hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
郭清術後のリンパ組織再構築術～悪性黒色腫予後の改善を目指して！

TDPLNではメラノーマ細胞移植後3週でリンパ節転移が確認されたが,TDTLNにおいては移植後4週になって初めて転移が確認された。この差はTyrp1をリアルタイムPCRで評価した結果とも相関していた。この差については移植リンパ節の一時的な虚血が影響しているものと考えられHigh endothelial venule(HEV)に着目した。Western blottingおよびELISAでは、TDPLNではTDTLNに比べHEVの割合が高かった。TDPLNではHEVの内腔が拡張していたが,TDTLNではHEVの内腔は拡張していなかった。以上から移植リンパ節は免疫系の機能を有するものの通常のTDLNと比較するとその機能は劣り,その原因としてHEV量の差が考えられた。近年,リンパ組織の破綻に対する外科的治療法の開発がすすみ,リンパ系の再構築法として,リンパ節移植が登場した。血管吻合を行うことで,viabilityを有するリンパ組織が移植先で機能し,リンパ浮腫に対する新たなドレナージ効果が期待できる。しかしながら,基礎および臨床でのリンパ節移植の有用性については詳細な報告が少ない。そこで今回外科的リンパ系再構築法によるリンパドレナージパターンの回復,およびリンパ節局所免疫能の回復について検証し,その結果リンパ節移植が循環系・免疫系の回復をもたらすことを証明することができた。移植した悪性黒色腫細胞を用いてリンパ組織再構築手術による転移・生命予後に対する影響を検討していく。ルシフェラーゼアッセイにより肺転移すサイズの評価を行い、モデル間での比較する。また各種リンパ節を採取し同様に転移の定量化を行い、モデル間での差を比較する。また腫瘍免疫の解明の為に、悪性黒色腫移植によるリンパ節の影響を免疫組織学的染色で評価する。IL-2, IL-10,Foxp3,TNF-α,TGF-βなどのサイトカインをPCRで定量化していく。移植リンパ節の機能評価としてさらに検証する為にフローサイトメトリーを用いて,より詳細なリンパ球の動態を追跡する。免疫組織学的染色によって生じたグループ間の差についても実際の割合を算出する事で再評価する。さらに,ホーミングしているリンパ球のリンパ節内への入り口とも言えるHEVの状態を確認する。MECA-79で免疫染色すると同時に,Western blottingでも評価する。さらに,リンパ球トラフィキングに関わるCCL21についても評価する。29年度が最終年度であるため、記入しない。形成外科29年度が最終年度であるため、記入しない。
ジストロフィン生理機能解明と平滑筋機能から見たDMD遺伝子治療開発に関する研究

Duchenne型筋ジストロフィー(DMD)では筋膜でジストロフィン(dy)が欠損しているが、筋壊死のメカニズム及びdyの生理作用は不明である。我々はDMDで筋壊死が起こるメカニズムにはnNOSの関与などによる血管平滑筋の機能障害に伴う異常と血液凝固系の亢進が関与していると考えるに至っている。そこで、mdxマウス(ジストロフィン欠損マウス)の血管平滑筋のみにdyを発現させたトランスジェニックマウス(Tg)作製し、血管病変に由来する筋壊死の有無を検討すればdyの生理機能についての大きな情報が得られるのではないかと考えた。そのmdx・Tgが3ライン得られた。そのマウスに於いて、肺での血管平滑筋をdyの発現を確認した。現在、mdxとmdx・Tgに於いて切片を作製し壊死再生などの程度を比較検討中である。今後、血流の異常やCKの比較検討する。血管平滑筋へdyを導入する事を目的として、血管平滑筋特異的プロモーターとCARの発現が低い血管平滑筋などで遺伝子導入効率を上昇させるRGDを含むアデノウイルスベクターを組み合わせたアデノウイルスベクターを開発し、血管平滑筋特異的な導入・発現効率をin vitro, in vivoで確認した。また、エコトロピック・レトロウイルスのレセプター(EcoRec)を発現させることのできるアデノウイルス(Ad)をまず感染させ、その後、lacZ遺伝子を発現させるレトロウイルスを感染させることにより、今まで、感染が難しいヒトの筋細胞に感染させることが可能となった。ヒト線維芽細胞をマイオチューブに分化させ、その細胞をウエスタンブロット法やジストロフィン染色によりジストロフィンの発現を解析することで、ジストロフィーの診断をする方法を開発した。本研究は1987年Kunkelらにより発見されたDuchenne型筋ジストロフィーの欠損蛋白ジストロフィン(dy)の生理機能を明らかにし、臨床的治療および遺伝子治療の指針とすることを目的としたものである。私達はこれまでの一連の研究からDMDにおける筋崩壊は血管の機能不全によるものであると考えてきた。つまり膜から膜へ伝導が伝わる血管平滑筋において血管の収縮拡張機能がdyの欠損によって損なわれていると考えられる。一方、局在に関する私達の研究によればdyはシナプスを中心に存在していて刺激伝導に関わる蛋白である可能性が高いことを主張してきた。DMDにおける筋の崩壊の機構を明らかにすることができれば臨床的な治療に有用な情報となるだけでなく遺伝子治療の標的臓器が明らかになる大きなメリットが産まれる。dy生理機能の解明のためにまずdyの欠損状態にあるmdxマウス血管平滑筋にトランスジェニックを作成することによりdyを発現させる研究を計画した。human smooth muscle α-actinプロモーターにdyを組み込んだコンストラクトを作成しマイクロインジェクション法によりトランスジェニックマウスを作成するというものである。今年度はそのコンストラクト作成に成功しトランスジェニックマウスを作成する段階に入ることができた。一方遺伝子治療に対する試みとして日本医科大学・生化学第二・島田隆教授との共同研究でアデノウィルスベクターとエコトロピックウィルスベクターを組み合わせた2段階遺伝子導入法を確立しており、この手法を基盤としてhuman smooth muscle α-actinプロモーターを用いて全身の血管平滑筋にdy遺伝子を導入する方法を用いて全身の平滑筋機能から見た遺伝子治療を開発中である。DMDでは筋膜でジストロフィン(dy)が欠損しているが筋壊死のメカニズム及びdyの生理作用は未だに不明である。我々はDMDで筋崩壊が起こるメカニズムには血管平滑筋の機能障害に伴う血流異常と血液凝固系の亢進が関与していると考えるに至っている。

そこで、mdxマウス血管平滑筋にdyを発現させたトランスジェニックマウス作製し、血管病変に由来する筋壊死の有無を検討すればdyの生理機能についての大きな情報が得られるのではないかと考えた。まず、トランスジェニック作製用のコンストラクトを作製することが必要であるがこの作業にこれまで時間を費やしてきた。手順は以下の通りで、コンストラクト作製に必要な制限酵素、ApaI,SpeI,HindIII,NotI,SalI,EcoRI,PstI,のサイトを持つオリゴDNAを作製する、このオリゴDNAをBluescript II KS-のApaIとPstIで切断したベクターにライゲーションする。その後、そのサイトを利用してSV40のPolyA signal.心臓と平滑筋特異的に発現させる(骨格筋には発現させない)。ヒト平滑筋α-アクチンプロモーター(EA4.7)、ジストロフィンcDNAをライゲーションする。更にに、このコンストラクトが機能するかmdxマウスの心臓より分離した筋芽細胞にトランスフェクションで導入しジストロフィンの発現を確認する。DMDでは筋膜でジストロフィン(dy)が欠損しているが筋壊死のメカニズム及びdyの生理作用は未だに不明である。我々はDMDで筋崩壊が起こるメカニズムには血管平滑筋の機能障害に伴う血流異常と血液凝固系の亢進が関与していると考えるに至っている。その後、そのサイトを利用してSV40のPolyA signal、心臓と平滑筋特異的に発現させる(骨格筋には発現させない)。結論として今年度は、ジストロフィンcDNAを平滑筋のみに発現させることのできるトランスジェニックマウス作製用のコンストラクトを作製することに成功した。DMDにおけるジストロフィン(dy)欠損が筋壊死に関わるメカニズム及びdyの生理作用は未だに不明である。
プロテインホスファターゼを標的とした、肺癌の診断・治療開発のための研究

(1)プロテインホスファターゼによる、mRNAスプライシング、KIF3モーターを介した細胞内輸送、および細胞増殖(ERK)経路におけう制御機構に関して重要な知見を得た。(2)肺癌サンプルにおけるプロテインホスファターゼ遺伝子発現の異常に関して重要な知見を得た。1.肺がん組織のホスファターゼ遺伝子の変異の同定のための実験(1)前癌病変、早期肺癌、進行癌の生検、手術検体、胸水に関して、凍結保存を行った。(2)上記サンプルからトータルRNAの抽出を行い、現在cDNAの合成を開始している。(3)(1)と(2)のサンプルは、匿名化され、組織バンクとして管理されている。(4)PT2,DSR,PPに属する全部で50のホスファターゼ遺伝子発現の解析のため、TaqManプローブを用いてのリアルタイムPCRの条件を設定中である。約半分のものに関しては完了。(5)遺伝子変異を簡便・安価・短時間にスクリーニングするために、high resolution melting(HRM)システムを導入することとした。そのためのプライマーの合成が完了した。2.細胞極性または小胞体輸送を標的とした癌治療(1)低分子量2重基質性ホスファターゼの新しい分子種であるLDP4の機能を探るために2ハイブリッドスクリーニングをし、KIF3Aを結合することを明らかとした、さらにキネシン複合体との関係を検討し、LDP4がKIF3複合体に含まれることがわかった。(2)LDP4により、KAP3が脱リン酸化されことを明らかとした。3.スプライシングを標的とした癌治療(1)PP1(セリンスレオニンプロテインボスファターゼtype1)が、NIPP1により核内(特にスプライシングのマシナリー)にターゲットされることを見出した。4.中心体を標的とした癌治療PP6(セリンスレオニンプロテインホスファターゼtype6)が中心体に存在するタンパクであるCP110に結合して、中心体へとリクルートされることを見出した。1.肺がん組織におけるホスファターゼ遺伝子の異常の有無の検討(1)前年に引き続き前癌病変、早期肺癌、進行癌の生検、手術検体、胸水の組織バンク化を行った。(2)上記サンプルからトータルRNAの抽出を行い、現在cDNAのバンク化を行った。(3)PTP,DSP,PPに属する全部で50のホスファターゼ遺伝子発現の解析のため、TaqManプローブを用いてのリアルタイムPCRの条件の設定が完了した。(4)遺伝子変異のスクリーニングするためのHRMシステムを導入し、注目している分子に関する条件設定を行った。2.小胞体輸送を標的とした癌治療(1)Dusp26が、KIF3Aを介してKAP3Aと結合しかつ脱リン酸化することを見いだした。(2)KIF3Aの脱リン酸化により、N-cadherin、βcateninの細胞膜への輸送が障害され、細胞接着が抑えられることを見いだした。(3)以上のことで、Dusp26は、細胞接着に重要なホスファターゼであり、その発現低下により細胞の播種や転移につながることが示唆された。3.スプライシングを標的とした癌治療(1)PP1の結合タンパクとして知られていたNIPP1が、PP1をスプライソゾームにターゲットし、そこでSAP155を脱リン酸化することを明らかにした。(2)PP1/NIPP1複合体の脱リン酸化活性を増強させることにより、スプライシングを阻害し、細胞死を誘導することが明らかとなった。この作用を用いた新しい癌治療の可能性が示された。1.ホスファターゼ遺伝子の肺がん組織における異常の有無の検討(1)前癌病変、早期肺癌および進行癌由来のcDNAを作製した。(2)胸水、気管ブラシ洗浄液よりgDNAを精製した。(3)PTP,DSP,PPの各ホスファターゼに関して(1)における発現の異常の有無を明らかにした。(4)PTP,DSP,PPの各ホスファターゼに関して(1)および(2)における遺伝子変異の有無をスクリーニングし、明らかにした。2.KIF3モーターを標的とした癌治療(1)Dusp26複合体同定し、DUSP26の基質を明らかにした。(2)細胞-細胞の接着に重要なN-cadherinおよびβcateninの細胞膜へ局在の制御に関して新たな知見を得た。(3)(1)および(2)の結果により、Dusp26を標的とした癌治療の可能性を検討した。3.スプライシングを標的とした癌治療(1)PP1/NIPP1複合体の標的であるスプライシングの基本因子SAP155のリン酸化部位の一部の同定に成功した。(2)SAP155のリン酸化部位に対する抗体を作製した。
HF10 アンプリコンベクター使用した樹状細胞による抗腫瘍免疫療法の研究

この研究が示した結果は以下の通りである。1HF10-packageアンプリコンで樹状細胞に送入したGPC3が特異的な細胞性免疫を誘導し、該当腫瘍抗原が発現する腫瘍の増殖を抑制した。さらにリンパ節の転移への抑制効果があった。2前投与で腹膜播種モデルでの評価は、腹内の投与が静脈投与と皮下より抗腫瘍効果がよかった。3LampシグナルペプチドとGPC3とのキメラは樹状細胞で、抗原提示能力を高めることが示された。27年度で、研究成果の報告1.HF10-packaged GPC3が発現するアンプリコンでの樹状細胞の感染力を樹状細胞cell line DC2.4細胞を用いて、確認した。GPC3が発現するマウス卵巣がん細胞でのHF10の非増殖性も確認した。HF10のマウス卵巣がん細胞への細胞障害性が無かったことも確認した。2.HF10-packaged GPC3が発現するアンプリコンで感染する樹状細胞の経皮下投与(腫瘍の近傍)でGPC3が発現する皮下モデルのマウス卵巣がんのの増殖が抑えられた。3.HF10-packaged GPC3が発現するアンプリコンで感染するDCの経皮下免疫マウスの脾臓細胞へのGPC3が発現する卵巣がん細胞の刺激で特異なINF-gammaの分泌を検出された。4.腹膜播種のモデルでHF10-packaged GPC3が発現するアンプリコンが感染する樹状細胞の免疫経路(皮下、静脈、腹内)を検討した。結果は、その樹状細胞の腹内の投与により、42日の観察期間内、腹膜播種マウスの生存率が100%になった。静脈の投与により、42日の観察期間内の生存率が20%だった。皮下の投与のマウスの生存率がcontrolと比べて、生存率の有意差がなかった。5.三種の投与経路で治療した担癌マウスの腫瘍内のCD8+t細胞の浸潤を凍結切片の免疫染色で観察した。腫瘍内に浸潤したCD8+t細胞多少は腹内>静脈>皮下≧controlの順のように示された。Lamp-1とGPC3のキメラcDNAが発現するアンプリコンの構築が順調ではないため、アンプリコンによりLamp-1とGPC3のキメラcDNAを導入した樹状細胞での抗腫瘍免疫の誘導はGPC3を導入した樹状細胞の免疫誘導より強いことを証明できていない。28年度、Lamp-GPC3キメラcDNA(キメラGPC3)が挿入するアンプリコンの作成を行って、回収率が低くて、十分な抗腫瘍免疫が誘導されていなかった。そして、我々は、electroporationでのキメラGPC3発現ベクターをマウス骨髄由来の樹状細胞に導入する方法で、キメラGPC3による抗腫瘍免疫の効果を検討した。1キメラGPC3が導入した樹状細胞をi.p.でGPC3発現腫瘍の増殖抑制効果を検討した。キメラGPC3が投入した樹状細胞は、樹状細胞及びGPC3が発現するグループと比較し、有意に癌の増殖を抑えた。2治療マウスの腫瘍内CD8 T細胞の浸潤状況をCD8, CD3の抗体の二重染色で確認した。キメラGPC3が発現するベクターの導入した樹状細胞で治療した腫瘍内にCD8 T細胞の浸潤が他の両グループと比べ、有意に多かった。3我々は、腫瘍移植側のリンパ節にGPC3が発現する癌転移の状況も組織免疫染色で状況を確認した。キメラGPC3が発現する樹状細胞で治療した群のマウスのリンパ節癌転移が他のグループより、少なかった。4我々は、樹状細胞、GPC3発現樹状細胞、キメラGPC3が発現樹状細胞で免疫したマウスの脾臓細胞を採取し、GPC3抗原の刺激により、flow cytometryで、CD4 T細胞とCD8 T細胞のIFN-gammaの分泌状況を調べました。5キメラGPC3が発現樹状細胞で免疫したマウスの脾臓細胞にIFN-gammaが分泌したCD4, CD8 T細胞の比率が他の両群より高かった。まとめ:LAMP-1のシグナルペプチドがGCP3の抗原提示能力を高められ、高い抗腫瘍免疫効果を示した。1.キメラcDNAが発現するアンプリコンの構築の方法を変える。2.腫瘍内の浸潤したCD8+細胞多少をFACSで確認する。3.Elispotで特異なt細胞の免疫反応を確認する。4.さらにCD4+t細胞の細胞障害性の有無を確認する。5.抗体によるCD4+t細胞のdepletがHF10-packaged GPC3が発現するアンプリコンの感染する樹状細胞の抗腫瘍効果にどうな影響を与えることを調べる。28年度が最終年度であるため、記入しない。ウイルス28年度が最終年度であるため、記入しない。
静磁場による骨誘導デバイスの開発

本研究課題では、骨誘導デバイスの開発を前提に、永久磁石を用いた歯科用磁性アタッチメントの静磁場をウサギの骨形成過程で付与し、静磁場の骨形成に及ぼす影響を調べた。その結果、磁性アタッチメントによる静磁場は、骨形成の初期において、骨形成速度の向上に寄与し、その現象は骨の成長を促す骨牙細胞の増殖と分化の加速に起因することが明らかになった。これより、永久磁石を利用した骨誘導デバイスの可能性が示唆された。申請者らは、着磁および無着磁の白金鉄磁石合金とチタンをラットの両側脛骨にそれぞれ埋入し、静磁場を有する着磁白金鉄磁石合金の骨生成量が無着磁に比べわずかながら多い傾向を見出した。しかしながら、骨代謝の速いラットを用いたこと、白金鉄磁石合金の形状が小さく静磁場の磁束密度が低いことから、静磁場刺激による骨の成長速度に関する十分な知見を得ることができなかった。そこで、本研究課題の初年度において、耐食性に優れ、磁気回路を利用して強力な磁気特性を示す歯科用磁性アタッチメント磁石構造体による静磁場の付与を試みた。はじめに、磁石構造体の漏洩磁場を軸対象とした2次元有限要素法により静磁場の分布を調べ、シールドリング付近で0.5T以上の磁束密度(白金鉄磁石合金の2.5倍以上)を付与できることを明らかにした。つぎに、磁石構造体のヨークとして表面を覆っている磁性ステンレス鋼のXM27および447J1の溶出イオンを求め、Cr含有量の多い447J1が生体用ステンレス鋼の316Lよりも、耐食性に優れ、Tiと同様に金属イオンをほとんど溶出しないことを明らかにした。磁石構造体を骨に直接埋入し、骨生長を調べるためには、磁石構造体表面が骨成長を阻害しないことが重要である。そこで、埋入予定の磁石構造体と同形状のφ4mm(径)×2mm(厚)に成形したXM27,447J1,316L, Tiを生後1年経過した日本家ウサギの脛骨に4週及び12週間埋入し、それらの骨親和'性を比較した。組織観察の結果、いずれの金属表面においても、埋入4週目では、軟骨性内骨化を呈した骨様組織が表面を覆っていたが、12週になると、447J1とTi表面に石灰化した成熟骨が一様に成長し、Tiと同様の骨形成が447J1表面でも可能であることが明らかとなった。これらの結果を基に、447J1をヨークとした磁石構造体を選び、着磁及び無着磁のものを作製し、ラットよりも骨代謝の遅いウサギの脛骨および大腿骨に埋入する実験を現在行っている。申請者らは、静磁場の付与を磁石構造体とし、ラットより骨代謝の遅い繁殖期を過ぎた日本家ウサギを用いた動物実験を行った。着磁及び無着磁の磁石構造体を日本家ウサギの両脛骨にそれぞれ2個ずつ埋入し、112週(1W、2W、4W、8W、12W)後に屠殺して組織切片を作製し、光学顕微鏡を用いて組織観察を行った。標本数は各週3羽とし、各週につき6個の組織切片を作製した。いずれも1週目から軟骨性内骨化がみられ、骨欠損部である磁石構造体吸着面の周囲から骨様組織が全域を覆うように形成される様子が表れた。両者を比較すると、着磁した方が骨様組織が多く現れる傾向であった。2週目以降になると、軟骨基質を多く含み多孔質で幼弱な骨様組織が磁石構造体底面全域をある程度の距離を取りながら湾曲に囲むように覆い、あたかも欠損部を骨髄から隔離するように骨成長が進行した。着磁した方が明らかに骨様組織の量が多く、静磁場の付与によって骨形成が加速されている様子を呈した。4週目に入ると、一変して多孔質で幼弱な骨様組織は減少し、石灰化の進んだ皮質骨と同様の骨が磁石構造体の吸着面全域を覆うように変化した。無着磁では、まだ多くの骨様組織が残留している様子がわかる。8週目を過ぎると、いずれも吸着面全域が皮質骨と同等の骨で覆われ、骨形成に大きな相違が見られなくなった。12週目以降では、両者の骨組織に相違は見られなかった。これより、静磁場による刺激は、骨形成初期(1週4週)の形成速度向上に寄与する可能性が高いと考えられるが、1週4週の標本において磁石構造体の固定不備により、標本数が所定の数よりも少ないものがあるため、追加実験を行い所定標本数を得てその事実を確認できた。昨年度まで行ってきた静磁場による骨形成の促進において、不備のあった標本を再実験するとともに、骨牙細胞を用いた骨形成マーカーの増減を調べ、その現象をさらに明確にすることを遂行した。再実験の結果、静磁場により骨形成初期の形成速度が促進される現象を確認でき、昨年度の結果を明確にすることができた。

細胞実験では、骨牙細胞のSaOS-2(RCB0428,理研バイオリソースセンター細胞バンク)を用いて静磁場の骨牙細胞に及ぼす影響を調べた。細胞培養液4mlにSaOS-2細胞を浸し、着磁及び無着磁の磁石構造体吸着面にのせて4日及び8日間培養した。標本数は各6個とし、DNA量とALP酵素活性を測定した。各測定データについて、有意水準0.05で分散分析(Scheffes' test)を行った。SaOS-2のDNAとALP活性値に及ぼす静磁場の効果を調べた結果、4日と8日の両者において静磁場がSaOS-2のDNA量、ALP活性値を増加させることがわかった。これより、静磁場によって細胞の増殖と細胞外基質(ECM)が有意(p<0.05)に増加し、骨牙細胞の活性に寄与することが明らかとなった。これより、磁石構造体によって付与した静磁場は、骨形成の初期において、骨形成速度の向上に寄与し、その現象は骨牙細胞の増殖と分化の加速に起因することが示唆された。骨様組織が石灰化して皮質骨と同様に変化した後は、静磁場の影響は表れなかったことより、インプラントなどの初期固定に応用可能であるが、長期的な骨増殖を期待する用途には適さないと考えられる。
『キリストの生涯の黙想』が15世紀の大衆思想に与えた影響について

14世紀中ごろから15世紀後半にかけて全ヨーロッパで流行した、キリストの生涯について「黙想」するという信仰方法が成熟した結果、一般信徒の信仰形態は個人充足的傾向を強めていった。それは信仰の自立を促す一方、教会と王権間の実権交代という社会の権力構造の変化も伴った。この信仰形態の圧倒的な伝播力と影響力は、キリスト・マリアに対する共感と崇敬を鼓舞することを重要な手法とする「黙想」という信仰の形が、生物学的に心身の相関関係を活性化させる構造を持っていたことにも起因していると言える。末期中世の情緒的信仰主義(affective devotionalism)においてしばしば報告される神秘体験も、一部この脳活動として説明しできるであろう。キリスト・マリア崇敬は、写本文化の終焉を華やかに飾ったという点でも重要である。(A)『イエス・キリストの尊い生涯の鏡』の認知論による論考:脳神経科学的認知理論の先端研究に関する国際学会に参加・発表した。茂木健一郎をはじめ世界各国の主要研究者による研究に触れ、最新の研究情報を仕入れることができたので、黙想という信仰形態を脳科学的理論に基づき分析する研究に新しい視点をいくつか加えることができた。その成果は一部22年度の国際学会(New Chaucer Society 2010 Congress, Siena)で発表する。これは、その後プロシーディングが刊行される予定である。また、昨年度発表した関連論文1本が学会プロシーディングに受理された。もう一編、関連論文が国際的学術雑誌の第一審査を通過し、二次審査のための準備を進めている。(B)Love『鏡』と15世紀英訳聖書:『鏡』に挿入された聖書英訳を分析。22年度国際学会(Medieval Translator 2010, Padova)に発表が受理された。(口頭発表)(C)『イエス・キリストの尊い生涯の鏡』の翻訳:続行中。(D)『キリストの生涯の黙想』の英語訳Pepys版の編集、刊行:本テキストについての研究が『キリストの生涯の黙想』に特化した特別国際学会(Mapping Late Medieval Lives of Christ, Belfast)で受理された(口頭発表)また校訂テキストの出版についてMiddle English Textsシリーズから内諾を得、準備を開始した。1.『イエス・キリストの尊い生涯の鏡』の認知論による論考:キリストの生涯の黙想という信仰形態はヨーロッパ後期中世の宗教・文化の大きな特徴の一つであり、特にイギリスで広く行なわれた。この信仰形態はその後の自我の形成・発達に貢献したと考えられている。キリストの生涯を如実に想像し、その想像した場面に参加する自らの姿を組み入れるという、いわばシミュレーションによる信仰が流布した理由を脳神経科学的認知論を応用して考察した。研究論文は中世英文学関連の国際学会で発表した。学会会場では類似したアプローチが複数のセッションで発表され、人の文化の発展と生物学的特性との関連についての関心が高まっていることを確信した。2.『キリストの生涯の黙想』の英語訳Pepys版の編集、刊行:1.『キリストの生涯の黙想』という後期中世の信仰形態に関する脳科学・認知論を応用した論考および『キリストの生涯の黙想』の中英語訳(Pepys版)に関する固有の特性についての論考22年度に国際学会で発表した2本の論文をそれぞれの学会のプロシーディングに投稿し掲載を許可されていたので、両論文について、エディターとの間で原稿の再校・再再校のやりとりがあった。脳科学と認知論を援用した論考は、2012年中に発刊が決定している。『キリストの生涯の黙想』についての発表原稿は、再校がエディターで半年以上止まっているが、2012年2013年前半に発行の見込みが高い。2.Pepys版『キリストの生涯の黙想』の編集・刊行準備Cambridge大学Magdalene College,Pepys図書館2125写本所収の注英語訳『キリストの生涯の黙想』の校訂本については、共編者に京都大学文学部家入葉子氏を迎え、テキスト校訂について会合を重ねてきた。テキスト校訂の方針について会議を重ねる一方、それぞれが分担領域の解説執筆を進めているが、わたくしは、Pepys 2125写本の全容について、特に受容に焦点をあてた研究を進めている。この写本の受容についての論文を国際学会で発表した。この学会は、ヨーク写本学会と初期刊本学会の合同で、イギリス、ヨーク市で開催され、両分野における世界中の専門家が多数参加しており、後期中世宗教写本文献の第一人者であるIan Doyle博士を含む多数の中心的研究者に研究発表を聞いていただくことができ、効果的な発信ができた。発表に対する反応も大変良好であったので、校訂本発刊に向けて、良い一歩を進めることができたと言える。
危険信号仮説に基づく薬剤性肝障害発症機構の解明

薬剤性肝障害の危険信号としての腸管由来因子の関与を明らかにするため、前年度に引き続き、トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)の直腸投与によりラット大腸炎モデルを作製し、肝機能変化とその制御について検討した。TNBS投与ラットでは、大腸炎の発症に伴う肝障害の血清マーカー酵素(ALT、AST)の有意な上昇は認められなかったが、肝薬物代謝酵素CYP3A2の発現低下が見られ、P450の炎症性因子に対する感受性の高さが示された。肝CYP3A2の発現定下はポリミキシンB投与によるエンドトキシンの中和、ニメスリドによるCOX-2の阻害、クルクミンによるNF-κB阻害、塩化ガドリニウムによるマクロファージの抑制により防御された。このことから、腸管由来のエンドトキシン、プロスタグランジン、炎症性サイトカインが腸管由来の危険信号となりうることが示唆された。また、これらは肝非実細胞を介して肝実質細胞に影響するものと考えられた。一方、ハプテン仮説-危険信号仮説の基盤となる、薬物の反心性代謝物生成とその意義に関して、肝障害惹起薬物であるジクロフェナックを用いて検討を行った。肝ミクロゾームを14C標識ジクロフェナックと酸化代謝条件下でインキュベートすることにより、ミクロゾームタンパクとの共有結合が観察された。得られた共有結合量は既知のジクロフェナック代謝能、特に5位水酸化の程度と相関した。マウス、ラット、サル、ヒト等での比較において、ラットが特に高い共有結合量を示したが、同時にラットでは反応性代謝物生成酵素そのものへの結合が多くを占めることが明らかとなった。実際ラットのジクロフェナック肝障害感受性は必ずしも高いわけでなく、結合の絶対量のみでは肝障害感受性は決定されないと考えられた。以上の検討より、薬剤性肝障害には薬物によって異なる特定のタンパクへの共有結合と、今回明らかにした腸管由来因子をはじめとする肝障害増幅因子によって、個体それぞれで重症度の異なる肝障害を引き起こすものと結論できる。薬剤性肝障害のうち特異体質性肝障害の多くは免疫学的機序によるものと考えられており、メカニズムとしてハプテン仮説やそれを補足する危険信号仮説が提唱されている。しかし、危険信号そのものが同定されていないために、両仮説とも肝障害メカニズムとしては仮説の域を出ていない。本研究では、薬剤性肝障害において危険信号仮説を実証するためのアプローチとして、まずToll様受容体(Toll-like receptor, TLR)の関与を明らかにし、危険因子となり得る内因性リガンドを同定することを試みた。また、危険信号として仮想されている細菌感染や他の疾患に由来する炎症性因子の関与を調べるため、大腸炎等他の疾患モデルを作製しそれらの薬剤性肝障害感受性を検討した。デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)を経口投与またはトリニトロベンゼンスルホン酸の直腸投与により実験的大腸炎モデルを作製したところ、これらのラットの門脈血中エンドトキシン濃度は上昇が見られた。大腸炎モデルでは四塩化炭素誘発性の肝障害は、むしろ抑制傾向が見られたが、これはCYP2E1等のDown-regulationによりラジカル生成が低下したためと推定された。そこで肝毒性発現に代謝活性化を要しないD-ガラクサミンにより同様の検討を行ったところ、DSS大腸炎ラットおよびマウスで感受性の上昇が観察された。また、このような肝障害増悪は、TLR4を欠損したマウスでは見られなかったことから、TLR4リガンドが危険信号となることが示された。

一方、アセトアミノフェンやジクロフェナックの肝障害においては、毒性発現とともにヘムオキシゲナーゼ-1(HO-1)の誘導が観察され、このHO-1誘導を抑えることにより毒性が増強した。これらの結果は危険信号としてのヘムの関与を示唆しており、またジクロフェナックやトログリタゾンは肝臓の主要なヘムタンパクであるP450を損傷させることから、P450がフリーヘムの生成源となる可能性が示唆された。薬剤性肝障害の危険信号としての腸管由来因子の関与を明らかにするため、前年度に引き続き、トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)の直腸投与によりラット大腸炎モデルを作製し、肝機能変化とその制御について検討した。TNBS投与ラットでは、大腸炎の発症に伴う肝障害の血清マーカー酵素(ALT、AST)の有意な上昇は認められなかったが、肝薬物代謝酵素CYP3A2の発現低下が見られ、P450の炎症性因子に対する感受性の高さが示された.肝CYP3A2の発現低下はポリミキシンB投与によるエンドトキシンの中和、ニメスリドによるCOX-2の阻害、クルクミンによるNF-kB阻害、塩化ガドリニウムによるマクロファージの抑制により防御された。このことから、腸管由来のエンドトキシン、プロスタグランジン、炎症性サイトカインが腸管由来の危険信号となりうることが示唆された。また、これらは肝非実質細胞を介して肝実質細胞に影響するものと考えられた。一方、ハプテン仮説-危険信号仮説の基盤となる、薬物の反応性代謝物生成とその意義に関して、肝障害惹起薬物であるジクロフェナックを用いて検討を行った。肝ミクロゾームを14C標識ジクロフェナックと酸化代謝条件下でインキュベートすることにより、ミクロゾームタンパクとの共有結合が観察された。得られた共有結合量は既知のジクロフェナック代謝能、特に5位水酸化の程度と相関した。マウス、ラット、サル、ヒト等での比較において、ラットが特に高い共有結合量を示したが、同時にラットでは反応性代謝物生成酵素そのものへの結合が多くを占めることが明らかとなった。実際ラットのジクロフェナック肝障害感受性は必ずしも高いわけでなく、結合の絶対量のみでは肝障害感受性は決定されないと考えられた。以上の検討より、薬剤性肝障害には薬物によって異なる特定のタンパクへの共有結合と、今回明らかにした腸管由来因子をはじめとする肝障害増幅因子によって、個体それぞれで重症度の異なる肝障害を引き起こすものと結論できる。
散逸エネルギー検出機能を持つ複合走査型プローブ顕微鏡によるナノ接合の力学的解析

本研究では、原子位置の変位や、物質の融着、転移導入過程で散逸される力学的エネルギー(散逸エネルギー)の検出技術を中心に、走査型プローブ顕微鏡(SPM)の観察・解析能力を拡張し、ナノサイズの物質接合の電気・力学特性を原子レベルで評価する。手法として、独自のSPM技術(1.力学的散逸エネルギーの高感度検出法および分光学的手法、2.チャージアンプを利用した電荷移動・表面電位の高速・高感度検出法、3.電子顕微鏡とSPMの複合化技術)を発展させながら複合・集積化する。SPM探針を試料表面に接近させてナノ接合を構築すると、原子集団の組替えや融着、転移導入が起こる。その過程で力学的エネルギーが内部摩擦として消費される。本年度、その過程の一旦を力学的散逸エネルギーとしてSPMで検出した。測定は、自作の超高真空(UHV)非接触原子間力顕微鏡(nc-AFM)を用いて、高いQ値を持つSi探針のAFMカンチレバー(Siピエゾ抵抗自己検知型)を一定振幅で振動させ続けるための励振エネルギーの変化を高感度計測することで行った。試料は、Si表面に蒸着した単原子Ge原子である。探針を試料に接近させると、SiとGe原子上で散逸エネルギーに差異が現れた。探針のSi原子と試料原子の間の結合力の違いで、探針が接近する毎のヒステリシスを伴う力学過程で力学的エネルギーの損失(すなわち、散逸エネルギー)に差が生じたと推定される。また、電子顕微鏡との複合化をめざし、小型の機械系微動駆動機構を導入して透過型電子顕微鏡(TEM)ホルダーを試作した。機械的な熱ドリフトが小さくなり、TEM像の原子分解能を損なうこと無く探針と試料の間に形成されるナノ接合を観察できた。散逸エネルギーの高感度検出をめざして、真空動作小型チャージアンプの開発も進めた。UHV-SPM(nc-AFM)を土台とした散逸エネルギーの検出は、上述したように原子レベルの差異を捉えることができ、順調に進んでいる。nc-AFMを内蔵した透過型電子顕微鏡(TEM)ホルダーの開発では、幾つかのタイプの設計・試作開発を行い、機械系微動駆動を工夫した。静電容量を構成する2電極間の電荷移動の計測ができる低ノイズ高感度高帯域チャージアンプの開発では、試作品の真空動作が順調なところまで確認した。一方、TEMホルダーに組み込めるほどの小型化の達成が遅れている。力学的散逸エネルギーの高感度検出化に関して、電子回路の更なる低ノイズ化を試みる。力検出系の初段に、特性値として現在よりも低雑音なアンプを設置して測定システムのパフォーマンスの改善を図る。並行して、散逸エネルギー計測に基づいたSiとGe原子の表面揺動の変化の解析を進め、理論的検討や、低温での揺動の変化を調べるための装置開発も進める。TEMホルダーの開発に関連して、チャージアンプの小型化の開発を進め、TEMホルダーに組み込めるようにする。これを利用して、探針と試料面の間にナノ接合を形成し、エネルギー散逸の過程を動的に解析する。また、ナノ接合の力学物性測定に関して、パルス力場の印加による歪み応答も調べる。

機械的な熱ドリフトが小さくなり、TEM像の原子分解能を損なうこと無く探針と試料の間に形成されるナノ接合を観察できた。静電容量を構成する2電極間の電荷移動の計測ができる低ノイズ高感度高帯域チャージアンプの開発では、試作品の真空動作が順調なところまで確認した。一方、TEMホルダーに組み込めるほどの小型化の達成が遅れている。力学的散逸エネルギーの高感度検出化に関して、電子回路の更なる低ノイズ化を試みる。力検出系の初段に、特性値として現在よりも低雑音なアンプを設置して測定システムのパフォーマンスの改善を図る。並行して、散逸エネルギー計測に基づいたSiとGe原子の表面揺動の変化の解析を進め、理論的検討や、低温での揺動の変化を調べるための装置開発も進める。TEMホルダーの開発に関連して、チャージアンプの小型化の開発を進め、TEMホルダーに組み込めるようにする。これを利用して、探針と試料面の間にナノ接合を形成し、エネルギー散逸の過程を動的に解析する。また、ナノ接合の力学物性測定に関して、パルス力場の印加による歪み応答も調べる。
マイクロ血液脳関門の開発

血液脳関門のマイクロモデル開発をめざし、細胞培養支持体として多孔質膜を挟み込んだPDMSマイクロチップを作製し、膜の両面にアカゲザル由来の血管内皮細胞株およびヒト由来の上皮様細胞株を共培養した。得られたデバイスを用いて蛍光色素の透過性試験を行い、デバイス内に形成された細胞シートが透過性バリアとして機能していることを確認した。PDMSマイクロチップ内に毛細血管に見立てた微細流路を作製し、ここに血管内皮細胞、周皮細胞、アストロサイト3種類の細胞を配置し、共培養することにより実際の血液脳関門(BBB)を模倣したマイクロBBBを構築することを目指してデバイス開発を行った。チップはソフトリソグラフィー法によりマイクロ流路を造形したポリジメチルシロキサン(PDMS)シートを貼り合わせて作製した。その際、PDMSシート間に多孔質ポリエステル膜を挟み込み、これを細胞培養の支持膜とした。フィブロネクチンやコラーゲンなど細胞外マトリックスをコーティング後、実際にモデル細胞の培養を試みた。開発するマイクロモデルでは最終的には血管モデルとして正常ヒト脳毛細血管内皮細胞と、正常ヒト脳毛細血管周皮細胞を用いる予定だが、これらの細胞はかなり高価であり、取り扱いが容易でないため、今年度の研究にはアカゲザル由来の血管内皮細胞株およびヒト由来の上皮様細胞株を用いた。検討の結果、通常のフォトリソグラフィーで作製する深さ200ミクロン以下の流路ではコンフルエントな培養は難しいことが分かった。そのため、新たに裏面照射フォトリソグラフィー法を開発し、深さ500ミクロン以上の鋳型を作製することに成功し、深い流路を構築してこれを培養槽とした。コンフルエントな細胞培養を実現するためには、細胞の播種時には通常よりも高密度の細胞懸濁液を用いる必要があった。細胞が接着後、極めてゆっくりの速度で培地を連続的に供給しながら培養することにより、細胞を良好に増殖させることに成功した。これにより、細胞支持膜の上面と下面に異種の動物細胞を培養することに成功した。また、得られたデバイスを用いて蛍光色素の透過性試験を行い、デバイス内に形成された細胞シートが透過性バリアとして機能していることを確認した。PDMSマイクロチップ内に毛細血管に見立てた微細流路を作製し、ここに血管内皮細胞、ペリサイト、アストロサイト3種類の細胞を配置し、共培養することにより実際の血液脳関門(BBB)を模倣したマイクロBBBを構築することを目指してデバイス開発を行った。チップはスライドガラス上にマイクロ流路を造形したポリジメチルシロキサン(PDMS)シートを貼り合わせて作製した。その際、PDMSシート間に多孔質ポリカーボネート膜を挟み込み、これを細胞培養の支持膜とした。開発するマイクロモデルでは最終的には血管モデルとしてヒト臍帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)を用いる予定だが、この細胞はかなり高価であり、取り扱いが容易でないため、今年度の研究にはヒト由来の株化された上皮細胞を用いた。検討の結果、フォトリソグラフィーで作製する深さ200ミクロン以下の流路ではコンフルエントな培養は難しいことが分かった。そのため、深さ500ミクロン以上の棒を鋳型として用いる方法により、深い流路を構築してこれを培養槽とした。また、細胞支持膜とPDMSの接着が十分ではないことが多かったため、支持膜の端を流路が通過すると液漏れをおこす危険性があったため、膜の端を回避する設計を見いだした。また、コンフルエントな細胞培養を実現するためには、細胞の播種時には通常よりも高密度の細胞懸濁液を用いる必要があった。細胞増殖を促すためには細胞が接着後、極めてゆっくりの速度で培地を連続的に供給しながら培養する必要があることを見いだした。研究計画にあったとおり、膜を挟んだPDMSチップを設計・試作し、膜の素材や表面修飾方法、流路構造や細胞播種方法、細胞培養条件などについて検討してきた。その結果、細胞培養にふさわしいチップ形状や培養方法についての様々な知見を得ることができ、培養の基本的な手順は開発できたと考えられ、本年度目指していた研究の多くは実現できた。しかしながら、これらの実験はすべてヒト由来のモデル細胞株を用いたものであり、実際に微小血管内皮を構築するために必要な細胞を使った実験は実現できなかった。そのため細胞の分化状態の確認などは行うことができなかった。23年度の研究内容について、引き続き検討をおこないながら、透過性試験を実際におこないながらマイクロBBBの改良をおこなう。構築したマイクロBBBについて、BBBとして正しい性能を有しているかを確認するために、各細胞特有のマーカータンパク質の発現を調べることにより、分化状態を確認する。必要な分化状態が確認できない場合は培養条件や用いる細胞種を変更することなどを検討する。脳腫瘍に対する抗がん剤や、精神疾患などに用いられる中枢神経作用薬など脳に働く薬として代表的な物のうち、蛍光性を持つかHPLCなどで分析しやすいものをいくつか選択し、実際に透過性試験をおこない、文献値と比較することによりその性能を評価する。

また、比較としてBBB非透過性物質でも同様の試験をおこなう。実際にバイオアッセイで利用するためには操作が容易であることと、再現性が高いことが必要である。BBBの性能を妨げない範囲で、細胞培養工程を簡略化できるか、試料導入の送液系を簡便化できるかについて検討する。研究費は主にマイクロチップの作製に関する消耗品の購入に充ててきており、24年度も引き続き当該消耗品購入に使用予定である。23年度に行った実験はすべてモデル細胞株を用いたものであり、実際に微小血管内皮を構築するために必要な細胞を用いた実験は24年度に行うように計画を変更したため、その変更に伴って24年度に使用する研究費が生じた。24年度は実際にBBBのモデルとしてふさわしい細胞を用いてマイクロモデル構築の最適化とその性質の検討をおこなう予定であるが、用いる細胞の多くは初代細胞であり、細胞及び専用培地が極めて高価であり、この費用について本研究費からまかなう予定である。
AlN系ナイトライドによる次世代小型・超高出力・高効率パワーデバイス

本研究では、バンドギャップエネルギーが半導体の中で最も大きいA1N系ナイトライドによる高性能デバイスを目指すことを目標に2カ年研究を遂行した。最終年度の平成19年度は、前年に実現した高性能ノーマリオフ型A1GaN/GaN系FETをさらに高性能化することを目指し研究を推進した。さらに、本技術を発展させ高感度フォトFETの検討を行った。主な検討項目と、その概要について以下に示し概説する。1.デバイスシミュレータを活用したデバイス構造の最適化...電流連続の式およびポアソン方程式をセルフコンシステントに解くことによって、バンド計算を行い、デバイス構造の最適化を進めた。2.エッチング条件および表面処理の最適化...本研究課題で取組む電力変換素子はp型を用いることによってノーマリオフ化しているため、プラズマエッチングを行う必要がある。そのエッチング条件の見直しを行った。さらにエッチングした表面ダメージによる表面準位を低減するために、表面パッシベーションを行った。特にSiO_2とSiN_xの比較などを行った3.フォトFETの検討を行った...本研究で開発を進めた電力変換素子は、非常に低OFF電流が実現できるため、その特性を生かしてフォトFETの開発を進めた本研究では、バンドギャップエネルギーが半導体の中で最も大きいAIN系ナイトライドによる高性能デバイスを目指すことを目標に2ヵ年研究を遂行している。平成18年度は前年度までに達成したpn接合を用いることによって実現したAlGaN/GaNによるノーマリーオフ型FETの高性能化およびAIN系ナイトライドの結晶成長の検討を行なった。主な検討項目と、その概要について以下に示す。1.理論的なシミュレーションを行った。パワーデバイスはノーマリーオフ動作が必須であるため、その動作に必要な、層構造や不純物濃度を決定し、それを実験的に検証した。特に、本研究ではボアソン方程式と電流連続の式をセルフコンシステントに解くことによって、ノーマリーオフ実現に必要なAlIGaNの条件、不純物濃度分布、デバイスの層構造等を検討した。2.理論結果と実験結果の検証シミュレーションは、物性値等を使っているため、実際の結果との対応が重要である。本研究は、多数のデバイスを作製し実際の結果とシミュレーションの結果を対応させた。その過程で、不純物濃度を精密に測定する必要があるためSIMS等の評価は外注で実施した。その結果として、1で行なったデバイス設計の妥当性、および設計の指針を明らかにし、学会等で報告したOn/OFF比、低オン抵抗、スイッチングロスの評価を行なった。その結果として、On/Off比が7桁、低オン抵抗、低スイッチングロスデバイスが実現できていることを明らかにし学会等で報告した。4.AIN系ナイトライドの結晶成長の検討を行なったMOVPE法によるAINナイトライドの結晶成長を検討し、高品質結晶を得るための指針を得た。特にSiO_2とSiN_xの比較などを行った3.フォトFETの検討を行った...本研究で開発を進めた電力変換素子は、非常に低OFF電流が実現できるため、その特性を生かしてフォトFETの開発を進めた
痴呆のメカニズム解明および抗痴呆薬開発のための動物モデルの確立

1.各種動物(イヌ、サル、クマ、ネコ、ラクダ、ヒト)の老人斑についてフラクタル次元(FD)を求め比較検討した。イヌ、サル、ヒトでび漫性老人斑(DP)と成熟型老人斑(MP)との間にFD値に有意な差が認められた。さらにイヌにおいてFD値と老人斑の大きさとをプロットしたところ、DPとMPで回帰曲線の傾きに差があった。これら動物ではDPとMPが異なる過程で形成されたと推測された。また、ネコのDPのFD値はイヌ、サル、クマ、ラクダ、ヒトのそれより有意に低く、ネコ老人斑の特殊性が考えられた。2.老齢犬の老人斑を三次元的に観察した。アミロイドβタンパク質(Aβ)の沈着巣はDPでは不均一な星雲状集合体で、MPでは比較的均一な薄膜状または線維状の集合体であった。いずれ老人斑でも沈着巣内には低密度部分がみとめられた。また、Aβ前駆体(APP)、ユビキチン、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、ニューロフィラメントについても三次元的分布を調べた。その結果、DPとMPの三次元構造の違いが明らかになり、両者はそれぞれ異なる過程によって形成されたものであることが示唆された。3.老齢犬の脳で老人斑におけるAβの2つの分子種(Aβ40とAβ42)の三次元沈着パターンとフラクタル次元を調べた。その結果、DPとMPにおけるAβ42とAβ40の凝集過程の違いが明確になった。4.カニクイザルを用いて、プリセニリン1の局在を調べた。プリセニリン1のC末端部分が大脳の神経網に検出され、その量は加齢とともに増加した。本研究の成果から老齢動物の脳における組織変化が明らかになり、「ヒト以外の動物では老化にともなって老人斑は形成されるが、神経原線維変化(NFT)は形成されない」など脳老化の比較生物学的問題点が明確になった。1)老齢犬の老人斑を三次元的に観察した。アミロイドβタンパク質(Aβ)の沈着巣はび漫性老人斑(DP)では不均一な星雲状集合体で、成熟型老人斑(MP)では比較的均一な薄膜状または線維状の集合体であった。2)各種動物(イヌ、サル、クマ、ネコ、ラクダ、ヒト)の老人斑についてフラクタル次元(FD)を求め比較検討した。イヌ、サル、ヒトでDPとMPとの間にFD値に有意な差が認められた。3)老齢犬および老齢リスザルを用いて、Aβの2つの分子種(Aβ40とAβ42)の老人斑における沈着パターンを調べた。その結果、Aβ42が最初に沈着し、それを中心としてAβ40が凝集してくることが示された。

4)カニクイザルを用いて、プリセニリン1の局在を調べた。プリセニリン1のC末端が大脳の神経網に検出され、その量は加齢とともに増加した。以上のことから、動物におけるAβとプレセニリン1の沈着様式および老人斑形成過程が明らかになった。1.各種動物(イヌ、サル、クマ、ネコ、ラクダ、ヒト)の老人斑についてフラクタル次元(FD)を求め比較検討した。イヌ、サル、ヒトでDPとMPとの間にFD値に有意な差が認められた。さらにイヌにおいてFD値と老人斑の大きさとをプロットしたところ、DPとMPで回帰曲線の傾きに差があった。これら動物ではDPとMPが異なる過程で形成されたと推測された。また、ネコのDPのFD値はイヌ、サル、クマ、ラクダ、ヒトのそれより有意に低く、ネコ老人斑の特殊性が考えられた。2.老齢犬の老人斑を三次元的に観察した。アミロイドβタンパク質(Aβ)の沈着巣はび漫性老人斑(DP)では不均一な星雲状集合体で、成熟型老人斑(MP)では比較的均一な薄膜状または線維状の集合体であった。いずれ老人斑でも沈着巣内には低密度部分がみとめられた。また、Aβ前駆体(APP)、ユビキチン、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、ニューロフィラメントについても三次元的分布を調べた。その結果、DPとMPの三次元構造の違いが明らかになり、両者はそれぞれ異なる過程によって形成されたものであることが示唆された。3.老齢犬の脳で老人斑におけるAβの2つの分子種(Aβ40とAβ42)の三次元沈着パターンとフラクタル次元を調べた。その結果、DPとMPにおけるAβ42とAβ40の凝集過程の違いが明確になった。4.カニクイザルを用いて、プリセニリン1の局在を調べた。プリセニリン1のC末端部分が大脳の神経網に検出され、その量は加齢とともに増加した。本研究のこれまでの成果から老齢動物の脳における組織変化が明らかになり、「ヒト以外の動物では老化にともなって老人斑は形成されるが、神経原線維変化(NFT)は形成されない」など脳老化の比較生物学的問題点が明確になった。これをふまえて脳老化機構、とくに老人斑とNFTの形成について比較動物学的な考察を試みた。ヒトアルツハイマー病脳ではβアミロイドの過剰沈着がおこり、これが神経細胞に毒性を発揮、タウの異常リン酸化を引き起こしてNFTが形成され、神経細胞が脱落する(アミロイド仮説)。この過程は通常十年以上を要し、このためアルツハイマー病は老齢期に発症する。こうした神経系の老化は遺伝子操作などをしない自然状態では、動物種によらない絶対時間を必要とするのだろう。動物の種類が異なっても、この絶対時間は変わらない。ヒト以外の動物の寿命は、老人斑を形成するには十分であるがNFT形成・神経細胞脱落に至るには足りないと考えられた。(研究発表論文参照)このようにヒト以外の動物が脳老化の比較進化学的研究に極めて重要であること、および老化研究における比較進化学的視点の重要性が確認された。上記の仮説を立証するために、各種動物の脳における遺伝子発現を網羅的に調べる研究に着手した。その手始めとして様々な年齢のイヌ脳組織における遺伝子発現を調べた。これにはヒトの神経系関連遺伝子マイクロアレイフィルター(東洋紡製)を用いた。このフィルターに用いられている遺伝子群はヒトに由来するが、それらの塩基配列は動物種によらず比較的よく保存されている部分が用いられており、イヌの組織に対しても十分使用できると考えられる。
分子内に2個のアミン配位子を持つ有機ホウ素錯体の合成・構造および動的挙動

分子内に2個のアミン配位子を持つ有機ホウ素錯体として、2,6-ビス(ジメチルアミノメチル)フェニルボロン酸エステエルを合成し、分子の構造と動的挙動を調べた。この化合物は立体障害が大きいため合成が困難であることが予想されたが、ベンゼン誘導体にアミン-ホウ素の順番に置換基を導入する方法で効率よく目的化合物を得ることができた。錯体の温度可変NMRの測定から、溶液中ではホウ素原子に対して2個のアミン配位子が相互に配位-解離を繰り返すような過程、「配位子のスイッチング」が非常に速く起こっていることが判明した。この実験事実は、ホウ素上の置換がS_N2的機構で進行していることを意味しており、ホウ素の反応機構に新しい概念を導入するものである。この種の機構の正当性は、モデル反応の分子軌道計算によっても確かめられた。エステル部の置換基の異なる2種類の錯体のX線構造解析を行い、結晶中では1個のアミン配位子のみがホウ素原子に配位した構造をとっていることがわかった。配位結合の結合距離などのその他の分子構造の特徴を明らかにすることができた。以上、本課題において当初の研究計画をおおむね達成することができた。今後、窒素にメチル基以外の置換基をもつもの、あるいは分子内に3個以上のアミン配位子を持つ化合物へと研究を展開していく上での基本的なデータが得られた。