hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
クライオ電子顕微鏡によるアクセサリーピリンを含む歯周病原細菌線毛の全貌解明

慢性歯周炎において最も重要な病原性細菌であるPorphyromonas gingivalisの病原性には菌体表面に形成されるV型線毛が重要である。本研究はこの線毛の天然状態の構造をクライオ電子顕微鏡解析によって近原子分解能で明らかにし、形成機構や構造と機能の関連性を解明することを目的とする。創薬研究においてターゲットタンパク質複合体の立体構造に基づく薬剤探索は主流であり、研究成果は将来、線毛の重合・定着阻害剤などの開発に繋がり、慢性歯周炎および関連疾患の予防・治療に貢献できると考えられる。
地理空間イメージと案内情報に基づいた自動車運転者の進路推論に関する研究

本研究は、自動車の運転者が、情報が不十分な分岐点で進むべき方向を推論するプロセスを明らかにすることを目的とする。このため、まず、運転者が予定経路の既知情報と走行中の情報を比較処理する構造、およびそれらを総合して進むべき方向を推論するプロセスをモデル化する。次に、推論の中心となる、分岐点での進路選択モデルにおけるパラメータを実験的に求めるため、実験シミュレータ用ソフトウェアを開発し、既知情報、案内情報に関する多くの条件下でシミュレータ実験を実施する。そして、実験データの分析結果を通して、案内情報が十分でない場合の分岐点での進路推論のプロセスを明らかにする。このため、平成15年度に、運転者が予定経路の既知情報と走行中の情報を比較処理する構造、およびそれらを総合して進むべき方向を推論するプロセスについて、運転経験者へのインタビューと専門家の討議を通して検討し、次に、進路推論モデルにおける運転者行動を実験的に明らかにするため、次の機能を有する実験用シミュレータの開発と道路網データの作成を行った。平成16年度は、シミュレータを用いた室内実験により、(1)認知距離の精度に関する実験、(2)認知距離に基づいた分岐点の同定確率に関する実験、(3)迷走時の進路選択行動に関する実験を行い、進路推論モデルのパラメータ推定を行った。また、案内標識とカーナビとがどのように使い分けられているかを実態調査した。平成17年度は、前出のシミュレータを改良し、案内標識に用いられる情報として交差点名を導入した場合や、地図に交差点ごとの案内標識情報を載せた場合の効果を、シミュレータを用いて実験した。その結果として、新しい情報を用いた案内体系の効果を確認した。本年度は、まず、運転者が予定経路の既知情報と走行中の情報を比較処理する構造、およびそれらを総合して進むべき方向を推論するプロセスについて、運転経験者へのインタビューと専門家の討議を通して検討した。なお,運転経験者へのインタビューで得られた結果は、本人の同意を得て分析に使用している。次に、進路推論モデルにおける運転者行動を実験的に明らかにするため、次の機能を有する実験用シミュレータの開発と道路網データの作成を行った。(1)任意の道路網データに対し、運転者(被験者)ごとに出発地・目的地とその間の予定経路、標識の配置と案内地名を設定することができる。(2)被験者が各分岐点で進行方向を入力するたびに、進入する交差点の分岐状況、地名案内状況、出発点または中継点からの経過時間、走行距離が、モニター画面上にイメージ表示される。次に、推論の中心となる、分岐点での進路選択モデルにおけるパラメータを実験的に求めるため、実験シュミレータ用ソフトウェアを開発し、既知情報、案内情報に関する多くの条件下でシュミレータ実験を実施する。本年度は、昨年度作成したシュミレータを用いて以下の実験を実施した。(1)認知距離の精度に関する実験被験者に地図をみせて、経路上の各中継地間の距離を問い、その認知距離と実距離の差の分布形に関する分析を行う。(2)認知距離に基づいた分岐点の同定確率中に関する実験直前の分岐点から認知距離だけ隔たった地点付近に存在する交差点が、分岐すべき目標交差点に同定される確率を実験的に明らかにする。(3)迷走時の進路選択行動に関する実験迷走状態に陥った運転者を対象にして、直進・左折・右折などの進路の選択確率を実験的に求め、ランダムな選択との間の有意差を検証する。(4)迷走脱出の推論プロセスに関する実験実験的に迷走状態を作り出し、迷走中の被験者が、予定経路あるいはその代替経路に復帰するために行う推論のプロセスを、走行軌跡データと被験者へのインタビュー結果から明らかにする。

平成16年度は、シミュレータを用いた室内実験により、(1)認知距離の精度に関する実験、(2)認知距離に基づいた分岐点の同定確率に関する実験、(3)迷走時の進路選択行動に関する実験を行い、進路推論モデルのパラメータ推定を行った。また、案内標識とカーナビとがどのように使い分けられているかを実態調査した。平成17年度は、前出のシミュレータを改良し、案内標識に用いられる情報として交差点名を導入した場合や、地図に交差点ごとの案内標識情報を載せた場合の効果を、シミュレータを用いて実験した。その結果として、新しい情報を用いた案内体系の効果を確認した。
高転移性ルイス肺癌細胞株が類洞様腫瘍血管を誘導する分子基盤の解明

(1)高転移性(H11)および低転移性(P29)ルイス肺がん細胞腫瘍内の血管の性質を解析した結果、高転移性腫瘍でLYVE1陽性のリンパ管内皮様細胞が認められ、DNAミクロアレイ解析でもLYVE1発現亢進が確認された。またNRP1の発現低下が示された。(2)H11およびP29細胞株から分離したRNAを用いたDNAミクロアレイ解析の結果、H11で発現上昇している遺伝子が約15種、発現低下している遺伝子が約10種同定された。(3)発現差が大きくかつ分泌性の蛋白質をコードする遺伝子を選択し、それらに対するshRNAを導入した細胞を作製してマウスに皮下移植し腫瘍内血管の構造を解析した。血管形成・新生は組織の発生や維持に必須なだけでなく、癌増殖・転移など多くの疾患に深く関わっている。血管内皮増殖因子(VEGF)の発見以来、血管研究の進展は目覚ましいが、未解明の部分がまだ多く存在する。たとえば、組織ごとに血管の微細構造が異なる分子基盤や癌転移と血管微細構造の関連などはほとんど明らかにされていない。本研究では、血管微細構造の決定機構を明らかにするため、構造の異なる腫瘍血管を誘導する転移性の異なる癌細胞株が分泌する血管形成関連因子群を包括的に明らかするとともに、それら因子群に応答して異なった微細構造を形成するために働く血管内皮細胞側の遺伝子群を明らかにする。24年度は以下の成果が得られた。1.高転移性と低転移性癌細胞株で発現に差のある血管形成関連因子(群)の解明(1)高転移性ルイス肺癌細胞株(H11)と低転移性細胞株(P29)からそれぞれRNAを分離し、DNAミクロアレイ法を用いて、両者で発現に差のある血管形成関連因子を解析した。その結果、高転移性癌細胞株で発現が上昇している遺伝子が約15種、発現が低下している遺伝子が約10種同定され、定量PCRでそれらの発現を確認した。(2)コラーゲンゲル中でのin vitro血管新生への高転移性細胞と低転移性細胞のconditioned mediumの影響を解析したところ、高転移性細胞のconditioned mediumがより促進的な傾向を示した。2.高転移性と低転移性腫瘍の血管内皮細胞の解明(1)高転移性癌細胞株(H11)と低転移性細胞株(P29)の一次腫瘍中の血管細胞を免疫組織学的手法等で解析したところ、低転移性細胞は宿主自身からの血管誘導能(血管を引き込む活性)が低いのに対し、高転移性細胞は血管誘導能が高く、また誘導された血管はリンパ管様・sinusoid様の性質を示すことが新たに示された。しかしながら、組織ごとに血管の微細構造が異なる分子基盤や癌転移と血管微細構造の関連など未解明な課題が残されている。本研究では、血管微細構造の決定機構を明らかにするため、構造の異なる腫瘍血管を誘導する転移性の異なる癌細胞株が分泌する血管形成関連因子群を包括的に明らかにするとともに、それら因子群に応答して異なった微細構造を形成するために働く血管内皮細胞側の遺伝子群を明らかにすることを目的とした。25年度は以下の成果が得られた。1.高転移性と低転移性癌細胞株で発現に差のある血管形成関連因子(群)の解明24年度に同定した因子群の中から特に発現量の差が大きく、かつ分泌性のタンパク質をコードする候補遺伝子を選択し、それらの発現を抑制するshRNAを導入したがん細胞を作成した。それぞれの細胞をマウスに皮下移植して腫瘍内血管の微細構造を解析した。現在定量的解析を行っている。2.高転移性と低転移性腫瘍の血管内皮細胞の解明高転移性および低転移性腫瘍内の血管の内皮細胞を単離し、両者の性質の差を明らかにした。高転移性および低転移性一次腫瘍内からCD31陽性の血管内皮細胞をMACSで分離し、マイクロアレイで遺伝子発現プロファイルを比較した。その結果、予想通りリンパ管内皮細胞のマーカーであるLYVE1の発現が高転移性腫瘍血管で低転移性腫瘍血管と比べて約4倍高いことが示された。また、高転移性腫瘍血管ではVEGF受容体の一つであるNRP1の発現が低下していた。さらに、血管新生に関与することが多く報告されているmicro RNAであるmiR-17-92クラスターの発現が著しく高いことが明らかとなった。

たとえば、組織ごとに血管の微細構造が異なる分子基盤や、腫瘍血管微細構造の違いと癌転移との関連などはほとんど明らかにされていない。本研究では、血管微細構造の決定機構を明らかにするため、構造の異なる腫瘍血管を誘導する転移性の異なる癌細胞株が分泌する血管形成関連因子群を包括的に明らかするとともに、それら因子群に応答して異なった微細構造を形成するために働く血管内皮細胞側の遺伝子群を明らかにする。23年度は以下の成果が得られた。1.高転移性と低転移性癌細胞株で発現に差のある血管形成関連因子(群)の解明(1)ルイス肺癌由来高転移性細胞株(H11)と低転移性細胞株(P29)を入手し、マウスに移植・転移腫瘍形成を行い、高転移性細胞の再度のセレクションを行うとともに転移能の確認を行った。(2)高転移性株と低転移性株をマウスに移植後の腫瘍組織形成に伴う腫瘍血管の微細構造の形成過程の経時的な解析を行った。(3)高転移性株(H11)と低転移性株(P29)からそれぞれRNAを分離し、DNAミクロアレイ法を用いて、両者で発現に差のある血管形成関連因子の解析を行った。2.高転移性と低転移性腫瘍の血管内皮細胞での遺伝子発現の差の解明(1)高転移性癌細胞株(H11)と低転移性細胞株(P29)をマウスに移植して形成させた腫瘍組織それぞれから、血管内皮細胞を分離する条件の検討を行った。23年度に高転移性ルイス肺癌細胞株(H11)と低転移性細胞株(P29)を、改めてマウスに移植・転移腫瘍形成を行って高転移性細胞の再度のセレクションを行ったため、その分の遅れが出ている。また、ミクロアレイ解析により多数の遺伝子が同定されたため、機能解析用の過剰発現用レンチウイルスベクターおよび遺伝子ノックダウン用shRNA発現レンチウイルスベクターの作製に時間を要した。高転移性ルイス肺癌細胞株(H11)と低転移性細胞株(P29)を入手後、改めてマウスに移植・転移腫瘍形成を行い、高転移性細胞の再度のセレクションを行うとともに、転移能の確認を行ったため、その分の時間を要した。また、実際の腫瘍から血管内皮細胞を純度よく分離する条件を検討するのに時間を要した。1.高転移性と低転移性癌細胞株で発現に差のある血管形成関連因子(群)の解明DNAミクロアレイ解析により同定した因子(群)が類洞様血管を誘導するかを確認する。具体的には、(1)同定されたすべての遺伝子の発現レンチウイルスベクターをミックスして低転移性細胞に導入してマウスに移植し、高転移性細胞と同様の構造を持った血管を誘導するかを検証する。(2)レンチウイルスミックスから順次遺伝子を除いて同様の解析を行い、類洞様血管構造を誘導するのに必須な遺伝子を同定する。(3)必要であれば、遺伝子ノックダウン様レンチウイルスベクターを用いて同様の解析を行う。(4)類洞様血管構造を誘導するのに必須な遺伝子に対するsiRNAや抗体を高転移性細胞を移植したマウスに投与し、腫瘍内に誘導される血管の微細構造を解析するとともに、癌転移が抑制されるかを調べ、新たな癌転移抑制のための標的遺伝子を明らかにする。2.高転移性と低転移性腫瘍の血管内皮細胞の解明(1)高転移性と低転移性腫瘍組織中の血管細胞の詳細な性質と由来を明らかにする。具体的には、両者から分離した血管内皮細胞からRNAを抽出してDNAミクロアレイ解析を行って両者間で発現に差のある遺伝子(群)を同定する。
森林生態系における地下部細根の長期的な生産動態の評価

滋賀県の温帯に位置するヒノキ人工林およびコナラ二次林において、1ー2週間に1度調査に赴き、細根観察用のルートスキャナーによる土壌断面の撮影を行った。また、3か月に1度、細根現存量の推定のために土壌コアを採取し、地上部リター生産量の推定のために落葉などのリターフォールを回収した。年1ー2回、地温や土壌水分などの気象データの回収を行い、冬期には非同化器官生産の推定のために各林分で直径や樹高測定等の毎木調査を行った。新潟県の冷温帯に位置するブナ天然林では、積雪期を除いて1か月に1度調査に赴き、細根観察用のミニライゾトロンによる土壌断面の撮影を行った。また、2か月に1度、細根現存量の推定のために土壌コアを採取し、共同研究者の協力のもとリターフォールと気象データの回収、および毎木調査を行った。ヒノキ・コナラ林において、土壌攪乱直後に生産される細根の形態特性を記述した。土壌攪乱直後に細根生産が一時的に増加する傾向は以前からわかっていたが、新たな解析により、攪乱直後は直径の大きなパイオニアルートが優先的に伸長し、土壌空間に新たな細根系を形成することがわかった。破壊的な手法による土壌の攪乱は一般的な吸収根とは形態の異なる根の生産を加速させる傾向があった。コナラ林において、養分の獲得戦略に関わる菌根の生産フェノロジーを記述した。菌根を含む細根の生産フェノロジーは春から秋にかけて活発に見られたが、菌根のみの生産は比較秋頃に多いことがわかった。生産される根の菌根化率は春よりも秋に有意に高い傾向を示した。これらの結果は、樹木が戦略的に菌根化率を変化させ、養分の資源要求度を季節ごとに変化させている可能性を示唆している。春は展葉にともなう水資源の要求度が高いため普通の細根を伸ばし、一方秋は養分要求度の高まりから菌根を伸ばしているのではないかと考えられる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。滋賀県のヒノキ人工林とコナラ二次林において、1-2週間に1度調査に赴き、スキャナーによる細根動態の定期観測を行った。また、年1-2回、気象データの回収を行い、冬期には各林分で毎木調査を行った。2009年から2016年の過去の細根動態の観察データと、地温・土壌水分・日射量・降水量の測定データを用いて、細根の生産動態と環境要因の相関関係を解析した。解析の結果から、コナラ林ではそれぞれの要因が単独で影響しているが、ヒノキ林では地温が他の要因の影響を制限しており、林分のタイプによって細根を生産する条件が異なることが示唆された。この成果を日本森林学会大会で発表した。また、同様の観察データを用いて、人為的な土壌攪乱直後の細根の生産パターンを解析した。一般的に、細根生産量の推定手法において、土壌攪乱が細根動態に与える影響は無視できると仮定されてきた。しかし、解析結果から、細根動態は土壌攪乱に有意に影響されることが示唆された。この結果は、従来の細根生産量の推定値の解釈を改める必要性を提唱している。この成果を論文にまとめ国際誌に投稿した。新潟県のブナ天然林において、積雪期を除いて1か月に1度調査に赴き、スキャナーを用いたミニライゾトロン法による細根動態の定期観測を行った。また、共同研究者の協力のもとリターフォールと気象データの回収、および毎木調査を行った。2009年から2015年の過去の細根動態の観察データと、リタートラップ法による葉・種子生産の推定値から、森林地上部と地下部の生産動態の相関関係を解析した。解析の結果から、地上部の種子生産の年変動(マスティング)に対して、秋期の細根生産が関係していることが示された。これ結果は、樹木の長期的な資源利用戦略を地下部も含めて理解するためには地下部器官との関連が重要であることを示している。この成果を日本生態学会大会で発表した。温帯と冷温帯の異なる気候帯に属する滋賀県・龍谷の森のヒノキ・コナラ林および新潟県・苗場山系のブナ天然林へ、積雪期を除き1-4週間に1度、野外調査に赴いた。当初の計画では、コナラ林は調査対象ではなかったが、同調査地のヒノキ林と並行して調査可能であり、本研究の目的である細根動態の理解を種間差も含めてより一般化するために、調査対象に加えた。各林分で調査毎に、ヒノキ・コナラ林ではルートスキャナー、ブナ林ではミニライゾトロンによる細根動態の定期観測を行った。また、細根現存量の推定のために2-3か月に1度、スチールパイプによる土壌コアの採取を行い、落葉期にはリタートラップによるリターフォールの回収を行った。加えて年1-2回、データロガーを用いた気温・地温・土壌水分等の測定データの回収を行い、冬期には毎木調査を行った。期間中、ヒノキ・コナラ林に予め埋設していたスキャナーが複数台故障したため、新規スキャナーを導入し、継続的な観測を維持した。また、リタートラップが破損した際には適宜修復した。ブナ林においては、地温・土壌水分等の環境データを補足するために、改めてセンサーを設置した。

リターフォールの回収や毎木調査は共同研究者の協力のもと行った。スキャナーによる細根動態の観察画像を細根画像解析ソフトウェア(WinRHIZO Tron)により画像解析し、土壌断面における細根の現存面積および生産・消失面積を算出した。土壌コアサンプルは一時的に冷凍保存し、土壌を洗い流したあと根を抽出したが、重量の測定までは行えなかった。リターフォールは葉・種子・枝等に分け、乾燥重量を測定した。本研究の目的である、細根動態と環境要因、および細根動態と地上部生産動態の関係性を、取得したデータと過去の調査データとを用いて統計解析により明らかにした。研究成果はそれぞれ日本森林学会大会および日本生態学会大会にて発表した。滋賀県の温帯に位置するヒノキ人工林およびコナラ二次林において、1ー2週間に1度調査に赴き、細根観察用のルートスキャナーによる土壌断面の撮影を行った。また、3か月に1度、細根現存量の推定のために土壌コアを採取し、地上部リター生産量の推定のために落葉などのリターフォールを回収した。年1ー2回、地温や土壌水分などの気象データの回収を行い、冬期には非同化器官生産の推定のために各林分で直径や樹高測定等の毎木調査を行った。新潟県の冷温帯に位置するブナ天然林では、積雪期を除いて1か月に1度調査に赴き、細根観察用のミニライゾトロンによる土壌断面の撮影を行った。また、2か月に1度、細根現存量の推定のために土壌コアを採取し、共同研究者の協力のもとリターフォールと気象データの回収、および毎木調査を行った。ヒノキ・コナラ林においては、地温や土壌水分の環境要因と細根生産との関係が季節によって変化するか一般化線形混合モデルを用いた多変量解析で明らかにした。両林分に共通して、展葉時期と落葉時期で細根生産の地温に対する環境応答は変化することが示唆され、細根生産が温度に対してヒステリシスを示すことが明らかになった。細根の環境応答性を明らかにするためには季節変化を考慮する必要があることがわかった。ブナ林においては、種子生産との相関を一般化線形混合モデルを用いた多変量解析で明らかにした。ブナの種子が豊作となる前年の特定の時期に細根生産が有意に高く、当年の特定の時期に細根生産が有意に低いという結果を得た。ブナの花芽が開花前年の春に形成されることから、今回の結果は細根生産が種子形成のため養分などの資源獲得に貢献し、また種子形成後の資源不足の影響を受けて抑制されている可能性が示唆された。細根生産が地上部の生産動態と連動し、資源分配に影響していることが明らかになった。当初の研究計画通り、ヒノキ林、コナラ林およびブナ林において定期的な野外調査を実施した。ヒノキ・コナラ林では、1ー2週間に1度調査に赴き、ルートスキャナーによる土壌断面の撮影を行った。また3か月に1度、細根現存量の推定のために土壌コアを採取し、地上部リター生産量の推定のためにリターフォールを回収した。ブナ林では、積雪期を除いて1か月に1度調査に赴き、ミニライゾトロンによる土壌断面の撮影を行った。また2か月に1度、細根現存量の推定のために土壌コアを採取し、リターフォールを回収した。各調査地で撮影した土壌断面の画像を、細根画像解析専用ソフトウェアを用いて手動で画像解析し、細根の現存量および生産を推定した。採取した土壌コアサンプルは、水で洗って土を落とし根だけを抽出して重量を測定した。画像解析から得られたデータおよび土壌コアサンプリングの結果を基に、高い分解能で記述可能な質量ベースの細根生産量の推定手法の開発に取り組んでいる。研究成果を国内外の学会および雑誌にて随時発表した。
国家後見的な集団的労使自治の創造―交渉主体と労働協約適用形態の多元化理論

本研究課題においては、国家が「後見的」に、団体交渉や集団的規範の形成の促進をエンカレッジするという方向での集団的労使自治の新たなモデル構築に向けての法的理論を検討しており、特に、集団の代表となるもの(労働組合)の正統性およびその者によってなされた合意(労働協約)そのものの正統性をいかにして認めるのか、という点を中心に研究を進めている。フランスでは、非組合員にも協約の適用があることに加え、1982年以降、労働者にとって、より不利な協約の締結が徐々に認められてきたことにより、正統性の議論は盛んであり、したがって、採択者は、フランス法の理論から示唆を得るべく、本研究において、日本法とフランス法の比較研究を行っている。本年度においては、前期は日本法の研究に注力し、主に邦語文献の精読および、企業内における労使間の集団的な合意に関する判例研究を行った。その後、後期からは、研究指導の委託によりボルドー大学・比較労働法社会保障法研究所に滞在し、フランス法に関する検討を中心に行った。特に、2017年のマクロン改革における新たな団体交渉システム、労働協約の締結システムに関しての検討および同改革により大きく発展した企業内レフェランダム制度に関する考察を進めた。同研究所資料室には、本課題に関連する多数の資料が所蔵されており、資料の収集・精読を行ったほか、研究会・講演会等にも積極的に参加し、フランス労働法についてより深い知見を得られた。同研究所においては、ボルドー大学教授のGilles Auzero氏・同大学所属CNRS研究員の笠木映里氏により指導、助言をいただきながら研究を進めている。このほか、パリにて労働組合、使用者組合および企業に対しインタビュー調査を行い、マクロン改革が労働の現場にどのような影響を及ぼすものなのか確認することができた。本研究課題にいうところの、集団的労使自治の新たなモデル構築に向けての法的理論に関して、現時点において採択者は2つの可能性を指摘する。第一に、1労働組合および団体交渉、労働協約の締結という、既存のシステムをより発展させる可能性、および第二に、2新たな労働者代表システムを構築する可能性である。本年度は、当初の計画通り、1についての研究を中心に進めることができた。特に、フランスに滞在したことにより、多数の関係資料を収集することができ、さらに、集団的労使関係について造詣の深いGilles Auzero氏からの助言を得られたことで、フランス法に関する研究は期待以上に進展したと評価できる。とりわけ企業内レフェランダム制度に関しては、1、2の両視点からの研究を進めることができた。しかし、他方で、日本での研究に関しては、当初予定していた研究成果の公表がうまくいかなかった。今後の研究計画を見直し、帰国後すみやかに研究成果を公表したい。これらの事情を総合的に踏まえると、本研究課題の進捗はおおむね順調であると評価できる。今後も、引き続きフランスに滞在し、上述1労働組合および団体交渉、労働協約の締結に関して「正統性」という観点からの検討を進めるとともに、2新たな労働者代表システムを構築する可能性についても研究を進める。特に、レフェランダム制度に関しては、本研究課題において重要な論点として捉えることができ、同制度と、団体交渉・労働協約および従業員代表システムとの関係について研究を行い、企業における労働者の集団的な意思決定システムの意義、そのあり方、正統性の根拠を解明するよう努める。また、研究成果の公表に向けて積極的に機会を探り、準備を進めていく。

本年度は、当初の計画通り、1についての研究を中心に進めることができた。特に、フランスに滞在したことにより、多数の関係資料を収集することができ、さらに、集団的労使関係について造詣の深いGilles Auzero氏からの助言を得られたことで、フランス法に関する研究は期待以上に進展したと評価できる。とりわけ企業内レフェランダム制度に関しては、1、2の両視点からの研究を進めることができた。しかし、他方で、日本での研究に関しては、当初予定していた研究成果の公表がうまくいかなかった。今後の研究計画を見直し、帰国後すみやかに研究成果を公表したい。これらの事情を総合的に踏まえると、本研究課題の進捗はおおむね順調であると評価できる。今後も、引き続きフランスに滞在し、上述1労働組合および団体交渉、労働協約の締結に関して「正統性」という観点からの検討を進めるとともに、2新たな労働者代表システムを構築する可能性についても研究を進める。特に、レフェランダム制度に関しては、本研究課題において重要な論点として捉えることができ、同制度と、団体交渉・労働協約および従業員代表システムとの関係について研究を行い、企業における労働者の集団的な意思決定システムの意義、そのあり方、正統性の根拠を解明するよう努める。また、研究成果の公表に向けて積極的に機会を探り、準備を進めていく。
直流ローレンツ力によるメタル内の異相微粒子の分離・合体挙動と粒子近傍の流速の効果

鉄鋼やアルミニウム等の金属材料の製錬・鋳造分野で重要な課題となっている非金属粒子の除去方法として,直流電流と直流磁場の重畳印加による直流ローレンツ力を利用する方法を提案する.本年度までで、単一の非導電性粒子に及ぼす直流ローレンツ力の浮力への寄与を, LeenovとKolinの理論により確認し,続いて2体間の粒子の相互作用とローレンツ力の関係を見いだしていた。さらに,実際の適用の場で問題となる対流の影響を明確にした。得られた知見を以下に示す.(1)重力制御効果は単一粒子と同等に現れるものの,ローレンツ力の増加に伴い,非回転力成分の割合が減少した。これは2つの粒子の存在が単一粒子よりも電流の経路に大きな影響を与え、対流が生じたためであると考えられる。(2)2つの粒子の間隔が減少すると,非回転力成分の割合が変化し、2つの粒子が相対的に合体あるいは反発することがわかった。鉄鋼やアルミニウム等の金属材料の製錬・鋳造分野で重要な課題となっている非金属粒子の除去方法として,直流電流と直流磁場の重畳印加による直流ローレンツ力を利用する方法を提案し,そこで問題となる,流動存在下でのみかけの重力に及す直流ローレンツ力影響を調査した.実験はガリウム合金中に侵漬した非導電性球体粒子の重量変化を測定することによって行われた.その際,まず,直流ローレンツ力が均一で流体の流動が発生しない条件で重量変化を測定し,LeenovとKolinの理論と一致していることを確認し,本実験系が正当であるとした.次に,流速の影響を正確に導くために,流速の測定方法を開発した.これは,Viveのプローブを簡素化したもので,直流磁場が存在している条件下で、2本のマイクロプローブに現れる電位差によって流速を補正するものである.この実験装置を使って得られた知見を以下に示す.1.対流が存在する場合の重量変化は対流が存在しない場合のそれより低下した。ローレンツ力の回転力成分が大きくなり,浮力制御に有効な成分(非回転力成分)が減少した.2.簡易的な流速プローブよって流速を測定した結果,ローレンツ力の回転力成分Frの増加にともない流速の増加が見られ、高磁場印加(0.95T)によって対流の抑制効果が現れた.3.ローレンツ力の回転力成分を磁束密度B、電流密度J、流速vで定量化するためスチュアート数Nを用いて記述できることを明らかにし,ローレンツ力の回転力成分とスチュアート数の関係を定量化した.鉄鋼やアルミニウム等の金属材料の製錬・鋳造分野で重要な課題となっている非金属粒子の除去方法として、直流電流と直流磁場の重畳印加による直流ローレンツ力を利用する方法を提案する。前年度までで、単一の非導電性粒子に及ぼす直流ローレンツ力の浮力への寄与を、LeenovとKolinの理論により確認し、実際の適用の場で問題となるであろう対流の影響を明確にした。本年度は粒子間の相互作用を明確にするために、2つの粒子が存在する条件で同様の実験を行った。得られた知見を以下に示す。1.重力制御効果は単一粒子と同等に現れるものの、ローレンツ力の増加に伴い、非回転力成分の割合が減少した。2. 2つの粒子の間隔が減少すると、非回転力成分の割合が変化し、2つの粒子が相対的に合体あるいは反発することがわかった。これについては詳細をさらに追求する予定である。鉄鋼やアルミニウム等の金属材料の製錬・鋳造分野で重要な課題となっている非金属粒子の除去方法として,直流電流と直流磁場の重畳印加による直流ローレンツカを利用する方法を提案する.本年度までで、単一の非導電性粒子に及ぼす直流ローレンツカの浮力への寄与を,LeenovとKolinの理論により確認し,続いて2体間の粒子の相互作用とローレンツカの関係を見いだしていた。さらに,実際の適用の場で問題となる対流め影響を明確にした。得られた知見を以下に示す.1.重力制御効果は単一粒子と同等に現れるものの,ローレンツカの増加に伴い,非回転力成分の割合が減少した。2.2つの粒子の間隔が減少すると,非回転力成分の割合が変化し、2つの粒子が相対的に合体あるいは反発することがわかった。
不活性X染色体のSex Chromatin Body形式に関わる因子

マウス体細胞中にヒト由来の染色体としては不活性X染色体のみを持つ雑種細胞CF150では、ヒト不活性X染色体は晩期複製を保ち、X連鎖遺伝子の発現も抑制されているにもかかわらず、正常細胞中での不活性X染色体とは異なり、Sex chromatin body(SCB)を形成せず、ヒストンH4のリジン残基も高アセチル状態になっている。CF150細胞から不活性X染色体をヒト細胞に移入すると不活性化に関する異常がすべて正常状態に復帰することから、SCB形成に必要なヒト特異的因子がマウス細胞中には欠乏しているためヒト不活性X染色体はCF150細胞中ではSCBを形成せず、因子に覆われていない裸のクロマチンにはアセチル化酵素が容易にアクセスできるため高アセチルになると考えられる。この作業仮説のもと、SCB形成及びヒストンの低アセチル化に関わる因子のクローニングを目指してヒト全染色体についてCF150細胞への移入を試みた。鳥取大学:押村研より分与された単一染色体ライブラリーからmicrocell融合法を用いてCF150細胞へのヒト染色体の移入を行い、第9番染色体を除く全ての染色体を一本づつ含む雑種細胞の単離に成功した。現在、残り9番染色体の移入と、得られたクローンの詳細な細胞学的な検討を行っており、不活性X染色体のヘテロクロマチン化に関わる因子遺伝子の座乗する染色体の決定に向けて努力している。また脱アセチル化酵素の阻害実験を行う過程で、ヒストンH4の高アセチル化によって容易にX染色体の不活性状態が解除され再活性化と思われる状態を示す2倍体性のマウス細胞株を見出した。この事実は体細胞分裂を通じて不活性化状態が極めて安定に維持されるという従来の知見に反する点で興味深いと思われるので、更なる検討を加えている。マウスA9細胞中にヒト不活性X染色体を含むCF150雑種細胞を用いた細胞学的観察から、マウス細胞中では、ヒト不活性X染色体は核膜から遊離した状態で間期核中に局在しており、Sex Chromatin Body(SCB)を形成できず、他のマウス染色体同様に高アセチル状態にあることが明らかになった。この事実から、不活性X染色体の特徴である(1)核膜との特異な結合、(2)SCB形成、および、(3)低アセチル化が達成されるためには種特異的因子が必要であると予想された。この因子の単離を目的に、正常ヒト由来細胞をCF150細胞に融合することを試みた。当初、正常ヒト由来の繊維芽細胞IMR90,MRC5をSV40のLarge Tで不死化させた後(IMR90T,MRC5T)、ブラストサイジン耐性(IMR90TB,MRC5TB)としたものと、G418(neo)耐性としたCF150細胞株(CF150N)を融合して2重耐性株の単離を目指したが、最終的にそのような雑種細胞は得られなかった。そこで、ヒトとマウスのウワバイン(Our)に関する耐性度の違いを利用して、再度、雑種細胞の単離を試みた。予備実験の結果、CF150細胞はヒト細胞の1050倍程度の濃度のOurに対して耐性であることが明らかになった。新たにIMR90、MRC5をneo耐性とした後(IMR90N,MRC5N)、これらとCF150を融合してG418とOurの2重選択を行ったところ雑種細胞が得られた。現在これらの雑種クローンに関して、上記の(1)(3)のを指標に、因子が座乗している染色体の検索を開始している。
日本ミッション(神奈川・横浜,長崎)における日本語研究資料の基礎的研究

幕末に来日した宣教師(S.R.ブラウン,J.C.ヘボン,C.M.ウィリアムズ,J.リギンズ,G.フルベッキ等)による日本語研究を日本ミッションという大きな枠組みからとらえなおすことを目的とする。来日極初期の宣教師の相互の連動と連環という視点に立ち,日本ミッションの手による日本語研究資料(辞書,会話書,文法書)を中心に据えて,継承と伝播について調査・研究を行った。幕末に来日した宣教師による日本語研究を日本ミッションという大きな枠組みからとらえなおすことを目的とする。来日極初期の宣教師の相互の連動と連環という視点に立ち,日本ミッションの手による日本語研究資料を中心に据えて,継承と伝播について調査・研究を行った。本年度は,日本ミッションにおける日本語研究資料の基礎的な調査を行いながら,事象面の連動と連環を明確にするように努めた。『和英語林集成』について,依拠関係が指摘されている『日葡辞書』(16043-04)と『日仏辞書』(1862-68)からの援用について調査を行った。先行研究は,『和英語林集成』「初版」(1867)を用いたものであるが,その原稿段階ともいえる「手稿」を用いたことで異なりがある。『日葡辞書』の影響はやはり時代的な問題のみならず,日本語学的にも確認できるものであるとの結論に至ったが,継続調査が必要である。また,辞書の見出し語の最初の文字の比率(語頭文字別分布)を探るため,『和英語林集成』「手稿」と「初版」,『雅俗幼学新書』(1855),『言海』(1891),『日本国語大辞典』(初版・1972)を用いて調査を行った。それぞれの収録語数や見出し語の性格は異なるものの,その比率は,行・段のみならず,個々の語頭文字レベルでもきわめて類似した分布を示した。さらに,周縁を埋めるため日本語と近世中国語の対訳書と言える『訳通類略』(1713-14)と同書の明治年間本の異同状況を明示したデータベース(約5,100語・約5,500語)を作成した。その上で,収録語数,収録語彙の特徴,参照資料などについてまとめた。本年度も引き続き,日本ミッションにおける日本語研究資料の基礎的な調査を行いながら,事象面の連動と連環を明確にするように努めた。宣教師による日本語研究資料における活用語の表示方法について,調査を進めた。特に『日葡辞書』(1603-04)にみられる「語根,現在形,過去形」(「連用形,連体(終止)形,連用形+た」とも)の表示方法は19世紀の日本語研究資料にもまま見受けられる。これらの表示方法を動詞・形容詞・形容動詞・助動詞の活用語にそれぞれ分類・整理し,考察を加えた。「語根,現在形,過去形」(3形標出方式)といった表示方法は『和英語林集成』においていは,版を重ねる上で助動詞を除いた動詞部分について,2形標出形式に整理統合され,集約されていく。また,大妻女子大学において,「19世紀日本ミッションにおける日本語研究資料の草稿について」(第2回草稿・テキスト研究所研究集会(「19世紀における<知>の移動と文化変容」))と題して,どのように日本語研究資料群が作成されていくのか,その背景にはどのような類書を参考としたのかなど,さまざまな日本語研究資料を挙げながら,個々の特徴,また全体にわたる共通性といったものをあつかった。あわせて,データーベースの作成を継続している。この点については次年度中の完成を目指している。『和英語林集成』初版には横浜で発行されたものと,ロンドンで発行されたものの二種類がある。それぞれの相違点について調査を行い,当時の目録なども資料として,実態を整理した。対訳辞書における日本語の意味記述の方法について,句形式のものから語による示し方への変化の過程を「魔女」ということばを題材として,整理を行った。その結果,外国人による資料においては,当初から語によって示しており,外国語をどのように日本語に置き換えるのかという語対語の関係に留意していることが確認できた。加えて,漢和辞書と国語辞書の接点とその展開について明治期から昭和期にかけての様相をまとめた。あわせて,『和英語林集成』初版(ロンドン版)の複製の解題執筆の機会を得た。その中で,成立過程とその展開について,日本ミッションにおける位置づけをはじめ言及した。

また,本研究課題の一環であるデータベースの作成が完了した。次年度,翻字と索引というかたちでの公開を目指して進めている。おおむね当初の計画に沿って,進めることができている。特に,日本語研究資料のデータベース化については順調である。24年度が最終年度であるため、記入しない。分析書誌学的な視点を加味することで,日本語研究資料における日本語学の研究の進展につながると考えている。印刷出版史と日本語学が相補完するような方法を検討していきたい。
神経変性疾患における小胞体・ミトコンドリア膜間領域の生理的意義の解明

本研究では、新たに若年発症型の家族性ALSの原因となるL95fsの変異をσ1受容体(Sig1R)に見出した。変異Sig1Rは細胞内で極めて不安定で、本来の結合相手であるイノシトール3リン酸受容体3型(IP3R3)とも結合できなかった。Sig1Rを欠損した変異SOD1-ALSモデルマウスを作製したところ、このマウスでは顕著な発症時期の早期化を認めた。さらに、変異SOD1の発現、Sig1Rの欠損のどちらにおいてもMAMは構造的に破綻し、Ca2+恒常性の破綻を介して神経細胞死を引き起こしていた。以上の結果から、MAMの破綻は孤発性も含めた幅広いALSに関して普遍的な現象であることが示唆された。本研究は、細胞の恒常性に重要であると考えられる小胞体・ミトコンドリア膜間領域(MAM)に着目し、MAMの恒常性破綻が神経変性疾患につながる神経細胞内の主要な病態であるかどうかを変異SOD1を用いたALSモデルにより検討することを目的としている。本年度の研究においては、MAMへの変異SOD1の異常蓄積と病態との相関様式の全容解明を目指して生化学的な検討を中心に実施した。その結果、変異SOD1を発現するALSモデルマウスにおいて、変異SOD1が病巣組織である脊髄および脳においてMAMに強く蓄積する一方、非病巣組織である肝臓ではほとんど蓄積しないことを見出した。さらに、初代培養アストロサイトにおいても変異SOD1のMAMへの異常蓄積は見られなかったことから、変異SOD1のMAMへの異常蓄積が神経細胞に特異的な現象であるであることが示唆された。加えて、このようなMAMへの変異SOD1の異常蓄積は、SOD1以外のALS原因遺伝子である変異TDP-43や変異FUSと野生型SOD1の共発現によっても引き起こされ、MAMの異常がALSの病態に広く関与する可能性が考えられた。一方、MAMに蓄積する変異SOD1の量をALSモデルマウスの脊髄を用いて経時的に比較した結果、発症時期を境に、変異SOD1の量が大きく変動することを見出した。また、同時にMAM特異的なタンパク質はMAM画分から減少していた。このことはMAMの構造的崩壊がALSの発症時期を規定している可能性を示すものであり、今後、どのような機序によってMAMの崩壊が生じるのか、その分子的機序を明らかにすることを目指す。本年度の研究は、MAM特異的タンパク質であるσ1受容体(Sig1R)の欠損が変異SOD1マウスの病態に与える影響を中心に解析を行った。まず、Sig1R欠損(Sig1R(-/-))マウスと変異SOD1マウス(SOD1(G85R))を交配してダブルトランスジェニックマウスを作製した。作製したマウスの病態を観察した結果、Sig1Rを完全に欠損したSOD1(G85R)/Sig1R(-/-)マウスでは、野生型Sig1RをもつSOD1(G85R)マウスやヘテロで欠損したSOD1(G85R)/Sig1R(+/-)マウスと比較して、発症時期が有意に早期化して生存期間が短縮することを見出した。一方、Sig1Rを欠損したSig1R(-/-)マウスにおける運動機能の異常は認められず、少なくともマウスではSig1Rの機能喪失のみでは運動神経細胞の変性には十分でないことが示唆された。また、ALS患者由来の変異をもつSig1Rを生化学的に解析したところ、変異Sig1Rは細胞内で極めて不安定であり、イノシトール三リン酸受容体(IP3R)との相互作用も失われることが明らかとなった。更に、変異SOD1マウスの腰髄の運動神経細胞ではSig1Rが凝集し、IP3Rが局在異常を示すことも明らかにした。以上の知見とIP3Rが細胞内のカルシウムイオン濃度を制御する重要な分子であることを併せて考えると、MAMにおけるSig1Rの機能喪失は細胞内カルシウムイオン制御の異常を介して神経細胞の変性を促進していることが推測できる。今後、更に生化学的な検討を進め、どのような経路でカルシウムイオンの異常が神経細胞変性につながるのか、その機序を明らかにする予定である。本年度の研究では、小胞体・ミトコンドリア膜間領域(MAM)特異的タンパク質であるσ1受容体(Sig1R)とイノシトール三リン酸受容体(IP3R)の相互作用の消失が、どのように運動神経変性を惹起するのか、その機序について生化学的な解析を中心に検討を行った。その結果、Sig1Rの凝集または欠損に伴ってIP3Rが局在異常を起こした細胞では、ミトコンドリアへのカルシウムイオン(Ca2+)流量が減少するとともに、細胞質へのCa2+流量が著しく増加していることが判明した。また、この変化と一致して、細胞内のカルパインの過剰な活性化と細胞内アデノシン三リン酸(ATP)量の減少が観察された。マウス組織を用いた解析でも、Sig1R (-/-) / SOD1G85Rマウスでカルパインの過剰な活性化が見られ、Ca2+流量の異常化がカルパインの過剰活性化とATP減少を通じて細胞傷害性に作用し、早期の発症に関与していることが考えられた。更に、IP3R3型の中枢神経系における局在を検証したところ、脊髄前角や顔面神経核、舌禍神経核などの運動機能に関わる部位の神経細胞において強い発現が見られた一方、皮質や海馬、視床などではほとんど発現が見られなかった。

従って、Sig1R-IP3R3型の相互作用の消失に伴うCa2+異常化が筋萎縮性側索硬化症(ALS)における運動神経への選択性に寄与していることが示唆された。今後は、これまでの成果を論文としてとりまとめるとともに、SIg1RのアゴニストによりSIg1R-IP3R3型の相互作用を回復して毒性を回避したり、発症を遅延させることが可能か、培養細胞と変異SOD1マウスを用いて検討を進める予定である。本年度の研究では生化学的解析と組織学的解析により、MAMの機能不全、すなわちSig1R-IP3R3の相互作用の消失がCa2+の異常化を招き、さらにCa2+の異常化がカルパイン過剰活性化とATP量の減少を伴って神経変性に関与することも明らかにできた。また、IP3R3の局在が運動機能に関連する部位の神経細胞に選択的であることも判明した。これらのことから、当初の研究目標は概ね達成できたと考えられる。本年度は、最終年度としてこれまでに得られた小胞体・ミトコンドリア膜間領域(MAM)の機能破綻とSOD1, SIGMAR1の各遺伝子における変異に起因する筋萎縮性側索硬化症(ALS)病態との関連をまとめ、論文としてEMBO Molecular Medicine誌に投稿、発表した。また、論文化の過程において学内共同研究により新たにMAMの破綻を直接的に電子顕微鏡で観察し、変異SOD1マウスおよびSIGMAR1欠損マウスのいずれの運動神経細胞内でもMAMの量が減少していることを直接的に確認した。生化学的な解析では、MAMの機能的な破綻はSIGMAR1遺伝子の場合は小胞体側の変調、SOD1の場合はミトコンドリア外膜側の変調がMAMの破綻につながっていることを見出した。これらの成果により、ALS病態に於いてMAMの破綻が広く共通した病態であることが示唆された。また、SIGMAR1遺伝子産物であるσ1受容体(SIg1R)のアゴニストで処理するとSig1Rとイノシトール三リン酸受容体(IP3R3)との相互作用が回復し、カルシウムイオン放出の異常化が抑制され、培養細胞に対する変異SOD1の毒性が軽減された。更に、変異SOD1マウスにSig1Rのアゴニストを発症前より投与したところ、MAMの破綻が抑制され、発症を遅延させることに成功した。これらの結果から、MAMの機能維持を標的とすることが新たなALS治療薬の開発戦略として有用である可能性が示唆された。本研究を通じて、ALS病態におけるMAMの機能破綻の意義が明らかになったことから、今後、MAMの破綻に基づいて孤発性も含めた幅広いALSに共通した病態機序の解明とそれに基づく、治療戦略の開発が可能になると期待される。本研究では、新たに若年発症型の家族性ALSの原因となるL95fsの変異をσ1受容体(Sig1R)に見出した。変異Sig1Rは細胞内で極めて不安定で、本来の結合相手であるイノシトール3リン酸受容体3型(IP3R3)とも結合できなかった。Sig1Rを欠損した変異SOD1-ALSモデルマウスを作製したところ、このマウスでは顕著な発症時期の早期化を認めた。さらに、変異SOD1の発現、Sig1Rの欠損のどちらにおいてもMAMは構造的に破綻し、Ca2+恒常性の破綻を介して神経細胞死を引き起こしていた。以上の結果から、MAMの破綻は孤発性も含めた幅広いALSに関して普遍的な現象であることが示唆された。
パルスダイレーザーによるケロイド抑制効果の病態解明

まず新生児・成人ラット皮膚の創傷治癒過程においてPDL照射によるCOX-1,-2の発現部位や強度の経時的変化を検討したが、発現の増強はみられるものの、創傷治癒の期間や性状において有意な差はみられなかった。また新生児・成人ラット正常皮膚組織から分離培養した線維芽細胞(FC)においても様々な条件下でPDL照射を施行したが、COX-1,2の発現抑制効果は確認困難であった。人のケロイド皮膚と正常皮膚においても同様の結果であった。また人のケロイド皮膚と正常皮膚の組織と分離培養したFCでCOX-1,-2の発現を免疫染色にて確認はできたが、その強度や部位に有意差は認めなかった。インフォームドコンセプトを得られた手術予定のケロイド患者に、パルスダイレーザーを一部に照射し、その後ケロイド組織を摘出した。これらをパラフォルムアルデヒドにて固定、パラフィン包埋したのち、HE染色および、COX-1,2の免疫染色を施行した。現在のところ、レーザー照射、未照射に関わらず、COX-1,2の陽性部位、強度には有意な差は認めておらず、ケロイド組織は照射に関わらず、COX-2を強発現し、COX-1は発現していない傾向がみられている。さらに免疫染色の前処理や抗体濃度などの条件を検討し、再確認する予定である。またケロイド組織よりfibroblastを分離、培養し、凍結保存している。この一部をさらに様々な細胞密度でwellにまき、数日後にパルスダイレーザーを照射し、最も適当な照射強度、回数を決定するため、MTT assayなどで、増殖曲線を確認している。その結果は細胞密度により結果が大きく左右される傾向を認めており、条件設定に困難をきたしている。今後さらに各培養上清を回収し、PGE2およびTGFβをELIZAにて検出するために、その蛋白濃度を計測し、保存している。しかしELIZAに供与するには蛋白濃度がやや不足しているため、さらに培養条件の設定を検討している。また培養細胞も今後、PCRに使用する予定があるため、回収し保存している最中である。さらに培養細胞そのものがCOX-1,2を発現していることを確認するために、これを用いた免疫染色を予定している。18年度に引き続き、同意を得られたケロイド患者に、パルスダイレーザーを一部に照射し、その後ケロイド組織を摘出し、これらをパラフォルムアルデヒドにて固定、パラフィン包埋したのち、HE染色および、COX-1,2の免疫染色を様々な条件下にて施行した。前年度同様、レーザー照射、未照射に関わらず、COX-1,2の陽性部位、強度には有意な差は認めておらず、ケロイド組織は照射に関わらず、COX-2を強発現し、COX-1は発現していない傾向がみられるため、さらにMIB-1の免疫染色を施行し核周期などの違いも含め、正常組織との詳細な比較検討をする予定である。またケロイド組織よりのfibroblast分離、培養、凍結保存も引き続き施行している。パルスダイレーザーをこの培養細胞に回数や強度を検討しつつ照射し、MTT assayなどでその影響を増殖曲線を求め確認したところ、現在のところ正常組織との有意な差はみられていない。一方培養細胞そのものがCOX-1,2を発現していることを確認するために、これを用いた免疫染色を施行中である。わずかではあるがケロイド組織よりの培養細胞の方が正常組織よりもCOX-2を強発現している傾向がみられており、再現性を確認中である。さらにパルスダイレーザー照射によりこの発現に変化がみられるかどうかも検討予定である。また培養細胞における上清よりELIZAでCOXを計測するために、最適の蛋白濃度を得られるように抽出方法をさまざまに検討している。今年度は18、19年度の実験の追加、および集積、統計を行った。現在までに集めた人のケロイド組織と正常皮膚組織のHE、EMG染色および、COX-1、Cox-2、MIB-1の免疫染色を施行した。パルスダイレーザー(PDL)照射、未照射に関わらず、免疫染色上、全てにおいて両者に有意差は認めなかった。また新生児と成人のラットの背部の皮膚に作成した創傷治癒過程においてPDLの照射を、回数と強度を数段階に条件を設定し、経時的に施行した。COX-1, COX-2の発現の増強はともに種々の程度にみられたものの、その発現部位や強度の経時的変化は創傷治癒の期間や創傷の性状において有意な差はみ照れなかった。さらに人のケロイド組織と正常皮膚、ラットの新生児と成人の正常皮膚より分離、培養したfibroblastのCOX-1, COX-2の免疫染色では、種々の刺激(カプサイシンなど)により全て陽性反応を認めた。しかしPDL照射によって、培養細胞の密度やPDLの強度により細胞壊死を容易に生じてしまうこと、熱処理が困難であることなどか照、正確なCOX-1, COX-2の発現抑制効果の確認が困難であった。
肝硬変症に対する高機能細胞製剤の予期的培養法とセルフリー肝臓再生療法の開発

我々が実施している非代償性肝硬変症に対する自己骨髄細胞を用いた再生療法(先進医療B「自己骨髄細胞投与療法」と臨床研究「培養自己骨髄間葉系幹細胞(MSC)を用いた低侵襲肝臓再生療法」)の知見から、さらに治療効果と安全性を高めた肝臓再生療法を開発するには「高機能・高品質な骨髄MSC」が必要であると考え、研究を進めている。また、これまでにThioacetamide(TAA)で酸化ストレスを誘導した初代肝細胞と骨髄MSCの共培養実験から骨髄MSCには肝細胞由来Reactive Oxygen Species(ROS)産生を抑制する直接的作用があることや、「高い細胞増殖活性とコラゲナーゼ活性を持つ骨髄MSCを培養可能な培養皿(特許第5935477号)」の解析から「骨髄MSC増殖促進因子(Mesenchymal proliferation factors, MPFs)」を見出している。今年度は、全骨髄細胞由来因子を含む培地(全骨髄調整培地)で培養した骨髄MSCは、通常培地と比べて良好な増殖能とコロニー形成能を長期にわたって維持したが、細胞外小胞を除去することにより、これらの効果は減弱することを見出した。さらに全骨髄調整培地による骨髄MSC培養はミトコンドリア機能を改善させることも確認し、関与するmicroRNAを複数同定した。このように、全骨髄細胞由来microRNAによって骨髄MSCミトコンドリア機能が改善(維持)するため、この方法で培養した骨髄MSCは肝臓再生療法の有効な細胞源となりうる。新たに全骨髄細胞由来因子を含む培地(全骨髄調整培地)で培養した骨髄MSCに注目して解析した結果、高機能な骨髄MSCが培養可能となることが明らかになったため。最終年度は、全骨髄細胞由来因子を含む培地(全骨髄調整培地)で培養した骨髄MSCの肝線維化改善効果を動物モデルを用いて検証し論文化する。我々が実施している非代償性肝硬変症に対する自己骨髄細胞を用いた再生療法(先進医療B「自己骨髄細胞投与療法」と臨床研究「培養自己骨髄間葉系幹細胞(MSC)を用いた低侵襲肝臓再生療法」)の知見から、さらに治療効果と安全性を高めた肝臓再生療法を開発するには「高機能・高品質な骨髄MSC」が必要であると考えた。また並行して、骨髄MSCニッチを模倣した骨髄細胞から作成した「骨髄調整培地」を用いて骨髄MSC高品質培養法の開発に取り組んだ。その結果、骨髄調整培地で培養した骨髄MSCは、通常培地で培養した骨髄MSCに比して細胞形態が紡錘形で良好な増殖能を長期にわたって維持し、この肝線維化評価モデルへの投与により肝線維化面積は有意に抑制されることを確認した。このことより、全骨髄細胞由来因子は骨髄MSCの健全性や機能性を保ち骨髄MSCによる肝線維化改善効果を高める効果を有することが示唆された。「高い細胞増殖活性とコラゲナーゼ活性を持つ骨髄MSCを培養可能な培養皿(特許第5935477号)」の解析から同定した因子の骨髄MSC増殖促進作用の解析を進めることができた。MMP9マウスの解析については発現量が少なく難渋したものの、「骨髄調整培地」を用いた培養法を開発することができたため。