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キラル有機分子触媒を用いた新しい精密重合法の開発

本研究はキラル有機分子触媒の重合反応およびポリマーの精密合成への応用を目的とし、リン酸水素(R)-(-)-3,3'-ビス(ペンタフルオロフェニル)-1,1'-ビナフチル-2,2'-ジイルを触媒としたラセミ体のラクチド(DLLA)の開環重合を試みたところ、重合反応は完全に制御されたリビング重合で進行し、DLLAの高い不斉選択性が見られ、光学活性なポリラクチドの合成に成功した。キラル有機分子触媒の重合反応およびポリマーの精密合成へ応用するため、23年度は先行実験としてジフェニルリン酸を触媒とし、3-フェニル-1-プロパノールを開始剤として用いたδ-バレロラクトンとε-カプロラクトンの開環重合を検討し、これらのリビング重合を確立した。次に、24年度ではキラル有機分子触媒を用いたラセミ体のモノマーの不斉選択重合を検討した。まず、β-ブチロラクトン(β-BL)の不斉選択重合による光学活性ポリブチロラクトン(PBL)の合成を目指し、りん酸水素(R)-(-)-1,1'-ビナフチル-2,2'-ジイルを触媒((S)-BNPA)としたβ-BLの開環重合を試みた。しかし、重合は進行したものの理論分子量と実験で得られた分子量は一致せず、SECトレースも多峰性となった。よって、リン酸触媒を用いたβ-BLの重合は可能であるが制御は困難であることが明らかとなった。次に、(S)-BNPAを用いたラセミ体のラクチド(DLLA)の開環重合を試みたところ、重合反応は完全に制御されたリビング重合で進行したが、DLLAの不斉選択は全く生じなかった。そこで、(S)-BNPAの3,3'-位に3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル基やペンタフルオロフェニル基を導入したキラル有機分子触媒を用いてDLLAの開環重合を行ったところ、DLLAの高い不斉選択性が見られ、光学活性ポリラクチドが得られた。以上、本研究の成果は、1)ジフェニルリン酸の用いたラクトンのリビング開環重合により高分子量のポリカプロラクトンおよびポリバレロラクトンの精密合成法を確立したことであり、さらに、2)キラルなリン酸触媒を用いることによりラセミ体のモノマーから光学活性なラクチドポリマーの効率よい合成に成功したこである。これらの成果はこれからの有機分子触媒を用いた高分子化学や高分子工業へ大いに寄与するものと思われる。当該年度は、キラル有機分子触媒の精密合成および重合反応へ応用するため、先行実験としてジフェニルリン酸を触媒とし、3-フェニル-1-プロパノールを開始剤として用いたδ-バレロラクトンとε-カプロラクトンのリビング重合系を検討した。1H NMR、SECおよびMALDI-TOF MS測定により、生成物はPPAを開始末端に有するポリエステルであることが確認された。またSECトレースは単峰性であり、副反応は生じていないことが示唆された。開始剤であるPPAに対するモノマーの比を変化させると、得られたポリマーの数平均分子量は増加し、理論分子量と良い一致を示した。また、一般に酸触媒を用いた開環重合系では分子量20,000以上のポリエステルは得にくいことが知られているが、本重合系においては高分子量のポリカプロラクトン(PCL)およびポリバレロラクトン(PVL)を得ることに成功した。さらに、分子量分散度はどちらも1.1以下と狭い値であった。よって、開始剤であるPPAに対するモノマーの値を調整することで、種々の分子量をもつポリエステルの合成が可能であった。続いて、δ-VLとε-CLを用いた動力学的解析の結果、モノマー転化率の上昇に対して、数平均分子量は直線的に増加し、モノマー消費は重合時間の増加に伴って直線的に増加した。ε-CLを用いたポスト重合では、数平均分子量が5,550から11,000となり、分子量は二倍に増加した。また、SECトレースは単峰性のまま高分子量側へとシフトすることが確認され、分子量分散度は狭い値のままであった。モノマーにδ-VLを用いた場合もε-CLを用いた場合と同様であった。重合系の動力学的解析およびポスト重合の結果から、副反応は生じておらず、ポリマー鎖の末端構造は保持されていることが判明した。よって、重合はリビング的に進行していることが明らかとなった。当該年度の研究では、有機ブレンステッド酸の一種であるリン酸ジフェニルを触媒に用いたε-カプロラクトンおよびδ-バレロラクトンの重合を検討し、新たな精密重合系の構築を達成した。有機分子触媒に酸触媒を用いたラクトンの重合の例は少なく、トリフルオロメタンスルホン酸や塩酸-ジエチルエーテル錯体のみである。しかし、それらの重合系では、酸性度の高い触媒が原因となって生長が阻害されることが知られている。その結果、副反応を生じることや高分子量体を得にくいという問題があった。

しかし、当該年度の研究では、酸性度の低い新たなブレンステッド酸触媒を用いることで触媒のプロトン供与能を調整し、制御重合系を達成でき、この成果を用いることで本研究が目的するキラル有機分子触媒の精密設計、それを用いた位置・立体・シークエンスが高度に制御されたポリエステル類の合成技術の提案、および生物由来資源を用いたポリエステルの高性能化を可能にした。当該年度は下記の2点に関して研究を進める。つまり、1)β-ブチロラクトン(β-BL)の不斉選択的重合による光学活性ポリブチロラクトン(PBL)の合成、ならびに2)合成したポリマーの各種物性評価(ガラス転移点、融点、粘弾性、引っ張り強度、生体適合性、生分解性)である。前年度の研究成果から、まずシンジオタクチック性およびステレオブロック性を発現するキラル有機分子触媒を選定する。ここで、D体とL体のβ-BLとの共重合を試みる。特筆すべきは、シンジオタクチック性、つまりL体のモノマーの後に確実にD体のモノマーが挿入されるという特徴、を生かすことで、シークエンス制御のされたポリエステルの創成が期待される点である。当該年度は、まず上述の共重合に焦点を絞り、シークエンス制御を積極的に行う。前年度の有機分子触媒を用い、アルコール誘導体を開始剤とし、β-BLのラセミ体の不斉選択開環共重合系の検討を行う。得られるポリマーの化学および立体構造は、各種NMR、SEC、CD、旋光度、MALDI-TOF MS測定により詳細に評価する。ここで得られるポリマー構造の情報を、キラル有機分子触媒の分子設計に再度フィードバックすることで、触媒構造とシークエンス制御能との相関を徹底的に明らかにする。さらに、得られた立体およびシークエンスが制御されたポリエステルの各種物性評価(ガラス転移点、融点、粘弾性、引っ張り強度、生体適合性、生分解性)を行う。これらの諸物性に関しては、示差走査熱量測定(DSC)、多角度光散乱検出器SEC(SEC-MALLS)、粘弾計などの測定により評価を行う。これらの検討をまとめ、本研究ではキラル有機触媒の精密設計、それを用いた位置・立体・シークエンスが高度に制御されたポリエステル類の合成技術の提案、および生物由来資源を用いたポリエステルの高機能化を期間内に達成する。当該年度で607,732円を繰り越すことなった。主な要因として、人件費・謝金に400,000円を計上していたが、当該年度の進捗状況から必要とならなかった。そこで、次年度では繰り越し金はガラス器具や試薬等の消耗品代、成果発表のために国内旅費、海外旅費、および、研究成果発表(論文発表)のための英文添削代にそれぞれ3分の1づつ充当する予定である。
膜動態変化を誘導するマクロピノサイトーシスの阻害剤を用いた神経軸索再生法の開発

研究目的神経突起伸長は標的細胞とのシナプス形成に重要な過程(誘因性軸索ガイダンス)である。また突起伸長の抑制は間違った標的とシナプス形成しないために必須な過程(反発性軸索ガイダンス)である。研究代表者は神経突起伸長の抑制がマクロピノサイトーシスによる細胞膜の大規模な細胞内への回収により達成される事を発見した。さらに神経回路形成に重要であるカルシウムや反発性ガイダンス分子Sema3aがマクロピノサイトーシスを誘導することで突起伸長を抑制している事を明らかにした。一方、神経軸索損傷時にカルシウムやSema3aは軸索再生を阻害していることが知られている。従って、マクロピノサイトーシスを阻害することで軸索再生を促進出来る可能性が示唆される。本研究では神経軸索損傷時におけるマクロピノサイトーシスの誘導メカニズムとその阻害剤による軸索再生法の開発を目的とした。研究方法マクロピノサイトーシスは高分子量の蛍光標識デキストランで可視化、定量が可能である。神経軸索損傷時にカルシウムが軸索再生を阻害していることから、高濃度カルシウム(20mM)存在下での脊髄後根神経節ニューロン成長円錐の蛍光デキストランの取り込みを検討した。また、脊髄損傷後1,2週間で損傷組織周辺部にSema3aの発現が誘導されることが報告されているため、この時期にデキストランが取り込まれるかを検討した。研究成果高濃度カルシウムは脊髄後根神経節ニューロン成長円錐内でカルシウム振動を誘導し、それによって、蛍光デキストランが取り込まれることが分かった。また、脊髄損傷後に損傷神経細胞の軸策末端に蛍光デキストランが取り込まれる可能性を得た。以上の事から、神経軸索損傷時のマクロピノサイトーシスを阻害する事で、神経軸索再生の促進をさせる可能性が示唆された。
フィブリノゲンの血小板結合に関する検討ー血小板内カルシウムの関与についてー

螢光標識のフィブリノゲン(Fbg)を用い血小板へのFbg結合のフロ-サイトメトリ-による測定法を確立した。本測定法は,アイソト-プ標識Fbgを用いる方法との相関も良く,簡便に経時変化を追える点で優れていた。この方法を用いた検討では,未刺激血小板にはFbgの結合はみられなかったが,トロンビンン刺激により濃度依存性にFbg結合が認められ,furaー2法により測定した細胞質遊離Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]i)の増加と平行した。細胞外液のCa^<2+>をキレ-トしたり,GPIIb/IIIaに対するモノクロ-ナル抗体により結合が抑制されたことから,その螢光標識FbgはCa^<2+>依存性にGPIIb/IIIaに結合するものと考えられた。BAPTAを細胞内に導入して細胞内のCa^<2+>をキレ-トするとFbg結合は濃度依存性に抑制された。また血小板cAMPを増加させ,トロンビン刺激後のIP_3産生を抑制して[Ca^<2+>]iの増加を抑える濃度のforskolinは,血小板へのFbg結合を抑制した。次に刺激血小板表面へのGMPー140発現をフロ-サイメトリ-にて測定した。未刺激血小板でのGMPー140の発現は3%以下であったが,トロンビン刺激により経時的にGMPー140の発現は増加した。このGMPー140の発現は,細胞外Ca^<2+>を除いても影響を受けなかったが,BAPTAの細胞内導入あるいはforskolinの添加により抑制された。トロンビン刺激による血小板へのFbg結合とGMPー140の発現をフロ-サイトメトリ-により同時測定すると,血小板へのFbg結合が先におこり,引き続きGMPー140の発現がみられた。細胞外Ca^<2+>の除去では主としてFbg結合が抑制されたが,BAPTAの細胞内導入,forskolinの添加により,両者とも平行して抑制された。ネフロ-ゼ症候群では,トロンビン刺激後の[Ca^<2+>]iの増加およびFbg結合はともに亢進していた。以上の結果から,血小板へのFbg結合は刺激後の細胞内Ca^<2+>の増加と密接に関連していると考えられた。血小板は種々の刺激に反応して,細胞質遊離Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]i)の増加がおこり,膜のGpIIbとIIIaが複合体をつくりそこに血漿中のフィブリノゲン(Fbg)が結合して,血小板の凝集がおこると考えられている。しかし血小板の[Ca^<2+>]i増加とFbg結合との関連については未だ不明である。従来から血小板へのFbg結合の研究は,アイソト-プ標識Fbgを用いておこなわれてきたが,この方法は経時的な結合を測定することが難しかった。

今回Fbgに螢光色素を標識することにより,フロ-サイトメトリ-を用いて血小板へのFbgの結合を経時的に測定する実験系を確立した。Fbgを溶解後,テトラメチルロダミンイソチオシアネ-ト(TRITC)の無水エタノ-ル溶液を加え37°Cで1時間インキュベ-トした。セファデックスGー25カラムを用いてTRITC標識Fbgを精製し,これをCa^<2+>ーfree Hepes bufferで透析した。洗浄血小板浮遊液を作成し,Ca^<2+>を調整後TRITC標識Fbgを加え,刺激後フロ-サイトメ-タ-により経時的に血小板に結合する螢光を測定した。未刺激血小板ではFbgの結合は全くみられないが,トロンビン刺激により濃度依存性にFbg結合がみられ,furaー2法により測定した[Ca^<2+>]の増加と平行した。細胞外液のCa^<2+>をEGTAでキレ-トしたり,GPIIb/IIIaに対するモノクロ-ナル抗体により結合が抑制されることから,この標識Fbgの血小板結合は従来から考えられているCa^<2+>依存性のGPIIb/IIIaへの結合と考えられた。血小板内にBAPTAを導入して細胞内Ca^<2+>をキレ-トすると,Fbgの結合は濃度依存性に抑制されたことから,GPIIb/IIIaの複合体形成,Fbg結合には直接細胞内Ca^<2+>が関与している可能性が示唆された。現在fluoー3法による血小板[Ca^<2+>]iの測定と本方法とを組み合わせて[Ca^<2+>]iとFbg結合との密接な関連について検討中であり,さらに病的血小板を用いてフィブリノゲン結合の検討を進める予定である。昨年螢光標識フィブリノゲンを用い血小板へのフィブリゲン結合のフロ-サイトメトリ-による測定法を確立した。そこで本方法によりトロンビン沙激血小板へのフィブリノゲン結合を測定し,それに対するforskolinの影響を検討した。forskolinの添加で血小板内のcAMPは増加し,トロンビン刺激後のIP_3の産生は抑制された。また同一サンプルを用いたトロンビン刺激後の細胞質遊離Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]i)の増加も濃度依存性に抑制された。さらに同濃度のforskolinは,トロンビン刺激による血小板へのフィブリゲン結合も抑制した。螢光Ca^<2+>インジケ-タ-fluoー3を細胞内に導入し,[Ca^<2+>]iをフロ-サイトメトリ-にて測定するとともに,その血小板に結合するTRITC標識フィブリノゲンの結合をも同時にフロ-サイトメトリ-により測定することを試みたが,fluoー3螢光がTRITC螢光測定に干渉し,同時測定は困難であった。次に刺激血小板の表面へのGMPー140発現をフロ-サイトメトリ-にて測定した。未刺激血小板へのGMPー140の発現は3%以下であったが,トロンビン刺激により経時的にGMPー140の発現は増加した。このGMPー140の発現は,細胞外のCa^<2+>を除いても影響を受けなかったが,BAPTAを細胞内に導入して細胞内Ca^<2+>をキレ-トしたり,forskolinによってcAMPを増加させると抑制された。トロンビン刺激による血小板へのフィブリノゲンの結合とGMPー140の発現のフロ-サイトメトリ-を用いての同時測定を試みた。トロンビン刺激により,血小板へのフィブリノゲン結合が先におこり,引き続いてGMPー140の発現がみられた。細胞外Ca^<2+>の除去では,フィブリノゲン結合が主として抑制されたが,BAPTA/AM,forskolinの添加により両者とも平行して抑制された。以上の結果から,血小板へのフィブリノゲン結合は細胞内Ca^<2+>の増加と密接に関連していると考えられた。
母親・児と高齢者の家庭血圧と血管内皮機能：妊婦コホートおよび地域住民コホート研究

血管内皮機能の臨床的な意義(危険因子、臓器障害、予後との関連)についてのデータは依然として僅かである。更にエビデンスを積み上げる必要がある。BOSHIコホートは平成22年11月から開始された出生コホートで、平成27年より追跡のフェイズに移行しているコホート研究である。本研究課題はBOSHIコホートの追跡調査に参画し、エンドパッドによる血管内皮機能を測定した。BOSHIコホートではユネクスFMDによる血管内皮機能も導入されているため、両方の血管内皮機能を併せて評価するため、同時測定のプロトコルを採用した。また、同時測定であるため、15分間の上腕駆血は1回で済むため対象者への負担も最小限である。初年度の後半にエンドパッドおよびユネクスFMDの同時測定のプロトコルの確認が完了し、また、協力病院内であるスズキ記念病院の検査体制が確立した。また、今年度は例数を重ね検査者の技量も向上し熟練した検査ができるようになった。今年度分の検査数はほぼ予定通りであるが、初年度の遅れ分は、まだ取り戻せていない。そのため最終的な目標測定人数には到達できていない。引き続き継続して対象者を積み上げ、十分なNで分析を行っていく。初年度に11名の女性でRHIとFMDの相関が0.52(P=0.098)と中等度の相関が認められたが、今年度までの累積の女性153名では相関係数は0.11(P=0.31)であり、ほとんど相関を認めなかった。LnRHIを従属変数、FMD、年齢、収縮期血圧、脈拍、BMIを独立変数とした重回帰分析を行ったところ、BMIのみ正の関連(標準化回帰係数β=0.23, P=0. 004)を認め、FMDおよび他の独立変数は有意な関連はなかった。LnRHIとFMDを入れ替えて、FMDを従属変数として同様の分析を行ったところ、脈拍のみが正の関連(β=0.20, P=0.017)を示し、LnRHIを含む他の独立変数は関連を認めなかった。以上の結果より血管内皮機能の指標であるRHIおよびFMDは、異なる測定であり、同一なものでなないことが改めて確認された。なお、フラミンガム研究などの既報とことなり、血管内皮機能の指標(RHIおよびFMD)と、年齢および収縮期血圧との関連を認めなかった理由については、第一に本対象者が比較的均一で、rangeが小さいためであることが考えられる。実際、年齢の第1四分位-第3四分位は39-44歳、収縮期血圧では96-112mmHgと狭い範囲内に分布していた。引き続き対象者数を増加させ次年度も解析を行う。当初の目的として、血管内皮機能の採血項目、血圧および生活習慣との横断的検討を行う予定であった。しかし、データセットの統合およびデータクリーニングが終わっていないため実質的な分析はまだ出来ていない。急ぎデータセットを完成させて最終年度である今年度に同解析を行う。つまり、BOSHIコホートにおいて、エンドパッドによる指先の血管内皮機能、およびユネクスFMDによる橈骨動脈での血管内皮機能の同時測定の測定体制は確立しているものの、初年度の遅れ、および、それに伴うデータセットの完成の遅れがあった。そのため研究期間を延長し、積み残しの課題を行っていく。つまり、1)血管内皮機能の指標であるRHIと、動脈硬化と関連する因子である採血項目(腎機能、尿酸、糖代謝、脂質、電解質、血漿レニン活性,血漿アルドステロン、BNP,高感度CRPおよび尿中アルブミン等)、血圧および生活習慣との横断的検討である。更に、2)血管内皮機能と動脈硬化指標との関連を横断的に確認後に、血管内皮機能と、Pulse wave velocity(PWV)、Augmentation Indexとの関連を横断的に検証する。さらに、年齢、性別、あるいは危険因子の重積の有無でサブグループ分析を行い、血管の障害の各段階での血管内皮機能と他の動脈硬化指標との関連を検討する。また、3)血管内皮機能と心血管アウトカムとの縦断的検討として、慢性腎臓病発症をアウトカムとして、血管内皮機能と既存の動脈硬化指標の予後予測能を比較する。各種交絡因子を補正したCox比例ハザードモデルで予後分析を行い、モデルに既存の動脈硬化指標(PWV、Augmentation Index)を適宜投入することで、血管内皮機能がそれらの指標を上回る予測能を追加できるのかを明らかにする。血管内皮機能の動脈硬化危険因子、中間イベント、予後予測能については、国内外で報告がなされつつある、しかし、臨床的な意義(危険因子、臓器障害、予後との関連)の確立の為に更にエビデンスを積み上げる必要がある。BOSHIコホートは平成22年11月から開始された出生コホートで、平成27年より追跡のファイズに移行しているコホート研究である。

平成28年度の当初の目的として、血管内皮機能の採血項目、血圧および生活習慣との横断的検討:採血項目として腎機能、尿酸、糖代謝(HbA1c,空腹時血糖,空腹時インスリン)、脂質(中性脂肪, TC, HDL, LDL)、血清電解質(Na, K, Cl, Ca, Mg)、総蛋白,アルブミン、血漿レニン活性,血漿アルドステロン、BNP,高感度CRP、尿検査項目として尿中電解質(尿Na、尿K、尿CI)および尿中アルブミン等の項目および、家庭血圧測定、調査票による生活習慣との関連についても横断的に血管内皮機能との関連を検討する予定であった。しかし、エンドパッドおよびユネクスFMDの同時測定のプロトコルの確認、協力病院内での検査体制の確立などに時間を要し、年度内に目標測定人数には到達できなかった。しかし、現時点では、それらの障害は解決しており、今後の進行に支障はきたさない。引き続き継続して対象者を積み上げ、十分なNで本分析を行っていく。血管内皮機能の動脈硬化危険因子、中間イベント、予後予測能については、国内外で報告がなされつつある、しかし、臨床的な意義(危険因子、臓器障害、予後との関連)の確立の為に更にエビデンスを積み上げる必要がある。BOSHIコホートは平成22年11月から開始された出生コホートで、平成27年より追跡のフェイズに移行しているコホート研究である。本研究課題はBOSHIコホートの追跡調査に参画し、エンドパッドによる血管内皮機能を測定した。BOSHIコホートではユネクスFMDによる血管内皮機能も導入されており、両方の血管内皮機能を併せて評価するため、同時測定のプロトコルを採用した。また、同時測定であるため、15分間の上腕駆血は1回で済むため対象者への負担も最小限である。初年度の後半にエンドパッドおよびユネクスFMDの同時測定のプロトコルの確認が完了し、また、協力病院内であるスズキ記念病院の検査体制が確立した。また、例数を重ね検査者の技量も向上し不安なく検査ができるようになった。以上より、今年度においては比較的安定して両検査の同時測定が実施できるようになった。ただ、初年度の遅れ分は取り戻せていないため目標測定人数には到達できていない。引き続き継続して対象者を積み上げ、十分なNで分析を行っていく。初年度に11名の女性でRHIとFMDの相関が0.52(P=0.098)と中等度の相関が認められたが、今年度までの累積の女性82名では相関係数は0.11(P=0.31)であり、ほとんど相関が無くなった。これは、フラミンガム研究などの既報の相関係数と同等であり、また、本研究の対象者である出産後の若い女性においても同様であることを明らかにした。LnRHIを従属変数、年齢、収縮期血圧、拡張期血圧、脈拍、BMIを独立変数とした重回帰分析を行ったところ、拡張期血圧と負の関連(標準化回帰係数β=-0.44, P=0.05)および脈拍と正の関連(β=0.27, P=0.02)であった。一方、FMDを従属変数とし、独立変数を同様とした分析では年齢が負の関連(β=-0.23, P=0.045)、脈拍と正の関連(β=0.27, P=0.03)であった。以上より基礎特性との関連でも両測定は同一なものでなないことが確認された。引き続き対象者数を増加させ次年度も解析を行う。当初の目的として、血管内皮機能の採血項目、血圧および生活習慣との横断的検討を行う予定であった。しかし、データセットの統合およびデータクリーニングが終わっていないため実質的な分析はまだ出来ていない。急ぎデータセットを完成させて最終年度に同解析を行う。
革新的拡散MRI技術、神経突起イメージングによるパーキンソン病の病態解明

平成28年度、拡散MRIによる神経突起イメージングがパーキンソン病の大脳灰白質変性を鋭敏に検出し、パーキンソン病群の灰白質の神経突起密度や神経突起配向を反映する定量値がパーキンソン病の運動症状と良く相関することを示した。さらに拡散MRIによる神経突起イメージングによって検出された変性領域は、剖検脳の病理進展ステージと良く一致することがわかった。平成30年度は、パーキンソン病で比較的早期に病理変化が生じる帯状束の変性を神経突起イメージングを用いて評価し、帯状束前方より変性が生じること、軸索密度の変化よりも軸索配向分散の変化が早期に生じうることを示した(鎌形ら、第46回日本磁気共鳴医学会大会)。加えて、神経認知精神障害を有するパーキンソン病患者における白質微細構造変性の評価に神経突起イメージングが有用であることを報告した(アンディカ、鎌形ら、第46回日本磁気共鳴医学会大会)。以上の研究結果より、パーキンソン病の病理変化の検出に神経突起イメージングは有用であり、パーキンソン病の疾患進行のマーカーとしても有望と考えられる。拡散MRIによる神経突起イメージングを用いてパーキンソン病群と正常対照群における全脳灰白質解析を行った。加えて、従来のMRIを用いた灰白質評価手法のゴールデンスタンダードであるvoxel based morphometry(VBM)による灰白質容積評価、surface-based cortical thickness analysis(SBCT)による皮質厚評価も併せて行い、どちらの解析手法がPDの灰白質変性を鋭敏に検出できるか比較検討を行った。その結果、パーキンソン病群と正常群の間に灰白質容積、皮質厚には有意な変化は見られなかったが、神経突起イメージング解析ではパーキンソン病群において、灰白質における神経突起密度、神経突起配向を示す定量値が有意に低下していることがわかった。加えて、それらの定量値変化はパーキンソン病における運動症状スコアと有意相関が見られた。パーキンソン病ではαシヌクレインと呼ばれるタンパク質が灰白質をはじめ神経系に広く異常蓄積することが知られ、パーキンソン病における神経変性と密接に関連することが知られている。従来の報告でもMRIを用いた灰白質評価手法のゴールデンスタンダードであるVBM, SBCTではパーキンソン病の灰白質変性を検出できないことが多く、パーキンソン病における灰白質変性を感度良く検出できるin vivo imaging技術は存在しなかった。今回の研究結果は神経突起イメージングがパーキンソン病における灰白質変性を鋭敏に検出することができることを示しており、神経突起イメージングはパーキンソン病の早期診断、疾患重症度評価のin vivo imaging markerとなりうる可能性がある。当初の予定通り、パーキンソン病及び健常対照者のMRIデータ収集は順調に進行しており、並行してデータ解析にも着手している。また、研究実績の概要にも述べたように、神経突起イメージングを用いてパーキンソン病における灰白質変性の解析を終え、神経突起イメージングがパーキンソン病の灰白質変性の評価に有用であることを示すことができた。これらの研究結果より、パーキンソン病の病理変化の検出に神経突起イメージングは有用であり、パーキンソン病の疾患進行のマーカーとしても有望と考えられる。来年度は他の大脳白質神経路についても拡散MRIによる神経突起イメージングを用いた評価を行い、大脳白質の変性をどの程度鋭敏に検出できるか検討する予定である。当初の予定通り、パーキンソン病及び健常対照者のMRIデータ収集及び画像データ解析は順調に進行している。また、研究実績の概要にも述べたように拡散MRIによる神経突起イメージングが、パーキンソン病の灰白質変性を鋭敏に検出できること、パーキンソン病の運動症状の主因である黒質線条体路変性を評価可能であることを既に示し、論文化しており、研究の進捗はおおむね順調に進行している。引き続き、パーキンソン病及び健常対照者のMRIデータ収集を進めつつ、MRIデータ解析を並行して行う。また全脳灰白質に加えて全脳白質の神経突起イメージング解析も行い、従来の拡散MRI手法である拡散テンソル、拡散尖度画像との比較検討を行い、パーキンソン病の早期診断に有用なin vivo imaging markerの探索に努める。疾患重症度や罹病期間との相関解析も行い、疾患進行の客観的imaging markerの探索も併せて行う。来年度も引き続き、パーキンソン病及び健常対照者のMRIデータ収集を進め、MRIデータ解析を並行して行う。

研究計画の最終年度である来年度は全脳白質解析を網羅的に行い、実際にパーキンソン病の早期診断に有用なin vivo imaging biomarkerの創出に努める。合わせて疾患重症度や罹病期間との相関解析を行い、疾患進行の客観的なbiomarkerの探索を行う。今年度、拡散MRIによる神経突起イメージングを用いて黒質線条体路の分析を行ったが、パーキンソン病における黒質線条体路の神経突起イメージング定量値の変化が当初予定していたよりも大きく、予定していたより少ない症例数で有意な変化を検出することができた。そのため、解析時間が短縮可能で当初予定していた業務委託を依頼しないこととしたため、未使用額が生じた。このため次年度に神経突起イメージングによる網羅的な大脳白質評価をすることとし、未使用額はその経費に充てることとしたい。
細胞膜および核におけるイノシトールリン脂質情報伝達系による細胞機能制御機構

本研究では細胞内におけるホスファチジルイノシトール(PI)情報伝達系において重要な役割を果たしているホスホリパーゼC(PLC)δ_1の細胞内における活性制御機構および生理機能を明らかにするためにPLCδ_1結合タンパク質の性状解析をおこなった。PLCδ_1と相互作用するタンパク質としてクローニングされたp122は、これまでに低分子量GTP結合タンパク質Rhoに特異的なGTPase activating Protein(GAP)であること、PLCδ_1の酵素活性を亢進させることなどが明らかになってている。本研究ではまずp122が細胞内情報伝達のプラットホームとして機能している膜領域のラフトに存在することを明らかにした。ラフトを介した細胞機能の調節の一つに細胞内Ca^<2+>濃度の調節がある。神経細胞様細胞株PC12細胞をカルバコールで刺激すると細胞内Ca^<2+>濃度が上昇する。この時、p122を免疫沈降したところ刺激前と比べ共沈してくるPLCδ_1が増加した。また、ショ糖密度勾配遠心分離による解析から、カルバコールによる刺激でPLCδ_1が低密度画分に移行すること、この移行はイオノマイシン処理でも、また、細胞外Ca^<2+>を除去した条件下でも観察されたことからPC12細胞においてPLCδ_1はカルバコール刺激による細胞内Ca^<2+>貯蔵部位からのCa^<2+>放出によりラフトに移行し、p122と結合し、活性化されると考えられる。これらの結果からPLCδ_1はラフトで活性化されラフトを介した細胞内Ca^<2+>濃度の調節に関与していることが示唆された。本研究では核および細胞膜直下のアクチンを中心とした細胞骨格制御系におけるイノシトールリン脂質(PI)情報伝達系の役割を明らかにするために、PI情報伝達系において重要な役割を果たしているホスホリパーゼC(PLC)δ1と相互作用するタンパク質の解析を行った。PLCδ1結合タンパク質p122/RhoGAPの解析。PLCδ1結合タンパク質としてクローニングされたp122は、これまでにRhoに特異的なGTPase activating proteinであること、PLCδ1の酵素活性を促進することが報告されている。このことよりp122はアクチン細胞骨格系とPI情報伝達系の橋渡しをするタンパク質と考えられる。今回我々はp122の細胞内局在についてBHKおよびMDCK細胞を用いて解析した。緑色蛍光タンパク質融合型p122、EGFP-p122を発現させ、その局在を調べた。EGFP-p122点状の局在パターンを示し、この局在はp122のC末端側に依存した。p122のC末端側にあるSTARTドメインはコレステロール結合ドメインとして知られていることからp122の局在とコレステロールとの関連について調べた。EGFP-p122の局在はコレステロールを除去した細胞では点状の局在を示さなかった。コレステロールは細胞情報伝達のプラットフォームとして機能している膜領域カベオラに多く存在することからカベオラとの関係を調べた。EGFP-p122の局在はカベオラのマーカータンパク質であるカベオリンと共局在した。ショ糖密度勾配遠心によりBHK細胞の分画を行ったところ、p122はカベオリンと同じ低密度分画に存在した。また免疫沈降の結果からp122はin vivoにおいてカベオリンと相互作用していることが示唆された。このことよりp122はカベオラでアクチン細胞骨格とPI情報伝達系の両方を制御していると考えられる。
音声情報圧縮の基礎研究：言語音のスペクトル変化と発声器官の動きとの同時観測

平成28年度に行った9名の英語母語話者による聴取実験のデータ分析を行った。英語音声において、臨界帯域ごとのパワーの時間変動情報が圧縮されたとき、言語内容をどれだけ明瞭に知覚できるかを確かめることが目的であった。英語音声は因子分析によって数個の因子の時間変動に情報圧縮した。圧縮された情報から元のパワーの時間変動を再構成し、雑音駆動音声として再合成した。因子数が2個まででは実験参加者はほとんど言語内容を聴き取ることができなかったが、因子数が3個以上から少しずつ内容が聴きとれるようになり、8個以上用いたところで、単語正答率が80%を超えることが分かった。日本語と同様に、英語においても3因子以上から音声の内容が理解され始めるということが示された。平成28年度までの研究で、約5001500 Hzの周波数帯域に高い因子負荷量をもつ因子は音声知覚において特に重要であると分かった。この因子は、音韻論の分野で提唱されている音素の鳴音性と強い相関があると先行研究で示されている。鳴音性の因子が現れていない2因子からなる因子、鳴音性の因子が現れている3または4因子からなる因子のそれぞれから2因子以上を用いて雑音駆動音声を再合成し聴取実験を行った。鳴音性の因子が与える情報を持たない音声の明瞭度は低く、また因子数が2個ではどのような条件でも明瞭度は低かった。よって、雑音駆動音声の明瞭な知覚には鳴音性の情報と3つ以上の因子の情報が必要であると分かった。29年度が最終年度であるため、記入しない。音声の音響的特徴と音声知覚との関係について調べることを中心に研究を行い,その成果を学会等で発表した.まず,本研究計画を着想する元となった,音声の臨界帯域ごとにおけるパワーの変動ー音声のスペクトル変化ーを因子分析することによって取り出される,3つないし4つのパワー変動因子によって音声に含まれる言語情報の大部分が伝わるという研究について,国際誌のFrontiers in Psychologyに論文を発表した.この研究の結果をうけて,音声の因子分析から取り出された4つのパワー変動因子それぞれが音声知覚においてどのような役割を持つのかについて調べる聴覚心理実験を行った.その結果,4つの因子のうち1000 Hz付近の周波数帯域に関連する因子が日本語の音声知覚において特に重要な役割を持っていることが明らかとなった.聴覚心理実験を通して明らかとなったパワー変動因子の特性が,日本語以外の言語においても共通しているのかを調べることを目的に,アイルランド国立大学ゴールウェイ校にて,英語母語話者を対象とした聴覚心理実験を行った.英語母語話者が英語音声を明瞭に知覚するために,パワー変動因子がいくつ必要であるかについて調べたこの実験で,実験参加者9名分のデータを得ることができた.音声を明瞭にかつより自然に聴こえさせるための音声信号の処理法についての研究を行った.雑音が混入した音声信号を,雑音と音声とに分離することで,音声を聴き取りやすくするという音声強調技術がある.従来法として提案されている手法で強調された音声に耳障りな成分が残るという問題に対して,音声合成で用いられている確率モデルから音声を生成するという技術を応用することにより,耳障りな音成分を抑え,より滑らかに聴くことのできる強調音声を得ることが出来るようになった.この音声強調技術について平成28年8月に特許として出願した.明瞭で,自然な聴こえの音声をデザインするために,我々がどのように音声を話し,聴くのかについて,聴覚心理実験と音声の多変量解析とを組み合わせることで明らかにすることが本研究の目的であった.音声を因子分析することによって得られる,様々な言語に共通してみられる4つのパワー変動因子が,音声の知覚においてそれぞれ異なる役割があることを示すデータを聴覚心理実験によって得ることできた.これにより明瞭な音声をデザインするために,どのような音響的特徴が音声に重要であるのかを因子という周波数スペクトル上の具体的な形で示すことが可能となった.英語母語話者が参加した聴覚心理実験を行うことができたことも当初の計画を超えた進展である.これにより,言語が異なる時に,同じように音声をデザインできるのか,言語ごとに調整が必要であるのかについて今後検討を進めることができる.音声を強調処理した際に生じる,強調音声の聴こえの不自然さを低減させる手法の研究を行い,独自技術として特許出願できた.これについても当初の計画に含まれていなかった内容である.発声器官の運動と音声のデータについては,予備分析を行った.共同研究者のWilly Wong准教授と分析結果について議論を重ねることができ,今後の方針を固めることができた.平成28年度に行った9名の英語母語話者による聴取実験のデータ分析を行った。

平成28年度までの研究で、約5001500 Hzの周波数帯域に高い因子負荷量をもつ因子は音声知覚において特に重要であると分かった。この因子は、音韻論の分野で提唱されている音素の鳴音性と強い相関があると先行研究で示されている。鳴音性の因子が現れていない2因子からなる因子、鳴音性の因子が現れている3または4因子からなる因子のそれぞれから2因子以上を用いて雑音駆動音声を再合成し聴取実験を行った。鳴音性の因子が与える情報を持たない音声の明瞭度は低く、また因子数が2個ではどのような条件でも明瞭度は低かった。よって、雑音駆動音声の明瞭な知覚には鳴音性の情報と3つ以上の因子の情報が必要であると分かった。音声の明瞭性について,音声のパワー変動因子がもつそれぞれの役割についてより詳細に調べるための聴覚心理実験を行う.また,28年度に開発した音声強調についての独自技術の効果について,シミュレーションだけでなく,聴覚心理実験で確かめる.音声のフォルマント周波数と発声器官の運動とが密接に関係していることが良く知られている.この知見を利用し,音声のフォルマント周波数と音声のパワー変動因子の関係を重回帰分析等によって明らかにすることで,間接的に発声器官の運動と音声のパワー変動因子とを結びつける.発声器官の運動の中で,音声の明瞭性および自然性において重要である特徴を,パワー変動因子を介して見出す.当初の計画にはなかった,英語などの多言語に研究を拡張する.9月に開催される国際精神物理学会大会に参加し,研究成果について発表を行う予定であるが,その大会開催中に,学会参加者を対象に様々な言語による聴覚心理実験を行う.大会主催者の一人が研究指導教員であり,この計画については既に打ち合わせを進めている.得られた知見を組み合わせ,合成音声の明瞭性と自然性を改善する技術を提案し,その効果を心理実験によって確かめる.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。
統合失調症の認知機能障害とコンプレキシンの変化-末梢血での検討

統合失調症患者とコントロールの末梢血を顆粒球、リンパ球に分けて、コンプレキシン2、D3RとD4Rの発現量をリアルタイムRT-PCR法を用いて定量した。コンプレキシン2は末梢血での発現量は少ないにもかわらず、死後脳研究と同様に末梢血でも変化があることが確認された。同様にD4Rは、以前の報告されているように作業記憶と関与しており、末梢血での変化は認知機能障害を反映する可能性があった。この研究の目的は、統合失調症患者の末梢血に発現しているシナプス前タンパクであるコンプレキシンの発現量が、死後脳研究で観察された変化と同様であるかどうかを確認することである。中枢神経内で観察された発現量の低下が末梢組織で再現できれば、今後統合失調症の診断、予後判定、治療指針に有用な情報を末梢血の分析により提供できる可能性がある。高知大学医学部倫理委員会の承認を得て、当院にて外来通院している統合失調症患者とボランティアの健常人の血液サンプルを同意のもとに集め、末梢血におけるコンプレキシンのRNAを定量した。健常人の末梢血5mlを一時間以内にリンパ球と顆粒球、血小板分画に分け、それぞれtRNAを抽出して、RT-PCR法によりコンプレキシンの発現量を定量した。末梢血におけるコンプレキシンRNAの発現量は中枢神経と比べて一桁少なかったが、コンプレキシン1と2のRNA発現が確認できた。それぞれのRNAの発現量は、血小板分画でコンプレキシン1が多く、顆粒球ではコンプレキシン2の発現量が多いという差異が認められた。また、予備的な実験結果によれば、患者群と健常人でのコンプレキシン発現量が異なる傾向がみられたが、今後症例数を増やして、年齢・性別などの因子をマッチングさせ、統計的な有意差を検定する予定である。また、抗精神病薬の服用がコンプレキシンの発現に影響を与える可能性を特定するために、マウスに抗精神病薬を投与して末梢血の各分画におけるコンプレキシンRNA発現量に対する影響を確認中である。統合失調症患者の末梢血におけるコンプレキシン(cplx)、ドーパミン3レセプター(D3R)、ドーパミン4レセプター(D4R)発現量の変化の有無を確認するために、同意を得た患者11名(44±12歳、男性8名)と対照健常者12名(56±12歳、男性3名)から血液を採取し顆粒球、リンパ球に分けて、cplx1とcplx2、D3RとD4Rの発現量をRT-PCR法を用いて定量した。予測されたように、対照として用いたヒト海馬における発現と比べて、リンパ球、顆粒球におけるcplx,D3R,D4Rの発現量は非常に少なく、末梢血でのこれらの分子の発現量は中枢神経系よりかなり小さいことが確認された。年齢や抗精神病薬の影響を除外するために、年齢、抗精神病薬量とcplx、D3R,D4Rの発現量との相関を調べたが、相関は認められなかった。cplx1は、顆粒球、リンパ球上では共に発現が小さく安定した定量ができなかったが、リンハ.球におけるcplx2は、定量が可能で、統合失調症患者において減少が確認された(p=0.023)。D3R,D4Rの発現量の変化を見ると、統合失調症とコントロールでは顆粒球とリンパ球共に変化が確認されなかった。しかし統合失調症患者の認知機能検査であるBACSにおける作業記憶スコアとリンパ球のD4Rが正の相関を示した(Pearsonの相関係数=0.824,P=0.006)。これらのデータを総合すると、cplxは末梢血での発現量は少ないにもかかわらず、死後脳研究と同様に末梢血でも変化があることが確認された,同様にD4Rは、以前の報告されているように作業記憶と関与しており、末梢血での変化は認知機能障害を反映する可能性がある。
インドの飼料穀物需要に影響を与えてきた理由の変化に関する実証的研究

インドは中国と並んで人口超大国であるが、中国のように飼料穀物需要の増大に大きな関心が集まらない。それは、間接的理由として「宗教的・文化的要因によりインドでは食肉需要が伸びにくい」(1)、直接的理由として「家畜の多くは庭先での少頭飼いであるためエサは作物残渣で済ませてしまう」(2)、という理由によるものである。しかしUSDAが示すデータでは、特に近年、飼料用トウモロコシの消費量が著しく増加しているのに加え、研究代表者が過去に現地調査を行った際、1や2に変化が生じている可能性を発見した。そこで本研究では、1と2がどのように変化しているのかという実態の把握を第一の目的としつつ、将来を展望するため、そのような変化が生じている要因を実証的に明らかにすることを第二の目的としている。この課題に取り組むに当たり、平成29年度と平成30年度において、肉食調査(肉食の意向に関する調査)と給餌内容調査(給餌方法の内容に関する調査)を農村部と都市部で進める予定としていた。初年度に当たる平成29年度は、肉食調査と給餌内容調査をソラプール県およびコラプール県における農村で実施した。現在データのとりまとめを行っている段階ではあるが、肉食調査では、農村部でも肉食への強い意向がうかがわれたことに加え、給餌内容調査では、比較的貧しい地域であるソラプール県でも配合飼料の使用がかなり進んでいることが確認できた。本研究は、インドでの現地調査をより重視して行うものである。特に、調査対象とする農村住民や都市住民などに対して、徹底的した聞き取り調査を行うことを最重視している。そこで、初年度である平成29年度の目標として掲げていたのは、インド西部マハーラーシュトラ州の農村部と都市部における現地調査を進めることであったが、都市部での調査を実施できなかったことに加え、ソラプール県とコラプール県における農村部での調査を一部完了させることができなかった。そのため本研究は、当初の予定よりやや遅れている状況にあると判断した。平成30年度は、平成29年度に実施できなかった調査を実施することに加え、当初から平成30年度に実施予定であった農村部と都市部での調査を、研究代表者、研究分担者、研究協力者で効率的に分担して行いたいと考えている。ただし、やや遅れている状況にあることから、当初からの予定が完了できなくなった場合は、平成31年度の前半に現地調査を行うことも想定しながら進めることとする。平成29年度は農村部と都市部両方での現地調査を予定していたものの、都市部での調査を実施できなかったため。実施できなかった都市部での調査については、平成30年度に行う予定とし、その際に使用したいと考えている。
液-液抽出法における固体微粒子の油-水界面への捕収機構に関する基礎的研究

油-水2相系を利用した液-液抽出法において,粒子の油-水界面への捕収現象あるいは同2相系での粒子の分配現象は,水中での固体-油間の相互作用エネルギーの観点から論ぜられる。本研究では,捕収剤を一切添加しない油-水系を利用し,表面を疎水性化処理していない酸化物粒子およびシリル化剤を用いてメチル化(疎水性化)処理を施したシリカ粒子を対象とし,本方法における微粒子捕収並びに微粒子分配に及ぼす各種相互作用力の影響について界面化学的な検討を行った。まず,シリカ,酸化チタン,アルミナなどの酸化物微粒子を対象とした液-液抽出試験を行い,あるpH値で回収率の極大点が存在することを確認し,このpHがそれら酸化物のそれぞれの等電点付近のpH域と一致していることを界面動電位解析により確認した。更に,金属塩化物を添加した系についても同様に液-液抽出試験と界面動電位測定を行い,金属イオンが特異吸着して粒子の表面電位を低下させるpH域で微粒子の回収率が増大することを認めた。以上の結果を基に,本方法において特に粒子間の静電的相互作用エネルギーの低下が重要であることを指摘した。次に,処理条件を種々変化させてメチル化処理を施したシリカ粒子を試料とし,表面およびバルク特性値が既知である各種液体を用いた接触角測定により一連のシリカ粒子の表面エネルギー解析を行い,併せて水-ヘキサンの油-水系におけるそれら粒子の分配実験を行うことにより,微粒子の初期懸濁液油(或いは水)相から水(或いは油)相への移行に伴う固体-油-水3相系の表面自由エネルギー変化ならびにその作用力に基づくいくつかの成分値との相関性について検討した。その結果,粒子-油相互作用の中でも特に酸-塩基相互作用成分値が粒子の2相間の移行現象と密接に関連していることを究明した。
非受容体型チロシンキナーゼHylとCskの機能分担と血小板活性化

Src型キナーゼの活性はCskによって常に抑制的に調節されている。我々は、Cskと高い相同性をもつHylを単離し、ゲノム構造の解析からCskとファミリーを形成することを明らかにしてきた。また最近、HylはCsk homologous kinase (Chk)へと名称が変更された。本研究では、ヒト血小板を用いて、Src型キナーゼ活性制御機構を調べることを目的とした。血小板におけるChkとCskの細胞内局在の解析から、Chkは、Cskと同様に膜結合モチーフを持たないにも拘わらず、膜画分に局在し、Csk細胞質局在と対比された。Chkは幾つかの細胞膜貫通蛋白との会合を示した。そして、Chk-膜蛋白複合体はCD36-Lyn複合体の近傍に局在し、化学架橋剤を用いた実験から、ChkはCD36と緩やかな相互作用をもつことが予測された。一方、CskとCD36との会合は見られなかった。トロンビン刺激により、Chkは細胞骨格画分へと迅速に移行するが、Cskは局在を殆ど変化させなかった。CD36-Lyn複合体近傍からのChkの迅速かつ完全な消失は、LynのC末端チロシン残基のリン酸化の著しい減弱を惹起した。そして、Lynは酵素活性の上昇を起こした後、シグナルを伝達するために細胞骨格画分へと徐々に移行した。LynのC末端チロシン残基の脱リン酸化反応は、Chkの細胞骨格画分への迅速な移行が引き金になっていると推測される。血小板におけるSrc型キナーゼのなかで、c-Srcは最も発現量が多いが、CD36とは会合しない。刺激後のc-SrcのC末端チロシンリン酸化状態変化とそれに伴う活性変動は一過性であり、Chkの細胞局在変化と呼応しなかったので、c-Srcの活性はCskによって制御されていると考えられる。しがたって、ChkとCsk共に発現している血小板において、ChkとCskはSrc型キナーゼに対する役割分担を示すことが分かった。
ヒト正常2倍体細胞及びマウス脳における増殖停止誘導遺伝子の単離

乳動物体細胞の分裂寿命は有限であり、それは細胞老化遺伝子によって規定されている。この遺伝子が欠損すると、細胞は無限増殖能を獲得し、不死化細胞に変身する。ヒト不死化細胞株(殆ど癌細胞由来)間の相補性試験を行い、今までに少なくとも4個(AD)の相補性群が見いだされている。我々は微小核細胞融合法を用いた単一染色体移入を行い、7番染色体がD群不死化細胞株(不死化細胞株の約4割を占める)の分裂停止を特異的に誘導することを示している。本年度の計画にしたがって、ヒト7番染色体断片を2-3Mb含むマウスA9放射線雑種細胞パネルを作成し、単一染色体移入を行って分裂停止を誘導するクローンを5個選別した。そのクローンからAluPCR法によってヒトDNAを回収し、それをプローブに用いてFISH解析を行ったところ、D群不死化細胞株特異的な細胞老化遺伝子は7番染色体上の0.5または1.0MbのDNA断片(染色体座はそれぞれ7p22および7q32-33)に位置することが示された。したがって、目的遺伝子を含むYACクローンが単離できる体制が整った。この遺伝子は、状況証拠から生殖細胞と体細胞の発生上の分岐に重要な働きをする、と考えられる。現在、4番染色体上に位置するB群特異的細胞老化遺伝子のクローン化が米国のSmith夫妻のグループによって精力的に行われており、我々と先陣争いをしている。他方、我々は、cGMP-依存プロテインキナーゼの阻害剤が、細胞老化の誘導を特異的に阻止することを見いだした。この発見は、細胞老化の誘導にシグナル伝達系が関与することを初めて示すものであり、細胞老化の研究の突破口になろう。ヒト線維芽細胞の不死化遺伝子の同定・分離の研究の進捗状況は以下のとおりである。I.染色体導入による不死化遺伝子の染色体マッピング。相補性テストによりD群に所属する不死化細胞株KMST及びSUSー1について、RFLP解析を全染色体について行なったところ、1番、7番、11番、16番染色体に部分的あるいは全体のloss of heterozygosiyが認められた。そこで、ミニセル融合法を用いて上記の染色体移入を行なったところ、特定の染色体はKMSTとSUSー1細胞の増殖を抑制あるいは停止させた。しかし、同時に増殖能の低下しないクロ-ンも一定の割合で生じたので、染色体パネル細胞と染色体を導入したクロ-ンの核型の解析を行ない、その原因を調べている。ちなみに、増殖抑制を起こす染色体はA,B,C群に属する不死化細胞の増殖には何の影響も及ぼさなかった。II.アンチセンスcDNAライブラリ-の導入による不死化細胞の分離。老化ヒト線維芽細胞で誘導されるmRNAを濃縮し、ランダムプライム法によりcDNAへ変換後、高発現ベクタ-へ組み込んだ。このライブラリ-と一緒にブラストサイジンS耐性(bsr)遺伝子を含むプラスミドをSV40線維芽細胞へコトランスフェクションを行ない、約10,000個のbsrコロニ-を分離した。ついで、3回の遺伝子導入実験を行ない10^5個以上のアンチセンスcDNAを組み込んだ独立クロ-ンを作成した。1回目の導入実験から約100個のコロニ-を単離し、その増殖特性を調べたところ、1個のコロニ-は増殖停止期を過ぎても正常に増殖しており(30代以上延長)、3個のコロニ-は増殖速度の低下を示すが増殖を続けている(20代以上)。以上の結果より、当初の研究計画はおおむね順調に進行している。ヒト細胞における老化遺伝子の解析を3年間色々な新しい手法を考察しながら行ってきた。

特にアンチセンスライブラリー法による不死化遺伝の単離の試み、ゲル内変性再会合を用いた組換え遺伝子の探索などは有望であったが、方法にまだ検討すべき点があり、満足な成果が得られていない。しかし、正攻法による老化遺伝子同定の研究は著しい進展を遂げたので、簡単に紹介する。細胞老化を終末分化あるいは癌抑制効果と区別するために、世界に2例しかない正常線維芽細胞由来の不死化細胞株KMST-6及びSUSM-1に着目した(それぞれγ線及び4NQO処理により分離された)。まず細胞の不死化は老化遺伝子の劣性変異によって生じることが示唆されているので、上記2株及びそれらの親細胞の全染色体についてRFLP解析を行い、意外にも7番染色体長腕の同じ領域にloss of heterozygosity(KMST-6)及び欠失(SUSM-1)を見出した。そこで、微少核細胞融合法を用いて、7番を含めたいくつかの染色体を上記2株及び癌細胞由来の対照群へ導入したところ、7番染色体だけが上記2株の細胞分裂を停止し、老化細胞に特徴的な形状を示した。7番染色体上の欠失は数Mbp以下(顕微鏡下では正常)と推定されるので、position libraryの作成及び7番染色体のradiation reduced hybridの解析によって、老化遺伝子が実際に欠失領域に存在するかどうか確認中である。以上から、正常細胞の老化を導く遺伝子が7番染色体上に存在することが初めて示され、それのクローン化の体制が築かれた。1.老齢及び若齢マウスの脳と肝臓から精製したゲノムDNAについて、構造変化が見られるかどうか検討した。L1反復配列をEcoRIスター活性で切断したとき、組織間あるいは年齢間でパターンの違いが認められたが、それは塩基配列レベルの違いではなくDNAの製精度や立体構造などの不安定な要因によることが分かった。したがって、老化に伴うゲノムDNAの構造変化の探索は中止した。2.ヒト不死化細胞株は細胞融合を用いた遺伝解析によって少なくともADの4個の相補性群に分類される。まず、D群の不死化細胞株KMST-6及びSUSM-1について詳細なRFLP解析を行い、7番染色体の共通な領域に染色体変化を見い出した。そこで、正常7番染色体を微小核細胞融合法を用いて上記の細胞株へ導入したところ、両者とも1030回の分裂をした後分裂を停止した。さらにD群に属する肝癌由来HepG2株に7番染色体を導入しても同様な結果が得られた。一方、7番染色体はA,B,C群の細胞株の分裂能には影響を与えなかった。したがって、D群細胞株は7番染色体上の分裂停止遺伝子の変異によって生じることが示唆された。次に、放射線雑種細胞を用いて7番染色体のサブパネルを作成し、分裂停止遺伝子を約10Mbの領域に絞り込んだ。これによってメガYACクローンに落とせる見通しが生じた。