hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
GFP導入口腔癌細胞を用いた分子標的薬による浸潤転移抑制治療の開発

口腔扁平上皮癌では,臨床的に初診時での頸部リンパ節転移は,約50%前後認められる.また,転移がみられないN0症例についても潜在的頸部リンパ節転移が約30%存在することが知られている.これらの転移症例について,現状の手術療法による救済治療は限界がある.そこで,本研究は口腔扁平上皮癌の局所浸潤と頸部及び遠隔転移に対する浸潤転移抑制による転移予防効果,さらに形成された転移巣に対する抗腫瘍効果について,分子標的薬による治療を開発することを目的としている.材料と方法:ヒト舌扁平上皮癌原発巣から樹立したSAS細胞から得られた,高浸潤性クローンSAS-H1細胞と低浸潤性クローンSAS-L1細胞を用いた.(1)Green Fluorescent protein (GFP)発現遺伝子の導入:2つの細胞株に,GFP発現遺伝子pEGFP-Cベクター(Clontech)をリポフェクション法により導入し,G418で高発現細胞を選択して安定したGFP発現癌細胞を得る.(2)In vivo転移実験の確立:得られたGFP高発現癌細胞を,2X10^5cells/200μl in PBSでKNSヌードマウスの舌側縁に注入し同所移植を行った.結果:(1)G418の濃度を400-800μg/mlに調整し,細胞を選択した.これによりGFP高発現癌細胞を得た.ヌードマウス舌に賀来癌細胞を同所移植後21日目に屠殺し,蛍光実体顕微鏡で観察した結果,舌にSAS-H1では6mm径,SAS-L1では4mm径の腫瘍形成が確認された.同時に頸部リンパ節転移を検索するとSAS-H1では,90%に顎下リンパ節転移を認め,対側頸部転移もみられた.一方,SAS-L1では30%に顎下リンパ節転移が認められたが,対側転移例はみられなかった.また,顕微鏡観察で,GFPの緑色蛍光は21日後でも減弱することはなかった.次ぎに原発部位の組織の凍結切片を作製し,局所浸潤を蛍光顕微鏡さらにHE染色標本で観察したところ,SAS-H1では,局所浸潤傾向が強く,SAS-L1では腫瘍胞巣を形成して拡張性の発育傾向がみられた.なお,本年度予定していた血中循環癌細胞数の検索は,まだ着手することが出来なかったため,次年度に続けて行うこととした.目的:口腔扁平上皮癌のin vivo転移実験系を確立し、分子標的薬による治療効果を判定する。方法:1.in vivo転移実験系の確立:ヒト舌扁平上皮癌細胞株SASから得られた高浸潤性癌細胞SAS-H1と低浸潤性癌細胞SAS-L1について、GFP発現遺伝しベクター(p-EGFP-N1)を電気穿口法で導入し、G418によりGFP高発現細胞を作製した。次にKNSヌードマウスの舌側縁に同所移植し、SAS-H1では、全例で局所浸潤と同時に頸部リンパ節転移が出現することを確認している。2.分子標的薬による治療実験:同所移植後1週経過した時点で、PI3K阻害剤LY294002を1-100mg/kgを毎日3週にわたり腹腔内投与を施行し、移植部の腫瘍径と、頸部転移抑制率をGFP蛍光強度で測定する。同様に、ヒト好中球由来抗菌蛋白質CAP18由来C-末端活性化ドメインペプチドhCAF18_<109-135>を1-100μgを尾静脈および同所移植部に投与し、同様の評価方法を用いた。3.血中循環癌細胞数の検討:同所移植後1週ごとに末梢血を採取し、FACScanで細胞数を計測した。結果:1.SAS-H1/EGFPN1は、きわめて局所浸潤性が高く、頸部転移が全例に認められたが、一方、SAS-L1/EGFPN1では局所で膨張性発育を示し、頸部転移は30%でみられるのみであった。そこで、主としてSAS-H1/EGFPN1の同所移植群で実験的治療を評価した。2.分子治療薬の効果:LY294002濃度100mg/kgで局所の抗腫瘍効果が認められた。
海洋環境中におけるＤＮＡ／ＲＮＡ両ウイルスの宿主争奪戦に関する研究

近年、海洋における藻類ウイルス研究が注目されている。本研究は、タイプが異なるウイルスの共通宿主に対する感染・優占化戦略を、珪藻とそれに感染する2種のウイルスを材料として解明することを目的とした。現場調査ならびに室内実験の結果、2種のウイルスは水温に対して異なる増殖特性を持つことが明らかとなった。このことから異種のウイルス同士は宿主を争奪するのではなく、異なる環境条件下で宿主をシェアしているものと推察された。近年、海洋を舞台としたウイルス学の著しい進歩が注目されている。本研究では、DNA/RNA両タイプのウイルスの共通宿主に対する感染・複製・優占化戦略を、珪藻とそれに感染する2種のウイルス(DNA/RNAウイルス)を材料として比較・解明することを目的とした。珪藻とウイルスの挙動に関し、有明海におけるキートセロス・デビリスとそれに感染するウイルスとの関係を調査した。その結果、ウイルスは本種の発生時に特異的に増加すること、ならびにウイルス個体群と宿主個体群はともに複数の異なる感染性・被感染性を持つ株から構成されていることが推察された。また、広島湾においてキートセロス・テヌイシマスに感染するウイルスは夏季に出現頻度が高くなることが明らかになった。キートセロス・テヌイシマスに感染するRNAウイルスならびにDNAウイルスをターゲットとし、それぞれのウイルスゲノム塩基配列特異的な分子プローブの設計を行った。ターゲット配列をプラスミドに組み込んだ後、約1kb長のハイブリダイゼーション用分子プローブの作製に成功した。有明海底泥ならびに広島湾海水からキートセロス・テヌイシマス計26株を分離し、25°C条件下におけるそれらのDNA/RNAウイルスに対する感受性試験を実施した。その結果、株により両ウイルスに対する感受性にバリエーションが存在することが明らかになった。珪藻キートセロスsp.に感染する新奇ウイルスSS08-C03Vを分離することに成功した。本ウイルスは粒径32nmの1本鎖RNAウイルスで、複製粒子は宿主細胞質内に蓄積されていた。主要構成タンパク質の組成は既知の珪藻RNAウイルスとは異なっていた。引き続き解析を実施することで、珪藻RNAウイルスに関して共通する新たな知見が集積されると思われる。本研究では、DNA/RNA両タイプのウイルスの共通宿主に対する感染・複製・優占化戦略を、珪藻とそれに感染する2種のウイルス(DNA/RNAウイルス)を材料としで比較・解明することを目的とした。珪藻とウイルスの挙動に関し、広島湾で定期モニタリングを行った。またDNA/RNAウイルス種を特定するための分子プローブの特異性を確認した。各プローブとも宿主ゲノムには反応せず、ターゲットウイルスのみを特異的に検出可能であることが明らかとなった。その系を用いて解析した結果、2010年に分離されたウイルスはいずれのプローブにも反応しなかった。この現象は再現性が高いことから、当該年に発生したウイルスはいずれの種にも該当しない新種である可能性が推察された。昨年度分離したキートセロス・テヌイシマス計26株を用い、15°C条件下におけるそれらのDNAIRNAウイルスに対する感受性試験を実施した。その結果、株により両ウイルスに対する感受性に差があることが明らかとなった。25°C条件下と比較した場合、15°C条件の方がウイルス感染の影響がより明確になる組合せがあることが確認された。またDNAウイルスに対するペプチド抗体の作製ならびに、RNAウイルス用抗体の精製を行った。昨年度分離に成功した新奇ウイルスSSO8-CO3Vについて、ゲノム配列の解読に成功した。ゲノム上のRNA依存性RNAポリメラーゼ領域を対象とした系統解析では、本ウイルスが珪藻感染性一本鎖RNAウイルス属のメンバーであることが明らかになった。さらに本課題遂行中、これまで明らかにされていなかった羽状目珪藻に感染するウイルスの存在を、世界で初めて証明することに成功した。この成果はインパクトファクター6.153の微生物生態学専門誌ISME Journalに掲載された。本研究では、DNA/RNA両タイプのウイルスの共通宿主に対する感染・複製・優占化戦略を、海産珪藻とそれに感染する2種のウイルス(DNA/RNAウイルス=CtenDNAV/CtenRNAV)を材料として比較・解明することを目的とした。過去に分離した上記と異なる新種と思われるDNA/RNAウイルスについて、基本的な性状解析を行った。その結果、ウイルスの形態や、宿主細胞内での増殖部位などは、それぞれ上記のウイルスと酷似していたものの、ゲノムの塩基配列が大きく異なることが明らかになった。具体的には新旧のウイルスのカプシドをコードする遺伝子が、アミノ酸配列の相同性で30%程度しか得られなかった。そのためいずれの場合も、新旧の両者が全く異なる種のウイルスであるものと推察された。RNAウイルス用抗体について、新たにペプチド抗体を作成し直した。ウイルスのカプシドのアミノ酸配列から、表面に露出すると予想される部位を抽出し、それについて抗体の作製を行った。その結果、本抗体はRNAウイルスのタンパク質に対する高い特異性が確認された。

水温20°C条件下において、異なる2株のChaetoceros tenuissimusのCtenDNAVならびにCtenRNAVの感受性を調査した。その結果、CtenDNAVはいずれの株も殺すが、CtenRNAVは片方の株しか殺せないことが明らかになった。これらの結果は、ノザン・サザン解析を用いた試験でも確認された。他の水温条件でのウイルス接種から死滅までの期間を顧慮すると、CtenDNAVは水温が高いほど宿主を早く殺し、CtenRNAVは水温が低いほど宿主を早く殺せる傾向があるものと推察された。これまでの現場観測と室内実験の結果を総合すると、本研究で扱ったDNA/RNAウイルスはお互いに同じ種類の宿主を複製のための工場として利用するが、両者は宿主争奪戦を展開するのではなく、宿主に対する異なる環境特異性を生かし、棲み分けをしている可能性が示唆された。本研究では、DNA/RNA両タイプのウイルスの共通宿主に対する感染・複製・優占化戦略を、珪藻とそれに感染する2種のウイルスを材料として比較・解明することを目的とした。キートセロス・テヌイシマスに感染するRNAウイルスならびにDNAウイルスをターゲットとしたプローブを用いて、2010年に分離したウイルスの種判別を行った。その結果、いずれのプローブもウイルスゲノムに反応を示さなかった。プローブを作製するために使用したウイルスが5年以上前に分離したものである点と分離場所が異なることから、今回アッセイしたウイルスゲノムの塩基配列とプローブの配列の相同性が低いことが起因していると推察された。そのため2010年に分離したウイルス全ゲノムの塩基配列解析を実施した。その結果、2010年に分離したいずれの核酸タイプのウイルスも、過去に分離したウイルスと種レベルで異なる可能性が推察された。ウイルス検出用の分子プローブは、DNA/RNAとも新たに作製し直し、改めてウイルス種判別を行ったところ、2010年に出現したウイルスは、宿主ブルームの前半にRNAウイルスが優占し、続いて後半にDNAウイルスが優占していた。RNAウイルスは宿主株2-10に対して、15°Cでは一週間以内に培養の崩壊が確認されたが、25°Cでは完全崩壊までに2週間以上を要した。また、宿主株2-6には、いずれの温度でもRNAウイルスの複製を許さないことがノザン解析により明らかとなった。今後、より多くの条件や宿主-ウイルスの組み合わせで解析を行い、理解を深めることが必要である。精製粒子を基にしたRNAウイルス用の抗体の特異性を高めるため、各種精製試験を行ったが、最終的に高度な種特異性は期待できないと判断された。そのため次年度にRNAウイルス用のペプチド抗体を作りなおす必要がある。一方、DNAウイルス用の抗体は高い特異性が確認された。現場調査を計画的に進めるとともに、出現したウイルスの分離保存に順次成功している。
乳癌患者の意思決定のプロセスを支える看護に関する研究

本研究は、様々な治療の選択肢をもつ乳癌患者の意思決定を支えるための看護援助を検討するために以下の目的で行った:1.乳がん患者が治療法を意思決定するまでの思考、行動様式を明らかにする。2.乳癌患者が意思決定の際に得ていた情報の内容、情報源などを明らかにする。3.乳癌患者の意思決定に影響を及ぼす要因と満足度との関係を明らかにする。対象は、初めて乳癌と診断され治療法を自ら決定した女性のうち、研究参加の承諾が得られた者とした。半構成的質問紙を用いた面接調査の結果、乳癌患者の意思決定には「情報収集」行動が関係しており、情報収集を行った患者は意思決定を主体的に行い、情報を持たない患者は決定を「おまかせ」する傾向が明らかとなった。また、乳癌患者は病院の専門性や設備、ケアの卓越性、および治療の効果、副作用とその対処などの情報を、家族、医療従事者、同病者、記録物を情報源として得ていることが明らかになった。さらに患者の意思決定のプロセスには、不安の程度やソーシャルサポートの大きさが影響を及ぼしていると考えられた。以上の結果を基に、意思決定役割、疾患・治療、患者の得た情報、ソーシャルサポート、不安および意思決定に対する満足度からなる質問紙調査を実施した。その結果、患者の満足度に影響を及ぼしていた要因は、意思決定役割、術式、配偶者以外の家族からのサポート、および情報量だった。また意思決定に役立っていた情報は、治療の選択肢や利点・欠点、病気の進行度や転移、および医療機関や医師の専門性などであった。以上から、乳癌患者の意思決定を支えるためには、意思決定に役立つ情報を術前から提供すると共に、配偶者以外の家族が患者をサポートできるよう働きかけていくことが重要であると考えられた。本研究は、手術内容を含めた自らの治療法を決定するまでの期間に、乳癌患者が行う意思決定に関する思考、行動様式を明らかにすることを目的として行った。研究対象は、初めて乳癌と診断され、病名告知後、治療法を自らの意思で決定した20歳以上の成人女性のうち、研究参加の承諾が得られた者とした。調査内容は、国内外の意思決定及び乳癌患者に関する文献を基に、患者の特性に関する情報、疾患に関する情報、病名告知に至る状況、治療法決定までに取った行動などとし、データ収集は、半構成的な質問紙を用いた面接、および記録調査により行った。分析は、研究参加の同意が得られた19名より得られた全資料を基に質的に行った。その結果、病院選択から受診に至る意思決定では、患者は普段から「乳癌罹患への恐れ」を抱いており、行動として「検診の習慣化」「病院についての情報収集」等を行っていた。手術療法に関する意思決定では、「仕方ない」「自分の判断が正しいか解らない」「治療への疑問・不安がある」ために、「医師に任せる」「友人の医療職にアドバイスをもらう」等の行動をとっていた。術後の補助療法に関する意思決定では、「副作用の心配・不安」「治療効果の心配・不安」等を抱いており、「情報収集」「医師に任せる」「自分の意思を押し通す」等の行動をとっていた。これらの思考・行動の結果として、乳癌患者は、治療法に対する情報不足への不満や将来への心配・不安などを抱き、自らの治療法を決定していることが明らかとなった。本研究は、乳がん患者が手術内容を含めた自らの治療法を決定するプロセスにおいて、病院選択、手術決定、補助療法決定の各時期に得た情報の内容、情報源、情報を得た(得なかった)方法およびその理由を明らかにすることを目的として行った。

研究対象は、初めて乳癌と診断され、病名告知後に治療法を自らの意思で決定した20歳以上の成人女性のうち、研究参加の承諾が得られた人とした。調査内容は、患者の特性に関する情報、疾患に関する情報、患者が情報収集のためにとった行動およびその時の思考・感情などとし、データ収集は、半構成的な質問紙を用いた面接、および記録調査により行った。分析は、研究参加の同意が得られた30名(平均年齢49.7歳)のデータから、意思決定と情報との関係についての記述を抽出し、質的に行った。その結果、病院選択の時期の意思決定では、主に家族を中心としたネットワークを用いて医師や看護婦、放射線技師、検査技師などの医療従事者からの情報や書物を基に、がん専門病院であるか否が、病院設備や術後のケアの卓越性、病理検査システム等についての情報を得ていた。手術決定に際しては、家族および医療従事者である知人および同病者を主たる情報源として、術式の長所と短所、癌の進行状況と術式選択、他患者の体験談等についての情報を得ていた。またこの時期は、医師に絶対的な信頼をおくことで全てを任せ、自分が情報を得ることによって生じる混乱・迷いを避けるために、あえて情報収集を行わないという行動をとる者が見られた。補助療法決定の時期では、主治医、医療従事者である知人、同病者、病院が作成した冊子、書物等を情報源として、治療効果、治療期間、治療方法、副作用とその対策についての情報を得ていることが明らかとなった。本研究は、乳癌患者が手術内容を含めた自らの治療法を決定するプロセスにおいて、意思決定に影響を及ぼす要因と患者の満足度との関係を明らかにし、主体的な意思決定を支える看護援助について検討することを目的とした。対象は、初めて乳癌と診断され、病名告知後に治療法を自らの意思で決定し、2001年1月以降に手術を受けた20歳以上の女性のうち、研究参加の承諾が得られた者とした。調査は、乳癌患者が治療法決定時にとった意思決定役割、個人的・社会的特性、疾患・治療、患者の得た情報、ソーシャル・サポート、不安、および意思決定に対する満足度からなる自己報告式の質問紙を作成、配布し、郵送法により回収した。分析対象は、有効回答の110名(78.0%)とした。分析には、x^2検定、t検定、一元分散分析を用いた。その結果、対象者の平均年齢は52.8±12.3歳で、乳房温存術の者が66名、乳房切除術の者が44名であった。患者の満足度に影響を及ぼしていた要因は、意思決定役割、術式、配偶者以外の家族からのソーシャル・サポート、および情報量であった(α=0.005)。また、患者の意思決定役割は、最終学歴と配偶者の有無の間で有意差がみられた。乳癌患者が主に用いていた情報源は、医師、病院パンフレット・医学関係雑誌、家族・知人であった。得ていた情報は、病気の進行度や転移、治療の選択肢や利点・欠点、治療の副作用、再発の可能性などで、自らの治療や疾患の進行・予後に関するものが多かった。また、意思決定に役立っていた情報は、治療の選択肢や利点・欠点、病気の進行度や転移、および医療機関や医師の専門性などであった。これらのことから、術前から意思決定に役立つ情報が得られるとともに、配偶者以外の家族が患者をサポートできるよう働きかけていくことが、複数の選択肢を持つ治療に取り組む乳癌患者の満足につながると考える。
植民地期インドにおける都市構造の変容に関する歴史地理学的研究

本年度は、1.研究成果とりまとめのため、これまでに収集した資料の判読及び入力をおこない、2.インドにおいて補足の資料収集及び現状調査をおこなった。主な資料名及び成果は以下のとおりである。1.資料BritishLibraryでの資料収集(昨年度入手済み、今年度は判読及び入力のみ)〔資料名〕2.調査3.成果・口頭発表本年度は、1.都市改良トラスト(City Improvement Trust Board, CITB)関連資料の収集(ロンドン、ボンベイ)と、2.イギリス都市計画・都市制度のインドへの移植に関する資料の収集を行った。主な資料名および成果は以下のとおりである。1.資料1897年のパレス火災以前、以後の都市計画図(5枚)2.成果ボンベイ都市改良トラストの資料(1-a.)には、ボンベイ市の都市整備の様子を示す地図及び行政資料が多く含まれる。断片的な資料ではあるが、ブロック単位の復原が可能となる。また、インドにおけるCITB設置の画期については、MUDAの資料によって、ボンベイの都市問題の切迫という事情のほか、マイソールパレスの火災という偶発的出来事も関連していたと言えるであろう。本年度は、本年度は、1.昨年度の研究成果の一部を口頭発表するとともに、2.既存収集資料を補足資料について、イギリスおよびインドにおいて調査を行った。1.資料ボンベイ、カルカッタのCITBに関する資料の判読、入力〔資料名〕・マイソールCITBに関する資料の閲覧、判読、入力・旧マイソール王侯国における都市制度に関する資料の閲覧、判読、入力2.成果・口頭発表木本浩一「1897年マイソール王宮の火災について-インドにおける都市「近代化」モデルへの道-」第47回歴史地理学会(於:島根県民会館、2004年7月3日)本年度は、1.研究成果とりまとめのため、これまでに収集した資料の判読及び入力をおこない、2.インドにおいて補足の資料収集及び現状調査をおこなった。1.資料BritishLibraryでの資料収集(昨年度入手済み、今年度は判読及び入力のみ)〔資料名〕2.調査3.成果・口頭発表
海馬亜鉛による学習・記憶の調節と障害

亜鉛シグナルはカルシウムチャネルなどを介してカルシウムシグナルとクロストークし、シナプス神経伝達に関与する。記憶の細胞レベルでのメカニズムの一つと考えられている長期増強(long-term potentiation: LTP)は海馬三シナプスにおいて亜鉛イオンにより多様に調節される。さらに、海馬依存性の物体・空間認識記憶に海馬シナプス亜鉛イオンが関与する。しかし、ストレスなどによりシナプス亜鉛イオンのホメオスタシスが崩壊すると記憶障害が惹起される。以上、本研究では海馬シナプス亜鉛イオンが記憶の獲得と障害に関与することを明らかにした。生体にストレスが負荷されると、視床下部-下垂体-副腎皮質(HPA)系機能が活性化され、副腎皮質からのグルココルチコイド分泌が増加する。HPA系機能は老化に伴い亢進するが、HPA系機能亢進とうつ病・認知症の症状あるいは海馬萎縮との間に相関性があることが知られている。ストレスはうつ病に加え認知症の増悪に関与すると指摘されており、高齢者の高罹患率にはストレスに対する脆弱性が関与するものと考えられる。老化による脳機能低下・障害ならびに行動変化は亜鉛欠乏食飼育時といくつか共通する現象がある。亜鉛は脳機能に不可欠な微量金属である。亜鉛欠乏食をマウス、ラットに与えると、血清グルココルチコイドレベルが上昇する。この上昇はシナプス亜鉛レベルが減少する前に観察される。血清グルココルチコイドレベルの上昇がストレス感受性を高め、うつ様行動などの精神症状様行動と関係する可能性がある。本研究では、亜鉛欠乏食ラットのうつ様行動にはシナプス亜鉛レベルの減少よりグルココルチコイド分泌増加を介した脳機能変化が関与していることが示唆された。加齢に伴いシナプス亜鉛レベルが減少する可能性があるが、老齢時のストレス脆弱性にはHPA系機能亢進が大きく関与していると考えられる。一方、シナプス亜鉛レベルが一過性に顕著に減少すると、記憶の細胞レベルでのメカニズムの一つと考えられている長期増強(LTP)は海馬で減弱し、海馬依存性の記憶が障害された。また、扁桃体は恐怖記憶と密接に関係するが、恐怖記憶の獲得と想起時にシナプス亜鉛をキレート化すると、恐怖記憶の想起時に竦み行動が増加した。シナプス亜鉛は海馬依存性の記憶とともに、扁桃体依存性の記憶にも関与すると考えられる。亜鉛は脳機能に不可欠であり、亜鉛イオンとして機能するものが神経細胞のシナプス小胞内に高濃度で存在する(約300μMとの報告があるが、その化学形態は不明)。亜鉛イオンは神経活動に伴いシナプス間隙に放出され、ダイナミックに脳機能を調節する。この神経はグルタミン酸作動性神経のサブタイプで亜鉛作動性神経とも呼ばれている。亜鉛作動性神経は学習・記憶ならびに精神活動に重要な役割を担うと考えられるが、その役割は十分には明らかにされていない。学習記憶を司る海馬では、貫通線維シナプス、苔状線維シナプス、シャーファー側枝シナプスの三シナプスで情報が処理されるが、いずれも亜鉛作動性神経を含む。苔状線維はすべて亜鉛作動性である。亜鉛作動性神経終末からグルタミン酸とともに放出される亜鉛イオンは、グルタミン酸受容体活性化により、カルシウムチャネルを介してカルシウムイオンとともに速やかにシナプス前神経とシナプス後神経に取込まれる。亜鉛シグナルはカルシウムチャネルなどを介してカルシウムシグナルとクロストークし、シナプス神経伝達に関与することを示した。そして、記憶の細胞レベルでのメカニズムの一つと考えられている長期増強(long-term potentiation:LTP)は、海馬三シナプスにおいて亜鉛イオンにより多様に調節されることを示した。さらに、海馬依存性の物体・空間認識記憶に海馬シナプス亜鉛イオンが関与することを示した。しかし、シナプス亜鉛イオンのホメオスタシスがストレスなどにより崩壊すると、LTPが減弱し、記憶障害が惹起されることを示した。亜鉛は脳機能に不可欠であり、亜鉛イオンとして機能するものが神経細胞のシナプス小胞内に高濃度で存在する(約300 μMとの報告があるが、その化学形態は不明)。亜鉛作動性神経終末からグルタミン酸とともに放出される亜鉛イオンは、グルタミン酸受容体活性化により、カルシウムチャネルを介してカルシウムイオンとともに速やかにシナプス前神経とシナプス後神経に取込まれ、記憶に関与することを示してきた。一方、海馬はストレス応答にも関与する。ストレスは副腎からのグルココルチコイド分泌を増加させ、学習記憶を障害する。

ストレスによる学習記憶の低下の一因としてグルココルチコイドを介したグルタミン酸作動性神経の活動亢進が考えられるが、シナプス亜鉛イオンの関与は明らかでない。本研究では、コルチコステロンは海馬CA1神経細胞を興奮させ、細胞内外で亜鉛イオンレベルを増加させ、記憶の分子基盤の一つと考えられている長期増強(LTP)を障害することを示した。さらに、高カリウム誘発過剰興奮モデルを用い、学習記憶障害に対するシナプス亜鉛シグナル過多の関与を検討したところ、海馬CA1錐体細胞において亜鉛イオンレベルが過剰に増加すると一過性に物体認識記憶が障害されることが示された。海馬歯状回において、シナプス亜鉛イオンが一過性に減少すると、記憶の獲得・想起が障害されるばかりか、獲得した記憶の想起が障害されることも明らかとなり(投稿論文作成中)、順調に進んでいる。24年度が最終年度であるため、記入しない。記憶の獲得・想起におけるシナプス亜鉛イオンの分子レベルでの作用メカニズムを、覚醒下での長期増強.(LTP)の発現と維持を指標、リアルタイムで学習・記憶と関連させて解析する。
教師教育における「アート」教材の意義－「場」と「仕掛け」－を重視する教材の有効性

本研究では、教師教育のための「アート教材」を開発し、その評価方法についても検討した。特に、教師の「からだ」に着目し、その実践知を支える即興的な対応力を育てることをねらいとした。一方で、津村禮次郎氏(能楽師)、山海塾の蝉丸氏(舞踏家)、遠藤卓郎氏(ボディワーク・気)を招聘し、ワークショップを行い、「からだ」の学びや気づきについて検討した。本年度は、前年度に蒐集した身体論関係・教師教育関係・芸術学関係の文献資料の購読会を行うとともに、本研究で開発を目指す「アート教材」の捉え方についての研究討議を行ってきた。また、前年度「人間科学と教材開発」の授業で実施した「教材」の有効性を検証するとともに、その改善と新たな「アート教材」の開発を試みた。残念ながら、大学の授業実施の関係で、本年度は授業が開講されず、来年度の開講(隔年開講)となったことから、開発された教材の実施は来年度以降に見送ることとなった。しかしながら、昨年度の能楽のワークショップにつづき、本年度は舞踏のグループ「山海塾」より蟬丸氏を講師として招聘し、「何がからだを動かすのか?」と題して、ワークショップとディスカッションを行うことができた。大学院生約20名、本学教員5名が参加し、舞踏の身体技法を体験することを通して、教師のからだに着目することの重要性を再確認することができた。「舞踏」のワークショップの体験を共有した上でのディスカッションは、身体と床の関係、自己と他者の関係を、「場」や「仕掛け」といったキーワードから捉え直す試みとなった。本年度は,年間を通じて,全員で,身体論関係・教師教育関係・芸術学関係の文献資料を蒐集し,その内容の検討を行ってきた。さらに,後期の大学院共通科目授業「人間科学と教材研究」(担当:阿部,大橋,玉村)及び教職大学院「身体教育学演習」(担当:加藤,大橋)の授業において「場」と「仕掛け」を重視した「アート」教育の授業を展開し,受講者のレポートをもとに授業の振り返りを行った。それぞれの授業の記録と受講生のレポートにおける記述を質的に分析し,教材の有効性を検討した。これまでの検討では有効性が認められるものの,さらに詳細な分析を行いながら,来年度の研究に向けての問題について検討を加えた。また,平成25年2月4日(月)午前・午後に,シテ方観世流能楽師津村禮次郎を講師に招き,日本伝統音楽(能楽)の歴史と表現の基礎についての解説と身体を使ってのワークショップを開催することができた。大学院生約20名が参加し,能楽の表現法を体験することを通して,教師のからだに着目した「アート」教材の一つの試みを体験することができたといえる。このような日本の伝統芸能における身体と空間の有り様を例として,「場」と「仕掛け」との関係を考え,「アート」教材を開発していくことで,新しい教材の可能性が見えてきたと考える。本年度は、一昨年および昨年度に開発、改善した「教材」を「人間科学と教材開発」の授業で実施した。それぞれの「教材」について、受講者のレポートを対象として、その有効性を質的に検証した。一方、一昨年度の能楽師津村禮次郎氏、昨年度の山海蝉丸氏(蝉は正しくは虫へんに口二つ)に続き、教師の身体論に造詣の深い筑波大学名誉教授遠藤卓郎氏を講師として招聘した。受講者のからだの気づきを促す様々な仕掛けの事例についてのワークショップの実施ならびに評価システムへの専門的な指導・助言がなされた。これらの実施をふまえて、これまで考案、試行してきたアート教材の有効性の質的検討に加えて、教材の評価の指標と内容について研究討議を行った。その結果、アート教材の評価について新たな項目が設定できた。身体教育体育哲学教材の開発、ワークショップの開催といった点では、おおむね研究計画どおりに進展していると判断したので。尚、今年度は授業の実施は叶わなかったが、その分、研究討議及び新しい教材開発に時間をかけることができた。当初の研究実施予定に基づき,研究を実施しており,おおむね順調に進展していると考えられるが,授業分析やレポートの分析などで検討すべき内容がでてきたために,現時点で完全な達成度とはいえないと判断した。来年度は、今年度開発した教材を実施してその有効性を検証するとともに、その成果の発表を目指していく。また引き続き、「からだ」にかかわる「アート」についてのワークショップの開催を企画し、本学の大学院生及び教員の体験の場を設定する。昨年度実施した「人間科学と教材研究」・「身体教育学演習」の教材について,有効性の検討をもとに,新たな教材案を計画する。また,授業についての振り返りをもとに,今年度の授業計画をたてる。並行して,国内外での授業例,活用できる教材などの資料を蒐集し,それらをもとに教材案を作成する。作成した教材案をもとに,授業を実施し,授業や受講者のレポートを分析する。本年度は、予定した授業が開講されなかったことから、教材は開発したものの、教材を使用個数分作成する必要がなくなったため。

今年度実施予定であった教材を来年度合わせて作成することから、その際に使用する予定である。教材作成のための経費や文献の購入費用,国内外における授業実践や活用できる教材資料の蒐集に使う旅費,その他記録媒体などの消耗品費用が必要となる。また,ワークショップやシンポジウム開催にむけて,講師の謝金などにも使用する予定である。
新しい動物モデルを用いた心サルコイドーシスの画期的な早期診断法の開発

心臓サルコイドーシス(心サ症)の病態機序解明と新しい診断治療法の開発のためにマウスモデルの作成を試みた。アポE欠損マウスにコール酸含有高脂肪食を負荷すると冠動脈内にマクロファージの集簇と血管周囲へのマクロファージの遊走・繊維化を認めた。本モデルはマクロファージの活性化とそれに引き続く心筋の血管周囲の繊維化を引き起こす。マクロファージが主体である点が心サ症と共通している。マクロファージが主体となる炎症病変では糖の取り込みが著明となるが正常心筋細胞も糖を利用するため診断にはこれを抑制する必要がある。心サ症の活動性病変評価には18時間以上の絶食によるFDG PETが良い。サルコイドーシス(サ症)は全身性疾患であり、一般に比較的予後良好であるが、ひとたび心臓に病変が及べば予後不良となる。早期に診断しステロイドを使用すれば予後は改善されるので早期診断がきわめて重要である。サ症の原因はアクネ菌感染による過敏性免疫反応が示唆されているが不明の点も多く、動物モデルは病因解明や早期の診断法開発に有用と考えられる。近年、肺サ症のマウスモデルが報告されたが、このモデルにおける心サ症の検討はなされていない。本研究の目的は肺サ症マウスから心サ症のマウスモデルを確立し、このマウスを用いて病態および早期診断法の可能性を探ることであった。3年計画の1年目は、肺サ症マウスモデルの確立と心サ症モデルの可能性を探ることであった。アポE欠損マウス(ApoE-/-)にコール酸含有高脂肪食(HFCD)を16週間与えるとその40%に肺サ症を発症するという報告の再現性を検討したが、10%程度に肺門リンパ節に肥大したマクロファージの集簇を認めたにすぎなかった。原因と考えられているアクネ菌が肺に存在する可能性が低いために、モデルの作成確率が低かった可能性が考えられた。2年目はこれを解決するためにアクネ菌をApoE-/-HFCDマウスの気道内に直接注入する肺サ症マウスモデルを作成解析した。このモデルでは肺病変はほぼ100%に認められた。しかし、心病変としては血管周囲の線維化や血管内に肥大したマクロファージの集簇を認めたが、ヒトのgranulomaとは明らかに異なる病理所見であった。ごく最近、マウスはヒトの炎症反応とは異なることが報告されたため、マウスにヒトで認められるgranulomaを期待するのではなく原因菌と考えられているアクネ菌の肺、心、血液の存在をPCR法により検討した。驚くべきことに肺だけではなく心にもアクネ菌が常在菌として存在する可能性が現在のところ示唆されている。サルコイドーシス(サ症)は全身性疾患であり、一般に心病変の合併がなければ比較的予後良好である。しかし、心サ症は診断が困難でありかつ治療が遅れれば予後不良となる。早期に診断し、早期にステロイドを使用すれば予後は改善されるため早期診断がきわめて重要である。サ症の原因はアクネ菌感染による過敏性免疫反応が示唆されているが不明の点も多く、動物モデルの確立は病因解明や早期の診断法開発に有用と考えられる。本研究においては心サ症のマウスモデルを確立し、このマウスを用いて画期的な早期診断法を開発することであった。アポE欠損マウスにコール酸含有高脂肪食を16週間負荷すると、肺にマクロファージの集簇を斑状に認める。この病変はサ症の肉芽腫に類似している。心筋には冠動脈内のマクロファージの集簇、血管外へのマクロファージの遊走、血管周囲の線維化を認めた。しかし、リンパ球の集積は認められず、マクロファージを主体とした心筋炎の動物モデルの可能性が示唆された。さらにアクネ菌(死菌)を経鼻的に投与した場合、炎症病変の変化は認められなかったため、このモデルでは、コール酸含有高脂肪食負荷の方が炎症病変形成の強い要因である可能性が考えられた。ヒトにおける心サ症は早期にはマクロファージの集簇とその周囲のリンパ球の浸潤を認める。その後、マクロファージの一部が上皮細胞様に変化し(類上皮細胞)肉芽腫を形成する。従って病変の中心はマクロファージであり、活性化したマクロファージでは糖代謝が活発である。一方、マクロファージをはじめとする炎症性細胞の浸潤により心筋細胞は障害を受け、障害心筋は脂肪酸よりも糖を利用する。正常心筋は18時間以上の絶食により糖よりも脂肪酸を利用するため、18時間以上の絶食を前処置としたF-18 FDG PET検査がサルコイドーシスによる炎症病変をとらえる事が示された。心サ症の活動性

病変評価には18時間以上の絶食によるFDG PETが良い。サルコイドーシス(サ症)は全身性疾患であり、一般に心病変の合併がなければ比較的予後良好である。しかし、心サ症は診断が困難でありかつ治療が遅れれば予後不良となる。早期に診断し、早期にステロイドを使用すれば予後は改善されるため早期診断がきわめて重要である。サ症の原因はアクネ菌感染による過敏性免疫反応が示唆されているが不明の点も多く、動物モデルの確立は病因解明や早期の診断法開発に有用である。近年、肺サ症のマウスモデルが報告されたが、このモデルにおける心サ症の検討はなされていない。本研究の目的は肺サ症マウスから心サ症のマウスモデルを確立し、このマウスを用いて病態および早期診断法の可能性を探ることであった。3年計画の1年目は、肺サ症マウスモデルの確立と心サ症モデルの可能性を探ることであった。アポE欠損マウス(ApoE-/-)にコール酸含有高脂肪食(HFCD)を16週間与えるとその40%に肺サ症を発症するという報告があるため、まずはこのモデルの再現性を検討した。我々の検討では10%程度に肺門リンパ節にgranuloma形成を認めたにすぎなかった。granuloma形成の再現性はマウスのstrainにも依存すると思われるが、ApoE-/-HFCDモデルではそれほど高率には肺サ症は発症せず、モデルとしては改善の余地がある。原因と考えられているアクネ菌が肺に存在する可能性が低いために、モデルの作成確率が低い可能性がある。これを解決するためにアクネ菌をApoE-/-HFCDマウスの気道内に直接注入する肺サ症マウスモデルを現在、作成解析中である。これに基づきアクネ菌を直接心筋に注入するモデルを計画する。アポE欠損マウス(ApoE-/-)にコール酸含有高脂肪食(HFCD)を16週間投与し、かつ経鼻からヒトアクネ菌(死菌)を投与することにより肺および心に肥大したマクロファージの集簇を認めるモデルを作成可能であった。マクロファージの集簇をgranulomaとすれば、サルコイドーシスのモデルマウス作成はほぼ完全に達成された。しかし、マクロファージの集簇のみではヒトでみられる非乾酪性のgranulomaとはいえない。ごく最近マウスの炎症反応はヒトと異なることが報告され、ヒトと同じ病理像を期待することが適切でないのではという疑問が提出されている。そこでマウスではマクロファージの集簇をもってgranulomaとし、現在注目されている病態としてのアクネ菌との関係を詳細に検討することが、病態解明および治療への近道と判断された。アクネ菌のプライマーセットを数種類用いたPCR実験より、マウスではアクネ菌は肺および心臓に常在菌としてある確率で存在する可能性が出てきた。しかも経鼻投与したアクネ菌(ヒトから抽出した死菌)までも心臓に存在する可能性がでてきた。現在その経路などの病態を検討中である。マウスの病態がそのままヒトに適合するかどうかは不明であるため、ヒトの肺および心の組織でも剖検標本において検討を予定している。研究計画では1年目では肺サルコイドーシスの動物モデルの確立であった。アポE欠損マウス(ApoE-/-)にコール酸含有高脂肪食(HFCD)を16週間与えたモデル(ApoE-/-HFCD)では10-40%の確率で肺サルコイドーシスを作成できることが判明した。肺サ症モデル作成を1年目の目標としていたのでほぼ目標は達成されたと思われる。
消化器癌の転移におけるCDK阻害蛋白質P27^<kipl>の役割

[研究目的]本研究では、Skp2の高発現およびp27^<Kip1>の分解亢進と消化器腫瘍の癌形質の悪性度増強の因果関係を実験的に証明するとともに、消化器癌の予後に影響を及ぼす因子を明らかにすることをめざす。[方法と結果]予後不良の癌ではCDK阻害タンパクp27^<Kip1>の分解が亢進していることが報告されているが、さらに我々は肺癌でp27^<Kip1>のユビキチンリガーゼSkp2とCks1の発現が有意に高いことを見いだした。加えてCks1の細胞内存在量はユビキチン-プロテアソーム系によって制御されていることを見出した。今後、Cks1の分解低下が消化器癌におけるCks1の高発現の原因となっているか、予後との相関はどうかを検討する予定である。一方でこれらの分子の高発現およびp27^<Kip1>の分解亢進がおこると、何故予後不良の癌形質が形成されるのかはなお不明であり、本研究ではさらにそれを明らかにすることを目標とした。我々が作成したSkp2高発現ヒト大腸癌細胞(HCT-Skp2)、p27^<Kip1>-ヘテロノックアウトヒト大腸癌(HCT-p27hKO)細胞はどちらもp27^<Kip1>タンパク質の存在量が有意に低下していた。それらの培養細胞としての増殖速度は親株と変化がないが、マトリゲル浸潤能はHCT-Skp2が有意に高かった。ヌードマウスでの移植実験ではHCT-Skp2、HCT-p27hKOの順に親株に比べて高い増腫瘍性を示し、さらに血管新生の亢進もみられた。以上の様に本研究からp27^<Kip1>の分解亢進が大腸癌の悪性化の一つの原因になることが実験的に示された。p27^<kip1>のユビキチンリガーゼSkp2を導入してp27^<kip1>の分解を亢進させたヒト大腸癌を作製し,ウエスタンブロット法ににてSkp2の発現とp27^<kip1>の低下を解析し,Skp2高発現細胞を既に樹立した.これはp27^<kip1>ノックアウト癌細胞樹立に先だって,Skp2過剰発現にてp27^<kip1>発現低下させた細胞をもちいてin vivoにおける実験を先行させた.in vivoにおけるp27^<kip1>発現低下ヒトがん細胞の転移能の検討BALB/Cヌードマウス脾注肝転移モデルを用いて,Skp2高発現細胞p27^<kip1>発現低下ヒトがん細胞の転移能の検討を行った.本モデルでは,着床後の転移巣形成および腫瘍増殖に関するp27^<kip1>の関与を評価した.Skp2過剰発現細胞(HCT/Skp2 cell)とHCT wild type cellを1×10^6個をBALB/Cヌードマウスへの脾臓へ注入し3分後に脾臓摘出.40日後に犠死し肝転移を評価した.1匹あたりの転移個数ではHCT/Skp2 cellでは0.917±1.51個でHCT wild type cellは1.727±2.24でp=0.5で有意差を認めなかったが肝重量ではHCT/Skp2 cellは1.944±0.22でHCT wild type cellは1.1125±±0.33,P=0.0267と有意差を認めSkp2を過剰発現させた細胞の転移能の亢進が示唆された.

しかし血管新生については明らかな差を認めなかった.in vivoにおけるp27^<kip1>発現低下ヒトがん細胞の腫瘍増殖能の検討これらの細胞を皮下に注入し,皮下腫瘍を作製し,p27^<kip1>発現低下における腫瘍増殖能の検討を行った.同様にSkp2過剰発現細胞(HCT/Skp2 cell)とHCT wild type cellを1×10^6個をBALB/Cヌードマウス皮下へ注入し皮下腫瘍作製し評価した.Skp2過剰発現細胞での腫瘍は皮下腫瘍重量(P=0.042)及び体積(P=0.019)ともに有意に増大しており増殖能の亢進が示された.また,Skp2過剰発現細胞での腫瘍は増殖能の亢進(PCNAで評価)ともにapoptosis(TUNEL法での評価)も亢進していた.悪性度の増強をもたらすp27^<kip1>の下流遺伝子の検索上記のSkp2過剰発現細胞(HCT/Skp2 cell)とHCT wild type cellマイクロアレイ(受託)およびサブトラクション法を用いて発現量の変動した遺伝子の同定を行った.そのなかでCYP24,metallothioncon E等の候補が上がった.CYP24は皮下腫瘍の大きさが小さいほどその発現が大きい傾向を認め、候補の1つと考えられる.その他の遺伝子については現在検索中である.p27^<kip1>ノックアウトヒトがん細胞の増殖,転移能の検討現在p27^<kip1>ノックアウトはヘテロノックアウトが作製され同様にin vivoでの評価を行ったが,p27^<kip1>ノックアウトヒト大腸癌細胞での皮下腫瘍はwild typeより増大傾向をもみとめたが有意な差を認めなかった.現在ホモでのp27^<kip1>ノックアウト作製中である.[研究目的]本研究では、Skp2の高発現およびp27^<Kip1>の分解亢進と消化器腫瘍の癌形質の悪性度増強の因果関係を実験的に証明するとともに、消化器癌の予後に影響を及ぼす因子を明らかにすることを目指す。[方法と結果]予後不良の癌ではCDK阻害タンパクp27^<Kip1>の分解が亢進している。さらに我々はヒト癌検体でp27^<Kip1>のユビキチンリガーゼSkp2とCks1の発現が有意に高いことを見いだした(Inui et al. 2003)。加えてCks1の細胞内存在量はユビキチン-プロテアソーム系によって制御されていることを証明した(Hattori et al. 2003)。今後は、Cks1の分解低下が消化器癌で起こっているか、そしてそれが予後と相関するかを検討する。一方でこれらの分子の高発現およびp27^<Kip1>の分解亢進が起こると、何故予後不良の癌形質が形成されるのかはなお不明であり、本研究ではさらにそれを明らかにすることを目標とした。我々が作成したSkp2高発現ヒト大腸癌細胞(HCT-Skp2)、p27^<Kip1>-ヘテロノックアウトヒト大腸癌(HCT-p27hKO)細胞はどちらもp27^<Kip1>タンパク質の存在量が有意に低下していた。それらの培養細胞としての増殖速度は親株と変化がないが、マトリゲルを用いた浸潤能アッセイではHCT-Skp2が有意に浸潤能が高いことがわかった。ヌードマウスへの移植実験ではHCT-Skp2、HCT-p27hKOの順に親株に比べて高い増腫瘍性を示し、さらに血管新生の亢進も見られた。
アンドロゲンによる造血・血管発生機構の解明

メダカ受精卵に生理的濃度のアンドロゲンが含まれており、アンドロゲン受容体を介したシグナルが、初期胚の赤血球、卵黄静脈の分化に重要な役割を果たすことが明らかとなった。アンドロゲンが作用するのは中胚葉からの血液血管内皮細胞前駆細胞分化段階であり、アンドロゲン受容細胞の細胞分化系譜解析により、アンドロゲン受容細胞が、細胞自律的に血球血管系細胞に分化することを示す先駆的知見を得た。さらに遺伝子発現解析からWnt, Bmpシグナル経路の複数の因子がアンドロゲンの制御を受けるエフェクター因子として機能することが明らかとなった。本研究は、1)アンドロゲン受容(AR)遺伝子機能阻害により生じるメダカ個体レベルの表現型を分子レベルからアプローチする。2)アンドロゲン応答細胞の分化系譜解析により、"Androgenによる生命機能に必須の発生現象"について、分子生物学的基盤を明らかにするものである。昨年度の解析から明らかとなったAndrogen下流標的候補遺伝子群のmRNAを合成し、ARβMorpholinooligo(MO)とともにメダカ受精卵に導入し、ARβ機能阻害胚の表現型回復実験を行った。ARβ機能阻害胚で顕著に発現減少したLmo2 (血液血管内皮細胞前駆細胞分化に必須の因子) mRNAを導入すると、ARβMO導入胚で見られる赤血球減少・血管走行異常が、顕著に回復した。また、Dominant-negative AR(DN-AR)の発現をHeat shock誘導するメダカを用いて、初期胚期のアンドロゲン応答期を解析した。体節形成期までの一次造血開始過程でDN-ARを発現させると、ARβMO導入胚と同様の赤血球減少・血管走行異常が誘導された。一方で、一次造血が既に開始しているst.22以降からDN-ARを発現させても異常は認められなかった。以上の結果から、メダカ初期胚中胚葉細胞からの血液血管前駆細胞分化過程にAndrogenが重要な役割を果たすことが明確となった。昨年度のARノックアウトマウス(KO)を用いた造血表現型解析から、11週齢マウスでは血液細胞分化に顕著な異常は認められなかった。しかし、ヒト更年期障害から、老齢期の造血・血液幹細胞維持機構にアンドロゲンが関与する可能性が考えられたので、老齢化AR遺伝子KOマウスにおける骨髄、胸腺、脾臓における血液幹細胞画分のFACS解析を行った。しかし、顕著な異常は認められず、哺乳類ではAndrogenは造血に必須の役割を果たしていないと考えられた。母体由来の内分泌ホルモンは、初期胚発生や胚の内分泌器官が機能開始するまでのホメオスタシス維持に貢献していると考えられている。しかし、具体的な作用メカニズムの多くは不明である。本研究では、メダカ受精卵に下流遺伝子を活性化するに十分量のアンドロゲン(11KT)を検出し、アンドロゲン受容体(AR)遺伝子機能阻害により生じるメダカ個体レベルの表現型解析を行った。ARに対するMorpholino oligo (MO)導入胚では、赤血球減少・血管走行異常が認められた。マイクロアレイ解析、アンドロゲン標的候補遺伝子群のmRNA注入実験により、AR機能阻害胚では、Bmpシグナルの活性化、Wntシグナルの抑制により、血液血管内皮細胞前駆細胞分化因子の発現が抑制されている可能性が示された。また、Dominant-negative AR (DN-AR)の発現をHeat shock誘導し、初期胚期のアンドロゲン応答期を解析した結果、原腸胚期から初期胚一次造血開始過程でDN-ARを発現させると、AR MO導入胚と同様の表現型が誘導された。さらにアンドロゲン応答細胞の分化系譜解析から、血管内皮細胞および血液細胞にアンドロゲン応答性の細胞を検出した。メダカTilling libraryからAR変異体を複数系統単離し、表現型解析を行った結果、母性由来のAR mRNAが初期胚発生に寄与していることを示す結果を得た。新たに単離に成功したナンセンス変異系統、TALEN法によるAR変異体を用いた解析を進めている。以上の結果から、これまで性分化因子として知られていたアンドロゲンが、メダカ初期胚血液血管前駆細胞分化に重要な役割を果たすことが明らかとなった。一方で、二次性徴発現過程との比較解析からWnt, Bmpシグナルのアンドロゲン応答性下流エフェクター因子としての重要性を明らかとした。本研究は、1)アンドロゲン受容体(AR)遺伝子機能阻害により生じるメダカ個体レベルの表現型を分子レベルからアプローチする。ARの機能阻害により、尾部側血島PLMからの血液血管内皮前駆細胞の分化にARシグナリングが貢献していると予想し、メダカ初期胚アンドロゲン応答細胞の造血・血管発生における分化系譜解析を行った。

具体的には、アンドロゲン応答配列により、アンドロゲン受容細胞をmCherry陽性細胞として可視化するレポーター遺伝子を血管内皮細胞、赤血球をGFP陽性細胞として検出できるFlk-GFP, GATA1-GFPトランスジェニックメダカに導入し、アンドロゲン応答細胞の分化系譜を解析した。その結果、卵黄静脈血管内皮細胞および赤血球において、アンドロゲン応答細胞を検出した。哺乳類において、血管内皮細胞やHSCにARが発現しているとの知見があるが、その役割の詳細はわかっていない。本知見は、ARシグナリングが細胞自律的に中胚葉細胞から赤血球・血管内皮細胞に分化している可能性を示す先駆的知見である。さらに、AR標的遺伝子の網羅的解析として、ARβMO導入胚とControl MO導入胚間のマイクロアレイ解析を行った。ARβMO導入胚では血液血管内皮前駆細胞で発現するFli, Tal1、および赤血球分化マーカーGATA1、αーglobinの発現低下、Bmp4、Bmp7、Dkk1の発現上昇、Wnt5aの発現低下が認められ、ARβMO導入胚では、Bmpシグナリングが活性化、Wntシグナルが抑制されている可能性が考えられた。Androgenはこうした増殖因子群の発現制御を介して初期胚期における造血・血管発生を制御している可能性が考えられた。マイクロアレイ解析より、候補となったAR標的遺伝子のmRNA導入による機能解析から、血液分化に必須の因子がAndrogenシグナルの下流に存在していることが明らかとなるなど、一次造血過程におけるARとAR下流因子との関連性が明らかとなった。一方で、AR MO導入は一過的な発現抑制であり、off-targetな効果を除外できない。既に、AR MO導入個体にAR mRNAを導入することで初期胚期の表現型が回復することを確認したが、AR tilling mutant, TALENによるAR遺伝子ノックアウト個体と表現型の比較解析が必要である。平成24年度AR tilling mutant missense系統のバッククロスを完了した。さらに、nonsense変異系統を単離することに成功した。さらにTALENによるAR遺伝子ノックアウト個体の作出を行っている。AR標的遺伝子候補の内、ARの直接的制御を受ける因子をChIP assayにより同定するために、Heat shock誘導によりARをGFPとの融合タンパク質として発現するメダカ系統を樹立したが、強制発現系では擬陽性を拾う。よって、新たにBAC cloneを用いて,ARをGFPとの融合タンパク質として発現するメダカ系統を作出する必要性が生じた。既にBAC constructを得ており、樹立に向けて導入を開始している。このように、目標達成にむけて新たに必要となったリソースについて既に準備ができており、本年度、ARと標的遺伝子との関連性が明らかになると思われる。AR遺伝子ノックアウトマウスを用いた解析を完了し、少なくとも哺乳類においては、Androgenが造血に必須の役割を果たしてないことが明らかとなった。造血発生の機構には種差があり、魚類と哺乳類では大きく異なることが予想された。