hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イヌアレルゲンの性状分析を通じてのイヌアレルギーのリスク評価とその制御法開発

人と動物が共に生きる社会が広まっている。伴侶動物としての代表の位置にあるイヌが、アレルギーを誘導するものとして、危害を持つか、すなわちイヌアレルギーとしてリスク性を示すか否か検討するために、イヌアレルゲンの構造と機能を詳細に解析した。また、同アレルゲンのIgE抗体反応における交差性を検討した。推定アミノ酸配列から、バイオインフォマティクスの技術を用いてイヌアレルゲンについてモデル構造を解析した。その結果、Can f 1およびCan f 2は、リポカリンファミリー蛋白質に属し、バレル構造とジスルフィド結合というアレルゲン蛋白質がもつ共通の特徴を有していた。X線小角散乱法解析と円偏光二色性分光法から、同蛋白質は球状で、溶液中で単分子として分散する事、推定アミノ酸から計算される分子量と一致する溶液中の分子量を示した。また、β-sheetが豊富な蛋白質であることが明らかになった。アルブミンの交差性について検討した結果、イヌアレルギー患者中にはイヌアルブミン(Can f 3)だけでなく多数の動物種のアルブミンにもIgE抗体を産生しており、アルブミンが広くアレルギーリクス物質である事を明らかにした。イヌとの共生は、ヒトがイヌアレルゲンに長期的かつ連続的曝露を受けることを示唆する。本研究ではイヌアレルゲンの性状解析を通じ、イヌアレルゲンのリスク評価を行う。さらに、アレルゲン検出法、治療・予防法を開発、イヌアレルギーの制御を目的とする。第1研究年度である本年度はイヌアレルゲンCan f1の抗原決定基解析、欠失変異体・点突然変異体の作製を行った。申請者がクローニングしたイヌアレルゲンCallf1遺伝子の推定アミノ酸配列をコンピュータ解析した結果、N末端の127(Can f1-1)、および93114(Can f1-2)、C末端を含む126148アミノ酸部分(Can f1-3)にエピトープがあることが予想された。それぞれを欠失変異体として遺伝子工学的に合成した。すなわち、全長のCan f1遺伝子が挿入されたpGEXプラスミドを鋳型に、各予想抗原決定基部分をPCR増幅し、制限酵素処理後pGEXプラスミドに挿入、大腸菌BL21(DE3)による各欠失変異体タンパク質の作製システムを構築した。各欠失変異体をグルタチオンSトランスフェラーゼが融合した形状の欠失変異体として精製した。精製した欠失変異体と、イヌアレルギー患者血清由来のIgE抗体の反応性を検討した結果、Can f1分子のN末端部分にIgE抗体のエピトープがあることを明らかにした。イヌアレルゲンCan f1には3ケ所(52、92、143)にシステイン残基が分布する。コンピュータによる推定立体構造解析結果から52と143番のシステインが近接しているため、まず52番目のシステインについて、点突然変異技術を用いてセリンをコードする塩基に変換し、上述のpGEXプラスミドに挿入、大腸菌による点突然変異体合成システムを構築した。精製した点突然変異体をマウスに投与してもIgE抗体の産生は刺激されず、同点突然変異体がアレルゲン活性を喪失していることが示唆された。このことは、同変異体をイヌアレルギーの減感作療法や、ワクチン療法に用いることができる可能性を示唆する。イヌアレルゲンはリポカリンタンパク質ファミリーに属する低分子量の分泌型タンパク質で耳下腺から分泌される。同アレルゲンには2種あり、それぞれCan f 1およびCan f 2と称される。本年度は、イヌアレルゲンのアレルゲン性や生体内機能の本質を理解する試みのため、同タンパク質の生理学的・生化学的性状を検討した。リポカリンタンパク質の基本性状として認知されている低分子の脂質性物質への結合性を調べた。現在までに知られているリポカリン群と異なり、両イヌアレルゲンはレチノイン酸やレチノイド、あるいはオレイン酸などの遊離脂肪酸には全く結合しなかった。同アレルゲンの予想立体構造をコンピュータ解析したところ、リポカリンタンパク質に共通するキャビティー(洞)は認められるものの、両アレルゲンともにキャビーティーが非常に小さく、低分子物質を許容しないものと推察された。また、アミノ酸配列から予想された、メタロプロテアーゼに対する阻害活性について調べたが、両イヌアレルゲンにはそのような活性は検出されなかった。

以上の成績は、イヌアレルゲンはリポカリンタンパク質ファミリーに属するものの、特異な性状を持っている事を示している。イヌアレルゲンのアレルゲン性や、イヌ体内での生理的役割の解析には、NMRや線結晶解析により、正確な構造を決定しての議論が必要と考えられた。近年,イヌとヒトが直接的に接触する機会が増加し,イヌアレルギーが大きな問題となってきている。イヌアレルゲンとして,唾液腺で産出され分泌されるCanis familiaris allergen 1(Can f1),及びCan f2が同定されている。Can f1,及びCan f2は,それぞれ148,及び161アミノ酸残基からなり,一次構造の相同性より生体内における疎水性低分子輸送蛋白質群であるリポカリンファミリーに属することが予想されている。しかし,両蛋白質の構造やアレルギー発症のメカニズムはほとんど解明されていない。本研究では,円二色性分光法(CD),及びX線小角散乱法(SAXS)を用いて,Can f1, Can f2の構造解析を行い,同じリポカリンファミリーに属し,当研究室において詳細な構造解析が行われているリポカリン型プロスタグランジンD合成酵素(L-PGDS)との構造比較を行った。Can f1,及びCan f2は大腸菌を用いてその組換えタンパク質を発現させ,精製した。次に,pH7.0, 35°Cの条件下,遠紫外CDスペクトルを測定し,DICROPROT 2000(Deleage G,et al.,1993)を用いて二次構造含量を計算した結果,Can f1,及びCan f2のα-helix,及びβ-sheetの含量は,それぞれ11.2%,及び36.6%,14.3%,及び38.8%となった。これらの結果は,CD,及びNMR解析から得られたL-PGDSの二次構造含量(14%,及び39%)と同程度の値を示し,β-sheetに富む構造を有することが判明した。さらに,SPring-8/BL40B2において,pH7.0,25°Cの条件下SAXS測定を行った結果,Can f1,及びCan f2は,球状蛋白質であり,慣性半径はそれぞれ18.9Å,及び19.2Åと求められ,L-PGDSの慣性半径(19.4Å)と非常に近い値を示した。以上の高次構造解析結果からも,Can f1及びCan f2が,リポカリンファミリーに属することが示唆された。
びまん性絨毛膜羊膜ヘモジデローシスが胎児肺の成長発達に与える影響の解明

妊娠中期に合併するびまん性絨毛膜羊膜ヘモジデローシス(DCH)が胎児肺の成長発達に与える影響をその実験モデルラットを用いて解析した.先ず,妊娠ラットの羊水に鉄を溶解させることによってDCHの実験モデルを確立することができた.次いで,羊水腔内で鉄に暴露させられたラット胎仔肺に肺胞化の停滞,すなわちびまん性気腫性変化が誘導され,この変化が成獣期まで持続することを確認した.以上より,DCHは早産児に最重症の慢性肺疾患を誘導する危険性があり,その病態解明と予防法の開発が待たれる.本研究の目的は、新生児慢性肺疾患のリスク因子である「びまん性絨毛膜羊膜ヘモジデローシス(以下DCH)」が胎仔肺ならびに新生仔肺の成長発達に与える影響を解明することである。われわれはDCHを生じる病態で、胎児肺を損傷ないし成長障害させている物質として赤血球中の鉄に注目した。そこで妊娠期間22.5日のWKAH/Hkm妊娠ラットに対し予備実験を行った。妊娠21.0日の妊娠ラットを開腹子宮を露出し、羊水腔内にデキストラン鉄を注入し閉腹した。鉄注入後24時間の胎盤胎児面ならびに卵膜にはヘモジデリン沈着が観察され、DCHと同様な病理組織像であった(DCHモデルラット)。また、胎仔肺をモルフォメトリー解析したところ、肺胞半径は大きく、単位容積あたりの肺胞数は少なかった。この結果に基づいて、平成23-25年度にDCHモデルラットを用いて、新生仔ラットの肺の成長とサイトカイン、肺動脈中膜について研究を進める予定をたてた。この実験系では妊娠後期に全身麻酔下で開腹術を行い、自然分娩で出生し、そのまま子育てをさせることが大きな障壁となる。そこで平成23年度には、開腹後妊娠ラットの自然分娩について予備実験を行った。他の研究者の私信からSDラットで実験を行ったところ、経産ラットの75%で開腹術後の自然分娩、育仔が可能であることが判明した。上田らのWKAH/Hkmラットにおける報告では、実験対象となるラットと同じ予定日の妊娠ラットを準備した上で、帝王切開で娩出したラット胎仔を育てさせるプロトコールであった。平成24年度はWKAH/HkmラットでDCHモデルラットと同様な実験を行った。開腹術後の自然分娩、育仔は8例の妊娠ラット中1例のみで可能であった。WKAH/Hkm妊娠ラットではこの実験を行うことが困難であると判断した。本研究の目的は、新生児慢性肺疾患のリスク因子である「びまん性絨毛膜羊膜ヘモジデローシス(以下DCH)」が、胎仔肺ならびに新生仔肺の成長発達に与える影響を解明することである。われわれはDCHを生じる病態で、胎児肺を損傷ないし成長障害を起こしている物質として、赤血球中の鉄に注目した。そこで以前、妊娠期間22.5日のWKAH/Hkm妊娠ラットに対して、妊娠20日に胎仔期羊水腔内に鉄を注入し、注入後24時間で胎盤胎仔面,卵膜にヘモジデリン色素の沈着が観察された(DCHモデルラット)。この結果に基づいて、平成23-25年度にDCHモデルラットを用いて、新生仔ラットの肺の成長とサイトカイン、肺動脈中膜について研究を進める予定を立てた。WKAH/Hkm胎仔ラット肺損傷のメカニズムについて、胎仔肺組織での好中球の浸潤を主とした急性炎症像か貪食細胞の増加と仮説を立てたが、ヘマトキシリンエオジン染色ではいずれも観察されなかった。そこで、妊娠21日のWKAH/Hkmラット胎仔羊水腔内に鉄を注入し、12時間後に胎仔肺を摘出する追加実験を行った。モルフォメトリー解析では、鉄投与により肺胞表面積が小さく、肺胞数が少なく、肺胞半径が大きいlarger and fewer alveoliを呈したが、ヘマトキシリンエオジン染色では好中球や貪食細胞はほとんど観察されなかった。そこで、胎仔肺組織の追加染色を実施し現在解析準備中である。平成23-24年度の新生仔ラットの予備実験の結果により、WKAH/HkmラットからSDラットに変更する必要があることが判明した。本年度は、妊娠20日のSDラット胎仔羊水腔内に鉄を注入し、出生した生後10、61日の新生仔ラット肺を摘出した。現在モルフォメトリー解析準備中である。妊娠中期に合併するびまん性絨毛膜羊膜ヘモジデローシス(DCH)が胎児肺の成長発達に与える影響をその実験モデルラットを用いて解析した.先ず,妊娠ラットの羊水に鉄を溶解させることによってDCHの実験モデルを確立することができた.次いで,羊水腔内で鉄に暴露させられたラット胎仔肺に肺胞化の停滞,すなわちびまん性気腫性変化が誘導され,この変化が成獣期まで持続することを確認した.以上より,DCHは早産児に最重症の慢性肺疾患を誘導する危険性があり,その病態解明と予防法の開発が待たれる.本研究の目的は、新生児慢性肺疾患のリスク因子である「びまん性絨毛膜羊膜ヘモジデローシス」が胎児肺の成長発達に与える影響を解明することである。本研究期間以前に妊娠期間

22.5日のWKAH/Hkm妊娠ラットに対し、妊娠21.0日に羊水腔内にデキストラン鉄を注入することにより、妊娠22.0日のラット胎盤胎児面に「びまん性絨毛膜羊膜ヘモジデローシス」を誘導し、胎児肺の発育が遅れることを示してきた。平成23年度の研究目的は胎児期の肺発育の遅れが出生後も継続することを示すことにある。一つ目として新生仔ラット実験にあたり、妊娠ラットを手術した後の自然分娩について予備実験を行った。その結果ストレスによる新生仔の食殺が続いたため、同様な実験系の報告を参考にして、ラットをWKAH/HkmからSDに変更した。妊娠21.0日のSDラット羊水腔にデキストラン鉄ないし生理食塩水を注入後自然分娩させた。生後14日ないし60日まで飼育したのちラット肺を摘出した。現在モルフォメトリー解析の準備中である。二つ目として「びまん性絨毛膜羊膜ヘモジデローシス」ラットから出生した新生仔のサイトカインを調べるために、新生仔ラットからの採血法の検討を行った。いくつかの採血法の中でおよそ5g程度の新生仔ラットからもっとも採血できたのは断頭法であり、全血でおよそ150μLの採血が可能であることが判明した。サイトカイン濃度の計測については現在検討中である。三つ目として前述した、「びまん性絨毛膜羊膜ヘモジデローシス」ラットモデルならびに胎児肺発育の停滞について、第16回オーストラリア/ニュージーランド周産期学会で発表した。本研究の目的は,新生児慢性肺疾患のリスク因子であるびまん性絨毛膜羊膜ヘモジデローシス(以下DCH)が,胎仔ならびに新生仔肺の成長発達に与える影響とそのメカニズムを解明することである.われわれはDCHを生じる病態で,胎児肺に損傷もしくは成長障害を誘導する物質として赤血球中の鉄に注目した.予備実験において,WKAH/Hkm妊娠ラットの羊水腔内に鉄を注入すれば,その24時間後には胎盤胎仔面と卵膜に鉄沈着が観察され,胎生期肺に肺胞化の停滞が誘導されることを確認した(DCHモデルラット).本研究期間には,好中球浸潤による急性炎症が胎仔肺に成長障害を誘導するという仮説を証明するため,新生仔期のDCHモデルラットを用いて組織モルフォメトリー,サイトカイン動態などについて解析する計画を立てた.平成23-25年度は,新生仔期の実験系確立と胎仔肺損傷の原因検索にあてた.母獣ラットの分娩育仔成功率は,WKAH/Hkmラットで13% (8例中1例),SDラットで75% (8例中6例)であったため,新生仔ラット肺の解析にはSDラットを採用した.また,鉄暴露後12時間と24時間いずれの胎仔肺においても急性炎症が観察されなかったため,5種類の組織染色を追加した.平成26年度は,生後10日(鉄群6例,対照群7例)と61日(鉄群4例,対照群4例)の新生仔ラット肺にモルフォメトリー解析を行い,いずれの時期にも胎仔期と同様の肺胞化の停滞が確認された.胎仔期の鉄暴露による肺胞化の停滞は出生後も持続し,成獣期まで継続する可能性が示唆された.この肺胞化障害の特徴を明らかにするため,本研究で得られた肺組織に胎仔肺組織で追加した5種類の組織染色について解析を継続している.周産期医学平成23年度の計画である「新生仔慢性肺疾患/DCHモデルラットの作成」に関して、WKAH/Hkmラットで開腹術後の妊娠ラットの自然分娩、育仔行動について検討を行った。妊娠21.0日に開腹し、羊水腔内に生理食塩水ないし鉄を注入し、自然分娩させた。計8例中出産、育仔は1例のみで観察された。以上より、上田らの研究で使用したWKAH/Hkmラットでは新生仔肺発育の評価が困難であることが明らかとなった。
ウィスカ強化アルミニウム合金の破壊強度評価

1.ウィスカ配向方向を引張り方向に対して0°、45°、90°と3通りに変えた試験片を作成し、引張り試験を行った。破断するまで試験した後、破断ひずみと破断応力を測定した。また破面を走査型電子顕微鏡にて観察し、ウィスカ繊維と母材との破壊の様相を観察した。その結果、ウィスカ繊維端部では母材がディンプル破壊を起こしていること、ウィスカ繊維の中央部ではウィスカと母材との剥離により界面破壊が余り大きな塑性変形を伴わずに生じていること、の2点が確認された。これにより、ウィスカ強化アルミニウム合金の破壊は、ディンプル破壊と界面剥離の二つの破壊条件がともに支配因子であることが明らかとなった。したがって、破壊シミュレ-ションには両者の条件を用いる必要がある。走査型電子顕微鏡写真より破壊時のディンプル径を測定し、母材単独の場合よりディンプル計は著しく小さくなっている個と、すなわち母材が脆化していることが分かった。またこの結果より、破壊時のボイド率を実験的に決定することができた。2.有限要素法(FEM)により同じ試験片の破壊解析を行った。実験的に得られた臨界ボイド率を用いてボイドの発生、成長、合体のシミュレ-ションを行った。0°試験片ではこれにより応力ーひずみ関係を良く表現できた。しかし90°試験片においては、繊維と母材との剥離が無視できないことが明らかとなり、剥離条件も破壊条件として使用した。剥離条件として臨界応力値を考慮して、実験と良く対応する応力ーひずみ関係を得ることができた。これよりGursonの提案による構成方程式はこの材料の破壊解析に適していることを確認できた。
転写と染色体分配の制御破綻に起因する多段階発がんとがん幹細胞性獲得機構の解析

本研究では、ダウン症随伴急性巨核芽球性白血病(DS-AMKL)における白血病幹細胞の同定と性質解明を目的とした。第一に、DS-AMKL細胞(超免疫不全マウスへの継続的な移植を経てAMKLへと進展した、TMD患者由来の細胞ライン)を、超免疫不全マウス(NOGマウス)に異種移植することにより、白血病細胞を安定的に増幅・供給できる実験系の樹立に成功した。同マウスにおいて、巨核球特異的CD41a表面形質を発現するAMKL様病態の形成を確認し、また最適な解析タイミングを見出すことができた。同マウスを用い、白血病幹細胞濃縮分画を単離するための指標として、造血幹細胞や従来から多くの報告があった白血病幹細胞に特異的な表面形質であるCD34の有無に基づき、白血病細胞の分画化と移植実験を行った。その結果、CD34陰性・ヘキスト高染色性細胞集団(MP-fraction)移植群において白血病発症を認めた。さらにCD34陰性分画の中で、白血病発症マウスに抗癌剤(5-FU)を投与した際に増加が認められた、ヒト造血幹細胞の指標となるCD45RA陰性細胞分画、同じくヒト造血幹細胞の指標となるCD49f陽性細胞分画に着目し、各細胞表面マーカー陽性集団、陰性集団をそれぞれ単離して移植実験を行った。CD45RAおよびCD49fの発現の有無に関わらず白血病の発症を認めたことから、本白血病における白血病幹細胞はCD34陰性分画中に広く分布することが示唆された。多くの骨髄性白血病において、CD34陽性分画に白血病幹細胞が濃縮されるという報告が多い中、本AMKLは非常に珍しい型の白血病であると言える。今後、真の白血病幹細胞濃縮分画を単離し、詳細な機能解析を行うためには、白血病細胞全体の中で非常に大きな割合を占めているCD34陰性分画から、細胞周期進行度といった別の指標を用いて候補分画を絞り込んでいく必要があると考える。29年度が最終年度であるため、記入しない。同マウスの血液学的所見より、巨核球特異的CD41a表面形質を発現するAMKL様病態が形成されることを確認し、また最適な解析タイミングを見出すことができた。その結果、CD34陰性分画移植群において白血病発症を認めた。さらにCD34陰性分画において、ヘキスト低染色性細胞集団(SP-fraction)および高染色性細胞集団(MP-fraction)をそれぞれ検出し、移植実験を行った。その結果、MP-fraction移植群において白血病発症を認めた。以上の解析より、本DS-AMKLにおける白血病幹細胞はCD34陰性、およびヘキスト高染色性分画に存在することが示唆される。今後、CD34以外の表面形質の発現プロファイル、および細胞周期の進行度に基づくさらなる指標を組み合わせ、白血病幹細胞濃縮分画を絞り込んで行くことで、白血病幹細胞を単離する上での新たな指標を提唱できると期待される。DS-AMKL細胞を、NOGマウスに異種移植することにより、白血病細胞を安定的に増幅・供給できる実験系の樹立に成功した。同マウスを用い、白血病幹細胞濃縮分画を単離するための指標として、造血幹細胞や従来から多くの報告があった白血病幹細胞に特異的な表面形質であるCD34の有無、およびヘキスト染色性の差異に基づいて、白血病細胞の分画化と移植実験を行った。その結果、本DS-AMKLにおける白血病幹細胞は、CD34陰性およびヘキスト高染色性分画に存在することが示唆される結果を得た。本研究では、ダウン症随伴急性巨核芽球性白血病(DS-AMKL)における白血病幹細胞の同定と性質解明を目的としている。平成27年度までに、DS-AMKL細胞を超免疫不全マウス(NOGマウス)に異種移植することにより、白血病細胞を安定的に増幅・供給できる実験系を樹立した。細胞表面形質の発現パターンにより白血病細胞を分画化し、NOGマウスへの移植実験により、本白血病における白血病幹細胞は、CD34陰性かつヘキスト色素高染色性細胞分画に存在すること、またCD117発現の有無では分離できないことがわかった。平成28年度は、CD34陰性分画の中から、更に別の指標を用いることで真の白血病幹細胞濃縮分画の絞り込みを試みた。

白血病発症マウスに抗癌剤(5-FU)を投与すると、ヒト造血幹細胞の指標となるCD45RA陰性細胞分画、CD49f陽性細胞分画の割合が増加することがわかった。この抗癌剤耐性を持つ細胞分画に着目し、各細胞表面形質陽性集団、陰性集団をそれぞれ単離し、移植実験を行った。その結果、CD34陰性分画の中では、CD45RAおよびCD49fの発現の有無に関わらず白血病の発症が認められ、CD45RAおよびCD49fではCD34陰性分画の中から白血病幹細胞を分離できないことが示された。しかしこの結果は、抗癌剤耐性を持つ細胞集団中に白血病幹細胞が存在する可能性を否定するものではない。さらに、核酸染色色素であるピロニンYとヘキストで染色し、共陰性となる細胞周期休止期の細胞集団、およびそれ以外の増殖期の細胞集団を検出した。単離した各細胞集団を用いて移植実験を行い、白血病発症が細胞周期特性の差異により影響を受けるか否か、現在経過を観察中である。本実験の結果と、先の抗癌剤耐性と関連する細胞表面形質の情報とを連結することで、白血病幹細胞分画単離の指標を探索できると期待している。本研究を推進するうえで、白血病細胞を安定的に増幅・供給できる実験系の樹立、白血病幹細胞濃縮分画を単離できる細胞表面形質発現パターンの解明、白血病幹細胞の性状解明という三つの段階を経る必要がある。現在までに、ヒト由来DS-AMKL細胞のNOGマウスへの異種移植により、巨核球特異的CD41a表面形質を発現するAMKL様病態が形成されることを確認し、また移植から解析までの最適なタイミングを見出すことができた。これにより白血病細胞を安定的に増幅・供給できる実験系の樹立に成功したと判断される。引き続き、ヒト-マウス異種移植系を用いて白血病幹細胞濃縮分画の単離を試みた。白血病幹細胞を特異的に識別する指標として、造血幹細胞や従来から多くの報告があった白血病幹細胞に特異的な表面形質であるCD34の有無、ヘキスト染色性の差異、抗癌剤に対する抵抗性、および細胞周期特性に基づき、白血病細胞の分画化と移植実験を行った。その結果、本DS-AMKLにおける白血病幹細胞は、CD34陰性およびヘキスト高染色性分画に存在することが示唆された。さらに同分画内には抗癌剤耐性を有する細胞集団が含まれることがわかったが、この集団の中から白血病幹細胞を濃縮することができる表面形質の解明には至っていない。これまでに同定することができたCD34陰性分画は、白血病細胞全体の中で非常に大きな割合を占めていることから、真の白血病幹細胞濃縮分画と定義するための指標としてはまだ不十分である。そのため白血病幹細胞の特異的な性状解明を目指すうえでは、今後更なる指標を同定していく必要がある。本研究では、ダウン症随伴急性巨核芽球性白血病(DS-AMKL)における白血病幹細胞の同定と性質解明を目的とした。第一に、DS-AMKL細胞(超免疫不全マウスへの継続的な移植を経てAMKLへと進展した、TMD患者由来の細胞ライン)を、超免疫不全マウス(NOGマウス)に異種移植することにより、白血病細胞を安定的に増幅・供給できる実験系の樹立に成功した。同マウスにおいて、巨核球特異的CD41a表面形質を発現するAMKL様病態の形成を確認し、また最適な解析タイミングを見出すことができた。同マウスを用い、白血病幹細胞濃縮分画を単離するための指標として、造血幹細胞や従来から多くの報告があった白血病幹細胞に特異的な表面形質であるCD34の有無に基づき、白血病細胞の分画化と移植実験を行った。
緊急時におけるエピネフリンの鼻腔内投与と舌内投与の効果

緊急時には薬物投与は一般的に静脈内投与である.しかし,歯科治療をはじめ一次医療では技術,設備が必要であり静脈内投与を迅速に行うことは難しい.これに対し鼻腔内投与は経験は必要なく,鼻粘膜には血管が豊富で薬物吸収が速いと考えられる.一方,舌にも同様に血管が豊富で口腔の入り口にあるため操作しやすく,技術,設備は必要でなく,これも緊急時の薬物投与経路として期待できると考えている.今回は,イヌを用いた全身麻酔下で低血圧状態にし,エピネフリンを鼻腔内と舌に投与して血中濃度を測定し両者を比較検討した.ビ-グル犬にイソゾールで導入し,血管内挿管を行い笑気・酸素・イソフルランで維持し,ニトログリセリンを静注して低血圧状態(安定状態の60%)にし,エピネフリン0.4mgを鼻腔内投与群に4例,舌内投与群5例に投与し血圧・心拍数を記録した.採血は20秒・40秒・1分・5分・10分に行った.結果は鼻腔内投与群では20秒後に2例が,1分後に1例が最高血中濃度に達しそれぞれ1.78ng/mlと0.82ng/ml,0.85ng/mlであった.舌内投与群では5分後に2例が最高血中濃度に達し,40.5ng/ml・16.1ng/mlであったが3例は上昇しなかった.血圧変動は鼻腔内投与群では収縮期圧は20秒後に最も低く510分後には投与前に戻り,拡張期圧は20秒後に最も低く10分後には投与前の77119%であった.舌内投与群は収縮期圧は投与後1分まで低下した状態だが10分後には投与前に戻り,拡張期圧は1分後までは投与前より低下あるいはほぼ同じだがそれ以降上昇した.鼻腔内投与群では20秒後に87232%まで変動したが10分後には104152%であった.舌内投与群では1例のみ急激に上昇し10分後にも147%であったものの他の4例は40秒後までほとんど変化なく,10分後にはほぼ投与前の数値に戻った.今回の研究では血中濃度・上昇する速度は舌内投与群が有利であったが吸収されなかった例もあり確実ではない.緊急時の投与法としてはさらに検討が必要である.緊急時には薬物投与は一般的に静脈内投与である.しかし,歯科治療をはじめ一次医療では技術,設備が必要であり静脈内投与を迅速に行うことは難しい.これに対し鼻腔内投与は経験は必要なく,鼻粘膜には血管が豊富で薬物吸収が速いと考えられる.一方,舌にも同様に血管が豊富で口腔の入り口にあるため操作しやすく,技術,設備は必要でなく,これも緊急時の薬物投与経路として期待できると考えている.今回は,イヌを用いた全身麻酔下で低血圧状態にし,エピネフリンを鼻腔内と舌に投与して血中濃度を測定し両者を比較検討した.ビ-グル犬にイソゾールで導入し,血管内挿管を行い笑気・酸素・イソフルランで維持し,ニトログリセリンを静注して低血圧状態(安定状態の60%)にし,エピネフリン0.4mgを鼻腔内投与群に4例,舌内投与群5例に投与し血圧・心拍数を記録した.採血は20秒・40秒・1分・5分・10分に行った.結果は鼻腔内投与群では20秒後に2例が,1分後に1例が最高血中濃度に達しそれぞれ1.78ng/mlと0.82ng/ml,0.85ng/mlであった.舌内投与群では5分後に2例が最高血中濃度に達し,40.5ng/ml・16.1ng/mlであったが3例は上昇しなかった.血圧変動は鼻腔内投与群では収縮期圧は20秒後に最も低く510分後には投与前に戻り,拡張期圧は20秒後に最も低く10分後には投与前の77119%であった.舌内投与群は収縮期圧は投与後1分まで低下した状態だが10分後には投与前に戻り,拡張期圧は1分後までは投与前より低下あるいはほぼ同じだがそれ以降上昇した.鼻腔内投与群では20秒後に87232%まで変動したが10分後には104152%であった.舌内投与群では1例のみ急激に上昇し10分後にも147%であったものの他の4例は40秒後までほとんど変化なく,10分後にはほぼ投与前の数値に戻った.今回の研究では血中濃度・上昇する速度は舌内投与群が有利であったが吸収されなかった例もあり確実ではない.緊急時の投与法としてはさらに検討が必要である.
脂質合成系調節転写因子SREBP-1/2の標的配列特異性を決定する共因子の解明

一定の機能をもった遺伝子群の発現制御機構の解明はポストゲノム時代の中心課題である。我々は、生活習慣病のsusceptibilityを規定する遺伝子の候補として、Sterol regulatory element-binding protein-1(SREBP-1)という転写因子に以前から着目して解析してきた。SREBP-1は、脂肪酸、トリグリセリド合成系の諸酵素の発現調節に最も重要な働きをしていると考えられている転写因子であり、炭水化物を脂肪へ変換して体内のエネルギー貯蔵を高める方向へと作用する倹約遺伝子のひとつとして注目されている。SREBP-1の標的遺伝子の発現調節機構の解明やその調節領域の多型性の解析はエネルギー代謝ホメオスタシスの生理機構、生活習慣病の病態いずれの理解にも重要である。SREBP-1が標的配列SREと結合し転写活性を発揮する際、他の共因子やDNA配列とどのように相互作用して転写効率が制御されていくのかそのメカニズムを探求していくことが我々のテーマであるエネルギー代謝制御の解明の第一歩と考えている。そのためには複数の転写因子間の相互作用やコファクターについて知見を深めていくことが必要である。またそれらの複合体形成因子は細胞・臓器特異的な存在様式をとっている可能性が高く、そういう観点からin vivoの臓器で検討を重ねる必要もある。本年度の研究実績として、in vivoの臓器での解析からSREBP-1cの遺伝子発現制御に重要なLiver X Receptorと相互作用する新たなタンパクを同定し、また、その分子がSREBP-1cを介してトリグリセリド合成系の調節にどのように関与するかを明らかにした。本年度の研究実績として、SREBP-1, -2と相互作用する新たな共役タンパク群を同定し、SREBPの機能に対する役割と作用メカニズム、特にSREBP-1(主にトリグリセリド合成系の調節)と-2(主にコレステロール合成系の調節)の標的遺伝子の特異性の本質を明らかにするために、脂肪酸およびコレステロール合成系の代表的な調節酵素について、プロモーター領域をクローニングした。さらにそこに作用する共役蛋白の発現クローニングに今後進んでいく予定である。
非アルコール性脂肪性肝炎発症・進展に関する脂質過酸化、及び糖化反応の役割

NASHは代謝・栄養障害が原因と考えられる肝障害で高度の脂肪沈着と繊細な線維化を特徴とする。本研究で明らかにされた点は次の通りである。1,NASH発症・進展に関連するミトコンドリア酸化障害NASHの発症・進展には酸化ストレスの関与が重要視され、核DNAの80HdG化が指標となる。NASH肝では80HdGが核に加えて細胞質にも存在する。細胞質80HdGはミトコンドリア(Mt.)DNAの酸化障害を反映しており、Mt.機能異常による細胞障害メカニズムが示唆された。(論文revise中)2,糖化反応最終産物(AGE)受容体(RAGE)バリアントの肝内における局在糖尿病の増悪因子として知られるAGEの受容体(RAGE)には膜型のほかに、分泌型バリアントが存在するが、それらの肝内分布や役割は不明である。ヒト正常組織を用いてRAGE各バリアントの分布を検討し、肝では毛細胆管に沿ってRAGEが分泌されていることを新規に見出した。RAGEの膜型、分泌型バリアントのバランス異常がNASHを含む各種疾患に関与する可能性が考えられた。(Mod Pathol. 2005Oct;18(10):1385-96)3,高コレステロール食ウサギに出現するNASH類似病変高コレステロール食を8-12週摂取したウサギ肝は病理組織学的にヒトNASHに類似した組織像を呈し、脂質過酸化反応も著明に亢進していた。本モデルはnon-obese, non-insulin resistance statusであり、複雑なNASHの病態を解明する一助になると考えられた。(論文投稿中)AGE受容体の一つであるGalectin-3を欠損したマウスが雄に有意に脂肪性肝炎を自然発症する事を見出し、その発症にAGE-RAGE系の異常が関与していることを明らかにした。(論文投稿中)NASHは代謝・栄養障害が原因と考えられる肝障害で高度の脂肪沈着と繊細な線維化を特徴とする。本年度はヒト疾患肝、及び動物モデルを主な研究対象とし、病理形態学的、免疫組織化学的見地から発症・進展メカニズム解明を試みた。1,NASH肝組織標本における検討NASHの発症・進展には脂質過酸化反応等の複数のfactorによる2hit theoryが提唱されており、その指標として核DNAの80HdG化を免疫組織学的に半定量する方法が報告されている。我々はNASH肝では80HdGが核と同時に細胞質にも存在する事に気づき、これがミトコンドリア(Mt.)DNAの酸化障害を反映している事を明らかにした。80HdG陽性Mt.は形態変化(巨大化)を呈しており、Mt.機能異常による細胞障害メカニズムが示唆された。80HdGのMt.発現は核発現よりも早期に出現し、脂肪肝と進行性のNASHを鑑別する指標になると考えられた。(論文投稿中)2,(1)高コレステロール食ウサギに出現するNASH類似病変高コレステロール食を8-12週摂取したウサギに高頻度に肝障害が出現した。病理組織学的にはヒトNASHの特徴をほぼ全て備えており、脂質過酸化反応も著明に亢進していた。(論文投稿中)糖尿病の増悪因子として知られるAGEは種々の受容体を介して分解処理されている。AGE受容体の一つであるGalectin-3を欠損したマウスはAGE過剰蓄積による糖尿病の進展が報告されている。我々は本マウスが雄に有意に脂肪性肝炎を自然発症する事、及びその発症頻度が脂質過酸化促進物質(NNK)投与によって著明に亢進することを明らかにした。現在、コリン・メチオニン欠乏食投与による発症頻度や病態変化を長期観察中である(平成17年度継続)NASHは代謝・栄養障害が原因と考えられる肝障害で高度の脂肪沈着と繊細な線維化を特徴とする。

(論文投稿中)AGE受容体の一つであるGalectin-3を欠損したマウスが雄に有意に脂肪性肝炎を自然発症する事を見出し、その発症にAGE-RAGE系の異常が関与していることを明らかにした。(論文投稿中)
部分構造マクロサイクル化によるポリエーテルマクロライド類の合成化学的立体化学解明

生物活性天然物の立体化学は、生物活性の本質の解明や医薬農薬開発への応用開発等に必要不可欠な情報である。一方、強力な生物活性を有し医薬品等各方面への開発が期待されながら、希少な天然物が存在する。これらは、希少さ故、構造情報が平面構造ないし部分的な相対配置に留まる場合が多い。また、希少さの合成供給による克服が求められるが、前提として合成化学的な立体構造解明が必要となる。本研究では、新たに創案した部分構造マクロサイクル化・NMR比較による大環状化合物全体の立体構造を推定する方法論を検証すべく、強力な生物活性を持つ一方で立体構造が未知の大環状ポリエーテルマクロライド天然物ゴニオドミンA(GDA)を対象として、全立体化学の解明と全合成を検討した。平成18年度は、GDAのBC環の合成法を開拓し、すでに相対立体化学が明らかなA環と連結して、ABC環の可能な3つのジアステレオマーをそれぞれ立体選択選択的に合成した。天然物のNMRとの比較により、相対配置に関する知見を得た。平成19年度は、AB環とCDE環セグメントを合成し、これらを連結・スピロアセタール化してABCDE環を構築すべく検討した。CDE環セグメント合成において、C環C15位の立体化学の構築に困難を極めたが、DE環Weinrebアミドのアルキル化・還元経路による立体選択的構築法を見出すことが出来た。よって、ABCDE環をマクロサイクル化するための基礎が確立した。また、ごく最近、東北大の佐々木教授により天然物のGDAの絶対配置が提案され、天然物のABC環は、平成18年度に申請者が合成したABC環の非マクロサイクルモデルのうちの一つのスピロアセタール部のエピ体であることが判った。すなわち、天然物のスピロアセタールはマクロライド構造に組み込まれて初めて実現できる立体化学を持つことが、申請者のモデル系との比較考察によって、明らかになった。生物活性天然物の立体化学は、生物活性の本質の解明や医薬農薬開発への応用開発などに必要不可欠な情報である。これらは希少さ故、構造情報が平面構造ないし部分的な相対配置に留まる場合が多い。また、希少さの克服は、合成供給に求められるが、前提として合成化学的な立体構造の解明が必要となる。本研究では、大環状ポリエーテルマクロライド天然物を対象とした、部分構造マクロサイクル化・NMR比較による大環状化合物全体の立体構造を推定する方法論の創出を目的とする。また、最終的に全合成により全立体化学を確認して方法論を実証する。平成18年度は、強力な生物活性を持つ一方で立体構造が道のマクロライド天然物のゴニオドミンA(GDA)を具体的な標的化合物として検討を加えた。現在までにGDAのBC環部の合成法を開拓し、すでに相対立体化学が明らかなA環と連結して、ABC環部の可能な3つのジアステレオマーをそれぞれ立体選択選択的に合成した。天然物のNMRとの比較により、相対配置に関する知見を得ることが出来た。さらに、別途マクロサイクル化・NMR比較で相対立体化学を推定したDE環部とABC環部の連結を検討した。また、ABCDE環部をマクロサイクル化して天然物とNMRを比較する事により、天然物の相対配置を確認すべく、予備的検討を行った。

これらは、希少さ故、構造情報が平面構造ないし部分的な相対配置に留まる場合が多い。また、希少さの合成供給による克服が求められるが、前提として合成化学的な立体構造解明が必要となる。本研究では、大環状ポリエーテルマクロライド天然物を対象として、部分構造マクロサイクル化・NMR比較による大環状化合物全体の立体構造を推定する方法論を創出・検証し、最終的に全合成により全立体化学を確認して方法論の妥当性を実証すべく検討を加えた。平成19年度は、平成18年度に引き続き、立体構造未知の渦鞭毛藻由来の生物活性マクロライド天然物のゴニオドミンAを具体的な対象として、部分構造マクロサイクル化により立体構造を決定すべく検討を加えた。具体的には、AB環部とCDE環部に相当するセグメントを合成し、これらを連結・スピロアセタール化してABCDE環部を構築すべく検討した。CDE環部セグメント合成において、C環部C15位の立体化学の構築に困難を極めたが、DE環Weinrebアミドのアルキル化・還元経路による立体選択的構築法を見出すことが出来た。よって、ABCDE環部をマクロサイクル化するための基礎が確立した。また、ごく最近、東北大の佐々木教授により天然物の詳細なNMR解析からゴニオドミンAの絶対配置が提案され、天然物のABC環部は、平成18年度に申請者が合成したABC環部の非マクロサイクルモデルのうちの一つのスピロアセタール部のエピ体であることが判った。すなわち、天然物のスピロアセタールはマクロライド構造に組み込まれて初めて実現できる立体化学を持つことが、申請者のモデル系との比較考察によって、明らかになった。
原子間電子遷移過程の再構築に基づく超高効率・超高速放射線検出素子の開発

高速かつ高発光効率な放射線検出素子の開発を目的に、シンチレータ材のA2ZnCl4(A=Rb,K)結晶を中心に新規オージェ・フリー発光の探索とそれらの基礎物性評価を行った。素子開発の特性評価として重要な発光寿命評価を、分子科学研究所極端紫外光施設においてシングルバンチ運転下の真空紫外光パルスと時間相関単一光子計数法を用いて行た。A2ZnCl4においてp-d原子間遷移による新規AFLの存在を明らかにし、その発光寿命解析を行った。本研究の実験結果に基づいて、オージェ・フリー発光の物理的側面と応用的側面について考察を行った。研究初年度は、(1)A2BX4 (A:アルカリ、B:遷移金属、X:ハロゲン)シンチレータ結晶の作製条件の確立、(2)分光実験による結晶の質評価、(3)X線光電子分光測定および光反射スペクトル測定による電子帯構造の解明を目的に研究を進めた。まずはA=Rb, K、B=Zn、X=Clを元素とする結晶作成に取り組んだ。ブリッジマン法による作成では、出発試薬の融点の違いによる試薬の分解が観測され、今のところ分光実験に十分な試料が得られていない。しかし、当初から計画していた水溶液法による試料作成においては、比較的大型の結晶の作成に成功した。ブリッジマン法による作成は今後出発試薬と温度条件の検討を行い、再度挑戦する予定である。水溶液法により作成した結晶の質評価のため、光吸収スペクトルを特に基礎吸収端近傍に注意して測定した。吸収端より低エネルギー側に吸収帯は観測されなかったが、念のため基礎吸収端励起による発光スペクトルを測定したところ何らかの不純物または格子欠陥によると考えられる発光が観測された。現在発光中心の特定を進めている。X線光電子分光測定および光反射スペクトル測定から電子構造の解析を行い、バンドギャップエネルギーおよび浅い内殻準位トップと価電子帯トップとの間のエネルギー差を評価した。その結果、本年度作成した結晶は何れもオージェ・フリー発光の発現条件を満足するという重要な結果が得られた。また、浅い内殻準位がZnの3d軌道で構成されるという、従来のオージェ・フリー発光にはなかった新たな知見が得られた。これらの結果は、新タイプのオージェ・フリー発光の実現の可能性を示唆する結果である。昨年度までの研究において、A2ZnCl4 (A:Rb,K)結晶におけるX線光電子分光測定および光反射スペクトル測定が何れの結晶もオージェ・フリー発光の発現条件を満足するとともに、浅い内殻準位がZnの3d軌道で構成されるという、従来のオージェ・フリー発光物質では見られなかった新規かつ重要な知見を示した。本年度は、これらの結果を受け、軌道放射光を用いた分光実験により新タイプのオージェ・フリー発光の存在を追跡した。また、新しい取組として、A2ZnF3 (A:Na,K,Rb)、α型およびβ型BaLu2F8結晶を作製し新規オージェ・フリー発光の探索を行った。内殻励起のできる真空紫外光を用いて光照射を行い発光の観測を行ったところ、4-7eVの領域に特徴的なスペクトル形状を持つ二本の発光帯が間作された。励起スペクトル測定から、これら発光帯が原子間p-d遷移によって生じる新規オージェ・フリー発光であることが明らかになった。また、光電子スペクトルとの比較から、オージェ・フリー発光のスペクトル形状が価電子帯の構造を反映していることが示唆された。現在、これら新規オージェ・フリー発光の発光寿命を明らかにするための実験準備を進めている。一方、A2ZnF3 (A:Na,K,Rb)において、X線光電子分光測定および光反射スペクトル測定から電子構造の解析を行い、バンドギャップエネルギーおよび浅い内殻準位トップと価電子帯トップとの間のエネルギー差を評価した。その結果、K2ZnF3結晶がオージェ・フリー発光の発現条件を満足するという重要な結果が得られた。しかし、まだオージェ・フリー発光の観測には至っていない。α-, β-BaLu2F8結晶においても同様の研究を進めた。何れの結晶においても5 eV付近にオージェ・フリー発光が生じることを明らかにした。本年度は、計画していた実験がほぼ予定通りに進行し、次年度の発光寿命測定が予定通りに開始できる段階にある。本研究では高速応答する放射線検出素子の開発を目的に、シンチレータ材としてA2ZnCl4 (A=Rb, K)結晶を中心にA2ZnF3結晶、α-,β-型BaLuF8結晶において基礎物性評価を行った。K2ZnCl4において新たにp-d原子間遷移によるオージェ・フリー発光(AFL)の存在を明らかにし、A2ZnCl4 (A=Rb, K)のAFLの特性評価を行うとともに、α-,β-型BaLuF8においてAFLの存在を確認した。A2ZnF3ではAFLの観測には至らなかった。最終年度は、素子開発の特性評価として重要な発光寿命評価を、分子科学研究所極端紫外光施設において測定した発光寿命の解析を通して行った。A2ZnCl4 (A=Rb, K)のp-d原子間遷移によるAFLの発光減衰曲線は片対数表示おいて直線的に減少し、単一指数減衰関数でよく再現できることが分かった。その減衰時定数は約8ナノ秒で、参照のため測定・解析したCs2ZnCl4のAFLの減衰時定数の約2ナノ秒に比べ、比較的寿命が長いことが分かった。

この点を考察したところ、Znの3d軌道がCl3p価電子帯に僅かながら混合しており、AFLの遷移過程であるp-d原子間遷移に原子内d-d遷移の性質が反映されていると考えられた。一方、本結晶では3本のAFL帯が観測されるが、すべての発光帯に対して発光減衰曲線を測定し、減衰時定数を求めたところ、時定数に違いは見られなかった。このことから、AFLの発光減衰時定数は最外内殻準位に作られた正孔の寿命によって支配されていることが示唆された。また、AFLの減衰時定数がナノ秒程度であるという事実と発光スペクトルの形状との考察から、最外内殻準位に作られた正孔がフォノンとの相互作用を通して格子歪みを誘起し、格子緩和することが示唆された。高速かつ高発光効率な放射線検出素子の開発を目的に、シンチレータ材のA2ZnCl4(A=Rb,K)結晶を中心に新規オージェ・フリー発光の探索とそれらの基礎物性評価を行った。素子開発の特性評価として重要な発光寿命評価を、分子科学研究所極端紫外光施設においてシングルバンチ運転下の真空紫外光パルスと時間相関単一光子計数法を用いて行た。A2ZnCl4においてp-d原子間遷移による新規AFLの存在を明らかにし、その発光寿命解析を行った。本研究の実験結果に基づいて、オージェ・フリー発光の物理的側面と応用的側面について考察を行った。本年度は、計画していた実験がほぼ予定通りに進行し、次年度の発光測定が予定通りに開始できる段階にある。新規に発見したオージェ・フリー発光に対して、特に発光寿命測定を主とした実験を行う。これまでの実験結果の解析を更に進めるとともに、寿命測定から得られる結果を総合して、新規オージェ・フリー発光の発現原理や内殻正孔の緩和過程等を追求する。光物性新規にオージェ・フリー発光を発現すると推定される他の結晶の作成に取り組み、特に浅い内殻準位の電子構造が構成元素や結晶構造とどのように関係するか注意しつつ、オージェ・フリー発光の発現原理を追求する。
カイコ脳における神経情報伝達分子の構造と機能

本研究では,カイコ脳から新しい神経情報伝達分子を単離し,構造決定してその機能を明らかにするものである.本年度の成果としては,以下の新しい発見が得られた.1)カイコ蛹から食道下神経節を摘出し非休眠卵産生型とした蛹に,天蚕麻痺性ペプチド(Any-ParP)を注射することで,本来の休眠ホルモン誘導による休眠胚子と生理的にまったく同じものを誘導することに成功した.これは,カイコ中枢神経系による休眠制御の解明のために新しい提案を行っている.2)カイコ脳の新しいペプチド・タンパク質となるボンビリンの発生成長過程を解析する目的で,ボンビリン抗体を作製し,免疫組織化学的に観察した.その結果,胚子の剛毛発生期から発現し,幼虫,蛹,そして成虫期に存在し,主に神経細胞の周核体外層からニューロパイルに分布していた.このことは,ボンビリンがカイコの中枢神経系の発生分化に不可欠であり,神経組織の機能維持に関与していると考えられる.3)ATPレセプターの1種であるマウスP2X_1の抗体を利用し,カイコの中枢神経系を免疫組織化学的に観察した.その結果,P2X_1様タンパク質陽性ニューロンを5齢幼虫脳で4対,蛹脳で6対確認することができた.この発見は,昆虫学分野では最初であり,カイコの脳を含む中枢神経系からのP2X_1様タンパク質の同定が分子昆虫学の新たな重要課題として提案することができた.カイコの蛹脳から5種類のタンパク質を単離精製することができた。約10,000頭の蛹脳を有機溶媒で磨砕し、その遠心上清を凍結乾燥後、数種カラム樹脂を用いたHPLCによって、Protein-1(15.5kDa),Protein-2(27kDa),Protein-3(17kDa),Protein-4(30kDa)およびProtein-5(29kDa)を単離した。それぞれのタンパク質はSDS-PAGEによって単一のバンドであった。Protein-2,Protein-4およびProtein-5は、プロテインシー-クエンサにより、N末端アミノ酸配列が一部解析された。その結果、Protein-2は、ハチミツガからすでに単離されているGallerinタンパク質と58%のホモロジーがあり、Protein-4はカイコの血液タンパク質の一種である低分子lipoprotein 30K Protein precursorのN末端の第18アミノ酸からの配列と完全に同じであり、Protein-5ではカイコの血液タンパク質の一種であるmature 30K lipoproteinとまったく同一のアミノ酸配列であった。さらに、Protein-1はN末端がブロックされており、現在deblocking処理してN末端アミノ酸配列を解析中である。これらの単離したタンパク質の機能を解析するために、カイコの非休眠卵産生蛹から脳-食道下神経球を摘出し、このin vitro系にタンパク質を添加して培養した後、回収された培養液を非休眠卵産生蛹に注射した。その結果、非休眠卵から休暇卵への変換が一部認められた。さらに、単離タンパク質を直接脳にミクロ注射しても同様の休眠性変換が一部確認された。以上のことは、カイコ脳における新しい神経情報伝達物質としてのタンパク質の存在を示唆している。本研究では,カイコ脳から新しい神経情報伝達分子を単離し,構造決定してその機能を明らかにするものである.本年度の成果としては,以下の新しい発見が得られた.1)カイコ蛹から食道下神経節を摘出し非休眠卵産生型とした蛹に,天蚕麻痺性ペプチド(Any-ParP)を注射することで,本来の休眠ホルモン誘導による休眠胚子と生理的にまったく同じものを誘導することに成功した.これは,カイコ中枢神経系による休眠制御の解明のために新しい提案を行っている.2)カイコ脳の新しいペプチド・タンパク質となるボンビリンの発生成長過程を解析する目的で,ボンビリン抗体を作製し,免疫組織化学的に観察した.その結果,胚子の剛毛発生期から発現し,幼虫,蛹,そして成虫期に存在し,主に神経細胞の周核体外層からニューロパイルに分布していた.このことは,ボンビリンがカイコの中枢神経系の発生分化に不可欠であり,神経組織の機能維持に関与していると考えられる.3)ATPレセプターの1種であるマウスP2X_1の抗体を利用し,カイコの中枢神経系を免疫組織化学的に観察した.その結果,P2X_1様タンパク質陽性ニューロンを5齢幼虫脳で4対,蛹脳で6対確認することができた.この発見は,昆虫学分野では最初であり,カイコの脳を含む中枢神経系からのP2X_1様タンパク質の同定が分子昆虫学の新たな重要課題として提案することができた.カイコの蛹脳の約5,000個(大造の休眠卵産生型)からmRNAを抽出し,cDNAライブラリーを作成中である.最終的には,休眠卵の環境情報伝達分子と考えられる27kDaの単離した脳タンパク質の遺伝子を同定し,バキュロウイルスシステムで大量発現した上で機能解析に利用する.一方,蛹脳内のヌクレオチド代謝が母親の胚子期にすでに確立されているかどうかについて,イオン交換カラムを利用したHPLCで各ヌクレオチドについて定量し検討した.その結果,休眠卵の誘導率と高エネルギー型リン酸濃度(特にUTP)の間では密接な関係が確認された.

さらに、5齢幼虫の雌脳の各ヌクレオチドについて休眠卵産生型と非休眠卵産生型で比較検討したところ,UTPが前者の脳で高い濃度であった.以上のことから,カイコの脳の発生分化期における環境情報の受容伝達にヌクレオチド代謝の変換が重要であり,これを制御するのが27kDaタンパク質であり,この胚子から蛹までの一連の系(27kDaのタンパク質→UTPを中心とした高エネルギー型リン酸→休眠ホルモン分泌促進)が休眠の環境情報伝達の分子群として作動している可能性が示唆された.本研究では,カイコ脳から新しい神経情報伝達分子を単離し,構造決定してその機能を明らかにするものである.本年度の成果としては、新規の脳タンパク質(27kDa)の遺伝子を解析し,ORFからシグナルペプチドの存在,開始コドン,タシパク質の推定全アミノ酸配列,終止コドンを明らかにすることができた.さらに,ノーザンブロッティング法により中枢神経系,脂肪体,唾腺とマルピーギ管の各組織器官について検討したところ,脳-食道下神経節-胸部第1神経節のみで発現しており,中枢神経系のみで発現する遺伝子であることが判明した.現在は,バキュロウイルスの発現系を利用しながら,この新規タンパク質の大量発現を進行中である.一方,次世代に休眠卵を産出するように環境情報(温度と日長)をコントロールされた5齢幼虫の後期では,脳内のヌクレオチドの三リン酸型(ATP,UTP)が,非休眠卵を産出するようにコントロールされたものより,増大していることを明らかにした.このことから,脳内では,環境情報→27kDaのタンパク質合成→ATP,UTPの増大→→食道下神経球からの休眠ホルモンの分泌促進という系が確立しつつある.この系は,昆虫のみならず,生物界における神経情報伝達系の共通原理にもかかわることであって,最終年度はまさにこの点に集約される.従って,論文による発表は慎重かつ一括して発表する.