hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大腸菌タンパク質膜透過複合体・中間体の動的状態の捕捉

本研究計画では、大腸菌タンパク質膜透過装置の反応機構を解明する目的で、1)膜透過反応中間体をin vitroで可逆的に捕捉するための基質・阻害剤系を開発し、2)これを用い、野生型またはsec突然変異体より調整した細胞質膜反転膜小胞における膜透過反応中間体を蓄積、これと相互作用している因子を同定する、の2点を目指した。現在までの進捗状況pro-OmpA-Hisおよびpro-MBP-Hisを発現・精製する系を確立した。まず、大腸菌分泌タンパク質OmpAおよびMBPのC-末端に6個のヒスチジン残基をもつ融合タンパク質過剰発現プラスミドを構築した。分泌タンパク質前駆体の精製にはこれを細胞内に蓄積させる必要がある。このため、極めて強い分泌阻害を,Ydrの過剰生産とsecY24突然変異により誘起した株内で、これら基質タンパク質を上記プラスミドより発現させた。この株から,Ni-NTAagaroseとDEAE-SepharoseまたはButyl-Sepharoseの組み合わせによって,pro-OmpA-Hisとpro-MBP-Hisが各々精製された。得られたpro-OmpA-Hisは、野生型のpro-OmpA同様in vitroの膜透過反応の良い基質となった。一方,Ni^<2+>と錯体を形成するnitrilotriacetate(NTA)基とアミノ基をもつ分子をリジン誘導体より化学合成し、これを2価架橋剤をもちいてアビジンに結合した。NTA-アビジンは、Hisタグと強く相互作用し、基質タンパクの膜透過を妨げると考えられる。現在、この架橋反応産物より,NTA基を1つもつアビジンを精製中である。今後の展開予想したとおりにHisタグを含む分泌タンパク質前駆体の膜透過が、NTA-アビジンによって阻害されるかを確かめている。この後、基質タンパク質におけるタグの導入位置を変えたものを作成し、これらを用いて反応を止めた場合に基質と相互作用している膜透過装置の構成成分に違いがあるか、また、sec突然変異体より調整した膜小胞での反応で差異があるかなどを解析して行きたい。
鱗翅目昆虫幼虫の摂食行動制御機構における味覚と生体アミン情報の役割と接点

ヤママユガ幼虫で味覚刺激による飲み込み行動を調べたところ、糖類による誘発とアルカロイドによる抑制作用があり、それらを受容する味覚細胞の存在する場所(小腮、上咽頭)との関連はなかった。カイコ幼虫で生体アミン関連物質の注射により摂食行動を調べたところ、オクトパミンによる摂食量の亢進、セロトニンによる抑制があった。また、ドーパミン受容体のアンタゴニストに摂食抑制作用があり、D2-likeドーパミン受容体のアゴニストに高い摂食亢進と排糞作用があることがわかった。広食性カイコとショ糖飼料を用いた実験により、そのアゴニストはショ糖の味覚情報処理を中枢又は末梢で制御すると考えられた。カイコとヤママユガ幼虫において、口器に水滴を与えて飲み込み速度を解析する方法を用いて、味覚刺激による摂食行動の影響を調べた。両種ともショ糖は飲み込み行動を誘発し、イノシトールと果糖はヤママユガで飲み込み行動を誘発したが、ストリキニーネは抑制的に作用した。チョウ目昆虫幼虫は小腮と上咽頭に味覚細胞があり、両種ともショ糖受容細胞は小腮に1対ずつ、イノシトール受容細胞はカイコでは小腮と上咽頭に類似の性質を示す各1対の細胞が、ヤママユガでは小腮に異なる応答パターンを示す2対の細胞が存在する。また、ヤママユガの上咽頭には果糖とストリキニーネに応答する細胞が別々に存在する。通常は咀嚼することなしに飲み込み行動が起こることから、咀嚼と飲み込みは独立した運動であり、味覚刺激の種類によって異なる反応があることがわかった。小腮と上咽頭に反応の違いは見られなかった。カイコ5齢幼虫に生体アミンの関連試薬を注射した後の人工飼料の摂食量、排糞量、摂食行動リズム等の解析を行ったところ、オクトパミンによる摂食量の亢進、セロトニンによる抑制があり、チラミンとドーパミンでは変化がなかった。アンタゴニストを注射した結果、ドーパミン受容体のアンタゴニストに摂食抑制作用があることがわかった。D2-likeドーパミン受容体のアゴニストであるブロモクリプチン(Bro)を注射すると、高い摂食亢進と排糞が認められた。このBroのショ糖の味覚刺激に対する影響を解析するために、味覚物質としてショ糖しか含まない飼料を食べる2系統の食性異常カイコにおいて行動解析を行った。その結果、1系統で摂食亢進が観察されたため、Broはショ糖の味覚刺激を促進している可能性がある。Bro類縁体のペルゴリドについても試験した結果、摂食量は増加傾向にあったが、排糞量や摂食行動のリズムの変化は観察されなかったことから、Broとは異なる受容体に作用している可能性がある。我々は、カイコの摂食行動に影響を及ぼす生体アミンを調査する中で、ドーパミン(DA)とその受容体を介した細胞内シグナルが摂食制御に大きく関わっていることを明らかにしてきた。特に、D2-like DA受容体選択的アゴニストであるブロモクリプチン(Bro)をカイコ幼虫に注射すると強力な摂食亢進作用が現れることを見出した。そこで今年度は、D2-like DA受容体を介した摂食亢進と味覚との接点を明確にするために、広食性カイコ(あさぎりなど)を用いたショ糖飼料での詳細な行動実験を行った。その結果、Broは摂食刺激物質であるショ糖の味覚シグナルを中枢または末梢で制御することで、カイコの摂食量を向上させていることが行動レベルで明らかとなった。あさぎりに関しては、4齢期で飼育飼料が変わると、実験で用いるショ糖飼料の摂食量が低下し、その分Broの亢進作用が顕在化しやすくなることも見出した。以上のことから、カイコの体内には、系統の違いによる差異はあるものの、D2-like DA受容体を介したショ糖シグナルの調節とそれに伴う摂食制御機構が存在することが分かった。D2-like DA受容体として、これまでBmDopR3を我々はクローニングしていたが、別予算の研究で、新規D2-like DA受容体BmDopR4遺伝子の全長クローニングにも成功したことで、ショ糖シグナルの調節に関与するD2-like DA受容体の候補として、カイコには2種類のD2-like DA受容体BmDopR3とBmDopR4が関係している可能性が出てきたことは、昆虫生理学上、非常に興味深い知見である。ヤママユガ幼虫において、口器に水滴を与えて飲み込み速度を解析する方法を用いて、味覚刺激による摂食行動の影響を調べた結果、ショ糖、イノシトール、果糖は飲み込み行動を誘発したが、ストリキニーネは抑制的に作用した。ショ糖とイノシトールを受容する味覚細胞は小腮に存在し、果糖とストリキニーネに応答する細胞が上咽頭に存在することから、少なくとも飲み込み行動においては、味覚刺激の種類によって異なる反応があり、味覚細胞の存在場所による違いはないことが分かった。

ドーパミン受容体のアンタゴニストに摂食抑制作用があり、D2-likeドーパミン受容体のアゴニストであるブロモクリプチンを注射すると、高い摂食亢進と排糞が認められた。以上のことから、鱗翅目昆虫幼虫の摂食行動制御に、味覚と生体アミンの情報が重要な役割をしていることが分かる。D2-likeドーパミン受容体を介した摂食亢進と味覚との接点を明らかにするために、広食性カイコ(あさぎり等)を用いたショ糖飼料での行動実験を行った結果、ブロモクリプチンは摂食刺激物質であるショ糖の味覚シグナルを中枢又は末梢で制御することで、カイコの摂食量を向上させていることが分かった。すなわち、カイコの体内には、D2-likeドーパミン受容体を介したショ糖シグナルの調節とそれに伴う摂食制御機構が存在することが明らかになった。ヤママユガ幼虫で味覚刺激による飲み込み行動を調べたところ、糖類による誘発とアルカロイドによる抑制作用があり、それらを受容する味覚細胞の存在する場所(小腮、上咽頭)との関連はなかった。カイコ幼虫で生体アミン関連物質の注射により摂食行動を調べたところ、オクトパミンによる摂食量の亢進、セロトニンによる抑制があった。また、ドーパミン受容体のアンタゴニストに摂食抑制作用があり、D2-likeドーパミン受容体のアゴニストに高い摂食亢進と排糞作用があることがわかった。広食性カイコとショ糖飼料を用いた実験により、そのアゴニストはショ糖の味覚情報処理を中枢又は末梢で制御すると考えられた。広食性カイコを用いたショ糖飼料での行動実験は、予想以上の成果を得ることができた。しかし、代表者の所内異動により、味覚器官の切除による飲み込み行動の解析や電気生理学的な解析はほとんど進めることができなかった。カイコ口器感覚器官でのアミン受容体発現解析に関しても、微小な組織ゆえ、サンプリング条件の検討と実際の摘出に時間を要し、解析まで到達できなかった。別予算で進めていた新規カイコD2-likeドーパミン受容体BmDopR4の全長クローニングには成功し、本研究に有益な情報をもたらした。昆虫行動生理本研究は、平成27年度まで継続される予定だったが、諸事情により今年度で中断となった。今後は、得られた成果を論文にまとめるとともに、特に大きな進展が見られたドーパミンシグナルと摂食・味覚との関係性について、さらに詳しく解析を進めていく。カイコ口器感覚器官における発現挙動解析についても、サンプリングまでは終わっているので、解析を進める。カイコから得られた生体アミンと味覚に関する知見を、農業害虫ハスモンヨトウへと展開するために、関連受容体のクローニングと同器官での発現解析も行うことを視野に入れて、科研費や他の外部資金の獲得を精力的に行う。カイコやヤママユガ幼虫における味覚刺激が飲み込み行動に及ぼす影響の解析、カイコ幼虫に生体アミン関連化合物を注射した後の摂食量、排糞量、摂食行動リズムなどの解析は、予定通り進めることができた。飲み込み行動は味覚刺激物質により反応が異なるが、味覚受容と行動との対応関係を明らかにすることができた。また、ヤママユガ幼虫を用いることにより味覚感覚子の場所(小腮と上咽頭)には影響がないことがわかった。食性異常のカイコでは、系統によりブロモクリプチンの効果が異なるという興味深い結果を得た。予定していた味覚器官の切除による飲み込み行動の解析やカイコ口器感覚器官等における発現挙動解析が出来なかったので、平成26年度に実施する。代表者の所内異動により、予定していた行動解析や電気生理学的解析をほとんど進めることができなかった。そのため、昆虫飼育費や行動実験で使用する種々の消耗品費に加え、電気生理関連の実験装置のメンテナンス費が余ることとなり、残額が発生した。
チェルノブイリ原発事故後ベラル-シ小児甲状腺がん発生頻度増加機序の解明

旧ソ連邦の崩壊後、1994年から3年間ベラル-シを中心に学術共同研究「小児甲状腺がん特別調査」を行ってきた。すでに関係機関や保健省、ミンスク医科大学、ゴメリ医科大学、ゴメリ診断センターとは良好な協力関係を構築し、放射能高汚染地区の小児検診活動が軌道に乗っている。昨年出版したNagasaki Symposium; Radiation and Human Health(Elsevier,1996)ではベラル-シ以外ウクライナ、ロシア、カザフ等の旧ソ連邦の放射線被曝者の実態を明らかにしてきた。1994年1995年の一期目はベラル-シ、ゴメリ州を中心に小児甲状腺検診プログラムの疫学調査の基盤整備を行い、共通の診断基準、統一されたプロトコールを作成し甲状腺疾患の確定診断を行った。特にエコー下吸引針生検(FNAB)を現地に導入し、細胞診を確立することで最終診断の上手術の適応を判定可能となった。更にゴメリ州で発見された小児甲状腺がん患者がミンスク甲状腺がんセンターで手術されることから、連携をとり、組織診断の確認や患者の追跡調査を行った(Thyroid 5; 153-154,1995,Thyroid 5; 365-368,1995,Int.J.Cancer 65; 29-33,1996)。チェルノブイリ周辺では慢性ヨード不足のため地方性甲状腺腫の診断の為、尿中ヨードの測定装置を開発し、現地での測定に役立て一定の成果を得た。すなわちヨード不足と甲状腺腫大の関係を明らかにした(Clin Chem 414; 581-585,1995)。一方、ヒト甲状腺発癌の分子機構や病態生理の解明のためには種々の基礎実験を行い、甲状腺癌組織におけるPTHrPの異常発現と悪性憎悪の関連性を明らかにした(J Pathol 175; 227-236,1995)。特に放射線誘発甲状腺癌の研究では細胞内情報伝達系の特徴から、細胞周期停止とアポトーシスの解離現象を解析した(Cancer Res 55; 2075-2080,1995)。その他TSH受容体の遺伝子異常(J Endocrinol Invest 18; 283-296,1995)、RET遺伝子異常(Endocrine J 42; 245-250,1995)などについても解析を行った。1995年1996年の二期目はベラル-シの小児甲状腺癌の激増がチェルノブイリの原発事故によるとする各国際機関発表を基本に被曝線量の再評価を試みた。しかし、ベラル-シの多くのデータは当時のソ連邦特にモスクワ放射線生物研究所を中心に測定、管理されており、窓口交渉やデータの共有化等で未解決の問題を残している。更にチェルノブイリ原発事故の対応はセミパラチンスクにおける467回の核実験の対策マニュアルに基づいて行われたことが明らかとなり、カザフを訪問し健康被害の実態調査(1958-1990年)について検討を加えた。一方、甲状腺癌の基礎研究においてはいくつかの新知見が得られている。1996年-1997年の三年目は、チェルノブイリ原発事故後激増する小児甲状腺がんの細胞診活動を継続し、30,000人の小児検診のうち60名近いがんを発見した。同時にほかの甲状腺疾患の診断が可能であった(Acta Cytol in press 1997)。チェルノブイリ以外に旧ソ連邦では467回の核実験を行ったセミパラチンスクが注目されるが、更に全土で100回以上の平和利用目的の原爆資料が判明した。甲状腺癌細胞を用いた基礎実験ではp53遺伝子の機能解析を温度感受性変異p53ベクター導入株を用いて行った。その結果、放射線照射における細胞周期停止とアポトーシスの解離現象にp53以外の因子が関与することが判明した。更にDNA二重鎖切断の再修復にp53が重要な役割を担っていることが明らかにされret再配列との関連性等が示唆された(Oncogene in press 1997)。TSH受容体遺伝子や脱感作の研究も進展している。しかしながら、放射線誘発甲状腺含発症の分子機構は未だ十分解明されておらず更なる研究が必要である。貴重なチェルノブイリ原発事故周辺の小児甲状腺がん組織の散逸やデータの損失を未然に防ぐためにも国際協調の下、Chernobyl Thyroid Tissue BankやPatient Network Systemなどの体制づくりも必要である。

更にゴメリ州で発見された小児甲状腺がん患者がミンスク甲状腺がんセンターで手術されることから、連携をとり、組織診断の確認や患者の追跡調査を行った(Thyroid 5; 153-154,1995,Thyroid 5; 365-368,1995,Int.J.Cancer 65; 29-33,1996)。チェルノブイリ周辺では慢性ヨード不足のため地方性甲状腺腫の診断の為、尿中ヨードの測定装置を開発し、現地での測定に役立て一定の成果を得た。すなわちヨード不足と甲状腺腫大の関係を明らかにした(Clin Chem 414; 581-585,1995)。一方、ヒト甲状腺発癌の分子機構や病態生理の解明のためには種々の基礎実験を行い、甲状腺癌組織におけるPTHrPの異常発現と悪性憎悪の関連性を明らかにした(J Pathol 175; 227-236,1995)。特に放射線誘発甲状腺癌の研究では細胞内情報伝達系の特徴から、細胞周期停止とアポトーシスの解離現象を解析した(Cancer Res 55; 2075-2080,1995)。その他TSH受容体の遺伝子異常(J Endocrinol Invest 18; 283-296,1995)、RET遺伝子異常(Endocrine J 42; 245-250,1995)などについても解析を行った。1995年1996年の二期目はベラル-シの小児甲状腺癌の激増がチェルノブイリの原発事故によるとする各国際機関発表を基本に被曝線量の再評価を試みた。しかし、ベラル-シの多くのデータは当時のソ連邦特にモスクワ放射線生物研究所を中心に測定、管理されており、窓口交渉やデータの共有化等で未解決の問題を残している。更にチェルノブイリ原発事故の対応はセミパラチンスクにおける467回の核実験の対策マニュアルに基づいて行われたことが明らかとなり、カザフを訪問し健康被害の実態調査(1958-1990年)について検討を加えた。一方、甲状腺癌の基礎研究においてはいくつかの新知見が得られている。1996年-1997年の三年目は、チェルノブイリ原発事故後激増する小児甲状腺がんの細胞診活動を継続し、30,000人の小児検診のうち60名近いがんを発見した。同時にほかの甲状腺疾患の診断が可能であった(Acta Cytol in press 1997)。チェルノブイリ以外に旧ソ連邦では467回の核実験を行ったセミパラチンスクが注目されるが、更に全土で100回以上の平和利用目的の原爆資料が判明した。甲状腺癌細胞を用いた基礎実験ではp53遺伝子の機能解析を温度感受性変異p53ベクター導入株を用いて行った。その結果、放射線照射における細胞周期停止とアポトーシスの解離現象にp53以外の因子が関与することが判明した。更にDNA二重鎖切断の再修復にp53が重要な役割を担っていることが明らかにされret再配列との関連性等が示唆された(Oncogene in press 1997)。TSH受容体遺伝子や脱感作の研究も進展している。しかしながら、放射線誘発甲状腺含発症の分子機構は未だ十分解明されておらず更なる研究が必要である。貴重なチェルノブイリ原発事故周辺の小児甲状腺がん組織の散逸やデータの損失を未然に防ぐためにも国際協調の下、Chernobyl Thyroid Tissue BankやPatient Network Systemなどの体制づくりも必要である。
胃癌リンパ節転移特異性lncRNAの解明-胃癌外科的個別化治療を目指して-

我々はこれまでに胃癌のリンパ節転移のメカニズムを解明するために、転移形成に関与する有用性の高いlncRNAの検索を施行し、リンパ節転移、さらには腹膜播種転移と強く関連を認めるlncRNA Xを同定することができた。このlncRNA Xは、正常粘膜と比較して胃癌組織において高発現を示し、さらに生存期間の独立した予後規定因子を示すだけではなく、腹膜播種転移の独立した危険因子であった。さらにin vivoの実験系においてlncRNA Xの増殖への関与を検証した結果、lncRNA XをsiRNAにて制御された細胞株において、有意に腫瘍増大の抑制が図られた。癌転移メカニズムの解明と克服法の確立は生命予後改善に大きく貢献する。癌細胞原発巣からの遊離、転移巣での接着、浸潤と増殖、血管新生の各過程に多数の転移促進・抑制分子群が関与している。そこで我々はこれまでに胃癌リンパ節転移のメカニズムを解明するために、転移形成に関与する有用性の高いlncRNAの検索を施行し、リンパ節転移、さらには腹膜播種転移と強く相関を認めるlncRNA Xを多数サンプルの原発巣発現解析から同定することができた。このlncRNA Xは、正常粘膜と比して胃癌組織において、高発現を示すことを、qRT-PCR、ならびにin situ hybridizationで確認し、さらに生存期間の独立予後規定因子を示すだけでなく、腹膜播種転移の独立危険因子を示した。さらにそのlncRNA Xの胃癌細胞における機能解析を進めるため、lncRNA X高発現胃癌細胞株2細胞を用いて、siRNA transfectionを行い、現在、増殖、浸潤、遊走能にかかわるかどうかについて、検討を行っている。さらにそのlncRNA Xの胃癌細胞における機能解析を進めるため、lncRNA X高発現胃癌細胞株2細胞を用いて、siRNA transfectionを行い、増殖、浸潤、遊走能への関与を検証した。さらにin vivoの実験系においてlncRNA Xの増殖への関与を検証している。さらにin vivoの実験系においてlncRNA Xの増殖への関与を検証した。その結果、lncRNA XをsiRNAにて制御させた細胞株において、有意に腫瘍増大の抑制が図られた。この結果はすでに学術論文として投稿し、受理されている。in vivoの検証ではlncRNA XはXenograftの腫瘍増大の関与を示し、腹膜播種への進展に大きな影響を与えることを証明した。更に、新たなコホートサンプルを用いて、胃癌組織中のlncRNA X発現解析のために、FFPEサンプルからtotal RNAを抽出し、その発現定量を行っているところである。上部消化管複数のコホートサンプルを用いて、lncRNA Xの臨床病理学的因子との関連を検証し、予後、再発ならびにリンパ節転移、腹膜播種転移を診断するバイオマーカーとしての意義と再現性の検討を加える予定である。サンプルからのRNA抽出とその発現解析の再現性確認をin situ hybridizationを実施中ではあるが、対象がlncRNAであるため至適条件設定に時間を要した。またsiRNAtransfectionにおける至適条件設定もやや時間を要したが、現在、in vitro実験は遂行中である。

研究計画が順調に遂行し、予定していた研究費の使用額が減じたことによる。臨床サンプルの検討では、バイオマーカーとしての意義と再現性の有無を含めて、新たなコホートサンプルを用いて、lncRNA Xの発現解析とその臨床病理学的因子について、再度検討を加える予定である。また並行してin vivo実験を行っていく。試薬、消耗品に使用をする予定である。実験の条件設定に時間を要したため、当初の実験計画では25年度に実施予定であった実験を26年度に実施することになった。
先天性心疾患に合併するチアノーゼ性腎症の発症機序の解明

チアノーゼ性心疾患の重篤な合併症であるチアノーゼ性腎症の病態解明を試みた。腎生検組織では、糸球体腫大・血管係蹄拡張・メサンギウム細胞/基質の増加を、免疫染色ではHIF-1αとVEGFの発現を糸球体内皮細胞に認めた。これらは正常対照では認めなかった。患者の血漿中VEGF、VEGF-a、VEGF-cは、前2者は正常対照と差を認めなかった。しかし、血漿VEGF-cは患者で有意に上昇していた。さらに、10種の血漿中サイトカインのうち、TNF-αのみが患者で有意に上昇していた。本研究により本症の発症には、糸球体内皮細胞におけるHIF-1αとVEGFの発現が関与している可能性が判明した。予備研究では少数患者の腎組織でHIFやVEGFの発現を確認したが、患者数を増やし臨床経過、腎組織と免疫染色(HIF-1α,HIF-1β,VEGF,NF-κB,TUNEL)を調べた。1患者の背景:患者8名(男5女3)の腎生検時年齢中央値23.5歳(14-33)。原疾患は単心室4名、肺動脈閉鎖2名、完全大血管転移1名、ファロー四徴症1名。腎生検時のeGFR中央値は68(38-118)、CKDステージ分類はstage 1(n=2), 2(n=3),3a(n=1),3b(n=2)。7名で蛋白尿を認め、尿TP/Cr中央値1.8、4名で微小血尿を認めた。Hb中央値19.0g/dL(17-24)。最終転帰4名死亡。2腎組織の検討:糸球体腫大と係蹄拡張・メサンギウム細胞/基質増生を全例で認めた。傍糸球体装置過形成性を6名で、基底膜二重化を3名で、巣状分節性硬化を4名で認めた。8名全てHIF-1αが糸球体内皮細胞に発現し、VEGFも8名全員内皮細胞に認めた。正常コントロールでは認めなかった。一方、HIF-1βは糸球体と尿細管の細胞核に本症とコントローの全員に染色された。NF-κB,TUNELは本症、コントロール全員陰性であった。【考察】HIF-1βは恒常的な核内蛋白とされ、本研究でも核内に発現を認めた。一方、HIF-1αは酸素濃度で制御され、正常酸素濃度ではプロテアソームの分解を受けるが、低酸素では分解が抑制され、核内へ移行しHIF-1βと結合し、VEGFやグルコースの能動輸送に関わるGLUT-1、赤血球増生を促すEPOなどの増殖因子を誘導し、低酸素に適応をはかる。本症ではHIF-1αとVEGFの発現を認め、本症に特異的と考えられた。一方、低酸素と炎症は関係があり、HIF-1αの誘導蛋白により腎症が惹起される可能性もある。しかし、NF-κB,TUNELは陰性であり、HIF-1αやVEGFは低酸素への適応のため可能性が高い。チアノーゼ性腎症はチアノーゼ性心疾患に伴い蛋白尿や腎機能低下を呈する疾患である。その原因は低酸素に伴った赤血球増多症と過粘調度症候群による糸球体内圧の上昇、さらに右左短絡による巨核球の腎皮質の浸潤と巨核球由来の血小板由来成長因子(PDGF)や形質転換成長因子(TGF-β)によるメサンギウム細胞や基質の増殖によるとされるが、詳細な機序はいまだに不明である。本研究は、その発症機序や病態生理を研究する。初年度の研究では免疫染色では患者8名全てにHIF-1αとVEGFを糸球体内皮細胞に認めた。正常コントロール3名では認めなかった。一方、炎症に関与する転写因子のNF-κB、アポトーシスのマーカーであるTUNELは染色されなかった。本年度は、チアノーゼ性腎症の進展機序が低酸素下の過剰な酸化ストレスによる可能性を考慮し、酸化ストレスの代表的産物としての4-HNE[4-hydroxy-2-nonenal]、8-OHdG(8-Hydroxydeoxyguanosine)の免疫組織染色を行った。しかしながら、両者とも患者および正常コントロールにおいても染色されなかった。すなわち、少なくとも強度の酸化ストレスによる組織障害は見いだせなかった。さらに前年度の研究において、チアノーゼ性腎症患者の腎組織内でVEGFの発現を認めたため、患者(n=5)血漿中のVEGFの測定を試みた。しかしながら、正常コントロール(n=9)との間に有意差を認めなかった(466±385 pg/mL vs 247±65pg/mL, P=0.09)。このことより、患者におけるVEGFは糸球体内に限局して発現が増加している可能性が示された。また、VEGFは蛋白尿が多い患者の方が強く発現している傾向が判明した。しかしながら、VEGFの腎臓内における発現が、低酸素に対して保護的に働いているのか、障害的に働いているかの検討が今後の課題である。初年度の研究で、チアノーゼ性心疾患における重篤な合併症であるチアノーゼ性腎症患者(n=8)の腎臓糸球体内皮細胞におけるHIF-1αとVEGFの発現が示された。

しかし、腎組織内でVEGFの発現を認めた患者(n=5)の血漿中VEGFは、正常コントロール(n=9)と有意差を認めなかった。しかし、VEGFには種々の分画があり、分画の検討が必要と考えられた。またVEGF以外にの炎症に関与する物質の存在が推定された。今年度は患者の血漿中の炎症性サイトカイン、VEGF分画(VEGF-a,VEGF-c)について、ルミネックス法を用い探索した。VEGF-aは血管内皮細胞の遊走・増殖に関与し、分画のなかでも主要な位置を占める。一方、VEGF-cは血管の増殖以外に、血管透過性亢進、さらにリンパ管の新生やがん転移にも関与する。本研究では、本症患者4名とコントロール9名において、血漿中のG-CSF、IFN-g、IL-1b、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17、MCP-1、TNF-a、VEGF-a、VEGF-cを測定した。その結果、患者においてTNF-α(患者vsコントロール;6.6±2.8 pg/mL vs 15.6±5.8pg/mL,P=0.04)とVEGF-c (同;892.8 ±192.9 pg/mL vs 56.4±27.4 pg/mL,P=0.003)の2つの分子が血漿中で有意に高値であった。本症の発症には、TNF-αやVEGF-cが関与している可能性が示唆された。しかし、本症は希少疾患であり検討した検体数が少ない事や腎症未発症のチアノーゼ性心疾患患者のこれらの物質との比較をしていないことがlimitationとなる。今後さらに検体数で検討し、患者糸球体内でのTNF-αやVEGF-cの免疫染色などを行う予定である。本研究から、チアノーゼ性心疾患患者の予後に影響するTNF-αやVEGF-cなどへのモノクローナル抗体の臨床応用は、根治療法のない本症の治療開発に発展する可能性があることが示された。チアノーゼ性心疾患の重篤な合併症であるチアノーゼ性腎症の病態解明を試みた。腎生検組織では、糸球体腫大・血管係蹄拡張・メサンギウム細胞/基質の増加を、免疫染色ではHIF-1αとVEGFの発現を糸球体内皮細胞に認めた。これらは正常対照では認めなかった。患者の血漿中VEGF、VEGF-a、VEGF-cは、前2者は正常対照と差を認めなかった。しかし、血漿VEGF-cは患者で有意に上昇していた。さらに、10種の血漿中サイトカインのうち、TNF-αのみが患者で有意に上昇していた。本研究により本症の発症には、糸球体内皮細胞におけるHIF-1αとVEGFの発現が関与している可能性が判明した。4-HNE[4-hydroxy-2-nonenal]、8-OHdG(8-Hydroxydeoxyguanosine)の免疫染色は条件設定に時間がかかったが、その検討を適切に実施しえた。また患者血清のVEGFの測定を行ったが、より多数例での検討が必要と考えられた。しかしながら、チアノーゼが持続する先天性心疾患の患者の予後は不良であり、検討対象となっている患者の2名が根治術後の合併症と肺動脈瘤の破裂により死亡している。通院中の生存患者が少なく、単施設では検体を得ることが難しいことが問題である。小児腎臓病学、小児リウマチ学VEGFには種々の分画があり、疾患により分画の増加や減少が異なるため、VEFGの分画(VEGF-A,C,D)による詳細な検討が必要であると考えられた。来年度は本症患者の血漿・血清中の炎症性サイトカインの測定を実施し、本症の発症機序に低酸素が誘導する炎症の関与について検討する。さらに糸球体内の毛細血管係蹄の増加の原因について、VEGF分画に加えPLGF, HGFなどの成長因子の測定を検討する。さらに患者の血球を用いたマイクロアレーによる低酸素化の分子の発現変化についても検討する。今年度の計画はおおむね順調である。
アポトーシスを誘導するTIA1の機能の解析

腫瘍に対する宿主の抗腫瘍活性を特異的に高めることを目的とした養子免疫遺伝子治療法を開発するためには、特異的な抗腫瘍活性を担う殺細胞Tリンパ球(CTL,cytotoxic T lymphocytes)の働きを増強することがポイントとなる。CTLが標的細胞を殺す機序として重要なものにアポトーシスによる細胞死の誘導がある。本研究では、CTLの抗腫瘍活性を強化することを目標として、CTLから分泌されて標的細胞のアポトーシス誘導に重要な働きをすると考えられるRNA結合タンパクTIA1の機能の解析を行う。本期間中は以下のような実験成果を得た。1.ヒト単球細胞株THP1のmRNAからRT-PCR法を用いて、TIA1のcDNAをクローニングし、コード領域の塩基配列を確認した。2.ヒトTIA1のcDNAのコード領域を大腸菌T7発現ベクターpETヘクローニングし、これを用いてTIA1タンパクを大量に調製した。このタンパクはmRNA(ポリA)に非常に強固に結合することが明らかとなった。3.TIA1のcDNAのコード領域をMoloney murine leukemia virus(MoMLV)から作成・改良したレトロウイルスベクターMFGへ構築した。これをマウス線維芽細胞由来のプロデューサー細胞へトランスフェクトし、タイターの高い組み換えレトロウイルスを作成中である。4.マウスの皮下に移植したB16メラノーマ腫瘍塊から分離したTIL細胞に、in vitroで遺伝子を導入するために基礎実験として以下のような実験を行った。(2)レトロウイルスによるマーカー遺伝子lacZの導入をさまざまな方法により試みたが、TILに対する遺伝子導入効率は1%以下ときわめて低率であった。(3)斉藤泉らの作製したアデノウイルスベクター(Adex1CAlacZ)を用いて、3日目で90%の高効率でTIL細胞にマーカー遺伝子を発現させることができた。(4)現在、マウスIL2、マウスIL7のアデノウイルス発現ベクターを用いて、TILへの遺伝子導入により抗腫瘍活性の強化が図れるかどうかを検討している。これに成功すれば、さらにTIA1のアデノウイルスベクターによる遺伝子導入も試みる予定である。
商用周波数で磁気共鳴させた鉄筋コンクリート越しのワイヤレス給電

金属格子や板越しのワイヤレス給電(WPT)を実現するために磁気共鳴方式のWPTに低周波の磁場を用いた。超低周波を用いると電磁コイルの重量が重たくなる欠点があるため、WPTの専用シミュレータを開発して軽量な電磁コイルの設計を行った。その結果、以前に作成した電磁コイルの重量が11.9kgであったのに対して1.69kgまで軽量化することに成功した。また、装置の性能は、伝送距離30mmにおいて伝送効率91%、伝送電力426Wを実現した。さらに、伝送空間を1mm厚のステンレス板で隔てた場合においても伝送効率80%、伝送電力317Wの高い性能を実現した。これらの伝送性能は過去の報告例に比べ格段に高い。一般的に非接触給電における電源周波数には,10 kHz以上が用いられている.周波数が高いとコイルのQファクターを高くすることができ,結果として長距離の伝送距離を実現することができる.しかし,伝送空間に伝導体や誘電体がある場合は,そこでの電力損失を考慮すると必ずしも高周波であることが望ましいわけではない.周波数を商用電源周波数まで極端下げた場合においては,鉄骨での渦電流損が少なく,コンクリートでの誘電損失がほとんど発生しなため,鉄筋コンクリート越しでも電力伝送が可能になると期待できる.研究期間の初年度(研究期間3年間)である本年度は,60 Hz非接触給電システムの等価回路解析と時間領域差分(FDTD)法による電磁界解析を統合したシミュレーターの開発を行った.等価回路解析では,鉄損と漂遊負荷損を考慮した式の導出に成功した.また,これらの式を用いた計算結果が実験結果と良く一致すること確認した.FDTD法による電磁界解析では,計算時間の問題を解決するためグラフィックプロセッシングユニット(GPU)を電磁界計算のアクセラレーターとして用いる方法を試みた.これにより計算時間は,これまでのCPUを用いた場合の計算時間に比べ1/163に短縮することに成功した.等価回路解析とFDTD法を組み合わせた新たなシュミレーターにより短時間でシミュレーションが行えるようになり非接触給電装置の最適設計を行うことが可能になった.研究成果は,学術論文として電気学会の産業応用部門誌に投稿した.研究期間の初年度(研究期間3年間)である本年度は,次年度において最適設計を行うためのシミュレーターの作成を中心に行った.当初計画していた等価回路解析とFDTD法を融合した専用シミュレーターを作成することに成功した.また,当初から課題として認識していた計算時間の問題は,GPUによる並列計算により劇的に改善することができた.また,研究成果は,学術論文として電気学会の産業応用部門誌に投稿することができた.以上より進捗状況は順調である.一般的な電磁誘導および磁気共鳴方式を用いた非接触給電装置では、伝送空間に金属製品があると、それ自身に流れる渦電流により高温に発熱してしまう問題がある。よって、鉄筋コンクリートや金属製の壁越しに非接触給電を行うことは、既存の技術では難しい。そこで、本研究では、商用電源周波数程度の超低周波に着目した。超低周波では、金属内部への磁場侵入深さが長いため金属の壁越しにでも高効率、大電力で電力伝送できる見込みがある。(実際に数mm程度のステンレス板越しに電力伝送可能であることを確認している。)研究期間の2年目である本年度は、当初の研究計画に従い最適設計を行うための設計方法およびシミュレーターの開発に着手した。設計方法に関しては、等価回路解析と時間領域差分法による電磁界解析を組み合わせることで精度の高い理論予測ができることがわかった。この研究成果は、学術論文誌に掲載された。また、シミュレーターに関しては、時間領域差分法の欠点である計算時間の問題を解決するためグラフィックスプロセッシングユニット(GPU)を用いた並列計算に取り組んだ。その結果、計算時間をこれまでの約1/80に短縮することに成功した。この研究成果についても学術論文としてまとめ、学術誌に投稿中である。以上の研究成果により、超低周波の非接触給電装置の設計が行えるようになった。最適設計による軽量化を行った結果、装置重量は、10 kgから2.7 kgまで軽量化することができた。3年間の研究期間の2年目である本年度は、最適設計支援のためのソフトウェア(シミュレーター)を完成させることが主な達成目標であった。また、シミュレーターを用いて設計し試作および特性試験を行うことも計画していた。ソフトウェアに関しては、等価回路解析と時間領域差分法を用いた電磁界解析を統合することで精度の高い理論予測ができることがわかった。しかし、計算時間が非常に長いという問題が起こったため、グラフィックスプロセッシングユニット(GPU)を用いた並列計算に取り組んだ。GPUを導入したことにより計算時間は約1/80に短縮され課題を解決することができた。それらの研究成果は、2編の学術論文としてまとめた。2編のうち1編は採録され、1編は投稿中である。また、完成に至ったソフトウェアを用いて設計した装置の試作、特性試験を行い、大幅な伝送性能の向上を確認した。以上の成果より本研究は順調に進展していると判断できる。研究期間の最終年度である今年度は、研究の最終目標である伝送空間に鉄骨などの金属物体がある場合でのワイヤレス給電に関してシミュレーションおよび実験の両面からアプローチした。尚、誘電体に関しては、前年度までに電力損失がほとんど発生しないことが明らかになったため、本年度は損失要因である金属体のみについて検討を行った。

研究当初は、鉄骨のようにスリットや格子状の隙間がある物体越しでしか電力伝送できないと考えていたが、シミュレーションを進めていく中で最適な周波数と最適なコイル形状が実現すれば、隙間の全くない金属板越しにも電力伝送できる可能性が明らかになった。本研究期間の前半において開発した超低周波ワイヤレス給電のためのシミュレーターを使い、ステンレス板越しのワイヤレス給電を実現するための周波数とコイル形状を明らかにした。その結果、400Hz付近の低周波が最も高効率かつ大電力で電力伝送できることがわかった。また、伝送性能を保持したまま、コイル形状の最適化のみでコイルの重量を2.9kgから1.5kgまで軽量化できることもわかった。これらのシミュレーション結果に基づき実機を設計、製作し、検証実験を行ったところ、ほぼ設計通りの伝送効率と伝送電力を実現することに成功した。例えば、1mm厚のステンレス板であれば、300Wを越える電力を80%を越える効率で伝送できた。これらの性能は、過去の報告例と比較すると格段に高い。この性能は、研究当初の目標を十分に達成している。金属格子や板越しのワイヤレス給電(WPT)を実現するために磁気共鳴方式のWPTに低周波の磁場を用いた。超低周波を用いると電磁コイルの重量が重たくなる欠点があるため、WPTの専用シミュレータを開発して軽量な電磁コイルの設計を行った。その結果、以前に作成した電磁コイルの重量が11.9kgであったのに対して1.69kgまで軽量化することに成功した。また、装置の性能は、伝送距離30mmにおいて伝送効率91%、伝送電力426Wを実現した。さらに、伝送空間を1mm厚のステンレス板で隔てた場合においても伝送効率80%、伝送電力317Wの高い性能を実現した。これらの伝送性能は過去の報告例に比べ格段に高い。本年度において開発した専用シミュレーターを使用して最適設計を行い.高性能な60 Hz非接触給電システムの作製を行う.磁性コアの形状が性能に強く影響することがこれまでの研究によりわかっている.よって,最適な磁極形状を見つけ出すことに主眼を置く.さらにこれまで検討していない負荷変動に対する性能の変化や連続運転における発熱など実用上の課題についても取り組む計画である.本研究課題は、当初の研究通り進展している。研究機関の最終年度である3年目は、ロボットなどの小型の移動体に搭載できるように装置の軽量化を最適設計により行う。現在装置の重量は2.7 kgであり、1.5 kg以下の重量を目標とする。軽量化された装置により、金属板越しのワイヤレス給電を実現する。目標とする性能は、2 mmのステンレス板越しに伝送電力300 W,伝送効率80%を目指す。また、負荷としてバッテリーやモーターを想定し、電力制御を行えるようにシステム全体を構築する。電力制御はPWM正弦波インバーターを作製して行う計画である。パワーエレクトロニクス論文登録料を予定していたが,現在,論文は査読中であり本年度は論文登録料を使用しなかった.また,ワイヤレス給電装置を製作するための材料として珪素鋼板の購入を予定していたが装置の小型化が実現して当初の計画よりも材料費が少なくて済んだため次年度使用額が生じた.
特異環境場におけるイオン液体-ガス貯蔵媒体としての特性解明と制御の試み

ブチル,ヘキシル,オクチルと異なる側鎖をもつイミダゾリウムカチオン([BMIM]^+,[HMIM]^+,[OMIM]^+)と,3種類のアニオン(PF_6^-,BF_4^-,(CF_3SO_2)_2N^-)との組合せからなるイオン液体について,二酸化炭素を加圧,吸収したときの電気伝導度を測定した。電気伝導度は低圧において直線的に増加し,その後ほぼ一定となった。この電気伝導度の変化は,カチオンのアルキル側鎖にはあまり依存しないが,アニオンの違いに敏感で(CF_3SO_2)_2N^-<BF_4-<PF_6^-の順で大きくなることが分かった。また,X線回折法により[BMIM]PF_6や[BMIM]BF_4に二酸化炭素を溶解した溶液の液体構造を調べたところ,二酸化炭素はアニオンに優先的に溶媒和していることが明らかとされた。この結果は,これらのイオン液体中において,二酸化炭素の炭素原子とアニオンのフッ素原子とのルイス酸-塩基的な相耳作用が重要であることを示唆している。実際,気相中で二酸化炭素とアニオンとの1:1型錯体の結合エネルギーが報告され,上述したルイス酸-塩基的な相互作用が支配的であることが確認されている。しかしながら,これらイオン液体における二酸化炭素吸収量はBF_4^-<PF_6^-<(CF_3SO_2)_2N^-の順序で増加し,エンタルピー的な相互作用ばかりではなく,エントロピーの寄与が大きいことが確認された。すなわち,バルキーで電荷が非局在化した(CF_3SO_2)_2N^-などは二酸化炭素を吸収可能な空隙も多く有利なことが示された。1-アルキル-3-メチルイミダゾリウム(アルキル鎖はブチル、ヘキシル、オクチル)をカチオン、PF6-、BF4-、(CF3SO2)2N-をアニオンとしたイオン液体に二酸化炭素を加圧、溶解したときの電気伝導度の圧力依存性を決定した。どのイオン液体の場合も、電気伝導度は7MPa付近までほぼ直線的に増加し、イオン液体中の輸送現象は二酸化炭素の溶解により大幅に改善された。さらに、電気伝導度をモル電気伝導度に換算し、その変化率を二酸化炭素のモル分率に対してプロットしたところ、BF4-と(CF3SO2)2N-をアニオンとしたイオン液体では側鎖の違いは観察されずほぼ同一線上に載ることが明らかとなった。PF6-をアニオンとしたイオン液体では、カチオンの側鎖が長くなるにしたがい濃度依存性は僅かながら大きくなる。一方、アニオン種が違う場合には、モル電気伝導度の濃度依存性は顕著に異なり、(CF3SO2)2N-<BF4-<PF6-の順で大きくなることが明らかとなった。これら3種類のアニオンからなるイミダゾリウムイオン液体への二酸化炭素の溶解度(ヘンリー定数の逆数に比例)はBF4-<PF6-<(CF3SO2)2N-で大きくなり、電気伝導度で観察された順番とは異なる。しかしながら、溶解エンタルピーの減少((CF3SO2)2N->BF4->PF6-)とは良く一致した。これらイオン液体中において二酸化炭素とアニオンとの相互作用を考えた場合には、BF4-やPF6-の方が(CF3SO2)2N-より有利であることが推察されるが、実際には(CF3SO2)2N-の溶解度が最も高く、二酸化炭素の溶解ではエントロピーの寄与が大きいことが明らかとなった。
抗体のクラススイッチ誘導に必須の遺伝子の同定

Activation-induced cytidine deaminase (AID)は抗体遺伝子のクラススイッチに必須の遺伝子であり抗体遺伝子に傷を入れることはわかっているが、AIDの直接の標的は何か明らかではない。本研究ではAIDがクラススイッチを誘導する詳細な機序を明らかにするため、AID以外のcDNA(おそらくAIDの標的RNA由来)でAIDノックアウトB細胞のクラススイッチが回復されることを示し、AIDの標的をクローニングすることを目的とした。スクリーニングの結果、AIDの標的と思われる候補分子の情報を得たので、今後それらのクラススイッチへの寄与を検討する。(研究目的)Activation-induced cytidine deaminase(AID)は抗体遺伝子のクラススイッチ(CSR)と体細胞突然変異(SHM)に必須の遺伝子である。その機序はDNA切断であることはわかっているが、AIDの標的がDNAであるか、RNAであるか、結論が得られていない。本研究ではAIDノックアウトB細胞ラインを樹立して、AID以外のcDNA(おそらくAIDにより編集されたcDNA)でCSRをレスキューできることを示し、AIDの標的がDNAではなく、RNAであることを証明し、かつAIDの標的RNAをクローニングすることを目的とする。(研究結果)平成20年度の計画の主軸はAIDノックアウトB細胞ラインの樹立であった。上記のレスキュー実験を成功させるためには実験に用いる細胞が重要である。現在、世界で使われているB細胞ラインのうち、もっとも効率良くCSRを誘導できるB細胞ラインはCH12である。現在までにCH12のAIDのノックアウトを申請者らの研究室も含めていくつかの研究室で試行されたが、いまだに成功していない。CH12のノックアウトに成功し報告された例は理研の王らのグループがpolymeraseのノックアウトに成功した一例だけである。彼らによればノックアウトの頻度は5000分の1程度と推定されている。王らのノックアウトの方法を参考にしながらノックアウト細胞のスクリーニングを行い、いくつかの候補細胞ラインを得ることができた。今後、サブクローニングなどを引き続き行う。(研究結果)平成21年度の計画の主軸はAIDノックアウトB細胞ラインの樹立であった。現在、世界で使われているB細胞ラインのうち、もっとも効率良くCSRを誘導できるB細胞ラインはCH12であるが、ノックアウトの頻度は5000分の1程度と推定されている。通常のノックアウトの手法では目的のクローンを得られなかったので新規の手法を試みるほか、AIDノックアウトマウスのB細胞でスクリーニングを行うべく、レスキュー用のライブラリーの作成も同時に行い、来年度内に結果を得られるように実験を進める。(研究結果)現在、世界で使われているB細胞ラインのうち、もっとも効率良くCSRを誘導できるB細胞ラインはCH12であるが、ノックアウトの頻度は5000分の1程度と推定されており、実際にノックアウト細胞を樹立できなかった。そのためAIDノックアウトマウスのB細胞でスクリーニングを行った。サイトカイン刺激でCSRを誘導した野生型マウスの脾臓B細胞からmRNAを分離し、AID mRNAをサブトラクトした後、cDNA libraryを作成した。library由来のcDNAによりCSRをレスキューされたAIDノックアウトB細胞を分離し、導入された遺伝子の検索を行っている。このスクリーニングで得られた候補遺伝子がCSRに必須の遺伝子であるかどうか、またAIDのターゲットmRNAであるかどうか、の確認実験が課題として残ったが、現在進行中である。
関節リウマチ滑膜線維芽細胞におけるヒストン修飾と DNA メチル化の解析

本研究において、関節リウマチ(RA)患者罹患関節における滑膜線維芽細胞において、RA病態に深く関与すると予想されるエピジェネティクな新規変化を複数明らかにした。その一つは関節破壊に直結する酵素で、もう一つは炎症を惹起する血液中の分子(炎症性サイトカイン)である。これら分子の発現制御に関与するヒストン修飾のなかで、RA特異的と考えられる変化を解明した。さらに、炎症性サイトカインの添加により病態に深く関与すると想像される変化を誘導する事も示した。本研究においては、RA滑膜線維芽細胞を用いて、DNAメチル化やヒストン修飾による遺伝子発現制御の異常を解明し、病態の一端を明らかにするとともに、RAの新規治療の開発に結びつける第1歩となるような新しい情報を獲得することを目的としている。平成22年度には、研究計画通りに、MMP蛋白群のヒストン修飾の変化が実際に遺伝子発現変化に関係するかどうかin vitroの系を用いて検討した。具端的には、整形外科膝関節人工関節置換術症例(RA8例、OA9例)から本人のインフォームドコンセントの下にヒト滑膜線維芽細胞(SF)を収集し、それらのmatrix metaloproteinases(MMPs)の遺伝子発現、プロモーター領域のヒストンメチル化およびアセチル化の検討を行った。その結果、興味深いことにRA患者由来SFにおいては、MMP-1,3,9,13のプロモーター領域のヒストンメチル化の有意な上昇を認めた。ヒストンアセチル化においてはMMP-13のみがRAにおいて有意に上昇していた。これらMMPsの遺伝子発現は、安静時にはRAとOA間で有意差はなかったが、液性因子の刺激に拠って一部のMMPsで発現上昇が見られた。この刺激下における遺伝子発現上昇とヒストン修飾の変化に相関がある可能性があり、現在蛋白発現を含む詳細な検討を行っている。このことが、RAの病態に関与する可能性がある。さらに他の蛋白に関しても発現とヒストン修飾の関係を検討している。この解析は来年度にも一部が持ち越されると予想する。申請者はヒストン修飾を中心として、関節リウマチ(RA)および変形性関節症(OA)患者滑膜線維芽細胞における変化が明らかな分子を見いだした。特に、RAに特徴的な関節破壊に強く関与することが知られている分子群の一部に、RAとOAで有意差をもってヒストンメチル化およびアセチル化に変化が見られた。特に興味深いのは、ある種の炎症性サイトカインをこの培養系に添加することによって、RA滑膜線維芽細胞にのみ蛋白産生が有意に増大するという変化を見出したことである。これは今まで全く知られていなかった現象であり、エピジェネティクスからの研究によって始めてその機序までを示すことが出来た。それが、現在明らかにした分子のヒストン修飾によって起るものか、それ以外の分子の介在をもって行われるものなのかは、今後明らかにする必要がある。それと伴に、これが本当にヒストン修飾の変化で起っているのかどうかもより詳細に示す必要があり、現在、RAおよびOA滑膜線維芽細胞に対してヒストン修飾を変化させる薬剤を投与することで、これら細胞の機能や表現形を変化させることが出来るかどうかを明らかに出来る様な実験を行っている。RA治療には現在幾つもの選択肢があるとはいえ、どれも治癒は寛解に直結するものではない。それは、RAの病因に迫る様な治療法が開発されていない空である。本研究の成果は、より病因の本体に迫ることが可能であり、新たな視点からのRA治療の道が開かれると期待出来る。滑膜細胞における関節リウマチ(RA)特異的エピゲノム変化を検討した。人工関節置換術施行に際して事前に、口頭および文章により患者本人の同意署名を得た後、手術にて採取されたRAおよび変形性関節症(OA)患者滑膜組織から分離した滑膜細胞(滑膜細胞様線維芽細胞)を用いて、クロマチン免疫沈降を行った。そのサンプルを用いて関節破壊に関与するマトリックスメタロプロテアーゼ群(MMPs)の1ー23までのヒストン修飾を検討した。その結果、MMP-3, 7, 9, 13のプロモーター領域においてヒストンメチル化の変化が見られた。これらの変化は、遺伝子転写亢進に働くと推定されるもので、実際にMMP-3, 7, 13ではIL-6依存性に著明な発現亢進を来すことが示された。一方、MMP-9に関しては、OAに比してRAにおいてヒストンメチル化の亢進は見られたものの、IL-6非依存性であった。さらに、同様の手法で、滑膜線維芽細胞のIL-6、IL-8など炎症性サイトカイン産生にヒストン修飾が関与するか検討した。その結果、プロモーター領域におけるヒストンメチル化およびアセチル化が、IL-6ではOAに比してRAで転写亢進に働くと推測される変化が見られた。実際に、は安静状態では変化は無いが、TNF-α添加によってIL-6 mRNAの著明な発現亢進が認められた。さらに、蛋白レベルでもIL-6産生亢進が確認出来た。

これらのエピゲノム的ヒストン修飾は、アセチル化およびメチル化酵素の活性変化によると推測され、現在これらの酵素活性に関して確認を行っている。上記結果は、日本リウマチ学会などにおいて発表しており、現在投稿準備を進めている。実験データーはかなり揃って来ている。滑膜の採取数もほぼ予定通りである。現在論文にまとめる準備をしている。24年度が最終年度であるため、記入しない。関節リウマチにおけるエピゲノムの関与を示すことが出来た。今後は、さらに機序の詳細、病態の本体にさらに迫ることが出来る様な方向に進める予定である。具体的には、MMPsにおける発現調節以外にも炎症性サイトカインやケモカインなどの制御に関与するエピゲノム変化を明らかにする。その一つとして、long non-coding RNAの関与を推測している。