hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
インプラント周囲組織の炎症防御機構―炎症時における歯周組織およびインプラント周囲組織の微笑循環―

平成11年度にはインプラント周囲組織と天然歯周組織の微小循環を形態学的に観察するためにビーにインプラントを上下顎各2本植立し、プラークコントロールを行い口腔衛生状態を清潔に保ち、片側は対照群として天然歯周組織の観察を行ない血管鋳型標本を作製し走査型電子顕微鏡で観察した。その結果両者とも規則的な網目を持つ血管網が観察されたがインプラント群においては接合上皮下の血管網が欠如していた。平成12年度には平成11年度に得られた正常な天然歯周組織の結果を基に、炎症を惹起させその変化を形態学的に観察した。ビーグル犬の歯肉部に炎症を惹起させるために、歯頚部にデンタルフロスを巻きプラークが付着しやすい環境とし血管鋳型標本を作製し走査型電子顕微鏡で観察した。その結果、歯肉溝上皮の血管網は炎症性の血管ループへと変性していたが接合上皮下の血管網には規則的な網目がみられる部分が存在した。平成13年度には正常なインプラント周囲組織に、炎症を惹起させその変化を形態学的に観察した。実験は平成11年度と同様にインプラント歯頚部にデンタルフロスを巻きプラークが付着しやすい環境とした。術後30日、60日、90日に血管鋳型標本を作製し走査型電子顕微鏡で観察した。その結果、インプラント上皮直下の血管網は腎糸球体状の拡張したループが集合したものに変化し、骨とインプラントの結合部の破壊された空間に下降し増殖していた。以上より、微小循環の視点から観察すると、インプラント上皮の外来刺激に対する防御バリアは天然歯と比べると,脆弱であることが示唆された。正常および炎症時の歯周組織およびインプラント周囲組織の微細血管構築の観察歯周組織の微小循環は歯周疾患に対する炎症防御作用を有していると考えられこの機構を微小循環から考察するためにビーグル犬3頭を用い以下の実験を行った。天然歯周組織に、炎症を惹起させるために、実験動物の片側小臼歯歯頚部にデンタルフロスを巻きプラークが付着しやすい環境とし、プラークコントロールは行わない。この時点から30日、60日、90日後に血管鋳型標本を作製し走査型電子顕微鏡観察を行った。また、非脱灰研磨切片の光学顕微鏡観察もあわせて行った。片側はコントロールとし、プラークコントロールを行い同様の手法で観察した。またインプラント周囲組織と天然歯周組織の微小循環を形態学的に観察するために、現在ビーグル犬2頭の片側上下前臼歯部を抜歯した。90日後、歯槽骨の再生を確認しチタニウム製インプラント(ITI System充実スクリュー型、直径3.3mm、長さ8mm)を上下顎各2本(計4本)を植立する予定である。平成11年度に得られたの結果を基に、実験的炎症を惹起させその変化を形態学的に観察した。材料と方法:実験にはビーグル犬の前臼歯部を抜歯し90日間、歯槽骨の再生を待った。チタンインプラントを植立し、次いで歯肉に炎症を惹起させるために、実験動物の歯頚部にデンタルフロスを巻き90日間プラークを付着させ、この間プラークコントロールは行わなかった。この時点から30日、60日、90日後に血管内樹脂注入を行い、走査型電子顕微鏡(SEM)観察を行った。結果:インプラント周囲炎に罹患した顎骨を血管鋳型標本としSEM観察した。インプラントの頸部にはデンタルフロスが残存し、その部分は歯石に覆われていた。本来インプラント周囲に密着する周囲組織は根尖方向に増殖しポケットを形成していた。そのため歯槽骨とインプラントは接触していなかった。インプラントを標本から取り外し骨表面をSEMで観察すると、骨表面の吸収部の中は拡張した扁平な血管網で満たされていた。

骨吸収が進んだ部位では増殖した血管に置換された骨と接触していない部分が示された。この血管は骨の背後の歯槽骨骨髄の血管網を介して、骨表面吸収部中の血管と吻合していた。考察:以上の結果から、インプラント周囲組織は人工的に堆積したプラークから容易に炎症に罹患し、軟組織の血管網は下方へと増殖していた。すなわち、炎症が生じると歯槽骨吸収部に侵入した肉芽血管とインプラント周囲の血管が吻合しながら骨吸収は進行していくことが観察された。これらのことから、インプラントを成功させるためには、インプラント周囲軟組織をインプラント体に密着させバリアーの機能と構造を保つ必要があることが示唆された。最も重要なのは、徹底したプラークコントロールで炎症を防止し、インプラント周囲軟組織の微小循環障害を起こさないことであることが推測された。平成13年度は炎症進行下の天然歯およびインプラント歯周組織の変化と微小循環の関わりを、平成11年度から12年度の結果をもとに新たな実験を行い、観察し考察した。【実験方法と材料】インプラント周囲組織と天然歯周組織の微小循環を形態学的に観察するために以下の実験を行った。実験にはビーグル犬を用い片側上下前臼歯部を抜歯した。90日後、歯槽骨の再生を確認しチタニウム製インプラント(ITI System充実スクリュー型、直径3.3mm、長さ8mm)を上下顎各2本(計4本)植立した。植立後90日間、片側上下2本の天然歯とインプラント歯頚部にデンタルフロスを設置し、実験的歯周炎を惹起させた。反対側は対照群として、デンタルフロスを設置せず、プラークコントロールを行い口腔衛生状態を清潔に保った。それぞれ潅流固定を行い、上顎を非脱灰切片、および透過型電子顕微鏡、下顎を血管鋳型標本とし観察した。【観察結果】1.血管鋳型標本による観察結果:血管鋳型標本をSEM観察すると、対照群では天然歯、インプラントともに先端に規則的なループを有する血管構築となっていた。歯周炎群では、対照群で観察された規則的なループが失われ拡張した血管が集合した像を呈していた。インプラント周囲炎群では血管が著しく拡張し一部では球状の構造物が連なっているのが観察された。これは、炎症により拡張した内皮細胞間隙より樹脂が漏出したことを示していた。2.組織学的(LMおよびTEM)による観察結果:炎症群では歯肉上皮細胞の離開や炎症性細胞浸潤が観察される。特にインプラント周囲炎群においては拡張した血管の増殖が著しかった。対照群においても炎症所見は観察され、天然歯よりもインプラントにおいてより明確であった。このことから、炎症時には血管および周囲組織には大きな変化が生じると共に、特にインプラント周囲においては適切なプラークコントロールと微小循環の維持を行うことが重要であることが認識された。
RAGE阻害薬吸入によるCOPD治療の試み

1)マウスマクロファージの培養系を用いて,リガンド添加によるRAGEシグナルがcAMP依存性シグナル伝達経路によって抑制されることを明らかにした。(2)cAMP依存性シグナルは,MMP9を活性化し膜結合型RAGEのシェディングを促進することにより,膜結合型RAGEを減少させ可溶型RAGEを増加させることを明らかにした。(3)cAMP依存性シグナルがRAGEリガンド-RAGE系シグナルを抑制するメカニズムとして,cAMP依存性シグナルによる膜結合型RAGEのシェディング促進が,シグナル伝達に関わる膜結合型RAGEを減少させる一方,デコイ受容体として働く可溶型RAGEを増加させることが考えられた。COPDにおいてはMMP等の肺プロテアーゼの活性亢進が病態に関与している。そこでRAGEがCOPDの病態において果たしている役割を検討するため、本年度はRAGEシグナリングとMMP活性の関連を解析した。1. cAMP依存性シグナルによるRAGEシグナルの抑制(1)RAGEリガンドのマウスマクロファージ培養液中への添加により、MCP-1の分泌亢進が見られた。この分泌亢進はRAGE欠失マウスのマクロファージでは見られないことから、RAGEを介するシグナルによるものであると考えられた。(2)上記のRAGEシグナル依存性MCP-1分泌亢進は、アデニル酸シクラーゼ賦活薬であるフォルスコリンおよびcAMPアナログである8-bromo-cAMPによって抑制された。このことから、cAMP依存性シグナルはRAGEシグナルを抑制すると考えられた。2. RAGEシグナル抑制へのMMP9の関与(3)RAGEリガンドのマウスマクロファージ培養液中への添加により、シグナル伝達に関わる膜型RAGEの増加が見られたが、この増加はフォルスコリンの添加によって抑制された。(4)RAGEリガンドとフォルスコリンの同時添加により、マクロファージ培養液中で、デコイ受容体として働く可溶型RAGEの増加が見られた。(5)上記(3)および(4)のフォルスコリンの効果はMMP阻害剤によって抑制された。また、フォルスコリンによるマクロファージのMMP9活性化が認められた。これらのことから、cAMP依存性に活性化されたMMP9により、膜型RAGEがシェディングを受けていると考えられた。以上のことから、cAMP依存性のシグナルは、MMP9を活性化し膜型RAGEのシェディングを促進することにより、RAGEシグナルを抑制することが示唆された。研究期間を通じて、上記成果と肺胞上皮系細胞株のRAGE発現パターンに関する成果を得た。本年度は、研究計画に従い、肺胞細胞上皮のin vitroでのRAGEの発現とその制御機構にアプローチするため、材料となる肺組織由来の不死化培養細胞株の解析を行った。肺は他の臓器に比べて圧倒的にRAGEの発現が高い臓器であり、また、膜型RAGEと分泌型RAGEという2つのスプライシング・バリアントの比については、血管内皮などに比べて膜型RAGEの占める割合が高いことがすでに明らかにされている。そこで、今回、II型肺胞上皮細胞由来のヒト肺腺がん由来細胞株であるA549、および、ヒト気管上皮細胞にSV-40ウイルスを感染させることによって不死化した細胞株であるBEAS-2Bについて、RAGEの発現パターンを2つのスプライシング・バリアントごとに検討した。具体的には、我々の研究室で確立した定量的RT-PCRの系を用いて、それぞれの細胞株から抽出したトータルRNA中における膜型RAGEと分泌型RAGEに対応するmRNAのコピー数を測定した。対照として、ヒト血管内皮初代培養株であるHMVEC、および血管内皮の性質を残すがん細胞株であるECVを同様の方法で解析した。その結果、A594、BEAS-2BにおけるRAGE mRNAの発現量はいずれも予想されたほど高くはなく、HMVECよりは高い値を示したものの、ECVとは同程度であった。また、膜型RAGEと分泌型RAGEの比についても、膜型が優位ではあったが、膜型/分泌型の比はECVと明らかな差を認められなかった。すなわち、肺由来細胞として期待されたRAGEの高発現、高い膜型/分泌型比という特性は認められなかった。培養密度を変えるなどして再検討も行ったが、同様の結果が得られた。肺由来細胞株であるA594もしくはBEAS-2Bのいずれかが肺組織で見られるRAGEの高発現、高い膜型/分泌型比という特性を示すことを期待していたが、慎重な検討の結果、期待されたような特徴的な発現パターンを示さず、これらの培養細胞株が、肺胞のin vitroモデル系として最適ではない可能性が示されたため。

肺細胞由来の細胞株として、本年度に検討した不死化細胞株は肺組織に特徴的なRAGE発現パターンを示さなかったため、肺胞上皮細胞初代培養細胞株を購入し、そのRAGE発現パターンを解析する。また、ニコチンなどの喫煙刺激に対するRAGE発現パターンの変化は、必ずしも肺組織に特徴的なRAGE発現パターンを示す細胞でなくても解析が可能であるため、次善の策としてA594もしくはBEAS-2Bを用いて検討する。上記の(今後の推進方策)に記載したとおり、新たな細胞株の購入と解析、および既に保有している細胞株の新たな実験系での解析を行うため、細胞株の購入費用、細胞培養および解析に用いる試薬・器具の経費として用いる。
腎におけるイオンチャンネルのクローニング

RACTK1塩基配列とアクチンとの結合部位を参考にPCRをもちいて、プローベを作成し、プラークハイブリダイゼーションをもちい目的のcDNAを単離することに成功した。M13/pBluescriptにサブクローニングされた新しいKチャンネル(Rabbit acting binding K channel 1:RAABK1)はin vitotranscriptionによりcRNAが合成されCHO(Chinese Hamster Ovary cell)で発現された。RAABK1は120pSでcell-attached patchesでは、安定して発現が観察されるが、自然に活性が落ち、またpatchesを細胞からはなすと(cell-free patches)消失する。この性質はROMK1(Nature,362:31,1993)と似ており、細胞内のATPで活性化されることが予想された。しかし、当初期待したように吸引などの物理的刺激には反応しなかった。現在この塩基配列を検討中であったが研究費等の問題で途中である。ごく最近mechano〓sensitive ion transportに必要な膜貫通部位における配列(Nature,367:470,1994)が明らかにされたが、そのような配列はRAABK1にはなく、むしろROMK1に約70%のホモロジーがあるところまで、突き止められた。今後塩基配列、組織分布、channelの詳細な性質を明らかにする予定である。
生体電気信号の発生機構に関する総合的研究

昭和59年度から3箇年にわたって設定された特定研究「生体電気信号の発生機構」は、刺激情報の受容から電気信号の発生に至るまでの一連の過程を、分子のレベルで統一的に理解することを目標としている。本研究はこの特定研究の全計画を効率よく推進させるために組織された総括班であり、その目的は当該特定研究の初期の目標を、その所定の期間内に、滞りなく達成させることである。この使命を全うするために、本総括班は以下の事業を行なった。1.当該特定研究の全計画の進捗状況を把握し、その研究推進の円滑化を計るために、2回の総括班全体会議、8回の班長会議、及び5回の幹事会を行なった。2.次の二つの実験技術に注目して、それぞれ講習会を開いた。(1)パッチクランプ法、(2)モノクローン抗体作製技術。3.Caチャネルの攻略についてプロジェクト研究討論会を開き、その協同研究組織を確立した。4.公開シンポジウム「生体電気信号発生に関する諸問題」を大阪ガーデンパレスで2日間にわたって開催し、13の演題の研究報告を行なった。5.外国の著名な研究者による「味と匂のシンポジウム」(仙台)及び「イオンチャネル講演会」(東京)を開催した。6.班員間交流のために、合同班会議を2回(蔵王,札幌)開いた。7.消耗品費は技術講習会及び次の事業のために使用された。(1)各種モノクローン抗体作成サービス。(2)新しいCaチャネル阻害剤の開発と供給。(3)イノシトール3リン酸の開発と供給。8.サーキュラーを平均月1回発行して、関連分野の最新の情報を提供し、かつ班員間の相互理解を計った。9.研究成果報告集を発行し、次年度以降の研究推進の資料とした。
カルボシランデンドリマーを基本骨格としたベロ毒素中和剤の開発

1)末端機能ユニット(Gb3の糖鎖部)数、核構造の異なるカルボシランデンドリマーの合成カルボシランデンドリマーはケイ素原子を核に持ち、スペーサーを介して末端機能ユニットを結合した基本構造を持つ。まず、末端機能ユニットとして、ベロ毒素受容体であるGb3の糖鎖部(グロボ3糖)を9,18,36個有する第1、及び第2世代のカルボシランデンドリマーを新たに合成し、ベロ毒素(Stx)の細胞障害活性の中和活性、Stxに対する結合活性、の両活性についてその他のカルボシランデンドリマーと比較検討を行った。その結果、Stxに対する強い中和活性には、1分子中のグロボ3糖数が6個で十分であること、むしろ個々のグロボ3糖の空間的距離がクラスター効果の発現に重要であることが明らかとなった。2)グロボ3糖数、核構造の異なるカルボシランデンドリマーの生体における活性評価これまでに合成してきた一連のカルボシランデンドリマーを用い、生体内におけるStxの毒性中和活性について比較検討を行った。具体的には、マウスに致死量のStx2を単独投与または各化合物と共投与し、致死性の阻害活性について検討を行った。その結果、合成した第0-3世代すべてのカルボシランデンドリマーのうちStxによる致死性を有効に阻害したのは、第1世代でグロボ3糖数が6個の化合物、第2世代でグロボ3糖数が18個の化合物の2種のみであった。両者に共通する構造上の特徴は、スペーサーを介して左右対称にグロボ3糖を3個、および9個づつ有する点である(dumbbell型)。一方両化合物のStx1および2それぞれのB-subunitに対するKd値をBiacoreを用いて決定したところ、他の第1世代、第2世代のカルボシランデンドリマーと大きな差違は認められなかった。これらの結果から、末端機能ユニットとしてグロボ3糖を高度に集積させたカルボシランデンドリマーが、生体内においてStx中和活性を示すためには、Stxに対して高い親和性を持って結合するだけでは不十分であること、その構造中グロボ3糖は左右対称にdumbbell型に配置されていることが必要であること、が明らかとなった。現在、生体内で有効に作用するための最適構造を決定するために、dumbbell型を基本骨格とし、そこに存在しているスペーサーの長さ、末端のグロボ3糖数、などのfactorについて最適化を行いつつある。末端機能ユニット(Gb3の糖鎖部)数の異なるカルボシランデンドリマーの合成カルボシランデンドリマーはケイ素原子を核に持ち、スペーサーを介して末端機能ユニットを結合した基本構造を持つ(第0世代)。末端機能ユニットの数を増やしたい場合、核となるケイ素原子からスペーサーを介して第2のケイ素原子を分岐点として結合させ、ここからさらにスペーサーを介して末端機能ユニットを結合させる(第1世代)。

すなわち1つのスペーサーについて分岐点となるケイ素原子を1つ増やせば(世代数を1つあげれば)、結合できる末端機能ユニットの総数は最大で3倍に増やすことが可能である。これまでにベロ毒素受容体であるGb3の糖鎖部(グロボ3糖)を3、6、12個持った第0、及び第1世代のカルボシランデンドリマーを合成し、そのベロ毒素中和剤としての活性を比較検討してきている。今回各々について世代数を1つあげ、末端グロボ3糖を9,18,36個有する第1、及び第2世代のカルボシランデンドリマーを合成した。ベロ毒素の細胞障害活性の中和活性、ベロ毒素に対する結合活性、の両活性について比較したところ、第0世代(グロボ3糖数が3個)以外の化合物は全て同様の活性を有することが明らかとなった。このことはベロ毒素に対する強い中和活性には、1分子中のグロボ3糖数が6個で十分であること、むしろ個々のグロボ3糖間の空間的距離がクラスター効果の発現に重要であることを示している。今後我々の開発したHUSモデル、及び生体レベルにおいて各種カルボシランデンドリマーのベロ毒素中和活性を検討し、生体内で有効に作用する最適構造を決定する予定である。末端機能ユニット(Gb3の糖鎖部)数の異なるカルボシランデンドリマーの活性評価カルボシランデンドリマーはケイ素原子を核に持ち、スペーサーを介して末端機能ユニットを結合した基本構造を持つ。平成13年度に、末端機能ユニットとして、ベロ毒素受容体であるGb3の糖鎖部(グロボ3糖)を9,18,36個有する第1、及び第2世代のカルボシランデンドリマーを新たに合成し、ベロ毒素(Stx)の細胞障害活性の中和活性、Stxに対する結合活性、の両活性について検討を行ってきた。今回これらのカルボシランデンドリマーも含め、これまでに合成してきた一連のカルボシランデンドリマーを用い、生体内におけるStxの毒性中和活性について比較検討を行った。マウスに致死量のStx2を単独投与または各化合物と共投与し、致死性の阻害活性について検討を行った。その結果、合成した第0-3世代すべてのカルボシランデンドリマーのうちStxによる致死性を有効に阻害したのは、第1世代でグロポ3糖数が6個の化合物、第2世代でグロボ3糖数が18個の化合物の2種のみであった。両者に共通する構造上の特徴は、スペーサ-を介して左右対称にグロボ3糖を3個、および9個づつ有する点である(dumbbell型)。一方両化合物のStx1および2それぞれのB-subunitに対するKd値をBiacoreを用いて決定したところ、他の第1世代、第2世代のカルボシランデンドリマーと大きな差違は認められなかった。これらの結果は、末端機能ユニットとしてグロボ3糖を高度に集積させたカルボシランデンドリマーが、生体内においてStx中和活性を示すためには、Stxに対して高い親和性を持って結合するだけでは不十分であること、その構造中グロボ3糖は左右対称にdumbbell型に配置されていることが必要であること、を示している。現在、生体内で有効に作用するための最適構造を決定するために、dumbbell型を基本骨格とし、そこに存在しているスペーサーの長さ、末端のグロボ3糖数、などのfactorについて最適化を行いつつある。
水疱性類天疱瘡におけるIgE関連免疫現象の解析

類天疱瘡病変部浸潤細胞の解析:病変部で認められるIgE陽性細胞,FcεRI陽性細胞およびFcεRII/CD23陽性細胞の解析をおこなった.本症病変部皮膚凍結切片(n=10),alkaline phosphatase-antialkalinephosphatase(APAAP)法および種々の抗体を用いた.対象は健常人皮膚(n=3)とアトピー性皮膚炎病変部皮膚(n=7)を用いた.現在までに以下の結果がえられている。1)表皮中のIgE陽性ランゲルハンス細胞はアトピー性皮膚炎病変部では認められるが,類天疱瘡病変部では認められない.この分布の違いは明瞭であり,両疾患におけるランゲルハンス細胞の関与の有無を反映した現象と考える.2)上記のIgE陽性ランゲルハンス細胞は,FcεRIを介してIgEと結合している可能性が高い.これは,FcεRI陽性細胞およびFcεRII/CD23陽性細胞を解析した結果得られた.すなわち,FCεRI陽性細胞はAD病変部表皮に多数認めるのに対し,BP病変部表皮にはほとんど認めない.一方,FcεRII/CD23陽性細胞は両疾患とも病変部表皮には認めないからである.3)CD14陽性マクロファージはAD病変部ではほとんど認めないのに対し,BP病変部真皮中に多数認められる.この分布の違いは明瞭であり,両疾患におけるCD14陽性細胞の関与の多寡を反映した現象と考える.4)類天疱瘡病変部には多数のIgE陽性細胞,FcεRI陽性細胞およびFcεRII/CD23陽性を認めるが,それらは真皮中に存在する.これら細胞の詳細を現在解析中である.類天疱瘡病変部浸潤細胞の解析:病変部で認められるIgE陽性細胞,FcεRI陽性細胞およびFcεRII/CD23陽性細胞の解析をおこなった.本症病変部皮膚凍結切片(n=10),alkaline phosphatase-antialkalinephosphatase(APAAP)法および種々の抗体を用いた.対象は健常人皮膚(n=3)とアトピー性皮膚炎病変部皮膚(n=7)を用いた.現在までに以下の結果がえられている。1)表皮中のIgE陽性ランゲルハンス細胞はアトピー性皮膚炎病変部では認められるが,類天疱瘡病変部では認められない.この分布の違いは明瞭であり,両疾患におけるランゲルハンス細胞の関与の有無を反映した現象と考える.2)上記のIgE陽性ランゲルハンス細胞は,FcεRIを介してIgEと結合している可能性が高い.これは,FcεRI陽性細胞およびFcεRII/CD23陽性細胞を解析した結果得られた.すなわち,FCεRI陽性細胞はAD病変部表皮に多数認めるのに対し,BP病変部表皮にはほとんど認めない.一方,FcεRII/CD23陽性細胞は両疾患とも病変部表皮には認めないからである.3)CD14陽性マクロファージはAD病変部ではほとんど認めないのに対し,BP病変部真皮中に多数認められる.この分布の違いは明瞭であり,両疾患におけるCD14陽性細胞の関与の多寡を反映した現象と考える.4)類天疱瘡病変部には多数のIgE陽性細胞,FcεRI陽性細胞およびFcεRII/CD23陽性を認めるが,それらは真皮中に存在する.これら細胞の詳細を現在解析中である.
栄養応答性miRNA発現制御に介在する新規シグナル伝達経路の解析

ヒトを含めた動物は、食後や空腹時など栄養状態の変化に応じて、幹細胞や前駆細胞の分裂や分化といった活動を調節することが知られている。本研究では線虫という実験動物を用い、nhl-2とnos-1という遺伝子が、飢餓時に神経の前駆細胞の活動を一時停止するのに必須であること、飢餓時にmiR-235というマイクロRNAの生合成調節を促進する可能性を見出した。今後、栄養状態の変化に伴いmiR-235やnhl-2、nos-1がどのように相互作用するか調べることで、動物がどのように栄養状態の変化に応答するか、遺伝子や細胞レベルでの理解が進むことが期待できる。pre-miR-235の5'末端より2.3 kb上流領域にgfpを融合させたレポーター遺伝子を作製し、gfpの転写産物の発現を調べたところ、内在性mature miR-235と同様に摂食によって顕著に抑制(飢餓時の約20%)されることを見出した。そこで、このGFPレポーター遺伝子のプロモーター領域を5'側から約100塩基対ごとに欠失したコンストラクトを作製し、GFPの発現パターンを調べた。その結果、約2 kb上流の領域をもつレポーター遺伝子は、2.3 kb上流領域をもつものと同様に、表皮、表皮幹細胞、神経前駆細胞でGFPの発現を示すのに対し、1.9 kb上流の領域しか持たないレポーター遺伝子は、表皮幹細胞でのみGFPの発現を示した。また、さらに1.6 kb上流領域までプロモーターを削り込んだコンストラクトは表皮幹細胞でのGFP発現も失うことを見出した。そこで2.3 kbのプロモーター領域のうち、1.9-2.0 kbおよび1.6-1.7 kb上流領域をそれぞれ欠失したGFPレポーター遺伝子の発現パターンを調べたところ、1.9-2.0 kb領域は表皮と神経前駆細胞におけるGFP発現に必須であるのに対し、1.6-1.7 kb領域は表皮幹細胞におけるGFP発現に必須でないことを見出した。さらに、1.9 kbのプロモーター領域しか含まないmir-235ゲノム断片は、mir-235 null変異体における神経前駆細胞の表現形を救助できないことから、表皮と神経前駆細胞におけるmir-235の発現が神経前駆細胞の静止期維持に重要であることが示唆された。上述の1.9-2.0 kb領域をベイトに酵母1ハイブリッド法を用いて結合因子を探索したところ、DNA結合タンパク質を1つ同定することができたが、そのタンパク質をコードする遺伝子の欠失変異体ではmiR-235の発現に影響は見られなかった。昨年度に引き続き酵母1ハイブリッド法を用いてmiR-235の転写調節に関与する因子の探索を進めたが、有力な候補因子を単離することができなかった。そこで、microRNAの生合成や活性調節に関与することがこれまでに示唆されたことのある因子群のなかで、機能阻害すると、mir-235遺伝子の欠失変異体と同様に飢餓条件下で神経前駆細胞の静止期からの異常活性化を示すものを探索した。その結果、TRIM-NHLタンパク質をコードするnhl-2遺伝子の欠失変異体が、ペネトランスは低いもののmir-235変異体と同様の表現形を示すことを見出した。飢餓条件下のnhl-2変異体におけるmiR-235の発現量をノザン解析にて調べると、daf-16/foxo変異体と同様に発現量の低下が見られた。さらに、nhl-2の欠失変異は、daf-16/foxoのnull変異体の表現形を増強することから、daf-16/foxoと並行する遺伝学的経路を介して神経前駆細胞の静止期を制御する可能性が示唆された。上述したようにnhl-2欠失変異体の表現形のペネトランスは比較的低いことから、nhl-2とリダンダントに機能する因子が存在すると考え、酵母2ハイブリッド法を用いて、nhl-2の相互作用因子を探索した。その結果、ヒトやショウジョウバエのNANOSオルソログであるnos-1と、CCR4-NOT複合体やデキャッピング複合体といった翻訳抑制やmRNAの分解に関与する複合体の構成因子群が単離された。さらにnos-1の機能阻害はnhl-2変異体の表現形を増強することも見出した。以上の結果より、TRIM-NHLやNANOSといった蛋白質が、miR-235、並びにCCR4-NOT複合体やデキャッピング複合体を介して、神経前駆細胞の栄養応答に関与する可能性が示唆された。当初の予定通り、飢餓時におけるmir-235 GFPレポーター遺伝子の表皮と神経前駆細胞における発現に必須である領域を同定することができ、さらにその領域が神経前駆細胞の静止期維持に重要であることを示唆する知見も得た。その一方で、酵母1ハイブリッド法を用いたスクリーニングでは、これまでにmir-235の発現を促進する因子が同定されていない。

しかしながら、今後表皮と神経前駆細胞での発現に必須であるシス領域をさらに狭め、より短いDNA断片をベイトとすること酵母1ハイブリッドスクリーニングの最適化が図れることと期待できるため。生化学上に述べたように、表皮と神経前駆細胞での発現に必須であるシス領域をさらに狭め、より短いDNA断片をタンデムに連結したものをベイトにすることで酵母1ハイブリッドスクリーニングの最適化を図る。また、これとは別のアプローチとして、mir-235と同様の表現形を示す転写因子の欠失変異体を探索し、そのような変異体におけるmir-235の発現量を野生型と比較することで、mir-235の発現制御に関与する転写因子の同定を試みる。さらに、上述の2.3 kbプロモーターにgfp cDNAを融合したレポーター遺伝子を形質転換した線虫を突然変異体誘発剤処理し、レポーター遺伝子の発現低下を示す変異体の単離を試みる予定である。今回同定したシスエレメントの生理的重要性を確認するべく、神経前駆細胞における静止期維持の重要性の検討実験を今年度の実験計画に加えたことで、シスエレメントの生理的重要性を確認できた。また、酵母1ハイブリッド法のコンストラクト作製や条件検討が予想以上に時間を要している。以上の2点により次年度使用額が生じた。mir-235発現機構解析の実験に、遺伝子工学試薬500,000円、線虫や酵母培養関連試薬500,000円、チップやチューブなどの使い捨てプラスチック器具400,000円が必要である。
韓国における「対日感情」-日韓関係への影響

本研究は、韓国社会の「対日感情」の構造的側面を言説分析の方法で考察しようととしたものである。そのため、歴史教科書問題、靖国問題、独島・竹島問題、そして従軍慰安婦問題などの日韓関係の懸案問題を『朝鮮日報』、『東亜日報』、『中央日報』などをはじめとする韓国の全国紙9紙がどのように報道するのか内容分析を試みた。一方、そのような現代のマス・メディアが作りあげる日本イメージと韓国の古記録に現れる「日本・日本人観」とを比較分析し、韓国人の対日感情が古代から現代に至るまで、時代の流れとともに何が変わり、何が変わらなかったかを明らかにしようとした。韓国新聞9紙の1990年から2001年までの12年間の対日記事の内容分析を行った結果、次のようなことが明らかになった。韓国で構築された「対日言説空間」は、その殆どが過去問題、歴史認識問題などを結びつけ、歴史の記憶を絶えず想起させていることが言及頻度分析で明らかになった。例えば、独島・竹島問題の領有権問題の記事に、過去問題を想起させる、帝国主義、過去史、歪曲、慰安婦、歴史認識、歴史教科書など、過去問題の単語群が多く登場し、いつの間にか領有権問題が、過去問題・歴史認識の問題にすり替えられていることなどである。また、14世紀末から19世紀後半までの歴史記録である朝鮮王朝実録の中から「倭人」に関する総3,276件の記録を、文禄の役を分水嶺として4期に分けて分析した。その結果、第1期では「倭人」を略奪、侵奪を恣行する「島夷」として認識し、第2期から奸詐、狡猜であるとする記述が多くなり、そのイメージが第3期、第4期に至るまで増え続けたこと、そのようなイメージが現在の韓国のマス・メディアの日本・日本人イメージにもある程度の連続性があることも頻度分析で明らかにした。研究成果は順次学会誌などに公表する予定である。本研究は、韓国社会のさまざまな側面における「対日感情」の構造を明らかにしようとするものである。具体的には、韓国社会の文化伝承形態、社会化過程、社会的統制、日常生活形態のなかの反日的要素を探索するとともに、日韓関係の懸案問題について韓国のマス・メディアがどのような「対日言説」を構築していくのか、内容分析(Content Analysis)を行う。そして、その情報の「受け手」の国民はどのように認識しているのかの「アンケート分析」を行い、韓国人の「対日感情」の構造を描き出そうとする。その際、日韓関係を長いタイムスパンで捉えるべく、古代から現代に至るまで、時代の流れとともに何が変わり、何が変わらなかったかを明らかにしようとしている。従って、研究の前半(2004年9月12月)には、古代における日韓関係像を掴むために、古代の日韓関係史に関する文献を広く集め、整理する作業を行った。また、『朝鮮王朝実録』と朝鮮通信史の使行記録など古文献に現れる「日本・日本人観」の整理も行った。後半(2005年1月3月)には、古記録に現れる「日本・日本人観」と戦後マス・メディアの日本言説に現れる「日本・日本人観」とを比較分析するため、『朝鮮日報』、『東亜日報』、『中央日報』、など韓国の全国紙新聞9紙の日本関連記事のデータを収集・整理した。この作業は引き続き進行中である。まだ具体的な研究成果物を出す段階までは至っていないが、研究は計画通り順調に進行している。
カイラル・クォーク模型に基づく核子の構造の研究

カイラル・クォーク・ソリトン模型に基づく核子の構造に関するここ一年間の研究成果を以下にまとめる。この模型はクォーク場のみを独立な自由度として含むQCDの有効模型であるが、この模型と有効中間子理論であるSkyrme模型の間には非常に密接な関係が存在する。実際、我々の研究のそもそもの動機は、π中間子から核子を作るというSkyrme模型の奇抜なアイデアの微視的な意味を明らかにしたいということにあった。これから当然予想されるように、多くの核子の観測量に対する二つの模型の予言は概ね似通ったものになっている。ところが、最近我々は、二つの模型の間に存在する決定的な違いを見いだした。即ち、カイラル・クォーク・ソリトン模型には存在する(ある種の物理量に対する)1/N_c回転補正が、Skyrme模型の枠組みの中には全く存在しないのである。この違いは、核子の模型としてのSkyrme模型の致命的な欠陥となる可能性がある。実際、Skyrme模型が核子の擬ベクトル結合定数g_Aを甚だしく過小評価することはg_A問題と呼ばれて10年来の問題となっていたが、1/N_c回転補正の欠落がこの原因であることはほとんど明らかである。Skyrme模型にこの1/N_c回転補正が存在しない理由は、ラグランジアン及びそれからNoether定理を用いて導かれる有効中間子流のLorentz構造を解析すれば、直接確かめることができる。しかし、この事実のもっと根元的な理由は、クォーク・レベルのラグランジアンに遡ることによってのみ明らかにされる。即ち、カイラル・クォーク・ソリトン模型における問題の補正は、関与する二つの演算子の正しい時間順序を保持することによって生じるが、Skyrme模型などの有効中間子理論と一対一の対応を付けられる標準的なfunctional bosonizationの方法は、この演算子順序を正しく取り入れていないことが示される。いずれにしても有効クォーク模型と有効中間子模型との間に見いだされたこの違いは、単にいくつかの観測量が再現できるかどうかという問題を超えて、もっと普遍的な意味を持つものであり、更なる探求が望まれる。
異種移植のためのカプセル化細胞移植療法の検討90140

アルギン酸ナトリウムはゲル化剤、安定剤、増粘剤などの各種改良材として古くから幅広い産業で利用されている。また、アルギン酸はその粘度とゲル強度(=M/G比)、精製度などによって医薬品、医療材料、化粧品、更には再生医療などのさまざまな分野でも利用されている。今年度はまずアルギン酸の粘度、ゲル強度、架橋剤、反応時間などによるカプセルの強度比較検討を行なった。また、解凍後のブタ肝細胞を用いてカプセル化を検討した。成熟したブタ肝細胞は重要な細胞源として考えられているが、凍結、解凍により肝細胞の生存率が落ちてしまう。しかし、カプセル化したブタ肝細胞をin vitroで培養した結果、長期間に渡り細胞の形が保たれ、アルブミン分泌が確認できた。またカプセル化したブタ肝細胞をマウスの腹腔内に移植して検討を行なった結果、in vivoにおいてもカプセルは数週間に渡り形が保たれ、臓器との癒着、腹水も認められなかった。さらにマウス血中のブタアルブミンも検出できた。これらの結果からある一定の条件下のアルギン酸ナトリウムカプセル化は、用いた細胞の宿主への拡散を回避でき、さらに免疫細胞をブロックできる有効で安全な方法の一つである可能性を示した。アルギン酸はその粘度とゲル強度(=M/G比)、精製度、管理規格などによって細かく分類される。所属機関が変更になったため、前職で提供契約を結んでいた製品が利用できなくなり、別の製品を紹介された。後、利用できる細胞源も変わったため、カプセル化に最適な条件のアルギン酸とその架橋時間を探すまで時間が掛かってしまった。現在提供されているアルギン酸である一定の条件下で、比較的に安定的に必要強度のカプセルか作れ、免疫隔離ができるという結果を得ている。今後も引き続き条件検討を行い繊維膜形成、癒着反応を防止するための方法を探ると同時に生体反応に強く、繊維化を起こしにくい既存・新素材の発掘を続ける。高額な試薬の購入がなかったため、動物購入が少なかったため。本年度にその購入などに充てる。
子どもの認知発達におよぼすコンピュータの影響を考慮した教授スキルの研究

コンピュータの子どもの知的機能への影響研究の結果に基づき、コンピュータを活用した授業の実践及び優れたアイデアの実践事例を整理し、子どもの知的発達を促進するコンピュータ活用教授技法やコンピュータの効果的利用方法を解明し、体系化することを目指して、コンピュータの教育利用の際の教授スキルの一覧リスト、各教材を通して行う情報教育のための教授スキル、コンピュータを利用した学習の際の学習スキル、コンピュータを利用した授業の評価項目、コンピュータの教育利用の効果測定、など一連の研究を行った。(1)コンピュータを利用している教師から効果的であった指導技術をできるだけたくさん取り出し、整理し、得られた項目について、重要度の評価をさせ、その結果、コンピュータの教育利用の際の教授スキル一覧を作成した。(2)情報教育の4つの目標達成のために、授業設計、実施、評価の各過程でどのような教授スキルが有効であるかを整理した。情報収集・選択、整理・処理、判断・創造、伝達、コンピュータ活用、倫理・態度の各能力の育成に際し、学力水準ごとに、必要な教授スキルの一覧を作成した。(3)教育効果測定については、川崎市の小、中学校8校(各2校ずつ、コンピュータ導入と非導入校)、計30クラス1000余名に、1992年7月と1993年2月の2時点で、こどものコンピュータに対する態度、知的能力、創造性の調査を行い、とくに、小学生女子学において、ワープロと創造性、プログラミングと演繹の能力に関係のあること等を見いだした。(4)数学における比率の学習で、言語による教示と図による教示、紙による教示とCAIによる教示の効果を比較し、図やCAIによる教示の有効なことを見いだした。本研究は、学校の授業においてコンピュ-タの与えるプラス影響を最大にし、負の影響を最小にするような影響を探り、コンピュ-タを用いた教育における具体的な教授スキルを明らかにし、それを体系化することを目的とし、調査・研究を行った。初年度に当たる今年度の研究成果としては、まず、コンピュ-タを用いた授業のビデオを収集する一方、コンピュ-タの教室等における利用事例を小学校・中学校を中心に収集し、学習指導要領の重視する教育内容の分類に対応して分類した。これらの資料にもとづき、コンピュ-タ利用の教授スキルのとり出しを行い、整理した。またアンケ-ト調査により、中学生958名についてコンピュ-タの利用状況と創造性、学習意欲、学習技能への影響を分析し、結果を学会報告した。さらに328名の教師を対象としたパソコン研修、授業参観とコンピュ-タの利用の積極的態度との関係を見いだし、学会報告した。また小学校550名についてコンピュ-タの自宅・学校の利用状況と空間認知、帰納、演繹、プランニング、メタ認知の5つの認知的能力のテスト結果の関係からコンピュ-タ授業が帰納、メタ認知以外に正の相関があることを見いだした。次年度以降は、1)前年度収集分析したコンピュ-タ利用の指導技法のリストを精選し、体系化し、2)各教科において、コンピュ-タの有効利用を類型化し、精選し、3)数学を題材として前年度施策した教授スキルの制御システムを洗練し、他教材へ広げ、4)数学を中心にして、コンピュ-タ利用教授スキルの指導書を試作し、5)再来年度にこの指導書を利用した授業実践を行い、その形成的評価による改善を行う。コンピューター使用が、子どもの認知能力に影響を及ぼす可能性は、これまでにくり返し指摘されてきたか、それを実証的に明らかにしてきた研究は非常に少ない。また、そのような研究があっても、実験的な手法によるものであり、現実場面での影響を明らかにしたかどうか定かではなかった。そこで、本研究は、このような影響の問題を、パネル調査によって検討しようとするものであった。

被験者としては、小学生と中学生を用い、7月と23月の2回にわたって、コンピューター使用に関する調査と、子どもの論理能力、空間知覚能力、創生性などのテストを行い、交差遅れモデルによって、コンピューター使用とそれぞれの認知能力の間の影響関係を明らかにしようとしている。小学校で16学級、中学校で20学級の協力が得られ(どちらも、半数がコンピュータ夕ーを授業に導入している)、小学生500名,中学生700名に近い被験者を確保することができた。4月6月は、文献の調査と、コンピューター使用の調査あるいは論理能力、空間知覚能力のテストの作成を行った。その作成にあたっては小学生・中学生20名程度に、予備調査を行った。本調査は、7月より開始した。第1回目の調査は7月に完了し、既に、各種のテストの採点,コード化,データ入力も終わっている。現在は、第2回目の調査を行っているところである。また、コンピューター導入校の場合には、教師にも、どのようにコンピューターを使用しているかの調査を行っている。第2回目の調査を終え、採点・データ入力を終わって後に、影響関係の分析にとりかかる。コンピュータの子どもの知的機能への影響研究の結果にもとづき、また、コンピュータを活用した授業の実践および優れたアイデアの実践事例を整理し、子どもの知的発達を促進するコンピュータ活用教授技能やコンピュータの効果的利用法を解明し、体系かすることを目指して、コンピュータの教育利用の際の教授スキルの一覧リスト、各教科を通して行う情報教育のための教授スキル、コンピュータを利用した学習の際の学習スキル、コンピュータを利用した授業の評価項目、コンピュータの教育利用の効果測定、など一連の研究を行った。(1)コンピュータを利用している教師から効果的であった指導技術をできるだけたくさん取り出し、整理し、得られた項目について、重要度の評価をさせ、その結果、コンピュータの教育利用の際の教授スキル一覧を作成した。(2)情報教育の4つの目標達成のために、授業設計、実施、評価の各過程でどのような教授スキルが有効であるかを整理した。情報収集・選択、整理・処理、判断・創造、伝達、コンピュータ活用、倫理・態度の各能力の育成に際し、学力水準ごとに、必要な教授スキルの一覧を作成した。(3)教育効果測定については、川崎市の小、中学校8校(各2校ずつ、コンピュータ導入と非導入校)、計30クラス1000余名に、1992年7月と1993年2月の2時点で、こどものコンピュータに対する態度、知的能力、創造性の調査を行い、とくに、中学校男子生徒において、ワープロと創造性、プログラミングと演繹の能力に関係のあること等を見いだした。(4)数学における比率の学習で、言語による教示と図による教示、紙による教示とCAIによる教示の効果を比較し、図やCAIによる教示の有効なことを見いだした。
腎障害におけるアナフィラトキシン、C3a,C5aの役割の解明

本研究により明らかにされた成果は以下の通りである。A.高度の糸球体障害の指標のひとつである糸球体内血栓形成には補体活性化産物であるアナフィラトキシン、特にC5aが深く関与していることが明らかになった。B.ラット血栓形成性糸球体腎炎モデルを用いた実験結果から、アナフィラトキシンC5a受容体を特異的阻害ペプチドで抑制することにより糸球体障害が軽減されることが明らかになった。C.抗血栓薬として期待されている可溶型トロンボモデュリンはその高い抗血栓作用の一部が、アナフィラトキシンを不活化させる作用を介していることが明らかになった。D.そのメカニズムとしてトロンビン・トロンボモデュリン複合体によるアルギニン特異的カルボキシペプチダーゼ(CPR)の活性化、すなわちpro-CPRからCPRへの転換が促進され、CPRがアナフィラトキシンC5aを不活性化することにより好中球の浸潤を抑制する事が明らかになった。E.腎臓においてアナフィラトキシンレセプターの発現が見られ、ループス腎炎などでその発現が亢進することが明らかになった。以上の研究成果により、これまで補体による腎障害がおもに補体活性化最終産物であるmembrane attack complex(MAC)によるとする仮説に一石を投じ、補体活性化の中間産物として生成されるアナフィラトキシンも糸球体障害に重要な役割を果たすことが明らかになった。さらにヒト、マウスに続き我々はラットでアナフィラトキシンを不活性化する酵素であるCPRをクローニングし、従来から用いているC5aレセプター拮抗ペプチドとともに、CPRを用いて糸球体障害を制御する試みが可能になった。今後、抗補体療法の臨床への応用を考えるうえで本研究の成果は重要な情報をもたらすものと期待される。腎臓におけるアナフィラトキシン受容体の局在に関して、我々はC3aレセプターに対する特異抗体でまずその局在を見た。正常の腎臓にはほとんど発現が見られないが、種々の腎疾患のうち、ループス腎炎では糸球体内皮細胞に免疫複合物の部位と一致して発現が確認された。これ以外では抗体による発現の確認は困難で、機能的な研究が重要であると考えられた。そこで、我々は2つの方法で腎障害におけるアナフィラトキシンの役割の解明を試みた。その第一は、C5aレセプター拮抗ペプチドを用いた実験である。まず6つのアミノ酸から成る拮抗ペプチドがラットでもC5a特異的に働くか否かの実験を行い、ラット好中球に対してC5a特異的な拮抗作用を持つことを確認した。次に、この拮抗ペプチドを用いてラット実験腎炎モデルでその作用を検討した。その結果、この拮抗ペプチドは好中球の浸潤抑制や糸球体内血栓形成の抑制などの作用があり、結果として、ラット腎炎モデルにおいてはアナフィラトキシンの関与が明確にされた。第二には培養メサンギウム細胞を用いて、in vitroの系でアナフィラトキシンの刺激を加えたときの細胞の活性化状態を増殖能、種々のサイトカインの産生能、細胞内シグナル伝達の変化を指標にして検討し、これに拮抗ペプチドを加えて抑制作用を検討する実験を実施中であり、これまでのところアナフィラトキシンによるメサンギウム細胞の活性化と拮抗ペプチドによる抑制効果が実際に存在する結果を得つつある。平成12年度の研究期間に腎障害におけるアナフィラトキシン、C3a,C5aの役割を解明するために下記の研究実績をあげた。(1)腎障害時におけるアナフィラトキシンレセプターの発現に関しては、ヒト腎生検組織を用いてC3aレセプター、及びC5aレセプターの発現を免疫組織学的に検討した。

その結果、ループス腎炎において特に糸球体に発現が有意に増加することを認め、臨床的に重要なこのタイプの腎炎におけるアナフィラトキシンの関与が強く示唆された。(2)ラット実験腎炎を用いた研究では、C5aレセプターを特異的にブロックするペプチドならびにC3レベルで補体の活性化を抑制する可溶性I型補体レセプター(sCR1)を用いて研究を行い、少なくともLPS(グラム陰性桿菌菌体成分)と抗基底膜抗体で惹起されるラット実験腎炎においてはMACよりもC5aが重要であることが明らかになった。(3)さらに我々は最近臨床応用が間近に迫っている可溶型ヒトトロンボモデュリンを用いて同じモデルで著明な抗腎炎効果を認めたが、その際、トロンビン・トロンボモデュリン複合体により活性化さされるアルギニン特異的カルボキシペプチダーゼ(CPR)がアナフィラトキシンを不活性化することが重要であることを証明した。このモデルはヒトではグッドパスチャー症候群や血栓性微少血管症の良いモデルとされており、今後、臨床応用に向けた取り組みが期待される。(4)さらに、我々はこの成果を将来の臨床応用に行かすべくラット腎炎における治療実験を推進する目的でラットCPRのクローニングを試みて成功した。以上の研究実績から、重篤な病態を示す血栓形成性糸球体腎炎におけるアナフィラトキシンの役割が明らかになった。
X線の抗腫瘍効果に占める腫瘍血管損傷の寄与の硼素中性子捕獲反応を用いた定量的解析

腫瘍細胞選択的な集積能を持つ硼素薬剤BPAを投与したマウスの腫瘍に低速中性子を照射すると中性子と硼素原子核の反応で極短飛程の極高LETが極短飛程の粒子が放出され、効果は硼素を集積した腫瘍細胞に略限定される。この効果をコロニー法で求めた細胞生存率と増殖遅延日数で調べ関係を求め、X線照射時の場合と比較する。その差を腫瘍細胞以外の腫瘍内構造、特に腫瘍血管に対する放射線の効果と見なし、定量的に評価する。斯うした研究はBNCRを利用する以外には手段がない。得られたデータはSRSやSRT時のX線一回第線量照射の効果を説明できる可能性が在る。
マイクロシステムにおける分子計算の研究

本研究では、合成DNAを用いて反応ネットワークを構成し、これをマイクロ流体システムと組み合わせることによって、動的な入出力に対応可能な新しい分子計算の可能性を示すことを目的とする。従来の分子コンピュータは、与えられた入力(=分子)に対して一連の反応操作を行うことにより、静的な計算結果を得るものであるのに対して、研究代表者のグループでは近年、合成DNAを設計し、これを複数の酵素と組み合わせることにより時間領域で振動する反応系を実現している。このような反応系を用いることによって、動的に変化する入力に対して、これに対応して動的に処理を行う分子コンピュータの概念を考えることができる。これにより、生体の動的なシグナルに対応する出力を計算することが可能になるため、たとえば投薬を支援するシステムなどへの医療応用を考えることができる。最終年度である平成25年度は、昨年度までに確立した液滴を用いる反応システムについて、反応条件の最適化を進めた。反応体積をさらに微小化することによって、平均的な濃度依存の現象ではなく、個々の分子の振るまいによる少数効果を見出すことを目的としているが、9月の時点では、そのような結果を得るには至っていない。(抄録なし)本研究では、合成DNAを用いて反応ネットワークを構成し、これをマイクロ流体システムと組み合わせることによって、動的な入出力に対応可能な新しい分子計算の可能性を示すことを目的とする。初年度である平成23年度は、研究代表者のグループの合成DNAによる反応系の構築方法、ならびにマイクロ流体デバイスの製作方法に習熟するとともに、ミハエリス-メンテン式に基づく反応モデルを用いた理論的な計算を試みた。デバイス製作については、シリコーンゴムの一種であるPDMS(Polydimethylsiloxane)を材料としたデバイス製作を行うとともに、数式計算ソフトウェアを用いて反応ダイナミクスのシミュレーションを行い、反応系ならびにパラメータ調整を行う基盤を整備した。これらの作業を通じて、周波数多重化(Frequency Multiplexing)、捕食者-被食者ダイナミクス(Predator-Prey Dynamics)等の操作について理論と実験の双方から検討を行った。さらに、Winner-take-all操作を実現するような反応系を設計し、実験的な検証を進めているところである。二年度目である平成24年度は、生化学反応ネットワークにおいて反応に必要な特定のリソースをめぐる競争が、情報処理の観点でどのような効果を有するかについて検討を加え、反応のシミュレーションモデルを構築して具体的な遺伝子ネットワークにおける競争の効果を示すことに成功した。さらに、このような性質を利用して論理回路を人工的に作成する方法のについて検討を進めている。一方、複数種の合成DNAからなる上記の振動反応系について、その反応体積を微小化するとともに、多数の反応を同時並行して実行・観察することを目的として、DNA振動反応系を微小な液滴に封入し、その内部で反応させる実験系の構築を試みた。これによって、直径数十μm程度の多数の液滴(=反応体積はナノからピコリットルオーダー)内部において振動反応を行い、これらを同時並行して観察する実験系を確立した。反応体積をさらに微小化することによって、平均的な濃度依存の現象ではなく、個々の分子の振るまいによる少数効果が観察されることを期待しうる。

研究立ち上げの段階である初年度は、おおむね順調に作業を進めることができている。シミュレーションによる検討は計画以上に進展しているが、実験部分がやや遅れている。全体の進捗状況としては、おおむね順調といってよい。今後は具体的な反応系を設計し、マイクロ流体デバイスへの実装を含め、実験と理論の両面から研究を進める予定である。また、いくつかの国際会議において、理論的な検討と基本的なコンセプトに関する発表を行うことを通じて、研究内容の充実を図る。最終年度はこれまでの成果を踏まえて、当初計画していた周波数多重化の実現可能性を示すこと、ならびに昨年度確立した実験系を用いて少数効果の観察を実現する予定である。(抄録なし)