hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
メタゲノミクスと数理統計学の融合による新規な環境影響評価法の開発

本研究は、あらゆる環境に生息する微生物のメタゲノム解析から得られる膨大なデータをもとに環境微生物が有する様々な生理代謝機能を可視化し、数理・統計物理学的な手法やネットワーク解析を駆使して環境への影響を鋭敏に評価する方法論の開発を目的とした。具体的には既知の海洋メタゲノム配列を研究代表者らが開発中の生理代謝機能評価システム(MAPLE)を用いて環境微生物が有する様々な生理代謝機能を機能の充足率として数値化し、その数値の過大/過少評価を補正するための指標(Q値)の計算手法を考案した。また、機能の存在度の計算手法も開発し、これらの数値をもとに環境間の生理代謝機能や生物種組成の違い等を明らかにした。本研究課題“メタゲノミクスと数理統計学の融合による新規な環境影響評価法の開発"では、大型生物の死滅や個体減少を基準とした海洋における環境影響評価法を一変し、普遍的に存在する微生物群集のメタゲノム配列情報に基づく環境影響評価を可能とすることを目的としているが、平成26年度は、まず、それに必要なメタゲノム配列情報に由来する生物の機能を数値したデータセットの作成を行った。具体的には、Venter研究所が中心となって行ったグローバル海洋サンプリングプロジェクトで採取された、サルガッソー海及びガラパゴス諸島近海、4サイトのメタゲノム配列データ(約120140万配列)から研究代表者らが開発中の生理・代謝機能ポテンシャル評価システム、MAPLEを用いて、エネルギー代謝、中央代謝や環境応答、物質輸送などに関わる機能のポテンシャルを、各反応単位でモジュール化された機能の充足率(MCR %)という形で数値化した(課題1)。また、数値化されたMCRの統計的な偏りによる過大/過小評価を補正するための指標として、Q値(significance)の計算手法の開発を行った。Q値の計算は、1. KEGGから公開されている機能モジュールの構成の特徴。2.ホモロジーサーチ時に得られたスコアー(類似度の優位性)。3.モジュールを構成する遺伝子(KO)の存在度。この3点を考慮して行った。KOの存在度は、KOがアサインされたメタゲノム中の配列数を各KOの平均長で標準化した数値を算出し、その値を各KOの存在度として用いた(課題2)。これらの結果、充足率が100%に満たない機能モジュールでもQ値の優位性から、機能ポテンシャルの存在を優位に示唆できることがわかった。また、このQ値の優位性を示すには、対象とする環境にもよるが、300万配列の遺伝子セットがあれば問題ないことがわかった。平成27年度は、26年度に行った個別生物種ごとでの各機能モジュールの充足率(MCR)の計算結果に基づき、近年、環境中での窒素や炭素循環への役割が注目されるようになったアーキアの機能分類をクラスタリング手法やPCA等の統計学的手法を用いて行った。その結果、同じ生理代謝機能を有する生物種は、系統学的分類パターンに必ずしも依存せずクラスター化され、各機能モジュールの充足率に基づき機能分類が可能であることがわかった。一方、実環境にはゲノム既知生物種との類似性が低い生物種が数多く含まれているが、メタゲノム的手法を駆使すれば、未培養菌からのゲノム再構築が可能である。そこで、機能未知生物種の生理代謝機能の推測を機能未知の未培養菌ゲノム配列から計算されたMCRパターンに基づいて行ったところ、系統的には独立栄養型栄養生物に近いが、機能的には従属栄養生物であることがわかった。平成26年度、MCRの過大/過少評価を補正するための指標となるQ値の計算手法を開発した。MCRはMAPLEシステムで自動的に計算されるが、MCRが100%に満たないモジュールでも、Q値によって完成度が高いと示唆される場合がある。そこで、実際手作業でモジュールの再評価を行ったところ、完成型モジュールであることがわかった。このように、ゲノム情報が既知であれば未培養菌であってもMCRパターンに基づき機能分類が可能であること、また未完成のモジュールであってもQ値によって高い完成度が示唆された場合には、再評価を行う価値があることが示された。本研究課題は、4つのサブ課題からなっているが、その最初の課題であるメタゲノム配列に潜む機能ポテンシャルの数値化データセットの作成については、平成26年度で終了した。これは、本研究で申請した計算ノードの増設とシステムの最適化がスムーズに進んだことによる寄与が非常に大きかった。平成26年度はグローバル海洋サンプリングプロジェクト以外で、研究代表らが採取した深海底サンプルの計算も行い、極端に異なる環境間での比較も可能となっている。

課題2の生物-環境相互作用の抽出・定量化法では、生理・代謝機能ポテンシャルの定量化法の開発を、機能モジュールの充足率の過大/過小評価を補正するためのQ値(significance)の計算手法の開発を中心に行い、平成26年度でほぼ終了した。現在は、これらの研究課題の成果を総括し、課題3の実環境の生態系をデザインする逆生態学的方法の開発に必要なモデル事例を現在検討中である。ゲノム科学平成27年度は、平成26年度に行った課題1、課題2の結果をもとに、実環境の生態系をデザインする逆生態学的方法の開発に着手する。平成26年度は主にメタゲノム配列データを用いて、生理・代謝機能の数値化を行ったが、平成27年度は、ゲノムが既読な生物種の生理・代謝機能の数値化を行い、個別生物種データセットを構築する。実環境の生態系には、既知ゲノム生物種との類似性が極めて低い生物種が多く含まれているので、ゲノムが既読生物種の各機能モジュールに対する充足率やそれを補正するQ値のパターンから、既読生物種を分類する。この結果と平成26年度のメタゲノム配列中の生物種の割合などを考慮して、実環境の生態系をデザインする方法論を開発する(課題3)。また、各生理・代謝機能のモジュール存在度の度合い(richness)とそれを担う生物種の多様性の度合い(evenness)を数値化し、課題4で行う環境維持力・復元力を予測する方法の開発へとつなげる。論文の投稿料として予定していたが、解析に予想以上の時間を要し論文の投稿が遅れたため、次年度に使用することとした。現在論文投稿中なので、アクセプト後に支払う投稿料や研究打ち合わせなどに必要な旅費などに使用する計画である。
マイクロプラズマ遺伝子導入法における周波数の最適化

30年度は遺伝子導入用のプラズマ発生装置の試作に取り組み、以下の研究成果をあげた。1)1MHzおよび500kHz帯での回路の検討と試作:前年度までに13MHz帯と同様の回路を試作し、プラズマの発生を試みたものの、実現することはできなかった。そこで、解析計算と数値計算の両方から、高い昇圧性能Qを有する回路を検討し、インダクタンスが高いこと、損失が十分小さいことが求められることが明らかとなった。リッツ線・φ40μm×660本(外径1.65mm)が入手できたためこれを利用した。この結果、1MHz帯ではQが60を超える回路を制作することができた。2)1MHzおよび500kHz帯でのマイクロプラズマの発生:上述のリッツ線を利用した共振回路に整合用コイルを取り付け、高周波を加えることで、これらの周波数帯域でマイクロプラズマの発生を得た。3)3つの周波数帯域でのプラズマによる遺伝子導入:低い周波数(1MHzおよび500kHz)では、プラズマの照射時間が長いほど、導入効率が高くなっており、一方、高い周波数(13.56MHz)では、照射時間が短いほど導入効率が高くなっていることが明らかとなった。また、高い周波数(13.56MHz)で導入半径が大きくなっていることが明らかとなり、周波数の違いがプラズマの物理的な性質の違いを引き起こし、それにより遺伝子導入に影響していることが明らかとなった。今後は、このような「違い」を明らかにすることで、キーとなっているものを明らかにして、導入効率の改善への可能性を探ることが期待できる。4)プラズマの照射回数:照射回数をパラメータとして上述の3周波数で比較を行った。1回の照射時間を0.4msとして、25回(計10ms)の場合と、1パルス照射の場合を比較したところ、前者の方の導入効率が高かった。照射回数も重要なパラメータであることが明らかとなった。平成29年度は遺伝子導入用のプラズマ発生装置の試作に取り組み、1)13.56MHzにおけるマイクロプラズマ発生の安定化:ガラス細管でのコーティングや樹脂コーティングなどを試み、ガラス被覆した厚紙を利用する方法でプラズマが極めて安定することとなった。小型共振・整合回路の改良も終了し、細胞等を用いた実験への準備は整った。2)1MHzおよび500kHz帯でのマイクロプラズマの発生:13MHz帯と同じ回路構成で、小型共振・整合回路を試作したが、プラズマの発生に至っていない。という状況であった。平成30年度は、3)1MHzおよび500kHz帯での回路の検討と試作:解析計算と数値計算の両方から、高い昇圧性能Qを有する回路を検討し、1MHz帯ではQが60を超える回路を制作することができた。4)1MHzおよび500kHz帯でのマイクロプラズマの発生:上述の回路を利用して、これらの周波数帯域でマイクロプラズマの発生を得た。5)3つの周波数帯域でのプラズマによる遺伝子導入:低い周波数(1MHzおよび500kHz)および、高い周波数(13.56MHz)で遺伝子導入を行い、遺伝子導入の傾向に違いが見られた。概ね、計画通りに進んでいるものの、一部に遅れが見られる。周波数ごとに、Q値が異なっている点である。この部分にスピードアップを図りつつ、その他の部分についても計画通り進める。1)13.56MHz帯:Q値の改善に取り組み、遺伝子導入に与える影響をみる。また、これまでは最大500Wの高周波電源(空冷)を使用していたが、1kWの電源(水冷)を使用して、他の周波数帯域と最大電力を揃えて、比較を行う。電力を上げ、一方でパルス幅を短くすることで、導入効率の改善を目指す。2)1MHzおよび500kHz帯でのマイクロプラズマ:プラズマの照射回数を最適化することで、導入効率を上げる。3)13.56MHz以上の周波数帯域への挑戦: 1MHz帯域と13.56MHzでは傾向は違うものの、導入効率を激変させるに至っていない。愛媛大学内には27.12MHzや40.68MHzの電源もあり、それらの利用を検討し、回路を試作する。29年度は遺伝子導入用のプラズマ発生装置の試作に取り組み、以下の研究成果をあげた。1)13.56MHzにおけるマイクロプラズマ発生の安定化:これまでに、共振・整合回路を小型化し、電極直上にこれらを配置することで、電源からの同軸ケーブルによる給電を可能とした。今年度は共振・整合回路内のコイルをトロイダル化することで、効率を上げ、より低い入力電力でのプラズマ発生に成功した。また、φ30μmの電極は不安定であったため、無機ガラスコーティングされた厚紙に電極金属を固定し、電極金属と厚紙を同時に切断することで、電極金属が支えからはみ出ることなく固定されている状態を作ることが可能となった。電極が動かなくなったことで、一層のプラズマの安定化を達成した。2)電極から離れた位置でのマイクロチャンネルプラズマの発生:2つの電極の間に、絶縁板を設け、2つの槽に分ける。その絶縁板に1つの貫通孔を設け、2つの槽と貫通孔を食塩水で満たす。電極間に13MHzの高周波を加えることで、貫通孔内に水中プラズマを発生させることが可能となる。有限要素法と高速カメラ観察から、プラズマ発生の機構が明らかになりつつあり、貫通孔とプラズマの間には水の膜があることが判明した。そこで、貫通孔や槽を全て、透明樹脂で一体的に成型したマイクロチャンネルプラズマ発生装置の施策が可能となった。デューティーや入力電力をコントロールすることで、温度上昇もなくプラズマの発生が可能である。

3)1MHzおよび500kHz帯でのマイクロプラズマの発生:13MHz帯と同様の小型共振・整合回路を試作し、プラズマの発生を試みた。インピーダンスは50Ωになっており、整合は十分であったが、プラズマの発生を実現することはできなかった。整合のための回路が不十分で、整合が取れる周波数と、共振周波数とが一致していないためであると考えられる。次年度以降の課題である。平成29年度は遺伝子導入用のプラズマ発生装置の試作に取り組み、以下の研究成果をあげた。29年度は機器の開発に対して主に取り組み、今後、これらの機器を使用して、細胞や人工細胞を用いた実験を進める予定である。なお、詳細は後述するが、一部に計画通りでない部分があり、スピードを上げて研究開発を行う所存である。1)13.56MHzにおけるマイクロプラズマ発生の安定化:ガラス細管でのコーティングや樹脂コーティングなどを試み、ガラス被覆した厚紙を利用する方法でプラズマが極めて安定することとなった。小型共振・整合回路の改良も終了し、細胞等を用いた実験への準備は整った。2)電極から離れた位置でのマイクロチャンネルプラズマの発生(実験):全透明樹脂製の装置を開発し、気泡の発生からプラズマの発生まで、高速カメラで観測することに成功した。これらの研究を通じ、プラズマと樹脂の間に水の膜があることを発見し、遺伝子導入用の小型装置の開発へと至った。CWでは水温上昇があるものの、パルス運転では問題なく、人工細胞などを用いた実験への準備が整っている。3)1MHzおよび500kHz帯でのマイクロプラズマの発生:13MHz帯と同じ回路構成で、小型共振・整合回路を試作したが、プラズマの発生に至っていない。整合のための回路が不十分で、整合が取れる周波数と、共振周波数とが一致していないためであると考えられ、電圧プローブを用いた計測では十分な電圧まで上がっていないことが確認された。パルス運転の装置では計測が面倒であるため、水冷されたCWタイプの装置を試作し、平成30年度前半には、まず、プラズマの発生に至る予定である。30年度は遺伝子導入用のプラズマ発生装置の試作に取り組み、以下の研究成果をあげた。1)1MHzおよび500kHz帯での回路の検討と試作:前年度までに13MHz帯と同様の回路を試作し、プラズマの発生を試みたものの、実現することはできなかった。そこで、解析計算と数値計算の両方から、高い昇圧性能Qを有する回路を検討し、インダクタンスが高いこと、損失が十分小さいことが求められることが明らかとなった。リッツ線・φ40μm×660本(外径1.65mm)が入手できたためこれを利用した。この結果、1MHz帯ではQが60を超える回路を制作することができた。2)1MHzおよび500kHz帯でのマイクロプラズマの発生:上述のリッツ線を利用した共振回路に整合用コイルを取り付け、高周波を加えることで、これらの周波数帯域でマイクロプラズマの発生を得た。
シュートヒーテイングしたスイカ果実の果肉温度、糖集積関連酵素および糖の偏在性

シュートヒータをスイカ植物体に装着加温する区を設け,果実発育後期まで加温し,果実内部における細胞形態学および生理学的な現象の面的解明し,スイカのように大きな果実における甘味の偏在性について調査した.ハウス内の最低温度は15°Cまで低下したが,シュートヒータの装置内温度は夜間でもほぼ設定温度の32°Cを中心にして推移した.その結果,果実表面温度は,加温区のほうが1°C前後高く,果実中心部の温度も無加温区26.5°Cに対して,加温区では加温部分がより広く,中心部の温度も28.3°Cと高くなった.果実の縱径,横径および重さは収穫時の6月14日では加温区で無加温区より有意に小さくなった.開花25日目の細胞の大きさは,無加温区では中心部で大きく外側部で小さくなったが,加温区では果実外側部の細胞が無加温区より大きくなり,これらの各部位の平均の細胞の大きさは,無加温区より加温区でより大きくなった.AI活性は,無加温区で加温区で無加温区より小さくなった.これとは反対に,SPS活性は加温区で15μmol min-1mg-1 protein以上の活性を示す部位が外側部3ヶ所と果実外側部で高いSPS活性が見られ,中心部でも1カ所あったが,無加温区では5μmol min-1mg-1 protein以下の部位がほとんどであった.平均値でみると, SPS活性は加温区で無加温区より有為に大きくなった.部位別のスクロース含量は,開花25日目では無加温区ではいずれの部位でも同じで,加温区では中心部で高くなった.開花35日目ではいずれの区でも外側部で大きくなったが,加温区では無加温区より極端に大きくなった.平均値でみると,25日目では何れの糖も区間で差異はなかったが,35日目になるとスクロース含量が加温区で無加温区の1.74倍の32.7g・L-1と大きくなったが,グルコース,フラクトースには差異は見られなかった.シュートヒータをスイカ植物体に装着加温する区を設け,果実発育後期まで加温し,果実内部における細胞形態学および生理学的な現象の面的解明し,スイカのように大きな果実における甘味の偏在性について調査した.ハウス内の最低温度は15°Cまで低下したが,シュートヒータの装置内温度は夜間でもほぼ設定温度の32°Cを中心にして推移した.その結果,果実表面温度は,加温区のほうが1°C前後高く,果実中心部の温度も無加温区26.5°Cに対して,加温区では加温部分がより広く,中心部の温度も28.3°Cと高くなった.果実の縱径,横径および重さは収穫時の6月14日では加温区で無加温区より有意に小さくなった.開花25日目の細胞の大きさは,無加温区では中心部で大きく外側部で小さくなったが,加温区では果実外側部の細胞が無加温区より大きくなり,これらの各部位の平均の細胞の大きさは,無加温区より加温区でより大きくなった.AI活性は,無加温区で加温区で無加温区より小さくなった.これとは反対に,SPS活性は加温区で15μmol min-1 mg-1 protein以上の活性を示す部位が外側部3ヶ所と果実外側部で高いSPS活性が見られ,中心部でも1カ所あったが,無加温区では5μmol min-1 mg-1以下の部位がほとんどであった(第31図).平均値でみると, SPS活性は加温区で無加温区より有為に大きくなった.部位別のスクロース含量は,開花25日目では無加温区ではいずれの部位でも同じで,加温区では中心部で高くなった.開花35日目ではいずれの区でも外側部で大きくなったが,加温区では無加温区より極端に大きくなった.平均値でみると,25日目では何れの糖も区間で差異はなかったが,35日目になるとスクロース含量が加温区で無加温区の1.74倍の32.7 g・L-1と大きくなったが,グルコース,フラクトースには差異は見られなかった.シュートヒータをスイカ植物体に装着加温する区を設け,果実発育後期まで加温し,果実内部における細胞形態学および生理学的な現象の面的解明し,スイカのように大きな果実における甘味の偏在性について調査した.ハウス内の最低温度は15°Cまで低下したが,シュートヒータの装置内温度は夜間でもほぼ設定温度の32°Cを中心にして推移した.その結果,果実表面温度は,加温区のほうが1°C前後高く,果実中心部の温度も無加温区26.5°Cに対して,加温区では加温部分がより広く,中心部の温度も28.3°Cと高くなった.果実の縱径,横径および重さは収穫時の6月14日では加温区で無加温区より有意に小さくなった.開花25日目の細胞の大きさは,無加温区では中心部で大きく外側部で小さくなったが,加温区では果実外側部の細胞が無加温区より大きくなり,これらの各部位の平均の細胞の大きさは,無加温区より加温区でより大きくなった.AI活性は,無加温区で加温区で無加温区より小さくなった.

これとは反対に,SPS活性は加温区で15μmol min-1mg-1 protein以上の活性を示す部位が外側部3ヶ所と果実外側部で高いSPS活性が見られ,中心部でも1カ所あったが,無加温区では5μmol min-1mg-1 protein以下の部位がほとんどであった.平均値でみると, SPS活性は加温区で無加温区より有為に大きくなった.部位別のスクロース含量は,開花25日目では無加温区ではいずれの部位でも同じで,加温区では中心部で高くなった.開花35日目ではいずれの区でも外側部で大きくなったが,加温区では無加温区より極端に大きくなった.平均値でみると,25日目では何れの糖も区間で差異はなかったが,35日目になるとスクロース含量が加温区で無加温区の1.74倍の32.7g・L-1と大きくなったが,グルコース,フラクトースには差異は見られなかった.スイカの早春の早出し栽培では,果実外側部の甘味が極端に低下する.加納はシュートヒーテイングするとスイカ果実中の糖含量が増大することを明らかにしているが,果実中の局在性については不明である.そこで,シュートヒーテイングしたスイカ果実中の各部位における細胞の大きさ,糖集積関連酵素活性およびスクロース含量との関係を調査した.2011年5月10日に開花した果実の近傍の蔓約15cmを最低温度を32°Cで20日間加温した.6月4日(開花25日目,加温処理終了時)に果実を採取し,果実を赤道面で折半し,果肉赤道面温度を赤外線サーモグラフィーで測定し,赤道面の各部位の細胞の大きさ,酸性インベルターゼ(AI),ショ糖リン酸合成酵素(SPS)およびスクロース含量について調査した.ハウス内最低温度は15°C以下であったが,装置内温度はほぼ32°Cであった.サーモグラフィーによる赤道面の果肉温度は,無加温区の中心部,中央部(外側部と中心部の中間部),果皮部の温度はそれぞれ25.3°C,24.8°C,23.4°Cであったのに対し,加温区では26.8°C,26.3°C,24.5°Cと1°C以上高くなった.細胞は,無加温区では外側部で小さく中心部にいくに伴い大きく,加温区では中央部で大きくなった.AI活性は加温区で小さく,無加温区との差異は,中央部で最も大きかった.SPS活性は,加温区の中央部で大きかったのに対し,無加温区では中心部で大きくなったので,SPS活性の部位的差異は,中心部で小さく中央部で大きくなった.スクロース含量は,両区とも中央部で大きく,加温区の中央部でより大きくなった.このように,シュートヒータで加温すると,果実中央部から外側部にかけての細胞の肥大成熟が促進される結果,中央部から外側部におけるAI活性の低下とSPS活性の増大が起こり,その結果,中央部におけるスクロース含量が大きくなるものと考えられる.シュートヒーテイングしたスイカ果実における,細胞の大きさ,AIおよびSPS活性,そしてスクロース含量との相関関係が極めて明確になったため.すなわち,シュートヒーテイングを行うと果実外側部の果肉細胞の肥大が促進され,AI活性が低下,SPS活性が増大し,その結果スクロース含量が外側部で大きくなる.昨年度は果実発育中期の1時期だけの,果実内における細胞,酵素,糖含量の局在性を調査したが,今年度はこれらの局在性が果実発育に伴いどのように変化するかを調べる.研究の推進方策に従い,細胞の形態観察,酵素活性,糖含量に関連する物品を購入する.
角膜血管新生におけるリンパ球の役割

初年度(平成17年度)でマウス角膜血管新生の過程で浸潤してくるリンパ球においてCD4陽性細胞の中に占めるCD25陽性細胞(CD4CD25陽性細胞)の割合が増加していることを確かめた。CD25陽性リンパ球は制御性T細胞と呼ばれ、様々な炎症性疾患でT細胞の機能を抑制し、炎症に対して抑制的に機能することが知られている。そのためこれらのリンパ球が角膜血管新生にどのような役割を果たしているか観察するために、CD4,CD25の中和抗体を同様のモデルにおいて、術前から一日おきに中和抗体を腹腔内に投与し、術後9日目における角膜新生血管領域の測定を試みた。するとCD4中和抗体投与群ではコントロール群と比較して血管新生が抑制されたのに対して、CD25中和抗体投与群では血管新生がむしろ増悪した。以上の結果からCD25陽性リンパ球は角膜血管新生を抑制的に機能することが考えられたため、平成18年度ではCD25陽性細胞を投与することにより、角膜血管新生に対してどのような効果を示すか検討した。10-Onylonをマウス角膜に通糸し、角膜に十分血管の侵入したマウスの骨髄や脾臓からマグネティックビーズを用いてCD25陽性細胞を分離した。分離したCD25陽性細胞は上述した通糸処置3日後のマウスに尾静脈から静注することにより投与した。しかし、細胞条件、投与条件などさまざまな検討を行ったにも拘らず、CD25移入による角膜血管新生の抑制効果は見られなかった。CD25陽性細胞の中にもさまざまなSubsetがあることが知られており、これらについてさらに検討する必要があると考えられた。初年度(平成17年度)はまず角膜血管新生の過程で浸潤してくるリンパ球について検討した。マウスを全身麻酔下で手術用顕微鏡にセットし、10-Onylon糸を角膜実質内にかけることにより角膜血管新生を誘導した。コントロール(無処置マウス)、術後3,9日後の眼球を摘出し、角膜における浸潤リンパ球に対し免疫組織化学染色を行い共焦点レーザー顕微鏡で観察した。リンパ球マーカーとしてCD4,CD25を用いた。コントロールの角膜ではいずれのリンパ球の浸潤は見られないものの、CD4陽性リンパ球は術後3日には角膜実質内に浸潤し(7.0±2.5/section)、9日目には数多くのCD4陽性リンパ球が浸潤していた(28.2±5.9/section)。CD25との二重染色を試みたところ、CD4CD25陽性細胞は術後3日目で1.1±0.6/section、9日目で9.7±40/sectionとCD4陽性細胞の中に占めるCD25陽性細胞の割合は増加していた。次にこれらのリンパ球が角膜血管新生にどのような役割を果たしているか観察するために、CD4,CD25の中和抗体を同様のモデルにおいて、術前から一日おきに中和抗体を腹腔内に投与し、術後9日目における角膜新生血管領域の測定を試みた。新生血管領域の計測はIsolectin B4による血管内皮染色から実体蛍光顕微鏡を用いて血管新生領域を取り込み、その画像からNIH imageを用いて角膜血管新生領域をpixel数で算出することによって行った。以上の結果からCD25陽性リンパ球は角膜血管新生を抑制的に機能することが考えられる。
内視鏡下手術操作における技術分析と新規教育方法の開発

腹腔鏡操作やロボット補助操作は触感覚の欠如から、指導者のみならず術者自身も鉗子作用力の理解困難な面がある。そのため操作の特徴を伝え技術を伝達することは容易ではない。過去に我々は、腹腔鏡鉗子先端や結紮縫合点の作用力計測、腹腔鏡手術およびロボット手術術者の関節肢位の位置計測をテーマに技術分析を行ってきた。本課題では、ロボット補助下前立腺全摘除術における尿道膀胱吻合操作に注目した。吻合時の尿道に加わる作用力の大きさおよび方向(垂直、水平方向)を定量化し、実際熟練者が注意を払っている点を明らかにし、初心者との差を分析することが目標である。前立腺手術における膀胱尿道吻合手技は、糸針を使用し吻合を行うが、尿道への過度の荷重は、尿道組織の損傷に繋がり術後尿禁制に影響すると考えられる。3軸力覚センサを組み合わせた骨盤膀胱尿道吻合モデルを作成し、作用力計測を行える環境を作成した。熟練者7名、初心者8名に対し、疑似膀胱と疑似尿道を全周性に縫合するタスクを課し、運針部位別に尿道への作用力を評価した。吻合時間は熟練者が短く、垂直方向の作用力、手前に尿道を引いてしまう力は初心者のほうが大きいという結果であった。吻合部位による難易度の差を鑑みた方向別の検討では、8ー10、11ー1時で熟練者の値が初心者と比べ小さく、2ー4、5ー7時方向では差を認めなかった。2ー4時は利き腕と逆の手を使用する頻度が高い事、5ー7時は運針が難しい箇所である事が、熟練者の作用力が大きくなる原因と考えられた。現在ステレオ画像に処理を加え、作用力を3次元的に重畳表示するシステムを作成し視覚的なフィードバックによる技術習得の有用性に関して検討を行っている。工学技術の進歩に伴い手術操作の定量化が注目され、手術技術を分析することが試みられている。経験の浅い術者への教育は重要課題であり、手術技術の分析は技術伝達に役立てることが出来、注目を集めている。手術操作には、結紮、縫合、把持、剥離など様々な操作がある。各操作を分析するには操作の特徴を捉え定量化することが重要である。今年度はドライボックス下での結紮縫合手技を行う際の結紮縫合点作用力計測、術者関節位置計測を、工学的デバイスにて行えることを検証した。熟練者は初心者に比べ垂直方向に加える力が少なく、関節の動きも狭い範囲で操作を行っていることが明らかとなった。ロボット手術における検証も行いマスターコントローラーの把持力を計測し、技術レベルの異なる術者の評価を行った。擬似膀胱尿道吻合モデル(擬似尿道膀胱吻合モデルを外部受注により作製する)を作製し、これを用い3軸センサをモデルに組み合わせ作用力計測を行う予定である。同時に関し把持力計測システムの作製にも取り掛かり、計測された尿道作用力と関節位置情報を表現するビューワーの開発を予定している。本課題の特色は、手術技術の定量化により、熟練者の特徴を明らかにし技術伝達の一助とすることである。過去に、単純結紮縫合時の結紮点作用力、膀胱尿道吻合時の尿道への作用力を方向別に計測した報告は例がない。また、関節の動きや姿勢を含めた統括的な技術分析は、熟練者の特徴でもある効率的な操作を、初心者に伝達することの一助となると考えられる。ロボット手術、腹腔鏡手術における肢位計測を行うことが出来た。熟練者と初心者のデータ分析を行っている最中である。今年度はフィードバックシステムの作製に取り掛かる予定であり順調に経過している。今年度は、前立腺手術における膀胱尿道吻合手技(in vitro)の技量分析を行い、尿道への作用力を表示可能なシステムを作成した。同手術では、糸針を使用し吻合を行うが、尿道への過度の荷重は、尿道組織の損傷に繋がり術後尿禁制に影響する。熟練者、初心者に対し、膀胱尿道を全周性に縫合するタスクを課し、運針部位別に尿道への作用力を評価した。さらにステレオ画像に処理を加え、作用力を3次元的に重畳表示するシステムを作成した。平均作用力は、熟練者2.5N、初心者3.5Nであった。吻合部位による難易度の差を鑑みた方向別の検討では、8ー10、11ー1時で熟練者の値が小さく、2ー4、5ー7時方向では差を認めなかった。技術レベルの異なる2群でロボット手術での膀胱尿道吻合時の尿道への作用力を分析し、作用力を重畳表示するシステムの作成に取り組んでいる。

作製した膀胱尿道吻合モデルを用いた膀胱尿道吻合手技の作用力分析を行うことが可能であり進捗状況はおおむね順調である。作用力を重畳表示するシステムの作製し、フィードバックの有用性に関して取り組みを進めたい。腹腔鏡操作やロボット補助操作は触感覚の欠如から、指導者のみならず術者自身も鉗子作用力の理解困難な面がある。そのため操作の特徴を伝え技術を伝達することは容易ではない。過去に我々は、腹腔鏡鉗子先端や結紮縫合点の作用力計測、腹腔鏡手術およびロボット手術術者の関節肢位の位置計測をテーマに技術分析を行ってきた。本課題では、ロボット補助下前立腺全摘除術における尿道膀胱吻合操作に注目した。吻合時の尿道に加わる作用力の大きさおよび方向(垂直、水平方向)を定量化し、実際熟練者が注意を払っている点を明らかにし、初心者との差を分析することが目標である。前立腺手術における膀胱尿道吻合手技は、糸針を使用し吻合を行うが、尿道への過度の荷重は、尿道組織の損傷に繋がり術後尿禁制に影響すると考えられる。3軸力覚センサを組み合わせた骨盤膀胱尿道吻合モデルを作成し、作用力計測を行える環境を作成した。熟練者7名、初心者8名に対し、疑似膀胱と疑似尿道を全周性に縫合するタスクを課し、運針部位別に尿道への作用力を評価した。吻合時間は熟練者が短く、垂直方向の作用力、手前に尿道を引いてしまう力は初心者のほうが大きいという結果であった。吻合部位による難易度の差を鑑みた方向別の検討では、8ー10、11ー1時で熟練者の値が初心者と比べ小さく、2ー4、5ー7時方向では差を認めなかった。2ー4時は利き腕と逆の手を使用する頻度が高い事、5ー7時は運針が難しい箇所である事が、熟練者の作用力が大きくなる原因と考えられた。現在ステレオ画像に処理を加え、作用力を3次元的に重畳表示するシステムを作成し視覚的なフィードバックによる技術習得の有用性に関して検討を行っている。フィードバックシステムの作製後、フィードバックの方法に関し検討を行い、可能であればランダム化により術者技能評価を行う予定である。ダビンチシステムにおけるステレオ内視鏡情報を外部出力し重畳表示させるシステムを現在作成中である。フィードバックシステムの構築が可能となれば、同システムによる学習効率の検討を行いたい。
術中術後の心房心室除細動用およびペーシング用ミニパドルの開発

我々は、2000年度において、一昨年度までの実験結果を踏まえ、さらにmini-paddleの性質を表す基礎データをそろえるべく実験を重ね、あるいは新たな実験項目を加えることにより臨床応用により近づく結果を得ることができた。1雑種成犬を用いた除細動閾値の測定:雑種成犬(n=7)を用いて心房除細動閾値を測定した。胸骨正中切開した後両側迷走神経を露出。刺激用電極を逢着した後心嚢切開。心房刺激用電極を右心耳に2本、ミニパドルをSinus Nodeを避けた右心房と左心房左心耳寄りに逢着した。パルス幅2msec,10Hz,2Vで迷走神経刺激を5分間行った後、Burst刺激で心房細動を誘発。心室同期にて各出力で除細動を試みた。心房除細動閾値は4.9±1.9Jであった。2雑種成犬(n=7)を用いて心室除細動閾値を測定した。心室にburst刺激を加え、心室細動を起こした後、mini-paddleを用いて除細動を試みた。心房除細動閾値は9.9±1.8Jであった。次いで、mini-paddleを用いた心房心室のペーシング閾値を雑種成犬を用いて測定した。3心房ペーシング閾値は6.0±1.5mAであった。4心室ペーシング閾値は7.2±1.7mAであった。5除細動による心筋組織の変化の観察により、30J X3回までは、心筋傷害が少なく許容範囲内と思われた。本実験結果を東京大学倫理委員会に提出した結果これを通過し、来年度から臨床応用に入る予定である。1.我々は19992000にかけ,ミニパトルに関する基礎データを増やした。その後,特に,除細動後の心筋へのダメージが問題となったため,慢性犬による組織学的検討を行ったところ除細動の間隔を30秒あけ,20Jで3回までが,組織への影響が少ないことが判明した。そして,ついに,2.2000年3月,臨床例2例にミニパドルを用いた。(ASD症例)細動誘発は,50H_37Vで安全に術野をさまたげることなく可能であった。☆心室ペーシング閾値は6.5V,5.8V,心房ペーシング閾値は6.6V☆心室センシング閾値は7.88.0mV,10.012.0mV,☆除細動は21Jで成功し,何ら合併症なく抜去した。今後臨床例を増やして行く。
一般炭による廃液中重金属回収,廃プラスチック脱塩素,並びに高発熱量発電燃料の創製

重金属水溶液に一般炭を混ぜてろ過することにより,一般炭中のカルボキシル基のプロトンと重金属イオンが交換されたカチオン交換炭を得た.交換炭とポリ塩化ビニルの共熱分解反応を行い,交換炭からの金属脱離の促進にともない有機塩素化合物の生成が抑制でき,高発熱量の固体燃料が得られた.鉛交換炭を用いて,水溶媒量11.1mlとし300°Cで0min.保持する共熱分解反応により最も金属・塩素含有率の低い固体燃料が得られた.重金属水溶液に一般炭を混ぜてろ過することにより,一般炭中のカルボキシル基のプロトンと重金属イオンが交換されたカチオン交換炭を得た.交換炭とポリ塩化ビニルの共熱分解反応を行い,交換炭からの金属脱離の促進にともない有機塩素化合物の生成が抑制でき,高発熱量の固体燃料が得られた.鉛交換炭を用いて,水溶媒量11.1mlとし300°Cで0min.保持する共熱分解反応により最も金属・塩素含有率の低い固体燃料が得られた.Morwell褐炭を硝酸水溶液中で撹拌後,純水でろ過,真空乾燥したものを脱灰炭とした.脱灰炭を硫酸銅水溶液中で撹拌後,純水でろ過,真空乾燥したものをCu交換炭とした.内容積100mlのオートクレーブに溶媒として純水を11.1ml,反応試料としてポリ塩化ビニル(PVC),及び銅交換炭または銅粉末+脱灰炭を,金属量とPVC中の塩素のモル比が1:2となる量でそれぞれ装入し,窒素ガスを置換した後,2.0MPaまで加圧した.外部電気炉にて300°Cまで昇温させ,60分間温度を保持して反応させた.反応終了後は直ちに空冷した.生成物に対して純水抽出を行い,水不溶分(改質燃料)と水可溶分を得た.水可溶分の塩素含有率は硝酸銀滴定による塩化銀生成量から,改質燃料の塩素含有率は高温燃焼イオンクロマトグラフ法により求めた.前者は交換炭中の金属により塩として安定化された無機塩素,後者は有機塩素とし,その割合を塩素残存率(%)とした.また,改質燃料の灰分測定から金属残存率(%)を求めた.銅交換炭を用いた反応と,銅粉末+脱灰炭を用いた反応による金属及び塩素残存率はそれぞれ80%,20%程度となり,ほぼ同等の結果が得られた.これは,各反応において,PVCから脱離した塩素が銅イオン,または銅により塩化銅(CuCl_2)として捕捉されたため,塩素と石炭の有機質の接触確率が低下し,有機塩素化合物の生成が抑制されたためと考えられる.以上より,銅交換炭を用いることで銅金属単体とほぼ同等に有機塩素化合物の生成抑制が可能であることが明らかになった.Morwell褐炭を硝酸水溶液中で撹拌後,純水でろ過,真空乾燥したものを脱灰炭とした.脱灰炭を硫酸銅(II),または硝酸鉛(II)水溶液中で撹拌後,純水でろ過,真空乾燥したものをそれぞれ,Cu交換炭,Pb交換炭とした.内容積100mlのオートクレーブに溶媒として純水を11.1ml,反応試料としてポリ塩化ビニル(PVC)及び交換炭を,交換炭中の金属量とPVC中の塩素のモル比が1:2となる量でそれぞれ装入し,窒素ガスを置換した後,2.0MPaまで加圧した.外部電気炉にて所定温度まで昇温させ,60分間温度を保持して反応させた.反応終了後は直ちに空冷した.生成物に対して純水抽出を行い,水不溶分(改質燃料)と水可溶分を得た.水可溶分の塩素含有率は硝酸銀滴定による塩化銀生成量から,改質燃料の塩素含有率は高温燃焼イオンクロマトグラフ法により求めた.前者は交換炭中の金属により塩として安定化された無機塩素,後者は有機塩素とし,その割合を塩素残存率(%)とした.また,改質燃料の灰分測定から金属残存率(%)を求めた.反応温度の上昇(200°C300°C)にともない金属及び塩素残存率は,Cu交換炭ではCu:98%→77%,Cl:55%→20%,Pb交換炭ではPb:43%→32%, Cl:39%→5%に減少した.これは,反応温度の上昇にともない交換炭中の金属が脱離し,PVCから脱離した塩素を金属塩化物として固定化したためと考えられる.また,いずれの反応温度においてもCu交換炭に比べPb交換炭を用いると金属及び塩素残存率が低い.これは,Cuに比べPbはイオン化傾向が高く,共熱分解時に溶媒である水中のH^+とのイオン交換により金属カチオンとして脱離しやすかったためと考えられる.Morwell褐炭を硝酸水溶液中で撹拌後,純水でろ過,真空乾燥したものを脱灰炭とした.脱灰炭を硫酸銅(II),または硝酸鉛(II)水溶液中で撹拌後,純水でろ過,真空乾燥したものをそれぞれ,Cu交換炭,Pb交換炭とした.内容積100mlのオートクレープに溶媒として純水を11.1ml,反応試料としてポリ塩化ビニル(PVC)及び交換炭を,交換炭中の金属量とPVC中の塩素のモル比が1:2となる量でそれぞれ装入し,窒素ガスを置換した後,2.0MPaまで加圧した.外部電気炉にて300°Cまで昇温させ,300°Cで所定時間保持して反応させた.反応終了後は直ちに空冷した.

生成物に対して純水抽出を行い,水不溶分(改質燃料)と水可溶分を得た.水可溶分の塩素含有率は硝酸銀滴定による塩化銀生成量から,改質燃料の塩素含有率は高温燃焼イオンクロマトグラフ法により求めた.前者は交換炭中の金属により塩として安定化された無機塩素,後者は有機塩素とし,その割合を塩素残存率(%)とした.また,改質燃料の灰分測定から金属残存率(%)を求めた.保持時間の延長(060min.)にともないCu交換炭では金属および塩素残存率が増加,Pb交換炭では減少した.また,Cu交換炭を用いた反応では保持時間の延長によりCO_2の収率が増加した.これは,保持時間の延長にともない交換炭の脱炭酸反応が進行し,金属カチオンの脱離が促進され,金属残存率が減少したためと考えられる.しかし,Cu交換炭を用いた反応では脱離したCu^<2+>が溶媒中に溶存したCO_2と反応し水不溶性のCuCO_3を生成したため,Cu^<2+>による塩素捕捉が抑制され,残存塩素率が増加したためと考えられる.以上より,Cu交換炭では保持時間を短縮,Pb交換炭では延長することで金属および塩素残存率を低減できると考えられる.
強相関系の為の量子古典ハイブリッド法の開発と生体酵素活性中心への応用

2011年に光合成光化学系IIの水酸化反応中心の構造が発表され、我々はその構造を用いた電子構造計算を行い、あらゆる可能な酸化状態に対するあらゆる可能なスピン状態を全て吟味し、論文発表を行った。我々の知る限り、世界的に光化学系IIのMnクラスターの初めての論文である。引き続き我々は自然軌道解析や構造変化を追い、水分子を分解する反応機構の提案をいくつか行った。一方で理論と計算の矛盾する部分もあったので、Mn錯体のオリジナルテストセットを構築し、その磁性の記述の汎関数依存性の吟味を行った。又、Mnクラスターのノンコリニア磁性を吟味し、スピン密度の線形応答関数に基づくQM/MMガイドラインを提案した。2012年度の研究でも、沈・神谷グループにより解明された光化学系IIの水分解反応中心をターゲットに第一原理計算による研究を進めてきた。彼らのX線回折実験によって得られた構造は暗所安定のS1状態に対する解像度1.9Åのもので、さらに(1)詳細な構造、(2)別酸化数の状態の構造とスピン非制限密度汎関数理論によって電子構造の解析を進めた。特にS0S3状態のいずれに対しても、ダングリングMnイオンとcubane中の酸素-Mnを結ぶMn-O-Mnの構造が、酸素の位置が右に偏るMn...OーMnと、左に偏るMnーO...Mnの2つの局所安定構造からなるdouble well型ポテンシャルである事、酸化数が上がるにつれてダングリングが外れるMn...OーMnが安定化する事を明らかにした。これは、高酸化状態でダングリングMn周りに水が挿入しうる事を示し、水の酸化反応機構の解明の鍵となる結果である。また同時に、周囲の環境効果を取り入れる為のQM/MM境界問題にも取り組んだ。具体的には、線形応答関数を計算する事で、境界設定のガイドラインを次々と設定していっている。具体的には、(i)共有結合系では、平衡状態近傍では片側の摂動を加えても密度誤差の伝播は比較的小さいが結合不安定点で誤差伝播が最大となり、完全なジラジカルでは最小となる。(ii)π共役系では共鳴構造を反映した減衰型伝播モードが起こる。(iii)MDによって得られた平衡状態のポリペプチド系では、アミド平面が誤差伝播単位となり、Cα原子を1つまたぐ毎に誤差は1/101/100程度減衰する。αヘリックス等の水素結合を介した誤差伝播は小さいが無視できない。等の一般的結果を得た。今後、具体的なQM/MM境界法と組み合わせた定量的解析を実施する。本年度はまとめの年であるので光化学系II(PS II)の応用研究の総括的な研究を行うとともに、平行して一般化スピン軌道(GSO)密度汎関数理論(DFT)によるMnクラスターの磁性と構造相関の研究そして線形応答関数解析に基づくQM/MM境界問題へのアプローチの磁性・および結合次数揺らぎへの拡張を行った。PS IIに関しては、(1-i)通常のDFT汎関数B3LYPを用いた水分解反応中心マンガン系の電子構造および構造最適化計算による反応機構の推定・提案、(1-ii)磁性をプローブとするマンガンクラスターの酸化数や構造などを検出する為の、マンガン複核錯体の磁気的相互作用および超微細構造定数(A値)の評価の為のDFT汎関数の選定・開発を行ってきた。一方、(ii-1)GSO-DFTによるマンガンクラスターの磁性と構造相関の研究としてはファンマン静電定理に基づき高スピン状態最適化の後にGSO-DFTの最安定スピン構造の研究を行い既存の最安定スピン状態と異なるノンコリニア磁性状態を指摘した。また(ii-2)線形応答関数解析に基づくQM/MM境界条件探索を磁性がある場合のスピン密度揺らぎへの拡張、および結合次数揺らぎへの拡張を行い境界設定アプローチとして完成させた。無論PSIIの反応機構は以前確定しておらず(1-i)の本研究期間中に行ったPS IIの反応機構の正誤が判明するのは何年も先になると思われるが、(1-ii)のマンガン錯体用の汎関数の選定開発や(ii-1),(ii-2)で開発した方法論は、世界的に見ても新しい成果であると言える。2011年度の研究では、沈と神谷教授グループにより解明された光化学系IIの水分解反応中心の構造に対し、第一原理計算を用い電子構造を解析した。具体的には、Mn4核錯体と第一配位圏アミノ酸のモデルを重原子はX線構造のまま固定し、取り得る全てのアキシャル型スピン構造、Mn(III)4からMn(IV)4に到る5段階の酸化状態に対し、DFT計算を実行した。結果局所酸化数およびスピン構造に対するエネルギー順位の縮退、また、(最隣接・次最隣接モデルではない)

全サイトがカップルするスピン構造である事を明らかにした。研究計画1年目、理論開発に力点を置く予定とはかなりズレたがこれはいち早く計算結果を出す為必要であったと考える。沈・神谷らのX線構造は、これまで謎に包まれていた光合成の水分解触媒Mnクラスタ-の構造を明らかにした歴史的な研究成果であり、実際2011年度のScience誌の選ぶ10大研究に選ばれている。日本のグループが解明した構造の世界初の第一原理計算を日本のグループである我々が実行した事は意味があるものと考えている。しかしいくつかの酸化状態では最安定スピンに関し実験が示すそれと矛盾しており、プロトン化様式ならびに構造緩和効果の吟味が必要である事も分かってきた。その研究に関しては計算設備と人員を必要とする研究であり競合するグループも多く特にMaxPlank研究所のNeeseらは多くのポスドクと計算機センター並みの設備を擁し同様の解析を行っていると見られる。私のグループは、計算の実務要員としては私と学生1名、計算設備に関しても比肩し得べくもないものである為、2011年度終盤からは理論の工夫に力点をおき彼らと差別化できる研究を行っている。具体的には磁気相互作用やESR超微細構造定数に有効なDFTの交換汎関数の設計とQM/MM境界問題への取り組みであり、いずれも世界初の研究である。光合成のPS IIの機構解明が世界的に見ても熾烈な競争状態に入っている為、そちらの応用研究を重点的に進行している。その結果、応用計算結果という意味では世界の競合研究者に負けない成果をあげており、植物による光エネルギーを利用した水の分解反応の解明という、人類に取って重要な課題解決に向け着実進んでいる。昨年度より世界に先駆け発表していた磁性状態の実験との齟齬も、他の研究グループ等により発表されている後発研究の結果と合致しいる。また本年度は構造依存性に重点を置き、特に酸化状態が進んだS2, S3での構造解明によって、ダングリングMnの位置、反応機構に対する1つの仮説が得られた事は極めて大きいと言える。ただ上記成果の一方、一般化スピン軌道(GSO)ベースの密度汎関数理論(DFT)、共鳴配置間相互作用(Res-CI)の理論開発に関しては多少遅れている。勿論、現在進行中であるので、本年度中には成果を発表する予定である。理論的に重要な成果は磁気的相互作用やESRのA値用の汎関数の吟味である。Review記事にそれぞれ1報発表したが、Mn錯体に特化した汎関数の構築という新しい試みの成果が出つつある。一方、QM/MM理論への展開に関しては、線形応答関数に基づく境界問題へのアプローチという新しいアイデアに基づく研究のプライオリティは取れたと言える。こちらも今年度定量的理論への発展を行う予定である。総合すると、昨年度来そうであったのだが、沈・神谷らのX線回折構造の発表で幕を明けた熾烈な応用計算分野での競争状態の中、沈・神谷構造に対する世界初の磁性状態の発表から始まり、当初の予定を大幅に上回る成果が上がっている一方、その為基礎理論およびコード開発は少し遅れている。今年度はその基礎理論へ研究の重点をシフトし、バランスの良く成果を出していく予定である。上記研究成果に書いた通り、本年度は、研究計画にあった理論開発よりむしろ応用計算を優先して進めた。その為、論文発表という形では成果は予定以上に出ていると言える。
線虫をモデル系としたパーキンソン病原因因子LRRK2の制御機構

本年度はまず、哺乳動物細胞を用いてLRRK1およびLRRK2とHSC70/HSP70そしてBAG2との関係について調べた。哺乳動物でtagを付けたLRRK1, HSC70/HSP70およびBAG2を発現させてその結合様式について詳細に検討したところ、LRRK1とBAG2はHSC70を介して弱く結合すること、またLRRK2でも同様の結合が見られることが明らかになった。しかし、内在性のLRRK1とHSC70/HSP70およびBAG2の結合について調べたところ、LRRK1とHSC70/HSP70の結合およびBAG2とHSC70/HSP70の結合はそれぞれ確認できたものの、LRRK1とHSC70/HSP70およびBAG2の三者複合体は確認できなかった。従って、内在性のレベルでは三者複合体ではなくそれぞれの二者複合体になっていると考えられる。興味深いことに、LRRK1とHSC70の結合はBAG2を共発現させると減少し、逆にHSC70とBAG2の結合はLRRK1を共発現させると減少した。このことから、BAG2とLRRK1のHSC70への結合は競合的であることが示唆された。次に、線虫においてLRK-1のゴルジ体への局在に対するhsp-1変異の効果について調べたところ、unc-23変異体で見られるLRK-1のゴルジ体への局在低下がh`sp-1変異により抑圧できることが明らかとなった。さらに、unc-23変異体の抑圧変異として単離されたhsp-1変異体のうち、最も表現型の強いkm59変異体について調べたところ、劣性の表現型としてホモ個体が生殖細胞の発育異常を起こして不稔になることが判明した。このことから、h<p-1の機能あるいは量の低下がunc-23変異を抑圧したと推測される。なお、上記の結果を含めたこれまでの成果について、論文としてまとめてジャーナルに投稿し、現在リバイズ中である。(抄録なし)これまでにヒトLRRK2の結合因子としてユビキチンリガーゼであるCHIPの抑制因子BAG-2とシャペロン因子Hsc70を同定し、これらの因子の線虫ホモログがLRRK2の線虫ホモログLRK-1と同様に、シナプス小胞タンパク質の極性的な局在を制御していることを見いだした。そして、更なる研究を進め、シナプス小胞タンパク質の局在異常を指標にした変異体スクリーニングに取り組み、複数の変異体の単離に成功した。これらの変異体の原因遺伝子をマッピングにより決定した所、JIP3(c-Jun N-terminal kinase(JNK)-interacting protein 3)の線虫ホモログであるUNC-16であることが明らかになった。unc-16変異体で見られるシナプス小胞タンパク質の局在異常の表現型は、lrk-1変異体と同様、クラスリンサブユニットであるUNC-101の変異により抑圧されることを明らかになった。培養細胞を用いた実験からJIP3はLRRK2と結合することが報告されている。これらのことから、UNC-16はLRK-1と結合し、シナプス小胞タンパク質の極性的な局在を制御していることが考えられる。また、シナプス小胞の局在異常の表現型とユビキチンプロテアソーム系の関係を検討した所、unc-23変異体で見られるシナプス小胞蛋白質の局在異常がユビキチンプロテアソームサブユニットの変異により抑圧されなかった。このことから、シナプス小胞蛋白質の局在異常にはユビキチンプロテアソーム系を介した分解は関与していない可能性が示唆された。このことは、LRK-1が分解ではない他の制御を受けている可能性を示しており、とても興味深い結果であり、さらなる解析を進めている。これまでにヒトLRRK2の結合因子としてユビキチンリガーゼであるCHIPの抑制因子BAG-2とシャペロン因子Hsc70を同定し、これらの因子の線虫ホモログがLRRK2の線虫ホモログLRK-1と同様に、シナプス小胞タンパク質の極性的な局在を制御していることを見いだした。当該年度ではさらにスクリーニングを進め、新たにユビキチン化に関与する変異体の単離に成功した。このことから、シナプス小胞の局在異常の表現型とユビキチン化に関わる因子との関係を生化学的方法により検討することにした。まず、LRK-1がユビキチン化されている可能性について検討するために線虫内でLRK-1を過剰発現させ、LRK-1がユビキチン化を受けるのか検討した。その結果、LRK-1はユビキチン化を検出することはできなかった。さらに、unc-23変異体においても同様の実験を行ったがLRK-1のユビキチン化を検出する事はできなかった。このことから、unc-23変異によりLRK-1のユビキチン化状態に変化を与えないことが示唆された。このことは、LRK-1が直接修飾を受けていない可能性を示したおり、とても興味深い結果である。今後はユビキチン化の標的の探索と、このユビキチン化とLRK-1との関わりについて検討していく。