hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
開口障害の高齢者に対するK-point刺激法による口腔機能向上支援システムの開発

さらに、咀嚼をすることで脳への血流量が増加するとともに脳への刺激が加わり、認知症の進行を遅らせることにつながる。摂食・嚥下への支援には、チーム医療が不可欠である。そこで看護と介護、医科と歯科、理学療法士と作業療法士、言語聴覚士、栄養士等のあらゆる専門職が情報を共有して、チームアプローチをすることができる地域連携システムを模索した。その結果、意思決定支援の前提となるのは、医療者と対象との信頼関係の樹立であり、対象の意思決定において情報や手段に対する支援は進んでいることが分かった。しかし一方で、価値観や感情面への支援はまだまだ途上だということが明らかとなった。意思決定支援の前提となるのは、医療者と対象との信頼関係の樹立であり、対象の意思決定において情報や手段に対する支援は進んでいる。価値観や感情面への支援はまだまだ途上だということが調査から判明したので、これをもとに次年度の計画を進めることができる。今年度は、前年度のデータに基づいて、コアカテゴリー化(類似性に沿ってまとめて,ラベル付けの妥当性を検討)を行う。Step 1:データの数値化,統計的解析:スーパーバイザーをまじえてグラウンデッド・セオリーの手法に基づき,要素を抽出/抽象化,各要素の質的・帰納的分析,コアカテゴリー化を実施する。調査データに基づき,分散構造分析モデルを構築し,これらの概念要素(潜在変数)間の関連性の分析を行う。次に,本モデルに基づく潜在変数のスコア化を実施する。さらに,算出された構成概念のスコアの妥当性を検証するために,それらの構成概念スコアとケア内容との関係性について追加調査・再検討する。Step 2:解析結果の可視化・共起ネットワーク分析,階層クラスター分析,多次元構成尺度等である。Step 3:分類された集合体のネーミング・スーパーバイザーをまじえて,PC処理との比較検討。Step 4:信頼性・妥当性の検討家族関係は今や劇的に変化しつつあるが、対象や家族の思いに目を向け、耳を傾けるような支援が大事である。そこで今年度の口腔機能向上支援システム案をさらに進展させる計画である。
マイタケ中の糖尿病改善作用物質の検索とその作用機の解明

マイタケ中の生理活性物質と思われる成分の分離を試みた。生マイタケを熱風処理を行って粉砕して粉末状にしたものを、10倍量のイオン交換水にて溶かした。3時間室温にてスターラーによって撹拌を行った。その後遠心分離を行い、水に可溶な画分を抽出した。その水可溶性画分は凍結乾燥を行い、再び10倍量のイオン交換水で溶かした後に0.45μmフィルターを通したものをゲル濾過を行った。カラムサイズは2.6×60cmを使用し、ゲル濾過担体は、Sephacyl S-200を使用した。溶媒はイオン交換水を用いた。ゲル濾過するサンプル量は1回で10mlを流せるようにサンプルインジェクターを改良して使用した。ゲル濾過の結果、溶出液70mlあたりから130mlあたりまでに大きなピークがあり(B1)、次に200mlから380mlあたりに大きなピーク(B2)、さらにその後小さなピークが見られた(B3)。これらの3つのピークから得られた溶出液をフラクションコレクターによって採取した。その後この溶出液を凍結乾燥した。凍結乾燥した溶出液は糖尿病マウスであるkkAyマウスに与える時に適宜イオン交換水に溶かした。投与方法は飲料水に溶かして自由摂取させた。マイタケを水で抽出した液を投与した群(A群)はControl群に比べて糖負荷時の血糖値が低下傾向にあった。マイタケを水で抽出した液をゲル濾過して最初に出たピークを投与した群(B1群)はControl群よりも糖負荷時の血糖値を低下させる傾向にあったが、A群よりは効果が薄かった。マイタケを水で抽出した液をゲル濾過して2番目に出たピークのものを投与した群(B2群)ではあまり血糖値の低下作用はなかった。なおこれらは昨年のkkAyマウスに対して胃ゾンデ投与法とほぼ同様の結果になった。なお血糖値の改善に伴い、糖尿病を起因とする高脂血症などの改善傾向にあった。ゲル濾過法を用いて、マイタケ中に含まれる生理活性成分の分離を行った。マイタケを熱風処理して粉末状にしたものを10倍量の蒸留水に溶かした。3時間室温中でスターラーにより撹拌を行った。その後遠心分離を行い、水に可溶な成分を抽出した。その水可溶性成分を凍結乾燥して粉末状にしたものを再び10倍量の蒸留水で溶かした。0.45μmのフィルターを通したものをゲル濾過した。カラムサイズは2.6×60cmで、ゲル濾過担体はsephacyl S-200を使用した。溶媒は蒸留水を使用した。サンプル量は10mlを一回で流せるようにサンプルインジェクターを改良した。ゲル濾過の結果、溶出液70mlあたりから130mlあたりまでに大きなピークがあり、次に200mlから380mlに大きなピーク、さらにその後小さなピークが見られた。そこで、この3つのピークをフラクションコレクターによって採取し、その溶出液を凍結乾燥した。各分画はそのまま餌に混ぜて投与するのではなく、蒸留水にて溶かしてからゾンデにて胃内に直接投与した。マイタケ水抽出液を投与した群(A群)はコントロール群(C群)に比べて血糖値は低下傾向にあった。マイタケ水抽出液をゲル濾過して最初に出たピークを投与した群(B2群)はA群よりも血糖値を低下させる効果は低かったものの、C群よりも血糖値は低下した。さらにゲル濾過で2番目に町たピークを投与した群はあまり血糖値を低下する効果は少なかったが、抽出量が少なかった為かもしれないので、今後は抽出量を増やしたものを投与した効果を調べたい。抽出液は3つのピークが存在したが、3つ目のピークは抽出量が少なかったので、実験には供しなかった。昨年に引き続き、マイタケ中の生理活性物質と思われる成分の分離を試みた。生のマイタケを熱風処理して粉末状にしたものを、10倍量のイオン交換水にて溶かした。半日室温にてスターラーによって撹拌を行った。その水可溶性成分は凍結乾燥を行い、再び10倍量のイオン交換水で溶かした後に0.45μmのフィルターを通したものをゲル濾過した。投与方法は胃内にゾンデにて投与した。マイタケを水で抽出した液を投与した群(A群)はコントロール群に比べて糖負荷時の血糖値が低下傾向にあった。

マイタケを水で抽出した液をゲル濾過して最初に出たピークを投与した群(B1群)はC群よりも糖負荷時の血糖値を低下させる傾向にあったが、A群よりは効果が薄かった。マイタケを水で抽出した液をゲル濾過して2番目に出たピークのものを投与した群(B2群)ではあまり血糖値の低下作用はなかった。なおこれらは昨年のストレプトゾトシン投与ラットと同様の結果になった。マイタケ中の生理活性物質と思われる成分の分離を試みた。生マイタケを熱風処理を行って粉砕して粉末状にしたものを、10倍量のイオン交換水にて溶かした。3時間室温にてスターラーによって撹拌を行った。その後遠心分離を行い、水に可溶な画分を抽出した。その水可溶性画分は凍結乾燥を行い、再び10倍量のイオン交換水で溶かした後に0.45μmフィルターを通したものをゲル濾過を行った。カラムサイズは2.6×60cmを使用し、ゲル濾過担体は、Sephacyl S-200を使用した。溶媒はイオン交換水を用いた。ゲル濾過するサンプル量は1回で10mlを流せるようにサンプルインジェクターを改良して使用した。ゲル濾過の結果、溶出液70mlあたりから130mlあたりまでに大きなピークがあり(B1)、次に200mlから380mlあたりに大きなピーク(B2)、さらにその後小さなピークが見られた(B3)。これらの3つのピークから得られた溶出液をフラクションコレクターによって採取した。その後この溶出液を凍結乾燥した。凍結乾燥した溶出液は糖尿病マウスであるkkAyマウスに与える時に適宜イオン交換水に溶かした。投与方法は飲料水に溶かして自由摂取させた。マイタケを水で抽出した液を投与した群(A群)はControl群に比べて糖負荷時の血糖値が低下傾向にあった。マイタケを水で抽出した液をゲル濾過して最初に出たピークを投与した群(B1群)はControl群よりも糖負荷時の血糖値を低下させる傾向にあったが、A群よりは効果が薄かった。なおこれらは昨年のkkAyマウスに対して胃ゾンデ投与法とほぼ同様の結果になった。なお血糖値の改善に伴い、糖尿病を起因とする高脂血症などの改善傾向にあった。
監査意見形成におけるゴ-イング・コンサーン問題に関する研究

財務諸表監査の本質的機能は一般に、証明機能であると理解されている。すなわち監査人は、財務諸表の適正性に関する監査意見の表明を通じた財務諸表の信頼性の保証によって財務諸表利用者の保護に貢献する。これに対して、ゴ-イング・コンサーン問題には、将来にわたる企業の存続能力の有無あるいは企業倒産の可能性というビジネス・リスクの評価に関連する側面がある。そのため、財務諸表の信頼性の保証という証明機能の枠組みにおいてこの問題にどのように対応するかについて、否定的意見、肯定的意見、積極的肯定意見といった諸見解がみられる。そこで今年度の研究では、財務諸表監査の証明機能の枠組みにおけるゴ-イング・コンサーン問題の位置づけと対応の方向を明らかにすることを目的とした。そこでは、カナダの勅許会計士協会が公表している2つの調査報告書を検討した。1つは、ゴ-イング・コンサーン問題を含む、企業が直面する危険と不確実性に関する財務報告の改善を目的として1990年に公表された報告書である。もう1つは、企業の存続能力の有無と継続企業の前提の関係を考察し、ゴ-イング・コンサーン問題に関する会計基準および監査基準への興味深い提言を行なっている1991年に公表された報告書である。そこから得られた知見は、つぎの3つである。1.ゴ-イング・コンサーン問題は、財務諸表作成の基礎にある継続企業の前提の妥当性、ひいては財務諸表の適正性に影響を及ぼすため、財務諸表監査において常に考慮する必要があること。2.この問題に対処するためには、監査人の行為基準である監査基準のみならず、監査人の判断基準である会計基準の確率、整備が必要であること。3.とくに会計基準については、継続企業の前提の妥当性の程度に応じた多元的あるいは多層的な会計基準の確立・整備が望まれることである。
新規のAPP変異ノックインマウスを用いたアルツハイマー病発症関連遺伝子の探索

我々が作出した家族性アルツハイマー病モデルマウス、即ち遺伝子ターゲティング技術によりES細胞ゲノム上のAPP(amyloid precursor protein)遺伝子にV642I点変異を導入し、Cre-loxP選択的遺伝子組み換えシステムによって下流イントロン内の薬剤選択カセットを除去して作成したV642I型APP変異ES細胞クローン由来のV642I-APPノックインマウスと、一方これと全く同様の手技を経ながら家族性アルツハイマー病型変異を導入せずに作出したマウス(V642V-APPノックインマウス)、および野生型対照群マウスの3種の動物を用いて、APPのV642I変異に伴う脳での発現遺伝子レベルでの差異検出を3つの手法(cDNAアレイ法、cDNAサブトラクション法およびディファレンシャル・デイスプレイ法)により試みた。交配実験の結果、V642I-APPマウスのホモ変異型は野生型およびヘテロ変異型に比べて若干出生率の低下がみられたものの、外見上特に明らかな異常を伴わずに産仔が得られ、成長後は正常に交配可能であることが複数の世代において確認された。これは対照群となるV642V-APPマウスにおいても同様であった。従って本研究においては、遺伝子背景の均一化による偽陽性遺伝子の検出阻止(特異性の向上)よりも、発現差異遺伝子の検出力向上を重視し、試料として用いる脳mRNAはV642I-APPマウス、V642V-APPマウスともF2世代のホモ変異型個体を用いることとした。また個体間の発現遺伝子プロファイルの変動を相殺することを目的に、それぞれ3腹より得られた同一遺伝子型・同一週令の個体各68匹分を選び、それぞれより独立に抽出した脳mRNAを等量ずつプールして作成したサンプルを用いて解析を行った。その結果、V642V-APPマウスは野生型対照群との間で発現に顕著な差異を認める遺伝子は検出されなかったのに対し、V642I-APPマウスは対V642V-APPマウスおよび対野生型マウスのいずれの比較においても、差異が有意と考えられる遺伝子群が各手法によって検出された。現在、それら各遺伝子について別個体によるプール化サンプルにおける再現性、およびC57BL/6Jマウスへの戻し交配(遺伝子背景の均一化)による差異の保存について、確認と解析を進めている。
原因不明食中毒の原因物質としての新規病原細菌の解析

既知の病原因子が検出されない、もしくは従来の分離同定法で検出できないために、原因不明として報告された食中毒について、推定原因物質となった4種類の新規病原細菌の解析を実施した。これら4種類の細菌は培養細胞レベルにおける感染様式に類似性は見られず、ゲノム解析によって近縁関係にある可能性が低いことが示唆された。また、既知の食中毒由来細菌とは異なるメカニズムで病原性を発揮する可能性が考えられた。これらの知見は、原因不明の食中毒の解明および検査法・予防対策のための科学的基盤の構築に寄与することが期待される。現在、原因不明として報告される食中毒の推定原因細菌については、既知の病原因子が検出されない、または検出された細菌による症状が当該食中毒症状と異なる等の理由から病原細菌と特定することが困難である。一部の原因不明食中毒については、メタゲノム解析により従来の分離同定法で検出できない原因細菌を推測できるものの、病原性評価および病原因子の同定・解析にまで至る事例は少ない。そこで、従来の分離同定法で推定された、もしくはメタゲノム解析により推定し分離された原因不明食中毒の原因細菌について病原性の評価を行った。推定原因細菌は宿主細胞に何らかの影響を与えることが推測されることから、まず始めにヒト由来の培養上皮細胞を用いて感染実験を行い、原因細菌の細胞毒性および細胞付着・侵入性を評価した。本研究においては、異なる食中毒事例から分離された2種類の推定原因細菌がともに大腸菌であったことから、下痢原性大腸菌の感染実験系の方法に準じて評価を行った。その結果、これらの原因細菌は細胞侵入性を認めなかったが、細胞付着・侵入能を有しない非病原性の大腸菌に比較すると有意に細胞付着することが認められた。一方、有意な感染細胞の細胞死および形態異常を認めず、実施した実験条件においては細胞毒性を認めなかった。メタゲノム解析により推定された原因細菌については大部分のゲノム情報をすでに得ているが、下痢原性大腸菌として特定するための既知の病原因子は認められなかった。また、従来の分離同定法で推定された原因細菌についてもゲノム情報の取得を行った。このゲノム情報を基にORF予測およびBLAST解析を実施したが、下痢原性大腸菌の既知の病原因子は認められなかった。以上のことから、2種類の推定原因細菌には新規の病原因子および病原性発揮メカニズムを持つ可能性が考えられる。現在、原因不明として報告される食中毒の推定原因細菌については、既知の病原因子が検出されない、または検出された細菌による症状が当該食中毒症状と異なる等の理由から病原細菌と特定することが困難となっている。一部の原因不明食中毒については、既知の病原体については未検出であったが、メタゲノム解析により原因細菌が推測されている。前年度においては、分離同定法により食中毒事例の原因細菌として推定された大腸菌ならびにメタゲノム解析により食中毒事例の原因細菌として推定し分離された大腸菌について細胞毒性および細胞付着・侵入性を評価した。また、分離同定法で推定された大腸菌についてゲノム情報を取得し、ORF予測およびBLAST解析を実施した。本年度においては、取得した2種類の大腸菌ゲノム情報を用いて比較解析等を行った。これらのゲノム情報について、既知の病原性大腸菌(EHEC、EPEC、EAEC、UPEC、ExPEC)のゲノム情報と共にSNP解析を行い、得られたSNPs情報を元にUPGMA法によるクラスター解析を行った結果、これらの大腸菌は2つの大きなクラスターに分けられ、本研究における新規の推定病原細菌は同一クラスターに属した。新規の推定病原細菌はEPEC、UPEC、ExPEC等が多く存在するクラスターに属し、ほとんどのEHECおよびEAECが存在するクラスターとは異なることが明らかとなった。新規病原細菌の比較解析を行うにあたり、新たな候補株を選定した。分離同定法により原因細菌が推定された食中毒事例のうち、既知の病原因子を保有しない大腸菌が検出された事例において、各事例で検出された菌株間の分子疫学解析を実施するとともに、遺伝子型ならびに血清型を決定し、候補株を選定した。ヒト由来の培養上皮細胞に対する当該細菌の細胞付着性が認められており、これは当該細菌による初期の感染様式を明らかにする上で重要な知見となる。現在のところ、既知の病原性大腸菌で確認されるような特徴的な付着様式(localized adhesion、localized adhesion、microcolony formation)は認められないが、特徴的な付着様式を呈する条件を検討する余地がある。また、細胞毒性の評価に関しては、現在の実験系および条件では評価できないため検討が必要である。新たに原因不明食中毒事例2事例における推定原因細菌の解析を本研究に加えた。新たに加えた推定原因細菌もこれまでの解析株と同様に大腸菌株であることから、比較解析等の実施が容易であると考えられる。上記の現状を考え合わせて、本研究はおおむね順調に進展していると判断できる。一部の原因不明食中毒においては、既知の病原体は未検出であったが、メタゲノム解析により原因細菌が推測されている。本研究においては、これまで分離同定法により食中毒事例の原因細菌として推定された大腸菌ならびにメタゲノム解析により食中毒事例の原因細菌として推定し分離された大腸菌について細胞毒性および細胞付着・侵入性を評価した。分離同定法で推定された大腸菌についてはゲノム情報を取得した。

これら推定病原大腸菌について、既知の病原性大腸菌(EHEC、EPEC、EAEC、UPEC、ExPEC)ならびに推定病原大腸菌間における近縁関係を明らかにするため、既知の病原性大腸菌のゲノム情報と共にSNP解析を行い、得られたSNPs情報を元にUPGMA法によるクラスター解析を行った。また、ORF予測およびBLAST解析を実施し、新規の推定病原大腸菌間の比較解析を実施した。原因不明食中毒の推定原因細菌について、病原性の評価ならびにゲノムレベルにおけるクラスター解析によって各推定原因大腸菌の新規病原細菌としての位置づけを行うことができた。これらの知見は、新規病原細菌の感染メカニズムの解明および検査法・予防対策のための科学的基盤の構築に寄与することが期待される。ゲノムレベルでのクラスター解析において、既知の病原性大腸菌は2つの大きなクラスターに分けられる:主にEPEC、UPEC、ExPEC等を含むクラスター(cluster A)とほとんどのEHECおよびEAEC等を含むクラスター(cluster B)。本研究における新規の推定病原細菌のうち3株はcluster Aに属するが、1株はcluster Bに属することを明らかにした。推定病原細菌間におけるSNPは40,000SNPs以上あり、近縁関係が低い可能性が示唆された。前年度においては、先に実施した2株においてヒト由来の培養上皮細胞に対する当該細菌の細胞付着性を認めた。そこで、新規に追加した2株においても同様にヒト由来の培養上皮細胞に対する細胞付着性について調べた。その結果、新規に追加した2株においては、先に実施した2株より細胞付着性が弱いことを明らかにした。ゲノムレベルでのクラスター解析による比較解析の結果から、これら推定病原細菌間における近縁関係は低く、細胞付着性においても異なることが示唆されることから、推定病原細菌間の病原性について類似性を見出すには至らなかった。上記の現状を考え合わせて、本研究はやや遅れていると判断できる。現在、原因不明として報告される食中毒の推定原因細菌については、既知の病原因子が検出されない、または検出された細菌による症状が当該食中毒症状と異なる等の理由から病原細菌と特定することが困難となっている。一部の原因不明食中毒においては、既知の病原体は未検出であったが、メタゲノム解析により原因細菌が推測されている。本研究においては、これまで分離同定法により食中毒事例の原因細菌として推定された大腸菌ならびにメタゲノム解析により食中毒事例の原因細菌として推定し分離された大腸菌について細胞毒性および細胞付着・侵入性を評価した。分離同定法で推定された大腸菌についてはゲノム情報を取得した。
自己先鋭化プローブによる高分解能原子間力顕微鏡の実現

電界誘起酸素エッチングの応用では、ヘリウム・酸素雰囲気で30 kVまでの高電圧の印加でも、先端形状の変化はなかった。また、電子ビーム誘起堆積法の応用では、真空中に有機金属ガスを導入し、電解研磨により先鋭化したタングステンワイヤを対向させ、高電圧印加による電子放出を行うと、カソード側のタングステンワイヤ先端に形状の変化が見られた。これらの結果により、AFMプローブ自己先鋭化の可能性を示した。本研究課題では、超高分解能原子間力顕微鏡(AFM:atomic force microscope)の分解能と計測感度向上のため、AFMプローブ先端に電界誘起酸素エッチングもしくは電子ビーム誘起堆積を施し、曲率半径10nm以下を実現する自己先鋭化プロセスの開発を行う。電界誘起酸素エッチング、電子ビーム誘起堆積いずれのプロセスでもAFMプローブ自身の形状の電界集中により、プローブ先端部分で選択的に加工が起こるため、非常に簡単なプロセスで先鋭化が可能である。平成27年度には、まず、水酸化カリウム水溶液による電解研磨により直径0.3mmのタングステンワイヤを先端曲率半径数十nmまで高い再現性で先鋭化する条件を見いだした。この条件は、平成27年度に行った電界誘起酸素エッチング、平成28年度に予定している有機金属ガスを用いた電子ビーム誘起堆積いずれでも必須な本研究課題の基礎技術である。次に、10の-3乗Pa程度の酸素雰囲気中で電界誘起酸素エッチングにより、電解研磨により先鋭化したタングステンワイヤの更なる先鋭化を試みた。タングステンワイヤ先端に印加した高電界と酸素分子により先端がエッチングされることは観察されたが、曲率半径数ナノメートルの先端を得ることは出来なかった。電界誘起酸素エッチングによる先鋭化プロセスでは、タングステンワイヤ先端とシャンク部分の電界強度の違いを利用して、シャンク部分のみに酸素分子を吸着させ、選択的にエッチングを行う。しかし、本研究で使用した現有の10kVの高電圧電源では、先端近傍の電界強度が足りず、タングステンワイヤ全体に酸素分子が吸着したことで、先端を残した選択的エッチングを行うことが出来なかったと考えられる。平成28年6月末までに、30kVまで印加可能な高電圧源を用いてタングステンワイヤ先端のみを残し、曲率半径数nmを実現するプロセス条件を明らかにする。本研究は、「1,水酸化カリウム水溶液による電解研磨により直径0.3mmのタングステンワイヤを先端曲率半径数十nmまでの先鋭化」「2(a),電界誘起酸素エッチングによる先端曲率半径数nmまでの先鋭化」「2(b),電子ビーム誘起堆積により曲率半径数nmの微小構造の作製」により実現する。平成27年度には、1を完了し、2(a)の実験系の構築と実際の電界誘起酸素エッチングを行った。しかし、曲率半径数nmのAFMプローブ実現には至らなかった。これは、現有の10kVの高電圧電源では、先端近傍の電界強度が足り無かったためと考えられるため、平成28年6月末までに、30kVまで印加可能な高電圧源を用いてタングステンワイヤ先端のみを残し、先端曲率半径数nmを実現するプロセス条件を明らかにする。本研究課題では、超高分解能原子間力顕微鏡(AFM: atomic force microscope)の分解能と計測感度向上のため、AFMプローブ先端に電界誘起酸素エッチングもしくは電子ビーム誘起堆積を施し、曲率半径10nm以下を実現する自己先鋭化プロセスの開発を目指した。電界誘起酸素エッチング、電子ビーム誘起堆積いずれのプロセスでもAFMプローブ自身の形状の電界集中により、プローブ先端部分で選択的に加工が起こるため、非常に簡単なプロセスで先鋭化が可能である考えた。昨年度に、タングステンワイヤ先端の電界強度不足のため電界誘起酸素エッチングによる先鋭化が実現しなかったことを踏まえて、30kVまで印加可能な高電圧源を用いての加工を試みたが、これまでと同様、先端形状は変化しなかった。次に、電子ビーム誘起堆積法を応用した先鋭化を試みた。真空チャンバー内で、電解研磨により先鋭化させた2本のタングステンワイヤを対向させ、両者の間に高電圧を印加した。これにより、カソードタングステンワイヤ先端から電子が放出され、電界集中によりアノードタングステンワイヤ先端に選択的に入射する。この状態で、タングステン含有有機金属ガスを導入すると、入射電子によりアノード先端にタングステンのナノ突起が作製されると考えた。実際には、アノードでの先端形状の変化は発生せず、カソードでの形状変化が見られた。カソードから放出された電子が発散し、アノード先端の電流密度が小さかったためと考えられる。これに対して、カソードでは、放出された電子自身により有機金属ガスが分解されたため、タングステンの堆積が起こったと考えられる。曲率半径の小さな電極を対向させ、有機金属ガス雰囲気で電圧を印加する非常に簡単なプロセスにより、先端形状を変化させることが可能であることを示したが、ナノ突起の作製条件を明らかにするには至らなかった。

これらの結果により、AFMプローブ自己先鋭化の可能性を示した。平成27年度までの電界誘起酸素エッチングプロセスでは、タングステンワイヤ先端の電界強度が足りず、本来残すべきワイヤ先端までエッチングされた。そこで、平成28年6月末までに10kV以上の高電圧を用いて電界誘起酸素エッチングプロセスによる先鋭化プロセスの開発を完了する。平行して、電子ビーム誘起堆積による自己先鋭化プロセスの開発のため、プローブ加工真空チャンバーに「有機金属ガスを導入可能な系の設計及び導入」と「ゲート付き冷陰極とプローブ用のタングステンワイヤの位置合わせ可能なホルダの設計及び導入」を行った後に、曲率半径数nmを実現する電子ビーム誘起堆積条件を明らかにする。量子ビーム応用
Nucleofectionによる神経栄養因子遺伝子導入骨髄細胞を用いた神経再生

遺伝子導入法の一種であるNucleofection法を用いて、神経栄養因子の一つであるGlial cell derived neurotrophic factor(GDNF)を骨髄間質細胞へ遺伝子導入することに成功した。6週齢SDラット大腿骨から取り出した骨髄間質細胞を10日間培養し、mouse GDNFcDNA(pcDNA3.1/Zeo(+)-mGDNF)を大腸菌プラスミドに組み込み精製した。骨髄間質細胞10^6個に対し、5μgのGDNF cDNAをNucleofectorを用いプログラムA-23でNucleofectionを行なった。導入12時間後にELISAでGDNFの発現を評価した。コントロールで発現は見られず、GDNF導入骨髄間質細胞では1812.9pg/mlと、導入していない骨髄細胞の25.8倍の発現を認めた。また導入12時間後のRT-PCRでは、negative controlではmRNAの発現は認めず、GDNF導入骨髄細胞でmRNAの発現を認めた。抗GDNF抗体による免疫染色でもGDNF導入骨髄細胞で陽性細胞が多く認められ、非ウィルス的に多分化能を有する骨髄間質細胞に神経栄養因子を遺伝子導入可能である事が確認された。この研究結果を得た後に、6週齢SDラットを用い別の同種ラット大腿骨から採取した骨髄間質細胞に上記と全く同じ手法で遺伝子導入し、12時間後に15mmの脛骨神経欠損モデルにシリコンチューブを介して再生実験を行った。細胞はシリコンチューブ内に10^5個を移植し12週後に、骨髄間質細胞のみの移植、自家神経移植群と病理及び電気生理学的に再生を比較した。結果は遺伝子導入を行わない骨髄間質細胞のみの移植に比べ再生は劣っており、自家神経移植にも及ばなかった。骨髄間質細胞の神経再生に関与する機序として支持細胞として再生に寄与した可能性が高いと考えた。6週齢SDラット大腿骨から取り出した骨髄間質細胞を10日間培養し増殖させ、一方mouse GDNF cDNA(pcDNA3.1/Zeo(+)-mGDNF)を大腸菌プラスミドに組み込み精製した。骨髄間質細胞1×10^6個に対し、5μgのGDNF cDNAをNucleofectorを用いてプログラムA-23によりNucleofectionを行なった。コントロールでは発現が見られず、GDNF導入骨髄間質細胞では1812.9pg/mlと、導入していない骨髄細胞の25.8倍の発現を認めた。抗GDNF抗体による免疫染色でもGDNF導入骨髄細胞で陽性細胞が多く認められた。またGFPを用いた同様のnucleofection法で導入率は約40%であったことが確認された。これらにより非ウィルス的手法により多分化能を有する骨髄間質細胞に神経栄養因子を遺伝子導入可能である事が確認された。今後、この導入細胞をラット末梢神経切断モデルで実際に神経再生が促進されるか検討する予定である。
光活性化興奮能の移植による単一ニューロンの行動レベルでの機能探究

海産動物アメフラシの口球神経節内の同定MAニューロンへクラミドモナス由来のチャンネルロドプシン2(ChR2)を機能移植し、MAの摂食神経回路網内での機能的役割を調べた。実験ではMA細胞体へChR2発現ベクター(pNEX-ChR2)を導入後、20°Cで3日間培養した。MA細胞体領域を明るい青色光(100Wキセノンランプ)で刺激すると、ほとんどのシナプス後ニューロンで脱分極応答が記録された。MAは多くのシナプス後ニューロンと電気シナプスに加えて抑制性結合をしていることから、今回の結果はこれまでの電気生理学的データと一致しない。ChR2は細胞全体に発現するため明るい光刺激は細胞全体を脱分極させるであろう。すると、本来、細胞体近傍で発生した活動電位が軸索側の脱分極でその伝導が抑制されて末端まで伝わらず、電気シナプスによる脱分極応答のみが発現した可能性がある。そこで、青色レーザー光源を用いたビーム径(10μm)の小さな光刺激をMA細胞体の一部に与えて調べたところ、予想されるほとんどのニューロンでIPSPを記録することができた。さらに本実験では、MA細胞体に長時間の強い光刺激やレーザービームを与えるとリズミカルな応答がMAやその他のニューロンに誘発されることがわかり、MAは潜在的にこのような能力があることが予想された。本研究の結果、この方法では適切な光刺激を行わないと本来の生理現象とは異なる応答が得られる危険性があることが示唆された。連携研究者の高橋グループがチャンネルロドプシン2(ChR2)遺伝子のアメフラシニューロン発現ベクターpNEXへの組込みを行い、長濱グループがアメフラシ神経節内のニューロン細胞体にpNEX-DNA(マーキング用色素含有)を微小電極から圧注入で導入した。イオン組成を海水に近付けたL15培養液(SL15)中で神経節を暗条件下で培養し、マーキングしたニューロンに赤色条件下、電極を再度刺入し、青色光刺激を適時与え、刺激に応じて脱分極応答が発現するかどうかを調べた。1)遺伝子導入・培養の条件:pNEX-DNAの導入量と培養条件の検討を行った。導入DNA濃度は他の遺伝子導入時と同様、1μg/1μl程度で良かったが、培養日数が2日以内では外液へのレチナール添加が必要であった。一方、3日以上培養ではレチナール添加は不要であることもわかった。そこで今後は3日間培養とした。2)光刺激の条件:最適な興奮性が得られる刺激光の強度、波長特性を調べたところ青色光では非常に明るい光(キセノン100ワット光源)でのみ応答が見られ、培養後の赤色安全光での操作は不要であることが明らかとなった。また、熱フィルターを介した白色光の方が青色光よりも明らかに大きな応答が得られた。3)外液条件:アメフラシニューロンの電気生理学実験は、通常、体液組成に近い人工海水中で行うが、これまでChR2が良く使われている哺乳動物に比べてイオン強度が極めて高い。そこでこのような条件におけるChR2の各種イオンに対する透過性を膜電位固定法を用いて調べた。この結果、ChR2の陽イオンチャンネルを透過するイオン種はナトリウムが主で、カルシウムはほとんど透過しないことがわかった。この結果、ニューロン回路網の研究を目的としたカルシウム濃度を様々に変えた外液を用いてもChR2がほとんど影響を受けないことが明らかになった。H22年度は、すでに同定されているMAニューロン細胞体にpNEX-DNA(マーキング用色素含有)を微小電極から圧注入した。このニューロンは口球神経節内の様々なニューロンにシナプス結合をしており、光刺激によりシナプス後ニューロンでMA由来のシナプス応答が期待できる。

塩組成を海水に近付けたL15培養液中で神経節を暗条件下3日間培養し、口球神経節内の様々なニューロンに電極を刺入し、光刺激によりこれらニューロンでMA由来のシナプス応答が発現するかどうかを調べた。1)口球神経節全体の光刺激により、口球神経節内の様々なニューロンに興奮性や抑制性のMA由来と考えられるシナプス応答が発現した。青色光と熱フィルターを通した白色光で比べると、白色光の方でより大きな応答が得られた。2)抑制性応答が見られるニューロンでも、MA細胞体が壊れると興奮性応答に変化することが多かった。ChR2はMAの細胞全体に発現していると考えられる。そこでこのような変化の原因として、細胞体が欠落した場合は軸索末端部のみが刺激されて脱分極し、電気的カプリングのみが観察されている可能性がある。そこで、次年度は光照射にビーム径の小さなレーザー光を用い、細胞体と軸索に分けて局所刺激を行い、応答の差を比べる予定である。3)神経節全体に数十秒間の長い光刺激を行うと、その間、MAおよび他のニューロンにリズミカルな活動が誘発されることがわかった。このような応答は、MAに刺入した微小電極から通電して長時間発火活動をさせても普段はおこらない。そこでこの応答が、ChR2の細胞全体にわたる脱分極効果によっている可能性もあり、次年度は2)と同様に刺激部位を変えて更に調べてみたい。また、このリズミカルな応答と摂食応答とを比較し、この応答の生理的意味も追求する予定である。H23年度もMAニューロン細胞体にpNEX-DNAを導入した。このニューロンは口球神経節内の様々なニューロンにシナプス結合をしており、光刺激によりこれらニューロンでシナプス応答が期待できた。培養液SL15(塩組成を海水に近付けたL15培養液)中で神経節を暗条件下で3日間培養し、外液を人工海水に戻した後、神経節内の様々なニューロンに電極を刺入した。1)MAからのシナプス入力で抑制性応答が予想されるニューロンでも、MAの細胞体が壊れると光刺激で興奮性応答が出やすい事が昨年わかった。細胞体が欠落した場合、MAの軸索末端部のみが刺激されて脱分極し、活動電位が発現せずに電気的カプリングのみが観察されている可能性がある。そこで、今年度は光照射用にビーム径の小さな(約10μm)レーザー刺激装置を作成し、細胞体と軸索に分けて局所刺激を行った。同一のシナプス後ニューロンに対してMAの細胞体と軸索へ局所光刺激を行うと、後者に比べて前者で明らかに抑制性応答が出やすく、予想された仮説が強く示唆された。2)神経節全体に数十秒の長い光刺激を行うと、その間、MAおよび他のニューロンにリズミカルな活動が誘発されることも昨年わかった。このような応答はMAに刺入した微小電極からの通電で長時間MAを発火させても普段はおこらない。そこでこの応答が、ChR2の細胞全体にわたる脱分極効果によっている可能性もあり、1)と同様に刺激部位を変えて実験を行った。この場合、細胞体、軸索の局所光刺激でいずれの場合もニューロンにリズミカルな応答が誘発され、MAニューロンが潜在的にリズミカルな応答を形成する能力があることが示唆された。以上の結果、ChR2実験では光刺激の部位によりシナプス後ニューロンの応答に差が見られる可能性が高く、最近の脊椎動物での広範な使用にあたり十分な注意が必要であることがわかった。
難治性婦人科がん特異的非コードRNAおよび結合因子複合体の作用機構解明と臨床応用

卵巣がんは、婦人科腫瘍の中でも特に予後が悪いことが知られており、新規の診断、治療ターゲットが望まれている。倫理基準を満たした卵巣がんの臨床検体を用いたRNA-seqによる網羅的な遺伝子発現解析を行い、卵巣がん特異的に高発現する新規長鎖非コードRNAを複数同定している。複数の卵巣がん細胞株にて当該長鎖非コードRNAの発現を、siRNAを用いて抑制(ノックダウン)すると細胞増殖が抑制されることから、着目した長鎖非コードRNAは卵巣がんの進展に関わることが示唆された。次にfluorescence in situ hybridization法と細胞分画法を用いることで、当該長鎖非コードRNAが特徴的な細胞内局在を有することを明らかにした。さらに当該長鎖非コードRNAのノックダウン下における網羅的な遺伝子発現解析を、マイクロアレイを用いて行い、当該長鎖非コードRNAがターゲットとする遺伝子群を明らかにした。上記のように卵巣がん臨床検体のRNA-seqデータを有しているので、卵巣がん臨床検体の遺伝子発現データと当該長鎖非コードRNAノックダウン下のマイクロアレイデータを統合的に解析することで、当該長鎖非コードRNAのさらなるターゲット遺伝子群の絞り込みを行なった。最後に卵巣がん細胞株を用いたin vivo腫瘍モデルを樹立し、当該長鎖非コードRNAのノックダウンは腫瘍の増大を抑制することを明らかにし、当該長鎖非コードRNAが卵巣がんの新規治療ターゲットとなる可能性を見出した。婦人科腫瘍の中でも特に予後が悪いことで知られている卵巣がんの進展、悪性化に関わる長鎖非コードRNAを同定するために、卵巣がんにてRNA-seqを行い、網羅的な遺伝子発現解析を行なった。その結果、いまだ同定されていない多数の長鎖非コードRNAが非がん部組織と比較して、卵巣がんにおいて発現が大きく変動していることが判明した。その中でも特に卵巣がんにおいて発現が高く、非がん部組織では発現が低い、がん特異的に高発現している長鎖非コードRNAに着目した。着目した長鎖非コードRNAは未だ同定されておらず、スプラシングサイト等の正確な構造も不明である。申請者は正確な転写開始点、また終止点を明らかにするために5' rapid amplification of cDNA end (RACE)法、3' RACE法を行った。さらにRACE法によって得られた情報を元に当該長鎖非コードRNAのクローニングを行い、正確な転写産物を同定した。これら長鎖非コードRNAに対するsiRNAを用いたノックダウン実験を行なったところ、複数種類の卵巣がん細胞株にて細胞増殖が抑制されることが判明した。さらにFISH法を用いて当該長鎖非コードRNAの細胞内局在を明らかにした。また長鎖非コードRNAノックダウン下でのマイクロアレイ解析を行うことによって、当該長鎖非コードRNAの関与するシグナル経路を同定することができた。さらには本研究課題で学んだ長鎖非コードRNAの知識を生かして、Cancer Lettersに総説を執筆した(Cancer Letters. 418:159-166, 2018)。平成29年度の研究によって、申請者らは卵巣がんにおいて高発現している長鎖非コードRNAを同定した。またsiRNAを用いた実験から、同定した長鎖非コードRNAは、がんの増殖に関わる可能性が示された。長鎖非コードRNAはタンパク質等の他の因子と結合することで機能することが知られており、結合因子を同定することは非常に重要である。当該長鎖非コードRNAの結合因子の同定は平成29年より現在も継続して進めている。それ以外の研究計画についても実施できており概ね順調に研究は進捗していると考えられる。1)長鎖非コードRNAの結合因子の同定と作用メカニズムの解明マイクロアレイ解析を元にパスウェイ解析を行い、同定した長鎖非コードRNAと強く関連していると予測されるタンパク質との結合を、RNA免疫沈降法を用いて解析する。長鎖非コードRNA結合タンパク質が同定された場合、結合タンパク質の機能に応じて長鎖非コードRNAの詳細な機能解析を行う。

2)解明したメカニズムの臨床応用腫瘍を移植した免疫不全マウスに対し、長鎖非コードRNAに対するsiRNA、もしくは上記実験で得られた因子に対するsiRNA、阻害剤を用いた時の腫瘍の増殖に対する影響を測定することで、長鎖非コードRNA、また解明したメカニズムを元にした新規治療法への応用を目指す。平成29年度の研究では長鎖非コードRNAの結合因子を同定するには至らず、次年度使用額が生じた。次年度使用額は引き続き長鎖非コードRNAの同定と、in vivoの卵巣がんマウスモデルの実験に使用する予定である。
絹フィプロイン被覆人工血管の開発

6mm径人工血管をイヌ腹部大動脈に、3.5mm径人工血管を総頸動脈に移植し病理学的検討を行った。ゼラチン被覆人工血管は内腔に厚い線維組織と平滑筋層が侵入し内皮化されているのに対し、絹フィブロイン被覆人工血管は内腔には線維組織の厚みがなく内皮化されており、その代わり外側に厚い平滑筋層を有した。特に小口径人工血管では内腔の狭小化を防ぐ意味で有利な特性であり、高い開存性につながると考えられた。現在普及している牛由来タンパク被覆人工血管の感染および炎症に関する欠点を克服するべく、絹フィプロイン被覆人工血管を開発し、その安全性と組織治癒における優越性を動物実験において証明する目的で、具体的には、現在市販されている被覆人工血管と絹フィプロインで被覆した人工血管をイヌの腹部大動脈に移植し、手術操作性、血液漏出性、炎症反応、器質化、開存性などを比較検討した。ビーグルのオス成犬(体重8-12kg)を使用し腹部大動脈置換モデルを確立し、絹フィプロインを使用した人工血管の試作品3種類、計8本の移植を行った。このうち3本の長期開存(最長で3カ月)を得て現在経過観察中である。またコントロールとして市販のポリエステル人工血管2本を移植し経過をみている。試作品についてはその都度手術操作性、血液漏出性などについて製作者である農工大の朝倉哲郎教授の研究室に情報をフィードバックし製品の改良に努めた。現在開存している人工血管は移植後6カ月をめどに摘出し、中枢、末梢吻合部および人工血管中央部の標本を作製し、被覆材の吸収、炎症反応、器質化などを検討する。また内皮細胞や平滑筋細胞の有無を免疫染色で確認する。そしてこれらの移植人工血管の分析結果をふまえ、絹フィプロイン人工血管の作製条件を確立し、開存性、耐久性、器質化、内皮細胞の定着などについてより詳細な比較実験を行う予定である。昨年の研究初年度は人工血管の作製条件を確立するための仕込み実験の位置づけとなった。また現在、朝倉研究室では3mm径の人工血管も開発中であり、これについても予備的な動物移植実験を行い総頸動脈の置換モデルを確立した。順次3mm径についても動物移植実験を行う予定である。23年度までに、動物実験としてビーグルのオス成犬(体重8-12kg)を使用し腹部大動脈に市販のポリエステル人工血管と絹フィブロインを使用した人工血管の試作品3種類を移植した。人工血管の径はすべて6mmで、絹にポリウレタンを混ぜて被覆したもの以外はいずれも良好な器質化と長期開存を得た。これによって絹は非常に組織親和性がよく炎症反応を起こしにくいことがわかった。しかし6mm径では市販のポリエステル人工血管でも良好な結果を得ており、絹素材の優越性を示すにはよりハードルの高い実験モデルが必要である。そこで我々は3mm径の人工血管用にイヌの総頸動脈置換モデルを確立した。これまでの予備実験では、市販の人工血管素材の一つであるePTFE製の3mm人工血管は早期に閉塞することがわかっており、絹製の3mm人工血管が3ヶ月程度の開存が得られたことを考えると3mm径の比較実験では良好な結果が得られることが期待される。これらの結果をふまえ24年度は、3mm径ポリエステル人工血管とこれを絹フィブロインで被覆した人工血管を作製し、総頸動脈置換モデルにおいて開存率を中心に比較実験を行う。またこれらの人工血管を移植後6カ月をめどに摘出し、中枢、末梢吻合部および人工血管中央部の標本を作製し、被覆材の吸収、炎症反応、器質化などを検討する。また現在、連携研究者である農工大の朝倉哲郎教授の研究室では、すでに3mm径の絹人工血管を数種類製作しており、これについても適宜動物移植実験を行っている。6mm径人工血管のイヌ腹部大動脈置換モデルにおいて、ポリエステル基盤の人工血管をゼラチンおよび絹フィブロインで被覆したものを中央でつなぎ合わせハイブリッド人工血管として移植した。移植6カ月後人工血管を摘出し病理学的検討を行った。ゼラチン被覆部は内腔に厚い線維組織と平滑筋層が侵入し内皮化されているのに対し、絹フィブロイン被覆部は内腔には線維組織の厚みがなく内皮化されており、その代わり外側に厚い平滑筋層を有した。これらの所見については、市販のポリエステル人工血管や新たに作製した絹フィブロイン基盤の人工血管を単独で移植した場合でも同様の結果が得られており、絹という素材を人工血管に利用した場合の共通の特徴と考えられた。特に小口径人工血管では内腔の狭小化を防ぐ意味で有利な特性であると判断した。一方、3.5mm径のイヌ頸動脈置換モデルにおいては、開存性に与える影響を調べる目的で比較実験を行った。ポリエステル基盤の人工血管はゼラチン、絹フィブロイン被覆に関わらず7本がすべて1ー2週間で早期閉塞した。

一方絹フィブロイン基盤の人工血管は、基盤の構造や被覆方法にもよるが概ね3ー4カ月の開存が得られ、6カ月の開存例もあった。これらの結果より絹の人工血管材料としての有用性が示唆されたが、その方法については基盤、被覆方法も含め改善の余地があると考えられた。以上の結果をもとに今後も絹の人工血管への利用について研究を進めたい。これまでの研究によりポリエステルの人工血管基盤、絹フィブロインの被覆方法が絞られてきており、本年度は条件をそろえた比較実験が可能である。24年度が最終年度であるため、記入しない。イヌの総頸動脈置換モデルにおいて、3mm径ポリエステル人工血管とこれを絹フィブロインで被覆した人工血管を作製し、開存率を中心に最終的な比較実験を行う。そして開存率、器質化の両面から絹フィブロインの被覆材としての有用性を証明する。
アンビエントエレクトロニクス創出に向けた超低電力CMOS集積回路技術に関する研究

本研究の目的は,MOSFETのサブスレッショルド領域を利用した超低消費電力センサLSIシステムの設計手法の確立することにある.この目的に向け,本年度は超低消費電力で動作するADコンバータの検討を行った.ADコンバータは温度や音声などのアナログ信号を,信号処理を行う際に適したディジタル信号に変換する回路ブロックである.一般にAI)コンバータは,アナログ回路ブロックの消費電力が全体の消費電力の大半を占める.そこで,本研究では,微小電流で動作するアナログ回路を用いてADコンバータを構成することでアナログ回路ブロックの消費電力を大幅に削減し,ナノワットオーダの超低消費電力で動作するADコンバータを開拓した.また,微小電流でADコンバータを動作させる際には,温度変化や製造プロセス変動によるAD変換の特性劣化が問題となる.提案ADコンバータは,ADコンバータ内部に温度変化や製造プロセス変動による劣化を補正する回路を新たに搭載する.そして,2種類の基準電圧を用いて回路内部で温度変化や製造プロセス変動によるAD変換の誤差を計算する.計算した誤差分をディジタル信号の結果からを除去することで劣化を抑制する.提案技術を評価するために,プロトタイプを作成し,測定評価を行った.測定結果より,AD変換の特性劣化を抑制し,目標性能を実現できることを確認した.本提案ADコンバータを用いることで,低電力で動作するセンサLSIシステムを実現することができる.この研究内容を国内学会で発表した.本研究の目的は,MOSFETのサブスレッショルド領域を利用した超低消費電力センサLSIシステムの設計手法の確立することにある.この目的に向け,本年度は大きく以下の研究課題に取り組んだ.(1)基準電流源回路の提案,試作,評価MOSFETをサブスレッショルド領域で動作させるには,微小な電流を生成する必要がある.しかしながら,サブスレッショルド領域動作は超低消費電力である一方で,温度変化や製造プロセス変動によって特性が変化する問題がある.そこで本研究では,従来技術である製造プロセス変動に対して安定に動作する基準電流源回路に対して,新たに温度特性を変化させる制御回路を提案した.制御回路自身も微小電流で動作することから,提案回路は安定かつ超低消費電力動作可能である.この研究内容が論文誌に掲載された.(2)レベルシフタ回路の提案,試作,評価サブスレッショルド領域で動作するディジタル回路は超低消費電力であるが,微小な電流を用いることで回路のドライブ能力が小さくなり,次段の回路を駆動できない問題が発生する,そこで本研究では,電流ではなく電圧に着目し,電圧レベルに応じて信号を生成することでドライブ能力の問題を解決するレベルシフタ回路を提案した.レベルシフタ回路自身も動作時のみ電流を消費することから低消費電力で動作する,この研究内容を国内学会,国際会議で発表し,論文誌に掲載された.本研究の目的は,MOSFETのサブスレッショルド領域を利用した超低消費電力センサLSIシステムの設計手法の確立することにある.この目的に向け,本年度は超低消費電力で動作するADコンバータの検討を行った.ADコンバータは温度や音声などのアナログ信号を,信号処理を行う際に適したディジタル信号に変換する回路ブロックである.一般にAI)コンバータは,アナログ回路ブロックの消費電力が全体の消費電力の大半を占める.そこで,本研究では,微小電流で動作するアナログ回路を用いてADコンバータを構成することでアナログ回路ブロックの消費電力を大幅に削減し,ナノワットオーダの超低消費電力で動作するADコンバータを開拓した.また,微小電流でADコンバータを動作させる際には,温度変化や製造プロセス変動によるAD変換の特性劣化が問題となる.提案ADコンバータは,ADコンバータ内部に温度変化や製造プロセス変動による劣化を補正する回路を新たに搭載する.そして,2種類の基準電圧を用いて回路内部で温度変化や製造プロセス変動によるAD変換の誤差を計算する.計算した誤差分をディジタル信号の結果からを除去することで劣化を抑制する.提案技術を評価するために,プロトタイプを作成し,測定評価を行った.測定結果より,AD変換の特性劣化を抑制し,目標性能を実現できることを確認した.本提案ADコンバータを用いることで,低電力で動作するセンサLSIシステムを実現することができる.この研究内容を国内学会で発表した.超低消費電力センサLSIシステムの実現に向け,基盤技術となる基準電流源回路とレベルシフタ回路を提案した.これらは論文誌に掲載されており,当初予定していた目標を達成できている.今後は,実現した基準電流源回路を用いて,低消費電力で動作するADコンバータを開発する.そして,これらの技術を統合することで,センサLSIシステムを実現する.
無性プラナリアに生殖器官を誘導するケミカルシグナルの研究

有性個体に含まれる化学物質の刺激により無性プラナリア(OH株)に卵巣、精巣およびその他の生殖器官の発達を誘導できる(有性化)。我々はD体トリプトファン(D-Trp)がOH株に卵巣発達を誘導することをすでに明らかにしている。本研究ではD-Trpの分解酵素が発達中の卵巣で一過的に強く発現することを明らかにした。このことから、発達中の卵巣周囲のD-Trp量が有性化に関与することが示唆され、D-Trpが卵巣を標的にしている可能性が考えられた。さらに、D-Trp以外の有性化誘導物質の探索結果より、有性化が複数の卵巣誘導物質の相加、相乗効果で進行することが示唆された。我々のグループではD-トリプトファン(D-Trp)がプラナリア無性個体(OH株)に卵巣発達を誘導することを明らかにしている。本研究では、D-トリプトファン(D-Trp)の標的細胞を明らかにすることを目的とし、分子プローブの作成を試みた。まず、D-Trpのどの部位に修飾を加えて分子プローブを作成すれば良いのか検討した。D-Trpのアミノ基、カルボキシル基、インドール環のC5位に修飾が加わった市販の物質を用いて、卵巣の誘導活性を調べた。アミノ基に修飾が加わった物質では卵巣が全く発達しなかった。カルボキシル基、インドール環のC5位に修飾が加わった物質は、D-Trpに比べて卵巣の発達の割合は低く、形成される卵巣の形態はD-Trpで誘導されるものとは異なっていた。これらの結果から、アミノ基、カルボキシル基、インドール環のC5位はD-Trpの卵巣誘導に必要な構造だと示唆された。よって、これらの部位に修飾を加えた分子プローブはD-Trpの機能を模倣しないと考えられる。また、本研究では、陸産プラナリア有性個体(B.nobile)を試料として用い、プラナリア無性個体(OH株)に対し生殖転換を誘導するD-Trp以外の化学物質の単離・構造決定も目的としている。22年度にB.nobile830gの80%aq.EtOH抽出物を,各種溶媒で分配、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分離・精製が完了した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離された各単一画分のみでは、OH株に対する生殖転換誘導活性はなかった。一方、この4画分を同時添加すると活性が著しく上がった。これらの結果から、4画分に含まれる物質が複合的に作用し、生殖転換を誘遵すると考えられる。我々のグループではプラナリアに含まれるD-トリプトファン(D-Trp)が無性個体(OH株)に卵巣発達を誘導することを明らかにしている。本研究では、D-Trpの標的細胞を明らかにすることが1つの目的である。前年度の結果より、卵巣誘導活性を保持しながらD-Trpに修飾を加えて分子プローブを作成することは困難だと判断された。今年度は、抗D-Trp抗体を用いてD-Trpの局在の検出を試みた。市販のD-Trp(ADVANCED TARGETTING SYSTEMS社)を用いて有性個体において免疫染色を行ったところ、顕著なシグナルは検出できなかった。一方、抗Tlp抗体(同社、L体およびD体を認識)では、卵黄腺に強く、その他の組織でも弱いシグナルが検出された。我々はHPLCを用いた解析より、有性個体にはL-Trpが豊富に、D-Trpが微量に含まれることを示唆する結果を得ている。以上より、微量であるD-Trpを検出するためにはさらに感度を上げる必要があると考えられる。22年度までにB.nobile 830gの80%aq.EtOH抽出物を,各種溶媒で分配、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分離・精製が完了していた。また、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離された各単一画分のみでは、OH株に対する生殖転換誘導活性はなかった。一方、この4画分を同時添加すると活性が著しく上がることが分かっていた。今年度、80%aq.EtOH抽出物を、各種溶媒で分配した活性画分にDr-DAO(プラナリアD-アミノ酸酸化酵素)処理することで生殖転換誘導活性が低下することを明らかにした。この結果から、活性画分中にはDr-DAOの基質が存在すると示唆された。また、我々はD-Trpの他にD-アルギニン、D-フェニルアラニン、D-ロイシン、D-アスパラギンがプラナリアに卵巣発達を誘導することを明らかにした。