hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
加齢によるNO産生遊離機能低下の機序解明と内皮細胞機能改善の試み

一方,PGI_2の遊離量は老齢ラットで有意に増加した.そこでそれらの機序について検討した.1)老齢ラットにおけるNO産生遊離機能低下の機序の検討:eNOSとiNOSの発現量に加齢変化は認められなかった.この結果は,老化に伴うNO産生遊離量低下にはNO合成酵素発現量以外の機序が関与していることを示唆している.2)PGI_2の遊離量増加と比例してCOX-1,COX-2の発現量増加が認められた.現在,上記以外NOの産生遊離機能低下の機序およびPGI_2の遊離量増加の意義,加齢により低下するNOの産生遊離機能改善を試みている.加齢に伴い内皮細胞機能が低下していること,この機能の低下が加齢に伴う循環器疾患の発症や進展に深く関わっている可能性をH15年度までの研究により明らかにした.しかしながら,予備実験において,最近抗動脈硬化作用で注目されている赤ワイン抽出物質(アルコール除去ポリフェノール化合物:RWPC)が,若齢のみならず老齢ラットに対しても冠循環改善効果を示すことを見出した.そこで,16年度は,RWPCを用いて内皮機能改善の試み,および食事療法に焦点を当てた研究に着手した.【方法】1.RWPCの血管平滑筋および冠循環に対する急性効果実験:本実験には3(若齢)と27ヵ月齢(老齢)のFisher 344 rat(♂)を用いた.Langendorff式摘出心灌流標本および摘出胸部大動脈標本を作製し,冠循環および血管平滑筋収縮弛緩反応を検討した.2.RWPCの慢性投与による血管平滑筋弛緩反応および冠循環改善効果:RWPCの慢性投与効果を検討するため,本実験には3カ月齢F344ラットを用い,通常の飼料,高コレステロール飼料,高コレステロール+RWPC飼料で2および3ヶ月間飼育した後に,血管反応性および冠循環について検討した.【結果】急性投与実験結果:RWPCは,coronary flow(CF)を濃度依存性に増加させた.CF増加の程度は,若齢に比べて弱いが老齢ラットでも観察された.また若齢老齢いずれの摘出大動脈平滑筋に対しても濃度依存性弛緩反応を惹起した.そこで,RWPCによるCF増加および弛緩反応の機序を検討した.その結果,若齢ではNO,PGI_2,EDHFの因子が血管拡張作用に関与しているのに対し,老齢ラットの拡張作用にはEDHFのみが関与していることを見出した.慢性投与実験結果:現在,RWPCの2および3カ月間の慢性投与実験を行っており,組織標本,血小板凝集反応に対する作用も含めて興味ある知見が得られつつある.
胚子発生の制御機構に関する発生工学的研究

1)卵成熟と受精の制御A)卵胞液から卵丘膨化を促進させる熱に安定な物質を分離した。また本物質は精子核の膨化に対しても促進的に作用することを明らかにした。B)c-mos遺伝子欠損マウスの卵成熟と受精について解析するとともに、c-mos遺伝子欠損により単為発生が誘起されることを明らかにした。また、遺伝子ターゲット法によりアクロシン遺伝子欠損マウスを作製した。このようなマウスから得た精子は透明帯を通過し卵子に侵入するものの、受精成立に要する時間が長くなることを明らかにした。C)膨化卵丘に含まれる液状成分に受精促進作用のあること明らかにした。2)初期卵割の制御A)プロジェステロンにより単為発生の誘起されることを明らかにした。また、XX型胚とXY型胚を凝集したキメラ胚は雄になるが、組織学的に解析しキメラ胚における性腺の分化過程を明らかにした。B)エンドセリン遺伝子欠損マウスを作製しホモ化したものでは頭蓋顔面に奇形を誘発することを明らかにした。C)ラット初期胚の内部細胞塊に由来する多分化能細胞株を樹立した。3)初期胚保存の制御A)マウス初期胚の凍結保存条件、特に凍結に用いる溶液や平衡時間について解析し、胚保存の最適条件を決定した。また、超急速凍結法によりラットの受精卵の凍結保存に成功した。1.マウス初期胚における着床前の発生速度におよぼす性差の影響個体発生過程における表現型上の性の分化は、すべて生殖腺の分化に伴う二次的なものであると考えられているが、その遥か以前の初期胚において既に表現されていることが本研究によって示唆された。すなわち、体外受精に由来するC57BL/6Nマウス胚を用いて、Y染色体上の遺伝子であるZfyの塩基配列をPCR法で特異的に増幅することによって、正確な性の判定ができることをまず確認し、次いでこの方法を用いて桑実胚から胚盤胞への発生時期と胚の性との関係を検討した。その結果、速、中間、遅胚における雄胚の比率はそれぞれ、76.9,52.2,42.3%であり、発生速度の早い胚において雄胚の割合が有意に高く、一方、発生速度の遅い胚では雌胚が有意に多いことが明らかになった。この性比の偏りは、胚移植実験によっても確かめられた。2.卵成熟過程における卵母細胞・卵丘細胞複合体の構造変化の解析雌マウスに性腺刺激ホルモンを投与して卵母細胞・卵丘細胞複合体の構造変化を誘導し、卵核胞崩壊とそれに続く減数分裂の過程における変化を組織化学的に検討した。その結果、強く陰性に荷電しコロイド鉄に結合する物質が卵胞組織、特に卵丘の細胞間に出現することが見出された。グリコサミノグリカンと推定されるこの物質は、減数分裂開始時期に顆粒膜細胞層と卵丘との間に蓄積し、それにともなって卵丘は顆粒膜細胞層から離れて行くので、卵母細胞を卵胞内の抑制機構から開放し、卵成熟を誘導する機構として重要な役割を果たしているものと考えられる。C)遺伝子ターゲット法によりアクロシン遺伝子欠損マウスを作製した。D)膨化卵丘に含まれる液状成分に受精促進作用のあることを明らかにした。B)XX型胚とXY型胚のキメラ胚は雄になるが、組織学的に解析し、キメラ胚における性腺の分化過程を明らかにした。C)エンドセリン欠損マウスを作製し、ホモ化したものでは頭蓋顔面に奇形を誘発することを明らかにした。D)ラット始期胚の内部細胞魂に由来する多分化能細胞株を樹立した。

3)始期胚保存の制御A)マウス初期胚の凍結保存条件、特に凍結に用いる溶液や平衡時間について解析し、胚保存の良好な保存条件を決定した。超特急凍結法によりラットの受精卵の凍結保存に成功した。
高強度光電場に駆動される電子・正孔ダイナミクスの理論研究

密度汎関数理論で評価した物理量を使った独立粒子近似の電子ダイナミクスコードをベースに、コードの開発の理論の構築を進めた。遂行内容は横緩和の導入とそれに関連した理論構築、バンド内電流の各バンドからの寄与への分解である。対象コードへの定款和金時に基づく横緩和の導入に先立って、電場の下での量子ダイナミクスシミュレーションに横緩和を導入する理論の構築を行った。横緩和は、長さゲージと速度ゲージにより、その表式が異なり、それに伴って同じ緩和の時定数に対しても、結果が異なる。両速度ゲージに対する表式を導出し、その物理的意味について検討を行った。本理論に従って横緩和項を加えたコードを開発して計算を遂行した。横緩和を導入したことにより、バンドギャップよりも高い光子エネルギーの高次高調波発生のシミュレーションをGaSeを対象に行うと、対応する実験とコンシステントな角度依存性を再現することが分かった。現在実験グループとの共同研究の論文を準備中である。対象コードに、バンド内電流をバンド毎への寄与へ分解する機能を実装し、ペロブスカイト結晶CsPbCl3からの高次高調波発生過程の計算結果を解析した。バンド内電流を、光励起に伴う一時的な占有数の時間変化とバンド勾配の積へ分解し、どちらが高調波のスペクトルを決めるうえで重要な役割を演じているかを明らかにした。計画していた、密度汎関数理論で評価した物理量を使った独立粒子近似の電子ダイナミクスコードをベースにしたコードの開発は順調である。関連する理論についても、計画通りに開発ができた。計画通り次年度は、電子・正孔相互作用を取り込んだコードの開発を行い、典型的な固体におけるシミュレーションを遂行する。特に電子・正孔相互作用の強さ(逆誘電関数により決まる)を変えたときに、高調波スペクトルがどのように変わるのかを調べる。さらに、こうしたスペクトルの変化がどのように直感的に理解できるのかを明らかにするため、解析を行う。実験家との共同研究を進め、実際実験条件における、固体からの高次高調波スペクトルにどういった物理過程が寄与しているのかを明らかにする。海外旅費の航空券代と物品費が想定したよりも抑えられたため。次年度使用額は、海外旅費、物品費に充てる。
土壌病原菌の寄生性分化の分子機構に関する研究

1。トマト萎ちょう病菌の病原性因子の検索トマト萎ちょう病菌は、フザリン酸とともに、病原性関連因子として多くのペクチナーゼを産生する。その一つとしてポリガラクツロナーゼ性状について調べた結果、本菌のポリガラクツロナーゼはシトラスペクチンの誘導により、容易に細胞外に分泌され、ペクチン濃度1.02.0%が最適で、静地培養では3040日目に活性が最大になることが判明した。また、F.oxysporum f.sp lycopcrsici880621a-1株から変異原処理により、原株に比べて非常に病原性が弱い弱病原性変異株OW932を作出し、SDS-PAGEによる総タンパクの分析および等電点電気泳動と活性染色によるアイソザイム分析により比較を行った結果、変異株OW932にはポリガラクツロナーゼのバンドが殆ど見られず、原菌の886021a-1との差が認められた。ポリガラクツロナーゼは病原性関連因子の一つと考えられている酵素であり、この差が認められたことは非常に興味が持たれる。2。トマト萎ちょう病菌の形質転換による薬剤耐性菌の作出植物病原菌Fusariumoxysporumの寄生性分化に関する研究を行うため、トマト萎ちょう病菌F.oxysporum f.splycopersiciの薬剤耐性マーカーとして抗生物質Hygromycin B耐性遺伝子の導入を試みした。Hygromycin B phosphotransferase gene(hph gene)を含むプラスミドpHL1をPEG法によりトマト萎ちょう病菌プロトプラストに導入し、Hygromycin B耐性の12菌株を得た。これらの菌株の中から、PCR法による解析においてhph geneの導入を確認し、さらに耐性が強く、トマトに対して強い病原性を示す菌株のR7-HygBを得ることに成功した。現在、キウリつる割病菌F.oxysporum f.sp.cucumcrinumへのプラスサイジンS耐性遺伝子の形質転換中である。1。2。
摂動磁場コイルで形成した閉磁気面によるトカマク・プラズマの立ち上げ改善

将来の超伝導大型トカマク装置では磁束変化速度が制限されるため、外部磁場コイルで形成した閉磁気面を利用して、プラズマ電流立ち上げに必要な周回電圧の低減することを目的とした。研究室に既存の小型トカマクの真空容器外側に摂動磁場コイルを取り付け、垂直磁場コイルと組み合わせて閉磁気面を形成できるようにした。水平誤差磁場が予想より強くその補正が不十分であったため、外部コイルによる閉磁気面の有無での周回電圧の変化は明確ではなかったものの、電子サイクロトロン共鳴(ECR)を用いた予備電離がなければトカマク放電が開始しなかったのに対して、閉磁気面の初期配位でECR無しでもプラズマ着火の効果が確認できた。本研究で使用予定の小型トカマク装置のトロイダル磁場コイルの通電試験と、真空容器の排気テスト・リークテストおよびベーキングを実施した。また、完成間近の小型トカマク装置において、マイクロ波発振源(2.45 GHz, 4.5 kW)を用いた電子サイクロトロン共鳴(ECR)よるプラズマ生成を実際に確かめた。さらに、55 kW誘導電動機に弾み車を組み合わせたフライホイール電源を、コイル電流制御のDCチョッパと発電機制御のインバータで構成して、1秒間を超えるトロイダル磁場発生し、その間ECRプラズマを維持できることも実証した。小型トカマク装置が未完成なので、摂動磁場コイルの検討を深化させた。垂直磁場と組み合わせてコイル系のみで形成される閉じた磁気面形状を磁力線計算により調査するとともに、3次元MHD平衡解析コードVMECを使用して、プラズマ着火後のMHD平衡の時間発展についても調べ、摂動磁場コイル設計の最適化を行った。また、実験で得られるMHD平衡を再構成するための磁気センサーである磁束ループと磁気プローブをリミター構造物と組み合わせ、真空容器内に設置するのに支障がないことを確かめた。プラズマに電流が流れているMHD平衡についてVMECで計算すると解釈に悩む解が得られる場合があったため、軸対称な配位で2次元MHD平衡解析コードTSCを用いた計算と比較を行い、VMECを用いた計算の妥当性を検討した。4セットのポロイダル磁場コイルを巻き、トカマク放電の調整を行った。その結果、2.45 GHz, 2 kWのマイクロ波による電子共鳴で生成したプラズマを火種として、プラズマ電流:約2 kA、放電時間:2秒程度のトカマク放電を実現した。しかしながら、研究室で製作したポロイダル磁場電源に用いているIGBTが壊れることを繰り返し、それを回避する保護回路を加える改良を行った。再現性のよいプラズマ放電を目指して、放電制御検討のために運転シミュレータを作成した。モデルでは、プラズマ・真空容器・制御コイルの磁束結合を考慮して、連立回路方程式の時間発展を求める。プラズマは導体リングとして扱い、トカマクプラズマの力学的なバランスを記述する細いプラズマリングの平衡モデルを適用した。プラズマ位置は、真空容器の誘導電流・外部コイル電流の生成する磁場を計算し、各方向の電磁力が最小になるエネルギー最小点として決定した。シミュレータによる評価により、制御コイル電源に必要な電圧・電流仕様を決定した。また、磁気センサーとフィラメント電流近似法によるプラズマ位置の高速演算法を検討した。これを実験解析に適用し、算出されたプラズマ位置と高速カメラの発光強度を比較することで、精度の確認を行った。実験を行う小型トカマク装置がH27年末にほぼ完成したが、研究室で製作したポロイダル磁場電源に用いているIGBTが壊れることを繰り返し、それを回避する保護回路を加えるのに手間取り、トカマク放電の調整があまり進まなかった。また、トロイダル磁場コイル通電に起因する水平誤差磁場が予想より大きく、水平磁場コイル電流による補正が十分できていない。放電時間は2ms程度まで伸びたものの、プラズマ位置のフィードバック制御はできておらず、放電の再現性が得られていないため。将来の超伝導大型トカマク装置では磁束スイングの速度が制限され、印加できる周回電圧が低くなる。外部摂動磁場コイルで形成した閉磁気面を利用して、プラズマ着火・電流立ち上げに必要な周回電圧を低減することを目的とした。ポロイダル磁場がほぼゼロとなる箇所から放電が開始する通常のプラズマ立ち上げでは、初期プラズマが小さいために、電流分布が中心尖塔化して垂直位置不安定性の誘発や縦長断面へ上下に引き伸ばす形状制御が妨げられる。有限な真空磁気面を利用して大きな初期プラズマが生成できれば、プラズマ電流の中心尖塔化を回避できる。研究室に既存の小型トカマクの真空容器外部に摂動磁場コイルを取り付け、垂直磁場コイルと組み合わて閉磁気面を形成できるようにした。ポロイダル磁場コイル電源に用いたIGBT素子が通電中に壊れるのを回避する保護回路を加えて整備し、プラズマ位置のフィードバック制御を調整した。トロイダル磁場コイルの設置誤差に起因する水平誤差磁場が予想より強く、その補正が不十分であったため、外部コイルによる閉磁気面の有・無での周回電圧の変化は明確ではなかったものの、電子サイクロトロン共鳴(ECR)を用いた予備電離がなければトカマク放電が開始しなかったのが、閉磁気面を形成すればECR予備電離無しでプラズマが着火する効果が確認できた。

摂動磁場コイルは非軸対称な磁場を生成するが、電流の立ち上げでプラズマによる軸対称磁場が支配的になった時刻で、真空容器内に設置した14本の磁束ループ基づくMHD平衡解析からプラズマ電流分布の中心尖塔化の指標である内部インダクタンスを評価を試みたが、プラズマ電流駆動に用いている鉄芯の磁性体の効果をうまく取り込めていないため、精度よく評価できなかった。また、プラズマ内部に挿入する磁気プローブ列を用いたポロイダル磁場分布計測からのプラズマ電流分布の評価も、今後の課題として残った。将来の超伝導大型トカマク装置では磁束変化速度が制限されるため、外部磁場コイルで形成した閉磁気面を利用して、プラズマ電流立ち上げに必要な周回電圧の低減することを目的とした。研究室に既存の小型トカマクの真空容器外側に摂動磁場コイルを取り付け、垂直磁場コイルと組み合わせて閉磁気面を形成できるようにした。水平誤差磁場が予想より強くその補正が不十分であったため、外部コイルによる閉磁気面の有無での周回電圧の変化は明確ではなかったものの、電子サイクロトロン共鳴(ECR)を用いた予備電離がなければトカマク放電が開始しなかったのに対して、閉磁気面の初期配位でECR無しでもプラズマ着火の効果が確認できた。実験を行う小型トカマク装置が以下の理由で平成26年度中に完成しなかったため。1)トーラス中心部に鉄芯と1次側コイルのスペースを確保するために、トロイダル磁場コイルとして、平角銅線をエッジ巻きし、トーラス外側部だけで支持する構造としたところ、定格通電でポリカーボネート製支持材を固定するリング状の天板がコイルに働く電磁力でめくれるような動きをし、ポリカーボネートのボルト穴のネジ溝にひびが入った。この問題に対処するために、天板に直交するリングとリブを溶接付けする必要があり、2ヶ月以上の中断があった。2)そのため、マンパワーを投入できる春休みに、トロイダル磁場コイルと真空容器を一旦分解し、鉄芯を加えて装置を組み立てることができなかった。トロイダル磁場コイル通電に起因する水平誤差磁場が想定したものより強いので、誤差磁場の3次元分布を詳細に測定する。その結果に基づいてトロイダル磁場コイルの設置位置調整を行い、誤差磁場の補正を軽減して、放電開始の運転領域を拡大させる。作成した運転シミュレータによりフィードバック制御の利得を決定し、実際の放電に適用し、利得の最適化を実施する。その後、誤差磁場コイルで形成した閉磁気面配位でのプラズマ電流の立ち上げを行い、プラズマ断面形状の時間発展を磁気センサーとフィラメント電流近似法によって詳細に調べ、高速度カメラの映像と比較する。核融合学摂動磁場コイルを特注で製作して真空容器外部に取り付けを行う。トロイダル磁場コイルと同様に、巻線は平角銅線をエッジワイズ曲げで製作する。小型トカマク装置が完成次第、実験を開始し、外部コイルによる閉磁気面の有・無で周回電圧は変化するかどうかを調べる。周回電圧は近似的に、プラズマ境界に一番近い磁束ループの電圧で検出できる。さらに正確には、MHD平衡解析で再構成されたプラズマ境界のポロイダル磁束変化率から、周回電圧を算出する。プラズマ着火の直後は磁束ループで周回電圧を直接計測し、電流の立ち上げでプラズマによる軸対称磁場が支配的になれば、MHD平衡計算を優先する。閉磁気面の位置や大きさにより、初期プラズマの生成位置と大きさが変化する事を確認する。初期プラズマ生成の様子は、接線方向の高速カメラにより可視光領域で観測する。
銅触媒による二酸化炭素を用いるアルケン及びアルキンのボリル化／カルボキシル化

N-ヘテロ環カルベン銅触媒と塩基であるLiOtBuを使うことによって、ビスピナコレートジボランと二酸化炭素を不飽和基質に導入し、温和な条件下で選択的に新規β-ボララクトン誘導体を合成することに成功した。これはアルキンやアルケン類に簡易に二酸化炭素を導入する、ボラカルボキシル化反応の初めての例である。また今回の反応は、多官能基化された有機化合物の合成に対し、広い基質適応範囲と位置・立体選択性を示した。また、いくつかの反応中間体の単離、構造解析を行うことで反応メカニズムを明らかにした。本研究はアルキンやアルケン類に二酸化炭素およびホウ素化合物を結合させ、カルボン酸を含む有機ボロン化合物を触媒的に合成することを目的とする。昨年度は、銅触媒を用いてピナコールボランB2(pin)2と二酸化炭素をアルキン類に触媒的に導入することに成功した。様々なタイプのN-ヘテロサイクリックカルベン銅触媒を合成し、これらの触媒活性、ならびに塩基、溶媒、温度、圧力等の反応に及ぼす影響を系統的に調査した。反応条件を最適化し、様々なアルキン類に対してこの反応を適用したところ、多くのアルキン類に対して位置・立体選択的にカルボン酸およびボラン類を導入でき、多くの新規不飽和ボララクトン誘導体の合成に成功した。さらに、これらの生成物は鈴木ー宮浦カップリング反応に適用することが可能である。いくつかの反応中間体の単離、構造解析を行うことで反応メカニズムを明らかにした。これらの成果は国際的な一流誌であるJACS誌に掲載され、SYNFACTS誌にハイライトとして紹介された。さらに、アルキンのみならず、上記銅触媒を用いて二重結合を有するアルケン類にも二酸化炭素、ホウ素化合物を導入することに成功し、現在基質適用範囲を検討中である。以上、昨年度は銅触媒によるアルキン、アルケン類のボラカルボキシル化反応について検討した。用いる二酸化炭素や銅触媒、そして基質は、いずれも安価で容易に調製できるものであり、また今回開発した反応は一度に二つの官能基を選択的に導入できる反応で、多くのメリットがある。これらの成果は二酸化炭素を利用した新たな有用物質の開発に貢献するものである。2012年度の研究計画にのっとって、新たな銅触媒の開発、アルキンのボラカルボキシル化反応の開発などを行った。アルケンのボラカルボキシル化反応にも着手し、現在進行中である。2013年度はアルケンのボラカルボキシル化反応を中心に検討する。昨年度開発した手法をもとに、銅触媒を用いてB2(pin)2および二酸化炭素からアルケンの二官能基化を検討する。また得られるボラカルボン酸のさらなる反応性も調査し、この手法の有機合成への適用を検討する。さらに、キラルヘテロサイクリックカルベン配位子を有する銅触媒を用いて、アルケンの不斉ボリル化、カルボキシル化反応にも取り組む。さらに得られた生成物から光学純度の高い複雑な分子や天然物分子などへの変換も試みる。また、量論反応による反応中間体の捕捉や構造解析を通じて反応メカニズムを明らかにする。これらの結果より触媒の構造と得られる生成物の関係を評価する。次年度使用額が生じた理由:研究が順調に進んだ為
行政処分に対する継続的権利救済に関する研究

本研究は、行政の継続性・安定性と行政による権利侵害に対する救済の両立を達成する行政法理論を提示する、という目標のもとに行われた。平成24年度は、不可争力理論を位置づけ直し、公定力理論とともに行政処分の効力論を再構成することが試みられた。《行政手続の再開》については、申請者がこれまでの研究で明らかにした総論にあたる部分(一般行政手続法)に加えて、継続的な権利救済モデルの精緻化のために、各論にあたる部分の研究を行った。具体的には、社会法、租税法の領域における手続の再開を扱った。この結果、社会法および租税法は、一般行政手続法の特別法として位置づけられるために、一般行政手続法よりも国民・市民の権利保護にとって手厚いことが如実に明らかになった。また、ドイツでは、1960年に義務付け訴訟が法定され、1976年に行政手続の再開の規定を含む(一般)行政手続法が制定されるまでの期間、義務付け訴訟を通じて実質的に行政手続の再開の機能が果たされていたことを立法史の資料に遡りながら実証した。これにより、ドイツにおける《行政手続の再開》が、行政手続法制定以前より、行政法上の「不文の法規(ungeschriebener Rechtssatz)」として認められていたことが確認できた。以上で得られた成果をもとに、不可争力理論を位置づけ直し、公定力理論とともに行政処分の効力論を再構成することを試みた。わが国において重厚な先行研究が存在する公定力理論と、上記で検討した不可争力理論を対応させる形で、行政処分の効力論を複合的に配置し、各効力論によってではなく行政処分全体として行政の継続性・安定性と行政による権利侵害に対する救済の両立を達成する行政法理論を実現する、という理論的見通しを示すようつとめた。本研究は、「行政処分に対する継続的権利救済」という構想のもと、行政の安定性・継続性を体現する不可争力と国民・市民の権利保障を両立させうる行政法解釈の指針を提供する理論構築を目指すものであった。具体的には、《行政手続の再開》及び《義務付け訴訟》の活用を図ることにより、不可争力概念を再構成し、一時的な権利救済ではなく継続的な権利救済を実現することを目的としていた。研究初年度である平成23年度は、理論的基盤を構築する作業を先行させ、《行政手続の再開》及び《義務付け訴訟》の制度設計の理論モデルの構築を行った。《行政手続の再開》については、総論にあたる部分(一般行政手続法)に加えて、継続的な権利救済モデルの精緻化のために、社会法、租税法の領域における手続の再開について文献調査を行った。今年度の大きな収穫として、一般行政手続法の立法過程における議論状況を調査したことがあげられる。すなわち、ドイツでは、1960年に義務付け訴訟が法定され、1976年に行政手続の再開の規定を含む(一般)行政手続法が制定されるまでの期間、義務付け訴訟を通じて実質的に行政手続の再開の機能が果たされていたことが明確になった。ドイツにおける《行政手続の再開》が、行政手続法制定以前より、行政法上の「不文の法規(ungeschriebener Rechtssatz)」として認められていたことが確認できただけではなく、義務付け訴訟が用いられていたということは、《義務付け訴訟》の検討を行おうとする本研究にとって大きな進展である。このような作業を踏まえて、行政の継続性・安定性と行政による権利侵害に対する救済の両立という矛盾する要請を架橋しうる行政法上の諸概念の構築の作業に取り組んだ。この作業の手がかりとして、義務付け訴訟の新たな活用可能性を考察するのに適切な最近の最高裁判例の評釈を口頭発表で行った。研究初年度である平成23年度は、本研究にとっての基盤となる作業、すなわち、文献調査を中心として計画していたところ、本研究にとって必要な文献の収集、読み込み、整理をほぼ終えたため。

研究最終年度となる平成24年度は、本研究の最終的目標、すなわち、行政の継続性・安定性と行政による権利侵害に対する救済の両立という矛盾する要請を架橋しうる行政法上の諸概念を構築し、こうした要請を両立させうる行政法理論を提示する。その際、より一般的な議論に耐えうる概念、理論を提示するようにつとめる。そのために、平成24年度前半は、概念、理論の構築に集中し、平成24年度の後半は、定立した概念、理論に関する論文を執筆するとともに、積極的に研究会等でも報告する。
フラクタル次元を適用した亀裂性岩盤の個別要素解析

岩盤には節理を始めとして、いろいろな成因形態を有する不連続面が存在する。従って、岩盤の強度・変形特性は岩石ブロックの物性とそれを取り囲む割れ目特性とによって支配される。ここでは、割れ目を定量的に表示するためにフラクタル次元解析を導入するとともに割れ目で区切られた岩石ブロックの挙動の解析に個別要素法の適用を図っている。亀裂性岩盤の節理の大きさと分布をビデオならびにカメラなどで現地観測して、2次元ならびに3次元分割手法を新たに開発した。また岩石供試体の割れ目の粗さ形状はレーザー変位計による計測を実施し、パーソナルコンピューターの画像処理システムを構築して、データベース化した。これらの基礎データに基づいて、割れ目の粗さ形状をフラクタル次元やパワースペクトル解析により、複雑な粗さ形状の定量化に明るい見通しを得た。上記の割れ目を有する岩石の室内一面せん断試験や圧縮試験を実施して、強度、応力-ひずみ、ダイレイタンシー、接触圧、接触面積などの割れ目物性と粗さが大いに関係することを明示したが、フラクタルと割れ目物性の関係についてはさらなる検討が必要である。一方、従来の岩質特性にのみ注目した連続体的取扱いに代わって、不連続性を考慮した解析が注目され始め、解析における不連続性の定量的表現が重要になってきた。個別要素法は割れ目で区切られた岩石ブロックをそれぞれ要素として解析できるので、割れ目データを直接要素分割に活かし得る特徴をもっている。ここでは個別要素法の拡張、割れ目物性と解析に用いる力学定数の検討、動的問題への適用などを検討した結果、個別要素法のたしからしさは実証されたものの、実地盤への適用には問題が残った。加えて、各要素の自由な大変形を許しながら要素間の連続性を保持できる新たな解析手法として流動要素法を提案し、この解析法の亀裂性岩盤への適用を図る基礎を築いた。
わが国の実験動物遺伝子資源の国際的有効利用のための情報システムの確立

申請時の本研究班の研究目的は、1.すでに公表されている実験動物の系統保存情報をコンピュータに入力して一元化し、保存中の系統を新たに調査し、データベース化する。2.凍結保存卵の情報を収集し、データベース化する。3.「データベースを容易に検索できるシステム」と「データ提供者が新しいデータを容易に入力・修正できるシステム」を開発し、初期段階では研究者へはフロッピ-ベースでの情報提供と新しい情報の収集を図る。4.最終的にはオンライン化を図り、国外への提供を図る。5.特殊な系統については、動画として提供できるよう試みる。であった。平成4年に総務庁の行政監察結果に基づく勧告により、現在4つの省庁所管の組織で行われているデータベースを国際的にも通用する統一的な実験動物のデータベースに構築するための連絡協議体制の整備と組織的な連携方策の検討が求められた。本研究班は本研究班以外の実験動物データベース構築を行っている4つの組織の代表者と協議し、国際的にも通用する統一的な実験動物のデータベースの構築を共同で行うこととなった。この協議によって得られた合意は、当初の本研究班の研究目的を逸脱するものではなく、研究規模が拡大されまた、充実されるものとなったが、本研究の目的はほぼ完成の域に達した。データベースは、継続的なものであるので今後の研究の継続が望まれる。本年度は当初の予定通り次のことが審議・実行された。1.日本実験動物協会、ヒューマンサイエンス振興財団でそれぞれ行われている実験動物のデータベース化の統合については、それぞれの団体で調査項目に特殊性があるので、日本実験動物協会は生産者を中心に、ヒューマンサイエンス振興財団は疾患モデル動物を中心に、本研究班は大学などの研究機関を中心に調査することなった。この三者のアンケート調査の共通項目を整理した。2.アンケート調査票について、具体的に作成され、来年度早々に調査を行うこととなった。3.凍結保存卵の調査については、すでに調査が行われている知的財産研究所の報告は公表を前提にしていないので、再度本研究班は調査を行うことが決められた。4.具体的な調査方法は、がん特別研究費で収集されているデータ並びに国立遺伝学研究所が所有するデータを用いて動物の所有者に追加・訂正を求めること。また、これらの資料に記載されていない研究機関のリストを作成し新たに調査を行うこととなった。5.来年度開発予定のフロッピーディスクによる検索はPC98,MAC,IBMの3機種で行えるようにすること。未経験者と経験者が使用する2種のソフトウェアを開発することとなった。6.ネットワークによる検索については、班長の所属する動物実験施設がキーステーションになり、PC98,MAC,IBMの3機種が対応できるようなソフトウェアを開発することとなった。であった。本年度は当初の予定を変更し、行政監察局の勧告に基づき、データベースの作成・検索等を一元化することとした。1.日本実験動物協会、ヒューマンサイエンス振興財団でそれぞれ行われている実験動物のデータベースの一元化については、それぞれの団体で調査項目に特殊性があるので、日本実験動物協会は生産者を中心に、ヒューマンサイエンス振興財団は疾患モデル動物を中心に、本研究班は大学などの研究機関を中心に調査することを決めるために、本班会議に出席を求め、一元化することが合意された。2.アンケート調査票について、具体的に検討されつつあり、細部に亘る内容について検討中である。アンケートの調査は来年度早々行うこととなった。3.最近全国各地で行なわれている遺伝子導入動物の調査も含めることが決められた。4.具体的な調査方法は、がん特別研究費で収集されているデータ並びにヒューマンサイエンス振興財団が所有するデータを用いて、調査を行うこととなった。5データは理化学研究所の大型コンピュータに入力され、情報の提供は理化学研究所で行なうこととなった。6班長の所属する動物実験施設はサブキーステーションとして、活用されることとなった。7PC98,MAC,IBMの3機種が対応できるようにすること、未経験者と経験者が使用する2種のソフトウェアの開発については、現在進行中である。
北アメリカ大陸における第3紀起源温帯植物群の集団生物学並びに分子系統学的,研究

2.サトイモ科はLysichitum,Symplocarpus,Acorusの3属、ヤマイモ科はDioscorea属のrbcLの塩基配列が決定された。すでにAcorusは単子葉植物群の中で極めて原始的なグループに属することが判明している。ヤマイモ科のオニドコロに関しては、phosphoglucoisomerase遺伝子座のcDNA全長の塩基配列を決定した(寺内、河野)。3.双子葉植物の中では、(i)ユキノシタ科、アジサイ科などの主要な第3紀温帯要素に関して北米産、日本産の属に関してDNAサンプルが採集され、rbcL,matKなどの遺伝子の解析が行われた。その他20属以上の第3紀要素植物群に関してもDNAサンプルの採集が行われた(D.Soltis,P.Soltis、河野、高須)。(ii)アブラナ科植物の中では、Arabis属のハクサンハタザオ8系統のadh遺伝子2.3kbの塩基配列を決定した。種内変異として61のヌクレオチドと25の挿入・欠失の多型を検出し、ヌクレオチド変異は全領域について0=0.0055と推定された。ハクサンハタザオとシロイヌナズナの塩基配列結果の比較を行ったところ、種内変異としては非同義置換が多く、同義置換が少ないが、種間においては同義置換が多く、非同義置換が少ないという結果を得た(宮下)。高等植物のミトコンドリアゲノムには、進化上重要な構造変異が集団間、集団内のレベルで高頻度で生じており、植物分子系統学の新たなマーカーとして有望視されているが、ダイコンとヒマワリのミトコンドリアゲノムの構造変異の解析を行い、雄性不稔現象との関連が検討された(寺地)。(iii)東アジアに固有なキク科シオン連ヨメナ属および日本産シオン属から遺伝子重複(6PGDH)が発見されたので北米東部の林床性シオン属植物との比較解析が進められている(森田)。DNA多型のデータから遺伝的変異の保有機構解析のための統計的解析方法の開発が行われた。また、分子進化の一定性を検定する方法、DNA配列間の進化的距離の不偏推定値を得る方法、系統樹を作成するために有効な進化的距離を推定する方法、および自家不和合性遺伝子座の遺伝的変異量を推定する方法を開発した(田嶋)。(1)ユリ上目(Liliiflorae)植物の内、Asparagaceae-Polygonatae連、Convallariaceaeに属する主な属中、Prosartes(2種),Streptopus(1種),Disporopsis(1種),Disporum(2種),Clintonia(1種),Convallaria(1種),Maianthemum(1種),Smilacina(1種)のrbcL遺伝子のsequencingを行った。その結果、従来Disporum属の亜属とみなされた北米産のProsartesはすべてStreptopus属などに近縁で、まったく独立属として取り扱うのが妥当であるとの結論に達した。一方、Lilialesの北米固有属Uvulariaceae,Uvularia(全5種)は、アジアのDisporum属に最も近縁出あることが明らかとなった。

(2)rbcLに関してはTrilliaceaeの全6属のsequenceが決定されたが、ScoliopusとMedeolaの2属はエンレイソウ科には属さず、他のユリ科植物群のいずれかにむしろ近縁であることが判明した。(3)Melanthiales,Heloniadae連の9属は極めて異質性の高いグループで、極めて類縁性と起源の異なる植物群から構成されることが判明した。(4)この他、狭義のLiliaceaeの18属と、ヒガンバナ科のLycoris,Crinum,LiliifloraeなどのrbcL遺伝子のsequencingが完了した。これによって、北半球の北米並びに北東アジアに分布するLiliiflorae全体の系統と類縁関係の解析が今後飛躍的に進展することが期待される。(5)サトイモ科はLysichitum,Symplocarpus,Arisaema,Acorusの4属、rbcLのsequencingが進行中であり、すでにAcorusは単子葉植物群の中で極めて原始的なグループに属することが判明している。以上は日本側メンバーの他、アメリカ側のD.Whigham,F.H.Utech両博士の協力の下に達成できた成果である。(6)双子葉植物の中では、D.Soltis,P.Soltis両博士の協力の下に、ユキノシタ科、アジサイ科などの主要な第3紀温帯要素に関して北米産、日本産の属に関してDNAサンプルの採集が進められ、目下解析が進行中である。アブラナ科植物の中では、Arabis属、Cardamine属の2属に集中してサンプルの採集が行われ、Arabisに関しては主としてADH遺伝子の解析が進行中である。
下請負人の法的地位の今日的課題

現代社会においては、直接の契約当事者以外の者が関連しながら、複雑で立体的な法律関係を作り出していることは少なくない。本研究では、請負契約におけるそのような関与者である「下請負人」に焦点を当て、その者の法的地位について検討を行った。下請負人は、元請負契約においては直接の当事者ではなく、立法過程においても必ずしも意識はされていなかったが、多角的法律関係の関与者として、一定の要件を満たした場合には、法的地位を認めるべきである。本年度は研究目的達成のために必要な資料の収集及び我が国並びにドイツにおける実態を調査することに主眼を置いて研究を行った。具体的には、(1)我が国及びドイツの資料の収集、(2)ヒアリングを含む実態調査、(3)資料及び実態調査から明らかになる問題点の確定、(4)我が国特有の問題点の発見という作業の作業である。1.資料収集について本年度は、本研究に関する書籍・資料について、我が国およびドイツを中心としたヨーロッパの動向に関する文献を随時購入し分析を行った。そこから明らかになったことについては、下記の論文で発表した。2.調査について我が国の実態調査については、もっぱら在宅就業という形での下請負人の法律問題についてヒアリングを行い、そこから浮かび上がる役務提供をめぐる下請負の実態について新たな問題意識を得ることができた。ドイツについては、震災の影響で半年遅れの8月に、ドイツに赴き、ヨーロッパにおける役務提供契約の第一人者であるバイロイト大学教授および、ミュンヘン高等裁判所裁判官、ドイツ人実務家弁護士にヒアリングを行い、ドイツ固有の実務上の問題や裁判例の他、ヨーロッパにおける法統一の可能性、その内容などについて専門的知識の提供を得た。3.まとめ上記の作業を行うことにより、先行するヨーロッパ・ドイツからの示唆、我が国の実態の問題点、さらには我が国の債権法改正動向における諸問題が明らかになり、翌年度以降の新たな課題を見つけ出すことができた。本年度も研究目的達成のために必要な資料の収集・分析・実態調査を行った。具体的には、(1)我が国でのアンケート調査実施の準備、(2)我が国及び諸外国の実態の解明、(3)資料及び実態調査から明らかになる<複数関与者>をめぐる問題の発見、という作業を行った。1.資料収集・分析については、これまでの資料分析から、さらに必要であることが明らかになった文献の収集に主眼を置き、ドイツ文献の調査を行った。ヨーロッパにおける統一私法に関する動向についても分析し、その一部については研究成果として公表した。また、我が国の民法債権法改正における議論にも着目し、この点についても検討を重ねた。2.実地調査については、さらには下請負に関連して、いわゆるトヨタ方式を採用している名古屋圏の実態調査も行った。実態調査に際しては、実態について問題点をよく知る研究者にヒアリングを行い、この結果、裁判例などでは明らかにならない実態についても知ることができた。さらに、役務提供契約の第一人者である国内法研究者にもヒアリングを行い、文献についての情報提供、アンケート項目に関する示唆を得ることができた。3.アンケート調査について上記のヒアリングの成果をもとに、我が国の企業にアンケート調査を行うための準備が整った。具体的には、アンケート項目の作成、送付先に関する情報を得ることができた。4.その他外部の研究機関においても、これらの調査をもとにした報告を行った。また、参加する実務家メンバーにもヒアリングを行い、震災後の状況についても聞くことができた。さらには、上記外部研究会主催団体からは、アンケートに関して送付先の選定、送付方法などについて有益な示唆を得ることができた。本年度は、これまでの資料分析、調査により明らかになった下請負人の法的地位をめぐる問題点、及びその法的解決の指向性について仮定的命題を確立し、その適否について再度検討する作業を行った。具体的には、ゼネコン企業法務部へのヒアリング、関連分野の専門家へのヒアリングと討論、公開型研究会での報告と専門家らからのコメント及び討論を行った。成果の1つとして、まずは用語の不明確さを改めて浮き彫りにし、明確化の必要性を明らかにしたことにある。我が国において「請負(人)」さらには「下請負(人)」という用語については、しばしば多義的に使われ、社会的用語法と法学的概念とが必ずしも一致していない。その結果、望まれる法的解決についても十分な検討が行われていない面がある。したがって、まずは法学的概念及びその用語法を確立する必要がある。民法学的には請負契約に基づき契約が連鎖する形態を下請負とよび、その従事者を下請負人と呼ぶが、実務的には実態は売買に近いものも請負とよぶことがあり、法解釈の場面において両者のバランスを図る必要がある。次に、各種の約款により、法規の内容が修正され、その解釈も限定的なものになっていることが少なくないことが明らかになった。下請負人がその法的地位が必ずしも適切でない形で契約関与者とされていることも少なくない。したがって、今後は各業界の約款を精査した上で、その共通項を探る必要があることが明らかになった。

さらには、法人を含めた下請負人が関与者として登場する形態には種々のものがあり(例えば、ジョイントベンチャーやコンソーシアムなど)、それぞれの形態に即した法的解決を志向する必要があることを浮き彫りにした。そのためには、各当事者を一体的に捉えた上での多角的法律関係という考え方が有益であると考え、私見の一部を研究会などで報告し討論した。東日本大震災の影響を受け、平成22年度に予定していたドイツでのヒアリングが、本年度にずれ込み、また、同じく東日本大震災の影響で、本研究の対象である下請負人およびその業界も大きな痛手を受け、ヒアリング・アンケートなどの実態調査が思うように進まなかった。とくに、アンケートについてはいくつかの対象にあたったところ、答えられる状況にないとの回答を得たため実施年度をずらさざるを得なくなった。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画について大きな変更点はない。今後は、対象先の復興状況を見ながらできる限り早い時期にアンケートを行い、実態調査に努めたい。幸いにして、徐々に復興しているようであり、それらの実態も研究成果の中に入れたいと考えている。また、その分析等を踏まえたシンポジウムの開催についても計画・事項したい。
洞房結節におけるCav1.3レアバリアントと持続性内向き電流の関連性の検討

心臓の洞房結節細胞に観察される持続性内向きナトリウム電流(Ist)は、心拍リズムの形成に寄与することが示唆されているものの、この電流を担うチャネル分子は同定されていない。本研究は、L型Caチャネル(Cav1.3)がIstの発生に関与する可能性について検討してきた。その結果、Cav1.3遺伝子を欠損したマウスではIstが完全に消失していることを見出した。そこで、次世代シーケンシングを用いてCav1.3のRNA編集あるいはスプライスを検討したが、ナトリウム透過性をもたらすバリアントの存在は確認できなかった。Cav1.3と機能的に連関した何らかのNaチャネルがIstの発生に関与すると考えられた。洞房結節は心臓のペースメーカー領域であり、自発的に活動電位を発生する細胞群で構成されている。本研究は、これらペースメーカー細胞に特異的に記録される持続性内向きナトリウム電流(Ist)の分子基盤を確立することを目的としている。我々は、L型カルシウムチャネルのCav1.3を遺伝的に欠損したマウスにおいては、洞房結節細胞のIstが消失していることを見出している。このことはCav1.3がカルシウム電流だけでなく、ナトリウム電流も担う可能性を示唆しているが、これまでにクローニングされているCav1.3を異種性に発現させてもIstに類似した電流を誘発できない。一方、次世代シーケンサーを用いて洞房結節に発現するCav1.3遺伝子産物を網羅的に解析したところ、いくつかのバリアントの存在が示唆されたものの、その検出率は極めて低くIstとの関連は未だ不明である。H26年度の本研究においては、洞房結節内のIstの機能的発現分布の不均一性に着目し、Istを発現する単一細胞を供してPCR法(単一細胞PCR法)を施しIstの背景となりうるCav1.3遺伝子産物の同定を試みた。難易度の高い方法でもあり、現在までにIstと関連しうるバリアントを検出するには至っていない。しかしながら、特異的プライマーを磁気ビーズで修飾することにより、精度の高い単一細胞PCR法が確立されつつある。また、Cav1.3ノックアウトマウスの洞房結節細胞を用いたパッチクランプ実験を行い、Cav1.3とIstとの関連性を示す実験結果が再現されることを確認することができた。洞房結節細胞にみられる持続性内向きNa電流(Ist)の分子基盤を明らかにすることを目的に、イオン選択性が変化することが期待されるL型Caチャネル(Cav1.3)のバリアントの探索を行った。まず、Istが洞房結節内の特定の細胞にしか観察されない点に着目し、単一細胞PCR法による検出を試みた。ストレプトアビジン磁気ビーズで修飾したプライマーを用いることで、比較的コピー数の少ないCav1.3転写産物の回収率をあげることができた。しかしながら、ポア領域を含むS5-S6領域における点変異は全く認められず、少なくともRNA編集のような転写後修飾は確認できなかった。また、最近、カタツムリのCavチャネルがスプライスによりNa透過性が著しく増加する現象が報告された。そこで、ラットの洞房結節においてCav1.3のスプライスパターンを検討する実験を行った。Exon-Exon間にプライマーを設計し、通常のRT-PCR法でスプライスを調べたところ、Exon8-14、E30-34の領域において数多くのスプライスパターンが検出された。これらのスプライスフォームをIn-Fusion Cloning法でCav1.3発現ベクターに組み込み、パッチクランプ法を用いてイオン選択性を観察を行ったがNa透過性を示すものは確認できなかった。一方、洞房結節細胞を用いたパッチクランプ実験を通して、Istの新たな性質を示す観察結果が得られた。それは、Istが細胞内Ca濃度により活性化されることである。この細胞内Ca感受性はIstの分子基盤を考える上で重要な手がかりとなる可能性がある。L型Caチャネル(Cav1.3)の遺伝子産物の探索の結果、Istを再現しうるバリアントを同定するには至らなかったが、同時に遂行してきた電気生理実験からIstの分子基盤の解明につながる可能性のある新しい実験結果を得ることができた。この新たに浮上した仮説は、Cav1.3と機能的に連関した別のイオンチャネルの存在を示唆するものであり、現在検証を進めているところである。この新しい仮説の検証は、当初の計画には記載していなかったものではあるが、本プロジェクトの「Istの分子基盤を明らかにする」という最終目標に前進する可能性がある。我々はIstの分子基盤としてL型Cav1.3チャネルが関与することを明らかにしてきているが、Istはカルシウムではなくナトリウムイオンによって運ばれる電流である。これまで本研究では、次世代シーケンサーなどの網羅的手法によりCav1.3のトランスクリプトーム解析を行ってきているが、ナトリウムイオン透過性を説明しうるバリアントの同定には至っていない。一方、H28年度の我々の研究では、Istの分子基盤として新たに浮上してきたTRPM4チャネルの関与の検討を開始した。Istに対するTRPM4チャネルの阻害薬の効果をパッチクランプ法で調べたところ、9-phenanthrolならびにflufenamic acidのいずれもがTRPM4を阻害する濃度でIstをも遮断することがわかった。また、TRPM4が細胞内カルシウム濃度の上昇に依存して活性化されるチャネルであることから、細胞内カルシウムのキレーターであるEGTAやBAPTAの細胞内負荷がIstに及ぼす効果も検討した。

その結果、細胞内カルシウム濃度が極めて低くなるとIstは誘発されず、Istの活性化に細胞内カルシウムが必要であることが判明した。このように、本研究からTRPM4とIstに機能的な類似性がみとめらることがわかった。TRPM4は心臓の中ではペースメーカー領域を含む刺激伝導系に多く発現しており、Istの機能分布の特異性とやはり相関がある。TRPM4がIstに関与する可能性はさらに検証する十分に価値があると考えられた。当初の予想とは異なる結果が出てきて、研究内容に少なからず変更があった。そのため、実験計画の練り直し、新しい実験の準備に時間を要し、やや研究活動が遅延した。しかしながら、Istの分子基盤の解明という目標に向けて着実に進展がみとめられる。心臓の洞房結節細胞に特異的に観察される持続性内向きナトリウム電流(Ist)は、心拍リズムの形成に重要な役割を果たすことが示唆されている。しかしながら、Istを担うチャネル分子は同定されておらず、その生理的意義を直接的に調べることが困難な状況である。本プロジェクトでは、Istの薬理学的性質がL型カルシウム電流のそれとほぼ共通していることに着目し、L型カルシウムチャネルがIstの発生に関与する可能性について検討してきた。これまでに、1)ホールセルパッチクランプ法と単一細胞PCR解析により、モルモット洞房結節細胞におけるIstの電流量は構成するL型カルシウム電流の大きさとそれを構成するCav1.3遺伝子発現と相関することを発見した。さらに、2)Cav1.3遺伝子を欠損したマウスの洞房結節細胞ではIstがほぼ完全に消失していることを見出した。これらの結果から、Istの発生にCav1.3が寄与することが明らかとなり、本成果を論文発表した。しかしながら、既知のCav1.3クローンを異種性に発現させてもカルシウム電流のみが誘発され、Istのようなナトリウム電流は発生しない。そこで、本プロジェクトでは期間を1年間延長し、洞房結節組織から得られたCav1.3のPCR産物を次世代シーケンシングやフラグメント解析に供してバリアントフォームを探索してきた。しかしながら、ナトリウム透過性をもたらすCav1.3のRNA編集あるいはスプライスの存在は確認できなかった。一方、我々はIstの活性の細胞内カルシウムを示す実験的証拠を得た。このことは、Cav1.3の活性化に伴う細胞内カルシウムの上昇が何らかのナトリウムチャネルを活性化することでIstが発生する可能性があると考えられた。現在、洞房結節に発現するカルシウム活性化型ナトリウムチャネルTRPM4とIstの関係について検討を始めている。心臓の洞房結節細胞に観察される持続性内向きナトリウム電流(Ist)は、心拍リズムの形成に寄与することが示唆されているものの、この電流を担うチャネル分子は同定されていない。本研究は、L型Caチャネル(Cav1.3)がIstの発生に関与する可能性について検討してきた。その結果、Cav1.3遺伝子を欠損したマウスではIstが完全に消失していることを見出した。そこで、次世代シーケンシングを用いてCav1.3のRNA編集あるいはスプライスを検討したが、ナトリウム透過性をもたらすバリアントの存在は確認できなかった。
時相変化に着目したAKI to CKD移行機序に果たす自然炎症の役割の解明

本研究は、AKI to CKDマウスモデルを用いて、TLR4シグナルあるいはその内因性リガンドがAKI修復過程に果たす役割を検討することを目的としており、平成30年度目標として、臓器特異的なMRP8 KOマウスおよびレポーターマウスを用いて、AKIからCKDへの移行過程のphaseごとにマクロファージが腎障害に対して果たす役割を明らかにすることを掲げている。骨髄特異的なMRP8 KOマウスを作成し、mRNAおよび蛋白レベルで60-80%発現が低下していることが確認された。野生型マウスを用いた先行実験では、37°C下で25分間の腎動脈クランプによる片側腎虚血再灌流障害から3週間経過後、障害側腎が非障害側腎と比較して有意に萎縮しており、NGAL、IL-1β、TGFβのmRNAが上昇していることを確認している。今後は骨髄特異的MRP8 KOマウスを用いた虚血再灌流障害実験を実施し、AKI to CKDの過程におけるMRP8およびマクロファージの役割を検討していく。骨髄細胞特異的MRP8 KOマウスの作成に時間を要した。現在、骨髄細胞特異的にZs-Greenを発するマウスと骨髄細胞特異的MRP8欠損マウスとを掛け合わせ、MRP8以外の骨髄由来細胞が緑色に蛍光するマウスを作成している。今後、このマウスに対して虚血再灌流障害実験を行い、腎組織内のマクロファージの動的変化がAKI慢性化に与える影響を解析する。また、本マウスの骨髄からマクロファージなどを誘導し、in vitroの検討を行う。本研究は、AKI to CKDマウスモデルを用いてTLR4シグナルあるいはその内因性リガンドがAKI修復過程に果たす役割を検討することを目的としており、平成29年度目標として、AKI to CKDマウスモデルの最適化、およびCKD移行過程におけるTLR4内因性リガンドの検討、を掲げている。AKI to CKDマウスモデルとしては片側腎虚血マウスを用い、37°C下で25分間の腎動脈クランプによる虚血再灌流障害から3週間経過後の障害側腎について検討した。障害側腎は非障害側腎と比較して萎縮しており、mRNAを用いた検討では、腎障害マーカー(KIM-1、NGAL)上昇、炎症マーカー(TNFα、IL-1β)上昇、線維化マーカー(TGFβ、αSMA)上昇を認め、TLR4内因性リガンド(MRP8)の増加を伴っていた。MRP8が腎組織局所の慢性炎症に与える影響を検討するために、RAW 264.7細胞を用いてLPSおよびリコンビナントMRP8の添加実験を行った結果、炎症マーカー(TNFα、IL-1β)の上昇を認めた。以上よりAKIからCKDへの移行過程に、MRP8による炎症が関与していることが示唆された。今後は、MRP8の主な産生細胞である骨髄細胞特異的MRP8KOマウスを用いて、AKI to CKDの過程におけるMRP8およびマクロファージの役割を検討していく予定である。AKI to CKDモデルとして片側腎虚血再灌流障害(IRI)を作成し、本モデルにおける自然炎症の解析を行い、In vitroではマクロファージに対する内因性リガンドMRP8とLPSの相乗効果について検討した。ただし、骨髄細胞特異的MRP8KOマウスでの検討の開始が遅れており、次年度実施予定である。平成30年度以降は、臓器特異的MRP8 KOマウスなどを用いて、AKIからCKDへの移行過程におけるMRP8およびマクロファージの役割を検討していく予定である。IRIの様な炎症性変化に対する細胞の反応は極めてダイナミックかつ複雑であるため、免疫組織学的解析やフローサイトメトリーといった従来の方法では、免疫反応におけるバランスを捕えることは難しい。そこで二光子励起顕微鏡を用いてMRP8が浸潤炎症細胞に与える影響を生きたままの腎臓で可視化することにより、生体レベルでの意義を明らかにする計画である。