hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植生の生理生態学的情報抽出のためのリモートセンシングデータ利用に関する実験的研究

観測データの整理と問題点の抽出研究グループ全員で、データ検討会を持ち、データの一次処理を行った。これによって平成10年度にむけて観測体制の改良点を抽出した。また、〔リモートセンシングデータ(分光放射特性、表面温度など)〕-〔生理・生態学的特性関係〕のモデリングに関し、たたき台となるコンセプチュアルモデルを検討した。個葉・群落レベルのガス交換過程と分光放射特性モニタリング桐生水文試験地、赤穂試験地において,個葉・群落レベルでCO_2/H_2O交換量の観測を実施した。桐生試験地には平均樹高17mのヒノキ人工林で高さ25mの観測用タワーが設置されており、定期的な乱流変動法によるガス交換量の継続観測が進められている。赤穂試験地は平均樹高4mの常緑広葉樹林で、光合成蒸散量測定装置(Licor Li-6400)、スーパーポロメーター等を用いた個葉レベルの観測が定期的に行われている。これによって,赤穂試験地に関しては,群落樹冠構造の影響を考慮したCO_2/H_2Oフランクスのシミュレーションモデルが構築された。モデルは,林内の放射環境,フランクスの鉛直分布を計算することができる。また,桐生試験地のに関しては,ビッグリーフ型の樹冠一層モデルが構築され,長期の蒸散量やCO_2の吸収量が算定できるようになった。どちらのモデルもコンダクタンスモデルと光合成生化学モデルを組み込んでおり,放射環境に対するレスポンスを再現できる機能を持っている。植物の生理・生態学的反応と分光反射特性の関係についての実験個葉レベルで分光放射特性と葉の生理特性の関係を明らかにするために,Li-6400と分光放射計を用い,常緑広葉樹を用いた室内実験を行った。この結果,分光放射計の測定によって得られるNDVIは,光合成速度とは一対一の単純な関係にはならず,個葉レベルでもリアルタイムの光合成活性を把握するためには,可視・近赤外行きのリモートセンシングで得られる情報に加えて,熱赤外域のリモートセンシングで得られる葉面温度等の付加的な情報が必要であることが示唆された。植物体に水ストレスを与えた実験では,従来知られている,レッドエッジのブルーシフトが確かに測定された。これが生じる原因は,これまでいわれてきているように,クロロフィル密度の減少等によるものではなく,葉構造内の水分減少の結果,光学的に光の吸収・散乱の特性が変化するためであることが示唆された。
聴覚的注意によるマルチモーダル情報処理過程の解明

ヒトは,複数の感覚器(例:目,耳など)を介して得られた感覚情報を組み合わせることで,効率よく周囲の環境を把握している(マルチモーダル情報処理).こうした情報処理を実現するためには,各感覚器によって得られた複数の信号の中から,脳は同一事象を発生源とする組み合わせを見つけ出す必要がある.しかし,脳がどのようにこのような処理を実現しているのかは明らかではない.そこで本研究では,特定の事象を背景から際立たせる「注意」に着目し,注意がマルチモーダル情報処理に及ぼす影響から,その情報処理過程を明らかにするのが目的である.平成30年度は,【A】対象に対して向けられる注意自体の時間的・空間的な特性,そして【B】注意の効果がマルチモーダル情報処理に及ぼす影響について検討した.詳細は以下の通りである.【A】無響室内に空間的に分散配置したラウドスピーカを用いて,競合音存在下で標的音を聴き取る実験を行った.この聴取環境下で音刺激による標的音の提示位置予告を行い,被験者の注意を操作することで,注意効果の空間的な広がりと,注意効果の持続時間を検討した.本実験の結果,注意の焦点における注意効果が最大で,その焦点から30°離れるごとに注意効果が57%程度ずつ減少していくことが示された.さらに,その効果が提示予告の500ミリ秒後を境に徐々に減衰することが明らかになった.【B】過去の研究において,マルチモーダル感覚情報の任意の組み合わせ(ルール)を数分間観察することで,脳がこの関係性を学習し,その後の知覚に影響を及ぼすことが報告されている(Teraoka & Teramoto, 2016).平成30年度は,このルール学習に注意が及ぼす影響から,マルチモーダル情報処理過程の検討を行った.実験の結果,ルール学習時に注意が対象のマルチモーダル感覚情報に向けられている場合,その学習が促進される可能性が示された.平成30年度は,(1)注意に関する情報処理が知覚に及ぼす影響とその時空間特性の検討と,(2)注意がマルチモーダル情報処理に及ぼす影響についての検討が目的であった.(1)に関しては,被験者が特定の位置に注意を向けた場合,注意効果が知覚に及ぼす影響から,その空間的な広がりと時間的な特性を測定した.その結果,注意の焦点において注意効果が最大であり,そこから離れるに従って効果の減衰が見られた.つまり,注意効果の空間的な広がりを明らかにすることができた.注意効果の時間特性に関しては,この注意効果は向けてから1000ミリ秒以内に減衰を始める,つまり,1000ミリ秒以上注意効果が持続しない可能性を示した.(2)に関しては,異種感覚連合学習と注意の関係性について,手には意図せずとも注意が向いてしまうという過去の知見を用いて検討を行った.その結果,提示した視覚刺激と空間的に同じ位置に,時間的に同期した触覚刺激を提示することで,異種感覚連合学習が促進される可能性を示した.これらの結果はインパクトが高く,計画通り順調に進展していると判断する.平成31年(令和元年)度は,(1)注意の時空間特性に関する詳細な検討と,(2)平成30年度に得られた知見からマルチモーダル情報処理と注意の関係性に関する検討を行う.(1)に関しては,平成30年度の結果は実験環境や刺激の制約から,正面でのみ検討を行った.そのため,正面以外,例えば真後ろなどでも同様の特性が見られるかは不明であり,過去の研究でも明らかになっていない.そこで本年度は,実験環境や刺激を変更し,様々な位置における注意効果を比較検討する.(2)に関しては,平成30年度で得られた注意の時空間特性を考慮し,刺激の時間的・空間的な一致が異種感覚連合学習にどれほど影響を及ぼすのか,また,注意の焦点から離れるとどれだけこの学習に影響するのかについてより詳細な検討を行う予定である.また,以上の結果をもとに,マルチモーダル情報処理過程の検討を行う予定である.ヒトは,複数の感覚器(例:目,耳など)を介して得られた感覚情報を組み合わせることで,効率よく周囲の環境を把握している(マルチモーダル情報処理).こうした情報処理を実現するためには,各感覚器によって得られた複数の信号の中から,脳は同一事象を発生源とする組み合わせを見つけ出す必要がある.しかし,脳がどのようにこのような処理を実現しているのかは明らかではない.そこで本研究では,特定の事象を背景から際立たせる「注意」に着目し,注意がマルチモーダル情報処理に及ぼす影響から,その情報処理過程を明らかにするのが目的である.平成30年度は,【A】対象に対して向けられる注意自体の時間的・空間的な特性,そして【B】注意の効果がマルチモーダル情報処理に及ぼす影響について検討した.詳細は以下の通りである.【A】無響室内に空間的に分散配置したラウドスピーカを用いて,競合音存在下で標的音を聴き取る実験を行った.この聴取環境下で音刺激による標的音の提示位置予告を行い,被験者の注意を操作することで,注意効果の空間的な広がりと,注意効果の持続時間を検討した.本実験の結果,注意の焦点における注意効果が最大で,その焦点から30°離れるごとに注意効果が57%程度ずつ減少していくことが示された.さらに,その効果が提示予告の500ミリ秒後を境に徐々に減衰することが明らかになった.【B】

過去の研究において,マルチモーダル感覚情報の任意の組み合わせ(ルール)を数分間観察することで,脳がこの関係性を学習し,その後の知覚に影響を及ぼすことが報告されている(Teraoka & Teramoto, 2016).平成30年度は,このルール学習に注意が及ぼす影響から,マルチモーダル情報処理過程の検討を行った.実験の結果,ルール学習時に注意が対象のマルチモーダル感覚情報に向けられている場合,その学習が促進される可能性が示された.平成30年度は,(1)注意に関する情報処理が知覚に及ぼす影響とその時空間特性の検討と,(2)注意がマルチモーダル情報処理に及ぼす影響についての検討が目的であった.(1)に関しては,被験者が特定の位置に注意を向けた場合,注意効果が知覚に及ぼす影響から,その空間的な広がりと時間的な特性を測定した.その結果,注意の焦点において注意効果が最大であり,そこから離れるに従って効果の減衰が見られた.つまり,注意効果の空間的な広がりを明らかにすることができた.注意効果の時間特性に関しては,この注意効果は向けてから1000ミリ秒以内に減衰を始める,つまり,1000ミリ秒以上注意効果が持続しない可能性を示した.(2)に関しては,異種感覚連合学習と注意の関係性について,手には意図せずとも注意が向いてしまうという過去の知見を用いて検討を行った.その結果,提示した視覚刺激と空間的に同じ位置に,時間的に同期した触覚刺激を提示することで,異種感覚連合学習が促進される可能性を示した.これらの結果はインパクトが高く,計画通り順調に進展していると判断する.平成31年(令和元年)度は,(1)注意の時空間特性に関する詳細な検討と,(2)平成30年度に得られた知見からマルチモーダル情報処理と注意の関係性に関する検討を行う.(1)に関しては,平成30年度の結果は実験環境や刺激の制約から,正面でのみ検討を行った.そのため,正面以外,例えば真後ろなどでも同様の特性が見られるかは不明であり,過去の研究でも明らかになっていない.そこで本年度は,実験環境や刺激を変更し,様々な位置における注意効果を比較検討する.(2)に関しては,平成30年度で得られた注意の時空間特性を考慮し,刺激の時間的・空間的な一致が異種感覚連合学習にどれほど影響を及ぼすのか,また,注意の焦点から離れるとどれだけこの学習に影響するのかについてより詳細な検討を行う予定である.また,以上の結果をもとに,マルチモーダル情報処理過程の検討を行う予定である.
脳疾患に伴う語用論的コミュニケーション障害の認知的・社会的側面に関する総合的研究

本研究では、成人の語用論的コミュニケーション障害に関して、以下の3つのサブテーマを設けて、その本質に接近し社会的影響を明らかにする。サブテーマ1:さまざまな脳損傷者に文の理解課題と認知課題を実施し、その成績の分析から同障害の認知的なメカニズムに接近する。サブテーマ2:患者家族への質問紙調査から、同障害の社会生活への影響を明らかにする。サブテーマ3:同障害を改善させるための、または社会適応を促進させるための治療的介入法・環境的介入法の開発を行う。
ケイ素の特性を活かした選択的オレフィン合成反応の開発と応用

本研究より以下の結果が得られた。(1)(t-BuO)Ph_2SiCH_2CNを試薬とするPeterson反応では,脂肪族アルデヒドのみならず芳香族アルデヒドを用いても92:8から>99:1の高いZ一選択性が発現した。(4)Peterson反応において高い選択性が発現する反応機構を探るべくして検討したモデル化合物より,選択性は主にはじめのアルデヒドへのPeterson試薬の付加の段階で決定されている可能性が高いことが示唆された。また,Elcb反応では,立体電子効果に加えて立体障害が選択性の大きな要因となっていることが示された。1)位置選択的にカルボニルをオレフィンに変換できるPeterson反応では,通常Z-オレフィンを得るのが困難であるが,(t-BuO)Ph_2SiCH_2CNを用いることによってアルデヒドとの反応において,脂肪族アルデヒドのみならず芳香族アルデヒドでも高いZ-撰択性(92:8->99:1)でα,β-不飽和シアニドを得ることができた。2)電子求引基を有するPeterson試薬が関与するオレフィン化反応は多段階反応であるが,電子求引基としてエステル基を有する試剤の反応のはじめの付加中間体および電子求引基としてシアノ基を有する試剤の反応のオレフィンを直接与える中間体のモデル化合物をそれぞれ検討することによって,Peterson反応が類似反応であるHorner-Wadsworth-Emmons (HWE)反応とは異なる反応機構を通ることを間接的に証明できた。3)(CF_3CH_2O)_2P(O)CH_2CON(OMe)Meおよび(o-tolylO)_2P(O)CH_2CON(OMe)Meを用いてHWE反応を検討したところ,前者は芳香族アルデヒド,後者は脂肪族アルデヒドとの反応で,高いZ-選択性でα,β-不飽和Weinrebアミドを生成することを見いだした。さらに,これらの共役オレフィンと有機セリウム化合物との反応では,1,2-付加のみが起こり,オレフィンの幾何がほぼ保持できることがわかった。それにより,2段階反応として効率よくZ-α,β-不飽和ケトンを得る方法を確立できた。前年度の研究において,(t-BuO)Ph_2SiCH_2CNを反応試薬としてアルデヒドとのPeterson反応に用いると92:8 - >99:1の高い選択性で二置換Z-オレフィンが得られることを見出したが,その高い選択性が発現する反応機構を明らかにするために,1-ナフチルアルデヒドおよびベンズアルデヒドとプロピオニトリルとのアルドール付加物の水酸基を種々のシリル基で保護した化合物をモデル化合物として用い,塩基との反応を検討した。アンチのジアステレオマーは立体電子効果を考えるとZ-オレフィンを優先して与えると予想されたが,実際にどのシリル基と塩基の組み合わせであっても,ほぼZ-オレフィンのみが得られた。そのことから,オレフィンを与える直前のアニオン中間体が短寿命であり,アニオン形成後のアニオンの異性化によるE-オレフィンの形成の可能性が低いことが示された。また,シンのジアステレオマーは逆にE-オレフィンを優先して与えると予想されたが,実際には,反応条件によって比が左右される混合物を与えた。1-ナフチルの付加物を用いた場合および反応性の相対的に下がった塩基を用いた場合にZ-オレフィンの比率が増加したことから,このE1cb反応において立体効果の寄与が重要であることが示された。一方で,PhMe_2SiCH_2CO_2Etとベンズアルデヒドの付加物を単離し,逆アルドール反応が起きるかどうか検討したところ,起きないことがわかった。このことから,類似するHorner-Wadsworth-Emmons反応と機構を異にすることが明らかとなった。
病態行動の発現に関わる中枢制御機構の解明

まず,シバヤギを用いて人為的に病態行動を誘起する感染モデルの作出について検討した。卵巣摘除シバヤギにエンドトキシンであるLPS(リポ多糖)を頚静脈より200mg/kg投与し,投与1時間前より10時間後まで各種の自発行動を詳細に解析したところ,摂食および反芻時間,飲水およびグル-ミング回数が減少し,逆に排尿回数が増加傾向を示した。また,臨床症状としては,縮瞳および二相性の震えが観察された。生理学的パラメーターについては,体温がLPS投与直後より上昇しはじめ,4時間後にピークに達したのち下降して8時間後には対照群と同レベルにまで低下した。心拍数は投与直後より軽度の増加傾向が観察され,4時間後より再び増加し7.5時間後をピークに減少した。呼吸数に関しては有意な変化は認められなかった。一方,免疫系の指標として用いた白血球,特に好中球数は,投与30分後より減少しはじめ,80分後に最低値を示した後,増加して平常値へと戻った。さらに,内分泌系の指標としたACTHおよびcortisolの血中濃度は投与1時間後および3時間後をピークとする2相性の上昇を示した。続いて,感染状態より近いモデルを作出すべくLPSを頚静脈より83.3ng/kg/hrで36時間持続投与し,投与1日前より4日後まで各種パラメーターについて解析した。その結果,基本的には単独投与と同様な傾向が認められたものの,投与開始10時間後より7時間の間体温が一時的に下降するのとほぼ同期して臨床症状および病態行動が軽快し,体温が再び上昇した投与開始17時間後より臨床症状および病態行動が再び発現することが明らかとなった。以上の結果より,シバヤギにLPSを投与した際には,免疫系,自律神経系および内分泌系の賦活と,再現性の高い一連の病態行動が一定の時間的配列に従って発現することが明らかとなり,病態行動は病原体の排除に効率的に取り組むための合目的的な行動であることを強く示唆する成績が得られた。
遊走性環状紅斑随伴性先天性表皮水疱症をモデルとしたケラチン病の分子生物学的解析

単純型先天性表皮水疱症(EBS)はケラチン遺伝子異常によりケラチン分子さらにKIF構築異常をもたらし基底細胞内に裂隙をきたし、臨床的には水疱を生ずる遺伝性疾患である。最近研究代表者らは、通常のEBSに見られる全身の水疱とびらんに加えて四肢体幹に遊走性遠心性に拡大する紅斑を伴ったEBS2家系を詳細に検討し遊走性環状紅斑随伴性単純型先天性表皮水疱症と命名し報告した。DNA解析では、KRT5の1649delGによりフレームシフトを起こし、読み過ごし変異から正常よりも長いアミノ酸鎖を形成していることを明らかにした。さらにこの変異アミノ酸鎖に対するポリクローナル抗体を作成し、この変異アミノ酸が患者皮膚で発現していることを確認した。すなわち異常K5蛋白の発現がケラチン中間径線維構築に影響を与え表皮基底細胞に裂隙をきたしている可能性を示した。今回の研究では、この症例において遺伝子異常により生じた変異アミノ酸やケラチン尾部に結合するケラチン関連蛋白が角化細胞の運動や分化にはどのように関わってくるのかをin vitroで検討することを計画した。結果1)変異K5をpCMVベクターを用いて種々の培養ケラチノサイト(HaCaT, DJM-1,NHEK)にトランスフェクションし形態的異常を観察した。wild typeに比べ変異K5遺伝子を導入したHaCaT, DJM-1でケラチン凝集塊が多い傾向があったが有意差はなかった。NHEKでは凝集塊に差はなかった。これは患者病変部の電顕像でtonofilamentの異常凝集塊がみられなかったことと一致し、この変異がケラチン線維形には大きく影響しないことを示唆している。2)変異アミノ酸を認識する抗体を用いて、患者及び正常皮膚で免疫組織学的に変異K5の発現を検討した結果、患者では表皮下層に、また正常でも角層内に陽性所見を認めた。これはK5のalternative splicingについて検討する必要性を示唆している。3)変異K5のアミノ酸配列と顆粒層に発現する蛋白のアミノ酸配列のホモロジーを検索したところ11個中5個がロリクリンと一致する配列2ケ所が確認された。DNA解析では、KRT5の1649de Gによりフレームシフトを起こし、読み過ごし変異から正常よりも長いアミノ酸鎖を形成していることを明らかにした。結果」

1)変異K5をpCMVベクターを用いて種々の培養ケラチノサイト(HaCaT,DJM-1,NHEK)にトランスフェクションし形態的異常を観察した。wild typeに比べ変異K5遺伝子を導入したHaCaT,DJM-1でケラチン凝集塊が多い傾向があったが有意差はなかった。NHEKでは凝集塊に差はなかった。これは患者病変部の電顕像でtonofilamentの異常凝集塊がみられなかったことと一致し、この変異がケラチン線維形成には大きく影響しないことを示唆している。2)変異アミノ酸を確認する抗体を用いて、患者及び正常皮膚で免疫組織学的に変異K5の発現を検討した結果、患者では表皮下層に、また正常でも角層内に陽性所見を認めた。これはK5のalternative splicingについて検討する必要性を示唆している。単純型先天性表皮水疱症(EBS)はケラチン遺伝子異常によりケラチン分子さらにKIF構築異常をもたらし基底細胞内に裂隙をきたし、臨床的には水疱を生ずる遺伝性疾患である。最近研究代表者らは、通常のEBSに見られる全身の水疱とびらんに加えて四肢体幹に遊走性遠心性に拡大する紅斑を伴ったEBS2家系を詳細に検討し遊走性環状紅斑随伴性単純型先天性表皮水疱症と命名し報告した。DNA解析では、KRT5の1649de1Gによりフレームシフトを起こし、読み過ごし変異から正常よりも長いアミノ酸鎖を形成していることを明らかにした。さらにこの変異アミノ酸鎖に対するポリクローナル抗体を作成し、この変異アミノ酸が患者皮膚で発現していることを確認した。すなわち異常K5蛋白の発現がケラチン中間径線維構築に影響を与え表皮基底細胞に裂隙をきたしている可能性を示した。今回の研究では、この症例において遺伝子異常により生じた変異アミノ酸やケラチン尾部に結合するケラチン関連蛋白が角化細胞の運動や分化にはどのように関わってくるのかをin vitroで検討することを計画した。結果」1)変異K5をpCMVベクターを用いて種々の培養ケラチノサイト(HaCaT, DJM-1,NHEK)にトランスフェクションし形態的異常を観察した。wild typeに比べ変異K5遺伝子を導入したHaCaT, DJM-1でケラチン凝集塊が多い傾向があったが有意差はなかった。2)変異アミノ酸を認識する抗体を用いて、患者及び正常皮膚で免疫組織学的に変異K5の発現を検討した結果、患者では表皮下層に、また正常でも角層内に陽性所見を認めた。3)変異K5のアミノ酸配列と顆粒層に発現する蛋白のアミノ酸配列のホモロジーを検索したところ11個中5個がロリクリンと一致する配列2ケ所が確認された。
環境管理のための評価手法の研究(特定地域を対象にした環境評価手法による事例研究)

計画研究「環境管理のための評価手法の研究」(R53-1)班は"環境管理策定のための方法論"を検討してきた。本研究は、この研究班の研究成果を踏えて、いくつかの特定地域の事例研究から抽出した計画策定の各プロセスにおける手法を一つの特定地域を対象に広範に適用し、その地域に即した環境の望ましい管理及び創造の方向を解明しようとするもので、この具体的で実践的な事例研究を通じて、環境の総合的評価尺度及び計画策定の総合手法の確立を図った。1.都市環境の評価に関する住民意識の体系的分析にもとづき、山形市の環境総合評価指標の作成を試みた。東京都,北九州市及び山形市の事例研究を通して、環境指標の体系化,指標作成の手順等をふくむ都市住民の意識に基づく環境の総合評価手法の確立を図った。また、社会・経済変動による東京都の人口及び土地利用の動向を空間統計予測モデルをもとに予測し、東京都の環境評価指標の將来予測値の試算を試みた。2.都市の街路景観を対象にして、昼景と夜景とを分類し、沿道用途利用との関係から詳細に分析して、昼と夜の時間のひろがりの中で都市の街路景観を評価できることを示した。3.山形市周辺地域の調査結果から両生類を用いた自然環境評価指標を提案したが、山形県内及び県外の数地域を調査した結果、本法が両生類の分布種が地方によって多少異なっても、当該地の分布種を、山形市周辺の類似種とおき換えることによって十分活用できることがわかった。4.天然水の汚染メカニズムを追跡するトレーサーの一つとして金属錯化容量をとりあげ検討してきたが、本年は桐生川及び山形市の河川に実施した。5.全員による計画班3年をふくむ4年間の研究成果の総括的な検討を行った。
分子線多重交差法による配向選別分子間ポテンシャルの直接決定

アダマール粒子分光法を利用した散乱分布測定装置を試作した。配向分子線交差反応装置に、15個のスリットよりなるアダマールスリットを設置した高真空対応パルス回転ステージを設置した。このアダマールスリットを反応交点を中心に回転させ、アダマールスリットで切り出した反応交点からの信号をMCPで検出することで、ペニングイオンおよび、弾性散乱された準安定希ガス原子の散乱分布を得ることを可能にした。また高真空対応パルスステージにアダマールスリットを設置し、これをビームコリメーターとして用いることでコード化された多重分子線を発生させた。今回は予備的に15個のスリットよりなるアダマールスリットを用いて多重分子線を発生させた。このようなアダマールスリットを用いた多重分子線を用いることで分子線交差により生成したイオンの信号強度を10倍程度改善させることができた。しかしながら同時にバックグラウンド信号も同様に増えてしまい、十分なS/N比の改善にはいたっていない。またスリットを掃引時における信号強度の時間変化がアダマール変換による散乱分布測定を困難にしていることがわかった。特に、微弱な信号を取り扱う本研究の場合バックグランド信号の長期的揺らぎが大きな影響をあたえてしまう。現在、スリット掃引サイクル時間を短くして測定をおこないこのような長期的揺らぎの影響を少なくするために、コンピューター制御された自動測定システムを構築中である。
二次的な自然環境におけるＣＯ２濃度客観評価による環境教育プログラムの開発

二次的な自然環境の変化をCO2濃度を指標として客観評価するための環境教育プログラムを、小・中・高の研究協力校と共に開発及び実践した。第一にCO2濃度測定による簡易的な吸収能調査のプログラムを実践したところ、樹勢回復を評価できる可能性が示唆された。第二に有菌土と無菌土が里山のCO2濃度に与える影響の調査プログラムを実践したところ、有菌土では夏季、無菌土では冬季のCO2濃度と同様の傾向を示したことから、土壌の影響がより大きいことが示唆された。第三にCO2濃度測定を取り入れた体験学習の担当教員への役立ちを念頭に、高解像度の航空写真を用いたCO2濃度マップの作成と考察を行うためのプロセスを示した。本研究は里山の様な二次的な自然環境の変化を、CO2濃度を指標として客観評価するための環境教育プログラムの開発と評価を行うことを目的としている。成果の具体的内容は以下の通りであり、成果の一部は名古屋産業大学環境経営研究所年報第13号等に掲載された。1演習林等によるCO2濃度測定のための授業計画の策定と実践:研究協力校(三重県立久居農林高校、岐阜県立岐阜農林高校、岐阜県立加茂農林高校等)において、研究目的を念頭に一年を通じた研究授業計画を具体化し、実践した。研究協力校の岐阜農林高校はスーパーサイエンスハイスクール指定校であり、国際性を育てる教育にも力を入れている。そこで高校と台湾苗栗県の育達科技大學が本研究のテーマにそれぞれ取り組むと共に、お互いの研究成果を元に交流学習を行うための支援体制を整えた。2CO2濃度データとその他の要因の比較による二次的な自然環境変化の考察と成果発表:研究協力校は短期的な時間変動が少ない二次的な自然環境を構成する要因との比較を通して、その濃度変化の理由を考察した。申請者らはそれぞれの専門分野の知見に基づいてフィードバックを行った。研究協力校は学内発表会や日本学校農業クラブ全国大会東海大会で研究成果の発表を行った。台湾育達大学において平成25年11月27日に開催された環境教育に関する国際フォーラムにおいて、研究協力校の久居農林高校と岐阜農林高校がWEB会議システムを利用して研究成果の発表を行った。苗栗県小・中学校科学コンテストで研究協力校の台湾新英小学校が銀賞を受賞した。3連携授業参加者へのヒアリングによる環境教育プログラムの評価:環境保全のような効果に多くの時間を要する取組みに対して、短期間の体験でもその変化を実感し意欲的に取組むことができる人材育成プログラムとしての観点から、授業参加者に対してヒアリングを実施し、今年度の研究授業を評価した。生物多様性条約第10回締約国会議で採択された「SATOYAMAイニシアティブ」の推進及び人材育成に対する有用性から社会的ニーズが高い体験学習プログラムモデルの提案という点で社会的意義があると考えている。成果の具体的内容は以下の通りであり、成果の一部は名古屋産業大学環境経営研究所年報第12号に掲載された。1研究協力校の演習林等によるCO2濃度測定のための授業計画の策定と実践:研究協力校(愛知県立稲沢高校、三重県立久居農林高校、岐阜県立岐阜農林高校等)において、研究目的を念頭に一年を通じた研究授業計画を具体化し、実践した。研究授業には、演習林等の空間内において10秒毎にCO2濃度、温度、湿度を測定したり、光環境調査、葉緑素調査、土壌水分調査等、短期的な時間変動が少ない二次的な自然環境を構成する要因を測定したりする等の、体験学習が含まれる。2CO2濃度データとその他の要因の比較による二次的な自然環境変化の考察と成果発表:研究協力校はCO2濃度の時系列変化をグラフにする等して、短期的な時間変動が少ない二次的な自然環境を構成する要因との比較を通して、その濃度変化の理由を考察した。3連携授業参加者へのヒアリングによる環境教育プログラムの評価:環境保全のような効果が表面化するまでに多くの時間を要する取組みに対して、短期間の体験でもその変化を実感し意欲的に取組むことができる人材育成プログラムとしての観点から、授業参加者に対してヒアリングを実施し、今年度の研究授業を評価した。成果の具体的内容は以下の通りであり、成果の一部は名古屋産業大学環境経営研究所年報第14号等に掲載された。

1演習林等によるCO2濃度測定のための授業計画の策定と実践:研究協力校(三重県立久居農林高校、岐阜県立岐阜農林高校、岐阜県立加茂農林高校等)において、研究目的を念頭に一年を通じた研究授業計画を具体化し、実践した。研究協力校の岐阜農林高校はスーパーサイエンスハイスクール指定校であり、国際性を育てる教育にも力を入れている。そこで台湾苗栗県環境保護局の協力を得て、苗栗県の小・中学校、高等学校が本研究のテーマにそれぞれ取り組むと共に、お互いの研究成果を元に交流学習を行うための支援体制を整えた。2CO2濃度データとその他の要因の比較による二次的な自然環境変化の考察と成果発表:研究協力校は短期的な時間変動が少ない二次的な自然環境を構成する要因との比較を通して、その濃度変化の理由を考察した。申請者らはそれぞれの専門分野の知見に基づいてフィードバックを行った。研究協力校は学内発表会や名古屋産業大学主催高大連携フォーラムで研究成果の発表を行った。苗栗県小・中学校科学コンテストで研究協力校の台湾新英小学校が金賞を受賞した。大気環境工学本研究は里山の様な二次的な自然環境の変化を、CO2濃度を指標として客観評価するための環境教育プログラムの開発と評価を行うことを目的としている。そのために、1研究協力校の演習林等によるCO2濃度測定のための授業計画の策定と実践、2CO2濃度データとその他の要因の比較による二次的な自然環境変化の考察と成果発表、3連携授業参加者へのヒアリングによる環境教育プログラムの評価、の3つのプロセスにより研究を進めた。科学的な知見を得たというレベルではないが、研究実績に記載した通り、全てのプロセスを実行し、CO2濃度を指標として客観評価を行う環境教育プログラムを実践するための様々な知見が得られ、次年度の研究授業計画に反映できていることから、研究はおおむね順調に進展していると判断した。本研究は里山の様な二次的な自然環境の変化を、CO2濃度を指標として客観評価するための環境教育プログラムの開発と評価を行うことを目的としている。そのために、1研究協力校の演習林等によるCO2濃度測定のための授業計画の策定と実践、2CO2濃度データとその他の要因の比較による二次的な自然環境変化の考察と成果発表、連携授業参加者へのヒアリングによる環境教育プログラムの評価、の3つのプロセスにより研究を進めた。研究初年度ということで、直ちに科学的な知見を得たというレベルではないが、研究実績に記載した通り、全てのプロセスを実行し、CO2濃度を指標として客観評価を行う環境教育プログラムを実践するための様々な知見が得られ、次年度の研究授業計画に反映できていることから、研究はおおむね順調に進展していると判断した。演習林の様な斜面、樹木、林床が混在する環境下では、障害物の無い開けた場所と違って大気が占める空間が狭く、鉛直方向への1次元性が成立しない大変な複雑系である。3次元的な挙動が支配的なCO2濃度と風向・風速の測定データを同時に比較するのは複雑すぎるため、風向・風速の要因については気象庁が発表する天気図から読み取れる気圧傾度(メソβ程度)を採用した方が望ましいと考えられた。平成25年度の授業への導入を検討したが、これを授業に取り入れるのは煩雑な作業が必要であり断念した。これを妥当な範囲で簡略化する方法を研究したい。
インフルエンザ菌の感染性免疫寛容に伴う慢性炎症化機序の解明

耳管閉塞およびインフルエンザ菌による慢性中耳炎症マウスモデルを用いて、中耳慢性炎症病態におけるIL-17産生T細胞の動態につき検討した。BALB/cマウスを用いて、中耳炎モデル作成後3日目、14日目、2ヶ月目に中耳貯留液、中耳粘膜および側頭骨を採取し、中耳貯留液中のIL-17濃度の測定、中耳粘膜下のリンパ球のフローサイトメトリーによる解析およびIL-17mRNAの発現につき解析を行った。中耳粘膜において、Th17細胞およびIL-17産生γδT細胞の増加を急性期から慢性期に認め、中耳貯留液中のIL-17濃度においても2週間目から2ヶ月の慢性期に至るまで、明らかに対照群と差を認めた。中耳粘膜の単核球細胞のIL-17mRNAの表出も、対象群と比して明らかな強発現を認めた。中耳粘膜におけるTh17細胞やIL-17産生γδT細胞が中耳局所の慢性炎症に関与している事が推測された。外来微生物に対する生体防御機構は、好中球の活性化による貪食作用を中心とした自然免疫や、B細胞の活性化に伴う獲得免疫といった2つの防御機構が関与しているが、今回、内因性制御性T細胞が両防御機構に与える影響について検討した。まず、CD4+CD25+T細胞における好中球に対する影響について検討した。SPF下にて飼育した、雄性、Balb/cマウス5週令より脾臓を採取し、steer meshを用いて単核球を採取した。磁気細胞分離装置を用いて、CD4+CD25+T細胞およびCD4+cD25-T細胞を分離し、Ly-6G陽性好中球とインフルエンザ菌を共培養した。培養後6時間、12時間目にインフルエンザ菌生菌数について計測し、また、培養細胞よりmRNAを抽出し、IL-10、TGF-β、FoxP3 mRNAの表出についても計測した。次に、獲得免疫の動態についても検討するため、耳管閉塞によるインフルエンザ菌による慢性中耳感染マウスモデルを作成し、感染後3日、2週、1、2、6ヶ月に断頭後に、顕微鏡下にて経鼓膜的に中耳洗浄液(250μl)を採取し、同時に組織学的評価を行うため、PLP固定液を経心臓的に灌流固定後、マウス頭部を脱灰しコンパウンド包埋、中耳粘膜凍結切片(6mm)を作成後、Thy1,2及びPanB免疫染色を行い、中耳局所におけるB細胞の経時的変化およびインフルエンザ菌由来外膜蛋白に対する中耳貯留液および血清中の特異的IgAおよびIgG抗体価についても計測した。CD4+CD25+T細胞共培養においては、明らかにIL-10、FoxP3 mRNAの表出が亢進し、インフルエンザ生菌数も明らかに増加しており、内因性制御性T細胞によるインフルエンザ菌に対する好中球の殺菌作用の減弱が認められた。また慢性炎症期において中耳局所におけるB細胞減少、および中耳貯留液および血清中の外膜蛋白特異的IgAおよびIgG抗体価の減少が認められた。以上より、内因性制御性T細胞は獲得免疫系に対しても抑制的に作用し、慢性持続感染を助長している可能性が示唆された。1.中耳局所におけるTリンパ球の集簇感染後3日目から2ヶ月まで中耳所見上、全例に中耳貯留液を認めている。Thy1.2免疫染色において、経時的に中耳粘膜下層の血管周囲中心に濃染細胞を認めており、2週目以降2ヶ月にわたり中耳粘膜下組織におけるThy1.2陽性細胞細胞浸潤を認め、経時的な増加を認めた。2.フローサイトメトリーによる中耳粘膜由来リンパ球の解析正常中耳では中耳由来の単核球のうち、CD3陽性Tリンパ球は33.6%であったが、感染後3日目から2ヶ月までCD3陽性Tリンパ球は漸増し、2ヶ月目においては64.6%がCD3陽性Tリンパ球であった。CD3陽性T細胞のうち、CD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞、CD4CD8共陰性T細胞(多くはγδT細胞を示す)の割合を経時的に比較検討したところ、正常中耳粘膜ではCD4CD8共陰性T細胞は24.1%と低値であり、CD4陽性T細胞が48.4%と優位であったが、2ヶ月目においてはそれぞれ35.9%と51.4%と増加した。一方、CD8陽性T細胞は減少した。

次に、IL-17産生Th細胞であるTh17細胞とIL-17産生γδT細胞につき検討を行ったところ、正常中耳粘膜ではTh17細胞およびIL-17産生γδT細胞はそれぞれ1.1%と2.7%であったが、感染後3日目より著明にIL-17産生細胞の増加を認め、Th17細胞は2ヶ月目まで7.89.7%に増加した。また、IL-17産生γδT細胞は14.119.5%にまで増加した。3.中耳貯留液中のサイトカイン濃度および中耳粘膜由来単核球におけるIL-17mRNAの表出今回、中耳炎における炎症性サイトカインのうち、IL-17濃度について計測を行っている。IL-17において感染後3日目では平均13.5pg/mlであり、上昇を認めないものの、2週目以降において著明に上昇し、平均128pg/mlであり、2ヶ月目においても113pg/mlであった。IL-17mRNAの表出においても同様の傾向を認めており、感染後2週目以降2ヶ月にかけて上昇しており、正常中耳と比較して明らかなIL-17mRNAの表出増加を認めた。以上の結果から中耳粘膜におけるTh17細胞やIL-17産生γδT細胞が中耳局所の慢性炎症に関与している事が推測された。耳管閉塞およびインフルエンザ菌による慢性中耳炎症マウスモデルを用いて、中耳慢性炎症病態におけるIL-17産生T細胞の動態につき検討した。BALB/cマウスを用いて、中耳炎モデル作成後3日目、14日目、2ヶ月目に中耳貯留液、中耳粘膜および側頭骨を採取し、中耳貯留液中のIL-17濃度の測定、中耳粘膜下のリンパ球のフローサイトメトリーによる解析およびIL-17mRNAの発現につき解析を行った。鼓膜切開後に、経鼓膜的に生理食塩水にて中耳洗浄液を採取し、中耳洗浄液を遠心後に上清を分離、中耳洗浄液中のIL-17濃度をmouse IL-17ELISA kitにて測定した。中耳粘膜組織における炎症反応を調べるため、マウス中耳粘膜を顕微鏡下にて粘膜を採取した後に、すべての中耳粘膜を1つの試料にまとめ、コラゲネース処置にて単核球を分離した.また、単核球よりRNAを抽出し、complemetary DNAを作成後に、IL-17A mRNAの表出についてリアルタイムRTーPCRを施行した。リアルタイムRT-PCRの評価は、内部標準である18リボゾーマルmRNAと中耳粘膜由来IL-17A mRNAの表出を、対照マウス中耳から採取した単核球を基準として、ΔΔCT法にて評価を行中耳粘膜において、Th17細胞およびIL-17産生γδT細胞の増加を急性期から慢性期に認め、中耳貯留液中のIL-17濃度においても2週間目から2ヶ月の慢性期に至るまで、明らかに対照群と差を認めた。中耳粘膜の単核球細胞のIL-17mRNAの表出も、対象群と比して明らかな強発現を認めた。中耳粘膜におけるTh17細胞やIL-17産生γδT細胞が中耳局所の慢性炎症に関与している事が推測された。慢性炎症モデルにおいて、順調に制御性T細胞の動態、Th17細胞の動態につき検討できるデータがでているため。24年度が最終年度であるため、記入しない。今まで、制御性T細胞とTh17細胞の慢性炎症における動態を検討したところ、慢性炎症に何らかの修飾を行っていることが判明しており、両者のバランスにより炎症動態が左右されている可能性が示唆されている。制御性T細胞もTh17細胞もナイーブT細胞からの分化にはTGF-βの刺激が必要であり、IL-6の有無により方向性が決定されている。
Topoisomerase阻害剤の抗腫瘍効果の検討

CDDP耐性細胞であるKBrc細胞はKB細胞と比較してTopoisomerase I型阻害剤のCPT-11およびその活性型であるSN-38、Topoisomerase II型阻害剤VP-16に対して交差耐性を示した。細胞周期の検討からKBrc細胞とKB細胞では異なった細胞周期への集積が観察された。つまりこれらの薬剤を接触させた際のcell cycleはKB細胞ではS,G_2M期に集積し、KBrc細胞はcontrol群とほぼ同様の周期を示した。さらにKB細胞ではG1 peakよりも左側のpreG1 peakがVP16を投与した際に観察された。Agarose gelelectrophoresisでもDNA fragmen tationがKB細胞に対してVP16を接触させた際に確認された。一方KBrc細胞ではVP-16を接触させた際DNA fragmentationは認められなかった。つまりTopoisomerase阻害剤の作用機序がapoptosisを引き起こす機序を有していると同時にKBrc細胞の耐性機序の一つとしてapoptosis経路の関与が推察された。
有機硫黄化合物および遷移金属触媒を用いる位置および立体選択的新合成反応の開発

(1)これまでに開発したパラジウム触媒を用いる位置および立体選択的アリル型スルホンの合成や,アリル型スルホンの1,3一転位反応,電子吸引基としてのスルホニル基の特性を活かした新規炭素-炭素結合形成反応などを巧妙に利用して,ホモアリル型アルコールの骨格を有するアリル型スルホンを調製し,これにパラジウムやニッケル,コバルト触媒の存在下に還元剤を作用させたところ,用いる触媒や還元剤の種類および反応条件によって,同一の前駆体から,二重結合の位置を保持したホモアリル型アルコールや,二重結合が転位したアリル型アルコールを,それぞれ,位置および立体選択的につくり分けることができることを見い出した.この反応を用いて,テルペン類の一種である(±)-LavandulolおよびIsolavandulolを高収率かつ高選択的に合成することができた.(2)オレフィンに対するヨードスルホン化あるいはスルホニル水銀化などの反応により,対応するビニル型スルホンを位置および立体選択的に合成することができたが,これらのビニル型スルホンのアリル型スルホンへの変換反応において興味深い立体化学的関係,即ち, (E)-および(Z)-ビニル型スルホンから,それぞれ, (Z)-および(E)-アリル型スルホンが優先的に得られることを見い出した.この現象を説明するために"Conformational Acidity"なる新しい概念を提案した.(3)上で位置および立体選択的に合成したビニル型スルホンおよびアリル型スルホンに対し,遷移金属触媒の特性を活用した一酸化炭素の挿入によるラクトン類の合成の他,光ホルミル化や,新しいアミノメチル化剤の開発によって,任意の位置に任意の置換基を有するピロール類の一般合成法を確立することができた.(1)これまでに開発したパラジウム触媒を用いる位置および立体選択的アリル型スルホンの合成や,アリル型スルホンの1,3一転位反応,電子吸引基としてのスルホニル基の特性を活かした新規炭素-炭素結合形成反応などを巧妙に利用して,ホモアリル型アルコールの骨格を有するアリル型スルホンを調製し,これにパラジウムやニッケル,コバルト触媒の存在下に還元剤を作用させたところ,用いる触媒や還元剤の種類および反応条件によって,同一の前駆体から,二重結合の位置を保持したホモアリル型アルコールや,二重結合が転位したアリル型アルコールを,それぞれ,位置および立体選択的につくり分けることができることを見い出した.この反応を用いて,テルペン類の一種である(±)-LavandulolおよびIsolavandulolを高収率かつ高選択的に合成することができた.(2)オレフィンに対するヨードスルホン化あるいはスルホニル水銀化などの反応により,対応するビニル型スルホンを位置および立体選択的に合成することができたが,これらのビニル型スルホンのアリル型スルホンへの変換反応において興味深い立体化学的関係,即ち, (E)-および(Z)-ビニル型スルホンから,それぞれ, (Z)-および(E)-アリル型スルホンが優先的に得られることを見い出した.この現象を説明するために"Conformational Acidity"なる新しい概念を提案した.(3)上で位置および立体選択的に合成したビニル型スルホンおよびアリル型スルホンに対し,遷移金属触媒の特性を活用した一酸化炭素の挿入によるラクトン類の合成の他,光ホルミル化や,新しいアミノメチル化剤の開発によって,任意の位置に任意の置換基を有するピロール類の一般合成法を確立することができた.
虐待が繰り返される神経基盤の解明

近年、幼児虐待の発生件数が急増し、深刻な社会問題となっている。虐待など幼少期養育環境の劣悪化によるストレスが、成長後の脳の機能・構造に重大かつ継続的な問題を引き起こすことが報告されている。しかし、幼少期のストレスが脳のどの部位に記憶の痕跡として残され、生涯にわたって行動に影響を及ぼすのかは未だ解明されていない。本研究では、幼児虐待の動物モデルの一つである母子分離マウスを用い、幼少期の母子分離ストレスによって活性化する神経細胞を非可逆的にラベルし、成体において母子分離記憶の痕跡をオプトジェネテイクスを用いて再活性化することにより、母子分離記憶を想起することが出来るかを検討する。そして「虐待は繰り返される」という概念の分子基盤を明らかにし、劣悪な幼少期養育環境が精神神経疾患等を引き起こすメカニズムの解明、さらに生育後の精神神経疾患の予防・治療法の開発を目指す。平成29年度はc-fos遺伝子プロモーターの下流でtetracycline transactivator (tTA)を発現するTgマウス(Jackson研究所:Stock Number:008344)を連携研究者・林から供与を受け、tetracycline response element (TRE)プロモータ制御下でCreリコンビネースを発現するTgマウス(RBRC05563)を理研バイオリソースセンターから購入し、交配させてc-fos promoter-tTA-TRE-Creマウスの作製を試みた。現在母子分離を行い、c-Fosの免疫組織化学で見られたのと同じ領域でtTA、Creの発現が見られるかの検討を進めている。上記研究実績の概要のところで示したマウスを用いて母子分離を行い、c-Fosの免疫組織化学で見られたのと同じ領域でtTA、Creの発現が見られるかの検討を進めている。CreリコンビネースによってloxPに挟まれたStopコドンがはずれ、ChR2-mCherryが発現するコンストラクトをRosa26遺伝子座にノックインしたTgマウス(RBRC05158)を理研バイオリソースセンターから入手し、上記のマウスと交配させる。テトラサイクリン類似化合物のドキシサイクリン(Dox)オフの状態においてc-fos遺伝子プロモーター制御下でChR2-mCherryを非可逆的に発現するTgマウスを作製する。予め、Doxオン/オフによってc-fos遺伝子の発現が調節されるかについて、マウスに急性拘束ストレスを負荷し、c-fosが顕著に増強することがわかっている視床下部の室傍核において、mCherryを指標にして検討する。また、このTgマウス作製と並行して、母子分離を経験した雌マウスを野生型の雄と交配させ、母子分離を経験したマウスが母親になった際の養育行動(仔運び、巣作り、licking等の行動)を解析し、「虐待は繰り返す」かについて検討する。

平成29年度はc-fos遺伝子プロモーターの下流でtetracycline transactivator (tTA)を発現するTgマウス(Jackson研究所:Stock Number:008344)を連携研究者・林から供与を受け、tetracycline response element (TRE)プロモータ制御下でCreリコンビネースを発現するTgマウス(RBRC05563)を理研バイオリソースセンターから購入し、交配させてc-fos promoter-tTA-TRE-Creマウスの作製を試みた。現在母子分離を行い、c-Fosの免疫組織化学で見られたのと同じ領域でtTA、Creの発現が見られるかの検討を進めている。上記研究実績の概要のところで示したマウスを用いて母子分離を行い、c-Fosの免疫組織化学で見られたのと同じ領域でtTA、Creの発現が見られるかの検討を進めている。CreリコンビネースによってloxPに挟まれたStopコドンがはずれ、ChR2-mCherryが発現するコンストラクトをRosa26遺伝子座にノックインしたTgマウス(RBRC05158)を理研バイオリソースセンターから入手し、上記のマウスと交配させる。テトラサイクリン類似化合物のドキシサイクリン(Dox)オフの状態においてc-fos遺伝子プロモーター制御下でChR2-mCherryを非可逆的に発現するTgマウスを作製する。予め、Doxオン/オフによってc-fos遺伝子の発現が調節されるかについて、マウスに急性拘束ストレスを負荷し、c-fosが顕著に増強することがわかっている視床下部の室傍核において、mCherryを指標にして検討する。また、このTgマウス作製と並行して、母子分離を経験した雌マウスを野生型の雄と交配させ、母子分離を経験したマウスが母親になった際の養育行動(仔運び、巣作り、licking等の行動)を解析し、「虐待は繰り返す」かについて検討する。研究協力者の都合により、今年度予定していた研究費を使用する必要がなくなったため。H30年度は順次使用していく予定である。
免疫学的手法を駆使したセンチネルリンパ節内小転移病巣の可視化技術の確立

センチネルリンパ節(SLN)内の転移状態をインビボで評価するために、SLN内の大部分を占める非がん部を構成する免疫細胞の状態を可視化することで、間接的に転移病巣の診断を可能とするサロゲート・イメージング技術の開発を目指した。SLNに転移が生じる場合、早期よりB細胞が増加し、胚中心(GC)を形成することが分かった。蛍光タンパク質(tdTomato)を強制発現したEMT6乳癌細胞移植モデルを用いた実験から、このGCががん細胞の増殖に反応していることが示唆された。こうした転移の進展に伴い発現が顕著となる細胞の局在をイメージングすることで、SLNの転移状態の診断につながることを明らかにした。がんのリンパ節転移が初発するセンチネルリンパ節(SLN)内の小転移病巣のin vivo可視化は、SLN生検の省略も可能とし、更なる低侵襲癌治療に繋がる。その一方、近年、SLN内の小転移病巣の存在が必ずしも予後を増悪させないことも報告されている。本研究課題では、SLN内の免疫反応を解析し、がんの予後不良に関連する免疫応答の発見とその反応に対応した信号の可視化技術の確立を目的とする。平成25年度は、B16悪性黒色腫細胞株-C57BL/6マウス足蹠皮下接種モデルを使用し、SLN内の免疫応答の変化を経時的に解析した。フローサイトメトリー解析により、SLNへのB16-F10 (強転移株)の転移が進むにつれて、B220陽性細胞がCD3陽性細胞よりも顕著に増加することが確認され、この細胞がCD19陽性でもあったことからB細胞であることが確認できた。さらに、B16-F1(低転移株)、B16-F0(弱転移株)を使用した場合と比較しても、転移が進んだSLN内では、胚中心の形成とその増強が免疫組織化学的解析によって明らかとなった。また、乳癌細胞株であるEMT6のBALB/cマウス移植モデルを使用し、同様に小転移の進行に伴ってB細胞が増加することが確認されたことから、他の癌種でもこの反応が生じることを明らかにした。さらに、蛍光タンパク質(tdTomato)をEMT6に遺伝子導入し、その安定発現株の樹立に成功したため、転移の状態が追跡可能なin vivo可視化モデルを樹立することが出来た。多くの癌で所属リンパ節の転移状態が重要な予後因子となっているため、センチネルリンパ節(SLN)生検を行い、できるだけ低侵襲で効率よく所属リンパ節の転移状態を評価することが求められている。その一方、SLN内への転移が認められる場合でも予後の増悪に結びつかないことが近年報告されている。本研究課題では、SLN内における癌の予後不良に関連する免疫応答の発見と、その応答もしくはそれに相関する反応を可視化する技術の確立を目的とする。平成26年度は、乳がん細胞株であるEMT6をBALB/cマウスの足蹠皮下に移植した動物モデルを中心に経時解析を進めた。これまでにB細胞が増加することが確認されていたが、この増加する細胞がIgM陽性、IgD陽性のナイーブB細胞であることが明らかになった。また、時間経過とともに形成される胚中心(GC)が増加することが免疫組織化学的解析によって確認された。さらに、フローサイトメトリー解析によって、胚中心B細胞(GL7陽性、PNA陽性)(GCB)が有意に増加していることが示された。このGCBの増加はB16悪性黒色腫細胞株-C57BL/6マウスモデルにおいても有意な増加であった。これらの免疫応答が転移とは関係のない炎症反応でも生じるか調べるため、マウスの足蹠皮下に完全フロイントアジュバント(CFA)を接種した皮下炎症誘導モデルを作製し、がん転移モデル同様、膝窩リンパ節を対象に同様の経時解析を進めた。その結果、経時的なナイーブB細胞の増加は確認されたものの、GCの形成やGCBの割合はがん転移モデルと比較し、明らかに小さかった。また、蛍光タンパク質(tdTomato)発現EMT6を使用したマウスモデルではGCにtdTomatoの蛍光が確認されたことから、これらの結果にがん細胞が大きく関与していることが明らかにされた。平成27年度は、コントロールと比較して有意な増加が確認され、また、構造的にも構成する細胞集団としても可視化に適した胚中心(GC)に関して解析を進めた。前年度までに、B16悪性黒色腫細胞株-C57BL/6マウスモデル、EMT6乳がん細胞株-BALB/cマウスモデルを樹立しており、両モデルにおいて移植後時間経過に伴い、GC形成および、胚中心B細胞(GL7陽性、PNA陽性)(GCB)の増加が有意に起こることを示した。このGC形成ならびにGCBの増加は対照モデルの完全フロイントアジュバント(CFA)接種皮下炎症誘導モデルと比較しても著しいものであった。従って、移植したがん細胞由来抗原によって誘導されたと考えられたことから、SLNにおけるGCとがん細胞の局在性を免疫組織化学的に解析した。その結果、B16悪性黒色腫細胞株モデルにおいて、GC周囲への黒色腫細胞の局在が確認された。