hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯周病原菌の病原因子の分子生物学的解析

歯周病の局所では,特定のグラム陰性菌とスピロヘ-タが激増している。スピロヘ-タは,歯周ポケットが深くなる成人性歯周炎の局所で,全歯数の過半数を占めることも少なくない。Treponema denticolaは,その中心といえる。本菌種は,免疫応答を抑制する作用のあることを,教室でも示してきた。事実,多くの歯周炎患者は,T.denticolaに対する免疫応答を起こしていない。さらにT.denticolaは,菌周組織を破損する酵素を保有する。本年度は,それらの歯周病原性に関わるタンパク抗原をクロ-ニングし,その組換えDNAタンパクの活性について検討し,本菌の病原性を分子レベルで解析することを試みた。T.denticolaATCC 33520株の染色体DNAをHind IIIで切断し,λ47.1ファ-ジベクタ-に挿入し,E.coli A358株に感染させ,本菌ウサギ免疫血清でタンパク抗原をスクリ-ニングした。得たクロ-ンを,λTDS12とした。この3Kbpから成る遺伝子をpACYC184プラスシドベクタ-に挿入し,E.coli HBlol株に形質転換した。E.coliHBlolの組換え体T.denticolaのタンパク抗原は,分子量57.5KDaで,T.denticolaの供試した株に共通するもので,他の口腔treporemaに存在しないものであった。本クロ-ニングDNAは,486のア酸を構成し,分子量は54,919と算定できた。本クロ-ニングDNAおよびタンパクを遺伝子バンクで検索したところ,E.coliおよびネズミチフス菌のaspartate carbomylーtransferase(ATCase)30%以上の相同性を示した。組換えDNAタンパクは,ATCase酵素活性を示した。T.denticolaの組換えDNAタンパク抗原を部分精製した。分子量は57.5KDaで,T.denticolaウサギ免疫血清と強く反応することから,歯周炎患者血清中の本菌数に対する抗体価測定に使えるだろう。また,クロ-ニングDNAは,本菌検出のためのDNAプロ-ブに使えるだろう。近年の研究から歯周病の発症と進行には特定のグラム陰性桿菌がスピロ-ヘ-タ-と共に深く関与していることが明らかにされてきた。それらの歯周病原菌の保有する病原因子としては歯槽骨吸収をもたらす内毒素を始めとして歯周組織破壊性を様々なタンパク分解酵素、歯面ペリクル・口腔粘膜への付着因子や血球凝集因子等が報告されている。しかし、各病原因子ともその抽出・精製は煩雑かつ困難であるために充分な検討が行なわれているのが実情である。本研究は組換え遺伝子の技術を利用して歯周病原菌の保有する病原因子を分子レベルから解析することを目的としている。本年度はまず有力な成人性歯周病原菌としてTreponema denticolaとBacteroides gingivalisの2つの菌種を選びだし、それぞれの菌から染色体DNAを精製した。さらに染色体DNAを制限酵素で切断し、適当なベクタ-へ挿入し、大腸菌へ形質転換(transformation)した。それと平行して病原因子の解析やクロ-ンのスクリ-ニングするための抗体としてウサギ免疫血清やマウス単クロ-ン抗体を作製した。今後は遺伝子バンクから免疫学的手法やプロ-ベによるサザンブロット法を用いて病原因子を発現しているクロ-ンを見つけだし、その塩基

配列さらにはアミノ酸配列を決定すると共に大量培養により病原因子を抽出、精製し、化学的、免疫学的特性を検討する予定である。成人性歯周炎は、歯周局所に定着・増殖してくるグラム陰性菌種にPorphyromonas gingivalisやTreponema denticolaなどによって発症し進行する。本研究では、この両菌種の病原性因子を分子レベルで解析すべき表層抗原産生geneをクロ-ニングし、その遺伝子および組換DNAによって得たタンパク抗原の性状を検討した。T.denticolaは、geneバンクの作製後、ラムダL47.1の<Hind>___ーIIIで部分消化したところに挿入し、Escherichia coli Q358株に感染させた。ファ-ジクロ-ンのスクリ-ニングは、T.denticolaの外膜成分に対する抗ウサギ血清を一次抗体に、ペルオキシダ-ゼ標識抗ウサギIgGを二次抗体としたイムノブロット法によって行った。スクリ-ニングによって5個の陽性クロ-ンを得、最も強く反応したファ-ジクロ-ンを入TOS12と名付けた。このクロ-ン抗原タンパクは、59.000の分子量であった。現在この遺伝子の塩基配列と発現している抗原について解析中である。また、このタンパク抗原の局在について検討している。P.gingivalisは、<Sau>___ー3AIで切断した染色体DNAを分離精製し、ファ-ジベクタ-ラムダL47、1の<Hind>___ーIII切断片に挿入した。これをE.coli Q358株にTrypticose agar plate上で感染させた。得たファ-ジプラ-クをニトロセルロ-ス膜に転写した。これらのファ-ジクロ-ンからP.gingivalisの血球凝集因子に対するウサギ抗血清と反応するクロ-ンをイムノブロット法によってスクリ-ニングした。反応陽性の47個のクロ-ンSー51からSー97の中から、反応性の高い25個のクロ-ンについてウェスタンブロットを行い、産生されるタンパクの解析を検討したところ分子量は15万から数十万程度のバンドを数本作り、類似したクロ-ンであった。現在、このクロ-ンタンパクを、歯周病の診断に使用出来るか否か検討している。歯周病の局所では,特定のグラム陰性菌とスピロヘ-タが激増している。スピロヘ-タは,歯周ポケットが深くなる成人性歯周炎の局所で,全菌数の過半数を占めることも少なくない。Treponema denticolaは,その中心といえる。本菌種は,免疫応答を抑制する作用のあることを,教室でも示してきた。事実,多くの歯周炎患者は,T.denticolaに対する免疫応答を起こしていない。さらにT.denticolaは,歯周組織を破損する酵素を保有する。本年度は,それらの歯周病原性に関わるタンパク抗原をクロ-ニングし,その組換えDNAタンパクの活性について検討し,本菌の病原性を分子レベルで解析することを試みた。T.denticolaATCC3350
遺伝性肝疾患に対する骨髄細胞移植療法の開発

GFP発現骨髄細胞(BMCs)を脾臓経路でウィルソン病モデル新生児ラットに注入・移植し、BMCからの肝細胞(BMDHs)発現、機能を検討した。注入後18ヶ月にてBMDHsが肝臓に生着していること、障害肝モデルでは低下しているはずのセルロプラスミンの酸性活性が上昇していること、BMDHsは細胞融合によって発生していることが確認され、出現したBMDsから新生物形成病変は確認されなかった。我々の実験結果は、この新しい戦略がBMDHsをつくるために効果的で安全なことを示唆すると思われた。骨髄幹細胞は様々な組織の細胞に分化または融合することが知られている.Fumarylacetoacete hydrolase欠損マウス(遺伝性高チロシン血症I型モデル)は、効率よく骨髄細胞が肝細胞と融合するモデルで、3050%の肝細胞が骨髄細胞と細胞融合すると報告された。遺伝性疾患においては、細胞融合することにより、融合した細胞内に正常の遺伝情報を導入することになるため、遺伝性疾患においては骨髄細胞と肝細胞の細胞融合が高確率でおこると考えられる。出生直後のLECラットに骨髄細胞を投与すると、骨髄細胞の性質(GFP陽性)も持った細胞が出現することを確認している。しかし、この細胞がどのような長期経過をたどり、レシピエント自体がどのような長期経過を取るのか評価する必要がある。そこで、骨髄細胞移植後3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月、12ヶ月、15ヶ月、18ヶ月、21ヶ月、24ヶ月と3か月ごとにタイムポイントを設定し、それぞれにおける肝臓に占めるGFP陽性範囲の割合を、全割した組織標本上で面積として算出した。さらに、全肝細胞に占める割合(GFP陽性肝細胞数/肝細胞数)を算出した。骨髄細胞(BMCs)は、機能性肝細胞を生成する能力を持って、代謝の肝疾患のために治療種類として若干の長所を持つと考えられる。しかし、BMCから派生した肝細胞(BMDHs)の外見は、低い。我々は、早いBMC注射が2つの主な理由のためにBMDHsをつくるために実行可能であると仮定した:肝臓は新生児ラットでの造血器官である(1)、そして、高度の肝臓損傷が起こる前に、それは充分な時間をより多くのBMDHsを生成させるかもしれない。(2)我々は、レシピエント、(1)ウィルソン病のモデルと(2)肝臓発癌性としてLong Evans Cinnamon(LEC)ラットを使用した。緑の蛍光性の蛋白-表しているBMCsは、脾臓を通して新生児LECラットに注射された。セルロプラスミン(それはLECラットで低い)の酸性活性は、治療を評価するたあに測定された。加えて、我々はこれらのBMDHsが悪性のポテンシャルを持っていたかどうか確認するためにRMDHsと免疫組織化学的分析の起始を明らかにするために蛍光原位置ハイブリッド形成を実行した。注射の後の18ヵ月に、我々は処理されたLECラットの肝臓において、肉眼的に緑の蛍光性の蛋白-表している若干の領域を見つけた。セルロプラスミンの酸性活性は、処理されたLECラット(n=7)で増加して、非処理のLECラット(P=0.015)でのそれより非常に高かった。さらに、我々はBMDHsが細胞融合によって発生して、新生物形成病変またはcholngiofibroticな部のいずれでも、検出されなかったことを確認した。我々の結果は、BMDHsをつくるためのこの新しい戦略が効果的で安全なことを示唆する。骨髄細胞(BMCs)は、機能性肝細胞を生成する能力があり、代謝性肝疾患のための治療方法として期待されるが,BMCからの肝細胞(BMDHs)出現率は低い。我々は、(1)肝臓は新生児ラットでの造血器官であり、(2)胎児期に代謝性肝疾患による高度の肝臓障害が起こる前に、より多くのBMDHsを生成させることが可能であると考え,胎児期早期のBMC注射がBMDHsをつくるために有効であると仮定した.方法:レシピエント、(1)ウィルソン病のモデルと(2)肝臓発癌性としてLong Evans Cinnamon(LEC)ラットを使用した。GFP発現BMCsは、脾臓を通して新生児LECラットに注射した。セルロプラスミン(それはLECラットで低い)の酸性活性を、治療評価の指標とした。結果:注射の後の18ヵ月に、我々は処理されたLECラットの肝臓において、肉眼的にGFP発現領域を認めた。BMDHsは細胞融合によって発生していることが確認され、出現したBMDsから新生物形成病変は確認されなかった.結語:我々の結果は、この新しい戦略がBMDHsをつくるために効果的で安全なことを示唆する。
共起情報格納型のトライ構造を利用した単語概念知識獲得と意味理解への応用

シソーラス(単語を意味で分類し体系化した語彙集)は,コンピュータに自然言語(日本語など人間が日常的に用いる言語)を理解させる上で重要であるが,人手による作成の労力や,作成者による分類の視点の揺れが問題であった.本研究は,シソーラスに代表される概念知識をコンピュータにより機械的に獲得し,体系を構築する技術確立を目的に実施され,成果として,概念知識をコンピュータが扱いやすい辞書形式で,少容量で保存する技術と,自動獲得,体系化を行う技術を考案した.シソーラス(単語を意味で分類し体系化した語彙集)は,コンピュータに自然言語(日本語など人間が日常的に用いる言語)を理解させる上で重要であるが,人手による作成の労力や,作成者による分類の視点の揺れが問題であった.本研究は,シソーラスに代表される概念知識をコンピュータにより機械的に獲得し,体系を構築する技術確立を目的に実施され,成果として,概念知識をコンピュータが扱いやすい辞書形式で,少容量で保存する技術と,自動獲得,体系化を行う技術を考案した.18年度は,共起情報からの意味的類似性に着目し,係り語に対する概念知識を獲得するため,共起情報を効率よく格納するための辞書構造の考案と,共起情報から係り語を意味的に分類するアルゴリズムの提案を次の順序で行った.1.共起情報とともに単語の概念情報を格納できる辞書構造の提案と開発過去の研究成果をもとに,トライ構造を用いて共起情報とともに単語の概念情報を効率よく格納できる新しい辞書構造を考案した.この手法は,数十万語彙から無限に生成される共起情報を,数十MB程度の辞書に格納できるようになることや,係り語の持つ受け語群や,同一概念を持つ単語が相互検索できるようになること,探索時間計算量も0(k)(k:語彙長)となることなどの特徴がある.また,この辞書構造を用いた,辞書エンジンのプロトタイプ開発を行った.2.共起情報を格納し,係り語を意味的に分類するアルゴリズムの提案と評価先に考案した辞書格納手法を用いて,共起情報から係り語を意味的に分類するアルゴリズムの提案を行った.具体的には,係り語の持つ受け語群の頻度などから,特徴ベクトルを生成し,他の係り語との類似度を判定することによって分類を行う.また,この分類処理は一単語単位で行うことができるため,頻繁な更新にも十分に対応でき,分類結果も同一の辞書構造内に格納できる.このアルゴリズムの評価のため,実験として開発した辞書エンジンのプロトタイプに共起情報を格納し,分類精度などの評価を行った.19年度は,18年度に開発した共起情報を効率よく格納する辞書構造を用いて,概念知識構築アルゴリズムの提案と,エンジンの開発,システム評価を次の順序で行った.1.概念知識構築アルゴリズムの考案18年度に提案した,共起情報から係り語を意味的に分類するアルゴリズムを元に,分類したグループ間の上位下位関係を決定する手法の考案を行った.具体的には,係り語の持つ受け語群の頻度などから生成される特徴ベクトルを,分類したグループごとにも生成し,グループ間の距離尺度を元に上位下位関係を決定する.この処理は,係り語を意味的に分類する処理と同時に行うつまり,類似度判定によって係り語を分類する際に,どのグループにも属さなかった係り語は独自のグループを形成し,グループ間の距離尺度による上位下位の決定が行われる.このため,一単語単位での更新に対応し,分類結果を同一辞書内に格納できる構造を踏襲している.2.システムの開発と評価概念知識構築アルゴリズムを実現するプロトタイプシステムの開発を行った.このシステムは,共起情報とその頻度の集合を入力として与えると,分類結果を辞書に格納する.入力に与える共起情報に制限はなく,例えば係り語と受け語の関係を与えれば単語の概念分類に,文書とキーワードの関係を与えれば文書分類に利用できると考えられ,応用性の高いシステムとなっている.また,Webから収集した文書から共起情報を抽出してシステムに与え,分類精度などの評価を行った.20年度は, 19年度までに提案され,開発された手法を用いて,概念知識構築アルゴリズムの改良と,エンジンの開発,システムの評価を次の順序で行った.1.概念知識構築アルゴリズムの改良とエンジンの開発19年度までに提案したアルゴリズムの改良を行った.具体的には, 19年度に開発したプロトタイプシステムを用いて,分類精度などの評価を行った結果を元に,グループへの分類や,上位下位関係の決定に用いる類似度判定のための距離尺度を見直した.また,グループ間の類似度を判定する際に,辞書内に存在する全てのグループとの総当たりで判定していたが,これを上位下位関係を考慮した判定に変更した.2.エンジンの開発19年度に開発したプロトタイプシステムは,辞書への記憶量や,処理速度などを全く考慮していないシステムであったため,これらを実運用に耐えうるエンジンとするための開発を行った.システムの動作は,プロトタイプシステムと同様で.共起情報とその頻度の集合を入力として与えると,分類結果を辞書に格納する.また,分類結果を視覚化して出力することも可能である.3.システムの評価開発したシステムを使用して, Web上の文書から共起情報を抽出し,概念知識を構築させる.その結果を,従来のクラスタリング手法などとの比較実験を行い,評価を行った.なお,共起情報の抽出のため,大量の文書を収集する必要があったが,研究の効率化のため,既存のN-Gramデータを利用した.
植物における新規シアル酸誘導体の同定とシアル酸生合成経路の解明

昨年度に引き続き、植物におけるシアル酸の存在の有無を再検討し、もしシアル酸が存在するならば、植物におけるシアル酸の生合成経路を解明することを目的にして、以下のことを行った。(1)タバコBY2培養細胞を用いたシアル酸誘導体の同定:昨年度、2-ケト-3-デオキシ酸構造をもちシアル酸類縁体と思われる水溶性化合物であるSiaXおよびSiaY、また比色反応からシアル酸類縁体と考えられる脂溶性化合物であるSiaZについて、まず、これらが定常期において最大発現量となることを見いだした。次に、定常期細胞から、これらの化合物を精製し、その構造解析を行った結果、SiaZはシアル酸骨格をもたないベンゼン環をもつ化合物であると推定された。一方、SiaXとSiaYについては、部分精製の段階での解析からシアル酸と似た大きさをもつことが判明した。また、シアル酸を認識するSSAレクチン反応性糖タンパク質においても、SiaYに相当する分子が見いだされた。(2)植物細胞におけるシアル酸誘導体の生合成機構の解析:まずタバコBYL2.細胞は、Neu5Acそのものを取り込むことが判明した。今年度、さらにプロトプラストを調製して調べた結果、同様の蓄積が起こることが判明した。しかし、その蓄積も最初の数時間で一定になり、取り込みとともに分解、代謝されることが推定された。しかし、新たな誘導体は見いだされなかった。この2年間の研究期間において、まず、植物においては、動物で見いだされる典型的なシアル酸は存在しないこと、次に、シアル酸類縁体としては、既に明らかにされているKDOの他に、未同定の類縁体が存在していることが明らかになった。今後、継続してその類縁体の構造決定を行う予定である。なお、2年間で国内の学会発表を1件ポスターで行った。植物におけるシアル酸の存在の有無を再検討し、もしシアル酸が存在するならば、さらに植物におけるシアル酸の生合成経路を解明することを証明することを目的に、順次以下を進めた。(1)植物におけるシアル酸の同定:これまで我々がサツマイモ、ジャガイモの総脂質画分中に見いだした、普通のシアル酸(Neu5Ac、Neu5Gc)と異なるNeu5Ac類縁体成分を同定することを目指した。しかし、天然産物ではこの成分が本当に植物成分由来であるかどうか、環境からの混入の可能性がないかどうかについてはっきりするためには、培養液の成分がはっきりしている条件で培養できる培養細胞からの成分同定が重要であることがわかり、タバコBY2細胞について調べ、同様の成分が確認された。(2)タバコBY2培養細胞を用いたシアル酸誘導体の同定:(1)でタバコBY-2細胞中に確認されたシアル酸類縁体成分について、増殖段階特異的な発現を調べたところ、細胞増殖期よりも定常期において、発現が増加することが判明した。Neu5Acα2,6Gal構造に結合する植物レクチンSSAを用いて調べた結果、糖タンパク質成分としてSSA反応性の数種の成分が確認されたが、SSA反応性成分は酵素に対する反応性や化学的性質において普通のシアル酸とは異なっていた。現在、構造解析中である。(3)植物細胞におけるシアル酸誘導体の生合成機構の解析:今年度はまずタバコBY-2細胞にNeu5Acそのものを取り込ませて、このシアル酸関連分子の量的変化を追跡した。BY2細胞は増殖段階依存的にシアル酸を取り込み、蓄積することが判明した。今後プロトプラストを調製して同様の蓄積効率が高まることを確認し、その取り込みの分子機構を調べる。
光及び電子音響スペクトロスコピーの研究

固体材料の新しい評価法として光及び電子音響スペクトロスコピーが注目されている。本研究では、材料及びデバイス評価技術としての光及び電子音響スペクトロスコピーの基礎の確立を目的とし、研究サブセンター構想を中心に系統的かつ広範囲な研究を行なった。研究サブセンター及び各研究分担者において、下記にあげる研究成果が達成された。(1)研究サブセンターでは、紫外から赤外領域にわたる光源と広帯域光変調器を備えた光ビーム走査型音響スペクトロメータ、及び電子ビーム変調機能を備えた電子ビーム走査型音響スペクトロメータが完成している。(2)研究分担者:東北大学では、色素レーザ光を用いた光・熱放射顕微鏡を用いてInドープ無転移n型GaAsウエハの微少欠陥の非接触非破壊観察を行なった。東京大学では、電子線超音波顕微鏡を用いてSEMでは見えないSi-ICの表面下のクラックを観察した。京都大学では、レーザ加工の際に出る音波をPASを用いて検出した。東京工業大学では、マイクロホンやトランスジューサを用いたPASによりZnS,ZnSeSonGaAsのPAS信号について半導体表面のポテンシャルがきくことを明らかにした。大阪大学では、光音響顕微鏡を開発し、Siレーザアニール層をモニタした。金沢大学では、光熱偏向顕微鏡を開発し、a-SiH:Nの吸収係数をα=10【cm^(-1)】まで測定できる装置を開発した。その他の分担者においては、マイケルソン干渉法を用いたPASの開発、相関光音響分光法の開発、水中光音響信号計測用セルの開発、EAMによる表面波発生の理論の完成をおこなった。
フェムト秒光ソリトンパルスを用いた情報通信システムに関する基礎的研究

本研究では,フェムト秒光ソリトンパルスを用いた情報信号システム構築に関わる基礎的諸問題について種々検討し,以下の成果を得た.まず,フェムト秒光ソリトンパルス伝送で問題となる3次分散効果,ショック効果,自己周波数シフト効果など,各種の摂動効果をすべて同時に考慮するとともに,偏波分散の影響を調べるための複屈折光ファイバ中のソリトンパルスの伝搬問題,超高速大容量伝送に不可欠な波長・偏波多重化問題,全光学信号処理のための光ソリトンパルスのスイッチング問題など,様々な光ソリトンパルス間の結合問題を取り扱うことが可能な,より一般化された非線形シュレディンガー方程式を導出した.次に,この一般化された非線形シュレディンガー方程式を解くための高精度数値計算アルゴリズムを考案するとともに,これを中核として,フェムト秒光ソリトンパルスを用いた次世代光通信システムの極限性能を追求するための光ソリトンパルス伝搬シミュレータを開発した.さらに,このシュミレータを駆使して,パルス幅やパルス間隔,あるいはパルス間の位相差などがフェムト秒光ソリトンパルス伝搬に与える影響を詳細に調査した.また,光ソリトンを用いた光論理回路デバイス実現の可能性についても種々検討を加え,各種の摂動効果の存在によってその論理演算動作特性が著しく劣化すること,こうした特性劣化を防ぐために分布定数形利得帯域制限増幅器を用いることを提案し,増幅器の利得や利得帯域幅を適当に調整することによって,光論理回路デバイスとしての動作の安定化を図ることが可能であることを見いだした.本研究では,フェムト秒光ソリトンパルスを用いた情報信号システム構築に関わる基礎的諸問題について種々検討し,以下の成果を得た.まず,フェムト秒光ソリトンパルス伝送で問題となる3次分散効果,ショック効果,自己周波数シフト効果など,各種の摂動効果をすべて同時に考慮するとともに,偏波分散の影響を調べるための複屈折光ファイバ中のソリトンパルスの伝搬問題,超高速大容量伝送に不可欠な波長・偏波多重化問題,全光学信号処理のための光ソリトンパルスのスイッチング問題など,様々な光ソリトンパルス間の結合問題を取り扱うことが可能な,より一般化された非線形シュレディンガー方程式を導出した.次に,この一般化された非線形シュレディンガー方程式を解くための高精度数値計算アルゴリズムを考案するとともに,これを中核として,フェムト秒光ソリトンパルスを用いた次世代光通信システムの極限性能を追求するための光ソリトンパルス伝搬シミュレータを開発した.さらに,このシュミレータを駆使して,パルス幅やパルス間隔,あるいはパルス間の位相差などがフェムト秒光ソリトンパルス伝搬に与える影響を詳細に調査した.また,光ソリトンを用いた光論理回路デバイス実現の可能性についても種々検討を加え,各種の摂動効果の存在によってその論理演算動作特性が著しく劣化すること,こうした特性劣化を防ぐために分布定数形利得帯域制限増幅器を用いることを提案し,増幅器の利得や利得帯域幅を適当に調整することによって,光論理回路デバイスとしての動作の安定化を図ることが可能であることを見いだした.
HtrA1阻害剤と新規ケロイド組織培養法を用いたケロイド治療薬の開発

当初計画していたケロイド組織培養系の確立は、条件検討を試みるも目標とする結果を得られなかったが、研究計画を変更し、ケロイド組織片を免疫不全マウスに移植し、移植動物種と移植法を検討することにより、新規ケロイドモデルを作成することに成功した。HtrA1をノックダウンにより細胞増殖が抑制され、この効果は正常皮膚由来線維芽細胞よりケロイド由来細胞で顕著に認められることが判明した。この結果を本モデルで検証を試みたが、研究期間内に実施できなかった。しかし、新規ケロイドモデルの開発は今後のケロイド研究の発展に大いに貢献するものと期待できる。研究実施計画に基づき、インフォームドコンセントを得たケロイド患者を対象に、ケロイド切除術を実施の際、切除されたケロイド組織を採取、そこから組織円柱組織を切り出し、オーガンカルチャーを試みた。直径3mmパンチでケロイド組織円柱を全層で採取する。この円柱を高さ5mmとなるよう下床をメスにて切除した。低温下で培養皿底面にメピオールジェル層を作成後、コラーゲンスポンジ(140°C熱架橋、平均孔径25マイクロm)を設置。その上に、ケロイド組織円柱を垂直に立つように静かに設置、ただちに温度を常温にし、ゲルを固化させ、円柱を固定する。WE培地を添加し、気液界面培養を行った。2日目の肉眼所見で組織に融解が認められたため、サンプリングして病理学的観察を行った。その結果、組織内に壊死が発生していたため、これ以上の経過観察は中止し、次の症例でやり直すこととした。この後、症例数を3例増やしても同様の結果となるため、組織培養条件の見直しを行った。具体的には、コラーゲンスポンジの除去やメピオールジェルの除去を行ったが、やはり壊死が生じ、結果は改善しなかった。このため、ケロイド病変部の中で病的活動性の高い部位を選んで円柱を作成することを検討した。組織円柱作成は、ケロイド手術後直ちに実施する必要があるため、病変部内の病的活動性が高い部位を選択するためには、術前にその評価を非侵襲的に実施する必要があった。このため、術前にケロイド病変部内の状態の評価法をケロイド4症例で検討したところ、超音波診断器機を用いて剪断波伝搬速度を測定することによりケロイド内部の活動性が評価できることを見いだした。Bagabirら(Exp. Dermatol,21,376-381,2012)の方法に基づき、それを改善した手法で組織培養を試みたが、成功しなかった。そのため、Bagabirらの原法で実施したが、再現性は得られなかった。これは当初予期していなかったことではあるが、Bagabirらの報告では、使用しているケロイド組織が黒人由来のもので、本研究課題では黄色人種である日本人のみである。ケロイドの重症度は、白人より有色人種の方が重症となりやすく、有色人種の中でも黄色人種より黒人の方が重症となる傾向にあるため、人種間の病態特性が影響している可能性が高いと考えられた。形成外科ケロイド組織円柱の高さを、当初の5mmから減少させ、4mmと3mmで検討を行う。また、術前に超音波診断器で剪断波伝達速度を測定し、組織内部で病変活動性の高い部分をマーキングしておき、同部より組織を採取することとする。以上より、すみやかにケロイド組織培養系の確立を目指す。また、このような改善、工夫を行っても、日本人組織を用いてケロイド組織培養が実施できない場合に備えて、組織培養系にかわる新たなモデルの検討も実施する。
有明海における貧酸素水塊発生抑制技術の研究開発

本研究では、夏期に有明海底層部で発生する貧酸素水塊を抑制のために、有明海が持つ自然エネルギーを利用する、負圧利用型海水交換装置とスクリューを利用した海水交換装置を開発した。(1)負圧を利用した海水交換装置の模型実験では、直径0.2m、0.3m、0.4mのパイプを用いた。管内流速は、パイプ上端の接近流速が2.6cm/s以上で発生が確認された。また、管内流速のパイプの太さによる変化は小さかった。(2)負圧利用の現地での適用実験は、直径0.6m、長さ5mの土木用暗渠配水管を用い、管の上端と下端及び管内に電磁流速計を装着し、観測用鋼管に固定して実験をおこなった。期間は平成16年1月10日1月30日までと平成16年8月16日から観測を開始したが、2回目は台風15号によって、装置が破壊され観測が続けられなくなった。1回目の現地調査から、上端の接近流速の最大値は38.2cm/s、管内流速の最大値は下方方向に35.4cm/sであったが両者は時間的に一致していない。管内流速と管上端の接近流速との関係よりも管内流速と有義波高との相関の方が大きく関わることが明らかとなった。これは新しい知見であり、今後の詳細な現地調査が必要である。(3)スクリューによる海水交換技術の開発実験として、高さ0.8m、上部の水車の直径が0.3m、下部の水車の直径が0.1mとして、その両者をシャフトで連結し、表層の流れを底層に伝達できる装置を開発した。農業用水路での実験の結果、上部の水車は、0.5m/sで回転し始めるように設計したが結果では、0.3m/sで回転を始めた。これによって下部の水車が回転し、18m^3/hの底層の流体が移動する結果を得た。現場では、直径1mの上部水車に対して、下部水車が0.5mの場合、表層に0.3m/sの流れがあれば、約100m^3/hの底層の流体を移動させることが期待できる。有明海は閉鎖性が強いため、河川郡から流入した栄養塩は長時間にわたり滞留する。この間に、夏期には高水温となって海水が成層化し、底層が停滞する。この底層に堆積した有機物の分解に大量の酸素が消費される結果、底層水が貧酸素あるいは無酸素状態となる。有明海は干満差が大きく湾奥部では、大潮時には表層で1.0m/s前後の流速に達する。しかし底層ではほとんど流れはないものと考えられる。本研究では、本年は、負圧を利用した海水交換の解析を室内実験と現地観測を用いて実施した。その方法は、揚水管を用いて、下層の停滞水塊を上層に揚水して海水交換を促す方法である。負圧による揚水原理が十分確立していないため実験で検証した。まず実験室において、内径20mmと31mmの2種類の揚水用パイプを用いる。パイプ上端部に流れ(接近流速)を与えることにより、下層の停滞部の水を揚水する(パイプ内の流速:揚水流速)。

実験の結果、接近流速の増加につれて揚水流速は指数関数的に増加する。パイプの内径による変化は、内径が大きくなると揚水流速の増加率が若干大きくなる。たとえば、接近流速がそれぞれ20cm/s、45cm/sの場合揚水流速は7.0cm/s、26cm/sを得る。次に、現地での測定を実施した。諫早湾口北部に農水省が設置している観測タワーを用いて実施した。揚水管として、直径60cm、長さ5mの土木用暗渠排水管を用いた。管中央部に電磁流速計を設置するとともに、パイプの上端と下端の位置にそれぞれ流速計を設置し、接近流速と下層部の流れの測定が出来るようにした。調査期間は平成16年1月10日1月30日である。その結果、上端の接近流速の最大値は38.2cm/sで揚水流速の最大値は5.3cm/sであった。今回の実験では、波浪の影響が大きく、現在詳細な分析を行っている。次回には夏期に実験を行い、底層におけるDOの測定を併せて実施する予定である。本研究では、夏期に有明海底層部で発生する貧酸素水塊を抑制のために、有明海が持つ自然エネルギーを利用した、負圧利用型海水交換装置とスクリューを利用した海水交換装置を開発した。(1)負圧を利用した海水交換装置の模型実験では、直径0.2m、0.3m、0.4mのパイプを用いた。管内流速は、パイプ上端の接近流速が2.6cm/s以上で発生が確認された。また、管内流速のパイプの太さによる変化は小さかった。(2)負圧利用の現地での適用実験は、直径0.6m、長さ5mの土木用暗渠配水管を用い、管の上端と下端及び管内に電磁流速計を装着し、観測用鋼管に固定して実験をおこなった。期間は平成16年1月10日1月30日までと平成16年8月16日から観測を開始したが、2回目は台風15号によって、装置が破壊され観測が続けられなくなった。1回目の現地調査から、上端の接近流速の最大値は38.2cm/s、管内流速の最大値は下方方向に35.4cm/sであったが両者は時間的に一致していない。管内流速と管上端の接近流速との関係よりも管内流速と有義波高との相関の方が大きく関わることが明らかとなった。これは新しい知見であり、今後の詳細な現地調査が必要である。(3)スクリューによる海水交換技術の開発実験として、高さ0.8m、上部の水車の直径が0.3m、下部の水車の直径が0.1mとして、その両者をシャフトで連結し、表層の流れを底層に伝達できる装置を開発した。農業用水路での実験の結果、上部の水車は、0.5m/sで回転し始めるように設計したが結果では、0.3m/sで回転を始めた。これによって下部の水車が回転し、18m^3/hの底層の流体が移動する結果を得た。現場では、直径1mの上部水車に対して、下部水車が0.5mの場合、表層に0.3m/sの流れがあれば、約100m^3/hの底層の流体を移動させることが期待できる。
多重散乱光トモグラフィのコンピュータビジョン的アプローチ

本研究は,等方散乱や単散乱ではなく,より現実に近い多重散乱をモデル化することのできる新しい光トモグラフィの手法を開発するものである.本研究は,物体内部で赤外線が散乱する様子をコンピュータグラフィクスで用いられている手法を用いて解析すること,そしてコンピュータビジョンのアプローチにより逆問題を解き,物体内部の様子を推定することである.本研究では,物体の上部1点から光を入射し,物体の下部から出射する光を観測することで,物体の内部構造(つまり各点における光の消散係数)を推定する.この問題を,近似レイヤ多重散乱モデルを用いた制約条件付き最適化問題として定式化し,効率的な計算方法を考案した.本研究の目的は,人体内部を安全に可視化するための新しいトモグラフィ手法の基礎となる理論を開発することである.本研究では,人体内部で赤外線が散乱する様子をコンピュータグラフィクスで用いられている手法を用いて解析し,コンピュータビジョンのアプローチにより逆問題を解いて物体内部の様子を推定する手法を開発する.本年度の成果は,2次元レイヤモデルを3次元に拡張したことである.2次元モデルの設定は,物体の上部1点から光を入射し,物体の下部1点から出射する光を観測するというものである.従来は,この入射と出射の位置を変えて得られる多数の観測から,物体の内部構造(つまり各点における光の吸収係数)を推定していた.これを3次元へ拡張するために,直方体の物体を格子状に区切り,物体上面に平行に2次元レイヤを形成した.しかし単純に3次元に拡張するだけでは,問題が生じる.これまでは計算量削減のために寄与の小さい光の経路をしきい値で除外していたが,除外されない経路を予測することが困難であり,計算量を制御することができない.これは3次元に拡張した場合には大きな問題となる.また,これまでは光の経路を総当り的に求めていたため,寄与の大きい経路を数え上げるだけでもには計算時間がかかり,非効率であった.そこで,本研究ではモンテカルロ法を用いた確率的な経路生成手法を提案した.この手法によって,寄与の大きい経路を効率的に生成することが可能となった.本研究の目的は,人体内部を安全に可視化するための新しいトモグラフィ手法の基礎となる理論を開発することである.本研究では,人体内部で赤外線が散乱する様子をコンピュータグラフィクスで用いられている手法を用いて解析し,コンピュータビジョンのアプローチにより逆問題を解いて物体内部の様子を推定する手法を開発する.本年度の成果は以下の2つである.1つ目は,減衰項を記述する非線形の指数関数を線形近似し,問題を定式化しなおしたことである.本研究において逆問題を解く部分に計算量が多くなる理由の1つが関数の非線形性である.これを区分線形近似し,非線形性を排除した形に新しく定式化しなおした.その結果,重み付き最小二乗法の反復更新という新しいアルゴリズムを得ることができた.しかしまだ問題が残っており,反復の収束性があきらかではないことと,非線形最適化の反復更新と比較してどの程度の計算量が削減できたのかという定量評価がないことが大きな課題である.これは今後の研究において明らかにする予定である.2つ目は,ヘッセ行列の高速計算式を考案したことである.これまでの定式化と実装では,ヘッセ行列の各要素を個別に計算していたため,変数の数が多くなると計算量が膨大になり,大型計算機を用いても計算が困難であった.そこでヘッセ行列の計算式を新しく導出し,行列計算の形で定式化しなおした.この結果,大幅に計算量を減らすことに成功し,これまで計算量が高いために適用を諦めていたニュートン法を用いて高速に計算を行うことが可能になった.そしてヘッセ行列の禁じ更新を用いる準ニュートン法と,本研究で導出したヘッセ行列を用いたニュートン法を比較し,本研究においてはニュートン法が計算量において優るという結果が得られた.当初の予定通り,計算量を低減するアルゴリズムを開発し,効率的な計算が可能になった.昨年度にはすでに3次元への拡張を行っていたが非効率であったため,今年度の成果により対象が3次元であっても効率的に計算することができる様になった.本研究の目的は,人体内部を安全に可視化するための新しいトモグラフィ手法の基礎となる理論を開発することである.本研究では,人体内部で赤外線が散乱する様子をコンピュータグラフィクスで用いられている手法を用いて解析し,コンピュータビジョンのアプローチにより逆問題を解いて物体内部の様子を推定する手法を開発することである.本年度の成果は,主双対内点法による効率的な推定方法の実装と,導出された効率的なヘッセ行列を実装し,大幅な計算量低下を実現したことである.これまで本研究においては多重散乱トモグラフィを制約付き最適化問題として定式化し,それを内点法の一つである対数障壁法を用いて解いていた.しかし一般に対数障壁法よりも主双対内点法のほうが収束性に優れていると言われている.そのため,本研究では主双対内点法を実装し,本研究における制約付き最適化問題を解くことにより,計算の高速化を実現した.しかし内部反復においてニュートン法を用いており,そのためのヘッセ行列の計算コストが高いという問題があった.そのため,ニュートン法を用いた主双対内点法では準ニュートン法を用いた対数障壁法よりもまだ計算コストが高いことが判明した.

そのため,前年度までの研究成果である効率的なヘッセ行列計算方法を実装し,主双対内点法と組み合わせることで,高速化を実現し,その結果を国際会議で発表した.その後,実装コードを最適化し,従来の準ニュートン法と対数障壁法では500秒かかっていた計算を,ニュートン法と主双対内点法によって20秒程度にまで高速化することが実現できた.この結果は現在国際論文誌に投稿中である.本年度はさらに実物体を用いた計測に着手し,3Dプリンタを用いて様々な形状の物体を作成し,シミュレーションにおける2次元媒体モデルを3次元実物体に対してどのように適用するのかを検討した.主双対内点法と効率的なヘッセ行列計算によるニュートン法を用いることで計算量の低減を実現することができたが,まだ計算量が大きく実行時間がかかる問題があり,このままでは大きい格子モデルのい適用することはまだ困難である.また申請段階に想定していたような実物体への適用はかなり困難であることが判明してきた.本年度に実物体の計測に着手した結果,得られるデータのノイズが大きく,まだモデルと実物体での乖離が大きいため,シミュレーションをそのまま実物体に適用することができていない..本研究の目的は,人体内部を安全に可視化するための新しいトモグラフィ手法の基礎となる理論を開発することである.本研究では,人体内部で赤外線が散乱する様子をコンピュータグラフィクスで用いられている手法を用いて解析し,コンピュータビジョンのアプローチにより逆問題を解いて物体内部の様子を推定する手法を開発することである.本年度の成果は以下のとおりである.主双対内点法と対数障壁法,さらに昨年提案したヘッセ行列と勾配ベクトルの効率的な計算方法,ニュートン法と準ニュートン法の組み合わせを比較検討した結果,それぞれの利点が明らかになった.まずいずれの組み合わせにおいても,効率的なヘッセ行列計算方法を用いることで計算速度が向上することがわかった.もっとも高速化されたのは,対数障壁法とニュートン法の組み合わせであり,従来の計算方法では1万秒程度の計算時間がかかるが,提案する計算方法では60秒程度にまで減少することが確認された.主双対内点法を用いた場合,ほとんどの場合に対数障壁法よりも計算時間が短縮された.しかし準ニュートン法を用いる場合,対数障壁法のほうが計算時間が短い場合があることが確認された.これは準ニュートン法による勾配ベクトル計算の近似精度が主双対内点法の収束性能に悪影響を及ぼしていると考えられるためである.したがって主双対内点法を用いる場合には準ニュートン法ではなくニュートン法を採用したほうが良いことがわかった.また3Dプリンタを用いて様々な形状の物体を作成し,2次元と3次元での散乱の違いを実物体での計測を行った.その結果,2次元散乱を上下から再反射させることによって,3次元散乱に近い形状が得られることが確認された.本研究は,等方散乱や単散乱ではなく,より現実に近い多重散乱をモデル化することのできる新しい光トモグラフィの手法を開発するものである.本研究は,物体内部で赤外線が散乱する様子をコンピュータグラフィクスで用いられている手法を用いて解析すること,そしてコンピュータビジョンのアプローチにより逆問題を解き,物体内部の様子を推定することである.本研究では,物体の上部1点から光を入射し,物体の下部から出射する光を観測することで,物体の内部構造(つまり各点における光の消散係数)を推定する.
抗アクアポリン４抗体陽性視神経脊髄炎に対する基礎的病態解析と新規治療法の開発

CGRP遺伝子導入樹状細胞を用い,実験的自己免疫性視神経炎(EAON)に対する遺伝子治療の可能性について検討した.細胞注入群において, EAONの発症率は対照群の80%と比較すると, CGRP遺伝子導入群では50%と有意に抑制された.また, EAONの病理組織学的評価においても対照群に比べ有意に抑制した.CGRP遺伝子導入群から得られた脾細胞培養上清ではIL-10が高値となった..さらに、抗アクアポリン4抗体陽性視神経炎患者血清を採取し、二次元電気泳動(2D-DIGE)を行い、protein AMBPおよびNicolin-1が患者血清と正常血清との間でスポット上の差を認めた。AQP4抗体陽性かつステロイドパルス療法不応例である視神経脊髄炎(NMO)患者症例から、血漿交換療法時に発生した廃棄血漿を患者の同意の下に回収し、IgG分画の抽出精製した(東京医科大学倫理委員会承認番号1971)。1.NMO血漿のアストロサイトへの障害の検討-in vivoモデル作成-C57BL6/Jマウスを用いて、ミエリン蛋白(MOG35-55)を強化検疫し、(300μg/匹)同時に百日咳トキシン(100μl/マウス)を腹腔内投与し、EAE-EAON(実験的自己免疫性視神経炎モデル)を作成した。患者血漿をIgGカラムNMO-IgGをマウスに免役する2日前から2回、100mg/匹の割合で腹腔内投与した。免疫14日目にマウスを屠殺して、視神経のアストロサイトの障害をH-E染色で確認するのと同時に、GFAP染色で評価した。また視神経炎に対して、OptomotryTMで視力測定を行い、臨床的にスコア評価を行ったところ、NMO-IgG投与マウス群で視力の低下が認められた。2.NMO-IgGのマウスアストロサイトの反応性を検討-in vitroモデル- NMO-IgG内に抗AQP4抗体が含まれているため、NMO-IgGはアストロサイト上に存在するAQP4を認識することが予想される。このため、大脳皮質由来のアストロサイトを新生児マウスより単離し培養して、アセトン固定後に以下の抗体と反応させ、免疫染色法で評価した。結果は、実験群(アストロサイト: GFAP-FITC (マウス由来)+抗ヒトIgG抗体)においてアストロサイト上のAQP4と反応し、染色されることを確認した。培養上清サイトカインをELISA、フローサイトメトリーを用いて測定したが、有意なサイトカイン上昇は得られなかった。実験1:NMO-IgGのアストロサイト障害性の検討-ex vivoモデル-NMO-EAONのin vivo、ex vivoモデルを昨年度の方法で作成して、視神経組織の培養下でヒトIgG 0.5-1.0mg/ml+ヒトNMO-IgG+補体を加えて、組織の変化を解析した。組織染色はアストロサイトの生存率を中心に検討した。NMO-EAONのin vivoモデルはNMO-IgGの状態によるものか、発症率にバラツキがあり、高濃度IgG投与実験の陽性コントロールとして問題があった。一方、実験1で示したex vivoモデルについては、高濃度IgGのin vitro投与により、NMO-IgG+補体群で抑制されたGFAP染色面積が一定量の割合で復元された。神経ペプチドであるcalcitonin gene-related peptide(CGRP)は免疫制御作用を有しており,我々はCGRP遺伝子導入樹状細胞を用い,実験的自己免疫性視神経炎(experimental autoimmune optic neuritis:EAON)および実験的自己免疫脳脊髄炎(experimental autoimmune encephalomyelitis:EAE)に対する遺伝子治療の可能性について検討した.遺伝子導入細胞の生存率は80%で,遺伝子導入効率は50%であった.EAONおよびEAEはmyelin oligodendrocyte glycoprotein(MOG) 35-55をマウスに強化免疫することによって発症させた.免疫後1日目の細胞注入群において, EAEの発症率は対照群の80%と比較すると, CGRP遺伝子導入群では50%と有意に抑制された.また, EAONの病理組織学的評価においても対照群に比べ有意に抑制した(CGRP遺伝子導入群:対照群=1:2). EAE-EAON発症直前である9日目の細胞注入群では, EAEの臨床学的評価(CGRP遺伝子導入群:対照群=1.5:3)およびEAONの病理組織学的評価(CGRP遺伝子導入群:対照群=1:2)は有意に抑制された.DHはCGRP遺伝子導入成熟樹状細胞の注入により抑制された.CGRP遺伝子導入群から得られた脾細胞培養上清ではIL-10が高値となり,さらに脾細胞の制御性T細胞のマーカーであるCD4+CD25+Foxp3の発現が有意に高値を示した.これらの結果から、CGRP遺伝子導入細胞による遺伝子治療はIL-10および制御性T細胞の上昇によってEAONおよびEAEの発症を抑制すると考えられた.マウス視神経炎ではこのように実証できたが、ヒト視神経炎ではマウスと発症原因に関与するタンパクがMOGもしくは抗アクアポリン4抗体のみとは限らないため、ヒト検体を用いて血清中の発症原因タンパク解析を行う必要がある。ヒト視神経炎がマウス視神経脊髄炎と同一の原因タンパクがどうかを判定するためには、2次元電気泳動(2D-DIGE)を用いて、視神経炎患者から得られた原因タンパク解析を行う必要があった。

現在まで、正常人から得られた血清と、抗アクアポリン4抗体陽性視神経炎患者および抗MOG抗体陽性視神経炎患者から得られた血清を比較した2D-DIGE実験では、病因となる得る9種類の新規タンパクを同定した。特に重要な病因タンパクとなり得る2種類については、多数の視神経炎患者から得られた血清を用いてELISAを行う必要があるが、ELISAキットが国内にはなく、米国からの輸入待ちとなった。このために本研究が平成27年度内に終了せず、平成28年まで延期することとなった。マウス視神経脊髄炎は、CGRP遺伝子導入細胞もしくはIL-10遺伝子導入細胞療法により、発症抑制可能であることが判明した。一方、マウス視神経脊髄炎の病態がヒト視神経炎の病態と一致するかどうか、未だ不明であった。このため、抗アクアポリン4抗体陽性視神経炎患者血清を採取し、二次元電気泳動(2D-DIGE)を行い、原因タンパクの同定を試みた。結果は、protein AMBPおよびNicolin-1が患者血清と正常血清との間でスポット上の差を認めた。一方、特発性視神経炎患者から得られた血清では正常血清と差が見られなかった。他に、Adiponectin, Carbonic anhydrase 1, Carbonic anhydrase 2で抗アクアポリン4抗体陽性視神経炎患者血清と正常血清との間でわずかに差を認めたが、有意差はなかった。抗アクアポリン4抗体陽性視神経炎患者血清と正常血清との間で有意差がみられたprotein AMBPおよびNicolin-1のタンパクにおいて、抗アクアポリン4抗体陽性視神経炎の病態と関与するか確かめるために、患者血清を用いてELISAを行った。12検体の患者血清を用いて、正常血清と比較したところ、protein AMBPでは差を認めなかった。一方、Nicolin-1では正常血清に比べて抗アクアポリン4抗体陽性視神経炎患者から得られた血清では、多い傾向が見られた。ただし、Nicolin-1は二次元電気泳動でtotal ion scoreが小さく、タンパク由来のシグナルが弱いと予想されるため、今後、より検体数を多くして精査する必要があると考えられた。CGRP遺伝子導入樹状細胞を用い,実験的自己免疫性視神経炎(EAON)に対する遺伝子治療の可能性について検討した.細胞注入群において, EAONの発症率は対照群の80%と比較すると, CGRP遺伝子導入群では50%と有意に抑制された.また, EAONの病理組織学的評価においても対照群に比べ有意に抑制した.CGRP遺伝子導入群から得られた脾細胞培養上清ではIL-10が高値となった..さらに、抗アクアポリン4抗体陽性視神経炎患者血清を採取し、二次元電気泳動(2D-DIGE)を行い、protein AMBPおよびNicolin-1が患者血清と正常血清との間でスポット上の差を認めた。Ex vivo実験は、概ね実験計画は順調に進展している。しかし、In vivoモデルはまだ発症率が不安定であり、高濃度IgGを用いた治療実験で有意な結果が得られなかった。NMO-EAONのin vivoモデルは投与経路が腹腔内のために発症率が一定しないのかもしれない。