hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
クモヒメバチにおける寄主操作の多様性とその進化史に関する研究

クモヒメバチ属群に関して3つの分子マーカー(COI, 28S, EF1α)を利用して、最尤法およびベイズ法により系統解析を行った結果、本群は3つのクレードに分けられた。クレードIにはPiogaster, Schizopyga, Brachyzapusなど、産卵室や漏斗網をつくるクモの寄生者が含まれる。クレードIIにはそれ以外の、空中に網を張るクモを利用するクモヒメバチが含まれ、さらにAcrodactyla、Megaetaira等から成るクレードと、それ以外に分けられた。寄主行動の操作は各クレードにおいて観察されたが、その様式は異なり、それぞれ固有の寄主操作が獲得されたと考えられた。アメリカ合衆国、イギリスを中心に海外の対象分類群を入手した。マレーゼトラップや灯火採集用具を用いて、解析上重要でありながらこれまでに得られたサンプルでは塩基配列の読み取りが不可能であった種に関して,追加サンプルを入手し解析に加えた。データの解析のためパソコンを購入し、これまでに得られている塩基配列データに基いて系統解析を行った。種の同定に利用可能なバーコード領域(mitochondria COI)等のデータはさらに蓄積でき、同属の種間関係など近縁なものについては系統関係が明らかになり、幼虫の解析も併せて行うことによって、寄主ー寄生者の対応付けをすることができた。一方で、属間などの上位の分類群間の系統関係については解像度が不十分で、新たな領域の探索を行なっている。サンプリングの過程で特異な寄主操作を行う種が見出され、解析に追加し、分類、系統、行動に関しての論文を作成中である。同内容に関して日本昆虫学会の大会にて口頭発表を行った。新たに、EF1a部分配列を分子マーカーとして利用し、解析を行い、対象とするクモヒメバチ属群の属間、特に初期の分岐関係を明らかにすることができた。これまでに解析済みであったCOI, 28Sと組み合わせて系統解析を行ったところ、クモヒメバチの単系統性が認められ、内部に高い値で支持されるいくつかの単系統群が見出された。これは従来の形態データに基づいた系統関係とは異なるものであった。クモヒメバチ属群は大きく3つのクレードに分けられた。Piogasterは従来、それ以外のクモヒメバチ全ての姉妹群となると考えられていたが、このクレードIのなかに含まれた。Schizopygaは多系統であることが明らかとなり、本属のシノニムとされたDreisbachiaを復活させる必要があることが明らかとなった。えられた系統樹上に、観察された寄主操作をマッピングしたところ、寄主操作はそれぞれのクレードで見られること、しかし各クレードでその様式は異なることから、寄主を操る能力そのものは同一の起源をもつかもしれないが、クレードごとに寄主に対応した寄主操作が進化したことが明らかとなった。三重県と熊本県でサンプリングを行った.購入したマレーゼトラップや灯火採集用具を用いた.解析上重要でありながら手持ちのサンプルでは塩基配列の読み取りが不可能であった種の一部に関して,追加サンプルを入手することができた.またこれまで未知であった分類群が2種得られたが,1種は寄主クモに付着した幼虫であったため,同時に寄主情報も得られ,クモの利用法の進化経路の解明を目的とする本研究において非常に重要なサンプルを得たことになる.実験は5つの領域における塩基配列データを対照群の大部分の種で読み取ることができた.バーコード領域であるmitochondria COI領域は,クモヒメバチ群においても,種の同定に利用可能であることが明らかとなった.寄主クモに付着した幼虫のみしかサンプルがないものに関しても,どの種のクモヒメバチか推定でき,寄主が未知あるいは不確実な寄主記録しかなかった5種について,寄主ー寄生者の対応付けをすることができた.予備解析では,塩基配列を読み取った5領域のうち,mitochondria COI領域,核28S,18S領域が系統情報を有していると考えられた.解析結果は概ね形態情報から描かれた系統像と一致していたが,一部齟齬が見られた.この点に関しては次年度で詳しく解析する.上位の分類群間の系統関係について予備解析を行った際に有用だと考えられてた領域が、実際には解像度が不十分なことが判明し、新たな領域について試行する必要がでてきたため、進捗状況はやや遅れていると評価した。ただし、研究期間の延長申請を行い、承認されているので、本年度にて目的は充分達成できると考えている。

対照群に関して5つの領域における塩基配列データを大部分の種で読み取ることができた.予備解析を行い,系統推定に有効な領域の見当をつけるという23年度の計画は達成されている.一方でサンプルの状態により実験が失敗に終わったものもあり,これらについては本年度に追加サンプルを得る必要があるが,これは計画当初より予定していた事柄であり大きな遅れとはならない.上位分類群間の系統関係の推定に有効な領域に関して解析を進める。候補はすでにあがっているので、実際に実験をすすめ、解析を進める。また、新たに得られた分類群に関しては既知種と比較し分類学的処理を行うためアメリカ合衆国のAmerican Entomologicak Instituteを訪問する(研究材料として分類上の地位を確定するのは本研究の遂行上の必要事項である)予定であったが、実施できていないため、これを実施する。属間の系統関係の解像度を上げるため異なる領域での解析を行う.標本の劣化によると考えられる配列の決定が不可能であった2種と,新たに見出された未記載種については解析に使えるサンプルが無いか,少ないため,過去に標本の得られた地域でサンプリングを行う.得られた配列により,本解析を行い,対象群内の系統関係を明らかにし,寄生習性,寄主利用,形態の進化(多様化)についての考察を行う.23年度は既存のサンプルの解析を主に行ったため,まだ十分に実施できていない新たに得られたサンプルの処理を,24年度に繰り越して行う.前年度の解析で得られた分子系統樹には形態による系統仮説との齟齬が見られるため,形態情報の再確認を行い,また新たに得られた分類群に関しては既知種と比較し分類学的処理を行う(アメリカ合衆国のAmerican Entomologicak Instituteに5日間滞在).研究材料として分類上の地位を確定するのは本研究の遂行上の必要事項である.試薬類や消耗品は概ね足りているが、不足分は追加購入する。対象群の資料が世界で最も充実しているAmerican EntomologicakInstituteを訪問し、新たに見出された分類群に関して,分類学的地位を確定する必要があり、このための旅費を使用する.また論文投稿料としても一部使用する予定である。引き続き解析を行うため,試薬類や消耗品費を使用する.得られたデータの解析のためパソコンを購入する.サンプルの状態が悪く十分に塩基配列を読み取れなかったサンプルに関して追加を得るため,また解析の信頼性を向上させる目的で地理的に離れた生息地のサンプルを解析に加えるため,サンプリング旅費とサンプル処理のための補助人件費を使用する.新たに見出された分類群に関して,分類学的地位を確定するために世界で最も対照群の資料の充実しているAmerican Entomologicak Instituteを訪問する必要があるが,このための旅費を使用する.
蛍光ナビゲーション内視鏡による消化器癌手術システムの開発

内視鏡下手術は、低侵襲性、術後回復の早さと速やかな社会復帰、優れた整容性などの利点がある。私共は蛍光イメージングを内視鏡手術に付加し、新規の生体情報を蛍光シグナルで提供できる内視鏡手術システムを構想した。私共はこれまでに生体微弱光計測の技術を背景として、蛍光の体外診断装置の開発、小型動物を用いた蛍光検出実験を行い、また培養細胞やマウスにおいて蛍光量子ドットを用い、ナノレベルの超微細蛍光計測システムを開発、in vivoリアルタイム観察することに成功している。本研究の目的は、これら超精細蛍光計測技術を基に、腫瘍の存在部位同定と切除範囲の決定、脈管(胆管、胸管など)走行の確認と副損傷回避、センチネルリンパ節描出などを術中リアルタイムに蛍光シグナルとして得ることで、詳細な生体情報を提供するシステムを構築することである。今年度はブタ消化管をモデルとして蛍光計測を行い、量子ドット投与量と蛍光強度について相関関係を得ることができた。また、蛍光ナノ粒子注入直後より蛍光ナノ粒子がセンチネルリンパ節に移動する様子をリアルタイムに観察、染色されたセンチネルリンパ節の精密蛍光計測により、リンパ管流入部位を高精度に同定することに成功した(Hikage,Nanotechnology,2010)。これによりリンパ経路が複雑かつ多方向に及ぶ可能性のある、胃をはじめとした消化管がんの術中センチネルリンパ節生検等に応用が期待される。また生体内の蛍光ナノ粒子の安定化を目指し、シリカコーティングした蛍光ナノ粒子の安定した作製に成功した(Cong,PLoS ONE,2010)。この技術により将来安全な蛍光マーカーの開発が期待される。以上の成果により今後、新規蛍光ナビゲーション内視鏡下手術による、より緻密で安全な内視鏡手術の開発が期待される。
複雑系３次元ナノメタマテリアルの創成

本研究は、金属ナノ粒子の多次元自己組織化とそこで発現する光学現象の理論的及び実験的解明、ならびにこの現象を用いた新規ナノ光デバイスの考案を目的として行った。科学的成果としては、金属ナノ粒子多次元自己組織化膜を金属基板上に積層した際に発現する呈色が「電磁誘導透明化(EIT)」であることを明らかにしたこと、応用としては、目視型高感度センサーの開発や細胞接着ナノ界面の超解像度イメージングに成功したことが注目に値する。これら我々独自の研究を通じて、プラズモニック・ナノメタマテリアルの基盤分野を世界に向けて発信することができた。近年我々はナノサイズの金属微粒子からなる二次元結晶シートを金属基板上に積み上げると、可視域での鮮やかな呈色変化に続き、紫外域に特有の強い吸収バンドが現れる現象を発見した。これは金属微粒子結晶シートのメタマテリアル的性質と、積層によるフォトニックバンド形成の効果によるものと考えられる。これらの独自の研究成果を発展させ、ナノ光デバイスとして具体的な応用例を世界に先駆けて提案するため、プロジェクト初年度である本年度は、以下の研究を遂行した。1)紫外吸収バンドの起源解明金基板上銀微粒子積層膜において現れる強い紫外吸収バンドの起源について、大規模FDTD計算を駆使して明らかにした。この成果について、論文発表の準備を現在進めている。また積層膜の吸収およびプラズモン増強蛍光には指向性があり、平面基板垂直方向が必ずしも最も強いとは限らない。この測定のために、本年度絶対PL量子収率測定装置(浜松ホトニクス)を導入し立ち上げた。2)層構造内への欠陥やヘテロ構造の導入誘電率の異なる銀および金微粒子の局在プラズモン間には電磁気的な結合が生じない。これに対して同種微粒子同士の場合、層間をクロスする3次元の電磁気相互作用が期待される。本年度は粒子間の異なる2種類の銀微粒子シート間の局在プラズモンカップリングについて、実験およびFDTD計算について検証した。その結果、予想した通りプラズモンの多重結合による大きな波長シフトが実験およびFDTD計算の両方で確認できた。3)微粒子シートのナノバイオ応用プラズモンフルカラーを用いて、ビオチンーアビジン相互作用を検出するバイオセンサーデバイスの開発に成功し、これについて論文にまとめた。さらに銀微粒子の細胞毒性について検討した。目的としていた研究はほぼすべて達成できた。唯一課題として残っているのが、層構造内への欠陥やヘテロ構造の導入法である。基板にナノ加工を施し、場所を規定することに加えて、微粒子積層膜作製法をLB法以外の方法に見直す必要がある。これらの独自の研究成果を発展させ、ナノ光デバイスとして具体的な応用例を世界に先駆けて提案するため、プロジェクト2年目である本年度は、以下の研究を遂行した。1)スプレーによる積層構造作製法の確立当初計画として、微粒子シートの積層構造の間に量子ドット等発光粒子を埋め込み、その発光現象について、前年度購入の絶対PL量子収率測定装置および蛍光寿命測定装置によって詳細に検討する予定であったが、これまで用いてきたLB法では、デバイスの目的とする箇所に粒子をうまく埋め込むことができなかった。そのためLB法に変わる手法として、スプレー法による微粒子積層膜の成膜法の開発に着手した。その結果、スプレー条件を工夫することで、従来のLB法による積層膜と同程度の品質の均一なフルカラーを得ることに成功した。また条件によって、視野角により色味の変化する構造色的な特性を示す膜の形成が可能であることが明らかになった。本年度は、この成果について特許申請した。2)ナノバイオ応用微粒子シートを高分解能バイオイメージング、特に細胞接着表面の観察へと応用し、全反射顕微鏡(TIRF)を超える高解像度のナノ界面蛍光画像を得ることに成功した。さらにTIRF顕微鏡を改良し、PおよびS偏光を顕微鏡内に導入できるようにし、蛍光ビーズ画像を比較した。その結果P偏光を用いることで、空間分解能を低下させずに、蛍光増強度をさらに2倍増強することに成功した。前年度予想していた通り、ナノ加工表面への微粒子シートの導入について、従来のLB法では難しいことが判明し、予定を変更し、スプレー法の検討を追加した。しかし、この計画外の成果が得られたものの、当初計画していた微粒子シートの積層構造の間に量子ドット等発光粒子を埋め込み、およびその発光現象についての検討は遅れている。次年度以降、急ぎ実行する。これは金属微粒子結晶シートのメタマテリアル的性質に起因する。これらの独自の研究成果を発展させ、ナノ光デバイスとして具体的な応用例を世界に先駆けて提案するために、プロジェクト3年目である本年度は、以下の研究を遂行した。1)微粒子自己組織化膜を使ったColorimetryセンサーによって、非接触光触媒反応の高感度検出に成功した。

2)上述の呈色現象並びに紫外域の吸収について、電磁誘導透明化(Electromagnetically Induced Transparency: EIT )であることを明らかにした。3)混合膜における相分離構造の形成メカニズムと形成過程において期待されるプラズモン散乱の増加について計算により明らかにした。4)今期購入したスプレー法により複雑系構造並びに勾配基板の作製に成功した。5)自己組織化膜をチオールあるいはジチオール溶液に浸漬することで、成膜後にキャッピング分子を簡便に置換する方法を発案した。6)蛍光ビーズ及び量子ドットを用いて、蛍光像の増強度及び空間分解能の定量評価に成功した(シンガポールとの共同研究)。7)微粒子シートを用いた細胞の界面観察において、全反射顕微鏡を使わずに垂直入射の蛍光顕微鏡下で細胞接着界面の高分解能観察に成功、動画観察にも着手した。8)想定外の成果として、微粒子シートとグラフェン等二次元材料とを組み合わせたデバイス開発を国際共同研究にて行った(サウジアラビアとの共同研究)。昨年度の予定が達成されたことに加えて、国際共同研究において成果が得られた(現在2報論文登校中;概要8)に相当)。近年我々はナノサイズの金属微粒子からなる二次元結晶シートを金属基板上に積み上げると、可視域での鮮やかな呈色変化に続き、紫外域に特有の強い吸収バンドが現れる現象を発見した。これは金属微粒子結晶シートのメタマテリアル的性質に起因する。これらの独自の研究成果を発展させ、ナノ光デバイスとして具体的な応用例を世界に先駆けて提案するために、プロジェクト最終年である本年度は、以下の研究を遂行した。1)微粒子シートを用いた細胞の高分解能動画観察に成功し、これを論文発表した。この成果は日本経済新聞にて報道された(世界最薄!局在プラズモンシートで細胞接着界面の可視化が可能に:日本経済新聞2017.6.16.)2)全反射顕微鏡へP偏光が入射できるよう装置を改良し、偏光入射による微粒子シートの局在プラズモンの励起状態と蛍光イメージング像との関係について明らかにした3)球以外の形状の粒子の自己組織化の効果についてFDTD計算により検討した4)シンガポール国立大学との国際共同研究で、金属基板上への半導体ナノ粒子(QDs)の多層積層による蛍光発光増強において最大10倍の増強度を得ることに成功した。さらに成膜後に熱処理によって発光波長を制御する手法を考案した。表面をデンドリマーで修飾したQDsの自己組織化構造と発光特性との関係についても検討した。5)微粒子シートの機能性チオール分子への置換による光および電気特性変化について検討し、一部論文発表した。6)サンジアラビアKAUSTとの国際共同研究、金属微粒子とグラフェンの組み合わせた熱電変換素子作製について論文発表した。7)オーストラリア国立大学との国際共同研究、表面力測定によるクエン酸の表面への吸着状態について論文発表した。
脳磁図、fMRI、近赤外分光法を用いた留学生の日本語習得過程の経年的研究

赤外分光法と脳磁図を用いて日本語学習者を対象として日本語の音声と漢字を言語刺激としたときの脳活動を測定した。近赤外分光法では短・長母音の分別時の脳活動変化を日本人及び日本語学習者を対象に調査した。近赤外分光法で測定できるのは相対的なヘモグロビンの量でベースの取り方で測定量が変化したり、側頭に外光がノイズとして入り測定できないことが多かった。またまだ確立された分析方法もなく言語のような高度の認知の脳活動を測定する方法としては時期尚早と思われる。脳磁図では絵フォント、ハングル文字、偽漢字、誤漢字及び真漢字刺激を視覚刺激として日本人及び非漢字圏日本語学習者(初級、初中級、上級)を対象に刺激提示後100ミリ秒のM100と150-200ミリ秒付近のM170での反応成分を測定し、比較した。M170では日本語学習経験のない成人非漢字圏初級学習者はすべての刺激に対して同じように反応していたが、初中級、上級、日本人では絵フォントの反応が真漢字よりも有意に低かった。これは学習が進むにつれて絵と漢字の区別が習得されている証拠と思われる。成人非漢字圏学習者でも漢字の学習に伴って脳活動も変化していると考えられる。五つの刺激に対する反応は個人差が大きく、個人差の原因は文字に対する個々の被験者の態度によると思われる。今後文字に対する態度と脳活動の関係を検証する必要がある。視覚刺激を用いた場合、脳磁図の反応は漢字運用能力とは比例せず、性別、瞬間視力、右手利き度に関係することがわかった。M100はすべての被験者でみられたわけではなかったが、日本人一人と初中級非漢字圏学習者一人でハングル文字のみM100の反応がほとんどみられない例があった。M100は文字か文字でないかの判断をしている可能性があり、その判断に右脳が深く関係している可能性が示された。11名の上級学習者を対象に漢字偽漢字非漢字を刺激として用いて視覚提示時の反応速度を測定し、MEG及びfMRIでの刺激提示時間の推定を行った。MEG用の刺激として用いられる漢字偽漢字非漢字を各90字作成し、提示の順番及び提示時間を検討し、本試験時の刺激時間を決めるため予備測定を予定している。fMRIでは音声刺激及び漢字刺激をブロックデザインにするか事象関連(event related)にするか現在検討中である。近赤外分光法では長母音の分別能力と脳活動の関係を調べた。課題は1)モニタ上に映されたひらがな(視覚刺激)とスピカーから再生された音声(聴覚刺激)が一致するかどうかと2)スピカーから再生された音声(聴覚刺激)が長母音か短母音かを判断するものである`刺激語としてはひらがな2字(短母音)と3字(長母音)を用いた。初級学習者9名上級学習者3名で測定した。一次的な分析では1)初級学習者で発音及び聞き取りが苦手な学習者(1名)の脳血流は全く変化がなかった2)初級学習者で習得が速い学習者は左右の側頭前部や前頂頭部に血流量の増加がわずかに見られた、3)上級学習者では左側頭前部で血流量の増加が見られたが、初級者では左側頭前部での増加はあまり見られなかった。初級学習者の習得速度と脳血流の賦活と関係があるということが示唆された。初級学習者では習得が速い学習者の脳は日本語音声に反応して血流量が増加するが、習得が遅い学習者は血流量があまり増加していない可能性がある。

上級者では音処理だけではなく意味処理も行われていると思われるので左側頭前部の賦活が見られたのではないだろうか。現在血流量の増加の度合い、反応時間、正答率との関係など近赤外分光法で得られたデータを詳しく分析中である。非漢字圏日本語学習者で初級学習者9人、中級学習者3人、日本人2人、中国人4人を対象に漢字および類似図形を視覚刺激として、脳磁図測定を行った。用いた刺激は、漢字、偽漢字、誤漢字、ハングル文字、絵フォントの5種であった。ほとんどの被験者のハングル文字認識正解率は100-95%であった。脳磁図に心電が原因と見られるノイズが多く混入して半数の被験者のデータはICA分析でノイズ除去が必要と思われる。現在早稲田大学理工学部村田昇研究室にICA分析を依頼中である。ノイズが少なかった被験者のデータをみると、文字認識の指標と言われている潜時150ミリ秒付近のM100成分の振幅の大きさが漢字圏の日本人、中国人では大きいのに対して、非漢字圏の日本語学習者では上級学習者でも小さく、初級のバングラディシュ人ではほとんど認められなかった。万国共通と思われる絵フォントで日本人と中国人はM100成分の振幅が大きいのに対して、バングラディシュ人ではほとんどなく、また上級学習者のベトナム人でも小さい。漢字圏の被験者は絵フォントを文字として認識しているのに対し非漢字圏の被験者は絵フォントを文字として認識していない可能性を示しているのではないだろうか。また中国人は日本人に比べて日本語の漢字以外では反応が大きいように見られるが、被験者数を増やして検討する必要がある。日本人被験者でハングル文字認知正解率100%(被験者(1))とハングル文字正解率が20%(被験者(2))という極端が差のあるデータが得られた。同じ日本人でもハングル文字認識能力が低いと絵フォントとハングル文字でのM100成分の振幅が顕著に小さく、漢字でも被験者(2)のM100成分の振幅は被験者(1)のものに比べてわずかに小さいように思われる。この結果は脳磁図の脳神経学的データと実際の漢字運用能力とは正比例の関係ではないことを示唆している。脳神経学的データと漢字学習の関係についてさらなる検討が必要である。非漢字圏日本語学習者で初級学習者8人、初級-中級学習者4人、上級学習者6人、日本人10人を対象に真漢字、偽漢字、誤漢字、ハングル文字、および絵フォントを視覚刺激として、脳磁図測定を行った。ハングル文字提示時に被験者にカスタネットをたたいてもらい、課題遂行の確認と精度の目安とした。被験者のハングル文字認識正解率は90-100%であった。脳磁図において文字認知の指標とされるM170(刺激呈示後150-200ミリ秒付近)の振幅の面積を漢字刺激を1.0とした時の偽漢字、誤漢字、ハングル文字、および絵フォントとの比率を各グループ間で比較した。日本人では真漢字に対する偽漢字、誤漢字、ハングル文字に対する反応に個人差が大きく、ハングル文字に対する反応が一番大きい被験者が4人、偽漢字が3人、誤漢字が3人だった。絵フォントのみはすべての日本人被験者で真漢字にたいする比率が低かったので、グループ間の比較には[真漢字:絵フォント]の比率を用いた。その結果、[真漢字:絵フォント]は初級学習者1.0中級学習者0.85上級学習者0.82日本人0.80となった。日本語学習経験のない非漢字圏初級日本語学習者は漢字と絵フォントの区別がないのに比べて学習が進むにつれて、絵と文字という区別がなされるようになったと考えられる。
高強度マトリックスを有する酸化物系セラミックス基複合材料の開発

安価でジェットエンジンの燃焼ガス雰囲気下の耐環境性に優れる酸化物系セラミックス基複合材料は民間用航空機エンジンへの適用が決定的となっている。しかし、マトリックスが多孔質で強度と高温クリープ特性が劣るため、使用部位は排気ノズル部に限定されている。本研究では、過熱水蒸気雰囲気を利用したマトリックスの揮発・再凝縮現象により多孔質マトリックスのネック部を強化し、機械的性質を改善する。
組織内活性型ビタミンK:メナキノン-4の新規生理機能の解明

すべてのビタミンK(VK)同族体は、凝固因子やオステオカルシン等のGlaタンパク質生成の際の補因子として必須であるが、最近になってVK_2のうちのメナキノン-4(MK-4)は、種々の組織に存在して、Gla化以外にも重要な生理機能を果たしているものと推測されてきた。我々は、ラットとマウスのin vivo実験ならびにこれら動物と、ウシ・ニワトリの各臓器酵素系を使ったin vitroのMK-4生成実駿の両方を行うことによって、VK同族体からMK-4への変換生成機構の概要を明らかにしてきた。しかし、各組織におけるMK-4変換生成の生理的意義を含めたMK-4機能の本質は、依然として不明のままである。たまたま我々は、VKの新規作用を検索しているうちに、VK類がin vivoに炎症反応を抑制する可能性を示した。そして、今回、VKの炎症反応に及ぼす影響について、脾細胞を用いてin vitroにさらに詳細に検討したところ、MK-4が破骨細胞性の骨吸収サイトカインであるIL-6の発現を抑制していることをつきとめた。Wistar系ラットをVK添加飼料(VK_1を75mg/kg飼料含む)およびコントロール飼料(VK_1を0.75mg/kg飼料含む)で10日間飼育し、リポポリサツカライド(LPS,0.5mg/kg体重)を腹腔内投与した。投与18時間後に解剖し、血漿中のGOT-GPT活性を測定したところ、コントロール飼料群に比べてVK添加飼料群では有意に低下していた。また、肝臓中のIL-6 mRNA量も同様に低下する傾向にあった。次に、マウス脾臓より初代培養細胞を調製して、in vitroでの検討を行った。培地中にLPSおよびK_1、MK-4を加えて培養し、細胞からRNAを調製した。IL-6発現量を比較したところ、コントロールに比べてVK_2(MK-4)を添加した場合に有意に低下していることが明らかとなった。我々はこれまで、メナキノン-4(MK-4)は、ほ乳類(ラット、マウス、ヒト由来細胞株)や鳥類の組織内で種々のビタミンK(VK)同族体(ナフトキノン骨格)から生成される、新規の生理活性を有するVIK同族体と推定してきた。血液凝固因子の生成がすべてのVIKのもつ機能であるが、MK-4だけはそれ以外にも重要な機能のあることが示唆されてきた。すなわち、すでに破骨細胞および白血病細胞のアポトーシス誘導作用が有名である。MK-4は各組織に分布して、重要性理機能を果たしている可能性が強い。それを解明するのが本研究の最終課題である。そのためには、各組織におけるMK-4生成機構を解明する必要がある。まずは、生成酵素の精製とDNAマイクロアレイ技術によって、この課題を解明しようと企図した。まず、酵素の精製については、細胞内膜画分からの可溶化によって活性が大きく低下したことから、MK-4合成酵素は膜に結合していることが活性を維持する条件であることが示された。現在、膜結合型酵素の精製手法を利用して、具体的に精製を進めつつある。DNAマイクロアレイ法では、VK欠乏時またはVK添加時に変化する遺伝子種を検索し、発現量の変化を指標としてVKの新規生理作用を推定する実験を行った。

すなわち、種々の臓器からトータルRNAを調製して、実験群ごとにプールしたものを鋳型にしてcDNAを作成し、これを市販DNAマイクロアレイとハイブリダイゼーションさせた。その結果、肝臓においては急性期相タンパク質に属する一連の遺伝子の発現が、VK欠乏群で顕著に上昇していることが明らかにされた。すべてのビタミンK(VK)同族体は、凝固因子やオステオカルシン等のGlaタンパク質生成の際の補因子として必須であるが、最近になってVK_2のうちのメナキノン-4(MK-4)は、種々の組織に存在して、Gla化以外にも重要な生理機能を果たしているものと推測されてきた。我々は、ラットとマウスのin vivo実験ならびにこれら動物と、ウシ・ニワトリの各臓器酵素系を使ったin vitroのMK-4生成実験の両方を行うことによって、VK同族体からMK-4への変換生成機構の概要を明らかにしてきた。しかし、各組織におけるMK-4変換生成の生理的意義を含めたMK-4機能の本質は、依然として不明のままである。たまたま我々は、VKの新規作用を検索しているうちに、VK類がin vivoに炎症反応を抑制する可能性を示した。そして、今回、VKの炎症反応に及ぼす影響について、脾細胞を用いてin vitroにさらに詳細に検討したところ、MK-4が破骨細胞性の骨吸収サイトカインであるIL6の発現を抑制していることをつきとめた。Wistar系ラットをVK添加飼料(VK_1を75mg/kg飼料含む)およびコントロール飼料(VK_1を0.75mg/kg飼料含む)で10日間飼育し、リポポリサッカライド(LPS,0.5mg/kg体重)を腹腔内投与した。投与18時間後に解剖し、血漿中のGOT・GPT活性を測定したところ、コントロール飼料群に比べてVK添加飼料群では有意に低下していた。また、肝臓中のIL-6mRNA量も同様に低下する傾向にあった。次に、マウス脾臓より初代培養細胞を調製して、in vitroでの検討を行った。培地中にLPSおよびK_1、MK-4を加えて培養し、細胞からRNAを調製した。IL-6発現量を比較したところ、コントロールに比べてVK_2(MK-4)を添加した場合に有意に低下していることが明らかとなった。
自己幹細胞由来心筋細胞シートによる移植医療にかわる重症心不全治療法の開発

自己骨格筋由来筋芽細胞を用いたシート移植について、基礎実験およびラットを用いた動物実験によりその効果を検証するとともに、それによる心機能改善のメカニズムの解析を組織学的および遺伝子学的に行った。さらに、それらの結果に基づき、当治療法の臨床応用を開始した。臨床治験の第一例目は末期重症心不全の患者に施行され、左室補助人工心臓からの離脱に成功した。重症心不全に対する治療は現在のところ心臓移植あるいは人工心臓装着といった治療が有効とされている。しかし、移植数の伸び悩みや免疫抑制剤の服用、人工心臓装着状態での合併症の問題等、いずれも完全なる治療とはいえない。そこで、移植や人工心臓に代わりうる新たな心不全治療法としての再生医療について、我々はこれまで細胞をシート化する技術を用いることでより効果的な細胞治療を行うことを検証してきた。まず、今年度においては、これまで行ってきた自己筋芽細胞を用いたシート移植をより効果的にするために重層化を行い、その治療効果の検討を小動物実験において検証した。梗塞モデル心に対し、自己筋芽細胞シート3枚以上の重層化移植でリモデリング抑制効果がみられ、5枚までは心機能の改善効果が枚数依存的に増幅された。同時に心筋再生のかかわる増殖因子の分泌が有意に増加し、線維化抑制、血管数増加、肥大化抑制効果がみられた。一方、他の細胞ソースとして脂肪由来幹細胞から分化誘導を行うことによって、心筋細胞様細胞の作成を行い、これをシート化して梗塞モデル心に対して治療を行い、その効果について検討を行った。その結果、分化誘導を行わなかった脂肪由来幹細胞シート移植群にくらべ、心筋細胞様細胞シート移植群において心機能改善効果の有意な上昇がみられ、移植後16週後においてもその効果は持続していた。また、免疫組織化学的検討においては、心筋様細胞シート移植群において、α-Cardiac ActinやMyosyn Heavy Chainといった心筋細胞にみられるタンパク質の発現がみられ、心筋再生の効果が証明された。前年度において、自己筋芽細胞を用いたシート移植の効果を検証するとともに、そのメカニズムについて多くの知見を得た。今年度はさらに、細胞のデリバリー方法としてのシート移植の有効性を、注射針を用いた移植法と比較することで検証した。その結果、針で移植した細胞は90%近くが心筋への注入時に失われていたのに対し、シート移植では移植細胞の半数以上が左室心筋において検出された。細胞調整時における、控訴を用いた細胞剥離、遠心分離操作、及び注射針の通過といった細胞への物理的障害が、シート移植により軽減されていると考えられた。また、ラットで肺動脈絞約による右室負荷モデルを作成し、これに筋芽細胞シート移植を行うことで、筋芽細胞シートによる右室の線維化抑制効果および心機能改善効果を実証した。そして、当施設の倫理委員会における慎重な審査を経たのち、十分なインフォームドコンセントのもとに自己骨格筋筋芽細胞シート移植の臨床応用を開始した。これまで、2例の左室補助人工心臓を装着した重症心不全患者に当治療法を行い、うち1例では補助人工心臓を離脱するほどに心機能が回復、現在も良好な心機能・ADLが保たれている。
筋原線維の自発的振動収縮

今年度は,我々が数年前に発見しSPOCと呼ぶことにした,筋原線維(骨格筋)の自発的振動収縮現象を定量的に解析する方法を確立した上で, SPOCを生じさせる条件を様々に検討すること,そしてSPOCの本質面を理解することを第1の目標とした.未だ十分な解明はなされていないが,研究成果を個条書にする.1.テレビカメラーパソコン接続によりSPOCの振動波形等の解析,その表示法等,そのためのソフトを改良した.その結果,波形,その相関関数等を迅速に求めることが出来るようになった.2.アクト・ミオシンからなる収縮要素と,並列弾性要素が粘性溶媒に浸っているという力学モデルによって, SPOCの一部の性質を理解することができた.筋原線維の両端部での弾性要素の役割が無視しえないものである.3.筋原線維のSPOC条件下でのATPaseを測定した.筋原線維の懸濁液を用いた場合には,収縮条件下と比べて幾分低い活性を示した.しかし,懸濁液の場合には,筋原線維の両端は固定されていないため, SPOC状態でのATPaseを測定したことにはなっていない.光学顕微鏡下でSPOCをしている際の活性は,測定が困難であるが,予備的な実験によれば,両端未固定の場合と比べて高いようである.この点は今後検討すべき重要な点である.4.筋原線維調製時のトロポニンの遊離(あるとしてもわずか)とSPOCが関連している可能性が懸念されたが,精製トロポニンの添加によってSPOCに何も変化はなかった.ただしトロポニンに混在していた微量のミオキナーゼの作用がみられた.5.心筋についてもSPOCを解析した.拍動数の低い牛の場合には, SPOCの周波数も非常に低かった.本年度は、我々の見出した筋原線維の自発的振動収縮(Spontaneous OscillatoryContraction,SPOCとよぶ)を様々な条件下で詳細に記録すること、その上でメカニズムの理解を目指した。以下その結果を個条書にする。1.ビデオ装置を導入することによって、記録を迅速かつ大量に行えるようにした。さらに、パソコンに接続し、独自に開発したソフトをもとに、SPOCの振動波形等を詳細に解析できるようにした。(位相差顕微鏡に設置)3.SPOC発生の力学的条件として、弾性要素であるコネクチンの寄与が期待されたが、微量トリプシンによりコネクチンを選択的に分解しても、SPOCにはほとんど変化が見られなかった。SPOCには弾性要素が必要だと思われるが、それはクロスブリッジ等の収縮要素そのものかもしれない。4.以上は骨格筋(速筋)の結果であるが、骨格筋(遅筋)及び心筋についても同様の実験を行った。顕著な相異点は、遅筋の場合には振動数が数分の一になること、心筋の場合にはSPOCの生じるADP,ATP濃度域が異なることであった。原因は、ミオシン等収縮要素の相異に帰せられよう。5.SPOCを力学モデルにより理解する試みも行っており、近い将来には、SPOCを性質の分ったいくつかの要素をもとにシミュレートできると思われる段階にきた。(以上)今年度は,我々が数年前に発見しSPOCと呼ぶことにした,筋原線維(骨格筋)の自発的振動収縮現象を定量的に解析する方法を確立した上で, SPOCを生じさせる条件を様々に検討すること,そしてSPOCの本質面を理解することを第1の目標とした.未だ十分な解明はなされていないが,研究成果を個条書にする.1.テレビカメラーパソコン接続によりSPOCの振動波形等の解析,その表示法等,そのためのソフトを改良した.その結果,波形,その相関関数等を迅速に求めることが出来るようになった.2.アクト・ミオシンからなる収縮要素と,並列弾性要素が粘性溶媒に浸っているという力学モデルによって, SPOCの一部の性質を理解することができた.筋原線維の両端部での弾性要素の役割が無視しえないものである.3.筋原線維のSPOC条件下でのATPaseを測定した.筋原線維の懸濁液を用いた場合には,収縮条件下と比べて幾分低い活性を示した.しかし,懸濁液の場合には,筋原線維の両端は固定されていないため, SPOC状態でのATPaseを測定したことにはなっていない.光学顕微鏡下でSPOCをしている際の活性は,測定が困難であるが,予備的な実験によれば,両端未固定の場合と比べて高いようである.この点は今後検討すべき重要な点である.4.筋原線維調製時のトロポニンの遊離(あるとしてもわずか)とSPOCが関連している可能性が懸念されたが,精製トロポニンの添加によってSPOCに何も変化はなかった.ただしトロポニンに混在していた微量のミオキナーゼの作用がみられた.5.心筋についてもSPOCを解析した.拍動数の低い牛の場合には, SPOCの周波数も非常に低かった.
超新星起源宇宙線スペクトルの導出

超新星爆発の際、宇宙線がどのようなメカニズムで加速されるのかを知ることは、宇宙線の加速機構を解明する上にとって重要である。南極氷柱の放射性元素ベリリウム10の到来時間分布はフォーワードショックとリバースショックの存在を暗示している。我々は放射性炭素14、ベリリウム10、クロライン36を測定し、それぞれのエネルギーレスポンスを利用して、超新星爆発の際作られた宇宙線のエネルギースペクトルを求めるための実験準備を本科研費を利用して実施した。今年度はまず、放射性炭素14の試料中の含有量を高精度(0.2%)で求める実験装置を作成するために本科研費を使用して実施した。我々は日本学術振興会の短期外国人研究者招聘制度で、ロシアのサンクトペテルスブルグ大学からア-スラノフ教授を招聘し、彼の下に、大量のベンゼンを一度に合成するライン(約20cc)を名大STE研構内に完成させ、まず手始めに、10例程そのサンプルを作り、名大構内の松の木に残されていた原子爆弾の爆発によって作られた放射性炭素の年代毎の含有量分布を求め、今までの測定器が大筋において再現できることを証明した。現在精度や経度による分布の違いを求め、論文としてまとめ、6月オランダのグローニンゲン大学で開かれる放射性炭素の国際会議に発表するよう準備中である。なおこれらの計測器はクワンタラス社のものを使用すると2,000万円必要となる。そこでその約十分の一の経費で手作りによる計測器を作成し、十分その精度が得られることを確認した。科研費はラインの製造と計測器の製作費、及び化学処理のための薬品を購入するのに使用した。
脆弱国におけるコミュニティ参加型学校運営と社会的結束性についての理論とモデル構築

研究期間にわたり、ボスニア・ヘェルツェゴビナ国の住民参加型学校運営制度と地域社会の社会的結束の関係について確認した。一年目の調査では学校運営協議会の実態を確認した。二年目は紛争中に民族虐殺が発生したスレブレニツアにおいて、少数民族系の生徒に対し面接調査を行った。生徒自身が民族交流の場としての学校を評価していた。三年目は民族混在性の高いブルチコ地区を中心に、協議会委員へ面接調査を行った。多民族から構成される協議会は、学校運営の正統性(legitimacy)を高めていたことがわかった。学校は社会的結束を促進しうる。多民族住民参加型学校運営は学校の正統性を確保しその役割を促進することが示唆された。研究初年度の本年では、教育、特に学校の機能と社会的結束性の関係性について、申請者によるこれまでの研究成果と照らし合わせつつ、国内・国外の最新の研究成果と理論的発展を確認した。これは、「紛争後社会の教育と多文化共生」『多文化共生社会におけるESD・市民教育』(上智大学出版社、2014年)にまとめられている。本年度は、現地事前調査を2014年9月および2015年2月に実施した。2月の調査では、対象地域を絞り(スレブレニツア)、主に開放型インタビュー手法を用いて大規模民族虐殺が起きた地における教育現場のリアリティを掴む作業を行った。インタビュー対象者は、サラエボおよびスレブレニツア地域の初中等学校の校長を中心に、学校評議会委員数名を含む。インタビューの結果、多くの学校評議会が委員欠如等の理由により機能不全もしくは停滞している現実が明らかとなった。無報酬性に加え、本来想定されていた学校運営におけるアクティブな役割が期待されておらず、その役割が苦情処理などに限定されるといった理由が委員志願者を少なくさせており、コミュニティの関心低下をも招いていると考えられる。今後は、住民参加型学校運営が機能している個別ケースに焦点を当て、その社会的結束性への影響を調査すると同時に、より広く住民の役割を考慮に入れた学校の社会的結束機能について調べ考察していく。なお、2回の現地調査においては、ボスニアの教育研究で知られるサラエボ大学教員のDr. KresoおよびDr. Kasumagicと研究内容および手法等について議論した。今後の研究にあたり、協力を頂くことも考えている。研究2年次の本年では、初年度の成果を踏まえつつ、教育と社会的結束の関係をより幅広く捉え、民族混合学校に通う少数派生徒の意識調査を行った。具体的には、セルビア勢力によるムスリム系住民に対する民族虐殺(ジェノサイド)が起きたスレブレニツア地域の中等学校2校を対象に、約30名の生徒にフォーカス・グループインタビューを実施した。これらの生徒はムスリム系であり、セルビア系学校で学んでいる。彼らが自らの学習体験をどう捉えているか理解することで、民族紛争後社会の学校が社会的結束の促進にいかなる役割を果たしうるか示唆を得ようとした。音声データは文字起こし・翻訳・第3者による確認を経ている。精緻な分析結果は翌年度に行うが、一般的な傾向として、セルビア系正規カリキュラムによる学びよりも、セルビア系生徒との学びの共有を評価している姿勢が伺えた。背景として、本地域の地域住民・保護者が、民族系科目が初等教育段階で一通り終わっていることもあり、中等学校では対立した民族と交流を促すのであればそれを認めていく、という姿も想定できる。初年度の成果を踏まえて修正した計画を遂行出来た。研究期間三年目は民族混在性の高いブルチコ地区を中心に、学校運営協議会委員および学校関係者への面接調査を行った。その結果、以下の3点が確認できた。第一に、学校運営協議会委員の民族混合性は、必ずしも地域社会内の社会的結束を促す学校運営につながっていないこと、第二に、しかしながら、多民族地域社会においては学校運営の正統性(legitimacy)確保にために民族混合の委員構成は以前として必要とされていること、そして第三に、異民族の生徒、親、教師間で交流を生む多民族統合学校の意義は地域社会で概ね受け入れられており、その実現のために各民族の代表者で学校運営協議会が構成されるのは不可欠であること、などが示唆された。当局や関係者の協力を得ながら、調査研究を遂行することが出来た。研究成果については、三年間のものをまとめたものを今後、学会等で発表していく予定である。研究最終年度(延長年度)では、これまでの3年間の研究成果について発信し、関係者と意見交換を行うため、紛争や災害に影響を受けた脆弱国の教育支援を議論するネットワーク「緊急下の教育支援に関わる機関間ネットワーク」(INEE: Inter-Agency Network for Education in Emergencies)の年次会合(平成29年4月4日平成29年4月9日、ポルトガル、ブラガに位置するミンホ大学がホスト)に出席した。年次会合は、非政府組織(NGO)、政府系機関(USAID等)、国際機関(UNICEF、世界銀行等)、コンサルタント会社、大学関係者が多数出席している。研究者は、本ネットワークの分科会メンバーとなっている。年次会合では、教育政策を議論する分科会の会合およびシンポジウムにおいて研究成果を発表する機会を得た。分科会では、研究者が関わる紛争要因に配慮した教育支援に関する研究の進捗状況を発表する中で、科研の研究成果についても言及した。研究者がモデレーターを務めたシンポジウムにおいても、本研究の成果を発信した。年次会合の参加者からは、分科会とシンポジウムの内外でフィードバックを得ることが出来た。

学会とは異なり、実践者が多く集まる会合であり、実践者の立場から住民参加型学校運営の役割や実態、それに対する支援について意見を交換することが出来た。得られたフィードバックや意見交換の結果は、科研の成果を論文にまとめ学会で発表する際に参考にする。研究期間にわたり、ボスニア・ヘェルツェゴビナ国の住民参加型学校運営制度と地域社会の社会的結束の関係について確認した。一年目の調査では学校運営協議会の実態を確認した。二年目は紛争中に民族虐殺が発生したスレブレニツアにおいて、少数民族系の生徒に対し面接調査を行った。生徒自身が民族交流の場としての学校を評価していた。三年目は民族混在性の高いブルチコ地区を中心に、協議会委員へ面接調査を行った。多民族から構成される協議会は、学校運営の正統性(legitimacy)を高めていたことがわかった。学校は社会的結束を促進しうる。多民族住民参加型学校運営は学校の正統性を確保しその役割を促進することが示唆された。当初予定していた主要先行研究のレビューと現地調査の実施は達成している。仮説の設定にあたっては、先行研究の成果と2014年度に実施した現地調査の成果を考慮する。最終年度では、民族混合学校を対象にした質問票調査を実施し、地域住民・保護者と学校、民族混合教育の関係性について更に探求していく。調査対象校は、別の研究で収集した民族混合性に関するデータを基に、恣意的サンプリングと無作為サンプリング手法を併用し選別する。調査協力者は学校長とし、民族混合学校におけるカリキュラム、生徒の交流、住民参加の度合い・性質についてデータを収集する。データ分析にあたっては、サラエボ大学で異文化間教育を専門としているカスマギッチ博士に協力を仰ぐ。最終的に3年間で収集したデータを基に、教育と社会的結束に関する理論構築を目指す。本研究の成果は2018年度中に論文の形でまとめ、書籍化する計画である。国際教育開発学2015年度(平成27年度)は、ボスニア国にて本調査を実施する。調査では、社会的結束の構築・回復が最も試されているスレブレニツア地域をケース・スタディとして、初・中等学校を引き続き調査する。対象校は主に前年度に訪れた学校を含め10校程度を想定する。これら学校の学校長、教員、地域住民、生徒を対象に半構造化インタビュー調査を行い、Heyneman(2003)の理論モデルに参照しつつ、学校の社会的結束機能について探究していく。また、学校評議会の委員にもインタビューを実施し、CBSM制度下の学校運営と社会的結束性の関係について、学校運営主要アクターの理解、課題認識、システム改善への提案を訊く。可能であれば、協議会の定例会議に出席し、非参与観察を行うが、民族関係がセンシティブな地域では困難が予想される。代替肢として、関係者へのイン・デプス・インタビューを通じてその実態に迫ることを考える。これら調査で収集したデータは、研究データ分析ソフトNVIVI10を用いて整理・分析し、その後の調査計画に反映させる。
ＦＧＦ－２徐放による組織再生誘導能を備えた接着性レジンの開発

本研究では、組織再生促進機能を備えた接着性レジンを実現するための基盤技術として、タンパク徐放用担体としてのpolyHEMA系ハイドロゲル粒子を開発した。そして、この試作ハイドロゲル粒子にFGF-2を担持させたところ、活性を維持した状態でのFGF-2の持続的な溶出が認められ、本粒子がFGF-2の徐放用担体として有用であることが明らかとなった。また、その物理化学的特性の評価に基づき、4-META/MMA系接着性レジンがFGF-2担持ハイドロゲル粒子を適用する基材として適していることが確認された。本年度は,タンパク徐放のキャリアとなるハイドロゲル粒子を試作し,まずモデルタンパクとしてのBovine serumalbumin (BSA)を用いて検討を行うことにより,有望な組成物を得ることに成功した。そして,得られたゲル粒子にFGF-2を担持させ,水中環境下でFGF-2の持続的な徐放が可能であることを確認した。1.タンパク担持用ハイドロゲルの作製HEMA単独の重合体を粉砕して得た粒子では,吸水により凝集が生じたため,HEMAに架橋モノマーを10%加えた重合体を作製した結果,吸水しても粒の形態を維持できる粒子の作製に成功した。つづいて,HEMA90%/架橋モノマー10%からなる粒径の異なる4種の粒子を調製し,吸水率・含水率を測定したところ,4種の間に差は認められず,いずれもハイドロゲルとして十分な吸水性を備えていることが分かった。また,ゲル内に残留した未重合モノマーを減少させるためには,粉砕後に48時間の洗浄が必要であることが判明した。さらに,その条件で洗浄したゲル粒子には骨芽細胞様細胞が吸着できることから,細胞親和性に問題がないことが確認された。2.試作ハイドロゲル粒子のタンパク担持・徐放性の検討粒径550μmのハイドロゲル粒子をBSA溶液に浸漬した後,9日間までの溶出実験を行ったところ,BSAの持続的な溶出が認められた。つづいて,4種のFGF-2試薬と1種の市販FGF-2製剤について,骨芽細胞様細胞の増殖と分化の点から効果を比較したところ,有効濃度には差が認められなかったため,市販製剤であるFGF-2を担持させたハイドロゲル粒子を作製した。この試作粒子を用いて溶出試験を行った結果,BSAの場合と同様に9日までの持続的なFGF-2の溶出が可能であることが確認された。本年度は、FGF-2徐放性ハイドロゲル粒子の4-META/MMA系レジンへの配合濃度と適用方法について検討を加えるとともに、HEMA系レジンへの添加の可能性を検討し、以下の成果を得た。試作ハイドロゲル粒子を4-META/MMA系レジン粉末に混合すると、添加濃度の増加に伴って曲げ強さの有意な低下が生じ、臨床使用上は10%以下の配合が望ましいことが分かった。また、ゲル粒子を硬化途中の4-META/MMA系レジン上に散布することにより、レジン表面に粒子を密に接着させることが可能であり、物性の点では、粉末への配合よりも有用な方法であるものと考えられた。一方、骨芽細胞様細胞であるMC3T3-E1細胞を用いた培養系で評価した結果、4-META/MMA系レジン硬化体上では、カルチャープレートと同様の細胞接着・増殖が認められ、FGF-2徐放性を付与する基材として適していることが分かった。一方、Metaseal SoftをベースにしたHEMAを多く含む基材レジンに試作ハイドロゲルの添加を試みたものの、ゲル粒子と基材が一体化する結果となり、ゲル粒子がFGF-2のリザーバーとして十分な役割を果たせない可能性が推測された。本年度に得られた結果と平成24年度までの成果を総合的に判断すると、試作FGF-2徐放性ハイドロゲル粒子を組み合わせる基材としてはMMA系レジンが適しており、これにより組織再生促進能を備えた接着性レジンの実現が可能であると結論づけられるが、物性の観点からは現在のゲル粒子を粉末に高濃度で直接添加できないため、散布併用法での使用条件や、ゲル粒子をさらに改良または修飾したもので動物実験に進むことが望ましいと考えられた。本年度は,昨年度に作製に成功したpolyHEMA系ハイドロゲル粒子のFGF-2徐放用担体としての有用性を詳細に検討するとともに,ゲル粒子配合の基材レジンとなる4-META/MMA系レジンを調製して実験を行い,以下の成果を得た。蛍光ラベルしたBovine serum albumin (BSA)を試作ゲル粒子に担持させ,共焦点レーザー顕微鏡による観察を行ったところ,BSAがゲル粒子の表層に蜜に吸着して担持されていることが分かった。また,BSAあるいはFGF-2を担持させたゲル粒子からの各タンパクの徐放挙動を調べた結果,いずれも21日間の長期にわたって持続的に溶出することが確認された。

つづいて,FGF-2担持ゲル粒子を浸漬した培地を用いて骨芽細胞様細胞であるMC3T3-E1細胞を培養したとこころ,有意な増殖促進作用が認められ,ゲル粒子から溶出したFGF-2が効果を示すことが明らかとなった。しかも,この細胞増殖促進作用は浸漬開始から長期間経過後も維持されていることが確認された。一方,サンメディカル社製Super Bondをベースにした4-META/MMA系レジンを調製し,熱電対センサーを用いて重合時の温度上昇を調べた結果,室温および37°C下のいずれであっても,上昇温度は2.5°C以下であり,タンパクの変性を引き起こすレベルではないことが判明した。また,調製したレジンの硬化体からの未重合モノマーの溶出濃度は,4-METで約2.2μg/mL,MMAで約9.8μg/mLと低濃度であり,これらの濃度の各モノマーの存在下でもFGF-2の活性は阻害を受けず,MC3T3-E1細胞の増殖が促進されることが分かった。ハイドロゲルの均質な粒子化のための組成決定と,細胞親和性を高めるための精製方法の確定に時間を要したため,交付申請書記載時に予定していたFGF-2担持ゲルの効果そのものを検討するまでに至らなかった。25年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの2年間の研究により,タンパクの担持に適した新規polyHEMA系ハイドロゲル粒子の作製に成功し,このゲル粒子にFGF-2を担持させることにより,長期間にわたってFGF-2を徐放するハイドロゲル粒子の実現が可能であることを明らかにした。また,骨芽細胞様細胞を用いた培養系で,試作ゲル粒子から徐放したFGF-2が担持前と同様の活性を維持していることが確認され,計画した目標はほぼ達成できていることから,研究はおおむね順調に進行していると判断できる。なお,試作ゲル粒子を基材レジンに混合した場合の物性の評価を含め,適用法全般に関連する検討を次年度に重点的に行うよう変更した点で,一部当初の計画とは異なる進展状況となっている。本年度に歯科用レジンへの応用に適していると予想されるハイドロゲル粒子の作製とFGF-2の担持に成功したため,細胞培養実験にてFGF-2を担持させたゲル粒子の効果の確認を行うとともに,長期的なFGF-2徐放特性について検討していく予定である。また,ゲルを適用する基材となる4-MET[A/MMA系接着性レジンの試作品を調製し,その材料特性を調べ,ゲル粒子の適用方法を考慮するために必要なデータを取得していく計画である。なお,に材となる4-MET[A/MMA系接着性レジンについても試作となるため,その組成の確定にはある程度の時間を要する可能性があり,工学研究科所属の連携研究者と十分な討議を重ねる予定である。臨床応用した際の有効性の点では,当初予定していた4-META/MMA系レジンに試作ハイドロゲル粒子を直接混合する方法は必ずしも最適であるとは限らないことや,ゲル粒子との親和性がより高い他のレジン組成への適用も検討する必要があると考えられる。そのため,次年度には,試作ゲル粒子の4-META/MMA系レジンへの直接混合の適否を曲げ特性等の点から検討するとともに,レジン表面への散布方式でのゲル粒子の適用の可能性についても調べる予定である。また,より弾性が高く,試作ハイドロゲルとの親和性にすぐれた新たな基材レジンの模索を行うことにしており,これらにより,臨床的有用性の高いFGF-2徐放性レジンの材料デザインの確定を試みる。