hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
頭頸部癌における低酸素誘導タンパク質の発現と高濃度酸素療法に関する研究

これらの実験が順調に遂行されれば、高濃度酸素環境下におけるLOX-1、P53、cyclinD1の発現とその関係性、癌細胞や担癌個体レベルにおける癌生物学的特質の変化についての関連性が明らかとなり、高濃度酸素環境を利用した新規の頭頸部癌治療の方法を確立させるための指標に繋がることが期待される。1.各種発現ベクターの構築LOX-1遺伝子のcDNAクローニングおよび抗LOX-1抗体の作製はすでに終了している。加えてタンパク質発現のためのベクター作製が概ね終了した。具体的にはクローニングされたLOX-1およびP53、cyclinD1のcDNAを哺乳類発現ベクター系(pcDNA3)、大腸菌発現ベクター系(pGEX-6p、pET30)、バキュロウイルス発現ベクター系(pFastBac-HT)、酵母発現ベクター系(pBTM116)、レトロウイルス発現系(pMX-puro)にサブクローニングし、各種の実験に対応したコンストラクトを複数作製した。これらの発現システムはすでに稼働できる状態にあるが、いくつかは現在も作製中である。作製した抗LOX-1抗体を用いて生検材料、手術検体など複数の癌組織におけるLOX-1の発現および安定性を解析した。また頭頸部以外の癌組織におけるLOX-1の発現を比較検討した。方法はウエスタン解析法によるティッシュアッセイおよび免疫組織学的手法を用いた。またP53およびcyclinD1の発現とLOX-1の発現の相関に関する検討も、同じく手術時に切除、採取した腫瘍検体を用いて行った。具体的には腫瘍の切除断端におけるLOX-1、P53、cyclinD1の発現について前述の方法で検討した。研究課題「頭頸部癌治療における高濃度酸素療法の可能性とロックス1発現に関する検討」において、本研究の最終目的は頭頸部癌に有効な新規治療法を確立することであった。この目的を達成するための目標に、まず分子生化学的手法を用いて、ロックス1の癌細胞に及ぼす分子生化学的機序を解明することを挙げた。具体的手順として1ヒトロックス1遺伝子のcDNAクローニング、2各種発現ベクターの構築、3ロックス1に対する抗体の作製、4酵母ツーハイブリッド法による基質タンパク質の同定、5ロックス1とその結合タンパク質に関する細胞生物学的解析を挙げた。さらに補助実験として細胞増殖アッセイ、フォーカスアッセイ、コロニーフォーメーションアッセイ、ヌードマウスへの移植実験、ボイデンチャンバー法などが計画された。これらのうち1cDNAクローニングおよびシークエンス、2発現ベクターの作製(哺乳類発現ベクター系: pcDNA3、大腸菌発現ベクター系: pGEX-6pおよびpET30、酵母発現ベクター系: pBTM116、レトロウイルス発現系: pMX-puro)、3抗ロックス1抗体の作製、4頭頸部癌細胞株および頭頸部癌組織におけるロックス1、P53、cyclinD1の発現解析、5頭頸部癌細胞株(HEp2細胞、KB細胞)や生検材料、手術検体の癌組織におけるロックス1の発現および細胞内局在や安定性の解析、6頭頸部以外の癌組織におけるロックス1の発現との比較検討はすでに終了している。以上に加え次年度に向けてin vivo実験の一部についても着手した。すなわち癌遺伝子を組み込んだトランスジェニックラットを使用して発癌モデルラットを作製した。これを用いて現在高濃度酸素環境下における癌の生物学的特質の変化についての検討を開始している。頭頸部
高分子固定化型キラル遷移金属錯体の形成と不斉反応への応用

光学活性1,2-ジアミンおよびその誘導体が多くの不斉触媒のキラルリガンドとしてきわめて有用な分子であることに着目し、この構造を高分子ネットワークの中に固定化する方法について検討を行った。高分子固定化型キラル1,2-ジアミンの性能を評価するために、不斉反応のための高分子触媒を調製し、反応に及ぼす種々の影響について考察した。・キラル1,2-ジアミン誘導体モノマーの合成:1,2-ジアミン誘導体にラジカル重合可能な官能基として4-ビニルベンジル基を導入したキラルモノマーを合成した。重合性官能基を分子内に複数有するキラルモノマーと1つだけのものを合成した。重合性官能基と1,2-ジアミンとの間にアルキレン鎖のスペーサーを導入したモノマーを合成した。・アキラルモノマーとの共重合:スチレン、メチルメタクリレート、アクリレート、メタクリルアミド、アクリルアミドなどのアキラルなビニルモノマーと上記キラルモノマーとの共重合を行い1,2-ジアミンの高分子固定化を行った。また、1,2-ジアミンモノスルホンアミド型モノマーとスチレンスルホン酸塩との共重合で親水性高分子キラルリガンドを合成した。アキラルなジヒドロキシ化合物、キラルモノマー、ジハライドの組み合わせで重縮合についても検討し、高分子主鎖に1,2-ジアミン構造を固定化した。・高分子固定化キラル遷移金属錯体を用いる不斉水素化反応:一級ジアミン型高分子については、BINAP-RuCl_2錯体を形成させ、ケトンの不斉水素化反応を検討し、高分子反応場の不斉反応に及ぼす影響を考察した。・水中での高分子触媒反応-不斉水素移動型還元反応:スチレンスルホン酸塩との共重合で得られたモノスルホンアミド型高分子をキラルリガンドとしてルテニウム錯体を形成し、高分子触媒による水中でのケトンの水素移動型不斉還元反応を確立した。光学活性1,2-ジアミンが種々の不斉反応において優れたキラルリガンドであることから、本研究では、高分子への固定化を試みた。その合成法の確立、BINAP-RuCl_2との錯体の形成、ケトンの不斉水素化反応への応用について検討した。1級の1,2-ジアミン構造を残したまま高分子に固定化するためにフェノール性OH基を有するジアミンの合成についてはすでに確立しているので、これを用いて種々のモノマーを合成した。重合性官能基にはスチレン型を用い、キラルジアミンモノマーを得た。1,2-ジアミンの持つ2つのOH基への重合性官能基の導入は、架橋剤型キラルモノマーを与える。このモノマーと種々のアキラルモノマーとの共重合を検討した。スチレン、メタクリレート、アクリレート、アクリルアミド型のアキラルコモノマーを、キラル1,2-ジアミンモノマーと共重合した結果、不溶性の高分子が高収率で得られた。一方、1,2-ジアミンの2つのOH基のうち片方だけに重合性官能基を導入したモノマーを合成することで、ジアミンが架橋点に存在することなく、錯体形成時に適切なコンフォメーションを取ることが可能になる。このモノマーからは可溶性及び不溶性架橋高分子を合成した。上記の共重合により得たキラル1,2-ジアミン高分子とBINAP-RuCl_2との錯体を形成させ、芳香族ケトンの不斉水素化反応を行った。溶媒として2-プロパノール/DMF混合溶媒を用いると、すべての高分子錯体で反応が進行し、高選択的に対応するキラルアルコールを得ることができた。架橋剤型キラルジアミンモノマーを重合した高分子では、メチルメタクリレートをコモノマーとした場合、反応性が向上した。重合性官能基を一つだけ導入したキラルジアミンモノマーを重合した高分子は、さらに反応性が改善され、エナンチオ選択性についても低分子錯体を用いた場合と同じ選択性を実現できた。これらの高分子錯体は繰り返し再使用することが可能で、20回の再使用実験で、触媒活性はまったく低下することがなかった。

・高分子固定化キラル遷移金属錯体を用いる不斉水素化反応:一級ジアミン型高分子については、BINAP-RuCl_2錯体を形成させ、ケトンの不斉水素化反応を検討し、高分子反応場の不斉反応に及ぼす影響を考察した。・水中での高分子触媒反応-不斉水素移動型還元反応:スチレンスルホン酸塩との共重合で得られたモノスルホンアミド型高分子をキラルリガンドとしてルテニウム錯体を形成し、高分子触媒による水中でのケトンの水素移動型不斉還元反応を確立した。
広葉樹枝払い機能付きハーベスタの開発に関する研究

ハーベスタは、高性能で多工程な機能を有する伐出用林業機械である。しかし、現在のところ広葉樹の枝払い機能があるハーベスタは開発されていない。一方、北海道を中心に、地掻きを施した更新地ではカンバ類の二次林が成立し、間伐期に達している林分が多い。このような二次林の間伐を進めるためにもカンバ類の枝払いが可能なハーベスタの開発が望まれている。広葉樹の枝払いが可能なハーベスタ開発の第一段階として、既存のハーベスタの枝払いナイフを改良して対応すことにした。すなわち、刃先形状と刃先角くの異なったナイフを6種類作製して、どの形状が有効かを切断荷重を基に検討した。平成5年度では、切断時のナイフの挙動と切断荷重を算出する試験装置の製作と、その試験装置によるカンバ類のハーベスタによる枝払い試験をおこなった。その結果、切断荷重が小さいナイフの形状は刃先角23゚、逃げ角3゚であった。平成6年度は、このナイフの形状を基にしながら、実際の枝払いに使用可能なナイフの開発を目指した。すなわち、ナイフの形状に加えて、耐久性や取付方法を含めて検討した。耐久性については2段刃を、取付方法については樹幹の曲がりに追随性の良い可動とした。枝払い試験に供したナイフの種類は今年度試作した4種類と、前年度の3種類の計7種類についておこなった。各ナイフの枝払い評価は、切断の可否、樹幹からの残枝状況、切断荷重、刃こぼれの程度、でおこなった。その結果、2段刃については1段目45゚、2段目18゚が、普通刃については23゚の刃先角のナイフの適応性が高いと考えられる。この研究から、ハーベスタによる広葉樹の枝払いは、立木密度が高く、そのため樹幹が比較的通直で、枝径が小さい二次林のカンバ類では、ナイフの改良で可能と思われる。しかし、天然林の広葉樹については刃の改良だけでは困難で、鋸断等別の機構が必要と思われ。しかし現在のところ広葉樹の枝払い機能があるハーベスタは開発されていない。一方北海道を中心に、地掻きによる天然更新補助作業を施した更新地ではカンバ類の二次林が成立し、間伐期に達している林分が多い。広葉樹枝払い可能なハーベスタの開発の第一段階として、既存のハーベスタの枝払いナイフを改良して対応することにした。即ち、刃先形状と刃先角の異なったナイフを6種類製作し、どの形状が有効かを切断荷重を基に検討した。ナイフの形状は、タイプI=刃先角26°逃げ角0°、II=刃先角26°逃げ角0°刃先をさらに52°落とす、III=刃先角26°逃げ角0°刃先をさらに26°逆に落とす、IV=刃先角23°逃げ角3°、V=刃先角26°逃げ角3°、VI=刃先角26°逃げ角0°の種類とした。切断に用いた樹種はシラカンバとダケカンバの2種類で、枝数は104本であった。

枝払いに要した単位断面積あたりの荷重は1.028.8kg/cm^2で平均は7.2kg/cm^2であった。またナイフの形状別では、単位切断面積あたりの切断荷重の平均では小さい方からIV<VI<I<V<II<IIIの順であった。また枝を逃さずに根元付近で切断できるのはIVやVが適していた。以上から広葉樹の枝の切断のためのナイフの形状ではIVが優れていた。この結果から、平成6年度はタイプIVのナイフを中心にその耐久性や樹幹の曲がりにも追随できるフレキシブルな取付方法を試み、広葉樹の枝払いに最も適したナイフの形状と取付方法を明らかにする。平成5年度から、広葉樹の枝払いを可能にするハーベスタの開発に関する研究をおこなってきた。前年度は、枝払いを可能にする機構を検討した。その結果、広葉樹の枝払いに適するナイフを開発することによって、対応することとした。まづ、異なった刃先角や逃げ角を持つ数種類のナイフを製作した。次に、シラカンバ類の枝払いによって、どの形状のナイフが枝払いに適するを、カンバ類の枝払いによって検討した。その結果、刃先角23度・逃げ角3度の形状のナイフが適するとの知見を得た。平成6年度は、このナイフの形状を基にしながら、実際の枝払いに使用可能なナイフについての開発を目指した。すなわち、ナイフの形状に加えて、耐久性や取付方法を含めで検討した。耐久性については2段刃を、また取付方法については追随性の良い可動で対応した。枝払いの評価は、今年度試作した4種類と、前年度の3種類の計7種類について、完全切断の可否、残枝長、切断荷重、刃こぼれの程度、でおこなった。これらの値を基に、適用性を検討した。その結果、2段刃については1段目45度・2段目18度、普通刃については23度の刃先角のナイフが適応性が高いと考えられる。この研究で、ハーベスタによる広葉樹の枝払いは、立木密度が高く、比較的樹幹が通直な2次林のカンバ類では、ナイフの改良で可能であると思われる。
熟達した運動パフォーマンスの基盤となる神経機構の解明

卓越したスポーツ選手は長年の鍛錬によって獲得した素早い状況判断や自動化された動作の実行を可能にする。このように十分に学習した行動の実行は、脳機能イメージング研究の結果から、複数の脳領域による同時並列的な情報処理が関与していると考えられているが、これらの情報が脳内にてどのように処理・統合されるかに関しては多くの不明な点を残している。本研究では、薬理学、解剖学、電気生理学的手法を用いて学習後の適切な行動実行を可能にする脳内情報処理機構を解明する。
脳内環境変化によるメンタルヘルス破綻―その分子機序の解明とPTSDの治療への応用

発生過程、及び成獣マウスの中枢神経系におけるTROY発現細胞を同定するため、TROYと中枢神経系の細胞の各種マーカーに対する抗体を用いて、生後0日齢、7日齢、14日齢、21日齢、及び成獣において蛍光免疫二重染色を行った。その結果、生後0日齢の大脳皮質において、TROYはGLAST陽性の放射状グリアに発現していた。生後7日齢から21日齢、成獣の大脳皮質では、GFAP、及びS100β陽性のアストロサイトに発現していた。TROY発現細胞は、NeuN, CNPase, Iba-1, CD31, PDGFRβ陰性であったことから、神経細胞、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、血管内皮細胞、ペリサイトには発現していないことが明らかとなった。TROYのシグナルの抑制を目的として、可溶型TROYとヒトIgGのキメラ蛋白を過剰発現したトランスジェニック(TG)マウスを作製し、発生過程、及び成獣のTGマウスにおいて、アストロサイトの形態や発現分子(GFAP, AQP4等)、及びBBBの形成や透過性に関連する分子(SSeCKS等)の発現を免疫染色法やウェスタンブロット法により解析した。その結果、成獣TGマウスにおいてSSeCKSやclaudin12の発現量の低下を認めた。TGマウスの行動解析を行った結果、オープンフィールドテストで不安様行動の亢進や受動的回避テストで恐怖記憶の亢進、音響驚愕反射において過剰な驚愕反応といった心的外傷後ストレス障害(PTSD)様行動を認めた。さらに、電気ショックを用いた強いストレス負荷と想起体験によるPTSD様行動発現モデルにおいて、野生型(WT)マウスと比較してTGマウスで早期に聴覚性驚愕反射の亢進を認め、このことから、TGマウスは、強いストレスを受けた後、早期にPTSD様行動を発現することが示唆された。行動解析の結果より、WTマウスと比較して、TGマウスは、強いストレスを受けた後、より早期に過剰な驚愕反射を示し、恐怖反応も増大していた。このことから、TGマウスはWTマウスよりもPTSD様の行動異常を発症しやすい、すなわちストレス脆弱性を有するPTSD発症モデルマウスとなる可能性が考えられた。また、組織学的解析の結果から、TROYがアストロサイトによるBBBの形成に関与し、その破綻がPTSD様の行動異常の発現に関連している可能性が示唆された。恐怖条件付け実験装置の購入予定を変更したため、今年度に予定していたTGマウスの恐怖条件付けテストによる恐怖記憶の検討を次年度に変更したが、次年度の予定であったストレス負荷によるPTSD様の行動異常の発現の評価を先に行っており、おおむね順調に進行している。(1)BBB形成におけるTROYの役割の検討:TROYは過剰発現させることでその下流のシグナルを活性化できるため、アストロサイト細胞株にTROYを過剰発現させ、TGマウスで異常の認められた分子の発現変化を検討する。(2)BBBの破綻とPTSD発症の関連性の検討:2-1) TGマウスは聴覚性驚愕反射の亢進が認められていることから、関連する脳領域(大脳辺縁系や前頭前皮質など)の神経細胞の形態学的変化を検討する。2-2)WTマウス、及びTGマウスの恐怖記憶を恐怖条件付けテストにより検討する。2-3)WTマウス、及びTGマウスのストレス負荷前・負荷後3週目、負荷後6週目において、各々のマウスの脳の各部位でトレーサーの漏出を組織学的に解析する。(3)TROYリガンドの同定とそのPTSD治療への応用:3-1) TROY-Fcを用いてリガンド発現細胞を同定し、同定されたTROY-Fc結合細胞をautoMACSにより分取し、cDNAライブラリーを作製後、発現クローニング法を用いてTROY固有のリガンドのクローニングを試みる。同定できた場合は、in vitroのBBBモデルとしてBBB構成細胞の共培養系を用いて、TROYリガンドの添加により(1)で認められたアストロサイトの形態や機能変化の有無、リガンドの投与量依存的なBBB透過性の亢進の有無を解析する。3-2)TROYのリガンドやTROYの発現が運動(トレッドミルランニングや水泳など)により変化するのかを、野生型マウスにおいて運動強度や時間を変えて検討する。3-3)WTマウスのPTSDモデルに対して、運動負荷や同定したリガンドの脳室内投与を行い、PTSDの行動やBBBの破綻・脳内環境の改善度を検討する。

TROYのシグナルの抑制を目的として、可溶型TROYとヒトIgGのキメラ蛋白を過剰発現したトランスジェニック(TG)マウスを作製し、発生過程、及び成獣のTGマウスにおいて、アストロサイトの形態や発現分子(GFAP, AQP4等)、及びBBBの形成や透過性に関連する分子(SSeCKS等)の発現を免疫染色法やウェスタンブロット法により解析した。その結果、成獣TGマウスにおいてSSeCKSやclaudin12の発現量の低下を認めた。TGマウスの行動解析を行った結果、オープンフィールドテストで不安様行動の亢進や受動的回避テストで恐怖記憶の亢進、音響驚愕反射において過剰な驚愕反応といった心的外傷後ストレス障害(PTSD)様行動を認めた。さらに、電気ショックを用いた強いストレス負荷と想起体験によるPTSD様行動発現モデルにおいて、野生型(WT)マウスと比較してTGマウスで早期に聴覚性驚愕反射の亢進を認め、このことから、TGマウスは、強いストレスを受けた後、早期にPTSD様行動を発現することが示唆された。行動解析の結果より、WTマウスと比較して、TGマウスは、強いストレスを受けた後、より早期に過剰な驚愕反射を示し、恐怖反応も増大していた。このことから、TGマウスはWTマウスよりもPTSD様の行動異常を発症しやすい、すなわちストレス脆弱性を有するPTSD発症モデルマウスとなる可能性が考えられた。また、組織学的解析の結果から、TROYがアストロサイトによるBBBの形成に関与し、その破綻がPTSD様の行動異常の発現に関連している可能性が示唆された。恐怖条件付け実験装置の購入予定を変更したため、今年度に予定していたTGマウスの恐怖条件付けテストによる恐怖記憶の検討を次年度に変更したが、次年度の予定であったストレス負荷によるPTSD様の行動異常の発現の評価を先に行っており、おおむね順調に進行している。(1)BBB形成におけるTROYの役割の検討:TROYは過剰発現させることでその下流のシグナルを活性化できるため、アストロサイト細胞株にTROYを過剰発現させ、TGマウスで異常の認められた分子の発現変化を検討する。(2)BBBの破綻とPTSD発症の関連性の検討:2-1) TGマウスは聴覚性驚愕反射の亢進が認められていることから、関連する脳領域(大脳辺縁系や前頭前皮質など)の神経細胞の形態学的変化を検討する。2-2)WTマウス、及びTGマウスの恐怖記憶を恐怖条件付けテストにより検討する。2-3)WTマウス、及びTGマウスのストレス負荷前・負荷後3週目、負荷後6週目において、各々のマウスの脳の各部位でトレーサーの漏出を組織学的に解析する。(3)TROYリガンドの同定とそのPTSD治療への応用:3-1) TROY-Fcを用いてリガンド発現細胞を同定し、同定されたTROY-Fc結合細胞をautoMACSにより分取し、cDNAライブラリーを作製後、発現クローニング法を用いてTROY固有のリガンドのクローニングを試みる。同定できた場合は、in vitroのBBBモデルとしてBBB構成細胞の共培養系を用いて、TROYリガンドの添加により(1)で認められたアストロサイトの形態や機能変化の有無、リガンドの投与量依存的なBBB透過性の亢進の有無を解析する。3-2)TROYのリガンドやTROYの発現が運動(トレッドミルランニングや水泳など)により変化するのかを、野生型マウスにおいて運動強度や時間を変えて検討する。3-3)WTマウスのPTSDモデルに対して、運動負荷や同定したリガンドの脳室内投与を行い、PTSDの行動やBBBの破綻・脳内環境の改善度を検討する。
エピプラキンと組織再生

自己免疫性表皮下水疱症の自己抗原として同定されたエピプラキンは、その機能としてエピプラキンノックアウトマウスの解析結果より、表皮細胞のケラチンの分布に関係し、創傷治癒における表皮細胞の移動速度に影響を及ぼしている可能性を示唆された。前回実験ではエピプラキンとケラチン6との分布の関連が指摘されていたため、今回、マウスケラチン6の発現量を野生型マウス、エピプラキン欠損マウス、ヘテロマウスのそれぞれの創部辺縁の組織より抽出したcDNAを使い、real time PCRにて測定した。結果、各マウス間ではエピプラキンの有無に関連した明らかな差は認められなかったが、これは、検体の数の不足及び創部よりcDNAを抽出する際の回収量が一定の条件を保てていないなどの実験背景に問題があったと思われた。これを解決するため、検体数を増やすことを考慮したが、real time PCRの試行に多くの費用が必要なため、現段階では困難であるとの判断を下した。また、in situ hybridizationにて実際に野生型、エピプラキン欠損型、ヘテロ型の創部におけるケラチン6の発現を可視化すべく、プローブの作成など準備を進めた。なお、ケラチン6は正常部では毛包に、また創部では創部辺縁にケラチン16及び17と共に発現しており、ダイマーを形成している。そこで、ケラチン6のみではなく、ケラチン16及び17の発現も確認すべく、両者の蛋白質を作成するため、創部辺縁よりRT-PCRにて両者のcDNAを作成することとした。いくつかのプライマーを作成し、実際に何度もRT-PCRを施行してみたが、今のところ、解析に十分なcDNAは得られていない。なお、ケラチン5、10に対するポリクローナル抗体は作成し、エピプラキンとの関連を電子顕微鏡にて解析している。1)ケラチン6のGST融合蛋白質の作成とエピプラキンとの結合実験マウスケラチン6の塩基配列をBLASTにて検索し、プライマーを作成、マウスの皮膚よりcDNAを合成した。ケラチン6の全長を作成する予定であったが、今回、作成したプライマーではケラチン6の全長を得ることはできず、一部のcDNAの合成を行った。それに対応するGST融合蛋白質を作成すべく、蛋白合成ベクターへのcDNAの挿入を行い、GST融合蛋白質の作成に成功した。エピプラキンの一部分のGST融合蛋白質の作成はすでに成功しており、それを使用して、エピプラキンとの結合実験を行った。蛋白質の結合実験にはdot blot法を採用したが、結果は、ケラチン6とエピプラキンの結合は確認できなかった。理由としては、ケラチン6、エピプラキンともに全長ではなく、一部であるため、結合ドメインを含んでいなかった可能性があると思われる。全長の作成は蛋白質のサイズが大きい場合、困難であることが多いため、今後は部分的に蛋白質を作成しつつ、結果として全長を網羅できるようにし、最終結論を出したいと思っている。2)ケラチン16及びケラチン17のcDNAの作成ケラチン6と同じく、ケラチン16及び17とエピプラキンとの結合実験をすべく、融合蛋白質を作成するために全長のcDNAを作成することとした。ケラチン6と同様にBLASTで塩基配列を検索、プライマーを作成した。cDNAに関してケラチン16はRT-PCRにてDNAのサイズ上は正しいと推定されるDNAの作成に成功したが、クローニングベクターへの挿入が未だ達成できていない。ケラチン17に関しては、目的とするcDNAは未だ作成できていない。こちらもケラチン6と同様に部分的に作成していく方針を検討している。
タンパク質結晶の熱伝導率および熱拡散率測定法の開発

2018年度は以下の項目に関して実施した。塩化ナトリウムによる最適な結晶化条件の調査:これまで磁器アルキメデス法を用いて結晶を浮揚させる場合、強磁性体である塩化ガドリニウムを沈殿剤として使用していた。しかし、塩化ガドリニウム自体に毒性等はないが、取り扱いに注意が必要である。二液法を行う場合は、沈殿剤の磁性は必要ないため、より安全な沈殿剤として塩化ナトリウムに対する最適な結晶化条件を調査した。二液法による測定試料容器の制作:二液法にはリゾチウム結晶より密度が高いフロリナートを使用する。しかし、結晶水溶液とフロリナートの表面張力の関係から、二液界面形状が多少湾曲し、細かい液面高さの調整が必要である。そこで、試料および測定プローブを設置後に液面高さの調整ができる試料容器を制作した。二液法によるリゾチウム多結晶の熱伝導率および熱拡散率の測定:二液法で育成したリゾチウム結晶に対し、熱伝導率および熱拡散率の測定を実施した。その結果、熱伝導率は磁器アルキメデス法と概ね一致する結果を示したが、磁器アルキメデス法で測定した結果より若干低めの値を示すことがわかった。測定精度の向上:二液法による熱拡散率の測定結果は測定データが大きくばらつくという現象が生じたため、測定回路のケーブルやADコンバータにおける差動入力の接地点の見直しを行い、現在効果を確認している。超電導マグネット傾斜用支持台の開発:磁器アルキメデス法と二液法で若干熱伝導率が異なる原因として磁器力による結晶の配向性の影響が考えられる。そこで、超電導磁石を傾斜させ、結晶配向性を90度ずらした状態で測定できるように、超電導磁石を傾斜させる支持台を制作した。磁器アルキメデス法および二液法により結晶化させたリゾチウムの熱伝導率および熱拡散率の測定に成功した。その結果、若干の測定データに差異が生じる可能性があることがわかった。これは、一つの原因として結晶の配向性の影響が考えられる。したがって、結晶の配向を90度変化させた状態で測定できるように超電導磁石を傾斜できる支持台を制作し、2019年度から計測を開始できる状態まで準備が整っているため。リゾチウム結晶の結晶配向性が熱伝導率、熱拡散率に影響を与えるか調査する。また、測定精度をさらに向上させるとともに、これまで準備してきた装置で測定を重ね、測定データの信頼性の向上を図る。非定常短細線加熱法の測定システムを構築し、熱伝導率および熱拡散率が測定できる状態にした。従来の非定常短細線加熱法の測定プローブは自然体流の発生時間を遅らせるため、垂直に細線を張っている。しかし、本研究では気液界面での測定を行うため、水平に細線を張った測定プローブを開発した。そして、卵白リゾチーム(HEWL)を水に溶解し、塩酸でPHを調整したのちに、沈殿材の塩化ガドリニウムを添加し、再現性良く結晶を育成できる組成比を見つけるとともに、温度管理を含め結晶育成技術を習得した。次に、超電導磁石内における結晶成長の様子を観察するため、硬性鏡、試料容器を設置する治具を開発した。これらの冶具を直径100mmの超電導磁石のボアの中へ入れ、上記方法で調整したHEWL溶液を入れた試料容器を冶具で固定し、磁場を掛けながら結晶育成を試みた。その結果、2.23で磁気アルキメデス効果によって無重力状態となることが確認され、これは数値解析結果と良好に一致することがわかった。更に磁場の強さを上げると、HEWL結晶が浮揚し、気液界面に蓄積することが確認された。また、2.23Tより若干高い程度の磁場では、多くの結晶が試料容器壁面に付着することがわかった。これは、ボア内の磁場には半径方向にも若干強度分布があり、それによって中心方向にわずかな磁気力が発生している。磁場が弱い場合はその磁気力が弱く、試料容器壁面に結晶が付着したものと考えられる。従って、きれいに観測するには比較的大きな磁場が必要であることがわかった。以上の結果をふまえ、磁気浮揚させた状態で気液界面においてHEWL結晶を育成し、そこに非定常短細線加熱法のプローブをあらかじめ設置し、HEWL結晶の熱伝導率および熱拡散率の測定に成功した。また、二液法に関する結晶育成技術に関しても実験を開始した。実験装置を構築し、熱伝導率および熱拡散率が測定できる状態となった。そして、HEWLの結晶育成技術を習得した。また、超電導磁石を用いHEWLの磁気浮揚に成功し、気液界面に結晶を集めることが出来た。更にそこにプローブを設置することにより、HEWL結晶の熱伝導率および熱拡散率の測定に成功した。以上により、本研究を行うための基本的な準備は整った。磁場の向きを変えるハイパーグラビティ実験もプローブのリード端子長を変えるだけで対応できる。二液法に関しては、これから詳細な実験が始まるが、磁気浮揚実験と比べて技術的ハードルは明らかに低い。従って、当初予測した通りの研究が進行しているといえる。

二液法を行う場合は、沈殿剤の磁性は必要ないため、より安全な沈殿剤として塩化ナトリウムに対する最適な結晶化条件を調査した。二液法による測定試料容器の制作:二液法にはリゾチウム結晶より密度が高いフロリナートを使用する。しかし、結晶水溶液とフロリナートの表面張力の関係から、二液界面形状が多少湾曲し、細かい液面高さの調整が必要である。そこで、試料および測定プローブを設置後に液面高さの調整ができる試料容器を制作した。二液法によるリゾチウム多結晶の熱伝導率および熱拡散率の測定:二液法で育成したリゾチウム結晶に対し、熱伝導率および熱拡散率の測定を実施した。その結果、熱伝導率は磁器アルキメデス法と概ね一致する結果を示したが、磁器アルキメデス法で測定した結果より若干低めの値を示すことがわかった。測定精度の向上:二液法による熱拡散率の測定結果は測定データが大きくばらつくという現象が生じたため、測定回路のケーブルやADコンバータにおける差動入力の接地点の見直しを行い、現在効果を確認している。超電導マグネット傾斜用支持台の開発:磁器アルキメデス法と二液法で若干熱伝導率が異なる原因として磁器力による結晶の配向性の影響が考えられる。そこで、超電導磁石を傾斜させ、結晶配向性を90度ずらした状態で測定できるように、超電導磁石を傾斜させる支持台を制作した。磁器アルキメデス法および二液法により結晶化させたリゾチウムの熱伝導率および熱拡散率の測定に成功した。その結果、若干の測定データに差異が生じる可能性があることがわかった。これは、一つの原因として結晶の配向性の影響が考えられる。したがって、結晶の配向を90度変化させた状態で測定できるように超電導磁石を傾斜できる支持台を制作し、2019年度から計測を開始できる状態まで準備が整っているため。次年度は磁場の向きを変えたハイパーグラビティ状態の実験を行う。そのために、プローブの設計を変更する。スポット溶接の作業性を向上させる溶接端子は、別途研究費で購入した。課題はプローブ高さの調整法だが、現在のねじを利用した蓋を用いた調整で対応可能である。また、二液法の結晶育成技術を確立する。今年度の水およびHEWL結晶より高密度で安定なフロリナートを用いた予備実験で、二液界面(HEWL溶液と高密度液体の界面)での結晶育成に成功している。しかし、気液界面の形状や安定性に多少問題があることがわかった。従って、フロリナートの粘度を変え、二液界面の形状変化を調査する。また、フロリナートを用いても実験に耐ええるが、更に、二液法の使用に資する有効な液体がないかを調査する。リゾチウム結晶の結晶配向性が熱伝導率、熱拡散率に影響を与えるか調査する。また、測定精度をさらに向上させるとともに、これまで準備してきた装置で測定を重ね、測定データの信頼性の向上を図る。定電流、電圧発生器に関し、当初予定していた機種と同等で安価なプログラマブル電源を見出した。次年度はハイパーグラビティによる実験を行うため、プローブのリード端子が長くなる。そのため、リード端子の強度を上げる必要が生じる可能性がある。従来の直径1mmの白金棒から2mmの白金棒へ変えた場合、プローブ製作費が著しく上昇するため、その点を考慮して次年度へ残した。予定していたより安く物品が購入できたため。
新規H^+ピロホスファターゼの分子構造、作動機構、生理機能の解析

1.放線菌H^+-ピロホスファターゼ(H^+-PPase)の変異ライブラリー解析H^+-PPaseの基質結合部位のある高度保存領域を含めた領域については、前年度のランダム変異体解析に引き続き、部位特異的変異導入法により解析した。H^+-PPaseの酵素機能に特に重要と考えられるドメインを明らかにした。さらに、第二の高度保存領域をもつ、隣接した領域を対象とした変異体解析を行った。約1500種類の変異体から膜サンプルを調製し、加水分解活性およびH^+輸送活性の測定と抗体を用いたH^+-PPase定量を行った。その後、期待される種類の活性変化を示す変異体について、変異位置を決定した。加えて、知見の乏しい膜貫通領域を中心に部位特異的変異導入による解析も行った。これら変異体の変異位置および活性評価から、H^+輸送および基質加水分解とH^+輸送の共役機構に関わるアミノ酸残基が推定された。放線菌H^+-PPase全長のほぼ半分について、網羅的な変異体解析を終了し、H^+輸送およびエネルギー共役に関わる膜貫通領域をはじめ、多くの機能残基について知見を蓄積した。2.放線菌におけるH^+-PPaseの生理的役割放線菌のH^+-PPaseが生体内で果たす役割について知見を得るため、ゲノム解読の終了したStreptomyces coelicolor A3(2)を用いた解析を行った。S.coelicolor A3(2)のH^+-PPase破壊株について、phenotypeが見られる条件を検討した。その結果、H^+-PPase欠損により、色素生産および培地pHに有意な差が出ることを明らかにした。また、S.coelicolor A3(2)におけるH^+-PPaseの転写についてmRNAレベルで確認し、時期およびパターンを明らかにした。1.放線菌H^+-ピロホスファターゼ(V-PPase)の酵素学的性質放線菌V-PPaseを発現させた大腸菌膜から活性を維持した酵素の精製方法を確立した。この精製酵素標品および放線菌V-PPaseを発現させた大腸菌膜を用いて酵素学的性質の解析を行った。V-PPase全体の分類に関わるイオン要求性を含め、新規V-PPaseである放線菌酵素について多くの知見を得ることができ、V-PPaseの新たな一面が見られた。放線菌V-PPaseはII型酵素であることが分かった。また、植物V-PPaseとの性質比較により、温度耐性や至適pH領域に関して植物酵素と特に異なる性質を持つことを明らかにした。ランダム変異導入した1万種以上のV-PPase変異体すべてを解析するため、多サンプル同時解析プロトコールの確立を目指した。具体的には、変異体膜サンプルについて、加水分解活性,H^+ポンプ活性の測定およびサンプル中のV-PPase定量を含めた連続的な解析プロトコールを確立した。変異体の膜調製とその解析を開始した。3.新規特異的阻害剤の検索アシルスペルミジンの構造を改変した化合物をデザイン・合成し、その阻害作用を検討した。13種類のサンプルの中には阻害効果が見られるものがいくつかあったが、アシルスペルミジンに匹敵するほどの強力な阻害作用を示す化合物は得られなかった。様々な構造のアシルスペルミジン改変化合物を用いた解析により、アシルスペルミジンの構造のうち、スペルミジン骨格ではなく、アシル基が阻害作用をもたらし、その構造の違いにより阻害作用の強さが大きく変わることが分かった。引き続き、基質類縁化合物を含めた新規化合物をデザイン・合成し、その阻害作用についての解析を行っている。1.放線菌H^+-ピロホスファターゼ(V-PPase)の変異体ライブラリー解析V-PPaseランダム変異導入ライブラリーのうち、基質結合部位をはじめとした高度保存領域をもつ,機能的にもっとも重要であると考えられる領域を対象に、変異体解析を行った。具体的には、およそ1500種類の変異体から膜サンプルを調製し、その加水分解活性およびH^+ポンプ活性の測定と抗体を用いたV-PPase定量を行った。その後、期待される種類の活性低下を示す変異体について、変異位置を決定した。これら変異体の活性評価および変異位置から、H^+輸送および基質加水分解とH^+輸送の共役機構に関わるアミノ酸残基が推定された。2.放線菌におけるV-PPaseの生理的役割3.新規特異的阻害剤の検索海洋生物由来の抽出物を対象にV-PPaseへの阻害効果を検討した。今回の試料には、これまでに発見したアシルスペルミジンに匹敵するほどの強力な阻害効果を示す化合物は得られなかった。引き続き、新しい試料を調製し、随時、その阻害作用について検討している。

加えて、知見の乏しい膜貫通領域を中心に部位特異的変異導入による解析も行った。これら変異体の変異位置および活性評価から、H^+輸送および基質加水分解とH^+輸送の共役機構に関わるアミノ酸残基が推定された。放線菌H^+-PPase全長のほぼ半分について、網羅的な変異体解析を終了し、H^+輸送およびエネルギー共役に関わる膜貫通領域をはじめ、多くの機能残基について知見を蓄積した。2.放線菌におけるH^+-PPaseの生理的役割放線菌のH^+-PPaseが生体内で果たす役割について知見を得るため、ゲノム解読の終了したStreptomyces coelicolor A3(2)を用いた解析を行った。S.coelicolor A3(2)のH^+-PPase破壊株について、phenotypeが見られる条件を検討した。その結果、H^+-PPase欠損により、色素生産および培地pHに有意な差が出ることを明らかにした。また、S.coelicolor A3(2)におけるH^+-PPaseの転写についてmRNAレベルで確認し、時期およびパターンを明らかにした。
タンパクアレイを指向した新規タンパク固定化センサを用いるタンパク機能評価システム

遺伝子組み換え技術を駆使することによって、ヒト甲状腺ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン(hTR-LBD)をヒスチジンタグとの融合タンパク質として大量発現させた。これを末端チオール化ニトリロトリ酢酸(NTA)誘導体と金属イオンを介して結合、さらに金-チオール間の化学吸着現象を利用することによって、hTR-LBD三元複合体を金ディスク電極表面上へ固定化した。リガンドとの結合実験はサイクリックボルタンメトリーによって行った。hTR-LBD固定化電極を測定溶液に浸積し、これに甲状腺ホルモンであるトリヨードサイロニン(T3)を加えて電気化学的応答を観察したところ、添加濃度に応じてピーク電流値が大きく減少した。この現象はhTR-LBDを固定化していない電極では全く観察されなかったことから、ピーク電流値の減少は電極表面上におけるリガンド-レセプター間の特異的な相互作用によるものと示唆された。各化学物質の添加濃度とピーク電流の減少量との関係をプロットした結果、得られた検量線はいずれの場合も線形応答がた。TRはリガンドとの結合によって、その立体構造を変化させることが知られている。本検出系では、このコンホメーション変化にともなって大きく変化したタンパク質の表面物性を、マーカーイオンの透過性に基づく電気化学的応答によって捉えたものと考えられる。本バイオセンサの測定時間は約5分と極めて高速であり、その検出感度も従来法に匹敵したことから、甲状腺ホルモンに対する新しい検出法として有効である。
脱メチル化酵素ＡＩＤによる慢性ウイルス感染再活性化の検討

同じく環状ゲノムを持つヒトパピローマウイルス(HPV)についてもHPV16陽性子宮頸部上皮細胞株を用いて検討し、同様の可能性が示唆された。慢性肝炎モデルとして、HBV全ゲノムを持つレプリコンプラスミドをトランスフェクションする事で、cccDNAが肝細胞核に安定維持される系を1試験管内2マウスで樹立する事を目指している。1培養細胞ではこれまでヒト肝細胞株であるHepG2, Huh7を用いてレプリコンプラスミドのトランスフェクションを行ったが、バイサルファイトシーケンスに十分なcccDNAのコピー数が得られなかった。近年HepaRG及びHus-E2がHBVを効率的に増殖できる系として頻用されており、今後これらの系を用いてHBV慢性感染のin vitro実験系の樹立を目指す。2C57BL/6Jにハイドロダイナミクス法を用いたレプリコンプラスミドのトランスフェクションでは、PCR法でcccDNAを検出できなかった。引き続きBalb/cなど他のマウスの系、さらにはヌードマウスやscidマウスなどの免疫抑制マウスを用いてcccDNAを長期維持できる系の樹立を目指す。12どちらの系も樹立でき次第AID/APOBECの発現の有無を分子生物学的に作り、慢性感染病態に差が出るかを見る。その評価は、ウイルスの複製活性(cccDNAのメチル化レベルとコピー数、各種ウイルス産物の定量)と病勢(漏出肝酵素量、マウス体重変化と生死、病理切片)の2つを行う。この際、メチル化レベルを変化させる因子(DNMTやTET)の発現を変動させAID/APOBECの寄与をよりよく見られるよう工夫をする。本研究はAID/APOBECのヒトB型肝炎ウイルス(HBV)のcovalently-closed-circular DNA (cccDNA)に対するDNA脱メチル化活性の検討を目的とした。cccDNAの検出にあたり、サザンブロット法にかわり環状DNAを特異的に増幅するRolling CircularAmpification (RCA)を立ち上げ、実際にHBV全長ゲノムが挿入されたヒト肝細胞株から検出できる事を確認した。ヒトB型肝炎ウイルスの代替モデルとして、より1細胞あたりのcccDNAコピー数の多いDuck Hepatitis B Virus (DHBV)ゲノムを安定発現したニワトリ肝細胞株を用いた。cccDNA選択的バイサルファイトPCR法を用いて評価した結果、APOBEC3Gの異所性発現によりメチル化の減少を認め、APOBEC3がcccDNAのメチル化を抑制している事が示唆された。慢性肝炎モデルとして、HBV全ゲノムを持つレプリコンプラスミドをトランスフェクションする事で、cccDNAが肝細胞核に長期維持される系を1試験管内、および2マウスで樹立する事を目指している。25年度が最終年度であるため、記入しない。慢性肝炎モデルとして、HBV全ゲノムを持つレプリコンプラスミドをトランスフェクションする事で、cccDNAが肝細胞核に安定維持される条件を1試験管内2マウスで樹立する事を目指している。今年度は1HBVを効率的に増殖できる細胞株であるHepaRG及びHus-E2を用いて、cccDNAが長期維持されるin vitro実験系の樹立を目指す。2Balb/cなど他のマウスの系、さらにはヌードマウスやscidマウスなどの免疫抑制マウスを用いてcccDNAを長期維持できるin vivo実験系の樹立を目指す。メチル化レベルを変化させる因子(DNMTやTET)の発現も変動させAID/APOBECの寄与をよりよく見られるよう工夫をする。
革新的微小インダクタ開発

現代のエレクトロニクスの発展において、デバイスの小型化は重要なファクターである。インダクタは3つの基本受動素子の1つであるにもかかわらず、100年以上も前に開発されたコイル型構造をいまだに利用している。微細化に向かないコイル型構造を脱却するために新しい原理のインダクタの提案が切望されている。そこで我々は物質の非線形伝導に関する新しい原理のインダクタを提案した。このインダクタは、微細化可能で、巨大なインダクタンス、巨大なQ値(インダクタンスの特性の目安:角周波数×インダクタンス/抵抗)、能動的素子特性を有することが期待される。これまでの研究でCa2RuO4の単結晶を用いて40 Hを超えるインダクタンスの観測に成功している。しかしその周波数帯域は1 Hz程度と、極めて低い周波数にとどまっている。また非線形伝導の応答が指数関数的単一緩和であると仮定していた。本研究の目的は、高周波帯域までインダクタンスの発現を目指すことと、単一緩和でない非線形伝導の場合の知見を得ることとした。本年度の研究では非線形伝導の応答速度が比較的速いとされる分子性結晶材料であるb-(meso-DMBEDT-TTF)2PF6を利用して行った。その結果、より高い周波数(100Hz程度)でもインダクタンスの観測に成功し、その周波数依存性は単一緩和では議論できないことも明らかになった。そこで緩和時間に分散を有するモデルと式を新たに提案した。このモデルを用いて実験データを解析すると見事に説明でき、本系の特徴的な時間や非単一緩和の度合いの指標が得られた。b-(meso-DMBEDT-TTF)2PF6を利用したインダクタンス研究が進んだため。現在、インダクタの微小化を目指してナノチューブを利用した研究を進めており、残り一年間で計測および解析まで進める予定である。名古屋大学に所属していた際に研究計画を作ったものので昨年度から豊田工業大学へ異動することとなり、出費との計画にずれが生じたため。現在所属している豊田工業大学ではインダクタ計測のための機器にいくつか不足があり経費がかさむものの、微細化のための装置が揃っており、このに予算を使う必要がなくなったため。
口腔癌の浸潤における microRNA の関与とその分子機構の解明

我々は、樹立した口腔癌細胞株と高浸潤能を有するクローンを用いてmicroRNA(miRNA)発現プロファイルを網羅的に解析し、高浸潤能細胞で発現が低下したいくつかのmiRNAから、miR-203を口腔癌の浸潤に関わるmiRNAとして同定した。さらに、その標的mRNAとして、NUAKおよびSNAI2を同定した。昨年度までに、我々は、口腔癌細胞株とその細胞より分離した高浸潤能クローンのmiRNA発現プロファイルを網羅的に比較検討した結果、高浸潤能を有する細胞で発現低下していたmiRNAとして、miR-200familyとmiR-203を同定した。miR-200familyの発現低下がE-cadherinの発現低下を介して、EMTに関わることはすでに報告されているため、miR-203に着目し、浸潤やEMTへの関与について検討し、miR-203が口腔癌の浸潤に深く関わることを明らかにした。今年度は、miR-203の標的mRNAを同定するため、Ago2抗体を用いて、標的mRNAを含めたRISC複合体を免疫沈降し、その産物をマイクロアレイを用いて網羅的に解析した結果と既存のデータベースにおける標的候補mRNAを照らし合わせ、63遺伝子を標的候補mRNAとして同定した。さらに、これまでの文献から、癌の浸潤、EMT誘導などに関わる13遺伝子に着目し、miR-203の導入により発現が低下し、miR-203 inhibitorの導入により発現が増加する遺伝子を調べたところ、NUAKおよびSNAI2の2遺伝子を標的mRNAとして同定した。SNAI2は、すでにmiR-203の標的遺伝子として報告されており、E-cadherinのリプレッサーとしてよく知られている因子であるため、NUAKに着目し、口腔癌細胞株から、NUAKの3'UTR領域をクローニングし、ルシフェレース解析を行ったところ、miR-203によりルシフェレース活性が抑制されたことから、NUAKがmiR-203の新規標的遺伝子であることを明らかにした。現在、NUAKの口腔癌細胞における浸潤への関与について詳細に検討しているところである。これら結果をまとめて、論文として、投稿する予定である。ヒト約900種のmiRNAアレイを用いて、親株と高浸潤能を有する細胞のmiRNAの発現を網羅的に比較検討した結果、高浸潤能を有する細胞で発現低下していたmiRNAとして、miR-200 family(miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-141)とmiR-203を同定した。そこで、我々が有している口腔癌細胞株におけるmiRNAの発現をreal-time PCRにより検討したところ、EMT(上皮間葉移行)をおこした癌細胞でのみ発現低下がみられた。miR-200familyの発現低下がE-cadherinの発現低下を介して、EMTに関わることはすでに報告されているため、miR-203に着目し、浸潤やEMTへの関与について検討した。miR-203の発現のない癌細胞に、内在性の成熟miRNAの機能を模倣したmiRNAmimicを導入し、癌細胞の浸潤への影響を検討したところ、浸潤が抑制された。また、miR-203の発現の高い癌細胞にmiRNA inhibitorを導入し、その発現を抑制したところ、癌細胞の浸潤が促進されたことから、miR-203は、口腔癌の浸潤に深く関わることが明らかとなった。また、EMTへの影響についても検討したところ、E-cadherinの発現変化はみられなかったが、細胞の形態や他のEMTマーカーであるvimentinの発現変化がみられた。そこで、miR-203の標的mRNAを同定するため、Ago2抗体を用いて、標的mRNAを含めたRISC複合体を免疫沈降し、その産物をマイクロアレイを用いて網羅的に解析した。多くのmRNAが同定できたが、浸潤やEMTに関わる標的mRNAを同定するため、既存のデータベースや成熟miR-203あるいはmiR-203 inhibitorを導入した細胞での発現動態を検索し、現在、絞り込んでいるところです。今年度は、おおむね順調に進展したが、標的mRNAの絞り込みに時間がかかったため、miR-203の標的mRNAの同定まではできなかった。次年度は、網羅的に絞り込んだ標的mRNAに対して、これら標的mRNAが浸潤にかかわるかどうかを標的mRNAのsiRNAを合成し、癌細胞へ導入することにより浸潤への関与をマトリゲルを用いたin vitro invasion assayにより解析する。また、ルシフェラーゼアッセイにより、miR-203と標的mRNAの結合を検討する。さらに、口腔癌症例の組織から抽出したtotal RNAを用いてmiR-203とその標的mRNAの発現をreal-time PCRを用いて定量的に解析し、臨床病理学的データより癌の浸潤動態や転移との相関を調べるとともに、標的mRNAの抗体を購入あるいは作製し、口腔癌症例のパラフィン包埋切片を用いてその発現を検討し、臨床病理学的データより癌の浸潤動態や転移との相関を調べる予定である。次年度は、miR-203の標的mRNAの浸潤への関与やルシフェラーゼ解析のための試薬を購入する。

また、miR-203の発現を臨床材料を用いて解析するための、microRNA抽出キットや抗体などの発現解析関連消耗品を購入する予定である。また、研究成果を発表するための日本癌学会への参加費用でも研究費を使用する予定である。
Bacteroides oralis Ig4aのグリカナーゼ遺伝子の解析

S.mutansが作るグルカンは歯垢形成に重要な役割を果たしている。本研究では口腔内常在菌の一つBacteroides oralis Ig4aが産生するα1 6グリカナーゼ(デキストラナーゼ)の遺伝子に着目し、遺伝子のクローニングと遺伝子構造・発現の解析を行った。得られた成果は以下の通りである。【○!1】B.oralis Tg4aのgenomic libraryを作成し、デキストラン分解能を示すクローン(pGI1)を得たこのクローンはB oralis Ig4a由来の4.2kbのDNA断片を保持していた。【○!2】pGL1に種々の欠失挿入変異を導入し解析したところ、左端から0.9-2.2kbの間の領域は活性発現にとって必須の領域で、左端から3kbから右端までの領域は活性発現に必要なかった。【○!3】そこで左端から3kbまでの領域の塩基配列をSanger法を用いて決定した。その結果、左端から2208塩基に始まる終止コドンまでOpen Reading Frame(ORF)がつながっており、このORFに典型的なシグナル配列は見い出させなかった。なおこのORFから合成されるタンパク質の分子量は82キロダルトン(kd)と推定された。またB oralis Ig4aの44kdのデキストラナーゼ蛋白質のC末端のアミノ酸配列はLeu-Leu-MetでORFのC末端と一致した。Bacteroides oralis Ig4aの染色体DNAをHindIIIで切断し, pUC8をベクター, EsuierichiacoliK-12, JM105を宿主とし,クローン・バンクを作製した.クローン・バンクから, 0.5%blue dextranを含む2YT培地でデキストラン分解能を発現するクローンを選択し,約3,700のクローンのなかから1つのデキストラン分解能を有するクローンを得た.このクローンは, HindIIIにより, 2.7kbと4.2kbに切断されるプラスミドをもっており,これをプローブとして,サザン・ハイブリダイゼーションを行った.その結果, 4.2kbDNAがB.oralis Ia4aに由来しており,本プラスミドをpGL1と命名し,制限酵素地図を作製した.この4.2kbDNA断片中には, EcoRIおよびBglII切断部位がおのおの1ケ所, PstI部位が, 3ケ所存在した.このクローンから産生されるデキストラナーゼは,分子量44KDの蛋白質として認められ,大部分の酵素活性はペリプラズム分画に検出された.更にPGL1をPstIで部分消化し,再結合した組変えプラスミドpGL11, pGL12およびpGL13をサブクローニングした結果, 2.2kbのHindIII-PstI断片がデキストラナーゼ分解活性の発現に必要であることがわかった.このペリプラズム画分のデキストラナーゼを分離・精製し,作用機序を調べたところ,エンド型の分解を示し, Boralis Ig4aのデキストラナーゼと同じものであった.更にこの断片は, IPTGの添加によりデキストラナーゼ活性が誘導されること,正逆両方向に断片を挿入した時,正方向でのみ活性が発現することから,独自のプロモーターが欠けていることが示唆された.今後,この遺伝子の塩基配列を知るとともに,高収量に目的生産物を産生するより強力な発現系について検討する予定である.昨年度までに,Bacteroides oralis Ig4aからα1,6グルカナーゼ(テキストラナーゼ)遺伝子を4.2kbのHindIIIDNA断片として大腸菌のプラスミドpUC8にクローニングし(pGL1),大腸菌で発現させることに成功した。さらにクローン化されたDNA断片は,この遺伝子の発現にとって必要な自らのプロモーターを欠くこと等の結果を得た。本年度においては,クローン化されたDNA断片の詳細な解析をすすめ以下の結果を得た。【○!1】pGL1を保持する大腸菌のデキストラナーゼ活性は主として細胞質に存在した。【○!

2】pGL1に種々の欠失挿入変異を導入し解析したところ,左端から0.9-2.2kbの間の領域は活性発現にとって必須の領域で,左端から3kbから右端までの領域は活性発現に必要なかった。【○!3】そこで左端から3kbまでの領域の塩基配列をSanger法を用いて決定した。その結果,左端から2208塩基に始まる終止コドンまでOpen Reading Frame(ORF)がつながっており,このORFに典型的なシグナル配列は見い出せなかった。なお,このORFから合成されるタンパク質の分子量は82キロダルトン(k.d)と推定された。また,B.oralis Ig4aの4.4kdのデキストラナーゼ蛋白質のC末端のアミノ酸配列はLeu-Leu-MetでORFでC末端と一致した。【○!4】B.oralis Ig4aで産生されるデキストラナーゼの最も大きな分子サイズを推定したところ105kdであった。以上の結果から,今回クローニングされたデキストラナーゼ遺伝子は3側の一部であり,B.oralis Ig4aではまず105kd蛋白質として合成され,44kd蛋白質にプロセスされる可能性が示唆された。