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行為障害への記憶理論からの接近-習熟行為の解放・脱落および解放症状について-

ヒトの行為障害には、行為の解体症状である古典的な失行症の他に、解放症状として使用行動・模倣行動・道具の強迫的使用・他人の手徴候・鏡像運動、葛藤症状として拮抗失行、脱落症状として運動無視などがある。とりわけ道具の強迫的使用は前頭葉内側面病巣+脳梁膝部病巣と、運動無視症状は前頭葉内側面病巣との関連が重視されている。今年度は物品使用動作に焦点をあてて、実使用時の動作障害、物品を実際には持たずに動作のみを行うパントマイム時の障害、ならびに左手の運動無視を検討し、以下のように説明できることを示した(中川ら,1997)。1)補足運動野が障害された場合は、自発的ないし自動的に運動記憶が引き出せない状態となり、対側の手に運動無視の症状がみられるが、外界からの刺激が入ると運動前野から運動記憶が取り出され運動は円滑に行なわれる。2)左半球内側面に加え、脳梁膝部に病巣が生じると、右半球からの抑制がきかない状態となり、外界からの刺激に対して運動前野が自動的、無意識的に左中心回にある運動記憶を解発し、利き手である右手で学習したまとまった運動が解放され、道具の強迫的使用現象として現れる。3)この補足運動野と運動前野という異なる運動解発系の存在から、失行症における習熟行為、すなわち手続記憶の取り出しに関する自動性-意図性の解離という現象が理解できた。さらに本年度は予備的研究として健常被験者を対象に、視覚刺激による物品の命名・指示課題や道具使用動作中のPETによるfunctional studyを行い、課題の性質による脳の賦活部位に関する検証を試みている。
X線・化学発光ビデオ顕微鏡の開発と生体微小域動態分析

1.化学発光ビデオ顕微鏡の開発フォトンカウンティングビデオカメラを市販顕微鏡の観察部に装着することにより、生体中の成分変化を化学発光像として捉えることに成功した。ビデオ検出の良さは、時間変化をリアルタイムに追跡できることにあり、動態分析としして、また顕微鏡による微小域分析法として大変有用なものであることが分かった。2.化学発光ビデオ顕微分析法の応用白血球の一種、好中球が、貪食作用の際、殺菌のため発生する活性酸素の検出に、本手法を適用、その発生点、時間、そしてその量の評価、および、これらの時間経過の追跡に成功した。同時に、その形態変化を明視野微分干渉顕微鏡像として捉え、また細胞内Caイオン濃度の変化を蛍光像としして捉えることにも成功し、これらの関連づけから、顆粒のはじけの位置、量の時間経過を明確にし、それが今まで言われてきたCaイオン濃度の立ち上がりとは直接関係がないことも明確にし、本手法の有用性を示すことに成功した。3.X線発光の検討シンクロトロン放射光を利用して、強力X線による、物質中の発光を、フォトンカウンティングカメラで捉えた。X線発光は、有機溶媒中では強いが、生体の存在する水系では著しく弱められることが分かった。これより、X線発光が環境プローブとして用いられる可能性が生まれてきた。4.本システムの他分野への応用本システムが、分離分析におけるカラム内での物質の分離過程の追跡に適用できることが分かった。その結果、いままで想像の世界でしかすぎなかった分離過程の様々な側面が明確になり、今後の物質分離の基本理念を構築するのに、大きく役立ちそうである。この様に、本手法開発が、これからの、生体微小域分析のみならず広い分野で極めて有効に利用できうる見通しが立った。1.シンクロトロン放射X線誘起発光現象の検出シンクロトロン放射X線誘起発光現象の至適化を図る為、様々な溶液系で発光の測定できるセルを作り、それをフォトマルチプライヤーを介した、フォトンカウンティングで測定できるようにした。有機溶媒は、比較的高い発光を示すが、水溶液は余り強い発光を示さず、溶媒の電子供与性がこの発光効率に大きく関与しているのではないかと思われた。限られたマシンタイムであったので、金属配位子を変えるなどの実験ができなかったが、今後水溶液系での発光の高効率化が鍵を握っていると考えられる。2.X線・化学発光ビデオ顕微鏡およびシステム開発倒立顕微鏡をベースにX線・化学発光ビデオ顕微鏡の開発を進めた。まず、検出カメラとして、冷却CCDカメラでは、リアルタイムの測定ができないので、イメージインテンシファイヤーが2段に入ったフォトンカウンティングカメラを用いる事にした。これを現有のビデオプロセッサーで画像処理し、さらにこのプロセッサーで積算取り込みも出来るようシステムを構築した。これを好中球の活性酸素発生の測定に応用した所、その発生部位のリアルタイム検出が、検出感度30amolという超微量な活性酸素量で測定可能となった。3.細胞の挙動解析法の開発外的刺激に対し、細胞の応答としての形態変化は様々で、その解析法は今まで余り開発されていなかった。我々はそれを画面上でトレースし、その経時変化を追跡し、行動の統計的時間変化を明確にした。1.化学発光ビデオ顕微鏡の改良昨年度までに開発した顕微鏡に、今年はさらに改良を加え、微分干渉像や蛍光像が、簡便に切り替え測定できるようにした。これにより、発光部位の同定が、簡単に追跡できるようになった。また、本顕微鏡は、蛍光と微分干渉観察が同時に行えるようにも改良したため、観察の幅が大きく広がった。2.化学発光ビデオ顕微分析法の応用白血球の一種、好中球が、貧食作用の際、殺菌のため顆粒を弾けさせる。

このメカニズムが何によるかを明確にするため、細胞骨格系形成阻害剤の共存下での動態の比較を、顆粒の動きの軌跡、弾けの数と時期の解析を行い、新しい知見も得た。また細胞内Caイオン濃度の変化を蛍光像として捉え、これらの関連づけから、顆粒のはじけが今まで言われてきたCaイオン濃度の立ち上がりとは直接関係がないことも明確にし、本手法の有用性を示すことが出来た。3.X線発光の検討シンクロトロン放射光を利用して、強力X線による、物質中の発光を、フォトンカウンターおよびフォトンカウンティングカメラで捉えた。X線発光は、有機溶媒中では強いが、生体の存在する水系では著しく弱められることが分かった。これより、X線発光が環境プローブとして用いられる可能性が生まれてきた。4.本システムの他分野への応用本システムが、分離分析におけるカラム内での物質の分離過程の追跡に適用できることが分かった。その結果、いままで想像の世界でしかすぎなかった分離過程の様々な側面が明確になり、今後の物質分離の基本理念を構築するのに、今後大きく役立ちそうである。この様に、本手法開発が、これからの、生体微小域分析のみならず広い分野で極めて有効に利用できうる見通しが立った。
転写因子とDNA損傷応答因子による心不全の分子機構解明と治療応用

心臓は負荷に対する適応として心筋リモデリングを生ずる。すでに多くの心肥大誘導因子が知られているが、心不全に至る適応破綻の機構は十分に解明されていない。我々はこれまでに心筋間質細胞の転写因子KLF5が負荷適応に重要であり、KLF5のアセチル化はin vitroで細胞増殖に関わることを示してきた。本研究では、KLF5分子のアセチル化とKLF5の相互作用因子であるDNA修復因子(ATM、H2AX等)に着目し、個体レベルで心臓の適応と破綻における役割を明らかにする。さらにこれらと相互作用する因子を単離することにより、新しい治療標的を同定する。本研究ではKLF5のアセチル化の病態における意義をin vivoで明らかにする。我々はKLF5のアセチル化されるリジン残基をアルギニンに置換したコンディショナルノックインマウス(K369R)を作成した。このマウスはin vivoでKLF5の非アセチル化変異を生ずることが可能である。KLF5のアセチル化の病態意義をin vivoで明らかにする目的で、圧負荷心肥大モデルによる心臓の負荷応答を検討した。本研究を通して、ATMがドキソルビシン心筋症の発症に重要であり、特に、心筋間質細胞のATMが重要な役割を果たすことを示した。最近、KLF5の新規抑制薬が合成されたため、圧負荷心肥大モデルマウスに投与したところ、心不全を予防ないし治療する薬理効果を認めた。これらの結果から、複数の心肥大モデルマウスを用いて、心臓の負荷適応と破綻にKLF5のアセチル化とDNA修復因子が関与することが明らかとなった。また、それらのシグナルの特異的な阻害薬が心不全発症を防止し、心不全を改善する可能性を有することが明らかになった。KLF5アセチル化はKLF5の転写活性を亢進し、細胞増殖に寄与することが細胞レベル(in vitro)で明らかになったが、個体(in vivo)における役割については不明である。このマウスは組織特異的Creマウスと交配することにより、心筋細胞や線維芽細胞等の特定の組織に特異的にKLF5の非アセチル化変異を生ずることが可能である。すでに心筋細胞(αMHC)と線維芽細胞(Periostin)特異的Creマウスも準備できている。平成27年度は、これらの交配により全身ないし、心筋細胞、線維芽細胞特異的KLF5の非アセチル化変異マウスの作成を進めた。今後はそれらのマウスを用いて圧負荷心肥大モデルと心筋梗塞後心不全モデルを作成し、KLF5アセチル化の有無による心臓の負荷応答の相違を明らかにする予定である。現在までは当初計画通り進行している。平成27年度は、ATMがドキソルビシン心筋症の発症に重要であり、特に、心筋間質細胞のATMが重要な役割を果たすことを示した(Cariovasc Res. 2016)。平成28年度は、前年度に引き続き、これらのマウスの交配により全身ないし、心筋細胞、線維芽細胞特異的KLF5の非アセチル化変異マウスの作成を進めた。

すでに多くの心肥大誘導因子が知られているが、心不全に至る適応破綻の機構は十分に解明されていない。我々はこれまでに心筋間質細胞の転写因子KLF5が負荷適応に重要であり、KLF5のアセチル化はin vitroで細胞増殖に関わることを示してきた。本研究では、KLF5分子のアセチル化とKLF5の相互作用因子であるDNA修復因子(ATM、H2AX等)に着目し、個体レベルで心臓の適応と破綻における役割を明らかにする。さらにこれらと相互作用する因子を単離することにより、新しい治療標的を同定する。本研究ではKLF5のアセチル化の病態における意義をin vivoで明らかにする。我々はKLF5のアセチル化されるリジン残基をアルギニンに置換したコンディショナルノックインマウス(K369R)を作成した。このマウスは組織特異的Creマウスと交配することにより、心筋細胞や線維芽細胞等の特定の組織に特異的にKLF5の非アセチル化変異を生ずることが可能である。本研究では心筋細胞(αMHC)と線維芽細胞(Periostin)特異的Creマウスを作成した。平成27年度は、ATMがドキソルビシン心筋症の発症に重要であり、特に、心筋間質細胞のATMが重要な役割を果たすことを示した(Cariovasc Res. 2016)。平成28年度は、前年度に引き続き、これら心筋細胞と線維芽細胞特異的KLF5の非アセチル化変異マウスの交配の作成を進めた。平成29年度は、KLF5のアセチル化の病態意義をin vivoで明らかにする目的で、圧負荷心肥大モデルによる心臓の負荷応答を実験していた。最近、KLF5の新規抑制薬が合成されたため、そのモデルに投与したところ薬理効果を認めた。このため、この薬効評価を追加実験で行うことにした。当初計画より時間を要するが、本補助事業の目的をより精緻に達成することが可能となる。本研究ではKLF5のアセチル化の病態意義をin vivoで明らかにする目的で、圧負荷心肥大モデルによる心臓の負荷応答を実験していた。心臓は負荷に対する適応として心筋リモデリングを生ずる。
CXCR4拮抗剤を基盤とする新規二価結合型癌転移抑制剤の開発

申請者は、昨年度までにCXCR4のリガンドであるFC131をポリプロリンリンカーで架橋した二価結合型リガンドががん細胞選択的な作用を示すことを細胞実験レベルで明らかにしている。そこで、最終年度は生体内における二価型リガンドの有効性を評価するため、がん細胞選択的な作用を示した二価結合型リガンドに近赤外蛍光団を導入した新規リガンドの開発を行なった。近赤外蛍光団はその吸収及び励起波長が600-800nmである蛍光団を指し、この領域の波長の光は生体内の水や有機分子の吸収を受けないため、生体を非侵襲的にイメージングすることが可能である。様々な近赤外蛍光団が報告されているが、申請者はその蛍光特性及び合成の簡便さからCy7誘導体を選択した。まず、申請者は二価結合型リガンドと合成したCy7誘導体とのコンジュゲート反応に関して、種々の検討を行なった。具体的には、1)カルボジイミド系縮合剤を用いたアミド化反応、2)ヒドロキシアミン-ケトン間におけるオキシム形成化反応、3)アジド-アルキン間におけるHuisgen反応の3種の反応について検討した。その結果、アミド化及びオキシム化反応では二価結合型リガンドのラベル化が困難であったのに対し、Cu触媒を用いたHuisgen反応においては非常に良好な収率で目的物が得られることが明らかとなった。しかしながら、得られた二価結合型リガンドの傾向特性を評価したところ、リガンドの蛍光の減少が観測された。これは、近赤外蛍光団がリガンド分子によってクエンチされることによって起こる現象であると考えられる。本研究の成果は、未だ実用化されていないがん細胞イメージングツールの開発に有用な知見を与えるものであると考えられる。当初の計画では、ヘテロなリガンドを組み合わせた二価型リガンドを用いた癌転移抑制剤の開発であったが、CXCR4ホモダイマーを標的とした本二価型リガンドにおいても十分に選択的かつ強力な癌転移抑制剤となりうることが本研究の成果から明らかになった。このことから、本来の研究目的である「がん細胞選択的な新規リガンドの開発」は概ね達成されていると考えられる。更に、申請者は本研究を通じて、二価結合型リガンドを用いたがん細胞の非侵襲的な可視化の可能性も見出している。本年度の研究成果から得られた問題点として、二価型リガンド及び近赤外蛍光団との相互作用によって、その蛍光強度が減少することが挙げられる。そのため、今後は導入する近赤外蛍光団の検討が必要であると考えられる。また、本研究においては合成の簡便さ及び結合活性の強度から環状ペプチドFC131を用いたが、ペプチドを構成するアミノ酸の一部(Tyr,Met)には蛍光団を消光する作用があることが知られているため、リガンドの検討も合わせて行う予定である。本申請内容において、申請者はCXCR4リガンドとインテグリンα_vβ_3リガンドのハイブリッド分子の創製を提案した。しかしながら、ハイブリッド分子の合成は困難であるため、まず申請者は癌細胞表面に過剰発現しているCXCR4二量体を標的としたホモ二価結合型リガンドを創製し、それらを用いて実際に二価型リガンドが受容体の発現数に応じた細胞の認識するのかどうかを検討した。CXCR4を含む多くのGPCRは構造が明らかでないため、二量体構造に対して適切なリガンド間の距離を保つ二価結合型リガンドの理論的な構築は困難であった。そこで、CXCR4結合リガンドである環状ペンタペプチド(FC131)を堅固な構造を有するポリプロリンリンカーで架橋した二価結合型FC131誘導体を設計・合成した。ポリプロリンリンカーの長さは一定に保たれているため、適切なリガンド間距離の場合に結合親和性の増大がみられると考えられた。CXCR4結合活性を評価した結果、リガンド間距離が5.5-6.5nmの場合に二価型結合形成による相乗的な結合活性の上昇が見られた。この結果に基づき、高い結合活性が得られた二価型リガンドを用いて細胞上のCXCR4に対する認識活性を評価した。これらの結果より、二価結合型リガンドのCXCR4高発現細胞に対する認識活性の高さが示された。さらに、フローサイトメトリーを用いた解析から、二価結合型リガンドは天然の状態でCXCR4を高発現している白血病細胞由来のJurkat細胞においても高い認識能を示すことが明らかとなった。本研究成果は、二価型リガンドががん細胞特異的な作用を示すがん転移抑制剤となりうることを示唆しており、今後の創薬研究において非常に有用な知見を示すものである。本申請内容において、申請者はCXCR4リガンドとインテグリンα_v β_3リガンドのハーイブリッド分子の創製を提案した.しかしながら、ハイブリッド分子の合成は困難であるため、まず申請者は癌細胞表面に過剰発現しているCXCR4二量体を標的としたホモ二価結合型リガンドを創製し、それらを用いて実際に二価型リガンドが受容体の発現数に応じた細胞を認識するのかどうかを検討した、CXCR4を含む多くのGPCRは構造が明らかでないため、二量体構造に対して適切なリガンド間の距離を保つ二価結合型リガンドの理論的な構築は困難であった。

そこで、CXCR4結合リガンドである環状ペンタペプチド(FC131)を堅固な構造を有するポリプロリンリンカーで架橋した二価結合型FC131誘導体を設計・合成した,ポリプロリンリンカーの長さは一定に保たれているため、適切なリガンド間距離の場合に結合親和性の増大がみられると考えられた。CXCR4結合活性を評価した結果、リガンド間距離が55-6.5nmの場合に二価型結合形成による相乗的な結合活性の上昇が見られた。この結果に基づき、高い結合活性が得られた二価型リガンドを用いて細胞上のCXCR4に対する認識活性を評価した.これらの結果より、二価結合型リガンドのCXCR4高発現細胞に対する認識活性の高さが示された。さらに、CXCR4発現量の異なる3種の細胞におけるフローサイトメトリーを用いた解析から、二価結合型リガンドはCXCR4発現量依存的に細胞を認識することが明らかとなった。そこで、蛍光基修飾型二価結合型リガンドのがん細胞選択的な作用を評価するため、正常細胞であるHUVEC及び肺がん細胞A549を用いたイメージング実験を行った。その結果、二価型リガンドはがん細胞選択的な認識を示した.現在、二価型リガンドの生体内での実用を目指し、近赤外蛍光基を付与した二価結合型リガンドを作成中である。申請者は、昨年度までにCXCR4のリガンドであるFC131をポリプロリンリンカーで架橋した二価結合型リガンドががん細胞選択的な作用を示すことを細胞実験レベルで明らかにしている。そこで、最終年度は生体内における二価型リガンドの有効性を評価するため、がん細胞選択的な作用を示した二価結合型リガンドに近赤外蛍光団を導入した新規リガンドの開発を行なった。近赤外蛍光団はその吸収及び励起波長が600-800nmである蛍光団を指し、この領域の波長の光は生体内の水や有機分子の吸収を受けないため、生体を非侵襲的にイメージングすることが可能である。様々な近赤外蛍光団が報告されているが、申請者はその蛍光特性及び合成の簡便さからCy7誘導体を選択した。まず、申請者は二価結合型リガンドと合成したCy7誘導体とのコンジュゲート反応に関して、種々の検討を行なった。具体的には、1)カルボジイミド系縮合剤を用いたアミド化反応、2)ヒドロキシアミン-ケトン間におけるオキシム形成化反応、3)アジド-アルキン間におけるHuisgen反応の3種の反応について検討した。その結果、アミド化及びオキシム化反応では二価結合型リガンドのラベル化が困難であったのに対し、Cu触媒を用いたHuisgen反応においては非常に良好な収率で目的物が得られることが明らかとなった。しかしながら、得られた二価結合型リガンドの傾向特性を評価したところ、リガンドの蛍光の減少が観測された。これは、近赤外蛍光団がリガンド分子によってクエンチされることによって起こる現象であると考えられる。本研究の成果は、未だ実用化されていないがん細胞イメージングツールの開発に有用な知見を与えるものであると考えられる。当初の計画では、ヘテロなリガンドを組み合わせた二価型リガンドを用いた癌転移抑制剤の開発であったが、CXCR4ホモダイマーを標的とした本二価型リガンドにおいても十分に選択的かつ強力な癌転移抑制剤となりうることが本研究の成果から明らかになった。このことから、本来の研究目的である「がん細胞選択的な新規リガンドの開発」は概ね達成されていると考えられる。更に、申請者は本研究を通じて、二価結合型リガンドを用いたがん細胞の非侵襲的な可視化の可能性も見出している。本年度の研究成果から得られた問題点として、二価型リガンド及び近赤外蛍光団との相互作用によって、その蛍光強度が減少することが挙げられる。
遺伝子工学的手法による脳機能の可視化

記憶、学習、情動などの脳の高次機能では、遺伝子の発現調節が、重要な役割を果たしている。神経細胞における遺伝子の発現変化を、遺伝子工学的手法を用いて可視化することを試みた。さまざまな脳機能に伴って誘導されることの知られている遺伝子、c-fos、Arc、zif268のプロモーターを用いて、これらの遺伝子の転写調節の変化を高感度でモニタリングできる系の開発を行った。これらのプロモーターにレポーターとして、短時間半減期型のルシフェラーゼ(ルシフェラーゼに蛋白分解促進配列やmRNA分解促進配列を付け、ダイナミックな反応性を示すように改良したもの)をつないだコンストラクトを作成した。これらのコンストラクトを、初代培養したラット海馬神経細胞に導入し、発光を経時的に観測することで転写レベルの変化をリアルタイムに観察できる系を開発した。また、記憶、学習に重要なNMDA受容体やMAPキナーゼの活性化に対応して反応することが知られている、serum response elementの配列に、短時間半減期型のルシフェラーゼをつないだコンストラクトも作成し、NMDA受容体やMAPキナーゼの活性化をモニターできる系も開発した。まだ、これらの系に、テトラサイクリンによる誘導システム(Tet-On)を組み合わせることで、発光強度を増幅する改良も行った。さらに、発光するのに基質を必要とするルシフェラーゼに代えて、短時間半減期型の蛍光蛋白YFPを用い、基質無しでモニターできる系も開発した。本研究では、記憶、学習、情動などの脳の高次機能と密接に関係した遺伝子の発現変化を、遺伝子工学的手を用いて可視化することを試みた。さまざまな脳機能に伴って誘導されることの知られている、c-fos遺伝子のプロモーターに、螢の発光酵素であるルシフェラーゼをつないだトランスジェニックマウスを作成した。複数のラインが得られており、今後は発光による遺伝子のリアルタイム・モニタリングを試みる予定である。また、記憶、学習に際して誘導されることの知られている、Arc遺伝子のプロモーターもBACクローンより単離し、ルシフェラーゼ遺伝子とつないだコンストラクトを作成した。これらを用いて、神経細胞における、遺伝子の転写レベルでのダイナミックな変化をリアルタイムに観測できる系の確立を目指している。Arc遺伝子のmRNAは、活性化されたシナプスへと運ばれることが知られている。この特性を利用し、シナプスの活性化に伴うmRNAの局在変化の可視化を試みた。ラットArcの全長cDNAを単離し、分散培養した海馬の神経細胞にリン酸カルシウム経で導入した。NMDAを投与して、シナプスを活性化し、導入したArc cDNA由来のmRNAが神経細胞内でどのような局在変化を示すか解析を行った。活性化されたシナプスへの選択的輸送に必要なArc mRNA内のシグナルを同定中である。神経細胞同士がつながり形成される回路レベルでの変化を観察するため、経シナプス性に神経細胞間を輸送されることの知られている、小麦胚芽レクチン,.テタヌストキシンHcフラグメントのcDNAを遺伝子工学を用いて修飾し、可視化のための新たなツールを作成した。
電子書籍を利用した新しい語彙学習の検証：付随的学習と意図的学習の融合

電子書籍を用いた読解活動を通して語彙を効果的に増やす方法について検証した。読む楽しさを阻害しない形で語彙に注意を向け(付随的語彙学習)、読解後に気になった単語を再度確認(意図的語彙学習)できるプログラムをMoodle上に構築した。いくつかの実験を通して効果を検証し、その結果を国内(全国英語教育学会)・海外(英国Swansea大学語彙研究会)における学会で発表、ならびに結果をまとめたものを論文(熊本県立大学研究科論集、CALICO)として発表した。また、平成26年度にも国内(JALT語彙研究会)・海外(AILA2014)の学会で発表することになっている。H24年度は読解プログラムのプロトタイプの作成を行った。二つの方法で作成を試みた。一つはGoogle App Engineを利用し、オンライン辞書と連携する方法である。もう一つは本研究で必要な機能をMoodleに追加する方法である。検討重ねた結果、H24年度は後者を採択した。Moodleを利用した読解プログラムを開発し、Moodleに存在するGlossary(注)の機能を活用し、テキストに出現する難解語にGlossaryを追加した。注を追加した語彙はテキスト中でハイライトされ学習者の注意が向きやすいようになっていた。Moodleプログラミングの専門家の支援を受け開発した、次のような機能を追加した。すなわち、読解後に、テキスト中で検索した語彙が一覧として表示され、学習者はクリックするだけで、その語彙の意味を確認することができる機能である。読解後に意図的な語彙復習の機会を、各学習者の語彙検索に合わせた形で提供するプログラムである。H24年度の前半では、このプログラムの開発を受けてパイロットスタディを実施した。大学生4名、大学院生4名を対象にプログラムを使用し、操作性、効率性、学習効果について意見を聞き、それに基づきプログラムに修正を加え、プロトタイプを完成させた。H24年度の後半では、大学生約40名を対象に付随的学習に意図的な学習を追加する効果について実験を行った。2段階の実験を実施し、最初に意図的な学習を追加する効果について、追加するグループと追加しないグループを比較し検証を行った。次の段階では、プロトタイプを使用して個人の検索情報に基づいた意図的な学習を行うことの効果について、検証した。読解中に検索した単語の中で、最後の確認作業を行ったものとそうでないものを比較し検証する。これまでのプログラム開発と効果の検証について、南フロリダ大学の専門家と意見交換を行った。H25年度はH24年度に作成した読解プログラムとその効果について検証した。H24年度後半に実施した実験の結果をまとめそれを基に検証した。読解プログラムについては引き続きMoodleを基盤としたプログラムを改良する方向に決定したが、各学習者のログファイルを整理し分析する手順が煩雑となり、履歴ファイルを自動で読み込み整理するソフトの開発が必要であることが判明した。こちらの方向でこれからも進むのか、それともMoodleとは別にデータベースとも連動したプログラムを開発した方が良いのか、今後も検討が必要となった。また、ブラウザーによってはMoodle上の注がポップアップで表示されるものと、全画面に表示されるものなど一定せず、ブラウザーに依存しない一貫した表示が可能となるよう今後も改良が必要であることが判明した。これまでの研究成果についてオンラインの読解問題に追加した注の役割に焦点を絞った論文を執筆しCALICO(アメリカで発行されている国際誌、コンピュータ支援言語教育学会)主催のMonographに発表した。また25年度の後半では昨年度実施した実験の追実験を実施した。注の検索情報に基づいて読解後に検索した語彙の復習が可能となるプログラムを用いて、復習をした単語とそうでない単語での習得率を比較する研究である。その結果をまとめてH26年度の国内学会で発表する予定である。またこれまでの結果をまとめたものをH26年の夏に国際学会で発表する予定である。本研究では主に二つの目的を持って研究に取り組んでいる。1)電子媒体による読解に着目し、読みながら語彙を学ぶこと(付随的語彙学習)を促し補助する、意図的な学習方法について検証する、2)読解語彙学習補助プログラムを開発し、読解前・読解中・読解後にどのようなタスクを課すことが効果的なのか検証する。平成23年度は以下のような4つの研究計画を立て、H24年度からの本実験に向けて準備を行なった。1)意図的・付随的学習、タスクの役割と効果に関する文献研究を行い、研究を支える理論構築に着手する、2)読解前・読解中・読解後に実施できる具体的なタスクを考案する、3)上記のタスクを導入した読解プログラムを開発する、4)予備実験を実施する。上記の計画における実施状況と研究の成果は以下の通りである。1)文献研究を行い、研究テーマに関連する研究論文・研究書等を収集し、論点の整理を行った。

第二言語習得研究はもとより幅広い視点から考察し、学習における認知負荷のバランスという視点をKeywordの一つとして取り上げた。2)読解における語彙学習を促す具体的なタスクを考案した。読解前タスクとしてテキストに出現する難解な単語をチェックするタスク、読解中のタスクとして難解な語彙に付けられた注を検索するタスク、読解後のタスクとして単語復習テストを考案した。3)プログラムの完成には至らなかったが、代わりにMoodleの既存の機能を利用して読解活動を実施した。4)平成23年度後半で予備実験を実施した。予備実験で読解中のタスクの検証を行なったが、通常の注(意味が一つだけ提示される)に加えて複数の意味が選択肢として提示される注の効果について比較検証を行なった。これまでの先行研究とは異なる結果となり、今後の研究の必要性・重要性を示唆するものとなった。結果をまとめ、平成24年3月に英国で開催された語彙研究学会で発表した。H24年度では予定していたプロトタイプを完成することが出来、第一歩の検証を行うことができた。プロトタイプのプログラムを使用して本実験を敢行しデータ収集ができたことは予定通りであり、達成度と進み具合は妥当なものであると言える。H24年度の後半に実施した実験では様々なデータを収集することが出来た。目標単語に関する事前知識、読解直後の語彙知識、2週間後の語彙知識(遅滞テスト1),実験から5週間後の語彙知識(遅滞テスト2),読解中の単語検索履歴、読解後の復習活動の記録(検索した単語の再度の意味確認)などのデータを収集した。今後は、これらのデータを早急に分析し論文にまとめることが必要である。これまでの活動で次のようなことが達成し成果を収めた。文献研究を行い資料収集と論点の整理を行い、認知的負荷という観点から研究の全体像を概観した。本研究の理論的な基礎作りとなった。読解における語彙学習を促す具体的なタスクを考案したことで、本実験に向けての具体的な準備に入ることができた。Moodleの既存の機能を利用して平成23年度後半に予備実験を実施した結果、注の効果について比較検証においては、これまでの先行研究とは異なる結果となり、今後の研究の必要性・重要性が示唆されたことも成果となった。結果をまとめて3月にイギリスで開催された語彙研究の学会で発表を行うこともできた。ただし、読解語彙学習補助プログラム開発では、やや遅れが生じている。二つの理由が挙げられる。一つは当研究者の計画実施時期の計算ミスである。研究開始当初にプログラミングに従事してもらえる研究者、協力者を勤務校内外であたってみたが、なかなか見つからず、最終的に二人の研究協力者を確保するまでに予想以上に時間がかかってしまった。これは当研究者のミスであり責任を感じている。もう一つは、協力者との連携における時間調整の難しさである。それぞれ異なる大学に所属する研究者と連携し、共同研究という形で次の2方向から開発を進めている。
スギの歴史をスギにいる虫の遺伝子で調べる

スギカミキリの成虫の出現時期に栃木県で追加採集を行い,系統地理的研究のサンプリングを完了した。昨年度開発したマイクロサテライトマーカーを用いて,つくば近辺の個体群についてゲノタイピングを行ったところ,多型が著しく不足していたため,以下の解析はミトコンドリアDNA (mtDNA)の結果から行った。本州四国の15地点,98個体のスギカミキリのmtDNAのCOI, tRNA^<Leu>, COII領域の部分配列1150bpを決定したところ,19のハプロイドが検出された。Nested Clade Analysis (NCA)を行うために,ハプロタイプネットワークの構造を調べたところ,3階層のクレードに取りまとめられた。それらのうち太平洋側に分布するものの多くは,異所的なフラグメンテーションにより分布が成立し,主に日本海側で最も高頻度で検出されたハプロタイプは制限された遺伝子流動および少し長距離分散,もしくは過去の遺伝子流動により分布が成立したことがNCAにより推定された。以上の分布成立過程は,花粉分析から推定されたスギの歴史と符合した。スギの分子系統地理の最新データである148座のCAPsマーカーを用いて解析した結果では,太平洋側に生育するオオモテスギは単系統であることが示され,近隣の個体群とは遺伝的組成が類似していることが判明したものの,分布変遷は辿れていない。一方,スギの寄生者であるスギカミキリはスギの地域内での詳細な歴史を辿るのに適当な遺伝子マーカーとなりうることが示された。スギカミキリの標本を収集し,プロジェクトを通じて必要な個体を入手した。これらの個体のDNAを長期間保存するために、脚を切断しエタノール液浸処理をした後に保管した。(AC)nと(AG)nの混合の遺伝子座および、(TC)nと(AC)nの複合の遺伝子座を目的遺伝子領域として、マイクロサテライト遺伝子マーカーの作成に着手した。はじめに、マツノマダラカミキリの純度の高いDNAを抽出し、制限酵素処理をすることでゲノムを断片化した。それらの断片にアダプターを負荷することにより、ライブラリーを構築した。ライブラリーをテンプレートにして、(AC)6(AG)5もしくは(TC)6(AC)5とアダプターに対応するプライマーによりPCRをし、複合マイクロサテライト遺伝子座を含む領域を増幅した。良好な増幅が認められたため、PCR産物をクローニングして各断片を単離した後、ダイレクトシーケンスにより塩基配列を決定し、得られた配列からプライマーを設計した。蛍光標識した上記の複合マイクロサテライトDNAプライマーと対にして、次年度以降のゲノタイピングに用いる。しかしこれらのマーカーのうちいくつかは増幅が悪く、多型頻度が期待以下であった。そのため,ビオチンバインディングによる,磁石を用いた濃縮法で現在マーカーの再開発を進めている。また、来年以降ミトコンドリアDNAとマイクロサテライト領域の解析を進めるために、Nested Clade AnalysisやIsolation by Distance等の手法を習得した。
喘息、精神分裂病の全ゲノム検索による疾患感受性遺伝子の同定

気管支喘息および精神分裂病は複数の遺伝要因と環境要因が複雑に関わって発症する多因子性の疾患であり、関わっている遺伝子の同定には、全ゲノムを対象とした連鎖解析が必要である。さらに、多因子性疾患の関連遺伝子は民族差があると推測される。本研究では日本人における気管支喘息と精神分裂病の遺伝子座の同定を目的とした。遺伝子座同定の方法は連鎖解析によった。気管支喘息は小児気管支喘息患者を発端者とする核家族を対象とした。連鎖解析は罹患同胞対の対立遺伝子共有法で行った。精神分裂病は患者を発端者とする核家族を対象とした。連鎖解析は精神分裂病と関連している生理学的マーカーである探索時の眼球運動数を指標とするQTL法で行った。気管支喘息の連鎖解析の結果、第4染色体長腕4q35でp=0.0002、第5染色体長腕5q31-q33でp=0.00002、第6染色体短腕6p22-p21.3でp=0.0009、第12染色体長腕12q21-q23でp=0.001、第13染色体長腕13q11でp=0.0004が示され、これらの領域に気管支喘息関連遺伝子が存在している可能性が示された。連鎖領域の関連遺伝子解析も一部行い、5q31-33領域では、インターロイキン4遺伝子、インターロイキン13遺伝子の5'調節領域、β2アドレナリン受容体遺伝子のミスセンス多型、インターロイキン12B遺伝子の多型と関連が示唆された。この結果は5q31-q33領域では影響力の比較的小さな複数の遺伝子が存在し、連鎖に寄与していることを示している。第6染色体ではTNFA遺伝子の5'調節領域の多型との関連が示唆された。精神分裂病では、探索時の眼球運動数と5q22でロッド値2.07、6p23-p21でロッド値2.46、8q24でロッド値1.90、17q24-q25でロッド値2.34、22q11-q12でロッド値3.48と連鎖を示唆する結果が得られた。この結果は精神分裂病と関連する生理学的マーカーも精神分裂病と同様に多因子により支配されていることを示している。これまでの研究により気管支喘息および精神分裂病の疾患感受性遺伝子座を特定することができた。
迅速・低コストに橋梁群の健全性を評価する車両応答分析技術の開発と検証

走行車両にセンサを搭載し,車両振動を計測することで,通過した橋梁の健全性を評価する技術の有効性を検証した.本研究により,数値シミュレーション・模型実験・実橋梁実験のデータ分析を行い,センサを前輪と後輪に設置した二点計測により,橋梁損傷に感度の高い指標を見出すことに成功した.ただし,路面凹凸の影響が卓越するため,橋梁の劣化進展速度よりも早く舗装の劣化が進む場合は,本技術を適用することは困難であり,今後の課題といえる.本研究目的は、走行車両の加速度応答から推定した橋梁モード形状に基づき、橋梁損傷の有無を判断することである。平成25年度は、数値計算、模型実験および損傷橋梁上の実車走行実験のデータ分析により、本手法について大きく2つの新たな知見を得た。1「本手法の適用により、システム非線形性を補正することが可能である。得られるモード形状に関する指標は、損傷前後で有意な差を持ち、損傷検知に有効である。」2「ただし、路面凹凸および車両そのものの振動による影響が含まれるため、推定モード形状は正解値とは異なる値を示す。」このため、本手法を適用するには、橋梁の健全時と損傷時で、全く同じ条件での計測が要求される。しかし、実用化にあたっては、このような条件は非現実的である。そこで、繰り返し走行可能な模型車両を用いた実験により、車両走行速度をわずかに変化させながら、推定モード形状の統計データを収集し、損傷前後での有意差を検知可能な範囲を調べた。結果、ある程度、走行速度がばらつく状態でも、推定橋梁モード形状は有意に変化し、損傷検知への適用性が認められることが示された。また、これらの統計データの分析により、空間補正手法のメカニズム解明が進展した。具体的には、モード解析理論における基準座標が、損傷前後での変化を数学的な制約のために推定値に含めることができず、その分の誤差が推定モード形状に影響を与えるため、モード形状の正解値がほとんど変化していない場合でも、推定モード形状が変化する可能性が示された。もし、非常に大きな損傷が発生した場合は、基準座標の損傷変化に対する数学的制約は弱まる。したがって、本仮説によれば、推定モード形状の変化が小さくなると考えられるが、分析結果は矛盾していないことも確認された。走行車両に搭載した加速度センサの応答値およびGPSデータから、SSMA(空間特異モード角)を求め、SSMAがトラス橋の斜材破断に対してどのように応答するかを数値シミュレーションにより求めた。数値シミュレーションにあたっては、三次元有限要素法に基づいた車両ー橋梁相互作用システムの数値解析コードを独自に作成し、車両の走行速度、重量、部材の破断位置、路面凹凸の特性などを変化させながら、それぞれのパラメータが損傷検知に及ぼす影響を考察した。結果、車両走行側のトラス部材の損傷は、SSMAの感度が高いことが分かり、車両応答分析の有効性が改めて確認された。ただし、SSMAのメカニズムは解明されておらず、損傷感度もトラス部材の破断位置によって変化するため、さらなる検証が必要である。また、SSMAは路面凹凸の変化に対する感度も高く、路面凹凸の変化がSSMAに及ぼす影響についても今後、検証が必要である。これまでに実施された模型実験や実橋梁での車両走行実験のデータと比較すると、数値シミュレーションにより得られるSSMAのばらつき特性は、実験データとは異なっているように見受けられる。最終年度は、SSMAの損傷変化メカニズムを統計データに基づいたアプローチにより解明することに取り組むとともに、最大の課題である路面凹凸の変化と橋梁構造物の構造パラメータの変化を識別する方法の開発を検討する。検討に先立ち、路面凹凸は同じでも舗装の内部で損傷が進展している状況にSSMAがどのように反応するかを調査する予定である。センサを搭載した車両を準備し,橋梁上を通過した際の車両振動のみを用いて,橋梁の健全性を迅速かつ低コストに評価する手法の開発を試みた.先行研究では,センサは一つである場合が多かったが,本研究では前輪と後輪にセンサを搭載することで,損傷感度が高い指標を見出した点に新規性がある.先ず,本指標が橋梁損傷に反応することを確認するため,数値シミュレーションを実施した.結果,本指標がさまざまな損傷に感度良く反応することが分かった.次に,実橋梁のトラス部材を破断させ,その前後で重量車を走行させる実験において得られた車両振動データを用いて,本指標が現実問題において,橋梁損傷を検出するのに利用可能であることを確認した.統計量が少ないため,偶然性が排除できなかったことから,模型実験により繰り返し走行実験も実施し,統計的妥当性があることも示した.課題として,橋梁損傷よりも路面凹凸の劣化進展が早い場合,指標の変化が橋梁損傷によるものか,路面劣化によるものかが判断できず,適用性が低下することが挙げられる.走行車両にセンサを搭載し,車両振動を計測することで,通過した橋梁の健全性を評価する技術の有効性を検証した.本研究により,数値シミュレーション・模型実験・実橋梁実験のデータ分析を行い,センサを前輪と後輪に設置した二点計測により,橋梁損傷に感度の高い指標を見出すことに成功した.ただし,路面凹凸の影響が卓越するため,橋梁の劣化進展速度よりも早く舗装の劣化が進む場合は,本技術を適用することは困難であり,今後の課題といえる.とするものである.この2年間の研究の中で、SSMA(Spatial Singular Mode Angle空間特異モード角)を提案し、実車両走行実験により得られたデータの分析を進めるとともに、模型を用いた繰り返し走行実験のデータを用いて、SSMAの損傷反応メカニズムを統計的アプローチによる明らかにすることが出来た。

加えて、独自の三次元有限要素プログラムを作成し、車両と橋梁の相互作用をシミュレートすることで、各種パラメータが及ぼす影響も明らかにすることが出来た。現在、これらの成果を学術論文に投稿する準備を進めているところである。構造工学この2年間で、トラス橋梁の斜材破断前後で、実際に車両を走行させた時の実車両振動データ、模型実験によるデータおよび数値シミュレーションの結果を用いて、SSMAへの影響因子を明らかにするための解析コードおよび統計的実験データを揃えることが出来た。今後、これらのリソースを活用して研究の進展が期待できる。また、舗装損傷の進展を再現することで、路面凹凸の影響を識別したり、環境因子(気温、湿度、降雨、積雪)の影響を検証して、より精度と実現性の高い手法へと発展させる必要がある。最終年度は、舗装劣化の影響を数値シミュレーション上で再現し、識別方法を検証する。本研究で掲げたミッション(1網羅的パラメータ分析、2最適車両の選定、3統計的分析、4実車データの分析、5損傷位置推定)のうち、14の3つを順調に達成した。また、車両の加速度応答データを相当量蓄積することが出来、今後の研究の発展も見込まれる。本手法のさらなる高度化とメカニズム解明を期待している。ただし、5の損傷位置推定は、予備検討結果より、困難が予想される。したがって、区分(2)の「おおむね順調に進展している」とした。MEMSセンサの開発を行ったことで、センサ購入費用を抑えることが出来た。また、模型実験および数値シミュレーションについても費用の抑制に成功した。残された「損傷位置推定」という課題については、ウェーブレット変換などの技術を応用して、平成26年度中にいくつかのアイデアを検討する予定である。一方、本手法の研究成果を学会等で報告したところ、健全時データが必要な点が短所として繰り返し指摘を受けた。この課題についても何らかの方策を示したい。本研究課題について、実験および数値シミュレーションに基づいた多くの知見を得ることが出来た。これらの研究成果を多く学術論文および学会で広く発信する予定で、そのための論文投稿料および旅費に充てる予定である。研究業績に関するページ。本年度中に必要な機材を借り受けることができたため。これまでに得られた分析結果および反省点に基づいて、自前での実験機材を購入する予定である。
大規模数値シミュレーションによる超伝導コイルの安定性の解明と設計最適化手法の構築

強制冷却型超伝導コイルの設計を合理化するためには、その臨界特性を正確に予測し、設計裕度を最小にする安定性理論が必要になる。しかし、このような理論を構築するには、超伝導コイルとその冷媒である超臨界ヘリウムの挙動を詳細に理解しなければならないが、約1,000本を束ねた超伝導線の電磁気的複雑さや、超臨界流体一般に見られる擬臨界線付近での伝熱劣化現象を始めとする冷媒と超伝導線の熱交換などの複雑さが重畳・連成するため、詳細な研究はほとんどなされていない。そこで、個々の電磁気的、熱流体力学的な現象を出発点に体系化したモデルを構築し、スーパーコンピュータを用いた数値シミュレーションによる研究手法を導入し、超伝導コイルと超臨界ヘリウムで構成される体系の冷却安定性を解明し、超伝導コイルの設計の大幅な合理化を図ることを目的とする。平成19年度は、昨年度製作した計算コードを用いて、過去に行われた超伝導コイルの実験を対象として数値シミュレーションを行い、ヒートパルス試験の実験結果を精度良く再現できることを確認した。更に、当機構において平成20年6月から新たな超伝導コイルの実験を開始するが、その解析を行えるように本計算コードの改良を行った。このコイルは構造が複雑な上に、コイル内部の温度を計測できないため、実験データのみでは冷却安定性などの性能を正確に評価することは非常に困難である。そこで、本計算コードを用いてコイル内部で生じる現象を再現することにより、その性能評価に重要な役割を果たすことが期待できる。平成18年度は、まず強制冷却型超伝導コイル内の現象を再現できる支配方程式を決定し、それに基づく独自のシミュレーションコードを製作した。ここで、高い解析精度と高速な並列計算を実現するために、冷媒(熱流体)・超伝導素線(電気回路)・構造材(伝熱)の連成解析をマスター・スレーブ型による粗粒度のMPI並列計算コードの完成に目処を付けた。平成19年度はこの計算コードにより、超伝導コイルを用いて過去に行われた実験を対象として数値シミュレーションを行い、実験結果との比較から計算コードの妥当性を評価し、超伝導コイルの冷却安定性の解明を図る。
ショウジョウバエ視細胞におけるジアシルグリセロールキナーゼの機能解析

本研究はショウジョウバエ視細胞において光情報変換過程のキーエンザイムのひとつであるジアシルグリセロールキナーゼ(RDGA/DAGK2)の機能発現の機構を明らかにする事を最終目的とした。それまでに我々はRDGA蛋白質が視細胞の光受容部を構成する微絨毛の根元に存在する特殊は滑面小胞体網工(subrhabdomeri cistern, SRC)の周囲に局在することを突き止め、RDGAが光情報変換系のシグナル蛋白質群が局在する微絨毛に密接に位置することが、その機能発現の上で重要であると考えた。そこで、本研究ではRDGAの様々な改変蛋白質を遺伝子組み換えの技術を用いてショウジョウバエ視細胞で発現させ、発現蛋白質の活性や細胞内局在を調べることにより、生体内でのRDGA蛋白質の機能解析を行った。RDGA蛋白質には酵素活性部位のN-末端側に2つのシステインリッチドメイン(CRD)が存在する。このドメインはDAG kinaseに共通して存在するが、その機能については殆どわかっていなかった。本研究では、CRDドメインを欠損するRDGA蛋白質の機能解析から、このドメインが蛋白質の細胞内局在と酵素活性に必須であることを見いだし、生体内でのDAG kinaseのCRDドメインの機能を初めて明らかにすることができた。また、RDGA蛋白質のC-末端に存在する4つのアンキリンリピートが蛋白質の細胞内局在や酵素活性には必要ではないことがわかった。このドメインについてはDAG kinaseの本来の機能とは別の働きをしていることがRDGAのほ乳類ホモローグであるDAG kinaseζの解析から示唆されており、RDGAにおいても同様の可能性が考えられた。このことについては今後の研究課題となった。本研究はショウジョウバエの光情報変換過程で中心的な役割を果たす、eye-diacylglycerol kinase(eye-DGK,RDGA蛋白質)の機能発現の機構を明らかにすることを最終目的とする。これまでの研究から、eye-DGKは光受容膜の近傍に存在する滑面小胞体subrhabdomeric cisternae(SRC)に局在しており、このことが機能発現と密接に関係していると考えられた。そこで、本年度はeye-DGK分子のどの領域がSRCへの局在やDGK活性に必須なのかを明らかにするため、以下の研究を遂行した。1.eye-DGK蛋白質のN-末端領域の構造解析これまでの実験結果から、eye-DGKはcDNAから予測された蛋白質よりもN-末端側が短い一次構造をしていると考えられた。そこで、質量分析法により、翻訳開始点の決定および翻訳後修飾の有無の解析を行うため、内在性eye-DGKを2次元電気泳動法により精製した。eye-DGK分子内のいくつかのドメインを欠損するような変異分子をコードするcDNAconstructsをgerm line transformationにより、eye-DGK欠損突然変異(rdgA)個体に発現させ、発現個体の視細胞の形態やDGK活性および光感受性を調べることにより、機能回復の有無を調べた。その結果、N末端領域のcystein-rich regionがeye-DGK蛋白質の細胞内局在及び、機能発現に必須であることがわかった。本研究は、ショウジョウバェの光情報変換過程で中心的な役割を果たすeye-diacylglycerol kinase(eyc-DGK, RDGA蛋白質)の機能発現の機構を明らかにすることを最終目的としている。そこで、本研究では、eye-DGKの分子内のどの領域が細胞内局在や機能発現に必要なのかを明らかにする目的で、eye-DGK蛋白質の部分欠損分子を発現する系を確立した。

germline transformationによる個体発現実験の結果から,eye-DGKの酵素活性部位よりC-末端側を全て欠損する蛋白質でも細胞内局在や酵素活性がほぼ正常であることがわかった。ところが,これまでの報告によると、eye-DGKの機能欠失突然変異alleleであるrdgA^<BS12>系統では、酵素活性部位から19アミノ酸残基分C-末端側にストップコドンが入っており、ここより下流のC-末端領域の欠損が機能欠失を引き起こしていると考察しており、今回の結果と矛盾することが分かった。そこで、rdgA^<BS12>系統において実際にどのようなeye-DGK蛋白質が発現しているのか調べるため、rdgA^<BS12>系統で発現しているeye-DGKのmRNAの解析を行った。その結果、ストップコドンの入っているエクソンをスキップして翻訳されたmRNAが発現していることがわかった。現在このmRNAについて、さらに詳細に配列を解析しているところである。また、eye-DGKのN-末端領域にあるシステインリッチ領域を欠損すると、eye-DGKの細胞内分布が異常になり、酵素活性も無くなることがわかった。本研究は、ショウジョウバエの光情報変換過程で中心的な役割を果たすeye-diacylglycerol kinase(eye-DGK, RDGA蛋白質)の機能発現の機構を明らかにすることを最終目的としている。本研究期間以前に我々は、eye-DGKは光受容細胞の光受容部である桿感分体に接した細胞質領域(subrhabdomeric region)に局在していることを見いだし、この領域に存在する滑面小胞体(subrhabdormic cistern)の膜上で機能していると考えた。本研究では、eye-DGKの分子内のどの領域が細胞内局在や機能発現に必要なのかを明らかにする目的で、eye-DGK蛋白質の部分欠損分子を作成しgermline transformationによる個体発現実験を行った。昨年度までに,eye-DGKのC-末端領域に存在するアンキリンリピートを欠損する蛋白質をrdgA null突然変異体で発現したところ、表現形質(網膜変性)が救済され,細胞内局在や酵素活性がほぼ正常に復帰することがわかった。このことから、この領域はRDGA分子内で酵素活性を抑制的に制御しており、これを欠損した分子を酵素活性のない突然変異体に発現した場合、発現分子は酵素活性を有し、表現形質を救済すると考えた。そこでこの仮説を証明するため、アンキリンリピート領域を野生型の光受容細胞で発現し、酵素活性が抑制されるかどうか調べる実験を進行中である。また、eye-DGKのN-末端領域にあるシステインリッチ領域を欠損した蛋白質を発現すると、突然変異体の網膜変性を救済せず、酵素活性も発現しないことがわかった。この蛋白質の細胞内局在を調べるために、光情報変換系においてRDGAの上流で機能するNORPAの欠損突然変異体との二重突然変異体を作成して、網膜変性をおさえて、発現蛋白質の細胞内局在を免疫電子顕微鏡法により調べた。