hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生活環・感染様式から探る藻類寄生性ツボカビ類の進化

透過型電子顕微鏡によって細胞微細構造を調べ、タイムラプス顕微鏡による生活環の各ステージ移行過程、および、レクチンを用いた染色による蛍光微鏡観察を行い、生活環の各ステージにおける細胞表面の糖鎖分布について調べた。その結果、遊走子放出タイミングやレクチン結合パターンが種あるいは生活環ステージによって異なることがわかった。アミノ糖の一種N-アセチルグルコサミンが遊走子嚢の仮根の基部に集積していることが示唆された。今年度はC. hyalinus ATCC-28165の生活環全ステージの細胞表面糖鎖分布をFITC-WGAを用いて調査することができ、研究成果は論文として発表した。現在は電子顕微鏡の固定条件を検討中である。また、宿主藻類の命名法上の問題点の洗い出しと学名の整理なども進めることができた。これに関しても論文公表準備中であり、総合して研究はおおむね順調に進展していると判断した。植物系統分類学本年度実施したレクチン染色による糖鎖の局在解析は、他のツボカビ2種にも適用できるため、本手法により今後の研究進捗を加速できるものと考えている。今年度(平成27年度)は特に透過型電子顕微鏡観察によるツボカビ類の微細構造の比較研究に取り組みたい。現在までに化学固定法による透過型電顕法を試みているが、最適な固定条件を見いだせていない。このため、今年度の出来るだけ早い時期に固定法の最適条件を見つけ、透過型電顕による細胞体制の解明を行う。Allomycesは有性生殖を行うことが知られている。このため、植物と菌類といったような界をまたぐ性の進化を他の生物と比較することができる。本年度は特にAllomycesを集中して観察することで、他の生物と比較可能な土台を作ることを目的として、今後の研究を進めたい。アメリカタイプカルチャーコレクション(ATCC)よりツボカビ株の分譲(輸入)手続きに予想以上に時間がかかってしまったことに加えて、分譲株のひとつ(Terramyces subanglosum MYA-4067)は、もともとコンタミネーションがあり、再分譲を受けるのに数ヶ月を要した。ツボカビの収集についてはほぼ計画通りであるが、株の調達に時間がかかった分観察が遅れているので、やや遅れていると判断した。主に旅費等の使用額が想定より少なかったため、差額が生じた。ツボカビの継代培養系、藻類との二員培養系が確立しているため、今年度はその系を用いて計画通り、ライブイメージングや透過型電子顕微鏡観察を進める予定である。またレクチンの分布など、ツボカビだけで実験・観察ができる系も用いて確実なデータ取得を目指す。本年度は海外出張を計画しており、国内学会旅費と含めて、研究計画の予算執行が行えると考えている。また論文の英文校閲料や投稿料も研究計画通りの予算執行を目指す。論文投稿料、英文校閲料、旅費等については予算よりも使用額が少なかったため。また、顕微鏡に関わる物品費についても想定した予算より使用額が少なかったため。
子宮頸部上皮内病変の細胞極性蛋白発現異常症例に対するBCG療法の有用性検討

子宮頸がんの前駆病変(Cervical Intraepithelial Neoplasia: CIN)は自然治癒する症例と病変が進行する症例がある.本研究の目的はCINのがん化の機序解明,病変の進行を予測する指標の開発および,保存的な治療法の開発である.atypical Protein Kinase Cλ/ι(aPKC)は正常な上皮では細胞の極性を制御し,がん遺伝子であると示唆されている.これまでに,CINでaPKCの発現異常を認め,aPKCが病変進行を予測するバイオマーカーであることを明らかにした.aPKCの発現異常の機序を解析し,aPKC経路の分子を標的とした治療の可能性を評価する.子宮頸がんの前駆病変(Cervical Intraepithelial Neoplasia: CIN)は自然治癒する症例と病変が進行する症例がある.本研究の目的はCINのがん化の機序解明,病変の進行を予測する指標の開発および,保存的な治療法の開発である.atypical Protein Kinase Cλ/ι(aPKC)は正常な上皮では細胞の極性を制御し,がん遺伝子であると示唆されている.これまでに,CINでaPKCの発現異常を認め,aPKCが病変進行を予測するバイオマーカーであることを明らかにした.aPKCの発現異常の機序を解析し,aPKC経路の分子を標的とした治療の可能性を評価する.
シェーグレン症候群患者のワークライフバランスと健康支援に関する研究

本研究は、中高年女性に好発するシェーグレン症候群の患者の家事労働を含む仕事や生活全般および療養生活のワークライフバランスの実態について困難な点、工夫している点などを明らかにすることで、慢性疾患を持ちながら生活する中高年女性と彼女らの職場や家族などへの理解を深める健康支援を検討することを目的として行った。平成22年度は、半構造化インタビューを用いた質的記述的研究を行った.その結果30歳代から70歳代の8名の女性から協力を得た診断を受けて病気の受け入れまでの体験として自分自身との葛藤の期間があり,その期間に【複数の受診科と頻繁な受診】【症状も精神的にも安定しない状況】,さらに【治らない病気になってしまった絶望感】という思いを体験していた.その後,病気と向き合うという受け入れの心境として【症状への対処法の構築】が出来,【仕事や生活のバランスのセルフコントロール】が出来るようになっていた.そしてシェーグレン症候群という疾患を抱える女性達のセルフヘルプ機能が【疾患との付き合い方として参考】とな,さらに【社会や家族から孤独にならないような働き】を担っていた.シェーグレン症候群の健康支援は,早期の介入が重要であり,セルフヘルプ機能が発揮できるような内容が必要であることが示唆された.平成23年度では、インタビュー結果をもとに調査表を作成し、412名を対象に質問紙調査を行った。結果、316名から回答が得られた。アウトカムである抑うつ尺度(CED-D)得点は、平均23.0(SD11.1)であり、抑うつ状態にある人が多いことが明らかになった。そこでCED-Dの結果と関連のあった項目は【療養生活において楽しめること】【レイノー現象】【疲れによる仕事への影響】【周囲の理解不足】【趣味などの行動制限】であった。身体症状をセルフコントロールし、生活を楽しむ能力を身につけることが抑うつ対策として重要であるといえる。本研究は、中高年女性に好発するシェーグレン症候群の患者の家事労働を含む仕事や生活全般および療養生活のワークライフバランスの実態について困難な点、また工夫している点などを明らかにすることで、慢性疾患を持ちながら生活する中高年女性と彼女らの職場や家族などへの理解を深める健康支援を検討することを目的として行った。初年度は、実態の基礎資料を得るため、8名のインタビューを実施した。診断から現在に至るまでのドライアイ、ドライマウスおよび代替療法などのヘルスケアにかかる費用や心理的負担、家事労働や仕事および受信や療養にかかる時間、生活時間などの工夫している点や困難な点などについて情報を得た。その結果、30代から70代まで幅広い年代の女性から協力を得た。背景は様々であったが共通するのは、病気の受容までの過程では、内科、眼科、歯科、心療内科など複数の科に頻繁な受診をしており、症状も精神的にも安定せず治らない病気になってしまったという自分自身との葛藤の期間を経験している。しかし、病気と向き合うという受け入れの心境になった時期に症状への対処方法が見つかり、仕事や生活のバランスをセルフコントロールできるようになっていた。一方でシェーグレン症候群という疾患を抱える女性たちのセルフヘルプ機能が、疾患との付き合い方として参考になり、社会や家族などから孤独に陥らないような働きを担っていた。「シェーグレン症候群になったからこそ経験できる」ということがワークライフバランスに生かされているようであった。病気を受容するには、葛藤の期間を経験しているからこそであり、さらに患者同士のセルフヘルプグループがその一助となっていた。今後さらに個人の中に生じている葛藤や受容について調べ、難治性疾患の患者への健康支援を目指す。

本研究は、中高年女性に好発するシェーグレン症候群の患者の家事労働を含む仕事や生活全般および療養生活のワークライフバランスの実態について困難な点、工夫している点などを明らかにすることで、慢性疾患を持ちながら生活する中高年女性と彼女らの職場や家族などへの理解を深める健康支援を検討することを目的として行った。H23年度は昨年度のインタビューの結果をもとに質的に分析を行い、「シェーグレン症候群患者の疾病受容過程の思い」として論文にまとめた。さらに今年度はインタビュー結果をもとに調査表を作成し、412名を対象に質問紙調査を行った。結果、316名から回答が得られた。平均年齢は62.1(SD12)歳、診断からの年数は10.5(SD7.7)年であり、好発年齢といわれている50歳前後に診断がついた人が多かった。今回のアウトカムである抑うつ尺度(CED-D)得点は、平均23.0(SD11.1)であり、抑うつ状態にある人が多いことが明らかになった。そこでCED-Dの結果と有意な関連のあった項目を投じたステップワイズ法(変数減少法)を実施したところ、【療養生活において楽しめること】【レイノー現象】【疲れによる仕事への影響】【周囲の理解不足】【趣味などの行動制限】がCES-D得点に有意な関連のある項目として抽出された。シェーグレン症候群患者の主たる乾燥症状は、個々には抑うつに有意な関連を認めたが、ステップワイズ法分析では抽出されなかった。シェーグレン症候群という慢性疾患を持つ女性たちにとって、身体症状をセルフコントロールし、生活を楽しむ能力を身につけることが抑うつ対策として重要であるといえる。また患者らの努力だけではどうにもならない、周囲の理解や職場の理解が患者らの精神面への影響を及ぼしていると推測できる。
動物の排卵開始の刺激因子の解明

実験材料となる産卵期のマナマコは、これまで佐賀県唐津漁協加部島支所から入手してきたが、近年続いている不漁により、排卵誘発活性成分の大規模精製に必要な数の成熟個体が入手出来なかった。地元漁協から少数の混獲個体を入手できた為、精製実験に資するデータ取得を目的として、イオン交換クロマトグラフィー法、試料調製時のプロテアーゼ阻害による回収量の向上等を検討した。29年度までに確立した生殖巣切断刺激法(組織切断刺激により生殖巣培養液中に排卵誘発活性が検出される)により同活性を回収し、脱塩処理後、陰陽の各イオン交換クロマトグラフィーを実施した。pH8.5で陰イオン交換カラムに強く保持され、0.9-1MのNaCL添加で溶出されることから、比較的強い塩基性成分であることが予想され、精製過程に陰イオン交換法を加えることが効果的であると結論した。また、プロテアーゼによる分解抑制の効果を調べる過程で、プロテアーゼ阻害剤そのものによる排卵が誘発されることが明らかとなった。6種の阻害剤からなる広域阻害カクテルを所定濃度で用いると、クビフリン(10-9M)による卵成熟が抑制されることから、クビフリンによる卵成熟誘起過程はプロテアーゼの活性化を伴うことが予想された。個々の検討では、セリンプロテアーゼ阻害剤AEBSF(4-(2-aminoethyl)benzensulfonylfluoride)は、1mMでクビフリンによる卵成熟を完全に抑制するが、排卵現象は抑制しなかった。興味深いことに1mMのAEBSF単独投与で卵成熟を伴わない排卵が誘導されることが明らかとなった。生殖巣切断刺激法で培養液中に検出される排卵誘発活性とAEBSFの作用過程に共通点があるかどうかは不明である。本課題は、ナマコを用い、排卵現象のみを惹起する未知の排卵誘起因子及び卵成熟誘起因子の精製を目的とする。初年度に引き続き、精製用材料(配偶子最終成熟を起こした卵巣・精巣の培養液(生殖腺培養液))を集めることを第1の目標とした。マナマコは唐津漁協加部島支所に依頼し例年100-200匹を購入しているが、29年春の漁期は極度に不漁で、実験用マナマコを購入出来なかった(不良の原因は不明)。急遽、宗像漁協地島支所より40匹程度のマナマコを入手したが、当初に計画した個体数には不足であった。排卵誘起活性・卵成熟誘起活性共に、精巣・卵巣の両生殖腺から検出出来るため(28年度成果)、入手したナマコ全てを材料として両活性を含む“生殖腺培養液"を調製した。生殖腺培養液を試料として、液体クロマトグラフィーによる卵成熟誘起活性および排卵誘起活性の分離・精製を試みた。両成分の活性は、マナマコ卵巣片中の卵母細胞の卵成熟誘起・排卵を指標にしたバイオアッセイ法で検出した。排卵誘起活性は、Sephadex G-10では塩画分前に、Superdex 30では塩類の溶出位置付近に検出された。また、同活性は逆相HPLCで中程度のアセトニトリル濃度で溶出された。これらの事から、同活性成分は、低分子の極性成分(例えば、低分子のポリペプチドなど)と予想されるが、その単離・構造解析にはより多量の材料が必要である。卵成熟誘起活性は、Superdex 30により分子量3000以上の画分に溶出されたが、濾胞付き卵母細胞や濾胞無し卵母細胞(裸の卵母細胞)への明確な作用は検定できておらず、別課題で解析している神経分泌性の産卵誘発因子である可能性も考えられる。しかし、他の動物の例からも、卵母細胞に直接作用する卵成熟誘起ホルモンが存在しないとは考えられず、本実験系では、同成分が微量過ぎる、又は化学的に不安定であることなどが予想された。入手したマナマコを4ロットに分けて、切断刺激法(28年度成果)により生殖腺培養液を調製し、脱塩(Sephadex G-10)→ゲル濾過(Superdex 30pg)→HPLC(C18逆相)の3段階の液体クロマトグラフィーを実施した(4回)。内、3ロットは精巣培養液、1ロットは卵巣培養液であった。Sepahdex G-10カラムにより、生殖腺培養液から除タンパク・脱塩すると共に酢酸アンモニウム緩衝液に置換した。排卵誘起活性、卵成熟誘起活性共に塩画分より前に溶出した。脱塩試料を凍結乾燥後、Superdex 30pgカラムでゲル濾過した。卵成熟誘起活性は分子量3000付近の画分に回収され、排卵誘起活性は塩画分から僅かに遅れた画分に掛けて回収された。卵成熟誘起活性は4ロットの内の2ロットでは検出出来なかったが、排卵誘起活性は4ロット全てで検出された。ロット間での卵成熟誘起活性の検出の有無の原因については、同活性の安定性・含量・アッセイに用いた卵巣の感受性など複数の原因が考えられるが、現時点ではいずれが主要因であるかは不明である。排卵誘起活性成分は比較的低分子量で、Superdex担体にごく僅かな吸着性を示した。C18逆相HPLCでは、排卵誘起活性は20%アセトニトリル、卵成熟誘起活性は25-30%アセトニトリル濃度付近で溶出した。

両者の間では、排卵誘起活性成分の方がより極性が高いと考えられる。いずれにしても、両画分共に多くの共雑成分を含むと思われ、分子構造解析には更なる分離・精製操作が必要である。現在、別課題で、生殖腺を刺激し最終的に放卵・放精を誘起する神経ペプチドを解析している。同ペプチドは濾胞や卵母細胞には直接作用せず、卵巣内の未知組織に作用して卵成熟・排卵を誘起する。本課題で追跡している卵成熟誘起活性とHPLCで似た位置に溶出されるため、これらの同不同を確認する必要がある。実験材料となる産卵期のマナマコは、これまで佐賀県唐津漁協加部島支所から入手してきたが、近年続いている不漁により、排卵誘発活性成分の大規模精製に必要な数の成熟個体が入手出来なかった。地元漁協から少数の混獲個体を入手できた為、精製実験に資するデータ取得を目的として、イオン交換クロマトグラフィー法、試料調製時のプロテアーゼ阻害による回収量の向上等を検討した。29年度までに確立した生殖巣切断刺激法(組織切断刺激により生殖巣培養液中に排卵誘発活性が検出される)により同活性を回収し、脱塩処理後、陰陽の各イオン交換クロマトグラフィーを実施した。pH8.5で陰イオン交換カラムに強く保持され、0.9-1MのNaCL添加で溶出されることから、比較的強い塩基性成分であることが予想され、精製過程に陰イオン交換法を加えることが効果的であると結論した。また、プロテアーゼによる分解抑制の効果を調べる過程で、プロテアーゼ阻害剤そのものによる排卵が誘発されることが明らかとなった。6種の阻害剤からなる広域阻害カクテルを所定濃度で用いると、クビフリン(10-9M)による卵成熟が抑制されることから、クビフリンによる卵成熟誘起過程はプロテアーゼの活性化を伴うことが予想された。個々の検討では、セリンプロテアーゼ阻害剤AEBSF(4-(2-aminoethyl)benzensulfonylfluoride)は、1mMでクビフリンによる卵成熟を完全に抑制するが、排卵現象は抑制しなかった。興味深いことに1mMのAEBSF単独投与で卵成熟を伴わない排卵が誘導されることが明らかとなった。生殖巣切断刺激法で培養液中に検出される排卵誘発活性とAEBSFの作用過程に共通点があるかどうかは不明である。本課題は、ナマコを材料とし、排卵を誘起する生理活性因子の解明を目的とする。同因子の精製に伴い同時に検出が可能となる卵成熟誘起因子の精製も目的とする。これら因子の組織含量は極めて微量であり、平成28年度は、同因子の精製材料となる卵巣培養液の収集を行う計画とした。春期に入手したマナマコは50匹以下と予定量に満たなかったことから、7月に北海道神恵内村より道産マナマコを50匹ほど追加購入した。ニセクロナマコは、沖縄県内の業者より空輸にて入手した。精製の出発材料となる卵巣培養液は、卵巣を産卵誘発ホルモンと共に培養することで、産卵誘発ホルモンの刺激を受けた卵巣組織から培養液中に種々の成分が分泌されたものである。この中に、卵成熟誘起因子や排卵のみを誘発する因子(排卵開始因子)が検出される。マナマコの卵巣はクビフリンを用いて、ニセクロナマコの卵巣は神経抽出液を用いて刺激した。平成28年度には、マナマコ・ニセクロナマコの卵巣培養液をそれぞれ、40匹分、50匹分調製・冷凍保存した。卵巣を小型剪刀で細切する事で、卵成熟・排卵が自律的に誘起されることがある。切断刺激による何らかの興奮が生じ、その結果としてクビフリン投与後と同様の変化が誘起されると考えられる。卵成熟・排卵が観察された場合には、その培養液中に卵成熟誘起因子や排卵開始因子の活性が検出されることが判った。しかし、クビフリンや神経抽出液を用いた場合との活性量の差は不明である。
超幾何微方変程式系の微分幾何的・代数的・解析的研究

射影空間P^n内の対称な部分多様体に関係する超幾何微分方程式系の幾何的・代数的・解析的研究に関わって次のような実績をあげた。1.K3曲面族に付随する周期写像のみたす微分方程式は局所解の構成,モノドロミ-群の数論的性質の解明を行った。この方程式のリ-環的構造にもとづいていくつかの低階微分方程式系の連接関係を明らかにした。2.高山は,ホロノミック系の接続問題と特異因子上への境界値問題の関係を明らかにし,特異性の伝播の記述,ある種の超幾何方程式系の連続係数の計算を行った。3.中屋敷は,ア-ベル多様体上のベクトル束上に可換微分作用系を構成する理論を完成させ,新しい特殊函数の導入や,方程式系の代数構造に新しい知見をひらいた。4.射影部分多様体と有限型微分方程式の局所構造との関係,不変式の計算,同値問題についての総合的解析を行った。5.3次元射影間内の射影的等質空間の分類を不変量の具体的計算によって行った。また,超曲面に対し4次の新しい不変量を定義し,その性質を論じ,アフィン球面の射影的特徴付けに用いた。アフィン等質曲面の新しいタイプを求め,分類を完成させた。余次元2のアフィナ部分多様体の理論の定式化を行い,射影超曲面の理論の新しい取扱い方を提示した。6.味村は低次元2次形式の研究,中西は絡み目の不変量の幾何的意味付け,樋口は特性汎函数の解析的性質に着目した確率場の研究を行い,本研究を代数的,位相的解析的側面より支援し,各研究結果を学術雑誌に発表した。
新生児脳内の近赤外領域拡散スペクトルの研究

新生児期における低酸素虚血性脳症の予防と管理のみならず未熟児への酸素毒性を回避する的確な酸素投与を行なうための指標として、近赤外線領域の連続NIR spectrum(cNIRS)を利用して、脳組織内の酸素化状態やエネルギー状態を把握する方法を考案した。それは、cNIRSを多ポイント測定し、拡散スペクトルの平坦化の補正、各スペクトルにおける光路長の違いの規格化により、脳組織内のHbO2/Hbと酸素飽和度(SbO2)、cytochrome c oxidaseのredox state、脳血液量(CBV)を絶対値表示でreal timeに非侵襲的に測定する方法であり、基礎的検討として行った新生仔豚の頭皮上と硬膜上での測定の比較で、多ポイント化による頭皮上よりの測定は硬膜上よりの測定と殆ど差の無いことを証明した。臨床的検討として、受光部を多ポイント化した光ファイバープローベを用いて、成熟新生児、低出生体重児、仮死児及び多血症児の部部交換輸血の前後、無呼吸発作時の測定を行った。成熟新生児のSbO2は6070%で、低出生体重児では5075%であった。仮死児における脳内総Hb、SbO2、cytochrome c oxidaseの酸化型は、正常児より高値を示した。部分交換輸血時の動脈血Hctの減少に比例して、直線的に脳内総Hbは減少した。無呼吸発作時には、cytochrome c oxidaseの酸化型はSbO2にやや遅れて減少した。以上の成績より、成熟児及び未熟児を対象として、ベットサイドにてreal timeに脳内HbやSbO2、cytochrome c oxidaseのredox stateの経時的変動を測定することが可能となり、脳循環動態の把握、特に脳内Hbの定量化や酸素化状態の把握などにcNIRS測定が有用であると結論された。新生仔豚の頭部へ直接近赤外領域の光を照射して,脳組織へ入射する光と,脳組織から射出してくる光の特に頭皮や頭蓋骨のレベルでの吸収,多重屈析・反射などに起因する光エネルギーの喪失による解析の障害を解消するために光の射出部位を多プロット化して差スペクトルによる演算方式を導入して,従来不可能であった頭蓋骨内の脳組織の各成分の吸収スペクトルを測定してoxygenationの状態をnon-invasive且つin situで自動的解析を可能にせしめ新生児・未熟児の脳障害の予防・治療に資することを究極の目的とするものである。ハロゲンランプ(150W/300W)の光を新生仔豚の脳に光ファイバーにて入射せしめ,一定の距離を隔てて射出してきた極微量な光をIMUC-7000を用いて増幅して脳実質内に存在する700900nmに吸光度を有し,且つ酸素分圧により吸収スペクトルが変動する一連の物質(HbO_2,Hb,cytochrome c oxidase)などの連続近赤外吸収スペクトルを測定することに成功した。さらに各波長における各物質の吸光能力(分子吸光係数とその濃度との積)の大きさにより実質光路長が変動して起こる吸収スペクトルの平坦化flatteningを拡散補正式を導入することにより線形性を有する透過スペクトルに導くことに成功した。ついでinteroptodeを515mmの間で順次変化させて差スペクトルを測定することにより,脳を覆う頭皮や頭蓋骨のスペクトルを除去して純粋に脳実質の吸収スペクトルのみを測定することに成功した。

上述の成果により臨床的実用化への次のステップとして多ポイント化を自動的に行うように光ファイバーのprobeを試作して実際にこれを使用して不備な点は改良を加え,且つ差スペクトルをコンピューター制御により自動的に行なえるようにソフトを改良し,脳組織のoxygenationの変化に起因するHb等のchromophores各物質の濃度変化をreal timeでin vivo且つin situで正確に追跡することが可能となりつつある。近赤外領域の拡散スペクトルの臨床的実用化として、脳組織へ入射する光と、脳組織より出射してくる光の特に頭皮や頭蓋骨レベルでの吸収、多重屈折、反射などの影響を除去するために、受光部を多ポイント化した光ファイバープローベを試作し、差スペクトルをコンピューター制御により自動解析を行い、従来不可能であった頭蓋骨内の脳組織の吸収スペクトルを特異的に測定してoxygenationの変化に起因するHb等のchromophores各物質の濃度変化をrealtimeでin vivoで且つin situで正確に測定し、臨床的に未熟児、新生児の脳障害の予防、治療に資することを究極の目的とする。基礎的検討として新生仔豚を用いて、頭皮上と硬膜上から脳組織のoxygenationの指標として脳内Hb酸素飽和度や総Hb、水の変動を、無呼吸負荷中およびその前後で測定し、多ポイント化により頭皮上よりの測定は硬膜上よりの測定と殆ど差を認めないことを証明した。さらに臨床的的検討として、日令7以内の成熟新生児においては、多ポイント化で求めた脳組織内Hb酵素飽和度(70-80%)やcytochrome coxidaseの酸化型は、受光部を1本で測定した値より高値を示し、特にcytochrome coxidaseをより正確に測定するためには多ポイント化が必要であることが確認された。また新生児仮死における経時的変動も検討した結果、新生児期早期においては脳内総Hb、Hb酸素飽和度やcytochrome coxidaseの酸化型は正常児と比較して高値を示し、以後減少する傾向が確認された。これからは、未熟児においても脳の拡散スペクトルと血圧、血液ガス、脳波などの対比を行い、未熟児における脳内oxygenationのモニターなどとしてこの機器の臨床的意義を確立する。新生児期における低酸素虚血性脳症の予防と管理のみならず未熟児への酸素毒性を回避する的確な酸素投与を行なうための指標として、近赤外線領域の連続NIR spectrum(cNIRS)を利用して、脳組織内の酸素化状態やエネルギー状態を把握する方法を考案した。それは、cNIRSを多ポイント測定し、拡散スペクトルの平坦化の補正、各スペクトルにおける光路長の違いを規格化により、脳組織内のHbO_2/Hbと酸素飽和度(SbO_2)、cytochrome coxidaseのredox state、脳血液量(CBV)を絶対値表示でreal timeに非侵襲的に測定する方法であり、固体間の比較が可能であることを証明した。今回はその近赤外分光測定装置による、脳エネルギー代謝測定の臨床的基礎的検討として、多血症児の部分交換輸血前後での測定及び極低出生体重児を含む早期産児を対象として生後早期の測定と無呼吸発作時における経時的な測定を行った。これらの結果、(1)多血症児の部分交換輸血においては、脳内総Hbは交換輸血後約10%減少した。また動脈血Hctの減少に比例して、直線的に脳内総Hbは減少した。(2)早期産児の日齢0における脳内酸素飽和度は約5075%であったが、生後1時間以内に40%前後の低値を示し、以後増加する症例も認められた。
円単数およびヤコビの和の研究

研究代表者は以前、円分体の類数と円単数の研究の中で次の事実に注目した。fl円分体K(lは奇素数、f≧1はlと互いに素な有理整数)の分岐しない素イデアルΡに対応するヤコビの和Jp(a、b)と或る種の円単数7φεKとの間に法lの合同関係が成立する。本研究で目標としたのは、この合同関係の(1)一般化と(2)応用であった。(1)についてはf>1でΡが完全分解しないとき上記合同関係の精度の改良に成功した。又f【l^n】円分体(n>1)における同様の合同式の成立も部分的に確認できた。(2)に関して、円単数7φとベルヌイ数及び単項イデアルの生成元との間の法lの合同式を導いた。これは巾剰余記号の補充法則やガウスの和のl進表示式を用いて証明されたIwasawa-Mikiの式の一般化であり、別の証明方法で与えられている。更にフェルマ問題の第一の場合への応用を考え、同問題が肯定される一つの十分条件をベルヌイ数で記述したKummerの古典的定理が改良できた。これらの結果の一部を二度口頭発表しそれぞれの報告集に掲載した。詳細は外国の雑誌へ投稿中である。なお研究集会や国際シンボジウムへの参加は極めて有意義であった。本研究はガウスの和の普遍的表示の問題やヴェイユの量指標の導手決定問題と関連しており、その方面の研究者と情報交換や討論ができたからである。一方研究分担者はそれぞれの役割分担された研究目標に関して多くの成果をあげた。特にその中で6名は研究論文を発表、または発表予定であり、その数は合計13編である。
新規なバイオポリエステルの理論的設計を目指した関連酵素の構造-機能研究

ポリヒドロキシアルカン酸(PHA)は微生物によって作られ、また分解されるバイオポリエステルである。モノマーユニットのR-3-ヒドロキシアルカン酸は様々な栄養物から微生物代謝によって作られ、PHA合成酵素によって重合されてPHAポリマーとなる。PHAは細胞内または細胞外に分泌される特異的な微生物酵素によって分解される。マルチドメイン構造を持つPHA分解酵素について、結晶化および構造解析を行った。その結果、単斜晶系に属する棒状結晶が得られ、マルチドメインPHA分解酵素の結晶化に世界に先駆けて初めて成功した。X線回折強度を大型放射光施設SPring-8において測定し、分解能1.7Åの回折強度データを得た。PHA合成酵素について、野生型および変異型酵素を用いて結晶化条件の検討を行った。この酵素は可溶性が低いために結晶化を行うのに問題があったが、添加剤を検討することで可溶性を向上させることができた。しかし、これまでに構造解析に適する高品質の結晶は得られなかった。芳香族化合物をモノマーユニットに持つポリマーの酵素分解を検討するため、4-ヒドロキシフェニル酢酸を分解する酵素について、構造と機能の検討を行った。4-ヒドロキシフェニル酢酸に水酸基を導入する反応を触媒する4-ヒドロキシフェニル酢酸モノオキシゲナーゼの分解能1.66Åにおける結晶構造解析に成功し、この酵素ファミリーにおける特異な酵素機能を初めて明らかにした。本酵素と基質との複合体の構造解析によって、酵素と基質の詳細な相互作用様式を明らかにした。本酵素には基質結合サイトが形成されておらず、コファクター(フラビン)の結合によって引き起こされる構造変化によって形成されることが判った。また不安定なC4a-ヒドロペルオキシフラビン反応中間体の生成および安定化の酵素機構を明らかにした。ポリヒドロキシアルカン酸(PHA)は糖や植物油など再生可能な原料から作られるバイオポリエステルであり、PHA分解酵素により効率よく分解される。3-ヒドロキシブタン酸(3HB)モノマーユニットに対する認識機構を明らかにするため、カビ由来のPHA分解酵素の結晶構造を初めて明らかにした。本酵素は319残基からなり、その構造はα/βhydrolase foldを有していたが、それはこれまで見られていないcircular permutationをした新規なタイプであった。Ser39,Asp121,His155が触媒3残基を構成し、構造上の保存された部位に存在した。このことから、リパーゼ様の加水分解機構によりポリマーを分解することが示唆された。また、オキシアニオンホールはSer40,Cys250の主鎖アミドによって形成されることが判った。分子表面にはポリマー鎖が取り込まれるようにクレバスが形成されていた。クレバス内部は触媒残基の他、主に疎水的なアミノ酸残基で構成され、ポリマー鎖と疎水的相互作用を形成することが示唆された。S39A変異体と3HB3量体メチルエステルとの複合体の構造解析により、Trp307が加水分解を受けるエステル結合の1つ隣のエステル結合のカルボニル酸素を認識することがわかった。また、3HBユニットのメチル基に対する疎水的なポケットが形成され、ポリマー基質の側鎖に対する特異性を規定していた。一方、分子表面のクレバス近傍は疎水的なアミノ酸残基が配置され、疎水的なポリマーの表面に吸着するのに都合が良いことが判った。分解酵素の構造情報はバイオポリエステルの分解性を考慮した設計を行う上で重要であり、以上の結果は、バイオポリエステルへの高い機能性の賦与を目指したバイオポリエステル・エンジニアリングにおいて大きく貢献すると期待される。これまでに、カビ由来のPHA分解酵素の結晶構造を初めて明らかにしている。さらに3-ヒドロキシブタン酸(3HB)3量体メチルエステルとの複合体の結晶構造を明らかにして、ポリマー基質のモノマーユニットに対する認識機構を詳細に検討している。これらの知見を基に様々な変異体を設計し、基質特異性や活性との相関を解析する。本酵素の変異体を数多く作成するには、大腸菌を利用した発現系を確立する必要があるため、本年度は、発現系の構築について検討した。本酵素の遺伝子はそのままでは大腸菌では発現しなかったため、本酵素のDNA配列を大腸菌で使われるコドンに変換したものを作成した。しかしながら、これまで検討した条件では大腸菌での発現は成功しなかった。また、4量体以上のオリゴマー基質に対する構造変化の有無を調べるため、複合体結晶のX線解析を行ったが、複合体としてのデータは得られなかった。生合成におけるモノマー供給酵素R-ヒドラターゼの炭素鎖長認識に関する変異体についても複合体の構造解析を試みた。また、芳香族モノマーのポリマー合成への取り込みを検討するため、芳香族化合物代謝系の酵素の構造解析を行った。4-ヒドロキシフェニル酢酸の代謝において初めに2成分モノオキシゲナーゼが水酸化反応を触媒する。そのリダクターゼ・コンポーネントの構造解析を行い、フラビン・リダクターゼのフラビンに対する親和性の多様性の構造的要因を明らかにした。

その結果、単斜晶系に属する棒状結晶が得られ、マルチドメインPHA分解酵素の結晶化に世界に先駆けて初めて成功した。X線回折強度を大型放射光施設SPring-8において測定し、分解能1.7Åの回折強度データを得た。PHA合成酵素について、野生型および変異型酵素を用いて結晶化条件の検討を行った。この酵素は可溶性が低いために結晶化を行うのに問題があったが、添加剤を検討することで可溶性を向上させることができた。しかし、これまでに構造解析に適する高品質の結晶は得られなかった。芳香族化合物をモノマーユニットに持つポリマーの酵素分解を検討するため、4-ヒドロキシフェニル酢酸を分解する酵素について、構造と機能の検討を行った。4-ヒドロキシフェニル酢酸に水酸基を導入する反応を触媒する4-ヒドロキシフェニル酢酸モノオキシゲナーゼの分解能1.66Åにおける結晶構造解析に成功し、この酵素ファミリーにおける特異な酵素機能を初めて明らかにした。本酵素と基質との複合体の構造解析によって、酵素と基質の詳細な相互作用様式を明らかにした。本酵素には基質結合サイトが形成されておらず、コファクター(フラビン)の結合によって引き起こされる構造変化によって形成されることが判った。また不安定なC4a-ヒドロペルオキシフラビン反応中間体の生成および安定化の酵素機構を明らかにした。
ソマトスタチン受容体の構造解析と発現調節機構、ならびに臨床的意義に関する研究

ヒト胎盤膜より調製した膜分画より10mMCHAPSを用いて受容体蛋白の可溶化を行った。標識ソマトスタチンと可溶化受容体のクロスリンクを行うと、SDS-PAGEでは複数のバンドを認め、ゲル濾過では660Kd以上の高分子として溶出された。次にヒト、ブタのソマトスタチン受容体遺伝子のPCR-クローニングを行った。得られたプローブによるサザーンブロットで、ヒト1型受容体はEcoRIで20Kb,PstIで2.7Kb,BamHIで7Kbの一本のバンドを認め、ヒト2型受容体ではEcoRIで30Kb,PstIで11Kb,BamHIで30Kbの一本のバンドを認め、いずれもシングルコピー遺伝子と考えられた。ブタ遺伝子ライブラリーのスクリーニングにより得られたブタ2型受容体遺伝子は1107bpのopen reading frameをもち、369アミノ酸残基の蛋白をコードしていた。ブタ2型受容体は7カ所の疎水性領域を有し、7回膜貫通型のG蛋白共役受容体に属すと考えられ、この型の受容体に特徴的な第二細胞内ループのAsp-Arg-Tyr構造、Cys残基の配置ならびに糖鎖結合部位が認められた。受容体の発現の検討では、正常組織では1型受容体は胃、腸に、2型受容体は下垂体、大脳、リンパ球で高い発現を認めた。各種内分泌組織における検討ではバセドウ病甲状腺、甲状腺腺腫、甲状腺乳頭癌で2型受容体の強い発現を認め、甲状腺髄様癌、褐色細胞腫で1型受容体の強い発現を認めるなど、受容体のサブタイプの発現は個々の症例により相違が認められた。腫瘍におけるソマトスタチン受容体遺伝子変異をSSCPとTGGEを用いて調べた結果、甲状腺腺腫1例、腺腫様甲状腺腫1例、甲状腺乳頭癌2例、副甲状腺腺腫1例、ACTH産生細胞株1例に移動度の異なるバンドを認め、塩基配列を決定したところ、2型受容体のコドン188にミスセンス変異が同定された。ヒト胎盤膜上にソマトスタンチン受容体の存在をレセプターアッセイとクロスリンクを用いて確認し、その精製を行い、次の成績を得た。1.ヒト胎盤より膜分画を調製し、Triton X-100. CHAPS,digitonin,cholic acidなどの各種界面活性剤で可溶化された分画と^<125>I標識ソマトスタチンを用いた結合実験では、10mM CHAPSによりソマトスタチン結合能を有する蛋白が可溶化され、可溶化蛋白への標識ソマトスタチンの結合は非標識ソマトスタチンにより阻害された。2.膜分画と標識ソマトスタチンを架橋剤を用いてクロスリンクを行うと、SDS-PAGE上、約60Kdと約30Kdの2本のバンドを認めた。3.膜分画へ標識ソマトスタチンをクロスリンクし、界面活性剤により可溶化後、非変性下の条件で行ったゲルろ過では、この蛋白は660Kd以上の高分子として溶出されたが、凝集塊を形成していることが考えられ変性化の条件で検討中である。4.受容体蛋白をアフィニティカラムとWGAカラムにより銀染色上ほぼ単一のバンドにまで精製した。今後、得られた蛋白の純度を等電点電気泳動、2次元電気泳動、HPLCにより確認した後、気相シーケンサーを用いてそのアミノ酸配列を決定し、クローニングのためのDNAプローブを作成する。

5.一方、ヒト膵ソマトスタチン受容体cDNAがG蛋白連結受容体のアミノ酸配列の相同性を用いてクローニングされたため、その情報を基にPCRにより受容体遺伝子の断片を増幅し、これをプローブとして、胎盤より抽出したmRNAを用いてOKayama-Berg法により作成したcDNAライブラリーのスクリーニングを行っている。相同性を用いて得られた受容体遺伝子と蛋白の1次構造の情報を基に得られる受容体遺伝子が同一のものであるか、また膵、下垂体、胎盤などの各組織に発現している受容体遺伝子に構造的差異が存在するかは興味深い重要な点であり、詳細に検討を加える予定である。ヒト胎盤膜より調製した膜分画より10mM-CHAPSを用いて受容体蛋白の可溶化を行った。標識ソマトスタチンと可溶化受容体のクロスリンクを行うと、SDS-PAGEでは複数のバンドを認め、ゲル濾過では660Kd以上の高分子として溶出された。次にヒト、ブタのソマトスタチン受容体遺伝子のPCRクローニングを行った。得られたプローブによるサザーンブロットで、ヒト1型受容体はEcoRIで20Kb,PstIで2.7Kb,BamHIで7Kbの一本のバンドを認め、ヒト2型受容体ではEcoRIで30Kb,PstIで11Kb,BamHIで30Kbの一本のバンドを認め、いずれもシングルコピー遺伝子と考えられた。ブタ遺伝子ライブラリーのスクリーニングにより得られたブタ2型受容体遺伝子は1107bpのopen reading frameをもち、369アミノ酸残基の蛋白をコードしていた。ブタ2型受容体は7カ所の疎水性領域を有し、7回膜貫通型のG蛋白共役受容体に属すと考えられ、この型の受容体に特徴的な第二細胞内ループのAsp-Arg-Tyr構造、Cys残基の配置ならびに糖鎖結合部位が認められた。受容体の発現の検討では、正常組織では1型受容体は胃、腸に、2型受容体は下垂体、大脳、リンパ球で高い発現を認めた。各種内分泌組織における検討ではバセドウ病甲状腺、甲状腺腺腫、甲状腺乳頭癌で2型受容体の強い発現を認め、甲状腺髄様癌、褐色細胞腫で1型受容体の強い発現を認めるなど、受容体のサブタイプの発現は個々の症例により相違が認められた。腫瘍におけるソマトスタチン受容体遺伝子変異をSSCPとTGGEを用いて調べた結果、甲状腺腺腫1例、腺腫様甲状腺腫1例、甲状腺乳頭癌2例、副甲状腺腺腫1例、ACTH産生細胞株1例に移動度の異なるバンドを認め、塩基配列を決定したところ、2型受容体のコドン188にミスセンス変異が同定された。
NLE(NBCA、Lipiodol、Ethanol)を用いたブタ門脈塞栓研究

経皮経肝門脈塞栓術(PTPE)は、術後肝不全を防ぐために広く行われている。従来の塞栓物質としてはゼラチンスポンジ、金属コイルなどが使用されている。一方、我々は、NBCAにLipiodolと無水エタノールを混和撹拌した混合液、NLEを開発し、基礎的・臨床的研究を行ってきた。今回、豚門脈を塞栓し、NLEは、NBCAの塞栓性とエタノールによる血管内皮障害作用などの相乗効果により、従来の塞栓物質よりも再開通の防止及び残肝体積の増加の促進が期待できるのか、およびバルーンカテーテルとの接着が本当になく安全に手技を施行できるのかを明らかにすることを主眼とする。
胃酸分泌の制御に関する細胞生化学的研究

1.胃酸分泌酵素の2種のサブユニット(αとβ)は協調的に合成され、酸分泌の昂進時には細胞膜(頂端膜)からなる分泌細管に、抑制時には細胞内管状小胞に局在化する。この細胞内移行の経路を明らかにするため、酵素を培養細胞に発現させる系を構築した。αサブユニットのアミノ末端約70残基に対応する部位特異的抗体、および、βサブユニットを特異的に認識する抗体を作成し実験に供した。両サブユニットのcDNAを発現ベクターに挿入し、培養細胞(Cos1細胞)に導入した。酵素の一過的発現に成功したので、アミノ末端領域に位置しリン酸化されるTyrをPheに置換したαサブユニットの発現プラスミドを構築し、細胞内局在性に及ぼす効果を検討することが可能になった。2.上記発現プラスミドから安定に胃酸分泌酵素を発現する、CHO-K1細胞株を樹立した。それらは、ウアバイン非感受性の増殖を示す。このことは、構造と機能が良く似たNa^+ポンプのかわりに胃酸分泌酵素が働いていることを示唆しており、胃潰瘍の薬の検定系が確立したと考えている。3.胃酸分泌酵素のサブユニット遺伝子が共通の転写制御を受けているのかを明らかにするため、ラットのαとβサブユニット遺伝子の推定調節領域(5'上流配列)をレポーター遺伝子(ルシフェラーゼ)に連結し、プロモーター領域を同定した。レポーター遺伝子をHeLa細胞株に導入した時の転写量は、申請者が発見した新しいDNA結合蛋白質(GATA-GT1またはGATA-GT2)を同時に発現させたときに増加した。部位特異的な変異導入を行った結果、TATA-boxに最も近いGATA蛋白質結合部位が転写の活性化に重要なことが明らかになった。これらの知見は、両サブユニット遺伝子がGATA-DNA結合蛋白質によって共通に転写活性化を受けることを示唆している。胃酸分泌酵素(αとβ)サブユニットの生合成および細胞内局在性の分子機構を検討するため、サブユニットに対するcDNAを培養細胞に発現させる実験系が必要である。そこで、ブタのβサブユニットに対するcDNAを高発現可能な発現プラスミドpcDL-SRαに挿入し、Cos-1細胞に導入した。その結果、βサブユニットに相当するバンドをウエスタンブロッテイングにより検出することができた。この結果から、βサブユニットだけでも安定に細胞内に発現することができるという報告を確認することができた。αサブユニットについては、最終的な発現プラスミドを作成する前に二本のcDNAを連結する操作が必要であり、これを進めている。胃酸分泌酵素のサブユニット遺伝子が共通の転写制御を受けているのかを明らかにする目的で、αとβサブユニット遺伝子の推定調節領域(5′上流配列)をレポーター遺伝子(ルシフェラーゼ)に連結し、転写に重要な領域を同定した。代表者が発見したDNA結合蛋白質(GATA-GT1とGATA-GT2)が存在すると、レポーター遺伝子の発現量が増加するので、GATA-GT1とGATA-GT2が両サブユニット遺伝子の転写に関与していることが示唆された。また、RNAポリメラーゼが結合する部位のすぐ上流にあるGATA蛋白質の結合部位が転写活性化に必須であることが明らかになった。ヒト胃ガン細胞MKN-45細胞はH2受容体を発現しており壁細胞様形態も示すことから、この細胞に着目してcDNAライブラリーを構築してスクリーニングし、ヒトGATA-GT1のクローンを得ることができた。1.胃酸

分泌酵素の2種のサブユニット(αとβ)は協調的に合成され、酸分泌の昂進時には細胞膜(頂端膜)からなる分泌細管に、抑制時には細胞内管状小胞に局在化する。この細胞内移行の経路を明らかにするため、酵素を培養細胞に発現させる系を構築した。αサブユニットのアミノ末端約70残基に対応する部位特異的抗体、および、βサブユニットを特異的に認識する抗体を作成し実験に供した。両サブユニットのcDNAを発現ベクターに挿入し、培養細胞(Cos1細胞)に導入した。酵素の一過的発現に成功したので、アミノ末端領域に位置しリン酸化されるTyrをPheに置換したαサブユニットの発現プラスミドを構築し、細胞内局在性に及ぼす効果を検討し始めた。2.上記発現プラスミドから安定に胃酸分泌酵素を発現する、CHO-K1細胞株を樹立した。それらは、ウアバイン非感受性の増殖を示す。このことは、構造と機能が良く似たNa^+ポンプのかわりに胃酸分泌酵素が働いていることを示唆しており、胃潰瘍の薬の検定系が確立したと考えている。3.胃酸分泌酵素のサブユニット遺伝子が共通の転写制御を受けているのかを明らかにするため、ラットのαとβサブユニット遺伝子の推定調節領域(5'上流配列)をレポーター遺伝子(ルシフェラーゼ)に連結し、プロモーター領域を同定した。レポーター遺伝子をHeLa細胞に導入した時の転写量は、申請者が発見した新しいDNA結合蛋白質(GATA-GT1またはGATA-GT2)を同時に発現させたときに増加した。部位特異的な変異導入を行った結果、TATA-boxに最も近いGATA蛋白質結合部位が転写の活性化に重要なことが明らかになった。これらの知見は、両サブユニット遺伝子がGATA-DNA結合蛋白質によって共通に転写活性化を受けることを示唆している。
網膜色素上皮でのリポ蛋白・アミロイドβの機能の解明と加齢黄斑変性の治療への応用

加齢黄斑変性は視覚障害に関わる重大な疾患である。加齢黄斑変性前駆病変である網膜色素上皮(RPE)下のドルーゼン内部にアミロイドβの局在を認め、病態への関与が示唆されている。また、加齢性に沈着する脂質はRPE由来であることがわかっている。RPE細胞の3次元球体培養を行うと、RPE球状塊は、内部のアポトーシスを起こした成分を表層のRPEが貪食、処理して、表面にリポ蛋白の排泄を観察することができる。アミロイドβ産生をβおよびγセクレターゼ阻害剤により阻害すると、リポ蛋白の排泄が少なく、表面は平滑でエラスチンの発現も低下していて、リポ蛋白の排泄にはブルッフ膜のリモデリングが不可欠であると推測された。加齢黄斑変性は成人失明の第4位であり、増加傾向にある、重大な疾患である。加齢黄斑変性の特徴的な前駆病変として、網膜色素上皮(RPE)の直下に沈着するドルーゼンが重要であるが、ドルーゼンの内部にはアルツハイマー病の老人斑に認めるアミロイドβが存在していて、加齢黄斑変性との関連が示唆されている。また、加齢性変化として、ドルーゼンやブルッフ膜内には脂質の沈着を認め、脂質の由来は、網膜色素上皮(RPE)細胞が産生するリポ蛋白であることがわかってきている。我々は、網膜色素上皮細胞の3次元球体培養を用いて、RPEのリポ蛋白産生機能とアミロイドβの関連の解明を行う。ヒトRPE細胞を96穴丸底培養皿にてメチルセルロース添加培養液で培養して、1層のRPEを表層にもつ球状塊を作成した。RPE球状塊は、内部のアポトーシスを起こした成分を表層のRPEが貪食、処理して、表面にリポ蛋白を排泄しながら縮小化が観察できる。アミロイドβ産生にはアミロイド前駆蛋白のβおよびγセクレターゼによる分解が必要であるが、各セクレターゼ阻害剤を培養液に混ぜ、経時的に光学顕微鏡にて細胞球の直径の計測およびリポ蛋白の排泄の有無や形態の観察を行ったところ、各セクレターゼ阻害剤で処理した細胞塊の直径はコントロール群に比べて観察期間を通じて大きく、リポ蛋白の排泄が少なく、表面は平滑であった。このように、セクレターゼ阻害剤でアミロイドβ産生を阻害すると、リポ蛋白排泄は低下し、アミロイド前駆蛋白とリポ蛋白排泄の関与が示唆された。加齢黄斑変性は成人失明の原因疾患の第4位であり、近年、増加傾向にある、重大な疾患である。我々は、網膜色素上皮細胞の3次元球体培養を用いて、RPEのリポ蛋白産生機能とアミロイドβの関連の解明を行っている。アミロイドβ産生をβおよびγセクレターゼ阻害剤により阻害すると、細胞球からのリポ蛋白の排泄が少なく、表面は平滑であった。リポ蛋白の主要構成成分であるapoEの発現低下と共に、ブルッフ膜の主要構成成分であるエラスチンの発現も低下していた。大型のリポ蛋白の排泄にはブルッフ膜のリモデリングが不可欠であると推測され、これはリポ蛋白とブルッフ膜の構成成分の発現低下が同調していることからも支持される。加齢黄斑変性は我が国の視覚による身体障害の原因疾患の第4位である重大な疾患である。加齢黄斑変性前駆病変として、網膜色素上皮(RPE)下に発生する脂質に富んだドルーゼンは発症リスクとして重要であるが、内部にアミロイドβの局在を認め、アルツハイマー病の老人斑と類似していて、病態への関与が示唆されている。また、加齢性変化であるドルーゼンやブルッフ膜内に沈着する脂質の由来は、RPE細胞が産生するリポ蛋白であることがわかってきている。我々は、RPE細胞の3次元球体培養を用いて、RPEのリポ蛋白産生機能とアミロイドβの関連の解明を行っている。アミロイドβ産生をβおよびγセクレターゼ阻害剤により阻害すると、細胞球からのリポ蛋白の排泄が少なく、表面は平滑でブルッフ膜の主要構成成分であるエラスチンの発現も低下していた。リポ蛋白とブルッフ膜の構成成分の発現低下が同調していることから、大型のリポ蛋白の排泄にはブルッフ膜のリモデリングが不可欠であると推測された。

ブルッフ膜の生成過程では、まずRPE細胞の葉状仮足の伸展が重要であることが考えられ、血清の高カルシウム濃度が関与していることが示唆された。今後もブルッフ膜形成過程と脂質代謝の関連について調査を進める。加齢黄斑変性は視覚障害に関わる重大な疾患である。加齢黄斑変性前駆病変である網膜色素上皮(RPE)下のドルーゼン内部にアミロイドβの局在を認め、病態への関与が示唆されている。また、加齢性に沈着する脂質はRPE由来であることがわかっている。RPE細胞の3次元球体培養を行うと、RPE球状塊は、内部のアポトーシスを起こした成分を表層のRPEが貪食、処理して、表面にリポ蛋白の排泄を観察することができる。アミロイドβ産生をβおよびγセクレターゼ阻害剤により阻害すると、リポ蛋白の排泄が少なく、表面は平滑でエラスチンの発現も低下していて、リポ蛋白の排泄にはブルッフ膜のリモデリングが不可欠であると推測された。3年間で行う研究計画の2年目としての結果が得られている。眼科今後、リポ蛋白の主要成分であるapoE以外にapoB-100の局在を免疫染色にて、発現量をウェスタンブロットにて評価を行う。また、ブルッフ膜の主要構成成分として、エラスチンの他、1型および4型コラーゲンの局在、発現量の評価も行う。3年間で行う研究計画の1年目としての結果が得られている。端数が生じたため、27年度分とした。今後、リポ蛋白の排泄の変化を確認するため、リポ蛋白の主要成分であるアポB-100の局在を免疫染色にて、発現量をウェスタンブロットにて評価を行う。また、リポ蛋白排泄に伴って必然的な機能としてブルッフ膜のリモデリングが行われていると考えられるが、ブルッフ膜の主要構成成分のエラスチンの局在、発現量の評価も行う。27年度分と合わせて、実験試薬を購入する。端数の残高少額にて次年度の使用計画の変更はない
超伝導導体と層間絶縁物の複合構造による非線形挙動の研究

強磁場利用機器は超伝導性能を生かすために、極低温下で使用される場合が多いため、構造材料の極低温下での材料の物性値および性質の変化について注目されている。また、超伝導コイルを構成する導体、層間絶縁物が受ける力は一般に圧縮力であり、これらの組み合わせ構造に依存する力学的挙動の解明が重要である。超伝導コイルは超伝導導体と絶縁物のそれぞれ複合部材どうしが組み合わされたものであり、その剛性、強度といった力学的挙動の評価は単一材料の構造物に比べて容易ではない。本研究では、超伝導導体と絶縁物の使用温度すなわち、極低温下での力学的挙動を明らかにするために、超伝導導体と絶縁物の機械的強度実験を行い、これと並行して異方性を考慮した弾性解析を実施することにより、上記の項目を実験的、解析的に明らかにした。実験は実際に大型ヘリカル装置の超伝導ヘリカルコイルで使用されている超伝導導体と絶縁物を用意し、これらを6列並べたものをさらに6段積み重ねた構造のサンプルを製作し圧縮荷重による荷重と変位の関係を測定した。この構造は実際のコイル構造を模擬して決定した。実験は常温および液体ヘリウム中で行った。実験結果より荷重と変位の間には荷重が高くなるほど剛性が高くなる傾向があり、この非線形性は超伝導導体と絶縁物間の接触率による影響であるとの仮定のもとに有限要素法による解析を行った。モデルには初期には非接触状態の接点が変位により、ある要素の接点間を結ぶ線を突き抜けた場合に、接触力に相当する反力がその接点に発生する方法によった。この結果実験と解析はよく一致し、コイル構造における導体と絶縁物間の接触が全体の剛性に与える影響が明らかになった。