hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
蛍光タンパク質の隠れた電子励起状態

蛍光タンパク質は生きたままの細胞の三次元イメージングを可能にするが、その基礎となる蛍光タンパク質の二光子励起蛍光メカニズムは観測技術の制約によりほとんど調べられていない。研究代表者は、新規に開発されたマルチプレックス二光子吸収分光法を用いて、最もイメージングに利用される蛍光タンパク質enhanced GFP (eGFP)と、様々な溶媒中でのeGFP発色団モデル化合物HBDIの二光子吸収スペクトルを測定した。その結果eGFPでは、一光子励起によって生成するS1電子励起状態の近傍に"隠れた"電子励起状態(S2 )が存在することを示し、GFPの二光子蛍光メカニズムを明らかにすることができた。本研究では、最もイメージングに利用される変異体enhanced GFP(eGFP)について、一光子励起によって生成するS1電子励起状態の近傍に、新しい電子励起状態(S2)が存在することをさらに明確に証明するため、二光子吸収分光法を用いて以下の二つの課題に取り組んでいる。(1) eGFP発色団モデル化合物HBDIの二光子吸収スペクトルの溶媒依存性5種類の溶媒中におけるHBDIのニュートラル型とアニオン型の二光子吸収スペクトルを測定した。シグナル/ノイズ比を大幅に改善させることにより、二光子吸収バンドと一光子吸収バンドのエネルギー差を定量的に決定することができた。(2) GFPとは異なる発色団構造を持つ蛍光タンパク質の電子励起状態蛍光タンパク質は生きたままの細胞の三次元イメージングを可能にするが、その基礎となる蛍光タンパク質の二光子励起蛍光メカニズムは観測技術の制約によりほとんど調べられていない。(1) eGFP発色団モデル化合物HBDIの二光子吸収スペクトルの溶媒依存性本年度はまずHBDIの合成を行った。さらに、さまざまな溶媒中におけるHBDIアニオン型の溶解度を調べ、10mM以上の高濃度溶液を調製することができる溶媒として、メタノール、酢酸エチル、アセトニトリル、N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドを見出した。これにより、非常に微弱な二光子吸収シグナルのシグナル/ノイズ比を向上させることが可能になった。各溶液の一光子吸収スペクトル測定により、各溶液におけるHBDIアニオンのS0-S1遷移エネルギーを決定した。(2) GFPとは異なる発色団構造を持つ蛍光タンパク質の電子励起状態蛍光タンパク質は生きたままの細胞の三次元イメージングを可能にする。しかし、その基礎となる蛍光タンパク質の二光子励起蛍光メカニズムは、観測技術の制約によりほとんど調べられていない。本課題研究者は以前、新規に開発されたマルチプレックス二光子吸収分光法を用いて、最もイメージングに利用される蛍光タンパク質enhanced GFP (eGFP)の二光子吸収スペクトルを世界で初めて精度よく測定した。その結果、群論に基づく予測とは異なり、二光子吸収ピークが一光子吸収ピークと比較して高エネルギー側に現れることを見出した。この結果に基づいて、一光子許容の電子励起S1状態の近傍に、一光子禁制で二光子許容の電子励起S2状態が存在すると報告した。しかしその後他研究グループにより、eGFPの二光子励起過程に関与するのは高振動励起S1状態であり、S2励起状態ではないという報告がなされ、広く議論になっていた。そこで本課題では、eGFPの二光子励起過程へのS2励起状態の関与を明確に証明することを目的とした。平成25年度までに、eGFP発色団モデル化合物HBDIの二光子吸収スペクトルを様々な溶媒中で測定した。eGFPと同様にHBDIの二光子吸収ピークも、一光子吸収ピークと比較して全ての溶媒において高エネルギー側に現れた。またそのエネルギー差は、溶媒によって大きく変化した。最終年度ではその結果を振電相互作用モデルにより考察し、二光子吸収ピークをS1の高い振動励起状態への遷移と帰属することは、観測された溶媒依存性とは矛盾することを明らかにした。この結果からeGFPの二光子励起過程にはS2励起状態が関与することを報告した。本成果は、慣習的に起こり得ないとされる現象も、分光学の原点に立ち戻ることでタンパク質のような複雑な分子に関しても理解可能となる好例であると考えている。物理化学作製した各試料の二光子吸収スペクトル測定が完了し、順調に進展している。(1) eGFP発色団モデル化合物HBDIの二光子吸収スペクトルの溶媒依存性二光子吸収バンドと一光子吸収バンドのエネルギー差を定量的に決定することができた。その結果、一光子、および二光子吸収スペクトルの吸収極大の差が、5種類の溶媒で大きく異なることが示された。

この結果は、二光子励起によって生じる励起状態がS1の振動励起状態ではないことを意味している。本課題により、HBDIの二光子蛍光メカニズムについて新たな知見が得られつつある。(2) GFPとは異なる発色団構造を持つ蛍光タンパク質の電子励起状態CFPでは一光子及び二光子吸収スペクトルが一致しなかったのに対して、発色団モデル化合物では完全に一致した。この結果は、CFPがHBDIやeGFPとは異なる二光子蛍光メカニズムをもつことを示唆している。すでに目的の蛍光タンパク質3種類、対応する発色団モデル化合物2種類の調製が完了した。現在、それぞれの二光子吸収スペクトル測定を開始しており、順調に進展している。(1) eGFP発色団モデル化合物HBDIの二光子吸収スペクトルの溶媒依存性予備実験により、一光子、および二光子吸収スペクトルの吸収極大の差が、いくつかの溶媒について大きく変化していることが示された。この結果は、二光子励起によって生じる励起状態がS1の振動励起状態ではないことを意味しており、本課題のアプローチによりS2状態の存在に関する新たな知見が得られることが証明されつつある。(2) GFPとは異なる発色団構造を持つ蛍光タンパク質の電子励起状態CFPとその発色団モデル化合物について、一光子、および二光子吸収スペクトルの予備測定を行っている。CFPでは両スペクトルが一致しなかったのに対して、発色団モデル化合物では完全に一致した。この結果は、CFPがeGFPとは異なる二光子蛍光メカニズムをもつことを示唆しており、現在、測定条件の検討などを行ってシグナル/ノイズ比のよいスペクトルを得るための準備を進めている。得られた実験結果を基に、蛍光タンパク質の二光子蛍光メカニズムを解明する。(1) eGFP発色団モデル化合物HBDIの二光子吸収スペクトルの溶媒依存性HBDIの二光子励起によって生じる励起状態はS1の振動励起状態ではないことが明らかになった。他の電子励起状態(S2)の関与を考えることで、得られた結果を説明することができる。HBDIに関する知見をeGFPに適用することで、eGFPの二光子蛍光に関与する電子励起状態を明らかにする。(2) GFPとは異なる発色団構造を持つ蛍光タンパク質の電子励起状態CFP発色団モデル化合物の結果から、一光子励起でも二光子励起でも生成する電子状態が同じであることが明らかになった。CFPで観測された一光子と二光子吸収スペクトルの差は、発色団周辺のアミノ酸が原因と考えられる。eGFPとは異なる二光子蛍光の起源について明らかにしていく。各蛍光タンパク質の二光子蛍光メカニズムに関与する電子励起状態を明らかにするためには、高精度の二光子吸収スペクトルを測定する必要がある。励起波長や光学系の調整などの測定条件検討により、これを実現する。(1) eGFP発色団モデル化合物HBDIの二光子吸収スペクトルの溶媒依存性一光子、および二光子吸収極大のエネルギー差が、溶媒によって大きく変化しなければ(数cm-1程度)、S1振動励起状態が関与している可能性が高い。逆に、溶媒による差が大きければ(数百cm-1程度)、S1振動励起状態の関与の可能性は低く、S2電子励起状態の関与の可能性が高いと結論できる。
β2アドレナリン受容体-IL-6シグナル増強による炎症制御メカニズムの解明

微生物由来低分子化合物SMTPはin vivoで、脳梗塞を始め、炎症性疾患を劇的に改善する。我々は、その機序がsoluble epoxide hydrolase(sEH)阻害に起因することを発見した。DNAマイクロアレイの結果より、SMTPはsEH KOマウスと類似する遺伝子発現変動パターンを示すことを見出し、SMTPがβ2アドレナリン受容体ーIL-6シグナル伝達経路の制御に関与する可能性が示された。本申請課題においては、sEH阻害とβ2ARーIL-6経路の制御を結ぶ新たな炎症抑制機構を解明する。
分子情報を利用した材穿孔性寄生蜂の系統分類と寄主同定手法の開発

これまで分類が滞っていたSpilopteron属、Yezceryx属、Coleocentrus属について分類学的再検討が修了し、国内のケンオナガヒメバチ亜科の全ての属について概要が明らかとなった。申請者が研究を行うまでは9属17種が知られていたが、研究を行った結果、9属35種にまで増加した。この結果、日本のケンオナガヒメバチ亜科の多様性は世界の中でも非常に高く、重要な地域であることが示された。また、日本に分布するケンオナガヒメバチ亜科の全属についてミトコンドリアDNA COI領域と核RNA 28S領域について分子情報を抽出し、Genbankに登録されている海外産の本亜科の3種を加えた計12属25種について分子系統解析を行った。その結果、多くの属では単系統性が支持されたが、種数を多く含むSpilopteron属とYezoceryx属では単系統性が支持されなかった。これは現在検索表で使われている形態形質が有用でない可能性を示しており、今後海外産の個体を含めた再検討が必要となることが示された。8月に長野県においてツマグロケンヒメバチの採集を行った。得られた計20個体の産卵管をその場で切断し、99.5%エタノールに入れて保存した。その後研究室に持ち帰り、産卵管からDNAを抽出し、ハチ目では伸長が見られないカミキリ特異プライマー(平成26年度作成)を用いてPCRを行った。本プライマーにおいて一部のカミキリ目昆虫においてのみDNAの増幅がみられるのは既に確認済みである。産卵管が産卵のために寄主に刺されていれば寄主DNAの伸長が見られるはずであるが、今回は全ての個体において伸長が見られなかった。このため今後プライマー設計の見直しと人工的に産卵管を寄主に突き刺したコントロールを用意し、再度実験を行っていく。一つの目標としていた日本産ケンオナガヒメバチ亜科の分類学的再検討が修了し、大きな進展があったと考える。また、産卵管からの寄主DNAの検出については概ねサンプル収集の目処が立ち、今年度からの大きな進展が見込まれるため。分類学的研究については全ての属の検討が修了したが、一部が論文化されていないため、速やかに論文化し、投稿を行う。産卵管からの寄主DNAの検出については寄生者が出現する7月までに寄主特異プライマーを再度設計し直し、7-8月にかけてサンプリングを行った後、速やかに実験を行う。また、寄主・寄生者両者の塩基配列をGenbank等のデータベースへ登録を進める。
マルチエージェントの協調による発展可能型ソフトウェアの実現

申請者等は、ソフトウェアシステム自体に基本メカニズムとして発展・進化能力を組込む研究を推進している。具体的にはPrologをベースとしたマルチエージェントシステム開発用言語を設計し、その処理系の開発を行い、ソフトウェア発展・進化機能を組込んでいる。処理系はJAVA言語を用いて開発しており、各エージェントはスレッドの形で実現されており、並行計算が可能となっている。またエージェントはネットワーク上の他のホストシステムにマイグレーションが可能となっており他ホスト上の知識(情報)を利用することにより、その機能を発展・進化させることを可能としている。
疎水性指標を用いた水性2相系におけるタンパク質分配係数の推定法

バイオテクノロジーにおける分離・精製法として水性二相分配法が注目されている。水性二相分配法による分離プロセスを設計する際には、水性二相分配系液液平衡と分離目的物質の分配係数は基礎データとして非常に重要となる。そこで、デキストラン(DEX)とポリエチレングリコール(PEG4000)からなる水性二相分配系液液平衡を、DEX分子量を4種類変えて測定した。その際、ポリマー系の液液平衡で重要となる、相分離後の上下両相のポリマー分子量分布についても測定した。DEXの分離量は、数平均分子量18800191000の範囲で4種類変えて、測定を行った。測定温度は20°Cで、ポリマー組成と分子量分布の測定にはサイズ排除クロマトグラフィーを用いた。分子量分布の測定結果から、分子量分布の広いDEXは上下両相でポリマーの分別が生じていることが確認された。また、代表的な加水分解酵素である、alpha-アミラーゼ、beta-アミラーゼおよびグルコアミラーゼの分配係数を、20°Cで、上述の水性二相分配系において測定した。分配係数は同類のアミラーゼであっても各酵素ごとに異なることが示された。さらに、経験的に相互作用項を改良した、修正Flory-Huggins式を用いて測定データの相関を行った。相互作用パラメータにポリマー分子量依存性を、相互作用項にはランダム混合からの偏倚を考慮するパラメータを、それぞれ経験的に導入した。DEXの分子量分布を分布関数を用いて近似し、連続熱力学の手法を用いて相平衡計算を行った。相互作用パラメータを最適化することにより、分子量の種々異なるデキストラン-ポリエチレングリコールからなる水性二相分配系液液平衡と、加水分解酵素の分配係数を良好に相関できた。液体クロマトグラフィーによる疎水性指標の測定については、測定条件、使用カラムを文献調査を行って検討し予備実験を行った。
サイトカインの循環系中枢調節における短期及び長期的作用-覚醒ラットでの解析

サイトカインの1つであるインターロイキン1β(IL-1β)の循環、体液調節における働きの解明を目的として、飲水行動、心血管系、腎機能と中枢神経系に対する作用を検討した。1.飲水行動に対する作用-IL-1βは浸透圧性飲水行動を抑制したが、アンギオテンシンII、ポリエチレングリコールによる飲水行動には有意な影響を与えなかった。また1日あたりの自発性飲水行動も抑制した。これらの反応はインドメサシンの前処理により減弱した。2.心血管系に対する作用-覚醒ラットにおいて、IL-1βの静脈と側脳室内への投与により、血圧、心拍数、体温、腎交感神経活動の増加が生じた。これらの反応の潜時は静脈内投与の方が脳室内投与より短かった。また褐色脂肪組織支配の交感神経活動もIL-1βにより増加した。血中ACTHとともにノルアドレナリンレベルはIL-1βにより増加した。IL-1βは全身的にCRF-ACTH-コルチゾル系とともに交感神経系を活性化させることが示唆された。3.腎排泄機能に対する作用-代謝ケージを用いて測定した尿量はIL-1β投与により有意な変化を示さなかったが、尿ナトリウム、カリウム排泄量は減少した。これらの変化は予め腎臓除神経を行うと消失したので、腎交感神経との関連が示唆された。4.上記IL-1βによる反応をもたらす脳内作用部を明らかにすることを目的として、まず想定される第3脳室前壁腹側部(AV3V)領域をカイニン酸で破壊したラットを作成した。AV3V破壊群ではIL-1βによる尿ナトリウム、カリウム排泄抑制反応が消失した。しかしIL-1βによる摂食、飲水抑制反応はAV3V破壊群で減弱傾向を示したが、尚投与前に比べて持続した。IL-1βによる体液調節への関与に少なくとも1部AV3V領域が係っていることが示唆された。サイトカインの1つであるインターロイキン1β(IL-1β)の心血管系と自律神経活動に対する作用を覚醒ラットを用いて検討した。慢性的に留置した電極とカテーテルを介して腎交感神経活動(RSNA)、褐色脂肪組織交感神経活動(BAT-SNA)、血圧、心拍数、体温を覚醒ラットから記録した。1.IL-1βを静脈および脳室内に投与すると、体温上昇に先行して血圧、心拍数とRSNAが増加した。これら心血管系と自律神経活動の潜時は静脈内投与の方が脳室内投与の場合より短かった。また持続時間は約2030分間と一過性であった。2.これらの反応は、プロスタグランジン合成阻害剤であるインドメサシンを予め静脈内に投与しておくと、消失した。したがって、プロスタグランジン系の関与が示唆された。3.下大静脈に同量の血液を還血しながら、腹腔大動脈より採血し、血中ACTHとカテコラミンをRIAにより測定した。IL-1βの静脈内投与15分後で、ACTHともにノルアドレナリンが有意に上昇し、90分後にはコントロールレベルに戻った。4.IL-1βによる発熱反応をもたらす標的器官と考えられている褐色脂肪組織(BAT)を支配している神経活動(BAT-SNA)を覚醒ラットから記録することに成功した。5.BAT-SNAはIL-1βの静脈内投与により顕著な興奮反応を示した。その時の交感神経活動パターンの変化を解析した結果、心拍動に同期性を示す振幅の大きい活動成分の増加が見られた。

一方、RSNAでは心拍動に同期性を示さない振幅の小さい活動成分が増加していることが判明した。このようにIL-1βの自律神経活動に対する作用に地域差の存在が示唆された。サイトカインの1つであるインターロイキン1beta(IL・1beta)の飲水行動と腎排泄機能に対する効果を調べた。代謝ケージを用いて1日あたりの摂食量、飲水量、尿量、尿ナトリウムとカリウム排泄量を測定した。1.IL-1betaの腹腔内投与(4mum/kg)により、摂食、飲水量が減少した。尿量は有意な変化を示さなかったが、尿ナトリウムとカリウムの排泄量が減少した。2.腎臓の除神経を予め行ったラットでは、IL-1betaによる尿ナトリウム排泄抑制反応は消失した。しかし、摂食、飲水抑制反応はコントロールラツトと差はなかった。昨年度、IL-1betaによって腎交感神経活動が増加することを報告した。したがってIL-1betaによる抗ナトリウム利尿反応は腎交感神経の興奮による尿ナトリウム再吸収の促進によって起こっている可能性が考えられる。なお除神経は腎臓ノルアドレナリン含量の消失により確認した。3.IL-1betaの上記反応をもたらす脳作用部位を明らかにする目的で、まず脳室周囲器官の1つである終板器官(OVLT)を含む第3脳室前壁腹側部(AV3V)領域を電気あるいは神経毒のカイニン酸投与によって破壊した。破壊後数日間、摂食、飲水は著しく抑制されたが約1週間後に回復した。IL-1betaによる飲水、摂食抑制反応は減弱傾向を示したが尚存続した。しかしIL-1betaによる尿ナトリウムとカリウム排泄抑制反応はAV3V破壊群で消失した。したがってAV3VがIL-1betaの電解質尿排泄調節に係わっていることが示唆された。一方脳弓下器官(SFO)領域破壊では有意な変化が認められなかった。
新しい白血球活性化因子とそのモノクロナル抗体による炎症の発現と病態の解析

合成した22種のカルパイン由来ペプチドを用い、多核白血球活性化能(遊走活性、脱顆粒活性)を測定した。遊走活性はヒト末梢血白血球のうち好中球のみならず単球に対しても認められた。好中球に対してホルミルペプチド(fP)はアセチルペプチド(aP)に比べ強い遊走活性を示し、最適濃度はfPでは10μMであった。単球では100pMであり、aPのほうがfPに比べ強い遊走活性が認められた。また単球系THPー1、Uー937やT細胞系MTー1やB細胞系BALLなどの白血病培養細胞に対してもaPは遊走活性を示し、現在詳細に検討中である。カルパインのアミノ末端はアセチル化されているので、本研究のカルパイン由来白血球活性化因子の標的細胞には好中球に加えて免疫担当細胞も含まれることが明らかになった。健常人42例、乾癬症患者18例、掌蹠膿疱症5例、扁桃病巣感染症4例、リウマチ1例の多核白血球にfPやaPを作用させ、脱顆粒活性を測定した。エラスタ-ゼ放出能はfPのみが反応し、各種aPでは健常人とも極めて微量であった。上記疾患患者の多核白血球は健常人に比べ約2倍強く反応することが認められ、これらの疾患では好中球の機能亢進が示唆された。ウサギの静脈に各ペプチドを投与したところ90分後に末梢血多核白血球が約30%上昇した。またモルモットではaPのうちaーMFLVのみが多核白血球活性化能を示した。とくにこのペプチドをブラジキニンとともに皮下投与すると、2時間後には多核白血球の強い浸潤が認められ、ブラジキニンなどの血管作動性物質とaーMFLVなどのカルパイン由来白血球活性化因子が細胞の浸潤に協調して働くことが示された。なお今回用いたペプチドは短いためか抗原性が弱くモノクロナル抗体が出来にくかった。そこで現在20残基以上のペプチドを合成し再度モノクロナル抗体の作製を試みている。ミノクロナル抗体の作製:カルパイン由来白血球活性化因子(アセチル/ホルミル(a/f)-MFLVNSFLK、a/f-MAGIAAKLAK、a-SEEIITPVY、a-MFLVN)を個相法により化学合成した。またカルパイン遺伝子の構造をもとにカルパインI、IIの抗原決定部位をコンピュ-タ-解析した結果、それぞれ8部位が推定されたので、このうち4種類のペプチドを合成した。これらのペプチドはそれぞれKLH、BSAに結合させ、抗原としてマウスに免疫し、モノクロナル抗体を作製した。これらのペプチドのうちa-SEEIITPVYについてはマウスモノクロナル抗体産生ハイブリド-マ細胞株を樹立し、抗体の量的生産を行っている。白血球活性化能の測定:現在までに合成した22種のペプチドをもちい、炎症性疾患の多核白血球活性化能を検討した。健常人42例、乾癬症患者18例、掌蹠膿疱症5例、扁桃病巣感染症4例、リウマチ1例の多核白血球に各ペプチドを作用させ、新たに開発した微量測定法により脱顆粒活性を測定した。このうち健常人2例にa-SEEIITPVYによるエラスタ-ゼ放出反応が認められた。また上記疾患患者の多核白血球のエラスタ-ゼ放出反応は健常人に比べ、標準物質であるf-MLFのみならず、f-MFL、f-MFLV、f-MFLVNSFLKに約2倍強く反応することが認められたが、他のペプチドでは反応性に著しい差異を認めなかった。各ペプチドによりヒト多核白血球が産生する活性酸素の測定は、ケミフォトメ-タ-を用いた化学発光法により行った。その結果エラスタ-ゼ放出反応と同様にホルミルペプチドに強い反応が認められた。またモルモットではaPのうち

aーMFLVのみが多核白血球活性化能を示した。とくにこのペプチドをブラジキニンとともに皮下投与すると、2時間後には多核白血球の強い浸潤が認められ、ブラジキニンなどの血管作動性物質とaーMFLVなどのカルパイン由来白血球活性化因子が細胞の浸潤に協調して働くことが示された。なお今回用いたペプチドは短いためか抗原性が弱くモノクロナル抗体が出来にくかった。そこで現在20残基以上のペプチドを合成し再度モノクロナル抗体の作製を試みている。合成した22種のカルパイン由来ペプチドを用い、多核白血球活性化能(遊走活性、脱顆粒活性)を測定した。遊走活性はヒト末梢血白血球のうち好中球のみならず単球に対しても認められた。好中球に対してホルミルペプチド(fP)はアセチルペプチド(aP)に比べ強い遊走活性を示し、最適濃度はfPでは10μMであった。単球では100pMであり、aPのほうがfPに比べ強い遊走活性が認められた。また単球系THPー1、Uー937やT細胞系MTー1やB細胞系BALLなどの白血病培養細胞に対してもaPは遊走活性を示し、現在詳細に検討中である。カルパインのアミノ末端はアセチル化されているので、本研究のカルパイン由来白血球活性化因子の標的細胞には好中球に加えて免疫担当細胞も含まれることが明らかになった。健常人42例、乾癬症患者18例、掌蹠膿疱症5例、扁桃病巣感染症4例、リウマチ1例の多核白血球にfPやaPを作用させ、脱顆粒活性を測定した。エラスタ-ゼ放出能はfPのみが反応し、各種aPでは健常人とも極めて微量であった。上記疾患患者の多核白血球は健常人に比べ約2倍強く反応することが認められ、これらの疾患では好中球の機能亢進が示唆された。ウサギの静脈に各ペプチドを投与したところ90分後に末梢血多核白血球が約30%上昇した。またモルモットではaPのうちaーMFLVのみが多核白血球活性化能を示した。なお今回用いちペプチドは短いためか抗原性が弱くモノクロナル抗体が出来にくかった。
構造情報に基づく新しい文字認識方式の研究

文字の構造に関する様々なパラメータを用いて、文字認識用辞書を小規模の多数のクラスに効率よく分類する方法について研究し、初期の目的を達成することができた。まず、文字の構造パラメータを抽出して、そのパラメータが辞書の分類に適しているか否かを判定する最適化問題を考案した。これにより種々の有用な構造パラメータの選択を可能とした。ついで、複数の構造パラメータを用いて辞書を自動的により規模の小さいクラスに分類していくアルゴリズムを考案すると共に誤分類を避ける統計的処理方法を導入した。これにより、例えば、JIS第一水準の3300余の文字(記号類を含む)を対象とする場合には、通常の文字認識精度より一桁高い分類精度で分類(クラス分け)された辞書の平均の規模を元の辞書の1/5程度に縮小することは容易にできる見通しを得た。誤分類を避けるために、グレイゾーンを設けてこの領域に入る字種については、分類された双方のクラスに共通に含まれるようにしている。このために、分類された辞書の平均の大きさが元の辞書の規模の1/5以下となるためには、分類された辞書の総数は64個程度となる。だだし、未知入力文字がこれらの辞書の一つに分類されるための計算量は、一回の距離計算(例えば、単純類似度計算)に比して遥かに少ない。したがって、本研究による辞書の分類法をパターン整合法を用いる認識方法に適用すれば、認識速度がほぼ(元の時辞書の規模)/(分類された辞書の平均規模)倍早くなることが期待される。なお、本研究で開発された辞書分類法は、国有特許として申請中であり、このため論文としての発表はその後になる予定である。本年度は、文字画像のヒストグラムを介した文字の構造情報を活用する文字認識において、字体の変動やノイズを吸収するのに有効な標準パターンの作成法について研究し以下のような研究成果を挙げた。1.文字画像の縦、横及び斜め(±45度)の各方向のヒストグラムの0-1パターン表現において、同一字種のサイズやフォントの違う種々のサンプルについて横軸の各区間で、それぞれ、1の列の最大値のみ及び最小値のみで構成される二つの0-1パターン表現からなる標準パターン(マックス・ミニ標準パターンと呼ぶ)を作成した。そして、未知入力パターンの1の列に基づいて候補字種を選択する場合には前者を用い、0の列に基づいて候補字種を選択する場合には後者を用いれば、標準パターン作成に用いたフォントや文字サイズについての字体の変動を完全に吸収することが可能となった。さらに、クラスタリングの手法を用いてフォントやサイズの違う同一字種のサンプルを字体のより近い文字どうしにクラス分けを行うことにより、候補字種を効率よく少数に絞ることを可能にした。2.標準パターンのセットとしての辞書が大規模化した場合の高速化と高精度化の観点から、辞書自体のクラス分けを行いかつその各クラスについてそれに適した大分類及び細分類を可能とする新しい着想を得た。これは一般的には各字種ごとに複数個の標準パターンが必須となる状況においては極めて有用な着想であり、現在その具体的手法の開発を進めており、本研究で予定していた文字切出用辞書の作成の一部はこの手法に包含される見通しである。日本語で使用される文字は、様々な字体を考慮すると、JIS第一水準のみでも標準パターンの総数はゆうに1万字を超える。そこで、認識の対象とする文字全体を文字の構造情報を用いて、先ず数百字程度の大きさのクラスに分類し、ついで分類された各クラスの特性に適した標準パターンの作成と中分類・細分類することにより、確認速度及び精度を飛躍的に進展させるという方針のもとに研究を進めた。(1)文字画像のヒストグラムを利用したノイズに強い構造情報として、縦または横の顕著な線分を持たず斜めの線分が主体となる文字の分類ができた。これにより全字種を4個のクラスの分類することが可能となった。

(2)文字画像の潰れは、縦及び横方向のヒストグラムの谷を埋めることに着目しいて、大部分が潰れの顕著な文字からなるクラスとその他のクラスに分類することを可能にした。これにより潰れも文字に重点を置いた認識手法を有効に活用することができるようになった。(3)縦及び横方向のヒストグラムの横軸を2等分して得られる4個の領域のそれぞれにおけるヒストグラムのピークの有無により、全字種を16個のクラス分類する実験を行い、その有用性についての見透視を得た。これにより、全字種を数百程度の大きさのクラスに分類することが、より現実的なものとなってきた。以上が平成8年度の研究実績の概要である。平成9年度はこれを基にして,飛躍的高速高精度のプロトタイプを実現する予定である。文字の構造に関する様々なパラメータを用いて、文字認識用辞書を小規模の多数のクラスに効率よく分類する方法について研究し、初期の目的を達成することができた。まず、文字の構造パラメータを抽出して、そのパラメータが辞書の分類に適しているか否かを判定する最適化問題を考案した。これにより種々の有用な構造パラメータの選択を可能とした。ついで、複数の構造パラメータを用いて辞書を自動的により規模の小さいクラスに分類していくアルゴリズムを考案すると共に誤分類を避ける統計的処理方法を導入した。これにより、例えば、JIS第一水準の3300余の文字(記号類を含む)を対象とする場合には、通常の文字認識精度より一桁高い分類精度で分類(クラス分け)された辞書の平均の規模を元の辞書の1/5程度に縮小することは容易にできる見通しを得た。誤分類を避けるために、グレイゾーンを設けてこの領域に入る字種については、分類された双方のクラスに共通に含まれるようにしている。このために、分類された辞書の平均の大きさが元の辞書の規模の1/5以下となるためには、分類された辞書の総数は64個程度となる。ただし、未知入力文字がこれらの辞書の一つに分類されるための計算量は、一回の距離計算(例えば、単純類似度計算)に比して遥かに少ない。したがって、本研究による辞書の分類法をパターン整合法を用いる認識方法に適用すれば、認識速度がほぼ(元の辞書の規模)/(分類された辞書の平均規模)倍早くなることが期待される。なお、本研究で開発された辞書分類法は、国有特許として申請中であり、このため論文としての発表は相当後になる予定である。
石灰化誘導性ホスホホリン類似リン酸化ペプチドを用いた新しいう蝕治療材料の開発

近年、う蝕治療がMinimal intervention(MI)に基づいた治療法に転換し、象牙質・歯髄複合体の可及的保存が求められるなか、我々のグループは生体親和性を示し短期間で強力に象牙質・歯髄複合体を誘導するような革新的な組織誘導材料および技術を開発することを最終目標としている。本研究では、新しいう蝕治療材料および治療法の確立をめざし、石灰化誘導活性を持つリン酸化ペプチドとコラーゲンとの複合体の作製、石灰化誘導活性の確認、象牙質・歯髄複合体誘導活性の確認およびリン酸化ペプチド・コラーゲン複合体の規格化を行うことを目的とした。平成19年度は、ホスホホリンのアミノ酸配列から石灰化誘導活性を有すると思われたリン酸化ペプチド(SSD)_4-(PO_4)および(SSD)_4-(PO_4)_2を合成して、コラーゲンに架橋剤を用いて結合させ複合体を作製した。同様にコントロールとして(SSD)_4を合成し、コラーゲンに架橋剤を用いて結合させ複合体を作製した。In vitro実験より(SSD)_4-(PO_4)_2が石灰化の可能性のあるペプチドであることが推測されたため、本複合体を用いてラットの歯に対して覆髄実験を行ったところ、明確な象牙質形成促進能は認められなかった。そこで、ヒトホスホホリンのN末端に位置するRGD配列を含むペプチドを合成して、歯髄細胞培養実験を行ったところ、歯髄細胞から象牙芽細胞への分化には、RGD配列を有するペプチドが必要であることが明らかになった。さらに、ホスホホリンは歯髄細胞の分化促進にあたって、その走化性を促進することが明らかになった。最近、編蝕治療がMinimal intervention (MI)に基づいた治療法に転換し、象牙質・歯髄複合体の可及的保存が求められるなか、我々のグループは生体親和性を示し短期間で強力に象牙質・歯髄複合体を誘導するような革新的な組織誘導材料および技術を開発することを最終目標としている。本研究では、新しいう蝕治療材料および治療法の確立をめざし、石灰化誘導活性を持つリン酸化ペプチドとコラーゲンあるいはアルギン酸ポリマーとの複合体の作製、石灰化誘導活性の確認、象牙質・歯髄複合体誘導活性の確認およびリン酸化ペプチド・ポリマー複合体の規格化を行う。平成18年度は、ホスホホリンのアミノ酸配列から石灰化誘導活性を有すると思われたリン酸化ペプチド(SSD)_4-(PO_4)および(SSD)_4-(PO_4)_2を合成して、コラーゲンあるいはアルギン酸ポリマーに架橋剤を用いて結合させ複合体を作製した。同様にコントロールとして(SSD)_4を合成し、コラーゲンあるいはアルギン酸ポリマーに架橋剤を用いて結合させ複合体を作製した。これらを用いてin vitro石灰化誘導実験を行ったところ、どれも明確な石灰化は認められなかったが、結果から(SSD)_4-(PO_4)_2が石灰化の可能性のあるペプチドであることが推測された。また、本複合体を用いて動物の歯に対して覆髄実験に関する予備実験を行った。これに関して結果はまだ得られていない。
超並列自律システムとしての生命体：その本質の追究

本研究では、生命体を非平衡開放系での自律的システムと捉え、生命現象の基盤を物理の視点で解き明かすことを目指す。生命現象の中でも、1)非平衡ゆらぎが引き起こすマクロな自律運動(nmからcmスケールへの逆カスケード)、2)DNA(一次元塩基配列)から形態形成(時空間4次元)への物理学、の2つの未解明の問題を中核的な課題として捉え、数理モデルと実空間モデルの研究を有機的・効果的に組み合わせる中で、生命現象の本質に迫ることを目指している。具体的な成果として、一定の直流電圧印加のもとで、電極間でμmスケールのプラスチックの安定な公転運動を引き起こす実験系を構築することに成功している。ミクロな系では、常にBrown運動によるゆらぎの効果があるが、そのような条件下、定常的な運動を起こすことが可能になったことは、重要な成果であると考えられる。更には、外部からのゆらぎのもと、ミクロな閉鎖系では、自律的に、サイズの異なる物体が細胞サイズの微小空間内でミクロ相分離を起こすことを、理論計算で明らかにした。また、このような理論的な考察に基づき、実験系を設計し、振動盤上で特異的な物体の局在化が可能であることを報告している。自律運動系の研究では、水層に浮かべた油滴に自律運動を調べた。その結果、等温条件下化学マランゴニ効果により、複数の液滴が同調した上下運動を行うことを見出し、論文で報告した。一方、DNA関連では、ゲノムDNAの放射線、紫外線、超音波刺激などにより引き起こされる二本鎖切断に関して、定量的な計測をすすめ、その損傷に対するDMSOなどの保護作用についても複数の論文をまとめている。新規性の高い重要な研究成果としては、培養細胞を3次元の組織体に組み立てるための手法について報告している。これは、共存する高分子のdeplation作用を利用するものとなっている。1)非平衡ゆらぎが引き起こすマクロな自律運動(nmからcmスケールへの逆カスケード)、2)DNA(一次元塩基配列)から形態形成(時空間4次元)への物理学この二つの主要な課題について、順調に研究が進展し、国際誌への発表も着実に進めてきている。本年度は、それに加えて、培養細胞を3次元の組織体に組み立てるための手法について報告している。ゲルなどの生体異物を用いることなく、培養溶液中で細胞を組織化する新手法として、今後の再生医学、細胞工学への応用が期待されるものとなっている。1)非平衡ゆらぎが引き起こすマクロな自律運動(nmからcmスケールへの逆カスケード)、2)DNA(一次元塩基配列)から形態形成(時空間4次元)への物理学。これらについては、順調に研究が進展中であるので、さらに研究を加速させていきたいと考えている。細胞の三次元組織化の新たな課題についても、研究をさらに発展させ、再生医学や細胞工学関係の研究者との共同研究も位置付けて、応用展開を計りたい。具体的な成果として、フラーレンのトルエン溶液を用いて、溶媒を蒸発させると、自発的にマイクロスケールのラセンや同心状のパターンが生成することを見出し、そのメカニズムについて、溶液の接触角のピン止め効果を取り入れた偏微分方程式を導入して定量的な説明をすることに成功している。また、酵素反応のダイナミックスについて、反応系への入力に時間的な周期性が有る場合には、反応自体にon/off性が現れることを理論的に明らかにしている。このような現象については、今後実際の実験系で検証をすすめていることを予定している。生物の動的な形態形成モデルとして、歯根の自律的な生成について、細胞が上皮と実質部分で細胞分裂することによって、自発的に表れる力学的不安定性が、buding構造の形成に関して中心的な役割を担うといった理論的なモデルを構築し、実際の実験系での観察結果と良く対応していることを明らかにすることができた。1)非平衡ゆらぎが引き起こすマクロな自律運動(nmからcmスケールへの逆カスケード)、2)DNA(一次元塩基配列)から形態形成(時空間4次元)への物理学、の2つの未解明の問題を中核的な課題として研究が順調に進展してきている。フラーレン溶液からの、マイクロスケールのらせんや同心円構造の自発的生成については、J. Chem. Phys.に掲載済みである。酵素反応系に対する周期的入力による、出力のon/off性については、Choasに発表済みである。また、歯根の自発的生成についての理論モデルについては、J. Theoretical Biol.に掲載した。

具体的な成果として、一定の直流電圧印加のもとで、電極間でμmスケールのプラスチックの安定な公転運動を引き起こす実験系を構築することに成功している。ミクロな系では、常にBrown運動によるゆらぎの効果があるが、そのような条件下、定常的な運動を起こすことが可能になったことは、重要な成果であると考えられる。更には、外部からのゆらぎのもと、ミクロな閉鎖系では、自律的に、サイズの異なる物体が空間内でミクロ相分離を起こすことを、理論計算で明らかにした。また、このような理論的な考察に基づき、実験系を設計し、振動盤上で特異的な物体の局在化が可能であることを報告ひている。自律運動系の研究では、気相からの化学的刺激により、走化性をしめす液滴についての研究を論文としてまとめている。一方、DNA関連では、超好熱菌由来の分岐型ポリアミンが、ゲノムDNAの高次構造を特異的に変化させること、更には、2価と3価のポリカチオンが、DNAの高次構造に対して拮抗的な作用を示すことなどを明らかにしている。1)非平衡ゆらぎが引き起こすマクロな自律運動( nmからcmスケールへの逆カスケード)、2)DNA(一次元塩基配列)から形態形成(時空間4次元)への物理学、の2つの未解明の問題を中核的な課題として研究が順調に進展してきている。自律運動系の研究では、走化性油滴の研究がApp.Phys.Lett.に、直流電場下でのミクロモータの研究はJ. Chem. Phys.に掲載されている。また、モデル人工細胞系の研究は、Physica Dおよび、ChemPhysChemに出版済みである。DNA関係では、2価と3価のカチオンのDNAに対する競合作用の論文がJ.Chem.Phys.に、好熱菌由来のポリアミンによるDNA高次構造変化の研究が、J.Chem.Phys.に掲載済みとなっている。本研究では、生命体を非平衡開放系での自律的システムと捉え、生命現象の基盤を物理の視点で解き明かすことを目指す。生命現象の中でも、1)非平衡ゆらぎが引き起こすマクロな自律運動(nmからcmスケールへの逆カスケード)、2)DNA(一次元塩基配列)から形態形成(時空間4次元)への物理学、の2つの未解明の問題を中核的な課題として捉え、数理モデルと実空間モデルの研究を有機的・効果的に組み合わせる中で、生命現象の本質に迫ることを目指している。更には、外部からのゆらぎのもと、ミクロな閉鎖系では、自律的に、サイズの異なる物体が細胞サイズの微小空間内でミクロ相分離を起こすことを、理論計算で明らかにした。また、このような理論的な考察に基づき、実験系を設計し、振動盤上で特異的な物体の局在化が可能であることを報告している。自律運動系の研究では、水層に浮かべた油滴に自律運動を調べた。その結果、等温条件下化学マランゴニ効果により、複数の液滴が同調した上下運動を行うことを見出し、論文で報告した。
細胞内構造のイメージングを目指した走査型プローブ顕微鏡応用マイクロCTの開発

本研究は、生体細胞や蛋白質等の3次元イメージング法として、核磁気共鳴マイクロスコピー(MRFM)の可能性を検討するとともに、従来から計測されてきた、プローブ顕微鏡による表面形状測定、局所粘弾性、さらには電気伝導特性などのデータを元に、計算機処理により3次元画像を構成しようとする試みである。核磁気共鳴マイクロスコピーを3次元イメージングに応用するには、(1)共鳴吸収による磁化変化を直接、磁気力顕微鏡により検出する方法、(2)共鳴吸収、放出される高周波電磁界を検出する方法、が考えられ、(1)の方法について検討を行った。その結果、現在のプローブ型磁気力顕微鏡の感度では、核磁気変化の検出は困難であり、常磁性鉄イオン1000個程度の集合体が検出限界と予想されることが分かった。磁気共鳴法を走査型プローブ顕微鏡に応用するには新たな測定法の開発が必要である。一方、液中AMF測定における局所電気伝導度測定では、まず、先端部分のみ導電性を持たせたプローブの開発を目指し、導電性カンチレバー表面に樹脂をコーティングし、先端部分の樹脂を収束イオンビーム(FIB)により除去する方法と、低抵抗シリコンカンチレバーを熱酸化し、先端部分をエッチングする方法について検討した。現在のところ、いずれの方法においても測定に使用可能なプローブは得られていない。そこで、ノンコンタクトAFMを応用した、交流法による測定法について検討を行った。現在、シミュレーションとして、周囲電解質、細胞膜、細胞質を単純な無限大層状構造とし、細胞質層に電気伝導度の異なる球状体が埋め込まれたモデルについて、プローブによる局所インピーダンス変化と分解能について検討を行っている。実際の測定においては、溶液中での測定法を確立するには至っていないが、大気中における赤血球の表面電位の測定に成功し、インピーダンス測定八の重要な手がかりを得ることができた。本研究は、生体細胞や蛋白質等の3次元イメージング法として、核磁気共鳴マイクロスコピー(MRFM)の可能性に着目し、従来から計測されてきた、プローブ顕微鏡による表面形状測定、局所粘弾性、さらには電気伝導特性などのデータを元に、計算機処理により3次元画像を構成しようとする試みである。第一段階として、液中AMF測定における局所電気伝導度測定のためのプローブの開発をおこなった。また同時に電気的特性と磁性を考慮した、マイクロ生体モデルについて検討した。液中にある細胞について電気化学STMによる、細胞の局所電気伝導、誘電特性の測定を行うために、先端部分のみ導電性を持たせたプローブが必要となる。このため、導電性カンチレバー表面に樹脂をコーティングし、先端部分の樹脂を収束イオンビーム(FIB)により除去する方法と、低抵抗シリコンカンチレバーを熱酸化し、先端部分をエッチングする方法について検討した。電気伝導性、誘電性、磁性を考慮したマイクロ生体モデルの構築については、周囲電解質、細胞膜、細胞質を単純な無限大層状構造とし、細胞質層に電気伝導度の異なる球状体が埋め込まれたモデルについて、プローブによる局所インピーダンスがどのように変化するか、計算機シミュレーションを行うためのプログラムを開発中である。このほかに、液中での磁気力顕微鏡(MFM)観察の感度および分解能に関しても、赤血球を用いた実験により評価中である。初年度に引き続いて、

(1)液中AMF測定における局所電気伝導度測定のためのプローブの開発、(2)電気的特性と磁性を考慮した、マイクロ生体モデルについての検討、(3)常磁性物質を含む生体試料の磁気力顕微鏡(MFM)観察、を行った。(1)については、液中にある細胞について電気化学STMによる、細胞の局所電気伝導、誘電特性の測定を行うために、先端部分のみ導電性を持たせたプローブが必要であり、初年度に引き続いて、導電性カンチレバー表面に樹脂をコーティングし、先端部分の樹脂を収束イオンビーム(FIB)により除去する方法と、低抵抗シリコンカンチレバーを熱酸化し、先端部分をエッチングする方法について検討した。現在のところ、いずれの方法においても測定に使用可能なプローブは得られていない。2)電気伝導性、誘電性、磁性を考慮したマイクロ生体モデルの構築については、周囲電解質、細胞膜、細胞質を単純な無限大層状構造とし、細胞質層に電気伝導度の異なる球状体が埋め込まれたモデルについて、誘電体理論による近似により、プローブによる局所インピーダンスがどのように変化するの予想を行った。(3)については酸化鉄コアを含む鉄貯蔵蛋白質フェリチンを試料として、磁気力顕微鏡(MFM)の感度および分解能の評価を行った。その結果、数10nmの蛋白質クラスターにおいて、磁性変化の検出の可能性が確認できた。一方、現在のMFMカンチレバーでは磁性膜コーティング層の厚さから先端径が50nm程度であるため、空間分解能は制限される。本研究は、生体細胞や蛋白質等の3次元イメージング法として、核磁気共鳴マイクロスコピー(MRFM)の可能性を検討するとともに、従来から計測されてきた、プローブ顕微鏡による表面形状測定、局所粘弾性、さらには電気伝導特性などのデータを元に、計算機処理により3次元画像を構成しようとする試みである。核磁気共鳴マイクロスコピーを3次元イメージングに応用するには、(1)共鳴吸収による磁化変化を直接、磁気力顕微鏡により検出する方法、(2)共鳴吸収、放出される高周波電磁界を検出する方法、が考えられ、(1)の方法について検討を行った。その結果、現在のプローブ型磁気力顕微鏡の感度では、核磁気変化の検出は困難であり、常磁性鉄イオン1000個程度の集合体が検出限界と予想されることが分かった。磁気共鳴法を走査型プローブ顕微鏡に応用するには新たな測定法のかいはつが必要である。一方、液中AMF測定における局所電気伝導度測定では、まず、先端部分のみ導電性を持たせたプローブの開発を目指し、導電性カンチレバー表面に樹脂をコーティングし、先端部分の樹脂を収束イオンビーム(FIB)により除去する方法と、低抵抗シリコンカンチレバーを熱酸化し、先端部分をエッチングする方法について検討した。そこで、ノンコンタクトAFMを応用した、交流法による測定法について検討を行った。現在、シミュレーションとして、周囲電解質、細胞膜、細胞質を単純な無限大層状構造とし、細胞質層に電気伝導度の異なる球状体が埋め込まれたモデルについて、プローブによる局所インピーダンス変化と分解能について検討を行っている。
網膜リボン型シナプスにおける情報伝達の定量的解析

網膜双極細胞からのグルタミン酸放出機構に関して実験的検討を行い、以下の成果が得られた。1.シナプス小胞のプールについて、開口放出に伴う膜容量変化と放出されたグルタミン酸を計測した。双極細胞に長い(2秒以上)脱分極パルスを与えると、グルタミン酸は一過性に放出されると共に持続性にも放出された。既に報告した即時放出可能な第1のプールと遅れて放出される第2のプール以外に、第3のプールの存在が示唆された。2.双極細胞軸索終末部のプロテインキナーゼCを活性化させると、グルタミン酸の放出量が増加した。これは、放出確率の上昇ではなく、プールサイズの増大であることがわかった。プールサイズの増大は、第2のプールで生じていた。電子顕微鏡で微細構造を観察したところ、プロテインキナーゼCの活性化によって、リボン周辺にシナプス小胞の集積が認められた。3.双極細胞から神経節細胞へのグルタミン酸作動性シナプス伝達は、グルタミン酸トランスポーターの働きで応答の減衰が速められていることが明らかになった。4.アマクリン細胞からの抑制性フィードバックにより双極細胞軸索終末部のGABAc受容体が活性化されると、グルタミン酸の放出量が制限されることが明らかになった。GABAc受容体の働きを止めると、双極細胞から放出されたグルタミン酸はシナプス間隙を漏出する可能性が示唆された。網膜第2次ニューロンである双極細胞からの伝達物質(グルタミン酸)の放出と除去に関して検討を行った。キンギョ網膜から単離した双極細胞の軸索終末部をパッチ電極で膜電位固定し、Ca電流を測定すると共に、エクソサイトーシスに伴う膜容量の変化を計測した。また、放出されたグルタミン酸はNMDA受容体により電気生理学的にバイオアッセイした。250ms程度の脱分極パルスで伝達物質の放出が枯渇すると報告したが、今回の実験で、数秒間の長い脱分極パルス中に、小さいながらも定常的な放出の生じることを見いだした。現在、シナプス小胞のプールサイズに関して定量的に検討している。また、プロテインキナーゼCを活性化させると放出可能なプールサイズが増加するとの生理学的知見を形態学的に検討するため、網膜に超薄連続切片法を適用し、双極細胞の軸索終末部におけるリボンとシナプス小胞に関して立体構築を試みている。グルタミン酸トランスポーターが双極細胞から神経節細胞へのシナプス伝達に直接関与するか否かを検討するために、イモリ網膜スライス標本を用いて、同時記録を行った。膜電位固定した双極細胞を脱分極したときに神経節細胞に発生する興奮性シナプス後電流の減衰時定数は、グルタミン酸トランスポーターを薬理学的に阻害すると長引くことが明らかになった。ただし、自発性興奮性シナプス後電流は阻害剤の影響を受けなかった。したがって、グルタミン酸の放出が微量な場合は、主に拡散によってシナプス間隙から除去されるが、多量な場合にはグルタミン酸トランスポーターが応答の減衰経過を速めることが明らかになった。網膜双極細胞からのグルタミン酸放出制御機構に関して検討し、以下の結果が得られた。1.マウス網膜スライス標本にホールセルクランプ法を適用して、双極細胞からアマクリン細胞へのグルタミン酸作動性伝達と、アマクリン細胞から双極細胞へのGABAc作動性フィードバック制御を解析した。アマクリン細胞にはAMPA型受容体とNMDA型受容体が共存していた。GABAc作動性フィードバック制御が働く状態では、光刺激によりアマクリン細胞のAMPA型受容体が主に活性化された。双極細胞のGABAc受容体を阻害すると、光刺激によりアマクリン細胞のAMPA型受容体に引き続きNMDA型受容体が活性化された。この現象を説明するために、グルタミン酸の放出部位直下にAMPA型受容体が局在し、そこからやや離れた部位にNMDA型受容体が存在するモデルを提案した。

GABAc作動性フィードバックにより双極細胞からのグルタミン酸の放出速度が制御されてグルタミン酸の漏出量が変化し、両グルタミン酸受容体の活性化の割合が変化すると考えられる。2.キンギョ網膜から単離した双極細胞軸索終末部に膜容量測定法を適用し、グルタミン酸の放出を定量的に解析した。双極細胞のプロテインキナーゼCをホルボールエステルで活性化するとグルタミン酸の放出量が増大した。この現象をダブルパルス法で検討した結果、放出確率の増加ではなくシナプス小胞のプールサイズが増加したためであることが明らかになった。双極細胞のシナプス小胞プールには即時に放出されるものと遅れて放出されるものとがあるが、プロテインキナーゼCの活性化は後者のプールサイズを増大させた。キンギョ網膜の超薄連続切片を電子顕微鏡で観察したところ、プロテインキナーゼCを活性化させた標本では、シナプスリボン周辺のシナプス小胞の分布が変化していた。
胃正常粘膜再生をめざした分化制御遺伝子群の免疫応答による可塑的調節機構の解明

胃正常胃粘膜では、Helicobacter pylori(H.pylori)によって、発癌母地である萎縮性胃炎や腸上皮化生という可塑的な"分化変更"が生じる。本研究では、H.pyloriに対する免疫応答の観点から、その"分化変更"機構の一端をホメオボックス遺伝子Cdx2とSex-determining region(SRY) related high mobility group(HMG)ファミリー転写因子Sox2に注目して明らかにした。まず、腸上皮化生に深い関係のある転写因子Cdx2は、H.pylori刺激によりAKT/NFκBシグナルを活性化することによって発現誘導することを明らかにした。また、H.pyloriに対する免疫応答の際重要なTh1関連サイトカインであるIFN-γ、IL-1β、TNF-αおよびTh2関連サイトカインであるIL-4によるin vitroでの刺激解析をしたところ、固有胃腺分化維持に関連のあるSox2の発現誘導機構の1つに、IL-4によるSTAT6シグナル伝達を介した系が存在し、H.pyloriおよびIFN-γは、そのSox2の発現誘導機構を抑制することを明らかにした。更にH.pylori感染ヒト胃粘膜におけるCdx2およびSox2の発現について免疫組織化学を用いて検討したところ、両者は相補的に発現し、Sox2siRNAを用いたin vitroの検討から、Sox2阻害はCdx2およびMUC2を誘導することを明らかにした。このため、H.pylori感染胃粘膜においてはSox2発現抑制が、胃粘膜萎縮の形成と腸上皮化生の進展に重要な影響を及ぼしている可能性を見いだした。このようにH.pycoliに対する免疫応答が、Cdx2やSox2の胃関連分化制御遺伝子の発現調節に関与し、胃における可塑的な"分化変更"に重要な役割を果たしていることが明らかになった。胃正常粘膜はHelicobacter pylori(H.pylori)により、可逆的に胃癌の発生母地である胃粘膜萎縮・腸上皮化生になる。このため、H.pylori自体と免疫応答の結果惹起されるサイトカインが、Cdx1/2、Sox2などの胃上皮細胞分化制御遺伝子をどのように調節制御しているか、その細胞内シグナル伝達機構を含めて主にin vitroで明らかにすることを目的としていた。2)免疫応答による分化制御遺伝子の転写活性部位とシグナル伝達機構の解析Sox2プロモーター領域には、IL-4によるシグナル伝達機構のSTAT6結合部位が、TransFacを用いた検索から存在することが判明した。このためIL-4によりSTAT6がリン酸化することをwestern blot法を用いて確認した。3)分化制御遺伝子の発現局在H.pylroi感染ヒト胃粘膜を用いた免疫組織化学の検討から、Sox2の発現は、固有胃腺および萎縮胃粘膜では主に腺頚部から管腔側の上皮細胞核で認め、MUC5ACの発現とほぼ一致していた。しかし、完全型腸上皮化生ではその発現を認めず、腸上皮化生に関連したCdx2の発現と相補的関係であることを見出した。H.pylori感染胃粘膜ではTh1優位の免疫応答がおこり、胃粘膜萎縮や腸上皮化生が進展し発癌の母地となる。HMGボックス転写因子Sox2は幹細胞を中心に脳、肺、胃の器官発生・分化維持に関与している。そこで本研究では、H.pyloriとその関連サイトカインによるSox2発現調節メカニズム、更に腸上皮化生関連遺伝子Cdx2との相互作用について、その細胞内シグナル伝達機構を含めて明らかにすることを目的とした。H.pylori感染胃粘膜におけるSox2の発現局在を確認(17年度研究実績)