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冷戦終焉の構想―1970年代後半の西欧諸国とデタント

本研究では、1970年代後半から80年代初頭のヨーロッパにおける緊張緩和の国際政治過程の史的検討を行った。特に、NATO内でのデタント研究と1980年81年に起こったポーランド危機に注目し、西側同盟内の構想を分析した。その結果明らかになったのは、1975年以降、さらなる緊張緩和を進める上で、西側諸国は具体的にどの分野で東側陣営と協力を進めるのかについてコンセンサスを形成できないまま、新冷戦と呼ばれる新たな対立の時代に突入していったというものであった。本年度はイギリスおよびフランスへ赴き、史料の収集を重点的に行った。夏季には、イギリス国立公文書館へ行き、首相官邸史料と外務省の史料を幅広く収集することができた。また春季にはフランス外務省公文書館へ私費で行き、1970年代のフランス政府の軍縮提案についての史料を収集することができた。また平成25年7月20日には九州大学政治研究会において研究報告をする機会を与えられ、「デタントと西側諸国の対ポーランド危機政策、1980ー81年」と題する報告を行った。これを通じて、1980年代初頭に起こった危機の最中、西側同盟諸国がどのような対応を行い、どのような対立が存在したのかについて暫定的な分析を行うことができた。この分析内容を意識しつつ、1970年代の同盟諸国のデタント政策のさらなる分析に役立てる予定である。本年度は、二本の論文の草稿を執筆した(どちらも27年度に論文集の中で出版予定)。一つは、冷戦の分断国家である東西ドイツと南北朝鮮のそれぞれの接近過程を比較検討した。冷戦の終焉を理解する上で、分断国家の関係を理解することは重要である。とりわけ1970年代に東西ドイツは、ブラント西独首相のイニシアティブ、いわゆる東方政策によって東西両国間で「基本条約」が締結された。他方、南北朝鮮は、同じく1970年代に初めて両国間で共同声明を打ち出すものの、韓国が「二つのコリア」による安定を目指す一方で、北朝鮮が統一された「一つのコリア」や駐留米軍の撤退に固執し、南北関係は再び悪化することとなった。このドイツと朝鮮半島の差異を、国際環境(大国間との関係や国連との関係)の文脈の中で浮き彫りにした。また、1970年代から80年代初頭にかけての東西貿易に関して、特にソ連から西ヨーロッパへのパイプラインを通じた天然ガスの輸出問題を史料に基づき分析し、草稿をまとめた。1970年代に、東西間の緊張緩和の一環として東西貿易が促進され、また石油危機の影響もあり、西ヨーロッパ諸国はソ連から天然ガスの輸入を計画するようになった。しかし、アメリカから見ると、それはソ連へのエネルギー依存を意味し、冷戦の安全保障上の問題とされた。そこに、米欧間で利害対立が生まれることとなった。1980年代初頭にはアメリカによる経済制裁の発動にまで至るものの、同盟内の交渉により危機が回避される過程を明らかにした。研究の史料調査に関しては、本年度はドイツの外務省外交史料館へ赴き、史料収集をおこなった。そこでは、1970年代後半にフランスより提案された軍縮問題に関する史料を収集できた。また当時のEC諸国が政治協力の枠組みを改革しようとした試みに関する史料も入手した。この3年間、イギリス、フランス、ドイツ、アメリカの各国公文書館において史料調査を行ったが、文書の開示状況にはバラツキが多く、また現時点では収集した全ての史料を精査できているわけではないため、以下の研究報告は暫定的なものである。1975年にヘルシンキで全欧州安全保障協力会議が開催され、ヨーロッパ冷戦はデタント(緊張緩和)の頂点を迎えた。1970年代後半は、さらなる緊張緩和が期待される一方で、具体的にどの分野で協力を進めるのかについてコンセンサスを得ることができず、むしろ新冷戦と呼ばれる新たな時代へと向かっていったと言える。とりわけ、軍縮・軍備管理分野におけるデタントは、主要国の思惑の相違が顕著であった。米ソは共に戦略核兵器の分野で削減を目指したものの、ソ連は戦域核兵器の近代化および配備を進め、他方で英仏は自国の核兵器の削減に消極的であった。通常兵力に関しては、フランスのジスカール・デスタン大統領が新たな軍縮イニシアチブを打ち出すものの、ソ連は消極的で、アメリカもまたNATOの軍備増強を望んだ。カーター大統領はデタント支持の立場を示し、1977年のNATO首脳会議で「東西関係の長期的傾向の研究」を行うことを提案するが、その実際の狙いは西欧諸国にさらなる軍事負担を求めることにあった。またカーターの人権外交が、米ソ関係を悪化させただけに終わったことはよく知られる。経済デタントも、西ヨーロッパ諸国の景気後退で東西貿易は縮小し、東側陣営が期待したほど進展しなかった。西ヨーロッパ諸国はさらなる緊張の高まりを望まなかったものの、ソ連が軍縮に消極的あったこと、1979年のソ連のアフガニスタン侵攻、1981-82年のポーランド危機などによって、東西関係改善の機運は失われていくことになった。今後はさらに史料の読解を進め、上記の分析結果を論文等で公表できるよう研究を進めていく予定である。

その結果明らかになったのは、1975年以降、さらなる緊張緩和を進める上で、西側諸国は具体的にどの分野で東側陣営と協力を進めるのかについてコンセンサスを形成できないまま、新冷戦と呼ばれる新たな対立の時代に突入していったというものであった。昨年度、イギリスおよびフランスの史料を収集し、今年度はドイツの史料も収集できたことから、史料収集は着実に進んでいる。しかしながら、史料の量が膨大であることもあり、その読解が十分なペースで進んでおらず、研究報告として形になるまで時間がかかっている。国際関係史今後は、集めた史料を読み進めることが重要である。また次年度は、アメリカの史料を収集し、NATOの主要国の動向を全体として把握できるよう試みる予定である。本年度はイギリスとフランスの史料を収集することができ、十分なスタートを切ることができたと思われる。また研究報告を通じて、1980年代からさかのぼって1970年代のヨーロッパ冷戦を検討する視点を強化することができた。1970年代の冷戦の緊張緩和の時代には冷戦は終わらず、1980年代後半以降に冷戦が終焉したことからしても、1970年代を相対化することが重要であろう。まずは収集した多くの史料を整理し、読み込んでいくことが必要である。その際に、イギリスとフランスの史料を比較したり、補い合ったりさせながら、歴史像を浮かび上がらせていく作業を進めることになる。1970年代の冷戦に関する研究は日進月歩の状態にあり、新しい研究をフォローアップしつつ、それらの成果を吸収していかなくてはならない。そして西ドイツおよびアメリカの史料の利用可能性ならびに、これまで利用できなかったイギリスの史料の新たな開示状況をチェックしながら、さらなる史料収集を進める予定である。イギリスでの史料収集旅行の日程上、旅費を予定より安く済ますことができたため。次年度において、研究上必要な史料や書籍の購入に使用する予定である。
網羅的ペプチドミクスによるＮＡＳＨの病態解析と分子標的の探索

近年、メタボリック症候群の増加が本邦にとって最大の問題となってきている。その病態の解明の進歩により代謝の基本臓器である肝臓の脂肪化が疾患の誘因や進展に大変重要な役割をしていることが明らかになってきた。しかし、脂肪肝、および脂肪性肝炎(NASH)の分子生物学的な機序の解明は十分になされていない。そこで、われわれは、最新のプロテオミクス解析を用い健常人とNAFLD/NASHから肝硬変に至る時間軸にそった患者由来試料を解析し、それぞれに特異的なペプチド発現データを中心に解析し、iTRAQを用いてNASH特有のペプチドを同定した。近年、病態プロテオミクスにおける血中ペプチドの重要性が明らかになってきている。病態の局所環境においては、数々のプロテアーゼによって特に細胞内や細胞外のタンパクを分解し、低分子量のタンパクを多数分泌や産生をしており、いわゆるペプチドームの産生源となっている。また、糖鎖やリン酸化などのタンパク修飾なども特異的にみられる。そこで本研究では、近年増加しているメタボリック症候群の一表現型と考えられる非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD/NASH)を対象にして、血液中、組織中ペプチドミクス解析により、特に代謝関連分子に着目して、新たなNASH進展の責任分子を探索する。最終的に病態進行の責任分子、分子標的を探索し臨床応用することを目的とする。Pooled sampleを用いてNASH特異的な新規バイオマーカー候補同定を試みた。方法は、iTRAQ法を用いて行った。その原理は、各検体に含まれるすべてのペプチドをそれぞれ異なるiTRAQ reagentでラベルし、すべての検体を等量で混合し、質量分析により各ペプチドのそれぞれの検体における発現比率を測定し、NASHにおいて疾患特異的に増加しているペプチドを探索するものである。これにより、serotransferrin peptide1、serotransferrin peptide2、S5A3、MUC5などがNASH患者血清のおいて上昇していた。また、NAFLD間(Type1+Type2とType3+Type4の間)でも有意差がみられるマーカーも検索できた。近年非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)は急増している。NAFLDの一部は非アルコール性脂肪肝炎(NASH)であり、肝硬変、肝がんへの進展の可能性がある。NASHとSSの区別は肝生検が標準法であるが、合併症のリスクも高いためNASHを診断できる新規バイオマーカーの開発が待たれる。そこで本研究では、血液中、組織中ペプチドミクス解析により、新たなNASH進展の責任分子を探索し、最終的に病態進行の責任分子、分子標的を探索し臨床応用することを目的とした。方法は、主にiTRAQ法を用いて行った。各検体に含まれるすべてのペプチドをそれぞれ異なるiTRAQ reagentでラベルし、質量分析により各ペプチドのそれぞれの検体における発現比率を測定し、NASHにおいて疾患特異的に増加しているペプチドを探索するものである。まずAST/ALT正常慢性肝炎患者にペプチドX濃度が上昇していることを確認した。また、このペプチドXは、Matteoni分類における脂肪肝の組織学的分類において、正常VS type1(P<0.001)、正常VS type2(p<0.001)、正常VS type3+4(P<0.001)と有意差を持って脂肪肝患者で上昇していたが、type 1、2 VS type 3+4では有意差を認めなかった。ペプチドYにおいては、type1→type3+4と進行するに従って増加し、ペプチドZはtype2で低下、ペプチドAはtype2及びtype 3+4で増加、ペプチドBはtype 3+4で増加していた。

またペプチドCは、type2と比較して有意にtype3+4で増加(p=4.2558E-3)しており、NASHとsimple steatosisの鑑別に有用であると考えられた。肝臓病学ある特定のタンパクにおける正常と脂肪肝(Type 1,Type2,Type3+4)の有意差は認められた。またType1+Type2と比較してType3+Type4でペプチド断片の増加が認められたこと、また、酸化ストレス関連マーカーにおいて両群に差があるようであり、マーカー探索という観点では順調に進行していると思われる。iTRAQラベル法を用いて血清のpool sampleよりSerotransferrinをはじめ、NASH血清において上昇する数種類のペプチドを検出した。さらなるマーカーの探索とマーカーのpathogenesisとの関連の検討および個々の症例、および多検体での定量評価によるvalidationが必要である。今回検出されたペプチドはNASH特異的な有用なバイオマーカーとなる可能性がある。そのためには、今後1pathogenesisとの関連の検討。2個々の症例、及び多検体での定量評価によるvalidation。が必要である。研究に関する機器、設備は現有している。前年度に引き続き、アミノ酸分析のための酵素や試薬等に60万円の計上を認めていただきたい。上記同定ペプチドの機能解析として、細胞への導入、シグマル解析のための培養試薬および一般試薬として60万円を計上したい。成果の経過発表のための予算として30万円計上を申請させていただきたい。
植物型鞭毛運動機構の祖先型に関する研究

これまで、鞭毛運動は主として動物生理学の研究対象として、その機構の解明という側面から詳細に取り扱われてきた。植物ではクラミドモナスの鞭毛運動が詳細に研究され、一般に手泳ぎ打法であると理解されて現在に至っている。しかし、植物はきわめて多様な多系統の生物群を含んでいる。クラミドモナスの所属する緑色植物群だけを取り上げても、シャジク藻網、緑藻網、アオサ網そしてプラシノ藻網など少くとも4つの異なる系統群からなる。過去に記載された多くの緑色鞭毛藻の中には、鞭毛を細胞側部から伸ばして運動するもの、あるいは鞭毛を後端から伸ばして細胞後方で運動することにより遊泳するものなど、遊泳様式から見ても多様な生物の集団であることが容易に想像される。われわれは、緑色植物の起源を探る目的で、緑色鞭毛藻、特にプラシノ藻の細胞構造の比較形態学的研究を行い、ピラミモナス、ハロスフェラ、プテロスペルマなどの4本鞭毛藻の鞭毛装置構造がシャジク藻網と緑藻及びアオサ網の双方の特徴を合わせもつことを明らかにすることができた。このことは、これらプラシノ藻が緑色植物全体の中でも進化・系統学的にきわめて原始的な性質を残していることを強く示唆している。このような形態学的知見と鞭毛運動パタ-ンを比較対照してみると、次のような進化傾向が明らかになった。(1)繊毛打(平泳ぎ型)と鞭毛打(逃避反応)を併せもつピラミモナスの運動様式は、鞭毛打しか行なわないプテロスペルマ、プラシノパピラのそれより新しい性質である;(2)同様に前方遊泳は後方遊泳より新しい;(3)一方向への運動は後方遊泳と密接に結び付いて出現する事実及び放射方向への運動は例外なく前方遊泳と結びついて観察されることから、後者は前者より新しい形質;(4)方向転換時に鞭毛基部を急激に屈曲する行動は後方遊泳と通常の様式とするプテロスペルマ、キンボモナスの小型細胞にのみ認められるので古い形質である。初年度の本年は、できるだけ多くの種についての情報を集めることに主眼を置き、約40種あまりの遊泳細細胞の記録を得ることができた。それらの多くについては詳細な解析を未だ行なっていないが、解析の主眼が置かれるプラシノ藻類について次のような興味ある知見が得られた。1.鞭毛を後方に運動して遊泳するプラシノ藻の一つPterospermaは、緑色植物の遊走細胞に一般的と言われる有効打と回復打を伴う、いわゆる平泳ぎ型運動はみられず、その運動パターンは動物の精子鞭毛の運動パターンときわめて類似しており、有効打と回復打の区別は認められない。本藻は4本の鞭毛を有し、3本が一列に、他の1本が離れて配列する〔3+1〕配列をとる。鞭毛軸糸の連管に存在するマーカー構造の解析から、これらの鞭毛は同一の方向に力を発生することを微細構造の上から予想したが、高速度ビデオ撮影でこのことが確かめられた。即ち、これら4本の鞭毛は一体となって同一平面上で同調的に運動する。本藻はしばしば停止し、数ミリ秒後に通常の遊泳状態にもどることをくり返して行うが、この時1本の鞭毛は他の3本と異なる動きを行なっており、この時の運動に鞭毛の配列が反映している。

2.Pterospermaと系統的に近縁であるとされるPyramimonas2種について調査した。P.parkeaeでは繊毛型の有効打と回復打があり、典型的な緑色植物の平泳ぎ型鞭毛運動を行う。ところが、P.amyliferaは、鞭毛前方に運動して遊泳するにもかかわらず、平泳ぎ型ではなく、鞭毛の動きはPterospermaに近い。このようなパターンは、他にOltmannsiellopsisでもみられた。Hafniomonasは、プラシノ藻ではないが、平泳ぎ型を行う近縁属の一種であることが観察された。このように、同属内でプラシノ藻類の進化の途上で運動パターンが鞭毛型から繊毛型に変化していることが強く示唆される。これまで、鞭毛運動は主として動物生理学の研究対象として、その機構の解明という側面から詳細に取り扱われてきた。植物ではクラミドモナスの鞭毛運動が詳細に研究され、一般に平泳ぎ打法であると理解されて現在に至っている。しかし、植物はきわめて多様な多系統の生物群を含んでいる。クラミドモナスの所属する緑色植物群だけを取り上げても、シャジク藻網、緑藻網、アオサ網そしてプラシノ藻網など少くとも4つの異なる系統群からなる。過去に記載された多くの緑色鞭毛藻の中には、鞭毛を細胞側部から伸ばして運動するもの、あるいは鞭毛を後端から伸ばして細胞後方で運動することにより遊泳するものなど、遊泳様式から見ても多様な生物の集団であることが容易に想像される。われわれは、緑色植物の起源を探る目的で、緑色鞭毛藻、特にプラシノ藻の細胞構造の比較形態学的研究を行い、ピラミモナス、ハロスフェラ、プテロスペルマなどの4本鞭毛藻の鞭毛装置構造がシャジク藻網と緑藻及びアオサ網の双方の特徴と合わせもつことを明らかにすることができた。このことは、これらプラシノ藻が緑色植物全体の中でも進化・系統学的にきわめて原始的な性質を残していることを強く示唆している。このような形態学的知見と鞭毛運動パタ-ンを比較対照してみると、次のような進化傾向が明らかになった。(1)繊毛打(平泳ぎ型)と鞭毛打(逃避反応)を併せもつピラミチナスの運動様式は、鞭毛打しか行わないプテロスペルマ、プラシノパピラのそれより新しい性質である;(2)同様に前方遊泳は後方遊泳より新しい;(3)一方向への運動は後方遊泳と密接に結び付いて出現する事実及び放射方向への運動は例外なく前方遊泳と結び付いて観察されることから、後者は前者より新しい形質;(4)方向転換時に鞭毛基部を急激に屈曲する行動は後方遊泳を通常の様式とするプテロスペルマ、キンボモナスの小型細胞にのみ認められるので古い形質である。
類洞微小循環系の形態的、機能的解析による肝の病態生理の解明と新しい治療法の確立

1.肝冷保存における肝傷害制御に関する研究:既に我々は肝冷保存においてクッパー細胞が活性化しこれが類洞内皮に傷害性に作用することを明らかにした。しかしクッパー細胞の活性化より早期に類洞内皮傷害が生じるとの知見から、類洞内皮傷害の新たな機序が想定された。そこで、我々は類洞内皮細胞のアポトーシスに着目し研究を進めた。その結果、冷保存において類洞内皮細胞は高率にアポトーシスに陥ることを走査型電顕、透過型電顕、TUNEL法などにより明らかにした。そして、VEGFがこれを抑制することを示した。又、脂肪肝は移植後、高率に無機能肝になることもよく知られた事実であるが、その原因については明らかではない。本研究では、コリン欠乏性脂肪肝をラットに作成し、超微形態的、機能的に検討した。その結果、類洞内皮細胞は冷保存前に既に変性を生じており、冷保存によりブレブの増加、ギャップの拡大、そして糸状変性が促進することが判明した。肝実質細胞の脂肪滴は冷保存時間が長くなるにしたがい大きくなり、ついには細胞質全域を占拠するまでになる。そして類洞を圧迫し、類洞径の狭少化をもたらす。以上の知見は脂肪肝移植後の機能不全に類洞微小循環が深く関与することを示唆するものである。2.伊東細胞におけるNa^+-Ca^^H exchangerの発見:伊東細胞は類洞を包囲するように存在し、その収縮は類洞微小循環の調節に関与するとの説がある。実際、伊東細胞は血管収縮物質に反応し、細胞内Ca^^Hの増加と収縮を来す。本研究ではNa^+-Ca^^H exchangerが伊東細胞の活性化及び肝の線維化に伴い出現することを初めて明らかにした。3.肝硬変門脈循環における一酸化窒素(NO)の意義:ラット肝硬変モデルにおいてNOが肝前性に血管抵抗を下げ肝血流量を増加させること、肝硬変における血清NO産物の上昇は肺、肝、膵でのiNOSのmRNAレベルでの上昇によることを明らかにした。I.肝冷保存における肝障害抑制に関する研究すでに我々は肝冷保存においてクッパー細胞が活性化し、これが類洞内皮に障害性に作用することを明らかにした。しかしながら、クッパー細胞の活性化により早期に類洞内皮障害が生じるとの知見から、クッパー細胞の活性化は類洞内皮の障害促進因子であると考えられた。そこで、我々はvascular endothelial growth factor (VEGF)が類洞内皮細胞の培養系における生存期間を著しく延長させることに着目して、VEGFによる冷保存肝の類洞内皮障害抑制効果を検討した。まづ、培養系において冷保存下培養類洞内皮細胞の復温後の生存率がVEGF添加により有意に向上することを形態学的、及びMTT assayで立証した。さらに、肝組織の冷保存においてもVEGF含有保存液により類洞内皮の形態と機能が維持されることを走査電顕とヒアルロン酸のクリアランス試験により明らかにした。まづ、マウスの70%肝切除モデルにおいて検討したところ、肝切除後24-48時間で著しいCD14mRNA発現の亢進を認め、抗CD14抗体による免疫染色で主として類洞壁が染色された。クッパー細胞のブロックによりこの発現亢進は減弱し、同時に残肝障害の指標となる血清GOT、血清ビリルビン値の上昇も抑制された。

現在、抗CD14抗体投与による障害抑制効果を検討中である。臨床的にも重要な肝硬変では20%肝切除でCD14mRNAの発現が肝、及び肺で認められることを明らかにした。正常肝の20%切除ではこの現象は観察されず、肝硬変切除後の病態との対応を解析する予定である。1.肝冷保存における肝障害制御に関する研究:既に我々は肝冷保存においてクツパ-細胞が活性化しこれが類洞内皮に傷害性に作用することを明らかにした。しかしクツパ-細胞の活性化より早期に類洞内皮傷害が生じるとの知見から、類洞内皮傷害の新たな機序が想定された。そこで、我々は類洞内皮細胞のアポトーシスに着目し研究を進めた。その結果、冷保存において類洞内皮細胞は高率にアポトーシスに陥ることを走査型電顕、透過型電顕、TUNEL法などにより明らかにした。そして、VEGFがこれを抑制することを示した。又、脂肪肝は移植後、高率に無機能肝になることもよく知られた事実であるが、その原因については明らかではない。本研究では、コリン欠乏性脂肪肝をラットに作成し、超微形態的、機能的に検討した。その結果、類洞内皮細胞は冷保存前に既に変性を生じており、冷保存によりブレブの増加、ギヤツプの拡大、そして糸状変性が促進することが判明した。肝実質細胞の脂肪滴は冷保存時間が長くなるにしたがい大きくなり、ついには細胞質全域を占拠するまでになる。そして類洞を圧迫し、類洞径の狭少化をもたらす。以上の知見は脂肪肝移植後の機能不全に類洞微小循環が深く関与することを示唆するものである。2.伊東細胞におけるNa^+-Ca^H exchangerの発見:伊東細胞は類洞を包囲するように存在し、その収縮は類洞微小循環の調節に関与するとの説がある。実際、伊東細胞は血管収縮物質に反応し、細胞内Ca^Hの増加と収縮を来す。本研究ではNa^+-Ca^H exchangerが伊東細胞の活性化及び肝の線維化に伴い出現することを初めて明らかにした。3.肝硬変門脈循環における一酸化窒素(NO)の意義:ラット肝硬変モデルにおいてNOが肝前性に血管抵抗を下げ肝血流量を増加させること、肝硬変における血清NO産物の上昇は肺、肝、膵でのiNOSのmRNAレベルでの上昇によることを明らかにした。
Gli転写因子による多様なシグナル伝達の制御機構の解明

1.シグナル伝達因子ヘッジホッグ経路において中心的役割を担う転写因子Gli1-3複合体の構成因子の同定1-1. GIi1-3を誘導的に発現する細胞株確立のため、それぞれのDNAコンストラクトを作製した。Gli1(野生型);Gli1cDNAをpcDNA3を基にしたSF-TAPベクターに導入した。Gli2(野生型);Gli1と同様にGli2cDNAをSF-TAPベクターに導入した。塩基配列を確認したところデータベース上の配列と異なり、2カ所のアミノ酸を置換する変異を確認したので、これを部位特異的ミュータジェネシスによりデータベース上の配列に変換して野生型として用いた。Gli3(野生型);Gli1と同様にGli3cDNAをSF-TAPベクターに導入した。それぞれのコンストラクトについては、塩基配列を確認している。各cDNAについては他研究室から寄与されたものを用いた。1-2. Gli1-3を誘導的に発現する細胞株の確立MEF/3T3Tet-off細胞株(Clontech);数回試みた結果、この細胞を用いてGli1-3を構成的に発現する細胞株確立はこれまでのところ失敗に終わっている。NIH3T3Tet-on細胞株(Clontech);現在細胞株の選択過程にあるが、ほぼ細胞株は確立されつつある。2.質量分析によるGli複合因子同定法の確立GliホモログであるCiを誘導的に発現するハエ培養細胞を用いて、その複合体を単離し、構成因子を質量分析機により同定する方法を確立した。既知の構成因子であるFu,Costa12,Sufuを含む48個の因子を独立した3回の実験のうち2回の実験で同定した。3.質量分析によるタンパク質ユビキチン化残基同定法の最適条件の検討Ciのユビキチン化残基による制御が転写抑制型Ci(プロテオソームによる部分分解により形成される)の形成に重要であるので(Wang & Price. MolCell Bio1.2008,28(18):5555-68)、質量分析機によるポリユビキチン化残基の同定法をGliに応用すべくその条件検討を行った。これまでの結果により特定の残基を同定できたことから、Gliに適用できる条件であると推定している。
共鳴トンネル素子をテラヘルツ波源とした無線通信へ向けた予測性能の包括的理論解析

平成26年度は、化合物半導体共鳴トンネルダイオード(RTD)と広帯域アンテナの一種である自己補対ボウタイアンテナを集積一体化したテラヘルツ発振器に関して、(1)実機作成・検証に向けた研究、(2)発振器安定性評価のための解析手法の検討、の2点を行った。(1)に関しては、自己補対ボウタイアンテナ集積RTD発振器の電源バイアス側回路のデバイス構造設計・等価回路同定・発振特性への影響評価・放射特性評価を行った。バイアス側回路はマイクロストリップ線路および薄膜抵抗により電磁気学的に設計し、電磁界シミュレーターにより周波数特性を解析、フィッティングにより等価回路同定を行った。結果として、発振・変調特性を悪化させないバイアス側回路構造を設計できた。またバイアス側回路構造によって放射指向性や広帯域性を向上可能であることも明らかにした。(2)に関しては、バイアス側回路を含めた発振器の等価回路から、ポテンシャル関数を定義し、その形状や、発振動作・変調時のポテンシャル内軌跡を検証した。変調方式はOOK(On Off Keying)を用い、発振器に印加するバイアス電圧を変化させる直接変調を変調周波数50GHzで解析を行った。結果として、Off状態の電圧がOn状態の電圧から離れていると、ポテンシャル内の位置が離れてしまい、On状態へ至る為に時間を用してしまうことが明らかとなった。またこの現象は発振器の動作モードが単一周期発振モード時に近い方が顕著であり、発振器の変調特性に大きな影響を与えることが予想される。今後は、自己補対ボウタイアンテナ集積RTD発振器の実機作成を目指し、周波数コム特性の実測検証を行う。また、RTD発振器はRTDの非線形特性を積極的に利用したデバイスであるため、この非線形性と発振特性との間の関係性を明らかにし、実用化のための設計手法確立を目指す。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は共鳴トンネルイオード(RTD)の非線形性の高周波に関して研究を行った。具的には、1. RTDの非線形性および高速応答性を決めている物理パラメータ(トンネル時間、緩和時間、走行時間)を考慮した物理モデルベースのRTDのアドミタンス関数を導出し、2,このアドミタンス関数が上記物理パラメータを調節することで測定データを表現できるかを検証した。また2の検証により導出したアドミタンス関数が妥当であると判明すると、測定データを表現できた際の物理パラメータはそのRTDの物理パラメータを抽出したことと同義となる。またこの物理パラメータの検証・抽出手法には、粒子群最適化(PSO)手法とFeature Selective Validation (FSV)という手法を組み合わせることを試みた。この試みは本研究が初めてであり、これら2つの手法を取り入れることで、1.考慮すべき物理パラメータの数が多くなっても検証・抽出が可能となる、2.理論が実測を表現できるか否かを数値的・視覚的に評価できる、というメリットがある。そして本年度の研究成果として、導出したアドミタンス関数はRTDの高周波測定結果を制度よく表現できることが明らかとなり、この結果からこのアドミタンス関数は妥当であるといえる。本年度の研究成果によってRTDの非線形性の高周波応答が明らかとなったため、本研究の目的であるRTDとアンテナを集積したテラヘルツ波源の高周波応答特性を定量的に評価できるようになると予測される。そしてこの高周波応答特性は波源の発振周波数や放射パワーの周波数的な揺らぎや、変調特性、雑音特性を予測する上で重要なパラメータである。こういった観点から本年度確立したRTDの物理パラメータ抽出手法は工学的に意義があり、本研究の基盤となる重要な部分である。

26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は博士論文の審査があったため、学会発表や学術誌への論文投稿を行う事はできなかったが、研究の達成度としては順調に進展していると考えている。今後の研究は、1. RTDの理パラメータの抽出精度向上、2. RTDとアンテナを集積したテラヘルツ波源の周辺部の回路に関して電磁界シミュレータを用いた構造設計、3. RTDとアンテナを集積したテラヘルツ波源の構造スケーリングに対する特性変化を大信号解析手法を用いて理論解析、の3点を行っていく。そのため申請時の研究計画であったデバイス作製から、デバイス作製に向けた理論解析への計画変更を行う。
光電子分光によるイッテルビウム系近藤物質の量子臨界現象に関する研究

重い電子系α-YbAlB4は,数%のAl-Fe置換により非従来型の量子臨界現象と反強磁性秩序が誘起される.我々は,α-Yb(Al,Fe)B4系における特異な量子臨界現象の起源を明らかにするために,思い電子状態や磁性に関係するYb価数状態の温度・Feドープ依存性を,硬X線光電子分光を用いて詳細に調べた.その結果,量子臨界領域において,Yb価数のFeドープ変化に鋭いクロスオーバーが観測され,さらにそのクロスオーバーが約100 Kという特徴的な温度以下で発達することを発見した.重い電子系α-YbAlB4は,数%のAl-Fe置換により非従来型の量子臨界現象と反強磁性秩序が誘起される.我々は,α-Yb(Al,Fe)B4系における特異な量子臨界現象の起源を明らかにするために,思い電子状態や磁性に関係するYb価数状態の温度・Feドープ依存性を,硬X線光電子分光を用いて詳細に調べた.その結果,量子臨界領域において,Yb価数のFeドープ変化に鋭いクロスオーバーが観測され,さらにそのクロスオーバーが約100 Kという特徴的な温度以下で発達することを発見した.本課題では,放射光や先端的なレーザー光源を用いた光電子分光法を用いることで,量子臨界現象や新奇な超伝導を示す重い電子系イッテルビウム化合物の特異な物性について,電子構造の直接観測という観点から解明を試みる.具体的には,イッテルビウム化合物で初めて重い電子系超伝導が報告され,かつ圧力・磁場という非熱的外部パラメータを導入せずに基底状態が量子臨界点にあるβ-YbA1B_{4}及びその関連物質であるα-YbA1_{1-x}Fe_{x}B_{4}に着目して研究を進めている.光電子分光は超高真空中で清浄な試料表面を得ることが不可欠であるが,β-YbA1B_{4}はその試料形状(c軸方向の厚みが10マイクロメートル程度)により壁開に相当の工夫を要する.また,重い電子系は一般に酸化膜形成などで清浄表面を長時間保つことが難しく,測定槽内の真空度の制御及び測定時間の短縮も重要である.本年度は,このような問題を排除するために,バルク測定のための実験条件の最適化を主に行った.その結果,β-YbA1B_{4}の壁開表面を得ることに成功し,フェルミ準位近傍に近藤ピークに対応するYb 4f^{13}終状態(J=7/2)が明瞭に観測された.これは,f電子がフェルミ準位における電子状態密度に寄与していることを直接的に示しており,電子比熱係数や量子振動実験から示唆される電子有効質量の増大や,以前に我々が硬X光電子分光によるYb 3d内殻準位の測定で明らかにしたβ-YbA1B_{4}の強い価数揺動状態とコンシステントな結果である.β-YbAlB4はYb系として発見された重い電子系超伝導体であり,従来の量子臨界現象の理論では説明できない特異な振る舞いを示すことから注目されている.さらに,結晶構造の異なるFermi液体金属α-YbAlB4においては,Al-Fe置換を行うことによりβ-YbAlB4と同様の量子臨界点および反強磁性相を起することが可能であり,つまり化学的に基底状態をFermi液体-量子臨界点-反強磁性と制御することができる.本課題では,電子分光・X線分光による電子構造測定を通して, Yb(Al,Fe)B4系の量子臨界現象の解明に繋がる成果を得ることが目的である.本年度は,硬X線光電子分光を用いてα-Yb(Al,Fe)B4のYb 3d内殻準位の測定を行い,Yb価数のFeドープ量・温度依存性を明らかにした.その結果,量子臨界点近傍の組成の試料について,温度上昇に伴いYb価数が価数揺動状態から3価に近づく振る舞いが観測されたものの,40 Kから室温での価数変化はわずか0.02程度に過ぎないことがわかり,高い近藤温度を持つことが示唆される.さらに,50100 Kの領域でYb価数の温度変化に異常が見られ,高い近藤温度とは異なるクロスオーバーがこの温度領域に存在する事が考えられる.また,反強磁性基底状態を示す組成においても,低温から室温に渡りYb価数2.8台という比較的大きい価数揺動状態を維持しており,遍歴性を示すYb 4f電子が磁気秩序の起源となっていることが強く示唆される結果を得た.本課題における主要テーマのひとつである,硬X線光電子分光によるYb価数評価の実験が,共同研究者の急逝により実行不可能になったため,まったく進展させることができなかった.24年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度頓挫した硬X線光電子分光実験は,新たに別のSPring-8共同利用グループ(東京大学・和達大樹特任講師)と共同研究を行うことで実行可能となった.よって,硬X線光電子分光によるYb価数評価の実験を優先的に進める.また,真空紫外軟X線領域における角度分解光電子分光実験も進めており,昨年度に引き続き高エネルギー加速器研究機構及び東京大学物性研究所での実験に加え,新たに分子科学研究所紫外放射光施設のグループとの連携を開始し,さらに研究スピードを向上させる計画である.24年度が最終年度であるため、記入しない。
遺伝子内組換えの新アリル創出力の研究―イネの遺伝的組換え位置の詳細把握と評価

イネ日印間の組換え自殖系統における遺伝的組換えに占める遺伝子内組換えの割合は約1/4であり、多くの研究者が考えるよりもずっと高頻度であった。シミュレーション研究等へ移行する予定であったが、諸般の事情により当課題は廃止となった。九州大学において作成された日本型イネ`あそみのり'とインド型イネ`IR24'の組換え自殖系統10系統を実験に供試した。これら材料についてSNPアレイ解析によって大まかなグラフ遺伝子型を推定した後、それらのゲノムの配列を次世代シーケンシング技術により解析し、日本型イネ`日本晴'との間でSNPを抽出した。各RILのSNPが「IR24型」と「あそみのり型」とが切り替わる位置が遺伝的組換えの推定される位置であるが、「IR24型」の方がはるかに高密度なので、「IR24型」のSNPが途切れる位置を遺伝的組換えの位置とした。`IR24'と`日本晴'間では2,227,332のSNPが検出され、これは平均すると168塩基に1つのSNPが検出されたことになり、このSNP頻度が組換えポイント推定の“解像度"に相当することになる。遺伝的組換えが生じたと推定されるSNP間の中間を組換えポイントと仮定して、その位置を`日本晴'の配列データ(RAP-DB)に照合した結果、約1/4の遺伝的組換えがイントロンを含む遺伝子内で生じたと想定された。1/4もの遺伝的組換えが遺伝子内で生じているであろうことは、遺伝的組換えがセントロメア近くなどの遺伝子が“疎"な領域よりも、染色体末端のような遺伝子が“密"な領域で生じやすいことを反映していると考察された。生じたキメラ遺伝子のうちどの程度が機能的に新たな表現型に結びつくのかは推測の域を出ないが、解析の対象とした材料のような、遺伝的に遠縁な材料を大集団で繰返し他殖させた場合、タイプの異なるゲノム間での遺伝的組換えにより、多数のキメラ遺伝子が生成しているはずである。トウモロコシのイリノイ実験などのように、他殖を繰返すことで集団内から継続的に変異が生じ得る一つのメカニズムであろうと考察された。これらの成果は2015年の春の育種学会で発表した。遺伝子内組換えの頻度が多くの研究者の想像よりも遥かに大きいことを明らかにすることができた。学会での発表も反響が大きく、研究そのものは順調に進展している。シミュレーション等の研究も進めている。また、遺伝的組換えが生じたことにより表現型が変化した事例を検索している。研究の進展により、データをとりまとめた後、研究論文として公表する。既存データの活用が有効であったため。当初計画通り。
ヒト生理活性物質からなる新しい免疫抑制剤の開発

ヒトRNaseは、剖検時に得られた肝臓よりゲル濾過、アフィニチ-クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにて分画し、イ-ストRNAを分解する活性により精製した。ヒト肝2kgより約1gのヒト肝臓由来RNaseが得られた。残念ながらこの量では、in vivoの実験は全く不可能であるので、今後はヒトRNase遺伝子をクローニングし、ベクターに組み込み大腸菌に入れることによりリコンビナント蛋白を合成させる予定でいる。本年度は主として、ヒトIL-2とウシRNaseとの結合によるconjugateの効果を検討した。それぞれSPDPと2-imunothiolaneによりSH基を導入後、S-S結合を作製した。ヒトリンパ球は、末梢血を採血後、細胞分画を分離し、IL-2で刺激して活性化したのち実験に用いた。IL-2受容体を過剰発現しているヒト白血病細胞であるHUT102およびMT-1をATCCより、また他のヒト白血病細胞2株を購入し実験に供した。これらの細胞に対して、IL-2を添加すると細胞の増殖が認められるが、ウシRNaseを添加しても大部分の細胞は死滅した。IL-2とRNaseのconjugateを上記の細胞株に添加し、3日後に各細胞に対する殺細胞効果をMTT法にて測定した。その結果、IL-2単独よりはconjugate投与群で同じIL-2濃度では細胞は減少していたが、conjugateでも濃度依存的に細胞増殖効果が認められた。電気泳動にて、conjugateを検討するとこの分画中にIL-2も含まれていることが判明し、このIL-2による増殖効果がconjugateによる殺細胞効果よりも優ったために上記の現象がみられたものと考えられる。完全に純化するのが困難なので、現在はヒトIL-2とヒトRNase遺伝子を結合させた遺伝子をベクターに組み入れ、大腸菌で発現させることを試みている。
神経芽細胞腫および小児白血病におけるMn-SOD増加の意義

小児血液腫瘍疾患(特に白血病や食細胞機能異常症)におけるMn-SOD増加の臨床的意義および生化学的意義を検討しようと申請期間内にこれら患者の血清および血球より、Mn-SOD量・活性酸素産生能およびサイトカイン濃度をただちに測定する研究状況を設定し、患者データよ臨床的意義を検討している。臨床検体は付属病院や関連病院だけでなく全国組織である小児癌白血病研究グループ(CCLSG藤本孟男代表)を通して集め、これら疾患におけるMn-SOD増加の臨床的意義および生化学的意義を検討しようと申請期間内に培養細胞株を用いたMn-SODの誘導発現を蛋白レベルであるいはmRNAレベルでの確認実験に着手している。培養細胞株において腫瘍壊死因子(TNF)やIL-1などのサイトカインによりMn-SODが誘導されることも報告され、腫瘍マーカーとしてまたサイトカインを反映する蛋白としてMn-SODの持つ意味が注目され、白血病や食細胞機能異常症の多彩な臨床症状や臓器障害に活性酸素やサイトカインが深く関わり、Mn-SODの誘導発現を検討している。
SASEによるコヒーレント光発生の研究

最大電荷量91nCの単バンチ電子ビームを加速できる阪大産研Lバンド電子ライナックを用いて、X線レーザーを実現する有力な候補と期待されているSASE(Self-Amplified Spontaneous Emission)の赤外領域での研究を行なった。ライナックで加速された単バンチ電子ビームの特性を広いエネルギー範囲にわたり測定した。電子ビームエネルギーが11-32MeVの範囲で、相対的なエネルギー広がりは1.1-4%、バンチあたりの電荷量20nC以上、バンチ長20-30ps、規格化エミッタンス150-250πmm mradという値が得られた。このビームパラメターを用いて予想される特性をSASEの1次元模型に基づいた理論で評価した。電子エネルギー11MeVでウイグラーのK値が1.47の時、FELパラメターは0.022であり、ゲイン長は0.128mである。この1次元模型理論が適用できるための電子ビーム特性に対する条件は、ピーク電流が1kAでエネルギーが20MeV以下の時に満足されることが分かった。エネルギー12.6MeVの電子ビームが、周期長6cmで周期数32のウイグラーを通過する時に放射される強い光をウイグラーのK値の関数として測定した。測定した光のピークパワーは、1Wから1kWまで3桁増大した。ピークパワーのK値依存性はSASEの1次元モデルと良く一致するので、観測した光をSASEによるものと結論した。回折格子分光器を用いて80から180μmの波長範囲でSASEの波長スペクトルを初めて測定した。SASE基本波の波長幅は2-3%であり、1次元模型理論の2.2-2.3%より幾分広がっている。またSASEの基本波の発展による2次高調波の発生をはじめて実験的に観測した。我々はSASEの特性を初めて実験で定量的に測定している。得られた結果を3次元FELシミュレーションコードを用いて解析している。本年度は研究の初年度であるので、SASE-FELの基礎となる電子ビームの特性測定から開始した。単バンチビームのバンチ長は、電子ビームがステンレス板を通過する時に放射される可視領域遷移放射をストリークカメラで測定することにより求めた。バンチの全電荷量が36.5nCの時、バンチ長は25.4psであった。電子ビームのエネルギースペクトルを20から30MeVの範囲で測定した。エネルギーの半値幅は1.11.6%であり、スペクトル形状も電子エネルギーによらずほぼ一定であった。電子ビームのエミッタンスは電子エネルギーが29MeVの時、水平方向で11.5πmm mrad、鉛直方向で23πmm mradであった。電子ビームのエネルギーに依らない規格化エミッタンスは100πmm mrad前後の値である。次に1次元モデルと実験で測定した電子ビームのパラメータを用いて、期待されるSASEの特性値を評価した。電子エネルギーを16から32MeVまで、ウイグラーのK値を0.7から1.47変えることによりSASE波長は10から100μmの範囲で変化させることができる。レーザー光がe倍に増幅されるゲイン長は最小7cmと他の実験での値より一桁小さい。そこでの増幅率は10^<12>倍に達する。この1次元モデルが成立するためには、電子ビームのエネルギー幅、ゲイン長と電子ビームのエミッタンスに対する要求が満足されなければならないが、測定した電子ビームの特性はほぼこれらの要求を満足している。

これらの測定と計算に基づき、SASE発生の実験を開始した。遠赤外FELの光共振器の上流側の反射鏡を取り外し、下流側の反射鏡を、ウイグラー出口の像が上流側反射鏡が有った位置になる曲率半径を持つものに交換した。これにより既存の光輸送路と光学系をそのまま使うことができる。実験を開始したばかりであるがSASEと思われる光を検出している。電子ビーム特性測定と1次元モデルによる期待される性能評価に関する昨年度の研究に引き続き、SASEの発生と特性測定を本格的に開始した。エネルギー1118MeVの単バンチ電子ビームが、周期長6cmで周期数32のアンジュレーターを通過する時に発生する強い光を、アンジュレーターのK値や単バンチ電子ビームの電荷量の関数として測定した。これに加えて回折格子分光器を用いて波長スペクトルを同じ波長領域で測定した。波長50160μmに検出感度を持つGe:Ga半導体検出器を光強度の測定に使用した。ビームエネルギーが13MeVの実験でK値と共に増大する強い光を波長70160μmの範囲で観測した。実験で得られた光強度のK値依存性は1次元モデルのそれと良く一致するので、観測した強い光はSASEであると結論した。同じ電子エネルギーの実験で波長が160μmの時に、電荷量を118nCの範囲で変化させると光強度の大きな変化が得られた。この光強度変化と1次元モデルのそれを比較すると、電荷量が大きい時に理論との不一致が見られた。波長169と183μmでSASEの波長スペクトルを初めて測定した。スペクトルの相対幅は共に標準偏差で1.0%であった。自発放射のバンド幅は1.3%であるが、SASEの理論値は2.3%である。実験値がSASEの理論と一致しない理由は現在のところ不明である。SASEの発生と特性測定の実験を引き続き行う。電子ビームの特性測定と期待される性能評価を1次元モデルを用いて行った後、SASEの発生と特性測定を本格的に行った。エネルギー11^18MeVの単バンチ電子ビームが、周期長6cmで周期数32のアンジュレーターを通過する時に放射する強い光を、アンジュレーターのK値や単バンチ電子ビームの電荷量の関数として測定た。光強度の絶対値とK値依存性がSASEの1次元モデルの予測と良く一致することから、観測した強い光がSASEによるものと結論した。本年度は、SASEの波長スペクトルの測定を中心に実験研究を進めた。回折格子分光器を用いてSASEの分光測定を行うには、強い光を安定して発生させる必要が有る。SASE強度と安定性は、電子銃の特性とライナックの運転状態に強く依存する。電子銃のグリッドパルサーと収束要素の改良により、より輝度の高い電子ビームが得られるようになった。数分から数時間の周期で変動するライナックの運転状態の原因を調査し、主な要素がRFの発生装置が納められているクライストロン室の温度変化であることが分かった。長時間変動の影響を避けるために、データー処理系の改良を行い、より短時間で波長スペクトルを測定できるようにした。これらに加えて光輸送路の改良を行った結果、100^200μmの波長領域ででSASEの波長スペクトルを初めて測定した。基本波のスペクトル幅は、1次元モデルの予言と良く一致した。
金属微粒子を集積化したカラークリスタルの成長過程の単一微粒子検出によるその場観察

ゼータ電位が1mVと-3 mVの白金および白金'微粒子を作製し、結晶への集積化を行った結果、白金'微粒子より白金微粒子の方が結晶に集積化しやすいことがわかった。これは微粒子、リゾチーム、塩化ナトリウムの相互作用で説明できた。また白金微粒子が核形成促進することを見出した。白金微粒子とリゾチーム分子の複合体形成によるリゾチーム分子の濃度の高い領域の形成と複合体内でのリゾチームの表面電位の低下により結晶核形成が促進されたと考えられる。また金属微粒子のタンパク質結晶への集積化のダイナミクスを調べる光学顕微鏡システムを構築した。数日にわたって単一蛍光微粒子からの蛍光観察ができる顕微鏡システムを作成した。カラークリスタル(タンパク質結晶に金属微粒子を包埋した構造体)に金属微粒子が集積化されるダイナミクス解明を試みた。ゼータ電位の極性の異なる白金微粒子を作製し、結晶への集積化を行った。Polyvinyl pyrrolidoneで被覆され安定化された白金微粒子をレーザーアブレーションで作製し、さらにこの白金微粒子を水溶液中でインキュベーションした。この微粒子を「白金'微粒子」と記す。白金および白金'微粒子のゼータ電位は、pH8以下で、それぞれ1mVと-3 mVであった。リゾチーム分子への集積化効率を測定した結果、白金微粒子は結晶に集積化しやすく、白金'微粒子は、結晶に集積化しにくいことがわかった。酸性溶液中でリゾチーム分子のゼータ電位は約12mVである。したがって、塩化ナトリウムの塩化物イオンが正帯電したリゾチーム分子に吸着する。その結果、白金微粒子周囲の塩化物イオンの濃度は減少し、pH8以下において、塩化物イオンによる白金微粒子のゼータ電位の遮蔽効果は減少する。この結果、白金微粒子は良く分散した状態で結晶表面と相互作用できる。一方、白金'微粒子はpH8以下においては負に帯電しており、したがって、塩化ナトリウムのナトリウムイオンによって効率よく遮蔽される。その結果、白金'微粒子は結晶表面と相互作用する前に凝集する傾向を持つ。以上のように微粒子の結晶表面と相互作用前における微粒子の分散性が集積化の効率の違いの原因になっている。さらに、光学顕微鏡を用いて、金属微粒子の集積化のダイナミクスを調べるシステムを作製した。そのために数日にわたって蛍光観察ができる顕微鏡システムを構築した。さらに、ガラス表面上に分散させた蛍光微粒子を試験試料として、単一蛍光微粒子からの蛍光検出を行った。タンパク質結晶に金属微粒子を包埋した構造体(カラークリスタル)を作製する方法を開発し、この方法を応用して金属微粒子の集積化、機能化に関する技術を開拓することを目標としている。そのためにまず、カラークリスタルに金属微粒子が集積化されるダイナミクスの解明を行った。まず、様々な金属微粒子のタンパク質結晶への取り込み機構を解明することを試みた。そのため、レーザーアブレーションでロジウム、パラジウム、白金、銀の微粒子を作製し、TEM観察とEDX成分分析を行った。TEM観察結果、各サンプルとも粒子の大きさは一定ではなく、5nm-数10nmと様々なサイズの球形粒子が混在していた。また、EDXの結果、金属微粒子自体は酸化せず、金属の状態で存在していることが分かった。次に、レーザーアブレーションで作成した金属微粒子を使って、ゼータ電位のpH依存性の異なる2種類の金属微粒子を調整し結晶へ集積化した。その結果、ゼータ電位の値が小さい金属微粒子がより集積化されることを見出した。この結果より、金属微粒子とタンパク質結晶表面との相互作用は疎水性相互作用である、との示唆を得た。さらに、光学顕微鏡を用いて、金属微粒子の集積化のダイナミクスを調べるために、結晶成長と金属微粒子を検出する顕微鏡システムを作製した。リゾチームの正方晶系結晶の{101}面の単位ステップの検出のために、位相差光学素子を倒立型顕微鏡に組み込み位相差顕微鏡を構築し、位相差像を得ることに成功した。さらに、ガラス表面上に分散させた金微粒子を試験試料として、単一金微粒子からのミー散乱光の検出に成功した。様々な金属ナノ粒子についてタンパク質の結晶の核形成の促進効果を探索した結果、Ptナノ粒子が核形成促進することを見出した。Ptナノ粒子の集積化と核形成促進のメカニズムを解明するために動的光散乱を計測した。その結果、Ptナノ粒子とリゾチーム分子が複合体を形成していることが明らかになった。Ptナノ粒子の周囲にリゾチーム分子の高濃度の領域が形成され、結晶核形成が促進されたと考えられる。またゼータ電位を計測した結果、Ptナノ粒子のみでは1mV、リゾチーム分子のみでは6mVであるのに対し、Ptナノ粒子とリゾチーム分子の複合体は2.5mVであることがわかった。

複合体形成により、高い表面電位を持つリゾチームの表面電位が低下し、リゾチーム分子同士の反発が抑制され結晶核形成が促進されたと考えられる。さらに光学顕微鏡を用いて、金属ナノ粒子の集積化ダイナミクスを調べるシステムを作製した。まず結晶化過程全体(数日間)を一定温度条件で観察ができる顕微鏡システムを作製した。またガラス表面上の金ナノ粒子に対して、単一金ナノ粒子からの表面プラズモン散乱の検出を行うことにより単一ナノ粒子検出可能な顕微鏡を構築した。さらに蛍光ナノ粒子に対して単一蛍光ナノ粒子からの蛍光検出が可能な蛍光顕微鏡も構築した。またPtナノ粒子を集積化したタンパク質結晶(カラークリスタル)を利用してPtナノ粒子の集積化のメカニズムを解明した。まずpH4前後で、1mVと-3 mVのPtナノ粒子を作成し、それぞれPtおよびPt'ナノ粒子とした。これらのナノ粒子のリゾチーム結晶への集積化効率を測定した結果、Ptナノ粒子は結晶に集積化しやすく、Pt'ナノ粒子は集積化しにくいことがわかった。PtおよびPt'ナノ粒子の集積化ダイナミクスはナノ粒子、リゾチーム、Naイオン、Clイオンの相互作用で説明できることがわかった。ナノ材料化学光学顕微鏡を用いて、金属微粒子の集積化のダイナミクスを調べるシステムを構築することができた。具体的には、金属微粒子またはその集合体の検出のための暗視野顕微鏡および蛍光顕微鏡の構築を行った。既に構築済みである倒立型顕微鏡へ水銀ランプ光源と光ファイバーによる紫外光の導入を行い、結晶成長に必要な時間(数日)にわたって蛍光観察ができるようにした。また金属微粒子、特に量子ドットを使う利点として、色素のような退色現象はなく、長時間のその場観察が可能な点が挙げられる。そこで、リゾチーム結晶への量子ドットの取り込みを確認した結果、量子ドットは結晶化条件下でも凝集することなく結晶に集積化することが分かった。このリゾチーム・量子ドットの系を用いて、結晶の核形成の過程を調べることができる。光学顕微鏡を用いて、金属微粒子の集積化のダイナミクスを調べるシステムを試みて、順調に光学系を構築することができた。位相差顕微鏡の構築について光学顕微鏡の横方向の分解能は光の波長の制限を受け,サブミクロン程度である。しかし、位相差顕微鏡は位相差の小さな物体の検出に優れており、おおよそ1/1000波長程度の光路差まで検出可能である。可視光では、ナノメートル以下の凹凸の検出が原理的に可能である。リゾチームの正方晶系結晶の場合、{101}面では、単位ステップは1分子高さの2.8 nmであるので、単位ステップの検出は十分可能である。そこで、結晶の単位ステップを検出するために位相差顕微鏡を作成した。具体的には、位相差光学素子を倒立型顕微鏡に組み込み位相差像を得ることに成功した。さらに、観察結晶面以外からの反射光を除去するために観察する結晶面に対して結晶底面や観察セル底面を傾けるなどの工夫を行った。金属微粒子またはその集合体の検出のための暗視野顕微鏡の構築金属微粒子を使う利点として、1、単一の金属微粒子の検出が容易。