hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物グリコシルトランスフェラーゼによる新規光学分割法の開発と創薬への応用

植物培養細胞から、イオン交換カラム、アフィニティーカラム、ゲルろ過カラムを使用する各種のクロマトグラフィーにより、植物キシロシルトランスフェラーゼを精製した。本酵素により、フェニルアルキルアルコールの(RS)-ラセミ体の配糖体を変換したところ、本酵素は、(R)-体のフェニルアルキルアルコール配糖体のみをプリメベロシド二糖配糖体に変換し、未反応の(S)-体のフェニルアルキルアルコール配糖体を高い光学純度で与える、新規な光学分割の能力を持つことが明らかになった。(1)医薬品の化学合成へ生体触媒を有効利用するため、植物培養細胞および植物グリコシルトランスフェラーゼに潜在する光学分割能力の解明と、その能力を医薬品開発へ応用して医薬品の品質の向上を図ることを目的とする。(2)植物培養細胞に潜在する、医薬品などの外来基質に対する光学分割機能、および立体選択性を明らかにする。(3)反応に関与するグリコシルトランスフェラーゼを精製し、それらの酵素特性を明らかにする。(4)精製した酵素系を用いて、生理活性を持つ医薬用基質、カテキン類、テルペノイド、フェニルアルキルアルコール類の光学分割機能を調べる。植物培養細胞および植物グリコシルトランスフェラーゼに潜在する光学分割能力の解明と、その能力を医薬品開発へ応用して医薬品の品質の向上を図ることは、有機合成化学のみならず有機合成への生体触媒の活用において意義ある研究といえる。具体的に、生理活性化合物のラセミ体混合物を植物培養細胞に投与し、植物培養細胞の作用により立体選択的に生化学的酵素反応を触媒させ、得られる生成物および回収反応物の光学純度を指標として、植物培養細胞の光学分割能力の評価を行った。反応基質として、モデル化合物であるフェニルアルキルアルコール類のラセミ体混合物を用いた。その結果、植物培養細胞を生体触媒として使用した場合には、立体選択的にS体のグルコシドを与えた。これに対し、フェニルアルキルアルコールのアセチル誘導体を基質として使用した場合、高収率で立体選択的に反応が進行し、同様にS体のグルコシドを生成物として与えた。一方、暗条件で生体触媒反応を行った場合には、R本のグルコシドを生成物として与えた。この結果より、植物培養細胞は立体選択的に基質であるラセミ体混合物のフェニルアルキルアルコールおよびそのアセチル誘導体を変換し、グルコシドを生成物として与えることが明らかとなった。今回得られた結果はさらに、植物細胞の培養の明暗条件により、生体触媒である植物培養細胞の光学分割能力をコントロールすることが可能となることを示唆している。植物培養細胞および植物グリコシルトランスフェラーゼに潜在する光学分割能力の解明と、その能力を医薬品開発へ応用して医薬品の純度および品質の向上を図ることは、生体触媒化学における発展へ寄与するのみならず、有機合成への生体触媒の活用により有機合成化学における発展への寄与が可能な意義ある研究といえる。今年度は古くから生薬成分の薬理活性作用に深い関連のあるモノテルペンアルコール類を植物培養細胞に投与し、植物培養細胞によるグリコシル化反応を利用して立体選択的酵素反応を作用させ、得られる生成物の核磁気共鳴スペクトルを利用した解析によりグルコシドアグリコン部位の選択性を調べ、植物培養細胞のモノテルペンアルコールの光学分割作用の解明を行った。シトロネロールを基質として用い、変換反応を行ったところ、植物培養細胞により立体選択的グリコシル転移反応が生起した。これにより、植物培養細胞はラセミ体混合物を基質とする光学分割の有効な生体触媒となることが示唆された。さらに、植物培養細胞から抽出した粗酵素画分に、モノテルペンアルコールのグリコシル転移活性を見出した。グリコシド生成物の核磁気共鳴スペクトルを利用した解析により、グルコシドアグリコン部位の選択性を調べたところ、本粗酵素画分が立体選択的触媒作用を有することを明らかにした。植物培養細胞および植物グリコシルトランスフェラーゼに潜在する光学分割能力の解明と、その能力を医薬品開発へ応用して医薬品の純度および医薬品の品質の向上を図ることは、生体触媒化学の発展へ寄与するのみならず、有機合成への生体触媒の活用により有機合成化学における発展への寄与か可能な研究といえる。今年度はフェニルアルキルアルコール類のグリコシル化反応を触媒する植物グリコシルトランスフェラーゼを植物培養細胞から精製した。植物培養細胞を摩砕して得た共細胞抽出液を、グリーンアフィニティーカラムを使用するクロマトグラフィーにより精製し、植物グリコシルトランスフェラーゼを得た。植物グリコシルトランスフェラーゼによるグリコシル化反応を利用して立体選択的酵素反応を作用させ、得られる生成物の核磁気共鳴スペクトルを利用した解析によりグルコシドアグリコン部位の選択性を調べ、植物グリコシルトランスラェラーゼのフェニルアルキルアルコールの光学分割作用の解明を行った。これにより、植物グリコシルトランスフェラーゼは生薬成分の薬理活性作用に深い関連のあるフェニルアルキルアルコールのラセミ体混合物を基質とする光学分割の有効な生体触媒となることが明らかになった。

植物培養細胞に潜在する光学分割能力の解明を図ることは、生体触媒化学の発展に寄与するのみならず、その能力を医薬品開発へ活用する有機合成化学への生体触媒の応用研究に貢献が可能な、意義ある研究といえる。今年度は、植物培養細胞から植物グリコシルトランスフェラーゼ(キシロシルトランスフェラーゼ)を単離精製し、ラセミ混合物として合成される医薬品の光学分割により、医薬品の品質向上を図ることを目的とした基礎的研究を行った。植物培養細胞を摩砕して得た無細胞抽出液を、ベンジルアルコール配糖体への触媒作用を指標として、イオン交換カラム、グリーンアフィニティーカラム、ゲルろ過カラムを使用する各種のクロマトグラフィーにより精製し、キシロシルトランスフェラーゼを得た。基質として、薬理活性を持つ医薬品成分に関連のあるフェニルアルキルアルコールのラセミ体の配糖体を選び、キシロシルトランスフェラーゼによるフェニルアルキルアルコールの光学純度の向上を試みた。キシロシルトランスフェラーゼの立体選択性については、グリコシル化反応を利用してフェニルアルキルアルコール配糖体への酵素触媒を作用させ、得られる生成物の核磁気共鳴スペクトルを利用した解析を行うことにより、グルコシドアグリコン部位の選択性を調べ、キシロシルトランスフェラーゼのフェニルアルキルアルコール配糖体の光学分割作用の解明を行った。その結果、今回単離したキシロシルトランスフェラーゼは、(R)-体のフェニルアルキルアルコール配糖体のみをプリメベロシド二糖配糖体に変換し、未反応の(S)-体のフェニルアルキルアルコール配糖体へ分割する能力があることが分かり、本酵素は、フェニルアルキルアルコールラセミ体混合物の配糖体を基質とする光学分割の有効な生体触媒となることが明らかになった。
複素力学系の不変量とその放物的分岐における連続性

Lyubich-MinskyはKlein群における3次元双曲多様体のアナロジーとして,複素力学系に付随する3次元双曲ラミネーションを構成した.しかしその積層構造の詳細は,限られた例を除きほとんど知られていなかった.例えば2次多項式が吸引的不動点を持つ場合,その構造はSullivanの2-Solenoidと呼ばれるRiemann面ラミネーションを3次元的に拡張したものになることが知られている.これが重複度2の放物的不動点をもつ2次多項式へと退化するとき,最も簡単なラミネーションの構造変化が期待されるのだが,この場合すら詳細は知られてなかった.この問題に対し,(1)充填Julia集合の内部を可算個の等角同型なタイルに分割してそのダイナミクスを追い,(2)退化を実現する2次多項式間の半共役写像を具体的に構成,さらに(3)付随するラミネーション間の半共役写像に持ち上げる,という独自の方法により,ラミネーションの退化を明解に記述することが可能になった.結果として,ラミネーションの大局的積層構造は変化せず,葉である3次元双曲多様体の構造のみが変化していることがわかった.また,この方法はその他の2次多項式にも威力を発揮し,Lyubich-Minskyが掲げたいくつかのラミネーション構造決定問題に対しても解答を与えた.タイル分割の様子は自作プログラムOTIS-Lで描くことができる.この改良,インターネット上で公開を行った.さらにタイルを擬似3次元で表現するプログラムTubesを公開している.Lyubich-MinskyはKlein群における3次元双曲多様体のアナロジーとして,複素力学系に付随する3次元双曲ラミネーションを構成した.しかしその積層構造の詳細は,限られた例を除きほとんど知られていなかった.例えば2次多項式が吸引的不動点を持つ場合,その構造はSullivanの2-Solenoidと呼ばれるRiemann面ラミネーションを3次元的に拡張したものになることが知られている.これが重複度2の放物的不動点をもつ2次多項式へと退化するとき,最も簡単なラミネーションの構造変化が期待されるのだが,この場合すら詳細は知られてなかった.この問題に対し,(1)充填Julia集合の内部を可算個の等角同型なタイルに分割してそのダイナミクスを追い,(2)退化を実現する2次多項式間の半共役写像を具体的に構成,さらに(3)付随するラミネーション間の半共役写像に持ち上げる,という独自の方法により,ラミネーションの退化を明解に記述することが可能になった.結果として,ラミネーションの大局的積層構造は変化せず,葉である3次元双曲多様体の構造のみが変化していることがわかった.また,この方法はその他の2次多項式にも威力を発揮し,Lyubich-Minskyが掲げたいくつかのラミネーション構造決定問題に対しても解答を与えた.タイル分割の様子は自作プログラムOTIS-Lで描くことができる.この改良,インターネット上で公開を行った.さらにタイルを擬似3次元で表現するプログラムTubesを公開している.
「うま味」成分配合の口腔保湿剤を利用した新たな口腔乾燥症対策

本研究は、うま味成分の唾液分泌に対する至適条件の確立し、それをもとにうま味成分を配合した口腔保湿剤の開発し、さらにうま味成分を配合した口腔保湿剤による口腔乾燥改善効果の検証を行うことを目的としている。平成30年度はうま味成分の唾液分泌に対する至適条件の確立する計画であった。つまり、6575歳の口腔乾燥症高齢者30人を対象とし、味覚刺激時の総唾液分泌量の測定、味覚刺激時のストレスの測定、小唾液腺唾液の分泌量の測定を行う予定であった。本研究の対象者は北海道大学病院高齢者歯科を受診する患者を主に予定しているが、それでも不足する場合には研究代表者が所属する研究室と連携している病院や高齢者施設にも協力を依頼する予定であった。本研究は外来患者などを対象とした研究であり、かつ、食品や食品添加物を使用するため、通常の診療の範囲を超える研究である。したがって、研究の遂行に関して然るべき倫理審査を受ける必要がある。平成30年度はこの研究の着手にあたり倫理審査の申請準備に多くの時間を要し、現在もその準備を継続している。また、研究対象者におけるうま味成分の至適条件を確立するため、健康成人を対象とした予備実験を新たに行う計画を立てた。健康成人はボランティアとし、研究代表者が所属する機関においてリクルートする予定である。この健康成人において、対象者と同様に味覚刺激時の総唾液分泌量の測定、味覚刺激時のストレスの測定、小唾液腺唾液の分泌量の測定を行う予定である。本研究を遂行するにあたり臨床研究に関する申請を行う必要があるが、これに関する準備にかなり時間を要しているため。また、予備実験として健常成人のボランティアからもデータを集める予定であり、研究方法について再検討を要するため。まずは臨床研究に関する申請を早急に行う。予備実験として健常成人のボランティアを活用し、味覚刺激時の唾液分泌量を測定してうま味に関しておおよその至適濃度を検討した後に、6575歳の口腔乾燥症高齢者30人を対象とした実験を行う。したがって、臨床研究の承認が得られたら、研究計画書にある平成30年度分について早急に実施し、可能な限り遅れを取り戻す予定である。本研究は当初の予定よりもかなり遅れている。まずは平成30年度に行う予定であった研究と、必要となった予備実験をを遂行する。これにより、次年度使用額を使用することができる。
背側視床における眼球運動信号の役割

運動性視床は皮質下の運動情報を大脳皮質につたえる上行性経路として重要であり、その信号は自身の行動をモニターすることに利用され、また、体性運動系においては随意運動の発現にも関与することが知られている。これまで、眼球運動系の研究では大脳皮質から直接、あるいは大脳基底核を経由して間接的に脳幹・小脳にいたる下行性の経路がよく調べられてきた。しかし、解剖学的には運動性視床の多くのニューロンが眼球運動関連領野に投射することが知られており、また、髄板内核群周辺からは眼球運動に関連したニューロンが記録される。本課題ではこれらの神経活動を解析するとともに、記録部位に微量のムシモールを注入し、眼球運動系における上行性信号の役割を調べた。2種類の眼球運動について検討した。(1)滑動性眼球運動の最中に活動を変化させるニューロンの約8割には方向選択性があり、多くは同側に至適方向をもっていた。運動性視床を不活化すると滑動性眼球運動のゲインがわずかながら低下し、その効果は同側にむかう運動で大きかった。多くの場合、障害は運動の開始後数十ミリ秒であらわれ、このことは運動性視床が同眼球運動系の内在性の正の帰還経路の一部であることを示唆する。(2)視床の障害によって反対側にむかう記憶誘導性サッカードの潜時が延長した。とくに、固視点を消すことによって運動を開始させる従来のexternally triggered課題よりも、手がかり刺激が提示された後、一定時間の後に自発的に記憶誘導性サッカードをおこなわせるinternally triggered課題で障害効果が大きかった。このことは上行性信号が自発性眼球運動の発現、特にその時間的調節に関与する可能性を示唆する。この障害効果を裏付ける神経活動として、遅延期間中にみられたbuildup activityが有力であると考えられる。
次世代シーケンサーを用いた網羅的解析による谷型難聴の原因遺伝子解明

中音域が障害される谷型難聴は、その特徴的な聴力像と家族内発症の報告から、以前より遺伝性難聴の可能性が示唆されてきたが、原因遺伝子は、これまでにEYA4、TECTA、COL11A2、CCDC50の4遺伝子しか報告がなく、先行研究(Yamamoto N, et al. 2017 Orphanet J Rare Dis.)によると最も多く報告されているTECTA遺伝子でさえ、谷型難聴のうち6%であった。そこで我々は、9割以上が原因不明の谷型難聴原因遺伝子の解明を目的に研究を開始した。2002年10月から2018年7月に当研究室で遺伝子検査を行った発端者2433人を対象に、非症候群性両側性感音難聴で、GENDEAFの谷型の基準もしくは独自に定めた浅い谷型の基準を満たす症例を選択したところ95例であった。過去の検査で原因遺伝子同定済みの8人と全エクソーム解析済みの15例を除く72例を対象に154難聴遺伝子のターゲットリシーケンス解析を行い、全95例の解析結果について検討した。谷型難聴全95例のうち23例(24.2%)にpathogenicもしくはlikely pathogenicに該当する原因変異が同定され、その内訳はMYO6が6例と最多で、POU4F3が3例、GJB2が2例、STRCが2例、その他COL11A、COL4A5、GRHL2、LOXHD1、MYH14、OTOGL、PTPRQ、TECTA、WFS1、m.7511T>Cが1例ずつであった。聴力型別では、GENDEAFの谷型の基準を満たす36例では7例(19.4%)に変異が同定されMYO6が2例と最多で、浅い谷型の基準を満たす59例では16例(27.1%)に変異が同定され、MYO6が4例と最多で、続いてPOU4F3とSTRCが2例ずつであった。新しい知見であり、臨床像も合わせて報告予定(論文執筆中)である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。中音域が障害される谷型難聴は、その特徴的な聴力像と家族内発症の報告から、以前より遺伝性難聴の可能性が示唆されてきたが、原因遺伝子は、これまでにEYA4、TECTA、COL11A2、CCDC50の4遺伝子しか報告がなく、先行研究によると最も多く報告されているTECTA遺伝子でさえ谷型難聴のうち6%であった。2002年10月から2017年11月に当研究室で遺伝子検査を行った発端者2105人を対象に、非症候群性両側感音難聴で、GENDEAFの谷型の基準もしくは独自に定めた浅い谷型の基準を満たす症例を選択したところ81人であった。そのうち13人には既に原因遺伝子が同定されており、TECTA遺伝子4人、GJB2遺伝子3人、CDH23遺伝子2人、WFS1遺伝子1人、OTOA遺伝子1人、OTOGL遺伝子1人、STRC遺伝子1人であった。残り68人のうち、12人は既に全エクソーム解析済みで原因不明であったため、56人を対象に154難聴遺伝子のターゲットリシーケンス解析を行った。その結果、LARS2遺伝子1人、STRC遺伝子1人、LOXHD1遺伝子1人が病的変異として確定し、現時点で解析が終了している34人の結果をまとめると、TECTA遺伝子4人、GJB2遺伝子3人、CDH23遺伝子2人、STRC遺伝子2人、WFS1遺伝子1人、OTOA遺伝子1人、OTOGL遺伝子1人、LARS2遺伝子1人、LOXHD1遺伝子1人と16人(42%)で原因遺伝子が同定できており、最も多かったのはTECTA遺伝子であった。現在、残り23人はターゲットリシーケンス結果の解釈及びサンガー法での確認作業中で、24人はかずさDNA研究所においてターゲットリシーケンス解析中である。当初の計画では、平成29年度に対象検体の選別およびターゲットリシーケンスによる既知の154難聴遺伝子の解析を終了し、原因不明であった症例に対して全エクソーム解析開始予定であった。実際には、検体の選別までは予定通り進行できたが、BAMファイル形式までのターゲットリシーケンス解析を委託しているかずさDNA研究所とのシステムの構築に予想以上に時間がかかったため、少し遅れが出た。しかしながら、現在はシステム構築が終了しているため、今後は遅滞なく進行可能と考えている。

2002年10月から2018年7月に当研究室で遺伝子検査を行った発端者2433人を対象に、非症候群性両側性感音難聴で、GENDEAFの谷型の基準もしくは独自に定めた浅い谷型の基準を満たす症例を選択したところ95例であった。過去の検査で原因遺伝子同定済みの8人と全エクソーム解析済みの15例を除く72例を対象に154難聴遺伝子のターゲットリシーケンス解析を行い、全95例の解析結果について検討した。谷型難聴全95例のうち23例(24.2%)にpathogenicもしくはlikely pathogenicに該当する原因変異が同定され、その内訳はMYO6が6例と最多で、POU4F3が3例、GJB2が2例、STRCが2例、その他COL11A、COL4A5、GRHL2、LOXHD1、MYH14、OTOGL、PTPRQ、TECTA、WFS1、m.7511T>Cが1例ずつであった。聴力型別では、GENDEAFの谷型の基準を満たす36例では7例(19.4%)に変異が同定されMYO6が2例と最多で、浅い谷型の基準を満たす59例では16例(27.1%)に変異が同定され、MYO6が4例と最多で、続いてPOU4F3とSTRCが2例ずつであった。新しい知見であり、臨床像も合わせて報告予定(論文執筆中)である。まず残り47人のターゲットリシーケンス解析を進める。ターゲットリシーケンス解析が全員終了した時点で、原因遺伝子の内訳、臨床的特徴(発症時期、進行の有無、難聴の程度、前庭障害合併の有無、語音明瞭度等)をまとめ、過去の報告と比較する。次に、ターゲットリシーケンス解析では原因と考えられる遺伝子変異を認めなかった家系に全エクソーム解析を行い、新規難聴遺伝子を探索する。下記の項目で選抜を行い、候補遺伝子を絞り込む。1Splice site(exonとintronの境界から5塩基まで)かexonにあるvariantを選択。2MAFが0.5%以上のvariantは除外。3missense variantであればsynonymous variantは除外。4遺伝子変異影響予測アルゴリズムPolyPhen-2,PROVEAN,SIFT等のalgorithmを用いたすべての予測システムで変異の影響が乏しいと予測されたものは除外。5アミノ酸の種の保存性が低いものは除外。6当研究室で保有している成熟サル蝸牛のcDNAライブラリーデータ(未発表)より、蝸牛内高発現遺伝子の中で検討する。7コントロールにおける変異頻度(allele frequency)と比較して対象家系内の変異頻度が高い遺伝子がないか検討する。8発端者の解析で絞り込まれた新規難聴遺伝子候補の変異について、サンガー法で家系メンバーに変異があるか解析し、家系内整合性を調べる。以上の情報から、ClinGenのDisease Clinical Validity Classificationを参考にして新規難聴遺伝子かどうか検討する。新規原因候補遺伝子が見つかった場合には、CRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集により候補遺伝子のノックアウトマウスを作成し、分子機能の検討も行いたい。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
腰部脊柱管狭窄症の発症要因の解明:車両搭載型MRIを用いた地域住民コホート研究

整形外科専門医が、住民ボランティアの運動器検診を実施すると共に車両搭載型MRIを用いて脊椎の画像検診を追加することで、一般地域住民における腰部脊柱管狭窄症の疫学的実態調査を行った。その結果、画像上に腰部脊柱管狭窄を有するものは参加者全体の約80%を占めたが、症状を有しているものは約10%に過ぎなかった。研究の具体的内容2008-2009年に和歌山県の2地域で実施した骨・関節疾患予防検診(Research on Osteoarthritis/osteoporosis Against Disability : ROAD study)第1次追跡調査に参加した1611人のうち、脊椎核磁気共鳴画像法(MRI)検診に参加を表明した一般住民1,011名(男性335名、女性676名、平均年齢66.3歳)を対象とし、整形外科専門医が脊椎診察を行った。画像検査は、車両搭載型MRI撮像装置を用いて全脊椎の神経圧迫病変を検索した。症候性腰部脊柱管狭窄症(LSS)患者の診断は、臨床症状と画像所見の双方から成る独自の診断基準を設定した。すなわち、(1)殿部・下肢の痛み、もしくはしびれ、下肢神経脱落症状、会陰部症状のいずれかが存在し、これらの症状は、歩行・立位により誘発あるいは増悪し、前屈、坐位、臥位にて軽快する、(2)MRIT2強調横断像において臨床症状を説明しうる狭窄病変が存在するものを症候性腰部脊柱管狭窄と診断した。結果として、40代未満においてLSS有病者は認めなかった。LSSに罹患するものの割合は50歳代以降に急増を示していた。女性においては年代が経る毎に有病率も上昇していたが、男性においては60代をピークにその後は徐々に減少傾向であった。本コホート全体のLSSの有病率は9.3%(男性10.1%、女性8.9%)と算出された。各年代別の観察では、年齢が上がるにつれて、有病率は有意に増加傾向を示したが、性別・BMIにおいては有意差を認めなかった。本研究の意義検診は和歌山県の2地域に限定して実施されたものであるが、本研究は大規模地域住民コホートにおける症候性LSSの年代別、性別有病率を明らかにした最初の報告である。本研究の重要性今後、本研究におけるコホートを追跡調査することで、腰部脊柱管狭窄症の自然経過や発症要因、および危険因子を明らかできるものと考える。研究の具体的内容大規模地域住民コホートにおける症候性腰部脊柱管狭窄(以下、症候性LSS)の年代別、性別有病率を明らかにした昨年度の研究に引き続き、今年度は無症候性も含めた放射線学的腰部脊柱管狭窄(以下、放射線学的LSS)の罹患率について核磁気共鳴画像を用いて調査した。対象は、検診を実施できた967名(男性319名、女性648名、平均年齢66.3歳)である。放射線学的LSSの診断は、脊柱管中心部、外側陥凹部、椎間孔部の3つの部位別に、1.なし、2.軽度、3.中等度、4.重度の4段階に定性的に分類した。結果として、脊柱管中心部(なし:1.3%、軽度:22.4%、中等度46.5%、重度:29.7%)、外側陥凹部(なし:1.6%、軽度:23.6%、中等度39.5%、重度:35.4%)、椎間孔部(なし;10.6%、軽度:50.1%、中等度32.5%、重度:6.8%)の分布を示した。結果として、男女とも参加者全体の8割以上が中等度以上の狭窄(男86.9%、女83.2%)を有していた。本研究の意義大規模地域住民コホートにおける放射線学的LSSの罹患率を調査した世界で最初の報告である。本研究の重要性昨年度調査した本コホートの症候性LSSの有病率は全体で9.3%であった。したがって、構造的な変化を伴っていても症状のない症例が相当数存在する。この事実は、腰部脊柱管狭窄症に対する短期的な治療目標を設定する場合は、症状を取り除くこと、すなわち、保存的治療を手術より優先すべきであることを意味する。また、本症に対しては画像上の狭窄が高度であっても症状がなければ予防的神経除圧という考え方は成立しがたい。研究の具体的内容本コホートにおける症候性腰部脊柱管狭窄症の有病率は全体で9.3%(男性10.1%、女性8.9%)であった。女性では、年代の上昇にともない有病率が高くなっていた(p < 0.01)。一方、男性における有病率のピークは60歳代であり、年齢に対して有意差を示さなかった。

核磁気共鳴画像上において脊柱管中心部狭窄が中等度以上である者の割合は77.9%(731/938)であり、重度で有る者は30.4% (285/938)であった。このうち中等度以上の狭窄を有する者のうち、臨床症状を有する者は12.9%(94/731)、重度の狭窄を持つ者のうち、症状を有する者は17.5% (50/285)であった。腰部脊柱管狭窄症が一般地域住民の身体・運動機能にどのような影響を与えているかについて、6m歩行速度(通常速度と最大速度)・いす立ち上がりテスト・片足立ちテストの結果を有症状者と無症状者間で比較検討した。その結果、6m最大速度のみ有症状者が劣っていて(オッズ比1.18、95%CI:1.02-1.35)、以外の項目には有意差が存在しなかった。本研究の意義本研究結果から、一般地域住民の約1/3は画像上重度の腰部脊柱管狭窄を有しているが、症候性にいたるものは約1/5程度に過ぎず、例え発症していても、運動機能が著しく損なわれているわけではないことが判明した。この事実は、本疾患は基本的に疾患と共存する形で日常生活を送ることが十分可能な予後良好な性質を有していることを示唆している。本研究の重要性本研究は、大規模地域住民コホートにおいて、MRI検査と医師診察により腰部脊柱管狭窄症の診断を行った、極めて精度の高い疫学コホート研究である。今後このコホートを縦断調査することで、腰部脊柱管狭窄症の疫学的実態と危険因子が明らかになることが期待できる。最終年度に予定している追跡調査は、既に住民の同意と地域自治体の協力が得られているため、準備は問題なく整っている。本調査の実施により、LSSの2年間の発生率、予後、それに影響する要因を明らかにすることが可能と考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。LSSの自然経過を十分に理解し、それに与える因子、すなわち、年齢、性、罹病期間、臨床症状、画像上の狭窄の程度などを詳細に検討することで、個々の参加者のLSSの発生、あるいは、すでに発生しているものについては予後予測が可能となる。本研究により明らかになったLSSの危険因子を地域保健福祉の現場に還元することにより、地域住民の要介護予防にわずかでも貢献することを目標としている。
神経欠損に対する新しい神経縫合法の開発

【目的】外傷などによる末梢神経欠損例で直接縫合が不可能な場合は自家神経移植術が行われている。しかし、自家神経移植術では縫合部が2カ所となり縫合部の瘢痕組織により再生神経の伸長が阻害されるため、神経欠損のない縫合例に比べて機能回復は劣る。神経欠損例でも関節屈曲により神経の緊張を弱め神経縫合を行い、術後徐々に関節を伸展することにより縫合した神経を延長することができれば強い緊張下での神経縫合や、神経移植を行った場合に比べて、優れた治療成績を得られる可能性がある。H9年度には6mm神経欠損モデルを作製し、関節屈曲により神経断端間の緊張をとり神経外膜縫合を行い2週後より関節を緩徐に伸展した神経延長群と強い緊張下に神経外膜縫合を行った縫合群及び神経移植群の機能回復をTFI(Tibial Functional Index)を用いて比較検討し、延長群と移植群の回復は同程度で縫合群に比べて有意に良好な結果を得た。本年度、8mm及び10mm神経欠損モデルでTFIを用いて3群の機能回復を比較検討した。【方法】体重約350gの雄Wistar系ラット49匹を用いた。左坐骨神経から脛骨神経への分岐部より1mm遠位から8mm及び10mm切除した神経欠損モデルで、膝関節を130゚屈曲位で外固定し縫合2週後より5゚/日ずつ12日間伸展した延長群、緊張下に神経外膜縫合を行い外固定を行わなかった縫合群、切除した神経片を用いた移植群を作製した。各群において術前及び術後2,4,8,12,16,24,36週に歩行解析を行いTFIを算出し、t-検定を用いて比較した。【結果】延長群は縫合群に比べて8mm神経欠損モデルでは術後24、36週、10mm神経欠損モデルでは術後8,12,36週で有意に良好な回復を示した(p<0.05)。移植群と延長群間にはすべての週で有意差を認めなかった。今回、神経欠損モデルを作製し、関節屈曲で神経上膜縫合したのち関節を徐々に伸展した神経延長法の機能回復を検討した。【方法】体重約350gの雄Wister系ラット51匹の脛骨神経を用い、差脛骨神経を分岐部より3mm遠位から6mm切除した。強い緊張下に神経外膜縫合を行い外固定を行わなかった縫合群(17匹)、切除した神経片を用いて神経移植し固定をおこなわなかった移植群(16匹)、膝関節を130°屈曲することにより神経断端にかかる緊張を弱めて縫合し自家考案した器具を用いて膝関節130°で術後2週間固定し、その後毎日5°ずつ12日間膝関節を伸展した延長群(18匹)を作製した。各群において術前および術後2,4,8,12,16,24週に歩行解析を行いTFI(Tibial functional index)を算出し、t-検定を用いて各群を比較した。【結果】移植群のTFIは縫合群に比べて術後8週、16週で良好な回復を示し、延長群のTFIは縫合群に比べて術後24週で良好な回復を示した(p<0.05)。移植群と延長群間にはすべての週での有意差を認めなかった。左坐骨神経から脛骨神経への分岐部より1mm遠位から8mm及び10mm切除した神経欠損モデルで、膝関節を130゚

屈曲位で外固定し縫合2週後より5゚/日ずつ12日間伸展した延長群、緊張下に神経外膜縫合を行い外固定を行わなかった縫合群、切除した神経片を用いた移植群を作製した。各群において術前及び術後2,4,8,12,16,24,36週に歩行解析を行いTFIを算出し、t-検定を用いて比較した。【結果】延長群は縫合群に比べて8mm神経欠損モデルでは術後24、36週、10mm神経欠損モデルでは術後8,12,36週で有意に良好な回復を示した(p<0.05)。移植群と延長群間にはすべての週で有意差を認めなかった。
ポリグルタミン病態における核ストレスの解析と治療応用

本研究課題では、ポリグルタミン病の病的機構を、転写障害から始まる核ストレスの観点から明らかにすることにある。研究の基盤となる知見として、これまでに以下の知見を得た。先ず、RNAポリメラーゼIIの特異的な阻害剤として知られるアルファアマニチンによって転写を抑制すると神経細胞に極めて緩慢な細胞死が起きることが明らかになった。この非典型的細胞死は、形態学的には、アポトーシス、ネクローシス、あるいはオートファジーの特徴は見られなかった。すなわち、核クロマチンの濃縮、断片化はなくDNA fragmentationもなかった。カスパーゼ阻害薬もこの細胞死には効果がなかった。ネクローシスのようなミトコンドリア膨張や細胞膜の破たんなどの形態変化もなく、変わりに核周囲の細胞質に空胞の形成が認められた。この空胞はマーカー蛋白の検索から小胞体であると推定された。次に、分子生物学的検索としてジーンチップを用いて、この細胞死に特異的な発現変化を示す分子をさがした。結果としてYAPがその候補として見つかった。驚いたことに、YAPには神経細胞に特異的に発現するアイソフォームがあり、これは細胞死を促進するp73の機能を阻害することがわかった。アポトーシスでは一般型のYAPがp73と協調して細胞死を促進するのに対して、転写抑制性細胞死の場合はYAPアイソフォームが発現して細胞死を遅らせていることが想像された。さらにポリグルタミン病の患者脳においてもp73の活性化が生じていた。これらの実験結果を総合すると、転写抑制がp73を介する核ストレスシグナルを起こしていることが推測される。さらに、本年度は、転写障害が誘導する核ストレス分子のリン酸化などの変化を検討し、その詳細な情報を得た。
心機能検査指標を用いたバンコマイシン個別化適正投与法開発に関する基盤研究

バンコマイシン塩酸塩(VCM)はMRSA感染症治療薬であり、その薬物排泄能力は腎機能に依存する。VCMによる副作用を防止し、高い効果を得るためには体内の薬物濃度を適切に管理することが非常に重要であるが、心不全病態においては心機能の低下に伴い薬物排泄能力が低下することが報告されている。今回、我々は心不全病態時において適切な治療を提供するためのVCM投与量について検討を行った。検討の結果、心不全病態において、より心機能が低いほど投与量を減量する必要のあることを明らかにし、また、成人患者と小児患者において、同様の傾向が認められることを見出した。バンコマイシン塩酸塩(VCM)は1950年代に開発された古典的な抗菌薬であるが、多くのガイドラインで推奨されるなど現在もなお感染症治療において非常に重要な位置付けの薬物である。VCMの効果はAUC/MICに、また副作用発現はトラフ血中濃度にそれぞれ相関するとされており、適切な血中濃度管理がより効果的かつ安全な治療をもたらすと考えられている。VCMは腎臓を介して尿中排泄されるため、腎機能に応じた投与設計が一般的に行われている。一方、心不全患者においては心拍出量低下とそれに伴う腎血流量の低下によると考えられる体内動態の変動が複数の薬物で報告されているが、心不全時のVCM体内動態は明らかになっていない。そこで、本研究では心不全患者におけるVCM体内動態モデルを確立し、心不全患者に対するVCM投与指針を構築することを目的としている。本年度は国立循環器病研究センターにおいて積極的なデータ収集を行った。VCMを投与され、かつLVEFを測定している症例を対象に、VCM体内動態を詳細に検討するために必要な3-5点の採血を行った。得られた血中濃度値に基づき、既存のBayesian estimatorによってVCM体内動態パラメータを算出し、心不全患者におけるVCM薬物動態について検討を行った。結果は、心不全患者は非心不全患者と比較してVCMのクリアランスが低く、それは心不全の重症度が高いほど顕著に認められた。また、解析の結果、VCMクリアランスに影響を及ぼす共変量のひとつにLVEFが抽出された。一方、小児の心不全症例においてもVCM体内動態の変動が予想されたため、小児症例に対する予備検討を開始した。一般的なVCM小児投与量と比較して、小児の心不全症例では非常に低用量で血中濃度が維持可能であることが観察されており、今後は成人症例のみならず小児症例についても本格的に検討を行う予定である。一方、心不全患者においては心拍出量低下とそれに伴う腎血流量の低下によると考えられる薬物体内動態の変動が複数の薬物で報告されているが、心不全時のVCM体内動態は明らかになっていない。本年度は国立循環器病研究センター入院症例を対象に、成人症例に加え、小児の心不全症例における検討を開始した。当院において心疾患を有する小児では、一般的なVCM小児標準投与量と比較して非常に低用量でVCM血中濃度維持が可能であることが観察された。これはすなわち、VCMクリアランスの低下を示唆する。加えて、各症例において時間経過とともにクリアランスの大幅な増大が認められた。低年齢の小児においては成長・発達により薬物クリアランスは増大するが、検討症例においてはこれら成長・発達に加えて治療による心不全の改善が加わったことで、クリアランスの大幅な増大が観察されたものであると考えられた。本年度は国立循環器病研究センター入院症例を対象に、成人症例に加え、小児の心不全症例における検討を行った。当院において心疾患を有する小児では、一般的なVCM小児標準投与量と比較して非常に低用量でVCM血中濃度維持が可能であることが観察されたため、レトロスペクティブに収集したデータより年齢別推奨投与量を算出した。本推奨投与量を臨床において実際に使用したところ、一般的な小児標準投与量を用いた場合と比較して至適濃度域への到達時間が1/2以下となり、速やかな濃度コントロールが得られた。

これはすなわち、小児において心不全病態と年齢に応じた推奨薬物投与量設定の必要性を実臨床で確認することができた結果であるといえる。バンコマイシン塩酸塩(VCM)はMRSA感染症治療薬であり、その薬物排泄能力は腎機能に依存する。VCMによる副作用を防止し、高い効果を得るためには体内の薬物濃度を適切に管理することが非常に重要であるが、心不全病態においては心機能の低下に伴い薬物排泄能力が低下することが報告されている。今回、我々は心不全病態時において適切な治療を提供するためのVCM投与量について検討を行った。検討の結果、心不全病態において、より心機能が低いほど投与量を減量する必要のあることを明らかにし、また、成人患者と小児患者において、同様の傾向が認められることを見出した。本年度より小児症例における検討を本格的に開始した。心不全を合併する小児症例のVCM個体内変動を検討した結果を第31回日本TDM学会・学術大会において発表し、優秀演題賞を受賞した。また、100例以上の心疾患を有する小児症例のデータを後方視的に検討し、体内動態に影響を及ぼす共変量の抽出を試みている。特殊病態時における抗菌薬の体内動態抗菌薬適正使用の観点から、当院におけるVCMの投与症例数が本研究計画時と比較して減少している。加えて、症例の重篤度が高い場合、患者家人や医療従事者が「研究目的の追加採血」に難色を示す場合も多い。このように成人症例のエントリーが課題である状況の中、対策として本年度から小児の心不全症例の検討を本格的に開始した。すなわちこれは、心機能低下のVCM体内動態への影響の普遍性を担保するためである。現在、小児症例におけるVCM体内動態において、共変量の抽出を後方視的に検討中である。また、小児心不全症例における前向き臨床研究の研究計画を立案し、倫理委員会の承認を受けた。今後は本研究計画に則り、小児症例における詳細な検討を本格的に実施する予定である。院内において、当研究対象症例の検索を連日実施中であり、対象となる症例には積極的に説明と同意取得を行っている。同意を得られた症例は、エントリー症例として採血を実施している。これら集積中の前向き検討データと、事前に集積された後方視的データとの比較によって心不全患者におけるVCM体内動態の特徴について検討に着手している。検討結果は第34回日本臨床薬理学会総会において発表を行った。平成26年度はレトロスペクティブなデータ解析を中心とした研究であったため、物品購入費の支出が少額であったこと、また、学会での成果発表回数が少なかったことより旅費の支出が少なかったことより次年度使用額が生じた。抗菌薬適正使用の観点から、当院におけるVCMの投与症例数が本研究計画時と比較して減少している。このような状況から、症例のエントリーが課題であった。この対策として本年度から小児の心不全症例にも対象を広げた。すなわちこれは、心機能低下がVCM体内動態へ及ぼす影響の普遍性を担保するためである。
細孔径制御型吸着剤／水系吸着式冷凍機の高性能化に関する研究

近年環境問題が深刻化しており,新しいエネルギー資源の開発および未利用エネルギーの有効利用に関する技術革新が求められている.今回我々が提案する吸着式冷凍機は排熱,太陽熱等の低温度(50°Cから70°C)レベルの未利用エネルギーを有効利用することが可能であり,環境問題の緩和策として大きな役割を果たすことが期待できる.この技術を実用化,特に民生レベルで使用するには性能向上,小型化が必要不可欠である.そこで,本研究では,細孔径制御型シリカゲルに注目し,さらに,高出力密度のために,フィンアンドチューブ型熱交換器を使用した場合の吸着冷凍システム性能を求めることを目的とし,研究を実施した.近年環境問題が深刻化しており,新しいエネルギー資源の開発および未利用エネルギーの有効利用に関する技術革新が求められている.今回我々が提案する吸着式冷凍機は排熱,太陽熱等の低温度(50°Cから70°C)レベルの未利用エネルギーを有効利用することが可能であり,環境問題の緩和策として大きな役割を果たすことが期待できる.この技術を実用化,特に民生レベルで使用するには性能向上,小型化が必要不可欠である.そこで,本研究では,細孔径制御型シリカゲルに注目し,さらに,高出力密度のために,フィンアンドチューブ型熱交換器を使用した場合の吸着冷凍システム性能を実験的に求めることを目的とし,3年計画で研究を実施する.今年度実施項目は以下の通りである.1.新型吸着器の性能測定フィンアンドチューブ型吸着器の性能測定を実施した.具体的には,吸着器単位体積当たり冷凍能力の測定ならびに飽和吸着量の測定を実施した.実施状況はほぼ計画通りであり,一定の研究成果が得られた.2.吸着器内三次元熱および物質伝達解析項目1.で得られた実験データおよび昨年度実施の吸着速度測定結果を基に,吸着器内三次元熱および物質伝達解析を実施する.本研究で用いる吸着器は,フィン形状等が複雑であるため,解析にあたっては吸着器のモデル化を実施した.本解析により,フィンアンドチューブ型熱交換器を使用した場合の吸着冷凍サイクルの性能評価を行った.実施状況は計画通り推移し,一定の研究成果が得られた.近年環境問題が深刻化しており,新しいエネルギー資源の開発および未利用エネルギーの有効利用に関する技術革新が求められている.今回我々が提案する吸着式冷凍機は排熱,太陽熱等の低温度(50°Cから70°C)レベルの未利用エネルギーを有効利用することが可能であり,環境問題の緩和策として大きな役割を果たすことが期待できる.この技術を実用化,特に民生レベルで使用するには性能向上,小型化が必要不可欠である.そこで,本研究では,細孔径制御型シリカゲルに注目し,さらに,高出力密度のために,フィンアンドチューブ型熱交換器を使用した場合の吸着冷凍システム性能を実験的に求めることを目的とし,3年計画で研究を実施した.実施項目・成果は以下の通りである.1.吸着剤の吸着速度測定吸着速度促進のため,フィンアンドチューブ型吸着器に吸着剤を充填し,その性能を測定した.具体的には,吸着器単位体積当たり冷凍能力の測定ならびに飽和吸着量の測定を実施した.2.吸着器内熱および物質伝達解析項目1.で得られた実験データおよび昨年度実施の吸着速度測定結果を基に,吸着器内熱および物質伝達解析を実施した.本研究で用いる吸着器は,フィン形状等が複雑であるため,解析にあたっては吸着器のモデル化を実施した.本解析により,フィンアンドチューブ型熱交換器を使用した場合の吸着冷凍サイクルの性能評価を行った.実施状況は計画通り推移し,一定の研究成果が得られた.3.吸着冷凍サイクルシミュレーション上記の成果を基に,吸着冷凍サイクルシミュレーションを実施した.熱力学的解析および熱・物質収支の検討による非定常解析の両方を実施し,さらに,応用先の一例として,PEFC型燃料電池システムの排熱(70°C程度)を利用した場合の冷凍能力を明らかにした.近年環境問題が深刻化しており,新しいエネルギー資源の開発および未利用エネルギーの有効利用に関する技術革新が求められている.今回我々が提案する吸着式冷凍機は排熱,太陽熱等の低温度(50°Cから70°C)レベルの未利用エネルギーを有効利用することが可能であり,環境問題の緩和策として大きな役割を果たすことが期待できる.この技術を実用化,特に民生レベルで使用するには性能向上,小型化が必要不可欠である.そこで,本研究では,細孔径制御型シリカゲルに注目し,さらに,高出力密度のために,フィンアンドチューブ型熱交換器を使用した場合の吸着冷凍システム性能を求めることを目的とし,研究を実施した.近年環境問題が深刻化しており,新しいエネルギー資源の開発および未利用エネルギーの有効利用に関する技術革新が求められている.今回我々が提案する吸着式冷凍機は排熱,太陽熱等の低温度(50°Cから70°C)レベルの未利用エネルギーを有効利用することが可能であり,環境問題の緩和策として大きな役割を果たすことが期待できる.この技術を実用化,特に民生レベルで使用するには性能向上,小型化が必要不可欠である.そこで,本研究では,細孔径制御型シリカゲルに注目し,さらに,高出力密度のために,フィンアンドチューブ型熱交換器を使用した場合の吸着冷凍システム性能を実験的に求めることを目的とし,3年計画で研究を実施する.今年度実施項目は以下の通りである.

1.平衡吸着量・吸着速度測定細孔径制御型シリカゲルの平衡吸着量および吸着速度測定を実施した.実験装置は主として吸着器および蒸発器から構成されており,両者はそれぞれ恒温循環水槽により温度制御を行う.吸着器内部圧力は蒸発器温度により制御する.本装置により,吸着速度および平衡吸着量の測定を,吸着器内部温度および圧力をパラメータとして実施した.2.吸着器解析実施項目1により得られた細孔径制御型シリカゲルの吸着速度・平衡吸着量の測定結果を基に,一次元ランプドパラメータモデルにより吸着器内熱・物質移動解析を実施し,吸着器冷却水温度および吸着器内圧力が吸着器性能に及ぼす影響を検討した.本研究課題は,実験および数値解析により構成されている.実験・数値解析の両面とも,ほぼ計画通り進行しており,一定の研究成果が得られた.実施項目1.実験装置製作および測定は計画通り順調に進展しているが,項目2.吸着器解析に若干の遅れが生じている.しかしながら,この遅れは一か月程度のものであり,研究計画全体の進捗に大きな影響はない.研究計画通りに実施すれば,当初想定していた研究成果が挙がるものと思われる.次年度は,新型吸着器を用いた冷凍サイクル性能の検討を実施する.現在のところ,研究の遂行にあたっての大きな問題点は無く,計画通り進行するものと思われる.次年度研究計画は,数値解析がメインであり,実験は実施しない.よって,次年度研究費は主として数値解析ソフトウェアおよび研究成果の公表に使用予定である.実験装置製作は既に完了しているので,今年度は,主として実験用消耗品の購入を予定している
低出生体重児における肝芽腫発生の機序に関する研究

次に新生児ラット肝細胞および胎児ラット肝細胞を高濃度酸素および低濃度酸素に暴露し、β-カテニン遺伝子の変異が誘導されるか否かに関し検討をおこなった。同時にβ-カテニン蛋白の細胞核への蓄積についても検討した。β-カテニン遺伝子の変異はDNAのdirect sequencing法を用い、またβ-カテニン蛋白の核内蓄積については免疫染色で検討した。しかし、あらゆる暴露条件においてもβ-カテニン遺伝子の変異やβ-カテニン蛋白の核内蓄積を確認することはできなかった。さらに胎児ラット肝細胞を用い酸化ストレスが肝細胞分化関連遺伝子の発現に与える影響を検討した。胎齢18日のラット肝細胞を低濃度、高濃度、低濃度後に高濃度の酸素を曝露する各条件下で培養し、α1AT、HNF4、AFP、albuminの各遺伝子発現の変化を観察した。その結果、胎齢18日ラットの肝細胞ではAFPの発現が経時的に減少するのに対し、酸化ストレス下ではAFPの発現が高レベルに保持される傾向が窺えた。この結果は酸化ストレスが未分化な肝細胞の分化を抑制しAFPの高発現を維持したか、あるいは直接にAFPの発現を亢進させたものと考えられ、酸化ストレスが未分化な肝細胞の分化に影響を与えること、その結果として最終的に発癌、腫瘍化の原因となり得る可能性を示唆するものと考えられた。肝芽腫の切除標本を用いて非腫瘍部の肝組織におけるDNA酸化障害の指標である8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG)の有無を免疫組織化学的に検索すると、肝小葉内、特に門脈域の肝細胞の核および細胞質に8-OHdGが検出される。一方、非腫瘍性の肝疾患では8-OHdGが肝小葉内に同定されるが、その分布の様式は肝芽腫例と異なるため、'両者におけるDNA酸化障害の原因が異なると推察された。一見、正常と思われる非腫瘍部の肝組織内に8-OHdGが検出されることから、DNA酸化障害の結果、肝芽腫が発生したとも考えられる。しかし、8-OHdGの存在は肝芽腫に特異的でなく、しかも低出生体重児の肝芽腫にも特異的ではなかった。ラットの肝細胞を震盪法または還流法で採取し、これを初代培養した。培養細胞を高濃度酸素に曝露すると生後1日目の新生児ラットでは培養液中の8-OHdGが時間依存性に増加した。しかし、生後数週あるいは数カ月を経過したラットの肝細胞では同様の現象は認められない。また、superoxide dismutase (SOD)の活性を測定すると新生児ラットの肝細胞ではその活性が有意に低い。実際にコメットアッセイを用いてDNAの断片化した細胞を検出してみると、幼弱ラットの肝細胞ほど酸素曝露によりDNAの断片化が陽性となった。以上の結果は新生児ラットでは抗酸化酵素活性が低くそのためにDNAが酸化障害を受けやすいことを示唆している。続いて同様に培養した新生児ラットの肝初代培養細胞を高濃度酸素あるいは低濃度酸素に暴露し、β-cateninの遺伝子変異が誘導されるかに関しdirect sequencing法を用いて検討をおこなった。現時点でこれら培養条件下でβ-cateninの遺伝子変異が誘導されるとの結果は得られていない。ラット新生児肝細胞初代培養の系を用いた。培養肝細胞を低濃度酸素、高濃度酸素、さらに両方に暴露する系を確立した。これにより未熟児における低酸素(呼吸傷害)もしくは、それに対する治療としての高濃度酸素による人工呼吸管理と肝芽腫発生の関連につき検討した。すでに高濃度酸素によるDNA酸化障害を報告しており、この障害が肝芽腫臨床症例において約70%強に認められるβカテニン遺伝子の変異に関わる可能性があると考えた。さらに、臨床症例全例に認められるβカテニン蛋白の細胞核への蓄積についても検討した。βカテニンの遺伝子変異は細胞から抽出したDNAのダイレクトシークエンスを、βカテニン蛋白の細胞核への蓄積と酸化ストレスによる8-OHdGの発現については免疫染色を行って確認した。しかしながら、あらゆる暴露条件においても8-OHdGの発現は認めるもののβカテニン遺伝子の変異やβカテニン蛋白の細胞核への蓄積は認めなかった。

そこで、未熟児における肝臓の未熟性を考慮し、本実験の系に胎児ラットを導入することとした。胎児ラットの肝臓細胞初代培養の系を確立した。同様に低濃度酸素、高濃度酸素への暴露実験を行い、様々な関連遺伝子(肝細胞の発生、腫瘍増殖、βカテニンを含むWntシグナルに関連するもの)の発現をmRNAレベルで検索することを計画した。胎児の系においてもβカテニンの異常は認めなかった。つまり、本実験の系においてはWntシグナル伝達系の異常は引き起こされないことが判明した。ついで本実験の系における肝芽細胞の分化(肝細胞の発生)の異常の有無を検討することとした。現時点では培養した細胞が未熟な肝細胞である肝芽細胞の性格を保持していることのmRNAレベルで確認が終了している。低出生体重児における肝芽腫発生の機序として、酸素暴露による未熟肝細胞または未熟肝幹細胞のDNA酸化障害がその原因であるとする仮説の検証を目的に、胎児ラット肝細胞の初代培養系を用い酸化ストレスが肝細胞分化関連遺伝子の発現に与える影響を検討した。すなわち、胎齢18日から20日までの胎児ラットから採取した肝細胞を初代培養し、肝細胞の分化関連のマーカー遺伝子としてTO、α1AT、albumin、AFPの発現、ならびにCK19、HGF、cMet、HNF4の各遺伝子発現をRT-PCRを用いて検討した。その結果、胎齢18日ラットの肝細胞はHGF産生間質細胞や胆管へ分化した細胞を含まず未分化な肝細胞の性質を保有していると考えられた。したがって同胎齢のラット肝細胞は低出生体重児における未熟肝細胞のモデルになり得ると考え、以下の実験を行った。すなわち、胎児ラット肝細胞初代培養株を低濃度酸素、高濃度酸素、低濃度酸素後に高濃度酸素の各条件下で培養し、α1AT、albumin、AFP、HNF4の各遺伝子発現の変化を観察した。その結果、胎齢18日ラットの培養肝細胞ではAFPの発現が経時的に減少するのに対し、酸化ストレス下ではAFPの発現が高レベルに保持される傾向が窺えた。この結果は酸化ストレスが未分化な肝細胞の分化を抑制しAFPの高発現を維持したか、あるいは直接にAFPの発現を亢進させたものと考えられ、酸化ストレスが未分化な肝細胞の分化に影響を与えること、その結果として最終的に発癌・腫瘍化の原因となり得る可能性を示唆するものと考えられた。