hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
タイレリア原虫のゲノム情報に立脚したワクチン開発

今後、本ToSPAG抗原の牛小型ピロプラズマ症ワクチン候補としての検証を進めていくことが必須であると考えられる。牛小型ピロプラズマ症は牛に貧血を引き起こし、我が国における主たる放牧病として大きな問題となっている。しかし、効果的なワクチン及び治療薬は未開発でありその候補となる原虫抗原もほとんど明らかでない。このような状況を打破すべく、本研究では比較ゲノム解析によるin silicoでの抗原探索、およびウシ血液置換免疫不全マウスとマダニを用いたラボ内でのタイレリア感染実験系の確立を行った。原虫各発育期における転写発現解析を行い、ワクチン候補抗原リストの作成を行った。本実験系及び得られた遺伝子発現情報は今後、T. orientalisの生物学特性を解明していく上で必要不可欠なツールとなりうる。今年度は当初の計画通り、T. orientalis2株の比較ゲノム解析、進化選択圧解析とin silicoでのワクチン候補遺伝子の選定を完了できた。その結果候補に挙がってきた遺伝子が、すでに悪性タイレリアT. parva/T.annulataにおける有力なワクチン候補抗原であった事は、期待通りの結果であると言える。また、幾つかの条件検討を行った事により、ウシ血液置換免疫不全マウスとマダニを用いてT. orientalisの維持を安定して行う事ができるようになった。その結果、精製度の高い原虫を手に入れる事が可能となり、これら原虫を用いてRNAを精製する事が出来た。得られたRNAは当初の予定通り次世代シーケンサーでRNAseqを行い、解析に用いる十分な量と質のデータを得る事に成功した。これら一連の実験は当初の予定どおり、何ら問題なく順調に進行していると言える。作製した抗血清をもちいて、各原虫発育期における当該遺伝子の性状解析を進める。今年度はマウスでポリクローナル抗体を作製したが、さらなる詳細な解析のためにモノクロの作製も検討する。また、同種内における遺伝的多様性がないかどうか、国内外を含めて候補遺伝子の遺伝子多型の調査を行う。獣医寄生虫学これまでに比較ゲノム解析およびトランスクリプトーム解析により、T. orientalisの赤血球内・マダニ内における抗原候補遺伝子の選定がほぼ完了した。今後はこれらワクチン候補抗原の遺伝子多様性の評価、ワクチン候補遺伝子の生物学的特性を評価してゆく。すなわち、国内外で流行しているT. orientalisにおけるワクチン候補抗原の塩基配列を解読してその多様性を解析し、保存性の高い領域を絞り込む。また、候補抗原に対する抗血清を作製し、各原虫発育期における蛋白発現とその局在を解析する。こうしてワクチン候補として絞り込んだ遺伝子について、最終的には抗血清の受動免疫を行った感染マウスを用いて、そのワクチン評価を判定する予定である。およそ研究は順調に進行しているものの、当初予定していた国内外における感染牛DNAの解析にまで着手が及ばなかった。そのため、計上していたシーケンス費用を使用せず多少の次年度の持ち越しが生じた。
拡散強調画像法と脳磁場計測によるヒトの第一次味覚野の同定

ヒトの第一次味覚野の場所を同定するために,拡散MRIの取得を行い、先行研究の脳磁場計測によって得られている頭頂弁蓋部と島皮質の移行部(human area G)から視床味覚中継核(視床後内側腹側核小細胞部VPMpc)さらに後者から鼓索神経の投射する弧束核との繊維連絡を拡散MR画像から逆行性に追跡を行う.その結果、human area GからVPMpcへの投射は確認されたが、前頭弁蓋部からVPMpcへの投射は見られず、頭頂弁蓋部と島皮質の移行部がヒトの第一次味覚野であることが裏付けられた。本研究では、ヒトの第一次味覚野の場所を同定することを目的とし、同一の実験協力者に対して味覚誘発脳磁場計測および拡散MRI撮影を行った。味覚誘発脳磁場計測には産業技術総合研究所に設置されている64チャンネル全頭型SQUIDシステム(CTF Systems Inc.(現VSM Medtech Ltd.)製)を用い、拡散MRIの計測には首都大学東京に設置されている3テスラの拡散MRI装置(Philips製)を使用した。まず、味覚に対する主観的評価において障害を感じていない2242歳の男女7名(男性2名、女性5名、平均年齢29.0±8.9歳)を対象に味覚誘発脳磁場の計測を行った。脳磁場計測装置のSQUIDセンサと実験協力者の頭部との位置関係を知るために、実験協力者の鼻根部と両耳珠部にコイルを取り付けた。味覚刺激として0.3M食塩水を用い、刺激提示時間400ミリ秒、刺激提示間隔20秒という設定で1セッションあたり60試行を実施した。計測中、実験協力者は1試行ごとに、05の6段階尺度(0:無味5:強烈)を用いて味覚刺激の内省強度を評定した。データ解析において、瞬きなどのアーチファクトが混入した試行を除外した後、加算を行ったところ、加算回数は4260試行(平均55.4±6,9試行)であり、内省強度は1.73.2(2.5±0.5)であった。続いて、味覚誘発脳磁場計測に参加した実験協力者の内、2242歳の男女4名(男性1名、女性3名、平均年齢32.5±10.5歳)を対象にMRIによる脳の拡散強調画像撮影を行った。実験協力者には、脳磁場計測の際にコイルを取り付けた箇所と同じ部分にマーカーを取り付けた。脳磁場データから推定された脳の活動部位の座標をMR画像にマッチさせることにより神経繊維の連絡を追跡できる。脳磁場の活動部位の推定およびMR画像とのマッチングについては現在解析中である。拡散強調画像(DTI:diffusion tensor imaging)を用いた神経構造解析についての基礎的検討をおこなった。超高磁場(3T)の磁気共鳴画像撮像(MRI)システム(Achieva Series Quasar 3.0T; Philips Medical Systems)を用い、8チャンネルのSENSEヘッドコイルを適応し、各パラメーター:RT/ET=7420/88msec, motion probing gradient 32軸(b value 800(s/mm^2):32; b balue 0(s/mm^2):1)、128×128matrix; 1.8×1.8mmで、スライス厚2mmで60枚の断面を撮像することで得られた拡散強調画像(DWI)に対して、渦電流による歪の補正処理をおこなった後、DTIを求めるとともに同マトリクスから固有値λ1、λ2、λ3を求めるとともに、トラクトグラフィーを求めた。各固有値およびそれらから計算されるFA(fractional anisotropy,拡散異方性)の値やトラクトグラフィーの結果と脳各部位の構造との対応関係を検討した。ヒトの一次味覚野であれば視床(VPMpc: parvicellular part of ventromedial posterior nucleus)からの皮質への投射を受けているかどうかがポイントとなるため、同部位に設定した関心領域からのトラクトの追跡をおこなった。その結果、area Gと同部位との連続的接続が観察される一方で、前頭弁蓋部へはそれが認められなかった。同結果は、area Gがヒトの一次味覚野である可能性を示唆するものである。
哺乳動物毒における化学コミュニケーションの解明

動物由来の天然毒には、フグ毒テトロドトキシンなど、ユニークな構造や切れ味鋭い活性をもつものが多い。また加速進化により、有毒動物の生理活性ペプチドには構造・機能に多様性がみられる。このような新規神経毒の化学的解明は、薬理学・神経科学・精神医学など広範な生命科学の基礎研究に寄与し、また疼痛治療薬など新規薬剤の開発にも直結する。本研究では、化学生態学・進化学的にも興味深い希少な哺乳類由来の有毒物質の構造・機能の解明と、より高活性な神経毒アナログの創製を目指した。さらに、これらの神経毒について異種の哺乳動物がもつ類似化合物と構造や機能を比較し、独自に進化してきた種がもつ化学コミュニケーション物質の生物学・生態学的意義を探ることを目指した。1.ブラリナトガリネズミ由来の麻痺性神経毒BPP類の構造決定と合成:ミールワーム麻痺活性などを指標に、顎下腺抽出物から4853アミノ酸残基からなる新規ペプチドBPP1,2を単離し、全アミノ酸一次配列と3組のS-S結合の存在を決定した。パッチクランプ実験によりBPP2にCaチャネル開口活性がみられ、かつこの活性はN型Caチャネル阻害剤ω-コノトキシンにより阻害された。BPP類はヒト脳内で発現している生理活性ペプチドの前駆体と類似しており、生物進化の観点からも非常に興味深い物質であることがわかった。2.カモノハシ毒液由来のCNP断片ペプチドの作用機序解明と新奇神経毒リガンドの創製:これまでに発見したカモノハシ毒液由来のC型ナトリウム利尿ペプチドホルモン(CNP)の部分断片について薬理活性評価を行い、それ自身ではGABA受容体に作用しないが、GABAリガンドのアロステリック調節を担う作用が示唆された。今後さらに詳しい作用解析を行い、炎症や痛みに特異的に作用する新規神経毒リガンドの創出を目指したい。当初計画した研究内容が順調に実施できていると判断されるため。公募研究の2年目にあたる今年度は、(1) BPP類の標的受容体との結合様式の解明と高活性アナログの創出、(2)トガリネズミ麻痺性神経毒の種間比較および化学コミュニケーションの解明を主に実施する。リコンビナントBPP類の生産については目処が立っており、二次構造と生物活性の解明を目指す。そのために、これまでも協力いただいてきた電気生理学やペプチド科学の研究者に加えて、本新学術領域の計画研究班・総括班の先生方との連携も一層密にすることで、効率的に研究を進めていきたい。
分裂酵母を用いたRev蛋白及びRev蛋白結合因子の解析

HIVのRev蛋白は、RRE配列を持つmRNA前駆体のスプライシング反応の抑制と、イントロンを含んだままの前駆体RNAの核外への輸送を促進することが知られている。Rev蛋白は、動物細胞では核小体に局在し、HIVウイルスの生活環において重要な調節因子の役割を担っているが、mRNAの核外輸送機構の面からも極めて興味深い因子である。我々は、遺伝的操作が行いやすく、かつ高等真核生物との類似点の多い分裂酵母を用いて、Rev蛋白の機能及びRev蛋白と結合する細胞内因子の解析を試みている。まず、野生型分裂酵母内で発現させたRev蛋白の核内での分布を調べたところ、発現されたRev蛋白が酵母核の核小体側の核膜付近に多量に局在することを明らかにした。この結果は、Rev蛋白と相互作用する因子が、酵母に於いては、核小体側の核膜付近に存在している可能性を示唆する。さらに、我々が分離している7種類の分裂酵母におけるmRNA核外輸送温度感受性変異株(ptr1ptr7)におけるRev蛋白の局在を、許容温度下(26°C)およびmRNAの核外輸送が阻害される制限温度下(36°C)で解析したところ、変異株の一つptr7変異株内ではRev蛋白の核膜付近への局在が消失していることが明らかになった。このことは、Rev蛋白の核内局在がmRNA核外輸送機構と何らかの密接な関連性を持つことを示している。また、酵母Two hybrid systemを用いたRev蛋白結合因子の探索を続行中である。
角度依存X線二色性分光による磁性薄膜・多層膜の磁気異方性と軌道状態に関する研究

本研究課題においてはベクトルマグネットを用いた角度依存X線二色性分光装置の改良を行い、従来以上に精密な磁場角度依存X線磁気円二色性(XMCD)の実験を行うことができるようになった。また、この手法を用いて強磁性体中の電子軌道の占有状態を調べるための具体的な方法論を確立した。さらに、(La,Sr)MnO3やL10型FePtなど、スピントロニクス材料として期待される複数の強磁性体について角度依存XMCDの実験を行い、磁性薄膜の磁気異方性を議論するためには、従来考えられていた軌道磁気モーメントの異方性だけでなく、電子分布の異方性をも考慮に入れなければならないことを実験的に示した。種々の磁性薄膜、特に磁気異方性を示す薄膜についてX線磁気円二色性(XMCD)実験を行い、ミクロな電子状態・磁気状態の解明を試みた。・巨大磁気抵抗を示すことで知られる酸化物磁性体(La,Sr)MnO3 (LSMO)の薄膜について、格子定数の異なる2種類の基板に作製することにより応力を加えた薄膜に対し、角度依存XMCD実験を行った。XMCD強度の磁場方向依存性から、伸長性応力を加えると面内磁化容易、圧縮性応力を加えると面直磁化容易となることが確かめられ、先行研究と一致する結果を得た。さらに、通常のXMCDスペクトルとは異なるスペクトル成分が存在すること、およびその強度が基板応力に依存することが示された。この結果は、磁性を担う電子の密度分布(スピン密度分布)が球状からずれて歪んだ形状になっていること、またその形状の違いが両者の磁気異方性の違いに関係していることを示唆するものである。・強い垂直磁気異方性を示し、高密度磁気記録媒体の候補物質として知られるL10型FePt合金について、強い磁気異方性が生じる機構を探るため、FeおよびPt元素に対するXMCD実験を行った。その結果、Feについては軌道磁気モーメントに異方性が見られたのに対し、Ptでは観測されなかった。この結果は、FeよりもPtが大きな軌道磁気モーメントの異方性を持ちそれが垂直磁気異方性に寄与しているという既存の理論とは異なっており、別の理論モデルの必要性を示唆するものである。・電子軌道の整列による金属ー絶縁体転移を示す2種類のスピネル型酸化物Fe3O4およびCoV2O4に対して、角度依存XMCDから軌道磁気モーメントおよびその異方性を測定した。実験結果と理論モデルとの比較から、軌道整列の様子についての知見が得られ、金属絶縁体転移の詳細な機構解明につながる結果を得た。・「研究実績の概要」で示した通り、当初計画に挙げたLSMO薄膜およびFePt薄膜に対するXMCDの実験を行い、磁気異方性とミクロな電子状態との関係性を示す重要な知見(軌道磁気モーメントの異方性・スピン密度分布の異方性)を得た。この他に、Fe3O4薄膜およびCoV2O4薄膜の角度依存XMCD実験も行った。LSMO薄膜については、LAO基板試料の作製条件最適化を行ったうえで次年度引き続き実験を行い、結果の再現性を検証する予定である。・装置改良として、課題の一つであった試料温度の安定化について、試料ヒーターの高出力化を行うことにより改善を測った。また、温度計を交換し、磁場中での温度測定精度を向上させた。これらの改良を加えたうえで、上で述べたLSMO薄膜の角度依存XMCD測定をさまざまな温度において行い、磁気異方性の大きさの系統的な変化を実際に観測することができた。また、真空排気系のアップグレードを本年度行った。この他、S/N比の改善を目的とした防振対策として、試料押さえ治具および試料ホルダの改造を現在進めている。・角度依存XMCD装置の改良として、試料マニピュレータの輻射シールドの改良、試料マニピュレータを上下から押さえる機構の作製、およびチャンバ内の試料電流計測線の同軸信号線への変更、を行った。これらを通じ、測定信号に見られていた機械的および電磁的ノイズを減少させることに成功した。さらに、フーリエ変換を使用することによって、時間的に変化する信号から左右円偏光の切り替えに由来する信号だけを精度よく抽出する手法を見出した。これにより、S/N比の改善およびXMCDのバックグラウンドの抑制が可能であることが明らかになった。・マグネタイトFe3O4薄膜において、長年その機構の詳細が明らかになっていないVerwey転移と呼ばれる電荷・軌道秩序を伴う相転移の機構解明につなげるべく、角度依存XMCD実験による電子軌道状態の観測を試みた。前述の装置および解析法の改良により、軌道磁気モーメントの異方性およびXMCDスペクトルのわずかな異方性を従来よりも高い精度で求めることができた。・磁壁移動を利用した磁気記録デバイスとしての応用が期待されるCo超薄膜/重元素金属(Pt, W等)多層膜のXMCD実験を行った。その結果、Coの軌道磁気モーメントの異方性と、界面でのジャロシンスキー守谷相互作用(磁壁の形成に関与する相互作用)の大きさ・符号との間に相関が見られることが分かった。・強磁性体と半導体の双方の性質をもつ材料の実現を目的として作製された、半導体Geに磁性元素Mnを少量ドープした系のXMCD実験を行った。その結果、Mn濃度の揺らぎに由来して強磁性成分と常磁性成分が共存していることが明らかになり、磁気抵抗測定の結果と矛盾しない結果が得られた。

・LSMO薄膜の角度依存XMCDの追測定を行い、磁性元素の電子軌道の形状が基板応力によって影響を受けるとする昨年度の結果の再現性を確かめた。本年度行った装置改良および解析法の改良によって、よりバックグランドを低減しS/N比を改善した質の良いXMCDのデータが得られるようになってきている。実際に、【研究実績の概要】で述べた通り、Fe3O4薄膜やCo/重金属多層膜のXMCDでは、これまでの測定ではっきりと見えていなかった軌道磁気モーメントの異方性やスペクトル形状の異方性をより精度よく測定できるようになってきている。これらのことから、測定・解析ともにおおむね順調であると判断できる。・L10型FePt合金や(Ba,K)(Zn,Mn)2As2といった、垂直磁気異方性を示すいくつかの強磁性体に対して新たに磁場角度依存X線磁気円二色性(XMCD)の実験を行った。前年度までに行った(La,Sr)MnO3薄膜の場合と同様に、磁性原子内での電子軌道の形状が異方的になっていることが示され、これが垂直磁気異方性の起源に関わっている可能性が示唆された。・同じく垂直磁気異方性を示すスピネル型酸化物強磁性体CoFe2O4の薄膜について、薄膜上下の界面における磁気的不活性層の成因をXMCDスペクトルとモデル計算との詳細な比較により調べた。その結果、特に膜厚を減らした薄膜において、一部のCoイオンおよびFeイオンの結晶内における位置が期待とは逆になっていることが示され、磁気的不活性層がこれにより生じていることを示唆する結果となった。・トポロジカル絶縁体などとの関連から近年注目を集めている2次元(層状)強磁性体の一つ、Cr2Ge2Te6に対してXMCD測定を世界に先駆けて行い、磁場方向が層に平行な場合と垂直な場合とでスペクトル形状に大きな異方性が現れることを示した。現在、モデル計算によりこの結果を説明することを試みている。・研究期間全体を通じて、ベクトルマグネットXMCD装置の改良により、従来以上に精密な磁場角度依存XMCDの実験を行うことができるようになった。また、この手法を用いて強磁性体中の電子軌道の占有状態を調べるための具体的な方法論を確立した。さらに、磁性薄膜の磁気異方性を議論するためには、従来考えられていた軌道磁気モーメントの異方性だけでなく、電子軌道の異方性をも考慮に入れなければならないことを実験的に示した。本研究課題においてはベクトルマグネットを用いた角度依存X線二色性分光装置の改良を行い、従来以上に精密な磁場角度依存X線磁気円二色性(XMCD)の実験を行うことができるようになった。さらに、(La,Sr)MnO3やL10型FePtなど、スピントロニクス材料として期待される複数の強磁性体について角度依存XMCDの実験を行い、磁性薄膜の磁気異方性を議論するためには、従来考えられていた軌道磁気モーメントの異方性だけでなく、電子分布の異方性をも考慮に入れなければならないことを実験的に示した。・LAO基板上LSMO薄膜について、試料作製条件の最適化を行ったうえで再度角度依存XMCDの実験を行い、本年度の実験で得られた磁気異方性と異方的スピン密度分布の関係性を示す結果について引き続き検証を行う。
O-アセチル-ガングリオシド合成酵素cDNAのクローニング(2)

1.本研究部門で開発した抗O-アセチル化ガングリオシドモノクローナル抗体を用い、発現ベクターcDNAライブラリーをトランスフェクト細胞からO-Ac-GD3を発現した細胞をソーティングし、最終的に1つのO-Ac-GD3合成に関連する蛋白をコードするp33H4cDNAを単離した。イムノステイニング法また〔^<14>C〕-Ac-CoAを用いたメタボリックラベリング法により、p33H4をトランスフェクトした細胞にO-Ac-GD3の発現が確認できた。よって、この蛋白をrAGS(rat AcetylGanglioside Synthase)と名称した。2.rAGSは427アミノ酸からなり、EGF様配列、第5因子や第8因子のホスファチジルセリンと結合すると考えられている部位と相同性を持つ配列が見つかっている。rAGSのmRNAは2.0kbの単一のバンドとして認められ、その発現は、脳、肺に多く認められた。rAGSはマウスのfatglobule membrane protein(MFGMP-E8)と90%近いホモロジーが認められた。そのMFGMP-E8蛋白は5つのドメインから構成されているが、その内の芳香族アミノ酸とプロリンに富む1つのドメインを欠いた4つのドメインによって、rAGSは構成されていた。3.rAGS-cDNAをヒスチジンヘキサマー-融合発現ベクター系に組み込み、大腸菌において融合蛋白を大量発現させた。この融合蛋白をウサギに免疫し、抗rAGS抗体を作製した。この抗体を用いて、成熟ラット小脳でのrAGSの発現を調べた。その結果、rAGSはプルキンエ細胞層に局在していることが明らかとなった。プルキンエ細胞層はO-アセチル-LD1が特異的に発現していることをわれわれはすでに報告している。したがって、rAGS蛋白の発現とO-アセチル-ジアシルガングリオシド発現が一致しているこおとが判明した。
時限分解性ポリプロピレンの開発

汎用プラスチックであるポリオレフィン(PO)は、高分子量であるために生物の細胞膜を透過できず、生分解性に乏しいが、Oxo-biodegradationは、酸化促進剤を添加することで、微生物が分解可能な低分子量まで劣化・分解(非生物分解)し、その後、微生物によって分解(生物分解)を行う手法である。汎用プラスチックに生分解性を持たせるというものであり、従来のプラスチックの優れた物性をそのまま生かすことが出来る。我々は、POの一つであるポリプロピレン(PP)にTiO_2を含有したPEoマイクロカプセル(PEO/TiO_2酸化促進剤)を導入することで劣化を均一且つ従来の30倍に高速化し、生分解性を発現させる事に成功した。PPなどのPOのOxo-biodegradationでは、一般的に鉄触媒系を使い、熱酸化劣化を経て生分解を行うが、"PEO/TiO_2酸化促進剤"は日光下(光酸化劣化)でOxo-biodegradationが可能であり、より実用性が高い。さらに今回、PEO/TiO_2酸化促進剤に用いるTiO_2にジカルボン酸挿入リン酸八カルシウム(OCPCで表面修飾を施し、用いた。PEOの光分解で生成する酸がOCPCを溶解させ、TiO_2光分解反応を開始させる水ならびに自動酸化劣化に対して促進効果を持つコハク酸(ジカルボン酸)イオンを放出させ、自動酸化劣化(非生物分解)をさらに促進させることを見出した。また、OCPC溶解時に放出される可溶性無機リン酸塩は、微生物の養分となり生物劣化を促進させていた。さらに、TiO_2の修飾条件を変えることで劣化速度を制御に成功し、時限分解性PPの開発に成功した。しかしながら、低弾性率体であるPEOを添加しているため、材料のヤング率が減少、また、親水性であるPEOを使用しているため、水ぬれの際にPEOマイクロカプセルごとがTiO_2溶出という問題があった。そこでさらに、PP/Cellulose複合材料への"PEO/TiO_2酸化促進剤"の適用を行った。複合材料に生分解性を付与し、ヤング率の約2倍の向上に成功した。また、水濡れ時のTiO_2の保持性も改善されていることが分かった。フィルム厚を変化させた光劣化試験では、劣化促進剤の拡散性も確認できた。本研究は、時限分解性および易生分解性を発現させる機構を付与させることで、ポリプロピレン(PP)をカーボンニュートラル可能なプラスチック材料に変えることを目的とする。水酸アパタイト前駆体であり、結晶水を有するリン酸八カルシウム(OCP)にジカルボン酸を挿入したもの(OCPC)で表面を部分修飾した二酸化チタン(TiO_2)の周りをポリエチレンオキシド(PEO)で包み、PPに導入したサンプルを作製する。親水性であるPEOの吸着水およびOCPCの結晶水によって、TiO_2未修飾部分で光分解反応がおき、PPの分解促進物質である酸・アルデヒドが、PEOの分解によって生成する。酸はOCPCを分解し、挿入されているジカルボン酸を放出させ、更なるPPの分解の促進をする。また、OCPCの修飾の度合いを変えることによって分解速度を変化させることに成功した(時限分解性)。この時限分解性によって、所定の時間の日光照射後に、直ちに微生物が代謝可能な低分子量体への持続的な分解反応を開始させる二段階の過程による生分解性の発現を試みた。方法としては、光劣化後に土中埋没試験を行い、前後でIRスペクトルの変化を調べた。その結果、生分解性前のサンプルに存在していたPPの光劣化生成物であるカルボニルのピーク(1718cm^<-1>)および酸素不足のPP劣化の際に生成する不飽和エチレン(1642cm^<-1>)のピークが生分解を受け消失していたことが確認された。走査型電子顕微鏡(SEM)観察から、サンプル表面上で真菌類による菌糸のネットワーク構造が確認でき、OCPC未修飾のTiO_2を用いたサンプル表面よりさらに激しい生物浸食挙動が観測された。この激しい浸食挙動については、次年度で検討することを予定している。

また、OCPC溶解時に放出される可溶性無機リン酸塩は、微生物の養分となり生物劣化を促進させていた。さらに、TiO_2の修飾条件を変えることで劣化速度を制御に成功し、時限分解性PPの開発に成功した。しかしながら、低弾性率体であるPEOを添加しているため、材料のヤング率が減少、また、親水性であるPEOを使用しているため、水ぬれの際にPEOマイクロカプセルごとがTiO_2溶出という問題があった。そこでさらに、PP/Cellulose複合材料への"PEO/TiO_2酸化促進剤"の適用を行った。複合材料に生分解性を付与し、ヤング率の約2倍の向上に成功した。また、水濡れ時のTiO_2の保持性も改善されていることが分かった。フィルム厚を変化させた光劣化試験では、劣化促進剤の拡散性も確認できた。
ヌクレオチド単結晶の顕微偏光ラマンスペクトルの測定と分極率ラマンテンソルの推定

核酸の多彩な機能発現の影にはそれを支える立体構造と原子間相互作用が存在する。モノヌクレオチドと天然のDNAを取り上げ、単結晶を作成してラマンスペクトルを測定し、ラマンテンソルの大きさと方向を推定する事により、構造推測の一手法を発展させた。ラマンテンソルの独立要素は各振動バンドに対して主値α_<xx>、α_<yy>、α_<zz>とオイラー角θ、φ、χの六つとなるが、絶対強度は得難いので比をとって五つとなる。針状及び板状結晶ではデータ数が不足するので、ヌクレオチド水溶液の主要バンドの偏光解消度ρのデータを整備した。5′-GMP、CMP、AMP、UMP、5′-dTMP、dAMPおよびATPの計七種について行った。次にATP、AMP単結晶の偏光ラマンを測定し、bb,cc成分の値とρの値を用いて、主だったバンドのr_1・r_2とその方向を推定した。AMPについては、結晶構造のデータが無いので定量的解析には至っていない。さらに、DNA A形・B形配向結晶の顕微ラマンを測定し、ラマンテンソルを推定した。仔牛の胸線から抽出したDNAのゲルをおし伸ばして繊維状とし、その配向性を確認後、ペルチエ素子で電子冷却しながら測定した。DNA繊維のラマンスペクトルは、488nmを励起光とし、bb,cc,bc,cb成分のものを得た。A繊維の807cm^<-1>、B繊維の835と796cm^<-1>のPO単結合伸縮振動バンドはcc成分がきわめて強いことがわかった。A・B両形の塩基面内振動について、強度比I_<bb>/I_<cc>、I_<bb>/I_<bc>とρの値から、ラマン散乱テンソルのr_1・r_2の値を推定した。PO_2基の対称伸縮振動については、PO_2面内の変化であるが、ラマンテンソルは面外成分の方が大きいという奇妙な結果が得られた。このことはA・B両形だけでなくZ形にも認められた。又A形では主鎖構造が一定しているが、B形ではI_<bb>/I_<bc>の値が説明できず、既知の平均構造からかなり乱れていることが推測された。
砕屑性ジルコンからみた南部アフリカおよびオーストラリアのクラトンの比較

本研究の目的は、ウラン-鉛年代測定法を南部アフリカおよびオーストラリアの原生代堆積岩中のジルコンに応用し、両者の比較を行うものである。しかし堆積岩中のジルコンは非常に細粒かつ微量であり、年代分析が困難であるため、本研究ではクラトンに広く分布する花崗岩質岩を用いて研究を行った。現在までに、南部アフリカのジンバブエクラトンについての研究を中心に行い、ジルコンの形態分類を行って年代分析の基礎試料とした。ジンバブエクラトンの花崗岩質岩は、3530億年の古期花崗岩質片麻岩(OG)と2926億年の新期花崗岩(YG)に区分される。両者はそれぞれト-ナル岩と花崗岩に分類されるが、必ずしもその区分が適応されるとは限らない。しかし、微量鉱物であるジルコンの形態(大きさ、伸長比、二重成長の有無)や化学組成(Hf/Zr比)を調べることにより、以下のように両者の区分を行うことができた。(1)YGは自形ジルコンが多く、長柱状の粗粒ジルコンを含む岩石もあった。しかしOGでは短柱状のものが多い。(2)二重成長を示すジルコンはOGで多く、YGではほとんど見られない。(3)OGでは、Hf/Zr比がジルコンの中心から不連続に増減し、二重成長が確認された。一方、YGではHf/Zr比が中心から連続的に増加するため、二重成長の証拠は見られない。以上の結果より、OGに二重成長を示すジルコンが多いのは、少なくとも2回の熱的イベントを受けているためと考えられる。その可能性としては、OGの固結後の変成作用(または、それに伴う部分溶融)によりジルコンの一部が二重成長したものと考えられる。これはOGのジルコンのHf/Zr比の不連続性からも明らかである。一方YGは、メルト中での新たな核形成と均質な累帯構造によるジルコンの成長を示すものと考えられる。したがって融食再成長を示さない自形ジルコンが多い。これら異なる起源のジルコンの年代から、ジンバブエクラトンの地殻進化過程を明らかにすることができる。
企業の多角化・集中戦略に着目したサプライネットワーク創発原理の追究とモデル化

本研究は、複雑な企業間サプライネットワーク構造の創発原理を、企業の多角化・集中戦略および企業間の相互依存性に着目して追究する。そのためにまず、さまざまな情報源から包括的な時系列データを収集・整理・分析し、企業のポートフォリオと取引関係の多角化・集中戦略を統合的に測る指標を立案する。その上で企業戦略間の相互関係をモデル化し、複雑ネットワーク解析と数理ネットワークシミュレーションによる検証をおこなう。
黒毛和種集団の人工授精受胎率向上を目指した遺伝子多型の解明

肉用牛畜産経営の最終生産物は肥育牛が生産する枝肉であるが、その肥育素牛となる子牛を生産する繁殖雌牛の生産性、すなわち子牛を産み育てるための繁殖能力は畜産経営にとって重要な能力である。この繁殖能力の1つである凍結精液による人工授精受胎率低下の原因究明や根本的な解決策は見出されていない。本研究では日本が誇る黒毛和種を維持、発展させるべく、その人工授精受胎率の低下要因となる遺伝子多型を探索し、人工授精受胎率向上を目指した知見を得ることを目的とする。要因となる多型の特定が行えれば宮崎県のみならず我が国の黒毛和種集団において受胎率低下要因の除去による生産効率の向上など家畜育種上有用な情報が得られる。
生体脳深部線維連絡蛍光イメージングの開発

これまで、我々は可視光の蛍光物質Alexa 555に効率の高い逆行性トレーサー・CTBを結合させたものを用いて、蛍光実体顕微鏡を用いて脳表から生体内での線維連絡を可視化する手法を開発し、電気生理学とウィルスベクターの組み合わせを用いて、神経回路における情報変換研究に用いてきた。本研究では、in vivo蛍光・定量トモグラフィ装置を用いて、組織透過性の高い遠赤外線の蛍光色素Alexa 750をトレーサーに結合させ、マウス、ラット、マーモセットで使用できる生体脳での脳深部(扁桃体、大脳基底核、海馬、視床、内側前頭葉、帯状皮質)を含む全脳結合の可視化を生体内で可能にする手法の開発を可能にした。購入可能なCTB-Alexa 647を、皮質、海馬、扁桃体に微量0.12 - 0.3 μl注入し、1週間後に、in vivo蛍光・定量トモグラフィ装置(FMT1500、Perkin-Elmer)で可視化する。すでに、マウスバレル皮質に0.12μl注入する試験は行っており、注入部位、視床、視床下部にラベルが見られ、CTBの免疫組織化学により、その投射の存在は裏付けられた。しかし、CTBの免疫組織化学で見られた、皮質ー皮質投射(含む反対側のバレル皮質への投射)は、確認できなかった。しかし、まだ閾値を下げて画像工学の手法による、改善を行ったり、他の会社のin vivo蛍光・定量トモグラフィ装置のデモをお願いして、どこまで免疫組織化学で検知できるレベルまで迫れるかに関して検討することが本研究の目的である。いずれにしても、視床や視床下部のラベルが確認できたのは、大きく道が開かれたと考えた。このホルダーはすでにperkin-elmerで開発済みのものを用いているが、実際に、ステレオ装置の位置の数字の部位に別なトレーサーを注入し、そのずれが最小になるように、検討を行う。また、結合している領域に刺激電極と記録電極を入れて、機能的結合を試み、LFPを書確認した。これまで、我々は可視光の蛍光物質Alexa 555を効率の高い逆行性トレーサー・CTBを結合させたものを用いて、蛍光実体顕微鏡を用いて脳表から生体内での線維連絡を可視化する手法を開発し、電気生理学とウィルスベクターの組み合わせを用いて、神経回路における情報変換研究に用いてきた。本研究では、in vivo蛍光・定量トモグラフィ装置を用いて、組織透過性の高い遠赤外線の蛍光色素Alexa 750をトレーサーに結合させ、マウス、ラット、マーモセットまで使用できる生体脳での脳深部を含む全脳結合の可視化を生体内で可能にする手法の開発を目的とする。この手法開発により、感覚情報処理により関わる脳表から見える大脳皮質と、そこで生成された情報を情動やモチベーションに変換するシステムを脳結合に基づいて研究することを可能とし、これまで謎であった、このシステムの動作原理に道を開く重要な手法となると考えられる。脳表の実験では、CTB-Alexa555で行っているが、脳深部は、さらにS/N比が高いより周波数の短い自家蛍光のないラベルが必要であとかんがえ、CTB-Alexa747を試すと、トレーサーの視認性が格段に上がり、DAB化した結果と近くなった。実験は順調に進行している。視認されたトレーサーをMRIを用いて、x,y,z空間にアラインして、電気生理や薬物注入出来るようにしなければならない。このために、トレーサーを用いた実験が必要である。これらをDAB可視化する薬物、グラスウェア、プラスティックウェアが500,000円。合計1,500,000円必要である。
自閉症スペクトラム障害の原因解明と治療法に関する研究

自閉症スペクトラム障害(ASD)では興奮性と抑制性のバランスが崩れ、通常の感覚入力でも情報伝達異常が誘発されていると考えられる。本研究では、興奮-抑制バランスに関与するSynaptic Vesicle Protein 2A(SV2A)遺伝子上の変異が気質・性格に影響を与えること、およびSV2Aに作用するレベチラセタムが気質・性格に与える影響を与えることから、SV2Aが精神機能に寄与することを明らかにした。さらに、レベチラセタムをASDモデル動物に投与すると行動障害およびグルタミン酸神経伝達に関わるシグナル伝達の亢進は改善されることから、ASD治療へのレベチラセタムの応用が期待される。自閉症スペクトラム障害(ASD)は、小児の代表的精神行動異常を示す疾患であるが、その原因については不明な点が多い。現時点において、そのメカニズムは、てんかんに似た症状を示す事が多く、中枢における興奮ー抑制バランス異常によって引き起こされることが考えられている。最近、痙性脳性麻痺、中等度認知障害ならびに焦点てんかんの患者においてレベチラセタム投与により自閉様症状を誘発した症例が報告されており、本剤の投与中止によりその症状が消失している。このことから、レベチラセタムと自閉症との間には何らかの関係があると考えられる。レベチラセタムは、ピロリドン誘導体の新規抗てんかん薬であり、SV2Aへの高い親和性は既存の抗てんかん薬にはみられない特徴である。そこで、本研究では興奮ー抑制バランスに関与するSynaptic Vesicle Protein 2A (SV2A)遺伝子上の変異と自閉症との関連について検討することを目的として進めている。本年度は、SV2Aの遺伝子変異のうち、特に日本人において発現頻度が高く、また、統合失調症との関連も報告されている4つの遺伝子型について検討するための手法を構築した。また、0.5%以上の発現頻度の認められている変異についても頻度の高い順に手法の構築を行っている。レベチラセタムは、ピロリドン誘導体の新規抗てんかん薬であり、Synaptic Vesicle Protein 2A(SV2A)への高い親和性は既存の抗てんかん薬にはみられない特徴である。そこで、本研究では興奮ー抑制バランスに関与するSV2A遺伝子上の変異と自閉症との関連について検討することを目的として進めている。本年度は、SV2Aの遺伝子変異について解析を行った。本年度は、SV2Aの遺伝子変異5箇所について解析を行った。SV2A遺伝子の変異については、5箇所の遺伝子型について解析を進めている。解析対象としている遺伝子変異の発現頻度は、東アジア人における過去の報告とよく似た傾向を示すものの、発現頻度に差が認められることから、人種ならびに地域差による違いがあるのかもしれない。今後はこのことを考慮に入れつつ、更なる対象を追加し比較検討をする予定である。SV2Aの遺伝子多型の発現頻度およびそれが気質・性格に影響するかどうか検討を行った。健常者を対象としたSV2Aの遺伝子多型の発現頻度は、過去の報告とほぼ同程度であった。さらに採血時に気質性格検査(TCI)、およびベック抑うつ評価尺度(BDI)により評価したところ、野生型と比べ、変異型をホモおよびヘテロにて有するとTCIにおいて損害回避が有意に低く、自己志向が有意に高く、BDIが有意に低かった。そこで、SV2Aの不安や抑うつに対する影響について、SV2A阻害薬であるレベチラセタムをマウスに投与して行動薬理学的評価を行った。レベチラセタムの高用量投与により、高架式十字迷路およびオープンフィールド試験において不安様行動が惹起されたが、新奇性抑制摂食テストおよび強制水泳試験においてうつ様行動は認められなかった。さらに、妊娠マウスにバルプロ酸ナトリウムを投与し、その出生マウスを自閉症モデル動物として評価したところ、社会性行動試験における社会性低下および新奇物体認知試験における物体認知記憶障害が認められた。不安様行動が惹起されない低用量のレベチラセタムを自閉症モデル動物に投与するとこれら行動障害は有意に改善された。

さらに自閉症モデル動物の前頭皮質において、グルタミン酸神経伝達に関わるタンパク質発現が有意に増加しており、それに伴った細胞内シグナル伝達の亢進が認められた。一方、その細胞内シグナル伝達の亢進は低用量レベチラセタムの投与により抑制された。以上の結果より、SV2Aは不安に関与するが、レベチラセタムによるグルタミン酸神経系の機能調節は自閉症の治療への応用が期待される。自閉症スペクトラム障害(ASD)では興奮性と抑制性のバランスが崩れ、通常の感覚入力でも情報伝達異常が誘発されていると考えられる。本研究では、興奮-抑制バランスに関与するSynaptic Vesicle Protein 2A(SV2A)遺伝子上の変異が気質・性格に影響を与えること、およびSV2Aに作用するレベチラセタムが気質・性格に与える影響を与えることから、SV2Aが精神機能に寄与することを明らかにした。さらに、レベチラセタムをASDモデル動物に投与すると行動障害およびグルタミン酸神経伝達に関わるシグナル伝達の亢進は改善されることから、ASD治療へのレベチラセタムの応用が期待される。SV2A遺伝子の4箇所の遺伝子変異については、順調に解析を進めている。また、発現頻度の高い遺伝子変異についても同様に検討を加え、手法の確立を行っている。培養細胞を用いたグルタミン酸およびGABAの分泌に及ぼすSV2A遺伝子型の影響についても手法の確立に向けて準備を始めている。次年度は、本年度に引き続きSV2A遺伝子変異の解析を進める。また、培養細胞を用いたグルタミン酸およびGABAの分泌に及ぼすSV2A遺伝子型の影響、ならびにバルプロ酸投与による自閉症スペクトラム障害モデルマウスの作出とレベチラセタム投与による評価についても検討を行う予定である。医療薬学次年度は、本年度に引き続きSV2A遺伝子変異の解析を進める。また、培養細胞を用いたグルタミン酸およびGABAの分泌に及ぼすSV2A遺伝子型の影響についても検討を行っていく予定である。本年度は、研究代表者の所属機関を異動したために、一部機器等を調達する必要が生じた。そのため、研究が少し遅れている。しかし、概ね準備が整い、順調に研究を進め始めている。SV2A遺伝子の変異については、4つの遺伝子型については解析を進めている。現在、SV2A遺伝子型については候補が決定し、解析を進めている。細胞培養ならびに動物実験については準備中のため、使用額と差が生じているが、概ね準備が整い、順調に研究を進めている。次年度に引き続き使用計画に基づき実施する予定である。現在、SV2A遺伝子型の候補を探っている最中であり、細胞培養による検討については準備中のため、使用額と差が生じているが、概ね準備が整い、順調に研究を進め始めている。次年度は、引き続き解析に必要な試薬等の購入にあてる。
テラスケール余剰次元模型の性質についての現象論的研究

素粒子物理学の標準理論では解決できない、ニュートリノ振動、暗黒物質の存在、宇宙のバリオン数非対称などの現象論的諸問題、及び理論的諸問題の解決を目指して、新物理理論のパラダイムとしてテラスケール余剰次元を念頭に置き、実験結果を用いた種々の素粒子模型の検証可能性の理論研究を行った。主な成果は以下のとおりである。1.最小超対称標準模型の付加的ヒッグス粒子の間接的発見可能性の研究発見されたヒッグス粒子からボトムクォーク対への崩壊分岐比とWボソン対への崩壊分岐比の比が、将来のILC実験で特に精密に測られることに着目し、最小超対称標準模型において付加的ヒッグス粒子により生じるこの比の標準理論予言値からのずれを正確に計算した。このずれの測定から間接的に発見可能な付加的ヒッグス粒子の質量領域をILC実験のステージ毎に示した。同様の手法を用いて、ユニバーサル余剰次元模型においてカルツァ・クライン粒子の存在により影響を受けるヒッグス粒子の性質を探る研究を進めている。2.強い一次的電弱相転移由来の重力波を用いた拡張素粒子模型の検証可能性の研究標準理論に複数個のスカラー粒子を付加した拡張模型において、初期宇宙で起きた強い一次的電弱相転移由来の重力波のスペクトルを計算した。予言される重力波スペクトルは導入されたスカラー粒子の個数と質量に大きく依存することを示し、将来宇宙空間で行われる重力波観測を用いて一次的電弱相転移を起こす様々な拡張模型が区別できる可能性があることを明らかにした。また、テラスケール余剰次元模型に特有なスカラーポテンシャルを重力波で探る可能性についても検討中である。27年度が最終年度であるため、記入しない。2012年に欧州の加速器LHCで万物の質量の源となるヒッグス粒子が発見され、素粒子物理学の標準理論はテラスケール以下のエネルギースケールの現象を矛盾なく記述する理論として確立した。しかしながら、ニュートリノ振動、暗黒物質の存在、宇宙のバリオン数非対称などは標準理論で説明できないことが知られている。これらの現象論的問題や理論的諸問題の解決策としてテラスケールで実現されている余剰次元に基づく模型が多数提案されている。これらの模型の予言を調べ、テラスケール余剰次元の実現可能性に迫るのが本研究の目的である。本年度は、拡張されたユニバーサル余剰次元模型においてカルツァ・クライン粒子の質量スペクトルが暗黒物質の残存量に与える影響について調べた。残存量を説明できる暗黒物質候補粒子の質量は最小構成のユニバーサル余剰次元模型の場合のそれと大きく異なり得ることを示した。また、申請者はXボソンを余剰次元方向に局在化させることで陽子崩壊実験の結果と矛盾せずに、テラスケールで大統一理論が実現できる余剰次元模型を提唱したが、本年度はこの理論の超対称化にも取り組んだ。さらに、超対称標準模型に右巻きニュートリノ超場を導入した模型において、ヒッグス粒子の不可視崩壊、及び真空安定性等の現象論的制限と矛盾せずに、ギガ電子ボルトの質量を持つ混合スニュートリノが暗黒物質の残存量を説明可能なパラメータ領域があることを示した。このようなシナリオはテラスケール余剰次元を導入することで説明できる可能性がある。拡張されたユニバーサル余剰次元理論で様々な物理量を計算できる数値計算コードを作成し、現在進行中、及び将来の素粒子実験、宇宙観測の結果と照らし合わせることが可能になった。その中で特に暗黒物質の残存量の計算結果に関して学会で発表した。それに加えて、テラスケール余剰次元の枠内で説明できる可能性のある、軽い混合スニュートリノが暗黒物質となる超対称模型が将来の国際リニアコライダーでのヒッグス粒子の性質の精密測定により検証可能であることが指摘できた。平成27年度にはエネルギー、ルミノシティーを増強して再開したLHC実験の結果の報告が期待される。

これにより得られる新しい物理模型の兆候、もしくは制限に関するデータを用い、テラスケール余剰次元模型の解析を遂行する。また、今後の暗黒物質の直接・間接実験や将来の国際リニアコライダー等を用いて多角的な観点からどのように模型の兆候が得られるのか、また区別できるのかを明らかにしていく。さらに、新しいテラスケール余剰次元模型の構築や、得られる予言の現象論的解析を行う。27年度が最終年度であるため、記入しない。
茎頂分裂組織形成遺伝子の解析から陸上植物の胞子体世代延長の誕を探る

被子植物胞子体の茎頂では、細胞分化を促進する遺伝子と未分化な状態を維持する遺伝子が異なる領域で機能し、未分化な分裂組織を維持しつつ、器官が分化していると推定される。未分化な状態の維持に関わる遺伝子としてKNOXクラス1遺伝子が知られている。KNOXクラス1遺伝子はサイトカイニン合成遺伝子(IPT)、ジベレリン代謝遺伝子(GA2酸化酵素遺伝子)とジベレリン合成遺伝子(GA20酸化酵素遺伝子)といった植物ホルモン生合成系遺伝子を下流に持ち、植物ホルモン量を制御することで茎頂分裂組織の細胞分裂及び伸長を制御し、茎頂分裂組織の未分化な性質を維持すると報告されている。KNOXクラス1遺伝子の関わる分子機構がコケ植物でも保存されているかを調べることで、陸上植物の形態進化を調べることを目的としている。コケ植物KNOXクラス1遺伝子3個を単離し、機能解析を行ったところ、これらはいずれも胞子体の初期発生で発現し、細胞分裂・伸長を制御していることがわかった。ヒメツリガネゴケではゲノム計画が進められている。ヒメツリガネゴケKNOXクラス1遺伝子も被子植物と同じく植物ホルモンを制御しているか調べるために、このデータベースからサイトカイニン及びジベレリン関連遺伝子を探索し分子系統解析を行ったところ、ヒメツリガネゴヶゲノム中にGA2酸化酵素相同遺伝子及びGA20酸化酵素相同遺伝子が存在すること、また、被子植物は2種類のIPT遺伝子を持つがヒメツリガネゴケは1種類しか持たないことがわかった。しかし、これらの遺伝子の発現レベルが野生株と三重遺伝子破壊株とで変わらかいことから、ヒメツリガネゴケにおいてはKNOXクラス1遺伝子はジベレリンとサイトカイニンを制御していないことが示唆された。KNOXクラス1遺伝子によるジベレリンとサイトカイニンの制御は維管束植物とコケ植物の分岐の後に維管束植物において獲得されたと推測された。未分化な状態の維持に関わる遺伝子としてKNOX遺伝子が、葉原基でKNOX遺伝子の発現を抑制し、器官分化を促進している遺伝子としてPhan遺伝子が知られている。コケ植物の胞子体は葉などの側生器官を持たず、先端に1個の胞子嚢を分化し、その発生を完了するが、コケ植物KNOX遺伝子を単離し発現様式を調べたところ、始め胞子体全体で発現するが、短期間で発現が消失し、その後、胞子嚢が分化することがわかった。申請者は維管束植物の進化の過程においてKNOX遺伝子の発現制御機構が変化し、頂端の一部で発現が維持されるような変化が生じたために胞子体世代が延長したのではないかという仮説をたてた。仮説検証の第1歩として、被子植物でKNOX遺伝子の発現を抑制するPhan遺伝子をヒメツリガネゴケで探索し、機能解析を行うことで、陸上植物の進化の初期においてKNOX遺伝子とPhan遺伝子の相互関係が存在していたか調べることにした。ヒメツリガネゴケでは4つのKNOX遺伝子が単離されている。そのうち3つはクラス1に属し、被子植物茎頂分裂組織で機能する遺伝子の相同遺伝子であり、残りはクラス2に属する。3つのクラス1遺伝子の三重遺伝子破壊株を作出し、胞子体の発生過程を観察したところ、胞子嚢の一部と朔柄の形態に異常が見られ、形成される胞子数が著しく減少することがわかった。KNOXクラス2遺伝子についても、破壊株及び内生プロモーターによってKNOXクラス2遺伝子とGUSの融合タンパクを発現する形質転換体を作出した。また、既知のPhan遺伝子間で相同性の高い領域にディジェネレイトプライマーを作成し、RT-PCRとゲノムDNAを鋳型としたPCRにより、5個のPhan遺伝子と同じ遺伝子族に属する遺伝子の配列の一部を得た。未分化な状態の維持に関わる遺伝子としてKNOXクラス1遺伝子が、葉原基でKNOXクラス1遺伝子の発現を抑制し器官分化を促進している遺伝子としてARP遺伝子が知られている。KNOXクラス1遺伝子は植物ホルモンの量を制御することで茎頂分裂組織の細胞分裂、及び伸長を制御し、茎頂分裂組織の未分化な性質を維持することが報告されている。KNOXクラス1遺伝子とARP遺伝子の関わる分子機構は非種子植物ヒカゲノカズラ類においても保存されていることが報告された。コケ植物の胞子体は維管束植物と異なり、葉などの側生器官を持たず、先端に1個の胞子嚢を分化し、その発生を完了する。申請者はKNOXクラス1遺伝子とARP遺伝子の関わる分子機構がコケ植物でも保存されているかを調べることで、陸上植物の形態進化を調べることを目的とした。コケ植物KNOXクラス1遺伝子3個を単離し、これらの発現様式を調べたところ、胞子体の初期発生で発現し、維管束植物のように発現が長期間維持されないことが明らかになった。また、KNOXクラス1遺伝子の三重遺伝子破壊株は胞子体の形態に異常を示し、これらの遺伝子が胞子体の正常発生に必須であることを明らかにした。また、組織切片による形態観察から、三重遺伝子破壊株では胞子体の初期発生において細胞分裂、細胞伸張が抑制されているため、多面的な形態異常を示すことがわかった。また、ヒメツリガネゴケゲノム中にはARP遺伝子の相同遺伝子は存在しないことがわかった。

すなわち、KNOXクラス1遺伝子とARP遺伝子による茎頂分裂組織維持の分子機構はコケ植物と維管束植物の分岐後に維管束植物で獲得されたと推定された。被子植物胞子体の茎頂では、細胞分化を促進する遺伝子と未分化な状態を維持する遺伝子が異なる領域で機能し、未分化な分裂組織を維持しつつ、器官が分化していると推定される。未分化な状態の維持に関わる遺伝子としてKNOXクラス1遺伝子が知られている。KNOXクラス1遺伝子はサイトカイニン合成遺伝子(IPT)、ジベレリン代謝遺伝子(GA2酸化酵素遺伝子)とジベレリン合成遺伝子(GA20酸化酵素遺伝子)といった植物ホルモン生合成系遺伝子を下流に持ち、植物ホルモン量を制御することで茎頂分裂組織の細胞分裂及び伸長を制御し、茎頂分裂組織の未分化な性質を維持すると報告されている。KNOXクラス1遺伝子の関わる分子機構がコケ植物でも保存されているかを調べることで、陸上植物の形態進化を調べることを目的としている。コケ植物KNOXクラス1遺伝子3個を単離し、機能解析を行ったところ、これらはいずれも胞子体の初期発生で発現し、細胞分裂・伸長を制御していることがわかった。ヒメツリガネゴケではゲノム計画が進められている。ヒメツリガネゴケKNOXクラス1遺伝子も被子植物と同じく植物ホルモンを制御しているか調べるために、このデータベースからサイトカイニン及びジベレリン関連遺伝子を探索し分子系統解析を行ったところ、ヒメツリガネゴヶゲノム中にGA2酸化酵素相同遺伝子及びGA20酸化酵素相同遺伝子が存在すること、また、被子植物は2種類のIPT遺伝子を持つがヒメツリガネゴケは1種類しか持たないことがわかった。しかし、これらの遺伝子の発現レベルが野生株と三重遺伝子破壊株とで変わらかいことから、ヒメツリガネゴケにおいてはKNOXクラス1遺伝子はジベレリンとサイトカイニンを制御していないことが示唆された。KNOXクラス1遺伝子によるジベレリンとサイトカイニンの制御は維管束植物とコケ植物の分岐の後に維管束植物において獲得されたと推測された。
DNA2重螺旋におけるCircular Dichroismの理論分光

量子・古典論を組み合わせた計算手法を開発し、同方法を光機能性蛋白質の励起状態に応用した。レチナール蛋白質はヒトの視覚やバクテリアのプロトンポンプ等で重要な機能を果たすが、蛋白質の環境に応じて、大きく光吸収エネルギーを変化させることが知られている。今回、我々の方法によりレチナール蛋白質の光吸収エネルギーを定量的かつ系統的に計算することに初めて成功した。これにより、レチナール蛋白質の光吸収特性に関する定量的な解析を行うことができた。種々のレチナール蛋白質における励起エネルギーを色素の構造ひずみ、蛋白質の静電的環境、カウンターイオンとの量子的相互作用の3点に分割して解析を行った。その結果、蛋白質との静電的な相互作用がスペクトル・チューニングに最も重要な役割を果たすことが明らかになった。レチナール蛋白質の励起状態は分子内電荷移動性が強いため、蛋白質による静電的な環境を敏感に反映する。レチナール結合サイトの静電環境は蛋白質により異なるため、多様な光吸収エネルギー示す原因になっている。蛍の蛍光色は発色団であるオキシルシフェリンによる。オキシルシフェリンの発光色は化学発光に関する実験結果を基に、ケト・エノール互変異性により説明されてきた。しかし、近年、エノール型への変換が抑制されたケト型オキシルシフェリンの生物発光において、通常の黄緑色発光が観測されて、従来説が疑問視されてきた。我々の方法を蛍の発光に応用し、北アメリカ蛍のケト型ルシフェリンが、化学発光では赤色、生物発光では黄緑色発光することを理論計算により示した。基底・励起状態の電荷分布と蛋白質の静電ポテンシャルの相互作用が発光色の変化に重要な寄与をしていることが明らかになった。更にこの結果を基に、ルシフェリンの分子設計を行った。アミノ酸残基を置換することにより活性中心の静電場を制御し、赤オレンジ色の発色を示すと期待されるミューテーション実験を提案した。