hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生体イメージングによるメタボリックシンドロームの病態と新規バイオマーカーの探索

慢性炎症という病態は、生体内における細胞間ネットワークの破綻が本態と考えられ、単一の臓器や細胞種の異常から全てを説明することはできない。その為、従来の単一培養細胞を用いた遺伝子からのアプローチでは、細胞ネットワークのメカニズムを明らかにすることは難しかった。申請者は、近年ニポウ式レーザー共焦点顕微鏡、さらに二光子レゾナンス顕微鏡を生体に応用し、「生体内で細胞を"みて""知る"」生体内分子イメージング手法を開発し、メタボリックシンドロームにおいて、肥満内臓脂肪の局所で慢性炎症を背景に異常な細胞間相互作用が生じている事を明らかにしてきた。その過程で、LPA(リゾホスファチジン酸)の生合成酵素であるオートタキシンが、脂肪組織における脂肪細胞分化と肥大に関わることを、オートタキシンヘテロノックアウトマウス、トランスジェニック過剰発現マウスを用いて証明した。これらの研究過程において、生体イメージング手法を積極的に取り入れ、分子生物学とのすりあわせを行うことで生体内の多様な病態メカニズムを明らかにしている。血栓形成の過程には血小板だけでなく、各種炎症性細胞(マクロファージ・リンパ球)や血管内皮細胞とその障害、局所の血流動態が関わっている。このような多細胞からなる複雑病変とそのダイナミクスが病態の本質であるが、今まで生体内で検討する手法は存在しなかった。長崎らのイメージング手法では単一血小板をはじめて生体内で可視化することに成功しており、血栓形成過程における多細胞のダイナミクスが明らかになっている。また、血清オートタキシンが肥満病態では、低下することのメカニズムを解明し、肥満患者における血清オートタキシン値は、メタボリック症候群の診断に有用であることを示した(論文査読中)。例えば、血栓形成の過程には血小板だけでなく、各種炎症性細胞(マクロファージ・リンパ球)や血管内皮細胞とその障害、局所の血流動態が関わっている。長崎らのイメージング手法では単一血小板をはじめて生体内で可視化することに成功しており、血栓形成過程における多細胞のダイナミクスを明らかにしている。心血管疾患の重大なリスク要因であるメタボリックシンドロームの病態解明を目指して、我々は光イメージング手法を用いて、肥満に伴う脂肪組織の形態変化(リモデリング)と機能異常を明らかにしてきた.。肥満脂肪組織では、M1マクロファージ、CD8陽性T細胞といった炎症精細胞が賦活化されて、脂肪組織炎症と糖尿病病態を起こすがその詳細なメカニズムはわかっていない。本研究ではまず、これらの病態解析をさらに進め、慢性炎症や免疫異常の肥満病態への関与をより詳細に検討し、いかに脂肪組織において炎症性・免疫細胞が遊走されるか、賦活化されるあ、その分子メカニズムを明らかにすることで、新たな治療の標的の可能性をさぐっている。また、いままで、「メタボ検診」として行われている腹囲の測定は、医学的根拠も乏しく、その有用性には疑問の声も多い。

そこで我々は、新たなメタボリックシンドロームのバイオマーカーの探索を行っている。我々が行っている、検診業務の一環として、脂肪組織の機能検査、各種血清修飾脂質・生合成酵素の測定を行い、非侵襲的な内臓脂肪の機能評価系の樹立を目指した。日本人は、「やせていても糖尿病になる方が多い」「遺伝子解析の結果でも肥満と病態に強い相関が認められない」など、依然として肥満病態形成メカニズムに不明の点が多い人種であるといえる。そこで、我々の知見を統合することにより、低侵襲で、より現実に即した、オーダーメイド治療が可能になると考えられる。慢性炎症という病態は、生体内における細胞間ネットワークの破綻が本態と考えられ、単一の臓器や細胞種の異常から全てを説明することはできない。その為、従来の単一培養細胞を用いた遺伝子からのアプローチでは、細胞ネットワークのメカニズムを明らかにすることは難しかった。申請者は、近年ニポウ式レーザー共焦点顕微鏡、さらに二光子レゾナンス顕微鏡を生体に応用し、「生体内で細胞を"みて""知る"」生体内分子イメージング手法を開発し、メタボリックシンドロームにおいて、肥満内臓脂肪の局所で慢性炎症を背景に異常な細胞間相互作用が生じている事を明らかにしてきた。その過程で、LPAの(リゾホスファチジン酸)の生合成酵素であるオートタキシンが、脂肪組織における脂肪細胞分化と肥大に関わることを、オートタキシンヘテロノックアウトマウス、トランスジェニック過剰発現マウスを用いて証明した(論文査読中)。また、In Vitroにおける培養細胞の実験からも、複雑脂質がインスリンシグナルを阻害することは明らかであるが、この作用機序については多様な報告がなされており、議論のまだ多いところである。各種病態モデル動物・遺伝子改変動物に適応して、慢性炎症を背景とする病態部位の局所における炎症性・免疫細胞の動態と、その賦活化・活性化・遊走の可視化を行う。すなわち、各種炎症性・免疫細胞と実質細胞の相互作用、病態下の臓器機能異常における細胞連関の役割をより明らかにする。血管内皮細胞・炎症細胞・血小板・筋細胞・脂肪細胞等をそれぞれ特異的にラベルし生体内観察することにより、肥満組織や動脈硬化巣における複数の細胞連関を可視化する。これらを、全身の脂質生合成酵素およびGPCRをはじめとする脂質受容体に欠損・異常を来たす遺伝子改変動物と組み合わせて、これらの遺伝子改変がいかに全身の表現系(耐糖能の変化等)に影響を来たすかを、臓器・組織・細胞レベル、それぞれについて検証を行う。これらの結果をふまえて、複雑脂質や脂質メディエーターがいかに生体内において局所免疫を賦活化し、脂肪組織炎症と病態を引き起こしているかを明らかにする。さらに、受容体の結晶構造解析から得られた阻害剤を用いて、生体への介入実験を行い、新規治療法の開発につなげる。主に消耗品試薬(蛍光標識抗体・実験動物代)に研究費を充当する。さらに、研究成果の発表のために、国内・国際学会の出席を予定しており旅費に充当する予定である。大型機材の購入は予定していない。
標本分布の漸近展開近似の精度と標本の大きさ、次元数との関係

統計的多変量解析における推測では、取り扱う統計量の標本分布を正確にかつ数値的に計算可能な形に求めることが困難なため、この漸近展開に基づく近似を用いて推測を行わざるを得ない。本研究の課題は、理論的でなく、漸近展開近似の実際的妥当性を研究し,ユーザに実用的指針を示すことを目的として計画したものである。漸近展開公式は標本の大きさ,次元数,非心パラメーターに依存しており,従ってその精度はこれらの関数である.この研究では,精度として展開公式の真の値に対する絶対誤差でとらえ、その上限を数学的ではなく数値実験的に構築する方法を開発した.この問題は甚だ複雑で、一般的な場合にも適用できることを考えながら、具体的にHotellingのT^2-検定のOC関数に対する漸近い展開公式の絶対誤差の実際的に有効な実験的近似上限を構築した。平成6年度は暗中模索の年度であったが,解決できる光明を得ていた。2年目の平成7年度に至り有用な実験的近似上限を具体な形で与えることに成功した。この結果は可成り有用で、漸近展開近似公式の精度と標本の大きさとの関係を次元数と非心パラメーターの関数として表現することを可能にし、推測の具体的設計を行うことを可能にした。また検定要求を満たす検定方式を漸近展開公式に基づいて設計した場合、その実際的妥当性をチエックすることも可能になった。これらの成果は日本統計学会および日・米合同研究集会で発表された。成果として重要なことの一つは、有効な上限公式を構築する方法が開発されたことである。これは直ちに判別分析における誤判別確率の場合に適用され目下進行中である。準備段階のものとして、母集団分布が多変量楕円分布である場合、実験計画に基づく特定の共分散行列構造を持つ場合の成果も得られている。課題に関する研究の第1年度は暗中模索の結果,漸く光が少し見えてきた段階である。検定統計量の正確な分布,漸近展開に基づく近似公式の両方がわかっている一標本の場合のHotellingのT^2-検定を用い,検定のOC関数について解決方法を模索したのである。しかしこの模索段階の研究で重要なことは,本末の目的が正確な分布が未知である場合を取り扱うものであるという観点に留意して研究を進めることである。未だ決定的な具体的な公式を得るに至っていないが,初年度の研究の概要を述べよう。検定の有意水準を5%とし,次元数をP,自由度V,非心パラメーターを△で表わし,同じパラメーターの組に対する正確なOC関数の値と近似公式の値の差の絶対値をYとするとき,Y=f(P,V,△)+ε,ε=誤差,の実用になる簡単な形の関数fを探すのである。2つのタイプのfを考えた。(1)Y=CP^αV^βexp{a(△-b)^2},(2)Y=a_0+a_1△+a_2△^2+a_3V+a_4V^2+a_5P+a_6P^2+a_7△V+a_8△P+a_9PV+ε。これに基づいて,回帰分析の考え方を適用して最小二乗法により係数をきめるわけである。点(Y_i,P_i,△_i,V_i)の選択の仕方にも回帰の時の考え方を用いた。膨大な数値実験を繰り返し,最適なものを探しているわけであるが,個々の試行においては,正確な分布が未知の場合,正確な値の情報はシミュレーションによらなければならないことを考慮すれば,用いるパラメーターの組に数は大きくすることができないことが困難を大きくする。

この結果は第2年度の初めには論文にまとまる予定で,学会,研究集会で発表されるだろう。楕円分布が母集団分布である場合のHotellingのT^2に対するBartlettタイプの修正は,漸近展開をコンパクトな形に導いたものである。この楕円型母集団の場合には,漸近展開は仮設のもとでのいわゆるnull分布に対してのみ得られている。実験計画法に関しては,計画に基づく共分散構造の特徴を生かした検定法の比較を種々論じている。第1年度の暗中模索の結果が実のり,HolellingのT^2-検定のOC-関数に対する漸近展開公式の絶対誤差Yの実験近似上限U_<EXP>の構成に成功した。すなわちたゞし,P:次元,N=n-p,n:標本の大きさ,Δ:非心率である。この上限の実際的有効性は実用のためのパラメーター(p,n,Δ)の対象範囲Pの全域でチエックされた。この公式はU^<EXP>≦γ(γは小さい値)を満たすnを決める便利な式を与えるし,与えられた検定条件を満たすnを決め検定手続を設計することを可能にする。この成果で重要なことは実際的有効性を持つ公式を構築する方法である。他の場合に適用することができるからである。この結果は論文としてすでに正式に受理されており近く発刊される予定である。また日米共同研究集会で発表し好評を博した。上記の成果の構築方法の直接的適用が可能な場合として,2群判別の誤判別確率に対する漸近展開公式の精度について目下進行中である。また本課題の研究は主として母集団モデルが正規の場合であったが,これを楕円型モデルの場合に拡張するための準備として,Hotellingの一般化T^2_0-分布に対する漸近展開の近似の速度を早やめるBartlettタイプの修正に関する研究も行われ成果を得た。また一般化線型モデルの回帰係数に対する仮説検定において,共分散行列の構造が具体的に指定された場合の検定統計量の分布,検定方式に関する研究も進められた。現在多重比較仮説の検定の場合に対し,基礎分布が楕円型の時,共分散行列の構造を指定した時に拡げて研究が進行中である。
生体環境に基づく人工揺らぎ反応場が酵素に与える影響

生体内は多様な生命分子が織りなす不均一な環境であり、酵素反応場は常に揺らぎの中に存在しているものと考えられる。また酵素自体の3次元構造も周辺環境の揺らぎに伴って動的に変化している可能性もある。本研究は酵素反応が生体内反応場に由来する揺らぎによって受ける影響を明らかにし、揺らぎを加味した酵素アッセイ法の確立を目的としている。そこで「分子濃度」「微小空間」「異常拡散」という3つの揺らぎ生む可能性のある要素を加味した反応場を構築し、その中で多様な酵素の活性・性状解析を行う。これにより生体内揺らぎの中で連続的に起こる酵素反応過程を分子レベルで理解することを目的としている。本年度は、前述の3つの揺らぎヨウ素を加味した分子クラウディング反応場、リポソーム反応場、ヒアルロン酸反応場を構築し、それらの環境場における酵素反応解析を行った。対象酵素反応として生体内の糖鎖変換反応を選択し、糖鎖が複数の酵素によって連続的にプロセシングされる過程を解析したところ、分子クラウディング環境においては小胞体グルコシダーゼIIによるグルコース切断反応が加速すること、ならびにマンノシダーゼ群によるマンノース切断反応が減速することを見出した。一方、リポソーム反応場においてはマンノース切断反応が加速することが分かった。いずれの反応も速度論解析を行い、特殊反応場が酵素に与える影響を詳細に検討した。また、ヒアルロン酸反応場においては糖加水分解反応がヒアルロン酸の濃度によって加速・減速の双方向に調節されることが分かった。以上の検討により、生体内では反応環境場に由来する揺らぎが生化学反応に有意の影響を与えていることが明らかとなった。本年度は、前述の3つの揺らぎヨウ素を加味した分子クラウディング反応場、エマルジョン/リポソーム反応場、ヒアルロン酸反応場を構築し、それらの環境場における酵素アッセイ法を確立するとともに、それぞれの系に特有な活性を示す酵素反応モデルを見出した。具体的には、小胞体グルコシダーゼIIが上記3つの特殊環境において通常のアッセイ環境に比べて有意に高い活性を示すこと,ならびに小胞体マンノシダーゼ郡の一部が分子クラウディング環境やリポソーム環境において、通常のアッセイ環境に比べて活性が低下することを発見した。さらに小胞体内の連続した糖タンパク質糖鎖プロセシング反応は分子クラウディング環境において、初期のトリミング速度が活性化し、後期のトリミング速度が低下することによって、通常のin vitroアッセイとは異なった糖鎖プロファイルを与えることが分かった。
枯草菌細胞壁結合複合リパーゼによる超高機能油脂分解菌体の創成

細菌表層への蛋白質のディスプレイは経口投与による抗体産成、細胞による物質吸着、バイオリアクターなどに利用可能な新規触媒酵素をはじめ環境利用の側面からも注目されている分野である。本研究ではグラム陽性細菌で、工業的に利用されている枯草菌の表層に複数のリパーゼを人工局在させ、超高機能な細胞を育種するとともに、人工局在化に伴う問題点を抽出し、改良を加えた。まず細胞壁結合ドメイン(CWB)として、以前使用していた細胞壁溶解酵素CwlBのCWBbとはアミノ酸配列が全く異なり、さらに半分以下のサイズのCwlCのCWBcを検討して、表層局在のアンカーとして使えることを示した。そこで枯草菌のリパーゼLipBとCWBcとの融合遺伝子LipB-CWBc、麹菌リパーゼCutLとCWBbとの融合遺伝子CWBb-CutLを別々のプラスミドに載せたものと、1つのプラスミドに両方の融合遺伝子をのせ、1つのプロモーターで2つの融合遺伝子を制御できるようにしたものを構築した。次にSDS-PAGEによる表層局在化蛋白の量、活性染色による脂質分解活性を調べた。2つの融合遺伝子を含むプラスミドを持つ細胞は、誘導物質であるテトラサイクリンの存在下でともに顕著な融合蛋白質の生産が認められ、それらはともに表層に局在していた。またこれら表層局在化リパーゼの蓄積には、表層プロテアーゼ欠損株の構築が重要であることも解った。
間葉系幹細胞の分化を制御する，アクチン細胞骨格の力学情報伝達機構の解明

本研究は,様々な機能細胞への分化能を有する間葉系幹細胞(MSCs)の分化メカニズム解明を目指す研究である.現在,細胞外基質の力学的特性が幹細胞の分化に大きな影響を与えることが報告されているが,細胞外基質の力学的情報が細胞核まで伝達し,遺伝子発現を変化させ,分化の系列決定に影響を及ぼす詳細なメカニズムの解明には至っていない.この力学情報伝達機構を解明することによって,MSCsの正確な分化制御を可能とする培養方法を提案し,幹細胞を用いた再生医療の実現に貢献する.本研究は,様々な機能細胞への分化能を有する間葉系幹細胞(MSCs)の分化メカニズム解明を目指す研究である.現在,細胞外基質の力学的特性が幹細胞の分化に大きな影響を与えることが報告されているが,細胞外基質の力学的情報が細胞核まで伝達し,遺伝子発現を変化させ,分化の系列決定に影響を及ぼす詳細なメカニズムの解明には至っていない.この力学情報伝達機構を解明することによって,MSCsの正確な分化制御を可能とする培養方法を提案し,幹細胞を用いた再生医療の実現に貢献する.
HIV表面糖蛋白質の糖鎖とその感染過程における役割

1.HIV糖蛋白質糖鎖の構造解析:HTLVーIIIBおよびLAVー1をMOLTー4細胞にそれぞれ感染させると、そこで増殖したHIVは感染能を同じにするとHTLVーIIIBでは合胞体形成能がLAVー1に較べて約40%まで低下していることが示されてたので、同じMOLTー4細胞の糖鎖生合成装置を利用している両ウイルスの糖蛋白質糖鎖を解析し、合胞体形成能と糖鎖の関係を検討した。まず、両ウイルス感染細胞をトリチウム標識したマンノ-ス、ガラクト-ス、Nーアセチルグルコサミンを加えて培養した後、細胞画分、ウイルス画分、培養液画分に分け、各画分よりエイズ患者血清とプロテインAアガロ-スを用いてトリチウム標識ウイルス糖蛋白質を調製した。次に、各糖蛋白質画分のトリチウム標識糖鎖をヒドラジン分解法を用い調製し、高圧濾紙電気泳動、BioーGel Pー4HPLCなどにかけてその糖鎖パタ-ンを比較検討した。その結果、両ウイルス間で糖蛋白質の糖鎖パタ-ンの違いが各画分で共通して存在することが示された。2.HIV感染者における血清IgGの糖鎖構造異常:まず、健常人2例およびHIV感染者[CDC第II期(3例)、CDC第IV期(3例)]の血液より調製したIgGからヒドラジン分解法を用いて糖鎖を調製した。次に、我々が開発した一連の微量糖鎖構造解析技術を駆使してそれらの糖鎖構造を解析した。その結果、健常人と比較してHIVキャリヤ-(CDCII期)、エイズ患者(CDCIV期)のIgGでは、ガラクト-スやシアル酸を含有する糖鎖が顕著に増加しており、また、フコ-ス含有糖鎖が半減していることが明らかとなった。今後は、検体数をさらに増やしてこの現象を確認するとともに、HIV感染者の診断への応用の可能性やエイズの病態との関係も調べてみる必要があろう。
１９F-NMR法を用いた細胞内環境下におけるタンパク質の動的構造の解明

人の体の中で様々な機能を果たすタンパク質はそれぞれ特徴的な立体構造を持っており、機能に際して構造が変化することが知られている。しかし従来の研究では単離したタンパク質を試験管内で解析しており、細胞内のように多種類の分子が存在する環境下でのタンパク質の構造変化を調べる研究は技術的に難しかった。本研究では、細胞内においてタンパク質を特異的に且つ高感度に測定できるフッ素をタンパク質に導入し、核磁気共鳴法で測定するための実験系を確立した。またこの方法を活用してタンパク質と基質との相互作用を観測することにも成功した。本成果は今後のタンパク質科学や細胞生物学の発展に大きく貢献するものである。本研究では,研究代表者が最近開発した19F標識技術とIn-Cell NMR法を組み合わせて、生きた細胞内におけるタンパク質、特に代表者が解析してきたキナーゼの動的構造を解析する技術を確立し、これまでin vitroで解析されてきた高次構造レベルでの作用機構を,本来タンパク質が機能しているin vivoの環境下で解明することを目的とする.本研究の平成26年度における研究成果は以下の通りである.1:In-Cell NMR法における感度の問題を克服するために高感度19F標識アミノ酸であるトリフルオロメチオニンによるタンパク質標識技術の最適化を行った。その結果、目標であるVRK1キナーゼタンパク質のトリフルオロメチオニン標識に成功した。さらに、19F標識VRK1タンパク質の大量合成・精製に成功し、超高感度19F-NMRスペクトルの測定にも成功した。2:次に、得られたトリフルオロメチオニン標識VRK1キナーゼタンパク質を培養細胞に導入する実験を行った。その結果、少量ながら細胞内に標識タンパク質を導入することに成功し、生きた細胞内におけるトリフルオロメチオニン標識VRK1キナーゼタンパク質のNMRスペクトルの測定に成功した。現在導入量を増やすため条件検討を行っており、測定感度の向上を進めている。以上の成果は、本研究の目的である、生きた細胞内における多様なタンパク質間相互作用の解析技術の開発や、細胞内におけるタンパク質の動的構造の解析に必要不可欠な技術であり、本研究の目標達成に大きく貢献した。本研究では研究代表者が開発した19F標識技術とIn-Cell NMR法を用いて、生きた細胞内におけるタンパク質の動的構造を解析する技術を確立し、これまで試験管内ので解析されていた高次構造レベルでの作用機構を、本来タンパク質が機能している細胞内の環境下で解明することを目的とする。本研究の平成27年度における成果は以下の通りである。平成26年度に引き続きトリフルオロアミノ酸標識タンパク質の合成および細胞導入の最適化を進めた。特に標識タンパク質の合成に関しては昨年度開発したトリフルオロメチオニンによる標識技術に加えて、新たにトリフルオロ標識したフェニルアラニンを部位特異的に導入する合成法を理化学研究所の研究者に協力を依頼して試した。その結果タンパク質の特定の位置にトリフルオロ標識したフェニルアラニンを導入することに成功し、さらに19FのNMRシグナルの観測に成功した。シグナルは1本のみ観測され、予定通り選択的に標識されていることが確認できた。この標識タンパク質に対して各種化合物を添加しシグナルの変化を観測した結果、化合物選択的にシグナルが変化することが判明した。この結果はトリフルオロ標識したフェニルアラニンの近傍に化合物が結合していることを示している。以上の成果は、本研究の目的であるところの細胞内におけるタンパク質と基質との相互作用の観測のためには不可欠な技術であり、今後の目標達成に大きく貢献した。平成27年度は部位特異的19F標識技術を用いてタンパク質と基質との相互作用を19Fを用いて高感度に測定することに成功したが、細胞内への標識タンパク質の導入効率の向上に手間取り、最終的な目標である細胞内での相互作用様式の解析までは至らなかった。本研究では研究代表者が開発した19F標識技術とIn-Cell NMR法を用いて,生きた細胞内におけるタンパク質の動的構造を解析する技術を確立し,これまで試験管内で解析されてきた高次構造レベルでの作用機構を,本来タンパク質が機能している細胞内の環境下で解明することを目的とする。本研究の平成28年度の成果は以下の通りである。平成27年度に引き続きトリフルオロ標識アミノ酸のタンパク質への導入を検討した。とくに27年度に部位特異的導入に成功したトリフルオロフェニルアラニンの活用を推進し,タンパク質の様々な部位への導入をすすめた。また酸化ストレス応答タンパク質の細胞内環境下での構造機能解析のため,各種発現系を検討するとともに,細胞内での実験の前準備として19F標識アミノ酸を含めた各種安定同位体で標識したタンパク質を合成し,in vitroでの相互作用実験を行い良好な結果を得た。一方,生体の状態を最もよく反映する指標として近年注目される代謝物に関わる各種酵素の細胞内における動的構造を観測するため,同様に各種発現系の構築を進めるとともに,遺伝子変異に伴う各種代謝酵素のアミノ酸変異が機能に与える影響をNMRメタボローム解析で明らかにした(Sci. Rep. 2017)。今後はこれら変異を持つ酵素の細胞内環境下での働きの違いをIn-Cell NMR方で明らかにしていく。

以上の成果は,本研究の目的である細胞内におけるタンパク質の振る舞いを解明するための基盤となる成果であり,今後の研究の進捗に大きく貢献するものである。本研究では研究代表者が開発した19F標識技術とIn-Cell NMR法を用いて,生きた細胞内におけるタンパク質の動的構造を解析する技術を確立し,これまで試験管内で解析されてきた高次構造レベルでの作用機構を,本来タンパク質が機能している細胞内の環境下で解明することを目的とする。平成28年度は部位特異的19F標識技術の応用を進めると共に,新たな解析対象となる各種タンパク質の標識体の合成に成功し,本研究の目標である細胞内での相互作用様式の解析法の確立にむけた基盤を確立した。人の体の中で様々な機能を果たすタンパク質はそれぞれ特徴的な立体構造を持っており、機能に際して構造が変化することが知られている。しかし従来の研究では単離したタンパク質を試験管内で解析しており、細胞内のように多種類の分子が存在する環境下でのタンパク質の構造変化を調べる研究は技術的に難しかった。本研究では、細胞内においてタンパク質を特異的に且つ高感度に測定できるフッ素をタンパク質に導入し、核磁気共鳴法で測定するための実験系を確立した。またこの方法を活用してタンパク質と基質との相互作用を観測することにも成功した。本成果は今後のタンパク質科学や細胞生物学の発展に大きく貢献するものである。本研究では,申請者が最近開発した19F標識技術とIn-Cell NMR法を組み合わせて,生きた細胞内におけるタンパク質,特に申請者が解析してきたキナーゼの動的構造を解析する技術を確立し,これまでin vitroで解析されてきた高次構造レベルでの作用機構を,本来タンパク質が機能しているin vivoの環境下で解明することを目的とする.本研究の平成29年度の成果は以下の通りである。平成28年度に引き続き、細胞内で高感度に検出できる19F-NMR法に関して19F標識を含めた各種同位体標識法の開発を進めるとともにNMR測定の検討を行った。また酸化ストレス応答タンパク質Keap1に関しては、基質である転写因子Nrf2タンパク質との相互作用をNMRを用いて解析を行い、分子認識機構を高次構造レベルで明らかにした(投稿準備中)。さらに低分子結合に伴うNrf2の活性化がKeap1のどのような高次構造変化に由来するか19F標識等を用いて解析している。また細胞内におけるアロステリック効果等による制御機構を高次構造レベルで計測するため、アミノ酸代謝酵素であるPAHとASPGの大量発現系を構築し、現在解析を進めている。本研究では研究期間全体を通じてタンパク質の各種19F標識技術を新たに開発し、細胞内環境下でのタンパク質の動的構造変化の解析に必要な高感度19F-NMR測定法の開発に初めて成功した。とくにトリフルオロメチル標識体の効果は絶大で、分子量が4万を超えるタンパク質でもNMRで高感度に測定可能である。また本標識はタンパク質の動的構造変化の解析のみならず、基質との相互作用を高感度に測定できることも証明した。
破骨細胞の多核化・活性化におけるアネキシンファミリーの機能解析

破骨細胞形成に関与する分子を明らかにする目的で、DNAイクロアレイの方法を用い、RANKL+M-CSF刺激で発現上昇してくるmRNAを調べたところ、アネキシン2,4,5が有意に上昇していた。確かに破骨細胞に、これらが蛋白として発現しているかを調べるため、特異抗体を用いて免疫染色を行った。アネキシン2,4,5全て単核破骨細胞にも多核破骨細胞にも存在し細胞全体に広く染色された。アネキシンの発現はM-CSF単独添加の場合でも認められ、特に破骨細胞特異的に発現しているわけではなかった。ある種の細胞ではアネキシンが細胞膜上の脂質ラフトに存在することが報告されている。破骨細胞における局在を調べるため、破骨細胞を1% Triton X-100で可溶化し、ショ糖密度勾配遠心法で分画を行った後、特異抗体でウェスタンブロッティングを行った。アネキシン2と4はTriton不溶性の軽い画分には存在せず、破骨細胞においてはラフト以外のところに局在したが、一方、RANKやc-Src, TRAF2,6などはラフトに局在した。ラフトを構成するスフィンゴ糖脂質の合成阻害剤D-PDMPを添加すると、RANKやc-Srcはラフトに局在できなくなり、それに伴い破骨細胞形成が顕著に抑制されたのに対し、ラフトに局在しないc-Fmsやアネキシンの局在は変化しなかった。外からスフィンゴ糖脂質を細胞培養に加えると、RANKやc-Srcはラフトに局在するようになり、それに伴い破骨細胞形成も回復するが、これらは脂質ラフトの形成が回復したためと思われる。成熟破骨細胞において特にRANKL/RANKを介したシグナル伝達は細胞膜上のラフトと呼ばれるミクロドメインで行われていることが本研究で明らかになったが、アネキシンは脂質ラフト以外のところに局在して何らかの機能を果たしていることが示唆された。破骨細胞におけるアネキシンの局在マウス骨髄細胞をSephadex G-10カラムに通してストローマ細胞を除いた培養系に、RANKL+M-CSFを添加して破骨細胞を形成させた。培養3日後に単核の酒石酸耐性酸性フォスファターゼ(TRAP)活性染色陽性の破骨細胞が出現し、5日以降には多核の破骨細胞が多数出現する。破骨細胞にアネキシン2,4,5が発現しているかを調べるため、特異抗体を用いて免疫染色を行った。アネキシン2,4,5ともに単核破骨細胞にも多核破骨細胞にも存在し、細胞全体に広く染色された。ある種の細胞ではアネキシンが細胞膜上のラフトに存在することが報告されている。破骨細胞における局在を調べるため、破骨細胞を1%Triton X-100で可溶化後、ショ糖密度勾配遠心法で分画を行った。それぞれの画分をTCA沈澱で濃縮し、電気泳動を行い、特異抗体でウェスタンブロッティングを行った。その結果、アネキシン2と4はTriton不溶性の軽い画分には存在せず、破骨細胞においてはラフト以外のところに局在することがあきらかになった。アネキシンの発現パターンの解析破骨細胞におけるアネキシンの機能を類推するために、G-10カラムを通したマウス骨髄細胞を(1)M-CSF単独添加群(2)M-CSF,RANKL添加群(3)M-CSF,IL-1添加群

(4)M-CSF,TNF alpha添加群の4群に分け5日間培養した。(2)(4)群はTRAP陽性破骨細胞が形成されるが、(1)および(3)群は破骨細胞は形成されない。4群の細胞をそれぞれ回収し、ウェスタンブロッティング法でbeta-actinをコントロールとして、アネキシンの発現量を比較した。その結果、アネキシンはM-CSF単独添加の場合でも発現が認められ、特に破骨細胞特異的に発現しているわけではないことが明らかになった。近年、アネキシンファミリータンパクが分泌小胞のみならず、細胞膜上の脂質ラフトにも存在していることが報告された。脂質ラフトとはコレステロールやスフィンゴ糖脂質から構成されている細胞膜上に存在するミクロドメインであり、多くの受容体やシグナル伝達に関わる分子がそこに集中して存在することが知られている。そこで我々は破骨細胞においても、アネキシンが脂質ラフトに存在しているのかを明らかにした。マウス骨髄細胞をSephadex G-10カラムに通してストローマ細胞を除いた培養系に、M-CSF+RANKLを添加して多核の破骨細胞を形成させた。1% TritonX-100で細胞を可溶化し、ショ糖密度勾配遠心法で分画を行った後、SDS-PAGE、Western blottingをおこなった。アネキシン2と4はTriton不溶性の軽い画分(脂質ラフト)には存在せず、成熟破骨細胞においてはラフト以外の画分に局在していた。同じ画分にはM-CSFの受容体であるc-Fmsやintegrin alphavなどの存在が認められた。一方、RANKやそれを介するシグナル分子であるTRAF2や6、c-Srcなどは脂質ラフトに局在していた。スフィンゴ糖脂質の合成阻害薬D-PDMPを添加すると、RANKやc-Srcはラフトに局在できなくなり、それに伴い破骨細胞形成が顕著に抑制されたのに対し、ラフトに局在しないc-Fmsやアネキシンの局在には変化は認められなかった。そとからスフィンゴ糖脂質を細胞培養に加えると、RANKやc-Srcはラフトに局在するようになり、それに伴い破骨細胞形成も回復するが、これらは脂質ラフトの形成が回復したためと思われる。成熟破骨細胞において特にRANKL/RANKを介したシグナル伝達は細胞膜上のラフトと呼ばれるミクロドメインで行われていることが今回の研究で明らかになったが、アネキシンは脂質ラフト以外のところに局在して何らかの機能を果たしていることが示唆された。
持続可能性（Sustainability）に関するSTEM教材の開発と国際比較

高校生(約295名)と大学生(272名)を対象として,「持続可能性」に関する意識調査を実施した.「将来」は,「10年」という回答が約8割を占めた.持続可能性に関わる「将来」(数十年から100年の時間スケール)の認識の難しさがわかった.世界の人口76億人に対して,70億人という回答が8割以上を占めた.80億人という回答は,高校生で15%程度,大学生で15%以下であった.持続可能性に関わる情報は常に変化しているので,継続的な学びの機会の提供が必要と考えた.日本の食糧自給率40%については,6割が正しく回答している.また,3割は20%と回答しているので,食糧自給率の低さについては認識されていると考えた.高校における指導者別の比較から,環境問題に関する情報の質に対する認識が指導者に依存している可能性が示唆された.高校生と大学生の比較では,日常生活における困難/問題や社会における困難/課題に差異があることがわかった.また,大学生の「科学技術」に対する期待度が高校生よりも低かった.これらの結果から若年層ほど指導者の影響を強く受ける可能性が示唆された.そのため,指導者研修のあり方も再検討すべきであろう.MDGsとSDGsでは,SDGsの認知度が高い.しかし,SDGsの概念理解の程度はそれ程でもないことが確認された.学部間の比較では,認知度の違いだけでなく,SDGsに対する意識にも顕著な差が認められた.この状況から,大学規模での取り組みが,持続可能性の理解増進に繋がると考えられる.本調査から,指導者研修や組織としての取り組み,継続な学びの必要性など,持続可能性の理解を増進させるための方向性を見極めることができた.また,大学生を対象とした「持続可能性に関するSTEM教材の必要性」が確認できた.今後,より多くの大学や学校種を対象とした調査の必要性が示唆された.再生可能エネルギー(風力と太陽光)の利用技術に関するSTEM教材を完成させた.風向の変化に合わせて風車の向きを変えるヨー制御と太陽の日周運動に合わせて太陽パネルの向きを変える太陽追尾プログラムをテーマとし,制御プログラムはレゴマインドストームEV3を用いた.大学生と高校生を対象とした実践からのフィードバックを踏まえて,「生徒用ガイド」と「教師用マニュアル」を作成した.持続可能性の重要トピックである食糧生産(農業)と関連付けて,水耕栽培の教材化を実施した.水耕栽培は,植物への気候影響(日照不足)や炭素循環の実験的指導に利用できることがわかった.しかし,使用する種子の影響や成長の度合いの指標などの課題も明確となった.また,光のスペクトルの影響評価では,放射強度とスペクトルの影響を切り分けるために,放射強度の調節可能な光源が必要となることや,日射計の波長依存性なども調べる必要があることもわかった.また,水耕栽培の教材化では,大気環境を測定するための小型測器,生物の成長を監視するためのカメラ,データの集積と管理を行うための電子機器の利用可能性を調査した.その結果,市販の機器を利用して,最先端の科学技術(STEM)を体験的に学習できることが確認できた.一方,教育用CO2センサーやO2センサーは,長期間の測定に対応できないことや人間活動の影響が大きい植物の光合成によるCO2濃度の変動を感知することが難しいこともわかった.循環型農業としてアクアポニックスを実践し,持続可能性に関するSTEM教材としての利用可能性を調査した.市販のアクアポニックスを利用して金魚とエビを飼育し,排泄物を肥料としてレタスとイチゴを栽培した.光源としては,青と赤のLEDを用いて四か月間実験した.アクアポニックスが,持続可能性とSTEMの重要性を指導する上で最適な教材であることが確認できた.平成28年度の研究計画に示した具体的な5項目の内の3項目については,研究業績の概要に記載した通り「当初の計画以上に進展している」と言える.しかし,残り2項目については「やや遅れている」状況となっているので,「おおむね順調に進展している」とした.持続可能性に関する市民の認識調査のためのwebサイトは開設することができず,予備調査を実施することができなかった.そのため,持続可能性に関する市民の認識調査については,文献調査だけとなってしまった.また,表計算ソフト(エクセル)を用いた環境モデリングの教材を開発することに関しては,既存の教材の評価に留まり,独自教材を開発することができなかった.光明理化学工業(株)と連携して取り組んでいるバイオマスに関する教材開発では,バイオ水素の実験教材に関して日本エネルギー環境教育学会で公表することができた.今後,バイオエタノールに関しても教材開発を進めていく予定である.また,日本科学教育学会では,「気候リテラシーに関する教材開発水耕栽培」として研究成果を発表することができた.また,水耕栽培の教材開発については,欧州気象学会の教育セッションで発表した.持続可能性の理解では,変化する地球環境への理解も重要となる.そこで,過去100年間の東京における降水パターンの変化を調査し,日本気象学会と欧州気象学会で発表した.この調査は気象学的研究ではあるが,統計学の社会への利用をテーマとしたSTEM教材として発展させる予定である.本研究の副次的な成果として,「STEM教育改善とアクティブラーニング」というテーマで大学教育学会において公表することができた.本研究は持続可能性を指導するためにSTEM的なアプローチを提案するものであるが,結果としてSTEM教育改善に寄与できることを示した.フォレスターの「世界のモデル」を表計算ソフト(エクセル)に移植することで,環境モデリングの教材を開発した.

表計算ソフトに移植したことで,利用者にプログラムの知識が無くても定数や変数の初期値,経験関数の編集が可能となった.世界のモデルは,持続可能性の中心にある人間活動の影響の指導に有効であることがわかった.例えば,出生数と死亡数が,食糧と物的資源,混雑度,汚染などに関係することを明示的に示すことができる.また,世界のモデルは,出生率と死亡率で構成される単純な人口モデルを高度化した結果として示すことで,科学技術の基礎研究から応用研究への過程(プロセス)の指導に利用できることがわかった.そして,世界のモデルの結果を二十世紀末から現在の状況を比較し,アップデートするこは,環境モデリングの良い教材となることもわかった.持続可能性に関する市民の認識調査の予備調査を行った.その結果,持続可能性で重要となる「将来」に対する時間スケールとしては,「10年後」の回答が多く,1000年以上が極めて少なかった.また,日本の食糧自給率,世界の食糧不足(飢餓),農業の環境負荷に対する理解の度合いが低いことが確認された.調査は,紙ベースのアンケートとGoogleフォームを用いて行った.Googleフォームを用いることで結果の処理は容易となるが,調査依頼の方法や回収率などに伴う結果の片寄り(バイアス)も認識できた.そして,調査用webを試作したが,ランダムに協力者を確保することの難しさも再確認できた.最終的な調査は,紙ベースとGoogleフォームを用いて行う事とした.これまでの研究成果の普及と評価を目的として,日本学術振興会のひらめき☆ときめきサイエンス事業の支援を受けて,再生可能エネルギーに関するSTEM教材の普及を目的として,高校生のための環境科学講座「持続可能な社会の構築と科学技術」を開催した.研究計画に示した具体的な5項目の内の3項目については,研究業績の概要に記載した通り「当初の計画以上に進展している」と言える.しかし,次に示す二項目については「やや遅れている」状況となっているので,「おおむね順調に進展している」とした.水耕栽培とアクアポニックスの教材化に関して,導入した人工気象器を用いることで温度と色別(赤・緑・青)光量の厳密な管理が可能なった.しかし,これまで色別の放射強度で議論してきたが,光合成分野では光量子束密度を用いた評価が必要であることが判明した.そこで,これまでの色別実験の結果を新たに導入したライトアナライザーで再評価を行っている.光明理化学工業(株)と連携してバイオエタノールの教材開発を進める予定となっていたが,本研究でも用いる同社製気体採取器の理科教育的研究が萌芽し,結果を日本理科教育学会で共著として発表した.また,本研究とも深く関わる水蒸気の測定に関する共同研究も始まった.そのため,バイオエタノールに関する教材開発が遅れている.
酸化的ストレスと老化:呼吸器系におけるメタロチオネインの生体防御蛋白としての意義

大気汚染物質の一つである浮遊粒子状物質(Suspended particulate matter,以下SPM)は肺への吸入・沈着により健康に悪影響を及ぼすことが示唆されている。様々な大気汚染物質に恒常的に曝露されている肺組織における生体防御機構を解明することを目的とし、金属結合蛋白メタロチオネインを含む防御システムについて解析(病理、分析化学)を実施した。14年度は、1)病理所見:ヒトで報告されているのと同様の形態学的変化として肺胞壁の限局的肥厚(線維化)、気腫(肺胞壁の拡張)、気管支腺の活性化、気管支軟骨の石灰化およびSPMの蓄積、肺胞上皮細胞、気管支腺上皮細胞および気管支上皮細胞でのメタロチオネイン陽性像、および2)分析化学的所見:肺および肺門リンパ節における金属の定性・定量的分析結果(Fe, Al, Mn, Zn, Cr, Mg)を報告した。15年度は、イヌの呼吸器系における防御機構の加齢に伴う変動をクララ細胞に焦点を当て解析した。終末細気管支から呼吸細気管支の領域は,様々な気道内異物の影響を受けやすいことが知られている。クララ細胞はその領域に存在する無線毛気管支上皮細胞であり,薬毒物を代謝する酸化酵素(Cytochrome P450)を多く有することなどから,肺の防御機構に深く関与している。肺の防御機構におけるクララ細胞の役割を明らかにするために,(1)浮遊粒子状物質(SPM)の沈着部位,(2)クララ細胞の形態学的および機能的変化について検索した。その結果、以下の所見が確認された。1.SPMの沈着部位SPMは細気管支粘膜上皮下のマクロファージ,細気管支の間質,一部の細気管支上皮細胞およびクララ細胞の細胞質内,肺胞マクロファージ内に認められた。クララ細胞の存在する近位肺胞領域に集中したSPMの沈着が認められた。2.クララ細胞の形態学的および機能的変化成齢犬では若齢犬と比較して,過形成所見(増数や豊富な細胞質を有する)および機能性蛋白(Cu-Zn SOD)の陽性所見の増強を示す傾向が認められた。また,老齢犬においては,過形成およびCu-Zn SOD陽性所見の減弱が認められた。大気汚染物質の一つである浮遊粒子状物質(Suspended pariculate matter.以下SPM)は肺への吸入・沈着により健康に悪影響を及ぼす事が示峻されている。金属はSPM中に質量比10%前後存在し、その構成元素は多種にわたる。これらの多くは微量でも生体に有害であることが多い。本年度は、イヌの呼吸器系における加齢性諸変化、酸化的ストレスの存在、防御機構を明らかにする目的で、加齢性諸変化(肺胞壁・肺胞腔内の線維北、気腫、毛細血管床の減少)および金属兀素(鉄)の蓄積(細胞種、細胞内外の局在)、酸化的ストレスの各種マーカーの有無について病理学的および分析化学的検索を実施した。1.病理学的所見老犬の肺には、肺胞壁の限局的肥厚(線維化)、気腫(肺胞壁の拡張)、気管支腺の活性化、気管支軟骨の石灰化およびSPMの蓄積が見られた。

これは、これまでにヒトで報告されている所見と一致する。また、肺胞の基庭膜におけるラミニン隅性所見の局所性の低下がしましま認められた。肺胞上皮細胞、気管支腺上皮細胞および気管支上皮細胞にメタロチオネイン陽性像が見られた。DNAの酸化的損傷のマーカーであるデオキシグアノシン酸化代謝産物8-0HdG(8ハイドロキシデオキシグアノシン)の免疫組織化学的陽性像:細気管支上皮細胞細胞核、肺胞上皮細胞細胞核および肺胞内マクロファージ細胞核に強い陽性所見が観察され、その所見は加齢に伴う増加傾向を示した。2.分析北学的所見:肺および肺門リンパ節における金眉の定牲・定量的分析(誘導結合プラズマ発光分析法)肺および肺リンパ節に加齢に伴い蓄積傾向の認められる金属種(Fe,Al,Mn,Zn,Cr,Mg)が存在した。また、大気中のSPMに多く含まれる金属種(Fe,Al)はイヌの肺においても多<蓄積する傾向が認められた。前年度は、1)病理所見:ヒトで報告されているのと同様の形態学的変化として肺胞壁の限局的肥厚(線維化)、気腫(肺胞壁の拡張)、気管支腺の活性化、気管支軟骨の石灰化およびSPMの蓄積、肺胞上皮細胞、気管支腺上皮細胞および気管支上皮細胞でのメタロチオネイン陽性像、および2)分析化学的所見:肺および肺門リンパ節における金属の定性・定量的分析結果(Fe,Al,Mn,Zn,Cr,Mg)を報告した。本年度は、イヌの呼吸器系における防御機構の加齢に伴う変動をクララ細胞に焦点を当て解析した。終末細気管支から呼吸細気管支の領域は,様々な気道内異物の影響を受けやすいことが知られている。クララ細胞はその領域に存在する無線毛気管支上皮細胞であり,薬毒物を代謝する酸化酵素(Cytochrome P450)を多く有することなどから,肺の防御機構に深く関与している。今回、肺の防御機構におけるクララ細胞の役割を明らかにするために,(1)浮遊粒子状物質(SPM)の沈着部位,(2)クララ細胞の形態学的および機能的変化について検索した。その結果、以下の所見が確認された。1.SPMの沈着部位SPMは細気管支粘膜上皮下のマクロファージ,細気管支の間質,一部の細気管支上皮細胞およびクララ細胞の細胞質内,肺胞マクロファージ内に認められた。クララ細胞の存在する近位肺胞領域に集中したSPMの沈着が認められた。2.クララ細胞の形態学的および機能的変化成齢犬では若齢犬と比較して,過形成所見(増数や豊富な細胞質を有する)および機能性蛋白(Cu-ZnSOD)の陽性所見の増強を示す傾向が認められた。また,老齢犬においては,過形成およびCu-ZnSOD陽性所見の減弱が認められた。
常温脳分離体外循環心拍動下における全弓部大動脈置換手術時の補助手段に関する研究

弓部置換手術ではなお,超低体温循環停止法を要し,術後の心肺機能不全・脳障害・血液凝固障害など合併症が多く,未だ満足すべき結果を得ていない.全弓部大動脈置換手術時の補助手段としての常温心拍動下体外循環法が確立すれば,重症例である弓部置換手術の成績は著しく向上することが期待される.これに対し,我々は一部臨床例において常温心拍動下脳分離体外循環とを併用し,その有用性を確認しているが,その際の心拍動を維持するための至適条件はいまだ明確ではない.本研究では上行大動脈遮断下・常温心拍動時における良好な心保護(non working beating heart)を得るための至適環境を解明する事を目的とした.【対象及び方法】体重916kgのビーグル犬を用い,全身麻酔下に予め心電図,左房圧,左心室圧,上行大動脈基部圧,大腿動脈圧及び右冠動脈流量のモニターを行う.大腿動脈送血,大腿静脈からのlong cannulaによる右房脱血でF-Fバイパスを開始.安定した循環動態を得た後に,上行大動脈を遮断し,120分間同条件を維持した.その後上行大動脈遮断を解除し,人工心肺からの離脱時点までのモニターを続けた.大動脈基部からの常温冠灌流を行った冠灌流群(2ml/min/kg)と非冠灌流群とに分け,上行大動脈遮断下・心拍動時及び人工心肺使用の前後での循環動態の変化を観察した.[結果]1)冠灌流群(6例)及び非冠灌流群(6例)の全例で,120分の上行大動脈遮断下心拍動環境を得ることが出来た.2)上行大動脈遮断解除後も循環動態は安定し人工心肺からの離脱も全例遮断解除後10分以内に可能で,極めて良好であった.3)左房圧の変化:CP群では平均左房圧は27mmHgと良好に維持されたが,non CP群では遮断開始後80分から上昇し,90分では15mmHgと高値を示した.(p<0.001)[結論]これらの結果より常温心拍動下における全弓部大動脈置換手術時の補助手段としての,心拍動下上行大動脈遮断の可能であった.併せて冠還流の併用が循環動態維持の為に重要と考えられた.現在は順行性冠潅流群の有用性の確認後に,更に逆行性冠潅流との比較を行うべく,検討を追加している.本稿作成時までに上行大動脈遮断下での常温心拍動の際に逆行性冠潅流下での心電図変化及び潅流量変化に対する心拍動の変化を確認した.弓部置換手術ではなお,超低体温循環停止法を要し,術後の心肺機能不全・脳障害・血液凝固障害など合併症が多く,未だ満足すべき結果を得ていない.全弓部大動脈置換手術時の補助手段としての常温心拍動下体外循環法が確立すれば,重症例である弓部置換手術の成績は著しく向上することが期待される.これに対し,我々は一部臨床例において常温心拍動下脳分離体外循環とを併用し,その有用性を確認しているが,その際の心拍動を維持するための至適条件はいまだ明確ではない.本研究では上行大動脈遮断下・常温心拍動時における良好な心保護(non working beating heart)を得るための至適環境を解明する事を目的とした.【対象及び方法】体重916kgのビーグル犬を用い,全身麻酔下に予め心電図,左房圧,左心室圧,上行大動脈基部圧,大腿動脈圧及び右冠動脈流量のモニターを行う.大腿動脈送血,大腿静脈からのlong cannulaによる右房脱血でF-Fバイパスを開始.安定した循環動態を得た後に,上行大動脈を遮断し,120分間同条件を維持した.その後上行大動脈遮断を解除し,人工心肺からの離脱時点までのモニターを続けた.大動脈基部からの常温冠灌流を行った冠灌流群(2ml/min/kg)と非冠灌流群とに分け,上行大動脈遮断下・心拍動時及び人工心肺使用の前後での循環動態の変化を観察した.[結果]1)冠灌流群(6例)及び非冠灌流群(6例)の全例で,120分の上行大動脈遮断下心拍動環境を得ることが出来た.2)上行大動脈遮断解除後も循環動態は安定し人工心肺からの離脱も全例遮断解除後10分以内に可能で,極めて良好であった.3)左房圧の変化:CP群では平均左房圧は27mmHgと良好に維持されたが,non CP群では遮断開始後80分から上昇し,90分では15mmHgと高値を示した.(p<0.001)[結論]これらの結果より常温心拍動下における全弓部大動脈置換手術時の補助手段としての,心拍動下上行大動脈遮断の可能であった.併せて冠還流の併用が循環動態維持の為に重要と考えられた.現在は順行性冠潅流群の有用性の確認後に,更に逆行性冠潅流との比較を行うべく,検討を追加している.本稿作成時までに上行大動脈遮断下での常温心拍動の際に逆行性冠潅流下での心電図変化及び潅流量変化に対する心拍動の変化を確認した.全弓部大動脈置換手術時の補助手段としての常温心拍動下体外循環法が確立すれば,重症例である弓部置換手術の成績は著しく向上することが期待される.

その際の心拍動を維持するための至適条件はいまだ明確ではない.本研究では上行大動脈遮断下・常温心拍動時における良好な心保護(non working beating heart)を得るための至適環境を解明する事を目的とした.[対象及び方法]ビーグル犬を用い,全身麻酔下に予め心電図,左房圧,左心室圧,上行大動脈基部圧,大腿動脈圧及び右冠動脈流量のモニターを行う.大腿動脈送血,大腿静脈からのlong cannulaによる右房脱血でF-Fバイパスを開始.安定した循環動態を得た後に,上行大動脈を遮断し,120分間同条件を維持した.その後上行大動脈遮断を解除し,人工心肺からの離脱時点までのモニターを続けた.[結果]1)冠灌流群(n=8)及び非冠灌流群(n=8)の全例で,120分の上行大動脈遮断下心拍動環境を得ることが出来た.2)上行大動脈遮断解除後も循環動態は安定し人工心肺からの離脱も全例遮断解除後10分以内に可能で,極めて良好であった.3)左房圧の変化:冠灌流群では平均左房圧は27mmHgと良好に維持されたが,非冠灌流群では遮断開始後80分から上昇し,90分では15mmHgと高値を示した.(p<0.001)[結論]これらの結果より常温心拍動下における全弓部大動脈置換手術時の補助手段の際に,冠灌流の併用が循環動態維持の為に重要と考えられた.現在は順行性冠潅流群の有用性の確認後に,更に逆行性冠潅流との比較を行うべく,検討を追加している.現在は上行大動脈遮断下での常温心拍動の際に逆行性冠潅流下での心電図変化について確認された.全弓部大動脈置換手術時の補助手段としての常温心拍動下体外循環法が確立すれば,重症例である弓部置換手術の成績は著しく向上することが期待される.その際の心拍動を維持するための至適条件はいまだ明確ではない.本研究では上行大動脈遮断下・常温心拍動時における良好な心保護(non working beating heart)を得るための至適環境を解明する事を目的とした.[対象及び方法]ビーグル犬を用い,全身麻酔下に予め心電図,左房圧,左心室圧,上行大動脈基部圧,大腿動脈圧及び右冠動脈流量のモニターを行う.大腿動脈送血,大腿静脈からのlong cannulaによる右房脱血でF-Fバイパスを開始.安定した循環動態を得た後に,上行大動脈を遮断し,120分間同条件を維持した.その後上行大動脈遮断を解除し,人工心肺からの離脱時点までのモニターを続けた.[結果]1)冠灌流群(n=8)及び非冠灌流群(n=8)の全例で,120分の上行大動脈遮断下心拍動環境を得ることが出来た.2)上行大動脈遮断解除後も循環動態は安定し人工心肺からの離脱も全例遮断解除後10分以内に可能で,極めて良好であった.3)左房圧の変化:冠灌流群では平均左房圧は27mmHgと良好に維持されたが,非冠灌流群では遮断開始後80分から上昇し,90分では15mmHgと高値を示した.(p<0.001)[結論]これらの結果より常温心拍動下における全弓部大動脈置換手術時の補助手段の際に,冠灌流の併用が循環動態維持の為に重要と考えられた.現在は順行性冠潅流群の有用性の確認後に,更に逆行性冠潅流との比較を行うべく,検討を追加している.現在までに上行大動脈遮断下での常温心拍動の際に逆行性冠潅流下での心電図変化及び潅流量変化に対する心拍動の変化を確認した.