hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エストロゲンレセプターによる核内受容体LXRの転写活性化制御機構の解析

肝臓は生体内においてさまざまな代謝制御に関与する重要な臓器として知られている。その機能の低下は重篤な疾患に繋がると考えられるため、肝疾患に着目し、そのメカニズムの解明を進めた。まず、女性ホルモンであるエストロゲンが肝臓におけるトリグリセリド(TG)蓄積(脂肪肝)を抑制するという報告から、エストロゲン受容体(ER)による脂肪肝抑制機構についての解析を行った。脂肪肝は、核内受容体の一つであるLXRの転写活性化により引き起こされることが知られている。本研究では、ERとLXRのcross-talkの可能性に着目し研究を進めた。その結果、ERのリガンドであるエストロゲン(E2)がLXRリガンドにより誘導される脂肪肝を抑制することを明らかとした。またその際、E2がTG合成に関与するLXR標的遺伝子の発現を低下することも明らかとした。これらの作用はERノックアウトマウスでは認められなかった。このことからE2はERを介してLXRの標的遺伝子の発現を低下し、TGの蓄積を抑制することが示唆された。次にERがLXR標的遺伝子の発現を制御する分子メカニズムについて解析を行った。免疫沈降法により、ERがLXRとリガンド非依存的に相互作用することを明らかとした。また、クロマチン免疫沈降法を用いた解析によりER-LXR complexのLXR target promoter上への結合もリガンド非依存的であることを明らかとした。一方、転写共役因子p300とSRC-1のLXR target promoter上へ結合がLXRリガンドにより促進するのに対し、これらの結合能がE2により抑制されることを明らかとした。以上の結果から、リガンド依存的にER-LXRcomplexが転写共役因子と複合体を形成し、転写を制御している可能性が示唆された。この新規のER-LXR pathwayの解明は、今後の肝疾患治療に繋がると期待される。本研究員は現在エストロゲンレセプター(ER)による核内受容体LXRの転写活性化制御について解析を行っている。これまでの報告からエストロゲンが減少する閉経後の女性で高脂血症や脂肪肝を発症する人が増加することが知られている。このことから、エストロゲンが脂質代謝異常を抑制することが示唆されている。また、LXRの標的遺伝子は主に脂質代謝関連遺伝子であることが知られている。このことから、本研究員はエストロゲンがLXRの転写を制御するのではないかと考え、研究を進めた。その結果、エストロゲンがLXRの転写活性化を抑制することを明らかにした。そこで、本研究員は次にエストロゲンがLXRの転写活性化を抑制する詳細な機構について検討した。その結果、ERとLXRがリガンド非依存的にER-LXR複合体を形成しており、LXRのリガンドによりこの複合体がLXR標的遺伝子のプロモーターへリクルートされることが明らかとなった。また、さらにそこにエストロゲンが加わるとER-LXR複合体のプロモーターへのリクルートが阻害されることで転写が抑制することも見出した。このことより本研究員はリガンド依存的なER-LXR複合体のDNA結合能の変化によりLXRの転写を制御する事を明らかとした。また、これまでの報告からLXRリガンドにより脂質代謝関連遺伝子の発現が上昇することでトリグリセリドの値が上昇することが知られている。本研究員はさらにこの上昇したトリグリセリドの値がエストロゲンにより抑制されることも明らかとした。エストロゲンによるトリグリセリドの抑制機構にはEREの転写活性化とは異なる新たなメカニズムがあることを示唆された。このメカニズムの解明は新たなる脂質代謝異常の治療薬の開発につながると考えられる。その結果、エストロゲンがLXRの転写活性化を抑制する制御機構を明らかにした。しかし、エストロゲンはこれまでの報告から、ERの転写活性化により発がん促進作用が知られている。そこで、本研究員は次にエストロゲン以外のERリガンドでERの転写制御とLXRの転写制御を個別に制御できるような化合物の探索を検討した。その結果、ERの転写活性化を示さずにLXRの転写活性化のみを抑制できるような新規化合物の同定に成功した。本研究員はさらにこの上昇したトリグリセリドの値が新規化合物により抑制されることも明らかとした。

脂肪肝は、核内受容体の一つであるLXRの転写活性化により引き起こされることが知られている。本研究では、ERとLXRのcross-talkの可能性に着目し研究を進めた。その結果、ERのリガンドであるエストロゲン(E2)がLXRリガンドにより誘導される脂肪肝を抑制することを明らかとした。またその際、E2がTG合成に関与するLXR標的遺伝子の発現を低下することも明らかとした。これらの作用はERノックアウトマウスでは認められなかった。このことからE2はERを介してLXRの標的遺伝子の発現を低下し、TGの蓄積を抑制することが示唆された。次にERがLXR標的遺伝子の発現を制御する分子メカニズムについて解析を行った。免疫沈降法により、ERがLXRとリガンド非依存的に相互作用することを明らかとした。また、クロマチン免疫沈降法を用いた解析によりER-LXR complexのLXR target promoter上への結合もリガンド非依存的であることを明らかとした。一方、転写共役因子p300とSRC-1のLXR target promoter上へ結合がLXRリガンドにより促進するのに対し、これらの結合能がE2により抑制されることを明らかとした。以上の結果から、リガンド依存的にER-LXRcomplexが転写共役因子と複合体を形成し、転写を制御している可能性が示唆された。この新規のER-LXR pathwayの解明は、今後の肝疾患治療に繋がると期待される。
ゼータ関数の値の挙動について

過去の数学の歴史の中で、リーマン予想の類似問題が解決された例を見ると、ドリーニュによるヴェイユ予想の証明や、ルオ、ルドニック、サルナック、キムらによるラマヌジャン予想への進展の証明があげられるが、それらの証明からわかることは、ゼータ関数の零点の和を零点に持つようなゼータ関数(多重ゼータ関数)を構成し応用することが重要だということである。本研究はこの多重ゼータ関数を、本来のリーマン・ゼータ関数に対して構成することを目的とした。研究の方法は、まず二重明示公式を書き下すことにより、ゼータ関数の非自明零点の組合せに渡る和と、素数の組に渡る和との関係式を導いた。これは、従来から知られていたリーマン・ゼータ関数の明示公式の二重化であるが、全ての非自明零点の組合せを取ると発散和が出てしまい意味をなさないため、上半平面あるいは下半平面に属する非自明零点同士の和だけを考えたところが新しい着想である。さて、従来、明示公式はゼータ関数のオイラー積表示から得られ、逆に、明示公式を特殊な試験関数に限定することでゼータ関数のオイラー積表示を復元できた。この原理を二重明示公式に適用し、我々は二重明示公式から二重リーマン・ゼータ関数の具体的な形(素数の組に渡るオイラー積表示)を得た。主定理として、そこで得た二重リーマン・ゼータ関数が実部が2より大の領域で絶対収束し、実部が正の領域に解析接続され、2と2-sとの間で関数等式を満たすことを得た。1.セルバーグ型ゼータ関数の非自明零点の分布、すなわちラプラシアンの固有値分布は、少なくとも数論的多様体に対してはランダムであろうと予想されており、この予想は素測地線定理の究極的な改善と同値であることが知られている.本研究では3次元数論的多様体に対し、保型L関数のリンデレーフ仮説の下で素測地線定理を改善した.改善された指数は11/7であり、従来の2より3/7の改善を得た.2.ゼータ関数の自明零点はガンマ因子によって定まる.セルバーグ・ゼータ関数のガンマ因子は、2,3次元の双曲多様体に対してのみ知られていたが、本研究では一般の階数1リー群の、商体積が有限な離散部分群についてガンマ因子を求めた.それらは多重ガンマ関数を用いて完全に表された.3.ゼータ関数は臨界領域において、変数の虚部を無限大にしていくと任意の関数を十分良く近似できることが知られている.この性質はゼータ関数の普遍性と呼ばれる.最近では変数の虚部を固定して他のパラメータを無限大にすることによる普遍性が発見されている.本研究では、量指標のヘッケL関数について、量指標を与えられた生成元のべき積で表し、その指数のなすベクトルの絶対値を増大させることによる普遍性を扱った.これはゼータ関数研究においてこれまでに研究されたことのなかった観点であり、今後のゼータ関数の評価などの問題にも新たな視点を与える発想であると考える.本研究では変数の虚部と量指標をともに動かした場合の普遍性を証明した.本研究は数論的ゼータ関数の値の挙動を主たる研究対象としている。セルバーグ・ゼータ関数やラプラシアンのスペクトルなど、幾何学的な対象における成果を踏まえ、元来の数論で未解決となっている数論的ゼータ関数の問題に進展を与えることが目標である。今年度の実績は、ゼータ関数の普遍性と多重化の2つの方向においてなされた。前者は、代数体の量指標ヘッケL関数の普遍性を、量指標が変化した場合に新たに定義して証明した研究(名古屋大学の見正氏との共同研究)であり、論文は日本学士院紀要に出版された。第二の方向の多重化とは、1974年にドリーニュがフィールズ賞を受賞した「合同ゼータ関数のリーマン予想の証明」に新たな解釈を与えて発展させたもので、1990年頃より黒川信重氏により考案されている理論である。一般に2つのゼータ関数の積(絶対テンソル積、黒川積)を、それらの零点や極の和を零点や極に持つような、位数の高い複素関数として定義し、そこに跡公式(明示公式)を用いることにより多重ゼータ関数のオイラー積表示を得、それよりリーマン予想への進展を得るという発想である。今年度の実績としては、有限体のハッセ・ゼータ関数の多重化を実現し、それらの応用としてセルバーグ・ゼータ関数のガンマ因子の計算、リーマン・ゼータ関数の特殊値の表示などを得た。この研究は一連の共著論文としてまとめ、既に三編が掲載決定、一編が投稿中、さらに二編が投稿準備中となっている。

これは、従来から知られていたリーマン・ゼータ関数の明示公式の二重化であるが、全ての非自明零点の組合せを取ると発散和が出てしまい意味をなさないため、上半平面あるいは下半平面に属する非自明零点同士の和だけを考えたところが新しい着想である。さて、従来、明示公式はゼータ関数のオイラー積表示から得られ、逆に、明示公式を特殊な試験関数に限定することでゼータ関数のオイラー積表示を復元できた。この原理を二重明示公式に適用し、我々は二重明示公式から二重リーマン・ゼータ関数の具体的な形(素数の組に渡るオイラー積表示)を得た。主定理として、そこで得た二重リーマン・ゼータ関数が実部が2より大の領域で絶対収束し、実部が正の領域に解析接続され、2と2-sとの間で関数等式を満たすことを得た。
国境を越えた法人課税と会計のルール

本研究は、欧州の会計制度(特に連結会計制度)と法人税(特に企業結合税制)を対比させ、国際会計基準のEU加盟国各国での受容の度合いと法人税の課税標準の国際化の進展具合について、英・独・北欧を軸に比較研究を行ったものである。会計制度については、イギリスが国際会計基準の国内法制化の先鞭を切ったのに対し、ドイツでは上場企業(その多くは多国籍企業である)と閉鎖企業(その多くは中小企業である)とを区別し、前者のみに国際会計基準を適用する方法を選択した。さらにその間に位置する北欧(スウェーデン)では、、会計基準の統一より、欧州委員会の出したCCCTB(統一法人課税標準)案について積極的であることがわかった。本年度の前半は、昨年度の国内の学会(税務会計研究学会)での研究発表に基づき、関連する分野の専門家であるケルン大学経済社会学部のーベルト・ヘルツィヒ教授(税務会計学)を日本に招へいし、明治大学と東北大学で3回の講演(うち1回は、日本人および日本在住の欧州出身(英・蘭・仏)の会計学者を中心とする非公開のワークショップ)を開催した。参加者は、法律系からは、租税法のほか、国際法・会社法・行政法の専門家が、また会計系からは、財務会計の専門家(日本人および日本在住のオランダ人・フランス人研究者)および、会計大学院および法科大学印の院生(含む卒業生)と多岐にわたった。この東北大学と明治大学での2回の講演(「国際会計基準とローカル・GAAP」および「欧州統一法人課税標準(CCCTB)」)に関しては、後日、講演録として日本語に訳出して、公表を行っている。また、欧州域内でも、大陸のアプローチと英国のアプローチでは異なることから、英国およびその影響を受けている豪州の研究者との交流を夏以降に開始した。具体的には、英国および豪州の研究者の来日時にインタビューを行い、翌年度以降、研究者同士の相互交流をする段取りを整えた。さらに、本研究のテーマは、実務とも密接にかかわることから、実務法曹の関係者ともコンタクトをとるべく、本年度の後半にかけてドイツの連邦憲法裁判所および連邦財政裁判所の判事からもインタビューを行ない、情報のup-to-dateを図った。平成24年度は、研究の初年度にあたるため、知識や情報のインプットに主力を注いだ。まず夏休みに松原が、ドイツ(ミュンヘン大学および連邦財政裁判所訪問・ニュルンベルク大学およびDATEV訪問・ベルリン税理士会および大手会計事務所訪問・マックスプランク国際私法研究所ハンブルクを訪問)とスェーデン(ストックホルム経済大学およびウプサラ大学を訪問)に出張し、欧州の国際課税(特に企業課税)についての情報収集を行い、現地の研究者および国際税務の実務家と意見交換を行った他、松原が8月にスェーデンのウプサラ大学で「日本の国際的租税回避防止策(CFCルール改正)の動向」について英語でプレゼンテーションをする機会を得た。松原は、その後9月末から10月始めにかけてアメリカのボストンで行われたInternational Fiscal Association(IFA)の年次大会に出席する機会を得て、米大陸(含む南米)および欧州大陸の実務家や研究者から米国の国際課税の現状および国際的租税回避への対応策をヒアリングする機会を得た。次いで、日本国内では、10月末に開催された、税務会計研究学会の自由論題において、松原と猪熊が共同で「国境を越えた法人税と会計のルール」と題して、欧州域内での会計ルールと連結法人の課税についての研究発表を行ない、質疑応答に対応した。現在、学会誌にその要約を執筆中である。その後、11月始めには、ドイツのミュンヘン大学から租税条約の専門家であるモーリス・レーナー教授を日本に招聘し、明治大学で講演会「欧州租税法の行方ドイツの租税条約ポリシー」を開催し、その際、松原が通訳(ドイツ語)をつとめた。最終年度は、欧州(オランダ・ドイツ)の研究者および実務家(財政裁判所裁判官)および豪州の研究者を日本に招聘し、近年わが国の企業の間でも問題となっている国際的租税回避に対する各国の対応(BEPS)について、研究することができた。具体的には、平成26年6月にライデン大学(オランダ)の国際課税の専門家であるKees van Raad教授が来日され、OECDのBEPS対応プロジェクトの進展状況およびオランダの対応について外部の有識者を交えて、東京で意見交換を行った。また、平成27年3月にチュービンゲン大学(ドイツ)教授兼ドイツ連邦財政裁判所長官のRudolf Mellinghoff氏が来日し、大阪国税不服審判所と最高裁判所(東京)でわが国の裁判官と意見交換をされた他、明治大学で「脱税と」と題して、ドイツ語で講演をされた。その結果、国際的租税回避(=国際的脱税)を誘発している国(オランダをはじめとする欧州のいくつかの国)とそれを阻止しようとしている国(ドイツ)の立場の違いを明確化することができ、わが国の今後の国際租税政策を考える上でも、当事国で大きな影響を有するお二方から直にヒアリングできたのは非常に有益な機会であった。

また、ヒアリングや講演会には、学者(含む院生・助教)だけでなく、政策決定サイド(官公庁)および民間の実務家(弁護士・会計士・税理士)も同席され、招聘した海外からのゲストには、わが国の状況を説明することもでき、こちらも有益であったと考える。その他、前年度からの継続事項として、ケルン大学(ドイツ)のNorbert Herzig名誉教授の東北大学での講演録も出版される運びとなった。同教授の専門は租税法ではなく、税務会計ではあるが、わが国でも問題となっている国際会計基準(IFRS)の適用範囲について、自国の方法をカーブアウトさせたやり方は極めて有益であると考えられる。租税法・国際租税法今年度は、ドイツの研究者を招へいし、従来、論文等の書籍でのみから得ていた研究内容について、欧州の実態を細かく知ることができた。また、租税法や財務会計の隣接分野の研究者との交流も生まれ、国際比較のみならず、国内でも学際研究を進めることができたのは、当初の予測を超えた成果であった。今後は、院生や学部の上級生も含めて、研究を進めて行きたいと考えている。初年度は、主たる研究対象を欧州に絞り、EU内での会計基準と法人課税の共通化の深度について比較研究することに主眼を置いた。その結果、EUでは会計基準の統合の動きの早さと比較して、加盟国間の直接税とくに法人税制統合の動きはまだまだ発展途上にあるといえ、むしろ、納税者(多国籍企業)側の低課税国への資本集中・本社移転などの動きに関連して、やや場当たり的かつパッチワーク的にEU加盟国各国の税制が改正されているという現状が明らかになった。そのため、各国の現行の法人課税に関しては、各国の立法府(議会)の直接税分野におけるEU協調(harmonization)への動きの停滞に対して、司法府(裁判所)がこれに先行してけん制する判例をだしている傾向がみられ、法人税に関するEU指令案が実現しない分、欧州裁判所や各国の最高裁判所など司法府の役割が重要になってきているという現状がわかった。さらに、会計基準についても、EU加盟国が必ずしも全面的にIFRSに転換するという訳ではなく、税務の問題や完全にドメスティックな中小企業の存在から各国とも国内独自の会計基準(税務基準)を放棄するわけにもいかず、その結果、IFRS for SMEと呼ばれる中小企業会計基準が独自形成されるなど、複線化がすすみ、後者に関しては、今後の動向が注目されていることが分かった。次年度は、本研究課題の最終年度にあたることから、これまでの研究成果を基礎に、さらに英独以外の国および個別の論点について、深めることを考えている。また、海外の研究者・研究機関との交流も引き続き、積極的に行いたいと考えている。具体的には、オランダやドイツの研究者や実務家を日本に招聘するほか、オーストラリアなど、従来の会計制度・法人税体系を近年(2000年)抜本的に改正した国(欧州型から米国型)にも焦点をあて、その理由および改革の進捗度合についても、わが国へのインプリケーションを含めて、フォローしたいと考えている。今後は、昨年度発表した国内学会での研究成果をまとめる他、ドイツのケルン大学から税務会計の専門家を日本に招聘して、(1)国際財務報告基準(IFRS)のドイツ国内法(会社法および法人税法)への受容
上皮性形態形成に必須な微小管の機能とその調節機構

上皮性の形態形成運動における微小管の機能とその調節機構を理解するため、ツメガエルとゼブラフィッシュの神経管形成過程をモデルとして発生細胞生物学的な見地から解析を行った。その結果、微小管が神経上皮細胞で起こる伸長運動を促進すること、その機能がxMIDタンパク質とMig12によって調節されていることを明らかにした。この成果は上皮組織の破綻に由来する様々な疾患の原因解明に寄与することが期待される。本研究では"上皮性の形態形成を微小管の振る舞いから理解する"を大きな目的とし、1、神経管閉鎖における微小管の役割に関する解析、2、微小管の振る舞いを調節する因子xMIDsの機能解析、3、ツールとしてのライブイメージング技術の発展と定量生物学的解析、を実施した。まず微小管の重合を阻害したツメガエル胚を解析し、微小管の機能が神経上皮細胞における細胞伸長、頂端収縮、細胞接着に必須であることを明らかにした。また、神経管閉鎖を制御する因子として同定したxMIDsの機能解析を進め、xMIDsの機能阻害により細胞伸長、頂端収縮、細胞接着、微小管ネットワークの再編成が阻害されることを明らかにした。一方でxMIDsの機能を阻害しても神経細胞の発生・分化・背腹軸に沿ったパターニング、そしてShhシグナル経路の活性に変化がなかったことから、xMIDsの機能は神経板(管)を構成する上皮細胞の形態と上皮構造の統合性の制御にあることが明らかになった。また既知の相互作用因子と質量分析にて同定した新規のxMIDsの相互作用因子の機能解析を行った。既知の相互作用因子の1つのAlpha4と質量分析にて同定したCasein kinase IIは神経上皮細胞における機能的関連性は検出されなかったが、もう1つの既知相互作用因子であるMig12に関して、上皮細胞の形態制御と微小管再編成制御におけるxMIDsとの機能的関連性を見出した。また、解析3、については、ツメガエル胚に加えゼブラフィッシュ胚のライブイメージングを新型顕微鏡DSLMにて行い、神経管形成における細胞伸長の過程とその際の微小管動態の経時観察の系を確立した。"上皮性の形態形成を微小管の振る舞いから理解する"を大きな目的とし、1、神経管閉鎖における微小管の役割に関する解析、2、微小管の振る舞いを調節する因子xMIDsの機能解析、3、ツールとしてのライブイメージング技術の発展と定量生物学的解析、を実施した。解析1について...in situ hybridizationと低分子阻害剤を利用した迅速アッセイ系により、神経管形成を正に制御する分子経路を複数同定した。更に免疫染色とライブイメージングを利用して候補分子経路を阻害した胚を観察したところ、グアニル酸シクラーゼの活性を阻害した場合の神経細胞の形態が微小管を阻害したときの細胞形態と酷似することが判明し、cGMP/PKG経路が微小管の分布の調節している可能性が示唆された。解析2について...xMIDsの機能解析を他の上皮性器官の形態形成にも拡張した結果、xMIDの機能を阻害した前腸、前腎管、セメント腺において上皮細胞の形態異常、頂端膜におけるアクチン細胞骨格の集積異常、基底膜におけるラミニンの集積異常が起こることが明らかになった。これらの異常は神経管における上皮細胞の異常とよく似ていたことから、xMIDの微小管に対する機能は神経管に留まらず多くの上皮性器官の形態形成に必須であることが示唆された。解析3について...ライブイメージングを利用してゼブラフィッシュの神経管形成の過程を解析した結果、30分から1時間程度の間に正中線付近の細胞が急激に伸長することが分かった。またこの時の微小管の動態を観察すると内外方向に極性化していことから、ゼブラフィッシュにおいても微小管は内外方向に安定化することで細胞の伸長を制御する可能性が示唆された。
糖尿病に対する膵島封入羊膜移植の治療効果

膵島移植後の治療成績の向上のためには、その治療効果を高める工夫が必要である。本研究では、羊膜内部に膵島を封入した膵島封入羊膜を作成し、この移植よる治療効果を明らかにすることを目指す。具体的には、糖尿病動物に対して同種同系、異系、または異種動物の膵島を封入した羊膜を移植し、いずれのモデルにおいても膵島の生着が得られ糖尿病が改善すること、羊膜と同じ構成成分の人工羊膜を開発し、これで作成した膵島封入羊膜の移植でも同様の治療効果が得られることを明らかにする。
aPKCλの機能的両義性による皮膚癌発生の分子機序

細胞内シグナル伝達経路を司るプロテインキナーゼCファミリーの一つ、atypical protein kinase Cλ(aPKCλ)は、上皮の極性形成を制御している。aPKCλの活性化は基底細胞癌の増殖を促進することが報告されているが、我々が表皮特異的aPKCλを欠失したマウスを用いて2段階化学発癌実験を行ったところ、予想に反して有棘細胞癌が高頻度で発生することが判明した。すなわち、「aPKCλは基底細胞癌では増殖を正に、また有棘細胞癌では負に制御している」可能性が示唆された。そこで本研究では、皮膚癌の種類により相反する作用を持つ、aPKCλの機能的両義性の分子機序を解明することを目的として研究を行った。研究2年目の平成30年度は、遺伝的バックグランドを好発癌系のFVB/N系統(白ネズミ)にした表皮特異的aPKCλ欠損マウスを用いて、2段階化学発癌実験を行った。その結果、C57BL/6系統(黒ネズミ)で得られた結果とは逆に、白ネズミ化した表皮特異的aPKCλ欠損マウスでは有棘細胞癌はできにくくなっていた。このことは、遺伝的バックグランドによりaPKCλは有棘細胞癌の発症に対して正にも負にも働きうることを示唆している。一方、C57BL/6系統(黒ネズミ)で創傷治癒実験を行ったところ、表皮特異的aPKCλ欠損マウスではコントロールマウスに比べ、創傷治癒時の表皮細胞の遊走方向がランダムになるために創傷治癒が遅れることを見出した。時間と労力をかけて作製した白ネズミ化した表皮特異的aPKCλ欠損マウスで当初予想した腫瘍形成の増進がみられず、研究計画の変更をされた。一方で、aPKCλが創傷治癒を制御する、という新しい知見を見出し報告した。したがって、総合的に「おおむね順調に進展している」と判断した。C57BL/6系統とFVB/N系統の遺伝的バックグランドの違いを詳細に調べるのは、本研究の目的を逸脱している。今後は白ネズミと黒ネズミで結果が異なったことをまとめる。また、当科の臨床標本を用いてヒトの有棘細胞癌でaPKCλの発現がどうなっているのか免疫組織化学染色、定量的PCR法、およびウェスタンブロット法で調べる。一方で、創傷治癒と発癌の関係に関する研究を進める。aPKCλの活性化は基底細胞癌の発症に関与していることが報告されているが、我々が表皮特異的にaPKCλを欠失したマウスを用いて2段階化学発癌実験を行ったところ、有棘細胞癌が高頻度で発症することが判明した。すなわち、「aPKCλは基底細胞癌の発症を正に、有棘細胞癌の発症を負に制御している」可能性が示唆された。本研究は、皮膚癌の種類により相反する作用を持つ、aPKCλの機能的両義性の分子機序を解明することを目的とする。マウスを用いた発癌実験の結果はマウスの遺伝的バックグランドに左右されうる。上述の我々の2段階化学発癌実験は、癌ができにくいとされるC57BL/6系統(黒ネズミ)のマウスを用いて行ったものである。そこで平成29年度は、遺伝的バックグランドを発癌実験に頻用される、好発癌系のFVB/N系統(白ネズミ)に変更し、aPKCλ欠損の効果をより短期間に、より効率よく調べることができるマウスの作製に注力した。遺伝的バックグランドを変更するには、最低5世代を経ることが必要とされている。我々は「黒ネズミ」と「白ネズミ」の交配を繰り返し、最終的に「白ネズミ化」した表皮特異的aPKCλ欠損マウスを得ることができた。「黒ネズミ」の表皮特異的aPKCλ欠損マウスは、毛包幹細胞の減少により脱毛をきたすのが特徴である。白ネズミ化した表皮特異的aPKCλ欠損マウスも脱毛をきたし、aPKCλは遺伝的バックグランドによらず毛包幹細胞の維持に必要なこともわかった。白ネズミ化したことにより、本研究課題がさらに効率よく進展することが期待される。「黒ネズミ」のC57BL/6系統のマウスで2段階化学発癌実験を行うと、腫瘍が形成されるまでに約半年間、発癌プロモーターをマウスの皮膚に塗布する必要があった。本研究の律速段階である表皮特異的aPKCλ欠損マウスの白ネズミ化に成功したことで、本研究課題がさらに効率よく進むことが期待される。

研究2年目の平成30年度は、遺伝的バックグランドを好発癌系のFVB/N系統(白ネズミ)にした表皮特異的aPKCλ欠損マウスを用いて、2段階化学発癌実験を行った。その結果、C57BL/6系統(黒ネズミ)で得られた結果とは逆に、白ネズミ化した表皮特異的aPKCλ欠損マウスでは有棘細胞癌はできにくくなっていた。このことは、遺伝的バックグランドによりaPKCλは有棘細胞癌の発症に対して正にも負にも働きうることを示唆している。一方、C57BL/6系統(黒ネズミ)で創傷治癒実験を行ったところ、表皮特異的aPKCλ欠損マウスではコントロールマウスに比べ、創傷治癒時の表皮細胞の遊走方向がランダムになるために創傷治癒が遅れることを見出した。時間と労力をかけて作製した白ネズミ化した表皮特異的aPKCλ欠損マウスで当初予想した腫瘍形成の増進がみられず、研究計画の変更をされた。一方で、aPKCλが創傷治癒を制御する、という新しい知見を見出し報告した。したがって、総合的に「おおむね順調に進展している」と判断した。「白ネズミ」化した表皮特異的aPKCλ欠損マウスを用いて、当初の計画に基づき以下の研究を進める。1コントロールと比較し、aPKCλが欠損すると腫瘍形成がさらに促進されるかを検討する。腫瘍ができ始めた週数、パピローマ、ケラトアカントーマ、有棘細胞癌の数、腫瘍の大きさ、転移の有無などを詳細に記録する。22段階化学発癌では、Ras経路が活性化される。活性化型Ras(RasV12)を導入した培養表皮細胞でsmall hairpin RNA (shRNA)によりaPKCλをノックダウンさせたときに、Rasの下流のMAPキナーゼ経路、PI3K経路の活性化状態がどのように変化するか、免疫ブロット法により調べる。また、増殖曲線、コロニー形成試験による腫瘍形成能を解析する。3化学発癌実験でできた有棘細胞癌から細胞株を樹立し、そこに野生型のaPKCλを導入して増殖、コロニー形成試験による腫瘍形成能を解析する。4有棘細胞癌の手術標本を用い、aPKCλの発現を免疫組織染色で調べる。また、新鮮な手術標本を用いて定量的PCR法でもaPKCλの発現を調べる。C57BL/6系統とFVB/N系統の遺伝的バックグランドの違いを詳細に調べるのは、本研究の目的を逸脱している。今後は白ネズミと黒ネズミで結果が異なったことをまとめる。また、当科の臨床標本を用いてヒトの有棘細胞癌でaPKCλの発現がどうなっているのか免疫組織化学染色、定量的PCR法、およびウェスタンブロット法で調べる。一方で、創傷治癒と発癌の関係に関する研究を進める。
細胞を遊走させる回転するストレスファイバ

アメーバ運動は様々な生物学的現象において不可欠な役割を果たす。魚類表皮の遊走細胞ケラトサイトのストレスファイバは、移動方向に垂直に配列している。このストレスファイバのユニークな配列は、アメーバ運動で独特の役割を果たしているかもしれない。本研究では、まず、ストレスファイバが細胞体内の細胞質を取り囲むように立体的に配置されていることを明らかにした。さらに、移動中のストレスファイバが車輪のように回転することを3次元動画で直接的に示した。ストレスファイバの一部を破壊すると、細胞は左右のバランスの崩壊させた。以上、ストレスファイバの回転がケラトサイトのアメーバ運動で車輪の役割を果たすことを示している。アメーバ運動(遊走)の原動力は細胞前端の伸長と後端の収縮だとみなされてきた。ところが,魚類表皮細胞ケラトサイト(keratocytes)や細胞性粘菌は繊維芽細胞よりも10倍速く運動するにも関わらず,前端の伸長に伴い基質へ発揮する牽引力は繊維芽細胞の1/10に過ぎない。この事実は前後端の伸長収縮が運動の原動力であるという説と矛盾する。ケラトサイトの細胞質はラグビーボール様の形態で,ボール表面の長軸方向にストレスファイバというアクチンフィラメント(以下Fアクチン)が束化した太い繊維構造が並ぶ。遊走中このファイバで囲まれたボールが回転するという説がかつて主張されたことがある。本研究では,ストレスファイバの回転こそがアメーバ運動の真の原動力であることを実証することを目標としている。細胞は一般に励起光に弱く,さらにケラトサイトは毎分10マイクロメートルと高速で運動するため,通常の共焦点顕微鏡では3次元動画計測は難しい。焦点面にのみ励起光を当て,スポット照明のスキャンの必要が無く高速稼働な光シート顕微鏡は,ケラトサイトの3次元動画計測に威力を発揮する。今年度、基礎生物学研究所野中茂紀博士との共同研究のもと、野中博士開発の光シート顕微鏡をもちいて、ケラトサイトのストレスファイバが回転する様子を動画として記録することに、まだ例数は少ないものの成功した。アメーバ運動は神経組織の形成から好中球の免疫応答にまで見られる普遍的な細胞機能である。運動中、細胞は前端の伸長と後端の収縮を繰り返す。この細胞前後端の伸長収縮がアメーバ運動の原動力だというのは現在、細胞生物学の定説である。ところが、魚類表皮細胞ケラトサイト(keratocytes)の細胞質はラグビーボール様の形態で,ボール表面の長軸方向にストレスファイバというアクチンフィラメント(以下Fアクチン)が束化した太い繊維構造が並ぶ。本研究は,このストレスファイバの回転が本当に起きていて、なおかつ,このファイバの回転こそがアメーバ運動の原動力であると予測し,それを証明するものである。基礎生物学研究所野中茂紀博士の開発した光シート顕微鏡で平成26年度にストレスファイバの回転する映像を1例記録することができたが、平成27年度は定量的なデータをそろえるべく、ファイバの回転データを複数例取得することができた。さらに、さらなる定量化のために、高速z軸スキャンが可能な共焦点顕微鏡を用いて、予備実験的ではあるものの、ストレスファイバの回転する映像を取得することができた。申請時には、共焦点顕微鏡によるデータの取得は計画にはなかった。しかし、光シート顕微鏡によるデータ取得の成功により、定量化がさらなる高い確度のストレスファイバの回転の証明になることが期待されたため、共焦点顕微鏡によるデータの取得を検討した。現在、数例ではあるものの、高解像度のデータを取得することができている。一般に、生物の皮膚が創傷を受けると、治癒の過程で周囲の表皮細胞が創傷箇所に移動する。魚ではケラトサイト(keratocytes)と呼ばれる遊走細胞が、この創傷治癒の過程で重要な役割を果たしている。遊走中のケラトサイトは、前方の三日月形の広大な葉状仮足と後部の紡錘形の細胞体から構成され、遊走中、この形状を維持し続ける。本研究の大きな目標は、ケラトサイトの細胞体内にストレスファイバーで作られた車輪が存在し、その回転が遊走に寄与していることを証明することである。平成26,27年には基礎生物学研究所野中茂紀博士らとの共同研究で野中氏らが構築した光シート顕微鏡で回転を3次元撮影することに成功した。この事実はケラトサイトの細胞体内でストレスファイバが回転していることを示しているものの、このストレスファイバの回転が遊走の原動力であるのか、遊走の結果回っているだけなのかはわからない。そこでストレスファイバの回転が遊走の原動力であることを示すために、遊走中のケラトサイトを人為的に操作できる実験系を構築することを目指した。すなわち、28年度、共焦点顕微鏡による撮影を試みた。共焦点顕微鏡による撮影の課題は、励起光による細胞のダメージと蛍光色素の退色である。退色防止剤の使用と細胞への色素の導入法などの工夫でこれらの課題を解決し、共焦点顕微鏡でも3次元撮影を可能にすることができた。29年度、共焦点顕微鏡下でケラトサイトのストレスファイバの回転の3次元動画を撮影しながら、細胞をグラスマイクロニードルで切断するなど、人為的な操作をした時に、ケラトサイトの遊走がどのように変化するかを確かめる予定である。車輪機構で運動する生物はこれまで発見されていない。本研究の目標は魚類表皮ケラトサイトがストレスファイバの回転で運動することの証明である。当初の目標は光シート顕微鏡で回転を3次元撮影することで、これは平成26,27年に達成した。

28年度にさらに共焦点顕微鏡による撮影成功という予想以上の成果が得られ、回転角速度定量など精緻な計測が可能となった。アメーバ運動は神経組織の形成から好中球の免疫応答にまで見られる普遍的な細胞機能である。運動中,細胞は前端の伸長と後端の収縮を繰り返す。この細胞前後端の伸長収縮がアメーバ運動の原動力だというのは現在,細胞生物学の定説である。ところが,アメーバ運動速度と前端伸長に伴う細胞の牽引力を同時に計測すると,魚類表皮細胞ケラトサイトや細胞性粘菌のアメーバ運動速度は繊維芽細胞より10倍速いにも関わらず,繊維芽細胞の1/10の牽引力しか出さない。この事実は前後端の伸長収縮がアメーバ運動の原動力であるという説と明らかに矛盾する。ケラトサイトの細胞質はラグビーボール様の形態で,ボール表面の長軸方向にストレスファイバというアクチンフィラメントが束化した太い繊維構造が並ぶ。本研究は,このストレスファイバが回転し,アメーバ運動の原動力であることを証明するものであった。当初の目標は光シート顕微鏡でストレスファイバの回転を3次元撮影することであった。この目標は平成26,27年に達成した。もし、共焦点顕微鏡で精密な3次元撮影ができれば、回転角速度の定量や車輪としてのストレスファイバの破壊など、精密な実験が可能となる。27,28年に高速にZ軸をスキャンできる共焦点顕微鏡を用いて、3次元撮影に成功した。29年度、さらに精密な実験を行い、回転速度等定量的な測定に成功した。以上により、回転が遊走の原動力になっていることを示すことができた。アメーバ運動は様々な生物学的現象において不可欠な役割を果たす。魚類表皮の遊走細胞ケラトサイトのストレスファイバは、移動方向に垂直に配列している。このストレスファイバのユニークな配列は、アメーバ運動で独特の役割を果たしているかもしれない。本研究では、まず、ストレスファイバが細胞体内の細胞質を取り囲むように立体的に配置されていることを明らかにした。さらに、移動中のストレスファイバが車輪のように回転することを3次元動画で直接的に示した。ストレスファイバの一部を破壊すると、細胞は左右のバランスの崩壊させた。以上、ストレスファイバの回転がケラトサイトのアメーバ運動で車輪の役割を果たすことを示している。ケラトサイトの細胞質中でストレスファイバが回転している様子を記録することができたことは、期待以上の伸展である。しかし、例数が少なく、回転速度の詳細な解析には至っていない。また、回転を人為的に促進させたり、抑制させたりすることには成功していないことは期待以上の伸展であるとはいえない。しかしながら、ストレスファイバの回転速度と細胞重心の運動速度とを精密に測定し、それらの大小関係を比較すれば、ストレスファイバの回転が細胞の運動の原動力になっているか、あるいは、細胞の運動の結果ファイバが回転しているのかを判断できるという着想を得た。
選択的ミトコンドリア分解の分子機構の解明

私たちの研究グループは出芽酵母をモデルに用いて、オートファジーによる選択的ミトコンドリア分解(マイトファジー)の分子基盤をゲノムワイドに獲得し、ミトコンドリアを分解すべき基質として特異的に認識するための分別マーク・タンパク質Atg32を世界に先駆けて同定・解析した。Atg32はミトコンドリア外膜へ局在する膜貫通型タンパク質であり、マイトファジーに特異的かつ必須な、唯一の因子である。これまでの研究で、マイトファジーの初期段階で、Atg32に特異的な高分子量のバンドが出現することを見出している。免疫沈降を行った結果、Atg32の高分子量のバンドにユビキチン陽性シグナルが検出された。そこで、Atg32のユビキチン化に関わるユビキチンリガーゼを探索した結果、小胞体関連分解(ERAD)システムのユビキチンリガーゼDoa10を欠損すると、Atg32のタンパク質レベルが増加することを見出した。。加えて、Doa10欠損細胞ではマイトファジーの誘導が亢進していることもわかった。以上の結果から、ミトコンドリア外膜タンパク質Atg32は小胞体膜のDoa10によって特異的にユビキチン化されていることが示唆された。これらの知見を踏まえた上で本年度は、Doa10とAtg32との関連性を調べた。まず、Doa10がAtg32を基質タンパク質として結合するかどうかを明らかにするため、免疫共沈降を用いて解析した結果、両者の相互作用が検出された。次に、Atg32の細胞内局在を調べるため、Atg32に3コピーのGFPを付加し(Atg32-3GFP)、その細胞内局在を蛍光顕微鏡を用いて解析したところ、Doa10欠損細胞ではミトコンドリア局在に加えて、小胞体局在も検出された。これまでの研究で、Atg32はその一部が小胞体へと運ばれ、Doa10によるユビキチン化を受けて分解される可能性を提起している。通常、ユビキチンE3リガーゼとその基質タンパク質の相互作用は一時的なものであり、結合を検出するのは容易ではない。そこで、一時的な相互作用を捉えるため、化学架橋剤で処理した細胞からAtg32を精製し、Doa10を検出することができた。また、E3リガーゼ活性を失ったDoa10変異体を用いることで、化学架橋なしにAtg32とDoa10の相互作用を免疫共沈降で捉えることが可能となった。これらの結果から、Atg32はDoa10の基質タンパク質となりうることが示唆される。また、Atg32の細胞内局在を解析するため、染色体上のATG32遺伝子に3コピーのGFPをタギングし、内在性プロモーターで発現したAtg32-3GFP局在アッセイ系を確立した。Atg32-3GFPは内在性のAtg32と同様のマイトファジー活性を持っており、1コピーのGFPタギングでは不可能だったAtg32の局在パターンの可視化が可能となった。このアッセイ系を用いてDoa10欠損細胞を観察したところ、従来のミトコンドリアパターンに加えて、小胞体パターンも見えることが判明した。これらのデータから、野生型細胞において、小胞体に運ばれたAtg32をDoa10が認識・結合し、ユビキチン化することで、Atg32をプロテアソーム分解系へと導いていること、Doa10欠損によってAtg32の分解が阻害され、小胞体へ蓄積することが考えられる。このように、実験系を工夫することにより、タンパク質間相互作用や細胞内局在の解析が可能となっただけでなく、ミトコンドリア外膜タンパク質が小胞体へも局在しうるという予想外かつ興味深い発見に至ったことから、本研究計画はおおむね順調に進展していると考えている。今後の研究計画として、(1)小胞体膜へのタンパク質の輸送に関わる因子の関与を検討するため、Doa10および候補因子の二重遺伝子破壊株を作成し、Atg32-3GFPの小胞体局在が影響を受けるかどうかを調べる。(2)小胞体とミトコンドリアとの接触部位(ERMES)を経由してAtg32がミトコンドリアから小胞体へ移動している可能性を検証するため、Doa10およびERMES構成タンパク質の二重欠損細胞でAtg32-3GFPの小胞体局在が影響を受けるかどうかを調べる。(3)これまでの研究で、ペルオキシソームに人為的に限局させたAtg32は、Doa10による制御を受けないことがわかっている。そこで、このペルオキシソームアンカー型Atg32がDoa10欠損細胞で小胞体パターンを示すかどうか、蛍光顕微鏡観察を行う。(4)Doa10欠損細胞で小胞体に局在したAtg32が小胞体特異的オートファジー(ERファジー)を駆動しうるかどうか明らかにするため、ERファジーマーカーを発現した酵母株を用いてDoa10およびERファジーの必須因子であるAtg39/Atg40の三重欠損細胞を作成し、蛍光顕微鏡とウェスタン解析でERファジーを調べる。必要に応じ、Atg32の過剰発現も試みる。

Atg32はミトコンドリア外膜へ局在する膜貫通型タンパク質であり、マイトファジーに特異的かつ必須な、唯一の因子である。本研究の目的は、マイトファジーの分子機構を解明することであり、分解レベルや選択性を調節する基本原理の理解を目指す。これまでの研究で、マイトファジーの初期段階で、Atg32に特異的な高分子量のバンドが出現することを見出している。免疫沈降を行った結果、Atg32の高分子量のバンドにユビキチン陽性シグナルが検出された。これらの知見を踏まえた上で本年度は、Atg32のユビキチン化に関わるユビキチンリガーゼの同定とその欠損変異体の解析を行った。その結果、小胞体関連分解(ERAD)システムERAD-CのユビキチンリガーゼDoa10を欠損すると、Atg32のタンパク質レベルが増加することを見出した。加えて、Doa10欠損細胞ではマイトファジーの誘導が亢進していることもわかった。さらに、ERAD-Cのユビキチン結合酵素Ubc6を欠損した細胞でも、Doa10欠損細胞と同様の表現型を示すことが判明した。一方、小胞体膜の別のシステムERAD-L/MのユビキチンリガーゼHrd1を欠損しても、Atg32のタンパク質レベルはほとんど影響を受けない。以上の知見から、ミトコンドリア外膜タンパク質Atg32は小胞体膜のERAD-Cによって特異的にユビキチン化されていることが示唆された。これまでの研究で、Atg32はユビキチン化されることにより、そのタンパク質レベルが負に調節され、マイトファジーの誘導が抑制されている可能性が浮上してきた。一般に、ユビキチンは基質タンパク質のリジンに共有結合で付加される。そこで、Atg32に存在するリジン残基をシステマティックにアルギニン置換し、ユビキチン化部位をマッピングしようと試みたが、特定のリジン残基を同定することはできなかった。これは、複数のリジンがユビキチン化を受けること、また近傍のリジン以外のアミノ酸残基がユビキチン化されることも考えられる。このような状況を踏まえ、Atg32のユビキチン化部位のマッピングから方向転換して、責任リガーゼの同定に焦点を絞り直し、半網羅的にユビキチンリガーゼ欠損変異体を探索する戦略を実行した。その結果、ERAD-CのユビキチンリガーゼDoa10がAtg32を基質タンパク質としてユビキチンを付加し、プロテアソーム依存的に分解することで、Atg32のタンパク質レベルを負に調節していることが示唆された。小胞体にはERAD-L/Mという別の分解システムが存在するが、そのユビキチンリガーゼはAtg32の発現量調節には関与していないと思われる。興味深いことに、ペルオキシソームに人為的に限局させたAtg32は、Doa10による制御を受けないことがわかった。このように、当初予定していた実験の代わりに、今後の解析に重要な責任リガーぜを同定できただけでなく、ミトコンドリアと小胞体との関係性において小胞体のDoa10がミトコンドリアタンパク質であるAtg32を基質として認識しユビキチン化する可能性を提起できたことから、本研究計画はおおむね順調に進展していると考えている。私たちの研究グループは出芽酵母をモデルに用いて、オートファジーによる選択的ミトコンドリア分解(マイトファジー)の分子基盤をゲノムワイドに獲得し、ミトコンドリアを分解すべき基質として特異的に認識するための分別マーク・タンパク質Atg32を世界に先駆けて同定・解析した。
高温暴露時の心臓への熱による直接的傷害の機序解明

心疾患は熱中症発症のリスクファクターの一つとされているが、そのメカニズムについては詳細な報告はない。そこで、心筋梗塞モデルラットに熱暴露を行い、心疾患と熱暴露の関係について検討した。本研究では健常心と比較して、心疾患(心筋梗塞)がある場合には、熱暴露直後から心臓の傷害を示す指標の上昇がみられ、熱暴露による心臓への直接的な傷害があったことを示している。また、熱暴露後でも、数時間にわたり心筋傷害や心筋虚血などの形で心負荷が継続する可能性が示唆された。これらのことから、心疾患がある場合には、健常心より熱暴露に対してより脆弱であり、熱暴露における熱中症発症・増悪リスクを高めていると考えられる。熱中症の死因判定方法の1つとして、井上らのこれまでの肺脂肪塞栓の研究から、脂肪肝由来の脂肪が熱暴露により溶出して、血流に乗り、肺脂肪塞栓を形成することが明らかとなっている。しかしながら複数の症例について検討を行ったところ、心疾患を有する者において多くはこの肺脂肪塞栓を認めないことが多く、その理由として、心疾患を有する場合には脂肪塞栓を形成するよりも前に、短時間の内に熱暴露で死亡する可能性が考えられた。そこで、心疾患モデルラットを作成して熱暴露を行い分子病態学的手法でそれを証明することが本実験の要である。心疾患モデルラットを作成するにあたり冠状動脈結紮が有効であると考え、本実験を遂行することとなった。平成24年度は冠状動脈手術を行うにあたり心臓へのアプローチや呼吸管理に難渋したことで、低い成功率しか得られなかった。そこで平成25年度は冠状動脈結紮手術の方法を見直すことにより、最小の手術創で心臓にアプローチができ、かつ短時間で冠状動脈結紮術を行うことが可能となり、ほぼ100%の結紮術成功率を達成することができた。しかしながら、当初は術後7日目に行った梗塞部位の均一性がとれていないことから、個体毎の冠状動脈走行に対応した結紮部位の修正が必要となり修正を施した。その結果として、心筋の前壁から側壁に至る梗塞を均一して得られた。熱中症の死因判定の1つとして、井上らのこれまでの肺脂肪塞栓の研究から、熱暴露により脂肪肝由来の脂肪が溶け出して、血流に乗り、肺脂肪塞栓を形成することが明らかとなっている。しかしながら複数の症例について検討を行ったところ、心疾患を有する者において多くはこの肺脂肪塞栓を認めないことが多く、心疾患を有する場合には脂肪塞栓を形成するに至るよりも前に、短時間の内に熱暴露で死亡する可能性が示唆された。そこで心疾患モデルラットを作成して熱暴露をおこない分子病態学的手法でそれを証明することが本実験の要である。心疾患モデルラットを作製するにあたり冠状動脈結紮が有効と考え、本実験を遂行することとなった。平成24年度は冠状動脈結紮手技に至る一連の作業に多くの時間を費やすことで手技の確立をめざした。イソフルランによる全身麻酔下で、開胸を行うため気管挿管を行い、その後心臓の冠状動脈を結紮し、閉胸するという過程があるが、それぞれの作業に熟練を要するために1つ1つのステップが重要な課題となった。これまで実験における熱中症モデル作成にあたりラットは300g前後が最適とされていたが、気管挿管及び肝臓動脈結紮をおこなうにあたり、それよりもやや小さめのラット、200g前後を用いることで良好な冠状動脈結紮が行えた。これは人工呼吸器の流量、挿管チューブと気管の比率および胸骨の柔軟さから実験を繰り返し、試行錯誤し、たどり着いた結果である。【緒言】熱中症発症のリスクファクターに心疾患があげられるが,詳細な知見に乏しく、心筋梗塞モデルラットに熱暴露を行い,心負荷関連遺伝子および血清タンパク量の経時変化を分子病態学的に検討した.【方法】心疾患群(M群)は8週齢Wistar雄ラットを開胸,左冠状動脈前下行枝結紮後閉胸.開閉胸のみで未結紮のものをSham(S群)とし,術後7日間飼育した。M群およびS群を非熱暴露群(N)と麻酔下で内温37°Cインキュベーターに90分静置する熱暴露群(H)に分け、MN、MH、SN、SHの4群を作成した。暴露直後(H0),2時間後(H2),4時間後(H4)、8時間後(H8)に断頭し,流出血液および心臓を採取.SNおよびMNを基準とし,SHおよびMHの左室に発現する心負荷関連遺伝子の定量的PCR,血清BNP45および心筋トロポニンT(cTnT)を測定した.加えて全群,心室横断面組織のHE染色にて梗塞程度を評価した.【結果・考察】

梗塞率はS;0%,M;28.3%±1.05(平均±SE).M各群間に有意差を認めなかった.BNP45はS,Mともに熱暴露で有意な増加を認めた.MHはH0で有意に増加,後に減少し,H8で再び増加した.このMH0増加は熱暴露に伴う臓器虚血からのRAS系作用が考えられるが,暴露から時間経過を伴ったMH8の増加は心筋虚血の増悪と考えた.一方でSHは有意差を認めなかった.cTnTの遺伝子Tnnt2は熱暴露でSは増加を認めず,Mに有意な増加を認めた.タンパクレベルではcTnTはS,Mともに熱暴露で有意な増加を示し,SHはH4で最も増加した.心筋傷害に伴うcTnT増加は2峰性を示すことからSH4増加は傷害初期の可溶成分によるものと考えられる.HIFの遺伝子Hif1aは熱暴露でMが有意に増加し,H2,4,8に有意差を認めた.すなわち心筋梗塞では熱暴露後も継続的な虚血状態が続くことで熱中症の発症・増悪リスクを高めると考えられる.法医学冠状動脈結紮手術の不備からバラツキのない心筋梗塞モデルラット作成に至るまでの経過に時間を費やしてしまった。手技が確立したことから今後はスムーズな実験進行が期待される。ラットの冠動脈結紮術における成功率にバラつきがあり、それが今後の実験過程や実験結果に大きく影響を及ぼすため、慎重を期する必要がある。一連の作業において発生した問題点は、開胸方法、心筋の冠状動脈の結紮及び閉胸方法である。個々の方法と問題点を具体的に述べると、開胸方法においては胸部正中左の第4、5肋間の横切開と、第4、5肋骨を含み縦切開を試行した。前述方法では出血量は少ないが、術野が狭いためにその後の冠動脈結紮法に困難を極める。後述方法においては術野が広く確保でき、冠状動脈結紮は容易に行えるが、肋間動静脈に損傷を与えるために出血が多くなってしまうという結果となった。冠動脈結紮法においては、その位置と結紮強度の模索に労力を費やした。結紮位置及び強度が心筋梗塞の発生率の大きなファクターとなる。すなわち、心筋梗塞の発生部位及び発生率にバラつきが生じると、後の熱中症の比較実験において整合性のない結果とになりうるため、バラつきのない冠状動脈結紮モデルラットの作製がこの実験の要となる。さらに閉胸時には、胸腔内の残存血液による肺の癒着や気胸発生などの問題が生じた。さらに手術時間が後の生存率へ大きな影響を及ぼすことがわかった。これらの事を加味しながら最適な位置や手術時間の短縮を模索するために多くの時間を費やすこととなったが、その方法はほぼ確立しつつある。今後、さらに良好な冠動脈結紮モデルが完成した場合の熱中症モデルの熱暴露方法やその他の手技はこれまでの実験から確立しており、スムーズな実験が可能であることが予測できる。心疾患モデルラットを従来から当教室で行っている熱暴露(熱暴露条件:37°C90分)を行ったところ、現在の実施数は少ないが、正常対象ラットに比べて熱暴露中に死亡するケースが多く見られた。このことから、心疾患では熱に対する脆弱性が正常対象よりもきわめて高い可能性があり、今後、体温上昇度合いや死亡時間を実験数を増やすことで確かなデーターとして補足していく予定である。さらに熱暴露に対する脆弱性を確認後、どのような機序で脆弱化しているのかと言うことを心筋中のmRNA検索や蛋白発現等で正常対象ラットと比較する必要がある。加えて、心筋梗塞の早期診断に有用であるトロポニンTは冠状動脈結紮術24時間後に採血して測定したところ、いずれも強い陽性反応を示したが、7日後には陰性化していた。