hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生分解性材料としての多糖誘導体/脂肪族ポリエステル系ブレンドの設計と特性解析

上記に加え、キチン誘導体の分子複合系へ本研究を展開するための準備として、新規キチン・キトサン誘導体の合成とその物性評価、および、部分脱アセチル化キチンと親水性ポリマーからなるブレンドの相溶性評価、などを行った。
武道固有の身体技法に関する基礎的研究-中学校武道教材のために-

平成24年度から中学校保健体育科目の武道が必修となった。それにともない、武道の伝統的特性を解り易く説いた教材の開発が急務である。しかしながら現代武道は、戦後、スポーツ宣言をし、競技として発展させ、伝統的特性を排除する方向で推進されてきたのが現状である。本研究は、不明瞭となった武道の伝統的特性を明確にするために、古流武術に共通する身体技法に着目し、その実践を通じて武道の伝統的特性を学ぶことのできる教材の可能性を提示するものである。武道に於ける『型』のサンプルとして、柳生新陰流と一刀流を取り上げ、現在継承されているそれぞれの型を総て撮影し、それぞれの伝書・目録に記述されている内容と身体操作及び技法とを照合し整合性を確認した。次に伝承の方法について、継承者との議論を踏まえて、型に籠められているメッセージの何であるかを抽出し、型学びの理念と方法を再確認できた。今回取り組んだ柳生新陰流と一刀流の特徴は、それぞれ「十文字勝ち」「切落し」と名づけられた極めてシンプルな刀の操作法(一刀)で千変万化のあいての技を制することにある。その「一刀」を「いつ、どのように」使うか、つまりタイミングと距離、そしてその時の身体運動あり方を分析し、型学びの構造と本質を明確し、更に、体の動きと心の動きを一体化させる具体的な場面がどこに現されているのか、映像と文言(伝書)の分析によって明確化することができた。過去5年間、国際武道大学の特定研究プロジェクト「東アジアにおける武術の交流と展開」の共同研究者であり、日本武道の特性について議論し、基礎文献と型の実技の照合を試みてきた。その時のメンバーに研究協力を依頼しており、実技実施者2名、撮影協力者1名、文献解読協力者1名、計4名の研究協力者との論議を重ねながら、古流剣術の特徴である「三重十文字の体(たい)作り」、「すり足」、「上虚下実」、「攻防一致」「一足一刀」「機先」などをキーワードとする武道固有の心身技法モデルの祖型を作成する準備が整った。21年度の研究では、古流剣術の特徴である「三重十文字の体(たい)作り」、「すり足」、「上虚下実」、「攻防一致」「一足一刀」「機先」などをキーワードとする武道固有の心身技法モデルの祖型を作成する準備が整い、それを基に22年度は以下のような研究計画を立てた。それは、「新しい型と実施要領の素案をもとに、剣道経験のある被験者とともにその型を実践し原型を制作する。週1回1時間、合計30時間(15時間×2回)実施。次に、制作された原型を実施要領に基づいて実践し、アンケート調査と面接法によって何を獲得し何を学んだか、実態を調査する。調査結果を基に原型と実施要領に修正を加え「型学び教材モデル」を作成する。研究方法として、埼玉大学附属中学校の生徒、埼玉大学学生、近在の一般希望者に一期10名、二期10名、計20名に被験者を依頼する」というものであった。しかしながら、協力校が実施している体育の授業での「武道」実践を担当できることとなり、被験者の大幅な変更が生じた。したがって、当初計画は次年度持ち越しとし、22年度は、既に作成された「武道固有の心身技法モデルの祖型」を、中学校1年生(男子80、女子80、合計160名)を対象とした体育の授業で実施するための武道教材としてあらたに組み直し、50分×5回分を作成し、実際に授業を試みることとなった。始めて武道体験をする生徒を対象とすることになり、「礼法」が「相手を尊重する」行為であるのみならず、強い体づくりのための「稽古」であること、また、それ自体が護身術と直結していることなどを中心軸としたあらたな教材モデルを作成することとした。そこでは「三重十文字の体(たい)作り」、「すり足」、「上虚下実」、と新たに「合掌体」を実施しその意義を説明した。それらの実践を通じて、「生徒自身の身体が変化し相手に強い力を与えるが自分自身の努力感は軽減されることを感じさせる」ことができた。実施された授業の録画と生徒が記載したワークシートを参考に、具体的な身体技法が生徒にどのように受け止められていたかを検討し、授業に参加していた現場の体育教員の感想や意見を取りまとめて、「攻防一致」「一足一刀」「機先」など、剣道の特性にかかわるさらに進んだ教材作成に役立つ資料が準備されたことは大きな成果であった。本研究は、「心と体を一体として捉えた」日本固有の運動学習即ち古流剣術の基礎構造を明らかにすることで、中等教育の体育においてスポーツ教材とは趣を異とする日本の伝統的な行動様式の面白さ(間と気の感覚養成)を織り込んだ新たな武道教材の作成を目指すことにある。

最終年度となる23年度は、古武道共通の身体技法である「三重十文字の体(たい)作り」・「合掌体」・「すり足」・「上虚下実」・「攻防一致」・「一足一刀」・「機先」などについて、個別の種目(剣道)との関係を考慮し、各配当時間内での位置づけと実施内容と方法及び適正な時間を検討し、授業で活用できる指導計画及び評価方法を試論的に作成した。実施に際しては、実施内容の検討と精選、指導計画及び指導案の作成、埼玉大学学生を対象とした予備実践、埼玉大学附属中学での授業実践、剣道経験をもつ生徒への適用と自己評価及びアンケートなど、段階を追って実施し、「いつでも、どこでも、だれにでもできる」指導計画・評価方法のモデルを提示することを目的とした。「礼法」が「相手を尊重する」行為であるのみならず、強い体づくりのための「稽古」であること、また、それ自体が護身術と直結していることなどを中心軸とした教材として「三重十文字の体(たい)作り」・「合掌体」が生徒の関心を高め、それが剣道の「充実した気勢」と「適正な姿勢」作りと「一本」という打突に結びつくことをも理解させるのに有効であることが判明した。これを軸とし、剣道の「一本」とは何かを考えさせる伝統性を強調する運動学習教材の道が開かれ、新学習指導要領の課題に十分応えることにもなることが確認できた。
高電流密度運転を指向した燃料電池用カーボンフリー触媒層の構造設計・開発

本課題は、固体高分子形燃料電池(PEFC)のためのカーボンフリーカソード触媒層における高速物質移動構造の設計・開発を目的としている。カソード内部では、触媒反応、プロトン・電子の伝導、酸素ガスの拡散など、複雑な現象が起こり、電池性能を決定している。特に、高出力化に必要な高電流密度領域での運転においては生成水の影響が顕著となるため、酸素の物質移動抵抗の低減には、カソード触媒層内での水の移動や凝縮(液水形成)を考慮した電極構造設計が必要である。2018年度は、カーボンフリーカソード触媒層から水を効率よく移動・排出させるために、触媒層とガス拡散層の間に設置するマイクロポーラス層(MPL)の構造に着目した。MPLは触媒層と直に接するため、水移動を制御する上で重要な構成要素である。本課題では、MPLに用いるカーボン粒子の粒径とバインダーポリマーの種類を変えることで、MPLの細孔構造および親疎水性を制御した。細孔構造の異なるMPLを用いた発電性能の比較から、大きい細孔径を有するMPLの場合、カーボンフリー触媒層からMPLに移動した水が凝縮しにくく、フラッディングが起こりにくいことが示唆された。さらに、親水性MPLは疎水性MPLに比べ、発電性能の向上が確認された。疎水性MPLの場合、触媒層/MPL界面に水が溜まり、液水によるフラッディングが生じ、一方で、親水性MPLは、カーボンフリー触媒層からMPLへの水移動が容易に起こり、高電流密度領域での物質移動抵抗低減につながったと示唆された。本成果は、カーボンフリーカソード触媒層における水移動特性向上に向けた重要な知見であり、現在着手している触媒層の構造制御と合わせて、電極全体での設計・開発を進めている。2018-2019年度は、カソード電極におけるカーボンフリー触媒層およびガス拡散層構造が高電流密度領域での発電性能(物質移動特性)に与える影響の調査を目的としており、2018年度は主にガス拡散層構造に着目し研究を進めた。ガス拡散層に用いるMPLの細孔構造や親疎水性を制御し、カーボンフリー触媒層と組み合わせた電極において、高電流密度領域で異なる発電性能を示した。得られた結果から、MPL構造が電極内部の水移動特性に与える影響を考察し、カーボンフリー触媒層に適したMPLの構造設計指針が得られた。さらに現在、テンプレート粒子を用いた触媒層の構造制御にも着手している。以上から、2018-2019年度の研究計画を順調に進めており、カソード電極全体(触媒層+拡散層)での構造設計から、高電流密度領域で液水の形成を抑え、酸素の物質移動抵抗を低減する電極を構築できると期待される。テンプレート粒子を用いた新規手法によるカーボンフリー触媒層の細孔構造制御を引き続き進め、カソード触媒層構造と高電流密度領域での発電性能との関係性を整理する。ここでは、導入するテンプレート粒子の粒径、粒径分布、濃度により、細孔構造の制御を試みる。さらに、2018年度で得られた知見を活かし、ガス拡散層を含めたカソード電極全体での水移動特性を議論する。得られた結果を踏まえて、触媒層の親疎水性制御も検討し、電極の各構造因子(カーボンフリー触媒層および拡散層の細孔構造、親疎水性)が水移動特性および酸素の物質移動抵抗に与える影響を明確にする。この際、電極内部での液水形成や物質移動現象を理解するために、カソード電極へ供給する酸素ガスの分圧や湿度を変化させた発電試験や電気化学的解析を行う。これらの知見を触媒層・拡散層開発にフィードバックさせ、高電流密度領域で高効率・高出力発電が可能なPEFCの実現を目指す。

2018-2019年度は、カソード電極におけるカーボンフリー触媒層およびガス拡散層構造が高電流密度領域での発電性能(物質移動特性)に与える影響の調査を目的としており、2018年度は主にガス拡散層構造に着目し研究を進めた。ガス拡散層に用いるMPLの細孔構造や親疎水性を制御し、カーボンフリー触媒層と組み合わせた電極において、高電流密度領域で異なる発電性能を示した。得られた結果から、MPL構造が電極内部の水移動特性に与える影響を考察し、カーボンフリー触媒層に適したMPLの構造設計指針が得られた。さらに現在、テンプレート粒子を用いた触媒層の構造制御にも着手している。以上から、2018-2019年度の研究計画を順調に進めており、カソード電極全体(触媒層+拡散層)での構造設計から、高電流密度領域で液水の形成を抑え、酸素の物質移動抵抗を低減する電極を構築できると期待される。テンプレート粒子を用いた新規手法によるカーボンフリー触媒層の細孔構造制御を引き続き進め、カソード触媒層構造と高電流密度領域での発電性能との関係性を整理する。ここでは、導入するテンプレート粒子の粒径、粒径分布、濃度により、細孔構造の制御を試みる。さらに、2018年度で得られた知見を活かし、ガス拡散層を含めたカソード電極全体での水移動特性を議論する。得られた結果を踏まえて、触媒層の親疎水性制御も検討し、電極の各構造因子(カーボンフリー触媒層および拡散層の細孔構造、親疎水性)が水移動特性および酸素の物質移動抵抗に与える影響を明確にする。この際、電極内部での液水形成や物質移動現象を理解するために、カソード電極へ供給する酸素ガスの分圧や湿度を変化させた発電試験や電気化学的解析を行う。これらの知見を触媒層・拡散層開発にフィードバックさせ、高電流密度領域で高効率・高出力発電が可能なPEFCの実現を目指す。
界面の微細構造と界面エネルギを考慮した薄膜剥離過程の解析と剥離力の逆解析システム

界面の微視的な構造を考慮して、剥離の物理モデルを構築し、剥離力を推定することを目的とする。ミクロに見た場合、剥離と凝着の過程は逆であるが非常に似ている。そこで、剥離のシミュレーションを行うために基板と薄膜との凝着プロセスを境界要素法でシミュレートするプログラムを作成した。この凝着プロセスと同じアルゴリズムを剥離プロセスの解析に用いた。本研究では分子間力(二面間の距離の関数)を凝着メカニズムに用いている。凝着についてはJohnson, Kendall, RobertsらのJKR理論が実験と比較されており有効性も確認されている。そこで、本研究で開発したプログラムを用いて円柱と平面の凝着を解析し、その結果をJKR理論と比較することにより解析アルゴリズムの妥当性を確かめた。解析の基礎式およびメッシュ間隔を平衡分子間距離で無次元化した式を解析に用いた。これにより、解析精度の向上と数値の安定性を確保した。1.円柱-平面モデルの凝着・剥離解析から,接触半径及び最大付着力を求め、他の接触理論と比較し,本解析の有効性を示した.2.表面粗さを考慮した凹凸のある円柱-平面モデルの凝着・剥離解析から,凹凸のある円柱を押し下げた場合,原子間距離である200[pm]を保ちながら円柱が凝着し,それに伴い接触半径が大きくなるのが確認できた.最大付着力,接触半径,表面力から,凹凸の数と最大付着力の関係は比例関係が成り立つことがわかった.3.表面応力と表面エネルギを用いた新しい凝着理論を考案し,その妥当性を実験と比較した.その理論はマイクロメータサイズの凝着領域に対しては,実験と良い一致を示した.ナノメータサイズにおける凝着について表面応力の影響が強くなるが,これに関する実験との比較は今後の課題である.界面の微視的な構造を考慮して、剥離の物理モデルを構築し、剥離力を推定することを目的とする。1.円柱-平面モデルの凝着・剥離解析から,接触半径及び最大付着力を求め、他の接触理論と比較し,本解析の有効性を示した.2.表面粗さを考慮した凹凸のある円柱-平面モデルの凝着・剥離解析から,凹凸のある円柱を押し下げた場合,原子間距離である200[pm]を保ちながら円柱が凝着し,それに伴い接触半径が大きくなるのが確認できた.最大付着力,接触半径,表面力から,凹凸の数と最大付着力の関係は比例関係が成り立つことがわかった.3.表面応力と表面エネルギを用いた新しい凝着理論を考案し,その妥当性を実験と比較した.その理論はマイクロメータサイズの凝着領域に対しては,実験と良い一致を示した.ナノメータサイズにおける凝着について表面応力の影響が強くなるが,これに関する実験との比較は今後の課題である.電子部品には薄膜を多層に積層した構造,また機械部品等には耐熱性,耐食性,耐磨耗性を向上するためにコーティングなどの膜構造を施したものが多くある.電子部品あるいは機械部品などに見ることができる多層薄膜構造は,熱・外力の作用により剥離することがある.そこで,本研究では多層薄膜構造における薄膜と基材の接着・接合の解析方法の確立と薄膜が剥離する際に必要な力を逆解析手法により推定することを目的とする.特に,界面の微視的な構造を考慮して,剥離の物理モデルを構築し、剥離力を推定することを目指す.今回,剥離実験装置の自動計測システムを試作する計画であったが,これまで考えていた剥離実験装置の原理的な問題点がわかってきたことから,剥離方法の検討を行った.これまでは軸対称な圧子により膜を押し上げることにより膜を剥離させることを考えていたが,この方法の場合,強制剥離時,剥離縁前方部に大きな塑性変形を生じてしまい,塑性変形に要する力を余分に測定し,剥離力の正確な推定ができない.そこで,剥離時に接着面に塑性変形を生じることが少ない方法も新たに考えることにした.現在のところ,基板上にある薄膜を他の板で挟み,片持ち梁の形式で剥離させるものを考えている.この装置は比較的難しくなく作製することができる.これまでの装置と併せて剥離力の推定に用いていくことにした.剥離の分子間力(二面間距離の関数)および界面の実際の形状を考慮した順解析の境界要素法プログラムの作成については,幾つかの問題があるため,分子間力における反発力の項を無視し,吸着力の項のみを用いて,プログラムを作成することにした.分子間力の有効範囲は数オングストロームであるため,剥離縁近傍の解析のための要素寸法は同程度のものとする必要がある。

反発力の有効範囲は原子半径内であることから,薄膜と基板の距離がこの中に入った場合,薄膜位置を平衡位置に置くというアルゴリズムを採ることにした.また、剥離縁は移動していくため常にリメッシュして要素寸法を調整することおよび要素数も変化するようにプログラムを作成している.最終的には,接着界面の凹凸と分子間力を考慮して,剥離界面のマクロな挙動を調べる時に,このプログラムを用いる.現在,デバッグ中であり,このプログラムによる剥離シミュレーションを機械学会に発表する予定である.電子部品には薄膜を多層に積層した構造、また機械部品等には耐熱性、耐食性、耐磨耗性を向上するためにコーティングなどの膜構造を施したものが多くある。電子部品あるいは機械部品などに見ることができる多層薄膜構造は、熱・外力の作用により剥離することがある。そこで、本研究では多層薄膜構造における薄膜と基材の接着・接合の解析方法の確立と薄膜が剥離する際に必要な力を逆解析手法により推定することを目的とする。特に、界面の微視的な構造を考慮して、剥離の物理モデルを構築し、剥離力を推定することを目指す。ミクロに見た場合、剥離と凝着の過程は逆であるが非常に似ている。そこで、剥離のシミュレーションを行うために基板と薄膜との凝着プロセスを境界要素法でシミュレートするプログラムを作成した。この凝着プロセスと同じアルゴリズムを剥離プロセスの解析に用いることにした。分子間力(二面間の距離の関数)を凝着メカニズムに用いる場合、解析アルゴリズムの妥当性を検証する必要がある。凝着についてはJohnson, Kendall, RobertsらのJKR理論が実験と比較されており有効性も確認されている。そこで、本研究で開発したプログラムを用いて球と平面の凝着を解析し、その結果をJKR理論と比較することにより解析アルゴリズムの妥当性を確かめた。その過程を通して分子間力を考慮した解析の困難な点を明らかにした。一般に、分子間力の有効範囲は数オングストロームであることから、解析のための要素寸法は同程度のものとする必要がある。このデータを用意するには多大の労力がかかることから、解析の基礎式およびメッシュ間隔を平衡分子間距離で無次元化し、これを解析に用いることにした。この処理を行うことにより、解析精度の向上と数値の安定性を確保した。また、同じプログラムを用いて剥離解析を行った。その結果、剥離、凝着の両方共に解析が可能となったが、解析に繰り返し計算を行っているため、繰り返し数の増加に伴い安定性の問題が新たに出てきた。また、剥離実験装置の自動計測システムを試作した。しかし、解析プログラムにおける問題を解決するため、時間を使ってしまったため、十分な実験を行うことができなかった。今回購入した計測機器を用いて電子基板とICの剥離強度の実験を行う。薄膜剥離の計算が高度な非線形性を有しているため逆解析アルゴリズムは難しいがJKR理論などから予測される凝着力-剥離距離の関係から凝着力を求めることができることから、数値解析による同様な関係を導出することで逆解析は可能と考える。
サイクリンタンパクの機能ドメインの解析

サイクリンは、cdc2と結合してMPFの活性を調節しているタンパク因子である。サイクリンタンパクの中央領域はサイクリンボックスとよばれてそのアミノ酸配列がよく保存されており、サイクリンの重要な機能を担っていると想像されるが、サイクリンタンパクのドメイン構造と関連づけてサイクリンの機能を探る試みは未だなされていない。本研究では、サイクリンタンパクの機能ドメインを明らかにするため、サイクリンボックスを含む種々の領域を改変した変異サイクリンを作成してその機能を調べ、MPFの活性を担うサイクリンの機能ドメインの解析をおこなった。アフリカツメガエル(Xenopus laevis)のサイクリンAは、419アミノ酸から成る。XenopusサイクリンAの変異クロ-ンよりmRNAを合成してXenopus卵母細胞にマイクロインジェクトし、そのGVBD(卵核胞崩壊)の誘導能を調べたところ、N末から169番までのアミノ酸を欠失すると、MPFの活性が消失した。この位置は、アミノ酸配列が強く保存されている領域(サイクリンボックス)のN末側の端に対応する。またXenopus卵エキストラクト中でmRNAからサイクリン変異タンパクを合成し、そのin vitro活性を調べたところ、同様に169番までの欠失によりcdc2との結合、ヒストンH1キナ-ゼ活性ともに失われた。サイクリンボックスの中央231番に欠失をいれた変異サイクリンでは、同様にMPF活性が消失した。161番目までの欠失では、上記の活性は全く失われない。サイクリンボックスはMPFの活性化に必須の領域であり、サイクリンのこの領域にcdc2が結合してMPF(cdc2ーサイクリン複合体)を形成していることが、本研究より明らかになった。
大学の規模・範囲の経済性と技術進歩に関する計量経済学的研究

本研究の主な結論は次の通り。第1に、日本の大学のデータを検討し、当局による大学行政を産業組織論の観点から再検討することが有益であることを指摘した。第2に、国立大学81校や私立大学107校のパネルデータを使いトランスログ費用関数をそのコストシェア方程式とともに同時推定することによって、規模や範囲の経済性が存在することを示した。第3に、国立大学のパネルデータを使い確率的フロンティアモデルを推定することにより、その非効率性の存在を明らかにした。第4に、国立大学の集計された時系列データを使い生産関数を推定し、大学教育の技術進歩率が年率0.4%0.8%程度と低いことを明らかにした。平成20年度は、わが国の大学を取り巻く環境について検討をするとともに、わが国の国立大学と私立大学について、データベースを構築した。国立大学については、毎年秋に公表される国立大学法人の財務諸表などに基づいて、全国90の国立大学法人と大学共同利用機関法人を対象に収集した。主なデータの項目は、ストックデータとして有形固定資産額のうち土地や建物、図書などの資産額、またフローデータとして診療経費、役員人件費、非常勤教員給与、教員人件費、非常勤職員給与、職員人件費、経常費用合計、付属病院収益、学部学生数、修士課程学生数、博士課程学生数などである。他方、わが国の私立大学についても、東洋経済の大学四季報に基づいて、全国102校の私立大学を対象に収集した。主なデータの項目は、ストックデータとして有形固定資産額のうち土地や建物、有価証券、現預金、総資産、負債、またフローデータとして学生納付金、寄付金、補助金、資産収入、事業収入、消費収入、人件費、管理経費、借入金利息、病院経費、経常収支、学生数、教員数、職員数などである。こうしたデータベースを作成し、そのデータを短い期間ではあるが時系列で考察したり、大学間の比較考察などを行った。また、データの背景にある国立大学と私立大学の会計制度の比較検討もあわせて行った。これらの考察から、わが国の国立大学や私立大学のような高等教育の市場について、産業組織論的なアプローチにより経済学的に考察することが今後の高等教育政策を考えるうえで有益であるという結論を暫定的に得た。平成21年度は、まず平成20年度に作成したデータベースを延長・拡充した。次に、我が国の高等教育を取り巻く環境や大学行政のあり方などを近年のデータ等に基づいて考察し、その考察を論文(「わが国の大学行政と市場構造-産業組織論の視点-」同志社大学経済学部ワーキングペーパーNo37)としてまとめた。さらに、作成したデータベースに基づいて規模の経済性や範囲の経済性、技術進歩などを計測するために、わが国の大学を対象にその費用関数を推定した。費用関数のパラメータを推定した後で、そこから規模の経済性や範囲の経済性、技術進歩率などの指標を計算するが、これらの指標が推定されたパラメータの非線形関数となる場合には、検定統計量の計算が簡単ではない。この問題に対しては、デルタ・メソッド(Davidson and MacKinnon, 2004, Ch5)やブート・ストラップ法(Efron(1979))の適用を検討し、TSPやEViewsなど計量分析ソフトウエアについても複数の場合を試みた。平成22年度は3年間にわたる研究期間の最後の年であり、その成果として5本の論文を加筆・執筆した。「わが国の高等教育政策と大学の市場構造-産業組織論の視点-」『経済学論叢』(掲載予定)では、大学行政を有効に機能させるには国立・公立・私立という設置形態に関わらず、財政、会計、情報公開など大学運営の枠組みを共通化させることが望ましいことを指摘した。「国立大学の費用関数:トランスログ・コストシェアモデルによる同時推定」『同志社大学経済学部ワーキングペーパー』では、国立大学の費用関数をシェア方程式とともに同時推定することによって、先行研究よりも統計的に信頼度の高い推定値を得ることに成功し、規模と範囲の経済性、生産要素の代替関係などを計測した。「私立大学の費用関数:トランスログ・コストシェアモデルによる同時推定」『同志社大学経済学部ワーキングペーパー』では、私立大学の費用関数をシェア方程式とともに同時推定することによって、統計的に信頼度の高い推定値を得て、規模と範囲の経済性、生産要素の代替関係などを計測した。「国立大学の効率性:確率的フロンティアモデルによる計測」『同志社大学経済学部ワーキングペーパー』では国立大学の確率的フロンティアモデルを最尤法によって推定し、各国立大学の非効率性指標を計測した。「国立大学の生産性:時系列分析による技術進歩率の計測」『同志社大学経済学部ワーキングペーパー』では、生産関数の共和分推定によって学部教育の技術進歩を年率0.4%0.8%と計測した。
予測誤差の可視化による自己感への貢献：行動・計算論・脳機能計測の統合

2000年以降の心理学関連領域において,「自己」という感覚はどう生起しているのか,「他者」との円滑な相互作用がどう実現されているのか,という問いに注目が集まっている。本研究では,その基盤となっている可能性のある「予測誤差」に注目することで,「自己と他者を分離しながら結合する」ことを可能にしている認知神経メカニズムの計算論的モデル化を行う。そのために,心理物理実験と脳機能計測を対応させ,「心」と「体」と「脳」の三位一体性の解明を目指す。これはその関係性が障害されてしまっている精神疾患の解明にも大いに貢献する内容である。
難無種子化ブドウの無種子果房をつくる

慣行の無種子化法では難無種子化品種である'ナイアガラ'および'コンコード'の無種子化には、実用上、300mg・L-1GA3と10mg・L-1ホルクロルフェニュロンの混用液を満開14日前に処理する方法が好適であった。両品種が難無種子化である原因は、無種子化が容易な品種に比べて胚のうの発達阻害が起きにくいためと推察された。'ナイアガラ'は、ストレプトマイシンとの混用処理を行っても無種子化はそれほど改善されなかったため、現段階では、ブドウ品種のなかでも著しく難無種子化品種であることが明らかとなった。今年度は、'ナイアガラ'および'コンコード'の無種子化のための好適処理薬剤および濃度を明らかにするために、ジベレリン(GA、GA_3およびGA_4:100および300mg・L^<-1>)と合成サイトカイニン〔ホルクロルフェニュロン(CPPU):10および20mg・L^<-1>、ベンジルアデニン(BA):1000mg・L^<-1>の満開15日前と10日後の2回の単用および混用処理による無種子化効果を検討した。その結果、両品種において単用処理ではGA_3およびGA_4のいずれの濃度でも果粒は粗着となり、無種子化効果は著しく低く、GAの種類による差異はみられなかった。また、両濃度のCPPUとBAではいずれも無種子化効果はほとんどみられなかった。しかし、300mg・L^<-1>GA_3と両濃度のCPPUとの混用処理では着粒数は多く密着し、無種子化が図られ、高濃度のCPPUの方が、また、'ナイアガラ'より'コンコード'に対してより効果的であったものの、両品種ではいずれも実用化に達しないレベルであった。また、BAとの混用処理でも無種子化効果は低かった。今年度は、'巨峰'の無種子化においても、例年に比べ無種子化効果が低下したことが生産圃場でもみられたことから、無種了化を阻害する何らかの内的あるいは外的影響の存在が推察された。以上の結果は両品種における無種子化効果をより安定化させる方法を追究しなければならないことを示唆するものであるものの、予備実験の結果もあわせて、300mg・L^<-1>GA_3と20mg・L^<-1>CPPUとの混用処理がより効果的であると推察された。なお、満開期にすべての処理区での花粉および子房を採取し、花粉発芽および胚のう形成の調査の準備は整えたが、無種子化効果の結果から、影響については明らかにならないと判断されたことから、この点については、次年度に好適処理時期の検討と別に調査を行うこととしたい。今年度は、昨年度の結果から'ナイアガラ'および'コンコード'の無種子化に最も効果的であった300mg・L^<-1>GA_3と10および20mg・L^<-1>ホルクロルフェニュロン(CPPU)との混用液の好適処理時期を明らかにするため、第1回目処理を満開21日、14日、10日、8日および0日前(第2回目処理はいずれも10日後)として無種子化効果を調査した。その結果、無種子果率(果房の全果粒数に対する無種子果粒数の割合)は、両品種ではともにCPPUの濃度に関わらず処理時期が満開日に近づくにつれて低下する傾向にあり、14日前処理で実用レベル(95%以上)になった。一方、満開14日前および10日後の300mg・L-1GA3およびGA4ならびに20mg・L^<-1>CPPUの単用処理効果を再調査した結果、GA_3処理では両品種間に差異はなかった(約70%)が、GA_4およびCPPU処理においてそれぞれ'ナイアガラ'では約70%、21%であったのに対し、'コンコード'では約3%、74%であった。他方、これら単用処理と同時期のGA3_とCPPUとの混用処理における満開日の胚のう形態を検鏡した結果、異常胚のうの割合は'ナイアガラ'では混用処理で最も高く(約56%)、次いでGA_4、CPPU、GA_3単用処理の順であったのに対し、'コンコード'でも混用処理で最も高かった(約57%)ものの、CPPU、GA_3、GA_4単用処理の順に高かった。以上のことから、両品種の無種子化には、実用上を考慮すると満開14日前の300mg・L^<-1>GA_3と10mg・L^<-1>CPPUとの混用処理が好適と考えられた。

また、両品種ではGA_4とCPPUの単用処理に対する無種子化効果が異なることから、内生GAおよびサイトカイニンの種類に違いがある可能性が考えられた。一方、無種子化には異常胚のうの割合が高まることが一因であるものの、主因ではないと考えられた。昨年度までの結果から実用上好適と考えた300 mg・L-1ジベレリン(GA3)と10 mg・L-1ホルクロルフェニュロン(CPPU)との混用の1回目および2回目処理を満開12日前および12日後に行い、無種子化効果の再現性と、主に胚珠形成を阻害して無種子化を誘起すると考えられている200 mg・L-1ストレプトマイシン(SM)を1回目処理に混用した効果を検討した。また、慣行の果房管理を行い、収穫期の果実形質および品質を有種子の無処理果房と比較した。その結果、`ナイアガラ'および`コンコード'の無種子果率は、GA3とCPPUとの混用処理では82.5%、99.7%、SMも混用した処理では94.0%、100%となり、SMも混用した処理でも`ナイアガラ'では実用化レベル(95%以上)に至らなかった。このことから、`ナイアガラ'は極めて難無種子化品種であると推察された。GA3とCPPUとの混用処理における果房長、果房当たりの果粒数、無種子果粒重、無種子果粒の糖度および酸度は、無処理果房と比べて`ナイアガラ'では約107%、106%、84%、103%、82%、`コンコード'では約116%、132%、82%、95%、155%となり、両品種でともに果粒重は小さくなり、品質には果粒数の多少が影響すると考えられた。一方、GA3およびCPPUの単用処理と混用処理における花粉発芽率は、両単用処理、混用処理で無処理の約25%以下、53%であり、花粉発芽は阻害されるものの混用による相乗効果はみられなかった。このこととSMとの混用処理ならびに昨年度の異常胚のうの出現割合の結果から、両品種が難無種子化である原因は胚のうの発達阻害が無種子化が容易な品種に比べて起きにくいためと推察された。他方、開花結実期における内生のGAおよびサイトカイニンの挙動は研究期間内に明らかとならず、継続して分析中である。これまでに難無種子化ブドウの無種子化の方法については明らかとなったものの、難無種子化のメカニズムについては一部明らかとなっただけであるため。24年度が最終年度であるため、記入しない。現在までの達成度がやや遅れている理由に記したように、難無種子化のメカニズムについては処理による雌性器官に対する影響として胚のう形成にかかる知見が得られたのみである。処理による雄性器官に及ぼす影響として満開期の花粉も採取したが、設定した処理区が多すぎたため、その採取に予想外の時間を要し、処理ではなくそのことにより花粉稔性が著しく低下してしまったことから、好適処理方法をもとに処理区を絞り込んで雄性器官に及ぼす影響について調査を行う。また、内生植物ホルモン分析では、試料採取から抽出・精製までは行ったものの、GC-MSでの何らかの原因により内生植物ホルモンを検出できない状態が続き、年度内にデータが得られなかったことから、早期にGC-MSを良好な状態に調整し、分析を行う。以上の調査・分析を通して、難無種子化のメカニズムについてさらなる検討を行う。
心筋細胞間の機能結合形成にいたる分子機構の発現過程にかんする研究

ラット心臓の発達過程におけるギャップ結合構成蛋白の発現パターンを特異抗体とcDNAプロープを用い検討した。心筋ギャップ結合は介在板の縦走部にあって細胞間の興奮伝達経路となり、コネキシン(Cx)蛋白群のうちCx40、Cx43、Cx45の少なくとも3種類の構成蛋白が存在している。ノーザン法では出生時から成獣期にかけCx43mRNAが増加するのに対し、Cx40およびCx45mRNAは成長につれ逆に発現の減少を認めた。心抽出膜分画のウエスタンブロット分析では出生時に優位なCx40の発現を認め、またCx43は新生仔と成獣との間でリン酸化状態の相違を示唆するバンドの移動がみられた。心凍結切片を用いた蛍光抗体法にて抗Cx43抗体では心発達の経過を通して心房、心室共に強い免疫標識を認めた。抗Cx40抗体では胎生末期から生直後の心室部において心内膜側に強く心外側に弱いgradient状の標識パターンを認めたが、生後1日目にはこの標識は心内膜側のプルキンエ線維に相当する部位に限局し、成獣と同じ分布パターンを示した。心房では生後一週まで強いCx40の標識を認めたが、2週目には消失した。抗Cx45抗体では標識レベルはかなり低いものの、新生仔心室でCx40と似た分布パターンが認められた。また心房では発達過程を通して弱い標識が常に認められた。内皮細胞にはCx37、Cx40およびCx43が発現し、大動脈・肺動脈ではCx40>Cx37>Cx43、肺静脈・上大静脈ではCx40、下大静脈ではCx37とCx43、心房の内膜内皮ではCx37、左右房室弁の内皮ではCx37>>Cx43という発現パターンが認められた。左右房室弁の内皮ではCx37は心室側、Cx43は心房側に発現する傾向が認められた。以上の結果は、電位依存性などの生理特性の異なるコネキシン分子種群がラット心臓の発達過程において時間的および空間的に異なる発現調節を受けていることを示唆する。
マキシKチャネル活性化を介する血管の機能発現機構に関する研究

1.プロスタサイクリン(IP)アゴニストがcAMPが依存性経路を介して血管弛緩を誘発することを見出し、マキシKチャネル活性化との関連性を多角的に検討した。2.モルモット大動脈標本のベラプロスト(IPアゴニスト)による弛緩反応は、マキシKチャネルの選択的ブロッカーであるイベリオトキシンにより強力に抑制された。3.ベラプロストはこの標本のcAMP量を顕著に増加させ、アデニル酸シクラーゼ阻害薬であるSQ22536はこれを有意に抑制した。しかし、SQ22536はベラプロストの弛緩作用に影響しなかった。4.モルモット大動脈の単離平滑筋細胞を用い、JPアゴニストであるベラプロストがGTP依存性にマキシKチャネル電流を増加させることを示した。GTP非水解性アナログであるGTP_γSでも同様の結果を得たが、GTPそれ自身によるチャネル活性化は認められなかった。5.マキシKチャネルのクローンチャネル(α-サブユニット)を発現させたHEK細胞およびカエル卵母細胞を用いてベラプロストの効果を検討したところ、チャネル活性化効果は全く認められなかった。6.モルモット大動脈では、非常に高密度のマキシKチャネル(α-サブユニット)mRNAの発現を認めた。7.Gs蛋白に作用するコレラトキシンで大動脈標本を処置(6時間)すると、緩徐に弛緩が誘発された。コレラトキシンを熱処理するとこの作用は消失した。8.コレラトキシンの作用はSQ22536処置によっても影響されなかった。9.コレラトキシンの血管弛緩作用は、SQ22536処置下および非処置下でもイベリオトキシンにより有意に抑制された。10.以上の結果から、IPアゴニストはcAMP-非依存性にマキシKチャネルを活性化し、その機構の一部にGs蛋白を介する直接的な活性化が関与することが明らかとなった。1.細胞内サイクリックヌクレオチド、特にcAMPを上昇させる刺激に伴う血管弛緩におけるマキシKチャネル活性化の役割について検討した。本年度は、IP受容体刺激を介する弛緩反応に主眼を置き、機能実験と電気生理実験(パッチクランプ)、さらに生化学実験を行って多角的な検討を試みた。2.モルモット大動脈標本をプロスタサイクリン安定誘導体であるベラプロストで刺激して得られる弛緩反応は、マキシKチャネルを選択的に阻害するイベリオトキシンとテトラエチルアンモニウムで顕著に抑制された。尚、グリベンクラミド・Ba^<2+>は影響せず、4-アミノピリジンは顕著ではないものの有意に抑制した。3.ベラプロストによる弛緩はcAMP特異的ホスホジエステラーゼを選択的に阻害するR0-20-1724で有意に増強され、イベリオトキシンはこれを完全に抑制した。膜透過性cAMPアナログである8-br-cAMPやフォルスコリンによる弛緩もイベリオトキシンで抑制された。4.ベラプロストはモルモット大動脈平滑筋のcAMP量を顕著に増加させ、アデニル酸シクラーゼ阻害剤であるSQ22536はこれをほぼ完全に抑制した。しかし、SQ22536はベラプロストによる弛緩には影響しなかった。5.モルモット大動脈標本から調整した単離細胞を用いたパッチクランプ実験から、ベラプロストはGTP依存性にマキシKチャネル電流を増加させることが明らかとなった。6。以上の結果から、(1)IP受容体刺激に伴うモルモット大動脈の弛緩では、マキシKチャネル活性化が中心的役割を果たす、

(2)その活性化にはcAMP-依存性とcAMP-非依存性機構が関与し、後者の機構の寄与が極めて大きい、(3)cAMP-非依存性のマキシKチャネル活性化機構としてはG蛋白(恐らくGs蛋白)による制御機構が関係する、ことが強く示唆された。1.昨年度の研究成果を踏まえ、収縮機能実験・電気生理実験、遺伝子発現実験を行うことにより、プロスタサイクリン(IP)受容体刺激に伴う血管弛緩反応におけるcAMP-依存性およびcAMP-非依存性機構を更に踏み込んで解析した。2.モルモット大動脈では、非常に高密度のマキシKチャネル(α-サブユニット)のmRNA発現を認めた。3.モルモット大動脈の単離平滑筋細胞を用いたパッチクランプ実験から、IPアゴニストであるベラプロストがGTP依存性にマキシKチャネル電流を増加させることを明らかにした。GTP非水解性アナログであるGTPγSでも同様の結果を得たが、GTPはそれ自身ではマキシKチャネルをほとんど活性化しなかった。4.マキシKチャネルのクローンチャネル(α-サブユニット)を発現させたHEK細胞およびカエル卵母細胞を用いてベラプロストの効果を検討したところ、チャネル活性化効果は全く認められなかった。5.Gs蛋白に作用するコレラトキシンで摘出大動脈標本を6時間処置すると、緩徐な血管弛緩が引き起こされた。熱処理したコレラトキシンではこの作用は消失した。6.コレラトキシンの作用はアデニル酸シクラーゼ阻害薬であるSQ22536処置によっても影響されなかった。7.コレラトキシンの血管弛緩作用は、SQ22536処置下および非処置下でもイベリオトキシン(マキシKチャネルの選択的チャネルブロッカー)により有意に抑制された。8.以上の結果は、Gs蛋白がマキシKチャネルを直接制御してこれを活性化することを示し、IPアゴニストによるcAMP-非依存性マキシKチャネル活性化機構の一部を説明するものである。9.現在、パッチクランプ法によりGs蛋白のα-サブユニットの効果を検討するとともに、微小電極法により、マキシKチャネル活性化の静止膜電位に及ぼす影響を検討している段階である。
遺伝子レベルからみたイネの分化における日長反応性の適応的意義に関する研究

1.三島の夏の長日下で出穂できない野生イネやindicaの強い日長反応性が複数の遺伝子の働き合いの結果であることがわかった。個々の遺伝子の作用は三島の自然日長下で出穂できるほどの強さであった。2.1の遺伝子の中に、補足的な働き合いをするものがあることがわかった。それは発生イネ、栽培イネを問わず、また栽培イネではindicaとjaponicaを問わず、さらに材料の収集地点に関係なく広範に認められた。なおこの場合にも補足遺伝子作用だけでは三島の自然日長下で出穂しないほどの強い日長反応性を発現することはなかった。よって上記環境下で未出穂となる系統の強い日長反応性は3つ以上の遺伝子の働き合いによることがわかった。3.日長反応性に関与する遺伝子座は、アイソザイム遺伝子との連鎖関係などから少なくとも4つあると考えられた。うち2つは2で述べた補足遺伝子でその一方は第1連鎖群のSe(=Lm)座と思われる。補足遺伝子ではない残り2座は、それぞれCa+-1およびPox-1に連鎖しているらしい。以上に基づき、イネの適応性や進化に対する日長反応性遺伝子の役割りを以下のように推定した。野生イネからの進化の過程で生じた日長反応性のそう失は段階的に起こった複数の突然変異に起因する。日長反応性のそう失によって生じた早生品種は畑地環境、高高度、高緯度など多様な環境への栽培品種の拡散を可能にした。japonicaはその過程で生じた亜種で、indicaとjaponicaの日長反応性の差異は季節的隔離の機構として両亜種の分化を促進した。なお研究の過程で抽出された日長反応性遺伝子に関する同質遺伝子系統を育成中である。1.日長反応性の異なる野生イネおよびインド型栽培イネを日長反応性がない日本型テスター(T65【E^b】m)と交配し、得た【F_2】を長日・短日両区で栽培し、出穂日とアイソザイム遺伝子型を個体ごとに調べた。その結果、(1)第1連鎖群のアイソザイム遺伝子座の対立遺伝子の頻度は長・短両日長区で著しく異なった。これは長日区で出穂しなかった日長反応性・強の個体がある特定のアイソザイム遺伝子型をもつ傾向があることを示すもので、その原因はこの遺伝子座(Est-2)に連鎖する日長反応性遺伝子座の存在にあると考えられた。(2)一部の交配組合せから、異なる2つのアイソザイム遺伝子(連鎖群不詳)に連鎖する2つの日長反応性遺伝子の存在が示唆された。(3)来年度以降、これらアイソザイム遺伝子をマーカーとして、連鎖関係にあると思われる日長反応性遺伝子を抽出する。2.61年度に新たに開始を予定していた交配、および以前からすすめてきた戻し交雑はほぼ予定どおりに完了した。一部の交配組合せでは【B_3】世代に達しているので、62年度ではこれらの【F_2】集団(【B_3】【F_2】)を展開して出穂日の分離様式を調査するとともに、異なる交配組合せ集団の日長反応性の個体どおしの交配を行い、それら日長反応性遺伝子の相同性の検定を行う予定である。1.日本型で日長反応微弱なテスター系統(T65Ebm)とベトナム産で日長反応が強のインド型品種(Ac.1)との交雑により昨年存在が予想された2つの日長反応性遺伝子は, 1つはアイソザイム遺伝子Pgi-2およびEst-2と連鎖,もう一つはCat-1と連鎖していることが確認できた.

これら3つのアイソザイム遺伝子はどれも第6染色体に廛乗することがわかっているから,確認できた2つの日長反応性遺伝子もこの染色体上にあることがわかった.2.マレー半島産野性イネ系統W593をドナーとして上記E^bm系統に戻し交配を行って得た系統の出穂日の分離様式より, W593の晩生を発現する遺伝子が少なくとも2つ(2遺伝子座)あることが示唆された.両方の座の優性遺伝子をあわせもつと日本では出穂しない.一方の座だけが優性遺伝子をもった系統はEbmより1ケ月以上晩生となるが出穂することがわかった.これらの遺伝子座の少なくも1つは日長反応性を支配していると考えられた.3.来歴や産地の異なる野性イネおよび栽培イネをドナーとしてE^bm系統に戻し交配を行って得た準同質遺伝子系統の相互交雑で得たF1個体を冬期に養成し, F_2種子を得た.来年度このF_2を栽培して出穂日の分離様式を調べ,準同質遺伝子系統の晩生性を発現する遺伝子の異同を明らかにする予定である.4.計画した戻し交雑などはほぼ計画通りすすんだ.これらは来年度BnF2世代として展開し,遺伝子分析に用いる予定となっている.
肺損傷と再生における末梢気道の役割とナノテクノロジーをもちいた治療法の開発

マウス肺線維症モデルにおける細気管支の細胞死、再生と線維化に関与する因子について検討した。マウスにおける細気管支障害モデルにおいて、細気管支上皮細胞のRNAを選択的に抽出し、上皮細胞特異的なmRNA発現を検討した。特に、細気管支上皮細胞の細胞死、老化、再生に関与する因子について解析した。ナノスフェアにBax siRNAを封入し、気道上皮細胞の細胞死に及ぼす効果を検討した。1.具体的内容マウスにおけるブレオマイシン肺臓炎モデル、抗Fas抗体吸入モデル、ナフタレンモデルを用いて、laser microdissectionによって細気管支上皮細胞のRNAを選択的に抽出した。microarrayを行うためにRNAの質の確認等行い、現在解析中である。結果に応じて、蛋白発現も検討することによって、細気管支上皮細胞の損傷・修復・再生過程における重要な因子の役割を解析するため、免疫組織染色、westernblotに用いる蛋白も抽出した。また、併行してナノスフェアにsiRNAあるいはペプチドを封入し、培養気道上皮細胞を用いて、invitroにおける損傷、修復、再生に関する発現と機能の確認を行っている。2.意義第一に、肺の再生メカニズムを明らかにすることが肺上皮細胞のアポトーシス、肺損傷・線維化という負のスパイラルを断ち切る根本的治療になりうる。アポトーシスに関する因子が重要なターゲットとなる。第二に肺の発生過程における肺幹細胞の分化制御因子を標的に選択した点である。アポトーシスの制御とともに再生を促すことができれば有用な治療となりうる。第三に、遺伝子治療のベクターとしてウイルスを使用していない点である。ウイルスを用いた治療はリスクを伴うため、non-viral transferは望ましい手法である。3.重要性細気管支上皮の損傷と再生の疾患における重要性や、細気管支上皮細胞や、肺胞上皮細胞の再生に関わる分子が明らかになれば、これらを標的とした治療、たとえば遺伝子治療への応用、幹細胞による肺再生医療と組み合わせたcombination therapyなど様々な治療応用の可能性を広げることが期待される。1.具体的内容マウスにおけるブレオマイシン肺臓炎モデル、ナフタレンモデルを用いて、laser micro dissectionによって細気管支上皮細胞のRNAを選択的に抽出し、microarrayを解析中である。主に、細気管支上皮細胞のアポトーシス、老化、再生に関与する因子について検討している。併行してナノスフェアにアポトーシス関連因子であるBax, Bud siRNAを封入し、培養気道上皮細胞を用いて、in vitroにおけるアポトーシスに関する機能を確認できた。ナノスフェア封入Bax siRNAは、in vivoにおいてブレオマイシン肺臓炎モデルにおける効果を検討中である。2.意義第一に、肺の再生メカニズムを明らかにすることが肺上皮細胞のアポトーシス、老化、肺損傷・線維化という負のスパイラルを断ち切る根本的治療になりうる。アポトーシスや老化に関する因子が重要なターゲットとなる。
哺乳類ミトコンドリアゲノム操作技術の開発

本研究の目的は、人工ヌクレアーゼをmtDNAに直接作用可能な遺伝子操作技術を開発することである。そこで、TALEN法を応用し、TALEN cDNAにミトコンドリア移行シグナルとHA-tagなどを付加したミトコンドリア局在型TALENの発現ベクターを構築した。本ベクターで形質転換した培養細胞で免疫染色を行ったところ、TALEN蛋白がミトコンドリアに局在することを確認した。次いで、mtDNA上の標的配列に対する切断効果を検証するために、本ベクターからRNAを合成し、マイクロインジェクション法によってマウス初期胚へ導入したが、現在までに明らかな切断効果は認められておらず、さらなる検討を進めている。。。本研究では、人工ヌクレアーゼの手法を応用することにより、哺乳類においてミトコンドリアDNA(mtDNA)の遺伝子操作技術を開発することを目的としている。本年度は、人工ヌクレアーゼとしてはTALEN (transcription activator-like effector nuclease)法を用いて、ミトコンドリア局在型TALENの発現ベクター構築に取り組んだ。まずmtDNA配列上の標的となる領域から候補配列を選定し、TALENの発現ベクターを構築した。さらにTALENsをミトコンドリアに局在させるために、ミトコンドリア移行シグナルの配列をTALENの発現ベクターに導入し、ミトコンドリア局在型TALENの発現ベクターを構築した。作製された本ベクターの細胞内での発現を検証するために、培養細胞に導入し免疫染色による検討を行った。また、TALENがミトコンドリアに局在するかを検証するために、ミトコンドリア局在型TALENの発現ベクターとミトコンドリア局在型蛍光タンパクの発現ベクターを同時に導入し免疫染色と蛍光観察による検討を行った。その結果、目的とするシグナルがミトコンドリアに局在する様子が確認されたが、発現がやや不安定であることが認められたため、ベクターの改変をさらに進めている。また、作製したミトコンドリア局在型TALENの発現ベクターによるmtDNAの標的となる配列の切断効果を検証するために、in vitro transcriptionによるRNA合成を行い、このRNAをマイクロインジェクション法によってマウス初期胚へ導入し、DNA試料を調製した後、PCR法によって目的とした配列を増幅することによって、変異導入の有無などの検討を進めている。本申請課題では、哺乳類ミトコンドリアDNA(mtDNA)の人工ヌクレアーゼの手法による遺伝子操作技術の開発を目的としている。本年度は、昨年度に作製したTALEN (transcription activator-like effector nuclease)法の原理を応用したミトコンドリア局在型TALENの発現ベクターの改良とその機能検証を中心に取り組んだ。昨年度の問題点であった発現の不安定性の改善を目的とし、別の強発現ベクターへミトコンドリア局在型TALENの配列を組み込んだベクターを構築した。構築したベクターを細胞へトランスフェクトし免疫染色により検証した結果、多少の改善効果が認められたケースがあったものの、明確な発現の増強が確認されるまでには至らなかった。構築した本ベクターには選択マーカーとなる薬剤耐性遺伝子が組み込まれており、これら選択マーカーを用いた安定発現細胞の単離を試みた。各ベクターを培養細胞へトランスフェクトし、選択培地にて培養した後にコロニーを単離した。各コロニーについて発現量を比較するために、各コロニー由来の細胞からRNAを調製し、リアルタイムPCR法による定量解析を行った。その結果、幾つかの高発現が認められた細胞株が単離されたが、免疫染色像からはその安定性が認められなかった。現在、さらに導入遺伝子の高発現安定細胞株の単離を試みている。一方で、ミトコンドリア局在型TALENの配列を用いてRNAを合成し、マイクロインジェクション法によりマウス初期胚へ導入し、欠失の変異導入の有無を検証したが、現時点では変異導入は認められていない。哺乳類遺伝学現在までに作製されたミトコンドリア局在型TALENの発現ベクターの発現に不安定な状況が認められたものの、RNAを合成しマウス初期胚へ導入することによって、その機能評価まで進められている。より安定した発現を可能とするように、ミトコンドリア局在型TALENの発現ベクターの改良を行う予定である。またこの新規に構築したベクターを含め、培養細胞やマウス初期胚へ導入しmtDNA切断の機能効果をさらに検証する予定である。分子生物学的実験を行なっていて、剰余金が派生した。剰余金は次年度分と併せ、執行する。