hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
魚類多型ビテロジェニン及び超低密度リポ蛋白質の受容体結合特性に関する研究

本研究は、魚卵中の卵黄についての研究であり、特に卵黄の素となる血液中の前駆体(ビテロジェニンと超低密度リポ蛋白質)が、どの様に卵へ取り込まれるかを調べた。スズキ類とボラ類の魚を使いこれらの蛋白質や遺伝子を解析した結果、まずビテロジェニンには3種類のサブタイプがあることが明らかとなった。また各種ビテロジェニンと超低密度リポ蛋白質は、それぞれ異なる受容体と結合してから卵の中に取り込まれる可能性が初めて示された。1.ビテロジェニン(Vg)および超低密度リポ蛋白(VLDL)の精製実験対象種(ボラ・パーチ)血清より、3つのVgサブタイプ蛋白およびVLDLを、各種クロマトグラフィーおよび超遠心法を用いて精製することに成功した。特に3種類のVgサブタイプを精製した例は、これまでに無く世界で初めての成果である。2.VgおよびVLDLの受容体結合試験ボラの3型Vgの精製法は、パーチの精製法と比べ煩雑であったため、受容体結合試験はパーチのVg、VLDL、および卵巣試料を用いて行った。その結果、パーチ卵巣膜抽出物にVg受容体とは異なるVLDLに特異的な受容体が存在することを示唆した。また、幾つかの体組織から細胞膜抽出物を調整し、VLDLプローブの結合性を観察した。その結果、プローブは卵巣および肝臓に強い結合性を示した。これらの結果は、鳥類では単一の受容体を介して行われると考えられてきたVLDLとVgの卵への取り込みが、魚類では各々のリガンドに特異的な複数の受容体を介することを示唆した。3.受容体結合領域のクローニング1.受容体結合ペプチド(VRBP)の結合試験:昨年度大腸菌発現系を用いて作製した組み換えパーチVRBPを用いて、パーチ卵巣由来の可溶化細胞膜に対する結合試験を行った結果、予想に反して本組み換え蛋白は結合能を示さなかった。今後、真核生物発現系を用いるなど、機能的VRBPの作製に発現系の検討が必要と考えられた。2. VRBPに対する特異抗体の作製および性状解析:組み換えパーチVRBPを家兎に免疫し、抗血清を作製した。作製した抗VRBP血清は、ウェスタンブロッティングにおいて、計12目13種の魚類および両生類のビテロジェニン(Vg)と考えられる高分子ペプチドと反応性を示した。このことは、魚類のみならず、卵生脊椎動物全般にわたり、Vg分子中の受容体結合領域が構造的に保存されていることを示唆した結果となった。また作製した抗体は魚類繁殖学分野または環境毒性学分野等の研究において、様々な動物種のVgの検出を容易にするユニバーサル抗体であり、同研究分野の発展に大きく寄与すると考えられた。3.多型Vgの取り込み機構:ボラの各種卵黄蛋白(リポビテリン、フォスビチン、β'成分)について、卵成熟に伴うこれら蛋白の分解過程を定量的に観察し、由来するVgサブタイプや各卵黄蛋白クラスの生理機能に関する知見を得た。この際各Vgサブタイプの血中量と卵への取り込み量は相関することが明らかとなったが、本種のVg受容体の多型性については今後の課題とされた。一方、パーチではリガンドブロッティングを用いた実験により、VgAとVgBに各々特異的な受容体の存在が示唆されたが、VgCに特異的な受容体の存在は確認できなかった。以上の結果は、多型Vgの受容体結合特性に関して、リガンドばかりではなく受容体側にも多型性を見出した初めての研究例であり、魚類の卵形成機構に新たなパラダイムをもたらすものと考えられた。
インタ-ロイキンー1(ILー1)によるヒスチジン脱炭酸酵素活性上昇機構の解明ー炎症、免疫応答におけるヒスタミン生合成の分子機構ー

細菌内毒素によるヒスチジン脱炭酸酵素(HDC)の誘導はインタ-ロイキン1(ILー1)様活性により中継されていることが報告されていたが、今回の純品のリコンビオナントILー1(rILー1)を用い、直接的にILー1がHDC活性化に関与することの解明を試みた。1;マウス(ddy20g雄性)を用い、ヒトrILー1によるHDC活性上昇を検討した。rILー1、0.110μgをマウス腹腔内注射すると約4時間後をピ-クとしてHDCの誘導が用量依存的に脾、肺、肝で認められた。この誘導は、タンパク合成阻害剤シクロヘキミドで完全に阻止された。また、各臓器の誘導前後のHDCのヒスチジンに対するミハエリス定数に有意な変化はなく、ウサギ抗ラットHDC抗体を用いた免疫学的酵素蛋白の定量結果は酵素活性と一致した。以上の結果よりrILー1によるHDCの誘導はHDC酵素蛋白のdenovo合成によるものであり蛋白分子の修飾や活性因子、阻害因子の変化によるものではないと考えられる。3;HDC産生細胞の同定には、rILー1処理後、マウス肝をコラゲナ-ゼで淮流し、それをPercol分画してHDC活性の測定、免疫組織化学的手法により同定しようと試みている。
ショウジョウバエのパターン形成遺伝子の網羅的探索

ショウジョウバエの翅は前後軸の形成に働くヘッジホッグおよびDpp、背腹軸の形成に働くWgの3種のモルフォゲンにより形作られる。モルフォゲンの作用機序を調べるために新たな遺伝子のスクリーニングを行い、ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)の糖鎖の生合成酵素(EXT)をコードする3遺伝子を同定した。ひとつは既知のtout-velu(ttv)とよばれる遺伝子で、ttvは糖転移酵素EXT1をコードしている。残りの2つの変異もそれぞれEXTに高い相同性を持つ遺伝子sister of ttv(sotv)とbrother of ttv(botv)と同定された。ttvはヘッジホッグの活性にのみ必要であると報告されていたが、3種のEXT遺伝子はヘッジホッグ、Dpp、Wg全てのモルフォゲンの活性に必要であることが解った。クローン内での各モルフォゲンタンパク質のレベルを調べると顕著に低下しており、HSPGが無ければモルフォゲンが安定に細胞表面に維持できないことをうかがわせる。ヘッジホッグは後部コンパートメントで合成されるが、後部に形成されたEXTクローンにおいてもヘッジホッグのレベルは大きく低下する。後部にはヘッジホッグの受容体であるPtcが発現していない。故にヘッジホッグの消失は受容体との結合に始まるエンドサイトーシスによるモルフォゲンの減弱の機構とは無関係であることがわかる。EXTクローンが前後コンパートメント境界に形成されるとそれに接する後部のヘッジホッグのレベルが著しく上昇する。このことはHSPGをもたない細胞にはヘッジホッグが伝播することができず、行き場を失ったヘッジホッグが後部に溜まると解釈できる。このことはHSPGが細胞表面を覆うモルフォゲン伝播の足場として機能していることを示すものである。
多数の実例を分類し系統づけた展開図教育と教材作成の難しさに関する研究

立体の展開図は教材としてよく用いられる。小学校では紙をハサミで切って工作して立方体の箱を作るのがよく広まった教育方法である。後に,見取り図や立体の切断で再び展開図が利用されるが,それ以降の学校教育では展開図はほとんど登場しない。本研究では,学校教育でよく扱われる展開図の範囲にしぼって,展開図から立体を作る教材を計算機を使って開発した。展開図の事例収集に努めた.紙で作る梱包や紙で作る模型などの資料を収集した。普段の生活の中で見る展開図の事を集め、教材に活用する素地を作った。また、学校教育の算数・数学で扱われる展開図について指導要領や教科書、問題集を調査した。展開図シミュレータのためのデータ構造を検討し、グラフで表現することとした。過去のプログラミングをもとに、展開図を与えたときに元の図形を折る様子をアニメーションで見せるシミュレータを開発した。これにより、実際の授業への利用が可能となる。平面図形を与えたとき、それが立体の展開図になっているか判定することは難しい。本研究ではこの問題の教材化に取り組んだ。一般の立体では難しいため、立方体を並べてできるような「箱型」の立体についてのみ考える。つまり、問題を書き直すと、n枚の正方形を並べて立体の展開図を作ることができるか?となる。立体を辺で切り開く辺展開するのとは逆の手順であるが、完成形がどのようになるかわからないので総当たりで確かめる方法をとる。計算量的に多項式時間内に計算することは難しいので、列挙アルゴリズムで用いられる技術を用いて、多項式時間遅延アルゴリズムを開発した。多面体は20世紀後半以降に活発な研究が成されるようになり、近年では性能の向上の助けもあり、計算機による多面体の研究が多く進められている。また、多角形を折ることで多面体にすることは、平面的に加工したものを立体に組み立てることにつながり現実の問題としても重要である。Demaineは「すべての多角形を多面体に折ることができるだろうか」という問題を提案したが、未解決問題である。これに対して、凸多角形から凸多面体を折るということに関してはすでに解決されている。凸であることに限ると解決できているが、非凸であるものを含むと解決できない問題がたくさん残されている。Bied1は面が硬い面(剛体)と仮定した直交折り線つき展開図の中には、ある面がある面を通過することを許されているときだけ、ドーナツ状に穴の開いているものではない(種数の)直交多面体を折れるものが存在することを証明した。三谷と上原は、直方体に着目し、計算機を用いて同じ展開図から違う直方体を折ることができる展開図を面の枚数毎で調べ、多数発見した。しかし、ここでは非凸なものを含む多面体は含まれていない。本研究では、非凸なものを含む多面体について扱い、その中でも連結する辺同士が直交している直交多角形から折る直交多面体について総当たり的に確かめる。つまり、Demaineの未解決問題の一部について、実験的に検証した。
テラヘルツ波帯域に迫るスピン注入発振の実証

ナノスケールの磁気抵抗素子に電流を流すと、スピン注入効果により磁性体の磁化の自励歳差運動が生じる。これをスピン注入発振と呼ぶ。本研究では、テラヘルツ波帯域の磁化歳差周波数に加え小さい磁気の摩擦を示す独自のマンガン系磁性体、ならびにその極薄膜形成技術を素子に応用することで、テラヘルツ波帯域に迫る0.1 THzのスピン注入発振を実証することを目指した。テラヘルツ波帯域に迫る、70 GHzを越える帯域における整流効果(いわゆるスピントルクダイオード効果)を示す素子の実証に世界に先駆けて成功した。さらに発振素子実現へ向けた素子作製とそのナノスケール微細加工を行い、目的達成への知見を得た。金属磁性体と非磁性金属の層構造から成る磁気抵抗素子をナノスケールに加工し電流を流すと、スピン注入効果により磁性体の磁化の自励歳差運動が生じる。この現象はスピン注入発振と呼ばれる。様々な基礎・応用研究が行われているものの、その発振周波数は最大でも45 GHz程度である。研究代表者らは、これまでテラヘルツ波帯域の磁化歳差周波数と小さい磁気の摩擦を示すマンガン系磁性体を発見し、ごく最近その極薄膜形成に成功している。そこで本研究では、この材料のユニークな特性を素子に適用することで、テラヘルツ波帯域に迫る0.1 THzのスピン注入発振を実証することを目的とする。以下にH28年度の研究の実績について記す。まず、マンガンガリウム極薄膜の結晶性と界面平坦性の向上を狙い、成長温度などを最適化することで、極薄膜領域においても高磁気異方性・低ダンピング定数を示すマンガンガリウムナノ層の形成を試みた。その結果、ダンピング定数が0.01-0.02程度であり、垂直磁気異方性の大きさが3テスラ程度の極薄膜を得ることができた。この垂直磁気異方性は約90 GHzの磁化才差周波数に対応するものである。一方、低ダンピング定数が得られる成長温度では表面形状が劣化することが判明したが、製膜後熱処理を併用することで平坦かつ低ダンピングを示す、磁気抵抗素子に適した極薄膜を得られることが新たに分かった。次に、このナノ薄膜成長技術を用いて、マンガンガリウムをベースとするナノスケールトンネル磁気抵抗素子を作製し、スピン注入整流効果(スピントルクダイオード)を用いてマンガンガリウム層の磁化歳差運動を調べた。磁気抵抗効果を稼ぐため、界面に1-2 nmのFe層を挿入した素子では、50-100 GHzの高周波領域付近で磁性層の歳差運動に伴う信号を観測することに成功した。平成28年度には、マンガンガリウムの極薄膜の作製条件を最適化することで、極薄膜領域においても低ダンピング定数を得るための知見を得た。また素子の作製・評価を進めることでスピン注入整流効果による高周波信号を検出できた。これらは、大きな成果であり、非常に順調に進展しているといえる。他方、本計画では、平成28年度内に素子の詳細なデータまでを取得する予定であったが、計画外の微細加工施設の移設があり、系統的な実験がまだ行えていない。この点を踏まえて、おおむね順調に進展している、という評価とした。ナノスケールの巨大磁気抵抗(GMR)素子や強磁性トンネル接合素子に電流を流すと、スピン注入効果により磁性体の磁化の自励歳差運動が生じる。これまで、その発振周波数は最大45 GHz程度である。本研究では、申請者が独自に開発してきた材料のユニークな特性を素子に適用することで、テラヘルツ波帯域に迫る0.1 THzのスピン注入発振を実証することを目的とする。前年度にマンガン系材料を用いたナノスケール強磁性トンネル接合でスピン注入整流効果(スピントルクダイオード)の研究を行い、70 GHzを超えるテラヘルツ波帯域に迫る高周波信号の検出を達成した。本年度は、その素子構成をベースにナノスケールGMR素子の作製を進め、テラヘルツ波帯域に迫るスピン注入発振の実証を目指した。まず、マンガン系材料極薄膜の作製に必須の規則合金下地層の、GMRや発振に対する影響を調べた。標準的な磁性材料と当該下地層を用いたGMRスタックを作製し、数%のGMRおよびスピントルク発振を観測することに成功した。次にマンガン系材料を用いた狙いとするGMR素子の作製を進めた。しかしながら、非磁性スペーサの材料とマンガン系材料を組み合わせると垂直磁化が劣化することが判明した。これは原子拡散によるものと考えられ、当初予想していなかったことである。最終的に垂直磁化マンガン系材料極薄膜を有するGMR素子を作製することに成功したが、素子層構造や薄膜作製条件の最適化に時間を要した。当該素子のGMR評価ならびに発振評価を行うため微細加工を進めたが、GMRが観測されなかった。これは微細加工の際に原子拡散が進行し、界面原子構造に乱れが生じたためであると考えられる。目標達成のためにはマンガン系材料をフリー層に用いたナノGMR素子の微細加工プロセスや層構造の更なる最適化が課題である。

本研究では、テラヘルツ波帯域の磁化歳差周波数に加え小さい磁気の摩擦を示す独自のマンガン系磁性体、ならびにその極薄膜形成技術を素子に応用することで、テラヘルツ波帯域に迫る0.1 THzのスピン注入発振を実証することを目指した。テラヘルツ波帯域に迫る、70 GHzを越える帯域における整流効果(いわゆるスピントルクダイオード効果)を示す素子の実証に世界に先駆けて成功した。さらに発振素子実現へ向けた素子作製とそのナノスケール微細加工を行い、目的達成への知見を得た。前年度から継続し、トンネル磁気抵抗素子の作製を加速し系統的なデータを取得、成果発表を行う。並行して、平成28年度の成果をベースとした当初計画通り研究を継続することで、本研究の目標を達成できると考えられる。具体的には、すでに得られている低ダンピング定数と高磁気異方性を備えたマンガンガリウムナノ薄膜をフリー層とする金属型巨大磁気抵抗素子を作製する。数パーセント以上の磁気抵抗比を得るため、十分な検討を行う。さらに、それを微細加工したナノ磁気抵抗素子を作製し、高密度のスピン注入を行うことで、テラヘルツ波領域に迫るスピン注入発振の観測を推進する。スピントロニクス本研究で計画しているトンネル磁気抵抗素子の作製に用いる微細加工機器・設備の移設があり、研究計画の一部が未達であった。これは当初計画していなかったことであり、そのために、予算使用計画が当初よりも遅れてしまった。平成28年度に未達であった素子の詳細な研究を上半期に平行して実施する。繰り越し予算はその研究の実施に充当する。新規移設後の微細加工室は使用時間がこれまでよりも長く確保でき、かつフレキシブルである。そのため、上記計画は、平成29年度計画と並行して実施でき、研究計画や予算使用上の問題はないと考えられる。
大規模災害における後遺障害に対する統合医療的戦略

大規模災害後の身体的・精神的苦痛を訴える患者に各種補完代替医療(カウンセリング、鍼治療、アロマセラピー、ヨーガ療法、思考場療法)を含む統合医療的な介入プログラムが実施可能であるか検討した。脱落はなく明らかな有害事象を認めなかった。大規模災害被害者をケアするもののストレスマネジメントとして、認知行動療法やヨーガ療法、思考場療法による統合的な介入の安全性と有効性を評価した。脱落は多かったものの明らかな有害事象を認めなかった。「ネクストクライシスへの備え、自助・互助・共助・公助で出来ること」と題した市民公開講座を2016年3月に千里金蘭大学にて開催した。約500人の市民の参加があった。先行研究としてJR福知山線脱線事故の被害者などに対して鍼やアロマセラピー、ヨーガ療法などの介入を行い、有意な苦痛の改善と抑うつ症状の改善を認め、その客観的な評価を得るために今回の臨床試験が計画された。これまで1年以上にわたり医療機関を通院したものの改善を認めない大規模災害などによる後遺障害を抱えるものを募集しヨーガ療法、アロマセラピー、思考場療法を組み合わせた10週にわたる統合医療的な臨床試験を施行、現時点で6名が脱落なく終了、明らかな有害事象を認めていない。施術直後では有意な苦痛の改善が認められ、長期的にも有意な悪化は認めず、苦痛がほぼ消失したものも認めた。各施術の満足度は高いものであり、セルフケアとして続けるものも多数存在した。ヨーガ療法における瞑想中の脳波においてtraining後では前帯状皮質(aCC:客観視を司る)からのfunctionalconnectivityの有意傾向の低下を認め、異常なconnectionが瞑想によって解除されたことが考えられた。また年齢をマッチさせた健常被験者との比較では瞑想training後に左下頭頂小葉(IPL:self-awarenessや内的な情報処理に関連している)の電流源密度(current source density;CSD)の有意な上昇を認め、瞑想trainingによって脳活動に変化が生じた可能性が考えられた。これらの結果は苦痛を客観視できるようになった可能性が考えられ、苦痛と距離を取り、苦痛を緩和している可能性が示唆された。JR西日本福知山脱線事故ご被害者対策本部スタッフへの認知行動療法およびマインドフルネス的Yogaなどの統合的介入は計画の概略を作成しJR西日本との交渉が終了、現在大阪大学医学部附属病院倫理委員会への提出書類作成中である。これまで1年以上にわたり医療機関を通院したものの改善を認めない大規模災害などによる後遺障害を抱えるものを募集しヨーガ療法、アロマセラピー、思考場療法を組み合わせた10週にわたる統合医療的な臨床試験を施行、全11名が脱落なく終了、明らかな有害事象を認めなかった。施術直後では有意な苦痛の改善を認め、長期的にも有意な悪化は認めず、苦痛がほぼ消失したものも認めた。ヨーガ療法における瞑想中の脳はにおいては苦痛がほぼ消失したものにおいてFrontal medial theta(fmθ)と呼ばれる瞑想熟練者で見られる脳波が認められた。この症例は介入一年後も良好な状態が保たれていることを確認しており、瞑想による効果は長期的に持続する可能性が示唆された。ヨーガ療法を行った10名の全体的な解析では年齢をマッチさせた10名の健常被検者との比較において左下頭頂葉(自己への気付きや内的な情報処理に関連)のガンマ帯域(高次機能に関連)において有意な電流源密度の上昇を認めた。fMRIを用いた研究では、PTSD患者の中で治療反応群は左下頭頂葉の過活動を認めたとも報告されており,治療抵抗性の状態から治療反応性の状態に移行したとも考えられた。大規模災害被害者のケアを行うものに対する統合的なストレスマネジメント介入研究としてJR西日本福知山線脱線事故ご被害者対応本部スタッフへの認知行動療法およびヨーガ療法、思考場療法の統合的介入を行った。明らかな有害事象の報告はなく、ストレスマネジメントに関する10項目の5段階評価の合計点で有意な改善を認めた。現在セルフケアの状況をフォローしている。大規模災害被害者のケアを行うものに対する統合的なストレスマネジメント介入研究としてJR西日本福知山線脱線事故後被害者対策本部スタッフへの認知行動療法およびヨーガ療法、思考場療法の統合的介入を行った。71名の被検者より同意取得が得られたが介入前の評価が得られたのは63名であった。平均年齢は49.8歳、女性は4名であった。勤務時間中の介入とインターネットでの回答であり最初の1ヶ月間のTFT後の評価が得られたのは30名、次の1ヶ月間のヨーガ療法後の評価が得られたのは17名、最後の1ヶ月の認知行動療法後の評価が得られたのは17名、その5ヶ月後のフォローアップ時に評価が得られたのが14名であった。主要評価項目の仕事の満足度は介入後3ヶ月間、8ヶ月で有意な変化はなく、副次評価項目のストレスとの距離(p=0.006)、考え方のクセ(p=0.030)、発想の切り替え(p=0.024)、ストレス対処(p=0.003)、問題解決(p=0.015)、自分への満足(p=0.027)、5段階評価10項目の合計点(p<0.001)で有意な改善がみられた。副次評価項目の8ヶ月間で有意な変化を認めなかった。

TFT、ヨーガ療法の前後では有意な改善を認めず、認知行動療法の前後で自分への満足、5段階評価10項目の合計点で有意な改善がみられた。K6では3ヶ月間で有意な変化を認めなかった。8ヶ月間では神経過敏(p=0.019)、そわそわ(p=0.013)、気分(p=0.040)で有意な悪化、TFTの前後ではそわそわ(p=0.030)で有意な悪化が見られた。ヨーガ療法、認知行動療法では有意な変化を認めなかった。研究結果の報告、広報のため「ネクストクライシス(来たるべき大規模災害)への備え、自助・互助・共助・公助で出来ることー生き残るのはあなた次第ー」と題した市民公開講座を2016年3月6日に千里金蘭大学にて開催した。大規模災害後の身体的・精神的苦痛を訴える患者に各種補完代替医療(カウンセリング、鍼治療、アロマセラピー、ヨーガ療法、思考場療法)を含む統合医療的な介入プログラムが実施可能であるか検討した。脱落はなく明らかな有害事象を認めなかった。大規模災害被害者をケアするもののストレスマネジメントとして、認知行動療法やヨーガ療法、思考場療法による統合的な介入の安全性と有効性を評価した。脱落は多かったものの明らかな有害事象を認めなかった。「ネクストクライシスへの備え、自助・互助・共助・公助で出来ること」と題した市民公開講座を2016年3月に千里金蘭大学にて開催した。約500人の市民の参加があった。大規模災害の後遺障害に対する統合医療的介入は予定通り平成26年7月に終了、12月には学会報告をし、現在論文投稿中である。大規模災害被害者のケアを行うものに対する統合的なストレスマネジメント介入研究は平成26年度中に終了予定であったがJR西日本との交渉が長引き、平成25年度に開始できなかったためやや遅れているがその後は順調に進んでいる。統合医療大規模災害の後遺障害に対する統合医療的介入の論文を発表し、大規模災害被害者のケアを行うものに対する統合的なストレスマネジメント介入研究を平成27年7月に終了、その後解析し報告を行う。予定通り大規模災害の後遺障害に対する統合医療的介入が進んでおり平成26年度中には終了の予定である。平成25年後開始予定であった大規模災害の後遺障害者に対するケアを提供するものに対するストレスマネージメントの臨床試験はJR西日本との交渉が長引いたが、実施可能な状態となり、大阪大学医学部附属病院倫理委員会への提出書類作成を進めている。平成25年度に開始予定であったJR西日本での臨床試験がやや遅れており、支出が次年度に持ち越しとなっている。平成26年度中に大規模災害の後遺障害に対する統合医療的介入は終了の予定であり、データをまとめて発表、報告してゆく予定である。ケアを提供するものに対するストレスマネージメントの臨床試験も平成26年度中に開始し、平成27年度には終了、データをまとめて発表、報告してゆく予定である。平成26年度に使用予定であったJR西日本での臨床試験分の支出を平成27年度に使用する予定である。平成25年度に使用予定であったJR西日本での臨床試験分の支出を平成26年度に使用する予定である。
生体異物処理機能蛋白の誘導により生じる薬物間相互作用の定量的予測

Wister系優性ラットにセントジョンズワート1000mg/kg/dayを24時間毎に7日間繰り返し経口投与し、最終投与24時間後にミダゾラム10mg/kgを経口投与して経時的に採血し、ミダゾラム濃度を測定した。血漿中濃度推移はモデル非依存的方法で解析した。セントジョンズワート投与1日目より血漿中ミダゾラム濃度が低下する傾向が検出され、3日後、7日後ではミダゾラムの全身クリアランスが投与前と比べて有意に増大した。クリアランスの増大の原因を同定するため、セントジョンズワートを繰り返し投与したラットの肝ミクロソーム分画によるミダゾラム代謝活性をin vitroで測定した。ミダゾラム代謝のVmaxはセントジョンズワート投与により有意に増大しており、酵素の誘導が確認できた。また、市販のラズベリーケトン製剤を12時間毎に7日間繰り返し投与し、同様に血漿中ミダゾラム濃度を測定した。セントジョンズワート投与群では血漿中ミダゾラム濃度が有意に低下したが、ラズベリーケトン処理群と対照群ではミダゾラムの体内動態に有意な差は認められず、ラズベリーケトン製剤はミダゾラム代謝酵素の発現に影響を及ぼさないことが示唆された。さらに、健康女性がラズベリーケトン製剤を7日間連続服用した場合のCYP3A活性を、尿中ヒドロキシコルチゾール/コルチゾール比を指標として検討した。20歳以上35歳以下の健康女性を対象として、月経終了から排卵日までの間にラズベリーケトンを7日間服用させ、尿中ヒドロキシコルチゾール/コルチゾール比を測定して非服用時と比較した。ラズベリーケトン製剤によりCYP3A活性は変化しておらず、経口避妊薬の効果に影響を与える可能性は低いと考えられた。この結果は動物実験の結果と一致している。Wistar系雄生ラット(体重280-300g)にセントジョンズワート200mg/kgを12時間毎に8回経口投与し、最終投与12時間後にミダゾラム5mg/kgを静脈内投与して経時的に採血した。速やかに血漿を分離し、ミダゾラム濃度をHPLC法により測定した。血漿中濃度推移は2-コンパートメントモデルに従うと仮定して解析した。経口投与実験では、セントジョンズウォート1000mg/kgまたは溶媒を1日1回3または7日間経口投与し、最終投与24時間後にミダゾラム10mg/kgを経口投与して同様の実験を行った。血漿中ミダゾラム濃度はHPLC法に従って測定した。投与に用いたセントジョンズワート中のヒペリシン含量は、吸光光度計あるいは質量分析機を検出器とするHPLC法で測定した。ヒペリシンの標準品およびセントジョンズウォートのクロマトグラムは波長590nmおよびm/z=503のいずれにおいても良好な単一ピークが得られ、いずれの検量線も良好な直線性が得られた。セントジョンズウォート中ヒペリシン含量は0.14%であった。ラットにセントジョンズワートを4日間繰り返し投与することによりミダゾラム5mg/kg静脈内投与後の全身クリアランスが有意に増加した。セントジョンズワートを投与後3日目で既にミダゾラムの経口クリアランスは低下傾向を示した。静脈内投与実験の結果から、ラットにおいては少なくとも4日間でクリアランスの増大が認められた。さらに、経口投与の結果から、投与後1日で代謝酵素が誘導されていることが示唆された。酵素蛋白含量あるいは酵素活性の変化による評価を現在検討中である。Wistar系雄性ラットにセントジョンズワート1000

mg/kg/dayを24時間毎に7日間繰り返し経口投与し、最終投与24時間後にミダゾラム10mg/kg経口投与して経時的に採血した。速やかに血漿を分離し、ミダゾラム濃度をHPLCで測定した。また、市販のラズベリーケトン製剤(ラズベリーケトンとして50mg/kg/day)を12時間毎に7日間繰り返し投与し、同様に血漿中ミダゾラム濃度を測定した。血漿中濃度推移はモデル非依存的方法で解析したセントジョンズワート投与群では対照群に比べて血漿中ミダゾラム濃度が有意に低く、セントジョンズワート処理によりミダゾラム代謝酵素が誘導されることが示された。一方、ラズベリーケトン処理群と対照群ではミダゾラムの体内動態に有意な差は認められず、ラズベリーケトン製剤はミダゾラム代謝酵素の発現に影響を及ぼさない事が示唆された。ラズベリーケトン製剤は体重減少作用がある健康食品として国内で市販されており、主に健康な若い女性が使用しているので、経口避妊薬との相互作用が重大な問題を引き起こす可能性が考えられる。そこで、健康女性がラズベリーケトン製剤を7日間連続服用した場合のCYP3Aの活性を、尿中ヒドロキシコルチゾール/コルチゾール比を指標として検討した。20歳以上35歳以下の健康女性を対照として、月経終了から排卵日までの間にラズベリーケトンを7日間服用させ、尿中ヒドロキシコルチゾール/コルチゾール比を測定して非服用時と比較した。ラズベリーケトン製剤によりCYP3A活性は変化しておらず、経口避妊薬の効果に影響を与える可能性は低いと考えられた。この結果は動物実験の結果と一致している。Wister系優性ラットにセントジョンズワート1000mg/kg/dayを24時間毎に7日間繰り返し経口投与し、最終投与24時間後にミダゾラム10mg/kgを経口投与して経時的に採血し、ミダゾラム濃度を測定した。血漿中濃度推移はモデル非依存的方法で解析した。セントジョンズワート投与1日目より血漿中ミダゾラム濃度が低下する傾向が検出され、3日後、7日後ではミダゾラムの全身クリアランスが投与前と比べて有意に増大した。クリアランスの増大の原因を同定するため、セントジョンズワートを繰り返し投与したラットの肝ミクロソーム分画によるミダゾラム代謝活性をin vitroで測定した。ミダゾラム代謝のVmaxはセントジョンズワート投与により有意に増大しており、酵素の誘導が確認できた。また、市販のラズベリーケトン製剤を12時間毎に7日間繰り返し投与し、同様に血漿中ミダゾラム濃度を測定した。セントジョンズワート投与群では血漿中ミダゾラム濃度が有意に低下したが、ラズベリーケトン処理群と対照群ではミダゾラムの体内動態に有意な差は認められず、ラズベリーケトン製剤はミダゾラム代謝酵素の発現に影響を及ぼさないことが示唆された。さらに、健康女性がラズベリーケトン製剤を7日間連続服用した場合のCYP3A活性を、尿中ヒドロキシコルチゾール/コルチゾール比を指標として検討した。20歳以上35歳以下の健康女性を対象として、月経終了から排卵日までの間にラズベリーケトンを7日間服用させ、尿中ヒドロキシコルチゾール/コルチゾール比を測定して非服用時と比較した。
携帯機器向けの手書き文字の準同期入力を併用した音声認識手法の研究

携帯情報機器における使いやすく、かつ、頑健な入力インターフェースが求められている。本研究課題では、「書きながら話す、話しながら書く、入力インターフェース」の実現を目指した。音声入力のみより周囲雑音に対し頑健で、手書き文字入力のみより高速な入力が可能となることが期待できる。そのために、本研究課題の研究期間内では、特にメール文などの自由文入力を想定し、音声入力と手書き文字入力との同時入力を統合して認識する手法を開発した。初年度は、速度の異なる2入力を用いた、使いやすく、かつ、それぞれの単独入力よりも高性能が期待できる形態として、文節の先頭ひらがな文字を手書き文字で入力するインターフェースを提案した。また、そのためのオンライン手書き文字入力方式を実装した。そして、同時入力に対する認識アルゴリズムを考案し、音声と手書き文字とを別々に収録したデータベースを用いてシミュレーション実験を行い、その有効性を確認した。最終年度は、提案したインターフェースを実装した収録システムを構築し、被験者10名の計530文のデータを収録し、認識性能評価を行った。探索方式は、まず、音声のみを用いた認識で認識結果候補を単語グラフの形で出力し、次に、音声スコアと手書き文字スコアを同時に用いてグラフ探索を行う2パス処理を用いた。あわせて音声と手書き文字の入力のずれに対し適応する方式も採用した。音声のみの認識結果に比べ、話者平均で5%程度認識性能が向上し、提案手法の効果を確認した。今後は、音声と手書き文字の間の重みの自動最適化などのアルゴリズム改良を行い、実時間で動作するシステムを実装する。また、インターフェースとしての使いやすさの評価、他の入力形態の検討を行う。さらに本手法は雑音下で特に有用と考えられるため、実環境下での評価も行いたい。音声と手書き文字を同時に入力する「話しながら書く」、「書きながら話す」インタフェースの実現を目的とした研究を行った。マルチモーダル認識では、モード毎の入力を認識処理前あるいは認識処理後に統合する方式が一般的であるが、ここでは入力と同期した認識サーチ処理の段階で両者を統合する方式を提案した。両者が補完しあうことで、周囲雑音が大きい場合でも頑健な認識が期待される。一方、音声と手書き文字とでは同一内容の入力速度が著しく異なることが課題となった。そこで、ここでは、手書き文字で入力する情報を選別し、探索空間を効果的に絞り込むことを狙った。本年度は、第一段階として、連続音声とそれに対応する各文節の先頭文字(ひらがな)とが同時に入力される形態について、シミュレーションを行った。まず、音声と手書き文字とが独立に収録されたデータから同時入力データを合成した。次に、それを入力とし、まず音声認識を行って認識結果候補の単語グラフを出力し、次に、手書き文字の認識結果を統合してその単語グラフを探索する2パス処理を行った。認識スコアとしては、音声と手書き文字のそれぞれの対数尤度の重み付け和を用いた。各ひらがなは文節の発声開始と同時に入力が開始されると仮定している。音声認識、手書き文字認ともに隠れマルコフモデルを用い、認識単位として音声認識ではtriphone,手書き文字ではストロークを用いた。音声認識のみの認識率が76%のところ、手書き文字の併用で79%まで認識性能が向上し、提案手法の実現可能性が示された。来年度は、まず、同時入力の収録システムを開発し、同時入力データベースを構築する。そして、1パスで実時間処理を行うサーチ手法の検討、音声と手書き文字入力の同期のずれに対する対処、使いやすいインタフェースの実現のための入力手書き文字の選別などを行う予定である。携帯情報機器における使いやすい入力インタフェースが求められている。

本研究では、「書きながら話す、話しながら書く入力インタフェース」の実現のため、特に携帯情報機器へのメール文などの自由文入力を想定し、音声入力と手書き文字入力との同時入力を統合して認識する手法を確立することを目的とする。昨年度は、そのためのアルゴリズムを考案し、音声と手書き文字とを別々に収録したデータベースを用いて、その実現可能性を確認した。本年度は、まず、手書きタブレット、PC、マイクロフォンなどの録音機材を用いて音声と文字の同時入力を収録するシステムを構築した。WindowsOS上で動作する。次に20人程度の被験者を集め、文節単位に手書き文字を入力する形態において、音声および手書き文字を収録した。このデータベースを用いて、認識性能の評価を行った。手書き文字入力を併用した場合の効果は、被験者により異なり、効果のある被験者がいる一方で、かえって性能が劣化する被験者も存在することがわかった。その原因として、手書き文字と音声の入力タイミングにずれ(同期のずれ)が存在し、そのずれの分散の大きい場合に性能が劣化することが判明した。同期のずれに対し確率分布を与えるなど、同期のずれに頑健なアルゴリズムを構築することで性能の向上が期待できる。今後の課題として、インターフェースとしての使いやすさの評価、他の入力形態の検討、および、実時間で動作するシステムの実装があげられる。
難治性口内炎に対するメラトニンを用いた戦略的治療法の開発

本研究では、口腔がんの化学療法ならびに放射線療法に伴って生じる難治性口内炎に対するメラトニンの有効性を検討することを目的とした。in vitroおよびin vivoにおいて、メラトニンの口内炎に対する予防薬、進行抑制薬または治療薬としての作用を検討した。結果より、メラトニンが口腔がん治療時の副作用軽減の一助となる可能性を示唆できた。口腔がんの抗癌剤治療、放射線治療によって生じる口内炎に対するメラトニンの有効性を検討することを目的に、本研究を施行した。平成23年度は以下の項目について検討を行った。(1)ハムスター由来の口腔粘膜上皮細胞、線維芽細胞の初代培養ゴールデンシリアンハムスターより麻酔下に頬粘膜を採取(デルマパンチ[○!R]使用)。その後、粘膜上皮細胞および線維芽細胞を初代培養し、ウェスタンブロット法によりメラトン1a受容体を確認した。(2)口腔粘膜上皮細胞、線維芽細胞に対する抗がん剤の影響の検討(1)で初代培養した各種細胞を34代継代。抗がん剤(5-FU)を培地に添加し、濃度依存的に増殖抑制することを確認した。(3)抗がん剤により影響を受けた正常細胞に対するメラトニンの影響の検討(2)で増殖抑制を受けた、正常細胞に各種濃度のメラトニンを添加し、経時的に増殖に対する作用を確認したところ、濃度依存的に増殖を促進する傾向が認められた(有意さは10000μMのみ添加群にて認められた。)(4)がん細胞に対する抗がん剤の作用をメラトニンが相殺しないことの確認がん細胞として、研究室で保有するヒト口腔扁平上皮癌細胞(B88)を使用した。各種濃度の抗がん剤(5-FU)を培地に添加し、濃度依存的に増殖抑制することを確認した。その後培地にメラトニンを追却して培養したが、無添加と比較して増殖の促進は認められなかった。むしろ、軽度抑制傾向が認められた(ただし、有意差なし)。このことより、抗がん剤の作用をメラトニンを打ち消す可能性がないことが示唆された。前年度までの研究において、ゴールデンシリアンハムスター(67週齢、雄性)を用いて、(1)5ーFUを投与して薬剤性に口内炎を作製したモデル、(2)エックス線を照射して放射線性に口内炎を作製したモデルの2種類の口内炎病態モデルを作製していた。本年度は、それらの病態モデルに対するメラトニンの影響について検討を行った。まず、局所投与として各種濃度のメラトニン(0、0.1、1、10μg)を混入したワセリンを口内炎部分に塗布した(3日目以降治癒するまで毎日)。口内炎の治癒状況については、1サイズ測定(毎日)、2肉眼所見におけるスコアリング(毎日)、組織所見におけるスコアリング(3日毎)、4MPO活性測定(3日毎)の4項目を行った。1μg以上のメラトニン投与群では、投与開始約1週間で肉眼的にも治癒したが、非投与群では治癒に平均約2週間を要した。MPO活性については、有意差は認めなかったが、メラトニンの濃度依存的に投与により早期より活性の低下傾向が認められた。全身投与としては、口内炎ハムスターに対して生理食塩液にて希釈したメラトニン(0、0.1、1、10 mg/kg)を腹腔内投与した(3日目以降治癒するまで毎日)。検討項目は、上記4項目にて行った。非投与群では、治癒に平均約2週間を要したが、0.1mg/kg以上投与群では、有意差は認めなかったが、治癒期間が濃度依存的に短縮される傾向が認められた。さらに、予防薬としてのメラトニンの効果を検討するために、口内炎作製0日目より病態ハムスターに対して生理食塩液にて希釈したメラトニン(0、0.1、1、10 mg/kg)を腹腔内投与した。これに関しては、メラトニンの投与の有無に関わらず、口内炎が形成され、明らかな予防効果としては認められなかった。<研究目的>本研究では、口腔がんの化学療法ならびに放射線療法に伴って生じる難治性口内炎に対するメラトニンの有効性を検討することを目的とする。すなわち、メラトニンの口内炎に対する予防薬、進行抑制薬または治療薬としての可能性を解明し、戦略的治療法を開発する。さらに、がん治療に伴う口内炎に対するメラトニンの治療および発症抑制機序を解明することにより、がん治療時の副作用軽減の一助となることを目指す。(1)正常細胞に対する放射線の影響についての検討、放射線により影響を受けた正常細胞に対するメラトニンの影響の検討:正常細胞は、初年度に培養した細胞の継続した培養が困難だったため、市販のヒト線維芽細胞(皮膚由来)を購入し、研究を施行した。セミコンフルエントに達した細胞に放射線照射を行った。0、6、12、24、48時間後に細胞増殖に対する影響を評価したところ、6時間48時間全ての時期において、対照群(放射線照射なし)と比較して細胞の増殖抑制が認められた。

この増殖抑制を受けた細胞に対して、各種濃度のメラトニン(0、1、10、100μM)を添加した培地で培養し、その増殖能の変化をMTTアッセイにて評価したところ、100μMで軽度の増殖回復が認められた(有意差はなし)。(2)ハムスターを用いた口内炎病態モデルの作製:ゴールデンシリアンハムスター(6週齢、雄性)を用いた。5ーFU投与後にミニワイヤーブラシにて左側頬粘膜を機械的に刺激したところ、約57mm大の潰瘍を伴う口内炎を形成した。同部の組織を採取し、ホモジナイズをしたものからタンパクを抽出し、メラトニン1aレセプターに対する抗体でウエスタンブロットを行ったところ、約43kDaのバンドを検出することができた。計画に従って、進行しているため。25年度が最終年度であるため、記入しない。正常細胞は初年度に初代培養した口腔粘膜上皮細胞・線維芽細胞の34代以上の継代が困難だったため、細胞を市販のヒト正常線維芽細胞(皮膚由来)へ変更したため、当初の計画とは少し異なっている。ただし、ハムスター頬粘膜での口内炎作製はほぼ順調に進んでいるため、最終年度の研究へ向けて準備はできたため、おおむね順調に進展していると判断した。次年度も引き続き、研究計画に従って、研究を進める予定。口内炎ハムスターに対して、メラトニンを投与(局所塗布・腹腔内投与)を行い、その変化を確認する予定。
海藻レクチンの生物活性、活性発現機構および構造活性相関に関する研究

本研究では、海藻レクチンのうち高マンノース型糖鎖特異的藻類レクチンファミリーおよび多機能ポリペプチド性藻類レクチンファミリーに属するものを対象として、それらの生物活性、活性発現機構および構造活性相関を解明することを目的とした。高マンノース型糖鎖特異的藻類レクチンファミリーに関しては、紅藻トゲキリンサイEucheumaa serraレクチン(ESA-2)の糖鎖認識能の詳細と分子構造を明らかにするとともに、本レクチンの経口投与(飲料)によるマウス初期大腸癌の発現抑制の機構に検討を加え、同抑制はレクチン投与による大腸組織での活性酸素産生量の激減に由来することを明らかにするともに、新しく確立した手法を用いてヒト大腸癌由来培養細胞(HT-29)の本レクチンレセプターを同定した。次に、淡水産藍藻Oscillatoria agardhiiレクチンの分子構造と糖鎖認識能を解明するとともに、本レクチンが強力な抗HIV活性を有していることを明らかにした。さらに、このファミリーの厳密な高マンノース型糖鎖認識能に基づいて、本ファミリーのレクチンはプリオン病等の高感度検出試薬として注目されているニワトリ型モノクローナル抗体の簡易精製用アフィニティーリガンドとしてきわめて有用であることを明らかにした。多機能ポリペプチド性藻類レクチンファミリーに関しては、紅藻カギイバラノリHypnea japonicaレクチンがコアα1-6FucをもつN-グリカンにきわめて高選択的な結合特異性を有することを見出し、本レクチンが高感度癌検出試薬ならびに抗体依存性細胞障害(ADCC)活性を有する高純度抗体医薬の調製に有用であることを示した。1.ヒト大腸癌細胞HT29の海藻レクチンレセプターの単離と構造解析紅藻カギイバラノリおよびトゲキリンサイの各レクチンがヒト大腸癌細胞HT-29の培養細胞の増殖を低濃度で抑制することを認めた。次に、カギイバラノリレクチンの同癌細胞膜レセプターとして、11および33kDaの二つのタンパク質の単離に成功した。同レセプターの構造解析は今後の興味深い課題である。なお、キリンサイレクチンの癌細胞膜レセプターの単離と構造解析については今後の課題として残された。2.トゲキリンサイレクチンの経口投与によるマウス大腸癌の発現抑制機構の解明レクチン投与マウス群と対照マウス群からそれぞれ大腸組織切片を作成し、アポトーシス、細胞増殖抑制および抗酸化作用の有無を免疫組織学的手法を用いて調べた。その結果、アポトーシスは観察されなかったが、弱い細胞増殖抑制能と強い抗酸化能が観察された。したがって、本レクチンの経口投与による大腸癌初期病変の抑制効果は、主として本レクチンの細胞内酸化抑制能に由来することを明らかにできた。本レクチンの抗酸化作用の機構解明が今後の興味深い課題である。一方、大腸癌細胞HT29の培養細胞に対する増殖抑制機構の解明は今後の課題として残された。3.その他早期癌検出試薬として有望であることが判明しているフォルスマン抗原特異的ハネモレクチン(54kDa)のcDNAクローニングに成功した。本レクチンcDNAは834bpの翻訳領域を有し、22残基のシグナルペプチドと256残基のレクチンタンパク質をコードしていることを明らかにできた。レクチンタンパク質の演繹アミノ酸配列の分子量は27,367で、SDS-PAGEでの挙動も考慮して、本レクチンは27kDaサブユニットとして翻訳された後、SS架橋してホモダイマーを形成していることが判明した。応用を意図して、本レクチンタンパク質の大量発現系の確立が今後の課題となった。1.ヒト大腸癌由来培養細胞HT29の海藻レクチンレセプターの同定紅藻トゲキリンサイのレクチン(ESA-2)はヒト癌培養細胞37系列のすべての増殖を抑制することから、本レクチンレセプターがヒト癌培養細胞表面に広く存在する可能性が示唆された。

そこで、まずヒト大腸癌由来培養細胞HT29の本レクチンレセプターを単離・同定を試みた。すなわち、ESA-2との結合反応および非結合反応に付したHT29の各膜標品から調製した膜可溶画分を、それぞれSDS-PAGEおよびウエスタンブロッティングに供し、タンパク質染色、抗ESA-2抗およびビオチン標識ESA-2を用いるレクチン染色に付し、両者の比較からESA-2-レセプター複合体バンドを検出した。同複合体をQIT-MS解析に供し、本レクチンレセプターを同定した。今後、他癌細胞膜における同レセプター分子の存在を調べる予定である。2.固定化海藻レクチンによるニワトリ型モノクローナル抗体の簡易精製法の構築ニワトリ抗体の有用性が注目されているが、ニワトリ抗体は哺乳動物抗体と異なり、抗体精製用リガンドのプロテインGやAに結合せず、その簡易精製法の開発が望まれていた。そこで、ニワトリ抗体の糖鎖を介した簡易精製法を開発することを目的として、6種海藻レクチンおよび7種陸上植物レクチン(市販品)とニワトリ抗体との相互作用を表面プラズモン共鳴法を用いて詳細に解析し、同抗体精製用リガンドとして2種類の海藻レクチンが有望であることを見いだした。さらに、これら海藻レクチンを固定化したアフィニティーカラムを用いることにより、抗体産生ハイブリドーマ上清からワンステップでニワトリ型モノクローナル抗体を高純度に精製できることを認めた。現在、同海藻レクチンのcDNAクローニングを終え、大量発現系の構築に関する研究が継続中である。1.紅藻キリンサイレクチン関係紅藻トゲキリンサイレクチン(ESA-2)およびアマクサキリンサイレクチン(EAA-2)の抗HIV活性を、MT-4細胞を用いるMTT法で調べ、それぞれEC50=105および34nMの同活性をもつことを認めた。しかし、両者ともHIV非感染細胞に対しても細胞障害性を示すことから、それらの有効係数は高くなかった。2.紅藻カギイバラノリレクチン関係これまで不明であった紅藻カギイバラノリの3種イソレクチンの糖結合特異性について、110種類の供試糖鎖に対する結合性を、フロンタルアフィニティークロマトグラフィー法を用いて精査した。その結果、3種イソレクチンとも共通して、ある特定の糖残基を有する糖鎖とのみ、きわめて選択的に結合することを見出した。また、本レクチンの糖タンパク質に対する結合性をBIAcoreを用いて定量的に解析し、先の糖鎖に対する結合特異性を支持する結果を得た。本レクチンに見出された新規の糖鎖結合特異性は、医療をはじめとする種々の分野で活用されることが期待される。本レクチンは多様な生物活性ときわめて強い赤血球凝集活性を示すことから、本科研費研究ですでに明らかにした新手法を用いて、本レクチンの赤血球膜レセプターの同定を試みた。その結果、本レクチンの赤血球レセプターとして種々の生物活性に関与する興味深い糖タンパク質を同定できた。この結果を基に、本レクチンの新しい生物活性の発見が期待される。3.その他ワトリ型モノクローナル抗体は狂牛病等の発病因子である悪性プリオンの早期検出試薬として有用であることが明らかにされているが、同抗体の簡易精製法が未解決であった。
地域住民の共助による高齢者の減災をめざした介入と評価

本研究は「共助による高齢者の減災をめざした介入と評価」をテーマとして行う。北海道内の高齢者クラブ等の地域組織に出向き、集団への啓発とグループワークによる災害の備え(自助)と、災害の発生を想定した地域住民間の共助で減災を目ざす介入研究である。介入後に、減災への認識の高まり、共助の意識の促進について、量的、質的な評価を行い、共助による減災に関する効果的な実施方法を明らかにする。本研究のゴールとして、多地域で活用可能な「共助による高齢者の減災介入プログラム」を作成する。
超分子戦略に基づく可逆的タンパク質性因子受容体活性化のリアルタイムイメージング

本研究では、蛋白質性因子とその受容体に代表される蛋白質間相互作用を標的として、これを制御、解析する化学的な方法論を開発した。さらに生細胞上で受容体との結合部位の同定、及び活性化のリアルタイムイメージングに成功した。さらに自己集合性ケミカルプローブの開発により、世界で初めて細胞内で蛋白質と小分子リガンドとの結合に伴い可逆的に作動する、超分子的方法の開発にも成功した。これらの知見を生かし、細胞内在性の蛋白質を特異的に化学修飾する方法論の開発や、植物ホルモン受容体が引き起こす蛋白質間相互作用の解析方法へと拡張することに成功した。本系では、ケモカインや成長因子などのタンパク質性因子(サイトカイン)に対する内在性レセプターが、いつどこで活性化されるかを解析する技術を開発する事を目標として研究を展開する。本年度は、まずサイトカインの人工機能化技術を模索した。その中で、非共有結合的に機能性分子を融合する方法が、サイトカインの機能を損なわないままに、極めて効率的に人工機能化出来る方法であることを見出した。この方法は、サイトカイン、人工分子の試薬を混ぜるだけで様々な機能性分子をサイトカイン上に提示する事ができ、今後のサイトカイン研究に有用なケミカルバイオロジー的手法としての展開が期待される。また、初年度は、モデルサイトカインリガンドとして、細胞の増殖・成長を制御する上皮成長因子(Epidermal Growth factor, EGF)を選択した。まずはEGFの大腸菌過剰発現系をプラスミドから構築し、これの発現・精製のプロトコルを確立した。ついで、EGFの人工機能化するための化学分子を設計・合成し、これらの分子を用いてEGFの人工機能化を、試験管レベルで最適化する事に成功した。さらに、この機能化EGFを用いて、EGFの受容体である上皮成長因子受容体(EGFR)を生細胞上で選択的に化学修飾する技術を構築した。具体的にはEGFRの過剰発現系をプラスミドから構築し、このモデル細胞を用いて初期的な検討を行った。これらの成果は、次年度以降のEGFRの活性化機構の検出に重要な知見をもたらすものと期待される。本系では、ケモカインや成長因子などのタンパク質性因子に対する内在性レセプターが、いつどこで活性化されるかを解析する技術を開発することを目標として研究を展開する。本年度は、前年度までに確立した上皮成長因子(EGF)の人工機能化と、過剰発現系のEGF受容体(EGFR)を用いた特異的なラベル化の結果をもとに、内在性のEGFRをラベル化することに成功した。具体的には、ウェスタンブロッティングによってラベル化反応を検証し、生細胞上でEGF-EGFRの相互作用に基づいたEGFR特異的なラベル化を実現した。さらに、EGFRの活性化機構について重要な知見として、内在性EGFRがEGFによって活性化され、細胞内に内在化(Internalization)を引き起こす様子を、リアルタイムに蛍光イメージングすることに成功した。これまでもEGFRの可視化は行われてきたものの、そのほとんどは蛍光修飾EGF(サイトカインリガンド側)を用いたものであり、EGFRの動態は間接的なものがほとんどであった。本結果は細胞表層のサイトカイン受容体がいかにして細胞内に取り込まれるかを、内在性の受容体を用いて可視化した初めての例となる。また、本年度は本系の有用性をさらに実証するため、EGFR以外の標的分子として、ケモカイン受容体であるCXCR4を選択した。CXCR4はエイズウイルスの感染の足場となったり、がん細胞上に過剰発現するなど、薬剤標的として近年注目を浴びるターゲットである。このCXCR4のリガンドはSDF1と呼ばれ、ケモカインの代表的な分子であり、過剰発現系等の実績がある。本年度は、このSDFを人工機能化を試験管レベルで達成した。今後、機能化SDFを用いてCXCR4のラベル化、可視化等を目指して検討を重ねる予定である。本系では、ケモカインや成長因子などのタンパク質性因子に対する細胞内在性の受容体が、いつどこで活性化されるかを解析する技術を開発することを目標として研究を展開する。前年度までにモデルケモカインレセプターやサイトカインレセプターの生細胞表層での特異的ラベル化を目的として、リガンドサイトカインの人工機能化と、レセプターの過剰発現系におけるラベル化を達成した。本年度はこれら確立した技術を、抗体をリガンドに据えてその抗原となる細胞膜受容体の特異的ラベル化に成功し、この技術を用いて細胞表層受容体のラベル化サイト同定を行うことで、生細胞表層での抗原・抗体反応の3次元的構造学的知見を得ることに成功した。今後、免疫細胞等に内在的に発現しているケモカインレセプターを標的としたラベル化、およびその可視化を達成し、細胞遊走等の生理応答におけるレセプターの局在変化などを詳細に解析する予定である。さらに標的としているレセプターは様々な疾患に関与することから重要な薬剤標的ともなっており、特異的ラベル化によって得られるバイオセンサーが、薬剤の細胞系スクリーニングにも展開可能となることが期待される。本研究では、モデル系として様々なサイトカインー受容体の組み合わせを用いて、これらの相互作用をリアルタイムにイメージングする技術の確立を目指してきたが、その可視化のみならず、本年度はサイトカインや抗体と受容体との相互作用の詳細を解析する技術にも展開することができた。