hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
複合的分析手法による消費者のリスク選好の形成要因を探求する研究

本研究は、統計的分析手法を用いる経済学と、文学作品等の記述的資料を分析対象とする文学とを融合し、個人のリスク選好と金融商品・資産選択に対する消費者行動分析に新しい視点を加えることを目的とする。本研究を遂行するにあたり、個人または個人が形成するグループ間でリスク選好に相違があることを示す指標を設定する必要がある。そこで、人口一人当たりの個人生命保険の契約件数や契約金額をその指標とし、都道府県別に集計したとき、地域間で相違があることを確認した。これは現在のみならず、1960年代まで遡ってもそうであった。一方、個人生命保険契約実績で示されるリスク選好について、こうした地域間で相違が生じる要因を長期的に考えたとき、世代間での選好の継承が存在しているのではないかという仮説に思い至った。すなわち、相対的にリスク回避的な個人が集まる地域において、そのリスク選好が次世代に継承されるのであれば、その地域では長期的にリスク回避的傾向が継続するであろう、ということである。この仮説を検証する方法の一つとして、一般的なミクロ経済学の概念に基づいた理論モデルを構築した。これは、主観的な事故確率を持つ個人が最適に行動する設定の重複世代モデルで、親と同居する個人は、親の主観的事故確率を継承するというように、親世代との同居・別居が結論に影響を与えることを仮定したものである。モデルとしては、様々な想定を組み込むことができるため、多様な設定でそれぞれの理論的帰結を導いた。そして、理論的接近だけでは結論の具体性に劣るため、現実的なパラメーター値に基づいてカリブレーションも行った。このように、親と同居する割合とリスク選好とを結びつける考え方に基づいた研究は前例が少なく、現時点では理論的接近によっていくつかの結論が導かれ、また実データ間における新たな関連性が発見されている。先に提出した研究実施計画に記したように、平成30年4月6月の第1期は交付内定前であるため、各種サーベイ作業は平成30年7月12月の第2期に並行して行った。第2期の主たる作業は個人のリスク選好の地域特性の抽出であるが、「インシュアランス保険統計号」(株式会社保険研究所)及び国立国会図書館所蔵書籍から引用したデータを基に、予定通り行われている。一方、国勢調査結果から得られる世帯の状況に関するデータは、想定以上に多様かつ有益な情報であることがわかり、上記の理論モデルの構築に至った。当初計画では理論的接近のみで結果報告を行う予定はなかったが、平成31年2月25日に金融プラス・フォーラム第6回研究報告会にて成果の一部を発表した(https://sites.google.com/site/financepluskaiin/6thkenkyukai)。そこでの議論を踏まえ、理論モデルの拡張と、より多様な数値を用いたカリブレーションを行い、国際学会での発表が認められるよう、原稿を作成した。その結果、初めにアジア太平洋リスク保険学会での報告機会が得られた。続いてより採択率の低いアメリカ保険学会の研究大会にも報告申請し、採択された。それぞれ平成31年7月8月に研究成果の報告を行う。前者では、理論モデルから得られた結論を中心に報告し、後者では実証データとの整合性から個人のリスク選好の形成過程について報告する予定である。現在は平成31年1月6月の第3期にあり、個人のリスク選好形成に影響を与えたと思われる歴史的に発生したイベントの抽出を、広範囲の資料を精査して行っている。研究前半で想定以上の成果が得られたことから、理論分析に当初計画よりも多くのエフォートを費やしている。これによって文献調査に若干遅れが生じているが、全体としての研究進捗状況はおおむね順調に進展しているといえる。本研究は、平成30年4月6月の第1期に人文地理学分野及び金融リテラシー分析分野の中で、地域金融市場に着目した既存研究をサーベイし、平成30年7月12月の第2期に地域学や人文地理学の手法を応用して個人のリスク選好の地域特性を抽出する計画だった。上記の通り現在は平成31年1月6月の第3期にあり、個人のリスク選好形成に影響を与えたと思われる歴史的に発生したイベントの抽出を、広範囲の資料を精査して行っている。理論分析を進める中で、想定以上に幅広い経済状況を描写するモデルが構築できた反面、特に文学分野の既存研究のサーベイに若干の遅れが生じているため、第3期の残りの期間では文献調査に注力していく。本研究の特色は、個人のリスク選好形成に影響を与えたと思われる歴史的に発生したイベントの抽出において、新聞や雑誌の記事及び文学作品を資料として用いることにある。それは、通常「史料」として用いられない文献を、その時代の消費者の金融リテラシーを示すシグナルとして用いることであり、記事内容の真実性よりも読者数と読者層が重視される。現存する文献は自ずと一定の部数が発行されたものとなるが、発行部数の特定に時間を費やすものと予想している。当初計画では第3期終了後、第23回アジア太平洋リスク保険学会で研究成果の一部を報告する予定だったが、提出した研究報告原稿は審査を経て採択された。また、研究の進行状況によっては他の国際学会にもエントリーすることを視野に入れていたが、こちらも審査の結果アメリカリスク保険学会で報告できる運びになった。これらの学会報告における議論を踏まえ、令和1年7月令和2年3月までの第4期では、仮説の検証を行いながら、頑健な結論について最終的な研究論文にまとめる予定である。

本研究は、統計的分析手法を用いる経済学と、文学作品等の記述的資料を分析対象とする文学とを融合し、個人のリスク選好と金融商品・資産選択に対する消費者行動分析に新しい視点を加えることを目的とする。本研究を遂行するにあたり、個人または個人が形成するグループ間でリスク選好に相違があることを示す指標を設定する必要がある。そこで、人口一人当たりの個人生命保険の契約件数や契約金額をその指標とし、都道府県別に集計したとき、地域間で相違があることを確認した。これは現在のみならず、1960年代まで遡ってもそうであった。一方、個人生命保険契約実績で示されるリスク選好について、こうした地域間で相違が生じる要因を長期的に考えたとき、世代間での選好の継承が存在しているのではないかという仮説に思い至った。すなわち、相対的にリスク回避的な個人が集まる地域において、そのリスク選好が次世代に継承されるのであれば、その地域では長期的にリスク回避的傾向が継続するであろう、ということである。この仮説を検証する方法の一つとして、一般的なミクロ経済学の概念に基づいた理論モデルを構築した。これは、主観的な事故確率を持つ個人が最適に行動する設定の重複世代モデルで、親と同居する個人は、親の主観的事故確率を継承するというように、親世代との同居・別居が結論に影響を与えることを仮定したものである。モデルとしては、様々な想定を組み込むことができるため、多様な設定でそれぞれの理論的帰結を導いた。そして、理論的接近だけでは結論の具体性に劣るため、現実的なパラメーター値に基づいてカリブレーションも行った。このように、親と同居する割合とリスク選好とを結びつける考え方に基づいた研究は前例が少なく、現時点では理論的接近によっていくつかの結論が導かれ、また実データ間における新たな関連性が発見されている。先に提出した研究実施計画に記したように、平成30年4月6月の第1期は交付内定前であるため、各種サーベイ作業は平成30年7月12月の第2期に並行して行った。第2期の主たる作業は個人のリスク選好の地域特性の抽出であるが、「インシュアランス保険統計号」(株式会社保険研究所)及び国立国会図書館所蔵書籍から引用したデータを基に、予定通り行われている。一方、国勢調査結果から得られる世帯の状況に関するデータは、想定以上に多様かつ有益な情報であることがわかり、上記の理論モデルの構築に至った。当初計画では理論的接近のみで結果報告を行う予定はなかったが、平成31年2月25日に金融プラス・フォーラム第6回研究報告会にて成果の一部を発表した(https://sites.google.com/site/financepluskaiin/6thkenkyukai)。そこでの議論を踏まえ、理論モデルの拡張と、より多様な数値を用いたカリブレーションを行い、国際学会での発表が認められるよう、原稿を作成した。その結果、初めにアジア太平洋リスク保険学会での報告機会が得られた。続いてより採択率の低いアメリカ保険学会の研究大会にも報告申請し、採択された。それぞれ平成31年7月8月に研究成果の報告を行う。前者では、理論モデルから得られた結論を中心に報告し、後者では実証データとの整合性から個人のリスク選好の形成過程について報告する予定である。
磁性半導体量子井戸における光スピングダイナミクスの研究

我々は磁性半導体から非磁性半導体へのキャリアスピン注入過程を明らかにするために、希薄磁性半導体量子井戸と非磁性半導体量子井戸の間に非磁性半導体バリアを挟んだ2重量子井戸構造試料における励起子発光のピコ秒時間分解分光を行った。磁場印加の下で試料を光励起すると、磁性超格子Zn_<1-y>Mn_ySe/CdSe(MW)内でスピン偏極されたキャリアはバリア層のZnSeをトンネルし、非磁性井戸Zn_<1-x>Cd_xSe(NW)へと注入される。NW励起子発光に生じた円偏光特性の時間変化を調べることによりスピン偏極キャリアのトンネル過程を解明した。MW幅を40nm、バリア幅を4nmと一定にし、NW幅(L_<NW>)が7nmと2nmへ変化させた試料について調べた。L_<NW>=2nmの試料は、L_<NW>=7nmの構造と比べ、NW内の量子閉じ込め効果の増大によりMW-NW励起子発光エネルギー差(ΔE)が190meVから60meVへと減少した。これらの試料について時間分解PL測定を行うと、L_<NW>=7nmの試料では、NWPLの円偏光度は励起直後から0.15の値を示したのに対し、L_<NW>=7nmの試料では、円偏光度は励起直後は0を示し、非常に遅い時定数で上がっていった。電子-正孔個別トンネルモデルのレート方程式により、電子、正孔のトンネル時間を求めると、電子トンネル時間は50ps、正孔トンネル時間は10nsと、特に正孔トンネル時間が大きく抑制されている事が分かったL_<NW>=7nmの試料では磁場印加時においてもΔEが100meVよりも大きく、2E_<LO>よりも充分に大きいため電子と正孔がともにLOフォノン散乱を介したトンネルをする。これに対して、L_<NW>=2nmの試料では、磁場を印加すると正孔の準位においてはΔEは1E_<LO>よりも小さくなり、正孔のLOフォノン散乱によるトンネル過程は抑制され音響フォノン散乱によるトンネルのみが起こると考えられる。即ち、LOフォノン散乱時間は0.1psと非常に高速であるが、音響フォノン散乱時間が500psと遅いために、L_<NW>=2nmの試料のトンネル時間は非常に遅いものになっていると考察される。スピンエレクトロニクスデバイスの実現にあたり、半導体中にスピンの偏極したキャリアを効率よく注入させることが重要な課題となっている。磁場印加の下で試料を光励起すると、磁性超格子Zn_<1-y>Mn_ySe/CdSe (MW)内でスピン偏極されたキャリアはバリア層のZnSeをトンネルし、非磁性井戸恥Zn_<1-y>Mn_ySe (NW)へと注入される。バリア幅(L_B)が励起子ボーア半径と同等のL_B=4nmの2重量子井戸試料ではNW励起子発光寿命は160psとなり、磁場印加時において、円偏光度は励起直後から0.15の値を示した。一方、バリア幅が励起子ボーア半径より充分厚いL_B=8nmの2重量子井戸試料におけるNW励起子発光寿命は150psと1.7nsの2成分の時定数をもち、円偏光度は0.06から0.3の値に400psの時定数で立ち上がる。これはMWから=400psの時定数でトンネルしてくるスピン偏極キャリアが存在することによる。MWの発光寿命が30psと短いことを考慮し、レート方程式を用いたモデル解析を行った。その結果によるとバリアの薄い試料では、電子と正孔は励起子として、電子スピンの偏極を保存したままトンネルし、バリアの厚い試料では、電子と正孔は個別のトンネル時間でMWからNWへとトンネルし、NWで励起子再結合していることがわかった。

これらの試料について時間分解PL測定を行うと、L_<NW>=7nmの試料では、NWPLの円偏光度は励起直後から0.15の値を示したのに対し、L_<NW>=7nmの試料では、円偏光度は励起直後は0を示し、非常に遅い時定数で上がっていった。電子-正孔個別トンネルモデルのレート方程式により、電子、正孔のトンネル時間を求めると、電子トンネル時間は50ps、正孔トンネル時間は10nsと、特に正孔トンネル時間が大きく抑制されている事が分かったL_<NW>=7nmの試料では磁場印加時においてもΔEが100meVよりも大きく、2E_<LO>よりも充分に大きいため電子と正孔がともにLOフォノン散乱を介したトンネルをする。これに対して、L_<NW>=2nmの試料では、磁場を印加すると正孔の準位においてはΔEは1E_<LO>よりも小さくなり、正孔のLOフォノン散乱によるトンネル過程は抑制され音響フォノン散乱によるトンネルのみが起こると考えられる。即ち、LOフォノン散乱時間は0.1psと非常に高速であるが、音響フォノン散乱時間が500psと遅いために、L_<NW>=2nmの試料のトンネル時間は非常に遅いものになっていると考察される。
微生物ナノファイバー紡糸装置における繊維排出機構の解明

Asaia bogorensisが生産するセルロース合成タンパク質複合体中の1成分であるCesD(AbCesD)について、異種発現生産した精製タンパク質をX線結晶構造解析し、最終的に中央に孔を形成する8量体構造であることを突き止めた。中央部の孔の構造がG. xylinusのCesDと異なり、これがセルロースナノファイバーの構造に影響していることが構造モデルから推測された。また、AbCesDの局在について、抗体を用いた免疫電顕観察から膜近傍に存在していることが明らかとなった。また、このタンパク質の発現時期を調べたところ、細胞周期に関係なく常時発現していることが明らかとなった。本年度は高知大と共同して、ターミナルコンプレックス(TC)の局在について抗CesD抗体を使い,まずは化学固定による免疫電顕を行った。培地表面に形成した薄膜中の菌体を,パラホルムアルデヒドで固定し、エチルアルコールによる脱水後、水溶性のLRWhite樹脂に置換し、低温で紫外線によって樹脂を重合させた。超薄切片を作製し、抗CesD抗体による一次抗体処理、金標識抗ウサギIgG抗体による二次抗体処理を行い、電顕観察した。金粒子は菌体の膜付近に多く存在したが、細胞質にも存在した。まだ解析が不十分であるが、菌体内で合成されたCesDタンパク質が、膜付近に移動する際の一過程とも考えられるが、詳細は今後の検討課題である。次に、フリーズフラクチャー法を用いて、TCの局在性について観察した。内膜上にはタンパク質複合体と思われる突起物が見られたが、Gluconacetobacterの時に見られるような一列に配列した構造は観察されなかった。このことがセルロース合成量に関係しているかどうかは今後の課題である。ついで、CesDの立体構造解析については、Hisタグカラムによって精製したAbCesDを用いて、ハンギングドロップ蒸気拡散法により結晶化を行った。その結果、マロン酸ナトリウム、PEG3400、2-methyl-2,4-pentanediolを用いた条件において、結晶を作成することができた。得られた結晶を用いてX線回折強度測定を行った結果、空間群I222、結晶格子(a=57.8Å、b=99.2Å、c=112.5Å)であり、Gluconacetobacter xylinus由来のCesDを用いた分子置換法により、最終的に分解能1.9Å、R factor=22.7%での立体構造を決定した。AbCesDは、ダイマー・テトラマーを形成しており、8量体構造を形成していた。A. bogorensisは非常に微細な繊維を菌体外に排出する。細胞膜に固定化されたこの特殊な紡糸装置の構造及びその防止機構を解明するため、タンパク質複合体の構造を明らかにすることを目的としている。本年度はタンパク質複合体のうち特にCesD遺伝子をターゲットとして、大腸菌を宿主とする発現用ベクターを用いて異種発現生産を行った。また組換え生産したタンパク質をニッケルカラムによる精製を行い電気泳動的に単一になるまで精製した。ついで、精製した組換えCesDタンパク質を抗原として抗体を外部委託により作成した。この抗体を用いて、免疫染色を行い、抗体が機能することを確認した。ターミナルコンプレックス(TC:セルロース合成タンパク質複合体)の局在を電顕下で確認するため、CesD抗体を用いたTCのラベル化条件を検討した。また、高知大学においては来年度に予定するフリーズ・フラクチャーによる外膜・内膜表面観察のための条件検討を行い、準備が整った。CesDの立体構造解析のため、CesDタンパク質の結晶化条件をスクリーニングキットを用いて検討し、結晶の析出条件を絞り込んだ。現在は、さらに結晶構造の解析に好ましい結晶の作成を行っている。Asaia bogorensisが生産するセルロース合成関連タンパク質の一つであるCesD(AbCesD)について、X線結晶構造解析を行い、最終的に1.95Å分解能での立体構造を決定することに成功した。AbCesDは非対称単位に2分子を含み、1分子のAbCesDは4つのα-ヘリックスと4つのβ-ストランドから形成されていた。更に、結晶中においてAbCesDは対称操作により2分子が4つ組み合わされた8量体構造を形成されていることが示唆された。一方、AbCesD溶液のNative-PAGE及びゲル濾過クロマトグラフィーの分析結果からも、AbCesDは8量体に相当する分子量を示したことから、生物学的な集合単位は8量体であると考えられた。AbCesDの8量体構造は、十字状の孔を中央に有するシリンダー状であった。

既に立体構造が明らかとなっているGluconacetobacter xylinusのCesD(GxCesD)の8量体構造と比較してみると、この孔の形状が大きく異なっており、この孔の形状が両菌におけるセルロース繊維形状及び生産量の違いに関与している事が示唆された。また、AbCesD抗体を用いた電子顕微鏡による局在観察から、AbCesDが膜付近に位置していることを確認することに成功した。また、CesDの発現時期についてmRNAについてRT-PCRを用いて解析したところ、常時発現していることが明らかとなり、細胞の周期に依存しないことが解った。このことから、CesDの局在に関して、抗体を用いた顕微鏡観察の実験条件が定めることができた。さらに、CesDの機能を詳細に調べるために、欠損株を作成しているが、作成のための薬剤耐性細胞選抜の手法を確立し、現在取得を試みているがまだ成功にまでは至っていない。加えて、CesDの8量体構造の孔の大きさを左右すると思われるN末端のアミノ酸配列について、Gluconacetobacter型の鎖長を延長した株を作成し、セルロース生産性の表現系を調査しているが、変異株の作成には成功し現在生産性について比較検討を行なっている。生物工学今年度の研究項目では、以下の2点が重点の課題であった。1CesDタンパク質の結晶化と立体構造解析2抗CesD抗体を用いた細胞における局在性の解明のための電顕観察これに対して、1については高分解能での立体構造の解析に成功し、GluconacetobacterのCesDと同様に、ダイマー・テトラマーの8量体構造を形成していることを明らかとした。これにより、セルロース合成の機構の解明の基礎的な知見が得られることが期待される。また、両菌間でのセルロース合成量の違いに関する要因を解析することが可能となるものと考えられる。また、2については抗体染色によるCesDの局在について、基礎的なデータが得られた。現在これを解析中であるが、今後さらに詳細に検討するための基礎は構築された。A. bogorensisのCesD遺伝子を大腸菌を宿主とする発現用ベクターを用いて発現させることに成功し、組換え生産したタンパク質を電気泳動的に単一になるまで精製することができた。ついで、精製した組換えCesDタンパク質を抗原として抗体を外部委託により作製し、この抗体を用いて免疫染色を行い、抗体が機能することを確認した。さらに、高知大学においては来年度に予定するフリーズ・フラクチャーによる外膜・内膜表面観察のための条件検討を行い、観察の準備が整った。また、CesDの立体構造解析のため、CesDタンパク質の結晶化条件をスクリーニングキットを用いて検討した結果、0.1×0.1×0.1mm程度の微結晶が精製する条件を見出した。さらに結晶楮の解析適する結晶の作成に成功し、次年度の解析の準備が整った。以上のように、次年度のTCの細胞膜上の局在を観察する準備が整い、またX線構造解析を行うための結晶作成条件の絞り込みができたことから、次年度の成果が期待できる成果が収められたので、計画通りに進捗していると判断した。セルロース合成に重要な合成酵素複合体のうち、CesDタンパク質の局在性について、抗体を用いた電顕観察から種々の仮説が考えることが可能となった、今後は、さらに精度をあげて観察するために、以下の検討を行う。1CesDの欠損株の構築とこの株におけるTCの局在の観察
ダイナミクスシンセシス:自然現象の高速アニメーション技術

本年度は以下のような研究成果を得た.成果発表については,完成度に応じて,論文への投稿と国際会議での発表などを行った.(a)平面状物体の揺らぎ運動を,揺らぎ(1/fノイズ)により直接的に生成するためのアルゴリズムについて,揺らぎの使用法の改良を行い,よりリアリティを向上させた.また,炎の画像を例にとり,揺らぎとモーフーフィング技術を用いた静止画像からのアニメーション生成技術の開発を行った.ろうそくの画像については良好な結果が得られた.(b)揺らぎの利用により,低次元のシミュレーションデータをベースとして,2次元から3次元への次元上げを行い,砕波のアニメーションを生成する方法について,境界形状の複雑な岸壁などに対応できるようなアィデアを考案した.また,以下の(c)と関係するが,速度場の次元上げによる水流の効率的なアニメーション法についても開発可能性の見通しを得た:(c)小規模なシミュレーションデータによる大規模な積雲の生成アルゴリズム(空間での拡張)について,データの配置法などについて改良を行った.また,GPUによる高速レンダリング技術も開発した.再帰配置による詳細形状の生成法については,小規模シミュレーションデータから基本となるアニメーションデータを生成する段階に適用するのが効果的であるという見通しが得られた.また,水流の流れのようなほぼ同様に繰り返す現象について,速度場の生成とトレースというステップで行う方法について実験を行い,良好な見通しが得られた.(d)GPUを活用した稲妻生成やプラズマボールの表現法について,リアルタイムで実現できる手法開発を行った.また,GPUを活用した,タンクモデルによる規模の大きな水流の運動シミュレーション法の開発を行い,砕波を伴わない流れの表現には効果的であることを確認した.(a)揺らぎ(1/f^βノイズ)により,運動を直接生成するアプローチについてこれまでに開発している広葉樹の揺らぎ運動の生成法について,板バネモデルと空気力学を考慮した改良アルゴリズムを考案した.また,布のような平面(格子)状物体についての試行的なアルゴリズムを考案し,プログラム実験を行い,実現可能性を示すことが出来た.(b)揺らぎの利用により,低次元のアニメーションデータを高次元のアニメーションデータに拡張するアプローチについて砕波の鉛直断面の2次元流体シミュレーションデータを3次元砕波に拡張する方法について,3次元の良好な境界面形状を得る方法と,GPUによるシミュレーションの高速化について試み,前者については,2つの改良案を考案し,試行実験を行った.後者については,プログラム実験の結果,現在のGPUの命令セットやメモリ構成では,種々困難な点が存在することが明らかとなった.また,火花放電についても,次元上げの手法についてプログラム実験を行い,良好な試行結果が得られている.(c)動的な再帰配置により,小規模なアニメーションデータを複雑で大規模なアニメーションデータに拡張するアプローチについて再帰配置のアイデアの効果の確認と,小規模なアニメーションデータを効率的に得るための準備として,粒子発生源の再帰的配置によるシミュレーション法や,体積を持った粒子ベースシミュレーション法についてプログラム実験を行った.また,小規模なシミュレーションデータによる大規模な積雲の再帰生成アルゴリズムの開発を行い,プログラム実験によりそのアプローチの有効性を確認した.また,水流の流れのような繰り返し現象について,限定された時間でのシミュレーション結果から無限長のシームレスなアニメーションのループ素材を生成する方法について,基礎的な検討を行い,実現可能性を示すことが出来た.本年度は以下のような研究成果を得た.成果発表については,完成度に応じて,論文への投稿と国際会議での発表などを行った.(a)平面状物体の揺らぎ運動を,揺らぎ(1/fノイズ)により直接的に生成するためのアルゴリズムについて,揺らぎの使用法の改良を行い,よりリアリティを向上させた.また,炎の画像を例にとり,揺らぎとモーフーフィング技術を用いた静止画像からのアニメーション生成技術の開発を行った.ろうそくの画像については良好な結果が得られた.(b)揺らぎの利用により,低次元のシミュレーションデータをベースとして,2次元から3次元への次元上げを行い,砕波のアニメーションを生成する方法について,境界形状の複雑な岸壁などに対応できるようなアィデアを考案した.また,以下の(c)と関係するが,速度場の次元上げによる水流の効率的なアニメーション法についても開発可能性の見通しを得た:(c)小規模なシミュレーションデータによる大規模な積雲の生成アルゴリズム(空間での拡張)について,データの配置法などについて改良を行った.また,GPUによる高速レンダリング技術も開発した.再帰配置による詳細形状の生成法については,小規模シミュレーションデータから基本となるアニメーションデータを生成する段階に適用するのが効果的であるという見通しが得られた.また,水流の流れのようなほぼ同様に繰り返す現象について,速度場の生成とトレースというステップで行う方法について実験を行い,良好な見通しが得られた.(d)GPUを活用した稲妻生成やプラズマボールの表現法について,リアルタイムで実現できる手法開発を行った.また,GPUを活用した,タンクモデルによる規模の大きな水流の運動シミュレーション法の開発を行い,砕波を伴わない流れの表現には効果的であることを確認した.
新しい有機ガリウム化学を基盤とする不飽和化合物の直接カップリング反応

ガリウム元素は周期律表で13族第4周期にあり,アルミニウムの一つ下に位置している.有機ガリウム化合物は半導体製造に大量に使われているが,有機化学的にはほとんど取り上げられなかった.同族の有機アルミニウム化合物に比べて,特徴的な性質を見い出すことができなかったためである.しかし最近,我々は新しい着想によって,有機ガリウム化合物に特徴的な新反応を見い出しつつある.特に,塩化ガリウムが炭素-炭素不飽和結合を強く活性化することが分かってきた.本研究では,この新しい有機ガリウム化合物の化学を解明するとともに,オレフィン,アセチレン,芳香族化合物といった不飽和化合物を直接カップリングさせる新反応の開発を行う.塩化ガリウムを用いる芳香族β-シリルビニル化反応について,反応中間体の構造と反応性の詳細な検討を行なった.その結果,アセチレンと塩化ガリウムの錯体,アレニウムカチオン中間体,およびビニルガリウム中間体をスペクトル法によって捕捉した.この反応を共役ジイン化合物に適用すると,エンイン化が起こることがわかった.興味深いことにここで,極めて高いオルト選択性を示した.塩化ガリウムは不飽和三重結合のみでなく,アレンの二重結合を活性化することを見いだした.これを用いて,芳香族炭化水素のアルケニル化反応を開発した.有機ガリウム化合物が不飽和結合にカルボメタル化を起こすことを利用して,シリルエノールエーテルのビニル化反応を開発した.これはエノラート誘導体を直接ビニル化した始めての例である.この反応を活性メチン化合物やチオエステルのビニル化に適用した.また,フェキシガリウムが同じようにオルト位でシリルビニル化されることを見いだした.ガリウム元素は周期律表で13族第4周期にあり,アルミニウムの一つ下に位置している.有機ガリウム化合物は半導体製造に大量に使われているが,有機化学的にはほとんど取り上げられなかった.同族の有機アルミニウム化合物に比べて,特徴的な性質を見い出すことができなかったためである.しかし最近,我々は新しい着想によって,有機ガリウム化合物に特徴的な新反応を見い出しつつある.特に,塩化ガリウムが炭素-炭素不飽和結合を強く活性化することが分かってきた.本研究では,この新しい有機ガリウム化合物の化学を解明するとともに,オレフィン,アセチレン,芳香族化合物といった不飽和化合物を直接カップリングさせる新反応の開発を行う.塩化ガリウムを用いる芳香族β-シリルビニル化反応について,反応中間体の構造と反応性の詳細な検討を行なった.その結果,アセチレンと塩化ガリウムの錯体,アレニウムカチオン中間体,およびビニルガリウム中間体をスペクトル法によって捕捉した.この反応を共役ジイン化合物に適用すると,エンイン化が起こることがわかった.興味深いことにここで,極めて高いオルト選択性を示した.塩化ガリウムは不飽和三重結合のみでなく,アレンの二重結合を活性化することを見いだした.これを用いて,芳香族炭化水素のアルケニル化反応を開発した.有機ガリウム化合物が不飽和結合にカルボメタル化を起こすことを利用して,シリルエノールエーテルのビニル化反応を開発した.これはエノラート誘導体を直接ビニル化した始めての例である.この反応を活性メチン化合物やチオエステルのビニル化に適用した.また,フェキシガリウムが同じようにオルト位でシリルビニル化されることを見いだした.
遺伝子改変マウスを用いた網膜変性モデルの作製

網膜色素変性や加齢黄斑変性では視細胞が進行性に変性し、いまだ根治療法は存在しない。近年、哺乳類網膜で傷害時にグリア細胞が神経細胞を再生することが示された。このようなグリア細胞の再生能をいかした治療を開発するには、培養下で薬剤をスクリーニングできる系の開発が必須である。本研究では遺伝子改変マウスを用いて、組み換え依存的に視細胞の傷害を誘導できるモデルマウスを作成した。網膜体外培養を行ったところ、培養下でも視細胞の傷害とグリア細胞の活性化を誘導できた。培養下で刺激依存的に網膜変性とグリアの活性化を誘導できる系は例がなく、グリア細胞の再生能を誘導する薬剤を探索する上で有用なツールとして期待される。網膜色素変性や加齢黄斑変性などの網膜変性疾患で共通して認めるのが、杆体視細胞の変性である。杆体視細胞の変性に伴う病態を詳しく解析するために、さまざまなモデルマウスが作られて来たが、成体網膜で任意のタイミングで杆体視細胞の変性を誘導できるモデルは限られていた。本研究では遺伝子改変マウスを用いて、誘導型の杆体視細胞変性モデルを作成した。杆体視細胞特異的に誘導型Cre組換え酵素を発現する遺伝子組換えマウスを用いて、タモキシフェン投与依存的に杆体視細胞でジフテリア毒素の発現を誘導した。その結果、投与1ヶ月後には杆体視細胞の約半分が消失し、網膜電図でも杆体視細胞の変性に一致する所見が得られた。マウスの健康状態は著変ないことから、ジフテリア毒素の発現漏れの影響は少ないと考えられ、杆体視細胞特異的に変性を誘導できることが示された。視細胞変性のさまざまなモデルマウスで共通して認めるのが、グリア細胞の活性化である。視細胞の変性により、ミュラーグリア細胞のリアクティブな変化と、ミクログリアのアメーバ状の形態変化、および網膜下腔への侵入が起こることが分かっているが、どのようなメカニズムでグリア細胞の活性化が誘導されるのかは良く分かっていない。私たちが作製したモデルマウスでも、タモキシフェン投与1週間後に、同様のグリア細胞の活性化を認めた。タモキシフェン投与直後には組織学的な変化を認めないが、RNA-seqによる網羅的な遺伝子発現解析から、遺伝子発現レベルではすでに変化が始まっていることが分かった。これらの遺伝子の中に、グリア細胞活性化のスイッチを入れるような分子が含まれていると考えられるため、その役割の解明が今後の課題である。以上から、本研究で作成した新規モデルマウスは、杆体視細胞変性による網膜グリア細胞の応答を解析する上で、有用なツールになると考えられた。網膜は中枢神経系の一部であり、一度傷害を受けると再生しないと考えられてきた。近年、哺乳類網膜において傷害時にグリア細胞が脱分化し、神経細胞を生み出すことが分かって来た。しかし、網膜傷害時にグリア細胞の脱分化応答を引き起こすメカニズムはよく分かっていない。網膜傷害時のグリア細胞の応答を理解するために、成体網膜で杆体視細胞特異的に傷害を引き起こすマウスモデルは有用なツールとなる。薬剤の投与や光照射による網膜傷害のマウスモデルについては報告が多いが、遺伝子組換えマウスを用いて、成体で杆体視細胞特異的に変性を誘導した報告はない。RNA結合タンパク質、Msi1は成体で杆体視細胞に発現することが知られている。我々はこのMsi1遺伝子座に、誘導型Cre組換え酵素(CreERT2)をノックインしたマウスを作成した(Msi1-CreERT2)。Msi1-CreERT2マウスにタモキシフェンを投与することでCreERT2が核内に移行し、杆体視細胞特異的にCreによる組み替えを誘導することができる。Rosa26遺伝子座は、マウス全身で発現を引き起こす遺伝子座として知られており、この遺伝子座にLox-Stop-Loxカセットとジフテリア毒素(DTA)がノックインされたマウス(R26-LSL-DTA)は、Creの組み換えにより、Cre発現細胞特異的に細胞死を誘導するツールとして広く使われている。このR26-LSL-DTAマウスとMsi1-CreERT2マウスを掛け合わせて、タモキシフェンを投与することで、杆体視細胞の細胞死を誘導し、誘導型の網膜変性モデルマウスを作成する。Msi1-CreERT2マウスにより、網膜の杆体視細胞でCreによる組み替えが起きることを確認するために、Rosa26遺伝子座にLox-Stop-LoxカセットとGFPがノックインされたR26-LSL-GFPマウスと、Msi1-CreERT2マウスを掛け合わせた。

このマウスに用量を変えてタモキシフェンを投与した(2mg、6mg、18mg)。投与量を増やすのに応じて、GFPを発現する杆体視細胞の割合が増加することが免疫組織染色とフローサイトメーターにより確認できた。このことから、Msi1-CreERT2マウスにおいてCreERT2が杆体視細胞に発現していることが示された。次に、杆体視細胞の変性を誘導するために、R26-LSL-DTAマウスをJackson Laboratoryから購入し、体外受精・胚移植により動物施設に搬入した。R26-LSL-DTAマウスとMsi1-CreERT2マウスを掛け合わせてタモキシフェンを投与したところ、投与後から少なくとも2ヶ月間は、マウスは顕著な異常を示さずに生存した。ジフテリア毒素(DTA)はタンパク合成を阻害するため、Cre組換え酵素の発現漏れは致死的な副作用を引き起こしうるが、Msi1-CreERT2マウスにおいて、生存に不可欠な臓器においてCre組換え酵素の発現漏れはないと考えられた。このマウスの網膜をタモキシフェン投与後1ヶ月に解析したところ、杆体視細胞が大部分を占める外顆粒層の縮小に加え、ミューラーグリア細胞においてGFAPの発現増強などリアクティブな所見が認められた。これらから、Msi1-CreERT2:R26-LSL-DTAマウスにおいて、タモキシフェンの投与により杆体視細胞の細胞死とグリア細胞の反応性変化を誘導できることが明らかになった。作成したモデルマウス(Msi1-CreERT2:R26-LSL-DTA)を用いて、網膜変性時に起きる変化を組織学的、機能的、細胞生物学的、分子生物学的に解析する。Msi1-CreERT2; R26-LSL-DTAマウスにタモキシフェンを投与することで、杆体視細胞の減少とミューラーグリア細胞の反応性変化を認めたが、これらの変化がどのような時間経過で起きるのかを調べるために、タモキシフェン投与後に経時的に組織解析・免疫染色を行う。さらに、これらの組織学的な変化が機能的なレベルにおいても影響を及ぼすかを調べるために、網膜電図(ERG)を行って、暗順応下で杆体視細胞・双極細胞の応答、また明順応下で錐体視細胞・双極細胞の応答を解析する。次に、グリア細胞の反応性変化について細胞生物学的、および分子生物学的な解析を行う。タモキシフェン投与後にグリア細胞のリアクティブな変化が開始する時期を特定し、その時期の網膜細胞を解離して増殖因子存在下で培養し、ニューロスフィアを形成する幹細胞の存在の有無を調べる。また、グリア細胞がリアクティブになる時期の網膜からtotal RNAを抽出してマイクロアレイを行うことで、傷害を受けた杆体視細胞が発現する遺伝子や、グリア細胞が活性化する際に発現が増強する遺伝子を網羅的に同定する。これらのデータから傷害時に杆体視細胞がミューラーグリア細胞に送るシグナルの候補遺伝子を絞り込む。これらの候補遺伝子について、発現量の変化を定量的PCRで確認し、in situ hybridizationで発現の局在を調べる。そして、これらの分子が本当にグリア細胞の応答を引き起こすかを実証するために、マウスのin vivoエレクトロポレーションのシステムを用いて候補遺伝子の遺伝子導入を行い、組織学的にグリア細胞の応答を解析する。1.マウスの実験に必要な費用(遺伝子組換えマウス系統の維持費、タモキシフェン投与に関連する試薬、ERGの測定に必要な試薬、エレクトロポレーション用のICRマウスの購入費)。
粥状動脈硬化症病変の発症進展をもたらす血流の作用の数値流体力学的研究

我々は、これまで、多点電気化学的ずり応力測定法を開発使用してきたが、本年度は、これによって得られた測定結果と、文部省科学研究費補助金(一般C)の援助をうけて行った数値流体力学シミュレ-ションによる流れの直接計算の予備的な結果とを比較した。本年度の研究においては、三次元非定常の条件下の血流の数値流体力学シミュレ-ションを広範な生理的パラメタに対して実行し、動脈疾患がもたらす血流異常の三次元的構造を詳しく検討し、病変の発症、進展様式、さらにはその予防、治療における流体力学的な問題点を明らかにし、病理所見、あるいは細胞生物学的所見と対比することを試みた。検討した項目は次の通りである。1.冠動脈等に発生する粥状硬化初期病変を忠実に模したものとして、流路の直径の1/2、1/4、1/20など数種類の高さを持ち、滑らかでかつ偏側性の発育を示す初期粥状動脈硬化斑(血管壁の一部膨隆)の数値計算モデルを開発した。2.定常(入口流れ、完全発達流れ)および、非定常流れ(正弦波様の流速変動波形、血流を模した流速波形など)の場合の、上記のモデルにおける、壁ずり応力、局所圧力、壁ひずみなどの空間的分布の推定を行い従来得られている病理所見、あるいは細胞生物学的所見と対比した。[結論]以上の結果、数値流体力学シミュレ-ションは、生理流体力学、および、粥状動脈硬化症と血流の関連の病態生理学的研究に極めて有力な手段となることを見出した。本年度の研究においては三次元非定常の条件下の血流の数値流体力学シミュレ-ションを広範な生理的パラメタに対して実行し、動脈疾患がもたらす血流異常の三次元的構造を詳しく検討し、病変の発症、進展様式、さらにはその予防、治療における流体力学的な問題点を明かにし、病理所見、あるいは細胞生物学的所見と対比することを試みた。
膜受容体・エフェクタータンパク質を構成した人工細胞システムによるシグナル伝達解析

細胞のGPCRシグナル伝達経路要素を人工2分子膜ベシクル(巨大リポソーム)膜に再構成しベシクルレベルで伝達機能の発現を見ようとした。私たちの報告した組換えバキュロウイルス出芽粒子とリポソームの膜融合を用いて、また、GUV膜への組込の顕微観察により、組換え受容体、エフェクターや下流タンパク質など、個別要素の導入は確認された。経路の完成は困難だったが、本課題の前進に有用な、界面通過法GUV利用の検討、培養法と組換えウイルス粒子の性状、に関する知見を得た。本研究では、細胞のシグナル伝達経路を、その構成要素を、人工脂質2分子膜ベシクル(巨大リポソーム)の膜界面に再構成することによって、少数ながら個別の要素の統合により伝達機能の発現を行おうとしている。とくに、ホルモン等の細胞外からのシグナル分子の受容に始まる膜受容体経路とその下流に在って活性化されるエフェクター、そして、情報の流れを感知する仕組みを同時に組み入れた、人工細胞システムに見立てたリポソームを作製することを目標とした。このため、Gタンパク質共役受容体(GPCR)の経路をモデルに、機能に必要な要素のセット(Gタンパク質、アデニル酸シクラーゼAC)とシグナルに応答するセンサー(cAMPにより活性化する酵素PKAあるいはチャネルCNG)とを組込むことに取り組んだ。組込みには、私たちの開発手法(要素の遺伝子を組み換え田バキュロウイルス出芽粒子(BV)が目的の膜タンパク質を提示することと、弱酸性により活性化される融合誘起タンパク質GP64が人工膜とBVとの膜融合を引き起すこととを利用したプロテオリポソーム調製法)を用いた。既に幾つかの組込み例を得ており、今年度は、界面通過法(張合せ法、droplet-transfer法)または静置水和法で調製した巨大リポソームを使って解析した。蛍光染色BVをリポソームと種々のpH条件(4-6)で混和し融合曲線を描いた。また、GPCR経路の膜上の終端、ACの再構成をし、プロテオリポソームによる活性検出を行った。即ち、ACのC末端にfolding reporterにもなる蛍光タンパク質タグを融合し提示したBVが調製されていることを、ウエスタンブロットにより確認し、融合後の巨大リポソーム膜上に取り込まれたことを確認した。基質(ATP)封入AC再構成リポソームをフォルスコリンで活性化し、特異的なcAMP産生を競合ELISAにより検出した。細胞シグナル伝達経路の構成要素を脂質2分子膜ベシクル(巨大リポソーム、GUV)の膜に再構成して、少数ながら個別の要素の統合で伝達機能の発現を行おうとしている。ホルモン等の外部刺激分子の受容に始まる膜受容体経路とその下流で活性化されるエフェクター、そして、情報の流れを感知する仕組みを組み入れたシステムとなるリポソームを作製することを狙っている。本研究では、私たちが開発してきた組換えバキュロウイルスの出芽ウイルス(BV)粒子とGUVとの膜融合を用いる。昨年度までに、エフェクタータンパク質(アデニル酸シクラーゼAC)のリポソーム膜への組込みと活性確認を行った。今年度は、(1)環状ヌクレオチド感受性イオンチャネル(CNG)組換えBVの多重感染効率と発現確認、(2)Gタンパク質共役受容体(GPCR)組換えBVの性状解析、を行った。(1)内水相中、ACによるcAMP産生を、CNGを介した陽イオン流で検出するには4量体(3遺伝子産物)形成が必要となる。CNGA2, CNGA4, CNGB1にRFP, GFP, BFPを融合し、感染・発現を共焦点顕微鏡で解析した。単感染効率はほぼ同じで、3重感染効率は各効率を乗じた値に近しかった。即ちBVについて、全因子が揃い機能するチャネルが搭載されることは少なく、構成因子の欠けたそれも存在することを意味する。個別調製したBVを、リポソーム膜に融合しその場で会合させる経路の検討が重要となる、と示唆された。(2)プロテオリポソーム調製の成否に重要であるため、膜タンパク質を提示するBVに関する他グループの先行研究を参考に、宿主細胞培養条件と得られるBVの性状との関係を、再度検討した。CRHR1, ADRB2等のGPCRについてリガンド結合の確認、形態観察等を行い報告した。本研究では、細胞シグナル伝達経路の構成要素を脂質2分子膜ベシクル(巨大リポソーム、GUV)の膜に再構成して、少数ながら個別の要素の統合で伝達機能の発現を行おうとしている。過去2年間の実績で、GPCR経路のエフェクタータンパク質であるアデニル酸シクラーゼをGUVに組み込むことに成功した。単独のGUVのアッセイには未だ達成できていないが、集団の反応は捉えられたと思われる。それらを踏まえて、H27年度の実績をさらに進め、組換え膜タンパク質を提示する組換えバキュロウイルス粒子とリポソームとの膜融合による人工細胞システム構成技術の研究を進めた。前年度は、環状ヌクレオチド感受性イオンチャネル(CNG)のサブユニットの細胞発現を調べ細胞の三重感染効率の低さを認めたが、高々3種類の膜タンパク質を含む混合のウイルス懸濁液として用いることで、今年度は張合せ法により調製したリポソーム膜への組込を行った。現在機能の発現に向けて実験の改良を行っている。インテグリン(ITG)の組込については、比較的効率よくα、βの2量体の組込に成功しており、目下、機能発現検討を試みている。

また、プロテオリポソーム調製の成否に重要である、膜タンパク質を提示するBV粒子の性状について、前年度、宿主細胞培養条件が影響していることを見出していた。GPCRであるアドレナリンβ2受容体を発現するBV粒子について、構成するタンパク質の解析や、透過電顕の観察により、ウイルス感染前の宿主培養方法(静置、振盪)に、組換えタンパク質の安定性、発現量や、粒子形態が強く相関していることが確かめられ論文発表した。膜融合実験、リガンド結合実験など、目的に応じて、性状の異なる、BV調製法を用いる重要性も認識でき、今後の研究推進に大いに役立つ。細胞のGPCRシグナル伝達経路要素を人工2分子膜ベシクル(巨大リポソーム)膜に再構成しベシクルレベルで伝達機能の発現を見ようとした。私たちの報告した組換えバキュロウイルス出芽粒子とリポソームの膜融合を用いて、また、GUV膜への組込の顕微観察により、組換え受容体、エフェクターや下流タンパク質など、個別要素の導入は確認された。経路の完成は困難だったが、本課題の前進に有用な、界面通過法GUV利用の検討、培養法と組換えウイルス粒子の性状、に関する知見を得た。昨年度に引き続き、GUVベースの人工細胞システム構築・改良のため、GPCRモデル経路の再構成と感知システムの構築を目標に置いた。なお、GPCR経路の要素(GPCR、3量体Gタンパク質、アデニル酸シクラーゼ)の、蛍光タンパク質やタグ等を融合させた遺伝子を組込んだBV粒子は準備済みであり、GUVとの膜融合による組換えタンパク質の移行等も確認している。GUV内水相においてACによるcAMP産生を捉えるシグナル感知タンパクとしてねらいをつけた環状ヌクレオチド感受性陽イオンチャネル(CNG)の組換えBVの準備を再検討し、適当に選択したサブユニット(A2, A4, B1)へ染分けのための蛍光タグ等を融合した。組換えBV上のCNGは多量体となるため、多重感染が重要であるが、前記操作で感染の程度が調べられる。3つのサブユニットの組換えBVを、種々の組合せで昆虫細胞に感染させ調べた。その結果、単感染効率を乗じた低い効率となることが分かり、寧ろGUVへの融合による再構成には単感染BVを其々用いる方法が有効となろうと示唆された。またGPCRとしてはCRHR1、ADRB2を選んでいる。膜タンパク質提示BVに関する他グループの先行研究を参考に、リポソーム融合により適したBVを調製する条件を再検討した。感染前の宿主細胞培養条件、感染後の条件、それらと得られたBVの形態等とが関連することが、電子顕微鏡観察等から分かった。シグナル伝達系のバリエーションを増やすため、細胞外基質受容体のインテグリン(ITG)についても組換えBVの作出ならびに膜融合によるプロテオGUVの調製を進めていった。今年度は、昨年度の達成内容をさらに進展していく過程で課題点となった問題を主に2点、取り組むことになった。新しい知見であるが、当初予定していなかった点でもあり、やや進展に遅れを見たところもあった。分子生物工学最終年度の今年度は、前年度までの結果を踏まえ、人工細胞システムへGPCR経路の再構成と感知システムの構築が確実となるよう、関係する方法の改良等を進める。
遺伝子破壊による葉緑体遺伝子の機能解析

タバコ葉緑体ゲノムにコードされるclpPは、ATP依存型プロテアーゼClpの活性サブユニットをコードする。clpPは生存に必須な遺伝子で、完全な遺伝子破壊による機能解析は困難であった。これまでに、葉緑体移行シグナルを繋いだclpPを35Sプロモーターで発現させるコンストラクトを核ゲノムに導入したラインを得ている。35SプロモーターによるclpPの大量発現は、いかなる表現型ももたらさなかった。そこでこれらのラインに対し葉緑体形質転換を行い、葉緑体clpPの破壊を行った。これらのラインでは、葉緑体clpPの機能が核ゲノムに導入した遺伝子で相補され、完全な遺伝子破壊が可能であった。しかしその相補は不完全であり、完全破壊株は、斑入り、葉の構造の著しい異常といった強い表現型を示した。また葉の白い部分では、柵状組織の分化が阻害されており、葉緑体と葉の組織分化がともに強く影響を受けていることが明らかになった。これらの表現型は、スペクチノマイシンを除いても安定で、不完全な破壊株での抗生物質の表現型への影響という懸念されていた問題が解決した。35SプロモータによるclpPの強制発現に関わらず、葉緑体clpPの機能が完全に相補されなかった理由として、ClpPが細胞質で翻訳を受けることによるシャペロンの欠損等の質的問題、35Sプロモーターと葉緑体clpPプロモータの差による発現組織、発現量の違いの問題が考えられる。生化学的手法により葉緑体内のプロテアーゼ複合体の量を評価する必要がある。完全破壊株はメリステムそのものにも異常を示すため、シュートの成長が頻繁に停止し、多数の側芽を生じるブッシュ状の植物になる。非常に稀に花芽がつくことがわかり、野生型花粉をかけることによって、次世代で、核遺伝子も落ちた真の完全破壊株の表現型が見られる可能性が出てきた。
ポリフェノール・銀ナノ粒子複合体を応用した口腔バイオフィルム形成制御技術の開発

口腔バイオフィルムの形成を制御する手段の一つとして、ポリフェノール・銀ナノ粒子複合体、とくにCurcumin(CCM)と銀ナノ粒子(SNP)の複合体(以下、CCM-SNP)の口腔細菌に対する抗菌効果およびバイオフィルム形成抑制効果を解析してきた。本年度は、Epigallocatechin Gallate(EGCG)とSNPの複合体(以下、EGCG-SNP)を調製し、その諸効果をBiofilm formation assayおよび形態学的解析にて行った。Biofilm formation assayから、種々のEGCG-SNP濃度でS.mutansの発育が阻害されることが確認され本複合体の抗菌効果が示唆されたが、その効果はCCM-SNPに比較して弱い傾向を示した。また、形態学的解析からバイオフィルム形成量は対照群(EGCG-SNP無添加)に比べ少なかったものの、その効果はBiofilm formation assayの結果と同様、CCM-SNPに比して弱い傾向を示した。一方、アパタイト試片を用いてCCM-SNPおよびEGCG-SNPの作用時期の違いによるバイオフィルムの形成状態の変化を形態学的に解析した。いずれの複合体においても、予め試片に複合体を作用させた場合において、被検細菌と同時に添加した場合より試片に接して存在する細菌数や菌体外多糖の形成量が少ない傾向を示し、また対照群(複合体無添加)と比較して少ない傾向を示したことから、これら複合体のバイオフィルム形成に対する抑制効果に加え、付着抑制効果の可能性が示された。口腔バイオフィルムがう蝕や歯周病の発症要因となるだけでなく、誤嚥性肺炎など死に至る疾患の原因にもなりうることが近年認識されつつある。ゆえに、口腔バイオフィルムの形成を制御する技術はこれら疾患の発症予防や進行抑制に大きく寄与すると考えられる。本研究ではナノサイズの銀粒子にポリフェノールを担持させた複合体に着目し、本年度はポリフェノールの一種であるクルクミンを担持した銀ナノ粒子複合体(以下、CCM-SNP)の口腔細菌に対する抗菌効果およびバイオフィルム形成抑制効果を検証した。すなわち、硝酸銀溶液にクルクミンを添加し37°Cで激しく撹拌混合後、遠心、沈渣の洗浄および凍結乾燥処理を行うことでCCM-SNPの粉末を得た。これをジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し種々の濃度に調製した上で、Streptococcus mutans UA159株を被検菌株として最小発育阻止濃度(MIC)および最小殺菌濃度(MBC)を測定した。また、同菌によるバイオフィルム形成に対する抑制効果をBiofilm formation assayにて解析した。その結果、種々のCCM-SNP濃度でS.mutansの発育を阻害、あるいは殺滅せしめることを確認し、本複合体の抗菌効果が示された。またバイオフィルム形成抑制効果も確認することができ、本複合体のう蝕予防など歯科臨床への応用の可能性が示された。次年度は、CCM-SNPの存在下で形成させたバイオフィルム中の細菌から抽出したmRNAを出発材料として、バイオフィルム形成関連遺伝子(gtfB/C/D geneなど)の発現変化を解析するとともに、う蝕誘発モデルに本複合体を適用した場合の歯質表面のバイオフィルムおよび歯質表層の構造変化を超微細形態学的に解析する予定である。本年度の研究の出発点であるポリフェノール・銀ナノ粒子複合体の合成に時間を要したものの、複合体の抗菌効果やバイオフィルム形成抑制効果については概ね想定した結果を得ることができ、次年度に計画している更なる検証にほぼ予定通り着手できる目処がついたため。口腔バイオフィルムの形成制御技術の一つとして、ポリフェノール・銀ナノ粒子複合体(以下、CCM-SNP)の口腔細菌に対する抗菌効果とバイオフィルム形成抑制効果を検討し、う蝕原性細菌の一種であるS. mutansに対して発育阻害あるいは高濃度での殺菌効果を示した。本年度は、う蝕関連細菌であるLactobacillus casseiに加え、歯周病原性細菌の一種であるPorphyromonas gingivalisに対する同様の効果を、最小発育阻止濃度(MIC)と最小殺菌濃度(MBC)で評価するとともに、Biofilm formation assayおよび同assayで形成させたバイオフィルムの超微構造を走査型電子顕微鏡にて観察した。さらに、同様に形成させたバイオフィルムをエポキシレジンに包埋し、そこから作製した超薄切片に菌体内外多糖特異的電子染色(過沃素酸-チオカルボヒドラジド-蛋白銀染色)を施し、透過型電子顕微鏡を用いて観察した。その結果、種々のCCM-SNP濃度でL. caseiおよびP. gingivalisともに、発育が阻害あるいは殺滅されることを確認し、本複合体の抗菌効果が示されたが、その効果はS. mutansに対してよりも弱かった。一方、バイオフィルム形成抑制効果はS. mutansと同様に確認することができ、MICの半量のCCM-SNPを添加した液体培地(Sucrose加)で形成されたL. caseiおよびP. gingivalis両菌種のバイオフィルムを走査型および透過型電子顕微鏡で観察したところ、CCM-SNP無添加の培地で形成させたバイオフィルム(対照群)よりも、菌体外多糖だけでなく菌体内多糖においても産生量が減じていることが観察された。ポリフェノール・銀ナノ粒子複合体の合成方法や最小発育阻止濃度(MIC)や最小殺菌濃度(MBC)の評価方法、ならびにBiofilm formation assayや超微細形態学的観察など各種の解析方法について、ほぼ安定した技術を獲得しており、概ね本年度の研究計画に沿って想定した結果を得ることが可能となった。