hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
子どもの健やかな運動発達に寄与する乳児期までの栄養環境

各試行において得られたすべての値を用いて、生後5日目から28日目までの変化を傾向検定を用いて検定したところ、有意な増加傾向が認められた(p=0.009)。これらの結果から、新生児期における把握力は個人における神経発達を反映する指標として有用である可能性が示唆された。研究開始1年目となる平成30年度は、骨格筋の発達に関わる指標として、乳児の筋力を評価する新しい研究をすすめた。都内大学病院と共同ですすめていた母児を対象とした出生前コホート研究において、児の精細なフォローアップを行う新しい研究(親子フォローアップ研究)を開始し、その研究において生後1か月児を対象に把握力の測定を開始した。倫理委員会の承認を得て8月より測定を開始し、現在までに約10名の握力のデータを収集した。しかし、出生前コホート研究の新規リクルートが中止となったため、その参加者を対象として行っていた親子フォローアップ研究についても年度末で実施が打ち切りとなってしまった。この点は想定外であったが、新しい研究をスタートしデータ収集をすすめられた現時点までは期待通りの進展であった。この他に、乳幼児における握力測定の信頼性を確認するために、生後5日の新生児1名および2歳児2名を対象に、1日23試行(各試行で左右2回ずつ)の(把)握力測定を、週に23回×1か月程度継続して行った。現在、これらのデータを解析する準備をすすめているところである。今後計画の見直しが必要であるが、生後1か月児の把握力の測定を国内外で初めて体系的に実施し、コホート研究における測定の実行可能性を確認することができた点や、その他にも関連するデータ収集および解析が行えた点を踏まて、「おおむね順調に進展している」と評価した。今後は、ニュージーランド・オークランド大学・Liggins研究所で行われているランダム化比較試験(DIfferent Approaches to MOderate & late preterm Nutrition: DIAMOND STUDY)の一部として、本研究を遂行する。DIAMOND STUDYにおいては、発達遅延のハイリスク群である早産児に対して、出生後から母乳栄養が確立するまで異なる栄養学的介入を行い、アウトカムとして2歳時点の神経発達の評価を行う。児の除脂肪量(≒筋量)の測定が当初より含まれているこの研究のプロトコルに、新たに児の筋力(握力)の測定を組み込む予定である。なお、この計画変更に伴い、渡航期間を当初予定の半年間から2年間に延長した上で、前倒しで平成31年3月中旬より渡航を開始した。
ゾウリムシの環境汚染センサーへの応用

繊毛虫は,繊毛打方向の逆転、細胞体の収縮,エキソサイトーシスといった細胞機能をもつ。これらはいずれも,細胞外からの化学的・機械的刺激を受け、細胞内カルシウムイオン濃度の変化を介して引き起こされる。しかし,これらがそれぞれ独立に制御されるメカニズムは解らないところが多い。本研究は,この3つの機能と外部の刺激,および細胞内カルシウムイオン濃度の細胞内での振る舞いの関係を明らかにすることで,繊毛虫が化学物質センサーとして用いることができるか検討した。我々は,光路の切り替えなしに細胞内カルシウムレベルと明視野像を同時に取得できる実験系を作成した。カルシウムレベルは,カルシウム感受性蛍光色素カルシウムグリーンを細胞内へ顕微注射により導入し,その蛍光強度を光電子増倍管により取得した。ゾウリムシへ化学物質をスプレーしたときの細胞内カルシウムレベルの変化と細胞機能の発現の様子を観察した。ゾウリムシにピクリン酸,エタノールをスプレーしたとき、ゾウリムシはいずれの場合もエキソサイトーシスを引き起こしたものの,細胞内カルシウムレベルを記録した波形は異なるものであった。ピクリン酸刺激では細胞内カルシウムレベルは高いまま保たれ,エタノール刺激では数秒間のカルシウムトランジェントとして記録された。これらの結果は化学物質によって細胞内のカルシウムの変化の仕方が異なることを示している。我々は,また,化学物質による刺激が繊毛逆転を引き起こすメカニズムを詳細に検討するため,大きな繊毛をもつ繊毛虫ディディニウムを用いて繊毛逆転時の繊毛内カルシウムレベルの変化を記録した。外部からの刺激により,ディディニウムは繊毛内のカルシウムレベルを均一に上昇させながら繊毛を逆転させた。現在,これらの研究成果をまとめ、英文雑誌に投稿準備中である。単細胞生物ゾウリムシは,繊毛打方向の逆転,細胞体の収縮,エキソサイトーシスという明確な3つの細胞機能をもつ。これらはいずれも,細胞外からの化学的・機械的刺激を受け,細胞内カルシウムイオン濃度の変化を介して引き起こされる。本研究は,この3つの機能と外部の刺激、および細胞内カルシウムイオン濃度の関係を検討することで,ゾウリムシを化学物質センサーとして用いることを目標としている。カルシウムレベルは,カルシウム感受性蛍光色素カルシウムグリーンを細胞内へ顕微注射により導入し,その蛍光強度を光電子増倍管により取得する。現在,ゾウリムシヘ化学物質をスプレーしたときの細胞内カルシウムレベルの変化と細胞機能の発現の様子を観察している。ゾウリムシのエキソサイトーシス誘発剤として知られるピクリン酸,エタノールをそれぞれゾウリムシにスプレーしたとき、ゾウリムシはいずれの場合もエキソサイトーシスを引き起こしたものの,細胞内カルシウムレベルを記録した波形は異なるものであった。現在,これらのカルシウムレベルの変化の違いを検討すると共に,他の細胞機能である繊毛打方向の逆転と細胞内カルシウムレベルの関係について検討中である。繊毛虫は,繊毛打方向の逆転,細胞体の収縮,エキソサイトーシスといった細胞機能をもつ。

ゾウリムシへ化学物質をスプレーしたときの細胞内カルシウムレベルの変化と細胞機能の発現の様子を観察した。ゾウリムシにピクリン酸,エタノールをスプレーしたとき,ゾウリムシはいずれの場合もエキソサイトーシスを引き起こしたものの,細胞内カルシウムレベルを記録した波形は異なるものであった。ピクリン酸刺激では細胞内カルシウムレベルは高いまま保たれ,エタノール刺激では数秒間のカルシウムトランジェントとして記録された。これらの結果は化学物質によって細胞内のカルシウムの変化の仕方が異なることを示している。我々は,また,大きな繊毛をもつ繊毛虫ディディニウムを用いて繊毛逆転時の繊毛内カルシウムレベルの変化を記録した。外部からの刺激により,ディディニウムは繊毛内のカルシウムレベルを均一に上昇させながら繊毛を逆転させた。現在,これらの研究成果をまとめ,英文雑誌に投稿準備中である。
機能性タンパク質の動力学と折り畳み

機能性タンパク質の典型として水溶性光受容タンパク質イェロープロテイン(PYP)および核酸分解酵素(SNase)を用いて、折り畳みおよび機能発現に伴う動力学に関する研究を行った。世界的に重要視されているタンパク質動力学に関する中性子非弾性散乱を用いた研究は、日本では我々のグループだけが行っている。1.PYP光反応中間体の溶液構造:PYPの活性光反応中間体であるM中間体の溶液構造を高角X線溶液散乱と揺らぎ解析の手法により明らかにした。発色団での光吸収の情報は、α4ヘリックス、β4とβ5のループおよびN端領域に伝播される。NMR溶液構造解析の結果は、必ずしも正確ではなく、局所的な変化を精度よく検出するが、大域的な構造変化に対してはあいまいさが残ることを示した。2.誘導折り畳みの機構:近年、天然変性タンパク質(IDP)の存在が脚光を浴びている。IDPは、生理的条件下では構造を取らず、標的との結合により折り畳まれる(誘導折り畳み)。我々は誘導折り畳みを示すSNase変異体を多種類創出した。阻害剤による誘導折りたたみの速度論的測定から、D⇔DI→FLの反応に従うものと、D⇔F→FLの反応に従うものが存在することを示した(D、F、Lは変性状態、天然状態、リガンドを表す)。前者は結合がフォールディングに先立って起きると言うモデルである。両方のメカニズムが起きうることを明確に示したのは世界で初めてである。3.動力学に対する水和効果:中性子非弾性散乱により動力学に対する水和の効果を詳細に調べた。水和の効果は、5meV以下の低エネルギー領域にのみ現れる。低温ではボソンピークと呼ばれる励起モードが現れるが、水和により、ボソンピークの位置は高エネルギー側にシフトした。この結果は、水和水による水素結合がタンパク質を硬くすることを示しており、城地らによる理論からの予測を裏付けるものである。機能性タンパク質の動力学と機能発現に関わる構造変化に関する研究を集中的に行ってきた。動力学においては、水和水の効果を詳細に検討することを最終目標としている。また、機能性タンパク質の溶液構造の動態や機能発現時の構造変化などについて研究を進めた。1.中性子非干渉性弾性散乱は、Qの小さい領域ではガウス近似が可能であり、平均自乗変異を評価することができる。しかし、Qが大きくなると、ガウス近似からのずれ(非ガウス性)が顕著になる。この非ガウス性の起源に関する解析を行なった。その結果、非ガウス性は、タンパク質動力学の不均一性に原因の一端があることを示した。不均一性を記述する分布関数として二値分布が単純であるが妥当であることを明らかにした。二値分布は、タンパク質は揺らぎの大きい部分と小さい部分の二領域から構成されることを主張するモデルである。この分布により、結晶学的温度因子の分布の特徴も表現できる。2.動物の眼において、視覚情報の遮断に関与するアレスチンについて、溶液構造の動態をX線溶液散乱により調べた。アレスチンは、リン酸化ロドプシンと一対一で結合することにより、情報遮断を行なう。X線溶液散乱の結果、アレスチンは溶液中では、低濃度では単量体、高濃度では四量体にあること、生理的濃度条件下では単量体と四量体の平衡にあることを明らかにした。濃度依存的な会合状態の変化を定量的に解析する方法を開発した。また、四量体形成は静電相互作用によることを明らかにした。さらに、アレスチンは、リン酸化ロドプシンにのみ結合することを示唆した。3.イェロープロテインの光反応に伴う二次構造の変化を、CDスペクトルから明らかにした。また、この変化は、N末端領域のヘリックスが解けることのみならずCドメインでも二次構造変化が起きることを示した。これまでの中間体の結晶構造解析の結果に疑問を投げかける結果である。黄色ブドウ球菌核酸分解酵素(SNase)および光受容蛋白質イェロープロテイン(PYP)、バクテリオロドプシンを機能性蛋白質のモデル蛋白質として、折畳み、機能発現機構及び動力学について、以下の結果を得た。1.SNase野生型(折り畳まれている)及びC末13残基欠損変異体(折り畳まれていない)について、中性子非干渉性弾性散乱による動力学転移の測定を行った。水和していない試料では、150K近傍の転移に両者の差が見出された。転移後は、変異体の方がやわらかくなる。より詳細な解析のために、高いQ領域までの測定を行った結果、散乱関数のガウス曲線からのずれが顕著になった。理想的な調和振動子では、散乱関数はガウス曲線になる。この非ガウス性の起源は、ソフトマター物理学にとっても重要な課題である。動力学的不均一性と運動の非調和性の二通りの起源が考えられるが、動力学転移点以下の温度でも非ガウス性が見出されることから、非調和性よりも不均一性の寄与を考えるべきである。これまで、動力学的不均一性のあらわな解析はなされていなかった。蛋白質動力学の不均一性は、表面とコアとで運動性が異なるという二値分布で表現できることを、実験結果から示した。また、動力学転移点以下では、表面の運動が支配的であり、転移点以上でコアの運動が活性化されることも示唆された。2.イェロープロテインの光受容後の変化を詳細に検討した。pH依存的にL中間体とM中間体の平衡が変化することをはじめて見出した。

3.バクテリオロドプシンの光反応サイクルのマイクロ秒時間分解X線回折を実現するためのシステムを開発し、実際に応用した。その結果、シッフ塩基の脱プロトン化に引き続きヘリックスレベルの構造変化がおきることが明らかになった。M1-M2転移を実験的に証明した初めての例である。中性子非干渉性弾性散乱のQ依存性は、理想的な調和振動子の場合、ガウス関数で記述できる。しかし、実際の測定では、ガウス関数からのずれ(非ガウス性)が観測される。我々は既に、この非ガウス性がタンパク質動力学の不均一性に起因するとして説明できることを示した。非ガウス性は運動の非調和性によっても説明できる。特に、ガラス転移点以上では、不均一性と非調和性の両者の寄与を考える必要がある。分子動力学シミュレーションにより、非干渉性弾性散乱への寄与を原子ごとに評価し、不均一性と非調和性の寄与の度合いを調べた。ガラス転移点以下では、予想通り、不均一性からの寄与がほとんどであり、非調和性の寄与は小さいことがわかった。一方、転移点以上では、非調和性が寄与してくるが、それでも不均一性の寄与の方が大きいことが明らかとなった。PYPのR52は発色団を取り囲む残基の一つであり、M中間体形成に伴い、タンパク質内部から表面に向きを変えることが知られている。また、M中間体では、発色団が脱プロトン化する、すなわちpKaが上昇する。R52Q変異体では、吸収スペクトルは野生型と同じであるにもかかわらず、発色団のpKaが上昇している。R52Qは、M中間体でのpKa制御の機構を模倣していると考えられる。この観点からR52Qの結晶構造解析を行った。RからQの変異に伴いキャビティーが生成しており、そのキャビティーは2分子の水で占められていることがわかった。M中間体形成に伴い、R52が向きを変えることで、発色団周りにキャビティーが形成され、そのキャビティーに水分子が移動することにより、pKaの制御がなされているというモデルを提唱した。機能性タンパク質の折り畳みおよび機能発現に伴う動力学に関する研究を行った。動力学に関しては、中性子非弾性散乱を用いた測定を系統的に行っている。中性子非弾性散乱を用いたタンパク質動力学研究は、世界的には重要視されているが、日本では我々のグループだけが行っている。1.イェロープロテインのF6とK123が構造保持、光反応に重要な相互作用を担っていることを、部位特異的置換を用いて明らかにした。F6の変異体の構造安定性および光反応速度の詳細な測定から、F6の位置にはフェニル基が重要であることが示された。K123Aは、ホロタンパク質を再構成できず、K123L、K123Eは、や静方と同様の安定性および光反応を示した。この結果は、123位には、正電荷は重要でなく、むしろ長鎖アルキル基が本質的であることを示している。これらから、F6とK123の間にはCH/π相互作用が働いていることが示唆された。この相互作用は、静電相互作用(F6E)や、疎水相互作用(F6L)では代用することができないことも明らかにした。2.単純な規則によりアミノ酸配列における情報の重複を解消することをもくろみ、配列の単純化を行った。前年度までに全長にわたる単純化は不可能であることが示されている。
セラミック系裏装材を用いた精密鋳造法の確立

当教室の研究(セラミックファイバー系裏装材を用いた精密鋳造法-埋没条件の違いによる全部鋳造冠内外面の寸法変化-日本補綴歯科学会雑誌1993年37巻89回特別号)では,従来の湿アスベスト法の精度に近い鋳造冠を得る埋没条件を確立することができたが,同時に次のような問題点が確認されている.・従来の湿アスベスト法と比較して鋳造体の変形のばらつきが大きい.・埋没材の破壊が見られることがある.・ワックスパターンの厚みの違いにより内面の適合に相当な違いが見られる.そこで本研究では,これらの問題点を補い,適合精度の良い鋳造冠を得るための埋没条件を明らかにすることを目的として次の基礎的実験を行った.全部鋳造冠用金型から採得したワックスパターンと,それを厚さ0.5mmのセラミックスファイバー系裏装材と石膏系埋没材の組み合わせで埋没鋳造して得られた鋳造体それぞれを三次元座標測定器を用いて寸法測定した.使用した石膏系埋没材(松風社製、リアルベスト)は専用液を水で希釈することにより総合膨張率を約1.42.2%の間で任意に変化させることができる.今回は希釈率0%(専用液100%),90%(専用液10%)で膨張率を変化させて得られたデータとセラミックファイバー系裏装材とクリストバライト埋没材の組み合わせによる既存のデータとを比較して以下の結果を得た.1.内面は希釈率0%でマージン方向へ裾開きの膨張を示したが,マージン以外の各部位では,セラミック系-クリストバライトのデータと比べて22.763.5%とかなり減少していた.また希釈率90%ではマージン部分でやや膨張するものの,他の部位では寸法変化はほとんど認められなかった.2.外面はいずれも大きく収縮する傾向にあり,セラミック系-クリストバライトのデータより若干収縮傾向は強かった.3.使用した石膏系埋没材の破砕抗力はクリストバライト埋没材の約23倍を示し、昇温中においても破壊や亀裂は認められなかった.しかし鋳造後に急冷した場合でも埋没材は崩壊せず,鋳造体の割り出しはかなり困難であった.4.今後,希釈率を段階的に変化させ,詳細に比較検討する必要があると思われる.当教室の研究(セラミックファイバー系裏装材を用いた精密鋳造法-埋没条件の違いによる全部鋳造冠内外面の寸法変化-日本補綴歯科学会雑誌1993年37巻89回特別号)では,従来の湿アスベスト法の精度に近い鋳造冠を得る埋没条件を確立することができたが,同時に次のような問題点が確認されている.・従来の湿アスベスト法と比較して鋳造体の変形のばらつきが大きい.・埋没材の破壊が見られることがある.・ワックスパターンの厚みの違いにより内面の適合に相当な違いが見られる.そこで本研究では,これらの問題点を補い,適合精度の良い鋳造冠を得るための埋没条件を明らかにすることを目的として次の基礎的実験を行った.全部鋳造冠用金型から採得したワックスパターンと,それを厚さ0.5mmのセラミックスファイバー系裏装材と石膏系埋没材の組み合わせで埋没鋳造して得られた鋳造体それぞれを三次元座標測定器を用いて寸法測定した.使用した石膏系埋没材(松風社製、リアルベスト)は専用液を水で希釈することにより総合膨張率を約1.42.2%の間で任意に変化させることができる.今回は希釈率0%(専用液100%),90%(専用液10%)で膨張率を変化させて得られたデータとセラミックファイバー系裏装材とクリストバライト埋没材の組み合わせによる既存のデータとを比較して以下の結果を得た.1.内面は希釈率0%でマージン方向へ裾開きの膨張を示したが,マージン以外の各部位では,セラミック系-クリストバライトのデータと比べて22.763.5%とかなり減少していた.また希釈率90%ではマージン部分でやや膨張するものの,他の部位では寸法変化はほとんど認められなかった.2.外面はいずれも大きく収縮する傾向にあり,セラミック系-クリストバライトのデータより若干収縮傾向は強かった.3.使用した石膏系埋没材の破砕抗力はクリストバライト埋没材の約23倍を示し、昇温中においても破壊や亀裂は認められなかった.しかし鋳造後に急冷した場合でも埋没材は崩壊せず,鋳造体の割り出しはかなり困難であった.4.今後,希釈率を段階的に変化させ,詳細に比較検討する必要があると思われる.
サイトカインにより活性化されたアストロサイトの神経栄養効果

同様にACMの大脳皮質ニューロン、中脳ドパミン作動性ニューロンに対する生存維持効果を検討した。大脳皮質ニューロンに対するACMの効果は明らかではなく、中脳ドパミン作動性ニューロンに大してはACMは生存維持効果を有したが、これはサイトカインの刺激による効果増強は認められなかった。次に、脳幹ニューロンのCAT活性を指標にして、S-ACM中に含まれる神経栄養因子の分離精製を試みた。現在、S-ACM中のヘパリン親和性蛋白が活性を有することが判明しており、さらにこの精製分離を進めているところである。脳幹コリン作動性ニューロンの多くは運動性脳神経であり、この因子は運動性脳神経機能障害の修復に関与すると考えられる。
胎生・幼年期におけるアルコール・依存性薬物暴露と成長後の神経回路網の変異

我々は,アルコールによる脳神経回路網修復・維持機構の変化という観点で,主に胎生期・若年期のアルコール摂取が脳に及ぼすダメージについて細胞生物学的な解析を実施した。はじめに,培養細胞・動物モデルを用いて,アルコール暴露とcAMPやCa2+およびCa2+結合蛋白質を中心とした細胞内情報伝達系変化の検索を行い,アルコールによるNF-kBの活性化とCREB活性の低下作用が,その後のBDNFなどの栄養因子蛋白の合成低下を引き起こし,そのことがアルコールによる神経細胞障害ならびに幼若神経細胞の発達機能障害の発現に重要な影響を及ぼすことを明らかにした。次に,アルコールによる脳神経ネットワークの異常に関わる細胞・分子変異について検索・解明を進め,1)生理的濃度に近い比較的低濃度のアルコールによって神経幹細胞の分化が特異的に変化し,神経細胞への分化が抑制され,一方で,グリア細胞への分化が促進されること,2)その機序に神経幹細胞内栄養因子シグナル伝達系の変化が関与し,神経幹細胞の分化運命決定に重要な役割を示す転写因子NRSF/RESTの活性変化が深く関与することをin vitroの系で明らかにした。さらに,3)妊娠ラットのアルコール摂取によって胎児脳内で神経幹細胞の増殖が抑えられグリア細胞への分化・増殖が促進されること,また,4)アルコール暴露後の胎児脳から取り出した神経幹細胞の分化機能はその後のアルコールの再暴露に極めて強く影響をうけること,を明らかとした。これらのことは,一言で言えば,母体のアルコール摂取によって,胎児の脳内で神経幹細胞の機能に異常が生じ,その後の子供の脳神経ネットワークの形成が重大な影響を受けることを強く示唆していると考えられた。母親のアルコール・依存性薬物摂取による胎生期の暴露と若年期の摂取が,成長後の認知行動異常にどのように結びついているかを神経薬理・生化学的に明らかにしようとする目的で,まず胎生期アルコール摂取モデルを用いて,脳内神経回路網の構築・維持・修復に重大な役割を果たしている神経幹細胞の機能変化について検索した。妊娠ラットに,5g/kg/dayのエタノールを4日間経口投与した後,その胎仔から神経幹細胞を得た。神経細胞への分化を誘導し,エタノール存在/非存在下での分化能を比較検討した。分化率は,抗MAP-2抗体を用いた免疫染色法を応用したMAP2-ELISAを用いて定量化し比較検討した。神経細胞,神経幹細胞の生存率はMTT法で評価した。さらに,細胞内シグナル分子Akt, ERKのリン酸化活性分子の発現に対するエタノールの影響を,Western blot法を用いて検討した。胎内でエタノールに暴露されたラット胎仔から得た神経幹細胞は,対象群に比べて分化能が劣っていた。エタノールは,神経細胞,神経幹細胞の生存に影響をおよぼす濃度よりもかなり低い濃度から神経幹細胞の分化を抑制した。エタノールはp-Akt, p-ERKの発現を時間依存的に減弱した。今回,妊娠母体の過度のアルコール摂取が,胎仔脳内の神経幹細胞に影響を及ぼす可能性が示唆された。エタノールによる神経細胞の減少は,神経細胞死のみならず,分化抑制による新生神経細胞の減少も関与しているものと思われた。エタノールによる神経幹細胞の機能抑制の作用部位として,栄養因子シグナルに関連する細胞内分子が考えられた。胎児性アルコール症候群(FAS)の病態基盤に神経幹細胞の機能異常が関与している可能性が疑われた。はじめに,培養細胞、動物モデルを用いて,アルコール暴露とcAMPやCa2+およびCa2+結合蛋白質を中心とした細胞内情報伝達系変化の検索を行い,アルコールによるNF-kBの活性化とCREB活性の低下作用が,その後のBDNFなどの栄養因子蛋白の合成低下を引き起こし,そのことがアルコールによる神経細胞障害ならびに幼若神経細胞の発達機能障害の発現に重要な影響を及ぼすことを明らかにした。

次に,アルコールによる脳神経ネットワークの異常に関わる細胞・分子変異について検索・解明を進め,1)生理的濃度に近い比較的低濃度のアルコールによって神経幹細胞の分化が特異的に変化し,神経細胞への分化が抑制され,一方で,グリア細胞への分化が促進されること,2)その機序に神経幹細胞内栄養因子シグナル伝達系の変化が関与し,神経幹細胞の分化運命決定に重要な役割を示す転写因子NRSF/RESTの活性変化が深く関与することをin vitroの系で明らかにした。さらに,3)妊娠ラットのアルコール摂取によって胎児脳内で神経幹細胞の増殖が抑えられグリア細胞への分化・増殖が促進されること,また,4)アルコール暴露後の胎児脳から取り出した神経幹細胞の分化機能はその後のアルコールの再暴露に極めて強く影響をうけること,を明らかとした。これらのことは,一言で言えば,母体のアルコール摂取によって,胎児の脳内で神経幹細胞の機能に異常が生じ,その後の子供の脳神経ネットワークの形成が重大な影響を受けることを強く示唆していると考えられた。
新しい超伝導有機錯体の開発

TMTSF塩において、超伝導が発見され、有機伝導体における一次元の不安定性を抑えるためには、次元性を増加させることが一つの方法である。そのために電子供与体を非対称にすると、構造や次元性はどのように変化するかを調べ、新しい有機超伝導体を開発する設計指針を得ることを目的とした。本年度は、TMTSFとBEDT-TTFの部分構造を持つ非対称な電子供与体DMET-DSDTFについて研究した。DMET-DSDTFは対応する置換基をもつ1,3-ジセレノール-2-セレノンと1,3-ジチオール-2-チオンのカップリング反応により合成した。精製には高速分取液体クロマトグラフィーを用いた。サイクリックボルタメトリーを用いて電気化学的性質を調べると、第1酸化電位は0.52eV、第2酸化電位は0.78eVであった。この値は、BEDT-TTFとほぼ同じで、エチレンジチオ基を1個導入するだけでも、分子内クーロン反発はTMTSFに比べると、かなり小さくなることがわかった。ラジカル塩の結晶は、THFを溶媒に用い定電流による電気化学的方法により作成した。【C10_4】塩は室温における電気伝導度も大きく(260【Scm^(-1)】)、室温付近では金属的温度変化をしめした。【PF_6】塩は室温では【C10_4】塩より伝導度は大きいが(300【Scm^(-1)】)、温度変化は半導体的挙動を示した。この両塩については熱起電力も測定したが、電気伝導度の温度変化の結果と一致した。【PF_6】塩については、予備的であるが、偏光反射スペクトルの測定とX線構造解析を行った。構造は【(DMET-TTF)_2】【PF_6】とよく似ており、DMET-DSDTF分子はc軸方向にカラムを形成している。そして、DMET-DSDTF分子はかなり二量体化していて、このため、電気伝導度は半導体的温度変化を示すと考えられ、これは反射スペクトルからも示唆される。分子間の重なりもバンド幅も、カラム方向では、TMTTF塩などよりかなり大きいことがわかった。C104塩が金属的挙動を示すことを考えると本供与体は有望な供与体であると考えられる。
近代日本農村における未婚女性への教育に関する史的研究：階層性と性別役割に着目して

本研究は近代日本における農村の女子教育の諸相の分析を通して、農村出身の未婚女性が置かれた社会的ありようについて検討することを目的とする。従来の議論において農村の未婚女性は、家内領域・農村における啓蒙活動・女子労働に関するテーマから論じられてきた。これらはいずれも近代日本の農村女性に期待された性別役割と階層性の差異を背景とする問題であり、教育が重要な鍵となっていることに共通性がある。本研究では、(1)農家出身の未婚女性の学歴と家内領域における役割に関する研究、(2)農村の未婚女性への啓蒙活動と教育に関する研究、(3)繊維工場における女子労働者の教育機会に関する研究という3つの課題を設定する。
CD44細胞外ドメイン切断および細胞外マトリクス代謝阻害による癌細胞運動抑制

1RNAiを用いたヒアルロン酸合成酵素(HAS)発現抑制による癌細胞運動の阻害これまでに我々はHAS2、HAS3の発現を効率よく抑制できるRNAiオリゴヌクレオチドを作成することに成功した。そこでこれらのRNAiを用いてヒアルロン酸合成能が高い癌細胞であるU251MGヒトグリオーマ細胞を用いて、そのヒアルロン酸産生を抑制し、どの酵素が癌細胞の細胞外マトリクス浸潤に関わっているかを細胞浸潤試験にて判定した結果、HAS2、HAS3のいずれのRNAiを導入した細胞で有意にマトリクス内浸潤を抑えることができた。2癌細胞浸潤におけるヒアルロン酸合成酵素とERMの役割についての検討U251MGヒトグリオーマ細胞における検討の結果、我々はHAS3の活性化に伴うヒアルロン酸の新規合成が、癌細胞の仮足形成を促進させると同時に、接着分子CD44の切断を誘導しそのターンオーバーを促進させることを見出した。またこれらの変化にはCD44とアクチン細胞骨格の連結分子であるERM、中でもMoesinの活性化が関わっていることを見出した。そこで、MoesinのRNAiを新たに作成し、運動性およびマトリクスへの接着性の違いについてタイムラプス顕微鏡を用いた解析した結果、ヒトグリオーマ細胞においてMoesinはHASタンパク質同様に癌細胞のマトリクス内浸潤能に強く関わっていることがわかった。これらHASおよびERMタンパク質をターゲットとした低分子量阻害薬の開発は浸潤性の癌細胞に対して大きな効果を期待できると考えられた。悪性グリオーマやメラノーマなど、悪性度の高い多くの癌細胞においてその細胞周囲に形成されるヒアルロン酸を主体とする細胞周囲マトリクスが癌細胞の浸潤に強く関わっていることが知られている。また、これらの細胞ではヒアルロン酸をリガンドとすろ接着分子であるCD44の切断を介した接着と解除のターンオーバーが促進しており、CD44の切断がこれらの癌細胞の運動能を規定する一因子であると考えられる。本研究は、ADAM17がいかなる制御を受けてCD44の切断を行うかを明らかにし、ヒアルロン酸合成酵素(HAS)の活性化やADAM17を介したCD44のターンオーバーによって制御され、癌細胞自身が形成する細胞外マトリクスのリモデリング機構がどのように癌細胞の運動を制御しているかを明らかにするとともに、更にRNAiを用いたこれらの酵素の特異的阻害が癌の浸潤転移抑制治療となる可能性について検討を行うことを目的として行った。初年度の主な成果を以下に示す【1】ADAM17によって制御される、ヒアルロン酸マトリクスと接着分子CD44の接着と解除の回転(turnover)がグリオーマ細胞の浸潤能を規定する重要な要素であることを見出したので、浸潤性の高い腫瘍においてそのturnoverを亢進させる分子機構を調べた。その結果、CD44のADAM17切断を介した切断にはERMを介したアクチン細胞骨格へのリンクおよびHAS3の活性化に伴うヒアルロン酸の新規合成が関わっていることを見出し、それらの阻害によって細胞の浸潤をきわめて効果的に抑制することに成功した。【2】網膜色素上皮細胞を炎症性サイトカインTNF-αで刺激すると上皮-間葉変換(epithelial-mesenchymaltransition:EMT)が生じることを見出している。この際、CD44の細胞骨格への連結分子であるERMタンパク質のリン酸化やHAS2およびHAS3のmRNA発現が上昇すること、またCD44のターンオーバーとそれに伴う細胞運動性が亢進することがTNF-αで誘導される網膜色素上皮細胞のEMTに重要であることが明らかになった。そこで来年度は網膜色素上皮細胞のEMTにおけるCD44、HAS、ERMの役割と活性化機構について明らかにし、網膜の変性疾患に対する治療のターゲット分子になりうるかについて検討したいと考えている。
スピン三重項超伝導体UPt3の準粒子低エネルギー励起構造の解明

本研究では,トポロジカル超伝導体の有力候補であるスピン三重項超伝導体UPt3の多重超伝導相各相における準粒子低エネルギー励起構造の詳細を明らかにし,スピン三重項超伝導の一般的理解を深めることを目的としている.平成26年度は,前年度に引き続き,熱ホール伝導率から各相での超伝導準粒子状態を調べた.これまで得られている熱伝導率に熱ホール伝導率を組み合わせることで非局在準粒子の状態密度および平均自由行程の情報を初めて得ることに成功した.一方,前年度に開発した超音波装置により,超伝導状態における縦波弾性率C11の磁場方向依存性を測定した.測定システムの高精度化に成功した結果,混合状態における多重超伝導転移を弾性率により明確に観測した.さらに弾性率を超音波の変位方向と磁場方向が平行な場合と垂直な場合の2つの配置で測定し,両者の差から各相での渦糸弾性率を求めた.一方,UPt3との比較のため,同じアクチナイド化合物でスピン三重項超伝導の可能性が指摘されているUBe13の超伝導状態も熱輸送,熱電係数を用いて調べた.このUBe13では超伝導相内で比熱や磁化に別の異常が見られていることから多重超伝導相の可能性が示唆されている.熱伝導率の温度および磁場依存性の結果,UBe13では低磁場低温領域において準粒子励起はほとんどないことが明らかになった.これは超伝導ギャップが等方的,あるいはフェルミ面の存在しない向きにポイントノードがあることを示唆しており,UPt3とは異なる超伝導状態であることがわかった.また,超伝導相内で熱伝導率に特に目立った異常がないことからギャップ構造が劇的に変化するような多重超伝導の可能性は低いことがわかった.また,スピン三重項超伝導の理解を深めるため,パリティが混合した超伝導が期待されている反転対称性が破れた結晶構造を持つCeIrSi3の超伝導ギャップ構造も調べた.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では,トポロジカル超伝導体の有力候補であるスピン三重項超伝導体UPt3の多重超伝導各相における準粒子低エネルギー励起構造の詳細を明らかにし,スピン三重項超伝導の一般的理解を深めることを目的としている.平成25年度は,超伝導準粒子状態を明らかにするため,これまでほとんど研究例のない熱ホール伝導率の測定を試みた.そして装置を極限まで最適化することにより,熱ホール効果で生じる微小な温度変化をとらえることに成功した.その結果,常伝導状態で極めて小さい値を示していた熱ホール係数が,超伝導転移温度よりも十分低温で急激に増加することがわかった.常伝導状態で熱ホール係数が極めて小さいのはUPt3が補償金属であるためであるが,それが超伝導状態で増加するということは超伝導状態においては準粒子がホール的な性格をもつことを示している.これは超伝導ギャップに存在するノードがホール面に走っていることを強く示唆している.そこで実際のフェルミ面との比較・考察により,逆格子空間のどの部分にラインノードが存在するかをかなり絞り込むことに成功した.この成果は,実際のフェルミ面とギャップ構造を対応させるというこれまで困難であった議論を可能にするものであり,超伝導発現機構の解明に重要な役割を果たすことが期待される.一方,これと並行に超音波測定システムの構築にも取り組んだ.測定法として位相比較法を用いたシステムの構築に成功した.その際,フィードバック機構を工夫することで非常に小さな単結晶に対しても6桁以上の精度で結晶中の音速が測定可能であることをUPt3の弾性率C11の温度依存性の測定から確認した.これにより平成26年度に予定している多重超伝導各相における渦糸格子弾性の変化を調べる準備が整った.本研究では,トポロジカル超伝導体の有力候補であるスピン三重項超伝導体UPt3の多重超伝導相各相における準粒子低エネルギー励起構造の詳細を明らかにし,スピン三重項超伝導の一般的理解を深めることを目的としている.平成26年度は,前年度に引き続き,熱ホール伝導率から各相での超伝導準粒子状態を調べた.これまで得られている熱伝導率に熱ホール伝導率を組み合わせることで非局在準粒子の状態密度および平均自由行程の情報を初めて得ることに成功した.一方,前年度に開発した超音波装置により,超伝導状態における縦波弾性率C11の磁場方向依存性を測定した.測定システムの高精度化に成功した結果,混合状態における多重超伝導転移を弾性率により明確に観測した.さらに弾性率を超音波の変位方向と磁場方向が平行な場合と垂直な場合の2つの配置で測定し,両者の差から各相での渦糸弾性率を求めた.一方,UPt3との比較のため,同じアクチナイド化合物でスピン三重項超伝導の可能性が指摘されているUBe13の超伝導状態も熱輸送,熱電係数を用いて調べた.このUBe13では超伝導相内で比熱や磁化に別の異常が見られていることから多重超伝導相の可能性が示唆されている.熱伝導率の温度および磁場依存性の結果,UBe13では低磁場低温領域において準粒子励起はほとんどないことが明らかになった.これは超伝導ギャップが等方的,あるいはフェルミ面の存在しない向きにポイントノードがあることを示唆しており,UPt3とは異なる超伝導状態であることがわかった.また,超伝導相内で熱伝導率に特に目立った異常がないことからギャップ構造が劇的に変化するような多重超伝導の可能性は低いことがわかった.

また,スピン三重項超伝導の理解を深めるため,パリティが混合した超伝導が期待されている反転対称性が破れた結晶構造を持つCeIrSi3の超伝導ギャップ構造も調べた.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度は,計画していた熱ホール伝導率測定および超音波測定システム構築に取り組んだ.その結果,熱ホール伝導率測定では,予想通り微小な温度変化を測定する困難な実験であったが,上述の通り装置の最適化を行うことにより目的とした信号をとらえることに成功し,熱ホール係数からUPt3の超伝導対称性に関する重要な知見を得ることができた.また,超音波測定システムについても一からシステムを構築し,改良を加えた結果,想定した性能が出ていることを確認した.このように計画していた2つの取り組みはいずれも計画通りの成果が得られており,順調に研究は進展している.平成26年度は,計画通り研究を進める.まず,完成した超音波測定システムを用い,渦糸格子の弾性率が各超伝導相においてどのように変化するかを調べ,多重超伝導状態の理解を進めたい.また,それと並行して圧力下電気抵抗測定を行い,UPt3の温度ー磁場ー圧力相図の詳細,特に磁場に関する異方性をしらべる.これにより常圧で見られている上部臨界磁場の抑制の起源を明らかにしたい.そして得られた知見からUPt3における超伝導発現機構およびトポロジカルな観点からの超伝導状態の理解を目指す..
NKT細胞および樹状細胞を介した食道癌に対する放射線併用免疫療法の開発

分子シャペロンgp96は,近年,抗原が抗原提示細胞に提示される際にきわめて重要な役割を担う分子であることが明らかになりつつある.今回われわれは,腫瘍由来のgp96の発現増強を放射線照射により誘導し,樹状細胞を用いた効率のよい免疫療法の開発を目指した「放射線併用樹状細胞腫瘍内局注」マウスモデルを作成しその効果を検討した.【方法】マウス扁平上皮癌細胞SCCVIIに2Gy/day x 1の放射線を照射し,細胞中のgp96の発現をウェスタンブロットにて,また,照射後の細胞の形態,細胞内のgp96の局在を蛍光染色にて検討した.また,in vitroにおけるgp96の細胞療法に及ぼす影響をcytotoxic assayにて検討した.in vivoの系ではマウスの大腿にlocal tumorとして,胸部皮下にはdistant tumorとしてSCCVII1x10<SUP>5</SUP>を皮下移植し,大腿のみに4Gy/day x 3の放射線照射とそれに続く樹状細胞の腫瘍内局注を行いlocal tumorおよびdistant tumorの抗腫瘍効果を検討した.さらに、腫瘍内に樹状細胞を直接注入した際の全身抗腫瘍効果を評価するため、TDLN(tumor drainage lymphnode)内の細胞障害性T細胞分画を検討した。【結果】gp96の発現は,照射後48時間で増強が見られた.また蛍光顕微鏡による観察では細胞の肥大化とともに細胞質内にgp96の強い発現増強が観察された.effector細胞をマウス脾臓細胞,抗原をSCCVIIのwhole tumor lysate,抗原提示細胞をDCとし,targetをSCCVIIとしたcytotoxic assayを行ったところgp96を加えた群では強い細胞傷害活性が観察された.また.in vivoの系において放射線照射およびDCの腫瘍内局注のマウスモデルでは、大腿のlocal tumorのみならず,遠隔の未治療distanttumorにも抗腫瘍効果が観察された.また、腫瘍内に樹状細胞を注射した際、TDLN内の細胞障害性T細胞分画の増加が観察され全身抗腫瘍効果が惹起されたことが確認された。【まとめ】腫瘍への放射線照射は,腫瘍のアポトーシス,あるいはネクローシスの誘導とそれによる腫瘍抗原の放出という利点だけではなく,gp96の発現増強を介したsystemicな免疫応答の増強が期待できる.一方で,樹状細胞の腫瘍内局注はcell deliveryの点できわめて有利であり,これらを組み合わせた放射線併用樹状細胞腫瘍内局注法はさらなる効率的な免疫治療になる可能性がある分子シャペロンgp96は,近年,抗原が抗原提示細胞に提示される際にきわめて重要な役割を担う分子であることが明らかになりつつある.今回われわれは,腫瘍由来のgp96の発現増強を放射線照射により誘導し,樹状細胞を用いた効率のよい免疫療法の開発を目指した「放射線併用樹状細胞腫瘍内局注」マウスモデルを作成しその効果を検討した.【方法】マウス扁平上皮癌細胞SCCVIIに2Gy/day x 1の放射線を照射し,細胞中のgp96の発現をウェスタンブロットにて,また,照射後の細胞の形態,細胞内のgp96の局在を蛍光染色にて検討した.また,in vitroにおけるgp96の細胞療法に及ぼす影響をcytotoxic assayにて検討した.in vivoの系ではマウスの大腿にlocal tumorとして,胸部皮下にはdistant tumorとしてSCCVII 1 x 10<SUP>5</SUP>を皮下移植し,大腿のみに4Gy/day x 3の放射線照射とそれに続く樹状細胞の腫瘍内局注を行いlocal tumorおよびdistant tumorの抗腫瘍効果を検討した.【結果】gp96の発現は,照射後48時間で増強が見られた.また蛍光顕微鏡による観察では細胞の肥大化とともに細胞質内にgp96の強い発現増強が観察された.effector細胞をマウス脾臓細胞,抗原をSCCVIIのwhole tumor lysate,抗原提示細胞をDCとし,targetをSCCVIIとしたcytotoxic assayを行ったところgp96を加えた群では強い細胞傷害活性が観察された,また.in vivoの系において放射線照射およびDCの腫瘍内局注のマウスモデルでは,大腿のlocal tumorのみならず,遠隔の未治療distant tumorにも抗腫瘍効果が観察された.【まとめ】腫瘍への放射線照射は,腫瘍のアポトーシス,あるいはネクローシスの誘導とそれによる腫瘍抗原の放出という利点だけではなく,gp96の発現増強を介したsystemicな免疫応答の増強が期待できる.一方で,樹状細胞の腫瘍内局注はcell deliveryの点できわめて有利であり,これらを組み合わせた放射線併用樹状細胞腫瘍内局注法はさらなる効率的な免疫治療になる可能性がある分子シャペロンgp96は,近年,抗原が抗原提示細胞に提示される際にきわめて重要な役割を担う分子であることが明らかになりつつある.今回われわれは,腫瘍由来のgp96の発現増強を放射線照射により誘導し,樹状細胞を用いた効率のよい免疫療法の開発を目指した「放射線併用樹状細胞腫瘍内局注」マウスモデルを作成しその効果を検討した.【方法】

マウス扁平上皮癌細胞SCCVIIに2Gy/day x 1の放射線を照射し,細胞中のgp96の発現をウェスタンブロットにて,また,照射後の細胞の形態,細胞内のgp96の局在を蛍光染色にて検討した.また,in vitroにおけるgp96の細胞療法に及ぼす影響をcytotoxic assayにて検討した.in vivoの系ではマウスの大腿にlocal tumorとして,胸部皮下にはdistant tumorとしてSCCVII1x10<SUP>5</SUP>を皮下移植し,大腿のみに4Gy/day x 3の放射線照射とそれに続く樹状細胞の腫瘍内局注を行いlocal tumorおよびdistant tumorの抗腫瘍効果を検討した.さらに、腫瘍内に樹状細胞を直接注入した際の全身抗腫瘍効果を評価するため、TDLN(tumor drainage lymphnode)内の細胞障害性T細胞分画を検討した。【結果】gp96の発現は,照射後48時間で増強が見られた.また蛍光顕微鏡による観察では細胞の肥大化とともに細胞質内にgp96の強い発現増強が観察された.effector細胞をマウス脾臓細胞,抗原をSCCVIIのwhole tumor lysate,抗原提示細胞をDCとし,targetをSCCVIIとしたcytotoxic assayを行ったところgp96を加えた群では強い細胞傷害活性が観察された.また.in vivoの系において放射線照射およびDCの腫瘍内局注のマウスモデルでは、大腿のlocal tumorのみならず,遠隔の未治療distanttumorにも抗腫瘍効果が観察された.また、腫瘍内に樹状細胞を注射した際、TDLN内の細胞障害性T細胞分画の増加が観察され全身抗腫瘍効果が惹起されたことが確認された。【まとめ】腫瘍への放射線照射は,腫瘍のアポトーシス,あるいはネクローシスの誘導とそれによる腫瘍抗原の放出という利点だけではなく,gp96の発現増強を介したsystemicな免疫応答の増強が期待できる.一方で,樹状細胞の腫瘍内局注はcell deliveryの点できわめて有利であり,これらを組み合わせた放射線併用樹状細胞腫瘍内局注法はさらなる効率的な免疫治療になる可能性がある
相互的・社会的納得観に基づく納得技術教育手法および学習支援システムの開発

本研究では、納得・説得教育のための教育手法の提案と支援システムの開発を目指した。そのために、具体的な納得・説得過程の分析をおこなった。その分析では、大学生がプレゼンテーションを構成する2つの場面を取り上げ、かれらが、どのように他者の納得を引き出すプランニングをおこなうかを、ビデオ分析の手法で明らかにした。その結果、納得プランニングにおいて、関連する人々の人間関係の把握、人々の声の想定、それらの声を用いた対話シミュレーションがなされていることがわかった。この知見に基づいてマンガ表現法というアイデア洗練手法を考案した。この方法は、自分のアイデアを、マンガの形式で表現し、それをもとに振り返りや議論をおこなう手法である。大学生を対象にした複数の授業においてこの手法を実施し、その効果を確認した。その後、その手法の実施を支援するための学習システムVoicingBoardを開発した。VoicingBoardは、マンガの作成を支援するためのネットワークアプリケーションであり、操作性の高いインタフェースを備えるとともに、他者のマンガを参考にして自分のマンガを洗練するための機能(並置モードおよびアクターデータベース)を備えている。システムの評価は、大学生を対象とした情報教育の場として行った。インタフェース評価より、VoicingBoardが、(1)容易に習得可能であり、(2)アイデアのマンガ表現がスムースにおこなえ、(3)完成したマンガを検討・修正することが負荷なくできる、ことが明らかになった。ビデオ分析の結果、VoicingBoardが、納得を構成するための社会的ネットワークを拡げていくことに寄与していることがわかった。実践を通して、システムの改善点も明らかになった。具体的には、(1)授業実践のためには、印刷機能が必須であること、(2)漫画を拡大する機能が必要であること、(3)細かい表現のための画機能が必要であること、等である。これらの機能を追加し、追加の実践評価をおこなった。システム開発と並行して、VoicingBoardを利用した納得・説得訓練の授業案を複数提案し、実践をとおして、手直しをおこなった。研究終了後、これらの実践案とシステムを合わせて、公開する予定である。本研究の目的は、「納得すること」を現代社会に生きる人々の必須技術として取り上げ、その過程を明らかにし、「よい納得者になるため」の教育手法と訓練システムを開発することである。今年度は、まず、相互的・社会的納得観の提案、概念整理をおこなった。従来の受動的・個人的納得観に変わるものとして、相互的・社会的納得観に基づく納得概念を明確化した。バフチンのコミュニケーション理論やアクターネットワーク理論に関する文献研究をするとともに、人を納得させようとする場面のエスノグラフィー的調査をおこなった。調査は、ある具体的なプレゼンテーションの準備と実施の場面を最初から最後までビデオに収め、そこからトランスクリプトをおこし検討するというものであった。この調査より、納得が、人と人工物からなる社会的ネットワークのアレンジメントとして達成されていることが明らかとなった。このような新しい納得観について、論文にまとめ公表した。次に、納得訓練手法の検討をおこなった。「対話をとおした合意(納得)形成能力」と「自分の納得内容の社会的説明能力」を納得教育の基本的な柱として、そのための訓練手法を検討した。具体的には、「代理説得」手法の検討をおこなった。代理説得とは、自分が納得した内容を自分のものとして他者にむかって説明をおこなう活動である。

アイデア発信者と自分という2者関係ではなく、発信者と仲介者としての自分と、説得すべき他者という3者関係を組みいれることで、動的な納得が得られると期待される。この手法は、大学生のプレゼンテーション授業をフィールドとしてテストした。質問紙調査の結果、代理説得という手法が、学生の「納得力」を高めることが示唆された。今後、実験場面の細かい分析をおこなう。来年度は、これらの結果をふまえて、納得訓練システムの基本仕様の決定、試作をおこなう予定である。本研究の目的は、「納得すること」を現代社会に生きる人々の必須技術として取り上げ、その過程を明らかにし、「よい納得者になるため」の教育手法と訓練システムを開発することである。本研究では次の3課題に取り組む。(1)相互的・社会的納得観に立った納得教育手法の開発、(2)納得教育のための訓練システムの設計と試作、(3)カリキュラム開発と教育現場での実証と公開本年度は、次の活動をおこなった。(1)双方向漫画要約手法の提案:昨年度に効果検証実験をおこなった仮想会議録作成法と代理説得法の欠点を補い、さらに効果が期待できる教育手法として「双方向漫画要約法」を提案した。漫画要約法とは、聴いたプレゼンテーション内容を漫画の形式で表現し、それをもとにプレゼンテーションの内容理解を図る訓練手法である。漫画という表現形態によって、プレゼンテーション内容に誰が関係しているのか考えたり、関係する人々の声を想像したりすることがサポートされ、質の高い納得に至る支援になると考える。(2)双方向漫画要約の効果実証実験:大学生を被験者とした効果検証実験を3回おこなった。その結果、双方向漫画要約が、人の意見を様々な立場から聞き、質の高い納得を得るための訓練手法としてすぐれていることが明らかになった。(3)双方向漫画要約手法を支援する教育システムの開発:双方向漫画要約を支援するためのシステムVoicingBoardの仕様を決定し、プロトタイプの開発をおこなった。このシステムは、登場人物とそのセリフを簡単な操作で入力する漫画入力機能と、作成された2つの漫画を比較するための並置機能、他者の書き入れたセリフを一望するセリフデータベース機能からなる。開発言語はFlashであり、多種多様なコンピュータ環境を持つ教育現場において広く利用されると期待される。昨年度、納得教育手法として双方向漫画要約法を提案し、その手法を支援するための学習システムVoicingBoardを試作した。本年度は、この試作システムを実践で利用できるように改良し、大学生を対象とした説得・納得訓練実習において評価をおこなった。評価は、操作性等のインタフェース評価、教育効果の両面から行った。
Extradiol型二原子酸素添加酵素の構造機能相関の解明

本申請の研究目的は、リグニン分解代謝系の基質特異性・四次構造などが異なる数種のExtradiol型二原子酸素添加酵素(DesZ酵素、DesB酵素、LigAB酵素など)の高精度立体構造(1.5Å以上)をX線結晶構造解析の手法により明らかにし、酵素活性データ、変異体酵素を組み合わせて総合的に解析することで、Extradiol型二原子酸素添加酵素全体における多様な基質特異性の起源と反応機構を立体構造にもとづいて明らかにすることを目指す。(1)DesB酵素について解析した1.8Å分解能におけるDesB酵素の立体構造とLigAB酵素の立体構造を比較した結果、以下の2つについて新たな知見を得ることができた。(1)従来、Extradiol型二原子酸素添加酵素の鉄イオンには、2つのヒスチジン残基と1つのグルタミン酸残基がアミノ酸由来の配位子として存在していたが、DesB酵素では、これら3つのアミノ酸残基に加えて新たに1つのアスパラギン残基が配位した新しいタイプであった。(2)この新たに加わった配位アミノ酸残基のために、基質が結合する際、DesB酵素ではLigAB酵素と異なるアクションが必要になると考えられる。現在、このアスパラギンに対して、他のアミノ酸に置換したものを調製しており、酵素活性および立体構造の解析を進めている。今後、多数の変異体酵素を調製・解析することで、DesB酵素における反応メカニズムを明らかにできると考えている。また基質特異性についても同様に変異体酵素を調製・解析することで、DesB酵素のもつ基質特異性の起源を立体構造の観点から明らかにしていく。(2)DesZ酵素について当初得られていた結晶では、構造解析が困難であると判断し、現在、他のスクリーニングキットによる結晶化条件の探索を行っている。本年度は以下に示した1,2の成果を得ることができた。1DesB酵素の結晶化条件の確立およびX線回折強度データ測定本酵素を大腸菌により発現・精製したものを用いて、結晶化条件の探索を行ったところ、微少な結晶を得ることができた。この結晶化条件に関わる因子に対して、最適化を行ったところ、1.8Å分解能を超える結晶を得ることに成功した。2DesB酵素の初期モデル構築上記結晶におけるX線回折強度データに対して、分子置換法(LigAB酵素をサーチモデル)によりDesB酵素の初期モデルを構築した。現在、精密化プログラム(CNS, REFMAC)により構造を精密化している。今後、DesB酵素に関しては、詳細な立体構造を明らかにし、基質複合体、変異体酵素の調製を行っていく。また、他の酵素に関しては、さらに結晶化条件の改良を行い、立体構造解析を可能としていく。本申請の研究目的は、リグニン分解代謝系の基質特異性・四次構造などが異なる数種のExtradiol型二原子酸素添加酵素(DesZ酵素、DesB酵素、LigAB酵素など)の高精度立体構造(1.5Å以上)をX線結晶構造解析の手法により明らかにし、酵素活性データ、変異体酵素を組み合わせて総合的に解析することで、Extradiol型二原子酸素添加酵素全体における多様な基質特異性の起源と反応機構を立体構造にもとついて明らかにすることを目指す。本年度は以下に示した(1),(2)の成果を得ることができた。(1)DesZ酵素の結晶化条件の探索本酵素を大腸菌により発現・精製したものを用いて、結晶化条件の探索を行ったところ、微少な結晶を得ることができた。現在、X線回折強度測定に耐えうる結晶調製を行っている。(2)DesB酵素のモデル構築2-1)naitive構造について昨年度結晶化・X線回折強度測定に成功し、1.8Å分解能におけるモデルを構築した。現在、更なる高分解能における構造解析を行うために、結晶の質の向上を目指している。2-2)基質複合体構造について基質複合体の構造解析を行うために、基質-酵素複合体結晶の調製を試みているが、適切な人工母液を調製することが困難なため、現在、共結晶化などの他の方法による複合体結晶の調製を試みている。