hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高齢者における長期温水浴が止血機能に与える効果に関する研究

高齢者(脳梗塞既往者及び血栓性疾患のない者)において、38°C、30分間の微温浴中には、血中Noradrenalin(NAd)が低下し、交感神経系の抑制効果が期待された。また、脳梗塞既往者では、出浴後にplasminogen activator inhibitor type-1(PAI-1)抗原量が有意に減少し、血栓形成傾向が改善される可能性が見られリハビリテーションとしての有効性も示唆された。高齢者の入浴では、入浴前後や室内外の温度差による血圧の大きな変動や出浴後の脱水に注意して、安全で効果的な入浴法を確立すれば、今後の梗塞の再発防止や予防に有効となる可能性が考えられた。本年度は、(1)発汗障害のある患者で、38°C、30分間の微温浴を施行した。体温もわずかな上昇傾向を認めたのみで、循環系にも負担は認めず、血中NAdレベルの低下を認め、交感神経系の抑制が示唆された。また、PAI-1抗原量の有意な減少も見られ、抗血栓効果が示唆された。発汗障害のある患者においても、有効かつ安全性である事が示唆された。(2)降圧剤や抗血小板剤等を服用していない事を確認した血栓性疾患のない高齢者で、38°C、30分間の微温浴を日常の習慣として利用した場合の効果について検討した。早朝空腹時に採血をし、その翌週から週に1回、38°C、30分間の微温浴を4週間に亘って行った。そして、第5週目には、再度早朝空腹時に採血した。第5週目には血中Adrenalin(Ad)レベルが低下し、交感神経系の緊張状態がとれる可能性が示唆された。また、PAI-1抗原量の有意な減少に加え、血小板分子マーカーであるβ-トロンボグロブリン(β-TG)、血小板第4因子(PF4)の有意な減少も見られ、抗血小板効果が示唆された。血栓性疾患におけるリスクファクターにも低下が認められ、抗血小板剤を使用している血栓性疾患に対するリハビリテーションやその予防法としての有効性が示唆された。降圧剤や抗血小板剤等を服用していない事を確認した健常男性で、室温29°C、相対湿度40%に調節した人工気候室内において、38°C、30分間および42°C、15分間の入浴を行った。実験中は、非観血式連続血圧測定装置、JENTOW-7700(日本コーリン社)を装着し、脈拍数、血圧をモニターしながら、座位安静30分後に入浴を開始した。採血は入浴前、入浴30分時そして出浴30分後の計3回行った。1.38°C、30分間の場合2.42°C、15分間の場合入浴時、収縮期血圧に変化は見られず、脈拍数は直後から著しく増加し、また二重積も増加した。自律神経指標は、心臓β作動性交感神経指標であるLF/HFppの増加傾向と心臓副交感神経指標であるHFppの減少傾向が見られ、心負荷が増加した。止血機能は、tissue plasminogen activator(t-PA)抗原量の増加によると思われるELTの短縮が見られ、線溶能の亢進が示唆された。次に、38°C、30分間の入浴が高齢者(脳梗塞既往者及び血栓性疾患のない者)の自律神経機能及び止血機能について検討した。3.高齢者では入浴中に自律神経指標に変動は見られなかったが、血中Noradrenalin(NAd)が低下し交感神経系が抑制された状態にあることが示唆された。また、出浴後には特に脳梗塞既往者群でPAI-1抗原量が有意に減少し、血栓形成傾向が改善される可能性が見られリハビリテーションとしての有効性も示唆された。詳細については現在検討中である。

第5週目には血中Adrenalin(Ad)レベルが低下し、交感神経系の緊張状態がとれる可能性が示唆された。また、PAI-1抗原量の有意な減少に加え、血小板分子マーカーであるβ-トロンボグロブリン(β-TG)、血小板第4因子(PF4)の有意な減少も見られ、抗血小板効果が示唆された。血栓性疾患におけるリスクファクターにも低下が認められ、抗血小板剤を使用している血栓性疾患に対するリハビリテーションやその予防法としての有効性が示唆された。
アドホックネットワークによる協力端末で実現するセルラMIMO空間多重伝送

本研究では,高速伝送での必要帯域を削減するためにMIMO (Multi-Input Multi-Output)チャネル伝送と呼ばれる技術の利用を検討した。MIMOは複数送受信機を必要とするため負担が大きいが,アドホックネットワークによる協力端末グループを利用して,1送受信機による実現を目指した。本研究の特徴は,そのままでは著しく送信電力が増えてしまう高速大容量移動通信について,アドホックネットワークとMIMOチャネル伝送を効果的に結合する点にある。アドホックネットワークでは多数の端末による中継が行われる。むしろ不要な中継を抑えることが重要な課題である。本研究では,送信端末が近傍端末とアドホックネットワークを構成して協力端末を得て,それら端末群から同時に同一周波数でMIMO空間多重伝送を行うことを提案し研究を行った。これによって周波数利用効率を高める必要のある基地局までの比較的長い通信の周波数利用効率が改善され,結果的に帯域を求めて高い周波数へ移動する必要性が減少する。同時に,複数端末からの分散送信となるため,1端末あたりで見れば送信電力の問題も緩和される。制御を適切に行えば,建物の影などで特に受信レベルが低くなる場所から,良好な伝搬環境に位置する端末に送信を依頼することができ,システム全体としてはさらに送信電力問題が改善できる。1.16年度に明らかにしたシステムの効率改善効果を具体的にするために,アドホックネットワークの構成技術について研究を行い,協力中継の有効性を明らかにした。2.協力中継を行う場合でも,その中継局の配置や数によって伝送特性が異なることを指摘し,改善手法を提案した。3.アドホックネットワーク側での伝送特性を確保するために端末間の同期アルゴリズムについて研究を行い,良好な同期特性が得られるアルゴリズムを提案した。4.更に,これらアドホックネットワークのフィールド実験準備を進めた本研究では,高速伝送での必要帯域を削減するためにMIMO(Multi-Input Multi-Output)チャネル伝送と呼ばれる技術の利用を考える。MIMOは複数送受信機を必要とするため負担が大きいが,アドホックネットワークによる協力端末グループを利用して,1送受信機による実現を目指す。本年度の研究成果は以下のとおりである。●MIMO受信信号処理を考慮した端末間通信について具体的に検討した●計算しシミュレーションによって,最大4倍程度の周波数利用効率が得られることを明らかにした●フィールド実験の準備を進め,無線局免許を取得した●初期のフィールド実験によって,基本的な伝送実験に成功した本研究では,高速伝送での必要帯域を削減するためにMIMO (Multi-Input Multi-Output)チャネル伝送と呼ばれる技術の利用を検討した。4.更に,これらアドホックネットワークのフィールド実験準備を進めた
心停止後症候群に対する運動誘発電位を用いた低体温療法の治療適応に関する研究

心臓が停止したあとに、心臓マッサージにより自身の心臓が動き出すことは知られています。心臓が動き出した後は、その原因治療を行わなくてはいけませんが、心臓が止まった際に脳に酸素が到達しない影響で、意識が回復しないことがあります。これに対して、体温を管理する治療法を行うことにより意識が回復する症例を経験します。しかしながら、意識が回復することを早期に予測することは非常に困難です。私達は、電気生理学的な評価を行い、意識が回復する可能性の高い患者さんを選り分けるための研究を行いました。手足を動かす運動神経を刺激して電位が記録される場合に、予後が良好な患者さんが含まれていることを確認しました。前年度までの研究(23592685)では、昏睡を合併した心停止蘇生後脳症の予後評価を早期に行う手段として体性感覚誘発電位:SEPの有用性を結論付けられた。しかしながら、SEPにおける大脳皮質感覚領野の誘発電位を意味するN20(潜時20msに記録される陰性の波)の出現は意識が回復するために必要な条件であるが、N20が存在するからといって意識障害が改善するわけではない。本研究では、SEP以上に脳虚血に鋭敏な運動誘発電位:MEPを用いて意識回復が期待できる患者の絞り込みに関する研究を開始した。研究では予想以上の症例数を上半期で経験できたが自身の異動により研究が一時的にストップした部分が多少影響しており対象症例を50例と見込んでいたが34例においてSEPとMEPの記録を行うことが出来た。来院直後にSEPを施行した34例のうちN20が記録できた例は26例であった。同時に記録したMEPでは20例に大脳皮質運動野に相当する電位が記録された。さらにはMEP運動領野成分が記録された症例は全例SEP N20が認められた。つまりMEP運動領野成分のみが記録された症例は認めなかった。以上のことから、脳低温療法を施行する前に行う電気生理学的検査において従来報告したSEP N20よりもMEP運動領野成分の記録の方が予後良好例の症例絞り込みが可能であった。昏睡を合併する心停止蘇生後症候群に対する予後評価に虚血に鋭敏である大脳皮質運動領野を反映するMEPを施行することは病院前の情報(心停止時の心電図。目の前で倒れる現状を見たかどうか。すぐに心肺蘇生を開始したかどうか)のみの情報より予後良好な患者を選択できる可能性を示している。心停止による全脳虚血によりその機能が完全に停止した後に発生する昏睡状態時の超早期に予後を判定する手段は今までにない。これに対して前回の研究(23592685)では体性感覚誘発電位(SEP)におけるN20(SEPの記録において潜時20msに記録される大脳皮質感覚領野における活動電位)がその手段としてなり得る可能性を示した。今回はさらに特異度を上げるために大脳皮質領野における活動電位(MEP)の記録を施行した。対象症例は56例で、51例においてSEPとMEPの記録を行うことが出来た。来院直後にSEPを施行した51例のうちN20が記録できた例は35例であった。同時に施行したMEPの運動領野成分の電位が記録できたのは27例であった。MEPにおける運動領野成分が記録された症例では全例においてSEP N20が記録された(MEPにおいて大脳皮質領野に相当する活動電位が記録されて、SEP N20に記録されない症例は存在しなかった)。MEPは温度管理を施行するために鎮静薬、麻酔薬、筋弛緩薬を使用すると記録の再現性に問題があり、様々な集中治療が開始されると記録が不安定になり所見の有無を同定することが困難であった。現状におけるガイドラインには、心停止から少なくとも48から72時間での電気生理学検査の有用性が中心となっており、いわゆる低体温療法を含めた温度管理を行う前の臨床設定ではその有用性は明らかにされていない。今回の結果から、脳低温療法を含めた温度管理により予後良好が期待できる症例の絞り込みにより、院外心停止後、自己心拍再開したにもかかわらず昏睡状態が継続する、いわゆる心停止後症候群を合併している症例に対する症例には、SEP N20以上に、MEP大脳皮質誘発電位の可能性についてさらなる症例の絞り込みが期待できる。症例数の蓄積は、昨年度の異動により減少したが今年度は症例数を確保できたので昨年度の達成状況:やや遅れているからおおむね順調に進展していると修正した。記録に関しても56例中51例においてSEPとMEPの両者に記録が可能であった。こうしたことから研究の基本設定には大きな問題は生じていない。昨年度の症例数と合わせて、SEPとMEPの両者の検査を施行で来た例数は、昨年度34例、今年度51例であった。心停止後に自己心拍が再開したにもかかわらず昏睡状態が改善しない心停止蘇生後症候群を合併する患者において、搬送直後の時間帯に神経学的予後を予想する手段は現在のところ全くない。少なくとも電気生理学的検索では、発症から72時間後にSEP N20が認められない場合に予後不良であるといった事実がある。この場合、発症から時間が72時間経過した時点での判断であることとSEP N20が認められない時の神経学的予後が不良であることを示している。

しかしながら、現場の臨床では温度管理療法における脳低温療法においても神経学的予後の期待できる症例は50%前後であることから、温度管理する前の状態で神経学的予後の良好となる症例群の洗い出しが非常に重要になってくる。対象症例は42例で、34例にSEPとMEPを来院直後に同時に行った。このうちSEPにおいてN20が記録されたものは21例であった。MEPにおいて運動領野の領域に一致する部位に活動電位を認めたのは15例であった。この15例においては全例SEPにおいてN20が認められた。SEPにおいては継続的な記録に関して大きな問題はないが、MEPに関しては鎮静薬、鎮痛薬、筋弛緩薬の使用状況により記録が不安定になることを良く経験した。さらにSEPにおいて大脳皮質成分が記録された15例においては14例において意識が回復した。その一方で大脳皮質成分が認められなかった症例群は全例意識の回復を認めなかった。今回の結果から、温度管理療法を含めた脳低温療法の予後良好例の絞り込みとして、来院直後のSEP N20陽性、MEP大脳皮質成分陽性の場合に可能である結果が示唆された。症例数の蓄積が少ないためにやや遅れているとした。これは単に搬送された症例数が少ないことを示しており、来院した症例に対してはシステムが整備されており網羅して対応可能であった。しかしながら、対象となった症例のデータ解析が進行しなかったために内容を学会発表に間に合わせて抄録提出することが出来なかった。昏睡を合併する心停止蘇生後症候群に対する神経学的予後の早期予測は困難であるとされ、現在のところ、来院直後の初療室で有用な評価方法はない。そのため、神経学的予後が良好であることを期待される症例のみに集学的な治療を行うことが困難となっている。予後良好であることが期待できる症例に対してその後の体温管理療法を含めた集中治療を行うことは、人的及び物的に資源を集約化できる利点がある。そうした現状から、予後評価のうち、最も客観的で迅速性のある検査方法として有力な電気生理学的手法を用いた手法の可能性を強調してきた。電気生理学的検査の中でも体性感覚誘発電位N20に関しては、早期予後を予測できる可能性を前回の研究で報告した。今回は体性感覚誘発電位より虚血時の電位変化の感度が高いとされる運動誘発電位を用いて、今までの予後評価より感度の高いものとなるかどうかの検討を行った。その結果として、体性感覚誘発電位N20よりも運動誘発電位の方が神経学的予後良好例の集約に関して可能性の高いことが示された。体性感覚誘発電位N20では、初療時に認められたN20が、心停止24時間後の時点で消失する現象が記録されていたが、そうした症例では、運動誘発電位が記録されなかった。以上の事実から昏睡を合併した心停止蘇生後症候群の神経学的予後の症例の絞り込みには、体性感覚誘発電位N20よりも運動誘発電位が有用である可能性が示唆された。心臓が停止したあとに、心臓マッサージにより自身の心臓が動き出すことは知られています。心臓が動き出した後は、その原因治療を行わなくてはいけませんが、心臓が止まった際に脳に酸素が到達しない影響で、意識が回復しないことがあります。これに対して、体温を管理する治療法を行うことにより意識が回復する症例を経験します。しかしながら、意識が回復することを早期に予測することは非常に困難です。私達は、電気生理学的な評価を行い、意識が回復する可能性の高い患者さんを選り分けるための研究を行いました。
各種耳疾患における側頭骨の発育状況の検討

メニエール病,慢性中耳炎,耳硬化症の側頭骨CT画像診断には病的所見など質的な解析が主体であり,側頭骨の発育のような量的な解析の研究は少ない.そこで本研究では内耳ターゲットCT画像を用いて各種耳疾患の側頭骨の発育状況を検討し,臨床診断上での有用性について考察した.対象疾患は,両側メニエール病13例,一側メイエール病41例,耳硬化症12例,一側慢性中耳炎25例とした。方法は,外側半規管が半円状に明確に撮影されている内耳ターゲットCT画像を計測用に各症例左耳右耳1枚づつ選択し,この画像を一旦35mmスライドフィルムに撮影した.フィルムスキャナーにてコンピュータに取り込み,コンピュータ画面上でNIH image計測ソフトにて内耳各部位の長さおよび面積を計測した.計測部位は,1.後半規管から後頭蓋窩錐体縁の最短距離(P-P距離),2.後半規管から外側半規管の最短距離(P-L距離),3.前庭の後端から後頭蓋窩錐体縁の最短距離(V-P距離),4.後半規管からS状静脈洞前端の最短距離(P-S距離),5.乳突蜂巣面積,以上の5項目とし,統計的な検討を加えた.その結果,後頭蓋窩側の側頭骨の発育(P-P距離,V-P距離)が最も悪いのは,両側メニエール病先発耳であり,次いで両側メニエール病後発耳と一側メニエール病患側であった.逆に最も発育が良かったのは耳硬化症(両側)であり,その中間に一側メニエール病健側と一側慢性内耳炎(両側)が位置していた.一方,乳突蜂巣面積では,一側慢性中耳炎の患側が最も小さく,次いでメニエール病(両側性,一側性とも)であり,耳硬化症(両側)が最大であった.各疾患の側頭骨発育に有意差が認められることは,診断的に利用可能であると考える.またメニエール病や耳硬化症における発育の差の要因として幼児期のウイルス感染も一因ではないかと考察し,今後は主としてメニエール病内リンパ嚢等のウイルス検索が必要な課題であると思われる.メニエール病,慢性中耳炎,耳硬化症の側頭骨CT画像診断には病的所見など質的な解析が主体であり,側頭骨の発育のような量的な解析の研究は少ない.そこで本研究では内耳ターゲットCT画像を用いて各種耳疾患の側頭骨の発育状況を検討し,臨床診断上での有用性について考察した.対象疾患は,両側メニエール病13例,一側メイエール病41例,耳硬化症12例,一側慢性中耳炎25例とした。方法は,外側半規管が半円状に明確に撮影されている内耳ターゲットCT画像を計測用に各症例左耳右耳1枚づつ選択し,この画像を一旦35mmスライドフィルムに撮影した.フィルムスキャナーにてコンピュータに取り込み,コンピュータ画面上でNIH image計測ソフトにて内耳各部位の長さおよび面積を計測した.計測部位は,1.後半規管から後頭蓋窩錐体縁の最短距離(P-P距離),2.後半規管から外側半規管の最短距離(P-L距離),3.前庭の後端から後頭蓋窩錐体縁の最短距離(V-P距離),4.後半規管からS状静脈洞前端の最短距離(P-S距離),5.乳突蜂巣面積,以上の5項目とし,統計的な検討を加えた.その結果,後頭蓋窩側の側頭骨の発育(P-P距離,V-P距離)が最も悪いのは,両側メニエール病先発耳であり,次いで両側メニエール病後発耳と一側メニエール病患側であった.逆に最も発育が良かったのは耳硬化症(両側)であり,その中間に一側メニエール病健側と一側慢性内耳炎(両側)が位置していた.一方,乳突蜂巣面積では,一側慢性中耳炎の患側が最も小さく,次いでメニエール病(両側性,一側性とも)であり,耳硬化症(両側)が最大であった.各疾患の側頭骨発育に有意差が認められることは,診断的に利用可能であると考える.またメニエール病や耳硬化症における発育の差の要因として幼児期のウイルス感染も一因ではないかと考察し,今後は主としてメニエール病内リンパ嚢等のウイルス検索が必要な課題であると思われる.各種耳疾患における「側頭骨の発育」という観点から内耳ターゲットCTを用いて検討した.外側半規管が半円状に明確に撮影されている内耳ターゲットCT画像スライスを計測用に選択し,この画像をスキャナーにてコンピュータに取り込み,コンピュータ画面上で解析ソフトウエア(NIHimage1.24およびPhotoshop)にて内耳各部位の長さを計測した.計測したCT上の箇所は以下の4ケ所である.(1)後半規管から後頭蓋窩錐体縁の最短距離(P-P距離)(2)後半規管から外側半規管の最短距離(P-L距離)(3)前庭の後端から後頭蓋窩錐体縁の最短距離(V-P距離)(4)後半規管からS状静脈洞前端の最短距離(P-S距離)

対象疾患は現在までのところ,両側メニエール病13例,一側メニエール病38例,耳硬化症14例であるが,コントロール群として慢性中耳炎25例を含めた.今年度は主としてメニエール病について検討し,上記4ケ所の計測部位の中でも特に後半規管から後頭蓋窩錐体縁の最短距離(P-P距離)と前庭の後端から後頭蓋窩錐体縁の最短距離(V-P距離)が慢性中耳炎群に比較して有意に短いことが判明した.この傾向は特に両側メニエール病で顕著であり,メニエール病では内リンパ嚢や内リンパ管が位置する周辺の骨の発育障害があることがわかった.この要旨は第54回日本平衡神経科学会総会のプレシンポジウム「末梢性前庭障害の臨床と成因-特に両側障害例について-」の中で「側頭骨の形態からみた両側前庭障害」と題して講演した.現在はこの講演をもとに論文を作成中である.メニエール病の原因を遺伝性とか先天性であるという意見があるが,メニエール病で見られる後頭蓋窩側の骨の発育障害の原因として幼児期にウイルス等の感染が考えられ、後天性の疾患であると考察した.メニエール病,慢性中耳炎,耳硬化症の側頭骨CT画像診断には病的所見など質的な解析が主体であり,側頭骨の発育のような量的な解析の研究は少ない.そこで本研究では内耳ターゲットCT画像を用いて各種耳疾患の側頭骨の発育状況を検討し,臨床診断上での有用性について考察した.対象疾患は,両側メニエール病13例,一側メニエール病41例,耳硬化症12例,一側慢性中耳炎25例とした.方法は,外側半規管が半円状に明確に撮影されている内耳ターゲットCT画像を計測用に各症例左耳右耳1枚づつ選択し,この画像を一旦35mmスライドフィルムに撮影した.フィルムスキャナーにてコンピュータに取り込み,コンピュータ画面上でNIH image計測ソフトにて内耳各部位の長さおよび面積を計測した.計測部位は,1.後半規管から後頭蓋窩錐体縁の最短距離(P-P距離),2.後半規管から外側半規管の最短距離(P-L距離),3.前庭の後端から後頭蓋窩錐体縁の最短距離(V-P距離),4.後半規管からS状静脈洞前端の最短距離(P-S距離),5.乳突蜂巣面積,以上の5項目とし,統計的な検討を加えた.その結果,後頭蓋窩側の側頭保熱の発育(P-P距離,V-P距離)が最も悪いのは,両側メニエール病先発耳であり,次いで両側メニエール病後発耳と一側メニエール病患側であった.逆に最も発育が良かったのは耳硬化症(両側)であり,その中間に一側メニエール病健側と一側慢性中耳炎(両側)が位置していた.一方,乳突蜂巣面積では,一側慢性中耳炎の患側が最も小さく,次いでメニエール病(両側性,一側性とも)であり,耳硬化症(両側)が最大であった.各疾患の側頭骨発育に有意差が認められることは,診断的に利用可能であると考える.またメニエール病や耳硬化症における発育の差の要因として幼児期のウイルス感染も一因ではないかと考察し,今後は主としてメニエール病内リンパ嚢等のウイルス検索が必要な課題であると思われる.
中枢神経回路の障害と修復を制御する生体システムの統合的研究

本研究では、中枢神経回路の障害、その後の修復過程を、生体システムの機能ネットワークの観点から解析し、生体システムの時空間的ダイナミクスによる一連の過程の制御機構の解明に取り組んだ。中枢神経回路障害と機能回復の過程を、生体システム全体のダイナミクスとして捉え、各システムの連関を統合的に解析することで、中枢神経回路障害における生体の動作原理を明らかにすることができた。マウスの片側大脳皮質の挫傷、脊髄損傷および局所脳脊髄炎(EAE)における、様々な細胞群の空間的・時間的な変動と遺伝子発現について解析を進めた。オリゴデンドロサイト、ミクログリア(M1, M2)、マクロファージ(M1, M2)、helperT細胞(Th1, Th2, Th17, Tregなど)、新生血管細胞(CD105陽性細胞)などの挙動を、FACSを用いて解析し、結果を得た。また中枢神経回路の損傷および修復の過程で、免疫系細胞がどのような役割を担っているかを明らかにしている。免疫系細胞としては、helper T細胞、ミクログリア、マクロファージの関与について検証する。具体的には1helperT細胞による神経回路の修復機構、2ミクログリアによる神経回路の障害と修復機構、そして3マクロファージによる神経回路の障害機構について明らかにすることを目的として、研究を進めている。さらに、本研究では、神経回路の修復の場面で新生血管が担う役割を明らかにすることを目的としている。神経回路の修復を促す脈管系細胞由来の因子による髄鞘の再形成への関与について研究を進めており、その分子メカニズムの一端を解明した。「免疫系細胞による神経回路障害と修復の制御機構の解明」というテーマに関しては、以下のような結果を得た。グリア細胞などに発現する軸索再生阻害因子は、成体の神経回路の安定性を保つ役割を担う。特にRGMという因子は強い軸索伸展阻害作用をもち、中枢神経障害後にこの因子の機能を抑制することで、中枢神経回路の修復を促進することができる。一方でRGMは、自己免疫性脳脊髄炎の発症および寛解過程において、免疫系を制御する役割を担っている。すなわちRGMは樹状細胞によるT cellsの活性化に必須であり、抗RGM中和抗体の投与によって脳脊髄炎の発症が抑制される。当該年度においては、脳脊髄炎病態下で、Th17細胞に発現するRGMが神経変性を誘導することを明らかにし、論文報告した。一方で我々は、RGMが血管内皮細胞にも働きかけることを見いだした。RGMはin vitroで血管内皮細胞の管腔形成を抑制する。さらにin vivoの新生血管形成モデルを用いた実験においても、RGMは新生血管の形成を抑制することがわかった。さらにミクログリアおよびマクロファージの役割についても研究を進めており、それらの細胞が神経回路障害と修復に深く関与していることがわかってきている。「脈管系細胞による神経回路障害と修復の制御機構の解明」というテーマに関しては、prostacyclinなどの因子が、髄鞘形成を促進するなどの結果を得た。特に髄鞘形成に関与する複数の因子を同定することができた。本研究において、マウス脳脊髄炎病態下で、Th17細胞がRGMを介して神経細胞および軸索の変性を直接誘導することを明らかにした。本知見はhelperT細胞による神経・軸索変性のメカニズムを初めて明らかにしたものである。さらに免疫系の関与として、ミクログリアの機能に関する研究を進めた。発達期の皮質脊髄路ニューロンの生存と誘導を脳の免疫系細胞であるミクログリアが支えていることを明らかにした。この研究を土台として、さらにミクログリアが軸索の経路に集積するメカニズムの解析を進め、候補分子を絞り込むことに成功した。本研究では、脈管系が中枢神経回路障害と機能回復過程をどのように制御するかについても検証している。中枢神経を傷害する様々な疾患によって炎症が惹起され、この炎症に伴い、新生血管が生成される。この新生血管が、皮質脊髄路の軸索枝形成の速度を速め、運動機能の回復を促進していることを、局所脊髄炎モデルを用いて突き止めていた。本研究ではさらに、新生血管から分泌される様々な因子が再髄鞘化を促進する効果をもつこと、pericyte lossを抑制することを明らかにした。以上の発見によって、神経回路の修復過程には、神経系以外の生体システムが重要な役割を演じているという新たなコンセプトを確立するとともに、その全体像の解明を順調に進めることができている。なかでも全身の多彩な臓器が神経回路の修復を制御するというエビデンスを得ることができたこと、また進行型多発性硬化症の分子標的を見いだすことができたことが特筆すべき成果である。当初は免疫系と脈管系の関与を明らかにすることを目標としていたが、本研究期間において、さらに広範囲の生体システムが神経回路の修復に関わることを発見した。また本研究成果を基盤として、治療法のない難治性疾患に対する創薬研究へと繋がっていった。さらに血管系の関与について、複数の因子を同定し、これらの因子による神経回路修復機構を明らかにすることができた点は、当初の目標に向けて順調に研究が進んだものと自己評価する。これらの知見によって、神経回路の修復過程には、神経系以外の生体システムが重要な役割を演じているという新たなコンセプトを確立した。その規模は当初の予想よりも大きく、さらにダイナミックなものであった。本研究期間のうちにその全貌を明らかにしたいと考える。また免疫系で得られた成果の一部は、治療法がない進行型多発性硬化症に対する新たな治療法の開発に繋がった。これらは当初の目標を超える研究の進展であり、予定以上の成果が見込まれると考える。

中枢神経障害の病態形成と機能回復の過程には、中枢神経系以外の生体システムが重要な役割を担っていることに着目して本研究を進めた。例えば炎症に伴って生じる新生血管がprostacyclineを分泌することで、軸索分枝を伸展させ、皮質脊髄路の修復を促進することを発見した。また免疫反応を担当するミクログリアが、発達段階において皮質脊髄ニューロンの生存を維持し、軸索の誘導を助けることを発見し、その分子メカニズムを明らかにした。本研究において、精神発達障害や末梢神経疾患においても、神経回路の修復という観点からのアプローチが有効であることを明らかにした。例えば、染色体微小重複による神経発達障害において、神経細胞を取り巻く細胞におけるprotocadherin-19の発現変化によって、神経回路の形成異常がおこることを見出した(Mol. Psychiatry, 2017)。また、cohesinの機能不全によって免疫系細胞におけるinterferonの発現が変化し、ADHD症状が出現することを示した(J. Exp. Med., 2017)。さらに神経障害性疼痛において、netrin-4により脊髄内介在ニューロンの回路異常が引き起こされ、疼痛過敏症状を発現させることを示した(J. Exp. Med., 2016)。これらの成果により、「生体システムによる神経回路の障害と修復の制御」の研究は、当初の予想を超えて、多くの臓器が幅広い神経疾患の病態形成に関与していることを明らかにした。当該研究によって、神経回路の修復過程には、神経系以外の生体システムが重要な役割を演じているという新たなコンセプトを確立するとともに、その全体像の解明を順調に進めることができた。本研究の当初計画として、局所中枢神経障害に限定し、免疫系と脈管系にフォーカスして生体システムと神経の連関の解明を目指した。具体的には、免疫系および脈管系が局所中枢神経回路障害と機能回復過程をどのように制御しているかを分子レベルで解明した。なかでも全身の多彩な臓器が神経回路の修復を制御するというエビデンスを得ることができたこと、また進行型多発性硬化症の分子標的を見いだすことができたことが特筆すべき成果である。本研究では、中枢神経回路の障害、その後の修復過程を、生体システムの機能ネットワークの観点から解析し、生体システムの時空間的ダイナミクスによる一連の過程の制御機構の解明に取り組んだ。中枢神経回路障害と機能回復の過程を、生体システム全体のダイナミクスとして捉え、各システムの連関を統合的に解析することで、中枢神経回路障害における生体の動作原理を明らかにすることができた。「免疫系細胞による神経回路障害と修復の制御機構の解明」および「脈管系細胞による神経回路障害と修復の制御機構の解明」について、その分子メカニズムを明らかにする研究が予定通りに進捗した。
穀物乾燥における食味と経済性に関する研究

数学モデル対象とした乾燥の数学モデル化は除湿乾燥、乾燥機乾燥、乾燥ハウス利用通風乾燥では薄層乾燥理論を適用し、乾燥ハウス利用放射乾燥では送風・攪拌時には薄層乾燥理論を、それ以外のときは熱及び水分移動方程式を利用することにより確立した。これらの乾燥方法では外気温度・湿度が与えられれば乾燥をシミュレーションすることができるので、同一条件下における性能・経済性を比較することが可能である。食味評価食味計による食味値については、時間の経過にともなう食味の変化は収穫後ほぼ67か月目から低下した。この傾向についてはハウス利用乾燥米・乾燥機乾燥米の両者に見られたが、食味値はハウス利用乾燥米が優った。精米、米飯の理化学的指標による食味では、竹生の重回帰式を用いて食味値を求めた。その結果、食味計と同様の結果が得られた。穀物乾燥施設の経済性分析投資決定の一方法として資本回収法を利用した利用料金設定モデルを提案し、利用料金の実態と比較・検討を行った。このモデルによると、現行の利用料金は施設運営に必要な額の61%しか回収していないことが明らかになった。モデルの精度をさらに高めるためには、操業費用に関するデータの集積が必要である。例えば修理費・変動費は処理量の、管理費は処理量または初期投資額の関数として与えられることが望ましい。次に高速度乾燥・省力という観点以外の低コスト・食味などの品質を加味した経済的評価を行うための選択基準を具体的に提案し、乾燥方法の相違が経済的に評価できる方法を確立した。1乾燥ハウス利用籾乾燥の数学モデル化取り上げた乾燥方法のうち、太陽熱を利用する乾燥ハウス利用籾乾燥で放射乾燥と通風乾燥について数字モデル化を行った。いずれの場合も、ハウス内外の空気温度、湿度を与え、まず結露判定を行い、次に乾燥ポテンシャルを推定し、必要に応じて換気、加温するモデルを行った。次に放射乾燥では水分拡散・熱伝導方程式より、また通風乾燥では、水分拡散方程式、熱伝達、水分収支式で温度、湿度を予測するモデル作りそれぞれ前のモデルと合体させた。同時に、このモデルの妥当性を検証するため、ハウス内に小規模な実験装置を作り、初期含水率、堆積厚さ等をパラメ-タ-として実験を行っている。2食味調査乾燥機による籾乾燥と乾燥ハウス利用籾乾燥(放射乾燥、通風乾燥)について、食味計(サタケ式とシズオカ式)、理化学的特性値(タンパク質含量、アミノグラフ、ヨ-ド呈色度)の測定と官能検査を行って食味を調査した。現在、そのデ-タを取りまとめている。これについては、3年間継続して測定する予定である。3穀物乾燥における経済性評価方法各乾燥方法について経済性を比較する場合、工学的な評価方法が重要である。設備投資計画の設備を穀物乾燥施設に置き換えれば、経済計算による評価方法が利用できる。その評価方法について考察し、これを具体的に適用して利用料金設定モデルを提案した。カントリ-エレベ-タについて試算しているが、このモデルの精度を上げるためには建設費、操業費用等の正確なデ-タが必要なので、その蓄積を考えている。1.乾燥ハウス利用籾乾燥シミュレーション昨年度は、乾燥ハウスを利用した籾乾燥における通風乾燥・放射乾燥の数学モデル化を行った。本年度は、実験を行いその妥当性を検討した結果、モデルの予測値は実験値とよく適合した。そこでそれぞれのモデルを利用し、天候の悪いときとくに夜間に乾燥することを考え、ハウス内外の空気温度・湿度の実測値を入力として、内外空気の換気・加温操作によりどのような操作を行えば乾燥速度・省エネルギの観点から最適な結果がえられるかシミュレーションを行った。この手法によりハウス利用籾乾燥施設を設計する場合の諸元が決定できまた他の乾燥方法と経済性等を比較することが可能になる。2.籾除湿乾燥の数学モデル化と検証実験

除湿機と通風乾燥機(テンパリング乾燥機)を接続したシステムについて、乾燥機の数学モデル化を行い乾燥実験によりその妥当性を検証した。同時に除湿機の数学モデル化を図り、空気温度・湿度を除湿機に入力すればこの乾燥のシミュレーションが可能である。3.食味調査乾燥機による籾乾燥と乾燥ハウス利用籾乾燥について、食味計・理化学的特性(アミノグラフ、ヨード呈色度、タンパク質含量)を測定した結果、いずれについても後者の乾燥ハウス利用放射乾燥の方が食味のよい傾向がえられた。現在、これらの乾燥法に除湿乾燥も加え、さらに官能検査も含めて食味を調査中である。4.穀物乾燥の経済的な評価比較法昨年度は、資本回収法を中心とした評価方法の利用法を提案した。本年度は、省エネルギ(環境にやさしい)の観点から、単位エネルギ原価法について検討し現在比較中である。1.数学モデルの完成対象とした除湿乾燥、乾燥機乾燥、乾燥ハウス利用通風乾燥の数学モデル化は、薄層乾燥理論を適用すればよい。しかし乾燥ハウス利用放射乾燥では、薄い籾堆積層の表面が太陽光と室内加熱空気で熱せられると同時に表面送風や層攪拌が行われる。したがって乾燥される籾の状態を考えると天候・ハウス操作により攪拌・送風、送風・無攪拌、無送風・無攪拌にわけられるので、それぞれについて数学モデルを構築した。送風・攪拌時には薄層乾燥が適用できるが、送風・無攪拌では熱伝導方程式と水分拡散方程式を連立したモデルを、また無送風・無攪拌では水分移動を無視し熱移動のみの数学モデルを考えた。これらのモデルの妥当性を検討するため室内実験を行った結果モデルによる計算値と実測値とはよく一致し、放射乾燥数学モデルは完成した。乾燥機乾燥、除湿乾燥、乾燥ハウス利用通風乾燥、乾燥ハウス利用放射乾燥の数学モデルを利用したシミュレーションにより各乾燥の性能、経済性の比較が可能になったので、経済性評価を現在検討中である。2経済性評価方法乾燥機の新設・更新においてその選択が重要な問題となる。この研究でとりあげたように高乾燥速度・省力という観点以外に低コスト化、食味などの品質を加味した経済的評価を行う必要がある。ここではその選択基準として一般的に利用できる方法で提案した。すなわち排反案の選択では(i)寿命年数・資本利率が同一であれば現価法・年価法・終価法いずれも利用できるが、資本利率が同一で寿命年数が異なるときは年価法が有効である。(2)寿命年数・資本利率がともに異なるときは追加収益率法の利用が有効である。(3)原価比較法が利用できる。3食味評価同一品種を同じように栽培・収穫・貯蔵した籾を利用して、乾燥ハウス利用放射乾燥と乾燥機乾燥の食味の相違を食味計・理化学的特性値で調査した結果、いずれの場合においても乾燥ハウス利用放射乾燥の食味が優れていることがわかった。官能検査による食味比較は現在検討中である。
腸炎疾患におけるカハール介在細胞の可塑性を制御する分子機構と組織幹細胞

本研究では、消化管運動の調節性細胞であるカハール介在細胞(ICC)の、トリニトロベンゼンスルホン酸誘起腸炎疾患モデルマウスの種々の病態時における遺伝子発現について解析した。網羅的遺伝子解析の結果、細胞増殖因子や転写制御因子など、特に炎症からの回復期のICCにおいて著明に発現量が変化する遺伝子が同定された。これにより、ICCの障害からの回復に関わる分子機構について新たに示唆することができた。昨年度は、年度の後半に新たに我々の研究室に導入されたKIT-GFPマウス(C57BL/6系)を用いて、TNBS腸炎モデルマウス作製と細胞単離を実施するという計画の変更を行ない、炎症の発症とc-KIT発現細胞の減少を確認し、細胞分取にとりかかった。本年度は当初このサンプリングを進めたが、このマウスでは炎症の発症が一定せず、BALB/cマウスに比べ炎症度が非常に弱い個体が多かった。これは、系統差や遺伝子導入の影響がある可能性が考えられた。そのため、初めの計画通りBALB/cマウスによる実験に戻して実験を進めた。細胞分取の結果、結腸筋層全細胞のうちc-KIT+CD45-であるICCの割合はTNBS投与2日目では約0.1%、5日目では約0.8%、未処理のBALB/cマウスでは約1%であり、これはTNBS投与2日目でICCが減少し、以後回復するという形態学的所見と一致した。1年目にサンプリングを終えている分と合わせて、十分量のTNBS投与2日目、5日目および未処理コントロールマウス遠位結腸のICCを単離し、RNA抽出後、マイクロアレイ解析を行った。その結果、TNBS投与5日目で発現量が著しく増加する遺伝子として、insulin-like growthfactor 1やRegenerating islet-derived family, member4などの成長因子や、inositol 1,4,5-triphosphate receptor 3およびpotassium voltage-gated channel, subfamily Q, member 1といったチャンネル分子、さらにいくつかの細胞内シグナル伝達関連遺伝子が見出された。この結果から、本研究では特に炎症回復期におけるICCの再構築に関わる候補遺伝子や、ICCの機能回復に関わる候補遺伝子を新たに見出すことができた。本研究は消化管運動のペースメーカー、あるいは神経筋伝達の介在の役割を担うカハール介在細胞(ICC)の、腸運動障害を伴う腸炎疾患時における障害と再構築に関わる分子メカニズムの解明を目指すものである。その目的のため、腸炎疾患モデル動物の病態時におけるICCが発現する分子を解析する。具体的には腸炎疾患モデル動物の病変腸管の筋層より受容体型チロシンキナーゼc-KITをマーカーとしてセルソーターを用いてICCを単離し、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション法およびマイクロアレイにより遺伝子解析を行うのが初年度の主たる実験予定であった。まずトリニトロベンゼンスルホン酸(TNBs)投与による腸炎モデルマウス作成を行った。その結果投与2日目の病変部結腸において、顕著なc-KIT発現細胞の減少が確認された。また、投与7日目にはc-KIT発現細胞の回復が見られた。そこでTNBs投与2日目に残存しているc-KIT発現細胞と、回復期にあると考えられる投与5日目のc-KIT発現細胞に発現する分子を解析するため、それぞれの時期におけるc-KIT発現細胞の単離を開始した。しかし年度の途中において、申請者の所属する研究室にc-KIT遺伝子に緑色蛍光タンパクGFP遺伝子を挿入した遺伝子改変マウス(KIT-GFPマウス)が導入された。このマウスはICCがGFPでラベルされており、同細胞の同定や単離に非常に有力なツールである。本研究の遂行においてもこのマウスの使用が極めて有効であろうと判断されたため、当初の実験計画を変更し、KIT-GFPマウスを用いて上述の実験を行った。その結果、このKIT-GFPマウスにおいてもTNBs投与による炎症の発生と筋層におけるc-KIT発現細胞の減少が認められた。そこで、TNBs投与2日目、5日目のKIT-GFPマウス病変部結腸よりKIT発現細胞の単離を実施中である。TNBs投与マウス結腸よりc-KIT発現細胞を単離し、そこから得られたmRNAからcDNAを合成後、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション法およびマイクロアレイ法による網羅的遺伝子解析を行うのが本研究の初年度の主たる予定であった。年度の途中までサンプリングは順調に進んでいたが、上述の通り、新たに所属研究室に導入された遺伝子改変マウスを用いることで、c-KIT発現細胞のより効果的な同定・単離が可能になることが期待されたため、当初の計画を変更してKIT-GFPマウスを用いた実験系を組み立てた。遺伝子解析まで到達することが初年度の予定であったが、上述の実験計画の変更によりサンプリングが全て終わらず、新年度に若干持ち越しとなった。しかしこの予定の変更によって、当初の予定よりもさらに正確なデータが得られることが期待される。上述の事由のため、当初の予定からは若干の遅れが生じている。

二年目においては、初年度に終了しなかったサンプリングを早急に終わらせ、なるべく早い時期(一・二ヶ月程度)で網羅的遺伝子解析を行いたい。その結果を基に、二年目は主として以下の二点の研究を実施する。1.網羅的遺伝子解析より得られたICCの障害・再構築に関わる候補遺伝子の発現解析:網羅的遺伝子解析実験によって同定された遺伝子群が実際にICCに発現しているか、免疫染色法あるいはin situ hybridization法にて検定する。同時に、発現量の動態について定量PCR法により解析する。2.腸炎疾患および回復期におけるICCの障害・再構築に関わる候補遺伝子の機能解析:候補遺伝子のうち、ICCの障害・再構築に関与する可能性が高いものについて解析を行う。具体的にはアンタゴニストを用いた機能阻害実験や候補遺伝子のsiRNAを用いたノックダウンなどの遺伝子阻害実験を行い、当該遺伝子の役割について、特にICCの再構築に対する役割に重点を置いて検討を行う。候補遺伝子の機能については、炎症度に与える影響(組織像や化学誘引物質発現量など)や、生理学手法を用いてペースメーカー機能や神経刺激への応答の変化を計測し評価を行う。また本課題のもう一つの柱である、「ICC幹細胞」の探索と炎症との関係についての研究も並行して実施する。Lorinczらの報告によれば、成熟ICCがKIT+CD44+CD34-Insr-Igf1r-という分子発現を示すのに対し、ICC幹細胞としての可能性が考えられている"ICC progenitor"はKITlowCD44+CD34+Insr+Igf1r+という分子プロファイルを示す。このことを指標に、炎症時および回復期にICC幹細胞が存在するか、ICCとの比率はどの程度であるか、セルソーターにより両細胞群を分離解析する。上述の通り、初年度の研究計画の変更に伴い、DNAマイクロアレイ解析費(外注:約400,000円)を二年目に繰越したい。その他、試薬・消耗品・実験動物や、成果発表のための旅費、外国語論文の校閲費、論文投稿料等に使用を予定している。
高分子コロイド結晶の動的相転移と結晶成長カイネティックス

コロイド結晶の相転移現象やそのカイネティックスは、見かけ上は古典的核生成及び結晶成長理論に従うが、同時に多くの粒子が関与する協同的ゆらぎ現象でもある。本研究では、これまでの間接的な動的研究手段を更に進めて、結晶成長過程及び成長した結晶内粒子の並進運動を光学顕微鏡により直接観測し、その画像解析からコロイド結晶における動的相転移の解明を行った。具体的には、1.コロイド粒子として0.3μmから2μmの単分散ポリスチレン粒子水分散液をイオン交換樹脂により6ヶ月以上徹底的に脱塩した。2.作製した下がカバーガラスで白金電極を備えたガラス製円筒状セルを用い、顕微鏡下で個々のコロイド粒子の結晶化に伴う運動の時間変化を拡大記録した。手持ちの市販画像解析システムをこの時系列画像の解析が出来るように一部変更した半自動画像計測システムを構築し、得られたコロイド粒子の運動画像をコントラストなどの処理後シンボライズしてフーリエ解析を行った。3.安定に結晶構造が発現している状態で、個々のコロイド粒子位置の時系列データの画像処理とフーリエ解析を行った。4.正弦電場(0.01Hzから1Hz)をセルに印加し、粒子の並進運動を時間分割解析した。5.これらの画像解析の結果、コロイド結晶の動的相転移に伴う各種の運動モードが観測され、これらは既に我々が動的光散乱実験で観測してきた運動モードと一致した。本研究の結果として、コロイド粒子個々のゆらぎは近接する多数の粒子のゆらぎとの協同的効果の結果であることが明らかとなった。沈降平均法による光学顕微鏡観察や静的および動的光散乱測定、そしてさらに反射スペクトル測定、電気光学測定などによりコロイド結晶を総合的、系統的に調査した。この結果、コロイド結晶の相転移現象やそのカイネティックスは見かけ上は古典的核生成および結晶成長理論に従うことが解った。しかし、同時に多くの粒子が関与する協奏的ゆらぎ現象であることが判明した。本研究ではこれまでの間接的な動的研究手法をさらに進めて、結晶成長過程および成長した結晶内粒子の並進運動を光学顕微鏡により直接観察し、コロイド結晶の相転移現象の理解を行った。具体的に行った研究経過を以下に示す。1.コロイド粒子のイオン交換樹脂を用いた完全な脱塩:0.3μmから2μmの単分散ポリスチレン粒子をイオン交換樹脂により6ヶ月以上完全に脱塩した。2.顕微鏡用光学セルの作成:下にカバーガラスを張り、白金電極を備えたガラス製円筒状セルを設計し、これを5個作製した。このセルはイオン交換樹脂を共存させて測定中も脱塩が出来るように工夫されている。また、セル厚を5種類換え、試料液をフロー方式で導入でき、しかもカバーガラス部は容易に取り替えられるようになっている。3.結晶成長過程における粒子の並進運動の顕微鏡観察:試料液の流動停止後の誘導期(核生成期)とつづく結晶成長期における粒子の並進拡散運動を100個程度について同時観察、記録を行った。4.結晶内粒子の振動運動の顕微鏡観察:安定に結晶構造が発現している状態での約100個の構成粒子の並進運動を30分の1ごとにビデオ撮影を行い各々の粒子位置の時系列データのフーリエ解析を行った。5.正弦電場下での結晶内粒子の振動運動の顕微鏡観察:0.01Hzから1Hz程度の正弦波をかけながら粒子の並進運動を時間分割測定した。

当該年度に於いては前年度に引き続き、1.コロイド粒子として0.3μmから2μmの単分散ポリスチレン粒子水分散液をイオン交換樹脂により6ヶ月以上徹底的に脱塩した。2.前年度作製した下がカバーガラスで白金電極を備えたガラス製円筒状セルを用い、顕微鏡下で個々のコロイド粒子の結晶化に伴う運動の時間変化を拡大記録した。手持ちの市販画像解析システムをこの時系列画像の解析が出来るように一部変更した半自動画像計測システムを構築し、得られたコロイド粒子の運動画像をコントラストなどの処理後シンボライズしてフーリエ解析を行った。3.安定に結晶構造が発現している状態で、個々のコロイド粒子位置の時系列データの画像処理とフーリエ解析を行った。4.正弦電場(0.01Hzから1Hz)をセルに印加し、粒子の並進運動を時間分割解析した。5.これらの画像解析の結果、コロイド結晶の動的相転移に伴う各種の運動モードが観測され、これらは既に我々が動的光散乱実験で観測してきた運動モードと一致した。本研究の結果として、コロイド粒子個々のゆらぎは近接する多数の粒子のゆらぎとの協同的効果の結果であることが明らかとなった。
発生早期の鳥類頚髄における運動神経細胞死の過程で働く因子の検討

鶏胚脊髄運動神経細胞へ効率よくGFP-LC3遺伝子を発現させる目的で、運動神経における転写因子であるIslet1のエンハンサーのもとで同遺伝子が発現するコンストラクトを福島県立医科大学の佐藤昇博士と共同で作製し、孵卵2日目(Hamburger-Hamiltonのステージ1314)の胚に遺伝子導入を行ない、蛍光顕微鏡でGFP融合蛋白の発現の有無を観察した。その結果脊髄前角細胞に同遺伝子を効率よく発現していることを見出し、本コンストラクトが運動神経特異的に効率よく遺伝子導入する上で有用であることが分った。そこで、GFP-LC3遺伝子を導入した胚に、Yaginuma(2001)らと同じ条件で、カスパーゼの阻害剤を投与して頚髄の細胞死が運命付けられた運動神経細胞(Apoptosis-specific protein(ASP)陽性細胞)と、そうでない細胞の間での、GFPの細胞内局在パターンの相違の有無を検討した。ASP陽性細胞にても、GFP-LC3蛋白が発現していることが共焦点レーザー顕微鏡を用いた解析から明らかとなったが、GFPの輝度が高く光学顕微鏡における細胞内局在の詳細な評価は困難であった。そこで免疫電子顕微鏡法で局在を検討することを試みた。ただし通常の免疫電子顕微鏡法(樹脂包埋、凍結超薄切片法)ではLC3蛋白の局在を検討することは非常に困難であることが分っているので、固定条件が弱くても行うことの出来る、フリーズレプリカ免疫電顕法(SDS-FRL)により同蛋白を同定する系をオートファジーが非常に亢進し膜結合型のLC3蛋白が豊富に存在することが分っているカテプシンD欠損マウス脳を用いて確立することを目指した。その結果2%パラホルムアルデヒド固定という非常に弱い固定条件で、LC3蛋白が膜内粒子にとぼしい初期のオートファゴソームと思われる膜に局在することを示すことに成功した。LC3のN末にGFPをつないだコンストラクトが実際使用可能か検討するため、まずラットPC12細胞の発現させ、イムノブロットにてGFP-LC3蛋白が産生されているか検討を行った。その結果GFPとLC3の間で原因不明のプロセシングが起こることが判明した。そこでGFPの代わりに酸性オルガネラ内にても輝度の低下を起こさない改変GFPであるSapphire遺伝子を用いたところ、Sapphire-LC3蛋白の生成が確認されたためこのコンストラクトを用いることにした。次に、孵卵2日目(Hamburger-Hamiltonのステージ1314)の胚の脊椎中心管内に遺伝子を注入する手技を確立した。エレクトロポレータの条件設定を行なった結果、25Vのパルスを150msの間隔で50ms間6回加えるのが胚の致死を惹起することなく効率よく遺伝子を導入出来る条件であることが分かった。遺伝子導入1日後の胚をin ovoで蛍光実体顕微鏡下で観察したところ、Sapphire蛋白の蛍光が胚内に確認された。蛍光は、脊髄に沿って認められることもあれば、主に後根神経節に認められるものもあった。蛍光実体顕微鏡で遺伝子導入が確認された胚を化学固定の後凍結切片を作製し、抗LC-3抗体にて免疫染色を行なった結果、Sapphire蛋白の分布と一致することが確認された。頸髄前角のプログラム細胞死の時期に於けるSapphire-LC3の挙動を確認するため、遺伝子導入が確認された胚を、孵卵45日目(遺伝子導入後23日)で採取、同様に凍結切片で観察したところ、後根神経節では比較的Sapphire蛋白の蛍光が認められたが、Islet-1陽性の脊髄前角の運動神経細胞に於けるSapphire蛋白の発現はほとんど認められなかった。現在効率よく運動神経細胞に遺伝子導入出来る条件を検討中である。