hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＲＣＣ１様タンパク質を中心とするミトコンドリア核様体分裂の分子制御機構の解明

また、長期にわたってpmn67を発現抑制した場合に、ミトコンドリア膜に局在するATPシンターゼの発現減少、およびミトコンドリア核様体に局在するトポイソメラーゼの発現増加がみられることが質量分析などを用いた解析により明らかになった。さらに、DNaseを用いた解析より、pmn67がDNA結合能を持つことが示唆され、pmn67がミトコンドリア膜と核様体の相互作用にかかわっていることが予想された。また、ヒトのミトコンドリア局在型RCC1様タンパク質を同定し、RNAiを用いた発現抑制解析により、ヒトにおいてもミトコンドリア核様体の分配にかかわっている可能性が示唆された。平成24年度に計画していたpmn67と相互作用する低分子量GTPaseの同定および、その機能解析については、現在、酵母Two-hybrid法の準備を行っているところであり、完了していない。しかし、平成25年度に予定していたpmn67の普遍性に関する解析に関してはミトコンドリア局在型ヒトホモログを同定し、その機能解析を進めることができたため、おおむね順調に進展していると考えられる。平成23年度に計画していたミトコンドリア核様体分裂過程におけるpmn67の局在解析については、作成した抗体が細胞染色に適していなかったために、現在、再度抗体作成を行っているところである。しかし、電子顕微鏡観察やDNaseを用いた解析により、当初計画していたミトコンドリア膜やDNAとの相互作用との関連については、新規知見を得ることができた。また、平成24年度以降に計画していたpmn67の普遍性に関する解析において、ヒト培養細胞を用いた解析を開始し、ミトコンドリア局在型のRCC1様タンパク質が普遍的にミトコンドリア核様体の不等分裂に関与している可能性が示唆された。pmn67と相互作用する低分子量GTPaseを同定するために、単離ミトコンドリア核様体のプロテオミクス解析による3種類の低分子量GTPaseを候補とし、pmn67がそれぞれのGTPase(GDP固定型変異をいれて不活性型にしたもの)に結合するか酵母Two-hybrid法を用いて調べる。さらに、ミトコンドリアのプロテオミクス解析も行い、低分子量GTPase候補をさらに同定し、同様の解析を行う。候補GTPaseに関しては、大腸菌で発現・精製し、GTPaseに対するグアニンヌクレオチド交換因子活性をもつかどうかをin virtoアッセイ系でかめ確る。さらに、候補GTPaseに関してモルフォリノアンチセンスオリゴを用いた遺伝子抑制解析を行い、ミトコンドリア核様体分裂の制御機構に関与するGTPaseを同定し、その機能解析、および標的タンパク質の同定を行う。さらに、hmtRCC1の機能解析も勧め、pmn67の普遍性を明らかにする。pmn67は、保存性の高いRCC1様ドメインをもつことから、低分子量GTPaseを活性型(GTP結合型)にするグアニンヌクレオチド交換因子であると考えられる。そこで、pmn67のターゲットとなる低分子GTPaseを同定するために以下の解析を行う。
海外高性能望遠鏡を用いた天文学の研究

中村はMUSES-Cの測光学的機上較正に用いる標準星システム構築のため、6バンドでの観測結果を得た。馬場はサンペド口天文台にて、スペックルによる撮像および分光観測をHα周辺で行い、HD5286,HD207652などを解像した。柴田はVLAを使いメガメーザー6天体のHI吸収線探査を行い、その相関解析を行った。佐藤(聡)はVLBAを用いNGC3079の多周波観測を行い、その相関解析を行った。田村はJCMTにてサブミリ波アレイ用偏光器を用いてTタウリ型星の星周ディスクからのサブミリ波偏光を検出し、原始惑星系円を初めて得た。佐藤(文)は太陽系近傍の星形成領域を含む広い範囲をHI21cm輝線で観測しスペクトルを取得した。大石はSESTを用い、大質量星形成領域周辺で環状分子であるフランの存在を示唆する信号を検出した。坂本は近傍の渦状銀河の中心角領域を観測し、銀河中心における分子ガスの分布と運動を100pc以下の分解能で明らかにし、ガスのツインピーク構造、銀河中心のコンパクトなガス円盤、ガス分布の穴などの、様々な構造を検出した。小倉はビュラカン天文台おうし座分子雲中に顕著なハービックハロー天体を1つ、NGC2264領域に特異な双極状輝線星雲を発見した。中井はVLBAを用いIC2560の水メーザーの空間分布を観測し、中心核の0.1pcというきわめて狭い領域にメーザースポットがほぼ一列に集中していることから銀河中心に、回転しているコンパクトな高密度ガス円盤があることを示した。馬場はサンペド口天文台にて、スペックルによる撮像および分光観測をHαで行い、HD5286,HD207652などを解像した。柴田はVLAを使いメガメーザ天体のHI吸収線探査を行い、その相関解析を行った。佐藤(聡)はVLBAを用いNGC3079の多周波観測を行い、その相関解析を行った.田村はJCMTにてサブミリ波アレイ用偏光器を用いてTタウリ型星の星屑ディスクからのサブミリ波偏光を検出し、原始惑星系円盤の磁場の情報を初めて得た。佐藤(文)は太陽系近傍の星形成領域を含む広い範囲をHI21cm輝線で観測しスペクトルを取得した.大石はSESTを用い、大質量星形成領域周辺で環状分子であるフランの存在を示唆する信号を検出した.坂本は近傍の渦状銀河の中心角領域を観測し、銀河中心における分子ガスの分布と運動を100pc以下の分解能で明らかにし、ガスのツインピーク構造、銀河中心のコンパクトなガス円盤、ガス分布の穴などの、様々な構造を検出した。小倉はビュラカン天文台おうし座分子雲中に顕著なハービックハロー天体を1つ、NGC2264領域に特異な双極状輝線星雲を発見した.中井はVLBAを用いIC2560の水メーザーの空間分布を観測し、中心核の0.1pcというきわめて狭い領域にメーザースポットがほぼ一列に集中していることから銀河中心に、回転しているコンパクトな高密度ガス円盤があることを示した。
繊毛虫のメイトキラー因子の解明とその因子の起源から探る同胞種群の系統進化

繊毛虫Euplotes属のE.woodruffi種群(シンゲン1,シンゲン2、シンゲン3、オートガミーグループ)、E.eurystomus、E.aediculatus、E.patella、E.harpaを北海道、本州、四国、九州、沖縄県で採集を行い、多数の株を作成した。このうち、E.woodruffi種群のシンゲン3でメイトキラーが発見されているので、主にこの種群で研究を行った。メイトキラーは接合後に対のパートナー(センシティブ)を殺すという特徴を持つが、センシティブとは顕微鏡レベルでは区別されない。そこで、2株の混合時に両者を区別するため、2細胞が融合した双体を実験的に作成し、この双体を用いて、E.woodruffi種群でのメイトキラー系統の探索を行った。シンゲン3は、島根、長崎、熊本、鹿児島、沖縄県で採集された。採集された698株をメイトキラーの双体と接合させて調べた。熊本県の水前寺湖と江津湖、沖縄県のビオスの丘と東南植物楽園の池にメイトキラーとセンシティブが共存していて、319株のうち287株(90%)がメイトキラーであった。それ以外の場所ではすべてセンシティブであった。興味深いことに、熊本県産のメイトキラー株と沖縄県産のメイトキラー株の接合は、互いに相手を殺しあう。両者は異なる種類のメイトキラーに属するのであろう。重要な発見なので現在研究中である。本研究のもう一つの重要な発見は、E.woodruffi種群の4種は生殖的に隔離されているが(Kosaka,1992)、ある条件下ではシンゲン3はシンゲン1および2のみならず、オートガミーグループとも接合することを発見した。このことにより、E.woodruffi種群のKosaka(1992)による種分化のプロセスの仮説が実証されたことになる。この条件下で接合対を形成させて調べたところ、これまでにシンゲン3と1では17株が、シンゲン3と2では60株が、シンゲン3とオートガミーグループでは204株が種間接合を行ったが、すべてセンシティブであった。繊毛虫下毛目のユープロテス属(Euplotes)のメイトキラーを、Euplotes woodruffiのシンゲン3(同胞種3)の熊本県の水前寺湖産と江津湖産の株で発見し、メイトキラーついて種々の観点から研究と分析を行っている。接合は繊毛虫の有性生殖の一方法で、これにより遺伝子の交換と若返りが行われるが、メイトキラーは接合のパートナー(センシティブ)を殺すという特徴をもつ。繊毛虫のメイトキラーの起原を探るため、沖縄県で2回、九州地方で3回の採集調査を行い、多数のE.woodruffiの株を単離・培養している。沖縄県では、那覇市の竜潭、残波岬付近、石川市のビオスの丘周辺、屋部川、源河川、平南川、比地川、与那川、辺野喜川で本種を採集することができた。これらの沖縄県産の株とE.woodruffiのシンゲン3の株は、低率ではあるが、両者を混合すると接合を行う。

メイトキラーとセンシティブは形態的に区別することができないので、メイトキラーの生活環の成熟期の株から双体(1個体は2細胞から成り、1双体は細胞分裂で2双体を生産)を実験的に作り、これと沖縄県産株を接合させて、メイトキラーかセンシティブかを決定した。これまでの研究から、調べた沖縄県産株はすべてセンシティブであることがわかった。九州地方では、佐々川(長崎県)、水俣川(熊本県)、大淀川(宮崎県)、川内川・池田湖・薩摩湖(鹿児島県)で、E.woodruffiシンゲン3の多数の株を採集することができ、これらの産地の株もセンシティブであることがわかった。さらに沖縄県と九州地方からは、他のユープロテス属の種であるE.aediculatus,E.patella,E.eurystomus,を多数採集することができ、これらも単離・培養している。これらがメイトキラーかどうかについては、接合は同属の他の種間では生じないので、マイクロインジェクションの方法を用いて解析する予定で、現在、インジェクションの方法を修得中である。なお、得られた成果の一部は、本年5月の日本動物学会中国四国支部大会、7月にオーストリアで開催される国際原生生物学会で報告する。下毛目繊毛虫のユープロテス(Euplotes)、特にEuplotes woodruffi種群でのメイトキラーついて種々の観点から研究と分析を行っている。繊毛虫の有性生殖の方法である接合の時に、メイトキラーは接合のパートナー(センシティブ)を殺すという特徴をもつ。メイトキラーの分布と起原を探るため、沖縄県で2回、九州地方で1回、高知県・愛媛県で1回、島根県・鳥取県で1回、和歌山県で1回、静岡県・山梨県・神奈川県で2回の採集調査を行い、多数のE. woodruffiの株を単離・培養している。沖縄県では那覇市の竜潭、読谷村残波岬付近、石川市のビオスの丘周辺、沖縄市東南植物楽園、安波川、汀間川、伊地川、我部祖河川で本種を採集することができた。これらの株とシンゲン3の株は低率ではあるが接合を行う。メイトキラーとセンシティブは形態的に区別できないので、熊本県江津湖産のメイトキラーの株から1個体が2細胞から成る双体を実験的に作り、双体と沖縄県産株を接合させて、メイトキラーかセンシティブかを決定した。非常に興味深いことに、読谷村残波岬付近、石川市のビオスの丘、沖縄市東南植物楽園から採集した株の中に、自身もメイトキラーに殺されるが、同時にメイトキラーを殺すものがいることを発見した。おそらく熊本県産のものとは別種のメイトキラーであろう。現在、詳しいことは研究中である。その他の河川から採集した株はすべてセンシティブであった。高知県四万十川・伊予木川・仁淀川、島根県宍道湖・斐伊川・三刀屋川・敬川、山梨県冨士川・本栖湖・精進湖・西湖・山中湖からも多数のE. woodruffiが採集された。これらの産地のものは、ほとんどがE. woodruffi種群のオートガミーグループとシンゲン2であるが、シンゲン3と高密度で混合した時に、低率ではあるが接合対が形成されることが新たにわかった。この種群間接合を用いて調べたところ、すべてがセンシティヴであった。なお、昨年得られた結果の一部は、日本動物学会中国四国支部大会とオーストリアで開催された国際原生生物学会で報告した。繊毛虫のユープロテス(Euplotes)、特にEuplotes woodruffi種群でのメイトキラーついて種々の観点から研究と分析を行っている。接合時に、メイトキラーは接合のパートナー(センシティブ)を殺すという特徴をもつ。メイトキラーの分布と起原を探るため、北海道で1回、和歌山県・滋賀県・福井県で1回、島根県で2回、九州地方で2回、沖縄県で1回の採集調査を行い、多数のE.woodruffiと他のEuplotes属の株を単離・培養した。
精密ハドロン物理学のための高強度レーザー電子光ビームの開発

SPring-8のレーザー電子光ビーム施設では、大型ソレノイド電磁石を用いた、ペンタクォーク粒子の検証やハドロン分子共鳴状態候補である(1405)の構造を解明を目的としたハドロン物理実験が本格的に始動する。多大な電力を消費するソレノイド電磁石の運転時間を抑えつつ、高統計の精密ハドロン分光により、ハドロンを記述するもっとも基本的な自由度として何が可能かという問いに答えるには、ビームの高強度化が喫緊の課題である。本研究では、SPring-8の蓄積電子ビームに対して、繰り返し周波数を最適化したパルスレーザー光を電子ビームに同期して入射することにより、散乱効率を劇的に改善し、レーザー電子光ビームの強度を増強することを目的とする。本研究では不規則なタイミングパターンでも高出力でかつタイミング制御された光増幅が可能なシステムを開発し、蓄積電子ビームのRF信号を外部トリガーシグナルとして用いることにより、入射レーザーと電子ビームの衝突がレーザー径が最小になる点で起こるように同期する。レーザー電子光ビームライン(LEPS)でSPring-8の電子ビームに同期させてレーザーを入射したところ、非同期に比べて顕著なビーム強度の増強が確認された。またレーザー光と電子ビームの衝突点をタイミング調整により、コントロールできる利点を活用して入射レーザーの衝突点付近のプロファイルを測定した。さらにプロファイル測定から計算したビームの増強度が実測値とほぼ一致することを確かめた。本研究では不規則なタイミングパターンでも高出力でかつタイミング制御された光増幅が可能なシステムを開発することが技術的に一番大きな課題であった。定常的な外部シグナルによるレーザー媒質中の反転分布形成では、励起と放出が釣り合うが、不規則なパターンによりシグナルが途切れると、反転分布密度が高くなりすぎ装置を損傷するという問題が起こる。そこでパススが途切れたことを検出して反転分布密度が高くなりすぎないように制御するシステムを開発した。そのシステム開発に当初の想定以上の期間がかかったが、システム導入後の研究は順調に推移ししており、高レーザー強度での実験に成功した。レーザー径のタテヨコ比を変化させて扁平な電子ビームとの衝突確率を増加させるためシリンドリカルエキスパンダーを導入し、さらなるビーム強度の増強を図る。
吾妻鏡と中世都市鎌倉の多角的研究

本研究を進めた結果、次の四点が成果として得られた。第一に、『吾妻鏡』の注釈を行うための諸環境を整えることを考え、注釈者相互間のシステム作りを行い、ホームページの作成に力をいれて完成させた。部分的な注釈を月一回の研究会で報告し、その成果は会誌『文献と遺跡』に報告してきたが、さらに現代語訳の出版に向けての基礎を築いた。第二には、鎌倉の発掘報告を集めてGISによって地図上に発掘現場の調査報告と関連する史料を貼り付け、発掘成果と文献の研究が融合して行う方法を模索した結果、国指定遺跡である永福寺跡についてはほぼ成果を整え、シンポジウムで報告した。第三には、『吾妻鏡』の原史料のうちでも最も重要な一つである『明月記』について注釈を進め、鎌倉で起こった和田合戦の記事や、京で起きた平賀朝雅事件について検討を加えてその成果を『明月記研究』で報告した。第四には、新たな中世都市鎌倉像の形成に向けて二度のシンポジウムを企画した。一つは中世都市研究会との共催による「交流・物流・越境」をテーマとするもので、もう一つは昨年立ち上げた中世鎌倉研究会のシンポジウム「日本史の中の永福寺」である。これらにより中世都市鎌倉の研究は大きく飛躍したものと考えられるが、それらの成果は『中世都市研究』11(新人物往来社、2005年9月)や会誌『文献と遺跡』に報告した。近年、鎌倉では中世遺跡の発掘が相次ぎ、中世の生活を復元するための材料が用意されつつある。けれどもそれらを統合する試みはなされていない。そこで各遺跡地図と研究成果(研究文献と遺物データ)を対応させたデータベースを作成し、ホームページ上にこれを反映し、検索システムを新たに構築した上で、考古画像史料部分だけは吾妻鏡本文に先駆けて公開することを期してきたが、まだ完全ではなく、これからさらに望まれよう。これにより『吾妻鏡』はより具体的・立体的な歴史像を獲得することが可能になり、あわせて中世都市鎌倉に関する研究へのきわめて有効な資料を提供できることになるであろう。本研究は鎌倉幕府研究の根本史料である『吾妻鏡』の史料学的な研究を行うとともに、幕府政治が展開した中世都市鎌倉に関する諸知見、特に成果の著しい考古学の発掘調査とを照らし合わせて、新たな幕府像、中世都市鎌倉像を描くことを目的としている。それに基づいて研究を進めた結果、次の三点を報告する。第一に、『吾妻鏡』の注釈を行うための諸環境を整えることを考え、注釈者相互間のシステム作りを行い、ホームページの作成にも力をいれ、ほぼ完成に近づいている。さらに部分的な注釈を月一回の研究会で報告しており、その成果は『文献と遺跡』1号・2号に報告したが、これは今後順次報告することとする。第二には鎌倉の発掘報告を集めて、GISによって地図上に発掘現場の調査報告と関連する史料を貼り付け、発掘成果と文献の研究が融合して行う方法を模索しており、その方向性がほぼ定まったので、その成果は順次報告してゆきたい。第三には、『吾妻鏡』の原史料のうちでも最も重要な一つである『明月記』について注釈を進めてきたが、今年度は鎌倉で起こった和田合戦の記事について検討を加えてきた。その成果は来年度の『明月記研究』で報告したい。以上に基づいて来年度は成果を広く公開してシンポジュウムを開く予定である。本年度は、前年度に引き続き(1)文書典籍史料・(2)記録文学史料・

(3)考古画像史料の三つの研究班を編成し、とりわけ文献史学と考古学との学問的交流に基づく新たな中世都市研究の在り方を提起することに重点を置いた研究活動を行った。具体的には、鎌倉遺跡データベースの構築を目的とする地理情報システムのソフトを導入し、試験的運用を開始した。その成果は研究者集会で逐次報告するとともに、平成16年9月、鎌倉市と本科研との共同後援という形で開催した「中世都市研究会2004鎌倉大会」(於.鎌倉女子大学二階堂学舎)で広く公開した。なおこの大会では、研究代表者及び研究分担者が報告等を行い、約300名の研究者の参加を得て文献史学と考古学の研究成果を包括的に議論しつつ中世都市研究の一つの姿を提案することができた。また同年7月には山梨県笛吹市にて「考古学と中世史研究」のシンポジウムを開催した(於.帝京大学山梨文化財研究所)。次に今年度は、鎌倉のほか会津若松市・松江市・京都市に赴き、史料採訪・研究集会を行った。これは、中世都市鎌倉の性格を多面的に考察するための比較研究という側面もあり、会津若松・松江では中世都市を構成する主な要素の一つである宗教施設(寺社)について多くの知見を得るとともに、貴重な史料を調査することができた。さらに(1)(3)の研究班による活動の成果として、『文献と遺跡』第3号・第4号・第5号、『明月記研究』第9号を刊行した。前者は、多様な角度からの中世都市に関わる研究や『吾妻鏡』の校注などを収め、後者は『吾妻鏡』と関わりの深い貴族の日記・軍記物語や和歌文学に関わる研究論文・史料紹介から成るものであり、いずれも今後の都市論及び史料学研究に寄与するものと考える。なお、研究代表者・分担者による個別の研究成果は、別項を参照されたい。本研究は鎌倉幕府研究の根本史料である『吾妻鏡』の史料学的な研究を行うとともに、幕府政治が展開した場である中世都市鎌倉に関する諸知見、特に成果の著しい考古学の発掘調査などを照らし合わせて、新たな中世都市鎌倉像を描くことを目的としたものである。本研究を進めた結果、次の四点が成果として得られた。第一に、『吾妻鏡』の注釈を行うための諸環境を整えることを考え、注釈者相互間のシステム作りを行い、ホームページの作成に力をいれて完成させた。部分的な注釈を月一回の研究会で報告し、その成果は会誌『文献と遺跡』に報告してきたが、さらに現代語訳の出版に向けての基礎を築いた。第二には、鎌倉の発掘報告を集めてGISによって地図上に発掘現場の調査報告と関連する史料を貼り付け、発掘成果と文献の研究が融合して行う方法を模索した結果、国指定遺跡である永福寺跡についてはほぼ成果を整え、シンポジウムで報告した。第三には、『吾妻鏡』の原史料のうちでも最も重要な一つである『明月記』について注釈を進め、鎌倉で起こった和田合戦の記事や、京で起きた平賀朝雅事件について検討を加えてその成果を『明月記研究』で報告した。第四には、新たな中世都市鎌倉像の形成に向けて二度のシンポジウムを企画した。一つは中世都市研究会との共催による「交流・物流・越境」をテーマとするもので、もう一つは中世鎌倉研究会(鏡の会)との共催による「日本史の中の永福寺」である。これらにより中世都市鎌倉の研究は大きく飛躍したものと考えられるが、それらの成果は『中世都市研究』11号(新人物往来社刊)や会誌『文献と遺跡』に報告した。
ブタ乳腺上皮細胞の分離・樹立

本研究課題であるブタ乳腺上皮細胞の分離・樹立を遂行するためには、1)乳腺組織からの上皮細胞の分離・培養条件の検討、2)in vitroにおける乳蛋白質合成能の確認、3)樹立株の構築のために適用する遺伝子導入法の検討ならびにその条件の最適化が不可欠である。ブタ乳腺上皮細胞の分離はこれまで報告例がなく、さらに遺伝子導入時の転換効率を考慮すれば、まずは他の細胞の混入が極力回避される上皮細胞の分離法の確立が望ましい。そこで、その条件を種々検討した結果、以下のようになった。ブタ乳腺組織を細切した後、コラゲナーゼ、デイスパーゼ、ヒアルロニダーゼ、インスリン、DNaseを添加した199倍地を用いて37°Cで5時間振とう処理した。一旦細胞を遠心分離によって回収し、DNase、プロナーゼを添加した199倍地を用いて37°C1時間処理した。回収した細胞をDNase、BSA、199培養液を加えて浮遊させ、パーコールを用いた密度勾配遠心分離法によって乳腺細胞の層を採取した。さらに、細胞をナイロンメッシュでろ過し、大きな細胞塊を取り除くと共に、その細胞浮遊液を静置しても沈まず分散した細胞も除去した。このようにして得た乳腺細胞の画分をインスリン、EGF、プロゲステロン、グルココルチコイドを単独あるいは併用で実験を行った結果、マウスやラットとは異なり、ブタ乳腺細胞の増殖にはグルココルチコイドが必要であることが明らかとなった。細胞のin vitroにおける乳蛋白質の発現は未確認である。しかし、ブタミルクよりα-、β-カゼイン、β-ラクトグロプリンをカラムクロマトグラフィーによって精製し、マウスに免疫した結果、特に力価の高い抗体として抗β-カゼイン血清を得ることができたため、これを用いて分離した細胞の分化能に関する観察が可能であると考えられる。
DNA修復経路を決定づける情報伝達機構の解析

A. DNA修復においてはユビキチン経路が修復因子の集積、活性化の調節をする上で重要な役割を果たしている。本研究ではユビキチンE3リガーゼRNF8とRNF168について、互いの協調した働き及び独立した働きを明らかにした。1.相同組換え修復におけるRNF8非依存的なRNF168の働きの解明相同組換えの初期過程においてRNF8, RNF168は協調して働いており、トリB細胞株DT40においてRNF8, RNF168の変異株はカンプトテシンやParp阻害剤に対してエピスタティックな感受性を示す(1年度目の報告)。しかし、Rad51のDNA損傷部位への集積動態から、RNF168と異なりRNF8はRad51ヌクレオフィラメントの形成には関与せず、その後の相同鎖探索の過程において相同組換えに働いている可能性が示唆された。2.複製後修復におけるRNF168およびRNF8の働きの解明複製後修復機能の解析結果から、RNF8とRNF168が同じ基質に異なるトポロジーのユビキチン鎖を竸合的に付加し、基質の分解と集積を制御していることが示唆された(1年度目の報告)。基質を探索する目的で野生株及びRNF8変異株において複製ブロック部位に集積するタンパク質をMS解析で比較した。B. DT40細胞株の標的組換え効率が高い機構の解明DT40細胞は高頻度で標的組換えを行うことのできる唯一の高等生物細胞株である。しかし、その機構は分かっていない。本研究ではRNA-seqによりDT40細胞株とトリT細胞由来39CU細胞株、ヒトBおよびT細胞との転写プロファイルを比較することで、DT40細胞において標的組換えに寄与している因子を探索した。その結果DT40では、減数分裂時の組換え時に働く遺伝子群が高発現していることがわかり、これらがDT40の組換え機能に寄与している可能性が示唆された。交付申請時にはDNA損傷応答において相同組換え修復ではRNF8とRNF168が協調して働き、非末端結合修復ではRNFI68のみが関与していることが分かっていたが、本研究により新たに1相同組換えのRad51ヌクレオフィラメント形成はRNFI68のみが促進していること、2複製後修復経路において両者は競合して制御している可能性があること、が示された。以上のように、当初の計画では予想されていなかったRNF8とRNF168の独立した機能が明らかとなった。上記1について、非相同末端結合修復経路を欠損させた変異株上でRNF8, RNF168を欠損させたRNF8/Ku70、RNFI68/Ku70細胞株は作成されている。これらの上に組換え後期において重要な働きを行うRad54を更に遺伝子破壊したRNF811 (u70/Rad54、RNFI68/Ku70!rad54変異株を作製、γ線照射に対する表現形を比較し、RNF8、RNF168、Rad54が同じ相同組換え経路で働いているのかを検証する。2について、複製後修復におけるRNF8、RNF168の基質を同定する目的で、HU処理後複製部位に集積するタンパク質について野生株とRNF8欠損株を比較し、解析中である。基質候補についてユビキチン化の有無、ユビキチン化されることの生物学的意義を検証する。Dm修復応答に関わるユビキチン化酵素RNF8とRNF168の機能解析研究の背景:研究目的:RNF8およびRNF168の2重遺伝子破壊細胞を創り、両者の機能的相互関係を解明する。閻題点と解決方策:複数のユビキチン化酵素が互いに相補しあいながら機能する場合、単一遺伝子破壊ではその相補性を解明できない。同様に遺伝子ノックダウン(90%しか発現抑制できない)でもできない。これらの問題点を克服する為に、多重遺伝子破壊株を作成し表現型解析した。研究方法、特色:本研究の特色は、(i)多重変異体を作成する点と、(ii)既に研究室で作製されたユビキチン化酵素欠損株(UBCI3-/-,RAD18-/-など)を対照できる点である。完全機能欠失型の多重変異体を用いる事で、複数のE3ユビキチンリガーゼが互いにどのように相補し合っているのかを解明できる。2.複製後修復におけるRNF168およびRNF8の働きの解明

複製後修復機能の解析結果から、RNF8とRNF168が同じ基質に異なるトポロジーのユビキチン鎖を竸合的に付加し、基質の分解と集積を制御していることが示唆された(1年度目の報告)。基質を探索する目的で野生株及びRNF8変異株において複製ブロック部位に集積するタンパク質をMS解析で比較した。B. DT40細胞株の標的組換え効率が高い機構の解明DT40細胞は高頻度で標的組換えを行うことのできる唯一の高等生物細胞株である。しかし、その機構は分かっていない。本研究ではRNA-seqによりDT40細胞株とトリT細胞由来39CU細胞株、ヒトBおよびT細胞との転写プロファイルを比較することで、DT40細胞において標的組換えに寄与している因子を探索した。その結果DT40では、減数分裂時の組換え時に働く遺伝子群が高発現していることがわかり、これらがDT40の組換え機能に寄与している可能性が示唆された。RNF8とRNF168の2重変異体を作成し、DNA2重鎖切断経路、複製後修復経路における両者の働きを調べた。mF8とRNFl68はDNA修復経路ごとに異なった相互関係を及ぼしていることがわかった。相同組換え経路においては以前から報告されていたようにRNF8とRNF168は同一経路上で働いているのに対し、非相同末端結合ではRNFI68のみが働いている。またRNF8は複製後修復経略を促進しているがRNF168はそのRNF8の働きを抑制している事が示唆された。交付申請時にはDNA損傷応答において相同組換え修復ではRNF8とRNF168が協調して働き、非末端結合修復ではRNFI68のみが関与していることが分かっていたが、本研究により新たに1相同組換えのRad51ヌクレオフィラメント形成はRNFI68のみが促進していること、2複製後修復経路において両者は競合して制御している可能性があること、が示された。以上のように、当初の計画では予想されていなかったRNF8とRNF168の独立した機能が明らかとなった。非相同末端結合経路と複製後修復経路においてRNF8とRNF168破壊株が示す表現型が異なるため、トリcDNA/タンパク質データベースは不完全であり、また、亜種に因るSNVがユビキチン鎖結合部位の同定に影響を与えることが考えられたため、RNA-seqでプロテオーム用のリファレンスデータベース作成を開始した。リファレンスが出来た後に野生型とRNF8,RNF168破壊株についてユビキトームを調べ、基質を同定後、その生物学的意義を解析する。上記1について、非相同末端結合修復経路を欠損させた変異株上でRNF8, RNF168を欠損させたRNF8/Ku70、RNFI68/Ku70細胞株は作成されている。これらの上に組換え後期において重要な働きを行うRad54を更に遺伝子破壊したRNF811 (u70/Rad54、RNFI68/Ku70!rad54変異株を作製、γ線照射に対する表現形を比較し、RNF8、RNF168、Rad54が同じ相同組換え経路で働いているのかを検証する。2について、複製後修復におけるRNF8、RNF168の基質を同定する目的で、HU処理後複製部位に集積するタンパク質について野生株とRNF8欠損株を比較し、解析中である。基質候補についてユビキチン化の有無、ユビキチン化されることの生物学的意義を検証する。
電気的特性による物性評価を基盤とした不飽和コンクリート中の塩化物イオン浸透予測

本研究では,電気化学的非破壊試験により把握したコンクリートの電気的特性に基づく不飽和コンクリートにおける塩化物イオン浸透予測手法を構築するために,(1)不飽和セメントペーストの見掛けの拡散係数と電気抵抗率の関係,(2)長期間海水中に浸漬されたコンクリートの塩化物イオン見掛けの拡散係数と電気抵抗率から推計される拡散係数の関係,(3)コンクリートの電気的特性を用いたコンクリート中含水率分布の非破壊評価試験の開発,に関する基礎的知見を積層・集約した.【飽和コンクリートの電気抵抗率とCl-拡散係数の関連性】Nernst-Planck式,Debye-Hückel理論,電荷保存則,Einsteinの関係式およびオームの法則を組み合わせることで理論的に導出した拡散係数と電気抵抗率の関係式について,これまでに得られたデータを再検証した結果,空隙率の算定方法および空隙壁の電気化学的特性を関係式に考慮する必要があることを確認した。これらのファクターを考慮した修正関係式を構築することで電気抵抗率から塩化物イオン拡散係数の推計手法の信頼性を飛躍的に向上させられる可能性があり,引き続き修正方法について検討することとなった。【電気化学的非破壊試験によるコンクリート表層部の電気抵抗の分布および時間変化の測定結果に基づく水の浸潤速度・移流層深さの評価方法の構築】空隙水の連続性に支配される導電率(電気抵抗率の逆数)と水で満たされていない空隙の連続性に支配される表面透気係数や表面吸水量との関係を実験的に整理し,散水処理前後で測定した導電率による表層品質評価の可能性を検討した。その結果,散水処理前後の導電率の変化量は,表面透気係数や表面吸水試験の表面吸水量と相関があり,乾燥した空隙構造に関連するコンクリート表層品質の評価に適した評価指標である可能性を示すことができた。また,低品質のコンクリートであると深部まで水分が浸透し,それを異なる複数の電極間隔で検知することで,水の浸潤速度やその範囲を評価できる可能を示した。本研究では,電気抵抗率と塩化物イオン拡散係数の関連性に及ぼす含水状態の影響を検討した.実験では含水状態を均質に調整した厚さ1cmのセメントペースト供試体を用い,電気抵抗率および電気抵抗率から推計される塩化物イオン拡散係数(以下,推計拡散係数),塩水噴霧試験から求めた見かけの塩化物イオン拡散係数(以下,見かけの拡散係数)を複数の含水状態で測定した.そして,測定結果から不飽和状態における推計拡散係数と見かけの拡散係数の関連性について検討した.その結果,次の結論が得られた.セメントペーストの相対含水率が0.421.00の範囲では,塩水浸せき試験から求めた見かけの拡散係数に対する塩水噴霧試験から求めた見かけの拡散係数の比(以下,見かけの拡散係数比)が,実験結果から導出した任意の相対含水率における推計拡散係数に対する飽和状態の推計拡散係数の比(以下,推計拡散係数比)の関係式と一致する傾向を示した.これより,相対含水率が0.421.00の範囲のセメントペーストにおいては,不飽和時の見かけの拡散係数を電気抵抗率により評価できる可能性を示唆することができた.なお,推計拡散係数と見かけの拡散係数の関係には空隙構造だけでなく,塩化物イオン固定化や材齢,塩分浸透の停滞などの要因の影響も考えられ,推計拡散係数と見かけの拡散係数は定量的には一致しない.しかし,これらの拡散係数を飽和状態の拡散係数の比を取って比較すると,同一相対含水率において推計拡散係数比と見かけの拡散係数比は概ね一致することが確認された.これは,飽和状態の拡散係数に対する不飽和拡散係数の比として表すと,見かけの拡散係数に影響を及ぼす諸要因の影響が相殺され,拡散係数の差異の支配的要因となる含水状態とその連続性の影響が強く表れたためと考えられた.本研究において最大の目的であった「電気抵抗率による不飽和状態の塩化物イオン拡散係数の推計」について,セメントペーストによる実験により,当初予想していた成果が得られた.特注した試験装置(塩水噴霧試験装置)の運転状況および性能は期待以上であり,今後も問題なく本研究課題を遂行していくことが可能である.塩化物イオン拡散係数はコンクリートの遮塩性を評価する際に重要な指標である.一方,電気抵抗率は塩化物イオン拡散係数と相関性があり,測定方法が簡便・即時的・非破壊であることから,コンクリートの遮塩性の評価指標として注目されている.本研究では理論的に導出した電気抵抗率と塩化物イオン拡散係数の関係式により,電気抵抗率と各種イオン濃度から推計した塩化物イオン拡散係数(以下,推計拡散係数)と塩水浸せき試験から求めた見かけの拡散係数について,その相関性の材齢依存性を検討した.なお,塩水浸せき試験に用いた供試体は,塩化物イオンやナトリウムイオンが浸透したものである.電気抵抗率はイオン濃度依存性があるため,遮塩性を電気抵抗率により評価するには,イオン濃度およびその分布の影響を考慮する必要がある.そのため,本研究では数値解析を援用し,電気抵抗率の測定領域を求め,その領域に存在する種々のイオンの平均濃度を計算した.そして,その平均濃度と電気抵抗率の実測値を用いて推計拡散係数を算出する方法を考案した.この方法を用いて,浸せき前および3 %,10 %の塩水に2.5年間浸せきしたコンクリートの推計拡散係数と見かけの拡散係数の関連性を整理した.

その結果,浸せき濃度が塩水浸せき2.5年後の推計拡散係数に及ぼす明確な影響は見られず,コンクリート中のイオン濃度に分布が生じている場合においても,それを適切に考慮することで,推計拡散係数による遮塩性能評価の信頼性が確保できることを確認した.さらに,塩水浸せき2.5年後の推計拡散係数は浸せき前に比べ小さくなり,見かけの拡散係数との差は小さくなった.また,高遮塩性コンクリートでは塩分浸透の停滞が両者の差に影響を及ぼすことが示唆される結果が得られ,推計拡散係数により見かけの拡散係数を評価する際には,塩分浸透の停滞も考慮する必要があることが示唆された.実構造物において電気抵抗率から塩化物イオン拡散係数を推計する際に,コンクリート中のイオン濃度およびその分布が推計結果に影響を及ぼすことが懸念されたが,それを回避する方法を数値解析を援用することで解決することができた.このため,供用開始から長期の時間が経過した構造物においても,塩化物イオン拡散係数を高確度で推計する方法論を提示することができた.コンクリート構造物内部の含水状態は塩化物イオン浸透や中性化あるいはそれらによる鋼材腐食の進行に影響を与える.そのため,含水状態を評価することはコンクリート構造物の維持管理にとって重要である.本研究では,モルタルの内部含水状態を評価するために,交流電流印加時にモルタル表面に生じる電位分布に着目した.含水率分布の評価方法として,FEM解析を用いて,解析モデル内部の含水率分布を変動させたときの電位分布を計算し,電位分布の解析値を実測値に擦り合わせることでモルタル内部の含水率分布を評価する手法を提案した.すなわち,同手法は,表面電位分布の実測値とFEMモデル内部で含水率分布を任意に変化させて得られる表面電位分布を比較し,それらの二乗誤差を最小とするFEMモデル内部の含水率分布を評価結果とするものである.手法の妥当性を検証するために,複数の相対湿度環境下に1面開放で曝露して乾燥させたモルタル供試体を対象に,同手法を適用した.その結果,同手法による評価結果には複数の解が生じることが明らかになった.そのため,別途で実施する4プローブ法にて実測される見掛けの電気抵抗率と同手法の評価結果から計算される見掛けの電気抵抗率とを比較することで,最も確からしい評価結果を選択する手法を考案した.そして,含水率分布を変化させたモルタル供試体にて手法の検証を行い,本手法によりモルタル内部の含水率分布を評価できる可能性を示すことができた.本研究では,電気化学的非破壊試験により把握したコンクリートの電気的特性に基づく不飽和コンクリートにおける塩化物イオン浸透予測手法を構築するために,(1)不飽和セメントペーストの見掛けの拡散係数と電気抵抗率の関係,(2)長期間海水中に浸漬されたコンクリートの塩化物イオン見掛けの拡散係数と電気抵抗率から推計される拡散係数の関係,(3)コンクリートの電気的特性を用いたコンクリート中含水率分布の非破壊評価試験の開発,に関する基礎的知見を積層・集約した.既往の知見・データの再解析については,概ね順調に推移しており,新たな課題を抽出することができている。また,電気抵抗率によるコンクリート表層部への水の浸潤速度の評価についてはフィージビリティースタディーを前倒しで実施し,適用可能性を確認することができた。一方,本研究の柱の一つである「不飽和コンクリートの塩分拡散と電気抵抗率の関連性」については,塩水ミスト噴霧試験装置の製作まで完了し,現時点ではその性能確認試験を実施中である。上記の進捗状況を鑑み,自己点検の結果は「(2)おおむね順調に進展している。」と判断した。
テラヘルツ分光分析による同族繊維識別に関する応用研究

本研究はテラヘルツ分光法を用い、衣服等の原料となる繊維種において、これまで識別が困難であった同族繊維に関する識別方法を開発し、近年の偽装表示問題に対応可能な信頼性の高い新規な鑑別法を確立することを目的とした。このため凍結粉砕に代わるプロセスとして、ミクロトームを用い繊維を中心軸に垂直に一定の長さで切断するプロセスを採用し、得られたテラヘルツスペクトルの1次微分情報を多変量解析することによって、テラヘルツ分光分析による高い定量性を実現した。これによってこれまで困難とされた同族繊維(分子構造や成分がほとんど同じ繊維種)の新規な識別方法としての応用の可能性を見出した。本研究は,衣服等の原料となる再生繊維(レーヨン,キュプラ,モダール,テンセル),植物由来繊維(綿,ヘンプ,リネン,ラミー),動物繊維(山羊毛,牛毛,羊毛,キャメル)を分析対象とし,テラヘルツ分光法を用いて繊維に内在する水素結合,分子間結合,および結晶構造に対応した格子振動のエネルギー状態を検出し,新たな繊維種の識別手法見出そうとするものである。各種繊維種は,77Kにて凍結式粉砕機を用い粉砕し,乾燥プロセスの後ふるいを用い所定サイズの粒子を抽出した。この試料粉末を秤量し,ポリエチレン微粉末と混合して圧粉することにより所定濃度のテラヘルツ分光分析用ペレットを形成した。本研究で実施した技術構成は,1繊維試料の凍結粉砕条件の最適化,2テラヘルツ分光分析による試料濃度依存性測定とデータベースの構築,および3取得したスペクトル情報の多変量解析(主成分分析およびクラスター分析)を用いた数学的処理技法の検討である。特に,セルロースを主体とする各種植物由来繊維と各種再生繊維の識別においては,同族の分子構成に由来し,中赤外分光分析では同一のスペクトルが得られるが,テラヘルツ分光分析を用いた場合は,各種植物由来繊維と各種再生繊維のセルロース結晶構造を識別でき,その結晶度合いの定量的分析によって各種繊維種が初めて識別できることを見出した。さらに平成26年度に予定しているスペクトル情報を定量化するための多変量解析について,本年度に導入した多変量解析ソフトを用い得られたスペクトル情報を試験的に用い解析し,スペクトル情報を定量化しセルロース系繊維の定量的識別に用いられる見通しを得た。このプロセスは各種動物繊維にも適用し同様の有効性を確認した。本研究は,衣服等の原料となる再生繊維(レーヨン,キュプラ,モダール,テンセル),植物由来繊維(綿,ヘンプ,リネン,ラミー),動物繊維(山羊毛,羊毛)を分析対象とし,テラヘルツ分光法を用いて繊維に内在する水素結合,分子間結合,および結晶構造に対応した格子振動のエネルギー状態を検出し,新たな繊維種の識別手法見出そうとするものである。本研究では昨年度まで各種繊維種を77Kにて凍結式粉砕し,粉末化した試料を秤量し,ポリエチレン微粉末と混合して圧粉することにより所定濃度のテラヘルツ分光分析用ペレットを形成してきた。しかしこの手法では凍結粉砕プロセスの時間や頻度により試料に含有される微結晶が損傷を受けるため,テラヘルツスペクトルが変化することが明らかとなり,新たな裁断方法を開発し安定なスペクトル情報を得た。本年度実施した技術構成は,1繊維試料のミクロトームによる裁断とその裁断サイズの最適化,2テラヘルツ分光分析による裁断した試料の濃度依存性測定と混紡率測定,および3取得したスペクトル情報の多変量解析(主成分分析)を用いた混紡率の定量測定法の検討である。特に,セルロースを主体とする植物由来繊維のテラヘルツ分光分析においては,セルロース結晶構造の識別が鍵となるが,この結晶度合いが凍結粉砕プロセスの頻度によって変化することを初めて確認し,結晶度の劣化を防止するため新たにミクロトームを用いた裁断方法を導入し,繊維の長さ方向に特定のサイズに裁断した場合に最も結晶度の良いテラヘルツスペクトルが得られることを確認した。さらに,この手法を用い2種類の繊維を一定の割合で混合した混紡試料を作製し,テラヘルツスペクトルの多変量解析(主成分分析)を行うことにより混紡率を高精度で分析できることを確認した。このプロセスは動物繊維にも適用しその有効性を確認した。本研究は,衣類の原料となる植物由来繊維である綿と,植物繊維を原料とした再生繊維(キュプラ,モダール,テンセル)を識別し,さらにこれら繊維の混合率を定量的に分析する新たな手法を見出すことを目的する。このため,本研究ではテラヘルツ波帯の電磁波を用いた分光分析によって,繊維中に内在する水素結合,分子間結合,および結晶構造に対応した格子振動のエネルギー状態を検出し,スペクトル情報を解析することにより新たな繊維種の識別手法見出そうとするものである。研究計画では,1繊維試料の凍結粉砕条件の最適化,2テラヘルツ分光分析による試料濃度依存性測定とデータベースの構築,および3取得したスペクトル情報の多変量解析,を予定していたが,1の繊維の凍結粉砕工程における繊維中の結晶セルロースに与えるダメージが凍結粉砕工程の頻度(加工時間)に応じて増加することが定量的に確認されたため,これに代わるプロセスとしてミクロトームを用い繊維種を100200μmの長さでカッティングした試料を用いる方針へと計画変更した。このカッティングプロセスを用いることにより,綿においてセルロースの結晶度がこれまでで最も高く,ほとんど結晶損傷を誘発しないテラヘルツスペクトルが得られることが明らかとなった。

この結果を受け,最終年度では繊維の均質化プロセスとしてカッティングプロセスを採用し,セルロース系繊維(植物繊維と再生繊維,およびそれらの混合繊維)のスペクトル情報を再取得し,これらのスペクトルデータを多変量解析することにより,統計的処理に必要なパラメータを選択し,セルロース系繊維種を高精度に識別し,さらに繊維種の混合率を23%の精度で定量的に識別できる技術を構築した。本研究はテラヘルツ分光法を用い、衣服等の原料となる繊維種において、これまで識別が困難であった同族繊維に関する識別方法を開発し、近年の偽装表示問題に対応可能な信頼性の高い新規な鑑別法を確立することを目的とした。このため凍結粉砕に代わるプロセスとして、ミクロトームを用い繊維を中心軸に垂直に一定の長さで切断するプロセスを採用し、得られたテラヘルツスペクトルの1次微分情報を多変量解析することによって、テラヘルツ分光分析による高い定量性を実現した。これによってこれまで困難とされた同族繊維(分子構造や成分がほとんど同じ繊維種)の新規な識別方法としての応用の可能性を見出した。本研究で計画したセルロース系繊維のテラヘルツ分光分析による識別手法については,昨年度までに行った凍結粉砕の最適条件の探索において新たな問題点が見つかり,凍結粉砕では安定なスペクトルが得られないことから,新規な裁断プロセスを採用しスペクトルデータベースを構築し直した。この手法ではハンドミクロトームを用い,繊維を長さ方向に特定のサイズに切断したときに安定なスペクトルが得られることを確認した。この手法は当初予定していたものではなく,実験を進める中で見出したものであり顕著な効果が期待されることから特許出願(PCT出願)を行った。この方法を用いて作製した試料のテラヘルツスペクトルを多変量解析し,特定の周波数帯を選ぶことにより繊維の混紡率を高精度に識別できることがわかった。この結果はすでにPCT出願し,国際会議に登録済みである。これらの技術は実用が見込まれるものであり当初の計画以上の進展であると思われる。一方,本年度は上記に示すようにセルロース系繊維にほぼ限定する形で研究を進めたため,動物繊維の識別に関しては当初の計画に対し遅れが生じた。電磁波工学各種繊維種のテラヘルツデータベースとスペクトル情報の多変量解析を用いた繊維種識別法を,未知の繊維種識別に適用するなどの実証試験を実施する。実施に当たっては検査協会などに協力を依頼し,本研究成果の新規な繊維種識別法が,検査協会が行っている検査に対して有効かどうかの検証試験を行う。当初の計画に含まれていた合成繊維の識別法については,従来法による中赤外分光分析で分析が可能であることから,本研究の対象から外した。合成繊維以外の繊維種については,対象とした繊維種数,凍結粉砕の最適条件と試料の作製手順の確立,テラヘルツ分光分析によるスペクトルデータベースの構築等においておおむね順調に進展しているものと思われる。ただし,スペクトルデータベースの構築においては試料作製条件の探索に時間を要したため,当初の計画よりは遅れが見られたものの,次年度予定しているテラヘルツスペクトル情報の多変量解析を試験的に取り入れ,統計的修理に必要なパラメータを抽出し,多変量解析(主成分分析およびクラスター分析)の有効性を確認できたことについては当初の計画以上の進展であった。
転写産物の大規模解析に基づく新規非コードRNAの発見,及び機能解析

カタボライト抑制とは生物のエネルギー生産の基盤となるコアなシステムであるが,その回路は種によって大きく異なる.今年度の研究目標は,その回路の進化的な保存性を解析する事によって,カタボライト抑制の進化的な獲得過程を解明する事であった.まず,ゲノムが解読された1,725生物種(真正細菌,古細菌,真核生物)の塩基及びタンパク質配列情報を用いて,グローバル転写因子,トランスポータ,代謝酵素,シグナル伝達経路といった糖代謝経路を構成する遺伝子群と,DNA結合モチーフ,cAMP結合モチーフ,RNAポリメラーゼ結合モチーフなどの機能ドメインについて,反復的なホモロジー検索手法とスペクトラルクラスタリングを組み合わせた独自の手法を用いて,遠縁なホモログ遺伝子を含めた進化的な保存性と各遺伝子間の相互作用の度合いを算出し,生物種毎に糖代謝制御モデルを構築した.その結果,大腸菌と酵母といった非常に遠い種間においても保存されているようなコア制御システムが予測された一方で,大腸菌と近縁な種間においても,従来報告されていたような,CRP依存型あるいはCre配列依存型といったような典型的な制御システムとは大きく異なる新たな制御システムの存在が示唆された.また一方で,昨年度までに次世代シーケンサを用いる事によって明らかにしたカタボライト抑制と関連した新規非コードRNA群についても,その進化的保存性を解析したところ,特にカタボライト抑制を支配する転写因子であるCRPやRNAとタンパク質の結合を促進するRNAシャペロンであるHfqのホモログ遺伝子と共に保存されている傾向が明らかとなった.これは非コードRNAが進化的に深くカタボライト抑制に関わっていることを示唆するものであり,いまだに大きな謎として残っている種間のカタボライト抑制システムの違いの起源を解明するための重要なヒントになることが期待される.当初の研究計画では,大腸菌及びその近縁種においてグローバル転写因子について解析する事が最終年の目標となっていたが,現在までに真正細菌と古細菌,「計1,657種とヒトやマウスを含む68種の真核生物を対象とした大規模な系統解析が完了し,さらに次世代シーケンサの解析結果と組み合わせる事で非コードRNAとグローバル転写因子の新たな相互作用も示唆する事ができた.従って当初の計画以上に研究は進展したと自己評価する.ChIP-seqやSELEXといったハイスループットな実験手法と組み合わせ,本研究によって予測されたグローバル転写因子が関与する新たな遺伝子発現制御システムや,グローバル転写因子と非コードRNAの新たな相互作用の検証を行いたいと考えている.また,これまで情報学的にしか出来なかった異種間横断的な解析についてもやはり次世代シーケンサを応用することによって分子生物学な手法をもって解明し,さらに異種間のコア制御システムを比較する事によって,進化の過程においてカタボライト抑制システムがどのように獲得されてきたのか,あるいは種特異的なシステムはどのように派生してきたのかを解明していきたいと考える。今年度の研究目標は,異なる糖源を用いて培養した大腸菌の各トランスクリプトームを次世代シーケンサ(Illumina/Solexa GAII)を用いて比較し,カタボライト抑制に関連したトランスクリプトームの動態を明らかにすることであった.特にsmall RNA(200塩基以下の非コードRNA)に着目して転写ネットワークを再構築したことが本研究の新規性である.本研究において,まずシーケンス結果の比較解析から,キシロース代謝に関わる複数の既知遺伝子に対して存在している新規cis-アンチセンスRNAが,既知遺伝子と同調して発現していることを初めて示唆することができた.一方で転写/翻訳系に関わる遺伝子群の発現が環境の変化に対して頑強性を示すことも改めて示された.さらに新規非コードRNA遺伝子を432個予測し,その多くがキシロース存在下において,著しく発現量を増加させていることを見いだした.これらの成果の第一の意義はカタボライト抑制という古典的な機構にsmall RNAが大きく関わっていることを示したことにある.複数の糖源の混合培地において,大腸菌が使用する糖源を切り替える際に生じる遅延期の長さは糖源によって大きな差異があるが,その原因はいまだ解明されていない.今回示唆した新規非コードRNAがキシロース代謝に関わる遺伝子の発現を制御し,カタボライト抑制の強弱に影響を及ぼしていることが想像され,カタボライト抑制のより深い理解につながることが期待される.またトランスクリプトームの定量的な情報を得たことにより,各遺伝子の発現量が培養条件の違いによって大きく変動する中でtRNAとコドン使用頻度の相関が保たれていることを改めて示すことができたように,今回得た大腸菌におけるsmall RNAの網羅的シーケンス結果は非常に応用範囲が広く,今後公共性の高いデータベースに集約されることが期待される.今年度の研究目標は,糖源を変えた場合の遺伝子発現の変化を大腸菌,及びその近縁種において比較することにより,カタボライト抑制に関連した遺伝子群について進化的な考察を行うことであった.まず,ゲノムが解読された1200種以上のバクテリアゲノム情報を用いて,カタボライト抑制に関わる遺伝子群の保存性を調べた.従来,グラム陰性菌はCRP依存型,グラム陽性菌はCre配列依存型といったように,カタボライト抑制は独立した制御システムによってなされているものであると理解されてきた.しかしながら今回の解析の結果,その両方の遺伝子群を持つ種や,逆に,大腸菌や枯草菌と同じような環境に住む近縁種においてもどちらの遺伝子群も保存されていない種が存在することが明らかになった.これはそれぞれの制御システムが進化的に独立に獲得されてきたものではないこと,また知られているカタボライト抑制のシステム以外にも未知のシステムが存在することを示唆するものである.