hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
320列面検出CT仮想展開像を用いた胃癌の多様性診断に関する研究

本研究の目的は、胃癌の病理学的多様性に着目し、画像的な評価が可能であるかを検索することであり、胃癌の診断ツールの一つである造影CTで我々独自の表示法であるWall-carving技術を用いて評価を行った。始めに、我々は胃のWall-carvingの正常構造を把握するために、Wall-carving展開像を用いて胃粘膜の内視鏡像との比較を行った。この研究では51例の早期胃癌症例のCT画像に対しWall-carving展開像を作成し、血管像の所見をnetwork(網状)、dendritic(樹枝状)、wavy(波状)の3パターンに分類し、胃粘膜の慢性変化(萎縮、襞腫大、びまん性発赤)、および胃癌の病理結果(肉眼型、組織型、深達度、局在)と比較した。上記血管像の頻度はそれぞれ16%、51%、33%で、dendriticパターンが最多であった。血管像については、萎縮の程度に伴い血管の蛇行が強くなる傾向を認めた。次に、我々は進行胃癌におけるWall-carving画像についての研究を行った。対象は造影CTを行い病理学的診断が得られた進行胃癌36例を用いた。Wall-carving像動脈相おける胃癌の増強の程度を表層からの深度ごとに評価し、病理学的所見(大きさ、肉眼型、深達度、組織型、間質量、発育様式、脈管侵襲、リンパ節転移)と比較した。結果、表層部は72%が強く増強され、深層は50%が強く増強された。病理学的所見は、深層の強い増強と組織型、間質量が有意な相関を示した。以上のことから、胃癌の造影CTでWall-carving像の深層を評価することで胃癌の病理構築(組織型、間質量)が類推できることが明らかとなった。本研究の基礎的研究として、CT画像による胃壁の血管・血流の評価を行った。対象は320列面検出CTで術前に本プロトコールによる造影CT検査を行った早期胃癌症例51例で、ワークステーションでWC展開像を作成した。これらの画像を二名の読影者が合議制にて読影し、胃粘膜下の血管を評価した。結果、胃粘膜下血管はnetwork、dendritic、wavyの3パターンに分けられ、それぞれ9例、21例、21例であった。これらを内視鏡での慢性胃炎所見と、早期胃癌の病理結果と比較したところ、統計学的にnetworkパターンは萎縮の比較的弱い胃粘膜に見られる傾向があり、有意に0-IIc型胃癌が多い傾向が認められた。このことから、胃粘膜の萎縮に伴って胃粘膜下の血管が蛇行などの変化をきたすことが示唆された。以上の内容は第76回日本医学放射線学会総会(平成29年4月13日16日・横浜)にて発表した。今後さらに症例を増やし、その検討結果については論文にまとめ発表する予定である。また並行して胃癌症例についても研究を進めている。本研究のプロトコールに該当する症例は320列面検出CTによる検査を行った胃癌39例であり、そのうち手術が施行された症例は22例(早期癌16例、進行癌6例)であった。早期胃癌については、ボーラストラッキング法を用いた造影CTを行い、動脈相を詳細に解析し病理結果と対比することで、胃癌の血管新生過程を調べる予定である。進行癌については、ヨードマッピングにて画像解析を行い、病理結果と対比し、胃癌の間質増生過程を調べる予定としている。現在、ワークステーションで解析用の画像作成を適宜行い、読影・解析を順次進めている。今後、病理結果を基に解析を行っていく予定である。本研究の対象である胃癌症例(320列面検出CTによる検査を行い手術が施行された症例)は22例(早期癌16例、進行癌6例)にとどまり、目標数の30症例より少なかった。順次、画像解析を進めているが以上の理由によりやや遅れている。本年度は、本研究課題である胃癌の多様性について研究するため、造影CTを用いた胃癌の増強効果について研究を行った。対象は当施設で登録された進行胃癌であり、造影CTで術前検査を行い外科的手術の後に病理学的評価がなされた47症例を対象とした。撮像方法は高濃度ヨード造影剤をボーラストラッキング法により急速静注し、40秒後(動脈相)、70秒後(門脈相)、240秒後(遅延相)に撮像した。胃癌の病理組織型は分化型腺癌が10例、未分化型が7例、混在型が20例であった。これらの造影CTにおける増強効果を評価するために、二名の放射線科診断専門医が読影を行い、腫瘍の最大断面での増強ピーク相を決定し、ROIを用いて実際にCT値を計測した。これらのパラメータを胃癌の病理組織型で3群比較し、統計学的解析を行った。結果、3群間で増強ピーク相に読影者両者において有意差を認めた。低分化型胃癌は遅延相にピークを認める傾向があった。またCT値計測では、遅延相にて読影者両者で低分化型胃癌のCT値が有意に高い傾向であった。以上、胃癌は組織型によって腫瘍内の増強パターンが異なるという結果が導き出された。この研究内容については、論文を作成し発表した。(Eur J Radiol. 2017Dec;97:90-95.

doi: 10.1016/j.ejrad.2017.10.018. Epub 2017Oct 26. PMID: 29153374)この結果は、本研究課題でもある胃癌の多様性が、組織学的に画像的に証明されたものと考えている。本研究のサンプルは臨床症例を用いているため症例数の予測が難しく、実際に上記の研究サンプル内には、320列面検出CTで撮像した症例が少なかった。このためそれ以前の症例も加えて仮想展開像なしでの検討を行った。以上より、本来行うべき研究からはやや遅れていると判断する。本研究の目的は、胃癌の病理学的多様性に着目し、画像的な評価が可能であるかを検索することであり、胃癌の診断ツールの一つである造影CTで我々独自の表示法であるWall-carving技術を用いて評価を行った。始めに、我々は胃のWall-carvingの正常構造を把握するために、Wall-carving展開像を用いて胃粘膜の内視鏡像との比較を行った。この研究では51例の早期胃癌症例のCT画像に対しWall-carving展開像を作成し、血管像の所見をnetwork(網状)、dendritic(樹枝状)、wavy(波状)の3パターンに分類し、胃粘膜の慢性変化(萎縮、襞腫大、びまん性発赤)、および胃癌の病理結果(肉眼型、組織型、深達度、局在)と比較した。上記血管像の頻度はそれぞれ16%、51%、33%で、dendriticパターンが最多であった。血管像については、萎縮の程度に伴い血管の蛇行が強くなる傾向を認めた。次に、我々は進行胃癌におけるWall-carving画像についての研究を行った。対象は造影CTを行い病理学的診断が得られた進行胃癌36例を用いた。Wall-carving像動脈相おける胃癌の増強の程度を表層からの深度ごとに評価し、病理学的所見(大きさ、肉眼型、深達度、組織型、間質量、発育様式、脈管侵襲、リンパ節転移)と比較した。結果、表層部は72%が強く増強され、深層は50%が強く増強された。病理学的所見は、深層の強い増強と組織型、間質量が有意な相関を示した。以上のことから、胃癌の造影CTでWall-carving像の深層を評価することで胃癌の病理構築(組織型、間質量)が類推できることが明らかとなった。当面はこれまで通り研究を進めていく。最終年度である本年度も併せれば、必要相当数の症例が集まる可能性は高いと考えており、本研究の主題である320列面検出CTを用いた仮想展開像による胃癌の画像解析が可能と考える。文献や学会出張・参加費が少なく済んだため。発表を予定していた学会に演題が採用されなかったため、旅費がかかりませんでした。次年度は、より採択されやすい学会発表を検討する予定です。次年度は差額の分を研究解析目的のPC購入や文献、学会出張費に充てる予定である。
in vivo光計測法を用いた視覚野方位優位性コラムの形成に関する研究

特定な方位の線条に反応する細胞が第一次視覚野に方位優位性コラムを作りながら集まっている。本研究は方位優位性コラムと視覚経験との関係の解明を目指すものである。麻酔したネコに、0,22.5,45,67.5,90,112.5,135,157.5度方位の縞模様を刺激として提示し、それぞれに対する反応を内因性光計測法によって記録した。個々の方位に優位的に反応したコラムの大きさを計るために、個々の反応マップはブランク刺激を呈示した時に記録した皮質画像と比較した。各々のピクセルにおいて光強度の平均値を比較し、統計的なパラメータであるt値を計算した。得られたt値を対応するピクセルに戻し、刺激ごとにtマップを構成した。皮質上活動領域の評価はこのtマップによって行った。測定には、605nmの光を用い、Optical Imaging 2000の計測システムを用いた。異なる方位刺激によって引き起こした皮質領域の面積は水平・垂直の0及び90度でピークになり、45及び135度で最も少なかった。これは、水平・垂直の方位を処理する細胞はより多いことを示唆する。水平と垂直の<0度+90度>によって引き起こした平均面積は測定領域の51.2%に占めた。斜め方向の<45度+135度>は43.8%の皮質領域を引き起こした。平均面積には統計的に有意差が認めた(p<0.0001)。また、水平の方位に誘発された領域の平均面積は垂直より有意に大きかった(p<0.006)。本研究によってはネコの視覚皮質において水平・垂直に方位する輪郭を処理するために、より多くの神経回路が関わっていることを明らかにした。水平・垂直方位と斜めの方位間に差をもつような方位優位性コラムの形成について、生後間もない仔ネコの視覚環境をコントロールし、更に検討する必要がある。
抗ウイルス抗体を産生する新規抗ウイルス剤EdAPの研究

ウイルスのRNA合成酵素が2'-デオキシヌクレオシドを受け入れることから、ウイルスRNA合成酵素の阻害を目的として、細胞膜透過性の上昇と5'-O-一リン酸への効率の良い加水分解を期待して、リボースの5'位に環状リン酸エステル基を持つ化合物EdAPを分子設計した。これはEdAPが細胞内に取り込まれた後、5'-O-一リン酸への加水分解が起こり速やかに活性型(5'-O-三リン酸)となることを期待したものである。本研究は、EdAP合成の最適化と活性評価を目的とした。D-Glucoseを出発原料とし、13工程でグルコフラノース誘導体へと導いた。これをSilyl-Hilbert-Johnson反応によりアデニンを導入した後、6工程でEdAPを合成した。EdAPの抗ウイルス活性試験を、培養細胞を用いて評価した。、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、エボラ出血熱ウイルスに活性を示した。またマウスによる動物試験においても、抗インフルエンザウイルス活性を示した。EdAPは5'位に形成している環状リン酸エステル基の疎水性により細胞膜を透過した後、細胞内の酵素の働きにより加水分解され、一リン酸体となった後に三リン酸化体となると予測している。In vitro活性や細胞内での実際の挙動を調べるため、三リン酸化体の合成を検討した。既にモノリン酸化体であるEdAPに二リン酸を付加する方法が簡易であると考え、各種検討を行ったが、目的の化合物を得られなかったため、合成法の再検討を要する。
人工多能性幹細胞由来幹細胞を用いたHBV持続感染とHBV起因肝癌の分子機構の解明

研究代表者らは、HBV持続感染に関わる自然免疫応答回避機構や発癌、あるいはgenotypeによる臨床病態の差異に関わる分子機構を明らかにすることを目的として研究を遂行し、以下の実績を得た。1. HBV持続感染に関わるHBVの自然免疫応答回避機構の解明:前回までの検討で、HBVの発現により一部のISGの発現が変化することが明らかとなったことを受け、既報で同定されているB型肝炎患者由来肝細胞で発現変動を認めるISG数種類の遺伝子発現についても追加で検証を行ったが、HBV発現により発現が抑制される遺伝子は明らかでなかった。次に、蛋白リン酸化への影響を検討するために、自然免疫応答以外の経路に関わる分子も含め、Hep2.2.15.7細胞やHBV強制発現肝癌細胞株等を用い網羅的なリン酸化アレイを行った。その結果、PRAS40, GSK3βのリン酸化がHBV発現時に抑制されている事が示唆された。2. HBV起因肝癌における分子機構の解析:予備実験として、HBV非感染肝癌症例2例について癌部・非癌部におけるSTINGのmRNA発現、およびSTINGが関わるシグナル経路の別の分子のmRNA発現を解析した。いずれの症例についても、STINGのmRNAは非癌部で発現低下しており、またSTINGの下流分子の一つと考えられているTBK1の発現も癌部で低下していた。一方で、IKKεの発現は癌部で増加していることが明らかとなった。3. HBVのgenotype間による慢性化率や発癌率の差を規定する機構の解明:1の解析(ISG発現解析、リン酸化アレイ)を異なるgenotypeのHBVを導入した場合で比較したが、genotype間による明らかな差は見出されなかった。しかし、IFN投与時におけるISG発現の比較では、IFN投与によって誘導されたCXCL10のmRNA発現がHBV発現により抑制され、genotype CのHBVでは抑制の程度が弱いことが示唆された。1. HBVの持続感染およびgenotype間による臨床病態の差異に関わるメカニズムの解明、については、概ね当初の計画通りに進めることができた。一部計画通りに進められなかった部分についても解析の対象を広げ一定の成果が得られたと考える。すなわち、前回までの検討で明らかとなった、HBV発現時に発現変化が認められるISG以外に新たに同様の変化を認める分子を同定し、また、自然免疫関連分子以外の分子にも解析対象を広げることにより、HBV発現時にリン酸化に変化を認める可能性のある分子を同定した。この結果を更に追究していくことにより、直接的な自然免疫経路以外のシグナル経路がHBV持続感染やIFN応答性に関わるという新しいメカニズムを明らかにできる可能性があると考えられた。2. HBV起因肝癌に関わる分子機構の解析に関しては、当初の予定通り臨床検体の解析に着手し、予備実験として非HBV感染症例における癌部・非癌部におけるSTINGを中心とした遺伝子発現の比較を行うことができた。興味深いことに、STINGおよびTBK1のmRNA発現量が癌部と非癌部で異なるだけでなく、TBK1と類似した機能を持つIKKεの発現パターンと異なっている事が明らかとなった。今後この発現パターンの違いについて更に解析を進めていくこと、またHBV感染肝癌症例で同様の検討を行い比較することにより、新たなHBV発癌メカニズムを明らかにするための知見を得ることができると考えられる。以上のように、研究計画はおおむね順調に進展しているものと思われる。1. HBVの持続感染およびgenotype間による臨床病態の差異に関わるメカニズムの解明:これまでの検討で明らかとなった、HBV発現により発現量が変化するISGについては当初の予定通り、正常機能を有するヒトiPS細胞を用いてこの結果を検証していく。また、今回新たにHBV発現によりリン酸化に変化が生じることが示唆されたPRAS40やGSK-3βについては、western blotting等によりその結果を検証し、再現された場合にはこれらに関連するシグナル経路の他の分子についても解析を追加する。一方、これまではHBV plasmidの強制発現による検討が中心であったが、より生理的な状況を再現するために今後はHBV感染系を用いて同様の実験を行い、genotype間での比較も含め検証していく。以上の解析より、特定の分子あるいはシグナル経路が関わっていることが示唆された場合には、これらの肝生検組織における発現や血清中の動態に関する解析も併せて検討する。2. HBV起因肝癌に関わる分子機構の解析に関しては、引き続き臨床検体の解析を続けていく。特にHBV感染症例において癌部、非癌部のSTING、TBK1、IKKεやこれらと関連する分子の発現パターンやリン酸化、可能であれば局在等の解析も併せて行う。In vitroの検討としては、今回明らかとなった結果を踏まえ、ヒトiPS細胞由来肝幹・前駆細胞を用いて、STING、TBK1、IKKεなどの強制発現あるいはknock down/knock outした場合の形質の変化を解析する。更に、HBV感染時にはHBV DNAがヒトゲノムにintegrationし、特に癌部では80%と高率にHBV integrationが認められることから、新たな解析として、ヒトiPS細胞にHBV遺伝子を導入したHBV integrationモデルを樹立し、STINGを中心としたシグナル経路の変化を解析することを検討する。研究代表者らは、独自に確立した手法で純化したヒトiPS細胞由来肝幹・前駆細胞を用いて、HBV持続感染に関わる自然免疫応答回避機構および発癌に関わる分子機構と、異なるgenotype間における病態の差異を明らかにすることを目的として研究を遂行し以下の実績を得た。

1. HBV持続感染に関わるHBVの自然免疫応答回避機構の解明:肝癌細胞株を用いて、HBVの発現時における、ISRE promoter活性、ISG15, PKRなどの各種ISGや自然免疫関連分子のmRNAや蛋白の発現量、蛋白リン酸化の変化を評価した。その結果、ISRE promoter活性はHBV発現により抑制された一方、複数のISGや自然免疫関連分子の発現上昇を認めた。以上より、HBV発現は自然免疫応答の活性化に関わるが、一部はHBVにより抑制され活性化の程度が不十分である事が示唆された。2. HBV起因肝癌における分子機構の解析:STINGと肝癌との関係を検討するにあたり肝癌細胞株におけるSTINGの発現をwestern blottingで確認したところ、HuH7細胞ではその発現を認めたが、HepG2細胞での発現は明らかでなかった。また、HBVおよびHBx蛋白発現プラスミドをHepG2細胞に導入しSTINGのmRNA発現を解析したところ、発現量の変化は明らかでなかった。3. HBVのgenotype間による慢性化率や発癌率の差を規定する機構の解明:1の検討でHBV発現により発現に変化を認めた分子に関して、異なるgenotypeのHBVプラスミドを用いて同様の検討を行った。その結果、HBV発現によるISRE promoter活性の抑制や複数のISG発現はgenotype Cではgenotype A, Bに比しやや弱いという結果であり、特に後者の結果はgenotype Cで慢性化しやすいことと関連がある事が示唆された。1. HBV持続感染に関わるHBVの自然免疫応答回避機構の解明、に関しては当初の計画通り研究を進めることができ、一定の成果を得ることができた。すなわち、HBV発現により複数の自然免疫応答分子の発現変化が認められ、HBV感染が自然免疫応答を惹起すること、およびHBVによる自然免疫応答抑制機構の存在が示唆された。そこで、当初平成30年度に計画していたHBVのgenotype間による慢性化率の差を規定する機構の解析、を一部平成29年度に計画を早めて行った。異なるgenotypeのHBVプラスミドを用いた検討から、genotypeにより自然免疫応答への影響の度合いが異なることが示唆され、解析を進めることによりHBVの持続感染メカニズムの一端を明らかにしうる重要な知見と考えられた。2. HBV起因肝癌に関わる分子機構の解析に関しては、肝癌細胞株でも株種によってSTINGの発現量が異なるがことが明らかとなった。HBV起因肝癌におけるSTINGの発現を解析するにあたり、患者から得られた肝癌検体の採取は既に進行中であり、準備が整い次第肝組織検体を用いた解析を進めることができる状態である。また、短期的な検討では、HBV発現によるSTINGの発現の変化は明らかでなかったが、今後長期的なHBV発現下での解析を行うことにより、持続感染下におけるSTINGの発癌への寄与を明らかにしうると考えられる。以上のように、研究計画はおおむね順調に進展しているものと思われる。
痒疹及び近縁アレルギー疾患の炎症・痒みの病態解明とピンポイントな治療法の確立

慢性痒疹のモデルマウスを樹立した。このマウスでは丘疹性病変が形成され、組織学的に表皮肥厚、真皮好酸球、好塩基球浸潤と神経の表皮内伸長が観察された。好塩基球が病変成立に必須であった。STAT6シグナルは病変成立に不要であったが、好酸球浸潤と掻破行動に関わっていた。ヒト痒疹では表皮細胞がTSLPやIL-33を発現。従来からいわれる内臓悪性腫瘍や金属アレルギーとの関連はみられなかった。また硬化性胆管炎患者にみられた皮膚そう痒症について観察を加えたところ、lysophosphatidic acidによる好塩基球からのヒスタミン遊離が痒みの機序の一つになっていた。1)TNP-IgEトランスジェニックマウスの耳介にTNO-OVAを反復投与することにより約1か月以上持続する慢性皮膚炎症反応を誘導した。また同様の反応を背部皮膚に惹起したところ丘疹性病変が形成され、痒疹反応に類似する病変が誘導されることがわかった。病変部は組織学的に不規則な表皮肥厚、好酸球、単核細胞、そしてマスト細胞の浸潤からなっていた。さらに表皮内への神経線維の伸長が確認された。組織中の好塩基球は少数であったが、好塩基球の除去により炎症がほぼ消失したことから好塩基球依存性反応であることが示された。さらに病変部のサイトカインプロフィールではIL-4, IL-13, IL-5などのTh2型反応が優位であり、またIL-17, IL-22, IL-31といったサイトカインも産生されていることが示された。マウスの掻破行動を観察したところ、病変部への後肢による自発的掻破が確認され、この病変はそう痒性病変であることも確認された。2)ヒト結節性痒疹および多形慢性痒疹病変部において表皮内へのPGP9.5陽生神経線維の伸長を免疫組織学的に確認した。現在、その機序をamphiregulin, semaphorin 3A, IL-33, TSLP発現などの面から検討中である。3)痒みにおけるERK1およびERK2の関与を検討するため、現在nav1.8 cre transgenic miceとERK欠損マウスとの交配を継続中である。1)TNP-IgEトランスジェニックマウスの背部にTNP-OVAを反復投与して作成した痒疹モデルの解析を継続して行った。病変部ではTGF-β1, Type1 collagen, eotaxin-1, eotaxin-3などの産生がみられ好酸球浸潤とリモデリングを反映していた。またTSLP, IL-33の産生がみられたことが注目に値した。表皮直下ではperiostinの強発現もみられた。さらに病変部では表皮内神経の伸長がみられ、表皮細胞はNGF, Amphiregulin発現が高く、一方semaphorin 3Aは低下していた。しかし極めて意外なことに掻破行動を抑制しても炎症の強さには影響を与えなかった。2)ヒト結節性痒疹と多形慢性痒疹ではいずれにおいても表皮細胞がTSLP, IL-33を発現していた。また乳頭層でのperiostin発現も顕著であった。3)痒みにおけるERK1, ERK2の関与の検討を継続した。ERK1欠損マウスでは起痒物質に対する掻破行動に変化はみられなかった。しかしwild-typeマウスにERK1/ERK2阻害薬を塗布すると掻破行動の抑制が観察された。1)C57BL/6 (wild type: WT)をTNP-IgEで継続的に授動感作しTNP-OVAを皮内投与することでマウス痒疹病変の誘導に成功した。これを利用しC57BL/6マウス由来のSTAT6 (-/-)マウスに痒疹病変を誘導したところ極めて意外なことに反応が増強した。局所のサイトカインとしては、TSLPとIL-33産生がSTAT6 (-/-)マウスで高まっていた。増強した病変部では好塩基球浸潤がWTマウスに比して目立っていたが、その一方で好酸球浸潤は消失していた。さらに炎症悪化にもかかわらずIL-31と掻破行動は減弱した。つまりこのモデルでは炎症と好塩基球は相関するが、好酸球浸潤や掻破には影響をうけないことが判明した。また痒みは好酸球浸潤に左右されることが示唆された。2)ヒト痒疹に関しては、A:結節性痒疹、B:多形慢性痒疹およびC:蕁麻疹様紅斑と痒疹丘疹がみられる分類不能な痒疹群について解析した。分類不能群はIL-33, TSLP発現において多形慢性痒疹と類似の結果がえられるとともに、血清TRAC値が有意に高い傾向にあった。真皮に多くの好塩基球浸潤と明瞭な脱顆粒像が確認された。3)マウス末梢神経からERK2を欠損させたconditional knockout mouseを作成した。セロトニンに対する掻破行動を観察したが著明な掻破抑制を観察することはできなかった。ERK1欠損マウスで掻破行動が変動せず、ERK1/ERK2阻害薬塗布でWTマウスの掻破が抑制されたこれまでの結果からみるとERK2欠損マウスの結果は矛盾していた。

このマウスでは丘疹性病変が形成され、組織学的に表皮肥厚、真皮好酸球、好塩基球浸潤と神経の表皮内伸長が観察された。好塩基球が病変成立に必須であった。STAT6シグナルは病変成立に不要であったが、好酸球浸潤と掻破行動に関わっていた。ヒト痒疹では表皮細胞がTSLPやIL-33を発現。従来からいわれる内臓悪性腫瘍や金属アレルギーとの関連はみられなかった。また硬化性胆管炎患者にみられた皮膚そう痒症について観察を加えたところ、lysophosphatidic acidによる好塩基球からのヒスタミン遊離が痒みの機序の一つになっていた。ヒト痒疹の解析がやや遅延しているものの基礎的解析は順調である。皮膚科学痒疹マウスモデルの解析を継続する。また各種の薬剤の治療効果を評価する。末梢神経においてERK2を欠損させたマウスでの痒み反応の解析を進める。さらにヒト痒疹との類似性を病態の面から評価し、治療の標的を推測する。一部の計画についてはまだ開始されていないが、概して予定通り進めている。マウス遺伝子改変と交配に時間を要していること、ヒトサンプルの収集に時間がかかっており、一部の研究を次年度にまわしたことによる。痒疹モデルのさらなる詳細な解析を予定しており、平行してヒト痒疹との類似性を検討していく予定である。またマウス作成も継続していく。研究を進め、該当する研究に予定通り使用する。主にマウスの遺伝子改変と交配に時間を要していることと、および一部の研究を次年度にまわしたことによる。該当する研究に予定通り使用する。
クーロン固体の固溶特性を利用した新しい多価イオン冷却法の探求

クーロン相互作用でイオンが強く結合したプラズマは白色矮星などの高密度星内部で,実験室系ではレーザー冷却されたイオントラップ系で実現されている.本研究によって得られた,2種のイオンが負電荷一様背景中で不規則に固溶した固体(クーロン固溶体)の相分離に対する安定性およびその弾性的性質についての詳しい解析結果が公刊された.今年度混合安定性についての解析をさらに進め,電荷比が約6以上で大きな電荷をもったイオンの組成比0.2近傍においてもっとも混合相が安定化することを見いだした.ローレンスリバモア国立研究所ではBe^{+}とXe^{+44}とからなるイオントラップ系のレーザー冷却実験が最近行われた(L.Gruber, Phys.Rev.Lett., vol.86,pp.636-639,2001).その実験では組成比が非常に小さいXeイオンが中心部に集中し,レーザー冷却のターゲットであるBeイオンがXeイオンを取り囲むように相分離が生じた.本研究の結果に照らしてみるとXeイオンの組成比を最適値0.2に近づけることによってXeイオンに対する間接冷却の効率が格段に改善される可能性があることが分かる.今後,そのようなイオントラップ系におけるプラズマ相特性の解明とともに多価イオンを間接冷却する有効性について分子動力学シミュレーションによって定量的に検討する.付け加えて白色矮星の内部でクーロン結晶が実現されているとの観測事実がつい最近報じられた(朝日新聞,2004年2月19日).これは高齢の白色矮星の振動を詳細に分析することに拠っている.観測精度の向上とともに本研究で得られたクーロン固溶体の弾性定数についての知見が白色矮星の内部状態の解明に大いに役立つものと期待される.2種のイオンが負電荷一様背景中で不規則に固溶した固体(クーロン固溶体)の相分離に対する安定性を詳細に調べ,「不規則型クーロン固溶体が電荷比の増大とともに安定化する」との異常な事実の発見を盤石のものとした.結果は相図の形にまとめられた.さらにこの解析をクーロン固溶体の力学的性質の解明へ進展させた.クーロン固溶体の弾性定数は高密度星の振動を予測する上で必須の情報である.クーロン固溶体は非圧縮性であり結晶の対称性として立方晶を仮定すると2個の弾性定数をもち,それらの違いが系の非等方性を計る物差しとなる.2種類の特徴的な変形を考え,弾性定数をエネルギーの歪みに対する二階微分から求めるとともに,あわせて有限の歪みに対するエネルギー変化について直接計算した.両者の結果を比較することによってクーロン固溶体の力学特性の非線形性を調べることができる.得られた結果をまとめると,1)固溶効果によって立方晶の非等方性は大きく失われる,2)方向平均するとクーロン固溶体の弾性定数は純粋結晶の混合相のものよく一致する,3)安定なクーロン固溶体は純粋結晶に比べて格段に小さい変形で弾性を失う.次年度ではこれらの結果を元に,イオントラップによって蓄積された多価イオン群を効率良くレーザー冷却する可能性を分子動力学シミュレーションによって定量的に検討する.実験室では10万個程度のイオンが閉じこめられている.そのような大規模系をシミュレーションするためにPCクラスター上での並列計算手法を利用する.クーロン相互作用でイオンが強く結合したプラズマは白色矮星などの高密度星内部で,実験室系ではレーザー冷却されたイオントラップ系で実現されている.本研究によって得られた,2種のイオンが負電荷一様背景中で不規則に固溶した固体(クーロン固溶体)の相分離に対する安定性およびその弾性的性質についての詳しい解析結果が公刊された.今年度混合安定性についての解析をさらに進め,電荷比が約6以上で大きな電荷をもったイオンの組成比0.2近傍においてもっとも混合相が安定化することを見いだした.ローレンスリバモア国立研究所ではBe^{+}とXe^{+44}とからなるイオントラップ系のレーザー冷却実験が最近行われた(L.Gruber, Phys.Rev.Lett., vol.86,pp.636-639,2001).その実験では組成比が非常に小さいXeイオンが中心部に集中し,レーザー冷却のターゲットであるBeイオンがXeイオンを取り囲むように相分離が生じた.本研究の結果に照らしてみるとXeイオンの組成比を最適値0.2に近づけることによってXeイオンに対する間接冷却の効率が格段に改善される可能性があることが分かる.今後,そのようなイオントラップ系におけるプラズマ相特性の解明とともに多価イオンを間接冷却する有効性について分子動力学シミュレーションによって定量的に検討する.付け加えて白色矮星の内部でクーロン結晶が実現されているとの観測事実がつい最近報じられた(朝日新聞,2004年2月19日).これは高齢の白色矮星の振動を詳細に分析することに拠っている.観測精度の向上とともに本研究で得られたクーロン固溶体の弾性定数についての知見が白色矮星の内部状態の解明に大いに役立つものと期待される.
AE法を利用した作物の水ストレスのリアルタイムモニタリング法の開発と灌漑への応用

本研究では,作物栽培において限られた水資源の利用効率を高めるための方策として,アコーステイックエミッション(AE)を利用して植物体の水分状態や水利用状態を感知するシステムを作ることを目的とした.AEとは可聴域以上の超音波であり,植物では木部に張力(負圧)が働いて木部内の水柱が途切れる,つまりキャビテーションが生じるときにAEパルスが発生する.本年は,サトウキビやトマト,ブドウを用いて,気孔の挙動とAEパルスの発生パターンとの関連性を検討した.具体的には,午前中は水欠乏が生じず,午後から水欠乏によって気孔が閉鎖する状態で,一日の気孔コンダクタンスとAEの発生を観察した.その結果,土壌に吸水可能な水が十分あるときにはAEは発生しなかった.そして,やや土壌乾燥が進むと,まずAEが発生し,その30分後前後から気孔が閉鎖した.気孔が閉鎖している間はAEの発生頻度が低下し,葉の水ポテンシャル(葉の脱水程度の指標)は大きくは低下しなかった.次に,土壌病によって吸水力が低下したトマトを用いて上記の観察を行ったところ,上述した気孔の挙動とAEの発生の関係がより明確に観察できた.以上のことから,AEは気孔が閉鎖する前の微小な水欠乏,言い換えれば木部の微小な張力によって発生することが明らかとなった.また,気孔が閉鎖している間は張力が緩和されてAEの発生が抑制すると予想された.以上の傾向は,いずれの植物種でも観察されたため,AEと気孔開度との間には植物種を問わない普遍的な関係があると考えられる.このようなAEと気孔閉鎖との関係を利用して,AEの発生を潅水開始のキューとする潅水制御システムが可能である.(1)作物に水ストレスがかかると導管内の負圧が大きくなり、気泡が生じるキャビテーションという現象が起こる。このキャビテーションに伴って生じる音をAEセンサーで検出することが本研究のポイントとなる部分である。今年度の試行錯誤によって、キャビテーシヨンをAEセンサーで検出することに成功した。ただし、まだノイズを完全に除去することができていないし、システム全体の安定性が十分でないという問題点が残った。これらの点については、次年度以降で解決したいと考えている。(2)実際にハウス栽培したメロンを利用してAE法による測定を行った結果、キャビテーションによると考えられる音を検出することができた。天気の日変化や培地の土壌水分条件の影響が大きいことが推察された。この点については次年度に詳細に検討する予定である。(3)次年度以降に作物の水ストレス程度とAE法による評価を進める予定であるが、その際に作物根系の形態や機能に関するデータが考察のために必要となる。今年度は、予備的に作物の根系形態が水ストレスによってどのような反応を示すかについても検討した。(1)作物に水ストレスがかかると導管内の負圧が大きくなり,気泡が生じるキャビテーションという現象が起こる.このキャビテーションに伴って生じる音をAEセンサーで検出することが本研究のポイントとなる部分である.研究開始初年度には,キャビテーション音をAEセンサーで検出することに成功したが,ノイズを除去することができず,また,システム全体の安定性が十分でないという課題が残された.これを受けて,本年度は,AE測定システムの設定や,植物体へのAEセンサーの設置方法等について試行錯誤を重ねた.その結果,システム全体の動作を安定化させ,ノイズを許容範囲内に抑えることに成功した.(2)上記の通り,AE測定システムの安定性とノイズの除去に成果が認められたため,次の段階として,AEシステムを複数構築し,幾つかの植物種(トマト,キュウリなど)を対象とした測定を行った.キャビテーションの生じやすい環境を創出する,あるいは植物体から葉柄を含む葉身を切除して根からの水供給を絶つことなどにより,AE発生頻度が高まることを認めた.これらは,AEシステムで検出した音がキャビテーションに由来する音であることを支持する結果であると考えられた.また,こうした結果は,供試した植物種に関わらず認められたが,同時に,AEの発生頻度が植物種によって異なることも明らかとなった.そのため,次年度には,AEを検出しやすい植物種を中心に実験に供試し,土壌水分含量や気孔コンダクタンス等を指標として水ストレスを定量化しながら,キャビテーションに由来すると考えられるAEの発生頻度との関連性を検討する予定である.また,AE発生頻度が少ない植物種と,そうでない種との比較により,灌概への適応について,より具体的に検討することが可能であると考えている.本研究では,作物栽培において限られた水資源の利用効率を高めるための方策として,アコーステイックエミッション(AE)を利用して植物体の水分状態や水利用状態を感知するシステムを作ることを目的とした.AEとは可聴域以上の超音波であり,植物では木部に張力(負圧)が働いて木部内の水柱が途切れる,つまりキャビテーションが生じるときにAEパルスが発生する.本年は,サトウキビやトマト,ブドウを用いて,気孔の挙動とAEパルスの発生パターンとの関連性を検討した.具体的には,午前中は水欠乏が生じず,午後から水欠乏によって気孔が閉鎖する状態で,一日の気孔コンダクタンスとAEの発生を観察した.その結果,土壌に吸水可能な水が十分あるときにはAEは発生しなかった.

そして,やや土壌乾燥が進むと,まずAEが発生し,その30分後前後から気孔が閉鎖した.気孔が閉鎖している間はAEの発生頻度が低下し,葉の水ポテンシャル(葉の脱水程度の指標)は大きくは低下しなかった.次に,土壌病によって吸水力が低下したトマトを用いて上記の観察を行ったところ,上述した気孔の挙動とAEの発生の関係がより明確に観察できた.以上のことから,AEは気孔が閉鎖する前の微小な水欠乏,言い換えれば木部の微小な張力によって発生することが明らかとなった.また,気孔が閉鎖している間は張力が緩和されてAEの発生が抑制すると予想された.以上の傾向は,いずれの植物種でも観察されたため,AEと気孔開度との間には植物種を問わない普遍的な関係があると考えられる.このようなAEと気孔閉鎖との関係を利用して,AEの発生を潅水開始のキューとする潅水制御システムが可能である.
すばるチェレンコフ光望遠鏡によるパルサーの観測

本研究では、「すばる」の主焦点に、光電子増倍管(PMT)を約100本使用した視野角1度のγ線カメラを取り付け、カメラからの信号を扱う電子回路・データ収集用計算機を用意してγ線天体を観測する。この装置は、現在特定領域[高エネルギー天体]の計画研究Bで建設中の大口径チェレンコフ光望遠鏡で使用されるPMTモジュールから構成されるγ線カメラ・電子回路およびデータ収集系と原理的には全く同じものを、「すばる」の主焦点に取り付けるために設計したものである。本補助金で、信号処理回路、データ収集系回路などを購入し、他の予算で購入したカメラモジュールや高圧電源などを合わせてシステムを組上げて試験を開始している。γ線カメラを『すばる」の主焦点に取り付けるにあたっては、国立天文台の担当者と数回にわたって詳細な打ち合わせを行い、観測スケジュールについても協議を重ねており、他の大型観測装置の観測と衝突しないように準備している。予測されるγ線強度は、かに星雲の場合約4Hzとなり、現在最も感度が高いWhippleグループの口径10m望遠鏡の数十倍の感度となる。バックグランドとなる宇宙線ハドロンや電子のシャワーのトリガー頻度は約10Hzである。さらに、最も深刻なバックグランドとなる宇宙線中のミュー粒子も、時間情報により除去できることが我々の研究でわかってきた。約3時間の観測で5σの統計精度で検出可能な強度は、パルス成分でcrab)の約100分の1、DC成分で約20分の1程度と予想され、Compton γ線衛星の100倍以上の感度となることが期待される。1999年度はシステムを組み上げ、国内で試験を行い、すばる」の調整期間にCrabの観測を始めたいと考えている。
クモ膜下出血後の遅発性脳虚血に対するADAMTS13の新規脳保護機能の解明

脳動脈瘤破裂によるクモ膜下出血(SAH)後、フォン・ヴィレブランド因子(VWF)が血小板および白血球と相互作用し、SAH後の遅発性脳虚血を増強する。我々はADAMTS13がVWFを分解し微小血栓と脳炎症を抑制し急性脳梗塞を縮小することを示した。本研究では、SAH後の遅発性脳虚血傷害に対するADAMTS13の神経保護効果を検証した。マウスSAHモデルにADAMTS13を投与すると遅発性脳虚血傷害が改善された。ADAMTS13遺伝子欠損マウスは、野生型と比し、SAH後の海馬神経細胞死が増加する傾向を示した。ADAMTS13はSAH後の遅発性脳虚血を抑制し、SAH患者の予後を改善する可能性がある。脳動脈瘤破裂によるクモ膜下出血(SAH)は死亡率が高く、また、高度の後遺障害もたらす予後不良の疾患である。これは、SAHによる一次的な脳傷害に加えSAH後の遅発性脳虚血という二次的病態の寄与するところが大きい。SAH後、フォン・ヴィレブランド因子(VWF)が血小板と白血球を脳の血管内皮に結合し微小血栓形成と白血球の組織浸潤を促進する。この血栓と炎症反応は、脳血管攣縮に加えて、SAH後の遅発性脳虚血を増悪する。我々は、脳梗塞モデルにおいて内因性のVWF切断酵素であるADAMTS13が、VWFを制御して脳微小循環を改善し脳組織炎症反応を抑制して、脳虚血傷害を軽減することを見出した(Blood 2010,Neurol Sci 2012)。この時、ADAMTS13は脳出血を起こさない。よって、ADAMTS13がSAHの新しい安全な治療薬となることが期待される。そこで、動物を用いたSAHモデルの作成方法を確立し、このモデルに遅発性脳虚血の病態を再現し、実験的SAH後の遅発性脳虚血に対するADAMTS13の脳保護効果を確認することを目的として、本実験を開始した。まず、C57BL/6マウスの頚部からナイロン糸を挿入し頭蓋内ウィリス動脈輪を穿破して、頭蓋内圧測定、MRI、脳病理組織を確認し、マウスSAHモデルの作成方法を確立した。このモデルの神経学的評価と脳病理(海馬、大脳皮質での神経細胞死、微小血栓形成、および神経炎症反応)および脳血管攣縮の組織学的評価から、このSAHモデルの遅発性脳虚血の病態はSAH後48時間で、そのピークを示すことを見出した。このSAHモデルにADAMTS13を静脈内投与すると、遅発性脳虚血の病態が改善した。これらの結果は、ADAMTS13がSAH患者の治療薬として開発される道を開く意義を有するものと考えられる。脳動脈瘤破裂によるクモ膜下出血(SAH)は、死亡率が高く、また、生存者も脳障害による高度の神経後遺症状で長期の闘病生活を強いられる予後不良の疾患である。この原因として、SAHによる一次的な脳損傷、および、SAHの数日後に発症する脳虚血・脳梗塞が、さらに脳障害を悪化させる二次的病態の寄与するところが大きい。SAH後、脳血管内では、活性の高いフォン・ヴィレブランド因子(VWF)が過剰に出現し、血小板による血管内血栓形成と白血球の血管外への遊出による組織炎症を促進する。この微小血栓と脳組織炎症が、SAH後の遅発性脳虚血の増悪因子となる。ADAMTS13は、このVWF活性を抑制することで、微小血栓症および脳炎症に対して抑制的に働き、SAH後の脳虚血を抑えることが期待される。我々は、以前に脳虚血モデルでADAMTS13が、脳梗塞を縮小させる可能性を示した(Blood 2010, NeurolSci2012,BrainRes 2015)。今回の研究では、マウスに作成したSAHの程度を客観的に評価する方法の一つとしてMRIが有用である可能性を示した(Vasospasm2015学会発表)。このマウスSAHモデル(Br J Neurosurg 2014, Acta Neurochir Suppl 2015)にADAMTS13を投与すると、遅発性の脳虚血病態の改善;微小血栓の減少、生存神経細胞の増加、神経炎症反応の改善、神経症状の改善、が確認された(J Thromb Haemost 2014,日本脳神経外科学会学術総会2015年)。これらの結果は、ADAMTS13がSAH患者の治療薬として開発される道を開く意義を持つと考えられる。今後、ADAMTS13遺伝子欠損動物にSAHを作成し、遅発性脳虚血における内因性ADAMTS13の病態生理学的意義を検討して行く。動物実験はおおむね順調にすすんでおり、当初の計画を勘案すれば、ほぼ予定通りに実験が進んでいると考えうる。脳動脈瘤破裂によって生じるクモ膜下出血(SAH)は、極めて予後不良の疾患である。この原因には、SAHによる一次的脳損傷と、SAH後の遅発性脳虚血による二次的脳損傷が挙げられる。SAH後、脳血管内皮上で、過剰発現した高活性のフォン・ヴィレブランド因子(VWF)が、血小板と反応して血管内血栓を形成し、また、白血球の血管外遊出を促し組織炎症を助長する。

この脳血管微小血栓と脳組織炎症が、遅発性脳虚血傷害の増悪因子となる(Neurosurgery 2013)。ADAMTS13は、VWFを分解し活性を抑え、微小血栓症と脳炎症を抑制し、SAH後の遅発性脳虚血傷害を改善すると期待できる。我々は、脳虚血でADAMTS13が、脳梗塞を縮小することを示した(Blood 2010, NeurolSci 2012,BrainRes 2015)。本研究では、マウスにSAHを作成し(Br J Neurosurg 2014, Acta Neurochir Suppl 2015)、SAHの程度および脳傷害の経時的変化をMRIと脳組織で評価した(J Clin Neurosci 2016)。SAH後48時間で、脳血管微小血栓が最も形成されるが、同時期のSAHモデルの神経症状と、海馬・大脳皮質の組織学的検証を行った。SAHモデルにADAMTS13を投与すると、遅発性脳虚血傷害が改善された(微小血栓、神経細胞死、神経炎症、神経症状)(J Thromb Haemost 2014,日本脳神経外科学会学術総会2016年)。ADAMTS13遺伝子欠損マウスでは、虚血後の脳血流低下に加え、血中HMGB1上昇が脳傷害増悪に寄与する可能性がある(Neurol Sci 2012)。我々は、トロンボモジュリンがHMGB1を制御して脳虚血傷害を改善することを確認した(J Neurol Sci 2016)。現在、ADAMTS13遺伝子欠損マウスにSAHを作成し脳標本の解析を行っている。遺伝子欠損動物を用いたSAHモデルを安定的に作成する準備に時間を要した。また、我々は、ADAMTS13遺伝子欠損動物における脳虚血傷害を増悪する因子として、微小血栓と脳炎症に焦点をあてて検証を行っているが、この脳炎症増悪に少なくとも部分的に寄与すると推定されるHMGB1について、さらに脳虚血モデルを作成し、検証を行った。当初の計画を勘案すれば、予定より実験はやや遅れていると考えられる。脳動脈瘤破裂によるクモ膜下出血(SAH)は予後不良である。この原因に、SAHによる一次的脳損傷と、SAH後の遅発性脳虚血による二次的脳損傷が挙げられる。SAH後、脳血管内皮上で発現した高活性のフォン・ヴィレブランド因子(VWF)が、血小板血栓を形成し、また、白血球の血管外遊出を促し組織炎症を助長する。この脳微小血栓と脳組織炎症が遅発性脳虚血傷害の増悪因子となる。我々はADAMTS13がこのVWFを分解し微小血栓と脳炎症を抑制し、脳虚血による脳梗塞を縮小することを示した(Blood 2010,NeurolSci 2012,Brain Res 2015)。それゆえ、ADAMTS13はSAH後の遅発性脳虚血傷害を改善することが期待された。我々は本研究で、マウスにSAHを作成し(Br J Neurosurg 2014)、SAHの程度および脳傷害の経時的変化をMRIと脳組織で評価した(J Clin Neurosci 2016)。SAH後48時間で脳血管微小血栓形成がピークとなるため、同時期のSAHモデルの神経症状と海馬・大脳皮質の組織学的検証を行った。SAHモデルにADAMTS13を投与すると、遅発性脳虚血傷害が改善された(微小血栓、神経細胞死、神経炎症、神経症状)(J Thromb Haemost 2014)。本研究において、ADAMTS13遺伝子欠損マウスでは、野生型マウスと比較し、SAH後の海馬神経細胞死が増加することが観察された。ADAMTS13はSAH後の遅発性脳虚血を抑制し、SAH患者の予後を改善することが期待できる。
肝転移腫瘍に対する腫瘍溶解性ウイルスの血管内投与法の開発

先にHSVに感染させたimmunizedマウスを使用してHSV抗体陽性個体での腫瘍溶解性HSVウイルスのin vivo抗腫瘍効果(生存率)について調査し、immunizedマウスではリピオドールエマルジョンウイルスとウイルス単独群では前者の方が優位に高い生存率を示した。この事からリピオドールエマルジョングループでは血液中の抗ヘルペス抗体からHSVウイルスを守り感染力を維持し抗腫瘍効果を示し、結果として生存率の改善をもたらしたと考えられた。腫瘍溶解性ウイルスの血液中でのデリバリーシステムを開発するため最適なリピオドールのミセル化を探るため以下の検討を行った。血液中のヘルペス抗体価がウイルス活性に与える影響の検討:HSV変異型腫瘍溶解性ウイルスが血液と混じった時に受ける影響について実際の患者の少量血液を使用してヘルペスウイルス抗体高陽性者、低陽性者で血液混入時のウイルス感染力の低下に与える影響についてin vitroで検討した。MTT assayおよびウイルスreplication assayにてウイルスは37度1時間の抗体陽性者の血液との暴露で不活化されたがリポソームで埋包したウイルスは抗体陽性者の血液中でも不活化されなかった。この実験結果はウイルス感作マウスと非感作マウスを使用した実験でも同様の結果であった。このことは実際の血管内投与におけるウイルスの安全性と有効性に直接関連するデータであると考えられる。またリポソームで埋包したウイルスは血管内投与でもヘルペス抗体IgGの上昇は低い傾向が認められた。リピオドールとウイルスの最適濃度の検討:リピオドールとウイルスを埋包したときの粒子構造について電子顕微鏡を使用して検討し最適な濃度の検討を行っている。ウイルスをリポソームで埋包する技術を当科は既に確立しているがリピオドールとのミセル化について電子顕微鏡像での構造からエマルジョンが最適なミセル化となるような溶液濃度と作製方法を検討している。現在物理的な撹拌による時間と粒子の大きさ、感染力化に与える影響、安定度から最適な方法を探っている。1)In vitroにおいて各種cell lineを使用してリピオドールとのエマルジョンがウイルスの感染に与える影響について検討した。リピオドールとのエマルジョンはMediumが過剰に豊富であっても有効にウイルスをcellに吸着させる事ができた。リピオドールがウイルスの吸着に有効に働く事を示した。この結果は実際の血流の中での有効性の評価に繋がる物と考える。2)In vivoでcontrolとリピオドールエマルジョンウイルスとウイルス単独群での血管内投与後の各種血液抗体に与える影響について検討した。ウイルスに対するIgGの上昇をリピオドールエマルジョンウイルス群は抑制したがIgE, IgMでは有意な抑制は見られなかった。また、CD4/8比率の低下をリピオドールエマルジョンウイルス群は抑制した。ウイルスが直接血液に触れるのをリピオドールでコーティングする事によって生じた差異であると思われる。このことは将来、ウイルスの投与によって抗体を獲得した患者さんへの再投与における有効性を示した物と考える。3)In vivoで担癌マウスを用いて門脈注入したリピオドールエマルジョンウイルスによる生存率の改善について検討した。ウイルスに対する抗体を持たない群ではウイルス単独群と同じ生存率の改善を示した。次にウイルス抗体を保有する群での実験を予定しており抗体保有群ではリピオドールエマルジョンウイルスがウイルス単独群よりも有効に生存率を改善できる可能性を示唆している物と考える。1. 6人の成人ボランティア群とマウス群から採取した血液を基にHSV抗体陽性者と陰性者の血清中での腫瘍溶解性HSVウイルスの感染Activityについて調査し、抗体陰性者ではリピオドールエマルジョンウイルスとウイルス単独群での差異はなかったが抗体陽性血清中ではリピオドールエマルジョンウイルス群が優位に高い感染効率を示した。この事からリピオドールエマルジョングループでは血液中の抗ヘルペス抗体からHSVウイルスを守り感染力を維持することが出来たと考えられた。2.マウスから採取した血液を基にHSV抗体陽性と陰性の血清中での腫瘍溶解性HSVウイルスのin vitro抗腫瘍効果について3種類の腫瘍細胞(アカゲザル腎細胞Vero cell,人膵癌細胞SW1991,マウス大腸癌細胞MC26)で調査し、抗体陰性ではリピオドールエマルジョンウイルスとウイルス単独群での差異はなかったが抗体陽性血清中ではリピオドールエマルジョンウイルス群が優位に高い抗腫瘍効果を示した。この事からリピオドールエマルジョングループでは血液中の抗ヘルペス抗体からHSVウイルスを守り感染力を維持し抗腫瘍効果を示すことが出来たと考えられた。3.先にHSVに感染させたimmunizedマウスを使用してHSV抗体陽性個体での腫瘍溶解性HSVウイルスのin vivo抗腫瘍効果(生存率)について調査し、担癌immunizedマウスではリピオドールエマルジョンウイルス治療群とウイルス単独治療群ではリピオドールエマルジョンウイルス群が優位に高い生存率を示した。この事からリピオドールエマルジョングループでは血液中め抗ヘルペス抗体からHSVウイルスを守り感染力を維持し抗腫瘍効果を示し、結果として生存率の改善をもたらしたと考えられた。
二次骨化中心初期石灰化の生命科学、材料学、双方向からの解析と理解

本研究では,マウス大腿骨二次石灰化現象について,軟骨内骨化の初期石灰化部位とタイミングを同定し,その部位における石灰化について,生命科学的・工学的に検討を行い,それぞれを時間空間的に比較することで,軟骨内骨化の多面的な理解を目的とした.実験の結果から,初期石灰化は生後6日目から開始することがわかった.開始点を電子顕微鏡で観察・解析した結果,細胞膜の断片(リン脂質)が石灰化の核になることがわかった.この結果から,リン脂質を基盤とした新しい無機有機ハイブリッド材料の開発に繋がる可能性があると考えられる.近年、組織工学によって実験室(in vitro)で生体組織を作る試みが盛んである。しかし、骨形成に関して多分野を統合した研究があまりされておらず、骨形成機構について未だ不明な点が多く残っている。そこで、我々は生命科学・材料学の視点から発生過程における二次骨化中心の初期石灰化機構の理解を目指して、マウス大腿骨骨端部の軟骨組織の時間空間的変化をナノCTを用いて解析を行った。その結果、二次骨化における初期石灰化は生後5日目(P5)に開始することが分かった。組織学的の解析から、石灰化開始点周囲では生後6日目まで骨芽細胞が認められず、初期石灰化は軟骨細胞の活性のみにて生じたものと考えられた。また、電子顕微鏡による詳細な解析を行った結果、初期石灰化部位では軟骨細胞膜の断片(ナノフラグメント)が石灰化の核となることを見出した。次に、初期石灰化周囲に軟骨細胞の破裂をタイムラプスで観察し、その破裂から細胞膜ナノフラグメントが生成されることがわかった。軟骨細胞破裂のトリガーについて、オリジナルデバイス作製し、それらを用いて浸透圧とメカニカルストレスが細胞破裂を起こすことを明らかにした。最後に、得た知見に基づいて、in vitro骨組織の構築を目指した。組織工学的なアプローチにより、人工的に作製した細胞膜ナノフラグメントを用いて、わずか2日間で迅速にin vitro骨形成を起こすことに成功した。本研究では,マウス大腿骨二次石灰化現象について,軟骨内骨化の初期石灰化部位とタイミングを同定し,その部位における石灰化について,生命科学的・工学的に検討を行い,それぞれを時間空間的に比較することで,軟骨内骨化の多面的な理解を目的とした.実験の結果から,初期石灰化は生後6日目から開始することがわかった.開始点を電子顕微鏡で観察・解析した結果,細胞膜の断片(リン脂質)が石灰化の核になることがわかった.この結果から,リン脂質を基盤とした新しい無機有機ハイブリッド材料の開発に繋がる可能性があると考えられる.29年度が最終年度であるため、記入しない。生体材料学分野29年度が最終年度であるため、記入しない。