hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
思春期の心身の健康における胎児期から幼児期の環境要因と遺伝要因に関する研究

妊娠届出時から中学3年までの2464人の縦断データセットを構築し思春期の健康に関連する要因を分析した。主な成果は次の様である。1)乳児期から14歳までのBMIの軌跡群を同定した。2)妊娠中の喫煙は低出生体重と児の肥満のリスクであるが、妊娠初期までの禁煙は影響をなくす。3)3歳児の睡眠不足が思春期の肥満のリスクである。4)中学生の咬合不全の割合が44.9%であり、頭痛のリスクを38%増加させる。5)思春期兆候のタイミングが早いほど児ほど高血圧の家族歴がある。6)思春期のうつはやせ願望、起立性調節障害、ICT依存に関連している。また、地域と大学との包括的連携協定を結び本調査の事業化を確認した。胎児期から幼児期の環境要因と遺伝要因が思春期の心身の健康に及ぼす影響を明らかにするために、1987年から継続している地域での出生コホート研究の対象者の内、中学生に達した約2500名を対象として、胎児期(妊婦)から幼児期に収集した生活習慣や社会経済学的変数と思春期調査として収集する生活習慣と心身の健康状態をリンケージしたデータをマルチレベルモデルで解析することを目的とした。本年度は下記のことを実施し、成果を得た。1.胎児期から中学生までのデータリンケージを行った。その結果、約1600名のデータについて胎児期(母親のデータ)、乳児健診、1歳6カ月児健診、3歳児健診、5歳児健診のデータリンケージが可能であった。2.胎児期の妊婦の喫煙と思春期の低体重についてはこれまでの研究のように妊娠期の喫煙が思春期の肥満となっていた。また、男女差があることが明らかとなった。飲酒と思春期のうつとの関係をパールソン自己記入式抑うつ評価尺度(DSRS-C)を用いて解析し、妊娠中の少量の飲酒でも思春期にうつ傾向が表れる可能性を示唆した結果が出た。しかし、母親のうつの情報がないことは曝露およびアウトカム両方に影響を与えることが予想され、大きな限界となっており、結論を出すに至っていない。2.小学校4年生から6年生および中学生に対して思春期調査を例年に準じて実施した。現在解析中である。3.成人期のコホートの立ち上げの方法を検討した。対象者の卒業した中学校の同期会を通じて、研究への協力を要請を試みたが、十分な成果を上げるに至っていない。昨年に引き続き思春期調査を実施した。対象はK市の小学校4年生から中学校3年生全員の1924人である。調査票により、生活習慣、バールソン自記式抑うつ評価尺度などを測定し、学校健診で測定された身長、体重、歯科健診の結果をデータセットに加えた。このデータセットと妊娠期からの出生コホート研究のデータセットを連結させて、妊娠初期から中学校3年生までのデータセットを構築した。これを用いて特に思春期の成長について解析をした。思春期の身長の伸びのピークと性との関連をマルチレベル解析で明らかにした。男子より女子で思春期の早期に身長の伸びはピークに達することを明らかにした(Journal of Epidemiology 23(4):275-279. 2013)。また、過体重が思春期の早期に身長の伸びが止まり、非肥満児は思春期の遅い段階で肥満時の身長を超えることを明らかにした(Paediatric and Perinatal Epidemiology. 28(3), 263-269. 2014)。思春期のメンタルヘルスに与える影響としてはやせ願望や携帯電話、テレビゲーム、パソコン、メールなどのICT関連の利用状況と関連していることを明らかにした。ICT関連の利用時間と就寝時間が相関ていること、ICT関連の利用が一日2時間以上の者はそうでない者に比べて2倍程度うつ症状を持つ者の割合が高くなることを明らかにした。他に、うつ症状は起立性調節障害と強い関連があり、起立性調節障害のない者はうつ症状が2%であったが、起立性調節障害のある者はは25%にうつ症状がみられた。小学校4年生から中学校3年生全員(2059人)に対して思春期調査を実施した。生活習慣、パールソン自己記入式抑うつ評価尺度(DSRS-C)を自記式調査票により調査した。また、学校健診で測定された身長・体重および歯科検診の結果を入力した。これらを用いて、乳児期から14歳までのBMIの軌跡をトラジェクトリー解析を用いて解析した。その結果、男子で5群、女子で6群に分類できた。トラジェクトリーに関連する因子として妊娠中の母親の喫煙が明らかになった(PLoS One. 2012)。また、思春期の身長の伸びのピークと肥満との関連を個人の繰り返しデータを用いてマルチレベル解析で明らかにした(in press. Journal of Epidemiology)。妊娠中の喫煙とその子どもの肥満に関する解析では妊娠中の喫煙は特に幼児期の男児の肥満のリスクとして影響が強いことを明らかにした。また、思春期のうつがやせ願望や携帯電話等の使用状況と関連していることを明らかにした。思春期調査の実施および乳幼児健診からのデータの突合を行った。突合できたデータは1560であり、78%の突合率であった。これまでのデータの蓄積で、乳幼児健診から中学3年生までのデータセットは2520人となった。

思春期調査は生活習慣に加えて、うつのスケールやICT依存のスケールを内容として加えた。また、身体測定、う蝕の診察に加えて、不正咬合を歯科医師により調査した。このデータセットにより、妊婦の喫煙と子どもの成長の軌跡の関連を描き、喫煙していた妊婦から生まれた子どもが、非喫煙の妊婦から生まれた子どもに比べて、低出生体重の後、肥満傾向になることを明らかにした(PLoS One. 2015Feb 13;10(2):e0118538. doi: 10.1371)。また、妊婦の喫煙と子どもの成長に関わる要因について構造分析を行い、直接的要因、間接的要因を明らかにした(J Epidemiol. 2015;25(1):44-9)。さらに、中学生の不正咬合が頭痛の原因になっていることを明らかにした(Community Dent Oral Epidemiol. 2014Dec;42(6):572-80)。メンタルヘルスに関しては、中学生に関して、うつのスケールを用いて、ICT使用との関連、やせ願望との関連を分析した。その結果、やせ願望がうつの要因になっていること、ICTの使用による就寝時刻が遅くなることやうつの要因、起立性調節障害の原因となることを明らかにした。さらに、アウトリーチ活動として、対象地域で結果の報告を行ったり、広報に結果を連載した。対象地域での小学4年生から中学3年生を対象とした思春期調査を平成27度も実施した。本研究機関で毎年5回の調査を実施して、妊娠届出時、乳幼児健診のデータの突合を行って、2464人の本研究における最終データセットを構築した。成果は次の様である。まず、思春期兆候のタイミングが早い子どもほど高血圧の家族歴をもっていることを明らかにした。思春期兆候は身長の伸び速度で観測した。思春期兆候が早い子どものは遅い子どもに比べてオッズ比が1.52(95%信頼区間が1.04-2.24)であった(Pediatr Int. 2016Apr;58(4):284-9.)。また、児童生徒のスマホなどICTの利用状況について、ヤングのスケールを使って、依存レベルを測定し、それと生活習慣との関連を明らかにした。その結果、ICT依存傾向にある生徒は、生活習慣の乱れやBirlesonのスケールよって測定したうつ状態とに強く関連していた。さらに、本研究のデータセット構築やその活用について、対象自治体と大学との間で協定を結び、今後本研究をふくめ事業化することとなった。妊娠届出時から中学3年までの2464人の縦断データセットを構築し思春期の健康に関連する要因を分析した。主な成果は次の様である。1)乳児期から14歳までのBMIの軌跡群を同定した。2)妊娠中の喫煙は低出生体重と児の肥満のリスクであるが、妊娠初期までの禁煙は影響をなくす。3)3歳児の睡眠不足が思春期の肥満のリスクである。4)中学生の咬合不全の割合が44.9%であり、頭痛のリスクを38%増加させる。5)思春期兆候のタイミングが早いほど児ほど高血圧の家族歴がある。6)思春期のうつはやせ願望、起立性調節障害、ICT依存に関連している。また、地域と大学との包括的連携協定を結び本調査の事業化を確認した。2013年、2014年、2015年に5編の論文が国際雑誌に受理された。また、アウトリーチ活動として、結果の一部を市民フォーラムおよび広報により報告できた。27年度が最終年度であるため、記入しない。
墓の変化からみた現代人の死生観の展開

本年度の研究では、仙台市内における墓地状況の実態調査を中心に、そこから派生した問題に関する他地域での資料収集、そしてまた墓制研究の実態把握の意味からのデータベースづくりの三つの柱を立て、それら個別課題の成果を統合することで当初目的を達成するよう実施した。1)仙台市内の墓地状況の実態調査仙台市内の市営墓地と民営墓地、そしてまた寺院墓地・部落有墓地の典型的事例を青葉区と泉区の中から10カ所ほど集めて墓石調査を実施した。またさらに、キリスト教墓地も二カ所選んで墓石調査を行った。2)他地域での資料収集仙台市内の墓地調査を進める中から、特に「墓相」に基づく造墓行動が見られることに気づき、その点の資料収集のため、京都への出張を行った。また合祀墓の模索も行われていることから、横浜etc.の新たな合祀墓を進めている地域へ出向き、その資料を収集した。3)墓制関係文献データベースの作成墓制へのアプローチは、さまざまな領域からの学術研究のみならず、「お墓ウォッチング」的な関心からの、また実用書的なガイドとしての文献が数多く出版されている。今回はその両者をできる限り網羅すべく網を打ち、墓制に関する総合的な文献データベースを作成した。以上を通じた成果に関しては、現在岩田書院から単行本を発行する予定で準備を進めている。本研究に対する助成は「追加採択分」として配分されため、研究代表者が内定を知ったのは平成11年の10月下旬のことであった。そこで、年度内に研究を遂行するために残された5ヶ月間を、申請時の研究計画を多少変更して構成し直し、以下の四点から研究課題の遂行を目指した。(1)仙台市青葉区および泉区の寺院墓地・部落有墓地・個人有墓地での資料収集気候上、フィールドワークの困難な時期であったが、市内でも温暖な東部地区において三カ所の地域の調査を完了した。(2)資料のデータベース化(1)で収集した資料を、同時並行的にコンピュータに入力し、データベースの構築を計った。(3)移入墓石に関する実態調査仙台市へ移入された墓石に注目し、その理由等に関する詳細な資料収集のため、以前建てられていた地域、具体的には福島県只見町へ出向いて移入の背景になる情報を収集してきた。(4)他地域の墓制の情報収集仙台市の墓制の特徴を確定する意味から、他地域の典型的墓制の実態に関する情報収集を行った。具体的には、出雲平野の「屋敷墓」と、仙台伊達藩から分かれた宇和島藩の古刹を手がかりに、情報収集してきた。1仙台市内の墓地状況の実態調査仙台市内の市営墓地と民営墓地、そしてまた寺院墓地・部落有墓地の典型的事例を青葉区と泉区の中から10カ所ほど集めて墓石調査を実施した。2.他地域での資料収集仙台市内の墓地調査を進める中から、特に「墓相」に基づく造墓行動が見られることに気づき、その点の資料収集のため、京都への出張を行った。3.墓制関係文献データベースの作成墓制へのアプローチは、さまざまな領域からの学術研究のみならず、「お墓ウォッチング」的な関心からの、また実用書的なガイドとしての文献が数多く出版されている。
神経芽腫の発症・進展におけるDENND2Aの役割に関する研究

神経芽腫は小児における代表的な再発・難治がんで、高リスク群患者の長期生存率は未だ40%に満たない。神経芽腫の再発は、治療抵抗性がん幹細胞の再活性化と捉えられており、その制御に細胞内小胞輸送の制御分子であるDENNドメイン蛋白質が関わっていることを明らかにしてきた。本研究では、DENNドメイン蛋白質のメンバーとして同定したDENND2Aが活性化するRabファミリー低分子量G蛋白質のメンバーとしてRab9Bを同定し、DENND2A-Rab9B系が神経芽腫の発症・進展に関与することを見出した。神経芽腫は小児の代表的な難治性固形がんで、高リスク患者においては半数以上が再発し、長期生存率は40%に満たない。本研究では、再発の原因となり、治療抵抗性を示すがん幹細胞の増殖・分化における分子機構の解明を目的とし、細胞内小胞輸送の活性制御機構に注目した。申請者は、スフェアで著しく発現の変化するDENNドメイン蛋白質(DENN/RabGEFs)のメンバーであるDENND2Aが、神経芽腫の発症・進展に関与することを明らかにしてきた。そこで本研究では、DENND2Aによる神経芽腫の発症・進展の分子機構の解明を試みている。本年度は既にDENND2Aにより活性化されることが報告されているRabファミリー低分子量G蛋白質であるRab9Bについて、過剰発現細胞及び発現抑制細胞を用いてスフェア形成能を検討した。その結果、過剰発現細胞でスフェア形成能が低下し、発現抑制細胞でスフェア形成能が亢進することを明らかにした。また、神経芽腫患者データベースであるR2(http://r2.amc.nl)においても、Rab9B高発現の患者で全生存率が有意に高いことを確認した。これまで申請者らは、DENND2A、Rab9Bの過剰発現・発現抑制細胞においてコロニー形成能・腫瘍形成能が変化することを明らかにしており、これらの結果と合わせて、DENND2A, Rab9Bについて、その発現が神経芽腫の進展に関与することを明らかにした。またRab9Bについて、GTP結合型変異体・GDP結合型変異体を作成し、それらを過剰発現した神経芽腫細胞株を樹立した。現在これらの細胞株を用いて遺伝子発現解析を進めている。またその後、Rab9B以外にDENND2Aに結合する他のRabの有無を検索し、上流/下流シグナルを同定する。本研究はDENND2Aとそれに関連するRabファミリー低分子量G蛋白質に注目して神経芽腫の発症・進展の分子機構の解明を進めている。DENND2A・Rab9Bによる発生・分化の制御機構の解析をおおむね期待通りに出来ている。本研究では、再発の原因となり、化学療法に対して治療抵抗性を示すがん幹細胞の増殖・分化における分子機構の解明を目的とした。申請者は、神経芽腫においては治療標的となる遺伝子異常が他のがん種に比べて少ないことから、新たな治療標的の同定には新たなアプローチが必要であると考え、神経芽腫がん幹細胞の集合体であるスフェアと、通常の神経芽腫細胞の形態が大きく異なっていることから、神経芽腫がん幹細胞の発生・分化に細胞のダイナミックな変化を細胞内小胞輸送の活性制御機構に注目した。これまでに申請者は通常の神経芽腫細胞に対してスフェアで著しく発現の変化するDENNドメイン蛋白質(DENN/RabGEFs)のメンバーであるDENND2Aが、神経芽腫の発症・進展に関与することを明らかにしてきた。そこで本研究では、DENND2Aによる神経芽腫の発症・進展の分子機構の解明を試みた。本年度は、DENND2Aにより活性化されるRabファミリー低分子量G蛋白質であるRab9Bについて、過剰発現細胞でスフェア形成能が低下し、発現抑制細胞でスフェア形成能が亢進すること、神経芽腫患者データベースであるR2(http://r2.amc.nl)においても、Rab9B高発現の患者で全生存率が有意に高いことを見いだすことができた。引き続きDENND2Aによる神経芽腫がん幹細胞の発生・分化機構を明らかにするべく、上流/下流シグナルの同定と共に患者検体における発現・機能解析を進めていく。小児血液腫瘍学昨年度は予定していた実験を一部開始出来ず、一般試薬及び培養試薬の使用量が当初計画を若干下回ってしまった。次年度はDENND2Aの上流/下流シグナルの同定に尽力する予定である。
新規ロジウム(II)錯体を用いる高選択的炭素-炭素結合形成反応の開発

1.ロジウム(II)トリフェニルアセタート錯体(Rh_2(OCCPh_3)_4)はRh_2(OAc)_4等の既存のロジウム(II)錯体では実現できない選択性を示す。本錯体が示すメチレンC-H挿入への極めて高い選択性は、従来極めて困難な課題とされてきたビシクロ[3.3.0]オクタン及びビシクロ[4.3.0]ノナン骨格の位置及び立体選択的構築を可能にした。架橋配位子トリフェニルアセタートの嵩高さが選択性発現の要因と考えられる。また、本錯体は芳香環C-H挿入への極めて高い選択性を示し、各種2-インダノン誘導体の効果的合成法を提供した。2.ロジウム(II)N-フタロイル-(S)-フェニルアラニナ-ト錯体を触媒とするα-ジアゾ-β-ケトエステルの分子内不斉C-H挿入反応は、最高不斉収率80%eeでR配置の3位置換シクロペンタノン誘導体を与えた。なお、本反応のエチンチオ選択性は、架橋配位子の構造のみならずエステル部の立体的及び挿入部位置換基の電子的影響を強く受けることが判明している。また、本錯体を触媒とする芳香環C-H挿入反応を経るエナンチオトピックな二つのベンゼン環の識別を機軸とし、第四級不斉炭素をもつ(S)-1-エチル-1-フェニル-2-インダノン誘導体が最高不斉収率95%で得られた。3.ロジウム(II)N-フタロイル-(S)-アラニナ-ト錯体を用いるα-ジアゾアセトアミド誘導体の分子内C-H挿入反応によりカルバペネム合成の重要中間体2-アゼチジノンが最高不斉収率96%で得られることが判明した。ロジウム(II)トリフェニルアセタート錯体を合成し、本錯体存在下、種々の挿入部位(メチル、メチレン、メチンおよび芳香環C-H)あるいはオレフィンが共存する系での分子内C-H挿入反応を体系的に行なった。以下にその結果を示す。2.本錯体は芳香環C-H挿入への極めて高い選択性を示し(アルキルC-H挿入及びオレフィンへの付加環化に優先する)、各種2-インダノン誘導体の効果的合成法を提供する。ここで得られた結果は、現在殆ど解明されていない本反応の機構解明への手掛かりを与えるものである。また、芳香環C-H挿入反応がロジウムカルベノイドによる芳香環への付加環化を経て進行する機構を示唆する結果が得られている。従って、これらの成果は、本年度に予定している光学活性カルボン酸を架橋配位子とするキラルなロジウム(II)錯体を用いる不斉触媒反応開拓への妥当性を与えている。ロジウム(II)錯体の設計・合成に基づく反応の制御、さらに不斉触媒化を試み、精密合成への汎用性を高めることを目的とする。本年度は、特に分子内不斉C-H

挿入反応について検討した。以下にその成果を記す。1.ロジウム(II)N-フタロイル-(S)-フェニルアラニナ-ト錯体を触媒とするα-ジアゾ-β-ケトエステルの分子内不斉C-H挿入反応は、最高不斉収率80%eeでR配置の3位置換シクロペンタノン誘導体を与えた。なお、本反応のエチンチオ選択性は、架橋配位子の構造のみならずエステル部の立体的及び挿入部位置換基の電子的影響を強く受けることが判明している。2.ロジウム(II)N-フタロイル-(S)-フェニルアラニナ-ト錯体を触媒とする芳香環C-H挿入反応を経るエナンチオトピックな二つのベンゼン環の識別を機軸とし、第四級不斉炭素をもつ(S)-1-エチル-1-フェニル-2-インダノン誘導体が最高不斉収率95%で得られた。3.ロジウム(II)N-フタロイル-(S)-アラニナ-ト錯体を用いるα-ジアゾアセトアミド誘導体の分子内C-H挿入反応によりカルバペネム合成の重要中間体2-アゼチジノンが最高不斉収率96%で得られることが判明した。この結果は、触媒的不斉合成による各種β-ラクタム構築への新たな展開を示すものである。
広域分布種フタバカゲロウ類における特殊な発生システムの究明

昆虫類は種多様性が高く多様な形質をもつが,最重要形質と言える発生システムに関しては保存性が高い.多くの種は「卵生」であるが,「卵胎生」も一部の種群から知られる.一方,最も特殊化した「胎生」については,極めて僅かな種に知られるのみである.そのような中,フタバカゲロウCloeon dipterumは,これまで報告された「胎生」とは全く異なる新規の「胎生」システムをもつ可能性が高いことが明らかになっている。本研究では,組織化学的手法や全ゲノム解析を通じこの新規「胎生」システムの詳細を明らかにするとともに,近縁系統の発生システムとの比較を実施することで,発生システムの進化的背景を究明する。
化学計測用表面プラズモン光センサの研究

光励起表面プラズマ共鳴現象の観測を原理とし、光ファイバやマイクロレンズ等の微小光学素子とイメージセンサ等エレクトロニクスディバイスを用いた新しいタイプの化学センサを試作し、そのプロセス計測等への適用性を検討した。以下、具体的成果を列挙する。1.非駆動角度走査光学系の設計と検討:従来、表面プラズモンの観察は、プリズムに入射する光ビームの角度を回転機構によって変化させて行われていたが、本研究において、イメージセンサとフーリエ変換光学系により電子スキャン機構を3方式、開発し、それぞれを比較した。2.照明光源系の選択と設計:発光ダイオード、面発光ダイオード、半導体レーザを光源とした場合の、それぞれの、ワイドアングルの入射・照明光学系の設計を行ない、それぞれ試作した。3.多層膜の設計・試作:角度分解能を上げる目的に、銀薄膜とブリズム間に低屈折率誘電薄膜層を加えることを提案し、(Optics Letters投稿中)、実際に作成した案を用いた実験より、その有効性を確認した。また、サンブルと銀薄膜間に保護用薄膜を塗布することを提案し、実際に作成した。4.温度依存性の測定と補正法の検討:本センサは、サンプルの温度に強く影響を受けるため、温度補償機構を加える必要がある。本研究ではサーミスタ等を用いず、プラズモンセンシング自身で温度補正する方法を考案した。5.プロセス計測への広用実験:エタノール等のアルコールに含まれる微量水分の濃度測定を試み、実用的であることを確認した。6.コンパクトセンサの試作:75mm×35mmの大きさのセンサを実際に作成し、実験を行なった。
酸素感受性蛋白質の発見に向けて-プロテオミクス解析からのアプローチ-

【背景】動脈管は低酸素状態で開き,酸素分圧の上昇に反応して閉じる.その反応は成熟仔でより顕著である.一方,末梢肺動脈は酸素分圧の上昇に反応して拡張する.このように酸素分圧あるいは発達の違いにより酸素に対する反応が異なる.これまで研究では細胞膜のKチャネル,Caチャネル,細胞質の筋小胞体,筋原線維のCa感受性などの違いが論じられているが,プロテオミクス解析を応用した研究は十分なされているとは言えない.【目的】動脈管における酸素感受性に関わる蛋白質をプロテオミクスの手法により網羅的に探索し,同定された蛋白質の相対定量解析を行うことを目的とする.【方法】家兎の妊娠23日胎仔30匹(平均体重:11.9g),30日胎仔25匹(平均体重:49.4g)から動脈管組織を,生後2日新生仔7匹(平均体重:49.8g)から第3分枝以降の末梢肺動脈組織を取り出し,組織蛋白抽出試薬(PIERCE)を加えホモジェナイスし,10,000g×5分間遠心した後の上清を回収する,得られた蛋白質に対しiTRAQ 2D-LC-MS/MS法による質量分析を行った。【結果】同定された蛋白質総数は202であった.胎仔動脈管組織の発達による蛋白質発現の差(30日胎仔動脈管/23日胎仔動脈管)が2以上であった蛋白質が25種同定された.逆に,血管組織による蛋白質発現の差(生後2日新生仔末梢肺動脈/30日胎仔動脈管)が0.5以下であった蛋白質は23種同定された.このうち16種の蛋白質は共通した蛋白質であった.【まとめ】酸素感受性に関わる蛋白質の探索を目的に、プロテオミクス手法により検討した.成熟動脈管組織で多く発現し,末梢肺動脈組織で発現が少ない16種の蛋白質同定された.これらが酸素感受性蛋白質の今後の研究ターゲットとなる可能性があり,今後さらに詳細な検討を加えていく.【目的】動脈管における酸素感受性に関わる蛋白質をプロテオミクスの手法により網羅的に探索することを目的とする。【まとめ】酸素感受性に関わる蛋白質の探索を目的に、プロテオミクス手法により検討した。成熟動脈管組織で多く発現し,末梢肺動脈組織で発現が少ない16種の蛋白質同定された。この内イオンチャネルに関連のある蛋白質も含まれており、今後の研究ターゲットとしてさらに詳細な検討を加えていく予定である。【目的】動脈管における酸素感受性に関わる蛋白質をプロテオミクスの手法により網羅的に探索することを目的とする。【方法】本年度はプロテインチップ法により動脈管における酸素感受性蛋白質の検索を試みた。方法の概略は以下の通りである。家兎の妊娠23日胎仔、30日胎仔から動脈管(DA)組織を、生後2日新生仔から第3分枝以降の末梢肺動脈組織(PA)を取り出し組織蛋白抽出試薬(PIERCE)を加えホモジェナイスし、その後遠心を行い、上清を回収する。上清中を用いて、陰イオン交換Q10ならびに陽イオン交換CM10チップにより各検体の蛋白質の発現を比較検討した。【結果】動脈管で、低酸素条件と比較して高酸素条件で高発現していた蛋白質は、4268da、12223da、5595da、6067da近傍で見られた。また、末梢肺動脈と比較した場合、動脈管で高発現していた蛋白質は、8185da、10635da、12153da、12339da近傍で見られた。これらの値には発達に伴う変化も観察された。【まとめ】酸素感受性に関わる蛋白質の探索を目的に、本年度はプロテインチップ法によるアプローチを試みた。本年度の研究で末梢肺動脈と動脈管では蛋白質の発現においていくつか特定に蛋白質において発現の差を認めた。今回のデータを平成21年度に行ったiTRAQ 2D-LC-MS/MS法による質量分析の結果と照合し、今後酸素感受性蛋白質の同定を進めていく。特に、酸素感受性イオンチャネルの発見を中心に検討を行う。
糖鎖高分子を一成分とする両親媒性ブロック共重合体の合成と機能

本研究では、糖鎖高分子を一成分とする新しいタイプの両親媒性ブロックポリマーをリビングカチオン重合法を用いて合成し、その構造特性と機能特性との相関を明らかにすることを目的とした。具体的には、糖鎖ブロックポリマーの合成原理の確立並びに本法に適した開始剤系および糖含有モノマーの開発を行うと共に、得られたブロックポリマーの性質について検討し、下記の成果を得た。1.グルコースおよびグルコサミン残基をビニルエーテル(VE)モノマーを設計し、水酸基およびアミノ基を保護することによりリビングカチオン重合に成功した。種々の開始剤系を探索した結果、エーテル系保護基を持つVEにはHI/ZnI_2系が、エステル系保護基を持つVEにはTFA/EtAlCl_2系が適することが判明した。さらに、脱保護反応により側鎖にグルコースあるいはグルコサミン残基を有しかつ分子量や分子量分布が制御された新規糖鎖ポリマーの合成に成功した。2.構造の明確な一連のグルコース含有両親媒性ブロックポリマーを合成し、その薄膜の透過型電子顕微鏡(TEM)観察を行い、表面モルホロジーと分子構造(鎖長、組成比)との相関を明らかにすると共に、ポリマーの一次構造制御により表面モルホロジーが制御可能であることを示した。3.上記両親媒性ブロックポリマーが安定な水面単分子膜を形成し、繰り返し基板に累積可能であることを見出した。表面プラズモン解析およびTEM観察の結果、圧縮に伴い膜構造が変化すること、並びに、組成および疎水成分ホモポリマーの混合により膜構造が制御可能であることを示した。4.グルコース含有両親媒性ブロックコポリマーもキャスト膜の外部環境による変化を接触角測定により検討した結果、空気中では疎水性セグメントが、水中では親水性糖鎖セグメントが膜表面を覆っており、良好な環境応答性を示すことを明らかにした。本研究は、糖鎖高分子を一成分とする新しいタイプの両親媒性ブロックコポリマーをリビングカチオン重合法を用いて合成し、その構造特性と機能特性との相関を明らかにすることを目的とする。本年度は、上記の両親媒性糖鎖ブロックコポリマーの合成原理を確立すると共に本合成法に適用可能な開始剤系および糖鎖含有モノマーの開発を併せて行い、以下の成果を得た。1.,リビングカチオンブロック共重合により、構造の明確な一連のグルコース含有両親媒性ブロックコポリマーを合成した。さらに、透過型電子顕微鏡観察により、ポリマー薄膜の表面モルホロジーと分子構造(鎖長および組成比)との相関を明らかにすると共に、ポリマーの一次構造制御により表面モルホロジーが制御可能であることを示した。2.グルコサミン残基を側鎖に有するビニルエーテル(VE)モノマーを新たに設計し、そのリビングカチオン重合に成功した。さらに、生成ポリマーの脱保護反応により、側鎖にアミノ糖であるグルコサミンを有しかつ分子量や分子量分布が制御された新しい糖鎖ポリマーを得ることに成功した。3.エステル系保護基あるいはエーテル系保護基を有する2種類のグルコース含有VEのリビングカチオン重合を、種々の開始剤系を用いて検討した。重合のリビング性並びに実用的な観点から検討した結果、エーテル系保護基を持つVEのリビングカチオン重合にはHI/ZnI_2開始剤系が、他方エステル系保護基を有するVEの場合はCH_3CH(OiBu)OCOCF_3/EtAlCl_2/1,4-ジオキサン開始剤系がより適していることを明らかにした。今後は、両親媒性糖鎖ブロックポリマーの性質に焦点を当て、特にキャスト膜表面の環境応答挙動について詳細な検討を行うと共に、単分子膜の作製と機能特性についても検討を加える予定である。

本研究は、糖鎖高分子を一成分とする新しいタイプの両親媒性ブロックコポリマーをリビングカチオン重合法を用いて合成し、その構造特性と機能特性との相関を明らかにするいことを目的とする。本年度は、昨年度精密合成に成功した両親媒性糖鎖ブロックコポリマーの性質に焦点を当てて研究を行い、特にキャスト膜表面の環境応答挙動について詳細に検討するとともに、単分子膜の作成と機能特性についても検討を加えた。1.グルコース含有両親媒性ブロックコポリマーのキャスト膜の外部環境による変化を接触角測定により検討した結果、空気中では疎水性セグメントが、水中では親水性糖鎖セグメントが膜表面を覆っており、良好な環境応答性を示すことを明らかにした。2.リビングカチオン重合法を用いてほぼ同じ組成を有する構造の明確なグルコース含有両親媒性ブロックコポリマーおよびランダムコポリマーを合成し、セグメント配列やセグメント長の差異が凝集構造形成や環境応答性に及ぼす影響を明らかにした。3.グルコース含有両親媒性ブロックコポリマーが安定な水面単分子膜を形成し、繰り返し基板に累積可能であることを見いだした。表面プラズモン解析および透過型電子顕微鏡観察により、圧縮に伴い膜構造が変化すること、ならびに、ポリマーの1次構造(ブロック組成)および疎水成分ホモポリマーの混合により膜構造を制御可能であることを示した。4.昨年度新規に分子設計したグルコサミン残基を側鎖に有するビニリエーテルモノマーのリビングカチオンブロック共重合により、アミノ糖含有両親媒性ブロックコポリマーの合成に成功した。
金属/シリコン界面の伝導電子プロ-ブによるシリコン内部からのESR評価

アイオン注入によりシリコン表面層にドナ-をド-プし,このSi:P系のドナ-/伝導電子の電子スピン共鳴(ESR)測定を低温域で試み,まず基礎デ-タの集積を行った。次にSi:P系上に以下の金属及び半導体薄膜を形成し,ドナ-/伝導電子のスピン緩和の変化についてESRで調べ,界面の新しい評価法について検討を行った。(I)金属/シリコン界面。分子線エピタキシャル(MBE)法でGaを10層,Asを2層それぞれ付け,Ga/Si:P系とAs/Si:P系を作製し、更に真空蒸着法でAu及びSbを蒸着し、Au/Si:P系とSb/Si:P系を作製した。界面形成直後はスピン緩和の変化はなく,その後の熱処理により変化が観測された。(II)GaAs/シリコン界面。MBE法によって膜厚の異なる結晶GaAsとアモルファスGaAs層をつけGaAs/Si:P系を作製した。このESR測定からこの系では著しいスピン緩和の変化が起ること,膜厚が厚い程スピン緩和時間が短くなり,アモルファスGaAsの方が結晶GaAsよりスピン緩和時間を短くすることを明らかにした。以上の実験結果は(a)ドナ-/伝導電子の界面でのトンネリングの確率,(b)Si:P系上の薄膜構成元素との相互作用の強さ,及び(c)その薄膜に於けるドナ-/伝導電子の滞在時間割合の主に三つの物理量の変化によって説明される。これ等の変化より逆に界面についての知見を得ることが可能と考えられ,今後,一層定量的な解析を行う必要がある。本年度の研究の成果は,本手法により界面形成に伴ったスピン緩和の変化が検出されることを明らかにしたことである。
ニュージーランドにおける中生代および新生代の含放散虫岩の地質学的研究-とくに南半球高緯度帯放散虫の進化と変遷

放散虫化石群集から汎世界的な古海洋環境や古生物地理区を特定しようとするためには,高緯度帯や低緯度帯のエンドメンバーを示す放散虫群集の特性を明らかにすることが必須である.我々は中生代から新生代にかけての高緯度帯の放散虫化石群集の内容を明らかにすること,また古地磁気学的手法による古緯度の推定を行うことを目的として,現地調査および研究を行ってきた.平成78年度にかけて,三畳紀・ジュラ紀・白亜紀古第三紀を中心に下記の地域で調査研究を行っており,その研究結果の概要を報告する.(1)Mahinepua半島:層状チャートから珪質頁岩,泥岩を経て塊状砂岩に到る地層で,チャートは上部ペルム系から三畳系と推定さ,珪質頁岩の下部には中期三畳紀,珪質頁岩の上部からは後期三畳紀の高緯度型と考えられる放散虫群集がリン酸塩ノジュールから産出した.とくに南島のCaplesTarraneの中部三畳系から知られているpylomeを持つ高緯度帯に固有な種が,北島のWaipapa Terraneからも産出することが初めて明らかになった.(2)ArrowRocks島:熔岩,インターピロ-石灰岩,珪質擬灰岩・層状チャートから紫色緑色珪質頁岩に到る連続性の良い地層で,熔岩とインターピロ-石灰岩は上部ペルム系,層状チャートは上部ペルム系三畳系ではないかと考えている.現在,平成8年度1112月に採集した試料を分析中であり,詳細な年代と放散虫化石の群集特性に関するデータは今後得られる予定である.北西部海洋(Fossil Bay周辺):三畳系とジュラ系のユニットが,構造的に繰り返して露出していることが判明した.その一つは枕状熔岩,層状チャートから珪質頁岩に到る地層で,層状チャートの上部はジュラ系,下部の黒色チャートから保存良好なSpumellariaからなる放散虫群集が産出した.珪質頁岩からはジュラ系中部の高緯度帯型放散虫群集が多産することが明らかになった.また黒色チャートの古地磁気学的予察結果は高緯度を示すデータが得られている.もう一方のユニットは青灰色泥岩と灰色砂岩で構成され,リン酸塩ノジュールから後期三畳紀の放散虫群集が得られた.(1)上部Ururoan階の模式層であるUruroa層はシルト岩・砂岩互層からなり,中部にはDactylioceras bedを挟むことで知られている.このマーカー層から上位70mまでのシルト岩部には随所に径1-2cmの石灰質ノジュールが挟まれ,保存良好なジュラ紀中期の放散虫化石を多産する.コスモポリタンな高緯度型とは言い切れない群集組成の放散虫を産出する.(2)ジュラ系下部のRewarewa層,Arawhero層はシルト岩・砂岩・擬灰岩からなる地層で,径3-4cmの石灰質ノジュールを挟んでいる.擬灰岩層の古地磁気学的予察結果は比較的に高緯度を示すデータが得られている.ジュラ紀初期の放散虫化石群集組成はSpumellariaに属する種が優勢であり,Perispyriium属を多産する.Wairoa River河岸:三畳紀前期(アンモナイトによる)の珪質頁岩中のリン酸塩ノジュールから放散虫が産するが,形態的多様性が少なく群集組成の特性を明らかにするのは今後の課題である.5.北島のWairarapa地域上部白亜系古第三系の地層について,地質調査及び古生物学的調査を行った.放散虫化石層序を明らかにする目的で,テカウカポイント,フアトキトキ川,カイファタ川の3つのセクションにおいて詳細な柱状図を作成し,放散虫用試料と古地磁気測定用試料を多数採集した.放散虫化石群集から汎世界的な古海洋環境や古生物地理区を特定しようとするためには,高緯度帯や低緯度帯のエンドメンバーを示す放散虫群集の特性を明らかにすることが必須である.我々は中生代から新生代にかけての高緯度帯の放散虫化石群集の内容を明らかにすること,また古地磁気学的手法による古緯度の推定を行うことを目的として,現地調査および研究を行ってきた.平成78年度にかけて,三畳紀・ジュラ紀・白亜紀古第三紀を中心に下記の地域で調査研究を行っており,その研究結果の概要を報告する.(1)Mahinepua半島:層状チャートから珪質頁岩,泥岩を経て塊状砂岩に到る地層で,チャートは上部ペルム系から三畳系と推定さ,珪質頁岩の下部には中期三畳紀,珪質頁岩の上部からは後期三畳紀の高緯度型と考えられる放散虫群集がリン酸塩ノジュールから産出した.とくに南島のCaplesTarraneの中部三畳系から知られているpylomeを持つ高緯度帯に固有な種が,北島のWaipapa Terraneからも産出することが初めて明らかになった.(2)ArrowRocks島:熔岩,インターピロ-石灰岩,珪質擬灰岩・層状チャートから紫色緑色珪質頁岩に到る連続性の良い地層で,熔岩とインターピロ-石灰岩は上部ペルム系,層状チャートは上部ペルム系三畳系ではないかと考えている.現在,平成8年度1112月に採集した試料を分析中であり,詳細な年代と放散虫化石の群集特性に関するデータは今後得られる予定である.

北西部海洋(Fossil Bay周辺):三畳系とジュラ系のユニットが,構造的に繰り返して露出していることが判明した.その一つは枕状熔岩,層状チャートから珪質頁岩に到る地層で,層状チャートの上部はジュラ系,下部の黒色チャートから保存良好なSpumellariaからなる放散虫群集が産出した.珪質頁岩からはジュラ系中部の高緯度帯型放散虫群集が多産することが明らかになった.また黒色チャートの古地磁気学的予察結果は高緯度を示すデータが得られている.もう一方のユニットは青灰色泥岩と灰色砂岩で構成され,リン酸塩ノジュールから後期三畳紀の放散虫群集が得られた.(1)上部Ururoan階の模式層であるUruroa層はシルト岩・砂岩互層からなり,中部にはDactylioceras bedを挟むことで知られている.このマーカー層から上位70mまでのシルト岩部には随所に径1-2cmの石灰質ノジュールが挟まれ,保存良好なジュラ紀中期の放散虫化石を多産する.コスモポリタンな高緯度型とは言い切れない群集組成の放散虫を産出する.(2)ジュラ系下部のRewarewa層,Arawhero層はシルト岩・砂岩・擬灰岩からなる地層で,径3-4cmの石灰質ノジュールを挟んでいる.擬灰岩層の古地磁気学的予察結果は比較的に高緯度を示すデータが得られている.ジュラ紀初期の放散虫化石群集組成はSpumellariaに属する種が優勢であり,Perispyriium属を多産する.Wairoa River河岸:三畳紀前期(アンモナイトによる)の珪質頁岩中のリン酸塩ノジュールから放散虫が産するが,形態的多様性が少なく群集組成の特性を明らかにするのは今後の課題である.5.北島のWairarapa地域上部白亜系古第三系の地層について,地質調査及び古生物学的調査を行った.放散虫化石層序を明らかにする目的で,テカウカポイント,フアトキトキ川,カイファタ川の3つのセクションにおいて詳細な柱状図を作成し,放散虫用試料と古地磁気測定用試料を多数採集した.ニュージーランド北島及び南島において主として三畳紀からジュラ紀の含放散虫岩の地質調査を行った.1.北島のワイパパテレーンに属するワイヘケ島において,玄武岩から層状チャートを経て半遠洋性珪質泥岩へ至る層序断面の調査を行い,詳細な露頭スケッチと柱状図を作成すると共に放散虫試料を55個,古地磁気測定用試料を66個採集した.帰国後,微化石処理の予察結果では緑色珪質泥岩中に挟まれる黒色リン酸塩ノジュールからは保存良好な三畳紀後期の放散虫群集を産出することが明らかになっている.2.北島のワイパパテレーンに属するマヒネプア地域において,上部三畳系である珪質頁岩層から泥岩を経て塊状砂岩層へ漸移する地層について,擬灰岩鍵層を用いて詳細な柱状図を作成した.また放散虫分析用に試料を84個,古地磁気測定用試料を33個採集した.3.北島のムリヒクテレーンに属するカフィア地域に分布する三畳紀後期からジュラ紀中期の地層について,地質調査および古生物学的調査を行った.高精度の放散虫化石層序を明らかにする目的で,ジュラ紀初期のレワレワ層とジュラ紀中期のウルロア層について,詳細な柱状図を作成し細かい間隔で放散虫分析用試料を採集した.また同時に本地域の堆積岩の古地磁気層序を明らかにするため,ジュラ紀初期から中期にかけての各層から試料を計217試料採取した.4.放散虫に関する研究が欠落しているマイタイテレーンに属する南島テアナウ地域とネルソン地域に分布するペルム紀から三畳紀初期の地層について,予察的研究を行うため放散虫用試料と古地磁気測定用試料を多数採集した.とくにネルソン地域のワイロア川沿いの地層からは放散虫が産出することが判明した.
上皮間葉移行誘導の分子機構解析による上皮性卵巣がんの浸潤・転移の病態解明

上皮性卵巣がんは近年我が国で増加、毎年1万人が罹患、約6000人が死亡するにもかかわらず、過去20年間治療成績は向上せず、有効な検診制度も確立されていない。進行期上皮性卵巣がん1054例(漿液性腺がん)を用いて遺伝子発現プロファイルによる予後予測を実施、遺伝子発現と予後を比較した結果、抗原提供システムの低下が予後不良群の特徴として観察された。以上の結果は癌免疫療法に組織適合抗原の活性化が必須であることを示唆する。臨床進行期III,IV期上皮卵巣がん組織(漿液性腺がんに統一)の遺伝子発現プロファイル解析により、上皮間葉移行(Epithehal-Mesenchymaltransition : EMT)に関与しているZinc-finger型転写因子ZEB2の高発現と細胞間接着因子CDH1の発現低下が予後不良に強く相関している結果が得られた。平成21年度はこの結果の再現性を確認する目的でさらに症例を増やし、予後解析を実施した。多施設の協力により110例集積、遺伝子発現プロファイルにによる予後解析を行った。集積した症例は漿液性腺がんに統一、組織摘出前に抗がん化学療法を実施していない症例、および手術後の化学療法を同一のレジメン(シスプラチン+タキサン)を受けている症例に限走した。遺伝子発現解析を実施後、全ての遺伝子について単変量解析を実施、遺伝子発現量が無病生存率と有意に(p<0.01)相関する88遺伝子を分離、Ridege Regression Cox Modelによる個々の遺伝子の重み付けを推定、Prognosis Index(PI)を作成した。このPIの有用性を110例を用いて多変量解析により検証したところ、Hazard Ratio(HR)3.72、95%CI,2.66-5.43;p<0.0001で有意に予後と相関する事が示された。次いで同一のプロファイルを示す外部データ(Tothill et.al.Clin Cancer Res 14 : 5198-208, 2008)を用いた検証実験においてもHR,1.54,(95%CI1.20-1.98:p=0.0008)test setと同様の結果が得られた。臨床進行期III,IV期上皮卵巣がん組織(漿液性腺がんに統一)の遺伝子発現プロファイル解析により、予後予測インデックスが作成可能であった平成22年度はこの結果の再現性を確認する目的でさらに症例を増やし、285例で予後解析を実施した。集積した症例は漿液性腺がんに統一、組織摘出前に抗がん化学療法を実施していない症例、および手術後の化学療法を同一のレジメンを受けている症例に限定した。遺伝子発現解析を実施後、全ての遺伝子について単変量解析を実施、遺伝子発現量が無病生存率と有意に(p<0.01)相関する遺伝子群を分離Prognosis Index (PI)を作成した。このPIの有用性を285例を用いて多変量解析により検証したところ、Hazard Ratio及びp<0.0001で有意に予後と相関する事が示された。次いで同一の臨床情報を有する外部データThe Cancer Genome Atlas (TCGA)の卵巣癌症例500例を用いた検証実験においてもtest setと同様の結果が得られ、有用性が検証された。index内の遺伝子群のIPAパスウエー解析では、Src, MYC, EGFR, VEGFAのパスウエーが抽出されため、発現量と予後について解析した結果、層別化された予後不良症例の中でSrc, EGFR両遺伝子の高発現例が、低発現症例に比較して有意に早期再発を起こしていた。以上、予後不良群のなかで発現レベルの高いマーカーに対して分子標的薬の投与を行う可能性を示唆した。進行期卵巣がんの予後不良群に対して、分子生物学的な理解を通して、適切な分子標的薬を選択するアプローチが有効であると思われた。更に孤発性卵巣がん(漿液性腺がん)の構造多型(CNV)解析の結果、43例中9例でSrc遺伝子の増幅が観察され、構造多型と病態発現が相関している興味ある結果が得られた。目的:ハイグレード卵巣がんは予後不良といっても、様々であり全体の約40%弱の患者が5年生存、治癒する。進行期卵巣がん症例のなかから本当の予後不良群を選び出し、新規の治療戦略をたてるために、腫瘍組織の遺伝子解析の結果を踏まえて、予後予測モデルを作る事を目的とした。実験法:六つの異なる基盤上の1054症例を対象に解析した。まず、日本人の260例を対象に統計処理により予後予測モデルを作成、次にその有用性を他の5つの基盤上にある794例で検証した。次に、予後予測モデルで分けられた良好群、不良群の遺伝子の変化を解析した。更に、予後不良群腫瘍組織では、免疫応答とりわけ細胞障害性T細胞へ腫瘍抗原を提示する機能が極端に低下している事が認められた。結論;126

遺伝子による予後予測は画期的且つ信頼性の高いものであり、ハイグレード卵巣がんの中でも、とりわけ予後の悪い症例に対する新しい治療戦略の確立に有望と期待される。
間質性肺炎合併皮膚筋炎における疾患関連マーカー蛋白の定量プロテオミクスによる探索

本研究では定量プロテオミクスの手法を用い間質性肺炎合併皮膚筋炎の治療前後により変動する血清蛋白を同定した。治療によりCRP,C3などの炎症性蛋白が減少し、レチノール結合蛋白などの抗炎症性蛋白が増加した。さらに炎症とは直接関連がないVitronectinやXが変化することがわかり、疾患との関連性が示唆された。皮膚筋炎(DM)はゴットロン徴候やヘリオトロープ疹などの皮疹を特徴とする原因不明の炎症性疾患で、しばしば間質性肺炎(IP)を伴う。DMに伴うIPは臨床経過から急性/亜急性進行型(A/SIP)と慢性進行型に分けられ、特に前者のDM-A/SIPは予後が悪い。本研究では、近年確立された蛋白質・ペプチドを高感度に同定できるプロテオミクスの手法を用い、DM-A/SIP患者の血清から早期診断や病勢把握を評価できる新たなバイオマーカーを見出すことを目的とする。昨年度、治療前後のDM-IP患者血清検体を用い、治療による血清蛋白の変動を二次元電気泳動で確認した。その結果、複数個のスポットにおいて蛋白量が増加あるいは減少していた。これらの蛋白を同定するために発現量に差のあるスポットをゲルから切り出し、ゲル内でトリプシン消化しペプチドの抽出し質量分析(MS)を行い、蛋白の同定を試みた。CRPやα1ミクログロブリンなど炎症性蛋白を同定できたが、未同定の蛋白も残った。治療前後のDM-A/SIP患者血清検体を用い、治療による血清蛋白の変動を二次元電気泳動で確認した。これらの蛋白を同定するために発現量に差のあるスポットをゲルから切り出し、ゲル内でトリプシン消化しペプチドの抽出し質量分析(MS)を行い解析した。CRPやα1ミクログロブリンなど炎症性蛋白が増加し、抗炎症性蛋白が減少した。しかし、未同定の蛋白も残った。また、二次元電気泳動法を用いない安定同位体^<13>Cで標識された2-nitrobenzenesulfenyl chloride(NBS)試薬による定量プロテオミクス法により、量的および質的変動する血清タンパク質の同定を行った。二次元電気泳動法を用いた方法と同様に炎症蛋白は同定できたが、アルブミンなどの多量の蛋白が解析の障害となった。CRPやα1ミクログロブリンなど炎症性蛋白が増加し、抗炎症性蛋白が減少したが、未同定の蛋白も残った。二次元電気泳動法を用いた方法と同様に炎症蛋白・抗炎症性蛋白は同定できた。それら以外に、VitronectinやXなどの蛋白を同定した。これらの蛋白についてELISAなどの従来法で定量を確認し、疾患活動性指標として役立つことが明らかになった。
酵母リボゾームRNA遺伝子の増幅に寄与する組換えのホットスポットの検出

本研究は真核細胞に普遍的に増幅して存在するリボゾームRNA反復遺伝子(rDNA)の増幅メカニズムの解明を目的に行われた。一般的に遺伝子の増幅にはその遺伝子が染色体上に整然と並ぶための組み換えのホットスポットが必須と考えられる。そこで本申請研究ではそのホットスポットとして働いていると予想されるDNA複製阻害点に着目して研究を行った。DNA複製阻害点は35SrDNAの転写終結点近傍に存在する130bpからなる配列で、35SrDNAの転写と反対方向から来るDNA複製フォークの進行のみを阻害する。昨年度までの研究の成果として、野生株で約150コピー存在するrDNAを数コピーまで減らした株をいくつか作製し、それらの株のrDNAコピー数の増幅(回復)能力を検証し、rDNAが2コピーあれば増幅が可能であることを見出した。本年度はその2コピーのrDNAに相同組み換えを利用してDNA複製阻害点(2コピーのrDNAの中間に一つ存在)をマーカー遺伝子であるURA3に置換した株を作製し、そのrDNAの増幅能力を調べた。その結果、DNA複製阻害点を持つ2コピーのrDNAの株では、45世代の培養で約80コピーまでコピー数が増加したのに対し、DNA複製阻害点をURA3に置換した株では、同じ世代培養してもその増幅は10コピー以下にとどまった(投稿準備中)。また、対照実験として行ったDNA複製阻害点のすぐ横の35S側の130bpをURA3に置換した株においては、何も置換していない元の2コピーの株とほぼ同等なコピー数の回復が見られた。以上の結果から、確かにDNA複製阻害点はrDNA中で、おそらく組み換えのホットスポットとして働き、rDNAのコピー数の増加に寄与していると結論できる。出芽酵母には半数体あたり約150コピーのリボゾームRNA(rRNA)反復遺伝子が存在する。申請者らの最近の研究で、rRNA遺伝子間に存在するDNA複製阻害活性に必須なFob1遺伝子がそのコピー数の調節に関わっていることが判明した(Kobayashi et al.Genes &Development,1998)。そのことから推定される調節のメカニズムとしては、複製阻害の結果生じた複製中間体の露出した一本鎖DNA部分がヌクレアーゼ等により切られ、2本鎖切断を生じ、それがその前後に多数存在するrRNA遺伝子の相同部位と組み換えることによりコピー数の調節がなされると考えられる(Fork Block Dependent Recombination model)。このモデルを証明すべく、本申請研究ではコピー数の調節に必須な配列の決定をその目的に掲げた。本年度はその予備実験としてコピー数の増加に必要な最低コピー数を決定した。酵母野生株にハイグロマイシン耐性のrRNA遺伝子(Hyg^r-rDNA)を持つプラスミドを導入し、同薬剤を含む培地で選択すると、Hyg^r-rDNAは劣性の変異であるため、染色体上に存在する優性の野生型rDNA遺伝子(ハイグロマイシン非耐性)のコピー数の極端に減少した株(1-数10コピー)が多数単離されてきた。それらの株についてその減少したコピー数の回復能を調べた結果、rRNA遺伝子を1コピーしか持たない株は全く回復しなかったのに対し、2コピー以上持つものは全て回復した。このことから増幅には最低2コピー必要であると結論できた。来年度はこの2コピーのrRNA遺伝子にさまざまな欠損を導入し遺伝子増幅に必須な領域を決定する。
老年期の自律神経機能低下に及ぼす運動処方の効果に関する研究

基礎疾患及び運動習慣のない40歳から54歳の中年女性18名,55歳から65歳の高年女性18名を対象とした。それぞれを運動群9名及び対照群9名づつに分け,運動群には最大酸素摂取量の5060%の運動負荷を1日3060分間,週34回の頻度で15週間行わせた。運動期間の前後に,体重,BMI,水中体重法による体脂肪量,安静仰臥位及び立位1分後の血圧,心電図RR間隔変動,心拍数,呼吸数を測定した。対象の内,中年運動群8名(平均年齢48.8歳,平均BMI27.6),中年非運動群7名(平均年齢47.4歳,平均BMI26.8),55歳から65歳の高年運動群9名(平均年齢58.2歳,平均BMI26.8),高年非運動群8名(平均年齢60.3歳,平均BMI26.5)について運動期間前後の測定結果を得た。15週後のBMIは中年運動群で平均1.8,高年運動群で平均2.1有意に減少した。迷走神経心臓枝の活動を反映する安静時のRR間隔変動係数(CV)は,中年運動群で3.2%から4.8%へ増加したが,高年運動群では2.7%から2.9%への変化であり有意ではなかった。迷走神経心臓枝の活動をより鋭敏に反映する安静時の心拍変動スペクトルの0.150.50Hzの積分値(HF)は,運動前,中年運動群が157msec^2に対し,高年運動群では76msec^2と低く,加齢により迷走神経心臓枝の活動が低下することが推察された。安静時HFは15週後,中年運動群で461msec^2,高年運動群で179msec^2へと増加し,その増加量は,中年運動群の方が大きかった。運動処方は迷走神経心臓枝の活動を活性化させるがその効果は加齢により弱まることが明らかになった。また,立位負荷によるHFの抑制も運動継続後に大きくなる傾向にあったが,その抑制の度合も中年運動群の方が大きかった。立位負荷によるHFの抑制には交感神経活動も関与しているため,運動は,交感神経活動の活性化にも関与し,その影響も迷走神経心臓枝への影響と同様,加齢により減弱することが推察された。