hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中国近世白話文学の電子化状況情報及びコーパスの共有基盤の構築に関わる基礎的研究

本研究は、学術的利用に適した中国近世白話文学コーパスを構築する為の基礎的研究として、文学及び隣接分野の研究上、必要と思われる電子テキストの形式、校訂、異体字表、複数の版本やテキストに付された批評の扱い、情報付与の方法等について基礎的な検討を行い、それに沿ってサンプル的に、明代の木版本・鈔本に基づく電子テキストの作成・校訂を行うと共に、電子テキストを利用した新たな文学研究のアプローチを試みた。1-1)基礎データを共同作業用サーバに載せるための整理・加工2005年度基盤研究(企画調査)で作成したデータを基に、情報の増補・整理・加工を進めた。1-2)共同作業用のサーバの構築共同作業用サーバーを設置し、この上で運用するUnicode対応アクセス制限付きWikiシステムの詳細について検討を行い、既存のプログラムに加える変更を概ね決定した。2)学術利用に適した中国近世白話文学コーパスを構築する為の基礎的研究2-1)コーパスの設計・校訂ルール等に関する検討古典文学・版本学・文献学・中国語史・歴史学等の研究状況を踏まえ、電子コーパスに必要な情報・形態について、全体的な検討を行い、整理した。また、校訂、特に異体字・誤字の扱いや変換テーブルについて検討を行い、既存のテーブル(CJK Unified Ideographs Extension A, Bを含まない)を利用する上での注意点を整理し、CJK Unified Ideographs Extension A, Bを含み、古典文学・版本学研究上の目的に適合したテーブルのスタイル、基準とすべき字書類につき検討を行い、サンプル的なテーブルを試作した。2-2)電子テキストの構築:底本の選定、OCR○白話小説2種3バージョン、戯曲3種につき、研究上重要な位置を占める版本を底本として選定してOCR外注し、中国古典小説研究会の一部メンバーの協力も得て、校勘を開始した。1)中国近世白話文学の電子化状況を共有するためのサイト構築基礎データ(2005年度基盤研究(企画調査)で作成)の修正・増補情報を引き続き収集するとともに、MySQLによる運用・管理を想定し、サーバー上で共同作業するのに適切な形式に組み替える作業を進めた。2)学術利用に適した中国近世白話文学コーパスを構築する為の基礎的研究8月に中国・首都師範大学の周文業教授を迎え「中国における古典籍のデジタル化とその応用研究」講演会を開催し、情報交換を行った。異体字変換テーブル(特に古典文学・歴史学等で広く利用されているデータベース『四庫全書』『四部叢刊』で使用されているフォントHT_CJK+がPrivate Use Areaを利用して表現しているグリフの対応宇)、ヘッダに付与する情報・形式等につき、作業・検討を行った。また、共同作業用サーバー上でのファイル共有のため、WebDavシステムを導入し、試用を開始した。新たに白話小説1種、戯曲8種の重要な版本を底本として選定してOCR外注し、前年度に外した小説・戯曲と合わせて校勘を進めた。1.学術利用に適した中国近世白話文学コーパスを構築する為の基礎的研究(1)コーパスの設計・校訂ルール等に関する検討:昨年度までの検討結果を踏まえ、引き続き異体字表(特に電子版『四庫全書』『四部叢刊』で採用されているフォントのうち、Private Use Area部分の変換用テーブル)の作成を進めた。また、メタデータ、木版本テキストに挿入されている批評などの情報付与の形式・方法についての初歩的な検討を行った。さらに、電子テキスト・コーパスの活用に関しても検討を行った。研究代表者の笠井は他言語のコーパス構築状況と研究への応用を参考にしつつ、電子コーパスを活用して行いうる文学・語学研究上の各種のアプローチ法、中国古典籍のコーパス・データベースを構築・活用するに際し、障害となる構造的な問題点等につき、整理し考察を進めた。また、研究分担者の上田望氏は電子テキストを活用した計量的アプローチで文体論に新たな視点を開くことが可能であることを示した。(2)電子テキストの構築:昨年度より引き続き、明代鈔本・木版本の戯曲・白話小説17種21バージョンのOCR済み「たたき台」テキストファイルが完成し、2種2バージョンを除き公開、うち、5種6バージョンにつき第一次校訂済みテキストを完成・公開した。また、3種4バージョンにつき校訂が進行中で、完成後に本研究で構築したサーバに公開予定である。2.中国近世白話文学の電子化状況に関する情報の集積・共有前年度までのデータに、中国古典文学研究では基本資料である、「電子テキスト・排印本の底本となった・或いは関係がある(可能性のある)木版本・鈔本等」との関連情報を、大塚秀高『増補中国通俗小説書目』の番号の追加という形で補充した。
in situ PCR法による気管支原発早期肺癌発生過程の遺伝子異常の多角的評価

微小な病変での遺伝子変異の有無は,これまでmicrodissectionとPCRによって検討されてきたが,細胞単位での変異の有無を知ることは不可能であった.細胞単位での遺伝子変異をin situで観察することが可能となれば,癌の発生における遺伝子変化と組織形態学的変化に関して極めて重要な知見が得られるであろう.最近開発されたin situ PCRは,PCRとin situ bridizationを組み合わせた手法で,単一または少ないコピー数の遺伝子のin situでの検出に期待がもたれている.in situ PCRは,遺伝子やプライマーが異なれば大きく条件が変わると考えられており,また,その条件を決定する要素が非常に多岐に亘る.3年間の研究で,標本の固定法,前処置法,プライマーの選定,PCRの条件,in situ bridizationの条件、およびシグナルの検出(染色)法を、一つ一つ決定してきた。その結果,細胞株Calu-l(K-rasコドン12変異株)およびH460(野生株)の細胞浮遊液を用いた実験で,95%エタノール固定16時間,0.1-1.0μg/dlプロテイナーゼK処理37度15分,40サイクルのPCR,10%緩衝ホルマリンによる後固定16時間in situ bridization後の厳密なwashingにより,単個の細胞内でのK-rasコドン12の変異をin situ PCRを用いて検出することに成功した.一方,プローブを用いないdirect in situ PCRは,操作が簡便で迅速な処理が可能であるが,非特異的染色が強くシグナルは検出不能であった.さらに,制限酸素とDNA分解酸素を用いて,非特異的染色の本態を明らかにすると共に,direct in situ PCRを用いた検出には限界があり,点突然変異の検出は困難であることを明らかにした.微小な病変での遺伝子変異の有無は,これまでmicrodissectionとPCRによって検討されてきたが,細胞単位での変異の有無を知ることは不可能であった.細胞単位での遺伝子変異をin situで観察することが可能となれば,癌の発生における遺伝子変化と組織形態学的変化に関して極めて重要な知見が得られるであろう.最近開発されたin situ PCRは,PCRとin situ bridizationを組み合わせた手法で,単一または少ないコピー数の遺伝子のin situでの検出に期待がもたれている.in situ PCRは,遺伝子やプライマーが異なれば大きく条件が変わると考えられており,また,その条件を決定する要素が非常に多岐に亘る.3年間の研究で,標本の固定法,前処置法,プライマーの選定,PCRの条件,in situ bridizationの条件、およびシグナルの検出(染色)法を、一つ一つ決定してきた。その結果,細胞株Calu-l(K-rasコドン12変異株)およびH460(野生株)の細胞浮遊液を用いた実験で,95%エタノール固定16時間,0.1-1.0μg/dlプロテイナーゼK処理37度15分,40サイクルのPCR,10%緩衝ホルマリンによる後固定16時間in situ bridization後の厳密なwashingにより,単個の細胞内でのK-rasコドン12の変異をin situ PCRを用いて検出することに成功した.一方,プローブを用いないdirect in situ PCRは,操作が簡便で迅速な処理が可能であるが,非特異的染色が強くシグナルは検出不能であった.さらに,制限酸素とDNA分解酸素を用いて,非特異的染色の本態を明らかにすると共に,direct in situ PCRを用いた検出には限界があり,点突然変異の検出は困難であることを明らかにした.in situ PCR法による癌関連遺伝子の検出に関しては,全世界的にみても,未だ一つの満足できる報告もなく,その実験条件は未知である.そこで,本年はK-ras遺伝子第12コドンの点突然変異(GGT→TGT)を標的として,in situ PCR法による検出条件の確立を行った.まず,当該点突然変異を有する遺伝子のみを特異的に増幅するプライマーを選択するために,20種のプライマーを設計し,それを様々に組み合わせてPCRを行った.その結果,変異特異的な1組のプライマーを見いだし,そのPCRの条件を確立下.続いて,当該点突然変異を有する細胞株と,有しない細胞株を用いて,細胞浮遊液中でのin situ PCR法を試みた.固定法及び後固定法(中性ホルマリン,パラホルムアルデヒド,エタノール,グルタールアルデヒドなど),前処置法(プロテイナーゼK,ペプシン,塩酸,無処理など),PCRの条件(PCRのサイクル数,アニーリング温度,バッフア-の組成など),in situ hybridizationの条件(hybridizationの温度,洗いの条件など),染色条件(反応時間,抗体の濃度など)などを種々検討し,当該点突然変異を有する細胞株のみを特異的に検出する条件を確立した.さらに,in situ PCR法の直接法を間接法を比較し,間接法が特異性において優れていることを証明した.現在,この結果を,他の遺伝子の検出,およびホルマリン固定パラフィン包埋切片での検出に応用すべく研究中である.微小な病変での遺伝子変異の有無は,これまでmicrodissectionとPCRによって検討されてきたが,細胞単位での変異の有無を知ることは不可能であった.細胞単位での遺伝子変異をin situで観察することが可能となれば,癌の発生における遺伝子変化と組織形態学的変化に関して極めて重要な知見が得られるであろう.最近開発されたin situ PCRは,PCRとin situ hybrisizationを組み合わせた手法で,単一または少ないコピー数の遺伝子のin situでの検出に期待がもたれている.

今回我々は,早期肺癌へのin situ PCRの応用に先立ち,細胞株を用いて単個の細胞内でのK-rasコドン12の変異を検出することを試みた.変異特異的プライマーは,ダブルミスマッチプライマーの中から通常のPCRで選択した.細胞株Calu-1 (K-rasコドン12変異株)とNCI-H460 (K-rasコドン12野性株)を材料として,プローブを用いるindirect in situ PCRを細胞浮遊液にて行った.細胞の固定,前処理の後,Thermal Cyclerを用いて40サイクルのPCRをおこない,サンプルの一部を採取し,サイトスピンにて細胞をスライドガラス上に散布した上で,後固定,in situ hybridizationを施行した.プローブはジゴキシゲニンでラベルしたものを用い,発色はNBT/X-phosphateを用いた.種々の固定,前処理,後固定を試みると共に数種のコントロールをおいた.また,同じ材料を用いてサザンブロットを行い,望ましい増幅が行われていることを確認した.さらに,プローブを用いないdirect situ PCRも行った.その結果,95%エタノール固定,プロテイナーゼK処理,10%緩衝ホルマリンによる後固定により,Valu-q, H460はそれぞれ望ましい染色を得,各コントロールも適切な染色を得た.一方,diret in situ PCRは,非特異的染色が強くシグナルは検出不能であった.平成8年度は,この結果を応用して,より一般的な検体におけるin situ PCRの条件を検討する予定である.微小な病変での遺伝子変異の有無は、これまでmicrodissectionとPCRによって検討されてきたが,細胞単位での変異の有無を知ることは不可能であった.細胞単位での遺伝子変異をin situで観察することが可能となれば,癌の発生における遺伝子変化と組織形態学的変化に関して極めて重要な知見が得られるであろう.最近開発されたin situ PCRは,PCRとin situ hybridizationを組み合わせた手法で,単一または少ないコピー数の遺伝子のin situでの検出に期待がもたれている.昨年度までの研究で,我々は細胞株を用いて単個の細胞内でのK-rasコドン12の変異をin situ PCRを用いて検出することに成功した.本年はさらに応用可能な条件を検討し,細胞浮遊液を用いた実験系で,95%エタノル固定16時間,0.1-1.0μg/dlプロテイナーゼK処理37度15分,40サイクルのPCR,10%緩衝ホルマリンによる後固定16時間,in situ hybridization後の厳密なwashingにより,細胞株Calu-l(K-rasコドン12変異株),H460(野生株)はそれぞれ望ましい染色を得,各コントロールも適切な染色を得ることに成功した.一方,プローブを用いないdirect in situ PCRは,操作が簡便で迅速な処理が可能であるが,非特異的染色が強くシグナルは検出不能であった.本年は制限酵素とDNA分解酵素を用いて,非特異的染色の本態を明らかにすると共に,direct in situ PCRを用いた検出には限界があり,点突然変異の検出は困難であることを明らかにした.
肺内胚中心様組織におけるアレルゲン特異的IgEの産生制御機構の解明

喘息モデルマウスにおいて肺内胚中心様組織には濾胞ヘルパーT細胞(T_<FH>細胞)様の細胞が存在することを確認し、T_<FH>様細胞はICOS, PD-1, BTLAを高発現し、TCR刺激によりIL-21を特異的に産生することを明らかにした。さらに喘息様の病態を高頻度で合併し、腫脹した涙腺内に胚中心様組織の形成を伴うIgG4関連疾患におけるIgE産生とCD4陽性T細胞の機能解析を行った。その結果、解析した9例全例で血清IgE値の上昇を認め、CD4陽性T細胞の解析では、健常者と比較してTh2サイトカインの産生亢進を認めた。気管支喘息は気道を場とした慢性アレルギー性炎症であり、その発症にはアレルゲン特異的IgE抗体の産生が重要な役割を果たしている。近年、吸入アレルゲンに対するIgEが、アレルゲン暴露により誘導される肺内胚中心様組織においても産生されることが示された。そこで本研究では、肺内胚中心様組織でのIgE産生機構、特に濾胞ヘルパーT細胞(T_<FH>細胞)及びその機能分子であるIL-21とBTLAの役割を解明することを目的に研究を行った。研究成果1.抗原吸入感作気道炎症モデルにおける肺内胚中心様組織の解析野生型マウスに卵白アルブミン(0VA)を14日間吸入投与することにより、肺内胚中心様組織が形成されることを確認した。現在、所属2次リンパ組織である傍気管リンパ節と肺内胚中心様組織におけるIgE産生細胞の分化の違いを免疫染色及びFACSを用いて解析中である。研究成果2.肺内胚中心様組織に存在するT_<FH>細胞の機能解析OVAで吸入感作したマウスの肺組織及び傍気管リンパ節のT_<FH>細胞(CD4陽性CXCR5陽性細胞)の表面抗原の発現、及びサイトカインの産生を検討した。肺内TFH細胞も傍気管リンパ節のT_<FH>細胞と同様にBTLAの高発現とIL-21の産生先進を認めた。研究成果3.肺内T_<FH>細胞の機能発現におけるIL-21の役割の解析肺内T_<FH>細胞の分化におけるIL-21の役割をIL-21R欠損マウスを用いて検討した。その結果、IL-21R欠損マウスにおいても肺内T_<FH>細胞の分化は正常に認められた。現在、肺内T_<FH>細胞の機能発現におけるIL-21の役割を解明するためOVA特異的TCRトランスジェニックマウス(DO11.10+マウス)とIL-21欠損マウスを交配し、DO11.10+IL-21欠損マウスを作製中である。気管支喘息は気道における慢性アレルギー性炎症であり、その発症にはアレルゲン特異的IgE抗体の産生が中心的な役割を果たしている。近年吸入アレルゲンに対するIgEが、アレルゲン暴露により誘導される肺内胚中心様組織においても産生されることが示された。そこで肺内胚中心様組織におけるIgE産生制御機構の解明を目的に、肺内胚中心様組織におけるIgE産生細胞の分化制御機構の解析およびT_<FH>細胞の機能解析を行なった。平成20年度の研究では、野生型マウスに卵白アルブミン(OVA)を連続投与すると肺内胚中心様組織が形成され、肺内胚中心様組織にはT_<FH>細胞様の細胞が存在することを明らかにした。平成21年度の研究では、肺内胚中心様組織に存在するT_<FH>細胞様の細胞はICOS,PD-1,BTLAを高発現し、TCR刺激によりIL-21を産生することを明らかにした。現在、肺内中心様組織と傍気管リンパ節からLCM法にて胚中心を切り出し、B細胞分化に関与するgerminal Cεtranscript及びμ-εcircle transcriptの発現を検討中である。今年度は、肺内胚中心様組織からT_<FH>細胞を分離し、表面抗原の発現パターン及びサイトカイン産生、B細胞と共培養した際のIgE,IgG各サブクラスの産生誘導能を解析予定である。

平成20年度の研究では、野生型マウスに卵白アルブミン(OVA)を連続投与すると肺内胚中心様組織が形成され、肺内胚中心様組織にはT_<FH>細胞様の細胞が存在することを明らかにした。平成21年度の研究では、肺内胚中心様組織に存在するT_<FH>細胞様の細胞はICOS,PD-1,BTLAを高発現し、TCR刺激によりIL-21を産生することを明らかにした。そこで今年度の研究では、肺内胚中心様組織の形成におけるT^<FH>細胞の役割を喘息モデルマウスを用いて解析するとともに、喘息様の病態を高頻度で合併するIgG4関連疾患におけるIgE産生とT細胞の機能解析を行った。その結果、IgG4関連疾患患者9例中、全例で血清IgE値の上昇を認め、5例で末梢血好酸球数の増多を認めた。さらにIgG4関連疾患患者のCD4陽性T細胞では、健常者と比較してIL-4,IL-5,IL-10の発現充進とTh2細胞のmaster regulatorであるGATA3の発現亢進を認めた。現在、細胞移入法により喘息モデルマウスにおける肺内胚中心様組織の形成機構を解析中である。
触媒基準エッチング法によるシリコンカーバイド基板の高精度・高能率平坦化

パワーエレクトロニクスにおいて,Siの物性限界を凌ぐ物性値を持つSiCによる低損失デバイスの開発が、国内外で活発に進められている。我々は、触媒基準エッチング法(CAtalyst-Referred Etching:CARE)という加工法を提案し、4H-SiC(0001)表面をダメージレスかつ非常に平坦にすることに成功した.本研究は,CARE加工後表面の分析を実験及び理論から系統的に明らかにし,触媒基準エッチング法の原理を解明することを目的とした.昨年度の成果より,CAREによる加工後表面は,Si-Cの1バイレイヤー(BL)のステップ高さをもったステップーテラス構造で,テラスの表面構造はF終端とOH終端の混在した4H-SiC(0001)1×1表面であり,広いテラスと狭いテラスが1BL毎に交互に形成していることが明らかとなった.また,広いテラスはキュービック面で,狭いテラスはヘキサゴナル面であることが明らかとなった.当該年度では,キュービック表面が安定になる理由を調査するため,原子間の静電エネルギーや原子軌道のハイブリダイゼーションの効果を調査した.静電エネルギーによって,F及びOH終端した表面はキュービック面が不安定化することが明らかとなったため,静電エネルギー以外の効果が表面安定性に寄与していることを示した.さらに,電子の波動関数の混成によるエネルギーの観点から,F及びOH終端において,終端種と最表面Siの電子の波動関数の混成によって,キュービック面が安定化していることが明らかとなった.この電子の波動関数の混成と静電エネルギーの効果の合計により,それぞれの終端の表面安定性が決定していることを明らかにした.以上の成果から,CAREはヘキサゴナル面が高エッチレート,キュービック面は低エッチレートであるステップフロー型のエッチングであると結論付けた.パワーエレクトロニクスにおいて,Siの物性限界を凌ぐ物性値を持つSiCによる低損失デバイスの開発が、国内外で活発に進められている。我々は、触媒基準エッチング法(CAtalyst-Referred Etching: CARE)という加工法を提案し、4H-SiC(000l)表面をダメージレスかつ非常に平坦にすることに成功した.本研究は,CAREによるSiCの加工速度を向上するため,加工表面の分析を実験及び理論から系統的に明らかにし,触媒基準エッチング法の原理を解明することを目的としている.当該年度では、STM,AFM及びXPSを用いた評価と、第一原理分子動力学シミュレーションを行うことで、CARE加工後の4H-SiC(0001)表面の構造を明らかにした.AFMを用いた評価から,4H-SiC結晶中のSi-Cの1バイレイヤー(BL)の高さに相当する0.25nmのステップ高さをもったステップーテラス構造が形成していることが明らかになった.また、表面に観察されるステップは,幅の広いテラスと狭いテラスが交互に形成していることが明らかとなり,これは4H-SiC(0001)表面に1BL毎に露出するヘキサゴナル面とキュービック面のエッチレートの差と考察した.STM及びXPSにより,4H-SiC(0001)表面は1×1構造をとっており、その表面は水素終端でなく、フッ素終端及びOH終端していることを明らかにした.この実験結果を踏まえて,第一原理分子動力学シミュレーションにより4H-SiC(0001)表面において,終端と結晶面による表面エネルギーの違いを求め,4H-SiC(0001)表面におけるステップ構造生成機構の考察を行った.F終端,OH終端の場合,ヘキサゴナル面とキュービック面で表面エネルギーが振動し,キュービック表面が安定であるという結果になり,実験結果とよく一致することが明らかとなった.パワーエレクトロニクスにおいて,Siの物性限界を凌ぐ物性値を持つSiCによる低損失デバイスの開発が、国内外で活発に進められている。我々は、触媒基準エッチング法(CAtalyst-Referred Etching:CARE)という加工法を提案し、4H-SiC(0001)表面をダメージレスかつ非常に平坦にすることに成功した.本研究は,CARE加工後表面の分析を実験及び理論から系統的に明らかにし,触媒基準エッチング法の原理を解明することを目的とした.昨年度の成果より,CAREによる加工後表面は,Si-Cの1バイレイヤー(BL)のステップ高さをもったステップーテラス構造で,テラスの表面構造はF終端とOH終端の混在した4H-SiC(0001)1×1表面であり,広いテラスと狭いテラスが1BL毎に交互に形成していることが明らかとなった.また,広いテラスはキュービック面で,狭いテラスはヘキサゴナル面であることが明らかとなった.当該年度では,キュービック表面が安定になる理由を調査するため,原子間の静電エネルギーや原子軌道のハイブリダイゼーションの効果を調査した.静電エネルギーによって,F及びOH終端した表面はキュービック面が不安定化することが明らかとなったため,静電エネルギー以外の効果が表面安定性に寄与していることを示した.さらに,電子の波動関数の混成によるエネルギーの観点から,F及びOH終端において,終端種と最表面Siの電子の波動関数の混成によって,キュービック面が安定化していることが明らかとなった.この電子の波動関数の混成と静電エネルギーの効果の合計により,それぞれの終端の表面安定性が決定していることを明らかにした.以上の成果から,CAREはヘキサゴナル面が高エッチレート,キュービック面は低エッチレートであるステップフロー型のエッチングであると結論付けた.
siRNAを用いた血管内皮接着分子抑制による脈絡膜新生血管の治療の開発

白血球は加齢黄斑変性における脈絡膜新生血管の進展に大きく関与していることが報告されている。そこでRNAi技術を用いて網膜色素上皮細胞-脈絡膜のIntercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)の発現抑制を試みた。In vivoでのsiRNAの導入は困難である。そのため細胞内導入効率を上げるため、siRNAのICAM-1をプラスミドでデザインして、マウスを用いhydrodynamics-based transfection techniqueで導入した。In vivoでの網膜へのプラスミドの導入の有無をGreer Fluorescent Protein(GFP)を用い確認した。導入後1日後より網膜各層へGPFの蛍光が組織学的に確認され経時的に増強し7日後にピークを認めた。同様にICAM-1 siRNAプラスミドをマウスに導入した。ICAM-1の過剰発現方法は、再現性の高い汎網膜光凝固術を行った。感覚網膜あるいは色素上皮細胞のICAM-1の測定はELISAで行った。無治療群では光凝固1日後に発現のピークを認めたため、比較検討は光凝固一日後に行った。対照における色素上皮細胞-脈絡膜のICAM-1発現は2.51±0.52ng/ml/protein、siRNAICAM-1治療群では1.5±0.32ng/ml/protein(n=12,P<0.01)とそれぞれ有意な抑制効果を認めた。また単球のRPEへの接着をフローサイトメトリーで比較検討したが、光凝固のみては9.5±1.3%治療群では3.9±0.8%と単球の集積を有意に抑制した。以上のようにin vivoでもsiRNA技術を用いて感覚網膜および網膜色素上皮細胞におけるICAM-1抑制できることを証明した。この技術を用いて加齢黄斑変性における所絡膜新生血管の治療効果を期待できる。【目的】近年加齢黄斑変性の脈絡膜新生血管(CNV)の発症過程において白血球の接着が関わっているとの報告がされている。今回我々はsiRNAを用いて脈絡膜血管内皮におけるICAM-1発現を抑制させ脈絡膜新生血管を抑制できるか検討した。【方法】C57BL/6Jマウスにレーザー網膜光凝固を行いICAM-1 siRNAおよび対照のsiRNA、10uMをレーザー光凝固直後に硝子体内に投与して、1週間後に眼球摘出し、FITC-lectinで染色しフラットマウントを作成後CNVの面積を測定し対照と比較検討した。またマウス眼にレーザー網膜光凝固25発を行い、治療群と対照群それぞれ3日後に眼球摘出し、網膜色素上皮-脈絡膜を分離してELISA法により血管内皮増殖因子(VEGF)の発現を測定した。また同様にレーザーを行い3日後に眼球摘出してCy5-F4/80で染色してフローサイトメトリーによりマクロファージの集積を見た。【結果】CNVの面積は、対照と比較しsiRNA投与群(62.7±4.3%;P<0.001)で有意に減少した。同様にsiRNA投与群は、VEGFの発現(66.5±9.3%、P<0.001)、マクロファージの集積伴に(45.6±6.5%,P<0.001)有意に減少した。【結論】ICAM-1 siRNAを硝子体内に投与することにより有意にレーザー発症のCNVの発症を抑制することができた。一般的な血管新生同様に、脈絡膜新生血管発症過程においても、白血球特にマクロファージが関与していることが考えられ、この手法が治療に用いられる可能性が示唆された。
半構造データからのスキーマ情報抽出アルゴリズムの開発

本研究では,半構造データから「各クラスの密度が与えられた閾値以上,かつ,クラス数が最小である」という条件を満たすデータベーススキーマ(以下,スキーマ)を抽出する最適化問題について考察している.ここで,クラス密度とはクラスの型とそれに属する各オブジェクトの型の類似度を表す尺度であり,クラス密度が大きいほどその類似度が高いことを表す.本年度の主な研究実績は以下の通りである.1.スキーマ抽出問題の計算量申請者らは,これまでに上記最適化問題が強NP困難であることを示している.本年度は,同最適化問題に関して,「各抽出クラスの型が最適である(型を表す属性系列が最短である)」という条件を加えた場合の計算量について考察した.そして,この場合,同問題が強NP困難でありかつΔ_2Pに属することを示した.2.スキーマ抽出アルゴリズムの改良上記の結果から,厳密な最適解(スキーマ)を効率良く抽出することは困難である.そこで,昨年度,申請者らは根付クラス(rooted class)というクラスを提案し,それを用いてスキーマを効率良く抽出する多項式時間アルゴリズムを構成した.本年度は,この根付クラスをより一般的な構造をもつクラス(bounded class)に拡張することにより,よりサイズ(クラス数)の小さいスキーマが抽出できるようにアルゴリズムの改良を行った.具体的には,根付クラスは「そのクラスに属するどの基本クラスも,一つのクラス(そのクラスの根)の下位クラスである」という制限をもつが,今回拡張されたクラスではそのような根に相当するクラスを複数もつことが許されている.そのような拡張を行った場合でも,スキーマ抽出アルゴリズムが多項式時間で実行時間可能であることを示した.本研究では,半構造データからデータベーススキーマを抽出する問題について考察を行った.ここで,データベーススキーマとはクラス集合,クラスとは(互いに類似した型をもつ)オブジェクト集合である.本研究では,半構造データから「各クラスの密度が与えられた閾値以上かつクラス数最小」という条件を満たすデータベーススキーマを抽出する最適化問題について考察し,以下の2つの結果を示した.ここで,クラス密度とはクラスの型とそれに属する各オブジェクトの型の類似度を表す尺度であり,クラス密度が大きいほどその類似度が高いことを表す.1.スキーマ抽出問題の計算量上記最適化問題の計算量について考察し,以下の2つの結果を示した.まず,同最適化問題に関する決定問題が強NP困難であることを示した.次に,P=NPでない限り,γ<3/2なるどのγに対しても同最適化問題を解く多項式時間γ-近似アルゴリズムが存在しないことを示した.2.スキーマ抽出アルゴリズムの開発上記結果から,厳密な最適解(データベーススキーマ)を効率良く抽出することは困難である.そこで,本研究では根付クラス(rooted class)というクラスを提案し,それを用いてデータベーススキーマを効率良く抽出する多項式時間アルゴリズムを構成した.根付クラスの利点は,オブジェクト間の上位型と下位型の関係を用いてクラスに属するオブジェクトの組合せを限定することにより,根付クラスの総数が入力データに関する多項式に低減されていることである.本アルゴリズムでは,まず,すべての根付クラスを求め,次に,それらクラスから(i)データベース上のすべてのオブジェクトを網羅しかつ(ii)クラス数が最小となるようなクラス集合を求めることにより,データベーススキーマを抽出している.本研究では,半構造データから「各クラスの密度が与えられた閾値以上,かつ,クラス数が最小である」という条件を満たすデータベーススキーマ(以下,スキーマ)を抽出する最適化問題について考察している.ここで,クラス密度とはクラスの型とそれに属する各オブジェクトの型の類似度を表す尺度であり,クラス密度が大きいほどその類似度が高いことを表す.本年度の主な研究実績は以下の通りである.1.スキーマ抽出問題の計算量申請者らは,これまでに上記最適化問題が強NP困難であることを示している.本年度は,同最適化問題に関して,「各抽出クラスの型が最適である(型を表す属性系列が最短である)」という条件を加えた場合の計算量について考察した.そして,この場合,同問題が強NP困難でありかつΔ_2Pに属することを示した.2.スキーマ抽出アルゴリズムの改良上記の結果から,厳密な最適解(スキーマ)を効率良く抽出することは困難である.そこで,昨年度,申請者らは根付クラス(rooted class)というクラスを提案し,それを用いてスキーマを効率良く抽出する多項式時間アルゴリズムを構成した.本年度は,この根付クラスをより一般的な構造をもつクラス(bounded class)に拡張することにより,よりサイズ(クラス数)の小さいスキーマが抽出できるようにアルゴリズムの改良を行った.具体的には,根付クラスは「そのクラスに属するどの基本クラスも,一つのクラス(そのクラスの根)の下位クラスである」という制限をもつが,今回拡張されたクラスではそのような根に相当するクラスを複数もつことが許されている.そのような拡張を行った場合でも,スキーマ抽出アルゴリズムが多項式時間で実行時間可能であることを示した.
Smurf/Arkadiaによる表皮自然免疫の分子制御機構の解明

TGF-β刺激におけるSmurfとArkadiaの機能を角化細胞で解析した。TGF-β刺激によりSmad2/3のリン酸化が誘導されSmad7の発現が増強し、Smurf1,2の発現は増強したがArkadiaの発現には影響を及ぼさなかった。SmurfをshRNAを用いて抑制すると、TGF-βで誘導されるSmad2/3のリン酸化およびSmad7の発現が著しく亢進した。逆にArkadiaを抑制すると、TGF-βで誘導されるSmad2/3のリン酸化およびSmad7の発現が減弱した。また、TGF-βにより誘導される角化細胞の増殖能および遊走能の抑制作用がSmurfのノックダウンにより更に増強した。1. Smadシグナルの解析。正常培養角化細胞をTGF-β刺激後にSmadシグナルを解析する。角化細胞を刺激後に細胞抽出液を作成し抗Smad2/3、抗リン酸化Smad 2/3抗体を用いてWestern blotを行い。その結果Smad経路の活性化を確認できた。2.角化細胞のインフラマソーム活性化。正常培養ヒト角化細胞をTLR2, 3のそれぞれのリガンドであるpam3csk4あるいはpeptideglycan (PGN)、およびpoly-(I;C)、また環境抗原としてダニ抗原、ブタクサなどで刺激し、TLR経路の活性化およびインフラマソームの活性化をIL-1β, IL-18, IL-33のELISA、RT-PCRで確認した。3.レンチウイルスベクターの作成、表皮特異的Smurf, Arkadia KOマウスの作成。培養細胞でsmurf/arkadiaの機能解析するために野生型、変異型のsmurf/arkadiaを組み込んだレンチウイルスベクターをすでに構築しており、現在実験に向けて増殖中である。Smurf, Arkadia遺伝子をloxP配列ではさみこんだSmurf flox/floxマウス、Arkadia flox/floxマウスとK5プロモーターで発現するK5-Creマウスを準備した。交配することにより、K5-Cre/Smurf, Arkadia flox/+マウスを作成する。このマウスを再度Smurf flox/floxマウス、Arkadia flox/floxマウスと交配することによりK5-Cre/Smurf flox/ flox, Arkadia flox/ floxマウスを作成する。培養角化細胞のインフラマソーム活性化にTGF-β、Smurf/Arkadiaが関与しているかどうかを解析する。また、KOマウスを作成し、KOマウスの表現型の解析を行う。1.角化細胞のインフラマソーム活性化のTGF-βによる抑制。TGF-β刺激でインフラマソームの活性化が抑制されるかどうか、TGF-βの前処理後、刺激し反応が減弱するかどうか検討した。その結果、IL-1βの産生は低下していた。3. Smurfの機能解析。レンチウイルスベクターを用いて培養角化細胞のSmurfをノックダウンし、Smadシグナルを解析した。その結果、Smurf 1/2両方のノックダウンではSmad 2/3のリン酸化が亢進し、Smad7の発現が増強した。4. KOマウスの解析。TGF-βシグナルは細胞の増殖・分化も制御しておりKOマウスは表皮の構築にも異常を来している可能性がある。Smurf 2 KOマウスを臨床的に評価したが外観上は著変を認めなかった。培養角化細胞のインフラマソームの解析、およびKOマウスを作成しその表現型の解析を行った。(1)角化細胞におけるインフラマソームの活性化、およびIL-1β、IL-18の産生がTGF-βにより抑制されることをELISA、RT-PCRで確認した。(2) TGF-β刺激によりSmad2/3のリン酸化が誘導されSmad7の発現が増強することをWestern blot、RT-PCRで確認した。また、TGF-β刺激でSmurf1,2の発現は増強したがArkadiaの発現には影響を及ぼさなかった。(3) SmurfをshRNAを用いて抑制すると、TGF-βで誘導されるSmad2/3のリン酸化およびSmad7の発現が著しく亢進した。逆に、ArkadiaをshRNAを用いて抑制すると、TGF-βで誘導されるSmad2/3のリン酸化およびSmad7の発現が減弱した。また、TGF-βにより誘導される角化細胞の増殖能および遊走能の抑制作用がSmurfのノックダウンにより更に増強することも明らかにした。(4) KOマウスを作成し解析した。Smurf2 KOマウスを臨床的に評価したがそれらの外観上の異常は特定できなかった。表皮角化細胞の増殖と分化に影響がでていないか確認した。組織学的にはパラフィン切片を用いたHE染色で皮膚の分化異常を確認し、さらに分化マーカーの発現を免疫組織学的に検討したが、明らかな異常は確認できなかった。また、同マウスを用いて、環境因子で刺激後の自然免疫活性化をSmurf、Arkadia、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1αβ、IL-18、IL-33、TSLPなどの免疫染色により検討したが、有意な差を明らかにすることはできなかった。

TGF-β刺激によりSmad2/3のリン酸化が誘導されSmad7の発現が増強し、Smurf1,2の発現は増強したがArkadiaの発現には影響を及ぼさなかった。SmurfをshRNAを用いて抑制すると、TGF-βで誘導されるSmad2/3のリン酸化およびSmad7の発現が著しく亢進した。逆にArkadiaを抑制すると、TGF-βで誘導されるSmad2/3のリン酸化およびSmad7の発現が減弱した。また、TGF-βにより誘導される角化細胞の増殖能および遊走能の抑制作用がSmurfのノックダウンにより更に増強した。角化細胞のSmadシグナルの解析、およびインフラマソーム活性化の解析はほぼ予定どおり進行している。さらに培養細胞のおける解析のために必要なSmurf 1/2レンチウイルスベクターを用いた解析はすでに進行中である。Arkadiaレンチウイルスベクターは現在作成中である。また、Smurf 2 KOマウスはすでに準備できている。27年度が最終年度であるため、記入しない。皮膚科平成26年度に引き続いて培養角化細胞のインフラマソームの解析、およびSmurf,Arkadia KOマウスを作成しその表現型の解析を行う。さらにSmurf,Arkadiaの発現を臨床的に解析する。1培養角化細胞を用いた解析。角化細胞のインフラマソーム活性化のTGF-βによる抑制。Smadシグナルの解析。Smurf, Arkadiaの機能解析。2 KOマウスの解析。表皮角化細胞の増殖と分化に影響がでていないか確認する。臨床的に評価した後、組織学的にはパラフィン切片を用いたHE染色で皮膚の分化異常を確認する。さらに、分化マーカーの発現を免疫組織学的に検討する。3臨床的なSmurf,Arkadia発現の検討。診断のためにすでに採取してある病理組織標本を用いて発現を検討する。アトピー性皮膚炎の病態に角化細胞インフラマソーム活性化は重要なので、患者病変部の皮膚を免疫組織学的に染色する。Smurf, Arkadia, NLRP3, ASC, Caspase-1, IL-18, IL-33に対する抗体を用いる。さらに、創傷、乾癬などの皮膚炎症部位ではTGF-βが増加し、その結果角化細胞の増殖が亢進しリンパ球浸潤を来すとされており、同様に検討する。4 3年間で得られた結果をとりまとめ、成果の発表を行う。さらに培養細胞のおける解析のために必要なレンチウイルスベクターはすでに構築済みで現在増殖中である。また、マウスの準備も整っており交配をすすめる予定である。Smurf 1/2ベクターをすでに作成済みであるが、Arkadiaベクター大量培養を次年度に行う予定である。大量培養が次年度にずれこんだため大量培養にかかる経費が次年度に生じた。また、マウス作成解析にかかる経費も次年度にずれ込んだ。培養角化細胞のインフラマソームを解析する。角化細胞特異的なSmurf,Arkadia KOマウスを作成し、KOマウスの表現型の解析を行う。
脂肪酸結合蛋白を介した神経系細胞の細胞周期制御脳腫瘍治療応用への可能性の追求

アラキドン酸やドコサヘキサエン酸などの長鎖脂肪酸は、神経系細胞の分裂・分化制御因子として知られている。本研究期間で我々は、長鎖脂肪酸の細胞内キャリアーである脂肪酸結合蛋白(FABP)の神経系細胞の分裂および形態形成に関する生体機能を明確にするために以下の実験を施行した。<実験>1)皮膚型FABP遺伝子欠損マウスを作製し神経系の発達異常の有無を、主に形態学的手法を用いて検討した。2)脳型FABP遺伝子欠損マウスの作製に着手した。<結果と進行状況>1)皮膚型FABP遺伝子欠損マウスは正常に発育し、神経系の形成異常などはこれまでのところ観察されていない。2)皮膚型FABP遺伝子欠損マウスでは、一部の神経細胞において、心臓型FABPの代償的な蛋白発現誘導が観察された。3)脳型FABP遺伝子欠損マウスの作製は、現在ES細胞の選択を終了し、キメラマウスの作製を行っている。<総括>遺伝子欠損マウスの解析結果は、FABPの複数のアイソフォームが神経系細胞の分裂・分化プロセスにおいて互いに代償的機能を果たす事実を示唆している。脂肪酸結合蛋白(FABP)が、グリオーマ細胞の分裂および細胞周期を制御している可能性を検討するために、グリア系細胞に発現している脳型(B-)と皮膚型(S-)FABPについて、形態学および細胞生物学的手法を用いてそれらの特性を追求してきた。その結果と継続研究過程を以下に報告する。1)正常発達期のグリア系培養細胞およびグリオーマ手術検体でのS-およびB-FABPの発現解析i) S-およびB-FABPがグリア芽細胞からアストロサイトへの分化に呼応して発現増強を示す。ii)両型FABPの蛋白発現は、正常アストロサイトにおいてもわずかながら検出される。iii)手術により得られたヒトグリオーマ12検体におけるS-およびB-FABPのmRNA発現についてのノーザンブロット解析では、病理学的悪性度と両型FABPの遺伝子発現強度との間に相関関係は認められない。2) S-およびB-FABPのグリオーマ培養細胞への強制発現株樹立のために、安定強制発現株の選択が可能な発現ベクターの作製が完了し、細胞への遺伝子導入を試行開始した。併せて両型FABP分子のアンチセンスオリエンテーションcDNAの細胞導入をも試行している。3) FABPがグリア細胞の分裂・分化に関与する機構をin vivoレベルでより詳細に解析するために、S-およびB-FABP遺伝子欠損マウスの作製を進めている。すなわち、両型分子のマウス型遺伝子の単離と構造解析およびこれらを用いたターゲッテイングベクターの作製作製はほぼ完了した。
過疎地域における高齢者福祉施設の整備システムに関する研究

1.研究の背景と目的過疎地域(農村・山村・魚村・離島など)では、都市地域と比べ比較的に高齢化率が高く、高齢者は、介護者の不在・住宅状況の悪化・身体機能の低下の中で厳しい居住問題に直面している場合が多い。本研究は、この様な問題により充実的に対応できる「福祉施設整備システム」開発のために行われたものである。2.これまでの研究経過と成果1)国内研究調査平成14年4月から、関連資料(書籍・論文・報告書など)の収集及び研究計画の検討を行い、同年6月から10月まで、研究対象地域である大分県の過疎地域状況と福祉施設の整備状況に関する全般的な調査を実施した。また、同年11月から12月には、過疎地域高齢者福祉サービス提供の拠点とも言える「生活支援ハウス」(21ヶ所)に重点を当てて、施設概要(立地・建築・設備・管理・運営など)、現在の入居者状況、開設からの退居者状況、そして既存調査(6年前)対象入居者に対する追跡調査を行った。更に、平成16年3月には、これまでの調査結果を全般的に整理・分析、その結果を踏まえた上、研究のポイントとなる生活支援ハウスに対し、より綿密な補足調査を実施した2)国外研究調査平成14年12月に、過疎地域の高齢者居住状況が大分県と類似している「韓国南西部の順天市(スンチョンシ)」を訪問、地元の光州大学との連携で、同市に隣接する農村地域の高齢者居住状況に関する基礎調査を行った。なお、平成15年9月には、韓国南東部の密陽市(ミリャンシ)を訪問、地元の密陽大学との連携で、周辺農村地域の高齢者居住状況に関する基礎調査を行った。3)研究結果発表まず、平成15年3月「日本建築学会九州支部研究報告会」、同年9月「日本建築学会学術梗概集(全国大会)」にてこれまでの研究結果を発表した。それから、平成16年1月から4月の間「大韓建築学会計画系論文集」に3篇を投稿、現在審査が進行中である。3.これからの研究計画今後、特別研究員の職責に引き続き、大分大学の客員研究員として残り、これまで得られた研究結果を総合的にまとめ、過疎地域に相応しい高齢者福祉施設の整備体系(システム)を見出していくための考察を深めていく予定である。また、最終的に得られた結果については、日本建築学会計画系論文集に投稿すると同時に、一方、韓国の事例を含めたものについては、大韓建築学会計画系論文集に投稿する計画である。1.研究の背景と目的過疎地域(農村・山村・魚村・離島など)では、都市地域と比べ相対的に高齢化率が高く、高齢者は、介護者の不在・住宅状況の悪化・身体機能の低下の中で厳しい居住問題に直面している場合が多い。本研究は、この様な問題に対し、より充実的に対応できる「福祉施設整備システム」を開発するため、その有効な知見を見出すことを目的としている。2.これまでの研究経過と成果平成14年4月から、関連資料(書籍・論文・報告書など)の収集及び研究計画の検討を行い、同年6月からは、研究対象地域である大分県の過疎地域状況と福祉施設の整備状況に関する全般的な調査を実施した。県内における過疎地域は、全58市町村の中44町村(75.9%)であり、全国で最もその比率が高い。居住施設としては生活支援ハウス(旧名、高齢者生活福祉センター)が20ヶ所で最も多く、そのほか、特別養護老人ホーム2ヶ所・介護老人保健施設1ヶ所・痴呆性高齢者グループホーム1ヶ所が整備されている。今回は、まず、過疎地域高齢者福祉サービス提供の拠点とも言える「生活支援ハウス」を研究対象施設として取り上げ、同年11月から12月にかけて、施設概要(立地・建築・設備・管理・運営など)、現在の入居者状況、開設からの退居者状況、そして既存調査(6年前)対象入居者に対する追跡調査を行った。「生活支援ハウス」20ヶ所における入居定員は219世帯分で、現在の入居者は188世帯(入居率85.8%)であり、その詳しい属性と居住状況等については平成15年3月「日本建築学会九州支部研究報告会」において発表を終えている。現在は、開設後における全ての退居者に対し、その施設利用状況・退居状況(時期・退居理由・退居先)などに関する分析と考察を行い、平成15年9月に発行される「日本建築学会学術梗概集(全国大会)」に投稿中の状況である。また、その他に、平成14年12月には、過疎地域における高齢者の居住状況が大分県と類似している「韓国南部の順天市(スンチョンシ)」を訪問し、地元の大学との連携で、同市に隣接する農村地域の高齢者居住状況に関する基礎調査を行った。3.これからの研究計画今後は、これまで得られた研究結果に、既存調査(6年前)に基づく「入居・退居者の追跡調査」に関する集計と分析結果を加え、各地域ごとの高齢者居住状況や他の福祉施設整備状況との関連性を考察しながら、過疎地域に相応しい高齢者福祉施設の整備体系(システム)方向を見出していく予定である。また、最終的に得られた結果については、日本建築学会計画系論文集に投稿すると同時に、一方、韓国の事例を含めたものに対しては、大韓建築学会計画系論文集に投稿する計画である。

本研究は、この様な問題により充実的に対応できる「福祉施設整備システム」開発のために行われたものである。2.これまでの研究経過と成果1)国内研究調査平成14年4月から、関連資料(書籍・論文・報告書など)の収集及び研究計画の検討を行い、同年6月から10月まで、研究対象地域である大分県の過疎地域状況と福祉施設の整備状況に関する全般的な調査を実施した。また、同年11月から12月には、過疎地域高齢者福祉サービス提供の拠点とも言える「生活支援ハウス」(21ヶ所)に重点を当てて、施設概要(立地・建築・設備・管理・運営など)、現在の入居者状況、開設からの退居者状況、そして既存調査(6年前)対象入居者に対する追跡調査を行った。更に、平成16年3月には、これまでの調査結果を全般的に整理・分析、その結果を踏まえた上、研究のポイントとなる生活支援ハウスに対し、より綿密な補足調査を実施した2)国外研究調査平成14年12月に、過疎地域の高齢者居住状況が大分県と類似している「韓国南西部の順天市(スンチョンシ)」を訪問、地元の光州大学との連携で、同市に隣接する農村地域の高齢者居住状況に関する基礎調査を行った。なお、平成15年9月には、韓国南東部の密陽市(ミリャンシ)を訪問、地元の密陽大学との連携で、周辺農村地域の高齢者居住状況に関する基礎調査を行った。3)研究結果発表まず、平成15年3月「日本建築学会九州支部研究報告会」、同年9月「日本建築学会学術梗概集(全国大会)」にてこれまでの研究結果を発表した。それから、平成16年1月から4月の間「大韓建築学会計画系論文集」に3篇を投稿、現在審査が進行中である。3.これからの研究計画今後、特別研究員の職責に引き続き、大分大学の客員研究員として残り、これまで得られた研究結果を総合的にまとめ、過疎地域に相応しい高齢者福祉施設の整備体系(システム)を見出していくための考察を深めていく予定である。また、最終的に得られた結果については、日本建築学会計画系論文集に投稿すると同時に、一方、韓国の事例を含めたものについては、大韓建築学会計画系論文集に投稿する計画である。
プローブ顕微鏡による機能蛋白質間相互作用の直接観察による視細胞情報変換機構の解析

視細胞では光信号を膜電位変化という電気信号に変換している。光を吸収した視物質が、トランスデューシン、ホスホジエステラーゼを活性化し、環状グアノシン一燐酸(cGMP)の加水分解を促進し、cGMP依存Naチャンネルを閉じる。これが視興奮である。グアニル酸シクラーゼ、ロドプシンリン酸化酵素、アレスチン、Sモジュリン、ホスデューシン、グアニル酸シクラーゼ活性化タンパク質などが関係しており、光信号に対し最もよく電気信号が出るように制御している。本研究では、それらの分子の状態とそれらが相互作用したときの状態を直接観察し、解析しようとした。原子間力顕微鏡の分解能は理論的にはサブオングストロームであるが、しかし実質分解能を上げるのにカンチレバーの工夫や試料の工夫が必要であった。この工夫は以後も続けて行う計画である。ウシ眼球から調製したロドプシンに対する単クローン抗体を作成し、そのうちのロドプシンとそれに光照射したときに反応性の変わるものを分離した。その1つのエピトープがArg21からGlu25を含む領域にあることを決定した。ザリガニの視細胞のラブドーム及びイモリの視細胞円板膜の白金レプリカを作成し、透過型電子顕微鏡で観察した。またそのレプリカを原子間力顕微鏡で観察した。グアニル酸シクラーゼ、コドプシンリン酸化酵素、アレスチン、Sモジュリン、ホスデューシン、グアニル酸シクラーゼ活性化タンパク質のcDNAをクローン化した。それらのうち、アレスチン、Sモジュリン、ホスデューシン、グアニル酸シクラーゼ活性化タンパク質のcDNAを発現ベクターに組み込み、大腸菌などで発現させた。発現したものが生体中のものと同じ性質を示すことを確認した。バクテリロロドプシンとセンソリーロドプシンのキメラ蛋白質、及びそれにトランスデューサーを結合した蛋白質をハロバクテリアで発現させ、生成した蛋白質の構造を原子間力顕微鏡で観察した。これが視興奮である。視細胞では光信号を膜電位変化という電気信号に変換している(光電変換)。光を吸収した視物質が、トランスデューシン、ホスホジエステラーゼを活性化し、環状グアノシン一燐酸(cGMP)の加水分解を促進し、その濃度低下を引き起こす。視細胞形質膜にあるNa/K・ATPアーゼはNaイオンを細胞内から汲み出している。視細胞形質膜のcGMP依存NaチャンネルはcGMPの濃度低下により閉じ、Naイオンを細胞内への流入を止める。その結果、視細胞電位が下がる。グアニル酸シクラーゼ(GC)はGTPからcGMPを合成し、供給している。ロドプシンリン酸化酵素(RK)はメタロドプシンになったとき表面に露出するであろうC末端付近のセリン残基を燐酸化する。そのリン酸化されたメタロドプシンにアレスチン(48Kタンパク質)が結合して、Gタンパク質を活性化出来なくする。これによりメタロドプシンからの信号は停止される。視細胞は環境光によって順応するが、それには、Sモジュリン、グアニル酸シクラーゼ活性化タンパク質などが関係しており、光信号に対し最もよく電気信号が出るように制御している。本研究では、原子間力顕微鏡により、それらの分子の相互作用を直接観察し解析しようと試みるものである。本年度は初年度であり、研究は現在助走段階にあり以下のことを行った。(1)原子力間力顕微鏡を購入し、視物質アナログであるバクテリオロドプシンの観察を行い、観察技術の向上と性能評価を行った。(2)円板膜試料としてイモリの視細胞外節円板膜、およびザリガニの視細胞感桿分体の分離精製法を工夫した。