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国産針葉樹の直接酵素糖化処理に向けたイオン液体前処理法の開発

国産針葉樹材からのバイオエタノール生産の実現に向け、国産針葉樹材からセルロースを単離することなく酵素糖化時の効率を向上させるためにイオン液体(1-エチル-3-メチルイミダゾリウムアセテート)を用いた前処理技術を検討した。最大100°C、8時間のイオン液体処理を施した針葉樹材の酵素糖化率は向上し、X線回折法による分析結果からセルロースの結晶構造に変化が見られた。活性炭処理および凍結乾燥法により水分除去した回収イオン液体は微量の溶解物よりも残存した水分が酵素糖化率に多大な影響を及ぼしていることが明らかとなった。国内の木質バイオマス資源、とくに針葉樹材からのバイオエタノール生産の実現に向け、国産針葉樹材からセルロースを単離することなく溶解を最小限に抑え、結晶構造のみを変化させる温和な処理条件を見いだすことにより、酵素糖化効率を向上させる、イオン液体を用いた前処理技術を確立する。イオン液体処理の条件として、既往の研究において、イオン液体の種類、バイオマスの処理量、処理温度、処理時間、水分が挙げられているが、セルロースの結晶構造におよぼす影響は明らかにされていない。そこで、セルロースの結晶構造に影響をおよぼすであろう、処理温度、処理時間、水分の影響について検討した。イオン液体処理における水分の影響についてトドマツを用いて検討したところ、残渣率は96%とほとんど溶解しなかったが、未処理木粉の酵素糖化率が3.7%であったのに対して水分量が10,20%の場合は約60%前後と著しく向上した。しかし50%まで水分量を増加すると38%まで低下した。FT-IRおよびX線回折の結果から水分量の減少とともに、セルロース結晶構造の減少・セルロースIの減少・セルロースIIの増加が示唆された。またイオン液体処理条件の影響について、スギを用いてイオン液体処理における温度および処理時間により酵素糖化率の検討を行った。イオン液体処理で残渣率は95%前後とほとんど溶解しなかったが、酵素糖化率は未処理木粉が約3%であったのに対して、処理温度および処理時間が増加するとともに11-58%と著しく向上していた。元素分析の結果からイオン液体の吸着量は試料に対して1-3%と充分除去できており酵素糖化に影響がないことが明らかとなった。X線回折の結果から酵素糖化率向上とともにセルロース結晶構造の減少・セルロースIの減少・セルロースIIの増加が示唆された。国内の木質バイオマス資源、とくに針葉樹材からのバイオエタノール生産に向け、国産針葉樹からセルロースを単離することなく溶解を最小限に抑え、結晶構造のみを変化させる温和な処理条件を見いだすことにより、酵素糖化効率を向上させる、イオン液体を用いた前処理技術を確立する。昨年度はセルロースの結晶構造に影響を及ぼすであろう水分の影響について検討した。今年度はイオン液体を回収・再利用するにあたり溶解した成分の影響および溶解成分と水分の除去法について検討した。回収したイオン液体処理液は茶色に着色しており、低分子の抽出成分が溶解していることが予想されたことから、各種有機溶媒(ヘキサン、酢酸エチル、クロロホルム等)により溶解成分の除去を試みたが、溶解抽出物はほとんど得られず着色したままであった。そこで活性炭処理を用いたところ、着色物は取り除かれイオン液体はほぼ100%回収することができた。次に大量の水分を除去するため、イオン液体の不揮発性という性質を利用し、凍結乾燥法により除去した。得られた回収イオン液体によりスギ木粉の処理を行ったところ、得られた残渣率は未使用(市販品)と同程度であったが、酵素糖化率は著しく減少した。回収したイオン液体の元素分析を行ったところ、市販品より水素および酸素の比率が若干高かったことから凍結乾燥法のみでは水の除去が不十分であったと考えられた。そこで凍結乾燥後に加熱減圧乾燥を行ったところ、酵素糖化率が向上した。イオン液体処理の条件として検討した、セルロースの結晶構造に影響をおよぼすと考えられた処理温度、処理時間、水分量についてほぼ検討を終了している。水分量を厳密にコントロールした場合、10-20%で酵素糖化率は最大であり、水分量を厳密にコントロールせず約10%(気乾状態)で処理温度および時間について検討したところ、温度および時間の増加とともに酵素糖化率の上昇していることから、酵素糖化率に関してはほぼ最適条件を決定できたといえる。X線回折については全ての試料の分析は終了していないが酵素糖化率の変化とともに結晶構造が変化する傾向はつかめており、当該年度に予定していた研究内容はほぼ終了している。木材化学「イオン液体の回収方法と酵素糖化率におよぼす回収したイオン液体の再使用の影響」

○水可溶部からのイオン液体の回収法(担当:岸野正典(連携研究者))前年度で検討した、成分の溶解を最大限押さえた条件におけるイオン液体[Emim]Acの回収法について、リグニンや抽出成分、低分子化した糖類などの各種溶解成分の影響、水や溶解成分の除去および精製法について検討する。○回収したイオン液体の再使用について:繰り返し使用回数の影響(担当:岸野正典(連携研究者))[Emim]Acの回収および繰り返し利用により蓄積される溶解成分由来の不純物が及ぼす影響について検討する。○回収したイオン液体の再使用について:回収イオン液体の処理時の不溶部結晶構造への影響(担当:中川明子(代表)、研究協力者1名)回収イオン液体を再使用した場合、除去しきれなかった溶解した成分が木材の溶解および再生セルロースの酵素糖化率の低下を生じることが問題であった。そこで回収[Emim]Acを用いて不溶部結晶構造および酵素糖化率への影響について、前年度の手法を用いて検討する。
中学校現場で情報モラル教育実践の定着を図る

○研究概要:新学習指導要領に示されているとおり、「情報モラル」をきちんと教えることが喫緊の課題である。ネットいじめについては、社会問題化する傾向にあり、大人の知らないところで子どもたちのネット社会ができており、それをきちんと把握した上で地域や家庭とともに対策を講じることが必要である。私たちは、それを対処療法的に処理するのではなく、あくまでもその予防として確実に「情報モラル]を徹底する実践を行っていきたいと考え、この取り組みを行った。具体的には、実態調査で生徒、保護者の意識を知る、そこから見えてきた課題を明らかにすることで、保護者啓発や生徒の指導に利用する。課題解決のために、全体計画の見直しを行い、教材、教具を準備する。その上で実践を行い、さらに各先生方から生徒のこと、教材のこと、方向性のことを確認し、職員集団で課題意識を共有する。このことにより情報モラル教育実践の定着を図った。○研究経過:(6月)生徒の実態調査、(6月7月)保護者の実態調査、(7月)調査のまとめ(生徒の実態<昨年度との比較>、保護者の意識実態、生徒と保護者の意識差確認等)、(7月9月)教材準備及び道徳全体指導計画の見直し(10月)懇談会にて保護者啓発(10月)各クラスでの情報モラル教育実践(2月)研究成果のまとめ○研究成果:生徒の実態、保護者の実態、今しなければならないことを明らかにした上で、保護者に情報モラルの年間指導計画を示す、さらに学校の情報教育部で教材、教具の準備がすぐにできるセットを準備することにより、全クラスでそれぞれの課題に合った情報モラルに関する授業が実践された。年間指導計画では学年進行で行っていくようにしたが、実際はそうはいかなかった。これは、今本当に目の前にいる生徒にどんなモラル指導をすれば効果的か、それぞれの学年、クラスで考えて実施した経過であり、先生方が今何をすべきか考え実行した結果である。実践してみて指摘されたこととして「擬似体験」をしてみることでより問題の認識が深まるという反省があった。これについても今後よりよい教材を探していく必要が確認された。
低レイノルズ数環境での翼の非定常空力特性予測の研究

高々度等の希薄大気中の飛行は、通常の飛行環境よりもレイノルズ数が大きく下がる。また、地表近傍で飛ばす模型飛行機よりも飛行速度は相当大きく、亜音速ながらマッハ数が高い。本研究では、このような環境で生じる音波と渦放出のカップリングを風洞実験により実証することを主目的とした。減圧風洞を用いて低密度流を作り、翼模型に対して風洞実験を行った。この結果、数値解析で予測される共鳴変動周波数と良好に一致する周波数特性が得られ、音波と渦放出のカップリングの存在が実験的にも明らかになった。高々度や火星大気などを想定した低密度流で実現する低レイノルズ数環境では、航空機の翼近傍で比較的大きなケールの渦変動が発生する。数値シミュレーション及び流れの安定性解析を用いると、高亜音速で渦変動が後縁近傍から発生する音波と共鳴し、カップリングを起こすことが予想される。本研究では、理論的に予測されるこの共鳴現象の存在を、実験的に捉えることを主目的とした。実験には減圧型の東北大学火星大気風洞を用いた。本年度は、昨年度実施した風洞実験の詳細を理解する目的で、流路中に置かれた翼周り流れを数値シミュレーションにより再現し、流路による音響共鳴を考慮に入れた解析を行った。昨年度の風洞実験では、閉流路の幅により決定される離散的な共鳴が支配的になり、翼周り流れ特有のカップリングによる共鳴現象が実現しているかどうかは確認できなかった。しかしながら、高次精度圧縮性数値シミュレーションにより流れと音響変動を直接的に再現することで、実際の周波数は流路の共鳴のみで決定されるのではなく、渦変動と音波のカップリングにより周波数が離散的に選択され、さらに流路幅の共鳴周波数に近いモードが励起されることが確認された。実験と数値計算との共鳴周波数は精度良く一致し、壁面の影響があってもカップリングが起きていることが確認された。さらに、動圧の低い火星大気風洞中の希薄流を熱線流速計により測定し、翼後流部の速度変動を取得することに成功した。その結果、実際に後流の渦変動も音響変動の周波数と一致し、フィードバックにより渦が励起されていることが確認された。低レイノルズ数において音響変動とのカップリングによる共鳴周波数を実験的に明らかにしたのは、恐らく世界初の成果である。今後の低レイノルズ数翼型の空力設計に関して音響変動を含めた非定常変動の重要性が示され、工学的にも流体物理学の観点からも非常に重要な成果であると言える。初年度は、低レイノルズ数での翼周り流れにおいて、数値計算では確認されている渦変動と音響変動のカップリングが存在することを実証するための風洞実験を実施した。NACA0012翼型模型に小型非定常圧力センサーを埋め込み、東北大学浅井・永井研究室の協力を得て減圧型の低レイノルズ数風洞で実験を行った。実験ではレイノルズ数を固定した上でマッハ数・迎角を変化させ、圧力センサーから非定常変動周波数を取得した。年度前半に実施した予備実験を通して、風洞壁と翼模型との間に固有な離散周波数を持つ音響共鳴が存在し、翼周り流れの非定常変動が増大する条件においては、共鳴によって決定される周波数が支配的となることがわかった。この共鳴を抑える目的で、風洞壁にウレタン製の吸音材を据え付けるための吸音壁を製作し、本試験に用いた。この後実施した本試験では、風洞壁に起因する共鳴を完全に抑えることは出来なかったが、翼の後流と境界層それぞれの不安定周波数と壁の共鳴振動数の相互作用により、マッハ数や迎角に対し周波数特性が大きく変化する様子が捉えられた。これは、低レイノルズ数翼周り流れにおいて、異なる周波数選択メカニズムのカップリングが存在していることの証明に繋がる大変重要な発見であり、今後より詳細に流れ場の測定を行う予定である。また、同様の流れ環境下における、最適翼型開発手法のフィージビリティースタディーとして、キャンバーを有する翼に対する数値計算を上述の実験と並行して行っている。こちらは6%厚みのNACA4桁翼を対象として、非定常変動の発生を抑えつつ空力特性が向上する翼型の知見を得ることを目的とする。現在、キャンバーを後縁側に置く場合に非定常変動を抑え空力特性が向上することがわかっている。これに関しては、低速風洞を用いた風洞試験も併用しながら今後研究を進めていく予定である。本研究テーマの最重要課題である、低レイノルズ数翼周り流れにおいて、渦変動と音響変動のカップリングが存在することの風洞実験を通した証明に目処がついたことが挙げられる。実験では予期されていなかった風洞壁と翼模型との音響共鳴が出現するなどの困難があるが、今後数値計算を用いて風洞壁を含めた流れの再現を検討しており、追試験により得られるより詳細な流れデータのとの比較を通して流れ現象の解明に繋げたい。現状では、減圧風洞で得られる実験データは、圧力センサーと感圧塗料による圧力値のみである。

現在、東北大学において、減圧下で熱線流速計を用いた速度変動の取得方法の研究を行っている。熱線プローブに比較的高価な白金線を使用し、プローブを高温に保つことで希薄流れの計測が可能となることがわかってきている。今後はその成果を利用して、より詳細な流れデータの取得を行う。また、低レイノルズ数流れにおいても、高迎角時には剥離剪断層が乱流に遷移することが、数値計算・実験両方で確認されており、この乱流遷移のマッハ数依存性や空力特性への影響の評価が課題である。今後はホットフィルム等を用いた遷移計測なども検討を行っている。翼型の最適化に関しては現在首都大学東京と共同研究を行っており、数値計算による最適化手法の研究を進めると共に、計算により導かれる翼形状の低速風洞を用いた特性評価を行う予定としている。東北大学所有の減圧風洞での実験のために必要な、流速計測のための消耗品、遷移計測用の翼模型、翼模型に埋め込む非定常圧力センサー等が挙げられる。特に非定常圧力センサーは1個当たり10万円超と高価であるが、風洞内の非定常変動を高精度に捉えるために必須なものである。首都大学東京所有の低速風洞用の実験に必要な消耗品も購入予定である。東北大学との研究打合せや実験のため、また国内外の学会やセミナーに参加し成果を発信するための旅費も予定している。
Phytotelmataの昆虫群集構造:環境の異質性と捕食の影響

ウツボカズラ捕虫袋および樹洞の溜まり水に棲息する蚊を中心とした水生節足動物群集構造を明らかにし、その形成と維持にかかわる地史的要因および、すみ分け、競争、捕食などの種間関係の意義を分析することを目的に、これまでの調査で得られているサンプルの同定と分析を進めると共に、樹洞については1988年に開始した佐賀県加部島の照葉樹林での月1回の野外調査を継続し、更に、群集構造の比較のために西表島、対馬で新たなサンプルを収集した。ウツボカズラ捕虫袋内群集については東南アジア各地で収集した15種のウツボカズラからのサンプルのうち、約半分の同定が終了した。次年度に同定を終了し、群集構造と地史的要因や捕牟袋構造などとのかかわりの分析する予定である。同定済のサンプルの一部について詳しく分析し、多様性の高い群集の維持にはウツボカズラ捕虫袋の老若に伴うすみ分け、集中分布による大型捕食者の種間競争の強化と低密度での個体群制御、集中分布による種間遭遇頻度の減少と種間競争緩和、および捕食者による種間競争に強い濾過食者の選択的除去がかかわっていることが推測された。自洞内群集についてはこれまでの定期的調査の結果から夏期に高温小雨による不規則な乾燥が起こるほかに、秋冬期に長期にわたる乾燥が起こることが明らかになった。従って樹洞内群集構造を決める一つの重要な要因は、個々の種が乾燥というカタストロフィ-を克服する能力の強弱にあると考えられたので、この点について、シマカ亜属のヤブカにつき実験室内での詳細な乾燥耐性種間比較を行なった。その結果、これらのヤブカのハビタ-ト選択の種間差は、卵の乾燥耐性の強弱と関連していることが明らかになった。
統合失調症患者におけるニューレグリン1機能の多角的解析

ニューレグリン1は神経細胞や神経細胞を覆うオリゴデンドロサイトの増殖や分化等に影響を与える因子であるが、同遺伝子のHapICEという多型の一つが統合失調症と相関することが知られている。この機能を解析するため、まず我々は統合失調症患者201名、健常者203名から遺伝子解析のための検体を得て解析している。遺伝子解析の結果から、HapICE多型が末梢神経の伝導速度や脳内の神経路等にどの様な影響を与えるかを解析していく。奈良県立医科大学精神科及び奈良県内の精神科に入院中、通院中の統合失調症患者(DSM-IV-TRによる)300名及びボランティアの健常者60名の病歴、経歴を調査し、各々の唾液を採取して、海外共同研究者Corfas (Harvard Medical School, Children's Hospital)に送付する。CorfasがNeuregulin1のハプロタイプを解析する。その結果から、Neuregulin1 (Icelandic Haplotype : HapICE)を有する統合失調症患者、有さない統合失調症患者、有さない健常者を抽出して3群に割り付ける。次にそれぞれの腓腹神経の伝道速度の測定、拡散テンソル画像の撮影、嗅覚の測定、採取した皮膚からiPS細胞を作製し神経細胞、オリゴデンドロサイトに分化させその様態、機能を解析する。これらにより統合失調症においてNeuregulin1-ErbBシグナルがどのような働きをしているのかを多角的に検討していくことを目的としている。現在、統合失調症患者、対照健常者の唾液の採取は終了しており、Neuregulin1遺伝子多型の解析を行っている。解析が終了したら、上記の通り3群に分け、末梢新神経伝道速度、頭部MRI拡散テンソル画像の解析、嗅覚の測定を行っていく。続いてiPS細胞の作製にも着手していく予定である。奈良県立医科大学精神科及び奈良県内の精神科に入院中、通院中の統合失調症患者(DSM-IV-TRによる)300名及びボランティアの健常者60名の病歴、経歴を調査し、各々の唾液を採取して、海外共同研究者であるCorfas(Harvard Medical School, Children's Hospital)に送付する。CorfasがNeuregulinlのハプロタイプを解析する。その結果から、Neuregulinl(Icelandic Haplotyp : HapICE)を有する統合失調症患者、有さない統合失調症患者、有さない健常者を抽出して3群に割り付ける。次にそれぞれの腓腹神経の伝道速度の測定、拡散テンソル画像の撮影、嗅覚の測定、採取した皮膚からiPS細胞を作製し神経細胞、オリゴデンドロサイトなどに分化させその様態、機能を解析する。これらにより統合失調症においてNeuregulinl-ErbBシグナルがどのような働きをしているのかを多角的に検討していくことを目的としている。現在、統合失調症患者、対照健常者の唾液の採取は終了しており、唾液からのDNAの抽出も終了しており、Neuregulinl遺伝子多型の解析を行っているところである。続いて、iPS細胞の作製にも着手していく予定である。奈良県立医科大学精神科及び奈良県内の精神科に入院・通院中の統合失調症患者(診断はDSM-IV-TRによる)、本研究の主旨に賛同する健常対照者の病歴、経歴を調査し、各々の唾液を採取して、理化学研究所分子精神科学研究チーム、副チームリーダー:山田和男(国内研究協力者)に送付し、DNAを抽出する。抽出したDNAをベルゲン大学のB.Havik(海外研究協力者)に送付し、ニューレグリン1の多型解析を行う。その結果から、ニューレグリン1のハプロタイプ(Icelandic Haplotype:HapICE)を有する統合失調症患者、有さない統合失調症患者、有さない健常者を抽出して3群に割り付ける。次にそれぞれの腓腹神経の伝導速度の測定、拡散テンソル画像の撮影、嗅覚の測定、採取した皮膚からiPS細胞を作製し神経細胞・オリゴデンドロサイトなどに分化させてその様態・機能を解析する。これらにより統合失調症においてニューレグリン1-ErbBシグナルがどのような働きをしているのかを多角的に検討していくことを目的としている。現在、統合失調症患者201名、健常対照者203名の唾液の採取は終了し、唾液からのDNA抽出も終了しており、ニューレグリン1遺伝子の多型解析を行っているところである。解析が終了次第、上記の通り3群に分け、末梢神経伝導速度、頭部MRI拡散テンソル画像の解析、嗅覚の測定を行っていく。一部の対象者から皮膚生検を行い皮膚線維芽細胞を得て、iPS細胞の作製を行っている。iPS細胞から神経細胞等への分化誘導についても同時に進行中である。
NMRによるアミロイド線維の成長末端中間体の構造解析

本研究の目的は、β2ミクログロブリン(β2m)アミロイド線維の形成中間体の構造の知見を、パルスラベル重水素交換をはじめとしたNMRの手法を用いて得ることである。19年度にはパルスラベルなしの重水素交換実験を行い、線維末端中間体が存在することを示唆する結果を得た。20年度にはパルスラベル実験とその他数種類の実験を行った。これらの結果から、過渡的な線維末端中間体では、モノマーβ2mと線維が非特異的な相互作用を形成するが、最終的には線維の形態に変化していくものと考えられる。本研究の目的はアミロイド線維末端中間体の構造の知見を、パルスラベル重水素交換実験の結果から得ることであり、19年度の計画は、このパルスラベル重水素交換実験の条件を確立することであった。しかし今年度に行ったのは、パルスラベルなしの重水素交換実験であった。中請書の研究計画・方法の頁で述べたが、パルスラベル方は急激なpH変化を伴うため実験結果が複雑になるという恐れがあり、はじめにより単純な実験系を試みたのである。実験は順調に進行し、線維末端中間体が存在することを示すと思われる結果が得られた。現在はデータの解析中であり、そこから中間体構造の知見が得られると考えられる。線維末端中間体の存在とその構造が明らかになれば、アミロイド線維伸長機構の解明に大きく貢献できると考えられる。また、パルスラベル実験の条件検討は今年度末期から開始している。20年度の早い時期に条件を確立し、本実験に移りたいと考えている。NMRを用いた実験ではないが、本研究に密接に関連する実験として蛍光を用いた線維末端中間体の構造研究も行った。この実験では、β2ミクログロブリンが本来持つ2つのトリプトファンの一つを欠失した変異体を作製し、その残されたトリプトファンの蛍光の線維伸長反応中の変化を観測した。得られた結果から、線維末端中間体は変性したポリペプチド鎖に近い構造を持ち、そのような構造から次第に規則正しい線維構造に変化していくという機構が得られた。この研究の結果は生化学会大会で発表した。蛍光実験からはトリプトファン残基近傍の情報のみが得られるが、NMRでは全残基における情報が得られる。蛍光実験とNMR実験の結果を合わせて、より詳細な線維末端中間体の構造と、線維形成機構が得られると考えている。本研究の目的はβ2ミクログロリン(β2m)アミロイド線維の末端中間体の構造の知見を、パルスラベル重水素交換実験の結果から得ることである。19年度には蛍光実験に加え、パルスラベルなしの重水素交換実験を行い、線維末端中間体が存在することを示唆する結果を得た。しかし、データ解析の結果、線維末端中間体の保護部位を決定したものの結果に不明瞭な部分があったため、より高い時間分解能の実験が必要となった。そこで、20年度は当初の予定に含まれていたパルスラベル実験を行った。20年度にはパルスラベル実験の他に、モノマーと線維共存下における重水素交換実験や、アミロイド線維の直接スペクトル観察などの実験も行った。これらの結果を総合すると以下のような反応過程が提案された。まず、伸長した線維内では、モノマーβ2mの中央部全体が線維の内部に取り込まれており、N末端とC末端のみが線維の表面に露出している。しかし、過渡的に形成する線維末端中間体においては、N末端やC末端も線末端β2m分子と相互作用していることが分かった。これらの結果から、モノマーβ2mが線維と相互作用する際、非特異的な相互作用の形成を繰り返すうちに、線維伸長に繋がる相互作用を形成し、そういった結合種のみが最終的な線維の形態に変化していくものと考えられる。今回の実験から、研究の途上ではあるが興味深い結果を得ることができた。まずは、今回の基本的な理解の報告を科学雑誌に投稿したいと考えている。そして今後は、今回得られた線維伸長機構に更に新たな実験結果を加え、モデルを詳細にしていきたいと思っている。
狭小空間において非対称に形成する多核金属中心の化学的挙動

光合成の光化学系II(PSII)で水の酸化を行う酸素発生中心(OEC)のMn4Caクラスターは「歪んだ椅子」と呼ばれる非対称な構造を持つ。これに類似の錯体を合成するため、我々は嫌気条件で籠型配位子に強塩基性のアミドを有する遷移金属塩と水を順次加えてM3(OH)3型の三核錯体(Mn, Fe, Co)を得た。さらに一つの水分子が内部で一つの金属中心と結合した構造(Fe, Co)やヘミキュバン型コアを有する錯体(Mn, Fe, Co)が得られ、天然のMn4Caクラスターに類似したMn3Na(OH)4型の非対称な異種金属含有のキュバン型マンガンクラスターの形成過程が明らかとなった。さらに電気化学的な性質の検討も行い、異種金属のキュバン型マンガンクラスターの形成に伴う酸化還元電位の変化を測定し、ナトリウムイオンとカルシウムイオンのイオン交換が可能であることや、アルカリ・アルカリ土類金属が電荷の補償の効果だけでなくキュバン構造内部に挿入されることがマンガンクラスターの酸化還元挙動に大きく影響することを改めて明確に見出した。次に複数のβ-ケトイミナート部位を持つ複数の分岐状配位子を用いて多核錯体(Mn, Fe, Co)の合成を行った。前述の籠型配位子と同様に嫌気条件で分岐状配位子に強塩基性のアミドを有する遷移金属塩を加えるとマンガン錯体においてはまず三核錯体が得られ、分岐した鎖長を伸長して水の添加も行うと、ヒドロキソ基で架橋されたcorner-shared-cubane状構造を有するMn7(OH)8型の七核錯体も得られた。さらに分岐状配位子の立体障害をより大きく調整して酸化剤と水を添加することで、それぞれ別種のヘミキュバン型のMn4(OH)2型の四核錯体などの種々のクラスター構造が得られた。籠型配位子を用いて異種金属含有のキュバン型マンガンクラスターの形成過程が明らかとなった。これは天然の酸素発生中心(OEC)に含まれるMn4Caクラスターと類似の構造が得られただけでなく、その酸化還元挙動も含めると、OECが蛋白質中で自発的に形成するPhoto-assemmbly過程がマンガン(II)状態から出発する際の機構解明に繋がる成果である。その非対称型キュバン型構造が基底状態で完全に電子スピンを打ち消し合わないという電子構造の特徴を示す結果も具体的に得られた。さらに他の第一遷移金属錯体の合成や分岐状配位子を用いても別種のヘミキュバン型構造の合成にも成功しており、様々な比較や性質の検討も継続して行っている。初年度に籠状配位子を利用して合成した各種の非対称な多核金属錯体の反応性や、そこで生成する活性中間体種の立体化学および電子構造に関する情報を得ることを目的とした検討を行う。アルカリ・アルカリ土類金属を含む非対称型の異種多核マンガンクラスター錯体を前駆体として、低温下で酸化するなどして酸素活性化中間体種の合成を行い、各種の解析を行う。OECのいわゆる触媒サイクルにおいて、理論計算による各種の重要な反応中間体種の構造が提唱されており、これらの活性種の構造状態や酸化状態を再現することが目標である。このような非対称構造はフレキシブルな一般の多核化配位子では困難であり、狭小空間を有する籠状配位子内部で生成することが期待できる。さらに、合成したOECに近い非対称な異種五核金属キュバンクラスターとその類似化合物について、酸素発生反応の追究を行う。初年度に引き続き、その他の遷移金属を全てターゲットに様々な非対称な異種多核金属中心構造を籠状配位子内部に合成するとともに、分岐状配位子においても同様な検討と比較を行う。

さらに分岐状配位子の立体障害をより大きく調整して酸化剤と水を添加することで、それぞれ別種のヘミキュバン型のMn4(OH)2型の四核錯体などの種々のクラスター構造が得られた。籠型配位子を用いて異種金属含有のキュバン型マンガンクラスターの形成過程が明らかとなった。これは天然の酸素発生中心(OEC)に含まれるMn4Caクラスターと類似の構造が得られただけでなく、その酸化還元挙動も含めると、OECが蛋白質中で自発的に形成するPhoto-assemmbly過程がマンガン(II)状態から出発する際の機構解明に繋がる成果である。その非対称型キュバン型構造が基底状態で完全に電子スピンを打ち消し合わないという電子構造の特徴を示す結果も具体的に得られた。さらに他の第一遷移金属錯体の合成や分岐状配位子を用いても別種のヘミキュバン型構造の合成にも成功しており、様々な比較や性質の検討も継続して行っている。初年度に籠状配位子を利用して合成した各種の非対称な多核金属錯体の反応性や、そこで生成する活性中間体種の立体化学および電子構造に関する情報を得ることを目的とした検討を行う。アルカリ・アルカリ土類金属を含む非対称型の異種多核マンガンクラスター錯体を前駆体として、低温下で酸化するなどして酸素活性化中間体種の合成を行い、各種の解析を行う。OECのいわゆる触媒サイクルにおいて、理論計算による各種の重要な反応中間体種の構造が提唱されており、これらの活性種の構造状態や酸化状態を再現することが目標である。このような非対称構造はフレキシブルな一般の多核化配位子では困難であり、狭小空間を有する籠状配位子内部で生成することが期待できる。さらに、合成したOECに近い非対称な異種五核金属キュバンクラスターとその類似化合物について、酸素発生反応の追究を行う。初年度に引き続き、その他の遷移金属を全てターゲットに様々な非対称な異種多核金属中心構造を籠状配位子内部に合成するとともに、分岐状配位子においても同様な検討と比較を行う。
スタック型ナノ触媒を用いた低級アルカン選択酸化触媒の開発

化学原料の多くが石油から合成されているが、その可採年数は40年程度と見積もられており、可採年数がより長い天然ガスなどの資源からの化学原料合成が求められている。天然ガスをアルコールやアルデヒドなどの化学原料へと変換するために、低級アルカン類の部分酸化のための触媒開発が盛んに行われてきたが、低級アルカン類は強いC-H結合を持つため、従来の触媒では選択酸化生成物を得ることはできない。本研究では、固体酸であるシリカーアルミナのナノ粒子と酸化反応に対し高い触媒活性を持つことが知られているマンガン種を組み合わせて用いることで、常温でヘキサンやエタンの選択酸化反応に成功した。本研究の目的は、低温で低級アルカン類を酸素化しアルコールまたはエポキシドの合成を行うための触媒を得ることである。本目的を達成するために、低級アルカン類の酸化的脱水素を低温で行うことができる触媒と、アルケンの水和あるいはエポキシ化反応に有効なナノ粒子触媒を複合化する。本年度は、多孔性のシリカアルミナの細孔内部に単核マンガン錯体を担持したナノ粒子触媒を調製し、過酸化水素を酸化剤とする選択酸化反応の開発に取り組んだ。その結果、室温常圧という温和な条件下でアルケンの選択酸化が可能であることを見出した。具体的には、シクロヘキセンのエポキシ化に成功した。さらに、この触媒は、難易度が高い芳香族化合物のベンジル位の酸化を行うことができ、トルエン誘導体を酸化することでベンジルアルコールやベンズアルデヒドの誘導体を得ることにも成功している。また、芳香族のC-Hを酸化することもでき、ベンゼン誘導体を水酸化することでフェノール誘導体を得ることにも成功した。次年度には、本研究の主目的であるアルカンの選択酸化を行うため、アルカンからアルケンへの酸化的な脱水素触媒の活性向上を目指す。具体的には、シクロヘキサンの酸化的脱水素反応によりシクロヘキセンを得ることが出来る触媒の活性向上を目指す。見出された触媒を単核マンガン錯体担持ナノ粒子触媒と組み合わせて用いることで、本年度に導入したLB膜製造装置によるスタック型構造の複合ナノ粒子触媒を調製し、その構造の有効性についても実証する。本研究の目的は、室温近くの低温で低級アルカンや芳香族化合物を酸素化し、対応するアルコールやアルデヒドをセ生物として得るために必要な高効率な触媒をナノ粒子を複合化することで得ることである。多孔性のシリカアルミナの細孔内部に単核マンガン錯体を担持したナノ粒子触媒を調製し、過酸化水素を酸化剤とする選択酸化反応の開発に取り組んだ。その結果、室温常圧という温和な条件下でベンゼンの選択酸化が可能であることを見出した。さらに、この触媒は、より難易度が高いエタンの酸化によるエタノールの合成も行うことも可能であった。この触媒の担体として用いたメソ多孔性の担体は、通常、その細孔の内部に基質が拡散するのが容易ではなく反応活性を上げることが難しい。そこで、直径数十nm程度のサイズならびに形状が揃ったシリカ-アルミナナノ粒子を積層させてできる構造体のナノ細孔を利用した触媒の開発にも取り組んだ。触媒化学過酸化水素を用いてシクロヘキセンを選択酸化し、シクロヘキセンオキシドを得るための触媒を得ることに既に成功している。今後、低級アルカン類からオレフィン類を生成させることができる触媒と組み合わせることで、低級アルカン類の選択酸化触媒が開発できる可能性が十分に示されている。現在、シクロヘキセンの脱水素反応を、低温で行うことが出来る触媒の探索を行っている。これは、高温で反応を行うと、エポキシドが分解または重合してしまい、目的化合物への選択性が低下するためである。脱水素触媒と選択酸化触媒の複合化手法の開発とあわせて脱水素触媒の高性能化に注力する。多孔性金属酸化物などの触媒を調製する際に使用するオートクレーブ(一式20万円)を4セット購入する予定であった。しかし、前年度に終了した他プロジェクトで使用していたものが、そのまま利用可能であったため、購入を見送ったため。オートクレーブは備品ではあるが、経年劣化する消耗品であり、劣化して爆発事故が起こると大惨事に繋がる。そのため、今年度中に買い替える。
低圧気体におけるカオス的流れの研究

1.蒸発・凝縮を伴うテイラー・クエット問題の数値解析:よく知られたテイラー・クエット問題において,流体が蒸気であり,円筒表面において蒸発・凝縮を伴う場合の解析を行った.蒸気の場合の特徴は,申請者の前回の研究によれば,蒸気の希薄度が小さい場合,軸方向一様の単なるクエット流にも分岐が生じることである.今回は軸方向一様の仮定を取り除き,ボルツマン方程式に基づくDSMC法による数値解析によって,分岐した各々の流れの安定性を調べた.その結果,軸方向一様の流れは(蒸発・凝縮量が大きければ)安定に存在するが,この流れとは別に,渦を含む軸方向に非一様な流れも安定に存在し,同一の条件の下で複数の流れが安定に存在し得ることが示された.また,希薄度が大きく,軸方向一様流に分岐が無い場合にも渦型の流れは存在し,安定であった.この研究では,分岐が存在する状況設定の下で,精度が不十分な数値計算を行うと,虚偽の非定常・非周期的な流れが得られる様子も示された.このことから,カオス的流れのDSMC法による取扱いには非常な注意が必要だと考えられる.2.分子流効果を用いたポンプの開発への応用:近年,分子流効果(熱遷移流)を利用した,非機械式ポンプが注目されている.このポンプの性能解析には,複雑な形の領域に在る気体の振舞を調べなければならない.上の解析で開発した計算方法の適用により,この非機械式ポンプの性能を調べた.3.分子流効果を用いたポンプの試作:2と平行して,単純な構成のポンプを提案し,その動作原理を実験で示した.この成果を受けて,2の解析結果を用いた真空ポンプの試作を行い,ポンプの到達圧力や排気速度の測定に成功した.現在,これらの結果を利用して,実用的な真空ポンプの製作を進めている.1.蒸発・凝縮を伴うテイラー・クエット問題の数値解析:円筒表面で蒸発・凝縮を伴うテイラー・クエット問題を取り上げ,その低クヌーセン数における振舞について,ボルツマン方程式に基づく直接シミュレーション(DSMC)法による数値解析を行った.以前からの研究によって,この問題では,軸方向一様のクエット流に2通りに分岐が生じること,また,十分クヌーセン数が小さい場合には,軸方向に一様という制限が無い場合には渦流が生じ,3通りに分岐が生じることが分かっていた.本年度の研究では,軸方向一様のクエット流に分岐が無い場合でも,渦流が存在することが明らかになった.渦流タイプの解で,渦が弱い場合にはクエット流に近づくが,その場合の数値計算結果には非定常的な振舞が現れる.この現象は,現在のDSMC法による解析精度の不足が原因として考えられる.その確認のためには,より大規模な計算が必要である.このため,小型の並列計算機を購入し,DSMC法の並列計算方法の開発に着手している.2.分子流効果を用いたポンプの開発への応用:近年,分子流効果(熱遷移流)を利用した,非機械式ポンプが数種類提案されている.このポンプの流れの解析に,上で開発中の計算方法を適用して数値解析を行い,この非機械式ポンプの実用可能性が高いことを明らかにした.3.分子流効果を用いたポンプの試作:上記2の数値解析結果に基づいて,効率的な真空ポンプの形状を検討し,その結果に基づいて真空ポンプの試作を開始した.現在までのところ,数値計算結果から予想される性能と同程度の結果が得られている.1.蒸発・凝縮を伴うテイラー・クエット問題の数値解析:よく知られたテイラー・クエット問題において,流体が蒸気であり,円筒表面において蒸発・凝縮を伴う場合の解析を行った.蒸気の場合の特徴は,申請者の前回の研究によれば,蒸気の希薄度が小さい場合,軸方向一様の単なるクエット流にも分岐が生じることである.今回は軸方向一様の仮定を取り除き,ボルツマン方程式に基づくDSMC法による数値解析によって,分岐した各々の流れの安定性を調べた.その結果,軸方向一様の流れは(蒸発・凝縮量が大きければ)安定に存在するが,この流れとは別に,渦を含む軸方向に非一様な流れも安定に存在し,同一の条件の下で複数の流れが安定に存在し得ることが示された.また,希薄度が大きく,軸方向一様流に分岐が無い場合にも渦型の流れは存在し,安定であった.この研究では,分岐が存在する状況設定の下で,精度が不十分な数値計算を行うと,虚偽の非定常・非周期的な流れが得られる様子も示された.このことから,カオス的流れのDSMC法による取扱いには非常な注意が必要だと考えられる.2.分子流効果を用いたポンプの開発への応用:近年,分子流効果(熱遷移流)を利用した,非機械式ポンプが注目されている.このポンプの性能解析には,複雑な形の領域に在る気体の振舞を調べなければならない.上の解析で開発した計算方法の適用により,この非機械式ポンプの性能を調べた.3.分子流効果を用いたポンプの試作:2と平行して,単純な構成のポンプを提案し,その動作原理を実験で示した.この成果を受けて,2の解析結果を用いた真空ポンプの試作を行い,ポンプの到達圧力や排気速度の測定に成功した.現在,これらの結果を利用して,実用的な真空ポンプの製作を進めている.
超高磁場1H-MRSおよびPETを用いたヒト貧困灌流における脳温度変化の解明

本年度は、慢性脳主幹動脈狭窄閉塞症例を対象とし、PETを用いた脳循環代謝量の測定および超高磁場7TMRI 1H-MRSを用いた脳温の測定の両者を実施する予定であった。全例PETにて脳循環代謝量を測定する予定であったが、過去の報告からSPECTでも代用可能な症例があったため、PET撮影が困難な場合にはSPECTにて代用した。また、超高磁場7TMRIにおける1H-MRSについては、撮像シーケンス自体は稼働しているが、信号の精度が低いため初年度は調整で終了した。本年度の夏頃には症例撮像可能となる予定であり、そのための倫理委員会申請も準備中である。・123I-IMP-SPECT撮影:頚部内頚動脈狭窄例20件(各々、安静時とアセタゾラミド負荷時の計2回の撮影を行なった。)・15O-PET撮影:もやもや病31件、両側内頚動脈閉塞例2件、両側内頚動脈狭窄例1件、右内頚動脈閉塞例1件の計35件(脳血流量、脳血液量、脳酸素代謝率、酸素摂取率を各々定量した。)また、本研究に関連し、当施設が行なった3TMRI 1H-MRSを用いた脳温イメージングが、頚部頚動脈狭窄症例に対する頚動脈内膜剥離術中における内頚動脈遮断中の脳虚血出現の予知精度を増加させることが判明し、海外誌に掲載された。現在、超高磁場7TMRI 1H-MRSを用いた脳温測定を行なうにあたり、撮像シーケンス自体は稼働しているが、信号の精度が低く、良好なspectrumを得るための改良を行なっている段階であるため。今後も引き続き慢性脳主幹動脈狭窄閉塞症例に対する脳循環代謝測定を継続的に行なう。脳温測定については、パルスシークエンスの改良が終了後、7TMRI 1H-MRSを用いて測定された数値が脳温として有効かどうかを検証する必要がある。人の脳温を直接測定することは困難であり、人間の脳に近い人型のファントムを作成して検証することを予定している。健常者を対象に7TMRI 1H-MRSによる脳温測定を行ない、その数値とファントムの脳温との相関を検証する。その後、慢性脳主幹動脈狭窄閉塞症例に対して脳温測定を開始する。慢性脳主幹動脈狭窄閉塞症例における脳循環代謝測定は、当研究施設において臨床および他の基礎研究を目的として日常的に撮影が行なわれており、これまでの測定費用に関しては本研究費の使用は行なわれなかったが、今年度は予定通りトレーサー代としてその使用が見込まれる。また、超高磁場7TMRI 1H-MRSを用いた脳温測定については、現状機械調整を行なっている段階であり、撮影が可能になり次第こちらも測定費用(MRI使用費、交通費等)としての使用が見込まれる。予定としては本年度夏頃からの撮影開始を目標に調整を続けている。
再生医療応用を視野に入れた、消化管組織発生過程におけるREGの機能解析

本研究は、胃粘膜組織の正常な構築に重要な役割を果たすことが示されている増殖因子Regの、その他の消化管における機能、特に発生分化過程における役割を解析するために、Regノックアウトマウスの解析を中心に据えて進行中である。Regノックアウトマウスの解析により今回初めてRegの小腸細胞増殖への関与が示された。AdultのRegノックアウトマウスの小腸粘膜を解析すると絨毛内の細胞密度が低く、陰窩のPCNA染色陽性増殖細胞数も減少しており、小腸幹細胞の増殖能が低下していた。小腸幹細胞の分裂娘細胞は、幹細胞の分裂により押し出されて絨毛上を移動して管腔側へと登っていくとされているが、この速度がノックアウトマウスでは正常にくらべ明らかに遅いということもBrdUラベルにより細胞の位置をトレースすることにより確かめられた。小腸の増殖をコントロールする増殖因子、細胞外液性因子はWnt以外にあまり知られておらず、将来の小腸再生医療応用を考えるとこの意義は大きいと思われる。さらに、発生分化過程におけるRegの役割を評価するためにまず正常マウスの胎児におけるRegの時間的発現パターンを解析したところ、Regの発現は小腸に絨毛構造ができ始める胎生15日頃から急激に上昇することがわかった。ノックアウトマウスの胎児ではこの時期に一致して正常マウスとの増殖の差が出始めることが示された。このように、Regは小腸において絨毛構造の形成に深く関与していることが示唆された。
閉塞性脳血管障害に対する血管新生促進療法

Encephalo-myo-synangiosis(EMS)モデルをウィスターラットで作成し、HIF-1αnaked DNAを脳表に散布し、血管新生の誘導を評価した。EMS術後5日または10日後にnylon sutureを右総頚動脈経由で頭蓋内へ挿入し、中大脳動脈を閉塞させた。この中大脳動脈領域の脳梗塞モデルでコントロール群と血管新生群との比較検討を行った。中大脳動脈閉塞24時間後に脳を摘出し、2mmスライスし、2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)により示された脳梗塞巣は血管新生群ではコントロール群より小さかった。また、術後5日目より10日目の群でより縮小する傾向にあった。HIF-1αの局所投与で新生血管が発生し、外頚動脈系と脳表との側副血行路が発達し、脳梗塞を軽減したと考えられた。脳虚血ストレスに対して脳神経細胞はHeat Shock Protein(HSP-70)の産生等の各種ストレス応答を示す。Geranylgeranylacetone(GGA)は長く胃薬として処方されていて、腸管や心筋にHSP-70を発現させると報告されている。神経細胞に関する報告は無く、以下の実験も行った。GGA内服ウィスターラットを用いて、フローセン麻酔下で右外頚動脈経由で内頚動脈にnylon sutureを挿入し、右中大脳動脈閉塞モデルを作成した。脳梗塞の体積をGGA群とコントロール群とを比較した。GGA内服で神経細胞にHSP-70の発現が観察された。これらの細胞は虚血耐性を獲得し、中大脳動脈閉塞モデル実験でも脳梗塞巣がコントロール群に比して有為に小さかった。これらの研究結果が臨床応用可能となりますと、脳卒中後の脱落症状で寝たきり、片麻痺、車椅子生活からの開放が期待され大変有意義と考えられる。閉塞性脳血管障害の病態は複雑で、細胞内で様々なカスケードが活性化され、細胞死から免れるメカニズムが働く。なかでも近年P13K/Akt pathwayが重要な働きをし、この経路を介してHypoxia inducible factor-1(HIF-1)などの転写因子の発現が誘導される。低酸素条件下でVHL(von Hippel Lindau遺伝子産物)依存性ユビキチンプロテオソーム系が抑制され、HIFファミリータンパク質HIF-1α、HIF-2αが著しく安定化して、血管内皮増殖因子(VEGF)の転写を誘導すると報告されている。「材料と方法」そこで、フローセン麻酔下ウィスターラットの両側内頸動脈結紮モデルで右開頭術を行い、硬膜を切開し、側頭筋内と脳表にHIF-1発現ベクターを注入散布し、側頭筋を脳表に接触させて閉創する。この実験系をコントロール群と比較し、血管新生を比較検討した。また、脳虚血ストレスに対して脳神経細胞はHeat Shock Protein(HSP-70)の産生等の各種ストレス応答を示す。GGA内服ウィスターラットを用いて、フローセン麻酔下で右外頸動脈経由で内頸動脈に4-0ナイロン糸を挿入し右中大脳動脈閉塞モデルを作成した。脳梗塞の体積をコントロール群と比較した。「結果と結論」HIF-1αの局所投与で新生血管が発生し、外頸動脈系と脳表との側副血行路の発達が観察された。またGGA内服で神経細胞にHSP-70の発現が観察された。

これらの細胞は虚血耐性を獲得し、中大脳動脈閉塞モデル実験でも脳梗塞巣がコントロール群に比して有為に小さかった。これらの結果の臨床応用が検討される。【材料と方法】フローセン麻酔下で雄Wistar rat(310-380g)に対して右開頭術・硬膜切開を行い、くも膜に包まれた脳表を露出して側頭筋と接着させてコントロール群とした。同時に100μgのHIF-1αnaked DNAを脳表に散布して脳表と側頭筋と接着させて血管新生群とした。EMS術後5日もしくは10日後に、3-0 nylon suture'を右総頚動脈経由で頭蓋内へ挿入し、中大脳動脈を閉塞させた。この中大脳動脈領域の脳梗塞モデルでコントロール群と血管新生群との比較検討を行った。中大脳動脈閉塞24時間後に脳を摘出し、2mm幅にスライスし、2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)と反応させることにより示された脳梗塞巣の大きさを両群で比較した。また、生じた新生血管を免疫染色にて評価した。【結果と結論】TTCにより示された脳梗塞巣はHIF-1α投与の血管新生群でコントロール群に比較し小さかった。また、術後5日目より10日目の群でより縮小する傾向にあった。また、生じた新生血管は、より太く、深部へ向かって伸びていく傾向にあった。HIF-1αの局所投与で新生血管が発生し、外頚動脈系と脳表との側副血行路が発達し、脳梗塞を軽減した。脳虚血に対してHIF-1αが有効な治療手段と成り得る事を示していると考えられた。ラットにおけるencephalo-myo-synangiosis(EMS)モデル作成時にHIF-1αnaked DNAを脳表に散布し、血管新生の誘導を評価した。EMS術後5日もしくは10日後に、3-0 nylon sutureを右総頚動脈経由で頭蓋内へ挿入し、中大脳動脈を閉塞させた。中大脳動脈閉塞24時間後に脳を摘出し、2mm幅にスライスし、2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride(TTC)により示された脳梗塞巣はHIF-1α投与の血管新生群でコントロール群に比較し小さかった。脳虚血ストレスに対して脳神経細胞はHeat Shock Protein(HSP-70)の産生等の各種ストレス応答を示す。Geranylgeranylacetone(GGA)は長く胃薬として処方されていて、腸管や心筋にHSP-70を発現させると報告されている。神経細胞に関する報告は無く、以下の実験も行った。GGA内服ウィスターラットを用いて、フローセン麻酔下で右外頸動脈経由で内頸動脈に4-0 nylon sutureを挿入し右中大脳動脈閉塞モデルを作成した。脳梗塞の体積をコントロール群と比較した。GGA内服で神経細胞にHSP-70の発現が観察された。
SWI/SNF複合体による、AP-1の多機能性発現の制御機構

本研究では、AP-1結合配列を持つ標的遺伝子の発現誘導に刺激特異性が見られる現象を支える分子機構を解明すべく、SWI/SNF複合体にsubstoichiometricalに結合する因子の同定と生化学活性の解析を行った。特に、BRG1に結合する因子群の中に見いだされたp54^<nrb>及びPSFに焦点を当て、これとSWI/SNF複合体構成成分との結合に関する生化学的解析とその結合が果たす役割について精査し、以下の成果を得た。2.p54^<nrb>及びPSFはBRG1型及び、Brm型SWI/SNF(もしくはこれらに類似した)複合体に結合する。本研究から、p54^<nrb>を含むSWI/SNF(もしくはこれに類似した)複合体は、恐らくはAP-1をはじめとする転写制御因子群によってTERT遺伝子のプロモーターに動員され、転写開始を誘導した後、その複合体分子が引き続いてalternative splicing過程にもcisに作用し、活性のあるTERTタンパク質の効率良い発現に多段階で機能すると考えられた。そして、AP-1の標的遺伝子群の中でも、特定の遺伝子群に対してのみ、p54^<nrb>を含むSWI/SNF複合体が多段階で機能し、効率良い遺伝子発現制御を行っている可能性が示唆され、AP-1の持つ多機能性を説明するための端緒が見いだされた。本年度は、AP-1結合配列を持つ標的遺伝子の発現誘導に刺激特異性が見られる現象を支える分子機構を解明すべく、SWI/SNF複合体にsubstoichiometricalに結合する因子の同定と生化学活性の解析を行った。FLAGタグを付加したBRG1もしくはBrmサブユニット(SWI/SNF複合体のATPaseサブユニット)を293T細胞に導入・発現させ、抗FLAG抗体を用いた精製を行いこれらにsubstoichiometricalに結合する因子としてp54^<nrb>を同定した。p54^<nrb>は精製したSWI/SNF複合体とin vitroで結合できる。そして、こうした結合には2つのRNA認識部位を含んだp54^<nrb>タンパク質のN端領域で十分であった。最近、p54^<nrb>はparaspeckleと呼ばれる核内構造体にも局在すること、mRNA中の一部の配列が分子内でヘアピン構造を形成するとAdenosine deaminase(ADAR)によって高度に'A to I'のeditingが行われ、editingされたRNAはparaspeckleに保持されることにより転写後制御がなされることが報告された。これまでに我々は、SWI/SNF複合体構成成分であるBRG1やBAF60aの中にはParaspeckle protein 2(PSP2)と共局在するものがあることを見出した。すなわち、SWI/SNF複合体は染色体上で、クロマチン構造変換因子として機能してAP-1の標的遺伝子の転写制御を行うばかりではなく、それに引き続き一部のRNA転写産物にも作用して、quality control、RNA editingを行うという新たな生化学活性を持つ可能性が高い。現在、転写後の制御にこのようなcis-preferenceがみられるようなAP-1標的遺伝子群を検索して、SWI/SNF複合体がp54^<nrb>と結合することがこれらの標的遺伝子の刺激特異的な発現誘導に重要であるか、検証を行っている。本年度は、AP-1結合配列を持つ標的遺伝子の発現誘導に刺激特異性が見られる現象を支える分子機構を解明すべく、SWI/SNF複合体にsubstoichiomethcalに結合する因子の同定と生化学活性の解析に関する前年度の成果を発展させた。BRG1に結合する因子群の中に見いだされたp54^<nrb>及びPSFに焦点を当て、これとSWI/SNF複合体構成成分との結合に関する生化学的解析とその結合が果たす役割について精査し、以下の成果を得た。本研究から、p54^

<nrb>を含むSWI/SNF(もしくはこれに類似した)複合体は、恐らくはAP-1をはじめとする転写制御因子群によってTERT遺伝子のプロモーターに動員され、転写開始を誘導した後、その複合体分子が引き続いてalternative splicing過程にもcisに作用し、活性のあるTERTタンパク質の効率良い発現に多段階で機能すると考えられた。そして、AP-1の標的遺伝子群の中でも、特定の遺伝子群に対してのみ、p54^<nrb>を含むSWI/SNF複合体が多段階で機能し、効率良い遺伝子発現制御を行っている可能性が示唆され、AP-1の持つ多機能性を説明するための端緒が見いだされた。