hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
難治性疼痛患者の脳波周波数解明と聴覚ニューロフィードバックトレーニングの基礎研究

本研究は、難治性疼痛患者の脳波周波数パターンの解明および聴覚刺激をフィードバック情報とするニューロフィードバックトレーニングを実施し、難治性疼痛症状の効果を検証した。その結果、聴覚ニューロフィードバックトレーニングを実施することで身体知覚異常の改善および痛みの破局的思考に改善がみられ、トレーニング終了後3週においてもその効果を認めることができた。このことから、聴覚刺激を用いたニューロフィードバックトレーニングの実施は、脳波周波数をコントロールすることができ、痛みの破局的思考および身体知覚異常などの難治性疼痛症状の改善に有効である可能性が示唆された。難治性疼痛は治療に難渋する慢性疼痛であり、ストレス要因と連動して脳内神経回路のひずみや可塑的変化を引き起こすことが原因とされる。慢性疼痛患者の脳機能に関する研究において、脳波周波数帯域に健常者とは異なる特性があることが報告されており、これらのことから、難治性疼痛には、脳機能状態を変容させるような治療が有用であると考えられる。本研究では、難治性疼痛患者の脳波周波数パターンの解明および聴覚刺激をフィードバック情報とするニューロフィードバックトレーニング実施による難治性疼痛への効果検証を目的とする。当該研究の実施は、難治性疼痛患者に対する効果的なニューロフィードバックトレーニングを確立し、ニューロリハビリテーションにおける新たな感覚障害改善プログラム創出のための基礎研究である。平成28年度は、聴覚ニューロフィードバックトレーニングに用いるターゲットとなる脳波周波数の解析を目的に取り組んだ。まず、予備調査として、難治性疼痛患者には女性も対象になると想定し、周期的に疼痛が生じる月経痛を有する女性の脳波周波数パターンの解明および聴覚刺激をフィードバック情報とするニューロフィードバックトレーニングを実施した。聴覚ニューロフィードバックトレーニングを実施することで対象者の多くは、ターゲットとなる脳波周波数のコントロールが可能となった。これらのことから、安静時脳波周波数帯域からターゲットとなる脳波周波数が明らかとなったが、介入トレーニング実施による痛みや不安に関する詳細な効果検証および難治性疼痛患者の安静時脳波周波数の特性パターンに対応するターゲット周波数の解明は、現在も研究を継続中である。データの収集、論文の作成が遅れているため、やや遅れていると判断した。慢性疼痛患者の脳機能に関する研究において、脳波周波数帯域に健常者とは異なる特性があることが報告されており、難治性疼痛には脳機能状態を変容させるような治療が有用であると考えられる。最終年度である平成29年度は、前年度に実施した予備研究を基に聴覚ニューロフィードバックトレーニングの効果をシングルケースデザインにより検討した。研究はABA法を用い、各期は3週間とした。B期では週3回、5分間のニューロフィードバックトレーニングを実施した。用いるターゲット周波数はα波帯域とし、そのパワー値がA1期の平均値に2倍の標準偏差を加えた値を上回った際に聴覚フィードバックを与えた。その結果、A1期前/A1期後/B期後/A2期後で疼痛の強さの程度(NRS)に変化はなかった。しかし、疼痛の破局的思考(PCS)および身体知覚異常スケール(BPDS)はそれぞれ改善した。これらのことから、頸髄損傷後疼痛に対する聴覚ニューロフィードバックトレーニングは、痛みの破局的思考および身体知覚異常の改善に有効である可能性が示唆された。本研究結果は、聴覚刺激を用いたニューロフィードバックトレーニングの実施は脳波周波数をコントロールすることができ、痛みの思考および身体知覚異常などの慢性疼痛症状に対するペインマネジメントの一助になると考える。平成29年度はさらに症例を蓄積し、難治性疼痛患者に対して現行のリハビリテーション治療は続けながら、聴覚刺激をフィードバック情報とするニューロフィードバックトレーニング実施することで、痛みや不安に関する効果検証をしていく。薬事日報メディカル版2018年6月発行に掲載予定疾患別リハビリテーションの現状と展望8慢性疼痛患者が参画するペインマネジメントー痛みの多面性に対するニューロフィードバックトレーニングの効果ーリハビリテーション科学次年度使用額が生じた理由としては、ベースライン調査の実施にあたり、研究協力施設への旅費があまり発生しなかったことがあげられる。また、初年度ということもあり、研究成果が学会発表の水準にまでは達しなかった部分があり、学会などへの出張を行わなかったため、旅費が発生しなかったことがあげられる。次年度使用額の使用計画は、主として聴覚ニューロフィードバックトレーニング介入によるデータ収集蓄積のため、研究協力施設への旅費として使用することを考えている。また、得られたデータの分析や成果の公表のため、学会に参加するための旅費、翻訳代等に使用する計画である。
生理反応を考慮した地震時の身体損傷度測定用ダミーの開発に関する基礎的研究

阪神・淡路大震災における典型的な死傷形態が既往の研究により明らかにされている。それらの結果によれば、この震災での死者のほとんどは、地震動により倒壊した建物が成傷器であり、死因としては胸部や胸腹部を圧迫されたことによる圧死(窒息死)が最も多かった。その発生メカニズムを明らかにするために、CTスキャナーを用いた人体での胸部圧迫実験や、有限要素法による胸部圧迫コンピュータシミュレーションを行なってきた。本年度の研究では、昨年度に引き続き救急処置トレーニング用シミュレータであるレサシアン・スキルガイドモデル((株)京都科学製)の胸郭内に変位計および加速度計((株)共和電業製)を設置し、準静的荷重および衝撃荷重によって人体に生じる変位・加速度を計測し、CTスキャナー実験およびシミュレーション解析の結果と比較することによって、より正確な胸部の荷重-変位関係を導き出すことを目指すとともに、計測手法の開発を目的とした。また、本年度には載荷重量を増すために、レサシアン・スキルガイドモデルの胸部受圧板をアルミ製にし、使用バネも180240kgに耐えられるよう強化した。バネ強度が変更になったため当然のことながら、昨年度の実験により得られた変換係数は異なるが、変位量と荷重の間には線形関係が得られており、基本的な実験はほぼ成功したと考えている。今後は、胸郭の変形量と窒息死にいたる閾値の関係を医学的な知見に基づき明らかにして、胸部圧迫による具体的な死亡危険度評価に結びつける必要がある。また、衝撃荷重による実験が、どの程度までの重量で可能かを試行することが求められる。本年度の研究では、救急処置トレーニング用シミュレータであるレサシアン・スキルガイドモデル((株)京都科学製)の胸郭内に変位計および加速度計((株)共和電業製)を設置し、準静的荷重および衝撃荷重によって人体に生じる変位・加速度を計測し、CTスキャナー実験およびシミュレーション解析の結果と比較することによって、より正確な胸部の荷重-変位関係を導き出すことを目指すとともに、計測手法の開発を目的とした。結果として、荷重30kg以下における荷重-変位関係は、変換係数0.46を乗ずることにより、生体を用いた実測結果とほぼ一致することが明らかとなった。また、載荷量を60kgまで増やした場合、荷重-変位量は2次曲線に近似され、荷重50kg辺りからやや曲率を異にすることが確認された。さらに、60mmを超えた範囲での変位量を求めるために、加速度計の適用の可否について検討した。加速度計を用いた変位量計測結果より、変位量-錘落下高さの関係が得られたが、変位量の計測値にはバラツキがみられ、今後の検討の必要性が示唆された。
金属の配位した炭素クラスター及び金属内包フラーレンの真空紫外光による光励起過程

1)Nd:YAGレーザーの3倍波をXeガスセルに集光して周波数逓倍し、その3倍波(118nm)を得るシステムを試作した。真空紫外光への変換効率を高めるため、集光するレンズの焦点距離依存性、Xeガスセル中のガス圧依存性、位相整合条件について検討を行った。位相整合条件以外はおおむね期待される依存性を示し、最適化を行うことができた。位相整合条件がうまく調節できなかったのは、2種類のガスが十分混合されなかったためとして理解された。一酸化窒素(NO)はこの光源を用いて一光子イオン化により十分参照イオンとして検出できることが示されたが、金属の配位した中性炭素クラスターを光イオン化して検出する試みはうまくいかなかった。光量不足あるいは中性クラスター自身の量が少なかったためと考えられる。2)高速液体クロマトグラフィーを用いて分離されたいくつかの金属原子を含むフラーレン類(LaC_<82>,La_2C_<80>,Sc_2C_<84>,Sc_3C_<82>,ScO_2C_<86>等)について、LD-TOF(Laser Desorption Time-of-Flight)法とArFエキシマーレーザーによる解離性光イオン化を組み合わせた実験を行った。その結果、MC_<82>の解離の様子とそれ以外のフラーレン類との解離の様子には違いが見られ、それぞれの構造の違いが解離の様子に反映されているのではないかとして理解された。
高安全性高信頼性を持つモバイルマルチメディア分散システムの管理及び評価法の研究

社会の基盤となりつつあるモバイルマルチメディア分散ネットワークシステムにおける安全性、信頼性と性能はますます重要になっている。本研究では、システムの信頼性、安全性及び性能の視点からモバイルマルチメディアネットワークシステムの管理(移動性管理、資源管理など)及び評価を総合的に行うものである。本研究の期間中、システムの安全性、信頼性と性能の視点からモバイルマルチメディアネットワーク、モバイルアドホックネットワークなどのマルチメディア分散ネットワークシステムの管理及び評価法について研究を全面的に展開している。1.モバイルマルチメディアセルラーネットワークのアーキテクチャと移動性管理について検討を行っている。その中に、次世代のモバイルマルチメディアセルラーネットワークのアーキテクチャに適している移動性管理手法を新たに提案し、その最適設計と評価を行った。また、モバイル端末の移動特性に考慮した移動性管理法を提案している。さらに、ネットワークのキャッシュの手法を用いている移動性管理法を提案し、そのアーキテクチャの設計及び性能評価について深く追究している。2.今後のモバイルマルチメディアネットワークはIPベースのネットワークと考えられる。IPベースの移動性管理とそのアーキテクチャについて検討を行っている。特にMobile IPとMobile IPv6などの移動性管理方式、その信頼性と安全性などについて深く追究している。3.モバイルアドホックネットワークに関する研究はますます重要になっている。我々はその環境でのセキュアな通信のための局所鍵管理プロトコールを提案し、その性能評価と実現方式について研究を行っている。4.モバイルアドホックネットワーク環境で電源資源管理方式について研究を行っている。特にモバイルアドホックネットワークのMAC層での電源管理方式を検討し、その動的管理方式の提案と評価を行っている。5.一般の分散ネットワークのセキュアなグループ通信方式について研究を行っている。6.次世代モバイルインターネットにおける改善した情報分散処理方式などについて研究を展開している。社会の基盤となりつつであるモバイルマルチメディア分散システムにおける安全性と信頼性はますます重要になっている。本研究では、システムの信頼性、安全性の視点からシステムの資源管理を総合的に行うものである。従来の資源管理はただシステムスループット等の基本的な性能に着目してシステムの最適化をはかる技術である。本研究では、システムの信頼性と安全性に対する資源管理影響を明らかにし、新しい資源管理技術を確立する。システムの基本性能だけではなく、システムの信頼性と安全性を統合的に考慮したモバイルマルチメディアネットワーク管理の技術、システムの構築技術とその開発環境に関する研究は国際的にも先駆的であり、次世代のインターネット技術及びその応用(電子商取引など)技術の確立に大いに貢献できる。また、本研究により開発されたシステム評価などのソフトウェアには実際のモバイルマルチメディアネットワーク管理及び評価に使うことが期待できる。今年度は特に、Mobile IPを含むモバイルマルチメディア分散システムの移動性管理モデルを確立し、その数学的な解析解と性能評価のシミュレータの開発を行った。また、その高度の分散システムの安全性と信頼性を考慮した総合的な評価及び管理のモデルについて国際的に研究調査と検討を行った。社会の基盤となりつつであるモバイルマルチメディア分散ネットワークシステムにおける安全性、信頼性と性能はますます重要になっている。従来のシステムの管理及び評価の手法は、システムスループット等の基本的な性能に着目してシステムの最適化をはかる技術である。本研究では、信頼性、安全性及び性能がモバイルマルチメディアネットワークシステムに対する影響を明らかにし、新しい管理及び評価技術の確立を目指している。システムの基本性能だけではなく、システムの信頼性と安全性を統合的に考慮したモバイルマルチメディアネットワーク管理及び評価に関する研究及びその開発環境に関する研究は国際的にも先駆的であり、次世代のインターネット技術及びその応用(電子商取引など)技術の確立に貢献することを目指している。今年度は、次世代(3G)のモバイルマルチメディアセルラーネットワーク、及びモバイルIPv6分散ネットワークの移動性管理モデルの確立と、その数学的な解析解とシステム評価のシミュレーションの開発を行った。

さらに、モバイルアドホックネットワークなどの高度化したモバイルマルチメディア分散ネットワークシステムの安全性と信頼性を考慮した総合的な評価及び管理のモデルについて国際的に研究調査と検討を行った。今年度は、引き続きおけるシステムの安全性、信頼性と性能の視点からモバイルマルチメディア分散ネットワークシステムの管理及び評価法について積極的に研究を展開している。1.モバイルマルチメディアセルラーネットワークのアーキテクチャと移動性管理について検討を行っている。その中に、次世代のモバイルマルチメディアセルラーネットワークのアーキテクチャに適している移動性管理手法を新たに提案し、その最適設計と評価を行った。また、モバイル端末の移動特性に考慮した移動性管理法を提案している。さらに、ネットワークのキャッシュの手法を用いている移動性管理法を提案し、そのアーキテクチャの設計及び性能評価について深く追究している。2.一般のモバイルネットワークにおけるセキュリティとルーティングプロトコールについて研究を重ねて、その関連分野の学術図書の編集を行っている。また、重要になりつつあるモバイルアドホックネットワークにおけるセキュリティの管理法について検討を行っている。モバイルアドホックネットワーク環境でのセキューアの通信のために、アーキテクチャに適用している局所鍵管理プロトコールを提案し、その実現方式などについて研究を行っている。3.ネットワークの設計と管理に関わっているルーティングプロトコールについて研究を行っている。まず、モバイルアドホックネットワークにおける動的ルーティングプロトコールの性能評価を行っている。また、一般ネットワークのルーティング方式とその性質について検討を行ない、その最適方式の構造の解明を務めている。4.モバイルマルチメディアネットワークにおける電源資源の管理方式について研究を行っている。特に移動体端末の電源管理を検討し、最適の方式の提案と評価を行っている。
潰瘍性大腸炎の発症および重症度を規定する遺伝的要因の検討

炎症性腸疾患の成立にはTh1免疫応答が関与し,炎症性サイトカインやメディエーター等が微小循環障害を惹起し病態が進展すると考えられる。しかし,特定の宿主にのみ発症し,また重症度が多彩である原因は明らかになっていない。オステオポンチン(OPN)は,Th1免疫応答の開始に必須のサイトカインである。OPN遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を解析したところ,日本人では4つの単塩基変異(SNP)が存在し,特にnt-443のSNPはC型慢性肝炎患者の肝炎活動性と関連した。OPNを肝細胞に過剰発現するトランスジェニックマウスを作成し観察したところ,本マウスは免疫応答がTh1系優位であり,CTL浸潤を伴う肝壊死を自然発症した。また肺,唾液腺,消化管などにも観察され,肝以外の臓器における免疫応答もTh1系優位に偏っていると考えられた。以上の成績から,nt-443のSNPはOPNの転写を制御していると推定され,細菌感染等の誘因を契機に,消化管を場とする免疫応答のTh1/Th2系免疫応答が破綻し,炎症性腸疾患を発症ないしは重症化する可能性があると示唆された。そこで,炎症性腸疾患患者のnt-443のSNPをINVADER法にて測定したところ,潰瘍性大腸炎ではT/T39%,T/C55%,C/C6%で,またクローン病ではT/T40%,T/C40%,C/C20%であった。同時にnt-616のSNPの測定では,潰瘍性大腸炎ではT/T0%,T/G61%,G/G39%,クローン病ではT/T20%,T/G0%,G/G80%であった。潰瘍性大腸炎、クローン病共に、nt-443のTの塩基、nt-616のGの塩基を持つ人が、多いことがわかった。治療において、ステロイド剤や免疫抑制剤を使用したり、手術を行なわれている重症患者の塩基配列を検討したが、nt-443及びnt-616の遺伝子配列による、特異性は見出せなかった。炎症性腸疾患の成立にはTh1免疫応答が関与し,炎症性サイトカインおよびメディエーター等が微小循環障害を惹起し病態が進展すると考えられる。オステオポンチン(OPN)は,Th1免疫応答の開始に必須のサイトカインとして作成する。OPN遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を解析したところ,日本人では4つの短塩基変異(SNP)が存在し,特にnt-443のSNPはC型慢性肝炎患者における肝炎活動性と関連することを見出した。一方,OPNを肝細胞に過剰発現するトランスジェニックマウスを作成し観察したところ,本マウスは免疫応答がTh1系優位であり,抗核抗体が陽性で,CTL浸潤を伴う肝壊死を自然発症した。また肺,唾液腺,消化管などにもCTLの浸潤が観察され,肝以外の臓器における免疫応答もTh1系優位に偏っていると考えられた。以上の成績から,nt-443のSNPはOPNの転写を制御していると推定され,その発現が高度になる宿主では,細菌感染等の誘因を契機に,消化管を場とする免疫応答のTh1/Th2系免疫応答が破綻し,炎症性腸疾患を発症ないしは重症化する可能性があると示唆された。

そこで,炎症性疾患のnt-443のSNPをINVADER法にて測定したところ,潰瘍性大腸炎ではT/T38%,T/C0%,C/C62%で,またクローン病ではT/T20%,T/C60%,C/C20%であり,nt-443のSNPのT/Cを有する患者が多い傾向が認められた。同時にnt-616のSNPの測定では,潰瘍性大腸炎ではT/T0%,T/G62%,G/G38%,クローン病ではT/T20%,T/G20%,G/G60%であり,潰瘍性大腸炎ではT/G,クローン病ではG/Gがやや優位であった。今後は,病態や重症度を比較することで遺伝子の特徴的所見が見出せればと思われる。炎症性腸疾患の成立にはTh1免疫応答が関与し,炎症性サイトカインやメディエーター等が微小循環障害を惹起し病態が進展すると考えられる。しかし,特定の宿主にのみ発症し,また重症度が多彩である原因は明らかになっていない。オステオポンチン(OPN)は,Th1免疫応答の開始に必須のサイトカインである。OPN遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を解析したところ,日本人では4つの単塩基変異(SNP)が存在し,特にnt-443のSNPはC型慢性肝炎患者の肝炎活動性と関連した。OPNを肝細胞に過剰発現するトランスジェニックマウスを作成し観察したところ,本マウスは免疫応答がTh1系優位であり,CTL浸潤を伴う肝壊死を自然発症した。また肺,唾液腺,消化管などにも観察され,肝以外の臓器における免疫応答もTh1系優位に偏っていると考えられた。以上の成績から,nt-443のSNPはOPNの転写を制御していると推定され,細菌感染等の誘因を契機に,消化管を場とする免疫応答のTh1/Th2系免疫応答が破綻し,炎症性腸疾患を発症ないしは重症化する可能性があると示唆された。そこで,炎症性腸疾患患者のnt-443のSNPをINVADER法にて測定したところ,潰瘍性大腸炎ではT/T39%,T/C55%,C/C6%で,またクローン病ではT/T40%,T/C40%,C/C20%であった。同時にnt-616のSNPの測定では,潰瘍性大腸炎ではT/TO%,T/G61%,G/G39%,クローン病ではT/T20%,T/G0%,G/G80%であった。潰瘍性大腸炎、クローン病共に、nt-443のTの塩基、nt-616のGの塩基を持つ人が、多いことがわかった。治療において、ステロイド剤や免疫抑制剤を使用したり、手術を行なわれている重症患者の塩基配列を検討したが、nt-443及びnt-616の遺伝子配列による、特異性は見出せなかった。
線虫捕捉糸状菌による線虫認識機構の生化学

1.線虫捕捉菌Arthrobotrysellipsospora Y4007の生産するレクチンの精製と性質,菌体内および培養〓液よりそれぞれのレクチンを硫安90%飽和沈でん,フェッインをリガンドとするアフィニティ・クロマト法で精製した.この菌体外レクチンの抗体をウサギを用いて調製し,この抗体との反応性を二重拡散法にてしらべ,細胞内外ともに同一のレクチンであることを確認した.本レクチンは,分子量55,000でサブユニットの分子量は14,500であり,おそらく4量体である.要求糖鎖はシアル酸を含む動物起源の多糖;線虫抽出流とよく反応するが,単糖とは全く反応しない.2.レクチンのモノクロナル抗体の調製マウス脾細胞より抗体生産株を細胞融合法によりクローン化し, ELISA法で活性のあるクローンをクローニングして6種のモノクロナル抗体を得た.3.蛍光抗体法を用いたレクチンの検出FITCで標識した二次抗体を用いる間接蛍光抗体法により菌糸上のレクチンの検出をこころみた.菌糸全体に蛍光が認められたが,捕捉部位の蛍光が強かった.モノクロナル抗体を用いて同上の蛍光抗体法により良好な写真を得た.線虫には蛍光が全くない.4.レクチンのモノクロナル抗体による線虫の捕捉の阻止ウサギより得たレクチンの抗体を菌〓に添加すると線虫の捕捉は100%阻止され,同様な結果をモノクロナル抗体にても得た.また線虫の体皮の抗体の反応性より線虫の体表にレクチン・レセプターの存在することを確認した.5.捕捉に関与する物質菌糸体を染色し,線虫を捕捉する部位に酸性多糖を検出した.この部位にマイクロビーズもよく接着することからこの多糖は粘性多糖であろうと推定した.従って本捕捉菌は多くの土壌線虫を非特異的に捕捉することができる.たゞし,レクチンの関与と粘性多糖との関係は解明されなかった.1.線虫捕捉菌Arthrobotrysellipsospora Y4007の生産するレクチンの精製と性質,菌体内および培養〓液よりそれぞれのレクチンを硫安90%飽和沈でん,フェッインをリガンドとするアフィニティ・クロマト法で精製した.この菌体外レクチンの抗体をウサギを用いて調製し,この抗体との反応性を二重拡散法にてしらべ,細胞内外ともに同一のレクチンであることを確認した.本レクチンは,分子量55,000でサブユニットの分子量は14,500であり,おそらく4量体である.要求糖鎖はシアル酸を含む動物起源の多糖;線虫抽出流とよく反応するが,単糖とは全く反応しない.2.レクチンのモノクロナル抗体の調製マウス脾細胞より抗体生産株を細胞融合法によりクローン化し, ELISA法で活性のあるクローンをクローニングして6種のモノクロナル抗体を得た.3.蛍光抗体法を用いたレクチンの検出FITCで標識した二次抗体を用いる間接蛍光抗体法により菌糸上のレクチンの検出をこころみた.菌糸全体に蛍光が認められたが,捕捉部位の蛍光が強かった.モノクロナル抗体を用いて同上の蛍光抗体法により良好な写真を得た.線虫には蛍光が全くない.4.レクチンのモノクロナル抗体による線虫の捕捉の阻止ウサギより得たレクチンの抗体を菌〓に添加すると線虫の捕捉は100%阻止され,同様な結果をモノクロナル抗体にても得た.また線虫の体皮の抗体の反応性より線虫の体表にレクチン・レセプターの存在することを確認した.5.捕捉に関与する物質菌糸体を染色し,線虫を捕捉する部位に酸性多糖を検出した.この部位にマイクロビーズもよく接着することからこの多糖は粘性多糖であろうと推定した.従って本捕捉菌は多くの土壌線虫を非特異的に捕捉することができる.たゞし,レクチンの関与と粘性多糖との関係は解明されなかった.1.線虫の捕捉の顕微鏡観察とビデオによる記録顕微鏡用カラーテレビ装置(島津CTV-270)を購入し、実体顕微鏡および光学顕微鏡に取りつけて、線虫の捕捉および捕捉後の線虫の行動をVTRにより画像の記録を行った。即ち、素寒天培地に生育したArthrobotrys ellisposporaの菌叢上に線虫を添加し、1,2,5,10分後に水洗により捕捉されていない線虫を除去した後、捕捉線虫の行動を記録した。その結果、線虫の捕捉は1分間の接触でもおこり、かつその捕捉は強固であり、捕捉線虫は脱出できなかった。この強固な捕捉は認識のみでは充分に説明することができない。2.非特異的な線虫の捕捉一粘性多糖の関与本菌の捕捉器官には今まで粘着性物質の存在を認めることができなかった。それは電子顕微鏡用試料として調整中に剥離除去されたのではないかと考えられる。今回光学顕微鏡による染色後の直接検鏡法により、捕捉部位に多糖が局在することを確認できた。すなわち、アルシアン青とPASの重染色を行うと、菌系体はアルシアン青で全く染色されず、特異な部位のみが青く染色され、菌糸体はPASにより紅色に染色された。線虫を添加した後に染色すると、線虫の捕捉部位のみが青く染色され、かつこの部分にポリスチレンのマイクロビーズが附着したので、この区分が捕捉器官であることが確認できた。

更にこの多糖は粘性を持っていることが示唆された。従ってこの段階での線虫の捕捉は全く非特異的と考えられる。事実素寒天培地上で生育した本菌は土壌より分離した各種線虫,Helicotylenchus,Rabditida,Mononchida,Dorylaimidaなどもマツノザイセンチュウ同様によく捕捉したことにより証明された。
トレオニン合成酵素の全反応機構の理論的解明

量子古典混合計算法と古典分子動力学法(CMD)を用いて、トレオニン合成酵素(ThrS)の化学反応について理論解明した。スパコンを利用することで、長時間(3 micro sec)CMDを実行し、反応選択性に重要な蛋白質・基質相互作用と自由エネルギー変化を十分な精度で求めた。特に、反応中間体ごとに活性中心(PLP,水,アミノ酸側鎖)の安定コンフォメーションが変化した。さらに、生成物支援機構に重要な陰イオンが構造保持を担っている事を明らかにした。それにより、ThrSでは各反応に適した構造を取るように精密に構造制御がなされていることが示された。この仕組みは他の酵素や機能改変にも有益な示唆を与える。トレオニン合成酵素はL-トレオニンの生合成を担っているが、複雑な化学反応を経るため、これまで反応機構の詳細については明らかになっていなかった。理論的手法は化学反応過程の解明に有益であるが、トレオニン合成酵素のように複雑な反応系は不確定要素が多く、これまで解明が進んでいなかった。そこで、スーパーコンピュータの利用を推進し、網羅的に反応を探索することで、トレオニン合成酵素のように複雑な化学反応過程を持つ触媒反応を明らかにする。量子古典混合計算(QM/MM)法を用いて、トレオニン合成酵素における化学反応過程の構造変化、自由エネルギー変化を明らかにする。それにより、多くの副反応をどのように抑制して高い反応特異性を実現しているのかという酵素特有の高次機能(反応制御機構)を明らかにし、化学反応の本質を解き明かす。このように生体酵素における反応機構を明らかにする事は、化学における究極的テーマであると共に、効率的な化学反応の反応制御を理解する上でも極めて重要である。トレオニン合成酵素の触媒反応機構の全貌解明を通じて生命機能を支える素過程を分子レベルで解明し、生体内現象の本質的解明を行う。トレオニン合成酵素:Threonine Synthase(ThrS)は特徴的な補欠分子族(ピリドキサールリン酸;PLP)を有し、複雑な反応を触媒している。ThrSは特に位置特異的かつ立体選択的な反応を制御しており、優れた酵素機能が備わっている。ThrSの酵素反応機構の解明は極めて重要であるが、未だ分子メカニズムは明らかになっていなかった。ThrSの酵素反応機構を解明するために、量子古典混合計算法(QM/MM)と分子動力学法(MD)による理論解析を行った。QM/MM計算により、全サイクルの後半の反応機構が解明された。また、阻害剤による副反応の反応機構も明らかにする事ができた。MD法を用いて生成中間体の室温での安定性(構造と自由エネルギー差での評価)を評価した。その結果、PLPのコンフォメーションが中間状態ごとに異なっており、反応を促進する構造を取っている事が明らかになった。これらは酵素の優れた反応効率と反応制御メカニズムを示唆しており、極めて重要な結果と考えられる。また、QM/MM法だけではこれらは明らかにすることができないため、理論解析でMD法を併用することの重要性が示された。QM/MM法は大変コストがかかる手法である。そのため、スーパーコンピュータ(SC)を利用したとしてもできる限り効率的に利用する事が必要である。我々は初期電子密度生成法を考察し、必要なプログラムを作成した。それによりSC利用が劇的に進展した。本研究で開発した方法を用いる事で、複雑な反応機構を持つ酵素反応機構を容易に解析できるようになり、計画以上の成果を上げる事ができた。光化学系II(PSII)における水分解反応、アプラタキシンにおけるDNA加水分解反応についても同様に理論解析を実施した。また、PSIIについてはモデル錯体の構造と電子状態解析をおこない、天然系と詳細に比較した。独自の電子状態解析法を用いて、補因子の持つ特徴的構造ゆがみを明らかにした。トレオニン合成酵素(ThrS)は特別な補欠分子族(ピリドキサールリン酸(PLP))を有し、アミノ酸合成に関わる様々な反応を触媒している。ThrSはPLP酵素の中でも、多くの位置選択的かつ立体選択的反応を触媒しているため、その反応機構の解明は優れた酵素反応機構を理解するための絶好の機会となっている。ThrSで報告されている生成物支援機構は環境に応じて酵素反応を変化させることが可能であり、酵素触媒の持つ高次機能の最たるものの一つである。しかしながら、その分子論的メカニズムは未だ明らかになっていなかった。そのため、量子古典混合計算法(QM/MM法)と古典分子動力学法(CMD)を用いて、網羅的にThrSの反応機構を詳細に理論解明する事を試みた。特に、スーパーコンピュータ(HA-PACS, COMA)を利用することで長時間(3micro sec)CMDを実行し、反応選択性に重要な蛋白質基質間相互作用の構造解析や自由エネルギー解析を十分な精度で議論する事ができた。本研究により、反応中間体ごとに活性中心(PLP, Water,アミノ酸側鎖)のコンフォメーションが異なっていることを明らかにした。さらに、生成物支援機構に重要な陰イオン(HPO42-)を(SO42-に)変えるによっても、構造変化が見られ、自由エネルギー差も実験値と極めて良い一致を示した。これらにより、酵素では反応中間体毎に反応に適した構造を取るように精密に構造制御がなされていることが示された。これらの結果はThrSにおける高い反応効率の仕組みと反応制御メカニズムを解明したのみならず、普遍的酵素反応の仕組みや酵素機能改変にも有益な示唆を与えた。研究成果の一部は現在論文審査中である(2017年3月28日投稿)。

量子古典混合計算法と古典分子動力学法(CMD)を用いて、トレオニン合成酵素(ThrS)の化学反応について理論解明した。スパコンを利用することで、長時間(3 micro sec)CMDを実行し、反応選択性に重要な蛋白質・基質相互作用と自由エネルギー変化を十分な精度で求めた。特に、反応中間体ごとに活性中心(PLP,水,アミノ酸側鎖)の安定コンフォメーションが変化した。さらに、生成物支援機構に重要な陰イオンが構造保持を担っている事を明らかにした。それにより、ThrSでは各反応に適した構造を取るように精密に構造制御がなされていることが示された。この仕組みは他の酵素や機能改変にも有益な示唆を与える。反応特異性を決定する後半過程を明らかにし、生成物支援機構で重要なリン酸イオンの役目について解明した。また、複雑な電子状態を自動的に生成できるアルゴリズムを考案した。本方法はスーパーコンピュータ利用で極めて重要になると考えられる。これらの研究成果を応用し、関連酵素系における反応機構解明と物性評価も行う事が可能となった。また、反応中間体の長時間古典同力学計算(CMD)を実施した事で、基質の動的挙動について明らかにする事ができた。それにより、エネルギー的にはわずかな差でしかないが、反応性を大きく作用すると考えられる分子配向効果について明らかにできた。これらの結果について現在、論文執筆中である。QM/MM法で高精度に反応機構を解明するためには大きなQM領域を持つ大規模計算の実施が不可欠であるが、1点計算の計算量の増加だけでなく構造自由度や不確定要素(水、プロトン化、イオン)が増えるために急激に取り扱いが難しくなる。しかしながら、酵素での反応を正確に理論解明するには大規模計算が不可欠であるため、スーパーコンピュータをより効率的に利用できる方法を開発していく。これまでにいくつもの方法(Generalized spin projection, Localized Natural orbital, Divide & conquer based initial guess formation)を提案し、その有用性を実証してきた。今後もこれら独自の方法を開発及び整備していく。また、本研究課題を通じて、静的な反応機構解析だけでなく、動的な解析も極めて有用である事を痛感した。今後、QM/MM-MDの適用と、QM/MMとMD計算との連携を図り、より正確な反応機構解析をできるようにする。特に電子移動やプロトン移動が関連する反応は取り扱いが難しく、これまでに正確な解析がなされてきていない。そのような過程でも十分解析できるようにし、酵素反応に関わる全反応を高精度に取り扱い、酵素反応という複雑多自由度系での理論解析方法を早期に確立する。量子化学(1)前半反応過程の反応機構の解明と(2)新規反応経路探索法の実装を行う事で、トレオニン合成酵素の触媒反応機構全貌を明らかにする。(1)については量子古典混合法(QM/MM)法を用いて前半過程における全中間状態の構造、遷移状態、自由エネルギープロファイルを求める。
個体の生息場所選択に着目したブナ原生林の鳥類群集構造の解明

本研究は個体の生息場所選択に着目し,主要種の繁殖生態と種内・種間内の相互作用を明らかにすることによりブナ林の鳥類群集構造の解明の糸口を見いだそうとしたものである.長野県北東部に位置する下高井郡木島平村カヤの平地区にあるブナ林(標高1460m)の10haの調査プロットをもうけ,3年間にわたり主要鳥類を個体識別し,なわばり形成にはじまる繁殖期の個体の行動データを3次元の位置データとともに収集した.調査プロットではヒガラ・シジュウカラ・クロジ・キビタキ・アカゲラ・ゴジュウカラが優占しており,これら6種が全鳥類個体数の約6割を占めていた.樹洞営巣性で越冬している種が,種数のわりに個体数で優占するのが調査プロットの鳥類群集の特徴である.優占6種の記録地点はすべて調査プロットのほぼ全面にわたっていたが,アオジやウグイスの分布は林緑部と林内のギャップに偏っており,ギャップが林緑性の種に林内の生息場所を提供していることが示唆された.優占6種は林内にほぼすきまなくつがいのなわばりを形成して繁殖し,種内では個体の生活空間を平面的に分割していたが,複数年連続でなわばりをもったオスは越冬鳥のみならず夏鳥でも毎年ほぼ同じ位置になわばりを形成する傾向があり,「一度繁殖した場所にくりかえしなわばりを形成する」という生息場所選択がはたらいている可能性がある.優占6種の生活空間は平面的には種間で重複していたが,垂直方向にはおおむね場所の使い分けがみられた.ただし,5月なかばの完全な雪解けとこれにともなうブナの開葉を境にその様相は大きく変化した.すなわち,残雪期のおそらくは餌条件のきびしい時期には各種は場所を使い分けて採餌していたが,ブナの開葉を境に全種がブナの葉で餌をとるようになる傾向がみられたのである.この変化はブナの開葉にともなう餌条件の改善を示唆するが,裏をかえせばブナが開葉する以前の餌条件のきびしい時期に鳥類群集の構造を決定している過程が存在することを示唆する.また,樹洞営巣種間で好適な巣穴をめぐる競争があることが示唆された.本研究は個体の生息場所選択に着目し,主要種の繁殖生態と種内・種間内の相互作用を明らかにすることによりブナ林の鳥類群集構造の解明の糸口を見いだそうとしたものである.長野県北東部に位置する下高井郡木島平村カヤの平地区にあるブナ林(標高1460m)の10haの調査プロットをもうけ,3年間にわたり主要鳥類を個体識別し,なわばり形成にはじまる繁殖期の個体の行動データを3次元の位置データとともに収集した.調査プロットではヒガラ・シジュウカラ・クロジ・キビタキ・アカゲラ・ゴジュウカラが優占しており,これら6種が全鳥類個体数の約6割を占めていた.樹洞営巣性で越冬している種が,種数のわりに個体数で優占するのが調査プロットの鳥類群集の特徴である.優占6種の記録地点はすべて調査プロットのほぼ全面にわたっていたが,アオジやウグイスの分布は林緑部と林内のギャップに偏っており,ギャップが林緑性の種に林内の生息場所を提供していることが示唆された.優占6種は林内にほぼすきまなくつがいのなわばりを形成して繁殖し,種内では個体の生活空間を平面的に分割していたが,複数年連続でなわばりをもったオスは越冬鳥のみならず夏鳥でも毎年ほぼ同じ位置になわばりを形成する傾向があり,「一度繁殖した場所にくりかえしなわばりを形成する」という生息場所選択がはたらいている可能性がある.優占6種の生活空間は平面的には種間で重複していたが,垂直方向にはおおむね場所の使い分けがみられた.ただし,5月なかばの完全な雪解けとこれにともなうブナの開葉を境にその様相は大きく変化した.すなわち,残雪期のおそらくは餌条件のきびしい時期には各種は場所を使い分けて採餌していたが,ブナの開葉を境に全種がブナの葉で餌をとるようになる傾向がみられたのである.この変化はブナの開葉にともなう餌条件の改善を示唆するが,裏をかえせばブナが開葉する以前の餌条件のきびしい時期に鳥類群集の構造を決定している過程が存在することを示唆する.また,樹洞営巣種間で好適な巣穴をめぐる競争があることが示唆された.本研究は、ブナ林の鳥類群集構造が各種個体の定着時にほぼ決定されるとの予測に基づき、毎年雪解け時に順次おこる各種の生息場所(オスのなわばり、メスの配偶者)選択とこれに影響をあたえる同種・異種間の相互作用を個体レベルで明らかにすることによりブナ原生林の鳥類群集の構造解明の糸口を見いだそうとするものである。6年度には、長野県下高井郡カヤノ平のブナ原生林において雪解け時から予備調査を行ない、鳥類群集と生息場所に関する概況の把握を行うとともに、5ha弱の調査地を具体的に選定した。また、秋期には調査地を小方形区に区分し、これらの各頂点に目印を打つとともに、小方形区の各辺にそって調査ルートを整備した。これによって7年度の雪解け時から、本格的な調査を開始する準備ができている。この調査地内では、越冬している可能性のある4種に夏鳥の主要5種(いずれもなわばり性)が順次加わって繁殖期の鳥類群集が形成されていくことがわかった。

また、雪解け以前には、樹木の根元が各種鳥類の重要な採餌場所になっており、雪解け・ブナの開葉とともに採餌環境が徐々、あるときは急激に変化していくらしいこと、このことに林内のギャップの位置が関係しそうなことが予想できた。鳥の捕獲・標識については方法上のめどがほぼ立ち、巣も一部の種については発見することができた。調査地ブナ林の鳥類群集は、キツツキ科やシジュウカラ科など越冬していると考えられる5種と、雪解け時に渡来するヒタキ科やホオジロ科の夏鳥9種の計主要14種、それにタカ科やホトトギス科の捕食者・寄生者数種からなっている。7年度は4月末から7月にかけて捕獲・標識、センサス、巣さがしをルーチンとする調査をおこなった。センサスの結果は、主要14種のなかに林内にのみ出現する種(林内種)と林縁部もしくは林内のギャップとその周辺にのみ出現する種(林縁種)があることを示したので、種レベルの生息場所選択を林内のギャップの分布との関係においてある程度明らかにできるめどがついた。夏鳥のキビタキは林内種であなりながら、発見された巣はいずれもギャップの周辺に位置しており、この種の生息場所選択もギャップの分布と関係していることが示唆された。地肌が姿をあらわす本格的な雪解けは、5月10日頃に調査地南東部の林縁から始まった。夏鳥の多くはこの頃に姿を現したが、林内種のオスは雪の解けはじめた林縁ではなく、雪がまだ解けず餌条件がきわめて悪いと予想される林内に渡来当初からなわばりを形成し、種内でさかんに争ったので、好適な生息場所をめぐる激しい種内競争が存在することが示唆された。一方、調査地内でもっとも数の多いシジュウカラ科の各種は、ギャップの分布とは無関係に、林内を埋めつくすかたちでつがいのなわばりを形成した。シジュウカラについては、ほぼ全つがいを標識し、巣を発見し、繁殖の進行状況を明らかにしたが、この過程で、種内はもちろんのこと種間でも少数ながら直接的な争いが記録され、巣穴占有種の交替も確認できたので、樹洞営巣種間での好適な巣穴をめぐる強い競争の存在が示唆された。8年度は、各種をより早い時期に標識・個体識別し、個体レベルの生息場所選択と個体間の相互作用との関係を明らかにする。8年度は5月はじめから7月中旬まで鳥の捕獲・標識、標識団体の行動追跡、巣探し、繁殖進行の把握を中心とする野外調査を行った。捕獲・標識がうまくいくようになり、林内の主要種であるシジュウカラ・コガラ・ゴジュウカラ・キビタキ・クロジについてはなわばり分布とその変化を個体レベルで明らかにすることができた。8年度は例外的に雪の多い年で前年と比べると約2週間雪解けが遅く5月末まで雪が残った。キビタキやウグイスといった完全動物食の夏鳥は例年通り5月はじめに渡来しなわばり形成を行ったが、5月中に相次いで死体が発見されるなど、この遅い春の訪れの影響を強くうけたことが示唆されたが、越冬していると考えられるキツツキ類やカラ類などの樹洞営巣種は(1種を除いて)特に影響をうけることなく、前年とほぼ同時期に営巣しヒナを巣立たせた。前年にある種が営巣した樹洞に今年度は他種が営巣した例が複数確認されたので、樹洞営巣種間での好適な巣場所をめぐる種間競争の存在はほぼ確実と考えられる。今年度の課題であったクロジの巣の探索もうまくいくようになり、調査地内になわばりをもつつがいの繁殖状況をほぼ明かにできたと同時に、この種の営巣場所選択を、本種と同様にササに営巣するアオジやウグイスと比較検討する材料がえられた(巣場所の環境測定データを比較検討中)。前年にも十分な情報のある種については、繁殖なわばり数・営巣場所ともに大きな変化はみられていないので、種とごの生息場所選択についてはそれぞれ明確な傾向がでることは確実である(詳細を分析中)。
潜在する微生物テルペノイドの発掘及び新型テルペン環化酵素遺伝子の取得

生合成研究:Mycobacterium chlorophenolicumから単離されたC_<35>環状テルペンはZ型のC_<35>直鎖状ポリプレニルニリン酸の環化反応によって生合成されると予想している。それを支持する証拠を得るため、市販の安価な試薬から容易に合成できる短鎖のC_<10>とC_<15>のポリプレニルニリン酸を基質として用いて無細胞抽出液と反応させた。E型のC_<10>ポリプレニルニリン酸は反応しなかったのに対し、Z型はC_<35>環状テルペンの部分構造と類似したリモネンを生成した。また、ω.E.E体のC_<15>のポリプレニルニリン酸も反応せず、ω, Z, Zで体は環化反応した。これらの結果は、Z型のポリプレニルニリン酸にのみ基質特異性をもつテルペン環化酵素が存在することを示していた。現在知られているテルペン環化酵素はE型を天然基質とするものだけであることから、新規性の高いテルペン環化酵素が存在していることが示唆された。遺伝子クローニング:昨年度までに2つのZ型プレニルトランスフェラーゼ遺伝子の一部を縮重プライマーによってクローニングしていた。今年度、染色体歩行によって上・下流の塩基配列を読み進んだ。高いGC含量の影響等により容易に読める配列ではなかったが、様々なシーケンス反応の条件を検討し改良した結果、Z型プレニルトランスフェラーゼ遺伝子の全長を読むことができた.現在、更に上・下流を読むことによってC_<35>環状テルペン生合成酵素の候補遺伝子を探している.また、2つのZ型プレニルトランスフェラーゼの生成物を同定するため、pET系ベクターで発現させる実験を進行した。潜在するテルペノイドの発掘:既にMycobacterium chlorophenolicumからC_<35>環状テルペノイドを見出していた。直鎖状イソプレノイドが直接環化して生合成されたと考えれるC_<35>環状テルペノイドの報告例は未だなく極めて新規性の高い発見となった。今年度、他のMycobacterium属細菌のテルペノイド探索を行った。その結果、新たに2種類のC_<35>環状テルペノイドと脂肪酸が結合したC_<35>直鎖状テルペノイドを見出し、構造決定することができた。また、Mycobacterium chlorophenolicumのC_<35>環状テルペノイド生産量と培養時間の関係を調べたところ、定常期から生産量が急激に増加することが分かった。それに加えて、MS解析からC_<35>環状テルペノイドと考えられる未知化合物が定常期から新たに生産されることが判明した。現在、この化合物の単離・精製を検討している。生合成研究:C_<35>環状テルペノイドが直鎖状イソプレノイドから直接環化して生合成されることの実験証拠を得るため、C_<35>直鎖状テルペノイド-P-マンノースをM.smegmatisから単離し、加水分解後、2リン酸体を得て、無細胞抽出液と酵素反応を行うことを計画した。現在、加水分解の条件検討の段階まで進んでいる。また、^<13>Cラベル体グルコースを用いたC_<35>環状テルペノイドの標識実験を行ったところ、MEP経路によって生合成されることを明らかにすることができた。遺伝子クローニング:C_<35>テルペン環化酵素の遺伝子クローングを開始した.まず、プレニストランスフェラーゼを縮重プライマーを用いたPCRによってクローニングし、染色体歩行によってクラスター遺伝子を明らかにし、環化酵素を見出す方法を計画した。プレニストランスフェラーゼ遺伝子の取得まで達成した。
ＨＳＶ／ＨＩＶ　経皮感染初期の免疫機構の解明と侵入阻害法の開発

粘膜・皮膚ランゲルハンス細胞(LC)は性行為HIV感染における最初の標的細胞であるため、我々はHSV-2がLCのHIV感染に影響を及ぼすかどうかについて検討した。ヒト表皮内LCにHSV-2、次いでHIVを曝露すると、HSV-2はLCのHIV感染性を有意に増加させた。また、HSV-2は表皮細胞からのLL-37の生産を誘導し、LL-37はLCでHIV感染性を有意に増強した。これらの研究結果から、HSV-2は表皮細胞からのLL-37の産生を誘導し、このLL-37がLCのHIV感染性を増加させることによって、性行為HIV感染リスクを高めることが示唆された。(目的)HSV、HIVによるKCからの抗菌ペプチド産生能;特に上皮細胞から産生されるαDefensin5/6, βDefensin1-4, LL-37 (cathelicidin)およびATPの細胞外放出について検討し、ランゲルハンス細胞(LC)のHIV感染への影響を検討する。(方法)HIVおよびHSV-2を正常ヒト表皮角化細胞(NHEK)に12時間暴露後、抗菌ペプチドに対するreal-time PCRを行う。また、培養液中のATPを測定する。2.次に、monocyte-derived LC (mLC)を樹立した後、各種抗菌ペプチドをmLCに24時間暴露した後、HIVに2時間感染させ、7日後、HIV感染mLC数を定量する。3.さらに、手術で余剰となった皮膚を患者の同意のもと提供して頂き、表皮水疱蓋を抗菌ペプチド液に4時間暴露した後、HIVを2時間暴露し、3日後に表皮水疱蓋から遊走するLCのHIV感染率をFACSで定量する。(結果)1.HSVの曝露によりNHEKにCathelicidin、βDefensin1-3の発現増強が認められたが他の抗菌ペプチドの発現上昇は認められなかった。HIVをNHEKに曝露してもすべての抗菌ペプチドの発現に影響を与えなかった。HSV,HIVによって有意なATPの産生は認められなかった。2.HIV曝露前に処理した抗菌ペプチドの中で、Cathelicidin(LL37)のみがmLCのHIV感染を有意に増加させた。(意義)これら13の結果より、HSVは表皮細胞にCathelicidin(LL37)、を誘導することによってHIVの生体内侵入を促進している可能性が示唆された。<LL-37発現誘導に関する検討>(目的)cathelicidinの活性は、カリクレイン5(KLK5;セリンプロテアーゼ)による前駆体hCAP18から成熟したLL-37ペプチドの酵素の処理によってコントロールされていることから、ケラチノサイト(KCs)におけるKLK5の発現レベルはLL-37の誘導と相関する。そこで我々は、KCsにおけるLL-37、hCAP18およびKLK5の蛋白レベルがHSV感染によってどのように変化するかを検討した。(結果)HSV-2はKCsにおけるhCAP18ならびにKLK5、LL-37の発現を同時に増加させることが明らかとなった。これらの結果から、HSV-2はKCsにおけるhCAP18とKLK5の発現を増加させることでLL-37を誘導することが示唆された。<KCsから産生されるLL-37のHIV感染増強作用の証明>(目的)HSV-2感染KCsから産生されるLL-37がランゲルハンス細胞(LCs)のHIV感染を増強させることを証明するために、LL-37 siRNAを用いた。尚、ウエスタンブロット法によって、KCsにおけるLL-37のタンパク質濃度は同siRNAのトランスフェクションによって有意にノックダウンされた(55%のダウンレギュレーション)。(結果)HSV-2感染KCsの培養上清によってLCsのHIV感染率は有意に増加した。さらにLL-37 siRNAを用いてLL-37をノックダウンしたKCsにHSV-2を感染させた際の培養上清は、コントロールsiRNA処理のHSV-2感染KCsの培養上清に比較して、そのLCsのHIV感染増加効果が有意に減弱していた。これらの結果は、HSV-2感染KCsの培養上清によるLCsのHIV感染増加効果にLL-37が寄与していることを示唆している。目的)HSVやHIVの皮膚への侵入に際し、個々の細胞群の自然免疫反応が皮膚全体してどのように生体内侵入に関与しているかについて、ex vivo皮膚感染モデルを用いて、HSV感染による表皮細胞(KC)由来のanti-microbialpeptides:AMPやATP(アデノシン三リン酸)産生能を測定し、それぞれのHIV感染に対する影響について検討する。方法)近年、細胞ダメージによって放出されるATPが重要なDanger signalの一つとして着目されているが、KCの細胞ダメージを誘発するHSV感染におけるATPの免疫惹起作用についての報告は未だない。そこで、HSV2を培養表皮細胞に曝露し、ATP産生量を測定した。

さらに単球由来ランゲルハンス細胞(mLC)を用いて、LCのHIV感染に対するATPの影響を検討した。結果)1.HSVの曝露により正常ヒト表皮細胞:NHEKからATPの細胞外放出が観察され、この放出はHSVのMOI依存性に認められた。2.さらにmLCのR5 HIV感染性はATPの添加によって有意に増加した(HIV p24細胞内染色およびフローサイトメトリー解析)。意義)前年度の研究結果から、HSVは表皮細胞に抗菌ペプチドLL37を誘導し、さらにLL37はランゲルハンス細胞表面のHIVレセプター発現を上昇させてHIVに対する易感染性を増加させることで、HIVの生体内侵入を促進している可能性が示唆されたが、今回の実験結果はHSVによるLCのHIV感染増強作用が、LL37のみでなく細胞外ATPによる間接的な作用を介していることを示している。このことから細胞外ATPの不活化作用を持つアピラーゼなどが新たな性行為HIV感染予防薬として有用な可能性が示唆された。HSVの曝露によりNHEKにCathelicidinの発現増強が認められることや、Cathelicidin(LL37)がヒト表皮内LCのHIV感染を増加させることは、世界でも未だ報告がなく、全く新しい知見と考えられた。25年度が最終年度であるため、記入しない。細胞ダメージによって放出されるATPが皮膚科領域でもっとも頻度の高いHSV感染で産生されることや、この細胞外ATPが性行為HIV感染における最も重要な初期感染ターゲットであるLCのHIV感染を増強することは、いづれも全く新しい知見であり、さらに性行為HIV感染予防の観点からもこれらの知見は大きなインパクトをもつと考える。今後、これまで得られた知見をさらに科学的に証明するため、NHEKのLL37遺伝子発現をsiRNAを用い、て低下させ、その際のHSV曝露後のNHEK培養液がLCのHIV感染にどのように影響するかを検討する。これまでmLCを用いて得られた知見をヒト皮膚を用いたex vivo感染モデルで検討する予定である。具体的にはATP不活薬アピラーゼの前処置によって、HSVによるLCのHIV感染増強効果が抑制されるかについて検討したい。