hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
母性行動とプロラクチン受容体発現制御機構に関する研究

その結果、ラットメス肝臓では発育と共にPRL-R mRNAレベルは徐々に増加するのに対して、オスではそのレベルが低下した。また腎臓におけるメスの発現レベルは発育に伴い減少傾向を示した。このことから、肝臓におけるPRL-R mRNAの発現はエストロゲンがその発現を刺激し、テストステロンがそのレベルを抑制していることが明らかになった。また腎臓ではエストロゲンがそのレベルを抑制しており、両組織は性ステロイドホルモンによりparadoxicalにその発現の調節されていることが明らかになった。次に、非妊娠メスラットおよびオスラットの仔ラットに対する母性行動、父性行動について検討した。各ラットを収容したケージ内に生後3-14日目の仔ラットを2匹入れ、crouching,lick,nestbuilding,retrieval,groupingの5項目について、毎日2時間、2週間その行動を観察記録した。その結果、仔ラットに対する母性行動、父性行動の発現には性差なく、仔ラットへの接触日数と共に愛着行動が増加していくことが明らかになった。プロラクチンは、単に乳腺発育や乳汁分泌維持作用を示すのみでなく、母性行動の誘起、維持にも重要な役割を有するホルモンであることが明らかになってきた。今年度私達は、乳仔接触刺激による非妊娠雌及び雄ラットの母性行動・父性行動を観察すると共に、脳内のプロラクチン受容体mRNAの発現について検討した。また同時に血中プロラクチン濃度の変化についても検討を加えた。雌及び雄ラットの母性行動については、各ラットを収容したケージ内に生後3-16日目の仔ラットを2匹入れ、crouching,licking,nest building,retrieval and groupingの5項目について毎日2時間、2週間仔に対する行動を観察記録した。脳内のプロラクチン受容体mRNAの発現についてはlong form及びshort formの2つの分子種を同時に特異的に検出できるように構築したRNAをプローブとするRNase Protection Assay法により行った。また血中プロラクチン濃度はEIA法により分析した。その結果、仔ラットに対する母性行動・父性行動の発現には性差なく、仔ラットへの接触日数と共に、愛着行動の増加していくことが観察された。そこで、乳仔に対する母性行動、父性行動が誘導された雌及び雄ラットの脳内プロラクチン受容体mRNAの発現をみると、プロラクチン受容体mRNAのlong formの発現が有意に増加していた。また母性行動、父性行動を示したラットでは明らかに血中プララクチン濃度が上昇していた。
リガンドスクリーニングのためのケミカルプロテオミクス手法の開発

微量に存在する核内受容体蛋白質をターゲットに高親和性抗体-磁気ビーズを用いたプロテオミクスを行うことで、複合体のストイキオメトリーを壊さずに、転写複合体が構造の類似した合成リガンドの濃度・時間によって遷移する様を追跡する系を樹立した。本研究ではバキュロウィルス上に融合蛋白を発現させた蛋白質を免疫する方法によって作成した高親和性抗体(Kd 10-8以下)を低ノイズ磁気ビーズに固定化させ、サンプル調整を行うことにより、現在のプロテオミクス解析を更に効果的なものとした。3T3-L1脂肪細胞では、スプライソゾームや蛋白のinitiation complexに関わる蛋白など、これまであまり報告のない蛋白が再現良く取れた。さらに、生体内の核内受容体によるシグナルはリガンドの多様性により決定されることから、PPARγの合成された種々近縁の多様なアゴニストリガンドによって変動するデータを比較検討することを行っている。これはアゴニスト作用のある種々類似の薬剤でのプロテオミクスは、大量のデータを意味づけるうえで重要である。しかしながら、PGC1やその他、よく知られたmediator複合体などが逆に検出することが出来なかった。これまでの過剰発現系で見られてきた複合体がネイティブ蛋白レベルで見られない理由については不明である。本研究ではネイティブ蛋白とのストイキオメトリュに重きを置いた研究であるが、アゴニストリガンドによる変動も必ずしも再現が取れるわけではなく更なる最適化が必要である。また、今回新たにPPAγはRXRαのみならずRXRβと複合体を形成することが明らかにされた。さらに、mRNA transportとmRNA locanzationにかかわるミオシン、Translation initiationにかかわるEIF4ファミリーも検出された。ただしこれらは通常細胞質に存在する蛋白であるため、さらに注意深い検討が必要である。CTCFとの複合体コンプレックスも見られ、PPARγの広範囲な機能が推測された。本研究ではバキュロウィルス上に融合蛋白を発現させた蛋白質を免疫する方法)によって作成した高親和性抗体(Kd 10^<-8>以下)を低ノイズ磁気ビーズに固定化させ、サンプル調整を行うことにより、現在のプロテオミクス解析を更に効果的なものとした。しかしながら、ショットガンプロテオミクスの方法では、まだ、特異性を決めるにはデータのばらつきが多く、また、アゴニストリガンドによる変動も必ずしも再現が取れるわけではなくデータのvalidationには更なる最適化が必要である。
象牙芽細胞の分化における一酸化窒素の機能に関する分子生物学的解析

本科研補助金により、正常時または歯の切削刺激後の歯髄における一酸化窒素合成酵素(Nitric Oxide Synthetases, NOSs)、特に血管型NOS(endothelial NOS, eNOS)および誘導型NOS(inducible NOS, iNOS)、ならびにiNOS遺伝子の転写に関与する転写因子のNF-κBの発現状態の変化を免疫組織化学的に検索をおこなった。正常歯髄象牙質/歯髄界面ではeNOSおよびiNOSの発現は象牙芽細胞ではほとんど認められなかった。NF-κBに関しては象牙質/歯髄界面における象牙芽細胞の細胞質のみにその強い発現が観察された。臼歯切削モデルにおける歯髄内細胞の変化ならびにeNOSおよびiNOS、NF-κBの発現変化を検索した。上顎臼歯近心面切削後2日目における窩洞直下象牙質/歯髄界面では、非切削象牙質/歯髄界面と比較して、大型の細胞が再配列し、活発な修復象牙質の開始が認められた。またこの部分には好中球の浸潤も観察された。11日後では、顕著な修復象牙質の形成が生じていた。切削後2日目における窩洞直下歯髄界面におけるeNOSの局在は再配列細胞(象牙芽細胞)に強く認められ、iNOSはこの細胞ならびに並列して存在する円形細胞にも認められた。また界面直下に浸潤した好中球にもその発現が認められた。NF-κB陽性免疫反応は歯髄全体に観察された。これらの免疫反応性は状態と比較して強く認められた。したがって、切削刺激により象牙芽細胞において大量のNO産生が推測され、NOによる細胞機能の賦活化による修復象牙質形成への関与が示唆された。さらに歯髄炎の発症や進行、修復象牙質の形成過程におけるNF-κBによる種々の遺伝子発現の調節の関与が推測される。本年度の研究テーマは、正常歯髄における一酸化窒素合成酵素(Nitric Oxide Synthetases,NOSs)のなかの血管型NOS(endothelial NOS,eNOS)および誘導型NOS(inducible NOS,iNOS)およびiNOS遺伝子の転写に重要な関与を示す転写因子の1つであるnuclear factor kappa chain in B cell(NF-κB)の発現を分子生物学的および形態学的に検索することであった。まず、当教室の得意とする研究手法の1つである形態学的検索から検索を開始した。6週齢雄性ラットのを固定後連続凍結切片の作製し、免疫染色を施した。象牙質/歯髄界面ではeNOSおよびiNOSの発現は象牙芽細胞ではその細胞質に微量の陽性反応のみ認められた。この結果より正常象牙芽細胞へのeNOSおよびiNOS蛋白の局在しないが、NF-κBは局在していること判明した。しかしながら免疫染色の結果から、NF-κBは核内転写因子であるにも関わらずその局在は核に認められなかったことから、活性化NF-κBの局在検索に免疫染色が最適でないと考え、合目目的な手法であるSouthwesren Histochemistryにて検索を試みた。結果は活性化NF-κBは象牙芽細胞の核に若干の局在が認められた。

現在は、eNOSおよびiNOS mRNAの発現を形態学的および分子生物学的手法によるアプローチを開始し、各遺伝子に対するプローブの作製しその特異性を検索中であるが、その特異性に問題があり、この先におこなう予定であるin situ hybridization法やNorthern blot法によるmRNAの発現が行えずにいるのが現状である。したがって現在は特異性の高いプローブの作製に邁進しているところである。本年度の研究テーマのひとつとしては、培養歯髄細胞における一酸化窒素合成酵素(Nitric Oxide Synthetases,'NOSs)の血管型NOS(endothelial NOS, eNOS)および誘導型NOS(inducible NOS, iNOS)の遺伝子レベル・蛋白質レベルにおける発現をRT-PCR法ならびにNorthrn blot法、in situ hybridization法、Western blot法、immunohistochemistry法にて発現ならびに局在の解析をおこなうと同時に、Southwesren blot法による転写因子NF-κBの発現を分子生物学的および形態学的に検索することであった。しかしながら、ラット歯髄細胞のプライマリーカルチャーはその収量の点から非常に少なく、上記の分子生物学的および形態学的検索をおこなうには不十分な細胞数であった。現在この点を改良するために培養方法の検討を精力的におこない、ラットプライマリー歯髄培養細胞の大量培養を試みている。一方、昨年度の結果より、正常ラット臼歯歯髄象牙芽細胞におけるeNOSおよびiNOS、NF-κBの発現を状態を明らかとし、正常状態での歯髄象牙芽細胞における一酸化窒素(Nitric Oxide, NO)の機能が推測された。本年度では、さらに臼歯切削モデルにおける歯髄内細胞の変化ならびにeNOSおよびiNOS、NF-κBの発現変化を検索した。上顎臼歯近心面切削後2日目における窩洞直下象牙質/歯髄界面では、非切削象牙質/歯髄界面と比較して、大型の細胞が配列し、活発な修復象牙質の開始が認められた。さらにこれらの細胞では、正常状態と比較して、とくにiNOSならびにNF-κBの免疫反応性が強く認められた。したがって、切削刺激により象牙芽細胞において大量のNO産生が推測され、NOによる細胞機能の賦活化による修復象牙質形成への関与が示唆された。
魚鱗癬に対する新規治療法ならびに胎児療法の開発

本研究では、魚鱗癬の治療法の開発を目的とし、正常ヒトABCA12導入遺伝子の作成、培養魚鱗癬患者表皮細胞およびABCA12ノックアウトマウス(魚鱗癬モデルマウス)表皮細胞に対する遺伝子導入実験、遺伝子導入幹細胞株よりの皮膚再生系の確立、再構成魚鱗癬病変に対する遺伝子導入による治療実験、ABCA12ノックアウトマウスに対する胎児治療実験を施行し、それらの研究成果から臨床応用への可能性を評価した。本研究の目的は、道化師様魚鱗癬患者由来培養表皮幹細胞、ならびに、ABCA12ノックアウトマウス由来培養表紙幹細胞に、正常ABCA12遺伝子を導入し、それらの細胞から表皮、毛包を再生することにより、ABCA12遺伝子変異による重症魚鱗癬の遺伝子治療の方法論を確立すること、また、正常ABCA12遺伝子を、liposome法、naked DNA法等を用いて導入することにより、魚鱗癬病変の表現形の改善を行うことである。さらに、レチノイド、または、正常ABCA12遺伝子を胎児に投与することにより、重症型魚鱗癬罹患ノックアウトマウス胎児の治療法の開発を行うことも目指す。平成20年度には、リポーター遺伝子としてのGreen fluorescent protein(GFP)遺伝子およびlacZ遺伝子を哺乳類遺伝子発現ベクターに組み込んだ。アデノウイルスを用いる系では、COS-TPC法に基づいて行った。レトロウイルスでは、LTRとψ配列以外のMoMLV由来の遺伝子を含まず、かつ導入遺伝子の発現にCMV-IEプロモーターが用いられているpDON-A1ベクターを用いた。バルジ細胞への遺伝子導入はアデノウイルスベクター、あるいは、レトロウイルスベクターを用いた。GP-293細胞をフラスコに播種し、翌日、リン酸カルシウム法にてβ-galactosidase遺伝子等のレポーター遺伝子を導入した。トランスフェクション後、56時間後にグリセロールショックを行った。これらの細胞を2日間培養し、上清を回収した。回収した上清は25000回転、1時間半超遠心機にて遠心分離し、得られたペレットをTNE bufferにて懸濁した。4°CO/N保存し、表皮細胞培養液中に添加した。得られた遺伝子導入幹細胞培養株より、細胞懸濁液を作成した。SCIDマウスの背部を除毛し、直径1cmの円形に皮膚を切除し、そこヘシリコンチャンバーを移植し、チャンバー上部の穴から細胞懸濁液を注入した。約1週間後、チャンバーの上部を切り取り、移植部位を乾燥させることにより上皮化を促し、遺伝子導入幹細胞株よりの皮膚再生系を確立した。具体的には本年度は以下の研究計画を施行した。1)再構成魚鱗癬病変に対する遺伝子導入による治療実験正常ABCA12遺伝子を、免疫不全マウス背部に患者由来表皮細胞から再構成した魚鱗癬皮膚病変に導入した。導入された再構成病変について、経時的に皮膚生検を施行、凍結切片を作成、蛍光顕微鏡等にて観察することにより、正常ABCA12遺伝子の導入、発現を確認した。さらに、免疫組織学的、in situ hybridization法、ノザン・ブロッティング、サザン・ブロッティングによって、再構成患者表皮における導入正常遺伝子および蛋白の発現をモニターした。遺伝子導入実験後、再構成皮膚における臨床症状の改善度を評価した。さらに可能な限り長期にわたり、遺伝子導入部を経時的に観察し、導入遺伝子の発現の持続時間、遺伝子導入による諸効果の持続時間を算定した。ここでは、導入遺伝子による副作用も評価する。2)ABCA12ノックアウトマウス(魚鱗癬モデルマウス)新生児に対する正常ABCA12遺伝子導入による治療実験上記計画1)同様に、前年度作成したリポーター遺伝子、ならびに、正常ABCA12遺伝子を、ABCA12ノックアウトマウス新生児の皮膚に導入し、その表現形の改善を目指した。遺伝子治療効果は、罹患新生児の生命予後を評価するとともに、経時的に皮膚生検を施行、ABCA12遺伝子の発現を確認した。さらに、電子顕微鏡的観察など、形態学的に表現形の改善を評価した。1)ABCA12ノックアウトマウス(魚鱗癬モデルマウス)新生児に対する正常ABCA12遺伝子導入による治療実験naked DNA法、liposome法、遺伝子ベクター含有ペースト外用等を用いて、前年度作成したリポーター遺伝子、ならびに、正常ABCA12遺伝子を、ABCA12ノックアウトマウス新生児の皮膚に導入し、その表現形の改善を目指した。2)ABCA12

ノックアウトマウスに対する胎児治療実験罹患胎児を妊娠している母マウスにおいて、妊娠後期に、正常ABCA12遺伝子(naked DNA、liposome等)を羊水中に、あるいは、胎児に直接投与した。さらに、母マウスに、レチノイドを経口、あるいは、羊水中に投与する実験を施行した。妊娠後期は、魚鱗癬の病変が発現する時期であると同時に、レチノイドの催奇形性を排除できる時期である。本研究においては、これらの胎児治療実験の結果、罹患新生児が出生し、有意な表現形の改善、予後の改善は認められなかった。3)研究結果の総括と臨床応用への可能性の評価今回の研究によって得られた結果から、遺伝子治療に関しては、最善と考えられる導入遺伝子、遺伝子導入法をまとめた。さらに、導入遺伝子の発現、遺伝子導入の効果、ならびにその持続時間について評価した。また、今回の結果から予想される本研究で用いる遺伝子導入法による副作用もまとめた。これらのデータから、本方法の実際の臨床応用の可能性につき考察した。さらに、胎児療法に関しても、同様に、データを総括した。有効な胎児治療法の確立は今後の課題である。
治療・処置を受ける子どものケアにおける遊びを中心とした介入モデルの開発

本研究は、遊びの持つ治療的な力に着目し、治療・処置に代表されるストレスフルな子どもの入院生活を支援するために遊びを活用する介入モデルの構築を目指すものである。研究の内容は、入院中の子どもの遊びに関する文献検討、全国の小児科病棟をもつ400床以上の病院に対する調査、入院児の遊びの参加観察に基づいた遊びプログラムの実施であった。その結果、以下の結果が得られた。1.処置室の環境として、73.9%が処置室に子ども向けの飾り付けをし、64.5%が気を紛らわせたるためのおもちゃを用意していた。また、半数以上のスタッフが、処置中に愛着のあるおもちゃを持たせたり、自分の服装に工夫を行っていた。しかし、治療・処置について子どもの理解を促したり、不安・恐怖を軽減するために遊びを活用することはほとんど実施されていなかった。「プリパレーション」という言葉は、「治療・処置を受ける子どもに対して、人形や絵本などを用いてわかりやすく説明すること」「子どもに対するインフォームド・コンセント」と認知されており、子どもへの説明の手段と考えられていた。2.入院している幼児の遊びでは、診察や血圧測定、検温、採血、坐薬挿入などが模倣遊びのテーマとしてしばしば見られた。また、嫌な処置を受けた後には、ぬいぐるみでの再現やねんど遊びが多く見られ、遊びを通してネガティブな感情を吐き出していることが示唆された。このことから、ストレスに焦点をあてた遊びを中心とした個別的な介入プログラムを実施し、効果を質的に検討した。治療・処置に関連する苦痛や、見慣れない環境への恐怖から病院環境への不適応状態が見られた幼児では、児の個別性に合わせた遊びのプログラムを実施することにより、感情表出が促され、結果的に適応が促進されていた。入院児のケアにおいて、遊びを計画的に援助していくことが有用であることが示唆された。本研究は遊びの持つ治療的な力に着目し、治療・処置の場面だけでなく、入院している子どもの生活全般を支えていくために遊びを最大限活用する介入モデルの構築を目指すものである。本年度は入院中の子どもの遊びがどのようにとらえられ、ケアに反映されているのかを、医学・看護学・心理学系の1990年以降の文献を元に検討した。また、子どもの入院生活を支援する専門職(チャイルドライフ・スペシャリストなど)に関しては、おもに外国の文献を検討した。その結果、遊びを実際の検査・処置場面に活用している事例の報告が多く見られるものの、遊びと看護介入との論理的な関連性に言及したものは少なく、経験的知見によって遊びがケアに取り入れられていることが分かった。看護・心理・教育系大学の卒業生に対する小児の発達段階の認識の調査では、ピアジェ理論をふまえてはいるものの、その知識はかなり暖昧であることが海外文献から明らかになった。一方、国内の研究では、看護師の子どもの発達に関する認識の調査はほとんど行われていなかった。子どものケアに携わる際、子どもの特徴を捉えていない現状は有効なケアの提供にとって不利であると思われ、これらの部分を探索する必要があることが分かった。しかし、心理系の文献からは、遊びは自発的なものであり、介入手段として遊びをとらえることの危険性も示唆された。これらの文献検討をもとに、入院中の子どもの遊びの実態を知ることに加えて、病棟において子どもの遊びはどのように考えられているのか、医師・看護師の遊びと発達に対する認識はどのようなものなのかに関して、質問紙を検討した。この質問紙を元にフォーカスグループとなる小児科病棟看護師に対して聞き取り調査を行い、さらに全国の小児科病棟をもつ400床以上の病院に対して質問紙調査を行う予定である。

今年度は、子どもが治療・処置をうける一連の場面における参加観察によるデータ収集の計画に先だって、小児がおかれている入院環境についての全国調査を実施した。それによると、7割の病棟が処置室に子どもが関心を持ちそうな飾り付けをし、6割が気を紛らわせたりするためのおもちゃを用意していた。治療・処置前に紙芝居や人形劇、あるいはぬいぐるみや人形を用いた疑似処置遊びをよく行っている病棟はごくわずかであった。治療・処置時の説明や、不安・恐怖を経験する目的で行われる、いわゆるメディカルプレイについては、まだ看護師に浸透していないことが要因の一つと考えられる。一方、処置中に愛着のあるおもちゃなどを持たせたり、看護師自身の持ち物や衣服の工夫に関しては半数以上がよく行っているとした。ケアの中に遊びの要素を取り入れることによって、子どもはスタッフに親しみを感じ、信頼関係の形成に役立つと考えられる。子どもは遊びによって多くのことを理解し、時にはストレスのはけ口にもなることから、治療・処置時のケアにおいても遊びの要素を取り入れることは、重要であると考えられる。「プリパレーション」という言葉についての認識は、6割が聞いたことがあるとしていた。そのとらえ方は、「治療・処置を受ける子どもに対して、人形や絵本などを用いてわかりやすく説明すること」「子どもに対するインフォームド・コンセント」と答えたものが多く、子どもへの説明の手段と考えていることが分かった。実施については、3割が行っているとし、実施者は8割が看護師であった。実施に関して解決しなくてはならない問題として多かったのは、管理者やスタッフの認識と、診療報酬制度への位置づけであった。本年度は、入院中の幼児の遊びの観察を通して、遊びを中心とした治療処置に関連する介入プログラムの試案を作成し、対象者にプログラムに基づいた援助を実施してその効果を質的に検討した。入院中の幼児の遊びに対する詳細な参加観察を実施するために、対象候補者の疾患の状況を主治医に確認し、保護者に説明を行って研究参加への同意を得た。幼児本人に対しては理解できる範囲で出来るだけ詳しく説明を行い、同意のあったものを対象とした。対象児は、35歳の幼児5名であり、遊び場面の観察により、次のことが明らかになった。対象児は、幼児期に特徴的である模倣遊び(ごっこ遊び)を多く実施しており、その中には、自分が受けた治療・処置をテーマとしたものがしばしば認められた。診察や血圧測定、検温、採血、坐薬挿入などの処置がごっこ遊びのテーマとなっていた。また、嫌な処置を受けた後には、自分の体験をぬいぐるみで再現する遊びや、作っては壊すというねんどに代表される構成遊びが多く見られ、遊びを通して抱えているネガティブな感情をはき出していることが伺えた。参加観察からの結果をふまえて、治療・処置に代表される病院でのストレスを緩和するために、遊びを中心とした介入プログラムを試作・実施し、その効果を質的に検討した。その結果、以下のことが明らかになった。治療・処置に対する苦痛やスタッフへの恐怖は病院環境への適応を遅らせており、遊びを中心としたかかわりは児の感情表出に効果があり、適応を促進させていた。また、治療に伴う活動制限は幼児にとってストレスフルであり、発散的な遊びを実施することが効果的であった。
パラジウム触媒へのアンチWacker型酸化的付加による新規環状化合物合成法の開発

5-および4-アルキナール、3,4-および4,5-ジエナールに対し、モノホスフィン配位子を有する0価パラジウみ触媒存在下、有機ホウ素試薬をメタノール溶媒中で作用させると、3位置換2-シクロアルケノールまたは3-シクロアルケノールが得られた。また、脂肪族2級アミン存在下、DMF溶媒中で反応を行うと、系中で生成したイミニウムイオンが求電子剤として働き、対応する3級アミンが得られた。そこで、エンド型イミニウムイオンに対して同様の環化反応が進行すれば、生物学的に重要な含窒素ヘテロ環化合物である4位置換1,2,3,6-テトラヒドロピリジンが得られるものと考え、検討を行った。その結果、3-ブチニルアミンまたは2,3-ブタジエニルアミンに対し、0価パラジウム触媒存在下、ホルムアルデヒド、有機ホウ素試薬を作用させると、三成分連結反応が進行し、所望のテトラヒドロピリジンを得ることができた。なお、本環化反応の開発過程において、触媒として2価パラジウムとジホスフィンの組み合わせを利用すると、カルボパラデーションへと反応機構が変化するという興味深い知見を得ることができた。この触媒系は、オルト位にエステル基を有するフェニルボロン酸と内部アルキンのカップリング反応を促進し、インデノンおよび2-ナフトールを与えることが明らかとなった。また、光学活性ジホスフィン配位子SEGPHOSを用いることによって、5,6-および6,7-ジエナールの不斉環化反応の開発にも成功した。平成18年度の検討から、反応基質として5-および4-アルキナール、3,4-および4,5-ジエナールに対して本環化反応が進行し、対応する環状アリルアルコール、ホモアリルアルコールを与えることが明らかとなった。5-アルキナールの環化反応においては、アルキン上の置換基によってその位置選択性が変化し、アルキンの末端炭素上に水素またはアリール基が置換している場合にはエンドオレフィンを有する六員環アリルアルコールを、アルケニル基が置換している場合にはエキソオレフィンを有する五員環アリルアルコールを選択的に与えた。また、4一アルキナールの環化反応は、アルキンの末端炭素上にアリール、アルケニル、アルキニル基が置換している場合においてのみ進行し、エンドオレフィンを有する五員環アリルアルコールを得ることができた。求電子部位としてはアルデヒドの他にもケトンやエノンが利用でき、また脂肪族2級アミン存在下反応を行うと系中で生成したイミニウムイオンが求電子剤として働き、対応する3級アミンを与えた。また、アルケニルパラジウム中間体の補足剤としては、アリールおよびアルケニルボロン酸を用いることによりsp^2炭素、トリアルキルホウ素を用いることによりsp^3炭素、シランを用いることにより水素原子の導入が可能となっている。なお、パラジウム触媒の配位子としては、モノホスフィンであるトリフェニルホスフィンやトリシクロヘキシルホスフィンがアンチWacker型環化反応に有効であり、ジホスフィンを利用するとカルボパラデーションヘと反応機構が変化するという興味深い知見も得られている。
健常成人における個人差を利用した発達障害に関連する行動特性の男女差の同定

本研究では、質問紙により測定される自閉症傾向(Autism-Spectrum Quotient, AQ)の個人差と、実験により測定される行動成績との相関を男女別に検討することで、自閉症スペクトラム(ASD)を構成する行動特性の連続性の男女差を明らかにすることを目的とした。視線認知、低次幾何学形態認知、顔の短期的な遅延再認、顔再認記憶の行動成績との関連を検討した結果、視線認知かつ男性のみにおいて自閉傾向を示すAQとの相関が認められた。この結果は、視線認知が必ずしも両性の自閉症中間表現型となっていないことを示すのみならず、自閉傾向と行動を考える上で性差を考慮することの重要性を示したと言える自閉症スペクトラム(autism spectrum disorders, ASD)や注意欠陥多動性障害(attention-deficit hyperactivity disorder, ADHD)などの発達障害は、そのほとんどが男性において生じるとされる。いずれも非典型的な行動上の問題を抱え、一般社会への適応に困難を持つ。しかし、これら発達障害の症状は個人間での不均質性が高く、原因となる遺伝子はおろか、行動特性の具体的な特定(本態か併発症状か)にも不十分な点が多い。行動特性の同定のためには、比較的大きな患者群プールにおける検討が必須であるが、患者を多人数集める実験調査を行う事は容易ではない。また、女性患者が少ないため、そこで得られたデータの一般性には限界がある。そこで申請者は、患者群ではなく、健常成人における発達障害傾向測定によるアプローチを提案し、健常成人における、質問紙によって測定される個々人の発達障害傾向と、実験的に測定される行動との相関を検討する事で、発達障害の行動特性の男女差を同定することを目的とした。初年度は健常成人における自閉傾向を測定する質問紙である自閉症スペクトラム指数(Autism-Spectrum Quotient, AQ)を用い、自閉症における代表的な行動特性の一つである視線・顔認知について、自閉傾向と視線・顔認知との関連が男女で異なるかどうかを検討した。その結果、AQと視線知覚は男性で優位な相関が観察されたにも関わらず、女性ではそのような相関は見つからなかった。このことは、視線認知は男性のみで自閉症の中間表現型(endophenotype)を構成していることを示唆しており、自閉特性の研究において男女差を考慮する重要性を示している。自閉症スペクトラム(autism spectrum disorders, ASD)などの発達障害は、その約8割が男性において生じる(Lai et al., 2013)。そこで申請者は、患者群ではなく、健常成人における発達障害傾向測定によってアプローチする。健常成人における、質問紙によって測定される個々人の発達障害傾向と、実験的に測定される行動との相関を検討する事で、発達障害の行動特性の男女差を同定するのが、本研究の目的である。昨年度までに、視線認知と自閉症傾向の関連が男女によって異なることを明らかにしたので、27年度は視線以外の行動・認知と自閉症傾向の関連に性差が存在するか否かを検討した。具体的には、低次な視空間弁別課題と顔認知課題を行ったが、いずれの課題成績も自閉症傾向との関連を示すことは(男女別々でも、男女込みでも)なかった。従って、現在のところ、自閉症傾向と行動が関連しうるのは男性における視線認知のみであり、低次な視空間能力や顔認知能力からの影響を受けていないことが分かった。東京大学から早稲田大学に移動し、実験室の立ち上げをはじめとする研究環境の整備に時間を要したため、進捗が当初計画よりやや遅れることとなった。そのため、当初計画を1年延長して平成28年度にも研究を行うこととした。ただし、本課題に関連する招待講演や論文発表等を行っており、一定の成果が得られた。27年度までに、視線認知と自閉症傾向の関連が男女によって異なる一方、低次な視空間弁別課題と顔認知課題については男女ともに相関が見られないことを明らかにした。28年度は顔記憶と自閉傾向の関連に男女差が見られるか否かを検討したが、いずれの課題成績も自閉症傾向との関連を示すことは(男女別々でも、男女込みでも)なかった。

従って、現在のところ、自閉症傾向と行動が関連しうるのは男性における視線認知のみであり、低次な視空間能力や顔認知能力、顔記憶能力からの影響を受けていないことが分かった。本研究では、質問紙により測定される自閉症傾向(Autism-Spectrum Quotient, AQ)の個人差と、実験により測定される行動成績との相関を男女別に検討することで、自閉症スペクトラム(ASD)を構成する行動特性の連続性の男女差を明らかにすることを目的とした。視線認知、低次幾何学形態認知、顔の短期的な遅延再認、顔再認記憶の行動成績との関連を検討した結果、視線認知かつ男性のみにおいて自閉傾向を示すAQとの相関が認められた。この結果は、視線認知が必ずしも両性の自閉症中間表現型となっていないことを示すのみならず、自閉傾向と行動を考える上で性差を考慮することの重要性を示したと言える視線認知と自閉症傾向との関連の範囲と限界を探る。これまで、より低次な知覚属性(形態弁別)によっては説明できないことが分かったので、特に、目そのものの知覚に原因があるのか、目の情報を使ったより高次な(あるいは社会的な)認知に原因があるのかを検討する。認知神経科学研究計画では、初年度に自閉症、次年度にADHDを扱う予定であったが、ADHDの男女差は従来考えられていたよりも小さいとする研究が増えつつある。従って、次年度はADHDに関連する研究のみを行うのではなく、自閉症関連特性軸足を置いて研究を進めることを検討している。2015年度に東京大学から早稲田大学に移動し、実験室の立ち上げをはじめとする研究環境の整備に時間を要したため、研究計画を一年延長することとした。このため、次年度使用額が生じたものである。当初予定よりも安価なコンピュータを購入したこと、海外での国際会議発表を予定していたが国内での国際会議発表への参加に変更したこと、ならびに共同研究により謝金額が抑えられたという3つの理由のため、予定よりも支出額が少なくなった。研究関連物品の消耗品に10万円、研究成果発表ならびに打ち合わせの旅費に10万円、謝金に10万円、英文校正等その他に8万円を支出予定である。2カ年全体としては計画通りとなるよう、計画的に支出していく予定である。ただし、最近の為替変動に伴い、国際誌の円建て投稿料・掲載料等が高騰しているため「その他」費目の支出が当初予定より増える可能性がある。そのため、初年度からの持ち越し含め、物品費20万、旅費30万、人件費・謝金70万、その他50万として支出することを計画している。
肺胞マクロファ-ジを介して起きる粒子状大気汚染物質の生体影響の病態生理学的研究

アスベストの発癌性は疫学調査および動物実験で認められるが、in vitroの変異原性は殆ど認められない。この事実はアスベストの生体影響が生体内での反応を介して起きることを示唆するが、我々はこの反応の相手をマクロファ-ジ(Mφ)と考え、以下の実験を行った。実験1:クリソタイル粒子を繊維状のものと粒状のものに分け、それを更にマウス血清でオプソニン化したもの(O)としなかったもの(N)に分けて、(1)in vitroのMφのス-パ-オキサイドアニオン(O_2)産生、(2)in vivoで粒子をマウス気管内に投与したときの肺重量および肺毛細血管透過性の増加とこの影響に対するO_2消去酵素(SOD)投与の効果、をみた。実験2:粒子で刺激したときのMφの細胞応答をMφ膜内酵素であるホスホリパ-ゼA_2の活性阻害剤を投与したときの(1)の反応でみた。実験3:0粒子に吸着している可能性がある生体物質(コレステロ-ル、リン脂質、IgG等)の(1)の反応に対する影響をみた。その結果、以下のことが判明した。(1)クリソタイル粒子の(1)(2)に対する影響には粒子形状依存性がある。(2)(1)の反応時間経過には、N粒子で刺激したときにみられる反応開始後4050分でピ-クに達してその後速やかに減衰する型と、O粒子で刺激したときにみられるピ-クが約120分後でその後も持続的産生がみられる型とがある。この反応型を決定する因子に粒子に吸着する物質の電荷がある。(3)粒子表面の疎水性が(1)の反応を強める。粒子に吸着したIgGはMφのFcリセプタ-と結合し(1)を増強する。(4)Mφ膜内のホスホリパ-ゼA_2の活性化を介して(1)の反応が起きる。(5)オプソニン化粒子に吸着している脂溶性物質をマクロファ-ジに投与すると(1)の反応が抑制される。(6)(2)の肺重量の増加は肺毛細血管透過性の亢進に起因し、O_2はこの直接の原因物質ではない。
パルスデトネーションエンジン(PDE)高速作動技術の開発

パルスデトネーションエンジン(PDE)を高速作動させるには,流入した空気と燃料(水素)とを速やかに混合して点火し,デトネーション波を点火源から短い距離で生成することが重要となる.そこで,ロータリーバルブを装着したPDEを試作し,その作動特性を調べる実験を行った,具体的には,燃料と酸化剤の混合方法,パージおよび混合気充填に要する時間を短縮化のため,デトネーション波に遷移するまでの時間を短縮させるための実験を行った.得られた結果を要約すると以下の通りである.1)燃料噴射孔径を小さくすることで,水素の空気流への貫通距離を増加させ,燃料と酸化剤の混合が促進される.2)混合促進プレートの形状を3種類に変化させて実験を行ったが,高周波作動には大きな効果は発揮せず,耐久性などの観点から,プレートは装着する必要がないと考えられる.3)燃料噴射バルブを2ポートと4ポートで変化させた結果,2ポートのほうがデトネーション波を安定させて生じさせることができる.4)PDE管を短縮するには,PDE管内のスパイラル形状に最適な組み合わせがある.管内の気体に乱れを与えるため,スパイラルのピッチを10mmにしたほうがDDT距離が短縮できる.5)ロータリーバルブを装着し,作動周波数40Hzで3秒間の運転を行うことができた.作動時間を延ばすには,PDE管の冷却を行う必要がある.パルスデトネーションエンジン(PDE)を高速作動させるには,流入した空気と燃料(水素)とを速やかに混合して点火し,デトネーション波を点火源から短い距離で生成することが重要となる.そこで,ロータリーバルブを装着したPDEを試作し,その作動特性を調べる実験を行った,具体的には,燃料と酸化剤の混合方法,パージおよび混合気充填に要する時間を短縮化のため,デトネーション波に遷移するまでの時間を短縮させるための実験を行った.得られた結果を要約すると以下の通りである.1)燃料噴射孔径を小さくすることで,水素の空気流への貫通距離を増加させ,燃料と酸化剤の混合が促進される.2)混合促進プレートの形状を3種類に変化させて実験を行ったが,高周波作動には大きな効果は発揮せず,耐久性などの観点から,プレートは装着する必要がないと考えられる.3)燃料噴射バルブを2ポートと4ポートで変化させた結果,2ポートのほうがデトネーション波を安定させて生じさせることができる.4)PDE管を短縮するには,PDE管内のスパイラル形状に最適な組み合わせがある.管内の気体に乱れを与えるため,スパイラルのピッチを10mmにしたほうがDDT距離が短縮できる.5)ロータリーバルブを装着し,作動周波数40Hzで3秒間の運転を行うことができた.作動時間を延ばすには,PDE管の冷却を行う必要がある.パルスデトネーションエンジン(PDE)において十分な推力を得るには,エンジンを高速作動させる技術を開発することが不可欠である.PDEを高速作動させるには,まず燃料(水素)と酸化剤(空気)を高速で噴射し両者を短時間のうちに混合させることが必要である.次に混合気体を着火させた際に,速やかにデトネーション波へと遷移させること,さらにデトネーション波が通過した後の既燃気体を高速で排気し,次の新しい混合気を噴射することなどがエンジン高速化の鍵となる.本研究では,燃料と酸化剤をエンジン筒内に噴射する数を増やすことにより,エンジン全領域に渡り混合気を短時間のうちに充填する方法を採用した.さらに,燃焼後の既燃気体を膨張波によって自然排気するのみではなく,エンジンの管端に掃気用のバルブを新たに設け,空気を高速で噴射し既燃気体を強制掃気することによってパルスデトネーションエンジンの作動周波数を向上させることができることを明らかにしている,エンジンの作動周波数および掃気に要する時間を変化させて実験を行ったところ,作動周波数を増加させ高速作動させるほど,掃気に要する時間も増加することが明らかにされた.これは,作動周波数を増加させると膨張波による自然掃気が十分に行われず,強制掃気の時間を増加させる必要があることを示している,最終的には噴射量,掃気時間を最適化することにより,試作エンジンの周波数40Hzまで安定的な間欠作動を実現することができた.さらに,燃料・酸化剤および掃気用のバルブをさらに高速作動させるには,ロータリーバルブを採用することが望ましいことから,PDE用のロータリーバルブの試作を行い,その特性について実験的に調査を行った,パルスデトネーションエンジン(PDE)を高速作動させるには,流入した空気と燃料(水素)とを速やかに混合して点火し,デトネーション波を点火源から短い距離で生成することが重要である.これまで,空気および水素の噴射には電磁弁を利用していたがさらに高速作動させるため,本年度はPDEの空気流入孔部分に新たに設計したロータリーバルブを装着して実験を行った.具体的には,バルブ内において噴射孔が設けてあるローターを高速回転させ,噴射孔とPDEの燃焼室が同軸となった際に空気を噴射する方式である.また,ローター背後に燃料噴射孔を設けて水素を噴射させた.予備実験の結果,ローターから噴射される空気流に対し水素を単純に垂直噴射した場合には,空気流と水素との混合が促進されないことが明らかにされた.そこで,噴射孔上流部分において空気流を乱すことを目的に開孔率の異なる板を数種類製作し,複数の孔を介して空気を流入することによって乱れを与えるようにした.さらに,水素の噴射位置を変化させて実験を行った結果,燃料噴射孔の上流に設置する板の開孔率には最適値が存在することが明らかにされた.

また,水素の噴射位置を変化させて燃焼実験を繰返すことにより,高速作動が実現できる燃料噴射位置を特定することができた.流入する空気流に乱れを与えること,および適切な燃料噴射位置から水素を噴射することにより,20Hzの高速作動条件においてもデトネーシヨン波が燃焼室内で生成されることを確認した.パルスデトネーションエンジン(PDE)を高速作動させるには,流入した空気と燃料(水素)とを速やかに混合して点火し,デトネーション波を点火源から短い距離で生成することが重要となる.これまで,空気および水素の噴射には電磁弁を使用してきた.エンジン内に空気と水素を個々の電磁弁から対向して噴射させて混合させる方式である.パルスデトネーションエンジンをさらに高速作動させるため,昨年度より試作したパルスデトネーションエンジンの空気流入孔部分にロータリーバルブを装着して実験を開始している.ロータリーバルブを用いた場合には,流入した空気と燃料とを速やかに混合させる必要があるため,流入した空気を乱す方法,噴射方式,エンジンの長さ,などを変化させて実験を行った.実験で得られた結果を要約すると以下の通りである.1)燃料噴射位置を検討した結果,2ポートの互い違い噴射/平行噴射/対向噴射方式を比較すると,平行噴射が最適な噴射方式である.2ポートおよび4ポートの平行噴射では,管内の燃料分布が異なる.4ポートでは,デトネーションの持続性は劣るが着火性は優れていると考えられる.2)ローターの回転によって流入する空気には乱れが与えられる効果により,空気と燃料との混合は促進される.3)エンジンの長さを短くした場合,エンジン全体に渡って混合気が充填されると考えられ,パルスデトネーションエンジンを高速作動させるには有効である.4)間欠燃焼を行うPDEを安定作動させる上で,燃料供給量の早期安定化が重要な役割を果たす.5)パルスデトネーションエンジンを高速作動させるには,燃焼後のパージを十分に行う必要がある.6)ロータリーバルブを装着することにより30Hzでの作動に成功した.パルスデトネーションエンジン(PDE)を高速作動させるには,流入した空気と燃料(水素)とを速やかに混合して点火し,デトネーション波を点火源から短い距離で生成することが重要となる.そこで,ロータリーバルブを装着したPDEを試作し,その作動特性を調べる実験を行った.具体的には,燃料と酸化剤の混合方法,パージおよび混合気充填に要する時間を短縮化のため,デトネーション波に遷移するまでの時間を短縮させるための実験を行った.得られた結果を要約すると以下の通りである.1)燃料噴射孔径を小さくすることで,水素の空気流への貫通距離を増加させ,燃料と酸化剤の混合が促進される.2)混合促進プレートの形状を3種類に変化させて実験を行ったが,高周波作動には大きな効果は発揮せず,耐久性などの観点から,プレートは装着する必要がないと考えられる,3)燃料噴射バルブを2ポートと4ポートで変化させた結果,2ポートのほうがデトネーション波を安定させて生じさせることができる.4)PDE管を短縮するには,PDE管内のスパイラル形状に最適な組み合わせがある.管内の気体に乱れを与えるため,スパイラルのピッチを10mmにしたほうがDDT距離が短縮できる.
マイクロ気液・プラズマ流体素子のグローバル集積化による高感度元素検出システム開発

バイオ研究、創薬、医療、環境などの広い分野で必要な分析作業に要するコストや時間を数桁に及ぶ革新的レベルで短縮可能なμTAS(Micro Total Analysis System)呼ばれる技術が、欧米を中心に急速に発展している。マイクロ化学分析チップを汎用性の高い測定装置にするためにはICP発光分析装置や質量分析装置並みのppmppbクラスの感度をもつ検出モジュールを集積化することが必要になる。本研究では申請者がこれまでに研究開発を進めてきたマイクロプラズマ源、マイクロキャピラリー電気泳動、マイクロネブライザーインターフェイスやプラズマ駆動電源整合回路をチップ化し、集積化することによりシステム全体を小型化し、携帯可能な高感度分析システムを実現して再現性や検出感度などの特性を評価し、血液化学検査の中でも緊急検査項目である血清成分の高精度測定やオンサイト環境分析への応用を目指している。最終年度にあたる本年度は高機能マイクロ分析システムの実現のため、マイクロプラズマ源とその周辺デバイスの開発を進め、大気圧マイクロプラズマ源の小型化を実現し、水溶液中のNaの検出限界として400ppbを達成するなど水溶液試料中の微量元素検出への応用の可能性を示すことができた。更に、マイクロ分析システムの作製に不可欠な微細加工技術についても従来の半導体加工技術にとらわれない新規なプロセスの開発を進め、マイクロプラズマジェットを用いたマスクレス加工システムの可能性を示した。また、新規なドライエッチングケミストリーによるパーマロイ薄膜の微細加工法を研究し、微細磁気デバイスをマイクロ流体デバイスに集積化したアフィニティアッセイ用磁気ビーズ操作デバイスを開発し、その動作を実証した。本年度は大気圧マイクロプラズマ源の小型化、高効率化とその周辺デバイスの開発を進め、水溶液試料中の微量Na元素の定量検出が可能であることを実証することができた。また、マイクロ分析システムの作製に不可欠な微細加工技術についても従来半導体加工技術にとらわれない新規なプロセスの開発を進めており、マイクロプラズマジェットを用いた超高速局所シリコンウエファエッチングプロセスを開発し、従来技術の100倍以上に及ぶ最高4mm/minのエッチング速度を達成した。最終年度にはこれまでの要素技術開発の成果を統合し、当初目標として掲げたマイクロキャピラリー分離分析チップとマイクロプラズマ検出デバイスとの集積によるオンサイト型高検出感度分離分析システムの実現を図る予定である。
損傷軟骨治癒過程におけるシンデカン-4の役割の解析

我々は幼若個体を用いることで、C57Bl/6マウスにおける軟骨全層修復モデルの確立に成功した(Matsuoka M, Onodera T et al., Tissue Eng. 2015)。本モデルは我々が独自に開発したモデルであり、本申請から発展した骨軟骨修復過程の病態解析として、糖脂質欠損マウスを用いた解析を行った(Matsuoka M, Onodera T et al., Sci Rep. 2017)。また、我々が本モデルを用いてシンデカン4欠損マウスを用いて検討を行ったところ、予想に反して野生型と比べシンデカン4欠損マウスの軟骨修復は促進される傾向を示した。本研究は、シンデカン-4に着目し、関節軟骨修復メカニズムの更なる解明を目指す。本研究では、1シンデカン-4遺伝子の欠損はSDF-1の機能に影響を与え、2シンデカン-4の発現を調整することでSDF-1の機能を修飾して軟骨修復が促進される。という2つの仮説を検証する。まず第一段階として、平成26年度はC57BL/6マウス骨軟骨損傷モデルの開発と、その組織学的・分子生物学的評価を行った。生後3週、4週、8週齢のマウスに対して、膝関節を展開し、大腿骨滑車部に27G針を用いて直径約150μm、深さ60μmの骨軟骨損傷を作製する骨軟骨欠損を作製し、その修復過程を調査した。まずは、組織学的検討結果から、骨軟骨損傷作製直後の組織学的検討において作製された骨軟骨欠損は充分な再現性が得られることを確認した。次いで、各週齢におけるマウス骨軟骨欠損の修復過程を組織学的に比較・検討したところ、生後3週・4週マウスにおいては良好な骨軟骨修復が得られる一方で、生後8週齢では不十分な軟骨修復であった。これらの研究成果は既に海外論文としてacceptされている(Matsuoka M, Onodera T et al., Tissue Eng Part C Methods. 2015, In press)。今後は昨年度得られた結果を基に、術後3・4週齢マウスを用いて、シンデカン-4遺伝子の欠損マウスの骨軟骨損傷修復過程におけるフェノタイプの確認作業を行う予定である。本研究は、プロテオグリカンの一つであるシンデカン-4に着目し、関節軟骨修復メカニズムの更なる解明を目指す。本研究では、1シンデカン-4遺伝子の欠損はケモカインSDF-1の機能に影響を与える。2シンデカン-4の発現を調整することで、SDF-1の機能を修飾して軟骨修復が促進される。という2つの仮説を検証を試みる。まずは第一段階として、平成26年度にC57BL/6マウスにおける骨軟骨損傷モデルの開発と、その組織学的・分子生物学的評価を行った。生後3週・4週マウスにおいては良好な骨軟骨修復が得られる一方で、生後8週齢の成熟したマウスでは不十分な軟骨修復であった。幼若マウスにおける骨軟骨欠損は骨軟骨修復モデルとして有用であることが証明された。これらの研究成果は既に海外論文としてacceptされている(Matsuoka M, Onodera T et al., Tissue Eng Part C Methods. 2015)。今年度は平成26年度に確立した軟骨損傷修復モデルを用いて、シンデカン-4遺伝子の欠損マウスの骨軟骨損傷修復過程におけるフェノタイプの確認作業を行ったところ、驚くべきことにシンデカン-4遺伝子欠損マウスでは、野生型マウスと比べて良好な組織修復を認めた。この結果は骨折治癒や皮膚損傷治癒におけるシンデカン-4の役割と異なる作用機序による可能性が考えられる。次年度は、得られたフェノタイプが生じる機序に関して検討を深めていく予定である。本プロジェクトの第1段階であるC57BL/6マウス骨軟骨損傷モデルの開発成果が発表されており、第2段階であるシンデカン4欠損マウスにおけるフェノタイプの解析も順調に進展しているため。本研究の目的は、プロテオグリカンの一つであるシンデカン4に着目し、関節軟骨修復メカニズムの解明を目指すことである。第1段階として、C57BL/6マウスの骨軟骨損傷モデルを確立し、その研究成果は海外論文に掲載された(Matsuoka M, Onodera T et al., Tissue Eng Part C Methods. 2015)確立された骨軟骨修復モデルを用いてシンデカン4遺伝子欠損マウスの軟骨修復過程を詳細に検討したところ、シンデカン4ノックアウトマウスは、野生型マウスと比べて良好な組織修復が認められた。この結果は骨折治癒や皮膚損傷とは異なり、それらの組織とは異なるメカニズムによる可能性が考えられた。フェノタイプの解析のため、SDF-1に対する細胞遊走能試験を施行したところ、シンデカン4KOマウス由来細胞ではSDF-1による細胞遊走能の亢進を認めなかった。今後はシンデカン4ノックアウトマウスがどのようなメカニズムで良好な軟骨修復を獲得するのかのメカニズムの解析を行う予定である.また、本プロジェクトで開発した骨軟骨損傷モデルを用いた骨軟骨修復過程の病態解析として、ガングリオシド欠損マウスを用いた解析を行い、その成果が海外論文に掲載された(Matsuoka M, Onodera T et al., Sci Rep. 2017)これらの業績は今回開発した新たなモデルの妥当性ならびに有用性を国際的に示すものである。

我々は幼若個体を用いることで、C57Bl/6マウスにおける軟骨全層修復モデルの確立に成功した(Matsuoka M, Onodera T et al., Tissue Eng. 2015)。本モデルは我々が独自に開発したモデルであり、本申請から発展した骨軟骨修復過程の病態解析として、糖脂質欠損マウスを用いた解析を行った(Matsuoka M, Onodera T et al., Sci Rep. 2017)。また、我々が本モデルを用いてシンデカン4欠損マウスを用いて検討を行ったところ、予想に反して野生型と比べシンデカン4欠損マウスの軟骨修復は促進される傾向を示した。本プロジェクトの第1段階であるC57BL/6マウス骨軟骨損傷モデルの開発をすでに終えており、その成果が発表されているため。今後は今まで得られたフェノタイプの発生する機序を解明していく予定である。具体的にはシンデカン4欠損マウスより得られた軟骨細胞・骨髄間葉系幹細胞の細胞増殖能・細胞遊走能・分化能などを解析していく。整形外科今後は今まで得られた結果を基に、術後3・4週齢マウスを用いて、シンデカン-4遺伝子の欠損マウスの骨軟骨損傷修復過程におけるフェノタイプの確認作業を行う予定である。支払いが次年度に跨いでしまったため。予定していた出張が中止となったため実験用の試薬および機材の購入費用に使用した。研究成果報告のための費用として使用予定
核膜崩壊の前夜:M期突入に伴う核内物質移動のダイナミズム

細胞核は染色体をはじめとする核内構造物と細胞質を隔てる単なるしきりではなく核内に選択的に物質を集積させるための能動的な構造物である。その働きは遺伝子の発現調節、細胞周期の制御など重要な役割を果たしている。我々はヒト中枢神経系の障害である滑脳症の原因遺伝子・LIS1の機能解析に取り組んできた。LIS1はその結合タンパク質であるNdel1ともに細胞質ダイニンの制御を行っていることを明らかにしてきた。Ndel1はさらにリン酸化の修飾によりカタニンやTACC3などの中心体への集積を制御し、微小管ネットワークのコントロールを行っていることを報告した。さらにNdel1は中心体特異的な脱リン酸化酵素.PP4の基質となり、リン酸化酵素と脱リン酸化酵素のバランスによってNdel1の機能は制御されていることが分かってきた。PP4のノックアウトマウスを用いた解析からPP4は中心体にあってCDK1を負に制御しPP4の欠損は分裂間期におけるCDK1を活性化し過剰なNdel1のリン酸化とカタニンの中心体への集積と微小管の切断に至ることが分かった。また、M期においてPP4は中心体から一時的に核膜に強い集積を認めるが、標的タンパク質の探索からCDK11、Lamin BがPP4の基質となることが分かった。CDK11はPP4によって負に制御され、PP4の移動に伴うCDK11の活性化がCDK1の活性化の引き金になることが示唆された。また、M期における核膜崩壊においてPP4がCDK1の制御、Lamin Bのリン酸化、脱リン酸化の制御を行っており核膜崩壊においてPP4が重要な役割を果たしていることが示唆された。我々は神経細胞の遊走障害による滑脳症と、より重症な滑脳症、顔面奇形などを特徴とするミラー・デッカー症候群の分子機構の解明に取り組んできた。滑脳症/ミラー・デッカー症候群の遺伝子はヒト染色体17番の短腕に位置するが、ゲノム解析の結果から同領域は種間を越えて高度に保存されていることがわかった。滑脳症の原因遺伝子・LIS1のノックアウトマウスの解析から、LIS1は神経細胞の遊走だけでなく細胞分裂にも重要な役割を果たしていることがわかった。さらにLIS1はLIS1結合タンパク質であるNUDELと共にダイニンを制御し、細胞分裂時の染色体移動をコントロールしていることがわかった。また、滑脳症/ミラー・デッカー症候群の領域にある他の遺伝子14-3-3eはNUDELと結合し、LIS1、NUDELと共に細胞分裂をコントロールし、ノックアウトマウスの解析から核移動の修飾因子であり、ミラー・デッカー症候群の有力な候補遺伝子であることを明らかにし、ミラー・デッカー症候群の責任領域にある遺伝子・Mntはがん遺伝子のMycの制御を介して、細胞周期の制御・がん化にかかわる遺伝子であることを解明した。NUDELのノックアウトマウスの解析からNUDELも神経細胞の遊走だけでなく細胞分裂と微小管のコントロールに必須であることを明らかにした(Mol.Cellular Biol.2005)。また、NUDELの微小管再編における標的分子としてカタニンを同定した(Human Mol.Genet.2005)。