hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
哺乳動物細胞における突然変異の制御とDNA複製の精度維持機構

8oxodGTPはシトシンともチミンとも同じ能率で対合するので、この結果はMutTミュ-タントがAT→CGトランスバ-ジョンを特異的にひき起こすという事実とよく適合する。この生物学的意義からみて同種のタンパクが哺乳動物にも存在すると考えられたが、そのような酵素の活性をヒトの細胞中に見出すことができた。現在その精製を進めているところである。(1)突然変異の誘起を抑えるDNA修復酵素の遺伝子のクローニングとその動きの解明ーO^6-メチルグアニンDNAメチルトランスフェラーゼはアルキル化剤でDNAにできた傷(O^6メチルグアニン)を修復し、突然変異や発癌を抑えるうえで中心的な役割を果たしている。この酵素のcDNAをヒト、マウス、ラットからクローニングして、その一次構造を明らかにした。また種々のアミノ酸置換変異をヒトの酵素タンパクに導入し、機能発現との関係を明らかにした。ヒトの癌由来の細胞株ではメチルトランスフェラーゼ活性を欠損しているものが多いが、欠損細胞ではこの遺伝子の発現レベルが低いことを明らかにした。欠損細胞でも転写の開始は正常通り起こるので、その以降の過程に異常があるものと考えられる。発癌におけるこの酵素の役割を明らかにするためには遺伝子欠損マウスを作製する必要があるが、そのためマウスの遺伝子のクローニングと解析を行なった。(2)DNA複製の精度維持機構の解明ー自然突然変異の制御機構を明らかにするには、DNA複製の精度がどのようにして維持されるか、その機構を分子レベルで明らかにすることが必要である。そのため次の2つの側面から研究を行なった。まず大腸菌で明らかになった自然突然変異の生起を抑える機能をもつタンパク質に注目し、それと同様な活性をもつタンパクが哺乳動物細胞に存在するかどうか調べた。その結果MutTタンパクと同じく8oxodGTPを特異的に分解するタンパクをヒトの細胞中に見出し精製することができた。現在そのcDNAをクローニングすべく研究を進めている。一方、哺乳動物細胞の染色体DNAの複製の調節機構を明かにすべく、核内癌遺伝子産物の役割を中心に解析した。△FosBタンパクによってDNA複製サイクルの始動が起こる系を構築して研究を進めている。自然突然変異率を一定の低い価に保つために生物は複雑な機構をもっているが、大腸菌ではそれに関与する遺伝子の多くが同定されている。哺乳動物細胞におけるその機構を明らかにするために、大腸菌で得られた結果を指標にして、遺伝子の同定とクローニングを試みた。大腸菌のmutT遺伝子はGC→TAトランスバージョン変異の生起を特異的に抑制することが知られているが、MutTタンパク質は8-oxo-dGTPを8-oxo-dGMPに分解する活性をもっていることがわかった。さらに哺乳動物の組織や各種培養細胞にも同様な酵素活性が存在することがわかったので、その中で特に高い活性をもつヒトのリンパ腫細胞株より酵素を精製し、均一な標品を得た。部分的なアミノ酸配列を決定し、その情報をもとにしてcDNAをクローニングした。塩基配列を決定した結果、ヒトのMutTタンパク質は156アミノ酸から成り(分子量17,900)、部分的ではあるが大腸菌のMutT
LMSの連合によるコンピュータ支援外国語協働学習の実践に関する研究

異なる教育機関で運用されているLMS(Webベースの学習管理システム)同士をインターネットでつなぎ、それぞれの大学の学生が自校のLMSの中に居ながら他のLMSの中に移動し、そこにある学習教材を利用したり、他大学の学生と同じLMS上で討論や協働学習をしたりする実験的取り組みに成功した。合わせてリモートユーザが自動的に色分けされて表示される仕組みを作り、交流活動の「見える化」を推進する事ができた。本科研課題の本年度の目標はLMSを連合させて協働学習活動につなげるための基盤,主にハードウェアのインフラ作りをすることであった.まず予算から2台の実験用サーバ,無停電装置を購入し,愛知県の日本福祉大学と東京都の東京電機大学構内に設置した.それぞれのサーバにOS,データベース,Webサーバなどの基盤になるソフトウェアを導入し,その上にオープンゾースのLMSであるMoodleをインストールした.このMoodleにはMoodle NetworkというLMS同士を連結する機能が組み込まれているが,設定や管理の難しさもあって,世界でもあまり利用されていない.このMoodle Networkを佐藤が設定,調整し,遠隔地にある二つのLMSサーバ間でユーザがログインし直すこと無しに,互いに行き来し,それぞれの場所にあるリソースを利用したり,異なるLMSユーザ同士が交流をする仕組みを実現することができた.その実現プロセスやセキュリティー上の配慮,活動の実演などはMoodle Moot Hakodate 2010で発表した.次に,各大学やそこでの学習者が持つブログを各校に設置されたMoodleで共有するための環境も構築した.これは複数のプログを集約した上で時系列に並べ,Moodleの画面上の一つのブロックに表示させるという仕組みである.これにより,各校における学生の学習状況や,それに関連した情報の共有が即時にできるようになった.神田はさらに独自のMoodleサーバを立て,そのチャットモジュールを使って海外とのクラス間交流を行い,リアルタイム会話を通じて同モジュールの巧拙を検証した。また同じ交流の中でフォーラムによるtandem learningも試行した。それらの成果とこれまでのMoodleを使った授業運用について,宮添とともにフォーラム活動を中心に学会において実践報告を行なった。本科研課題の本年度の目標は、昨年度の取り組みで実現したMoodle Network (M-Net)を実用に移し、実験レベルから実働レベルに移行させることであった。まず実験サーバをネットワークハブとして位置付け、複数大学のMoodleサーバをリム状に繋ぐ、スター型ネットワークを確立した。前期はまず関東圏の3大学がM-Netを介して英語でニュース記事を紹介し合う「交流フォーラム」活動、ハブサーバに置いたTOEICスタイルのクイズをリモート解答する活動、3大学の学生で協力して世界の有名人について英語のデータベースを作る「協働データベース」活動を行った。いずれの活動も支障なく進行したが、各リモートユーザが識別しにくいという問題が露見した。そこで改良を検討し、仕様を決め、プログラマーに依頼してM-Netプログラムのカスタマイジングを行った。我々の知る限り世界でまだ誰もやっていない試みである。これにより、各リモートユーザ名はリモートサーバ毎に色分けされるようになり、学生同士、どこの学生と対話・討論しているのかがひと目で分かるようになった。また教師側でも活動や成績の管理において自分の指導する学生をまとめて把握し易くなった。後期ではこの改良版M-Netを用い、参加大学も4大学に増やし、更にかみ合った討論を導くためにディベート的要素を取り入れた「交流討論」活動を行った。事後アンケート調査も行った結果、ライバル意思が沸いて討論に熱が入ったとの回答が目立った。この研究テーマについては8月に外国語教育メディア学会でシンポジウムを主催し、参加者と貴重な意見交換をすることができた。また、2月にはMoodle Moot Japan 2011において上記実践について発表を行った。本年度の研究は春先の東日本大震災の影響で大幅に計画変更を余儀なくされた。連携に参加する各大学の裁量で前期学期の開始日程や終了日程が1ヶ月幅で不揃いになり、複数の大学がLMSを連携させ呼吸を揃えて協働学習、交流活動に取り組もうという我々の試みにとっては大きな障害となった。加えて春から初夏にかけての計画停電があり、インターネットとコンピュータに依存する本研究課題にとっては先が見えない状況が続いた。ようやく後期になり、教務日程や電力が落ち着いたが、前期のしわ寄せがあり、学生のコンピュータリテラシー教育が追いつかない状況の大学も在って、発展的な活動に思うように取り組むことができなかった。加えて科学研究費補助金の執行が2期に分かれたことも影響し、予定していたサーバ機の購入が遅れ、それを利用したBig Blue ButtonやMaharaとの連携など、新たな試みができなかった点も痛手であった。その中で、外部ブログをMoodleに連携させ、LMSとブログがシームレスに近い形でリンクした交流活動を実践できた。Blogger上に大学毎の共通アカウントを作成し、そこに学生にコンピュータや携帯端末でブログ記事を英語で投稿させ、その記事がRSSの仕組みで各Moodleサイトのブログブロックに自動的に表示される仕組みを作った。学生にそれらの記事を読んで英語でコメントを書かせ、交流をもたせた。

学生アンケートで浮き彫りになったブログの簡易性や携帯端末の操作性の良さを訴求する声を反映させ、ブログがLMSと連動し、より柔軟な学習・交流空間を創造できた事は成功と言えるだろう。その成果についてはイギリス、Nottingham大学でのEuroCALL 2011、教育工学会第27回全国大会などで発表した。また、この活動に対する学生の反応分析について三重大学でのMoodleMoot 2012で発表を行なった。
60000 rpm，50 kWの出力を持つ大容量高速ベアリングレスモータの開発

近年,省エネルギー・省資源対策などから,モータへの高効率化・高出力化の要望が年々高まっている。その解決策として注目されているのがモータの高速化である。特に,大容量モータの高速化への要望は極めて強い。そこで,電動機と磁気軸受の機能を一体化したベアリングレスモータが注目されている。本研究では,損失密度に基づいたベアリングレスモータの構造最適化を行い,大容量高速ベアリングレスモータを実現するために欠かせない低損失密度を実現できる構造を提案した。そして,大容量高速ベアリングレスモータの試作機を開発し,提案構造の有効性を実験により検証した。平成27年度は,まず,数百kWの大容量にも対応できる損失密度に基づいた大容量高速ベアリングレスモータの構造最適化とその設計手法の確立を行った。これまでのように,トルク・軸支持力,効率を高めるように,ただモータ構造を最適化するだけでは,大容量高速ベアリングレスモータの実現は難しい。そのため,本研究で検討した設計法は,モータ内の損失密度分布を設計段階でコントロールすることで,冷却面も含めたモータ構造の最適化を行うという方法である。そして,確立した設計手法を用いて,60000 rpm,50 kWの大容量高速ベアリングレスモータの詳細設計を実施した。その結果,11.16 kW/Lという非常に高い出力密度を達成し,60000 rpmにおいて,目標とした出力50 kWを大きく上回る60 kWという高出力を実現した。その際の損失密度は,552.9 W/Lと比較的小さい値に抑制できており,強制空冷と水冷をハイブリットした冷却システムを用いれば十分に冷却可能な値となっている。加えて,軸支持性能に関しては,軸支持巻線にのみ電流を流した場合,52.01 Nと想定回転子自重16.4 Nに対して3.17倍と十分な軸支持力を発生できている。また,安定な非接触軸支持運転の実現に大きな影響を与える軸支持力の脈動率は,平均値に対して4.02%と非常に小さく抑制できている。さらに,電動機巻線に電流を流した場合の平均軸支持力は51.31 Nであり,電動機巻線に電流を流していない場合に対する軸支持力の減少率は僅か1.35%である。以上の結果より,高出力に加えて良好な軸支持特性を備えた大容量高速ベアリングレスモータを設計できた。最後に,設計した大容量高速ベアリングレスモータを運転するために,TI社製のTMS320C6657(1.25 GHz)の高性能DSPシステムを備えた高性能ドライブシステムを製作した。平成27年度の研究実施計画は,(1)損失密度に基づいた大容量高速ベアリングレスモータの構造最適化とその設計手法の確立,(2)確立した設計手法を用いた60000 rpm,50 kWの大容量高速ベアリングレスモータの詳細設計,(3)大容量高速ベアリングレスモータを運転するための高性能ドライブシステムを製作,の3つであった。そして,まず,(1)に関してであるが,モータ内の損失密度分布を設計段階でコントロールすることで,冷却面も含めたモータ構造の最適化を行うという,大容量高速ベアリングレスモータを実現するうえで欠かせない構造最適化と設計手法を確立した。次に,(2)に関してであるが,確立した設計手法を用いて,目標とする出力50 kWを大きく上回る60000 rpm,60 kWの大容量高速ベアリングレスモータを詳細に設計した。設計した大容量高速ベアリングレスモータは,高出力であることに加えて,十分な軸支持力の大きさに加えて,軸支持力脈動の小さい,良好な軸支持特性も備えている。最後に,(3)に関してであるが,設計した大容量高速ベアリングレスモータを運転するために必要なTI社製のTMS320C6657(1.25 GHz)の高性能DSPシステムを備えた高性能ドライブシステムを製作した。したがって,おおむね順調に進展している。平成28年度は,まず,試作を行う前に,昨年度に実施した60000 rpm,50 kWの大容量高速ベアリングレスモータの構造及び設計を改めて見直し,損失密度に基づいた構造最適化をさらに進化させることで,15.5 kW/Lという極めて高い出力密度を達成できる新設計を実現した。昨年度に実施した設計でも,11.16 kW/Lと十分に高い出力密度であったが,損失密度に基づいた構造最適化手法をさらに進化させることで,38.9%も出力密度を向上した。一方,損失密度に関しては,599.4 W/Lと比較的小さな値に抑制できており,昨年度からの増加は8.4%と小さい。このことから,平成28年度に改良した構造最適化手法は,損失密度をほとんど増加させずに,出力密度のみを増加できる有効な手法である。そして,599.4 W/Lという損失密度は,試作機の新設計と一緒に改良設計した冷却システムを用いることで,十分に冷却可能な値である。加えて,軸支持力特性についても,新設計は71.9 Nの軸支持力を発生可能であり,昨年度の設計に比べて,38.2%も軸支持力を増加できており,十分な軸支持力を発生できる。そして,新設計に基づいて,60000 rpm,50 kWの大容量高速ベアリングレスモータの試作機を実際に製作した。この時,回転子の回転バランスと回転子に装着するギャップセンサターゲットの真円度と同心度が高精度になるように回転子製作を工夫した。これらの精度が低いと,軸支持に必要な軸支持入力

電力の増加に直結するため,高効率,すなわち,低損失なベアリングレスモータを製作するには,非常に重要なポイントである。さらに,製作した試作機と前年度に製作したドライブシステムを組み合わせることで,安定な磁気浮上運転を実現し,高速回転において安定な磁気浮上運転を実現するのに欠かせない制御システムの構築を行った。平成28年度の研究実施計画は,(1) 60000 rpm,50 kWの大容量高速ベアリングレスモータの試作,(2)製作した試作機による安定な高速回転運転の実現と負荷試験による提案するベアリングレスモータや設計手法の有効性の検証,の2つであった。そして,まず,(1)に関してであるが,当初の計画通り,今年度実施した新設計に基づいて,試作機を製作した。この試作において,大きな研究成果は,昨年度提案した損失密度に基づいた構造最適化手法を,今年度さらに進化させることができ,15.5 kW/Lと極めて高い出力密度を達成できる新設計を実現した点である。この構造最適化手法の進化という研究に関しては,当初の研究実施計画の中では予定していなかった内容であるが,試作のために,昨年度に実施した試作機の設計を見直す過程において,構造最適化手法を改良できることに気づき,急遽実施した研究である。この研究自体は,平成29年度に予定している試作機の改良設計を先取りしたものであり,研究全体を大きく進捗させる成果である。次に,(2)に関してであるが,製作した試作機に前年度に製作したドライブシステムを組み合わせることで実験を行った。そして,同定した試作機の詳細なパラメータを用いて,研究代表者が提案している仮想の座標系と電流の非干渉化制御を用いた電流制御システムを構築し,高速回転においても安定な軸支持制御を実現するのに欠かせない制御システムを構築した。しかし,高速回転下において,負荷試験を実施し,提案するベアリングレスモータを検証する実験に関しては,先に述べた構造最適化手法の改良に時間がとられてしまい,未達となっている。しかし,構造最適化手法の改良は平成29年度に予定していた研究内容を先取りしたものであり,研究全体としての進捗は計画通りといえる。したがって,研究はおおむね順調に進展している。近年,省エネルギー・省資源対策などから,モータへの高効率化・高出力化の要望が年々高まっている。その解決策として注目されているのがモータの高速化である。そのため,電動機と磁気軸受の機能を一体化したベアリングレスモータが注目されている。そこで,平成29年度は,製作したベアリングレスモータの試作機およびドライブシステムを用いて引き続き負荷試験を実施した。試作機は,2ユニットをタンデムに接続した構造となっており,1ユニットをモータ動作させ,残りの1ユニットを発電動作させることで,通常実施することが難しい,高速回転下での実負荷試験を試作機単独で実施することが可能な構造となっている。この特長を活用することで,高速回転下における試作機の運転性能と冷却装置によるモータ内の各所の冷却性能の測定を実施した。さらに,測定結果と解析結果について,比較・検証を行い,提案構造と設計手法の有効性を明らかにした。加えて,試作機は,高速回転を実現するために,低インダクタンスとなっていることから,インバータのスイッチングによるリプル電流が通常の回転速度で回転させる一般的なモータに比べて,原理的に大きくなる。
石炭灰のコンクリートへの大量使用を可能にする外割調合則と性能発現メカニズム

研究代表者らはこれまで,石炭灰を外割調合でコンクリートに大量使用する方法を提案し,その効果および調合方法について明らかにしてきた。本研究では,このようなコンクリートのフレッシュ性状や強度,耐久性といった性能に対して,研究代表者が従来より示してきた性能発現メカニズムに関して実証を行ったものである。本研究により下記について確認することができた。・石炭灰を外割使用したコンクリートが同じ水セメント比のセメント単味コンクリートよりも若材齢から高い強度を発現する理由は,材齢28日以降に活発となるポゾラン反応では説明できない。・単位石炭灰量の増大とともに,空隙の総体積は変わらないものの,径の小さい空隙が多くなり,硬化体組織が緻密化する。水銀圧入式ポロシメータで測定される径50nm以上の空隙量と圧縮強度は相関を示し,50nm以上の空隙量が少なくなるほど強度は高くなる。・上記傾向は,走査型電子顕微鏡(SEM)によっても確認される。・したがって石炭灰を外割で混合すると空隙構造が緻密化され,一定サイズ以上の径の空隙体積が減少するため,材齢初期から高い強度を発現する。・よって上記コンクリートの強度発現は,活性度指数の大きく異なる石炭灰の種類が変わっても大差なく,また1,000ブレーン程度の粗粉を使用した場合でも影響が見られない。さらに砕石粉のような非反応性粉体でも同様の結果が期待できる。・石炭灰を外割使用したコンクリートのフレッシュ性状は,全粉体が形成する空隙の総体積と練混ぜ水体積との関係から説明でき,前者に対して後者が余剰するほど高い流動性が得られる。・このことにより,粗粉を単独でコンクリートに用いると流動性が悪いのに,細粉と混合して使用すると細粉単独の場合よりも流動性が向上する現象を定量的に説明できる。本研究ではこのような石炭灰外割コンクリートの強度や耐久性といった性能発現性状について定量的な検証を行い,下記について確認することができた。・単位セメント量を285kg/m^3に固定し,単位石炭灰量を0455kg/m^3の間で大量使用したコンクリートの材齢3日,7日,28日,91日,1年における圧縮強度発現性状を検討した。石炭灰を外割使用したコンクリートは材齢3日から普通ポルトランドセメント単味のコンクリートよりも大きい強度を発現し,長期にわたって良好な強度増進を示した。ポゾラン反応に伴う強度発現への寄与は材齢28日以降に生じるとする既往の研究結果を考慮すると,若齢からの強度発現はポゾラン反応とは異なるメカニズムで生じている。・また上記の強度発現は,活性度指数の大きく異なる石炭灰の種類が変わっても大差なく,また1,000ブレーン程度の粗粉を使用した場合でも影響が見られなかった。さらに砕石粉のような非反応性粉体でも同様の結果が得られた。・一方,単位石炭灰量の増大とともに硬化体組織は緻密化し,圧縮強度と相関を示した。・これらのことから石炭灰外割コンクリートの強度現は,ポゾラン反応とは無関係に,硬化体組織の緻密化によって生じていることを確認した。・上記コンクリートの耐中性化性状を検討した結果,単位石炭灰量が大きくなるに従って透気係数が小さくなるため,中性化速度係数が小さくなる。

本研究により下記について確認することができた。・石炭灰を外割使用したコンクリートが同じ水セメント比のセメント単味コンクリートよりも若材齢から高い強度を発現する理由は,材齢28日以降に活発となるポゾラン反応では説明できない。・単位石炭灰量の増大とともに,空隙の総体積は変わらないものの,径の小さい空隙が多くなり,硬化体組織が緻密化する。水銀圧入式ポロシメータで測定される径50nm以上の空隙量と圧縮強度は相関を示し,50nm以上の空隙量が少なくなるほど強度は高くなる。・上記傾向は,走査型電子顕微鏡(SEM)によっても確認される。・したがって石炭灰を外割で混合すると空隙構造が緻密化され,一定サイズ以上の径の空隙体積が減少するため,材齢初期から高い強度を発現する。・よって上記コンクリートの強度発現は,活性度指数の大きく異なる石炭灰の種類が変わっても大差なく,また1,000ブレーン程度の粗粉を使用した場合でも影響が見られない。さらに砕石粉のような非反応性粉体でも同様の結果が期待できる。・石炭灰を外割使用したコンクリートのフレッシュ性状は,全粉体が形成する空隙の総体積と練混ぜ水体積との関係から説明でき,前者に対して後者が余剰するほど高い流動性が得られる。・このことにより,粗粉を単独でコンクリートに用いると流動性が悪いのに,細粉と混合して使用すると細粉単独の場合よりも流動性が向上する現象を定量的に説明できる。
卵巣がん・子宮体がん幹細胞のがん腫特異的制御機構の解明

新潟大学遺伝子倫理委員会の承認,および患者同意を取得後に,新潟大学医歯学総合病院で手術・処置を施行された婦人科悪性腫瘍患者さまの臨床検体(腫瘍・腹水)由来の3次元スフェロイド培養を行い,これまでに複数の卵巣がん・子宮体がん由来の細胞の安定培養に成功した。特に子宮体がんスフェロイド細胞についてはがん幹細胞マーカーとして知られる“X"の差により,腫瘍形成や細胞増殖の差異を認め,マーカー“X"の重要性が示された。これまでに子宮体がん臨床検体由来のスフェロイド細胞5種の樹立に成功し,それぞれのがん幹細胞性質の確認を行った。すなわち造腫瘍能や幹細胞因子の発現,分化能などである。これら子宮体がんスフェロイド細胞は,それぞれ異なる幹細胞因子の発現を呈していた。また5種の由来検体は類内膜腺癌のほかにも明細胞腺癌や癌肉腫などその組織型は多岐にわたっている。卵巣癌幹細胞とは異なる培養下での細胞増殖が確認できることから,卵巣癌・子宮体がん幹細胞それぞれの制御メカニズムを解明に向けた取り組みを行っている。がん幹細胞性質をもつ子宮体がんスフェロイド細胞の樹立に時間を要し,十分な生化学的特性の解析への発展に至らなかった。上記理由として,臨床検体由来の細胞樹立には高悪性度腫瘍症例からの樹立が成功率が高い傾向にある中,取得可能な検体が低悪性度症例が多かったことが考えられる。子宮体がん幹細胞の特異マーカーが卵巣癌幹細胞のマーカーと異なることから,子宮体がん幹細胞の同定確認を行う必要となった。本年度,これまでに培養確立した臨床検体由来の子宮体がんスフェロイド細胞(がん幹細胞)の特性解明を目的とし,以下の研究を遂行した。(unpublished data)(1)子宮体がん幹細胞マーカーの同定:in vitroスクリーニング法により,マーカーXを同定した。同マーカーXの差異によりin vitroにおけるスフェロイド細胞の増殖,およびin vivo免疫不全マウスにおける腫瘍形成能の差異ならびに幹細胞因子の発現差を確認した。形成腫瘍は臨床検体と組織学的に差異のない子宮体がん腫瘍であることを確認した。以上の結果より,子宮体がんスフェロイド細胞はがん幹細胞性質を有する事を確認した。(2)マーカーXに基づくがん幹細胞機能:マーカーXの高低により区分した細胞の免疫不全マウスへの移植により形成される腫瘍内におけるマーカーXの発現差異を確認した。(3)マーカーXの機能的意義:shRNA法による発現抑制ならびに阻害剤による抑制により細胞増殖の顕著な抑制が示された。以上より,子宮体がん幹細胞スフェロイド細胞においてマーカーXががん幹細胞マーカーとしての意義とともに機能的意義を有することを確認した。(4)網羅的遺伝子発現検証:子宮体がん幹細胞特異的発現遺伝子の検証を目的に,マーカーX発現差で区分したスフェロイド細胞における網羅的遺伝子発現解析をmicroarray法を用いて施行した。さらに幹細胞因子の子宮体がんにおける機能的意義を検証する目的に,子宮体がん細胞株を用い,幹細胞因子のひとつであるSOX2発現の抑制による細胞増殖・腫瘍形成の差異を確認した。また子宮体がんにおいて,p21がSOX2の標的因子であることを確認した。(Yamawaki etal.,CancerScience 2017)前年度からの継続により,子宮体がん幹細胞の幹細胞性質の検証ならびに機能的意義の検証の遂行に時間を要,平成27年度に予定していた「ヒト卵巣がんおよび子宮体がん幹細胞における幹細胞特異的因子の役割の検証」実験を今年度施行した。新潟大学遺伝子倫理委員会の承認,および患者同意を取得したのちに,新潟大学医歯学総合病院で手術・処置を施行された婦人科悪性腫瘍患者さまの臨床検体(腫瘍・腹水)由来の3次元スフェロイド培養を行い,これまでに卵巣がん12例,子宮体がん15例,子宮頸がん1例由来の細胞の安定培養に成功した。これまでに樹立したスフェロイド細胞は腫瘍形成などの一般的ながん幹細胞性質を有するが,特に子宮体がんスフェロイド細胞についてはがん幹細胞マーカーとして知られる“X"を用いた細胞分離により,造腫瘍能や細胞増殖の差異を認めるとともに,多能性幹細胞因子の発現変化も確認した。また同マーカー“X"の抑制により,スフェロイド細胞の増殖抑制が起こり,かつマーカー“X"の発現上昇による細胞増殖をあわせて確認し,子宮体がん幹細胞におけるがん幹細胞マーカー“X"の意義を見出した。一方,他のがん幹細胞マーカーCD44やCD133についてはその発現差による性質の差異を認めなかった。加えて,子宮体がん細胞株を用いた検証において,多能性幹細胞因子の一つであるSOX2の発現が細胞増殖・腫瘍形成に寄与することを確認し,またp21がSOX2の直接的な標的であることを見出した。さらに子宮体がん臨床検体におけるSOX2とp21の発現による臨床予後の差を見出した。以上より,子宮体がん幹細胞の性質と子宮体がんにおける多能性幹細胞因子の意義を見出した。

子宮体がんスフェロイド細胞中の癌幹細胞性質を有する細胞の抽出に向け,特異的マーカーの探索を行っている。ここで検出した幹細胞マーカーを指標として,その発現に寄与する因子をアレイ解析により探索し,子宮体がん幹細胞に重要なシグナル解析を行う。また同因子の卵巣癌幹細胞における意義を卵巣癌スフェロイド細胞を用いて検証する。網羅的遺伝子発現解析により同定した子宮体がん幹細胞特定的発現遺伝子群ならびにシグナル活性の意義について検証する。またこれら発現・活性が卵巣がん幹細胞における機能的意義の有無について検証し,婦人科悪性腫瘍におけるがん腫特異的な制御機構の有無について確認を行う。婦人科腫瘍国際学会などへの参加を見送ったために余剰額が生じた。翌年度での使用を予定する。国際学会への参加を取りやめたために余剰額が生じた。当初計画した平成28年度交付助成金とあわせて,抗体・細胞培養培地などの実験試薬の購入を予定する。また研究成果発表のための学会参加の際の旅費として使用する場合もある。次年度交付助成金とあわせて抗体や試薬などの購入に充てる予定である。
高齢者に対する暑熱障害予防のための飲水援助に関する基礎的研究

高齢者は成人に比べ,環境変化の影響をうけやすい.そのためにここ数年来の熱波による暑熱障害が高齢者に多発しており,それへの対応は緊急の課題である.そこで本研究では,高齢者の暑熱障害予防のための基礎的な資料を得ることを目的に,暑熱順化によって高齢者での水分出納および飲水行動の基礎となる口渇感・塩味の感受性がどのように変化するのかを若年者を対照群として比較検討する.研究期間は2年である.まず初年度(平成12年)は,対象者に対して暑熱順化実験の前後に水分出納や飲水行動の調査を実施し,その実態を把握した.次年度(平成13年)は初年度の結果に基づき,暑熱順化による高齢者の水分出納や飲水行動に影響を及ぼす因子を抽出し,暑熱障害予防のための具体的な飲水等,具体的な生活援助の方法を検討した.暑熱順化実験前後の水分代謝や飲水行動についてを,高齢者9名を対象者として,若年者5名を対照群に調査した結果,両者共に短期間の暑熱順化により蒸泄量が増加し,それに見合った補水がなされていることが確認された.しかし,順化による尿量の減少や蒸泄量の増加は,高齢者では若年者に比べて少なく,加齢による体液量調節機能や発汗機能の低下が示唆された.従って,高齢者の暑熱障害予防には積極的な飲水補給だけでなく,外出時工夫や適時の冷房使用,飲水時間の工夫など生活上の配慮が必要であり,特にこれらの工夫を高齢者自身が自覚できるような支援が大切であると考える.高齢者は成人に比べ,環境変化の影響をうけやすい.そのためにここ数年来の熱波による暑熱障害が高齢者に多発しており,それへの対応は緊急の課題である.そこで本研究では,高齢者の暑熱障害予防のための基礎的な資料を得ることを目的に,暑熱順化によって高齢者での水分出納および飲水行動の基礎となる口渇感・塩味の感受性がどのように変化するのかを若年者を対照群として比較検討する.研究期間は2年である.まず初年度(平成12年)は,対象者に対して暑熱順化実験の前後に水分出納や飲水行動の調査を実施し,その実態を把握した.次年度(平成13年)は初年度の結果に基づき,暑熱順化による高齢者の水分出納や飲水行動に影響を及ぼす因子を抽出し,暑熱障害予防のための具体的な飲水等,具体的な生活援助の方法を検討した.暑熱順化実験前後の水分代謝や飲水行動についてを,高齢者9名を対象者として,若年者5名を対照群に調査した結果,両者共に短期間の暑熱順化により蒸泄量が増加し,それに見合った補水がなされていることが確認された.しかし,順化による尿量の減少や蒸泄量の増加は,高齢者では若年者に比べて少なく,加齢による体液量調節機能や発汗機能の低下が示唆された.従って,高齢者の暑熱障害予防には積極的な飲水補給だけでなく,外出時工夫や適時の冷房使用,飲水時間の工夫など生活上の配慮が必要であり,特にこれらの工夫を高齢者自身が自覚できるような支援が大切であると考える.高齢者は成人に比べ,環境変化の影響をうけやすい.そのためにここ数年来の熱波による暑熱障害が高齢者に多発しており,それへの対応は緊急の課題である.そこで本研究では,高齢者の暑熱障害予防のための基礎的な資料を得ることを目的に,暑熱順化によって高齢者での水分出納および飲水行動の基礎となる口渇感・塩味の感受性がどのように変化するのかを若年者を対照群として比較検討する.研究期間は2年である.計画では,まず初年度(平成12年)は,対象者に対して暑熱順化実験の前後に水分出納や飲水行動の調査を実施し,その実態を把握する.次年度(平成13年)は初年度の結果に基づき,暑熱順化による高齢者の水分出納や飲水行動に影響を及ぼす因子を抽出し,暑熱障害予防のための具体的な飲水等,具体的な生活援助の方法を検討する,となっている.初年度(平成12年度)の研究計画はほぼ予定通り実施することができ,高齢者では9名,若年者5名を対照群に,暑熱順化実験前後の水分代謝や飲水行動の実態を把握することができた.すなわち本対象者では,短期間の暑熱順化により蒸泄量が増加し,それに見合った補水がなされていることが確認されたが,順化による尿量の減少や蒸泄量の増加は若年者に比べて少なく,加齢による体液量調節機能や発汗機能の低下が示唆された.従って,高齢者の暑熱障害予防には積極的な飲水補給だけでなく,出時の工夫や適時の冷房使用など生活上の配慮が必要と考えられ,次年度に具体的な検討を行いたい.高齢者は成人に比べ,環境変化の影響をうけやすい.そのためにここ数年来の熱波による暑熱障害が高齢者に多発しており,それへの対応は緊急の課題である.そこで本研究では,高齢者の暑熱障害予防のための基礎的な資料を得ることを目的に,暑熱順化によって高齢者での水分出納および飲水行動の基礎となる口渇感・塩味の感受性がどのように変化するのかを若年者を対照群として比較検討する.研究期間は2年である.

まず初年度(平成12年)は対象者に対して暑熱順化実験の前後に水分出納や飲水行動の調査を実施し,その実態を把握した.次年度(平成13年)は初年度の結果に基づき,暑熱順化による高齢者の水分出納や飲水行動に影響を及ぼす因子を抽出し,暑熱障害予防のための具体的な飲水等、具体的な生活援助の方法を検討した.暑熱順化実験前後の水分代謝や飲水行動についてを,高齢者9名を対象者として,若年者5名を対照群に調査した結果,両者共に短期間の暑熱順化により蒸泄量が増加し,それに見合った補水がなされていることが確認された.しかし,順化による尿量の減少や蒸泄量の増加は,高齢者では若年者に比べて少なく,加齢による体液量調節機能や発汗機能の低下が示唆された.従って,高齢者の暑熱障害予防には積極的な飲水補給だけでなく,外出時工夫や適時の冷房使用,飲水時間の工夫など生活上の配慮が必要であり,特にこれらの工夫を高齢者自身が自覚できるような支援が大切であると考える.
超音波ドップラー信号のウェーブレット解析による胎児心不全の診断法の開発への試み

日常臨床に使用されているドプラ信号は、心活動に関する種々の情報を含んでいると考えられている。また現在脳室周囲白質軟化症は低血圧によっても生じる可能性があると言われている。そこで本研究の目的はは心機能の悪化に伴うドプラ信号の変化をとらえ、胎児心不全の診断に役立てるものであった。コントロール時と臍帯圧迫時によるストレス下における羊胎仔心からドプラ信号を記録し、そのスペクトル構造を解析し、胎仔心不全時のスペクトル構造の特徴を抽出した。方法は日齢114135(満期147)の妊娠羊慢性実験モデル5頭を作成。胎仔左前胸部に2.5MHzの連続ドブラ端子を縫着しドプラ信号を記録した。さらに頸動静脈カニュレーション、心電図電極、臍帯オクルーダーを装着。手術後35日目に実験を行い、臍帯を40秒圧迫、80秒解放を15回くり返し、その後60秒圧迫、60秒解放をくり返し、ドプラ信号などを記録し動脈血ガスを測定した。臍帯圧迫より30秒後の連続した5心拍のドプラ信号をFFTによる周波数解析を用い検討した。結果は200Hz以下のコントロール時と臍帯圧迫時のパワー比はpH>7.2以上、7.2≧pH>7.0、7.0>pHでそれぞれ、0.71±0.12SD、0.29±0.09SD、0.135±0.04SDとなり有意(P<0,001)に低下することがわかった。また、それは胎仔血圧と有意に相関していた。今回の実験において、臍帯圧迫を繰り返すことにより代謝性アシドーシスとなり、心筋収縮能が低下し結果的に血圧が低下したと予想される。よって今回のこの実験において胎児心ドプラ信号をFFT解析することにより胎児心機能を評価しPVLなどの発症を防ぐ可能性が示唆された。本研究の目的は、心臓弁の振動状態変化をドプラ信号の変化として捉えることにある。これによって、胎児心不全の新しい検査法の研究確立が可能になると考えられる。しかし、胎児心臓弁の音響特性に基づき心臓弁の非侵襲的診断を行うためには、心臓弁各所の振動状態を50Hzから1000Hzまでの周波数帯域にわたり母体腹壁上から経母体的に計測する必要がある。本研究では第一段階として胎児心臓の心拍動に伴う振動状態を、母体の呼吸などの雑音の影響を除いて純粋に見るための基礎的実験とし、ビーム幅20mm以内、焦点距離50mmの2.5MHzドプラプローベを羊胎仔の胸壁に固定し胎児心臓からの振動を直接計測できる実験システムを設定した。ドプラのフィルター特性は50Hz以上3000Hz以下でフラットに設定した。実験は妊娠週日120130日の羊を全身痲酔下で胎仔を子宮外に出し心電図、観血的血圧計、ドプラプローブ、頚動脈血流計、採血用静脈カテーテルを付け、胎仔を子宮内に戻し子宮を縫合し、閉腹した状態で行われた。Digital audiotape recorderに記録された心電図、血圧波形、頚動脈血流波形を基に超音波ドプラ信に対し一心拍ごとにウェーブレット解析を行い心房室弁、大動脈弁の動きと連動するドプラシグナルが存在するかどうかを同定した。時間領域の観測ではドプラ信号は各心臓の弁の開閉にあたる明確なピークは観測できなっかた。ウェーブレット解析による時間周波数領域では、房室弁・大動脈弁開放時に血流の影響によると思われる400Hzから1000Hzの高周波数のドプラ信号成分が観測された。また、房室弁開放区間には心房の収縮によると考えられる50から200Hzの低周波数の成分が観測された。これにより胎児心ドプラ信号の時間周波数分布と心臓弁の動きとの対応が可能となった。

今回の実験において、臍帯圧迫を繰り返すことにより代謝性アシドーシスとなり、心筋収縮能が低下し結果的に血圧が低下したと予想される。よって今回のこの実験において胎児心ドプラ信号をFFT解析することにより胎児心機能を評価しPVLなどの発症を防ぐ可能性が示唆された。
生体非線形光学を利用した高度非接触皮膚診断システムの開発と応用

本研究では、非常に高い瞬時ピークパワーを有するフェムト秒(=10の-15乗秒)パルスレーザー光によって誘起される『真皮コラーゲンの非線形光学効果』に着目し、生体SHG光(第2高調波発生光)を用いた皮膚診断の非接触リモート化及び高度化に関する研究を行った。生体組織のコラーゲン配向測定では、生体SHG発生効率がレーザー偏光とコラーゲン配向の関係に強く依存することに着目し、コラーゲン配向を抽出する手段としてSHG偏光解析法を提案した。実際のヒト組織に適用した結果、組織学的所見と一致した結果が得られ、本手法の有効性を確認した。真皮コラーゲンのキャラクタリゼーションでは、高コントラスト・高空間分解なSHGイメージから、真皮コラーゲン線維の3次元分布を可視化した。また、臨床応用に向けた予備実験として、ヒト前腕皮膚のin vivo計測を表皮越しに行い、SHG偏光解析結果から前腕では腕長手方向にコラーゲン配向していることを確認した。皮膚計測への応用例として、火傷診断と老化診断に関する基礎研究を行った。火傷診断では、コラーゲン熱変性に伴い生体SHG光強度が減少することに着目し、生体SHG光を用いた新しい火傷診断法を提案した。深さ分解SHGイメージング及びSHG断層イメージングから、火傷領域及び火傷深度を非接触リモートで可視化することに成功した。一方、老化診断では、自然老化及び光老化に伴う特徴的なコラーゲン線維分布の変化を、SHGイメージングを用いて捉えることを試みた。その結果、光老化真皮では表皮境界付近の真皮コラーゲン線維からの生体SHG光が減少することを確認した。これら一連の研究成果から、生体SHG光を用いた真皮コラーゲン測定が皮膚科学の基礎分野だけでなく火傷や老化といった臨床分野にも有用であることが分かった。本研究では、非常に高い瞬時ピークパワーを有するフェムト秒(=10の-15乗秒)パルスレーザー光によって誘起される『真皮の非線形光学効果』に着目し、皮膚真皮診断の非破壊・非接触リモート・経皮測定化と同時に診断そのものの高度化を実現することを目的とする。ここでは、フェムト秒パルスレーザー光を表皮越しで真皮に入射時、真皮のみが有する2つの非線形光学特性により発生する真皮内コラーゲン線維由来の第2高調波発生光(コラーゲンSHG光)とエラスチン線維由来の2光子励起自己蛍光を用いて、皮膚科学と関連の深いコラーゲン線維配向及びエラスチン線維架橋の3次元分布情報をそれぞれ抽出し、皮膚真皮診断の高度化に活用する。本年度は、コラーゲンSHG光のin vivo測定手法の確立を目指し、SHG測光装置の開発を精力的に行った。まず、反射型共焦点SHG顕微鏡の開発を行い、ヒト真皮サンプルにおいて深さ200μmまでの内部コラーゲン構造を良好な3次元空間分解能(面内空間分解能=1.5μm、深さ分解能=15μm)かつ高コントラストなSHGイメージとして取得した。その結果、真皮上層(乳頭真皮)におけるキメの細かいコラーゲン線維構造に対して、真皮下層(網状真皮)では太く発達したコラーゲン線維が縦横に絡み合って分布している様子が観測され、コラーゲン線維構造の明確な相違が確認された。また、ヒト前腕のin vivo測定を行い、レーザー安全照射レベルにおいて表皮越しに真皮からコラーゲンSHG光を検出し、偏光SHGイメージングより前腕が伸縮しやすい方向に沿ってコラーゲン線維が配向分布していることも確認した。

さらに、臨床応用性の優れたSHG測光手段として、光コヒーレンス・トモグラフィー(OCT)技術を複合したSHG-OCTを独自に開発し、測定信号の取得に成功した。本研究では、非常に高い瞬時ピークパワーを有するフェムト秒(=10の-15乗秒)パルスレーザー光によって誘起される『真皮の非線形光学効果』に着目し、皮膚真皮診断の非破壊・非接触リモート・経皮測定化と同時に診断そのものの高度化を実現することを目的とする。ここでは、フェムト秒パルスレーザー光を表皮越しで真皮に入射時、真皮のみが有する2つの非線形光学特性により発生する真皮内コラーゲン線維由来の第2高調波発生光(コラーゲンSHG光)とエラスチン線維由来の2光子励起自己蛍光を用いて、皮膚科学と関連の深いコラーゲン線維配向及びエラスチン線維架橋の3次元分布情報をそれぞれ抽出し、皮膚真皮診断の高度化に活用する。本年度は、老化と火傷という代表的な皮膚疾病に対してコラーゲンSHGイメージング法を適用しその有用性の評価を行った。皮膚の老化診断に関しては、自然老化及び光老化させたマウス皮膚切片サンプルを準備し、真皮コラーゲン線維のSHGイメージを取得した。その結果、自然老化マウスでは真皮全般においてSHG強度が減少したが、これは自然老化に伴うコラーゲン産生量低下によるものと考えられる。一方、光老化マウスでは、真皮上層部のみにおいてSHG強度が確認され、これは紫外線照射に伴うコラーゲン分解酵素の産生が原因と考えられる。火傷診断に関しては、コラーゲン分子(ポリペプチド鎖3重螺旋構造)の非中心対称性構造に起因して発生するコラーゲンSHG光が、火傷(熱変性)に伴う非中心対称から中心対称への構造変化を敏感に反映し、減少及び消失するという特徴を利用する。鶏皮及び豚皮サンプルに対して様々な程度の火傷を作成し、深さ分解SHGイメージングした結果、火傷診断において重要な火傷面積及び火傷深度の計測に本手法が有効であることを確認した
ユビキチン-プロテアソーム系を標的とするシヌクレイン封入体の形成・分解機構の解明

この2年間の研究により得られた成果は以下の5点にまとめられる。1.パーキンソン病(PD)PDの黒質および青斑核ではチロシン水酸化酵素(TH)陰性神経細胞の出現とαシヌクレインの蓄積、神経細胞脱落には密接な関係が存在することが明らかになった。PDの黒質および青斑核におけるTH活性の低下は細胞を保護する目的で生じている現象である。2.多系統萎縮症(MSA)では15例中6例で心臓のTH陽性神経線維が減少しており、さらに6例中4例では交感神経節におけるTHの免疫原性が低下していた。つまり、MSAでも心臓交感神経系の変性が起こりうる。3.シヌクレイノパチー(PD、レビー小体型認知症、MSA)を含む43剖検例について検討した結果、神経変性疾患では神経細胞やグリア細胞に種々の封入体が認められるが、NUB1はシヌクレイノパチーに出現する封入体に持異的に発現していることを明らかにした。4.Incidental Lewybody disease(ILBD)では交感神経節および延髄に神経細胞脱落は認められなかったが、20例中10例で心臓交感神経の脱落が認められ、心臓交感神経におけるαシヌクレインの蓄積は免疫組織化学的に検出できる最も早期の変化であった。心臓交感神経の脱落はPDにおける早期の変化であり、心臓交感神経の変性は軸索の末端から逆行性に進行する。5.PDの線条体におけるαシヌクレインの蓄積について25剖検例を対象に検討した。その結果、小型神経細胞ではstage3(中期)から、大型神経細胞ではstage5(末期)にαシヌクレイン陽性封入体が形成されることが明らかになった。このことは線条体ではintrinsic neuronが障害されることを初めて明らかにした報告であり、PDの病変進展過程を理解する上で重要な知見である。本年度は、まずパーキンソン病の黒質および青斑核におけるαシヌクレインの蓄積と神経細胞変性との関係について検討を行った。対象としてパーキンソン病10例、正常対照7例の剖検脳組織を用いた。その結果、チロシン水酸化酵素(TH)陰性神経細胞の出現とαシヌクレインの蓄積、神経細胞脱落には密接な関係が存在することが明らかになった。パーキンソン病の黒質では10%、青斑核では54.9%の神経細胞がαシヌクレイン陽性封入体を含有していた。さらに、黒質ではαシヌクレイン封入体含有神経細胞の82.3%が、青斑核でも39.2%がTH陰性であった。最近、TH活性の低下は細胞障害性物質の減少をもたらすこと、ドパミンの産生低下は細胞障害性に作用するαシヌクレインオリゴマーの減少を起こすことが報告されている。したがって、今回の結果から、パーキンソン病の黒質および青斑核におけるTH活性の低下は細胞を保護する目的で生じている現象であると考えられる。次に、多系統萎縮症の心臓交感神経系における変性過程を明らかにする目的で、多系統萎縮症15例の交感神経節と心筋を免疫組織化学的に検索した。その結果、多系統萎縮症では15例中6例で心臓のTH陽性神経線維が減少しており、さらに6例中4例では交感神経節におけるTHの免疫原性が低下していた。つまり、多系統萎縮症においても心臓交感神経系の変性が起こりうることが示された。さらに、パーキンソン病では病初期から心臓の交感神経線維の脱落が生じており、それは交感神経節や迷走神経背側核の神経細胞脱落に先立つことを明らかにした。

さらに、αシヌクレイノパチー(パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症)、タウオパチー、運動ニューロン病、ポリグルタミン病を含む43剖検脳の検討により、NUB1の蓄積はαシヌクレイノパチーに特異的であることを明らかにした(投稿中)。現在、その分子メカニズムに関して研究を継続中である。本年度は以下の3つの研究を実施し、以下の成果を得た。1)タンパク質変性ストレスに対する防御機構に関与している新規蛋白(NUB1)のヒト脳内における局在について検討した。種々の神経変性疾患を含む43剖検例にっいて検討した結果、神経変性疾患では神経細胞やグリア細胞に種々の封入体(タンパク質凝集体)が認められるが、NUB1はシヌクレイノパチー(パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症)に出現する封入体に特異的に発現していることを明らかにした。2)パーキンソン病(PD)10例、発症前のパーキンソン病と考えられるIncidental Lewybody disease(ILBD)20例、多系統萎縮症(MSA)20例の心臓神経叢、交感神経節、延髄迷走神経背側核を検索した。その結果、(1)PDでは全例において心臓交感神経の高度の脱落が認められた。(2)ILBDでは交感神経節および延髄に神経細胞脱落は認められなかったが、20例中10例において心臓交感神経の軽度から中等度の脱落が認められた。(3)心臓交感神経におけるαシヌクレインの蓄積は免疫組織化学的に検出できる最も早期の変化であった。(4)MSAでは心臓交感神経は保たれていた。このことは、心臓交感神経の脱落はパーキンソン病における早期の変化であり、心臓交感神経の変性は軸索の末端から逆行性に進行することを示唆する。3)パーキンソン病の線条体におけるαシヌクレインの蓄積について25剖検例を対象に検討した。その結果、小型神経細胞ではstage3(中期)から、大型神経細胞ではstage5(末期)にαシヌクレイン陽性封入体が形成されることが明らかになった。このことは線条体ではintrinsic neuronが障害されることを初めて明らかにした報告であり、パーキンソン病の病変進展過程を理解する上で重要な知見である。
実環境における歩行安定性と移動効率を考慮した２足歩行ロボットの歩行軌道計画

28年度が最終年度であるため、記入しない。
肝細胞癌における癌抑制遺伝子p53の解析

本邦では年間約2万人が肝癌で死亡しており、その多くはB型肝炎ウィルス、C型肝炎ウィルス、アルコールなどによる慢性肝障害を発生母地としているが、何故肝細胞が癌化するのか、未だ解明されていない。発癌は遺伝子異常の蓄積により生じ、特に発癌遺伝子の活性化と癌抑制遺伝子の欠損・異常が重要であると考えられている。肝癌の多くの例では既存の発癌遺伝子の異常は認められていない。そこで発癌に抑制的に働くと考えられる癌抑制遺伝子の中で、特にその性状が詳しく研究されており、ヒトの種々の癌で異常の報告されているp53遺伝子について、肝細胞癌20症例を対象に解析した。凍結肝組織から染色体DNAを抽出し、Southernblot hybridzation法により第17染色体短腕の遺伝子の多型性を調べるpYNZ22をプローブとしp53遺伝子の近傍の変化を調べたところ、14例に多型性がみられそのうち5例(36%)にヘテロ接合性の消失(LOH)が認められた。p53遺伝子のエクソン210をpolymerase chain reaction(PCR)法で増幅後、その産物をクローニングせずにdideoxy法で直接塩基配列を決定した。p53遺伝子の変異は20例中3例(15%)に認められ、コドン176、236、294の3ヶ所であった。両方の結果をまとめると、LOHとp53遺伝子の変異の両者は2例に、LOHのみは3例に、p53変異のみは1例(LOH)は未検に認められ、20例中6例(30%)にp53遺伝子の異常がみられた。肝発癌物質のアフラトキシンが浸淫している地域である南アフリカや中国の肝癌では、p53遺伝子のコドン249に高頻度に変異が報告されているが、日本の肝癌症例にはこの変異は認められなかった。径3cm未満の小肝細胞癌3例にはp53遺伝子の異常は認められず、また門脈腫瘍塞栓や肝内転移のない8例にも異常は認められないことから、p53遺伝子の異常は進行した肝癌に生じる変化であり、肝発癌の後期における癌の進展に関与していると考えられた。本邦では、年間約2万人が肝細胞癌により死亡しており、その約80%がB型肝炎ウイルスあるいはC型肝炎ウイルスによる慢性肝障害を発生母地としており、危険因子と考えられるが、肝発癌の機序は未だ解明されていない。正常細胞の癌化は、発癌遺伝子の活性化や癌抑制遺伝子の不活化などの、遺伝子変異の結果生じると考えられている。我々も、多くの癌細胞で活性化の報告されているras遺伝子について点突然変異を調べたが、肝細胞癌では12例中1例も認められなかった。そこで、様々なヒトの癌で変異の報告されている癌抑制遺伝子p53について解析した。対象は、肝細胞癌20例で、男性18例、女性2例、平均年齢56才、HB_S抗原陽性8例、陰性12例である。凍結肝組織(癌部,非癌部)よりgenomic DNAを抽出し、Southern blot hybridization法により、第17染色体短腕の遺伝子の多型性を調べるpYNZ22およびpHF12ー2をプロ-ブとし、p53遺伝子の近傍の変化を検索した。pYNZ22プロ-

ブでは14例に多型性がみられ、そのうち5例(36%)にヘテロ接合性の消失(LOH)が認められた.又、pHF12ー2プロ-ブでは6例に多型性がみられ、そのうち2例(33%)にLOHが認められた。LOHの認められた5例はすべて腫瘍径30mm以上の癌で、それ以下の小さな癌には1例も認められなかったことより、肝細胞癌における第17染色体短腕(p53遺伝子)の欠失は、癌の発生よりも、癌の増大・進展に関与していることが推察された。polymerase chain reaction(PCR)法でp53遺伝子を解析する為,各種の間で保存されている領域すべてを含むエクソン29の、各エクソンを増幅する約20merのプライマ-を合成した。今後、このプライマ-を用いて、p53遺伝子の塩基配列を調べ、点突然変異などの微細な変化を検索する予定である。本邦では年間約2万人が肝癌により死亡しており、その多くはB型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、アルコールなどによる慢性肝障害を発生母地としているが、肝細胞が何故癌化するのか、未だ解明されていない。発癌は遺伝子異常の蓄積により生じ、特に発癌遺伝子の活性化と癌抑制遺伝子の欠損、異常が重要であると考えられている。肝癌の多くの例では既存の発癌遺伝子の異常は認められていない。そこで、発癌に抑制的に働くと考えられる癌抑制遺伝子の中で特にその性状が詳しく研究されており、ヒトの種々の癌で異常の報告されているp53遺伝子について、肝細胞癌20症例を対象に解析した。p53遺伝子のエクソンの殆んどの領域を含むエクソン210の各エクソンを増幅する合成オリゴヌクレオチドは昨年度に作製した。これらのブライマーで凍結肝組織から抽出したDNAを用いてp53遺伝子の各エクソンをpolymerase chain reaction(PCR)法で増幅した。PCR反応産物はゲル電気泳動・染色にて確認後、クローニングせずにその塩基配列をdideoxy法で直接決定した。p53遺伝子の変異は20例中3例(15%)に認められ、コドン176(エクソン5)、236(エクソン7)294(エクソン8)の3ヶ所で、アミノ酸の変わる変異が2つ、停止コドン変異が1つであった。昨年度に解析したp53遺伝子のある第17染色体短腕のヘテロ接合性の消失(LOH)の結果とあわせると、p53遺伝子の変異とLOHの両者は2例に、LOHのみは3例に、p53変異のみは1例(LOHは未検)に認められ、20例中6例(30%)・にp53遺伝子の異常がみられた。径3cm未満の小肝細胞癌3例にはp53遺伝子の異常は認められず、また門脈腫瘍塞栓や肝内転移のない8例中7例にも認められないことから、p53遺伝子の異常は進行した肝癌に生じる変化であり、肝発癌における初期の段階ではなく、後期の癌の進展に関与していると考えられた。