hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ニオブ酸リチウム変調器を用いた高速光ラベル生成に関する研究

本研究では超高速・大容量なフォトニックネットワーク実現のために、その要素技術である光符号ラベル生成・処理に関する研究を行った。多くの光ラベル生成・処理の手法についての研究がなされてきているが、それらで用いられているほとんどのデバイスは符号のパラメータやパターンが固定でしか動作できず、ネットワークの状況が変化したときに、柔軟に対応できるかについては十分な検討と検証がされていない。そこで申請者は、パラメータの可変性が高く高速性に優れた電気光学効果に着目し、ニオブ酸リチウム(LiNbO_3:LN)変調器を光符号ラベルの生成に、液晶空間光変調器(Spatial light modulator : SLM)を光符号ラベル処理に用い、検討を行った。本研究では光ラベル処理をスペクトル制御で行うことを提案し、SLMを用いた高分解能かつ広帯域なスペクトル制御デバイスであるVariable bandwidth spectrum shaper(VBS)と高速LN変調器を組み合せて実現することを特徴とした。これにより、可変かつ高速な符号の生成・処理を低損失で行えるなどのさまざまな利点が明らかとなった。シミュレーションと実証実験を行い、LN変調器とVBSを組み合わせたシステムの可変性・有効性を示した。チップ数4、8chip、チップレートが20Gchip/sの符号を用い、1つのデバイスで複数の符号を処理できることを実証した。本研究はフォトニックネットワークの要素技術である光符号ラベル生成・処理技術の柔軟性、効率化、高精度化の実現に貢献しようとするものであり、各種光変調器の組み合わせを選べば、有効な手段となりうることを示した。これまでに光ラベル生成技術に関する研究は活発に行われているが、光符号ラベルのパラメータや符号パターンの可変性については十分に示されていなかった。そこで任意の符号を生成可能なニオブ酸リチウム変調器を符号器として用いる手法を採用し、符号パラメータを最適化し、識別可能な符号数の算出を行った。当該年度の検討では、光マルチプロトコルラベルスイッチング(MPLS)に適用する光ラベルの符号数を確保することを目指し、符号数が数10から100程度が得られるパラメータの算出を行った。本手法では、ニオブ酸リチウム変調器で光符号ラベル生成、平面光回路で構成されるトランスバーサルフィルタでラベル処理を行い、ディテクタにおける光電変換までを考慮したシミュレーションにより、最適な符号と識別可能な符号数の算出を行った。チップ間隔10 Gchip/sのBPSK符号を、チップ数8 chip以上にした場合に、識別可能な符号数が128個と、100以上の符号数が得られた。次に、このシミュレーションの有効性を確かめるために、実証実験を行い、シミュレーション結果と同様の結果が得られた。この検討により、ネットワークの状態が変化した場合にも、消費電力や使用帯域を最低限に抑えながら、それに対応した正確かつ効率の良い宛て先処理を行うことができる。これらの結果は光通信の国際会議(OECC 2010)等で発表し、各国の研究者からも関心を集めている。
尿流可視化による尿道機能の解析

本研究では男性前立腺部尿道の変形と尿流の変化を、数値流体力学の手法により解明を試みた。当初計画していた内視鏡映像上も尿道振動は抽出されたが、弾性の推測まで至らなかったので、非変形モデルにより尿流可視化を行った。その結果、膀胱頸部硬化症のモデルでは、膀胱頸部の変形が尿流動態の変化と尿流エネルギーの減弱を引き起こすことが判明した。さらに前立腺肥大症患者の、α受容体遮断薬内服前後の尿道内視鏡映像から再構築した尿道立体画像を用いた計算でも、尿道の一部の変形による尿流エネルギー減弱が、排尿パラメータに関連することが示された。本研究で得た手法が新たな排尿機能評価手法になることが示唆された。CADと数値流体計算ソフトをもちいて前立腺肥大症患者の前立腺部尿道モデルを作成し、内腔を流れる尿流のシミュレーションを行った。これにより前立腺の尿道内腔への突出が高度になるにつれ、前立腺部尿道背側の閉塞が強くなり、同部の遠位部に渦流の形成とエネルギー損失が生じることが推測された。また渦流とエネルギー損失の程度が相関することも判明した。次いで排尿障害を有する前立腺肥大症患者の尿道内視鏡映像から、前立腺部尿道の立体構造を作成し、同部の尿流動態シミュレーションとともに、エネルギーの損失を計算した。前立腺肥大症の標準的治療薬であるα受容体遮断薬による治療を行った前後で、計算結果と排尿障害のパラメータの比較を行い、たとえば残尿量や最大尿流量率の改善とエネルギー損失の改善との間に相関を認めた。これより本手法は前立腺部尿道内腔で生じている尿流状態を推測する方法として妥当と考えた。前立腺部尿道の渦流形成部位がエネルギー損失責任部位と仮定した場合、排尿障害の治療上、渦流形成に関する尿道の変形部位の同定が必要であるので、α遮断薬服用前後の前立腺部尿道の断面図を比較するソフトを作成し、約30例の尿道について検討を行った。その結果排尿障害改善例では前立腺部尿道遠位部の拡張が認められることが分かった。このことは前立腺肥大症における排尿障害に前立腺部尿道の尿流エネルギーの維持が重要な役割を持つこと、および排尿反射の維持に関与する可能性が示唆された。膀胱頸部の弾性や閉鎖機能の評価を目的に、尿道内に固定した内視鏡による灌流液注水下の映像を撮像し、膀胱頸部の輪郭抽出をフレームごとに行い同部の振動を抽出した。振動の抽出は可能であることが判明し、現在振動数のフーリエ解析を試みている。排尿障害を有する男性の前立腺部尿道の立体形状を、膀胱尿道鏡ビデオ映像から仮想空間上に再構築し、この中を流れる尿流動態を数値流体力学的手法で解明を試みた。平成25年度は、コンピュータ支援設計ソフトおよび数値流体解析ソフトをもちいて膀胱頸部硬化症の精細なモデルを作成し、連成解析により膀胱頸部および前立腺部尿道の変形が前立腺部尿道の尿流動態と流体エネルギーの損失を計算した。その結果、膀胱頸部の変形の程度により発生する尿流の乱れは渦流として可視化でき、その程度は前立腺部尿道遠位端の圧損として表現できることを見出した。同時に膀胱尿道鏡ビデオ画像から前立腺部尿道の仮想内視鏡画像作成手法の精度を、これまでに撮像した30例の前立腺肥大症症例のビデオファイルを元に検証した。前立腺部尿道の仮想内視鏡画像をもちいた数値流体計算では、前立腺部尿道を通過する際に生じる圧損は前立腺重量と相関すること、およびα受容体阻害薬内服後の圧損の改善の程度は排尿パラメータと相関が見られたことから、前立腺部尿道における「尿道抵抗」を評価する有用な手法を確立できた。男性における排尿障害の治療対象臓器は主に前立腺部尿道に集約されるので、本研究により同部の尿流動態を評価する手法が確立されたことは、排尿生理学的にも意義が深い。また同部は男性の生活の質に重要な排尿障害と性機能障害にも関連性が深く、前立腺部尿道における尿流動態の把握は診療の高度化に重要な役割を果たすと考える。本研究で重要な点は、渦流の可視化により、排尿障害の責任病変の部位が推定できると思われることである。さらに外科的治療が内視鏡視野下で行われることを考えた際、本研究で確立した内視鏡映像に基づく診断手法は臨床的な有用性が高いと考えられる。仮想空間上に男性下部尿路のモデルを作成し、流体解析ソフトを用いて前立腺部尿道における尿流動態を定常流及び非定常流の条件で解析した。前立腺肥大症では前立腺部尿道の遠位部背側に渦流が発生し、これが排尿エネルギーの損失に関連する事が示唆された。

尿道膀胱鏡ビデオ映像から尿道壁の振動を抽出し、フーリエ変換により振動周波数の解析を行い、8Hz付近に特有の周波数帯があること、および健常者と前立腺肥大症患者で差がある事を見出した。前立腺肥大症患者約40例のαー1ブロッカーを投与前、投与4週間後に尿道鏡を行い、尿道鏡映像から前立腺内腔の立体形状を再構築し、流体シミュレーションを行った。その結果、下部尿路モデルで見出した部位と同様の部位に渦流の発生を確認した。前立腺部尿道背側の拡張により、渦流の消失と流体エネルギー損失の改善が認められ、この程度が残尿量の軽減と相関する事を確認した。この研究成果は従来明らかでなかった、前立腺肥大症における排尿障害の発生機序を、世界で初めて前立腺部尿道局所の流体解析により明らかにしたものである。これにより今後排尿障害の原因部位の特定が可能になると思われる。このことは前立腺肥大症患者の治療法の選択や、現在より低浸襲治療法の開発及びオーダーメイド治療の可能性を示すものであり、前立腺肥大症診療に対して重要な意義があると考える。またこれに関連して、体腔内を多量の液体で満たした際の臓器周辺の流体シミュレーションを行い、手術操作が可能であることを確認し、動物実験でこれを検証した。当初の研究計画の1.内視鏡ビデオ映像処理により内腔の立体形状、弾性、尿道壁の振動周波数を抽出し、可変系モデルの作成、2.流体シミュレーションにより渦流の発生する部位、大きさ、対称性などの計測、3.渦流の性状と抵抗との関連性を求める、4.尿道壁の振動周波数と渦流の発生及び流体に対する抵抗の変化の解析、5.可変形モデルによる時系列での尿流変化と尿道抵抗の変化の検討、のうち、1、2、3、5.はある程度達成できた。5.の可変形モデルの作成と、これをもちいた非定常流での流体解析に関しては、可変形モデルでは非変形モデルでの計算結果より生理的に整合性のある結果が得られることが判明した。一方計算時間を考えると、臨床データの処理には非変形モデルでの計算結果を用いることが現実的と考えられた。1.2.に関して内視鏡ビデオ映像から再構築する尿道内腔の立体形状は、尿道の色調に影響を受けるので、より正確な計算にはこの補正が必要であることが判明した。尚、当初ブタの尿道をもちいた精度評価を考えていたが、尿道径が狭いこと、および内視鏡の準備が十分でないためまだできていない。また出血時の血液による「霞み除去」は赤血球と背景のヘモグロビンの色調の分離が難しく、達成できていない。代わりに灌流方向と液量の制御により視界の確保ができ、今後この方法を中心とする予定である。4.はこれまでの研究で、前立腺部尿道の振動抽出と排尿障害に関連性があると思われる低周波数帯域を推定できていたが、計測条件の影響を受けやすいため、膀胱とのコントラストが明瞭な膀胱頸部を対象として画像処理条件の変更を行った。その結果、安定した振動周波数抽出が可能となったが、周波数帯域が異なるようであり、再度データの集計を行っている。下部尿路モデルを用いて行った連成解析手法による、排尿時の下部尿路の変形と尿流変化の計算結果が、臨床データと整合性を持つことが確認できた。ヒト尿道膀胱鏡ビデオ映像の集積が順調に進み、約40例、80尿道のデータを解析する事が出来た。
原発性骨粗鬆症に対する骨密度・骨質同時評価によるテーラーメード治療の確立

家兎高ホモシステイン血症モデル(ヒト型骨質劣化モデル)を作製し、各種薬剤投与と骨質マーカー測定を施行した結果、我々が報告したヒト骨質劣化型骨粗鬆症と同様にホモシスティンがコラーゲンの架橋異常を惹起し、骨密度とは独立した機序で骨脆弱化をもたらすことが明らかになった。従って、骨質低下型の骨粗鬆症に対してはエストロゲン受容体モジュレーターの効果がより優れていることから、症例に応じた使い分けが必要と考える。これまでにヒト骨粗鬆症では,骨密度非依存性に骨折することが明らかとなり,骨密度以外の骨強度因子として骨質の重要性が指摘されている.我々は、ヒトと同様の骨質異常であるコラーゲンの架橋異常が誘導され、かつ骨密度の低下を伴わずに骨強度が低下する、すなわち、血中ホモシスティン高値を来す動物モデル(ラット,家兎)を確立した。さらに、同モデルに卵巣摘出を加えることにより「低骨密度+骨質劣化型」の骨粗鬆症モデルが誘導できることも明らかにした。そこで、本研究の目的は、ヒトに近い骨代謝動態(リモデリング骨)を示す家兎のヒト型骨質劣化モデルを用いて、テーラーメード治療の確立(薬剤の使い分け)を行うことにある。また、骨質評価マーカーとして確立した「血中ホモシスティン値」「血中および尿中悪玉架橋ペントシジン値」が、骨質改善の評価マーカーとしても有用であるかを検証する。成熟New Zealand白色家兎に卵巣摘出(OVX)或いはSham手術を施行し、それぞれ通常食群と1%メチオニン混餌群に分け、6ヵ月間飼育した後に、血中Hcys濃度、骨代謝マーカー、骨密度、骨強度、コラーゲン架橋(生理的架橋:未熟型,成熟型,非生理的架橋:老化型,AGEs架橋,ペントシジン)分析を行った。その結果、混餌投与群の血中Hcys濃度は、通常食群に比べて有意に高値を示し、我々が報告したヒト骨粗鬆症に類似した架橋異常が誘導されていた。さらに混餌群にOVXを加えると、架橋異常はさらに増悪した。また同モデルでは、骨密度の低下を伴わない骨強度の低下を生じた。高Hcys血症に伴う骨質低下モデルを初めて確立し、Hcysがコラーゲンの架橋異常を惹起し、骨密度とは独立した機序で骨脆弱化をもたらすことを明らかにした。これまでにヒト骨粗鬆症では、骨密度非依存性に骨折することが明らかとなり、骨密度以外の骨強度因子として骨質の重要性が指摘されている。我々は、ヒトと同様の骨質異常であるコラーゲンの架橋異常が誘導され、かつ骨密度の低下を伴わずに骨強度が低下する、すなわち、血中ホモシスティン高値を来す動物モデル(ラット,家兎)を確立した。本研究の目的は、ヒトに近い骨代謝動態(リモデリング骨)を示す家兎のヒト型骨質劣化モデルを用いて、テーラーメード治療の確立(薬剤の使い分け)を行うことにある。

成熟New Zealand白色家兎に卵巣摘出(OVX)或いはSham手術を施行し、それぞれ通常食群と1%メチオニン混餌群に分け、6ヵ月間飼育した後に、血中Hcys濃度、骨代謝マーカー、骨密度、骨強度、コラーゲン架橋(生理的架橋:未熟型,成熟型,非生理的架橋:老化型,AGEs架橋,ペントシジン)分析を行った。Met投与群では、血中ホモシステイン濃度は著しい高値を呈していた。大腿骨の骨密度および骨強度試験の結果、Met負荷群、OVX群、共に骨密度の低下や骨吸収の亢進を伴わない骨強度の低下をきたしており、骨質の低下がもたらされたと考えられた。同モデルの骨コラーゲン分析を行ったところ、高ホモシステイン血症を誘導した群では、我々が報告したヒト骨質劣化型骨粗鬆症と同様の架橋異常、すなわち、善玉架橋の低形成と悪玉AGEs架橋ペントシジンの過形成が誘導された。一方、OVX単独群で善玉架橋の低形成のみが誘導された。以上の結果より、高Hcys血症に伴う骨質低下モデルを初めて確立し、Hcysがコラーゲンの架橋異常を惹起し、骨密度とは独立した機序で骨脆弱化をもたらすことを明らかにした。
社会的に望ましい基準を満たす資源配分ルールの設計可能性の研究

今年度は、まず昨年度に引き続き、貨幣移転が可能な状況での非分割財の配分問題について、社会的に望ましい基準を満たし、かつ戦略的虚偽表明を防止する資源配分ルールの設計可能性について検討を行った。この問題は、住宅や周波数帯の利用権などの配分におけるオークション制度の設計に応用できる。特に、各個人が非分割財を最大1個まで消費でき、かつ個人の選好に所得効果が存在する状況での分析を行った。本研究では、戦略的虚偽表明の防止、効率性、個人合理性、および支払いの非負性の条件による競り上げ式配分ルール(競り上げ式オークションを用いて配分を行う配分ルール)の特徴付けを与え、この研究成果を、Social Choice and Welfare、およびInternational Young Economists'Conferenceなどの学会やセミナーで報告した。次に公共財の確率投票モデルの研究を行い、単峰選好より狭いMinimally Rich選好のクラスにおいて、確率一般化中位投票者ルールの戦略的虚偽表明の防止および全射性(効率性に関する条件)の条件による特徴付けを行った。また、Minimally Rich選好を含む選好クラスの中で凸選好のクラスが、上記の2つの条件に加え、拒否権投票者の不在の条件を満たす投票ルールが存在する唯一の最大定義域であることを示した。さらに、個人が単峰な選好を持つ場合の同質な非分割財の確率配分問題において、戦略的虚偽表明の防止と効率性の条件を満たす配分ルールのクラスを特徴付けた。また、これまで研究を行ってきた複数の分割可能財の配分問題についても、一様ルールの戦略的虚偽表明の防止、全会一致性、対称性、および非介入性の条件による特徴付けの研究をまとめた論文の改訂を行った。今年度は、分割可能な私的財の配分問題において、社会的に望ましい基準を満たす資源配分ルールの設計可能性について研究を行った。本研究では、複数の分割可能な私的財が存在し、各個人がその財の消費量について連続、強凸および分離可能な選好を持っている場合の配分問題について特に分析を行った。そして、戦略的虚偽表明の防止(全ての個人にとって、自分の真の選好の情報を表明することが弱支配戦略であることを要求する条件)、全会一致の尊重(全ての個人に最も望ましい消費量を配分することが可能な場合には、実際にその配分を行うことを要求する条件)、対称性(同じ選好を持つ個人には、無差別な消費量を配分しなければならないことを要求する条件)、および非介入性(どの個人も自分の選好表明を変えることによって、自分の消費量を変化させることなく他の個人の消費量を変えられないことを要求する条件)の条件を満たす資源配分ルールについて主に検討した。本研究によって、複数財かつ複数の個人が存在する配分問題において、一様ルールが戦略的虚偽表明の防止、全会一致の尊重、対称性、および非介入性を満たす唯一の資源配分ルールであることが明らかとなった。また、各個人が財の消費量について単峰な選好を持っている場合の複数財の配分問題においても同様の結果が成立することを明らかにした。今年度は、貨幣移転が可能な状況での非分割財の配分モデルにおいて、社会的に望ましい基準を満たし、かつ戦略的虚偽表明を防止する資源配分ルールの設計可能性について主に検討を行った。本研究は、住宅や周波数帯の利用権などの配分におけるオークション制度の設計に応用することを目的としている。これまで個人の選好に所得効果が存在しないと仮定した場合の研究は盛んに行われており、特にHolmstrom(1979)によって、戦略的虚偽表明の防止、パレート効率性、および個人合理性(個人の自発的参加を促すための条件)の条件によるVickrey配分ルールの特徴付けが与えられている。しかしながら、これらの結果は個人の選好に所得効果が存在するような状況には適用できない。単一需要かつ財が1種類のみ存在する状況では、所得効果を考慮に入れた場合でも、上記と同様の結果が得られることがSakai(2007)およびSaitoh and Serizawa(2007)によって明らかにされているが、複数種類の非分割財が存在する状況での検討は行われておらず、結果の現実経済への応用は限定される。そこで本研究では、単一需要かつ複数種類の非分割財と選好に所得効果が存在する状況での配分ルールの設計可能性について検討し、これまでに2財のケースにおいて、競り上げ式配分ルール(競り上げ式オークションを用いて配分を行う配分ルール)が戦略的虚偽表明の防止、パレート効率性、個人合理性、および支払いの非負性の条件を満たす唯一の配分ルールであることを示した。

また、Minimally Rich選好を含む選好クラスの中で凸選好のクラスが、上記の2つの条件に加え、拒否権投票者の不在の条件を満たす投票ルールが存在する唯一の最大定義域であることを示した。さらに、個人が単峰な選好を持つ場合の同質な非分割財の確率配分問題において、戦略的虚偽表明の防止と効率性の条件を満たす配分ルールのクラスを特徴付けた。また、これまで研究を行ってきた複数の分割可能財の配分問題についても、一様ルールの戦略的虚偽表明の防止、全会一致性、対称性、および非介入性の条件による特徴付けの研究をまとめた論文の改訂を行った。
マグネシウム・カルシウム同時可視化蛍光分子プローブの創製と細胞イメージング測定

細胞内シグナル伝達は多数の分子の動態からなり、それらを解析するマルチカラーイメージングは進歩しつつある。そこで、多数のセンサーを細胞に導入するときの欠点(スペクトルの重なり、代謝や分解、局在の違い、毒性)を低減する必要がある。ここでは、一分子のセンサーでの細胞内多数物質同時定量を目指したプローブを提案する。その最初の例として、シグナル伝達物質として重要なCa2+,であり、様々な状況の補因子として機能するMg2+の相関に焦点を当て、マグネシウムとカルシウムを同時に可視化する蛍光プローブ(カルシウムマグネシウムマルチ蛍光プローブ)の開発を行った。カルシウムマグネシウムマルチ蛍光プローブKCM-1は、カルシウムイオンを認識する部位としてBAPTA、マグネシウムイオンを認識する部位としてチャージドβジケトン構造を有し、それがD-A型蛍光団であるクマリンに存在することで、カルシウムとマグネシウムに対して逆の応答を示すように設計された。KCM-1は、吸収スペクトルにおいて、Ca2+と応答して35nmのブルーシフト、Mg2+と応答して20nmのレッドシフトを示した。励起波長を変えることでそれぞれの応答を異なるスペクトル変化として出力可能であり、また蛍光比をとり解析することで指示薬濃度の影響を受けずに、Ca2+およびMg2+濃度を定量できる。また、細胞膜を透過可能なアセトキシメチル体を合成し、PC12細胞において、世界で初めての単分子のセンサーによる細胞内Ca2+とMg2+の同時イメージングを実現した。さらに、細胞をFCCPなどで刺激することによる、細胞内カルシウムマグネシウムの動態のイメージングに成功した。(論文投稿中)本研究に関係し、論文6報、和文の解説文1報が報告された。1報は投稿中である。また、関連した研究がアメリカの一般科学雑誌に紹介された。さらに、設計、合成した蛍光プローブの特性や基礎的な細胞応用例などに関して、国際学会8件、国内学会20件の発表を行った。当初の計画通りの研究が完了した。新規な蛍光プローブを利用した細胞内シグナルの解明が進んでいくことを期待する。1報は投稿中である。本年度は、これまでに開発したマグネシウム蛍光プローブ(KMG-20、KMG-29など)を改良したKMG-104の設計・合成し、その特性について評価した。KMG-104は、マグネシウムイオンと高選択的に錯形成するβ-ジケトン部位と、蛍光発色団としてフルオレセインを併せ持つ骨格を有している。マグネシウムイオンと錯形成することにより、光誘起電子移動が阻害され、蛍光強度が増加するように設計している。KMG-104とマグネシウムイオンおよび他のアルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオンとの錯形成挙動について、吸収スペクトルおよび蛍光スペクトル測定を用いて評価した。KMG-104はマグネシウムイオンと錯形成した時のみ、蛍光強度の大幅に増加した。一方、妨害となるカルシウムイオンおよびナトリウムイオン、カリウムイオンなどを添加した時、蛍光スペクトルは全く変化しなかった。マグネシウムイオンおよびカルシウムイオンの解離定数を算出したところ、それぞれ4.0mM、16.0mMであり、カルシウムイオンに対して約4倍の選択性を有していた。次にKMG-104のカルボキシル基をアセトキシメチル化した後、DMSOに溶解し、この溶液を生細胞の培養液に添加することにより、KMG-104を生細胞中に投与した。蛍光顕微鏡を用いて観察したところ、KMG-104は細胞質に均一に分散していた。ここに細胞内のマグネシウムイオン濃度を増加させる刺激を与えると、蛍光強度は時間の経過と共に増加した。またこの様子は、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡を用いて観察することに成功した。

生細胞ではイオン、蛋白質をはじめとした多くの物質が、互いに協同的かつ連鎖的に作用することにより、細胞の機能を正常に維持している。このうちマグネシウムイオンとカルシウムイオンとの関係では、互いに拮抗し合い、マグネシウムは細胞内のカルシウムを取り出す様に働き、さらに動脈硬化の原因となるカルシウムの蓄積にもマグネシウムが関与していることが知られている。そこでカルシウムイオンとマグネシウムイオンとの協同的な作用の可視化を目的として、本年度はマグネシウムイオンとカルシウムイオンの同時認識可視化定量を可能にする分子プローブ(KCM-1)を設計・合成し、その特性を評価した。KCM-1は、マグネシウムイオンと高選択的に錯形成するβ-ジケトン部位、カルシウムイオン認識部位としてBAPTA構造、蛍光発色団としてクマリンを併せ持つ骨格を有している。KCM-1とマグネシウムイオンおよびカルシウムイオンとの錯形成挙動について、吸収スペクトルおよび蛍光スペクトル測定を用いて評価した。その結果、KCM-1の極大吸収波長は400nmであり、Ca^<2+>と錯形成すると360nmにブルーシフトし、Mg^<2+>と錯形成すると420nmにレッドシフトした。さらにCa^<2+>およびMg^<2+>濃度を変化させた際のKCM-1の蛍光強度変化から、短波長側で励起させることによりCa^<2+>の濃度を、長波長側で励起させることでMg^<2+>の濃度を定量することができた。今後、細胞に投与した後、蛍光顕微鏡を用いて、動的測定を行う。本年度は、これまでのマグネシウムプローブを改良した化合物の合成及びマグネシウムとカルシウム同時イメージング用プローブの大量合成と性能評価、バイオ応用までの完成を目指した研究を行った。昨年の結果から、マグネシウムイオン及びカルシウムイオンに同時に応答する有効な構造は明らかとなったマグネシウムイオンを認識する部位としてのβ-ジケトン骨格、カルシウムイオンを認識する部位としてBAPTA型構造を併せ、蛍光団としてクマリンを導入したKCM-1を大量合成した。設計通り、マグネシウムイオンがβ-ジケトン部位に配位すると、蛍光スペクトルが長波長側にシフトし、カルシウムイオンがBAPTA部位に配位すると短波長側にシフトし、各金属イオン濃度は、3次元的検出線により決定できた。次に、KCM-1を用いた細胞測定を行った。細胞に導入する際には、培養液から細胞膜への移行を容易にし、細胞膜近傍で細胞内のエステル加水分解酵素によって加水分解するように、プローブ中のカルボキシル基にアセトキシメチル基を導入し、脂溶性化合物から水溶性化合物への変換を容易にする構造とした。KCM-1と比較しながら細胞培養液に添加し導入して、マグネシウムとカルシウムの動態解析をPC-12細胞で行ったところ、期待通りにマグネシウムとカルシウムの同時イメージングが達成された。
生体膜を範とする金属認識機能場の構築

1.研究の目的天然生体膜や金属酵素系に見られるような金属錯体形成に基づく特徴ある化学反応系の開発には、活性中心となる金属錯体自身の特性化とともに、高度な分子認識を可能とする特異的な分子環境の構築が不可欠である。本研究では、従来より知見の乏しい金属錯体を認識する反応系の設計・開発を目指して、生体膜類似合成脂質膜および酵素リパーゼを活用する金属錯体の認識とその応用において、以下の成果をおさめた。2.研究成果の要約(1)生体膜類似膜を活用する金属錯体認識場の構築脂溶性環状配位子を溶解・担持した脂質二分子膜複合系が、水溶液中で高選択的な金属錯体形成を行なう新しい「分子環境場」を提供することを見い出した。これによって、銅・ニッケル・コバルト・亜鉛イオンの混合水溶液中から銅イオンのみを養択的に分離できることを明らかにした。(2)天然酵素リパーゼを活用する金属錯体認識場の構築天然酵素リパーゼは生体内基質のみらなず種々のエステル化合物を加水分解することが知られているが、本研究においてはじめて金属錯体を立体選択的に加水分解することを見い出した。これによって、分子認識素子として注目される光学活性クラウンエーテルの新しいア成ルートを確立した。
骨吸収抑制ペプチドを徐放するナノゲルを臨床応用する為の検討

ポストゲノム時代において、タンパク質の結晶構造解析情報をもとにペプチド薬を設計する機会が増えてきている。ところが、ペプチド自体、易分解性であり、安定性に欠け、実際の臨床応用に際して障害が多い。我々はペプチド薬の臨床応用のために、骨破壊を抑制するW9ペプチドを用い、ペプチド薬をコントロールリリースできる担体を検討した。本研究により、ペプチドの担体として、コレステロールとプルランとの合成体であるCHPナノゲルがペプチドの担体として使用できる性質を持ち合わせていることを明らかにできた。我々は、W9ペプチドが抗炎症作用と骨吸収抑制作用を兼ね備えた炎症性骨吸収抑制薬として働くことを報告した(J.Clin Invest.116(6):1525-1534,2006,Arthritis Rheum.56:1164-1174,2007)。このW9ペプチドの臨床応用を考えたとき、W9ペプチドの半減期の短さや酸性下における不安定性が問題となる。本研究の目的は、これらの問題点を克服するため、ナノゲルとW9ペプチドとの複合体を作成し、徐放性があるか否かまた、酸性下でも安定しているか否かを検討するところにある。W9ペプチドは、単独であると溶液のpHが7.0を下回ると明らかに沈澱してくるが、今回、W9ペプチドとナノゲルとの複合体を作成すると酸性環境下でも沈澱は起こらないことが確かめられた。また、徐放性に関してはW9単独であると3時間おきに投与しなければ低カルシウム食飼育マウスの骨量減少を抑制することはできないが、CHPナノゲルを用いると同じマウスの骨吸収モデルにおいて一日2回投与で骨吸収抑制効果を認めた。このことから、酸性環境下におけるW9ペプチドの安定性は改善し、ナノゲルと組み合わせて複合体を作製することにより、徐放性が発揮されることが明らかになった。今回用いた濃度は1回24mg/kg/dayと比較的高い薬物投与量で効くことが示されたが、現在行っている違うタイプのナノゲルを用いると浸透圧ポンプに匹敵する徐放性を示すことが明らかになってきている。本実験の目的は、すでに骨吸収抑制効果および炎症抑制効果が明らかとなっているW9ペプチド(Aokiet al. J Clin Invest 116(6):1525-1534, 2006, Saito et al. Arthritis Rheum. 56:1164-1174,2007)を臨床応用する為に、ナノゲル/W9ペプチド複合体が徐放性ポンプを使用しなくても骨破壊を抑制できるか否かを明らかにすることにある。昨年の実績より、CHPナノゲルとW9ペプチドとの複合体がW9単独投与と較べて4分の一の投与量で効果があることがわかったが、さらにより良いコントロールシステムの構築のために、ナノゲルの一種であるハイドロゲル(CHP nanogel cross-linking hydrogel (CHP-PEG hybrid nanogels))を用いて、前年度と同様に低カルシウム食飼育マウスを用いた実験を行った。2mg/kg/day,10mg/kg/dayの投与量で7日分のW9量を含有させたハイドロゲルをマウスの皮下に埋めた群、ハイドロゲルだけ埋めた群、W9だけ投与した群を比べてみると、低カルシウム食飼育によって減少した骨密度を10mg/kg/dayのW9ペプチドを含有したハイドロゲルを埋めた群のみ、回復させることができた。骨形態計測法による解析の結果、骨量の変化も骨密度と同様な結果が得られ、低カルシウム食飼育による破骨細胞数の増加も10mg/kg/dayのW9を含有させたハイドロゲルを皮下に埋めた群では、正常カルシウム食群と有意差がないレベルまで減少していた。昨年行ったCHPナノゲルを皮下に投与する実験では、一日の投与量が減ったとはいえ、48mg/kg/dayの投与量が必要であったが、今回はその4分の一以下の投与量で骨吸収抑制効果が発揮されたことになり、W9ペプチド単独投与による大量頻回投与に比べると、16分の一以下の用量で効果を発揮することが明らかとなった。現在まだ新しいタイプのナノゲルも合わせて、将来の臨床応用に向けて検討中である。
ザリガニ歩行運動の自発的開始にかかわる中枢神経機構の神経生理・解剖学的解析

ザリガニの自発的な歩行運動の脳内シナプス機構を明らかにする目的で、歩行の開始に先行して、あるいは、歩行開始時にシナプス活動を示すニューロンを探索し、その樹状突起投射部位を調査した。その結果、主に前大脳に投射する複数のニューロンを同定することができた。歩行開始に数100ミリ秒先行してスパイク活動を示すニューロンは、脱分極性の電流注入によって実験的に活動させても、歩行運動を引き起こした。このニューロンは、細胞体および樹状突起は脳内に持たず、軸索のみを前大脳に投射する上行性介在ニューロンであった。このニューロンは、機能的には従来知られている司令ニューロンに対応すると考えられる。また、同様に歩行に先行する下行性介在ニューロンも同定された。これらの下行性ニューロンは、樹状突起を前大脳、とくに中心体や内側ニューロパイルに投射していた。尾部刺激で引き起こされる歩行にも先行して活動上昇を示したが、その先行時間は、自発性歩行開始の場合と較べて短かった。個々のニューロンを細胞内電流注入で実験的に興奮させても、いずれでも行動出力は観察されなかった。この結果は、これらの下行性ニューロンが集団として歩行運動開始に関わる可能性を示唆しており、今回同定した上行性ニューロンとは対照的であった。一方、歩行開始とともに賦活されるニューロンは多数見出された。これらのニューロンは機能的に多様なものを含むと考えられるが、感覚刺激に対しては明確な応答を示さないグループは、歩行運動の維持に関わると推定された。これらのニューロンも、その樹状突起を前大脳内側ニューロパイルに投射していた。これらの結果は、1)自発性の歩行開始は刺激誘発性の歩行開始とは異なる脳内機構に基づくこと、および2)自発性歩行の開始に関わる特異的な脳内部位として前大脳内側ニューロパイルがあげられること、等を示唆している。本年度は、歩行運動にかかわる脳内ニューロンの活動を記録するためのトレッドミル装置を制作するとともに、自発的な歩行運動の開始時点を定義するための客観的基準を歩脚からの筋電図を用いて確立した。トレッドミルの動き検出システムに光学マウスを用いることにより、これまで以上の制度でザリガニの動きを記録することが可能となった。また、このトレッドミルは、ザリガニの動きに合わせてガラス管微小電極とそれを保持するマニピュレーターも動くよう工夫したため、脳内ニューロンからの長時間にわたる細胞内記録が可能となった。歩行の開始時点を客観的に確定することが可能かどうかを明らかにする目的で、8本の歩脚すべてから筋電図(長節屈筋)記録を行い、接地していない条件および接地している条件で、自発的に脚のステッピング運動が開始される時の筋活動を解析した。その結果、自発的な歩行運動の開始(歩脚のステッピング運動の開始)に先立って、すべての歩脚でほぼ同時に(接地条件下で約0.1秒以内)筋活動が持続的に上昇することが判明した。ステッピングのための律動的筋活動は、この後に続いて起こるが、前・後方歩行によってそれぞれ特定の歩脚からステッピングが起こることが判明した。この結果は、歩行運動の自発的開始を定義するには、どの歩脚から筋電図記録を取ることによっても可能であることを示している。また、歩行運動で見られる左右歩脚のステッピング運動は、無接地条件下では見られず、接地条件下でのみ確認された。この結果は、歩行運動パターンの形成に接地にともなう感覚信号が重要な働きをしていることを示す。トレッドミル上での実験は、接地条件下で行われる。約0.1秒の誤差の中で歩行運動開始時点を特定できることを示した今年度の研究成果は、次年度に行う自発的歩行開始に関わる脳内ニューロンの検索のための基礎となるもので、本研究計画でのその異議は極めて大きい。

これらのニューロンも、その樹状突起を前大脳内側ニューロパイルに投射していた。これらの結果は、1)自発性の歩行開始は刺激誘発性の歩行開始とは異なる脳内機構に基づくこと、および2)自発性歩行の開始に関わる特異的な脳内部位として前大脳内側ニューロパイルがあげられること、等を示唆している。
ヘミングウェイ博物館蔵書の「書き込み」判読研究

本研究の具体的内容は、キューバのヘミングウェイ博物館でデジタル撮影したアイテム1339点の「書き込み(marginalia)」資料の1判読、2分析と考察、3分析結果の編集と公開である。また、その意義はこれら未公開資料を公開する受け皿を作ることで世界中のヘミングウェイ研究者に新たな一次資料を提供することであり、ヘミングウェイ研究に「蔵書研究」という新たな研究手法を提案する点で重要である。当初設定していた、「デジタル化とPDF編集まで終えた現在未公開の書き込み資料に対して本格的な分析と考察を加える試みであり、この試みによってこれまで知られていなかったヘミングウェイの対人関係および知的活動の記録を明らかにする」という目的に照らし、以下の成果があった。1判読:ヘミングウェイ直筆の書き込みの判読ほぼ100%完了、2分析・考察:資料の「小切手記録帳」に関する考察をおこなった、32に関して論文を執筆、学部紀要に掲載された。ヘミングウェイ直筆の「小切手簿」の判読と分析から、このころのヘミングウェイの銀行預金、前妻の子供たちへの教育費、さらに所得税の分割払いや出版社からの前借りなど、家計に関わるさまざまな実生活が垣間見える。狩猟や海釣り、豪華なパーティーなど私生活の豪胆なイメージとは異なる、家計における誠に堅実なヘミングウェイの一面が明らかとなった。ヘミングウェイによる主要な書き込みの判読が完了したことで、本研究の目的はほぼ達成されたと言ってよいが、それ以外の書き込みの判読、および判読内容に基づいた伝記的、文学的研究をさらに進めていく予定である。キューバ側の事情により、未だ全資料を公開するための環境が整備できていないのが残念である。本研究の具体的内容は、キューバのヘミングウェイ博物館でデジタル撮影したアイテム1247点、画像総数7537点からなる蔵書の「書き込み(marginalia)」資料の1判読、2分析と考察、3分析結果の編集と公開である。当初設定していた、「デジタル化とPDF編集まで終えた現在未公開の書き込み資料に対して本格的な分析と考察を加える試みであり、この試みによってこれまで知られていなかったヘミングウェイの対人関係および知的活動の記録を明らかにする」という目的は、部分的には達成されたと言ってよい。例えば、ヘミングウェイ所蔵の地図類を中心に判読を進めた結果、ヘミングウェイの私生活におけるドライブ移動の軌跡が部分的に明らかになった。「行動の作家」と称されたヘミングウェイが、アメリカの社会的文化的アイコンでもある自動車という移動媒体を、北米大陸の生家や別荘、米国最南端のキーウェスト、さらに海を隔てたキューバのそれぞれの拠点をどのように移動し、家族との記憶の痕跡として創作に反映させていたかについて、その諸相の一端を明らかにすることができた。この点については2017年4月開催予定の日本アメリカ文学会中部支部大会および同年6月キューバのヘミングウェイ博物館主催のアーネストヘミングウェイ国際会議にて発表を予定しいている。「研究実施計画」に照らすと28年度中に339アイテムの判読を終えている予定であったが、100アイテムの判読分析にとどまった。この遅延を解消べく29年度30年度では更なる巻き返しを図る。その理由は学部の新設と初年度運営に係るさまざまな校務により、十分な研究時間が獲得できなかったことによる。また、キューバのヘミングウェイ博物館との出版交渉に係る手続きが文化遺産評議会の応答を待つ形でしか行えないため、協働すべき箇所での連携が図りずらいという問題も重なった。この点については2017年4月開催の日本アメリカ文学会中部支部大会および同年6月キューバのヘミングウェイ博物館主催のアーネストヘミングウェイ国際会議にて発表した。「研究実施計画」に照らすと29年度までに7割のアイテムを判読し終えている予定であったが、判読が極めて困難なアイテムもあり、5割の判読分析にとどまった。

平成30年度での完了が危ぶまれる場合には、引き続き科研に継続申請する予定である。「研究実施計画」に照らすと7割の判読を完了していなければならないが、実際は5割にとどまった。その理由は次の3点。1判読が極めて困難なアイテムに多くの時間を割かねばならなかった2校務により、長期の海外出張が不可能だった3情報インフラのためか、電子メールでのヘミングウェイ博物館との円滑なコミュニケーションが図りづらいというキューバ側の事情もあった。本研究の具体的内容は、キューバのヘミングウェイ博物館でデジタル撮影したアイテム1339点の「書き込み(marginalia)」資料の1判読、2分析と考察、3分析結果の編集と公開である。また、その意義はこれら未公開資料を公開する受け皿を作ることで世界中のヘミングウェイ研究者に新たな一次資料を提供することであり、ヘミングウェイ研究に「蔵書研究」という新たな研究手法を提案する点で重要である。当初設定していた、「デジタル化とPDF編集まで終えた現在未公開の書き込み資料に対して本格的な分析と考察を加える試みであり、この試みによってこれまで知られていなかったヘミングウェイの対人関係および知的活動の記録を明らかにする」という目的に照らし、以下の成果があった。1判読:ヘミングウェイ直筆の書き込みの判読ほぼ100%完了、2分析・考察:資料の「小切手記録帳」に関する考察をおこなった、32に関して論文を執筆、学部紀要に掲載された。ヘミングウェイ直筆の「小切手簿」の判読と分析から、このころのヘミングウェイの銀行預金、前妻の子供たちへの教育費、さらに所得税の分割払いや出版社からの前借りなど、家計に関わるさまざまな実生活が垣間見える。狩猟や海釣り、豪華なパーティーなど私生活の豪胆なイメージとは異なる、家計における誠に堅実なヘミングウェイの一面が明らかとなった。ヘミングウェイによる主要な書き込みの判読が完了したことで、本研究の目的はほぼ達成されたと言ってよいが、それ以外の書き込みの判読、および判読内容に基づいた伝記的、文学的研究をさらに進めていく予定である。キューバ側の事情により、未だ全資料を公開するための環境が整備できていないのが残念である。28年度で生じた実施計画上の遅れは、29年度と30年度を軸に下記のように計画修正する。29年度:620アイテム、30年度:620アイテム学部運営も2年目に入り、判読作業により多くの時間を増やすことが可能になると思われる。この平成30年が研究の最終年度であるため、判読作業に努力を傾注する。また、現在進めているNHKとのプロジェクト化を実現し、判読成果を日本のアーカイブとして発信できるよう整備していきたい。報告者による提案事項に対するキューバの文化遺産評議会からの応答の遅延、およびそれに伴うヘミングウェイ博物館の協働体制の不備などが原因で、判読にかかる経費および旅費の出費が執行されなかったため。次年度使用額が生じた理由としては、当該年度において、プロジェクトに関わるキューバ海外出張の調整ができなかったことによる。しかしながら、次年度はキューバの博物館とのミーティングのための訪玖渡航費用も含め、プロジェクトの成果を配信する媒体に助成金を使用する予定である。
幹細胞を用いた上皮間葉相互作用の解明と歯硬組織の再生

3.上皮間葉相互作用を解析するために、ヒト歯髄細胞とヒト歯肉細胞または、ヒト歯髄細胞とヒト上皮細胞を共培養し、細胞の石灰化能を観察した。その結果、共培養群では単独培養群と比べて石灰化の増大が観察された。またRT-PCRにより、DSP,Osteocalcinの発現が認められた。平成17年度の研究実績として、ヒト歯髄組織の分離を行いコラゲナーゼとディスパーゼを用いた酵素処理によりヒト歯髄組織中の細胞を分離した。細胞培養を行い継代数とコロニー形成率の観察を行っている。またBone sialoprotein(BSP),Dentinmatrix protein(DMP1),type 1 Collagen, Dentinsialoprotein(DSP), Osteopntin(OPN)を用いた免染組織染色を行っている。さらにテロメラーゼ活性を測定するためにTRAPアッセイを行っている。これらの実験結果についてサンプル数を増やし追加実験を行っている。幹細胞の特性の一つである細胞の分化能を調べるため、採取した細胞に分化培地を用いた。用いた分化培地は、石灰化形成を誘導する培地である。その結果、アリザリンレッド染色において陽性を示した。ヒト歯肉組織より分離しコラゲナーゼを用いた酵素処理によりヒト歯肉組織中の細胞を分離した。細胞培養を行い継代数とコロニー形成率およびTRAPアッセイの実験を行っている。これらの実験結果についてもサンプル数を増やし、さらに追加実験を行っている。また、分化誘導培地による石灰化形成の誘導を行った結果、ヒト歯髄細胞と同様に陽性であった。上皮間葉相互作用の解明のため、ヒト歯肉由来上皮細胞とヒト歯肉線維芽細胞を分化培地で共培養し細胞の石灰形成能を観察した。石灰化をアリザリンレッド染色で観察した結果、共培養群では単独培養群と比べ石灰化の促進がみられた。この現象は、ヒト歯肉由来上皮細胞とヒト歯髄細胞を共培養した群でも観察された。昨年の秋、第47回歯科基礎医学会学術大会(宮城県仙台国際センター)へ「ヒト歯肉由来上皮細胞と線維芽細胞およびヒト歯肉由来上皮細胞と歯随細胞の共培養による石灰化の促進」として研究結果の発表を行った。1.ヒト歯髄をコラゲナーゼとディスパーゼを用いて分離し、綴代培養を行いコロニー形成率の観察を行った。また、これらの細胞についてRT-PCRを行いbonesialoprotein(BSP), typel collagen, alkal ine phosphatase(ALP)の発現を確認した。BSPの発現はウエスタンブロッティンにおいても確認した。次に、幹細胞の特徴の一つである多分化能を解析するため、細胞を分化培地で培養したところ、石灰化能が観察され、かつ脂肪細胞や神経細胞に分化することを観察した。免疫不全マウスを用いたin vivo実験においてハイドロキシアパタイト/リン酸三カルシウムと共に皮下移植を行った。移植片はH-E染色より象牙質様硬組織と歯髄様組織が確認された。2.ヒト歯肉をコラゲナーゼを用いて分離し、これらの細胞についてRT-PCRを行いBSP, typel collagen, ALPの発現を確認した。BSPの発現はウエスタンブロッティングにおいても確認した。ヒト歯髄細胞と同様の分化培地を用いてヒト歯肉の石灰化能を観察できた。移植片はH-E染色より硬組織形成は確認されなかった。3.ヒト歯肉上皮細胞のRT-PCRを行いBSP, typelcollagen, ALPの発現を確認した。さらに、免疫不全マウスを用いたin vivo実験においてハイドロキシアパタイト/リン酸三カルシウムと共に皮下移植を行った。4.上皮間葉相互作用を解析するため、ヒト歯肉上皮細胞とヒト歯肉線維芽細胞を分化培地で共培養し、細胞の石灰化能を観察した。その結果、共培養群では単独培養群と比べて石灰化の促進がみられた。この現象は、ヒト歯肉上皮細胞とヒト歯髄細胞を共培養した群でも観察された。また、いずれの共培養群においても、リンとマグネシウムの他に、カルシウムの顕著な集積がElectron probe micro analysis(EPMA)により観察された。
細胞膜型アミノ酸センサーの分子同定と機能解析

哺乳類においては、細胞がアミノ酸供給量を感知する機構は明らかにされていない。本研究は、アミノ酸により哺乳類培養細胞に惹起される細胞増殖促進およびp70S6 kinaseのリン酸化には、アミノ酸トランスポーター阻害により抑制されるものと抑制されないものがあることを明らかにし、新たな細胞膜型アミノ酸センサーの存在を示した。また、細胞膜型アミノ酸センサーはCa^<2+>シグナル系に連結する可能性を示した哺乳類においては、細胞がアミノ酸供給量を感知する機構は明らかにされていない。また、細胞膜型アミノ酸センサーはCa^<2+>シグナル系に連結する可能性を示した本研究は、細胞膜型アミノ酸センサーの分子実体を解明し、その代謝調節における役割を明らかすること目的とするものである。研究初年度にあたる平成19年度は、細胞膜型アミノ酸センサーの分子実体解明に向けて、以下の解析を行った。(1)培養細胞系における細胞膜型アミノ酸センサーの解析。アミノ酸枯渇状態で維持したHeLa-S3細胞がロイシンを高親和性に感知し増殖速度を変えること、及び同細胞がインヒビターBCHによるアミノ酸トランスポーターの抑制により、p70S6 kinaseのリン酸化で評価したmTORシグナル系の活性を変えることを見いだし、その定量的特性を明らかにした。また、HEK293細胞も同様にロイシンに応答するが、それはBCHにより影響を受けないことが明らかになり、細胞膜型アミノ酸センサーのモデル細胞としてのHeLa-S3細胞の特徴を浮き彫りにした。さらに、アミノ酸枯渇状態で維持したHeLa-S3細胞は、ロイシン添加により細胞内Ca^<2+>動員が起こることをCa^<2+>感受性色素fluo-4負荷により明らかにした。これは、HeLa-S3細胞の細胞膜型アミノ酸センサーは、Ca^<2+>動員に導くGタンパク質共役型受容体であることを示唆するものである。(2)アフリカツメガエル卵母細胞を用いた機能発現クローニング。飢餓状態で維持したHEK293細胞からpoly(A)^+RNAを抽出し、アフリカツメガエル卵母細胞に注入することにより発現させ、膜電位固定下で細胞外から与えたロイシンに対する膜電流変化を観察したところ、ロイシンよる内向き電流が観察された。これは、細胞内Ca^<2+>動員を生じる受容体はアフリカツメガエル卵母細胞に発現させると同様に細胞内Ca^<2+>上昇を引き起こし、細胞膜のCa^<2+>感受性C1^-チャネルを活性化するためと考えられる。本応答を指標にアフリカツメガエル卵母細胞を用いた機能発現クルーニングを進行させている。本研究は、細胞膜型アミノ酸センサーの分子実体を解明し、その代謝調節における役割を明らかすること目的とするものである。平成20年度は、細胞膜型アミノ酸センサーの分子実体解明と細胞内シグナル機構との連関について、以下の成果を得た。(1)培養細胞を用いた細胞膜型アミノ酸センサーの解析。アミノ酸枯渇状態で維持したHEK293T細胞は、ロイシン添加に対して、細胞増殖応答を示すが、これはアミノ酸トランスポーターのインヒビターBCHにより抑制されなかった。同様に、ロイシン添加は、p70S6kinaseのリン酸化を亢進させるが、これはBCHにより抑制されなかった。従って、HEK293T細胞においては、細胞膜型アミノ酸センサーが細胞のアミノ酸応答に主要な寄与をしていることが示された。数種の細胞株において同様な検討を行ったところ、p70S6kinaseのリン酸化がBCHにより抑制される細胞と抑制されない細胞に分類され、細胞内センサーと比較しながら細胞膜型センサーの解析を進めるモデル系を確立できた。(2)アミノ酸によるCa^<2+>動員の解析。アミノ酸枯渇状態で維持したHEK293T細胞は、ロイシン添加により細胞内Ca^<2+>動員が起こることをCa^<2+>感受性色素を用いたCa^<2+>イメージングにより明らかにした。アミノ酸によりCa^<2+>動員が起こることは、細胞膜型センサーがGタンパク質共役型受容体であることを示唆するものである。Ca^<2+>動員と上記p70S6kinaseのリン酸化との関連性については今後の検討課題であるが、新しいシグナル系の存在を強く示唆す成果である。(3)アフリカツメガエル卵母細胞を用いた機能発現。飢餓状態で維持したHEK293細胞からpoly(A)^+RNAを抽出し、アフリカツメガエル卵母細胞に発現させ、膜電位固定下で細胞外からロイシンを与えると内向き電流が観察された。この電流の濃度依存性が確認され、細胞膜型アミノ酸センサーがロイシンを感知したことによる電流であることが示された。
カイコタンパク質翻訳機構の改変による非天然アミノ酸含有シルクタンパク質の創製

カイコが産生するシルクタンパク質に対してピンポイントな化学反応(クリック反応)が可能な非天然アミノ酸を導入する手法を開発し、医工学分野などへ高機能なシルクタンパク質材料を提供するための技術基盤を構築することを目的に研究を進めた。その結果、カイコの遺伝子組換え技術を利用し、クリック反応が可能なアジド基を有する非天然アミノ酸(AzPhe)をシルクタンパク質中に導入することに成功した。実際に、水溶液やフィルムなど異なる形態において、クリック反応によりシルクタンパク質中のアジド基を選択的に反応させられることを確認した。これにより、高機能なシルクタンパク質材料を作出するための技術基盤を構築できた。本研究では、カイコ幼虫個体のタンパク質翻訳機構を改変し、高選択的な化学反応が可能な非天然アミノ酸を含有するシルクタンパク質を創製する。具体的には、1カイコ培養細胞で成功したタンパク質翻訳機構の改変がカイコ幼虫個体でも可能かどうか、2選択的な化学反応が可能な非天然アミノ酸をシルクタンパク質へ高効率に導入できるかどうか、という2点を明らかにすることを主な目標とし、本年度は、以下の4点を実施した。(1)フェニルアラニン(Phe)の類縁体を認識可能なカイコ由来フェニルアラニル-tRNA合成酵素(PheRS)の変異体(A450G)を絹糸腺で発現する遺伝子組換え(GM)カイコを作出し、PheRS変異体遺伝子をホモで有する系統を確立した。(2)具なるアミノ酸置換を有するカイコ由来PheRS変具体(T407A)をカイコ培養細胞で発現させることで、A450G変異体では取り込まれなかったパラ位にブロモ(Br)基を有するPhe類縁体がタンパク質中に取り込まれることを明らかにした。(3)カイコ由来PheRS変異体(T407A)を絹糸腺で発現するGMカイコの作出に着手した。(4)メチオニン(Met)を基質とするカイコ由来メチオニル-tRNA合成酵素(MetRS)の3アミノ酸変異体を新たに作製し、そのMetアナログ認識能を解析したところ、以前に作出した2種の1アミノ酸変異体同様に変異導入によって酵素活性そのものが失活することが示唆された。(1)カイコ由来PheRS変異体(A450G)を発現させたカイコ培養細胞を、パラ位にアジド基・ブロモ基・ヨード基・シアノ基を持つフェニルアラニン(Phe)類縁体を含む培地中で培養した。いずれのPhe類縁体も通常濃度のPhe存在下ではタンパク質へ取り込まれなかったが、培地中のPhe濃度を大幅に低減させると取り込みが起こることを明らかにした。(2)PheRS変異体(T407A)を絹糸腺で発現する遺伝子組換え(GM)カイコを作出し、同遺伝子をホモで有する系統を確立した。(3)PheRS変異体(A450G)を絹糸腺で発現するGMカイコ幼虫に対し、クロル基、ブロモ基、およびアジド基を有するPhe類縁体(ClPhe, BrPhe, AzPhe)を投与し、シルクフィブロインタンパク質への取り込み効率を調査した。その結果、ClPheとBrPheは通常組成の飼料への添加によりフィブロイン中へ取り込まれるのに対し、AzPheの取り込みはほとんど起こらなかった。そこで飼料中のPhe含量を低減させたところ、AzPheの取り込み効率が向上することを見出した。(4)フィブロイン中に導入したAzPheのアジド基は、末端アルキンを有する化合物とのクリック反応により選択的に反応させられることを明らかにした。また、反応は均一溶液中のみならず固体(繊維)状態でも進行することを明らかにした。具体的には、1カイコ培養細胞で成功したタンパク質翻訳機構の改変がカイコ幼虫個体でも可能かどうか、2選択的な化学反応が可能な非天然アミノ酸をシルクタンパク質へ高効率に導入できるかどうか、という2点を明らかにすることを主な目標とし、本年度は、以下の3点を実施した。(1)アジド基を有するPhe類縁体を導入したシルクタンパク質から、精練(セリシンの除去)・溶解・透析のプロセスを経て再生水溶液を調製した。再生水溶液中のフィブロインタンパク質は精練によって加水分解を受けているものの、アジド基の反応性は維持されていることを確認した。