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鎌倉中期の古典注釈に現れる言語意識についての総合的研究

鎌倉中期の文永永仁年間には、仙覚『万葉集註釈』、源氏物語の注釈書である『紫明抄』、古今集の注釈書である『三流抄』などが成立した。本研究では、これらを同時代の学芸とみなし、ジャンル横断的にとらえて、この時代の注釈書の特徴について考察した。とくに、悉曇学(梵語の文字と音韻の学問)の考え方が、古典文学の注釈書と深い関わりを持っていることに着目して、注釈書に見られる言語意識を明らかにした。本研究は、鎌倉中期の文永永仁年間に成立した古典注釈書を総合的に検討し、当時の言語意識について明らかにしようとするものである。すなわち、万葉集研究に画期をなした仙覚『万葉集註釈』、源氏物語注釈書として注目される『光源氏物語抄』『紫明抄』、『三流抄』をはじめとする古今集注釈、そして歌学および思想の書として見逃せない『野守鏡』などを、ジャンル横断的に考察の対象とする。本年度はとくに、仙覚『万葉集註釈』を中心として研究を進めた。まず、同書の本文について仁和寺本をもとに、冷泉家本等の諸本と照らし合わせながら翻刻をすすめた。次に、同書のなかから、悉曇学に由来する注釈方法が見られる記述を抜き出してデータ化した。たとえば、仮名の一字一字に意味をあてることで語句の解釈を導き出すいわゆる音義説の方法があらわれている記述や、五十音図の同じ行・同じ段の音が交替すると考える相通説にもとづく方法が洗われている記述などである。そして、上記のようにして抜き出した『万葉集註釈』の記述を、中世以降現在にいたる『万葉集』の注釈書の説と比較し、仙覚の考えの独自性を明らかにした。ついで、仏教書や悉曇学書の記述と比較して、仙覚の注釈方法の根底には、密教からくる言語思想や言語意識が深く浸透していることを実証的に明らかにした。本年度はとくに、仙覚『万葉集註釈』に現れる悉曇学の考え方にもとづく記述と、院政期から鎌倉中期にかけての悉曇学書の記述との比較および分析的考察を中心として研究を進めた。前年度において、仙覚『万葉集註釈』のなかから悉曇学に由来する注釈方法が見られる記述を抜き出してデータ化する作業はおこなっていた。本年度はその抜き出したデータをもとに、明覚『悉曇要訣』や了尊『悉曇輪略図抄』の記述との共通点と差異を、より具体的に検討したのである。上記の検討から、仙覚の注釈に特徴的に見られる音義説的な叙述(一字一字に意味をあてることで語句の解釈を導き出す方法)が、悉曇学や密教において重視された種子の考え方に通ずるところがあることを明らかにした。悉曇学は、古代インドの言語である梵語・梵字の音韻や意味に関する学問である。その考え方を日本の言語に関する学問にとりいれることは、日本の言語のあり方に対する自覚を芽生えさせるものであったのではないか。仙覚の言語意識から、その一端をうかがい知ることができた。鎌倉中期の文永永仁年間には、万葉集注釈の精華である仙覚『万葉集註釈』、源氏物語の注釈書として重要な位置を占める『光源氏物語抄』『紫明抄』、古今集の注釈書である『三流抄』、そして歌学および思想の書として注目される『野守鏡』などといった古注釈や歌学書が多く成立した。本研究では、これらを同時代の学芸としてジャンル横断的にとらえたうえで、先行する院政期の学芸とも比較して、鎌倉中期の古典注釈の特性を考察した。具体的には、悉曇学(梵語の文字と音韻の学問)にもとづく音韻相通説や音義説、和語を注釈する際に漢語をあてて解釈する説などといった、日本語学的な注釈方法が、これらの文献に共通して現れることに着目した。悉曇学の側の資料では、八世紀の安然『悉曇蔵』、院政期の明覚『悉曇要訣』『梵字形音義』『反音作法』を参照しつつ、鎌倉中期に成立した了尊『悉曇輪略図抄』にとくに注目した。そこで、上記の諸文献について、資料調査にもとづく本文の基礎的研究からはじめて、対象とする資料から着目すべき部分を抽出して、それぞれの部分について考証と分析を試みた。それらの検討を通して、悉曇学の影響のもとで形成された自国の言語に対する意識と、古典文学の注釈書の言説とのあいだに深い関わりがあることを、総合的に明らかにした。

具体的な研究成果として、論文「勅撰和歌集序という論理ー『千載集』から『新続古今集』へ」(平成24年7月、『日本文学』)などを公表した。鎌倉中期の古典注釈の資料と、悉曇学の資料の収集および比較検討を堅調に進めることができているから。当初の研究計画で挙げた目標のすべてを達成できていない部分もあるが、その分、達成した部分についての考察が計画以上に精緻になされており、総じて、研究はおおむね順調に進展していると言える。24年度が最終年度であるため、記入しない。来年度は本研究課題の最終年度になるので、これまでの研究を深化させるとともに、研究期間に実践した成果をまとめることにも力を注ぐこととする。研究計画の変更はとくにないが、進捗状況を見ながら、おおむね来年度上半期は具体的な研究を継続し、下半期は研究成果をまとめることにあてる予定である。それが、もっとも効率的に研究を進めるための推進方策であると考えられる。
日中間における生体代謝調節に関する研究

従来原因不明とされていた難病の多くが、生体代謝異常に起因するということが近年明らかになりつつあるが、その代謝異常が何故生ずるかについては、いまだ詳細な原因分析ができていないのが現状である。本研究は中国の生化学研究者との共同研究により特に生体酸化還元機構とその調節の研究を推進することで、代謝異常の原因解明の一助とすると同時に日中の学術交流を促進させることを目的とするものである。生体酸化すなわち生体エネルギ-代謝において酸素が重要な働きをしていることはいうまでもない。しかし、それ以外にも生体の多岐にわたる反応に酸素が関与していることもよく知られている。たとえば、酸素添加酵素反応を介しての物質代謝、還元反応により活性化された活性酸素を介しての食作用、脂質過酸化反応等であり、これら酸素の関与する多岐にわたる反応を取り上げ総括的に研究を進めた。1.酸素添加酵素のアイソザイムの研究酸素添加酵素は分子状酸素を直接基質に添加する反応を触媒する一群の酵素であり、アミノ酸、脂質、ビタミン、ホルモン、神経伝達物質、芳香族化合物等生体必須物質あるいは外来性物質の代謝に関与した酵素である。我々は、芳香族化合物を代謝するカテコ-ル1,2ー二原子酸素添加酵素を緑膿菌から精製し、3種のアイソザイムがあることを明らかにした、すなわち、本酵素の精製過程で活性が3つの画分に分かれることを見いだし、それぞれの画分の酵素についてN末端アミノ酸配列を決定したところ2つの異なるサブユニット(α、β)からなる2量体によるアイソザイム(α_2、αβ、β_2)であることを明らかにした。その生理的意義については目下研究中である。2.ペルオキシソ-ムに含まれる酸化酵素の脳内分布と生理作用近年、脳肝腎症候群を始めペルオキシソ-ムの異常に起因すると考えられる疾患が注目を集めている。我々はペルオキシソ-ム中に含まれるフラビン酵素、特にDーアミノ酸オキシダ-ゼ(DAO)について脳内分布と生理作用について研究を行った。DAOの生理的な基質はいまだ不明であるが、ハミルトンらはシステアミンとグリオキシル酸との脱水縮合物(チアゾリジンー2ーカルボン酸)が基質となることを報告した。脳内におけるDAO活性とチアゾリジンー2ーカルボン酸オキシダ-ゼ活性を組織化学的に調べた結果、両活性の分布は一致し、中枢神経系においては中脳以下の下位脳幹、小脳、脊髄の星状グリア細胞(ベルクマングリア細胞を含む)に限局していた。近年、代謝調節や細胞内情報伝達においてSH/SS交換反応の生理的役割が注目されているが、DAOがSH化合物であるシステアミンを基質とすること、特にシナプスの周囲のグリア細胞の突起に活性が強いことから神経系における代謝調節や細胞応答に関与している可能静が示唆された。
地歌における上方と江戸の文化交流－「芝居歌物」と「浄瑠璃物」を中心に

平成30年度は、前年度に引き続き、(1)地歌の「芝居歌物」「浄瑠璃物」の原曲に関する歌舞伎・浄瑠璃側の資料の収集と調査、(2)地歌側の資料と歌舞伎側の資料の照合、(3)地歌の「芝居歌物」「浄瑠璃物」の作品分析を行うとともに、研究実施計画にそって、(4)上方文化と江戸文化の交流についての考察を行った。(1)(2)については、芝居歌物の分類を記述する最初の歌本である『歌系図』、芝居歌物と浄瑠璃物の詞章を掲載する大坂系の『糸のしらべ』類、京都系の『糸の節』類、収録作品数の多い『歌曲時習考』類などの調査と考察を中心に、詞章の内容を手掛かりに、歌舞伎や浄瑠璃との影響関係を調査した。『糸のしらべ』類、『糸の節』類、『歌曲時習考』類については、各作品の作曲年代を特定し、詞章の変遷を調査するために、年代の異なる諸本の収集を行った。また、作品分析の資料となる演奏資料の収集と音源のデジタル化を進めた。(3)(4)については、前年度に行った「レンボ」をめぐる上方文化と江戸文化の交流の考察をさらに推し進めた。「レンボ」は、江戸時代初期に流行した歌謡をルーツとする旋律型であり、上方文化の地歌、江戸文化の河東節、一中節、山田流箏曲、長唄などの作品に登場する。ルーツである江戸初期の流行歌謡の詞章については、江戸の流行歌謡を掲載する『吉原はやり小哥そうまくり』、上方で作られた三味線組歌《飛騨組》などが資料となり、その旋律は、上方で出版された『糸竹初心集』『糸竹大全』に掲載される楽譜が資料となる。その江戸初期の流行歌謡が上方の地歌作品にどのような影響を与えたのか、さらには、江戸の山田流箏曲などに影響を与えたのかを考察して、論文にまとめた。平成28年度は、交付申請書に記載した研究計画に沿い、主に2つの研究を行った、一つ目は、「芝居歌物」と「浄瑠璃物」について、地歌側の資料の調査を行った、まずは、地歌の曲目リストである『歌系図』(一七八二・天明二)の調査と整理を行った。『歌系図』には、江戸時代の地歌側の文献のなかでは唯一、「芝居歌物」の分類が立てられている。『歌系図』が分類する「芝居歌物」の作品の特徴を、曲名に添えられている作曲者と作詞者の情報に基づいて整理した。『歌系図』の「芝居歌物」の記述のなかに盛り込まれている「浄瑠璃物」(「繁太夫物」と「半太夫物」)の情報も整理し、さらに、それらの作品の歌詞や楽譜を収録する江戸時代の歌本や譜本の情報も整理した。そのうえで、上方と江戸の文化交流に関わる作品と人物を抽出した。また、そこに記される楽曲の現在の伝承を分析するために、資料となる映像・音源・楽譜に何があるかを調査し、収集した。映像と音源については、利用しにくいVHSとカセットのものをDVDとデジタル音源に変換した。二つ目は、上方の地歌と江戸の長唄の交流が伝えられる作品について調査した。江戸時代の後期に近い時期に大坂で作られた地歌《越後獅子》をとりあげ、地歌《越後獅子》を摂取して江戸で作られた長唄《越後獅子》と比較した。また、《越後獅子》と同様に角兵衛獅子を題材とする作品の一覧を作成、そこに見られる上方文化と江戸文化の違いを分析した。また、長唄《越後獅子》が演奏された七変化舞踊《遅桜手爾葉七字》の上演に関わる資料と、その舞踊の上方での上演である《慣ちょっと七化》をきっかけに作られた地歌《江戸土産》の資料と楽曲について調査した。「芝居歌物」と「浄瑠璃物」について、本研究課題の基礎となる地歌側の基本的な情報は整理できた。また、江戸の長唄と上方の地歌の交流を示す作品のうち、その代表である《越後獅子》の分析をすることができた。平成29年度は、計画に沿い、前年度からの継続の研究として、(1)「芝居歌物」「浄瑠璃物」に関する地歌側の資料の整理、(2)地歌の「芝居歌物」「浄瑠璃物」の原曲に関する歌舞伎・浄瑠璃資料の収集と調査、(3)江戸長唄に移曲された地歌の作品分析をすすめた。(1)については、昨年度に行った『歌系図』に記される「芝居歌物」の作品について、その後の歌本類における収録状況の特徴を検討した。大坂系の歌本と京都系の歌本の比較を主軸に行った。未見であった『歌曲時習考(温習考)』の明治版の諸本の収集と比較も行った。また、現行の伝承を音楽的に分析するために、昨年度に作業できなかったLP音源のCD化を進めた。東京と京都(柳川流)の伝承に違いがある作品もあり、その分析にも着手した。作曲者・作詞者については、口伝を紹介する『三曲』などの雑誌から情報を収集して整理した。『歌系図』に記される作詞者の情報には、歌舞伎や浄瑠璃の初演に関係した役者や演奏家の情報が紛れ込んでおり、真実であるとは断定できない情報が多い。その検討の材料となる情報を、歌舞伎研究の成果も含めて収集した。(2)については、(3)とも重なる研究として、長唄《越後獅子》の資料収集と分析を行った。長唄

《越後獅子》については、地歌の音楽的特徴と直接には関連しないが、東京国立博物館所蔵の「太鼓手附」の考察も行った。そのうえで、地歌《越後獅子》と長唄《越後獅子》についての論文をまとめた。また、上方と江戸との交流の一例を示す「レンボ」の旋律について、江戸時代初期の旋律の復元を試み、長唄、河東節との関係を含む地歌と山田流箏曲の事例研究を行った。『歌系図』の「芝居歌物」に関連する歌舞伎および浄瑠璃の資料(絵番付、正本、丸本など)については、どこに何があるのかの情報整理を行った。地歌側の資料については、昨年度の成果をおしすすめて、作曲者、作詞者、歌詞の情報整理に基づく分析にまで進めることができた。上方文化と江戸文化の交流を知ることのできる地歌《越後獅子》と長唄《越後獅子》については、研究の成果を論文にまとめることができた。同じく上方文化と江戸文化の交流の一例である「レンボ」の旋律については、江戸時代初期の楽譜の復元を行い、江戸の長唄や河東節との比較を含む地歌と山田流箏曲の事例研究を行うことができた。平成30年度は、前年度に引き続き、(1)地歌の「芝居歌物」「浄瑠璃物」の原曲に関する歌舞伎・浄瑠璃側の資料の収集と調査、(2)地歌側の資料と歌舞伎側の資料の照合、(3)地歌の「芝居歌物」「浄瑠璃物」の作品分析を行うとともに、研究実施計画にそって、(4)上方文化と江戸文化の交流についての考察を行った。(1)(2)については、芝居歌物の分類を記述する最初の歌本である『歌系図』、芝居歌物と浄瑠璃物の詞章を掲載する大坂系の『糸のしらべ』類、京都系の『糸の節』類、収録作品数の多い『歌曲時習考』類などの調査と考察を中心に、詞章の内容を手掛かりに、歌舞伎や浄瑠璃との影響関係を調査した。『糸のしらべ』類、『糸の節』類、『歌曲時習考』類については、各作品の作曲年代を特定し、詞章の変遷を調査するために、年代の異なる諸本の収集を行った。また、作品分析の資料となる演奏資料の収集と音源のデジタル化を進めた。(3)(4)については、前年度に行った「レンボ」をめぐる上方文化と江戸文化の交流の考察をさらに推し進めた。「レンボ」は、江戸時代初期に流行した歌謡をルーツとする旋律型であり、上方文化の地歌、江戸文化の河東節、一中節、山田流箏曲、長唄などの作品に登場する。ルーツである江戸初期の流行歌謡の詞章については、江戸の流行歌謡を掲載する『吉原はやり小哥そうまくり』、上方で作られた三味線組歌《飛騨組》などが資料となり、その旋律は、上方で出版された『糸竹初心集』『糸竹大全』に掲載される楽譜が資料となる。その江戸初期の流行歌謡が上方の地歌作品にどのような影響を与えたのか、さらには、江戸の山田流箏曲などに影響を与えたのかを考察して、論文にまとめた。上方文化と江戸文化の交流がうかがわれる地歌の作品のうち、歌舞伎や文楽の上演と関連する作品については、歌舞伎や文楽側の資料(丸本、正本類)との照合が必要である。しかし、平成28年度には一部しか遂行できなかった。研究計画調書には、平成29年度の課題として、(1)地歌の「芝居歌物」「浄瑠璃物」の原曲に関する歌舞伎・浄瑠璃側の資料の収集と調査、(2)地歌側の資料と歌舞伎側の資料の照合、(3)地歌の「芝居歌物」「浄瑠璃物」の作品分析、(4)江戸長唄に移曲された地歌の作品分析の4点を記載した。このうち平成28年度には一部しか遂行できなかった(1)を主軸として、研究を推進する。平成30年度の実施計画は(1)地歌側の資料と歌舞伎・浄瑠璃側の資料の照合、(2)地歌の「芝居歌物」「浄瑠璃物」の作品分析、(3)江戸長唄に移曲された地歌の作品分析、(4)上方文化と江戸文化の交流についての考察、の4点である。このうち(1)から(3)は昨年度からの継続の課題である。
困難なクラスに属する組合せ最適化問題に対する集中化/多様化制御法の開発

我々はアルゴリズム工学の中でも特に離散最適化アルゴリズムのメタ解法を開発し,同時にデータ構造の工夫を盛り込んだプログラムを開発した.主に,配送計画問題やスケジューリング問題を扱った.また,アルゴリズムそのもののみならず,そこで得られた理論的知見を国内外で発表した.そして,メタ解法の開発過程で得られた成果を元にして最大クリーク問題,グラフ分割問題,チャネル割当問題に対するアルゴリズムをアルゴリズム工学の成果の一つであるアルゴリズムデータベースにおいてデモプログラムとして公開している.配送計画問題に関しては,実務で重要とされまた学術的にも困難という意味で興味深いソフト時間枠制約を考慮した近傍探索を高速に計算する方法を開発した.また,配送と在庫を同時に考慮した在庫配送計画問題も扱った.配送経路のみならず,各顧客を訪れる時間間隔を適切に調節するアルゴリズムを開発した.時間間隔の調整は動的計画法で,配送経路の改善は近傍探索によって行った.配送のみと在庫のみを分けて最適化した場合に比べ,総費用が大幅に削減できることを計算実験により確かめた.スケジューリング問題に関しては,ジョブショップスケジューリング問題や資源制約付きスケジューリング問題に対する変数固定テストの高速化手法を提案した.変数固定テストは本来厳密な意味での最適解を求める手法のなかで開発されたテストであるが,近似解を求める過程でも解空間の探索額域を狭くするための実用的手法として近年その有用性が認識されている.変数固定テストは,人工知能分野でよく知られている制約伝搬技術をスケジューリングに特化したものであるとも言える.我々はアルゴリズム工学の中でも特に離散最適化アルゴリズムのメタ解法を開発し,同時にデータ構造の工夫を盛り込んだプログラムを開発した.主に,配送計画問題やスケジューリング問題を扱った.また,アルゴリズムそのもののみならず,そこで得られた理論的知見を国内外で発表した.そして,メタ解法の開発過程で得られた成果を元にして最大クリーク問題,グラフ分割問題,チャネル割当問題に対するアルゴリズムをアルゴリズム工学の成果の一つであるアルゴリズムデータベースにおいてデモプログラムとして公開している.配送計画問題に関しては,実務で重要とされまた学術的にも困難という意味で興味深いソフト時間枠制約を考慮した近傍探索を高速に計算する方法を開発した.また,配送と在庫を同時に考慮した在庫配送計画問題も扱った.配送経路のみならず,各顧客を訪れる時間間隔を適切に調節するアルゴリズムを開発した.時間間隔の調整は動的計画法で,配送経路の改善は近傍探索によって行った.配送のみと在庫のみを分けて最適化した場合に比べ,総費用が大幅に削減できることを計算実験により確かめた.スケジューリング問題に関しては,ジョブショップスケジューリング問題や資源制約付きスケジューリング問題に対する変数固定テストの高速化手法を提案した.変数固定テストは本来厳密な意味での最適解を求める手法のなかで開発されたテストであるが,近似解を求める過程でも解空間の探索額域を狭くするための実用的手法として近年その有用性が認識されている.変数固定テストは,人工知能分野でよく知られている制約伝搬技術をスケジューリングに特化したものであるとも言える.組合せ最適化問題に対する効率的な最適化法の開発は,工学における最重要問題の一つである.本研究では,種々のメタ解法に体汁系統的な数値実験を通して得た知見を一段高い視点から整理した結果,優れたメタ解法の設計のための基本指針として,集中化(良い解の周辺を探索すること)と多様化(同じ領域を探索しないようにすること)の二つの相反する戦略を統合することが重要であるとの結論を得た.本研究では,この知見を踏まえて一般性のある効率的な算法である集中化/多様化制御法を構築した.ここで提案するメタ解法の設計思想は,従来のほとんどのメタ解法に集中化および多様化を付加的に組み込むことが可能なテンプレートを提供するものである.本年度の研究では,集中化/多様化制御法の実装と種々の組合せ最適化問題(巡回セールスマン問題,最大クリーク問題,グラフ彩色問題,運搬経路問題,グラフ分割問題,ジョブショップスケジューリング問題,二次割当問題,多重制約ナップサック問題)への適用を行うための準備として,集中化/多様化制御法のテンプレートを作成した.組合せ最適化問題に対する効率的な最適化法の開発は,工学における最重要課題の一つである.本研究では,種々のメタ解法に対する系統的な数値実験を通して得た知見を一段高い視点から整理した結果,優れたメタ解法の設計のための基本指針として,集中化(良い解の周辺を探索すること)と多様化(同じ領域を探索しないようにすること)の二つの相反する戦略を統合することが重要であるとの結論を得た.本年度の研究では,この知見を踏まえて一般性のある効率的な算法である集中化/多様化制御法を設計し,種々の組合せ最適化問題(巡回セールスマン問題,最大クリーク問題,運搬経路問題,グラフ分割問題,多重制約ナップサック問題)への適用を検討した.我々は,困難なクラスに属する組合せ最適化問題に対する集中化/多様化制御法の開発として,アルゴリズム工学の中でも特に離散最適化アルゴリズムのメタ解法開発を行い,時間枠付き配送計画問題,在庫配送問題,移動体通信網におけるチャネル割当問題,ジョブショップスケジューリング問題などに対する非常に優秀かつ頑強なアルゴリズムの開発に成功した。アルゴリズムそのもののみならず,そこで得られた理論的知見は国内外の学会で多大なる関心を受けることとなった。本年度に発表した学会は以下の通りである。・INFORMS・スケジューリング学会・日本オペレーションリサーチ学会・アルゴリズム工学全体会議本研究の成果のいくつかは,特定領域研究(B)「アルゴリズム工学」の成果のひとっであるアルゴリズムデータベースにおいてデモプログラムとして公開している。
脳梗塞発症前・後の運動療法による機能回復と神経保護メカニズム解明に関する研究

ラットを用いて3週間のトレッドミル運動(25m/min、30分/日、5回/週)を行い、予防運動後に脳梗塞を作製した。その後、梗塞巣の体積や運動感覚機能を評価した。また、内在性保護タンパクである14-3-3γ、預血誘導因子であるHIF1α、ATP受容体でイオンチャンネル型P2X受容体であるP2RX7、活性化アストロサイトのマーカーであるGFAP、アポトーシスに関与するBax、Caspase-3、さらにリン酸化β-catenin Ser37の発現を調べた。運動によって14-3-3γ、HIF1α、P2RX7の発現量が増加しており、虚血類似ストレスが脳に生じ虚血耐性を獲得することが確認された。脳梗塞後に、14-3-3γ、HIF1αは運動群で有意に増加し、14-3-3γの増加と関連して、p-β-catenin Ser37も有意に増加していた。さらに、Bax、Caspase-3の発現量が有意に減少し、脳梗塞巣の縮小と運動-感覚機能も非運動群と比較して運動群で有意に改善していた。本研究では、虚血前の運動が内在性の保護因子であるHIF-1α及び14-3-3γの発現を介して脳虚血耐性を誘導することを示唆した。preconditioning exerciseによって増加した14-3-3γは、神経保護機構の1つの基礎をなす14-3-3γ/p-β-catenin Ser37/Bax/Caspase 3の抗アポトーシス経路による神経細胞死を減少させ、脳梗塞後の脳梗塞体積および運動-感覚障害を減少させることを示唆した。計画通り研究計画が進行しており、研究成果を国内、国外に発表している。当該年度は、定期的な運動トレーニングによる脳梗塞後の神経保護効果を免疫組織化学的、分子生物学的に調べた。実験動物にはSD系雄性ラットを使用し、無作為に運動群、非運動群、運動のみ群、コントロール群の4群に分けた。運動介入としてトレッドミル運動(25m/min、30分/日、5回/週)を3週間行った。非運動群とコントロール群は3週間の自由飼育とした。運動群と非運動群は3週後に脳梗塞モデルを作製し48時間後に脳を採取しTTC染色によって梗塞巣の体積を測定した。脳内の生理活性物質として、神経栄養因子(MK、BDNF)、反応性アストロサイト(GFAP)、微細血管(PECAM-1)、アポトーシス(Caspase-3)、酸化障害(Nitrotyrosine:NT)の抗体を用いて免疫組織化学染色とWestern blottingを行った。3週間の運動により、脳梗塞巣の体積縮小と運動-感覚機能改善が見られた。免疫組織化学染色の結果、運動群は非運動群に比べ、MK、BDNF、GFAP、PECAM-1免疫陽性細胞面積が有意に増加していた。運動群のCaspase-3やNTは非運動群と比較して有意に減少していた。Western blottingも同様の結果であった。これらの結果より、定期的な運動により神経保護効果が認められ、神経栄養因子の発現増加によるアポトーシスや酸化ストレス抑制が神経保護作用に関与していることが示唆された。今年度の学術研究助成基金助成金により、我々の研究室でタンパク定量、分析が行えるようになり大幅に研究が進んだため。申請時の予定通り、定期的な運動トレーニングによる脳損傷後の神経保護効果の継続期間の検討、高齢脳を対象として運動が神経保護作用に及ぼす分子機構を検討していく。
ラクトコッカスのプラスミドを応用した口腔レンサ球菌の耐酸性因子の検索

アルカリSDS超遠心法により単一バンドの12.5ng/ulのpGB301を抽出した。ウマ血清を加えたTodd-Hewittbrothで培養した上記3株の質転換効率をpGB301のerythromycin分解酵素を指標として測定した。上記3株ともpGB301によってerythromycin耐性に形質転換され、1.5×10^4から5.5×10^4cfu/ugの形質転換効率を示した。この転換効率は菌の回収時間が早いほど高効率を示した。すなわち、菌を培地に植菌して、560nmでのoptical densityが0.1程度の時がもっとも効率がよい結果となった。電気的穿孔法により形質転換を行うと、効率は5倍に上昇することがわかった。S.milleri 10707をEthyl methanesulfonateを用いて変異株を作製し、低pHに感受性を示す株を選択した。変異株は塩酸でpHを調整したpH5.0のTodd-Hewittbrothに植えると、pHが4.6になったところで成育を止めてしまうのに対し、親株は4.2まで成育した。この菌株の形質転換効率は1.4×10^3cfu/ugであった。5.βガラクト糖類はミュータンスレンサ球菌によって代謝されなかったがこれを分解する酵素は存在することが分かった。上記3株ともpGB301によってerythromycin耐性に形質転換され、1.5x10^4から5.5x10^4 cfu/ugの形質転換効率を示した。
チロシナーゼ陰性型白皮症の病因であるチロシナーゼ遺伝子の異常についての研究

先天性白皮症のうち、チロシナーゼ(以下Taseと略す)陰性型においては、染色体TaseDNAの塩基配列の変異により色素細胞内に活性のない不完全なTaseが作られ、それが病因となることを我々は世界に先駆けて発表した。今までに我々が日本人の患者3人において見い出した異常は、Tase遺伝子の蛋白codingregionの一塩基挿入によるnonsence mutation(Biochem Biophys Res Commun 164:990,1989)とpoint mutation(J Biol Chem 265:17792,1991)である。Tase遺伝子のプロモーター領域の異常により、RNA転写が起こらず、そのためTaseの蛋白合成がなされないために発症する白皮症もあるはずである。しかし、このような症例の報告はまだない。このような症例では、今までの様なTase蛋白のcoding regionの異常の検索をいくら行っても決して、その病因を明らかにできない。そこで今回の研究では、プロモター領域の異常の検索も行えるようなシステムの開発を試みた。そのためにまず、正常なプロモター領域の解析を行った。その結果、ヒトTaseのプロモター領域として、転写開始点より上流までの約200塩基が得られた。しかし、これはマウスのプロモター活性と比べて3-4倍低い。そのため、ヒトのTase遺伝子においては、発現を促進するようなElementが、もっと上流領域に存在する可能性が示されました。事実、Tase遺伝子の転写開始点よりも約1.8kbから2.0kbの間約200bpに、SV40プロモターのコントロール下で色素細胞特異的なエンハンサー活性を検出した。さらに、この約200bpを解析した結果、エンハンサー活性に不可欠であった39bPのコアエレメントが同定された。今後、Tase陰性型患者のうち、Tase蛋白のcoding regionの異常の見い出せない場合は、Tase遺伝子のプロモターおよびエンハンサー領域の異常の検索を行う予定である。
Drug Delivery systemを応用した悪性脳腫瘍の集学的治療に関する研究

1)悪性脳腫瘍の治療は手術的摘出、化学療法および放射線照射が主体であるが、全摘出が不可能であり、適正な補助療法の開発がまたれている。徐放性制癌剤ペレットは、高濃度の制癌剤を針状の高分子材料の中に包理可能であること、複合体の制癌剤の徐放期間が約30日まで可能である、作成は低温下で行うために制癌剤の活性がおちない、などの利点があり、一回の局所投与で大量の制癌剤を腫瘍内に投与できる方法である。今回は徐放性5Fu含有複合体を用いて、悪性脳腫瘍症例に対して、局所投与をし、その後放射線照射およびACNUなどによる化学療法を施行した。これらの治療を行なった悪性脳腫瘍と通常の治療を行なった症例の臨床病理像の検討と長期予後について検索した。54例の星細胞系腫瘍のうち12例がDDS(5Fu)を応用した集学的治療を行なっている。このうち膠芽腫よりも星細胞系腫瘍でわずかに平均生存期間が延長した。2)神経膠腫の増殖能を免疫組織化学的方法にて検討した。Ki67のモノクロナール抗体MIB-1はホルマリン固定、パラフィン包埋切片で検索が可能となり、腫瘍全体像としての増殖能の検索が可能となった。MIB-1陽性率は膠芽腫初発例では13.7%、再発8例では14.1%で大きな変化は見られなかった。悪性星細胞腫では初発で11%、再発時には9%である。良性の星細胞腫では平均2.5%である。病理所見と増殖能とは比較的一致する。subependymal giant cell astrocytomaは良性腫瘍といわれているがMIB-1陽性率6-10%のものもみられ、これらはいずれも再発している。この様に増殖能の検索は治療にあたり、極めて重要であることがわかった。悪性脳腫瘍に対して高分子材料をcarrierとした徐放性制癌剤による局所療法を主体とした集学的治療を行った。これらの臨床例の解析をおこない、今後の研究の指標とする。すなわち、ACNU徐放性剤と5Fu徐放性剤によって治療された症例では明らかにその効果について差があり、これが腫瘍の組織学性格によるものか、担体によるものなのか、検討する。まず、悪性脳腫瘍の病理形態学的検索では、とくにmalignant gliomaをGFAP,S-100,MBP,Vimentin,NSE,Ki-67などのいわゆる腫瘍マーカーを用いたimmunohistochemical methodにて検討し従来の組織学的及び電子顕微鏡検索結果と合せて、その悪性因子について研究した。悪性神経膠腫、とくに膠芽腫は局所療法を加えた放射線化学療法にても充分な治療効果は上げられなかった。しかし、2例は4年生存しており、一部には従来の治療より効果がよい症例もみられた。本治療を行った5例の悪性膠腫において、再発手術により得られた組織標本の検索を行った。局所治療後の免疫反応について免疫組織学的検索を行った。結果:1)脳腫瘍再発部周辺では免疫反応としてリンパ球浸潤、とくにT細胞の浸潤と反応性グリアの増生が見られた。2)周辺組織は結合組織の増生が強く見られ、局所治療投与された抗腫瘍剤がこの結合組織で覆れる傾向にあった。3)徐放性抗腫瘍剤の投与され部位は著明な腫瘍組織壊死が見られた。悪性脳腫瘍は他の腫瘍に比べて外科的全摘出術が不可能であり、治療成績が極めて悪い。

しかも、化学療法に関しては脳血液関門の存在のため従来の投与方法では制癌剤が病巣内に十分に到達しないことが、脳腫瘍の治療をさらに困難にしている。このためには制癌剤に徐放性機能を持たせ、局所投与可能な製剤を作る事である。これによって、局所の残存腫瘍を初回の治療によって制御し、さらに、集学的治療を行い得るようにする。これらの治療により悪性脳腫瘍の治療効果を向上するためには脳腫瘍の生物学的検討が必要不可欠である。病理組織学的検索では、通常の検索による悪性度および組織診断をおこない、さらに免疫組織化学的検索を詳細に行い、腫瘍の増職能などを検索した。これに各種の本治療による抗腫瘍効果の判定を病理組織学的に検索した。この結果、複合体を用いた局所治療を行った症例の病理解剖学的検索では本剤による腫瘍組織の壊死範囲は僅かに10mmであったが、腫瘍増殖抑制は確実に効果はみられた。また、5Fu-ラクトン共重合体の徐放性剤を作成し、悪性脳腫瘍に応用した。これについては、強い局所反応と抗腫瘍性が見られた。本剤は生体分解型であり今後有用と考えられる。一方、本治療を行った症例の予後調査において、膠芽腫4例において3年間有意義な成績を治めた。これらの症例の中で再発時の腫瘍および腫瘍周辺組織の免疫組織学的検索にて腫瘍周辺組織において反応性グリアの増生、リンパ球浸潤およびT細胞の浸潤がみられた。さらに、補助療法であるBRM療法との併用ではその腫瘍組織内に免疫学的にT細胞の増加が見られた。頭蓋内悪性リンパ腫では腫瘍組織内の浸潤能をGFAP陽性細胞の程度で調べ、増殖能をPCNA、またはMIB-1陽性細胞率で検索した。この結果浸潤能はその予後にはおおきな影響はおよぼさなかった。しかし、増殖能はその予後に関与していた。悪性脳腫瘍の治療は手術的摘出、化学療法および放射線照射が主体であるが、全摘出が不可能であり、適正な補助療法の開発がまたれている。従来の化学療法は腫瘍を制するまでに至らず、その治療予後は慘澹たるものである。これは、制癌剤が脳腫瘍に十分浸透せず、腫瘍内濃度が上らないためである。これを解決するために髄腔内投与や内径動脈内投与などが試みられている。我々の徐放性制癌剤ペレットは1)高濃度の制癌剤を2mmX10mmの針状の高分子材料の中に包理可能であること、2)高分子材料と制癌剤の複合体は制癌剤の徐放期間が約30日まで可能である、(3)複合体の作成は超低温下で行うためにどの様な制癌剤でも使用可能である、などの利点があり、一回の局所投与でしかも大量の制癌剤を長期間、脳腫瘍ないに投与できる方法である。この治療法の確立されれば悪性脳腫瘍の治療成績は一段と向上するものと考えます。今回は徐放性5Fu含有複合体を用いて、悪性脳腫瘍例に対して局所投与をし、その後、超高圧X線照射とACNU、またはCDDPなどの化学療法を施行した。これらの治療を行った悪性脳腫瘍と通常の集学的治療を行った症例の臨床病理像の検索と長期予後について検索した。54例の悪性星細胞系腫瘍のうち12例が徐放性5Fu剤を用いて集学的治療をおこなっている。多形性膠芽種と悪性星細胞腫では悪性星細胞腫で僅かにその平均生存期間が延長した。Mixed gliomaとくにoligo-astrocytoma20例について組織像および増殖能と治療成績について検討した。Astrocytic cellとoligodendrogliaが分かれて存在するような腫瘍ではMIB-1増殖能のひくく、治療成績もよい傾向にあった
異環境生物のエネルギー

異常に極端な環境に生存する生物では,自身の環境に適応/進化できたか否かでその種の存続の可否が決まったと考えられる.この研究では,これらの異常環境に生息する(微)生物が工夫/改変して持つ独特のエネルギー転換系の構造と作動機作を解明することと,これを通じて常環境のエネルギー転換系についての理解を深めることを目的とする.本年度研究結果抜枠:高度好塩性古細菌ハロバクテリアで,そのH+駆動型ATP合成酵素が従来全ての好気性生物の酵素として普遍的であると考えられていたF_0F_1型と異なって,分子量32万, α_2β_2というサブユニット構成をもつ触媒部位(ATPアーゼ)を含んでいることが示された.さらにこのATPアーゼの抗体は,他の古細菌のATPアーゼおよび植物液胞のアニオン感受性H^+ATPアーゼと強い交叉反応をしたが, F_1ATPアーゼとの反応は非常に弱かった.これにより, H^+ATPアーゼ/ATP合成酵素の全体像/進化について考察する新しい緒が得られた.好酸好熱性古細菌スルホロブスからもATPアーゼが単離され,この酵素の抗体はハロバクテリアのATPアーゼともFiATPアーゼとも交叉反応をした.このことも, H^+ATPアーゼ研究に新展開を予期させる.好酸性鉄酸化細菌でチトロクロムc-552と同酸化還元酵素が単離同定され,この細菌の特異な電子伝達系の様相が明らかになりつつある.海洋細菌ではNa^+排出型呼吸鎖の普遍性を示唆する結果が得られ,腸炎ビブリオではNa^+駆動型ATPアーゼの存在が示唆された.好アルカリ性菌のNa^+駆動型ブ毛モーターでは,特異的阻害剤としてアミロライドが見出され,モーター機構の解明に新しい緒が見出された.本年度の研究は極めて順調に進捗し,また新しい展開が期待される局面を迎えていると考えられる.相互の連携を強めて,なお一層の相乗的な成果増大を計る.異常に極端な環境に生存する生物では,自身の環境に適応/進化できたか否かでその種の存続の可否が決まったと考えられる.この研究では,これらの異常環境に生息する(微)生物が工夫/改変して持つ独特のエネルギー転換系の構造と作動機作を解明することと,これを通じて常環境のエネルギー転換系についての理解を深めることを目的とする.本年度研究結果抜枠:高度好塩性古細菌ハロバクテリアで,そのH+駆動型ATP合成酵素が従来全ての好気性生物の酵素として普遍的であると考えられていたF_0F_1型と異なって,分子量32万, α_2β_2というサブユニット構成をもつ触媒部位(ATPアーゼ)を含んでいることが示された.さらにこのATPアーゼの抗体は,他の古細菌のATPアーゼおよび植物液胞のアニオン感受性H^+ATPアーゼと強い交叉反応をしたが, F_1ATPアーゼとの反応は非常に弱かった.これにより, H^+ATPアーゼ/ATP合成酵素の全体像/進化について考察する新しい緒が得られた.好酸好熱性古細菌スルホロブスからもATPアーゼが単離され,この酵素の抗体はハロバクテリアのATPアーゼともFiATPアーゼとも交叉反応をした.このことも, H^+ATPアーゼ研究に新展開を予期させる.好酸性鉄酸化細菌でチトロクロムc-552と同酸化還元酵素が単離同定され,この細菌の特異な電子伝達系の様相が明らかになりつつある.海洋細菌ではNa^+排出型呼吸鎖の普遍性を示唆する結果が得られ,腸炎ビブリオではNa^+駆動型ATPアーゼの存在が示唆された.好アルカリ性菌のNa^+駆動型ブ毛モーターでは,特異的阻害剤としてアミロライドが見出され,モーター機構の解明に新しい緒が見出された.本年度の研究は極めて順調に進捗し,また新しい展開が期待される局面を迎えていると考えられる.相互の連携を強めて,なお一層の相乗的な成果増大を計る.
デジタル動画を使用した外国人のための漢字学習システムのWWW化

日本語教育環境を整備の基礎となる効率的な漢字学習支援システムを構築することが本研究の目的である。本研究の代表者は、平成7年度から本重点領域研究(平成10年度より特定領域研究)の助成を受け、2056字の漢字のデジタル動画データを作成し、常用漢字すべておよび日本語能力試験一級出題範囲すべての漢字学習を支援する漢字データベースを構築してきた。これまで主にMacintosh上で開発してきたが、昨年度からは、学習システムをインターネット上でコンピュータの機種に関係なく広く公開するための手法を研究し、現在ではデータとともにその手法とプログラムを公開している。これまで開発し、現在世界中の学習者が利用できる本システムは、インターネット上で公開しているもので、以下のサイトから漢字学習支援システム「WWKanji」の利用が可能となっている。ここに置いているデータは、漢字2056字分の音訓、画数、筆順が見られる動画、熟語情報である。知りたい漢字が簡単に見つけられるように検索ページがある。各漢字カードには、筆順を示す動画がQuickTimeムービー形式でおいてあり、何度でも繰り返し見て覚えることができる。「WWKanji」の構成は、表紙のページ、List of Kanji(一覧表示)、Search Page(漢字検索)である。表紙のページには、主旨、構成、使い方などの簡単な解説があり、List of Kanji(一覧表示)では2056字の漢字の一覧表があり、見たい漢字をクリックするとその漢字のページに移動できる。Search Page(漢字検索)は、漢字の音訓、画数、熟語などを手がかりに見たい漢字を探すときに使う。この他に、自分で書いた漢字をお手本と比べて評価する「JKanji」という練習機能も用意した。このぺ一ジは「WWKanji」の各漢字カードから移動できるようになっている。JKkanjiでは、練習したい漢字を左のリストから選び、お手本を見て、右側の四角に書いて、書き終わったら「Finish」というボタンを押す。システムはお手本と比べて、形を100点満点で、筆順を○か×で評価する。「JKanji」はまだ開発途中のもので実験段階であるが、今後も試用、改良を重ねて、よりよい日本語学習支援システムの開発を進めていく予定である。
虚血性脊髄運動障害の機能再生のための骨髄幹細胞移植の試み

骨髄幹細胞が神経細胞へ分化する可能性が示唆された今までのエビデンスをもとに、脊髄においても移植した骨髄幹細胞は神経細胞へと分化するという仮説をたてた。従来の研究手法が、脊髄への直接的移植であり、移植手術に発生する組織の炎症及び炎症性物質が、骨髄幹細胞の神経細胞への分化を阻み、神経膠細胞への分化へ導くと考え、別の移植経路として経動脈的移植を試みた。ラット脊髄虚血モデルは、大動脈の一過性遮断・再灌流に低血圧を負荷し作成した。虚血後の自然な運動機能回復期間とされる2週間を経た後に、下肢運動機能障害が持続しているラットを用い、経大腿動脈的に移植を行なった。脊髄の組織の検索により、移植細胞の一部に神経細胞の特異的マーカーを認めた。しかし、多数の細胞が移植できたにも関わらず、血管外の組織に遊走する細胞は少なく、神経細胞の特異的マーカーを示す細胞も少なかった。運動機能の評価においても、組織での評価と同様、運動機能の回復を示すものはなかった。この研究において、経動脈的な移植により多数の骨髄幹細胞が、手術で生じるような組織の損傷なく、移植が行なえるという点は特筆すべき結果である。また、血管外に遊走した細胞の一部は神経細胞に分化した可能性も示唆された。しかし、多数の細胞移植が可能だったにも関わらず、虚血組織への遊走が少ないのは、虚血組織の誘引に比べ、骨髄幹細胞の血液に対する親和性が高かったのかもしれない。今後、骨髄幹細胞の移植を成功させるには、骨髄幹細胞の走化性因子の研究が必要である。平成17年の目標は、ラット脊椎虚血モデルを確立し、Green fluorescent protein(GFP)を遺伝子導入したラット(グリーンラット)から得た骨髄幹細胞を経動脈的に移植し、運動機能評価をすることである。すてにラット脊椎虚血モデルを確立していたため、ただちに経動脈的移植を行った。移植後の経過を判定するのに約3ヵ月かかるため、現在移植は3回目の結果を待っている段階である。第1回の実験では、グリーンラットを使用したが、2回目以降は、グリーンラットの供給が停止しているため、通常のラットを用いて実験を行った(グリーンラットを供給している日本SLCと米国の企業間でのパテントの問題が生じたため、この1年間一時的に供給が停止している。尚、この問題を解決するために、現在当施設での自家繁殖の手続きを行っていて、組換えDNA実験委員会と動物実験委員会の許可を受けたばかりである。親となるグリーンラットは、岡山大学から分与される予定である)。移植後、下肢の運動機能に改善を認めたラットがいるか、初期の麻痺の程度により改善にばらつきがあるため、現在、統計学的検討を行っている。組織学的検討では、経静脈的投与に比べ経動脈的投与では明らかにグリーンラット由来の細胞が多いが、移植した細胞が多いと塞栓を生じている箇所があり、移植細胞数の検討を行っている。脳への骨髄幹細胞の移植実験の報告から、骨髄幹細胞がニューロンの細胞マーカーを発現した細胞へ分化していることは確かであるが、それが機能を獲得しうるか否かは、未だ明らかではない。このため、介在ニューロンに分化するための骨髄幹細胞の培養条件の検討を開始した。基本となる培養条件は、Deng Wらの方法(Biochem Biophys Res Commun 2001)に則して検討している。幹細胞は、種々の細胞へ分化する可能性のある細胞であり、骨髄にも存在する。本研究の目的は、骨髄に存在する幹細胞をラットの脊髄虚血後対麻痺モデルへ経動脈的に移植し、(1)移植した幹細胞が神経細胞へ分化するか、(2)移植の手段として、経動脈的方法の可能性はどうか(経静脈的方法との比較)、(3)さらに、移植により運動機能を回復させる可能性があるか等を検討することにある。

今回の研究成果として以下のことが分かった。(1)移植した幹細胞が神経細胞へ分化する可能性が高い:移植した骨髄幹細胞を免疫組織学的に検索したところ、移植に用いたグリーンラットの骨髄幹細胞と考えらえられる緑色自発発光した細胞が、脊髄に認められた(移植の成功を示唆する)。さらに、その一部は、神経細胞のマーカーであるNeuronal N陽性であった。マーカー陽性と陰性の両方の細胞が存在することから、移植細胞の一部が神経細胞になった可能性が高いと考えられた(第42回日本脊髄障害医学会にて発表予定)。(2)経動脈的移植の可能性は高い:従来の移植の方法である障害脊髄局所への移植や経静脈的移植に比べ、経動脈的移植は移植されて残存する細胞が多く、このため、神経細胞へ分化した移植細胞を確認できた。このことは、経動脈的移植が成功率の高い移植方法である可能性を示唆している(第42回日本脊髄障害医学会にて発表予定)。(3)運動機能の回復に関しては、未だ確認できていない:移植した細胞が生存し、神経細胞に分化している可能性が高いが、運動機能の回復には至っていない。これは、神経細胞に分化した後に、新たな神経系ネットワーク(情報伝達経路)の回復のための手助けが必要なことを示唆するものである。
ヒト血管移植片に対する抗ドナー抗体の病的意義と免疫抑制性細胞による治療効果の検討

本研究ではNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)マウスに消化管手術患者の腸管膜動脈を移植するヒト血管移植モデルの構築を目指した。しかし移植後に血栓閉塞の合併症ががみられ、その原因にGr-1+細胞の関与が疑われた。そこで移植マウスをBALB/c IL2Rg -/- Rag -/- (BRG)マウスに変更した。またヒト皮膚の移植モデルにも着手、デルマトームで採取した余剰皮膚を用いて、最終年度にNSGマウスへのヒト皮膚移植を実施した(n=8)。しかし、同様にGr-1+細胞による異種反応により移植片の生着が得られなかった。皮膚の提供件数が少なく研究が滞る現状があり、定期的にヒト皮膚が得られる施設との共同研究を準備している。また繁殖後のBRGマウスを用いて、C57BL6をドナーとした心移植を実施した(n=3)。拒絶反応無く全例生着し、興味深いことに心グラフト内のpassenger細胞が免疫不全マウスに生着し、マウス末梢血でT細胞の存在が確認された。即ち少量のリンパ球も移入可能な実験ツールとしての有用性が示唆された。一方、肝移植後のHLA class II抗体検出例にLabscreenを実施し、血清を14例、延べ28回分採取した。これらのdataをまとめ臨床的意義や陽性症例の特徴につき、複数の学術集会で報告した。また移植後抗体はほぼ全例class IIであり、class I抗体の採取は困難であったが、最終年度に移植前のリンパ球クロスマッチ陽性の保存血清(12例)を測定し、移植後グラフト不全で死亡した5例は予後良好の7例と比べ有意に高値(DSA-MFI 2万程度)であった。このように抗HLA抗体の臨床的な意義(線維化や予後との関与)は明らかにできたが、病理学的機序は未だ不明であり、今後のヒト化マウスを用いた研究で明らかにしたい。平成28年度はヒト腸間膜動脈を用いたヒト化マウス血管移植モデルを確立すべく、結腸切除などの手術検体から腸間膜動脈を採取、NSGマウスの腹部大動脈に置換移植した。結果、移植した全マウスが生存し、モデル確立と考えられたが、移植後2週間以内に移植血管は全て閉塞した。原因として、免疫不全マウスの種類が考えられ、研究代表者が留学先で同モデルを確立した時と同じBALB/c IL2Rg -/- Rag -/-マウスを輸入し、我々の施設で繁殖、使用することとした。そのため血管移植モデルの確立にマウスの繁殖を待つ必要があった。一方で、肝移植後のHLA class II抗体検出症例から同意を得て、抗体量をLabscreen single antigen testで測定し、抗体を含む血清をー80度に保存した。同意を得た症例は8例、延べ11回であり、計画通り必要な抗体量の採取、保存が進んでいる。また本実験では、まず抗体のみを投与し、血管病変に及ぼす影響と機序解析を検討しているが、抗体のみで血管病変が生じなかった場合には、抗HLA抗体産生がみられる肝移植患者のリンパ球を免疫不全マウスに再構築する予定である。その準備として、マウスにヒト免疫細胞を移入した時の抗体産生性B細胞の再構築の有無につき検討した。まず健康成人(n=5)のヒト末梢血単核球2.5x106個を免疫不全マウスの腹腔内に投与し、21日目のマウス脾臓内にヒトCD45陽性細胞が21.37±2.76(Mean±SEM)%構築されることを確認した。それらヒトCD45陽性細胞の大部分はヒトCD3陽性T細胞(86.45±3.08%)であったが、ヒトCD19陽性B細胞も9.50±2.80%確認された。このことはヒト化マウス内に抗体産生性のBリンパ球が再構築できたことを示唆するが、今後実際にHLA抗体の産生が確認されるか観察が必要である。血管移植モデルの作成でマウスの問題からと考えられるモデルの確立に難渋したが、新しく導入した免疫不全マウスの繁殖状況は順調であり、microsurgeryの技術は安定しているため今後モデルの確立が可能と考えている。患者血清からの抗体採取は順調に進んでおり、免疫不全マウスへのヒト免疫システムの構築は確立された。これらの状況を総括して概ね順調に進んでいると考えている。平成29年度はNSGマウスと異なる免疫不全マウスであるBALB/c IL2Rg -/- Rag -/-マウスを輸入し、我々の施設で繁殖した。このマウスは研究代表者が留学先でヒト化マウス血管移植モデルを確立したものと同種である。まずこのマウスをレシピエントとした時のアロ系統マウス移植モデルが確立できるのか確認した。アロ系統であるC57BL6マウス(H2kb)の心グラフトをBALB/c IL2Rg -/- Rag-/-マウス(H2kd, 129)の腹腔内に異所性移植したところ、拒絶反応は観察されず全例(n=3)生着した。則ち免疫不全マウスに見られる自然免疫系による反応での拒絶反応は観察されなかった。移植モデルへの使用が可能であることを確認した後、まずはヒト組織に対する反応を観察することした。平成28年度の成果でNSGマウス(BALB/c IL2Rg -/- Rag-/-

マウスより自然免疫の関与が強いと考えられる免疫不全マウス)においてヒト血管グラフトは血栓形成をきたすことを報告したが、これが自然免疫による炎症反応の結果なのか、移植手技の問題であるのか判定が困難であった。そこで手技的にはより簡便で確立されている皮膚移植を用いて検討することとした。ヒト皮膚は形成外科との共同研究とし、デルマトームで皮膚移植用に採取した組織のうち余剰分がでた場合に提供頂く計画を立案した。ヒト組織を使用する臨床研究となるため北海道大学病院が定めるIRBにて承認を取得し、現在組織採取の同意が得られる症例選択を行なっている。一方、肝移植後のHLA class II抗体検出症例から同意を得て、抗体量をLabscreen single antigen testで測定し、抗体を含む血清をー80度に保存した。同意を得た症例は14例、延べ28回であり、計画通り必要な抗体量の採取、保存が進んでいる。血管移植モデルの作成でおそらくNSGマウスの自然免疫の問題と考えられる血栓閉塞からモデル確立に難渋し、新しく導入したBALB/c IL2Rg -/- Rag -/-マウスでは異種であるヒトへの自然免疫反応を考慮し、簡便な皮膚移植からスタートすることとした。その場合診療科をまたいだ共同研究となるため研究推進に時間を要している。患者血清からの抗体採取は順調に進んでおり、研究に使用する十分量の血清が保存できていると考えている。これらの状況を総括してやや遅れていると考えているが、皮膚移植は一度に多くの移植を施行可能なモデルであり、この実施により研究は飛躍的に推進すると考えている。本研究ではNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)マウスに消化管手術患者の腸管膜動脈を移植するヒト血管移植モデルの構築を目指した。しかし移植後に血栓閉塞の合併症ががみられ、その原因にGr-1+細胞の関与が疑われた。そこで移植マウスをBALB/c IL2Rg -/- Rag -/- (BRG)マウスに変更した。またヒト皮膚の移植モデルにも着手、デルマトームで採取した余剰皮膚を用いて、最終年度にNSGマウスへのヒト皮膚移植を実施した(n=8)。しかし、同様にGr-1+細胞による異種反応により移植片の生着が得られなかった。皮膚の提供件数が少なく研究が滞る現状があり、定期的にヒト皮膚が得られる施設との共同研究を準備している。また繁殖後のBRGマウスを用いて、C57BL6をドナーとした心移植を実施した(n=3)。拒絶反応無く全例生着し、興味深いことに心グラフト内のpassenger細胞が免疫不全マウスに生着し、マウス末梢血でT細胞の存在が確認された。即ち少量のリンパ球も移入可能な実験ツールとしての有用性が示唆された。一方、肝移植後のHLA class II抗体検出例にLabscreenを実施し、血清を14例、延べ28回分採取した。これらのdataをまとめ臨床的意義や陽性症例の特徴につき、複数の学術集会で報告した。また移植後抗体はほぼ全例class IIであり、class I抗体の採取は困難であったが、最終年度に移植前のリンパ球クロスマッチ陽性の保存血清(12例)を測定し、移植後グラフト不全で死亡した5例は予後良好の7例と比べ有意に高値(DSA-MFI 2万程度)であった。このように抗HLA抗体の臨床的な意義(線維化や予後との関与)は明らかにできたが、病理学的機序は未だ不明であり、今後のヒト化マウスを用いた研究で明らかにしたい。