hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アミノ酸の脂質代謝改善効果の分子細胞生物学的解析

アミノ酸が単独で脂質代謝を変動させ、生活習慣病予防に寄与するかについて、分子細胞生物学的評価を行い、グルタミンに特異的な効果を認めた。この知見に基づき、グルタミンの作用機序を分子レベルで解析した。ヒト肝癌細胞HepG2をグルタミンを通常培地の10倍量含む培地で培養すると、脂質代謝に関与する遺伝子の発現上昇が認められた。この効果は転写因子SREBPの発現上昇、活性化亢進に起因していた。グルタミン添加1時間以内に、SREBPのタンパク質プロセシングによる活性化の亢進が認められた。この効果は、SREBP-1,-2のいずれでも認められ、その後に、SREBP応答遺伝子群の発現上昇が確認された。グルタミンはヘキソサミン合成経路を活性化し、種々の蛋白質のO-グリコシレーションを促進する。実際、この作用により転写因子Sp1の転写活性が上昇し、応答遺伝子であるSREBP-1aの遺伝子発現亢進が認められた。この亢進は、ヘキソサミン合成経路阻害剤によりキャンセルされ、グルタミンの効果の一部はこの合成経路の活性化に起因することが明らかになった。SREBPのプロセシングは小胞体からゴルジヘの輸送に伴い進行することから、グルタミンの効果を検討した。その結果、グルタミンはSREBP前駆体の小胞体からゴルジヘの輸送を亢進させ、その結果として活性型へのプロセシングを促進していた。さらに、グルタミンを4%含む飼料でマウスを飼育し、小腸におけるSREBPプロセシングを評価した。その結果、小腸においてグルタミンはSREBPの活性化を促した。高齢社会を迎えた日本において、生活習慣病患者数は今後いっそうの増加が予想され、医療費の膨大化が懸念される。生活習慣病の多くは脂質代謝異常に起因することから、薬物治療に頼らず生活習慣病を予防することが望まれ、そのために食品の機能活用が期待されている。しかし、食品成分の中でも生理的効果の検証されているイソフラボンは過剰摂取が懸念されており、安全性を考慮した上で、摂取量の設定に困難さを伴う。また、極微量食品成分を有効なレベルまで摂取するには、経済性の観点から実現しない例もある。これらを考慮した時、アミノ酸は安価で供給され、代謝回転が速いことから多量摂取が可能で、機能性食品素材候補としての優位性は突出している。本研究では、個別のアミノ酸が単独で脂質代謝を変動させ、生活習慣病予防に寄与するかについて、分子細胞生物学的評価を行い、候補アミノ酸についてはその機能の分子レベルでの作用機序を解析する。脂質代謝関連遺伝子のプロモーター活性を変動させるアミノ酸の解析ヒト培養肝細胞HepG2を低濃度アミノ酸培地で4時間程度培養すると、細胞内の遊離アミノ酸レベルは培地のそれと近似してくることが知られている。低濃度アミノ酸培地を用意し、これに各種アミノ酸を1種類ずつ過剰量添加した培地を用意する。Hep G2細胞に例えばLDL受容体遺伝子プロモーター挿入レポーター遺伝子を導入し、アミノ酸添加培地で12時間培養し、その後ルシフェラーゼアッセイを行う。LDL受容体遺伝子発現を充進するアミノ酸を検出する。同様にして、脂質代謝関連遺伝子のプロモーター領域を挿入したレポーター遺伝子(およそ30種類程度)について解析を行った。その結果、脂質代謝関連遺伝子の発現を特異的に上昇させるアミノ酸としてグルタミンを特定できた。候補アミノ酸の内因性応答遺伝子発現制御の確認実験上記実験により得られた候補アミノ酸に関して、添加培地でHep G2細胞を培養した際に、目的の遺伝子が予想された応答を示すかについてreal-time PCR法を用いて検証した。その結果、内因性応答遺伝子も同様に応答することが確認された。以上の結果は、肝細胞内においてグルタミンがある種のシグナル伝達を介し,各種転写を変動させる機能を持つことを意味している。さらに、その分子機構について解析を進めている。

さらに、グルタミンを4%含む飼料でマウスを飼育し、小腸におけるSREBPプロセシングを評価した。その結果、小腸においてグルタミンはSREBPの活性化を促した。
高度成長期における地域社会高齢化過程の研究

本研究では、これまで研究されてこなかった戦後日本における高齢者の集団的な活動について実証的に検討した。1950年代から60年代にかけて、農村部と都市部をそれぞれ検討し、社会教育活動や女性たちによる自主的なサークル活動など、福祉という枠にとどまらない様々な主体の関与を明らかにした。制度的な福祉が整う以前には高齢者は独自に、自らの「老い」を受け止めるために多様な実践と要求をしている。戦後改革に伴う家族関係の変化と結びつけて、高齢者の存在のあり方を主体に即して研究する基盤を得た。(1)成果公開査読論文「高度成長期地域社会における高齢者の研究」を日本農業史学会の学会誌『農業史研究』50号、2016年3月に掲載した。本研究の着想を得た原点となる論文からすすめてきた、一次資料の読解に基づいた論文を公開し、新たな研究段階へ進むことができた。本論文を関係者に送付し、成果の普及と研究の交流・発展につなげる。(2)資料調査【地域資料】2015年度においては中盤に所属研究機関の移動があり、研究計画を組み替えた。具体的には、長野から大阪に移転したため、社会福祉の先進地であった大阪をはじめとする関西地方の資料も収集対象に加えた事である。大阪および京都において社会福祉関係の文献を収集し、読解をすすめた。今後は長野と関西の同時代的比較を目指す。【文献資料】『老壮の友』という高齢者向けの雑誌や、「戦後高齢社会基本文献集」など刊行された資料集などを収集した。高齢者自身による資料は散逸が進んでおり、蒐集が難しいが引き続き取り組む。(3)研究基盤整備研究プロジェクト初年次であることにかんがみ、移動しながら活用できるPCや資料整理のために必要な機材をそろえた。(4)次年度にむけての予備調査全国老人クラブの初代の代表を務めた灘尾弘吉関係の資料を親族を訪ねて探したが、調査着手には至らなかった。査読付き論文として日本農業史学会の学会誌『農業史研究』50号に論文「高度成長期地域社会における高齢者の研究ー課題の提示と地域老人クラブ形成期の事例」を掲載できたため。(1)成果公開2017年3月26日、同時代史学会関西研究会の例会において「「老後の心配」の戦後史」と題して研究報告を行った。本成果は、2017年度において論文化する予定である。(2)資料調査【地域資料】本年度の調査として、1長野県伊那市の光久寺所蔵の楽生学園関係資料の調査と整理、2全国老人クラブ連合会所蔵資料の調査に取り組んだ。高齢者の活動を示す資料は断片的であるのが現状であるが、継続して資料調査に取り組みたい。【文献資料】高齢者に関するルポルタージュや調査報告なども含め、文献資料の収集に努めた。(3)研究基盤整備初年度において重要な基盤は形成したため、本年度は資料整理に必要な消耗品類を購入した。(4)次年度にむけての予備調査最終年度においては学会発表と論文執筆に重点的に取り組むと同時に、研究のさらなる発展と継続のために関西地方の調査を行う。資料の整理が進捗したことによって、研究内容は充実し、次の課題も見えてきた。次年度の学会報告および論文化というかたちでの成果公開の道筋も立ったのでおおむね順調に進捗していると評価する。本研究では、高齢化社会の歴史的形成過程を地域社会の変化に即して明らかにすることを目的としてきた。初年度の2015年度には研究の課題と個別資料分析を併せた「高度成長期地域社会における高齢者の研究」を『農業史研究』50号に発表した。最終年度である2017年度は研究成果の公表を中心的な課題と位置づけて、2017年10月に開催された日本史研究会大会において「「老い」に集団で向きあうということ」として研究発表を行った。本発表は同タイトルの論文として2018年3月に刊行された『日本史研究』667号に掲載された。戦後社会史の研究において高齢者の視点はこれまで欠けていたのに対し、論点提起を行うことができた。当初の計画では農村部を中心とした計画であったが、研究遂行の過程で調査地を都市部にも拡大した。大阪・神戸両市の老人クラブを訪問し、それぞれの機関誌の閲覧を許可されたことで、農村と都市の差異を分析に付け加えた。また、老人クラブ資料の都道府県ごとの調査のため各図書館や博物館等に照会をおこない、個別事例の位置づけを確認する作業も一定程度進んでいる。こうした一連の調査の過程で高齢者による自主的な活動の資料が喪失している一面も明らかになり、今後の対策が必要であることが明らかにできた。本研究の結果として、政府による施策が本格化する1970年代以前の高齢者たちの自主的・社会的な活動がどのように発生し、拡散していったのかについて、地域に存在する一次資料を収集・整理し、解明した。また、研究計画で立案した社会教育と女性史の研究についても、農村部での社会教育に従事した公民館関係の資料を閲覧・整理することと共に『月刊社会教育』の通読をすすめて、高齢者教育が全体としてどのような議論と結びついてきたかを検討している。得られた研究成果は研究協力をいただいた各地の方に送付することで還元した。

1950年代から60年代にかけて、農村部と都市部をそれぞれ検討し、社会教育活動や女性たちによる自主的なサークル活動など、福祉という枠にとどまらない様々な主体の関与を明らかにした。制度的な福祉が整う以前には高齢者は独自に、自らの「老い」を受け止めるために多様な実践と要求をしている。戦後改革に伴う家族関係の変化と結びつけて、高齢者の存在のあり方を主体に即して研究する基盤を得た。(1)長野県から大阪に研究の拠点が移ったため、大阪・京都・神戸の事例を調査対象に含める。長野での集中的な調査に必要な予算を計上していなかったため、環境的に難しくなったが、当初の研究計画で提示した飯田市歴史研究所との協力関係は維持されているため、規模を変更して引き続き取り組み、対象地域を拡大することで、広い視野から取り組むこととする。(2)学会報告国内でまとまった成果の公開に成功したため、海外での研究発表を目指す。前年度においては都市部における老人クラブの活動を調査する必要を想定したが、都市部についての資料の散逸は想像以上に進行していた。当初の計画通り着実に農村社会の研究をすすめる方が良いか検討中である。日本近現代史
環境微粒子中プルトニウム同位体比迅速分析法の開発

本研究では、原子核乾板を用いた核物質含有微粒子試料のスクリーニングおよびプルトニウムグレードの事前評価と、共鳴イオン化質量分析法(Resonance Ionization Mass Spectrometry : RIMS)を用いた同位体比分析を組み合わせた、保障措置における環境微粒子試料分析のための迅速分析法の開発を目的としている。平成26年度においては、1.原子核乾板上に設置した粒径1μmの微粒子試料から、2π方向にランダムに記録された飛跡について、光学顕微鏡による撮影時のボケを考慮した断層画像モデルを作成し、読み取り可能な飛跡数について評価し、実験条件と評価可能なプルトニウム含有量について検討を行った。2.RIMSの原子源としてイオンスパッタリングやレーザーアブレーションを用いた時の効率や測定時間を検討し、核物質含有微粒子試料の分析時間が、従来法である表面電離型質量分析法に比べ短縮できる見込みを得た。3.RIMSを用いた超ウラン核種の同位体比分析における高精度・高確度化のため、複数のシステムパラメーターの相関を利用して測定中の揺らぎを補正する逐次補正法の開発・実証を行った。実証実験として、抵抗加熱による安定原子源により試料を原子化し、高繰り返し率チタンサファイアレーザーによる共鳴イオン化と飛行時間型質量分析計による同位体比分析と同時に、レーザー出力、波長、実験室の室温、気圧を同期させて記録し、イオン信号量との相関を求め補正に適用することで、試料にチタンを用いた場合、最大で11.1%の誤差を1.65%に、ジルコニウムを用いた場合では最大で3.02%の誤差を1.18%にまで抑えることが出来た。本補正法は原理的に試料の核種に依らず、また実験においても複数の核種に適用出来たことから、プルトニウムを含む超ウラン核種の分析に適用が可能であると考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、保障措置環境試料分析の迅速・効率化のため、原子核乾板を用いた核物質含有微粒子試料の同位体比事前評価と、レーザーアブレーション支援共鳴イオン化質量分析法(LA-RIMS)による同位体比の高精度分析により、プルトニウム含有微粒子の迅速分析法の開発を目指す。平成24年度は事前評価法と質量分析法について、それぞれ下記の項目を実施した。1.原子核乾板におけるα粒子飛跡解析の評価光学顕微鏡を用いた原子核乾板断層像の高速自動撮影システムと、一連の原子核乾板断層像に記録されたα粒子飛跡を画像認識により抽出し、飛跡の3次元形状を自動認識するプログラムからなる原子核乾板飛跡解析システムを開発した。ウラン鉱石に含まれるα崩壊核種起因のα粒子を3種類の原子核乾板(OPERAフィルム、NGITA乾板、NIT)に記録し、自動飛跡解析を行った結果、α粒子飛跡長分布が得られた。試料および乾板中でのα粒子輸送に関するモデル計算との比較より、NGITA乾板とNITがα粒子飛跡解析に適していることが示された。2.共鳴イオン化質量分析法のためのシステムパラメーターを用いた補正法の開発超ウラン核種に対しLA-RIMSにて同位体比測定を行う場合に不可欠な同位体比補正法として、共鳴励起用レーザー光源の発振波長・強度変動などのシステムパラメーターを取得し、補正を行う手法について基礎実験により概念検討を行った。レーザー加熱式原子源と2色2段共鳴励起イオン化過程を用いたYb共鳴イオン化基礎実験において、2本の共鳴励起用パルスレーザーのエネルギーと照射タイミングの差をイオン信号と同期させて取得し、同位体比測定結果を補正することで、同位体比測定値が補正されることを実証した。本研究では、高空間分解能を有する原子核乾板を用いることで、核物質を含む粒径1μm未満の微粒子試料から放出されるα粒子飛跡(αT)と核分裂飛跡(FT)を読み出し、試料のスクリーニング及びプルトニウムの同位体比の事前評価を行った後、高繰り返し率チタンサファイアレーザーを利用したレーザー共鳴イオン化質量分析法(RMS)を用いた同位体比分析により、保障措置環境試料の迅速・効率的な分析手法の開発を目的としている。平成25年度は事前評価法、同位体比分析法に関して下記の項目の開発を進めた。(1)原子核乾板を用いた微粒子試料中の核物質事前評価の開発・原子核乾板中飛跡の自動読み出しアルゴリズムの改良を行い、実験により原子核乾板(NIT)に記録された長さ14μm以上のαTの飛跡長分布が、モデル計算で得られた結果とよく一致することが確認出来た。・粒径1μmのPuO_2微粒子起因のαTがNIT中で飛跡長2225μmと算出出来ることから、同乾板を使ったプルトニウム起因αT読み出しの適用可能性が得られた。(2)RIMSシステムの整備および補正法の開発・共鳴イオン化にレーザーを2本使用した場合のレーザーH-L照射タイミングに対するイオン信号量の相関モデルを作成し、補正法への適用を検討した。・フィラメントの抵抗加熱からなる安定原子源、高繰り返し率(5kHz)チタンサファイアレーザー、飛行時間型質量分析器を組み合わせたRIMSシステムの整備と、システムの各種信号の取り込み回路およびソフトウェアを開発した。・上記システムを用いたTiの1色1段および2色2段イオン化を行い、特に1色1段イオン化時の同位体比の波長依存性を調べ、補正により測定値を真値(天然同位体比)に近づけることが可能であることを明らかにした。

本研究では、原子核乾板を用いた核物質含有微粒子試料のスクリーニングおよびプルトニウムグレードの事前評価と、共鳴イオン化質量分析法(Resonance Ionization Mass Spectrometry : RIMS)を用いた同位体比分析を組み合わせた、保障措置における環境微粒子試料分析のための迅速分析法の開発を目的としている。平成26年度においては、1.原子核乾板上に設置した粒径1μmの微粒子試料から、2π方向にランダムに記録された飛跡について、光学顕微鏡による撮影時のボケを考慮した断層画像モデルを作成し、読み取り可能な飛跡数について評価し、実験条件と評価可能なプルトニウム含有量について検討を行った。2.RIMSの原子源としてイオンスパッタリングやレーザーアブレーションを用いた時の効率や測定時間を検討し、核物質含有微粒子試料の分析時間が、従来法である表面電離型質量分析法に比べ短縮できる見込みを得た。3.RIMSを用いた超ウラン核種の同位体比分析における高精度・高確度化のため、複数のシステムパラメーターの相関を利用して測定中の揺らぎを補正する逐次補正法の開発・実証を行った。実証実験として、抵抗加熱による安定原子源により試料を原子化し、高繰り返し率チタンサファイアレーザーによる共鳴イオン化と飛行時間型質量分析計による同位体比分析と同時に、レーザー出力、波長、実験室の室温、気圧を同期させて記録し、イオン信号量との相関を求め補正に適用することで、試料にチタンを用いた場合、最大で11.1%の誤差を1.65%に、ジルコニウムを用いた場合では最大で3.02%の誤差を1.18%にまで抑えることが出来た。本補正法は原理的に試料の核種に依らず、また実験においても複数の核種に適用出来たことから、プルトニウムを含む超ウラン核種の分析に適用が可能であると考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。原子核乾板を用いた事前評価法のための原子核乾板におけるα粒子飛跡解析システムの開発と、LA-RIMSによる同位体比の測定時のシステムパラメーターを用いた補正法の開発を進め、基礎実験によりこれらの有用性を示しており、当初の計画に沿って研究開発が勧められているため。本年度中の研究により、事前評価法ではNITを用いたプルトニウム起因α粒子飛跡読み出しの適用可能性を実験的に示し、また、飛行時間型のRIMSにおいて波長を使った補正の有用性を示すなど着実な進展が見られる。一方で、RIMSの原子源の影響を抑制するため、フィラメント原子源のみに着目して研究を進めていることから、おおむね順調であると評価した。微粒子試料のLA-RIMS分析のために、分析装置に精密ステージを導入するとともに、微粒子試料の事前評価と精密同位体比迅速分析における試料形状について検討を進める。ただし、プルトニウム含有微粒子試料の測定は、掌握している分析装置・施設の制約により困難であることから、プルトニウムの模擬物質として、ウランを含む微粒子の分析を行う予定である。本研究の最終年度となる平成26年度は、主に以下の3点を行う。(1)NITを用いた微粒子試料起因飛跡の読み出しから、事前評価法の適用性を評価する。(2)安定原子源を用いたRIMS補正法の開発による高精度分析の実証を行う。特に、システムの複数のパラメーターの変動を多次元データとして解析し、その相関を利用した補正法の確立を目指す。
ニューロン・グリアの脳虚血抵抗性とプロテオグリカンの役割

ラット海馬スライス標本を対象にCA1錐体細胞から細胞内記録し、酸素・グルコー・ス除去液を灌流する(in vitro虚血負荷)と、約6分後に急峻な脱分極電位が発生する。その直後に酸素・グルコースを再灌流しても脱分極し続け(持続性脱分極電位)、5分後には0mVに達して細胞膜障害が発生する。この持続性脱分極電位の発生には細胞内へのCa^<2+>流入とイオン透過型グルタミン酸受容体活性化が関与している。一方、ヘパラン硫酸プロテオグリカン(シンデカン)はニューロンのスパイン形成と成長因子の細胞内シグナル伝達に関与し、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンは主に細胞外マトリツクス形成に関与している。それぞれの分解酵素であるheparinase II, III(1 U/ml), chondritinase ABC (20mU/ml)およびheparinの分解酵素heparinase I(1U/ml)を用い35°C,30分前処置すると、急峻脱分極電位発生潜時はheparinase II, III前処置で有意に延長した。酸素・グルコース再灌流30分後の膜電位回復を検討すると、heparinase II, IIIおよびchonddtinase ABC前処置は部分的ではあるが有意に再分極させた。即ち、ヘパラン硫酸およびコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの限定的分解は、in vitro虚血負荷による急峻脱分極電位発生を延長させ、虚血性神経細胞障害の発生を部分的に抑制することを示唆した。虚血性障害抑制機序としては、細胞外マトリックスの構造が粗になり細胞間隙のグルタミン酸濃度上昇が起こりにくくなったか、プロテオグリカンを介する細胞内情報伝達系(チロシンキナーゼあるいは低分子G蛋白質の活性化)が抑制されたためと考えられる。中枢神経系の海馬は記憶の座といわれ、虚血に最も易損性の高い部位である。成熟ラット海馬スライス標本を作成し、無酸素、無グルコース液を灌流(実験的虚血負荷)すると、CA1錐体細胞(ニューロン)は約6分後に急峻脱分極電位を誘起する。この時点で酸素、グルコースを再投与(虚血解除)しても、持続的に脱分極し膜電位が消失する。また、虚血負荷解除直後に標本を固定、染色すると細胞膜にblebs(小胞)が多数形成されているのが観察される。平成16年度は以下の研究を行った。1.ニューロン・グリアにおける虚血負荷誘起膜電位変化に関する研究アストロサイト(グリア)から細胞内記録を行い実験的虚血負荷すると、ニューロン同様6分後に急峻脱分極電位を誘起した(peak potential -43±9mV)が、虚血解除により再分極し、5分後には完全に膜電位が回復した。組織間腔K^+膿度([K^+]_0)を膜電位変化と同時に記録すると、[K^+]_0は実験的虚血負荷開始から徐々に上昇し急峻脱分極電位の直前で8±4mMに、急峻脱分極電位のpeakから12±8秒後に最大値に達し、18±17mMであった。さらに、虚血解除後5分では6±3mMに低下した。虚血負荷中の[K^+]_0から推定される膜電位のpeakは-48mVであり、実測値に近似していることから、虚血負荷によるグリアの膜電位変化は[K^+]_0変化に対する応答と考えられた。2.ニューロン・グリアにおける虚血負荷による細胞構築変化に関する研究Biocytin封入

微小電極を用いて細胞内記録を行い虚血負荷前、負荷解除直後、負荷解除後20分のスライス標本を固定し、染色を行い、細胞構築の変化を調べた。その結果、ニューロンと異なりグリアにおいてはblebs形成のような著しい細胞構築の変化は認められなかった。3.培養ニューロン・グリアにおける虚血負荷による細胞内Ca^<2+>変化に関する研究胎生17日目のラット胎児から海馬を摘出し、ニューロン比率の高い培養に成功した。ニューロンはMAP2陽性、GFAP陰性で、グリアはMAP2陰性、GFAP陽性であった。現在、Fura-2/AMでインキュベーションした後実験的虚血負荷を行い、それぞれの細胞内Ca^<2+>濃度変化を測定中である。ラット海馬スライス標本を対象にCA1錐体細胞から細胞内記録し、酸素・グルコース除去液を灌流する(in vitro虚血負荷)と、約6分後に急峻な脱分極電位が発生する。その直後に酸素・グルコースを再灌流しても脱分極し続け(持続性脱分極電位)、5分後には0mVに達して細胞膜障害が発生する。この持続性脱分極電位の発生には細胞内へのCa^<2+>流入とイオン透過型グルタミン酸受容体活性化が関与している。一方、ヘパラン硫酸プロテオグリカン(シンデカン)はニューロンのスパイン形成と成長因子の細胞内シグナル伝達に関与し、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンは主に細胞外マトリックス形成に関与している。それぞれの分解酵素であるheparinase II, III (1 U/ml), chondritinase ABC (20 mU/ml)およびheparinの分解酵素heparinase I (1 U/ml)を用い35°C,30分前処置すると、急峻脱分極電位発生潜時はheparinase II, III前処置で有意に延長した。酸素・グルコース再灌流30分後の膜電位回復を検討すると、heparinase II, III,およびchondritinase ABC前処置は部分的ではあるが有意に再分極させた。即ち、ヘパラン硫酸およびコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの限定的分解は、in vitro虚血負荷による急峻脱分極電位発生を延長させ、虚血性神経細胞障害の発生を部分的に抑制することを示唆した。虚血性障害抑制機序としては、細胞外マトリックスの構造が粗になり細胞間隙のグルタミン酸濃度上昇が起こりにくくなったか、プロテオグリカンを介する細胞内情報伝達系(チロシンキナーゼあるいは低分子G蛋白質の活性化)が抑制されたためと考えられる。
次世代型血管新生療法の開発を目的とした側副血行路発達メカニズムの分子病理的検討

本研究では、まずラビット虚血肢モデルを独自の手法で検討することにより、虚血肢の尾骨大腿筋に分布する後臀動脈の末梢が、細動脈ネットワークの状態から側副血行路に発達して行く過程を分子病理学的に明らかにした。これに基づき、塩基性線維芽細胞増殖因子や骨髄単核球をラビット虚血肢の尾骨大腿筋に選択的にデリバリーする実証実験を行い、血管新生療法において効果的な側副血行路発達を達成するには、デリバリーターゲットの選択が重要であることを示した。本研究では、ラビット虚血肢モデルを用いて発達途上の側副血行路における生物学的特性を明らかにし、そのデータをもとに側副血行路の発達メカニズムを検討する。1.側副血行路発達の生物学的特性に関する検討大腿動脈を切除して作成するラビット虚血肢モデルでは、後臀動脈が側副血行路に発達することが明らかになっている。後臀動脈が存在する尾骨大腿筋を、モデル作成後2日、7日、14日に採取し、その組織像を検討した。モデル作成後2日目には後臀動脈周囲に炎症細胞浸潤が認められ、表面マーカーの検討からリンパ球がメーンであることが明らかになった。また7日目において後臀動脈壁の内膜及び中膜でKi-67陽性細胞の増加を認め、活発な細胞増殖が惹起されていることが示された。動脈径に関しては、有意な拡大を14日目より認めた。これらよりリンパ球浸潤→動脈壁細胞の細胞増殖→動脈径の拡大といった順番で側副血行路の発達が進むことが明らかになった。2.発達途上にある側副血行路の周囲におけるhypoxia環境の検討モデル作成後における後臀動脈周囲筋組織の酸素分圧を測定した。しかし、骨格筋組織の酸素分圧は、健常時より予想以上に低値(約5%)であり、モデル作成によってやや低下するものの大きな低下を認めることができなかった。そのため、側副血行路発達において経路周囲におけるhypoxiaの関与は少ない可能性が示唆された。3.側副血行路発達メカニズムの分子病理学的検討発達する側副血行路(後臀動脈)が存在する尾骨大腿筋組織を、モデル作成後2日、7日、14日において、その中枢から末梢にかけて5箇所サンプリングし、タンパク発現を検討している。現在、筋組織溶解液からヘパリン・ビーズを用いて回収したbFGFをウエスタンブロットを用いて解析中であり、モデル作成後2日目に発現のピークがあることを明らかにした。H23年度の実施目標は、ラビット慢性虚血肢モデルを用いてin vivoにおける側副血行路発達メカニズムに関して分子病理学的に検討することであった。ラビット慢性虚血肢モデルは、大腿動脈を全長にわたり切除することにより作成するが、これによって同側の尾骨大腿筋に分布している後臀動脈の末梢が側副血行路に発達する。虚血肢モデル作成後、2日目、7日目、14日目に、側副血行路の発達が見込まれる尾骨大腿筋と、その近傍に存在するが側副血行路の発達経路からは外れた内転筋を、それぞれ採取して病理組織学的に比較検討するとと、もに筋組織の抽出液における様々なタンパクの発現を調べた。その結果、まず2日目に後臀動脈周囲の尾骨大腿筋において炎症性細胞が浸潤するとともに、同部の筋抽出液においてMCP-1、bFGF、FGFレセプター1、VEGFの発現上昇を認めた。また、7日目には、抗Ki-67染色により後臀動脈壁における活発な細胞増殖が示され、14日目からは動脈径の有意な拡大が認められた。一方、内転筋では、毛細血管密度の増加を認めたものの、それ以上の有意な所見は得られなかった。これらの所見は、後臀動脈周囲に炎症性細胞の浸潤とともに発現した各種生理活性物質が、後臀動脈に複合的に作用することによりarteriogenesisを誘導し側副血行路の発達を促していることを示唆している。特に後臀動脈周囲に発現したFGFレセプター1は2日から7日目にかけ強いリン酸化が認められ、bFGFの果たす役割の重要性が示された。以上の知見の裏づけをするため、bFGFタンパクのラビット尾骨大腿筋への選択的デリバリー実験を実施した。すでに得られた結果としては、デリバリー後28日目での虚血肢動脈圧インデックス、血流量測定、血管造影スコア評価において、コントロールと比較して有意な血流改善効果を観察することができた。H23年度までの研究により、虚血肢において効果的に側副血行路を発達させるにはarteriogenesis誘導物質を、側副血行路の発達が見込まれる動脈系周囲に選択的にデリバリーすることが必要であるとの仮説を得ることができた。H24年度では、これを実証するためにラビット虚血肢モデルを用いて以下の実験を実施した。塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)の選択的デリバリー実験

大腿動脈を全切除するラッビト虚血肢モデルでは、側副血行路は同側内腸骨動脈の枝である後臀動脈より発達し、この後臀動脈は尾骨大腿筋内に分布している。そのためラビット虚血肢モデルに対して、arteriogenesis誘導因子であるbFGF(100μg)を尾骨大腿筋に選択的に筋注する群(B-FGF群)と、隣接する大内転筋に同様に筋注する群(D-FGF群)を作成した。筋注後28日目での評価では、下腿血圧比、血管造影スコア、内腸骨動脈血流量のすべてにおいてB-FGF群はD-FGF群と比べ有意な改善を得た。また筋注後3日目の尾骨大腿筋の検討により、筋内におけるFGFレセプターの発現量及びリン酸化と、MCP-1陽性血管密度、Ki-67陽性血管密度において、B-FGF群はD-FGF群と比べ明らかに増加・増強していることが示された。様々な血管新生因子を放出する骨髄単核球の選択的デリバリー実験虚血肢モデルを作成したラビットの腸骨より骨髄単核球を採取して、尾骨大腿筋に選択的に筋注する群(B-MN群)と大内転筋に筋注する群(D-MN群)を作成した。筋注後28日目の下腿血圧比、血管造影スコア、内腸骨動脈血流量の検討に加え、筋注後3日目の尾骨大腿筋の検討でも、bFGFデリバリー実験とほぼ同様の結果を得た。以上の二実験により、効果的に側副血行路を発達させるには、治療物質のデリバリーターゲットの選択が重要であることが示された。側副血行路発達メカニズムに関する分子病理学的検討として、「研究実績の概要」に記載した項目の他にも接着分子、NOS、ERK1/2、MMPsなどの発現や活性を検討する計画を立てていたが、実際に測定を試みたものの有意な結果を得ることができなかった。測定方法や測定感度などに問題があった可能性もあるため、側副血行路発達メカニズムにおいてこれら因子の関与が少ないと結論づけるのは早計であろう。しかし、今回明らかになったエビデンスのみからでも、側副血行路発達メカニズムの概要を理解する上での重要なヒントを得ることができたと考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。H24年度は、bFGFタンパクのラビット尾骨大腿筋への選択的デリバリー実験を継続するとともに、さらに組織学的検討や分子生物学的検討を加えることにより、次世代型血管新生療法開発に向けたさらなるエビデンスを蓄積する。また、ラビットモデルにおいて自家骨髄単核細胞の尾骨大腿筋への選択的デリバリー実験も実施し、細胞治療においてもより効率性に優れたプロトコルの開発を目指す予定である。
細孔内自由水の移動によるコンクリート粘性発現機構の解明と支配的空隙スケールの特定

コンクリートのひずみ速度依存性は微細空隙内の自由水の移動抵抗性によって生じ,また自由水の移動抵抗性は空隙のスケールに依存することを明らかにすることを目的として,直径50mm,高さ100mmのモルタルおよびセメントペースト円柱供試体を用いて,様々な条件下において一軸高速試験を行った.実験結果から,セメントペースト中の毛細管空隙の形成に伴いがひずみ速度効果の発現度合が大きくなると考えられる一方,遷移帯の影響は比較的小さいことがわかった.「研究の目的」コンクリートのひずみ速度依存が微細空隙内の自由水の粘性抵抗と間隙水圧によって生じ,またその機構は自由水の存在する空隙のスケールに依存するという研究代表者の仮説を検証することである.「研究実施計画」に照らした成果の説明・具体的内容・直径50mm高さ100mmのモルタル円柱を作成し,異なる条件下で98体の載荷試験を行った.セメントは普通ポルトランドセメント,とし,異なる細孔構造の形成を期待して水セメント比を35%, 50%, 60%の3種類設定し,混和剤は用いていない。載荷直前まで水中養生を行っているが,KT50シリーズ4体は水中養生後に100°Cで24時間乾燥,E60シリーズ6体は養生槽から出して気中に30日静置した。常温での載荷はWシリーズ,凍結後の載荷は,凍結手法により凍結融解試験(-20°)と液体窒素浸漬(-197°)の2種類とした。これらの低・高ひずみ速度での一軸圧縮試験を行い,荷重と動ひずみを詳細に記録した.その結果,自由水が部分的に凍結した状態でも高速載荷によって一軸圧縮強度が増加するというひずみ速度依存性の発現が確認された。凍結供試体の結果はばらつきが大きいものの平均では,常温供試体よりもひずみ速度依存性の発現は顕著であり,かつー20°C凍結供試体よりもー197°C凍結供試体で強度増加は大きい傾向を得た.・意義・予想とは異なる結果が得られたことから,新たな検討課題が生まれた.急速冷却後の供試体細孔構造のを調べることである.・重要性・国内外で1920年代から知られてきたコンクリートのひずみ速度依存性について,そのメカニズムを解明するための独創的試験方法が提案された.メカニズムの解明は,コンクリート工学上重要である.昨年度凍結モルタルの載荷実験を3温度帯で実施し,凍結モルタルであってもひずみ速度依存性が発現することを示した.しかし結果のばらつきが大きかったことから,今年度は,試験体の材料配合は統一し,別の温度での実験を実施するとともに,試験体の冷却および保温状態を改善するため,装置の開発を行った.また,試験体の細孔構造を調べるため,水銀圧入試験を実施した.具体的には,液体窒素,ドライアイス,氷水による試験体冷却を行った.温度はそれぞれおよそー197,ー72,0°C程度である.この際,試験体に冷却媒体が直接触れるのを避けるため,銅板を用いた間接冷却装置を作成し,冷却を実施した.また,保温装置は,冷却溶媒の容器の中に試験体を設置して溶媒をためておく貯留型と,パイプ状の装置を試験体にまきつけて溶媒を流す流動型の2種類を作成した.溶媒として使用した液体窒素の管理の容易さと,載荷時の試験体の変形に伴い拘束を生じさせないことを条件として両者で予備実験を行った結果,流動型を採用することを決定した.これらの装置を用いてひずみ速度依存特性を調べる高速および低速の載荷試験を実施し,試験結果のばらつき(変動係数)は昨年度よりも減らすことができた.その結果,やはり当初の仮定に反して,モルタル試験体中の液状水が凍結した場合でも,ひずみ速度依存性は顕著に表れることを確認した.ただし,ひずみ速度依存性の発現程度と,冷却温度との間には,一義的な関係は見いだせなかった.当初計画より,1年目は問題の把握と課題の抽出のための実験,2年目は実験方法の改善,3年目はデータの蓄積と理論的考察を行う計画であった.そのとおり実施できている.「研究の目的」コンクリートのひずみ速度依存は微細空隙内の自由水の移動抵抗性によって生じ,また自由水の移動抵抗性は空隙のスケールに依存することを明らかにするのが,本研究の目的である.最終年度である今年度は,細骨材周辺の遷移帯に存在する自由水に着目し,モルタルとセメントペーストの一軸載荷試験を行い,ひずみ速度効果の発現程度を比較する.また,細孔構造の形成が急速に進行する若材齢期での試験と,凍結状態での試験を行った.「研究の内容」試験概要:試験にはφ50×100mmのモルタルとセメントペースト円柱供試体を用いて一軸高速載荷試験を行った.C50-D7,C40-D7では材齢7日に統一し,W/Cを50%と40%とした.若材齢試験(C40-D1M40-D5)ではW/Cは40%に統一し,材齢を1日,3日,5日に設定した.冷却試験(C40-D28-E,M40-D28-E)ではW/Cを40%,材齢28日とし,液体窒素を用いて-190°Cまで冷却を行った.主な試験結果:セメントペースト,モルタル共に材齢が高くなるにつれて強度増加倍率の平均値は増加している傾向が見られた.

これは材齢に伴い形成されるセメント内の毛細管空隙が影響していると考える.強度増加倍率の平均値で比較する場合,モルタルとセメントペーストでは大きな差はなかった.遷移帯から発生するマイクロクラックによる応力分散の影響は,明らかではなかった.凍結モルタルのみ,ひずみ速度上昇による強度増加が見られた.セメントペーストでは,自由水の凍結による固結効果よりも,自由水凍結時の膨張による組織劣化が,モルタルよりも進行していたことが考えられる.結論:セメント内および遷移帯内の自由水がひずみ速度効果に影響している可能性がある.コンクリートのひずみ速度依存性は微細空隙内の自由水の移動抵抗性によって生じ,また自由水の移動抵抗性は空隙のスケールに依存することを明らかにすることを目的として,直径50mm,高さ100mmのモルタルおよびセメントペースト円柱供試体を用いて,様々な条件下において一軸高速試験を行った.実験結果から,セメントペースト中の毛細管空隙の形成に伴いがひずみ速度効果の発現度合が大きくなると考えられる一方,遷移帯の影響は比較的小さいことがわかった.研究計画で提案した独創的な手法を,従来の凍結融解装置だけでなく液体窒素を用いることで簡易に試験体を極低温条件に導くという計画を実現することができた.この点から,研究は概ね順調に進展していると判断している.しかし「概ね」であり,まだ課題が残っている.それは,現在の試験結果にはばらつきが大きいことである.したがって,さらに安定した結果を得るため,今後試験体の冷却,保温システムの改良を行う予定である.実験方法を改善したにも関わらず,研究着手当初の予想と異なる実験結果を得ている.今年度は当初の仮定を検証するための方策をあらためて考え直すとともに,なんらかの数値シミュレーションによる検証も取り入れたいと考えている.コンクリート1.試験体の冷却,保温システムの改良試験体を極低温条件にする際,直接液体窒素に浸漬するのではなく,間接的冷却とする.具体的には,小型の保護ケースを作成しパイプクーリング等の手法でケースを冷却すること,またケースに温度感知センサをとりつけ,試験体温度をモニタリングしなかがら載荷を行う手法を考える.2.細孔構造の確認当初の研究計画通り,冷却後の試験片を採取し,ポロシメーターにより細孔構造を分析する.特に,急速冷却による細孔構造の変化を定量的に把握する.概ね計画的に研究を執行したが,消費税や値引き等により価格が若干異なるものがあったため,656円という少額が残った.研究計画どおり必要な消耗品の購入をすすめたが,商品の価格変更等があり430円という少額が未使用となって残った.消耗品購入にあてたい.次年度の消耗品購入費に加算して使用する予定である.
戦間期の日本における都市農村関係の社会地理学的研究

本研究は、「都市政治生態学」の視点から、戦間期の日本における都市・農村関係の転換を、都市計画と区画整理事業をめぐる諸社会集団の対立・協働、およびし尿処理問題をめぐる都市・農村関係という二つの課題を通して明らかにするものである。本年度は、前者に関して特に広島市における都市計画の資料調査を行い、また後者の課題に関しては長崎市、呉市、佐世保市について、新聞資料、農会資料、役場資料などの調査と資料収集を実施した。基本的な研究成果は以下のようである。1大正中期以降に、各市で屎尿くみ取りが滞り、市営事業化が構想されるようになるが、昭和初期の不況期に入ると、肥料使用をめぐる社会・経済状況が変化したこともあって、屎尿くみ取りが再び増加する場合も見られ、屎尿処理の市営事業化が必ずしも直線的に進んだわけではないことが明らかとなった。2佐世保市の海軍施設における昭和初期の屎尿処理の実態と問題点が明らかとなった。3明治後期以降の長崎市におけるし尿汲み取り圏の変遷の概要が明らかとなった。4広島市周辺地域において、昭和初期の蔬菜・園芸農業の拡大の様相やその要因などが明らかとなった。5当初研究対象としていた市以外の広島県内の市(福山市、尾道市)においても屎尿値下げ運動が発生しており、広島県が四市の関係者を集めて対策を講じるなど、し尿処理問題について県の衛生行政の役割についても着目する必要があることが明らかとなった。行政資料のなかにまだ十分な資料を発掘できていないが、主に複数の新聞資料の調査から、広島県、長崎市、佐世保市における1920年代以降のし尿処理問題をめぐる諸問題と、都市計画の実施をめぐる地域社会との関係などについて基本情報を収集し、今後さらに深めるべき論点を確認することができた。また社会・政治地理学研究や「政治生態学」研究の動向について英仏独圏の文献を検討した結果、その基本的論点や本研究にフィードバックできる到達点などを明らかにすることができた。1長崎市と佐世保市に関しては都市周辺の農村地帯で聞き取り調査も実施し、昭和期のし尿汲み取り作業の実態を明らかにすると同時に関連資料の発掘、収集を進めていく。また都市計画や都市施設をめぐる都市間競争に関する資料の収集も進める予定である。2呉市に関しては地元新聞の閲覧を行い、し尿の市営事業化と都市計画をめぐる地域社会の動向について調査を実施する。3社会・政治地理学と都市政治生態学、および「空間的不平等」に関する理論的研究の検討を進め、本事例研究で得られた知見も生かして、新たな理論的枠組の形成を目指す。本研究は、「都市政治生態学」の視点から、戦間期の日本における都市・農村関係の転換を、都市計画と区画整理事業をめぐる諸社会集団の対立・協働、および屎尿処理問題をめぐる都市・農村関係という二つの課題を通して明らかにするものである。本年度は特に後者の問題に関して、広島市、呉市、佐世保市について、新聞資料・農会資料・役場資料などの調査と資料収集を実施した。基本的な研究の成果は以下のようである。1三市において、大正中期から農村によるくみ取り料の減額運動が発生し、広島市では周辺の三つの郡が協力して組合を結成するといった動きがあったことが明らかとなった。また農村地域間でもくみ取り競争があり、都市・農村関係に加えて農村間競争の側面を明らかにすることも必要であることが確認できた。2都市側では市営事業化の検討が始まるが、その手法に関しては多様で、仲介業者へ請け負わせる場合、農村側にくみ取り組合を組織させて契約を結ぶ場合、市が直接実施する場合など、各地域のこれまでの慣行や市の財政力によって異なっていたことが明らかとなった。3佐世保市では市営事業化が衛生問題よりも財源確保といった側面から実施されたため、個別町と市行政が対立し、市営による処理事業の実施1年後に、再度個別町による処理へと戻った。地方都市における市行政・自治体と個別町の関係についてさらに検討の余地があることが明らかとなった。4広島市ではし尿処理の契約変更をめぐって、軍隊と農民の間に対立が発生したことが明らかとなった。主に新聞資料の調査から、広島市、呉市、佐世保市における大正中期以降の屎尿処理問題の発生の経緯と背景、市営事業化をめぐる問題点、都市内部における権力構造の変化について基本的情報を収集し、今後の研究で掘り下げるべき論点を確認することができた。社会・政治地理学研究、とくに「コモンズ」研究の動向について、英仏独圏の文献を検討し、基本的な到達点と論争点を明らかにすることができた。

3明治後期以降の長崎市におけるし尿汲み取り圏の変遷の概要が明らかとなった。4広島市周辺地域において、昭和初期の蔬菜・園芸農業の拡大の様相やその要因などが明らかとなった。5当初研究対象としていた市以外の広島県内の市(福山市、尾道市)においても屎尿値下げ運動が発生しており、広島県が四市の関係者を集めて対策を講じるなど、し尿処理問題について県の衛生行政の役割についても着目する必要があることが明らかとなった。行政資料のなかにまだ十分な資料を発掘できていないが、主に複数の新聞資料の調査から、広島県、長崎市、佐世保市における1920年代以降のし尿処理問題をめぐる諸問題と、都市計画の実施をめぐる地域社会との関係などについて基本情報を収集し、今後さらに深めるべき論点を確認することができた。また社会・政治地理学研究や「政治生態学」研究の動向について英仏独圏の文献を検討した結果、その基本的論点や本研究にフィードバックできる到達点などを明らかにすることができた。1広島市、呉市、佐世保市について昭和前期の屎尿汲み取り問題や市営事業化の具体化について資料の調査と収集を継続して実施する。また都市計画地域の選定をめぐる周辺農村との関係にかんする資料調査を実施する。2長崎市について、屎尿処理と衛生問題の関わり、都市し尿の活用と周辺部の近郊農業の発展などについて資料収集を実施する。3社会・政治地理学と都市政治生態学の先行研究について、特に「空間的公正・不公正」をめぐる理論研究の検討を進め、事例研究の成果も踏まて新たな理論的枠組の構築を目指す。1長崎市と佐世保市に関しては都市周辺の農村地帯で聞き取り調査も実施し、昭和期のし尿汲み取り作業の実態を明らかにすると同時に関連資料の発掘、収集を進めていく。また都市計画や都市施設をめぐる都市間競争に関する資料の収集も進める予定である。2呉市に関しては地元新聞の閲覧を行い、し尿の市営事業化と都市計画をめぐる地域社会の動向について調査を実施する。3社会・政治地理学と都市政治生態学、および「空間的不平等」に関する理論的研究の検討を進め、本事例研究で得られた知見も生かして、新たな理論的枠組の形成を目指す。
ヒメミカヅキモの性決定遺伝子から迫る、ストレプトファイツ植物の性決定

CpMinus1遺伝子の発現レベルを変動させた形質転換体を解析し、この遺伝子がヒメミカヅキモの性決定におけるマスター遺伝子であることを明らかにした。一方、CpMinus1と連鎖する、もう一つの未知性決定遺伝子であるCpMinus2は発見されなかった。さらに、雌雄異株種であるオーストラリアシャジクモを用いた性比較Iso-seq解析を行った結果、CpMinus1と弱い配列類似性を示す2種の遺伝子を見出し、そのうちの1種が雄株特異的に発現する可能性が示された。本研究では、CpMinus1遺伝子の発現レベルを変動させた形質転換体の状態をRNAseqにより解析することで、性決定に対する貢献を評価すること、もう一つの未知性決定遺伝子であるCpMinus2を発見することを目的としている。本年度は、ヒメミカヅキモのヘテロ株のゲノム解読を進めるため、+型、ー型両性のゲノムについて、PacBioを用いて、ゲノム配列を決定した。しかし、現時点で、IlluminaのデータとPacBioのデータの両方を使用できるハイブリットアセンブラーの開発がされておらず、以前としてscaffoldサイズは小さいままとなった。しかしながら、ー型細胞特異的なContigを、CpMinus1以外に1つ見いだしており、全長クローニングを行いつつ、CpMinus2となりうるかを今後検討する。CpMinus1については、cDNAをHSP70遺伝子プロモーターの下流で強制発現するようなコンストラクトを作製し、+株に導入し6株の形質転換体を得ている。そのうち、2株は+株と混合することで顕著に接合反応が進行し、ー型との混合ではほとんど接合子を形成せず、あたかもー型細胞のような表現型を示したものの、残りの株では完全に性表現の転換は起こらなかった。遺伝子発現に用いたプロモーターが不適切であることが考えられてため、ー型細胞のゲノム配列からCpMinus1遺伝子のプロモーターを含む領域を増幅し、新たな遺伝子導入用コンストラクトを作製した。CpMinus1を導入することで、あたかも+型細胞のように振る舞うようになった1株を用いて、比較transcriptomeのためのデータを取得した。本研究では、ー型細胞ゲノムのみに存在し、+型細胞で特異的に発現する遺伝子群を発現抑制する遺伝子(CpMinus2)を、CpMinus1遺伝子との連鎖を前提に近傍のゲノム情報を精査することで明らかにすることを目的とした。H27年度には、PacBio P6-C4ケミストリーを用いたゲノム解読を行った。結果として、両接合型細胞のゲノム情報のアセンブルが向上したものの、ヒメミカヅキモ用にアルゴリズム設計をした、Illumina short read dataとPacBioデータのハイブリッドアセンブラーの開発に難航しており、CpMinus1遺伝子を含むー型性染色体領域の全貌は未だ解明されず、さらに+型性染色体領域については、全く明らかにならなかった。一方で、CpMinus1遺伝子をCpMinus1 native promoter下流に連結し、あらたな+型細胞形質転換体作出に成功した。これらの株では、CpHSP70 promoterにてCpMinus1遺伝子を発現させた場合に比べて、遥かに高い発現上昇が示され、ー型細胞と比べても、その10倍近い発現レベルを示した。これらは顕著にー型化傾向を示したものの、依然として自家生殖能力を示した。これらから、CpMinus2遺伝子、または+型細胞ゲノムのみに存在し、+型細胞で特異的に発現する遺伝子群の発現を正に制御する遺伝子(CpPlus1)が存在することが確定的となった。それらをtranscriptomeデータからも探るため、PacBioによるIso-seq解析のためのライブラリー調製を進めた。また、オーストラリアシャジクモ(Chara australis、雌雄異株)についても、同様にライブラリー調製を進めた。ゲノムのscaffoldingには、相変わらず難航しているが、PacBio P6-C4ケミストリーデータとIllumina short read dataとのハイブリッドアセンブラーの開発され次第、一気に進むものと思われる。また、仮定に過ぎなかったCpMinus2,もしくはCpPlus1の存在が強く示唆されるようになったことも重要な進展である。ヒメミカヅキモ、オーストラリアシャジクモでのIso-seq解析のためのライブラリー調製が進行しており、総合的に見て、想定の範囲内で進展していると判断した。本研究では、マイナス型細胞ゲノムのみに存在し、プラス型細胞で特異的に発現する遺伝子群を発現抑制する仮想遺伝子CpMinus2を、CpMinus1遺伝子との連鎖するゲノム領域を精査することで明らかにすることを同定することを第一の目的としている。PacBio P6-C4ケミストリーを用いたゲノム解読を行ったものの、ヒメミカヅキモの部分的な配列重複などの影響もあり、現時点でアセンブルが難航したままである。またIllumina short read dataとPacBioデータのハイブリッドアセンブラーの開発にも難航している。しかし、子孫株の性表現とIlluminaによる解析の結果から、マイナス型特異的なゲノム領域は存在するものの、プラス型特異的なゲノム領域は存在しない可能性が浮上した。本年度確立したCRISPR/Cas9法により、CpMinus1遺伝子の破壊に成功した。その結果、遺伝子を破壊されたマイナス型細胞は、ほぼ完全にプラス型へと性表現をシフトした。しかし、接合時に発現する遺伝子が接合条件でなくてもわずかに発現したことから、CpMinus1が性表現の決め手となるものの、発現を微調整するCpMinus2を破壊しない場合、100.00%性転換出来ないことがあらためて示唆された。第二の目的であるCpMinus1オルソログ

遺伝子をオーストラリアシャジクモから見出し、その性表現への影響を調べることについては、Isoseq解析用のcDNAライブラリーの調製までは進んでいるが、PacBioシークエンサーの使用が混み合っており、現時点では待機中である。仮想遺伝子であるCpMinus2の存在する可能性は非常に高まったものの、未だに同定に至っていない。またオーストラリアシャジクモのIsoseq解析は準備が進んでいるものの、解析に至っていない。そのため補助事業を延長することとなり、遅れを自覚している。本研究では、マイナス型細胞ゲノムのみに存在し、プラス型細胞で特異的に発現する遺伝子群を発現抑制する仮想遺伝子CpMinus2を、CpMinus1遺伝子との連鎖するゲノム領域を精査することで明らかにすることを同定することを第一の目的としている。CpMinus1遺伝子破壊株の作出と表現型解析の結果、仮想遺伝子であるCpMinus2の存在する可能性は非常に高まったものの、ヒメミカヅキモの部分的な配列重複などの影響もあり、アセンブルが難航していた。しかし、PacBio P6-C4ケミストリーを用いたゲノム解読データを、バージョンアップしたアセンブラーFalconを用いることにより、プラス株においては、primary contigがN50 416 kbでtotal 318 Mb、associated contigがN50 60 kbでtotal 42 Mbまで改善した。マイナス株の場合も、primary contigがN50 319 kbでtotal 302 Mb、associated contigがN50 58 kbでtotal 34 Mbまで改善した。そのうえで、子孫株の性表現とIlluminaによる解析の結果から、マイナス型特異的なゲノム領域は存在するものの、プラス型特異的なゲノム領域は存在しない可能性が高まった。また、CpMinus1を含むcontig自身は、あまり長く伸びてはいなかったため、その中からCpMinus2の候補配列は得られなかった。第二の目的であるCpMinus1オルソログ遺伝子をオーストラリアシャジクモから見出し、その性表現への影響を調べることについては、Isoseq解析データを取得した。その中からCpMinus1のホモログはいくつか存在していたが、オルソログとは断定できなかった。CpMinus1遺伝子の発現レベルを変動させた形質転換体を解析し、この遺伝子がヒメミカヅキモの性決定におけるマスター遺伝子であることを明らかにした。一方、CpMinus1と連鎖する、もう一つの未知性決定遺伝子であるCpMinus2は発見されなかった。さらに、雌雄異株種であるオーストラリアシャジクモを用いた性比較Iso-seq解析を行った結果、CpMinus1と弱い配列類似性を示す2種の遺伝子を見出し、そのうちの1種が雄株特異的に発現する可能性が示された。