hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
口腔扁平上皮がんの上皮間葉移行と浸潤能にpodoplaninがどう関与するのか

本年度の実験において、以下の点を明らかにした。UMSCC81B細胞株を含めた複数のヒト口腔扁平上皮癌(OSCC)細胞株においてPodoplanin発現はTGF-βにより増強されたが、この変化はSmad2のリン酸化を介していた。反対にPodoplanin発現はTGF-βtype I受容体阻害剤により抑制された。また、Podoplanin発現はHistone deacetylase (HDAC) inhibitorにより抑制されるなどエピジェネティクスの関与も示唆されたが、DNAメチル化異常は認められなかった。また、TGF-βはPodoplanin発現の促進とともに、E-cadherinの発現抑制とvimentinの発現を増強し、EMTを誘導した。このPodoplaninの発現とEMTとの関連についてRap1がどのように関与するかを現在in vitro系で検討中である。上記の結果からPodoplaninのブロックがEMTを抑制し、従ってOSCCの増殖、浸潤転移の抑制に繋がることが予想された。そこでin vivo実験としてPodoplanin抗体を用いた分子標的治療の検討を行った。まずPodoplanin抗体がマウス皮下腫瘍に集積することをICG標識Podoplanin抗体を用いた蛍光イメージング法を用いて確認した。次に種々のPodoplanin抗体のうちADCC活性の高いことが知られている抗体(LPMab-21)を用いてPodoplanin高発現OSCC株(UMSCC-81など)のヌードマウス皮下移植腫瘍に対する抗腫瘍効果を検討した。しかしながら、当初の予想に反し、今回の検討では有意な抗腫瘍効果は認められず、今後さらなる検討が必要と思われた。約50例のOSCC患者組織標本を用いてPodoplaninの発現を比較検討した結果、高分化型扁平上皮癌に比べ低分化型癌で発現が高い傾向があることが判明した。そこで低分化型OSCC細胞株でPodoplaninを高発現すると同時にがん幹細胞マーカーも高発現するUMSCC81B細胞のヌードマウス移植腫瘍を用いてin vitro及びin vivo(抗腫瘍効果)の両面から検討した。UMSCC81B細胞株を用いたIn vitro実験ではPodoplaninをノックダウンにより発現抑制すると、E-cadherinや扁平上皮マーカー(CK13)の発現上昇など分化の促進と軽度の増殖抑制を示唆する結果を得た。しかしながら、ADCC活性及びCDC活性の高いPodoplanin抗体(LPMab-21)を用いたマウス皮下腫瘍モデルを用いた予備的なin vivo実験の結果では、予想に反して明らかな抗腫瘍効果や浸潤抑制効果は認められなかった。Podoplanin抗体はそもそもMAPK経路やPI3K/Aktなどの増殖シグナルを直接的には阻害しないので、抗腫瘍効果は間接的で比較的マイルドである可能性も示唆された。今後、Podoplanin抗体の抗腫瘍効果については後記するように種々の工夫を行うなど、さらに詳細な検討を行う必要がある。上記とは別に、研究代表者の在外研究(平成30年8月より米国、ミシガン大学)が発生し、上記研究遂行が困難となった。以上の理由により、平成31年度への補助業期間の延長を申請し承認された。今後、引き続き上記研究実施計画に基づいて検討を行う予定である。上記の進捗状況をふまえて、今後以下のごとく研究を進めて行く予定である。1)本年度の実施計画で十分遂行できなかったPodoplaninの発現変化に伴う癌細胞の増殖と浸潤能の変化に対して、Rap1がどのように関与するかを引き続きin vitro実験で検討して行く。2) In vivoの抗腫瘍効果を検討する実験において、当初の予想に反して明らかな腫瘍縮小効果が観察されなかった。このin vivo及びin vitroでの結果、またPodoplaninの機能面も含めて考え直してみるとPodoplanin抗体の抗腫瘍効果はあっても免疫学的機序に基づくマイルドな効果に止まる可能性が高いものと考えられる。今後、マイルドな抗腫瘍効果を検出するには移植後早期からの治療などレジメの変更や抗体IL-2など生物製剤の併用投与などにより免疫反応を促進させることなど、種々の角度からの検討が必要であると思われる。またPodoplanin抗体は血小板凝集を抑制し、転移を抑制することが古くから知られている。OSCCマウスモデルは一般に転移能が低く、転移実験には必ずしも適したモデルではないが、今後抗腫瘍効果だけでなく転移にも注目して、肺転移などへの影響に関しても組織学的に詳細に検討してゆく予定である。本研究目的は、口腔扁平上皮癌における浸潤・転移のメカニズムの一端を、上皮間葉移行(EMT)との関連性をふまえて明らかにすることである。具体的には、口腔扁平上皮癌においてEMTとmatrix metalloproteinase (MMP)を介した腫瘍浸潤・転移能に対し、扁平上皮癌での発現が主であるpodoplaninとRasスーパーファミリーに属するRap1がどのように関与するかを明らかにすることである。当該年度の主な研究計画は、EMT形質を発現する細胞株を含めた複数の細胞株を用いて、podoplaninの発現による浸潤能を比較検討することであった。高分化型扁平上皮癌細胞株であるUMSCC6細胞と低分化型扁平上皮癌細胞株であるUMSCC81B細胞を比較した結果、免疫組織化学とウエスタンブロット法にてUMSCC81B細胞はUMSCC6細胞に比べてpodoplaninを高発現すると同時に、リアルタイムPCR法にてALDH、Nanog、Sox2、Klf4等のがん幹細胞マーカーも高発現することを確認した。

免疫不全マウスへの移植実験を行った結果、UMSCC81B細胞は高い腫瘍形成能を有していた。UMSCC81B細胞を用いてsiRNAによるpodoplaninノックダウン実験を行った結果、リアルタイムPCR法にてE-cadherinの発現上昇とvimentin, ALDHの発現低下を認め、podoplaninの発現低下による分化の促進が示唆された。Side population (SP)法によりUMSCC81B細胞からがん幹細胞を分離した結果、SP fraction細胞株はリアルタイムPCR法にてALDH、Nanog、Oct4、Sox2等のがん幹細胞マーカーを高発現していた。以上より、podoplaninはがん幹細胞形質維持に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。当該年度の具体的な研究計画は以下のごとくであった。1)EMT形質を発現する細胞株を含めた複数の細胞株を用いて、podoplaninの発現による浸潤能を比較検討する。2)podoplaninの発現変化と浸潤能の変化に伴うMMPs(MMP2, MMP7, MMP9等)の転写活性への影響を明らかにする。3)外科切除材料を用いたリアルタイムPCRと免疫組織化学的検討。1)に関しては、研究実績の概要に記載したごとく進行中であるが、今後は細胞株の種類を増やした検討が必要である。2)に関しては、進行が遅れており、1)の結果をふまえて今後進めて行く必要がある。3)に関しては、手術件数に依存するところであり、引き続き検討を行っていく予定である。当該年度の主な研究計画は、TGF-β受容体/Smadシグナルを介したPodoplaninの浸潤能におけるRap1の関与を検討し、この経路に伴う上皮間葉移行(EMT)マーカーとMMPの発現と転写活性の変化を解明することであった。予備実験において、TGF-βを投与することによりUMSCC81B細胞株を含めた複数の口腔扁平上皮癌(以下OSCC)細胞株においてPodoplanin発現の増強を認めた。この変化はSmad2のリン酸化の増加に並行して認めた。反対に、TGF-βtype I受容体阻害剤は、Podoplanin発現をタンパクレベルとmRNAレベルで抑制した。また、TGF-βはEMTを誘導し、E-cadherinの発現抑制とvimentinの発現増強を認めた。この結果をふまえて、Podoplaninの発現と浸潤能に対してRap1がどのように関与するかをin vitro系で検討中である。一方、in vivo実験としては上記の結果からPodoplaninのブロックがEMTを抑制し、従ってOSCCの浸潤転移の抑制に繋がることが予想されたため、Podoplaninが治療ターゲットとなり得るか否かの予備的検討を行った。分子標的薬としてはPodoplanin抗体を用い、まずこれがマウス皮下(皮内)腫瘍に特異的に集積するか、またどのくらいの期間持続するかなどの体内動態をICG標識Podoplanin抗体と遠赤外線蛍光イメージング法を用いて検討した。
人魚鯨共通寄生虫アニサキスの地理的分布の謎に迫る

魚体から得たAnisakis simplex s.s.とA. pegreffii3期幼虫の高温耐性をin vitroで調べたところ、A. simplexのほうが高温耐性が低い傾向が得られた。また、ミンククジラから得たA. simplex s.sとA. pegreffiiの虫卵について高温耐性を調べたところ、A. simplexのほうが高温耐性が低い傾向が得られた。これらの結果は、A. simplex s.s.は太平洋沿岸、特に北部太平洋沿岸の低温域に分布すると傾向と合致する。しかしなながら、2018年度に得られたデータは、断片的な部分も多いため、2019年度にも実験を繰り返し、より正確なデータを得る必要がある。日本近海各地のある種の鯨類から得たAnisakis成虫を分子生物学的手法で分類した結果、主として2種のアニサキスので構成されていた。この結果は、鯨類の分子生物学的系群識別結果と強い関連が認められた。加えて、鯨類個体によっては、成虫はA. pegreffii、幼虫はA. simplex s.s.が優占しているという個体も得られた。日本海側の魚類ではA. pegreffiiが太平洋側の魚類ではA. implex s.s.が優占してるという過去の報告を考え合わせると、虫体の発育段階による優占種が異なる鯨個体は、日本海でA.pegreffiiに感染した後に、オホーツク海域や太平洋海域でA. simplexに感染した個体であることが推察された。このように、Anisaks2種の感染は鯨類の分布や回遊経路を反映していると考えられた。これらについても、さらにサンプル数を増やして精度を上げる必要がある。鯨類のアニサキス成虫の種組成が鯨類の分布や回遊経路を反映しているという可能性が示唆された。これは、研究開始時には予想していなかったことであり、鯨類の研究に対する波及効果が予想される。平成30年度に得られたデータを例数を増やすことによって、精度を高める。また、アニサキス2種の魚類への感染実験を行い、魚体内での生残成長におよぼす水温の影響を把握する。調査捕鯨調査は地点に出かけてて鯨類からのアニサキス虫体のサンプリングを行う予定であった。しかし、調査捕鯨団体との相談により、本年度は現地に出かける回数が一回に限られ、旅費の支出額が予定より少なくなった。
生成文法の研究成果に基づく学習英文法の試み

本研究の最終目標は生成文法の成果に基づく学習英文法を作り上げることである。これまで生成文法の研究分野において膨大な研究成果があがっており、また、膨大な言語事実が発掘されているにもかかわらず、それを英語教育に効果的に適用・使用する努力がなされたことはほとんどなかったのが現状である。このような状況を打破し、現在英語教育が抱えている諸問題の解決に役立つような応用的研究が急務である。本研究は、英語学研究、特に生成文法の研究成果を英文法教育に反映させることによって英語教育の改善に役立て、社会的貢献を果たすことを目的としている。この目的を達成する一つの段階として、本年度にはワークショップ「英文法と学習文法のインターフェイス」を開催した。大学にかぎらず、専門学校、高等学校の教員が参加することにより、生成文法の成果を学校教育に還元する試みであり、多くの参加者がさまざまなトピックを巡って意見交換をした。その報告書を『英文法と学習文法のインターフェイス』(東北大学大学院文学研究科)として作成し、全国の主要大学に配布して、研究資料として役立てるように配慮した。大学教員間のワークショップはよく見られることであるが、大学、専門学校、高等学校の共同によるワークショップはこれまであまり例がなく、新しい形の社会貢献となっていると思う。本年度は最終年度であり、『生成文法に基づく英文法』(総頁数392)の原稿執筆を完了し、研究成果報告書としてまとめた。今後本の形で出版する予定である。生成文法の研究成果を取り入れた学習文法の枠組みに基づく学習英文法を作り上げるためには、(A)学習文法として必須な要素は何か(学習項目の選定)、(B)学習項目の配列はどのようにするのが適切か(学習項目の配列)、(C)生成文法の成果をどの程度盛り込むか(学習内容の説明方法)の3点について検討する必要がある。本年度に行う主たる作業は、従来の学習文法の学習項目、項目の配列、記述内容に関わる問題点を徹底的に洗い出すこと、及び英語教育関係者とそれらの問題点について議論することであった。本年度は大学の入学試験問題を材料として、英文法に関わる資料を採取し、その一部に基づいて、成果を雑誌に報告した。学習文法の枠組みの試案を作るにあたっては、学習項目の選定、その配列順序、学習内容の説明方法の要点・留意点・注意点などについて述べる必要がある。しかし最終的な説明方法は、学習文法書の完成をみてはじめて明らかになる。

大学教員間のワークショップはよく見られることであるが、大学、専門学校、高等学校の共同によるワークショップはこれまであまり例がなく、新しい形の社会貢献となっていると思う。また、現在『生成文法に基づく英文法』(仮題の)の原稿を執筆中であり、文の種類、助動詞、動詞の型、形容詞の型、名詞の型、動名詞節、不定詞節、関係節、能動文と受動文、情報の流れ・右方移動・左方移動などの項目については原稿が完成している。本研究の最終目標は生成文法の成果に基づく学習英文法を作り上げることである。これまで生成文法の研究分野において膨大な研究成果があがっており、また、膨大な言語事実が発掘されているにもかかわらず、それを英語教育に効果的に適用・使用する努力がなされたことはほとんどなかったのが現状である。このような状況を打破し、現在英語教育が抱えている諸問題の解決に役立つような応用的研究が急務である。本研究は、英語学研究、特に生成文法の研究成果を英文法教育に反映させることによって英語教育の改善に役立て、社会的貢献を果たすことを目的としている。この目的を達成する一つの段階として、本年度にはワークショップ「英文法と学習文法のインターフェイス」を開催した。大学にかぎらず、専門学校、高等学校の教員が参加することにより、生成文法の成果を学校教育に還元する試みであり、多くの参加者がさまざまなトピックを巡って意見交換をした。その報告書を『英文法と学習文法のインターフェイス』(東北大学大学院文学研究科)として作成し、全国の主要大学に配布して、研究資料として役立てるように配慮した。本年度は最終年度であり、『生成文法に基づく英文法』(総頁数392)の原稿執筆を完了し、研究成果報告書としてまとめた。今後本の形で出版する予定である。
高等植物・茎の光屈性現象を制御する鍵化学物質

光屈性は植物が具備する環境応答反応の代表的な生物機能である。従来、光屈性は光側と影側組織におけるオーキシンの偏差分布によって引き起こされるというCholodny-Went説によって説明されてきた。しかし、機器分析によるオーキシン量の測定から、オーキシンの偏差分布は全く起こらないことが明らかになり、更に光側組織で成長抑制物質が生成し、光側の成長が抑制されることによって屈曲することが明らかにされている(Bruinsma-Hasegawa説)。本研究は光屈性を制御する成長抑制物質(鍵化学物質)を探索し、更にその生成機構と作用機構を明らかにすること等を主な目的として研究を行った。様々な植物を用いて光屈性制御物質の探索を行い、ダイコン下胚軸からraphanusaninsと4-methylthio-3-butenyl isothiocyanate(MTBI)を、アベナ幼葉鞘からuridine, L-tryptophanやavenacoside Bを、トウモロコシ幼葉鞘からbenzoxazolinon類等を単離・同定した。ダイコン下胚軸の光屈性では、光屈性刺激に伴うraphanusanin関連物質の動態と成長抑制活性を精査した結果、青色光照射によって光側組織でmyrosinase遺伝子の発現が誘導され、myrosinase活性が高まり、不活性型の4-methylthio-3-butenyl glucosinolateからglucoseが切り出され活性型のMTBI次いで最も活性の強いraphanusaninsが生成され、光側組織の成長が抑制されることによって光側に屈曲することが強く示唆された。uridineはアベナの他に、トウモロコシやクレスのシュートでも青色光で増量することも分かった。この他、青色光によってその生成が誘導される成長抑制物質として、ダイズからkievitone、クレスから4-hydroxy-2,3-dimethyl-3-nonen-4-olide等を単離・同定した。平成12年度に引き続き、光屈性制御物質の構造解析と、光屈性刺激による光屈性制御物質の生合成経路について天然物化学、植物生理化学及び分子生物学的手法を用いて研究を行い、以下の知見を得た。1.光屈性制御物質の構造を解明するために、青色光によって誘導される成長抑制物質をクレス、モヤシマメ及びダイコンといった双子葉植物の芽生えから単離・同定した。NMRやMS分析から、クレスの成長抑制物質は4-hydroxy-2,3-dimethyl-2-nonen-4-olideであり、モヤシマメの成長抑制物質はkievitcmeで、ダイコンの成長抑制物質はraphanusol Aと1,2-Di-O-sinapoyl-β-D-glucopyranoseであることを明らかにした。以前得られた知見と総合すると、光屈性制御物質は植物種によって異なる可能性が高い。2.光屈性反応の見られないシロイヌナズナの突然変異株と野性株に、青色光を一方向から照射しそれぞれの下胚軸における物質の動態をHPLCで精査した結果、光照射によって野生株で増章し、突然変異株で増量しない物質を少なくとも2種類検出することができた。現在これらの物質の精製・単離を行っている。3.ダイコンの光屈性制御物質の生合成経路において、光屈性刺激によって光側組織でβ-thioglucoside glucohydrolase遺伝子の発現が誘導され、その酵素によって不活性型の4-methylthio-3-butenyl glucosinolateから活性型の)4-methylthio-3-butenyl isothiocyanateが切り出され、次いで活性型のraphanusaninが合成されることを明らかにした。
坂田諸遠『野辺夕露』にみる近世後期戯作者の伝記的研究

今年度に行なった研究は以下の通り。1.『野辺夕露』本文の確定:東大蔵本・国会図書館本によって、近世後期戯作者に関する記載内容をワープロにて翻字し、確定本文を作成した(公開予定)。また東大蔵の坂田諸遠旧蔵本の調査から、後期戯作者に関する伝記試料が補充しえた。2.試料的信憑性の検証:『野辺夕露』中の曲亭馬琴関連記事をみるに、その記載内容が、当時あまり知られていなかった馬琴自筆の記録を披見して書かれており、そこに何ら虚構を交えていないことが確認された。同様のことは他にも見られ、明治期に作成された資料ながら、資料的信憑度の観点からみて、十分資料として用いることのできる一等資料であると検証された。3.従来研究との比較検討:当該資料に掲載された近世後期戯作者、特に山東京伝と曲亭馬琴を中心に、それぞれ先学の研究成果を調査・整理を行ない、それと『野辺夕露』の内容との比較検討を行なった。その研究成果の一端として、京伝と考証随筆との関わりについての新見を論文として発表した(「京伝と〈考証〉」)。今後は、京伝や馬琴、柳亭種彦等に関する調査結果の発表と、彼らと交流を持つ江戸派国学者達との交流も視野に入れて伝記研究に一石を投じたい。4.当該資料を手掛かりとした伝記資料の発掘:『野辺夕露』に引用された資料の存在を確認するため、目録等を購入し、実際に各地の文庫調査を行なったが、それによって例えば、馬琴の亭和年間の伝記に関する資料や、柳亭種彦の書簡資料等が確認しえた。今後は、その資料的意義の検討も行ない、公にしたい。
種子根の活力による水稲の湛水土壌中直藩法における苗立ち可否診断

品種により出芽・苗立ちの過程での種子根の伸長経過および種子根の周辺に形成される土壌酸化域の大きさや酸化の程度には差が見られた。苗立ちの良否との関係から見ると、出芽後早い時期に種子根周辺に酸化域が形成される場合に苗立ちが良好な傾向と見られた。出芽の可否は、発芽前後の数日の種子周辺の土壌の酸化還元状態に大きく左右される。さらに調査が必要ではあるが、出芽の可否は出芽後数日の種子恨の土壌酸化能力と関係するようであった。苗立ちが保障されるためには種子根等の土壌酸化力がどのような経過をたどれば良いかを解明し、苗立ち可能個体の事前識別法の確立を目標としたが、事前識別法の確立には至らなかった。種子恨周辺の土壌酸化域の大小には種子根の伸長速度も関与すると考えられるが、この点については調査が不十分であった。今後さらに詳細に調査を継続する必要がある。また、苗立ちの可否による根の呼吸速度の違いを明らかにすることも目標としたが、苗立ちの可否の診断が充分にできたと言い難かったため、この点についても不十分な結果しかえられなかった。以上のように、本研究では充分に明快な結果が得られなかった。この原因として、信州大学が立地する地域に分布する黒ボク土壌は湛水すると特に暗黒色となるため、メチレンブルーの酸過呈色域(濃青色)の大きさおよび呈色の強度(酸化程度)を定量化することは、画像解析的手法でも必ずしも容易ではなかった。黄色系土壌を混合してメチレンブルーの呈色の識別をし易くする、あるいは赤く発色するレサズリンなど、呈色の識別の容易な他の酸化還元指示薬の利用の検討も必要と考えられた。また、種子根の酸化力の指標として調査した根の呼吸速度については、種子恨という微量サンプルであることもあり、サンプルによる測定値のばらつきが大きかった。サンプルの取り方などが今後の検討課題として残った。
CH/π相互作用を利用したPKCアイソザイム選択的な薬剤開発

発がんプロモーターの受容体であるプロテインキナーゼC(PKC)には,10種のアイソザイムが存在する.個々のアイソザイムは,様々な疾患に関与していることから,アイソザイム選択的な薬剤の開発が強く求められている.放線菌の産生するindolactam-V(1)は,nMオーダーでPKC C1ドメイン(C1A,C1B)に結合する.本研究代表者らは,1とPKCδのC1Bとの結合において,1のインドール環とC1Bの11番目のプロリン残基(Pro-11)が,CH/π相互作用することにより結合能が高められていることを明らかにした.Pro-11は,各PKCアイソザイムで空間的位置が異なると考えられることから,C1ドメイン間のCH/π相互作用の差異を利用することにより,PKCアイソザイム選択的な薬剤の開発が可能である.各アイソザイムでのCH/π相互作用を変化させるため,1のインドール環の1位あるいは12位に各種アルキル側鎖を導入した.これらのPKCアイソザイムへの結合能を,本研究代表者らが開発したPKC C1ペプチドを用いて評価したところ,1位に嵩高いイソプロピル基を導入することによってnovel PKC(δ,ε,η,θ)に対する選択性が顕著に増大すること,逆に12位においては立体障害の小さい直鎖の置換基がnovel PKCに対する選択性を高めることが明らかになった.各種PKCアイソザイムのC1ドメインのPro-11を4,4-difluoro-prolineで置換したペプチドを用いた結合試験を行ない,1-isopropyl-indolactam-Vのnovel PKC選択性の一部は,アイソザイム間でのCH/π相互作用の相違に起因することを明らかにした.さらに,このCH/π相互作用に着目して,ピロロインダゾール環を有する新しい蛍光プローブの合成にも成功した.発がんプロモーターの受容体であるプロテインキナーゼC(PKC)には,10種のアイソザイムが存在する.放線菌の産生するindolactam-V(1)は,nMオーダーでPKC C1ドメイン(C1A,C1B)に結合する.昨年,本研究代表者らは,1とPKCδのC1Bとの結合において,インドール環とC1Bの11番目のプロリン残基(Pro-11)が,CH/π相互作用することにより結合能が高められていることを明らかにした.Pro-11は,すべてのC1ドメインに保存されていることから,C1ドメイン間のCH/π相互作用の差異を利用して,novel PKC(δ,ε,η,θ)選択的な薬剤の開発を試みた.これまで,1のインドール環の1位にアルキル側鎖を導入することによって,絶対的な結合能を低下させることなく,novel PKCのC1Bへの結合選択性が向上することが明らかになっている.そこでさらに選択性を高める目的で,9員環から10員環に環拡大することによって,Pro-11に対するインドール環の空間的位置を変化させた1-hexyl-indolactam-V10(2)をデザインした.化合物2は,4-nitroindoleより14段階,総収率4.1%で合成した.化合物2の各C1ペプチドに対する結合能を1と比較したところ,1がconventional PKC(α,β,γ)のC1Aとnovel PKCのC1Bに530nMの結合定数で強く結合したのに対して,2はnovel PKCのC1Bに対してのみ1と同等の高い結合能を示した.さらに,2による各PKCアイソザイムの細胞内局在性の変化を調べたところ,2は500nMの低濃度でHeLa細胞において,3種のnovel PKC(δ,ε,η)を選択的に細胞質から細胞膜に移行させて活性化することが明らかになった.発がんプロモーターの受容体であるプロテインキナーゼC(PKC)には,10種のアイソザイムが存在する.個々のアイソザイムは,様々な疾患に関与していることから,アイソザイム選択的な薬剤の開発が強く求められている.放線菌の産生するindolactam-V(1)は,nMオーダーでPKC C1ドメイン(C1A,C1B)に結合する.本研究代表者らは,1とPKCδのC1Bとの結合において,1のインドール環とC1Bの11番目のプロリン残基(Pro-11)が,CH/π相互作用することにより結合能が高められていることを明らかにした.Pro-11は,各PKCアイソザイムで空間的位置が異なると考えられることから,C1ドメイン間のCH/π相互作用の差異を利用することにより,PKCアイソザイム選択的な薬剤の開発が可能である.各アイソザイムでのCH/π相互作用を変化させるため,1のインドール環の1位あるいは12位に各種アルキル側鎖を導入した.これらのPKCアイソザイムへの結合能を,本研究代表者らが開発したPKC C1ペプチドを用いて評価したところ,1位に嵩高いイソプロピル基を導入することによってnovel PKC(δ,ε,η,θ)に対する選択性が顕著に増大すること,逆に12位においては立体障害の小さい直鎖の置換基がnovel PKCに対する選択性を高めることが明らかになった.各種PKCアイソザイムのC

1ドメインのPro-11を4,4-difluoro-prolineで置換したペプチドを用いた結合試験を行ない,1-isopropyl-indolactam-Vのnovel PKC選択性の一部は,アイソザイム間でのCH/π相互作用の相違に起因することを明らかにした.さらに,このCH/π相互作用に着目して,ピロロインダゾール環を有する新しい蛍光プローブの合成にも成功した.
アクティブなステレオビジョンシステムに関する研究

本研究の目的は,環境情報を高速かつ高い信頼度で獲得できるアクティブなステレオビジョンシステムを構築することである.平成4年度は,アクティブな両眼視差の検出アルゴリズムの開発と,カメラの運動を制御するために必要なハードウエアとソフトウエアを作成した.アクティブな両眼視差の検出方法の研究においては,観測者のアクティブな運動によりステレオ対応問題が簡単になり,従来のパッシブな観測者では困難であったオクルージョンやフェンス越しのシーンのような特徴の無いシーンに対しても,高速かつ高い信頼度で両眼視差を検出することが可能であることを示した.平成5年度は,平成4年度に提案したアルゴリズムを,曲面を含んだ一般のシーンに対しても環境の奥行きが計測できるように拡張した.一般に,曲面物体を撮影した場合,その画像中での輪郭は隠れ輪郭と呼ばれ,物理的には存在しない偽の輪郭である.したがって,そのような隠れ輪郭のステレオ対応を取れば,誤った3次元位置を獲得することに継り,従来からステレオ法の問題点とされてきた.本研究では,アクティブな視点の移動に伴う隠れ輪郭の見え方をモデル化することにより,シーン中のエッジを,1)ステレオ対応の取れるエッジ,2)オクルージョンの生じているエッジ,3)曲面の隠れ輪郭であるエッジ,に分類することができた.またその結果,1)については両眼ステレオにより精度の高い3次元位置を,2)についてはモーションステレオにより粗い3次元位置を,また3)については,曲面の局所的な曲率半径を計算することができた.曲面の曲率半径の情報が得られれば,シーン中の曲面物体の検出ができるだけでなく,その局所表面を再構成することも可能となる.また,これらの情報は曲面物体を認識するときの有力な手がかりにもなると考えられる.本研究の目的は,環境情報を高速かつ高い信頼度で獲得できるアクティブなステレオビジョンシステムを構築することである.平成4年度は,アクティブな両眼視差の検出アルゴリズムの開発と,カメラの運動を制御するために必要なハードウエアとソフトウエアを作成した.アクティブな両眼視差の検出方法の研究においては,観測者のアクティブな運動によりステレオ対応問題が簡単になり,従来のパッシブな観測者では困難であったオクルージョンやフェンス越しのシーンのような特徴の無いシーンに対しても,高速かつ高い信頼度で両眼視差を検出することが可能であることを示した.平成5年度は,平成4年度に提案したアルゴリズムを,曲面を含んだ一般のシーンに対しても環境の奥行きが計測できるように拡張した.一般に,曲面物体を撮影した場合,その画像中での輪郭は隠れ輪郭と呼ばれ,物理的には存在しない偽の輪郭である.したがって,そのような隠れ輪郭のステレオ対応を取れば,誤った3次元位置を獲得することに継り,従来からステレオ法の問題点とされてきた.本研究では,アクティブな視点の移動に伴う隠れ輪郭の見え方をモデル化することにより,シーン中のエッジを,1)ステレオ対応の取れるエッジ,2)オクルージョンの生じているエッジ,3)曲面の隠れ輪郭であるエッジ,に分類することができた.またその結果,1)については両眼ステレオにより精度の高い3次元位置を,2)についてはモーションステレオにより粗い3次元位置を,また3)については,曲面の局所的な曲率半径を計算することができた.曲面の曲率半径の情報が得られれば,シーン中の曲面物体の検出ができるだけでなく,その局所表面を再構成することも可能となる.また,これらの情報は曲面物体を認識するときの有力な手がかりにもなると考えられる.本研究では,環境情報を高速かつ高い信頼度で獲得できるアクティブなステレオビジョンシステムを構築することを目的とし,本年度は,アクティブな両眼視差の検出アルゴリズムの開発と,注視行動を自動化するために必要なハードウエアとソフトウエアを作成した.アクティブな両眼視差の検出方法の研究においては,観測者のアクティブな運動によりステレオ対応点問題が簡単になり,従来のパッシブな観測者では困難であったオクルージョンやフェンス越しのシーンのような特徴のないシーンに対しても,高速かつ高い信頼度で両眼視差を検出することが可能であることがわかった.種々のシーンを用いた実験により開発したアルゴリズムの有効性を示した.注視行動を自動化するための研究においては,まず人間の目の運動を実現するためのハードウエア(ビジョンロボット)を作成した.これは,左右の目(カメラ)の運動を独立に制御するための3台のサーボモータと首の位置と姿勢を制御する2台サーボモータからなり,並列計算機(トランスピュータ)を用いて高速かつ高精度にカメラの運動を制御できる.カメラから入力された左右の画像は,画像入力ボードによりトランスピュータのメモリに取り込まれ,DSPにより画像処理することにより高速なビジュアルフィードバックを実現した.目の運動としては,高速に視線を変えるサッケード運動,移動物体を追跡するパーシュート運動,左右の視線を物体上で合わせるバージェンス運動,頭部の運動を打ち消す前庭性動眼反射(VOR)を実現し,これらを組み合わせることにより移動物体を両眼で追跡する方法を確立し,その3次元位置をリアルタイムで計測することができることを確認した.本研究は,環境情報を高速かつ高い信頼度で獲得できるアクティブなステレオビジョンシステムを構築することを目的としている.本年度は,昨年度までに提案したアクティブな両眼視差の検出アルゴリズムを,曲面を含んだ一般のシーンに対しても環境の奥行きが計測できるように拡張した.一般に,曲面物体を撮影した場合,その画像中での輪郭は隠れ輪郭と呼ばれ、物理的には存在しない偽の輪郭である.

したがって,そのような隠れ輪郭のステレオ対応を取れば,誤った3次元位置を獲得することに継り,従来からステレオ法の問題点とされてきた.本研究では,アクティブな視点の移動に伴う隠れ輪郭の見え方をモデル化することにより,シーン中のエッジを,1)ステレオ対応の取れるエッジ,2)オクルージョンの生じているエッジ,3)曲面の隠れ輪郭であるエッジ,に分類することができた.またその結果,1)については両眼ステレオにより精度の高い3次元位置を,2)についてはモーションステレオにより粗い3次元位置を,また3)については,曲面の局所的な曲率半径を計算することができた.曲面の曲率半径の情報が得られれば,シーン中の曲面物体の検出ができるだけでなく,その局所表面を再構成することも可能となる.また,これらの情報は曲面物体を認識するときの有力な手がかりにもなると考えられる.本研究では,計算機により人工的に作成した画像と実際にカメラで撮像した画像の2種類を用いて,提案した手法の有効性を確認した.
培養細胞を用いた角膜内皮の創傷治癒モデルの開発

Hydroxyethyl methacrylateを用いて培養面を限局することにより,培養細胞の周囲への移動拡大を防ぎ,一定面積の安定した角膜内皮のシートを作成した.このシート上に一定の面積の創傷を作成し,経時的に治癒過程を観察した.増殖中及び増殖後の細胞核のみを染色するためにブロモデオオキシウリジン添加培養液,モノクローナル抗体, ABCを用いた間接酵素抗体法を行なった.その結果,創傷治癒過程における細胞の伸展,増殖の時間的関係が明らかになった.また培養液中に,細胞の伸展,増殖に影響を及ぼす薬剤,フィブロネクチン,サイトカラシンB, EGF, 5-FUを添加して経時的にシート上の創傷面積を測定し,創傷治癒率を算出した.フィブロネクチン添加群では,創傷治癒過程において伸展がその主体をなすと思われる初期に創傷治癒率の促進効果が認められ,サイトカラシンB添加群では,その抑制効果が認められた.EGF, 5-FU添加群では,初期にはこれらの薬剤無添加の群との間に創傷治癒率の差は認められなかったが,後期ではそれぞれ促進,抑制効果が認められた.以上のごとく今回作成した創傷治癒モデルに新しい染色法を加えることにより,薬剤等か,伸展,増殖に与える影響を解析する事が可能になった.このモデルを利用して,臨床的に頻繁に使用されるヒアルロン酸ナトリウムの創傷治癒に帯する影響の解析を行ない,その低濃度における創傷治癒促進効果と高濃度における抑制効果が明らかとなった.今後も臨床的に用いられる薬剤の創傷治癒に対する効果の解析に有用と思われる.Hydroxyethyl methacrylateで培養の周囲をコーティングすることにより培養細胞の周囲への移動拡大を防ぎ、一定面積の安定した角膜内皮のシートを作成することに成功した。この角膜内皮シートを使用して角膜内皮の創傷治癒実験を行ったが、創傷の面積は5%以内の誤差範囲で作成することが出来、治癒過程における各測定時間毎の創傷面積も標準偏差が約7%と非常に安定した結果を得ることが出来た。このことにより、従来不可能であった一定面積の創傷の作成や、創傷治癒過程の経時的な観察が、我々の開発した角膜内皮培養法で可能となり、定量性に秀れた角膜内皮創傷治癒実験が行えることがわかった。この実験系の最初の応用として、創傷の面積と治癒時間との関係を数式化して求めてみたが、こうした試みは従来の報告には無く、本法を用いて初めて可能と成った。次に、fibronectin.laminin.EGF.5-FUなどの細胞の増殖や運動に影響を与える薬剤の角膜創傷治癒への影響を求めた。これらに関しては現在実験継続中であるが、従来の薬剤判定法と比べ、より信頼性の高い結果が得られると思われる。Hydroxyethyl methacrylateを用いて培養面を限局することにより,培養細胞の周囲への移動拡大を防ぎ,一定面積の安定した角膜内皮のシートを作成した.このシート上に一定の面積の創傷を作成し,経時的に治癒過程を観察した.増殖中及び増殖後の細胞核のみを染色するためにブロモデオオキシウリジン添加培養液,モノクローナル抗体, ABCを用いた間接酵素抗体法を行なった.その結果,創傷治癒過程における細胞の伸展,増殖の時間的関係が明らかになった.また培養液中に,細胞の伸展,増殖に影響を及ぼす薬剤,フィブロネクチン,サイトカラシンB, EGF, 5-FUを添加して経時的にシート上の創傷面積を測定し,創傷治癒率を算出した.フィブロネクチン添加群では,創傷治癒過程において伸展がその主体をなすと思われる初期に創傷治癒率の促進効果が認められ,サイトカラシンB添加群では,その抑制効果が認められた.EGF, 5-FU添加群では,初期にはこれらの薬剤無添加の群との間に創傷治癒率の差は認められなかったが,後期ではそれぞれ促進,抑制効果が認められた.以上のごとく今回作成した創傷治癒モデルに新しい染色法を加えることにより,薬剤等か,伸展,増殖に与える影響を解析する事が可能になった.このモデルを利用して,臨床的に頻繁に使用されるヒアルロン酸ナトリウムの創傷治癒に帯する影響の解析を行ない,その低濃度における創傷治癒促進効果と高濃度における抑制効果が明らかとなった.今後も臨床的に用いられる薬剤の創傷治癒に対する効果の解析に有用と思われる.
高齢歩行者の交通事故防止を目的とした速度弁別検査に関する研究

本研究の目的はヒトの接近速度弁別能力という知覚特性を定量化できるシステムを構築し,成人と高齢者を対象にその能力を検査することにより加齢による影響を明らかにすることである。以前我々が開薬したシステムでは,車両にみたてた光点(以下,ターゲット)を実空間に呈示させ,接近速度弁別能力を検査した,その結果,成人と比タその能力都低下している高齢者がいること,高齢者でほ単眼視と両眼視で正答率に差がないことを明らかにした。この理由として我々ほ,高齢者の両眼性の奥行知覚能力が低下していると推測した。そこで,実体鏡の原理を用いて両眼性の奥行手がかりで奥行知覚される接近対象を仮想空間に呈示し,援近速度弁別能力を検査する大規模な検査システムを構築した。交通事故防止という観点から,実際の交通環境を再現した基礎データが足りなかった。交通環境条件として日中,夕暮れ,夜といった交通環境条件で車両の接近の視覚刺激を呈示し,接近速度弁別能力を検査した。そめ結果,暗くなり周囲の環境が見えにくくなる程,接近速度の弁別は難しくなることわかった。しかし,高齢者が最も多く事故に遭う夕暮れと夜を比較した場合の明確な差は見られなかった。夕暮れや夜の環境では周囲が見えにくくなる。つまり,単眼性の奥行知覚情報が少なくなる。その条件で車画の接近速度弁別に差がなかった。すなわち,接近速度弁別には単眼性の奥行知覚情報が両眼性の奥行知覚情報よりも優位に働く,または両眼性の奥行知覚能力が低下している可能性が示唆ざれだ。周囲が見えなくなる夜だからドライバーからも歩行者は見えていないだろうと歩行者が思い込んで道路の横断をしないたぬ。夕暮れより交通事故が少なくなるなど,歩行者の心理も影響していると考えられる。今後,アシケニト等も併用し統計手法を用いて判断する予定である。我々が住む秋出県においても,見通しの良い直線道路において高齢歩行者は車が接近しているにも関わらず道路を横断しようとして交通事故に遭うケースが多発している.この原因として我々は,加齢による感覚機能の低下により接近してくる車の速度を誤って知覚している可能性を考えた.過去の研究において,被験者に実空間の視覚刺激が接近してその刺激の速度を弁別してもらうシステムを構築した.そめ結果,高齢被験者の中には成人健常者やそれ以上に接近速度を弁別できる高齢者もいたが,極端に能力が低下した高齢被験者を発見できた.しかし,この能力の低下の原因は明らかに出来なかった.仮想空間での視覚刺激を用いることにより,接近を知覚する能力は実空間とで分割できる.そのため,仮想空間の視覚刺激を呈示し,接近速度を弁別する能力を検査するシステムを構築した.次に,各パラメータを決定するため,立体映像のパラメータから観察者が得る奥行き距離知覚特性の理論式を導出した.市販の液晶シャッター眼鏡方式立体カメラを用いて立体映像を呈示し,理論式から得られる距離知覚特性と液晶シャッター眼鏡によって観察者から得られた距離知覚特性と比較検討した.その結果,観察者から得られた距離知覚特性は,我々が導出した理論式にほぼ一致することが明らかになった.次年度はこれらの結果を用いて様々な視覚刺激(たとえば大型スクリーンとプロジェクタを用いて実際の交通環境のように視覚刺激を大型化するなど)を作り同様に検査することである.一方で,より自然な人工現実感を作り出すには観察者個々の立体視機能に応じた適正条件の調整可能な3次元空間表示装置が必要である.また,年齢による心理的な視空間効果(例えば,高齢者は接近速度を過大評価または過少評価するのか)を検査する必要があるので,今後検討したい.本研究の目的はヒトの接近速度弁別能力という知覚特性を定量化できるシステムを構築し,成人と高齢者を対象にその能力を検査することにより加齢による影響を明らかにすることである。
高病原性クリプトコックス感染症における宿主感染防御機構に関する研究

自然免疫回避が高病原性クリプトコックス症の感染病態解析の本態か?ならびにIFN-gがCryptococcus gattii株貪食に与える影響は?我々の現在までの研究結果では、高病原性であるC. gattii株のR265株、JP02株肺感染マウスにおける肺局所の乏しい炎症反応が観察され、R265株での検討ではマクロファージによる貪食能がC. neoformans H99株に比較し低下している事象が観察された。さらに検討をすすめ、JP02株でもR265株と同様にJ774細胞による貪食率は5%以下と低率であったことがわかった。また、H99株ではIFN-gの存在下では貪食率が3%程度から22%程度へ上昇したのに対し、C. gattii株ではR265株、JP02株ともにIFN-g添加による貪食率への影響はほとんど認められなかった。一方、貪食能と共に貪食細胞から炎症性サイトカインの放出状況についての検討を行った。方法はH99株、R265株とJ774細胞を共培養し、IFN-gの存在の有無別に培養上清中に放出されるIL-12(IL-12β、p40)をELISAで測定した。H99株においてはIFN-g存在下では無添加に比べIL-12の放出の増加が観察されたが、R265株ではIFN-gを添加してもIL-12の検出量に変化は認めなかった。さらに生菌と死菌別でも同様の検討を行った。H99株では生菌と死菌でのJ774細胞による貪食能の変化はなく、またR265株においても生菌、死菌に対するJ774細胞の貪食能に相違は認められなかった。しかしながら、H99株の生菌を貪食した細胞からは有意にIL-12の放出量が増加したのに対し、R265株では同様の検討でもIL-12産性の増加は認めなかった。一部やや遅れた部分もあるが、全体的には予定していたペースで概ね行えていると考える。以上の結果から、C. neoformans感染モデルとC. gattii感染モデルでの肺病理組織像の違いは、マクロファージの貪食像ならびにそれから放出される炎症性サイトカインの相違、ならびにIFN-gに対する反応性の違いが大きく関与していることが推定された。今後の方針として、引き続きIFN-gなど炎症性サイトカインが高病原性クリプトコックス症の感染防御に与える影響の解析を行う。C. neoformans感染症においてはIFN-gが感染防御に重要な役割を果たしていることが知られ、感染マウスにIFN-gを投与すると臓器菌数の減少などが観察されるが、C. gattii感染症に対する効果はまだ確立していない。さらに、高病原性クリプトコックス症、とくに難治性とされている脳髄膜炎においてIFN-gが感染病態改善に与える影響を検討し、IDSAガイドラインでも評価が定まっていない中枢神経系C. gattii感染症の治療におけるIFN-gの位置づけを検証する。さらにIL-12、TNF-αなど他のサイトカインの感染防御に果たす役割についても検証する。現在までにクリプトコックス脳髄膜炎モデルの作成を試みている。H99株、R265株、JP02株を経頭蓋的にマウスに接種し、生存率、病理組織学的検討を行った。これらの株を接種したマウスは接種後7日目から死亡する個体が観察され、14日-21日後までに約80-90%が死亡し、病理組織学的検討では、いずれも脳髄膜炎に矛盾しない病理像が観察された。これらの結果から、今後の検討に適切なマウスモデルであると考えられた。今後は本モデルを使用し、IFN-g投与の有無によるマウスモデルの生存率の検討や、臓器菌数の検討、ならびに引き続きJ774での貪食によるTNF-αなど他の炎症性サイトカインの発現について検討を進める予定である。自然免疫回避が高病原性クリプトコックス症の感染病態解析の本態か?ならびにIFN-gがCryptococcus gattii株貪食に与える影響は?我々の現在までの研究結果では、C. gattii株のR265株、JP02株肺感染マウスにおける肺局所の乏しい炎症反応が観察され、R265株での検討ではマクロファージによる貪食能がC. neoformans H99株に比較し低下している事象が観察された。本検討では現在まで検討したR265株に対する貪食能評価法に沿って、高病原性であるJP02株等を対象に検討し、C. gattii-マクロファージのinteraction、すなわちマクロファージによる貪食回避が感染病態であるのかを検討し、さらにIFN-g添加の有無別で貪食能の変化があるのかを検討した。方法は従来と同様とし、C. gattii JP02株とJ774細胞を3時間共培養し、共焦点顕微鏡を用いてJ774細胞による菌の貪食能について評価を行った。またIFN-gの存在下にて貪食能が亢進するかについて検討した。結果として、JP02株でもR265株と同様にJ774細胞による貪食率は5%以下と低率であった。

これらの結果は、R265株、JP02株などの高病原性クリプトコックス株による感染病態はC. neoformansによる感染病態と相違を見せ、その原因の一つとしてマクロファージによる貪食能の違いがあるものと考えられた。計画書と照らし、ほぼ計画に沿って進捗しているため。自然免疫回避が高病原性クリプトコックス症の感染病態解析の本態か?ならびにIFN-gがCryptococcus gattii株貪食に与える影響は?我々の現在までの研究結果では、高病原性であるC. gattii株のR265株、JP02株肺感染マウスにおける肺局所の乏しい炎症反応が観察され、R265株での検討ではマクロファージによる貪食能がC. neoformans H99株に比較し低下している事象が観察された。さらに検討をすすめ、JP02株でもR265株と同様にJ774細胞による貪食率は5%以下と低率であったことがわかった。また、H99株ではIFN-gの存在下では貪食率が3%程度から22%程度へ上昇したのに対し、C. gattii株ではR265株、JP02株ともにIFN-g添加による貪食率への影響はほとんど認められなかった。一方、貪食能と共に貪食細胞から炎症性サイトカインの放出状況についての検討を行った。方法はH99株、R265株とJ774細胞を共培養し、IFN-gの存在の有無別に培養上清中に放出されるIL-12(IL-12β、p40)をELISAで測定した。H99株においてはIFN-g存在下では無添加に比べIL-12の放出の増加が観察されたが、R265株ではIFN-gを添加してもIL-12の検出量に変化は認めなかった。さらに生菌と死菌別でも同様の検討を行った。H99株では生菌と死菌でのJ774細胞による貪食能の変化はなく、またR265株においても生菌、死菌に対するJ774細胞の貪食能に相違は認められなかった。しかしながら、H99株の生菌を貪食した細胞からは有意にIL-12の放出量が増加したのに対し、R265株では同様の検討でもIL-12産性の増加は認めなかった。一部やや遅れた部分もあるが、全体的には予定していたペースで概ね行えていると考える。今後の方針として、まず上記J774細胞貪食の実験系を使用し、クリプトコックス貪食時の炎症性サイトカインの産生状況の検討を行う。これはIFN-g添加の有無の両面で検討する。また、IFN-gなど炎症性サイトカインが高病原性クリプトコックス症の感染防御に与える影響の解析を行う。C. neoformans感染症においてはIFN-gが感染防御に重要な役割を果たしていることが知られ、感染マウスにIFN-gを投与すると臓器菌数の減少などが観察されるが、C. gattii感染症に対する効果はまだ確立していない。さらに、高病原性クリプトコックス症、とくに難治性とされている脳髄膜炎においてIFN-gが感染病態改善に与える影響を検討し、IDSAガイドラインでも評価が定まっていない中枢神経系C. gattii感染症の治療におけるIFN-gの位置づけを検証する。さらにIL-12、TNF-αなど他のサイトカインの感染防御に果たす役割についても検証する。その手始めとして、高病原性クリプトコックス症(脳髄膜炎モデル)作成を行う。以上の結果から、C. neoformans感染モデルとC. gattii感染モデルでの肺病理組織像の違いは、マクロファージの貪食像ならびにそれから放出される炎症性サイトカインの相違、ならびにIFN-gに対する反応性の違いが大きく関与していることが推定された。
タンパク質リポイル化の分子機構と構成タンパク質の結晶構造解析

リポ酸転移酵素はlipoyl-AMPを基質として,リポ酸依存性のタンパク質にリポ酸を転移する反応を触媒する.その反応機構を明らかにするために,ウシのリポ酸転移酵素(bLT)の結晶構造解析を行った.組換え型bLTには内因性のlipoyl-AMPが結合しており,このことはbLTがlipoyl-AMPに対して非常に高い親和性を持つことを示す.bLT分子はN末端側とC末端側の2つのドメインより成る.lipoyl-AMPはN末端側ドメインの活性中心において,そのリポイル部分は疎水性ポケットの中で疎水結合によって,一方,AMP部分は別のトンネル様空洞中で多くの水素結合を介してbLTと結合する.bLTのlipoyl-AMPに対する親和性はadenylate-binding loopによって補強される.これらの結合によってlipoyl-AMPのカルボニル基の炭素原子はbLT分子の表面に露出する.Lipoyl-AMPのカルボニル基の酸素原子はbLT中に保存されたLys135と相互作用し,それによってカルボニル基の炭素原子の正電荷は強まる.結果的にリポイル化されるべきアポタンパク質のリシン残基の求核攻撃が促進され,カルボニル基とリン酸基の間の結合が切断してリポイル化されたタンパク質が生成する.我々は,ミトコンドリアから精製したリポ酸転移酵素にも又lipoylmononucleotideが結合しており,ミトコンドリア内に移行してきたアポタンパク質を直ちにリポイル化できる状態で待機していることを証明した.リポ酸転移酵素はlipoyl-AMPを基質として,リポ酸依存性のタンパク質にリポ酸を転移する反応を触媒する.その反応機構を明らかにするために,ウシのリポ酸転移酵素(bLT)の結晶構造解析を行った.組換え型bLTには内因性のlipoyl-AMPが結合しており,このことはbLTがlipoyl-AMPに対して非常に高い親和性を持つことを示す.bLT分子はN末端側とC末端側の2つのドメインより成る.lipoyl-AMPはN末端側ドメインの活性中心において,そのリポイル部分は疎水性ポケットの中で疎水結合によって,一方,AMP部分は別のトンネル様空洞中で多くの水素結合を介してbLTと結合する.bLTのlipoyl-AMPに対する親和性はadenylate-binding loopによって補強される.これらの結合によってlipoyl-AMPのカルボニル基の炭素原子はbLT分子の表面に露出する.Lipoyl-AMPのカルボニル基の酸素原子はbLT中に保存されたLys135と相互作用し,それによってカルボニル基の炭素原子の正電荷は強まる.結果的にリポイル化されるべきアポタンパク質のリシン残基の求核攻撃が促進され,カルボニル基とリン酸基の間の結合が切断してリポイル化されたタンパク質が生成する.我々は,ミトコンドリアから精製したリポ酸転移酵素にも又lipoylmononucleotideが結合しており,ミトコンドリア内に移行してきたアポタンパク質を直ちにリポイル化できる状態で待機していることを証明した.リポ酸転移酵素はリポ酸依存性タンパク質の特定のリシン残基にlipoyl-AMPからリポ酸を転移し,リポイル化されたタンパク質とAMPを生成する.その反応機構を原子レベルで明らかにするために,ウシのリポ酸転移酵素の結晶化を行ない,構造解析をした.結果:リポ酸転移酵素の結晶は空間群,P3_121に属し,格子定数は,a=81.44Å,c=81.44Å,c=120.53Å,α=β=90°,γ=120°であり,非対称単位に1分子を含んでいた.その構造はα/βクラスに分類され,N-ドメインとC-ドメインより構成される.N-ドメインは大,小2っのβ-sheetとそれを取り囲む9つのα-helixと1つの3_<10>ヘリックスより成る.C-ドメインは1つのβ-sheetとその片側に2つのα-helixと1つの3_<10>ヘリックス構造より成る.N-ドメイン部分の構造は,これまで報告されている、Escherichia coliやThermoplasma acidophilumのlipoate-protein ligaseとの間で高い類似性を示すが,adenylate-binding loopの構造およびC-ドメインの立体配座はそれぞれお互いに大きく異なっている.N-ドメインには基質,lipoyl-AMP,が結合しており,タンパク質のペプチド鎖と水素結合および疎水結合によって強固に結合している.Lipoyl-AMPのカルボニル基の炭素原子は分子表面に露出し,酸素原子はLys135のε-アミノ基と水素結合している.この水素結合はリポ酸転移反応に重要な役割を果たすと示唆される.また,ミトコンドリアのリポ酸転移酵素にもlipoyl-mononucleotideが結合しており,このことはリポ酸転移酵素がミトコンドリアに移行してくるリポ酸依存性タンパク質に対して常にリポイル化の準備をしている状態であることを示す.リポ酸転移酵素はlipoyl-AMPを基質として、リボ酸依存性のタンパク質にリボ酸を転移する反応を触媒する。その反応機構を明らかにするために、ウシのリボ酸転移酵素(bLT)の結晶構造解析を行った。組換え型bLTには内因性のlipoyl-AMPが結合しており、このことはbLTがlipoyl-AMPに対して非常に高い親和性を持つことを示す。bLT分子はN末端側とC末端側の2つの、ドメインより成る。