hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
タンパク質合成系への作用からみたN-アセチルシステインの抗精神病作用機序の解明

そこで、もう一つのcystathionine合成経路であるCBSの発現量について検討した。その結果、予想と異なり、対照群と慢性コカイン投与動物を比べた結果、背側線条体では両群間に有意な差はなかったが、側坐核では、対照群に比べ、コカイン群でCBSのタンパク量が約20%ほど有意に低下していた。神経薬理学CBSタンパク質量の低下は予想に反するものであったが、この結果より二つの可能性が考えられる:1xCT, GLT1、あるいはメチオニンからCBSを介してcystathionine(cysteine)を合成する経路以外にも、cysteineをグリア細胞内に供給するルートが存在する、2CBSのタンパク量は低下しているが、活性は上がっている。CBSは酸化ストレスによって誘導されるglutathionylation化によって活性が上昇することが最近報告された(Niu et al, Antioxid Redox Signal, 2015)。一方、慢性コカイン投与は側坐核内でタンパク量のglutathionylation化を促進すると予想されている(Uys et al, Neuropsychopharmacol, 2012)。そこで今年度は、CBSの慢性コカイン投与後のglutathionylation化について免疫沈降法で検証する。慢性コカイン投与によるCBSのglutathionylation化促進が確認されたら、glutathionylation化に対する特異的阻害剤はまだ知られていないため、浸透圧ポンプを用いてCBS mRNAに特異的なsiRNAを側坐核に持続注入して発現量(活性)を抑制し、コカイン依存様の行動が変化するか検討する。
長期医療管理を要する子どもに対する家族の感情コーチングへの看護援助

本研究の目的は長期医療管理を要する子どもに対する家族の感情コーチングへの看護援助を検討するための基礎資料を得ることである。その研究方法は,入院児に付き添い継続的に支援している母親を対象にして、半構成的面接法を用いて行った。その結果は以下のことが明らかになった。母親は痛みを伴う医療行為に対して病気や治療に関わる事実を子どもに説明していた。そして母親の感情コーチングの核は患児に対して`逃げない態度づくり'をすることであった。その上で、母親は子どもに対して「頑張りを引き出す儀式」や「静かに見守る手立て」などで感情コーチングを行っていた。その背景として母親の精神的健康が影響していることが分かった。平成21年度の研究目標は、まず「コーチング」に関する概念分析を明らかにすることである。医中央雑誌をもとに、過去10分の先行研究(原著36件)を析し、そのうち患者の健康教育関連が30%、看護師の現任教育関連が60%で、小児看護関連が極少数のしかなった。そのため、家族援助に関わる「コーチング」の概念分析は、継続的に検討を重ねて、かつ療育に関わる感情コーチングに関する講習を受けて信頼性の確保を図っている。そして、第2の研究目標として長期医学管理を要する子どもに対する家族の感情コーチングに関する検討を深めることをねらいとして、育児や看護に関わる家族のメンタルヘルスに対する対処行動や子どもの医療管理に対する親の感情コーチングについての事例や著書の記述内容などを参考に、研究計画の修正を図った。そして、関連する医療機関に研究協力の要請手続きや研究の倫理的配慮に関する検討を行い、9月に新潟大学医学研究倫理審査委会に申請し、その委員会の承認を得て、10月から研究参加者への応募を開始した。研究参加者を29名程度として、半構成的面接法の手法を用いてM-GTAで、データに密着させて、質的な分析を行いながらデータの精度を上げて飽和化に向けて、かつデータ収集を併せて行いたがら検討を重ねて行っている。その間、データ集方法と分析方法について質的研究に関する専門家(西條剛央氏)より、的指導を受けて、研究活動を推進させている。その研究成果を、平成23年度日本小児看護学会へ発表する予定である。平成22年度の研究目標は、調査対象者(親)の感情コーチィングに関するデータ収集を行い、そのデータからコーチング関する意味内容を共通性・相違性の観点から分析する予定であった。しかし、20名の調査対象者を目標に研究参加の応募をおこなったが、予定より募集期間数ヶ月を延長して、ようやく10名の協力を得てデータ収集を終えた。その後、12月に入ってから録音データのテープ起こしを業者に依頼した。その逐語録に起こしたデータの解析が12月下旬からとなり、大幅に予定していた研究計画よりも遂行が遅れた。1月以後にデータ分析を本格化させ、その精度を上げるため、西條剛央先生による「質的分析法」におついて、専門家のアドバイスを受けながら、共同研究者と共に分析結果の事実性・飽和化に向けて分析精度を上げているところである。従って、研究目標2であった学術雑誌への論文投稿は達成できなかったが、昨年度に学会発表したデータを研究報告としてまとめ、新潟大学医学部保健学科紀要に投稿し、受理された。そして研究目標3は、親の感情コーチングのための援助モデル開発のための質問票作成であったが、目標1と目標2の未達成に関連して、その目標は滞っている。そこで、医療管理を要する子どもに対する親への感情コーチングのための援助に向けて、平成23年2月に研修を受けて援助モデルの構築のための一助にすべ、準備を重ねているところである。平成23年度の研究目標を3つ掲げた。1.目標1は、調査対象者(10名)である親(養育者)の感情コーチィングの意味内容に関する結果の事実性・飽和性等を再検討し、その妥当性を図るために、質的な内容分析を繰り返し、見直しを行った。しかし、やや分析テーマや分析者から焦点がずれていることに気づき、さらにデータ内容の精度に弱点があることが分かり、データ収集によって部分的な補強を行った(4月8月)。さらに、質的に解析した結果を「質的分析法」の専門家からアドバイスを受けながら、共同研究者と共に分析結果の事実性・飽和化に向けて分析精度を上げ、一定の成果を得た(9月12月)。2.研究目標2は、第32回日本看護科学学会学術集会への一般演題として研究成果を発表するために結果を資料化し、それを基に抄録作成等の手続きに向けて準備を行った(1月3月)。従って、学術雑誌への投稿まで至らず、研究の目標達成には至らず遅れた。3.最後に研究目標3は、上記目標

1、目標2の遅れから親(養育者)の感情コーチィングのための測定用具の開発、そして援助モデル構築に向けた目標達成は滞っている。当初の研究計画では、平成25年3月で研究成果を上げて報告書を作成予定であったが、平成24年7月頃に質的研究者から、次の研究計画における研究方法に関する妥当性・信頼性を確保するための見直しおよび再検討の指摘を受けた。そこで、平成25年の研究目標は、以下のことを掲げて取り組んだ。1.平成25年1月から3月にかけて、web医学中央雑誌INDEX及びPubMedlineを基にして過去5年間の先行研究について再検討を重ね、参考とすべき資料収集とそのレビュー等を行った。それを踏まえてStructure- Construction-Qualitative Research Method(SQRAM)参考にして、リサーチクエスチョンの設定について見直しを図った。研究方法におけるデータ収集法および分析手法の妥当性や信頼性についても再検討した。2.収集したデータに密着させて、見直した分析焦点者並びに分析テーマを踏まえて「長期医療管理を要する子どもに対する家族の感情コーチング並びに親の感情ワーク」とも関連させて質的分析手法を用いて概念生成を行った。それを基にカテゴリー化を図り、繰り返し見直し、専門家の意見を受けて分析結果の妥当性・真実性の確保に努め、看護援助のモデル化に必要な基礎資料として概念図を修正し作成し直すことができた。3.上記2.で得た研究成果を平成26年度開催予定の第34回日本看護科学学会学術集会(於;名古屋国際会議場)における小児看護領域の一般演題として応募予定で、研究発表に向けて抄録を作成中である。面接手法に基づいて収集したデータ内容の精度がやや乏しく、データ収集の取り直し等により、分析結果の精度の確保や飽和化に向けて、かなり予定外の時間・期間を要した。25年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、上記目標1、目標2で得た研究成果や関連する文献分析等を基に、予備調査のための質問票を作成し、関連機関に協力依頼し、倫理審査で承認を得て、研究成果の実質化を図る予定である。
嚥下関連筋の加齢変化とその抑制に関する研究

嚥下機能は病的原因のみならず加齢変化により低下するが、ラットを用いて検討した。喉頭機能の一部である誤嚥防止機能の加齢変化の間接的証明として筋肉のタンパク成分をみた。甲状披裂筋、外側輪状披裂筋において加齢変化による筋内の筋のミオシン重鎖分画(MHC)が町,type IIx、すなわち筋収縮速度が遅い筋に変化していた。しかしながら後輪状披裂筋においては明らかな加齢変化は見られなかった。甲状披裂筋の神経筋接合部を観察するため蛍光免疫三重染色を行ったところ、加齢変化により神経筋接合部の形態が崩れ、アセチルコリンレセプターが空包化もしくは点状化し、その占有面積が減少していた。この二つの結果は加齢変化での筋および神経筋接合部への影響と思われ、その機能低下に関わることが予想された。嚥下口腔期に関与すると考えられるオトガイ舌筋は甲状披裂筋、外側輪状披裂筋に近い開配パターンを呈し、type IIb MHCが優位であり、加齢変化に従いtype IIb MHCに変化している所見がえられた。嚥下第二期に関与する下咽頭収縮筋はtype IIb MHCが優位でありオトガイ舌筋に比して遅筋であると考えられるが、加齢変化による変化はみられなかった。オトガイ舌筋の神経筋接合部の染色では甲状披裂筋における同様の変化がみられた。下咽頭収縮筋は嚥下時に反射的に弛緩しており、後輪状披裂筋と同様の動きをする。すなわち筋収縮よりも筋弛緩作用が重要である筋は加齢変化を受けにくいのではないかと推測された。年齢変化に嚥下運動の抑止は難しいが、リハビリテーションやサプリメント的な薬物により筋老化を防ぐことは可能と考えられ、その部分を含めた研究で治療につながるヒントが見いだせると思っている。研究の基盤となる加齢変化に関しては喉頭筋、嚥下関連筋の一部において、ミオシン重鎖分画、神経筋接合部の形態変化として捉えられてきている。筋のミオシン重鎖分画(MHC)の検討を行うことによって、筋の性状、特に筋の収縮速度がわかる。加齢変化における検討において甲状披裂筋では収縮速度が早いtype IIb MHCが多く、加齢変化に従いtype IIx MHCに変化している所見であった。反回神経脱神経モデルでは有意にtype IIx MHCが増加していた。外側輪状披裂筋においても同様の結果が得られた。後輪状披裂筋においては明らかな加齢変化は見られなかった。脱神経の結果type IIx MHCが増加しているが、脱神経された筋の性状変化、この場合は間接的に障害を受けた状態、もしくはその修復状態にあることが考えられた。また甲状披裂筋の神経筋接合部をwhole mountした検体を蛍光免疫三重染色を行ったところ、加齢変化により神経筋接合部の形態が崩れ、アセチルコリンレセプターが空包化もしくは点状化し、その占有面積が減少していた。嚥下関連筋については内喉頭筋のみならず、内舌筋のオトガイ舌筋と下咽頭収縮筋の加齢変化をMHCから検討した。本来下咽頭収縮筋は甲状咽頭筋、輪状咽頭筋に分けられるが、手技的な問題からラット検体ではその明確な分離ができなかったため、下咽頭収縮筋として検討した。結果は現在解析中である。加齢により嚥下機能は低下する。ラットモデルの内喉頭筋では甲状披裂筋、外側輪状披裂筋において加齢変化による筋内の筋のミオシン重鎖分画(MHC)がtype IIx、すなわち筋収縮速度が遅い筋に変化していた。嚥下に関して喉頭は誤嚥防止に働く。嚥下運動全体をみるとき、運動器としては舌、咽頭、食道が関与する。内舌筋のオトガイ舌筋と下咽頭収縮筋の加齢変化をMHCから検討した。オトガイ舌筋は甲状披裂筋、外側輪状披裂筋に近いMHCパターンを呈し、type IIb MHCが優位であり、加齢により加齢変化に従いtype IIx MHCに変化している所見がえられた。下咽頭収縮筋はtype IIx MHCが優位でありオトガイ舌筋に比して遅筋であると考えられるが、加齢変化による変化はみられなかった。すなわち比較的作用のポイントが筋弛緩にある筋は加齢変化を受けにくいと推測される。

しかしながら後輪状披裂筋においては明らかな加齢変化は見られなかった。甲状披裂筋の神経筋接合部を観察するため蛍光免疫三重染色を行ったところ、加齢変化により神経筋接合部の形態が崩れ、アセチルコリンレセプターが空包化もしくは点状化し、その占有面積が減少していた。この二つの結果は加齢変化での筋および神経筋接合部への影響と思われ、その機能低下に関わることが予想された。嚥下口腔期に関与すると考えられるオトガイ舌筋は甲状披裂筋、外側輪状披裂筋に近い開配パターンを呈し、type IIb MHCが優位であり、加齢変化に従いtype IIb MHCに変化している所見がえられた。嚥下第二期に関与する下咽頭収縮筋はtype IIb MHCが優位でありオトガイ舌筋に比して遅筋であると考えられるが、加齢変化による変化はみられなかった。オトガイ舌筋の神経筋接合部の染色では甲状披裂筋における同様の変化がみられた。下咽頭収縮筋は嚥下時に反射的に弛緩しており、後輪状披裂筋と同様の動きをする。すなわち筋収縮よりも筋弛緩作用が重要である筋は加齢変化を受けにくいのではないかと推測された。年齢変化に嚥下運動の抑止は難しいが、リハビリテーションやサプリメント的な薬物により筋老化を防ぐことは可能と考えられ、その部分を含めた研究で治療につながるヒントが見いだせると思っている。
自己免疫疾患の発症要因としてのＮＫレセプターリガンド群の発現抑制機構

大腸がん細胞株およびBリンパ芽球様細胞株においてULBP4-5近傍のメチル化パターンおよびULBP遺伝子群の発現性を検討し、ULBP4遺伝子の発現性はメチル化の程度と逆相関することを明らかにした。また、自己免疫疾患を対象とした関連解析では、グレーブス病とULBP4多型との間に関連傾向を見出した。一方、霊長類ULBP遺伝子群の進化学的検討から、これまで解析されていない旧世界ザルのULBP5遺伝子の多様性の特徴を解明したが、ULBP分子群のうち、膜貫通型タンパクであるULBP4およびULBP5では、可溶性分子をコードする多様性が観察された。本研究では、NK細胞レセプター(NKG2D)のリガンドであるULBP分子群に着目し、難治性血管炎、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患などの慢性炎症性疾患および自己免疫疾患を対象とし、ULBP遺伝子群の多型と個々の疾患との関連を明らかにするとともに、ULBP遺伝子群多型とULBP遺伝子領域のDNAメチル化および個々のULBP遺伝子発現性との関係を明確にし、さらにそれらがNK細胞機能に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした。昨年度までに、大腸がん細胞株ではULBP4-5近傍が高度にメチル化されており、ULBP4および5の発現が認められることを明らかにしているが、本年度は、Bリンパ芽球様細胞株を用いて、この領域のメチル化と遺伝子発現パターンを解析した。その結果、Bリンパ芽球細胞株では高度なメチル化は観察されず、ULBP5は発現するもののULBP4の発現が検出されなかったため、本領域のメチル化はULBP4遺伝子の発現性と逆相関すると考えられた。ついで、グレーブス病患者83例について、ULBP領域に存在するtagSNP 6種を用いてタイピングを行ったところ、ULBP4遺伝子近傍のあるSNPのホモ接合型が患者群に多い傾向が認められた(case 31.3% vs control 20.8%, p<0.06 OR1.72)。一方、ULBP遺伝子群の重複や多型についての意義を検討するために、旧世界ザル(アカゲザルおよびカニクイザル)のULBP2遺伝子群の多様性を決定するとともに、霊長類におけるULBP遺伝子群の進化系統樹を作成したところ、旧世界ザルではULBP2遺伝子が重複していること、ULBP遺伝子群の祖先型は旧世界ザルのULBP2遺伝子より分岐したこと、ヒトULBP6遺伝子はチンパンジーやゴリラと分岐した後にULBP2遺伝子が重複して形成されたと推定された。さらに、旧世界ザルのULBP2遺伝子群ではNKG2Dとの結合部位と推測されるアミノ酸残基に多型が見いだされたことから、NKG2Dとの結合能への影響を検討するための良いモデルになると考えられた。本研究では、NK細胞レセプター(NKG2D)のリガンドであるULBP分子群に着目し、難治性血管炎(高安病、バージャー病、慢性血栓塞栓性肺高血圧症)、若年性糖尿病、慢性関節リウマチ、自己免疫性腸炎などの自己免疫疾患を対象として、ULBP遺伝子群の多型と個々の自己免疫疾患との関連を明らかにする。また、疾患関連多型とULBP遺伝子領域のDNAメチル化および個々のULBP遺伝子発現性との関係を明確にし、さらにそれらがNK細胞機能に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした。平成24年度は、日本人一般集団由来のBリンパ芽球様細胞株96種を用いてULBP領域内の遺伝子多型ーDNAメチル化ー遺伝子発現パターンの関係を体系的に検討し、特定のULBP遺伝子の発現性と関連するULBP領域連鎖不平衡ブロックを特定することとした。その結果、ULBP遺伝子群では、ULBP4-ULBP5遺伝子近傍において高頻度なメチル化が起こっていることをみいだした。さらに、特定のtagSNPが前述のメチル化と部位と連鎖不平衡にある可能性をみいだした。そこで、平成25年度に先駆け、大腸がん患者由来サンプルを用いて同様の検索を行ったところ、メチル化頻度、発現パターン共に日本人由来サンプルとは異なることが明らかになったため、平成25年度計画に含まれている自己免疫疾患患者由来サンプルについて、グレーブス病患者92例を用いてtagSNPの検索に着手した。本研究では、NK細胞レセプター(NKG2D)のリガンドであるULBP分子群に着目し、慢性炎症性疾患ないし自己免疫疾患を対象として、ULBP遺伝子群の多型と個々の疾患との関連を明らかにするとともに、ULBP遺伝子群多型とULBP遺伝子領域のDNAメチル化および個々のULBP遺伝子発現性との関係を明確にし、さらにそれらがNK細胞機能に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした。今年度は、とくにULBP遺伝子群の重複および多型の意義を検討した。霊長類ULBP

遺伝子群の進化学的検討は、ヒトにおけるULBP遺伝子群の構造と機能的意義に関する示唆を与えるが、昨年度までに旧世界ザル(アカゲザルおよびカニクイザル)のULBP2遺伝子群の多様性を決定したことに続き、今年度はこれまでに解析されていないULBP5遺伝子の多様性を解析した。ULBP5遺伝子もULBP2遺伝子と同様に2個(ULBP5.1およびULBP5.2)存在し、いずれも著明な多型性を示した。ULBP5.1アリルはアカゲザルで5種、カニクイザルで9種、ULBP5.2アリルはアカゲザルで6種、カニクイザルで12種検出された。また、ULBP5.1ではフレームシフトをもたらす遺伝子多型が存在した。これらのアリルは、2本のαヘリクスで構成される通常のULBP5分子とは異なり、αヘリクスが1つのみの細胞外ドメインで構成されるULBP5分子(切断型ULBP5分子)をコードすると考えられた。さらに、旧世界ザルのULBP5遺伝子の多様性を進化学的に考察することを目的として、本研究で得られたアカゲザルおよびカニクイザルのULBP5.1配列およびULBP5.2配列を含めてULBP遺伝子群の系統樹を作成したところ、ULBP5.1はULBP5.2から分岐していることが判明した。また、ULBP5.1、ULBP5.2ともアカゲザルのアリルとカニクイザルのアリルが混在することより、これらの多様性はアカゲザルとカニクイザルが分岐するより以前に成立したものと考えられた。免疫遺伝学大腸がん細胞株およびBリンパ芽球様細胞においてULBP4-5近傍のメチル化パターンおよびULBP遺伝子群の発現性を検討し、ULBP4遺伝子の発現性はメチル化の程度と逆相関することを明らかにした。また、自己免疫疾患を対象とした関連解析では、グレーブス病とULBP4多型との間に関連傾向を見出したことから、今後さらに解析患者数を増やし、関連を確認するとともに、病態との関連を検討する予定である。一方、霊長類ULBP遺伝子群の進化学的検討は、ヒトにおけるULBP遺伝子群の構造と機能的意義に関する示唆を与えた。本研究では、NK細胞レセプター(NKG2D)のリガンドであるULBP分子群に着目し、自己免疫疾患を対象として、ULBP遺伝子群の多型と個々の自己免疫疾患との関連を明らかにすることを目的としている。このため、疾患関連多型とULBP遺伝子領域のDNAメチル化および個々のULBP遺伝子発現性との関係を明確にし、さらにそれらがNK細胞機能に及ぼす影響を明らかにする。平成24年度は、日本人一般集団由来のBリンパ芽球様細胞株96種を用いてULBP領域内の遺伝子多型ーDNAメチル化ー遺伝子発現パターンの関係を体系的に検討し、特定のULBP遺伝子の発現性と関連するULBP領域連鎖不平衡ブロックを特定することとして以下の実験を遂行した。1.日本人由来のBリンパ芽球様細胞株96種を用いて、ULBP領域内に存在するCpGアイランドのメチル化パターンをバイサルファイトシークエンシング法によって明らかにする。2.上記細胞株について、ULBP領域内のtagSNP群をタイピングし、連鎖不平衡ブロック構造を明確にする。3.上記細胞株についてmRNAを抽出、ULBP1ULBP6遺伝子発現パターンを検討する。
妊婦交通外傷と胎児予後に関する科学的エビデンスの確立及び予防安全対策の検討

平成17年度に行った動物実験結果および平成18年度に行った妊婦衝突試験用ダミーを用いたスレッド試験結果を総合的に解析した。その結果、妊婦が時速30km/h以下の追突事故に遭遇した際、腰部にかかる外力のみでは、胎児の予後に悪影響をおよぼすというエビデンスは得られなかった。さらに、追突事故に遭遇した前席乗員は、反動で腹部を車室内部に強打することがわかった。したがって、妊婦乗員のシートベルト着用効果を考えるうえでは、この腹部にかかる外力を低減させることが重要であると結論づけた。シートベルト着用で、追突時における腹部とステアリングとの二次衝突をある程度予防し、子宮内圧の変化を低減できることがわかった。しかし、負荷された加速度が大きいか、あるいは乗車位置がハンドルと近い場合に、シートベルトを着用してもある程度の外力が腹部へ作用することが明らかになった。そこで、さらなる積極的予防策として、緊急ベルト引き締め装置を追突事故時に作動させるシステムを考案した。その結果、比較的高速度の追突事故遭遇時には、子宮内圧をさらに低減させ、胎児保護に効果的であることが示唆された。また、低速度(約13km/h)の正面衝突事故をモデルしたスレッド試験を行ったところ、シートベルト着用時には、子宮内圧の上昇を3545%に軽減できることがわかった。したがって、シートベルトの着用は、追突および正面衝突時の妊婦子宮内圧上昇を抑制するうえで有効であった。妊婦のシートベルト着用について社会的議論がされているなか、われわれはシートベルト着用が胎児保護に有効である科学的根拠を明らかにした。本研究成果の一部は新聞、テレビ等でも紹介されたが、これら成果を積極的に公表し、一般の方に正しい知識を啓蒙している。妊婦交通外傷の特徴を明らかにし、外力と胎児予後に関する科学的エビデンスを確立するために以下の検討を行った。1)妊婦自動車乗員の特殊性についての調査妊娠30週の妊婦ボランティアを対象に、乗車位置、車室内部との位置関係を計測して、一般女性(非妊婦)との差異を調査した。その結果、ステアリング下端から腹部までの水平距離は、妊婦群が非妊婦群に比べて約11cm短いことがわかった。すなわち、妊婦は腹部が前方へ突出し、ステアリングと接触する危険性が高くなることが分かった。2)妊婦交通外傷と胎児予後についての実態調査交通事故後に何らかの傷害を負った妊婦を対象に、妊婦交通外傷と胎児予後との関係を検討した。妊婦の腰部あるいは腹部に外力が作用すると、胎児予後がより不良になる傾向であった。さらに、胎児死亡例では妊婦の全身および腹部損傷の重症度が有意に高かった。しかし、流産例と新生児が健康な例では、妊婦損傷の重症度に有意差はみられなかった。妊婦の損傷重症度が低い場合でも、胎児を含む子宮全体が衝撃を受けている可能性がある。したがって、外力と胎児予後との関係を明確にすべく、以下の動物実験を行った。3)妊娠ラットを用いた外力と胎児予後についての検討妊婦への外力と胎児予後についての関係を科学的に検証するために、落下装置を用いたインパクトバイオメカニカル試験を行った。加速度及び衝撃を可変的に作用できる落下装置(衝撃のアクティブコントロール装置)を作製した。麻酔下で妊娠中期(11日目)のラットを仰臥位で落下させ、60Gまでの外力を腰部に作用させた。実験後から妊娠までの期間を観察した後、出生児の数、出産後の胎児予後を調査した。その結果、コントロール群、外力作用群で、出生児数、出生児の平均体重、出生後2週間目の体重に有意差は認められなかった。したがって、妊娠ラット腰部への外力が、胎児予後に影響をおよぼすことはなかった。妊婦交通外傷の現状を調査したこれまでの検討で、妊婦の損傷重症度から胎児予後を推定することが困難であることがわかった。また、動物実験では、妊娠ラットの腰部に92Gまでの加速度を作用させても、出生ラットの数、体重、予後に影響をおよぼすことがなかった。これらの結果に基づいて、軽微な追突事故を想定したスレッド試験を行い、ダミーに観察される生体力学的パラメーターを計測した。台車上に実車同等の設備(シート、ステアリング、シートベルト等)を装着したInstron社製サーボスレッド装置を用いた。女性の5パーセンタイル体格をモデルした衝突試験用ダミーに、FTSS社製の妊婦腹部を装着した。Folksamのテストプロトコールにしたがって、衝突速度約24km/hで追突試験を行った。シートベルト着用時には衝突開始から約100ms後に、ダミーは約15cm後方に移動した。そして、反動で前方へ移動したが、腹部とステアリングとの接触はなかった。子宮内圧は、後方に最大移動したときに第一のピークを示し、さらに反動で最前方へ移動したときに第2のピークを示した。圧力変化は第二のピーク時に最も大きく、約23KPaであった。これは腹部前面におけるシートベルトの圧迫で生じたと考えられる。次に、シートベルト非着用時に同様の試験を行った。ダミーは同様な軌跡をとったが、衝突開始から230ms後に、腹部はステアリングと接触した。このときの子宮内圧は約62KPaであった。追突事故では、乗員の体が反動で前方へ移動した際に、子宮内圧が最も高くなることがわかった。さらにシートベルト非着用時には腹部がステアリングと接触し、子宮内圧変化はより大きくなることがわかった。

シートベルトの着用は、追突時における腹部とステアリングとの二次衝突を予防するうえでも重要である。平成17年度に行った動物実験結果および平成18年度に行った妊婦衝突試験用ダミーを用いたスレッド試験結果を総合的に解析した。その結果、妊婦が時速30km/h以下の追突事故に遭遇した際、腰部にかかる外力のみでは、胎児の予後に悪影響をおよぼすというエビデンスは得られなかった。さらに、追突事故に遭遇した前席乗員は、反動で腹部を車室内部に強打することがわかった。したがって、妊婦乗員のシートベルト着用効果を考えるうえでは、この腹部にかかる外力を低減させることが重要であると結論づけた。シートベルト着用で、追突時における腹部とステアリングとの二次衝突をある程度予防し、子宮内圧の変化を低減できることがわかった。しかし、負荷された加速度が大きいか、あるいは乗車位置がハンドルと近い場合に、シートベルトを着用してもある程度の外力が腹部へ作用することが明らかになった。そこで、さらなる積極的予防策として、緊急ベルト引き締め装置を追突事故時に作動させるシステムを考案した。その結果、比較的高速度の追突事故遭遇時には、子宮内圧をさらに低減させ、胎児保護に効果的であることが示唆された。また、低速度(約13km/h)の正面衝突事故をモデルしたスレッド試験を行ったところ、シートベルト着用時には、子宮内圧の上昇を3545%に軽減できることがわかった。したがって、シートベルトの着用は、追突および正面衝突時の妊婦子宮内圧上昇を抑制するうえで有効であった。妊婦のシートベルト着用について社会的議論がされているなか、われわれはシートベルト着用が胎児保護に有効である科学的根拠を明らかにした。本研究成果の一部は新聞、テレビ等でも紹介されたが、これら成果を積極的に公表し、一般の方に正しい知識を啓蒙している。
新しい繊維強化プラスチックの界面接着強度測定法の開発

炭素繊維強化プラスチックにおける、炭素繊維と樹脂の間の界面接着強度を計測する新たな試験法を開発した。本試験法は、金属薄膜にあけられたピンホールに樹脂を溶かし込み、そのピンホールに1本の炭素繊維を貫通させ、炭素繊維と樹脂が接着した後、その炭素繊維を引き抜き炭素繊維と樹脂間の界面接着強度を測定する方法である。試験機は、炭素繊維をピンホールに埋め込むためのXYZステージ、ピンホールを有する金属薄膜を固定する取り付け治具、界面接着強度を測定するロードセル、樹脂を溶融するヒータ、炭素繊維を引き抜くマイクロメータ、観測用顕微鏡、データ収録装置で構成される。本法で、エポキシ樹脂、ポリプロピレン樹脂、ピーク樹脂における界面接着強度を計測し、いずれの樹脂においても精度よく計測できる事を確かめた。本方式の特徴としてa :炭素繊維の埋め込み深さを精度よくコントロールできる。b :金属膜の厚さを変えることにより適切な埋め込み深さの試験体を作成できる。c :熱可塑性樹脂及び熱硬化性樹脂が使用できる。d :試験体制作時における樹脂の熱劣化を最小限にできる。e :試験の取り扱いが容易である。等が明らかとなった。また、多くの研究者の間で使用されているドロップレット試験手法と本試験結果を比較したところ、測定値のバラツキが同程度である事がわかり、本法の実用可能が確かめられた。等が明らかとなった。
確立した移植免疫寛容における胸腺上皮細胞の役割と誘導された抑制・調節T細胞の解析

平成9年度より平成10年度の当研究において、以下の研究結果が得られた。免疫寛容実験モデルで、TCRのVα、β領域のサブファミリーを調べた結果、予想に反し、欠失は認められなかった。樹立した胸腺上皮細胞の胸腺内移入により、膵ラ氏島・皮膚移植片が長期に生着した。この胸腺上皮細胞の免疫寛容に関する特異性を研究した。胸腺上皮細胞の形態を光顕・電顕で確認し、サイトケラチンや神経内分泌ペプタイドに対するモノクローナル抗体を用い免疫組織学的に検討した。また、サイトカインの産生を検討した。In vitro培養で典型的なモザイク状配列を示した。電顕では、細胞内に豊富なトノフィラメントやミトコンドリアが認められが、粗面小胞体は少なかった。大きい細胞質突起が認められ、個々の細胞はよく発達したデスモゾームによって接着している。このように、上皮細胞の典型的な形態を持っていることが判明した。免疫組織染色では、MHC class-I,-II,ケラチン、オキシトシン、バソプレシンやinsulin-like growthfactor (IGF) IIが陽性であった。IGF-Iは陰性であった。次に、interleukin-3(IL-3)依存性の細胞株FDC-P2を用い、WEHI-3培養上清をコントロールとし、また、骨髄細胞を用い、マウス肺培養上清をコントロールにし、IL-3とCSAのbioassayを行った。この結果、IL-3とCSAの産生が認められた。Kupffer cellやmacrophageの除去をliposome-encapsulated dichromethylene disphosphonate (LE-Cl2MDP)を用い、膵ラ氏島・皮膚移植片モデルで検討したが、有意な効果は認められなかった。しかし、肝移植予備実験モデルでは、移植片のKupffer cellやレシピエントのKupffer cellや脾のmacrophageを除去することにより、移植片の生着延長することができた。胸腺上皮細胞(TEC)・ナ-ス細胞(TNC)の神経内分泌自己抗原発現をoxytocinとIGF-I、IIの抗体を用い、蛍光抗体法・免疫染色にて観察した。培養TEC・TNC細胞質内にIGF-I、IIは有意に染色されたが、oxytocinは免疫染色で検出されなかった。マウスから摘出した胸腺では皮膜下、皮質でoxytocinが強く染色されることから、今後TEC・TNCをin vivo培養(腎皮膜下)し発現するかどうか確認する。この確認は胸腺由来oxytocin様ペプタイドを詳しく調べるため、及びこれとMHCプロテインとの関連を検討するために必要なペプタイドのcDNA libraryを作製上で重要である。免疫寛容誘導に必要な市販ALSのLot変更に伴い適正な力価が認められなくなり、独自にALSを作製した。このALSを用い免疫寛容誘導マウスを平成9年度後半より準備している。このマウスを用い免疫寛容状態のT細胞のTCRのV領域のサブファミリーの欠失・増加の検討をPCR法で順次行う予定である。免疫寛容誘導における胸腺内外のマクロファージの消去する意義の検討を皮膚移植系で行った。マクロファージ消去はリポソーム封入dichromethylenedisphosphonate投与で行った。マクロファージの減少は確認されたが、ALSとの同時投与のみでは皮膚移植片の生着延長は認められなかった。今回、胸腺内に移入された細胞はALSを投与しなくても生着する事が明らかとなった。これは樹立したTEC・TNC細胞株、分離した肝・ラ島細胞がALSなしで胸腺内に長期生着することから確認できた。

樹立した胸腺上皮細胞の胸腺内移入により、膵ラ氏島・皮膚移植片が長期に生着した。この胸腺上皮細胞の免疫寛容に関する特異性を研究した。胸腺上皮細胞の形態を光顕・電顕で確認し、サイトケラチンや神経内分泌ペプタイドに対するモノクローナル抗体を用い免疫組織学的に検討した。また、サイトカインの産生を検討した。In vitro培養で典型的なモザイク状配列を示した。電顕では、細胞内に豊富なトノフィラメントやミトコンドリアが認められが、粗面小胞体は少なかった。大きい細胞質突起が認められ、個々の細胞はよく発達したデスモゾームによって接着している。このように、上皮細胞の典型的な形態を持っていることが判明した。免疫組織染色では、MHC class-I,-II,ケラチン、オキシトシン、バソプレシンやinsulin-like growthfactor(IGF)-IIが陽性であった。IGF-1は陰性であった。次に、interleukin-3(IL-3)依存性の細胞株FDC-P2を用い、WEHI-3培養上清をコントロールとし、また、骨髄細胞を用い、マウス肺培養上清をコントロールにし、IL-3とCSAのbioassayを行った。この結果、IL-3とCSAの産生が認められた。Kupffer cellやmacrophageの除去をliposome-encapsulated dichromethylene disphosphonate(LE-Cl2MDP)を用い、膵ラ氏島・皮膚移植片モデルで検討したが、有意な効果は認められなかった。しかし、肝移植モデルでは、移植片のKupffer cellやレシピエントのKupffer cellや脾のmacrophageを除去することにより、移植片の生着延長することができた。免疫寛容実験モデルで、TCRのV領域のサブファミリーを調べた結果、欠失は認められなかった。本研究により、胸腺上皮細胞株が神経内分泌ペプタイドを持つことや免疫寛容を誘導できることから、胸腺上皮細胞の特異性が示された。
末梢神経-筋麻痺に対する電気刺激療法の作用に関する形態学的生理学的基礎研究

マウスの坐骨神経を大腿中央の高さで切断し、近位断端における有髄神経線維の初期変化を電子顕微鏡で観察した。近位断端では切断後数分以内から、軸索内に小胞の集積が始まり、早いものでは20分以内に大きな終端集積が形成される。また終端集積部やその近位側では、軸索膜の陥入が起こる。このような初期変化は、傷害された軸索部の修復過程として非常に重要であると思われる。本研究では、終端集積の形成とその後の変化および軸索膜の陥入過程について、電子顕微鏡で詳細な観察を行った。また、これと平行して起こる再生軸索の形成と、それに対する電気刺激の影響について、電子顕微鏡による観察を行った。断端近位側のランビエの紋輪では、切断後数時間以内に再生芽が形成され、娘再生軸索として伸長を開始する。切断直後に、切断部に電気刺激を与えても、初期変化としての終端集積が形成され、数時間以内にランビエの紋輪において再生芽が形成されていた。また、切断後2日に断端部に電気刺激を与えると、再生軸索先端の成長円錐では小胞の崩壊や多胞体およぶ水解小体の形成が見られたが、さらに24時間を経過すると、電気刺激を与えなかった対照群との間に、明らかな形態的違いは認められなかった。このことは、神経再生に対する電気刺激の影響は比較的軽微で、一時的であり、しかも成長円錐のような、構造的に未熟な部位に限局している可能性を示唆している。また、筋の傷害モデルを作成するために、坐骨神経を切断して、下腿三頭筋における形態変化を組織化学的に観察したり、下り坂走行を強制し、下腿三頭筋における血流量や酸素分圧の変化を生理学的に観察した。本研究の第一の目的は,末梢神経の再生に及ぼす電気刺激の影響を調べることである。末梢神経が再生するに当たっては,まず最初に神経障害部位の修復と再生芽の形成が重要なポイントとなる。そこでマウスの大腿部中央の高さで坐骨神経を切断し,切断部における軸索の修復過程を電顕で観察した。切断直後から,神経軸索の近位断端には小胞やミトコンドリアなどの細胞小器官が集積する。これは形態的にも再生芽と非常によく似ている。これと平行して,断端部では形質膜が陥入して断端部を閉鎖する。この細胞小器官の集積部位は髄鞘に包まれていると,やがて変性し始める。一方,小器官集積部よりも近位で,微小管や神経細胞糸が多い部分は変性を免れ,今度は小器官集積部と細胞骨格優位部との移行部で形質膜が陥入して,変性部位が隔絶される。細胞骨格優位部でも,神経細糸束の間に小器官の小集積が形成され,この部分も髄鞘に包まれている場所では変性を始める。この場合,神経細系間の小胞同士が癒合して,不規則な虫食い状の腔所を作る。このような隔壁膜の形成は,変性部位から健常部位を境界し,健常部位を外界の影響から保護するために行われるもので,末梢神経の修復と再生に非常に重要な意味を持つものと思われる。また今回の観察から,集積部位が髄鞘に囲まれている限り,細胞小器官の集積と変性,形質膜の陥入や小胞の癒合により変性部位の切り放しが繰り返されている可能性が示唆された。このような切断端における変化と平行して,断端よりもすぐ近位のランビエの絞輪では,切断後数時間もすれば側枝芽の形成が始まり,シュワン細胞の基底膜と髄鞘の間を,再生芽は遠位に向かって伸び出す。

現在,この修復過程における電気刺激の影響を電顕的に観察しているが,切断端のすぐ近くに電気刺激を与えると,細胞小器官の集積や隔壁膜の形成が遅れるようである。また側枝再生芽の形成も断端部のすぐ近くで起こるために,ランビエの絞輪における再生芽の形成も少し遅れるようである。この理由を明らかにするために,さらに詳細な形態学的分析が必要である。マウスの坐骨神dを矢腿中夫の高さで切断し、近位断端における有髄神経線維の初期変化を電子顕微鏡で観察した。近位断端では切断後数分以内から、軸案内に小胞の集積が始まり、早いものでは20分以内に大きな終端集積が形成される。また終端集積部やその近位側では、軸索膜の陥入が起こる。このような初期変化は、傷害された軸索部の修復過程として非常に重要であると思われる。本研究では、終端集積の形成とその後の変化および、軸索膜の陥入過程について、電子顕微鏡で詳細な観察を行った。また、これと平行して起こる再生軸索の形成と、それに対する電気刺激の影響について、電子顕微鏡による観察を行った。断端近位側のランビエの絞輪では、切断後数時間以内に再生芽が形成され、娘再生軸索として伸長を開始する。切断直後に、切断部に電気刺激を与えても、初期変化としての終端集積が形成され、数時間以内にランビエの絞輪におて再生芽が形成されていた。また、切断後2日に断端部に電気刺激を与えると、再生軸索先端の成長円錐では小胞の崩壊や多胞体およぶ水解小体の形成が見られたが、さらに24時間を経過すると、電気刺激を与えなかった対照群との間に、明らかな形態的違いは認められたかった。このことは、神経再生に対する電気刺激の影響は比較的軽微で、一時的であり、しかも成長円錐のような、構造的に未熟な部位に限局してしいる可能性を示唆している。また、筋の傷害モデルを作成するために、坐骨神経を切断して、下腿三頭筋における形態変化を組織化学的に観察したり、下り坂走行を強制し、下腿三頭筋における血流量や酸素分圧の変化を生理学的に観察した。
骨材回収型リサイクル指向コンクリートの実用化に関する研究

本年度は、平成10年度より継続されている「コーティング骨材を用いたコンクリートの諸物性の確認」の検討に加えて、新たに抽出されたコーティング剤に関連する問題点の解決及びコーティング骨材界面の付着性状について検討を行った。以下に、その結果を示す。(1)型枠剥離剤として使用される水溶性エマルション系コーティング剤を塗布したコーティング骨材を用いてコンクリートを製造し、再生骨材を回収し、その性質を調べた。結果、原骨材及び再生骨材等の吸水性状の違いがコーティング剤の被覆性状に影響を及ぼし、コーティング効果にばらつきが生じることが確認された。コーティング効果はコンクリートの力学特性に大きく影響を与えるために、吸水性状に関わりなく、一様なコーティング効果を発現することが必要と考えられた。(2)コンクリートの摩擦処理・打継処理等に使用される合成樹脂エマルション系のコーティング剤を使用して、コーティング骨材を製造し、その界面性状を高解像度デジタルマイクロ顕微鏡で観察した。各種コーティング骨材の10150μm程の微細空隙には、コーティング剤塗布回数に比例して、一様にコーティング剤が浸透した平滑面が形成されており、骨材の吸水性状に関わりなくほぼ同等なコーティング骨材の製造が可能であることが示された。(3)コンクリートの摩擦処理・打継処理等に使用される合成樹脂エマルション系のコーティング剤を使用して、骨材ペースト間付着モデルの強度試験体を作製し、コーティング剤塗布回数を考慮した付着強度を測定した。引張及びせん断力が作用する付着界面において、コーティング剤塗布回数に比例して付着強度の低減を図ることが可能となり、明確なコーティング効果が確認された。本年度は「分離採取しやすい骨材の開発」及び「コーティング骨材を用いたコンクリートの諸物性の確認」に関して、数次のリサイクル性能を考慮した検討を行った。すなわち、原骨材に石灰石を用いて再生セメント原料としての適用性を確保したコンクリート及び一次再生骨材を製造し、一次再生骨材を原料として二次コンクリート及び二次再生骨材を製造した。骨材はコーティング骨材として使用し、コーティング効果がコンクリート及び再生骨材品質に及ぼす影響について検討した。(1)石灰石骨材にコーティング剤を塗布したコーティング石灰石骨材の品質は、原骨材である石灰石骨材の物理特性とほぼ同等であり、良好であることが確かめられた。(2)コーティング石灰石骨材による一次骨材回収型完全リサイクルコンクリートの基礎物性は、比較用コンクリートと比べて、若干の強度低下が確認されたがほぼ同等であった。(3)一次骨材回収型完全リサイクルコンクリートから得られる一次再生骨材の品質は、吸水率・比重に注目した場合、比較用骨材よりも若干品質が向上していた。また石灰石骨材は汎用されている砕石骨材と比較して、コーティング効果が出にくいことが確かめられた。これは石灰石表面の組織特性により吸水率が小さくなり、付着コーティング量が低下するためであると考えられる。(4)コーティングー次石灰石再生骨材による二次骨材回収型完全リサイクルコンクリートは、比較用コンクリートと比べて明確な強度低下が確認された。これは吸水性の良好な付着モルタル部分に、コーティング剤が十分に浸透し、表面被膜が形成された結果であると考えられた。このことは再生骨材の付着モルタルがコンクリートに与える一般的な諸性状を、コーティング効果により低減させる可能性があることを示唆するものである。

以下に、その結果を示す。(1)型枠剥離剤として使用される水溶性エマルション系コーティング剤を塗布したコーティング骨材を用いてコンクリートを製造し、再生骨材を回収し、その性質を調べた。結果、原骨材及び再生骨材等の吸水性状の違いがコーティング剤の被覆性状に影響を及ぼし、コーティング効果にばらつきが生じることが確認された。コーティング効果はコンクリートの力学特性に大きく影響を与えるために、吸水性状に関わりなく、一様なコーティング効果を発現することが必要と考えられた。(2)コンクリートの摩耗処理・打継処理等に使用される合成樹脂エマルション系のコーティング剤を使用して、コーティング骨材を製造し、その界面性状を高解像度デジタルマイクロ顕微鏡で観察した。各種コーティング骨材の10150μm程の微細空隙には、コーティング剤塗布回数に比例して、一様にコーティング剤が浸透した平滑面が形成されており、骨材の吸水性状に関わりなくほぼ同等なコーティング骨材の製造が可能であることが示された。(3)コンクリートの摩耗処理・打継処理等に使用される合成樹脂エマルション系のコーティング剤を使用して、骨材ペースト間付着モデルの強度試験体を作製し、コーティング剤塗布回数を考慮した付着強度を測定した。引張及びせん断力が作用する付着界面において、コーティング剤塗布回数に比例して付着強度の低減を図ることが可能となり、明確なコーティング効果が確認された。
塩味受容体タンパクをセンサーとした塩味増強物質の探索とその単離・精製及び構造解析

生活習慣病の中で最も罹患者数が多い高血圧は、その原因が塩分の摂り過ぎに由来し、この高血圧を予防するには塩分の摂取を低減することが重要なことは自明の理ではある。しかし、単なる減塩では味が味気なくなるという問題が伴う。そこで、我々はこの問題を解決する手段として、塩味を増強する塩味増強方法の開発により減塩をしてもおいしい塩味を享受できる技術開発を試みた。具体的には、ヒトの塩味受容体遺伝子をアフリカツメガエルの卵母細胞に注入・発現させた塩味受容体タンパク質をセンサーとして、塩味増強物質を農作物、発酵食品、食品素材等を対象に探索した結果、1種類の農作物より塩味を有意に増強する物質を見出すことに成功した。ヒト由来の塩味受容体タンパクの遺伝子であると推定されているナトリウムイオンチャネル遺伝子であるENaCα,β及びδの内、先ずENaCαのcRNAを合成して、この遺伝子をアフリカツメガエルの卵母細胞にインジェクションしてタンパク発言させたものをセンサーとして用いるパッチクランプ法による電気生理学的アッセイシステムの基本形の樹立と塩味増強効果を有するサンプルの調製を目的に下記の課題について検討した。(1)ENaCのNa+イオンチャネルのブロッカーとしての亜鉛イオン濃度のタンパク質発現への影響の検討(亜鉛濃度:0, 25, 50, 100μM)(2)Na+刺激としての食塩水のNa+イオン濃度の影響の検討(3)塩味増強物質候補(市販のカテキン系、サンファイバー系、アミノ酸・ペプチド系のサンプル)の調製その結果、(1)については、ENaCαタンパクの発現には亜鉛50μMが最も好ましく、これより低い及び高い濃度域ではタンパクの発現が悪く、また電気信号も安定しないことが分かった。加えて、電気生理学的アッセイに先立って亜鉛50μMに浸漬した卵母細胞はND96中の2倍量のNa+を含むND6バッファで23洗浄して、表面の亜鉛を洗い流す必要のあることが分かった。(2)については、ND96の26倍涼のNa+イオンまでは比較的濃度依存的な電気信号が生じたが、10倍以上では電気信号の応答が極端にひくくなる傾向を示したことから、最も安定した電気信号が得られたND96の2倍量のNa+イオンを含むバッファーでの電気信号をベースとすることにした。(3)については、太陽化学より提供を受けたカテキン系、サンファイバー系及びアミノ酸・ペプチド系の試料の1%ND96バッファー(対ND96 pH7.4)に対する透析処理して調製したものをアッセイ用のサンプルとした。科研費の採択が2015年10月であったことを考慮すると、電気生理学的アッセイ系システムの樹立と塩味増強物質候補の調製という目的に対しては、おおむね順調に進展していると言える。1.塩味受容体遺伝子(ENaC)発現の安定化条件の設定塩味修飾アッセイに用いる卵母細胞の塩味受容体インジェクション後からアッセイまでの遺伝子発現条件と卵母細胞の状態について塩味受容体阻害因子であるZn++(50,100,200μM)とアミロライド(10,20,40,60μM)についてその濃度とENaC遺伝子発現との関係を調べた結果、Zn++では唯一50μMにおいてのみ塩味刺激応答と卵母細胞が安定していたが、アミロライドでは10,20μMでは卵母細胞は安定していたものの塩味刺激の応答が鈍化し、60μMでは塩味刺激応答、卵母細胞の状態ともに良好であったが、60μMでは塩味刺激応答は良好だったものの卵母細胞の状態が著しく異常を示した。これらの結果から、アミロライド40μMで塩味受容体遺伝子のインジェクション後の卵母細胞を培養することに決めた。2.自然界からの塩味増強物質のスクリーニング10種類の野菜抽出・透析液からの塩味増強物質のスクリーニングを行った結果、シシトウガラシとブロッコリーで明らかな塩味増強効果が確認された。一方、人参とリンゴで強い塩味抑制効果及びパプリカで弱い塩味抑制効果が認められた。当初塩味刺激に対して増強効果を示したシシトウガラシとブロッコリーの抽出・透析液のpHを確認したところ、pH6.8と弱酸性を示したことから、改めてpH7.4に調整した後、塩味刺激に対する応用を確認したところ塩味増強のシグナルが認められなかったことから、pHの酸性化による電気信号の発生が生じた可能性が想定されたが、一方、サンプルを含まないpH6.8とpH7.4での塩味刺激に対する応用を比較してもpH6.8で特段電気信号が発生することがなかったことから塩味増強成分が保存中に何らかの作用で失活した可能性も含めて現在サンプル調製段階から再現試験を実施して確認中である。1.塩味修飾の安定的なアッセイ系の確確立本研究課題を推進していく上で最も大きな課題であった塩味受容体遺伝子ENaCのアフリカツメガエルの卵母細胞での安定した遺伝子発現の条件の確立が律速になると想定されたが、安定化因子のZn2+とアミロライドの条件検討の結果、予想外に安定的にENaC遺伝子の発現が可能になった点が大きく寄与している。2.自然界からの塩味増強物質のスクリーニング安定的なアッセイ系が確立されたとして次に大きな課題と想定された塩味増強物質のスクリーニングの可能性も予想外に早くスクリーニングできたと考えられる結果が得られたことも大きく寄与している。

1.塩味受容体遺伝子(ENaCα)の単発現系での安定的アッセイ条件の樹立塩味増強アッセイに用いる塩味受容体(ENaCα)のアフリカツメガエルの卵母細胞内での安定的な発現条件について塩味受容体阻害因子であるZn2+とアミロライドの各種濃度と塩味刺激応答並びに卵母細胞の状態について調べた結果、アミロライド40μM処理で最も安定した塩味応用に由来する電気応答が得られることを確認することができた。2.塩味増強物質のスクリーニング1農作物(野菜類、果物類、キノコ類、豆類、穀物類)50種類、2発酵食品(味噌類、納豆類)30種類、3蛋白質素材の塩酸ないしは酵素による部分加水分解物12種類、4食品素材(大豆由来、茶由来)10種類、5微生物産生界面活性物質6種類の合計108種類の試料について、透析膜を用いて100倍希釈の透析を5回繰り返すことにより、試料中に含まれるNa+を完全に除去した透析膜内液(pH7.4)について上記の電気生理学的アッセイ系で塩味増強物質を探索した結果、1の農作物については、1種類から有意に塩味応答が増強されることが再現性を伴って認められた。2については、酸味受容体ASICsの酸味応答において酸味増強(納豆、豆味噌)あるいは酸味抑制(米味噌、麦味噌)作用を有するものが見出されており、ASICs同様ENaCsも同じイオンチャネル型の受容体であることから、これら酸味増強及び酸味抑制物質についてアッセイしたが全く塩味応答しなかった。3についても、12種類全てにおいて塩味増強を確認できなかった。ただし、透析膜の分画サイズが多すぎて外液に透析されてしまった可能性は否定できない。4と5については、2同様酸味増強ないしは酸味抑制作用を有する物質が見出されたことから塩味応答を調べたが、塩味増強の応答は見出せなかった。生活習慣病の中で最も罹患者数が多い高血圧は、その原因が塩分の摂り過ぎに由来し、この高血圧を予防するには塩分の摂取を低減することが重要なことは自明の理ではある。しかし、単なる減塩では味が味気なくなるという問題が伴う。そこで、我々はこの問題を解決する手段として、塩味を増強する塩味増強方法の開発により減塩をしてもおいしい塩味を享受できる技術開発を試みた。具体的には、ヒトの塩味受容体遺伝子をアフリカツメガエルの卵母細胞に注入・発現させた塩味受容体タンパク質をセンサーとして、塩味増強物質を農作物、発酵食品、食品素材等を対象に探索した結果、1種類の農作物より塩味を有意に増強する物質を見出すことに成功した。2016年度中には下記の課題の完了を目標に研究推進していく予定である。(2)ENaCα,β及びδのそれぞれ共発現系(αとβ,αとδ,βとδの二つの遺伝子の発現系及び三つの共発現)2017年度中には2016年度にスクリーニングされた塩味増強物質候補の単離・精製とその構造解析を行う予定である。1.自然界からの塩味増強物質のスクリーニングの継続現在までにシシトウガラシとブロッコリーという2つの有力候補素材が見出されているが、引き続き野菜、果物およぞその他の食品素材を対象に塩味増強物質候補をスクリーニングしていく。2.塩味増強物質の構造解析の推進シシトウガラシとブッロリーの2つについては、分子量が3,500以上と推定されることから、セファロールを担体としたゲルろ過で分画を行った後、カラムクロマトグラフィを駆使して有効成分と想定されるものを分離・精製してLC/MS, GC/MSなどの機器分析にかけて構造解析する。