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ヴィクトリア朝生体解剖論争の文化研究

ヴィクトリア朝英国における生体解剖をめぐる論争は、めざましい発展を示しながら唯物論化していったヴィクトリア朝の科学(生体解剖とはそのような科学の典型としての生理学が生み出した新しい科学的方法だった)と、18世紀後半以降、福音主義などの影響とともに発展していた動物愛護の文化が真っ向から衝突した事件であった。そのようなものとしての生体解剖論争のなかに、そしてその論争のディスコース圏のなかで書かれた多くの文学作品(たとえばウィルキー・コリンズの『心と科学』、H・G・ウェルズの『モロー博士の島』、G・B・ショー『医者のジレンマ』など)のなかに、われわれは、宗教性を離れて没道徳的に真実を追求しはじめた唯物論的な科学にたいするヴィクトリア朝人のさまざまな反応を見てとることができるだろう。本研究の目的は、1870年代なかばから急に活発化しはじめた生体解剖論争をとおして見えてくるヴィクトリア朝文化の諸相のうち、動物愛護文化の確立と、それにともなう唯物論的な科学への批判、さらに、そのような批判を前にした科学の反応を、『モロー博士の島』を中心とするいくつかの文学作品と、この時代の歴史資料とを往還しながら記述するところにある。研究の1年目にあたる本年度は、生体解剖に関連する後期ヴィクトリア朝の文学作品・歴史資料を収集読解することに努めた。その一環として、8月に、ボストン・パブリック・ライブラリ(この分野での必読文献の著者ジェイムズ・ターナーが利用していた図書館)およびハーヴァード大学図書館に行って、日本では入手しがたい第一次資料を収集した。と同時に、それをふくめて、今後読むべきテクストのビブリオグラフィを作成した。そのうえで、19世紀後半の総合雑誌に掲載された生体解剖論争に関連する論文を読んで、そのなかから論争の争点を構成しているいくつかの頻出するモティーフを抽出しながら、研究の基礎となるノートを作成した(冬学期には前期課程の「総合科目」の授業のひとつでその成果の一端を明らかにした)。さらに、動物愛護の文化と生理学における生体解剖実践の歴史的展開に関する基本的な第二次資料として、ジェイムズ・ターナーの『動物への配慮』とキース・トマスの『自然と人間』を精読した。これらのテクストを読むことによって、来年度『モロー博士の島』について論じるための歴史的背景を理解することができた。研究の2年目にあたる本年は、1年目に収集した生体解剖関連の歴史資料、とくにBritish Medical Journalなどに掲載された医者の立場からの論文を読みながら、動物愛護陣営と科学研究陣営のあいだで展開されていた生体解剖論争の実体を二元的・対話的に理解することをめざした。また、生体解剖をめぐるその論争のなかから、いくつかのモチーフを抽出した。そのひとつとして、宗教性を離れて没道徳的に真実を追求しはじめた唯物論的な科学にたいするヴィクトリア朝人の不安と不信というモチーフを抽出したうえで、そのようなモチーフを文学的表現に高めた例のひとつとして、オスカー・ワイルドの『ドリアン・グレイの肖像』をとりあげ、「ワイルドの唯美主義と生体解剖」というタイトルの論文のかたちでまとめた。それは未刊行ではあるが、2006年11月25日、日本オスカー・ワイルド協会全国大会において、口頭発表した(2007年度のワイルド協会の機関誌に掲載されることが決定している)。さらに、生体解剖論争がエドワード朝にまで継続していたことを示す事件として、20世紀初頭に生じたブラウン・ドッグ暴動についても調査した。生体解剖論争が明るみに出したのは、動物の痛みにかんするヒューマニズム的な関心の存在から推測される動物愛護文化の確立であり、宗教性を離れて没道徳的に真実を追求しはじめた唯物論的な科学にたいするヴィクトリア朝人の不安と不信であり、その一方で、そのような不安と不信を前に己れの実践的有用性(宗教性・道徳性ではなく)を主張して自己正当化をはかろうとしていた科学の全体的傾向だった。本年度は、唯物論的な科学にたいするヴィクトリア朝人の不安と不信を表象するイメージとしての、マッド・サイエンティストの科学者像を、後期ヴィクトリア朝の文学作品と歴史資料の双方から抽出した。もちろん、マッド・サイエンティストとしての科学者像というイメージ自体は、生体解剖論争に特有のものでも、この時代に特有なものでもない。

したがって、Dr. Faustus (Marlowe)以降のマッド・サイエンティスト像の系譜をもたどりつつ、Frankenstein (Mary Shelley)、Dr.Jekyll and Mr.Hyde (Stevenson)といった作品もあつかった。そのうえで生体解剖に関わるテクストに特徴的なマッド・サイエンティスト像特有の要素を抽出したが、その成果は、「後期ヴィクトリア朝の科学批判」というタイトルのもと、日本英文学会北海道支部大会(2007年10月6日(土)札幌大学)において発表した。本研究の目的は、1870年代なかばから急に活発化しはじめた生体解剖論争をとおして見えてくるヴィクトリア朝文化の諸相のうち、科学の唯物論化、動物愛護文化の確立と、それにともなう唯物論的な科学への批判、さらに、そのような批判を前にした科学者側の反応を、『モロー博士の島』を中心とするいくつかの文学作品と、この時代の歴史資料とを往還しながら記述するところにある。研究の最終年度にあたる本年は、『英語青年』に1年半(平成15年10月から平成17年3月まで)にわたって連載した関連論文と、本研究のなかで過去3年間に書きためた論文を基盤にして、1冊の本として出版可能なかたちに原稿をつくりあげることをめざした。生体解剖をめぐるその論争のなかから浮かびあがってくるのは、ヴィクトリア朝をとおして科学がめざましい発展を示しながら唯物論化していったこと、生体解剖とはそのような科学の典型としての生理学が生み出した新しい科学的方法だったということ、その一方で18世紀後半以降、福音主義などの影響とともに動物愛護の文化が発展していたこと、生体解剖論争とはそのような科学と動物愛護の文化が真っ向から衝突した事件であったということである。結論ともては、生体解剖論争のなかにわれわれは、宗教性を離れて没道徳的に真実を追求しはじめた唯物論的な科学にたいするヴィクトリア朝人の不安と不信を見てとることができるということである。文学作品と歴史資料を往還する文化研究的な方法をとおして、ヴィクトリア朝の人びとの内面の一端を明らかにできたと確信している。出版にまでもっていきたい。
cDNA microarrayを利用した大腸癌の網羅的遺伝子解析

平成13年度は、cDNAマイクロアレイを独自に開発・作製し、臨床検体を用いて遺伝子発現プロファイル解析について検討した。まず、大腸組織での遺伝子情報を濃密化するために、大腸癌部、正常粘膜、肝転移巣由来のcDNA library 30000クローン及び文献上の大腸癌関連遺伝子約170個より発現頻度情報をもとに重複のない約4600個を選択した。実際の臨床大腸癌サンプルを用いて発現プロファイルを検討した結果、正常に比べ癌部で2倍以上の発現上昇している遺伝子23個と、1/2倍以下に発現低下している遺伝子36個、計59個を大腸癌関連候補遺伝子として同定した。これらのうち15遺伝子はこれまでに文献で報告されているものであり、14遺伝子についてはsemiquantitative RT-PCR、12遺伝子についてはSAGEデータベースで発現比の確認をとったが、マイクロアレイのデータと相同性はそれぞれ93%、83%といずれも非常に高かった。平成14年度は、新規サンプルで肝転移について検証したところ、約85%の正確性をもった予測が可能であった。さらに、臨床応用を考え、クロスハイブリの問題、スプライシングバイリアントの検出にも対応可能で、プローブ長による不安定性を取り除くために、プローブにはcDNAクローン方式を採用せずに、一定長(60mer)のオリゴヌクレオチドをデザインすることとした。すでにヒト全遺伝子に対応した特異的配列をもつオリゴプローブの設計・合成(30000種類)を終了した。細胞株をもちいた検討では従来型のマイクロアレイよりも高い定量性・再現性・感度を得ることに成功している。得られるデータは極めて大量のデータとなり、その解析手法は非常に重要であるため、スーパーコンピュターを駆使したsupervised learning手法のアルゴリズムを開発中である。今年度の本研究によって得られた知見について報告する。本研究ではポストゲノム時代における網羅的遺伝子発現解析ツールとして注目を集めているcDNAマイクロアレイを独自に開発・作製し、臨床検体を用いて遺伝子発現プロファイル解析について検討した。研究目的は、大腸癌に特徴的な遺伝子解析のための遺伝子を選択すること、豊富かつ十分な情報量を有し、さらに結果の正確性に優れたマイクロアレイ作製することであった。マイクロスポット上での高精度のhybridization条件を達成した後、実際の臨床大腸癌サンプルを用いて発現プロファイルを検討した。その結果、正常に比べ癌部で2倍以上の発現上昇している遺伝子23個と、1/2倍以下に発現低下している遺伝子36個、計59個を大腸癌関連候補遺伝子として同定した。以上よりこのマイクロアレイは、情報量に富みかつ正確性を有するものと考えられた。今回開発したcDNAマイクロアレイは、臨床病理学的事項を裏付ける遺伝子発現パターンの同定や、癌の発育・進展の解明に役立つものと考えられる。さらに、今後、癌の個性化診断の向上や、個々の症例に応じた癌治療(オーダーメード医療)による治療成績の向上に繋がることが期待され今後、臨床応用に向けた解析が期待される。これまでに大腸癌解析用の独自のcDNAマイクロアレイを開発・作製し、大腸癌の遺伝子発現プロファイル解析を行ってきた。

本年度は、prospective検討を行い、新規サンプルで肝転移について検証したところ、約85%の正確性をもった予測が可能であった。しかし、このマイクロアレイでもその情報は質・量ともに臨床応用への発展とういう観点からは、まだ十分に満足できるレベルに到達しているとは言えず、現在、より高水準なDNAチップの開発・作製にとり組んでいる。まずクロスハイブリの問題、スプライシングバイリアントの検出にも対応可能で、プローブ長による不安定性を取り除くために、プローブにはcDNAクローン方式を採用せずに、一定長(60mer)のオリゴヌクレオチドをデザインすることとし、現在すでにヒト全遺伝子に対応した特異的配列をもつオリゴプローブの設計・合成(30000種類)を終了している。細胞株をもちいた検討では従来型のマイクロアレイよりも高い定量性・再現性・感度を得ることに成功している。またこのDNAチップは、ヒト遺伝子の全ての発現状態を一度に知ることができるため、解析対象となるのは大腸癌のみならず、あらゆる癌腫、ひいては全ての疾患にまで拡大応用が可能である。こうして得られるデータは解析遺伝子数30000種類、解析症例数2600例と未曾有の大量データとなり、その解析手法は非常に重要であるため、スーパーコンピュターを駆使したsupervised learning手法のアルゴリズムを開発中である。
最上川上流域における溶存金属種の緩衝作用について

本研究では,鉱山廃水処理水を受容する酸性河川松川における水環境調査および実験室内におけるモデル実験を行い,それらデータの解析に基づいて酸性化河川の水質変動に影響をおよぼす環境因子について検討した。調査結果から,松川上流部は酸性度が高く,硫酸イオンやAl等の金属が高濃度で存在しており(硫酸イオンc.a.240ppm, Al c.a.8.7ppm, pH c.a.4.3),流下に伴ってそれらの酸性度,硫酸イオン濃度および金属濃度が減少することが明らかとなった.この酸性度の低下は支流の流入による希釈効果とアンモニア等のアルカリ源の供給に伴う溶存Alの加水分解によりAl濃度が減少することに起因することが示唆された.また,実験室内においてAl_2(SO_4)_3・18H_2Oと硫酸を用いてpH3.6程度に調整した模擬河川水試料の中和滴定実験を行った結果,pH4.75.3においてpHの緩衝現象が確認された.また,初期溶存Al濃度が増加するにつれpHの緩衝幅は長くなることが明らかとなった,初期溶存Al濃度が1ppmである試料の滴定中における溶存Al濃度の変化をモニターしたところ,緩衝前は0.96ppm,緩衝中は0.75ppm,緩衝後は0.39ppmと減少する結果が得られ,Alの加水分解反応の進行に伴って溶存AlがAl(OH)_3等の水酸化物を形成し,沈殿することが示唆された.現地調査における松川上流部のAl濃度7ppmを基準に,溶存Caをモル比Al:Ca=1:1で共存させて滴定したところ滴定曲線はあまり変化せず,モル比1:2の場合では過剰のNaOH溶液を要した.モル比1:3では1:2の場合と同様であった.珪酸イオンを松川の濃度平均値にほど近い10ppm(モル比Al:珪酸イオン=1:1.4)で共存させた場合においても緩衝域が高滴定側へ移動した.結果から,酸性河川環境において存在する溶存AlはpHの上昇を阻害する主要な因子であり,溶存Caおよび珪酸イオン等の共存下においてそのpH緩衝効果は強まることが明らかになった.また,本研究によって得られたデータを使用して国内および海外において酸性河川環境に関する研究成果発表を行った本研究では,鉱山廃水処理水を受容する酸性河川松川における水環境調査および実験室内におけるモデル実験を行い,それらデータの解析に基づいて酸性化河川の水質変動に影響をおよぼす環境因子について検討した。調査結果から,松川上流部は酸性度が高く,硫酸イオンやAl等の金属が高濃度で存在しており(硫酸イオンc.a.240ppm, Al c.a.8.7ppm, pH c.a.4.3),流下に伴ってそれらの酸性度,硫酸イオン濃度および金属濃度が減少することが明らかとなった.この酸性度の低下は支流の流入による希釈効果とアンモニア等のアルカリ源の供給に伴う溶存Alの加水分解によりAl濃度が減少することに起因することが示唆された.また,実験室内においてAl_2(SO_4)_3・18H_2Oと硫酸を用いてpH3.6程度に調整した模擬河川水試料の中和滴定実験を行った結果,pH4.75.3においてpHの緩衝現象が確認された.また,初期溶存Al濃度が増加するにつれpHの緩衝幅は長くなることが明らかとなった,初期溶存Al濃度が1ppmである試料の滴定中における溶存Al濃度の変化をモニターしたところ,緩衝前は0.96ppm,緩衝中は0.75ppm,緩衝後は0.39ppmと減少する結果が得られ,Alの加水分解反応の進行に伴って溶存AlがAl(OH)_3等の水酸化物を形成し,沈殿することが示唆された.現地調査における松川上流部のAl濃度7ppmを基準に,溶存Caをモル比Al:Ca=1:1で共存させて滴定したところ滴定曲線はあまり変化せず,モル比1:2の場合では過剰のNaOH溶液を要した.モル比1:3では1:2の場合と同様であった.珪酸イオンを松川の濃度平均値にほど近い10ppm(モル比Al:珪酸イオン=1:1.4)で共存させた場合においても緩衝域が高滴定側へ移動した.結果から,酸性河川環境において存在する溶存AlはpHの上昇を阻害する主要な因子であり,溶存Caおよび珪酸イオン等の共存下においてそのpH緩衝効果は強まることが明らかになった.また,本研究によって得られたデータを使用して国内および海外において酸性河川環境に関する研究成果発表を行った
クロザピンによる痙攣発作回避のための血中濃度および患者リスク因子の探索

【研究目的】一般的に抗精神病薬は痙攣閾値を低下させ、脳波異常や痙攣発作を引き起こすことがあることが知られているが、入浴中の痙攣による溺死や、転倒による二次的外傷など生命に関わる重大な事故をを引き起こす恐れがあり、使用には十分な注意が必要である。抗精神病薬の中でもクロザピンは、脳波異常に関連した痙攣発作やミオクローヌス(以下、脳波異常関連イベント)に関する報告が多く、他の抗精神病薬に比較しても、そのリスクは特に高いとされる。そこで本研究では、クロザピン服用患者の、脳波異常を含めた脳波異常関連イベントの発生を未然に回避することを目的として、脳波異常関連イベントの発生と、クロザピンの投与量および血中濃度との関連を明らかにし、併せてそれらの発生に影響を及ぼす患者リスク因子の探索を目的とした。【研究方法】当院のクロザピン登録患者の内、クロザピン服用中に脳波異常関連イベントが発生した患者、および、脳波検査を実施した患者、計96名を対象患者とした。電子カルテを基に、患者背景やクロザピンの投与量および血中濃度、痙攣を誘発する可能性のある併用薬剤を後ろ向きに抽出した後、脳波異常関連イベント発生の有無と影響する因子を単変量解析にて検討した。【研究成果および今後の計画】解析対象患者の内、脳波異常関連イベントが発生した患者は62名、発生しなかった患者は34名であった。脳波異常関連イベント発生の有無と、年齢、性別に関連は認められなかった。また、クロザピンの投与量および血中濃度についても、イベント発生との関連は認められなかった。一方、併用薬剤については、イベント発生群で炭酸リチウムの併用が多い傾向にあった。本研究から、炭酸リチウムがクロザピンによる脳波異常関連イベントの発生に何らかの影響を与えている可能性が推察された。なお、血中濃度との関連については、イベント発生群で1,000ng/mLを超えるような高い血中濃度が明らかになったケースが数例あったものの、解析に十分なデータ数が得られなかったため、引き続きデータを蓄積して再度検討をする予定である。
仮想廃棄物焼却炉モデルの構築による非意図的生成物質の生成機構解明

日本のような国土状況では、廃棄物の焼却は必須であるが、ダイオキシンなど非意図的に生成する化学物質の制御を十分に行うことが求められている。しかしながら、ダイオキシンなどの生成する有害物質が多様であって、焼却炉の操業条件と特定有害物質の放出の相関をマクロ的に解明するといった立場の研究が主流であり、ミクロあるいは分子論的検討が決定的に遅れている。マクロ的な研究情報を補完し、よりミクロ的・分子論的立場から焼却プロセスを理解するために、仮想焼却炉モデルを構築することが本研究の最終的な目的である。実際の焼却炉では、まさに混合状態にある様々な固形物が燃焼している。そこで、本実験では、ある特定した条件下での個別的な廃棄物の燃焼を調べ、燃焼ガス中の化合物の同定を試みた。燃焼条件としては、酸素量、温度を変化させることによって生成ガスをGCおよびGC-MSにより定性・定量分析を行った。試料は汎用のプラスチックであるポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリスチレンを用い、試料量を変化させた燃焼実験の結果、酸素量が十分である場合は発生ガスはほぼCO2であり、試料量が増すとCO2に加え、分解反応によると考えられるCH4、C2H4、COが発生した。紙試料の燃焼においてもCO2、CO、CH4のみの発生が観測された。また、プラスチックの燃焼において、それらの化学組成から燃焼反応による見積もられる完全燃焼がおこる酸素量よりも多いプラスチック試料が存在する場合には、ベンゼン環を含まないポリエチレンでも、排出ガス中にベンゼンが見られ、このようなより高い炭素数への反応が起こることが分かった。しかしながら、ダイオキシンなどが有害性であるためもあり、また、生成する有害物質が多様であることもあって、焼却炉の操業条件と特定有害物質の放出の相関をマクロ的に解明するといった立場の研究が主流であって、ミクロ的あるいは分子論的検討が決定的に遅れている。本研究では、マクロ的な研究情報を補完し、よりミクロ的・分子論的立場から焼却プロセスを理解するために、仮想焼却炉モデルを構築することが目的である。実際の焼却炉では、まさに混合状態にあるさまざまな固形物が燃焼している。そこで、本実験では、個別的な廃棄物を微量の塩素および金属元素に着目して分析し、併せて、燃焼ガス中の化合物の同定を試みる。燃焼条件としては、酸素量、温度、金属元素の存在の有無を変化させることによって、主たる生成物の追求を行う。しかし、これまでの経験からも、生成物の特定は相当困難である。そこで、次の分子論的燃焼炉モデルを構築し、どのような分解生成物が存在しうるかについて検討を行う必要がある。本年度は、単一物質の加熱・燃焼に伴う非意図的生成物の同定を行った。先ず、特定の条件下で燃焼が可能である密閉系の加熱燃焼装置を自作した。燃焼後、その気体生成物のうちの分析対象物をガスクロマトグラフによって分析した。実験は特定の酸素量と試料量での燃焼を行った。ポリエチレンとPETを個別に燃焼し発生した気体を調べた。そして、2つの成分を混合したときに燃焼させたときは、個別に燃やしたときのデータの相加平均とほぼ等しい区なるという結果が得られ、加熱・燃焼する単一物質の基礎データの収集が基礎データとなることが示された。

本研究では、マクロ的な研究情報を補完し、よりミクロ的・分子論的立場から焼却プロセスを理解するために、仮想焼却炉モデルを構築することが目的である。実際の焼却炉では、まさに混合状態にあるさまざまな固形物が燃焼している。そこで、本実験では、個別的な廃棄物を微量の塩素および金属元素に着目して分析し、併せて、燃焼ガス中の化合物の同定を試みる。燃焼条件としては、酸素量、温度、金属元素の存在の有無を変化させることによって、主たる生成物の追求を行う。しかし、これまでの経験からも、生成物の特定は相当困難である。そこで、次の分子論的燃焼炉モデルを構築し、どのような分解生成物が存在しうるかについて検討を行う必要がある。酸素濃度が一定の条件での燃焼反応を調べている。昨年度に自作した密閉系の加熱燃焼装置をさらに発展させ、系の酸素を十分に利用できる装置を自作した。完全燃焼となる量のプラスチック試料を燃焼後、その気体生成物のうちの分析対象物をガスクロマトグラフによって分析した結果、酸素濃度は反応前のほぼ数%になった。この装置を用いて、試料量を変化させた結果、酸素量が十分である場合は発生ガスはほぼCO2であり、試料量が増すとCO2に加え、分解反応によると考えられるCH4、C2H4、COが発生し、さらに試料が多いと、ポリスチレン、ポリエチレン、PETのどの試料においても、ベンゼン(C6H6)の発生がGC-MSの分析によって明らかとなった。日本のような国土状況では、廃棄物の焼却は必須であるが、ダイオキシンなど非意図的に生成する化学物質の制御を十分に行うことが求められている。しかしながら、ダイオキシンなどの生成する有害物質が多様であって、焼却炉の操業条件と特定有害物質の放出の相関をマクロ的に解明するといった立場の研究が主流であり、ミクロあるいは分子論的検討が決定的に遅れている。マクロ的な研究情報を補完し、よりミクロ的・分子論的立場から焼却プロセスを理解するために、仮想焼却炉モデルを構築することが本研究の最終的な目的である。実際の焼却炉では、まさに混合状態にある様々な固形物が燃焼している。そこで、本実験では、ある特定した条件下での個別的な廃棄物の燃焼を調べ、燃焼ガス中の化合物の同定を試みた。燃焼条件としては、酸素量、温度を変化させることによって生成ガスをGCおよびGC-MSにより定性・定量分析を行った。プラスチックの燃焼において、それらの化学組成から燃焼反応による見積もられる完全燃焼がおこる酸素量よりも多いプラスチック試料が存在する場合には、ベンゼン環を含まないポリエチレンでも、排出ガス中にベンゼンが見られ、このようなより高い炭素数への反応が起こることが分かった。このような反応により非意図的物質が生成されると考えられる。また、密閉容器中の酸素をほぼ完全に使用する装置の作製を試みた。昨年度に設計した密閉系の加熱燃焼装置では、燃焼用の発熱体である白金をコイル状にした部分に石英ガラス管で覆い、その中に試料をセットしたが、その管内で燃焼が起こるため、密閉容器内の酸素量に対して完全に燃焼する試料量よりもさらに多い試料を燃焼させた場合でも、系の酸素は燃焼後数%測定された。次に、25φ程度の石英ガラス製の皿に試料をセットし、その上部にコイル状にした白金発熱体を設置し燃焼を試みた。
モンゴル帝国期の国際貿易と多言語環境下の文書行政の関連性に関する基礎的研究

元朝とイルハン朝の外交および通商関係におけるイランおよび中国の国際貿易商人の役割、国家と商人の関係、および、インド洋貿易における陶磁器、銀、馬の流通と商人の関係を明らかにし、日本語、英語、ペルシア語によって国際学会、国内学会における口頭発表および論文発表をおこなった。
小動物臨床におけるてんかん外科の導入

平成30年度の研究実績は以下の通りである.1.対面集合しての研究者会議を2019年1月29日に行った.前年度(2018)3月19日に本年度の計画は話し合われており,また年度中,学会等で幾度も互いに対面あるいはメールで本研究に関連する話し合いが行われた.2.実験:1長谷川(日獣大)班では健常犬における前側頭葉切除術の実験が終了し,現在病理組織学的調査および論文投稿の準備(執筆)に入っている.また当該研究室で飼育されていた難治性てんかんの猫に対し,慢性皮質電図記録および切除外科として皮質切除および海馬切除を行い,現時点(術後半年)で良好な発作予後が得られている.2齋藤(麻布大)班では所属研究室で使用されていた難治性てんかん犬に対し,迷走神経刺激装置の埋め込みを行い,刺激条件を調整しながら管理しており,現時点(術後半年)で良好な発作予後が得られている.3北川(日大)班では皮質切除前の術前検査法確立として,運動野および感覚野のマッピングを経頭蓋電気刺激にて行っているが,感覚誘発電位は問題なく取得できるが,運動誘発電位はうまくとれず,開頭にて直接的な皮質刺激に切り替えて行っている(継続中).4金園班では3頭の犬死体に対し,深部脳刺激のターゲットになる視床前核への電極定位刺入のプレ実験を行い,計測誤差2ミリ以内での定位刺入が可能であることが確認された.5内田(東大)班:長谷川班で得られた脳組織の病理組織学的解析および下述される死亡症例の病理組織学的表化を行った.3.臨床:1例の臨床例において,術中皮質電図記録による軟膜下皮質多切および脳梁離断術を実施した.現時点(術後3ヵ月)では良好な発作予後が得られている.もう1例,てんかん外科候補の犬症例を手術直前の術前検査まで実施したが,他の脳疾患(特発性脳炎)が急性発症し,手術直前に死亡した(上述の病理組織検査を実施).北川班において健常犬における皮質切除の実験を行う計画であったが,当該研究機関での倫理承認が得られず,このため皮質切除に必要な皮質マッピングの実験に切り替えて,承認を受けて行った.当初の計画では3年次(H31年度)より臨床研究を開始する予定であったが,適応症例があったこと,また急性に悪化している症例であり,全研究者の同意および飼い主の要望もあったため,1例を先行して実施した.H31(R1)年度からは臨床例でのてんかん外科を本格的に開始する.そのため研究者は学会やセミナー等で本研究の喧伝活動をより頻繁に行い,一般臨床獣医師に周知する.基礎研究としては長谷川班は当該研究室で系統維持している家族性てんかん猫に対する前側頭葉切除の実施を計画.齋藤班では引き続き迷走神経刺激埋め込み例の経過観察と臨床例での適応を行う.北川班は皮質マッピングを完了させ,手技確立に努める.金園班では,死体での予備研究が成功したので,H31年度は生体での実験に移行する.また各々が行ってきた研究活動を学会報告および論文投稿にて公表していく.H29年度の研究実績は以下の通りである.1.研究者会議を3回(4/27, 12/4, 3/19)開催し,研究計画,進捗状況の確認を行った.2.基礎研究ー1長谷川(代表者):健常犬を用いた前側頭葉切除術を7頭で行った.前側頭葉切除術の成功率を向上させるため,Neuronavigatorを購入したが,人用装置であり,犬猫に対応させるため,頭部およびリファレンスの固定具を考案し,特注生産した.また覚醒脳波測定を可能にするための犬用脳波キャップを開発中である.また犬猫用硬膜下電極を特注生産した.てんかん猫におけるvoxel basedmorophometryに関する研究論文を投稿した(審査中).他大学で不要となったてんかん犬,および異所性灰白質を有する子犬の譲渡を受けた.2齋藤(分担者):迷走神経刺激に必要となるプログラミングワンドおよびリードを購入.医大の研究協力者との協議で,使用済みジェネレーターの譲渡手続きの形式が確立され,譲渡を受けることが可能となった.同学他研究室でてんかんを発症した犬の譲渡を受けた.犬てんかん症例の脳波研究論文を投稿した(審査中).軟膜下多切除術を3頭で行っており,死亡した2例を病理(内田)へ提出.米国学会へ出張.3北川(分担者):当初の研究計画では皮質切除術の実験研究を行う予定であったが,大学での倫理委員会の承認がおりず,脳機能マッピングの研究に計画変更した.マッピングに必要な機材および実験動物を揃え,実験を開始.同時にNavigatorで容易に脳回を同定できないかどうかを試行錯誤している.4金園(協力者):深部脳刺激装置の購入.次年度より死体頭部を用いて刺激電極の挿入に関する基礎実験を行う.5内田(分担者):2齋藤より提出された脳組織の評価を行った.3.臨床研究ーてんかん外科適応症例の基準を作成した.症例募集のパンフレットを作成,啓蒙活動を行った.

各大学での研究計画の倫理承認に時間がかかったこと,および実験用動物の飼育室や管理に関する世情が変化している最中で新たな実験動物の飼育に制限があることが,一部の研究計画に遅れを出した.また代表者が備品購入したNeuronavigatorの犬猫用固定具の開発に時間を要し,それを用いた実験が開始できていない(H30.4月時点で開始できる状態になった).その他の点においては概ね順調に進展している.平成30年度の研究実績は以下の通りである.1.対面集合しての研究者会議を2019年1月29日に行った.前年度(2018)3月19日に本年度の計画は話し合われており,また年度中,学会等で幾度も互いに対面あるいはメールで本研究に関連する話し合いが行われた.2.実験:1長谷川(日獣大)班では健常犬における前側頭葉切除術の実験が終了し,現在病理組織学的調査および論文投稿の準備(執筆)に入っている.また当該研究室で飼育されていた難治性てんかんの猫に対し,慢性皮質電図記録および切除外科として皮質切除および海馬切除を行い,現時点(術後半年)で良好な発作予後が得られている.2齋藤(麻布大)班では所属研究室で使用されていた難治性てんかん犬に対し,迷走神経刺激装置の埋め込みを行い,刺激条件を調整しながら管理しており,現時点(術後半年)で良好な発作予後が得られている.3北川(日大)班では皮質切除前の術前検査法確立として,運動野および感覚野のマッピングを経頭蓋電気刺激にて行っているが,感覚誘発電位は問題なく取得できるが,運動誘発電位はうまくとれず,開頭にて直接的な皮質刺激に切り替えて行っている(継続中).4金園班では3頭の犬死体に対し,深部脳刺激のターゲットになる視床前核への電極定位刺入のプレ実験を行い,計測誤差2ミリ以内での定位刺入が可能であることが確認された.5内田(東大)班:長谷川班で得られた脳組織の病理組織学的解析および下述される死亡症例の病理組織学的表化を行った.3.臨床:1例の臨床例において,術中皮質電図記録による軟膜下皮質多切および脳梁離断術を実施した.現時点(術後3ヵ月)では良好な発作予後が得られている.もう1例,てんかん外科候補の犬症例を手術直前の術前検査まで実施したが,他の脳疾患(特発性脳炎)が急性発症し,手術直前に死亡した(上述の病理組織検査を実施).北川班において健常犬における皮質切除の実験を行う計画であったが,当該研究機関での倫理承認が得られず,このため皮質切除に必要な皮質マッピングの実験に切り替えて,承認を受けて行った.当初の計画では3年次(H31年度)より臨床研究を開始する予定であったが,適応症例があったこと,また急性に悪化している症例であり,全研究者の同意および飼い主の要望もあったため,1例を先行して実施した.基礎研究に関しては前年度をかけて各大学・各研究者で実験環境および動物が揃ったため,各人本年度より本格的な実験を開始する;1長谷川ー慢性頭蓋内脳波記録,犬猫でのNavigatorを用いた前側頭葉切除の実施;2齋藤ーてんかん犬での迷走神経刺激の実施;3北川ー実験犬における運動野および感覚野のマッピング研究の実施;4金園ー死体頭部を用いた深部脳刺激電極の挿入実験;5内田ー病理解析の継続.臨床研究に関して,パンフレット等を用い,各研究者が発表する学会やセミナー等で喧伝しているが,てんかん外科候補症例の応募が少ない.より簡易化したパンフレットの配布,喧伝を強化するとともに,各研究者自身の症例で候補症例が数件あるので,そららのより詳細な検査の実施とオーナー家族への十分なインフォームド・コンセントに努める.また各研究者にてんかん動物が幾らか譲渡されてきている.これらをどの研究に配属するか研究者相互で検討し,適材適所で研究に供する.H31(R1)年度からは臨床例でのてんかん外科を本格的に開始する.
骨格筋疲労に関連するカルノシン合成遺伝子の発現機序の解明

本研究では、骨格筋疲労に関連するカルノシン合成遺伝子(ATPGD1)の発現機序について、ヒトを用いて解明することを目的とし、ATPGD1と骨格筋カルノシン濃度および筋線維組成との関係について、また、カルノシン摂取による体内でのカルノシン濃度およびATPGD1の発現について経時的に検討した。その結果、骨格筋中のカルノシン量は、速筋線維に多く存在すること、また、それはATPGD1の多少ではなく、トレーニングなどの環境的要因に起因すること、さらには、カルノシンの経口摂取による骨格筋中のカルノシン濃度の増加にはATPGD1が関与する可能性が示唆された。本研究では、骨格筋疲労に関連するカルノシン合成遺伝子(ATPGD1)の発現機序について、ヒトを用いて解明することを目的とし、平成24年度は、骨格筋カルノシン濃度とATPGD1および筋線維組成との関係について検討した。被検者には一般健常男性13名を用い、これらの被検者の右脚外側広筋より筋バイオプシー法により筋サンプルを摘出し、骨格筋カルノシン濃度、ATPGD1および筋線維組成を測定した。その結果、骨格筋カルノシン濃度とType II線維との間に有意な正の相関関係が認められた。一方、ATPGD1と骨格筋カルノシン濃度およびType II線維との間には有意な相関関係は認められなかった。以上の結果から、骨格筋中のカルノシン量は、速筋線維に多く存在すること、また、それはカルノシン合成酵素の多少ではなく、トレーニングなどの環境的要因に起因する可能性が示唆された。平成25年度は、カルノシン摂取による体内でのカルノシン濃度およびカルノシン合成遺伝子の発現について経時的に検討した。16名の被検者8名ずつに0.05g/kgのL-カルノシンまたは水のどちらかを摂取させ、血中遊離アミノ酸濃度、骨格筋カルノシン濃度およびATPGD1の遺伝子発現量を測定した。その結果、カルノシン摂取により血中カルノシンは検出されず、β-アラニンは摂取20-60分後、L-ヒスチジンは30-180分後に摂取前と比較して有意に増加した。また、骨格筋カルノシン濃度はカルノシン摂取30分後および120分後に水摂取群と比較して有意に増加し、ATPGD1は30分後に摂取前と比較して有意に増加した。以上の結果から、カルノシンは経口摂取により、血中ですぐにβ-アラニンとL-ヒスチジンに分解されるが、骨格筋中のカルノシン濃度が増加した。その増加にはATPGD1が関与する可能性が示唆された。カルノシンは、βアラニンとヒスチジンから成るジペプチドで、ヒトをはじめとする多くの脊椎動物の骨格筋に存在している。またカルノシンの主な生理作用には、乳酸緩衝作用、活性酸素除去作用および筋小胞体でのカルシウムイオン調節作用などがあり、高強度運動中に引き起こされる筋疲労に関連する様々な生理機能に関与していることが知られている。また、スプリンターにおける骨格筋中のカルノシン量は、マラソン選手および一般人と比較して有意に高値を示すことや、カルノシン摂取や高強度トレーニングによって骨格筋中のカルノシン量が増加することが明らかになっている。しかしながら、その体内での合成機序は明らかになっておらず、これには近年同定されたカルノシン合成酵素(ATPGD1)が関与する可能性が推察されている。そこで本研究では、カルノシンの体内での合成機序における基礎的知見を得るために、骨格筋カルノシン濃度とATPGD1および筋線維組成との関係について明らかにすることを目的とした。被検者には一般健常男性20名を用い、これらの被検者の右脚外側広筋より筋バイオプシー法により筋サンプルを摘出し、骨格筋カルノシン濃度、ATPGD1および筋線維組成を測定した。骨格筋カルノシン濃度とType II線維との間に有意な正の相関関係が認められた。以上の結果から本研究では、骨格筋中のカルノシン量は、速筋線維に多く存在すること、また、それはカルノシン合成酵素の多少ではなく、トレーニングなどの環境的要因に起因する可能性が示唆された。本研究では、2年間の申請期間中で、骨格筋疲労に関連するカルノシン合成遺伝子の発現機序について、ヒトを用いて解明することを目的とし、平成24年度は、(1)一過性の高強度運動前後における体内でのカルノシンの変動を、血中および筋中レベルから検討し、それらとカルノシン合成遺伝子(ATPGD1)の発現量とを関連づけながら、カルノシンの代謝機序を経時的に観察すること、また、(2)カルノシン合成遺伝子(ATPGD1)と筋線維組成および運動パフォーマンスとの関係について検討することを目的とした。

(1)の課題については、一過性の運動前後での採血および筋バイオプシーが技術的な問題により今年度実施することができなかったため、来年度の課題とする。(2)の課題については、当初の計画通りに実施することができ、カルノシンの合成機序について新たな知見を見いだすことができた。被検者には一般健常男性20名を用い、これらの被検者の右脚外側広筋より筋バイオプシー法により筋サンプルを摘出し、骨格筋カルノシン濃度、ATPGD1および筋線維組成を測定した。その結果、骨格筋カルノシン濃度とType II線維との間に有意な正の相関関係が認められた一方で、ATPGD1と骨格筋カルノシン濃度およびType II線維との間には有意な相関関係は認められなかった。以上の結果から、骨格筋中のカルノシン量は、速筋線維に多く存在すること、また、それはカルノシン合成酵素の多少ではなく、トレーニングなどの環境的要因に起因する可能性が示唆され、カルノシンの合成機序について新しい知見を見いだすことができた。平成25年度は、カルノシン摂取による体内でのカルノシン濃度およびカルノシン合成遺伝子の発現について経時的に検討する。本研究は二重盲検法を用いて行い、被検者がどちらの群に属しているのかを分からないようにする。カルノシンもしくはプラセボ摂取前後に右脚外側広筋より筋サンプルを摘出し、骨格筋カルノシン濃度およびカルノシン合成遺伝子(ATPGD1)を、また採血により血中カルノシン濃度の測定を行う。筋生検および採血は、1人の被検者に対し摂取前および摂取後0.5時間、1時間、2時間、3時間後の計5回行い、骨格筋カルノシン濃度、カルノシン合成遺伝子(ATPGD1)および血中カルノシン濃度を経時的に測定する。骨格筋および血中カルノシン濃度は、得られた筋および血清サンプルを液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて測定する。カルノシン合成遺伝子(ATPGD1)の発現量は、定量PCRを用いてATPGD1遺伝子を、また、ウエスタンブロッティングを用いてタンパク質の発現量を測定する。カルノシン摂取群には、0.15 g/kgのL-カルノシン(浜理薬品株式会社)を体重に合わせて計りとり、水に溶かして摂取させる。なお、L-カルノシンは海外で販売しているL-カルノシンサプリメントの原料と同等であり、L-カルノシンのLD50値は、14.93 g/kg以上(経口投与、マウスによる急性毒性試験)で、先行研究においても、ヒトに4週間、364 gのL-カルノシンを摂取させており(Harris et. al. 2006)、安全性においても問題はない。研究経費の主な用途は、バイオプシー(筋生検)による筋線維組成、カルノシン濃度およびカルノシン合成遺伝子(ATPGD1)の解析に必要な消耗品と試薬が大半を占める。また筋生検は、被検者に対する負担度も大きいことから謝金を20千円に設定し、筋生検を実施する医師に対する謝礼も1日15千円で計上した。その他、本研究に関する情報収集、研究協力機関である国立スポーツ科学センターおよび日本ハム(株)中央研究所との研究打ち合わせ、研究成果を広く社会に還元するための国内・外での学会発表に関わる旅費、論文発表に関わる経費を計上している。
保育所・幼稚園・学校・地域の組織的連携による子どもと家族の生活習慣病予防教育

保育所・幼稚園と小中学校と地域等の関係機関が組織的に連携するためには、関係者が共通の課題を認識してそれぞれの活動を理解したうえでそれぞれの立場で取り組む必要がある。そこで、保育所・幼稚園と小中学校において、関係機関の協働による子どもと家族の生活習慣に関する実態調査を実施し、分析結果を保健教育に活用する取り組みを実践した。実態調査の結果から、子どもの食事の栄養バランスについては、保護者の食事パターンと関連しており、食生活の改善のためには保護者に対してアプローチする必要性が示された。子どもの就寝時刻の規則性については、小学生では子どもの就寝時刻や母親の就寝時刻の規則性等、中学生では子どものスマートフォンの利用時間や生活リズムに対する子どもの意識等が関連していた。睡眠・生活リズムの改善のためには、子どもの学年に応じた子どもおよび保護者に対する保健教育の必要性が示唆された。これらの子どもや保護者の生活実態を分析することで得られた結果は、学会発表や査読付き論文として発表し、関係者の実践活動の基礎資料として活用された。また、保育所・幼稚園の保護者に対する教育講演会、小中学校の児童生徒および保護者に対する学校保健委員会、さらに子育て支援センターやPTAの研修会、保健所における研修会など研究調査の参加者以外の多くの一般市民、専門職の方々の研修等に活用することができた。なお、今回の研究では、当初の目的であった都市部における組織的連携による生活習慣病予防教育の実践プログラムの構築まで至らなかった。今後は、関係機関の協働による調査や実践活動を継続し、すべての子どもと家族が健康的な生活が送れるよう支援の輪をつなげたい。1.小中学校養護教諭および地域等の関係者との打ち合わせ: K市小中学校の養護教諭の研修会で、研究代表者が実践研究を継続してきた長野県の取り組みを紹介し、保育所、小中学校、地域の関係者が連携会議を実施しながら、協働で目標を立て、それぞれの実践活動を把握・理解した上で地域全体で生活習慣病予防教育を実施することの意義を説明した。また、同研修会に高等学校の養護教諭と市役所健康課の保健師を招き、高校生の生活実態と地域の乳幼児および成人の健康実態および第二次健康日本21K計画について知る機会とし、中学校区別に各校の健康課題や今後の連携活動の進め方について話し合った。さらに、小学校第5学年の血液検査結果で何らかの異常がみられた児童の中学校第2学年での血液検査結果や生活習慣の変化等を追跡調査すること等を確認した。2.幼稚園、小中学校等における生活習慣病予防の講演会:研究代表者は、幼稚園、小学校、中学校等において計10回の講演会を実施し、子どもの健康的な生活習慣の重要性と家族で生活習慣を見直すことの大切さについて児童生徒および保護者に対して説明した。3.幼稚園の子どもと両親の生活習慣に関する質問紙調査:K市立の3つの幼稚園の幼児384人(参加率82.8%)とその父親359人、母親382人を対象に生活習慣に関する質問紙調査を実施した。その結果、21時すぎに就寝する幼児は、子どもの生活リズムに対する母親の意識が低い、夜食を摂取する、寝つきが悪い、睡眠時間が10時間未満、寝起きが悪い、朝食を毎日摂取しない、朝食のバランスがよくない等の割合が21時までに就寝する子どもと比べて有意に高かった。さらに親子の生活習慣等の関連を検討した結果、体格、就寝時刻は母親と有意な正の相関がみられ、起床時刻、テレビ・DVD・ゲームの時間、朝食・夜食の摂取、朝食のバランス、運動頻度等は両親と有意な正の相関がみられた。1.小中学校の養護教諭および関係機関との連携会議:K市の小中学校の養護教諭研修会で、平成26年度に実施した幼稚園の子どもと家族の生活習慣質問紙調査の結果について説明した。そこで平成27年度は、K市北部地区の保育園・幼稚園、小中学校において親子の生活習慣質問紙調査を実施することを決め、教育委員会学校教育課、次世代育成部子ども課の承認の元で各学校長、園長の協力を得て調査を実施することになった。2.保育園・幼稚園、小中学校の子どもと家族の生活習慣質問紙調査:平成27年10月に質問紙調査を実施し、K市北部地区の保育園・幼稚園の4歳児、小学校の第2学年、第5学年、中学校の第2学年の合計1,449人(回答率82.2%)の子どもと父親1,271人、母親1,423人から回答を得た。集計概要は、1テレビゲームのプレイ時間は、すべての学年で男子は女子に比べて時間が長い、2スマートフォンの利用時間は、中学生の女子は男子より時間が長い、3子どもの就寝直前の行動でメディアを利用する子どもは、高学年になるほど割合が高い、4子どもの朝食で主食と主菜と副菜がそろった3食組合せの割合は約4割等であった。親子の生活習慣等で相関がみられた項目は、1子どもと両親では、テレビ・DVD視聴時間、テレビゲームプレイ時間、体格、朝食の料理の組合せ、夜食の摂取、夕食後の外出等、さらに2子どもと母親では、就寝時刻、起床時刻、就寝時刻の規則性であった。3.幼稚園、小中学校等における生活習慣病予防の講演会:幼稚園、小学校、中学校等において講演会を実施し、保護者、児童、生徒に対して健康的な睡眠・生活リズムの重要性と家族で生活習慣を見直すことの大切さ等を説明した。4.他市教育委員会学校保健会研修会における生活習慣病予防の講演会:近隣他市の小中学校長、保健主事、養護教諭の研修会において、K市の取り組みや研究成果について説明した。

K市小中学校養護教諭の研修会および関係機関との連携会議を実施し、平成26年11月に研究代表者が実施したK市立幼稚園の35歳児計384人(参加率82.8%)とその父親359人、母親382人の生活習慣質問紙調査およびその結果について共通理解を図ることができた。子どもの就寝時刻が遅い群は早く就寝する群に比べて、テレビ・DVDの視聴時間が長く、就寝時刻が不規則で睡眠時間が短く、起床時刻が遅く、朝食を毎日摂取する割合が低く、朝食のバランスがとれている割合が低かった。さらに、子どもの生活リズムに対する保護者の意識が低かった。また、親子の生活習慣等の関連を検討した結果、起床時刻、テレビ・DVD視聴時間、テレビゲームプレイ時間、朝食の摂取、朝食のバランス等は子どもと両親の間で有意な正の相関がみられた。子どもの生活リズムを保護者が意識することは、幼児の規則正しい睡眠や栄養バランスのよい食事等の健康的な生活習慣の確保に必須である。子どもの生活習慣は家族の影響が大きく、幼児期から親子で生活習慣を整える必要性が示された。これらの調査結果を各園に報告すると共に幼児の保護者に対して調査報告書を作成して配付し、さらに調査報告会を開催して説明した。研修会や連携会議を通じて実態調査の流れやその結果等について理解を図り、小中学校における実態についても調査をして、児童生徒および保護者に対する保健指導等に活かす必要性について共通認識することができた。そこで、平成27年度はK市の北部地区の2つの中学校区の小中学校、保育園・幼稚園の子どもと家族を対象にした質問紙調査を計画し、関係機関の協力を得て実施することができた。1.研究成果の発表:査読付き論文「幼児・児童・生徒の睡眠・生活リズムに関連する要因の検討」を発表し、その概要について学会発表した。子どもの睡眠・生活リズムに関連する要因として幼児期から就寝時刻の規則性やテレビゲームの利用等があげられ、さらに児童・生徒ではスマートフォンの利用も影響していた。子どもの生活リズムを保護者が意識するとともに子ども自身が意識することは、健康的な生活習慣の確立に不可欠であり、幼児期から親子で楽しく学習できる環境を整える必要性が示唆された。2.小中学校の養護教諭との連携会議:K市の小中学校の養護教諭研修会で、平成27年10月に実施したK市北部地区の保育園、幼稚園、小学校、中学校における親子の生活習慣質問紙調査の結果について説明し、小中学校における保健指導の重要性について共通理解を得た。3.保育所、幼稚園、小中学校等における生活習慣病予防の講演会:子育て支援センター、保育所、幼稚園、小学校、中学校等において講演会を実施し、保護者、児童、生徒に対して健康的な睡眠・生活リズムの重要性と家族で生活習慣を見直すことの大切さ等を説明した。4.保健所における生活習慣病対策研修会:愛知県内の保健所において、管内の小中学校の養護教諭、市町村役場の保健師、栄養士、歯科衛生士等に対して、K市の取り組みや研究成果について説明し、子どもの時期から生活習慣病予防教育に取り組む必要性や親子で取り組むことの意義について助言した。K市小中学校養護教諭との連携会議を実施し、平成27年10月に研究代表者が実施したK市の北部地区の2つの中学校区の保育所、幼稚園、小中学校の子どもと保護者を対象にした生活習慣質問紙調査の結果について共通理解を図ることができた。
マウス細胞内に存在する低分子ＲＮＡの高次構造に基づく網羅的解析

マウスの脳に由来するRNAについて次世代シーケンサーによる配列解析等を行い,約1億配列を得た.二次構造予測とその結果に基づくクラスタリングを行うシステムを開発し,解析を行った結果, 16個の新規低分子RNA候補,MsncR(mouse structured non-coding RNA)を見出した.ノーザン解析による発現評価を行い,予想よりも小さいRNAの存在を示唆するものがあった.MsncR-11は,ミトコンドリアtRNA遺伝子の裏鎖に相当するRNAである.NMR法による解析により,MsncR-11は,tRNAのアクセプタステムとTステムに相当する二次構造を形成していることが示唆された.マウスの脳に由来するRNAについて次世代シーケンサーによる配列解析等を行い,約1億配列を得た.二次構造予測とその結果に基づくクラスタリングを行うシステムを開発し,解析を行った結果, 16個の新規低分子RNA候補,MsncR(mouse structured non-coding RNA)を見出した.ノーザン解析による発現評価を行い,予想よりも小さいRNAの存在を示唆するものがあった.MsncR-11は,ミトコンドリアtRNA遺伝子の裏鎖に相当するRNAである.NMR法による解析により,MsncR-11は,tRNAのアクセプタステムとTステムに相当する二次構造を形成していることが示唆された.本研究計画では,遺伝学的,生化学的,および構造生物学的アプローチを駆使して,マウス由来の新規低分子RNAの解析を進めている.平成24年度における研究実績は次のとおりである.1)低分子RNA候補の二次構造解析とクラスタリングマウスの脳に由来するRNAおよびマウスのES細胞に由来するRNAついて次世代シーケンサーによる配列解析を行うことによって得られた配列データを用い,二次構造に基づくクラスタリングを進めている.脳については約1億配列,ES細胞については約6千億配列が得られている.脳に由来するデータについては,解析をほぼ完了し,10を超える新規低分子RNA候補を見出した.2)低分子RNA候補の立体構造形成スクリーニング多数の低分子RNA候補について,その立体構造形成を迅速に評価するための,NMR試料管内転写法を開発し,構造既知のRNAについて適用することによって,その有用性を実証した.また,プロジェクトで見出したいくつかの候補RNAについて,実際に適用した.3)配列解析マウスES細胞が神経細胞に分化する過程のさまざまな段階の細胞から低分子RNAを抽出し,その配列解析を進めている.4)ノーザン解析プロジェクトでこれまでに見出した低分子RNA候補について,ノーザン解析を行い,発現の確認を行った.その結果,3つのRNAについて強い発現を確認し,また,4つのRNAについて弱い発現を確認した.本研究計画では,遺伝学的,生化学的,および構造生物学的アプローチを駆使して,マウス由来の新規低分子RNAの解析を進めている.平成25年度における研究実績は次のとおりである.1)低分子RNA候補の二次構造解析とクラスタリング:マウスの脳に由来するRNAついての次世代シーケンサーによる配列解析から得られた約1億配列の解析を終了し,現在投稿論文を作成中である.また,マウスES細胞から得られた約6千億配列およびES細胞から神経細胞に分化する過程でのさまざまな段階の細胞から得られたそれぞれ約1千万配列についても解析を進めており,新規低分子RNAの候補を数個見出している.2)低分子RNA候補の立体構造形成スクリーニング:新規スクリーニング手法であるNMR試料管内転写法については論文投稿中である.この手法をこれまでに見出した低分子RNA候補に適用し,安定な立体構造を形成するRNAを探索している.3)ノーザン解析:次世代シーケンサーによる配列解析によって見出した新規低分子RNA候補の発現量等を確認するため,マウスのさまざまな組織からRNAを抽出し,ノーザン解析を行った.昨年度までに,3つのRNAについて強い発現,4つのRNAについて弱い発現を確認しているが,今年度は暫定的にS4-11と命名したRNAが,ほとんどの組織で100残基程度として発現していること,また,いくつかの臓器ではさらに短い断片として発現していることが示唆された.4)低分子RNA候補の立体構造解析:次世代シーケンサーによる配列解析によって見出した候補であるS4-11およびS4-22について,NMR法による構造解析を進めた.イミノプロトンシグナルの解析から,それぞれ単一のコンホメーションを形成していることが示唆された.一方,SAT遺伝子座からの発現が確認されている新規低分子RNA候補についてもNMR法による構造解析を進めている.本研究計画では,遺伝学的,生化学的,および構造生物学的アプローチを駆使して,マウス由来の新規低分子RNAの解析を進めている.平成26年度における研究成果は次の通りである.1)低分子RNA候補の二次構造解析とクラスタリング:マウスの脳に由来するRNAの解析の結果,16種類の新規RNA候補を見出した.これらをMsncR(mouse structured non-coding RNAに由来)と呼ぶこととした.この成果をまとめ,論文として発表した(雑誌論文1).2)低分子RNA候補の立体構造スクリーニング:新規スクリーニング手法としてINTT法(in NMR tube transcriptionに由来)を開発し,論文として発表した(雑誌論文2).3)ノーザン解析:16種類の新規RNA候補の発現を確認するため,得られたcDNA配列をもとにプローブを作製し,ノーザンハイブリダイゼーションを行った。このうち,明確なシグナルが得られたものは1種類であったが,その大きさに関してはcDNA配列と矛盾する点があった。継続して解析を行っている。