hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
砂浜歩行の健康増進効果-特徴的な足趾・足部負荷に着目して-

足趾筋力が砂浜歩行動態に与える影響を確認するとともに専用の砂場床反力計測装置にてその衝撃特徴を評価した.足趾筋力と砂浜歩行動態の関係については,筋力の強弱において特異な変化は見られなかった.砂場による床反力計測では砂の粒子が細かいほど衝撃吸収力は高いものの,最も筋力が必要とされるterminal stance時においては逆に床反力垂直成分および水平成分が減少するため特異な足関節底屈運動の減少が必要となることが判明した.砂浜歩行の足趾筋活動およびその動態を解明するため,初年度は足部動態の詳細を把握するための三次元運動解析の計測項目をプレ実験を通じて検証するとともに砂の衝撃力を検証するための特殊な床反力計測装置の作成を行った.砂質によってはまだ床反力垂直成分においてムラが大きいがいわゆる粒子の細かい砂であれば計測可能となった.なお砂浜歩行において重要とされる足趾の筋力計測についても圧力センサーを改造した専用の機器を開発した.最終年度では足趾筋力が砂浜歩行動態に与える影響を確認するとともに専用の砂場床反力計測装置にてその衝撃特徴を評価した.足趾筋力と砂浜歩行動態の関係については,筋力の強弱において特異な変化は見られなかった.砂場による床反力計測では砂の粒子が細かいほど衝撃吸収力は高いものの,最も筋力が必要とされるterminal stance時においては逆に床反力垂直成分および水平成分が減少するため特異な足関節底屈運動が必要となることが判明した.今後はこれらの検証結果から発展的には個別の訓練効果のみならず障害予防の視点から高齢者への砂地ウォーキング効果の検証へ発展させることを目標とする.足趾筋力が砂浜歩行動態に与える影響を確認するとともに専用の砂場床反力計測装置にてその衝撃特徴を評価した.足趾筋力と砂浜歩行動態の関係については,筋力の強弱において特異な変化は見られなかった.砂場による床反力計測では砂の粒子が細かいほど衝撃吸収力は高いものの,最も筋力が必要とされるterminal stance時においては逆に床反力垂直成分および水平成分が減少するため特異な足関節底屈運動の減少が必要となることが判明した.砂浜歩行の足趾筋活動およびその動態を解明するため,本年度は足部動態の詳細を把握するための三次元運動解析の計測項目をプレ実験を通じて検証するとともに砂の衝撃力を検証するための特殊な床反力計測装置の作成を行った.砂質によってはまだ改善を必要とする箇所があるがいわゆる粒子の細かい砂であれば計測可能となった.次年度においては,機器の微調整を行い被験者を用いた本実験を実施する予定である.本研究計画では移動型床反力計測装置を使用し,砂質の影響も踏まえた被験者への力作用と砂による緩衝作用について検証することが主目的である.また,これらの検証結果から発展的には個別の訓練効果のみならず障害予防の視点から高齢者への砂地ウォーキング効果の検証へ発展させることを目標とする.砂地を歩く時のセンサー(光学反射マーカー)精度低下と砂質の影響およびそれらを床反力上で計測するための歩行路および砂地ボックスの作成に時間がかかり年度末に何とかパイロットスタディが行えた状況である.しかし,実験環境の整備は行えたため,次年度においては早速,データ収集を行う予定である.次年度は4-5月にて砂地の性質に合わせた実験環境を2種類以上準備し,6-9月にて被験者によるデータ収集を実施する.10-12月にてデータ解析を行い1-3月に成果発表を行う予定.なお,データ収集期間にて順調にデータが得られた場合,被験者として高齢者を加える予定.これまでのパイロット実験の結果から砂浜歩行の影響を「足部動態」と「鉛直成分床反力」の両視点で検証することとする.計測環境の整備はほぼ修了しているので,次年度においては主に被験者に対する報償費と実験に伴う消耗品の支出が中心となる予定.
細胞分化機構から見た血管－神経共通シグナルの意義の解明

研究代表者はES細胞及びiPS細胞を用いた心血管分化再生研究を行ってきた。本研究は、「細胞分化の観点から血管と神経に共通な新しい分子群を同定し、血管、特に内皮細胞と神経分化の関連性に関して新たな理解をもたらす」ことを目的とし、1)オピオイドの内皮分化・血管形成における意義、2)cAMPシグナルと内皮・神経分化、3)Notch-beta-cateninシグナルと内皮・神経分化、4)新規動脈化誘導シグナルと神経分化、5)神経作用性物質の内皮分化における意義、の5項目の検討を行った。特に1)に関しては、オピオイドの成体における意義を検討するため、カッパオピオイド受容体(KOR)欠損マウスにおける腫瘍血管新生を検討し、KOR欠損マウスにおいては腫瘍血管形成が亢進していることを見いだしている。2)に関して、PKAがVEGF受容体発現を亢進させる機構の解析を行い、Ets転写因子群のEtv2遺伝子にcAMP応答配列が存在し、PKA下流で活性化されたCREBが同配列に結合し、Etv2発現を誘導することにより、種々のVEGF受容体遺伝子発現を誘導し、内皮分化を惹起することを明らかにした(Yamamizu, Stem Cells, 2012)。また、RSK4がPKAに結合してその活性を抑制することにより、血管内皮細胞の分化に対する新しいnegative regulatorとして働いていることを明らかにした。生体における血管発生過程においてもRSKは内皮分化抑制的に作用しており、RSKの作用を阻害剤により抑制すると血管内皮分化と血管形成の異常な促進が観察された。RSKの血管形成における新しい意義を明らかにした。また4)に関して、内皮細胞と神経細胞に共通して発現するmicroRNAを同定し、その標的分子の同定と機能確認を進めている。このように本研究において着実な進捗を認めている。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、「細胞分化の観点から血管と神経に共通な新しい分子群を同定し、血管、特に内皮細胞と神経分化の関連性に関して新たな理解をもたらす」ことを目的とし、1)オピオイドの内皮分化・血管形成における意義、2)cAMPシグナルと内皮・神経分化、3)Notch-β-cateninシグナルと内皮・神経分化、4)新規動脈化誘導シグナルと神経分化、5)神経作用性物質の内皮分化における意義の検討を行う。本年度は以下の2項目に関し進捗を認めた。1)オピオイドの内皮分化・血管形成における意義PKAシグナルの下流遺伝子の探索を行い、Etv2がPKA/CREB活性化により発現が亢進し、内皮・血球分化の開始に貢献していることを明らかにした(Yamamizu,Stem Cells,2012)。DynorphinのKOと、KORのKOはほぼ同じ形質(胎生早期における一過性血管形成亢進)を認め、KORのリガンド-受容体系が血管形成抑制性に作用していることが示された(Blood,2011)。iv) KORノックアウトマウスにおける血管走行異常(体節への異所性血管侵入)の機構解析KORがNeuropillnとPlexinD1の発現バランスを調節し、血管走行に寄与していることを示した(Blood,2011)。2)cAMPシグナルと内皮・神経分化研究代表者はES細胞及びiPS細胞を用いた心血管分化再生研究を行ってきた。1)において、PKA下流で機能している分子を探索し、血管分化の最も早期の新しい分子機構を明らかにすることに成功し、論文報告した(Stem Cells,2012)。

さらに、2)において、PKAとエピゲノム制御をつなぐ新しい分子連関を見出し、神経系も血管も含む三胚葉の分化タイミングの制御機構という新しい概念の提唱に成功した(Cell Stem Cell,in press)。このように当初予想していなかった新しい重要な知見を示すことに成功している。24年度が最終年度であるため、記入しない。オピオイドに関しては、成体における作用を検討し、オピオイドの血管作動薬としての可能性を検討する。PKAによる三胚葉分化制御機構に関して、エピゲノムを含めたさらなる解析を行う。神経と内皮に共通に発現しているmicroRKAを見出しており、その機能解析を行う。これらの研究により、神経と血管に共通した分化や機能制御の分子基盤の解析を進める。
SCID-huマウスを用いた実験的歯周炎誘発モデルの開発とその発症機序の解析

歯周炎の発症機序の解明、有効な治療法の開発のために、多くの実験的歯周炎誘発モデルが考案されてきたが、サル、イヌなどに対して、マウス、ラットなどげっ歯類では歯周炎を誘発しにくい。これらの動物間には、炎症に対する免疫担当細胞の応答性に違いがみられ、また遅延型過敏反応においては、前者ではリンパ球、マクロファージの集積が多いのに対し、後者では好中球が多く浸潤してくる。本研究では、ヒト、モルモット、ラットの免疫系を再建したSCIDマウスを作製し、これらの歯周組織を歯周病関連細菌の内毒素で一定期間刺激し、異種の免疫担当細胞の可溶性抗原に対する挙動の違いと歯周組織の炎症像を組織学的に比較検討した。ヒト末梢血単核球またはモルモット、ラットの脾細胞を移入し免疫系を再建したSCIDマウスおよび対照SCIDマウスを、予め、内毒素腹腔投与で感作した後、上顎右側臼歯部歯肉を内毒素で刺激し、歯周組織に2次性の免疫応答を誘発した。刺激開始後7日目のマウスの歯周組織をH.E.染色により光顕的観察した結果、ヒト単核球移入SCIDマウスでは著明な白血球の浸潤が観察され、さらにモルモット脾細胞移入SCIDマウスでは破骨細胞による骨吸収窩も形成されていたのに対し、対照マウスでは若干の白血球の浸潤が認められたにとどまった。このことは異種動物由来白血球の炎症性組織破壊に及ぼす影響の違いを示していると考えられるが、今後、細胞表面抗原に対する各種抗体を用いた免疫組織染色により、浸潤細胞の由来する動物種を同定し、さらに多形核白血球、単球、T及びBリンパ球の比率などについて比較検討する予定である。
磁気化フェライトバルーンポリマー複合凝集沈殿処剤による革新的水処理プロセス

本研究では、フェライトバルーンタイプの有機ー無機ハイブリッド凝集沈殿処理剤を提案し、特に磁気吸着性を有するバルーン状のフェライトやナノサイズ酸化鉄を核とし、それに生体ポリマーをグラフトした複合体を凝集剤として磁石による回収を視野に入れた次世代の環境浄化システム開発を実施した。複合化するキトサンやアルギン酸などの水溶性バイオ高分子とナノサイズの酸化鉄を複合化した凝集沈殿処理剤を調製に成功した。磁気を活用した磁石による新規機能性発現でき、プルシアンブルーを用いたセシウム分離に磁気法が有効である事がわかった。またイオンインプリント技術を凝集剤に導入した新規材料の開発についても検討を行った。本研究の目的は、これまでにないフェライトバルーンタイプの有機-無機ハイブリッド凝集沈殿処理剤を提案し、これを利用し水環境浄化の革新的技術開発を展開することにある。そこで磁気吸着性を有するバルーン状のフェライトを核とし、それに生体ポリマーをグラフトした複合体を環境浄化用凝集剤として活用する事を提案し、磁性特性を利用し、磁石による回収を視野に入れた次世代の環境浄化システム開発を実施する。さらに、本研究では、電解質ポリマーとフェライトバルーンを複合化したフェライトバルーン凝集沈殿処理剤を調製し、これを利用した新規高度化水処理システムの開発を目指す他、ナノサイズの酸化鉄微粉末を用いても同様に検討する。また重金属インプリント粉体に磁石応答性を持たせた凝集吸着剤も新規に検討する。これらの凝集沈殿処理剤は、表面積の大きなフェライトバルーンを核とし、その表面に高分子電解質を共有結合により導入したこれまでに無い凝集沈殿処理剤であり、磁気を活用した磁石による新規機能性発現が期待できる。本研究ではこれまでにないフェライトバルーンと有機ポリマーとのハイブリッド凝集沈澱剤を開発しこれを用いた新たな水処理技術を確立した。特に、色素溶液を凝集沈澱処理する際に、凝集沈澱したスラッグを磁石により集め、これまでのような濾過によるプロセスを省く事ができるプロセスの開発を可能とできた。特にフェライトバルーンのサイズを変化させた場合と、フェライトバルーンの代わりにナノサイズ酸化鉄を用い、これらをインプリントポリマー、ゼオライト、キトサンやアルギン酸ナトリウム等と複合化した凝集剤は効率よく色素溶液を凝集珍ですることを確認できた。これらのバイオポリマーと無機粒子とのハイブリッド化が、凝集沈澱作用に大きく影響するため、組成、無機粉の処理状況等変えて、検討を行った。またプルシアンブルー系色素はセシウムを効率よく色素内に取り込む事が知られているが、均一溶液であり分離できない事から、応用としてセシウムと結合化したプルシアンブルーをフェライトバルーン系凝集沈澱剤で沈降させたところ、98%以上の除去率を発現できる事が明らかとなった。このように、今後の新規応用展開が可能となる事が明らかとなった。本研究の目的は、これまでにないフェライトバルーンタイプの有機ー無機ハイブリッド凝集沈殿処理剤を提案し、これを利用し水環境浄化の革新的技術開発を展開している。特に磁気吸着性を有するバルーン状のフェライトを核とし、それに生体ポリマーをグラフトした複合体を環境浄化用凝集剤として活用する事を提案し、磁性特性を利用し、磁石による回収を視野に入れた次世代の環境浄化システム開発を実施してきた。さらに、本研究では、キトサンやアルギン酸などのバイオ高分子とナノサイズの酸化鉄を複合化した凝集沈殿処理剤を調製し、これを利用した新規高度化水処理システムの開発を目指している。また水処理用の分離膜内にナノサイズ酸化鉄を複合化した分離膜を作製し、磁気を活用した磁石による新規機能性発現を期待して、現在、研究検討している。震災の影響で備品の搬入が遅れたため、評価が遅れたが、おおむね予定どおりに進行している。しかし設備備品の納入が遅れ、発表データの公表が遅れ論文投稿にも影響しているが、次年度に公表を予定している。25年度が最終年度であるため、記入しない。フェライトバルーン系に加えて、ナノサイズの酸化鉄を複合化した凝集沈殿剤を開発し,その磁気特性等を検討しており、おおむね順調に進展している。フェライトバルーンのみならず、新規にナノサイズの酸化鉄微粉末を用いても同様に検討する他、基質選択性の高いインプリント粉体に磁石応答性を持たせた凝集吸着剤も新規に検討し、高度化水処理システムの開発をめざす。新規にナノサイズの酸化鉄微粉末を用いても磁石応答性を持たせた凝集吸着剤も新規に検討し、高度化水処理システムの開発をめざしており、最終年度はこの研究開発をメインに検討する予定である。
繊維強化複合材料における微視破壊クライテリオンを基にした損傷進展予測手法の確立

軽量・高剛性・高強度の特徴を有する連続繊維強化積層型複合材料・構造のより効果的設計法構築の基礎のため,微視破壊クライテリオン(マイクロフラクチャクライテリオン)をベースとした損傷発生・進展挙動予測手法を検討した.すなわち,繊維,マトリックス及び界面それぞれの破壊クライテリオンを実験的に明らかにし,それらとプライレベルの損傷発生・進展挙動の関係を検討し,プライレベル損傷発生・進展挙動予測手法を構築した.軽量・高剛性・高強度の特徴を有する連続繊維強化積層型複合材料・構造のより効果的設計法構築の基礎のため,微視破壊クライテリオン(マイクロフラクチャクライテリオン)をベースとした損傷発生・進展挙動予測手法を確立することを目的としている.すなわち,繊維,マトリックス及び界面それぞれの破壊クライテリオンを実験的に明らかにし,それらとプライレベルの損傷発生・進展挙動の関係を検討し,プライレベル損傷発生・進展挙動予測手法を確立する.それにより,安全側に設計せざるを得なかった本材料の設計手法をより材料の特性を生かしたものへと進歩させることが可能であると考えられる.平成24年度は,前年度行った単繊維モデル複合材料による組み合わせ応力下での界面破壊クライテリオンの結果を踏まえ, CFRP一方向強化積層板,数種の多方向積層板(クロスプライ積層板,アングルプライ積層板,擬似等方積層板)を作製し,種々の面内負荷,面外負荷を与え,変形挙動,損傷発生・進展挙動,強度特性を得る.自作その場観察用負荷装置(光学顕微鏡などに装着し損傷進展プロセスをその場観察する)を用い,あるいは,必要に応じて試験機から取り外し,光学顕微鏡,走査型電子顕微鏡,軟X線探傷装置を用いた損傷状態の観察を行い,負荷レベルと損傷状態の関係を実験的に検討した.軽量・高剛性・高強度の特徴を有する連続繊維強化積層型複合材料・構造のより効果的設計法構築の基礎のため,微視破壊クライテリオン(マイクロフラクチャクライテリオン)をベースとした損傷発生・進展挙動予測手法を確立することを目的としている.すなわち,繊維,マトリックス及び界面それぞれの破壊クライテリオンを実験的に明らかにし,それらとプライレベルの損傷発生・進展挙動の関係を検討し,プライレベル損傷発生・進展挙動予測手法を確立する.それにより,安全側に設計せざるを得なかった本材料の設計手法をより材料の特性を生かしたものへと進歩させることが可能であると考えられる.平成25年度は,航空宇宙用先進複合材料としてCFRP一方向強化積層板,数種の多方向積層板(クロスプライ積層板,アングルプライ積層板,擬似等方積層板)を作製し,種々の面内負荷,面外負荷を与え,変形挙動,損傷発生・進展挙動,強度特性を得た.自作その場観察用負荷装置(光学顕微鏡などに装着し損傷進展プロセスをその場観察する)を用い,あるいは,必要に応じて試験機から取り外し,光学顕微鏡,走査型電子顕微鏡,軟X線探傷装置を用いた損傷状態の観察を行い,負荷レベルと損傷状態の関係を実験的に明らかにした.損傷としては,マトリックスクラック及び層間はく離を考えるが,積層構成,負荷形態により,その発生順序,発生負荷レベルが異なった.構築した微視破壊クライテリオンを基にしたプライレベル損傷挙動予測手法の妥当性を検討した.いくつかの複合材料積層板を想定し,損傷発生・進展プロセスを予測し,実験結果と比較し,その妥当性を検討した.軽量・高剛性・高強度の特徴を有する連続繊維強化積層型複合材料・構造のより効果的設計法構築の基礎のため,微視破壊クライテリオン(マイクロフラクチャクライテリオン)をベースとした損傷発生・進展挙動予測手法を検討した.すなわち,繊維,マトリックス及び界面それぞれの破壊クライテリオンを実験的に明らかにし,それらとプライレベルの損傷発生・進展挙動の関係を検討し,プライレベル損傷発生・進展挙動予測手法を構築した.軽量・高剛性・高強度の特徴を有する連続繊維強化積層型複合材料・構造のより効果的設計法構築の基礎のため,微視破壊クライテリオン(マイクロフラクチャクライテリオン)をベースとした損傷発生・進展挙動予測手法を確立することを目的としている.すなわち,繊維,マトリックス及び界面それぞれの破壊クライテリオンを実験的に明らかにし,それらとプライレベルの損傷発生・進展挙動の関係を検討し,プライレベル損傷発生・進展挙動予測手法を確立する.それにより,安全側に設計せざるを得なかった本材料の設計手法をより材料の特性を生かしたものへと進歩させることが可能であると考えられる.平成23年度は,初年度として,単繊維とマトリックス樹脂とを組み合わせた試験片を用いて,1.フラグメンテーション試験,2.マイクロボンド試験,3.Cruciform試験を行い,界面特性の評価,また界面破壊クライテリオンの実験的評価を行った.フラグメンテーション試験では,単繊維を引張方向に埋め込んだ試験片に対し引張試験を行い,繊維多重破断を起こさせ,その破断プロセス,および最終多重破断状態から,繊維強度分布や繊維ーマトリックス界面特性(界面応力伝達性やはく離強度)を推定した.マイクロボンド試験では,繊維にマトリックス樹脂の液滴を付着・硬化させ,繊維引き抜きを起こさせることで,界面せん断応力を求めた.また,Cruciform試験は,引張方向に垂直に繊維を埋め込んだ試験片を使用するが,自由縁での応力の特異性をさけるために試験片を十字架型にする方法である.これにより界面引張強度を測定した.さらに,繊維を引張方向に垂直にするだけではなく,任意の角度傾けた方法を開発し,組み合わせ応力下での界面破壊クライテリオンを求める手法を提案した.平成24年度に予定していた

CFRP積層板における変形挙動,損傷発生・進展挙動,強度特性評価及び負荷レベルと損傷状態の関係の実験的評価について一定の成果を得たため.平成23年度に予定していた単繊維モデル複合材料を用いた界面強度評価・界面はく離発生クライテリオン構築について一定の成果を得たため.平成23年度に構築した微視破壊クライテリオンを基にし,平成24年度で得た積層板損傷観察結果を総合して,プライレベル損傷挙動予測手法を構築し,その妥当性を検討する.いくつかの複合材料積層板を想定し,損傷発生・進展プロセスを予測し,実験結果と比較し,その妥当性を検討する.損傷挙動の予測には,結合力要素を用いた有限要素法による数値モデルの検討を行う.さらに,耐損傷性複合材料開発のための繊維・マトリックス・界面特性の組み合わせを検討し,新規材料開発へのフィードバックを行いその指針を得ることを試みる.CFRP一方向強化積層板,数種の多方向積層板(クロスプライ積層板,アングルプライ積層板,擬似等方積層板)を作製し,種々の面内負荷,面外負荷を与え,変形挙動,損傷発生・進展挙動,強度特性を得る.自作その場観察用負荷装置(光学顕微鏡などに装着し損傷進展プロセスをその場観察する)を用い,あるいは,必要に応じて試験機から取り外し,光学顕微鏡,走査型電子顕微鏡,軟X線探傷装置を用いた損傷状態の観察を行い,負荷レベルと損傷状態の関係を実験的に明らかにする.実験のための材料及びジグの製作費,また成果発表のための国際会議出張旅費を計上している.実験のための材料及びジグの製作費,また成果発表のための国際会議出張旅費を計上している.
緑茶と唾液腺機能-緑茶と唾液分泌量および唾液中抗菌蛋白質量に関する基礎的研究

1)緑茶およびEGCGの唾液分泌量ならびに唾液中抗菌蛋白質量におよぼす影響同意が得られた50歳台以上の健康な被験者に対し、市販のEGCG(1回300mg)を一ヶ月連日投与してもらい、摂取前後の唾液中の抗菌蛋白質であるLactoferin,sIgA,Histatin5さらにβ-defencinと唾液中のEGCGについて測定した。唾液中のEGCGについては、軽度の上昇がみられたものの、抗菌蛋百質については、差はみられなかった。2)マウス顎下腺に対するEGCGの作用についての実験EGCGを混入させた水を1ヶ月の間、連日飲水させて、EGCG投与前後のマウスの唾液分泌量について比較検討を行った。その結果、ピロカルピンを腹腔投与して刺激した際の唾液分泌量について、軽度の上昇はみられたものの、統計学的に有意な差はみられなかった。しかし、顎下腺を取り出し、電子顕微鏡にて観察したところ、腺房細胞内の分泌顆粒の数については、有意に上昇がみられた。3)ヒト不死化正常唾液腺を用いたEGCGの作用の検証ヒト不死化正常唾液腺腺房細胞および導管細胞を培養し、培養液中にEGCGを混入させた場合における抗菌蛋白質であるLactoferrin,sIgA,Histatin 5やβ-defencinの発現を、Western blotting法にて検詩した。EGCG混入培地で1週間培養したが、いずれの蛋白質においても、Western blotting法で明らかな差は認められなかった。しかし、RT-PCR法を用いたmRNAめ発現解析では、わずかではあるが、抗菌蛋白質の発現に上昇がみられた。1)緑茶の唾液分泌量ならびに唾液中抗菌蛋白質量に及ぼす影響5080歳の健常人(男性:3例、女性:5例;平均年齢:63±5歳)にエピガロカテキンガレート(EGCG、300mg)を含有した緑茶を1ヶ月間投与した後、唾液を採取し、投与前後における安静時・刺激時唾液分泌量、唾液中の成分を比較検討した。その結果、投与前後における唾液分泌量は、安静時、刺激時ともに明らかな違いは認められなかった。唾液に含まれる抗菌蛋白質(ラクトフェリン、α、β-ディフェンシン、sIgA、Secretory component)の濃度も、投与前後において有意差は認められなかった。2)マウス顎下腺機能に及ぼすEGCGの作用についての検討老化促進マウス(SAM)に、EGCG(0.3mg/Body)を2ヶ月間投与した後、唾液分泌量を測定するとともに、顎下腺を摘出し、病理組織学的、免疫組織化学的および電顕的に検討した。その結果、(1)唾液分泌量は両群間に有意差は認められなかった。(2)顎下腺の腺房細胞および導管細胞いずれにおいても、SAM群とコントロール群との間で形態的に差は認められなかった。(3)酸化ストレスの指標である8-OHdGの染色性は、EGCGを投与したSAMの顎下腺組織ではコントロール群に比べ減弱していた。(4)加齢の指標である5-ブロモ-3-インドリル・β-D-ガラクトシダーゼの顎下腺における活性は、両群間に明らかな違いはみられなかった。(5)EGCGを投与したSAMの顎下腺では、腺房細胞におけるミトコンドリアや粗面小胞体の数および大きさ、さらには分泌顆粒の数が、コントロール群に比べ有意に増加していた。以上より、EGCGは老化に伴う唾液腺組織における酸化ストレスを軽減することが明らかとなったが、唾液分泌量やその成分比率には影響を及ぼさなかった。
マルチリスクマネジメント機能を備えたソーシャルキャピタルの成熟化とその効果検証

研究者らは、A小学校区の住民組織6団体と公的機関2団体、大学による「A健康まちづくり会」を7年前に結成し、年2回イベント(5月の体力測定とウオーキング、11月の学習会と運動体験)、活動参加100回記念表彰を実施している。65歳以上291名(回収率12.5%)を対象とした調査の結果、先行研究と同様に高齢者の孤独感と社会的つながりを示す項目に関連が見られた。京都市は小学校区ごとの体育会や地蔵盆が継続されるが、高齢化が進み社会的つながりの希薄化による住民のwell-beingへの影響が考えられる。本会は社会的つながりを醸成する住民参画による地域包括ケアシステムの1モデルとして示唆を得ると考える。本研究では、都市部高齢化地域のA小学校区におけるソーシャルキャピタルを醸成するプログラムを運営し、その効果を検証する。ヘルスケアタウンプロジェクト(A小学校区で住民組織、地域包括支援センター、介護予防推進センター、我々研究者の大学2校)による“A健康まちづくり会"の実践活動を継続しながら、小学校区におけるソーシャルキャピタルの効果検証を行うことを目的としている。その1年目にあたる平成26年度は、A小学校区のソーシャルキャピタルプログラムを運営実施している。“粟田健康まちづくり会"では、4月から6回および7回のイベント実施に向けて毎月会合を持ち企画及び準備を行った。第6回粟田地域健康力アップ大作戦(2014年5月11日)体力測定とウオーキングを実施、第7回(粟田地域健康力アップ大作戦(2014年11月9日)認知症予防の講話を聞き、運動を取り入れるためのスクエアステップを実施した。会実施後は、報告書を作成し“粟田健康まちづくり会"の各組織と共に、活動の振り返りを行っている。また、活動実績を、超高齢化地域における汎用型健康づくりのデザイン設計(第1報)-粟田健康町づくり会のヘルスアップ大作戦の理念-「超高齢化地域における汎用型健康づくりのデザイン設計(第2報)-粟田健康町づり会のヘルスアップ大作戦の活動-」平成26年、第63回日本農村医学会総会(つくば)日本農村医学会雑誌,63(3)で発表した。本研究では、都市部高齢化地域のA小学校区におけるソーシャルキャピタルを醸成するプログラムを運営し、その効果の評価を目的とする。住民と専門職、大学などの多組織(自治連合会、学区社協、シニアクラブ、学区体育振興会、地域包括支援センター、地域予防介護推進センター、京都府立医大、京都大学)が協働して“A健康まちづくり会"を結成し活動を継続している。“A地域健康力アップ大作戦"の実践活動は、年2回の共同イベントを実施し地域に定着している。5月は体力測定とウオーキング、11月は健康講座と体験学習である。まちづくり会協議は2ヶ月に1回開催され、活動の企画、実施、評価、及び修正について協議し改善を加えて継続実施している。住民参画による活動内容を検討すると、1役割期待に応える努力と責任の確立がなされたため、住民自らの企画(足指体操等)や健康講座に加えて体力測定や体験学習、運動体験等多彩な内容が含まれ、実践と役割遂行(体操、ウォーキング、先導、受付、勧誘等)が実現した。2参加継続の仕組み作りとして、地域の多様な健康づくり活動のスタンプカードの作成や、継続参加者を表彰する機会が持たれた。3組織の代表として組織への周知と準備の強化がなされたため、PTA参画による子供と父兄の参加による世代間交流が生じた。今後は新たな住民の参加を促し、住民主体のソーシャルキャピタル醸成をどう支えるのかの課題がある。コミュニティ機能が低下しつつある都市部少子超高齢地域の人々の安全安心な暮らしと健康を支えるためには、住民が地域の社会的な問題を共有し、世代を越えた地域のつながりを促す実践活動が極めて有用であると考える。平成27年度は、前年度に引き続き、A小学校区内でのヘルスタウンケアタウンプロジェクト、“A地域健康力アップ大作戦"の実践活動は、年2回(5月は体力測定とウオーキング、11月は健康講座と体験学習)、まちづくり会協議は2ヶ月に1回開催され、活動の企画、実施、評価、及び修正について協議し改善を加えて継続実施し、ソーシャルキャピタルの醸成を継続している。調査ついては、対象地域への他組織の調査が入ったため、本研究調査時期を見合わせた。今後の調査について対象組織へ内諾を得て、時期の調整をすすめているところである。また、倫理審査申請も進めている。本研究では、都市部高齢化地域のA小学校区におけるソーシャルキャピタルを醸成するプログラムを運営しその評価を目的として、住民と専門職および大学教員などの多組織が連記して「A健康まちづくり会(自治連合会、学区社協、シニアクラブ、体操クラブ、学区体育振興会、地域包括支援センター、地域介護予防推進センター)」を結成し活動を継続している。学区の各組織の住民代表と包括支援センターや介護予防推進センター、大学教員による「A健康まちづくり会」では、住民の健康を作りを共有する目的として確認し、継続しているイベントの修正や変更について話し合いを重ねている。この過程が、ソーシャルキャピタルを醸成するプログラム運営の重要な部分となると考える。この会議は40回を重ねており、住民代表の活発な発言がある。こうのようなプロセスを経て、平成28年度は、「A健康まちづくり会」会議を5回持ち、2回のイベントを実施した。

イベントの内容は、第10回:4月20日(体力測定とウオーキング26名参加)、第11回:11月13日(健康講話「健康寿命の延伸とその秘訣」とスクエアステップ17名)である。安全安心を確保するために、ボランティア参加の大学生および院生が15名20名参加している。活動の広報を兼ねて地域住民へ実施報告チラシを(第10回の報告(4/20)の6月30日発行・A4版の各世帯向け)を配布または回覧した。研究代表者が平成27年より所属長となり管理業務が増えたことに加え、平成28年度は博士後期変更申請書類の作成と学内及び学外の調整会議が頻繁に開催され、研究のための時間を設けることが困難になり、研究遂行に支障を来した。また昨年度後半に調査対象地域に、商店街活性化を目的としたNPO街作り会の調査が実施されたため、調査依頼と調査時期を遅らせる必要が生じた。困難な状況ではあったが、本研究の目的とするソーシャルキャピタルを醸成するプログラム運営の「A健康まちづくり会」の会議や恒例の年2回のイベント等の研究活動は実施継続している。研究者らは、A小学校区の自治連合会、体育振興会、学区社協、シニアクラブ、女性会等の住民組織、地域包括支援センター、予防介護推進センタ-と共に“粟田健康まちづくり会"を結成し、ソーシャルキャピタルを醸成するプログラムを運営し活動している。A小学校区は、65歳以上高齢者1,139名(男性457名,女性682名)、高齢者人口構成割合は31.4%、京都市でも高齢者人口構成割合が最も高いB区に位置する。本研究では都市部高齢化地域におけるソーシャルキャピタルの効果検証を目的として、A小学校区の40歳以上の住民2,015名を対象に質問紙調査を実施した。回答者は427名(回収率21.1%)であった。40歳以上の分析対象者420名中{女性253名(60.2%),男性165名(39.3%)、不明2名(0.5%)}、4064歳129名(30.7%)、65歳以上291名(69.3%)であった。属性項目では外出頻度の多さ、経済的ゆとり、コミュニティ関連の項目では近所つきあいの深さ、コミュニティ感覚、身体的健康関連の項目では主観的健康感、生活習慣得点(ブレスローの健康習慣7項目)、精神的健康関連項目では孤独感(J-UCLA)と抑うつ度(GDS)が、生活満足度(LSIK)との相関(p<0.01)があり、“粟田健康まちづくり会"への参加の有無別2群の生活満足度では参加群の生活満足度が有意に高かった。京都市は、歴史的な祭事が数多く受け継がれており、小学校区ごとに地区体育会や地蔵盆行事の催しを継続している地域が比較的多い。しかし、今後さらに加速される都市部の高齢化は、行事遂行の困難さやつながりの希薄化等の過疎的な現象を進め、住民のwell-beingに影響を及ぼすと考える。研究者らの“粟田健康まちづくり会"の実践は、住民参画による地域包括ケアシステムの具体的な実践例としてのモデルを示唆するものと考える。研究者らは、A小学校区の住民組織6団体と公的機関2団体、大学による「A健康まちづくり会」を7年前に結成し、年2回イベント(5月の体力測定とウオーキング、11月の学習会と運動体験)、活動参加100回記念表彰を実施している。65歳以上291名(回収率12.5%)を対象とした調査の結果、先行研究と同様に高齢者の孤独感と社会的つながりを示す項目に関連が見られた。
酸耐性と選択的透過性を両立する生物由来シリカ膜の解析とin vitroでの再現

一部のBacillus属細菌はケイ酸を細胞内に取り込み、その重合体であるシリカを胞子殻上に蓄積する。形成されたシリカ層は酸に対する防壁として機能する一方で、発芽誘起物質の少なくとも一部を透過すると考えられた。これらの機能を両立しているメカニズムを解明するために、胞子よりシリカ層を単離し、その内部に存在する有機物を抽出した。質量分析の結果、本物質は多数のアミノ基を有するポリマーであることが判明した。本ポリマーを合成できない遺伝子破壊株を作製したところ、シリカ層の微細構造がわずかながら野生株と異なる様子が観察された。このことから、本ポリマーがシリカ層の性質に影響を与えている可能性が示唆された。一部のBacillus属細菌は胞子形成期に培地中のケイ酸(Si[OH]4)を取り込み、その重合体であるシリカ(SiO2)を胞子殻上に蓄積する。シリカ層が形成された胞子は、酸や塩素に対する耐性が向上しており、胞子表面のシリカ層が酸などに対する防壁として機能していると考えられた。一方で、発芽誘起物質(糖やアミノ酸など)の少なくとも一部を透過する性質を有しており、また、胞子発芽時にはシリカ層が脱落することが示唆された。つまり、本菌が形成するシリカ層は単なるガラス質のコーティングではなく、化学的耐久性と選択的透過性を併せ持ち、なおかつ能動的な分離が可能な多機能性の膜状構造体といえる。本研究では、多彩な機能を可能とする微細構造ならびに形成機構を明らかにし、それを模倣した機能性シリカ膜を形成することを目的とした。本年度は、シリカ層の微細構造を詳細に観察するために、胞子殻のシリカ層の単離を行った。シリカ層を形成した胞子を濃硝酸・濃硫酸混合液中で強熱し、シリカ外部の有機物を分解した後、超遠心によりシリカ層を回収した。得られた画分の電子顕微鏡観察を行ったところ、胞子と同サイズの殻状の構造体が観察された。元素分析の結果、この構造体がシリカで構成されていることが確認されたことから、シリカ層の単離に成功したと判断した。現在、高解像度の電子顕微鏡により微細構造の観察を進めている。また、単離したシリカ層をフッ化アンモニウム処理に供し、シリカを溶解することで、シリカ内部に存在する有機物を回収することに成功した。現在、得られた物質の同定を進めている。おおむね当初の計画通りに進展している。シリカ層が形成された胞子は、酸に対する耐性が向上しており、胞子表面のシリカ層が酸に対する防壁として機能していると考えられた。平成28年度の研究において、本菌のシリカ層を単離することに成功した。また、得られたシリカ層をフッ化アンモニウム処理に供し、シリカを溶解することで、シリカ内部に存在する有機物を回収することに成功した。平成29年度の研究において、質量分析により本物質の同定を試みたところ、本物質は予想に反してタンパク質ではなく、アミノ基を多数有するポリマーであることが明らかとなった。本ポリマーの生合成経路を予想し、合成に関与すると予想される遺伝子を破壊したところ、本ポリマーを形成できない変異体を得ることに成功した。得られた変異体の胞子よりシリカ層を回収し、透過型電子顕微鏡を用いて微細構造の観察を行ったところ、シリカ層を構成する粒子状構造体の形状がわずかながら変化している様子が見られた。このことから、本ポリマーがシリカの性質に影響を与えている重要な物質である可能性が強く示唆された。本年度の研究において単離に成功したシリカ層の微細構造の電子顕微鏡観察を引き続き行い、化学的耐久性と選択的透過性を両立しているメカニズムについて構造的な面から考察する。また、シリカ層から抽出した有機物の同定を行うとともに、抽出した画分を用いてin vitroでシリカ層形成反応を再現し、形成されたシリカ層の構造・性質を胞子由来のものと比較する。生物工学体調不良により、当初参加を予定していた学会への参加を取りやめたため、次年度使用額が生じた。
新しい初代癌細胞培養法を用いた、癌における破壊・再生連鎖の解析

創傷治癒と同様に、癌細胞集団の構造破壊とそれに伴う再生が癌の進展に関与している可能性がある。我々が開発した患者癌組織から癌細胞を三次元培養する新しい方法(CTOS法)を用いて、CTOSの構造破壊とその後の再生に着目し、破壊・再生過程を病理学的・分子生物学的に解析した。破壊再生過程で増殖能と幹細胞性が亢進した。破壊再生過程で発現上昇する遺伝子群(破壊再生シグナチャー)は大腸癌患者の予後を反映していた。WNTシグナルとERBBシグナルが重要な役割を果たしていた。以上より腫瘍内の炎症などによる破壊的環境は癌細胞集団の破壊再生連鎖を惹起することで癌の悪性化に寄与していることが示唆された。癌は創傷治癒と類似しており、癌細胞集団の構造破壊とそれに伴う再生(破壊・再生連鎖)が癌の進展に関与している可能性がある。最近、我々は患者癌組織から癌細胞を培養する新しい方法を開発した。細胞-細胞間接着を維持したまま無血清・浮遊培養すると、純粋な癌細胞からなる細胞塊(cancer tissue-originated spheroid,CTOS)を調製できる。CTOSは癌細胞集団の三次元的特徴を維持している上に、機械的破壊後に短時間に再生することから、癌細胞集団の破壊・再生連鎖の研究に最適である。昨年度はCTOSの構造破壊によって惹起される再生に注目して、破壊・再生連鎖の過程を病理学的・分子生物学的に明らかにすることを試みた。まず、患者大腸癌検体をマウスに移植した腫瘍から調製したCTOSを用いて条件の検討やパイロット的実験を行った。まず再現性の良いCTOSの破壊プロトコールとして機械的破壊を選択し、単細胞化せず、細胞塊として部分的かつ均一に破壊し、破壊後の細胞塊のサイズと細胞死を指標に手技の均一化を行った。次にCTOS破壊後の継時的変化を時・空間的に解析した。形態変化、細胞増殖、細胞死、幹細胞的性質を解析するために、経時的にサンプリングし、マイクロアレイ法により遺伝子発現を網羅的に解析した。パスウェイ解析によって関与する候補細胞内シグナルを特定した。候補遺伝子の免疫染色を共焦点顕微鏡で解析した結果、破壊前と比較して局在が変化することを見出した。細胞ー細胞間接着を維持したまま無血清・浮遊培養すると、純粋な癌細胞からなる細胞塊(cancer tissue-originated spheroid, CTOS)を調製できる。これまでにCTOSの構造破壊によって惹起される再生に注目して、破壊・再生連鎖の過程を病理学的・分子生物学的に検討を進めてきた。再現性の良いCTOSの破壊プロトコールとして機械的破壊を選択した。破壊後の遺伝子変化に関与する候補細胞内シグナルを特定した。25年度は破壊再生過程で増殖と幹細胞性の亢進が起こること、破壊再生過程で活性化するシグナルを同定し、阻害により増殖と幹細胞性の亢進が抑制されることを明らかにした。CTOSに対する機械的破壊に加えて、さまざまな治療的破壊(抗がん剤、放射線)を行い、機械的破壊と同様の再生変化が起こることを確認した。Xenograftモデルに機械的破壊を行うことにより、in vivo腫瘍でも同様の変化が起こることを確認した。同所移植モデルでは腫瘍内の脈管侵襲が増加した。大腸癌CTOSを脾臓に注入する肝転移モデルを作成し、CTOSの転移能が破壊後に上昇することを明らかにした。マイクロアレイの結果から破壊再生過程で発現が上昇するマーカー分子を見出した。CTOSの破壊再生過程で劇的に蛋白レベルで発現が上昇することを確認した。我々は患者癌組織から癌細胞を培養する新しい方法を開発した。再現性の良いCTOSの破壊プロトコールとして機械的破壊を確立し、破壊再生過程で増殖と幹細胞性の亢進が起こることを明らかにし、破壊再生過程で活性化するシグナルを同定した。

CTOSに対する機械的破壊に加えて、さまざまな治療的破壊を行い、機械的破壊と同様の再生変化が起こることを確認した。本年度は特に放射線照射に着目し、再生過程をモニターするアッセイ系を開発した。破壊再生過程で活性化する細胞内シグナルを阻害すると、放射線治療による再生過程を消失させることができることを明らかにした。これまでに候補としてあがていた破壊再生の指標となるマーカー分子について、臨床病理検体を用いた解析を行った。ヒト腫瘍においても破壊部分で発現が亢進していたが、同時に間質細胞で強く発現しており、マーカーとしては不適当であることが明らかになった。網羅的発現解析に立ち返り、他の候補マーカーを複数選定し、現在同様の解析を進めている。CTOSと宿主細胞の共培養系の確立を試みた。共培養条件を検討した結果、血管内皮細胞とCTOSを共培養することに成功し、血管網を有するCTOSを作成することができた。これまでの成果について、現在論文投稿準備中である。26年度が最終年度であるため、記入しない。腫瘍生化学26年度が最終年度であるため、記入しない。計画に沿った研究を行った結果、本研究の基礎となる実験系を確立することができ、また今後解析を進めるべき細胞内シグナルの候補を絞り込むことができた。25年度は様々な治療的破壊が機械的破壊と同様の変化を引き起こすことを発見したことから、構造破壊は普遍的な破壊再生現象を解析するよいモデルになることを示すことができた。現在の治療法の改善や新たな治療戦略への足掛かりになると期待できる。昨年度の研究成果で明らかとなった候補となる細胞内シグナルを、薬剤などで阻害して破壊再生過程に及ぼす影響を調べる。in vivo腫瘍増殖における破壊再生の役割を探索する。これまでの結果から破壊再生過程で発現するマーカー分子を見出している。マーカー分子を用いて臨床病理組織検体を用いた解析を行う。免疫染色によるマーカー局在部位が、破壊・再生を示す形態学的な特徴と一致するか検討する。また、マーカー分子の発現と予後、病期、治療感受性などとの相関を検討する。破壊再生過程を阻害する薬剤を化学療法剤の併用による治療効果を検討する。腫瘍組織内での癌細胞集団に対する破壊・再生における線維芽細胞、炎症細胞、血管内皮細胞など宿主細胞との相互作用の関与を検討する。CTOSと宿主細胞の共培養系の確立を試みる。以上の結果について、患者腫瘍から直接調製したCTOSでも検証し、普遍的要素と症例間の多様性について検討する。本研究の背景と成果をアメリカ癌学会(AACR)で発表するため、旅費を申請する。本研究の背景と成果を発表し、情報を収集するため、アメリカ癌学会(AACR)、化学療法基盤支援シンポジウム他に出席する。このための旅費を申請する。26年度に行う研究で、試薬、マウス等の消耗品が増加するため。
アトピー性皮膚炎の表皮における神経ペプチドとその病因的役割

1皮膚における神経ペプチドの局在について免疫組織化学的に検討した。アトピー性皮膚炎と乾癬患者の病変部皮膚と健常者について比較した。神経ペプチドはVasoactive intestinal peptide(VIP),サブスタンスP(SP),calcitonin gene relatedpeptide(CGRP)について検討した。抗VIP抗体では、アトピー性皮膚炎および乾癬患者の病変部皮膚において表皮細胞間に蛍光が認められ、健常者との差が見られた。CGRP抗体では、アトピー性皮膚炎、乾癬患者の病変部皮膚の表皮内や、真皮乳頭層に神経線維様の蛍光が認められ、健常者との間に差が認められた。SP抗体では、健常人との差は認められなかった。3培養表皮細胞におけるのVIP1Rの発現に対するサイトカインの作用をRT-PCR法により検討した。DJM-1を培養し、培養液中にIL-4,TNF-α,INF-γを添加した。サイトカイン添加培養1,3,6,12,24時間培養後,DJM-1中VIP1RのmRNAの発現を半定量し、比較したが、サイトカイン添加前後において有為な差は認められなかった。今回の検討では、VIPやCGRPがアトピー性皮膚炎や乾癬において何らかの役割を果たしている可能性が示唆されたが、マスト細胞やリンパ球など真皮に存在する細胞から放出されるサイトカインが、表皮細胞のVIP receptorの発現の制御に関わっているかどうかについては明らかにされなかった。2各種神経ペプチドについて表皮細胞での存在を調べるために有棘細胞癌株(DJM-1cell)と正常表皮細胞の培養細胞で免疫組織化学的に検討した。VIP,CGRPは細胞質、細胞膜ともに陰性であったが、SPについては、所見が一定していないのでさらに検討する予定である。また、DJM-1cellと正常表皮細胞の培養細胞にVIPと反応させ、細胞に接着するかどうかを免疫組織化学的に検討したが、結果が一定していないので、条件を変えてさらに検討する。さらに、サイトカインを加えてVIPの受容体の存在に変化が認められるかをどうか、免疫組織学的検討を行う予定である。
腹膜中皮細胞へのinterleukin-10導入を応用した消化器癌遺伝子治療

腹膜中皮細胞の初代培養系の確立・遺伝子導入効率の検討7週令Wistar系雄性ラットを用い、腹膜中皮細胞の初代培養系を確立した。またβ-galactosidase発現adenovirus vector(Ad-LacZ)を用い、遺伝子導入効率について検討した。その結果、胃癌細胞株MKN45細胞に比較し、ラット腹膜中皮細胞へは約10.9倍と高い遺伝子導入を認めた。腹膜中皮細胞を標的としたInterleukin-10遺伝子導入によるマウス胃癌腹膜播種抑制1.adenovirus投与1、3週後の腹膜において、X-gal染色性がびまん性に認められ、腹膜中皮細胞は遺伝子導入標的として有用だと考えられた。2.1、3週後の腹腔洗浄液IL-10濃度は、それぞれ3431±1378、4665±2859pg/mlと上昇し、5、7週では98±176、117±104pg/mlと大幅に減少していた。すなわち少なくとも3週間は、腹腔内で高濃度のIL-10産生が維持されることが判明した。3.血清IL-10濃度は腹腔洗浄液の約1/13と低く、全身性の副作用出現も認められなかった。4.Ad-mlL-10群にて、腸間膜腫瘍結節数は、3、5週後ともにAd-LacZ群に比し有意に抑制されており、経時的な体重減少からの回復、生存期間の延長が認められた。その機序には、結節内血管新生抑制を介したものであることも判明した。サイトカインのひとつであるInterleukin(IL)-10は、Th1 T細胞を介した炎症過程のなかでは一般に抗炎症的に作用し、消化器領域における実験的大腸炎モデルに対し、IL-10遺伝子の導入は抗炎症的に作用し、大腸炎に対する予防効果のみならず、治療にも応用しうることがすでに報告されている。その抗炎症機序には、催炎症的に作用するサイトカインの、転写領域に存在するNF-κBを抑制することが明らかにされてきた。その一方で、食道・胃・大腸におよぶ消化器癌組織においてはNF-κBが恒常的に活性化していることが知られており、その結果癌増殖に関連した遺伝子(例えばCOX-2、VEGFなど)発現が制御・誘導されていることが報告されている。従って、IL-10の恒常的発現を来す環境は、癌組織における局所炎症の制御のみならず、癌細胞増殖抑制にも繋がる可能性が想定される。そこで、樹立化消化器管細胞株NUGC3,MKN45およびHT29 cellを用いIL-10投与による細胞増殖に及ぼす影響についてMTT法を用いてはじめに検討した。その結果、MKN45細胞は、IL-10を添加により用量依存性に細胞増殖の抑制が認められた。しかし、NUGC3およびHT29 cellにおいては、IL-10添加による細胞増殖能への影響は認められなかった。MKN45 cellにおいて、VEGFおよびCOX-2の発現は時間経過およびIL-10添加のいずれにおいても有意な変化は認められなかった。今後は、各細胞におけるNF-κBの活性化の程度をEMSA等の手法を用いて確認すると同時に、増殖因子あるいはサイトカインにより前処理し、NF-κBを活性化させた状態での細胞増殖能、それに続くmRNA発現について検討する。Interleukin(IL)-10はサイトカインのひとつであるが、Th1 T細胞を介した炎症過程のなかでは一般に抗炎症的に作用する。また、腹膜中皮細胞は、存在数あるいはその性質上、遺伝子発現の恒常性や導入効率の高さは十分に期待される。これらの観点から広域性(臓器に対する普遍性)と、遺伝子発現に対する恒常性をも加味した腹膜中皮細胞へのIL-10遺伝子導入は、標的遺伝子のみならず標的細胞をも鑑みたものであり、臨床的応用価値が高いものと期待される。

今年度は臨床応用への前段階として、in vitroおよびラットにおける検討を行った。培養癌細胞株におけるNF-kB活性の測定:血清刺激によるNF-kB活性の変化をEMSA法にて測定したところ、HT29細胞において血清刺激(1-24時間)により増加していた。刺激開始6時間後にピークに達し、刺激前の約4倍に増加していた。NF-kB活性誘導下におけるIL-10が癌細胞増殖に及ぼす影響:癌細胞株(MKN45,HT29)を96穴プレートへ1000個ずつ播き、NF-kB活性誘導サイトカインであるTNF-α(100ng/ml)により1時間刺激した0,24,48時間後にそれぞれIL-10(100ng/ml)を添加し、72時間後にMTS法により細胞増殖の影響を検討したが、いずれの方法においてもIL-10添加により有意な細胞増殖能への影響はみられなかった。また、同時にNF-kB活性を介した発現増強が報告されているVEGFおよびCOX-2 mRNA発現への影響も測定したが、有意な変化はみられなかった。腹膜中皮細胞の初代培養系の確立:ヒト腹膜中皮細胞の初代培養系確立の前段階として、ラットを用い、既報(Robson RL et al : J Immunol,2001,167:1028-1038)に従い腹膜中皮細胞の初代培養を行った。また、培養した腹膜中皮細胞およびMKN45細胞にAd-LacZの遺伝子導入を行ったところ、両細胞において導入に成功した。腹膜表皮細胞の初代培養系の確立・遺伝子導入効率の検討7週令Wistar系雄性ラットを用い、腹膜中皮細胞の初代培養系の確立に成功した。またβ-ガラクトシダーゼ発現アデノウイルスベクター(Ad-LacZ)を用いた遺伝子導入効率を検討、胃癌細胞株MKN45に比較しラット腹膜中皮細胞は約10.9倍と高い遺伝子導入を認めた。腹膜中皮細胞を標的としたlnterleukin-10遺伝子導入によるマウス胃癌腹膜播種抑制5週令BALB/c系ヌードマウスに対し、MKN45細胞を腹腔内投与し胃癌腹膜播種モデルを作成、3日後にIL-10遺伝子組み換えアデノウイルス(Ad-mlL-10)、Ad-LacZ、コントロールとしてPBSの腹腔内投与を施行、以下の結果を得た。1.ウイルス投与1、3週後の腹膜でびまん性のX-gal染色性が認められ、腹膜中皮細胞は遺伝子導入標的として有用だと考えられた。2.1、3週後の腹腔洗浄液IL-10濃度はそれぞれ3431士1378、4665±2859pg/mlと上昇、5、7週では98±176、117±104pg/mlと大幅に減少していた。すなわち少なくとも3週間は腹腔内で高濃度のIL-10産生が維持されることが判明した。3.血清IL-10濃度は腹腔洗浄液の約1113と低く、副作用は認めなかった。4.Ad-mlL-10群にて腫瘍結節数は3、5週後ともにAd-LacZ群に比し有意に抑制され、経時的な体重減少からの回復、生存期間の延長が認められた。