hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
セキュリティ解析の共通基盤となるマルウェア・インフォマティクスの確立

本研究の目的である「マルウェア・インフォマティックス」の確立に向けて、本年度はH28年度およびH29年度に確立した技術に基づき、主にモバイル・アプリアプリケーションを対象とした分析、および悪性通信に着目した研究を遂行した。これまでH28年度には、検体収集・蓄積に必要なプラットフォーム、およびマルウェア検体やマルウェアが生成する悪性通信の検出に必要となる素性エンジニア技術を確立した。H29年度には、感染したホストによる攻撃通信の解析技術、モバイル・アプリケーションのセキュリティ診断技術、およびモバイル・アプリケーションに内蔵されたドメイン名がもたらす脆弱性の分析技術を確立した。本年度のモバイル・アプリケーションに関する研究では、アプリケーションの証明書に着目した解析、アプリケーションの開発に利用したライブラリとその脆弱性に着目した解析、アプリケーションのコードと説明文の齟齬に注目した解析、マルウェアのセキュリティ・レポートを自動生成する研究、アプリケーションの評判情報を不正に操作する攻撃に関する研究等、多方面からモバイル・アプリケーションのセキュリティ解析に取り組んだ。本年度の悪性通信に着目した研究では、国際化ドメイン名を利用した攻撃とその対策に関する研究、およびクラウドサービスが用いるIPアドレス空間の特定方法に関して研究を進めて、それぞれジャーナル論文誌、国際会議で発表した。以上のように本研究はマルウェア・インフォマティクスという構想のもとに、多方面にわたって悪性アプリケーションと悪性通信の解析を進めて、データ解析手法および応用技術を開発した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的である「マルウェア・インフォマティクス」の確立に向けて、平成28年度は主として(1)検体収集・蓄積に必要なプラットフォームの構築、および(2)マルウェア検体やマルウェアが生成する悪性通信の検出に必要となる素性エンジニアリング、ならびに(3)前記で得られた素性を用いた検体・悪性通信検出の評価実験を行った。(1)の検体収集では、マルウェアの攻撃対象となるプラットフォームをWindowsに限定せずに、Androidを含むように拡張した。具体的には容量が200TB超のRAID6構成のストレージサーバを構築して、WindowsとAndroidを合計して500万を越える検体の収集に成功した。また様々なAndroidサードパーティマーケットでの検体収集用のスクリプトを整備して、新たな収集源への柔軟な対応を実現した。大量の検体を収集する方法と得られた成果は国内研究会であるSCIS2017で発表済みであり、さらに現在、国際会議に投稿中である。(2)ならびに(3)に関しては、Windowsマルウェアが発生する悪性通信に特有な素性を網羅的に整理・分類して、得られた素性に機械学習アルゴリズムを適用することによって悪性通信を高精度に検出・分類可能であることを実証した。得られた結果を国内研究会の発表6件、国際会議における発表6件(招待講演3件および査読付き会議3件)、さらにジャーナル論文誌(採録決定1件)としてまとめた。またAndroidマルウェアに関しては、不正に作成されたクローンアプリの検出方法およびアプリの挙動に基づいたクローンの分類方法を確立して、ジャーナル論文誌1件としてまとめた(採録決定)。本研究の開始時点の計画では、最初の2カ年はWindowsマルウェアにフォーカスして研究を遂行し、その研究成果を活用して3年目にAndroidマルウェアへの拡張を行うことを想定していた。しかしながらAndroidの脅威が日増しに高まっている現状がある。このような事情を鑑みて、Androidマルウェアを含むように対象を拡張することを初年度に実行した。また、収集した検体の数は500万を越えて、当初の目標値を上回った。ここにAndroidの検体にはマルウェアのみならず正規アプリも多数含まれているカウント数である。本年度には研究成果の発表をジャーナル論文誌2件、国際会議6件、国内研究会8件として行い、十分な成果を得ることができた。本研究の目的である「マルウェア・インフォマティクス」の確立に向け、H29年度はH28年度に確立した検体収集・蓄積に必要なプラットフォーム、およびマルウェア検体やマルウェアが生成する悪性通信の検出に必要となる素性エンジニアリング技術を活用し、主として以下の3つの研究テーマに取り組んだ。テーマ(1)マルウェアあるいはPUA (Potentially Unwanted Application)と呼ばれるマルウェアとは断定できないものの潜在的に害悪を及ぼしうるアプリケーションに感染したホストによる攻撃通信解析技術テーマ(2)実行ファイルの静的解析、動的解析、およびメタデータ解析を統合した大規模なモバイルアプリのセキュリティ診断技術テーマ(3)モバイルアプリに内蔵されたドメイン名がもたらす脆弱性の分析テーマ(1)に関しては、ジャーナル論文1件、国際会議1件、国際ワークショップ1件、査読なし国内研究会発表1件として成果を発表した。テーマ(2)に関しては、ジャーナル論文1件、国際会議1件(BEST PAPER AWARD)、国際ワークショップ1件、国内研究会1件(学生論文賞)として成果を発表した。国内外で2件の表彰を受け、高いレベルの成果を得ることができた。テーマ(3)に関しては、国際会議1件(トップ会議)、国内研究会発表1件として成果を発表した。特にテーマ(3)の国際会議ACM ASIACCS 2018は採録率が20%の難関会議であり、テーマ(2)と同様に高いレベルの研究成果を得ることができた。当初計画では12年目はWindowsマルウェアにフォーカスし、3年目にモバイルプラットフォームへの拡張を行うことを計画していたが、初年度から前倒しでモバイルプラットフォームに着手していた。

2年目は初年度で得られた成果を元として、モバイルプラットフォームで著しい研究成果を得るとともに、当初計画にはなかった機械学習を活用したPUA分類の課題に取り組むことにも成功した。全体的な成果としてもジャーナル論文誌2件、国際会議・ワークショップ5件(表彰1件、トップ会議1件)、国内研究会3件(表彰1件)と十分な成果を得ることができた。本研究の目的である「マルウェア・インフォマティックス」の確立に向けて、本年度はH28年度およびH29年度に確立した技術に基づき、主にモバイル・アプリアプリケーションを対象とした分析、および悪性通信に着目した研究を遂行した。これまでH28年度には、検体収集・蓄積に必要なプラットフォーム、およびマルウェア検体やマルウェアが生成する悪性通信の検出に必要となる素性エンジニア技術を確立した。H29年度には、感染したホストによる攻撃通信の解析技術、モバイル・アプリケーションのセキュリティ診断技術、およびモバイル・アプリケーションに内蔵されたドメイン名がもたらす脆弱性の分析技術を確立した。本年度のモバイル・アプリケーションに関する研究では、アプリケーションの証明書に着目した解析、アプリケーションの開発に利用したライブラリとその脆弱性に着目した解析、アプリケーションのコードと説明文の齟齬に注目した解析、マルウェアのセキュリティ・レポートを自動生成する研究、アプリケーションの評判情報を不正に操作する攻撃に関する研究等、多方面からモバイル・アプリケーションのセキュリティ解析に取り組んだ。本年度の悪性通信に着目した研究では、国際化ドメイン名を利用した攻撃とその対策に関する研究、およびクラウドサービスが用いるIPアドレス空間の特定方法に関して研究を進めて、それぞれジャーナル論文誌、国際会議で発表した。以上のように本研究はマルウェア・インフォマティクスという構想のもとに、多方面にわたって悪性アプリケーションと悪性通信の解析を進めて、データ解析手法および応用技術を開発した。今後は、大量に収集した検体群を活用して、本研究の要素技術の洗練化と多角的な分析を進めて行く。次年度にも検体収集を継続し、長時間にわたるデータの収集、ならびに時間軸を考慮したデータ解析を行う。特にAndroidマルウェアについては、本年度の研究において過去にリリースされたアプリの取得技術を確立したので、実際にマーケットに出回ったマルウェアがどのような変遷を経てマルウェアとして検知されるに至ったかといった観点で分析を試みる。また、必ずしもマルウェアとは判定されないが、潜在的にユーザに害を及ぼしうるPUP (Potentially Unwanted Program)にも今後は着目して、PUPの検出方法や分類方法についても取り組む予定である。最終年度となるH30年度はこれまでの検討成果を総合して「マルウェアインフォマティクス」の体系化を目指す。
人工設計した短鎖RNAによる組織特異的な遺伝子発現抑制システムの構築

本研究の最終目標は、小型淡水魚ゼブラフィッシュ胚において、人工的にデザインした短鎖RNAにより、時期・組織特異的に標的遺伝子の発現抑制を行なう汎用性の高い実験システムを構築することである。その糸口として、ゼブラフィッシュにおける内在性microRNA(miRNA)について解析を行った。ゼブラフィッシュnanos1遺伝子の母性mRNAは生殖質に局在化し、生殖細胞形成過程に働いている。非局在nanos1 mRNAは体細胞に取り込まれるが、初期胚中に豊富に存在するmiR-430によって認識され、ポリA鎖の短縮化を介して発現抑制制御が行われることを見出した。この制御は、体細胞における生殖細胞プログラムの誤作動を防ぐ機構として働くことが示唆された。一方、miR-430は生殖細胞にも存在するが、nanos1 mRNAの3'UTR中に生殖細胞特異的にmiRNAによる抑制を解除する活性が存在することを明らかにした。さらに、生殖質に局在化する新規mRNAとしてTDRD7を同定し、このmRNAがmiR-430によってnanos1と同様の制御を受けることを示した。以上の結果から、ゼブラフィッシュにおいてmiRNAによる制御システムが生殖細胞・体細胞の分化確立機構に重要な役割を果たすことが明らかとなった。これら内在性miRNAに関する知見を踏まえつつ、人工デザインしたmiRNA発現系を構築中である。本研究の目的は、小型淡水魚ゼブラフィッシュ胚において、人工的にデザインした短鎖RNAにより、時期・組織特異的に標的遺伝子の発現抑制を行なう実験システムを構築することである。本年度は、まず、その糸口として、ゼブラフィッシュにおける内在性microRNA(miRNA)について解析を行った。そして、米国Alex Schier博士らとの共同研究により、下記のような成果をあげた。1.ゼブラフィッシュ胚発生初期に豊富に存在するmiR-430について標的mRNA群を同定し、これら標的mRNAの多くが母性mRNAであることを示した。この結果から、初期発生過程における母性プログラムから接合子型プログラムへの変換過程において、miRNAによる母性mRNAの発現抑制制御システムが重要な役割を果たすことが強く示唆された。2.miRNAによる標的mRNA制御機構について解析を行い、miR-430がmRNAのポリA鎖短縮化を誘導することによって翻訳抑制やRNA分解制御を行っていることを明らかにした。
情報融合による遠隔探査データの多次元超解像

ハイパースペクトルデータは100以上の波長で観測することができるが、空間分解能が低いという欠点がある。観測する波長が少ないが、空間分解能の高いマルチスペクトルデータと融合することで、高スペクトル分解能かつ高空間分解能のデータを生成することが期待される。航空機に2つのセンサを搭載して同時に撮像した実データを対象に高解像度化のアルゴリズムの妥当性を調べ、スペクトル画像がより精細に表現されていることを確認した。異種衛星センサデータへの応用、非線形反射率への拡張も示した。地表面が比較的少ない物質から成り立っているという事前知識に基づいて、非負値行列因子分解とミクセル分解を核として、ハイパースペクトルセンサデータを地表面物質とその含有率に分離した。物質と含有率の積を足し合わせたものが観測されるスペクトルとなる線形モデルにより、物質と含有率を逆推定する混合分離のアルゴリズムおよびソフトウェアを完成させるとともに、非線形性が存在する場合への適用方法を見出した。2つのセンサデータを融合する際に必要となる、装置関数推定を行い、光学収差に起因する点像分布関数およびスペクトル応答関数について、実測データに基づいて推定する手法を開発した。これは、2つの装置間の関係を最適化問題として定式化するものであり、ハイパースペクトルセンサを用いて、マルチスペクトルセンサの特性を校正することにつながる。実験室のハイパースペクトルセンサとマルチスペクトルセンサに対して適用して屋外撮像実験を行うとともに、軌道上で運用中のHyperionセンサとASTERセンサに対して問題を適用し、解像度の向上に成功した。航空機実験のために、搭載可能な装置の選定および配置の検討を行うとともに、信号系や電源系の設計を行った。安全審査を通過するために必要な事項をピックアップし、搭載に必要な準備を行った。マルチスペクトルカメラについては二次元センサ型とラインセンサ型を検討し、両者が搭載できるような構成を見出した。カメラ群を搭載する架台を製作し、平成25年夏季に実験を行える見通しを得た。ハイパースペクトルセンサは将来の地球惑星遠隔探査において、多くの知見をもたらすものとして期待されているが、センサに入射する光量が少ないため、空間分解能を高くすることに困難を伴う。本研究では、波長分解能の高いスペクトル画像と空間分解能の高いカラー画像を融合することで、両者の長所を兼ね合わせた融合データを作成する手法を研究している。平成24年度に開発した装置を航空機に搭載し、多摩森林科学園および東大駒場キャンパスの撮像を行った。撮像に適した天候がなかなか得られず、センサの輝度の調整にも難航したが、最終的に研究に適した撮像結果が得られた。ハイパースペクトルセンサおよびマルチスペクトルセンサ両者の装置関数のシステム同定を行い、スペクトル精度や空間分解能の点で融合データの品質を向上させるアルゴリズムを開発した。作業中にハイパースペクトルセンサの光学軸あわせのずれが検出されたため、キーストーン補正処理を行った。ソフトウェア面では、物質・含有率分離を行う非負値行列因子分解と観測データから装置関数を導く最適化について、完全な統合を行った。スペクトル応答関数が正値であること、ならびに空間応答関数の拘束条件を用いて、2つの観測データの推定値誤差を最小とする解を得ることで、装置関数の推定値を得た。空間分解能は低いがスペクトル取得ができるハイパースペクトルセンサと空間分解能の高いマルチスペクトルセンサによって得られた画像データを組み合わせることで、両者の長所を併せ持つデータ融合を行い、空間分解能の高いスペクトル情報を得ることを目的としている。平成25年度の実験の反省を踏まえ、センサの感度調整を行うとともに、ソフトウェアをバージョンアップし、東大駒場キャンパスおよび筑波の農業地帯の撮像を行った。あわせて、現地データを取得し、地物の構成や地上スペクトルを同時に調査した。データ融合にあたっては、センサのスペクトル応答関数などの装置関数が重要であるため、全スペクトル領域において校正ランプを用いた絶対校正を行った。また、センサの視野角度によって画像の明るさに分布が発生する問題を解決するために、双方向反射分布関数の補正を行うことで、得られたデータがシームレスに利用できるようになった。空間分解能を向上させる際に、物質・含有率分離を行う非負値行列因子分解においては、物質特有のスペクトルを用いるために、観測画像を輝度データから反射率データに変換できると精度が高まると期待される。大気補正を行うことで、反射率データに変換し、有効なデータセットを作成した。また、ハイパースペクトルセンサの地上フットプリントに対して、サブピクセルレベルのターゲットを配置し、そのスペクトル復元の程度について検討を行い、完全ではないが十分なターゲット検出に用いることができることを示した。ハイパースペクトルセンサを無人航空機に搭載し、田無農場の撮像を行った。ラインセンサ画像であるために、無人航空機の姿勢変動の影響が大きいため、姿勢補正だけでは十分ではなく、ライン間のずれ量に基づく画像ベースの姿勢補正を実施した。また、小型レンズを使用したために、視野内での輝度分布が均一となるように輝度補正を行った。さらに、以上の処理により、幾何学的および輝度的に補正されたハイパースペクトルデータが得られた。同時に、簡易マルチスペクトルカメラを搭載し、データの融合を行った。簡易マルチスペクトルカメラの特性が不明であるため、適切な仮定を用いることとした。ハイパースペクトルセンサで得られたデータに対して、栽培作物、雑草、土壌の3つの土地被覆の分類に適用した。まず、3つの土地被覆に対する教師データを作成し、比較を行った。次に、教師データに基づいて分類を行った。教師無し学習のk-means法では分類精度が低かったが、サポートベクトルマシーンにより、高精度の分類ができることを示した。あわせて、6月に主催したWHISPERSにおいて、データ融合のためのアルゴリズムについて、海外の研究者と議論を行った。

ハイパースペクトルカメラとマルチスペクトルカメラを同時搭載する機会が少ないこと、とりわけ衛星ミッションでは計画がないことから、同時に撮像してない場合のアルゴリズムが重要であることが提起された。同時にデータ融合を念頭に置いたミッション実現も必要と考えられる。ハイパースペクトルデータは100以上の波長で観測することができるが、空間分解能が低いという欠点がある。観測する波長が少ないが、空間分解能の高いマルチスペクトルデータと融合することで、高スペクトル分解能かつ高空間分解能のデータを生成することが期待される。航空機に2つのセンサを搭載して同時に撮像した実データを対象に高解像度化のアルゴリズムの妥当性を調べ、スペクトル画像がより精細に表現されていることを確認した。異種衛星センサデータへの応用、非線形反射率への拡張も示した。ハイパースペクトル画像とマルチスペクトル画像を同時に航空機に搭載し、データ取得を行った。また、得られた二種類の画像に対して、データ融合に成功し、空間分解能とスペクトル分解能に優れた情報を抽出することに成功した。さらに、得られたデータに対して、双方向反射率分布関数による観測角度依存性を除去するとともに、反射率への変換を行い、データセットを完成させた。このような例はほかにないため、データ利用の希望が多々出ている。27年度が最終年度であるため、記入しない。リモートセンシングデータの一般公開の手段を検討し、世界各国の研究者が使えるようなものとする。あわせて、地物情報の精緻化を行い、分類の研究にも用いられるようにする。物質・含有率分離の研究においては、対象物体の非線形性も考慮した理論構築にまで、装置関数推定の研究では衛星搭載センサの特性推定までの成果が得られており、ソフトウェア面は極めて順調に進捗している。ハードウェア面ではセンサの装置関数取得実験や地上撮像実験において良好な結果が得られており、航空機実験については、特性の明確な研究室所有装置を搭載して実験を行う準備が完了しつつある。航空機実験については、さまざまな試行錯誤を重ね、ハイパースペクトルセンサとマルチスペクトルセンサのデータを重ねあわせる処理を完成した。前者がラインセンサ、後者が画像センサであるために、標高による倒れ込みの補正が重要である。また、それぞれのデータの撮像タイミングの記録装置もきちんと作動した。一方、航空機の飛行日が直前まで決まらないため、地上での同期観測の体制には検討を要する。
炎症後色素沈着の機序の解明と低瘢痕創傷治癒に関する基礎的研究

身体各部位由来の正常皮膚由来線維芽細胞を用いて、瘢痕形成、色素沈着にかかわるサイトカインの発現解析を行い、線維芽細胞の部位特異性を明らかにした。特に急性期創傷治癒過程において、真皮深層の線維芽細胞は、浅層の細胞に比較して創収縮、細胞外器質の産生に有利な性質を有しており、真皮内の線維芽細胞の部位特異性は、非常に合目的的であることを報告した。さらに、解剖学的な部位による真皮線維芽細胞の特異性を明らかにするため、同一個体由来の顔面真皮線維芽細胞および体幹真皮線維芽細胞について、増殖特性および、瘢痕形成、色素沈着に深くかかわると考えられる因子(サイトカイン、マーカー、細胞外器質)の発現解析を行った。結果として、同一個体由来の顔面、体幹線維芽細胞はほぼ一致した増殖特性を示すが、瘢痕形成にかかわる因子の発現は、顔面由来の線維芽細胞で低発現であることが明らかになった。一方、体幹由来の線維芽細胞は、色素沈着に関するメラニン刺激性サイトカインであるStem cell factorを高発現していた。これらの知見は、顔のきずは体のきずに比べて、肥厚しにくく、色素沈着をきたしにくい、という臨床的な印象とよく一致し、臨床的に経験される創傷治癒の部位特異性は、線維芽細胞の部位特異性に起因することが示唆された。平成20年度は、まず、細胞培養を行う実験施設の整備から開始した。組織検体の採取、細胞の採取保存を中心に研究を遂行した。組織検体としては強い炎症後色素沈着を呈する潰瘍性病変の組織4症例分を採取、保存した。報告時現在、組織学的検討を目的とする免疫染色方法の最適化を行っている。具体的な病態生理についての検討は次年度以降に計画している。他方、皮膚炎症後色素沈着および瘢痕形成に深くかかわる細胞として線維芽細胞および表皮角化細胞の培養、検体保存を行った。本研究では、特にこれらの細胞の部位特異性について明らかにしたいと考えているため、35症例140部位から線維芽細胞を初代培養した。特に同一症例で多部位から組織採取を行いえた14症例74部位については、第2-3継代培養細胞の32日間にわたる増殖曲線を調べた。結果として、皮膚に限っていえば皮膚浅層と深層の線維芽細胞とでは全く異なった増殖能を持つ細胞群から構成されていることを示唆する知見が得られている。また同実験と並行して、各細胞群における培養上清を採取し凍結保存しており、来年度以降に各細胞群が培養液中に分泌するサイトカイン量(特に創傷治癒、瘢痕形成に重要と考えられるもの)を測定し、おのおのの細胞群の特徴を明らかにしていく予定である。表皮角化細胞の培養については、過去の報告において、研究代表者が使用していた培養液が販売中止となっていたため、現在複数メーカーの培養液を用いて初代培養を行い、培養方法の最適化を試みている状況である1.健常ヒト由来の線維芽細胞の解剖学的部位特異性を明らかにするため、形成外科の手術症例より顔面、体幹皮膚由来の真皮線維芽細胞をexplant法により初代培養し、細胞のライブラリーを作成した。2.臨床的に、顔面と体幹では瘢痕形成、色素沈着など、創の成熟に大きな差異を認めることから、文献的に創成熟にかかわりが深いと報告されている細胞外器質、サイトカインなど12種類の遺伝子についてmRNA発現を、Real time PCRを用いて解析した。その結果、コラーゲンや、フィブロネクチンなどの細胞外器質、創局所の瘢痕形成に強い影響を及ぼすTGF-β,CTGFについては体幹真皮由来の線維芽細胞は、顔面真皮由来の線維芽細胞に比較して有意に高発現であるという結果が得られた。3.次に、色素沈着に影響をもつサイトカインとして、bFGF,HGF,SCFの発現を調べた。SCFは体幹由来線維芽細胞で有意に高発現であった。有意差の認められた各因子に関しては、培養上清中の蛋白定量を行い、同様の傾向が認められることを確認した。

これらの知見は、体幹の創傷は顔面の創傷に比較して瘢痕形成、色素沈着傾向が強い、という臨床的な知見と非常によく一致するものである。肥厚性瘢痕になりやすい傾向などの創成熟の部位特異性には、創にかかる物理的なストレスなどの外的要因もかかわっている可能性もあるが、われわれの研究によって、内在する線維芽細胞の性質自体が異なっていることも、一つの要因である可能性があることが明らかになった。手掌や、足底など非常に高い特殊性を有する部位を除いて、機能的な線維芽細胞の部位特異性を明らかにした研究は過去になく、今年度までに得られた結果は、醜状瘢痕を治療対象として扱う形成外科領域においては非常に意義深い知見であると考えられる。平成22年度は、集積した身体各部位由来の正常皮膚由来線維芽細胞を用いて、瘢痕形成、色素沈着にかかわるサイトカインの発現解析を行い、線維芽細胞の部位特異性を明らかにした。特に急性期創傷治癒過程において、真皮深層の線維芽細胞は、浅層の細胞に比較して創収縮、細胞外器質の産生に有利な性質を有しており、真皮内の線維芽細胞の部位特異性は、非常に合目的的であることを報告した(Kaminishi-Tanikawa Kurita,Okazaki,et al.JPSHS,in press)。さらに、解剖学的な部位による真皮線維芽細胞の特異性を明らかにするため、同一個体由来の顔面真皮線維芽細胞および体幹真皮線維芽細胞について、瘢痕形成、色素沈着に深くかかわると考えられる因子(サイトカイン、マーカー、細胞外器質)の発現解析を行った。結果として、同一個体由来の顔面、体幹線維芽細胞はほぼ一致した増殖特性を示すが、瘢痕形成にかかわる因子の発現は、顔面由来の線維芽細胞で低発現であることが明らかになった。一方、体幹由来の線維芽細胞は、色素沈着に関するメラニン刺激性サイトカインであるStem cell factorを高発現していた。これらの事実は、顔のきずは体のきずに比べて、肥厚しにくく、色素沈着をきたしにくい、という臨床的な印象とよく一致する。以上の知見より、創傷治癒の部位特異性は、線維芽細胞の部位特異性に由来する部分がある旨、現在論文投稿中である。
肝発癌過程におけるゲノム/エピゲノム異常の相関の統合的解析

ヒト癌組織には多様なゲノム・エピゲノム異常の報告がなされているものの、その生成機序に関しては大部分が不明のままである。申請者らは、肝細胞を含むさまざまな上皮細胞に異所性に、炎症性サイトカイン刺激により遺伝子編集酵素AIDが発現誘導されること、その結果、発癌に関連したゲノム異常が生成・蓄積し、癌細胞の発生に重要な役割を果たしていること、を明らかにしてきた。本研究課題では、炎症刺激によりさまざまな癌抑制遺伝子の転写が亢進しAIDによる転写依存性の遺伝子変異生成が促進されること、ゲノム異常が生じた肝胆道系の組織幹/前駆細胞は肝細胞癌の発生起源となりうること、を明らかにした。ヒトの癌の発生には慢性的な炎症の持続が重要な役割を果たしている。他方、癌細胞の発生にはゲノム異常とエピゲノム異常の両者が関与しているものと推定されている。しかしながら、これまで肝癌を含むさまざまなヒト癌組織において多様なゲノム・エピゲノム異常の報告がなされているものの、その生成機序に関しては大部分が不明のままである。申請者らのこれまでの研究により、炎症性サイトカイン刺激により肝細胞に異所性に、遺伝子編集酵素AIDが発現誘導されること、その結果、発癌に関連した遺伝子に変異が生成・蓄積し、肝癌の発生に重要な役割を果たしていること、が明らかになった。そこで、慢性炎症により持続的にAIDを発現した肝細胞に生成・蓄積するゲノム/エピゲノム異常を統合的に解析することにより、ヒト肝癌発生の分子機構を解明することを本研究の目的とした。本年度は、肝細胞に特異的にAIDを持続発現させるため、肝細胞系統の分子マーカーのプロモーター依存性にAIDが発現誘導される遺伝子改変マウスの作成を行った。肝細胞系マーカーとして、EpCAM,アルブミン(ALB)に着目し、それぞれのプロモーター配列下流にCreをknock inしたマウス(EpCAM-Cre, ALB-Creマウス)を作成/準備した。これらのマウスと、Cre recombinase作用下にAIDを発現するAIDコンデイショナルトランスジェニックマウス(AID-cTg)を交配させることにより、EpCAM, ALB発現細胞にAIDを発現するEpCAM-AIDマウス、ALB-AIDマウス、をそれぞれ作成した。また、慢性肝障害を背景に発生したヒト肝細胞癌症例の腫瘍部ならびに非腫瘍部の肝組織の全エクソンのゲノム変化を、次世代シーケンサーを用いて解析した。ヒトの癌の発生にはゲノム異常とエピゲノム異常の両者が関与しているものと推定されている。まずはじめに、肝細胞に特異的にAIDを持続発現させるため、肝細胞系統の分子マーカーのプロモーター依存性にAIDが発現誘導される遺伝子改変マウスの作成を行った。これらのマウスと、Cre recombinase作用下にAIDを発現するAIDコンデイショナルトランスジェニックマウス(AID-cTg)を交配させることにより、EpCAM, ALB発現細胞にAIDを発現するEpCAM-AIDマウス、ALB-AIDマウス、をそれぞれ作成し表現型の解析を行った。また、これらのモデルマウスを用いて、四塩化炭素やチオアセトアミドを負荷することによる慢性肝炎モデル、肝発癌モデルを樹立し、次世代シーケンサーを用いて発生した腫瘍のゲノム・エピゲノム異常を網羅的に解析した。発癌モデルマウスの作成炎症発癌モデルの樹立については順調に進行している。ゲノム・エピゲノム解析のための次世代シーケンサー解析の一部は、試薬手配のための時間を要しており、次年度に実施予定としている。申請者らは、肝細胞を含むさまざまな上皮細胞に異所性に、炎症性サイトカイン刺激により遺伝子編集酵素AIDが発現誘導されること、その結果、発癌に関連したゲノム異常が生成・蓄積し、癌細胞の発生に重要な役割を果たしていること、が明らかにしてきた。本研究課題では、慢性炎症により持続的にAIDを発現した肝細胞に生成・蓄積するゲノム/エピゲノム異常を統合的に解析することにより、ヒト肝癌発生の分子機構を解明することを目的とした。肝細胞に特異的にAIDを持続発現させるため、肝細胞系統の分子マーカーのプロモーター依存性にAIDが発現誘導される遺伝子改変マウスとしてAIDコンデイショナルトランスジェニックマウス(AID-cTg)を準備した。

このマウスと、肝細胞系マーカーとして、EpCAM,アルブミン(ALB)に着目し、それぞれのプロモーター配列下流にCreをknock inしたマウス(EpCAM-Cre, ALB-Creマウス)を交配させることにより、EpCAM, ALB発現細胞にAIDを発現するEpCAM-AIDマウス、ALB-AIDマウス、をそれぞれ作成し表現型の解析を行った。また、AIDと協調して脱メチル化反応を担っているTETファミリー分子が同定されていることから、これらのTETファミリー分子の発現を肝細胞特異的にノックアウトしたTETコンディショナルKOマウスを樹立し、EpCAM-TET KOマウス、ALB-TET KOマウス、の表現型の解析を行った。これらのマウスでは高率に肝癌を発生することが明かとなったため、それぞれのモデルマウスに発生した肝癌組織のゲノム異常・エピゲノム異常を、次世代シーケンサーを用いて網羅的に解析を行った。ヒト癌組織には多様なゲノム・エピゲノム異常の報告がなされているものの、その生成機序に関しては大部分が不明のままである。申請者らは、肝細胞を含むさまざまな上皮細胞に異所性に、炎症性サイトカイン刺激により遺伝子編集酵素AIDが発現誘導されること、その結果、発癌に関連したゲノム異常が生成・蓄積し、癌細胞の発生に重要な役割を果たしていること、を明らかにしてきた。本研究課題では、炎症刺激によりさまざまな癌抑制遺伝子の転写が亢進しAIDによる転写依存性の遺伝子変異生成が促進されること、ゲノム異常が生じた肝胆道系の組織幹/前駆細胞は肝細胞癌の発生起源となりうること、を明らかにした。新しい遺伝子改変マウスの準備・作成については順調に進行している。ヒト臨床検体の解析についても全エクソン解析はほぼ終了している。AIDと協調して脱メチル化反応を担っているTETファミリーとしては、TET1, TET2, TET3の3つの分子が同定されていることから、これらのTETファミリー分子の発現を肝細胞特異的にノックアウトしたTETコンディショナルKOマウスの表現型を解析するとともに、肝細胞に生じているメチル化変化とゲノム変化を包括的に評価することが重要と考えられる。28年度が最終年度であるため、記入しない。消化器病学近年、AIDがTen-eleven translocation (TET)ファミリー分子とともに、能動的な脱メチル化反応を介したエピゲノム制御に中心的な役割を果たしていることが明らかとなってきた。そこで、AIDと協調して脱メチル化反応を担っているTETファミリーとしては、TET1, TET2, TET3の3つの分子が同定されていることから、これらのTETファミリー分子の発現を肝細胞特異的にノックアウトしたTETコンディショナルKOマウスの作成作業を継続する。次に、Cre組換え酵素作用下にそれぞれのTET分子がKOされるfloxed KOマウスと、EpCAM-Cre, ALB-Creマウスを交配させる。最終的に得られた、EpCAM-TET KOマウス、ALB-TET KOマウスの表現型を解析するとともに、肝細胞に生じているメチル化変化とゲノム変化を包括的に評価する。ゲノム・エピゲノム解析のための次世代シーケンサー専用試薬が国内在庫なく海外からの取り寄せとなったため、その支払いが次年度繰越となった。
神経ペプチド上の過酸化脂質由来の化学修飾解析:神経変性疾患への新規アプローチ

アンジオテンシンIIと脂質過酸化由来アルデヒドとの反応を精査し、4,5-エポキシ-2(E)-デセナールあるいは4-ヒドロぺルオキシ-2(E)-ノネナールでは主にN末端とHis6付加体、4-オキソ-2(E)-ノネナールではN末端α-ケトアミド体の生成を明らかにした。更にα-ケトアミド体では、ピリドキサミンからのアミノ基転移によるアミノ酸への変換も見出した。またヒドロキシラジカルとの反応では、N末端α-ケトアミド体と環化体を確認した。これらの修飾による代謝への影響も明らかにした。ちなみにN末端α-ケトアミド化とそのアミノ基転移、環化反応は、神経ペプチドでも観察され、病態との観点で興味深い。1. Ang A、Ang III、Ang IVなどN末端がアスパラギン酸以外の場合も同様に、ONEによりα-ケトアミド体へと変換した。2. ONEに替わりヒドロキシラジカルを用いた場合、より効率的にN末端α-ケトアミド体が得られた。3.ピリドキサミン(PM)存在下N末端ケトアミド体は、アミノ基転移によりD-およびL-アミノ酸へと再生し、この反応は経時的かつPM濃度およびCu(II)イオンの添加で促進された。4. ONE/ヒドロキシラジカル由来のN末端α-ケトアミド化とPM由来のアミノ基転移は、他の神経ペプチド(アミロイドβ1-11;neurokinin B, NKB; cholecystokinin-8, CCK-8; melanin-containing hormone, MCH)でも観察された。N-末端α-ケトアミドペプチドの環化反応の研究2. Cu(II)/AAとAng Pの反応から、Ang PがAng Cの前駆体である事を確認した。反応は、Cu(II)イオンとのキレート生成で安定化されたアミニルラジカルからの5員環を形成、更に環上のアルコキシラジカルのβ開裂による末端CH3CO基の脱離を経る物と推測した。3. Ang CのAng II type 1レセプターとの親和性は、Ang IIやAng Pに比べ著しく低下していた。Ang Cは、Ang IIをAng IIIに代謝するアミノペプチダーゼAの基質とならなかった。ヒドロキシラジカル由来のN-末端環化反応は、N-末端アラニン、アルギニン、バリンであるAngペプチド類、更にはアミロイドβ1-11(DAEFRHDSGYE)でも観測された。これらの結果の一部は、既に報告済みである(Lee et al., Chem. Res. Toxicol., 28, 59-70, 2015. DOI: 10.1021/tx500332y)。1. 4,5-Epoxy-2(E)-decenal (EDE)と4-hydroperoxy-2(E)-nonenal (HPNE)によるアンジオテンシン(Ang) II修飾反応の解析アンジオテンシンIIと脂質過酸化由来アルデヒドとの反応を精査し、4,5-エポキシ-2(E)-デセナールあるいは4-ヒドロぺルオキシ-2(E)-ノネナールでは主にN末端とHis6付加体、4-オキソ-2(E)-ノネナールではN末端α-ケトアミド体の生成を明らかにした。当初の計画通り、ヒドロキシラジカルによるα-ケトアミドを経由したN-末端環化体生成の反応機構を初めて明らかにした。N-末端α-ケトアミドペプチドは、ヒドロキシラジカルのみならず4-oxo-2(E)-nonenal (ONE)との反応でも生成する。しかしながら、N-末端α-ケトアミドの環化反応は、Cu(II)/AA存在下でのみ進行する事も明らかにした。更にα-ケトアミドとその環化体は、ペプチドの生理活性に大きく影響を及ぼす事も見出した。医歯薬学2.ヒト血漿中のα-ケトアミドAngペプチドの検出Girard試薬による誘導体化とイオン交換カートリッジによる前処理条件の最適化。選択反応モニタリングを用いたLC/ESI-MS法の構築。当初の計画通り、ONE由来のN末端ケトアミド化とPMのアミノ基転移によるアミノ酸への再生を、各種神経ペプチドを用い検討し、上記知見を得た。その過程に於いて、N末端アスパラギン酸以外の物でもN末端α-ケトアミド化が進行する事、更にヒドロキシラジカルにより効率的に進行する事を、期せずして見出した。1. N末端α-ケトアミド体からの環化反応の精査2.生体試料からのAng P分析法の開発ジラード試薬など、ヒドロキシルアミン・ヒドラゾン型試薬による誘導体化法の検討。固相抽出、イオン交換クロマトグラフィー、ビオチニル化とアビジンカラムの併用などを用いたクリーンアップ法の検討。LC/MSによる選択イオン検出(SRM)およびプレカーサーイオンスキャンを用いた高感度検出系とスクリーニング系の検討。
消化器癌におけるM期調節遺伝子に関する分子疫学的研究

細胞周期の異常は癌化において重要な変化である。なかでも、M期制御機構の異常は染色体の増幅や欠失を引き起こし、癌化において重要な役割を果たすと考えられる。消化器癌においては、M期制御機構の異常により、DNAやマイクロチューブルの損傷に対して高い感受性を示すがその分子機構は不明である。これまで、M期制御遺伝子のジェネティックな異常は頻度が低いことが明らかとなっており、DNAメチル化などのエピジェネティックな異常の解析が重要と考えられる。本研究では消化器癌におけるM期制御遺伝子のDNAメチル化異常について解析し、癌の多段階発癌における役割を明らかにすることを目的とした。まず、M期におけるチェックポイント遺伝子のエピジェネティックな異常を明らかにする目的で、CpGアイランドを有する8個のM期チェックポイント遺伝子の異常メチル化について解析した。解析した遺伝子中prophaseチェックポイント遺伝子であるCHFRが大腸癌、胃癌において高率に不活化されていることを明らかにした。CHFRが異常メチル化により不活化されている癌細胞においては、docetaxelやpaclitaxelなどの微小管阻害剤投与による細胞周期の停止が起こらず、高いmitotic indexを示した。CHFRがメチル化により不活化している細胞ではdocetaxel投与後cyclin B1の核への移行が認められるなど、チェックポイント機構の異常が認められた。また、CHFRがメチル化により不活化している細胞は、docetaxel感受性が高く、CHFRのメチル化を微小管阻害剤感受性のマーカーとして用いることが可能と考えられた。今後、実際の癌症例においてCHFRの異常メチル化と微小管阻害剤感受性に関連を認めるか、検討する必要があると考えられる。
正準交換関係に関連した量子力学の関数解析的構造の解明

1.Wignerによって発見された交換関係は、量子力学における正準交換関係の1つの拡張になっている。この交換関係にしたがう1次元調和振動子の運動量作用素は-iDで与えられる。ここで、D=∂/∂x-(c/x)R、Ru(x)=u(-x)、またcは実数のパラメータである。この作用素Dの特徴は原点x=0で特異、ということにある。パラメータcがゼロのときにはD=∂/∂xとなり、これについては偏微分方程式論で重要なSobolevの埋い込み定理やFriedrichs-Lax-Nirenbergの定理が知られている。その結果、偏微分方程式の弱い解の`滑らかさ'についての知見が得られる。そこで、原点で特異になる上記のような作用素についても同様な定理が成立するのか、ということを調べた。このような作用素に関しては`滑らかさ'のみならず`原点における特異性'についての知見も期待できるからである。その結果、1次元についてのSobolev型の埋め込み定理を証明し、特異な係数をもついくつかの偏微分方程式へ応用した(研究発表欄の2つの論文)。さらに係数が特異な、ある拡散方程式のexplicitな解を発見したので論文にまとめ、現在は投稿中である。2.正準交換関係が仮定された量子力学はEuclid空間上の力学法則とみなされる。他方、これ以外の交換関係を仮定することにより、いろいろな多様体上の量子力学が提案されている。そしてこれらが正しく量子力学となりうるためには力学変数が自己共役作用素でなければならない。したがって自己共役性の証明から、どれが量子力学として妥当であるかを判定できる。本年度はDiracの方法によるS^1上の量子力学について自己共役性を証明し、そしてスペクトルの解明を行った。また、これをS^1上の量子力学的粒子の運動を記述するSchrodinger方程式へ応用した。現在はこれらを論文にまとめ、投稿中である。
咀嚼機能面からみた全部床義歯の咬合接触に関する研究

全部床義歯において,義歯に与える咬合様式を咀嚼機能面から明らかにすることは極めて重要なことである.本研究は,多チャンネルの咬合接触の情報を無拘束状態で送受信可能なテレメータシステムの開発,およびその口腔内への応用を目的としたものである.開発したテレメータシステムは,送信器系と受信器系からなり,送信器は搬送周波数が65MH2で,酸化銀電池(3個)を電源とし,消費電流約1.0mA,通達距離約2m,連続送信時間約7時間である.なお重量は電源を含めて約2.6gである.咬合接触検知のために,左右下顎第1・第2小臼歯,下顎第1大臼歯,下顎第2大臼歯に0.5mm幅の金属格子を互いに違いに0.5mm間隔で合着し,この互い違いに埋め込まれた格子をスイッチとした・これに,対合の上顎義歯臼歯部金属咬合面が接触すると約100KH2の周波数偏移が生じる.この送信器側の周波数偏移を受信後,復調器にて増幅,波計整形し,記録可能な電圧の変化としている.これにより,左右の小臼歯部の,第1大臼歯部,第2臼歯部の計6チャンネルの咬合接触の有無についての情報を得ることが可能となっている.本システムを無歯顎者に応用したところ,非咀嚼側の各臼歯部間において咬合接触の開始にtirne lagが認められた.このような現象については,従来報告されておらず,非咀嚼側の咬合接触は,第2大臼歯,第1大臼歯,小臼歯と遠心部位から近心への順に生じたことは興味ある知見である.また咬合接像などから考えると,咀嚼時に食塊の存在により義歯は回転,変位することは明らかである.非咀嚼側においてより遠心の人工歯から接触を生じるということは,咀嚼時における義歯の安定という観点からすると,いわゆるbalancing contactの与え方について再考の必要性が示唆された.全部床義歯において,義歯に与える咬合様式を咀嚼機能面から明らかにすることは極めて重要なことである.本研究は,多チャンネルの咬合接触の情報を無拘束状態で送受信可能なテレメータシステムの開発,およびその口腔内への応用を目的としたものである.開発したテレメータシステムは,送信器系と受信器系からなり,送信器は搬送周波数が65MH2で,酸化銀電池(3個)を電源とし,消費電流約1.0mA,通達距離約2m,連続送信時間約7時間である.なお重量は電源を含めて約2.6gである.咬合接触検知のために,左右下顎第1・第2小臼歯,下顎第1大臼歯,下顎第2大臼歯に0.5mm幅の金属格子を互いに違いに0.5mm間隔で合着し,この互い違いに埋め込まれた格子をスイッチとした・これに,対合の上顎義歯臼歯部金属咬合面が接触すると約100KH2の周波数偏移が生じる.この送信器側の周波数偏移を受信後,復調器にて増幅,波計整形し,記録可能な電圧の変化としている.これにより,左右の小臼歯部の,第1大臼歯部,第2臼歯部の計6チャンネルの咬合接触の有無についての情報を得ることが可能となっている.本システムを無歯顎者に応用したところ,非咀嚼側の各臼歯部間において咬合接触の開始にtirne lagが認められた.このような現象については,従来報告されておらず,非咀嚼側の咬合接触は,第2大臼歯,第1大臼歯,小臼歯と遠心部位から近心への順に生じたことは興味ある知見である.また咬合接像などから考えると,咀嚼時に食塊の存在により義歯は回転,変位することは明らかである.非咀嚼側においてより遠心の人工歯から接触を生じるということは,咀嚼時における義歯の安定という観点からすると,いわゆるbalancing contactの与え方について再考の必要性が示唆された.昭和60年度の研究計画は、1)義歯に埋入可能なテレメーターの開発、2)テレメーター埋入用実験義歯の製作、3)有線方式によるテレメーター・システムの信頼性の確認である。テレメーターは、1)小型で義歯に埋入可能であること、2)電源の問題から低消費電力、3)安全性から低電圧動作が要求されており、テレメーターの回路を単純にせざるをえない。そのため、テレメーターの発信周波数の安定性、通達距離などに問題が生じる。現在のところ受信器には周波数追従方式のものを用い、テレメーターは恒常発信させ、咬合接触の有無を雑音に強いFM変調方式を採用することにより検知しようと試みている。これにより、テレメーターの安定性は向上したが、連続的に発信させているので、電池の寿命が短くなるという欠点を生じる。現在、テレメーターの安定性、動作寿命、チャンネル数についても検討中である。テレメーターを組み込むための実験義歯の製作は、順調に進んでいいる。テレメーター方式の信頼性を有線方式との比較により確認するので、この実験義歯は、有線方式においても、咬合接触が検知可能なものである。現在は、有線方式により実験を行っているが、全部床義歯装着者の咀嚼時における咬合接触について以下の知見が得られた。1.咬合接触の開始は、非咀嚼側が咀嚼側に先行した。

2.咬合接触の解除は、咀嚼側・非咀嚼側ともほぼ同時であった。3.咬合接触回数は、非咀嚼側の方が咀嚼側より多かった。昭和61年度は、テレメータシステムの開発および解析システムの開発である。開発したテレメータシステムは、送信器系および受信器系より構成される。送信器は、コルヴィッツ回路を基本回路とし、3個のIC,すなわち(1)週波数約85kHzのクロック,(2)カウンタ,(3)多チャンネル化のためのマルチプレクサ,および2個のアナログ回路,すなわち(4)発信週波数約67MHzのFM発信回路,(5)咬合接触検知回路から構成されている。電源に酸化銀電池を3個使用し、通達距離約2m,連続送信時間約2時間,重量約2.6g′(電源を含む)であり、義歯に埋入可能なものである。さらに、時分割多重方式を採用することにより、6チャンネルのデータを発信することが可能である。この時のサンプリング周波数は、666kHzで実効値333kHzであり、口腔内現象を観測する上で十分な値である。送信系と受信系の同期は、8チャンネルのデータを8ビットデータと考え、調歩同期方式の原理を採用している。咬合接触の検知は、送信器においては、咬合接触の有無を67MHz±50kHzの周波数偏移としてとらえ、受信後、復調器にて出力を増幅・波形整形しこの±50kHzの周波数偏移を記録可能な電圧の変化としてとらえている。解析システム用コンピュータは、高速16チャンネル・長時間にわたるアナログデータの入力が行なえ、さらに、データ収集と同時にカラーCRT上でモニタリングすることが可能である。本システムは口腔内においても十分安定して動作し、その安全性についても問題はない。以上について、日本補綴歯科学会第76回学術大会(1986年10月)において発表している。
ＰｌｅｘｉｎＡ４輸送複合体を介した樹状突起成熟機構の解明

神経細胞は、細胞体、軸索、樹状突起と呼ばれる特徴的な細胞区画を有する細胞である。これらは常に相互に情報交換をしており、例えば軸索先端で感知された情報を、他の細胞区画まで伝える必要がある。本研究では、海馬神経細胞において、軸索先端で受容されたSema3A(Semaphorin3A)シグナルが、PlexinA4受容体を介し、グルタミン酸受容体の樹状突起内輸送を亢進することを発見した。さらに、Sema3Aを介したグルタミン酸受容体の樹上突起内輸送の亢進が、樹状突起の正常な発達に重要なことが分かり、実際に神経発生に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。昨年度の研究から、PlexA4が種々の相互作用分子と複合体を形成し、樹状突起に局在するには、まず、細胞体で相互作用してから樹状突起へ輸送されることをが示唆された。しかし、この仮説を具体的に証明できていなかったため、本年度は、PlexA4とGluA2の相互作用をモデルとしての証明に取り組んだ。これまでにin situ PLA法により、培養海馬ニューロンにSema3Aを添加すると、PlexA4とGluA2の相互作用シグナルが、まず細胞体で増強し、その後樹状突起でも上昇することを見出していたが、このSema3Aによる変化は、PlexA4側の相互作用ドメインであるPlexA-IPTドメインの強制発現により完全に消失した。一方、GluA2が樹状突起に輸送されるときに微小管との相互作用を仲介するGRIP1をノックダウンしたときは、細胞体での上昇には変化がなかったが、樹状突起での変化は著しく阻害された。これらのことから、PlexA4とGluA2は細胞体で相互作用後に、GRIP1を介して微小管と相互作用することにより樹状突起に移行することが明らかになった。Sema3Aによる樹状突起成熟作用についても更なる解析を行った。まず昨年度見出したGluA2のノックダウン効果を検証するため、ノックダウン耐性のGluA2変異体を作成しレスキュー実験を行ったところ、GluA2ノックダウンによるSema3Aの作用の減弱がレスキューされることを見出した。さらに、Sema3Aシグナル自体を抑制せず、GluA2を含む輸送複合体の形成を選択的に阻害する可溶性PlexA-IPTを添加してもSema3Aによる効果の減弱が認められた。これらから、Sema3Aにより樹状突起への輸送が促進されるPlexA4、GluA2を含む輸送複合体の生理的な役割は、樹状突起の成熟を促進することであることが明らかになった。PlexA4とGluA2の相互作用が、Sema3Aを介した樹状突起成熟に関与するかを明らかにするために、海馬培養ニューロンを用いた解析を行った。まず、in situ PLA法という相互作用の検出法を用い、PlexA4とGluA2の相互作用が観察される細胞区画を調べた。その結果、Sema3A刺激により、PlexA4とGluA2の相互作用シグナルは、まず細胞体において観察された。さらにこのシグナルは樹状突起へと移行することが分かった。したがって、Sema3AはPlexA4-GluA2からなる複合体を樹状突起へ移行させることが明らかとなり、これらが樹状突起成熟に関与する可能性が示唆された。そこで、PlexA4側の相互作用部位である、PlexA-IPTドメインから成る可溶型タンパク質を発現・精製し、その培養ニューロンにおける効果を検討した。その結果、Sema3Aによる樹状突起成熟促進作用が、可溶型PlexA-IPTの添加により抑制されることが分かった。興味深いことに、可溶型PlexA-IPTの添加は、Sema3Aを介した樹状突起成熟は阻害したが、Sema3Aによる軸索成長円錐の退縮応答は阻害しなかった。したがって、可溶型PlexA-IPTは、Sema3Aの樹状突起への作用のみを特異的に阻害できることが分かった。また、GluA2のノックダウンベクターの作製にも成功し、GluA2をノックダウンすると、Sema3Aの樹状突起成熟作用は抑制された。これらから、PlexA4-GluA2複合体がSema3Aを介した樹状突起成熟に関与するが明らかになった。PlexA4-GluA2複合体に、他にどのような分子が含まれるかについても検討した。FlagタグつきPlexA4を安定発現する細胞株を樹立に、相互作用タンパク質を網羅的に同定したところ、細胞内輸送に関連するいくつかの相互作用分子が同定できた。

過去二年間の研究から、軸索先端にSema3Aを投与すると、Sema3Aおよびその受容体複合体の一つであるPlexinA4が細胞体方向へ逆行性に輸送されること、さらに細胞体まで輸送されたPlexinA4は、グルタミン酸受容体の一つであるGluA2と相互作用後に樹状突起まで運ばれ、この輸送複合体が、Sema3Aによる樹状突起成熟促進作用に必要であることがin vitroの実験系において明らかになった。そこで本年度は上記の事象のin vivoレベルでの生理的意義を検討した。子宮内電気穿孔法を用いて、GluA2とPlexinA4の相互作用を阻害するPlexinA-IPT変異体を海馬神経細胞に強制発現したところ、コントロール細胞と比べ、樹状突起におけるGluA2の局在量が著しく減少した。このような局在異常は、GluA2と同じくAMPA型グルタミン酸受容体であるGluA1では認められなかった。Sema3Aを培養海馬ニューロンに添加すると、樹状突起におけるGluA2の局在化は促進されたが、GluA1の局在化は促進されなかった。従って、in vivoにおけるPlexinA-IPTの強制発現による表現型は、Sema3AがGluA2の樹状突起への局在化を選択的に促進するという、初代培養細胞を用いた実験結果と一致するものであることが示唆された。以上の結果から、本研究計画全体を通し、軸索先端に作用したSema3Aが樹状突起成熟を促進する機構がin vitroならびに、in vivoレベルにおいて明らかになった。神経生物学過去二年の実験から、培養海馬ニューロンを用いたin vitroの実験において、Sema3Aによって惹起されるPlexA4輸送複合体の樹状突起までの輸送機構、ならびに、生理的意義が明らかになった。このことは当初計画していた構想とほぼ合致しているため、概ね順調に進展していると評価できると考えられる。さらに、in vivo解析を行うため、子宮内電気穿孔法を用いた実験条件の設定に取り組んだところ、生後15日目における海馬神経細胞の樹状突起の形態解析が行える条件を見出すことに成功したことも、計画が順調に進展していると評価できる点である。交付申請書の平成24年度の研究実施計画に記した、可溶性PlexA-IPTの添加実験、GluA2のノックダウン実験、PlexA4に相互作用する新規分子の同定に関して、概ね予想通りの結果が得られたから。当初計画に沿って進み、in vitorでの解析に関してはほぼ終えたと評価できる状態に到達した。そこで最終年度である平成26年度は、これまで見出してきた実験結果のin vivoレベルでの意義を検討するため、主に子宮内電気穿孔法を用いた実験に取り組む。表現型の評価には、すでに申請者を含む研究グループが見出しているsema3A遺伝子欠損マウスの表現型を参考に、PlexA4、GluA2を含む輸送複合体の形成を阻害したときに、sema3A遺伝子欠損マウスと類似した表現型が認められるかを検討する予定である。当初計画通り順調に進んでいるので、今後も申請時に記した計画に従い、グルタミン酸受容体のような、PlexA4が含まれる輸送小胞内に存在する分子と、これらのSema3Aによる樹状突起成熟促進作用との関連を明らかにする。昨年度は主に培養ニューロンを用いたin vitroの研究が主体であったが、最終年度に向け、個体レベルでのin vivo解析の準備を進めるようにする。昨年度同定されたPlexA4に相互作用する分子について、予想より多くの分子が同定されたため絞り込みに時間がかかった。そのため、当該分子を認識する抗体の購入が年度内にできず余剰金が生じた。