hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
食餌中Cdの化学形態がマウス体内Cdの動態と存在状態へ及ぼす影響

イネを、Cdを含む土耕で栽培し、1.7kgのCd含有米を得た。金属分析からはこのコメにはCdが3.9ppm含まれていることが分った。Cd米におけるCdの化学形態をHPLC-ICP/MSで解析すると、高分子量画分にCdに基づくピークが4個確認された。マウスへの投与実験から、CdならびにCd-グルタチオン錯体ではCd蓄積に変化が認められなかったが、Cd米では肝と腎へのCd蓄積が増加することが認められた。Cd含有米でのCdの化学形態を調べた。まず、試料を分砕の後、50mM HEPES/NaOH緩衝液(pH7.0)での抽出を試みた。その結果、可溶性画分には全体の20%のCdが存在し、残りは不溶体として存在していた。緩衝液のpHを2.5とすると、約50%のCdが可溶性画分に存在したことから、コメの中でCdは何らかの物質と結合して不溶化していると考えられた。なお、この結合はpHの低下で切断されることから、比較的弱い結合であると推察される。コメ中のCd結合物質を分析するために高速液体クロマトグラフィーの検出法としてバソクプロインスルホン酸蛍光の脱消光を利用した。現在、ゲルろ過のカラムを用いてコメに含まれるCd結合物質の単離を行っている。マウスによるCdの化学形態と摂取量の関係はAIN93M組成の粉末飼料を対照食とし、これにCd硫酸塩、またはCd-グルタチオン錯体をCd濃度として、0.05または3mg/kg添加した特注飼料を用いた飼育期間を通じて、肉眼的な変化や行動異常はいずれの群でも認められなかった。体重の増加抑制は認められず、CdSO4-3群とCd comple 0.05群は、投与2週目以降はCont群より体重が増加する傾向があった。また、肝臓および腎臓重量は、Cd投与による変化は認められなかった。Cd含有餌摂食により肝臓および腎臓のCd濃度はCont群と比較して増加した。Cd濃度は、0.05mg/kg群<3mg/kg群、肝臓<腎臓であり、CdSO_4とCD-グルタチオン錯体の差は認められなかった。イネをCdを含む土耕栽培で、1.7kgのCd含有米が得られた。この玄米を精米して白米を取得し、金属分析に供した。その結果、Cd含有米にはCd,3.9ppm;Zn,17.5ppm;Cu,2.9ppmを含むことが分かった。この値は、コントロール米の金属分析値、Cd,02ppm;Zn,11.1ppm;Cu1.1 ppmと比べるといずれも高い値を示したため、マウスへ食餌として与える場合にはこれらの影響を勘案する必要があることがわかった。Cd米におけるCdの化学形態について、二つの手法で解析を行った。HPLC-ICP/MSによる分析のために、Cd結合物質の抽出条件を検討した。粉砕試料100mgに冷抽出液1000μLを加えて冷暗所で1昼夜放置し、可溶化したCd結合物質を、Cd濃度を指標として求めた。抽出液として、50mM Tris-HNO3(pH7.4)とこれに0,1%SDSを加えたものに関して検討した結果、前者では15%であった抽出率が、後者では45%と大幅な改善が認められた。この抽出液をHPLC-ICP/MSで分析した結果、高分子量画分にCd-114に基づくピークが4個確認された。また、Cd-キレータ特異的分析法の開発では、BCSを用いる方法からTPPを用いる方法へと変更を行った。これは、Cu(1)-BCS錯体が比較的酸化を受けやすく、そのコントロールに多大の労力を必要としたからである。Cd(II)-TPP錯体をポストカラム溶液として用いる方式では、簡便にCd結合物質の選択的定量ができるようになった。マウスにおけるCd含有米を食餌とした実験では、Cd含有米において見られた他の金属濃度の上昇を考慮した食餌の作成を行い、実験を継続中である。今年度はCd含有米を摂食させたときのマウス体内Cd分布を調べた。Cd含有米を38.5%加えたAIN93M組成の飼料を4週間摂食させたマウス肝臓および腎臓中Cd濃度は168.4±72.9および265.1±54.2 mg/kg wetであった。Cont米群(3.6±0.9および7.2±5.7 mg/kg wet)に比して非常に高く、濃度は肝臓<腎臓であった。Cont米にCd無機塩を添加した場合も、Cd濃度が増加し濃度は肝臓<腎臓であった。

また、米を含まないAIN93M組成飼料にCdを添加した飼料を摂食させた結果から、Cd米の方が肝臓へCdが高濃度に蓄積する傾向が見られ、Cd米の中での化学形態が肝臓への蓄積に影響している可能性が考えられた。これらの結果は、Cdを無機塩あるいはグルタチオンとの錯体として加えた場合とは好対照の結果であった。すなわち、CdSO4とCd-グルタチオン錯体をAIN93Mに加えて摂食させた場合には、肝臓および腎臓のCd濃度はCont群と比較して増加し、Cd濃度は、0.05 mg/kg群<3 mg/kg群、肝臓<腎臓であり、CdSO4とCd-グルタチオン錯体の差は認められなかった。AIN93M組成+Cdを4週間摂食したあと、Cd無添加のAIN93M組成飼料に切替えて、さらに4週間飼育すると、肝臓および腎臓のCd濃度は減少した。肝臓中濃度が約1/2になるのに対し、腎臓中濃度は2割程度しか減少せず、腎臓に蓄積したCdは長く留まることが示された。以上の結果は無機化合物と高Cdコメを用いた場合には、Cdの体内動態が異なることを示唆するものであり、大変興味が持たれる結果である。Cd含有米の分析は順調に進んでいるが、大量のCd含有米の精米に手間取り、食餌作成が若干遅れた。24年度が最終年度であるため、記入しない。Cdキレーターの分析に関しては、分析法の最適化が終了している。また、Cd含有米の抽出物によるHPLC-ICP-MS分析により、Cd結合物質の分子量が判明した。こんご、複数のクロマトグラフィーを組み合わせ、Cd結合物質の特定を行う。また、Cd含有米を食餌としたマウス臓器の分析と合わせて当初の目的であるCdの化学形態による毒性発現の差異を明らかにする。
病害応答における低酸素ストレス応答との拮抗制御の分子機構に関する研究

昨年度までに、イネにおいてジテルペノイド型ファイトアレキシン合成遺伝子の転写制御を行う転写因子DPFの遺伝子の転写が、サリチル酸シグナルの活性化時には転写活性化因子WRKY45および転写抑制因子WRKY62のヘテロダイマーによって活性化すること、また低酸素ストレス応答時にはWRKY62のホモダイマーによって抑制されることを示唆する結果を得た。今年度は、このことについてさらに検証するため、DPF遺伝子プロモーター中に特定したシスエレメント(W-box)をプローブとして用い、ゲルシフトアッセイを行った。その結果、WRKY45単独、WRKY62単独、WRKY45&#8211;WRKY62複合体のいずれの場合も、当該シスエレメントに高アフィニティかつ高特異性で結合することを明らかにし、DPF遺伝子の制御に関わる上記のモデルをさらに裏付けることができた。またWRKY62遺伝子のRNAi抑制体イネを用いたマイクロアレイ解析を行い、DPF等の病害応答関連遺伝子以外にどのような遺伝子がWRKY62の制御を受けているかについて調査を行った。その結果、Alcohol dehydrogenase 2遺伝子、stearoyl-acyl carrier protein 9-desaturase 6遺伝子およびERF型転写因子遺伝子などの冠水応答性遺伝子群がWRKY62によって正に制御されていることが明らかになった。以上の結果はWRKY62が、サリチル酸シグナル応答時と低酸素ストレス応答時とでは異なる役割を担い、病害応答と低酸素ストレス応答のトレードオフを制御する役割を果たしていることを示唆している。27年度が最終年度であるため、記入しない。イネの病害応答サリチル酸(SA)シグナル伝達経路によるジテルペン型ファイトアレキシン(DP)合成遺伝子群の発現制御に、転写因子DPF(BU2より改名)、WRKY45、WRKY62の三者が関与する転写制御カスケードSA/BTH →WRKY45 →WRKY62 →DPF →DPを示唆する結果をこれまでに得ていた。本研究では、この制御の分子機構を解明するため、各過程の転写制御の詳細な解析を行っている。DPFによりジテルペン型ファイトアレキシン(DP)合成遺伝子の発現が制御されているか否かを調べるため、DPF遺伝子のRNAi抑制を目的としたイネ植物体を作製した。同時にTOS17挿入による機能欠損変異体をPCRスクリーニングにより探索したが、挿入変異体は見いだされなかった。また、DPFによるDP合成遺伝子の制御について解析するため、ファイトカサンの生合成遺伝子CPS2の上流配列をルシフェラーゼ遺伝子に接続したレポーター遺伝子およびDPFを発現させるエフェクター遺伝子を用いてイネ葉鞘での一過的発現による転写制御活性解析を行い、DPFによるCPS2の転写活性化にN-box配列が必要であることを明らかにした。DPF遺伝子の転写は、転写活性化因子WRKY45および転写抑制因子WRKY62の両者に依存していることがわかっていた。この制御の詳細を解析するため、DPF遺伝子の上流配列をレポーターとした上記と同様の一過的発現による解析により、WRKY45単独では本レポーター遺伝子を活性化し、WRKY62単独では活性化しないことがわかった。一方、WRKY45とWRKY62が共存すると、WRKY45単独の場合より数倍強い活性化が見られた。これらの結果から、SA経路においてWRKY45とWRKY62とが協調的にDPF遺伝子を制御していることが示唆された。DPF遺伝子(DPF)のRNAi抑制した形質転換イネを作製した結果、根において、DPFのRNAi抑制が効いていることがわかった。これらのイネの根において、DPF抑制系統では野生型と較べてDP合成遺伝子の多くが顕著に抑制され、それとともにDPの蓄積が著しく低下していることがわかった。一方、DPF過剰発現系統では、DPの蓄積が著しく増加していた。これらのことから、DPFがDP合成遺伝子群の転写のキーとなる転写因子であると結論した。また、昨年度、DP生合成遺伝子CPS2の上流配列を接続したルシフェラーゼ・レポーター遺伝子およびDPFを発現させるエフェクター遺伝子を用いた一過的発現において、DPFによるCPS2の転写活性化にN-box配列が必要であることを見だしたが、今年度は別のDP合成遺伝子CYP99A2について同様の実験を行い、やはりN-box配列様の配列が必要であることを明らかにした。DPFの転写は、転写活性化因子WRKY45および転写抑制因子WRKY62の両者に依存していることがわかっていた。昨年度、DPFの上流配列をレポーターとした上記と同様の一過的発現による解析により、WRKY45単独でも本レポーター遺伝子を活性化するが、WRKY45とWRKY62が共存するとさらに強くレポーター遺伝子の活性化が起こることを見だした。今年度はこの点をさらに詳細に解析し、両者の分子数がほぼ同等の時に転写活性が最大になることがわかった。また、WRKY62単独ではレポーター遺伝子の活性が強く抑制されることがわかった。さらに、WRKY45とWRKY62とは、酵母2ハイブリッド法および免疫共沈降法により、それぞれのホモダイマーおよび両者のヘテロダイマーを形成することがわかった。これらの結果から、WRKY45とWRKY62とが、異なるダイマー形成を介して協調的にDPFを制御していることが示された。

昨年度までに、イネにおいてジテルペノイド型ファイトアレキシン合成遺伝子の転写制御を行う転写因子DPFの遺伝子の転写が、サリチル酸シグナルの活性化時には転写活性化因子WRKY45および転写抑制因子WRKY62のヘテロダイマーによって活性化すること、また低酸素ストレス応答時にはWRKY62のホモダイマーによって抑制されることを示唆する結果を得た。今年度は、このことについてさらに検証するため、DPF遺伝子プロモーター中に特定したシスエレメント(W-box)をプローブとして用い、ゲルシフトアッセイを行った。その結果、WRKY45単独、WRKY62単独、WRKY45&#8211;WRKY62複合体のいずれの場合も、当該シスエレメントに高アフィニティかつ高特異性で結合することを明らかにし、DPF遺伝子の制御に関わる上記のモデルをさらに裏付けることができた。またWRKY62遺伝子のRNAi抑制体イネを用いたマイクロアレイ解析を行い、DPF等の病害応答関連遺伝子以外にどのような遺伝子がWRKY62の制御を受けているかについて調査を行った。その結果、Alcohol dehydrogenase 2遺伝子、stearoyl-acyl carrier protein 9-desaturase 6遺伝子およびERF型転写因子遺伝子などの冠水応答性遺伝子群がWRKY62によって正に制御されていることが明らかになった。以上の結果はWRKY62が、サリチル酸シグナル応答時と低酸素ストレス応答時とでは異なる役割を担い、病害応答と低酸素ストレス応答のトレードオフを制御する役割を果たしていることを示唆している。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。イネの病害応答サリチル酸(SA)シグナル伝達経路によるジテルペン型ファイトアレキシン(DP)合成遺伝子群の発現制御における、転写因子DPF、WRKY45、WRKY62の三者が関与する転写制御カスケードを証明するため、各素過程の解析を行っている。DPFによるCPS2(DP合成遺伝子の一つ)遺伝子の転写制御が証明されたことは、DPFによるDP合成遺伝子が統括的に制御されていることの証明に向けた重要なステップの達成と考えている。DP合成遺伝子の発現が、SA経路中の転写活性化因子WRKY45のみならず転写抑制因子WRKY62にも依存していることは謎であり、その仕組みを解明することにより、病害応答とその他の制御(環境応答等)の関係を解明し得ると考えている。今年度、DPF遺伝子の転写制御にWRKY45とWRKY62の両者が協調的に関わっていることが示されたことは本研究の核心に関わる部分であり、これによりさらに踏み込んだ解析と仮説の検証が可能になった。DPFによるDP合成遺伝子の転写制御については、DP合成遺伝子のひとつであるCPS
骨髄低形成発症機序の解明:Fanconi貧血原因遺伝子の機能解析

Fanconi貧血(FA)は常染色体劣性遣伝形式により発症する遣伝性疾患であり、高率に起こる骨髄低形成を特徴とする。本症は、8つの相補性群(A,B,C,D1,D2,E,F,G群)に分類され、B群を除く原因遺伝子は全てクローニングされている。しかし、その遣伝子産物の機能は不明のままであり、骨髄低形成を発症する機序に関しては、TNF-αの関与を示唆する実験結果が報告されているものの、その詳細は明らかではなかった。我々はFA蛋白質の機能を明らかにすることを目的として、FANCAをbaitとしたyeast two-hybrid実験を行ない、IKK2をFANCA結合蛋白として同定した。IKK2は、NF-κBの活性化に必須である巨大複合体:inhibitor κB(IκB)kinase(IKK)complexの重要な構成因子の一つである。TNF-αは、細胞にアポトーシス誘導シグナルを伝えるが、同時にNF-κBの活性化を介して抗アポトーシス作用も惹起する。NF-κBは、通常、細胞質でIκBに結合して非活性型の状態で存在するが、細胞がTNF-α刺激を受けると、IκBがIKK complexによりリン酸化を受け、ユビキチン化の後に26Sプロテオソームにより分解される。すると、NF-κBはフリーの活性型となり、核へ移行して本来の転写因子としての働きを発揮し、抗アポトーシス作用を発揮すると考えられている。FANCAはIKK2との結合を通じてIKK complexの機能を修飾することにより細胞のアポトーシス誘導への感受性を調節している可能性があると考えられた。実際、FA-A群患者由来リンパ球と、これにレトロウイルスにより正常のFANCA cDNAを導入したリンパ球をTNF-αで刺激した後に細胞内のIκB量を比較すると、後者においてdegenerationが亢進しているというデータが得られた。これは、FA-A群患者由来リンパ球では、TNF-α刺激後にNF-κBを介した抗アポトーシス作用がおこりにくいことを意味しており、TNF-αのアポトーシス作用が強調される結果、細胞がアポトーシスに陥りやすくなっていることが予想される。この一連の研究は、FA細胞のアポトーシス誘導への高感受性のメカニズムの一端を説明しうるものであると思われる。再生不良性貧血などの骨髄低形成をきたす疾患について、その骨髄低形成を発症する分子病態については不明な点が多いのが現状である。骨髄低形成をきたす疾患の中でも、Fanconi貧血は近年その原因遺伝子が続々とクローニングされており、その遺伝子産物の機能解析を行うことにより分子病態が解明されることが期待される。そのうちの一つであるFANCA遺伝子産物をbaitとしたyeast two-hybrid法により、FANCA蛋白質と結合するものとしてIKK-2がクローニングされた。IKK-2の細胞内における機能は以下の通りである。TNF-αは細胞にアポトーシスを誘導するシグナルを伝えるが、同時にNF-кBの活性化を通じてanti-apoptoticなシグナルも伝える。IKK-2は、NF-кBの活性化に必須である巨大複合体分子:IKK signalsomeの重要な構成因子の一つである。

我々の研究結果から、FANCA蛋自もIKK signal someのcomponentの一つであることがわかった。今後はFANCA遺伝子産物のIKK signalsome内における機能を明らかにする予定であるが、FANCA遺伝子産物がIKK-2とのinteractionによりIKK signalsomeの活性を上昇させ、細胞をanti-apoptoticな状態にすることに寄与していると仮定すると、Fanconi貧血細胞におけるアポトーシス誘導に対する高感受性を分子レベルで説明できることになり、Fanconi貧血の分子病態の解明に大いに貢献するものと思われる。また、他の骨髄低形成をきたす疾患でもNF-кBの活性化に異常がある可能性を示唆するものである。Fanconi貧血(FA)は常染色体劣性遺伝形式により発症する遺伝性疾患であり、高率に起こる骨髄低形式を特徴とする。本症は、8つの相補性群(A,B,C,D1,D2,E,F,G群)に分類され、B群を除く原因遺伝子は全てクローニングされている。しかし、その遺伝子産物の機能は不明のままであり、骨髄低形成を発症する機序に関しては、TNF-αの関与を示唆する実験結果が報告されているものの、その鮮細は明らかではなかった。我々はFA蛋白質の機能を明らかにすることを目的として、FANCAをbaitとしたyeast two-hybrid実験を行ない、IKK2をFANCA結合蛋白として同定した。IKK2は、NF-κBの活性化に必須である巨大複合体:inhibitor κB(IκB)kinase(IKK)complexの重要な構成因子の一つである。TNF-αは、細胞にアポトーシス誘導シグナルを伝えるが、同時にNF-κBの活性化を介して抗アポトーシス作用も惹起する。NF-κBは、通常、細胞質でIκBに結合して非活性型の状態で存在するが、細胞がTNF-α刺激を受けると、I_κBがIKK complexによりリン酸化を受け、ユビキチン化の後に26Sプロテオソームにより分解される。すると、NF-κBはフリーの活性型となり、核へ移行して本来の転写因子としての働きを発揮し、抗アポトーシス作用を発揮すると考えられている。FANCAはIKK2との結合を通じてIKK complexの機能を修飾することにより細胞のアポトーシス誘導への感受性を調節している可能性があると考えられた。実際、FA-A群患者由来リンパ球と、これにレトロウイルスにより正常のFANCA cDNAを導入したリンパ球をTNF-αで刺激した後に細胞内のIκB量を比較すると、後者においてdegenerationが亢進しているというデータが得られた。これは、FA-A群患者由来リンパ球では、TNF-α刺激後にNF-κBを介した抗アポトーシス作用がおこりにくいことを意味しており、TNF-αのアポトーシス作用が強調される結果、細胞がアポトーシスに陥りやすくなっていることが予想される。この一連の研究は、FA細胞のアポトーシス誘導への高感受性のメカニズムの一端を説明しうるものであると思われる。
イネ種子グルテリンの小胞体からの輸送に関わる因子の機能解明とその育種的利用

コメにはデンプンのみならず,約78%の貯蔵タンパク質が含まれている.コメ貯蔵タンパク質、グルテリンは小胞体で前駆体型として合成され、ゴルジ体を経由し、液胞へと輸送される。液胞内で前駆体は2つに開裂し、成熟型グルテリンとして蓄積される。本研究の目的は、グルテリンの合成・輸送に関わる因子の同定及びその因子の機能を明らかにすることである。申請者らはグルテリン前駆体の細胞内輸送に関わる因子、Golgi transport 1 (GOT1B)を明らかにしたが、その機能の詳細については未解明であった。GOT1Bの存在部位を調べたところ、GOT1Bは小胞体膜に存在していたことから、GOT1Bはグルテリン前駆体及びグロブリンの小胞体からの輸送に関与していることが示唆された。グルテリン前駆体を高蓄積する変異体、Glup1,Glup5,glup7変異の原因となる因子は未解明である。これら3変異の原因となる因子の機能を推定するために、3変異体の貯蔵タンパク質の局在を蛍光及び電子顕微鏡解析により調査した。その結果、Glup1及びglup7変異体種子において、グルテリン、グロブリン、プロラミンを集積するタンパク質顆粒が小胞体内に存在していた。got1b変異体と同様の蓄積形態を示したことから、Glup1及びglup7変異は、got1b変異と同様にグルテリンの小胞体からの輸送に関わる因子の変異であると示唆された。また、Glup5変異体種子において、グルテリン及びグロブリンは細胞外に存在し、Paramural body(PMB)を形成していた。glup4/rab5a及びglup6/gef変異体においても、同様にPMBが存在したことから、Glup5変異はglup4/rab5a及びglup6/gef変異と同様に、グルテリン及びグロブリンのゴルジ体から液胞への輸送に関わる因子の変異であることが示唆された。野生型におけるGOT1Bの細胞内局在をSDGーWestern blotにより調べた結果、GOT1BはCis-ER、PB-ER、ゴルジ体に局在することが示唆された。更に、GOT1Bの局在を免疫電子顕微鏡解析により調査した結果、GOT1BはCis-ER、PB-ER、細胞膜、デンスベジクル、液胞に局在が認められた。しかし、ゴルジ体膜にはその局在が認められなかった。両実験結果は一致しなかったものの、GOT1Bは小胞体膜(Cis-ER、PB-ER)に局在し、Cis-ERからのグルテリン前駆体及びPB-ERからのグロブリンの輸送に関与していることが考えられた。一方、GOT1Bがゴルジ体膜に局在するか否かは未解明のままであり、再度検討する必要がある。グルテリン前駆体を高蓄積する3変異体(Glup1,Glup5及びglup7)種子における貯蔵タンパク質の蓄積形態を調査した。その結果、Glup1及びglup7変異体において、グルテリンとグロブリン、プロラミンが集積する変異PBが小胞体内に認められた。glup2/got1b変異においても同変異PBが存在した(Fukuda et al., 2016)。従って、Glup1及びglup7変異はglup2変異と同様にグルテリン前駆体の小胞体からの輸送に関わる因子の変異であることが示唆された。Glup5変異体において、グルテリン及びグロブリンを蓄積するParamural body (PMB)が認められた。glup4及びglup6変異体においても、PMBが存在していた(Fukuda et al., 2011, 2013)。従って、Glup5変異はglup4及びglup6変異と同様にゴルジ体から液胞への輸送に関わる因子の変異であると考えられる。上記の結果は、遺伝子間相互作用解析の結果と対応しており、期待していた通りの結果が得られた。イネ種子胚乳細胞内における、GOT1Bの機能を明らかにするために、まず同因子の局在解析を行う。前年度に行ったSDG-western blot解析の結果、GOT1Bは小胞体(Cis-ER及びPB-ER)膜及びゴルジ体膜に存在することが示唆された。そこで、GOT1B抗体を用いて、野生型の登熟種子の電子顕微鏡解析を行い、GOT1Bがゴルジ体膜に存在するか否かを再度検討する。小胞体からゴルジ体への物質輸送にはCOPII小胞が関与している。近年、COPII小胞形成に関与するSar1がイネ種子胚乳細胞において、グルテリン前駆体の小胞体からの輸送に関与することを明らかにした(Tian et al. 2013, J. of Experimental Botany, 64)。しかし、イネ種子胚乳細胞内において、そのCOPII小胞を電子顕微鏡で捕らえたことが未だかつて無い。そこで、電子顕微鏡解析により、COPII小胞の特定を試みる。そのために、高圧急速凍結固定法を用いてイネ種子を包埋し、解析する予定である。更に、種子の連続切片を作成し、COPII小胞の3D画像の構築も試みる。小胞体から出芽するCOPII小胞をイネ胚乳細胞内で見出す事ができたなら、そのCOPII小胞の膜にGOT1Bが局在していることを、免疫電子顕微鏡解析により明らかにする予定である。現在、glup7変異遺伝子を同定するために、次世代シークエンスによる解析が進行中である。GLUP

7遺伝子が同定されたなら、glup7の同座変異体をTilling法により選抜し、同座変異体における貯蔵タンパク質の蓄積形態を調べ、グルテリン、グロブリン、プロラミンの小胞体内での異常蓄積がglup7変異に因ることを明らかにする。コメにはデンプンのみならず,約78%の貯蔵タンパク質が含まれている.コメ貯蔵タンパク質、グルテリンは小胞体で前駆体型として合成され、ゴルジ体を経由し、液胞へと輸送される。液胞内で前駆体は2つに開裂し、成熟型グルテリンとして蓄積される。本研究の目的は、グルテリンの合成・輸送に関わる因子の同定及びその因子の機能を明らかにすることである。申請者らはグルテリン前駆体の細胞内輸送に関わる因子、Golgi transport 1 (GOT1B)を明らかにしたが、その機能の詳細については未解明であった。GOT1Bの存在部位を調べたところ、GOT1Bは小胞体膜に存在していたことから、GOT1Bはグルテリン前駆体及びグロブリンの小胞体からの輸送に関与していることが示唆された。グルテリン前駆体を高蓄積する変異体、Glup1,Glup5,glup7変異の原因となる因子は未解明である。これら3変異の原因となる因子の機能を推定するために、3変異体の貯蔵タンパク質の局在を蛍光及び電子顕微鏡解析により調査した。その結果、Glup1及びglup7変異体種子において、グルテリン、グロブリン、プロラミンを集積するタンパク質顆粒が小胞体内に存在していた。got1b変異体と同様の蓄積形態を示したことから、Glup1及びglup7変異は、got1b変異と同様にグルテリンの小胞体からの輸送に関わる因子の変異であると示唆された。また、Glup5変異体種子において、グルテリン及びグロブリンは細胞外に存在し、Paramural body(PMB)を形成していた。glup4/rab5a及びglup6/gef変異体においても、同様にPMBが存在したことから、Glup5変異はglup4/rab5a及びglup6/gef変異と同様に、グルテリン及びグロブリンのゴルジ体から液胞への輸送に関わる因子の変異であることが示唆された。野生型におけるGOT1Bの細胞内局在をSDGーWestern blotにより調べた結果、GOT1BはCis-ER、PB-ER、ゴルジ体に局在することが示唆された。更に、GOT1Bの局在を免疫電子顕微鏡解析により調査した結果、GOT1BはCis-ER、PB-ER、細胞膜、デンスベジクル、液胞に局在が認められた。しかし、ゴルジ体膜にはその局在が認められなかった。両実験結果は一致しなかったものの、GOT1Bは小胞体膜(Cis-ER、PB-ER)に局在し、Cis-ERからのグルテリン前駆体及びPB-ERからのグロブリンの輸送に関与していることが考えられた。一方、GOT1Bがゴルジ体膜に局在するか否かは未解明のままであり、再度検討する必要がある。グルテリン前駆体を高蓄積する3変異体(Glup1,Glup5及びglup7)種子における貯蔵タンパク質の蓄積形態を調査した。その結果、Glup1及びglup7変異体において、グルテリンとグロブリン、プロラミンが集積する変異PBが小胞体内に認められた。glup2/got1b変異においても同変異PBが存在した(Fukuda et al., 2016)。従って、Glup1及びglup7変異はglup
既設鋼構造部材の残存耐荷性能評価に関する実験的および解析的研究

実橋から撤去した腐食部材を対象にして、その腐食形状の計測精度と再現性、およびその終局強度特性、さらに耐荷力低下を最も精度良く評価できる腐食パラメータ因子について実験的および解析的に明らかにした。その研究成果として、まず、腐食した柱部材の残存耐荷力式として、最大断面欠損率による線形式を提案した。次に、実橋のリベット接合部の接触面(ガセットプレートおよびT断面フランジの接触面)およびその近傍の腐食計測を実施して、接合部のすきま腐食形態の現状を明らかにした。劣化・損傷に伴う鋼橋およびその部材の残存耐力評価方法を確立するためには、(1)腐食した鋼桁おとび部材の腐食形状計測技術の開発し、(2)それら腐食鋼部材の終局強度特性の把握、(3)耐荷力低下を最も精度良く評価できる腐食パラメータ因子を実験的および解析的に明らかにする必要がある。本年度は、以下について検討した.(1)腐食鋼圧縮部材(銚子大橋撤去上・下横構、横支材)の腐食表面形状および残存板厚計測・対象試験体は,長さ2400mm×高さ200mm×幅180mmのH形状溶接部材(細長比57)および長さ1500mm×高さ100mm×幅180mmのT形状溶接部材である.健全板厚は9mmである.・腐食形状は,現有設備である『表面粗さ計測装置』において,一部狭隘部分を計測するために,レーザ変位計ヘッドを小型のものに変更することで,さらに効率よく計測を可能にした・計測データにより残存板厚、最小断面積を算出するとともに腐食要因パラメータ因子を提示した.(2)下横構部材の圧縮実験・両端単純支持されたT断面部材の残存圧縮耐荷力実験を実施した.また、残留応力をひずみ法を用いて計測した.・残存耐荷力の実験結果と腐食形態の関係、さらに実験結果と残存板厚や最小断面積の関係について明らかにした.現在のところ、最小断面積を用いた最大断面欠損率を用いることにより残存耐荷力との間に線形相関が成り立つことが明らかになった.劣化・損傷に伴う鋼橋およびその部材の残存耐力評価方法を確立するためには、(1)腐食した鋼桁おとび部材の腐食形状計測技術の開発し、(2)それら腐食鋼部材の終局強度特性の把握、(3)耐荷力低下を最も精度良く評価できる腐食パラメータ因子を実験的および解析的に明らかにする必要がある。本年度は、以下について検討した.(1)腐食した鋼圧縮部材の残存耐荷性能に関する解析的検討を行い、腐食損傷に伴う鋼圧縮部材の残存耐力評価方法の確立を目的に、実腐食部材の腐食形状の計測精度と再現性、およびその終局強度特性、さらに耐荷力低下を最も精度良く評価できる腐食パラメータ因子について実験的および解析的に明らかにした。(2)選定された評価パラメータを用いた残存耐荷力評価式として、最大断面欠損率による線形式を提案した。これにより、腐食した柱部材に対して、道示の柱の基準耐荷力曲線から算出される強度および部材の最小断面積を用いることにより残存耐荷力を評価することが可能になった。(3)鋼構造物の鋼板の重ね合わせ部やボルト下などのすきま部分の金属が腐食する、いわゆるすきま腐食の実態を解明するため、実橋のボルトおよびリベット接合部および鋼板重ね合わせ部の接触面およびその近傍の腐食計測を実施して、接合部のすきま腐食形態の現状を明らかにした。
迷走神経刺激療法有効性事前判定のためのてんかん発作軽減効果予測手法の開発

難治性てんかんの治療法の1つに迷走神経刺激療法(VNS)がある.VNSは手術で胸部に植込んだデバイスにより左頸部迷走神経を電気刺激することで,てんかん発作の回数や症状を軽減する緩和的治療法であり,半数の患者において発作回数が半減すると報告されている.しかし,その作用機序は未だ解明されていない.そこで本研究では,VNSの作用機序解明に向け,VNS施行患者の臨床データ解析を行った.解析対象データはVNS施行患者のEEGである.本研究では,脳活動を反映したEEGにVNSによってどのような変化が現れたのかを調べた.前頭葉のコネクティビティ向上がてんかん発作緩和に影響しているとの知見が得られた.難治性てんかんの治療法の1つに迷走神経刺激療法(Vagus Nerve Stimulation; VNS)がある.VNSは手術で胸部に植込んだデバイスにより左頸部迷走神経を電気刺激することで,てんかん発作の回数や症状を軽減する緩和的治療法であり,2年間の治療継続により半数の患者において発作回数が半減すると報告されている.しかし,その作用機序は未だ解明されておらず,患者に対し装置の植込み手術以前にVNSが有効かどうかを判断できないため,場合によっては植込手術が無駄になるという問題があった.そこで本研究では,VNSの作用機序解明に向け,VNS施行患者の臨床データ解析を行った.解析対象データはVNS施行患者の脳波(Electroencephalogram; EEG)である.本研究では,脳活動を反映したEEGにVNSによってどのような変化が現れたのかを調べ,VNSの作用機序解明につながる知見を得ることを目的とした.まず,信号処理手法の1つである経験的モード分解(Empirical Mode Decomposition; EMD)を用いてEEGを複数の狭帯域信号である固有モード関数(Intrinsic Mode Function; IMF)に分解し,その瞬時位相を計算した.EEGの同期度を評価する指標として位相同期度(Phase Locking Value; PLV)を用い,平均PLVとPLV平均変化量をスカルプマップ上でトポロジカルマッピングした.その結果,刺激中のγ帯域の同期度の増加や,刺激後のVNSによる効果の持続,同期度の低い部位における同期促進など,既存研究と一致する知見が得られた.また,刺激中にHigh-γより高い周波数帯域の同期度が低下するという新たな知見が得られた.本研究で得られた知見は,VNS作用機序解明につながると期待される.難治性てんかんの治療法の1つに迷走神経刺激療法(Vagus Nerve Stimulation; VNS)がある.VNSは手術で胸部に植込んだデバイスにより左頸部迷走神経を電気刺激することで,てんかん発作の回数や症状を軽減する緩和的治療法であり,2年間の治療継続により半数の患者において発作回数が半減すると報告されている.しかし,その作用機序は未だ解明されておらず,患者に対し装置の植込み手術以前にVNSが有効かどうかを判断できないため,場合によっては植込手術が無駄になるという問題があった.そこで本研究では,VNSの作用機序解明に向け,VNS施行患者の臨床データ解析を行った.解析対象データはVNS施行患者の脳波(Electroencephalogram; EEG)である.本研究では,脳活動を反映したEEGにVNSによってどのような変化が現れたのかを調べ,VNSの作用機序解明につながる知見を得ることを目的とした.本年度はこれに続き,グラフ理論に基づいたコネクティビティの解析を実施した.コネクティビティの指標として,グレンジャー因果性を用いた.その結果,その結果,VNS刺激中の左右脳半球間での神経活動の非対称性,VNS刺激の大脳辺縁系の神経活動への影響の2点で,既存の研究成果との一致が見られたことで,本研究の解析手法の有効性を確認した.さらに,VNS刺激がてんかん焦点における神経活動に影響を及ぼす可能性を見出した.本研究は臨床で採取されたVNS施行患者の脳波を解析し,その作用機序の一端の解明を目的とするが,VNSは本邦で保険適用になって日が浅く,十分な症例が集まっていない状況である.その中で,本研究は採取済みの少数のデータを用いて解析を行い,一定の成果を見た.難治性てんかんの治療法の1つに迷走神経刺激療法(VNS)がある.VNSは手術で胸部に植込んだデバイスにより左頸部迷走神経を電気刺激することで,てんかん発作の回数や症状を軽減する緩和的治療法であり,2年間の治療継続により半数の患者において発作回数が半減すると報告されている.しかし,その作用機序は未だ解明されていない.そこで本研究では,VNSの作用機序解明に向け,VNS施行患者の臨床データ解析を行った.解析対象データはVNS施行患者の脳波(EEG)である.本研究では,脳活動を反映したEEGにVNSによってどのような変化が現れたのかを調べ,VNSの作用機序解明につながる知見を得ることを目的とした.これまでにグラフ理論に基づいたコネクティビティの解析を実施した.コネクティビティの指標として,グレンジャー因果性を用い,その結果,VNS刺激中の脳波解析手法を確立することができた.本年度は確立した手法を用いて,臨床データからVNSが脳活動に与える影響について考察した.左右脳半球間での神経活動の非対称性,VNS刺激の大脳辺縁系の神経活動への影響の2点で,既存の研究成果との一致が見られたことで,本研究の解析手法の有効性を確認した.

さらに,特に前頭葉てんかんにおいて,VNS刺激中に前頭葉のコネクティビティが著しく上がっている様子が確認できた.てんかん発作は主に寝起きやぼうっとしているときなど集中力の欠けた状況で起きやすいとされるが,前頭葉の活動は集中力との関係が指摘されている.このことより,前頭葉のコネクティビティ向上がてんかん発作緩和に影響していると考えられる.今後はVNS刺激が前頭葉に影響を及ぼすメカニズムなついて,臨床データを用いて調査する予定である.これまでにVNS脳波解析手法を確立した.また,限られた数の症例ではあるが,VNSが脳活動にあたらる影響について,いくつかの知見を得ることができた.難治性てんかんの治療法の1つに迷走神経刺激療法(VNS)がある.VNSは手術で胸部に植込んだデバイスにより左頸部迷走神経を電気刺激することで,てんかん発作の回数や症状を軽減する緩和的治療法であり,2年間の治療継続により半数の患者において発作回数が半減すると報告されている.しかし,その作用機序は未だ解明されていない.そこで本研究では,VNSの作用機序解明に向け,VNS施行患者の臨床データ解析を行った.解析対象データはVNS施行患者の脳波(EEG)である.本研究では,脳活動を反映したEEGにVNSによってどのような変化が現れたのかを調べ,VNSの作用機序解明につながる知見を得ることを目的とした.これまでにグラフ理論に基づいたコネクティビティの解析を実施した.コネクティビティの指標として,グレンジャー因果性を用い,その結果,VNS刺激中の脳波解析手法を確立することができた.本年度は確立した手法を用いて,臨床データからVNSが脳活動に与える影響について考察した.左右脳半球間での神経活動の非対称性,VNS刺激の大脳辺縁系の神経活動への影響の2点で,既存の研究成果との一致が見られたことで,本研究の解析手法の有効性を確認した.さらに,特に前頭葉てんかんにおいて,VNS刺激中に前頭葉のコネクティビティが著しく上がっている様子が確認できた.てんかん発作は主に寝起きやぼうっとしているときなど集中力の欠けた状況で起きやすいとされるが,前頭葉の活動は集中力との関係が指摘されている.このことより,前頭葉のコネクティビティ向上がてんかん発作緩和に影響していると考られる.現在,これまでの成果を論文として公表するために,解析結果を整理するとともに,原稿の作成にあたっている.難治性てんかんの治療法の1つに迷走神経刺激療法(VNS)がある.VNSは手術で胸部に植込んだデバイスにより左頸部迷走神経を電気刺激することで,てんかん発作の回数や症状を軽減する緩和的治療法であり,半数の患者において発作回数が半減すると報告されている.しかし,その作用機序は未だ解明されていない.そこで本研究では,VNSの作用機序解明に向け,VNS施行患者の臨床データ解析を行った.解析対象データはVNS施行患者のEEGである.本研究では,脳活動を反映したEEGにVNSによってどのような変化が現れたのかを調べた.前頭葉のコネクティビティ向上がてんかん発作緩和に影響しているとの知見が得られた.本研究は臨床で採取されたVNS施行患者の脳波を解析し,その作用機序の一端の解明を目的とするが,VNSは本邦で保険適用になって日が浅く,十分な症例が集まっていない状況である.
日本における家族介護支援策の検討：高齢者・家族介護者のケアリング関係の視点から

本研究では、現在、役割が増していながら十分な支援策が制度化されていない家族介護について、新たな支援策を考えることを目的とする。これまでの家族介護支援に関する先行研究では家族介護者の権利やニーズが着目されている。これらの介護者の権利の議論では、ケアを受ける立場とは明確に区分された家族介護者のニーズを対象とした「家族介護者支援」が議論されている。しかし、家族介護のケアリングという相互関係の特質を考えると、家族介護支援を介護者の立場だけで議論することには、限界がある。そこで本研究では、家族介護の実態や支援策の現状から、現在日本に置かれている家族介護の課題を明らかにし、今後どのような家族介護支援策が必要かについて検討する。具体的には、研究期間内に、研究1家族介護の実態からのニーズの把握、研究2現行の家族支援策の検討、研究3家族介護支援策の国際比較の3つの研究課題に取り組んだ。前年度までは、次の実証研究・理論研究を行った。実証研究(研究1・研究2の課題に関連し、研究1国内での家族介護者・高齢者に対するインタビュー調査、研究1・研究2・研究3実証研究のための文献調査・先行研究の収集整理、研究2国内の家族介護支援策の状況把握を行った。本年度は、これまでの研究成果の総括を行った。年度前半は、実証研究のデータの分析を深めた。研究1に関しては、インタビュー調査のデータを分析し、実証研究の成果と理論研究の成果の接続を図った。研究年度後半は、今後は、これらの研究成果の公表をめざし、福祉社会学会、日本社会学会など関連学会での報告、および学会誌への投稿を行う予定である。(抄録なし)本研究では研究期間内に、<研究1>家族介護の実態からのニーズの把握、<研究2>現行の家族支援策の検討、<研究3>家族介護支援策の国際比較の3つの研究課題に取り組むものであるが、本年度は、主に<研究1・研究2>の課題に関連し以下の三つの研究活動を行った。(1)<研究1>国内での家族介護者・高齢者に対するインタビュー調査家族介護の実態からのニーズの把握のために、東京都A市での、高齢者・家族介護者へのインタビュー調査を行った。研究計画では、東京都内での調査と宮城県での高齢者・家族介護者へ調査と地域間比較を予定していたが、2011年3月11日の震災のため宮城県での調査を断念し、東京都のみでの調査実施となった。主に重度高齢者を対象にした高齢者と家族介護者へのインタビュー調査からは、夫婦間介護の閉鎖性と支援の困難、家族介護者が望む介護支援と要介護者の意向との齟齬など、実態に即した家族介護支援の課題が明らかになった。(2)<研究1・研究2・研究3>実証研究のための文献調査・先行研究の収集整理実証研究のための文献調査(2)先行研究の収集整理、国内外の論文検索システムなどを活用し、家族介護におけるケアリングの把握、および家族介護支援策に関する国内外の理論および実証研究を収集し、研究動向をまとめレビューし、国内外の家族介護支援策の実施状況について資料収集を行った。(3)<研究2>国内の家族介護支援策の状況把握国内の民間(制度外)家族介護支援策の状況把握として、家族会の代表へのヒアリング調査を行った。ヒアリングからは、市・公という家族支援のあらたな展開の可能性が感じられる一方、家族会の特色と支援につながる人々の特徴との関連や、地域間の支援状況の格差、などの課題も見出された。本研究では、前年度までの成果をふまえ、研究1家族介護の実態からのニーズの把握、研究2現行の家族支援策の検討、研究3家族介護支援策の国際比較に関して次の研究を行った。1.研究1家族介護の実態からのニーズの把握:調査データの分析およびフォロー調査を行った。前年度の高齢者・家族介護者へのインタビュー調査の結果のデータをとりまとめ、分析を行った。また、調査結果から、不足分のフォロー調査を実施した。2.研究2現行の家族支援策の検討:研究1と同様に、調査データの分析およびフォロー調査を行った。前年度の調査のフォロー調査を実施するとともに、昨年度の調査データを整理し、研究成果をまとめ分析を行った。3.研究3家族介護支援策の国際比較:イギリスの家族介護者支援団体の報告書等の資料収集を行った。まず、地区ごとの活動内容の報告書から、支援活動の実態を把握した。加えて、協会で行った家族介護者への調査や家族介護世帯へのホームヘルプサービス関する調査の報告書についても収集し、家族介護の実態や外部支援の状況を把握した。4.研究1・研究2・研究3実証研究のための文献調査・先行研究の収集整理: PubMed, NACSIS、Social Work Abstract, Medline等の国内外の論文検索システムなどを活用し、家族介護におけるケアリングの把握、および家族介護支援策に関する国内外の理論および実証研究を収集し、研究動向をまとめレビューし、国内外の家族介護支援策の実施状況について、資料収集を行った。

しかし、家族介護のケアリングという相互関係の特質を考えると、家族介護支援を介護者の立場だけで議論することには、限界がある。そこで本研究では、家族介護の実態や支援策の現状から、現在日本に置かれている家族介護の課題を明らかにし、今後どのような家族介護支援策が必要かについて検討する。具体的には、研究期間内に、研究1家族介護の実態からのニーズの把握、研究2現行の家族支援策の検討、研究3家族介護支援策の国際比較の3つの研究課題に取り組んだ。前年度までは、次の実証研究・理論研究を行った。実証研究(研究1・研究2の課題に関連し、研究1国内での家族介護者・高齢者に対するインタビュー調査、研究1・研究2・研究3実証研究のための文献調査・先行研究の収集整理、研究2国内の家族介護支援策の状況把握を行った。本年度は、これまでの研究成果の総括を行った。年度前半は、実証研究のデータの分析を深めた。研究1に関しては、インタビュー調査のデータを分析し、実証研究の成果と理論研究の成果の接続を図った。研究年度後半は、今後は、これらの研究成果の公表をめざし、福祉社会学会、日本社会学会など関連学会での報告、および学会誌への投稿を行う予定である。本年度は、国内でのフィールドワークと文献調査を中心に研究をすすめることができたが、一部研究計画は震災のため実施することができなかったため。実際の調査方法の多少の変更はあったが、当初の目的どおり研究を進めることができたため。今後は、海外でのフィールドワークの実施を予定している。なお、国内でのフィールドワークについては、2011年の東日本震災により、東北地方で予定していたフィールドワークが実施できなかったため、家族介護支援についての都市部・農村部での地域間比較という課題については、他のフィールドでの調査の実施可能性を鑑みつつ、研究計画の変更も視野にいれて検討する。次年度は、最終年度であり、これまでの研究成果を総括し、研究成果の公表を目指す。(抄録なし)
唾液腺幹細胞を用いた機能障害唾液腺修復モデルの確立と臨床への応用

放射線照射したマウス顎下腺組織において、α-アミラーゼ、EGF、EGFR、HGF、c-Met、bFGF、FGFRはタンパクおよび遺伝子発現が減少し、顎下腺の機能低下と成長因子・成長因子レセプターの減少が確認できた。マウス顎下腺幹細胞に放射線照射(2.0Gy)を行ったところ、顎下腺組織と同様の傾向を示した。放射線照射した顎下腺幹細胞をIV型コラーゲンと高Ca培地で分化誘導を行うと、腺様配列の構築とα-アミラーゼの発現の上昇が認められ、放射線障害顎下腺細胞の機能修復の可能性が示唆された。本研究ではEGF、KGFおよびIV型コラーゲンが放射線障害による機能低下・修復に関与している可能性が示唆された。加齢および放射線障害により機能低下をきたしたマウス唾液腺の解析1)加齢マウス顎下腺の解析:正常マウス24週齢、老化促進モデルマウス48週齢にそれぞれ顎下腺を摘出してタンパク抽出を行い、申請者らが過去に報告した分化・増殖に関わるタンパク(EGF、EGFR、HGF、c-met、FGF、FGFR、c-Met、フィブロネクチン、I型コラーゲン)の変化をウェスタンブロット法にて検索した。その結果、EGF、HGF、FGFタンパクの発現量は減少し、そのレセプターであるEGFR、c-Met、FGFRや細胞外基質のフィブロネクチン、I型コラーゲンも同様に減少した。それぞれの顎下腺の免疫組織染色を行った結果も同様な結果を示した。real time PCRによる検索もEGF、HGF、FGF、EGFR、c-Met、FGFRタンパクの遺伝子発現は減少し、同様の傾向を示した。2)放射線照射マウス顎下腺の解析:4週齢の顎下腺と放射線照射した20週齢の顎下腺を用いて上記と同様の検索を行った。その結果、EGF、HGF、FGFタンパクの発現量は減少し、そのレセプターであるEGFR、c-Met、FGFRや細胞外基質のフィブロネクチン、I型コラーゲンの発現量はほとんど変化を認めなかった。免疫組織染色による検索も同様な結果であった。real time PCRによる検索ではEGF、HGF、FGFタンパクの遺伝子発現は減少していた。本研究では加齢および放射線照射顎下腺において発現する成長因子の減少が認められたが、そのレセプターや細胞外基質の発現において差異がみられ、機能低下の過程において機序の違いが示唆された。マウス唾液腺幹細胞を用いた放射線照射による細胞障害の解析24週齢の正常マウスから顎下腺を摘出し、0.2mM Ca無血清培地を用いて顎下腺幹細胞を分離し実験に用いた。放射線照射はcontrol, 0.2Gy, 0.6Gy, 1.0Gy, 2.0Gyをそれぞれ単照射し、48時間後に細胞増殖曲線作成、細胞形態観察を行い、細胞溶解液を採取した。1細胞増殖に与える影響:増殖能は0.2Gyで最も低下し、照射量の増加とともに増加傾向を示し、2.0Gyで最も高く、コントロールの1.4倍であった。2.0 Gy照射で放射線照射の影響が観察され、唾液腺細胞の増殖や修復に関係していると思われる成長因子の減少が確認された。マウス唾液腺幹細胞を用いた分化誘導による細胞機能修復の解析前年度までに24週齢正常マウスの顎下腺から分離した顎下腺幹細胞に2.0Gyの放射線を照射すると細胞増殖が1.4倍に増加し、形態学的には変化がみられなかったが、細胞内のAmylase、EGF、EGFR、HGFα、c-Met、KGF、FGF4、FGFR3、FGFR4の減少が観察された。今年度はマウス顎下腺幹細胞に2.0Gyの放射線を照射し、その後IV型コラーゲン基質と高カルシウム培地(1.0 mM)を用いて細胞の分化誘導を行うとともに、放射線照射によって減少した成長因子EGF、KGF、FGF4を外因性に刺激した。細胞増殖に与える影響や形態的変化を検索し、細胞機能修復の指標として唾液腺特異的なタンパクであるアミラーゼの発現の解析を行った。1細胞増殖に与える影響:放射線2.0Gy照射した細胞をIV型コラーゲンコートディッシュ上で培養を行うと細胞増殖は115%に増加した。さらに、その培地のカルシウム濃度を上昇させると(0.2 mM→1.0 mM)、細胞増殖は90%に減少した。2形態的変化:IV型コラーゲン上の培養による変化は認めなかった。培地のカルシウム濃度を上昇により、個々の細胞は立方形からやや紡錘形に変化した。細胞の配列は敷石状から円形を形成するような腺様構造の構築が認められた。3アミラーゼ発現の変化:EGF、KGF刺激によって、細胞内と細胞上清中のアミラーゼの上昇が確認された。FGF4においてそれらの変化は認めなかった。ウエスタンブロットと免疫染色で同様の結果が得られた。

放射線照射した顎下腺幹細胞をIV型コラーゲンと高Ca培地で分化誘導を行うと、腺様配列の構築とα-アミラーゼの発現の上昇が認められ、放射線障害顎下腺細胞の機能修復の可能性が示唆された。本研究ではEGF、KGFおよびIV型コラーゲンが放射線障害による機能低下・修復に関与している可能性が示唆された。研究実施計画の予定通り概ね遂行中である外科系歯学平成27年度はマウス唾液腺幹細胞を用いて、細胞障害後の機能修復を中心に解析を行う予定である。放射線照射による影響に関しては2.0 Gyで機能の低下が示唆されており、減少するEGF、EGFR、HGFα、c-Met、KGF、FGF4、FGFR3、FGFR4の外的刺激や強制発現を行い、機能回復や放射線耐性いついて解析を行う。機能的評価はアミラーゼ、アクアポリン5をマーカーとし、タンパク、遺伝子変化を観察し、機能回復に関与する因子を同定する予定である。研究実施計画の予定通り概ね遂行中である。遺伝子の検索に関する消耗品の納期が間に合わなかったため次年度使用額が発生した平成26年度はマウス唾液腺幹細胞を用いた分化誘導による細胞機能修復の解析を中心に行う予定である。48週齢老化促進モデルマウスおよび放射線照射マウスから0.2mM Ca無血清培地を用いて顎下腺幹細胞を培養する。その細胞に25年度に検索を行ったタンパク(EGF、EGFR、HGF、c-met、FGF、FGFR、c-Met、フィブロネクチン、I型コラーゲン)を刺激または強制発現させることにより分化誘導を行い、機能的、形態学的に評価を行う。i)機能的評価はアミラーゼ、アクアポリン5、ムチンに関して免疫染色、ウェスタンブロット法、real time PCRにて検索を行う。ii)形態的評価は1腺様構造(分枝の長さ、分枝数、腺管数)の測定2電顕にて細胞内小器官(分泌顆粒、ゴルジ装置、デスモソーム)の発達の確認に関し検討する。今年度の遺伝子検索にて引き続き使用予定であるタンパクの検索に関する消耗品の納期が間に合わなかったため次年度使用額が生じた。今年度のタンパク検索にて引き続き使用する予定である。