hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多細胞シアノバクテリアが持つ水陸両用運動装置の解明

Arthrospira platensis(通称:スピルリナ)は、多細胞の繊維状シアノバクテリアである。この生物は水中を移動することができ、また、陸上でもスムーズな滑走運動を行うことができる。この生物の個体は数百個の細胞が1列に並んで形成されているが、細胞の表面には線毛や鞭毛のような構造は見られず、これらの細胞が、どのようにして協調してスムーズな個体の運動をもたらしているのかは謎である。この生物を用いて、環境条件を変えた際の運動の解析や、形態が物理的あるいは遺伝的に改変された個体を用いた運動の解析を行い、この生物の滑走運動に影響を与える環境要因と構造的要因を明らかにした。また、運動機能に欠損が生じて動くことができなくなった突然変異体を、効率よく選別する系を確立した。さらに、得られた突然変異体の1つについて、復帰突然変異が比較的高頻度で生じることを見出し、その株を用いて複数株の復帰突然変異体を単離した。これらの復帰突然変異体とその親株は、運動に関わる遺伝子のみに遺伝子構造の違いがある可能性が高く、突然変異の原因遺伝子の同定に有効であると期待される。A. platensisは増殖の過程で酸性多糖を多量に分泌するため、ゲノムDNAを調製する際にゲノム標品に多量の酸性多糖が混入する傾向がある。それらの酸性多糖はDNAの調製の際にDNAと類似した挙動を示すことが多いため、従来、DNA標品から簡便に除去することは困難だった。このような酸性多糖がゲノムDNAの標品に含まれていると、塩基配列の解析などを妨げることがある。この問題を解決する過程で、有機溶媒による抽出を組み合わせることで比較的簡単に酸性多糖を除去できることを見出した。この手法は、この生物でゲノム塩基配列の解析を行う際に有効であると考えられる。運動機能に欠損を持つ突然変異体の単離法に改良を加えて、運動機能に関する突然変異体を極めて効率よく分離する手法を開発することができた。その系では、運動機能が回復した復帰突然変異体についても効率よく単離でき、突然変異体を用いた運動機能の解析を効率化できるようになった。また、A. platensisのゲノムDNAを調製する際にゲノム標品に混入する酸性多糖を、効率よく除去できる抽出条件を見出した。条件はもう少し検討する余地があるが、今後、改良された条件を用いて、A. platensisのゲノム解析を効率化できるものと期待できる。また、機能欠損の原因遺伝子の同定には遺伝子の導入による相補実験が有用であるが、A. platensisは多数の制限酵素を持っており、それらが、細胞に導入された外来DNAを分解してしまう。細胞抽出液にどのような種類の制限酵素が含まれているかを解析し、その一部について塩基配列特異性を決定した。運動機能の欠損の原因遺伝子の同定については進行中であるが、種々の実験手法の整備を進めることができ、研究はおおむね順調に進展している。突然変異体のゲノム塩基配列を次世代シークエンサーで決定し、親株(野生株)のゲノム塩基配列と比較することにより、運動に関わる遺伝子の候補を絞り込む。候補が絞り込めたら、それらの野生型の遺伝子を突然変異体に導入し、表現型を相補できるかどうか調べる。動けない突然変異体の表現型を相補できれば、その遺伝子が運動に関わる遺伝子産物をコードしていることが確定できるはずである。このような実験により、運動装置を構成するタンパク質の遺伝子を同定していく。なお、この生物は内在性の制限酵素を持っているため外来のDNAの導入効率が極端に低いが、相補実験にはDNAの導入が必要なため、その効率の改善も並行しておこなっていく。

運動機能に欠損を持つ突然変異体の単離法に改良を加えて、運動機能に関する突然変異体を極めて効率よく分離する手法を開発することができた。その系では、運動機能が回復した復帰突然変異体についても効率よく単離でき、突然変異体を用いた運動機能の解析を効率化できるようになった。また、A. platensisのゲノムDNAを調製する際にゲノム標品に混入する酸性多糖を、効率よく除去できる抽出条件を見出した。条件はもう少し検討する余地があるが、今後、改良された条件を用いて、A. platensisのゲノム解析を効率化できるものと期待できる。また、機能欠損の原因遺伝子の同定には遺伝子の導入による相補実験が有用であるが、A. platensisは多数の制限酵素を持っており、それらが、細胞に導入された外来DNAを分解してしまう。細胞抽出液にどのような種類の制限酵素が含まれているかを解析し、その一部について塩基配列特異性を決定した。運動機能の欠損の原因遺伝子の同定については進行中であるが、種々の実験手法の整備を進めることができ、研究はおおむね順調に進展している。突然変異体のゲノム塩基配列を次世代シークエンサーで決定し、親株(野生株)のゲノム塩基配列と比較することにより、運動に関わる遺伝子の候補を絞り込む。候補が絞り込めたら、それらの野生型の遺伝子を突然変異体に導入し、表現型を相補できるかどうか調べる。動けない突然変異体の表現型を相補できれば、その遺伝子が運動に関わる遺伝子産物をコードしていることが確定できるはずである。このような実験により、運動装置を構成するタンパク質の遺伝子を同定していく。なお、この生物は内在性の制限酵素を持っているため外来のDNAの導入効率が極端に低いが、相補実験にはDNAの導入が必要なため、その効率の改善も並行しておこなっていく。ゲノムの塩基配列の決定がまだ途上のため次年度使用額が生じた。翌年度に塩基配列の解析費として使用する予定である。
海岸侵食を伴う流路変動機構の解明と予測手法の構築

本研究は,河岸侵食とそれに伴う流路変動に対して,その機構を解明し,的確に予測する手法を確立することを目的としており,まず河岸の侵食と流路変動の実験を行い,さらにそこで得られた資料をもとに,侵食位置,侵食速度等の予測が可能なモデルを構築した.以下,それぞれについて主要な成果を述べる.(1)河岸侵食・流路変動の水理実験これまでの河床変動実験は固定壁を用いたものが多く,河岸侵食現象を考えるにあたっては,河岸侵食速度と水理量との関係等明らかにすべき点が残されていた.そこで本研究では,侵食性河岸を有する蛇行流路を対象に水理実験を行い,流速分布、河岸位置等の時間変化を詳細に計測し,予測モデル構築に際して必要となる知見を集積した.さらに,流量,河床勾配,流路平面形状等を変化させ,複数ケースの実験を行うことにより,水理条件の相違により流路変動形態はいくつかのパターンに分類されることを指摘するとともに,その原因について検討を行った.(2)河岸侵食・流路変動の予測モデルの開発(1)の実験で得られた知見をもとに河岸侵食の間欠性を考慮した侵食過程をモデルに取り入れ、河岸侵食、流路変動の予測モデルを開発した。ここで開発したモデルは,河岸侵食に伴う河岸線の移動による計算対象領域の時間的変化に対応できるように,移動一般座標系を用いている.また,河岸侵食過程においては,特に水際近傍で流砂の非平衡性に卓越することを指摘し,平面2次元的な流砂の非平衡現象のモデル化を行った.以上の特徴を有するモデルを,(1)で行った流路変動実験に適用し,計算結果と実験結果を比較した結果,モデルの妥当性が確認された.本研究は,河岸侵食とそれに伴う流路変動に対して,その機構を解明し,的確に予測する手法を確立することを目的としており,まず河岸の侵食と流路変動の実験を行い,さらにそこで得られた資料をもとに,侵食位置,侵食速度等の予測が可能なモデルを構築した.以下,それぞれについて主要な成果を述べる.(1)河岸侵食・流路変動の水理実験これまでの河床変動実験は固定壁を用いたものが多く,河岸侵食現象を考えるにあたっては,河岸侵食速度と水理量との関係等明らかにすべき点が残されていた.そこで本研究では,侵食性河岸を有する蛇行流路を対象に水理実験を行い,流速分布、河岸位置等の時間変化を詳細に計測し,予測モデル構築に際して必要となる知見を集積した.さらに,流量,河床勾配,流路平面形状等を変化させ,複数ケースの実験を行うことにより,水理条件の相違により流路変動形態はいくつかのパターンに分類されることを指摘するとともに,その原因について検討を行った.(2)河岸侵食・流路変動の予測モデルの開発(1)の実験で得られた知見をもとに河岸侵食の間欠性を考慮した侵食過程をモデルに取り入れ、河岸侵食、流路変動の予測モデルを開発した。ここで開発したモデルは,河岸侵食に伴う河岸線の移動による計算対象領域の時間的変化に対応できるように,移動一般座標系を用いている.また,河岸侵食過程においては,特に水際近傍で流砂の非平衡性に卓越することを指摘し,平面2次元的な流砂の非平衡現象のモデル化を行った.以上の特徴を有するモデルを,(1)で行った流路変動実験に適用し,計算結果と実験結果を比較した結果,モデルの妥当性が確認された.
重力波源のX線対応天体の検出と位置決定を目指したMAXI-NICER連携の構築

国際宇宙ステーション(ISS)に搭載された全天X線監視装置(MAXI)から同じくISSに搭載されたX線望遠鏡NICERへの宇宙ステーション上での速報の伝達と追跡観測を可能にするソフトウエアシステムの開発と、宇宙ステーションでの実証試験を行った。試験の結果、それまでに開発したソフトウエアではいくつかの問題があることが判明し、どの部分にどのような不備があるのか、試験で得られたデータを解析した。この結果から、今後どのように修正を行い、どのようにさらなる試験を行うかの計画を立てることが可能になった。また、ISS上でMAXIからNICERへの速報が可能になることで期待される科学的な成果やその意義について、海外の研究会で発表し、関係する研究領域の研究者からの理解を得られた。海外の研究者からの期待の声も聞くことができ、あらためて本研究の重要性を確認することができた。本研究では、MAXIで観測される起源の不明な突発天体現象と重力波との関連を調査することも研究の一部としている。2019年春から開始される重力波の第3期の観測に先立って、重力波が観測された際に、その到来方向にX線での突発天体が出現したかどうかを確認するための自動解析システムの構築を行った。また、解析結果を国際的なネットワークに発信するための体制についても検討を勧めた。これまで(2015年の第1期・2017年の第2期)の重力波観測でもMAXIによるX線対応天体の探査の結果(すべて上限値)を報告してきたが、それらと比較してより迅速に解析結果を報告できる枠組みが整った。2019年度中に、開発したソフトウエアシステムの実運用を開始する予定であったが、先に述べた試験によりまだ不備があることがわかった。今後も修正等が必要であり、修正後の試験も行わなければならない。したがって運用の開始時期も未定である。ソフトウエアシステムの開発が終了せず、運用が開始できないことで、当初予定していた本システムを用いた観測をこの研究期間内に行うことは難しくなった。ソフトウエアシステムの開発の中心は研究者からメーカーへと移っているため、こちらで行えることは多くない。そこで、今後は現在の地上システムを用いた観測・速報による成果をまとめることを中心に研究を行う。具体的には、これまでに観測した未同定の突発天体の解析結果の論文化、より効率的に地上での解析を行うためのコンピュータ(ハードウエア、ソフトウエアを含む)の整備、重力波対応天体の探査などを中心に行う。国際宇宙ステーションに搭載されている全天X線監視装置MAXIを用いて重力波の観測を行った。2017年度は重力波観測装置の2度目の観測期間と重なっており、観測された重力波天体の到来方向を観測したMAXIのデータを調査し、対応天体の有無を調べた。残念ながらいずれの重力波についてもX線の対応天体を発見することはできなかったが、対応天体の明るさの上限を得ることができた。とくに多波長で対応天体が観測された重力波イベントGW170817については、他のX線望遠鏡が観測したより早い時間帯に観測をおこなうことができており、明るいX線天体が現れなかったことを明らかにすることができた。また、2017年度にMAXIは4つの新天体を発見し、これらに関して速報を行った。本研究の最終目標である、軌道上での自動速報ではないが、地上で人を介してnicerに依頼し、追跡観測を実現することができた。このことは、本研究で必要となる、突発天体の発見と速報が地上では実現できていることを示している。このシステムを改良して機上でも運用できるようにすることが、本研究の目的である。ソフトウエアの修正に関しては、いくつかあるソフトウエアの各々の機能を軌道上用にいかに簡略化するかについて、研究協力者と相談し、簡単なテストを行うことで、実現可能なことを明らかにした。また、実際軌道上に配置するコンピュータの準備については、2017年度に実装をお願いする業者の選定が済み、どのような変更を行うのかを明らかにして、すでに作業を進ている。研究計画の段階では、2017年度にはソフトウエアの設計とインストール作業を予定していた。現時点でソフトウエアの設計は予定通り終了しており、現在はソフトウエアの作成を業者に進めてもらっている。作業は作成終了後のテストを含めて今後数ヶ月と予定されており、今年度のうちにはすべて終了することができる。軌道上へのインストールと運用開始は2018年度を予定していたので、打ち上げ時期が流動的ではあるが、概ね予定通りであると考えている。

2019年春から開始される重力波の第3期の観測に先立って、重力波が観測された際に、その到来方向にX線での突発天体が出現したかどうかを確認するための自動解析システムの構築を行った。また、解析結果を国際的なネットワークに発信するための体制についても検討を勧めた。これまで(2015年の第1期・2017年の第2期)の重力波観測でもMAXIによるX線対応天体の探査の結果(すべて上限値)を報告してきたが、それらと比較してより迅速に解析結果を報告できる枠組みが整った。2019年度中に、開発したソフトウエアシステムの実運用を開始する予定であったが、先に述べた試験によりまだ不備があることがわかった。今後も修正等が必要であり、修正後の試験も行わなければならない。したがって運用の開始時期も未定である。今後、8月頃までにソフトウエアの開発とテストを進めてもらう。開発中には専門的な知識も必要となるので、必要に応じて助言を行う予定である。国際宇宙ステーションへの装置の設置については、今後の交渉次第の部分もあり、現時点でははっきりしないが、これがうまくいかない場合にも、現状でできている、地上経由での速報と追跡観測を継続し、これをより迅速に行えるようにすることで、できるかぎりの成果を得たい。ソフトウエアシステムの開発が終了せず、運用が開始できないことで、当初予定していた本システムを用いた観測をこの研究期間内に行うことは難しくなった。ソフトウエアシステムの開発の中心は研究者からメーカーへと移っているため、こちらで行えることは多くない。そこで、今後は現在の地上システムを用いた観測・速報による成果をまとめることを中心に研究を行う。具体的には、これまでに観測した未同定の突発天体の解析結果の論文化、より効率的に地上での解析を行うためのコンピュータ(ハードウエア、ソフトウエアを含む)の整備、重力波対応天体の探査などを中心に行う。当初はNASA側との打ち合わせのため、海外出張の費用を計上していた。しかし、別の出張者が別の機会にNASAを訪れた時にMAXIとnicerの連携についても打ち合わせの機会をもつことができたり、逆にNASAから日本への出張者と打ち合わせの機会をもつことができたため出張は不要となった。今後も打ち合わせのための出張は必要ないと考えられるため、MAXIの地上速報とデータ整理用のデータベースの整備にあてる計画である。速報とデータ整理用のデータベースの構築のために計上していた部分は、別の資金によりまかなうことができたため不要となった。しかし、それとは別に以前から使用していたデータ解析用のサーバが老朽化し、使いにくくなってきたため、これに替わる計算機を新たに購入する予定である。
メソ多孔化炭素・金属酸化物ハイブリッド電極を用いるスーパーキャパシタの開発

活性炭、カーボンシルク、ダイヤモンド電極(BDD電極)のそれぞれに、Coナノ粒子を担持し、水素気流中で加熱することによって5100nmの細孔と溝を、ほぼ制御して形成させるボことに成功した。この多孔化により、スーパーキャパシタ用活性炭のキャパシタンスの向上と金属酸化物の強固な担持が可能となる。また、活性炭の場合には、Coナノ粒子が掘削した跡に数層のグラファイト層が形成されることを見出した。このグラファイト層生成メカニズムのモデルを提案した。表面の部分グラファイト化により、活性炭の電気伝導率が向上し、キャパシタ特性の向上に繋がると予想される。活性炭およびBDD表面層に金属ナノ(Co, Ni, Pt)粒子を担持した場合、加熱温度(800-1000°C)を制御することにより、金属超微粒子を半ば埋め込むことができた。BDDを用いることにより、金属ナノ粒子による炭素材料の多孔化の様子(細孔の掘削挙動)を明確にでき、多孔化した表面の静電容量の増加の様子を明確にすることができた。メソポーラスおよびマクロポーラスなRuO_2の合成に成功した。また、小型燃料電池とハイブリッドさせるため、ルテニウム酸チノシートを泳動電着で電極面にキャストし、その電極を用いたマイクロスーパーキャパシタのを試作した。1.炭素材料のメソ多孔化(細孔径、ナノチャンネル径制御法の確立)活性炭、カーボンブラック、HOPG(高配向性熱分解グラファイト)にコバルト、ニッケル、鉄、白金、ルテニウムなどの金属ナノ粒子を担持し、水素と窒素の混合気流中で加熱すると、230nmの細孔や溝(ナノチャンネル)を形成させることが出来ることを見出した。この反応は金属ナノ粒子の触媒作用により、水素と炭素材料が反応してメタンを生成することによる。白金以外のこれら金属超ナノ粒子は硫酸などの強酸で容易に溶解除去することができた。HOPGを用いたのは、金属ナノ粒子が炭素材料(グラファイト)を掘削する挙動を明確にするためである。この実験により、約20nmより小さなサイズの金属ナノ粒子は炭素結晶の原子配列に影響され直線的ナノチャンネルを形成することが明確になった。活性炭の場合には金属ナノ粒子はランダムに掘削し、かつ、メソ孔率が高くなることがわかった。2.メソ多孔化炭素材料への各種金属酸化物の含浸担持メソ多孔化活性炭に金属酸化物粒子を担持するため、活性炭に塩化モリブデンを含浸させ、大気中300°Cで加熱し、酸化モリブデン担持活性炭を得ることができた。3.形態制御した金属酸化物の合成酸化ルテニウムの層状化、その剥離によるナノシート化、ゾルゲル法および錯体重合法による酸化チタンと酸化バナジウムの低温複合化を行い、それぞれの電気化学キャパシタとしての特性を評価した。1.炭素材料のメソ多孔化(細孔径、ナノチャンネル径制御法の確立)1)活性炭、カーボンブラック、ダイヤモンドに210nmの細孔、溝を形成させる方法について引き続き検討し、活性炭には含浸法、ダイヤモンドには真空蒸着法にて金属ナノ粒子を担持した後に水素気流中で加熱する方法が適していることがわかった。2)炭素材料表面層の金属超微粒子を半ば埋め込む手法、および、活性炭とカーボンブラックに担持した金属超微粒子の触媒作用によりメソ孔、溝をつくる方法について引き続き検討し、活性炭およびダイヤモンド(100)面に210nm金属ナノ粒子を半ば埋め込むことに成功した。3)金属超微粒子の溶解除去条件を確立すること検討したが、細孔内に取りこまれたCoナノ粒子の完全除去には未だ成功していない。2.形態を制御した金属酸化物の合成Ru_<1-x>V_xO_2ナノ粒子を合成し、キャパシタンスを測定した。また、メソポーラス酸化ルテニウムの合成に成功した。なお、メソ孔Ti_<1-x>V_xO_2ナノ粒子ノ合成に挑戦したが、未だ成功していない。1.炭素材料のメソ多孔化(細孔径、ナノチャンネル径制御法の確立)活性炭(関西熱化学(株)MSP-20)、

カーボンシルク(シナノケンシ(株)、絹を炭化させた活性炭)、ダイヤモンド電極(BDD電極)のそれぞれに、Coナノ粒子を担持し、水素気流中で加熱することによって5100nmの細孔と溝を形成させ、制御することに成功した。この多孔化により、スーパーキャパシタのキャパシタンスの向上と金属酸化物の強固な担持が可能となる。また、活性炭の場合には、Coナノ粒子が掘削した跡に数層のグラファイト層が形成されることに成功した。表面の部分グラファイト化により、活性炭の電気伝導率が向上し、キャパシタ特性の向上に繋がる。活性炭およびBDD表面層に金属ナノ(Co, Ni, Pt)粒子を担持した場合、加熱温度(800-1000°C)を制御することにより、金属超微粒子を半ば埋め込むことができた。この手法によって、金属酸化物の強固な担持法に道を拓くことができた。BDDを用いることにより、金属ナノ粒子による炭素材料の多孔化の様子(細孔の掘削挙動)を明確にでき、多孔化した表面の静電容量の増加の様子を明確にすることができた。2.形態を制御した金属酸化物の合成とキャパシタ特性の把握メソポーラスおよびマクロポーラスなRuO_2の合成に成功した。また、NaFe02型層状ルテニウム酸ナノシートの合成とその層剥離を行い、最高で1400F/gものキャパシタンスが得られることを見出した。また、小型燃料電池とハイブリッドさせるため、ルテニウム酸ナノシートを泳動電着で電極面にキャストし、その電極を用いたマイクロスーパーキャパシタのを試作に成功した。
糸状菌多糖分解酵素遺伝子の転写抑制に関わる情報伝達ネットワークの解明

糸状菌Aspergillusnidulansのカーボンカタボライト抑制(CCR)には転写抑制因子CreAが主として機能することが知られていたが、これとは独立してcAMP情報伝達系構成因子であるGanBとPkaAが関与することが明らかとなった。その根拠としては、まずアミラーゼ遺伝子とセルラーゼ遺伝子のCCRにおける各因子の貢献度の違いがある。すなわち、前者のCCRはCreAにより制御されていたが、後者ではCreAの貢献度は低くGanBとPkaAが主として機能していた。さらに、様々な培養条件下でのセルラーゼ遺伝子の詳細な転写解析では、各因子の貢献度は誘導物質や抑制物質の種類、プレート培養と液体培養の違いなどで変化した。従って、CCRには複数の制御システムが関わり、これらの起動状況が培養条件によって変化することになる。今後はこの複雑なCCRの全体像を把握することが重要になってくる。A. nidulansにおけるセルラーゼ遺伝子の転写活性化因子であるClrBには遺伝子重複により生じたパラログ因子が存在する。本パラログは主としてマンナナーゼ遺伝子の発現誘導に関与する。これら因子の遺伝子破壊株の解析からClrBはセロビオースとマンノビオースに応答して転写活性化を引き起こすことが可能であるにも関わらず、マンノビオース存在下ではパラログ因子がClrB依存的転写を妨げた。これはパラログ間競合による新奇なCCRの存在を示している。これら因子のDNA結合ドメインのアミノ酸配列は極めて類似していたため認識配列を決定したところ、それぞれに特異的な配列と共通な配列が存在することが明らかとなった。共通配列への結合が競合しこれによりCCR類似の現象が引き起こされる可能性がある。事前研究の結果から構築したカーボンカタボライト抑制(CCR)に関する推定シグナリング経路の証明から研究を開始したが、当初予想よりはるかにメカニズムが複雑であることが明らかとなった。そのため、研究は計画通りには進行しなかったが、様々な培養環境下における3種のCCR関連因子(CreA、PkaA、GanB)の転写抑制への貢献度を詳細に解析し、CCRの複雑性に関する論文の公開に至ったことは十分な成果と考えている。また、この結果は産業用酵素生産において用いる培地の組成や培養条件により生産低下の原因となるCCRのメカニズムが異なることを意味しているため、応用微生物学的観点での本研究の重要性は増したと言える。一方、転写因子パラログ間の競合による新奇なCCRに関しては、2018年度計画には含まれていなかったがClrBパラログ(ManS)の認識配列の決定を行い、事前に明らかとしていたClrBの認識配列とManSの認識配列が一部共通することを見出した。これは競合がDNA結合の段階で起こることを示唆する結果であるため、この点に関する解析を2019年度に行う。今後の推進方策は当初計画とほぼ同様であり、後回しになってしまったCCRに関わるGタンパク質共役受容体(GPCR)を同定し、それが認識する糖類を明らかにする。また、CCRに関わる他因子の探索を行い、見出された因子については様々な培養環境でのCCRへの関与の程度を検証することによりCreA、PkaA、GanBとの類似性を探り、CCR情報伝達経路のモデルを構築する。2018年度の研究でCCRの複雑性とこれに関わる環境因子が明らかとなってきたため研究は効率的に進められると考えられる。一方、複雑さゆえに実験量の大幅な増加は否めず、状況によっては実験条件を制限せざるを得ない可能性はある。転写活性化因子パラログ間の競合に関しては、ClrBとManSには独立した標的配列と共通の標的配列が存在することが明らかとなったため、共通配列がこの阻害に関わる可能性について検証する。

そのため、研究は計画通りには進行しなかったが、様々な培養環境下における3種のCCR関連因子(CreA、PkaA、GanB)の転写抑制への貢献度を詳細に解析し、CCRの複雑性に関する論文の公開に至ったことは十分な成果と考えている。また、この結果は産業用酵素生産において用いる培地の組成や培養条件により生産低下の原因となるCCRのメカニズムが異なることを意味しているため、応用微生物学的観点での本研究の重要性は増したと言える。一方、転写因子パラログ間の競合による新奇なCCRに関しては、2018年度計画には含まれていなかったがClrBパラログ(ManS)の認識配列の決定を行い、事前に明らかとしていたClrBの認識配列とManSの認識配列が一部共通することを見出した。これは競合がDNA結合の段階で起こることを示唆する結果であるため、この点に関する解析を2019年度に行う。今後の推進方策は当初計画とほぼ同様であり、後回しになってしまったCCRに関わるGタンパク質共役受容体(GPCR)を同定し、それが認識する糖類を明らかにする。また、CCRに関わる他因子の探索を行い、見出された因子については様々な培養環境でのCCRへの関与の程度を検証することによりCreA、PkaA、GanBとの類似性を探り、CCR情報伝達経路のモデルを構築する。2018年度の研究でCCRの複雑性とこれに関わる環境因子が明らかとなってきたため研究は効率的に進められると考えられる。一方、複雑さゆえに実験量の大幅な増加は否めず、状況によっては実験条件を制限せざるを得ない可能性はある。転写活性化因子パラログ間の競合に関しては、ClrBとManSには独立した標的配列と共通の標的配列が存在することが明らかとなったため、共通配列がこの阻害に関わる可能性について検証する。
原子構造に基づく黄色ブドウ球菌ファージS13’の感染マシナリーの解明

平成30年度は、黄色ブドウ球菌ファージS13'の宿主認識とゲノム注入に関わる分子装置の仕組みを原子レベルで理解するために、クライオ電顕単粒子解析法を用いて、黄色ブドウ球菌ファージS13'を構成する全タンパク質の原子モデルの決定を目指して研究を進めてきた。研究費の申請時において、既に構造解析に必要となるクライオ電子顕微鏡写真の撮影と、頭部と尾部の主要部分に関しては、原子モデルの構築ができていたが、尾部先端領域等で宿主認識に関わるタンパク質など機能的に重要な部位の構造は決めることが出来ていなかった。特に、尾部には対称性のミスマッチがいくつも存在し、通常の解析ではその全体の構造を決定することは不可能であった。そこで、今年度は、それら原子モデルの構築がまだ出来ていなかった尾部の先端領域や頭部のマイナー構成要素であるタンパク質の原子モデルを構築するために、Focused classificationとrefinementの方法の条件検討をおこなった。その結果、頭部ファイバーを構成するgp14と尾部の最も先端に位置するgp11の一部構造を除いて、黄色ブドウ球菌ファージS13'を構成するほぼ全ての原子モデルの構築に成功した。gp11に関しては、原子モデルの構築は出来なかったが、尾部先端において2量体で存在していることが判明した。そして、その決定した原子モデルから、ファージの構成要素タンパク質が機能的に配置されている様子を明らかにすることができた。今後、これらの分子装置が実際どのように動作しているのか変異体実験や宿主へのゲノム注入後の構造を調べることにより解明する。本年度は、精製した黄色ブドウ球菌S13'のクライオ電顕単粒子解析において、これまで構造決定が出来ていなかった、尾部の先端領域や頭部の内部等の機能的に重要な部位の原子モデルの構築を計画していた。特に、尾部には対称性のミスマッチが存在し、通常の解析ではその全体の構造を決定することは不可能であった。そこで、Focused classificationとrefinementの方法を検討し、局所的領域での構造分類をおこなうことによって、尾部のほとんどの領域の原子モデルを構築することができた。そして、その構築した原子モデルから、ファージの宿主との相互作用様式や、ゲノムを宿主細胞へ注入する際の構造変化を推察することができた。現在、それを実証するために、尾部を構成するタンパク質の発現系の構築と変異体作製に取り組んでいる。従って、当初予定した通り研究が進展しているので、進捗区分としては、「おおむね順調に進展している」という判断に至った。平成30年度は、黄色ブドウ球菌ファージS13'のほぼ主要部分の原子モデルの構築に成功し、ファージの構成要素タンパク質が機能的に配置されている様子を明らかにすることができた。今後は、これらの分子装置が実際どのように動作しているのか調べていく。まずは、ゲノムを宿主へ注入した後の構造解析に取り組むことで、ゲノム注入装置である尾部の構造変化や動作機構を明らかにする。このゲノム注入後の構造を決定するために、精製したファージを黄色ブドウ球菌へ一旦吸着させてゲノムを放出させた後に、界面活性剤を用いてファージを菌体から温和に剥離させて、それを精製しクライオ電顕単粒子解析により構造解析をおこなう。ゲノムを放出したファージ粒子は、頭部の密度が低くなっているので、放出前の粒子と画像中で区別ができると考えられる。また、ファージの感染中の構造変化を経時的に調べるために、位相差クライオ電子線トモグラフィーにより、in vivo解析を進める。黄色ブドウ球菌とファージを混ぜてから、凍結するまでの時間を調節することで、感染段階の異なる試料を作製し、感染過程で生じるファージと宿主との相互作用やそれに伴い生じる構造変化の過程を詳しく解析する。

特に、尾部には対称性のミスマッチが存在し、通常の解析ではその全体の構造を決定することは不可能であった。そこで、Focused classificationとrefinementの方法を検討し、局所的領域での構造分類をおこなうことによって、尾部のほとんどの領域の原子モデルを構築することができた。そして、その構築した原子モデルから、ファージの宿主との相互作用様式や、ゲノムを宿主細胞へ注入する際の構造変化を推察することができた。現在、それを実証するために、尾部を構成するタンパク質の発現系の構築と変異体作製に取り組んでいる。従って、当初予定した通り研究が進展しているので、進捗区分としては、「おおむね順調に進展している」という判断に至った。平成30年度は、黄色ブドウ球菌ファージS13'のほぼ主要部分の原子モデルの構築に成功し、ファージの構成要素タンパク質が機能的に配置されている様子を明らかにすることができた。今後は、これらの分子装置が実際どのように動作しているのか調べていく。まずは、ゲノムを宿主へ注入した後の構造解析に取り組むことで、ゲノム注入装置である尾部の構造変化や動作機構を明らかにする。このゲノム注入後の構造を決定するために、精製したファージを黄色ブドウ球菌へ一旦吸着させてゲノムを放出させた後に、界面活性剤を用いてファージを菌体から温和に剥離させて、それを精製しクライオ電顕単粒子解析により構造解析をおこなう。ゲノムを放出したファージ粒子は、頭部の密度が低くなっているので、放出前の粒子と画像中で区別ができると考えられる。また、ファージの感染中の構造変化を経時的に調べるために、位相差クライオ電子線トモグラフィーにより、in vivo解析を進める。黄色ブドウ球菌とファージを混ぜてから、凍結するまでの時間を調節することで、感染段階の異なる試料を作製し、感染過程で生じるファージと宿主との相互作用やそれに伴い生じる構造変化の過程を詳しく解析する。(理由)平成30年度は、解析をおこなう計算機購入のため前倒し請求をおこなった。一方で、論文投稿費用として形状していた費用が、今年度論文投稿が間に合わなかったので、次年度使用することにした。(使用計画)当初の予定どおり、論文作成および投稿の際の費用として、次年度に使用する。
細胞ビーズによる血管形成を利用した肺気腫の組織工学的治療法の確立

肺気腫は、非可逆性の気流閉塞が進行性し、肺機能の低下をもたらす予後不良な疾患である。現在肺気腫の治療法には、内科的治療法と外科的治療法が存在するが、直接的な生存率改善につながる治療法が存在しないのが現状である。本研究では、細胞ユニットを気腫肺に移植し、周辺組織内での血管構築による正常肺組織の再生方法を確立することを目的としている。血管内皮細胞と成長因子を用いて、申請者らは、細胞ユニットに血管内細胞を付着させることで、効率的な血管構築を図り、それが肺組織の再生に有利であると考えられ、最適化することで、移植部位における血管形成の加速が期待される。また、正常肺組織の分化誘導とともに、微小血管網を構築することができれば、ガス交換可能な肺胞構造を増やすことも期待される。本研究の意義として、肺移植を受けることができない肺気腫患者のQOL (quality of life)改善、生存率の向上が挙げられる。本研究により、正常肺組織の再生を促すために、最適な細胞ユニットの作製が可能となれば、将来的には胸腔鏡下に直接移植することで肺気腫患者の肺機能を改善できる可能性がある。現在までの研究により、マイクロ加工技術を利用した移植用細胞ユニットの作製の検討を行い、最適な細胞種、形状および素材について検討を行い、移植実験の準備が整った。In vitroにおける血管形成の挙動を定量的に評価し、in vivoでのより効率的な血管形成による肺組織再生を目指す。平成30年度は、マイクロ加工技術を利用して、コラーゲンゲルのビーズではなく中腔状のコラーゲンゲルユニットを作製した。これにヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を付着させ細胞ユニットを調製し、in vitroにおける血管内皮増殖因子(VEGF)添加による血管新生挙動について検討した。in vivoにおける細胞ユニットとホスト血管との接合について調査し、ビーズの材質などの検討を行うことで、より効率的な再生方法を模索する予定であったが、ユニットの検討実験に時間を要し、移植に到らなかったため次年度に行う予定である。血管内皮細胞、成長因子を付着させた細胞ユニットを作製し、マウスの大腿、肺(肺気腫モデルおよび正常モデルマウス)へ移植する。付着させる細胞、成長因子の割合を様々に変化させた細胞ユニットを作製し、血管形成を組織学的に比較検討する。また、血管内皮細胞がどの程度の期間移植部位に残存しているかについても免疫組織学的に評価する。その後は、正常、気腫マウスの肺へ移植することにより、正常肺胞構造の修復の可能性を検討する。移植した部位の肺胞構造の評価(肺胞上皮の免疫染色、肺胞径の測定)、微小血管の構造(組織切片を作製し、血管密度を定量化して評価)と、治療前後のマウスの耐運動能を回転式運動量測定装置を用いて評価し、本研究の肺気腫治療への応用の可能性について総合的に評価を行う予定である。

移植した部位の肺胞構造の評価(肺胞上皮の免疫染色、肺胞径の測定)、微小血管の構造(組織切片を作製し、血管密度を定量化して評価)と、治療前後のマウスの耐運動能を回転式運動量測定装置を用いて評価し、本研究の肺気腫治療への応用の可能性について総合的に評価を行う予定である。次年度使用額が生じたが、少額であり、概ね予定通り研究費を使用できている。次年度使用分については、物品費などで使用する予定である。
オルガノポリゲルマン光分解の中間体の確認および動的挙動の解析

初年度は、オルガノポリゲルマンとして、3種類のフェニル置換トリゲルマンとドデカメチルシクロヘキサゲルマンの光分解過程を捕捉剤との実験、マトリックスアイソレ-ション法(77K)、およびレ-ザ-閃光法(293K)を用いて研究した。(1)フェニル置換トリゲルマン(PhMe_2Ge)_2GeMe_2,(Me_3Ge)_2GeMePh,(Me_3Ge)_2GePh_2,を低圧水銀ランプで光照射するとジゲルマンとゲルマニウムを含む高沸点化合物が生成した。光反応における可能な反応中間体を捕捉するために捕捉剤との実験を行なった。その結果、ゲルミレン、ゲルミルラジカル、およびジゲルミルラジカルが存在することがわかった。ゲルミレンは分光学的にも観測できた(吸収極大420-440nm)。ジゲルミルマジカルも同様、分光学的に観測できた(吸収極大320-330nm)。得られた実験結果をまとめると、トリゲルマンの光分解過程は、ゲルミレンが協奏的に放出される経路とトリゲルマンのゲルマニウム-ゲルマニウム結合がホモリティフに切断され、ゲルミルラジカルとジゲルミルラジカルが生成する過程が競争していることが初めてわかった。(2)ドデカメチルシクロヘキサゲルマン(Me_2Ge)_6、を低圧水銀ランプで光照射するとジメチルゲルマレンを放出して、デカメチルシクロペンタゲルマン(Me_2Ge)_5、さらにオクタメチルシクロテトラゲルマン、(Me_2Ge)_4、が生成した。ジメチルゲルミレンはジエンや四塩化炭素により捕捉できた。レ-ザ-閃光法により得られた450nmの過渡吸収がジメチルゲルミレンのものと確認できた。3-メチルペンタン中で(Me_2Ge)_6を光照射すると(77K)430nmにジメチルゲルミレンの吸収極大を、650nmにケイ光スペクトルを観測でき、ゲルミレンの励起状態に関する情報が初めて得られた。
ヒト子宮内膜細胞による骨格筋再生と筋ジストロフィーに対する細胞治療の基盤的研究

本研究の目的は、子宮内膜細胞の寿命延長することにより細胞増殖させ、筋ジストロフィーに対する細胞治療の基盤的研究を行うことである。昨年度に引き続き、今年度も、子宮内膜由来細胞の分離培養、細胞のプロファイリングの確定後、遺伝子導入による細胞寿命延長の検討と拒絶についても検討を行った。In vitroの検討により、子宮内膜細胞の骨格筋マーカー(MyoD, desmin, myogenin, CD56)の発現を確認した。さらに、ヒト子宮内膜細胞を筋ジストロフィーマウスへ移植し、その具体的な実験手法を確立した。ヒト子宮内膜細胞を皮下・筋肉注射によりNOD/SCID IL-2γノックアウトマウスへ移植し、移植する細胞量・移植部位の検討を行った。その後、移植部位周辺を固定、包埋、薄切、染色し、移植した子宮内膜細胞の変化を調べた。その結果、移植した細胞からCD34(Human特異)、Vimentin(マウス細胞と反応しない)陽性が見られた。またdystrophin(Human特異)陽性骨格筋細胞も発現され、骨格筋への分化の可能性を示した。これらの結果は将来筋ジストロフィーなどの疾患への細胞治療に極めて重要な意味を持つと考えられる。また、調整したヒト子宮内膜細胞をモデルマウスへ移植し、特に拒絶を含めた免疫学的な視野から検討した結果生着した。dystrophinの発現を認めた。細胞の調整、プロファイリング、遺伝子導入による細胞動態および安全性を明らかにすることができた。筋ジストロフィーは筋繊維の変成・壊死を主病変とし、進行性の筋力低下の遺伝子性疾患であり、病因はジストロフィンの形成不全である。Duchenne型筋ジストロフィーの薬物療法として最近ステロイドホルモンが使用されているが、症状の進行を遅らす程度の効果しか得られず、対症療法が中心である。近年、この問題を解決する打開策として、「細胞移植」が注目されている。本研究では、子宮内膜細胞の寿命を延長することにより細胞を増殖させ、筋ジストロフィーに対する細胞治療の基盤的研究を行う。具体的には、子宮内膜由来細胞の分離培養、細胞のプロファイルの確定後、遺伝子導入による細胞寿命延長の検討を行なった。in vitroの検討により、子宮内膜細胞の骨格筋マーカー(MyoD, desmin, myogenin, skeletal myosin)の発現を確認した。さらに、ヒト子宮内膜細胞の疾患モデルマウスへの移植の具体的な手法を確立するため、ヒト子宮内膜細胞を皮下・筋肉内注射によりNOD/SCID IL-2γノックアウトマウスへ移植し、移植する細胞量・移植部位などの検討を行なった。その結果、移植した細胞からCD34(human特異),Vimentin(human特異)陽性がみられた。また、Vimentin陽性骨格筋細胞も発現され、骨格筋への分化の可能性を示した。これらの結果は、将来筋ジストロフィーなどの疾患への細胞治療に極めて重要な意味を持つと考えられる。今後さらに、調整したヒト子宮内膜細胞をモデルマウスへ移植し、特に拒絶を含めた免疫学的な視野からの検討を進めるつもりである。この極めて有用と考えられる研究を疾患モデルマウスに適応することで、細胞の調整、プロファイリング、遺伝子導入による細胞動態および安全性を最終的に明らかにしていきたい。
励起電子状態計算に基づいたJ会合体の色素増感機構の研究

シアニン色素などのJ会合体を用いた色増感技術は、銀塩カラー感光材料のキーテクノロジーとして、その完成に決定的な役割を演じた。銀塩感光材料は写真における主役の座を降りたけれども、色増感技術の解明は、太陽エネルギー利用技術で新たな役割を担うことが期待される。本研究では電子状態計算に基づいて色増感の理論的基礎を解明する方法論を確立することを目的とした。理論的解明に適していると考えられるスクエアリリウム色素を取り上げ、その単量体、二および三量体ならびに多量体の幾何構造を構造最適化法で決定し、その電子状態波動関数から色増感機構の理論的解明を行うという方法論の確立を目指した。J会合体の構造としていろいろな配列が提案されているが、本研究では一次元積層配列の五量体までの最適化幾何構造を求めることに成功した。三量体以上では階段型および梯子型の2種類の一次元配列がいずれも存在可能であることを明らかにした。階段型は、吸収バンド幅が広がって広範囲の光エネルギーの吸収に有利であることが明らかとなった。梯子型は、エネルギー的には階段型より安定であるが、吸収バンドが狭くなり、特定波長の吸収に有利である。これらのことから、J会合体による色増感においては、構成色素の配列様式の制御が特に重要であることを明らかにすることができた。この方法論を適用することにより、シアニン色素の色増感機構の解明から、更に進んで太陽エネルギー利用技術への展開も期待できる。
ユビキチンプロテアソームシステムの応用による癌遺伝子ワクチンの開発研究

近年、田中等によりペプチド抗原をユビキチン化することにより、その抗原がプロテアソームでプロセッシングを受け必然的にMHCクラスI分子に提示されるため抗原特異的CD8+T細胞が効率よく誘導されることが証明された(Immune.Rev.:163;161-76,1998)1)本申請研究ではまずマウスメラノーマ由来のTRP-2遺伝子とユビキチン遺伝子の融合遺伝子(フュージョンDNA)を構築した。(なお、メラノーマ以外にマウス肺癌(3LL)およびマウス消化管(colon26)を用いて同様の研究を行っている)2)in vivoの動物実験の前に構築したワクチンベクターを様々な細胞株に遺伝子導入を行って発現の確認を行い、抗原蛋白のプロセッシングおよび抗原提示機構を解析した。この目的のためプロテアソーム阻害剤であるMG-132、エポキソマイシン等を用いて、抗原蛋白質のプロセッシングにおけるプロテアソームの役割について確認を行った。3)上記フュージョンDNA(メラノーマにおいてはubiqitin-TRP-2遺伝子(以下pcUB-TRP-2))を用いてC57BL/6マウスにDNAワクチンを一週間毎に3度行った。ワクチンは生体への遺伝子導入効率の優れた遺伝子銃を用いた。最終ワクチン終了後2週間目にC57BL/6マウス由来のB16メラノーマを移植した。腫瘍増殖に程度を系に知的に計測した。TRP-2遺伝子でワクチンした宿主マウスでは腫瘍増殖抑制効果は全く認められず腫瘍は増殖を続け、40日目までに全マウスが腫瘍死した。一方、pcUB-TRP-2遺伝子によりワクチンを受けた宿主マウスでは移植腫瘍の増殖は顕著に抑制された。4)このフュージョンDNAによるワクチンを受けたC57BL/6マウスではB16メラノーマの転移も著しく抑制され、強い抗腫瘍免疫が誘導されていることがこの現象から確認された。5)上記ワクチンによる抗腫瘍効果はTRP-2特異的なCD8^+キラーT細胞により担当されていることが証明された。なお、この実験系はCD4^+T細胞の関与は認められなかった。6)上記ワクチンによる抗腫瘍免疫はproteasome activatorであるPA28α/βをノックアウトしたマウスでは誘導されたことによりユビキチンプロテアソーム経路へTRP-2抗原が効率よく提示され、活性の強いCD8^+キラーT細胞が誘導されることが証明された。7)ユビキチンプロテアソーム経路の応用による抗腫瘍効果の誘導はマウス肺癌の系でも認められた。
炎症性腸疾患関連腫瘍に対する非侵襲的核酸変異検出術の開発

本研究の目的は、Liquid biopsyを利用し、血液中のctDNAに加え、さらに情報量が多いと予測される糞便中のctDNAなどにも着目し、IBD関連腫瘍の新たな診断法を開発することである。また、近年大腸癌の増悪因子としても報告されているフソバクテリウムにも注目し(Science 358: 1443-1448, 2017)、IBD関連腫瘍と腸内細菌叢などの環境因子との関連についても検討を加えるとともに、ctDNAの起源についての検証も行う。
ホルモン療法抵抗性前立腺癌の分子基盤の解明

ホルモン療法に抵抗性を示す前立腺癌に高頻度で見られるアンドロゲン受容体(AR)点変異体(T877A)をマウス前立腺上皮細胞に導入したノックインマウスを作出し、前立腺腫瘍の発癌と増悪に対する影響を検討した。その結果、AR点変異は癌増悪に強く関与していることが明らかとなった。次に、各種遺伝子欠損へテロマウスとの遺伝学的相互作用を検討した結果、新たな前立腺癌増悪因子としてWnt-5aを同定した。ヒト前立腺癌検体を用いた解析により、Wnt-5aは多くの前立腺癌で発現が上昇していることが明らかとなり、ホルモン療法耐性前立腺癌においてAR点変異体はWnt-5aシグナルとのクロストークにより、癌増悪を促進している可能性が示された。前立腺癌の多くはアンドロゲン感受性癌であり、抗アンドロゲン剤等によるアンドロゲン遮断療法が有効である。しかしながら、こうしたホルモン療法は初期の段階では有効であるが、ほとんどの患者でアンドロゲン依存性の消失にやがて至る例が大多数を占める。そこで、ホルモン療法抵抗性前立腺癌で高頻度でみられるアンドロゲン受容体(AR)点変異体(T877A)導入モデルマウスを確立し、前立腺癌の発癌と増悪に対する以下の知見を得た。マウスAR遺伝子座に、ヒト型AR点変異体(T877A)cDNAを接続し、loxP配列を2箇所導入したターゲティングベクターを構築し、定法によりAR点変異体floxマウスを作製した。このfloxマウスと時期誘導性前立腺上皮細胞特異的Cre-ERT2(PSA-Cre ERT2)マウスを交配し、成体期の前立腺上皮細胞のみでAR点変異体が発現するモデルマウスを樹立した。AR点変異導入マウスでは前立腺過形成が観察され、抗アンドロゲン剤であるタミフルや他種ステロイドホルモンに応答した結果、前立腺の増殖が亢進することを見出した。一方、AR点変異を単独で導入しただけでは前立腺癌は発症しなかったことから、AR点変異導入は発現のプロセスには寄与していないことが判明した。前立腺癌発症(TRAMP)マウスとAR点変異導入マウスとの交配により、腫瘍増殖が亢進した。一方、Wnt5aヘテロ欠損マウスのgenetic backgroundではAR点変異導入によって誘起される前立腺癌の増殖がキャンセルされたことから、非古典的Wntシグナルが癌増悪に関与している可能性が示された。前立腺癌検体におけるWnt5aの発現を検討した結果、多くの進行性前立腺癌においてWnt5aの発現亢進が確認された。前立腺癌は欧米では男性癌死亡者の約20 %を占める頻度の高い癌であり、日本においても現在食生活の欧米化に伴い、その発症頻度が急激に上昇している。そこで、ホルモン抵抗性を示す前立腺癌に高頻度でみられるアンドロゲン受容体(AR)点変異体(T877A)をマウス前立腺上皮細胞に導入したノックインマウスを作成し、前立腺癌の発癌と増悪に対する以下の知見を得た。1、マウスAR遺伝子座に、ヒト型AR点変異体(T877A)cDNAを接続し、loxP配列を2箇所導入した。AR点変異体floxマウスと時期誘導性の前立腺上皮細胞特異的Cre発現マウスとの交配により、成体期の前立腺上皮細胞のみでAR点変異体が発現するモデルマウスを樹立した。2、AR点変異導入マウスでは前立腺過形成が観察され、抗アンドロゲン剤であるフルタミドや他種ステロイドホルモンであるエストロゲンに応答した結果、前立腺の増殖が亢進する。一方、単独のAR点変異導入では前立腺癌発症への進展は観察されなかったことから、AR点変異体は発癌のプロセスには寄与していない。3、前立腺癌発症マウス(TRAMPマウス)とAR点変異導入マウスとの交配により腫瘍増殖が亢進したことから、AR点変異体は前立腺癌の進行に関与している。困難が予想されたAR点変異体導入マウスの作成が当初の予想よりも早く終了し、表現型解析の進捗があった。前立腺癌の進行には上皮細胞と間質細胞との液性因子を介した相互作用が重要であることが知られている。本研究により樹立されたAR点変異導入マウスは前立腺上皮細胞のみにAR点変異体が発現しているため、相互作用因子を同定するための格好のツールとなることが期待される。

そこで次年度は、前立腺の発生及び前立腺癌の進展に関与する液性因子群との機能的相関を検討すると共に、マイクロアレイ解析を用いて前立腺癌の増悪に関わる因子を同定する。さらに、ヒト前立腺癌検体を用いて、同定し得た癌増悪因子の発現を検討する。次年度使用額の繰越金はわずかなため物品費として充足する。次年度の研究費の使用計画としては、AR点変異体をベイトとしたタンパク精製を予定しているため、大量細胞培養のための培地や血清、各種抗体作成のための実験試薬・消耗品等の購入を中心に充てる。また、抗アンドロゲン耐性前立腺癌の進行に寄与するサイトカインを検索するため、各種サイトカインの購入が必要となる。また、金沢にて開催されるInternational Congress on Hormonal Steroids and Hormones & Cancer出席のための旅費も支出する。
局所尤度推定クラスタリングと多目的GAによる優良解綱羅戦略とその応用

解を集団として保持しつつ探索する遺伝的アルゴリズムは、目的関数を複数有する多目的最適化において、パレート解集合を高精度で求めるのに適する手法として注目されている。得られたパレート解集合は目的関数空間上での均一さや広がりなどで評価される場合が多いが、工学的実用性の観点からは、種類の異なる解をなるべく多数発見する探索戦略(優良解網羅戦略)も重要である。種類の異なる解を類似度に基づき分類する基礎技術としてクラスタリングが知られており、この点から多目的最適化にクラスタリング技術の活用は有料解網羅戦略に不可欠である。今年度は特徴の異なる二種類のクラスタリングアルゴリズムに関する論文を二編発表した。一つは、実数値GAの交叉として知られる単峰性正規分布交叉をカーネル関数として利用することによって、混合正規分布をノンパラメトリック推定するEM法である。この手法はデータ次元数が高い場合において特に優れた性能を持つことが実験により確認された。またカーネル関数に交叉を用いているため、実数値GAによる最適化フェーズとEM法によるクラスタリングフェーズがシームレスに統合可能な点に特色がある。もう一つは、平均場近似の導入により、比較的分離度の高い混合正規分布を高速に推定するコンポーネントワイズEM法である。この手法は、特に混合数が高い場合において、スケーラビリティに優れることが実験により確認された。また混合数決定フェーズが不要である点に特色がある。大域的パレート解の獲得を困難にする性質の一つに局所パレート解の存在が知られている。多目的GAにおけるその対処法として、単目的GAと多目的GAを段階的に組み合わせるSolidEMOに関する論文を発表した。困難な多目的最適化の実問題として知られるレンズ設計問題においてSolidEMOは多様で優れた解を発見することが確認できた。SolidEMOで類似・非類似の判断をk近傍で行っており、クラスタリング法と組み合わせることにより効率比・性能上が期待でき、この方向での発展は今後の課題である。解を集団として保持しつつ探索する遺伝的アルゴリズムは,目的関数を複数有する多目的最適化において,パレート解集合を高精度で求める手法として注目されている。一般に、得られたパレート解集合は目的関数空間上での均一さや広がりなどで評価されるが,工学的実用性の観点からは,種類の異なる解を,なるべく多数発見する探索戦略(優良解網羅戦略)が重要である.ここで種類の異なる解とは、決定変数空間において互いに類似度の低い局所解を指す。今年度は、優良解網羅戦略の要素技術となる、クラスタリング法であるCWEM法と、多目的局所探索手法であるPDRを提案した。混合分布推定には一般にEMが利用されるが、EM法による推定は,与えられた混合数と初期モデルパラメータに基づき,逐次的にモデルの対数尤度を単調増加させ,局所最尤推定に収束することが知られている.また混合数の事前の決定は一般に困難ゆえ,通常は様々な混合数mにっいて混合分布推定を行い,BICなど情報量基準により決定する.のため混合数$m$が大きい場合はこの点においても計算コストが高いといえる,上記の事情を考慮し,本研究では混合数およびデータ数に対し優れたスケーラビリティを実現するComponent-Wise EM (CWEM)を提案した.CWEMは平均場近似に類似した方法により事後確率計算を高速化し,一般化EM法による推定を行う方法である。これらの成果は人工知能学会論文誌にて公表予定である。また多目的最適化において、解と実行可能領域境界の関係,また,パレート降下方向と降下方向の実行可能性を適切に考慮する高性能な局所探索手法Pareto Decent Method (PDM)を考案し、目的関数の微分可能性を仮定した上で,3目的以上で制約条件がある場合でも少ない計算コストで効率よく探索を行う局所探索手法を提案した.これらの成果は人工知能学会論文誌、Genetic and Evolutionary Computation ConferenceおよびEvolutionary Multi-CriterionOptimizationのProceedingsにて公表した。

困難な多目的最適化の実問題として知られるレンズ設計問題においてSolidEMOは多様で優れた解を発見することが確認できた。SolidEMOで類似・非類似の判断をk近傍で行っており、クラスタリング法と組み合わせることにより効率比・性能上が期待でき、この方向での発展は今後の課題である。