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陽子線・炭素線の生物学的効果に関する基礎的比較・検討

陽子線や炭素線を用いた粒子線治療は従来のX線治療よりも効果が高いことが基礎的にも示された。また、放射線の生物学的効果に重要な役割を果たす活性酸素種(ROS)の照射による発生は一時的ではなく、持続的であるという新しい知見が得られた。そして、ROS発生をN-アセチルシステイン(NAC(を用いて持続的に抑制することで、照射後の細胞生存率が上昇することが分かり、NACが放射線(粒子線(防護剤として臨床応用できる可能性が示唆された。1.培養細胞を用いた照射後細胞生存率の比較粒子線治療の主要対象腫瘍の培養細胞(HSG:唾液腺癌、HMV-2:粘膜悪性黒色腫)を用いて、X線・陽子線・炭素線照射後の細胞生存率を比較した。良好なコロニー形成能を有するHSGには放射線感受性試験のゴールドスタンダードであるコロニー形成法を用いた。細胞生存率10%(SF10)での生物学的効果比(RBE)は陽子線1.10、炭素線1.96で従来とほぼ同様の結果であった。HMV-2はカウント可能なコロニーを形成しないため、薬剤感受性試験で頻用されるWST-8法を転用することとしたが、この方法の放射線感受性試験における信頼性を確立するため、まずHSGを評価してみたところ、SF10でのRBEは陽子線1.31、炭素線1.90とコロニー形成法の場合とほぼ同様の結果となり、転用可能であることが分かった。次にHMV-2をWST-8法で評価したところ、RBE(SF10)は陽子線1.25、炭素線2.49であり、HMV-2はX線・陽子線には抵抗性であるが、炭素線には感受性があることが明らかとなった。2.照射による細胞およびコロニーの形態変化の評価上記コロニー形成法を行う過程で、我々は照射後の細胞および形成されるコロニーの形態が、線種によって異なることに気付き、ダメージの度合いによって4グレード(G1:正常G4:高ダメージ)に分類し、評価した。その結果、臨床での治療線量に近いX線/陽子線2Gy・炭素線1Gyでは、X線に比べて陽子線・炭素線ではG4の割合が非常に高くなるが、高線量であるX線/陽子線6Gy・炭素線3Gyでは、線種間でのグレードの割合の差が小さくなることが分かった。3.本年度の研究の意義炭素線治療の粘膜悪性黒色腫に対する有用性が基礎的にも示された。治療線量の照射において、陽子線・炭素線は同一線量のX線よりも細胞にダメージを与えている可能性が高い。1.照射による細胞老化の評価前年度に得られた研究成果である「線種による照射後の細胞および形成されるコロニーの形態の差異」が細胞老化(senescence)によるものではないかと考えた我々は、細胞老化マーカーとして知られる細胞老化関連ベータガラクトシターゼ(SA-β-gal)にて照射後培養細胞(HSG:唾液腺癌)を評価した。X線・陽子線・炭素線いずれの線種においても、線量依存性にSA-β-gal発現の上昇を認めたが、線種による差異は明らかではなかった。2.照射による活性酸素種発生の比較次に我々は、線種による活性酸素種発生の違いが「線種による照射後の細胞および形成されるコロニーの形態の差異」に関連しているのではないかと考えた。活性酸素種は放射線の生物効果において重要な役割を演じているが("間接効果"と呼ばれる)、生物効果全体におけるその割合は線種によって異なる。まず、照射単独における活性酸素種発生を測定したところ、X線>陽子線>炭素線であり、発生量は線量依存性に増加した。これは従来から言われている低LET(線エネルギー付与)放射線の方が間接効果の割合が高いという考えと一致するものである。次に抗酸化物質であるN-アセチルシステイン(NAC)併用下での活性酸素種発生を評価した。いずれの線種においてもNAC 300μMを併用することで照射による活性酸素種発生はほぼ抑制された。よって、NAC 300μM併用下での照射効果は、活性酸素種の関与しないいわゆる"直接効果"と考えることができると思われたため、WST-8アッセイにて照射後の細胞生存率を評価したが、HAC併用の有無で明らかな差は見られなかった。3.本年度の研究の意義線種による生物効果の差異として、細胞老化および活性酸素種発生に着目したが、明らかな関連をみいだすことはできなかった。今後、活性酸素種について別のアプローチを行う予定である。【内容】前年度、我々は「照射単独における活性酸素種(ROS)発生はX線>陽子線>炭素線」であり、「N-アセチルシステイン(NAC) 300μM併用で照射によるROS発生はほぼ抑制される」という重要な研究成果を得たが、細胞生存率の差につながる成果は得られなかった。そこで、照射によるROS発生は持続的であり、一時的なNACによるROS抑制では細胞生存率に影響を及ぼさないのではないかと考えた。

まず、照射単独における照射67日後のROS発生を測定したところ、非照射細胞と比べて3.33.8倍であった(線種間で有意差なし)。一般的に照射によるROS発生は一時的と考えられているので、これは照射後の細胞が持続的にROSを発生させているということを示した新しい知見である。次に、照射時培養期間中にNAC 300μMを持続的に作用させることによりROSの発生を2.22.4倍まで抑制することができた(線種間で有意差なし)。さらに、NACの濃度を3mMに上げて同様の実験を行ったところ、ROSの発生を1.31.5倍に抑制することができた(線種間で有意差なし)。この結果を受けて、照射時培養期間中にNAC 1mMおよび3mMを持続的に作用させた状態でコロニー形成法にて細胞生存率を評価した。NAC用量依存性に細胞生存率の上昇が見られ、X線・陽子線・炭素線の殺細胞効果におけるROSの重要性が示唆された。尚、細胞生存率上昇の程度は、1mMでは線種間で差は見られなかったが、3mMでは陽子線の上昇の程度が大きかった。この理由についてはさらなる研究が必要である。【意義・重要性】照射によるROS発生は一時的ではなく、持続的であるという新しい知見が得られた。また、ROS発生を持続的に抑制することで、細胞生存率が上昇することが分かり、NACが放射線(粒子線)防護剤として臨床応用できる可能性が示唆された。
急性心筋梗塞症患者が安静度を保持するために効果的な看護援助の方法に関する研究

AMI急性期における安静度に対して、患者は「医師や看護師に言われたことだからしかたない」「回復するために必要である」「痛みや疲労のため考えられない」「どうすることがいけないのかわからない」といった受けとめをしていた。患者が意図的に安静度を保持することを阻害する要因としては、「腰痛・不眠など安静度保持に伴う身体的苦痛があること」「点滴や酸素吸入など治療上必要なライン類に伴う苦痛があること」「臥床による食事や排泄など日常生活行動の規制による苦痛があること」「安静度外行動にあたるものを認識していないこと」「看護に何を要求してよいかわからないこと」などがあり、それに自ら対応した結果、安静度外行動をとる傾向がみられた。患者が意図的に安静度を保持するために効果的であると感じた看護援助には、上記の苦痛を緩和する援助に加え、「安静度の具体的な行動レベルでの説明」「即時対応」「親切な態度」などがあげられた。AMI急性期における安静度外行動防止の看護援助について、看護師は「安静度に関する理解不足による行動を防止するために安静度を説明する」「身体的苦痛による行動を防止するために苦痛緩和に努める」「行動制限による精神的苦痛に関して傾聴し、制限緩和の目安を伝える」「理解の得られない場合は監視を強化し、必要時は鎮静剤などを用いて生命維持を優先する」といった行動をとっていた。また、患者が苦痛に対して自己対処する前に関われた場合、看護援助が効果的にはたらく傾向があった。一方、患者が意図的に安静度を保持するのに効果的であったかどうかについては、患者の意図的な行動であったかどうかより安静度外行動があったかどうかにおいてなされている傾向がうかがわれた。1.AMI急性期における安静度に対する患者の受けとめ、患者が意図的に安静度を保持することを阻害する要因、及び患者が意図的に安静度を保持するために効果的・非効果的と感じた看護援助に対する面接調査(継続)AMI急性期における安静度に対して、患者は「医師や看護婦に言われたことだからしかたない」「回復するために必要である」「痛みや疲労のため考えられない」「どうすることがいけないのかわからない」といった受けとめをしていた。患者が意図的に安静度を保持することを阻害する要因としては、「腰痛・不眠など安静度保持に伴う身体的苦痛」「点滴や酸素吸入など治療上必要なライン類に伴う苦痛」「臥床による食事や排泄など日常生活行動の規制による苦痛」「安静度外行動にあたるものを認識していないこと」「看護婦に何を要求してよいかわからないこと」があり、それに自ら対応した結果、安静度外行動をとる行動がみられた。患者が意図的に安静度を保持するために効果的であると感じた看護援助には、上記の苦痛を緩和する援助に加え、「安静度を具体的な行動レベルで説明してくれること」「ナースコールの対応が早いこと」「親切に対応してくれること」また、非効果的であると感じた看護援助には、「苦痛の大きいときに説明されること」などがあげられた。2.AMI急性期における安静度外行動防止の看護援助を、看護者はどのように考え実施しているかに対する面接調査(継続)以上のデータより、AMI急性期において患者が意図的に安静度を保持するために効果的な看護援助の方法について検討を行っている。
ヒト角膜におけるKチャンネルのアラキドン酸による制御機構

平成11年度には、主に、従来の新鮮ウシ角膜上皮におけるKチャンネルの研究を継続し行った。特にアラキドン酸などの脂肪酸による電位依存型Kチャンネルの抑制および持続型外向き整流K電流の活性増大について詳細に調べた。アラキドン酸類似の作用を有する脂肪酸にはパルミトオレイン酸やリノールライディン酸などがある。一方、オレイン酸のようにアラキドン酸類似作用がない脂肪酸もある。これらに関しては、論文をInvestigative Ophthalmology & Visual Scienceに投稿中である(平成12年10月に初版投稿、現在、改訂版審査中)。また、平成1112年度において、円錐角膜の角膜移植に際し新鮮ヒト角膜上皮細胞を得る機会があり、Kチャンネル由来のK電流を記録した。新鮮ヒト角膜上皮細胞で初めて、アラキドン酸により活性化されるKチャンネルが発現していることを確認した。その結果の一部は、平成12年4月の第104回日本眼科学会総会にて発表した。上記の新鮮単離細胞を用いた実験に平行して、平成12年度には、ヒト角膜上皮培養細胞での実験を行った。すなわち、組織培養のシステムを整え、ヒト角膜上皮培養細胞を購入し、解凍してからの初代および2代目の培養細胞において、K電流の特性を調べた。その結果、新鮮ウシや新鮮ヒト角膜上皮にも発現しているフェナメート感受性Kチャンネルが確認された。今後、このヒト角膜上皮培養細胞を用いて、同Kチャンネルの制御機構や構造につき調べる予定である。平成11年度には、従来のウシ角膜上皮Kチャンネルの研究を継続し行った.特にアラキドン酸などの脂肪酸による電位依存型Kチャンネルの抑制および持続型外向き整流K電流の活性増大について詳細に調べた.アラキドン酸類似の作用を有する脂肪酸にはパルミトオレイン酸やりノールライディン酸などがある。これに関しては目下論文発表の準備中である。また円錐角膜の角膜移植に際し新鮮ヒト角膜上皮細胞を得る機会があり、Kチャンネル由来のK電流を記録した.新知見としては、アラキドン酸により.活性化される電位依存型Kチャンネル(ウシでは抑制される)が発現していることが判明した。これに関しては、平成12年4月の日本眼科学会総会にて発表する予定である.上記の新鮮単離細胞を用いた実験に平行して、組織培養のシステムを整え、ヒト角膜上皮培養細胞(商品購入が可能なもの)の継代培養を試みた.購入後解凍してからの初代の細胞増殖には成功したが、2代目の増殖が芳しくなく、パッチクランプの実験にまでは至っていない.平成12年度には同様に培養を試み、良好な細胞が得られれば、これまでのウシやヒトの新鮮細胞の結果を参考にして培養角膜上皮Kチャンネルの特性を調べる.培養細胞による実験が常識順調に行えるようになれば、分子生物学的手法を用いて、Kチャンネルの同定さらには上皮増殖とチャンネル発現との関係についても研究する予定である.平成11年度には、主に、従来の新鮮ウシ角膜上皮におけるKチャンネルの研究を継続し行った。
定応力拡大係数試験によるチタン基繊維強化複合材の疲労中の繊維劣化機構の解明

SiC繊維強化Ti基複合材料は高強度、高弾性率のため、次世代の航空宇宙用材料として注目されている。航空宇宙用材料は使用時に繰返し応力負荷を受けるため、その実用化には疲労挙動の解明が不可欠である。しかし、繊維強化基複合材料の疲労き裂伝播挙動は複雑で、加えた応力拡大係数に対してき裂の伝播速度が一定せず、再現性が乏しいことが問題となっている。これは、通常一定荷重振幅で試験を行っているため、母相のき裂長さの増加による応力拡大係数の上昇と繊維のブリッジングによる有効応力拡大係数の低下との微妙なバランスによって、き裂の進展が停止することや、試験片が破壊することがあるためである。そこで本研究では、一定応力拡大係数幅で疲労き裂伝播試験を行い、疲労き裂の進展挙動を測定した。また繊維の劣化に対する温度、環境の効果を調べるため、試験を室温および450°C、大気中および真空中で行った。その結果、き裂が進展し破壊に至るか、き裂が停止するかの閾応力拡大係数幅は再現性良く測定された。また、450°C大気中、応力周波数1Hzでは、き裂はほぼ一定速度で伝播し、その途中で規則的にき裂伝播速度が1桁以上低下する現象が観察された。この伝播速度が現象する間隔は、ほぼ繊維の間隔に等しかった。これらの結果より、以下のことが明らかとなった。1.繊維強化複合材料であっても、基本的には応力拡大係数幅が一定ならば母相のき裂伝播速度は一定であり、繊維によりブリッジングが起きている間はき裂伝播速度が低下する。2.さらに同一振幅の負荷をかけていると、繊維が劣化、破壊し、以前と同じ速度でき裂が進展する。3.この繊維の劣化は、低温より高温、真空中より大気中でより顕著である。4.き裂伝播、ブリッジング、繊維の劣化、繊維の破壊という過程を繰り返しながら、き裂が伝播していく。
脳グリコーゲン代謝と新生児仮死の神経学的予後予測：バイオマーカー探索と臨床応用

新生児仮死は周生期の一定頻度で起こる事象である。重篤な神経後遺症として脳性麻痺などを含む中枢神経障害を残すことがあり、障害児医療を考えるうえで重要な、そして解決すべき課題である。本研究の予備研究を踏まえ、新生児仮死を経験しながら正常に発達する群(N群)と神経後遺症を残す群(A群)との間で、緊急時のエネルギー産生機構である嫌気性解糖に関わる酵素群の発現に、差異がないかを検討した。特に嫌気性解糖の鍵となる酵素であるホスホリラーゼ遺伝子多型に注目した。本研究では:1この2群におけるホスホリラーゼ遺伝子多型の差異が神経予後を予測しうる新たなバイオマーカーとして有用かどうか、2遺伝子多型が低酸素下で脳エネルギー代謝にどのような影響を及ぼすのかを明らかにし、ホスホリラーゼ活性賦活作用のあるビタミンB6を脳保護目的のためのオプション治療として臨床応用へ展開する可能性についての研究基盤を確立することを目的としている。本年度では新生児仮死を経験した対象症例の収集の継続と(現在40症例を検索中)、同意を得たうえで検体採取に際して侵襲の少ない頬粘膜、あるいは唾液を試料として収集した。得られた試料よりgenomeDNAを抽出し遺伝子多型の特定、臨床症状との比較検討、統計学的検討を継続している。また病態基盤の基礎的検討のためホスホリラーゼ遺伝子の複数の遺伝子多型を挿入したプラスミドDNAの作成を行い、HEK293細胞に変異プラスミドDNAを導入し、ホスホリラーゼ酵素活性の発現を検索し、定常の酸素下では活性に変わりがないことを確認した。今後は実験的低酸素状態下での酵素活性の発現状況について各遺伝子多型ごとに次年度検討する予定である。現在までに約40名の対象者の分析を終了した。症例収集がやや遅れている事が研究計画が「やや遅れている」原因である。次年度ではさらに症例収集について配慮するとともに資料収集も併せて行ってゆく。また嫌気性解糖に関わる鍵となる酵素はホスホリラーゼ以外にも脳に発現しており、今後検討をホスホリラーゼ以外の嫌気性解糖の酵素群にも広げる可能性もある。細胞レベルでは当該遺伝子の遺伝子多型を含むプラスミッドDNAの作成が終了した。今後病態基盤をHEK細胞を用いて低酸素状態での動態を観察する予定である。本年度の研究成果を基に、ホスホリラーゼ遺伝子多型、および嫌気性解糖に関わる酵素群の遺伝子多型を合わせて検討し、新生児仮死の予後を予測するバイオマーカーとして位置づけられるかを評価する。同時にその病態基盤を明らかにした後、ビタミンB6の臨床応用に展開するための基盤となる研究を行う。成果によって、実際の新生児仮死脳に対するレスキューとして一つのオプションの治療として確立できるか調査を行う。本年度は研究計画に沿って次の計画を実施した。(1)症例の収集とPYGB多型の解析:対象の条件として未熟児、成熟児出生で新生児仮死を経験し3年以上追跡できた症例で出生5分後Apgarscoreが7点以下のものとする。奇形、染色体異常、代謝異常など明らかな基礎疾患が見られるものは除外する。脳性麻痺などの中枢神経後遺症を残した群(Abn群)と、対象として同程度の仮死がありながら発達が正常な群(Nor群)の2群に分類して症例を収集した。現在までに脳性麻痺群(仮死に起因する)の症例を20例、DNA分離のための唾液を収集できている。累積では脳性まひ児約40例となっている。(2)遺伝子多型検索:唾液よりDNAを抽出し、脳型ホスホリラーゼ遺伝子(PYGB)について、特に予備実験でNor群とAbn群との間に見出した相違について検討を進めている。同時に約100例の正常対照群のDNAを用いて比較検討しその意義づけを行っている。正常対照群のDNAは財団法人ヒューマンサイエンス振興財団ヒューマンサイエンス研究資源バンク(HSRRB)から日本人由来B細胞株抽出精製DNAの分譲を受けこれを利用した。(3)PYGB遺伝子の組み換え実験:常葉大学遺伝子組み換え実験委員会に遺伝子組み換え実験の申請を行い承認された(承認番号(第2017-004号)。承認後必要な試薬の購入を進め、今後PYGBの変異を組み込んだ培養細胞を用いて脳型ホスホリラーゼの様々な条件下での動態を検討する準備を整えてゆく。本年度の計画である症例収集については、協力施設の協力によりほぼ順調に症例が収集できた。今後唾液からDNAを抽出し多型を調べる予定である。これにより従来のものも含め総数が約40例ほどとなり、比較検討するにほぼ満足できる症例数と考えられる。また基礎実験として予定していた、遺伝子組み換え実験については大学内の手続きが終了し、実験計画が承認され、試薬などの購入もほぼ完了し、次年度に向けて基礎実験の準備も整った。このように本年度の計画としてはおおむね順調に進んでいる。本研究では:

1この2群におけるホスホリラーゼ遺伝子多型の差異が神経予後を予測しうる新たなバイオマーカーとして有用かどうか、2遺伝子多型が低酸素下で脳エネルギー代謝にどのような影響を及ぼすのかを明らかにし、ホスホリラーゼ活性賦活作用のあるビタミンB6を脳保護目的のためのオプション治療として臨床応用へ展開する可能性についての研究基盤を確立することを目的としている。本年度では新生児仮死を経験した対象症例の収集の継続と(現在40症例を検索中)、同意を得たうえで検体採取に際して侵襲の少ない頬粘膜、あるいは唾液を試料として収集した。得られた試料よりgenomeDNAを抽出し遺伝子多型の特定、臨床症状との比較検討、統計学的検討を継続している。また病態基盤の基礎的検討のためホスホリラーゼ遺伝子の複数の遺伝子多型を挿入したプラスミドDNAの作成を行い、HEK293細胞に変異プラスミドDNAを導入し、ホスホリラーゼ酵素活性の発現を検索し、定常の酸素下では活性に変わりがないことを確認した。今後は実験的低酸素状態下での酵素活性の発現状況について各遺伝子多型ごとに次年度検討する予定である。現在までに約40名の対象者の分析を終了した。症例収集がやや遅れている事が研究計画が「やや遅れている」原因である。次年度ではさらに症例収集について配慮するとともに資料収集も併せて行ってゆく。また嫌気性解糖に関わる鍵となる酵素はホスホリラーゼ以外にも脳に発現しており、今後検討をホスホリラーゼ以外の嫌気性解糖の酵素群にも広げる可能性もある。細胞レベルでは当該遺伝子の遺伝子多型を含むプラスミッドDNAの作成が終了した。今後病態基盤をHEK細胞を用いて低酸素状態での動態を観察する予定である。仮死状態により個体による中枢神経系の脆弱性の差について、臨床面と基礎実験を用いた病態の解明の両面から病態を明らかにする。(1)遺伝子検索の継続平成29年度に開始したPYGBの検索について症例をさらに蓄積し検索を継続する。(2)神経予後推定の遺伝子バイオマーカーの意義付けと検証:収集した臨床情報、唾液から抽出したDNAの遺伝子情報の結果を解析し、神経後遺症罹患リスクをもつ個体に関連する有力な遺伝子バイオマーカーを探索する。有力な遺伝子バイオマーカーが確立できた場合は、バイオマーカー候補のハイスループットな測定法の確立をめざす。またPYGB遺伝子の機能を検討するために、GeneScriptよりpcDNA3.1+発現ベクターに遺伝子バイオマーカーを導入したものを購入し、HEK293細胞で発現機能評価を行う。以上の臨床データと基礎データを基盤として仮死に起因する脳性麻痺リスク児の早期介入フォローアップ体制の構築を検討してゆく。本年度の研究成果を基に、ホスホリラーゼ遺伝子多型、および嫌気性解糖に関わる酵素群の遺伝子多型を合わせて検討し、新生児仮死の予後を予測するバイオマーカーとして位置づけられるかを評価する。同時にその病態基盤を明らかにした後、ビタミンB6の臨床応用に展開するための基盤となる研究を行う。成果によって、実際の新生児仮死脳に対するレスキューとして一つのオプションの治療として確立できるか調査を行う。(理由〉今年度は症例の収集および遺伝子組み換えによる発現実験の準備のため、試薬類の購入が予定を下回った。
腸内細菌叢解析による骨粗鬆症のメカニズム解明と新治療開発の試み

本年度は既報で広く用いられている卵巣摘出による骨量減少モデル動物(OVXマウス)を用いて腸内細菌の変化を明らかとした。既報通りマイクロCTを用いて大腿骨の骨密度を計測したところ、OVXマウスはコントロールマウスに比べて、骨密度の低下が認められた。同OVXマウスとコントロールマウスで腸内細菌叢を比較したところ、小腸細菌叢の違いは軽微であったが、大腸細菌叢の違いはαDiversityおよびβDiversityの双方で有意であった。Phylumレベルの検討では、小腸大腸共にFirmicutesが再優性の菌種であり、Bacteroidetesが2番目に優性な細菌種であった。大腸細菌叢ではOVXマウスではコントロールマウスと比較しActinobacteriaの上昇をみとめた。小腸細菌叢の変化は有意差にとどかなかった。Genusレベルの検討では、小腸、大腸ともに有意差をもって変化している菌種が複数存在し、骨塩量に影響している細菌叢の候補があきらかとなった。現在、この細菌叢が骨塩量に影響をあたえているのか、OVXによる結果であるのかを確かめるために、小腸便、大腸便それぞれを抗生剤処理後のマウスに移植するいわゆる便移植の実験を遂行中である。同時に、本研究において腸内細菌がどのように骨塩量に影響を与えているかを明らかにするために、血清を用いた骨塩量マーカの計測や骨、および腸管に対する免疫組織学的検討も施行中である。基礎研究で、マウスを用いた骨粗鬆症と腸内細菌の関連をあきらかにする検討が進んでおり、結果の一部が出ている状態であるため。基礎研究マウスOVXモデルマウスでの結果を遂行するとともに他の骨粗鬆症モデルマウスを用いて同様の結果が得られるかを検討する予定としている。また、腸内細菌のどの部分が骨塩量に影響を与えているかを明らかとする方針である。ヒト腸内細菌の至適部位の検索と、以後の研究の進展のために、まず最初に生検組織よりの腸内細菌叢の解析が可能であるかの検証と、各消化管部位における腸内細菌叢の変遷の検討を行った。検体としては当院で小腸内視鏡を施行した患者における生検組織を用いた。採取した後、複合酵素法でDNAを抽出PCR後、16SrDNA解析を行った。得られた配列データは情報学的解析(Operational Taxonomic Unit解析)を介して細菌叢の菌種組成を明らかにした。小腸内視鏡にて採取した生検検体では、ほとんどのサンプルが増幅可能であり各部位での細菌叢検討が可能であることが明らかとなった。しかしながら、食道、胃などの上部消化管のサンプルでは増幅効率が下部消化管のサンプルに比較して悪く、結果としてPCR増幅不能なサンプルが上部消化管では下部消化管に比して多かった。結果としては消化管すべての部位でFirmicutesが最も優勢であり、Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteriaの4種で95%以上を占める結果となった。また、小腸と大腸では細菌叢の傾向が異なっており、大腸ではBacteroidesが占める割合が小腸に比べて増加していた。また、すべての部位で個々人の細菌叢の差は大きく今後の研究で個人差をどのように解決するかが重大な問題になると予測された。以上を考えるとやはり、小腸もしくは大腸のサンプルを用いた検討が本研究では必要ではないかと考えられる。マウスを用いた基礎実験は現在のところモデル作成段階であり、結果は未だでていない。基礎実験ではモデル作成に時間がかかるため。また臨床検体は事前条件検討に時間がかかっているため。今回の得られた臨床知見を更に検証し、条件設定をすすめていく。また、基礎実験ではこのまま検討を継続する。

基礎研究マウスOVXモデルマウスでの結果を遂行するとともに他の骨粗鬆症モデルマウスを用いて同様の結果が得られるかを検討する予定としている。また、腸内細菌のどの部分が骨塩量に影響を与えているかを明らかとする方針である。現在計画より少し遅れており、次年度に合わせて実験を進める予定である。基礎実験をおこなっており、経費のかかる実験が次年度に繰り越しになったため。
ナノ粒子を使った、甲状腺癌の高精度・高感度・迅速診断法の開発

本研究は、甲状腺癌を特異的に認識するIgM抗体(JT95抗体)とナノ粒子を組み合わせることで、癌抗原の検出感度を飛躍的に高め、血液検査による甲状腺癌の診断法の開発、及び穿刺吸引細胞診の更なる精度向上を目的としている。ナノ粒子を使った検出法を構築するため、「抗体-ナノ粒子による1ステップ抗原検出法」の新規開発を行うと共に、抗原抗体反応の最適化条件を検討した。現在、本研究成果を活用した検査法の実用化に向けて臨床研究が進められており、血液からの癌抗原の検出精度を検討している。将来的に、患者サンプルによる診断試験を行ない、臨床における有用性を検証、患者負担の少ない腫瘍検査法を開発する事を目指している。当該年度は、診断を迅速に行う検出法「抗体-ナノ粒子による1ステップ抗原検出法」の開発のため、蛍光ナノ粒子(量子ドット)とJT95抗体を直接結合させる条件を、架橋試薬による結合法とビオチン-ストレプトアビジンを介した結合法で検討した。本検討から、直接結合法によって、SW1736甲状腺癌細胞株の免疫染色、ウエスタンブロッティング法による検出、及びELISA様法に応用できることを見出した。しかしながら、IgM抗体は分子量が大きく、量子ドットと反応させた際に一部凝集し、収率が落ちてしまう傾向が見られた。現在、収率の向上、感度の増強を目的に、JT95抗体をペプシン等で酵素処理して細分化し、これらと量子ドットとの結合に取り組んでいる。また、磁性ナノ粒子とJT95抗体を結合させた抗原検出法の開発も進めており、結合の確認や甲状腺癌抗原との反応性を検討している。これらの研究成果の一部を、平成22年度がん若手研究者ワークショップ、及び第53回日本甲状腺学会学術集会で発表した。将来的に、患者サンプルによる診断試験を行ない、臨床における有用性を検証、患者負担の少ない腫瘍検査法を開発する事を目指してきた。当該年度は、ナノ粒子を使って効果的な検出を行なうため、その前段階である(1)JT95抗体の認識効率向上に向けた検討、(2)サンドイッチELISA法を使った抗原検出法の構築、及び(3)抗原糖鎖構造の推定について検討を行なった。(1)認識効率の向上に向けた検討では、スペーサー付きのビオチンをJT95抗体へ導入すると共に、ビオチン化反応比を詳細に検討し、最も効率の良い反応条件を見出した。また、(2)抗原検出法の構築では、JT95抗体と種々のファイブロネクチン(癌胎児性ファイブロネクチン、血漿ファイブロネクチン、または細胞型ファイブロネクチン)を認識する抗体を組み合わせたサンドイッチELISA法を検討し、JT95抗体同士を組み合わせた手法が最も抗原の検出に適していることを見出した。更に、(3)抗原糖鎖構造の推定では、甲状腺未分化癌細胞(SW1736)の可溶化物から糖鎖を単離し質量分析を行なった。その結果、alpha2-6/2-3のシアル酸構造が多く検出されており、JT95抗体がこれらの糖鎖構造を認識している可能性が示唆された。現在、これらの研究成果を用いた臨床研究が進められており、血液からの抗原検出法の精度を検討している。今後、ELISA法による検出とナノ粒子による検出とを比較し、精度・感度を検証、より良い腫瘍検査法の構築を進めていく。
ニューロンオペラントコンディショニングを用いた細胞集団活動の適応的変化の数理基盤

麻酔したネコ視覚皮質から同時記録した多細胞データに多次元ガウスモデルを適用し、視覚提示された運動するバー刺激の方位(16種の方位)推定を行った。細胞間の発火数相関の刺激依存性をも取り入れたモデルの有効性を検証したところ、得られたデータの試行数が限られるために、モデルパラメータが多すぎて、過学習を生じるため、適切な推定が出来ないことが判明した。主成分分析や多重判別分析などにより特徴次元圧縮を行った後に多次元ガウスモデルを適用することで有効な推定結果を得られることが分かった。これらの解析はブレインマシンインタフェースでのディコーディングにおいて有効である。ミニチュアマニピュレータを内蔵し、各tetrodeを独立にミクロン精度で刺入深度を調整可能なtetrode電極配列を開発した。また、皮質活動(局所脳波)に含まれるガンマ波成分のパワーに応じてリアルタイムで報酬を与えるクローズド・ループ・フィードバックシステムを完成した。開発したtetrode配列電極をラット視覚皮質に埋め込み、覚醒行動下での慢性記録を開始し、視覚皮質から記録される局所脳波のガンマ波パワーの上昇をターゲットとしたニューロンオペラントコンディショニング実験を開始した。赤外線カメラを用いて頭部固定下覚醒ネコの視線計測を行うシステムを開発した。ネコ視覚皮質の細胞活動を用いたニューロン・オペラントコンディショニング実験の実施に向けて注視課題訓練を完了した。実験データの解析結果が当初の予想に反していたため、その原因の究明に多くの時間を費やす必要があった。結果として、原因の究明および新たな理解が得られたため、有意義な研究を実施することが出来た。この事情により、成果の学会発表および学術論文発表のスケジュールが遅れた。また、皮質から記録される局所脳波のガンマ波パワーの強度に対してリアルタイムで報酬を与える制御システムの開発に予想以上の時間を要したため実験開始が遅れた。このシステムは完成して、実験を開始している。ネコ視覚皮質から記録した多細胞データから刺激方位を推定するモデルに関しては成果をまとめ、学会発表および学術論文の発表を行う。ニューロン・オペラントコンディショニングは、ラットの視覚皮質活動を用いたガンマ波パワーの強化をターゲットとした実験を継続し、クローズド・ループ・フィードバックシステムによる神経活動のvolitionalな制御が可能であるかどうかを検証する。ラットを用いた実験結果を検討し、必要な改善を行った後にネコ視覚皮質の細胞活動を用いたニューロン・オペラントコンディショニング実験に早期に移行する計画である。伊藤と森(研究員)は視覚皮質での細胞集団活動をターゲットとしたNeuron Operant Conditioning実験のために、注視課題訓練システム、視線計測システム、記録用埋め込み電極の開発を行い、実際の記録実験の準備を進めた。具体的には、開発した注視課題訓練システムを用いて、覚醒ネコ2匹に対して訓練を開始した。また、頭部を固定するためのヘッドポストの装着を行った。さらに、頭骨内に収まる微小サイズの記録用電極マニピュレータの開発を検討し、試作品の作成を行った。伊藤と圓山(連携研究者)は配列型電極を用いたネコ視覚皮質からの多細胞活動データを解析し、同時記録された細胞の方位選択性の分布をcircular varianceを用いて定量化した。Optical imagingで記録されたOrientation mapデータを元にしたシミュレーション記録実験を合わせて行い、実際の生理実験データとの統計比較を行った(論文発表Maruyama and Ito, 2017)。視覚皮質では異なる方位選択性の細胞が皮質表面上で空間的に分布しているが、pinwheelと呼ばれる構造の周辺では、異なる方位選択性細胞が密に分布している。このため、空間的な局所において多数の細胞を同時記録できるtetrode電極からなる配列電極の方が、多数のmicroelectrodeを密に配列させた電極よりも効率的に異なる方位選択性細胞の活動を記録できることが判明した。この結果から視覚皮質におけるNeuron Operant Conditioning実験においても、tetrode電極からなる配列型電極を利用することになった。伊藤と圓山(連携研究員)は視覚皮質での多細胞活動記録において異なる方位選択性を持つ細胞を出来るだけ均一に記録するための配列型電極の開発のために、麻酔下ネコの視覚皮質から2種類の配列型電極による多細胞活動同時記録を行い、データの統計比較結果を論文発表することが出来た(Maruyama and Ito, 2017)。この技術は、視覚皮質での細胞集団活動をターゲットとしたNeuron Operant Conditioning実験に活かされる。伊藤と森(研究員)が実施する視覚皮質での細胞集団活動をターゲットとしたNeuron Operant Conditioning実験のために、覚醒ネコの注視課題訓練システムを開発し、2匹のネコに対して訓練を行った。頭部を固定するためのヘッドポストの装着および赤外線カメラによる視線位置計測システムの開発も合わせて行った。注視課題訓練システムの開発に当初の計画以上の時間を要したが、視覚皮質への埋め込み電極によるNeuron Operant Conditioning実験を開始する準備は整った。伊藤は池田(京大医学部)が主催したHigh Frequency Oscillation (HFO)に関するミニシンポジウムに参加して、ネコの外側膝状体で伊藤が記録した多細胞データにおけるhigh gamma帯域での同期振動発火現象の統計解析結果を紹介し、てんかん患者で観測されるHFOとの関連を議論した。伊藤と森(研究員)は視覚皮質での細胞集団活動をターゲットとしたNeuron Operant Conditioning実験の立ち上げに従事してきた。2016年度は視線計測システム、記録用埋め込み電極、頭部を固定するためのヘッドポストの開発を行った。2017年度はこれらの開発を更に進め、実験で有効なシステムを完成させた。

視線計測システムはヒト・サル用に設計された赤外線カメラ画像の画像解析による非侵襲型であるが、実験で使用するネコの瞳孔のサイズおよび形状がサルと大きく異なっているために正確な視線をトラッキングすることが難しかった。画像処理でのパラメタの変更やカメラ画像のピントをぼかすなどの工夫で、十分な精度での視線トラッキングに成功した。記録用埋め込み電極は4本のtetrode電極を皮質に刺入し、電極チェンバーを頭骨に固定することで慢性記録の実現を行う。長期に渡る実験において、電極刺入深度を自由に変更できることが望ましいが、従来の方法では精度の悪いネジを用いるか精度の高い大型ステッピングモータに接続する必要があった。我々は、米国New Scale社が開発した超小型のステッピングモータを用いて電極マニピュレータを開発することで、電極チェンバー内にステッピングモータ部を常設することを可能とし、電極深度の変更のためにはモータコントロール用のケーブルを接続するだけでよい。この小型電極マニピュレータの完成により、容易かつ高精度に電極深度の変更が可能となった。頭部を固定するためのヘッドポストは頭骨との生体親和性からチタン製のチェンバーを3Dプリンタで製作し、チタン製ネジで頭骨に固定した。固定して半年以上を経過するが安定してヘッドポストを支えている。現在は、1匹目のネコに注視課題を訓練しており、Neuron Operant Conditioning実験の開始準備は整ったため、2018年度は本格的な細胞記録実験を行う。伊藤と圓山(連携研究員)は視覚皮質での多細胞活動記録において異なる方位選択性を持つ細胞を出来るだけ均一に記録するための配列型電極の開発のために、麻酔下ネコの視覚皮質から2種類の配列型電極による多細胞活動同時記録を行い、データの統計比較結果をNeuroscience Research誌に論文発表し(Maruyama and Ito, 2017)、日本神経科学会での発表も行った(Maruyama and Ito, 2017)。この技術は、視覚皮質での細胞集団活動をターゲットとしたNeuron Operant Conditioning実験に適用する。また、この多細胞活動データを高橋、三浦(関西学院大学)と共同研究し、発火率の非定常性変動に伴うirrelevantな細胞間の発火数相関を除外し、神経活動に起因するrelevantな発火数相関のみを評価する統計的手法を開発し、日本神経科学会での発表を行った(Takahashi et al., 2017)。
光ネットワーク特性を考慮した高性能光グリッド環境の構築に関する研究

本研究は,光ネットワーク特性を考慮した高性能光グリッドの環境の構築を目的としている.光ネットワークでは一般に,データ伝送時において,伝送に使用する波長の競合が頻繁に発生するため,波長競合の回避は重要な課題の一つであり,光グリッドにおいても例外ではない.本研究では,波長競合を効果的に回避し高性能な光グリッド環境を構築するための主要な課題を提起し,それらを解決するための複数の手法を提案した.また,シミュレーション実験を用いて,これらの手法が効果的に波長競合を抑制し,光グリッドの計算処理性能を高めることを示した.本研究は,光ネットワーク特性を考慮した高性能光グリッドの環境の構築を目的としている.光ネットワークでは一般に,データ伝送時において,伝送に使用する波長の競合が頻繁に発生するため,波長競合の回避は重要な課題の一つであり,光グリッドにおいても例外ではない.本研究では,波長競合を効果的に回避し高性能な光グリッド環境を構築するための主要な課題を提起し,それらを解決するための複数の手法を提案した.また,シミュレーション実験を用いて,これらの手法が効果的に波長競合を抑制し,光グリッドの計算処理性能を高めることを示した.本研究は,光ネットワーク特性を考慮した高性能光グリッドの環境の構築を目的としている.光ネットワークでは一般に,データ伝送時において,伝送に使用する波長の競合が頻繁に発生するため,波長競合の解決は重要な課題の一つであり,光グリッドにおいても例外ではない.本研究では,ネットワーク内での波長競合が光グリッドの計算処理性能に与える影響について検討を行い,高性能な光グリッド環境を構築するための主要な課題を提起し,それらを解決するための手法を段階的に提案している.まず,本年度は光グリッドにおけるファイル配置法に注目した.光グリッドでは,効率的なデータ伝送を行うために,計算に使用するファイルが,複数のサーバに地理的に分散されて保存され,並列的にダウンロードされることが想定されている.本年度は,このファイル配置方法について検討を行い,ネットワークコーディングと呼ばれる符号化方式を利用し,符号化したファイルをサーバに配置することで,波長競合を効果的に回避し,並列ダウンロードの効率を高める手法を提案した.本年度はシミュレーション実験を用いて,提案手法が光グリッドにおいて効果的に波長競合を抑制することを示した.また,この研究成果を電子情報通信学会ネットワークシステム研究会において2度発表した.加えて現在,国際会議に投稿中である.今後の課題として,本年度で提案したファイル配置手法を背景に,どのサーバを選択し,どの波長を使用してデータ伝送を行うことで,より効果的に波長競合を回避できるかを検討する必要がある.本研究は,光ネットワーク特性を考慮した高性能光グリッドの環境の構築を目的としている.光ネットワークでは一般に,データ伝送時において,伝送に使用する波長の競合が頻繁に発生するため,波長競合の解決は重要な課題の一つであり,光グリッドにおいても例外ではない.本研究では,高性能な光グリッド環境を構築するための主要な課題を提起し,それらを解決するための手法を段階的に提案した.まず,前年度において提案した光グリッドにおけるファイル配置法の成果をまとめた.この成果を国際会議において発表した.また,論文誌への投稿を行い,その掲載が決定した.次に本年度は,光グリッドにおける複製選択手法を提案した.光グリッドでは,効率的なデータ伝送を行うために,ファイルの複製が,複数のサイトに分散されて保存される.効果的なファイルのダウンロードを行うためには,どの複製を選択するかが非常に重要である.本研究では,光グリッドの性能を効果的に向上させるために,波長競合を考慮した複製選択手法を提案した.加えて本年度は,光グリッドに流れるトラヒックの種別を考慮した波長予約手法を提案した.光グリッドを流れるトラヒックには,即時的な転送が必要なものと,予め定められた期間内に伝送されれば良いものが存在する.提案手法はそれらを考慮して伝送に使用する波長を決定するものである.シミュレーション実験を用いて,これらの手法が効果的に波長競合を抑制することを示した.
カヤツリグサ科スゲ属植物の分子系統解析と分類学的再検討

カヤツリグサ科スゲ属植物213種の核および葉緑体遺伝子を解析し、現在広く採用されている形態に基づく分類体系と比較した。日本から韓国および中国東北部に分布するタガネソウ節が祖先型であり、属または亜属に分類できることが明らかになった。スゲ属植物の染色体は、異数的に染色体数が増加する方向に進化したことが明らかになった。また、節の分類が分子系統から強く支持されたものと、分類体系を見直す必要がある節が明らかになり、新しい分類体系が提案された。本年度は、染色体やDNA解析が終了していないスゲ属植物40種を研究分担者の協力を得て日本各地から採集し、体細胞分裂中期染色体の分析および葉緑体trnT-L-F領域の解析を行なった。現在までに、スゲ属植物120種のtrnT-L-F領域を解析した。今まで報告されている核リボソーム遺伝子ITS、ETS 1fをあわせて分子系統学的研究を行った。その結果、スゲ連の5属(Carex,Cymophyllus,Kobresia,Schoenoxiphium,Uncinia)は単系統となり、その中に次の4つのクレードが認められた。1)スゲ亜属タガネソウ節:小穂は複数で有柄、葉幅が広く、染色体数が2n=12とスゲ属内で最も少ない。2)原始スゲ亜属:小穂は1個。3)マスクサ亜属:小穂は複数でほとんどが無柄、花序は穂状、前葉はない。4)スゲ亜属とハナビスゲ亜属:小穂は複数でほとんどが有柄、花序は総状または円錐状。近縁3属(Kobresia,Schoenoxiphium,Uncinia)は、原始スゲ亜属と同一クレードに含まれ入れ子状になっておりKukenthalの見解は支持されなかった。さらに、タガネソウ節がスゲ連の基部で独立したクレードを形成することが明らかになった。国外の種を加えた400種の核リボソームおよび葉緑体遺伝子trnL,trnL-Fの非コード領域を用いた解析でも同様な結果が得られていることから、タガネソウ節は亜属レベルの分類群として区別できると考えられ、亜属の再検討が必要である。また、日本産スゲ属の節の分類と系統樹の比較では、ヒエスゲ節のように単系統を示すものや数個の節がまとまって1つのクレードに含まれるものが多かった。従って、節の分類に関しても分子系統を参考にして組み直す必要があると考えられる。本研究では、日本各地より採集した、カヤツリグサ科スゲ属植物213分類群の核リボゾーム遺伝子ITS、ETS 1f領域を解析した。また、185分類群に関しては、葉緑体遺伝子trnL, trnL-F非コード領域を解析した。さらに、スゲ属に近縁なヒゲハリスゲ属などの4属7種も含めた。また、外群にはホタルイ属、ワタスゲ属、ミネハリイ属を用いた。最尤法で系統解析し、得られた分子系統から、日本産スゲ属植物の亜属と節の分類体系を検討した。スゲ連の5属は単系統となり、その中に次の4つのクレードが認められた。(1)スゲ亜属タガネソウ節:小穂は複数で有柄、葉幅が広く、染色体数が2n=12とスゲ属内で最も少ない。(2)原始スゲ亜属:小穂は1個。(3)マスクサ亜属:小穂は複数でほとんどが無柄、花序は穂状、前葉はない。(4)スゲ亜属とハナビスゲ亜属:小穂は複数でほとんどが有柄、花序は総状または円錐状。近縁4属は、原始スゲ亜属と同一クレードに含まれ入れ子状になっていた。タガネソウ節は、国外の種を加えた解析でも同様な結果が得られていることから、新属または新亜属として区別できるものと考えられる。系統樹と節の対応では、タガネソウ節、バクサンスゲ節、ヒエスゲ節、タマツリスゲ節、イワカンスゲ節、ナキリスゲ節、サツマスゲ節は節の分類が強く支持された。しかし、ヌカスゲ節やアゼスゲ節はそれぞれ2クレードに分かれ、それぞれのクレードは形態で区別できることから節を分けることが望ましいと考えられる。また、ヒエスゲ節にキノクニスゲとセキモンスゲが含まれたが、小穂や果胞の形態も似ており、この2種はヌカスゲ節に移すことが望ましいと考えられる。本研究では、スゲ属植物の分子系統解析を行ない、形態に基づく現在の分類体系と比較した結果、近縁属および属内の亜属および節に関する新たな分類体系を提案した。
microRNAの放射線治療への応用に関する研究

microRNAは翻訳レベルでタンパク質の発現を制御している近年同定された細胞性のRNAである。その機能については未知な部分が多い。しかし、その中には細胞の放射線感受性に関わるものも報告されており、microRNAと放射線感受性との関係を詳細に分析すれば、放射線の生物学的影響について新しい知見が得られるのではないかと思われる。本研究の結果から、幾つかのmicroRNAが放射線感受性に関わっていると考えられた。放射線感受性の異なる細胞群を液体培地上で培養後、それぞれの細胞群に低線量のγ線を照射後、一定期間インキュベートした。それぞれの細胞群の非照射群と照射群の生存曲線を作成。また、それぞれにつき、細胞を1,000,000個取り出し、照射前後の細胞抽出液からmiRNAを抽出した。そして、各miRNAの発現量についてリアルタイムPCR法を用いて比較したところ、放射線高感受性細胞群においては、γ線照射後hsa-let-7g遺伝子を始め8種のmiRNA遺伝子が照射前に比べて有意に発現量が増加し、また、hsa-miR-324-5p遺伝子を始め14種のmiRNA遺伝子が照射前に比べて有意に発現量が減少していた。一方、放射線低感受性細胞群においては、γ線照射後hsa-miR-155遺伝子を始め10種のmiRNA遺伝子が照射前に比べて有意に発現量が増加し、また、hsa-miR-527遺伝子のみが照射前に比べて有意に発現量が減少した。よって、hsa-let-7g遺伝子やhsa-miR-527遺伝子は放射線感受性を増加させるmiRNAと考えられ、その一方、hsa-miR-324-5p遺伝子やhsa-miR-155遺伝子は放射線感受性を低下させるmiRNAと考えられる。次に、上記放射線感受性に関する考えられるmiRNAに対する強制発現試薬を合成。siRNA用トランスフェクション試薬を用いてこれら試薬をHeLa細胞に24 wellplate中でトランスフェクションした。トランスフェクション72時間後にγ線を照射し細胞群の放射線誘発アポトーシスの確認を行ったところ、残念ながらhsa-let-7g遺伝子やhsa-miR-527遺伝子を強制発現させた系、及びhsa-miR-324-5p遺伝子やhsa-miR-155遺伝子を強制発現させた系のいずれも放射線誘発アポトーシスの発現に有意な差は得られなかった。放射線高感度群の細胞群、及び放射線低感度群の細胞群を液体培地上で培養後、それぞれの細胞群の対数増殖期に低線量(1Gy5Gy)のγ線を照射後、一定期間37°C、5%CO2下でインキュベートした。また、それぞれにつき、細胞を1,000,000個取り出し、照射前後の細胞抽出液からsmall RNA精製用キットを用いてmiRNAを抽出した。そして、各miRNAの発現量についてリアルタイムPCR法を用いて比較したところ、予備実験で行ったマイクロアレイ法による解析と同じく放射線高感受性細胞群においては、γ線照射後hsa-let-7g遺伝子を始め8種のmiRNA遺伝子が照射前に比べて有意に発現量が増加し、また、hsa-miR-324-5p遺伝子を始め14種のmiRNA遺伝子が照射前に比べて有意に発現量が減少していた。上記の実験結果から、hsa-let-7g遺伝子やhsa-miR-527遺伝子は放射線感受性を増加させるmiRNAと考えられ、その一方、hsa-miR-324-5p遺伝子やhsa-miR-155遺伝子は放射線感受性を低下させるmiRNAと考えられる。当初予定していた、放射線感受性に関係するmiRNA遺伝子に対し、強制発現試薬や阻害薬を用いた実験(生存曲線の作成及び各miRNAの発現量の比較、各細胞群の放射線誘発アポトーシスの確認等)についてはまだ施行していないため。まず、平成23年度に予定していた、放射線感受性に関係するmiRNA遺伝子に対し、強制発現試薬や阻害薬を用いた細胞レベルでの実験を施行する。次いで、マウスなどの動物に放射線高感受性の腫瘍或いは放射線抵抗性の腫瘍を持つ坦癌動物を作成し、それぞれのグループに線量分布が適切になるように外部照射、小線源照射を行なう。その際の治療計画はマウスにおける癌の生着度や広がり等を考慮し、また高度な壊死にも陥らずかつ適切なアポトーシスが生じるように決定する。それぞれにおいて、照射前後での癌組織のアポトーシスの発生状況をTUNEL法により判断。また、各miRNAの発現量を確認する。一方、各癌にはin vivo用のトランスフェクション試薬を用いて各miRNA強制発現試薬・抑制試薬を導入、それらの導入前後及び照射前後のアポトーシスの発現率をTUNEL法で確認し、また、各miRNAの発現量を確認する。

更に坦癌動物の照射前後及び各miRNA強制発現試薬、抑制試薬導入前後においてFDG-PETを施行し坦癌動物の放射線治療効果の判定をし、また11C-AnnexinVを用いたアポトーシスPETによってアポトーシスの出現頻度を画像化し評価する。平成23年度では当初予定していた、放射線感受性に関係するmiRNA遺伝子に対し、強制発現試薬や阻害薬を用いた細胞レベルでの実験が施行出来なかったため、試薬購入費が余ってしまったが、速やかにこれらの試薬を購入し当該実験を施行する。更に、平成24年度では動物実験が主となるため、試薬購入費用以外に、動物の購入費用や飼育費用が多くを占める可能性がある。また、実験の進行状況によっては実験補助者の活用も考慮する必要があるため謝金などの支出が生ずる可能性もある。
GaAs化合物半導体スクラップの精製に関する基礎研究

GaAs化合物スクラップからのヒ素の揮発処理を考察する目的で,Ga-As2元系の活量データに基づき,Ga-AS2元系合金の有効蒸気圧-温度-組成相関図を作製した。ヒ素の有効蒸気圧は,P_<eff>/atm=PAs+2PAs_2+3PAs_3+4PAs_4で定義される値である。Ga-As2元系合金の有効蒸気圧-温度-組成相関図を作製した結果,GaAs化合物の融点1510Kにおけるp_<eff>の値は1atmを越えるが,ヒ素のモル分率N_<As>の減少とともにP_<eff>が急激に小さくなることが分かった。したがって,GaAs化合物のスクラップを,1500K,1atmの中性気流中下で熱分解した場合,GaAsスクラップからヒ素が容易にの解離揮発するものと予測される。化合物は,熱分解によりヒ素元素濃度の低い溶融2元系合金に転換されるが,溶融合金の呈するP_<eff>もかなり大きいため,N_<As>が0.1以下のヒ素濃度の低濃度域まで熱分解によるヒ素の回収が可能と思われる。さらに大気下ではなく,真空下における揮発工程を採用することにより分離効果は大幅に向上するものと考えられる。GaAs化合物のヒ素を酸化揮発させるうえで興味のもたれるGaAs_2O_4の生成自由エネルギーを,起電力法による酸素ポテンシャルの測定と,ヒ素の分配平衡の実験より導出することを試みた。しかしながら,焼結法でGaAs_2O_4を合成した場合,未反応のAs_2O_3が確認され,また,水溶液から合成したGaAs_2O_4は結晶性が悪く,安定したGaAs_2O_4の生成自由エネルギーを導出することが困難であった。今後は,低温でさらに焼結時間を長くしてGaAs_2O_4を合成する必要があるものと考えられる。また,配線基板上のガリウムヒ素を分離回収するうえで,銅や鉄などの基板材料とガリウムないしはヒ素をどのように分離回収していくのかも重要な課題である。GaAs化合物スクラップからのヒ素の揮発処理を考察する目的で,著者ら導出したGa-As2元系の活量データに基づき,Ga-As2元系合金の有効蒸気圧-温度-組成相関図を作製した。ヒ素の有効蒸気圧とは次式で定義される。ヒ素の蒸気種としては,単体,2量体,3量体,4量体が存在しており,有効蒸気圧は気相中に含まれるヒ素原子数の目安とされる。したがって,P_<eff>が大きいほどがGaAsスクラップからのヒ素の解離が進むものと評価される。Ga-As2元系合金の有効蒸気圧-温度-組成相関図を作製した結果,GaAs化合物の融点1510KにおけるP_<eff>の値は1atmを越えているが,ヒ素のモル分率N_<AS>の減少とともにP_<eff>が急激に小さくなることが分かった。一般に,1atmの気流中にある物質の揮発速度についておおよその概念を得たい場合は次のような目安が参考になる。1)0.1atm以上:迅速に揮発する,2)0.01atm以上:揮発するが遅い,3)0.001atm以上:非常に遅いこのような目安をもとにGaAsスクラップの1atmの中性気流中での熱分解によるヒ素元素の揮発による回収を考えた場合,GaAsスクラップの解離揮発は容易に進行するものと予測される。化合物は,熱分解によりヒ素元素濃度の低い溶融2元系合金に転換されるが,溶融合金の呈するP_<eff>もかなり大きいため,NAsが0.1以下のヒ素濃度の低濃度域まで熱分解によるヒ素の回収が可能と思われる。

しかしながら,焼結法でGaAs_2O_4を合成した場合,未反応のAs_2O_3が確認され,また,水溶液から合成したGaAs_2O_4は結晶性が悪く,安定したGaAs_2O_4の生成自由エネルギーを導出することが困難であった。今後は,低温でさらに焼結時間を長くしてGaAs_2O_4を合成する必要があるものと考えられる。また,配線基板上のガリウムヒ素を分離回収するうえで,銅や鉄などの基板材料とガリウムないしはヒ素をどのように分離回収していくのかも重要な課題である。