hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
巨大葉緑体イネ変異体の利用による葉緑体ゲノム改変技術の確立

giant chloroplast</i> (<I>gic</I>)の整備と原因遺伝子の同定、2<I>gic</I>を用いた葉緑体形質転換の研究を進めた。1の<I>gic</I>変異体の解析では、24年度までに第4染色体下腕に変異をマップしたので、今年度はインタクトな葉を用いた葉緑体観察法を開発してマッピング集団を拡大し、F2集団で110個体のgic形質を示す個体を選抜して詳細なマッピングを進めた。その結果、ゲノム領域を582 kbにまで絞り込んだ。さらにこの領域に存在する123遺伝子のうち葉緑体輸送シグナルを持つと予想されるタンパク質、既知のシロイヌナズナ関連遺伝子との相同性などから、シロイヌナズナPARC6遺伝子と相同性を持つ遺伝子Os4g0675800を見出した。この遺伝子の配列を決定して日本晴と比較すると、アミノ酸置換を生じる1塩基置換が検出された。現在、この遺伝子のcDNAをクローニングしており、クローンが得られた後、<I>gic</I>変異体でこの遺伝子を発現させる相補実験を行い、原因遺伝子であることを証明する。圃場で栽培すると、<I>gic</I>変異体は野生型に比べ若干生育が悪く、シロイヌナズナとは異なり、イネでは葉緑体分裂が桿長などに影響することが示唆された。<I>gic</I>を用いた葉緑体への遺伝子導入は昨年度から継続して行っているが、ストレプトマイシン耐性を示す形質転換体は得ることが出来なかった。変異体の解析はほぼ予定通りに進行しており、来年度中に原因遺伝子の同定が可能と予想される。ライン化した種子を用いての形質転換も行なわれている。巨大葉緑体変異の出現数が予想よりもはるかに少なく、マッピング進展のための障壁となっている。24年度が最終年度であるため、記入しない。巨大葉緑体の出現数が予想よりもはるかに少ないが、簡便な観察法を確立したので予定通りに研究が進められる。実際の形質転換では、抗生物質を用いた選抜法の適性がポイントとなるので、今後、選抜の時期、最適濃度などについて、先行研究を行っている国内のグループとも連携して研究を進める。
イカ類におけるボディーパターンの機能と発達に関する行動学的研究

イカ類は発達した脳,神経系を基盤に瞬時で多彩な体色変化を伴うボディーパターンを示すが,これは個体間のコミュニケーションの重要な手段と考えられる.本研究は,イカ類の思考および水圏環境への適応性を理解するという観点から,ボディーパターンの機能とその発達過程を明らかにすることを目的に,アオリイカを対象に飼育個体の行動観察を中心とした以下の研究を実施した.平成15年度は「遺伝,経験環境と連関したボディーパターンの発達過程の解明」を目指し,次のような事柄を実施した.初めに,孵化したアオリイカの行動を経時的に観察し,ボディーパターンが孵化期から成体期にかけてどのように発達するのかを追跡した.次に,同一雌個体より産出されたアオリイカ卵を様々な物理・心理的環境下で育成し,パターン発達の遺伝性と環境依存性を検討した.さらに,昨年度見出した鏡像自己認知について,ボディーパターンとの関連から観察した.これらを通じて,ボディーパターンは孵化直後から表出されるもののそのパターン数は成体に比べると少なく,成長に伴い増加すること、擬態効果を持つDownward V'sのようなパターンは若齢期のみに表出されてその後は発現しないこと,ボディーパターンの種類数は繁殖期において最高となり,雄間闘争におけるゼブラ縞,雄による産卵雌の保護行動時における威嚇斑点など特有なものを含むこと,ボディーパターンは遺伝的プログラムにより発現しているようであることなどを明らかにした.さらに,成体期であっても長期の隔離飼育といった異常環境に置かれると自己認知系が崩れ,通常は表出されない驚愕を示すボディーパターンを自己鏡像に向けることなどを明らかにした.これらおよび平成14年度の研究結果から,アオリイカにおいては同種個体の存在が重要であり,ボディーパターンにより自らの情動を同種個体に示すことで緻密な社会を形成して生残をはかっていることが考えられた.イカ類は発達した脳,神経系を基盤に複雑で精巧な行動を表す動物である.中でも,神経支配による瞬時で多彩な体色変化を伴うボディーパターンは個体間のコミュニケーションの重要な手段と考えられる.本研究は,イカ類の思考および水圏環境への適応性を理解するという観点から,イカ類に特有な行動特性であるボディーパターンの機能とその発達過程を明らかにすることを目的に,理化学研究所イカ長期飼育施設において飼育管理されているアオリイカを対象に行動観察を中心として以下の研究を行った.平成14年度は,「アオリイカのボディーパターンの意味解読」を目標に次のような事柄を実施した.卵から水槽内で育成した亜成体期から成体期のアオリイカについて,その行動を詳細に観察し既往の報告も参照しつつボディーパターンの種類と特徴に関するカタログを作成した.次に,捕食や繁殖など生活史上の特徴的な行動に注目し,それに伴い発現するボディーパターンをデジタルビデオカメラにより記録しその発現順序や規則性について解析した.これらを通じて,アオリイカは捕食の際に円錐形に窄めた腕に明瞭な暗色帯(ハンティングマーク)を発すること,交接時の雌を巡る雄間の争いにおいて雄は腕を水平に広げて外套背面に際立つ縞模様(ゼブラ縞)を形成してライバル雄を威嚇すること,群れ形成に際して隣接する個体がある距離よりも接近すると外套先端部を白く浮き立たせ接近個体への注意を促すシグナル(アテンションシグナル)を発することなど,ボディーパターンの具体的な機能について明らかにした.さらに,アオリイカ成体は自らの鏡像に対して高い関心を示し,体色を暗化させて鏡像に接近して繰り返しそれ(鏡面)に触るという特異なボディーパターンを示すことを発見した.これは,通常は見られない行動であり,イカ類における自己認知,或いはその萌芽を示唆するものと考えられた.イカ類は発達した脳,神経系を基盤に瞬時で多彩な体色変化を伴うボディーパターンを示すが,これは個体間のコミュニケーションの重要な手段と考えられる.本研究は,イカ類の思考および水圏環境への適応性を理解するという観点から,ボディーパターンの機能とその発達過程を明らかにすることを目的に,アオリイカを対象に飼育個体の行動観察を中心とした以下の研究を実施した.平成15年度は「遺伝,経験環境と連関したボディーパターンの発達過程の解明」を目指し,次のような事柄を実施した.初めに,孵化したアオリイカの行動を経時的に観察し,ボディーパターンが孵化期から成体期にかけてどのように発達するのかを追跡した.次に,同一雌個体より産出されたアオリイカ卵を様々な物理・心理的環境下で育成し,パターン発達の遺伝性と環境依存性を検討した.さらに,昨年度見出した鏡像自己認知について,ボディーパターンとの関連から観察した.これらを通じて,ボディーパターンは孵化直後から表出されるもののそのパターン数は成体に比べると少なく,成長に伴い増加すること、擬態効果を持つDownward V'sのようなパターンは若齢期のみに表出されてその後は発現しないこと,ボディーパターンの種類数は繁殖期において最高となり,雄間闘争におけるゼブラ縞,雄による産卵雌の保護行動時における威嚇斑点など特有なものを含むこと,ボディーパターンは遺伝的プログラムにより発現しているようであることなどを明らかにした.さらに,成体期であっても長期の隔離飼育といった異常環境に置かれると自己認知系が崩れ,通常は表出されない驚愕を示すボディーパターンを自己鏡像に向けることなどを明らかにした.これらおよび平成14年度の研究結果から,アオリイカにおいては同種個体の存在が重要であり,ボディーパターンにより自らの情動を同種個体に示すことで緻密な社会を形成して生残をはかっていることが考えられた.
炎症発癌に特化した分子標的療法の開発

遷延した炎症反応を背景とする発癌は炎症発癌と呼ばれる.その代表例は,ヘリコバクター・ピロリ菌感染による胃発癌や肝炎ウイルス感染による肝発癌などがある.この炎症発癌の予防もしくは治療の根幹は,炎症局所への炎症細胞浸出を阻害することにより達成されると考えた.そこで,炎症細胞の血管内皮細胞への接着・浸出を定量評価できる培養アッセイ系を作製した.この系を用いて,これまでに所属教室に保有するシグナル伝達,サイトカイン・増殖因子,プロスタノイド系,脂質・イオンチャンネル系,活性酸化窒素合成等を抑えることが知られている計282種類の化合物スクリーニングを施行した.その結果,濃度依存性を有し,かつ血管内皮細胞と炎症細胞のそれぞれに直接的な細胞傷害活性を持たない23種類の化合物を選択した.これらの中から接着・浸出活性の最も高い候補化合物をC57BL/6マウスに腹腔内投与すると,皮下に移入した異物のゼラチンスポンジ(10x5x3mm)内に浸出する炎症細胞数を顕著に抑制した.候補化合物の投与は,スポンジの腹腔内移入により惹起される腹腔浸出細胞数も抑制した.この候補化合物は,既に炎症を惹起させたマウスに投与しても炎症細胞浸出を抑制した.さらに,スポンジ誘発炎症細胞の存在下で非腫瘍原性の同系良性線維肉腫細胞の癌化が進展する炎症発癌モデルに候補化合物を投与すると発癌が抑制された.この候補化合物は,炎症細胞由来の活性酸素・活性窒素の生成には影響を与えなかった.候補化合物の投与を受けたマウスから炎症組織や臓器を摘出し,HPCL-質量分析を行った結果,投与候補化合物は炎症局所あるいは主要臓器に到達していることを確認した.今後は異なる炎症発癌モデルを導入し,得られた知見の普遍性を検証する予定である.炎症を背景とした発癌には,ヘリコバクター・ピロリ菌による胃発癌や肝炎ウイルスによる肝発癌などがある.こういった炎症発癌の原因は,対象臓器における遷延した炎症反応である.従って,炎症発癌の予防もしくは治療の根幹は,標的臓器への炎症細胞の浸出阻止にある.そこで報告者は,この炎症細胞の浸出阻害に焦点を絞った分子標的療法の基盤を確立するために,炎症細胞の血管内皮細胞への接着・浸出を評価する定量アッセイ系を作製した.これは,96穴プレートにマウス血管内皮細胞(MBE)を播種し,その後TNF-αを添加して活性化させる.異物のゼラチンスポンジ(10×5×3mm)をC57BL/6マウス腹腔内に移入して腹腔浸出細胞(炎症細胞)を回収し,蛍光色素(PKH-77)にて標識後に活性化血管内皮細胞上に重層培養する.その後に非接着炎症細胞を除去し,血管内皮に接着・浸出した炎症細胞をこれの蛍光量を指標として定量するアッセイ系である.この定量アッセイ系を用いて,炎症細胞の接着・浸出を阻害する化合物のスクリーニングを行った.対象としては,所属教室に保有する,シグナル伝達,サイトカイン・増殖因子,プロスタノイド系,脂質・イオンチャンネル系,活性酸化窒素合成等を抑えることが知られている化合物を用いた.その結果,計282種類の化合物の中から34種類(12%)の候補化合物を選択した.さらに,34種類の候補化合物の中から,濃度依存性をもち,かつ血管内皮細胞と炎症細胞のそれぞれに直接的な細胞傷害性を持たない化合物を選択したところ,最終的に23種類(8%)が抽出された.この23種類の標的分子を検索した結果,1)ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体,2)HER2(erbB2/neu),EGFR,PDGFRの増殖因子・受容体,3)p38やMAPキナーゼ経路,4)Akt,PI3K,GSK-3経路,5)細胞周期(CDK/サイクリンとその阻害分子)に分類された.遷延した炎症反応を背景とする発癌は炎症発癌と呼ばれる.その代表例は,ヘリコバクター・ピロリ菌感染による胃発癌や肝炎ウイルス感染による肝発癌などがある.この炎症発癌の予防もしくは治療の根幹は,炎症局所への炎症細胞浸出を阻害することにより達成されると考えた.そこで,炎症細胞の血管内皮細胞への接着・浸出を定量評価できる培養アッセイ系を作製した.この系を用いて,これまでに所属教室に保有するシグナル伝達,サイトカイン・増殖因子,プロスタノイド系,脂質・イオンチャンネル系,活性酸化窒素合成等を抑えることが知られている計282種類の化合物スクリーニングを施行した.その結果,濃度依存性を有し,かつ血管内皮細胞と炎症細胞のそれぞれに直接的な細胞傷害活性を持たない23種類の化合物を選択した.これらの中から接着・浸出活性の最も高い候補化合物をC57BL/6マウスに腹腔内投与すると,皮下に移入した異物のゼラチンスポンジ(10x5x3mm)内に浸出する炎症細胞数を顕著に抑制した.候補化合物の投与は,スポンジの腹腔内移入により惹起される腹腔浸出細胞数も抑制した.この候補化合物は,既に炎症を惹起させたマウスに投与しても炎症細胞浸出を抑制した.さらに,スポンジ誘発炎症細胞の存在下で非腫瘍原性の同系良性線維肉腫細胞の癌化が進展する炎症発癌モデルに候補化合物を投与すると発癌が抑制された.この候補化合物は,炎症細胞由来の活性酸素・活性窒素の生成には影響を与えなかった.

候補化合物の投与を受けたマウスから炎症組織や臓器を摘出し,HPCL-質量分析を行った結果,投与候補化合物は炎症局所あるいは主要臓器に到達していることを確認した.今後は異なる炎症発癌モデルを導入し,得られた知見の普遍性を検証する予定である.
子どもの造形活動における相互行為の論理に基づく臨床的教育実践開発の追究

1研究目的造形的な活動を通して子どもたちが周囲のもの、人、こととの関係において、自己をつくり変え、自分が生きている社会や文化との通路をつくりだしていくためには、子どもたちの学習活動を生きることと学ぶことを一体化した全人的な人間形成の視点からとらえ直し、真に学びがっくられていく学習状況へとつくり変える必要がある。そこで、中学校との連携を図りながら、これまでの造形教育を成り立たせてきた個人活動モデルの枠組を問い直し、次の点について明らかにすることを目的とした。(1)一人ひとりの子どもが教材(もの)、場(状況)、活動、他者(人)とのかかわり合いを通して、社会的で文化的に新たな行為をつくり生きることが可能となる行為と活動の論理を明らかにすること。(2)こうした行為と活動の論理に基づきつくられた学習状況において、子どもたちが行うつくり表す行為を、もの・こと・人との相互行為の視点からとらえ直す試みを繰り返すことにより、全人的な表現活動を展開することが可能となる教育実践の在り方とその開発研究の在り方を小中連携の視点から実践的に明らかにすること。2研究方法造形的な学習場面をビデオカメラを用いて記録し、会話、相互作用、相互行為、造形行為を記述し、子どもの活動世界とつくり表していくものとの世界とが、どのような関係性において相互的につくられていくのか、相互行為分析を行いとらえ直した。3研究成果中学校との連携を図りながら、子どもが学びを生成していく行為や活動の論理に基づき、新たな活動状況を開発し再実践することにより、子どもたちがもの・こと・人との相互行為を通して、自身の行為や活動の論理と、学びを拡張する在り方について検証と考察を行った。その結果、子どもたちがもの・こと・人と生き合う学びの過程をつくり成り立たせていく臨床的な実践研究開発法を明らかにすることができた。
抗原受容体遺伝子V(D)J組換えの制御機構

抗原受容体遺伝子のV(D)J組換えは、高等動物において唯一見られるDNAの体細胞組換えを伴う多重遺伝子系の発現制御機構である。このV(D)J組換えは、高度に保存された7mer(CACAGTG)および9mer(ACAAAAACC)と、それを隔てる12bpあるいは23bpのspacer配列からなる共通の組換えシグナル配列(RSS)を、組換え酵素Recombination Activating Gene-1,2(RAG-1,2)が認識し、DNAの二重鎖切断を導入することによって引き起こされる。V(D)J組換えでは、12bpと23bpのspacer配列を持つRSS間でのみ組換えが許されるという、いわゆる12/23 ruleにより、機能的な抗原受容体の発現およびリンパ細胞の正常な分化が保証されるが、これら組換えの分子機構に関してはいまだ不明な点が多い。本研究ではV(D)J組換えの分子機構を明らかにするために、組換え酵素RAGと組換えシグナル配列との構造解析を試みた。これまでRAGタンパク質の構造解析は、可溶性のタンパク質を得ることが極めて難しく、ほとんど進展が見られなかった。本研究では、昨年in vitroのタンパク質合成系を用いてRAG1タンパク質の可溶化に成功したが、発現量が非常に少なく構造解析に必要な量のタンパク質を得ることが困難であった。そこで、本年度は、in vitroタンパク質合成系にてRAG1タンパク質を合成する過程で新たに同定した、RAG1タンパク質のNonamer binding domain(NBD)に関して、合成ペプチドを化学的に合成し、これをRefoldingすることにより可溶性のNBDタンパク質を得ることに成功した。また、大腸菌の菌株、発現ベクターを検討した結果、大腸菌を用いた発現系により可溶性のNBDタンパク質を得ることにも成功した。これらの系によって得られたNBDタンパク質はゲルシフト解析の結果、DNA結合活性を持つことが確認され、機能的なタンパク質であることが確認された。いずれの系においてもmgオーダーのタンパク質が容易に得られることから、今後はこれらのタンパク質を用いてNBD-9mer複合体の構造解析をX線結晶構造解析、NMRの手法を用いて行う予定である。これにより、V(D)J組換えの最初のステップであるRAG1のNBDによるRSSの9mer認識の分子機構を明らかにする予定である。
釜炒り茶における炒り葉機の開発に関する基礎的研究

本研究は、「揉みの作用」によって均一な乾燥を行う「円筒連続式炒り葉機」の設計・製作、および、炒り葉機の加工精度を量的に示す「炒り葉評価システム」の実用化を検討し、炒り葉工程の改善を行うものである。本年度は、昨年度に設計・開発した回文式平釜炒り葉機を用い、本機における「揉みの作用」が製茶品質に及ぼす影響,並びに円筒型連続炒り葉機の設計要素を所得した。さらに加工精度の評価については、昨年度の研究成果で述べた面積割合(最適減水率時の葉色分布が、処理葉全体に占める割合)の結果を実用的レベルで視覚的に確認するため,最適な減水率時の色の分布状態を見るソフトウェアの開発を行った。以下に結果を述べる。1)製作した回文式平釜炒り葉機を宮崎県総合農業試験場茶業市場に持ち込み,1番茶基の「やきぶた」を供試材料として性能試験を行った。試作機は、回転する平釜と平蓋の間隙に生葉に「揉みの作用」を与えるが,昨年度設計時の構造では揉みの強さが弱くかつ茶葉に蒸れ色が見られた。このため,揉みの教科と上記の速やかな排気を行うために平釜と平蓋を改造し,丸リベットおよび排気蒸気孔の取付け・加工が有効であることを確認した。2)性能試験で得られたサンプルを乾燥し,官能審査に供した結果,投入量40g,釜底温度200°C(加工時間は最適減水率3845%となるように調整)の時に最高品質を示した。しかし,丸リベットによる葉痛み,砕粉化も若干見られ,釜や蓋への茶渋の付着と合わせて今度改善策を検討する必要が生じた。3)昨年度と今年度の成果から,円すい型連続式炒り葉機の設計に着手したが,直径1m程度の円すい釜の加工には特殊な製管技術と高い加工精度を要するため,加工が容易で円すい釜と同等の性能が得られると考えられる円筒型連続式炒り葉機に設計を変更し,製作した。今回は,組立と基礎的性能試験を実施し,目標の温度に到達することを確認した。4)VisualC++で開発したソフトウェアは,炒り葉のRGB画像に対してRGB各色の階調幅を任意の色に変換して視認させ,任意の色の分布状態を数値化するものである。現在,これを用いてこれまで取得した炒り葉処理葉の画像を解析中である。また現場での適応を考えたリアルタイム化した加工精度の評価システムの開発までには至らなかった。以上の結果をふまえ、来年度は、円筒型連続式炒葉機の性能試験とリアルタイム式炒り葉評価システムを開発してデータを取得・解析し,研究報告会や研究報告会や学会誌等で成果を公表する予定である。釜炒り茶の炒り葉工程は、生葉の青殺を行う工程で葉の発酵を抑える。現行の炒り葉機では、釜で炒るのみの工を行うため、乾燥の過不足状態が茶葉中に混在する「炒りムラ」が生じ、釜炒り茶の品質を大きく低下させることから、生葉水分を均一に除去するために熟練の技術が必要となる。また、炒り葉工程における加工精度の評価は、製茶後の官能審査によって行われるため、迅速、かつ、定量的な評価方法の開発が急務である。そこで、本研究では、「揉みの作用」によって均一な乾燥を行う「円すい型連続式炒り葉機」の設計・製作、および、炒り葉機の加工精度を定量的に示す「炒り葉評価システム」の実用化を検討し、炒り葉工程の改善を行うものである。本年度は、円すい型連続式炒り葉機を設計するための基礎資料を得た。すなわち、上下に位置する2つの円すい釜の間隙の大きさ、その間隙に投入される適正な生葉量、円すい釜側面の形状、および円すい釜の回転速度から生葉の均一乾燥、および揉捻による針状成形の程度等の基礎資料を取得できる回分式平釜炒り葉機を試作した。加工精度の評価は、現在、開発中の炒り葉評価システムにおける評価指標の抽出を行った。以下に回分式平釜炒り葉機、および、炒り葉評価システムを用いた性能試験、および、解析結果を示す。1)回分式平釜炒り葉機は、高さ・揉圧の調節が可能な固定式平蓋とニクロムコンロで加熱される回転式平釜との間隙に生葉が投入され、平釜の回転によって生葉と平釜・平蓋との間に摩擦が生じ、生葉が揉まれる構造を有する。本機の温度調節は、平蓋、平釜の温度が2つの非接触式温度計で計測される構造としたことから、平釜の温度を基準にしてニクロムコンロの電圧がスライダックで調節されるようにした。2) 3番茶期の「やぶきた」を供試した性能試験の結果、(1)平釜底120140°C前後、間隙12mmの時に乾燥、および、揉みの状態、香気が良好であったこと、(2)揉みによるある程度の形状変化が観察されたものの、改善が必要であること、(3)生葉の投入量の変化によって処理葉の性状が変化したこと、等が明らかとなった。3)炒り葉評価システムでは、生葉から過度にまで処理した炒り葉のRGB画像をコンピュータで解析し、B(青)の面積割合(最適減水率時の葉色分布が、処理葉全体に占める割合)が、最も炒り葉工程を評価する指標として有効であることを明らかにした。

以上の結果を踏まえ、来年度は、円すい型連続式炒り葉機の設計・製作、炒り葉評価システムの現場での適用、今年度データの充実等を行う。本研究は、「揉みの作用」によって均一な乾燥を行う「円筒連続式炒り葉機」の設計・製作、および、炒り葉機の加工精度を量的に示す「炒り葉評価システム」の実用化を検討し、炒り葉工程の改善を行うものである。本年度は、昨年度に設計・開発した回文式平釜炒り葉機を用い、本機における「揉みの作用」が製茶品質に及ぼす影響,並びに円筒型連続炒り葉機の設計要素を所得した。さらに加工精度の評価については、昨年度の研究成果で述べた面積割合(最適減水率時の葉色分布が、処理葉全体に占める割合)の結果を実用的レベルで視覚的に確認するため,最適な減水率時の色の分布状態を見るソフトウェアの開発を行った。以下に結果を述べる。1)製作した回文式平釜炒り葉機を宮崎県総合農業試験場茶業市場に持ち込み,1番茶基の「やきぶた」を供試材料として性能試験を行った。試作機は、回転する平釜と平蓋の間隙に生葉に「揉みの作用」を与えるが,昨年度設計時の構造では揉みの強さが弱くかつ茶葉に蒸れ色が見られた。このため,揉みの教科と上記の速やかな排気を行うために平釜と平蓋を改造し,丸リベットおよび排気蒸気孔の取付け・加工が有効であることを確認した。2)性能試験で得られたサンプルを乾燥し,官能審査に供した結果,投入量40g,釜底温度200°C(加工時間は最適減水率3845%となるように調整)の時に最高品質を示した。しかし,丸リベットによる葉痛み,砕粉化も若干見られ,釜や蓋への茶渋の付着と合わせて今度改善策を検討する必要が生じた。3)昨年度と今年度の成果から,円すい型連続式炒り葉機の設計に着手したが,直径1m程度の円すい釜の加工には特殊な製管技術と高い加工精度を要するため,加工が容易で円すい釜と同等の性能が得られると考えられる円筒型連続式炒り葉機に設計を変更し,製作した。今回は,組立と基礎的性能試験を実施し,目標の温度に到達することを確認した。4)VisualC++で開発したソフトウェアは,炒り葉のRGB画像に対してRGB各色の階調幅を任意の色に変換して視認させ,任意の色の分布状態を数値化するものである。現在,これを用いてこれまで取得した炒り葉処理葉の画像を解析中である。また現場での適応を考えたリアルタイム化した加工精度の評価システムの開発までには至らなかった。以上の結果をふまえ、来年度は、円筒型連続式炒葉機の性能試験とリアルタイム式炒り葉評価システムを開発してデータを取得・解析し,研究報告会や研究報告会や学会誌等で成果を公表する予定である。
未来予測手術具現化のための脳機能データベース及び標準脳の作成

当該施設では2000年以降、術中MRIを利用したナビゲーションシステムを1600例以上に経験し、加えて2004年以降、覚醒下脳機能マッピングを行う際、ナビゲーション画像や電気刺激及び患者反応の情報を同時記録したビデオ記録(IEMAS)を行い350症例以上に活用された。これら可視化プロセスは手術経験という勘のみならず科学的評価、そして意志決定プロセスとして重要である。ただし、脳表面や白質を電気刺激したprobeの位置情報はアナログのため術中MRIへの反映が不十分であった。この発展的解決のため、覚醒下手術中の刺激probeからの位置情報をログ情報として記録し、患者の脳機能情報を付加することでデジタル化さらにはデータベース構築を行い活用することを目的とした。2015年から2016年に実施した覚醒下神経膠腫摘出手術29例(男性16名、女性13名、平均38.1±10.8歳、うち初発23例)に対し、マッピング時の刺激電極装置(ユニークメディカル社)の位置情報をログとして取得し、術中MRIナビゲーション(BrainLab社)と連動させ、画像解析ソフト(3D-slicer)上で電気刺激部位のデジタル情報を得た。得られた術中MRI上の反応点は術前MRI及び標準脳上に変換表示すると共に、画像変換に伴う精度を算出した。29名全例でログ情報取得が可能であった。従来のビデオ記録だけでは不確定な刺激位置情報の同定や、brain shiftの判定に有用であった。術中MRI上反応点の画像変換精度については、脳表上で言語停止が得られた10症例に対して近隣脳溝を基準に計測を行い、術前MRIへは2.8±1.3 mm、さらに標準脳へは5.5±3.6 mmと算出された。術中MRIナビゲーションと連動し脳機能マッピング情報のデジタル化が行えた。また、標準脳上への変換に関しても、個々の患者脳へ応用可能となる成果を得た。28年度が最終年度であるため、記入しない。覚醒下手術予定患者のMRI撮影を術前高磁場撮影を行い、脳溝を中心としたobject-based morphometryに基づき、BrainVISA解析ソフトウェアを用いた入念な術前準備を行った。計画1実績について:電気刺激装置の位置情報の取得を14名の患者に対して行った。具体的には、MRI画像をアップデートしたナビゲーションシステム(BrainLAB社装置)に読み取り可能な、滅菌されたプローベを準備し電気刺激装置に装着した。画像及び位置情報の読み込みはSlicer等ソフトウェア上で行い、電気刺激装置の位置情報のログを取得した。ログ情報取得の手法については、研究協力者である山田氏と共に数例の試行を行った後に実際の患者に適用し実現した。成果については学会およびProceedingsとして報告を行った。計画2実績について:覚醒下手術のビデオにおける検査者タスク提示、電気刺激条件、患者の反応を確認し統合させ、覚醒下手術におけるマッピング工程の可視化の作業を行った。検査者が行う検査タスク(物品呼称、動詞生成、数字のカウンティング、漢字・ひらがな音読、計算)、術者が行う脳表面(MRIで作成した3D構築脳表画像と顕微鏡映像との相違を確認後)上の電気刺激範囲、反応が起こった位置を電流値と共に可視化する。平成27年度については24名の患者の覚醒下手術に参加し行程解析のデータ作成を行った。また、過去のマッピング症例を上記ビデオ記録をもとに154名の後方視的解析としてまとめ、学会及びProceedingsとして報告を行った。行程解析については研究協力者である南氏と共同して調査を進め、術後症状も含めさらに研究内容を深化させている。現在のところ、ログ情報を手術中に取得できるプロセスは確立させたためログ取得を自動化出来るようなソフトの改良を加えている。今後は全ての覚醒下手術において自動的なログ取得が行える手法を確立できるようさらに研究開発を進めている。

術中MRI上反応点の画像変換精度については、脳表上で言語停止が得られた10症例に対して近隣脳溝を基準に計測を行い、術前MRIへは2.8±1.3 mm、さらに標準脳へは5.5±3.6 mmと算出された。術中MRIナビゲーションと連動し脳機能マッピング情報のデジタル化が行えた。また、標準脳上への変換に関しても、個々の患者脳へ応用可能となる成果を得た。計画1に関しては全ての手術においてログ取得を自動化し、簡便かつ確実にデータ取得したものを保存し解析可能とすることである。術中に電気刺激部位の特定と同時に機能部位のデータベース化も同時に進める。計画2に関して、マッピングで脳機能反応解析を進めながら閾値の設定を行い脳機能毎の詳細な解析を更に進める。上記計画1と2の結果を基に、当初の計画であった標準脳作成に向けての研究を加速させる。28年度が最終年度であるため、記入しない。
SCC抗原の結合分子の検索と機能解析、臨床的意義の解明および分子標的治療への応用

SCC抗原の結合分子としてcarbonyl reductase (CR)を同定した。CR遺伝子の導入によって機能解析を行った結果、CRの発現抑制により細胞形態は線維芽細胞様に変化し、MMPの発現、細胞浸潤能および移動能は亢進した。一方、CRの過剰発現ではMMPの発現は抑制された。子宮頸部扁平上皮癌でCRの発現パターンを解析した結果、CRの発現低下パターンでは骨盤リンパ節転移と有意の相関を認め、無進行生存と全生存は有意に低下していた。以上より、CRの発現低下は癌の進展に促進的に働き、予後不良となることが考えられる。[研究目的]SCC抗原のもつ様々な生物活性に関して、当教室から報告してきた。しかしながら、SCC抗原の分子作用機構や細胞内結合分子については明らかでなかった。最近、SCC抗原の組み換え蛋白質(GST融合蛋白)を精製し、これと結合する細胞内蛋白を分離し、プロテオーム解析した結果、carbonyl reductase(CR)と同定した。さらに、CRの機能を解析し、リンパ節転移、再発および予後との関連性を検討し、臨床的意義を明らかにする。また、CRを標的とした新たな予後診断法あるいは新たな分子標的治療を開発することを研究の目的とする。以下、平成20年度の研究計画と研究成果を報告する。1.SCC抗原の結合分子であるCRの抗体を作成し、細胞内局在および組織局在を検討する。CRの抗原決定部位となりうる場所を選び、合成ペプチドを作成しウサギに免疫した結果、CRのポリクローナル抗体を作成できた。これを用いてケラチノサイトおよびヒト子宮膣部正常扁平上皮を免疫染色した結果、CRは細胞質に局在し、正常扁平上皮の全層性に強く発現していることが明らかとなった。また、子宮頸癌症例を免疫染色した結果、CRの発現が低下している症例では骨盤リンパ節への転移が有意に多く、予後も有意に不良であった(この結果は特許出願し、平成20年8月14日公開)。以上より、子宮頸癌の予後を判定し、追加治療の必要性についてCRの発現状態に応じた個別化の指標となりうることが期待される重要な結果が得られた。2.CRの強発現および発現抑制による細胞機能を検討する。CRの機能を解析するために子宮頸部扁平上皮癌培養細胞株SiHaおよびSKGIIにCRのセンスおよびアンチセンスcDNAを遺伝子導入したクローンが得られた。これらを用いて、CRの機能を解析中である。[研究目的]SCC抗原の持つ生物活性について当教室から報告してきた。しかしながらSCC抗原の分子作用機構や細胞内結合分子については明らかでなかった。プロテオーム解析の結果、SCC抗原の結合分子としてcarbonyl redqctase(CR)を同定した。(論文として報告Murakami A Int J Oncol, 2010)さらに、CRの機能を解析し、リンパ節転移、再発・予後との関連性を検討し、臨床的意義を明らかにする。また、CRを標的とした新たな予後診断あるいは分子標的治療を開発することを研究の目的とする。以下、平成21年度の研究成果を報告する。1. CRの臨床的意義の解明子官頸癌症例を免疫組織染色し、その発現パターンを解析した結果、原発巣でのCRの発現が低下している症例では骨盤リンパ節への転移が有意に多く、再発・予後に関して不良であった(この結果は特許出願しWeb上で公開となっている)。また、CRの発現低下は再発の独立因子となっている。以上の結果よりCRは子宮頸癌の予後を判定し、追加治療の必要性についてCRの発現パターンに応じた個別化の指標となりうる重要な結果が得られた(論文作成中)。2. CRの分子機能CRの機能を解析するために子宮頸癌細胞にCRのセンス、アンチセンスcDNAを遺伝子導入して解析した。アンチセンスcDNAを導入したクローンでは細胞の移動能・浸潤能が亢進していることが分かった。その分子機構としてアンチセンスではCOX-2の過剰発現を誘導し、その結果PGE2の発現亢進を誘導していた。PGE2は癌の浸潤・転移機構に重要な役割を果たしていることが明らかになっているが、CRの関与する分子機構について、詳細なデータについて解析中である。CRに対する抗体を作成し、細胞局在を検討した結果、細胞質に存在することが明らかとなった。遺伝子導入によってCRの過剰発現および発現抑制を行った結果、CRの発現抑制により細胞の形態は線維芽細胞様の形態に変化し、細胞浸潤能および移動能は亢進した。さらに、CRの発現抑制によりMMPの発現は亢進する、一方、CRの過剰発現ではMMPの発現は抑制された。

臨床的意義に関しては、CRの発現パターンをSCC抗原と同様にCRの発現が保たれているstrong pattern、癌細胞すべてが一様に染色されているものの発現程度は正常上皮よりも弱いパターン(weak and homogenous pattern)、正常上皮と同程度の染色性を示す癌細胞と染色性が失われている癌細胞の両者が混在しているパターン(heterogenous pattern)の3パターンに分類できた。発現が低下している細胞が混在するweak and homogenouspatternおよびheterogenous patternでは、骨盤リンパ節転移と有意の相関を認めた。また、weak and homogenous patternおよびheterogenous patternでは無進行生存および全生存は有意に低下していた。以上より、CRの発現低下は骨盤リンパ節転移の発症と有意の相関があり、予後不良を示すことが明らかとなった。
情報通信ネットワークに対する待ち行列モデルの適用とその漸近的性質に関する研究

本研究では到着間隔およびサービス時間が相型分布に従うような3段直列型待ち行列システムの定常分布に関する漸近的な性質を取り扱った。昨年度は、2段の直列型待ち行列システムの漸近的解析および数値計算による解の吟味をベースとして、3段直列型待ち行列システムの漸近的性質の予想と基礎的な解析に注力した。この結果に基づき、本年度は以下に示されるような成果を得た。1. 3段直列型待ち行列の定常分布を数値的に得るための計算法を異なるアーキテクチャのワークステーション上でも容易に動作するよう改良し、より多様な計算機環境での数値的解析を可能にした。2.前年度よりの懸案であった、従来の理論が3段直列型待ち行列に直接適用できないという点を克服することに注力した。この結果、数学的証明の途中で現れるある種の推移行列によって表される確率過程が、エルゴード的なマルコフ連鎖になっていることを証明できれば、その他の部分については従来の理論を適用できることがわかった。3.上記の未証明部分を仮定として取り込むことにより、2段直列型待ち行列システムと同様に、定常分布がある条件下において漸近的に幾何的な減少を示すことがわかった。これは、数値解に基づいて昨年度に立てられた予想とも矛盾しない結果である。未証明部分については現在もなお証明作業を継続中であるが、ある程度の漸近的性質が明らかになったため、この性質を利用して待ち行列システムの特性値を高速かつ高精度で求める近似的計算法について、今後研究を進めていく予定である。なお、本研究の成果については、1件が投稿中、1件が投稿準備中である。本研究では到着間隔およびサービス時間が相型分布に従うような3段直列型待ち行列システムの定常分布に関する漸近的な性質を取り扱っているが、本年度は以下に示されるような新たな成果が得られた。1.既に得られている2段直列型待ち行列システムに関する理論的成果を利用して、3段直列型待ち行列の定常分布を数値的に得るための計算法を改良し、またこれを高速計算用ワークステーション上に実装した。2.上述の数値計算法によって求められた3段直列型待ち行列の定常分布の数値解を分類・吟味し、定常分布の漸近的性質を予想した。その結果、定常分布の裾は幾何的に減衰しているであろうという予想が得られた。さらに、定常分布の裾には減衰率が方向によって異なるという予想がなされた。これらの性質は、いずれも2段直列型待ち行列システムで見られた性質よりさらに複雑であると考えられるが、その本質はよく類似していると考えられる。3.この予想に基づき、2段直列型待ち行列システムに関する理論的成果の拡張にとりかかった。これは、一般に「擬出生死滅過程」と呼ばれる確率過程の理論を援用したものであるが、現段階では従来の理論を直接3段直列型待ち行列に適用できないということが明らかになっている。そこで、来年度はこの障壁を乗り越えるための理論に注力する。
削除構文の獲得における日英語比較研究:日英文法の第一言語獲得の理論的・実証的研究

本研究では、英語を母国語とする幼児は大人と同様に文中の省略部分を理解することが可能かをいくつかの省略を含む構文を対象に調査した。まず、それらの削除を含む構文の文法規則の理論分析を行った。その文法規則を幼児が獲得しているかを確かめるという観点から実証実験を行った結果、幼児は大人と同様の解釈をそれらの構文にあてはめているということが判明した。これは幼児が大人と同様の文法規則を既に保持している証拠の一端となりうるものである。本研究では、日本語、英語の削除に関する構文を取り上げ、言語理論に密接に基づいた実証研究を実現する。日本語、英語の母国語話者に内在する文法のモデルを理論的に構築し、モデルの妥当性を確認する実験を積み重ねることで日本語、英語母国語話者の言語知識とその獲得過程の解明に寄与する。具体的には句、節の省略、削除が関与する他の構文の調査も行い、それが言語獲得モデルにおいてどのような含意があるかを見極め、実験を行い、言語獲得・言語発達理論ひいては現在の文法理論に対して新たな知見を提供することが本研究の目的である。初年度である本年度は、まず海外研究協力者R.Thorntonが既に採集に着手していたFragmentsの2歳から4歳の英語母国語話者の発話データの研究結果報告(GALA2007)について、本研究の初期実験データとして分析した。英語の母国語話者が発声しない類の2歳児の発話が日本語の文法では適切な発話であるなど興味深い点が見られた。また、今後のデータ収集分析においての着目点についても討論を重ねた。日本語においても英語のFragmentsに対応する実験パラダイムを複数企画した。英語と日本語のFragmentsに関しては、前者はMerchant(2003)が間接疑問文縮約と同様の派生を経ていると主張しているが、後者は主に強調構文からの派生として分析される。このことに留意しながら、海外協力研究者を交えて実験計画の検討を続けており、来年度早々より実験が開始となる見込みである。本年度は、英語と日本語のPseudo-cleftsと束縛原理の相関に関して、理論的研究と実証的研究に着手した。まず日本語における理論的研究を行ない、日本語のPseudo-cleftsも移動による派生として分析されると主張する研究を論文にまとめた。英語における実証的研究においては、海外研究協力者Rozz.Thorntonを交えて実験計画の検討を重ね、Pseudo-cleftsと束縛原理の相関に関する複数の実験に着手した。この実験結果は平成21年度での発表を計画している。また、名詞句内でも指定部と主要部に一致現象が見受けられる場合にのみ削除が認可されるとするLobeck(1995)やSaito&Murasugi(1990)の主張を鑑み、日本語における名詞句内の指定部と主要部の意味的な一致現象における脳内処理の実証的研究結果を論文にまとめた。(IEICE TRANSACTIONS on Information and Systemsに掲載)本研究でなされた理論的研究はRizzi(1997)が提唱した補文標識句(CP)の内部構造を援用している。本研究での理論的研究の実証実験により支持されたことは、英語を母国語とする幼児の文法理論においてもRizzi(1997)が提唱する豊かな補文標識句(CP)構造が必要であることを示唆すると思われる。
染色体分断技術とゲノム編集技術の融合による酵母ゲノム工学の新展開

ゲノム工学は、基礎(ゲノム機能の解明)、応用(有用微生物の育種)の両面で今後の生命科学、バイオテクノロジーの発展に欠かせない研究の推進エンジンである。ゲノムを自在に操作するため、ゲノム編集技術を取り入れ、ゲノムの複数部位の同時分断技術、ゲノムの複数領域の同時削除技術、ゲノムの複数領域の同時重複技術、染色体大規模領域の置換技術の開発を行なった。また、そうした技術を、さらに、ユーザーフレンドリーにするため、ゲノム編集技術における多様なガイド(guide) RNAのデリバリーのための簡便な調製技術の開発も行なった。計画1-1)2領域同時削除技術(PCD-CRISPR)の開発従来のPCD技術では成功していなかった染色体2領域の同時削除が、CRISPR/Cas複合体の発現下においてPCD技術を行う(PCD-CRISPR法と称す)事により可能となるかどうか試みた。まず、染色体末端領域の2カ所について同時欠失を行ったところ、従来法では全く得られなかった同時欠失形質転換体が、形質転換体数総数の約20%の頻度で得られることがわかった。次に、相同組換え部位が倍となり、より難易度の高い染色体内部領域の2カ所同時欠失を行ったところ、同じく従来法では全く得られなかった2領域同時欠失形質転換体が約50%の頻度で得られることがわかった。これらの結果より、染色体の末端、内部にかかわらず、PCD-CRISPR法によって、少なくとも2領域については、同時欠失が可能である技術が確立した。計画1-2)2領域同時重複技術(PCDup-CRISPR)の開発従来のPCDup法では成功していなかった染色体2領域の同時重複が、CRISPR/Cas複合体の発現下でPCDup技術を行う事により可能となるかどうか試みた。その結果、形質転換体総数の約40%の頻度で、目的の2領域が同時に重複している形質転換体が得られることがわかった。これらの結果から、PCDup-CRISPR法は、従来法では実現できなかった染色体2領域同時部分重複が可能であることが示された。こうした技術の開発を進める中で、要素技術の最適化に関連した実験も行った。例えば、従来のPCD法では、染色体DNAとの相同組換え領域の長さが400bp必要であり、オーバーラップPCRを行う必要があったが、PCD-CRISPR法では、プライマーに付けた50 bpの短い相同配列を持つ欠失用断片を用いても、高い効率で染色体の部分欠失を行うことが出来ることなどを明らかにした。これまでに開発してきたPCD、PCDup法(従来法と称す)では取得できなかった同時2領域欠失や同時2領域重複を持つ形質転換体が、本年度開発したPCD-CRISPR法、同時2カ所重複技術(CRISPR-PCDup)の開発によって、初めて可能となった。原理的には可能であるとは信じていたが、予期せぬ問題点が出て来る等によって、期待通りに進展するとは思っていなかった。しかし、それが、実際に、期待通りに進展したことは、大きな進展であると評価しても良いと思っている。この進展は、次のステップとして、同時3カ所欠失、同時3カ所重複技術、さらにはもっと多数の領域を、一度の形質転換操作で可能とする、これまでになかった革新的ゲノム工学技術の開発に結びつくものである。PCD-CRISPR法とPCDup-CRISPR法は、一度に少なくとも2領域を操作できるため、複数箇所の染色体部分欠失株や重複株の作製に要する日数を大幅に減らすことが出来る。例えば、2つの染色体領域を操作するために必要な日数を比較すると、従来法では確認作業も含めて25日程度必要であったが、それが12日程度で可能となる。また、従来のPCD法やPCDup法では、相同組換え効率の低さから、標的領域との相同配列が400 bp必要であり、ゲノムDNAから増幅させた相同配列とマーカーやテロメアを含むPCR断片を個別にPCRによって調製した後、オーバーラップPCRによってこの2つのPCR断片を繋げるという作業が必要であった。しかし、PCD-CRISPR法やPCDup-CRISPR法では、標的領域との相同配列が50 bpのものを用いて高効率な部分欠失や部分重複を起こすことが出来ること、すなわち、必要なPCR断片を一回のPCRで調製することが出来るようになった。こうした成果を考えると、当初の計画以上に進展していると評価しても良いと思っている。従来のPCS技術では成功していなかった染色体複数箇所の同時分断技術を、CRISPR/Cas技術を融合することによって確立し、Natureの姉妹誌であるScientific Reports誌(2016)に発表することができた.同様に、従来のPCD技術では成功していなかった染色体2領域の同時削除、および同時重複についても、CRISPR/Cas技術を併用すれば、可能であることを示すことができた.しかし、こうした技術の開発を進める中で、必要な要素技術をもっと簡単にする必要があることを痛感し、本年度は、最も重要な要素技術であるがguide RNA (gRNA)の発現を簡単化することにも取り組んだ.具体的には、様々な部位のgRNAを一過的に発現する(transient expression)DNA断片を、共通の鋳型プラスミドを用いて、PCRによってのみ調製できるシステムの構築を行った.

その結果、それぞれの標的配列を含むgRNA断片(断片A)と、それを発現させるSNR52遺伝子のプロモータ部(断片B)を別々のPCRによって調製し、その後、2つの断片を混合し、断片Aと断片Bを融合させるオーバーラップPCRを行うことにより、そうした断片を調製できる「gRNA transient expression system (gRNA-TES)」を構築することができた.そして、gRNA-TESが、従来の方法では困難であった染色体の大規模領域を簡便に削除するのに有効であることを示すことができた.オーバーラップPCR断片から発現するgRNAのレベルがどのようなレベルかは測定していないが、最終的に、期待される染色体構造を持つ形質転換体を取得できるので、適正なレベルで発現しているものと想定される.今後は、さらに効率良く形質転換体が取得できるようにgRNA-TESの最適化を図る予定である.本研究は本年で2年目を終了したが、その目的は、これまでに申請者らが開発してきた様々なゲノム工学技術(染色体の任意部位の分断(PCS)、任意領域の削除(PCD)および重複(PCDup))に、近年新しく開発されたCRISPR/Casゲノム編集技術を融合し、飛躍的な効率化、簡便化、迅速化により新しい展開を図ろうとするものである.1年目は、CRISPR-PCS技術を確立し、2年目の本年には、その成果を、Natureの姉妹誌であるScientific Reports誌(2016)に発表した.また、2カ所の領域の同時削除(CRISPR-PCD)、同時重複(CRISPR-PCDup)が可能であることを示すこともできた.さらに、従来法では、いわゆるDonor DNAをオーバーラップPCRによって調製する必要があったが、それを標的部位の両側50塩基対の相同配列をプライマーに付けて調製できるように改良した.さらに、これらの技術をハイスループット化する上で最も重要な要素技術は、様々なguide gRNAの発現の簡便化であるが、これを共通の鋳型プラスミドを用いて、PCRだけで調製するユーザーフレンドリーな技術の開発(gRNA-TES:gRNA transient expression system)に成功した(投稿準備中).こうして開発してきた一連のゲノム工学技術は、本研究申請のもととなったNucleic Acids Research誌(2014年)の論文、そして、本研究の1年目の成果としてNatureの姉妹誌であるScientific Reports誌(2015年)に発表した論文、さらに2年目の成果として同じくScientific Reports誌(2016年)に受理された論文と、毎年IFの高い国際誌に発表してきており、進捗状況は計画以上に進展していると言っても良いと自負している.我々が開発してきた種々のゲノム工学技術(分断、削除、重複など)とCRISPR/Cas9技術を融合して、より強力でユーザーフレンドリーなゲノム工学技術とするためにはいくつかの点を簡便化する必要がある。そのひとつが、多様な標的部位に応じて個々に作成する必要があるgRNA発現プラスミドの構築である。これを簡便化するため、昨年、共通のプラスミドを鋳型として、それぞれの標的配列に応じたgRNAを一過的に発現するDNA断片をPCRだけで調製できる技術(gRNA-TES: gRNA transient expression system)を確立することに着手した。本年度は、この技術を最大限に発揮するための最適化を(gRNA発現断片の量、オーバーラップPCRの条件、DNAポリメラーゼの種類など)行った。
口腔癌におけるアポトーシスの発現とヘリコバクター・ピロリ局在の分子遺伝学的証明

ヘリコパクター・ピロリ(以下HPと略す)感染と胃癌の発生との関わりを示唆する報告は数多く、その病原牲は様々な観点から指摘されているが、単なる細菌に癌化に関わる働きがあることは従来の常識からは考えられないことであった。胃癌と同様に口腔癌の発生においてもHP感染が関与するか否か、以下の方法により検討した。HPに対するポリクロナール抗体を用いて、口腔癌組織における感染あるいは存在の有無につき免疫組織学的に検討した。対象とした口腔癌26症例のうち、陽性反応が認められたのは13例(50.0%)であった。これは事前の予想に反して高い数値であり、正常あるいは他の良性疾患における陽性率をはるかに凌ぐものである。さらに22例についてはアポトーシス関連の各種免疫組織学的所見と比較することができた。その結果、DNA fragmentationを検出するTUNEL法によって標識のない症例ではHP陽性の群が多く、逆にHPが陰性の場合は10例(90.9%)がTUNEL法陽性であった。またHP陽性群ではbcl-2蛋白の陽性率が高く、細胞増殖抗原であるPCNAに対する抗体の標識率も若干高かったが統計学的な有意差は得られなかった。臨床的な予後についてみるとHP陽性群は陰性群に比べて局所の再発率が72.7%と高く、5年累積生存率も54.5%と低い結果であった。ちなみに陰性群ではそれぞれ45.4%、81.8%であった。局所での存在は二次的な細菌定着に過ぎないという可絶性もあり、その病原性の発現、ひいては癌化への関与を何ら証明するものではない。今後は遺伝学的な検討が必要であると思われるが、口腔癌における高頻度のHP陽性率が明らかとなり、アポトーシスとの関連性を示唆する結果も得られたものと考えている.ヘリコパクター・ピロリ(以下HPと略す)感染と胃癌の発生との関わりを示唆する報告は数多く、その病原牲は様々な観点から指摘されているが、単なる細菌に癌化に関わる働きがあることは従来の常識からは考えられないことであった。今後は遺伝学的な検討が必要であると思われるが、口腔癌における高頻度のHP陽性率が明らかとなり、アポトーシスとの関連性を示唆する結果も得られたものと考えている.
催唾ペプチドの活性部位の同定

超高齢化社会の到来、激動する社会情勢下にストレスの高まりに伴う神経抑制性の薬物の服用機会の増加、エステの流行に伴う食欲抑制剤の飲食等が原因となり、老齢者だけでなく若年者にもHyposalivationあるいはXerostomiaの患者が年々増加している。これらの人々のQOLを確保するために自律神経系を介さない催唾剤の開発が急がれる。これらのことから本実験の最終目的は自律神経系を介さない催唾剤の開発にある。このような理由からペプチド性催唾剤の開発に着目した。催唾作用を示すペプチドはC末のペンタペプチドの構造(FXGLM-NH2)が特異でタキキニンに分類されるもののみであった。昨年にC末のヘプタペプチドの詳細を明らかに出来たので、今年はその成績を基に1-4位にあるN末及びC末5、6あるいは8位の機能を検索した。また、NKAやNKB及びそれらのアナログも検索した。その結果、C末のヘプタペプチドの活性が強い時はN末1、2位のアミノ酸は抑制的に働き、ノナペプチドで十分に機能を発現する事、逆にC末のヘプタペプチドの活性が弱いか不活性の時には、N末部分のアミノ酸残基は促進的に働くこと、C末ヘプタペプチドの活性は5、6及び8位のアミノ酸残基の組み合わせモードにより決定されること及び5位のSやFのみがNK2やNK3レセプターを認識するアミノ酸ではないこと等を明らかに出来た。更に、今回、天然に存在する20個のタキキニンのうち催唾作用が最も強いChiken SPの2倍以上の活性を持つノナペプチドを開発できた。これを用いて更なる検索を重ね初期目的の催唾剤を開発する予定である。多くの市販のペプチドを用いたこれまでの研究から催唾活性を示すペプチドはC-末構造がFXGLM-NH2であり、この構造を欠くペプチドには催唾活性が認められないことと投与量を加味したこれまでの研究から、催唾ペブチドのうち催唾活性が最大のものはphysalaemin(physa)であることが明らかになった.そこで、本研究ではphysaのC-末のへプタペプチド(NKFYGLM-NH2)のアミノ酸配列を参考にして、N-Mの各アミノ酸を天然に存在する共通の18個のアミノ酸(Wを除く)にそれぞれひとつずつ置換した126個のへプタペプチドをMultipin法で合成し、これらの一次構造と催唾活性の相関を明らかにした。また、天然に存在するタキキニン11種類も購入あるいは合成し、催唾活性を調べた。さらに、physaのC-およびN-末からNH2やPyrだけでなく、ひとつずつ順番にアミノ酸を削除したペプチド17個も合成し、それらの催唾活性を検索した結果は以下のとうりである。1.C-末のアミド基は催唾活性に必須である。2.7番目のFと置換できるアミノ酸はYのみであったが、置換できたヘプタペプチドの催唾活性は有意に抑制される。3.5、6番目のNとKはいろいろのアミノ酸と置換でき、しかも催唾活性を有意に促進する場合が認められたので、この位置のアミノ酸を工夫する事によりいろいろの催唾剤が開発出来る。4.7-11番目のアミノ酸は置換できるアミノ酸が少なく、しかも促進作用を示す例はほとんどみられない。タキキニンの活性部位を同定し、その成績を基に新しい催唾ペプチドを開発する事を目的に本実験に着手した。そこで天然に存在するタキキニンのうち最大の催唾作用を示すフィサレミンのアミノ酸配列を参考に活性部位の同定を行った。すなわち、フィサレミンのC-末ヘプタペプチドのアミノ酸をそれぞれ20個のアミノ酸とひとつずつ置換した126個のC-末のヘプタペプチドをmultipin法で合成し、催唾作用を検索した。