hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多国籍企業の石油開発がケニア地元民に与える不利益に関する研究：土地収奪と地域紛争

その結果、イギリスに本部をおく石油開発会社が野生生物保全を推進する国際NGOとの協力体制のもとに、石油探査をおこなっている土地に「自然保護区」を設定し、その土地に対する地域住民のアクセスを制限しようとしたことに対して、トゥルカナ郡の政治家たちが協力してその計画に反対し、地域住民の反対運動を扇動したため、この計画は阻止されたものの、そのプロセスでは治安が悪化したことが明らかになった。平成29年度にはまた、地元社会に対する石油開発事業の経済的影響に関する現地調査を実施した。その結果、探査井戸の設置やその事業を実施するためのキャンプの設営は、地元民トゥルカナの主たる生業である牧畜活動に直接的にはあまりおおきな影響を与えていないことが明らかになった。むしろ、開発事業に雇用されている多くの労働者が外部から移住し、開発基地を中心として「町」が出現したために、地元民がそこに集まり、薪や炭、建材、酒、そして家畜を販売するなどの現金稼得の機会が拡大したことが、地元社会に多大な影響を及ぼしていることが判明した。本研究は3年計画で実施しており、平成29年度はその2年目にあたる。初年度および第2年度ともに、当初に予定していた研究計画を、ほぼ順調に遂行し、石油開発事業が地元社会におよぼす多面的な影響を解明しつつある。ケニアでは、2010年に新憲法が制定されて以来、地方分権化が進められてきたが、そのプロセスは全国的にいまだに完成していない。しかし平成29年度の研究では、この地方分権化のプロセスにおいて政治権力を強化したトゥルカナ郡の地方政治家たちが、ケニア中央政府の方針に反する行動をとり、そのことが石油探査事業におおきな影響をもったこと、そしてその過程では治安が悪化したことに関する理解を深めることができた。さらにまた、平成29年度の研究では、石油開発事業にともなって外部から移入した労働者たちによってトゥルカナの地に「町」が形成され、そこで活発な経済生活が営まれることによって、地元民が現金稼得活動をおこなう機会を得ていること、そのことが地元民の生活全体におおきな影響をもっている実態を解明することができた。アフリカにおける欧米や中国などによる鉱物資源の開発は、土地収奪や環境破壊、地域紛争など、多くの問題をひきおこしてきた。ケニア北西部のトゥルカナ地域では、2012年に石油が発見され、多国籍企業による探査・開発が進行している。本研究の目的は、この事業が地元社会に対してどのような影響をおよぼしているのかを解明することである。地元民は、開発企業であるターロウ(Tullow)に対して両義的な感情をもち、その活動を支持すると同時に、様々な妨害行動をとっている。ターロウは、井戸掘りと水の供給、学校や病院の建設、奨学金の提供などの便宜を地元に供与し、また、地元企業は、多くの仕事をターロウから請け負い、地元民は現金稼得の機会を得ている。しかし地元民は、ターロウは事業内容を自分たちに十分に説明せず、雇用機会を提供していないし、また、環境を破壊・汚染していると考えている。さらに、この事業により立ち退きを強制された人びとが存在し、将来、さらに自分たちの土地が奪われることを懸念している。ターロウは2018年6月に、原油をインド洋岸までトラック輸送し、国際的なマーケットに売却する準備を開始した。しかし地元民は、ターロウと中央政府に対する鬱積した不満を表明して、道路を封鎖してトラックの通行を阻止し、原油輸送は2カ月弱にわたって中断した。
光情報処理コンピューティングとファジイ最適化手法の応用によるフラクタル解析

本研究は,カオス現象とフラクタル的特性を結ぶ微細構造を解明するとともに,その結果得られる知見を応用して擬似乱数発生法の考案することを目指した.その最適化手法の特徴は,ファジィ数理解析および,DNAアルゴリズムにおける光情報制御等の手法を開発・考案している点である.本年度に関して得られた成果・知見は以下のとおりである:(1)グーモウスキ・ミラ写像のリアプノフ指数に関する数値シミュレーション・データを多数検討した.結果,3パラメータを様々に変化させ,各場合につき,初期値鋭敏性がどのように現れているか観察し,Marottoの定理(J.Math.Appl.Anal.,No.63,1978)が適用不可能であるという知見に至った.グーモウスキ・ミラ写像のカオスを証明するためには,ある種のヤコビ行列の固有値の絶対値の計算,ホモクリニック軌道の存在性を確認するなどして,多次元離散力学系の写像に関し,カオス存在のための新たな具体的手法を確立することが必要である結論を得た.また,本年度は,線形合同法を用いた暗号用擬似乱数生成法を考案し,その有用性を相関係数,ラン検定,カイ2乗検定,相互情報量等による定量的解析により実証した.今後その解析結果をグーモウスキ・ミラ写像におけるカオスを利用して,擬似乱数発生法を見いだす端緒を得た.(2)本来,線形的でないファジィ数の集合に線形構造を導入して,従来の線形関数解析学的手法を用いてファジィ微分方程式の解に関して,定性的研究,特にファジィ境界値問題ついて新しい判定法を考案した.本研究は,カオス現象とフラクタル的特性を結ぶ微細構造を解明するとともに,その結果得られる知見を応用して擬似乱数発生法の考案することを目指した.その最適化手法の特徴は,ファジィ数理解析および,DNAアルゴリズムにおける光情報制御等の手法を開発・考案している点である.本年度に関して得られた成果・知見は以下のとおりである:(1)グーモウスキ・ミラ写像のリアプノフ指数に関する数値シミュレーション・データを多数検討した.結果,3パラメータを様々に変化させ,各場合につき,初期値鋭敏性がどのように現れているか観察し,Marottoの定理(J.Math.Appl.Anal.,No.63,1978)が適用不可能であるという知見に至った.グーモウスキ・ミラ写像のカオスを証明するためには,ある種のヤコビ行列の固有値の絶対値の計算,ホモクリニック軌道の存在性を確認するなどして,多次元離散力学系の写像に関し,カオス存在のための新たな具体的手法を確立することが必要である結論を得た.また,本年度は,線形合同法を用いた暗号用擬似乱数生成法を考案し,その有用性を相関係数,ラン検定,カイ2乗検定,相互情報量等による定量的解析により実証した.今後その解析結果をグーモウスキ・ミラ写像におけるカオスを利用して,擬似乱数発生法を見いだす端緒を得た.(2)本来,線形的でないファジィ数の集合に線形構造を導入して,従来の線形関数解析学的手法を用いてファジィ微分方程式の解に関して,定性的研究,特にファジィ境界値問題ついて新しい判定法を考案した.カオス現象を観察するときは時間が推移するにつれて,どのように変わってゆくかに注目する.一方,フラクタル図形は現象ではなく,無限回繰り返される極限操作の後,最終的にたどり着く集合である.ゆえに,発生する軌道としてはカオス現象が観察され,時間経過して得られる集合はフラクタル的な場合もある.例えば,エノン写像は2次元写像であり,フラクタル構造が潜んでいるとエノンが指摘し,また,エノン写像はカオスであることもすでに証明されている.カオス的に発生しながら,出来上がってゆくフラクタル図形には,カントール構造の存在が示唆されている.カントール構造とは,カントール3進数集合を特徴付ける性質で,離散的な無限閉集合の一つである.カオス現象(初期値鋭敏的不規則性)に内在するフラクタル集合(自己相似性)を深く決定付けるカントール構造を解明することは有意義と判断できる.今年度の研究では,特に,グモウスキ・ミラー写像に関して,3パラメータのうち2つを固定し,1つを-1から+1まで変化させることにより,その不規則変化する様子をシミュレーションし,多数の図版を検討することにより,カオス性,フラクタル性とカントール構造についての議論を重ねた.その結果,リアプノフ指数を数値計算してその不規則性のしくみを探り,また,多次元離散系におけるカオス判定定理が適用可能かどうか今後検討する方針を得た.さらに,ファジィ解析的手法の考案するために,ファジィ微分方程式の定性解析もすすめ,光情報処理系への実装を目指して,ファジィ解の可視化ソフト,ディジタル・スマートピクセル,ストリーム暗号システムに関する研究発表も行った.本研究は,カオス現象とフラクタル的特性を結ぶ微細構造を解明するとともに,その結果得られる知見を応用して擬似乱数発生法の考案することを目指した.その最適化手法の特徴は,ファジィ数理解析および,DNAアルゴリズムにおける光情報制御等の手法を開発・考案している点である.本年度に関して得られた成果・知見は以下のとおりである:1.グーモウスキ・ミラ写像のリアプノフ指数に関する数値シミュレーション・データを多数検討した.結果,3パラメータを様々に変化させ,各場合につき,初期値鋭敏性がどのように現れているか観察し,Marottoの定理(J.Math.Appl.Anal.,No.63,1978)が適用不可能であるという知見に至った.

グーモウスキ・ミラ写像のカオスを証明するためには,ある種のヤコビ行列の固有値の絶対値の計算,ホモクリニック軌道の存在性を確認するなどして,多次元離散力学系の写像に関し,カオス存在のための新たな具体的手法を確立することが必要である結論を得た.また,本年度は,線形合同法を用いた暗号用擬似乱数生成法を考案し,その有用性を相関係数,ラン検定,カイ2乗検定,相互情報量等による定量的解析により実証した.今後その解析結果をグーモウスキ・ミラ写像におけるカオスを利用して,擬似乱数発生法を見いだす端緒を得た.2.本来,線形的でないファジィ数の集合に線形構造を導入して,従来の線形関数解析学的手法を用いてファジィ微分方程式の解に関して,定性的研究,特にファジィ境界値問題ついて新しい判定法を考案した.3.前年度に考案した最大クリーク問題に対する2次離散型計画問題を解くためのDNAコンピューティングのアルゴリズムにおいて,2値符号化の問題点を解決してヘアピンDNAによる自律計算が正しく実行されるように改良した.また,DNA実験により,計画問題の1次項と2次項が結合したDNA配列を合成できることを確認した.
酵母cRNA endonuclease複合体のアセンブリーと核移行

本研究において我々は、Sen54p、Sen2p、Sen34p、Sen15pからなる酵母S.cerevisiaeのtRNAendonuclcaseの細胞内局在を研究した。tRNA endonucleaseはpre-tRNAからのintronを切り出す酵素で、酵母ではこの活性が膜結合性であり、上記のうちSen2pが膜貫通可能な疎水領域を持つことから、この疎水領域を介して核内膜に結合している内在性複合膜蛋白質であると考えられてきた。各Senサブユニットの細胞内局在を、GFP融合タンパク質発現株を用いて調べたところ、全て核内に局在せず、GFP-Sen54pは細胞内に分枝したひも状に、Sen2pとSen34pは細胞質の少数の顆粒状に、Sen15pは細胞全体に一様に分布した。Sen54pとSen2pに関して、間接蛍光抗体法でその局在を詳しく検討したところ、Sen54pとSen2pはミトコンドリアに局在していた。細胞分画法、抽出実験などにより、両サブユニットともミトコンドリア外膜の細胞質側に強固に結合した表在性膜蛋白質であることが示された。これは、従来予想されていた局在とかけ離れている。Sen2pのミトコンドリア局在化シグナルはN-末端とC-末端に重複して存在し、また、223-243残基に存在する疎水領域は、C-末端側の1次構造が保たれていると膜貫通領域として機能しない。Scn2pのこの領域を含むC-末端部分は古細菌のtRNAendonucleaseと相同性があり、この疎水領域は蛋白質内部に埋め込まれて疎水コアを形成しているものと考えられる。一方、Scn54pは、その233-313残基部分にミトコンドリア局在に必要なシグナルが存在する。この領域は、芳香族アミノ酸に富んだ特徴的な配列を持っており、現在、その意義を解析中である。
前立腺がんを中心とする泌尿器系腫瘍の分子疫学的解析とリスクモデルの構築

目的;前立腺がんの発生・進展危険因子に内分泌・性生殖活動要因、食餌要因などがあげられているが、明確な危険因子は得られていない。我々はこれまで「前立腺がんの発生・進展」を研究テーマに、地理病理学的、分子病理学的手法で解析を行い、前立腺がんも他の固形がんと同様に各種の遺伝子変異あるいはエピジェネティクスが関与する多段階発がんであることを示した。これらの研究の中で、症例対照研究のサイズの拡大、複数の遺伝子多型でのプロファイリングと泌尿器系腫瘍の中での前立腺発がんリスクモデルの位置付けの必要性を感じ、研究スケールの拡大(前立腺がん400例、前立腺肥大症200例、健常者コントロール1000例)およびSNPの大量解析を準備している。症例の解析を通じて、前立腺がんの遺伝子多型データ、ライフスタイルデータをもとに、発がんリスクモデルを構築する。同時に環境因子の明確な関与が考えられる尿路上皮系がんとの比較をすることにより、泌尿生殖系腫瘍の発がんリスクモデルを構築する。最終的には、個人レベルでの前立腺がんを含む泌尿器系腫瘍のリスクを管理可能にすることが目標である。結果;エピジェネティクスが関与する遺伝子の検索を行った結果、GSTP1、RARbeta2とVEGFR-1のメチル化頻度、家族性前立腺癌関連遺伝子HPC2/ELAC2のある多型が良性病変に比べ癌組織で有意差があることが判明した。E-cadherinの発現量を変化させるpromoter領域の遺伝子多型では、移行上皮癌患者と健常者の間で有意な差が見られた。癌の増殖、進展に関与すると考えられる遺伝子やその多型についての情報が得られた。更に情報量を増やすことにより癌の罹患や予後に対するリスクモデル構築の実現に寄与できると考えられる。
DNA結合ドメインの特長を生かしたDNA修飾酵素の開発とゲノム編集への応用

CRISPR-Cas9などのゲノム編集技術の発展に伴い、ヒトゲノムへの理解を深化させる多様なゲノム機能改変ツールに関心が高まっている。分割型DNAメチル化酵素の酵素活性に与えるDNA結合活性の影響を明らかにし、酵素活性の向上につながる知見を得ることを目的とした。会合状態の分子モデリングよりZFPおよび分割型ドメイン同士が立体障害を起こす可能性が示唆された。標的配列上での会合様式やZFPと酵素ドメインを繋ぐリンカーの長さが与える酵素活性への影響について様々な変異体を用いて活性を評価した。異なるDNA鎖上に標的配列がある場合に高い活性を示し、複合体モデルからも実験結果を支持するデータが得られた。ヒトゲノムに対する理解が深まるにつれ,その編集操作にも関心が高まってきている。次世代の遺伝子改変・編集技術としてジンクフィンガー融合型DNA修飾酵素を用いたノックアウト個体の作製例が増えている。新たなDNA結合ドメインとしてTranscription-like activation effector(TALE)が同定され,ジンクフィンガードメインと同様に酵素への応用が試みられている。しかし,DNA結合の詳細な解析,結合親和性と酵素活性の相関性などについて詳細な検討を行った例はない。そこで,本研究ではジンクフィンガードメイン,TALEドメインをDNA結合ドメインとするDNA切断酵素,および世界初のメチル化酵素の構築を行い,それぞれDNA結合カイネティクスの違いによる酵素活性への影響について解析を行い,酵素活性の最適化に関する知見を得ることにした。当該年度においてはTALEドメインの作製方法について効率的に構築するプロトコールを確立した。また,MBP融合タンパク質として大腸菌内で発現し,抽出,精製を行い,各TALEドメインのDNA結合親和性評価を行うことを可能にした。これまでにASH1エクソン領域を標的としたTALEドメインを構築することに成功している。分割型DNAメチル化酵素についてはジンクフィンガー融合型と比較してTALEドメイン融合型においてはTALEのDNA結合様式がジンクフィンガードメインと異なるため,これまでの分割型メチル化酵素ーDNA結合ドメインの融合形式とは異なる形での構築が必要とされる。そのため,様々なアッセンブリー様式の分割型DNAメチル化酵素(ジンクフィンガー融合型)を構築し,そのメチル化効率について定量を行った。次年度以降に行うTALE融合型酵素構築に有用な情報を得た。応募者はジンクフィンガードメインをDNA結合タンパク質に用いた酵素開発を推進してきた。最近になり,新たなDNA結合ドメインとしてTranscription-like activation effector(TALE)が同定され,ジンクフィンガードメインと同様に酵素への応用が試みられている。第二年度の本年も継続して分割型DNAメチル化酵素の開発研究に取り組んだ。TALEドメインについては合計で8種の標的配列に対して結合するドメインを構築した。ジンクフィンガー融合型DNAメチル化酵素に関して、さまざまなアッセンブリー様式を検討した結果、これまでと比較して明らかに高い活性を示すドメインの組み合わせを得ることができた。次年度においては引き続きアッセンブリー様式とメチル化効率の相関に関して詳細を検討するとともにTALEをDNA結合ドメインとした分割型DNAメチル化酵素の構築にも取り組む。既存のゲノム編集技術はヌクレアーゼ活性に基づく技術であるが、ジンクフィンガー(ZF)融合型DNA修飾酵素によって配列特異的にDNA組み換えやDNAメチル化が行える。これらはゲノム編集/エピゲノム編集に利用できる技術として有用である。本研究では分割型DNAメチル化酵素の酵素活性に与えるDNA結合活性の影響を解析し、より高活性な酵素を取得することを目指した。DNA配列に応じて再会合する分割型メチル化酵素を構築し、DNAの片方の鎖にZFPの認識配列を設定した場合にメチル化活性を示すことが確認されている。DNAメチル化酵素の会合状態を分子モデリングで確認すると、ZFと分割型ドメイン同士において立体障害が存在する可能性が示唆された。そこで標的配列上での会合様式やZFと酵素ドメインを繋ぐリンカーの長さについて様々な変異体を構築して酵素活性への影響を解析した。ZFには9塩基を認識する結合親和性が明らかなHS1、HS2を用い、分割型メチル化酵素にはHhaI methyltransferase(M.HhaI)を基に、アミノ酸配列を1-240 (N末端ドメイン)および210-327 (C末端ドメイン)に分割し、各ZFと異なる長さのリンカーで繋いだ組み合わせを用意してメチル化効率を大腸菌内で評価した。発現プラスミドpAraに分割型メチル化酵素ドメインの各遺伝子と標的配列を導入し、大腸菌内での一定培養時間を経てプラスミドを回収し、HhaIによるプラスミド切断でメチル化反応効率を算出した。また、バイサルファイト反応を行い、標的配列上でのメチル化を確認した。その結果、異なるDNA鎖上に標的配列がある場合に高い活性を示すことが示され、複合体モデルからも実験結果を支持するデータが得られた。今回得られた知見は哺乳類細胞内で機能する分割型DNAメチル化酵素開発の基盤となることが期待される。

分割型DNAメチル化酵素の酵素活性に与えるDNA結合活性の影響を明らかにし、酵素活性の向上につながる知見を得ることを目的とした。会合状態の分子モデリングよりZFPおよび分割型ドメイン同士が立体障害を起こす可能性が示唆された。標的配列上での会合様式やZFPと酵素ドメインを繋ぐリンカーの長さが与える酵素活性への影響について様々な変異体を用いて活性を評価した。異なるDNA鎖上に標的配列がある場合に高い活性を示し、複合体モデルからも実験結果を支持するデータが得られた。26年度の研究計画では(4)TALEをDNA結合ドメインとしたヌクレアーゼ(TALEN)の構築と(5)ジンクフィンガー融合型酵素とTALE融合型酵素の活性の比較に取り組むことを挙げていた。(4)については,DNA結合活性と酵素活性の相関性の評価をするために,DNAメチル化酵素のほかにヌクレアーゼとしても利用した。また転写活性化因子のDNA結合ドメインとして利用した場合、結合親和性に応じて転写活性化能も向上することが知られているため,この実験系を導入した。転写活性化についてはレポーター遺伝子によって定量する系を構築することができた。(5)についてはTALE融合型DNAメチル化酵素のメチル化反応効率を,これまでに構築したジンクフィンガー融合型酵素と同条件で追跡することを計画していた。この方法では大腸菌内に酵素遺伝子をコードしたプラスミドを導入する。同じプラスミド遺伝子上にメチル化の標的配列もコードしてあるため,大腸菌内で酵素が発現してメチル化反応が起こったのちにプラスミド遺伝子を回収する。メチル化反応の定量はメチル化配列を切断しない制限酵素(HhaI,FspI)を用いた切断反応によって行う。ジンクフィンガー融合型酵素のアッセンブリー様式を検討する中で明らかに活性が向上した組み合わせを見出したため,これに関する解析に重点を置いて種々検討を進めた。得られた知見はTALE融合型酵素に関しても利用することが可能であると考えている。生物化学第二年度までの進捗状況が概ね当初の予定通りであるため,引き続き研究計画に沿って実施する。大腸菌内もしくは試験管中での反応を評価することで定量性のある実験結果から酵素活性とDNA結合活性の相関関係,またアッセンブリー様式の違いが反応効率に与える影響を明らかにできた。最終年度では細胞内での活性評価を行う予定であるが,大腸菌内で安定した高い活性を示す分割型酵素が得られているためこれを用いて哺乳類細胞を用いた実験を実施する。
樹木細胞におけるリグニン前駆物質の分布

樹木分化中木部におけるリグニン前駆物質の分布をマトリックス支援レーザー脱離イオン化/飛行時間型/質量イメージング(MALDI/TOF/MS imaging)を用いて調べた。四酸化オスミウム蒸気による処理と組み合わせることにより、分子量が等しいスクロースとコニフェリンの分布を識別することに成功した。その結果、針葉樹分化中木部において二次壁形成中の仮道管にコニフェリンが存在することが明らかになった。ヒノキの直立木から活発に木化が進行している時期に分化中木部を採取し、凍結保存した。得られた正常材分化中木部より、スライディングミクロトームを用いて厚さ20μmの横断面切片を作製し、乾燥させた。切片をMALDI-TOF MS測定用のターゲットに導電性両面テープで固定し、その上からマトリクスの溶液をスプレーし、真空乾燥させた。その切片についてMALDI-TOF MSを用いてマッピング測定を行った。その結果、コニフェリンと同様にm/z=381のピークを示す物質が、二次壁形成中木部に局在することが明らかになった。この結果は同一試料を顕微ラマン分光法を用いて調べたこれまでの結果とよく一致していた。さらにMALDI-TOF MS測定時にアルゴンガスを導入し、m/z=381にピークを示す物質のフラグメントイオンのパターンを標品のコニフェリンと比較した。その結果、分化中木部からの物質と、標品のコニフェリンの両方からコニフェリルアルコール及びグルコースに由来する2つのピークが見られた。この結果より、二次壁形成中木部にコニフェリンが存在することが確認された。この方法は分化中木部に微量に存在するリグニン前駆物質(コニフェリン、シリンジン)の種類と分布を高感度で可視化するための有効な手法となりうることが明らかになった。樹木分化中木部におけるコニフェリンとシリンジンの存在についてはこれまで、抽出物の化学分析によって調べられてきており、必ずしもすべての樹木の分化中木部に存在するわけではなく、存在しない樹木もあることが報告されている。今回のMALDI-TOFイメージングを用いることにより、これまで抽出物の化学分析では検出されないような微量のコニフェリン、シリンジンの分布を検出できる可能性がある。スギ、ヒノキ、アカマツ、イチョウの直立木から活発に木化が進行している時期に分化中木部を採取し、直ちにスライディングミクロトームを用いて厚さ20μmの横断面切片を作製し、室温で乾燥させた。特別に深さ120μmとなるように座ぐり加工を施したMALDI-TOF MS測定用のターゲットプレートに、導電性のC両面テープ(厚さ約110μm)を用いて切片を固定した。その後、カチオン化剤としてトリフルオロ酢酸を含むマトリクス(DHB)溶液を噴霧し、真空乾燥させた。その結果、コニフェリンと同様にm/z=365のピークを示す物質が、二次壁形成中木部に局在することが明らかになった。さらにMALDI-TOF MS測定時にアルゴンガスを導入し、m/z=365にピークを示す物質のフラグメントイオンのパターンを標品のコニフェリンと比較した。しかしながら、標品として分化中木部に存在する可能性のあるスクロースのMALDI-TOF MSスペクトル及びフラグメントイオンのパターンを調べたところ、これらがコニフェリンと一致することが明らかになった。この結果は、MALDI-TOF MSイメージング測定のみではコニフェリンとスクロースを識別することが困難なことを示している。スクロースとコニフェリンのラマンスペクトルを測定した結果、両者のスペクトルは明確に異なることが明らかになった。このことより、MALDI-TOF MSイメージングにより、切片中の大まかな分布を調べた後に、連続切片を顕微ラマン分光法によって高分解能で測定することが、切片中におけるコニフェリンの分布を調べるのに有効な方法であることが明らかになった。スギ、ヒノキの直立木及び傾斜木から分化中木部を採取し、厚さ20μmの横断面切片を作製し、室温で乾燥させた。深さ120μmとなるように座ぐり加工を施したターゲットプレートに、導電性のC両面テープ(厚さ約110μm)を用いて切片を固定した。その後、カチオン化剤としてトリフルオロ酢酸ナトリウムを含むマトリクス(DHB)溶液を噴霧し、真空乾燥させた。その切片についてMALDI-TOF MSを用いてイメージング測定を行った。その結果、正常材分化中木部において、コニフェリンと同様にm/z=365にピークを示す物質が、二次壁形成中木部に局在することが明らかになった。

さらにアルゴンガスを導入し、その物質のフラグメントイオンのパターンを標品のコニフェリンと比較した結果、両者のパターンが一致した。しかしながら、分化中木部に存在する可能性のあるスクロースのMALDI-TOF MSスペクトル及びフラグメントイオンのパターンを調べたところ、これらがコニフェリンと一致した。この結果は、MALDI-TOF MSイメージング測定のみではコニフェリンとスクロースを識別することが困難なことを示している。そこで、切片を四酸化オスミウム蒸気で処理することにより、分布を変えずにコニフェリンのみに水酸基を2個導入することに成功し、切片中のコニフェリンとスクロースの分布を識別することが可能となった。この方法により、コニフェリンは二次壁形成中木部に存在することが確認された。また、同様の方法で圧縮あて材分化中木部をイメージング測定した結果、あて材形成時にはコニフェリンは貯蔵されず、合成と同時に細胞壁へ効率よく輸送される機構が働いている可能性が示唆された。四酸化オスミウム蒸気処理と組み合わせたMALDI-TOF MSイメージングは、切片中のコニフェリンの分布を調べるのに有効な方法であることが明らかになった。MALDI-TOF MSイメージングは空間分解能はやや低いものの、切片中の物質の分布を高感度で測定できる利点がある。一方、顕微ラマン分光法は空間分解能が高く、物質の化学構造に関する情報量に優れている。本年度の研究により、これらの2つの方法を組み合わせることで、分化中木部におけるリグニン前駆物質の分布を明らかにできる目処が得られた点で、おおむね順調に進展していると考えることができる。24年度が最終年度であるため、記入しない。マトリクスの種類、フラグメントイオンの測定条件等を検討することにより、イメージングにおいてコニフェリンとスクロースの識別ができないかどうかについて検討する。また、横断切片上で放射組織上にコニフェリンもしくはスクロースの分布が観察されたため、横断面切片に加えて、連続板目切片をMALDI-TOF MSイメージング及び顕微ラマン分光測定に供することで、放射柔細胞中でのコニフェリンの有無を確認する予定である。また、針葉樹に加えて、広葉樹を用いてコニフェリン及びシリンジンの分布を調べる予定である。
身体運動によるヒト生物時計の構造解析

ヒト生物時計の機能的構造を明らかにする目的で、健常成人男子を外界の昼夜変化から隔離した住居型実験室において生活させ、睡眠覚醒リズムと血中メラトニンリズムの内的位相関係を解析して、以下の研究成果を得た。光の影響を排した低照度環境下で、覚醒時間帯を8時間前進させ4日間固定する強制的スケジュール、および引き続き時刻の手がかりを除いたフリーラン条件(脱同調パラダイム)を荷すと、睡眠覚醒リズムは位相前進して新しいスケジュールに再同調したが、血中メラトニンリズムは位相後退し、2つのリズムに内的脱同調が生じた。スケジュールシフト時の覚醒期の前半と中頃に4時間の身体運動を負荷すると、睡眠覚醒リズムの再同調は有意に促進し、この効果はフリーラン時にも持続した。一方、身体運動の効果は血中メラトニンリズム位相には認められなかった。また、スケジュールシフト時の覚醒期に2時間間隔で3回、1回あたり2時間の身体運動を負荷した場合、睡眠覚醒リズムに対する効果は認められなかった。また、血中メラトニンリズム位相にも効果はなかった。以上の結果から、身体運動は睡眠覚醒リズムに作用して、8時間位相前進したスケジュールへの再同調を促進するが、血中メラトニンリズムには影響を与えず、睡眠覚醒リズムに特異的な同調因子と考えられる。また、身体運動の効果には位相依存性が存在することが示唆された。本研究の目的は、身体運動がヒト生物時計の同調因子として作用しているか否かを明らかにし、さらに身体運動に伴う様々な機能変化のどの要素がヒト生物時計に作用するのかを明らかにすることにある。すなわち、身体運動強度、及び身体運動の要素(代謝変化、体温変化、覚醒レベルの変化など)と生物時計の変化との関係を明らかにする。健常成人17名を対象として、光の影響を排した低照度環境下で睡眠時間帯を8時間前進させ4日間固定する強制的内的脱同調、および引き続き時刻の手がかりを除いたフリーラン実験をおこなった(脱同調パラダイム)。主観的昼の前半と中頃にそれぞれ4時間の身体運動を負荷し、脳波的に判定した睡眠覚醒リズムと血中メラトニンリズムを指標としてリズム再同調速度を測定した。また実験期間中、深部体温を連続測定した。その結果、運動負荷群(n=9)、非負荷群(n=8)とも睡眠覚醒リズムは位相前進して新しい睡眠時間帯に再同調したが、血中メラトニンリズムは位相後退し、2つのリズムに内的脱同調が生じた。睡眠覚醒リズムの再同調は、運動非負荷群に比べ運動負荷群で有意に促進され、この差はフリーラン時にも持続した。一方、メラトニンリズムの位相には両群で差はなかった。脱同調した2つのリズムはフリーランの5日目にほぼ再同調した。再同調に際し、睡眠覚醒リズムが位相前進して再同調を達成した例が、運動負荷群、非負荷群にそれぞれ1名ずつ観察された。以上の結果から、身体運動は睡眠覚醒リズムに作用して新しい睡眠時間帯への再同調を促進すると考えられるが、血中メラトニンリズムにはほとんど影響を与えず、内的脱同調の解消には至らなかった。しかし、統計学的検定で有意差がみられなかった背景には身体運動の効果における個体差があり、運動強度や運動に伴う身体機能の変化と生物時計の反応を精査する必要がある。本研究の目的は、身体運動がヒト生物時計の同調因子として作用しているか否かを明らかにし、更に身体運動に伴う様々な機能変化のどの要素がヒト生物時計に作用するのかを明らかにすることにある。すなわち、身体運動強度、及び身体運動の要素(代謝変化、体温変化、覚醒レベルの変化など)と生物時計の変化の関係を明らかにする。健康人を対象として、光の影響を排した低照度環境下(<10 1x)で睡眠時間帯を8時間前進させ、4日間固定する強制的内的脱同調、および引き続き時刻の手がかりを除いたフリーラン実験を行った(脱同調パラダイム)。覚醒時に3回2時間間隔で、1回あたり2時間の自転車エルゴメーターによる身体運動(15分間隔のインターバル走法)を負荷し、脳波的に判定した睡眠覚醒リズムと血中メラトニンリズムを指標として、リズム再同調速度を測定した。また、実験期間中、深部体温を連続測定した。

その結果、フリーラン直後の睡眠覚醒リズムは運動群及び対照群とも位相前進させた睡眠時間帯には同調しておらず、両群に有意差はみられなかった。また、血中メラトニンリズムは、位相変位日およびフリーラン日には基準日に比較しリズム振幅が有意に低下していたが、リズム位相には基準日に比較し有意な差異は無かった。また、リズム位相には両群に際は見出されなかった。これらの結果は、覚醒期間中を通した身体運動は、覚醒期間の前半に集中した身体運動とは異なることを示し、身体運動の効果に位相依存性が存在することを示唆した。
脊髄小脳失調症6型における神経細胞死と核転写因子

我々はこれまでポリグルタミン数の異なるヒト全長alpha 1aカルシュウムチャンネルを持続的に発現する細胞系列において、細胞死の解析を続けてきた。他のいわゆるポリグルタミン病においては、ポリグルタミン数の延長が核転写因子の機能異常をきたし、細胞死を誘導することが報告されてきた。今回、本奨励研究Aにより、我々はルシフェラーゼアッセイ系を用いた核転写因子測定系を確立できた。細胞系列によって、適切な条件決めが必要なためそのアッセイは難しく、難儀したが、トランスフェクトするDNA量とリポフェクト法の試薬量の至適値を決定、核転写因子活性を安定してアッセイすることが出来るようになった。この系を用い、すでに細胞死をひき起こしやすいことが確認されているポリグルタミン鎖が長い細胞系列と正常のポリグルタミン鎖数における血清除去による細胞死誘導下における核転写因子AP1, CRE, NFkB, SRF, p53, NFAT, SREにおいて測定した。その結果、血清除去下では、各々の核転写因子が様々な挙動をしめすことが確認された。特にNFATはポリグルタミン鎖数が長い細胞系列で優位な差を持って上昇していた。しかしながら、その上昇はわずかな上昇で、それが細胞死にどのような影響を与えているのか、現在確認中である。NFATはカルシニューリンを介した系であり、現在、カルシニューリン活性阻害薬投与後のNFATの活性化などを計測中である。今後、細胞内シグナルを介した核転写因子について、実験を続けていく予定である。
C, R, 構造の局所埋めこみ理論(アブストラクト〓bの局所可解性)

Mを複素多様体N上の実超曲面とする.するとM上にはCR-structureと呼ばれる構造, i・e, ^ρT^1=T^<0,1>NIM〓CTMがはいり, (1)^ρT^<11>〓^6T^^-^<11>=0, (2)〔「M,^ρT^<//>),「M,^ρT^<//>)〕(「M,^ρT^<//>)を満たす.私が取り扱っているのはこの逆でアブストラクトな微分可能多様体Mとその上のC^∞-vectorbundle^0T^<11>で上の(1)と(2)を満たす時(M,^ρT^<//>)は,局所的に複素多様体の実超曲面として実現できるか?この問題は, dim_<1R>M=2n-1≧9の時は, OK(倉西), dim_<1R>M=2n-1=7時OK(筆者)そしdim_<1R>M=3の時は,反例がある(Nirenberg).これ故dim_<1R>M=2n-1=5の時が,問題であったがまだ未解決で今年度は,残念ながら出来なかった.筆者としては,来年以後の研究に全てをかけたいと思っています.Mを複素多様体N上の実超曲面とする.するとM上にはCR-structureと呼ばれる構造, i・e, ^ρT^1=T^<0,1>NIM〓CTMがはいり, (1)^ρT^<11>〓^6T^^-^<11>=0, (2)〔「M,^ρT^<//>),「M,^ρT^<//>)〕(「M,^ρT^<//>)を満たす.私が取り扱っているのはこの逆でアブストラクトな微分可能多様体Mとその上のC^∞-vectorbundle^0T^<11>で上の(1)と(2)を満たす時(M,^ρT^<//>)は,局所的に複素多様体の実超曲面として実現できるか?この問題は, dim_<1R>M=2n-1≧9の時は, OK(倉西), dim_<1R>M=2n-1=7時OK(筆者)そしdim_<1R>M=3の時は,反例がある(Nirenberg).これ故dim_<1R>M=2n-1=5の時が,問題であったがまだ未解決で今年度は,残念ながら出来なかった.筆者としては,来年以後の研究に全てをかけたいと思っています.
炎症における発熱の分子病態機構の解析

炎症局所で産生されるインタ-ロイキン1(IL-1)の内因性発熱因子としての意義を明らかにすることを目的とし、ウサギの腹腔に起こしたカゼイン炎症をモデルとして、以下の成績及び結論を得た。ウサギの腹腔にアルカリ変性カゼインを注射すると、注射後1.5時間目より12時間目にわたる単峰性の発熱がみられ、そのピ-クは5時間にあった。我々が、免疫応答増幅因子として精製しN末端アミノ酸配列を決定した標品にも発熱活性が認められたが、その遺伝子情報に基づき作製したレコンビナントIL-1_βにも免疫応答増幅活性と発熱活性が認められた。カゼイン炎症局所より経時的に滲出細胞と滲出液を採取し、以下の解析を行った。滲出細胞中のIL-1mRNA量をIL-1cRNAを用いて定量すると、IL-1_βmRNAは27時間目の細胞に検出され、細胞当りでは2時間目にピ-クがあったが、滲出細胞数の急増に併ない総量は7時間目にピ-クに達した。IL-1_αmRNAも同時期に検出されたが、量はIL-1_βmRNAの1/5以下であった。免疫応答増幅活性は、29時間目の滲出細胞に検出され、細胞当り及び総量共に5時間目にピ-クを達したが、滲出液中には認められなかった。酵素抗体法を用いて、滲出細胞を界面活性剤を含む緩衝液で抽出しIL-1_β抗原量を測ると、218時間目の細胞中に検出され、総量は9時間目にピ-クに達した。そして、524時間目の滲出液中にも検出され、抗原量は5時間目がピ-クで、その量は発熱を起こすに十分の量であったが、血液中には検出されなかった。以上より、IL-1産正のピ-クに当る5時間目の滲出細胞を酵素抗体法で染色すると、滲出細胞の40%がIL-1_βを保有しており、その99%が多核白血球であり、染色の程度は、残りの1%を占めるマクロファ-ジとほぼ同等であった。以上より、ウサギ腹膜炎時の発熱には、炎症早期に滲出した多核白血球がIL-1を合成して滲出液中に遊離する系が関与していると考えられた。
ディスクリプタ表現に基づくダイナミカルシステムの解析と制御系設計

物理システムを考えたとき,時間の経過や環境の変化によりその物理的特性が変化してしまうことがある.このようなシステムの制御をする場合,状態方程式表現に基づく制御法では特性の変化をうまく扱えず,所望の制御性能が得られない,または制御できないことがあった.対象の物理システムをディスクリプタ方程式で記述すれば,もとの物理的な特性を失わずにその変化を精密に捉えることができるため,状態方程式の問題を解決できる.ただ,システムの表現方法として優れたディスクリプタ方程式でも,コントローラを設計した場合に理論的には可能でも実際には実装できないことがあった.本研究では,ディスクリプタ方程式に対する制御系設計法について研究を進展させ,この問題を解決し,以下の1の研究成果を得た.また,この導出過程で得られた知見から,対象システムの特性が変化しない場合であってもコントローラを故意に変化させることで,変化させない場合と比べて高性能な制御が実現できることを分かった.本研究では,そのような可変コントローラの設計法についても新たに考案し,2の成果を得た.これは,ディスクリプタ方程式よりも簡単な場合である状態方程式に対するコントローラ設計法である.1.線形ディスクリプタ方程式に対して,直接実装可能な安定化コントローラとH∞コントローラの設計法について,線形行列不等式(LMI)の形で提案した.2.状態方程式で表現された線形時不変システムを対象として,指定した任意の時間関数よりも速く制御するための線形時変コントローラ設計法を線形行列微分不等式の形で導出した.以上の成果について,学術論文,国際会議,国内学会にて発表した.物理システムを考えたとき,時間の経過や環境の変化によりその物理的特性が変化してしまうことがある.このようなシステムの制御をする場合,状態方程式表現に基づく制御法では特性の変化をうまく扱えず,所望の制御性能が得られない,または制御できないことがあった.対象の物理システムをディスクリプタ方程式で記述すれば,もとの物理的な特性を失わずにその変化を精密に捉えることができるため,状態方程式の問題を解決できる.ただ,システムの表現方法として優れたディスクリプタ方程式でも,コントローラを設計した場合に理論的には可能でも実際には実装できないことがあった.本研究では,ディスクリプタ方程式に対する制御系設計法について研究を進展させ,この問題を解決し,以下の1の研究成果を得た.また,この導出過程で得られた知見から,対象システムの特性が変化しない場合であってもコントローラを故意に変化させることで,変化させない場合と比べて高性能な制御が実現できることを分かった.本研究では,そのような可変コントローラの設計法についても新たに考案し,2の成果を得た.これは,ディスクリプタ方程式よりも簡単な場合である状態方程式に対するコントローラ設計法である.今後はこの結果をディスクリプタ方程式の場合に理論を拡張し,より扱いやすい制御理論を構築する予定である.1.線形ディスクリプタ方程式に対して,直接実装可能な安定化コントローラとH∞コントローラの存在判別条件と設計法について,線形行列不等式(LMI)の形で提案した.2.状態方程式で表現された線形時不変システムを対象として,指定した任意の時間関数よりも速く制御するための線形時変コントローラの存在判別条件と具体的な設計法をRiccati行列微分方程式の形で導出した.以上の成果について,学術論文,国際会議,国内学会にて発表した.物理システムを考えたとき,時間の経過や環境の変化によりその物理的特性が変化してしまうことがある.このようなシステムの制御をする場合,状態方程式表現に基づく制御法では特性の変化をうまく扱えず,所望の制御性能が得られない,または制御できないことがあった.対象の物理システムをディスクリプタ方程式で記述すれば,もとの物理的な特性を失わずにその変化を精密に捉えることができるため,状態方程式の問題を解決できる.ただ,システムの表現方法として優れたディスクリプタ方程式でも,コントローラを設計した場合に理論的には可能でも実際には実装できないことがあった.本研究では,ディスクリプタ方程式に対する制御系設計法について研究を進展させ,この問題を解決し,以下の1の研究成果を得た.また,この導出過程で得られた知見から,対象システムの特性が変化しない場合であってもコントローラを故意に変化させることで,変化させない場合と比べて高性能な制御が実現できることを分かった.本研究では,そのような可変コントローラの設計法についても新たに考案し,2の成果を得た.これは,ディスクリプタ方程式よりも簡単な場合である状態方程式に対するコントローラ設計法である.1.線形ディスクリプタ方程式に対して,直接実装可能な安定化コントローラとH∞コントローラの設計法について,線形行列不等式(LMI)の形で提案した.2.状態方程式で表現された線形時不変システムを対象として,指定した任意の時間関数よりも速く制御するための線形時変コントローラ設計法を線形行列微分不等式の形で導出した.以上の成果について,学術論文,国際会議,国内学会にて発表した.
Interspherical写像と作用素値関数の補間問題

作用素のsphereをsphereに移すinterspherical写像および部分的に定義された作用素値関数を期待される条件を満たして全体に拡大する補間の立場から、極値問題、作用素不等式およびノルム不等式を考察した。主要な結果を以下に述べる。(1)安藤は、作用素平均が写像として各変数に関して単調であることに着目してGolden-Thompsonのtrace不等式を補う下からの評価式の確立に成功した。また、異なるスカラーを中心として作用素の空間での2つのsphereが積写像で移されるとき、その値域を含む最小半径を持つ中心がスカラーのsphereの中心および半径を導出する公式を確立した。(2)中路と高橋は共同して、加重Hardy空間でのToeplitz作用素の可逆性を補間の立場から考察しその形を完全に決定した。また、Toeplitz作用素が準正規性を持つための条件を確立し、exposed関数を求める極値問題に応用した。(3)さらに、中路と高橋は、共同して、関数環の2次元表現は常に連続関数環全体の表現に拡大されることを見いだした。(4)中村はCaratheodory-Fejerの補間定理を応用して非共役作用素環の数域指数、すなわち数域半径とノルムの比の最小値の取り得る範囲を完全に決定した。(5)榊原は一般の*-半群での負定値関数に対するLevy-Khintin型の積分表示を調べた。
森林流域における水質浄化機能に関する水文学的研究

森林流域の水質の特徴は、濁りがなく、pHが中性に近く、窒素など下流の富栄養化の原因物質が少ないこととされる。本研究では、森林流域の渓流水のpHが中性になるプロセス、無機態の溶存窒素が少なくなるプロセスの両者に、雨水が森林土壌を鉛直浸透する水文過程が大きい影響を与えていることを示した。また渓流水のpHが中性になるプロセスには、土壌中の二酸化炭素濃度と土壌鉱物の化学的な風化が大きな影響をもつことをふまえ、土壌中の二酸化炭素濃度が浸透水の水質に与える影響を明らかにするための、カラム浸透実験を行った。従来、実験的に風化現象を扱うことは困難とされてきたが、二酸化炭素濃度を制御した不飽和状態での浸透実験で、土壌中の二酸化炭素濃度が水質に与える影響が明瞭に現れた。土壌中の有機物分解と根の呼吸で形成される土壌中の高い二酸化炭素濃度が、森林流域の水質形成に影響することを実験的に検討したこの研究は、今後幾つかの新しい研究に発展する可能性を持っている。実際の森林流域を対象としては、東京大学千葉演習林の袋山沢試験流域の2流域で水質が観測された。この流域は1999年35月に一方の流域伐採される予定で、伐採による影響が検討される。本研究の期間では、伐採前における当該流域の水質の特徴と物質収支が把握された。本研究は、雨量、流出量が継続的に測定され、斜面の土壌水分量、斜面下端の地下水位観測が詳細に行われている東京大学千葉演習林袋山沢の南谷(1.005ha)と北谷(0.825ha)の隣接する2流域において、水質観測をおこない、1)雨水が林内雨になる過程、2)土壌に浸透した水が斜面を流下する過程、3)斜面下端に存在する地下水帯に滞留する過程、4)地下水が湧出して渓流を流下する過程のそれぞれで過程での水質変化を追跡するものである。・水文観測降水量、林内雨量、樹幹流下量、流出量(南谷、北谷)、土壌水分量(流域内10地点)、地下水位(流域内約20地点)の計測を年間を通して継続した。・水質分析用試料採水毎週1回、雨水、渓流水(南谷、北谷の量水地点)、飽和地下水、土壌水を採取した。また、試料採取時に、現場で電気伝導度、pH、水温を測定した。水質分析本年は、雨水が流出水となる過程で森林流域が水質変化に与える影響を、"水質形成機構"の面から明らかにする前段階として、一年間の計測による各物質の物質収支が算定された。南谷と北谷の流出水はほぼ同じ水質であるが、NO_3^-濃度は両者で差が見られた。この差は、水文観測の結果と対比すると、渓流沿いの飽和地下水の存在と対応するものと考えられる。本研究は、順調に進んでいる。本研究は、雨量、流出量が連続的に測定され、斜面の土壌水分、斜面下端の地下水位が詳細に計測されている東京大学千葉演習林袋山沢の南谷、北谷の隣接する2流域において、水質計測をおこない、A.ヒノキ、スギ壮齢林に覆われた流域の物質収支を明らかにし、それを踏まえて、B.流域内での水質変化を追跡することを目的としている。流域内の水質形成は、1)雨水が樹冠を通過する過程、2)土壌浸透の過程、3)斜面下部の飽和地下水帯に滞留する過程、4)地下水が湧出して渓流を流下する過程で生起するので、それぞれの過程での水質変化を追跡する。本年は、雨水、林内雨、地下水、渓流水の水質分析資料が1年分蓄積されたので、Cl^-、NO_3^-、SO_4^<2->、K^+、Na^+、Ca^<2+>、Mg^+、SiO_2について2流域の物質収支が得られた。2流域の差異はNO_3^-を除いて小さい結果であった。が2流域で異なることは、渓流沿いに存在する飽和地下水帯が一方の流域では通年存在しているのに対し、他方は無降雨が続く渇水期に消滅することに対応して、飽和帯で起きる脱窒が異なることによると解析された。

また本年度は、森林が水質形成に与える影響の一つとして、有機物分解などによる大気に比べ著しく高い土壌中二酸化炭素濃度が浸透過程の水質形成に与える影響を実験的に明らかにする研究に着手した。豊浦標準砂を詰めた2本のカラムを用い、一方を森林土壌中で計測される二酸化炭素濃度の上限と考えられる10%に制御し、他方を大気濃度下においた浸透実験を進めた。この結果、高い土壌中二酸化炭素のカラムは、SiO_2、Ca^<2+>、Mg^+の流出が著しく増加し、植生が土壌中二酸化炭素濃度の上昇を通して、鉱物の風化に影響を与え、結果として流出水の水質に影響を与えているというプロセスを新たに確認すことになった。これらの成果は、いずれも学会誌投稿準備中である。森林流域の水質の特徴は、濁りが無く清澄であること、pHが中性に近いこと、窒素など下流の富栄養化の原因物質が少ないこととされる。本研究は、雨量、流出量が連続的に測定され、斜面の土壌水分、斜面下端の地下水位が詳細に計測されている東京大学千葉演習林袋山沢の南谷、北谷の隣接する2流域において、濁りに関わる浮流土砂測定、pH形成と風化に関係して水質形成ににかかわる土壌中二酸化炭素濃度の動態、硝酸体窒素を含む流域の物質収支を測定して、森林における水質浄化機能を明らかにした。また、室内実験によって大気に比べ著しく高い土壌中二酸化炭素濃度が浸透過程の水質形成に与える影響を調べた。浮流土砂計測では、自動採水器による採水試料を用いた計測と濁度計による計測の併用が有効であることを提示し、詳細な浮流土砂流出の実態把握が進み、年間流出量も推定された。隣接する2流域の物質収支はCl^-、NO_3^-、SO_4^<2->、K^+、Na^+、Ca^<2+>、Mg^+、SiO_2の各物質について得られたが、2流域で差が生じたのはNO_3^-で、飽和帯で起きる脱窒が異なることによると解析された。土壌中二酸化炭素濃度は、温度と土壌水分に影響される土壌中有機物の分解と土壌水分で変わるガス拡散係数の影響を受けて変化することが示された。森林土壌中で計測される二酸化炭素濃度の上限と考えられる10%に制御し、他方を大気濃度下においておこなった浸透実験では、、高い土壌中二酸化炭素のカラムは、SiO_2、Ca^<2+>、Mg^+の流出が増加し、植生が土壌中二酸化炭素濃度の上昇を通して、鉱物の風化に影響を与え、結果として流出水の水質に影響を与えているというプロセスを新たに確認した。以上の成果より、森林流域が水質の良好な水を供給するメカニズムについての理解を深化させることができた。
不斉生合成を指向したディールス・アルドラーゼの機能解析と新規デカリン誘導体の創製

不斉炭素に富んだ複雑な骨格は天然物の最たる特徴であり、立体化学が異なると生物機能が大きく変化する。よって、天然物の生合成経路において立体化学を規定する鍵酵素を特定し、その厳密な選択性を自在に操ることができれば、天然にはない立体化学を有する新規複雑骨格分子の創製が可能となる。本研究は、[4+2]環化付加反応を介した立体選択的デカリン形成を触媒する酵素Fsa2とそのホモログを対象に、酵素の構造機能相関の理解とそれに基づく非天然型構造を有する複雑骨格分子の創製を目指した。Fsa2が関与する生合成経路の最終産物であるエキセチンと鏡像異性体の関係にある類縁化合物フォマセチンを対象に解析を行った。生産菌のゲノム解読とそれに次ぐノックアウト実験により、フォマセチンの生合成遺伝子を同定し、Fsa2ホモログであるPhm7が、Fsa2と同様、[4+2]環化付加反応を介した立体選択的trans-デカリン形成を担っていることを明らかにした。さらに、Phm7が関与する[4+2]環化付加反応について、その反応経路と立体選択性に関する知見を得るため、密度汎関数計算解析を行ったところ、phm7遺伝子欠失株の代謝物プロファイルをよく支持する結果が得られた。phm7遺伝子をfsa2遺伝子に置換した遺伝子改変糸状菌から得られたフォマセチン誘導体は、非天然型立体配置のデカリン骨格を有していた。理論計算から、その生成にはより高い活性化障壁の遷移状態を経る必要があることが示され、酵素の立体配置の制御、すなわち環化付加反応で生じる4カ所すべての不斉点の立体配置を制御していることが明らかとなった。本成果は、[4+2]環化付加反応を担う遺伝子の改変によって、非天然型環構造を持つ天然物誘導体の創出に成功した最初の例となった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、[4+2]環化付加反応を介した立体選択的デカリン形成を触媒する酵素Fsa2とそのホモログを対象に、それらの機能と構造を比較解析することで、Fsa2ファミリーに属する酵素が触媒する反応を分子レベルで理解することを目指している。本年度は、複数のエキセチン類縁化合物の生産菌についてゲノム解読を行い、生合成遺伝子クラスターの候補を取得した。そのうち、Pyrenochaetopsis sp. RK10-F058株の培養物からphomasetinとその関連化合物を取得するとともに、ノックアウト実験を行うことで、phomasetin生合成遺伝子クラスターを同定した。遺伝子欠失株の解析の過程で得られる関連化合物の各種スペクトルデータを収集、比較解析した。そこに理論計算を組み合わせることで、絶対立体構造を含む、デカリン化合物の効率的な構造同定が可能となった。ノックアウト実験と代謝物解析から、fsa2ホモログであるphm7もまた立体選択的デカリン形成に関与していることを明らかにした。本酵素ファミリーの結晶構造解析に向け、Hisタグ融合タンパク質の大腸菌発現系を構築し、組換えFsa2およびPhm7の大量精製に成功した。また、Fsa2が関与する反応について、モデル基質を用いたDFT計算を行うことで、非酵素条件下での反応経路および立体選択性に関する知見を得た。1. 4種類の立体化学の各々複数のエキセチン類縁化合物の生産菌についてゲノム解読を行い、生合成遺伝子クラスターの候補を取得した。ノックアウト実験を行うことで、fsa2ホモログを同定することに成功した。これまでに取得した関連化合物のスペクトルデータの比較解析により、効率的な構造決定が可能となった。特に、絶対立体構造の推定において、CDスペクトラムについては理論計算と実測値とを比較する方法を整備した。2. Fsa2の関与する反応について、モデル基質を用いたDFT計算を行った。基質ミミックの合成については、SNAC体の合成が困難であることが判明した。その過程で得られた類縁体を用いて、in vitro反応を行うことを検討中である。組換えFsa2およびPhm7の大腸菌発現系を構築し、NiNTAアフィニティー精製により、精製酵素を取得した。