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子供靴選択時の意識と機能性に関する認識-日本とドイツの消費者および教育者の比較-

靴は人間の立位を支え、歩行を担う重要な道具である。なかでも子供靴は、発育期にある子供の身体や足の成長を助け、十分な運動を保障する上で非常に重要な役割を果たしている。本研究では子供靴選択時の意識と機能性に関する認識を、日本とドイツの消費者および教育者を対象に調査し多くの問題点を明らかにした。日本国内の調査では、全国(関東・中部・近畿・中国・四国・九州)幼稚園18園、保育園5園の保護者2,812名(回収率70%)を対象とした調査をおこなった。幼児靴の選択にあたって日本の保護者はほとんどその重要性を認識しておらず、安易な購入をしており、多くの子供たちが足に合わない靴を履かされていた。したがって早くから足のトラブル症状を訴えるものが多くみられた。保育士の調査からも靴は機能性よりも脱ぎ履きの速さを重視する傾向がみられた。また、市場調査からも靴販売店に専門のシューフィッターが置かれておらず、靴の機能性が十分アドバイスされないまま、安価な靴や子供の目を引くキャラクターものの靴が大量に販売されていた。ドイツにおける調査では、ベルリン、デュッセルドルフ、フランクフルト、フライブルク、ミュンヘンの5地域で市場調査と小学校、幼稚園、保育園調査を行った。また子供靴メーカーのリコスタ社、整形靴工房テュルクスタジオを視察し、ドイツの靴事情を明らかにした。小学校保護者を対象にしたアンケート調査から、わが国と比較すると子供も保護者も足のトラブル症状は非常に少なかった。靴は体を支える重要な役割があるから、足と靴はしっかり固定させることが大切であるという認識が家庭教育のなかで既にあり、紐靴が最も良い靴であると答えていた。しかし最近では、年齢が上がるとドイツにおいてもマジックベルトの靴やスポーツブランドの靴を好む傾向がみられるようになってきていた。(1)「親たちの子供靴選びに対する意識」を探ることを目的とし、子供靴の機能性への認識の程度、成長と経済性から見た子供靴購入の現状、子供靴のサイズ適合性、足に関するトラブルの実態等について、まず日本国内におけるアンケート調査を実施した。調査地域は群馬県から福岡県におよぶ幼稚園18園、保育園5園に協力を得、計3,829名の保護者対象に実施し、2,812名から回答を得た。回収率は約70%であり、保護者の子供靴に対する関心の高さが伺えた。データは現在集計解析中である。また、平成16年度に実施予定のドイツでのアンケート調査に向けて、フランクフルト・デュッセルドルフ・フライブルク・ミュンヘン・ベルリンの現地校および園への視察、およびドイツ国内の子供靴メーカーや流通小売事情の事前調査に赴いた。その結果、幼少期の子供靴選びのシステムが確立されている点は日本とは異なったが、小学生以上のヒップホップ系フアッションの流行が、子供靴の選び方や履き方にも影響しており、子どもの足の健康に悪影響を及ぼしている可能性があるのではないか懸念された。この点は日本とも共通した問題点であり、今後さらに検討を行っていく予定である。(2)「教育者の目から見た子供靴の現状」を探ることを目的とし、教育者自身の足と靴に関する知識と意識、教育の中での具体的な取り組みについてのアンケート調査実施準備を行った。この事前調査として、前述のアンケート実施ドイツ現地校および園に赴き、現場の教諭および保育士にドイツでの足と靴に関する教育や教育者自身の意識について聞き取り調査を行った。その結果、ドイツでは子どもの足の機能性を考えた靴選びの文化が根付いているが、昨今の世界的な簡易便利を良しとする風潮に流され、学校や保育の現場でも、簡易便利な靴選びやスポーツブランドが幅を利かせる靴選びが主流になりつつあり、問題視されていることが明らかになった。

(1)「親たちの子供靴選びに対する意識」を探ることを目的とし、ドイツ3地域の計3小学校の保護者338名を対象に調査を実施した。その結果、普段履く靴のタイプは紐靴がほとんどで、留め具のない靴はほとんど履かれていない。靴購入時の重視点はフィット性と子供の足の健康であり、シューフィッターなどのいる靴専門店で足のサイズを測って購入している。普段の靴一足の平均購入価格は6570円であり、わが国の平均価格よりかなり高い。靴購入時の不満では価格の高さと答えている者が多いが、中古靴を履かせる者はほとんどいない。子供の足の健康には非常に関心があると答えており、足のトラブル症状に対しては、専門家のいる靴店で靴を選ぶ、病院で受診していると答えていた。子供が最初に履いた靴を6割近くの者が大事に残しているのも靴文化の違いであろう。以上のように、ドイツにおける子供靴選択の実態から、日本とは異なる状況を明らかにすることができた。(2)「教育者の目から見た子供靴の現状」を探ることを目的とし、愛知県下の公立保育園25園に勤務する保育士138名を対象とした調査を行った。その結果、園児の足の健康について、保育士の2割が非常に気になると答え、やや気になるを合わせると9割近くが気になると答えていた。園児の足の症状では靴ずれ、偏平足などを指摘しているが、それらが靴に原因があると考えているのは靴ずれのみで、他の症状はあまり靴に原因があるとは考えていない。幼児に適した靴のタイプを、留め具のない靴とした者が34%もあった。幼児の靴と足の関係あるいは靴の履き方について、これまでに教わったことがあるという者が83%であったが、これもマスコミ等の情報でというあいまいな知識であり、足の健康と靴の関係を正しくとらえた者とは思われなかった。以上のように、保育現場における日本の子供靴の新たな問題点と今後の課題を把握することができた。
機能的コンポーネントを有するマイクロ化学デバイスに関する研究

本研究は,主として医療に用いるためのディスポーザブルなマイクロ化学デバイスを実現するため,新しいキーコンポーネントの創出と,コンポーネントを組み込んだデバイス制御技術およびデバイス作製技術の確立を目指す.本年度は以下のコンポーネントおよびデバイス化技術に関して研究を進め,それぞれ新しい成果を得た.1)サンプルの複数チャンネルへの定量分離を行うための,可動部のないマイクロバルブ.ガラス基板上でのマイクロヒータによる実験をベースに,本年度は樹脂基板上にマイクロヒータを組み込んだ実験を行い,プラスティック基板への蒸着によるマイクロヒータおよび電極形成,プラスティック成形した流路との組み合わせによるマイクロバルブの動作実験を行い,基本性能を確認した.2)遠心分離を必要としない血球分離マイクロフィルタ.マイクロ柱状構造を用いて,血漿成分は通過するが血球成分はフィルタ全面で捕獲できる迷路構造を提案し,フォトリソグラフィにより作製し,原理実証を行い,血球分離を確認した.その成果を特許出願した.3)サンプルと試薬の効率のよいマイクロ混合器.流路に微細構造を組み込み,流体に回転力を付加し,流体を[90°回転-分岐-90°回転-合流]すると2層流を4層流変換できる.このユニットを並列接続し,2層流-8層流変換流路を実現した.4)基板材料を樹脂とし,樹脂の持つ可塑性を生かしたディスポーザブルなインプリント作製技術.無電解めっきとフォトリソグラフィーを組み合わせ,流路のマイクロ金型作製を行った.プロセスを工夫し,流路中の微細構造を有するマイクロ金型作製が可能となった.さらに樹脂成形装置の改良を行い,金型を用いた樹脂成形と,蓋の熱圧着を行い,オールプラスチック化の目処を得た.本研究は,主として医療に用いるためのディスポーザブルなマイクロ化学デバイスを実現するため,新しいキーコンポーネントの創出と,コンポーネントを組み込んだデバイス制御技術およびデバイス作製技術の確立を目指す.本年度は以下のコンポーネントおよびデバイス化技術に関して研究を進め,それぞれ新しい成果を得た.1)サンプルの複数チャンネルへの定量分離を行うための,可動部のないマイクロバルブ.ガラス基板上でのマイクロヒータによる実験をベースに,本年度は樹脂基板上にマイクロヒータを組み込んだ実験を行い,プラスティック基板への蒸着によるマイクロヒータおよび電極形成,プラスティック成形した流路との組み合わせによるマイクロバルブの動作実験を行い,基本性能を確認した.2)遠心分離を必要としない血球分離マイクロフィルタ.マイクロ柱状構造を用いて,血漿成分は通過するが血球成分はフィルタ全面で捕獲できる迷路構造を提案し,フォトリソグラフィにより作製し,原理実証を行い,血球分離を確認した.その成果を特許出願した.3)サンプルと試薬の効率のよいマイクロ混合器.流路に微細構造を組み込み,流体に回転力を付加し,流体を[90°回転-分岐-90°回転-合流]すると2層流を4層流変換できる.このユニットを並列接続し,2層流-8層流変換流路を実現した.4)基板材料を樹脂とし,樹脂の持つ可塑性を生かしたディスポーザブルなインプリント作製技術.無電解めっきとフォトリソグラフィーを組み合わせ,流路のマイクロ金型作製を行った.プロセスを工夫し,流路中の微細構造を有するマイクロ金型作製が可能となった.さらに樹脂成形装置の改良を行い,金型を用いた樹脂成形と,蓋の熱圧着を行い,オールプラスチック化の目処を得た.マイクロ化学デバイスに関する研究ディスポーザブルな血液分析に用いるマイクロ化学デバイスに組み込む各コンポーネントの研究開発状況について報告する。1.マイクロバルブマイクロ流路中にマイクロヒーターと樹脂による微細構造を形成し、ヒーターの加熱条件と樹脂微細形状の変形状態を観察し、最適条件として1.5ジュールのエネルギーで最適にマイクロバルブが駆動することを確認した。2.マイクロフィルタマイクロフィルタを実現するための微細構造を形成するため、フォトグラフィー用マスク製作を行った。3.マイクロミキサマイクロ流路においては低レイノルズ数において層流になることから、マイクロ流路内における流体を回転させるための流路内の微細構造形成を行った。流路底面に斜め方向の微細繰り返し構造を設けることにより、効率よく短い距離にて流体が回転することを、実験と流体シミュレーションを用いた解析の両面から確認した。今後この構造を組み合わせて新しい流体マイクロミキサの提案と、実現のための実験を進める予定である。4.マイクロ金型フォトリソグラフィーを用いた厚膜レジストのパターニングとNi無電解メッキにより、マイクロ流路パターンを有するマイクロ金型作製実験を行った。当初厚膜フォトレジストのメッキ液による剥離が顕著であったが、条件設定により回避し、Ni基板上にNiパターンの形成が可能になった。金型パターンは幅100μm、高さ50μmのパターン化した流路でマイクロ金型の製作が可能となった。5.マイクロ樹脂成形加熱加圧による樹脂の熱成形を行うための、ダイセットを用いた手動による成形装置を設計製作した。成形のための樹脂には、軟化点が低く成形が容易でかつ生体への影響の少ないポリエチレンテレフタレート(PET)を使用した。i)圧力、ii)温度、iii)時間をパラメータとして最適化を行い、加熱温度、加熱冷却のプロフィルを最適化することにより、金型の微細構造をほぼ正確に転写できることを確認した。機能的マイクロコンポーネントを有するマイクロ化学デバイスに関する研究ディスポーザブルな血液分析に用いるマイクロ化学デバイスに組み込む各機能的コンポーネントおよびデバイス作製に関する研究開発状況について報告する。

1)マイクロバルブマイクロ流路中にマイクロヒーターと樹脂による微細構造を形成し、マイクロヒーターによる加熱および樹脂変形の様子を観察した結果、単純化した微細構造で流路が変形し、バルブとしての性能を確認した。2)マイクロフィルタマイクロフィルタを実現するための新しい迷路様微細構造を考案し、微細構造を形成するためのフォトグラフィー用マスク製作を行った。3)マイクロミキサマイクロ流路においては低レイノルズ数において層流になることから、マイクロ流路内における流体を回転させるための流路内の微細構造形成を行った。微細構造により流体が回転することを実証し、90°回転する微細構造と流路の分岐合流を組み合わせることにより、シンプルな構造で2層流を4層流に変換する流路を実現し、多層流化の可能性を実証した。4)マイクロ金型フォトリソグラフィーを用いた厚膜レジストのパターニングとNi無電解メッキにより、マイクロ流路パターンを有するマイクロ金型作製実験を行った。無電解メッキプロセスを改良することにより、レジストの剥離がなくなり、メッキの質が向上した。5)マイクロ樹脂成形加熱加圧による樹脂の熱成形を行うための、ダイセットを用いた成形装置の改良を行った。ダイセットの加圧にステッピングモータを用いて、加圧ばらつきの少ない、再現性のよい加圧を実現できた。本研究は,主として医療に用いるためのディスポーザブルなマイクロ化学デバイスを実現するため,新しいキーコンポーネントの創出と,コンポーネントを組み込んだデバイス制御技術およびデバイス作成技術の確立を日的とする.本研究では以下のコンポーネントおよびデバイス化技術に関して研究を進め,それぞれ新しい成果を得た.1)サンプルの複数チャンネルへの定量分離を行うための,可動部のないマイクロバルブ.ガラス基板上でのマイクロヒータによる実験をベースに,本年度は樹脂基板上にマイクロヒータを組み込んだ実験を行い,プラスティック基板への蒸着によるマイクロヒータおよび電極形成,プラスティック成形した流路との組み合わせによるマイクロバルブの動作実験を行い,基本性能を確認した.2)遠心分離を必要としない血球分離マイクロフィルタ.マイクロ柱状構造を用いて,血漿成分は通過するが血球成分はフィルタ全面で捕獲できる迷路構造を提案し,フォトリソグラフィにより作製し,原理実証を行い,血球分離を確認した.その成果を特許出願した.3)サンプルと試薬の効率のよいマイクロ混合器.流路に微細構造を組み込み,流体に回転力を付加し,流体を[90°回転-分岐-90°回転-合流]すると2層流を4層流変換できる.このユニットを並列接続し,2層流-8層流変換流路を実現した.4)基板材料を樹脂とし,樹脂の持つ可塑性を生かしたディスポーザブルなインプリント作製技術.無電解めっきとフォトリソグラフィーを組み合わせ,流路のマイクロ金型作製を行った.プロセスを工夫し,流路中の微細構造を有するマイクロ金型作製が可能となった.さらに樹脂成形装置の改良を行い,金型を用いた樹脂成形と,蓋の熱圧着を行い,オールプラスチック化の目処を得た.
ホログラフィックX線回折イメージング法による単細胞藻類細胞分裂機構の研究

細胞分裂の構造基盤を、特にオルガネラ相互作用に焦点を当てて明らかにすることを目指し、X線レーザーを利用したホログラフィック回折イメージング法の開発と単細胞紅藻の構造研究を行った。間期と分裂期の紅藻細胞を有効分解能110200 nmでイメージングし、複数個体について共通のオルガネラ構造を認めることができた。また、オルガネラ分裂の様子や核内電子密度分布の変化を非侵襲・無染色で可視化することができた。SACLAで単細胞紅藻の低温ホログラフィックX線回折イメージング実験を行った。半値全幅1.5 μm程度に集光したXFELシングルショットでのホログラムを取得し、本研究提案手法により投影電子密度像を再生した。細胞分裂間期および分裂期の個体の投影電子密度像を有効分解能110200 nm程度で取得し、葉緑体やミトコンドリアの分裂の様子や細胞核内の電子密度分布変化を非侵襲かつ無染色で可視化することに成功した。また、SACLAでの実験で取得される膨大な回折パターンから解析に適切なホログラムを選別するため、本研究で提案する解析アルゴリズムを応用した、ホログラム選別ソフトウェアを開発した。本ソフトウェアにより試料面積およびregion of interest内の総回折強度、最高空間周波数等に基づいたデータ選別を行い、良質なデータを選出することができた。シングルショットホログラム取得効率の向上に向けて、本手法に適当な大きさ2 μm以下の細胞の分離技術、細胞と参照光源を適切に配置した試料の作製技術の開発を行った。前者では濾過カラムを利用した方法で良好な結果が得られたが、細胞懸濁液の濃度が著しく希釈される問題が生じた。現在、濾過・濃縮システムを構築しているところである。後者については半導体プロセス技術を応用し、試料支持基板上に直接参照光源を成形した。SACLAでのホログラフィックX線回折イメージング実験を行い、得られたホログラムの解析を進めているところである。細胞分裂間期および分裂期の細胞像取得に成功し、申請当初の計画通りの進度である。今後の研究を円滑に進める上で必要なホログラフィックX線回折イメージング実験用試料基板も開発方針が決まり、順調に高度化を進めている。本研究では、細胞分裂機構の構造基盤を、特にオルガネラ間の相互作用に焦点を当てて明らかにすることを目指し、ホログラフィックX線回折イメージング法の開発と原始単細胞紅藻の構造研究を行った。X線自由電子レーザー施設SACLAにて、光子エネルギー5.5 keVのXFELパルスを半値全幅1.5 μm程度に集光して、凍結水和状態の原始単細胞紅藻のシングルショットホログラムを取得し、本研究提案手法により投影電子密度像を有効分解能110200 nm程度で再生した。複数個体の構造比較から細胞核の異方的な形状や不均一な密度分布が共通して認められた。また、細胞分裂間期および分裂期の個体の投影電子密度像を比較し、オルガネラ分裂の様子や核内電子密度分布の変化を非侵襲・無染色で可視化することができた。より詳細な構造比較に向けて、シングルショットホログラム取得歩留まりの向上を目指し、参照光源をパターニングした試料基板の開発を進めた。参照光源は照射野に複数入るよう配置し、試料由来の回折波と参照光源群由来の回折波の干渉による回折シグナルの増強とそれによる空間分解能の向上も図った(Takayama et al., Sci. Rep. 5, 8074 (2015))。開発した試料基板でホログラフィックX線回折イメージング実験を行い、26 nmを超える空間分解能までホログラムを観測できた。また、位相回復計算においてマイクロ集光XFELパルスの波面形状を考慮することで、従来は像を再生できなかったホログラムからも参照光源像を再生することに成功した。本手法に適当なサイズの細胞の分離技術や参照光源を成形した試料基板の開発を引き続き進め、細胞像取得効率の向上を図る。本技術開発を通じて比較解析に十分な数の試料像を収集し、構造解析を行う。X線イメージング
ルネサンス期「パンフレ文学」に於ける悪魔化・魔女化の問題-文学の政治性を巡って-

広義のパンフレ文学として、16世紀後半のフランスでおさたジャン・ボダンとヨーハン・ヴァイヤーの論争にまず焦点をあてた。その前提として、両者の魔女観や思考スタイルの違いを浮き彫りにすべく、各々の主著に的を絞って分析し、違いを極立たせた.その上でボダンがヴァイヤーを本物の魔女とみなし、彼に「被告不在の論告文」を投げつけた。というのが我々の得た結論である。この見解は今までになされたことのない独創的かつ説得力あるものと自負している。又,パリ国立図書館でも、その他多くのパンフレを収集し、エルヴェ,グーラール,ベーズ...らの聖体を巡る論考と悪魔視の問題にも着手しはじめたが、これを論文として形にできるのためには、まだ1年ほど必要だと思われる。引き続き研究を進めていく予定である。本年度は様々な文献の充実をはかると同時に、一次的文献の読解作業にも取り掛かった。その成果の一部を論文の形で発表している。「16世紀のモンテスキュ-」と呼ばれたジャン・ボダンが、主にドイツ語圏で活躍した同時代人の医者ヨ-ハン・ヴァイヤ-を標的にした「論駁文」に先ず着目した。ボダンの『魔女の悪魔狂』とヴァイヤ-の『魔女論』の双方とに照らし合わせながら、ボダンの「論駁文」というテクストの特性を探っていった。その結果、これは単なる反駁のために記されたものではなく、ヴァイヤ-を正真正銘の魔女として告発する「告発文」であること、従って厳密に司法的な枠組みの中で記されていることが明らかとなったのである。この研究に対しては、1999年10月に東京大学大学院人文社会系研究科より博士の学位を授けられている。また、ヴァイヤ-のテクストの特殊性についても、『青山フランス文学論集』に寄せた論文「ヨ-ハン・ヴァイヤ-:魔女学の論理から文学へ」の中で詳しく論じ、このテクストが、他のパンフレ的テクストとは大いに異なり、「物語的側面」を色濃く有している点を明らかにしている。また、「パンフレ的」文学の代表作であるアグリッパ・ド-ビニエの『悲壮曲』の分析を行い、これに関する論文を準備しているところである。さらに、カトリック、プロテスタント双方の「パンフレ文学」のテクストを少しずつ入手し、そこに見られる敵の「魔女視」の問題という観点から分析を進めているところである。これらについては、来年度に研究成果を公表したい。
遺伝子治療を用いた小腸移植の新しい戦略

本研究ではアデノウィルスベクターを用いた遺伝子治療によりT細胞の活性化・増殖に重要なB7-CD28およびCD40-CD154の副刺激(costimulatory signal)をブロックすることで移植小腸アログラフトの長期生着が得られ、本遺伝子治療による免疫抑制法が小腸移植において非常に有効であることを報告した。しかし、欧米でのアデノウイルスを用いた遺伝子治療で合併症例が報告され、より安全な免疫抑制という観点から遺伝子治療の開発は断念せざるを得なかった。新しいLeflunomide誘導体FK778/FK779およびNF-κB阻害剤DHMEQは小動物移植実験においてアログラフトの生着延長効果が認められ、これらの免疫抑制剤としての有効性が示された。また、小動物やイヌを用いた実験で脂質過酸化は臓器虚血再灌流傷害の程度を反映し、ラジカルスカベンジャーEdaravoneなどはその傷害軽減に有用であることが示された。更に前述のDHMEQは小腸虚血再灌流傷害モデルにおいて再灌流後の組織血流を維持し傷害による動物の死亡率を有意に低下させた。小腸移植における新しい治療戦略を確立するためには今後更なる研究が必要であるが、特にB7-CD28およびCD40-CD154副刺激遮断剤やNF-κB阻害剤は免疫抑制及び虚血再灌流傷害抑制に有効で、臨床小腸移植への応用が期待されるものと考えられた。先ずマウスCTLA4Ig及びCD40Ig組込み5型アデノウイルス(AdCTLA4Ig及びAdCD40Ig)を作成した。同所性小腸移植モデルにおいてウイルスを移植直後にレシピエント陰茎静脈より単回投与(1×10^9pfu)し、血中CTLA4Ig濃度およびCD40Ig濃度を測定した(ELISA法)。移植後510日でCTLA4IgおよびCD40Igが最高血中濃度(CTLA4Ig:300μg/ml以上、CD40Ig:1000μg/ml以上)に達した。これら血中濃度はピークに達した後漸減したが、数週間に渡り比較的高値に維持された。続いてBNラット(RT1^n)からLEWラット(RT1^l)への同所性小腸移植モデルでAdCTLA4Ig及びAdCD40Igの効果を検討した。LacZ遺伝子組込みウイルス(AdLacZ)をコントロールベクターとして用いた。各々のベクターは移植直後にレシピエント陰茎静脈より1×10^9pfuを単回投与した。グラフトの生着期間は移植からレシピエント死亡までの期間とし、各群をn=6で作成した。無治療群およびAdLacZ投与群のグラフトは全例2週間以内に拒絶され、グラフト生着期間の中央値は共に10.5日であった。AdCTLA4Ig投与群では、6例中3例のグラフトが100日以上生着し、グラフト生着期間の中央値は>60.5日とAdLacZ投与群のものに比し有意に延長した。また、AdCD40Ig投与群のグラフト生着期間中央値は21.5日と軽度の延長に留まったが、6例中2例のグラフトが100日以上生着した。グラフトの病理組織学的検討で、コントロール群では移植後7日目に移植小腸内へ広範なリンパ球浸潤と絨毛の破壊像を認め、典型的な急性拒絶反応像を呈していたが、AdCTLA4Ig及びAdCD40Ig投与群では、グラフトのリンパ球浸潤は抑制され粘膜絨毛には保たれていた。昨年度、本研究において我々はアデノウィルスベクターを用いた遺伝子治療によりT細胞の活性化・増殖に重要なB7-CD28およびCD40-CD154の副刺激(costimulatorysignal)をブロックすることで移植小腸アログラフトの長期生着が得られ、本遺伝子治療による免疫抑制法が小腸移植において非常に有効であることを報告した。しかし、最近欧米でのアデノウイルスを用いた遺伝子治療で合併症例が報告され、より安全な免疫抑制という観点から遺伝子治療の開発は断念せざるを得なかった。

そこで今年度は慶應義塾大学の梅澤らが最近開発したNuclear factor-κB(NF-κB)阻害剤であるdehydroxymethylepoxyquinomicin(DHMEQ)を用い、小腸の虚血再灌流障害に対する効果を検討した。NF-κBは炎症惹起因子である敗血症、活性酸素などの刺激により腸管で活性化され、炎症反応に関わるサイトカイン、接着因子、ケモカイン、growthfactor、や炎症誘導酵素であるcyclooxygenase-2、NO合成の誘導などに関わっていることが知られている。体重250300gの雄性ラットを用いた60分の小腸虚血再灌流モデルを作成した。実験群は無治療群をコントロールとし、治療群は血流遮断1時間前と再灌流5分前にDHMEQ(10mg/kg)を腹腔内投与した。動物生存日数、レーザードプラー血流量計による小腸組織血流量、組織学的障害度、血液中のIL-6,TNF-α濃度を測定・検討した。無治療群で25%(2/8)の生存に対し治療群では87.5%(7/8)と有意に生存日数の延長を認めた。治療群では無治療群に比べ再灌流5および60分後の組織血流量が維持され、再灌流15分後の組織障害も有意に抑制されていた。また、血液中のIL-6,TNF-α濃度上昇も抑制された。DHMEQによるNF-κB阻害は小腸の虚血再灌流障害抑制に有用である。昨年、新しいNF-κB阻害剤であるDehydroxymethylepoxyquinomicin (DHMEQ)を用い、小腸虚血再灌流障害におけるNF-κB活性阻害の効果を検討した。今年度は本剤によるNF-κB活性阻害が急性拒絶反応を抑制し得るか検討した。C57BL/6マウスT細胞を抗CD3抗体+抗CD28抗体で刺激するin vitro実験では、DHMEQ(1-10μg/ml)を細胞培養液中に添加するとCD4+T細胞上の活性化表面マーカーであるCD69、CD25の発現および増殖(^3H-Thimidine uptake)は用量依存性に抑制された。また、T細胞活性化に伴い産生されるIL-2やIFN-γなどのサイトカインも抑制された。これらの所見はアロ脾細胞を用いた混合培養の系でも同様であった。BALB/c(H-2^d)からC57BL/6(H-2^b)への全MHCミスマッチマウス心移植モデルにおいて、DHMEQ(10-40mg/kg)を2週間(連日)もしくは4週間(週3日)投与したところ、グラフトへのT細胞浸潤は抑制され、その生着期間は用量依存性に延長した。更に、tacrolimusとの併用によりNFATをNF-κBを同時に阻害する事で、in vitroおよびin vivoにおいて相乗もしくは相加効果が認められた。DHMEQによるNF-κB阻害では、虚血再灌流障害のみならず急性拒絶反応も抑制することが見いだされ、小腸移植において将来的に本剤の臨床応用が期待される。
膵炎発症における小胞体ストレスの関与と新規治療法の検討

急性膵炎発症時の小胞体(ER)ストレスの関与とその軽減による治療効果について検討した。セルレインとリポポリサッカライドを投与してマウス急性膵炎モデルを作製し、セルレイン初回投与から24時間後の血清アミラーゼと炎症性サイトカイン、膵炎組織像、膵臓のERストレス関連蛋白について検討した。対照膵炎群ではGRP78、CHOPが増加した。膵炎誘導後にeIF2α脱リン酸化阻害薬を投与した群では膵炎の軽減、リン酸化eIF2α、ATF4の増加とGRP78、CHOPの減少を認めた。蛋白合成の抑制やATF4を介したERストレス誘導蛋白の増加が膵炎を軽減したと考えられ、膵炎の有効な治療法となりうることが示された。膵臓は体内で最も蛋白合成の盛んな臓器のひとつで、膵腺房細胞では消化酵素を含めた多量の蛋白合成が行われる。それ故、膵炎を引き起こすような過剰な刺激は容易に腺房細胞の小胞体機能障害につながり小胞体ストレスを引き起こすと推定される。膵炎発症における小胞体ストレスの関与について、セルレイン/リポポリサッカライド(LPS)を投与して作製したマウス実験的膵炎モデルを用いて検討を行った。膵炎群では対照群と比較して膵臓で小胞体ストレス関連蛋白の発現が増加していた。生体には小胞体ストレス応答経路の一つであるeukaryotic initiation factor-2α(eIF2α)のリン酸化を介して蛋白合成におけるmRNAから蛋白の翻訳を制御する防御機構が存在する。膵炎マウスにeIF2aの脱リン酸化抑制薬を投与して膵炎の重症化について検討したところ、薬剤投与群では無治療群と比較して炎症性サイトカイン上昇が抑制され膵炎の軽減が認められた。膵炎の軽減機序についてさらに解析するためにマウスの単離膵腺房細胞を用いて検討を行った。単離膵腺房細胞を用いた実験においても、動物実験と同様にセルレイン/LPS添加により細胞培養上清中の炎症性サイトカインが増加し、腺房細胞における小胞体関連ストレス蛋白の発現増加が認められた。培養液中にeIF2aの脱リン酸化抑制薬を添加することにより、炎症性サイトカイン増加および小胞体ストレス関連蛋白の発現増加が抑制された。以上の結果より、実験的膵炎モデルを用いた検討と同様に単離膵腺房細胞を用いた実験においても、薬剤投与でUPRを増強させることにより膵炎が軽減することが示された。急性膵炎は多彩な臨床像を呈する膵臓の急性炎症で、重症例では依然として致命率が高く臨床的に重要な課題である。慢性膵炎は炎症細胞浸潤を伴う膵臓の線維化と膵腺房細胞の変成・脱落が非可逆的に進行し末期には膵内外分泌機能不全に至る病態で、膵癌の危険因子と考えられている。膵臓は蛋白合成の盛んな臓器のひとつで、膵腺房細胞に対する様々な過剰刺激は、蛋白合成に関与する小胞体内への異常蛋白の蓄積をもたらし、小胞体の機能異常(小胞体ストレス)につながると推定される。本研究ではマウスにセルレイン/リポポリサッカライド(LPS)を投与して実験的膵炎モデルを作製し、膵炎発症における小胞体ストレスの関与について検討した。セルレイン/LPS投与群では、セルレイン単独群と比べて血清アミラーゼ上昇を伴った膵炎の重症化が認められ、血中炎症性サイトカインもセルレイン単独群と比べて高値であった。膵炎組織のウエスタンブロッティングの検討では、コントロール群と比較してセルレイン膵炎発症群で小胞体ストレス関連蛋白の発現が増加しており、LPS併用群ではより高い傾向を認めた。生体には小胞体ストレスに対する応答(UPR)の一つにeukaryotic initiation factor 2-α(eIF2-α)のリン酸化を介して蛋白合成におけるmRNAから蛋白の翻訳を制御する防御機構が存在する。上記膵炎マウスにeIF2-αの脱リン酸化抑制薬を投与して膵炎の重症度の変化について検討した。薬剤投与群では無治療群と比較して血中炎症性サイトカイン上昇が抑制され膵炎の軽減が認められた。治療群では無治療群と比較して膵組織におけるリン酸化eIF2-αの発現が高かった。以上の結果より、膵炎を発症した膵組織では小胞体ストレスが亢進しており、薬剤投与でUPRを増強させることにより膵炎が軽減することが示された。膵臓では腺房細胞やランゲルハンス島で消化酵素やホルモン産生が活発に行われており、体内で最も蛋白合成の盛んな臓器の一つである。膵腺房細胞に対する過剰な分泌刺激は、蛋白合成を促すと同時にその合成過程で生じる異常蛋白の蓄積により小胞体の機能障害(小胞体ストレス)を引き起こすと推定される。セルレイン投与によるマウス実験的

膵炎モデルを用いて膵炎発症における小胞体ストレスの関与を検討した。これまでの検討では、セルレインにリポポリサッカライド(LPS)を併用投与した群では、セルレイン単独投与と比べて血清アミラーゼ上昇を伴った膵炎の重症化が認められ、血中炎症性サイトカインも併用投与群で高値であった。膵炎組織のウエスタンブロットの検討では、コントロール群と比較してセルレイン膵炎群で小胞体ストレス関連蛋白の発現が亢進しており、LPS併用群でより高い傾向を認めた。小胞体ストレスに対する生体防御応答の一つにeukaryotic initiation factor-2a (eIF2a)のリン酸化を介して蛋白合成過程でのmRNAから蛋白翻訳を制御する防御機構が存在する。膵炎マウスにeIF2aの脱リン酸化抑制薬を投与して膵炎の重症度について検討した結果、薬剤投与群では無治療群と比較して炎症性サイトカイン上昇が抑制され膵炎の軽減が認められた。ウエスタンブロットでの検討では薬剤投与群でリン酸化eIF2α、リン酸化eIF2α/eIF2α比の増加と小胞体ストレスマーカーGRP78の低下を認めた。今年度はPERK経路シグナルの増強と膵腺房細胞のアポトーシスとの関連について検討した結果、薬剤投与群で腺房細胞のアポトーシスの減少と小胞体ストレス関連アポトーシス因子であるCHOP蛋白の発現低下を認めた。以上より、PERK経路シグナルの増強は小胞体ストレス軽減を介した膵炎治療の選択肢になる可能性があると考えられた。消化器内科学、特に自己免疫消化器疾患単離膵腺房細胞を用いた実験に加えて、野生型マウスを用いたセルレイン/LPS誘発膵炎モデルの実験においてeIF2a脱リン酸化抑制薬の投与量の変化による膵炎改善効果の追加検討を行ったため、遺伝子改変マウスを用いた検討は十分に行えなかった。野生型マウスを用いたセルレイン/LPS誘発性膵炎モデルにおける小胞体ストレスの検討は実験計画通り順調に進行した。さらに、膵炎発症時の小胞体ストレス軽減による膵炎の改善効果について、eIF2-α脱リン酸化抑制薬を用いてPERKシグナル経路を介したUPRの増強による治療介入実験を行い予想された治療効果が得られた。平成24年度に予定していた遺伝子改変マウスを用いた動物実験は、研究期間後半に大学・研究施設・動物飼育施設の移転があったため行えなかった。1.遺伝子改変マウス(C57BL/6由来CD4, CD8, RAG2各欠損マウス)にセルレイン/LPSを投与して、免疫不全状態での膵炎発症と小胞体ストレスの検討を行う。2.野生型マウスを用いてエタノール/LPS投与によるアルコール性膵炎モデルを作製して、血中炎症性サイトカインの動態と小胞体ストレスについて検討する。3.野生型マウスを用いたアルコール性膵炎モデルを用いて、小胞体ストレスを軽減させる薬剤を投与して膵炎軽減効果について検討する。1.遺伝子改変マウス(C57BL/6由来CD4、CD8、RAG2各欠損マウス)にセルレイン/LPSを投与して免疫不全状態での膵炎発症と小胞体ストレスの検討を行う。2.野生型マウスを用いてエタノール/LPS投与によるアルコール性膵炎モデルを作製し血中炎症性サイトカインの動態と小胞体ストレスについて検討を行う。
体外肺潅流技術を用いた、傷害のあるドナー肺の評価とその治療への挑戦

肺移植におけるドナー不足を解消する手段として、マージナルドナー肺などの「障害ドナー肺」の利用が必須である。障害ドナー肺の安全な利用のためには、ドナー肺の質を移植前に正確に評価する必要がある。そこで、体外肺潅流(EVLP)を用いてドナー肺の質を移植前に正確に評価し、さらに、EVLP中に治療まで行うという研究を行った。まず、EVLPを用いてドナー肺の機能が正確に評価できることを示した。続いて、EVLP中に薬剤を吸入投与した群では、投与しない群に比べ、有意に肺機能が良好であることが示され、EVLPを用いた障害ドナー肺への治療の可能性が示唆された。肺移植におけるドナー不足を解消する現実策として、マージナルドナー肺や心臓死ドナー肺といった「傷害を受けた、または潜在的に傷害のある可能性がある」ドナー肺の積極的な利用が重要である。このような、いわば「傷害のあるドナー肺」の安全な利用のためには、ドナー肺の質を移植前に客観的に評価する必要がある。そこで、申請者はこれまでの準備に基づき、小動物を用いた基礎実験を続ける傍ら、(1)中大動物を用いた体外循環回路(EVLP)を用いて、「傷害のあるドナー肺」の機能を移植前に正確に評価するシステムを構築し、(2)EVLP中の薬剤投与など、肺傷害を軽減する手法を開発することで、「傷害のあるドナー肺を治療し、いわば蘇生させる」ことを検討する。われわれは、平成23年度の実験計画として、イヌ傷害肺モデル(脳死ドナー肺、マージナルドナー肺、controlled DCDドナー肺の3モデル)の確立を掲げて実験を開始した。Sham群となる脳死ドナー肺モデルについては、実験手技の確認として行った。マージナルドナーモデルについては、急速輸液による肺水腫モデルであるが、再現可能であることを確認した。現在世界的に行われている安楽死モデルであるcontrolledDCDドナーモデルは、実臨床で、人工呼吸器の接続を外した後に心停止に至るまでの時間の重要性が認識され始めていることを鑑み、その時間設定に重点を置き実験した。まず、小動物(ラット)を用いた予備実験にて、低換気持続時間が心停止時間に及ぼす影響と肺障害について一定の知見が得られたので、今後、中大動物実験に移行する予定である。EVLPでの評価については、脳死ドナー肺、マージナルドナー肺モデルにおいて、EVLPのデータを取得した。これまでに、EVLPによって肺障害が軽減するようなデータを得ているため、その効果が肺移植後にも持続するのか、検討を続ける。なお、肺内エネルギー測定、アポトーシス、遺伝子発現などの測定も、並行して適宜行っている。「傷害のあるドナー肺」の安全な利用のためには、ドナー肺の質を移植前に客観的に評価する必要がある。そこで、申請者はこれまでの準備に基づき、小動物を用いた基礎実験を続ける傍ら(1)大動物を用いた体外循環回路を用いて「傷害のあるドナー肺」の機能を移植前に正確に評価するシステムを構築し、(2)EVLP中の薬剤投与など、肺傷害を軽減する手法を開発することで「傷害のあるドナー肺を治療し、いわば蘇生させる」ことを検討する実験を行った。平成23年度は、イヌ傷害肺モデルの確立を行った結果に基づき、平成24年度は、DCDドナーモデルにおけるEVLPでの薬物治療の有効性を検討する実験を行った。また、DCDドナーモデルにおいての実臨床での課題である、心停止までの時間と肺障害についての検討の必要性が生じたため、平成24年度には、小動物を用いた実験を行い、心停止時間までがある一定以内であると肺障害が増強しないことを示し得た。平成25年度は、DCDドナーモデルにおいて、EVLP中のBeta-2 agonist吸入による肺保護効果を、大動物EVLPを用いた実験系で確認した。このように、申請者は、体外肺潅流(EVLP)の技術を用いて、ドナー肺の質を移植前に精密に評価し、治療まで行うという計画3年間かけて遂行した。「傷害肺」を用いた肺移植の実現はドナー不足から救うのみならず、レシピエントの手術成績向上、生体ドナーへの負担の回避など、さまざまな観点から、有用であるのみならず急務の課題である。また、肺でのEVLPの実験及び臨床知見は、他臓器でも応用可能であり、「傷害臓器の評価とその治療」として全臓器的計画が行われることも視野に入れたい。

肺移植におけるドナー不足を解消する現実策として、マージナルドナー肺や心臓死ドナー肺といった「傷害を受けた、または潜在的に傷害のある可能性がある」ドナー肺の積極的な利用が重要である。このような、いわば「傷害のあるドナー肺」の安全な利用のためには、ドナー肺の質を移植前に客観的に評価する必要がある。そこで、申請者はこれまでの準備に基づき、小動物を用いた基礎実験を続ける傍ら、(1)大動物を用いた体外循環回路(EVLP)を用いて、「傷害のあるドナー肺」の機能を移植前に正確に評価するシステムを構築し、(2)EVLP中の薬剤投与など、肺傷害を軽減する手法を開発することで、「傷害のあるドナー肺を治療し、いわば蘇生させる」ことを検討する実験を行った。平成23年度は、イヌ傷害肺モデルの確立を行ったので、その結果に基づき、平成24年度は、DCDドナーモデルにおける、EVLPでの薬物治療の有効性を検討する実験を行った。DCDドナーモデルにおけるEVLPの再現性を十分に確認した後、これまで小動物EVLPや大動物肺移植実験で検討を行ってきたBeta-2 agonistを用いた大動物EVLP実験を行った。中間解析では、治療群において有意な肺保護効果を認めている。今後、肺組織などの検体を用いて、分子メカニズムなどを検討していくとともに、大動物肺移植実験も考慮している。さらに、DCDドナーモデルにおいての実臨床での課題である、心停止までの時間と肺障害についての検討の必要性が生じたため、平成24年度には、小動物を用いた実験を行い、心停止時間までがある一定以内であると、肺障害が増強しないことを示し得た。現在、小動物EVLPを用いて心停止時間の設定を綿密に行っており、設定完了後、小動物実験で再確認する予定である。平成23年度において、当初の予定通り、3種類の傷害肺モデルの確立をほぼ行いえた。さらに、EVLPおよびその後の肺移植による検討については、2種類の傷害肺モデルではほぼ順調に実験が進んでいる。しかしながら、DCDドナーモデルにおいては、実臨床での課題である、心停止までの時間と肺障害についての検討の必要性が生じたため、小動物を用いた予備実験を行っている。これによって、中大動物における設定が整うと、EVLPおよび肺移植実験が可能となるので、おおよその目途は立っている状態である。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成23年度において、当初の予定通り、大動物における3種類の傷害肺モデル(脳死ドナー、マージナルドナー、DCDドナー)の確立を行い、モデルの再現性も確認した。また、大動物EVLPや肺移植を用いた実験を進め、肺機能の評価についても検討を始めることができた。その結果に基づき、平成24年度には、DCDドナーモデルにおける、EVLP中の薬物治療の可能性および有効性についても、検討を行うべく実験を開始することができた。まず、KCLを用いたDCDドナーモデルにおけるEVLPの再現性を十分に確認した後、これまで申請者らが、小動物EVLPや大動物肺移植実験で検討を行ってきたBeta-2 agonistを用いた大動物EVLP実験を行った。現在、コントロール群(n=4)、治療群(n=5)の実験が終了し、中間解析では、治療群において有意な肺保護効果を認めている。今後、肺組織などの検体を用いて、分子メカニズムなどを検討していく予定である。
Volterra型非線形適応システムの理論解析と高速適応アルゴリズムに関する研究

本研究では,非線形適応システムのうち,Volterra級数展開をシステムモデルとして用いたVolterra型非線形適応システムの理論解析を行い,特に適応収束の不安定な要因と成る,誤差曲面の自明でない幾何学的な特徴を明らかにした。この理論解析に基づいて,安定で高速な適応アルゴリズムの開発と実現している。まず、正規分布の入力の場合,誤差曲面の主曲率と主軸を固有値と固有ベクトルより、1方向上の主曲率だけが著しく大きく,他のもののN倍のオーダ(NはVolterraシステムの線形項の数とする)である,つまり,ある方向上においてのみ著しく急峻で,他の方向では比較的に平坦である,という興味深い特徴を明らかにしている,この事実は、Volterra系の誤差曲面も著しくゆがんでいる、また、その適応推定問題は、常に悪条件或いは不良設定問題であることを意味する.この理論解析の結果に基づいて、高速適応アルゴリズムを開発している。まず、白色入力の場合では、誤差曲面の幾何学形状に適した高速適応アルゴリズムの考案をする。具体的に,誤差曲面の主曲率の逆数をその主軸方向のステップサイズとして採用して,最急降下法と同程度の計算量で,ニュートンラフソン法と同程度の収束速度を有する適応アルゴリズムを提案する.次に有色入力の場合では、白色化操作を行うことで,白色信号に対する高速適応アルゴリズムを利用して,有色信号に対しても,RLS型の演算を高速化する適応アルゴリズムを開発する.特に,2次系の場合では、RLS法はO(N^5)の計算を必要とするが,新規アルゴリズムは,LMS法と同程度のO(N^2)の計算量で,RLS法の同様な収束速度を有する.本研究では,非線形適応システムのうち,Volterra級数展開をシステムモデルとして用いたVolterra型非線形適応システムの理論解析を行い,特に適応収束の不安定な要因と成る,誤差曲面の自明でない幾何学的な特徴を明らかにした。具体的に,誤差曲面の主曲率の逆数をその主軸方向のステップサイズとして採用して,最急降下法と同程度の計算量で,ニュートンラフソン法と同程度の収束速度を有する適応アルゴリズムを提案する.次に有色入力の場合では、白色化操作を行うことで,白色信号に対する高速適応アルゴリズムを利用して,有色信号に対しても,RLS型の演算を高速化する適応アルゴリズムを開発する.特に,2次系の場合では、RLS法はO(N^5)の計算を必要とするが,新規アルゴリズムは,LMS法と同程度のO(N^2)の計算量で,RLS法の同様な収束速度を有する.本年度はまず、二次Volterra系の理論解析を行った。(i)白色入力の場合,線形系の誤差曲面と異なり、Volterraの誤差曲面も著しくゆがんでいることを解明している。具体的に、自己相関行列の構造解析により,誤差曲面のすべての主曲率と主軸を固有値と固有ベクトルから求めて,1方向上の主曲率だけが他の方向のN倍のオーダ(NはVolterraシステムの線形項の数とする)である,つまり,ある方向上においてのみ著しく急峻で,他の方向では比較的に平坦である,という特徴を示している.(ii)さらに,この結論を有色信号入力の場合へと拡張している.一般的に,有色信号の特有の性質を使わずに,その高次自己相関行列の固有値と固有ベクトルを求めるのはできないため,固有値の厳密な値の代り,そのできるだけタイトな上下界を求めて,同様に最大固有値,即ち誤差曲面の最大曲率が,他のもののN倍のオーダである,つまり,ある1方向に著しく急峻で,他の方向では相対的に平坦である特性を示している.そして、上記解析結果に基づき、高速適応アルゴリズムを開発している。(i)白色入力の場合:誤差曲面の主曲率の逆数をその主軸方向のステップサイズとして採用して,最急降下法と同程度の計算量で,ニュートンラフソン法と同程度の収束速度を有する適応アルゴリズムを提案している.(ii)有力入力の場合:最大固有値の上下界から,その推定値を求めて,さらにグラムシュミット直交化によって,誤差曲面の最急峻方向の固有ベクトルを推定する.それによって,主曲率に反比例するステップサイズを用いることで,最急峻方向上のオーバーシュートを抑えながら,高速且安定に収束する適応アルゴリズムを開発している.さらに、2次系においては,白色化操作を行うことで,有色信号に対するRLS型の演算を高速化する適応アルゴリズムの開発に取り込んでいる。

従来、RLS法は0(N^5)の計算を必要とするが,新規アルゴリズムは,LMS法と同程度の0(N^2)の計算量で,RLS法の同様な収束速度を有する.本研究では,非線形適応システムのうち,Volterra級数展開をシステムモデルとして用いたVolterra型非線形適応システムの理論解析を行い,特に適応収束の不安定な要因と成る,誤差曲面の自明でない幾何学的な特徴を明らかにした。この理論解析に基づいて,安定で高速な適応アルゴリズムの開発と実現している。まず、正規分布の入力の場合,誤差曲面の主曲率と主軸を固有値と固有ベクトルより、1方向上の主曲率だけが著しく大きく,他のもののN倍のオーダ(NはVolterraシステムの線形項の数とする)である,つまり,ある方向上においてのみ著しく急峻で,他の方向では比較的に平坦である,という興味深い特徴を明らかにしている.この事実は、Volterra系の誤差曲面も著しくゆがんでいる、また、その適応推定問題は、常に悪条件或いは不良設定問題であることを意味する.この理論解析の結果に基づいて、高速適応アルゴリズムを開発している。まず、白色入力の場合では、誤差曲面の幾何学形状に適した高速適応アルゴリズムの考案をする。具体的に,誤差曲面の主曲率の逆数をその主軸方向のステップサイズとして採用して,最急降下法と同程度の計算量で,ニュートンラフソン法と同程度の収束速度を有する適応アルゴリズムを提案する.次に有色入力の場合では、白色化操作を行うことで,白色信号に対する高速適応アルゴリズムを利用して,有色信号に対しても,RLS型の演算を高速化する適応アルゴリズムを開発する.特に,2次系の場合では、RLS法はO(N^5)の計算を必要とするが,新規アルゴリズムは,LMS法と同程度のO(N^2)の計算量で,RLS法の同様な収束速度を有する.
転写因子Bach2をハブとする活性酸素シグナル-遺伝子ネットワーク共役機構の解明

免疫を担うB細胞ではB細胞レセプターからのシグナルが分化・成熟や増殖および活性化を制御する。近年、B細胞で活性酸素シグナルがBCRシグナル経路のセカンドメッセンジャーとして機能することが示されている。本年、私たちが明らかにしたのは、抗原刺激後に成熟B細胞が形質細胞へ最終分化する過程で、Bach2が形質細胞分化を抑制することがクラススイッチを実行する遺伝子ネットワークの実体であるということである。Bach2の直接標的遺伝子のBlimp-1は、形質細胞分化に必須の転写因子をコードする。一方で、転写因子Blimp-1はクラススイッチに必須の酵素AIDの遺伝子発現を抑制する。Bach2はこの作用を抑制する役割を担うことをマウスの遺伝学的手法を用いて明らかにできた。一方で、Bach2が活性酸素刺激に応答して細胞内局在やDNA結合活性が制御されるという知見を得ている。従って、活性酸素シグナルがBach2を介してB細胞活性化応答の遺伝子ネットワークの切り換えに貢献すると予想した。そこで、Bach2タンパク質で酸化還元反応に必須のシステインの同定を試みた。大腸菌で発現させたリコンビナントBach2を化学修飾剤し、質量分析して化学修飾されたシステインを含む断片を解析した。その結果、DNA結合ドメイン近傍にあり、今回検討できたシステインは全て化学修飾されていた。このことから、Bach2は活性酸素シグナルのセンサーとなる可能性があるシステインが多いと考えられる。今後は、システインに変異を導入したBach2タンパク質を発現するトランスジェニックマウスでBach2ノックアウトマウスをレスキューする実験をおこない、活性酸素センサーの生理的意義の解明につながる研究である。免疫担当のB細胞では、B細胞レセプター(BCR)からのシグナルが分化・成熟や増殖および活性化応答を制御する。我々は、転写因子Bach2がB細胞の活性化応答の遺伝子ネットワークの切り換えに重要な役割を担うことを解明してきた。従って、活性酸素シグナルは、Bach2を介してB細胞活性化応答の遺伝子ネットワークの切換に貢献すると予想される。立体構造予測から、Bach2にはDNA結合を担う塩基性ロイシンジッパー領域では4個のシステインが特徴的な繰り返し配置で蛋白質表面に存在すると推定された。そこで、この領域にあるシステインが酸化還元応答に関わるシステインか検証するため、大腸菌発現Bach2蛋白質を用いて、酸化溶液中でS-S結合するシステインの同定を目指した。始めに、DTT存在下ないしは非存在下で、システインの特異的化学修飾剤と精製されたBach2蛋白質を反応させる。次に電気泳動後にトリプシン消化したものをサンプルとして質量分析すると、化学修飾状態の差があるシステインは、活性酸素センサーとなり得る可能性が高い。さらに、Bach2のファミリー因子であるBach1とアミノ酸配列を比較してBach2に特異的である塩基性ロイシンジッパー領域よりもN末端側の領域を対象として検討を試みている。さらに、システインに変異を導入したBach2の細胞内局在の制御を顕微鏡下での観察を試みている。本研究から、B細胞における活性酸素シグナルの役割を遺伝子ネットワークの切り換えという視点から明らかにできる可能性がある。
慢性肉芽腫症、特に非定型例(Variantタイプ)の診断と治療法の確立

慢性肉芽腫症(CGD)の全国規模の病型調査の過程で、幾つかの非定型例CGD(遺伝的にCGDと診断されているにもかかわらず白血球が微量の活性酸素を産生しうるタイプ)を見いだした。一つは、長崎における60歳という高齢のCGDであるが、インターフェロンガンマの投与によって活性酸素産生レベルが変動した。活性酸素産生系構成タンパク質の発現量も変化することがイムノブロッティングで確かめられた。もう一つの症例は、新潟の常染色体性のCGDであるが、こちらもごく微量の活性酸素産生が検出された。イムノブロッティングの結果、細胞質必須因子である47Kタンパク質の欠損であることが判明した。これらの非定型例CGD患者の末梢血を用いて、化学発光法による微量の活性酸素産生の定量法を検討した。血液中の好中球を測定用のプラスチック容器の内側に付着させることによって、好感度で活性酸素を検出・定量することに成功した。非定型例および典型例CGD患者の末梢血から、EBウイルス感染によって不死化B細胞を樹立し、同様な方法で微量活性酸素産生の評価を行った。しかし、末梢血由来の好中球と異なり、株化B細胞では、非定型例における微量活性酸素は認められなかった。また、これらの培養細胞では、インターフェロンガンマ処理によっても活性酸素産生能に変化はなかった。さらに、活性酸素産生系タンパク質の量もインターフェロンに不応答であった。したがって、株化B細胞は、末梢血由来細胞の基礎的実験には利用できないことが判明した。