hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
TNF-αノックアウトCTLを用いた肝炎ウイルス排除機構の研究

最も強力なin vivoの免疫方法と考えられているplasmid immunizationを用いても、一回法では全く誘導できず、さらに強力な脾臓内に免疫する方法でも誘導できなかった。Plasmid immunizationを2回繰り返すことにより、特異的障害活性が約10%のCTL lineを誘導できたが、in vitroでは2週目には細胞障害活性は消失した。この免疫法で得られた脾細胞にwild type mouseの脾細胞をMMC処理して加えた場合、細胞障害活性は3週間維持できた(a)。aで得られたCTL lineから限界希釈法でクローニングしたところ、HBV特異的障害活性を有するクローンが得られた。3)1-aで得られたCTL lineはTNF-αを添加することで、より増殖したが、wild typeのCTLは同濃度のTNF-α添加によって増殖能は著しく低下した。以上の結果より、HBV特異的CTLのprecursor cellはTNF-αknockout mouseにも存在するが、そのin vivoでの分化にはTNF-αが極めて重要な因子であることが明らかとなった。また、実験3の結果からは、mature CTLであっても、適度な濃度のTNF-αが存在しないと増殖はできないことが判明した。TNF-αはHBV特異的CTLの分化・増殖の両者に必須の因子であることが明らかとなったが、今後は長期的に維持可能なTNF-αknockout CTLクローンの樹立に着手したい。近年の研究からTNF-αは、細胞障害やウイルス排除機構に深く関わっているだけでなく、細胞の分化・増殖にも影響していることがわかってきた。このため、肝細胞の破壊やウイルス排除において中心的役割を担っているCTLの増殖に対するTNF-αの影響を検討する必要がある。我々の検討では、TNF wild type(WT)マウスでHBV特異的CTLを誘導できる免疫法では、TNF-αknockout(KO)マウスからは極めて低いCTL活性を示すlineしか誘導できなかった。また、免疫したTNF-αKOの脾細胞に含まれる、HBV特異的CD8陽性細胞のflequencyは低かった。In vitroの培養系においても、TNF-αWT CTL lineは増殖も良好で、細胞障害活性も極めて高く維持されるのに比して、TNF-αKO CTL lineは増殖能が低く、細胞障害活性も低値のまま推移した。これらのデータから、in vivoおよびin vitroにおけるウイルス特異的CTLの誘導には、TNF-αの存在は極めて重要であると考えられる。しかしながら、TNF-αKO CTL lineを限界希釈法でクローニングしたところ、高い細胞障害活性を有するTNF-αKO CTL cloneが存在することが判明した。すなわちTNF-αKOマウスにおいても、HBV特異的CTLは分化することはできることを意味している。この事実から、TNF-αはCTLの分化ではなく、増殖に深く関与していることが考えられた。筆者らが樹立した、極めて高い増殖能と細胞障害活性を有するHBV
公会計分野に適用可能なテキスト分析及び実験研究の探求

本研究の主題は、計算社会科学の観点から、公会計分野に適用可能なテキスト分析及び実験研究を探求することである。近年、計算社会科学の分野でテキストデータの分析やオンライン実験が行なわれ始めているが、会計学の分野では未だ少数に留まっている。そこで、本研究では、どのような会計情報のディスクロージャーが会計情報利用者にとって読みやすく理解可能性が高いかという論点について、文字情報のテキスト分析と、読みやすさのオンライン実験によって効果を検証する。企業会計の分野では読みやすさの実験が行なわれはじめているが、公会計の分野では世界的にも未だ実施されておらず、世界に向けた研究の発信が期待できる。
スピングラスにおける階層的緩和機構の研究

スピングラスの転移温度T_c以上の'グリフィス相'での短距離秩序やT_c以下のスピングラス相での長距離秩序は階層的に構成されている。本研究は、そのような秩序に伴う固有な階層的緩和機構を、主にモンテカルロ法の数値シミュレーションで解明する研究を進め、以下の成果を得た。まず、T_c以上での緩和について3次元イジングスピングラス(EA)模型の'グリフィス相'における特異な緩和現象を、相関関数から緩和時間分布を評価する最大エントロピー法を用いて詳しく調べ、臨界緩和とクラスター緩和の二つの機構が絡み合って働いていることを高い精度で検証した。スピングラスを高温からT_c以下のある温度Tに急冷すると、その温度Tの平衡状態に達するまでにきわめて長い時間を要する。エイジング現象とよばれるこの現象を有限サイズのSK模型について解析した結果、多数の準安定状態が存在する位相空間において、系が高いエネルギーの準安定状態から熱活性化過程で順次より低いエネルギーの準安定状態へ、それぞれの時間スケールに対応した位相空間のある限られた領域で準平衡を保ちながら緩和していく機構を明らかにし、これを"Growth of Quasi-Equilibrium Domains"のシナリオとして提起した。また、3次元ガウス型EA模型におけるエイジング現象に関して、急冷後のエネルギー緩和やクローン相関関数の解析から、実空間における温度Tの平衡ドメインが時間に対してべき乗則に従って成長することを検証した。さらに、関連する問題として、SK模型のリエントラント転移に伴う非線形磁化率の異常、サイトランダム模型における転移、および、神経回路網に対するHopfield模型のTAP自由エネルギーなどに関して新しい知見が得られた。昨年度から引き続いて、3次元±Jイジングスピングラス模型の転移温度T_c以上の`グリフィス相'における緩和現象をモンテカルロ・シミュレーションによって詳しく調べた。相関関数から緩和時間分布を評価する方法として新たに最大エントロピー法を採用し、これまで我々がその存在を主張してきた、同相における臨界緩和とクラスター緩和の機構をより高い精度で検証した。スピングラスをT_cの高温側からT_c以下のある温度Tに急冷すると、その温度Tの平衡状態に達するまでにきわめて長い時間を要する。エイジング現象とよばれるこの現象は、スピングラスにみられる最も典型的な階層的緩和現象である。本年度,スピングラスSK模型における同現象について、モンテカルロ・シミュレーションを用いて詳しく解析した。その結果、多数の準安定状態が存在する位相空間において、系が高いエネルギーの準安定状態から熱活性化過程で順次より低いエネルギーの準安定状態へ、それぞれの時間スケールで位相空間の限られた領域で準平衡を保ちながら緩和していく機構を明らかにし、これを“Growth of Quasi-Equilibrium Domains"のシナリオとして提起するに到った。関連するスピングラス問題として、リエントランス転移に伴われる非線形磁化率の特徴的な振る舞いをスピングラス平均場理論に基づいて明らかにし、また、3次元立方格子上の、二つの磁性原子からなるサイトランダム模型おいては、対応する±Jボンドランダム模型と異なり、二つの原子の濃度がちょうど等しい場合を除いてスピングラス相が出現しないことを交換モンテカルロ法を用いた数値解析で明らかにした。スピングラスを転移温度T_cの高温側からT_c以下のある温度Tに急冷すると、温度Tの平衡状態に達するまでにきわめて長い時間を要する。エイジング現象をよばれるこの現象は、スピングラスにみられる最も典型的な階層的緩和現象である。昨年度から引き続いて、有限サイズのSK模型における同現象について、モンテカルロ・シュミレーションを用いて詳しく解析し、我々が提案したエイジング現象のシナリオ、“Growth of Quasi-Equilibrium Domains(GQED)",を支持する結果をいくつか得た。特に、急冷後の待ち時間t_wたってから微小磁場をかけ、その後の時刻τにおける系の応答(磁化率)とスピン自己相関関数の関連を調べ、τ【less than or similar】t_wの時間領域で成立していた揺動散逸定理が、τ【greater than or similar】

t_wの時間領域では破れ、さらにτを大きくしていくと磁化率が平衡状態におけるパリジ磁化率に漸近していくことを明らかにした。この結果は、GQEDシナリオでよく説明される。今後、有限サイズのSK模型のエイジング現象に関する以上の結果が、系のサイズを大きくしていったとき、熱力学的極限の系における同現象にどのように漸近するかを調べたい。3次元ガウス型イジングスピングラス(EA)模型におけるエイジング現象に関する解析も行った。上記SK模型のGQEDシナリオのドメインはスピンの配置空間におけるものであるのに対して、この系のエイジング現象については、実空間における温度Tの平衡ドメインが成長するという見方が有力である。急冷後のエネルギー緩和は系のサイズと時間の関数で表されるが、その関数に伴われるスケール則を新たに見出し、急冷後の時間に対してべき乗則に従う平衡ドメインの成長則が導かれた。その結果は、スピングラス磁化率の時間発展から既に得られている成長則と一致している。
癌転移におけるαvβ3インテグリン・結合分子オステオポンチンの機能解析

本年度においては癌細胞において発現し、その転移性との関連が推測されている細胞接着分子、オステオポンチンについて、癌細胞転移におけるこの分子のホスト側についての役割を検討した。癌細胞としては、マウスの悪性黒色種B16をもちいた。まず、この細胞の接着性のオステオポンチン依存性を、インビトロにおいて明らかにした。この上で、B16細胞を左心室内より注入することにより、実験的な転移モデルを作成して、オステオポンチンノックアウトマウスと野生型マウスについての転移の効率を検討した。動脈内注入モデルでは以前の報告通り野生型マウスに骨に対して転移巣(11.5+/-2.5,n=18)が観察された。これに対してオステオポンチンノックアウトマウスにおいては骨で約50%(5.4+/-1.7,n=19,p<0.05)の有意な転移効率の低下が見られた。副腎でも野生型マウスに対してオステオポンチンノックアウトマウスにおいては有意な転移効率の低下(17.8+/-5.5,n=18対6.5+/-2.8,n=19,p=0.0514)が観察された。静脈内注入モデルで野生型マウスで肺に対して多数の転移巣(126.7+/-42.1,n=11)が観察された。これに対してオステオポンチンノックアウトマウスにおいては約3分の1(37.8+/-11.4,n=17,p<0.05)の有意な転移効率の低下が見られた。本研究の結果、ホスト側のオステオポンチンの存在は、B16悪性黒色腫の転移を促進する活性を持つことが明らかとなった。
創傷感染メカニズムの解明による新たな看護ケア方法の確立

本研究は高齢者で特に問題となる褥瘡の感染を適切に予防・管理する新しい方策を構築することを目的に、褥瘡感染発症メカニズム解明のための基礎的検討を行った。緑膿菌のクオラムセンシングシグナルであるアシルホモセリンラクトンを線維芽細胞に曝露させた際の細胞応答を検証したところ、Matrix metalloproteinase (Mmp-9)の遺伝子発現が上昇していることが明らかとなった。特にこれらはAP-1/ERK/p38シグナリングパスウェイによって制御されていることを直接的に証明した。また、AHLにより特異的に上昇する遺伝子群をDNAマイクロアレイ解析にて特定した。本研究により、創傷感染のメカニズムに、AHLによる線維芽細胞のMmp-9発現誘導が関与していることが明らかとなった。褥瘡細菌感染は重篤な合併症であるが、消毒や抗生剤など、細菌を死滅させる侵襲的な対応ではほとんど効果がない。「細菌の死滅に依らない感染制御」の確立を目的に、クオラムセンシングという細菌の遺伝子調節機構に着目して、研究を計画した。緑膿菌クオラムセンシングシグナルであるアシル化ホモセリンラクトン(AHL)は哺乳細胞の遺伝子発現を変化させることが報告されており、それが創傷感染の一部を担っている可能性がある。平成23年度はラット線維芽細胞株(Rat-1)に対して、緑膿菌AHL(3-oxo-C12)を作用させた際の遺伝子発現の変化をreal-time RT-PCRにて経時的に解析し、各種阻害剤を用いてシグナル伝達経路を明らかにした。その結果、AP-1パスウェイを介して、組織障害の原因となるMatrix Metalloproteinaseの遺伝子発現を亢進させることが明らかになった。平成24年度にはその詳細なメカニズムを解明すべく、より広範にAHLの濃度を変化させ、10μMを境に遺伝子発現および細胞形態がDrasticに変化することを見出した。そこで、1μMと10μMの濃度のAHLへの反応の違いがどのようにもたらされるかを明らかにすることがAHLの作用メカニズムの解明につながると考え、両濃度に曝露させた細胞よりRNAを抽出し、DNAマイクロアレイに供した。その結果、798遺伝子が10μMのみで上昇していることが明らかになり、Wikipathwayを用いたパスウェイ解析より、いくつかのGタンパク質共役受容体の候補が見いだされた。今後得られた情報を参考に受容体探索を行い、AHLによりもたらされる過剰な炎症を制御する技術を開発する基盤を構築する予定である。ラット線維芽細胞株(Rat-1)に対して、緑膿菌AHL(3-oxo-C12)を作用させ、各種MMPの遺伝子発現をreal-time RT-PCRにて経時的に解析した。また、その作用メカニズムを検討するため、種々のシグナル伝達経路阻害剤で前処理した後、AHL処理を行い、遺伝子レベル、蛋白質レベルにて検討を行った。Mmp遺伝子発現の解析の結果、Mmp3、7、9、13において著明に発現が増加していた。また、それらの発現制御に共通に関わるシグナル伝達経路に着目し解析を行ったところ、AP-1サブユニットであるc-fosおよびc-junにおいて発現が上昇していた。また、c-Fosが活性化し、核内移行が生じていた。各種シグナル伝達経路を検討した結果、ERK、p38およびAP-1阻害により、Mmpの遺伝子発現およびc-Fosの核内移行が抑制された。さらにラットMmp9のプロモーター領域をクローニングし、プロモーター活性を検討したところ、Wild typeではAHL処理により活性が上昇したが、AP-1結合サイトを欠損させると活性上昇は抑制された。以上より、AHLはラット線維芽細胞において、AP-1/ERK/p38を介してMmpの遺伝子発現を上昇させていることが強く示唆され、AHLによる炎症誘導メカニズムの一端が明らかになった。ラット線維芽細胞株を用いて、緑膿菌AHLによるMmp発現制御機構の一端を解明し得た事により、AHLが哺乳細胞へ直接的作用を及ぼしている証拠を改めて確認し、その制御機構を考察するための十分なデータを取得し得たため、概ね順調に経過していると判断した。

初年度に得られた結果を基に、緑膿菌AHLによって引き起こされる過剰な炎症反応を抑制する手法を考案し、当研究室の保有しているラット創傷感染モデルを使用してその効果を検証する。また、直接的な抑制方策を追求するため、AHLによるMMP発現誘導機構のうち、より上位のメカニズムを解明するin vitro実験も合わせて行う。初年度においてシグナル伝達経路を検討するために利用した系では十分に明らかにすることが出来なかったより上位のメカニズムを検討するために、AHLの濃度条件を段階的に調整し、DNAマイクロアレイにて網羅的に遺伝子発現の挙動を比較することで、特定の濃度で上昇するMmpの遺伝子発現に特異的な調整システムを探索する。このための実験費用が必要となる。
地元高校生を中心とした若者地縁組織による地域振興と災害時貢献についての研究

本研究は大規模災害発生時から復興に至るまでを、地域のコミュニケーション力を活用して問題解決していくシステムの構築を目的とした。方法としては地域の次世代育成の観点から、地縁のある小中学生をまとめ、地域や商店街と協同し、大学や行政とも連携しやすい位置にある地元高校の生徒を組織の中心とした。高校生に地域の特性を学ばせ、地域人脈との接点を作り、具体的な地域振興策を提案させることにより、地元への愛着心を育てる。これにより小中学生から地域の高齢者さらには外国人を含めた組織が作られ、平常時は地域振興イベントを企画実践しながら、災害時には避難所をサポートできるという仕組みを構築した。具体的には10月と12月に商店街にてオリジナルの防災関連ブースを出展し、提案の趣旨説明と販売活動を行った。売り上げで災害時に使う備品を購入しながら、一部を次回の資金として循環させることにより資金の自己調達を可能とした。さらに昼は地域に通学する高校生が、夜間はこの計画に参加した小中学生がやがては高校生となり、24時間の災害時貢献体制が可能になることや、参加した高校生が地域での人脈と社会帰属意職をもち、コミュニケーション力、ホスピタリティ、企画力等を身に着けた地域振興の担い手に成長することを検証した。25年度は3年計画の初年度として、企画イベントを実施しながら高校生が直接、小学生、高齢者、外国人、商店街を含む地域、大学、行政と個々の接点を作った。また、宮城県東松山市、石巻市、気仙沼市にて被災状況、産業体験や視察を実施した。26年度は被災地や外国人との連携を強化しながら、地域商店街にて引き続き独自の防災関連イベントを継続し、人材育成とともに災害時及び地域振興の計画を推進していく。
エピゲノム制御による糖尿病眼合併症に対する新たな治療戦略基盤の確立

申請者らは、これまでに糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、糖尿病白内障、糖尿病角膜症といった糖尿病眼合併症の克服を目的とすべく、それらの病態解明および治療に関する研究に一貫して取り組んできた。近年、申請者らは糖尿病白内障において、いくつかのエピゲノム制御薬が高血糖による水晶体の混濁を抑制することを見い出した。このことは糖尿病合併症という高血糖による眼組織の変化を、遺伝子のオン・オフを調節するエピゲノム制御により改善させ得るという革新的な概念を示していることにほかならない。糖尿病という生活習慣病の発症には遺伝因子と環境因子の両方が互いに影響しており、エピゲノムすなわち環境により影響されるDNAの塩基配列によらない遺伝子制御は、それを繋ぐ機構として注目されている。我々はその観点に着目し糖尿病眼合併症の研究を進めているが、糖尿病眼合併症におけるエピジェネティクスに関する詳細はいまだ未解明に等しい。本研究では、糖尿病動物モデルや糖尿病患者から得られた眼組織を用いた解析により、糖尿病白内障、糖尿病角膜症、糖尿病網膜症といった糖尿病眼合併症の病態においていかなるエピジェネティック変化が生じ関与しているか、そのメカニズムの解明、またエピゲノム薬によりその異常が制御可能か検討を行っている。まずは、糖尿病角膜症の動物モデルについて、ラットで一定の安定した進行度の角膜症モデルを作成する条件検討を行っている。糖尿病眼合併症の動物モデルの安定性についての検討に時間がかかるため。安定した糖尿病眼合併症モデルの確立をすすめる。(理由)高価な物品費がかかる実験段階ではないため。(使用計画)安定した糖尿病眼合併症モデルの作成に使用する予定である。
非小細胞肺癌における増殖抗原、GSH関連抗原発現と制癌剤感受性の研究

外科的切除を行なった107例の非小細胞肺癌で、Cisplatin(CDDP)感受性とグルタチオン関連酵素ならびに増殖抗原発現の関係を検討した。CDDP感受性の判定は腫瘍組織を浮遊細胞とした後、CDDPを加えたRPMI溶液と培養し、フローサイトメトリーによるDNAヒストグラムで対照と比べてS期あるいはG2M期の比率の増加がみられるものをCDDP感受性群、無変化のものを非感受性群とした。またホルマリン固定後の病理標本を用いて免疫組織学的にグルタチオンペルオキシダーゼ(GPX)、グルタチオンリダクターゼ(GR)、増殖細胞核抗原(PCNA)、上皮細胞増殖因子リセプター(EGFR)の発現を酵素抗体間接法で調べた。対象症例のCDDP感受性率は大細胞癌40%、扁平上皮癌31%、腺癌6%であった。一方GPX、GR発現は扁平上皮癌26%、大細胞癌50%、腺癌61%で、CDDP感受性とGPX、GR発現には逆相関が認めら、CDDP感受性群は非感受性群に比べてGPX、GR発現が有意に低かった。またCDDP感受性群は非感受性群に比べてPCNA、EGFR発現が有意に低かった。以上の結果は細胞内グルタチオンが制癌剤の代謝に関係し、増殖脳の高い肺癌はCDDPでDNA障害を受けても修復が速いため結果としてCDDP非感受性になることが示唆された。これらの所見よりグルタチオン関連酵素ならびに増殖抗原の免疫組織学的検査は肺癌のCDDP感受性推定に有用と考えられた。平成5年度までに外科的切除を行なった122例の肺癌で、組織型別にCisplatin(CDDP)感受性とグルタチオン関連酵素ならびに増殖抗原発現の関係を検討した。感受性の判定は腫瘍細胞をCDDP加RPMI溶液と培養し、DNAヒストグラムでS期あるいはG2M期の増加がみられるものをCDDP感受性群、無変化のものを非感受性群とした。また免疫組織学的にGlutathioneperoxidase(GPX)、Glutathione reductase(GR)、Proliferating Cell Nuclear Antigen(PCNA)、Epidermal Growth Factor Receptor(EGFR)の発現を酵素抗体間接法で調べた。対象症例のCDDP感受性率は33%で、組織型別では小細胞癌86%、大細胞癌40%、扁平上皮癌31%、腺癌6%であった。CDDP感受性とGPX、GR発現には逆相関が認められ、各組織型のGPX、GR発現頻度は腺癌で最も高く、以下大細胞癌、扁平上皮癌、小細胞癌の順となっていた。また小細胞癌を除く非小細胞肺癌197例ではCDDP感受性群にPCNA、EGFR発現が有意に低かった。これらの所見よりグルタチオン関連酵素ならびに増殖抗原の免疫組織学的検索は肺癌のCDDP感受性推定に有用と考えられた。平成6年度は接着因子として癌の浸潤、遠隔転移の点で注目される糖鎖抗原、アポトーシスとの関連が推定されるLe^y抗原、p53癌抑制抗原とCDDP感受性との関係についても研究を進める予定である。またホルマリン固定後の病理標本を用いて免疫組織学的にグルタチオンペルオキシダーゼ(GPX)、グルタチオンリダクターゼ、(GR)、増殖細胞核抗原(PCNA)、上皮細胞増殖因子リセプター(EGFR)の発現を酵素抗体間接法で調べた。

一方GPX、GR発現は扁平上皮癌26%、大細胞癌50%、腺癌61%で、CDDP感受性とGPX、GR発現には逆相関が認められ、CDDP感受性群は非感受性群に比べてGPX、GR発現が有意に低かった。またCDDP感受性群は非感受性群に比べてPCNA、EGFR発現が有意に低かった。以上の結果は細胞内グルタチオンが制癌剤の代謝に関係し、増殖能の高い肺癌はCDDPでDNA障害を受けても修復が速いために結果としてCDDP非感受性になることが示唆された。これらの所見よりグルタチオン関連酵素ならびに増殖抗原の免疫組織学的検査は肺癌のCDDP感受性推定に有用と考えられた。
国際的視野に立つ社会科・地域学習の理論的・実践的基盤の構築

本研究では、国際理解教育と「地域」との接合が求められる理由を理論的に究明するとともに、国際的視野を組み込んだ地域学習の実践的指針の構築に取り組んだ。1980年代以降の国際理解教育は国際貢献という政策課題への対応を重視する一方、「多文化共生」を除いては日本社会内部の問題状況に向き合う関心は低調であった。そのため、「多文化共生」へのリアリティを持てない地域では、国際理解教育と地域を関連づける理論的言説や実践的指針が不足してきたことを指摘した。そのうえで、世界/国家/地域を往還する見方・考え方の育成が求められていることを明確化し、そうした資質育成に資する学習の類型的枠組みを提案した。平成27年度は、地域学習と国際理解教育を連関させるべき根拠を理論的に探究する作業を進め、その成果を日本国際理解教育学会・全国研究大会の場で発表するとともに、学術論文として投稿した。この理論構築作業を進めるに際しては、1戦後初期のユネスコ協同学校計画の教育実践、21990年代の地域に根ざした国際理解教育実践、3上原専禄の国民教育論の検討を進めた。このうち、1の検討からは、戦後初期の経験主義教育と関連付けられた国際理解教育実践が積極的に模索されながらも、地域それ自体を目的化する視点が希薄だったことを明らかにした。また2については、1990年代に至り、地域自体を目的化する関心が萌芽する一方で、その関心が都市圏における多文化共生問題に集中していたこと、そして「日本文化」や「伝統文化」という観点から地域文化へ接近し、国家的枠組みを強調するような学習の潮流が生まれていたことを読み解いた。そして、3については、上原の教育論が「地域・国家・世界」の重層的かつマルチ・スケールな見方・考え方をいち早く提起していたこと、そして地域の自治や自立性を基盤に据えながら国家権力への批判的視座を導いていた点を析出する一方で、地域が「国家・民族」の下部構造として位置づけられる傾向にあった点を批判的に検討した。これらの検討を踏まえつつ、国際理解教育においては主体的な学びの環境基盤として「地域」に立脚するとともに、その重層性・開放性を捉えていくことが重要になることを提起した。当初の予定通り、文献資料の収集を進め、その検討を通じて、地域と国際理解教育を連結させる理論的根拠を明確化することができた。平成28年度は、昨年度に取り組んだ国際理解教育と地域学習を連結させる理論構築作業に基づきながら、地域に立脚した国際理解教育の実践的指針づくりのための基礎作業を、以下の3つの観点から進めた。第1に、1960年代末に上原専禄が提起した「世界・日本・地域を串刺しにする」という教育課題が教育実践領域の中でどのように実践化されたかについて、分析対象となる基礎資料の収集と分析作業を進めた。具体的には、上原理論の影響下にあった歴史教育者協議会の定期刊行物や出版物、鈴木亮氏や吉田悟郎氏の著作などの収集・分析に取り組んだ。第2に、秋田県大館市で起きた「花岡事件」を掘り起し、1960年代末に教育実践として世に問うていった教師たちの営みに着目し、いかなる課題意識と方法論、社会的条件によってそれが可能であったかを探るために、関連する教育実践資料の収集を進めつつ、関係者との関係構築を進めた。第3に、日本社会科教育学会や東京学芸大学社会科教育実践研究会などへの参加を通して、喫緊の教育課題として急浮上してきた主権者教育と本研究との接点を探る作業を進めた。主権者を育成するうえで地域学習が重要な役割を果たしうること、そして地域社会の特質・課題を探る上でマルチスケールな認識枠組みが重要であることを明確化し、その成果の一部を書籍として刊行した。概ね当初の計画通りのペースで進んでいる。本研究では、日本の「先進国」としての位置付けを強調してきたこれまでの国際理解教育が歴史的役割を終えつつあるとの認識に立ち、それとは異なる新たな学習モデルを「地域」に視点をおきながら探究することを目的としている。その際、社会科を主要な検討対象に置きつつ、国際理解教育と地域学習の接合が求められている背景を理論的に究明するとともに、教育実践の指標となる実践的枠組みを構築することをめざした。このうち、国際理解教育と地域学習を接合する論理に関する理論的検討については、前年度までに検討を終えており、本年度は実践基盤の構築に取り組んだ。まず初めに、これまでの国際理解教育において「地域」が教育実践の中に以下に組み込まれているかを検証した。その結果、「地域」が専ら活動・行動の舞台として位置づけられる傾向にあること、そして地域と世界を結合させる認識枠組みが不足していることを問題化した。そのうえで、世界と地域を結合させるための認識論的枠組みとして、1国際比較アプローチ、2関係発見アプローチ、3重層構造アプローチという3つの学習アプローチを考案し、各アプローチの意義や教材開発の視点などを青森県の地域素材と関連付けながら探究した。この探求の成果は、学術論文として発表した。現在、これらの実践的な指針を基盤にして、青森県の地域素材の教材化に焦点を当てた書籍づくりを進めており、その成果は2019年2月ごろに刊行する予定である。

そのため、「多文化共生」へのリアリティを持てない地域では、国際理解教育と地域を関連づける理論的言説や実践的指針が不足してきたことを指摘した。そのうえで、世界/国家/地域を往還する見方・考え方の育成が求められていることを明確化し、そうした資質育成に資する学習の類型的枠組みを提案した。平成28年度は、地域と関連付けた国際理解教育の実践基盤の確立に取り組む予定である。その際、上原専禄の国民教育論に刺激を受けて、1970年代に提案された教育実践の検討を進める。「地域・国家・世界」を串刺しにする教育論を展開した上原の問題提起に呼応して、どのような主題が、どのような観点から教育実践化されたのかを究明していく。そのうえで、今日の教育実践の主題や方法について実践的指針を導出したい。平成29年度は本研究の最終年度に当たるが、これまでの研究活動を総括する意図も含めながら、以下の二つの作業に取り組んでいく。一つは、28年度に取り組んだ教育実践資料の収集・分析作業の結果をまとめ、論文として投稿することである。この作業を通じて、地域に立脚した国際理解教育の実践的指針を明確化していく。もう一つの作業は、青森県内の地域事象を取り上げ、本研究で解明してきた理論的・実践的指針を手掛かりとしながら、具体的な学習プログラムを開発することである。現在のところ「自由民権運動」と「満州移民」を取り上げ、地域の主体性やマルチスケールな認識枠組みを組み込んだ学習プログラムを開発する予定である。社会科教育本研究では歴史的検討を実施するにあたり、絶版本などは古書店を通じて収集を進めた。それらの書籍の中には、定価よりも安価なものも含まれていたため、予定よりも支出を少なく抑えることができた。そのため、これらを次年度に繰り越し、旅費等に充てることとした。年度途中に体調を崩して入院を余儀なくされ、予定していた調査を実施できなかった。繰り越し分は、旅費として使用することを計画している。関連学会が地方で開催されることに決定したので、当初予定よりも多くの支出が見込まれるためである。現在も治療中であるが、体調が回復次第、予定した調査を実施する予定である。
電気泳動法によるカーボンナノチューブ・ポリマー高強度エレクトロニクス材料の開発

本研究では、従来の偶発的な作製プロセスと異なる、我々が開発した簡単かつ再現性の極めて高い新しいプロセスである電気泳動法を進展させ、ナノチューブ(CNT)糸の新しい応用及び新性質を探索した。特にCNT糸の基礎物性探索と共に、CNT糸の複合化技術を確立し、高密度・高配向CNTファイバ及びシートポリマー複合材料作製のためのプロセス技術として開発した。また、CNTをベースとしたロボット用高性能アクチュエータ材料及び生物用電極を創製した。さらに、カーボンやCNT糸の性質に関する基礎理論計算を行い、実験の解釈と物性予測を行った。平成19年度において、カーボンナノチューブの糸の力学性質の測定方法を確立し、高強度・高電導性伝カーボンナノチューブの作製方法を開発し、アクチュエータ用軽量・高強度・導電性カーボンナノチューブ・ポリマー複合材料の作製に進めていた。CNTは、円筒形の立体構造として様々な螺旋構造を持ち、その構造に依存して金属にも半導体にもなるという著しい特徴を持っている。われわれは電気泳動法で簡単かつ制御レやすい長繊維化CNTの糸の作製に成功した。それにより、軽量・高強度・導電性カーボンナノチューブ・ポリマー複合材料の作製を進めているが、微小な長繊維化CNTの糸の力学測定法の確立が必要である。普段使われている顕微力学測定法はCNT糸の測定に対して、試料のサイズが小さすぎて使いにくい。それで、原子間カプローブ顕微鏡を用いて、長繊維化CNTバンドルのヤング率の測定を試みた。直径が100nmのCNTバンドルの強度は250GPaであり、普通のカーボンファイバ増強材料より強度が4倍高くなったことを解明した。これから進めたいカーボンナノチューブ・ポリマー複合材料の開発について、明るい道が示されたと考えられる。この研究成果は既に英文誌に投稿した。この結果に基いで、今後、軽量・高強度・導電性カーボンナノチューブ・ポリマー複合材料の作製プロセスを確立し、性質評価を行う。また、カーボンナノチューブ糸が変形した場合の構造や電気的性質の変化を第一原理理論を用い原子配列及び電子構造の観点から調べ、圧力に対し非常に敏感でありまた、ナノチューブの種類により性質が大きく変わることがわかった。カーボンナノチューブ(CNT)は、円筒形の立体構造として様々ならせん構造を持ち、またその構造に依存して電気的性質が変化するという著しい特徴を持っている。高い強度、電気伝導性、熱伝導性など、従来の材料にみられない優れた特性を持つため、現在ナノテクノロジーを支える中心的な素材として世界的な注目を集めており、多様な製品への応用が期待される。本研究では我々が開発に成功した電気泳動法によるCNT制御技術により、高純度・高配向性を持つCNT束とポリマーの複合化を行い、導電性かつ高強度を持つ新型導電性プラスチック材料や強化材料の応用を展開することであった。今年度の実績として、1)多層カーボンナノチューブをポリピロールに分散させることにより、引っ張り強度は16.1MPaに向上させることができた。これは、ポリピロールの7.7MPa、NSFI添加ポリピロールの1.9MPaによりはるかに高い。なお、破断伸びは27.5%と高水準を維持できた。カーボンナノチューブ分散により、出発材料のポリピロールのアクチュエータ機能、特に最大発生応力を格段に向上させることができた。2)また、高導電性及び高熱伝導性をもつ軽量・高強度・高弾性・高配向のCNT集積体としての長尺ファイバ作製プロセスを開発した。電気泳動法による金属チップ先端へのCNTバンドルの集積・成長機構を明確にし、ファイバ化に影響する諸因子(純水中のCNTバンドル濃度、バンドルのサイズ・形状等)を最適化した。また、長尺ファイバ作製システム及び作製プロセスの開発を行った。得られた数ミリカーボンナノチューブファイバはグラファイトの電気的な性質と類似した。CNTは様々な特性を制御することがいまだに困難であるにも係わらず、やはりその微細な構造は応用へ魅了してやまない。従来、CNTの配置制御は偶発的な方法により行われることが多かったが、しかし、我々はこれまでの研究により、電気泳動法を利用することで、簡単かつ再現性の極めて高いCNTの配置制御プロセスの開発に成功した。そこで、本研究の目的は我々が開発に成功した電気泳動法によるCNT制御技術により、高純度・高配向性を持っCNT束とポリマーの複合化を行い、導電性かつ高強度を持つ新型導電性プラスチック材料や強化材料の応用を展開することである。

今年度の実績として、我々は2層液電極技術を用い、表面分散剤を添加することなどにより、電気泳動法を用いて、カーボンナノチューブ分散液から、カーボンナノチューブが相互に密着し、結晶状に方向の揃ったファイバを作製することに成功した。このファイバの弾性率は、265GPaで、これは世界のチャンピオンデータである。電気泳動法による高性能カーボンナノチューブファイバの実用化を目指して、長尺ファイバ作製法を開発し、エンドレスのファイバを作製できる技術としている。また、CNTファイバプロセスの制御によって作製したCNTファイバはグラファイトの電気的な性質と類似し、かつハイキャパシタンスCNTファイバ(150F/g)の作製に成功した。従来の同様なCNTファイバのキャパシタンス20-44F/gと比べて、遥かに向上した。単層CNT単体のキャパシタンスは180F/gであることから、我々が作製したCNTファイバはCNT単体の特性が十分生かされている。その結果、英文誌に発表した。(Nano 3(11),3679(2009))。さらに、ポリマーの被覆によって、絶縁性を得るプロセスの制御を進めている。
腎不全に伴う病的石灰化における基質小胞のプロファイリング

Ca沈着は骨などの形成に必須で、また異所性石灰化は多くの疾患で見られる現象である。しかしその仕組みは正常な石灰化と異所性石灰化のメカニズムが同一かという基本的な点すら未知である。又、石灰化装置である基質小胞(MV)がどんな物質構成なのか、各硬組織での共通性についても議論がある状態である。本研究では、MVの石灰化に関する分子を同定、機能を解明するため、軟骨細胞で研究した。分化した軟骨細胞は無機リンにより石灰化するが、MVは未分化な状態でも形成されていた。また軟骨細胞を関節軟骨様に分化させたところ、MV形成は見られたが石灰化能は見られなかった。これらのMVを比較し石灰化に必要な分子を同定した。(1)本年度は培養細胞を用いた実験を行うための設備更新と予備実験を行った。培養軟骨細胞ATDC5を使い、成長板軟骨様分化のモデルとしてInsulin刺激群を使用、関節軟骨様分化のモデルとしてGDF5刺激群を用いて、培養上清中より基質小胞(MV)の回収と比較を試みた。MVの回収法として、予備実験では超遠心法を用いていたが、より簡便な方法を検索した。MVとよく似た物性を持つExosomeの回収法を参考にし、ゲル濾過カラム法とフィルター法を予備的に試みたが、MVについては再現性よく回収することが出来なかった。現在、これらの方法の改善と、超遠心法での回収分画との違いについて検討中である。また回収したサンプルについて、二次元電気泳動法により比較すべく準備中である。(2)遺伝的腎障害マウスに高リン食を与えることにより、石灰化異常を引き起こし、これとMV上のタンパク質構成の変化と比較することにより、石灰化異常と関連したタンパク質を同定する実験を予備的に行った。期待に反して、腎障害マウスにかなりの期間高リン食を与えても、顕著な石灰化異常や骨密度異常は検出されなかった。また、ごく少量のマウス血清からのMV回収も再現性よく行うことが出来なかったので、現在実験系の改良を行っている。昨年度は、実験条件を確立すべく、培養細胞系と動物個体を用いた実験を何シリーズか行った。実験条件の最終的な決定には至らなかったが、本年度に、本実験を行う程度の知見は集積することが出来たと考える。(1)今年度は、昨年度に引き続き、培養軟骨細胞を用いた基質小胞の回収条件の決定と生化学的解析を行った。予備的に行っていた研究では、超遠心機を用いた方法で基質小胞を単離していたが、昨年より新たに基質小胞とよく似た性質を持つとされるExosomeの精製法を改造したゲル濾過法とフィルター法を用いて、同様の結果を得るべく試みた。残念ながら、精製方法の違いにより得られる細胞外小胞にかなりの違いがあることがわかり、そのままでは超遠心法での結果を再現できなかった。そこでもう一度超遠心法に立ち戻り、再現性よく結果を得られるよう計画している。(2)昨年度は、遺伝的腎障害マウスに高リン食を与えて石灰化異常を惹起する事を試みたが、そのままでは石灰化異常は認められなかった。本年度には、さらにこの系統のマウスの高齢群を用いて、石灰化異常・骨格異常を引き起こし、それと血中の基質小胞組成との関連について検討を行った。また同様に、数種類の骨代謝に影響する刺激をマウスに与えて、骨密度の減少を惹起し、その際に見られる血中の基質小胞の変化について検討するため実験を行った。これらのいくつかの条件では、骨密度の変化が認められたので、これらの血中の基質小胞について現在生化学的検討を行っている。これらの結果については、一部を今年度の日本分子生物学会において発表した。本年度は組織学的解析を担当する予定であった分担者が産休に入ったため、その分、進展はやや遅れている。また、当初の予想よりも、基質小胞を含む細胞外小胞の多様性が大きく、また精製法により実験結果が大きく変わることも明らかとなったため、実験条件の再検討をしている点も影響した。(1)昨年に引き続き、高リン食負荷マウス、副甲状腺由来遺伝子変異マウスなど各種のマウスを用いて、血管石灰化の亢進や異常を惹起する条件の検討を行った。各種条件で採血し、PTH、Estrogen、TestosteronなどCa代謝・骨代謝関連ホルモンの濃度を測定するとともに、大動脈・腎臓をサンプリングし、石灰化病変を検索した。同時に血中のMatrixVesicle画分の変動についても調べた。残念ながら、石灰化病変の出現については個体差が大きく、安定した結果を得ることは困難であった。また、血中のMatrix Vesicleの回収と検出も、個体の状態と採血条件の影響を強く受け、まだ再現性よく結果を得られるには至っていない。現在、安定して石灰化病変を起こすような遺伝子改変マウスについて検討中である。石灰化の検討の過程でカルシウム代謝に大きな影響を与えることが知られる血中亜鉛の影響についても予備的な検討を行った。具体的には亜鉛欠乏環境下での血管石灰化やMatrix Vesicle産生について検討を行った。(2)培養細胞を用いた実験では、昨年度までの実験をまとめ、培養軟骨細胞を用いた分化・石灰化条件と産生されるMatrix Vesicleの関係について一定の結果を得られた。昨年試みたゲル

濾過法やフィルター法では良好な結果が得られなかったが、超遠心法では安定した結果が得られているため、これらについては今年度の分子生物学会・生化学会合同年会(ConBio2017)にて発表した。Matrix Vesicle精製法による違いについては、exosomeとMatrix vesicleの間に大きな違いがあることを示唆していると思われる。ConBio2017での発表内容の論文化を現在進めている。Ca沈着は骨などの形成に必須で、また異所性石灰化は多くの疾患で見られる現象である。しかしその仕組みは正常な石灰化と異所性石灰化のメカニズムが同一かという基本的な点すら未知である。又、石灰化装置である基質小胞(MV)がどんな物質構成なのか、各硬組織での共通性についても議論がある状態である。本研究では、MVの石灰化に関する分子を同定、機能を解明するため、軟骨細胞で研究した。分化した軟骨細胞は無機リンにより石灰化するが、MVは未分化な状態でも形成されていた。また軟骨細胞を関節軟骨様に分化させたところ、MV形成は見られたが石灰化能は見られなかった。これらのMVを比較し石灰化に必要な分子を同定した。本年度は昨年行った軟骨細胞を用いた研究に加え、骨芽細胞や血管内皮細胞を用いた実験を行う予定である。また動物個体を用いた実験も、昨年度とは違った変異マウスのサンプルを入手・解析の予定である。また今年度にはRNAプロファイリングを初めて実施する予定で、現在準備を進めている。次年度には、培養細胞を用いた実験計画に関しては、予備実験の際に用いた超遠心法に立ち返り、再現性よく実験結果を得るべく行っていく予定である。また次年度は最終年度であるので、成果を論文発表すべく、取りまとめていく予定にしている。動物個体を用いた実験計画に関しては、加齢が一つのポイントであることが今年度の実験で明らかになったため、現在加齢動物を作製すべく、繁殖・飼育を行っている。分子生物学今年度は再現性の問題から、二次元電気泳動を行うに至らなかった。このため予定と異なり次年度への繰り越しが生じた。また予定していた炭酸ガスインキュベータの更新が必要なくなったため、その予算の一部を次年度で使用することとした。今年度は研究分担者の一人が産休に入ったため、一部実験計画を変更した。また、基質小胞の精製法の検討の結果、新たに試みた方法では再現性が確保できなかったため、今年度に予定していた二次元電気泳動による解析を、次年度に行うよう計画を変更した。次年度は、予定の実験に加えて本年度に予定していた二次元電気泳動などの実験計画を行う予定である。今年度に行えなかった分を実施し、特に論文作成とそのリバイスの対応を行う予定にしている。
皮膚血管内皮細胞の分化誘導を制御する新たな因子群の同定と解析

血管新生が生体のホメオスタシスに重要な現象であり、それに関与する主たる細胞が血管内皮細胞(EC)であることは衆知である。しかし、血管新生過程をより詳細に観察すれば、そこにはECの遊走、増殖、分化という事象が複雑に絡み合い、また血管の大きさによるECの相違性を考慮するならば、血管新生にはまだまだ多くの不明な点が残されている。筆者らは、これらの事情を踏まえ、皮膚微小ECの分化とは何かに特に興味を持ち、先ずマウス皮膚由来培養EC株F-2を樹立した。これは正常ECの機能を多く保有していることを示した。更に今回その亜株F-2C樹立にも成功し、これが特別な人為的因子群の添加なしに自発的に分化しネットワーク状の管腔構造を誘導する、全く新しい血管新生研究インビトロモデル系提供株であることを報告した。この分化誘導には、EC下基質(SEM)としての基底膜構造の形成メタロプロテアーゼ群の活性化が関与していることを示した。また、この分化には血清のある種の因子(群)が抑制的に作用することも合わせて示し、その分子量が10万KD前後であることも判明し現在それを同定中である。一方、培養系ECの分化には2種類の形態があり、一つが上記した基底膜上で形成されるネットワーク構造であるがもう一方はI型ゴラ-ゲン上あるいは内で形成される管腔構造であり、これもネットワーク構築を示すが、この場合には、初期に一次元EC細胞シート上に先ずネットワーク構造を誘導し、最終的に細胞シートを伴わない同様構造を完成させることが知られている。我々が今回確立したF-2Cによる血管新生モデル系においても、細胞増殖期に1型コラーゲン処理をほどこすこと。同様の細胞シート上の構築を誘導した。更に5型コラーゲン処理においてもまったく同じ変化を示した。また、この管腔は基底膜上の管腔とは異なり、内部にコラーゲン繊維を充満させており、基底膜上で完成される管腔が中空であることを対比された。しかし経時的に観察すると、コラーゲン処理誘導のネットワークも基底膜上のそれに変化した。また、この構造の変化は有血清時において抑制された。これらの事実はこれまで独立に議論され、互いの関連が不明であったこれら2種類の培養系でのECの分化/管腔形成は、実は互いに関連するものであり、その関連を制御する重要な因子群の一つにECと血清との動的な関係が示唆された。
中枢時計のin vivo計測による概日リズムのシステム的理解

哺乳類の概日時計の中枢は視交叉上核に存在する。私たちは、時計遺伝子Cryに依存してAVP発現量が低下し、発達初期にはVIPを介したネットワークが重要であることを明らかにした。(Ono et al., 2016 Science Advances)。光ファイバーを用いて、自由行動下マウス視交叉上核からのPer1とBmal1の遺伝子発現リズム計測システムを構築し、外界の光環境を一時的に変化させた際にPer1とBmal1の位相関係が変わることを明らかにした。また培養視交叉上核では、Per1とBmal1のリズム周期が異なる事を、明らかにした(Ono et al., 2017 PNAS)。哺乳類における概日リズムを、個体を含めた一つのシステムとして理解するために、概日時計の中枢である視交叉上核内の遺伝子発現リズムと、そこからの出力系を同時に計測し、細胞から個体に至るまでの概日リズム形成メカニズムを明らかにする目的で研究を行った。本年度はex vivo, in vivoにおける多機能同時計測システムを構築した。Ex vivoにおいては、時計遺伝子Per2のタンパク質にルシフェラーゼを結合させたレポーター(PER2::LUC)マウスの視交叉上核スライスを作成し、アデノ随伴ウイルスを用いてGCaMP6をスライス表層に発現させた。さらにこの培養視交叉上核をメンブレンごと切り出し、多電極ディッシュ上に培養した。これにより遺伝子、細胞内カルシウム、神経発火の同時機能計測に成功した。これらの位相関係はカルシウム、神経発火、Per2の順に認められこれまでの知見と一致していた。In vivoにおいてはPER2::LUCマウス以外に、他の時計遺伝子Per1あるいはBmal1のプロモーター下流にルシフェラーゼcDNAが挿入されたレポーターマウス(Per1-luc, Bmal1-ELuc)を用い、視交叉上核あるいは嗅球に光ファイバーを挿入し逆単面から得られる発光輝度を光電子増倍管にて計測した。また同時に赤外線センサーを用いてマウスの自発行動量を計測することに成功した。このシステムを用いて、自由行動下マウス脳内の遺伝子発現計測に連続して3週間以上行う事に成功した。In vivoでみとめられたそれぞれのレポーターマウスの視交叉上核から得られた発光ピーク位相は、ex vivoで見られるピーク位相に比べ2-3h位相後退していた。またin vivoでの嗅球のPER2::LUCリズムのピーク位相は主観的夜の中心付近に認められた。概日時計の中枢である視交叉上核の時計遺伝子、細胞内カルシウム、神経発火のリズムを同時に計測するシステムを用い、培養視交叉上核の三つの機能を評価した。野生型視交叉上核はカルシウム、神経発火、PER2::LUCの時間経過に従いピーク位相が見られた。申請者はこれまでCry欠損マウスの新生児期の視交叉上核に概日リズムが存在することを明らかにしている(Ono et al., 2013 Nature Communications)。この多機能同時計測システムを用い、Cry欠損マウスの新生児期の視交叉上核のリズムを計測したところ、これら3つの位相関係が培養経過に伴い変化をしていた。また視交叉上核のdorsal領域のカルシウム濃度がventral領域に比べ低下していた(投稿準備中)。本年度は培養視交叉上核における多機能同時計測システムを用いて、野生型とCry欠損型マウスの時計遺伝子、細胞内カルシウム、神経発火の概日リズムの位相関係を同一培養スライスで評価することに成功した。この多機能同時計測は世界でも行われていない本研究室が世界をリードしている手法である。また自由行動下マウス脳内の時計遺伝子発現と自発行動量の長期同時計測も世界でも行われていない手法で、本年度はこの手法を用いた研究成果をScientific reports, European Journal of Neuroscienceに報告することができた点で予想を上回る成果が出せたと考えている。得られた時系列解析についても、用いる相対的データ数が周波数に依存しないウェーブレット解析を導入し、周期を定量化することにも成功し、計測・解析の点でも大きな進歩が見られた。哺乳類の概日リズムは、複数の時計遺伝子の転写・翻訳を介したネガティブフィードバックループにより形成されることが提唱されている。その中で、Per1とBmal1は逆位相で振動し、それぞれのフィードバックループがインターロックして24時間のリズムが刻まれている。私たちは、光ファイバーを用いたin vivo発光計測システムを用いて、自由行動下マウス視交叉上核からのPer1およびBmal1の遺伝子発現リズムと、自発行動の同時計測システムを構築し、外界の光環境を一時的に変化させると、Per1とBmal1の位相関係が変わることを明らかにした。また培養視交叉上核では、Per1とBmal1のリズム周期が異なる事を、発光・蛍光多機能同時計測を行う事で明らかにした(Ono et al., 2017 PNAS)。この結果は、二つの異なる振動機構が視交叉上核に存在する事を示す。

また培養視交叉上核では、Per1とBmal1のリズム周期が異なる事を、明らかにした(Ono et al., 2017 PNAS)。本研究を進めるにあたりex vivo, in vivo多機能同時計測の構築がもっとも重要なステップである。本年度は視交叉上核の初代培養を用いて遺伝子、細胞内カルシウム濃度、神経発火の同時計測システムを立ち上げることができた。また光ファイバーを用いた自由行動下マウスの脳内の時計遺伝子発現計測と、赤外線センサーを用いた自発行動量の同時計測はこれまで技術的に困難であるため成功例がなかったが、今回我々のグループがこの手法を構築した点において十分な達成度が得られたと考えている。概日時計の中枢である視交叉上核以外の脳部位における遺伝子発現計測にも成功し、視交叉上核とその他脳部位の相互作用を無麻酔・無拘束マウスを用いて長期に評価する事ができた点もその理由の一つである。最終年度は、これまで構築した培養視交叉上核における多機能同時計測を用い、時計遺伝子Per1, Bmal1および細胞内カルシウム濃度、神経発火リズムを同時に計測するシステムを構築する。Per1-lucとBmal1-ELucは得られる発光の波長が異なることを利用し、610nmのロングパスフィルターを用いて両波長を分離する。まずは光電子増倍管を用いて実現可能かを確認し、イメージングに持っていく。また抑制性神経伝達物質GABAの機能欠損マウスを用いて、視交叉上核の時計遺伝子、細胞内カルシウム、神経発火を同時計測し、視交叉上核におけるGABAの機能的意義を明らかにする。最終的にin vivoにおいて視交叉上核特異的にGABA機能を欠損させ、行動出力にいたるGABA機能を明らかにする。概日リズム今年度構築した、ex vivo, in vivo多機能計測システムを用い、視交叉上核の遺伝子発現、細胞活性の操作を行い、時計遺伝子とその出力系の関係を明らかにする。Ex vivoでは薬理的に細胞間の情報伝達を阻害すること、またノックアウトマウスを用い遺伝的に細胞の状態を操作し、その際に見られる遺伝子、細胞内カルシウム、神経活動の時空間パターンを定量化する。In vivoでは光ファイバーを用いた自由行動下マウス脳内の遺伝子発現計測システムを用い、視交叉上核特異的に細胞間連絡を阻害したり、遺伝子機能を欠損させたりした際の脳内遺伝子発現プロファイルと行動リズムへの出力系を評価する。また蛍光プローブを用いた細胞内カルシウム濃度の変化を自由行動下マウスの視交叉上核から計測するシステムを構築し、in vivoにおける細胞内カルシウムの動的変化とその生理的意義について明らかにする。昨年度はex vivo, in vivoにおける多機能同時計測を構築することを第一目標として研究を進めてきた。昨年度の前半はほとんど機器のセットアップで時間を要したため、大きな支出がなかった。しかしその後おおむね計測システムについては完成し、後半は動物実験を含めデータが順調に得られた。
フゾバクテリウム糖抗原に対応する好中球の受容体と刺激応答の研究

Fusobacterium nucleatum(フゾバクテリウム)表層糖抗原が好中球の酸素代謝系を活性化する。刺激による活性酸素を化学発光法で測定し、好中球の情報伝達系との関連を研究した。1.フゾバクテリウム糖抗原に対する好中球受容体マウス腹腔好中球の細胞膜画分を電気泳動後、ニトロセルロース膜に転写し、フゾバクテリウム糖抗原と結合実験を行った。膜画分の14、31、42、55kDaの蛋白が結合したので、これらの一部あるいは全部が受容体を形成すると考えられる。ヒト好中球では14、42kDaの膜蛋白がフゾバクテリウム糖抗原と結合した。2.糖抗原刺激-活性酸素産生における情報伝達系(1)ヒト好中球では、細胞内cAMP濃度は糖抗原刺激により増加し、活性酸素産生と相関を示したが、cGMP濃度は無刺激時のレベルであった。(2)細胞内Ca^<2+>濃度は、刺激により徐々に上昇するが、同程度の活性酸素産生を示すシオノマイシン刺激時に比較すると濃度変化は約10%であった。(5)抗ホスホチロシン抗体を用いたイムノブロットの結果、刺激によって19および40kDaの好中球蛋白が、チロシン残基のリン酸化を受けていた。以上の結果、フゾバクテリウム糖抗原は好中球細胞膜上の受容体に結合し、刺激によりcAMP濃度の上昇、Ca^<2+>の流入が起こる。また、活性酸素産生にはPLC、PLDおよびTKが関与することが明らかになった。