hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
情報公開制度の政治学―アメリカ情報の自由法(FOIA)の制定・改正過程を中心に

とくに、政府内の諸機関や社会の諸主体の間での、情報公開の範囲に関する対立を踏まえて、二つの重要な立法の過程を焦点に、20世紀後半のアメリカの情報公開制度をめぐる政治を再構成しようとしている。本研究課題の1年目にあたる本年度は、研究対象であるアメリカの情報公開法、とりわけ1966年の立法に向けた過程に関する基礎的な資料を収集し、その精査を通じて本格的な分析に向けた戦略を練ることに集中した。これは、この分野の通説を提供するような本格的な先行研究が存在しないためである。関連する二次文献を渉猟する以外に、二度の渡米で最も基本的な一次史料をあらかた収集できたのが、本年度の大きな収穫である。具体的には、夏期に米国公文書館にて立法時の議会側の、春期にリンドン・ジョンソン大統領図書館にて政権側の史料を精査した。このうち政権側史料は残念ながら質量とも限定的であったのに対して、議会側史料については、従来カリフォルニア州公文書館に収められていた、情報公開立法の立役者のジョン・モス下院議員の大規模な文書が最近になって新しく統合されており、法案の起草および審議の過程をある程度詳細にたどれるようになった。また同文書には、当時情報公開法の制定に向けて尽力していたジャーナリストの団体の指導者の文書や、各種団体の刊行物も含まれており、予想以上に多くの有意義な情報を得られた。本年度は、史料調査を行ったうえで可能であればその成果を活かしてワーキングペーパーの執筆を行いたいと考えていた。結果的にまとまったペーパーの執筆には到達できなかったものの、史料調査が予想以上に進んだために、上のような評価となった。研究の計画段階では、米国公文書館の議会側史料以外とは別個にカリフォルニア州公文書館のジョン・モス個人文書にあたる必要性があるとみられていたが、ごく最近になって両者が統合されて議会側史料に収められたため、調査が一気に前進したのである。このような事情もあって、統合された文書を活用した研究はまだほとんど公刊されておらず、本研究課題が独創的な成果を上げられる余地はかなり大きいと考えている。本研究課題では、情報公開制度をめぐる政治について、各国での情報公開法制度導入の成否が注目されてきたのに対して、制度が導入される場合に情報公開の範囲がどう決まるのかまでを意識し、アメリカの情報公開法(FOIA)の制定・改正過程を軸に検討している。本研究課題の2年目にあたる本年度は、前年度に収集した資料を精査・分析する以外に、アメリカの情報公開法でなぜ行政機関(のみ)が対象となったのかを、そもそも行政機関の位置付けに遡って検討を行った。それは、日本と異なりアメリカでは行政(機関)の存在が憲法上規定されていないばかりでなく、コモンローの伝統もあってむしろ行政国家を強化することが忌避されてきたためである。
就労支援におけるマッチングのための職務分析チェックリストの運用

本研究は,障害者の一般就労のマッチングの精度を高めるため,職務分析を用いたチェックリストを運用し,その効果を測定することを目的としている。仕事を分析することで,支援の方向性や技能訓練の目標設定に有効なデータが得られることが期待できる。また,就職先となる仕事の情報を,障害者や就労支援サービス担当者,企業の採用担当者などの関係者間で共有できる仕組みづくりについても検討する。クラウドストレージを用いて,職務分析の就労支援サービスへの活用可能性と円滑な情報共有のあり方を模索する。
梅漬けの低着色化に関する研究-梅漬けの着色に及ぼす天日晒し処理の影響-

硬度保持剤として00.9%濃度の水酸化カルシウムを添加して塩蔵した梅を、脱塩のみ(無処理梅)および天日さらしと脱塩処理(天日さらし処理梅)し、食用赤色色素102号および106号および赤キャベツ色素により着色を施した結果、以下のことが明らかになった。(1)無処理梅、天日さらし処理梅ともに、いずれの着色料においても7日間で、梅表面の着色の変化が平衡に達することが明らかとなった。(2)天日さらし処理梅のL値、a値およびb値は、無処理梅の値に比べて高い傾向であった。(3)食用赤色色素102号および106号に比べて、赤キャベツ色素は染着力が弱かった。(4)官能検査の結果、天日さらし処理梅のほうが無処理梅に比べて、有意に「明るさ」および「赤さ」があり、総合的にも「好まれる」という傾向のあることが認められた。
鉄イオンは細胞の磁場センサーか：鉄貯蔵タンパク質フェリチンの低周波磁場感受性解析

フェリチンは細胞内において遊離Fe2+をFe3+の形で貯蔵する。50ヘルツ磁場が小児白血病リスクを上昇させるという報告から細胞内酸化ストレスが磁場により増強されるという可能性がある。その原因としてフェリチンからのFe2+の磁場による遊離を想定し、検討した。フェリチン水溶液を50ヘルツ/1キロヘルツ3.2ミリテスラの磁場に2.5/5時間曝露し、Fe2+指示薬フェロジンを用いて曝露試料と非曝露試料のFe2+を測定した。測定曲線をGNUプロットによりフィッティングし、解析した。その結果、50ヘルツ、5時間曝露の場合フェリチンからの鉄イオン解離プロセスが磁場によりわずかに促進されることが分かった。フェリチンは細胞内に存在する球状蛋白質で、内部に8ナノメートルの空洞を持つ。鉄イオンはここにIII価の結晶として貯蔵されているが、ヘムの構成要素として用いられる場合などはII価に還元され、たんぱく質の殻にあるチャンネルを通ってフェリチン外に放出される。先行研究(Cespedes & Ueno, Bioelectromagnetics, 2009)でこの鉄イオン出入りの速さにメガヘルツ帯の磁場が影響するという報告があった。一方我々は以前より50ヘルツ磁場が細胞の一酸化窒素産生に影響することを報告してきた(Miyata et al., J. Phys. Con. Ser., 2013)。鉄イオン放出にも一酸化窒素号税にも酸化還元反応が関与することから、われわれはフェリチンにおける鉄イオンに50ヘルツ磁場が影響するかどうかに興味を持った。ファンクションジェネレータで発生させ、バイポーラ電源で増幅した50ヘルツ交流電流をヘルムホルツコイルに流し、50ヘルツ、または1キロヘルツ(いずれも3.2ミリテスラ)の磁場を発生させ、フェリチン溶液を5時間曝露した。曝露後にII価鉄指示薬フェロジンを加え、吸光度上昇で遊離II価鉄イオンを測定した。非曝露試料についても同様に測定した。先行研究を参考にフェリチンからの鉄イオン放出過程が鉄イオン結晶から蛋白質部分への鉄イオン移行、蛋白質部分からフェリチン外へのII価鉄イオン遊離、II価鉄イオンと指示薬フェロジンとの反応による吸光度上昇、という3ステップからなる、と仮定し、各過程に対する速度論的方程式を解いた。こうして得られた理論式を用いて実験曲線をフィッティングし、各ステップでの速度定数を見積もった。その結果唯一50ヘルツにおいて鉄結晶から蛋白質部分へのII価鉄イオン移行の速度定数が磁場曝露により数%有意に上昇することを突き止めた。低周波(50ヘルツ)磁場によりフェリチンからの鉄遊離が変化するかどうかを分光法を用いて研究した。フェリチンは細胞内において遊離II価鉄イオンをIII価の形で微結晶として貯蔵する。過去の疫学研究により、低周波磁場が小児白血病のリスクを上昇させることが示唆されている。一方発がんと酸化ストレス上昇の関連が疑われているが、鉄イオンは酸化ストレスを上昇させる因子として知られている。そこで低周波磁場がフェリチンから鉄イオンを遊離させる結果細胞内酸化ストレスが上昇するのではないかと考え、上記の実験を行った。フェリチン水溶液を50ヘルツ、3ミリテスラの低周波磁場に5時間曝露した場合としなかった場合でフェリチン外のII価鉄イオン濃度が変化するかどうかを、II価鉄の指示薬フェロジンの吸光度増加を指標として調べた。フェロジンの発色は非常に長い時間変化(>48時間)をしめし、GNU-plotを用いたフィッティング解析の結果単一の指数関数では表せないことが分かった。先行研究を参考に、2段階の鉄イオン遊離モデル(フェリチン内微結晶からの鉄イオン遊離と遊離鉄イオンのフェリチンからの解離)を用いてフェロジン発色曲線をフィッティングした。その結果、微結晶からの鉄イオン遊離に対しては磁場効果は見られず、フェリチンからの鉄イオン解離プロセスの速度定数と遊離II価鉄イオン濃度がわずかに増加することがわかった。なお、得られた速度定数等の値は磁場なしで先行研究において得られていた値とまずまずの一致を見た。フェリチンからの鉄イオン遊離機構そのものはいまだに決着を見ておらず、本研究の結果は、鉄イオン遊離の定量法、結果の解析法において工夫を行うことによって得られたものである。その後の追加実験により、解析に用いたキネティックスの仮定を再検討することが望ましいと分かった。今後その方向で研究を進める予定である。先行研究の結果からはフェリチンからの鉄イオン放出に50ヘルツ磁場が与える影響は曝露、非曝露でかなりの差があると予想された。

このため、当初計画ではII価鉄イオンとフェロジンの結合に伴うフェロジン吸光度上昇を定性的に比較することで磁場の曝露影響を評価する予定だったが、「研究実績概要」で述べた通り、実験的に得られた差は数%であった。そのため解析方法をより精密なものにする必要が生じた。そこで「研究実績概要」に述べた通り、小さな差でも見逃さないために実験方法を工夫する(系統誤差を避けるため、曝露と非曝露試料の測定順序をランダム化すること、サンプル測定用セルごとの吸光度の差をあらかじめ測定しておく)こと、フェリチンからの鉄イオン遊離を3つのステップを分けてレート方程式を作り、これを解き、Gnuプロットに基づいたフィッティング法を行うためのプロトコルを開発すること、にかなりの時間を投入した。以上の理由から、計画では初年度に行うはずだった磁場条件依存性の検討が不十分となっている。ただし、上記の研究経緯で得られた結果そのものは先行研究とは異なる新規なものである:先行研究では磁場曝露によりフェリチンへの鉄イオン吸収が増加するという結果が得られていたが、本研究では遊離が促進されるという結果であった。さらに、フェリチンからの鉄イオン遊離過程が先行研究よりはるかに精密に解析できるようになったことから、今後はこの手法を用いて当初計画に沿った実験を行うことで研究全体を発展・完成させる予定である。生物物理学「研究実績概要」で述べた通り、我々はフェリチンからの鉄イオン放出を定量的に解析する手法を確立し、放出過程に50ヘルツ磁場が弱いながら影響することを明らかにした。一方1キロヘルツではそのような差は見られなかった。そこで、当初計画にある目標達成のため、周波数と磁場強度の様々な組み合わせでフェリチンからのII価鉄放出過程を測定し、解析する。その結果をCespedes & Uenoによる先行研究(Bioelectromagnetics, 2009)と比較検討し、本実験で初めて明らかにされた、低周波磁場によるフェリチンからの鉄イオン遊離促進のメカニズムの手掛かりを得たい。さらに、当初の実験計画に従い、フェリチンの鉄イオンコアを用いた磁場影響の検討ならびに、フェリチン蛋白質殻部分を用いた鉄イオン吸収過程における磁場影響の検討を行う。磁場条件探索の上で予想される課題として、高周波数(>0.1キロヘルツ)におけるヘルムホルツコイルインピーダンスの著しい増加がある。先行研究との比較においてはメガヘルツ帯までの実験が必要となるが、周波数増加とともに出力電流の最大値が減少し、それに比例して磁場強度も減少する。そこで周波数に応じて出力をゼロから最大となるまで変化させて曝露実験を行う。このようにして周波数と磁場強度に応じてフェリチンからの鉄イオン遊離レートがどのように変化するかをマトリックス状に調べる。高周波数では十分な出力は得られないが、フェリチンの磁場応答が全体としてどのようになっているかの様子はつかめると考えている。
次世代型の光増感用DDS担体を企図したC60ナノ粒子製剤の構築

フラーレンC60は炭素原子が球状のネットワーク構造をしている分子であり、一重項酸素、スーパーオキシドアニオンラジカルなどの活性酸素種を効率よく生成する光増感物質として注目を集めている。本研究ではC6。の光増感剤としての医薬への応用を目的とし、可溶化剤として医薬品での使用実績がある2一ヒドロキシプロピルーβ一シクロデキストリンを用いてC6。をナノ粒子化し、その複合体構造を解明するとともに、物理化学的特性や生物活性を明らかにした。フラーレンC60は炭素原子が球状のネットワーク構造をしている直径約1.0 nmの分子である。C60は既存の光増感剤と比較して非常に高い量子収率や長波長の吸収スペクトルを持つことから、一重項酸素、スーパーオキシドアニオンラジカルなどの活性酸素種(ROS)を効率よく生成する光増感物質として注目を集めている。本研究では新規C60医薬の開発を企図し、可溶化剤として医薬品での使用実績があり、親水性で生体適合性に優れる2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン(HP-β-CyD)を用いてC60をナノ粒子化し、その複合体構造を解明するとともに、物理化学的特性や生物活性を明らかにした。溶液・固体NMRなどの各種スペクトル測定および粒度分布、ζ-電位、TEMなどのコロイド粒子に関する表面分析の結果より、HP-β-CyDはC60ナノ粒子表面で相互作用(吸着)し、C60ナノ粒子表面を広く覆い、安定な親水性の層を形成しているものと推察された。また、ESR測定の結果より、C60/HP-β-CyDナノ粒子は可視光照射下においてスーパーオキシドアニオンラジカルや一重項酸素などの活性酸素種を効果的に生成した。さらに、C60/HP-β-CyDナノ粒子は、可視光照射条件下でのみ細胞障害活性を示したことから安全性の高いナノ粒子であることが示唆された。このC60ナノ粒子は担がんマウスに対しても優れた抗腫瘍効果を示し、副作用も確認されなかった。本研究は優れた光増感作用を有し、ナノマテリアルとして注目されているC60を生体適合性に優れるHP-β-CyDを用いてナノ粒子化し、その汎用性を高めるものであり、本研究で調製したC60/HP-β-CyDナノ粒子は次世代型の光増感剤、DDS用素材として有力な候補物質になるものと考えられる。本研究ではC6。本研究ではC60ナノ粒子を基盤とした、光増感剤、抗酸化剤、DDS用担体として効果的なC60ナノ粒子製剤の構築を目的として検討を行った。当初の予定通り、HP-b-CyDによるC60ナノ粒子の生成機構、ナノ粒子構造および凝集安定化効果の詳細を明らかにし、論文・学会発表を行った。また、本研究で調製したC60ナノ粒子が可視光照射下で活性酸素生成能を有し、HeLa細胞やA549細胞などの各種癌細胞に対し、障害活性を有することを明らかにし、論文・学会発表を行った。以上より、本研究の目的であるがん光線力学療法における次世代型の光増感剤として有用なC60

ナノ粒子製剤の構築は順調に進展中である。C60ナノ粒子の癌光線力学療法への応用に焦点を絞り、C60/HP-β-CyDナノ粒子のin vitro、in vivo抗腫瘍効果を明らかにする。すなわち、C60ナノ粒子の可視光照射下での細胞毒性をHela細胞、A549細胞などのがん細胞を用いて検討する。また、担癌マウスを作成し、C60/HP-β-CyDナノ粒子のin vivo抗腫瘍活性を検討する。抗腫瘍効果はC60ナノ粒子投与+光照射後の腫瘍体積の変化から評価する。さらに、C60ナノ粒子をポリエチレングリコールやスチレンー無水マレイン酸コポリマー等で表面修飾したC60ナノ粒子を調製し、EPR効果を利用した腫瘍集積性の向上ならびに抗腫瘍効果の増強を期待する。平成24年度はin vitroならびにin vivoでの光線力学活性の評価を主として行うため、メディウム、ディッシュ、蛍光試薬、マウスなどを購入する予定である。また、本研究を遂行するために必要不可欠な溶媒等の消耗品も購入する。さらに、研究成果の学会発表に必要な旅費、研究打ち合わせのための旅費にも使用する予定である。
独居高齢者の閉じこもり要因と介護予防プログラムに関する研究

本研究では独居高齢者に焦点あて、独居による生活の不具合や不安要因を明らかにし、個人の生活に即した介護予防プログラムを開発することを目的とした。平成18年度は、介護予防に関する注意事項や体操を含めた介護予防を目的としたプログラムを作成し、地域の施設等で、のべ179名に実施した。その結果、関節の拘縮や身体機能の低下が見られる参加者があり、これらを予防するために、継続してできるプログラムが必要であることが明らかになった。平成19年度は改良したプログラムをのべ20回実践し、評価を行った。対象者はデイサービスに通所する34名、平均年齢は84.7±4.2歳であった。「布団からの起き上がり」や「いすからの立ち上がり」に対する困難感を抱く傾向があったが、プログラム後はその困難感が減少していた。また、転倒のリスクは「家の中」が多かったが、プログラム後では有意に減少していた。歩行状態は一定距離の歩数が減少し、足の踏み出しが大きくなっていた。続けて、独居高齢者の生活行動パターンと運動量を明らかにするために、3名の自宅に人感センサーを設置した。これによって1日の生活パターンやトイレの回数、室内での部屋移動の状況が把握できた。さらに1ヶ月の情報を得た後、1日あたりの身体活動量を算出し、自宅でできる介護予防プログラムを提供した。また、これを家族が毎日観察し、活動状況によっては家族が高齢者に連絡をするといったコミュニケーションをとる機会にもなっていた。これらの結果より、高齢者は身体機能の低下によっておこる下肢の筋力を使う日常生活行動について不具合や不安を抱く可能性がある。しかし、高齢者の動きを生活活動量として捉え、個別性のあるその人に合った介護予防プログラムを提供することによって、不安や転倒のリスクの減少につながり、効果的であると考える。本年度は、介護予防プログラム開発を進めた。まず、高齢者向けの介護予防を目的とした全身の筋肉を使うリズム体操とタオルを使って上半身の柔軟性を養う体操を運動指導士と共に作成した。その後、この二つの体操を含めたプログラムを作成した。主なプログラムの内容は、1.健康チェック、2.看護予防とは、3.介護予防のために気をつけてはしいこと(歩き方、姿勢)、4.運動のポイント(2.3.4.5は参加者に説明)5.介護の方法、6.介護予防体操(5,6は実演)である。このプログラムを平成18年8月から平成19年3月までに、施設など9ヶ所において、のべ179名に対して実施した。参加者によっては、関節の拘縮や身体機能の低下が見られ、椅子に座って参加される方もいたが、ほとんどの方がプログラムに積極的に参加され、「楽しかった。」「家でもやってみる。」などの言葉が聞かれ、笑顔も見られた。また、このプログラムに基づいたパンフレットを作成し、継続的に介護予防ができるように参加者に配布した。平成18年12月には、高齢者に関わる介護士や保健師を対象とした交流会を実施し、独居高齢者の個別性に応じたプログラムの開発が必要性であること、独居高齢者のプログラムの客観的な評価が必要なこと、交通の便が悪い場所に住む独居高齢者が集まることができる場所でのプログラムの実施の必要性であるとの示唆を得た。これらのことから、今後、高齢者の身体状況に合うような運動プログラムの開発やプログラムの評価を行う必要があることが明らかになった。独居高齢者の生活の不具合や不安定要因に関する調査については、現在調査表を検討している段階であり、早急に実施し、調査の結果も含めて介護予防プログラムの開発を進める予定である。

平成18年度に作成した介護予防プログラムの効果を明らかにすること、独居高齢者の生活行動パターンと運動量を明らかにすることを目的に、平成19年度は前年度の作成したプログラムを実践し、プログラムの評価を行った。また、独居高齢者の自宅に見守りのセンサーを設置し、高齢者の生活行動の調査を行った。プログラムの評価対象者はデイサービス施設に通所する34名、性別は女性のみ、平均年齢は84.7±4.2歳、最高齢者は93歳であった。プログラムはのべ20回実施した。その結果、プログラム前後を比較すると、玄関で転びそうになった人は増加していたが、家の中や乗り物に乗る時の転倒のリスクは減少していた。日常生活の困難度については、プログラムの前後で有意差を認めなかった。16mの歩数は前後で比較すると歩数が減少し、足の踏み出しが大きくなっていた。これらのことから、本プログラムは、転倒のリスクや生活動作の困難状況を減少、維持させることができていると考える。人感センサーを設置は3名実施し、一日の生活パターンやトイレの回数、入浴の状況、室内での部屋移動の状況が把握でき、その情報を家族は毎日観察していた。約1ヶ月間の情報を得た後、1日あたりの身体活動量を算出し、自宅でできる介護予防プログラムを作成した。高齢者の室内での行動はなかなか把握しにくい。また、高齢者に尋ねてもその情報は掴みにくい。本研究では、高齢者の動きを生活活動量として捉え、独自に開発した行動分析、運動量分析、閉じこもり分析のソフトを用いることで、客観的にデータとしてわかりやすく示すことができ、自宅での介護予防プログラムの実践につながっていると考えられる。
気孔の圧着を利用した材質制御

ポーラス金属は、軽量でエネルギー吸収性に優れることから、注目を集めている。ポーラス金属に圧縮加工を施すと気孔が閉塞するが、その際に局所変形を生じるとともに、圧着境界が導入されるため、特異な組織が形成される可能性がある。そこで、ロータス型ポーラス銅の冷間圧延を行い、圧延材と焼鈍材の組織を調査した。連続鋳造法で作製した気孔率40%のロータス型ポーラス銅とノンポーラス銅の厚さ10mmスラブを、鋳造方向を圧延方向として、径φ412mmの圧延機で板厚1mmまで冷間多パス圧延を行った。この圧延材とその種々の温度における焼鈍材の組織を光学顕微鏡とFE-SEM/EBSDで観察した。両材ともに鋳造ままでは粗大な凝固組織であったが、圧延により伸長した層状の加工組織が形成された。ポーラス材の層状組織の厚さは薄く、気孔は圧下率90%の強圧延によって完全に閉塞していた。この圧延材に573Kで1.8ksの焼鈍を施すと、ポーラス材、ノンポーラス材ともに再結晶組織を呈した。このとき、ポーラス材は体積ひずみを生じるため銅部に導入された実効的な付与ひずみが小さいしにもかかわらず、ノンポーラス材に比べて平均結晶粒径が小さい再結晶組織を示した。また、ポーラス材の圧延焼鈍材には粗大粒が少なく、粒成長が圧着界面で抑制された箇所が観察された。したがって、ポーラス金属を出発材として用い、気孔を圧着させて中実材を作製することによって、通常の中実材を出発材とするよりも、圧延焼鈍後により微細な再結晶組織を有する材料が得られることが、新たに明らかとなった。溶融した電気銅の水素加圧雰囲気下での一方向凝固により寸法10mm^t×30mm^w×700mm^lのロータス型ポーラス銅スラブを作製した。その気孔率は40.9%、平均気孔径は155μmであった。雰囲気をアルゴンとし、比較のためのノンポーラス銅スラブも作製した。両スラブを長さ150mmに切断し、気孔の伸長方向を圧延方向と一致させて、2種のパススケジュール(a)ロール径φ412mmで各パス圧下率20%,(b)ロール径φ100mmで各パス圧下率10.6%,により板厚1mmまで冷間多パス圧延を行い、その際の変形・負荷特性を調査した。また種々の段階で小片の試料を採取し、圧延中の気孔形態の変化および硬さの変化についても調査した。低圧下率ではポーラス材料の圧延方向の伸び、すなわち延伸は限られていた。気孔率は全圧下率とともにほぼ直線的に減少したが、小径ロールを用いることでその減少を抑制することができた。例えば全圧下率36%により気孔率は、大径ロールでは40.9%から16.4%に減少するが、小径ロールでは、24.4%への減少に留まった。したがって、小径ロールによる加工は、ポーラス構造を維持しながら成形できる点で有利である。気孔の閉塞化は一様に生じるわけではなく、塑性不安定現象により一部の気孔が優先的に閉塞化することで進行することも明らかになった。さらには、ポーラス銅も冷間圧延により顕著な加工硬化を示し、その挙動は、提案する体積ひずみを除外した有効ひずみを用いることによってノンポーラス材と統一的に説明できることも明らかとなった。
非ホジキンリンパ腫中におけるホジキン病巣の遺伝子的検討

非ホジキンリンパ腫でホジキン様病巣を伴う4例につき、ホジキン様B細胞の免疫グロブリン重鎖可変領域を調べた。4例の内訳は1例がホジキン様病巣と瀰漫性大細胞型リンパ腫の合併、1例はangioimmunoblastic T-cell lymphoma(AILD-T),2例はATLであった。全例ホジキン様B細胞は非ホジキンリンパ腫と同じリンパ節に病巣があった。このうち瀰漫性大細胞型リンパ腫の症例ではホジキン様細胞は瀰漫性大細胞型リンパ腫とは隣接するも、混在する場所は少なかった。その他の3例では非ホジキンリンパ腫の腫瘍病巣中にホジキン様細胞が散見された。ホジキン様B細胞はCD20,CD30が陽性であったが、CD15は陰性であった。EBウイルスは1例の瀰漫性大細胞型リンパ腫と2例のATLで陽性であったが、1例のAILD-Tでは陰性であった。4例とも非ホジキンリンパ腫細胞はEBウイルス陰性であった。全例につきホジキン様B細胞はsingle cell manipulationで取り出され、免疫グロブリンH鎖遺伝子のPCR増幅がなされた。その結果ホジキン様B細胞は全例多クローン性であった。このうち瀰漫性大細胞型リンパ腫の1例とATLの1例でVH遺伝子の塩基配列を調べた。このうち瀰漫性大細胞型リンパ腫では分析した5つのホジキン様B細胞はin-frame sequenceを示し、これらのsomatic mutationの頻度は0から2.8%であった。ATLの1例では分析した5個のホジキン様B細胞はそれぞれ3.5%と17.7%のsomatic mutationを呈するin-frame sequenceを示したが、のこり3個はout-of frame sequenceであった。これらの結果から種々のタイプのリンパ腫に出現するホジキン様B細胞は多クローン性であり、EBVに関連したものであると言える。これらの細胞は非腫瘍性であり、非ホジキンリンパ腫を背景として生じたものと考えられる。EBVは免疫グロブリン遺伝子のcrippling mutationに重要な関わりを有している事が示唆された。ホジキン病を特徴づけるホジキン細胞ないしReed-Sternberg細胞は最近の研究で殆どがBリンパ球由来であるとされつつある。通常のホジキン病と異なり稀ではあるがホジキン病と非ホジキン病が同じリンパ節或いは同じ患者で異なった部位のリンパ節に生じる事がある。この様な症例で両者が同じクローンの細胞であるか否かを解明することは、本症のB細胞由来説を更に裏付ける事になる。我々は4例のこれらcomposite lymphomaにつき、single cell PCRの手法を用いて検討を行った。このうち1例は濾胞性リンパ腫の後にホジキン病を来したもので、残る3例は同じリンパ節にホジキン病と瀰漫性大細胞型リンパ腫を合併したものである。このうち2例(1例は濾胞性リンパ腫とホジキン病の合併例)ではIgH遺伝子のRCR増幅とoligonucleotideの塩基配列分析により、非ホジキンリンパ腫細胞とホジキン細胞とが同一のクローンであることが証明された。

残り2例のうち1例はホジキン細胞の5つのPCR産物が多クローン性であり非ホジキンリンパ腫細胞とは異なった。残る1例ではPCR産物は得られなかった。これらの結果から明らかに一部のcomposite lymphomaでは非ホジキンリンパ腫細胞とホジキン細胞が同一のクローンであることが明らかとなったわけで、ホジキン細胞がB細胞由来であること及びクローナルな腫瘍細胞であることが明らかになった。然し多クローン性であった症例では本当にこれがクローナルでは無かったのか或いは操作に不備が有ったのかは更なる検討が必要であろう。非ホジキンリンパ腫でホジキン様病巣を伴う3例につき、ホジキン様B細胞の免疫グロブリン重鎖可変領域を調べた。3例の内訳は1例がangioimmunoblastic T-cell lymphoma(AILD-T),2例はATLであった。全例ホジキン様B細胞は非ホジキンリンパ腫と同じリンパ節に病巣があった。これらのリンパ節ではいづれも非ホジキンリンパ腫の腫瘍病巣中にホジキン様細胞が散見された。ホジキン様B細胞はCD20,CD30が陽性であったが、CD15は陰性であった。EBウイルスは2例のATLで陽性であったが、1例のAILD-Tでは陰性であった。3例とも非ホジキンリンパ腫細胞はEBウイルス陰性であった。全例につきホジキン様B細胞はsingle cell manipulationで取り出され、免疫グロブリンH鎖遺伝子のPCR増幅がなされた。その結果ホジキン様B細胞は全例多クローン性であった。このうちATLの1例でVH遺伝子の塩基配列を調べた。その結果ATLの1例では分析した5個のホジキン様B細胞はそれぞれ3.5%と17.7%のsomatic mutationを呈するin-frame sequenceを示したが、のこり3個はout-of frame sequenceであった。これらの結果から種々のタイプのリンパ腫に出現するホジキン様B細胞は多クローン性であり、EBVに関連したものであると言える。これらの細胞は非腫瘍性であり、非ホジキンリンパ腫を背景として生じたものと考えられる。EBVは免疫グロブリン遺伝子のcrippling mutationに重要な関わりを有している事が示唆された。今後はB細胞性リンパ腫とホジキン病様病巣を伴う症例において両者の関連性を検討するつもりである。
高分子錯体ナノ結晶の表面修飾による非線形な光応答系の創出

本研究では独自に開発・確立した「ナノ固相反応法」と「エピタキシャル的表面修飾」を駆使して高分子錯体ナノ結晶の作製および特異な表面修飾を行い、エンドキャップ分子が結晶表面で協同的構造変化することで、低閾値かつ高感度に光物性制御できる高分子錯体ナノ結晶材料の創出を可能とした。「ナノ固相反応法」とは、予め「再沈法」で作製したビピリジン配位子ナノ結晶分散系を用いて錯化反応を行うもので、難溶性高分子錯体の合成とナノ結晶化を同時に達成した。この手法は他の類縁体配位子でも適用可能であった。得られた高分子錯体ナノ結晶の結晶方位をTEM観察および電子線回折測定により決定したところ、ナノ結晶の特定のファセット(010)面に高分子末端が露出していることが示唆された。実際に、表面に配位不飽和な鉄イオンを露出したプルシアンブルー(PB)ナノ粒子が高分子錯体ナノ結晶の(010)面に選択的に吸着することを確認した。すなわち、鉄イオンと配位結合可能なビピリジン配位子が高分子末端としてナノ結晶表面に露出しており、PBナノ粒子をプローブとしてナノ結晶表面の化学構造の“可視化"に成功した。続いて、「エピタキシャル的表面修飾」による更なる機能化に着想した。ナノ結晶表面に露出したビピリジン配位子をハロゲン化アルキルにより四級化した結果、反応前後で高分子錯体ナノ結晶の結晶構造は変化せず、発光波長が短波長シフトすることを見出した。すなわち結晶表面の化学的改質が高分子錯体ナノ結晶の光学特性に影響を及ぼすことを意味する。さらに、アゾ系フォトクロミック部位を有するハロゲン化アルキルでナノ結晶表面を密に修飾すると、フォトクロミズムをトリガーとした表面修飾分子の協同的配向・配列変化が可能となり、高分子錯体ナノ結晶の光学特性を非線形制御する道筋が付けられた。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
非侵襲的検査によるＢｒｕｇａｄａ型心電図の予後予知

Brugada症候群は突然死の原因疾患の1つとして知られている。同様の心電図波形は健診等で0.2%程度の頻度で発見されることがあるが、無症候性で偶然発見された症例の取扱いは未だ確定していない。当大学での過去14年間のBrugada心電図症例について、問診、ホルター心電図による不整脈検査、心拍変動解析、微小心電図による心室遅延電位の検出及びQT計測パラメータの評価を行った。登録症例中29例の検査が終了した。失神歴1名、胸部症状7名、家族歴(母親の急死)が1名に見られた。心室遅延電位は健常者には見られない所見であるが、29例中18例と高率に陽性であった。Brugada症候群は特徴的な心電図波形を呈し、若年中年の男性が突然死する原因となる疾患として1992年に報告された。その後、同様の心電図波形が健康診断等で0.10.2%程度の頻度で発見されることがあり、Brugada型心電図としてその予後が注目されてきたが、診断や治療についてはまだ確定していない。佐賀大学では12年間で約1万7千名の心電図検査受診者に対して約60名のBrugada型心電図症例の登録がある。これらの学生について、問診、ホルター心電図による不整脈解析、心拍変動解析、微小心電図検査による心室遅延電位の検出を行った。また、QT計測ソフトを用いてQT計測パラメータの評価も行った。器質的疾患の除外のため心臓超音波検査も施行した。登録症例のうち在学中の29症例の検査が終了した。問診で、失神歴、動悸、胸部症状、家族歴のいずれも認めなかった者が多く、21名(72.4%)であった。一方、1名は失神歴があり、動悸4名、胸痛などの胸部症状3名、母親が急死した者が1名あった。ホルター心電図では多くの症例に心室性不整脈は見られるものの、心室細動につながるような重篤な不整脈はほとんど見られなかった。心室遅延電位(LP:Late potential)は通常、健常者では見られない所見であるが、29例中18例(62.1%)と高率に陽性であった。また、家族歴、失神歴のある2名はいずれもLP陽性であった。経過観察期間は差があるが、経過観察中に失神等のイベントは全症例で認めなかった。24年度は登録症例のうち9症例の検査が終了した。問診で大学入学以降にも失神や胸部症状等を認める症例もあったが、心事故につながる重大な症候は見られなかった。ホルター心電図では多くの症例に心室性不整脈は見られるが、心室細動につながるような重篤な不整脈は見られなかった。心室遅延電位は半数以上の症例で陽性となり、自覚症状や他のデータとの関連について検討中である。25年度は引き続き残りの症例について検査を実施し、データの解析まとめを行う。Brugada型心電図のうち家族歴や失神歴のないものについては、致死性不整脈発現のリスクは高くないものとして臨床的には取り扱われてきている。学校や職場の健診で偶然に発見されるBrugada型心電図波形を示す症例については、治療の是非について取り扱いが難しいことも多い。当研究では大学生の健診で発見されたBrugada型心電図症例について突然死や重大心事故に関するリスク評価を可能な限り非侵襲的な方法で行うことを目的としている。様々なデータの検討を行い、症例数を重ねることがリスク評価方法の確立に寄与すると思われる。Brugada型心電図の症例数は全検査数の1%未満と少ないことから着実な症例の集積が必要となる。

24年度中には症例の全数の検査は終了しなかったので、若干データ収集の遅れを認めているが、25年度前半期には検査を終了させ、データ解析とまとめに取り組みたい。24年度の9症例についてはとくに問題なく各種検査を終了出来ているので、25年度も同様の検査内容、方法で引き続き残りの症例について検査を実施し、データの解析まとめを行う。卒業生についての予後調査と検査については遠隔地に在住している方も多いため難航も予想される。確認を早急に行う。検査に必要な機器類、消耗品等は既に購入済である。検査データの解析、まとめ、学会発表等に必要な費用が25年度の使用額として残となっている。
高分子の高次構造制御による機能集積型ナノ反応場の創出

本研究課題は、ミクロ相分離によりナノシリンダーアレイを形成する液晶性ブロック共重合体(LCBCPs)薄膜に機能基を集積し、透過型の触媒膜を開発することを目的とし提案された。当初の目的である透水膜の触媒化には至らなかったものの、実用化に向けた要素技術の確立と、申請時には思い至らなかった高分子液晶の本質ともいえる現象を発見した。当初の目的である透過型の触媒膜を目指す上でまず、1欠陥のない、透水経路がナノシリンダーにより確実に規定された透水膜を、大面積製膜するプロセスの確立が必須であった。更に、シリンダー経路上の任意位置に、任意機能基を組み込む技術を開発することが、ナノシリンダーの高度リアクター化に必須である。2膜内部で、膜を構成する任意高分子鎖の座標を指定する技術の確立はこれまでに報告例がなく、これについても試みた。以下にそれぞれについて述べる。1一般に限外濾過膜と呼ばれる、孔径分布20250 nm程度の市販のポリスルフォン(PSf)多孔膜を支持膜とし、この上に直径10±1 nmの垂直シリンダーを形成する液晶性ブロック共重合体を直接塗工することを狙った。予め多孔膜上に粘調なアルギン酸ナトリウム(AlgNa)水溶液を塗工し、多孔質基板の平滑化と、LCBCPの有機キャスト溶液を遮蔽することで、極めて高いサイズ選択性(半径2 nm粒子は100%透過し、半径4 nm粒子は97%阻止)を有する透水膜の連続塗工に成功した。2互いに異なるメソゲン基を有する複数種LCBCPsのブレンド膜において、各LCBCPsの深さ座標を指定し、三次元異方的なミクロ相分離構造の構築を試みた。すなわち、異種LCBCPsのブレンド薄膜を、等方転移温度以上でアニールすると、冷却過程において空気界面から等方転移温度の高い順に液晶相が析出するため、異種スメクチック液晶相を一意配列に積層させることに成功した。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題では、膜面に対して垂直配向したシリンダー相を形成する、親水性ポリエチレンオキサイド(PEO)と液晶性側鎖を有するメタクリレート(PMALc)からなるブロック共重合体のミクロ相分離界面に、機能基を集積することで、PEOナノシリンダーをフロー型のナノリアクター化し、原料のインプットと生成物のアウトプットが連続的に行われる触媒膜を開発することを目的としている。本年度の成果は主に以下の三点である。【1.多孔質支持基板上へのブロックコポリマー層大面積塗工法の確立】これまでにも、表面エネルギーの中性化処理が施された平滑な基板上での垂直配向シリンダー相は報告されているが、その殆どは物質透過性を有さないため、フローナノリアクターとしての応用は困難であった。本年度は、物質透過性を有する多孔質基板上に、大面積にわたって均質なブロック共重合体の薄膜を直接塗工・製膜し、シリンダー相を垂直配向させる手法を新たに確立した。【2.新規トリブロック共重合体による相分離界面の多機能化】本研究では、ブロック共重合体のブロック接合点に機能性官能基を導入することで、ミクロ相分離構造の界面機能化を狙っている。本年度は、高反応性基を接合点に有する共重合体を相分離させた後に、固液反応で機能性官能基を導入し、多様な機能を一様に相分離構造に付与可能な手法を確立した。【3.固体NMRを用いた分子運動論的アプローチによる透水挙動の解析】EO-PMALcブロック共重合体の相分離構造は、PEOナノシリンダーが温度応答性の透水チャンネルとして機能することが明らかとなっているが、このメカニズムの詳細な考察は行われてこなかった。本年度は、含水した薄膜サンプルの固体NMR測定より水の横緩和時間測定をから、40°C以上でPEOが部分的に凝集することでシリンダー内部に間隙が開き、透水性が向上するのではないかとの仮説を提唱した。ポリエチレンオキサイド(PEO)と液晶(LC)性メタクリレートが形成するブロック共重合体(LCBCs)の形成するミクロ相分離シリンダーアレイ構造を利用し、多様な機能を発現しうる透過性「スマートメンブレン」の開発を進め、本年度は以下三点の基盤技術を確立した。1多孔質基板へのLCBC相分離膜直接塗工市販のマクロ多孔膜上に保護水溶性高分子層を予め塗布することで、LCBC薄膜の連続Roll to Roll塗工プロセスを確立した。加圧透水により保護層は除去可能で、また透水流束は0.5L/m2/h/bar(実用RO膜と同程度)であった。ガス透過では、水素選択性が見られた。2異種LCBCsブレンド膜における組成分布制御等方転移温度が互いに異なる異種LCBCブレンド薄膜においては、等方転移の高い順に空気界面側から基板に向けて自発的に積層し、組成分布が制御されることを見出した。これは、液晶の空気界面アンカリング効果と、ホメオトロピック配向性、異種へテロ液晶間の非相溶性を利用したもので、高分子液晶の本質をついた新規相分離形態である。3相分離界面に組み込まれた活性エステルのアミノリシスによる界面修飾法前年度より、シリンダー相分離界面の壁面に偏析させた活性エステルを水溶液中でアミノリシスすることで、任意官能基による壁面修飾を可能とする手法を検討している。

本年度は、高分子側鎖に加え、高分子主鎖に活性エステルを組み込むことで、シリンダー界面の機能化と同時に、空孔化を可能とした。上記の各基盤技術を融合することで、壁面が高度に機能化された透過性のナノチャネルを有する「スマートメンブレン」の創出が期待でき、高分子の高次構造制御によるナノ反応場としての応用検討が可能となる。申請者は当初、ポリエチレンオキサイド(PEO)と液晶(LC)性メタクリレートが形成するブロック共重合体(LCBCs)の形成するミクロ相分離シリンダーアレイ構造を利用し、その界面を官能基修飾することで、ナノシリンダーをフロー系のナノリアクター化することを提案し、採択された。その研究自体は順調に進行し、界面の任意機能化や、多孔質基板への直接連続塗工、更には透水実験などによりナノシリンダーの基本物性・性能を確認するところまで進展している。一方、課題遂行中に着想を得た、等方転移温度が異なる異種LCBCsブレンド薄膜における組成分布制御法は、課題提案時には予定していなかった現象だが、高分子液晶の本質に迫る興味深い挙動を示すことを見出した。この現象は、液晶の空気界面アンカリング効果と、ホメオトロピック配向性、異種へテロ液晶間の非相溶性を利用したものである。すなわち、薄膜熱処理後の冷却過程において、ブレンド薄膜構成LCBCs中、最も等方転移温度の高いLCBCsの液晶相が空気界面に析出し、等方転移の低いLCBCsはこのとき融解状態を保っている。更に温度を下げていくことで、等方転移温度の高い順に、逐次析出することで、組成分布を膜厚方向に沿って制御可能となる。特筆すべきは、このヘテロ液晶間のマクロ相分離が、面内の液晶ドメイン-PEOドメイン間ミクロ相分離を維持したまま起こる点である。したがって、マクロ相分離したヘテロ液晶間をPEOシリンダーは垂直貫通するため、界面官能基修飾法と組み合わせると、シリンダーに沿って官能基の配列を制御することができる。このように、当初計画していなかった新現象により、更なるPEOシリンダー・ナノチャネルの高度機能化が可能となるため、計画以上の進展といえる。本研究課題は、ミクロ相分離によりナノシリンダーアレイを形成する液晶性ブロック共重合体(LCBCPs)薄膜に機能基を集積し、透過型の触媒膜を開発することを目的とし提案された。当初の目的である透水膜の触媒化には至らなかったものの、実用化に向けた要素技術の確立と、申請時には思い至らなかった高分子液晶の本質ともいえる現象を発見した。当初の目的である透過型の触媒膜を目指す上でまず、1欠陥のない、透水経路がナノシリンダーにより確実に規定された透水膜を、大面積製膜するプロセスの確立が必須であった。更に、シリンダー経路上の任意位置に、任意機能基を組み込む技術を開発することが、ナノシリンダーの高度リアクター化に必須である。2膜内部で、膜を構成する任意高分子鎖の座標を指定する技術の確立はこれまでに報告例がなく、これについても試みた。以下にそれぞれについて述べる。1一般に限外濾過膜と呼ばれる、孔径分布20250 nm程度の市販のポリスルフォン(PSf)多孔膜を支持膜とし、この上に直径10±1 nmの垂直シリンダーを形成する液晶性ブロック共重合体を直接塗工することを狙った。
転写装置とmRNAプロセシング装置のクロストーク機構の解析

転写やmRNAプロセシングといった核内事象を連携(カップル)させている分子機構を明らかにするアプローチとして、精製した二種類のリン酸化及び非リン酸化フォームのRNAポリメラーゼII(Pol II)のin vitroスプライシング反応に対する影響を解析した。その結果Pol II最大サブユニットのカルボキシル末端領域(CTD)が高度にリン酸化したPol IIはスプライシング反応を強く促進し、一方非リン酸化フォームPol IIは反応を逆に抑制することを見い出し(Hirose et al. Genes & Dev.1999)、Pol IIが、転写後のmRNAプロセシングにも直接的に機能しうることを生化学的にはじめて明らかにすることが出来た。更にPol IIが、CTDのリン酸化調節を介して、転写反応のみならずmRNAプロセシング等の他の核内事象に如何なる分子間相互作用を通じて関わっているかを明らかにするために、リン酸化CTDに結合する新規蛋白質の同定をFar-western法を用いた発現クローニングによって試みた。これまでの解析から、リン酸化CTDに結合する候補蛋白質としてヒトの新規蛋白質PCIF1(Phosphorylated CTD Interacting Factor 1)及び既知のヒト核蛋白質Pin1を同定した。これらの蛋白質のリン酸化CTDとの結合責任領域をFar-western法及びGST-pull down法で同定した。新規蛋白質PCIF1については、flag-PCIF1叉はGFP-PCIF1をトランスフェクトした細胞を用いた免疫共沈実験、及び細胞内局在解析実験より、内在性のリン酸化RNAポリメラーゼIIとPCIF1の細胞内における特異的会合を確認した(未発表データ)。
PPY細胞の細胞系譜制御機構の解明－新規β細胞起源の探索

目的:ノックインマウスを用いたPPY細胞の細胞系譜の追跡により、PPY-β細胞間の分化転換制御機構を解明し、PPY細胞が新たなβ細胞の起源となる可能性を証明する。方法:PPY遺伝子にCreリコンビナーゼ配列を挿入したノックインマウスを用い、生理的条件下でのPPY遺伝子発現細胞がどのような細胞系譜にあるのかを明らかにする。結果:416週齢までのPpy-Cre:Rosa-YFPマウスにおける、GFP、PPY陽性細胞の分布の免疫組織化学的解析を行った。加齢に伴い膵島内にGFP陽性PPY陰性細胞が増加した。成体の膵島内に多くのPPY細胞由来β細胞が存在することが明らかとなった。ノックインマウスを用いたPPY細胞の細胞系譜の追跡により、PPY-β細胞間の分化転換制御機構を解明し、PPY細胞が新たなβ細胞の起源となる可能性を証明することである。本研究課題遂行に用いる抗PPY抗体の特異性を確認するため、Ppy遺伝子欠損マウス(Ppycre/cre)の膵組織切片の免疫組織化学を行った。市販の抗PPY抗体陽性細胞が複数認められ、抗PPY抗体の特異性に乏しいことが判明した。そこで、新たに抗PPY抗体を作製した。Ppycre/creにPPY抗原を免疫し、最終的に免疫組織化学法およびウェスタンブロット法に適したモノクローナル抗PPY抗体(mPP 32-1A8)を作製した。Ppycre/creの膵組織切片を用いて、mPP-321A8の免疫組織化学を行った。結果、野生型マウスの膵島では複数のmPP-321A8陽性細胞が認められたが、Ppycre/creでは全く認められなかった。したがって、mPP 32-1A8は、PPYタンパクを正確に検出できることが判明した。mPP-321A8は特許申請中(特願2015-246912)である。現在mPP 32-1A8の特異性に関する論文を作成中であり、以後の検討にはmPP 32-1A8を用いることとした。申請者は、研究結果について研究室内で定期的なdiscussionを行いながら遂行した。本研究課題の遂行にあたり、特異性が高い抗PPY抗体が必要である。申請者は、本研究課題遂行に伴い、Ppycre/creの膵組織切片を用いて市販の抗PPY抗体の特異性を検証した。その結果、Ppycre/creにおいてもその陽性細胞が認められ、市販の抗PPY抗体の特異性に乏しいことが判明した。本研究課題の遂行に適した特異性の高いモノクローナル抗PPY抗体を新たに作製したため、本研究課題の目的である「PPY細胞の細胞系譜の追跡」に関する検討の開始が遅れた。平成27年度、Ppycre/creの膵組織で陽性細胞が認められない、特異性の高いモノクローナル抗PPY抗体を作製したことにより、今後の検討におけるPPYタンパクの検出は、最も正確であるが明確である。本研究課題の目的は、ノックインマウスを用いたPPY細胞の細胞系譜の追跡により、PPY-β細胞間の分化転換制御機構を解明し、PPY細胞が新たなβ細胞の起源となる可能性を証明することである。前年度に作製したモノクローナル抗PPY抗体(mPP 32-1A8)を用いて以下の解析を行った。2. 2型糖尿病状態におけるβ細胞からPPY細胞への分化転換過程の解析:本研究課題の背景である、β細胞からPPY細胞への分化転換過程に関する論文作成において、抗PPY抗体の特異性が問題となり投稿が困難であった。そこで、前年度に作製したモノクローナル抗PP抗体(mPP32-1A8)を用いて全実験を再検討した。またβ細胞由来のPPY細胞が増加することは明らかとなっていたが、インスリンのみ発現細胞から、インスリン、PPY共発現細胞を経てPPYのみ発現細胞へ分化転換する連続的な過程については未解明のままであった。そこで本検討では、インスリン、PPY、GFPの三重染色を追加検討した。結果、HF+STZマウスでは、βからPPY細胞への分化転換、β細胞の脱顆粒が誘導されることが明らかとなった。現在論文作成中である。平成27年度の検討により、8から18週齢までのPpy-eGFPマウスにおいて、加齢に伴い膵島内の抗GFP抗体陽性抗PPY抗体陰性細胞が増加することが確認できた。平成28年度以降は、これまでの所見を元に、特にPPY細胞とβ細胞の分化転換の可能性に焦点を絞り、以下の検討を行う。実験計画1. PPY細胞はどのような細胞系譜をとるのか?発生期から成体までPpy遺伝子発現細胞の細胞系譜を膵臓の領域別に解析する。

さらにβ細胞は、自己複製により数が維持されると考えられている(J Clin Invest 123 (3), 990-995, 2013)。長期的な解析により、PPY細胞由来のβ細胞数の減少が認められない場合、加齢に関わらずPPY遺伝子発現細胞のβ細胞への分化能が保持され、β細胞の起源(source)となるPPY細胞が、成体でも持続的に供給されることを証明する。実験計画2. PPY細胞からβ細胞への分化転換の引き金は?インスリン抵抗性・糖毒性条件において、β細胞ではPdx1発現量が低下し、PPY細胞へと分化転換する。申請者は、同様のメカニズムがPPY細胞からβ細胞への分化転換を制御する場合、PPY遺伝子発現細胞をβ細胞のsourceとして機能させることが可能であると考えた。本研究課題では、PPY細胞でPdx1を過剰発現させ、PPY細胞からβ細胞への分化転換を制御することができるのか?、その可能性を明らかにする。細胞生物学
骨折治癒過程におけるTGF-βスーパーファミリー・レセプターの遺伝子発現

骨組織の治癒過程を解明することは骨の再生を理解する上で重要であると考えた。TGF-βsuperfamilyは骨芽細胞の初期分化や細胞外マトリックスを調節し骨の形成において中心的な役割をになっている。そこで,骨再生過程におけるTGF-βリガンド,BMPリガンド,シグナル伝達物質およびそのreceptorの局在を観察したいと考え、BMPおよびTGF-βのリガンドおよびレセプターの局在と遺伝子発現を検索した。BMPおよびTGF-bのリガンドおよびレセプターの遺伝子発現は,ほぼ同様の局在を示し、骨折後1日目では凝血組織周囲の結合組織のfibroblast-like cellおよび筋組織の結合組織細胞に観察され,この免疫反応は骨折後2日目ではより強かった。骨折後3日目では線維化が開始され,線維芽細胞の免疫反応は最も強かった。骨折後4日目以後では,軟骨形成とともに軟骨芽細胞,増殖期および休止期軟骨細胞に認められたが,肥大期軟骨細胞には免疫反応は認められなかった。また骨吸収部では破骨細胞にも強い遺伝子発現が観察された。骨折後714日目では骨形成が盛んに行われ,骨芽細胞は強い遺伝子発現を示したが,ほぼ骨性治癒が得られた骨折後21日目以後では,細胞成分はほとんど遺伝子発現を示さなかった。また,2 color FISH法ではBMPおよびTGF-βのリガンドおよびレセプターの遺伝子発現は一致していた。以上のことから,BMPおよびTGF-βは骨折治癒過程においてreceptorを介し,autocrine、paracrineに作用し、骨芽細胞や軟骨細胞の初期分化を促進するのみならず,破骨細胞を刺激して,骨吸収においても重要な役割を果たすものと考えられた。骨組織の再生過程におけるBMPの機能を解明することを目的として,ラットの下顎角部に骨折を形成し,骨折後のreceptorの免疫組織学的検索および遺伝子発現を検索し以下の結果を得た。BMPR-IAのsignalは,骨折後1日目では凝血組織周囲の結合組織のfibroblast-like cellおよび筋組織の結合組織細胞に観察され,このsignalは骨折後2日目ではより強かった。骨折後4日目以後では,軟骨形成とともに軟骨芽細胞,増殖期および休止期軟骨細胞に認められたが,肥大期軟骨細胞にはsignalは認められなかった。また骨吸収部では破骨細胞にも強い発現が観察された。骨折後714日目では骨形成が盛んに行われ,骨芽細胞は強い免疫反応性を示したが,ほぼ骨性治癒が得られた骨折後21日目以後では,細胞成分にほとんどsignalは認められなかった。BMPR-IBを用いた遺伝子発現はBMPR-IAとほぼ同様の発現を示したが,骨折後3日目まではBMPR-IBを用いた遺伝子発現は-IAによるsignalよりも弱く,骨形成期,軟骨形成期に一致して-IBのsignalが強く認められた。また,免疫組織化学をもちいた検索でもほぼ同様の結果を得た。以上のことから,BMPは骨折治癒過程においてreceptorを介し,骨芽細胞や軟骨細胞の初期分化を促進するのみならず,破骨細胞を刺激して,骨吸収においても重要な役割を果たすものと考えられた。平成12年度でラット下顎角部に骨折形成を施して作製した試料を用いて,骨折の治癒過程におけるTGF-βリガンド,BMPリガンド,シグナル伝達物質およびそのレセプターの局在を観察したいと考え,BMPおよびTGF-βのリガンドおよびレセプターの免疫染色を行った。本年度においては免疫組織化学および遺伝子発現の検索を行った。

BMPおよびTGF-βのリガンドおよびレセプターの遺伝子発現は,ほぼ同様の局在を示し,骨折後1日目では凝血組織周囲の結合組織のfibroblast-like cellおよび筋組織の結合組織細胞に観察され,この免疫反応は骨折後2日目ではより強かった。骨折後3日目では線維化が開始され,線維芽細胞の免疫反応は最も強かった。骨折後4日目以後では,軟骨形成とともに軟骨芽細胞,増殖期および休止期軟骨細胞に認められたが,肥大期軟骨細胞には免疫反応は認められなかった。また骨吸収部では破骨細胞にも強い遺伝子発現が観察された。骨折後714日目では骨形成が盛んに行われ,骨芽細胞は強い遺伝子発現を示したが,ほぼ骨性治癒が得られた骨折後21日目以後では,細胞成分はほとんど遺伝子発現を示さなかった。また,two-color FISH法ではBMPおよびTGF-βのリガンドおよびレセプターの遺伝子発現は一致していた。以上のことから,BMPおよびTGF-βは骨折治癒過程においてレセプターを介し,autocrine, paracrineに作用し,骨芽細胞や軟骨細胞の初期分化を促進するのみならず,破骨細胞を刺激して,骨吸収においても重要な役割を果たすものと考えられた。