hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
合成撮像による病理組織標本画像解析

光学顕微鏡の3種類の撮像法(明視野,暗視野,位相差)の合成画像を一度に撮影する手法を実現した.異なる撮像法の異なるチャンネルの画像や照明方向が異なる暗視野画像を一度の撮影で得る手法も実現した.また,複数の撮像法による画像や合成撮影画像が,胃のHE染色標本中のピロリ菌の視認性と抽出精度の改善や,肝臓のHE染色標本や無染色標本の視認性と画像解析精度の改善に有用であることを明らかにした.また,明視野画像のみを用いた場合についても肝臓の標本中の特徴量分布を可視化する手法を実現した.実現した機能の一部を診断支援システムに組み込み,診断に有用な特徴量を抽出できる機能を実現した.【目的】病理組織の画像解析において,通常の明視野を含む複数の撮像法を活用した画像解析手法を実現するとともに,撮像法を変えて複数回撮影する代わりに,それらの合成画像を一度に撮影できる新しい撮像法(合成撮像法)を実現する.そして,それら実現した機能を利用し,診断支援機能を実現する.さらに,病理診断時の観察法としての合成撮像法の有用性も評価する.【研究成果】平成25年度は、色フィルタを利用した合成撮像法について検討した結果,明視野,暗視野,位相差の3種類の撮像法に対応する光の透過部分に色フィルタを用いることにより,ある撮像法のRチャンネルの画像と,別の撮像法のBチャンネルの画像を一度の撮影で得られることがわかった.これにより,1チャンネルずつであるが,撮像法の異なる2枚の画像を一度の撮影で得ることが可能となり,従来の重み付き加算だけでなく,減算や分離したままの画像の利用が可能となった.また,合成撮像法で利用する3種類の撮像法を組み合わせた画像解析の応用として,無染色標本の画像解析にも取組んだ.その結果,撮像法を組み合わせることで,肝臓の無染色標本から細胞膜を抽出する精度を改善できることを明らかにした.さらに,胃のHE染色標本から画像処理によりピロリ菌を検出する手法についても検討した結果,明視野画像のみを用いる場合よりも,位相差と暗視野画像の合成画像を用いる方が良好な結果が得られることを明らかにした.合成撮像法を用いた病理組織標本の観察法としては,通常の明視野では観察しづらい無染色標本を対象とした場合に,その視認性を向上できる可能性があることを明らかにした.また,診断に有用な可能性のある特徴量として,明視野画像を用いてHE染色標本中の肝細胞の核の密度と形状特徴(円形度)を自動的に算出する機能を実現した.光学顕微鏡の3種類の撮像法(明視野,暗視野,位相差)の合成画像を一度に撮影する手法を実現した.異なる撮像法の異なるチャンネルの画像や照明方向が異なる暗視野画像を一度の撮影で得る手法も実現した.また,複数の撮像法による画像や合成撮影画像が,胃のHE染色標本中のピロリ菌の視認性と抽出精度の改善や,肝臓のHE染色標本や無染色標本の視認性と画像解析精度の改善に有用であることを明らかにした.また,明視野画像のみを用いた場合についても肝臓の標本中の特徴量分布を可視化する手法を実現した.実現した機能の一部を診断支援システムに組み込み,診断に有用な特徴量を抽出できる機能を実現した.【目的】病理組織の画像解析において,通常の明視野を含む複数の撮像法を活用した画像解析手法を実現するとともに,撮像法を変えて複数回撮影する代わりに,それらの合成画像を一度に撮影できる新しい撮像法(合成撮像法)を実現する.そして,それら実現した機能を利用し,診断支援機能を実現する.さらに,病理診断時の観察法としての合成撮像法の有用性も評価する.【研究成果】H24年度は,合成撮像法について検討し,顕微鏡の3種類の撮像法(明視野,暗視野,位相差)について,遮蔽板を利用することで,それらとほぼ同等な撮像ができる撮像法(擬似明視野,擬似暗視野,擬似位相差)を実現した.HE染色標本の同じ領域について撮像し,画素値の誤差を評価する実験を実施し,従来の撮像法とほぼ同等な画像を撮影できることを確認した.また,遮蔽板の一部にNDフィルタを用いることで,3種類の撮像法の合成画像を一度に撮影する撮像法を実現した.そして,別々に撮影した画像を計算機により合成した画像と合成撮像法により一度に撮影した画像の画素値の誤差を評価する実験を実施した.その結果,3種類の撮像法を全て組み合わせる場合を含め,任意の組合せについて画素値の平均誤差を10程度以内で合成撮影できることを明らかにした.病理組織標本の構成要素の特性測定については,肝臓と胃の病理組織標本の構成要素について,主に画素値の分布を測定し,明視野では差が小さい場合でもあっても,暗視野や位相差などの他の撮像法では差が大きい場合があることを確認した.画像解析に関しては,肝病理組織標本画像中の核位置を自動選別し,核密度を平均誤差15%程度で自動的に算出する機能を実現した.また,明視野と暗視野を合成することで核位置と核の輪郭抽出精度を改善できることを明らかにした.顕微鏡の3種類の撮像法(明視野,暗視野,位相差)について,NDフィルタを利用することで,本研究の最大の目的である合成撮像法を実現した.具体的には,3種類の撮像法の任意の比率での合成画像を一度に撮影する手法を実現した.H26年度は撮像法の改善を進め,視野全体での画素値の平均誤差を2.7%程度以下に低減した.色フィルタの利用についても検討し,異なる撮像法の異なるチャンネルの合成画像を一度の撮影で得る手法を実現した.H26年度は,さらに照明方向が異なる2種類の暗視野画像を一度に撮影する手法も実現した.病理組織

標本の構成要素の特性測定については,肝臓と胃の構成要素について撮像法により大きな差があることを確認した.胃のHE染色標本からピロリ菌を検出する手法について検討し,位相差と暗視野の合成画像により精度を向上できる可能性があることを明らかにした.肝臓の画像解析に関しても,明視野と暗視野の合成画像を用いることで核位置と核輪郭の抽出精度を改善できることを明らかにした.また,明視野画像のみを用いた場合についても,特徴量分布を可視化する手法を実現すると共に,H26年度は手法を改善し20枚の肝臓の手術標本を用いた評価実験で特徴量分布を可視化できることを確認した.また,明視野では難しい無染色標本の観察に合成撮像法を利用できる可能性があることを明らかにした.無染色標本画像からの細胞膜抽出に関しては暗視野と位相差も組合わせることで精度を改善できることを明らかにした.H26年度は核位置の抽出にも取り組み,HE染色標本と同様に抽出可能なことを明らかにした.合成撮影画像を利用する場合には,例えば位相差Rと暗視野Bの合成撮影画像により核と細胞膜の抽出を行えることも明らかにした.そして,実現した機能の一部を診断支援システムに組み込み,核密度やN/C比などの診断に有用な特徴量を容易に抽出できるようにした.画像処理,画像計測,画像認識,画像応用システム,医用画像当初の予定どおり,色フィルタを利用して重み付き加算以外の合成画像を撮影する手法を実現できた.また,前年度に実現した核位置の抽出法を改良し,肝細胞の核の密度と形状特徴(円形度)を自動的に算出する機能を実現できた.さらに,胃のHE染色標本から画像処理によりピロリ菌を抽出する場合に,通常の明視野画像より暗視野と位相差の合成画像を用いる方が優れていることを明らかにした.通常の診断には利用されない無染色標本の利用についても新たに検討し,合成撮像法によりその視認性を向上できる可能性があることを明らかにするとともに,HE染色標本と同様に,無染色標本からも細胞膜を抽出できることを明らかにするなど,ほぼ当初の予定どおり順調に進展している.顕微鏡の3種類の撮像法(明視野,暗視野,位相差)の合成画像を一度に撮影できる合成撮像法を実現できた.また,複数回に分けて撮影した画像を計算機で合成した画像との画素値の誤差も小さいことを確認できた.さらに画素値の分布などを測定し,従来の明視野以外の撮像法を利用することで情報量を増やせることを確認した.そして,核位置の自動選別機能を実現するとともに,合成画像により核位置と核輪郭の抽出精度を改善できることを明らかにするなど,当初の予定どおり順調に進展している.平成26年度は,これまでに実現した構成要素の識別法や特徴量の算出法などを改良するとともに,評価を行う.特に,特徴量の有用性については病理医である中野の指導のもとに医学的な有用性について評価する.最終的には,診断支援システムによって特徴量の抽出機能を利用者が容易に利用できるようにする予定である.平成25年度は、色フィルタなどを利用した合成撮像法についても検討し、重み付き加算以外の合成画像の撮像法を実現する。具体的には,負の重みによる合成画像の実現などを検討する予定である.そして、24年度に実現した基本的な解析手法を改善すると共に、診断に有用な特徴量を算出する手法を実現する.対象とする病理組織としては,肝臓以外に胃についても検討する.
談話効果の構成的分析

本研究では、日本語において不変化詞(助詞「は」など)・イントネーション・そして文型(平叙文・疑問文・命令文など)が談話に及ぼす影響について明らかにすることを目的としている。人々はこれらの要素を単独で用いるだけでなく、組合わせて使うことによって複雑な話し手の意図を談話に投影することが可能である。まず日本語という言語でこれらがどう戦略的に使われるのかを明らかにした上で、自然言語に共通して表される文脈情報は何なのか、そしてどういったパラメタが言語間の差異を生じさせるのかを明らかにすることを目指す。
新しい渦位診断による気象力学の深化

前年に引き続き,CMIP5データベース(IPCC第5次評価報告書作成に使われた気候モデルデータベース)に収められた大気海洋結合モデル出力における,亜熱帯・中緯度の上部対流圏から下部成層圏にかけての力学擾乱とそれによる降水への影響,そして両者の将来変化予測に関する研究を行い,論文出版した。この研究によって,渦位力学で説明できる夏季の気象学的関係,すなわち,上層の渦位擾乱によって総観規模の降水帯が形成・移動することが,気候モデル内の降水の気候学的特性,さらに,各モデルにおける将来変化予測にまで影響を与えることが明らかになった。これにより,梅雨降水帯の位置の将来変化予測についてのモデル間のばらつきが説明できることが明らかになり,地球温暖化に伴う地域毎の降水の変化に関する気象力学的な診断の有効性が示された。上記の気候モデル出力の利用に加え,大気大循環モデルDCPAMによって外部条件をコントロールする数値実験を行って,中緯度のジェットの将来変化のメカニズムを探った。極域,中緯度,熱帯の表面温度上昇の効果のうち,後二者の相反する効果によって,(全般的な中緯度循環の極向きにシフトにもかかわらず)ジェットの緯度はあまり変化しないことが示された。以上の研究のほか,平成30年7月豪雨における上層の渦位擾乱の効果に関する診断を実施し報道発表等のための議論を行い,さらに,領域気象モデルによる数値実験を実施した。TMPA 3B42衛星降雨データ,JRA-55客観解析データを用い,アジア・太平洋域の暖候期における対流圏上層の総観規模擾乱による降水の変動を,コンポジット解析を用いて,上層のポテンシャル渦度変動の位相依存性という形で定量的に示した。その結果,従来から知られている上層擾乱との東西の位相関係に加え,位相非依存的に降水が起こりやすいところがあること,それは自身による先行研究(Horinouchi 2014)で示唆されたように,350 K等温位面上の2 PVU程度の等渦位線に沿うことが明らかになった。そのメカニズムを,理想化した設定で,潜熱の効果を取り入れた準地衡解析を行って,明らかにした(そのためのモデル開発も行った)。その中で,下層ジェットの重要性と具体的なメカニズムが示された(Horinouchi and Hayashi, 2017)。上層の総観規模擾乱と降水帯の関係を,暖候期に加え寒候期も,そして対象領域も全球に広げて,統計解析を行った。その結果,アジア・太平洋域の暖候期における関係性が,寒候期においても,そして他の亜熱帯降水帯でも成り立つことが示された。この研究では,降水と等温位等渦位線の関係性の季節・地域依存性もある程度明らかになった。(研究協力者である大学院生の修士論文。今後さらに研究を進めて学術雑誌に投稿の予定。)28年度の計画でできてないこともあるが,計画以上の進展もあるので。気候モデルにおける亜熱帯・中緯度の上部対流圏から下部成層圏にかけての力学擾乱と,それによる降水への影響を調べた。多数の大気海洋結合モデルの出力のデータを集めたCMIP5データベースに収められた,日平均および月平均のデータを用いて,様々な診断計算を実施した。これまで,上部対流圏から下部成層圏にかけての力学擾乱の指標として,等温位面上の渦位に着目してきたが,よりシンプルで,鉛直分解能の低いデータでも安定的に利用可能な,東西風のピーク(ジェット軸)に着目し,ジェット軸ベースのコンポジットと,等温位等渦位線ベースのコンポジットが統計的には同様な結果をもたらすことを示した。多数のモデル出力より,これまで客観解析データと衛星降水データから得られた夏季の気象学的な(総観的時間空間スケールでの)関係性が基本的に再現されること,ただし,定量的にはモデル毎に大きな差異があること,そして,その差異の特徴は,各モデルの夏季降水の平均的な際の特徴(つまりモデル毎の気候学的な東アジアモンスーンの降水の特徴)に類似することが示された。前年までに行った研究では,直接には気象学的な関係に着目してきたが,例えばHorinouchi and Hayashi (2017)で提示した上・下層のジェットの向きの関係による二次循環誘起と降水帯形成は,より長い時間スケールにも当てはまると考えられる。今回,特性の異なる多数のモデルを解析することで,それが裏付けられたといえる。以上のようなモデルを用いた研究のほかに,台風に関する特異性が大きかった2016年夏季の循環の研究なども実施した。29年度の計画でできてないこともあるが,計画以上の進展もあるので。

上記の気候モデル出力の利用に加え,大気大循環モデルDCPAMによって外部条件をコントロールする数値実験を行って,中緯度のジェットの将来変化のメカニズムを探った。極域,中緯度,熱帯の表面温度上昇の効果のうち,後二者の相反する効果によって,(全般的な中緯度循環の極向きにシフトにもかかわらず)ジェットの緯度はあまり変化しないことが示された。以上の研究のほか,平成30年7月豪雨における上層の渦位擾乱の効果に関する診断を実施し報道発表等のための議論を行い,さらに,領域気象モデルによる数値実験を実施した。今後も引き続き観測・モデリング・理論すべてにわたって研究を遂行し,成果をあげていく。今後も引き続き観測データ解析,モデリング・理論すべてにわたって研究を遂行し,成果をあげていく。論文未投稿の研究の論文を作成し,投稿する。今回,次年度使用額が生じたが,26千円と少額である。これはほぼ使い切りつつも無理にゼロにしなかったということである。
国民の安全・健康を保障する社会的規制の必要性と当該規制が規制緩和に及ぼす影響

本申請に基づく研究は、社会的規制の緩和が遅々として進まない原因を探ること、国民生活上必要のない規制を撤廃して、競争原理のスムースな導入を図る方策を見いだすことを主眼とした。そこで、社会的規制の中で文化の普及という理由から、書籍の再販が独禁法の適用除外になっている問題を取り上げた。その視点は、1.文化を普及するために書籍の再販を存続すべしとする要求が、政・官・業に規制強化の口実を与えていないか、2.社会的規制を緩和する際に、規制緩和が諸団体間の利益調整によって歪められていないか、というところにおいて研究を進めた。まず、社会的規制に関する事実認識を行うために、1.各種統計資料を使って、書籍業界の実態(流通実態)調査、2.消費者団体・国の機関(公取委、通産省、総務庁、文化庁)からの聞き取り調査及び資料収集、を行った。これらの資料を精査した結果、独禁法上の書籍の再販適用除外は、小売業者の保護を図ることを目的としたもので、書籍の価格を全国一律にして文化の普及を図るという理由は、後からつけた口実にすぎないことが知見できた。規制緩和が進む中で、独禁法の適用除外制度の縮小・廃止問題で、必ず出てくるのが政・官・業が一体となってこれを阻止しようとする動きである。今回の書籍の再販制度の撤廃問題についても、この三者が文化の普及という理由をつけて現在の制度を維持しようとする姿勢が明確になった。したがって、書籍の再販制度は、独禁法秩序にそぐわない制度であること、書籍業界は、寡占市場構造下におかれた取次業主導の運営が行われていること、から同制度を早急に撤廃すべきことを結論づけた。この研究成果は、『競争法と消費者法の基礎理論-独占禁止法・知的財産権法・消費者保護法-』(嵯峨野書院)で、発表することとした。
経時変化した指紋の可視化に関する研究

犯罪現場に残された指紋は捜査の重要な手がかりとなるが、経時変化した指紋は検出が困難になるという問題がある。そこで経時変化した指紋の可視化を目的として研究を行った。様々な条件で指紋を保管し、一定の期間ごとの蛍光スペクトルの変化を観測した。実験には紫外線パルスレーザを用い、時間分解分光法により測定を行った。その結果、暗条件のものは、日照下及び蛍光灯下よりも劣化が少なく、また低湿度に保ったものも比較的劣化が少ない結果となった。またレーザ照射時間と共に大きくなる蛍光ピークを利用して指紋の可視化を試み、はじめは観測されなかった指紋が、時間が経過すると観測できるようになることを示した。犯罪現場には犯人の指紋が残されていることが多く、捜査においては重要な手がかりとなっており、指紋を検出するために、薬品やレーザを使った検出法が開発されている。しかし印象したばかりの指紋は鮮明に検出できるが、経時変化した指紋は太陽光や温度・湿度等のため検出が困難になるという問題がある。そこで本研究では経時変化した指紋の可視化を目的としての研究を行った。まず経時変化した指紋を可視化するために、様々な条件下での指紋の経時変化を調べた。無蛍光ガラス及び白紙上に印象した指紋を、太陽光、蛍光灯、箱の中等の条件を変えて保管し、可視化が可能かについて調べた。現時点までの実験においては、条件によっては時間が経つと、指紋が見えにくくなるものもあったが、再現性を確かめるために、現在も引き続き測定中である。またレーザ光を照射し続けると、発光波長350nmを中心としたピーク以外に、発光波長440nmを中心としたピークが現れ、次第に大きくなっていったが、さらに照射し続けると、440nmのピークが減少し始める場合があることが分かった。一方、これまで光学フィルタ(波長フィルタ)や時間分解分光(時間フィルタ)による指紋蛍光像の可視化を行ってきだが、新たな手法とし位相分解分光を行うために、CWレーザ、ファンクションジェネレータ、EO変調器等を選定し購入した。現在、それらを組み合わせて、位相分解分光システムを構築中である。なお本研究に関連する論文が1件掲載され、学会発表を1件行った。しかし印象されたばかりの指紋は鮮明に検出できるが、経時変化した指紋は太陽光や温度・湿度等のため検出が困難になるという問題がある。そこで本研究では経時変化した指紋の可視化を目的として研究を行った。無蛍光ガラス及び白紙上に印象した指紋を、太陽光、蛍光灯、箱の中、湿度等の条件を変えて保管し、可視化が可能かについて調べた。箱の中のものは、太陽光及び蛍光灯よりも劣化が少なく、また低湿度に保ったものも比較的劣化が少ない結果となった。以前の研究で、レーザ光を照射し続けると、発光波長340nmを中心としたピーク以外に、発光波長440nmを中心としたピークが現れ、次第に大きくなっていくことを示した。これまでは時間分解法と340nmバンドパス光学フィルタを組み合わせることにより行ってきたが、時間が経った指紋は可視化できなかった。そこで時間と共に大きくなる440nmのピークを利用して指紋の可視化を試みた。その結果、はじめは観測されなかった指紋が、時間が経過すると観測できるようになった。この結果は、指紋がつけられてから、どの程度時間が経過したかをわかるための目安一つとなる可能性がある。今回の実験は限られた期間の測定しかできなかったが、さらに時間が経った指紋がどのような変化を示すかを調べるため、今後も引き続き指紋を保管し経年劣化の実験を続けていきたい。
アストロサイトに着目した筋萎縮性側索硬化症の分子病態解明と治療標的の同定

筋萎縮性側索硬化症(ALS)モデルマウス(SOD1マウス)において病原タンパク質である変異SOD1をアストロサイト特異的にノックアウトするとALSの進行が抑制されるが(Yamanaka, 2008)、このマウスの運動神経では変異SOD1の蓄積が抑制されることを見出した。本研究では、アストロサイト由来の細胞外小胞(EV)が病原タンパク質の伝播に寄与するかどうかを検証することを目的とする。前年度は、SOD1-G93Aマウスの脊髄組織の活性化アストロサイトにおいて、エクソソーム関連タンパク質の発現上昇や、p62が陽性となる封入体が認められることを見出した。さらに、オートファジー障害により初代培養アストロサイトにおけるエクソソームの産生が促進され、さらに回収したエクソソームは変異SOD1タンパク質が陽性であったことから、アストロサイトにおけるオートファジー障害とエクソソーム産生亢進およびそれに伴う病原タンパク質の放出が密接に関連することを明らかにした。今年度は、AcGFP融合変異SOD1を発現させたアストロサイト様細胞であるT98G細胞由来のエクソソームを初代培養運動神経へ処理すると一部の神経細胞がAcGFP陽性となり、運動神経様細胞であるNSC-34細胞へ処理するとアポトーシスが誘導されたことから、病原タンパク質を含むアストロサイト由来のエクソソームは運動神経への病原タンパク質の伝播に寄与し、神経傷害性を発揮することを見出した。本研究成果より、アストロサイト由来のエクソソームがALSの進行を抑制する新たな治療標的となる可能性が示唆された。筋萎縮性側索硬化症(ALS)モデルマウス(SOD1マウス)において病原タンパク質である変異SOD1をアストロサイト特異的にノックアウトするとALSの進行が抑制されるが(Yamanaka, 2008)、このマウスでは運動神経の病原タンパク質の蓄積が抑制されることを見出した。本研究ではまず、アストロサイト由来の細胞外小胞(EV)が病原タンパク質の伝播が寄与することを明らかにすることを目指す。今年度は、SOD1-G93Aマウスの脊髄組織の活性化アストロサイトにおいて、EV関連タンパク質の発現上昇や、p62が陽性となる封入体が認められることを見出した。さらに、in vitroの検討では、オートファジー障害によりアストロサイトにおける変異SOD1タンパク質陽性EVの産生が促進され、AcGFP融合変異SOD1を発現させたアストロサイト様細胞由来のエクソソームを運動神経様細胞へ処理すると一部の神経細胞が数時間でAcGFP陽性となることから、変異SOD1タンパク質の伝播が生じると考えられた。次年度以降、SOD1マウスの脊髄組織におけるEVの解析、アストロサイトから運動神経への変異SOD1タンパク質の伝播の解析とその阻害についてのin vivoでの検討を開始する。次に、本研究では、アストロサイトの神経毒性機序の解明進行の早い通常のSOD1マウスとアストロサイト特異的に変異SOD1を除去した進行の緩やかなSOD1マウスの脊髄からアストロサイトを単離し、抽出した遺伝子を用いて網羅的遺伝子解析を行い、ALSの進行に関与するアストロサイト由来因子・分子カスケードを同定することを目指すが、今年度はマウス脊髄組織からアストロサイトを単離するmagnetic sortingの技術を確立した。次年度以降、SOD1マウス脊髄由来のアストロサイトから遺伝子を抽出し、網羅的遺伝子解析を行う予定である。当初の予定では、SOD1マウス組織からのアストロサイトの単離および網羅的遺伝子解析を先行して行う予定であったが、アストロサイト由来変異SOD1の神経細胞への伝播の病態に細胞外小胞が関与することを示唆する有望な結果が得られたため、今年度は前倒しして、こちらの実験課題を優先して行った。SOD1マウス組織からのアストロサイトの単離に関しては、アストロサイト特異的にEGFPを発現するALDH1L1-EGFPマウスとSOD1マウスとの交配によりアストロサイト特異的にEGFPを発現させ、セルソーターを用いてアストロサイトを単離する方法を予定していたが、当研究室で磁気細胞分離法を用いることにより簡便に組織からアストロサイトを単離する方法を確立したことから、次年度はこの方法により実験課題を進めることを予定している。

次年度は、ALSの進行速度の異なるSOD1マウスの脊髄組織からアストロサイトを単離し、遺伝子発現解析を行う予定である。また、アストロサイト由来細胞外小胞の運動神経へのin vitroでの毒性評価、SOD1マウス組織を用いた細胞外小胞の解析等を行う予定である。次年度は、アストロサイト由来因子・分子カスケードを同定するため、マウス組織からアストロサイトを単離する予定であるが、必要な磁気ビーズを含む関連試薬が必要である。また、細胞外小胞を分離するための限外濾過フィルター類、運動神経培養のための細胞培養用培地類、さらに遺伝子発現解析用酵素類、タンパク質発現解析用抗体等、その他各種試薬を購入予定である。また、国内外の学会に参加し、積極的に研究発表したいと考えている。
障害を受けた灌流下培養血管内皮細胞に高血糖、高酸素が及ぼす影響

血管内皮は炎症や虚血再灌流障害の際に臓器と同様に重要な役割を果たし、様々なシグナル伝達を介してメディエータとして働いている。生体内では血管内に血液が流れることによりシェアーストレスがかかり、血管内皮細胞が様々な反応を起こしている。しかし今まで報告されている血管内皮細胞を用いた研究では静止モデルが使われており、実際に灌流したものはほとんどない。我々は実際に培養開始時期から血管内皮細胞に対して灌流を行い、シェアーストレス下に生体内の血管内皮に類似した細胞を作成し、より生理的な条件下で臨床の場でよく見られる虚血再灌流や重症感染にともなう急性の高血糖と高酸素の合併ストレス状態を作成し、その時の内因性活性酸素種の定量や炎症に関連する内皮細胞機能の変化を検討することを目的とする。細胞を灌流下で培養することにより、細胞の形態や機能に違いが起こることが知られている。我々は実際に血管内皮細胞に対して細胞培養開始時期から灌流を行うことで、より生理的条件下で培養細胞を完成させる予定である。これは実際の血管内皮に類似する構造や性質を持つと考えられ、更にこの細胞に灌流下で低酸素再酸素刺激または感染刺激を与えた後に高血糖、高酸素状態で灌流するモデルを作成しその時の内因性活性酸素種の定量、細胞内シグナルおよび細胞機能の変化、細胞障害作用を示すかどうかを検討する。灌流下での血管内皮細胞培養モデルの作成が最初の目的となる。これまでに酸素濃度変更可能な培養庫を準備し、灌流用装置を作成し、最適な流量、培養日数、培養細胞数などを検討中である。また現在までに静置培養した血管内皮に軽度の急性高血糖状態を作成し、正常血糖状態および無糖状態と比較しブラジキニンによるカルシウム応答が変化するか確認中であるが、統計処理可能なn数を得るには時間を要する。灌流培養モデルの作成に時間を要し最適な流量、培養日数、培養細胞数などを検討中である。今年度は灌流培養モデルを完成させ、また同時に静置モデルでも実験を進めていく予定である。1.灌流下培養血管内皮モデルを用い、低酸素再酸素化刺激を受けた血管内皮細胞に1急性高血糖状態2高酸素状態、のいずれか一方、または同時に両方の状態を作り後述の項目を測定し、通常血糖、通常酸素濃度の場合と比較する。2.灌流下培養血管内皮モデルを用い、リポポリサッカライドやインターロイキン、TNF-αなどによる炎症刺激を受けた血管内皮細胞に1急性高血糖状態2高酸素状態のいずれか一方、または同時に両方の状態を作り後述の項目を測定し、通常血糖、通常酸素濃度の場合と比較する。

当初の計画では既存の灌流モデル用を購入予定であったが、より安価で同様な培養環境を実現できる方法を模索しているところであり、実現可能な場合には余剰分は試薬や酸素ガスや窒素ガス、その他消耗品などに振り替えて使用する予定である。
高強度テラヘルツ波を用いた熱の固有状態の波動制御

本研究では,近年分担者らによって開発が進められている高強度テラヘルツ波光源の同調可能範囲(約13 THz)が低温領域でのソフトモードの周波数域をカバーできることに着目し,高強度テラヘルツ波レーザーによって赤外活性なソフトモードを共鳴励起して,その状態密度を人為的に増大させ,熱励起下では実現が困難な熱波動(第二音波)の理想的な存在条件を引き出すことを計画している.平成30年度は前年度に引き続き,立命館大学グループと理研テラヘルツ光源開発グループとの間の研究打合せを進め,量子常誘電体におけるソフトモード誘起型第二音波の物理的機構,および可搬型テラヘルツ光源の性能と開発状況について情報共有を行った.チタン酸ストロンチウムはテラヘルツ波に対して大きな屈折率を示すことから,真空中からのテラヘルツ波入射において大きなフレネル反射率を持つことが大きな問題の一つであった.そこで,シリコンのウェハとチタン酸ストロンチウムを接触させ,反射防止膜の原理により,特定の周波数のテラヘルツ波の反射率を抑制することを計画し,この実験を行った.その結果,設計周波数において反射率をほぼゼロとすることに成功した.この結果は量子常誘電体チタン酸ストロンチウムに対して,反射のロスなくテラヘルツ光を入射できることを示しており,ソフトモードフォノンを従来よりもはるかに効率よく強制振動できることが期待される.このことは,極低温下でソフトモード誘起型第二音波をエンハンスできる可能性を確認できたものと認識している.チタン酸ストロンチウムはテラヘルツ波に対して大きな屈折率を示すことから,真空中からのテラヘルツ波入射において大きなフレネル反射率を持つことが大きな問題の一つであった.そこで,シリコンのウェハとチタン酸ストロンチウムを接触させ,反射防止膜の原理により,特定の周波数のテラヘルツ波の反射率を抑制することを計画し,この実験を行った.その結果,設計周波数において反射率をほぼゼロとすることに成功した.この結果は量子常誘電体チタン酸ストロンチウムに対して,反射のロスなくテラヘルツ光を入射できることを示しており,ソフトモードフォノンを従来よりもはるかに効率よく強制振動できることが期待され,極低温下でソフトモード誘起型第二音波をエンハンスできる可能性を確認できたものと認識している.シリコンのウェハとチタン酸ストロンチウムを接触させ,反射防止膜の原理により,特定の周波数のテラヘルツ波の反射率を抑制することに成功したので,今後は周波数を変化させた場合にも反射防止の効果が得られるように,シリコンウェハの厚さを傾斜させるか,区域ごとに厚さを変えて研磨したものを用意して実験すること,などを計画している.また,テラヘルツ波の入射時にソフトモードが励振されていれば,過渡的に中心対称性が失われているはずであり,このことによって,光第二高調波発生が起こること考えられる.そこで,1064nmの近赤外光を入射し,その第二高調波である532nmの緑色光を検出する実験を計画している.また,ソフトモードの状態密度の上昇をハイパーラマン散乱法を用いて確認することを計画している.本研究では,近年分担者らによって開発が進められている高強度テラヘルツ波光源の同調可能範囲(約13 THz)が低温領域でのソフトモードの周波数域をカバーできることに着目し,高強度テラヘルツ波レーザーによって赤外活性なソフトモードを共鳴励起して,その状態密度を人為的に増大させ,熱励起下では実現が困難な熱波動(第二音波)の理想的な存在条件を引き出すことを計画している.平成29年度は立命館大学グループと理研テラヘルツ光源開発グループとの間の研究打合せを進め,量子常誘電体におけるソフトモード誘起型第二音波の物理的機構,および可搬型テラヘルツ光源の性能と開発状況について情報共有を行った.また,その知見に基づき,予備実験として,薄片化した量子常誘電体チタン酸ストロンチウム試料において,テラヘルツ光透過率の温度依存性を測定した.その結果,量子常誘電体チタン酸ストロンチウムでは,(i)テラヘルツ光源の同調範囲において,テラヘルツ光の反射率が高いこと,(ii)それと同時にソフトモードがテラヘルツ光で強制振動されていること,(iii)温度降下ともにソフトモードの共鳴周波数が低下すること,を実験的に確認できた.この結果は量子常誘電体チタン酸ストロンチウムにおいて,テラヘルツ光の照射によってソフトモードフォノンをほぼエネルギーロスなく強制振動できることを示しており,極低温下でソフトモード誘起型第二音波をエンハンスできる可能性を確認できたものと認識している.量子常誘電体チタン酸ストロンチウムにおいて,(i)テラヘルツ光源の同調範囲において,テラヘルツ光の反射率が高いこと,(ii)それと同時にソフトモードがテラヘルツ光で強制振動されていること,(iii)温度降下ともにソフトモードの共鳴周波数が低下すること,を実験的に確認できた.この結果は量子常誘電体チタン酸ストロンチウムにおいて,テラヘルツ光の照射によってソフトモードフォノンをほぼエネルギーロスなく強制振動できることを示しており,極低温下でソフトモード誘起型第二音波をエンハンスできる可能性を確認できたものと認識している.本研究では,近年分担者らによって開発が進められている高強度テラヘルツ波光源の同調可能範囲(約13 THz)が低温領域でのソフトモードの周波数域をカバーできることに着目し,高強度テラヘルツ波レーザーによって赤外活性なソフトモードを共鳴励起して,その状態密度を人為的に増大させ,熱励起下では実現が困難な熱波動(第二音波)の理想的な存在条件を引き出すことを計画している.

平成30年度は前年度に引き続き,立命館大学グループと理研テラヘルツ光源開発グループとの間の研究打合せを進め,量子常誘電体におけるソフトモード誘起型第二音波の物理的機構,および可搬型テラヘルツ光源の性能と開発状況について情報共有を行った.チタン酸ストロンチウムはテラヘルツ波に対して大きな屈折率を示すことから,真空中からのテラヘルツ波入射において大きなフレネル反射率を持つことが大きな問題の一つであった.そこで,シリコンのウェハとチタン酸ストロンチウムを接触させ,反射防止膜の原理により,特定の周波数のテラヘルツ波の反射率を抑制することを計画し,この実験を行った.その結果,設計周波数において反射率をほぼゼロとすることに成功した.この結果は量子常誘電体チタン酸ストロンチウムに対して,反射のロスなくテラヘルツ光を入射できることを示しており,ソフトモードフォノンを従来よりもはるかに効率よく強制振動できることが期待される.このことは,極低温下でソフトモード誘起型第二音波をエンハンスできる可能性を確認できたものと認識している.チタン酸ストロンチウムはテラヘルツ波に対して大きな屈折率を示すことから,真空中からのテラヘルツ波入射において大きなフレネル反射率を持つことが大きな問題の一つであった.そこで,シリコンのウェハとチタン酸ストロンチウムを接触させ,反射防止膜の原理により,特定の周波数のテラヘルツ波の反射率を抑制することを計画し,この実験を行った.その結果,設計周波数において反射率をほぼゼロとすることに成功した.この結果は量子常誘電体チタン酸ストロンチウムに対して,反射のロスなくテラヘルツ光を入射できることを示しており,ソフトモードフォノンを従来よりもはるかに効率よく強制振動できることが期待され,極低温下でソフトモード誘起型第二音波をエンハンスできる可能性を確認できたものと認識している.ソフトモードの共鳴周波数に同調可能な高強度テラヘルツ波レーザー光源を用いて,ソフトモードを大振幅で強制振動させ,熱抵抗に関与しないΓ点近傍のフォノンの状態密度を極度に増大させながら,誘導ブリルアン散乱過程によってコヒーレントな熱の波動(第二音波)をこれまでより遥かに効率よく発生できることを実験的に示したい.具体的には,ポンプ光を空間光変調器のホログラムに入射し,その共役光を試料内に結像させる.この変調器はパソコンによって瞬時にパターンを描き換えできるので,熱波動の波長(周波数)や位相を効率よく制御でき,また,多彩な二次元の初期温度パターンも試料に描き込める.このような温度パターンはいわば「熱のホログラフィ」であり,これまでの干渉計を用いた単純な一次元熱回折格子よりも熱波動の位相の情報を反映させやすいため,熱の波動性をより顕著に引き出すことが可能であると考えている.さらに,従来の過渡的熱グレーティング法による第二音波励起に加えて,過渡的熱レンズ法による励起も試みる計画である.シリコンのウェハとチタン酸ストロンチウムを接触させ,反射防止膜の原理により,特定の周波数のテラヘルツ波の反射率を抑制することに成功したので,今後は周波数を変化させた場合にも反射防止の効果が得られるように,シリコンウェハの厚さを傾斜させるか,区域ごとに厚さを変えて研磨したものを用意して実験すること,などを計画している.
統合ゲノム解析による大腸癌におけるヒストンメチル基転移酵素の機能解析

我々は、siRNAを用いた遺伝子発現解析により、SMYD3が直接制御する下流遺伝子群の同定を行った。その結果、SMYD3によって発現増加する1543遺伝子を同定し、それらが126個の転写因子で調節されている可能性を示唆していた。更にSMYD3抗体を用いたChIP on chipデータも加えた統合解析により、SMYD3が直接制御する110個の遺伝子を同定した。またインシリコ解析により、SMYD3の発現は細胞周期調節に深く関わっていることが示された。この結果は、SMYD3ががん細胞の増殖に重要な役割を演ずるとともに、その機能抑制が有望ながん治療戦略になることを示唆している。以前の研究において、我々は大腸がんや肝がんで発現亢進しているSET and Mynd domaincontainingprotein(SMYD3)が、がん細胞の増殖に関与していることを明らかにした。しかし、その詳細なメカニズムは不明であった。本研究では、次の3つのアプローチで研究を展開した。1)まずSMYD3の生理的な役割を明らかにするために、,ゼブラフィッシュを用いた解析を行った。2)他の腫瘍の発生における役割を明らかにするため、HTLV-1ウイルス感染からの成人T細胞白血病(ATL)発症過程における役割を解析した。3)大腸がん細胞における役割を解明するために、SMYD3を特異的に抑制するsiRNAを複数合成し,その効果によって発現変動する遺伝子群を同定した。この解析の為に、インシリコ解析によるパスウェイ推定アルゴリズムを用いて検討した。これらの研究の結果、ゼブラフィッシュを用いた解析ではSmyd3はその発生過程で、心臓および骨格筋の形成に関与していることが明らかとなった。すなわちSmyd3をモルフォリーノで抑制すると、心嚢水腫や体幹の屈曲を生じた。この骨格筋の発達異常においては、MyoDの発現異常が認められた。HTLV1感染によるATLの発症では、SMYD3がHTLV-1ウイルスタンパクであるTatと結合し、その細胞内局在とNF-kBシグナルの活性化を増強することが示された。この発見は、SMYD3が大腸がんや肝がんのみならず、ウイルスによる発がんに関与することを示唆している。siRNAを用いた発現解析によって、SMYD3が発現制御する多数の遺伝子群を同定した。これらの情報をもとにパスウェイ推定アルゴリズム解析を行い、SMYD3がEGFR-RasシグナルやNF-kBシグナルなどに関与していることを示した。これらの成果は、今後のSMYD3の機能や発がんメカニズムの解明、新規治療法の開発に役立つものと期待される。我々は以前の研究で、ヒストンメチル基転移酵素であるSMYD3が、ヒトの大腸がんや肝細胞がん、乳がんで高頻度に発現上昇していることを報告した。さらに、SMYD3が特定の配列をもつDNA領域に結合し、転写を調節していることを示した。本研究では、4種類のSMYD3特異的siRNAとcontrol siRNAで処理した大腸がん細胞株を用いた網羅的遺伝子発現解析と、SMYD3特異的抗体を用いたChIP on chip解析を行い、SMYD3が直接制御する下流遺伝子群の同定を試みた。その結果、SMYD3によって有意に発現増加する1543個の遺伝子と、4つのsiRNAのうち3つで共通して発現制御される608個の遺伝子を同定した。これらのデータを用いたgene set enrichment analysisにより、それらの遺伝子を調節する可能性のある126個の転写因子群を見出した。ChIP on chip解析では、SMYD3と結合が示唆される4070か所の候補調節領域を発見し、遺伝子発現解析のデータと合わせた解析により、SMYD3が直接制御する110個の下流候補遺伝子群を同定した。さらにgene ontologyを用いた統合的解析を行い、SMYD3の発現が細胞周期調節に深く関わっていることを見出した。これらの結果は、SMYD3ががん細胞の増殖に重要な役割を演ずることを示すとともに、その機能抑制が有望ながん治療戦略になることを示唆している。以前の研究において、我々は大腸がんや肝がんで発現亢進しているSET and Mynd domain- containing protein (SMYD3)が、がん細胞の増殖に関与していることを明らかにした。平成24年度は、1)まずSMYD3抗体を用いたChIP on chip解析により、SMYD3が対象に比較し2倍以上濃縮したゲノムの4070領域を同定した。さらに2)ChIP on chipのデータと、SMYD3により調節を受けている1543種類の遺伝子群のデータを統合し、SMYD3がゲノムへ結合して調節している110種類の遺伝子群を同定した。

3)これらの遺伝子群について、インシリコによる機能推定を行ったところ、統計学的有意差のある上位10種類のプロセスの中で、8種類は細胞周期または細胞分裂に関係するものであった。KEGG Pathwayを用いた検討においても、細胞周期と有意な相関が認められた(p=0.036)。これらの結果は、SMYD3が細胞周期の重要な制御因子であることを示している。これら110種類の遺伝子群の中で、特に重要と思われる複数の遺伝子について発現変動の確認と、転写調節領域へのSMYD3の結合を検証中である。またMetaGP profilerを用いた制御転写因子予測では、SMYD3の下流遺伝子群を特異的に制御する転写因子が126種類予測された。SMYD3はこれらの転写因子と協調して細胞周期を制御していることが考えられた。今後、SMYD3による細胞周期・細胞分裂制御における主要分子の同定と、その発現調節機構を明らかにする予定である。これらの成果は、今後のSMYD3の機能解明や発がんメカニズムの解明、新規治療法の開発に役立つものと期待される。SMYD3により調節される遺伝子群が明らかとなり、重要と思われるパスウェイの候補も同定できた。さらに他の腫瘍における役割、発生において調節されている候補分子なども見つかっており、今後はそれらの確認を行いながら機能解析が進められる状況に達した。25年度が最終年度であるため、記入しない。SMYD3により発現が調節される遺伝子群と、今回同定されたゲノムへの結合領域の統合解析から、SMYD3が細胞周期・細胞分裂を制御するという新たな機能が示された。このことは、がん細胞においてSMYD3発現が増加していることに合致する。またこの機能に関わる主要分子が同定されれば、SMYD3が関わるがん化のメカニズムが明らかとなるとともに、新たな治療法開発に役立つものと期待される。SMYD3に対するsiRNAを用いた発現解析と、パスウェイ解析により推定されたシグナル伝達経路、およびATLでSMYD3とTatとの結合により増強されたNF-kBシグナルが、大腸がんや肝がんでも同様に制御されているのか、レポーターアッセイ等を用いて検討する。さらに影響を受けるシグナル伝達の中で、細胞の生存、増殖、運動などの機能に着目し、表現型の検討を行う予定である。引き続きSMYD3がゲノムに結合して直接制御する遺伝子群の中から、主要な役割を演ずる分子を同定する。具体的には、SMYD3に対するノックダウンにより発現が発現が変化するかどうか確認するとともに、その発現調節領域にSMYD3が結合するかどうかChIPアッセイにより解析する。さらにその領域のヒストン修飾が変化しているかどうか、ヒストン修飾を特異的に認識する抗体を用いたChIPアッセイで検討する。加えて遺伝子発現を制御する転写因子の同定と、詳細な発現調節メカニズムの解明を試みる。配列から予測される転写因子や、インシリコ解析で予測された転写因子が、その遺伝子発現に影響を及ぼすかどうかsiRNAを用いた解析で調べる。これら制御遺伝子群の中から、発現抑制すると増殖が阻害できる分子を探索する。
血清NM23蛋白質のサイトカイン様新機能の解析

白血病、悪性リンパ腫におけるNM23遺伝子の過剰発現や、細胞外に分泌されたNM23蛋白質に着目して、血液を用いた予後診断法を開発した。血清「NM23蛋白質が予後不良因子となる生物学的基盤を解明するために、細胞外環境におけるNM23蛋白質の細胞生物学的機能を検索し、そのサイトカイン様の機能を明らかにした。1)血清NM23蛋白質の正常末梢血単核細胞に対する作用予後不良の白血病に検出される血清NM23濃度において、NM23蛋白質は正常末梢血単核細胞(特に単球)の生存を阻害した。血清NM23が予後不良因子となる生物学的基盤としてこの機能に注目した。NM23蛋白質を処理した正常末梢血単核細胞に誘導される遺伝子/蛋白質の発現をcDNA microarray、RT-PCR、Protein array、ELISAを用いて包括的に解析した。サイトカイン、ケモカイン,ICAM-1,MMP12,MMP7等、腫瘍の悪性化に関与する多くのサイトカインが誘導されることが判明した。誘導されたサイトカインは初代培養の白血病細胞の増殖・生存を直接促進した。NM23は単球を活性化し、サイトカイン産生を介して間接的に腫瘍細胞の増殖を支持することができると推察される。2)血清NM23蛋白質の初代培養白血病細胸に対する作用NM23蛋白質は初代培養の白血病細胞の増殖・生存を直接促進した。この作用はサイトカインの誘導およびMAPKおよびSTAT系シグナル伝達の活性化が関与していた。白血病細胞が分泌したNM23分子をメディエーターとしてオートクラインに、また単球を介してパラクラインに自身の増殖を促進すると考えられた。これは細胞外環境におけるNM23蛋白質の新しい機能であり、血清NM23蛋白質が予後不良因子となる生物学的機能基盤の1つと考えられる。さらに、治療の新しい標的としても今後の展開が期待できる。目的:血清NM23蛋白質の正常組織の生体防御機構への関与を解析する。成果:予後不良の造血器腫瘍に検出される血清NM23濃度において、NM23蛋白質は正常末梢血単核細胞(特に単球)の生存を阻害することを見出した。これは、生体防御機構に関与する正常細胞に対するNM23蛋白質の新しい生物活性である。この活性と予後不良因子活性との関連を明らかにするためにその分子基盤を解析した。ヒト正常末梢血単核細胞にリコンビナントNM23蛋白質を処理後、免疫担当機能や増殖・生存に関わるサイトカインやアポトーシス関連遺伝子の発現をmultiple RT-PCRにより解析した。NM23蛋白質処理後3-6時間をピークとしてTNFα,IL-1β,IL-6,IL-8,COX2等が誘導された。特に、IL-1βとIL-8の発現促進は72時間後も継続していた。24時間後以降にMCP-1が誘導された。この作用は正常末梢血単核細胞の接着細胞(単球)において顕著であった。したがって、NM23蛋白質が正常単球を活性化し、炎症性サイトカインの発現が亢進したと考えられる。正常免疫担当細胞の活性化は基本的に細胞死がプログラムされているので、生存が阻害されたと考えられる。今後、プロテインチップを用いてNM23蛋白質で正常単球(およびその培養液)に誘導される分子の包括的・網羅的な発現解析を予定している。NM23を高発現/分泌している腫瘍細胞が免疫系から逃れる1つの手段としての単球の生存阻害という新しい機構を提示したい。

腫瘍細胞におけるNM23遺伝子の過剰発現や、細胞外に分泌されたNM23蛋白質に着目して、血液を用いた予後診断法を開発した。この血清NM23蛋白質による予後診断法は白血病、悪性リンパ腫および神経芽腫に応用できることを報告した。血清NM23蛋白質が予後不良因子となる生物学的基盤を解明するために、NM23蛋白質の正常および白血病末梢血単核細胞の増殖・生存に対する効果を検討した。昨年度までに、NM23蛋白質が単球の生存を阻害するという機能を見出している。この過程で正常単級は活性化され、多くのサイトカインの発現が亢進されていた。今年度は、NM23蛋白質を処理した正常末梢血単核細胞細胞に誘導される遺伝子/蛋白質の発現をcDNA microarray、Protein array、ELISA等を用いて包括的に解析した。サイトカインやケモカイン(GM-CSF,IL-1α,IL-1β,TNFα,IL-6,IL-8、Gro α/β/γ,MIP-1β,MCP1,I-309),ICAM-1,MMP12,MMP7等が誘導され、IP-10,MIG等のケモカインの誘導は抑制された。腫瘍の悪性化に関与する多くのサイトカインが誘導されることが判明した。また、誘導されたサイトカインの内GM-CSFやIL-1βは初代培養の白血病細胞の増殖・生存を直接促進した。NM23は単球のサイトカイン産生を介して間接的に腫瘍細胞の増殖を支持することができると推察される。一方、NM23蛋白質は初代培養の白血病細胞の増殖・生存を促進した。この増殖促進機構にもサイトカインの誘導が関与していた。腫瘍細胞はNM23分子をメディエーターとして、直接的および単球を介して間接的に腫瘍細胞の増殖を支持すると考えられる。この活性は、血清NM23蛋白質が予後不良因子となる生物学的基盤の1つと期待される。腫瘍細胞におけるNM23遺伝子の過剰発現や、細胞外に分泌されたNM23蛋白質に着目して、血清を用いた予後診断法を開発した。この血清NM23蛋白質による予後診断法は白血病、悪性リンパ腫および神経芽腫に応用できることを報告してきた。血清NM23蛋白質が予後不良因子となる生物学的基盤を解明するために、細胞外環境におけるNM23蛋白質の生物学的機能を検討した。NM23(組み替え体)存在下で、急性骨髄性白血病細胞を初代培養し、MTT assayにて生存細胞数を測定した。NM23蛋白質により白血病細胞の増殖・生存が促進された。Human Expression CHIP、RT-PCR、Human Cytokine Antibody ArrayおよびELISAを用いて、NM23で誘導される遺伝子/蛋白質の発現解析を行った。増殖促進が観察された症例では、種々のサイトカイン(GM-CSF,IL-1β,IL-6,TNFα,IL-8,MCP-1,Gro等)が誘導された。GM-CSF,IL-1βには直接白血病細胞を促進する活性があった。また、NM23の増殖・生存促進作用は、各種サイトカイン抗体処理で一部中和されたので、サイトカインの産生誘導を介していると考えられた。
放し飼いの食肉はなぜ美味しい？－メタボロミクスから分かる運動と呈味性との相関

牛・豚・鶏などの食肉は、舎飼いのものと比較して、放し飼いで育てられたものの方が「美味しい」と評価されることが多い。食用に供する食肉は主に骨格筋である。近年、運動などの環境要因によって筋線維タイプが後天的にも変化しうることが明らかになっている。運動により骨格筋の筋線維タイプはどの程度変化するのか、また、この変化は食肉の特性にどの程度影響を与えるのか。この問いに答えるため、筋線維タイプを詳細に分類する手法の確立し、筋タイプ別のメタボローム解析を行い、呈味性成分をはじめとする代謝物質と筋タイプとの相関を得た。本研究は、運動や不活動が食肉のおいしさに及ぼす影響について、メタボローム解析による定量的な評価を軸として、物性面(硬さ・保水性)、筋線維タイプ変化の解析も加え、明らかにしようとするものである。骨格筋は運動により、その質と量をダイナミックに変化させることが分かっているが、この変化が食肉としての特性にどの程度影響を与えるかは不明である。また、ブタ・牛などの大型の家畜に定量的な運動を負荷させ条件を検討するのはコスト・管理面で難しい。そこで、本研究では、マウスをモデル動物として最適な運動量を解析し、それをブタに還元することで、「運動」と「食肉の美味しさ」について、物質・物性面での相関関係を明らかにし、運動が食肉の美味しさにどのような影響を与えるのかを定量的に解析することを目指す。平成26年度は以下の研究を行った。1)マウスに運動負荷させた後の理化学的特性の変化マウスに週3回30分の遊泳運動を負荷した後、筋持久力及び、肉の硬さの指標である剪断力価を測定した。その結果、運動を負荷していないコントロール群と比較して、運動負荷群において、有意な筋持久力の増加、有意な剪断力価の低下が認められた。したがって、運動負荷により運動能力がアップし、肉質も軟らかくなることが示唆された。2)運動特性の大きく異なる2種の筋組織を用いたメタボローム解析遅筋を多く含むsoleusは持久的な運動に使われ、速筋を多く含むEDLは瞬発的な運動に利用されることが知られている。運動特性の顕著に異なる両者をメタボローム解析に供した結果、乳酸、ピルビン酸などの解糖系由来の代謝物がEDLで有意に多く、クエン酸、アセチルCoAなどTCA回路に利用される代謝物がsoleusで有意に多く検出され、両者の性質の明確な違いが各代謝物量の違いからも確認された。骨格筋は運動によりその質と量をダイナミックに変化させることが分かっているが、この変化が食肉としての特性にどの程度影響を与えるかは不明である。本研究では、マウスをモデル動物として最適な運動量を解析し、それを豚に還元することで、「運動」と「食肉の美味しさ」について、物質・物性面での相関関係を明らかにし、運動が食肉の美味しさにどのような影響を与えるのか定量的に解析することを目指す。最終年度は、豚を対象に移し、以下の研究を行った。九州の放牧農場で育てた豚肉を購入し、「運動ブタ肉」群とした。また、通常の環境で飼育された国産豚肉を購入し、「コントロール群」とした。ロース肉厚さ1 cm、グリルで調理し、加熱終了後、サンプル片に小分けした。1試料につき二切れを1人分として被験者に提示した。肉の味、やわらかさ、多汁性、香りなど各項目の評価を行ったが、二群間で各項目に有意な差異は認められなかった。これは各項目のばらつきが大きかったことが一因として挙げられる。豚の年齢、系統などに統一性がなかったため正確に比較が行えなかったためであると推察される。そこで、豚の素性を統一し、同一機関で同様に飼育したものを二群に分け、片方には、一定期間放牧させ、「運動ブタ群」とした。もう片方は畜舎で通常飼育をし、「コントロール群」とした。両者から得られた豚肉に、焼く・揚げる・煮るの調理を施し官能評価を行った結果、いずれの調理法においても、運動ブタ群の肉の呈味性がアップしている傾向が確認された。運動特性および筋線維タイプが顕著に異なるsoleus(遅筋), EDL(速筋)をサンプルとしてメタボローム解析を行い、多くの代謝物に差があることを定量的に見いだせたことは次年度につながる成果であったと考えられる。栄養生理学マウスに複数の運動強度と運動時間を設定し、遊泳運動トレーニングを負荷する。その後、大腿四頭筋の剪断力価といくつかの代謝物レベル、そして筋線維タイプ組成を電気泳動で評価し、最も遅筋タイプが増加する運動条件を見いだす。また、本年度は、ブタを用いた検討も並行して推し進めていく。

舎飼いのブタと運動量が多いと思われる放牧飼育のブタ(系統は同一)の肉質の理化学的特性の解析及び官能評価テストを行う予定である。