hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グリア細胞を標的とした脳機能改善薬の開発

cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)の発現を促進させることをmRNAおよびタンパクレベルでの観察で明らかにした。FK960の作用点は、これまで報告のあるソマトスタチン遊離やニコチン様アセチルコリン受容体を介さない新規のものであることが示唆された。アストロサイトのMAP kinaseファミリーに対し、FK960はERKを活性化させたが、p38およびJNKの活性化は惹起しなかった。FK960によるGDNF産生は、MEK阻害薬PD98059およびpratein kinase A阻害薬H89で抑制され、GDNF産生にこれらのシグナル系が関与することが示唆された。海馬組織培養系におけるグリア-神経相互作用: in vitroにおける薬物評価系として培養ラット海馬切片を用いた実験系を確立した。本組織培養系に対し、脳虚血様の処置(外液グルコース除去およびアジ化ナトリウム添加)を負荷すると海馬CA1およびCA3領域の神経細胞層にアポトーシスによる細胞死が生じた。この虚血様処置による細胞死は、グルタミン酸受容体拮抗薬(MK801,CNQX)で減弱した。アストログリア型の高親和性グルタミン酸輸送体の阻害薬であるジヒドロカイニン酸は、この虚血様処置による神経細胞死を抑制した。以上の結果は、培養海馬切片においてin vivoでの虚血性神経傷害が再現されること、そしてその発生にアストログリアからのグルタミン酸放出が関与する可能性を示す。アストログリア由来神経栄養因子産生に対するエンドセリン受容体刺激薬の作用:脳傷害後の神経系の再生は、アストログリアが産生する種々の神経栄養因子により促進される。脳損傷時に発現が増加するエンドセリン'(ET)神経栄養因子産生作用を検討し、これが、glialcell line-derived neurotrophic factor(GDNF)およびbrain-derived neurotrophic factor(BDNF)の発現を促進させることをmRNAおよびタンパクレペルでの観察で明らかにした。また、ET_B受容体アゴニストのラット脳室内投与は、大脳・海馬および線条体でGDNFおよびBDNFを各々増加させた。アストロサイトにBDNFの発現機構について検討し、アストロサイトではBDNF遺伝子のexon3およびexon4を持つmRNAのみが存在することが示された。ETによるexon3 BDNFmRNAの増加はERK、Pl-3 kinaseおよびCa/calmoduin kinaseの阻害薬で生じなくなり、これらのシグナル系の関与が示された。一方、exon4 BDNFmRNA発現ではCa/calmodulin kinaseの関与が示された。各々の発現に関わる転写因子について検討し、exon3発現にはCREBが、exon4にはαEBPβの活性化が関与することを明らかにした。新規脳機能改善薬の作用点の解明:
物質場制御による電子活性無機系材料の創製

本研究では物質場制御による電子活性無機系材料の創製に関する調査研究を行い、重点領域研究の計画として具体化した。これを以下に要約する。1)本計画では、機能の発現および構造の形成の両面においては、結晶表面場などの物質場が中心的役割を果たすという認識から出発する。2)本計画では、国際発信型研究を指向している。具体的には、新奇機能材料を常に発見し続けるための基礎科学の構築を目標としている。そのために、新奇機能材料の感覚的化学設計からこれらを発見・発掘するグループ、発見された物質系を対象とし、物質場を応用して、これらを原子オーダーで制御された構造体につくりあげる合成科学を開拓するグループ、および電子活性機能の発現と合成反応における物質場の役割を理論化し、物質設計の新たな基盤を構築するグループを配置し、相互の有機的協力により新材料の創製をはかる。3)本計画では、特に酸化物に注目することにした。酸化物はこれまで、一般には電子的不活性材料と見なされてきた。しかし最近、主として本計画に参加する研究者らによって、これらは実は電子的活性材料であることが明らかにされつつある。即ちワイドキャップpn伝導体の発見、ペロブスカイト構造を母体にしたエピタキシ-薄膜積層構造形成技術の確立、Siクラスレート超伝導体の発見などの先駆的実績である。
精神科医療におけるプラシーボ使用の実態と適切な使用手続きの検討

本研究の目的は日本の精神科病院で働く看護師と医師にプラシーボに関する使用の質問紙調査を行い、その上でプラシーボの適切な使用手続きについて検討することである。ほとんどの対象者はプラシーボ与薬を経験したことがあるが、今でも使用している人は減少している。また、プラシーボに対する意識では、対象者は実薬に比べて副作用がないことや薬物に対する依存について心配がないために、肯定的な意見が多く、プラシーボは倫理に反するという否定的な意見は少数であった。プラシーボを倫理的に適った方法で使用するには、治療のいずれかの段階で患者に説明を行い、了承を得ていくことが必要であると考える。看護師および医師に関するプラシーボ使用の実態調査は終了し、現在は結果の分析を実施している。看護師のプラシーボ使用の実態は以下のような結果になっている。日本の精神科病院1114施設のうちランダムに抽出した259施設に本研究実施の意向調査を実施し29施設(意向調査回収率11.2%)から了承を得た。調査の了承を得た施設の看護師1529人に質問紙を配布、948人から回答があった(回収率62%)。質問内容は、1)属性、2)プラシーボ使用に対する主観、3)プラシーボ使用の実態などとした。プラシーボ与薬に対する主観(複数回答可)では、948名中「実薬に比べて副作用がないので、プラシーボを試す価値がある」557名(58.8%)、「患者によっては依存傾向を強めるために、実薬よりもプラシーボを使うほうがよい」428名(45.1%)、など肯定的意見が多く、「業務のためとはいえ抵抗がある」136名(14.3%)、「プラシーボとわかって、患者の信頼を失うのが怖い」125名(13.2%)などの抵抗を示す意見は少なく、その倫理的問題に関しては関心が薄いと考えられる。プラシーボ使用実態は使用経験がある人は948名中888名(93.8%)、ない人は53名(5.6%)であった。また、使用する際には「包括指示で看護師がその場に合わせて判断している」が616名(65.0%)と多かった。医師のプラシーボ使用の実態に関する調査に関しては、1166名郵送し216名から返送があった。(回収率18.5%)回収に時間を要したため、現在分析中である。量的分析に加えて、自由記載からはプラシーボ使用に関する葛藤もみられるため、質的分析も行う予定である。今後は分析結果を学会やシンポジウムを通じて、報告するとともに、プラシーボの適切な使用について検討していく予定である。2012年7月から12月にかけて全国の精神科病院の看護師1529人、医師1156人に対して、プラシーボ与薬についての実態調査を質問紙にて実施した。その結果、精神科医療におけるプラシーボ使用実態については、看護師および医師ともに、同様の傾向がみられた。今回の調査対象では「使用経験がない人」と「1年以上使用していない人」をあわせて、看護師ではおよそ3割、医師ではおよそ4割で現在プラシーボを使用していなかった。しかしながら、共同研究者の小松らが一般科で調査したプラシーボ使用経験では「過去1年間にプラシーボを使用したことがない」が479人中331人(69.1%)であり、この結果と比較すると精神科では一般的な薬物療法であると考えられる。多くの場合は医師からの包括指示のもと、看護師が判断し、プラシーボを使用していた。精神科では不定愁訴などに効果があり、薬物依存の予防や薬物依存患者への使用などの場合に多く使用されていた。また、プラシーボに対する態度では肯定的な意見が多くみられ、その有効性を支持している様子がみられた。プラシーボ使用の背景には、現在の精神科医療の薬物の多剤大量投与の現状が背景にあると考える。実薬を過剰に投与して有害反応を引き起こすよりもプラシーボを使用したほうが患者にとってメリットが高いと多くの医療者は考えており、患者への思いやりや無危害の原則を優先していた。その反面、プラシーボ使用は倫理に反すると考えている医療者は少数にとどまっており、プラシーボのもつ誠実さや自律性の尊重に反する倫理的問題には気づけていない可能性がある。これら結果を、学会にて発表した。また、シンポジウムで結果を公表し、プラシーボの適切な使用について検討した。本調査は医療者側から見たプラシーボ使用の実態であり、今後は当事者の意見も踏まえて、適切な使用の在り方を検討する必要があると考える。

プラシーボは全く害がない上に、実際に効果が現れることもよくあるが、服用する患者に説明をした途端に効果は期待できなくなるため、インフォームド・コンセントを得ることはできない。そのため、プラシーボは患者の知る権利や治療同意を尊重すべきという「自律の尊重」に反するが「仁恵」「無危害」の原則に合致するという倫理的ジレンマが生じることとなる。わが国におけるプラシーボ使用については、どうあるべきかの議論もなされず、その実態は何も知られていない。精神科医療では長い間、患者に対して管理的な服薬行動をすすめて患者の自律性を妨げてきたが、現在は患者の能動性を尊重し患者自らがアドヒアランスを重んじる傾向に変化してきている。また、精神科でプラシーボが使用されるのは経験上、訴えがあいまいで治療が必要なくても患者が投与を希望する場合や過剰に薬物に依存する場合などがある。このような背景がプラシーボ使用にどのように影響しているのか、実態はわかっていない。そこで、本研究では、まず精神科臨床におけるプラシーボ使用の実態と、投与の実態を担う医師・看護師の意識を把握したうえで、今後の望ましいあり方を検討することを目的に研究を進めている。本年度は研究分担者(小松,田中)が一般科を対象として作成した質問紙をもとに研究代表者・研究分担者で打ち合わせ会議を開催し、精神科医療向けに修正を加えた医師および看護師対象の質問紙を作成した。その上で、本研究は本学の生命倫理委員会にて倫理審査を受け、承認を受けた。現在は医療者に対する(医師・看護師)質問紙による全国調査の実施に向けて、準備をすすめている。本年度は質問紙を看護師・医師ともに配布し、全国調査を実施した。看護師の収集は終わり、分析もほぼ終了している。医師に関しては、文具をつけることやプライバシー保持を約束し、個人に対して郵送したものの、回収は約200程度にとどまった。医師の結果回収に時間をとられたため、少し分析が遅れている。その上で本学の生命倫理委員会にて倫理審査を受け、承認を受けた。パイロット・スタディを実施する予定であったが、本研究は倫理的問題を取り扱い、一部の対象者のみの実施では個人が特定される恐れがあり、個人情報保護等を遵守できない可能性もあるため、全国調査の実施に着手することにした。そして、発送準備として、アルバイトを雇用し、インターネットで都道府県別、規模別にて精神科病院リストを作成した。また、回収率を上げるため、研究対象者に対し、文具程度の謝礼を予定し、購入した。現在は、全国調査の実施に向けて準備をすすめ、発送段階まできている。進捗状況はおおむね従来の計画通りに進んでいる。今後は医師の調査結果の分析を実施し、看護師の調査結果と合わせて、精神科医療におけるプラシーボの使用実態、倫理的問題に関する意識等を中心に分析を実施する。医師からの調査票の自由記載には、プラシーボに関わる意見が多くみられ、多くの医師は倫理的な葛藤を抱えている様子のため、量的分析に加えて、質的分析も実施していく予定である。そして、その結果を学会、シンポジウムを通じて、発表、報告することで多くの方の意見を聴き、プラシーボの適切な使用方法について検討していきたい。今後は医師・看護師に対しての質問紙による全国調査を実施していく予定である。
ゼータ関数と超幾何関数

ゼータ関数の対称性を表す、関数等式を、超幾何関数係数のモジュラー関係式を通して研究するという当初の目標は、科学研究費補助金のおかげで大部分達成することができ、次なる段階である、より広いクラスの関数の係数をもつモジュラー関係式を通して、リーマン、アイゼンシュタイン以来160年間に渡って研究されてきた、ゼータ関数の理論の21世紀的超克という段階に至ることが可能になりました。本年度は、過去2年間の研究を、近隣分野、特に、物理、化学の問題への応用という試みにいくつか成功致しました。対象の基本的な構造は、結晶であり、結晶のエネルギーを表す量である、マーデルング定数等が数論的にゼータ関数を通して解明できれば非常に興味深いものであります。今年度出版された論文の内の3編におきまして、格子に付随するエプシュタインゼータ関数の特殊値を、関数等式に同値なモジュラー関係式の同値な表現である、ベッセル級数表示、不完全ガンマ級数表示を用いて表すことにより、過去のあらゆる結果を明確に同定することに成功いたしました。とくに、物理で古くから、イーワルド展開として知られており、テラスによって再発見された、ベッセル級数表示、また、ロシア学派、とくにラブリックによって60年代に展開された不完全ガンマ級数表示の2つは、現在展開中の新研究において重要な例として、進路を導いてくれるものと期待しております。また、これまで行なってきた、2乗平均に関する研究においても、ディリクレL-関数の2乗平均を、ディガンマ関数のそれと捕らえ、特殊関数としての性質をフルに用いることにより、2乗平均の完全解明を致しました。この方面の研究は、継続しており、既に、フルウィッツゼータ関数の一般化である、レルヒゼータ関数の2乗平均の完全解明へと進展しております。フルウィッツゼータ関数については、これまで、リーマンゼータ関数の場合に行なってきた、部分和の積分表示から、あらゆる情報を引き出すという研究を完成致しました。これにより、ゼータレギュラリゼーション等で用いられる、根拠の定かでない多くの公式を厳密に定式化することが可能になりました。この研究は、レルヒゼータ関数等の場合への一般化が進展しております。また、近畿大学理工学部において、ゼータ関数、トポロジー、量子物理学の国際シンポジュームを共催いたしました、その報告集を出版致します。この会が機縁となりまして、平成16年5月には、量子計算の国際シンポジュームを共催し、その報告集を出版予定であります。

ゼータ関数に対する,モジュラー関係式を貫く微分積分のルートが存在することを予想して以来,個々のゼータ関数へこの原理を実際に適用している段階である.これまでの研究では,すべて,関数等式が主になっていたところを,ボホナーによる,「モジュラー関係式」を中心に据えることにより,複雑な計算をしなければ分からなかったラマヌジャンのタイプの公式などが,非常に簡明な計算で,しかも,何を計算すればよいか明らかに分かるようになった.すなわち,ガンマ因子が一個の場合には,モジュラー関係式を「微分」することによって,保型形式(の変換公式)がえられ,したがって,関数等式をみたすゼータ関数から保型形式をつくりだすことができ,逆に,保型形式(の変換公式)を「積分」することによって,モジュラー関係式,したがって,関数等式をみたすゼータ函数がえられるという,ヘッケ理論の中身を端的に表す原理がなりたつ.つまり,これまで,保型形式には,モジュラー群が作用すると考えていたところを,単に,正の実軸の掛算の群構造からある程度計算でき,附随するゼータ関数がよく分かるようになった.さらに,この原理により,モジュラー関係式を「積分」することによって,不完全ガンマ関数係数級数表示を経由して,臨界領域でなりたつ唯一の公式である,リーマン-ジーゲル公式に至ることができるものと期待している.この方法が如何に本質をついたものであるかは,既に出版済みの「rapidly convergent series」のタイトルをもつ論文2編および,「Ramanujan's formaula and modular forms」において,この原理により,数10編の論文がこの3篇の論文にまとまってしまっていることからも分かる.また,「divisor problem」,「mean value theorem」の論文は,この原理発見以前の研究であり,これらもやはり,「モジュラー関係式」原理から得られることが分かり,現在論文にまとめている.「Bessel series」の論文は,結晶格子のマーデルング定数のこれまでの研究を「ゼータ対称性」の観点からまとめるシリーズの最初のものである.また,(合流型)超幾何関数表示を導入し,これまで,ベッセル関数の範囲で考察されていた,級数表示の新局面-たとえば関数等式が,超幾何関数の変換公式から出てくる-等の新局面,いわば,21世紀の数論的特殊関数の応用を多方面に渡って研究している.ゼータ関数を通して自然現象を研究すると言う方向は同じであり,とくに,函数等式という,データの対称性を表す,ゼータ関数の性質に同値なモジュラー関係式を通して係数の性質,ゼータ関数値の具体的な表示を求める研究を継続して行ないました.2003年度は,いよいよ,その一端として,格子和に附随するマーデルング定数について,その値を,ヘッケ型の函数等式をみたすエプシュタインゼータ函数の特殊値とみなすことにより,これまで,天下り的に与えられて来た,塩化セシウムのマーデルング定数等を食塩のそれのデュアルとみなし,その漸化式を求める研究をおこない,J. Phys. A : Math. Gen.に掲載されました(ここでは,ベッセル函数が現れます).この研究の発展板が既にあり,2003年に近畿大学理工学部で開催された,国際シンポジュームで発表後,報告集に投稿済です(こちらには,主題である超幾何函数が現れます).また,より整数論的な方向で,多重フルウィッツゼータ函数の有理点における値の急収束級数表示を求め,計算に乗る形に致しました.ジーゲル零点の検証に使えるのではないかと期待しております.今年度は,以前から行なっていた,解析数論的な方向での結果が立続けに出ました.一つは,クルースターマン和の計算,今一つは,イデアル函数の漸近式でありました.また,フルウィッツゼータ函数値を係数にもつベキ級数を閉じた形で求めるという研究の一端をJ. Appl. Comput. Math.誌に発表致しました.
口腔扁平上皮癌とそ気前癌病変におけるヒトパピローマウイルスの関与

1口腔扁平上皮癌と発癌の関連を検索する基礎として、正常口腔粘膜におけるヒトパピローマウイルス(HPV)の存在頻度について検討した。北海道大学歯学部附属病院口腔外科を受診した患者のなかで、臨床的に口腔粘膜に異常を認めなかった56例の擦過材料よりDNAを抽出し、ユニバーサルプライマーを用いたPCRで良性型(HPV6、11)、悪性型(HPV16、18、31、33、52b、58)について検索したところ、HPV6型1例、HPV16型1例が検出された。このような結果は正常口腔粘膜でのHPV感染はまれであることを示唆するものであった。2 79例の口腔扁平上皮癌を対象にPCRとDot blot hybridizationを用いて、HPV DNAの存在について検討した。その結果、HPV DNAは79例中24例(30.4%)に検出され、HPV16型が23例、HPV16.18型混合が1例で、口腔扁平上皮癌ではHPV16型が高頻度に認められることが明らかになった。3リンパ節転移を生じた20例について原発巣と転移リンパ節でのHPV DNAの存在について検討した。20例中5例の原発巣でHPV DNAが検出され、これらはHPV16型4例、HPV16・18型1例であり、転移リンパ節でも同一のHPV DNAが検出された。4 16例の口腔扁平上皮癌新鮮材料からDNAを抽出し、PCRによるHPV DNAの検出とPCR-SSCPによる癌抑制遺伝子p53のmutationの有無について検索を行った。HPV DNAは16例中8例に検出され、p53は16例中4例でmutationが確認された。検出されたHPVは全てが16型であり、p53はexon5(1例)、exon7(2例)、exon8(1例)でmutationを生じていた。このうち2例はHPV DNAとp53のmutationが同時に確認され、口腔扁平上皮癌の発生の多様性を示すものと思われた。77例の口腔扁平上皮癌を対象に、PCRとDot blot hybridizationを施行し、HPV DNAの存在について検索した。77例中22例(28.6%)にHPVDNAが検出され、HPV16型が21例、HPV16・18混合型が1例で、口腔扁平上皮癌の発生にはHPV16型が高頻度に認められることが明らかになった。部位別では、舌(9/32,28.1%)、歯肉(4/15,26.7%)、口底(2/11,18.2%)、上顎(3/7,43%)、〓(2/5,40%)、口蓋(2/4,50%)、臼〓部(0/2,0%)、口唇(0/1,0%)で、口底癌でHPV DNAの検出頻度が少い傾向を示した。更に、リンパ節転移を生じた15例について、原発巣と転〓巣でのHPV DNAの存在について検討した。15例中4例は原発巣でHPV DNA陽性(HPV16i3例,HPV16-18,1例)であったが、これらの症例では転〓リンパ節でも同一の型のHPV DNAが検出された。このような所見は、口腔扁平上皮癌ではHPV DNAが細胞DNAに組み込まれた状態で存在していることを示唆するものと思われた。

舌扁平上皮癌を対象にHPV DNAの分布をIn situ hybridizationにより検索し、同時にDNA polymeruse〓のassociate proteinであるPCNAの発現を免疫組織学的に検索した。その結果、HPV16DNAは基底細胞に類似した形態の腫瘍細胞に存在し、角質変性を示す腫瘍細胞にはhybridized signalの減弱が認められ、このような細胞の分布はPCNA陽性細胞の分布とほぼ一致していた。これらの所見はHPV DNAによる細胞の不死化作用との密接な関連を示しているものと思われた。正常口腔粘膜でのHPVの存在頻度をユニバーサル・プライマーを用いたPCRで検索した。56例中2例にHPV DNAが検出され、1例はHPV6型、他の1例はHPV16型であった。このような所見は、HPV DNAは正常粘膜上皮に存在することは極めて稀であり、口腔癌患者では比較的高率に見出されることから、HPVの潜在感染患者では上皮性腫瘍の発現の潜在的危険因子となることが示唆された。1.口腔扁平上皮癌と発癌の関連を検索する基礎として、正常口腔粘膜におけるヒトパピローマウイルス(HPV)の存在頻度について検討した。北海道大学歯学部附属病院口腔外科を受診した患者のなかで、臨床的に口腔粘膜に異常を認めなかった56例の擦過材料によりDNAを抽出し、ユニバーサルプライマーを用いたPCRで良性型(HPV6.11)、悪性型(HPV16、18、31、33、52b、58)について検索したところ、HPV6型1例、HPV16型1例が検出された。このような結果は正常口腔粘膜でのHPV感染はまれであることを示唆するものであった。2.77例の口腔扁平上皮癌を対象にPCRとDot blot hybridizationを用いて、HPV DNAの存在について検討した。その結果、HPV DNAは77例中22例(28.6%)に検出され、HPV16型が21例、HPV16.18型混合が1例で、口腔扁平上皮癌ではHPV16型が高頻度に認められることが明らかになった。3.リンパ節転移を生じた20例について原発巣と転移リンパ節でのHPV DNAの存在について検討した。20例中5例の原発巣でHPV DNAが検出され、これらはHPV16型4例、HPV16・18型1例であり、転移リンパ節でも同一のHPV DNAが検出された。4.19例の口腔扁平上皮癌新鮮材料からDNAを抽出し、PCRによるHPV DNAの検出とPCR-SSCPによる癌抑制遺伝子p53のmutationの有無について検索を行った。HPV DNAは19例中8例に検出され、p53は19例中5例でmutationが確認された。検出されたHPVは全てが16型であり、p53はexon5(1例)、exon7(2例)、exon8(2例)でmutationを生じていた。このうち2例はHPV.DNAとp53のmutationが同時に確認され、口腔扁平上皮癌の発生原因の多様性と関連するものと思われた。
ゼブラフィッシュを用いた9p21に存在するヒト疾患に関連する機能多型の同定

ヒトの9p21領域にある疾患関連SNPsのから真の病因となっている多型を同定することを目的に、ゼブラフィッシュを用いたエンハンサー解析を行った。対象の疾患としては緑内障を選んだ。緑内障はありふれた病気であり誰もが罹患する可能性を持つことに加え、目はヒトとゼブラフィッシュ間で高度に保存されていると考えたためである。ゲノムワイドな関連解析の結果を集めたサイトであるGWASCatalogを利用して緑内障と関連する一塩基多型(SNP)からヒトの9p21領域にあるものをリスト化し、それらと連鎖不平衡にあるSNPを全て抜き出した。これらのうち、ノンコーディング領域にあるものに関してエンハンサー活性解析をゼブラフィッシュにより行った。エンハンサー活性の解析のために、SNPを中心に約500塩基対をPCRにより増幅し、レポーターコンストラクトにクローニングした。リストから選んだ16のSNPs領域をクローニングし、これを1細胞期のゼブラフィッシュにマイクロインジェクションし解析した。その結果、いずれのコンストラクトにおいてもGFPのシグナルが得られたが、目において発現があったのは7つであった。そのうち3つのSNPコンストラクトについて独立した8つのF1世代を作成し、GFPの発現パターンを解析した。得られたF1世代での発現パターンは残念ながら、G0で見られたものとは大きく異なっていた。加えて、同じコンストラクトでもF1間で発現パターンが大きく異なっていた。恐らく、今回解析したエンハンサーは弱いエンハンサーでありレポーターコンストラクトが挿入されたゲノム周辺の内在性のエンハンサーの影響を大きく受けた結果エンハンサートラップと同様に挿入部位特異的な発現パターンになってしまったと考えている。平成30年度の活動により、ヒトの疾患関連SNPsを含む領域のエンハンサー活性に関してゼブラフィッシュを用いて解析するための実験系の確立に成功したと考えている。エンハンサー解析のための発現解析用コンストラクトをマウスのc-fosミニマムプロモーターとTol2トランスポゾンシステムを利用して構築した。このコンストラクトに、これまでに脊索での発現を誘導することが知られるヒトエンハンサーをつないだ場合には、ゼブラフィッシュの脊索においてGFPのシグナルを観察した。逆に、ネガティヴコントロールとしてヒトエンハンサーをつないでいないコンストラクトをインジェクションした場合には、ゼブラフィッシュにおいてGFPのシグナルが観察されなかった。このコンストラクトにヒトのエンハンサー候補領域をつないだところ、コンストラクトをインジェクションしたゼブラフィッシュでGFPのシグナルが観察された。そのうちのいくつかは期待どおりGFPのシグナルが目において観察された。このことから、私の作成したコンストラクトはゼブラフィッシュでヒトのゲノム領域のエンハンサーのスクリーニングに使えると結論づけた。今後はG0世代でのゼブラフィッシュを用いたエンハンサー解析を行っていく。これにより、スクリーニングの効率化が見込まれ、より多くの候補領域についてエンハンサーとしての活性を評価することが可能になる。当初の計画では同じコンストラクトで複数の独立したGFP系統を作成する予定であった。しかし、同じコンストラクトを持つF1においても様々なパターンのGFPシグナルが観察された。このことは、今回の解析の対象となるようなありふれた病気に関わるエンハンサーの多くは弱いエンハンサーであり、レポーターコンストラクトが挿入されたゲノム周辺の内在性のエンハンサーの影響を大きく受けることを意味している。このことから、今回のエンハンサー解析ではG0世代でのスクリーニングがより適していることがわかった。また、今後はスクリーニングでGFPシグナルをドライブできたエンハンサー領域が本当にヒトでエンハンサーとして働いているか否かをヒトの培養細胞を用いた解析を行っていく。

エンハンサー解析のための発現解析用コンストラクトをマウスのc-fosミニマムプロモーターとTol2トランスポゾンシステムを利用して構築した。このコンストラクトに、これまでに脊索での発現を誘導することが知られるヒトエンハンサーをつないだ場合には、ゼブラフィッシュの脊索においてGFPのシグナルを観察した。逆に、ネガティヴコントロールとしてヒトエンハンサーをつないでいないコンストラクトをインジェクションした場合には、ゼブラフィッシュにおいてGFPのシグナルが観察されなかった。このコンストラクトにヒトのエンハンサー候補領域をつないだところ、コンストラクトをインジェクションしたゼブラフィッシュでGFPのシグナルが観察された。そのうちのいくつかは期待どおりGFPのシグナルが目において観察された。このことから、私の作成したコンストラクトはゼブラフィッシュでヒトのゲノム領域のエンハンサーのスクリーニングに使えると結論づけた。今後はG0世代でのゼブラフィッシュを用いたエンハンサー解析を行っていく。これにより、スクリーニングの効率化が見込まれ、より多くの候補領域についてエンハンサーとしての活性を評価することが可能になる。当初の計画では同じコンストラクトで複数の独立したGFP系統を作成する予定であった。しかし、同じコンストラクトを持つF1においても様々なパターンのGFPシグナルが観察された。このことは、今回の解析の対象となるようなありふれた病気に関わるエンハンサーの多くは弱いエンハンサーであり、レポーターコンストラクトが挿入されたゲノム周辺の内在性のエンハンサーの影響を大きく受けることを意味している。このことから、今回のエンハンサー解析ではG0世代でのスクリーニングがより適していることがわかった。また、今後はスクリーニングでGFPシグナルをドライブできたエンハンサー領域が本当にヒトでエンハンサーとして働いているか否かをヒトの培養細胞を用いた解析を行っていく。
蚊唾液腺抽出物に対する重症蚊アレルギー患者のリンパ球反応とその抗原の同定

現在、我々の研究対象である「蚊刺過敏症」は、アレルギー、感染症、腫瘍の3疾患にまたがり、CD 4陽性冊細胞(Th細胞)が大きく関わった疾患であるが、さらに、高IgE抗体を示すことより、Th 2優位疾患と考えられる。一方、自己免疫疾患や、感染症、皮膚科領域では尋常性乾癬など様々な炎症性疾患で発現が亢進していると報告があがっているIL-17は、Th 17細胞が産生すると考えられているが、IFN-γ産生亢進疾患に上昇するという報告されており、主にTh1優位疾患と考えることができる。そこで、我々は、Th 1優位疾患の代表である尋常性乾癬患者と、Th 2優位疾患の代表であるアトピー性皮膚炎患者の細胞内サイトカイン産生をみることにより、IL-17の動態を見極め、果たしてTh1優位疾患にのみ相関がみられるのか、他のサイトカインからの制御を受けないのかなど既知の検討および新しい知見を導き出そうとしている。さらに、Th1優位疾患およびTh2優位疾患での有意差がみられた場合、一般にTh 2疾患と考えられる「蚊刺過敏症」が、実はNK 1細胞としての性格、すなわちIFN-γ産生亢進をもち、Th 1としての顔も持ち合わせていることより、ここでのIL-17の産生が亢進しているか否かでTh 1およびTh 2にからむTh 17の役割や存在意義への解明の糸口を見いだすことを目的としている。以上の目的を達成すべく、現在尋常性乾癬患者、アトピー性皮膚炎患者、正常人の3グループのIL-17を含む細胞内サイトカインのデータを蓄積している段階である。これまでに、蚊アレルギー、EBウィルス感染、NK(ナチュラルキラー)細胞増多症を3主徴とするHMB-EBV-NK disease (HEN病)が提唱されてきた。これまでの研究で、蚊唾液腺抽出物に対し患者末梢血リンパ球のうちCD4陽性T細胞がCD56陽性NK細胞の存在下で強く反応する事が見いだされている。しかし、どのような機序でCD56陽性NK細胞がCD4陽性T細胞の反応亢進を促しているか、蚊の唾液腺のどの成分に対して強く反応しているかなど不明な点も多い。次に、正常人と比較しCD4陽性細胞数、CD56陽性細胞数、CD94陽性細胞数の割合をみていき、CD56、CD94陽性細胞であるNK細胞が優位に増加していることを確認した。これによってHEN病での3主徴の一つであるNK増多症を確認した。そのうえで、細胞内サイトカインであるIL-4、IL-5、IFN-γの産生をみることで、蚊の唾液腺と患者末梢血リンパ球反応させることによりどのような機序でCD4陽性細胞およびCD56陽性細胞が関わりあっているのかを検討している。
膵管内乳頭粘液性腫瘍における分化誘導関連遺伝子の発現解析

手術で得られた膵切除標本(膵管内乳頭粘液性腫瘍=IPMN8症例、IPMN以外2症例、計10症例)のパラフィン固定標本にて、免疫組織学的検討を行った。第一抗体として抗MUC1抗体(clone Ma695,clone 1.10.F3,clone Ma552),抗MUC2抗体(clone Ccp58),抗MUC5AC抗体(clone CLH2),抗MUC6(clone CLH5)抗体、抗CDX1抗体(PAB-10468)、抗CDX2抗体(PAB-10469)、抗Sox2抗体(SC-17320)、抗PDX-1抗体(SC25403)、抗Notch抗体(SC23304)、抗SHH抗体(SC9024)を使用し、4°Cオーバーナイトで反応させた。第一抗体に対応したビオチン結合第二抗体と室温で30分間反応させた洗浄後HRP標識アビジンと室温で30分間反応させた。正常膵では、intralobular ductsにおける3種の抗体に対するMUC1免疫活性の発現は、膵管上皮細胞の内腔側の細胞表面に限局していた。一方、非浸潤性IPMNでは、MUC1免疫活性は細胞表面に限局しているか、全体に陰性であった。浸潤性IPMNではMa695抗体で強いMUC1免疫活性が認められた。MUC5AC免疫活性は全てのIPMN病変で認められた。MUC2とMUC6の免疫活性の発現は、IPMNの亜分類(胃型・腸型・膵胆型)によって異なっていた。さらに、分化誘導に関与する遺伝子であるcdx1・cdx2・sox2・pdx-1・notch・hedgehogの蛋白免疫活性発現パターンを検討したところ、興味深い知見が得られた。標本試料を3%hydrogen peroxidase中で5分間incubateした。さらに非特異反応ブロッキング試薬(ダコX090930)で20分間ブロッキングした。第一抗体として抗MUC1抗体(clone Ma695,clone 1.10.F3,clone Ma552),抗MUC2抗体(clone Ccp58),抗MUC5AC抗体(clone CLH2),抗MUC6(clone CLH5)抗体を使用し、4°Cオーバーナイトで反応させた。第一抗体に対応したビオチン結合第二抗体と室温で30分間反応させた。洗浄後HRP標識アビジンと室温で30分間反応させた。さらに、抗CDX1抗体(PAB-10468)、抗CDX2抗体(PAB-10469)、抗Sox2抗体(SC-17320)、抗PDX-1抗体(SC25403)、抗Notch抗体(SC23304)、抗SHH抗体(SC9024)を用いて、分化誘導関連蛋白の発現について検討を加えているところである。

手術で得られた膵切除標本(膵管内乳頭粘液性腫瘍=IPMN8症例、IPMN以外2症例、計10症例)のパラフィン固定標本にて、免疫組織学的検討を行った。第一抗体として抗MUC1抗体(clone Ma695,clone1.10.F3,clone Ma552),抗MUC2抗体(clone Ccp58),抗MUC5AC抗体(clone CLH2),抗MUC6(clone CLH5)抗体、抗CDX1抗体(PAB-10468)、抗CDX2抗体(PAB-10469)、抗Sox2抗体(SC-17320)、抗PDX-1抗体(SC25403)、抗Notch抗体(SC23304)、抗SHH抗体(SC9024)を使用し、4°Cオーバーナイトで反応させた。第一抗体に対応したビオチン結合第二抗体と室温で30分間反応させた。洗浄後HRP標識アビジンと室温で30分間反応させた。正常膵では、intralobular ductsにおける3種の抗体に対するMUC1免疫活性の発現は、膵管上皮細胞の内腔側の細胞表面に限局していた。一方、非浸潤性IPMNでは、MUC1免疫活性は細胞表面に限局しているか、全体に陰性であった。浸潤性IPMNではMa695抗体で強いMUC1免疫活性が認められた。MUC5AC免疫活性は全てのIPMN病変で認められた。MUC2とMUC6の免疫活性の発現は、IPMNの亜分類(胃型・腸型・膵胆型)によって異なっていた。分化誘導関連蛋白の発現パターンに関する興味深い知見が得られた。
ウマに対する生体組織工学を用いた再生医学の応用検討

ウマの骨および関節軟骨疾患は発生が多く、治療も長期化することから影響は大きい。近年、骨および関節軟骨疾患の治癒促進に対して再生医学の一分野である生体組織工学の応用が期待されているが、ウマにおける検討は少なく、その効果には不明な点も多い。よって、本研究はウマの骨および軟骨疾患に対する再生医学の影響の検討を目的とした。前年度末に以下の4検討が完了した。1骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)、骨形成蛋白-2(BMP-2)ならびにゼラチンβ-TCPスポンジ(β-TCPスポンジ)の骨再生に対する影響の検討:これら3種の併用が最も効果的に骨再生を促進することが示された。2MSC誘導手技の一種であるsubchondral drilling、成長因子を多量に含むとされる多血小板血漿(PRP)の併用の関節軟骨再生に対する影響の検討:これらの併用は関節軟骨の再生を促進することが示された。3MSC、BMP-2、PRP、β-TCPスポンジの混合体(混合スポンジ)の適用による骨軟骨欠損再生に対する影響の検討:混合スポンジの適用は良好に骨軟骨欠損再生を促進することが示された。4離断性骨軟骨症デブリードマン処置後に生じる骨軟骨欠損再生に対する混合スポンジの影響の検討:骨軟骨欠損は良好に再生され、臨床例に対する有効性も示すことが可能であった。本年度はこれらの結果をまとめ、英文雑誌に発表することを実施した。上記の結果から、骨および関節軟骨再生に対する生体組織工学の適用の有効性が示された。今後は、骨再生に対してはさらに再生を促進する手技を発見すること、関節軟骨に対しては硝子軟骨性の組織による再生が起こる手技を発見することが必要であると考えられた。近年、正常細胞の存在が幹細胞の分化を促進するという報告がなされている(共培養法)。この共培養の応用により、骨の更なる再生促進、硝子軟骨の再生が期待された。本年度はこの共培養法による再生促進効果を検討するために、予備実験を進め、次年度以降の検討に備えた。申請時点の研究は2012年度に完了することができ、2013年度中にすべての結果を査読ありの英文雑誌に発表することができた。2013年度には2012年度中の研究で明らかとなった問題点の解決を目標とし、そのための予備実験を進めることが出来た。以上のことから、当初の計画以上に進展していると判断した。本年度に実施した研究より、骨および関節軟骨再生に対する生体組織工学の適用の有効性が示された。しかしながら、生体組織工学の適用は骨の再生を促進したものの、4か月間では完全な骨の再生には至らなかった。また、関節軟骨再生に対しては再生促進が示されたものの、関節軟骨の従来の構成成分である硝子軟骨による再生には至らなかった。今後は、骨再生に対してはさらに再生を促進する手技を発見すること、関節軟骨に対しては硝子軟骨性の組織による再生が起こる手技を発見することが必要であると考えられる。共培養法の応用はこの問題を解決する可能性が予備実験により示されたため、今後はこの方法の検討を実施する必要があると考えられた。以上のことから、本研究はウマの骨および軟骨疾患に対する再生医学の影響の検討を目的とした。本年は4検討を実施し、以下その概略を記載する。(1)は骨再生に対する検討、(2)(4)は関節軟骨再生に対する検討である。供試動物はいずれもサラブレッド種ウマを用いた。(1)骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)、骨形成蛋白-2(BMP-2)ならびにゼラチンβ-TCPスポンジ(β-TCPスポンジ)の骨再生に対する影響を検討した。本検討により、これら3種の併用が最も効果的に骨再生を促進することが示された。(2)MSC誘導手技の一種であるsubchondral drilling、成長因子を多量に含むとされる多血小板血漿(PRP)の併用の関節軟骨再生に対する影響を検討した。本検討により、これらの併用は関節軟骨の再生を促進することが示された。(3)MSC、BMP-2、PRP、β-TCPスポンジの混合体(混合スポンジ)の適用による、骨軟骨欠損再生に対する影響を検討した。本検討により、混合スポンジの適用は良好に骨軟骨欠損再生を促進することが示された。(4)離断性骨軟骨症デブリードマン処置後に生じる骨軟骨欠損再生に対する混合スポンジの影響を検討した。本検討により、骨軟骨欠損は良好に再生され、臨床例に対する有効性も示すことが可能であった。以上の研究により、骨欠損ならびに関節軟骨欠損に対して生体組織工学の適用は再生促進効果を示すことが確認された。また、(4)から臨床例に対する有効性も少ないながら示すことが可能であった。これらの結果から、今後は生体組織工学の適用がウマの骨および関節軟骨疾患に適用されることが期待された。1骨髄

由来間葉系幹細胞(MSC)、骨形成蛋白-2(BMP-2)ならびにゼラチンβ-TCPスポンジ(β-TCPスポンジ)の骨再生に対する影響の検討:これら3種の併用が最も効果的に骨再生を促進することが示された。2MSC誘導手技の一種であるsubchondral drilling、成長因子を多量に含むとされる多血小板血漿(PRP)の併用の関節軟骨再生に対する影響の検討:これらの併用は関節軟骨の再生を促進することが示された。3MSC、BMP-2、PRP、β-TCPスポンジの混合体(混合スポンジ)の適用による骨軟骨欠損再生に対する影響の検討:混合スポンジの適用は良好に骨軟骨欠損再生を促進することが示された。4離断性骨軟骨症デブリードマン処置後に生じる骨軟骨欠損再生に対する混合スポンジの影響の検討:骨軟骨欠損は良好に再生され、臨床例に対する有効性も示すことが可能であった。本年度はこれらの結果をまとめ、英文雑誌に発表することを実施した。上記の結果から、骨および関節軟骨再生に対する生体組織工学の適用の有効性が示された。今後は、骨再生に対してはさらに再生を促進する手技を発見すること、関節軟骨に対しては硝子軟骨性の組織による再生が起こる手技を発見することが必要であると考えられた。近年、正常細胞の存在が幹細胞の分化を促進するという報告がなされている(共培養法)。この共培養の応用により、骨の更なる再生促進、硝子軟骨の再生が期待された。本年度はこの共培養法による再生促進効果を検討するために、予備実験を進め、次年度以降の検討に備えた。骨再生に対する検討は当初の仮定通りの結果が得られ、関節軟骨再生に対する検討は一部仮定に反する部分もあったものの、おおむね良好な成績を得ることができた。また、当初の研究計画では2013年度に実施予定であった研究を2012年度内に完了することが可能であった。以上から、研究は当初の計画以上に進展していると評価をする。申請時点の研究は2012年度に完了することができ、2013年度中にすべての結果を査読ありの英文雑誌に発表することができた。2013年度には2012年度中の研究で明らかとなった問題点の解決を目標とし、そのための予備実験を進めることが出来た。以上のことから、当初の計画以上に進展していると判断した。本年度に実施した研究より、骨および関節軟骨再生に対する生体組織工学の適用の有効性が示された。しかしながら、生体組織工学の適用は骨の再生を促進したものの、4か月間では完全な骨の再生には至らなかった。また、関節軟骨再生に対しては再生促進が示されたものの、関節軟骨の従来の構成成分である硝子軟骨による再生には至らなかった。今後は、骨再生に対してはさらに再生を促進する手技を発見すること、関節軟骨に対しては硝子軟骨性の組織による再生が起こる手技を発見することが必要であると考えられる。共培養法の応用はこの問題を解決する可能性が予備実験により示されたため、今後はこの方法の検討を実施する必要があると考えられた。
感性コミュニケーションにおける顔の役割に関する心理学的研究

本研究は,コミュニケーションにおいて顔から読みとられるさまざま情報がどのような機能を果たしているかを多面的に検討することを目的としている。本年度は,(1)意図的に表出した喜怒哀楽等の表情について,表出者自身の評価と受け手の認識の分析,(2)意図的な情動表出に影響する要因の抽出,(3)表情,性別等の顔から読みとられる情報が受け手の対人行動(発話,表出)に及ぼす影響の3点について検討を進めている。(1)と(2)については,幸福,驚き,怒り,悲しみ,嫌悪,軽蔑,恐れ,中性の表情を意図的に表出して,表出者自身がカメラで撮影する課題を,自分のみで撮影する,他者が見ている状況で撮影する,という2つの条件下で行った。表出者数は男女各20名である。評定者は,各表出者について16枚の写真を10種類の評定尺度で評定した(計24名)。尺度は,7種の感情語および好悪,話しかけやすさ,日常みかける頻度であった。評定値を男女別にまとめて分析したところ,一部を除いて意図した情動尺度の評定値がもっとも高いことが分かった。しかし表出の程度については,情動の種類によって違いがあり,幸福や驚き,怒りのように明確に他の情動と区別して表出される情動と,悲しみ,嫌悪,恐れ,軽蔑のように他の情動と混同されやすい情動があることが分かった。また,表出のしやすい情動が男女によって異なること,自分のみで表出する場合のほうが他者が見ている状況よりも表出がしやすいことも分かった。(3)では,表情や性別の異なる顔写真を対話相手とみたてて,質問,勧誘,謝罪,抗議という4種の状況で話かける課題を行い,発話開始までの反応時間を従属変数として,顔に含まれる情報がその個人に対する「話しかけやすさ」にどのように影響するかを検討した。現在までの結果から,話者は顔に含まれる情報を手がかりに発話行動を調整していることが示されている。
中国・台湾諸都市における建築コンバージョンの実態調査及びデザイン手法と都市的背景

時代の変化と共に都市構造が変化することによって生じる建築コンバージョンは、一般的に欧米に盛んとされていたが、これまでの研究で隣国中国の上海において多数の事例を確認していた。本研究は、都市の更新技術として近年重要な意味を持ちつつある建築コンバージョン(用途変更を主とした建築改修)について、高度経済成長を迎え都市構造に急激な変化が生じている中国・台湾を対象に研究するものである。初年度は中国および台湾における建築コンバージョンの実態把握を行なうため、文献調査および現地調査を主として実施した。事前の文献調査では、中国に関しては、中国国内で出版されている建築雑誌「建築学報」の1990年以降に出版されたものを中心として調査し、また台湾に関しては台湾国内で出版されている建築雑誌「建築師」の1990年以降に出版されたものを中心に調査した。これによって多くの事例が確認された都市として、中国の北京、唐山、天津、上海、西安など、また台湾の台北、金瓜石、新竹、台中、台南、高雄などが挙げられることが分かった。その成果を受けて、9月25日10月8日にかけて中国のこれらの都市を、10月31日11月6日にかけて台湾のこれらの都市を対象に現地調査を実施し、建築コンバージョン事例の写真や図面資料、また現地でのみ入手可能な文献資料など、貴重な研究資料の収集に成功した。そして、現地で収集した資料により、さらに多くの建築コンバージョン事例を発見することができ、次年度の補足調査での内容を充実させることができた。今年度の調査研究の内容の一部は、平成26年度建築学会大会学術講演会に7編の梗概としてまとめ、うち1編を口頭発表する予定である。最終年度である本年度は、初年度の補足調査と調査対象都市と事例との関係を考察し、研究をまとめる計画であった。補足調査では、現地調査に先立ち行なった文献調査により、予想を大きく上回る多数のコンバージョン建築事例が発見された。中国の調査では、北京、天津、上海、無錫、重慶の調査を実施した。天津を除くそれぞれの都市においては、2事例から8事例が対象であったが、天津においては100事例を超えるコンバージョン建築を対象とする膨大な調査となった。これらの事例に関して、一部実測や詳細写真の撮影、現地でのみ入手可能な資料を獲得するなどを通じて、十分な調査成果が得られた。台湾の調査では、初年度に実施した調査が主要都市の集中する台湾島西側だったため、それを補足する形で、台湾島東側の花蓮や南端の屏東に集中して立地したコンバージョン建築の調査を実施した。西側の諸都市と同じく、日本統治時代の既存建築を転用した事例が多かったが、地区や街区といった面的な事例集中の傾向が見られた。今後は現地の大学や史料館との連携も視野に入れている。当初の計画では、最終年度である2年目には、補足調査を実施して調査の成果をまとめ、都市的背景との関連について研究論文の執筆を行なう事としていたが、研究を進める過程で、当初想定していた対象都市おいて想像を超える事例数のコンバージョン建築が発見され、また中国の無錫や台湾の花蓮など、その他の都市においても多くの事例が存在することが判明したため、全体像の把握を優先せざるを得ない状況となり、それらに関する追加調査が年度全体に渡って追加されることとなった。結果として研究の進度が遅れてしまったが、当初計画していた都市の数、事例の量において共に大きく上回るデータベースの構築に成功した。現在、これらの成果をもとに、都市的背景との関係に関する分析を進めている。26年度が最終年度であるため、記入しない。建築歴史意匠26年度が最終年度であるため、記入しない。事前に示していた研究計画では、初年度の内容として中国、台湾両国に存在する建築コンバージョン事例の把握と実態調査を行ない、また現地でのみ入手可能な文献資料を入手することであった。当初の計画どおり研究を遂行することができ、また次年度への追加調査の課題を発見することもできた。次年度は、追加となる補足調査を行ないつつ、当該研究の最も重要な視点である都市的背景との関連について考察を深めたい。最終年度である次年度の研究計画は、初年度の調査によって更なる調査が必要と判断された内容に関する補足的な追加調査を実施する第1段階と、これまでの成果の取りまとめに移る第2段階とからなる。第1段階では、初年度の調査により明らかとなった、中国における重要な建築コンバージョン事例が確認されている天津、重慶、南京を対象として追加調査を行なう必要がある。特に天津は、初年度に調査を行った上海と同じように欧米列強や日本による租界地であったため、上海との比較という意味でも非常に興味深く、本研究に対して重要な視点が生じる期待がある。また台湾は、初年度の調査が主に大きな都市が集中する台湾島の西側の調査であったため、次年度では残された台湾島東側の郊外地区に複数存在する事例の調査を実施する。台湾はエリアによって歴史的変遷が大きく異なるため、それら都市の推移と建築コンバージョンの関係についても調査を行う。第2段階では、この調査研究を通して得られた資料をもとにデータベースを構築し、中国・台湾の建築コンバージョンの概要および実態調査結果を一覧化する。そして、都市構造の変化により生み出される建築コンバージョンという現象を、そのデザイン手法と都市的背景から考察を行なう。そしてこれらの成果は、論文などの形にまとめ、学術誌等に発表する。
生体分子セルフアセンブリを利用した新規タンパク質複合ナノデバイスの構築

本研究では、タンパク質の配向性をナノスケールで制御可能にする新しい修飾法に焦点を当てて、研究を推し進めてきた。前年度において、ストレプトアビジン(Stav)のC末端側にLPETG配列を付与した組み換えタンパク質を発現精製し、Sortase Aの反応機構を利用することで、Stavと目的タンパク質との複合体を形成することに成功した。また、Stavが元来もっビオチンとの強固な親和性を利用することで、Stavをタンパク質固定化の足場と考え、2種類のタンパク質を同時に固定化する手法の開発にも成功した。該当年度においては、本技術を応用し、エンドグルカナーゼおよびβ-グルコシダーゼの2種類のセルラーゼを同時固定化することで、セルロースを高効率に分解できる固定化酵素の調製を試みた。Stavを足場とすることで、一つの粒子に2種類のセルラーゼを同時に固定化することに成功した。調製した粒子は、別々の粒子にそれぞれのセルラーゼを固定化した場合に比べて、効率よくセルロース(リン酸処理したもの)を分解することができた。上記研究内容と同時にバイオ燃料電池に関する研究も進行してきた。具体的には、デンプンを分解する酵素であるα-アミラーゼおよびグルコアミラーゼ、さらに、グルコース酸化酵素を電極に同時に固定化することにより、デンプンを直接燃料とできる新規バイオアノードの開発を行った。また、電池性能の向上を目的として、グルコースを複数の酵素で多段階酸化できる電極の開発を行った。具体的には、電極上にグルコース脱水素酵素、グルコン酸脱水素酵素およびジアフォラーゼを固定化することで、グルコース1分子あたり4つの電子を取り出すことのできる電極を作製し、電池として組み立てた際、グルコース脱水素酵素およびジアフォラーゼを固定化した従来の電極と比較して、最大で約1.6倍の電力を取り出すことに成功した。(抄録なし)本研究では、タンパク質の配向性をナノスケールで制御可能にする新しい修飾法に焦点を当てて、研究を推し進めてきた。具体的には、Sortase A (SrtA)と呼ばれるタンパク質連結酵素を用いて、部位特異的にタンパク質を連結する手法の開発・応用を行ってきた。SrtAはL,PETGから成る特定のアミノ酸配列を認識し、グリシンの繰り返し配列からなるアミノ酸配列のN末端を連結することから、これらの二種の配列をタンパク質上に介在させることで目的タンパク質をつなぎ合わすことができる。当該年度において、ストレプトアビジン(Stav)のC末端側にLPETG配列を付与した組み換えタンパク質を発現精製し、前述のSrtAの反応機構を利用することで、Stavと目的タンパク質との複合体を形成することに成功した。また、Stavが元来もつビオチンとの強固な親和性を利用することで、Stavをタンパク質固定化の足場と考え、2種類のタンパク質を同時に固定化する手法の開発にも成功した。具体的には、緑色および赤色蛍光タンパク質の同時固定化に成功した。また、グルコース酸化酵素およびペルオキシダーゼを同時に微粒子表面に固定化することによって、溶液中のグルコースを検出できる機能性微粒子の開発に成功した。本研究では他に例がないでんぷんなどの多糖を燃料としたバイオ燃料電池の開発を目指した。デンプンを分解する酵素であるα-アミラーゼおよびグルコアミラーゼ、グルコース酸化酵素を電極に同時に固定化することにより、デンプンを直接燃料とできるバイオアノードの開発を行った。テトラチアフルバレンを電子メディエータとして、カーボンペースト電極上に3種類の酵素と同時に練り込むことによって、デンプンの糖化と酸化を同時に行う電極を開発した。実際に、モデル基質として、粉末状にした白米を燃料とすることで、開回路電圧:0.522V、最大電力密度:99.0μW cm^<-2>を達成することができた。