hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
暖地型牧草の蛋白質画分の生産と蓄積様式及び利用に関する研究

ジではいずれの草種も6時間目までにほぼ溶出し,24時間目までは一定の値を示す傾向であった.非分解性タンパク質のうち,生体内で利用できない不消化タンパク質を分画した結果,マメ科草ではサイレ-ジ調製をした場合でも,材料草との差は認められなかったが,イネ科草ではサイレ-ジすることによって,不消化タンパク質割合は低下するのが認められた.開封後の加熱処理により消化率,有機酸生成量は低下し,pHは上昇する傾向を示した.第一胃内における窒素成分溶出率は,各草種とも僅かに増加した.これにより摂取タンパク質の分解性画分も増加した.易溶解性画分は加熱処理によりマメ科では減少し,イネ科では増加した.しかし,不消化タンパク質割合については,さらに高い加熱温度による変動について追究している.本研究は,牧草飼料中の摂取タンパク質分画方法の確立,並びに暖地型牧草の材料草(乾草)とそのサイレ-ジ中のタンパク質画分をそれぞれ比較することを目的とする.昨年度,反芻家畜による牧草の摂取タンパク質の分画の方法を明らかにした.今年度は昨年度に引続き、開封後2次発酵による発熱を考慮した加熱処理が,暖地型マメ科及びイネ科牧草サイレ-ジの反芻胃内における摂取タンパク質の利用性に及ぼす影響,並びに摂取タンパク質の画分のうちで,不消化タンパク質(窒素成分)の測定方法について,最も適当な方法の検討も併せて行った.1.75点の試料について,ルーメンバッグによるIn situ法-ペプシン処理後の窒素(N)及びペプシン-セルラーゼ法後のNを測定した結果,これまでの測定方法であるADF処理後のNとの間に各々高い(P<0.0001)正の相関関係を示し,これらの新規導入した方法によっても,不消化窒素成分(タンパク質)の評価ができることが明らかとなった.2.暖地型マメ科牧草5草種,暖地型イネ科牧草1草種の計6草種を供試草種とし,サイレ-ジ調整を行い,30日間埋蔵後開封して,凍結乾燥後粉砕した試料に蒸留水を加え,40°Cと70°Cの2水準でそれぞれ2日間保蔵した後,摂取タンパク質分画を行ったところ,加熱温度が高まるに伴い,原料草並びにサイレ-ジ共に第1胃内での乾物消失率はマメ科牧草において顕著に低下し,窒素成分溶出率は各草種において低下する傾向を示した.また,各草種において不消化タンパク質の割合は加熱処理によって高まることを示した.下部消化管で吸収され,体内で利用される真のルーメンバイパスタンパク質の割合は,一部のマメ科牧草種では増加する傾向がみられたが,他の草種では低下を示した.3.これまでの試験結果から,牧草中の摂取タンパク質の分画の方法と暖地型牧草の摂取タンパク質成分の反芻家畜による利用性を制御する際の基礎的資料としての知見が得られたものと考えられる.
MAPキナーゼカスケードを活性化する酸化ストレスセンサーの網羅的同定

ストレス応答型MAPキナーゼカスケードは活性酸素によるダメージに対抗する生体システムのひとつであるが、酸化ストレスがどのような"酸化ストレスセンサー"を介してMAPキナーゼカスケードを活性化するのか、また酸化ストレスの種類や発生様式によって個々のカスゲードがどのように使い分けられているのかについては、ごく一部を除いてほとんど未解明のままである。本研究は、線虫をモデルとした網羅的なスクリーニングおよび機能解析により、線虫においてMAPキナーゼカスケードを活性化する酸化ストレスセンサーを個別に同定し、それがMAPキナーゼカスケードをそれぞれどのように活性化し、その結果何が誘導あるいは抑制されているのかを明らかにすることを目標としていた。本年度は、酸化ストレスによって修飾を受けるセンサーの候補を同定し、これがp38型のPMK-1 MAPキナーゼカスケードの上流で機能するMAPKKKのさらに上流で機能することを見いだした。ちなみにこの因子は、PMK-1の上流にある2つのMAPKKKのうち、片方MAPKKKの上流でのみ働いていた,さらに酵母2-ハイブリッド法を用いたスクリーニングにより、上記の酸化ストレスセンサー候補の下流で機能する側のMAPKKKに結合する新規因子を同定し、それも酸化ストレスによるPMK-1の活性化に必要であることを見いだした。一方、JNK型のKGB-1 MAPキナーゼカスケードについては、昨年度までにKGB-1 MAPキナーゼが転写因子FOS-1をリン酸化することを見いだしていたが、本年度の解析によりFOS-1による転写制御が負の制御であること、さらにKGB-1はFOS-1をリン酸化して不活性化することにより、結果的に銅依存的に転写誘導を行うことを明らかにした。ストレス応答型MAPキナーゼカスケードはさまざまな酸化ストレスにより活性化するが、それがどのようなセンサーを介して活性化するのかについてはよくわかっていない。また、酸化ストレスの種類の違いにより、異なるストレス応答型MAPキナーゼカスケードが活性化するが、それがどこで区別されているかについてもよくわかっていない。本申請では、線虫をモデルとした網羅的なスクリーニングおよび機能解析により、線虫においてMAPキナーゼカスケードを活性化する酸化ストレスセンサーを個別に同定し、それがMAPキナーゼカスケードをそれぞれどのように活性化し、その結果何が誘導あるいは抑制されているのかを明らかにすることを目標とする。本年度は、JNK型のKGB-1 MAPキナーゼカスケードを標的とした網羅的RNAiスクリーニングにより、KGB-1カスケードの上流で機能する新規チロシンキナーゼを同定することに成功した。また、そこで重金属である銅に依存して活性化する経路と、依存しない経路の2つが存在することも見いだした。さらにKGB-1 MAPキナーゼが転写因子FOS-1をリン酸化することによりその機能を制御することも見いだし、FOS-1の下流で銅依存的に転写制御される遺伝子を、マイクロアレイを用いたスクリーニングによって同定した。
地下性甲虫の飼育法検討及び昆虫－微生物相互作用に関する基礎研究

地下性甲虫の一種であるタイシャクナガチビゴミムシを飼育下で安定して生存させるための要素として生息地で優占する微生物の関与が示唆された。本種は抗生物質の施用によって生存期間が延長し、また糖質の餌よりも肉質の餌によって安定して生存した。抗生物質、肉質餌の双方がない場合でも生息地の土壌を飼育系に導入することで類似した効果が見られたことから生息地の微生物が抗生物質と良質の栄養源を供給している可能性が高い。特に微生物が自身のために生産した抗生物質を甲虫が一方的に利用するという新たな共生関係について言及した。H24年度の段階で実験室での安定した低温高湿度環境が作出できたため、これを利用して地下性甲虫の飼育を継続し、前年度に引き続き餌と飼育床材を変えた試験を行った。長期間の飼育が可能になったことで、飼育中の死亡要因について検証することができるようになってきた。生存に必要な要件の一つに餌の質があり、肉質系の餌を与えない場合には1,2ヶ月で死亡する個体が多かった。必須栄養素が不足するためだと思われるが、地下性動物は一般に飢餓耐性が高いと言われており、実験に使用しているタイシャクナガチビゴミムシは予想よりも飢えに弱いと思われる。さらに興味深いのは3種の抗菌抗真菌剤を施用した区で死亡率が大きく低下することで、中には1年以上飼育できた個体もあった。このことからは飼育下においては感染症で死亡が早まっている可能性が示唆され、すなわち野外においては共生微生物等の働きで病気から保護されているのかもしれない。生息地における飼育実験は前年度に装置破損があって再試験中であったが1年間の継続試験の中で20匹中1匹は死体を確認し、上部を開放した容器で飼育していた2匹が所在不明だが残りの17匹は生存しており野外における死亡率は低く、おそらく寿命も数年はあると思われる。従って飼育下における死亡要因は上記の餌の質と感染症以外にもあると考えなければならないが、その寄与の程度については現在検証中である。計画では飼育試験に加えて、野外での生存に重要な役割を果たしているであろう地下の微生物を単離同定し、また抗生物質等のコード遺伝子が発現しているのかどうかを追跡することとなっていたが、これについては現時点で有効な培養法が確立できておらず道半ばである。遺伝子発現の追跡も、成長速度から考えて発現量が非常に小さいために有効な量のサンプルが得られていない。RNAの分解を押さえながら濃縮する手法を現在検討中である。H24年度の研究計画に基づいて、地下性甲虫の人工飼育環境を構築し、長期間の飼育実験を行えるようにした。本研究で扱う地下性甲虫の野外での生息地環境は6-18°C、90-95%RHであり従来のインキュベーターでは再現が難しかったが、インキュベータ壁全面の精緻な温度制御と透湿防水素材による結露対策を兼ねた加湿装置によって12°C、95%RHの安定した飼育環境が構築できた。これは低温高湿度条件を必要とする他の飼育実験にも応用可能である。構築した飼育装置で餌と飼育床の種類を変えて長期の飼育実験を継続中であるが、これまでの飼育装置では不可能であった6ヶ月以上の飼育に成功しており、条件操作に伴う死亡率の変化について今後の結果が期待される。現時点では飼育床を滅菌した区で死亡率が高かった。またバクテリア用の最少培地を餌として与えた場合、滅菌区と未滅菌の地表土壌区では死亡率が高い傾向が見られ、生育に地下の微生物が関与している可能性が確認された。生息地における飼育実験は脱出防止用の囲いが落石によって破損してしまったため再試験中であるが、5ヶ月の試験期間中に死亡個体はいなかった。生息地の微生物群集については分類群は整理できており、地下性甲虫の生育に関与する機能についても想定できるレベルになった。死亡個体の解剖結果からは予想に反して消化管等に共生している微生物を見いだせなかったが、これによって外部環境の維持によって微生物が間接的に甲虫の成育に影響している可能性が高まった。今後の検証を通してこのようなタイプの共生系を明らかにできれば昆虫と微生物の関係に新たな一面を加えることができるだろうH26年度も微生物学的な側面と甲虫の飼育・繁殖条件の検討の両面から課題に取り組んだ。Trechiama yokoyamaiの死亡率低下に関与していると思われる微生物あるいはその代謝物の分離同定のため、野外生息地(洞窟)の微生物群集の中でバイオマスの多い種を単離同定することを前年度に引き続き試みた。培地組成に腐植成分を加え貧栄養に調整して数ヶ月の培養をすることで数種の放線菌を単離培養することには成功したが、PCR-DGGE法でメジャーバンドを示す種とは一致しなかった。これまでの結果から従来的な概念では単離培養は難しいと判断し、野外コロニーを大量に収集して有効な代謝物(抗生物質等)を抽出、質量分析によってプロファイリングする手法に切り替えた。しかしながら目的とする代謝物の特性が未知であり、一般的な生体成分の精製方法で調整したサンプルのLC-MSから得られたスペクトラムは有効な手がかりを示さなかった。飼育試験では環境の操作によって当初の予測を超えて1年以上の飼育が可能であることが示され、その環境条件のもとで繁殖試験を行う段階へと移行した。

H26年10月にサンプリングした個体を飼育下に置き、任意のタイミングで交尾させたのちにあるものは生息地の気温を模した環境に、あるものは5°C、10°Cの低温刺激にさらし、その後通常環境に戻して産卵行動が見られるかどうかをビデオ解析によって追跡した。これまでに明らかな産卵行動は発見されていないが、野外個体群では春にメス個体の分散が見られることから5月中旬まで観察を続けたのちに解剖して卵巣の発育状況を確認する。前年度までにTrechiama yokoyamaiの飼育環境下での死亡リスクについて、微生物による感染と必須栄養素の供給という2点について仮説を支持する結果が得られたが、感染すると思われる微生物と野外環境で感染を抑止している微生物を単離同定することも継続的に試みており、今年度は各種選択培地で単離培養を行った。生息地土壌を接種源として単離した微生物の抽出物を飼育系に適用して飼育を行ったが、これまでの試験で見られた明瞭な生存期間の延長は確認できなかった。また虫体抽出物を混合した培地で単離した微生物を虫体に再接種しても死亡率は変わらなかった。したがって現時点で本種の死亡リスクと関連している微生物は単離できていないと考えられる。本種の保存的な飼育には成功していることから、続いて繁殖に関する試験を行った。野外個体を各時期に採集して解剖し、卵巣の発育時期を整理したところ5-10月に卵巣の発育した個体が多く、2-4月では発育の見られない個体が多かった。また、発育初期の卵はほとんど見られず、成熟卵に近い状態か、未発達かに二分された。産卵期は比較的長期にわたると思われるが、新成虫の羽化が10-12月ごろに観察されることから、羽化には同調性があるのかもしれない。野外個体を採集し雌雄を2週間同居させたのちに別離して継続的に飼育し、一定期間後に卵巣の発達状態を評価したところ飼育下に移して4か月以上経過した個体では卵巣発育がみられなかった。この傾向は飼育前に低温刺激を行っても変わらなかった。飼育ケージを赤外線カメラで撮影して行動解析を行うと、同居後多くのケースで交尾行動が見られたが、床材を掘るなどの産卵に関連する行動を見いだすことはできなかった。野外と飼育環境での傾向が異なることから現状の飼育環境は死亡リスクの管理は可能なものの繁殖環境に関してはまだ十分ではないと思われ、今後も検証を行っていきたい。地下性甲虫の一種であるタイシャクナガチビゴミムシを飼育下で安定して生存させるための要素として生息地で優占する微生物の関与が示唆された。本種は抗生物質の施用によって生存期間が延長し、また糖質の餌よりも肉質の餌によって安定して生存した。抗生物質、肉質餌の双方がない場合でも生息地の土壌を飼育系に導入することで類似した効果が見られたことから生息地の微生物が抗生物質と良質の栄養源を供給している可能性が高い。特に微生物が自身のために生産した抗生物質を甲虫が一方的に利用するという新たな共生関係について言及した。今年度の実績で述べたとおり、飼育試験が予想以上に長期間に及んだため、その後のスケジュールも全体に遅れている。特に飼育環境下での繁殖に関する試験は交尾後の卵巣発育を促す刺激が明らかでは無いため、野外生息地の条件から推測された低温刺激による発育促進を試みているが、これが妥当でなければ野外個体群の産卵時期と思われる春まで卵巣発育と産卵が起こらない可能性もあり、検証が次年度にずれ込んでいる。加えて、微生物側からのアプローチについても目的の種に近縁な放線菌を分離するために数ヶ月の培養が必要なことから短期間で効率よく検証を重ねることができていない。
分子マーカーを用いたイネのツマグロヨコバイ抵抗性遺伝子のマッピング

イネのツマグロヨコバイ(Nephotettix cincticeps UHLER)抵抗性の遺伝分析を行い,以下の成果を収めた.1.近似同質遺伝子系統を用いたイネのツマグロヨコバイ抵抗性遺伝子のマッピング抵抗性品種「DV85」を供与親,感受性品種「金南風」および「台中65号」をそれぞれ反復親として戻し交配を繰り返し,それぞれの近似同質遺伝子系統であるXB4F2, LHB3F1を育成した.このうち,3集団のXB4F2における抵抗性検定の結果,抵抗性個体と感受性個体は103 : 81に分離し,独立した2個の優性補足遺伝子を仮定した場合の理論分離比9 : 7に適合した.そこで, XB 4F2 8とXB4F2 20の2集団において,DNAマーカーと抵抗性との連鎖分析を行ったところ,両集団とも染色体3上のDNAマーカーであるXNpb144は抵抗性と密接に連鎖していた.またXB4F2 20の集団においては,染色体11上のDNAマーカーであるXNpb181とG1465で抵抗性との連鎖が見られ,とくにG1465に関しては密接に連鎖していた.2.組換え自殖系統を用いたツマグロヨコバイ抵抗性の遺伝分析金南風とDV85との交雑に由来する組換え自殖系統を用いてツマグロヨコバイ抵抗性の分析を行ったところ,抵抗性個体と感受性個体は34 : 84に分離し,独立した2個の優性補足遺伝子支配を仮定した場合の理論分離比1 : 3に適合した.以上の結果から, DV85の示す出穂期前後のツマグロヨコバイ抵抗性は独立した2個の優性補足遺伝子に支配されており,そのうち1個は染色体3上のXNpb144の近傍に位置づけられ,もう1個は染色体11のG1465の近傍に座乗する可能性が高いと示唆された.イネのツマグロヨコバイ(Nephotettix cincticeps UHLER)抵抗性の遺伝分析を行い,以下の成果を収めた.1.近似同質遺伝子系統を用いたイネのツマグロヨコバイ抵抗性遺伝子のマッピング抵抗性品種「DV85」を供与親,感受性品種「金南風」および「台中65号」をそれぞれ反復親として戻し交配を繰り返し,それぞれの近似同質遺伝子系統であるXB4F2, LHB3F1を育成した.このうち,3集団のXB4F2における抵抗性検定の結果,抵抗性個体と感受性個体は103 : 81に分離し,独立した2個の優性補足遺伝子を仮定した場合の理論分離比9 : 7に適合した.そこで, XB 4F2 8とXB4F2 20の2集団において,DNAマーカーと抵抗性との連鎖分析を行ったところ,両集団とも染色体3上のDNAマーカーであるXNpb144は抵抗性と密接に連鎖していた.またXB4F2 20の集団においては,染色体11上のDNAマーカーであるXNpb181とG1465で抵抗性との連鎖が見られ,とくにG1465に関しては密接に連鎖していた.2.組換え自殖系統を用いたツマグロヨコバイ抵抗性の遺伝分析金南風とDV85との交雑に由来する組換え自殖系統を用いてツマグロヨコバイ抵抗性の分析を行ったところ,抵抗性個体と感受性個体は34 : 84に分離し,独立した2個の優性補足遺伝子支配を仮定した場合の理論分離比1 : 3に適合した.以上の結果から, DV85の示す出穂期前後のツマグロヨコバイ抵抗性は独立した2個の優性補足遺伝子に支配されており,そのうち1個は染色体3上のXNpb144の近傍に位置づけられ,もう1個は染色体11のG1465の近傍に座乗する可能性が高いと示唆された.イネのタイワンツマグロヨコバイおよびツマグロヨコバイ抵抗性遺伝子の分子生物学的解析を目的として,従来の遺伝分析では同定が困難であった抵抗性遺伝子を分子マーカー連鎖地図上へマッピングするために,(1)タイワンツマグロヨコバイおよびツマグロヨコバイ抵抗性遺伝子の同質遺伝子系統の育成,ならびに(2)組換自殖系統の育成をおこなった.その結果,本年度はタイワンツマグロヨコバイ抵抗性遺伝子(glh-8)がトリソミック分析によりイネの染色体7に座乗するものと推定され,分子マーカーと抵抗性遺伝子との連鎖分析の効率を高めた.また,組換自殖系統を用いたタイワンツマグロヨコバイおよびツマグロヨコバイ抵抗性遺伝子のマッピングを行うために,抵抗性品種DV85と感受性品種台中65号のF_2160個体から単粒系統法によりF_6系統を育成した.イネのツマグロヨコバイ(Nephotettix cincticeps UHLER)抵抗性の遺伝分析を行い,以下の成果を収めた.1.近似同質遺伝子系統を用いたイネのツマグロヨコバイ抵抗性遺伝子のマッピング抵抗性品種「DV85」を供与親,感受性品種「金南風」および「台中65号」をそれぞれ反復親として戻し交配を繰り返し,それぞれの近似同質遺伝子系統であるXB4F2,LHB3F1を育成した.

このうち,3集団のXB4F2における抵抗性検定の結果,抵抗性個体の感受性個体は103:81に分離し,独立した2個の優性補足遺伝子を仮定した場合の理論分離比9:7に適合した.そこで,XB4F2 8とXB4F2 20の集団において,DNAマーカーと抵抗性との連鎖分析を行ったところ,両集団とも染色体3上のDNAマーカーであるXNpb144は抵抗性と密接に連鎖していた.またXB4F2 20の集団においては,染色体11上のDNAマーカーであるXNpb181とG1465で抵抗性との連鎖が見られ,とくにG1465に関しては密接に連鎖していた.組換え自殖系統を用いたツマグロヨコバイ抵抗性の遺伝分析金南風とDV85との交雑に由来する組換え自殖系統を用いてツマグロヨコバイ抵抗性の分析を行ったところ,抵抗性個体と感受性個体は34:84に分離し,独立した2個の優性補足遺伝子支配を仮定した場合の理論分離比1:3に適合した.以上の結果から,DV85に示す出穂期前後のツマグロヨコバイ抵抗性は独立した2個の優性補足遺伝子に支配されており,そのうち1個は染色体3上のXNpb144の近傍に位置づけられ,もう1個は染色体11のG1465の近傍に座乗する可能性が高いと示唆された.
北海道における先史時代の農耕活動について

1:北海道大学構内サクシュコトニ川遺跡出土西暦9世紀代の植物炭化種子20万粒の同定作業を5月から実施.走査電子顕微鏡を使用してアワ・キビ・ムギが多数存在していたことを確認した.しかし,予想されていたヒエは存在しなかったことが判明.これを確かめるために,苫前郡苫前膜香川6遺跡の擦文時代集落で採集された土壌サンプルを処理,同様の所見を得た.2:南茅部郡南茅部町臼尻の縄文時代中期後半の遺跡で竪穴住居中から採取された土壌の処理を行ない,その中に確実なアワ・ヒエの存在していたことを確認.これは縄文時代中期に雑穀が存在していたことを日本で初めて確認したことになる.3:北海道各地で行なわれている行政発掘の現状から良好なサンプルを集めて,走査電子顕微鏡で栽培植物の検出作業を実施した.この結果,擦文時代にはキビが優勢,アワ・ムギがこれにつぎ,わずかではあるがエゴマらしきものの存在が判明した.4:以上の調査から,北海道の先史時代の農耕活動以外に古く,縄文時代前・中期に開始された可能性が考えられるようになり,擦文時代(9世紀12世紀)においてはオホツク海岸沿いを除きほぼ農耕主体の生活基盤を持っていたことが推定できるようになった.5:走査電子顕微鏡を種子同定に利用する場合,どのようなプロセスで実施するのがもっとも効果的であるのか実験した.また,現生植物の種子を集めて撮影し,マニュアル作成の容易を始めることができた.6:遺物の使用痕を走査電子顕微鏡で撮影するためにレプリカ法がもっとも効率的であることを確認した.1:北海道大学構内サクシュコトニ川遺跡出土西暦9世紀代の植物炭化種子20万粒の同定作業を5月から実施.走査電子顕微鏡を使用してアワ・キビ・ムギが多数存在していたことを確認した.しかし,予想されていたヒエは存在しなかったことが判明.これを確かめるために,苫前郡苫前膜香川6遺跡の擦文時代集落で採集された土壌サンプルを処理,同様の所見を得た.2:南茅部郡南茅部町臼尻の縄文時代中期後半の遺跡で竪穴住居中から採取された土壌の処理を行ない,その中に確実なアワ・ヒエの存在していたことを確認.これは縄文時代中期に雑穀が存在していたことを日本で初めて確認したことになる.3:北海道各地で行なわれている行政発掘の現状から良好なサンプルを集めて,走査電子顕微鏡で栽培植物の検出作業を実施した.この結果,擦文時代にはキビが優勢,アワ・ムギがこれにつぎ,わずかではあるがエゴマらしきものの存在が判明した.4:以上の調査から,北海道の先史時代の農耕活動以外に古く,縄文時代前・中期に開始された可能性が考えられるようになり,擦文時代(9世紀12世紀)においてはオホツク海岸沿いを除きほぼ農耕主体の生活基盤を持っていたことが推定できるようになった.5:走査電子顕微鏡を種子同定に利用する場合,どのようなプロセスで実施するのがもっとも効果的であるのか実験した.また,現生植物の種子を集めて撮影し,マニュアル作成の容易を始めることができた.6:遺物の使用痕を走査電子顕微鏡で撮影するためにレプリカ法がもっとも効率的であることを確認した.
学校経営に関わるコンサルテーションのニーズ・手法・理論に関する研究

高等学校の学校経営上の課題とコンサルテーションのニーズについて質問紙調査を実施した。共通する課題としては、予算不足、教職員の意識が変わらないこと、予算の裁量性が乏しいこと、特定の専門性を有する職員が不足していることなどがある。また、学校経営上の課題及び知識ニーズと支援ニーズは、普通科と専門学科で異なるとともに、普通科でも難関大学への進学の重視度によって異なることが明らかになった。学校経営に関するコンサルテーションを行っている研究者による2回の検討会を通じて、(1)目先の課題にとらわれないコンサルテーションの重要性とその技法、(2)学校経営コンサルテーションとスクールリーダー教育の基盤となる学校管理職の専門職基準の必要性、その内容、活用方法等を明らかにした。学校経営コンサルテーションについてシャインのプロセス・コンサルテーションの理論を援用して検討を加え、広義のプロセス・コンサルテーションが学校変革を促す際にも有効であることを明らかにした。1.学校のコンサルテーションニーズに関する質問紙調査の実施関東地方の全公立高等学校の校長を対象として、(1)学校経営の重点目標、(2)重点目標の達成状況、(3)重点目標達成上の課題、(4)外部機関との連携の実態、(5)外部機関との連携の推進予定、(6)学校経営に関する相談要望事項と相談相手、などについての質問紙調査を実施した。質問内容が年度末における重点目標の達成状況に関するものを含んでいたために、調査実施が平成19年度末にならざるを得なかった。平成20年度中に分析し、結果を論文等の形で発表する予定である。2.学校経営コンサルテーションニーズに関するインタビュー調査の実施学校の管理職やベテラン教員に対して、学校経営コンサルテーションのニーズや研究者への期待についてインタビューした。3.学校経営に関するコンサルテーション実践についての検討会の開催と検討学校経営に関するコンサルテーションを行っている研究者による検討会を実施した。小松郁夫国立教育政策研究所高等教育研究部長および佐古秀一鳴門教育大学教授の実践報告に基づいて、(1)コンサルテーションの経緯,(2)対象校のニーズ,経営環境,(3)活用したコンサルテーション手法・モデル,(4)コンサルテーションの効果,(5)コンサルテーションを通じて得られた知見,(6)基盤となっている学校組織認識(とりわけ企業組織と対比した時の学校組織の特質),(7)スクールリーダー教育との関連等について共同的なリフレクションを行った。。平成20年度にその報告書を作成する予定である。4.学校経営コンサルテーションについての理論的研究学校改善研究,スクールリーダー教育に関する研究,企業経営コンサルテーションに関する研究などをレビューした。高等学校の学校経営上の課題とコンサルテーションのニーズについて、質問紙調査の結果を分析した。共通する課題としては、予算不足、教職員の意識が変わらないこと、予算の裁量性が乏しいこと、特定の専門性を有する職員が不足していることなどが挙げられている。それに対応して教職員の意識変革に対する知識ニーズと支援ニーズが高くなっている。また、効果的な学習指導についての知識ニーズと授業改善・学習指導に関する支援ニーズも全般的に高い。また、学校経営上の課題及び知識ニーズと支援ニーズは、普通科と専門学科で異なるとともに、普通科でも難関大学への進学の重視度によって分類したタイプによって異なることが明らかになった。研究者のコンサルテーション活動、とくにスクールリーダー教育の場面におけるその手法について報告会を行うとともに、スクールリーダー教育を行っている研究者に対するインタビュー及びコンサルテーション活動に関する事例検討を実施し、スクールリーダー教育の開発課題を明らかにした。とりわけ、学校経営コンサルテーションとスクールリーダー教育の基盤となる学校管理職の専門職基準の必要性、その内容、活用方法等について明らかにした。学校経営コンサルテーションについてシャインのプロセスコンサルテーションの理論を援用して検討を加え、広義のプロセスコンサルテーションが学校変革を促す際にも有効であると考えられることを明らかにした。以上の内容及び前年度の研究成果をまとめて報告書(『学校経営に関わるコンサルテーションのニーズ・手法・理論に関する研究』全112頁)を作成した。
慢性肉芽腫症と顆粒球生体防御欠損機構-遺伝子治療の基礎的研究

本研究は慢性肉芽腫症(CGD)を中心とした遺伝性白血球機能障害の情報伝達から見た解析と、それを通じて好中球の殺菌能として重要なNADPHオキシダーゼの活性化機構を明らかにすることを目的とした。本研究で明らかに出来た事として、次のようなものである。第一に正常好中球のNADPHオキシダーゼ活性化と貪食機構に関してp38MAPキナーゼという、最近発見された新しいキナーゼの関与を明らかにした。第二に好中球の活性酸素生成が欠損しているヒト慢性肉芽腫症(CGD)の細胞を用いた研究で,NADPHオキシダーゼコンポーネントであるp47phox発現ベクターを発現させることでNADPHオキシダーゼ活性を回復させる事に成功した。これは遺伝子治療の基礎的研究として意義があると考えられる。またこのp47phoxの部位特異的突然変異法を用いた詳細な研究で、p47phoxの11個のセリン残基のうちS303.S304.S359.S370のリン酸化がNADPHオキシダーゼ活性化の引き金になること、スピンラベル法を用いた研究でp47phoxがリン酸化する際に、そのC末端領域の構造変化が起きることを明らかにした。第三にCGDと類似の活性酸素生成能が欠損しているウシ顆粒球粘着不全症(BLAD)の好中球はlgGや補体受容体刺激による活性酸素生成能は著しく低下しているが、その情報伝達系にPKCが関係するNADPHオキシダーゼ活性化システムの寄与が大きくなる(up-regulation)ことを明らかにした。ホスファチヂルイノシトール3キナーゼ、p38MAPKあるいはチロシンキナーゼが関与する機構については寄与の程度は正常なものと変化は無かった。第四にBLADのウシに正常ウシの骨髄の移植を試みたところ、28カ月にわたりCD18の好中球での発現が観察され、臨床的症状の改善が見られた。これは、今後のBLADへの骨随移植の適用と言う点で意義があると考えられる。第五にこの様な血球細胞からの活性酸素は生体系では、炎症、虚血時の傷害と深く結びついて考えられているが、その防護機構として、活性酸素に曝された細胞をその後、Troloxやカテキンなどの抗酸化剤で処理することにより軽減出来ることを細胞レベルとスナネズミの脳虚血モデルで見いだした。これは活性酸素傷害に対する新たな防護法の確立と言う点で意義がある知見である。以上のようなNADPHオキシダーゼの活性化機構をCGDならびBLAD由来の細胞を用いることで明らかにすることができた。さらに欠損酵素のコンポーネントの発現、骨髄移植、酸化傷害からの抗酸化剤による防護法など、将来への治療という点でも意義のある成果が上げられた。

さらに欠損酵素のコンポーネントの発現、骨髄移植、酸化傷害からの抗酸化剤による防護法など、将来への治療という点でも意義のある成果が上げられた。本年度は慢性肉芽腫症の好中球のモデルを作成するために、NADPHオキシダーゼのコンポーネントであるp47phox欠損B細胞を慢性肉芽腫症患者から単離し、Epstein-Barrウイルスで株化し、それにp47phox cDNAを発現ベクターに組み込み、この細胞に導入、発現させることに成功した。通常はホルボールで刺激してもスーパーオキサイド(O_2-)の生成は見られないが、野生型p47phoxをこの細胞の過剰発現させると、O_2-の生成が観察された。このことは慢性肉芽腫の発症原因の一つであるO_2-生成低下を欠損酵素成分を補ってやることで、回復できることを示している。また一方では、正常の好中球の活性化機構を調べる目的で情報伝達径路をまず明らかにするために各種キナーゼ阻害剤を用いて検討した。Cキナーゼ阻害剤としてGF109203Xを、MAPキナーゼ阻害剤としてPD98059、p38(HOG)の阻害剤としてSB203580、PI3キナーゼ阻害剤としてワ-トマニンを用いて評価した。PMAで刺激した際NADPHオキシダーゼの活性は、GF109203Xでほぼ完全に阻害された。このことはCキナーゼが活性がPMA刺激の際には重要であることを意味している。またOZ刺激の際にはp38阻害剤、PI3キナーゼ阻害剤、Cキナーゼ阻害剤が効果が見られ、MAPキナーゼ阻害剤にはNADPHオキシダーゼの阻害効果は見いだされなかった。このことはOZ刺激の際にはCキナーゼ以外にもキナーゼの関与があると考えられる。来年度は、慢性肉芽腫の好中球についてキナーゼ系を検討する予定である。具体的には発現ベクターのp47phoxのリン酸化部位のセリン残基をアラニン残基に変異を人為的に起こさせ、発現させることでPMAに対するキナーゼの貢献度を評価する。本碩究は慢性肉芽腫症(CGD)を中心とした遺伝性白血球機能障害の情報伝達から見た解析と、それを通じて好中球の殺菌能として重要なNADPHオキシダーゼの活性化機構を明らかにすることを目的とした。本研究で明らかに出来た事として、次のようなものである。第一に正常好中球のNADPHオキシダーゼ活性化と貪食機構に関してp38MAPキナーゼという、最近発見された新しいキナーゼの関与を明らかにした。第二に好中球の活性酸素生成が欠損しているヒト慢性肉芽腫症(CGD)の細胞を用いた研究で、NADPHオーキシダーゼコンポーネントであるp47phox発現ベクターを発現させることでNADPHオキシダーゼ活性を回復させる事に成功した。これは遺伝子治療の基礎的研究として意義があると考えられる。またこのP47phoxの部位特異的突然変異法を用いた詳細な研究で、P47phoxの11個のセリン残基のうちS303,S304,S359,S370のリン酸化がNADPHオキシダーゼ活性化の引き金になること、スピンラベル法を用いた研究でp47phoxがリン酸化する際に、そのC末端領域の構造変化が起きることを明らかにした。第三にCGDと類似の活性酸素生成能が欠損しているウシ癲粒球粘着不全症(BLAD)の好中球は19Gや補体受容体刺激による活性酸素生成能は著しく低下しているが、その情報伝達系にPKCが関係するNADPHオキシダーゼ活性化システムの寄与が大きくなる(up-regulation)ことを明らかにした。
くも膜下出血誘発性心筋障害における男女差の発生メカニズムに関する検討

くも膜下出血(SAH)により誘発された心筋障害(タコツボ心筋症)のメカニズムと性差との関連を含め研究した。通常のタコツボパターン(心基部の過収縮/心尖部の無収縮)と逆タコツボパターンとが生化学的に異なるかにつき研究。タコツボ心筋症発症に関与するカテコラミン中、エピネフリンの過剰が逆タコツボパターンと関連することを示し、両者は生化学的に異なっている可能性を示した。研究開始から約一年間経過しましたが、順調に遂行されています。中間解析のバイプロダクトとしてのデータを査読のある英文学術誌に掲載が出来ました(以下に示します)。【背景・目的】くも膜下出血と脳内出血で反応性高血圧の程度とカテコラミン濃度との相関関係が異なるかあるいは同一かについて臨床的に調査した。【方法】くも膜下出血患者200名と脳内出血200名それぞれを抽出し、入院時収縮期血圧(SBP)とカテコラミン(エピネフリン、E)(ノルエピネフリン、NE)濃度との関係を調査した。【結果】くも膜下出血患者ではSBPとNE濃度との間に比較的リニアな相関関係が認められたのに対し、脳内出血患者では認められなかった。【結語】出血性脳卒中のカテゴリーのなかでも反応性高血圧の病態生理(特にカテコラミンの関与程度)は異なることが示唆された。従来、ストレス性心筋障害の発生原因として交感神経終末・副腎髄質からのカテコラミン・サージ仮説が提唱されていたが、SAH臨症例で血中カテコラミン濃度と心筋障害との関連を調査した研究はなかった。申請者は循環器科と共同で前向き研究を行い血中カテコラミン濃度と心筋障害との関連を検討。その結果、女性においてSAH誘発性心筋障害が低エストロゲン/高ノルアドレナリン状態で高率に発症しやすく、反対に高エストロゲン/低ノルアドレナリン状態では起きにくいことを見出した。申請者はより最近、SAH患者において障害された大脳半球間で自律神経障害の発現の仕方に差異(左右差)があるのを発見。これは脳幹自律神経核と島皮質のネットワークが左右半球間で解剖学的に異なることを示す独創的研究として注目された。対象症例は順調に増えており、臨床データの蓄積も十分にできたため予定よりも早くデータ解析可能であった。今回の科研費による研究成果は複数の英文論文にて発表済である(前述)。H28年度は三年計画の最終年度であった。過去二年間の研究内容に引き続き、SAHにより誘発された心筋障害(タコツボ心筋症)のメカニズムを研究した。特に通常のタコツボパターン(心基部の過収縮/心尖部の無収縮)と逆タコツボパターン(心基部の無収縮/心尖部の過収縮)とが生化学的に異なるかを研究。タコツボ心筋症発症に関与するカテコラミン中、エピネフリンの過剰が逆タコツボパターンと強く関連することを示し、両者は生化学的に異なっていることが示された。当初予定したよりも順調に経過しており、既に一編の論文が掲載された他、もう一本の論文は異なった査読+英文医学雑誌に投稿済みです(現在査読中)。予定していた研究はおおむね終了したので、今後は新たなプロジェクトへ向け調査を開始したところである。神経救急研究の方向性としては特に修正や変更は必要としないと思われ、現在のプロトコールで更に症例を増やしデータの蓄積に努めて参ります。研究が予定よりも早く達成されそうであったため結果が予想より早く出たため(=より少ない症例数で出た)差額として次年度使用額が生じました。当初測定しない予定であったバイオマーカーに対しても測定を検討することとし、その費用を計上させていただきたい。次年度使用額は、今までと異なったバイオマーカーの計測することとし、その購入費用(消耗品費)に計上する予定です。
ゲノム機能解析による鳥類血液原虫の感染制御へ向けた基盤研究

本年度は原虫遺伝子の転写解析および遺伝子導入法を検討するために、鳥マラリア原虫(Plasmodium gallinaceum)のin vitro培養法、継代維持法を検討した。はじめに、P. gallinaceumを感染させたニワトリの血液を用いて、赤内型および赤外型虫体のin vitro培養条件を検討した。赤内型虫体の培養はヒトのマラリア原虫と同様の複数の条件下で行い、培養後3日目までは原虫の生存性が顕微鏡下で観察できたが、4日目以後に生存する原虫数は顕著に減少した。赤外型虫体の培養は、原虫の宿主細胞となる鶏胚繊維芽細胞(CEF)を継代培養し、原虫の細胞への侵入と増殖の様子を確認し、安定した赤外型虫体の継代維持法を確立する予定である。次いで発育鶏卵を用いた原虫の培養条件を検討した。10日齢の発育鶏卵の漿尿膜腔、羊膜腔および静脈内に原虫感染血液を接種後7日目に鶏胚の感染状態を確認した。その結果、漿尿膜腔および羊膜腔では原虫の発育は認められなかったが、静脈内に接種後は発育が認められ、赤血球における原虫寄生率は7099%であった。原虫が発育した鶏胚から採取した血液を、10日齢の発育鶏卵の静脈内に再度接種したところ、接種後7日目には原虫の発育が認められ、血液ステージの原虫を継代培養が可能であることが示唆された。さらに、上記培養法で維持された原虫の発育環を完成させるために、ベクター(蚊)を介した原虫維持法を検討した。用意した17日齢鶏卵の気室部卵殻を除去し、卵殻膜を介して蚊が吸血できる環境を整えたところ、複数の蚊が鶏卵を吸血していた。今後は原虫に感染した17日齢鶏卵を用いて蚊に吸血させ、蚊体内での原虫の発育および鶏卵への感染能の有無を検討することが可能となるだろう。さらに、培養した原虫へ遺伝子を導入するためには、各発育ステージの原虫を分離精製する必要がある。鶏卵培養で得られた原虫感染血液を用いて密度勾配遠心を行い、シゾント期の虫体を40%含む分画を得ることができた。前年度までに原虫の分離精製に成功し、原虫継代維持に必須となる手法を確立したが、発育鶏卵を用いた培養系は予想以上に手技の習熟に時間を要した。また、長期間原虫を維持するin vitro培養条件の検討にも時間を要し、予定期間中に手法を確立することができなかった。先行研究の詳細な検証が不足していたことと、培養手法が確立している近縁な原虫種との比較が不十分であったことが原因と考えている。本年度確立した発育鶏卵を用いた原虫培養および維持方法を用いて、ベクター(蚊)も用いて原虫の発育環を完成させる。さらに、in vitro培養系の確立のために、可能な限り培養条件の組み合わせを検討する。そして遺伝子導入実験系を確立するために、プロモーター、ターミネーターおよびレポーター遺伝子を組み込んだコンストラクトを作製し、発現効率の良いプロモーター遺伝子の選定とクローニングを実施する。これらの実験系は所属研究室が引き続き継続して検討する予定である。原虫感染防除のためには、病原体の生理機構を解明し、薬剤およびワクチンの有効なターゲットとなる原虫特異的な代謝機構やタンパクなどの関連分子を選択する必要がある。本年度はLeucocytonzoon caulleryiを対象として原虫特異的な各種ゲノム情報の収集を試みた。これまでのところ、原虫特異的な代謝機構であるヘム合成系の調節に関わるPBGS遺伝子の存在および塩基配列を明らかにした。また、アピコンプレクス門原虫に特有なゲノムを持つ細胞小器官であるアピコプラストのゲノム解読に着手し、想定される35kbpのアピコプラストゲノムのほぼ全長を解読できた。アピコプラストゲノムにはSSUおよびLSU rRNA、25個のtRNA、17個のrRNA、tufA、clpC、sufB、6種のORFがそれぞれコードされており、遺伝子構成および配置は近縁種であるP.falciparumとほぼ同様であった。AT含量は約86%であり、多種のヒトおよびネズミマラリア原虫と比較して同様のゲノム構成であることが分かった。さらに、上記ゲノム情報の保存性を比較解析するため、国内の野鳥においてLeucocytozoon属原虫の感染状況を調べたところ、522個体のうち98個体から43系統のLeucocytozoon sp.が得られた。なお、本研究結果は第152回日本獣医学会学術集会で発表し、さらに国際学術雑誌(veterinary parasitology)に掲載された。原虫感染防除のためには、病原体の生理機構を解明し、薬剤およびワクチンの有効なターゲットとなる原虫の生存に必要な特異的代謝機構やタンパクなどの関連分子を選択する必要がある。本研究ではニワトリの重要な血液寄生原虫であるLoucocytozoon caulleryiを対象とし、本年度は原虫特異的な各種ゲノム情報の収集を試みた。これまでに、本原虫感染ニワトリ血液から原虫を精製・分離する手法を検討し、高精製度の原虫DNA溶液が得られた(第155回日本獣医学会学術集会で発表)。さらに、精製したゲノムDNA溶液を用いて、次世代シーケンサーにより網羅的に塩基配列を解読し、本原虫のドラフトゲノム情報を収集することができた。

さらに、原虫特異的な代謝機構であるヘム合成系の調節に関わるPBGS遺伝子を本種原虫で初めて同定し、関連する他の遺伝子5種についても部分的配列情報が得られた。また、アピコンプレクス門原虫に特有で、独自のゲノムを持つ細胞小器官、アピコプラストのゲノム解読を試み、想定されるアピコプラストゲノムの全長を解読した。本原虫のアピコプラストゲノムサイズは約35Kbp、AT含量は約86%であり、ゲノム中には、25個のtRNA、17個のrRNA、tufA、clpC、sufB、および6種の機能未同定のORFがそれぞれコードされており、長短2種のサブユニットから成るrRNA(SSUおよびLSU)を含む特徴的なinverted repeat領域が1対認められた。この遺伝子構成および配置は、近縁種である熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)などのほ乳類寄生とほぼ同様のゲノム構成であることが明らかになった。本年度は原虫遺伝子の転写解析および遺伝子導入法を検討するために、鳥マラリア原虫(Plasmodium gallinaceum)のin vitro培養法、継代維持法を検討した。はじめに、P. gallinaceumを感染させたニワトリの血液を用いて、赤内型および赤外型虫体のin vitro培養条件を検討した。赤内型虫体の培養はヒトのマラリア原虫と同様の複数の条件下で行い、培養後3日目までは原虫の生存性が顕微鏡下で観察できたが、4日目以後に生存する原虫数は顕著に減少した。赤外型虫体の培養は、原虫の宿主細胞となる鶏胚繊維芽細胞(CEF)を継代培養し、原虫の細胞への侵入と増殖の様子を確認し、安定した赤外型虫体の継代維持法を確立する予定である。次いで発育鶏卵を用いた原虫の培養条件を検討した。10日齢の発育鶏卵の漿尿膜腔、羊膜腔および静脈内に原虫感染血液を接種後7日目に鶏胚の感染状態を確認した。その結果、漿尿膜腔および羊膜腔では原虫の発育は認められなかったが、静脈内に接種後は発育が認められ、赤血球における原虫寄生率は7099%であった。原虫が発育した鶏胚から採取した血液を、10日齢の発育鶏卵の静脈内に再度接種したところ、接種後7日目には原虫の発育が認められ、血液ステージの原虫を継代培養が可能であることが示唆された。さらに、上記培養法で維持された原虫の発育環を完成させるために、ベクター(蚊)を介した原虫維持法を検討した。用意した17日齢鶏卵の気室部卵殻を除去し、卵殻膜を介して蚊が吸血できる環境を整えたところ、複数の蚊が鶏卵を吸血していた。今後は原虫に感染した17日齢鶏卵を用いて蚊に吸血させ、蚊体内での原虫の発育および鶏卵への感染能の有無を検討することが可能となるだろう。さらに、培養した原虫へ遺伝子を導入するためには、各発育ステージの原虫を分離精製する必要がある。鶏卵培養で得られた原虫感染血液を用いて密度勾配遠心を行い、シゾント期の虫体を40%含む分画を得ることができた。原虫特異的なタンパク代謝経路に関わる重要遺伝子の存在が明らかとなり、また原虫の生存に必須なアピコプラストゲノム情報のほぼ全容を解明したため、原虫感染防御の標的となる有用遺伝子の基礎情報が蓄積された。原虫の分離精製に成功し、原虫継代維持に必須となる手法を確立した。また、原虫の生存に必須であるアピコプラストゲノムの全容を解明し、原虫特異的代謝経路に関連する遺伝子の存在が確認できた。さらに、原虫の生態解明に必須となるゲノム情報の網羅的解析に着手し、原虫の感染防御に関連する遺伝子の同定や機能解明が期待できる。
転写とDNA修復のカップリングの分子機構の研究

1.線虫TFIIEホモログの同定と解析真核生物では遺伝子の2本鎖DNAのうち、RNAポリメラーゼII(PolII)が転写を行っている鎖が紫外線等により傷害を受けた場合、非転写鎖よりも素早く修復される、転写とカップルしたDNA修復が知られている。その際に重要な役割を果たす基本転写因子TFIIHとそれを制御するTFIIEの解析の目的で、これまでヒトTFIIEの構造と活性の相関を欠失変異体を用いて解析し、2030アミノ酸の範囲内に活性領域を特定した。現在更に個々のアミノ酸レベルで解析を進めるため、異なる種間でホモログを取りアミノ酸配列の保存性を調べている。今回、線虫からTFIIEホモログを同定し、解析した。まず小さいTFIIEβサブユニットは、大腸菌で発現、精製してヒトと転写機能が置き換るかを調べると、不完全ながら置き換った。一方、線虫TFIIEαは置き換らなかった。TFIIHのPolIIリン酸化のTFIIEによる促進活性について調べると、転写と良く一致して線虫TFIIEβではリン酸化が促進されるのに対し、線虫TFIIEαではリン酸化の促進は見られなかった。2. TFIIHの欠損に起因する遺伝病患者由来の欠損THIIHの活性と機能の解析TFIIHは9サブユニットよりなり、転写だけでなくDNA除去修復に関与する重要な蛋白である。特に、大きい2サブユニットXPBとXPDがDNA修復に直接関わっている。遺伝的にこれらに欠損を有する家系が存在し、患者は転写、DNA修復能が低下することにより癌になりやすかったり、発育や神経系の発達が遅れていることが明らかにされている。今回、これらのサブユニットに欠損を有する2種の細胞から欠損TFIIHを精製し、そのサブユニット構成や転写、DNA修復における活性を調べた。すると転写やDNA修復活性の低下と患者の病態に相関性があることが分った。
生活環・感染様式から探る藻類寄生性ツボカビ類の進化

本研究は原始的真菌類の一群であるツボカビ類の糖鎖を認識するレクチン結合パターン、生活環や感染様式を観察し、藻類と菌類の相互作用やツボカビの進化を明らかにすることを目的とした。透過型電子顕微鏡によって細胞微細構造を調べ、タイムラプス顕微鏡による生活環の各ステージ移行過程、および、レクチンを用いた染色による蛍光微鏡観察を行い、生活環の各ステージにおける細胞表面の糖鎖分布について調べた。その結果、遊走子放出タイミングやレクチン結合パターンが種あるいは生活環ステージによって異なることがわかった。アミノ糖の一種N-アセチルグルコサミンが遊走子嚢の仮根の基部に集積していることが示唆された。本研究は、原始的真菌類の一群であるツボカビ類の生活環・感染様式を詳細に観察し、その進化を明らかにすることを目的とする。明視野・蛍光ライブイメージングによりツボカビ類の生活環を明らかにし、藻類への感染過程における宿主の認識や感染様式、さらに宿主細胞内のツボカビ類の動態を電子顕微鏡レベルで詳細に観察することで、原始的菌類における細胞体制や感染様式の進化を解明する。初年度はツボカビ類のカルチャーコレクションの収集とその継代維持培養系の確立について重点的に取り組んだ。アメリカタイプカルチャーコレクション(ATCC)よりツボカビ類3種(Terramyces subanglosum ATCC-MYA-4067, Chytriomyces hyalinus ATCC-28165, Allomyces javanicus ATCC-10984)を分譲してもらい、まずそれらの基本的な体制・生活環を光学顕微鏡により観察した。特にChytriomyces hyalinusについては、遊走子の放出条件を詳細に検討し、生活環の基本的な部分についてはライブイメージングを行った。現在は特に菌類・藻類が共存できる二員培養系のための条件検討や、長時間のライブイメージングで用いる培養器の最適化を進めている段階である。今後はその確立した培養系を用いてライブイメージングや透過型電子顕微鏡データの取得に取り組みたい。本研究は原始的菌類の一群であるツボカビ類の生活環や藻類への感染様式を光学顕微鏡や透過型電子顕微鏡を用いて詳細に観察し、原始的菌類の細胞体制や進化を明らかにすることを目的としている。次年度(平成26年度)では、ツボカビ類のレクチン染色を行い、細胞表面の糖鎖の分布を調べた。特にC. hyalinus ATCC-28165の糖鎖の分布をFITC-WGA(フルオレセインイソチオシアネートが結合したwheatgermagglutinin)を用いて蛍光顕微鏡観察したところ、胞子のうの表面とrhizoidal networkの基部で特に強いシグナルを観察した。一方で遊走子はFITC-WGAのシグナルが観察されなかった。これはツボカビ表面のN-acetyl-D-glucosamineの分布を示していると考えられる。ツボカビにおける生活環のレクチン局在パターンの違いは、感染様式と何らかの関係があると推測されるが、さらなる解析が必要である。本研究では、宿主藻類としてHaematococcus pluvialis (ヘマトコッカス藻)に着目している。これは、ヘマトコッカス藻を屋外大量培養した際のツボカビの被害が複数報告されているからである。研究の過程でヘマトコッカス藻の学名にいくつかシノニムが存在し、混乱していることがわかった。本研究では、将来的な学名適用の混乱を防ぐため、凍結保存株に基づくエピタイプを指定し、客観的な学名の適用を提案した。本研究は原始的真菌類の一群であるツボカビ類の生活環や微細藻類等への感染様式を詳細に観察し、その多様性や進化を明らかにすることを目的とした。ATCCカルチャーコレクションより選定したツボカビ種3株(Terramyces subangulosum, Chytriomyces hyalinus, Allomyces macrogynus)について、タイムラプス顕微鏡による生活環の詳細な観察のほか、レクチン(WGA:Wheat Germ Agglutinin)を用いた蛍光顕微鏡観察を行い、生活環の各ステージにおける細胞表面の糖鎖分布について詳しく調べた。C. hyalinusについては、生活環の各ステージにおけるWGA結合部位について、研究をまとめ論文として発表した(Ota et al. 2015, Cytologia)。ツボカビ類の遊走子嚢あるいは配偶子嚢から遊走子/配偶子が放出されるタイミングを調べたところ、ツボカビ種によって全く異なっていることが明らかとなり、種レベルに特有な特徴であることが予想された。本課題で用いた藻類種であるHaematococcus lacustris(ヘマトコッカス藻)は屋外培養でツボカビ感染による被害が報告されている(Hoffman et al. 2008, Mycol. Res.)。本研究でレクチン(WGA)染色による顕微鏡観察をしたところ、ヘマトコッカス藻はWGA染色されないが、一方、ツボカビはWGA染色されることがわかった。この染色の違いは、将来的に屋外培養のコンタミネーションのモニタリングなどにも応用できる可能性がある。さらに、本課題の研究の過程で、ヘマトコッカス藻の学名が混乱している問題にも取り組み、シノニムリストを整理しエピタイプ指定を行うことで学名の安定化を図った(Nakada and Ota 2016, Taxon)。