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超高感度表面増強近赤外分光法の開発とその非破壊血液分析への応用

近赤外(NIR)分光法はその場測定可能な非破壊分析法として多方面へ応用されている.しかし,NIR領域における吸収は微弱なため,微少な試料の測定には不向きであった.そこで表面プラズモン共鳴(SPR)を利用した超高感度なNIR分光法,SPR-NIR分光法の開発を行った.この方法は実屈折率応答型SPRセンサで汎用されるKretschmann配置に基づき,複素屈折率の虚部,即ち試料の吸光度を増強させて観測するものである.前年度,フレネルの式を用いた光学設計に基づいて作製したKretschmann配置型の測定用アタッチメントに,温度調整機能を備えたフローセルを新たに追加した.これにより同一の光学条件で濃度の異なる溶液などを連続して測定することが可能になった.具体的実験としてはアルコール水溶液,グルコース水溶液などを用いて濃度の定量が可能であることを示した.溶質濃度の定量としては主に2種の方法を提案した.1)SPRピークの変化から直接測定する方法この方法ではSPRを使わない場合に比べて数百倍の感度が得られるが,従来のLambert-Beerの法則に基づくスペクトル解析は使用できないため,センサとしての使用が期待できる.2)共鳴から外れた条件を用いる方法.この方法で得られるスペクトルは吸光度の増強は高々数十倍だが,従来のスペクトルと同様に扱うことが出来ることが明らかになった.このように吸光度が高感度に測定できるSPR-NIR分光法だが,これに加えて屈折率のスペクトルも同時に測定できることを示した.これはクラマース・クローニッヒの関係を使わない吸収一屈折率の分離であり,外部参照値を使わずに正しい屈折率を算出する全く新しい方法である.屈折率からも溶質濃度の定量は可能であるが,この方法はむしろこれまで注目されてこなかった,近赤外領域における材料の光学定数決定に役立つものと考えられる.近赤外(NIR)分光法はその場測定可能な非破壊分析法として多方面へ応用されている.しかし,NIR領域における煩収は微弱なため,微量分析には不向きであった.そこで表面プラズモン共鳴(SPR)を利用した超高感度なNIR分光法,SPR-NIR分光法の開発を行った.この方法は実屈折率応答型SPRセンサで汎用されるKretschmann配置に基づき,複素屈折率の虚部,即ち試料の吸光度を増強させて観測するものである.フレネルの式を用いた光学設計に基づき,Kretschmann配置型の測定用アタッチメントを作製した.水や各種溶媒をサンプルとし,入射光の角度及び金薄膜の厚さを変えて測定した.なお,スペクトルの測定は光ファイバーで連結されたFT-NIR分光若芽を用いた.偏光子の回転並びに入射角度変化はステッピングモーターによりスペクトル測定と連動して自動的に行うことができる.この方法で水のOH伸縮振動の倍音の吸光度が10倍以上に増強されることを実験的に示した.また,その様子がフレネルの式でほぼ完全に再現できた.この方法の特徴をまとめると以下のようになる.(1)試料を選ばず,水以外の液体でも同様に10倍以上の吸光度増強が期待される.(2)nLオーダーの極微量な試料があれば定量測定が可能である.(3)プラズモン共鳴条件のシフトから屈折率の微細な変化も同時に評価できる.しかしSPR-NIR分光法で得られるスペクトルはSPRピークと試料の吸収スペクトルの単純な足し合わせではない.よって今後は理論的なレベルから解析法を創出する必要がある.次年度は特に血中糖度の定量のため,ケモメトリックス等のスペクトル解析法を含む総合的な測定法に発展させる.近赤外(NIR)分光法はその場測定可能な非破壊分析法として多方面へ応用されている.しかし,NIR領域における吸収は微弱なため,微少な試料の測定には不向きであった.そこで表面プラズモン共鳴(SPR)を利用した超高感度なNIR分光法,SPR-NIR分光法の開発を行った.この方法は実屈折率応答型SPRセンサで汎用されるKretschmann配置に基づき,複素屈折率の虚部,即ち試料の吸光度を増強させて観測するものである.前年度,フレネルの式を用いた光学設計に基づいて作製したKretschmann配置型の測定用アタッチメントに,温度調整機能を備えたフローセルを新たに追加した.これにより同一の光学条件で濃度の異なる溶液などを連続して測定することが可能になった.具体的実験としてはアルコール水溶液,グルコース水溶液などを用いて濃度の定量が可能であることを示した.溶質濃度の定量としては主に2種の方法を提案した.1)SPRピークの変化から直接測定する方法この方法ではSPRを使わない場合に比べて数百倍の感度が得られるが,従来のLambert-Beerの法則に基づくスペクトル解析は使用できないため,センサとしての使用が期待できる.2)共鳴から外れた条件を用いる方法.この方法で得られるスペクトルは吸光度の増強は高々数十倍だが,従来のスペクトルと同様に扱うことが出来ることが明らかになった.このように吸光度が高感度に測定できるSPR-NIR分光法だが,これに加えて屈折率のスペクトルも同時に測定できることを示した.これはクラマース・クローニッヒの関係を使わない吸収一屈折率の分離であり,外部参照値を使わずに正しい屈折率を算出する全く新しい方法である.

屈折率からも溶質濃度の定量は可能であるが,この方法はむしろこれまで注目されてこなかった,近赤外領域における材料の光学定数決定に役立つものと考えられる.
近代七宝に用いられた釉薬の技術史的・文化財科学的研究

今年度は、近代七宝の釉薬について、製造技術的な観点から以下の4点の研究を実施した。1近代七宝釉薬の再現実験を行った。ワグネル(1831-1892)の京都舎密局での講義録をもとに、基礎となる透明釉薬の配合を決定した。基礎釉に対して3元素(Co・Cu・Mn)の着色材の配合を変えたテストピースを作製し、元素量と色調変化の関係を検討した。結果、2元素の混合でも着色材の割合が増加すれば黒色化し、基礎釉に対して10%を越えると釉表面が光沢を失い、15%以上では結晶が生じた。基礎釉の組成、冷却速度など考慮せねばならないが、着色材の含有量には一定の制限があることが明らかとなった。引き続き様々な配合で実験する予定である。2分光光度計による七宝釉薬の色調測定法の標準化に向けた研究を行った。しかし、七宝釉薬の外見は、色調以外に透明度や光沢度、下地色などへの考慮が必要で、分光光度計の測定では色調の測定は可能であったが、光沢感や透明感を含めた釉薬の外見を科学的に表示することは困難であった。今後、光沢計などを用いてさらなる検討を行い、測定法の確立を目指す。3近代七宝の製造技術について時期的変遷や陶磁器やガラスなどの異業種との関係性を考察するため文献調査を行った。特に釉薬の原料配合の記載の捜索とデータ入力を行なった。その中での一番の成果は、高松豊吉(1852-1937)が記した『ON JAPANESE PIGMENTS』中に1878年当時の並河七宝釉薬の科学分析に関する記載を発見したことである。記載の検討は今後の課題だが、初期の並河七宝の技術的水準をはかることができる重要なデータである。4近代七宝との比較として、江戸や長崎の近世遺跡から出土したガラスや色絵磁器の科学分析を実施した。以上の研究により、近代七宝業における釉薬製造技術について限定的だが基礎的なデータを得ることができた。今後も研究を継続し、七宝と陶磁器などとの技術的な関連性から近代七宝の特性を詳らかにしたい。
糖尿病の病態におけるメチル水銀の動態・毒性発現の修飾機構

メチル水銀曝露に対する感受性要因の解明において、様々な生理的条件下におけるメチル水銀の生体内動態の変化を明らかにすることは必須である。メチル水銀の動態・代謝の修飾因子の一つとして疾患に伴う代謝異常が挙げられる。従来の研究において、摂取したメチル水銀の各組織への移行・蓄積は疾患由来の代謝異常の影響を受ける可能性が示唆されているが、これまで糖尿病の罹患状態における水銀の動態については明らかになっていない。本研究においては糖代謝異常がメチル水銀の動態に及ぼす影響の解明を目的として、KK-Ay(2型糖尿病モデル)及びBL/6(正常:コントロール)マウスを用いて、Kp値(組織/血漿中の水銀濃度)を指標としたメチル水銀の生体内動態や各組織への移行性の比較を行っている。これまで12週齢のKK-Ay、BL/6マウスにメチル水銀(10 mg Hg/kg BW)を単回投与し、24時間後の血液(血漿、血球)及び組織(脳、腎臓、肝臓)中の総水銀の測定・解析を行った。その結果、12週齢マウスにおけるメチル水銀の脳への移行性は、KK-Ay>BL/6の傾向が観察された。Kp値の適切な比較を行うために、投与したメチル水銀濃度と血中水銀濃度が用量依存的にほぼ比例して減少傾向を示す条件下のデータを用いることが必要である。これまで、H29、H30年度に各マウスに3点の濃度のメチル水銀を単回投与し、23週間にわたる3点のタイムポイントにおいて、血液(血漿、血球)及び組織(脳、腎臓、肝臓、膵臓)中の総水銀濃度の測定を行った。現在、得られたデータに関して統計学的解析を行っている。KK-Ay、BL/6マウス各グループに約一か月の投与・解剖実験が必要である。一回の試験の各タイムポイントにおいて、マウス1グループあたりの実験可能な最大数はn=3なので、統計学的解析を行う上で少なくとも2回以上の試験を実施する必要がある。得られる試料数が非常に多いため(各メチル水銀投与濃度、各タイムポイント)、水銀濃度の測定に長時間を要する。その際、血液及び各組織中のサンプル処理や水銀分析の条件決定においても検討を要する。H30年度までに実施したKK-Ay、BL/6マウス各グループの血液(血漿、血球)及び各組織中の水銀濃度の経時的変動に関する結果に関して統計学的解析を行っている。解析結果を踏まえ、メチル水銀の組織移行に関連することが報告されている因子(タンパク質等)の発現に関する検討を行う予定である。これらの実験結果をまとめ、学会発表、及び論文として投稿する予定である。レビュアーからの審査結果に基づき、必要に応じて追加実験を行う。メチル水銀の毒性発現の解明において、メチル水銀の生体内動態を明らかにすることがキーである。メチル水銀の動態・代謝の修飾因子の一つとして疾患に伴う代謝異常が挙げられ、従来の研究において、摂取したメチル水銀の各組織への移行・蓄積は疾患由来の代謝異常の影響を受ける可能性が示唆されているが、これまで糖尿病などのメタボリックシンドロームの罹患状態における水銀の動態については明らかになっていない。本研究においては糖尿病に伴う糖代謝異常がメチル水銀の動態に及ぼす影響の解明を目的として、KK-Ay(2型糖尿病モデル)およびBL/6(コントロール)マウスを用いて、Kp値(組織/血漿中の水銀濃度)を指標としたメチル水銀の生体内動態や各組織への移行性の比較を行う。今年度は、Kp値の適切な比較を行うためのメチル水銀の曝露条件を確立するために、12週齢のKK-Ay、BL/6マウスにメチル水銀(10 mg Hg/kg BW)を単回投与し、24時間後の血液(血漿、血球)及び組織(脳、腎臓、肝臓)中の総水銀の測定・解析を行った。また、実験動物におけるメチル水銀の体内動態を解析するために、H29年度受理された魚介類中のメチル水銀の簡易分析法(Yoshimoto K, et.al. (2016) J Toxicol Sci 41: 489-500)のマウス組織への適用試験を行い、少量(15-100 mg)の組織(脳、腎臓、肝臓)中の総水銀・メチル水銀は正確に測定可能との結果を得た。予試験として行ったメチル水銀の動態に関する検討において、仮説に沿うことが想定される結果を得ることができた。また、マウスの各組織(脳、腎臓、肝臓)中の総水銀・メチル水銀測定に関して当研究グループが開発した新規な分析法による検討を行った結果、良好な結果が得られた。一方、水銀分析計の不具合の調整と、血液(血漿、血球)および各組織中の水銀分析条件の検討に時間を要したため、やや進捗状況が遅れている。H29年度:メチル水銀の毒性発現の解明において、メチル水銀の生体内動態を明らかにすることがキーである。従来の研究において、摂取したメチル水銀の各組織への移行・蓄積は疾患由来の代謝異常の影響を受ける可能性が示唆されているが、これまで糖尿病などのメタボリックシンドロームの罹患状態における水銀の動態については明らかになっていない。

本研究においては糖尿病に伴う糖代謝異常がメチル水銀の動態に及ぼす影響の解明を目的として、KK-Ay(2型糖尿病モデル)およびBL/6(正常:コントロール)マウスを用いて、Kp値(組織/血漿中の水銀濃度)を指標としたメチル水銀の生体内動態や各組織への移行性の比較を行う。これまで12週齢のKK-Ay、BL/6マウスにメチル水銀(10 mg Hg/kg BW)を単回投与し、24時間後の血液(血漿、血球)及び組織(脳、腎臓、肝臓)中の総水銀の測定・解析を行った。その結果、12週齢マウスにおけるメチル水銀の脳への移行性は、KK-Ay>BL/6の傾向が観察された。Kp値の適切な比較を行うためには、メチル水銀の曝露濃度と血中濃度の用量相関性を確認するために、投与したメチル水銀濃度と血中水銀濃度が用量依存的にほぼ比例して減少傾向を示す条件下のデータを用いることが必要である。そこで、今年度は3点の濃度のメチル水銀を単回投与し、23週間の3点の血漿中水銀濃度の経時的変動を追跡し、線形性が保たれる用量範囲を確認する実験を行っている。さらに本試験で得られた各組織中の水銀濃度を測定中である。KK-Ay、BL/6マウスグループそれぞれ約一か月の投与・解剖実験が必要であり、得られる試料数(各メチル水銀投与濃度、各タイミング)は非常に多いため、水銀濃度の測定だけでも長時間を要する。さらに、血液(血漿、血球)および各組織中のサンプル処理や水銀分析の条件検討に時間を要する。また、一回の試験の各ポイントにおけるマウスの最大数はn=3なので、統計学的解析を行う上で少なくとも2回以上の試験を実施する必要がある。今年度は最終年度なので、これまでの実験結果をまとめて論文化したい。メチル水銀曝露に対する感受性要因の解明において、様々な生理的条件下におけるメチル水銀の生体内動態の変化を明らかにすることは必須である。メチル水銀の動態・代謝の修飾因子の一つとして疾患に伴う代謝異常が挙げられる。従来の研究において、摂取したメチル水銀の各組織への移行・蓄積は疾患由来の代謝異常の影響を受ける可能性が示唆されているが、これまで糖尿病の罹患状態における水銀の動態については明らかになっていない。本研究においては糖代謝異常がメチル水銀の動態に及ぼす影響の解明を目的として、KK-Ay(2型糖尿病モデル)及びBL/6(正常:コントロール)マウスを用いて、Kp値(組織/血漿中の水銀濃度)を指標としたメチル水銀の生体内動態や各組織への移行性の比較を行っている。Kp値の適切な比較を行うために、投与したメチル水銀濃度と血中水銀濃度が用量依存的にほぼ比例して減少傾向を示す条件下のデータを用いることが必要である。これまで、H29、H30年度に各マウスに3点の濃度のメチル水銀を単回投与し、23週間にわたる3点のタイムポイントにおいて、血液(血漿、血球)及び組織(脳、腎臓、肝臓、膵臓)中の総水銀濃度の測定を行った。現在、得られたデータに関して統計学的解析を行っている。KK-Ay、BL/6マウス各グループに約一か月の投与・解剖実験が必要である。
ベシクルを利用した人工光合成系の創製

光合成は太陽光の有効利用の観点から注目されており、人工の光合成システムを構築することは大変重要である。本研究では、生物の光合成システムが分子膜を利用しながら構築されている点に着目し、太陽光を効率よく吸収するクロロフィル分子を分子膜内に配置させたベシクル(小胞体)を作成した。化学修飾したクロロフィル分子を効率よく分子膜内で集積化させることによって、光合成システムを模倣した光捕集システムを作成することに成功した。光合成生物の光捕集アンテナ系には多くのクロロフィル分子が含まれており、チラコイド膜と呼ばれる脂質分子膜内に存在する。このような生体膜を利用した光合成系を再現するため、本研究ではリボソームの脂質二分子膜内にクロロフィル誘導体を導入した人工光捕集アンテナの構築を目指した。まず、クロロフィルa分子から側鎖にアルキル鎖やオキシエチレン鎖を持つクロロフィル誘導体を合成した。つぎに、クロロフィル誘導体分子とジパルミトイルポスファチジルコリン(DPPC)との混合物からエクストルージョン法によりリボソームを作成した。このとき、水溶性の蛍光色素をリボソーム内に保持できたことから内水相を持つ小包体であることが確認できた。可視吸収スペクトルの結果から疎水性のクロロフィル誘導体は脂質二分子膜内に挿入されていることがわかった。さらに、脂質二分子膜内に挿入されるクロロフィル誘導体の量は側鎖の置換基によって変化することを見出し、長いオキシエチレン鎖をもつクロロフィル誘導体より多く二分子膜内に挿入されることがわかった。加えて、リボソームに導入したクロロフィル誘導体分子の間で励起エネルギー移動も確認できた。一方、緑色光合成細菌の膜外アンテナであるクロロゾームでは、クロロフィル分子が自己会合体を形成して光捕集の役割を果たしている。そこで本研究では、リボソームの二分子膜内でクロロフィル誘導体を自己会合させたクロロゾーム型の人工アンテナ系の構築を目指した。3位にヒドロキメチル基をもつ亜鉛クロロフィル誘導体の存在下でリボソームを作成するとクロロフィル誘導体の単量体の吸収(650nm)と比較して長波長シフトした吸収帯(743nm)を示し、脂質分子膜内で、クロロゾーム型のクロロフィル会合体を調製することに成功した。緑色光合成細菌の集光アンテナであるクロロゾームでは、バクテリオクロロフィル(BCh1)-c分子が自己会合体を形成して光捕集の役割を果たしている。これまでの研究から亜鉛クロリンの自己会合体がクロロゾームのモデルとして有効であることが明らかとなっている。そこで本研究では、亜鉛クロリンとリン脂質を用いてリポソームを調製し、その二分子膜内で亜鉛クロリンを自己会合させた集光アンテナモデルの構築を目指した。まず、3^1位にメトキシ基、17位のエステル部にヒドロキシデシル基を導入した亜鉛クロリンを合成し、亜鉛クロリンおよびホスファチジルコリンの混合物から亜鉛クロリンを脂質膜内に含むリポソームを作製した。このリポソーム溶液の可視吸収およびCDスペクトルの結果から、亜鉛クロリンは自己会合体を形成していることが確認できた。つぎに、蛍光スペクトルを測定したところ、亜鉛クロリン自己会合体からの発光が見られた。さらにエネルギーアクセプターとしてバクテリオクロリンを加えたところ、亜鉛クロリン自己会合体からの発光が消光し、新たにバクテリオクロリンからの発光が観測され、亜鉛クロリン自己会合体からバクテリオクロリンへのエネルギー移動が確認された。このようにして、天然の光合成系と同様に生体膜を反応場とした集光器官を構築することに成功した。一方、イオン性の親水性基をもつクロロフィル誘導体を新規に合成した。これらの両親媒性クロロフィル誘導体は水中で安定な自己会合体を形成することを確認し、また脂質二分子膜内に効率よく挿入できることも見出した。さらに、これらの両親媒性クロロフィル誘導体はポリペプチドとの複合体形成により、集光アンテナのモデル系を構築できることも明らかとなった。生体の光合成系は脂質二分子膜を反応場として、光捕集-エネルギー変換を行っている。そこで、リポソームの脂質二分子膜内にクロロフィルの誘導体を導入することで、光合成の光捕集機能を模倣したリポソームの作成を試みた。光合成の光捕集器官の中で、緑角光合成細菌はクロロゾームと呼ばれるバクテリオクロロフィル(BCh1)-c分子の自己会合体からなる集光アンテナを持っている。ここでは、クロロゾームのモデルとして有効である亜鉛クロリンの自己会合体を脂質二分子膜内に挿入した集光アンテナモデルの構築を目指した。まず、3^1位にメトキシ基、17位のエステル部にヒドロキシデシル基を導入した亜鉛クロリンを合成し、亜鉛クロリンおよびボスファチジルコリンの混合物から亜鉛クロリンを脂質膜内に含むリポソームを作製した。また、AFMおよび蛍光色素を封入する実験から、亜鉛クロリンを導入した状態でも球状リポソームの形態を保っていることを確認した。

また、エネルギーアクセプターとしてバクテリオクロリンを加えたところ、亜鉛クロリン自己会合体からの蛍光発光が消光し、新たにバクテリオクロリンからの発光が観測され、亜鉛クロリン自己会合体からバクテリオクロリンへのエネルギー移動が確認された。このようにして、天然の光合成系と同様に生体膜を反応場とした集光器官を構築することに成功した。加えて、親水性のオキシエチレン基をもつ種々の亜鉛クロリンを合成し、その会合体がクロロゾームと同様にロッド状の形態を示すことや、水酸基周りの立体配置の違いによって会合体の超分子構造が大きく変化することも見出した。
肝移植患者におけるミコフェノール酸の適正使用を目指した母集団薬物動態・薬効解析

本研究課題では、ミコフェノール酸の適正使用を目指して、臨床で使用される薬物との相互作用解析を中心に検討を行った。ラットを用いた実験の結果、ミコフェノール酸とmTOR阻害剤エベロリムスを併用投与した場合、ミコフェノール酸のグルクロン酸抱合代謝物の胆汁中排泄が抑制され、血漿中濃度が上昇することを見出した。本研究成果は、臨床におけるミコフェノール酸の薬物相互作用を理解する上で有用な情報になると考える。ミコフェノール酸モフェチル(MMF、ミコフェノール酸のプロドラッグ)は、移植後の拒絶反応を抑制する目的で、タクロリムスやシクロスポリンなどのカルシニューリン阻害剤と併用されることが多い。しかしながら、重篤な下痢などの副作用のために、MMFの服用中止を余儀なくされている症例がある。また、タクロリムスとミコフェノール酸を併用した場合、それぞれの薬物の至適投与法に関する情報は不足している。本研究では、ミコフェノール酸のみならず、主要な免疫抑制剤として汎用されているタクロリムスも解析対象とし、これら薬物の体内動態変動因子、及び副作用関連因子を解明することを目的とした。60名の成人生体肝移植患者を対象に、タクロリムスの母集団薬物動態解析を実施した。経口クリアランス(CL/F)に対する影響因子として、患者背景や臨床検査値、小腸及び移植肝MDR1やCYP3A4/5などの遺伝子情報を検討した。その結果、CL/Fは移植後14日目まで経日的に増大し、その後一定となることが明らかとなった。術直後のCL/Fは、小腸MDR1 mRNA発現量と有意に関連することが判明した。また、小腸CYP3A5*1アレルを有する患者は、*3/*3の患者と比べ術後経過に伴うCL/Fの回復速度が、1.47倍大きいことが明らかとなった。さらに、血清クレアチニンの上昇(術前ベースラインから0.5mg/dL以上)を指標に、タクロリムスによる腎機能障害を術後1年間に亘り評価した。その結果、腎機能障害の発現頻度は、ドナーではなくレシピエントのCYP3A5*3/*3の患者で有意に高いことが判明し、腎臓CYP3A5はタクロリムスによる腎機能障害と関連することが示唆された。研究計画初年度では、免疫抑制剤の体内動態変動因子、及び副作用関連因子に関する有用な情報を得ることができた。次年度以降、実施計画を進め、研究目標の早期達成を目指す。ミコフェノール酸(MPA)は、移植後の拒絶反応抑制剤として広く使用されている。カルシニューリン阻害剤による腎毒性を軽減する目的で、mTOR阻害剤のエベロリムスやMPAが投与される症例が存在するが、両薬物の相互作用やそれらを併用する場合の至適投与法に関する情報は乏しい。そこで本研究では、MPAとエベロリムスの薬物動態学的相互作用を明らかにすることを目的に、以下の検討を行った。まず、HPLC-UV法を用いたMPAとそのグルクロン酸抱合代謝物(MPAG)の同時定量法を確立した。MRP2欠損ラット(EHBR)を用いてMPA(5mg/kg)を静脈内投与した後、MPAGの胆汁中排泄はほぼ消失し、正常ラット(SDR)と比べてMPAGの血漿中濃度が顕著に上昇することが確認された。次に、エベロリムス(5mg/kg)をSDRの小腸内に投与した後、MPA(5mg/kg)を静脈内投与し経時的に採血した。その結果、MPAの血漿中濃度には影響が認められなかったが、MPAGの血漿中濃度は有意に上昇し、MPAGの胆汁中排泄率は有意に低下した。従って、エベロリムスは、MRP2を介したMPAGの胆汁排泄を抑制することによって、相互作用を惹起することが示唆された。以上、本研究成果に基づき、MPA/MPAGの薬物動態学的相互作用に関する有用な情報を得ることができた。今後、MPAの薬効解析を進め薬物動態情報と組み合わせることによって、MPA適正使用法へと発展できると考える。
抗微生物薬物療法に関する看護実践と看護継続教育の全国実態調査

質問紙調査1(研究課題1・研究課題2-1)の質問紙を作成した。研究課題1として,全国の特定機能病院,がん診療拠点病院,300床以上の地域医療支援病院に勤務する看護師を対象とした,「抗菌薬療法に関する看護実践と教育の現状」に関する質問紙を作成した。研究課題2-1として,同病院に勤務する感染管理担当看護師(感染管理認定看護師あるいは感染症看護専門看護師)を対象とした,「抗菌薬療法に関する職員教育とAST/ICTにおける活動の現状」に関する質問紙を作成した。質問紙は,感染管理および抗菌薬に関する専門的知識を有する専門家4名による内容妥当性の検討を経て修正した。研究課題1の調査内容は,施設特性・個人属性に関する項目(6項目),抗菌薬の準備に関する項目(4項目),抗菌薬の投与に関する項目(16項目),抗菌薬の血中濃度測定の採血に関する項目(6項目),抗菌薬治療の効果・副作用のアセスメントに関する項目(6項目),抗菌薬に関する教育についての項目(17項目)とした。研究課題2-1の調査内容は,抗菌薬治療に関する教育・指導の必要性の認識(18項目;5件法),抗菌薬治療に関する教育・指導の実施経験の有無(18項目;2件法),ASTまたはICTでの活動(21項目;2件法),施設特性(5項目),対象者の属性(7項目)とした。研究課題1と研究課題1-2について,研究者が所属する組織の倫理委員会の承認が得られ,各課題について,1012名を対象に予備調査を実施した。質問紙の郵送先施設として,全国の特定機能病院,がん診療拠点病院,300床以上の地域医療支援病院の全数抽出を行いかつ,その中から感染管理認定看護師あるいは感染症看護専門看護師が在職している病院を抽出し,リストアップを行った。2種類の質問紙を作成するにあたり,内容を吟味したこと,感染管理および抗菌薬に関する専門的知識を有する専門家4名による内容妥当性の検討を経て修正をはかったこと,質問紙の信頼性を確保するため,予備調査を実施したことにより,本調査実施の遅延が生じた。予備調査の結果を分析し,質問紙を修正し,調査項目の確定をはかる。本調査の質問紙の郵送先施設のリストアップは終了しているので,質問紙の修正後,速やかに本調査を開始する(67月)。全国調査であり,質問紙の郵送先の施設数が多いため,印刷と発送作業を業者に依頼し,発送の効率化をはかる。データ入力に関しては,データ入力に精通した人に入力を依頼し,入力期間の短縮化をはかる。データの分析に関しては,12月までに終わらせる。質問紙調査1の発送およびデータ入力期間中は,質問調査2(研究課題2-2)の質問紙の作成にとりかかり,今年度中に質問紙調査2に関する倫理委員会の承認を得る。

質問紙調査1の発送およびデータ入力期間中は,質問調査2(研究課題2-2)の質問紙の作成にとりかかり,今年度中に質問紙調査2に関する倫理委員会の承認を得る。2種類の質問紙を作成するにあたり,内容を吟味したこと,感染管理および抗菌薬に関する専門的知識を有する専門家4名による内容妥当性の検討を経て修正をはかったこと,質問紙の信頼性を確保するため,予備調査を実施したことにより,本調査実施の遅延が生じた。そのため,本調査における質問紙印刷・発送にかかる経費が未使用のため,次年度使用額が生じた。
DNAのCpGモチーフは魚類の免疫系を活性化するか

非メチル化・CpGジヌクレオチド(ODN)を含んでいるDNA分子は、哺乳類においてすぐれた免疫賦活作用があることが近年報告されている。しかし、これらのDNAのモチーフが魚類の免疫系に及ぼす作用についてはほとんど研究されていない。そこで本研究では、コイを用いてDNAのCpGモチーフの免疫賦活作用について検討した。CpGモチーフ含んだDNAは、腎臓の白血球の活性を有意に増強することが確認された。このCpGモチーフ含んだDNAを注射したコイの腎臓の白血球の貪食能は、コントロール魚に比べて有意な増加が確認された。さらに白血球のNBT活性も有意に増加した。また、血清中のリゾチーム活性もCpG-ODNsを津射した魚において増加が認められた。ODN BはODN Aよりも高い免疫賦活作用を示した。さらに、DNAのCpGモチーフは、インターロイキン1β、腫瘍壊死因子(TNF)の炎症性サイトカインの発現を増強した。これらの結果よりDNAのCpGモチーフはコイの非特異的免疫応答を増強する作用があることが示された。その結果、CpGモチーフ含んだDNAを注射したコイの腎臓の白血球の貪食能は、コントロール魚に比べて有意な増加が確認された。また、血清中のリゾチーム活性もCpG-ODNsを注射した魚において増加が認められた。このCpGモチーフ含んだDNAを注射したコイの腎臓の白血球の貧食能は、コントロール魚に比べて有意な増加が確認された.さらに白血球のNBT活性も有意に増加した。
音響学的考察に基づくコンクリート部材の劣化度診断技術の高度化

加振器を用いたコンクリート部材の周波数スイープ試験の方法を提示した.荷重や鉄筋腐食,凍結融解作用によって損傷を受けた試験体の共振周波数,減衰特性,高次モードの周波数比の変化などを整理した.さらに周波数特性の実測データを速度スペクトルに変換して,音声合成処理することにより,コンクリート部材の音色を再生する方法を示した.健全時のモードの周波数比が整数倍になる棒部材の縦振動に対して,音の高さの変化を聞き取ることにより,構造物の損傷程度を判断できる可能性が示唆された.特に,地震などによって大きなひび割れが生じた場合などには,本手法によって損傷判定が容易に行えると考えられる.本研究課題は,振動試験によって得られる周波数特性(周波数伝達関数)の測定値を用いてコンクリート部材の音色を聴く技術を構築し,これをコンクリート部材の健全性評価に応用するものである.具体的には,(1)加振器を用いたコンクリート部材の強制加振試験(ハードウェア技術開発),(2)周波数特性に基づくコンクリート部材の音色の再生(ソフトウェア技術開発),(3)音色の変化に着目したコンクリート部材の健全性評価(アプリケーションへの応用)を検討する.平成24年度の研究によって得られた成果を以下に示す.(1)加振器を用いたコンクリート部材の強制加振試験:動電式加振器を用いた強制加振試験の方法を考案し,寸法や形状が大きく異なるコンクリート供試体,および実構造物の振動試験を行った.これらの構造諸元および加振条件と測定精度を整理し,提案する強制加振試験によって精緻に周波数特性が測定できる構造諸元と加振条件の関係を整理した.(2)周波数特性に基づくコンクリート部材の音色の再生:上記(1)の強制加振試験によって得られる周波数特性の逆フーリエ変換によって時刻歴の波形データを作成し,これをオーディオファイル(RIFF waveform Audio Format)に書き換えるソフトウェア技術を構築した.さらに,人間の耳に聞き取りにくい高周波数成分をフィルター除去し,平均律に基づく音階と旋律を与えて波形合成することにより,コンクリート部材の周波数特性や音響特性を人間の耳に聞き取りやすい音色や音楽として再生することができた.本研究課題は,加振器を用いた周波数スイープ試験によってコンクリート部材の周波数特性を精緻に計測し,波形データを処理することによって人の耳に聴き取りやすい音色を再生する.さらに,コンクリート部材の音色の変化に着目して,損傷度判定を試みるものである.これまで載荷や鋼材腐食によって生じたコンクリート部材のひび割れに対して,共振周波数,減衰定数,高次モードの周波数比の変化を整理した.さらに,周波数特性(周波数ー応答加速度関係,位相特性)のデータを速度スペクトルに変換して波形処理することによって,音色を再生することができた.特に,単音で聴く場合よりも旋律に乗せることによって,音程や音色を容易に判定することができた.棒部材の縦振動など,健全時にモードの周波数比が整数倍になる場合には,旋律を奏でた際にストレスなく音色や音程を聴くことができた.しかし,損傷を受けた場合には,モードの周波数比の調和が崩れるため,不快な和音が聴こえた.また,部材の形状と損傷状況によっては音程や減衰が大きく変化するため,澄んだ音色が濁った低い音に変化することも確認できた.健全時のモードの周波数比が整数倍になる棒部材の縦振動や,単純ばりのたわみ振動などに対して,本提案技術を用いて音色や音程を聴き取り,その変化から構造物の損傷を評価できる可能性が示唆された.特に,地震などの大きな力の作用によって部材に大きなひび割れが生じた場合などには,損傷度判定が容易に行えると考えられる.加振器を用いたコンクリート部材の周波数スイープ試験の方法を提示した.荷重や鉄筋腐食,凍結融解作用によって損傷を受けた試験体の共振周波数,減衰特性,高次モードの周波数比の変化などを整理した.さらに周波数特性の実測データを速度スペクトルに変換して,音声合成処理することにより,コンクリート部材の音色を再生する方法を示した.健全時のモードの周波数比が整数倍になる棒部材の縦振動に対して,音の高さの変化を聞き取ることにより,構造物の損傷程度を判断できる可能性が示唆された.特に,地震などによって大きなひび割れが生じた場合などには,本手法によって損傷判定が容易に行えると考えられる.本研究課題は,振動試験データに基づきコンクリート部材の音色を聴く技術を構築し,これをコンクリート部材の健全性評価に応用するものである.具体的には,(1)加振器を用いたコンクリート部材の強制加振試験(ハードウェア技術開発),(2)周波数伝達関数に基づくコンクリート部材の音色の再生(ソフトウェア技術開発),(3)音色の変化に着目したコンクリート部材の健全性評価(アプリケーションへの応用)を検討する.平成23年度は,上記(1)(2)について重点的に取り組んだ.平成23年度の研究によって得られた成果を以下に示す.(1)加振器を用いたコンクリート部材の強制加振試験導電式加振器を用いた強制加振試験の方法を考案し,道路橋のコンクリート床版とコンクリート主桁の現場試験を行った.その結果,提案する振動試験方法は,既存技術と比較して高い試験精度を有することが確認できた.さらに,加振器周りの局所的な振動特性の評価も可能となり,着目する部位の周波数伝達関数を得ることができた.(2)周波数伝達関数に基づくコンクリート部材の音色の再生上記(1)の強制加振試験によって得られる周波数伝達関数の逆フーリエ変換によって時刻歴の波形データ(以下,元波形)を作成し,これをオーディオファイル(RIFF waveform Audio Format)に書き換えるソフトウェア技術を構築した.

さらに,元波形を用いて平均律に基づく音階と旋律を合成することにより,コンクリート部材の周波数特性や音響特性を人間の耳に聞き取りやすい音色や音楽として再生することができた.本研究課題に取り組む前に行った基礎研究の成果が優れていたため,当初の計画以上に研究が進展した.本研究課題に取り組む前に行った基礎研究の成果が優れていたため,当初の計画以上に研究が進展した.凍害や塩害,疲労などの劣化・損傷を模擬したコンクリート供試体を作製する.広範な諸元と多様な劣化性状,損傷レベルに対して供試体の振動試験を行い,音色の変化によって検知可能な諸元,劣化性状および損傷レベルを整理する.本研究課題は,(1)加振器を用いたコンクリート部材の強制加振試験(ハードウェア技術開発),(2)周波数伝達関数に基づくコンクリート部材の音色の再生(ソフトウェア技術開発),(3)音色の変化に着目したコンクリート部材の健全性評価(アプリケーションへの応用)に取り組む.このうち(1)(2)は平成23年度に技術的な基盤を築いており,平成24年度にはこれらの技術のさらなる高度化を目指す.また,平成24年度には,上記(3)の検討を新たに開始する.具体的には,鉄筋コンクリート部材の供試体を作製し,凍結融解試験と鋼材腐食促進試験を実施する.これらの鉄筋コンクリート供試体の振動試験を行い,劣化レベルと音色の変化を整理する.そして,音色の変化に着目したコンクリート部材の健全性評価の可能性を検討する.凍結融解試験,電食試験,載荷試験に使用するコンクリート供試体の作製費用,実験消耗品費,および研究打ち合わせや現場試験に係る旅費に充てる.次年度使用額は,今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額であり,平成24年度請求額とあわせて,次年度に計画している研究の遂行に使用する予定である.
ＩｇＡ腎症進行にインフラマソームが果たす役割の解析とその応用による新治療法の開発

IgA腎症でみられる糸球体炎症でNLRP3インフラマソームが役割を有するかを明らかにするために、NLRP3インフラマソーム、およびその活性化の結果産生されるIL-1β・IL-18の遺伝子発現を、IgA腎症患者の腎生検組織を用いて解析した。IgA腎症(組織重症型、軽症型)と、対照として無症候性蛋白尿の腎生検組織におけるNLRP3、CASP1 (caspase 1)、IL-1β、IL-18それぞれの遺伝子発現を検討し、患者では2年間の治療前後の比較もした。その結果、NLRP3、CASP1、IL-1βで患者と対照間に有意な差を認め、本症発症への関与が示唆され、疾患特異的治療の基礎データが得られた。IgA腎症8例(組織重症型3例、軽症型5例)と、対照として無症候性蛋白尿7例の腎生検組織におけるNLRP3、CASP1(caspase 1)、IL-1β、IL-18それぞれの遺伝子発現を検討し、患者では2年間の治療前後の比較もした。これまでの結果として、患者と対照間に有意な差はなく、治療前後でも有意な差はみられなかった。NLRP3インフラマソーム関連遺伝子多型がIgA腎症の発症・進展に関与するかを明らかにするために食物アレルギーとの関連が証明されている一塩基多型rs4612666とrs10754588につき、IgA腎症患者52名と対照103名において解析した。結果として、rs4612666(Genotype frequencies、C/C:0.5871、C/T:0.3419、T/T、0.071、Allele frequencies、C:0.7581、T:0.2419)、rs10754588(Genotype frequencies、G/C:0.5548、C/C:0.2258、G/G:0.2194、Allele frequencies、C:0.5032、G:0.4968)を得た。患者と対照を比較したところ、rs4612666において、ドミナント、レセッシブ、コドミナント、アレルの全てのモデルにおいて有意な差がみられ、アレル比においてはP=0.00088、オッズ比2.4(95%CI[1.4-4.2])であった。リスクアレルの役割が既報と逆であるため、今後の検討が必要であるが、rs4612666のNLRP3インフラマソームの疾患発症への関与が示唆された。IgA腎症8例(組織重症型3例、軽症型5例)と、対照として無症候性蛋白尿7例の腎生検組織におけるNLRP3、CASP1 (caspase 1)、IL-1β、IL-18それぞれの遺伝子発現を検討し、患者では2年間の治療前後の比較もした。無症候性蛋白尿群に比べIgA腎症群でNLRP3、Caspase1、IL-1βの遺伝子発現が有意に増加していたが、IL-18では両群に有意な差はなかった。各分子のIgA腎症軽症重症間での差は認めなかった。NLRP3インフラマソーム関連遺伝子多型がIgA腎症の発症・進展に関与するかを明らかにするために食物アレルギーとの関連が証明されている一塩基多型rs4612666とrs10754588につき、IgA腎症患者148名と対照103名において解析した。結果として、rs4612666(Genotype frequencies、C/C:0.53、C/T:0.37、T/T:0.1036、Allele frequencies、C:0.71、T:0.29)、rs10754558(Genotype frequencies、G/C:0.51、C/C:0.27、G/G:0.21、Allele frequencies、C:0.53、G:0.47)を得た。

患者と対照を比較したところ、rs4612666において、ドミナントモデルP=0.005;オッズ比0.23 (95%CI[0.077-0.69])、レセッシブモデルP=0.0002、オッズ比0.38 (95%CI[0.22-0.63])、コドミナントモデルP=0.0003、アレルP=0.00002、オッズ比2.5 (95%CI[1.6-3.8])と有意な差がみられ、Tアレルが発症危険因子であった。rs10754558においては有意な差はみられなかった。両多型において症例の臨床・病理的因子との有意な相関はみられなかった。リスクアレルの役割が食物アレルギーと逆であるため今後の検討が必要であるが、rs4612666のNLRP3インフラマソームの疾患発症への関与が示唆された。IgA腎症でみられる糸球体炎症でNLRP3インフラマソームが役割を有するかを明らかにするために、NLRP3インフラマソーム、およびその活性化の結果産生されるIL-1β・IL-18の遺伝子発現を、IgA腎症患者の腎生検組織を用いて解析した。IgA腎症8例(組織重症型3例、軽症型5例)と、対照として無症候性蛋白尿7例の腎生検組織におけるNLRP3、CASP1 (caspase 1)、IL-1β、IL-18それぞれの遺伝子発現を検討し、患者では2年間の治療前後の比較もした。その結果、NLRP3、CASP1、IL-1β、で患者と対照間に有意な差を認め、本症発症への関与が示唆された。しかし、治療前後、軽症重症間で有意な差はみられなかった。NLRP3インフラマソーム関連遺伝子多型がIgA腎症の発症・進展に関与するかを明らかにするために食物アレルギーとの関連が証明されている一塩基多型rs4612666とrs10754588につき、IgA腎症患者52名と対照103名において解析した。結果として、rs4612666(Genotype frequencies、C/C:0.5871、C/T:0.3419、T/T、0.071、Allele frequencies、C:0.7581、T:0.2419)、rs10754588(Genotype frequencies、G/C:0.5548、C/C:0.2258、G/G:0.2194、Allele frequencies、C:0.5032、G:0.4968)を得た。患者と対照を比較したところ、rs4612666において、ドミナント、レセッシブ、コドミナント、アレルの全てのモデルにおいて有意な差がみられ、アレル比においてはP=0.00088、オッズ比2.4 (95%CI[1.4-4.2])であった。リスクアレルの役割が既報と逆であるため、今後の検討が必要であるが、rs4612666のNLRP3インフラマソームの疾患発症への関与が示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。小児腎臓病学26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では症例数が重要であると考えられ、その集積が若干遅れ気味であるから。また、IgA腎症におけるインフラマソームの役割を鋭敏に検出するためには、腎全体での評価ではなく、糸球体単独の評価が必要かもしれないから。本研究では症例数が重要であると考えられ、その集積が遅れ気味であるから。基礎的実験の遅れから動物実験開始が困難であるから。本研究ではインフラマソームの役割を明らかにすることが重要であり、その確認の後、その修飾による疾患特異的治療開発のための基礎研究(動物実験等)を進める。
加齢によるピッチ情報と時間情報の統合過程の崩壊についての研究

老人の場合、聴力の低下(老人性難聴)により、音の識別や音声コミュニケーション行動が著しく制限されるようになる。加齢によってピンチ知覚や時間知覚がどのように変化するのか、またそれらの統合過程がどのように崩壊していくのかを明らかにすることが本研究の目的であった。1.平成9年度では、タウ効果とカッパ効果について、若年者と高齢者からデータを取り、結果を比較した。ここで、高齢者については実験の実施に様々な問題を伴う場合があり、数名のデータしかとれなかった。現在も実験中であり、今後データの蓄積を計ることにしている。2.高齢者がコミュニケーションを円滑に進めにくい場合が生じる原因の一つには、ピッチ情報と時間情報の統合過程における問題の他に相手の情動認知の正確さが加齢によって低下することが考えられる。そこで、音声刺激による情動判断についての基礎データを得るために、成人若年者についての情動・認知実験を行った。その結果、「恐れ」の情動以外は非常に高い識別率であることが分かった。2年間の研究期間の第1年目の今年度は、老人の聴覚についての基礎的なデータの収集を目指して、音声分析やより効果的な実験方法や刺激の範囲の選定などを調べるための実験を行った。具体的には、以下に示す通りである。1.ピッチ知覚と時間知覚の統合能力を調べるために、タウ効果(時間知覚がピッチ知覚に影響を与える効果)とカッパ効果(ピッチ知覚が時間知覚に影響を与える効果)の実験を行った。時間範囲の短い条件から長い条件まで様々な範囲にわたる条件を設定して、成人若年者からまずデータを取り、次に高齢者に対して実験を行って結果を比較した。2.高齢者は語音の明瞭度を高くしないと聞き取り成績が低下するが、その原因について調べるために、まず高齢者に好まれる声と嫌われる声を分類し、それぞれ音声分析を行った。成人若年者からのデータはほぼ取り終わったが、高齢者については実験の実施に様々な問題を伴う場合があり、今年度は予備実験程度のデータしかとれなかった。平成9年度は高齢者を対象とした実験を中心にして、結果を成人若年者の場合と比較して、「高齢者にとってどのような声が聞き取りにくいか」「どのような話し方をすれば、聞き取りやすいか」などについて明らかにし、高齢者の音声知覚認知モデルを作成することを目指す。加齢によってピッチ知覚や時間知覚がどのように変化するのか、またそれらの統合過程がどのように崩壊していくのかを明らかにすることが本研究の目的であった。そこで、音声刺激による情動判断についての基礎データを得るために、成人若年者についての情動認知実験を行った。
放射線被ばく事故に対応したDNA損傷解析による被ばく線量評価法の開発と実用化

リアルタイムPCRを用いた生細胞の評価法の検討のための基礎的実験として、ウシ血液を対象にガンマ線照射した場合の、血液細胞内のDNAの損傷の頻度について評価した。ウシ全血液(日本生物材料センター)1.0mlに対して、大阪大学産業科学研究所のコバルト60線源を用いてガンマ線を0.01、0.1、1、10Gy照射した。照射後、QIAampDNA Mini Kitを用いてゲノムDNAを精製した。TE緩衝液(pH8.0)により1ng/μlに希釈したサンプルに対し、研究室で設計した哺乳動物全般のDNA増幅に適用可能なプライマー(特許審査中)を用いてリアルタイムPCRを実施した(解析数6)。結果から、吸収線量の増加に伴って、ウシ血液中のDNAが損傷する傾向があることが示された。また10Gyを照射したサンプルについては未照射サンプルに対して、DNA損傷量の有意な差が認められた。この結果から、緊急被ばく領域での血液サンプルを対象とした本手法の判定が可能であることが示唆された。解析数6での結果であるので、実験回数を増やすことにより、精度の向上を図る予定である。損傷したDNA分子の絶対定量が可能であるデジタルPCRのシステムを用いた、線量評価の可能生について検討した。デジタルPCR装置はリアルタイムPCR装置に比べ絶対定量に優れており、感度上昇が期待される。その装置によりDNA濃度およびPCR反応温度について評価し、最適な条件を決定した(DNA濃度0.0001ng/1反応)。次年度以降、決定した条件に基づき実用化レベル(mGy以下の)線量域での評価の妥当性を確かめる。新規に導入したデジタルPCR装置が線量評価の感度上昇に寄与することが確認された。初年度の目標が概ね達成され次年度以降の研究計画が予定どおり進められる目処がついた。初年度はウシ血液を用いて条件設定を行った。今後はウシ血液をさらなる条件設定を厳密に行うとともに、ヒト血液への適応を試みる。
ケロイド治療薬トラニラストの標的分子解析と新しい分子標的ケロイド治療薬の開発

ケロイドは、傷の部分が赤みを帯び、盛り上がり、痒み、痛みなどを伴う皮膚の病気で、傷を修復する線維芽細胞がコラーゲンを異常産生することに病因がある。ケロイド形成の主役を担うコラーゲンの異常産生にはTGF-βが関与する。Hgs蛋白はTGF-βシグナル伝達を促進する一方、Hgs蛋白のC領域はTGF-βシグナル伝達を阻害する。このC領域を構成するオリゴペプチドから新しいケロイド薬のリード化合物を検索し、ケロイド薬に求められる活性を有するオリゴペプチOP20-7を見いだした。ケロイドは、廠痕組織が過剰に増殖した病変であり、良性線維増殖性病変に分類される。ケロイドは真皮から皮下組織にかけて、ビメンチン陽性の紡錘形線維芽細胞が存在する太い膠原繊維が縦横に錯綜している特徴を持つ。症例によっては平滑筋原性アクチンが陽性で、筋線維芽細胞への分化が示唆される。ケロイドに対しては外科的治療法が多く施されているが、現在、内科的内服ケロイド治療薬はトラニラストのみである。トラニラストは細胞のTGF-βの産生あるいは遊離を抑制することが知られている。一方、われわれは線維芽細胞にHgsを強制発現することにより、ビメンチン、平滑筋原性アクチンが陽性の筋線維芽細胞への分化が誘導されることを見出している。HgsはSMAD2/3のリン酸化を促進することにより、TGF-βシグナル伝達活性を促進すると考えられる。本研究は、Hgsがケロイド治療薬トラニラストの標的分子である可能性を検討し、Hgsがケロイド治療薬の標的分子となりえることを明らかにすることを第一の目的としている。そして、Hgsを標的としたケロイド治療薬のシード化合物を検索することを第二目的としている。当該当年は、TGF-βシグナルにより生合成が促進するplasminogen activator inhibitor 1のプロモーター活性を測定することにより、TGF-βシグナル伝達活性へのトラニラストの影響を検討した。その結果、トラニラストがTGF-βシグナル伝達を阻害することにより、TGF-βの産生を抑制することを明らかになった。ケロイドは、瘢痕組織が過剰に増殖した病変であり、良性線維増殖性病変に分類される。内科的内服ケロイド治療薬トラニラストは細胞におけるTGF-βの産生、あるいは、細胞からの放出を抑制することが知られている。われわれはこれまでに、HgsがSMAD2/3との相互作用を介して、SMAD2/3のリン酸化を促進することにより、TGF-βシグナル伝達活性を促進する知見を得ている。本研究は、Hgsがケロイド治療薬トラニラストの標的分子である可能性を検討し、Hgsがケロイド治療薬の標的分子となりえることを明らかにすることを第一の目的とした。そして、Hgsを標的としたケロイド治療薬のシード化合物を検索することを第二目的とした。昨年度の本研究において、トラニラストがTGF-βシグナル伝達を阻害することにより、TGF-βの産生を抑制することを明らかした。今年度は、トラニラストが、HgsとSMAD2との相互作用を阻害することを動物細胞2-ハイブリッドシステムを用いて明らかにした。その結果として、トラニラストがTGF-βシグナル伝達を阻害することにより、TGF-βの産生を抑制する可能性が考えられる。本研究は、Hgsがケロイド治療薬トラニラストの標的分子である可能性を見いだしている。さらに、Hgsを標的としたケロイド治療薬のシード化合物を検索するために、Hgs/C領域構成ペプチドによるTGF-βシグナル伝達活性阻害試験を行っている
遷移金属錯体触媒を用いるフェノール類へのO位およびP位選択的置換基導入反応の開発

本研究の初年度にあたる平成11年は、おもにフェノール類のo位選択的アリール化について検討を行った。その結果、無置換あるいはp位置換フェノール類を、芳香族臭化物とともに、酢酸パラジウム-トリフェニルホスフィン触媒存在下、塩基として炭酸セシウムを用い、o-キシレン還流条件下で処理すると、五つのアリール-アリール結合が効率よく形成され、2-(1,1'-ビフェニル-2-イル)-6-(1,1':3',1"-タ-フェニル-2'-イル)フェノール誘導体が選択的に得られることを見い出した。本反応で得られた生成物のあるものについては、X線構造解析法により構造を決定し、結晶中ではフェノール性酵素のまわりが立体的に込み合っているにもかかわらず、興味深いことに二分子一単位でface-to-faceの形をとることが明らかになった。また本反応系を用いると、相対的に反応性に劣るとされる脂肪族C-H結合の分子間アリール化にも適用できることがわかった。すなわち2,4,6-トリメチルフェノールをブロモベンゼンとともに処理すると、2,6-ジベンジル-4-メチルフェノールが、少量の2-ベンジル-4,6-ジメチルフェノールとともに生成する。今後、このフェノール類のo位アリール化反応に関しては、光学活性ホスフィン配位子を用いるo位置換ブロモベンゼン類とのカップリングへの展開を図り、軸不斉を有するo-アリールフェノール類の簡便な合成法の確立を試みる。
p53によるアポトーシス誘導機構の解析

p53によるアポトーシスの誘導は重要な癌抑制機構の一つである。p53によるアポトーシスは転写を介した経路が知られており、私はこれまでに新規p53標的遺伝子,Noxaを単離し、p53によるアポトーシスに関与することを報告して'いる。しかし、p53によるアポトーシス誘導はすべての細胞において起こるのではなく、癌遺伝子が活性化しRBによる制御が破綻している細胞においてp53が発現した時などに起こる。本研究は、癌遺伝子の標的となった細胞が、どのようにしてp53が認識しアポトーシスにより排除されるかを解析することを目的とし、RBとp53の両方の因子に制御されている標的遺伝子をマイクロアレイ法を用いて単離することを試みた。その結果、多くの既知のp53標的遺伝子と新規p53標的遺伝子と思われる候補遺伝子約180種類を単離した。次に、RNAブロッティング法を用いて、単離したすべての候補遺伝子の発現パターンを調べ、18種類の有力候補遺伝子に絞り込んだ。次にこれら候補遺伝子をレトロウイルスを用いた発現系により細胞に強制発現させ細胞内局在、p53による細胞周期、アポトーシス制御における役割についての検討行った。その結果、そのうちの一つ、クローン#130はp53依存的に発現誘導され、p53によるアポトーシス誘導に関与することが知られているPUMAやNoxaによるアポトーシス誘導を増強させることが分かった。現在、クローン#130がどのような機構でp53によるアポトーシスに関与するのか解析を行っている。