hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
EBウイルス特異的治療用アデノウイルスベクターの作製

新規EBV特異的遺伝子治療システムの確立を目指した研究を行い、以下の成果を得た。1.改良アデノウイルスベクター(Adv)の作製EBV陽性腫瘍細胞特にリンパ球系腫瘍への治療用遺伝子ユニット導入効率の上昇、Advへの挿入可能DNAサイズの増加を図るため、従来の5型ベクター(Adv5)のfiber knob遺伝子を35型のものに置換したベクター(Adv5/35f)を作製した。両AdvにGFP遺伝子を組み込み(Adv5/35f-GFP、Adv5-GFP)、様々なEBV陽性ヒト細胞株への比較感染実験を行った結果、ほとんどの細胞で遺伝子導入率がAdv5/35f>Adv5であった。またAdv5/35fは許容挿入DNAサイズも0.8kb大きくできた。2.rtTA発現カセットの挿入方向、駆動プロモーターの選択EBVoriPのFR-DS間介在領域に置換配置したrtTA発現カセット(Tet-on)の挿入方向と駆動プロモーターの違いによる発現量を、Lucレポーター・アッセイにて293細胞で検討した結果、発現カセットはDS→FRの向きに挿入し、かつSV40p駆動性にすることで293packaging細胞内でのrtTA発現leakを抑制でき、挿入DNAサイズもさらに約0.3kb削減が可能となることが示された。以上より、目的の治療用Advの作製が可能になったと考える。今後は、遺伝子の挿入/切り出しが不安定なCre-loxP系に代えて、我々が最近独自に開発した部位特異的組み換え(RES-attP/B)系を利用し、また、組み換え酵素遺伝子とrtTAの発現プロモーターをTREからbi-directional TREに変更して非誘導時のrtTA発現を一層抑制する改良を計画中である。構築した治療用遺伝子ユニットの細胞内環状化と長期維持を確認後、Adv5/35fへ組み込む操作に移る予定である。[Advベクターへの挿入DNAサイズの縮小化]EBV oriPの各種欠失変異体plasmidを作製し、EBV感染細胞内での長期維持能を検討した。その結果、oriPの二つの機能領域FRとDS間の介在ウイルス配列全域をtetracycline応答性トランスアクチベーター(rtTA)発現カセットで置換した変異型oriP plasmidが野生型oriPと同程度の効率でepisomeとして複製維持されることを見い出した。これにより0.9kbのサイズ縮小が可能となった。また293細胞ではCMV promoter活性がSV40 promoter活性よりも強いことを見い出したので、TREからの発現leakを最小とするためにrtTAを従来のCMV promoter駆動からSV40 promoter駆動に変更した。これにより0.3kbのサイズ縮小を行った。SV40 promoterはoriP配列の近傍に配置するとEBNA1による転写活性化を受けることが確認され、SV40 promoterを用いることでrtTA発現がEBV感染細胞でのみさらに増強されることが期待される。以上の成績からベクターに組み込む遺伝子群は総計約9kbであったものが約7.8kbにまでサイズ縮小でき、Advベクターへの挿入が可能となった。[293/tTS細胞の作製]293細胞内でのTREからのCre発現leakによる環状化を未然に防ぐため、tetracycline調節性転写サイレンサー(tTS)遺伝子発現ユニットと薬剤耐性マーカーを含んだプラスミドを構築、293細胞にtransfectし、stable-transfectantを得た。レポーターアッセイによりTRE活性が強く抑えられるクローン(293/tTS)を選択した。その結果、293細胞に比較してTRE活性を1/100以下に抑えられるクローンを見い出した。以上の成果を踏まえ、引き続きベクターゲノムを構築中である。
神経栄養因子様効果をもたらす脳内レチノイド受容体の新規シグナル伝達機構の解明

前年度までに、レチノイド受容体作動薬であるAm80が一酸化窒素(NO)/cGMPシグナル経路を駆動してドパミンニューロン保護効果をもたらすことを見出した。本年度は、Am80の神経保護効果に、新規NOシグナル関連分子である8-nitro-cGMPの産生を介したシグナル経路の動員が関与する可能性について、タンパク質のS-グアニル化修飾に着目して検討した。ヒト神経芽細胞腫であるSH-SY5Y細胞、胎仔ラット脳より調製した中脳ニューロンの初代培養系および、新生仔ラット脳より調製した中脳-線条体組織切片共培養系を用いて検討した結果、Am80はドパミンニューロンにおいて8-nitro-cGMPの産生を増大し、タンパク質のS-グアニル化レベルを亢進させ、その効果はNO/cGMPシグナル阻害薬との併用あるいは、神経型NO合成酵素(nNOS)のノックダウンによって顕著に抑制された。さらに質量分析の結果、S-グアニル化を受ける標的分子として、細胞骨格である微小管を構成するタンパク質であるβ3-tubulinを同定した。そこで微小管の動態に着目して検討した結果、Am80は微小管の重合レベルを亢進し、その効果はNO/cGMPシグナル阻害薬との併用あるいは、nNOSのノックダウンによって抑制された。加えて、Am80あるいは8-nitro-cGMPが、ドパミン神経毒であるMPP+による傷害性からドパミンニューロンを保護することも見出した。以上の結果から、Am80は8-nitro-cGMPの産生を介したシグナル経路を動員し、β3-tubulinのS-グアニル化を介した微小管安定化作用によって、ドパミンニューロンを保護することが示唆された。1.レチノイド受容体リガンドによるNO/cGMPシグナルおよびMEK/ERKシグナルの誘導とBDNF発現増大機序の解析レチノイド受容体サブタイプのうちRARαおよびRARβに対する強いアゴニスト活性を有するAm80は、処置時間および処置濃度依存的に中脳組織におけるBDNF mRNAおよびタンパク質の発現レベルを増大させ、その効果は一酸化窒素合成酵素(NOS)阻害薬であるL-NAME、可溶性グアニル酸シクラーゼ阻害薬であるODQ、プロテインキナーゼG阻害薬であるKT5823、MEK阻害薬であるPD98059の適用により抑制された。またAm80は神経型一酸化窒素合成酵素(nNOS)の発現量増大およびERKリン酸化を誘導した。ODQおよびKT5823の適用がAm80によるERKリン酸化誘導を抑制した一方、PD98059はAm80によるnNOS発現増大を抑制しなかった。以上の結果より、Am80はNO/cGMPシグナル経路を駆動し、その下流でMEK/ERKシグナルを活性化することでBDNFの発現を誘導することが示唆された。2.レチノイド受容体リガンドによる8-nitro-cGMP産生増大機序の解析と8-nitro-cGMPにより修飾される標的タンパク質の同定レチノイド受容体リガンドがNO/cGMPシグナル経路を駆動するという知見に基づき検討した結果、Am80の適用がドパミンニューロンにおいて新規シグナル伝達分子である8-nitro-cGMPの産生を増大し、L-NAMEおよびODQがこの効果を抑制した。さらにプロテオーム解析により、Am80処置後の中脳組織において8-nitro-cGMPによるS-グアニル化修飾を受ける候補タンパク質を複数見出した。これらの結果から、レチノイド受容体刺激が、中脳領域において新規のシグナル伝達系を誘導することが示唆された。
異種材料(接合)界面の価電子状態分析システム

異種材料の接合プロセスにおいて,材料選択や接合条件選択を合理的に行うためには,接合界面の化学結合状態(原子間相互作用),すなわち界面の電子状態を知ることが必要不可欠であるという立場に立って,電子線収束技術,超格子多層膜積層技術に,離散データ解析技術などを応用し,AESなどの電子スペクトル計測結果から,界面固有のスペクトルを抽出するシステムを試作した.使用するAESをコントロールしている表面分析システムに,計算機を接続し,データを取り込めるようにした.また,VAMAS projectで構築された標準データベースの資産を利用するため,異なる計測器間でデータ転送できるようにした.照射ビームによる励起域中の界面構成原子密度を考慮して,理想的な重量スペクトルを試作し,修正したDavidon-Fletcher-Powell(DFP)法の妥当性を確認した.明らかにしたその適応限界から,界面特有の情報を取り出すためのs/nを求めたが,実際に実験で確かめることの出来ないオーダーの時間が必要で有ることが解った.有る程度の危険率を見込んで実際面への適応性を確認するため,単純化した系での分析を試みた.異種材料の接合プロセスにおいて,材料選択や接合条件選択を合理的に行うためには,接合界面の化学結合状態(原子間相互作用),すなわち界面の電子状態を知ることが必要不可欠であるという立場に立って,電子線収束技術,超格子多層膜積層技術に,離散データ解析技術などを応用し,AESなどの電子スペクトル計測結果から,界面固有のスペクトルを抽出するシステムを試作した.使用するAESをコントロールしている表面分析システムに,計算機を接続し,データを取り込めるようにした.また,VAMAS projectで構築された標準データベースの資産を利用するため,異なる計測器間でデータ転送できるようにした.照射ビームによる励起域中の界面構成原子密度を考慮して,理想的な重量スペクトルを試作し,修正したDavidon-Fletcher-Powell(DFP)法の妥当性を確認した.明らかにしたその適応限界から,界面特有の情報を取り出すためのs/nを求めたが,実際に実験で確かめることの出来ないオーダーの時間が必要で有ることが解った.有る程度の危険率を見込んで実際面への適応性を確認するため,単純化した系での分析を試みた.
セルオートマトンによる群集避難行動の数理解析と防災応用

セルオートマトンを用いた建物からの人の避難シミュレーションについて検討し、以前より提唱しているフロアフィールドモデルの詳細な検討を行なった。特にシミュレーションの基盤である、動的フロアフィールドと視野の関係について詳しい比較をした。動的フロアフィールドとは、人が通過する際に残す足跡を利用して追従行動を表現するものであるが、この足跡は実際にフロアに存在するものではなく、計算効率の向上を図るためのアイディアである。実際には、人は自分の視野内の他人の行動を見て自分の動きを決めるわけであるため、同一条件でこの2つのシミュレーション結果の比較を行なった。その結果、視野を使った場合と足跡の場合はほとんどの場合、振る舞いに違いは見られなかった。そして計算時間は動的フロアフィールドの方が圧倒的に速いことも示された。以上の結果から、本研究においてフロアフィールド法の基礎は確立したので、今後は応用的研究に移ってゆくことが重要である。現在は、実際の建築物や空港、イベント会場などにおける人の動きの解析を行なっており、そのソフトウエア化の契約も決まっている。こうしてフロアフィールド法の基礎的検討から応用まで一連の研究が完成し、今後は実験・観測データとの詳細な比較検証が重要である。災害避難のデータはほとんど入手できるものは無いが、航空機からの脱出に関しては比較的詳細なデータがとられている。現在までに、このデータとシミュレーションの比較ができており、競争と協力的行動が総避難時間に与える影響について定性的に一致する結果が得られた。火災時など緊急事態におけるビルからの人々の避難計画は、建築設計上極めて重要であり、これまでさまざまな事例からの経験則をもとに定式化されてきている。しかし、実際の状況での実験が困難な事や、人間心理が関わっているために客観的な数理物理的手法による解析が適用しにくい事などが相侯って、現在の建築法規にある評価方法は決して満足できるものではない。そこで本研究では、セルオートマトンを用いて人間の行動をモデル化しパニック状況における人間心理を組み入れてシミュレーションすることで、実験不可能な様々な状況下での群集の行動を調べた。特にドア幅によって、人が逃げる際に、「協力」するのか、「競争」するのかで結果が大きく変わることを見出した。本研究で提案するモデルはフロアフィールドモデルである。これは、生物学の化学走性(フェロモン)という概念を援用したもので、ここでは2種類のフロアフィールドを考える。一つ目は静的フロアフィールドで、これは扉までの距離情報を持つ場のことである。その計算はダイクストラ法を用いる方法を新たに開発した。もう一つは動的フロアフィールドで、人の通った跡を記憶する場で人の足跡の累積数を記憶しておく。パニック時ではこの動的フロアフィールドの値が大きい、つまり足跡の数の多いほうに人は進む傾向がある。動的フロアフィールドは記憶を持った場と考えられ、フェロモンに相当する新しい概念である。これにより、人どうしの遠距離相互作用を、周囲のセルとの値を見ることで近距離相互作用で近似できる。また、静的フロアフィールドと動的フロアフィールドの比はパニツクの度合いを表し、パニック度と呼び、この値を調整することで現実のデータをうまく再現する結果も得られた。セルオートマトンを用いて自律粒子系の集団運動を記述するモデルを考案し、その理論解析および数値計算を行った。自律粒子として、本年度は蟻を中心にその1次元行動の数理解析、また双方向流や開放系の研究を行った。これらは人のモデルの1次元版と考えられ、人の避難行動のモデルの精密化に役立つ。この1次元モデルの研究により、フェロモンの存在により低密度でダンゴ状態の行動パターンになることが分かり、これは従来の平均場近似では取り扱えないものであることが確認できた。そのため、ゼロレンジ過程という新しい確率過程を用いて解析したところ、その結果が非常にシミュレーション結果に近くなった。よって、生物の行動の本質部分は数学的にゼロレンジ過程を用いて解析できるという重要な知見が得られた。また、ルールを多少変えることによりこの1次元モデルはバスの運行システムに類似していることが分かり、こちらでもシミュレーションの結果、最適なバスの運行台数やバス停数などが明らかになった。そして低密度の際のバスの平均速度などの理論値が得られた。さらに、生物の体内の分子モーターに関しても同様の渋滞現象があることが分かり、このモデル化と解析も行った。それはラングミュアー運動を取り入れた新しいセルオートマトンであり、渋滞と非渋滞を分けるショックドメインの構造が明らかになりつつある。以上の結果により1次元的振る舞いはほぼ解明できたと考えられるので、この結果を踏まえて、2次元モデルの解析へつなげてゆくよていである。そのために、ネットワーク的に絡んだ格子についてのセルオートマトンについて研究をはじめ、スモールワールドネットワークと言われる新しいネットワークが人などの生物の相互運動の本質ではないかと考えるようになってきた。来年度以降はこの見地から人の行動について分析し、よりよいセルオートマトンモデルを考えて避難行動のシミュレーションに役立てたいと考えている。

その結果、視野を使った場合と足跡の場合はほとんどの場合、振る舞いに違いは見られなかった。そして計算時間は動的フロアフィールドの方が圧倒的に速いことも示された。以上の結果から、本研究においてフロアフィールド法の基礎は確立したので、今後は応用的研究に移ってゆくことが重要である。現在は、実際の建築物や空港、イベント会場などにおける人の動きの解析を行なっており、そのソフトウエア化の契約も決まっている。こうしてフロアフィールド法の基礎的検討から応用まで一連の研究が完成し、今後は実験・観測データとの詳細な比較検証が重要である。災害避難のデータはほとんど入手できるものは無いが、航空機からの脱出に関しては比較的詳細なデータがとられている。現在までに、このデータとシミュレーションの比較ができており、競争と協力的行動が総避難時間に与える影響について定性的に一致する結果が得られた。
腸管グリア・神経細胞間シグナル伝達系からみたヒルシュスプルング病の病態発生学研究

新生児・乳児の腸管運動障害を呈するヒルシュスプルング病(以下H病と略す)の病態発生においては、神経堤細胞由来の腸管神経細胞の分布の異常が認められている。本研究においては腸管グリアと神経細胞の間のシグナル伝達に注目して、H病の病態発生メカニズムの詳細な解析を目指した。即ち、H病モデルマウスを用いて、これらの病態発生の原因となった遺伝子変異、消化管神経叢におけるニューロン・腸管グリア細胞間シグナル(RET、GDNF,SOX10,NGF,NGFR,P2X7 receptor)の発現変異との相関を検討する目的で研究を行った。自然突然変異系マウス:Lethal spotting(ls/ls)系、Piebald spotted(sl/sl)系およびDominant megacolon(Dom/Dom)系を免疫不全マウス維持管理環境下に準じたクリーン度に管理し維持した。消化管神経叢におけるニューロン・グリア細胞間シグナル伝達因子の発現動態解析として、各マウスより摘出した全消化管標本ならびに子宮より採取した胎仔を直ちに4% paraformaldehyde溶液(pH7.400)にて浸潤固定後、急速凍結し、その標本を10μm12μm厚の薄切、連続切片とした。腸管グリア細胞の特異的マーカーとしてGFAP及びS100α分子に対する抗体、ニューロン・グリア細胞間シグナル伝達因子のマーカーとしてRET,GDNF,SOX10,NGF,NGFR,SOX10,P2X7の各抗体を用いた。各標本において蛍光抗体法にて分子の局在性を特定し、H病の病態発生の原因となった遺伝子変異、消化管神経叢におけるニューロン・腸管グリア細胞間シグナルの発現変異との相関を検討した。さらに、これらの知見をH病の臨床例の神経発達について当てはめて検討した。その結果、臨床例においてSOX10の異常を有する症例がみられ、これらの例では腸管のグリア系のみならず末梢神経系さらには中枢神経系でのミエリン化の異常を示唆する所見が得られた。近い将来、H病のより詳細な病態解析が可能となり得ると考える。消化管神経叢におけるニューロン・グリア細胞間シグナル伝達因子の発現動態解析として、各マウスより摘出した全消化管標本ならびに子宮より採取した胎仔を直ちに4%paraformaldehyde溶液(pH7.400)にて浸潤固定後、濃度勾配Sucrose溶液にて浸透圧プロテクトを施した上でO.C.T.compoundに浸し液化窒素下にて急速凍結させた。標本を組織架台にマウント後、凍結標本薄切装置にて10μm12μm厚の薄切、連続切片としてコーティングスライドグラスに貼付した。ここで腸管グリア細胞の特異的マーカーとしてGFAP及びS100α分子に対する抗体、ニューロン・グリア細胞間シグナル伝達因子のマーカーとしてRET,GDNF,SOX10,NGF,NGFR,SOX10,P2X7の各々に特異的親和性を有するマウスmonoclonal及び抗ウサギpolyclonal抗体(gene Bank及びcommercial baseにて入手)を反応させた。続いて、FITCないしRhodamineにて蛍光標識した二次抗体を反応させ蛍光抗体法にて分子の局在性を特定中である。

即ち、これらの病態発生の原因となった遺伝子変異、消化管神経叢におけるニューロン・腸管グリア細胞間シグナル(RET,GDNF,SOX10,NGF,NGFR,P2X7 receptor)の発現変異との相関性について検討する実験系を確立した。新生児・乳児の腸管運動障害を呈するヒルシュスプルング病の病態発生においては、神経堤細胞由来の腸管神経細胞の分布の異常が認められている。本研究においては腸管グリアと神経細胞の間のシグナル伝達に注目して、ヒルシュスプルング病の病態発生メカニズムの詳細な解析を目指した。即ち、ヒルシュスプルング病モデルマウスを用いて、これらの病態発生の原因となった遺伝子変異、消化管神経叢におけるニューロン・腸管グリア細胞間シグナル(RET、GDNF、SOX10,NGF, NGFR, P2×7 receptor)の発現変異との相関性について検討することを目的として研究を行った。自然突然変異系マウス:Lethal spotting(1s/1s)系、Piebald spotted (s1/sl)系およびDominant megacolon (Dom/Dom)系を免疫不全マウス維持管理環境下に準じたクリーン度に管理し維持した。消化管神経叢におけるニューロン・グリア細胞間シグナル伝達因子の発現動態解析として、各マウスより摘出した全消化管標本ならびに子宮より採取した胎仔を直ちに4% paraformaldehyde溶液(pH7.400)にて浸潤固定後、濃度勾配Sucrose溶液にて浸透圧プロテクトを施した上で0.C.T.compoundに浸し液化窒素下にて急速凍結した。その標本を組織架台にマウント後、凍結標本薄切装置にて10μm12μm厚の薄切、連続切片としてコーティングスライドグラスに貼付した。ここで腸管グリア細胞の特異的マーカーとしてGFAP及びS100α分子に対する抗体、ニューロン・グリア細胞間シグナル伝達因子のマーカーとしてRET, GDNF, SOX10,NGF, NGFR, SOX10,P2×7の各々に特異的親和性を有するマウスmonoclonal及び抗ウサギpolyclonal抗体(gene Bank及びcommercial baseにて入手)を反応させた。続いて、FITCないしRhodamineにて蛍光標識した二次抗体を反応させ蛍光抗体法にて分子の局在性を特定した結果、以上の実験法を用いて、これらの病態発生の原因となった遺伝子変異、消化管神経叢におけるニューロン・腸管グリア細胞間シグナル(RET, GDNF, SOX10,NGF, NGFR, P2×7 receptor)の発現変異との相関性について検討した。これらの知見を、ヒルシュスプルング病の臨床例の神経発達について当てはめて検討した。その結果、臨床例でSOX10の異常を有する例がみられ、これらの例では腸管のグリア系のみならず末梢神経系さらには中枢神経系でのミエリン化の異常を示唆する所見が得られた。近い将来、ヒルシュスプルング病のより詳細な病態解析が可能となり得ると考える。
魚類の卵母細胞を標的とする分子輸送体を産生するトランスジェニックメダカの作製

本研究は、親魚から卵・仔魚へ様々な有効物質を輸送できる分子輸送システムの開発を目指し、遺伝子組換え魚によるモデル分子輸送体の生産に挑戦し、将来的な生物工場(バイオリアクター)開発に向けた萌芽的技術基盤を得ることを目的とした。卵母細胞への輸送部位、蛍光蛋白質、リンカー、遺伝子組換え導入システムを複数組み合わせて発現コンストラクトを作製し、最終的に、蛍光性モデル輸送体あるいはリンカー付きモデル輸送体を産生する第2世代(F1)と第3世代(F2:蛍光性モデル輸送体のみ)を得た。本研究の成果により、今後同輸送体の大量生体内生産に向けた新たな試験系の確立に有効な知見を得ることができた。本研究の最終目的は、卵に特異的に発現する受容体を標的として、親魚から卵・仔魚へ世代を超えて様々な有効物質を輸送することのできる、分子輸送システムを開発することである。試験期間内の到達目標は、遺伝子組換え技術によるモデル分子輸送体の生体内生産に挑戦し、将来的に同輸送体を大量生産する生物工場(バイオリアクター)開発に向けた萌芽的技術基盤を得ることである。H27年度は、卵への輸送を担う分子として、卵黄蛋白質前駆体ビテロジェニンの一部領域(リポビテリン重鎖領域:LvH; Lv軽鎖領域:LvL)を設定し、以下の成果を得た。・遺伝子組換え魚飼育および同作製試験に必要な設備を整備すると共に、モデル魚であるメダカ受精卵への遺伝子導入に必要な条件(飼育条件・マイクロキャピラリーの作製条件等)を最適化した。・これら発現コンストラクトを導入した培養細胞(COS1)を作製し、各組換えキメラ輸送体を一過性発現させた結果、コンストラクト導入細胞は赤色蛍光を示し、機能的なコンストラクト蛋白質の発現が示唆された。初年度であるH27年度の目標である遺伝子導入に向けた準備(組換え魚の飼育・作製試験設備整備・作製条件の検討・導入コンストラクトの作製等)がほぼ終了したため、「おおむね順調に進展している」と判断した。H28年度は、昨年度作製したモデル蛍光輸送体ベクターコンストラクトの生体内発現試験、並びに新規コンストラクトの作製・生体内発現試験を行い、以下の成果を得た。・卵黄前駆体ビテロジェニンの受容体結合領域候補配列(VRBP:2種類)と赤色蛍光蛋白質(DsRed又はmCherry)の融合蛋白質をコードするモデル蛍光輸送体ベクターコンストラクトを計5種類、並びに緑色蛍光蛋白質(GFP)を単独でコードするベクターコンストラクトを計2種類用意し、メダカ受精卵への遺伝子導入に供した。・上記コンストラクトの遺伝子導入に向け、ベクター濃度等の最適化試験を行い、最適条件を確定した。・VRBP/蛍光蛋白質融合輸送体の場合、DsRed融合では蛍光が微弱すぎて観察が困難であった。一方、mCherry融合では観察に十分なレベルの蛍光モデル輸送体を発現する組換えメダカ胚が作製された。・GFP単独発現の場合、2種の強制発現系(pCAGGS系及びTol2系)を比較した結果、両発現系共に蛍光性を有する組換えメダカ胚の作製に成功したが、pCAGGS系の方がより安定して強い蛍光を有する個体が作出できる傾向があった。・VRBPとビオチン結合性リンカー(アビジン)の融合蛋白質をコードするモデル輸送体ベクターコンストラクトを作製した。当初計画では、蛍光モデル輸送体にはDsRedを使用し、これを発現する組換えメダカを作製する予定であったが、実際に初代組換えメダカを作製した際にDsRed由来の蛍光が微弱であった。このまま研究を進展した場合、今後同モデル輸送体に関する輸送動態の可視化が困難となることが予想された。そのため、融合する蛍光物質を、DsRedより蛍光強度の高いmCherryに変更し、再度組換えメダカの作製を行い可視化に適した蛍光強度が得られた。この予期せぬ再作業ため、当初予定より「やや遅れている」と評価した。しかし、可視化可能な蛍光強度を持つ初代(F0)組換えメダカの作製には成功しており、今後の研究の継続には問題はない。現報告時点において、F0個体は性成熟期にあり、次世代F1およびF2の作製はH29年度内に達成可能である。この目標を達成するため、H27-28年度では、卵母細胞への輸送能を持つと推定される

ビテロジェニン分子上の受容体結合部位(VRBP)を2種類、蛍光蛋白質を2種類、リンカーを1種類、遺伝子組換え導入システムを2種類を組み合わせて発現コンストラクトを作製し、複数の組換えメダカ初世代(F0)を作出した。最終年度(H29)では、VRBPと蛍光蛋白質(mCherry)あるいはVRBPとリンカー(単量体アビジン:mSA)の融合蛋白質を発現する組換えF0親系統から、第2世代(F1)と第3世代(F2:VRBP/mCherryのみ)を得た。その結果、VRBP/mCHerry組換えメダカF2胚(受精卵)において微弱ではあるが赤色蛍光が確認できた。これらの成果より、到達目標である遺伝子組換え技術によるモデル分子輸送体のうち、少なくとも蛍光輸送体の生体内生産が確認された。また、推定VRBPが機能的であることが示唆された。一方、F2での蛍光性が低いという結果は、組換え蛋白質の生産性が低いことを示している。そのため、リンカー付き輸送体(VRBP/mSA)組換えメダカを用いて輸送体機能試験を遂行するには、新たにプロモーター変更による生産性の向上が必須と考えられた。本試験ではVRBP/mSA組換え系統(F1)作出に成功したことを以て計画を終了し、今後同輸送体の大量生体内生産に向けた新たな試験系の確立に有効な知見を得た。本研究は、親魚から卵・仔魚へ様々な有効物質を輸送できる分子輸送システムの開発を目指し、遺伝子組換え魚によるモデル分子輸送体の生産に挑戦し、将来的な生物工場(バイオリアクター)開発に向けた萌芽的技術基盤を得ることを目的とした。卵母細胞への輸送部位、蛍光蛋白質、リンカー、遺伝子組換え導入システムを複数組み合わせて発現コンストラクトを作製し、最終的に、蛍光性モデル輸送体あるいはリンカー付きモデル輸送体を産生する第2世代(F1)と第3世代(F2:蛍光性モデル輸送体のみ)を得た。本研究の成果により、今後同輸送体の大量生体内生産に向けた新たな試験系の確立に有効な知見を得ることができた。今後は、上記3種の蛍光キメラ輸送体を発現する初世代(F0)遺伝子組換えメダカを作製し、野生型との戻し交配により第1(F1)世代、続いてF1同士交配による第2(F2)世代の作出を試みると共に、発現した蛍光キメラ輸送体の卵への輸送性状を生化学的・組織学的に解析する。蛍光キメラ輸送体の輸送能が確認でき、輸送能を持つビテロジェニン部位が特定できた後に、蛍光蛋白質部位をアビジン(Av)に置き換えたモデル輸送体インサート(LvH/Av, LvL/Av)を含むコンストラクトを作製し、上記と同様な手法で組換えメダカを作製するとともに、蛋白質として発現したコンストラクトの生化学的性状解析(分子サイズの確認、ビオチン標識物質との結合等)を行う。H29年度は、組換えF1・F2ラインの確立を行い、蛍光モデル輸送体に関して卵母細胞への輸送動態を観察することで、その輸送機能について実証する。また、当初、蛍光輸送体の機能確認を終えてから実施する予定であったVRBPとリンカーの融合コンストラクトの生体内発現についても、本年度に並行して実施する予定である。これにより、H28年度の遅れを解消できると考える。VRBP・リンカー融合蛋白質の生化学的性状解析は、これを発現する組換えF0個体から得た卵で行う予定である。魚類繁殖生理学
Tacit learningによる行動意図推定と義手制御への応用

生物規範型の学習則であるTacit learningを用いて、筋電前腕義手の制御アルゴリズムの開発を行った。これまでの前腕義手の多くは手首関節に自由度を持たないものが多く手の向きを制御するために残存する肩関節を用いて制御していたため使用者の負担が大きかったが、提案したシステムでは残存ずる肩肘関節の動きに、Tacit learningを用いて人工的な手首関節の動きを適応させるため、使用者は手首の動きを強く意識することなく自然に使いこなせることが可能である。普段から義手を使用されている方にご協力いただいた臨床試験により提案するシステムを用いることで効率よく手の姿勢を制御できることが示された。運動学習には,1. Cognitive Stage,2. Associative Stage,3. Autonomous Stageの3つのステージがあると言われている.Cognitive Stageとは運動の目的や手法を本などから学ぶステージであり,Associative Stageとは教えられた運動を試行錯誤の末に獲得する段階である.この2つの段階では学習が主に意図的に進行するのに対し, Autonomous Stageは試行錯誤の末に生まれた行動を,身体や環境に適応した洗練された行動へと変化させる,いわゆるコツの獲得や慣れに相当する段階であり,主に無意識下で進行する.これまでロボット学習則として提案されているものは主にAssociative Stageに相当するものであり,生物の慣れに相当する学習則はほとんど提案されていない.またこのことがロボットが自然環境において有効な行動を取ることができない理由の一つである.我々はこれまでに,慣れを人工物制御に応用するため,生物制御の特徴に基づいた学習法であるTacit learningを提案してきた.Tacit learningとは,環境入力に対する反射的な行動と,環境に依存しない本能的な行動目標を事前に与え,その本能的な動作を通じて環境と相互作用することでその情報を取り込みながら適応的な行動を獲得していく学習法である.これまでに多自由度マニピュレータの姿勢制御やヒューマノイドロボットの歩行動作などを,ロボットモデルを用いることなく実環境での行動を通じて獲得することに成功している.本年度は,Tacit learningを義手の制御に応用するための基礎的な制御アルゴリズムの検討を行った.義手の制御では人の動きさらにその個性を環境の変動ととらえ,義手の手首の動きを残存する肩の動きに適応させるための制御則の検討を行った.生物規範型の学習則であるTacit learningを用いて、筋電前腕義手のデバイス開発及び制御アルゴリズムの開発を行った。これまでの筋電前腕義手は手首関節に自由度を持たないものが多く、手の向きを制御する際に主に残存する肩の自由度を用いて制御していたため、使用者の負担が多かった。開発した義手では手首の回旋に自由度を与え、残存する肩・肘の動きにTacit learningを用いて手首の動作を適応させることで、使用者は特に手首の回旋を意識することなく手の姿勢を意図通りに操ることのできるシステムの開発に成功した。提案したシステムの有効性を検証するため、普段から筋電義手を使用されている10名の患者に対し臨床試験を行った。その結果、ほぼ全員で提案するシステムを使用することで手の姿勢を制御する際の消費エネルギが減少することが示された。エネルギ消費は義手を使用している動作をモーションキャプチャで取得し、筋活動を推定することで行った。また提案した義手を臨床試験に参加した患者に10分程度使っていただいて慣れていただいた後、角度の違う数種類の引き出しの取っ手やダイヤルの回転などの日常生活に直結する動作を行っていただき、患者は手の姿勢を強く意識することなく引き出しの開け閉めやダイヤルの回転を行うことができることが示された。これにより提案システムが、患者の動作意図と実際の手首の動きを残存する肩肘の動作を通してうまく推定できていることが示された。この結果は生物の制御原理が順を追って複雑さを増すNeuro-Synergy Systemを構築していることの重要な証拠にもなっている。ロボティクス義手をTacit learningにより制御するための基礎的な制御アルゴリズムが完成し,健常者実験によりその有効性を確認することができたため.初年度に開発した制御アルゴリズムを用いて臨床実験を進めていく予定である.臨床試験のための,実際に腕をなくされている方に装着可能な義手を設計する必要があり,そのインターフェースが大きな課題である.また残存する肩肘の動作を計測する手法についても,実際の患者さんに対応するには計測が可能であるだけでなく,装着が容易である必要があり,センサの開発も合わせて進めていく.制御系の開発が非常にスムーズに進み,プロトタイプの開発費用を節約することができたためH25年度の予算に残額が生じた.H26の臨床試験用の義手の開発において,患者さんの装着しやすさを考慮した開発に充てていく予定である.
学習記憶に関わる新規分子の発見と神経系における動態・機能の解明

本研究では神経系の機能解析に多くの利点を持つ線虫を用い、新規分子を発見し、その分子動態を調べることにより、細胞内分子のダイナミクス→回路のダイナミクス→行動のダイナミクス、という各階層で学習・記憶の機構を包括的に理解することを目指した。その結果、短期記憶・特に刺激強度の記憶の機構、記憶シグナルの細胞間転移、一細胞での分別記憶の機構などについて、分子神経機構が多く明らかになった。1.短期記憶、特に刺激強度の記憶:線虫は特定の塩濃度で餌の存在下で飼育されると、以前に経験していた塩濃度付近に向かう。逆に、餌がない状態で飼育したのちには、経験した塩濃度を避けるように行動する。この塩濃度の記憶の機構について研究を進めた。今回、餌有りでの飼育後にのみ、野生株より高塩濃度に向かう傾向を持つ変異体を複数分離し、マッピングを進めた。さらに、次世代シーケンサーで全ゲノム配列を決定中である。また、ホスホリパーゼCεのホモログplc-1の機能獲得型変異体が高塩濃度に、機能欠失変異体が低塩濃度に向かう傾向を持つことを見いだしている。カルシウムイメージングの結果、PLC-1が塩の受容に関わるASER神経で働きAIB神経へのシナプス伝達を制御していることを示唆する結果を得た。次年度以降、PLC-1経路の動態をイメージングにより調べ、塩濃度記憶の分子実体に迫る。2.長期記憶、短期から長期への固定化:長期記憶の実験系の構築を試みた。既報に従い、匂いへの化学走性の長期学習系を複数試したが、いずれも満足できる形で再現できなかった。そこで、塩濃度学習に関する新たなパラダイムを考案し、繰り返し条件付けを試みた結果、間を置いた繰り返し条件付けにおいて4時間時点での記憶保持が有為に優れていた。3.一細胞での分別記憶の機構: ASE神経が複数のモダリティを感知し、記憶できることが分かってきたので、これらの記憶が交差するかどうかを調べるとともに、左右のASER、ASELの寄与について調べた。4.マウスにおける学習関連遺伝子の機能解析:線虫の知見をもとに、インスリン受容体の細胞内局在制御にカルシンテニンが関わるかを検討した。3つのカルシンテニン遺伝子に対するsiRNAを子宮内電気穿孔法でマウス大脳皮質の神経細胞に導入したところ、受容体の局在が変化するという予備的な結果を得た。1.短期記憶、特に刺激強度の記憶:線虫は、餌を与えて飼育されていた際の塩濃度を記憶し、その塩濃度に向かう。この行動に重要なPLC/DAG/PLC経路の動態を知るため、FRETによりDAG量に応じて蛍光が変化するDownward DAG2をASER神経に発現させて蛍光測光を行った。この結果、ASERのDAG量が塩濃度変化につれて変化することがわかった。このことは、DAGが実際に記憶を形成しそれを行動に結びつける機能に中心的に関わっていることを示唆する。2.長期記憶、短期から長期への固定化:以前より長期記憶の実験系の構築を試みていたが、塩と餌、塩なしと餌無しという条件を繰り返し与えることにより、繰り返しなしでの場合と比べて塩走性が長期に亘って変化するアッセイ系を見いだすことに成功した。いくつかの変異体について調べたところ、グルタミン酸受容体の変異体で長期記憶に欠損があることがわかった。3.一細胞での分別記憶の機構:ASE感覚神経は塩類を受容することが知られ、これまでよく知られていたASERに対し、ASEL神経が行動可塑性に関わるかは明らかでなかった。しかし今年度、Na+に対する化学走性実験やASELを光刺激する実験により、ASELも過去の経験に依存した行動変化に寄与することが明らかになった。4.マウスにおける学習関連遺伝子の機能解析:飢餓により飼育塩濃度を避けるようになる学習に必要な遺伝子としてみつかった線虫CASY-1の哺乳類ホモログであるカルシンテニンは、マウスには3つの遺伝子があり、それらの機能的役割は十分解明されていない。そこでこれら3つの遺伝子を破壊した遺伝子改変マウスを作成しその機能を調べることを計画した。今年度はCRISPR/Cas9法の導入を行い、効率よく遺伝子破壊ができることがわかったので、来年度は実際に3つのカルシンテニンのノックアウトを行う。1)短期記憶、特に刺激強度の記憶:線虫は、餌を与えて飼育されていた際の塩濃度を記憶し、その塩濃度に向かう。この神経機構について明らかにするために、自由行動中の線虫を追尾しながらカルシウムイメージングにより神経活動を測定する装置を用いて実験を行った。その結果、感覚神経から介在神経に至る段階で、応答が経験により正逆に変化することを見出した。2)記憶シグナルの細胞間転移:化学走性行動とその可塑性に異常を示す変異体としてTOR経路の変異体を見出した。TORC1複合体とTORC2複合体とで寄与が異なることを明らかにし、下流因子についても同定した。さらに、一部は腸で働くことを明らかにした。これにより、腸から神経へのシグナルの存在が示唆された。3)長期記憶、短期から長期への固定化:この実験については。繰り返し条件づけにより2時間および4時間の時点での記憶の保持が向上することが確認されたが、より長期の記憶を形成する条件を模索している。4)一細胞での分別記憶の機構:糖走性の機構を行動レベルで解析した。さらに、細胞特異的レスキュー実験により、糖走性にはASELおよび他の複数の神経が関わることを明らかにした。

ASELはNa+も受容し、糖走性もNa+走性も経験依存に変化する。ASELおよび介在神経を光刺激する実験により、経験により介在神経への伝達が変化することが示唆された。5)マウスにおける学習関連遺伝子の機能解析:マウスの3つのカルシンテニン遺伝子を破壊した遺伝子改変マウスの作成を試みた。3つの遺伝子に対するguide RNAとCas9 mRNAを受精卵へ微小注入し子孫を得た。変異を塩基配列レベルで特定し、いろいろな組み合わせで3つの遺伝子に変異をもつ集団が得られていることを確認した。RT-PCRや組織染色により、これらの一部についてmRNAや蛋白質が消失していることも確認した。概ね予定通りである。1)短期記憶、特に刺激強度の記憶:餌と共に低塩濃度を経験しても低塩濃度に集まらない変異体の原因遺伝子としてCLC型塩化物イオンチャネルの遺伝子を同定している。この遺伝子のノックアウト株を調べたところ、意外なことに異常を示さなかった。取得した変異体はいずれもミスセンス変異を持つため、単純な機能欠失変異ではないと思われる。2)記憶シグナルの細胞間転移:飢餓状態で経験した塩濃度を避けるようになる学習で、ASER感覚神経と他の神経との相互作用が必要と分かっていた。感覚変異体のレスキュー実験により、ASG神経がこの学習に必要であることを明らかにした。ASG神経の機能を調べたが、来年度も引き続き調べる必要がある。3)長期記憶、短期から長期への固定化:繰り返し条件づけにより2時間および4時間の時点での記憶の保持が向上する。今年度は、CREB転写因子の変異体がこの学習に異常を持つことを見出した。ただし、つねに野生型株に比べて低塩濃度に移動する傾向があるという表現型に近く、学習・記憶の異常であるかは引き続き検討する。4)一細胞での分別記憶の機構: Na+イオンに予め曝されたときにのみNa+への走性を示すことを見出していた。Na+はASEL感覚神経により受容されるので、ASELおよび介在神経を光刺激する実験とカルシウムイメージングの実験を行い、ASEL神経の内在的興奮性がNa+イオン暴露により変化することがこの行動可塑性の主たる機構であることを明らかにし、論文発表した。5)マウスにおける学習関連遺伝子の機能解析: CRISPR/Cas9法により、マウスの3つのカルシンテニン遺伝子を破壊した3重遺伝子破壊マウスを取得した。脳の組織染色や電気生理学的実験により、3つの遺伝子の破壊にもかかわらず、脳の基本的な構造や興奮性シナプス伝達に大きな異常がないことを確認した。概ね予定通りである。1)短期記憶、特に刺激強度の記憶:分子イメージングによりASER感覚神経のシナプス部位でのジアシルグリセロール量が感覚入力により両方向に変化することを観測した。さらに、飢餓によりこの変化が小さく短くなることを明らかにし、これらの結果を論文発表した。一方、CLC型塩化物イオンチャネルはASER感覚神経で働き塩濃度走性を制御することがわかった。2)記憶シグナルの細胞間転移:飢餓状態で経験した塩濃度を避けるようになる学習で、ASER感覚神経とASG神経の両者が必要であることを見出し、ASG神経がASERからの入力を制御する重要な神経であることを明らとした。
比較史の観点による史料学の総合的研究

1.本研究の第一段階である各国史料の比較研究については,分担者各自の分野における重要史料に関する基礎的研究を通じ,その存在形態や性格,現状の確認において一定の成果をあげた.日本史関係では,正倉院文書の現行版編纂過程における錯誤,および再整理と復原作業の現状や問題点を明らかにし,同文書研究史の書誌学的整理がなされた.中世文書一般に関しては,機能と伝来の形態による分類を新たに提唱し,また文書群の保管と廃棄の原則を明確にした.東洋史関係では,中国史料中の重要史料たる石刻について,六朝時代を中心にその実態と歴史的性格を検討し,またトルコ近代史史料としての定期刊行物の現状の確認と,分類整理を行なった.西洋史関係では,ビザンツ史の重要史料である年代記史料,イタリアを中心とする中世商業史史料の収集と整理を行ない,一部史料については書誌学的検討を加え,目録を作成した.また,帝政ドイツにおける外国人労働者研究の中心史料となる統計資料の調査を行なった.以上の成果は主として本報告書に収められているが,若干のものは別に公表されている.2.以上のような史料の基礎的研究の上に各分担者による実証的研究が推進されて,一定の成果を収めた.日本古代中世文書を用いた古代財政や中世社会構造の研究,石刻史料による六朝貴族制研究,地方志による中国近代地域社会研究,ビザンツ帝国の国家財政,中世イタリア商人,オスマン帝国のイスラム改革主義の研究などで,それらは各種刊行物に公表されている.3.史料保存,利用,文書館制度の問題については,実地の見聞を分担者各自が広めたほか,特に日本と西ドイツの文書館の比較を行なうことによって認識の深化をはかった.本報告書にはその西ドイツ文書館制度の実態についての文書を収めている.ただ,この問題についてはなお一層の研究が必要と思われる.1.本研究の第一段階である各国史料の比較研究については,分担者各自の分野における重要史料に関する基礎的研究を通じ,その存在形態や性格,現状の確認において一定の成果をあげた.日本史関係では,正倉院文書の現行版編纂過程における錯誤,および再整理と復原作業の現状や問題点を明らかにし,同文書研究史の書誌学的整理がなされた.中世文書一般に関しては,機能と伝来の形態による分類を新たに提唱し,また文書群の保管と廃棄の原則を明確にした.東洋史関係では,中国史料中の重要史料たる石刻について,六朝時代を中心にその実態と歴史的性格を検討し,またトルコ近代史史料としての定期刊行物の現状の確認と,分類整理を行なった.西洋史関係では,ビザンツ史の重要史料である年代記史料,イタリアを中心とする中世商業史史料の収集と整理を行ない,一部史料については書誌学的検討を加え,目録を作成した.また,帝政ドイツにおける外国人労働者研究の中心史料となる統計資料の調査を行なった.以上の成果は主として本報告書に収められているが,若干のものは別に公表されている.2.以上のような史料の基礎的研究の上に各分担者による実証的研究が推進されて,一定の成果を収めた.日本古代中世文書を用いた古代財政や中世社会構造の研究,石刻史料による六朝貴族制研究,地方志による中国近代地域社会研究,ビザンツ帝国の国家財政,中世イタリア商人,オスマン帝国のイスラム改革主義の研究などで,それらは各種刊行物に公表されている.3.史料保存,利用,文書館制度の問題については,実地の見聞を分担者各自が広めたほか,特に日本と西ドイツの文書館の比較を行なうことによって認識の深化をはかった.本報告書にはその西ドイツ文書館制度の実態についての文書を収めている.ただ,この問題についてはなお一層の研究が必要と思われる.1.各国史料の比較研究については、分担者各自の分野における重要史料に関する基本的研究を通じ、その存在形態や性格、現状等の確認を行った。(1)日本史関係:正倉院文書に関し、発見後の編纂過程で生じた錯誤(文書の分断,恣意的編集,流出等)、および再整理、復原作業の現状と問題点が明らかとなり、また研究文献の整理も行われた。中世文書一般に関しては、機能の形態による分類(所領宛行及び行政文書)、史料の伝来形態による分類(大寺社・公家・武家・村落共同体・都市共同体・地方寺社への伝来・所有)を提唱し、その理解を進展させた。なお、丹波・丹後地方,長崎・島原地方で実地見学を行い、中世・近世史料の存在形態についての知見を得た。(2)東洋史関係:中国史料中、注目すべき石刻史料、及び地方志について、研究史の整理を行った。トルコ近代史史料としての定期刊行物(雑誌・新聞)については、刊行の歴史、収集・整理・研究の現状を確認するとともに、その一部については分類整理(一覧表作成)と分析を行った。(3)西洋史関係:ビザンツ史の重要史料である年代記史料、及びイタリアを中心とする中世商業史史料の収集と整理にあたり、前者については個別史料の検討、後者についてはその一部を目録として発表した。2.上記成果に基づき、中国六朝時代の墓誌銘を史料とした研究や、オスマン帝国のイスラム改革主義に関する研究、ビザンツ帝国の国家財政にかんする研究物等の成果が生み出された。3.今後各地域・分野の史料の比較検討を一層推進し、近世・近代史料に関する知見の増加、文書館と「史料学」の検討を進める。
ALS患者の「呼吸器」問題を中心とした臨床倫理コンサルテーション・システムの構築

平成18年度は、NHO宮崎東病院神経難病病棟の協力のもと、具体的なフォーマット検討とパイロットスタディを行い(倫理審査は宮崎東病院倫理委員会にて認可済)、東病院内に常設型倫理コンサルテーションルームを平成17年5月より開設し、病院スタッフに気軽に足を運んでもらうために「カフェ・スタイル」とし、【かふぇ☆りんり】と名付けた。基本的に毎週、水曜又は木曜の18時から20時30分まで、報告者が「臨床倫理コーディネーター(倫理コンサルタント)」として常駐し、主に神経難病病棟スタッフからの倫理相談を受け付けながら、「私の希望書」運用症例についても検討を行った。2005年5月から2006年12月までの利用状況については、以下の通りであった。(1)延べ利用者数177名、(2)利用者内訳(延べ人数)〔医師21名、看護師104名、MSW7名、児童指導員18名、その他27名〕。また、「倫理問題協議会」においても、「私の希望書」運用症例についても検討を重ねる中、判断能力のある14名のALS患者(平均年齢65.2歳±10.0歳)のうち、12名の患者に対し「私の希望書」を提示したところ、2名は記入を希望せず、4名は記入するかしないかの意思表示が最後まで不明なままとなり、6名の患者が記入を希望した。その中で実際に記入があったのは4名であり、2名は結局、記入には至らなかった。医療スタッフへの倫理的支援体制、いわゆる「倫理コンサルテーション」のシステム構築を伴った組織的対応がとられることなく、もし「書類のみ」としての事前指示書運用がなされるなら、それは医療現場に混乱をもたらすだけでなく、「文書だけ」を独り歩きさせてしまい、最も大切な患者自身を置き去りにしてしまうことになるだろう。以上のことから、いわゆる「事前指示書」を臨床現場にて運用するにあたっては、決して「書類」を独り歩きさせないよう、医療者がチームでアプローチし、患者・家族の揺れ動く心理に寄り添える「体制づくり」を進めること、その際には医療者を支援する「倫理コンサルテーション・システム」の構築が不可欠であることを強調しておきたい。本研究では、臨床現場で日常的に生じている倫理問題に遭遇した医療スタッフをサポートする「臨床倫理コンサルテーション・システム」の構築を目指すに際し、特にALS患者の「呼吸器」をめぐる倫理問題に定位した。とりわけALS患者にとっては、呼吸不全に至るプロセスの中で「人工呼吸器を付けるか否か」に関する情報提供がいかに医療サイドからしっかり行われるかということが、患者自らの「自己決定」を支える上での重要な倫理的ポイントとなる。そこで、本研究では、患者の自己決定を支える事前指示書作成のための明確な体制作りを具体的に構築することが不可欠であるとの観点から、以下のことを目的とした。(1)既存の代表的な事前指示書の比較検討を行い、「書くことだけ」を目的としない、患者の自己決定の過程を支える事前指示書フォーマットの検討、(2)フォーマット研究にあたっては、倫理学的な理論的アプローチのみによる抽象的なレベルに留まるのではなく、ALS医療の現場に根差し、実践的なcase-based approachによる明確化を行う。(3)事前指示書を運用する医療スタッフに対するサポート体制のあり方、特に臨床倫理コーディネータの役割の明確化。平成17年度は、(1)および(2)に関しては、NHO宮崎東病院神経難病病棟の協力のもと、具体的なフォーマット検討とパイロットスタディを行い(倫理審査は宮崎東病院倫理委員会にて認可済)、(3)についても東病院内に常設型倫理コンサルテーションルームを平成17年5月より開設し、平18年3月現在で、およそ70件の倫理相談を受ける中で、システム構築の諸課題を具体的に把握してきた。また2月には、倫理相談システム構築に関して、国際的にも先進的な試みを行っている英国のUK Clinical Ethics Networkについて現地調査を行い、研究年度2年目に向けて、その視察調査の研究成果を現在執筆中である。

医療スタッフへの倫理的支援体制、いわゆる「倫理コンサルテーション」のシステム構築を伴った組織的対応がとられることなく、もし「書類のみ」としての事前指示書運用がなされるなら、それは医療現場に混乱をもたらすだけでなく、「文書だけ」を独り歩きさせてしまい、最も大切な患者自身を置き去りにしてしまうことになるだろう。以上のことから、いわゆる「事前指示書」を臨床現場にて運用するにあたっては、決して「書類」を独り歩きさせないよう、医療者がチームでアプローチし、患者・家族の揺れ動く心理に寄り添える「体制づくり」を進めること、その際には医療者を支援する「倫理コンサルテーション・システム」の構築が不可欠であることを強調しておきたい。