でのアニールと,酸化雰囲気下でのアニールを行い,電気特性の評価を行ったところ,フォーミングガスアニールにより,ヒステリシスの消失,リーク電流の大幅な低減が可能であることが分かった。酸化雰囲気下でのアニールもリーク電流低減などに効果的であったが,界面酸化層の形成による静電容量の低下,フラットバンド電圧のシフトなどが観測され,結果としてフォーミングガスアニールが,本酸化アルミニウム薄膜を改質するのに適したアニール手法であることが分かった。また,製膜方法として原料のパルス供給を行う手法も検討し,ヒステリシスの低減などに効果があることを確認した。今後,これらの検討結果をもとに,本手法による酸化アルミニウム薄膜の高誘電率ゲート絶縁膜としての応用を検討する予定である。本研究では、高誘電率絶縁膜を用いたMOSスタック構造の作製と放射光解析を用いた物性評価を行うこととしている。平成19年度は、下地への損傷が少なくゲート絶縁膜形成に適しているMOCVD法を用いて、Al_2O_3膜の形成を試みた。ここでは、ジメチルアルミニウムハイドライド(DMAH),(CH_3)_2AIHと酸素の組み合わせを反応系として選定した。Al_2O_3のMOCVD原料ガスとしては、トリメチルアルミニウム(TMA),(CH_3)_3Alを用いるのが一般的であるが、DMAHを用いると不均化反応によりメチル基をTMAの形で取り除くことができ、そのため、TMAを用いた場合と比較して、比較的弱い酸化雰囲気でも膜中取り込み炭素濃度を低減できる可能性がある。このことは、Siだけでなく、酸化に弱い高移動度半導体材料を用いたMOSFET合成にも長所となり得る。この効果を期待して、まずは膜中取り込み炭素濃度や屈折率と製膜条件との対応を検討した。その結果、酸素分圧5Torr程度、製膜温度300°C以上で膜中炭素濃度が1%以下、屈折率1.62程度のAl_2O_3膜を合成することができた。TMAを原料として用いた場合には、酸素を酸化剤として高純度のAl_2O_3膜を合成することは困難であることから、本反応スキームの有効性を確認することができた。また、膜厚23nmのAl_2O_3膜を作製し、Si基板との界面構造を高エネルギー研究所の高輝度放射光を用いた光電子スペクトル解析により検討したところ、SiO_2などの界面酸化物の形成は認められないことを確認した。また、バンドギャップ、バンドオフセットの評価、アニールによる界面構造変化なども併せて検討を行い、MOSスタック形成最適条件の検討を行っている。来年度も継続してこのような検討を行う予定である。
球脊髄性筋萎縮症特異的ｉＰＳ細胞を用いた病態解析

球脊髄性筋萎縮症の患者4名より疾患特異的iPS細胞を各患者につき複数クローンずつ樹立し、その品質評価を行った。続いて、効率的かつ迅速な運動ニューロンの分化誘導系を構築した。また、運動ニューロンに特異的に発現する遺伝子であるHB9のレポーターシステムを構築し、きわめて効率の高い運動ニューロンの標識および純化方法を構築した。また、hMyoD1遺伝子の導入により、効率の高い骨格筋の分化誘導系を構築した。次に、疾患特異的iPS細胞より運動ニューロンを誘導し、遺伝子発現を解析する事により、先行研究でも認められた、VEGFシグナルの異常が軽微ながら認められた。CGRP1の発現亢進とそれに伴うc-Junのリン酸化も観察され、初期の病態が再現出来たと考えられるが、発症の直接的な原因と考えられるアンドロゲン受容体の凝縮体形成やリガンド依存的な細胞死は観察出来なかった。これは先に見られた病態が、比較的初期の軽微な病態を反映しているためと考えられる。今後は薬剤によって加齢等による運動ニューロンへのストレスを再現し、より顕著な病態を観察する予定である。次に、運動ニューロンと骨格筋にそれぞれ生じる病態が協奏的に球脊髄性筋萎縮症の病態を形成する可能性を考え、運動ニューロンと骨格筋の共培養系を構築を試みた。先の方法によって誘導した運動ニューロンは骨格筋に対して投射する能力を持ち、蛇毒であるブンガロトキシンによって認識される機能的な神経筋接合を形成した。現在、神経近接合をリアルタイムにイメージングする手法を構築している。27年度が最終年度であるため、記入しない。4名のSBMA患者および3名の健常者よりiPS細胞を各被験者20-40クローン程度取得した。さらに、遺伝子発現、奇形種形成能、運動ニューロンへの分化能を指標に、各被験者3クローンを選択した。次に、2週間で、HB9, Isl-1およびchorine acetyltransferaseを発現する運動ニューロンを50%前後の効率で誘導する事が可能な培養系を構築した。また、HB9エンハンサーによって発現が制御されるVenusあるいはRFPを有するHB9レポーターを作成し、運動ニューロンを可視化した。次に病態解析を行った。SBMA特異的iPS細胞および健常者由来iPS細胞より運動ニューロンを誘導した。これをdihydrotestosterone (DHT)存在下あるいは非存在下で特定の期間、培養した。SBMA患者由来運動ニューロンでは、DHT存在下において細胞死のマーカーである活性型caspase3が発現している細胞が相対的に多く観察された。また、SBMA患者由来運動ニューロンではDHT存在下においてARの核内局在が亢進していることがわかった。続いて、遺伝子の発現量を定量的PCRによって定量した。この結果、TGFβreceptor2 (TβR2)に関しては、健常者の群でDHT依存的に発現量が上昇しているにもかかわらず、SBMA患者の群ではDHTをくわえてもTβR2の発現量が上昇しなかった。これは、これまでの研究で示されて来たARの毒性獲得のみがSBMAの発症に寄与するのではなく、ARの機能不全もSBMAの発症機序に関与している可能性を示す物である。上記に併せて、骨格筋分化誘導系を構築している。これまでに、様々な液性因子および低分子化合物を用いて検討を行い、GSK3β阻害剤を培地中に添加することで、沿軸中胚葉で発現する因子の発現量が増加することを明らかにした。4名のSBMA患者および3名の健常者より皮膚生検によって繊維芽細胞を取得した。これにエピゾーマルベクターを用いて細胞初期化因子群を強制発現し、iPS細胞を樹立し、胚性幹細胞に特異的な転写因子群を内在的に発現していること、奇形種を形成する能力があること、運動ニューロンへの分化能を持つことを指標にクローンを選択した。次に、ヒト多能性幹細胞より2週間という短期間で、HB9, Isl-1およびChATを発現する運動ニューロンを50%前後の効率で誘導する事が可能な培養系を構築した。この培養系によって取得できる運動ニューロンは、myotubeに投射して神経筋結合を形成した。また、HB9エンハンサーによって発現が制御されるVenusあるいはRFPを有するHB9レポーターを作成した。この系を用いて、SBMA特異的iPS細胞および健常者コントロールiPS細胞より運動ニューロンを誘導し、これをアンドロゲン受容体のリガンド存在下あるいは非存在下で培養した。この時、運動ニューロンの誘導効率は健常者と患者間で同様であった。次に、定量的PCRによって遺伝子発現を解析した。SBMA患者由来運動ニューロンでは、初期にCALCAの発現が抑制されるのに対して、後期ではCALCAの発現は逆に亢進した。また、CALCAの増加に伴ってJunのリン酸化が亢進した。このCALCAの発現異常が、初期では細胞増殖を阻害し、後期では細胞死を引き起こしていると考えられる。また、TGFβ受容体2や下流のKLF10の発現量は健常者でDHT依存的に増加するのに対して、患者ではDHTを加えても増加しないことがわかった。また、骨格筋特異的な転写因子であるMYODの強制発現、CHIR99021やFGF2の添加によって2週間程度で50%程度の純度の骨格筋をヒトES細胞および健常者iPS細胞より誘導した。

球脊髄性筋萎縮症の患者4名より疾患特異的iPS細胞を各患者につき複数クローンずつ樹立し、その品質評価を行った。続いて、効率的かつ迅速な運動ニューロンの分化誘導系を構築した。また、運動ニューロンに特異的に発現する遺伝子であるHB9のレポーターシステムを構築し、きわめて効率の高い運動ニューロンの標識および純化方法を構築した。また、hMyoD1遺伝子の導入により、効率の高い骨格筋の分化誘導系を構築した。次に、疾患特異的iPS細胞より運動ニューロンを誘導し、遺伝子発現を解析する事により、先行研究でも認められた、VEGFシグナルの異常が軽微ながら認められた。CGRP1の発現亢進とそれに伴うc-Junのリン酸化も観察され、初期の病態が再現出来たと考えられるが、発症の直接的な原因と考えられるアンドロゲン受容体の凝縮体形成やリガンド依存的な細胞死は観察出来なかった。これは先に見られた病態が、比較的初期の軽微な病態を反映しているためと考えられる。今後は薬剤によって加齢等による運動ニューロンへのストレスを再現し、より顕著な病態を観察する予定である。次に、運動ニューロンと骨格筋にそれぞれ生じる病態が協奏的に球脊髄性筋萎縮症の病態を形成する可能性を考え、運動ニューロンと骨格筋の共培養系を構築を試みた。先の方法によって誘導した運動ニューロンは骨格筋に対して投射する能力を持ち、蛇毒であるブンガロトキシンによって認識される機能的な神経筋接合を形成した。現在、神経近接合をリアルタイムにイメージングする手法を構築している。再現性と効率の高い骨格筋の誘導系および骨格筋の長期にわたる維持培養系の構築に一年以上の歳月を要した。また、CALCA遺伝子由来のmRNAは極めてコピー数が少なく、正確な定量PCRを行うためには、高感度な検出系を必要とした。これらの技術的な課題を解決するために、当初の想定よりも1-2年の歳月を多く要したため。27年度が最終年度であるため、記入しない。運動ニューロンの誘導系、骨格筋誘導系およびそれらの共培養系を構築し、EGFPを融合させたタンパク質の強制発現によって神経筋結合をリアルタイムに観察する系の構築を行い、一つ目の論文を作成する。さらに、運動ニューロンにおいて観察されたSBMAの病態を、SBMA患者由来骨格筋においても観察し、骨格筋単体の病態を明らかにする。神経筋結合部に関しては、SBMA患者での縮小が想定されるので、これを経時的に観察するとともに、神経筋結合部の形成を増強する因子であるDOK7の強制発現によって、その病態を緩和できることを確認する。当初の予定では、25年度の段階で既知の病態に基づく疾患の再現性の確認を行い、26年度に前治療薬の探索を行うはずであったが、病態の再現が遂行されなかった。また、ヒト多能性幹細胞からの骨格筋誘導法の確立を終えることができなかった。iPS細胞由来運動ニューロンを用いた病態解析では、病態を一部しか再現することができなかった。iPS細胞由来の組織は胎児の組織と似て若いと一般的にいわれていることから、late-onsetの病態を再現するには、運動ニューロンの成熟度が十分でなかったと考えられる。
多発性骨髄腫のサイトカインシグナル伝達におけるネガティブフォードバック機構の解析-SSI-1導入による遺伝子治療の試み-

IL-6は骨髄腫細胞の増殖因子であり、かつデキサメサゾンが誘導する骨髄腫細胞のアポトーシスを阻害する。STATs-inducedSTAT inhibitor-1(SSI-1)はIL-6刺激によりSTATlとSTAT3のリン酸化を介して誘導され、JAKに結合しJAKの機能を阻害してIL-6によるSTATlとSTAT3のリン酸化を抑制する、IL-6シグナルのネガティブフィードバック因子であり、多発性骨髄腫の病態に関与する可能性がある。そこで骨髄腫細胞株を用いてSSI-1の発現ならびにIL-6による発現の誘導の可否を検討し、SSI-1の発現異常の有無を検討した。実験に用いた6種類の骨髄腫細胞株(OCI-My5、RPM18226、U266、Hs、ARH77、IM9)のうち、OCI-My5、RPMI8226、U266ではIL-6の刺激後30分でSTAT-1とSTAT-3の一過性のチロシンリン酸化が誘導され、それに引き続き約60分をピークとするSSI-1の一過性の発現誘導が観察された。一方、Hs、ARH77、IM9の3株では無刺激の状態でもSSI-1は大量に発現されており、IL-6を用いた刺激を行っても発現量に変化はなかった。さらにこれらの細胞株ではSTAT-1とSTAT-3のチロシンリン酸化は認められなかった。そこでSTATlとSTAT3のリン酸化が生じSSI-1が誘導されるグループよりOCI-My5、STATリン酸化は生じず、SSI-1が恒常的に発現しているグループより,ARn77を用いSSI-1の遺伝子の強制発現ならびにSSI-1の遺伝子消去実験を行った。OCI-My5へのSSI-1導入によりIL-6によるSTAT-1とSTAT-3のリン酸化は抑制された。またARH77においてはSSI-1の消去によりIL-6によるSTAT-3のリン酸化が回復した。以上により、骨髄腫細胞株の一部にはSSI-1の恒常的発現があり、それがIL-6のシグナル阻害に関与していることを確認すると同時に、SSI-1遺伝子導入によるIL-6依存性骨髄腫の治療の可能性を明らかにした。
韓国・マレーシア・シンガポール戦後ニュータウンの各国固有文化を踏まえた再生手法

平成18年度:国内での研究作業、2006年11月の韓国調査、2007年1月のマレーシア/シンガポール調査、2月のマレーシア調査、平成19年度:国内でのインタビュー調査(2007年6月、12月)、分析作業、および、2007年9月-10月のマレーシア/シンガポール実地調査、9月の韓国実地調査により、下記の成果を得た。(1)ストック・フローの推移の把握:各国のストック・フローの状況を人口・世帯数の推移とともに整理した。(2)住宅政策の把握:(1)の状況を踏まえ、各国の住宅政策の特徴と成果を明らかにした。(3)課題・資源の抽出:対象国の行政・公的団体を対象としたインタビュー調査を行ない、ニュータウンに存在する問題点・課題・資源の概略の抽出を行なった。(4)ニュータウン・リストの作成及び調査対象の選定:韓国-ソウル、マレーシア-クアラルンプール(以下、KL)、シンガポールに第二次世界大戦以降、発生したニュータウンのリスト化及び分布マップの作成を行なった。(5)各年代の典型的住棟タイプ・住棟配置の整理:各国の年代毎の典型的な住棟タイプ・住棟配置を整理し、調査対象団地の選定・実地調査を行った。※本研究課題に対する国際研究組織:韓国(Yang博士、Jo博士;大韓住宅公社)、マレーシア(Mansor教授;国際イスラム大学、Nathan博士)、シンガポール(齋藤助教授;シンガポール大学)平成18年度:国内での研究作業、2006年11月の韓国調査、2007年1月のマレーシア/シンガポール調査、2月のマレーシア調査、平成19年度:国内でのインタビュー調査(2007年6月、12月)、分析作業、および、2007年9月-10月のマレーシア/シンガポール実地調査、9月の韓国実地調査により、下記の成果を得た。※本研究課題に対する国際研究組織:韓国(Yang博士、Jo博士;大韓住宅公社)、マレーシア(Mansor教授;国際イスラム大学、Nathan博士)、シンガポール(齋藤助教授;シンガポール大学)本研究の初年度である平成18年度は、国内での研究作業、および、2007年1月のマレーシア/シンガポール調査、2月のマレーシア調査により、下記の研究実績を得た。1国際研究組織の確立:韓国(Yang博士、Jo博士;大韓住宅公社)、マレーシア(Mansor教授;国際イスラム大学、Nathan博士)、シンガポール(齋藤助教授;シンガポール大学)との協同研究体制を確立し、3月のマレーシア調査時に構成メンバーによるミーティング・合同調査を実施した。更に、ニュータウンを管理する国家担当部局・自治体担当部局・公社公団などによる協力体制を整えた。2第二次世界大戦後の各国住宅政策と供給の変遷:各国の公的機関・有識者へのインタビュー調査、文献調査により第二次世界大戦後の各国住宅政策と供給の変遷を抽出・整理した。3ニュータウン・リスト/マップの作成:実地調査・文献調査を基に、各国のニュータウン・リスト/マップを作成し、平成19年度の詳細調査対象を抽出した。4各国ニュータウンの課題の抽出:実地調査、インタビュー調査により、各国ニュータウンの課題を抽出し、共通項目・個別項目について整理を行った。本研究の最終年度(2年度)である平成19年度は、国内でのインタビュー調査(2007年6月、12月)、分析作業、および、2007年9月-10月のマレーシア/シンガポール実地調査、9月の韓国実地調査により、下記の研究実績を得た。1国際研究組織の稼動:韓国(Yang博士、Jo博士;大韓住宅公社)、マレーシア(Mansor教授;国際イスラム大学、Nathan博士)、シンガポール(齋藤助教授;シンガポール大学)と平成19年度に確立した協同研究体制を基に、9月-10月のマレーシア・シンガポール調査時に構成メンバーによるミーティング・合同調査を実施した。各メンバーは、研究成果報告書への執筆を行っている。2各国ニュータウンのストック調査:19年度に作成した各国のニュータウン・リスト/マップを基に、典型的調査対象事例を抽出し、実地調査を元にして住宅地・住宅の形式・環境・維持保全状況を整理した。3居住環境評価:マレーシアでは、国際イスラム大学の教員・学生の協力を得て、居住環境評価に関するアンケート調査を行った。比較対象として、日本(名古屋市、多治見市)においても同様の内容のアンケート調査を行った。その他の各国については、文献より比較分析を行った。4各国ニュータウンの再生上の課題の抽出:実地調査、インタビュー調査、アンケート調査、ワークショップ(マレーシア、韓国)により、各国ニュータウンの再生上の課題を抽出し、共通項目・個別項目について整理を行った。
哺乳動物未受精卵に含まれる初期化因子の探索

前年度は,体細胞あるいはES細胞を除核未受精卵へ核移植後,胚盤胞への発生能を支持しなくなる卵細胞質を作り出す条件を検討した。今年度はその結果を参考に,発生を支持する能力を持つ卵細胞質と支持しない卵細胞質との間で2次元電気泳動等を行ない,両者間にタンパクレベルで差異があるかどうかを調べた。方法:MII期未受精卵に電気刺激等による活性化刺激を付与した卵子を集め,活性化刺激を付与していない卵子との間で2次元電気泳動による比較をおこなった。結果:両者の2次元電気泳動像を比較検討したところ,1カ所で著しい差異のあるスポットが見つかったので,スポットの差異に注目して詳細を検討した。その結果,それはヒトやマウス等で既知のタンパクであることが分かった。今後,そのタンパクの性質やそれが初期化に直接関与しているかをさらに詳細に検討する必要があると考えている。本研究では,哺乳動物の卵細胞質に含まれる初期化因子が,活性化刺激を付与後,どの程度保持されているのかを検討した。方法:(1)ウシMII期未受精卵に電気刺激による活性化刺激を付与し,その後,1から6時間目に体細胞を核移植し,胚盤胞への発生率を検討した。(2)マウスMII期未受精卵に活性化刺激を付与後,1から6時間目にES細胞を核移植し,胚盤胞への発生率を検討した。結果:(1)G0期のドナー細胞を用いた場合は,除核MII期卵子に活性化刺激後1時間目で胚盤胞への発生率は有為に低下した。それに対し,M期のドナー細胞を用いた場合は,活性化刺激後5時間目までは高率に胚盤胞へ発生し、6時間目で有為に低下した。(2)M期に同期化したES細胞を活性化した除核MII期卵子へ核移植したところ,2時間目までは高率に肺盤胞へ発生したが,3時間目以降では有為に低下した。以上の結果より以下のことが考えられる。G1期のドナー細胞を用いた場合に活性化刺激後1時間目で胚盤胞への発生率が低下したのは,卵細胞質中に含まれるMPFの活性が低下することにより,premature chromosome condensation (pec)が起こせなくなったためと考えられる。そしてMPFの活性が低下した卵細胞質にM期のドナー細胞を融合した場合は胚盤胞へ発生したことから,MPFは初期化因子として直接的に働いている因子ではない可能性が示唆された。現在,初期化因子を含むと考えられる卵細胞質と含まないと考えられる卵細胞質との間で2次元電気泳動を行ない,タンパクレベルでの検討を行なっている。マウスを用いた実験でも同様の検討をおこなう予定である。
神経細胞が細胞死を免れる機構の解明

マウスの全大脳半球培養の際に大量の神経細胞死が生じることを確認し、ある特定の培地成分の有無によって神経細胞死が大きく影響を受けることを発見した。この成分が神経細胞死を誘導する機構を検討し、分子的機序の一部を明らかにした。さらに、この成分による神経細胞死誘導を阻害できる薬剤を見出した。また、マウス胎生期に一過的に虚血にして神経細胞死等を誘導した際に発現が変動する分子群を同定し、変化の大きいシグナル経路を同定した。発生神経生物学
大脳棘シナプスと分泌現象の2光子顕微鏡による研究

光刺激法を中心とした2光子顕微鏡法の開拓を目的として、以下(1)(5)の研究を推進した。(1)光刺激によるシナプス可塑性誘発法の系統的開拓、(2)スパイン収縮・除去の分子基盤の可視化、(3)個体動物における光によるシナプス可塑性誘発法の開発、(4)精神障害モデル動物におけるスパイン運動異常の可視化の開発、(5)シナプス前終末・開口放出機構の可視化手法の開拓。このうち、(1)(3)の研究を特に中心的に推進し、多様な知見の蓄積を得た。(1)では、マクロアンケイジング法で多数のスパインを光刺激して収縮を誘発させる手法により、スパインの除去・新生を含む多様な可塑性を光刺激で誘発する技術をスライス標本で観察し、知見を蓄積した。これにより、スパイン収縮、除去および新生を自由に誘発する可能性を開拓した。(2)では、光で活性化する低分子量G蛋白質Rac(PA-Rac)等を用いて、スパイン収縮・除去の分子基盤の可視化を試み、知見を蓄積した。これにより、大筋解明されていないスパイン頭部収縮や除去を起こすカルシウム濃度分布を明らかにし、各可塑性の最適誘発条件を解明する可能性を開拓した。(3)では、スパイン頭部増大、収縮、除去、生成などの可塑性をin vivoで効率よく誘発し、定量化する手法に関する知見を蓄積した。これにより、大脳各領域や変異動物における可塑性の特徴を明らかにし、シナプス可塑性と神経細胞・個体機能への影響を解明する可能性を開拓した。以上のように、我々は、シナプス可塑性の網羅的解析および開口放出現象の独自な研究手法を継続して開発した。本研究の推進により、2光子励起顕微鏡の技術を一層増強・発展させ、この方法論の広い利用を通じて、医学・生物学分野に貢献する基盤を整えた。
種々リグノセルロースの水熱反応による脱リグニンのトポ化学

リグノセルロースを水熱処理することで、酸やアルカリ触媒を用いずに低分子化でき、有用ケミカルスとしての有効利用が期待される。その際のリグニン分解挙動の解明が本研究の主な目的である。本年度は、以下の3点について主に研究した。(1)トウモロコシ穂軸の各組織部の構造解析:樹木と分類学的位置付けが異なる被子植物単子葉類のトウモロコシの穂軸について、リグニンのトポ化学を明らかにするため、トウモロコシ穂軸を構成する三つの組織部(殻、木化環、髄)の構造解析及び組織観察を検討した。その結果、三つの組織部でリグニン基本骨格やケイ皮酸量が異なることが明らかにした。また、各組織部で構成細胞が異なり、リグニン濃度及びケイ皮酸の分布が細胞組織部位によって異なることも示唆された。(2)種々リグノセルロースの水熱処理で得られるリグニン由来分解物:分類学的位置付けが異なる5種類のリグノセルロース(裸子植物針葉樹:スギ木部、被子植物双子葉類広葉樹:ブナ木部、被子植物単子葉類:ニッパヤシ茎葉、稲わら、トウモロコシ穂軸に対して水熱処理(230°C/10MPa)した際のリグニン分解挙動を比較した。その結果、いずれも、エーテル結合の開裂によるリグニンの分解が示唆された。特に樹木に比べて単子葉類では脱リグニンが大きく進行しており、高分子リグニンが溶出していた。(3)ブナの超臨界メタノール処理による脱リグニンのトポ化学:昨年度検討した水やフェノールとの比較のため、ブナを超臨界メタノール処理(270°C/27MPa)し、脱リグニン挙動を検討した。その結果、リグニンが優先的に分解、溶出しており、木部繊維二次壁、道管二次壁、細胞間層のいずれの部位でも脱リグニンが大きく進行していた。一方で、柔細胞内腔に強い紫外線吸収を示す物質の生成が確認された。この生成物について、柔細胞内腔に特異的に分布する無機成分が影響していることが示唆された。29年度が最終年度であるため、記入しない。リグノセルロースを水熱処理することで、酸やアルカリ触媒を用いずに低分子化させることができ、有用ケミカルスとしての有効利用が期待される。本年度は、以下の3点について研究した。1)広葉樹のブナの水熱処理(230°C/10MPa/15分)により得られる水可溶部を、常温常圧のもと12時間静置すると、一部が凝集沈殿した。得られたこの沈殿物は、リグニンが90%を占めていたため、天然リグニンに類似の摩砕リグニンとの構造比較を行った。その結果、沈殿物リグニンは木部繊維二次壁リグニンの構造を比較的保持し、フェノール性水酸基やメトキシル基が多く、エーテル結合を有していることを明らかにした。2)針葉樹や広葉樹などの樹木と分類学的な位置付けが異なる被子植物単子葉類のトウモロコシの穂軸に対して水熱処理(230270°C/10MPa/60分)を施した結果、大部分(98.8%)が水可溶部として回収された。リグニンについても95.6%が可溶化し、同条件で処理したスギやブナに比べて可溶化が容易であることを明らかにした。3)水熱処理との比較のため、ブナを亜臨界フェノール処理(230°C/1.2MPa/30分)し、両者の脱リグニン挙動を比較した。その結果、水熱処理(230°C/2.9MPa/30分)では木部繊維二次壁からの脱リグニンが優先的に進行するが、細胞間層リグニンは耐性を示した。一方、亜臨界フェノール処理では二次壁からの脱リグニンは認められたものの、細胞間層からの脱リグニンも進行しており、溶媒による脱リグニン挙動にトポ化学的な相違が認められた。今後は、草本植物の稲わら及びトウモロコシ穂軸の水熱処理における脱リグニンのトポ化学の解明を進める予定である。本年度の主な目的は、木質バイオマスと細胞壁構成成分やリグニン構造が異なる草本植物を研究対象とし、稲わら及びトウモロコシ穂軸を水熱処理した際のリグニンの分解挙動を明らかにすることであったが、研究実績の概要で述べたように、草本植物は木質バイオマスより脱リグニンが容易であることを明らかにした。しかし、トウモロコシ穂軸のリグニン分布に関する研究自体が少なく、脱リグニンのトポ化学については、今後も引き続き検討していく。また、ブナの水熱処理で得られる沈殿物リグニンの構造解析から、その有効利用の可能性を提案することができた。さらに、異なる溶媒である亜臨界フェノール処理を用いた検討から、溶媒による脱リグニン挙動にトポ化学的な相違が認められることを明らかにした。以上の研究進捗状況を踏まえ、“おおむね順調に進展している"と判断した。

(1)トウモロコシ穂軸の各組織部の構造解析:樹木と分類学的位置付けが異なる被子植物単子葉類のトウモロコシの穂軸について、リグニンのトポ化学を明らかにするため、トウモロコシ穂軸を構成する三つの組織部(殻、木化環、髄)の構造解析及び組織観察を検討した。その結果、三つの組織部でリグニン基本骨格やケイ皮酸量が異なることが明らかにした。また、各組織部で構成細胞が異なり、リグニン濃度及びケイ皮酸の分布が細胞組織部位によって異なることも示唆された。(2)種々リグノセルロースの水熱処理で得られるリグニン由来分解物:分類学的位置付けが異なる5種類のリグノセルロース(裸子植物針葉樹:スギ木部、被子植物双子葉類広葉樹:ブナ木部、被子植物単子葉類:ニッパヤシ茎葉、稲わら、トウモロコシ穂軸に対して水熱処理(230°C/10MPa)した際のリグニン分解挙動を比較した。その結果、いずれも、エーテル結合の開裂によるリグニンの分解が示唆された。特に樹木に比べて単子葉類では脱リグニンが大きく進行しており、高分子リグニンが溶出していた。(3)ブナの超臨界メタノール処理による脱リグニンのトポ化学:昨年度検討した水やフェノールとの比較のため、ブナを超臨界メタノール処理(270°C/27MPa)し、脱リグニン挙動を検討した。その結果、リグニンが優先的に分解、溶出しており、木部繊維二次壁、道管二次壁、細胞間層のいずれの部位でも脱リグニンが大きく進行していた。一方で、柔細胞内腔に強い紫外線吸収を示す物質の生成が確認された。この生成物について、柔細胞内腔に特異的に分布する無機成分が影響していることが示唆された。草本植物の稲わら及びトウモロコシ穂軸の水熱処理による脱リグニンのトポ化学の解明を検討する。特に、トウモロコシ穂軸のリグニン分布に関する研究は少なく、トウモロコシ穂軸の各形態部位に注目した構造解析や顕微鏡観察により、リグニンのトポ化学を明らかにする。29年度が最終年度であるため、記入しない。
小児期拡張型心筋症および心筋緻密化障害の遺伝子解析〜細胞骨格関連遺伝子の関与〜

小児期発症の拡張型心筋症と心筋緻密化障害は予後不良であり、心移植の対象となる疾患であるが、我が国においては、その頻度、臨床像や遺伝学的な側面に関する系統だった検討はなされていない。我々は、本邦で初めて心筋緻密化障害の症例を報告し、さらに全国調査を行い、その臨床的特徴を報告した[Ichida, Am J Coll Cardiol 1999]。また、Barth症候群に見られるX染色体上の遺伝子異常(Xq28,G4.5)が乳児期発症心筋症にも認められ、Barth症候群の特徴を有しない場合も、乳児期発症の心筋症では、G4.5遺伝子異常を念頭に置く必要があることを強調した[Ichida, Circulation 2001]。本邦でも、Barth症候群の特徴を有しない孤立性心筋緻密化障害の1家系で、本邦では初めてG4.5遺伝子異常を報告した[Chen, Mol Genet Metab,2002]。今回の研究の目的は、これまでの研究をさらに発展させ、1)大規模な全国調査を行い、小児期発症の拡張型心筋症と心筋緻密化障害の頻度、遺伝的背景や臨床像を把握し、特にBarth症候群の特徴の有無に関しても検討を行った。2)承諾が得られた症例では、これまで検討を行ってきたG4.5遺伝子の他、細胞骨格蛋白関連遺伝子に着目し、dystrophin, sarcoglycan, DTNA, LDB3の遺伝子異常に関しスクリーニングを行い、これらの遺伝子の関与を明らかにすることである。その結果、遺伝子異常は、79例中6例(4家系例、2弧発例)に認められ、G4.5遺伝子異常2例、LDB3遺伝子異常3例、DTNA遺伝子異常1例であった[Xing, Mol Genet Metab,2006]。孤立性心筋緻密化障害の2家系4症例においては、わが国ではじめて、LDB3の遺伝子異常(1876G>A)を発見し、アミノ酸の変化(D626N)を確認した。この遺伝子変異は、LIM domainの機能を変化させ、protein kinaseCの親和性が亢進することが報告されている。他の弧発例では、LDB3の遺伝子変異(163G>A)がhomozygoteで認められ、アミノ酸の変化(V551I)が確認された。20例の家族歴を有する症例の検討では、優性遺伝形式をとる家系が多く、X連鎖性遺伝形式は5家系のみであった。心筋緻密化障害には遺伝的多様性があり、また同一家系内での臨床所見にも多様性があることが明らかになった。

我々は、本邦で初めて心筋緻密化障害の症例を報告し、さらに全国調査を行い、その臨床的特徴を報告した[Ichida, Am J Coll Cardiol 1999]。また、Barth症候群に見られるX染色体上の遺伝子異常(Xq28,G4.5)が乳児期発症心筋症にも認められ、Barth症候群の特徴を有しない場合も、乳児期発症の心筋症では、G4.5遺伝子異常を念頭に置く必要があることを強調した[Ichida, Circulation 2001]。本邦でも、Barth症候群の特徴を有しない孤立性心筋緻密化障害の1家系で、本邦では初めてG4.5遺伝子異常を報告した[Chen, Mol Genet Metab,2002]。今回の研究の目的は、これまでの研究をさらに発展させ、1)大規模な全国調査を行い、小児期発症の拡張型心筋症と心筋緻密化障害の頻度、遺伝的背景や臨床像を把握し、特にBarth症候群の特徴の有無に関しても検討を行った。2)承諾が得られた症例では、これまで検討を行ってきたG4.5遺伝子の他、細胞骨格蛋白関連遺伝子に着目し、dystrophin,sarcoglycan,DTNA,LDB3の遺伝子異常に関しスクリーニングを行い、これらの遺伝子の関与を明らかにすることである。その結果、遺伝子異常は、79例中6例(4家系例、2弧発例)に認められ、G4.5遺伝子異常2例、LDB3遺伝子異常3例、DTNA遺伝子異常1例であった[Xing, Mol Genet Metab,2006]。孤立性心筋緻密化障害の2家系4症例においては、わが国ではじめて、LDB3の遺伝子異常(1876G>A)を発見し、アミノ酸の変化(D626N)を確認した。この遺伝子変異は、LIM domainの機能を変化させ、protein kinase Cの親和性が亢進することが報告されている。他の弧発例では、LDB3の遺伝子変異(163G>A)がhomozygoteで認められ、アミノ酸の変化(V551I)が確認された。20例の家族歴を有する症例の検討では、優性遺伝形式をとる家系が多く、X連鎖性遺伝形式は5家系のみであった。心筋緻密化障害には遺伝的多様性があり、また同一家系内での臨床所見にも多様性があることが明らかになった。小児期発症の拡張型心筋症と心筋緻密化障害は予後不良であり、心移植の対象となる疾患であるが、我が国においては、その頻度、臨床像や遺伝学的な側面に関する系統だった検討はなされていない。本邦でも、Barth症候群の特徴を有しない孤立性心筋緻密化障害の1家系で、本邦では初めてG4.5遺伝子異常を報告した[Chen, Mol Genet Metab, 2002]。
機能性RNAを用いた制癌戦略

本研究は、タンパク質とRNAという異なる素材の生体高分子の間の「分子擬態」(研究分担者・中村ら発見)という概念と、研究代表者が既に実施しているタンパク質への特異的な結合性を付与するRNA分子(RNAアプタマー)を取得するSELEX法を組み合わせて、近年がんとの関連性が指摘されている翻訳開始因子(eukaryotic Initiation Factor、eIF)に特異的に結合し、がんの診断・治療に応用できる新規のRNA創薬を目指すものである。本年度の研究より、eIFをターゲットに、タンパク質精製→SELEX→アプタマーの取得→生化学的解析というラインを確立し、複数種類のRNAアプタマーを取得した。これらのアプタマーは標的タンパク質の機能を阻害し、in vitroでのタンパク質翻訳を阻害した。さらに、アプタマーをリポフェクション法で培養細胞に導入し、細胞内での翻訳阻害効果も確認する事ができた。また、アプタマーによる共沈実験により、培養細胞破砕液より標的タンパク質を特異的に検出できる事が分かった。さらにアプタマーと標的タンパク質の結合様式の解析結果から、RNAアプタマーはその配列全体でかなり広範囲の標的タンパク質の構造を認識している事が示唆されてきた。このことは、変異により構造変化を伴って疾病につながるような原因因子に対して、変異型と野生型のタンパク質を識別する事が可能なアプタマーを作製すれば、より副作用の少ない薬の開発につながると考える。以上より、本研究によりRNAアプタマーを用いた診断薬、治療薬の開発については、実用化の為に解決すべき問題は多いが、feasibility studyとして、その可能性を十分に示す事ができたと考える。
Kant's Religious Solution to Reason's Self-Subversion

3.その他、カント全集(ドイツ語原書)をはじめとする文献を購入したほか、初期投資としてノート型パソコンを購入し、研究準備を整えた。2015年度は、ドイツのCatholic University of Eichstätt-Ingoldstadtに客員研究員として所属し、カントの純粋理性批判を原書で精読するとともに、純粋理性批判に関する文献で、ドイツ語、フランス語、日本語、英語で出版されているものを読み込む。論文を23本執筆し、査読学術雑誌(カント研究におけるトップジャーナル)掲載を目指す。また、2015年度は以下の学会に出席する予定。本来は書籍購入代金で精算する予定であったが、打ち切りにするには額が大きかったため、次年度入金を待って精算することとした。上記のとおり書籍代に充当。