hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本語講義音声の英語字幕付き教材を生成するための音声翻訳に関する研究

まず、日本語と英語の講義音声のDNNによる音声認識システムを開発した。次に、英語講義音声の日本語字幕化の研究を行った。複数音声認識器の複数音声認識結果を統計的手法に基づいて機械翻訳し、言語モデル等で翻訳結果をリスコアリングすることにより、翻訳精度を向上させた。また、音声認識誤りに対処するため、音声認識器のシュミレーションによる学習データを増加させる方法の有効性を示した。予定研究期間を1年間延長し、統計的機械翻訳とニューラル機械翻訳を併用し、翻訳候補の逆翻訳に基づくリスコアリングにより、翻訳精度を大幅に向上させることが出来た。以上の手法を、日本語講義音声の英語への翻訳・字幕化にも適用した。本研究の目的は、日本語講義音声と英語講義音声を対象に、話し言葉音声を自動認識し、その整形・要約・翻訳を統一的に扱うことによって、留学生や日本人学生の講義の理解を効果的に支援する日本語講義に対する英語字幕や英語講義に対する日本語字幕を付与する技術を開発することである。本年度は、字幕の表示方法に関する検討と英語講義音声の日本語への翻訳の初期的検討を行った。(1)字幕の表示方法の検討以下の5つの字幕表示方法を比較した。(a)講義音声をすべて字幕にして表示する方法(フルテキスト)、(b)重要文を抽出し、重要文だけを翻訳して表示する方法(重要文)、(c)重要な句(フレーズ)を抽出し、重要句だけを翻訳して表示する方法(重要句)、(d)重要なキーワードを抽出し、キーワードだけを翻訳して表示する方法(キーワード)、(e)字幕なし。比較の結果、英語の講義音声に対する日本人学生、および日本語講義に対する留学生は、ともに同じ傾向を示し、フルテキストだけでなく、重要文の字幕表示や重要句の字幕表示も有用であることが分かった。(2)英語講義音声の認識と日本語への翻訳英語講義音声の日本語字幕表示の初期的検討として、まず、英語講義音声の自動認識と統計的機械翻訳手法による英語講義音声の日本語への翻訳を行った。英語講義音声に対しては、本研究室で開発されたSPOJUS++を用いた。次に、日英の新聞記事のパラレルコーパスを用いて、オープンソースであるMosesを用いて統計的機械翻訳を行った。新聞記事と講義では、話しスタイルの相違と内容の相違があり、上手く翻訳ができないことが分かった。そこで、話し言葉であり技術的話題が多いTEDコーパスを用いた。このコーパスには、日本語字幕も付与されているため、これから日英のパラレルコーパスを作成し、機械翻訳に使用し、改善が得られた。前年度に講義音声の字幕表示方法に対して比較研究を行い、重要文や重要句だけの字幕表示でも学習効果があることが分かった。これに基づき、英語講義音声と日本語講義音声の翻訳システムを作成した。まず、日本語の講義音声の認識では、従来のガウス混合分布モデルを出力分布とする隠れマルコフモデル(GMM-HMM)と最近目覚ましい成果が出ている深層ニューラルネットワークの出力を事後確率とする隠れマルコフモデル(DNN-HMM)を実装し、前者で単語正解率が約40%、後者で約50%程度が得られた。日本語の英語への翻訳に関しては、新聞や講演(TED)の日英の文同士の対訳がとれているパラレルコーパスを用いて、統計的機械翻訳システムを実装した。デコーダには、公開されているMOSESを使用した。翻訳精度の向上を図るために、(1)言い淀み・間投詞などを削除し、話し言葉の言い回しを書き言葉の言い回しに変換する前処理、(2)日本語と英語の語順が大きく異なることから、日本語の述語を主語の直後に移動する前処理、(3)1段目の翻訳で語順の翻訳が不完全なので、2段目で語順を修正する2段階翻訳、の手法を提案し、それぞれ効果のあることを確かめた。英語の講義音声の認識では、MITの講義音声を対象とし、新聞の読み上げ音声で作成した音響モデルを講義音声で適応すること、および、講義話者の音声に適応することを試みた。GMM-HMMとDNN-HMMで音声認識システムを実装し、GMM-HMMよりもDNN-HMMの方が認識率が良く、読み上げ音声のモデルで単語認識率が約70%、講義音声の発話スタイル適応モデルで約77%、さらに話者適応したモデルで約79%を得た。英語の日本語への翻訳に関しては、上述の日本語ー英語翻訳と同じパラレルコーパスを使用した。講義音声の言い回しの翻訳が重要と考え、この翻訳テーブルの追加で翻訳率が向上することを確かめた。本年度は、フレーズベースの機械翻訳以外に、階層的フレーズベース翻訳、ツリーストリングベース機械翻訳の比較研究を行い、講義音声の英日翻訳では、フレーズベース翻訳が最も優れていることを示した。次に、講義音声中によく出てくる頻出句の日本語訳を登録し、機械翻訳の質の向上を図った。頻出句の定義として単語のnグラムと構文解析木に基づく句単位の比較、および、日本語訳の登録方法として、パラレルコーパスに頻出句の日英ペアを追加する方法とフレーズ翻訳テーブルに直接追加する方法を比較検討した。その結果、頻出句の単位は、nグラムよりも構文解析木による句単位の方が優れていること、日本語訳の登録方法としては、直接フレーズテーブルに追加する方法が副作用が少なく優れていることが分かった。すなわち、パラレルコーパスとして追加する方法では、頻出句の日英ペアの単語列のアライメントが、他のコーパスのアライメントに悪影響を及ぼす可能性があることが分かった。

初年度の平成25年度は、日本語講義音声の英語への翻訳を試みたが、以前から指摘されているように、英語から日本語への翻訳よりも難しく、しかも話し言葉であるため、翻訳が非常に難しいことが分かった。そこで、まず、英語の講義音声を日本語に翻訳する技術を開発することにした。この技術を最終年度に、日本語講義音声から英語への翻訳に利用するという方針にした。平成27年度は、平成26年度に引き続いて、英語講義音声の日本語への音声翻訳システムを開発してきた。その結果、フレーズベースに基づく翻訳モデルが良いこと、講義ドメインへの適応技術として、対象ドメインの頻出句を抽出し、その日本語訳をフレーズテーブルに登録する方法が良いこと、を明らかにした。この枠組みで、講義の話し言葉音声のパラレルコーパスを増やして行けば、機械翻訳の質は向上するであろうという見通しを得た。講義音声の翻訳には、講義音声の音声認識とその翻訳の二つの部分からなる。まず、音声認識に関しては、話者クラス情報をディープニューラルネットワークに補助情報として入力する方法を提案し、不特定話者の音声認識に関して有効性を示した。次に、ヒトの聴覚機能を模擬するために音声分折用のフィルタバンクのフィルタ形状を学習する方法を提案した。フィルタをディープニューラルネットワークによる音声認識の前処理として用い、識別学習によるフィルタ形状を学習することにより、認識率の向上を得た。英日翻訳に関しては、音声認識誤りに対処するために、翻訳モデルの学習に用いるテキストベースの英語ー日本語対からなるパラレルコーパスに対して、テキストの代わりに英語コーパスの音声認識結果を使用する方法と、模擬的に英語音声認識を行って音声認識誤りを自動生成した結果を使用する方法を試みた。その結果、両手法とも翻訳精度の改善に役立つことを実証した。特に、音声認識を模擬する手法は、音声データを必要としない利点がある。最後に、本手法を、本研究の課題である日本語講義音声の英語への翻訳に適用した。しかし、語順の自由な話し言葉である日本語の講義の翻訳は非常に難しく、ベースラインが悪くて、提案手法の有効性を示すには至らなかった。講義音声の認識に関しては、話者クラスの導入、フィルタ形状の識別学習など、新たな手法を提案し、有効性を示せた。英語講義音声の日本語への翻訳に関しては、音声認識誤り対策法を提案し、有効性を示せた。ただし、日本語講義音声の英語への翻訳に関しては、ベースラインが悪くて、提案手法の有効性を示すには至らず、今後の課題として残った。本研究課題が当初の予想よりも困難であったため、1年間研究期間を延長した。困難であった理由は、我々の使用した日本語講義音声の認識が比較的難しかったこと、および日本語講義の英語への翻訳が極めて難しかったためである。例えば、英語のオープンコースウエアであるMIT講義音声の認識率は、単語換算で約80%であるのに対し、日本語講義音声の認識率は、単語換算で約60%であった。また、MIT講義の日本語への翻訳精度はBLEU値で約15であったのに対し、我々の使用した日本語講義の英語への翻訳精度は約10であった。そこで、まず、基本技術の確立を目指し、2年度目から英語講義音声の翻訳に重心を移した。
バイオマスを由来とする強靭で透明な新規多孔体の機能解析と応用展開

セルロースナノファイバー(CNF)を骨格とする新規多孔質の構造と伝熱特性の関係を調査した。その結果、CNFが網目状に骨格を形成したナノポーラスな多孔体よりも、CNFが薄膜状に凝集した骨格を有するマクロポーラスな多孔体のほうが、著しく熱拡散率を低下させることが明らかとなった。すなわち、多孔体中の空気の熱拡散を抑制するためには、ナノスケールの網目状骨格により空気分子の自由行程を直接阻害することよりも、薄膜状骨格によりマイクロスケールの閉塞的な空間をつくるほうが効率的であった。その他、常圧乾燥によるCNF多孔体の調製や、CNF多孔体を由来とする新規ナノカーボンの形成についても検討した。本年度は、空隙率・細孔径・比表面の異なるセルロースナノファイバー(CNF)エアロゲルについて、伝熱特性を比較した。ナノポーラスなエアロゲル1・2は、2種の異なる工程で調製した。エアロゲル1は、CNF分散液に希酸を加えてゲル化し、液体二酸化炭素で溶媒を置換後、超臨界乾燥することによって調製した。エアロゲル1は、よく孤立したCNFのネットワーク骨格を有する。エアロゲル2は、CNF分散液にt-BuOHを加えてゲル化し、t-BuOHで溶媒を置換後、凍結乾燥することによって調製した。エアロゲル2は、CNFが部分的に凝集したネットワーク骨格を有していた。マクロポーラスな発泡体状のエアロゲル3は、CNFの水分散液を直接凍結乾燥することによって調製した。分散液を液体窒素中で急速凍結すると、ミクロンスケールの氷晶が形成し、その周りにCNFが局在化する。氷晶を昇華させると、局在化したCNFの膜状凝集体を固相とするマクロポーラスな発泡構造体が得ることができる。これら3種のエアロゲル試料のについて、固相の体積分率に対する熱拡散率を比較したところ、log-log plotにおいて線形関係を示すことが見出された。log-log plotの直線の傾きは、固形分率への依存性を示す。エアロゲル1、2、3の各傾きは、それぞれ-0.6、-0.5、-1.6であった。すなわち、エアロゲル1・2と比較して、発泡体状のエアロゲル3の熱拡散率αは、固形分率が増加したとき、著しく低下した。これは、エアロゲル3の膜状固相が形成する閉塞的な細孔構造が、温度勾配の緩和を著しく遅らせることができることを示している。平成27年度は、構造の異なるCNFエアロゲルについて、伝熱特性を比較し、効率的な断熱性を発現する固相構造を明らかにした。当初、エアロゲルを炭化して得られる新規ナノカーボン材料についても構造決定まで進展させる予定であったが、想定よりもプロセスに時間がかかってしまうため、解析が計画に追いついていない状況である。平成28年度は、CMFヒドロゲルから新規キセロゲルを形成しうる条件を見出すことができた。ヒドロゲルをエタノール、ヘキサンの順に溶媒置換し、得られたオルガノゲルをデシケーター内で蒸発乾燥させると、水から直接乾燥させたものよりも比表面積が著しく大きくなることが判明した。この結果は、表面張力の小さい溶媒(ヘキサン)を使用することで、乾燥時の毛管力が小さくなり、ゲルの収縮が抑えられたものと解釈できる。また、金属イオンでCMF間を架橋したヒドロゲルを調製し、同様にエタノール、ヘキサンと溶媒置換した後、デシケーター内で蒸発乾燥させたところ、さらに比表面積が向上していた。この結果は、金属イオンでCMF間をイオン架橋することで、ゲルの弾性率が上昇し、ゲルの収縮が更に抑えられたものと解釈できる。また、平成28年度は、CMFエアロゲルから調製した新規ナノカーボンの構造解析まで研究を進めることができた。ヨウ素前処理したCMFエアロゲルを、管状電気炉を用いて窒素フロー下で500°Cまで炭化した。それ以上の高温処理に供する場合は、その後、真空炉を用いて900°C、1700°C及び2450°Cまで昇温して1時間処理した。炭化した試料は、元のエアロゲルから約80%線収縮した形状を有していた。処理温度が増加するとともに収率は低下し、不純物の脱離及び一部の炭素の揮発が確認された。空隙率は処理温度の増加とともに増加していた。電子顕微鏡解析では、全ての試料についてナノメートル径の繊維状構造が確認された。900°Cまでは、繊維内部で炭素網面が完全にランダムな配向を有しており、非晶質構造であった。1700°Cまで昇温すると、炭素網面が曲面状に成長しており、部分的に23枚の層構造を有していることが確認された。2450°Cまで昇温すると、炭素網面が平面に近づいており、層構造も57枚に増加していた。研究計画書に記載した通りに、研究が進展しており、新たな知見を蓄積できている。前年度までに、高空隙率かつ大比表面積のキセロゲルを調製するプロセスを確立した。しかし、得られたキセロゲルは不透明であり、超臨界乾燥で得られるエアロゲルのような光透過性はなかった。この原因として、キセロゲルの表面粗さが想定された。キセロゲルは湿潤ゲルの蒸発乾燥によって形成するが、乾燥の際に不均一に収縮してしまう。そこで、溶媒をゲルの側面のみから蒸発させるために、蒸発乾燥時にゲルの上下面をプレートで覆い、溶媒蒸発をゲルの側面方向に限定することとした。

その結果、キセロゲルは平滑な膜状となり、光透過性を発現した。すなわち、キセロゲルの不透明性は表面粗さに起因するものであり、乾燥の方向性を制御することで光透過性を発現させることが可能であることが判明した。得られた膜状キセロゲルの空隙率と比表面積を測定したところ、乾燥の方向性を制御していないブロック状のキセロゲルと比べて、低下してしまっていた。これは、膜状キセロゲルがプレートで挟んで乾燥させており、圧縮応力がかかった状態で溶媒が抜けていることが原因として挙げられる。すなわち、乾燥時に細孔がつぶれてしまっていることが想定される。一方で力学特性について評価したところ、非常に良好な結果が得られた。超臨界乾燥で得られるエアロゲルの課題として、柔らかいこと(低弾性率)であることが挙げられるが、本検討で得られた膜状キセロゲルは、構造用途で使われるプラスチック並み(例えばPETフィルム)に堅いことが明らかとなった。しかし、熱伝導率はエアロゲルよりも数倍高く、断熱用途を想定するためには、空隙率と比表面積の向上が課題であることが明確となった。すなわち、乾燥の方向性を制御することは光透過性の発現に有効であることが分かったが、その工程で細孔が潰れてしまうという課題を解決することが必要である。セルロースナノファイバー(CNF)を骨格とする新規多孔質の構造と伝熱特性の関係を調査した。その結果、CNFが網目状に骨格を形成したナノポーラスな多孔体よりも、CNFが薄膜状に凝集した骨格を有するマクロポーラスな多孔体のほうが、著しく熱拡散率を低下させることが明らかとなった。すなわち、多孔体中の空気の熱拡散を抑制するためには、ナノスケールの網目状骨格により空気分子の自由行程を直接阻害することよりも、薄膜状骨格によりマイクロスケールの閉塞的な空間をつくるほうが効率的であった。その他、常圧乾燥によるCNF多孔体の調製や、CNF多孔体を由来とする新規ナノカーボンの形成についても検討した。27年度に引き続き、ナノカーボン材料の形成と解析のトピックを進展させ、28年度内には構造解析まではまとめる予定である。また、蒸発乾燥により形成させるCNFキセロゲルについても、28年度は着手する。研究計画に従って、平成29年度はCMFゲルを由来とする新規キセロゲル及び新規ナノカーボン構造体の機能解析に着手する。29年度が最終年度であるため、記入しない。木質科学29年度が最終年度であるため、記入しない。
白血病における治療効果予測マーカーとしての細胞内TNFの意義

本研究では、前年度に引き続き、(1)実際に各種白血病患者から腫瘍細胞を分離し、細胞内TNF発現量とanthracyclin系抗癌剤(DOX)に対する感受性との相関を調べた。その結果、DOX感受性と細胞内TNF発現量との間には、強い逆相関関係が認められた。(2)各種白血病細胞株における、細胞内TNF発現量と、Inhibitor of apoptosis(IAP)familyであるsurvivinの発現量との関係について調べた結果、正の相関傾向がみられた。そこで、構成的に細胞内TNFおよびsurvivinが発現しているHL-60細胞を、all-trans-retinoic acid(ATRA)で処理後、両者の発現を5日目まで経時的に調べた。その結果、両者の発現量は分化誘導にともない明らかに低下した。(3)抗癌剤治療の前後で細胞内TNF発現量を測定し、anthracyclin系抗癌剤、あるいは他の抗癌剤の治療効果予測マーカーとして臨床応用が可能か否か検討した。Anthracyclin系抗癌剤で治療された患者群で、治療に抵抗性を示したno response群では、治療が奏功したpartial response及びcomplete response群に比べ、治療前の平均細胞内TNF発現量が約2倍高かった。前年度の実績および本年度の実験結果から、細胞内TNFの、白血病における自然耐性および獲得耐性因子としての意義が明らかとなり、抗癌剤に対する新しい治療効果予測マーカーとしての有用性が示唆された。これまで我々は,培養細胞を用いた実験から細胞内に存在するTNFが,antioxidant enzymeであるMnSODの誘導を介し,Doxorubicin(DOX)等の抗癌剤に対し防御因子として働くことを報告してきた。このことは,細胞内TNFが、anthracyclin系抗癌剤に対する耐性マーカーになり得る可能性を示している。そこで本研究では,(1)実際に各種白血病患者から腫瘍細胞を分離し,細胞内TNF発現量とanthracyclin系抗癌剤(DOX)に対する感受性との相関を調べた。その結果、DOXに低感受性の白血病細胞では、細胞内TNF発現量及びMnSOD活性が高く、両者の間には逆相関関係が認められた。(2)細胞内発現量が低く、DOXに対して高感受性のKG-1細胞に非分泌型TNF発現ベクター(pTNF△pro)を遺伝子導入した結果、得られたクローンにおける細胞内TNF発現量及びMnSOD活性はそれぞれ4-6倍、2-2.3倍に上昇し、DOX感受性は約1/2に低下した。(3)抗癌剤治療の前後で細胞内TNF発現量を測定し,anthracyclin系抗癌剤,あるいは他の抗癌剤の治療効果予測マーカーとして臨床応用が可能か否か検討した。DOXを含む抗癌剤治療後に耐性を獲得した症例では、細胞内TNF発現量及びMnSOD活性は治療前に比べ、それぞれ約2倍、1.6倍に上昇した。一方、p-glycoproteinに関しては若干の発現が認められたが、MRPは検出されなかった。(4)Anthracyclin系抗癌剤で治療された14例中、治療に抵抗性を示した4症例(no response群)では、治療が奏功した10症例(partial response及びcomplete response群)に比べ、治療前の細胞内TNF発現量が高い傾向がみられた。(5)細胞内TNFの発現が高い患者由来白血病細胞に、アンチセンスTNFmRNA発現ベクターを遺伝子導入した結果,DOX感受性は全例で、1.4-2.5倍に上昇した。
呼吸・心拍同時モニターが可能な小型レーダーを用いた非接触ストレスモニターシステム

「ストレスが測れる椅子」を試作しその性能を評価した。平面パッチアンテナ付き小型ドップラーレーダー(24GHz, 7mW)を椅子の背もたれの後ろに装着し、非接触で心拍に伴う体表面微小振動を捉え、心拍間隔の時間変動から自律神経活性を示す心拍数変動指数(HRV)を求めた。精神科医の協力を得て、健常者とストレス性疾患患者(うつ患者)をイスに座らせ、リラックス負荷(映像と音声)を加えたとき、健常者は副交感神経活性の有意な上昇が認められたが、ストレス性疾患患者では副交感神経活性の明確な上昇は認められなかった。椅子に座りリラックスを誘導するだけで、ストレス性疾患の一次クリーニングが可能となった。主となる研究内容は以下の2点に集約される。1小型レーダーを用いた新しいストレス評価システムの開発ストレスに伴う自律神経の活性や呼吸数の変化を非接触で計測可能なシステムを構築するために、椅子の背もたれの後ろに設置した小型レーダーを用いて心拍数変動指標を計測する。これにより、ストレス負荷による生化学的指標である唾液中αアミラーゼ濃度の変化を、生理学的指標から推定することが可能になった。さらに、多変量解析を行うことにより、ストレス負荷前後の唾液中αアミラーゼ濃度の変化を、生理学的指標である非接触で測定した心拍数変動指標と呼吸数の変化から推定できた。これらの生理学的指標はいすに座るだけで、被検者に負担をかけることなく継続して測定可能なので、ストレスの客観的評価を行う上で、極めて有益だと考えられ、今後の展開が期待される。2小型レーダーを用いた「うつ傾向」評価システムの開発ストレス指標のひとつである唾液中αアミラーゼ濃度の変化の推定に加えて、小型レーダーを用いて自律神経の活性を非接触で計測可能なシステムを用いて、うつの簡易診断を行うシステムを構築する。うつ病患者の多くは、自律神経失調の傾向があり、この自律神経失調傾向を客観的に評価するシステムを構築できれば、新たなうつ診断が可能になる。リラックスにともなう自律神経活性の変化を誘導するために、小型レーダーを背もたれ背面に装置したイスに腰掛けた被検者にリラックス映像と映像に同期した音を視聴させ、視聴前後の自律神経活性の変化を測定する。うつ患者の交感神経活性と副交感神経活性が、健常者と異なる挙動を示している。イスに座ってリラックス映像を視聴するだけで「うつ傾向」の評価が可能になると期待される。「ストレスが測れる椅子」を試作した。これは小型マイクロ波レーダーを内蔵したアンテナボックス・ハイパスフィルター・AD変換機・PCから構成されるシステムを、背もたれがメッシュ状の椅子に裏側から備えつけたものである。非接触型バイタルサイン測定器であるマイクロ波レーダーは最大出力10mW,24GHzの安定したマイクロ波を発生させる。アンテナボックスには送・受信用の4重極の平面アンテナを収納した。このアンテナボックスを背もたれの裏側、背部左側第4肋間狭付近に設置し、被験者の心臓の動きによって変調されたレーダーのアナログ反射信号をPCで記録する。マイクロ波を利用することにより、数センチ程度の離れた位置、且つ着衣のままという完全なる非接触状態を作り出すことができた。非接触のまま心拍に伴う微小な体表面の変則を測定し、最大エントロピー法(MemCalc)を用いて心拍数変動指標(HRV)を計測する。また心肺計測と同じレーダーにて呼吸数を求め、ストレス指標である唾液中αアミラーゼ濃度を推定する。ストレスに伴う交感神経の緊張は、通常では心電図電極を用いる接触型にて測定され、被測定者に負荷を与えるものであるが、本研究により試作された椅子を用いることにより、その負担を軽減させ、尚且つ客観的なストレスの度合いを判断することが可能となる。また椅子に座るという単純な動作は、被測定者にも理解しやすく、必要に応じてモニターリング時間を変更することも容易である。労働衛生におけるメンタルヘルスの重要性が問われる現在、職務上のストレスに起因するうつ病のなどの客観的判断を容易にする本研究は大変意味のあるものである。小型マイクロ波レーダーを内蔵したアンテナボックス・ハイパスフィルター・AD変換機・PCから構成されるシステムを,背もたれがメッシュ状の椅子に裏側から備え付けたものである。非接触バイタルサイン測定器であるマイクロ波レーダーは最大出力10mW,24GHzの安定したマイクロ波を発生させる。アンテナボックスには送・受信用の4重極の平面アンテナを収納し,背もたれの裏側,背部左側第4肋間狭付近に設置し,被験者の心臓の動きによって変調されたレーダーのアナログ反射信号をPCで記録する。このシステムを用いて呼吸数およびストレスに関連する生理学的指標である心拍数変動指数(HRV)から,椅子に座っただけで客観的かつ非接触なモニターを可能とした。

この「ストレスが測れる椅子」を用い,バイオフィードバックシステムを構築し,リラックス誘導とリラックス状態の評価を同時に行えるようにした。また臨床を応用を目指し,共同研究を行っている精神科医と共に改良を重ねている。25年度には様々な年齢の健康な男女を対象として,不快な音を聞くことによるストレス擬似状態の中におけるHRV,呼吸数,唾液中のαアミラーゼを測定する実験を行った,αアミラーゼ濃度はストレスホルモンである血液中のノルエビネフィリン濃度と強く相関することが知られており,ストレス反応が起こった場合に濃度ケンカの生起が早い。ストレスに関する生理学的指標である心拍等の指標と生化学的指標であるαアミラーゼを比較することにより,試作中である「ストレスが測れる椅子」の有用性を検証することができた。研究最終年である26年度は静岡済生会総合病院において、うつの診断を受けた精神科の外来患者臨床データの収集を行った。リラックス負荷時のHRVで求めた自律神経活性がうつ患者と健常者では異なっていた。この違いをもとにうつのスクリーニングが可能になると期待される。マイクロ波レーダーを用いた生体計測に関連する医療工学椅子の背もたれの後ろに設置した小型レーダーを用いて心拍数変動指標を計測することにより、ストレスに伴う自律神経の活性や呼吸数の変化を非接触で計測可能なシステムを構築した。ストレス負荷による生化学的指標である唾液中αアミラーゼ濃度の変化を、生理学的指標から推定する方法を開発した。青年期から中年期までの様々な年齢の男女を対象として、ストレス刺激としての不快音負荷前後の唾液中αアミラーゼ濃度の変化と心拍数変動指標、およぶ呼吸数の変化を測定した。αアミラーゼ濃度はストレスホルモンである血液中のノルエピネフィリン濃度と強く相関することが知られており、ストレス反応が起こった場合に濃度変化の生起が早い。また血液と比較して唾液の採取は容易で、アミラーゼモニター等の計測機器を用いることで容易に唾液中αアミラーゼ濃度の計測が可能である。多変量解析を行うことにより、ストレス負荷前後の唾液中αアミラーゼ濃度の変化を、生理学的指標である非接触で測定した心拍数変動指標と呼吸数の変化から推定することが可能になった。これらの生理学的指標はいすに座るだけで、被検者に負担をかけることなく継続して測定可能なので、ストレスの客観的評価を行う上で、極めて有益だと考えられる。現在までに、小型レーダーをイスの背もたれの後ろに設置し、自律神経の活性を非接触で測定可能なイスを作成した。このイスをもとにバイオフィードバックシステムを構築し、リラックスの誘導とリラックス状態の評価が同時に行えるようになった。バイオフィードバックシステムは、リラックスや緊張の程度を表す心拍数変動指標のHFやLF、LF/HFを自動かつリアルタイムで計測し、システムの利用者にリラックスの程度を表す副交感神経活性指標HFの値およびその変化を提示させ、バイオフィードバックが行える仕様とした。それに加え、映像と音でリラックスを誘導する設計とした。また、このシステムを病院の精神科に設置し、うつ病患者を対象としてシステムの試験的運用を行った。
自然免疫におけるオートファジー誘導機構の解明

本研究は、病原体センサーが細胞内感染を認識した後に、どのようにして恒常性維持機構であるオートファジーを誘導するのか解析した。その結果、哺乳動物p62(SQSTM1)のショウジョウバエホモログであるRef(2)Pタンパク質が、リステリア菌の細胞内感染を認識しオートファジーを誘導する病原体センサーPGRP-LEに結合する事、そして、Ref(2)PがPGRP-LEによるオートファジー誘導に必要であることが明らかとなった。さらに、PGRP-LEのオートファジー誘導に必要な機能ドメインを同定した。本研究では、オートファジー誘導に必要とされる因子を同定するために、ゲノムワイドRNAiスクリーニングを行う。このスクリーニングは、21,306の転写産物に対して網羅的なノックダウンスクリーニングが可能なショウジョウバエS2細胞系で行う。すなわち、PGRP-LEを発現させたS2細胞で、それぞれの転写産物特異的にRNAiを行い、細胞内寄生細菌であるリステリア菌を感染させる。RNAiにより、PGRP-LEによるオートファジー誘導に必要な因子の発現が抑制されると、リステリア菌の細胞内増殖が抑制されない。したがって、リステリア菌の細胞内増殖をモニターすることで、PGRP-LEによるオートファジー誘導に必要な因子が同定できる。そのために今年度は、ルシフェリンなどの基質を添加することなくルシフェラーゼ発現に必要な全ての因子群を含むluxABCDEオペロンを、宿主への感染時に活性化するhly遺伝子のプロモーター、宿主感染と関係なく恒常的に発現するsecA遺伝子のプロモーター、および高発現リステリアプロモーター(Help : highly expressed listeria promoter)に連結し、リステリア属菌(病原性のあるListeria monocytogenesは用いずに、病原性が著しく低いListeria ivanovii、および非病原性のListeria seeligeriを用いた)にエレクトロポーレーション法を用いて導入した。これにより、リステリア菌の細胞内増殖をリアルタイムで検出できる感染レポーターが確立できた。このレポーターをPGRP-LEを発現させたS2細胞へ感染させたところ、PGRP-LE依存に細胞内での増殖が抑制されることを確認できた。これにより、ゲノムワイドRNAiスクリーニングが可能となった。本研究では、病原体センサーが細胞内感染を認識した後に、どのようにして恒常性維持機構であるオートファジーを誘導するのか、その分子機構を解明することで、細胞内寄生細菌に対する感染防御機構の一端を明らかにすることを目的としている。昨年度は、オートファジー誘導に必要とされる因子を同定するために行うゲノムワイドRNAiスクリーニングを確立した。すなわち、病原体センサーであるPGRP-LEを発現させたショウジョウバエS2細胞を用いて、21,306の転写産物に対して網羅的なRNAiによるノックダウンを行い、リステリア菌の細胞内増殖をモニターすることで、PGRP-LEによるオートファジー誘導に必要な因子を同定する系を確立した。今年度は、このゲノムワイドRNAiスクリーニングを開始し、継続している。その一方で、変性したタンパク質のオートファジーによる分解に関わることが示されているp62タンパク質のショウジョウバエホモログRef(2)Pに着目して研究を準めた。その結果、ref(2)P変異体では、細胞内寄生細菌であるリステリア菌の感染抵抗性が低下しており、ref(2)Pが細胞内寄生細菌に対する感染抵抗性の発現に重要であることが明らかとなった。その際、ref(2)P変異体の体液細胞内で、リステリア菌の細胞内増殖抑制が見られなかった。さらに、Ref(2)Pタンパク質ほ、PGRP-LEに依存して、細胞質内に感染したリステリア菌と共局在することが明らかとなった。これらの結果は、PGRP-LEが細胞質に感染したリステリア菌を認識し、Ref(2)Pタンパク質をそこに局在させることで選択的にオートファジーを誘導していることを示唆している。今年度は、病原体センサーのPGRP-LEがオートファジーを誘導する際に必要な機能ドメインを明らかにした。そのために、各種変異を加えたPGRP-LE変異体をS2細胞で発現させ、リステリア菌の細胞内増殖抑制が起きるかどうか調べた。その結果、1アミノ酸置換によりリステリア菌の細胞内増殖抑制が解除される領域を同定した。このドメインは、リステリア菌の感染で誘導されるPGRP-LE依存のオートファジー誘導に必要であった。このドメインは、哺乳動物の自然免疫シグナル伝達に関わるタンパク質間相互作用ドメイン、RHIMドメインと相同性を有していたことから、オートファジー誘導に必要なタンパク質相互作用を担うドメインであることが考えられた。PGRP-LEはリステリア菌の細胞内感染を認識した後に、オートファジーだけでなく、細胞内シグナル伝達系であるimd経路を活性化し、抗菌ペプチドの産生をも誘導する。

今回同定したドメインは、この抗菌ペプチドの産生誘導には関わらないことが明らかとなった。この結果は個体においても同様であり、機能ドメイン内の4アミノ酸を置換したPGRP-LEを、PGRP-LE欠損変異体に発現させ、同定したドメインがオートファジーの誘導には必要であるが、抗菌ペプチドの産生誘導には必要でないことを明らかにした。一方、抗菌ペプチド誘導に必要な機能ドメインも同定されており、こちらのドメインもRHIMドメインと相同性を有している。したがって、PGRP-LEは、それぞれオートファジー誘導と抗菌ペプチド産生誘導に必要な二つのRHIM様ドメインを有しており、おそらくこの領域に異なるアダプター分子が結合し、オートファジーと抗菌ペプチドの産生を個別に誘導しているものと考えられた。
プラスチックの酸化劣化機構の解明

ポリプロピレン(PP)の劣化は一般的に熱、光等によって第三級炭素上にラジカルが生成して開始されると考えられている。生成したラジカルが酸素と反応してペルオキシラジカルとなった後、周囲の分子鎖より水素を引き抜きヒドロペルオキシドとなる。このヒドロペルオキシドは熱や光によって容易に分解してアルコキシラジカルと水酸化ラジカルを生成し、これが反応1して分子鎖切断反応等を引き起こし、劣化が進行する。しかしながら、PPではC-H、C-Cの結合エネルギーが大きく安定性が高いことから熱や光によって容易にラジカルが生成するとは考え難い。その為、劣化開始反応は触媒残渣の触媒作用、酸素とポリオレフィンの電荷移動錯体の分解等の要因によるラジカル生成であると推測されているが、従来の研究では用いられた試料には酸素が吸着しており、複数の要因が混在しているため劣化開始反応及び劣化要因の確定ができなかった。そこで本研究ではプロピレンの重合から劣化試験における全ての工程において窒素雰囲気下で行ない、酸素が吸着がないPP試料を用いることにより劣化開始反応の解明を検討した。本実験では触媒残渣が劣化開始の要因となるかについて明らかにするために以下の検討を行なった。・触媒残渣量(Ti)が0.515ppmのPPを合成し、これらを用いて熱劣化を中心に検討を行ない、ケミカルルミネッセンス測定を用いてその場観察により劣化の進行を速度論的な解析により残渣量が劣化挙動に及ぼす影響を調べた。結論として1)Tiの残渣量(mol%)の0.37乗に比例して劣化が進行する。2)劣化の活性化エネルギーはTiの残渣量に依存せず一定である。以上の今までに無い新しい知見を得ることに成功した。
エラスチンを構成する新架橋アミノ酸オキソデスモシンの生合成と機能に関する研究

エラスチンは繊維芽細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞および軟骨細胞などで合成され、水溶性の分子量約7万のトロポエラスチンとして細胞外に分泌されるが、分子内および分子間で架橋を形成し、器官の形成および細胞の分化、移動、増殖、代謝などに関わる機能を発現するようになると考えられている。最近では細胞を認識する認識機構を含む、高度な生命現象主担っていることが明らかになってきている。本研究によって、牛項靭帯および大動脈エラスチンからエラスチンを構成する新規な2種のジヒドロオキソピリジン環式架橋アミノ酸を分離することができた。これらのアミノ酸は世界的に見ても全くその存在が知られていないアミノ酸であり、その構造からオキソデスモシンおよびイソオキソデスモシンと名称づけ、その極めて特長的な構造の確定を、高分解能機器分析によって明らかにすることができた。構造から、これらのアミノ酸は水溶液中において、いくつかの互変異生体として存在するが、異性体の一つは強い蛍光をもつことから、これがエラスチンの持つ蛍光物質の一つであると推定された。ついで、これら2種のアミノ酸の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)による分析を試みた。分析に先立ち、エラスチンの加水分解条件の設定を行ったが、その結果、これらのアミノ酸は酸素による分解を受けることを認め、ラジカルスカベンジャーとしてフェノールを用いて加水分解を行う事によって、定量的に加水分解のできることを明らかにした。HPLCは、カウンターイオンとしてSDSを用いた、ODSカラムによった条件を設定した。オキソおよびイソオキソデスモシンはその構造から、それぞれデスモシンイソデスモシンの代謝の中間体である可能性があり、これによって従来知られていなかったエラスチンの架橋構造の分解が明らかにされれば、肺気腫などの疾患の原因解明に資すると考えられる。牛大動脈エラスチンの酸加水分解物から、新規なオキソピリジン環式架〓アミノ酸と考えられ、オキソデスモシンと名付けた、分子量465の化合物の構造確定を行なった。同アミノ酸は2-オキソジヒドロピリジンを基本骨格とし、さらに側鎖にシクロペンテン構造を持つ、極めて特異的な新架〓アミノ酸であった。さらに、同じ分子量の4-オキソジヒドロピリジン環式架〓アミノ酸の発見が行なわれたが、本化合物はオキソデスモシンの構造異性体であることが明らかとなって、イソオキソデスモシンと名付けた。これらの2つの化合物はデスモシンおよびイソデスモシンの酸素添加によって生じた、代謝中間体であると考えられた。また、これらの2つの架〓アミノ酸は、共に強い蛍光をもつことを明らかにした。従来、ヒトの血管エラスチンは蛍光をもち、その蛍光物質が種々の症患の指標となる可能性があって、その構造解明が待たれていたが、本結果はこれらの諸点の解明にも資すると考えている。とくに、代謝に関わることが明らかとなれば、メタロプロテアーゼ関与のエラスチン分解以外に、エラスチンの分解過程が存在することとなり、注目される。HPLCによる定量は、ODSカラムによる、SDSをカウンターイオンとする分析系によって分離定量することに成功し、当初の計画が達成できたが、さらにオキソデスモシン類はその不安定性から、酸水解中にある程度の分解がさけられず、障害となっていたところ、フェノールをスカベンジャーとして添加することにより、分解が防止され、定量に寄与することも明らかになった。また、オキソデスモシン類の紫外部吸収スペクトルは異なっており、スペクトルの違いの算定により、同時定量法の検討も行なった。

エラスチンは繊維芽細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞および軟骨細胞などで合成され、水溶性の分子量約7万のトロポエラスチンとして細胞外に分泌されるが、分子内および分子間で架橋を形成し、器官の形成および細胞の分化、移動、増殖、代謝などに関わる機能を発現するようになると考えられている。最近では細胞を認識する認識機構を含む、高度な生命現象主担っていることが明らかになってきている。本研究によって、牛項靭帯および大動脈エラスチンからエラスチンを構成する新規な2種のジヒドロオキソピリジン環式架橋アミノ酸を分離することができた。これらのアミノ酸は世界的に見ても全くその存在が知られていないアミノ酸であり、その構造からオキソデスモシンおよびイソオキソデスモシンと名称づけ、その極めて特長的な構造の確定を、高分解能機器分析によって明らかにすることができた。構造から、これらのアミノ酸は水溶液中において、いくつかの互変異生体として存在するが、異性体の一つは強い蛍光をもつことから、これがエラスチンの持つ蛍光物質の一つであると推定された。ついで、これら2種のアミノ酸の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)による分析を試みた。分析に先立ち、エラスチンの加水分解条件の設定を行ったが、その結果、これらのアミノ酸は酸素による分解を受けることを認め、ラジカルスカベンジャーとしてフェノールを用いて加水分解を行う事によって、定量的に加水分解のできることを明らかにした。HPLCは、カウンターイオンとしてSDSを用いた、ODSカラムによった条件を設定した。オキソおよびイソオキソデスモシンはその構造から、それぞれデスモシンイソデスモシンの代謝の中間体である可能性があり、これによって従来知られていなかったエラスチンの架橋構造の分解が明らかにされれば、肺気腫などの疾患の原因解明に資すると考えられる。
胸腺外分化T細胞によるマラリア感染抵抗性の分子機構

肝類洞に見い出される胸腺外分化T細胞は、加齢、細胞内寄生細菌感染、担癌状態、及び自己免疫疾患等で著しく活性化してくる。この胸腺外分化T細胞は、自己応答性を持つ禁止クローンを主体としていることが明らかとなっている。すなわち、この胸腺外分化経路は異常自己の監視システムを担っている。種々の病態において、胸腺由来のT細胞では説明できない現象が認められることから、マウスマラリア感染における肝T細胞を主体とする胸腺外分化T細胞の役割を解析した。マウスマラリアP.yoelii17X(致死株)及びP.yoelii17XNL(非致死株)をC57BL/6及びC3H/Heマウスに接種し、肝臓、脾およびその他のリンパ系器官よりリンパ球を分離し、フローサイトメトリーを用いて細胞表面マーカーを解析した。マウスの胸腺外分化T細胞(intTCR細胞)は、CD3(TCRαβ)の蛍光強度が弱く、IL-2Rβ鎖が陽性であることから容易に同定される(CD3^<int>IL-2Rβ^+T細胞)。マウスマラリア感染においては、肝や脾に著しいリンパ球増多が起き、特に肝の腺腺外分化T細胞が増加する。非致死株感染マウスの回復期には、γδT細胞が肝臓で著しく増加する。胸腺外分化T細胞おいては、両株感染とも急性期にはCD4^+細胞が、非致死株の回復期にはCD4^-CD8^-DN細胞が増加している。胸腺外分化T細胞に存在する自己応答性の禁止クローン(Vβ3^+、Vβ11^+細胞)は、非致死株感染の急性期に増加した。感染マウスの肝リンパ球は、感染赤血球に対して細胞障害活性を示した。また、マラリア患者の末梢血リンパ球の解析では、マウスと同様にヒト胸腺外分化T細胞であるCD56^+T、CD57^+T細胞が有意に増加していた。以上の結果は、細胞内寄生であるマラリア原虫感染では胸腺外分化T細胞の活性化が主要な免疫反応であり、しかもマラリア感染自己細胞を異常自己と認識して免疫系が働いていることを示唆している。
重力波観測に及ぼす地殻変動と地面振動の影響に関する基礎的研究

本研究は、既存の地殻変動観測室に設置されている多成分の伸縮データから、1年1秒(3x10^<-8>Hz1Hz)の範囲の地殻ひずみ変化を詳細に調べ、わが国における地殻ひずみ変化の平均的なノイズ・レベルを明らかにするとともに、高感度加速度計システムを用いた1Hz10^3Hzの雑微動観測を近畿および中部地域で実施し、得られたデータを総合して、10^<-8>Hzから10^3Hzにいたる幅広い周波数帯域における地面振動の周波数特性を定量的に明らかにし、重力波天文台の候補地選定や重力波検出器の除振装置の設計に必要な基礎的データを得ることを目的としており、平成4年度には、つぎの研究を実施した。1.六甲高雄、天ケ瀬、屯鶴峯、上宝および江刺の合計5カ所の地殻変動観測室における合計10成分の伸縮計で得られた1時間データをスペクトル解析し、10^<-7>10^<-4>Hz(約116日3時間)の範囲の地殻ひずみの変化の定常的なノイズ・レベルを調べた。その結果、10^<-7>10^<-4>Hzの範囲内における地殻ひずみ変化の定常的なノイズ・レベルは、ほぼf^<-1>に比例して減衰すること、また、場所および成分の遠いにかかわらず、そのばらつきの範囲は1桁、すなわち、20db程度であることが明らかになった。2.つぎに、屯鶴峯観測所の6成分伸縮計に10秒サンプリングのディジタル・レコーダーを接続し、地殻ひずみデータの収集を行なった。得られたデータのスペクトル解析の結果、地殻ひずみのノイズ・レベルは、約500秒まではほぼf^<-1>に比例して減衰していることが明らかになった。それより短周期側は、計器の分解能の限界を超えていた。3.110^3Hzの周波数帯域における近畿および中部地方の地面振動の特性を調べる目的で購入された高感度加速度計を用いた観測が上宝観測所・蔵柱観測室、大阪府・亀の瀬地すべり地および京都大学理学部構内の重力基準点において行なわれた。
モジュラー形式と数論的多様体の性質の研究を,中心とする代数学の研究

研究分担者は各々の専門分野の研究を進めた。ここでは研究代表者(畑田)の研究内容のみ記す。下記の研究内容に関して,研究分担者から助力は受けなかった。
熱ルミネッセンス法による地熱探査に関する研究

本研究の目的は石英の熱ルミネッセンスを測定し,熱発光強度から地熱活動の時期とその規模を推定し,地熱探査への利用の可能性を明らかにすることであり,この立場から熱ルミネッセンスの研究は皆無である。有望な地熱地域として新エネルギ-総合開発機構により地熱開発のための調査が行われている秋田県小安地域を研究対象地区とした。石英結晶を放射線で照射すると,本来は占有が許されない準安定準位に電子が捕獲される。これを加熱すると電子は安定な準位に遷移し,過剰のエネルギ-を光として放出する。発光量は準安定準位の電子の数,すなわち被爆した放射線量に比例する。地中の鉱物はほぼ一定量の自然放射線の照射を受けるので,発光量は地質年代の測定に利用されている。しかし古い年代の地層でも地熱活動により一但加熱されると,それまで蓄積されて来た捕獲電子は放出され(ゼロセットされる)ので,地熱温度が励起電子の蓄積可能な温度に低下するまで蓄積は開始しない。よって地熱地域の鉱物の熱発光量と自然放射線量を測定すれば,測定地点がいつまで加熱されていたかを知ることができるであろう。冷却後の地質年代を測定するため,石英に人工照射を行い,照射線量と発光強度との関係を求め,さらに地中の年間放射線量を測定した。その結果以下のことが明らかになった。(1)本地域の石英は過去に地熱によりゼロセットされ,その後地温の低下とともに電子が蓄積された。(2)熱源から離れるほど地質年代が古くなっており,現在の地下の地温の低下とほぼ調和的である。(3)この傾向は地表付近にまで現れる。以上,熱ルミネッセンス法による冷却年代が地表付近の試料からも推定できるので,本方法は地熱開発の初期調査に有効な手段として利用できると期待される。
腸内細菌叢代謝産物から腸管幹細胞増殖刺激因子同定を目指す探索研究

Wntシグナルを制御するR-spondin-LGR4/5/6-ZNRF3/RNF43系に対するアッセイ系を用いて腸管幹細胞刺激因子を健常者腸内細菌叢由来代謝産物より探索する。出発試料である健常者由来大腸内視鏡排液の収集準備をすすめると同時に、本学所有の低分子化合物ライブラリーを探索し、R-spondin作用増強化合物を2つ同定した。これは本アッセイ系が探索研究に耐えうる優れた系であることを実証する。また他施設との共同研究において、常在性腸内細菌叢由来のメタボライトを54種類同定した。今後は内視鏡排液より抽出された低分子画分のみならずこれらメタボライトの生理活性の検定を継続する。スクリーニングの出発試料である健常者由来大腸内視鏡排液の収集準備を適宜すすめると同時に、パイロット実験として本学薬学部創薬機構所有の低分子化合物コアライブラリー(約一万種類の代表的な化合物群よりなる)をスクリーニングしたところ、R-spondinの作用を増強する興味深い化合物を2つ同定できた。この結果は、独自に樹立したアッセイ系が生理活性物質探索に耐えうる優れたスクリーニングシステムであることを示唆している。また併行して慶応大学薬学部長谷研究室との共同研究において、無菌マウス、SPFマウス、SPFマウスの糞便を移植された無菌マウス(糞便移植から3日後、6日後、9日後、16日後、23日後にサンプル採取)の盲腸内容物をメタボロミクス解析したところ、常在性腸内細菌叢依存的なメタボライトを54種類同定することにも成功した。今後は健常者由来大腸内視鏡排液から抽出した低分子画分のみならずこれら同定されたメタボライトの生理活性も本アッセイ系を用いて検定していく予定である。消化器内科学、消化器内視鏡学
真正細菌における非翻訳型RNAによって遂行される遺伝子発現制御機構の解析

本研究において、枯草菌において、8個の新規のnon-coding RNAを同定しており、破壊株を作成し、機能解析を行った。BS101 RNAは、yurY-yurZ遺伝子間領域に位置し、ストレスにより発現が上昇することから、non-coding RNAとして他の遺伝子の発現制御に関与している可能性が考えられた。枯草菌野生株(168)とBS101遺伝子欠損株(△bs101)の対数増殖期中期における細胞内タンパク質を比較したところ、△bs101においてMtnAタンパク質のスポットが消失じていた。mtnAは、バクテリアにおけるメチオニン再生経路において機能するタンパク質をコードしており、その上流のmtnKとオペロンを形成している。しかし、MtnKタンパク質は、△bs101においても168株同様の発現されており、mtnKAオペロンのうち、下流のmtnA遺伝子の発、現のみを制御していた。さらに、168と△bs101において、mtnA mRNA発現量に違いが見らないことから、BS10l RNAはmtnAの発現に関し、転写後レベルでの制御に関与している可能性が考えられた。さらに、枯草菌で得られた成果を元に、ウェルシュ菌で同定されたVR-RNAの機能解析を行った。その結果、ウェルシュ菌には、少なくとも3種類のタンパク質が存在し、培養時期に特異的な複合体を形成していることが明らかとなった。ゲノム解析により、多くのギャップ領域が存在することが明らかにされてきた。ギャップ領域は、非常に小さな分子量のタンパク質をコードする場合もあるが、多くは翻訳されない非翻訳型RNAをコードする。ゲノム上の全遺伝子情報を解析し、機能面でのネットワークを解明する上で、非翻訳型RNAの機能解析は重要である。枯草菌の対数増殖期の菌体の全RNA中に10種類程度の低分子RNAの存在を確認した。ノーザン解析から、このうち、4種類は5SRNA、scRNA、tmRNA、M1RNAであった。長さが200塩基付近の2本のバンドについて(BS190RNA、および、BS200RNA)、ゲル抽出後、3'末端へpoly(A)付加して作成したcDNAの塩基配列を決定した。その結果、aspS-yrvM遺伝子間のギャップ領域にコードされていた。両末端の解析から、BS200RNAから、5'末端の10塩基が切断され、BS190RNAとなることが示唆された。BS190RNA遺伝子の欠損変異株では、増殖能の低下が見られ、タンパク質合成も一部阻害されていた。一方、X6Hisタグを付加したRNAポリメラーゼβサブユニットを発現する枯草菌から調製した菌体抽出液に対して、Ni-NTAカラムを用いてプルダウン実験を行った結果、BS190RNAは、特異的に、RNAポリメラーゼのホロ酵素と結合することが明らかとなった。また、枯草菌で新たに見いだした10種類の非翻訳型RNAの破壊株を用いたマイクロアレイ解析より、5種類の非翻訳型RNAは、他の遺伝子を転写レベルで制御していた。また、100塩基以下の領域の解析により、3種類のリボスイッチ領域を同定して、解析を行った。真核・原核生物で多くの非翻訳型RNA (non-coding RNA, ncRNA)が同定され、細胞内で重要な機能を担っていることが明らかになっている。本研究では、枯草菌から同定したncRNAの機能解析を行った。BS101 ncRNAは塩ストレス下で発現がおよそ6倍に上昇しており、上流に存在するσ^Bプロモーターによって転写されていることが示唆された。BS101 ncRNA欠損変異による生育への影響は見られなかった。DNAマイクロアレイ解析の結果、BS101 ncRNA欠損変異株においてストレスタンパク質の発現が1/4に減少していた。BS62 ncRNA欠損株を用いたDNAマイクロアレイ解析の結果、BS62 ncRNA欠損株ではmannose operon (manPA-yjdF)の発現量が上昇していた。

ノーザン解析の結果、BS62 ncRNA欠損株ではmannose operonのうちmanP, manAの発現がマンノースの添加60分後に10倍以上となり、この発現の上昇は時間が経過した後も見られた。一方、野生株では2倍程度の上昇であった。このことから、BS62 ncRNAはmannose operonのマンノース添加時の発現誘導の制御に関与していることが示唆された。一方、101ncRNAの欠損株では、マイクロアレイ解析では変化する遺伝子は見出せなかったが、プロテオーム解析の結果、1遺伝子の発現が欠損株でみられた。以上の結果、新規ncRNAの機能解析には、マイク折られいやプロテオーム解析が大きな効果をもたらすことがわかった。非翻訳型RNAは、転写や翻訳などの過程でタンパク質や他のRNA分子と時間的・空間的に相互作用し、ネットワークを形成している。本研究では、多様な機能を持ち、生命活動に重要な機能を持つ非翻訳型RNAが担う空間的、時間的な機能ネットワークを解明するために、1)枯草菌を中心として、非翻訳型RNAの機能解析に焦点を当て、すでに解析を行っているBS190 RNAをはじめとする転写制御機能を有する非翻訳型RNAの機能解析、2)枯草菌および類縁菌における新規な非翻訳型RNAの同定と機能解析を行った。非翻訳型RNAよる遺伝子発現制御は、急激な環境の変化に対応できると考えられる。枯草菌における酸化ストレスにより誘導される非翻訳型RNAの同定を行った。100μMの過酸化水素水(H_2O_2)存在下で15分培養後、全RNAを抽出した。枯草菌の遺伝子間領域を含むジーンチップアレイ(Affymetrix社GeneChip Genome Array)を用いて解析し、2倍以上発現量が増加する遺伝子間領域を10箇所同定した。このうち、patA-cheV遺伝子間からの転写物として約270ntのバンドを検出した。プライマーエクステンション解析から、2つの転写開始点が確認でき、そのうち1つからの転写は、酸化ストレス下で約2倍の発現量の増大が見られた。このRNAのコード領域の遺伝子配列には、SD配列やORFが見られなかった。さらに、枯草菌リボスイッチの結合タンパク質を同定し、制御機構を明らかにした。