hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
鱗翅目昆虫の成虫翅の形を決めている機構

1.蛹翅における細胞間連絡の状況についての予備的結果蛹の翅の分化域・退化域の境界を決めている仕組みを考える一環として、各領域内あるいは領域間の境界線での細胞間連絡の様子を検討することとした。ギャップ結合による低分子の細胞間拡散を検出するために、Lucifer Yellowを顕微注入しその拡散を観察する。今回は、蛹翅の操作法、顕微注入の方法などを、蛹化後4日の蛹を用いて検討した結果、この時期では分化域・退化域ともに細胞間の色素拡散は見られないことがわかった。領域間の境界での拡散については不明である。これより早い時期の蛹の翅は、クチクラとともに扱う必要があり、なお操作法の検討が必要だが、クチクラ自体は非特異蛍光もほとんどなく、実現の可能性は高い。2.退化域の速やかな消失に対するマクロファージ(顆粒細胞)の役割の検討退化域の速やかな消失が起きる時期に、分化域で背側・腹側の上皮が強く接着し、顆粒細胞を含む体液の流路が、退化域の上皮下に制限されている可能性を検討した。このような時期に、腹腔中に墨汁を注入すると、退化域に選択的に流れ込むことはすでに観察していたが、今回はフェリチン粒子を注入したところ、細胞に比べてはるかに小さいフェリチン粒子でも、分化域での密度は退化域での密度を下回っており、分化域の上皮間接着が非常にタイトなものであることが確認された。3.特徴的な翅形態を有する種での退化域退縮過程の観察翅周辺部での細胞死領域が広い種(ゴボウトガリキバガ)や、成虫翅にいくつかの深い切れ込みを有する種(ヨモギトリバ)を用いて、細胞死による成虫翅形態形成が一般的な現象であることを検証するとともに、その機構についての洞察を得ようとした。いずれの種においても特徴的な細胞死が見られたが、最終的な成虫翅の形態には分化域の収縮も寄与していることが示され、退縮と収縮の総合的な結果として形態が決まることがわかった。
ラット同種心移植おける活性酸素消去剤の免疫学的作用の検討

ラット同種心移植における活性酸素消去剤(SOD)の免疫抑制作用について検討した。(方法)ルイスラットをドナー、ブラウンノルウェーラットをレシピエントとしてOno and Linseyの方法に準じて異所性心移植を行った。Humanrecombinant superoxide dismutase(SOD)を移植術後陰茎背静脈より10000単位あるいは20000単位静注投与した。graft survivalは心拍を触知することによって判定した。(結果)SODを投与しなかったコントロール群ではgraft survivalは平均6日であった。SOD10000単位投与群では平均7.5日、SOD20000単位投与群では平均7日であり、コントロール群と差はみとめなかった。以上の結果よりラット同種心移植に於いてSODによる免疫抑制作用(graft survival延長効果)はみとめなかった。(考察および今後の展望)SODによる免疫抑制作用は、再潅流時の阻血障害が移植片の免疫担当細胞におけるclass II antigen-expressionのupregulationなどにより免疫原性が増強され拒絶反応を引き起こすという仮説に基づき、SODがこの過程を抑制するものとされている。しかし今回の我々の検討ではこのようなSODによる免疫抑制作用は証明し得なかった。酵素抗体法を用いたgraftのantigenPresenting cellのclass II expressionの頻度もコントロール群と差はみとめなかった。SODの作用機序から考えるとSOD単独では明らかなgraft survivalの延長は望めない可能性もあるため、今後SODとサクロスポリンA、あるいはFK506という免疫抑制剤を併用し検討を加える予定である。
神岡地下実験室における液体-気体二相型キセノン検出器を用いた暗黒物質探索実験

テスト用1kg検出器を製作し、キセノンのシンチレーション光に対する反射材としてPTFEテフロンを使用した。その性能試験を行った結果、PTFEの反射率が90%前後と非常に高いことを確認した。また、10keV以上のγ線とキセノン反跳核の信号の識別能力が99%以上であることを確認した。さらに、低バックグラウンド用光電子増倍管の開発を浜松ホトニックスと共同で開始した。平成13年8.月末、神岡地下実験施設内に放射線遮蔽を含むテスト用1kg検出器の設置を終え、バックグラウンドの測定を開始した。まず、キセノン中の放射性不純物の含有に関しては、2種類の純化装置をテストした。Oxisorbからは多量の放射性不純物が認められたが、SAESゲッターからは殆ど認められなかった。低バックグラウンドゲルマニウム検出器や質量分析器を用いて検出器自身および検出器周辺の物質の放射性不純物濃度を測定し、使用材質の選定を行った。さらに、これらの測定結果を基に詳細なシミュレーションを行い、それと測定結果を比較検討した。その結果、光電子増倍管と検出器を断熱するためのステンレス製の真空容器が大きなバックグランド源であることを突き止めた。以上、測定結果は、目標の値よりも1桁程度悪かったが、原因は究明されており、改良を加えることにより世界のトップレベルに到達できることが分かった。この結果を踏まえて15kg検出器の断熱真空用容器は無酸素銅を使用し、光電子増倍管に関しても、さらなる低バックグラウンド化を進めていく方針である。この検出器の特徴である、バックグラウンドの識別能力に関は低エネルギー部において、未だ99%以上という目標には達していない。その要因としては、陽極部のワイヤーが緩んだため、小さな放電が液体キセノン中でおこり、低エネルギー部の雑音となりバックグランドγ線の識別能力が落ちたことが挙げられる。このワイヤーの固定方法に関しては、これまでの半田付けの代わりに、より確実なスポット溶接を用いることにした。ワイヤー中に無視できない量の放射線不純物が含有していることが分かったので、ワイヤーの径を30μmから1020μmの物に変えることにした。以上の結果を踏まえて、15kg検出器の設計、製作を行った。有効質量20kgの検出器を設計するために、有効質量lkgの検出器によるテスト実験を開始した。神岡地下実験施設のクリーンルーム内に放射線遮蔽を含むテスト検出器を設置し、バックグランドの測定を行った。結果は、目標の値よりも2桁以上悪かった。その最も大きな要因としては、従来の光電子増倍管を使用したことにある。そのため、浜松ホトニックスと共同で低バックグランド光電子増倍管を開発した。もう一つの要因としては、陽極部の金メッキタングステンワイヤーが緩んだため、小さな放電が液体キセノン中でおこり、低エネルギー部の雑音となりバックグランドγ線の識別能力が落ちたことが挙げられる。ワイヤーの固定方法に関しては、これまでの半田の代わりに、より確実なスポット溶接を用いることにした。それと平行して、低バックグラウンドゲルマニウム検出器や質量分析器を用いて検出器自身および検出器周辺の物質の放射性不純物濃度を測定し、更なる物質の選定を行った。これらの放射性不純物濃度の測定結果を基に詳細なシミュレーションを行い、それとテスト検出器によるバックグランド測定の結果を比較検討した。その結果、検出器を断熱するためのステンレススチール製の真空容器が大きなバックグランド源となることを突き止めた。以上の結果を踏まえ、シミュレーションによる光の収集効率の最適化を行い、無酸素銅製の20kg検出器を設計し、その製作を開始した。キセノン中の放射性不純物の含有に関しては、2種類の純化装置をテストした結果大きな差がみられた。即ち、従来使用していたOxisorb(モレキュラーシーブス+Cr合金)からは多量のウラン、トリウム系列の放射性不純物が認められたが、SAESゲッター(Zr+Vゲッター)からは殆ど認められなかった。さらに高度な純化装置を目指して、蒸留を用いた方法を太陽東洋酸素の協力を得て研究・開発を開始した。

この結果を踏まえて15kg検出器の断熱真空用容器は無酸素銅を使用し、光電子増倍管に関しても、さらなる低バックグラウンド化を進めていく方針である。この検出器の特徴である、バックグラウンドの識別能力に関は低エネルギー部において、未だ99%以上という目標には達していない。その要因としては、陽極部のワイヤーが緩んだため、小さな放電が液体キセノン中でおこり、低エネルギー部の雑音となりバックグランドγ線の識別能力が落ちたことが挙げられる。このワイヤーの固定方法に関しては、これまでの半田付けの代わりに、より確実なスポット溶接を用いることにした。ワイヤー中に無視できない量の放射線不純物が含有していることが分かったので、ワイヤーの径を30μmから1020μmの物に変えることにした。以上の結果を踏まえて、15kg検出器の設計、製作を行った。平成13年8月末、神岡地下実験施設内に放射線遮蔽を含むテスト用1kg検出器の設置を終え、バックグラウンドの測定を開始した。まず、キセノン中の放射性不純物の含有に関しては、2種類の純化装置をテストした。Oxisorbからは多量の放射性不純物が認められたが、SAESゲッターからは殆ど認められなかった。低バックグラウンドゲルマニウム検出器や質量分析器を用いて検出器自身および検出器周辺の物質の放射性不純物濃度を測定し、使用材質の選定を行った。さらに、これらの測定結果を基に詳細なシミュレーションを行い、それと測定結果を比較検討した。その結果、光電子増倍管と検出器を断熱するためのステンレス製の真空容器が大きなバックグランド源であることを突き止めた。以上、測定結果は、目標の値よりも1桁程度悪かったが、原因は究明されており、改良を加えることにより世界のトップレベルに到達できることが分かった。この結果を踏まえて15kg検出器の断熱真空用容器は無酸素銅を使用し、光電子増倍管に関しても、さらなる低バックグラウンド化を進めていく。我々の検出器の特徴である、バックグラウンドの識別能力に関しても99%以上という目標には達していない。ワイヤー中に無視できない量の放射線不純物が含有していることが分かったので、ワイヤーの径を30μmから20μmの物に変えることにした。今年度中に最終テストを終える予定である。以上の結果を踏まえて、15kg検出器による実験を開始するが、DAMAグループの領域或いはさらに低い領域の探索が期待できる。
新しい脚延長法の開発に関する基礎的、臨床的研究

我々は河邨式脚延長器を開発し、1963年以降多くの症例に延長術を行ってきた。しかし合併症も多く発生している。つまり、ピンの移動によるピン孔感染、再骨折、偽関節、骨髄炎、ピンの刺入角異常による延長部での変形治癒などである。本年度は今までの経験をもとに三次元的に調節可能でかつコンパクトな延長器を試作した。[特長]1.下腿用は両側支持、大腿用は片側支持とし、それぞれ5mmφの貫通ピン、6mmφのハ-フピンにより骨を固定する。2.ピンの刺入角がある程度狂った場合でも三次元的に補正して正しいアライメントを保持して固定できる。3.延長中に内外反が生じた場合でも矯正できる。4.延長中の歩行に耐えうる強度を持つ。[人工骨を用いた強度試験]26mmφのベ-クライト棒を人工骨として使用し、圧縮試験および曲げ試験を行った。下腿用延長器:圧縮試験では、110kgまではリニア-に荷重に耐え、最大220kgまでは荷重に耐えられ、曲げ試験では15kgまでリニア-に荷重に耐えられ十分な強度を持つことがわかった。大腿用延長器は、クランプ部でのピンの滑りが比較的早期に起こり十分な強度を得られず、現在改良中である。[今後の展望]1.今回の試作器はステンレス製であるが、チタン製に変更する。これにより延長器の重さは1.4kgから0.8kgに43%軽量化される。摩擦係数の違いによりクランプの固定性が1020%向上すると思われる。2.ロッドにロ-ドセルを組み込めるようにして、延長中および延長後の骨にかかる張力をモニタ-できるようにする。3.持続延長用のステップモ-タ-を組み込めるようにし、そのコントロ-ルシステムを開発する。
グローバル・キャリアの転進：アジア系医療従事者の心の動きとマクロ環境

日本とインドネシア両政府の経済連携協定(Economic Partnership Agreement,以下EPA)により来日した14陣のインドネシア人看護師と介護福祉士を前科研と合わせ10年近く追跡した。彼らの日本体験を文化心理学の立場から検討した。マイクロ・メゾ・マクロの三次元の関係性に着目し、個々のアクターが特定の社会的文脈において、自身や状況をどう認知しどう意味づけるかを重視した。定住化には、主観的ウェルビーイング(Subjective well-being, SWB)、すなわち人生に対する情動的また認知的かつ主観的な評価(Diener, 1984)が重要であることがわかった。今までの異文化接触研究においては、ホスト文化で感じる否定的情動に焦点をあて、「ストレスー対処ー適応」の枠組みから研究されることが多かったが、異文化適応という限りいつまでも「外国人」として捉えることになる。国際移動をした人をホスト社会の一員としてみるためには、ホスト社会での定住に際しては、異文化でのストレス対処を含め、どのようにしてSWBを得るかという視点が肝要である。SWBは、国際移動した人がホスト国で定住できそうかどうかを予測するめどとして使える。母国とホスト国とを公私の様々な領域で比較・評価することで肯定的・否定的情動の総和の帰結として定住化を選択している。帰国後のキャリア選択や再入国も、SWBで説明できる。帰国者には主に3つのキャリア選択があった。インドネシアで得た看護・助産師の資格を生かす場合、日本で得た日本語や介護の知識を生かす場合、それ以外の道である。このキャリア選択にも仕事におけるやりがいや経済的満足、日本で習得した資格や技術の活用、家族生活の安定のSWBが関係している。EPAは技術移転ではなく、若者を規律訓練や日本語習得により日系企業に貢献する人材を育成する制度といえる。本年度の目的は、EPAインドネシア人看護師の日本体験についての理論化と、研修終了後のキャリア展開における心の動きとその背後にあるマクロ要因を検討することである。イ看護師候補者の来日当初の正看護師でありながら看護助手や介護福祉士として扱われることで感じる否定的情動への対処方略を、自己の意味の再編成という視点から理論化を進めた。候補者は、看護助手の立場を甘受した候補者は,看護師国家試験合格の目的を明確にし,自己の中に新たに受験生としての意味を創出させ,勉強に励んだ。自己の新しい意味づけは、日本人看護師, EPA仲間など他者との関係によって可能となった。個人内の意味空間の再編には,否定的情動の解消が重要で,正看護師としての自己評価基準の高さや領域の変更,目標設定がなされていた。イ看護師の研修終了後の継続就労をする場合と、帰国後のキャリア選択する場合の影響要因を、国内とインドネシアでの聞き取り調査から検討した。合格者の継続の理由は、看護技術と知識の習得、日本語力の向上であり、職場環境と自身の能力の認識と欲求を調整している。急性期患者を扱う病院ではさまざまな看護技術を学べるが、日本語力の限界や日本人とのコミュニケーションの困難から、技術的に比較的容易な慢性期病棟に落ち着く。継続の大きな動機は家族にとっての経済的メリットである。国家試験合格帰国者の主な帰国理由は、結婚は30歳までという社会通念で、家族志向や、イスラム教の教えなど宗教的価値観が背景にある。帰国者の看護職か非看護職かの選択には、看護師アイデンティティの強さ、自身の看護技術の自己評価、日本語活用や新しい事への挑戦欲が関係していた。制度(マクロ)からくるマイクロレベルの否定的な心理(合格後のサポートの欠如感)に対処するため、在日イ看護師の中には看護師協会日本支部を設立するなど、メゾレベルでの互助組織を作り出す動きも出てきた。EPA医療人材の受け入れ制度をめぐり、日本側の制度とインドネシアの送り出し政策は著しい変遷があり、複雑である。日本側の制度は、国家試験問題改訂(わかりやすい文章、難解な漢字への振り仮名付記、疾病名英語併記)、国家試験受験不合格者に滞在延長、再受験制度、滞日前日本語研修延長、看護師国家試験時間、問題改訂など、毎年のように制度改善が加えられている。現在介護福祉士候補者の活躍促進策が検討されており、受入れ対象施設の範囲の拡大(同施設内の障害者施設やデイサービス)、EPA介護福祉士の就労範囲の拡大などが検討されている。2015年度は看護師への聞き取りが中心となり、国内の介護福祉士の動きに注力できなかったため、2016年度は介護福祉士への聞き取りを進めて行く必要がある。一方、インドネシア側は、保健医療人材の教育・資格制度の整備と質的向上を積極的に進めている。2012年より看護師、医者などの登録制度が導入され、看護師は5年間うちに25単位、医者は30単位集めなければならない単位制度(SKP)も導入された。この資格登録とSKPの制度により、国内医療従事者だけでなく外国人医療従事者の品質を担保しようとしている。2012年のこの改革は、EPA看護師・介護福祉士の帰国後のキャリア選択に少なからず影響を与えている。このような複雑かつ変化が激しい両国、とくにインドネシアの制度や政策の理解に時間をとられた。2015年度は、イ看護師の日本の病院で看護助手として扱われることに対するアイデンティティショックとその対処についての投稿論文は修正掲載となったので掲載まで持っていく。また、学会発表した内容(正看護師となったときのアイデンティティショックとその対処、インドネシア人候補者の宗教実践にみる位置取り)、をより精緻化し関連雑誌への投稿を進めていく。

本年度の実績概要を、(1)国家試験合格後に日本で働いているEPAインドネシア人の定住化の実態、(2)研修終了帰国後のキャリア展開、(3)帰国後のキャリア選択に影響するマクロ要因(4)EPAのインドネシアへの技術移転の実態、に分けて報告する。(1)2008年に来日した1陣は2017年1月で9年が経過し、定住化が進んでいる。日本に定住する条件は、受け入れ病院・施設との折り合いの良さ(職務内容、残業など労働時間、宗教的実践への配慮)、呼び寄せ家族の問題(パートナーの日本語、同国人ネットワーク、子どもの教育)が関係している。特に稼ぎ手の性別によって、家族にかかる負担が違う。稼ぎ手が妻の場合、夫の就労時間制限(1週間に28時間)と日本語の問題があるうえ、子どもを保育園に入れられるかどうかが鍵となる。イスラム教徒の場合、子どもが小学校高学年になると、宗教教育の困難さがある。(2)インドネシア帰国後、非看護学校卒で介護福祉研修を受けてEPAに参加した2&3陣の者の多くは、日系企業の翻訳・通訳、日本語教師、助産師、学校の図書館の司書、宝石や日常品の商売など多様なキャリア展開があった。(3)非看護職を選択するイ国内の背景には、看護職の賃金の低さ、国内の医療関連の資格制度の強化(5年で資格を更新する制度)による負担感があった。インドネシア看護協会はこの問題を認識しており、政府に働きかけていた。地方在住者や子育て中の主婦がオンラインビジネスに従事することができるICT環境の発達があった。(4)高齢者施設やEPA枠外の若い介護士養成コース開設の事例(論文として発表)など、日本の研修制度の介護部門介護士養成をねらった動きが活発化しており、日本での経験、日本語や介護技術を期待してEPA帰国者が起用されていた。日本語や職務規律(時間厳守など)だけでなく、介護技術を家族の介護に役立てるだけでなく、職場への転用(重い荷物を運ぶ体位変換)の事例があった。国内のEPA合格者の1、2陣を中心に9年間追跡してきた事例をもとに、定住化の条件の分析を進めている。看護師と介護福祉士では、給与や職場環境が違うが、両者に共通なのは家族単位で定住化が決まることがわかった、配偶者、子ども、母国の家族の状態について条件を整理するために、より細かな事例の整理を行う必要がある。2016年度の2回にわたるインドネシア調査により、帰国者のキャリア選択の実態がおおむねわかってきた。帰国者に影響を与える社会経済状況や保健医療制度の変化(SKP制度)、また帰国者自身の再来日への希望の強さが見出された。インドネシアへの技術移転の側面について、より深く検討していく。(1)国家試験合格後に日本で働いているEPAインドネシア人の定住化の実態:定住化には家族としての主観的ウェルビーイング(Subjective well-being, SWB)が重要であった。SWBの構成要素として「職場での自己効力感」「家族の生活の安定」「家族の宗教実践の継続」が関係していることがわかった。
がん研究のための国際情報の収集と配布

本研究班は、がん特別研究に所属する研究者に対して、国内外のがん研究情報を配付することを目的としたサービスを主体とする役割を果たしている。昭和63年度における進捗状況は、次のごとくである。(1)がん関係のデータベースの収集とUTOPIAへの収録。本研究費によって購入した「Excerpta Medica」データベースを、研究代表者の所属している筑波大学学術情報処理センターに設置されている大型計算機システムに入力し、同センターで開発したオンライン文献検索システムである「UTOPIA」に収録した。63年度に収録した文献件数は、298,989件である。(2)収録されたデータベースのオンライン利用の実施。収録されたデータベースを、オンライン利用に供した。利用している研究者は58機関であり、その利用範囲は全国に及んでいる。UTOPIAに収録されている他のデータベースも同時に公開しているので、研究者にとって必要な研究情報をえるソースとしての役割を果たしている。(3)SDIサービスの実施がん特別研究に所属している研究者の中で、定期的に情報を入手することを希望している研究者を対象に、本研究費で購入した「Excerpta Medica(EM)」及び筑波大学学術情報処理センターの校費で購入している「Cancer Literature(CL)」を対象にSDIサービスを実施した。SDIサービスは、研究者があらかじめ登録している必要とする情報の内容に基ずき、新たなデータベース・テープが納入される度に検索を行って、求められている情報がある時には、情報を打ち出して各研究者に送付するサービスである。1988にSDIサービスを実施した回数は、EMが19回、CLが11回で、サービス対象者は延べ4,890名である。
マウス骨転移モデルに対するリン酸化プルラン・ゾレドロン酸混和物の抗腫瘍効果の検討

乳がん細胞および,乳がん骨転移モデルマウスにリン酸化プルラン・ゾレドロン酸混和物を投与し抗腫瘍効果を検討した.in vitroでは,リン酸化プルラン・ゾレドロン酸混和物からの溶出液が抗腫瘍効果を示し,リン酸化プルランがゾレドロン酸の徐放効果を有していることが分かった.in vivoでもマウス脛骨の腫瘍内に局所投与したリン酸化プルラン・ゾレドロン酸混和物周囲に腫瘍壊死を認め抗腫瘍効果があった.また混和物周囲には骨形成を認めた.昨年度に引き続き、第三世代のビスホスホネートであるゾレドロン酸を混入したリン酸化プルランのビーズを作製した。37°CのPBSバッファーに浸漬させ、24時間毎ににPBSバッファーを交換し、PBS溶液を回収した。ビーズから溶出したゾレドロン酸の濃度を測定するために高速液体クロマトグラフィー法の条件検討を行った。徐放されたゾレドロン酸を検出したが、リン酸化プルランと思われる夾雑物により、正確な検量線の作成が困難であった。リン酸化プルランにゾレドロン酸を混和し、PBSバッファーに浸漬させて生じた溶出液と乳がん細胞株(MDA-MB-231)と共に培養し、WST-1 assayを行った。ゾレドロン酸群と同等程度の抗腫瘍効果がin vitroで認められた。4週齢のBALB/c nu/nuマウスを用い,全身麻酔下に右大腿骨骨内に乳がん細胞株(MDA-MB-231-luc)を接種させる。接種後3週時に,全身麻酔下にゾレドロン酸含有リン酸化プルランを右大腿骨内に充填し、X線学的評価(micro CT)およびIVIS Imaging Systemによる腫瘍活性の評価、組織学的評価を行った。未治療群に比べゾレドロン酸含有リン酸化プルラン投与群では、IVISにて腫瘍の活性が低下していた。乳がん細胞および,乳がん骨転移モデルマウスにリン酸化プルラン・ゾレドロン酸混和物を投与し抗腫瘍効果を検討した.in vitroでは,リン酸化プルラン・ゾレドロン酸混和物からの溶出液が抗腫瘍効果を示し,リン酸化プルランがゾレドロン酸の徐放効果を有していることが分かった.in vivoでもマウス脛骨の腫瘍内に局所投与したリン酸化プルラン・ゾレドロン酸混和物周囲に腫瘍壊死を認め抗腫瘍効果があった.また混和物周囲には骨形成を認めた.当初の計画通り、第三世代のビスホスホネートであるゾレドロン酸を混入したリン酸化プルランのビーズを作製した。それにより、徐放されたゾレドロン酸を検出可能であった。ゾレドロン酸の濃度を高速液体クロマトグラフィー法を用いた測定したが、条件設定が困難で、時間を要した。当初、平成24年度に行う予定であった、リン酸化プルラン・ゾレドロン酸混和物から溶出した溶出液を用いて、がん細胞株に投与しin vitroでのリン酸化プルラン・ゾレドロン酸混和物の抗腫瘍効果の検討を行う。さらに、当初の予定通り、マウスがん骨転移モデルにリン酸化プルラン・ゾレドロン酸混和物を局所投与し,その抗腫瘍効果を検討する。H24年度の研究計画では、高速液体クロマトグラフィー法を用いたゾレドロン酸濃度の測定後、がん細胞株に投与しin vitroでのリン酸化プルラン・ゾレドロン酸混和物の抗腫瘍効果の検討を行う予定であったが、ゾレドロン酸濃度の測定が、条件設定が困難で、時間を要したため、in vitroでのリン酸化プルラン・ゾレドロン酸混和物の抗腫瘍効果の検討は次年度に繰り越すことになった。そのため今年度に以下の研究を行い、繰り越した研究費とともに使用する。(1)がん細胞株に投与しin vitroでのリン酸化プルラン・ゾレドロン酸混和物の抗腫瘍効果の検討を行う際に薬品、必要物品の購入を行う。(2)マウスがん骨転移モデルに対するリン酸化プルラン・ゾレドロン酸混和物の抗腫瘍効果の検討を行う際に、ヌードマウスおよび薬品、必要物品の購入を行う。
水系での固相合成〜グリーンケミストリーを指向したペプチド合成法の開発

科学技術における重要課題に「グリーン・サスティブナルケミストリー」が挙げられ,有機溶媒使用の低減化,毒性の少ない試薬の利用が望まれている.しかし、現在、固相合成のほとんどが有機溶媒中で行われており,水中での試みは特殊な例に限られている。試薬、building block等の水に対する難溶性が、それらを利用した水中反応の試みと一般汎用化を障害している.本研究では、building blockの難溶性解決の方法として水溶性基の導入と水分散性をもたせることを提案し,また,ペプチド合成においてそれを実証した.科学技術における重要課題に「グリーン・サスティブナルケミストリー」が挙げられ,有機溶媒使用の低減化,毒性の少ない試薬の利用が望まれている.しかし、現在、固相合成のほとんどが有機溶媒中で行われており,水中での試みは特殊な例に限られている。試薬、building block等の水に対する難溶性が、それらを利用した水中反応の試みと一般汎用化を障害している.本研究では、building blockの難溶性解決の方法として水溶性基の導入と水分散性をもたせることを提案し,また,ペプチド合成においてそれを実証した.水分散型ナノ粒子としたFmoc保護アミノ酸を用いた水中固相合成技術の開発を行った。これまでFmoc保護アミノ酸が水に難溶であるため、完全水系でのFmoc法による固相合成は検討されてこなかった。しかし、Fmoc保護アミノ酸を水に分散型ナノ粒子に加工すれば、比表面積の増大、他成分との均一に混合により、水中でも、Fmoc法による円滑な固相合成が期待できる。また、反応後のナノ粒子は遠心分離等で水から回収、再利用でき、水を循環できる方法にもつながる。そこで今回、Fmoc保護アミノ酸の水分散型ナノ粒子の調整法、及びそれらを利用した水中ペプチド固相合成法の確立を検討した。まず、Fmoc保護アミノ酸[Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH及びFmoc-Tyr(tBu)-OH]の水系分散型ナノ粒子の調製を行った。Fmoc保護アミノ酸に分散添加剤としてpoly(ethylene glycol)を加え、ジルコニアビーズを用いた遊星ボールミルで水中2時間室温粉砕した。走査型電子顕微鏡の投影から得られた粒子いずれもがナノサイズであることを観察した。モデルペプチドとして7残基ペプチドdermorphin amideを選択し、水分散型ナノ粒子へと加工したFmoc保護アミノ酸を用いる水中固相合成を検討したところ、目的のdermorphin amideを収率よく得ることができた。Fmoc保護アミノ酸の水分散型ナノ粒子の調整し、それらを利用した水中固相合成法を確立することができた。水分散型ナノ粒子としたFmoc保護アミノ酸を用いた水中固相合成技術の開発を目指す。また、反応後のナノ粒子は遠心分離等で水から回収、再利用でき、水を循環できる方法にもつながるといえる。ナノサスペンションはフリュッチ製遊星ボールミル中、ジルコニアビーズで水中2時間室温粉砕して調製した。分散添加剤として、ポリエチレングリコールを加えた。DLS測定、走査型電子顕微鏡の投影から得られた粒子がナノサイズであることを観察した。続いて、このナノサスペンションを用いロイシンエンケファリンアミド、デルモルフィンアミドなど数種のペプチドについて、固相上での水中合成を検討し、いずれも効率よく得ることができた。また、分散性を向上させるとその反応性も改善されると考え、界面活性剤(TritonX-100など)の添加について検討してところ収率、純度の向上が認められた。このように、Fmoc保護アミノ酸を水分散型ナノ粒子すなわちナノサスペンションへと加工することで水中でも反応に用いることができることを示した。また、それらを利用した水中固相合成法を確立することができた。本技術は、building blockの難溶性解決の新たな提案でもあり、環境に調和した水循環型固相有機合成法の足掛かりと期待できる。ペプチド合成の一般的building blockであるBoc保護アミノ酸、Fmoc保護アミノ酸である。これらは有機溶媒に優れた溶解性を示す水に難溶の固体で水中反応への利用は不適とされており、完全水系でのBoc法、Fmoc法によるペプチド合成の検討はなされてこなかった。最近我々は、新しい技術としてFmoc保護アミノ酸を用いる水中固相合成法を報告した。今年度は、Boc保護アミノ酸を水分散型ナノ粒子として用い、水を溶媒とした液相合成について検討を行った。まず、Boc保護アミノ酸の水系分散型ナノ粒子の調製を行った.調製したBoc保護アミノ酸の水分散型ナノ粒子を用いたLeu-enkephalinamideの水中での液相合成を検討した。縮合反応は、DMT-MMを用いて行った。Boc基の脱保護反応はHCl-ジオキサンを用いて行った。縮合反応は、水中で水分散型ナノ粒子のBoc保護アミノ酸とアミン成分を混合し、DMT-MMを加え、中性条件下室温で12時間撹拌することにより行った。反応後、未反応のナノ粒子や試薬の副産物を濾過によってのぞき、目的物の各保護ペプチドフラグメントを,純度よく得ることができた.純度を示す。

いずれも、収率は、80%以上と高くその純度も90%以上と高収率、高純度得ることができ、水分散型ナノ粒子を用いた水中での縮合反応が円滑に進行したことがわかった。また、最終脱保護によって得られた目的のLeu-enkephalinamideのtotalの合成収率は83%で、TOF-MS、旋光度により確認した。以上、今回、Boc保護アミノ酸の水分散型ナノ粒子を遊星ボールミル中で調整し、それらを用いたBocchemistryによる水中でのLeu-enkepahlinamideの合成に成功した。また、水分散型ナノ粒子を用いたDMT-MMによる水中での縮合反応は、高収率、高純度で進行することがわかった。
認識レベルに応じた交流活動を核とし、理解から表現への深化拡充を図る単元構想の研究

「理解」から「表現」へと展開する単元構想において、言語交流自体を思考や認識レベルで有効に機能させる方法について、以下の内容で研究した。1学習課題・教材等に関する生徒の認識レベルを判断・評価する基準の設定キーワードの抽出、イメージマップや意味マップ、感想などによる認識レベルの把握の仕方の開発。2認識レベルに応じた、認識の変容過程における有効な新情報の質・量・段階等の設定認識が変容する要因は様々であるので、以下の視点でその影響の度合いを検証した。(1)教師からの新情報の取得(2)生徒相互の言語交流(話し合い、筆記等)による新情報の取得3意図的グループ編成のタイプに対応した交流活動の方法交流活動をシステム化するために、意図的なグループ編成の方法の開発を目指した。4言語交流が有効にはたらく、「理解」から「表現」へと展開する単元の開発大きくは「理解」から「表現」であるが、言語活動で言えば「話す」「聞く」「書く」「読む」の組み合わせで考えることになり、そのまとめ方や組み合わせ方などにはいくつものパターンが考えられる。「認識レベルに応じた意図的グループ編成」による単元を開発した。2年「見るということ」(題材「神奈川沖浪裏」)、3年「古典を味わう」(題材「おくのほそ道」)である。認識レベルに着目してグループ編成することによって、意図する方向での深まりが得られやすかった。
Trudinger-Moser型臨界非線形楕円型方程式の符号変化解の漸近挙動

当該年度より本研究課題の発展的研究として,一般の有界領域上での符号変化爆発解の構成を目指し,研究協力者であるローマ大学のMassimo Grossi氏との共同研究を始めた。当面の目標はまず軸対称領域での符号変化爆発解の構成を行うことである。我々が構成を目指す解は非線形問題特有の挙動を示すものであり興味深い。特に適切な極限において,解のある部分は集中現象を起こし,ある部分は臨界方程式の正値解に強収束をするという2種の異なる挙動を合わせ持つものである。この種の解は我々の去年度までの研究によって球対称領域では存在することが示されているが,一般の有界領域で存在するか否かは未解決であり,非自明な問題である。この解決のために我々はLyapunov-Schmidtの方法を用いた解析を行う。これまでの準備研究によって,この解の構成のためには対応する臨界方程式の正値解の非退化性を示す必要があることが明らかになっている。そこで当該年度はこの臨界方程式の正値解の非退化性を証明することを目指し研究を行った。手法は爆発解析を用いた。まず解析の第一段階として高次元におけるSobolev臨界問題や2次元領域におけるLiouville-Gelfand問題に対する同種の先行研究の手法を我々のTrudinger-Moser型臨界問題に応用することを試みた。その結果,対応する線形化問題の解および爆発解が満たすべき恒等式を用いた証明部分において,当該問題の非線形性の特殊性により,深刻な困難が生じることが明らかになった。現在はこの困難を解消するべく研究を継続している。また,本研究課題に関連して国内外における諸学会・研究集会において招待講演を6回行った。さらに前年度までに得られた結果についてまとめたMassimo Grossi氏との共著論文の出版が決定した。前年度までに当初の目標は達成しており現在発展的研究課題に取り組んでいる。臨界方程式の正値解の非退化性に関する研究を継続する。特に当該年度までの研究によって明らかになった証明が困難な箇所「対応する線形化問題の解および爆発解が満たすべき恒等式を用いた証明」の解析を重点的に行う。この為に爆発解および線形化問題の解の漸近展開を用いることが有効であると考えられる。これについて球対称領域に対する先行研究であるMalchiodi-Martinazzi('14)やMancini-Martinazzi('17)が参考になると期待される。これらの論文のアイディアを我々の考察している軸対称領域における問題に拡張することを試みる。このことで証明の困難を解消し正値解の非退化性を証明する。この結果が得られ次第,当該発展課題であるLyapunov-Schmidtの方法を用いた軸対称領域における符号変化爆発解の構成に適用しその証明を完成させる。研究遂行を円滑にするために随時メールやローマ大学を直接訪れることで研究協力者であるMassimo Grossi氏との研究討論を行う。またこれまでに得られた解析結果について諸学会や研究集会において講演を行い周辺領域の専門家らとの議論を行うことで本研究課題達成のための新たなアイディアを模索する。私は当該年度の研究によって,Trudinger-Moser型非線形項を持つ臨界楕円型方程式の球対称符号変化解の漸近挙動に関する解析を行った。特に,先行研究Adimurthi-Yadava(1992)によって得られたk回符号変化する低エネルギー球対称符号変化解についての爆発解析を行い,その解は適切な極限においてk個の爆発(値が無限大に発散)する点を持つこと,それらの爆発点の周りで適切なスケーリングを施すことで解はLiouville方程式の解に収束することおよび,そのエネルギー極限値には2πの自然数倍が現れること,つまり「エネルギーの量子化現象」が現れることを証明することに成功した。さらに,解はk個の爆発する部分に加え,1つのコンパクト性を有する(方程式の正値解に強収束する)部分を持つことも同時に証明できた。これは1つの解の漸近挙動の中に非コンパクト性(集中現象)とコンパクト性(強収束性)が混在することを示したもので興味深い結果である。これらの証明のために私はまず,代表的な集中関数列であるMoser列を用いて適切な試験関数を構成することで解のエネルギーの計算を行った。続いてこのエネルギー評価をもとに,Adimurthi-Druet(2004)やGrosii-Grumiau-Pacella(2014)による爆発解析法を応用することで,それぞれの爆発点の周りでの解の挙動を調べた。本研究結果は研究協力者であるローマ大学のM. Grossi准教授との共著論文として執筆を行い,現時点で数学専門誌に投稿中である。さらに本結果について4件の国内外研究集会及び学会において口頭発表を行い,聴講者らとの討論を行った。本結果は本研究課題の当初の研究目的を達成しており,今後は発展的研究課題である一般領域における符号変化爆発解の構成に取り組む。当初の研究目的を達成し,発展的研究課題の着想及び研究計画を得ている。よって当初の計画以上に進展しているといえる。

特に適切な極限において,解のある部分は集中現象を起こし,ある部分は臨界方程式の正値解に強収束をするという2種の異なる挙動を合わせ持つものである。この種の解は我々の去年度までの研究によって球対称領域では存在することが示されているが,一般の有界領域で存在するか否かは未解決であり,非自明な問題である。この解決のために我々はLyapunov-Schmidtの方法を用いた解析を行う。これまでの準備研究によって,この解の構成のためには対応する臨界方程式の正値解の非退化性を示す必要があることが明らかになっている。そこで当該年度はこの臨界方程式の正値解の非退化性を証明することを目指し研究を行った。手法は爆発解析を用いた。まず解析の第一段階として高次元におけるSobolev臨界問題や2次元領域におけるLiouville-Gelfand問題に対する同種の先行研究の手法を我々のTrudinger-Moser型臨界問題に応用することを試みた。その結果,対応する線形化問題の解および爆発解が満たすべき恒等式を用いた証明部分において,当該問題の非線形性の特殊性により,深刻な困難が生じることが明らかになった。現在はこの困難を解消するべく研究を継続している。また,本研究課題に関連して国内外における諸学会・研究集会において招待講演を6回行った。さらに前年度までに得られた結果についてまとめたMassimo Grossi氏との共著論文の出版が決定した。前年度までに当初の目標は達成しており現在発展的研究課題に取り組んでいる。今後は,発展的研究課題として一般の有界領域上での符号変化爆発解の構成に取り組む。手法はLyapunov-Schmidtの方法を用いる。ただし,はじめから直接的に一般の有界領域を考えることは難しいと思われるため,当面の目標としてやや特殊な状況である軸対称領域を考え,その上での符号変化爆発解の構成を行う。このためにVaira(2015)による高次元の臨界問題の爆発解の構成を行った先行論文が参考になると思われる。これによると,我々の課題達成のためには対応する2次元Trudinger-Moser型非線形楕円型方程式の正値解の非退化性を用いる必要があると思われる。しかしこれまでの研究では一般領域における当該方程式の正値解の非退化性についてはまだ明らかになっていない。そこで,今年度は当該方程式の正値解の非退化性を証明することを目標とする。このために,関連する2次元指数型非線形楕円型方程式に対する先行研究であるGrossi-Ohtsuka-Suzuki(2011)による爆発解析に基づいた解の非退化性の証明法を学び,本課題への応用を行う。さらに彼らの議論を応用するためには爆発解のより詳細な解析結果が必要であると思われる。このために先行研究であるAdimurthi-Druet(2004)やMarchis-Ianni-Pacella(2017)などを参考に爆発正値解のさらなる詳しい解析を行う。さらに球対称解の非退化性を研究した先行論文であるAdimurthi-Karthik-Giacomoni(2016)を通読しその応用を模索する。
潰瘍性大腸炎に対する新規治療薬の探索研究－大建中湯の作用機序解明

潰瘍性大腸炎は難治性の慢性炎症疾患であり、その病態解明ならびに新規で有用な治療薬の創出が求められている。本研究では、漢方薬である大建中湯の急性大腸炎および大腸炎関連発がんに対する作用ついて検討を行った。大建中湯は急性大腸炎の発生を抑制し、大腸組織における炎症性サイトカインの上昇を有意に抑制した。また大建中湯は腸管マクロファージにおけるTNF-αの発現を低下させた。さらに大建中湯は、大腸炎関連発がんモデルにおける腫瘍形成を有意に抑制した。本研究から、大建中湯は腸管マクロファージにおける炎症性サイトカインの産生阻害を介して大腸炎および炎症関連発がんを抑制することが示唆された。潰瘍性大腸炎やクローン病などの炎症性腸疾患(IBD)は難治性の慢性炎症疾患であり、その病態解明ならびに新規で有用な治療薬の創出が求められている。これまでに報告者は漢方薬である大建中湯が、マウスにおける急性大腸炎を改善することを見出しており、本研究において大建中湯の作用機序について検討を行った。大建中湯は急性大腸炎モデルマウスの大腸において上昇したTNF-α、IL-6のmRNA発現を有意に抑制した。IBDの病態形成には腸管マクロファージが関与することが知られており、腸管マクロファージの炎症性サイトカイン産生能について検討を行った。炎症時の大腸粘膜固有層の腸管マクロファージにおけるTNF-αおよびIL-6のmRNA発現は、大建中湯を投与したマウスでは対照群と比較し有意に低下していた。近年、大建中湯は腸管上皮に作用し、抗炎症作用を有するアドレノメジュリンの産生を促す事が報告されている。そこで、大建中湯による大腸炎抑制作用にアドレノメジュリンが関与するかについて検討を行った。アドレノメジュリンの投与は急性大腸炎の発症を抑制したが、大建中湯の抑制作用に対してアドレノメジュリン受容体拮抗薬の前投与は影響を与えなかった。慢性炎症疾患に伴う重大な合併症の一つは腫瘍形成であるが、実際IBD患者は大腸がんを発生するリスクが高く、腸管粘膜の慢性炎症を背景とした大腸炎関連発がん(CAC)の発生は、臨床において大きな問題となっている。CACモデルマウスを用い、CACに対する大建中湯の作用について検討を行った。大建中湯はCACモデルマウスにおける腫瘍形成を数および大きさともに有意に抑制した。本研究から、大建中湯は急性大腸炎および慢性炎症を背景とした大腸発がんを抑制することが明らかとなり、その作用機序には腸管マクロファージにおける炎症性サイトカインの産生阻害が関与することが考えられる。潰瘍性大腸炎(UC)は難治性疾患であり、その病態解明ならびに新規で有用な治療薬の創出が求められている。これまでに報告者は、漢方薬である大建中湯が、マウスにおけるデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘起大腸炎を改善することを見出している。そこで本研究は、DSS誘起大腸炎モデルマウスを用い、大建中湯によるUC病態改善機序について腸管粘膜免疫系、特に腸管マクロファージに対する作用を中心に研究を行った。大建中湯はDSS誘起大腸炎モデルマウスの大腸において上昇したTNF-α、IL-6およびIFN-γのmRNA発現を有意に抑制した。IFN-γは炎症性マクロファージの活性化に関与、TNF-αおよびIL-6は炎症性マクロファージが高産生するサイトカインであり、大建中湯は炎症性マクロファージの活性化の阻害を介し大腸炎を改善する可能性が考えられる。また、大腸粘膜におけるマクロファージの発現分布について免疫組織学的検討を行ったところ、大腸炎マウスのF4/80 (マクロファージのマーカー)陽性細胞は、正常マウスと比較し著明に増大しており、大建中湯の投与により減少していた。さらに大腸粘膜固有層におけるマクロファージの割合について解析を行い、大建中湯は、大腸炎マウスにおいて増大した腸管マクロファージの割合を有意に減少すさせることを見出した。以上のことから、大建中湯によるUC病態改善効果にはマクロファージの抑制が関与することが示唆される。UCの病態形成における腸管マクロファージの役割およびそれに対する大建中湯の影響について詳細な検討を行うため、腸管粘膜固有層よりF/80陽性細胞を選択分取し、サイトカイン産生、貪食能などの腸管マクロファージの機能を評価する実験系の確立を行った。本研究より大腸炎の病態形成における腸管マクロファージの役割および大建中湯の作用の一端を解明することができた。報告者はUC病態における腸管マクロファージの役割およびそれに対する大建中湯の影響について検討を行い、大建中湯によるUCの病態改善作用には炎症性マクロファージの抑制が関与することを示唆する知見を得た。

さらに、腸管マクロファージの機能(サイトカイン産生、貪食および遊走など)を評価するための実験系を確立し、今後大腸炎の病態形成における腸管マクロファージの役割ならびに大建中湯の影響について詳細な解析を行うことが可能となった。一方、大建中湯の標的として着目している上皮細胞および腸管上皮内リンパ球のγδIELに関するデータの収集は達成しておらず、今後の課題である。UC病態における上皮細胞およびγδIELの役割について検討を行うため、マウス大腸粘膜から腸管上皮内リンパ球を採取し、その表現型ならびに機能を評価する方法を確立する。確立した手法を用い、正常マウス、UCマウスおよび大建中湯マウスにおけるγδIELの表現型について解析する。また、UCマウス由来γδIELのIFN-γ産生に対する大建中湯の効果について検討する。さらに、UC病態における上皮細胞、γδIELおよびマクロファージのクロストークについて共培養実験を行い、検討を行う。今後報告者は、大建中湯がγδIELの活性を抑制し、最終的にγδIEL/マクロファージ経路の阻害を介し大腸炎を改善するというこれまでにない新規メカニズムを持つ治療薬として提示できるかについて研究を進める。該当なし
MyoD転写活性化ドメインを付加したRunx2による骨芽細胞への分化転換機構

分化特異的な転写因子による、ある組織細胞から別の分化系列へ分化転換現象が知られる。間葉系組織では転写因子MyoDによる筋肉細胞への分化転換や、Sox9と複数の遺伝子の組み合わせで、軟骨細胞への分化転換が起きると報告されている。MyoD以外では頻度が高く安定した効率の分化転換条件はまだ示されていない。MyoDの転写活性化能に着目し、その転写活性化ドメイン(TAD)を他の転写因子と共同的に作用させて、安定した分化転換が可能になるか否かを検討した。Runx2やsox9とTADを作用させると、転写活性化能は格段に上昇した。一方で安定かつ十分な分化転換には更なる条件が必要である事が示唆された。分化転換モデルとしてはOsx-cre-GFP miceを用いた。これはthe osterix (Sp7) promoterの直下にtTA tetracycline transactivatorがあり、その直下にtetracycline responsive element (TRE; tetO)-controlled GFP/Crefusion proteinが存在する。tetracycline analog doxycyclineの非存在下では、Osx1が発現している細胞でオンになっており、GFPもプラスになる。そこでOsx陰性細胞が、陽性細胞になった状態を骨芽細胞形質を獲得したとの指標とできる可能性があるため、予備的検討としてOsx-cre-GFP mice由来の皮膚線維芽細胞を培養し、GFPの状態とOsxの発現状態を調べた。定常状態ではほとんどGFPは発現していないが、BMP処理することにより、GFPが発現することを確認した。内在性の遺伝子発現を調べて見たところ、Osx、Id-1,ALPの遺伝子発現が上昇しており、分化誘導が非骨芽細胞においてもモニターできることを確認できた。次に骨軟骨分化に関与する重要な転写因子Osterixrunx2 sox9についてそれぞれTAD fusionタンパクを作成しその機能を解析した。MyoD-runx2についてはrunx2 binding siteを持つosteocalcinプロモーターのOG-2 Lucに対しての転写活性化能、MyoD-sox9についてはtype II collagen promoter sox9 binding siteを持つcoll2 sox9BD-Lucに対しての転写活性化能を指標とした。前者についてはMyoD fusionをつけたものが、付けないものに対して20倍以上転写活性化が見られた。後者についてはその差は10倍程度であるが、興味深いことに、2コピーのMyoD-TAD fusionと1コピーのものと比べると前者のほうが若干低く、至適な量が存在する可能性が示された。またMyoD-Osterixについては10T1/2細胞に発現させたとき、コラーゲンI型遺伝子の発現はMyoD fusionをつけたものが、付けないものに対して10倍以上発現を促進させた。前年度までの結果からmyoD-TAD fusionによって骨格系に関わる転写因子の3つの機能が活性化されていることが示唆された。しかしながら、myoDそのものがターゲット遺伝子に影響を与え筋肉分化を誘導する場合と異なり現在までのところ、myoD-TAD fusionタンパクだけで安定して分化そのものを誘導できるわけではない。活性化するメカニズムを調べ、さらなる活性化を得る可能性を追求する目的でfusionタンパクによる活性化能とリンカータイプのもの(glycin linker)とを比べ、それも挿入部位が異なるものを用意した。glycin linkerを付与することによって若干の活性化の向上が認められたが、顕著なものではなかった。この傾向はTADの挿入位置とは無関係に見られた。さらに、myoD-TAD fusionと協調して働く分子を探索しその候補としてヒストン修飾タンパクに着目した。ヒストンメチル化修飾酵素が骨芽細胞や軟骨細胞の分化に伴って発現が認められることから、それらのmyoD-TAD fusionタンパク機能への影響を調べた。本来、抑制型のメチル化修飾を示すヒストンメチル化修飾酵素が、myoD-TAD fusion転写因子の機能に対しさらに促進的に働く結果が得られた。現在、myoD-TADに対して、直接あるいは間接的にヒストンメチル化修飾酵素が影響を与える可能性について検討している。以上の結果はmyoD-TADを付加することにより、Runx2を含む骨格系に関わる転写因子の活性化が認められること、その効果は挿入部位には影響を受けないこと、またヒストンメチル化修飾酵素によって影響を受ける可能性を示している。安定した分化転換を行うには転写活性化メカニズムのさらなる追求が必要であることも強く示唆された。発生学薬理学本年度の研究においてmyoD-TAD-fusionを発現させることで有効に転写活性化能をあげるのは、2つの転写因子runx2 sox9で示された。Osterixについては転写活性化を測定する上でのターゲットとなる配列が不明確であるため、正確に転写活性化能を評価することは難しい。

しかしながら内在性の遺伝子発現に及ぼす影響はコントロールに比べはるかに上昇させており、少なくとも転写因子としての機能は高まっていることが示された。またTADコピー数が高まればその効果が増加するものである、ということではなくむしろ至適な量(あるいは位置)がある事が示された。また分化転換モデルとしてのOsx-cre-GFP mice由来の皮膚線維芽細胞もosterixがオンになっている状態を評価できる、という点で一定のモデルとなり得ることが示された。この皮膚由来の細胞を効率よく骨芽細胞系譜へ分化させることができるか、が次年度への課題である。myoD-TAD fusionによって少なくとも骨格系に関わる重要な転写因子の3つとも機能が活性化されていることが前年度の結果から示唆された。そこで今年度はどのようなメカニズムによって転写活性化が起こるか、次のアプローチで明らかにする。1)TADのどこが特に重要であるか、調べるためにTAD deletion mutantを作成し、それぞれの活性化能を比較する。2)転写活性化に関わる候補としてHAT活性のある分子(p300など)が考えられる。そこでそれらのノックダウンをすることで活性化能にどのような影響があるか、調べる。3)2)で影響が得られた分子についてはTADドメインとの直接の作用があるか否かをIPによって調べる。4)fusionをリンカータイプのもの(たとえばglycin linker)に変えたときにその活性がどのように影響があるかを調べる。前年度に引き続き皮膚由来の細胞を効率よく骨芽細胞系譜へ分化させる条件を検討する。25年度には一時的な研究補助のための人件費を計上していたが、進行上また試薬の進歩により効率よく研究を行うことができる部分があり、必ずしもその研究補助は必要が無くなったが、一方でそのために高額な試薬を購入する必要が生じた(物品費)。そのため、予定より物品費がかかった。しかしながらトータルでは、次年度使用額が生じた。高価な試薬を当初の想定より多く購入する必要があること、また輸入試薬であり、外国為替の影響で価格の値上げが予定されており、次年度には物品費が予定より多く必要であると思われる。したがってこの使用額を次年度の使用予定額に加えてトータルでの物品費増加に充当させる。