hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
情報文明学の構築:高度情報化に伴う地球文明および諸地域の変容についての研究

今日、異なるコンピュータを網の目状に結合し、瞬時に、自由に双方向のコミュニケーションを行うことのできるインターネットの網は、地球全体を覆うに至った。また、情報処理技術の発展によって、動画や音声も扱えるようになり、人工的に現実感を体験できる技術も可能になった。この様な高度情報化の時代にあって、情報技術の進歩に翻弄されることなく、それがもたらす地球文明全体および諸地域の社会変容・文明の変容の方向を見定め、それを人類の幸福に役立て、利用するにはどうすればよいかをあきらかにすること、いわば情報文明学の樹立、それが本研究の目的である。この総括的な課題を解明するために、次の5つの課題群を学際的なネットワーク体制で研究に取り組むことが本研究の課題である。(1)文明間摩擦研究、(2)日本語情報研究、(3)心身情報研究、(4)情報行動研究、(5)情報経済研究上記課題を研究する研究班を5人の研究班長を中心として編成し、各研究分担者の研究資料の収集・整理及び、平成10年度、甲南大学国際交流センターに設置した全海外衛星放送受信システムによるリアルタイムな全世界情報の収集と分析による情報文明と社会の研究や、研究班内での討論を行った。また、同年度導入したマルチメディア会議・通信システムを利用した研究班間での研究報告・意見交換(甲南大学-関西学院大学間等)を行うことにより遠隔研究会(ネットワーク・コラボレーション)の可能性を考察した。平成11年10月16日、研究の成果を報告するシンポジウム「情報文明学の構築」を甲南大学にて開催した。シンポジウムには各研究分担者をはじめとして約百名の研究者や一般聴衆が参加、吉沢研究代表者の基調講演はじめ、5つの研究班の代表者による研究報告、フロアを交えての討論を行い、情報技術やネットワーク化がもたらすメリットや問題点を指摘した。このシンポジウムの成果として刊行物を発行する準備をすすめている。第1:文明間摩擦研究-情報による諸民族の共生と安全保障の確立のための情報方策第2:日本語情報研究-日本語の国際化を促進し、情報による諸文明の相互理解に役立てる方策第3:心身情報研究-情報による人間の心身環境の改善方法の研究第4:情報行動研究-情報化に伴う人間行動と社会システムの変容の研究第5:情報経済研究-地球レベルの情報化による産業構造への影響と情報産業の育成についての研究本年度は、上記課題を研究する研究班を5人の研究班長を中心として編成し、各研究分担者の研究資料の収集・整理及び、今年度甲南大学国際交流センターに設置した全海外衛星放送受信システムによるリアルタイムな全世界情報の収集と分析による情報文明と社会の研究や、研究班内での討論、今年度導入したマルチメディア会議・通信システムを利用した研究班間での意見交換(2/6甲南大学-関西学院大学間、3/6甲南大学-京都大学及び関西学院大学間)など、来年度開催予定のシンポジウムの準備を進めた。

今日、異なるコンピュータを網の目状に結合し、瞬時に、自由に双方向のコミュニケーションを行うことのできるインターネットの網は、地球全体を覆うに至った。また、情報処理技術の発展によって、動画や音声も扱えるようになり、人工的に現実感を体験できる技術も可能になった。この様な高度情報化の時代にあって、情報技術の進歩に翻弄されることなく、それがもたらす地球文明全体および諸地域の社会変容・文明の変容の方向を見定め、それを人類の幸福に役立て、利用するにはどうすればよいかをあきらかにすること、いわば情報文明学の樹立、それが本研究の目的である。この総括的な課題を解明するために、次の5つの課題群を学際的なネットワーク体制で研究に取り組むことが本研究の課題である。(1)文明間摩擦研究、(2)日本語情報研究、(3)心身情報研究、(4)情報行動研究、(5)情報経済研究上記課題を研究する研究班を5人の研究班長を中心として編成し、各研究分担者の研究資料の収集・整理及び、平成10年度、甲南大学国際交流センターに設置した全海外衛星放送受信システムによるリアルタイムな全世界情報の収集と分析による情報文明と社会の研究や、研究班内での討論を行った。また、同年度導入したマルチメディア会議・通信システムを利用した研究班間での研究報告・意見交換(甲南大学-関西学院大学間等)を行うことにより遠隔研究会(ネットワーク・コラボレーション)の可能性を考察した。平成11年10月16日、研究の成果を報告するシンポジウム「情報文明学の構築」を甲南大学にて開催した。シンポジウムには各研究分担者をはじめとして数百名の研究者や一般聴衆が参加、吉沢研究代表者の基調講演はじめ、5つの研究班の代表者による研究報告、フロアを交えての討論を行い、情報技術やネットワーク化がもたらすメリットや問題点を指摘した。このシンポジウムの成果として刊行物を発行する準備をすすめている。
パラノイアにおける潜在・顕在的認知についての実証的研究

パラノイアの生起メカニズムを自尊心の観点から説明する2つのモデルが提唱されている。ひとつは、潜在的に低い自尊心が顕在化することに対する防衛としてパラノイアが生じるとするものである。これによれば、潜在的に自尊心が低くとも、パラノイア(誰かに陥れられた。私は悪くない)を抱くことで顕在的には自尊心は保護される。もうひとつのモデルは、パラノイアには防衛的な側面はなく、低い顕在的自尊心を直接反映していると仮定するものである。本研究では、質問紙調査および認知実験によってこれらのモデルの検討を行った。その結果、いずれの分析でも後者のモデルが支持された。本研究は、潜在的認知および顕在的認知の両面からパラノイアの生起メカニズムを明らかにしようとするものである。本年度は、潜在レベルのパラノイアを測定するための実験手法(パラノイアIAT)の開発を試みた。既存の尺度や事例研究などに基づいてパラノイアIATを構成する刺激語の候補を抽出し、その中から重要度が高いと考えられる語を選定した。最終的に、パラノイアー非パラノイアの属性についてそれぞれ5つの刺激語を決定した。この結果をもとにパラノイアIATを作成し、現在そのデータを収集中である。顕在レベルのメカニズムに関しては多くの先行研究が積み重ねられているが、本研究ではパラノイア者にみられるあいまいさ耐性の低さに焦点を当てた。既存のあいまいさに関する研究では、あいまいさへの態度をあいまいさ耐性の低さのみでとらえてきたが、本研究では、あいまいさへの多様な態度を測定する「あいまいさへの態度尺度(西村,2007)を用いて、パラノイアとあいまいさへの態度の関係についてさらに詳しく検討した。その結果、情報収集によってあいまいさを統制する傾向と、あいまいさに対して不安を感じる傾向がパラノイアと特異的に関連していることが明らかになった。これは、不確実性を低減しようとするための努力の結果として自己関係づけやパラノイアが生じるとする先行研究の知見と整合するものである。この成果は平成25年度の日本グループ・ダイナミックス学会第60回大会で発表された。本研究は、潜在的認知および顕在的認知の両面からパラノイアの生起メカニズムを解明しようとするものである。本年度は、潜在レベルのパラノイアを測定するための実験手法を引き続き開発し、本実験を行い、データを収集した。分析の結果、非臨床群においては自己とパラノイアの結びつきは自己と非パラノイアの結びつきよりも弱いことが明らかになった。臨床群ではこれと反対の結果になる可能性があり、もしそうであれば、将来的にはパラノイアの客観的な診断ツールのひとつとして活用できる可能性がある。潜在的パラノイアの他に、潜在的自尊心についても研究を行った。潜在的自尊心は主にIATやネームレター効果によって測定されるが、本年度は後者に焦点を当てた。具体的には、ネームレター効果を算出するためのアルゴリズムについて検討し、I-アルゴリズムと呼ばれる方法が推奨される結果となった。この研究成果は愛知学泉大学・短期大学紀要第49巻に掲載された。顕在レベルのメカニズムについては、曖昧さへの態度とパラノイアの関係について検討し、情報収集によって曖昧さを統制しようとする傾向や、曖昧さに不安を抱く傾向がパラノイアと関係することを明らかにした。この研究成果は対人社会心理学研究第15巻に掲載予定である。今後は、今年度までに開発した潜在的パラノイアや潜在的自尊心の測定法なども用いながら、パラノイアのメカニズムとして有力視されている「防衛モデル」と「表出モデル」の妥当性の検討を行う予定である。顕在的認知とパラノイアの関連の検討では、パラノイア者にみられるあいまいさ耐性の低さに焦点を当て、具体的にどのような側面がパラノイアと関連しているのかを調べた。その結果、情報収集を通じてあいまいさを統制しようとする傾向が特にパラノイアと関連していることが明らかとなった。パラノイアは、情報収集によってあいまいさを低減しようとする傾向の強い個人が、外部から情報を得られないときに、その人自身の中で情報を生み出した結果である可能性がある。潜在的認知とパラノイアの関連の検討では、潜在連合テストを用いて潜在的パラノイアを測定し、顕在的なパラノイアとの関連を調べた。その結果、両者には関連はみられなかった。一方で、潜在的自尊心と潜在的パラノイアには有意な正の相関がみられ、両者はネガティブなスキーマを共有している可能性が示唆された。また、本研究課題の最も大きな目的である、パラノイアが低い潜在的自尊心の顕在化を防いでいるという仮説(防衛モデル)と、パラノイアは低い顕在的自尊心をそのまま反映しているという仮説(表出モデル)のいずれが支持されるのかを検討した。非臨床群を対象としてデータを収集し、分析を行った結果、表出モデルが支持された。潜在的自尊心の指標としては複数のものを用いたが、そのいずれにおいても表出モデルが支持された。また、パラノイアと抑うつには強い正の相関がみられた。

前述の防衛モデルをはじめとして、、パラノイアは顕在的自尊心の低下や抑うつの発生を防いでおり、それゆえパラノイアへの介入は逆効果となるという指摘もあるが、本研究の結果はそのような逆効果は生じないことを示唆している。これは、パラノイアそのものへの介入が必要かつ有用であることを意味する。パラノイアの生起メカニズムを自尊心の観点から説明する2つのモデルが提唱されている。ひとつは、潜在的に低い自尊心が顕在化することに対する防衛としてパラノイアが生じるとするものである。これによれば、潜在的に自尊心が低くとも、パラノイア(誰かに陥れられた。私は悪くない)を抱くことで顕在的には自尊心は保護される。もうひとつのモデルは、パラノイアには防衛的な側面はなく、低い顕在的自尊心を直接反映していると仮定するものである。本研究では、質問紙調査および認知実験によってこれらのモデルの検討を行った。その結果、いずれの分析でも後者のモデルが支持された。計画どおり、パラノイアIATを作成し、データ収集を行った。また、本研究にとって重要である潜在的自尊心の測定法についても研究を進めることができた。臨床心理学今後は、本研究課題において最も重要である、パラノイアのメカニズム(「防衛モデル」と「表出モデル」)の検討を行う予定である。本研究課題においては、潜在的自尊心をいかに正確にとらえるかが重要な役割を果たすため、副次的な研究として、今年度も行った潜在的自尊心についての研究をさらに詳しく進める予定である。計画どおり、パラノイアIATの作成を進めることができた。データの収集は平成26年度の前半に完了する予定である。潜在レベル以外に顕在レベルでのパラノイアの心理的プロセスについても検討し、学会発表を行った。この研究は学術雑誌への投稿に向けて準備中である。また、日本カウンセリング学会の奨励賞受賞者講演において、これまでの研究をまとめた講演を行った。予定していた国際学会への参加が校務により不可能になったため、旅費の未使用分が生じた。今後は、作成したパラノイアIATを用いて、パラノイアにおける潜在ー顕在間の関係を明らかにする。それと同時に、パラノイアのメカニズムとして有力視されている防衛モデルと表出モデルの検討を行う。これにより、パラノイアの生起に潜在的プロセスが関与しているのかを明らかにする。これらの研究成果を、学会発表や学術論文等を通じて発信する予定である。学会発表のための旅費、もしくは英文校閲費、実験参加への謝礼等に充てる。学内業務により、予定していた学会発表を取り消しせざるを得なくなったため旅費の未使用分が生じた。学会発表のための旅費、実験用ソフトウェア、英文校閲・翻訳費、調査にかかる印刷費、論文や書籍の購入費に充てる。
レンチウイルスベクターによる視床大脳皮質シナプス結合の定量的解析

本研究課題は、経シナプス順行性・逆行性トレーサータンパクを発現するレンチウイルスを開発・利用し、視床皮質神経回路におけるシナプス結合特性を単一神経細胞レベルで解析することを目的とするものである。本年度は、(1)経シナプストレーサータンパク(WGAもしくはGFP-TTC)とマーカータンパク(GFPもしくはRFP)を共発現するレンチウイルスベクターの開発・検討、(2)経シナプストレーサータンパク検出系の最適化を行った。(1)共発現型レンチウイルスの開発:Tet-Offシステムを用い、2種の遺伝子を効率的に共発現するレンチウイルスの開発・検討を、成体ラット線条体にて行った。Tet応答性双方向性プロモーター(TREB)下でGFPとRFPを発現させた場合、両者の発現量は感染細胞間でバラツキが非常に大きかった。脳心筋炎ウイルス由来のinternal ribosomal entry site (IRES)を用いた場合、発現量のバラツキは少なかったものの、IRES下流遺伝子の発現量が20分の1程度にまで低下した。手足口病由来の2Aシグナルを用いた場合、GFP・RFP共に強い発現を示した。よって現時点では2Aシグナルが共発現に最も適していると考えられる。(2)検出系の最適化:WGAもしくはGFP-TTCを単発現するレンチウイルスベクターを成体ラット脳内に注入し、WGAもしくはGFPに対する自作抗体を用い、検出方法の検討を行った。PAP法・TSA法・BAC法を組み合わせることで、免疫活性を検出することに成功したが、未だにシグナルが弱く、定量的解析を行えるレベルには達していない。引き続き、検出法を高める工夫が必要であると考えられる。本研究課題は、経シナプス順行性・逆行性トレーサータンパクを発現するレンチウイルスを開発・利用し、視床-皮質神経回路におけるシナプス結合特性を、単一神経細胞レベルで解析することを目的とするものである。昨年度に引き続き、(1)経シナプストレーサータンパク(WGAもしくはGFP-TTC)とマーカータンパク(GFPもしくはRFP)を共発現するレンチウイルスベクターの開発・検討、(2)経シナプストレーサータンパク検出系の最適化を行った。(1)共発現型レンチウイルスの開発:Tet-Offシステムを用い、2種の遺伝子を効率的に共発現するレンチウイルスの開発・検討を、成体ラットで行った。昨年度は線条体で検討を行ったが、本年度は皮質・視床で検討を進めた。レンチウイルスを用いた本発現系では、視床では感染数が少なかったため、皮質において定量的解析を進めた。脳心筋炎ウイルス由来のinternal ribosomal entry site (IRES)を用いた場合、発現量のバラツキは少なかったものの、IRES下流遺伝子の発現量が低下した。ただし、2Aシグナルを用いた場合、2種のタンパクが融合された形で発現されるとの報告もあり、より詳細な検討が必要であると考えている。(2)検出系の最適化:WGAもしくはGFP-TTC(コドンを最適化して人工遺伝子を使用)を単発現するレンチウイルスベクターを成体ラット脳内に注入し、WGAもしくはGFPに対する自作抗体を用い、検出方法の検討を行った。PAP法・TSA法・ABC法を組み合わせることで、免疫活性を検出することに成功したが、未だにシグナルが弱く、定量的解析を行えるレベルには達していない。さらに高感度な検出系の開発が必要であると考えている。
オリゴタクレオチドの見直し:遺伝子発現の非侵襲的画像化と遺伝子治療に向けて

今まで、悪性腫瘍特異的な遺伝子発現を画像化によって評価するといった研究はほとんど認められなかった。われわれは、^<11>C(positron emitter)標識アンチセンス・オリゴヌクレオチドの経静脈的投与による、動物脳腫瘍(グリオーマ)モデルにおける遺伝子発現画像化法の開発を行い、さらにアンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いたグリオーマの遺伝子治療を、画像化による定量的根拠を持った治療法として完成させるべく研究を行った。まず、C6グリオーマ細胞株のラット脳内移植モデルおよびENU(N-ethyl-N-nitrosourea)誘発ラット・グリオーマモデルでは、免疫組織学的染色によって強染するグリオーマ組織に一致して、アンチセンス・オリゴヌクレオチドの一様な集積が認められた。ところがセンス・オリゴヌクレオチドおよび20%mismatchオリゴヌクレオチド(アンチセンスの配列の内、5塩基に1塩基の割合で相補的な塩基に変えたもの)では周囲の正常脳組織との差異が見られなかったことより、塩基配列特異的な集積と考えられた(Kobori,N.,et al.NeuroReport10:2971-2974,1999)。次いで、ヒト・グリオーマ細胞株のヌードマウス脳内移植モデルを用い、腫瘍の増殖活性と非常に強い相関をもつと考えられる、human telomerase reverse transcriptase gene(hTRT)およびMib-1geneのアンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いて同様の研究を行った。結果として、hTRTおよびMib-1共に腫瘍組織に一致した集積が認められ、周辺の正常脳組織には集積が見られなかった。ところが、GFAPmRNAの様な一様な分布とは異なり、hTRTおよびMib-1共に腫瘍中心部に比して腫瘍辺縁部に強い集積が認められた。これは腫瘍の増殖活性が腫瘍辺縁部に強いことと対応する結果と考えられた。画像化法に関する基礎的研究を終えたので、今後、同じ方法を遺伝子治療に発展させるべく研究を続ける予定である。
個人認証・識別用熱型指紋センサーに関する研究

本研究では、マイクロ抵抗体を用いた今までない微細パターン検出の新しい原理を提案し、MEMS技術を駆使して、既存技術の改善ではなく従来課題の根本的な解決によって、個人認証・識別用指紋センサーデバイスの超小型化及び高度なセキュリティの実現を図った。デバイスの加工プロセス技術を開発し、解析・実験研究を通じて作製デバイスの作動確認と提案手法の微細パターン検出原理の実証及び指紋センサへの応用可能性を立証した。(2)FDTD(Finite Difference Time Domain)法を用いて素子間cross-talk現象の影響をセンサ素子の材質・センサアレイピッチ・パルス時間・入力パワーなど総合パラメータ関係から解析を行った;解析結果に基づいて最適構造設計を行い、サンプル作製用フォトマスクを設計・発注し加工済である;MEMS技術を投入した加工プロセスを開発し、一次元アレイデバイスの加工プロセス技術を確立;曲面対象物にも対応できる柔軟性基板を持つデバイス作製の安定した加工が実現できた。貫通配線と平面交差配線法を検討し、構造設計と材料選定によりノイズ影響の除去を図った;柔軟性と熱絶縁性に優れたPl film(25μm)を基板材料に用いた。マイクロ抵抗体アレイのセンシング素子には薄膜作製技術を投入した。センシング素子の薄膜化技術の投入と基板との熱絶縁効果によってセンサ素子の高感度・高応答性が実現できた;デバイスに必要な回路設計と信号処理・アルゴリズム開発は研究進行中である。平成19年度の研究成果をまとめ、SPIE, JMM(Journal of Micromechanics and Microengineering)雑誌へ論文投稿を予定している。今年度では、H19年度FDTD(Finite Difference Time Domain)法を用いた素子間cross-talk現象の解析結果に基づいた設計によって作製した2次元アレイフォトマスクを用いて、指紋センサ画像度に要求される素子間ピッチ50μm(500dpi)アレイデバイスの加工プロセスを検討しサンプル作製を行った。スパッタ技術による製膜手法を用い保護膜材料による特性の影響を検討し評価を行った。熱絶縁効果とセンサ素子の感度・応答性の改善のため柔軟性特性を備えたポリイミドフィルムをデバイス基板材料とし、貫通配線と平面交差配線法など2次元センサ素子アレイに対する配線手法を加エプロセスの面から詳細検討を行った。2次元アレイ配線において、素子数の増加に伴う配線数の急激な増加と、熱型センサ特有のセンシング素子加熱用配線とセンサ素子から検出信号を取り出す配線の配置の課題について、回路技術と信号処理技術を活用することによってセンサ素子加熱用とセンサ素子からパターン検出用電気信号を引き出す配線を共有させて配線の数を減らす手法を検討中である。半導体プロセスによる制御回路の別チップの案も考慮に入れ、これからの1年を利用し、今までに蓄積してきた基礎データと基本研究手法を活かして検討中の残り課題を解決し、既存技術での課題解決の実証を目指す。本研究では、マイクロ抵抗体を用いた今までない微細パターン検出の新しい原理を提案し、新しい検出原理とMEMS技術の投入によって個人認証・識別用指紋センサーデバイスの超小型化及び高度なセキュリティの実現を研究目的とした。パターン検出の具体的原理は、センサ基板上にマイクロヒータ素子を高密度にアレイし、指紋の凹凸によるヒータ素子温度変化を電気抵抗値の変化から識別することにある。本研究は、従来研究とは全く違う新しい検出原理を利用し、MEMS技術を駆使することによって既存技術の改善を目標とするのではなく、課題の根本的な解決を目指すものである。本年度は、これまでの1素子・1次元アレイデバイスの作製加工技術と機能性評価結果を基に、指紋パターン検出可能な素子間ピッチ50μm (500dpi)の2次元アレイデバイスの加工プロセス技術を開発し、柔軟性基板を特徴とする配線・保護膜の実施などハード面での技術課題を詳しく検討し、熱絶縁効果とセンサ素子の感度・応答性の改善評価を行った。2次元アレイ配線において、素子数の増加に伴う配線数の急激な増加と、熱型センサ特有のセンシング素子加熱用配線とセンサ素子から検出信号を取り出す配線の配置の課題について、回路技術と信号処理技術を活用することによってセンサ素子加熱用とセンサ素子からパターン検出用電気信号を引き出す配線を共有させて配線の数を減らす手法を検討した。センサ自体の小型化には成功しているが信号線と駆動線の配線による面積増加の対策としてデバイスのシステム化や製品化に向けてはアレイ数を極限(23行までに)減らしてのスキャン方式の投入が望ましい。
多ソ-ト帰納学習システムの設計と応用

本研究は記号データと数値データを統一的に処理できる多ソ-ト帰納学習システムの設計と応用を行った。具体的には以下のようである。(1)凸包構成による数値データの帰納一般化法の提案従来の帰納一般化は記号データを対象としたが、本方法では数値データを帰納一般化するアルゴリズムを提案した。このアルゴリズムは有限個のクラスと実数をとる属性値集合を入力とし、ボトムアップ的に最小一般化を行う。最小一般化後は、ルールの条件部を簡単化し意味のない変数を自動的に消去する。実験によると、処理性能は帰納学習の標準ソ-ルに匹敵する性能が得られた。(2)制約つき帰納論理システムの開発従来の帰納学習システムはエルブラン領域しか扱えないため、代数的関係を学習することは困難であった。本システムは制約論理プログラミングにならって、単一化を制約解消系に置き換えた。その結果、扱える計算領域が増え、仮説言語の表現力が向上した。さらに、仮説言語へ適切な制限を加えることにより、仮説空間を大幅に縮小し、システムの効率化が図られた。以上の学習システムは標準のProlog処理系上で作成しているため汎用化が高い。システムの応用としては、医療画像等の特徴抽出を実施した。
高品質タンパク質単結晶育成技術の確立～交流電場印加によるエントロピー変化の検出～

高齢化社会に対応するゲノム創薬やテーラーメイド医療を実現するためには、高品質タンパク質結晶の育成技術の確立が望まれている。このため、これまで我々は交流電場を利用し、タンパク質結晶の高品質化に成功してきた。本課題では、電場印加によるエントロピー変化に焦点を当て、タンパク質結晶の高品質化の機構解明を試みている。結果として、電場印加によるタンパク質結晶の高品質化を達成するためには、最適な周波数が存在することを示した。加えて、交流電場印加によるタンパク質結晶の高品質化は、ステップ自由エネルギーの増加によって生じることを示した。さらに、その増加が、固相のエントロピーの減少に起因することを明らかにした。高齢化社会に対応できるゲノム創薬やテーラーメイド医療を実現させるためには、精密なタンパク質分子の三次元構造の情報が必須である。そのタンパク質分子の三次元構造は、主に、タンパク質単結晶を用いてX線構造解析を行うことにより得ることができるが、その結果をゲノム創薬やテーラーメイド医療につなげるためには、少なくとも1.5オングストローム以下の分解能で構造を精密化することのできる高品質なタンパク質単結晶が必要となる。しかしながら、そのような高分解能を得ることのできるタンパク質単結晶は非常に育成が難しい。近年、申請者は、1 MHzの交流電場を印加しながら正方晶リゾチームを育成することにより、その結晶の完全性の改善に成功した(J. Appl. Cryst. 46, 25 (2013).)。そして、1 MHz印加による結晶性の改善が、結晶内のサブグレイン間の配向不整と局所的な歪みの減少に起因していることを明らかにしてきた(Cryst. Growth Des. 14, 5662 (2014))。しかしながら、交流電場印加による結晶内のサブグレイン間の配向不整や局所的な歪みの減少のメカニズムの根本は十分に明らかにできていない。そこで、本申請では、このメカニズムをラマン散乱による結合状態の変化から解明することを目的としている。特に、タンパク質結晶内には水分子が存在し、その一部はタンパク質分子と結合している。本測定では、このタンパク質分子し結合した結合水に注目し、ラマン散乱測定を行った。結果として、1 MHzの交流電場を印加しながら正方晶リゾチームを育成すると、結合水に関与する振動モードの半値幅が減少することが分かった。これは結合水の秩序が高くなったことを示している。本研究は、交流電場印加によるタンパク質結晶の完全性改善のメカニズムを解明することを目的としている。特に、交流電場を印加することにより固相のエントロピーの減少が熱力学的に解析されており、このエントロピーの減少が何に起因しているのかに注目して研究を行っている。その結果、ラマン散乱測定により結合水に起因する振動モードの半値幅の減少を確認できており、おおむね順調に進展している。タンパク質分子の構造解析の精密化は、これまで如何に高角の回折波を検出するかという一点にのみ注意が向けられ、放射光施設の高輝度化、および、検出器システムの高感度化といった装置の開発が国内外で活発に行われてきた。しかし、SPring-8のような高輝度放射光施設を用いても、創薬において最低限必要とされる1.5オングストローム以下の分解能を持つタンパク質分子の構造は、Protein Data Bankに登録されるすべてのタンパク質の内の僅か9 %にしか過ぎない。これは、高輝度化および高感度化といった測定技術の向上にのみ目を向けるだけでは限界があることを如実に示している。つまり、タンパク質結晶の不完全性にも目を向け、なぜ高角の回折波が起こり難いのかという問題に取り組む必要がある。近年、申請者は、1 MHzの交流電場を印加しながら正方晶リゾチームを育成することにより、その結晶の完全性の向上に成功した(J. Appl. Cryst. 46, 25 (2013).)。そして、1 MHz印加による結晶性の向上が、結晶内のサブグレイン間の配向不整と局所的な歪みの減少に起因していることを明らかにしてきた(Cryst. Growth Des. 14, 5662 (2014).)。しかしながら、交流電場による結晶内のサブグレイン間の配向不整と局所的な歪みの減少のメカニズムは、これまで不純物の取り込みの観点から議論してきたが、十分に明らかにできていない。そこで、本申請では、その場観察を行い、実際に正方晶リゾチームが成長する様子を観察することによって、成長のカイネティックを評価し交流電場の影響を調査した。結果として、1 MHz印加することによって、正方晶リゾチームの面成長速度の低下が起こることがわかった。そして、その低下が表面自由エネルギーの上昇によってもたらされていることを明らかにした。

1 MHzの交流電場を印加すると固相のエントロピーは減少し、20 kHzの交流電場を印加すると液相のエントロピーは増加することが熱力学的に解析されている。そこで、今後は、1 MHzの交流電場を印加しながら育成した正方晶リゾチームの測定も行いつつ、20 kHzの交流電場を印加しながら育成した正方晶リゾチームも準備し、その測定も行っていく。結晶成長物理学計画していた国際会議をキャンセルしたため、その旅費分を次年度に繰り越した。また、2月に購入を計画していた分光光度計が、年度末キャンペーンで5割引の価格で購入できたため、その差額を次年度に繰り越した。タンパク質粉末等の消耗品を購入していく。
超音速燃焼ラムジェットにおける衝撃波保炎機構の解明

高エンタルピー衝撃風洞内にスクラムジェットエンジンモデルを設置して,マッハ7,高度約30キロメートルの飛行条件で燃焼試験を行った。スクラムジェットエンジンモデルでは、2段ランプの1段目の圧縮部あるいは2段目のランプから燃料(ガス水素)を噴出した.上記のモデルでは、マッハ7の流れが燃焼器内部ではマッハ数約1.7まで減速された。燃焼器内の流れの静温は約1600K、静圧は約30kPaであった。実験では、流れの可視化と圧力測定を行った。実験結果は、2段目のランプ壁から燃料を噴射した場合,着火は燃焼器入り口で生じた。これは、当初の予定通りであった。特に、燃焼器入り口のカウルからの反射衝撃波後方で強い発光が認められた。このことから、流れの圧縮を受け持つインテーク部からの燃料噴射を行い、かつ、インテークから燃焼器にいたる衝撃波システムで着火を行う機構が実現できることをしめした。保炎に対しては、試験時間が短いことから、さらに詳しい実験が必要と考えられる。モデルが小さいことから、燃焼器内部での圧力上昇は観察されなかった。今後、大スケールの実験が必要である。燃料の混合促進と混合評価の観点からも研究を進め、燃料噴流と超音速流との干渉現象、境界層と超音速流の干渉現象、触媒反応を利用した混合評価方法の開発、等の研究を精力的に進めた。特に,触媒反応を用いた混合評価法では,混合状態の時間変動を捉えることに成功した.本研究結果は、日本航空宇宙学会やAIAA主催の国際会議等で、発表済みまたは発表予定である。本年度は,まず,高エンタルピ衝撃風洞の改良を行い,ノズル出口直径を90mmとした。その結果,やや大型のスクラムジェットエンジン模型を実験に供することができるようになった。本衝撃風洞で達成される飛行条件は高度30km,マッハ数7であった。なお,一様流の持続時間は約500μsである。実験に供したスクラムジェットエンジンモデルは機体前部2段圧縮型であり,マッハ7の流れが燃焼室でマッハ2まで減速されるように設計した。予備実験の結果,燃焼器内部ではマッハ2.1まで減速されており,ほぼ設計どおりの流れ場が得られた。水素燃料(気体)は機体前部下面(燃焼器の前方)から噴射される。燃焼器前方より噴射された燃料はマッハ3程度の流れの中で混合拡散し,予混合気を形成する。その予混合気は機体前部の圧縮を受けた後,燃焼器に流入する。機体前部下面から燃料を噴射した場合,圧縮過程の流れ場に与える影響は少なく,流れ場は,燃料噴射がない場合とほぼ同じであった。なお,圧力の測定は,本研究費で購入したロガーステーションを用いて行った。燃焼現象の測定,観測は高速度ビデオを用いて行った。その結果,水素燃料を噴射した場合,燃焼器ないで0.04MPaの圧力上昇と自発光を観測できた。特に,自発光領域は,機体前部圧縮部の2段圧縮部から発生する衝撃波後方で生じ,衝撃波誘起燃焼を確認した。燃焼領域(自発光領域)は衝撃波後方と燃焼器内であることが確認できた。このように発光領域が広範囲にわたっているので,デトネーションとはなっていないと考えている。一方,燃料の混合促進をめざして,超音速流と噴流との干渉現象の解明も並行して,勢力的に行った。その結果,噴流と主流との干渉現象を定量的に整理する方法を見出した。これを応用して,スクラムジェットエンジンにより適当な燃料噴射機構を提案する目処が立った。来年度は,今年度の成果を踏まえて,より効率的な燃料噴射機構の開発を行い,衝撃波誘起燃焼の実現とその保炎機構の解明を行う予定である。今年度は、昨年度に引き続き高エンタルピー衝撃風洞を用いて実験を行った。

昨年度のスクラムジェットエンジンモデルでは、2段ランプの1段目の圧縮部から燃料(ガス水素)を噴出したため、2段目のランプから発生する衝撃波のより着火した。そこで、今年度は、2段目のランプから燃料を噴射するように、新たにモデルを製作した。また、当量比を大きくするために、燃料噴射孔を3つにした。実験条件は、昨年度とほぼ同じであり、高度35km、マッハ7の飛行条件で試験を行った。上記のモデルでは、マッハ7の流れが燃焼器内部ではマッハ数約1.7まで減速された。燃焼器内の流れの静温は約1600K、静圧は約30k Paであった。実験では、流れの可視化と圧力測定を行った。今年度購入した圧力計とアンプは昨年度購入したロガーステーションと組み合わせて使用された。実験結果は、2段目のランプ壁から燃料を噴射したため、着火は燃焼器入り口で生じた。これは、当初の予定通りであった。特に、燃焼器入り口のカウルからの反射衝撃波後方で強い発光が認められた。このことから、流れの圧縮を受け持つインテーク部からの燃料噴射を行い、かつ、インテークから燃焼器にいたる衝撃波システムで着火を行う機構が実現できることをしめした。保炎に対しては、試験時間が短いことから、さらに詳しい実験が必要と考えられる。モデルが小さいことから、燃焼器内部での圧力上昇は観察されなかった。今後、大スケールの実験が必要である。燃料の混合促進と混合評価の観点からも研究を進め、燃料噴流と超音速流との干渉現象、境界層と超音速流の干渉現象、触媒反応を利用した混合評価方法の開発、等の研究を精力的に進めた。
プロバイオティックスを用いる乳酸菌セラピーの基礎研究

本研究はプロバイオティックスとしての乳酸菌の機能をより一層高めるために宿主腸管との高い接着能や有用物質の分泌能を乳酸菌に賦与させようと言う企てで行ったものである。目的の乳酸菌を得ることができれば、腸管に接着する病原性細菌の排除などが可能であり、乳酸菌によるセラピーを具現化することが可能になる。本年度は異種タンパク質を乳酸菌で発現させるための異種タンパク質発現系の構築を試みた。先ず、T7RNAポリメラーゼ遺伝子をラクトースプロモーターの制御下に置いたプラスミド(pKM143)を構築するとともに、レポーター遺伝子として大腸菌β-グルクロニダーゼ遺伝子をT7プロモーターの制御下においたプラスミド(pKM143)を構築し、両プラスミドをLactobacillus casei102Sにエレクトロポレーション法にて導入した。この組換え菌をラクトースを添加した培地で培養するとβ-グルクロニダーゼ活性が誘導され、異種タンパク質を誘導発現する系が構築できた。しかし、この系においてはグルコース培養時(非誘導条件下)において発現の抑制が見られた。これはβ-グルクロニダーゼ遺伝子を挿入したプラスミド上のCm^Rの転写が完全には終結せずに、300塩基下流から始まるβ-グルクロニダーゼ遺伝子の転写も続いて進行するために活性が高くなると考えた。そこで、Cm^Rとoriをお互いに逆の位置に挿入したところ、非誘導条件下における活性が抑制された。この系を用いることによってラクトース誘導下でβ-グルクロニダーゼ活性が30倍以上高発現され、異種タンパク質の発現誘導を行なう系として有効であることが明らかになった。本研究はプロバイオティックスとしての乳酸菌の機能をより一層高めるために宿主腸管との高い接着能や有用物質の分泌能を乳酸菌に賦与させようと言う企てで行う。目的の乳酸菌を得ることができれば、腸管に接着する病原性細菌を排除することが可能であり、乳酸菌によるセラピーを具現化することが可能になる。本年はラクトバチルス属乳酸菌にヒト乳汁中の鉄結合性タンパク質ラクトフェリンを分泌させることを試みた。ラクトフェリンは抗菌性や免疫応答修飾活性など多彩な生理機能を有している。先ず、市販のヒト乳腺cDNAライブラリーからさまざまなcDNAを含むプラスミドを抽出し、これをテンプレートとして、既に報告されているラクトフェリンcDNAの塩基配列情報を基に作成したプライマーを用いてPCRを行った。得られたDNA断片をプローブとして、ライブラリーからコロニーハイブリダイゼーションによってラクトフェリンcDNAを保持する陽性クローンを選択し、プラスミドをシークエンスした。次に、得られた遺伝子を大腸菌BL21株に組み込み、ラクトフェリンの発現を調べた。即ち、pETシステムを用いてラクトフェリンを大腸菌に誘導発現させ、ウエスタンブロッティングによってラクトフェリンの発現を調べたところ、本タンパク質は可溶性部分に存在し、菌体内において強い分解を受けることが明らかになった。次に、乳酸菌におけるタンパク質発現ベクターの構築を試みた。Lactobacillus caseiの乳酸脱水素酵素の塩基配列情報をもとにPCRによって本遺伝子をクローニングし、本遺伝子のプロモーターとターミネーターを挟んで異種遺伝子の発現カセットを導入した大腸菌・乳酸菌のシャトルベクターを構築している。
高次脳機能障害者における談話障害の評価

交通事故等による外傷性脳損傷者(TBI)群27名(平均年齢38歳)に対し、自発談話の評価を行った。自発談話は、独自に作成した生活史に関する半構造化面接法(約10分20分)により得た。同意を得た上ですべて録音して転記を行い、音声と転記の双方を用いて面接時の談話を評定した。評定基準は、Thought, Language, Communication尺度など既存の尺度から、TBI群で問題になると思われる22項目(例えば、「談話量の貧困」「談話内容の貧困」「脱線」「迂遠」「意味性錯語」など)を選択し、それぞれの項目について「なし=0」から「重度=3」の4段階で採点を行う方式とした。談話のほかに、既存の談話尺度としてWAB失語症検査の「自発話」およびSLTA補助検査の「まんがの説明」、記憶評価としてWMS-RのLogical Memory(直後・遅延)および数唱(順・逆)、遂行機能評価として、BADSの「規則変換カード課題」「鍵探し」「時間判断課題」を行った。また、年齢でマッチさせた健常者(NC)群19名にも同様のバッテリーを行った。その結果は以下のとおりである。(1)TBI群では「内容の貧困」「脱線」「非論理性」の平均点がNC群と比較して有意に高く、これらの項目についての障害が顕著であった、(2)自発談話22項目の合計点はSLTA補助検査の「まんがの説明」段階別合計点と有意な逆相関がみられ、本研究の自発談話項目の妥当性が示唆された、(3)TBI群において低かった「内容の貧困」「脱線」「非論理性」の得点と、記憶・遂行機能尺度の得点とは、有意な相関がみられなかった。
エイズ制御のための基礎研究 柱2.HIV感染症の病態と免疫

HIV-1感染とケモカイン/ケモカイン受容体、HIV特異的CTLの課題を中心に研究を進め、以下の成果を得た。内山は、innate immunityにおいて重要な役割を果たしている末梢血中に存在する特異な樹状細胞サブセットであるpreDC2に対して、HIV-1感染が成立し、さらにHIV-1に対する反応としてI型インターフェロンを大量に分泌することを示し、本細胞のHIV-1感染における役割を明らかにした。長澤は、胎児肝の系列分化直後の最も初期のB前駆細胞を同定し、各種の欠損マウスを用いた実験から、この細胞の発生にSDF-1が必須であることを明らかにした。義江は、おもにリンパ系組織で構成的に発現する「免疫系ケモカイン」のHIV-1持続感染における役割を多角的に検討するとともに、さらに、P2G-SDF-1-FcキメラのHIV-1感染に及ぼす影響を検討した。本キメラ分子は、in vitroにおいてはHIV-1の感染抑制を示し、in vivoにおいても骨髄でのPre-B細胞と未熟B細胞の減少および骨髄系細胞の減少傾向を認めたが、SCID-huを用いた感染実験では、逆にX4ウイルスの増殖を促進するという結果を得た。清野は、gp160-fusogenic liposomeを経鼻免疫した結果、HIV-1に対する中和能を持つ抗体の誘導が野生型マウスのみならず、IFN-γ欠損マウスやIL-4欠損マウスでも認められたことより、治療ワクチンの可能性を示唆した。高橋は、ウイルスエピトープペプチドによりCTL活性が抑制される直前に大量のIFN-γや様々な細胞障害性因子を放出するとともに、自身の再活性化に向けた因子を産生することを示した。滝口は、HIV-1特異的CD8T細胞上にCCR5が発現しており、そのリガンドにより遊走することを示し、これらケモカインがTh1の免疫反応に関与することを示した。内山は、T-tropic HIV-1のgpl20のV3ループ領域に対応したV3ペプチドが直接CXCR4に結合しうることを示し、gp120のV3ループ領域と対応するケモカイン受容体との結合性によってコレセプターが選択され、cell tropismが決定されるというモデルを提示した。長澤は、CXCR4欠損マウスを作製し、SDF-1/PBSF欠損マウスで見出されたのと同様の表現型が認められることを明らかにし、CXCR4を標的とする治療法を開発する上で考慮すべき問題点を指摘した。滝口はHLA-B51およびHLA-A11が提示するHIV-1 CTLエピトープをリバース・イムノジェネテイクス法を用いて同定し、HIV-1 CTLエピトープを新たに11種類明らかにした。清野は、粘膜付着性高分子の含有量が異なるOVA含有AdMMSを作製し、in vitroにおける溶出性およびマウスの小腸へ開腹投与による免疫誘導能を比較し、粒子からの抗原の溶出性や滞留時間といったワクチンキャリアーの特性がその後の免疫応答誘導に影響を与える重要な因子であることを示した。小柳は、ヒト末梢血由来のIL-12またはIL-4添加OKT3刺激CD4+T細胞への感染系を用いて、M-tropic株とT-tropic株がそれぞれThl優位およびTh2優位の培養環境を好むこと、さらにこのウイルスの指向性はエンベロープのV3loop領域が決定していることを明らかにした。高橋は、インフルエンザ臥遺伝子内にV3遺伝子を組み替えたワクチニアウイルスを作成し、移入したV3蛋白および臥蛋白に対する免疫応答を追跡し、こうしたワクチニアではV3特異的なC比が抗体産生に比し優位に誘発できることを見いだした。

内山は、NL4-3 gp120のV3領域をSDF-1、endothelin、またはANPで置換したキメラenvをもったpseudotyped virusを調製して、これらのウイルスがそれぞれ上記リガンドに対応する受容体を発現した細胞に感染しうることを示し、ウイルス侵入におけるV3領域と細胞膜分子の結合の意義を明確にした。長沢は、CXCR4欠損マウスの胎児肝造血細胞を致死量放射線を照射したLy5.1アロタイプの成体マウスに移植する実験を行い、SDF-1/CXCR4の作用が成体個体の骨髄初期分化に特異的かつ必須であることを明らかにした。清野は、Fusogenic liposomeをキャリアーに用いてHIV gp160でC57BL/6マウスを経鼻免疫すると、p160単独で免疫した場合に比べて高い抗原特異的抗体産生が誘導され、脾臓、鼻腔粘膜固有層、小腸粘膜固有層、膣においてgp160特異的抗体産生細胞の強い誘導が認められることを示した。高橋は長期未発症の発症遅延に関わる感染制御因子を追跡し、クラスIMHC拘束性CD8^+CTLと非拘束性NK細胞の双方が関与すること、また、こうした細胞性免疫や特異抗体産生を制御するヘルパーT細胞の認識エピトープがHIVのV3領域などの高頻度可変部領域であることを確認した。滝口は6種類のCTLエピトープペプチドを用いてHLA-B^*3501テトラマーを作製してHLA-B35をもったHIV-1感染者末梢血単核球のHIV-1特異的CD8^+T細胞を検出する手技を確立し、HAART治療前後での比較検討の結果、ウイルスRNAの低下とともにテトラマー結合CD8^+T細胞の数が減少することを観察した。小柳はHIV感染急性期患者検体から限界希釈法にて得た分離株の解析を通じて、ウイルスが初感染時においても比較的に多様性に富んでいることとX4ウイルスの出現に一致して急速な病状進行がみられることを明らかにした。HIV感染とケモカイン/ケモカインレセプター、HIV特異的CTLの課題を中心に研究を進め、以下の成果を得た。内山は、NL4-3gp120のV3領域をSDF-1、MIP-1に置換したpseudovirusを用いた感染実験の結果から、V3領域とコレセプターとの物理的結合がその後の膜融合の開始に重要であり、V3領域のウイルス固有アミノ酸配列そのものが必須ではないことを明らかにした。長澤は、欠損マウスを用いた実験から、B細胞は分化段階の非常に早期にCXCR4依存性となることを明らかにした。義江は、RANTES、SDF-1のアンタゴニストMet-RANTES-Fc、P2G-SDF-1-Fcを作製して、その阻害作用を検討した。その結果、後者に強い阻害活性を認め、HIV-1の感染も強く抑制した。in vivoでの活性を検討している。清野は、HIVgp160を封入したfusogenic liposomeをサルに経鼻免疫することにより、粘膜面に抗原特異的抗体産生とgp160特異的CTL活性を認め、経鼻ワクチン開発につながる結果を得た。高橋は、強毒株SHIV-89.6Pに対する感染抵抗性アカゲザルを用いて、感染T細胞をCTLの標的細胞にした方法で解析し、その体内に存在するCTLの認識抗原はgag-pol領域であることを明らかにした。
プロテオミクスを利用した脳特異的アロマターゼ遺伝子発現を制御するタンパク質の解析

脳の性分化に関与するアロマターゼの時期および領域特異的発現機構を明らかにするため、脳内アロマターゼの発現制御を担う転写因子、Deaf1の機能解析を行った。マウス胎仔より間脳部を摘出し、核抽出液を調製した。内因性Deaf1タンパク質を認識する抗体を用いて免疫沈降反応を行い、Deaf1と相互作用するタンパク質を含む試料を得た。得られた試料をSDS-PAGEに付し、タンパク質バンドを切り出して、LC-MS/MS解析を行った結果、Deaf1タンパク質と相互作用する分子としてTranscriptional intermediary factor-1β(TIF-1β)が同定された。平成26年度は、すでに単離された転写調節因子による転写制御の解析、およびsiRNAによるタンパク質発現抑制の実験を主に実施した。アロマターゼ脳特異的プロモーター活性は、アセチル化酵素阻害剤であるTSAの添加により、Deaf1非存在下でも高い活性を示すことから、Deaf1による転写活性化にはアセチル化酵素が関係している可能性が考えられた。そこでDeaf1による転写制御機構とアセチル化との関連性の解明を目的として、代表的なヒストンアセチル化酵素(HAT)であるp300やPCAFがアロマターゼの脳特異的プロモーター活性に及す影響について検討した。Lhx2存在下でp300やPCAFを共発現したところ、アロマターゼ脳特異的プロモーター活性は、Lhx2のみを発現させた場合と比べて、ほとんど変化が認められなかった。さらにLhx2とDeaf1の共存下で、p300やPCAFを共発現した場合も、プロモーター活性にほとんど変化を示さなかった。このように、p300やPCAFはLhx2やDeaf1による転写能に影響を及ぼさなかった。アロマターゼ遺伝子のプロモーターに及すTSAの効果は、二次的な作用であるかもしれない。また、今回用いたp300やPCAF以外にもGCN5やSRC-1といった様々なHATが存在しているので、Deaf1による転写制御には、p300やPCAFとは異なる種類のHATが関与する可能性も考えられた。一方、siRNAを用いた遺伝子発現の抑制に関する実験では、Deaf1あるいはARP1の発現抑制に有効な塩基配列の探索を行い、これらの転写因子の発現を効率よく抑制する塩基配列を決定することができた。当該年度の目的の一つは、脳で発現してアロマターゼの脳特異的プロモーターに作用する転写因子のうち、Deaf1やARP1と相互作用する因子を同定することであった。このような因子を免疫沈降法により効率的に共沈殿させ、単離・同定するためには、Deaf1やARP1を目的の細胞に高濃度に発現させる必要がある。アロマターゼを発現する初代培養神経細胞に様々な方法を利用して遺伝子導入を試み、最も発現の高い方法を確定した。また、今年度は単離した転写因子の翻訳後修飾、特にリン酸化による機能制御の可能性についても検討した。脳におけるアロマターゼ遺伝子の発現は、α1アドレナリン受容体アゴニストによって増加する。この受容体の細胞内情報伝達には、種々のタンパク質リン酸化が関与している。一方、申請者はDeaf1などが細胞内でリン酸化されることを確認しており、これらの転写因子のリン酸化とアロマターゼ遺伝子発現の関連が推測された。そこで、キナーゼ阻害剤が脳内アロマターゼの発現にどのような影響を及ぼすか、マウス胎仔間脳部の初代培養神経細胞系を利用して調べた。その結果、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼを主として多くのキナーゼを阻害するK252aは、培養開始3日目までに認められるアロマターゼmRNAの増加をほぼ完全に阻害した。また、プロテインキナーゼC(PKC)の阻害剤であるBisindolylmaleimide Iも、アロマターゼmRNAの増加を大きく阻害したが、PKCのアイソフォームのうち、主にPKCα、β、およびγを特異的に阻害するGo6976やGo6983では、ほとんど阻害が認められなかった。これらの結果は、周生期の脳におけるアロマターゼの発現増加にPKCの特定のアイソフォームを含む複数のキナーゼが関与することを示唆する。アロマターゼの脳特異プロモーターに形成されるDeaf1あるいはARP1を含む転写制御因子複合体を免疫沈降により単離するため、マウス間脳部の初代培養神経細胞にそれらのタンパク質を効率良く強制発現させる方法を検討した。本研究に使用する間脳部の神経細胞は、トランスフェクション操作においてダメージを受けやすく、導入効率も悪い。そのため、簡便なリポソーム法では免疫沈降に十分なタンパク質の発現が得られず、遺伝子導入の条件設定には予定以上の時間を要した。効率の良い遺伝子導入にはウイルスベクターを利用した方法などを使用することが必要となり、発現タンパク質のデザインおよびベクター構築に時間を要し、年度内に予定していた実験を行うことができなかった。もう一つの方法として、内因性に発現しているタンパク質で免疫沈降させるために、Deaf1やARP1を強く認識する抗体を作製し、外部から遺伝子を導入することなく免疫沈降を行うという可能性も検討している。一方、転写因子の翻訳後修飾による転写機能制御の検討については、SUMO化およびリン酸化について解析を行っているので、次年度(28年度)も申請書に準じて実験を進める。免疫沈降反応により、マウス胎仔間脳部の細胞の抽出液からDeaf1タンパク質と相互作用する因子を単離し、LC-MS/MS解析を利用してタンパク質の同定を行うための準備実験を行った。

Deaf1結合タンパク質が、免疫沈降反応において効率よく共沈殿する反応条件の検討を詳細に行い、以後の解析の使用に足る量の目的タンパク質が採取できるような条件を確立した。また、N40株化細胞を用いて、ARP1、Lhx2、およびDeaf1のアロマターゼ脳特異的プロモーター活性への影響を検討した。N40はマウスの視床下部由来の細胞であり、アロマターゼを発現しているという点から、実験系として生理的条件に近いと考えられる。この結果を、以前から実験に用いていたCos7細胞でのそれと比較したところ、ほぼ同様の結果が得られ、細胞種の違いによるARP1、Lhx2、およびDeaf1のプロモーター活性への影響には、大きな差異は無いことがわかった。一方、N40細胞では、継代を繰り返すにつれて、アロマターゼmRNAの量が低下し、アロマターゼ遺伝子の発現量が低くなることがわかった。遺伝子の発現の低下には様々な原因が考えられるが、今回はDNAのメチル化による遺伝発現抑制の可能性について検討した。アロマターゼ発現量の低下したN40細胞をメチル化阻害剤存在下にて培養し、72時間後にアロマターゼmRNAの量を測定したところ、発現量の増加が認められた。しかしながら、その増加はわずかであり、胎仔脳において発現しているアロマターゼmRNAの量に比べ著しく低いままであった。このことより、N40細胞の長期培養によるアロマターゼmRNA遺伝子発現低下の原因は、DNAのメチル化だけではないことが明らかとなった。平成28年度の下半期に、deaf1タンパク質と相互作用する因子として単離したタンパク質のLC-MS/MSによる解析作業を完了する予定であったが、免疫沈降実験の条件設定のために、予想以上の時間を要した。そのため、タンパク質同定のために行う解析の完了が次年度にずれ込むことになった。今年度中に研究課題を完了することができなかったため、「遅れている」と判断した。マウス胎仔より間脳部を摘出し、核抽出液を調製した。前年度に行った反応条件の下で、内因性Deaf1タンパク質を認識する抗体を用いて免疫沈降反応を行い、Deaf1と相互作用するタンパク質を含む試料を得た。得られた試料をSDS-PAGEに付し、4つの異なるタンパク質バンドを切り出して、LC-MS/MS解析を行った。解析の結果、4つのバンドの複数にTranscriptional intermediary factor-1β(TIF-1β)のペプチド断片が認められた。TIF-1βは、分子内にRINGフィンガーやブロモドメインなどを有するアミノ酸834個からなる転写因子で、クロマチンリモデリングやヒストン修飾に影響を及ぼすことで染色体機能の調節に関わっていると報告されている。今回のLC-MS/MS解析では、試料の調製過程でタンパク質の部分水解が生じ、SDS-PAGE上で異なる分子量のバンドとして解析したペプチドが、いずれもTIF-1βであったものと考えられる。TIF-1βを用いた免疫沈降反応でもDeaf1タンパク質との共沈殿が認められ、Deaf1とTIF-1βとの相互作用がin vitroでも確認された。このようにDeaf1のアロマターゼ遺伝子を含む様々な遺伝子の転写制御機能にはTIF-1βが関与していると考えられる。