hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞膜の非対称性の分子機構とその生理・病態的意義の解明

細胞膜におけるリン脂質の非対称的な分布は、真核細胞で見られる普遍的な現象である。すなわち、ホスファチジルセリンなどのアミノ基を持つリン脂質は、細胞膜の内層に限局し、細胞膜の外層には分布しない。細胞膜におけるリン脂質の非対称的分布の分子機構は不明であり、細胞膜リン脂質の物性における大きな謎である。本研究では、細胞膜の網のリン脂質を移層する酵素、リン脂質フリッパーゼとしてP4型ATPaseであるATP11AとATP11Cを同定し、その生化学的特性を解析した。また、P4型ATPaseのベータサブユニットであるCDC50Aの機能に必須なアミノ酸を同定した。本年度は細胞膜で機能するリン脂質フリッパーゼを同定することを試みた。ATP11Cが属するP4型ATPaseファミリーメンバーにフリッパーゼとして作用する分子が存在する可能性があることから、ATP11C欠損細胞にP4型ATPaseファミリーを発現させ、細胞膜における蛍光標識ホスファチジルセリン(NBD-PS)の移層活性を測定した。その結果、ATP11Cの他にATP11A、ATP8A2がNBD-PSを細胞膜の内層へ移層させた。実際、これらのタンパク質を精製し、試験管内でATPase活性を測定したところPSの存在下でATPase活性が強く上昇した。以上よりATP11C, ATP11A, ATP8A2が細胞膜PSフリッパーゼとして機能することが示唆された。ATP11Cはアポトーシスに陥る際に、分子中央部分でカスパーゼによる切断・分解をうけることで不活性化される。ATP11Cと同様に、ATP11Aは分子中央部分で実行型カスパーゼにより切断されるが、ATP8A2は切断されなかった。カスパーゼと同様に、ATP11AおよびATP11CはカルシウムによりATPase活性が阻害されるが、ATP8A2のATPase活性はカルシウムの上昇に対し抵抗性を示した。これらの結果と一致するように、内因性のATP8A2が発現しないTリンホーマ株にATP8A2を発現させると、アポトーシスの際にPSを細胞表面に露出しなかった。ヒト、マウスにおける遺伝子発現を解析した結果、ATP11AおよびATP11Cは全身性に発現しているがATP8A2は精巣や脳など限局した発現パターンを示した。以上より、ATP11CおよびATP11Aがユビキタスに発現するカスパーゼーカルシウム調節性の細胞膜フリッパーゼであること、ATP8A2はこれらのフリッパーゼとは異なる細胞において異なる制御を受けることが明らかとなった。細胞膜で機能するリン脂質フリッパーゼの生化学的な解析を行い、論文に報告した(Segawa K, et al., JBC, 2016)。実験計画にある、P4型ATPaseのシャペロン分子であるCDC50Aに対するモノクローナル抗体の樹立も進行中であり、遺伝子改変マウスの解析の準備も整いつつある。細胞膜におけるリン脂質の非対称的な分布は、全ての真核細胞で見られる普遍的な現象である。つまり、ホスファチジルセリン(PtdSer)などのアミノ基を持つリン脂質は、細胞膜の内層に限局し、細胞膜の外層には分布しない。細胞膜の非対称性の分子機構は不明であり、細胞膜の物性おける長年の大きな謎である。さらに、「なぜ全ての細胞は細胞膜を非対称にする必要があるのか」という点、すなわち、細胞膜の非対称性の生物学的意義は依然として不明である。そこで本研究では、哺乳類細胞における細胞膜の非対称性を制御する分子であるCDC50Aを解析することを目的としている。本年度はCDC50Aの遺伝子欠損マウスの作製を行った。全身で遺伝子を欠損したマウスは胎生致死であり、産仔を得ることができたなかった。そこで、組織特異的にCDC50Aを欠損するマウスを作製した。実際、T細胞特異的にCreリコンビナーゼを発現させることでT細胞特異的にCDC50Aを欠損するマウスを作製し、現在解析を行っている。また、種々の細胞特異的にCreレコンビナーゼを発現するマウスと交配させて、その生理的機能を解析する予定である。また、計画どおりCDC50Aの抗体を作製中であり、いくつかのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得つつある。また、FLAGタグを付加したCDC50Aをフリッパーゼ欠損細胞に発現させ、抗FLAG抗体を用いた免疫沈降法を行い、CDC50Aに結合するタンパク質をいくつか同定しつつある。CDC50Aを全身性に欠損したマウスは胎生致死の為、解析が不可能であったが、組織特異的遺伝子欠損マウスの樹立に成功し、現在解析中である。また、CDC50Aに対するモノクローナル抗体に関しても、いくつかポジティブな反応を示すラインを樹立できている。細胞膜の非対称性の分子機構は不明であり、細胞膜の物性における長年の大きな謎である。さらに、「なぜ全ての細胞は細胞膜を非対称にする必要があるのか」という点、すなわち、細胞膜の非対称性の生物学的意義も不明である。本研究では、哺乳類細胞における細胞膜の非対称性の分子機構とその生理的、病態的意義の解明を目的とする。本年度では、細胞膜の非対称分布に関与する分子、P4型ATPaseのベータサブユニットであるCDC50Aの組織

特異的欠損マウスの樹立に成功した。種々のプロモーターの支配下でCreリコンビナーゼを発現するTgマウスと交配させ、解析を行いつつある。また、CDC50Aの機能解析を遺伝学的手法と生化学的手法を用いて行い、機能に必須なアミノ酸を同定することに成功した。具体的に、ヒトCDC50AのcDNA配列にerror-prone PCR法を用いてランダムに変異を導入し、変異体をCDC50A欠損細胞に安定発現させた。フローサイトメトリーを用いて、CDC50Aの機能、すなわち、細胞膜でのフリッパーゼ活性を回復させない変異体を回収後、次世代シークエンサーを用いて変異を解析した。その結果、CDC50Aの機能に必須の14アミノ酸を同定した。さらに、CDC50Aは260番目のトリプトファン残基を用いて、アルファサブユニットであるP4型ATPaseの酵素活性を制御することが示唆された。細胞膜におけるリン脂質の非対称的な分布は、真核細胞で見られる普遍的な現象である。すなわち、ホスファチジルセリンなどのアミノ基を持つリン脂質は、細胞膜の内層に限局し、細胞膜の外層には分布しない。細胞膜におけるリン脂質の非対称的分布の分子機構は不明であり、細胞膜リン脂質の物性における大きな謎である。本研究では、細胞膜の網のリン脂質を移層する酵素、リン脂質フリッパーゼとしてP4型ATPaseであるATP11AとATP11Cを同定し、その生化学的特性を解析した。また、P4型ATPaseのベータサブユニットであるCDC50Aの機能に必須なアミノ酸を同定した。細胞膜におけるリン脂質の非対称性の分子機構について解析を進める。CDC50Aに対するモノクローナル抗体を作成し、免疫沈降法などを用いてCDC50Aに結合する分子を解析する。また、組織得的なCDC50A欠損マウスの樹立を目指す。計画どおり、組織特異的CDC50A遺伝子欠損マウスの解析を行う。特にT細胞特異的に遺伝子欠損させたマウスの解析を中心に行う予定である。CDC50Aに対する抗体が得られた場合、組織切片におけるCDC50Aの局在やCDC50Aを中心とした生化学的解析に持ちいる予定にしている。具体的には、CDC50Aに結合するタンパク質を免疫沈降法と質量分析を持ちいることで解析する予定にしている。分子生物学、生化学昨年度に作製した安定発現細胞株を用いた実験が主となり、大きく培養関連消耗品を使用することがなかった。当初予定していたCDC50A遺伝子欠損マウスの解析が、胎生致死の表現系の為に遅れたこと、またCDC50Aに対するモノクローナル抗体の取得が当初の見込みより遅れたことに起因する。培養細胞を大量に使用する生化学実験を計画していることから、培養関連の消耗品を大きく使用することになる。具体的には血清および培地の購入、さらに生化学実験で使用する界面活性剤や抗体の購入、マウス関連実験にかかる費用などで次年度使用する見込みである。組織特異的遺伝子欠損マウスの作製に成功したこと、CDC50Aの抗体を得つつあることから、CDC50Aの各種組織特異的遺伝子欠損マウスの解析を集中的に行う予定である。マウスの解析にかかる経費に使用する予定である。
フローセル式SAXS法によるナノ粒子のサイズ・分子量・形状の分布付き同時測定

ナノ粒子や高分子の分子特性は、基礎と応用のいずれにおいても重要となるが、数十nm以下の粒径の分子に関しては、サイズ評価、特に回転半径の評価は従来困難であった。フローセルを利用したX線小角散乱を利用して、本研究でこれまで測定が困難であった領域のサイズ評価を可能にし、さらにサイズや形状が異なる一連の分子の混合物に対しても、各分子種毎にサイズや形状等のキャラクタリゼーションを迅速に行う事が可能なSEC-SAXS法を開発した。本研究では、ナノ粒子の「サイズ、分子量、形状(構造)」を、分布を含めて精密に測定する手法を開発することを目的としている。これらは基礎的性質であるが、液中での測定は従来限定された条件(サイズ分布が狭い、分布形状を仮定した場合等)でのみ可能であった。本研究で放射光(SPring-8)を利用した「フローセル式SAXS法」を確立して実現する。フローセルの利用により、X線強度が強い放射光利用時の欠点の一つでもある、「照射の影響によるサンプルの変質が大きい問題」等も自ずと解決されると期待できる。本手法で弱会合性高分子など、会合のために孤立鎖の研究がバッチ式では困難となる系の応用が可能になれば、これまで測定対象外であった各種ナノ粒子混合物中の各成分の測定も可能になり、今後の様々な用途への応用が期待できる。本年度は、本研究の要である「フローセルSAXS法」の確立を目指すべく、基礎的事項の確認を行った。具体的には、装置の校正及び精度限界の確認(2)X線照射効果(サンプルの変質)低減による精度向上、(3)濃度依存性の短時間測定による精度向上、(4)混合物の各成分を対象とした溶液散乱の短時間測定、を始めとした基本的な確認実験を行い、条件を最適化すると同時に、本手法の利点でもある、放射光のビームタイムを有効利用(ハイスループットイト化)するための装置開発も行った。SPring-8で、実験ハッチ内において高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を利用できるように、ハッチ外からのサンプル注入、フラクションコレクターによるサンプル回収等の制御を行うシステムを構築した。これにより、前述の(1)(4)の測定を自動化することが可能となり,条件探索の迅速化が可能になった。高分子のキャラクタリゼーションは基礎科学から応用まで幅広く求められているが、比較的低分子(分子量5万以下)のサイズ評価、特に回転半径の評価は、従来困難であった。高分子量に限定してサイズ評価が簡便に実施可能なSEC-MALLS法を応用して、放射光施設でSAXS測定を行う事により、一連の分子のサイズ等のキャラクタリゼーションを迅速に行う手法の開発を今年度も引き続き取り組んだ。昨年度は比較的太いカラムを利用して、調整の容易さを重視した実験を行って来たが、今年度はより細い径のカラムを利用して多種類のサンプルに適用して、回転半径の分子量依存性を得た。カラムの径が増加すると、より多くのサンプルを注入可能となり、感度が高くない検出器での同時分析が可能となり、濃度他の確認時になる利点があった。SEC-SAXS実験を行った後のサンプルを回収して各種分析を行う際にも、サンプル量が比較的多く、各フラクションで十分な量が得られるため、各種確認が容易であった。しかし、必要なサンプル量が多いために、貴重なサンプルを利用しにくいという欠点があった。実験時間が限られる放射光施設では調整の容易さは最重要であったが、基本的な装置系のセットアップは昨年度終了したため、本年度は多種類のサンプルに対してSEC-SAXS法を適用する事を目的として、必要サンプル量の低減化を測った。具体的には細いカラムを利用し、フローセルに流す流量も減らすことで、分離及びSAXSの測定精度を保ったまま、必要サンプル量を約1/10にする事に成功した。また、より高性能なX線検出器、ピラタスを使って高精度化にも取り組んだ。高感度かつデータ転送速度が速い特徴を活用して、ダイナミックレンジの広い測定が可能となった。これにより、より広範囲な応用が見込めるようになった。一連の多糖類、デキストラン、デキストラン硫酸、プルラン、イヌリン、キシログルカン、ガラクトマンナン等についてSEC-SAXS測定を行い希薄溶液物性を検討した。
犯罪抑止条件に関する環境心理学的研究-犯罪抑止をもたらす住居構造及び近隣地域の特徴を中心に

本研究は、近年増大しつつある犯罪を抑止する条件を環境設計の側面から明らかにするために、最近我が国においてもその研究が関心をもたれるようになった犯罪への環境論的アプローチを用いて、犯罪の発生や住民の犯罪に対する不安を生み出す住居、環境要因について検討することを目的とした。研究は大きく二つに分かれる。一つは、環境論的視点からの研究をおこなうにあたり、警察統計を用いて、犯罪をその発生場所に着目して分類することである。他は、犯罪被害や犯罪への不安、および地域環境条件についての質問紙調査を実施し、犯罪被害と不安に関与する住居、地域環境要因を明らかにするものである。その結果、地域の無作法性や乱雑度、集合住宅の比率などの地域特性、あるいは高齢者、若年者の比率などの住民特性など、多くの地域環境要因が犯罪の発生や不安形成に関与していることが明らかとなった。また、監視性や道路構造、集合住宅のエレベーターなどの場所的要因もまた、犯罪多発地点の形成に関与することが明らかとなった。しかし、本研究の重要な点は、こうした環境要因の犯罪発生過程における役割は犯罪の種類ごとに異なり、特定の環境要因が多くの犯罪に一様なかたちで関与するものではないことを示した点である。すなわち、無作法性にみるように、それが犯罪の機会を増大させるかたちで犯罪を促進する場合と、逆に犯罪対象(獲物)の不在を意味し、犯罪を抑制する役割を果たす場合がある。もう一つの重要な点は、高齢者や集合住宅における子供の存在のように、潜在的被害者の提供という点で犯罪に関与する場合があることを明らかにしたことである。また、本研究は、同一の犯罪でも実際の被害発生に関与する要因と住民のその犯罪に対する主観的な不安形成に関与する要因は必ずしも一致しないこと、したがって犯罪抑止の方策と不安軽減のための方策は区別して策定する必要があることを明らかにした点でも重要な意味をもつ。本研究はわが国における犯罪抑止の環境条件を明らかにすることを目的とした。そのため、本年度では次年度での本調査で用いる環境指標(変数)と犯罪指標を検討するための予備調査を行った。予備調査は次の二つの調査からなる。一つは居住環境の指標の検討を目的とした質問紙調査である。具体的には環境犯罪学などが問題としてきた住居や地域の領域性・監視性・無秩序性などの指標と、犯罪抑止に関連すると思われる他の住環境の指標について、それらと各種犯罪の実際の発生件数や居住者の犯罪への不安との関連を分析することで次年度での本調査で用いる指標を検討する。もう一つは、犯罪を環境との関連性に応じて分類する必要があることから、警察庁などの各種統計資料の分析により、犯罪をその発生場所に基づいて分類することであった。まず、住居構造や近隣地域特性に関する質問紙調査では、名古屋市内の古くからの住宅地と新興住宅地の二つの地域を選定し、それぞれさらに集合住宅の多い地域と一戸建て住宅の多い地域を選定した。回答者は30代から50代の女性に限走した。これは犯罪被害への不安では性と年齢が関与することが知られているため、対象を限定したことによる。回答者については900名を住民台帳から無作為に抽出した。まず、葉書で調査への依頼をおこない、その2週間後に質問紙を郵送する方法をとった。回答も、匿名性を維持するために、郵送によった。葉書による依頼や質問紙配布の段階での回答拒否や転居等による不在などの事情から、結果的に配布数は882部となった。回答は530部で回収率は60.1%であった。現在その結果を分析している段階である。統計指標による犯罪の分析は、犯罪統計書(警察庁)をもとにクラスター分析をおこない、犯罪発生場所に基づく犯罪種別の分類をおこなった。その結果、年度により若干の相違があるものの、大きく45のグループに分かれ、なかでも強姦が他の犯罪と異なることが明らかとなった。これについても現在、グループ毎の発生場所の特徴を分析中である。

もう一つの重要な点は、高齢者や集合住宅における子供の存在のように、潜在的被害者の提供という点で犯罪に関与する場合があることを明らかにしたことである。また、本研究は、同一の犯罪でも実際の被害発生に関与する要因と住民のその犯罪に対する主観的な不安形成に関与する要因は必ずしも一致しないこと、したがって犯罪抑止の方策と不安軽減のための方策は区別して策定する必要があることを明らかにした点でも重要な意味をもつ。
シロアリ共生原生生物が持つユニークなヘミセルロース分解関連酵素群の性質の解明

シロアリ腸内原生生物由来のGHF26に属するマンナナーゼRsMan26A、B、CおよびHの発現・精製・性質の検討を行った。各種基質に対する活性を検討した結果、興味深いことにHは直鎖マンナンやオリゴマンナンからマンノビオースを生成するマンノビオヒドロラーゼであることがわかった。またCのX線結晶構造解析から本酵素が典型的な(beta/alpha)8 TIMバレル構造を持ち、活性中心付近においてマンノースを特異的に認識する残基などを有することがわかった。サブサイト-5から-2にかけてはグルコマンノオリゴ糖が結合しており、これがグルコマンナンに対し高い活性を示す理由であると考えられた。シロアリ腸内原生生物由来マンナナーゼRsManCの発現と精製を行い、様々な基質に対する分解活性を調べた。その結果、RsMan26Cは4糖以上のマンノオリゴ糖、直鎖マンナン及び不溶性の結晶性マンナンをランダムに分解した。また、ガラクトマンナンとグルコマンナンに対しては直鎖マンナンの2倍を超える高い比活性を示した。RsMan26Cはその活性部位においてガラクトース側鎖を許容しやすく、マンノースとグルコースのヘテロ多糖を基質として認識できる緩やかな基質特異性を持つことが示唆された。続いてRsMan26CのX線結晶構造解析を行った。精製RsMan26Cを用いてシッティングドロップ法により結晶の取得を行い、分子置換法により位相を決定し、精密化して分解能1.3Å、Rwork/Rfree=17/19%で最終構造とした。また、本来のネイティブ構造に加え、グルコマンナンの加水分解産物(グルコマンノオリゴ糖)との共結晶構造も得た。RsMan26Cの全体構造(ネイティブ構造)は典型的な(beta/alpha)8 TIMバレルで、他のGH26ファミリー同様に、活性中心残基やサブサイト-1においてマンノースを特異的に認識する残基などが保存されていた。一方、グルコマンノオリゴ糖との共結晶構造では、活性部位のサブサイト-5から-2にかけてグルコマンノオリゴ糖が結合していた。サブサイト-2にはマンノースのみが結合していたのに対して、サブサイト-4と-3にはマンノースとグルコースの両方が、サブサイト-5にはグルコースのみが結合していた。特にサブサイト-3では、Arg-126と、酸化されたメチオニン(SME85)がグルコースの特異的な認識にそれぞれ関与していることが示唆された。以上の結果から、RsMan26Cはサブサイト-5、-4、-3においてグルコースを許容または認識できることが示唆され、このことはRsMan26Cがグルコマンナンに対し高い活性を示す理由であると考えられた。ヤマトシロアリReticulitermes speratusの後腸に共生する原生生物群からクローニングされた2種類のマンナナーゼ(RsMan26AおよびRsMan26B)はいずれも糖質加水分解酵素(Glycoside Hydrolase: GH)ファミリーのGH26に属している。本研究ではその機能解析を目的として、P. pastoris KM71H株を宿主とした異種生産を行った。生産に用いたプラスミドは、GAPプロモーター制御下でN末端にmycタグとHis6タグが付加された成熟体RsMan26X(X=AまたはB)が菌体外に分泌されるように構築されている。培養上清のマンナナーゼ活性を検討した結果、どちらも活性が認められた。精製酵素を用いて酵素学的性質を解析したところ、両酵素とも低pH(3.05.0)において高い活性を示した。マンノオリゴ糖との反応産物を薄層クロマトグラフィーにより解析したところ、RsMan26Aは6糖以上の鎖長のマンノオリゴ糖を、RsMan26Bは4糖以上の鎖長のマンノオリゴ糖を基質とすることが分かった。また、天然のマンナン基質である直鎖マンナン、Locust bean gum(LBG)、グルコマンナン、グアーガムとの反応性を比較したところ、RsMan26AはLBGに対して最も高い活性を示し、RsMan26Bはグルコマンナンに対して最も高い活性を示した。オオシロアリHodotermopsis sjostedtiの腸内に共生するEucomonympha属原生生物から単離されたcDNAがコードするセロビオヒドロラーゼ(EuCBH)は、分子系統解析によりGHファミリー7に属するCBHと近縁であると予想された。さらに、そのアミノ酸配列中にGHファミリー7のCBHが持つ触媒残基が保存されていたことから、EuCBHはCBH活性を持つと予想された。A. oryzaeを用いた生産のため、EuCBHをα-アミラーゼAmyBとの融合タンパク質として発現させるプラスミドを作製した。発現後に両者が分離できるように、AmyBとEuCBHの間にKex2様プロテアーゼ切断配列およびグリシン3残基を挿入し、さらに検出・精製のためEuCBHのC末端側にHA-His6タグを付加した。この発現プラスミドを用いてA. oryzae株の形質転換を行ったのち、得られた株を培養し、菌体および培地画分のタンパク質について抗HA抗体を用いたウエスタン解析を行った。その結果、菌体画分においてはAmyBとEuCBHの融合タンパク質の発現が確認され、Kex2様プロテアーゼによる切断を受けていないと考えられた。

一方、培地画分については濃縮およびNi-NTAカラムによる精製を行ったのち、同様にウエスタン解析を行ったところ、目的タンパク質のサイズと考えられるバンドが検出された。以上の結果から、EuCBHの生産に成功したと考えられた。シロアリ腸内原生生物由来のGHF26に属するマンナナーゼRsMan26A、B、CおよびHの発現・精製・性質の検討を行った。各種基質に対する活性を検討した結果、興味深いことにHは直鎖マンナンやオリゴマンナンからマンノビオースを生成するマンノビオヒドロラーゼであることがわかった。またCのX線結晶構造解析から本酵素が典型的な(beta/alpha)8 TIMバレル構造を持ち、活性中心付近においてマンノースを特異的に認識する残基などを有することがわかった。サブサイト-5から-2にかけてはグルコマンノオリゴ糖が結合しており、これがグルコマンナンに対し高い活性を示す理由であると考えられた。2つの新規マンナナーゼの発現と精製、および性質の検討に成功した。それぞれがお互いに、また従来取得されていたシロアリ共生原生生物由来のマンナナーゼとも異なる性質を持つことがわかり、ヘミセルロース分解に用いる酵素の選択肢を増やすことができた。微生物学引き続き新規マンナナーゼの生産に取り組み、その性質をこれまで得られていた酵素群と比較検討する。また、GH10およびGH11キシラナーゼ、およびCE15に属するグルクロン酸エステラーゼの生産も試みる。RsManCとRsManHという二つのシロアリ共生原生生物由来のマンナナーゼの精製に成功し、その詳細な酵素学的性質を明らかにした。また、平成26年度に予定していたRsManCのX線結晶構造解析も前倒しで行い、その立体構造、および基質との共結晶構造を明らかにした。これにより、RsMan26Cがグルコマンナンに対し高い活性を示す理由が明らかとなり、シロアリ腸内に共生する原生生物の木材分解機構に関する理解が深まった。一方、GH10およびGH11キシラナーゼ、およびCE15に属するグルクロン酸エステラーゼについては予定通りその発現に着手した。酵母Pichia pastorisを用いた生産では細胞内での発現には成功したが、分泌生産が認められなかった。そのため、宿主として大腸菌を用いるなどの変更も試みている。GH10およびGH11キシラナーゼ、およびCE15に属するグルクロン酸エステラーゼの酵母Pichia pastorisを用いた生産において、分泌生産が認められなかったため。GH10およびGH11キシラナーゼ、およびCE15に属するグルクロン酸エステラーゼを始めとする様々なシロアリ共生原生生物由来のバイオマス分解酵素の発現とその性質解明に取り組む。優れた性質を持つ酵素群を選抜し、シロアリ由来の酵素を用いたバイオマスの酵素分解システムの構築を目指す。大腸菌での生産とリフォールディングを行う。平成27年4月から準備を始め、5月に発現プラスミドを作製し、大腸菌への形質転換を行う。6月以降、発現条件を検討し、発現に成功すれば、高圧法を用いたリフォールディングを行う。GH10およびGH11キシラナーゼ、およびCE15に属するグルクロン酸エステラーゼの酵母Pichia pastorisを用いた生産において、分泌生産が認められなかった。そのため、宿主として大腸菌を用いるなどの変更も試みているため。
エイズに合併する日和見真菌感染症の発症要因に関する研究

これまでに我々は、動物モデルを用いてクリプトコッカスやペニシリウム・マルネッフェイに対する感染防御機構について検討を行ってきた。本研究では、クリプトコッカスの感染防御がTh1-Th2サイトカインバランスによって巧妙に調節されることを明らかにした。Th1サイトカインであるIFN-γは感染防御に、逆にIL-4は感染を悪化させる方向に作用した。クリプトコッカスの強毒株は脳への播種性感染を起こして全マウスを死に至らしめるが、肺内でのサイトカイン産生動態を調べてみると、Th2サイトカインは早期から産生されるものの、Th1サイトカイン及びその誘導に重要なIL-12、IL-18の産生は極めて弱かった。こうして、強毒株はTh1-Th2サイトカインバランスをTh2側にシフトさせることで宿主の感染防御機構からエスケープしている可能性が考えられた。実際に我々は、同じクリプトコッカス株がマクロファージからのIL-12産生を抑制した。さらに、強毒株の感染ではTh1サイトカインだけではなく、感染防御に重要なリンパ球やマクロファージの遊走を引き起こすことが知られているCCケモカインやIP-10の産生がみられず、感染局所でのこれら細胞の浸潤が極めて乏しかった。一方、IL-12を投与されたマウスでは、Th1サイトカイン及びCCケモカイン、IP-10の産生が著明に誘導され、局所へのリンパ球およびマクロファージの浸潤及び肉芽腫性炎症反応が明瞭にみられるようになった。また、各種サイトカインの遺伝子を欠損したマウスを用いた研究から、IL-18及びIL-12が感染防御に重要なサイトカインであることも証明した。ペニシリウム・マルネッフェイは、活性化マウスマクロファージの殺真菌活性に対して酵母とコニディアでは感受性が異なり、前者が殺菌されるのに対して後者は抵抗性であった。殺菌機構には、一酸化窒素が重要であり活性酸素は直接には関与していなかった。一方、ヒト好中球もある程度の殺菌活性を示したが、本活性はGM-CSFなどのサイトカインによって強く増強された。この殺菌機構には活性酸素は関与しておらず、顆粒内の殺菌物質が重要な働きをすることも明らかにした。これまでに我々は、動物感染モデルを用いてCryptococcus neoformansやPenicillium marneffeiに対する感染防御機構における細胞性免疫能の重要性、特にC.neoformansではIFN-γ、TNF-α、IL-12を中心としたTh1関連サイトカインの重要性、マクロファージ殺菌機構における一酸化窒素(NO)、活性酵素の役割について明らかにしてきた。これらの知見に加えて本年度の研究では、新しいサイトカインとして発見されたIFN-γ誘導因子(IL-18)がIL-12と同様にC.neoformans感染に対して防御的に働くこと、本サイトカインに対する中和抗体によって感染が悪化すること、そしてさらに興味深いことにIL-12とIL-18を併用で用いるとマウス腹腔滲出細胞の抗C.neoformans活性を相乗効果的に増強することを明らかにした。これらのIL-12,IL-18の作用はIFN-γに依存しており、in vitroでは腹腔滲出細胞中のNK細胞が主要なIFN-γ産生細胞であった。

現在は、これらの知見をさらに拡大するために、IL-12とIL-18の併用投与によるin vivoでのC.neoformans感染防御に及ぼす効果について検討し、in vitroと同様に両サイトカインが相乗効果的にマウスの感染抵抗性を高めること、その効果は感染局所でのTh1-Th2バランスをTh1側にシフトさせることによること、そして感染初期における肺内でのIFN-γ産生細胞はNK細胞及びγδT細胞であることも明らかにしている。これらの結果から、C.neoformans感染防御には異なる2種類のIFN-γ誘導サイトカインが中心的な役割を担っていることが明らかになった。一方我々は、haost-parasite interactionの中で宿主側からだけでなく真菌から宿主への作用も存在し、C.neoformansがマクロファージからのIFN-γ及びLPS刺激によるTNF-αやNOの産生を抑制するという興味深い現象も見出している。また、P.marneffeiに対するマクロファージの殺菌機構として活性酸素よりもよりもむしろNOがより重要であることも明らかにした。今後は、これらの知見をさらに拡げることによって、これら真菌の発症病体のメカニズムを明らかにしていきたい。これまでに我々は、動物感染モデルを用いてCryptococcus neoformansやPenicillium marneffeiに対する感染防御機構における細胞性免疫能の重要性、特にC.neoformansではIFN-_y、TNF-α、IL-12、IL-18を中心としたTh1関連サイトカインの重要性、マクロファージ殺菌機構における一酸化窒素(NO)、活性酸素の役割について明らかにしてきた。これらの知見に加えて本年度の研究では、IL-12とIL-18が相乗効果的にNK細胞及び_yδT細胞からのIFN-_y産生を誘導することでC.neoformans感染に対して防御効果を有すること、この作用にはTNF-αがマクロファージからのNO産生を増強することで関与していることを明らかにした。一方、我々はC.neoformans感染後肺内では炎症細胞の集積が極めて乏しく真菌が肺胞腔を埋め尽くしているような像を観察していたが、本年度の研究ではこの現象をフローサイトメトリを用いて確認するとともに、各種ケモカインの産生動態を解析することでケモカインの産生異常がこのような病理学的変化を起こしている可能性を示す結果が得られた。逆に、IL-12を投与すると著明な炎症反応が誘導され致死的感染から免れるが、これはケモカインの産生異常が是正されるためと考えられた。一方我々は、host-parasite interactionの中で宿主側からだけでななく真菌から宿主への作用も存在し、C.neoformansやCandida albicansが活性化マクロファージからのNOの産生を抑制するという現象を見出してきたが、本年度の研究ではC.neoformansが同細胞からのIL-12産生を抑制しIL-10産生を軽度増加させることを報告した。これらのことは、host-parasite interactionを考える上で大変興味深い。また、P.marneffeiに対するマクロファージの殺菌機構として活性酸素よりもむしろNOがより重要であり、活性酸素はNOによる殺菌に対して調節的に働くことを示した。今後は、これらの知見をさらに拡げることによって、これら真菌の発症病態を解明していきたい。
間葉系幹細胞を応用したバイオハイブリッド人工骨の開発

骨組織構造に類似した三次元的構造を持つ、連通多孔性ハイドロキシアパタイト(多孔性HA)に多分化能を持つ間葉系幹細胞(MSC)を導入することで自家骨に代わる骨形成能を付与したバイオハイブリッド人工骨の開発を試みた。ビーグル犬腸骨よりMSCを含む骨髄間質細胞を採取し、bFGFを用いた超高速増幅法により短期間に必要量の細胞培養・増殖を行った。これらより得られたMSCを,三次元的構造を持った多孔性HA内へ導入、走査型電子顕微鏡による観察を行った。導入したMSCは多孔性HA内部に広範囲に分布しており、中心部においても観察された。また、導入細胞は伸展しアパタイト表面に付着している像が観察された(実験1)。次に、バイオハイブリッド人工骨を生体内に移植し、骨形成能を評価した。まず、蛍光色素標識を施したMSCを導入したバイオハイブリッド人工骨(直径3.7mm、高さ7mm)を動物大腿骨に円柱状骨窩(直径3.7mm,深さ7mm)を形成し埋入した。埋入4週後、組織ブロックを採取し、凍結組織切片を作製した後、蛍光顕微鏡で観察を行った。蛍光観察により、組織形成部に相当する部位において、蛍光発色が観察され、導入したMSCによる組織形成が行われたことが確認された(実験2)。次に、多孔性HAおよびバイオハイブリッド人工骨を、実験2と同様の手法で、動物大腿骨にそれぞれ埋入し、骨形成能を比較検討した。埋入4週後、組織ブロックを採取し、脱灰標本を作製した後、HE染色を行い組織観察を行った。皮質骨欠損部の骨欠損辺縁部では全ての条件で骨形成が確認され、骨欠損中央部ではバイオハイブリッド人工骨の方が多孔性HAと比較して、顕著な骨新生像が観察された。以上,本研究においては,多孔性HA内にMSCを組み入れることに成功し,作製したバイオハイブリッド人工骨による著明な骨形成を得、自家骨に代わる新たなる人工骨移植材の開発に成功した。骨増生における骨移植材として,従来の自家骨移植にかわる新しい材料である自己間葉系幹細胞と連通孔を有する新開発のハイドロキシアパタイトを組み合わせた「バイオハイブリッド人工骨」を目指して,骨新生のスキャフォールド(足場)としてのハイドロキシアパタイトの連通孔内に自己間葉系幹細胞を導入し,確実な骨再生能を有する材料の開発を目的として,研究を立案し実行した。本年度の研究実施状況を以下に示した。1.動物からの間葉系幹細胞の採取,分化。増殖雄性ビーグル犬より骨髄液を採取,骨髄幹細胞の分離・培養後,超高速幹細胞培養法により分化。増殖させた骨芽細胞を得た。2.バイオハイブリッド人工骨の作成得られた骨芽細胞をアパタイトブロック内の連通孔内に導入し,骨形性能を有するバイオハイブリッド人工骨を作成した。3.バイオハイブリッド人工骨の動物への填入雄性ビーグル犬5頭の両側小臼歯,第一大臼歯部に用意した無歯顎部に高さ5mm長さ10mm幅8mmの骨欠損を作製し,同部に欠損と同形状のバイオハイブリッド人工骨を填入した。4.臨床的ならびに放射線学的観察。手術後1,2,4,8週に口内法X線写真の撮影を行い,同時に臨床的に口腔内の診査を行った。次年度では,8週後に動物を塗擦し,バイオハイブリッド人工骨を含む組織標本を作成,組織学的ならびに組織形態計測学的検討を併せて行い,新開発のバイオハイブリッド人工骨の骨形性能を検討する。

以上,本研究においては,多孔性HA内にMSCを組み入れることに成功し,作製したバイオハイブリッド人工骨による著明な骨形成を得、自家骨に代わる新たなる人工骨移植材の開発に成功した。
酸化的ストレスを介した薬剤性肝障害における感受性因子の探索

アセトアミノフェン(AA)は解熱鎮痛薬として汎用されているが、酸化的ストレスを介した肝障害の発現が問題とされている。本研究はマウスを用いてAAによる肝障害の感受性を予測できるか血中mRNAを用いて検討を行った。マウスにAAを処置したところ、肝障害の発症には個々のマウスで感受性の差異が認められたもの、AA血中濃度とは相関が認められなかった。AA投与前における血中mRNAの変動を検出したところ、Il1b, Il10, TNF, Ttr, Mt1, GPX3の変動と肝障害の発現に相関が見られた。以上の結果は、相関が認められたmRNAがAA肝障害の感受性因子であると示唆される。本研究の目的は、薬剤性肝障害を生じやすい患者または使用者の感受性危険因子を予測することにより、薬剤性肝障害の発生を阻止すること、そして肝障害の新たな治療戦略を開発することに寄与する研究である。本年度の研究実施計画として、(1)マウスをGenotypingすることにより遺伝子発現を確認し、(2)薬剤性肝障害を誘発させて、(3)肝障害の結果と候補遺伝子を照合することを計画した。具体的には下記のように研究を進行した。酸化的ストレスを介した薬剤性肝障害の誘発物質として、解熱鎮痛薬として広く汎用されるアセトアミノフェンに焦点を置いた。実験は、マウスへ薬物を投与する前に採血をし、血液中からtotal RNAを抽出した。感受性因子を探索するGenotypingの手段としてリアルタイムPCRを用い、採取したRNAよりcDNAを合成し、PCRのtemplateとして使用した。酸化的ストレスを介した感受性因子の候補として、活性酸素酸性酵素や抗酸化酵素、あるいは過去に報告されているアセトアミノフェンによる肝毒性のメディエーターや免疫系調節物質などを標的としてPCRを行った。マウスへアセトアミノフェンを経口投与し、肝障害を誘発させた後、採血をして血清を回収した。血清中のトランスアミナーゼ活性(AST,ALT)を測定、ならびに投与マウスを開腹して肝臓への障害度を指標とし、肝障害の発生を確認した。研究初年度であることから、実験系の確立と基礎データの採取を中心に実施した。本年度で得られた知見をもとに、更なる展開を広げて研究を行う予定である。昨年度は、酸化的ストレスを介して肝障害を生ずるモデルとしてアセトアミノフェンをマウスに投与し(ddY系雄性マウス、n=150)、肝毒性の発現には個体差を生じることを確認した。そこで本年度は、あらかじめ採取した検体(血液よりtotalRNAを抽出し、cDNAを合成)を元に、リアルタイムPCRにて遺伝子発現の変動を検出し、肝毒性発現との相関について解析を行った(Genotyping)。また、アセトアミノフェンの血中濃度を測定するため、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて個々のマウスにおけるアセトアミフェン血中濃度を測定した。得られた結果として、アセトアミノフェン投与後、約6割のマススに肝障害を発症し、その内で死亡率は約1割であった。肝障害の有無に関わらずアセトアミノフェン血中濃度の有意な差は認められなかった。検出した遺伝子群として酸化的ストレスの発現に深く関与することが知られているものを過去の文献より選択し、候補遺伝子群の探索を行った。アセトアミノフェン肝障害未発症群と発症群、更には重症群と死亡群に分けてmRNAの発現を解析すると、IL-1βやIL-10は死亡群において有意に発現が高く、Transthyretin(Ttr)やMetallothionein 1(Mt1)の発現はAA肝障害発症群で有意な上昇を示し、Glutathione peroxidase 3(Gpx3)は明らかに低下していた。他の因子には有意な差は認められなかった。以上のことから、マウスにおけるアセトアミノフェン肝障害の発現には、血清中のmRNAとしてIL-1β, IL-10, Ttr, Mt1, Gpx3は有用な指標となる可能性があるものと示唆された。これまでの研究結果(平成2526年度)をまとめ、国内外における学会発表と学術誌への論文投稿をした。また、研究結果の一部を展開して更なる実験を行った。マウスへアセトアミノフェンを処置することによる薬剤性肝障害の発現には、薬剤投与前における血中のグルタチオンペルオキシダーゼー3(Glutathione peroxidase 3; GPX3)mRNAの発現が薬剤性肝障害の発症と予後に強く影響することを見出したことより、本年度はヒト培養細胞株を用いたin vitroの実験系による細胞レベルでの検討を行った。培養細胞内GPX3の発現を変動させるため、siRNAを用いたジーンサイレンシングとGPX3発現ベクターを用いた過剰発現系のモデルを構築した。GPX3の発現はリアルタイムPCRとwestern blottingや蛍光顕微鏡を用いた分子イメージングにより確認を行った。培養細胞におけるアセトアミノフェンの処置は生体内で活性代謝物として存在することが知られているNーアセチルーpーベンゾキノンイミン(N-acetyl-p-benzoquinoneimine;NAPQI)を用いて検討をした。NAPQIは細胞接触時間と処置濃度に依存した細胞毒性を示したもの、細胞間で感受性が大きく異なり、血球(浮遊)系細胞で感受性が高く、組織(接着)系細胞では低感受性であった。培養細胞株にGPX3の発現を変動させた後にNAPQIを処置したところ、GPX3によるNAPQIの感受性が変動した。以上の結果は、GPX3の発現がアセトアミノフェンの毒性に細胞レベルで寄与することを示唆している。

アセトアミノフェン(AA)は解熱鎮痛薬として汎用されているが、酸化的ストレスを介した肝障害の発現が問題とされている。本研究はマウスを用いてAAによる肝障害の感受性を予測できるか血中mRNAを用いて検討を行った。マウスにAAを処置したところ、肝障害の発症には個々のマウスで感受性の差異が認められたもの、AA血中濃度とは相関が認められなかった。AA投与前における血中mRNAの変動を検出したところ、Il1b, Il10, TNF, Ttr, Mt1, GPX3の変動と肝障害の発現に相関が見られた。以上の結果は、相関が認められたmRNAがAA肝障害の感受性因子であると示唆される。候補遺伝子群より感受性の規定因子を特定して挙げられるものと推測していたが、予想より変動していた候補遺伝子群が多く、規定因子を一つに限定することができなかった。その反面、過去にアセトアミノフェンの肝毒性に対して深く関与する遺伝子群の変動が、我々の検討では影響が見られないものも存在したため、既に報告されている文献の結果とは符号せず、実験結果の解釈に時間を要した。これらの結果を元に候補遺伝子群の遺伝子組み換え体を作製してin vitroへの実験へと進展する予定をしており、今後の検討を行う上での重要なデータであると考える。また、アセトアミノフェンの血中濃度を測定する際、当教室で所持していたHPLCの故障が認められ、機器のメンテナンスや測定法の確立に大きく時間を要した。毒性薬理学In vivoにおける検討として、空腹によりアセトアミノフェンの肝毒性は増強することが知られているため、絶食マウスにおける遺伝子発現の変動とアセトアミノフェン肝毒性の影響を精査する予定である。本結果は、我々の実験データより得られたアセトアミノフェン肝毒性に関与する感受性の候補遺伝子群が空腹により影響されるか否かを証明する結果となると考える。さらにIn vitroの実験として、候補遺伝子を標的とした遺伝子組み換え体の細胞株を作製し、変異細胞株を樹立する。これら標的タンパク質を発現または抑制する技術については、これまで当教室で行われてきた経験と実験手技を用いることにより、作成の円滑化を図る。Genotypingを行う候補遺伝子は、文献検索による過去の学術論文より候補となり得る遺伝子群より、約40遺伝子を選出し、相補的なプライマーを外部発注にて合成し用いた。候補遺伝子群の発現を探索するために用いるリアルタイムPCRは、多検体を処理し、データを網羅的に解析する必要があるため、96wellプレートを使用して行うことができる、本学中央機器室に設置してあるStepーOneリアルタイムPCR(ライフテクノロジー社製)を使用した。PCRの条件は、メーカーより市販されているリアルタイムPCR専用の試薬(TOYOBO社製)を用い、マニュアルに準じて使用した。候補遺伝子群の中でも、PCR反応が認められないものや検出に乏しいものは候補より除外した。実験対象となるマウスは本学実験動物センターにて使用申請を行い、許可を得た後に飼育・使用した。
被害要素と復旧・復興過程からみた東アジア型震災の地域特性に関する研究

日本の震災と台湾集集地震における被害特性と復旧・復興過程の比較から被害の特徴、計画概念、策定方法などを明らかにして、震災被害の軽減につながる地域のあり方を検討するために次のような点を研究対象として現地調査を行った。・まちづくりの概念に関する検討(日本のまちづくりと台湾の社區総体営造との関係について)まちづくりと社區営造との明確な区別はなく、抽象的な議論が散見される。専門家によっては、社區営造は生活営造と捉える見方があった。これは台湾における従来の社區営造は公共の議論が中心であり、公共から個々の空間まで至らなかったものの、震災復興の社區営造は内部から外部へという意識のもとで行うように変化していることに基づく。一方、日本では震災を契機に空間の広がり方の方向性について、活発に議論、検討された様子はうかがえず、震災前から議論されてきた内容が大きく発展、成長したと考えられる。・震災復興における地域産業、雇用促進に関する分析阪神・淡路大震災では住宅再建と産業、雇用施策との間に必ずしも連携はうかがえなかった。これに対して、台湾では地域復興と産業・雇用育成に関係のみられる事例が確認された。政府関係者へのヒアリングなどから明らかになったのは、台湾においても当初は既存産業の回復等に主眼をおいたものの成果が見いだせず、途中から新しい産業育成に転換したこと、WTO加盟から農産物輸入の増加による農業への影響、強い危機感が行政、住民ともにあったこと、震災を契機としたまちづくり、産業育成にNPOなどが関与でき、それらを行政が支援したことなどである。こうした考え方は、平成16年10月に発生した新潟県中越地震の復興を検討する際の参考になると考える。また本年度は、阪神・淡路大震災の復旧・復興期の被災者支援施策として行政がおこなった内容を整理、検討しこれらの成果を、国際会議において報告した。本年度は、被害状況とその地域特性に関する考察および復旧・復興対策の検討を計画目標とした。11月および3月の現地調査では、特に地域特性を反映していると思われる台湾集集地震における仮設住宅の供給についてヒアリング、資料収集を行った。仮設住宅の供給は、わが国における震災復興対策でも重要な論点であり、台湾の事例は新しい視点となるからである。台湾集集地震の特徴としては、仮設住宅の多様な供給主体があげられる。この地震では、約5,800戸の仮設住宅が建設されたが、行政による建設分は半数にみたず、宗教団体や民間団体など非行政機関が行った。行政側の利点としては、行政負担が大幅に軽減したことがあげられる。また被災者にとっては、建設過程で仮設住宅の住戸面積などを互いに競い合うなどの副次的効果もみられた。非行政機関が仮設住宅を建設した要因としては以下のような点がある。(1)台湾の災害対応関係の法律において、仮設住宅供給の主体者に関する言及がなかったため、すべて行政が担うという認識が薄かった。(2)台湾の宗教団体や民間団体は、震災以前から社会貢献への関心が高く、災害発生直後から被災自治体等へ支援施策としての需要調査を独自に行っていた。(3)宗教団体や民間団体は、建築資材の調達から、運搬、建設作業に至るまで一連の作業について、自組織ネットワークを生かして行うことが可能であった。また一部の宗教団体には、海外支援として仮設住宅を供給する実績があった。一方、問題点としては、複数の非行政機関と行政との間で建設場所や供給戸数について意見調整が十分に機能せず混乱した形跡がうかがえた。また台湾地域内における仮設住宅建築資材の生産能力は一定であったため、各機関からの要求に応えることができず、効率的に生産することができなかったことなどがあげられる。これらの調査結果から、わが国において仮設住宅の多様な供給主体を考える際には、関連機関を調整する組織・体制構築や企業グループの有効活用等が検討すべき課題になると考える。

こうした考え方は、平成16年10月に発生した新潟県中越地震の復興を検討する際の参考になると考える。また本年度は、阪神・淡路大震災の復旧・復興期の被災者支援施策として行政がおこなった内容を整理、検討しこれらの成果を、国際会議において報告した。
フランス語および日本語におけるモダリティの意味論的研究

この研究においては、フランス語と日本語をはじめとする諸言語における、動詞の時制・叙法、法的(準)助動詞、副詞類などのカテゴリーにわたるモダリティの多様な発現を、一貫した視点にもとづいて考察した。とりわけ、どのようにしてモダリティが、条件法、半過去、叙想的時制・アスペクト、未来諸時制、fallor, devoir, semblerなどの法的(準)助動詞、ステレオタイプにまつわる諸表現、留保表現、ジェロンディフと現在分詞、ポリフォニー、伝聞表現などのさまざまな言語事象にあらわれるに至っているのかを示すことができた。当研究課題では、動詞、(準)助動詞、副詞、連結辞、(メタ)比較など、さまざまなカテゴリーにまたがるモダリティの研究を、一貫した視点にもとづいて進めることで、モダリティが、どのような理路を介してさまざまな言語事象にあらわれるにいたっているのか、そしてそれらの事象相互はどのような関係にあるのかを見さだめることを目標としたい。主たる対象はフランス語、日本語とするが、スペイン語、イタリア語、ボルトガル語などのロマンス諸語に視野をひろげ、他言語との対照のなかからこそ明らかになる知見も積極的に拾いあげてゆくことにする。この中間評価の対象となる各年度別の計画は、つぎのようになっていた。研究の初年度にあたる平成20年度には、モダリティの各領域における具体的な研究対象となる諸表現のデータ収集、ならびに整理を行なうとともに、テストケースとしての事例研究をも開始し、全般にわたる基礎づけを行なう。平成21年度、平成22年度は平成20年度に蓄積した基礎的データ、および試行的研究の成果をふまえて、他のすべての領域へと研究の範囲をひろげ、広範な事例研究を積みかさねてゆく。各年度とも、各領域の専門家とともに研究会をひらき、それぞれの領域に固有の問題点やそれに対する見解をうかがい、議論するとともに、平成21年度以降はみずからも国内外の学会、研究会などで積極的に成果を発表することとする。本年度は研究計画の初年度にあたるため、フランス語と日本語のモダリティに関して、総論的な基礎づけと、具体的な研究対象となる諸表現のデータ収集、整理を行なった。各論的な研究としては、とくに時制形式のモダールな用法に着目し、時間指示機能と、モダリティ標示機能がどのような連関におかれているかを検討した。それらの連関を説明しうる枠組みとして、分岐的時間(temps ramifie)の表象を用いた説明がとくに有効であることが判明した。その枠組みを用いることにより、従来は必ずしも一貫した説明が与えられなかったいくつかの現象を関連づけながら扱うことができることが明らかになった。平素の活動としては、科学研究費補助金(基盤研究(C))課題番号19520414「目英語ならびに西欧諸語における時制の比較研究」(研究代表者和田尚明)と合同で、筑波大学内で6回にわたって研究会を開催したほか、当研究課題独自では下記の公開講演会を実施し、新たな知見を得るとともに、討論を行なった。伊藤達也(名古屋外国語大学)「モダリティの意味、モダリティと意味-日仏対照言語学の観点から」2008年12月5日成果発表としては、別欄に示した学会発表を行ない、論文を公刊したほか、現在印刷中の論文もある。本年度は研究計画の2年目にあたるため、昨年度蓄積した基礎的研究の成果をふまえて、いくつかの具体的な領域へと研究範囲を広げていった。動詞の時制・叙法の問題に関しては、昨年度にひきつづき、各言語において具体的な形態の具体的な用法をとりあげ、なぜ、どのようにしてモダリティの諸価値が出てくるのかを研究した。とくに、フランス語の半過去、条件法と、諸言語でそれらと関連づけられる時制から、反実仮想の解釈が生まれる過程に着目し、これについても昨年度研究した未来形の事例と同様、分岐的時間による説明が有効であることがわかった。法的(準)助動詞に関しては、フランス語のdevoir, falloir, pouvoirなどの動詞(および他の言語でそれらに対応する動詞や(準)助動詞)、ならびにそれらと類義の諸表現について、同様にモダリティの価値のあらわれかたを明らかにした。とりわけ、拘束的用法の否定の多義性について詳細に研究し、各解釈が生まれる過程を解明した。さらに、フランス語と日本語の近似表現approximatifの対照研究もおこない、いずれの言語においても、ある辞項を射程とする近似表現と、発話文全体を射程とする近似表現とがまったく平行的にとらえられることが明らかになった。平素の活動としては、科学研究費補助金(基盤研究(C))課題番号19520414「日英語ならびに西欧諸語における時制の比較研究」(研究代表者和田尚明)と合同で、筑波大学内で5回にわたって研究会を開催したほか、当研究課題独自では下記の公開講演会を実施し、新たな知見を得るとともに、相互に討論を行なった。・髭郁彦(中央大学非常勤講師)「ポリフォニーと対話」