hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
土砂トレーサーを利用した土砂動態－地形変動過程の理解と予測

河床変動ー河岸侵食を伴う場における土砂トレーサー輸送の長期計算を実施した.その結果,河岸侵食により河道内に供給される土砂は,河道内に形成される砂州に大部分が取り込まれ,移動速度は極めて遅いことが明らかとなった.このような砂州上に堆積した土砂は,新たな河床変動が生じない限り下流に進行せず,河道内の河床変動の時間スケールが土砂の輸送過程に極めて重要であることを示した.昨年度までに構築した交換層モデルをベースとしたトレーサー輸送モデルに,新たに交換層以下の層とのトレーサー交換モデルを導入し,そのモデル性能について検討した.交換層モデルでは,河床変動が生じない限り,下層との土砂交換は生じず,下流側に輸送されるのみであるが,実際には土砂は交換層以下の土砂とも混合しながら,移流分散する.この土砂輸送過程をモデルに新たに導入し,室内実験結果と比較したところ,鉛直方向の土砂輸送を考慮した方が,実験結果を再現出来ることを明らかにした.一方で,砂州などにより動的に河床が変動する場合は,この影響は極めて小さくなることも明らかにした.また,これらトレーサー輸送モデルの構築と合わせて,河川上流域から下流域に至るまでの特徴的な河床形態を再現する予測モデルの構築を行った.上流域では,特に三次元的な反砂堆の形成や河川遷急点における河床変動モデル,また下流域においては流量変動を繰り返し受ける場における交互砂州の動態や混合粒径河床における砂州のモデル化に関する検討を行った.これらのモデルを用いて現地河川において測定されたトレーサー輸送過程との比較を実施し,その再現性と予測性能について予備的検討を実施した.当初予定していた河床変動や河岸侵食が卓越する場におけるトレーサー輸送の長期計算を実施し,トレーサーの輸送と河床変動過程の因果関係を示すことができた.また,交換層モデルを改良することで,より現実的なトレーサー移動分散過程を捉えるモデルを構築できた.さらに,流域における様々な特徴的な地形変動過程のモデル化について実施でき,現地スケールの土砂動態ー地形変化予測モデルの構築の予備的検討を十分に行えた.これまでに構築したモデルを現地河川における現象に適用し,最終的な大規模ー長期間の土砂輸送過程を理解予測するモデルを構築する.トレーサーの移流分散過程を再現するモデルについて明らかにするために,交換層の概念を導入した上で,掃流砂モデルとしてよく用いられるフラックス形式と連行形式の土砂保存則をベースとした土砂トレーサー輸送モデルの性能について検討した.両者を河床変動のない動的平衡状態を仮定した一次元場に適用することで,フラックスモデルではトレーサー粒子の流下方向分散を一切再現出来ないこと,連行形式モデルでは,土砂の堆積分布を表現するステップレングスの確率密度関数を通じて流下方向のトレーサーの分散を適切に表現出来ることを明らかにした.一方で,両モデルを顕著な動的河床形態である自由砂州が存在する場に適用したところ,巨視的にはどちらも同程度の流下方向分散を示すことが明らかとなった.これは形状や移動速度にある程度のランダム性を持つ自由砂州が,土砂トレーサーを分散させる作用を持っており,かつこの河床形態による分散作用が粒子運動固有のランダム性であるステップレングスのばらつきに起因する分散作用よりもかなり大きいためである.この検討より,顕著な河床変動がある場合にはどちらのモデルを用いてもトレーサーの移流分散を表現出来ることが明らかとなった.上記で構築したフラックス形式のトレーサーモデルと,河岸侵食を伴う流路変動に適用した.実験では,河岸から供給される土砂を着色しており,トレーサーの移動・分散作用を可視化している.計算結果は,河床変動,河岸侵食,流路変動の相互作用をよく再現出来るだけでなく,それに伴う土砂トレーサーの分布まで定性的に再現出来ることが明らかとなった.特に,固定砂州のような静的な河床形態が存在する場合,トレーサーは砂州に取り込まれることで長時間河床に停止し,流路変動等の大規模な地形変動に伴いゆっくりと下流に移動分散することがわかった.初年度で当初計画していた,土砂トレーサーの移流分散モデルの構築とその基本的特性を明らかにすることができた.また,構築したモデルを室内実験に適用することで,その予測可能性を示すことができた.さらに,同時並行して河川における河床変動をより合理的に表現可能な数値モデルの構築も実施しており,次年度以降,このモデルをトレーサーモデルと結合し,大規模河床変動現象に適用する準備を整えることができた.河床変動ー河岸侵食を伴う場における土砂トレーサー輸送の長期計算を実施した.その結果,河岸侵食により河道内に供給される土砂は,河道内に形成される砂州に大部分が取り込まれ,移動速度は極めて遅いことが明らかとなった.このような砂州上に堆積した土砂は,新たな河床変動が生じない限り下流に進行せず,河道内の河床変動の時間スケールが土砂の輸送過程に極めて重要であることを示した.昨年度までに構築した交換層モデルをベースとしたトレーサー輸送モデルに,新たに交換層以下の層とのトレーサー交換モデルを導入し,そのモデル性能について検討した.交換層モデルでは,河床変動が生じない限り,下層との土砂交換は生じず,下流側に輸送されるのみであるが,実際には土砂は交換層以下の土砂とも混合しながら,移流分散する.この土砂輸送過程をモデルに新たに導入し,室内実験結果と比較したところ,鉛直方向の土砂輸送を考慮した方が,実験結果を再現出来ることを明らかにした.

一方で,砂州などにより動的に河床が変動する場合は,この影響は極めて小さくなることも明らかにした.また,これらトレーサー輸送モデルの構築と合わせて,河川上流域から下流域に至るまでの特徴的な河床形態を再現する予測モデルの構築を行った.上流域では,特に三次元的な反砂堆の形成や河川遷急点における河床変動モデル,また下流域においては流量変動を繰り返し受ける場における交互砂州の動態や混合粒径河床における砂州のモデル化に関する検討を行った.これらのモデルを用いて現地河川において測定されたトレーサー輸送過程との比較を実施し,その再現性と予測性能について予備的検討を実施した.当初予定していた河床変動や河岸侵食が卓越する場におけるトレーサー輸送の長期計算を実施し,トレーサーの輸送と河床変動過程の因果関係を示すことができた.また,交換層モデルを改良することで,より現実的なトレーサー移動分散過程を捉えるモデルを構築できた.さらに,流域における様々な特徴的な地形変動過程のモデル化について実施でき,現地スケールの土砂動態ー地形変化予測モデルの構築の予備的検討を十分に行えた.初年度に構築した河床変動モデル,並びに土砂トレーサーモデルをより複雑な場に適用することで,実河川におけるトレーサーの移動・分散に関する予測可能性をより明らかにする.また,モデルの検証をより厳密に行うための室内実験,理論的検討を行うことで,最終的に構築するモデルを多角的な視点で検証する.また,最終的に現地に適用することを念頭に,モデル河川における調査や基礎的検討を実施していく.これまでに構築したモデルを現地河川における現象に適用し,最終的な大規模ー長期間の土砂輸送過程を理解予測するモデルを構築する.初年度実施予定であった室内実験が,実験施設の稼働状況により実施が困難であった.数値計算モデルの検証という意味での実験については,既往の室内実験等で代替できたため,事業の進捗には支障はないが,この分を次年度に繰り越し,実施予定であった室内実験を進めていく.また,初年度に予定していた国際会議への参加については,初年度に得られた成果をまとめて次年度の複数の国際会議において発表予定であり,その旅費に使用する.昨年度実施した室内実験にかかるコストが予定よりも削減できたため,繰り越しが発生している.これと合わせて最終年度は,学会発表,論文発表等の研究成果の公表に使用する予定である.
強化学習仮説に基づく淡蒼球の役割について明らかにする研究

大脳基底核線条体の投射細胞には、ドーパミンD1受容体を持ち淡蒼球内節へ投射する直接路とドーパミンD2受容体をもち淡蒼球外節から視床下核を経て淡蒼球内節へ投射する間接路の異なる二つの経路が存在する。今回これらのドーパミン受容体をそれぞれの拮抗薬で阻害したときの動物の試行錯誤学習課題における影響を調べたところ、D1受容体拮抗薬の注入によって報酬の履歴を反映した適切な行動選択が障害された。一方、D2受容体の拮抗薬ではD1受容体拮抗薬の注入によって見られたような障害は現れなかった。このことから、淡蒼球内節には報酬履歴に基づいた行動選択に必要な情報が送られていることが示唆された。我々の研究室では運動を遂行する直前の待機期間に課題関連の活動を示す線条体の投射細胞の中に、多くの行動価値をコードしている細胞が存在することを報告した。しかしながらこれらの細胞が、待機期間以降(運動遂行期間および強化信号提示期間)の期間にどのような情報をコードするのかということに関しては、明らかではなかった。また、前回解析に用いた細胞に加えて、記録された細胞の中には運動遂行期間あるいは強化信号提示期間に、課題に関連した放電活動が現れるものも多く存在しており、これらの細胞がどのような情報をそれぞれの期間でコードしているのか、また待機期間に行動価値をコードしていた細胞との関係はどのようになっているのかということも明らかではなかった。今回これらのことを明らかにするため、すべての期間において細胞の放電活動を評価した。その結果、運動を遂行する直前の待機期間だけでなく、運動遂行期間および強化信号提示期間においても行動価値をコードしていると考えられる細胞群が存在することが解った。加えて、運動期間中には運動関連の情報(運動方向など)を、また強化信号提示期間においては強化信号に関連した情報をコードする細胞が多数見つかった。このことは、線条体内において、一試行遂行中にコードする情報が変化していくことを示唆している。待機期間・運動遂行期間・強化信号提示期間のどの期間においても行動価値をコードする細胞は観察されたが、運動遂行期間および強化信号提示期間に行動価値をコードする細胞群と、待機期間に行動価値をコードする細胞群とは、線条体の内部において別の細胞群であることが示唆された。待機期間に行動価値をコードする細胞群は、運動遂行期間および強化信号提示期間に行動価値をコードする細胞群より、線条体の吻側側(前交連より前側)により多く存在することが示唆された。このことは、線条体内部で行動価値情報のコードに対して時間的・空間的な特性が存在することを示唆している。この成果については、平成18年度の第29回日本神経科学大会で報告し、現在論文を執筆中である。我々は以前,試行錯誤学習課題遂行中のサルの線条体に,過去経験した数試行の結果に基づいた行動価値をコードする細胞が多数存在することを示した。この行動価値の情報が線条体に形成されるメカニズムとして,この細胞に対するドーパミンを介した報酬予測誤差情報の入力が重要であるという仮説が強化学習仮説の枠組みから提唱されている。この仮説を検証するため平成19年度の実験において,ドーパミンD1受容体の選択的阻害剤である薬物SCH23390を,課題遂行中のサルの線条体へ注入し,行動選択にどのような影響が表れるかを調べた。この結果,サルはいつまでも価値の高い行動を適切に選択することが困難になった。つまり,ドーパミンのD1受容体を介した情報が線条体に入力することが,この課題において,適切な行動選択発現をすることに必須であると示唆されたのである。この結果は,ドーパミンを介した報酬予測誤差情報が,線条体の細胞にD1受容体を経て伝わることが阻害され,線条体において適切な行動価値が形成されにくくなったことに原因があると我々は考えている。この知見は,線条体の強化学習仮説に基づいた役割について提唱されている前出の仮説を強く支持する重要な発見である。この結果に関しては,Neuro2007第30回日本神経科学大会で報告を行ない,現在論文を執筆中である。さらにわれわれは本年度,この線条体から投射を受け,かつ大脳基底核の最終出力を担う神経核である淡蒼球において神経活動の記録を行う予定をしている。この記録によって線条体から淡蒼球へ投射する行動価値の情報が,どのようにして淡蒼球で取捨選択を受け,行動選択が起こるのかが明らかになると考えている。

線条体の学習のモデルとして、行動選択の前に期待される将来の報酬と、行動選択後によって得られる報酬との差(報酬予測誤差)を使って、それぞれの選択肢の価値(行動価値)を更新し、最終的に期待される報酬が最大となるような行動を学習するという強化学習モデルが提唱されている(Sutton, R.and Barto, A. G. 1998)。線条体へ投射している中脳ドーパミン細胞が、この報酬予測誤差を反映した放電活動を示すことが報告され(Schultz W et.al., 1997)、この投射を受ける線条体では、多くの細胞が行動価値を反映した放電活動を示すことが報告されている(Samejima et.al., 2005)。行動価値の情報は、解剖学的な知見から線条体から淡蒼球へと送られていると考えられている。これらの線条体の細胞によってコードされている行動価値を使って、線条体以降でどのように行動選択が行われているのかについて明らかにすることが本研究課題の目的であった。この実験を遂行するためには、強化学習モデルで提唱されているように、行動価値の報酬予測誤差を使った更新と、強化学習モデルで説明される行動価値を利用した適切な行動選択に、ドーパミンを介した情報入力が重要であることを示しておく必要がある。本年度は線条体に対して、ドーパミンD1受容体の拮抗薬およびドーパミンD2受容体拮抗薬を注入し、サルの行動選択に影響が現れるか否かを調べた。この結果線条体に入る報酬予測誤差情報を遮断することによって、長期の報酬履歴に基づいた適切な行動選択が阻害されることが示された。しかし、短期の報酬履歴に基づいた行動選択は保存されていた。一方で、D1受容体の阻害で見られたような行動選択の障害は、D2受容体拮抗薬の注入と生理食塩水の注入によっては観察されなかった。このことから、ドーパミンD1受容体を介した報酬予測誤差情報は、線条体内の行動価値を表現する細胞の情報の更新に重要な役割を担っており、このことが行動選択にとって重要であることが示された。
インドネシアの石炭採掘跡地の森林造成における生育阻害環境因子の把握と樹種特性

Melaleuca cajuputi(Mc)とEucalyptus camaldulensis(Ec)について、根圏低酸素ストレスが低pHストレスに対する成長応答に与える影響を明らかにするために生物環境調節実験室(自然光、30°C/25°C)において水耕栽培系を用いて栽培実験を行った。酸素濃度については水耕液の酸素濃度が約7 mg/Lの好気条件と1 mg/L以下の根圏低酸素条件を設け、培養液のpHとして3と5.8の2種類を設定した。酸素環境とpHの組み合わせで4処理区を設け、12日間栽培した。Ecでは、好気条件でも低pHストレスにより樹高成長が抑制されたが、根圏低酸素条件ではその低下の程度が著しく強まった。本種は、根圏低酸素条件では、低pHストレスにより処理後1日目から気孔が閉鎖し、光飽和光合成速度が低下した。また処理終了時、好気条件下で低pHストレスによりエネルギー充足率(AEC)が低下し、低酸素条件下では低pHストレスによりAECは低下しなかったものの、総アデニル酸量が減少した。本種では、低pHストレスによる根の機能阻害が根圏低酸素環境下でより顕著となり、その結果、吸水機能の低下により気孔が閉鎖して光合成が低下し、成長が阻害されたと考えられる。Mcでは、好気条件で成長や光合成が低pHストレスによって阻害されることはなく、根圏低酸素条件でも低pHストレスによる阻害は生じなかった。Ecに比べてMcは低pHストレスに対する耐性が強く、その耐性が根圏低酸素条件でも維持されることが明らかとなった。McとEcを含む6種のフトモモ科樹木について、根圏低酸素ストレスがAl過剰ストレスに対する成長応答に与える影響を明らかにするために、過剰Alストレスとして1 mMのAl濃度を設定し、同様の栽培実験を行った。Ecのみで過剰Alストレスによる根の伸長阻害の程度が根圏低酸素ストレスにより強まった。植栽試験地の設定のため、試験候補地を探したが、管理上の都合などから適当な場所が見つからず、試験地の設置に至らなかった。2019年度以降に実施予定であった、根圏低酸素ストレスとAl過剰ストレスとの複合ストレスに関する栽培実験を前倒しして実施した。植栽試験については、植栽試験地を設置して湛水環境と土壌pH、土壌Al濃度を中心に環境因子のメッシュデータを取得し植栽木の生残と成長との関係を追跡し、生育阻害因子に対する耐性の樹種特性を把握する。植栽木の成熟葉の光飽和光合成速度、気孔コンダクタンス、炭素安定同位体比などを測定し、環境因子との関係を解析して、樹種間で比較して樹種特性を明らかにする。栽培試験については、根圏低酸素ストレスと低pHストレスとの複合ストレス応答に関して、Melaleuca cajuputiとEucalyptus camaldulensis以外の樹種について同様の実験を行い、樹種特性を把握する。栽培実験に供した樹種のうちからMelaleuca cajuputiを含む複数樹種を対象に、根の細胞膜の健全性などの短期的なストレス応答を調べ、耐性の樹種特性の背景を探る。解析結果をもとに、現地での情報意見交換等も活用しながら石炭採掘跡地の森林再生のための造林指針を提示する。

植栽試験については、植栽試験地を設置して湛水環境と土壌pH、土壌Al濃度を中心に環境因子のメッシュデータを取得し植栽木の生残と成長との関係を追跡し、生育阻害因子に対する耐性の樹種特性を把握する。植栽木の成熟葉の光飽和光合成速度、気孔コンダクタンス、炭素安定同位体比などを測定し、環境因子との関係を解析して、樹種間で比較して樹種特性を明らかにする。栽培試験については、根圏低酸素ストレスと低pHストレスとの複合ストレス応答に関して、Melaleuca cajuputiとEucalyptus camaldulensis以外の樹種について同様の実験を行い、樹種特性を把握する。栽培実験に供した樹種のうちからMelaleuca cajuputiを含む複数樹種を対象に、根の細胞膜の健全性などの短期的なストレス応答を調べ、耐性の樹種特性の背景を探る。解析結果をもとに、現地での情報意見交換等も活用しながら石炭採掘跡地の森林再生のための造林指針を提示する。
人体の熱的特性の解明とモデルの構築―医学的および日常的応用を目指して―

人体の熱的特性は多岐にわたるため、単年度研究として(1)人体モデルの構築、(2)その実験検証、(3)生活行動と人体温度、の3課題について理論的、実験的研究を行った。(1)の人体モデルでは、人体を頭、腕、手、胴体上部、胴体下部、足、足元の7要素に分割、それぞれの要素について、中心部(core)、筋質部(muscle)、脂肪部(fat)、表皮部(skin)に分割し、これら29要素に加え、血液要素を加えた都含29要素からなる熱モデルを構築した。そして環境と放射、対流、物質移動があるとし、要素間での熱移動(熱伝導)を考慮した。このモデルの検証のため・今回の(2)の実験では特に、沐浴前後の温度変動を調べる実験を行った。これは、水泳、温浴、冷水浴など、人間の諸活動における応用を考えての実験である。被験者5名はいずれも青年であり対象はやや限られるが、被験者の示す温度応答はいずれも構築したモデルの予測とよく合致した。この研究とは別に、(3)の研究では、人体の温度と生活行動の関連性について実験的に調べた。すなわち、人体の温度、特に行動に敏感に反応すると考えられる顔及び掌の温度の変化を、1)食事、2)頭脳作業、3)自律神経緊張、の前後で調べた。そして、これら行動と温度の相関をよく表す温度分布率の新しい表現法を提案すると共に、健康状態の変化(血圧の上昇)をこの温皮分布率(鼻と手首の温度)でよく検出できることが判明した。こうした成果は、在宅介護支援システムや健康管理支援システムに有効と考えられる。研究の成果はまだ公表していないが、学術誌に投稿すべく準備している。
鶏腸管におけるカンピロバクター感染動態のゆらぎに関する研究

C. jejuni感染に伴う鶏盲腸内菌叢変動として、感染群では非感染群に比べFaecalibacterium属の占有率増加を認めた。感染群・非感染群共に、血中Tregの数的比率は日齢間で著変を認めなかったが、偽好酸球の盲腸集簇は感染初期に増加した。鶏マクロファージ様細胞HDー11細胞内で本菌は48時間以上生残したが、ヒトやマウス由来マクロファージ様細胞に比べ顕著に低い傾向を示した。HD-11細胞はC. jejuni感染に伴い速やかなNO産生を示し上記形質との関連性が示唆された。本菌感染に対するHD-11細胞の遺伝子発現応答として、TLR2/4/9遺伝子群の発現亢進が明らかとなった。ヒト・カンピロバクター感染症は主に汚染鶏肉の喫食を介して成立するため、鶏宿主における本菌汚染制御は、ヒト感染予防に資する根源的な対策と目される。しかしながら、本菌が顕す同宿主内での感染動態については未だに十分な知見が集積されていない。本研究では、カンピロバクター感染に伴い、鶏宿主内での顕著な変動が想定される腸内細菌叢および腸管免疫応答の動態に着目し、同宿主の発育過程あるいは本菌感染に伴うこれら要素の相互作用を包括的にとらえることで、鶏宿主における本菌感染と持続定着に係る分子基盤を理解することを目的とする。平成26年度はSPF鶏を用いて、発育過程における盲腸内菌叢変動を検討した。滅菌飼料(発育期による切り替えなし)・滅菌水等を与えた環境下において発育させた同鶏群の時系列に伴う菌叢変動については、全体を通じて高い優勢度を示す嫌気性細菌の存在を見出した。同菌の相対構成比は、2週令以前では概ね80%以上であったが、3週齢の個体群において有意な減少を示し、4週齢以降では個体間で著しい差異を示した。2週齢のSPF鶏個体を用いたC.jejuni 81-176経口感染実験を行ったところ、鶏盲腸菌叢に占める同菌の構成比率は速やかな低減を認めた。当該菌株については、分離培養を行い、ゲノム解読に供した他、共培養によるC. jejuniの生存性低下試験を通じ、細菌間での生存挙動に関する知見を収集した。血中の偽好酸球分布は、発育期による有意な変動を示さず、サルモネラ属菌感染とは異なり、C.jejuni感染鶏群においても、顕著な変動は認められなかった。この他、現在は炎症性サイトカインの血中動態等について検討を行っているところである。隔離鶏舎において飼育したブロイラー鶏盲腸へのカンピロバクター・ジェジュニ(以下、Cj)の定着による、腸内菌叢への影響について、菌叢の経時的プロファイリングを作成した。導入時はClostridiaが優勢であったが、成鶏に至る過程において、Cj定着群では非定着群に比べ、Faecalibacterium属菌の増加が認められた。盲腸内容における後者の増加については、定量PCR法及びFISH法により確認した。Cj定着群及び非定着群間において、血中のCD4+/CD25+細胞の数的比率は6週令を除き、日齢間で著変が認められなかった。一方、盲腸内壁における偽好酸球の集簇性は、Cj定着初期において増加を認めた。CjはHD-11細胞(ニワトリマクロファージ様)中で48時間まで生残していたが、同数値はヒトあるいはマウス由来マクロファージ細胞(THP-1, J774等)に比べ、顕著に短く、また、細胞内生残数も前者は後者の2細胞に比べ、極めて低い数値を示した。Cj感染に対してHD-11細胞は、極めて速やかなNO産生性を示し、当該形質との関連性が示唆された。Cj感染に対するHD-11細胞はTLR2/4/9遺伝子の発現を亢進させた。計画の各項目について、概ねカバーしている他、C.jejuniの実験感染あるいは同菌の感染成立時期に顕著な変動を示す腸内細菌叢の同定を行うことができたため。獣医公衆衛生学平成27年度も、従来の計画に沿った内容にて進めていく予定である。情報通信費の使用計画が次年度へ変更となったため。平成27年度に執行予定である。
安定同位体を用いたササにおける炭素・窒素の転流に関する研究

本研究はクローナル植物であるチマキザサがなぜ暗い林内でも優先しうるのか?そのメカニズムはササの生理的統合によるものである、という仮説をもとに野外調査および野外操作実験、室内操作実験を行いササの生理的統合を実証した.被陰と地下茎切断を組み含わせた野外操作実験を行った.ササは被陰されても明るい所と地下茎が繋がっていることによって、現存量の低下が抑制されたことを明らかにした。これは光合成生産物が地下茎を通じて暗い林内部分(地上稈や地下茎)に転流されていることを強く示唆した。安定同位体窒素(^<15>N)を用いた室内操作実験は窒素が地下茎を通じて離れた別の地上稈に転流されていることを明らかにした。さらに、地下茎でつながった2つのラメートの間に環境の資源量(光量・土壌養分量)に差がある場合ほど、転流量は多くなり、資源勾配が転流を促進させていることが明らかになった。ササは、ギャップなどの明るい環墳下で光含成を活発に行い、その同化産物を地下茎を遍じて暗い林内に生育するラメートに転流することによって、森林の林床で優先しているであろうことが強く示唆された。また、本研究は、このような生理的統含が、草本植物だけでなく竹・ササ類(チマキザサ)においても存在することを初めて見い出したものである。森林の林床はギャップなどの形成によって光量などの資源の分布が空間的にヘテロであることが知られている。ササは一個体がこのようなヘテロな資源環境に股がって生育し、ギャップ内などの個体内の光量の豊富な所から暗い林冠下にある地上稈へ地下茎を通じて同化産物などを転流することによって個体を維持していると予測される。この仮説を以下の野外調査および野外実験を行い検証した。野外実験:開放地に成立するササ群落で被陰と地下茎切断を組み合わせた操作実験を行い、被陰による影響が地下茎の繋がりによってどう緩和されるかを調べた。開放地に広がったチマキザサ個体群の中に1m方形枠を40個設け、被陰処理(有・無)と地下茎切断処理(有・無)の計2処理(10反復)を行った。処理は1997年6月に開始し、1998年8月に終了した。この間3回の収穫を行い、枠内に現存する地上部・地下部の全てのササ植物体を回収し、乾燥重量を測定した。結果:個体重(地上部および地下部重も)は被陰しても地下茎を切断しなかったことで被陰・非切断区の現存量の低下が少なく、ANOVAでは2つの処理間に交互作用が認められた。これは被陰下でも地下茎による生理的統合によって被陰の影響が回避されたことを示唆する。グリーンハウス操作実験:地下茎で連結された同一ジェネットの二つの地上稈(ラメット)のそれぞれに^<14>Nと^<13>Nを与え、土壌窒素に勾配がある場合とない場合(実験1)、光量に勾配がある場合とない場合(実験-2)を設定した。資源勾配の有無と^<15>Nの転流との関係を調べた。結果:土壌窒素量の多い方から少ない方の葉へ、また光量の少ない方から光量の多い方の葉へ、それぞれ窒素が転流されていた。これらは、森林においてササが暗い林内で獲得した窒素を明るいギャップの葉へ転流し、ギャップ内でより多く生産した同化産物を林内へ転流していることを示唆している。本研究はクローナル植物であるチマキザサの生理的統合を野外調査および野外操作実験、室内操作実験の3つから実証した。被陰と地下茎切断を組み合わせた野外操作実験は、被陰されても明るい所と地下茎が繋がっていることによって、現存量の低下が抑制されたことを明らかにした。これは光合成生産物が地下茎を通じて暗い林内部分(地上稈や地下茎)に転流されていることを示唆している。

安定同位体窒素(^<15>N)を用いた2つの室内操作実験は窒素が地下茎を通じて離れた別の地上稈に転流されていることを明らかにした。これは草本植物だけでなく竹・ササ類(チマキザサ)においても生理的統合が存在することを初めて見い出したものである。
巨核球―血小板炎症サイクルの分子機構と病態形成メカニズム

本研究では、巨核球における転写因子NF-E2 p45の機能解析を軸として、血小板とその母細胞である巨核球が、炎症の病態形成に果たす役割の解明を目的とした。巨核球におけるNF-E2 p45の標的遺伝子プロファイルを明らかにし、NF-E2 p45が血小板形成のみならず、血小板の活性化に重要な遺伝子を制御することを見いだした。炎症の際、NF-E2 p45の制御下でこれら遺伝子の発現が亢進することが予想される。近年、血小板が、止血作用に加えて多様な生命現象において重要な貢献を果たしていることが明らかにされてきた。本研究では、巨核球における転写因子NF-E2の機能解析を軸として、血小板とその母細胞である巨核球が、炎症の病態形成に果たす役割の解明に挑む。炎症による巨核球の変化を検討し、巨核球が生体内の炎症性シグナルに応答する分子メカニズムを明らかにする。母巨核球の応答に伴い、産生される娘血小板に現れる変化を機能的側面から検討し、血小板が炎症の病態形成に及ぼす影響を明らかにする。これらの解析から、炎症の増悪、遷延化のメカニズムとして「巨核球-血小板炎症サイクル」を検証し、炎症の収束を促進する治療法開発における標的としての有効性を検討する。本年度は、マウス肺がん細胞株3LL細胞を用いた移植実験を実施し、担癌状態におけるp45の蓄積量とその標的遺伝子の発現を調べた。当初は、担癌状態のマウスでは、巨核球におけるp45の発現が上昇し、それに伴って、その標的遺伝子の発現も上昇するということが観察されていた。しかし、その後実験を繰り返すうちに、巨核球におけるp45の発現誘導が顕著に観察される場合と、それほどでもない場合とのばらつきが大きいことが判明した。一方、NF-E2活性が減弱しているp45^<-/->:ΔNTDTgマウスでは、NF-E2活性が正常であるp45^<-/->:p45Tgマウスに比較して、血小板の機能が低下し、かつ、メラノーマ由来のB16-F10細胞株の肺転移が顕著に抑制されるという結果が得られた。この結果から、p45が血小板の活性化能を規定し、血小板の活性化能はがん細胞の肺転移に大きく影響を与えることが明らかになった。担癌ストレスに対する巨核球応答を調べるため、マウス卵巣がん由来の細胞株、ID8VEGF164とIG10ip1を用いてマウスの癌移植実験を準備したが、細胞が不調で十分な培養が出来ず、移植実験を行うことが困難であった。そこで、担癌ストレスによる巨核球応答に変えて、慢性炎症モデルマウスを用いて巨核球応答を調べるということにした。そこで、本年度は、2種類の慢性炎症モデルマウスを用いて、それらの造血細胞の解析を実施した。一つは、ダイオキシン受容体の恒常的活性化型因子が皮膚ケラチノサイトで過剰発現するトランスジェニックマウスK14-AhR-CAマウスであり、同マウスは、典型的なアトピー性皮膚炎を生後1ヶ月あたりに自然発症する。このマウスの骨髄を解析したところ、造血幹細胞の活性化、前駆細胞の増加、顆粒球系と単球系への分化の亢進が観察された。血小板数はあまり変化していなかった。もう一つのモデルは、FoxP3の変異マウスであるScurfyマウスであり、同マウスは、Treg細胞の分化不全による重度の自己免疫疾患を発症して生後3週目あたりに致死となる。このマウスの骨髄を解析したところ、やはり、造血幹細胞の活性化、前駆細胞の増加、顆粒球系と単球系への分化の亢進が観察され、さらに、T細胞への分化亢進が認められた。このマウスにおいても血小板数の大きな変化はみとめらなかった。今後、血小板の活性化の増強を、セレクチンPの細胞表面への露出や、血小板ー白血球複合体の形成などをモニタリングすることで明らかにする。また、巨核球の分化の程度を、形態、ploidy、遺伝子発現などの解析により評価する。本年度は、昨年度に引き続き、慢性炎症モデルマウスの解析を実施した。K14-AhR-CAマウスの解析K14-AhR-CAマウスは、典型的なアトピー性皮膚炎を生後1ヶ月あたりに自然発症する。活性化能を調べるために末梢血からplateletrich plasmaの調製を試みたが、活性化が亢進しているためかあまり純度が高いものが得られなかった。フローサイトメトリーによる活性化状態の検討では、通常状態において白血球と結合しているplatelet-

leukocyte aggregateが増加する傾向が認められた。Scurfyマウスの解析Scurfyマウスは、Treg細胞の分化不全による重度の自己免疫疾患を発症して生後3週目あたりに致死となる。このマウスの骨髄を解析したところ、やはり、造血幹細胞の活性化、前駆細胞の増加、顆粒球系と単球系への分化の亢進が観察され、さらに、T細胞への分化亢進が認められた。このマウスにおいても血小板数の大きな変化はみとめらなかった。今回我々は、転写因子NRF2の活性化は巨核球の分化成熟過程においてp45機能を抑制し、血小板の活性化に重要な遺伝子発現が低下することを見いだしている。そこで、Scurfyマウスを、全身でNRF2が活性化しているKeap1ノックダウンマウスと交配したところ、軽度ながら炎症の改善と延命効果が得られた。26年度が最終年度であるため、記入しない。転写因子による遺伝子発現制御機構とその生体内機能の解明26年度が最終年度であるため、記入しない。マウス肺がん細胞株3LL細胞の移植による、巨核球でのp45の発現促進が期待したほど明確に認められなかったが、p45変異体を発現する遺伝子改変マウスを用いた実験では、予想通りの成果が得られた。担癌ストレスを調べるための実験が細胞の不調のため難しくなってしまったが、それに変わるべく慢性炎症モデルマウスを入手し、その解析が順調に進んでいる。これにより、慢性炎症の増悪因子としての血小板と巨核球の貢献を明らかにすることができると予想される。こちらのほうが本来の目的である巨核球と血小板による炎症の増悪機構の解明により相応しい実験系であると考えられる。担癌状態におけるp45の遺伝子発現をより明確に観察するために、3LL細胞よりもさらに巨核球の増加が顕著に観察されることが報告されているマウス卵巣がん由来の細胞株、ID8VEGF164とIG10ip1を利用することにする。これらの細胞は、MD Anderson Cancer CenterのSood, Anil K Sood博士より分与を受けている。造血組織の解析を更にすすめる。特に血小板の活性化状態、巨核球の分化状態を、細胞生物学的、生化学的な手法により検討する。特に、p45-MafGの標的遺伝子の発現レベルに着目して解析をすすめる。また、近年、造血幹細胞から巨核球が直接分化する場合があることが報告された。そこで、慢性炎症に伴い、造血幹細胞の性質が変化することで、巨核球への分化態度に変化が合われるかどうかを検討する。さらに造血幹細胞の移植を行い、慢性炎症による血小板産生に対する幹細胞応答の寄与を評価する。Scurfyマウスの解析基本的には、K14-AhR-CAマウスと同様の解析を行う。ただし、こちらのマウスでは、FoxP3の遺伝子変異による直接的な影響を否定するために、正常はT細胞移植により炎症を改善した場合に、造血組織が正常化することを確認しておく。次年度使用額は、今年度の研究を効率的に推進した事に伴い発生した未使用額であり、平成25年度請求額と合わせて平成25年度の研究遂行に使用する予定である。本年度は、当初予定していた、がん細胞の移植による巨核球応答を調べる、という実験が、がん細胞の培養が不調であったために実施できなかった。そこで、研究の方針を一部変更して、担癌ストレスに対する巨核球の応答に変えて、慢性炎症に対する巨核球の応答を調べることにした。
深夜勤務に従事する看護婦の覚醒度の研究 高照度光の効果について

本研究の目的は、深夜勤務看護婦の勤務中の心身の負担を軽減することにある。交代制勤務による心理・社会的負担を軽減するには深夜勤務中の眠気を軽減させ、生体リズムの乱れを極力防ぐようにすることが必要である。今回、実際の交代制勤務看護を対象として勤務中の高照度光照射を行い、勤務中の覚醒度を継時的に測定し、深夜勤務明けの睡眠とその主観的評価、生体リズムの測定を行い、光が交代制勤務に与える有効性を検討した。研究の対象は3交代勤務に従事している健康な看護婦20名である。研究期間は1月である。被験者の背景因子については活動型をMorningness-Eveningness Scale(朝方-夜型スコア)、CMl健康調査票、性格調査票を施行し、そのうえで全員に1月にわたる通常勤務状態の睡眠日誌を依頼した。睡眠持続時間と睡眠前後の自覚的評価をアナログスケールにて行った。各自の一月の研究期間中の深夜勤務中に8名の被験者に対し、2500ルクスの高照度光を照射し、勤務中の気分、精神作業能力、覚醒度などの主観的評価を100mmV. AnalogueScaleを用いて測定した。特に高照度光と睡眠覚醒リズムの関連については米国A.M.I社製の光検知付きアクティラム(活動計)を使用し、光の照度の程度と、活動休息リズムの関係を把握した。以上から高照度光が深夜勤務中、後の生体リズムに与える効果を照射していない時期と比較して、特に覚醒度を中心に検討した。今回の研究の結果、高照度光照射条件下では勤務中の眠気が有意に抑制され、また疲労度が軽減される傾向が認められた。また、深夜勤務明けの日中の睡眠は安定して得られていた。この結果から、高照度光を照射は勤務中の覚醒度を高め、疲労を軽減し、結果的に看護婦の心身の負担を少なくする効果があると思われる。
新規ラングハンス細胞特異抗体による胎盤関門機能の解析

今回の研究で、胎盤ラングハンス細胞に特異的なマーカーであるHAI-1(肝細胞増殖因子(HGF)に関連する、セリンプロテアーゼインヒビターであるHGFactivator inhibitor 1型;別名SPINT1)に対する抗体を用いて、胎盤発達に伴うラングハンス細胞層の構造変化を、光顕レベルで電子顕微鏡の解像力に迫る、独自に開発した超高分解能蛍光顕微鏡法を軸に解析を行った。初期胎盤絨毛において抗HAI-1抗体で染色されたラングハンス細胞は栄養膜合胞体層直下に連続した立方状の細胞層として観察された。正期産においてもHAI-1陽性細胞(ラングハンス細胞)は場所によっては非常に薄い扁平状を呈していたが、層構造が断裂することなく終末絨毛のほぼ全周にわたり連続して観察された。定量解析では、初期絨毛ラングハンス細胞層の連続性は約90%であり、正期胎盤においても終末・中間・幹絨毛すべて約80%以上の連続性を認めた。正期胎盤絨毛の基底膜と結合組織をNaOHで消化処理し、栄養膜基底側を露出し、走査電子顕微鏡で解析した。たくさんの細胞突起を伸ばしたラングハンス細胞と合胞体の複雑なネットワーク構築の可視化に成功した。さらに、HGFシグナルカスケードに関連する分子(HAI-1,HGF,MET,ST14等)に関してreal-time PCRにてmRNAレベルでの発現量を検討した。いずれも初期と比較し、正期胎盤において上昇しており、胎盤形成初期のみならず、HGF関連分子が後期においても胎盤絨毛構築、維持にかかわっている可能性が示唆された。今回の解析から、従来の成書のヒト胎盤の記載(定説)とは異なり、正期胎盤においてもラングハンス細胞層は断裂せず、層構造が維持されていることを世界で初めて明らかにした。胎盤絨毛の生理機能や関連疾患を考える上で興味深い新知見と考えられる。胎盤絨毛を構成している栄養膜は、母体血に接している合胞体層とその内側に位置する細胞層(ラングハンス細胞層)の二層よりなる。妊娠初期にはラングハンス細胞層は連続的に存在するが、妊娠後期には胎盤の発達に伴い胎盤関門の構造は大きく変化し、細胞層が非連続的となり、物質交換が加速されると定説化されている。今回の研究で、ラングハンス細胞に特異的なマーカーであるHAI-1(肝細胞増殖因子(HGF)に関連する、細胞膜結合クニッツ型セリンプロテアーゼインヒビターであるHGF activator inhibitor 1型)に対する抗体を用いて、胎盤発達に伴うラングハンス細胞層の構造変化を分子解剖学的に明らかにした。同意を得て、妊娠中絶例の初期胎盤を、帝王切開例の正期産胎盤を採取し、HAI-1抗体等で多重標識し、独自に開発した超高分解能蛍光顕微鏡法、電子顕微鏡法で解析した。正期産においてもHAI-1の陽性細胞は、コラーゲンタイプIVで同定される栄養膜細胞基底膜の直上に存在し、かつ栄養膜のマーカーであるサイトケラチン-7陽性であることから、ラングハンス細胞であることが確認され、そのラングハンス細胞は場所によっては非常に薄い扁平状を呈していたが、層構造が断裂することなく終末絨毛のほぼ全周にわたり連続して観察された。定量化解析では、初期絨毛ラングハンス細胞層の連続性は約90%であり、正期胎盤においても終末・中間・幹絨毛いずれも約80%以上の連続性を認めた。今回の解析から、従来の成書の記載とは異なり、正期胎盤においてもラングハンス細胞層は断裂せずに層構造を維持していることがはじめて明らかとなった。

いずれも初期と比較し、正期胎盤において上昇しており、胎盤形成初期のみならず、HGF関連分子が後期においても胎盤絨毛構築、維持にかかわっている可能性が示唆された。今回の解析から、従来の成書のヒト胎盤の記載(定説)とは異なり、正期胎盤においてもラングハンス細胞層は断裂せず、層構造が維持されていることを世界で初めて明らかにした。胎盤絨毛の生理機能や関連疾患を考える上で興味深い新知見と考えられる。
鶏の消化管における壁内神経叢の構築様式

鶏の消化管には内在性の神経要素として筋層間神経叢と粘膜下神経叢がある。これら2つの神経叢がどのように構築されているのかを明らかにするために、次の実験を行った。1.壁内神経細胞の投射方向に関する研究。十二指腸と直腸の壁内にトレーサーとして西洋ワサビ過酸化酵素をマイクロピペットにより微量注入した。標識細胞と注入場所の位置関係から判断すると、輪状投射が多く、頭側投射が少なかった。標識された外来性神経線維が十二指腸では輪状に、直腸では縦に走っていた。2.壁内神経叢の全体像の解明。腸管各部位のホールマウント標本を作製し、神経組織全体を免疫組織化学的に染色した。筋層間神経叢の神経線維束は太くて縦走し、神経節の数は少なくて網目が大きかった。粘膜下神経叢は小腸では神経線維束が細くて主に輪走し、神経節の数が多く、網目が細かくて複雑に分枝しているのに対し、大腸では網目が大きくなり、神経節と神経線維束との区別が容易であった。3.絶食による影響。給水絶食の状態で一週間飼育すると、下部の腸管で筋層間神経叢の抑制性神経細胞数が有意に減少した。絶食により腸管運動が停止したために起こったと思われるが、神経細胞自体が消失したとは考えにくく、神経細胞が一時的に神経伝達物質を合成しなくなったためであると思われる。以上の結果から、消化管の運動を制御している壁内神経叢は部位、特に小腸と大腸で構築様式に差が見られる。鳥類の消化管は食物の消化と吸収、糞の貯蔵と排出などに加え、鳥類の消化管に特有な機能として、尿として排泄腔に排泄された尿酸と水分を盲腸に運ぶ逆蠕動運動を行うことが知られており、壁内神経叢はこれらの消化管運動を支配していると思われる。3.絶食による影響。鶏の消化管には筋層間神経叢と粘膜下神経叢があり、消化、吸収、排泄機能を調節している。両者の神経叢は消化管全体を被う二重の網目構造を形成しており、網目の交点に神経節が存在する。しかし、これらの神経叢に存在する神経節細胞がどの方向に軸索を投射しているのかは明らかでない。本年度は十二指腸と直腸の壁内にトレーサーとして西洋ワサビ過酸化酵素(HRP)をマイクロピペツトで注入し、神経叢内における標識細胞の分布を明らかにした。注入部位の腸管を長さ56cm採取し、腸間膜の付着部位に沿って縦に切開し、粘膜を除去してからHRPの酵素反応を行い、ホールマウント標本を作製した。標識された神経節細胞は主として標本の粘膜側に観察され、粘膜下神経叢の神経節細胞と思われた。十二指腸で標識された細胞体のうち70%は注入部位とその口側6mmの間に分布していた。それらの軸索は下行性に投射し、平均の投射距離は3.5mmでした。標識細胞のうち25%は輪状方向に投射し、平均の投射距離は1.8mmでした。一方、直腸で標識細胞のうち75%は注入部位から輪状方向の壁全体に分布していた。それらの軸索は輪状方向に投射し、平均の投射距離は5.0mmでした。残りの標識細胞は注入部位とその口側9mmの間に分布しており、下行性に投射した。平均の投射距離は4.7mmでした。上行性の投射は十二指腸と直腸でともに数が非常に少なかった。

これらの標識神経節細胞とは別に、十二指腸では輪状方向に、直腸では長軸方向に平行に走る多数の細い神経線維束が標識された。これらは標識された神経節細胞の分布範囲を超えて投射するので、壁内神経叢の細胞体から出た神経線維ではなく、外来性の神経線維、おそらく交感神経の節後線維と思われる。これらの結果から、十二指腸と直腸では神経節細胞の投射方向と投射距離・外来性神経線維の投射方向に差が見られる。消化管壁内には粘膜下神経叢と筋層間神経叢があり、自律的な消化管運動を支配している。鳥類の消化管は哺乳類と異なる点が多く存在するが、鳥類ではこれら2つの壁内神経叢が消化管壁内でどのように広がっているのか、全体像は解明されていない。今回は鶏の消化管壁内神経叢をホールマウント標本で免疫組織化学的に染色し、消化管各部位における壁内神経叢の分布と形態学的特徴を明らかにしようと試みた.雄の成鶏を用い、ネンブタール麻酔下で0.75%生理的食塩水、4%パラホルムアルデヒドを含む0.1M燐酸緩衝液を総頚動脈に流し、灌流固定を行った。十二指腸、空腸、回腸、盲腸、直腸から長さ12cmの組織を摘出し、腸間膜の付着部位に沿って縦に切開した。粘膜を擦り落として筋層だけからなるホールマウント標本を作製し、protein gene product 9.5に対する抗血清を用いてABC法で免疫染色を行った。消化管壁内の神経要素全体が免疫陽性反応を示した。粘膜下神経叢は、小腸では神経線維束が細くて主に輪走し、神経節の数が多く、網目が細かく、複雑に分枝しているのに対し、大腸では網目が大きくなり、神経節と神経線維束の区別が容易であった。筋層間神経叢の神経線維束は太くて縦走し、神経節の数は少なくて網目が大きく、消化管の部位による違いが少なかった。一般的に壁内神経叢は、小腸では神経叢の網目が細かく、大腸、特に盲腸では網目が大きくなった。また、粘膜固有層で陰窩の底部を取り囲むように走る神経線維を観察できた。鳥類の消化管は食物の消化と吸収、糞の貯蔵と排出などに加え、尿として排泄腔に排泄された尿酸と水分を盲腸に運ぶ逆蠕動運動を行うが、壁内神経叢はこれらの消化管運動を支配していると思われる。鶏の消化管壁内には粘膜下神経叢と筋層間神経叢があり、自律的な消化管運動を支配している。養鶏業界では次第に低下してきた産卵率を再び向上させるために鶏を1週間ほど絶食し、強制換羽を行っているが、本研究は絶食によりこれら壁内神経叢を構成する神経節細胞にどのような影響があるのかを形態学的に明らかにしようと試みた。雄の成鶏を用い、給水絶食の状態で1週間飼育した。麻酔下で頸動脈を切断して放血し、直ちに腸管各部を摘出して4%パラホルムアルデヒド液に入れ、浸漬固定した。腸間膜に沿って腸管を縦に切開し、粘膜を剥ぎ取って筋層だけのホールマウント標本を作製した。抑制性神経節細胞をNADPHジアホラーゼの酵素反応により、興奮性神経節細胞をChATに対する抗体を用いた免疫組織化学法により可視化した。絶食群の鶏は摂食群の鶏と比べて回腸、盲腸、直腸で筋層間神経叢の抑制性神経節細胞数が有意に減少した。一方、粘膜下神経叢は腸管のいずれの部位でも抑制性神経節細胞数に変化が見られなかった。筋層間神経叢の神経節細胞は輪筋層と縦筋層の平滑筋に分布しており、腸管の蠕動運動や分節運動を支配している。筋層間神経叢における抑制性神経節細胞数の減少は絶食により腸管の内容物がなくなり、腸管運動が停止したために起こったと考えられる。また、絶食後に腸管が収縮し、管径が小さくなるのも単に内容物がなくなっただけでなく、抑制性神経節細胞数の減少により平滑筋の弛緩が起きなくなったためと思われる。抑制性神経節細胞数の減少は神経節細胞自体が消失したとは考えにくく、一時的に神経伝達物質を合成しなくなったために起きたと推測される。
ハンチントン病の病態におけるプロテインホスファターゼ2Cの関与

我々はこれまで、小胞体膜上に存在するプロテインホスファターゼであるPPM1Lが、SAPK経路やセラミド輸送の制御に関与していることを報告した。PPM1L KOマウスを解析したところ、成熟したホモKOマウスで、ハンチントン病モデルマウスで観察される前脚や後脚の握り込みが認められた。脳の組織学的な解析を行った結果、側脳室の拡大や線条体尾状核被殻の縮小が観察された。認められた異常は大脳皮質に入出力する軸索線維の異常であると考えられ、大脳皮質の神経細胞もしくは大脳皮質へ投射する神経細胞の軸索形成不全あるいは発達異常が示唆された。プロテインホスファターゼ2Cε(PP2Cε)は、哺乳動物の小胞体に局在するプロテインホスファターゼで、ストレス応答経路や脂質輸送などの制御に関与する。個体におけるPP2Cεの機能を明らかにする目的でPP2Cε遺伝子欠損(KO)マウスを作成したところ、線条体の縮小と、それに伴う脳室の拡大というハンチントン病(HD)モデルマウスと類似した表現型を示すことが明らかとなった。さらに、左右の大脳半球を結ぶ交連神経である脳梁および前交連にも異常が認められた。PP2Cεの機能不全により惹起された中枢神経系の異常の原因を明らかにするため、野生型マウスおよび欠損型マウスを用いて行動試験を行ったところ、運動機能の協調性や平衡感覚を評価するワイヤーハング試験およびバランスビーム試験において、欠損マウスが異常な行動を示すことが明らかとなった。一方、海馬における短期記憶の能力を評価するY迷路試験においては、異常を認めなかった。また、ミエリン塩基性タンパク(MBP)抗体を用いて有髄神経を染め出したところ、大脳皮質と下部の神経核を繋ぐ神経線維が、著しく縮小・減少していることが観察され、線条体の縮小の原因が、ここを通過する神経線維の縮小・減少に起因することが示唆された。さらに、脳梁および前交連でも、そこを走行する神経線維の減少が著明に観察された。一方、小脳髄質など、他の領域では神経線維の顕著な減少は認められなかった。個体におけるPP2Cεの機能を明らかにする目的でPP2Cε遺伝子欠損(KO)マウスを作成し、行動試験を行ったところ、運動機能の協調性や平衡感覚を評価するワイヤーハング試験およびバランスビーム試験において、遺伝子欠損マウスが異常な行動を示すことが明らかとなった。一方、組織学的解析の結果、線条体の縮小と、それに伴う脳室の拡大が観察された。ミエリン塩基性タンパク(MBP)抗体を用いて有髄神経を染め出したところ、大脳皮質と下部の神経核を繋ぐ神経線維が、著しく縮小・減少していることが観察され、線条体の縮小の原因が、ここを通過する神経線維の縮小・減少に起因することが示唆された。さらに、これらの神経線維の減少が神経回路の形成不全ではないかとの仮説の下、子宮内電気穿孔法によるGFP蛍光タンパク質の神経細胞における特異的発現やDiIなどの蛍光色素を用いた神経回路の標識を行い、中枢神経における神経回路形成を解析したが、野生型と遺伝子欠損型の間で顕著な違いが認められなかった。一方、胎生16日目の胚の大脳皮質の遺伝子発現をDNAアレイ解析で網羅的に解析し、ubiquitin遺伝子をはじめとしていくつかの遺伝子の発現変動を観察した。PP2Cεの中枢神経系における機能を解明する目的で、昆虫細胞にて発現させたPP2Cεタンパクをbaitとした相互作用蛋白質のアフィニティ精製法を用いて、マウス脳抽出液より相互作用タンパク質の同定を試み、protein kinase Cγ,脳型glycogen phosphorylase等のタンパク質を同定した。また、胎生16日目の胚の大脳皮質の遺伝子発現をDNAアレイ解析で網羅的に解析し、ubiquitin遺伝子をはじめとしていくつかの遺伝子の発現変動を観察した。PPM1L KO

マウスを解析したところ、成熟したホモKOマウスで、ハンチントン病モデルマウスで観察される前脚や後脚の握り込みが認められた。脳の組織学的な解析を行った結果、側脳室の拡大や線条体尾状核被殻の縮小が観察された。認められた異常は大脳皮質に入出力する軸索線維の異常であると考えられ、大脳皮質の神経細胞もしくは大脳皮質へ投射する神経細胞の軸索形成不全あるいは発達異常が示唆された。遺伝子欠損マウスで観察された神経線維の減少が神経回路の形成不全ではないかとの仮説の下、蛍光色素を用いた神経回路の標識を行ったが、野生型と遺伝子欠損型の間で顕著な違いが認められなかった.生化学遺伝子欠損マウスで観察された神経線維の減少が神経回路の形成不全ではないかとの仮説の下、蛍光色素を用いた神経回路の標識を行ったが、野生型と遺伝子欠損型の間で顕著な違いが認められなかった。そこで、神経線維の減少が神経細胞の細胞死によるものかどうか検討していく。この仮説が正しかった場合、その分子機構を培養細胞やin vitroの系を用いて明らかにしていく。線条体の萎縮の原因としてそこを通過する神経線維の減少を見いだせたこと。当該年度に予定してた特異的抗抗体の作製ができなかったため、当該年度の所要額が少なくなってしまったため。神経線維が縮小・減少して見える原因としては、通過している神経軸索の数が少なくなっている場合と、実際には、同数の軸索が存在していても、その周りを取り囲む髄鞘の形成が不全であるため、免疫染色に染まらなくなっているということが考えられる。そこで、特に顕著な減少の見られた前交連に関して、電子顕微鏡により観察を試みる。今年度は抗体の作製を進めより詳細な解析を進める予定である。当該年度に予定していた特異的抗体の作製ができなかったため、当該年度の所要額が予定よりも低くなってしまったため。今年度は特異的抗体の作製を進め、より詳細な解析を進める予定である。
CyTOFを用いた自己免疫疾患病態におけるセマフォリンと免疫細胞動態の網羅的解析

従来の免疫動態研究はフローサイトメーターを用いて限られた少数の表面蛋白分子を測定し氷山の一角のみを解析してきた。本研究では、自己免疫疾患患者の臨床検体を用いて、従来の免疫関連分子群とともに新しい免疫調整分子であるセマフォリン分子群を同時に測定して関連性を解析する。その目的のため最新技術であるマスサイトメーター(Cytometry by time-of-flight: CyTOF)を用いて1細胞40種類の発現蛋白を一度に測定し免疫疾患の免疫細胞動態解析においてブレイクスルーを目指す。様々な免疫細胞集団に今まで解析されなかったセマフォリン分子群を同定し新規臨床病態マーカーに位置づける突破口を開く。