hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＤＮＡナノエンジニアリングによる分子ロボティクスの創成

また、油中水滴エマルションの界面をテンプレートにしたマイクロカプセルの作製についても検討し、正に帯電した界面活性剤分子で界面を作ることにより,負に帯電したY-motif DNAが界面に集積して膜状の構造を取ることが分かった.(瀧ノ上)。インターフェース実装:インターフェースとして使用しうるナノメカニカルDNAオリガミデバイスに関して、X字型のモデルデバイスを設計・作成して構造と機能の関係を検討した(葛谷)。また、開発した光応答性分子cnvKの光クロスリンク反応の詳細を明らかにするために、速度論的解析やNMRによる構造解析を行うとともに、さらに応答速度が大きい新規光応答性人工分子cnvDの開発に成功した(藤本)。リポソームをコンパートメントとする場合についても検討し、脂質二分子膜に局在して物質透過能を示す人工DNAイオンチャネルの構築と,その測定評価系を構築した(野村)。通信・制御手法:外部から与える磁場により空間移動が可能な回転するリポソーム・マイクロクロラを構築した.また,分子ロボットに搭載する機能として,遺伝子発現とカップリングした遺伝子複製系の構築とバクテリアのシャペロン活性を利用した塩濃度センサの構築を行った.分子ロボット間協調ルールの設計: DDSへの応用を想定して,がん細胞由来のmiRNA検出するための決定木をDNA計算系として構築し,シミュレーションおよびhas-miR21を用いた実験で有効性を検証した.また,分子ロボット群の確率的行動選択手法として,免疫ネットワークアルゴリズムをDNA計算で定式化した(関山).コンパートメント作製:秒単位で光架橋可能なシアノビニルカルバゾール誘導体を合成した.これをもちいて,新規にDNAゲルの作製を試み,ゲル化およびゾル化が可逆的に光制御可能なDNAゲルモチーフの設計に成功した.この成果により,DNAタイルモチーフのかわりに,DNAゲルモチーフでもコンパートメントを作製できるという可能性が開けた.また,ゲルビーズなどの帯電表面へのDNA吸着およびその基板上の成長を予測するための理論構築を行い,DNA吸着には最小の長さのあることを見出した.また,細胞環境を再現する濃度と組成の溶液を調製することに成功した.インターフェース実装:DNAオリガミハッチの構築に必要な平行型のDNA乗り換え(クロスオーバー)構造の力学特性についてオリガミペンチを用いて検討し,DNAオリガミ構造体でも平行型DNAクロスオーバーの使用が可能であることが示された.制御・通信:DNAロボットの内部状態をペトリネットで表現し,二者間相互作用によって他者状態依存によるロボットの内部状態遷移モデルを構築し,シミュレーションで検証するとともに,対応する実際のDNA反応系を構築し,実験的に検証を行った.協調ルール:DNAロボットは群知能システムとしての振る舞いが期待されており,その基本モデルのDNA計算での実現は先駆的なものとして学術的意義が高いと考えられる.
臓器特異的な甲状腺ホルモン脱ヨード酵素の発現調節因子の探索と機序の解明

肝臓に多く発現する核内受容体であるLXRαはヒト甲状腺ホルモン脱ヨード酵素1型の転写調節を行い、プロモーター領域のLXRα結合部位では、甲状腺ホルモン受容体とのクロストークが行われていることが分かった。また、成長ホルモンが甲状腺ホルモン血中濃度を調節しており、各種細胞株に対する投与実験から、甲状腺由来細胞株においてのみヒト甲状腺ホルモン脱ヨード酵素2型が増加することを明らかにした。これら2つの研究成果を論文として報告した。また、新規の調節因子の探索のために、プロモーターアッセイを応用した新たな検出系を構築し、化合物ライブラリーによるスクリーニングを開始し、現在解析中である。本研究では、脱ヨード酵素(DIO)1型に加え2型、3型に関しても広く臓器特異的な脱ヨード酵素の調節機序を解明し、それに基づいた薬剤開発の基盤構築を行ことを目標としている。平成28年度には、臓器特異的にDIOの発現・調節を行うプロモーター領域の解析を目指した。現時点までに、in vitroの実験系として、ヒト肝細胞株(HepG2)、ヒト子宮頸癌細胞株(HeLa)、ヒト腎細胞株(TSA201)、ヒト乳腺癌細胞株(MCF7)、ヒト甲状腺未分化癌細胞株(HTC/C3)、ヒト大動脈内皮細胞株(HAEC)の細胞培養系の確立を行った。そして、各細胞株における各脱ヨード酵素の発現量を調べた。HepG2はDIO1優位、HeLaはDIO2優位、TSA201はDIO3優位、MCF7、HTC/C3、及びHAECはDIO1-DIO3に発現していた。また、プロモーター領域の解析の準備のため、プロモーターアッセイ用に既存のDIO1コンストラクトに加え、DIO2のコンストラクト(-6860、-1792、-722、-601、-322、-134、-83)を作成し、これらコンストラクトを用いて、まずはT4によるT3非依存的なDIO調節の解析を行った。DIO1のモデルとしてHepG2、DIO2のモデルとしてHeLa、DIO3のモデルとしてTSA201を用いた。結果として、T4によりDIO1 mRNA、及びDIO1レポーター活性とも変化することが分かり、現在解析を進めている。現時点までに、ヒト肝細胞株(HepG2)、ヒト子宮頸癌細胞株(HeLa)、ヒト腎細胞株(TSA201)、ヒト乳腺癌細胞株(MCF7)、ヒト甲状腺未分化癌細胞株(HTC/C3)、ヒト大動脈内皮細胞株(HAEC)の細胞培養系の確立を行い、各細胞株における各脱ヨード酵素の発現量を確認することができた。また、プロモーターアッセイに用いるDIO2のコンストラクトも作成し、実際にこれらコンストラクトを用いて、T4によりDIO1 mRNA、及びDIO1レポーター活性とも変化を確認し、おおむね研究計画通りに進んでいると考える。本年度においては、これまでに得た知見を活かして検討を進め、(1)肝臓において多く発現する核内受容体であるLXRαはヒト甲状腺ホルモン脱ヨード酵素1型(D1)の転写調節を行い、プロモーター領域におけるLXRαの結合部位では、甲状腺ホルモン受容体とのクロストークが行われていること、(2)成長ホルモンが甲状腺ホルモン血中濃度を調節しており、各種細胞株に対する投与実験を行ったところ、甲状腺由来細胞株においてのみヒト甲状腺ホルモン脱ヨード酵素2型(D2)が増加することを明らかにすることができ、論文報告した。また、新規の調節因子の探索のために、化合物ライブラリーによるスクリーニングを開始した。甲状腺ホルモン脱ヨード酵素の領域では、性能の良い特異抗体がなく、酵素活性の測定もラジオアイソトープやカラム処理を要するなど、ハイスループットな検出が困難であった。そこで、プロモーターアッセイを応用した新たな検出系を構築した。具体的には、ヒト甲状腺ホルモン脱ヨード酵素のプロモーターをクローニングし、下流にレポーターとして高い発光強度と安定性を有するNanoluc&reg;ルシフェラーゼを用い、384ウェルプレートと少ない試薬量で十分に検出できる、ランニングコストと安定性に優れた系である。トランスフェクション効率が高いヒト由来細胞株であるHEK293Tを用い、細胞播種・化合物分注などいずれの工程においても種々の分注器を使用し、誤差を可能な限り小さくした。本年度に既にヒトD2のスクリーニングは終了しており、再現性・濃度依存性を確認し、複数のヒット化合物を得た。今回使用したのは臨床応用されている薬剤のライブラリーであり、各化合物についての基礎・臨床の豊富な知見を活かして、現在メカニズムの解析を開始している。現在、DIO3コンストラクトを作成しており、今後、DIO1、DIO2、DIO3の分泌型レポーターベクターを作成し、ルシフェラーゼアッセイをベースとしたハイスループットスクリーニングを行う準備を行っている。また、化合物ライブラリーに関してもどの化合物ライブラリーを使用するかも検討中である。29年度が最終年度であるため、記入しない。内分泌29年度が最終年度であるため、記入しない。
培養脳傷害モデルを用いた低温の脳浮腫抑制効果の基礎的研究

脳浮腫の発生についてはKlatoらにより、vasogenicな機序・cytotoxicな機序の存在が示唆されているが、その実際の水の移動経路については明確でないままである。最近、脳内の水移動においてはグリアに存在する水チャンネルであるアクアポリン(AQP)が重要な働きをしていることが報告されている。脳低温療法は臨床的に脳浮腫を軽減する効果があることが多く報告されている。しかし、脳浮腫軽減の機序についても不明な点が多い。従って、脳浮腫発生とその治療法としての脳低温療法を分子生物学的に調査した。ラット培養アストロサイトに低酸素負荷をかけ、その後、人体が耐え得ると考えられる32°Cの低温状態とし、AQPのmRNA・蛋白質の発現の変化をそれぞれ、RT-PCR法・western blot法により観察した。脳室周囲の脈絡膜組織に局在していることから、脳浮腫発生・軽減に関係が深いとされているAQP-4に最も着目した。アストロサイトのAQP-4の発現量は低酸素負荷により増加した後32°Cの低温により、mRNA・蛋白質とも4時間後には有為に低下し、12時間後にはcontrolの約2倍まで増加した。AQP-9は低酸素:負荷・低温維持中、mRNA・蛋白質とも継続して有為に低下していた。低酸素負荷により増加したAQPの発現がアストロサイトを低温維持したことにより減少したことは、低酸素脳症における脳低温療法の脳浮腫軽減の機序のひとつと考えられる。ニューロンとアストロサイトにおけるアクアポリン(AQP)の発現と低酸素負荷によるその変化申請者らは、ニューロンにはAQP-3,5,8、アストロサイトにはAQP-3,4,5,8が発現していることを明らかにしている。すでに、アストロサイトでは低酸素負荷により発現が増強することも確認している。今回さらにニューロンについても低酸素時の変化を細胞培養系で検討する。方法は、RT-PCRとwestern blottingによりmRNA発現、蛋白発現を検討する。軽度低温による脳浮腫軽減のメカニズムの解明ニューロンとアストロサイトに低酸素と同時に低温負荷を加えた場合のAQPの変化を細胞培養系で検討する。方法は、RT-PCRやwestern blottingによりmRNA発現、蛋白発現を検討する。脳保護薬の軽度低温との相乗効果の検討ニューロンとアストロサイトに低酸素と同時に低温に加え、きらに脳保護薬(プロポフォール、プロスタサイクリン、リポコルチン等)を添加した場合のAQPの変化を細胞培養系で検討する。方法は、RT-PCRやwestern blottingにより検討する。これにより、軽度低温による脳浮腫軽減作用の増強効果のある薬剤を発見する。すでに我々はさまざまなラット脳損傷モデルを確立している(Yamamoto et al. Mol. Brain Res. 90(2001)26-38)。これらのモデルを使用して低温の効果を増強する薬剤の実際の効果を判定する。方法は、脳重量、あるいは損傷範囲等の検討により行う。これらの研究により、より効果的で経済的な脳低温療法の確立を目指したい。脳低温療法は脳浮腫予防の有力な治療法として一般に認められているが、そのメカニズムについてはほとんど明らかにされていない。今回我々は水チャンネル(アクアポリンAQP)のうち、脳室周囲の毛細血管に多量に発現していることから、血液脳関門と深く関わりがあるとされているAQP-4を用いた。脳低温療法による低酸素負荷後の脳浮腫軽減にAQP-4が関与しているかを調査するため、低酸素負荷時、低酸素負荷かつ軽度低温時のAQP-4のmRNA,蛋白の発現の変化を測定した。#1アストロサイトにおけるアクアポリン(AQP)の発現と低酸素負荷によるその変化我々はアストロサイトにはAQP-3,4,5,8,9が発現していることを明らかにしている。それらのうち、常温で低酸素負荷により経時的にAQP-4のmRNA、蛋白発現が減少することを見い出した。#2低酸素負荷と軽度低温(32°C)によるAQP-4の発現変化AQP-4 mRNA RT-PCR法で増幅し半定量を行った。低酸素負荷と軽度低温下では、4時間後まで減少し、その後増加し8時間でコントロール値まで回復、12時間後には約2倍となった。AQP-4蛋白western blotting後densitometryにて定量したAQP-4 mRNA同様、4時間後まで減少したが、12時間後には約2倍となった。以上より、脳低温療法の脳浮腫軽減のメカニズムとして、AQP-4の発現の増加が関与している可能性が示唆された。

脳室周囲の脈絡膜組織に局在していることから、脳浮腫発生・軽減に関係が深いとされているAQP-4に最も着目した。アストロサイトのAQP-4の発現量は低酸素負荷により増加した後32°Cの低温により、mRNA・蛋白質とも4時間後には有為に低下し、12時間後にはcontrolの約2倍まで増加した。AQP-9は低酸素:負荷・低温維持中、mRNA・蛋白質とも継続して有為に低下していた。低酸素負荷により増加したAQPの発現がアストロサイトを低温維持したことにより減少したことは、低酸素脳症における脳低温療法の脳浮腫軽減の機序のひとつと考えられる。
位相的弦理論における観測可能量の代数構造と時空多様体の幾何学

1自己双対半径をもつ円にコンパクト化した非臨界弦理論が位相的弦理論としての性質をもつことをLandau-Ginzburg(LG)記述を用いて調べた。LG記述を用いると、理論の可積分構造として戸田格子方程式系が自然な形で得られる。この理論の分配関数を一意的に特徴づけるストリング方程式をLG記述の立場から書き下した。この条件式は、行列模型の立場からも自然なものであることが示されている。このような可積分性が二次元量子ブラック・ホール時空のような幾何学に対して重要な情報を与えているかどうかは今後の課題である。2位相的CP^1シグマ模型と位相的極小模型を融合して得られる位相的弦理論の系列を調べ、これらもまた、戸田格子方程式系により統一的に記述できることを示した。また、この系列の位相的弦理論は、円にコンパクト化した非臨界弦理論とは異なるタイプのストリング方程式から得られることを明らかにした。さらに、離散的戸田格子方程式系の連続極限を利用して、リーマン面の種数いよる摂動展開の様子を調べた。3より高い次元の位相的弦理論を構成するための一つの方法は、対称性を拡大して位相的W代数に基づく弦理論(位相的W弦理論)を考えることにある。我々は、位相的W代数が超リー代数A(n,n-1)からハミルトニアン・リダクションにより得られることを示した。また、位相的W弦理論における物理量のなす代数がグラスマン多様体のコホモロジー環と同一視できることを利用して、位相的W弦理論の可積分構造とグラスマン多様体のコホモロジー環の量子変形との関係を調べた。
19世紀後半における国際社会の変容と北方世界

本年度は、以下の資料調査を行った。第一に、ロシア国立海軍文書館における調査である。ロシア国立海軍文書館(在サンクトペテルブルグ)所蔵のサハリン関係史料の収集を行った。(1)1863年にサハリンのクシュンコタン(日本の拠点)に上陸し、家作を建設するさいの史料群を入手した。上陸の指揮をとったルダノフスキーやブッセの報告書など基本史料を収集することができた。(2)867年前後のロシア海軍のサハリン政策に関する資料群を入手した。これは、明治維新期における北方世界の変容の契機を明らかにする史料群である。第二に、日本国内で以下の資料調査を行った。国立公文書館ならびに国立国会図書館において明治期のサハリン・クリル諸島・北海道に対する政策関係の史料を収集した。特に、千島樺太交換条約以後の北方世界における漁業問題に関する史料を中心に収集した。これらの調査から以下の点について新たな知見を得た。19世紀後半におけるロシアの極東政策の変容が日本の北方政策に強く影響を与えている、という点である。特に、クリミヤ戦争以後に、ロシアの極東政策の中心がロシア領アメリカ-アラスカ-から沿海州へ変化することと幕府の北方政策の関係を解明した。さらに千島樺太交換条約の締結により明治政府は、クリル諸島の実効的な支配を行わなければならなくなった。しかし、明治政府の政策担当者たちは、気候や地理的な問題から効果的な政策を展開することができなかった。このような明治政府の北方地域への政策に対するジレンマと試行錯誤的な政策の展開を明らかにできた。本年度は、大きく三つの分野の資料調査と撮影を行った。第一に、ロシア史料については、ロシア海軍の東アジアにおける活動を明らかにできる『海軍論集』を系統的収集し分析した。第二のアメリカに所蔵されている史料については、ハーバード大学における調査でロシアとアメリカの長年にわたる共同研究の動向やその成果と史料を収集した。特に、ロシアの植民地であったロス(後のロサンジュエルス)と日本のクナシリ島・エトロフ島・ウルップ島などの島々との情報ならびに物資の交換等について新しい知見を得ることが出来た。第三の日本における北方地域史の史料調査では、二つの点で成果があった。一つは、北海道大学北方資料室、北海道立図書館、北海道立文書館の史料群から北方世界の流通を支配していた場所請負商人の史料を調査し収集した。もう一つは、東京大学史料編纂所が所蔵する北方史に関する史料を収集した。特に、外務省から引継がれた一連の史料の内、北方史に関する史料を収集し分析した。この史料は、19世紀後半における国際社会の変容と北方世界の関係を分析する上で、極めて重要な史料群と位置づけられる。以上、三つの分野の調査から特に、以下の点が明らかになった。第一は、クリミヤ戦争とロシアの極東政策の変容が、日本の北方世界に与えた影響である。第二は、北京条約による露と中国の領土変更が日本の北方世界に与えた影響である。このように、国際社会-とりわけ東アジア地域-の変容が北方世界に与えた影響を分析する新たな視点を得ることが出来た。
学習と動機づけの自律化プロセスと学習支援ニーズの多様性に関する研究

まず、学習支援ニーズに関する議論を整理し、教育心理学の観点から理論化を図った。次に、学習困難の事例をもとに子どもの視点からみたニーズと支援する側からみたニーズを明らかにした。また、親による動機づけ支援に関して青年期の子どもがどのようなニーズをもち、評価をしているか、両者のズレによって自律的動機づけに違いがみられるのか、明らかにした。さらに、中国語学習において教師による"Normative needs"と"Felt needs"の視点から実践への示唆を得た。次いで、親による動機づけ支援に関して青年期の子どもがどのようなニーズをもち、評価をしているか、両者のズレによって自律的動機づけに違いがみられるのか、明らかにした。全体としてみると,母親と父親のいずれの支援もニーズに対して評価が上回っていた。また,「関与」よりも「温かさ」,これらよりも「自律性支援」が重要であることが示された。両者のズレに関しては母親も父親も「自律性支援」と「温かさ」においてニーズを満たしていない「ー」群で自律的動機づけが低いということが明らかとなった。さらに、学習支援ニーズは多様な学習領域に着目して明らかにしていく必要がある。中国語学習について調査を行い、因子分析の結果、「会話」「語彙」「文化・歴史」の学習支援ニーズが存在することが明らかになった。これらのニーズと取り入れ的調整、同一化的調整、内発的動機づけの間には正の相関が認められた。“Felt needs"と教師の視点に基づく“Normative needs"の2つの側面のニーズの有無によってこれらの動機づけに違いがみられた。結果をふまえ、実践への示唆について検討した。平成23年度の研究の大きな目的の1つは,学習支援ニーズに関する議論を整理し,理論化を図ることであった。まず,学校心理学や社会教育の領域などで行われてきている議論を検討し,子どもの学習支援ニーズを捉える図式について提示した。"Felt needs"/"Normative needs"(e.g. Griffith, 1987; Pearce, 1995),"Expressed needs"/"Inferred needs"(Noddings, 2003),支援者によるニーズの把握の有無/学習者によるニーズの自覚の有無の2次元の図式などをふまえて,支援を要する仮想の事例をもとにした調査と保護者を対象とした調査について検討を行った。自己調整学習の理論をもとに,質の高いニーズへの転換を図ること,ニーズが生成されてくる心理的プロセスをふまえた学習支援の必要性について指摘をした。次に,ニーズをふまえた学習支援のあり方について示唆を得るために,支援に関するニーズと評価のズレに着目した検討を行った。研究の目的としては,親による動機づけ支援に関して青年期の子どもがどのようなニーズと評価をしており,両者のズレによって自律的動機づけに違いがみられるのかについて検討を行った。以上の成果は2本の論文としてまとめており,学習支援ニーズを出発点とした学習支援研究の今後の可能性と方向性について示唆を得ている。概念的な検討について1本の論文としてまとめ,また,支援ニーズに関してデータに基づく検討を行った結果を1本の論文としてまとめた。研究計画は,おおむね問題なく進行していると考えている。2件の学会発表を行い,2件の図書の執筆を通じて研究成果の一部を公開するよう努めた。平成24年度も調査を計画しており,すでに準備を進めているところである。研究協力を求める依頼先との調整を速やかに進めるようにする。学会発表や研究会の報告も計画しており,着実にその成果を公表していくようにする。23年度では,遠方で開催された学会への参加や資料収集のために旅費に多くを支出した。24年度にも,資料収集及び成果を発表するために多くの学会や研究会に参加する必要があり,また,高度な統計処理を行うため最新のソフトウェアやPCなどの物品を購入する必要がある。「次年度使用額」の予算と合わせて本年度も適正かつ効率的に執行していく。
ウイルスベクターシステムを駆使した線条体入力系の構造─機能連関の解明

本研究課題では、さまざまなウイルスベクターを利用した先端的神経ネットワーク解析システムを確立し、それらを駆使して、霊長類の大脳基底核を巡る神経ネットワークの構造と機能を明らかにすることを目的としている。以下の3つの項目に関する研究計画が順調に進展し、それぞれ興味ある研究成果が得られた:(1)高発現型multi-color狂犬病ウイルスベクターを用いた前頭葉皮質への多シナプス性出力様式と皮質ー線条体入力様式に基づく線条体の機能マッピング、(2)線条体の特定の部位に入力する視床および黒質のニューロン群の入出力解析、(3)視床、黒質、前頭葉皮質から線条体の特定の部位に入力する神経路に対する機能介入。平成25年度は、外来遺伝子の高発現化など、独自に開発、改良をおこなった狂犬病ウイルス固定株をベースとするウイルスベクターに、4種類の蛍光タンパク質遺伝子を組み込んで多重逆行性越シナプス的トレーシングのための狂犬病ウイルスベクターを作製し、前頭前野の4領野への注入実験を実施した。その結果、このベクターは親株であるCVS26株と同等の逆行性感染伝播効率を保持しており、1シナプスにつきおよそ24時間で移動し、注入後72時間ではベクターが注入部位からシナプスを3つ介する3次ニューロン(大脳皮質ー大脳基底核ループ回路では線条体の投射細胞)まで到達していることが確認され、かつ大脳基底核のさまざまな領域において蛍光タンパク質による多重ラベルが発見された。また、線条体の特定の部位に入力するニューロン群の軸索投射を解析するためのシステムとして、研究代表者らが近年開発に成功した逆行性レンチウイルスベクターとアデノ随伴ウイルスベクター、およびTet-On発現誘導系を利用した経路選択的細胞可視化法に改良を加え、発現量の増加とリーク発現の低下に成功した。さらに、線条体の特定の部位に入力するニューロン群の入出力解析法の開発としては、同法に必須なベクターである感染伝播能欠損型(G遺伝子欠損型)狂犬病ウイルスベクターにゲノム配列の改変をおこない、従来型と比べて外来遺伝子発現能を向上させ、かつ細胞毒性を低減した改良型ベクターを開発することに成功した。本研究では、さまざまなウイルスベクターを利用した先端的神経ネットワーク解析システムを確立し、それらを駆使して、霊長類の大脳基底核を巡る神経ネットワークの構造と機能を明らかにすることを目的としている。平成26年度は、まず「高発現型multi-color狂犬病ウイルスベクターを用いた前頭葉皮質への多シナプス性出力様式と皮質ー線条体入力様式に基づく線条体の機能マッピング」において、前年度に開発した4種類の蛍光蛋白質をそれぞれ発現する狂犬病ウイルスベクターを、単一サル個体の異なる前頭前野領域に注入し、二次および三次ニューロンとして各蛍光蛋白質でラベルされた淡蒼球内節・黒質網様部ニューロンあるいは線条体ニューロンの分布、および複数の蛍光蛋白質で多重ラベルされたニューロンの分布を解析するとともに、アデノ随伴ウイルスベクターによる皮質領域からの順行性トレーシングを併用して、線条体への入力と線条体からの出力の局在関係を解析し、大脳皮質ー大脳基底核ループ回路の基本的構築を明らかにする研究計画を進めている。また、「線条体の特定の部位に入力するニューロンの入出力解析法の確立」では、前年度に改良したマーカー蛋白質のリーク発現を低減した逆行性感染型レンチウイルスベクター(改変テトラサイクリン応答配列の下流にFLEX配列に挟まれた逆位の膜局在型蛍光蛋白質(pal-XFP1)遺伝子とシナプシンプロモータの下流にタグ遺伝子の2つの配列を組み込んだもの)を線条体に、Creリコンビナーゼ等の部位特異的組換え酵素と、flagタグを付加した改変テトラサイクリンアクチベータを発現するアデノ随伴ウイルスベクターを黒質に注入したモデルザルを作製し、線条体に投射する黒質ニューロンで2種類のベクターの多重感染が成立し、pal-XFPの発現が誘導され軸索が可視化されることを確認する研究計画を進めている。本研究では、さまざまなウイルスベクターを利用した先端的神経ネットワーク解析システムを確立し、霊長類の大脳基底核を巡る神経ネットワークの構造と機能を明らかにすることを目的としている。平成27年度は、まず前年度から進めてきた「高発現型multi-color狂犬病ウイルスベクターを用いた前頭葉皮質への多シナプス性出力様式と皮質ー線条体入力様式に基づく線条体の機能マッピング」に関する研究計画を継続している。新規に導入したデジタルスライド解析装置を用いて、4種類の蛍光蛋白質をそれぞれ発現する狂犬病ウイルスベクターを異なる前頭前野領域に注入したマカクザルにおいて、二次および三次ニューロンとして各蛍光蛋白質でラベルされた淡蒼球内節・黒質網様部ニューロンあるいは線条体ニューロンの分布、および複数の蛍光蛋白質で多重ラベルされた単一ニューロンの分布を解析している。また、「線条体の特定の部位に入力するニューロンの入出力解析法の確立」についても、前年度から進めてきたマーカー蛋白質のリーク発現を低減した逆行性感染型レンチウイルス(rLV)ベクターとアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを組み合わせた遺伝子改変サルモデルの作製に関する研究計画を継続している。「線条体の特定の部位に入力する視床および黒質のニューロン群の入出力解析」については、上記と同様の入出力解析法により、遺伝子改変サルモデルの作製に関する研究計画を進めている。

「視床、黒質、前頭葉皮質から線条体の特定の部位に入力する神経路に対する機能介入」について、Tet-On発現制御法を用いた神経路選択的開口放出阻害により、テトラサイクリン応答配列の下流にテタヌストキシン軽鎖遺伝子を組み込んだrLVベクターを線条体に、改変逆テトラサイクリンアクチベータを発現するAAVベクターを黒質に注入してパーキンソン病サルモデルを作製することを検討している。本研究課題では、さまざまなウイルスベクターを利用した先端的神経ネットワーク解析システムを確立し、それらを駆使して、霊長類の大脳基底核を巡る神経ネットワークの構造と機能を明らかにすることを目的としている。以下の3つの項目に関する研究計画が順調に進展し、それぞれ興味ある研究成果が得られた:(1)高発現型multi-color狂犬病ウイルスベクターを用いた前頭葉皮質への多シナプス性出力様式と皮質ー線条体入力様式に基づく線条体の機能マッピング、(2)線条体の特定の部位に入力する視床および黒質のニューロン群の入出力解析、(3)視床、黒質、前頭葉皮質から線条体の特定の部位に入力する神経路に対する機能介入。「高発現型multi-color狂犬病ウイルスベクターを用いた前頭葉皮質への多シナプス性出力様式と皮質ー線条体入力様式に基づく線条体の機能マッピング」については、平成26年度の研究実施計画に記載したように、異なる前頭前野領域に注入した4種類の狂犬病ウイルスベクターで二次および三次ニューロンとして単一あるいは複数の蛍光蛋白質でラベルされた大脳基底核ニューロンの分布を解析するとともに、アデノ随伴ウイルスベクターによる皮質領域からの順行性トレーシングを併用して、線条体への入力と線条体からの出力の局在関係を解析する研究計画が進行中である。また、4種類の蛍光タンパク質を発現する改変型狂犬病ウイルスベクターを利用した前頭葉皮質からの多重逆行性越シナプス的トレーシングに成功し、現在、大脳基底核各領域におけるラベルされたニューロンの分布様式を解析中である。同様に、「線条体の特定の部位に入力するニューロンの入出力解析法の確立」についても、開発・改良に成功した2種類ウイルスベクターを用いて、線条体に投射する黒質ニューロンでベクターの多重感染が成立し、pal-XFPの発現が誘導され軸索が可視化されることを確認しており、全体として研究が順調に進展していると考えられるため。27年度が最終年度であるため、記入しない。神経科学研究計画は当初の予定どおり順調に進展しているので、平成27年度(最終年度)は以下の3つの研究計画を進める。(1)前年度から進めてきた「高発現型multi-color狂犬病ウイルスベクターを用いた前頭葉皮質への多シナプス性出力様式と皮質ー線条体入力様式に基づく線条体の機能マッピング」および「線条体の特定の部位に入力するニューロンの入出力解析法の確立」に関する研究計画を継続する。(2)「線条体の特定の部位に入力するニューロンの入出力解析法の確立」に関する研究計画を達成後、そこで開発した入出力解析法を用いて、「線条体の特定の部位に入力する視床および黒質のニューロン群の入出力解析」に着手する。具体的には、2種類の逆行性感染型レンチ
発達期水晶体の透明性獲得機構の解明:SPring-8X線回折による統合的解析

<目的>水晶体はその発生初期には混濁しておりその後発生後期にかけて透明になることが知られている。しかし、水晶体が透明性を獲得する過程のメカニズムについては十分解明されていない。水晶体における分子間近距離秩序は、分子量20 kDaのαA,Bクリスタリンが作る平均分子量800 kDa、直径15 nmの粒子の配列であると考えられている。この集合体をX線が通過すると、電子密度の高低を反映して、平均分子間距離に反比例した直径を持つリング状のX線回折像として現される。平成19年度、私は水晶体が発育期においてどのように透明性と高い屈折率を獲得していくかを把握するためにラット新生児を用いて水晶体タンパク量とX線回折像の経時的変化を観察した。<方法と結果>生後5日、10日、15日目のラット水晶体をBicinchonianate法を用いてウシ血清アルブミンを標準としてタンパク濃度を計測した。また、X線回折像についても同様の生後日数のものを37°Cで計測した。X線の波長は1Å、カメラ長は1.5mと同様の条件とした。X線は光軸と平行に水晶体の中心を通過させた。水晶体のタンパク濃度は274.4±39.6,347.4±41.6,569.0±60.7[mg/ml lens volume](それぞれn=5)と生後日数とともに上昇した。X線像では、生後10日までは散乱のみで回折像を認めなかったが15日目では約15 nmに該当するリング状の回折像が出現した。<結論>水晶体タンパク濃度は生後10日から15日の間に著名に上昇し、それに伴いX線回折像も出現した。この回折像を成ラット水晶体のものと比べると分子量の大きい部分の輝度が高く、幼弱な水晶体ほど大きな粒子を含んでおり成長に伴って均一な大きさに統一されると考えた。
プロセスモデルに基づく医療安全教育のためのゲーミングシミュレーション法の開発

本研究の目的は、疑似体験型の学習から得る多層的インパクトを構造化し、心理教育型の医療安全教育を創出することであった。平成24年度平成26年度においてゲーミングシミュレーション法の適用を着想し、従来の静止的な事故研究を超えて、事故の「プロセス性」を重視する斬新な教育手法を開発した。そして看護学生だけでなく臨床の看護師を対象として、人間のヒューマンエラーに関する環境要因の影響に関し、シミュレーションゲーム法を適用した医療安全教育を実施した。その結果、医療安全に対する意識変容において、介入後に有意な効果が認められた。【平成25年度】に実施した医療安全教育の開発を報告する。1)<目的>安全確保のためにアサーティブな行動が望まれる場面を設定してゲームを行った。参加者と共にそこでの心理と行動、課題達成を振り返り、医療エラーの発生機序を確認した。対象は同意の得られた看護学生でゲーム参加者31名。<結果>「声のかけづらさ」があると、聞き返しの行動が抑制され、薬剤選択課題の正解率が有意に低下した。このゲーム環境では、時間的切迫が一層声かけをためらわせていた。その中で尋ねることを諦めなかった人だけが、正解にたどりついていた。医療安全を確保するには、相談がしにくい環境圧力の下でも声をかけ続けるという、アサーティブな行動が重要であることが示された。2)<目的>ヒューマンエラーの発生と防止を模擬体験で学ぶ研究の一環として、心理学のゲーミングシミュレーションを応用し、作業中断時の指さし呼称の効果を学ぶ教育的ゲームを試行した。対象は同意の得られた看護学生31名。<結果>作業が中断される配薬作業において、作業の正確さ向上に指差呼称が効果を持つことが確認された。指さし呼称は意識向上の効果があるといわれるが、作業中断による注意低下を防止したと考えられる。学習者は指差呼称をより有用と感じ、医療事故に対する危機感もより高くなっていた。配薬過程のヒューマンエラー対策の防止策を認識する教育効果があったと考えられる。3)<目的>医療安全のゲーミングシミュレーションとして、新人看護師が意見交換の場で先輩看護師からの同調圧力下で意思表示を行う模擬体験をして貰い、医療安全教育としての総括を加えて医療安全教育を試みた。<結果>先輩たちが特定の看護方法を強く主張して同意を求めると、新人が同調してしまう様子が見られた。判断が正しい選択のみならず、誤った選択にも導かれていく現象は、病棟で医療事故につながりかねない可能性を示唆している。従来の静止的な事故研究を超えて、事故の「プロセス性」を重視するため斬新な教育手法が必要であり、ゲーミングシミュレーション法の適用を着想した。疑似体験型の学習から得る多層的インパクトを構造化し、心理教育型の医療安全教育を創出することを目的とする。【平成24年度】に実施した医療安全教育の開発を報告する。1)曖昧な指示のもたらす反応の多様性と危険性に気づくためのシミュレーションゲームを試行し、体験から何を学習したかを探索した。2012年7月実験協力の依頼に応じたA大学生18名を対象としてゲームを行った。113種類の瓶から1人17本を選択させたが、時間切迫にプレッシャーを感じ、不明瞭な指示には遂行の迷いと困難を覚えていた。2曖昧な指示は多様な反応を引き起こし、他者の反応を予想することは困難だと学んでいた。ゲーム後の振り返りではエラー防止には詳細な指示を出し、不明点を確認することが大切との認識が示された。3ゲーム前後の安全意識の変化として、実験後11項目の安全意識が有意に高くなった。2)2012年10月、看護学生を対象に作業中断を取り入れた業務を指示し、指差呼称の効果を検討することを目的とした。1対象者31名を指差呼称あり・中断あり群、指差呼称あり・中断なし群、指差呼称なし・中断あり群、指差呼称なし・中断なし群の4群に分け、患者・薬剤名を指示し配薬をさせた。2分析の結果、薬剤の種類に関してのみ、4群間に有意差が認められた。薬剤の量、薬剤の種類における指差呼称に関し、主効果が認められた。3ゲーム実施後、指差呼称の医療事故防止に関する効果、多重課題下での指差呼称の有用性に関し、実施前に比べ顕著な高まりがみられた。また自由記述からは「指差呼称でスムーズに実施できた」「確認の重要性が分かった」等の指差呼称や確認の重要性に関する項目が抽出された。《3年間の研究目的》事故の「プロセス性」を重視ゲーミングシミュレーション法の適用を着想した。そして疑似体験型の学習から得る多層的インパクトを構造化し,心理教育型の医療安全教育を創出することを目的とした。【平成26年度】に実施した医療安全教育の開発を報告する。<目的>看護師を対象に時間切迫と思い込み,

指さし呼称有無の要素を取り入れた物品選択のゲーミングシミュレーション(以降,ゲームと略)を試みた。そして看護師においても学生と同様,心理・教育的効果が確認できるかどうか,検討することを目的とした。<対象>同意の得られたA病院に勤務する看護師27名。平成26年10月の3日間に実施。<方法>1)実験群をA:指さし呼称指示あり(図示通り遵守),B:指さし呼称指示あり(普段通りの手順)C:指さし呼称指示なしの3群に分け,群ごとに指示書を渡し物品を選択させた。5種類の物品選択を課し,物品選択正解率に差が生じるかどうかを検討した。2)「医療安全の意識」関するゲーム実施前後の値を分析した。<結果>1.正解率の群別比較では,A群が最も高く82.5%で,B群53.3%,C群48.9%であった。AとB・Cの2群間比較を行った結果,一つの物品で有意差,二つの物品で傾向差が認められた。2 .医療安全に関する意識において,ゲーム実施後は実施前に比べ,「自分は事故を起こす可能性があると思う」等の上昇が認められた。以上,正解結果から゙普段通り゙の手順において,指さし呼称が遵守されていない可能性が示唆された。一方,時間切迫下においても指さし呼称の遵守は,類似物品選択エラー軽減に繋がることが明らかになった。さらに指さし呼称の遵守によって,集中して作業を行える心理効果も生じていた。ゲーム実施後の感想から,医療事故に対する危機感や怖さ,確認や指さし呼称の重要性等の学びも認められたことから,学生と同様な効果が確認された。基礎看護学毎年、医療安全教育に関するゲームを開発してきており、研究課題は概ね順調に進展していると言えよう。内容についても年々充実したものになってきている。本年度の収穫は、医療場面におけるアサーティブな行動に着目し、ヒューマンエラー発生のプロセスが、目の前で再現できたことである。さらに時間切迫があると人はどのような行動を取るかが段階的に把握することができた。指さし呼称においても、作業中断下における効果が明らかになり、今後の対策への示唆を得ることができた。毎年、2-4個の医療安全教育に関するゲームを開発してきており、研究課題は概ね順調に進展していると言えよう。本年度の収穫は、日本心理学会において講演とゲームの実演を依頼した中村美枝子先生から、ゲーミングシミュレーションの詳細を学ぶ機会を得たことである。カードを使用して行うゲームは初めてで、新鮮であった。早速、開発中のチームにおける権威勾配に関するゲーム作成にアイデアを取り入れ、興味深い結果を得ることができた。来年度は、研究計画の最終年度となる。今後は臨床応用を目指し。教室内だでなく臨床での活用を視野に入れたゲーミングシミュレーションの開発を目指したい。さらにゲーミングシミュレーションに関する理論や医療事故の要因となるヒューマンエラーに関わる要因等を基礎に包括的なゲーム作成を指向していく。またゲームの種類についても特性・状況ゲームを作成すると共に、個人は勿論、集団での意思決定に関するゲームも精力的に作成していきたい。
実特異点論

本年度の成果は以下の通り.実解析関数芽の同値関係でblow up等のproper modificationで持ち上げたら解析的に同値になるような位相同型芽を用いて分類する事を考える。このような同値関係を考えるのは関数の分類の見地から妥当性がありますがここで次のような事が問題となる。与えられた関数芽族が上の意味で自明となるかどうかを判断する事。言い替えれば自明化を構成する事と十分多くの上記の同値類の不変量を構成する事である。不変量については例えば重複度がそうである事が示されこの証明のアイデアを事を一般化する事により多くのmodefied analytic同値の不変量を定義することができます。このことはpreprint“Seeking invariants for brow-analytic equvalence"に纏めてあります。自明化の構成については、孤立特異点をもつ重み付き斉次多項式の重みを変えない族は上記の意味での自明化を許容するだろうと予想し現在シドニー大学のL. Paunescu氏と共同で研究中です。その結果考えている族があるよい性質をモツtoric modificationで特異点解消されるなら正しいことが判りました。このよい性質をもつtoric modeficationで特異点解消されない例があるかどうかは今のところ不明です。現在この定理を改良すべく努力しています。また写像芽の安定摂動に表れる特異点の個数に付いても考察しました。その結果そこにでてくるThem-Boardman特異点の個数は元の写像芽からきまるある代数のベクトル空間としての次元で抑えられる事を示しよう条件の下では複素化したときに等号が成立する事を示しました。このことは数理研での短期共同研究「実特異点の幾何学時様相」にて報告し、その成果は講求録の形で利用する事ができます。理論的にもっとも大切な部分はある特異点の表れ方を支配する環がある条件の元にCohen-Macaulayである事を示す部分です。なおこの理論は以降も進展し、Cohen-Macaulayの判定ができる部分が若干増えています。さらに現在までの計算を総合してみるとある程度Cohen-Macaulay性の判定条件の全体像を予想できる様になってきたといえるでしょう。
ヒトレトロウイルス感染によるIRFファミリーの調節異常

本研究では成熟リンパ球を標的とするヒトレトロウイルス感染とIRFファミリーメンバーとの関連に焦点をあてた.明らかにすることができたのは以下の通りである..2)IRF-1遺伝子欠損マウスは、ヒトレトロウイルス感染が疑われている多発性硬化症の実験モデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎において抵抗性を示す(J. Exp. Med., 185, 231- 238, 1997).3)予備実験で示されたようにLSIRF/IRF-4はヒトT細胞腫瘍においてはHTLV-I巻Sン細胞特異的に発現しており、患者末梢血においてはリンパ球の白血化と強い関連がみられ、予後、および治療のよいマーカーとして応用できることが示された(投稿準備中).4)LSIRF/IRF-4のHTLV-Iにおける恒常的な発現の機序を解析した結果、その転写開始点-60から下流に調節エレメントが存在することが明らかとなった(投稿準備中).5)ヒトレトロウイルスと7つのIRFファミリーメンバーの発現を検討したところICSBPがヒトレトロウイルス感染細胞では低下していることが明らかとなった(未発表データー).6)LSIRF/IRF-4のリンパ球増殖における役割を遺伝子変異マウスを作製して解析した結果、LSIRF/IRF-4が成熟リンパ球の機能発現に必須の転写因子であり、遺伝子欠損によって液性免疫、細胞性免疫に重篤な障害をおこした免疫不全マウスになる(Science, 275, 540-543, 1997).本研究では成熟リンパ球を標的とするヒトレトロウイルス感染とIRFファミリーメンバーとの関連に焦点をあてた.明らかにすることができたのは以下の通りである..2)IRF-1遺伝子欠損マウスは、ヒトレトロウイルス感染が疑われている多発性硬化症の実験モデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎において抵抗性を示す(J. Exp. Med., 185, 231- 238, 1997).3)予備実験で示されたようにLSIRF/IRF-4はヒトT細胞腫瘍においてはHTLV-I巻Sン細胞特異的に発現しており、患者末梢血においてはリンパ球の白血化と強い関連がみられ、予後、および治療のよいマーカーとして応用できることが示された(投稿準備中).4)LSIRF/IRF-4のHTLV-Iにおける恒常的な発現の機序を解析した結果、その転写開始点-60から下流に調節エレメントが存在することが明らかとなった(投稿準備中).5)ヒトレトロウイルスと7つのIRFファミリーメンバーの発現を検討したところICSBPがヒトレトロウイルス感染細胞では低下していることが明らかとなった(未発表データー).6)LSIRF/IRF-4のリンパ球増殖における役割を遺伝子変異マウスを作製して解析した結果、LSIRF/IRF-4が成熟リンパ球の機能発現に必須の転写因子であり、遺伝子欠損によって液性免疫、細胞性免疫に重篤な障害をおこした免疫不全マウスになる(Science, 275, 540-543, 1997).1. LSIRF遺伝子欠損マウスを作製し,リンパ球の分化と機能におよぼすLSIRFの役割を解析した結果、LSIRF遺伝子欠損によって機能的には重篤な免疫不全をきたしていることが明らかになった.LSIRF遺伝子欠損マウスは免疫グロブリン産生がほとんどなく、またT-dependent, T-independent antigenに対する免疫応答も極めて弱い.-方、T cellではallogenic response, CTL responseが観察されずallogenic tumor rejectionも全くおこっていない。2. LSIRFの過剰発現とヒトT細胞腫瘍化の関係を検討するためにT細胞株での発現をみたが、HTLV-I感染細胞株のみに発現がみられた.またtrans-activatorであるTaxによるLSIRFの発現をinducible Taxが導入されたJurkat細胞、JPX-9(東京医科歯科大学、中村正孝教授より分与)にて検討した結果、LSIRFはTaxにて誘導がかかるが、その効果は極めて弱くTaxによる直接誘導なのかをpromoterの解析から更に検討する必要が示唆された.3. ATL患者検体を用いてLSIRFの発現を検討したが現在までのところ慢性期の患者での発現の昂進はみられていない.しかし急性期患者由来リンパ球では発現が増強していることが見い出された.4. IRF-1遺伝子欠損マウスの解析からNK細胞の機能発現にはIRF-1が必須であることが証明された。一方、多発性硬化症のモデルともいわれるアレルギー性実験性脳脊髄炎の系ではIRF-1が増悪因子として働くことも示されヒトレトロウイルスによる中枢神経系の疾患とIRFファミリー分子との関連の検討も必要と考えられた。
細胞周期におけるチェックポイント制御機構

現在知られているすべての真核生物において、減数分裂ではDNA複製が完了した後に遺伝子組み換えのための二重鎖切断が生じると考えられている。本研究において、分裂酵母でこの過程を詳しく調べてみた。DNA合成阻害剤であるヒドロキシレア(HU)で処理すると、DNA複製が阻害されるだけでなく、二重鎖切断も阻害された。しかし、DNA複製後にHUを加えても二重鎖切断は阻害されなかった。このことより、HUは直接二重鎖切断の形成を阻害しているのではなく、DNA複製を介して二重鎖切断を抑制していると考えられる。すなわち、DNA複製と二重鎖切断は独立した現象で、チェックポイント因子により制御されていることが示唆される。そこで、DNA複製と二重鎖切断をカップリングさせているような因子をスクリーニングしたところ、Rad1,Rad3,Rad9,Rad17,Rad26,Hus1,Cds1がこの制御に必要であることが明らかになった。さらに、これらの変異株でみられる二重鎖切断は正常な場合と同じ位置に観察され、二重鎖切断因子Rec12を必要としていた。以上のことから、DNA複製と二重鎖切断は独立した現象で、チェックポイント因子により制御されていると考えられる。このチェックポイントはいかなる生物でも未同定の新しい経路であると思われる。また、このような因子のホモログはヒトにおいても存在し、DNA複製や損傷のチェックポイント機能があると考えられている。この研究により、このようなチェックポイント因子がヒトを含む高等動物の減数分裂におけるDNA複製と遺伝子組み換えのカップリングにも関与していることが推察された。出芽酵母ではこの過程は直接カップリングしていることが知られている。さらに、これらの変異株でみられる二重鎖切断は正常な場合と同じ位置に観察された。

そこで、DNA複製と二重鎖切断をカップリングさせているような因子をスクリーニングしたところ、Rad1,Rad3,Rad9,Rad17,Rad26,Hus1,Cds1がこの制御に必要であることが明らかになった。さらに、これらの変異株でみられる二重鎖切断は正常な場合と同じ位置に観察され、二重鎖切断因子Rec12を必要としていた。以上のことから、DNA複製と二重鎖切断は独立した現象で、チェックポイント因子により制御されていると考えられる。このチェックポイントはいかなる生物でも未同定の新しい経路であると思われる。また、このような因子のホモログはヒトにおいても存在し、DNA複製や損傷のチェックポイント機能があると考えられている。この研究により、このようなチェックポイント因子がヒトを含む高等動物の減数分裂におけるDNA複製と遺伝子組み換えのカップリングにも関与していることが推察された。
グアニン四重鎖を標的としたAXLの抑制と、可視化プローブを用いた作用機構の検証

グアニン四重鎖は二重らせんから動的に形成される核酸の高次構造であり、現在細胞内で複製・転写・翻訳をはじめとした様々な機能を持つことが示唆されている。しかしながら、vitroでの多くの研究がなされてきたにも関わらず、細胞内でのG4の機能については未だ未解明な点が多い。これを解決する一つの方法としてG4結合し安定化する化合物(G4リガンド)が有用である。G4リガンドはアゴニストのように働き、G4が形成することに付随して発現する機能を知ることが出来る有用なツールである。近年、より詳細なG4の機能を知るために細胞の局在を調査できる蛍光型G4リガンドが求められている。しかし、蛍光型G4リガンドは未だ報告例が限られている上、生細胞での検出が可能な蛍光型G4リガンドは殆ど知られていない。以上を背景に本研究ではグアニン四重鎖と結合し、蛍光で検出が可能な低分子化合物を設計・合成することを目的とした。種々の検討の結果、合成した化合物が、二本鎖DNAを安定化しない一方で、グアニン四重鎖と結合し、グアニン四重鎖を安定化することを見出した。またこのとき、G4のトポロジーは変化していなかった。これは生細胞でのG4検出を考慮すると好ましい特性と言える。また、当該化合物が蛍光でG4の検出が可能であることを実証した。詳細な検討の結果、合成した化合物はグアニン四重鎖に結合してはじめて蛍光を発するLight-up型の蛍光化合物であることが明らかとなった。これにより、G4の高感度な検出を可能とした。さらに固定化した細胞へ当該化合物を添加すると核酸が存在する核小体や細胞質が染色されることを明らかとした。これは細胞内でグアニン四重鎖を蛍光検出できたことを示唆している。本年度は本研究で目的としているG4を蛍光検出する低分子化合物を創生することが出来た。未だ生細胞でのG4の可視化は出来ていないものの、vitroでのG4検出、二本鎖との選択性、固定化した細胞での染色が可能になったため、本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。次年度では生細胞でのG4の可視化に取り組む。そのために本年度見出した骨格を基に、細胞透過性を考慮しながら構造活性相関を行う事で生細胞でのG4の可視化が可能な化合物の取得を目指す。一部の予算を、次年度に購入する消耗品を購入するために使用した方が円滑に研究が進行すると考えたため。実際に次年度使用額は必要な試薬の購入に使用する予定である。
三次元構築脳器官培養を用いた悪性グリオーマ浸潤モデルの確立と抗浸潤療法の開発

新しいグリオーマ浸潤モデルを開発する目的でラット脳スライスを用いた三次元器官培養を行い、グリオーマ細胞との共培養によりグリオーマ細胞の運動、浸潤の動態を検討した。生後2日の新生仔ラットより大脳を摘出し、厚さ300μmの脳スライスを作成した。スライス培養1週間後、細胞標識蛍光色素PKH2にて標識したC6グリオーマ細胞を脳スライス上面に静置させ共培養した。細胞運動性を検討するためにC6グリオーマ細胞のaggregation cultureを行い、径約60-100μmのスフェロイドを用いて経時的に標識グリオーマ細胞の移動を観察した。一方、浸潤能を評価するために1μl(5x10^4個の細胞含)の細胞浮遊液を用い、脳スライス下面に到達したグリオーマ細胞を測定した。細胞運動においては、グリオーマ運動性因子(GMF)、神経接着因子L1、フィブロネクチン、テネイシンによるグリオーマ細胞運動性への効果を検討した。浸潤においては、L1遺伝子導入細胞を用いて、分泌L1に対するグリオーマ細胞の脳内浸潤能について検討した。グリオーマ細胞は培養大脳切片上を移動し、その運動促進効果はL1が最も強く、GMFが次に強かった。フィブロネクチン、テネイシンは共に、むしろ対照に比べ細胞運動を抑制する傾向がみられた。C6グリオーマ細胞はL1遺伝子導入細胞との共存により対照細胞に比べ、強い脳内浸潤を示した。また、この効果は抗L1抗体の添加により有意に抑制された。今回、確立した培養脳スライスはグリオーマ細胞との共培養が可能であり、in vivoに近い環境の下でのグリオーマ浸潤の動態を研究する上で極めて有用であると考えられた。生後2日のウィスターラットより、大脳を摘出し、脳梁を含む大脳薄切切片を作成した。大脳薄切切片をメンブレン上、静置培養とし、その形態および組織構築を観察した。培養3日後には大脳切片直下および周囲にシート状にグリア細胞の遊走がみられ、以後切片の厚みが減じた後、脳梁の組織構築を維持したまま、安定期となり、約1カ月培養が可能であった。本培養脳組織切片モデルを用いて、グリオーマ細胞の運動および脳内浸潤様式について検討した。先ず、グリオーマ細胞の脳組織上での運動能を調べるため、C6グリオーマ細胞をPKH2色素にて蛍光標識し、sggregation cultureを行った。径約100μm大の細胞集塊を選別し、脳組織切片上に滴下し、切片上での移動を経時的に観察した。また、各種細胞外マトリックスおよび神経接着因子L1の運動への効果について検討した。C6グリオーマ細胞は時間と共に大脳切片上を同心円状に周囲に移動し、L1はその細胞運動を早期(1日目)より著明に高めた。グリオーマ運動性因子はL1同様、運動性を高めたが、その効果は3日以後にみられた。一方、フィブロネクチンおよびテネイシンには運動促進効果がみられず、むしろ細胞は集塊化増殖をきたした。現在、グリオーマ細胞の浸潤様式について本切片モデルを用いて実験中である。本年度は、ラット脳器官培養を用いてグリオーマの浸潤動態について検討を行った。生後2日の新生仔ラットより大脳を摘出し、脳梁を含む厚さ30μmの大脳冠状スライスを作成した。脳スライス内の腫瘍浸潤を評価するため、0.4μmの孔径を有するCMmembrane上に8μm孔径のpolycarbonate membraneを重層し、スライス内を浸潤し上層のmembraneの下面に到達した腫瘍細胞を算定した。スライス培養1週間後、細胞標識蛍光色素

PKH2にて標識したC6グリオーマ細胞を脳スライス上面に静置させ共培養した。培養下室にはL1遺伝子導入細胞あるいは、その対照細胞または、培養液のみを用いた。また、抗L1抗体を用いた中和実験も行った。C6グリオーマ細胞はL1遺伝子導入細胞との共存により対照細胞および培養液単独に比べ、有意に多く8μm孔径の膜下面に遊走し、強い脳内浸潤を示した。また、この効果は抗L1抗体の添加により著明に抑制された。今回、確立した培養脳スライスはグリオーマ細胞との共培養が可能であり、in vivoに近い環境の下でのグリオーマ浸潤の動態を研究する上で極めて有用であると考えられた。