hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
麻酔薬の悪性腫瘍細胞に対するアポトーシス誘導活性に関する研究

ヒト悪性腫瘍細胞をin vitroで種々のオピオイドの抗癌作用とその機序を検討してみた。モルヒネでは、臨床使用濃度において正常細胞には傷害を与えず、HL-60,A549(ヒト肺癌細胞),MCF7(ヒト肺癌細胞)を選択的に傷害する。この抗癌作用はHL-60,A549ではアポトーシス誘導が、MCF7(ヒト乳癌細胞)では非アポトーシス誘導が主たる機序であった。モルヒノン(モルヒネの酸化生成物)もHL-60、ヒト口腔扁平上皮癌細胞に対して強力に抗癌作用を発揮する16)。そして、この抗癌作用はオートファジー誘導によることが強く示唆された。また、オピオイドのオートファジー誘導による抗癌作用はHL-60と比べて口腔癌細胞では弱かった。以上のことから、オピオイドの抗癌作用は、オピオイドの種類によって効力、及び、誘導される細胞死のタイプが異なること、α、β不飽和ケトン類(コデイノン、モルヒノンなど)のオピオイドは、強力な抗癌作用を有すること、また、癌細胞の種類によってもオピオイドの感受性や細胞死のタイプが異なることが明らかとなった。次に、種々の局所麻酔薬と静脈麻酔薬の抗癌作用について検討した。局所麻酔薬について各悪性腫瘍細胞に対する抗癌作用はジブカイン、テトラカイン、ブピバカイン、リドカイン、メピバカイン=プロカインの順であった。腫瘍選択性はジブカイン、ブピバカインが比較的高かった。ジブカインは、特に口腔扁平上皮癌細胞に対する感受性が高かった。リドカインはいずれの癌細胞においても腫瘍選択性は低かった。次に、プロポフォールの影響を見てみると臨床使用濃度よりもかなり高濃度となって初めて悪性腫瘍細胞と正常細胞の双方に細胞傷害作用が見られ、腫瘍選択性が低いことがわかった(腫瘍選択係数。むしろミダゾラム、ジアゼパムの方が抗癌作用は強く腫瘍選択係数も高かった。また、チアミラールは口腔扁平上皮癌で比較的感受性が高かった。コデイノンによるヒト口腔扁平上皮癌(HSC-2 Cell)の細胞傷害効果について検討する。細胞培養はMTT法で測定する。1)コデイノンでhormesis(低濃度で増殖促進、高濃度で増殖抑制)が起こるか否かについて検討する。結果コデイノンはhormesisを起こさない。2)コデイノンによるHSC-2 Cellにおけるアポトーシスおよび非アポトーシスの誘導について検討する。アポトーシス誘導はDNAの断片化(アガロースゲル電気泳動により検出)、Caspase3,8,9の活性化(基質の切断活性により測定)を指標として判定する。結果HL-60;コデイノン単独効果Caspase 3活性はpositive controlのAct, Dよりも弱い。Cas8,9活性はない。しかしDNA断片化は起こる。HSC-2;Caspase 3活性はpositive controlのAct.Dと比較しほとんど起こらない。Caspase8,9活性はない。これは、DNA断片化が起こらなかったのと一致する。3)さらに、ヒト前骨髄性白血病細胞(HL-60)との比較検討など細胞種により細胞死の形態が異なることが明らかとされているので、コデイノンの細胞傷害活性に影響を与える物質の検索をおこない、HSC-2でHL-60比較検討する。

臨床で使用されている抗がん剤(5-FU, cisplatin, doxorubicin, methotrexate)、その他、抗酸化剤(NAC, VC, EGCG)含め、9種の薬剤を添加し、細胞傷害活性を調べる。結果NACのみがコデイノンの作用を抑制した。他の抗がん剤、抗酸化剤に関しては、相乗的な増殖阻害効果は無かった。モルフィノンによるヒト口腔扁平上皮癌(HSC-2 Cell, HSC-3 Cell, HSC-4 Cell, NA, Ca9-22)とヒト前骨髄性白血病細胞(HL-60)の細胞傷害効果について検討する。細胞培養はMTT法で測定する。1)モルフィノンでhormesis(低濃度で増殖促進、高濃度で増殖抑制)が起こるか否かについて検討する。2)モルフィノンによるHL-60Cellにおけるアポトーシスおよび非アポトーシスの誘導について検討する。アポトーシス誘導はDNAの断片化(アガロースゲル電気泳動により検出)、Caspase3,8,9の活性化(基質の切断活性により測定)を指標として判定する。結果HL-60;モルフィノン単独効果Caspase3活性はHSC-2 Cellと同じように投与量依存性に賦活化した。しかし、actinomycin Dほどでなかった。Caspase8,9活性はない。これは、DNA断片化が起こらなかったのと一致する。3)電子顕微鏡ではモルフィノンによるHL-60 Cellにおいてミトコンドリアのshrinkage, autophagosomeが生じた。Apoptoticbodyを生じなかった。モルフィノン投与によってHL-60 Cellではアポトーシスよりもむしろ第2のプログラミングされた細胞死を生じることがわかった。また、Autophagy inhibitorを投与するとモルフィノンの細胞傷害効果が若干減弱した。モルフィノンによるヒト正常口腔組織由来細胞(歯肉線維芽細胞、歯髄細胞、歯根膜線維芽細胞)、ヒト口腔扁平上皮癌(HSC-2 Cell, HSC-3 Cell, HSC-4 Cell, NA, Ca9-22)とヒト前骨髄性白血病細胞(HL-60)の細胞傷害効果について検討した。細胞培養はMTT法で測定した。結果HL-60;モルフィノン単独効果Caspase 3活性はHSC-2 Cellと同じように投与量依存性に賦活化した。しかし、actinomycinDほどでなかった。また、3時間、6時間、12時間の時間経過を観察してもCaspase活性はなかった。3)走査型電子顕微鏡ではモルフィノンによるHL-60 Cellにおいてミトコンドリアのshrinkage, autophagosomeの形成が生じた。アクリジンオレンジ染色で細胞質にドット状の酸性オルガネラの蓄積を観察した。
トウヒの実生更新を制御する生物間相互作用解明のための微生物群集の構造と機能の解析

トウヒ属は北半球の温帯以北の地域において優占する林業上重要な針葉樹であり、倒木上に実生が更新するという特徴をもつが、トウヒの倒木上更新に関わる生物間の相互作用に関しては不明な点が多い。近年、菌類による木材の分解様式である「腐朽型」が、倒木に生息する様々な生物に影響することが筆者らの研究により明らかになってきた。腐朽型には、リグニンが分解されて白色化する白色腐朽と、リグニンが分解されずに蓄積する褐色腐朽が知られている。本研究では、倒木の分解に関わる菌類群集とその分解機能に注目し、トウヒ実生の倒木上での更新に関わる生物間相互作用に及ぼす影響を明らかにする。トウヒ属は北半球の温帯以北の地域において優占する林業上重要な針葉樹であり、倒木上に実生が更新するという特徴をもつ。本邦におけるトウヒの分布南限である紀伊半島の大台ケ原では、近年トウヒの実生更新が阻害される現象が知られており、トウヒ林の存続が危惧されている。本研究では、倒木の分解に関わる菌類群集とその分解機能に注目し、トウヒ実生の倒木上での更新に及ぼす影響を明らかにする。トウヒ実生の良好な更新が確認されている他の調査地との比較から、大台ケ原などにおけるトウヒの更新阻害に関する微生物学的要因の解明を目指している。平成26年度は、長野県の八ヶ岳、乗鞍岳、御嶽山の3つの地域において、合計5カ所の調査地において倒木の腐朽型およびコケ、トウヒ実生の野外調査を行った。御嶽山のデータを解析した結果、倒木が褐色腐朽というリグニンの蓄積した分解様式をとっている場合、直接的にはトウヒ実生の定着は阻害されており、ヨーロッパにおける先行研究を裏付ける結果となった。ただし、倒木の褐色腐朽は、倒木上のコケ群集に影響を与えており、御嶽山でのコケ優占種のうち、タチハイゴケよりもキヒシャクゴケが褐色腐朽した倒木上で被度が大きくなっていた。コケの種がトウヒ実生の定着に与える影響を調べたところ、トウヒ実生密度はタチハイゴケよりもキヒシャクゴケの上で大きかった。以上の結果から、倒木の褐色腐朽は直接的にはトウヒ実生の定着を阻害するが、倒木上のコケ群集を介して間接的にはトウヒ実生の定着を促進することが分かった。本結果を、日本生態学会東北地区会にて口頭発表し、最優秀賞を受賞した。トウヒ実生の良好な更新が確認されている他の調査地との比較から、大台ケ原などにおけるトウヒの更新阻害に関する微生物学的要因の解明を目指す。平成27年度は、紀伊半島の大台ケ原および山梨県の北沢峠、大菩薩峠、富士山において倒木の腐朽型と倒木上の実生更新に関する野外調査を実施した。これで、調査カ所は7カ所となり、予定の9カ所まであと2カ所を残すのみとなった。予備的な解析を行った結果、低緯度ほど褐色腐朽の割合が大きいという、これまでの報告を指示するデータが得られている。また、大台ケ原では、森林の衰退度合いに応じた3カ所の調査地で倒木の腐朽型を比較した結果、衰退の進んだ調査地ほど褐色腐朽の頻度が高いことが明らかとなった。さらに、分離菌株を用いて、菌株の生長に阿対する温度の影響や、様々な分解段階の木紛に対する各菌種の分解力を評価する接種培養試験を実施した。現在、培養は終了し、木紛の分析およびデータの解析を行っている。関連した研究論文9編を発表し、また、国際学会での口頭発表ならびに国内学会において招待講演を行った。予定していた9カ所の調査地のうち、7カ所の野外調査を27年度までに終了した。さらに、分離菌株を用いた接種分解実験も終了している。以上から、おおむね順調に進展しているといえる。平成28年度は、倒木上のコケとトウヒ実生の菌類群集の解析を行った。倒木上で優占していたコケ2種(キヒシャクゴケ、タチハイゴケ)及びコケのマット上や地上から採取したトウヒ実生の根からDNAを抽出し、菌類に特異的なプライマー(ITS1F/ITS4)を用いてrDNAのITS1領域を増幅したのち、次世代シーケンサー(イルミナ社、MiSeq)により遺伝子配列の決定を行った。得られたDNA配列情報から、各サンプルに含まれている菌類の操作的分類群(OTU)を決定した。コケからは子嚢菌類、実生根からは担子菌類が高頻度で検出された。非多次元尺度計量法により菌類群集の解析を行ったところ、コケの種間で菌類群集は有意に異なっていた。また、トウヒ実生の根の菌類群集は、実生が定着している基質の影響を有意に受けていることがわかった。

さらに、実生の根から検出された菌根菌OTUのうちのいくつかは、その実生が定着していたコケからも共通して検出された。これらの結果は、倒木上のコケの種によって異なる菌類群集が、コケのマット上に定着するトウヒ実生の生存や成長に影響酢る可能性を示している。一方、倒木の腐朽型がコケの成長に与える影響について、コケの栽培実験を行った。御嶽山の調査地から採取した白色腐朽材及び褐色腐朽材を粉砕して木粉(5mmメッシュ通過)としポットに詰め、その上に5mm程度に切断したコケ(キヒシャクゴケ、タチハイゴケ)を混ぜ込み、半年間栽培した。その結果、キヒシャクゴケの成長は白色腐朽材よりも褐色腐朽材で大きくなった。一方、タチハイゴケの成長は白色腐朽材と褐色腐朽材で差がなかった。これらの結果は、野外で観察されたキヒシャクゴケが褐色腐朽材上に高頻度で観察される現象をよく説明している。トウヒ属は北半球の温帯以北の地域において優占する林業上重要な針葉樹であり、倒木上に実生が更新するという特徴をもつが、トウヒの倒木上更新に関わる生物間の相互作用に関しては不明な点が多い。近年、菌類による木材の分解様式である「腐朽型」が、倒木に生息する様々な生物に影響することが筆者らの研究により明らかになってきた。腐朽型には、リグニンが分解されて白色化する白色腐朽と、リグニンが分解されずに蓄積する褐色腐朽が知られている。本研究では、倒木の分解に関わる菌類群集とその分解機能に注目し、トウヒ実生の倒木上での更新に関わる生物間相互作用に及ぼす影響を明らかにする。予定していた全調査地10カ所のうち、3カ所について調査できただけでなく、予定していなかった2調査地についても研究協力者を得て、データを得ることができた。そのうちの1カ所(御嶽山)のデータを詳細に解析した結果、先行研究のデータを裏付ける結果が得られただけでなく、倒木上の生物間相互作用によって倒木の腐朽型が実生に与える影響が逆転するという、これまで報告されていなかった非常に興味深い効果が見つかった。この結果は科学的にも新規性が高いので、早々に論文として国際誌に投稿する予定である。また、本研究課題で注目すべき調査地としている奈良県の大台ケ原における調査の注目点を絞る上でも、非常に有益な知見と言える。このように、実施1年目の野外調査において十分な地点の野外データを得られただけでなく、科学的な新知見を得ることができたことから、おおむね順調に進行しているといえる。今年度は、残り2カ所の野外調査を実施する。また、サンプルの分析およびデータの解析を進め、気候条件と菌類群集、倒木の腐朽型と倒木上のトウヒの実生更新の関係について明らかにし、投稿論文を執筆する。森林微生物生態学平成27年度は、山梨県、静岡県、長野県、奈良県の未調査の調査地での野外調査をすべて終わらせる予定である。調査区において胸高直径1cm以上の全ての木本の胸高直径を測定して植生のデータとする。調査区内の直径10cm以上の倒木すべてについて直径と長さ、および5段階の分解段階、可能であれば樹種を記録し、調査区の面積あたりの倒木の面積の割合を算出して、トウヒ実生の定着サイトとしての倒木の面積割合を評価する。平成26年5月10月に、倒木ごとに発生している菌類の子実体とトウヒ実生、コケの被度を記録する。新鮮な子実体試料については組織の一部や胞子を用いて菌株の分離を行う。分離菌株は、出現頻度の高かった菌種について、それぞれの種につき少なくとも3菌株ずつ確保する。先行研究から、分解の進んだ倒木(分解段階4)において最も実生密度が高いことが分かっているので、分解段階4の倒木では腐朽型を記録するほか、材サンプルを採取し、実生の生存・成長に影響すると予想される水ポテンシャル・pH・可給態養分量(窒素・リン)の分析を行う。
高強度レーザー駆動表面電磁波による電子光学系の概念実証

本研究では、高強度レーザーと固体標的とその近傍に設置した金属素子により、電子発生・加速および表面電磁波(テラヘルツ波)発生・伝送の機能をもたすことを提案実証することを目的としている。金属ワイヤーを標的にし、標的内あるいは面上で、電子の発生・加速・誘導が生じることを我々は実証してきたが、本研究では電子の「発生・加速」と「誘導」の機能を分離して制御できることを実験的に検証した。つまり、高強度レーザー固体相互作用により発生する巨大電流により誘起される電磁波を、近傍に設置した金属表面に表面電磁波として変換・転送することを実験的に観察した。他方、我々が開発してきたレーザー加速電子を用いた超高速電子線回折装置の性能向上にも取り組み、100fs以下の電子パルスを発生できるまでになった。これらの技術基盤を基に、レーザーと固体との相互作用により発生加速した極短パルス電子線を用いた偏向法により、レーザーと金属表面との相互作用現象を超高速で捉えることに成功した。従前の相互作用研究では電子やイオンの粒子(プラズマ)を測定することが主流であったが、本成果により相互作用近傍の超高速電磁場を捉える手法を提供することができた。これらの研究の派生として、真空中を集光伝搬するレーザーパルスを世界で初めて捉えることにも成功した。以上の成果は、高強度短パルスレーザーが光物質相互作用を誘起するだけではなく、その高速現象を観察するための量子線(電子や電磁波など)を発生し、それらを巧みに制御(短パルス化など)できれば、相互作用とその高速観察を高強度短パルスレーザーだけで自己完結型で行えることの実証である。本研究の成果は、高強度相対論的レーザープラズマ科学分野において、新たな研究展開と複雑系相互作用物理の解明に貢献するものである。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。超高強度短パルスレーザーを固体標的に照射した際に瞬時に流れる巨大電流により誘導される電磁波を、標的近傍に設置した金属固体表面に流れる表面電磁波に変換し、この表面電磁波がレーザー生成加速電子を誘導や集束する電子光学素子として機能することを実証し、高強度レーザー駆動小型電子光学素子の可能性を検証する。つまり、本研究では、高強度レーザーと固体標的とその近傍に設置した金属素子により、電子発生・加速・伝送制御の機能をもたすことを提案し、実証することを目的としている。高強度短パルスレーザーと薄膜標的との相互作用により発生・加速した電子が標的近傍に設置した金属ワイヤーにより誘導されることを実験的に検証した。金属ワイヤー端にて電子の強度分布を測定した結果、レーザー加速電子は明らかに金属線方向に誘導された。その強度分布は多重リング状であり、従前のワイヤー直接照射とは異なる特異な放射特性を観察した。薄膜標的との相互作用により、標的近傍に設置した金属ワイヤー近傍にどのような電場が形成されているか電気光学結晶を用いて調べた。その結果、数ピコ秒のパルス幅のサブテラヘルツ表面波(ゾンマーフェルト波)が誘起されていることが観察された。ワイヤーに直接照射した場合と電界の方向が異なることが明らかとなった。レーザー加速電子による表面波誘導のダイナミックスを明らかにするために、電磁場・粒子コードによる計算機シミュレーションを実施した。その結果、レーザーと薄膜との相互作用により電子加速(大電流発生)に伴って発生した大強度電磁波の一部が近傍の金属ワイヤーに表面波として結合していることが明らかとなった。上述の目的達成に向けて、下記のとおり研究が進捗した。(1)超高強度短パルスレーザーの薄膜標的への集光照射系、薄膜標的近傍への金属ワイヤーの設置位置調整系、ワイヤー端での電子測定、金属ワイヤー上の表面波測定系を構築した。(2)レーザー加速電子の金属ワイヤーによる誘導の検証:高強度レーザーを絶縁体薄膜に45度方向に集光照射し相互作用により電子を加速する。通常、加速電子はレーザー方向に広がりをもって放射される。集光位置の薄膜の裏側に金属ワイヤーを空隙を設けて薄膜に垂直の方向に設置した。金属ワイヤーの他端において電子分布とエネルギー測定を行った。ワイヤー直接照射とは異なる特異な放射特性を観察した。(3)レーザー電子加速による近傍金属ワイヤーへの表面波誘導の検証:高強度短パルスレーザーを一部分岐して、プローブビームとしてワイヤー近くに設置した電気光学結晶に導き電気光学効果を用いてワイヤー近傍の電場のダイナミックスを測定した。ワイヤーに直接照射した場合と径方向電界の方向が異なることが明らかとなった。(4)表面波誘起機構の考察:レーザー加速電子による表面波誘導のダイナミックスを明らかにするために、電磁場・粒子コードによる計算機シミュレーションを実施した。その結果、発生電場の強度の薄膜ーワイヤー空隙間隔依存性について実験と良い一致を示した。レーザーと薄膜との相互作用による電子加速(大電流発生)に伴って発生した大強度電磁波の一部が近傍の金属ワイヤーに表面波として結合していることが明らかとなった。本研究は、高強度短パルスレーザーと固体標的との相互作用による電子生成・加速(パルス大電流発生)の結果生じる高強度パルス電磁場の物理を詳細に調べ、それを用いた動的電子光学系の可能性を検証することが目的である。

本年度までに、高強度短パルスレーザー(8x1018W/cm2)と金属細線との相互作用により、金属細線上にテラヘルツ帯の高強度パルス表面電磁波(プラズマポラリトン、Sommer-feld Wave)が生成されることを実験的に捉えた。その強度は100MV/mを超えるものである。また、金属細線へのレーザーの直接照射では金属細線が損傷し、連続照射が困難なため将来の応用が制限される。連続照射が可能な回転駆動薄膜標的にレーザーを照射することにより、その近傍に金属細線を設置して表面電磁波を生成伝送する形態を提案し、その実証実験を行った。その結果、薄膜近傍に設置した金属細線上に10MV/mの表面電磁波を観測した。生成表面電磁波の特性について、電気光学検出法を用いたポンプ&プローブ法により詳細に調べた。偏向方向は金属にレーザーを直接照射した場合は外向径方向、近傍の薄膜に照射した場合は外内向径方向となることが明らかとなった。パルス幅はps程度であり、半サイクル波が観測された。さらに、薄膜照射の場合は、発生表面電磁波強度の薄膜ー金属細線端間隔の依存性、金属細線への直接照射の場合は、発生表面電磁波強度の照射レーザー強度依存性、金属細線径依存性などの知見を得た。レーザー強度の増加に伴って生成表面電磁波強度が増大することが確認されたが、比例指数についての物理的な議論は課題として残っている。また、電磁場計算機シミュレーションにより、薄膜照射の場合は、レーザーと薄膜との相互作用により生成・加速された電子が作り真空中へ放射される電磁波の一部が金属細線に表面電磁波として変換されることが明らかとなった。高強度レーザーと固体標的との相互作用に付随する、表面電磁波の発生に関する実験的研究は順調の進捗している。得られた知見から、高強度テラヘルツ波の生成の手法として極めて有効な方法であることを示せた。表面電磁波発生の研究に注力し、その結果、有意義な成果が得られたが、その電磁場の用いた電子光学系としての応用研究にまでは至っていない。当初の課題としては、「おおむね順調に進展している」にとどまるが、その派生研究まで含めると「当初の計画以上に進展している」といえる。本研究では、高強度レーザーと固体標的とその近傍に設置した金属素子により、電子発生・加速および表面電磁波(テラヘルツ波)発生・伝送の機能をもたすことを提案実証することを目的としている。金属ワイヤーを標的にし、標的内あるいは面上で、電子の発生・加速・誘導が生じることを我々は実証してきたが、本研究では電子の「発生・加速」と「誘導」の機能を分離して制御できることを実験的に検証した。つまり、高強度レーザー固体相互作用により発生する巨大電流により誘起される電磁波を、近傍に設置した金属表面に表面電磁波として変換・転送することを実験的に観察した。他方、我々が開発してきたレーザー加速電子を用いた超高速電子線回折装置の性能向上にも取り組み、100fs以下の電子パルスを発生できるまでになった。
肝線維化治療におけるマクロファージ活性化制御と骨髄細胞移植による増強効果の検証

ラットの肝線維化モデルにおいてBMCもSAGも肝線維化を抑制するが、その機序の違いは不明である。前年度に引き続き、肝臓組織での解析を続行している。それに加えて、SAGはマクロファージ分極を制御するため、マクロファージ分極に及ぼすSAGの作用を解析するため、DNAマイクロアレイを行った。その結果、M0からM1, M2への分極により多くの遺伝子が変動するがその変動遺伝子のうちSAGが正常化した数十個の遺伝子について、タンパクレベルでの確認を行っている。1四塩化炭素肝線維化モデルにおけるBMCとSAG投与併用における線維症改善増強と機序についてBMCとSAGを併用してもそれぞれ単独投与と肝線維化病態改善にはあまり差はなかった。これより、全身麻酔下で骨髄穿刺をしてBMCを採取する方法よりSAG単独投与で十分な線維化抑制効果があると考えられた。しかしながら、SAGのマクロファージ分極制御における詳細な機序解明には至っていないので、この点について次年度継続する。2SAGのマクロファージ分極における機序解明ラットの骨髄細胞から分化させたマクロファージ(BMDM)を用いて、LPS+IFN-gを添加しM1へ分極させたマクロファージおよびIL-4;IL-13を添加してM2へ分極させたマクロファージについて未刺激(M0)のものと比較して差があった遺伝子群でSAGがM0へシフトさせる遺伝子を解析すると下記の経路をSAGが制御する可能性が考えられた。M1:脂肪細胞、脂質代謝、ミトコンドリア、エネルギー代謝、ヌクレオチド代謝、ペルオキシソーム、Sirt1、Ca、GST、プロテアーゼ、NK細胞、神経、細胞骨格、細胞接着など、M2:癌、プロテアーゼ、苦味レセプター、TGFb/Hippo/Wnt、エストロゲン、NK細胞、細胞骨格、翻訳など肝線維化を抑制する2つの方法である薬剤と骨髄細胞移入療法での機序の違いや差別化が出来そうな結果を得ている。1SAGのマクロファージ分極制御における詳細な機序解明のため、この点についてin vivoのサンプルを継続解析する。2DNAマイクロアレイでピックアップした遺伝子についてタンパクレベルでの確認を行い機序の解明に努力する。I.肝線維化モデル(CCl4反復投与)におけるSAGおよびBMC移植による線維化改善の相乗効果の検討ラットにCCl4を週2回反復投与し、その4週後にGFP発現ラット(グリーンラット)から採取した骨髄細胞(BMC)を1 x 104, 1 x 105, 3 x 106個/ratを尾静脈より移植した。SAG(20, 60, 200 mg/kg)は飲水で投与を開始した。BMCおよびSAGの併用投与も行った。CCl4投与開始から9週間での肝切片の線維化形成や肝組織のヒドロキシプロリン量を解析評価すると、SAG,骨髄細胞それぞれ単独では用量依存性に肝線維化を改善した。BMCおよびSAGの最も少ない量では単独効果が見られず、両者併用投与でもほとんど肝線維化を改善しなかった。また、単独でも肝線維化を有意に改善した高用量では、それらを併用しても線維素のさらなる改善効果はなかったが、Col1A1 mRNAの低下は単独投与よりも亢進することが判明した。これより、さらに観察すればBMCとSAGの併用投与は線維素形成をより低下させることが示唆された。今後は、その他併用効果を示す指標がないかどうかを含めて採取したサンプルの解析を継続したい。具体的には、GFPラットの骨髄細胞を肝線維化モデルに投与することによりKφ細胞の由来と表現型を解析し、肝組織切片を用いて、F4/80(Mφ抗体)とGFP抗体で二重染色することにより共局在するかどうかなどKφ(Mφ)細胞の由来を評価する予定であったが、GFP発現BMC投与1時間後の肝GFP発現タンパクは投与量依存性に増加したが、24時間後にはその発現はほぼ消失した。よって、肝硬変を評価する時点の肝臓ではマクロファージの由来を解析することは困難であると結論した。BMCの細胞数とSAGの投与量の併用において、相乗効果を示す至適投与量の探索ができなかった。2SAGのマクロファージ分極における機序解明ラットの骨髄細胞から分化させたマクロファージ(BMDM)を用いて、LPS+IFN-gを添加しM1へ分極させたマクロファージおよびIL-

4;IL-13を添加してM2へ分極させたマクロファージについて未刺激(M0)のものと比較して差があった遺伝子群でSAGがM0へシフトさせる遺伝子を解析すると下記の経路をSAGが制御する可能性が考えられた。M1:脂肪細胞、脂質代謝、ミトコンドリア、エネルギー代謝、ヌクレオチド代謝、ペルオキシソーム、Sirt1、Ca、GST、プロテアーゼ、NK細胞、神経、細胞骨格、細胞接着など、M2:癌、プロテアーゼ、苦味レセプター、TGFb/Hippo/Wnt、エストロゲン、NK細胞、細胞骨格、翻訳など肝線維化を抑制する2つの方法である薬剤と骨髄細胞移入療法での機序の違いや差別化が出来そうな結果を得ている。II.SAGとBMC併用投与における(Iの実験より)MΦ動態の解析(継続)III. IIの結果を踏まえて肝硬変時のM1、M2分布がBMCとSAGで変化するかどうかとその局在を免疫染色で検討する。IV. SAGのマクロファージ分極に対するマイクロアレイを行い、その発現に変化のあった遺伝子についてタンパクレベルで検証する。1SAGのマクロファージ分極制御における詳細な機序解明のため、この点についてin vivoのサンプルを継続解析する。2DNAマイクロアレイでピックアップした遺伝子についてタンパクレベルでの確認を行い機序の解明に努力する。予定の試薬調達が遅れたため、次年度に購入予定である。機序解明のために抗体を新たに購入したかったが、どのタンパクから検討するかを文献やで共同研究者とのディスカッションなどを参考に選択したが、納期に時間がかかっているため。現在、納品待ちの状況である。
ミクログリアを介したエリスロポエチンの脳保護作用機序の解明と治療薬開発の基盤研究

EPOの抗酸化作用を確認するための実験として、LPS刺激を加えたミクログリアセルライン(BV-2)を使用してEPOの効果を調べた。各種抗酸化酵素に対するウエスタンブロット、assayを行ない、具体的には抗酸化酵素であるSOD1, SOD2, catalaseなどに注目した。EPOが抗酸化酵素の活性を増強することで抗酸化作用を発揮すると思われたが、EPOによる抗酸化酵素の活性増強は有意ではなかった。また、活性酸素の存在を染色するcellroxという蛍光色素を用いて、活性酸素の量を視覚化した。EPOによる活性酸素低下が見られたが、controlで活性酸素の染色が強くなる事が時々あり再現性に乏しかった。LPS刺激を加えたBV-2細胞において、EPOの作用機序の解明のため、タイムコースの実験を行った。LPS下流経路、EPOの下流経路に注目し、MAPK(ERK, p-38, JNK)やPI3K、NFkBなどの活性をウエスタンブロットで確認した。上記のリン酸化タンパク質の活性を調べ、30-60分で活性が最大になることを確認し、そこにEPOを追加してEPOの作用機序を検討した。PI3Kを介した抗酸化、細胞保護的な機序を予測していたが、EPOによるPI3Kの変化はなかった。ウエスタンブロットでは、EPOによりJNK活性が抑制されたことが確認された。EPOがJNKを抑制する事により抗炎症作用や抗酸化作用を示し、この機序を一因として結果的に神経保護作用を示す可能性が考えられた。今後は、虚血性脳症に対する脳低温療法にEPOを併用する事で脳低温療法の抗炎症作用を強化できるのではないかと考え、実験を行う予定である。1.ラット初代培養細胞およびBV-2細胞におけるEPORの確認日齢1日のラット大脳皮質から分離した初代培養神経細胞、ミクログリア、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、およびミクログリア細胞株BV-2細胞におけるEPORの発現をRT-PCRと免疫組織染色により確認した。結果として、ミクログリアにおいて有意にEPOR発現が多いことが確認された。2. EPOの神経細胞保護効果の確認BV-2細胞に対してLPS投与、あるいはLPS+EPO投与を行った。細胞染色によりBV-2細胞の形態変化を確認した。LPS刺激で活性型形態となった細胞がEPOを追加することで静止型形態の割合が有意に増加した。3. BV-2細胞のLPSによる活性化とEPOによる傷害的活性化の抑制効果の確認BV-2細胞にLPS投与を行い、TNF-α, IL-1β, IL-6などの細胞傷害関連遺伝子の発現量の増加をRT-PCRで確認した。LPSにより傷害的なM1型になったことが確認された。それぞれタイムコースを設定し、最も炎症性サイトカインが高値となる時間においてEPO同時投与による上記の遺伝子発現量の有意な抑制を確認した。次に、BV-2細胞の貪食能をポリスチレンビーズの細胞内取り込みを共焦点顕微鏡で確認した。LPS刺激により有意に貪食能が亢進し、EPO追加により亢進した貪食能は有意に低下した。次に、BV-2細胞にLPS投与を行い、RT-PCR、western blotによりiNOS発現が有意に増加することを確認、EPO追加により有意に抑制された。また、Griess試薬を用いたELISAにより全NO産生量を解析したがNO産生を検知できなかった。予備実験をすでに行っていたこと、国内外の学会でEPOに関する情報を前もって集めていたことで、全体としてはスムーズに実験が進行している。ただ、ミクログリアのM2型への誘導、NO測定など予定通りに結果が得られない事もあった。■初代培養ミクログリアのLPSによる活性化とEPOによる傷害的活性化の抑制効果の確認ラット初代培養細胞から分離したprimaryミクログリアにおいてもBV-2と同様の実験を行なう予定であったが、primaryミクログリアの細胞は単離してしまうと増殖が悪く、同実験を行うことができなかった。■マウスへのLPS投与によるミクログリアの活性化とEPOによる傷害的活性化の抑制効果の確認8週齢のマウスに対してLPS刺激をした場合の脳におけるEPO、EPOR、サイトカイン遺伝子の発現量を調べた。tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin-1β(IL-1β), interleukin-6(IL-6)などの炎症性サイトカイン関連遺伝子の発現量を調べた。LPSによりTNF-α、IL-1 β、IL-6の遺伝子発現は有意に増加下が、腹腔内に追加でEPOを投与することによって各種遺伝子発現量は低下した。次に、摘出した脳の凍結切片を使用して、免疫組織学的な手法でミクログリアの形態変化を観察した。刺激により活性化したミクログリアの形態はEPOを追加投与した場合にはミクログリアは形態変化が観察され、EPOにより形態学的に活性低下していることが確認された。■EPOによる傷害的活性化の抑制効果の機序解明LPS- Toll like Receptor-4(TLR-4)シグナルとEPO-EPORシグナルのクロストークから、EPOの神経保護作用機序に関連している経路を明らかにすべく、LPS刺激、EPO投与によるリン酸化MAPK、リン酸化NFkB、リン酸化Aktなどの変化をwestern blotで確認しているが、現時点で有意な結果は得られていない。またEPOの抗酸化作用についての実験を進めていたが有意な結果は得られていない。

予備実験を行なっていたこと、国内外での学会でEPOに関する情報を収集していたことなどから、全体としてはスムーズに進行していたが、プライマリーミクログリアの培養でたくさんの細胞が得られなかったため予定通りにいかなかった。ウイルスベクターを用いてEPORのsiRNAを導入を予定していたが、まだできていない。EPOの抗酸化作用を確認するための実験として、LPS刺激を加えたミクログリアセルライン(BV-2)を使用してEPOの効果を調べた。各種抗酸化酵素に対するウエスタンブロット、assayを行ない、具体的には抗酸化酵素であるSOD1, SOD2, catalaseなどに注目した。EPOが抗酸化酵素の活性を増強することで抗酸化作用を発揮すると思われたが、EPOによる抗酸化酵素の活性増強は有意ではなかった。また、活性酸素の存在を染色するcellroxという蛍光色素を用いて、活性酸素の量を視覚化した。EPOによる活性酸素低下が見られたが、controlで活性酸素の染色が強くなる事が時々あり再現性に乏しかった。LPS刺激を加えたBV-2細胞において、EPOの作用機序の解明のため、タイムコースの実験を行った。LPS下流経路、EPOの下流経路に注目し、MAPK(ERK, p-38, JNK)やPI3K、NFkBなどの活性をウエスタンブロットで確認した。上記のリン酸化タンパク質の活性を調べ、30-60分で活性が最大になることを確認し、そこにEPOを追加してEPOの作用機序を検討した。PI3Kを介した抗酸化、細胞保護的な機序を予測していたが、EPOによるPI3Kの変化はなかった。ウエスタンブロットでは、EPOによりJNK活性が抑制されたことが確認された。EPOがJNKを抑制する事により抗炎症作用や抗酸化作用を示し、この機序を一因として結果的に神経保護作用を示す可能性が考えられた。今後は、虚血性脳症に対する脳低温療法にEPOを併用する事で脳低温療法の抗炎症作用を強化できるのではないかと考え、実験を行う予定である。EPOの抗オキシダント効果作用について、活性酸素の実験を開始しているが、かなり難渋している。H2O2の検出もいくつか方法を変更して今後も行う予定である。今後はBV-2細胞で行った実験を、ラット初代培養細胞から分離したprimaryミクログリアでも同様に確認していく予定である。また、マウスを使用した生体実験でのLPS、EPOの作用を検討していく。最終的にはEPOの神経保護作用の機序をウエスタンブロットなどを用いて解析していく。EPOの作用機序の解明をするための実験を行なっていく。LPSによって有意に増加した活性酸素に対してEPOがどのように効果があるのか、またLPSの下流経路、EPOの下流経路を順番に調べてEPOの神経保護作用機序を解析していく。CO2インキュベーターを購入予定であったが、培養実験は分子神経生物学研究室で行うことができたため、購入を見送った。(理由)前回の次年度使用額よりは減っており、初年度の残が影響している。(使用計画)次年度の各種プレートやフラスコなどの消耗品、作用機序解明のための分子生物学用試薬などに使用予定である。次年度の分子生物学用
メタサイクロジェネシス関連ベクターパラサイト相互作用の分子機構 に関する研究

世界で初めてアフリカトリパノソーマ全発育期のプロテオームおよびESTデータベースを作製し、今後のアフリカトリパノソーマ制圧を目指した基礎研究を大きく進展させる研究資源を提供することができた。さらにツェツェバエ体内で同原虫が動物感染型へと分化する発育期にその細胞表面に特異的に発現するCESP蛋白質を同定し、その発育時期特異的転写翻訳メカニズムの一端を明らかにしたことはベクター体内での原虫発育阻止法を開発する上で大きな一歩と言える。本研究はツェツェバエ体内型アフリカトリパノソーマのうち下咽頭内壁で細胞接着依存性に動物感染性メタサイクリック虫体へと分化するエピマスティゴート虫体の特異表面抗原CESPとメタサイクロジェネシスおよびベクターパラサイト相互作用との関連を分子レベルで明らかにし,伝播阻止ワクチン開発への手掛かりを求めることを目的とする。本年度は距Trypanosoma congolense全発育ステージ虫体由来トータルプロテインわよびRNAを抽出し、カナダビクトリア大学(テリーピアソン博士)およびアイオワ大学(ジョンドネルソン博士)との共同でプロテオーム解析、蛋白質発現量ディファレンシャルディスプレイ解析、ESTデータベース構築と解析を実施した。プロテオームおよびディファレンシャルディスプレイを詳細に解析した結果、我々がクローニングしたCESP以外に3種類のまったく新規なエピマスティゴート型虫体特異的蛋白質が同定された。一方構築したESTデータベースはサンガーセンターから一般に公開(http://www.sanger.ac.uk/Projects/T_congolense/EST_index.shtml)され、今後広くトリパノソーマの分子寄生虫学的研究に活用されることが期待される。加えて、同ESTデータベースの詳細を解析し、分子寄生虫学分野で権威あるMolecular and Biochemical Parasitologyに論文発表した。我々が同定したトリパノソーマ・エピマスティゴート型ステージ特異的表面タンパク質(CESP)および既によく調べられている表面タンパク質GARPについて、カナダ・ヴィクトリア大学・ピアソン博士と共同で、結晶構造解析を進めている。H22年度はGARPの構造解析が完了し、論文発表した。CESPについては親水性が極めて高いため立体構造解析のための結晶化が難航しており、現在組換えCESP発現系の検討などを含めて鋭意実施中である。加えて、トリパノソーマの4種類の重要な発育ステージすべての網羅的プロテオーム解析が完了し、論文発表した。このプロテオームデータと前年度に論文発表した遺伝子発現プロファイル(ESTデータ)を合わせることで、トリパノソーマの全発育ステージを網羅する世界初のデータベースを構築することができた。これらの成果によって、これまで明らかでなかったGARPの立体構造が明らかとなった。それによりGARPの基本構造が動物感染ステージの表面抗原、VSGと類似していることが判明し、トリパノソーマのステージ変化と表面抗原の変換が密接にリンクしていることが明らかとなった。また、網羅的プロテオーム解析から、未知のトリパノソーマ発育ステージ特異的タンパク質を多数同定することができ、これらのタンパク質について今後解析を進めていくことで、トリパノソーマの発育ステージ変換に関与する表面抗原の役割が明らかになっていくと期待される。本年度は昨年度までに我々が同定したトリパノソーマ・エピマスティゴート型(EMF)ステージ特異的表面タンパク質をコードする遺伝子(cesp)の原虫発育時期特異的発現調節メカニズムを明らかにする目的で研究を実施した。EMFは他の発育ステージとは異なり、接着依存性に増殖する点がユニークである。EMFの細胞接着は哺乳類感染型原虫への分化に必須であるため、本研究の成果は接着を阻止して原虫の伝播を防ぐ新規感染予防法開発に発展する可能性がある。まず始めにcespの転写を核run-on assayで解析した結果、α-アマニチン感受性RNA polymerase IIによって転写されていることを明らかにした。次にcespのEMF特異的発現調節機構を明らかにするために、そのmRNA 3'UTRに着目した。cespの3'UTRをeGFP遺伝子と組合せた発現コンストラクトを作製し、トリパノソーマのゲノムに挿入してmRNAおよび蛋白質の発現量を各発育ステージで比較した。その結果cesp 3'UTRを組合せたeGFPの発現はEMFステージ特異的であった。以上の結果からcesp3'UTRにはEMFステージ特異的遺伝子発現を制御するcis-elementが存在すること明らかとなった。そこでコアとなるcis-elementを同定するため、作製したeGFP発現カセットの一部の配列を欠損させたdeletion mutantを作製し、eGFPの発現をステージ間で比較した。その結果、AUに富むコアcis-element配列を同定し、さらにcis-elementに特異的に結合するEMF細胞質由来RNA結合蛋白質の存在をRNAゲルシフトアッセイで証明した。これら一連の成果はアフリカトリパノソーマEMF特異的遺伝子発現調節機構を明らかにした初めての報告である(Suganumaら, MBP, 2012)。24年度が最終年度であるため、記入しない。
海塩粒子エアロゾル中のジカルボン酸と海水表面を覆う薄い有機膜との関係

本研究では、海水表面を覆う薄い有機物の膜(以下SMLと略す)に関して、SMLとそれ直下のバルク海水中の吸光度および有機炭素濃度を測定した結果から、SML中でそれぞれ約1.3から2倍高いことを明らかにした。次に、SMLおよびバルク海水ジカルボン酸を高速液体クロマトグラフィーを用いて、検出する方法について諸条件を変えながら検討したが、海水に多く含まれる塩分によって、大きな妨害を受けるため、前処理が必要であることが明らかとなった。さらに、ジカルボン酸の生成に重要なOHラジカルの生成では、Fe(II)と過酸化水素の反応であるフェントン反応から生成されるOHラジカルがほとんどないことが明らかとなった。海水表面は、厚さが501000μm程度の非常に薄い有機物の膜(Sea Surface Microlayer:以下SMLと略す)で覆われている。SMLは、大気ー海水間の化学物質の移動を制御し、さらに、海表面で波が砕ける際に発生する海塩粒子エアロゾルの化学組成及び粒径に大きく影響する。そこで、本研究では、SMLから大気へ拡散していく有機物、特に、大気エアロゾル中の有機物の中で最も多いと報告されているジカルボン酸に着目し、その挙動および発生メカニズムを解明することを目指した。海水表面へ人工的に風を送り、海塩粒子を発生させ、海塩粒子エアロゾル中のジカルボン酸に対するSMLの役割、さらに、SML中で光化学反応により生成・分解するジカルボン酸の挙動を明らかにすることを目指した。また、海水中で有機物の反応をコントロールするOHラジカルにも注目し、その発生メカニズムにおいて重要なフェントン反応(Fe(II)と過酸化水素の反応)にも注目し、研究を実施した。研究2年目は、SMLから大気へ拡散する海塩粒子エアロゾルの発生法および採取に必要な機材を購入し、開発および改良を進めた。また、SML中とバルク海水中で光化学反応によって発生する過酸化物に着目し、過酸化物を有機過酸化物と過酸化水素に分けて計測を実施した。これは、昨年度実施したフェントン反応の寄与を調べた研究において、予想に反して、フェントン反応の寄与が小さかったことから、過酸化物の光化学的な挙動について検討したものである。過酸化物の中で、有機過酸化物については、光照射されてもほとんど生成が見られなかったが、過酸化水素については、TOC濃度に比例し、光生成速度が増加する傾向が見られた。この結果は、SMLに含まれる有機物とバルク海水に含まれる有機物が大きく異なることが予想されるものの、単に、TOC濃度だけに影響されることを示唆している。海水表面へ人工的に風を送り、海塩粒子を発生させ、海塩粒子エアロゾル中のジカルボン酸に対するSMLの役割、さらに、SML中で光化学反応により生成するジカルボン酸の挙動を明らかにすることを研究の目的とした。初年度は、ジカルボン酸を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて、検出する方法について諸条件を変えながら検討した。その結果、海水に多く含まれる塩分によって、大きな妨害を受けるため、前処理法の検討が必要であることが明らかとなった。また、SMLとそれ以下のバルク海水中の吸光度および有機炭素濃度(TOC)を測定した結果、SML中でそれぞれ約1.3倍高いことを明らかにした。さらに、SMLとバルク海水に対して、光照射を行うことで、その中で起こるフェントン反応(Fe(II)とHOOHの反応で発生するOHラジカル)の寄与を調べた結果、SML中のFe(II)の化学形態としてHOOHと反応し難いものになっていることが示唆された。そこで、本研究では、まず、有機物の中でもジカルボン酸に着目し、その挙動および発生メカニズムを解明することを目指した。さらに、海水中で有機物の寿命や反応を支配するOHラジカルにも注目し、その発生メカニズムに関して研究を行った。

研究の結果、まず、SMLとそれ以下のバルク海水中の吸光度および有機炭素濃度(TOC)を測定した結果、SML中でそれぞれ約1.3から2倍高いことを明らかにした。次に、SMLおよびバルク海水ジカルボン酸を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて、検出する方法について諸条件を変えながら検討したが、海水に多く含まれる塩分によって、大きな妨害を受けるため、前処理法の検討が必要であることが明らかとなった。ジカルボン酸の生成に重要な寄与が想定されるOHラジカルの生成に対して、Fe(II)と過酸化水素の反応であるフェントン反応から生成されるOHラジカルがほとんどないことが明らかとなった。これは、Fe(II)は光化学的に生成するものの、過酸化水素と反応し難い化学種(例えば、錯イオンのようなもの)になっているためであると考えられる。本研究の結果より、SMLに有機物が多く存在することは明らかとなったが、光化学的には、それほど活性な有機物は多くなく、特に、活性酸素の生成における重要性は低いことが明らかとなった。よって、光化学的に活性なジカルボン酸の濃度自体、SML中ではそれほど高くないことが示唆された。実験結果を総合的に解析し、研究成果をまとめ、学術論文として投稿する。環境化学研究2年目は、SMLから大気へ拡散する海塩粒子エアロゾルの発生法および採取に必要な機材を購入し、開発および改良を進めた。また、SMLとバルク海水の両方を用いて光照射実験を行い、過酸化物(有機過酸化物と過酸化水素)の挙動を調べた。これは、OHラジカルの生成に重要なフェントン反応を理解する上で重要であり、海水中での有機物の分解過程(ジカルボン酸の発生メカニズム)において重要な活性酸素種の挙動を把握するためであった。研究計画では、1年目は、沖縄本島沿岸海水表面のSMLと表面海水に含まれるジカルボン酸および化学成分の定量を中心に行い、また、SMLの光化学的特性を明らかにすることを計画していた。初年度は、計画通り、ジカルボン酸の代表であるシュウ酸の計測を試み、さらに溶存有機炭素や吸光度を測定することで、SMLとバルク海水に含まれる化学成分の違いを明らかにした。研究最終年度の3年目は、SML中で光化学反応により生成・分解するジカルボン酸に関する研究を主に実施し、光化学反応による生成・分解に関する反応速度論的なメカニズムの解明を目指す。また、実験結果を総合的に解析し、研究成果をまとめ、学術論文として投稿する。研究2年目は、SMLを採取するサンプリングポイントを増やし、異なる条件下にあるSMLを採取する。また、SMLから大気へ拡散する海塩粒子エアロゾルの発生法および採取に必要な機材を購入し、開発および改良を進める予定である。さらに、SML中で光化学反応により生成するOHラジカルの反応メカニズムの中でも大きな役割を果たすFe(II)の挙動解析に関する研究にも着手する。予算執行は、計画的に実施されていたものの、年度末に計画していた試薬やガラス器具の購入が間に合わず、次年度への繰り越しとなった。研究遂行に必要なガラス器具や試薬および海水試料採取に必要な旅費に使用する予定である。2年目は、大気へ拡散する海塩粒子エアロゾルの発生装置の開発を試みるため、その機材購入を計画している。また、SMLとバルク海水に含まれる化学成分の分析に必要な試薬類やガラス器具類も必要に応じて購入を検討している。
大気圧マイクロプラズマを用いた半導体結晶成長アシストの基礎研究

大気圧マイクロプラズマを用いてGaNの表面改質効果を実験的に検討した。接触角をθ/2法による算出を行ったところ、プラズマ処理前では65.8°、プラズマ処理後では22.6°となり、40°以上の減少が確認された。またプラズマによる表面処理によって対象物の表面への官能基の導入や化学組成の変化が期待されるためGaNの表面処理後の化学的変化を調べるためXPSを用いてGaN表面の化学結合解析を行ったところ、GaNを形成しているN-Gaピークの増加がマイクロプラズマ処理後のサンプルより確認された。マイクロプラズマ処理による各種活性種がGaN表面へ作用したものと考えられる。GaNは3.45eVと広いバンドギャップを持っているなど、Si系系半導体と比較して優れた特性を有している。現在では、青色発光ダイオードや青紫色半導体レーザといった発光デバイスに実用化されている。また、半導体をプラズマ処理することで、GaNの発光強度が増加したという報告も存在する。本研究では大気圧マイクロプラズマを用いてプラズマによって生成されたラジカルや励起種を用いて表面改質を行うリモート表面改質によりGaNの表面改質を行った。本研究では、低電圧下で大気圧マイクロプラズマを発生させ、GaNの表面改質を実験的に検討した。実験によりGaNを形成しているN-Gaの結合がマイクロプラズマ処理前後のサンプルの両者で確認された。処理を行う際に大気に暴露されていたため、若干の窒素酸化物(N-O)も確認された。マイクロプラズマ処理後では、処理前と比較して信号強度の増加が確認された。これはN2およびH2O等との反応が起こったものと考えられる。またGaN表面のプラズマ処理において酸化種等を含む環境下ではGaN表面からの窒素離脱を促進する効果があると考えられているが、N 1sピークの増加はArプラズマにより発生した環境空気由来の活性種の影響によるものだと考えられる。GaNのMCEのためには、選択成長性の優れた有機金属分子線結晶装置(MOMBE)を用いる。しかし、MOMBEは成長の駆動力が小さいので、初期成長が島状成長になり問題である。窒素マイクロプラズマを用いた成長前処理の効果を調べたところ、初期成長の平坦性が大幅に向上した.このような処理により、MCEの初期成長の島状化を抑えることが出来れば、マイクロチャンネル部の成長側面の直線性が大幅に向上し、横方向成長の歩留りが格段に改善する。成長層の大面積化に欠くことの出来ない重要な技術となる。GaAs表面を窒化することにより原子層レベルのGaN層が形成されるが、この窒化過程で大気圧プラズマを用いる事で、GaNを再成長する際の再現性や膜質の改善が行われ、その生産性が大きく向上する可能性を持つ。本研究では高分子樹脂フィルムなどの表面改質に用いられている大気圧マイクロプラズマを用いてGaNの表面改質効果を実験的に検討したところ、以下の結果が得られた。放電電圧ー1.3 kV、パルス繰り返し周波数24 kHz、Arガス5 L/min、マイクロプラズマ電極とGaN表面の間隔1 mm、処理時間10秒でマイクロプラズマ処理を行ったGaNサンプルで比較を行い、接触角測定器(協和界面科学, PCA-1)を用いて、GaN表面に5 &#181;Lの蒸留水を滴下し、θ/2法による算出を行ったところ、プラズマ処理前では65.8°プラズマ処理後では22.6°となり、40°以上の減少が確認された。大気圧マイクロプラズマ処理の結晶成長への応用例はほとんどなく、処理表面へのダメージを低減出来るため成長前処理手法として極めて有望であると考えられる。プロセスガスや原料種の選択による異なるプラズマ反応を成長前処理に適宜応用できれば、結晶成長的な観点でも有用な成果が得られる。大気圧マイクロプラズマ応用マイクロプラズマの活性種のエネルギーは数eVと低く、基板表面にダメージを残さない成長前処理に適した手法である。今後の検討課題としてはマイクラプラズマによる成長前処理で基板表面のダメージを除去する方法を検討する。これらの方法でも問題が解決出来ない場合は、グラフェンと基板の間にSiO2などの保護膜を挟み、グラフェンのパターン化の後で保護膜をのみを選択エッチングしダメージのない基板表面を露出させるなど、種々の改善方法を検討していく。GaN表面へのプラズマ照射では駆動ガスによりエッチングや表面ダングリングボンドの生成がかなり起こることが観測されている。

今回の研究では転移低減を目指して、GaN表面を再成長に適した条件にする事が必要であるが、マイクロプラズマ表面処理を行い、その表面分析を行ったところ、N-Ga結合が確認された。これは今後、GaN薄膜の大面積化につながる可能性を有しているものと考えられる。GaNの成長をアシストするためマスクを使用したパターン上での再成長を確認したい。また再成長前の表面画像を観察することで、表面上の不純物の有無などを確認し、それらとマイクロプラズマ照射パワー、時間などによる依存性を定量的に判断したい。