hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
先進的多自由度マイクロマニピュレータの開発

1.静電気力を用いた細胞搬送装置の開発:今年度は,3次元回転が可能な細胞回転装置の試作を行った.互いに直行する300μm線上の両端に電極を4個配置し,90度ずつ位相を変えて電荷を印加して,回転電場を発生させ卵細胞を回転させる.この平面上に構成されて4個の電極からなる回転電場発生板を300μm間隔で2枚重ねる事により,2枚の間の空間で細胞を3次元的に回転させることが出来ることを確認した.2.植物細胞ハンドリング試作機の製作:パラレルリンク機構で駆動する微細作業機器取り付けプレートを試作した.試作機はマイクロステップモータで駆動して,プレートを1μmの精度で位置決め可能な性能を有していることを確認した.3.液流を用いた細胞整列機構(平成10年度文部省科学研究費研究助成課題)を利用して,倒立顕微鏡上で細胞を整列させるための基礎研究用装置の試作:液流を用いた細胞整列機構(平成10年度文部省科学研究費研究助成課題)では,四角もしくは円形のシャーレをボイスコイルモータを用いてXもしくはY軸上の1軸上での加振のみの研究であった.そこで今回,XY2軸での加振を行える装置を試作し,シャーレ内に散乱している卵細胞をシャーレ内の任意の位置に直線上に整列させることが出来ることを確認した.シャーレ全体を加振するのではなく,波だけを発生させる装置も試作して細胞整列実験を試みた.本年度は,下記に示す各テーマに関する実験装置を試作し,種々の実験を行った.また,下記に示す研究機関へ試作機を貸し出し評価して頂いた.1.静電気力を用いた細胞搬送装置の開発:今年度は,細胞保持用ホールディングピペットに微細電極を取付け(ピペット型電極),マウス卵細胞の回転制御を試みた.試作したピペット型電極を用いてマウス卵細胞を回転させることに成功した.ピペット型電極は,アルミニウムを蒸着したガラス管を加熱して伸張するという,極めて簡易な方法によって製作できた.これによって卵細胞の回転操作を実現することはできるが,各電極には形状のばらつきが大きいため,電極事に最適な印加電圧の条件をみつけなければならない.また予期せぬ個所に電界が集中し,そこから電気分解が生じるといったことも考えられる.今後はより精密で再現性の高いピペット型電極の加工方法を考案する必要がある.2.電磁衝撃力を用いたマイクロマニピュレータの開発:核移植における脱核用ピペットは,ICSI用インジェクションピペットと比べると径が大きい.よって,圧電インパクトマイクロマニピュレータ(ピェゾマイクロマニピュレータ)では穿刺不可能な場合が有る.そこで,より大きな衝撃力が発生できる電磁インパクト機構を用いて,電磁衝撃力を用いた細胞穿刺システムを試作した.ピペット先端部を鋭利に加工せずブタ卵細胞に脱核用ピペットを挿入できた.3.試作した自動化マイクロマニピュレーションシステムを下記に示す研究機関へ貸し出した.・鹿児島大学,帯広畜産大学,東京農業大学,弘前大学,セントマザー産婦人科医院.
先天性プラスミノゲン欠乏症の遺伝子異常、発症機構および病態生理に関する研究

(1)本研究では、先天性プラスミノゲン(PLG)欠乏症のC家系とN家系の遺伝子異常が明らかになった。polymerase chain reaction(PCR)法を用いて発端者のPLG遺伝子の19個のエクソンを増幅した後、M13ベクターにサブクローニングし、dideoxy法で塩基配列を決定した。その結果、PLG遺伝子のエクソン17にAla^<675>からThrへのアミノ酸置換を生じるコドンGCTからACTへの変異を約半数のクローンに認めた。このGからAへの変異により、この部位に新たにMae III(GTNACを認識する)の制限酵素部位が形成されることを利用して、C家系の各家系員のPCRフラグメントの切断解析を行った。その結果、PLG欠乏症の家系員にのみ、発端者と同様に正常対立遺伝子と変異対立遺伝子とを有するヘテロ接合体の切断パターンを認めた。さらにK家系について同酵素による切断解析を行ったところ、PLG欠乏症の発端者と弟にC家系と同一の切断パターンを認めた。このように、凝血学的検査所見と遺伝子解析の結果が一致したことから、C家系およびK家系のPLG欠乏症はエクソン17における点突然変異が原因であることが明らかにされた。(2)先天性PLG欠乏症のN家系ですでに同定されているSer^<572>→Proへの変異により、PLG欠乏症が引き起こされる機序を遺伝子発現実験で解析した。PLGcDNA内にSer^<572>→Proへの変異を部位特異的変異誘発法で作製し、正常および変異PLGcDNAをpCDM_<neo>哺乳動物発現ベクターに挿入することにより発現プラスミド(pTH3/WT、pTH3/S572P)を構築した。pTH3/WTおよびpTH3/S572PをCOS-1細胞にトランスフェクトし、^<35>S-メチオニンでラベル後、抗PLG抗体を用いて免疫沈降法で検討した。その結果、組み換え正常および変異PLG(rWT、rS572P)はともに培養上清中に検出され、しかもその分子サイズはHepG2細胞から分泌されたそれと同じであった。さらに、培養上清中に分泌されるrS572Pの量はrWTのそれに比べて著しく少ないことも認められた。現在、rS572P分子の分泌不全の機序についてさらに詳細に検討中である。
新しい自己免疫性水疱症と思われる粘膜限局性IgA天疱瘡における抗原の同定

免疫ブロット法(平成10年度)方法自己抗体の性状の確認のため、免疫ブロット法を先行した。EDTA剥離正常ヒト表皮および正常ヒト培養表皮細胞から蛋白分画を抽出し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動にて流した蛋白をニトロセルロース膜に転写する。患者血清、IgA分画のみの患者血清を1次抗体として、ABC法で反応させ、ケミルミネッセンス法にて陽性バンドを同定した。結果通常のプロット法では陽性バンドが検出されなかったため、サンプルの濃度を上げる、washingを念入りに行う、露光時間を上げる等の処置を加えたところ、200kD付近にIgAに反応する陽性バンドが認められた。しかしながらサンプル量があまりにも少量であったため陽性バンドから抽出した分画を用いた蛍光抗体間接法は施行できなかった。このことから血清中に自己抗体が存在するものと考え、次の免疫電顕法に進んだ。免疫電顕法(平成11年度)方法平成10年度から引き続き免疫電顕法を施行した。患者結膜、正常人結膜、正常人皮膚を固定した後レジン包埋した。ウルトラミクロトームにて超薄切片作製後、抗ヒトIgA抗体、患者血清を1次抗体として、ABC法を用いコロイド金にてラベリングし、透過型電子顕微鏡(JEOL,JEM-100SX)にて観察した。免疫スクリーニング法(平成11年度)方法正常ヒト結膜細胞、正常ヒト表皮細胞よりmRNAを抽出、逆転写反応にて合成されたcDNAをλgt11発現ベクターにサブクローニングする。発現ベクターを吸着させた宿主菌Y1090のコロニーのプラークリフティングを行い、精製された患者IgA分画血清を1次抗体として免疫染色を行う。陽性コロニーを取り出した後増殖、cDNAを抽出し、塩基配列を決定する。結果正常ヒト皮膚の表皮細胞間にわずかながらコロイド金のラベリングが認められた。しかしながら、ラベリングの分布特性がはっきりしなかったため、患者血清のIgA分画を用いて再度免疫電顕法を施行したが、前回以上の所見は得られなかった。原因としては患者血清中の自己抗体価が非常に低かった、あるいはサンプル量自体が少なく免疫スクリーニング法等の実験の継続が困難であったことなどが考えられる。以上のことから本患者血清には上皮細胞間の成分を認識する自己抗体分画が存在することは非常に強く示唆されるが、認識される抗原の分布特性や正常を確定するまでには至らなかった。平成10年度の研究としては免疫電顕法および免疫ブロット法による検討を行った。1.免疫電顕法では、患者結膜、正常人結膜、正常人皮膚を2%パラホルムアルデヒド固定した後、低温下にて脱水、レジン(Lowicryl K4M)包埋し、ウルトラミクロトーム(ソーバルMT2-B)にて超薄切片作製後、抗ヒトIgA抗体、患者血清を1次抗体として、ABC法による免疫染色を行いコロイド金にてラベリングを行った。こうして免疫染色した超薄切片のラベリングの分布を透過型電子顕微鏡(JEOL,JEM-100SX)を用いて観察した。正常人皮膚の表皮細胞間にコロイド金のラベリングは見られるものの、その分布特性を確定するまでには至っていない。2.免疫ブロット法では、EDTA剥離正常ヒト結膜および正常ウシ表皮細胞からSDSサンプルバッファーにて蛋白分画を抽出し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動にて蛋白を流した後、ニトロセルロース膜への転写を行った。患者血清およびあらかじめ抗ヒトIgA抗体にてIgA分画のみを精製した患者血清を1次抗体として、ABC法で反応させた後ケミルミネッセンス法にて陽性バンドを同定した。患者血清のIgA分画を用いた免疫ブロット法では、200kDの部分に陽性バンドが認められ、現在確認作業中である。今後、上述の検査法を用いてさらに検索を進めるとともに、免疫スクリーニング法を用いた抗原の同定も行う予定である。

陽性コロニーを取り出した後増殖、cDNAを抽出し、塩基配列を決定する。結果正常ヒト皮膚の表皮細胞間にわずかながらコロイド金のラベリングが認められた。しかしながら、ラベリングの分布特性がはっきりしなかったため、患者血清のIgA分画を用いて再度免疫電顕法を施行したが、前回以上の所見は得られなかった。原因としては患者血清中の自己抗体価が非常に低かった、あるいはサンプル量自体が少なく免疫スクリーニング法等の実験の継続が困難であったことなどが考えられる。以上のことから本患者血清には上皮細胞間の成分を認識する自己抗体分画が存在することは非常に強く示唆されるが、認識される抗原の分布特性や正常を確定するまでには至らなかった。
若年者のキャリア形成における資格の有用性に関する研究

本研究では、10代から20代の若年期におけるキャリア選択・支援・形成が多様化している現在、学校卒業以降の実社会において教育資格(学歴・学校歴)や、職業資格がいかなる評価をされているのか、企業等の組織や学卒者へのインタビュー調査によって検討した。さらに、「若年者のキャリア形成」に係る政策的課題が学校現場でどのように実施され、その効果をいかなる方法で測定しているのかについても調査研究を行った。平成19年度は、講義や就業体験、インターンシップなどの多様な大学教育経験を通して、学卒者がいかにキャリア形成を行っているのか、これらの経験がキャリア形成のうえでいかなる効果を及ぼしているのか、卒業生へのアンケート調査から考察した。さらに、キャリア形成を時系列的に捉えるため、職業への移行期、初職から現職までのキャリア形成期、将来のキャリアビジョンという3つの時点を設定し、大学教育の教育効果について評価した。まず、日本の学卒者の大学教育の教育的効果への評価についてまとめる。第1に、学卒者は、職業への移行期において、在学中の専攻分野と関連した就業体験が効果を及ぼしていると認識していた。第2に、職業への移行期や初期キャリア形成期では、在学中の学習意欲が効果を及ぼしていると認識していた。第3に、キャリア形成期や将来のキャリアビジョンでは、現在の仕事が専門的、または管理的な仕事である学卒者が、大学教育が初期キャリア形成に教育効果を及ぼしていると認識していた。以上、学卒者へのアンケート調査から、学卒者のキャリア転換期における大学教育、その中でも特に在学中の就業体験や学習意欲の教育効果の影響を検証してきた。日本の学卒者は欧州諸国に比べると専攻分野に関連した就業体験を経験する割合はまだ少ないが、経験した学生の大学から職業への移行期では強い影響を及ぼしていることが示された。しかし、この教育効果は職業への移行期という短期的な効果にとどまっている。本研究から得られた課題として、大学教育におけるインターンシップ等の就業経験やキャリア教育、そして学生が自主的に行う就業体験が、学卒後のキャリア形成に教育効果を及ぼす「教育プログラム」を開発することであろう。最終年度は、こういった課題の追求ならびに、教育プログラムの開発を実施する。平成20年度は、平成19年度に実施した卒業生調査から得られた知見をもとに、企業等の人事担当者や大学等にてキャリア支援に関わっている教職員へのインタビュー調査を実施した。さらに、先進的な教育プログラムの代表例として、GP等で採択されている大学・短大のキャリア支援関連プログラムの教育内容・方法、そしてプログラムの構成とその教育効果について現地調査や資料等で検証した。企業等では、学卒者の採用・教育担当者のみならず、学生のインターンジップの受入担当者にもインタビュー調査を行った。大学等はこれまで学校から職業への移行に重点を置いて就職支援を行ってきたが、インタビューにより企業等はインターンシップ等の短期研修を通して、在学中から将来のキャリアビジョンを設計できる人材の育成を期待していたことが分かった。この点について各大学・短大は多様なプログラムにより取り組んでいるが、企業側からの評価は低いものであった。その理由として、プログラムで何を教え、学生にどの程度身に付いているのかが不透明であるというものだった。このような状況を踏まえ、先進的なキャリア支援の事例としてGP採択大学・短大を調査研究した。その中には、島根大学「学生の自主的の活動の評価と教育効果の向上」のように履修状況、就職活動、面談記録等の諸活動を一元的に参照できる「学生電子カルテシステム」により学生の教育・就職支援に取り組んでいる事例や、奈良女子大学「チャレンジする女性のキャリア形成支援」のように卒業生ネットワークを活用した学生のキャリア支援に取り組んでいる事例があった。本調査を通して、学生の諸活動をポイント化している島根大学、メーリングリストでキャリア関連の情報を提供している奈良女子大学のように、これからの大学・短大におけるキャリア支援は卒業生の活用、最新情報の提供、学生の諸活動を把握するシステム形成が必要であることが分かった。
移植に適したヒトES・iPS細胞由来内皮作成と腎不全進行に対する新規治療法の開発

ヒトES・iPS細胞を用いた分化誘導研究は近年盛んに行われている中で、我々は以前よりヒトES,iPS細胞から血管内皮細胞(EC)への分化誘導研究を行い、ヒトES由来EC(ESEC)は成人ECに比べ移植生着率が高いことを見出している(PLoS One. 2008 Feb 27; 3(2): e1666, Arterioscler Thromb Vasc Biol.2007Oct; 27(10):2127-34.)。この点に注目し検討を行ったところEsEcやヒトiPs由来Ec(iPSEc)は、成人Ecに比べて、細胞増殖、内皮欠損後の回復能、酸化ストレス耐性能が高かった。これら各種内皮細胞の遺伝子発現を網羅的に解析した結果、最近抗老化因子として血管内皮細胞機能との関連が指摘されているNAD依存性ヒストン脱アセチル化酵素Sirt1発現がESEC,iPSECではヒト大動脈血管内皮細胞(HAEC)に比べて高いことが分かった。ESEC、iPSESにおいてSirt1特異的抑制薬およびsiRNAを用いてSirt1発現を抑制すると、細胞増殖・遊走能、酸化ストレス耐性能が低下した。さらに、in vitroにおけるtube形成能はESEC,iPSECでは成人ECに比べて高かったが、Sirt1を抑制することでその効果も減弱した。一方で、ヒト未分化ES細胞からESECへの分化過程におけるSirt1発現は有意な変化を認めず、また、Sirt1を抑制しても分化効率への影響は認めなかった。このことより、Sirt1は我々の分化誘導法においてESECやiPSECの分化過程に関与しないが、その細胞機能維持には重要な役割を担っていることが示唆され、今後Sirt1をターゲットとした移植療法に最良なESEC,iPSECの作製が期待される。ヒトEs・iPS細胞由来血管内皮細胞(Es・iPS-EC)の細胞機能をヒト大動脈内皮細胞と比較検討したところ、増殖、遊走、酸化ストレス耐性能がES・iPS-ECで高いことを見いだした。この差異は何に由来するのかを明らかにするために、マイクロアレイ解析を行い、Es・iPS-ECではSIRT1発現が高いことに注目した。そこで、SIRT1をsiRNAで抑制したところ、両者の差が打ち消された。このことより、ES・iPS-ECの細胞機能においてSIRT1が重要な役割を担っていることが示唆された。一方、慢性腎臓病(CKD)では、初期の段階ですでに血管内皮前駆細胞が減少していることが明らかとなっているため、ES・iPS-ECの細胞移植をCKD新規治療法として注目した。CKDでは慢性低酸素状態であるため、まずES・iPS-ECの低酸素に対する反応をmicroRNAに注目して検討した。その結果、0.1%の低酸素刺激により、microRNA 210の上昇および、そのターゲット遺伝子であるiron-sulfur cluster assembly proteinのdown-regulateを確認した。この反応は、成人内皮細胞ですでに報告されており、細胞が生き残るために解糖系代謝を亢進させる重要な反応である。さらにこの反応がヒト大動脈内皮細胞に比べて大きく、ES・iPS-ECは低酸素耐性が強い可能性も考えられた。このことより、ES・iPS-ECは低酸素状態において代謝をスイッチさせることが可能であることが示唆され、CKDに対して有用な移植ツールとなりうる可能性が示唆された。今後は、実際にCKDモデル動物への細胞移植を行い、治療効果を検討する所存である。
茶ポリフェノールによる循環器疾患およびその危険因子への予防効果

前年度までの結果より、茶ポリフェノールなど食品に含まれる微量栄養素による血圧上昇抑制、循環器疾患およびその危険因子の一時予防には、それらが持つ抗酸化能が重要な役割をしていることが確認され、天然の抗酸化物質の検索が益々必要と考えられる。そこで、その他の地域で摂取されているものについても抗酸化能に注目し、検討を行うこととした。アフリカ西部、マサイ族において様々な疾病や傷病の治療に用いられている、樹皮、根、果実などの粉末の熱水抽出により得られた水溶液、数種について、DMPOを用いたESR・スピントラップ法により分析し、抗酸化能の検討を行った。そのうちの一つ、シクンシ科のTerminalia Brownii Fresの樹皮粉末の熱水抽出により得られた水溶液について、強い抗酸化能を有する市販の高濃度カテキン含有緑茶と比較したところ、ヒドロキシルラジカル消去能は1.7倍に達し、スーパーオキシド消去能も示した。次に、この水溶液をポリフェノール抽出条件下で高速液体クロマトグラフィーを用い、分離を行ったところ、数種の化合物を得た。そこで、得られた化合物一種について、NMRにより構造の推定を行い、次にFAB-MSにより、構造を確定した。その結果、Terminalia Brownii Fresの樹皮粉末の熱水抽出により得られた水溶液中の化合物は、新規化合物(分子式C_<17>H_<12>O_5)であることが明らかとなった。この新規化合物の構造より、エストロゲン様作用が推測されたことから、エストロゲンレセプターαに対する受容体結合親和性をCoactivator Ligand Binding Assay systemを用い検討した。その結果、水溶液および新規化合物についてエストロゲンレセプターαに対する受容体結合親和性が認められた。以上について、特許申請(306004885、平成18年3月29日)を行った。脳卒中易発症高血圧自然発症ラット、SHRSPは加齢とともに重症な高血庄を呈し、ほぼ全例が脳卒中で死亡する。このSHRSPに紅茶および緑茶より抽出したポリフェノールを負荷し、非拘束下で24時間、5分間隔での血圧測定が可能なテレメトリー法を用い、茶ポリフェノールの血圧への影響を検討した.13週齢SHRSPを、コントロール群(n=5)、紅茶ポリフェノール(BTP)群(n=5)、緑茶ポリフェノール(GTP)群(n=5)の3群に分け、BTP群には、紅茶ポリフェノール150mg/日を、GTP群には緑茶ポリフェノール150mg/日を3週間投与した。明時の血圧について、3群にて比較したところ、コントロール群は加齢とともに、血圧上昇が認められたが、BTP群およびGTP群において収縮期・拡張期血圧とも上昇抑制効果が認められた。また、暗時においても同様の傾向が認められた。この、血圧抑制効果の機序を検討するため同様の実験を行い、大動脈中カタラーゼおよびミオシン軽鎖リン酸化のタンパク発現量をWestern Blotting法にて分析した.血中および尿中一酸化窒素(NO)量はコントロール群において、BTP群およびGTP群より有意に高値であった。抗酸化酵素、カタラーゼのタンパク発現量がコントロール群に対し、BTP群、GTP群が有意に高値であり、また、血管収縮に関与するミオシン軽鎖リン酸化がコントロール群に対し、BTP群およびGTP群が有意に低値であった。

本実験結果より茶ポリフェノールによる血圧上昇抑制機構ついて、ミオシン軽鎖のリン酸化の抑制が認められたことから、茶ポリフェノールの抗酸化作用により、NO活性が上昇し、ミオシン軽鎖のリン酸化が抑制され、収縮反応が低下し、血圧上昇が抑制された可能性、そしてカタラーゼタンパク発現の促進が認められたことから、茶フラボノイドによりカタラーゼの減少が抑制され、H_2O_2の水への還元が促進され、その結果H_2O_2による収縮反応が抑制され、血圧上昇が抑制された可能性が考えられた。以上について、Journal of Nutritionおよび国際高血圧学会、日本カテキン学会にて報告を行った。現在までに循環器疾患だけではなく、その危険因子である高血圧にヒドロキシルラジカルをはじめとする活性酸素が影響していることが報告されている.また、疫学研究により紅茶あるいは緑茶を摂取することにより循環器疾患が予防できる可能性も報告されている。Fenton反応にて発生させたヒドロキシルラジカルを、Xantine+Xantine Oxidaseにて発生させたスーパーオキシドをDMPOを用いたスピントラップ法において消去能を検討した.その結果紅茶および緑茶ポリフェノールはヒドロキシルラジカル、スーパーオキシド両方に対し,消去能を示した.このことから、様々な活性酸素生成系において茶ポリフェノールが抗酸化作用を示し,SHRSPにおける血圧上昇抑制に働いたと考えられる.以上について、「血圧」および第4回DIJカンファレンス、第11回国際SHR学会にて報告を行った.
電場下の高周波電子スピン共鳴を用いた強相関磁性有機絶縁体の巨大電磁気応答の解明

電子間に働く電気的クーロン力およびスピン間の磁気的相互作用は物質の磁気的・電気的性質を決める重要な要因である.本研究では強いクーロン相互作用のために絶縁化した有機半導体の中でも特に局在スピンを持つ鉄イオンを導入した系に着目し,磁性と伝導性の相関を調べた.その結果,電気抵抗がスピンの状態変化によって大きく減少する事,またその時同時に電子間クーロン力の閉じ込めが弱くなる事等を明らかにした.電子間に働く電気的クーロン力およびスピン間の磁気的相互作用は物質の磁気的・電気的性質を決める重要な要因である.本研究では強いクーロン相互作用のために絶縁化した有機半導体の中でも特に局在スピンを持つ鉄イオンを導入した系に着目し,磁性と伝導性の相関を調べた.その結果,電気抵抗がスピンの状態変化によって大きく減少する事,またその時同時に電子間クーロン力の閉じ込めが弱くなる事等を明らかにした.磁性(スピン)と伝導(電荷)の結合した現象は現代の物性物理学における重要な課題の一つである.しかし、磁気抵抗効果に代表されるように、従来の研究では系の電荷状態の磁場依存性を調べる研究が主であって、スピン状態の電場依存性を調べる研究はほとんど行われていない。特に、電荷秩序系として知られる、強相関効果によって絶縁化した一部の有機絶縁体では巨大な非線形伝導現象が観測されており、系の電子状態が電場によって大きく変化している事が充分に考えられる。本研究ではその中でも磁性イオンを含む系を中心に、電子状態を電場で変化させた場合にスピン状態がどのように変化するかを調べることを目的とする。具体的な試料としては鉄フタロシアニン伝導体TTP[Fe(Pc)(CN)_2]_2や磁性有機伝導体λ-(BETS)_2FeCl_4等を対象とする.平成20年度はTTP[Fe(Pc)(CN)_2]_2において磁気抵抗,電流電圧特性,磁気トルクの詳細な測定と,電場を印加しない状態でのESR測定を行った.まず磁気抵抗と磁気トルク測定からは,低温で発現する巨大な負の磁気抵抗の起源が何らかの磁気転移による物である事が明らかになった.また,電流電圧特性の測定と解析から,電子間クーロン相互作用の次元性が,磁気転移によって変化する事を見いだした.これまで,クーロン相互作用の次元性は,結晶格子や原子(分子)軌道の異方性のみにから決まると考えられていたが,本研究によって物質中の磁気(スピン)状態もクーロン相互作用の異方性に寄与することが明らかになった.この効果は磁性と電荷の新しい相関効果であると考えられる.ESR測定からは非常に大きなg値の異方性を観測し,磁気抵抗効果の角度依存性がg値の主値の異方性によってほぼ説明できる事が明らかになった.平成21年度は,電場を印加した状態でのESR測定を行い,スピン状態の電場依存性を調べる予定である.磁性(スピン)と伝導(電荷)の結合した現象は現代の物性物理学における重要な課題の一つである.本研究では特に強相関効果によって絶縁化した磁性有機伝導体に焦点を絞り、その磁性と伝導の相関について調べる事を目的とする.昨年度までの研究で鉄フタロシアニン伝導体TTP[Fe(Pc)(CN)_2]_2において低温で4桁以上にも及ぶ巨大な負の磁気抵抗を観測し、その起源が何らかの磁場誘起相転移(転移磁場約15テスラ)によるものである事を明らかにしてきた.平成21年度は27テスラまでのより強磁場中で磁気抵抗、磁気トルク測定を行う事により磁気相転移の詳細を明らかにした.その結果,15テスラ付近での磁気相転移はフタロシアニン分子中の鉄スピンの反強磁性相関が強磁場を印加することで破壊され、スピン配列が強磁性的になる事によるものである事が明らかになった.またこの系では結晶中に磁化容易軸の異なる4種類の伝導鎖が存在するが、それらが同一の磁場で磁気転移を起こすような磁場方位では磁気抵抗の変化がさらに巨大になり6桁程度変化する.これらの結果について国内外での学会・研究会および誌上にて成果発表を行った.また昨年度はTTP[Fe(Pc)(CN)_2]_2の電子スピン共鳴(ESR)において異常なg値を持つ信号を観測した.今年度はさらに解析を進めたがその起源については未だ解明できていない.しかし、磁気的な単位胞に存在するスピンを単純に足し合わせただけでは実験結果を説明する事はできず、何らかの多体効果を考慮する必要があると考えられる.
口腔機能の向上に効果的な新しい機能訓練プログラムの確立

本研究の目的は、口腔機能の向上に効果的な新しい機能訓練プログラムを確立することである。はじめに口腔機能評価法の有用性を明らかにする目的で、口腔周囲筋圧、咬合力、咀嚼能率の測定を行い、その信頼性を検証した。続いて、口腔機能訓練としてガム咀嚼トレーニング(ガムを左右側後方臼歯部で10回ずつ交互に繰り返し5分間咀嚼する運動)と舌回旋トレーニング(舌尖を唇頬側歯肉と頬粘膜との移行部に押しつけながらゆっくり回旋させる運動を、右回り、左回りの順に交互に20回回旋する運動)を実施した際の口腔機能の変化を検証した。その結果、いずれの方法も口腔機能の向上に有用なトレーニングプログラムであることが立証された。本研究の目的は、口腔機能の向上に効果的な新しい機能訓練プログラムを確立することであり、そのためにはまず、口腔機能を客観的かつ簡便に複数の要素から評価でき、その基準値を明確化することが必要である。そこで健常成人を対象として、1JMS舌圧測定器、Lip & Tongue Pressure Gaugeを用いた口腔周囲筋圧(舌圧・頬圧・上唇圧・下唇圧)の測定、2デンタルプレスケールを用いた咬合力の測定、3グミゼリーを用いた咀嚼能率の測定を行った。得られたデータは、Bland-Altman分析およびICCを用いた信頼性と妥当性の検定から測定精度を検証し、Spearman-Brownの公式とICC値から信頼係数が0.9以上となる測定回数を求めた。また、1口腔周囲筋圧の測定に関しては、1日目の測定日から1週間後に2日目の測定日を設けて変動係数を求めた。さらに各筋圧の相関関係をPearsonの積率相関係数を用いて分析した。その結果、各筋圧の測定日間の変動係数は同等であった。ICCはいずれも高値を示し、信頼係数が0.9以上となる測定回数は舌圧・頬圧・上唇圧で1回、下唇圧・咀嚼能率で2回であった。Bland-Altman分析の結果、各筋圧の加算誤差と比例誤差はいずれも認められず、系統誤差は検出されなかった。各測定器により得られた複数の筋圧値の変動係数に大差はなかった。上唇圧と下唇圧、両測定器の舌圧、舌圧と頬圧、舌圧と咀嚼能率の間で正の相関関係が、下唇圧と舌圧の間で弱い正の相関関係が認められた。以上のことから、各口腔周囲筋圧と咀嚼能率の間に関連性があること、各測定器により得られた測定値は再現性および信頼性が高く、チェアサイドでの口腔機能の評価法として簡便で有用である可能性が示唆された。本年度の研究により、各測定器を用いた口腔機能評価が短時間で簡便に行えることが明らかとなり、かつ少ない測定回数で信頼性の得られる測定値を得られることが示されたことから、高齢者や疾病を有する対象者にも応用可能である可能性が示されたため。本研究の目的は、若年者と高齢者の口腔機能を複数の要素から評価して基準値を明確化し、国民の健康の維持・増進に寄与できる新しい機能訓練プログラムを確立することである。そこで、健常成人30名を対象としてガム咀嚼トレーニングを実施し、トレーニングの継続が口腔機能に与える影響について検討を行った。ガム咀嚼トレーニングは、閉口状態でガムの咀嚼を左右側臼歯部で10回ずつ交互に行う方法で、対象者には1日23回、3か月間毎日実施するよう指示した。なお、1回のトレーニング時間は5分間とした。口腔機能の評価は、前年度に検証した測定機器の測定精度と再現性、信頼性の検定結果を参考に、1JMS舌圧測定器を用いた最大舌圧と習慣性咀嚼側の頬圧、2Lip De Cumによる口唇閉鎖力、3グミゼリーを用いた咀嚼能率、により行った。測定時期は、ガム咀嚼トレーニング開始前、開始2週間後、開始1か月後、開始2か月後、開始3か月後、訓練中止2週間後、中止1か月後、中止2か月後、中止3か月後の計9時点とした。トレーニングの継続による効果は、男性の方が女性よりも早期に現れる傾向があり、いずれの測定項目もトレーニング開始2週間後から開始3か月後まで増加する傾向を示した。トレーニング中止後は、男性、女性ともに減少傾向を示したが、訓練開始前よりも有意に高い値を示した。本研究の結果、ガム咀嚼トレーニングの継続により口腔周囲筋圧、口唇閉鎖力、咀嚼能率は増加することが明らかとなり、口腔機能の向上に寄与する効果的なプログラムのひとつである可能性が示唆された。健常成人に対するガム咀嚼トレーニングの継続によって口腔周囲筋圧、口唇閉鎖力、咀嚼能率が増加することが示され、トレーニング中止後に減衰傾向を示すものの増加した値を維持することが、本年度の研究により明らかとなり、高齢者や疾病を有する者においても本トレーニングが口腔機能の向上に寄与するプログラムである可能性が示されたため。初年度は、健常者を対象として口腔機能の評価法を検証した。口腔周囲筋圧、咬合力、咀嚼能率を測定し、測定値の信頼性と妥当性を検証して信頼係数0.9以上となる測定回数を求めた。

検証の結果、信頼係数0.9以上となる測定回数は舌圧・頬圧・上唇圧で1回、下唇圧・咀嚼能率で2回であった。次年度は、ガム咀嚼トレーニングの継続が口腔機能に与える影響を検証した。ガム咀嚼トレーニングは、ガムを左右側臼歯部で10回ずつ交互に繰り返し咀嚼する運動で、1回につき5分間継続するものとし、対象者には1日3回、3か月間継続するよう指示した。その結果、口腔機能はトレーニング開始2週間後から3か月後まで上昇傾向を示し、トレーニング中止後もその効果が維持されることが明らかとなった。続いて、新しい口腔機能訓練プログラムを模索するため、ガムの硬さによる効果の違いと、舌回旋トレーニングの効果を比較した。舌回旋トレーニングは、舌尖を唇頬側歯肉と頬粘膜との移行部に押しつけながら回旋させる運動で、対象者には、右回り、左回りを交互に20回、1日3回、3か月間実施するよう指示した。ガム咀嚼トレーニングは、咀嚼訓練用の硬性ガムと通常の硬さのガム(軟性ガム)を用い、前年度と同様のスケジュールで両群にトレーニングを指示した。その結果、軟性ガム群、舌回旋トレーニング群、硬性ガム群の順に口腔周囲筋圧の増加率は高くなり、トレーニング中止後の減衰はトレーニング効果の高い群の方が緩やかであった。このことから、トレーニングの効果はプログラムにより異なり、咀嚼試料の硬さにも依存することが明らかとなった。現在、各機能訓練プログラムによる顎頸部の筋負荷の相違を検証しており、トレーニング効果発現時期と中止後の経過について調査を続けている。本研究の目的は、口腔機能の向上に効果的な新しい機能訓練プログラムを確立することである。はじめに口腔機能評価法の有用性を明らかにする目的で、口腔周囲筋圧、咬合力、咀嚼能率の測定を行い、その信頼性を検証した。続いて、口腔機能訓練としてガム咀嚼トレーニング(ガムを左右側後方臼歯部で10回ずつ交互に繰り返し5分間咀嚼する運動)と舌回旋トレーニング(舌尖を唇頬側歯肉と頬粘膜との移行部に押しつけながらゆっくり回旋させる運動を、右回り、左回りの順に交互に20回回旋する運動)を実施した際の口腔機能の変化を検証した。その結果、いずれの方法も口腔機能の向上に有用なトレーニングプログラムであることが立証された。本年度の研究で各種口腔機能の関連性が示され、各測定器の特徴を踏まえた測定項目や測定回数を含む評価法が明示された。次年度は口腔機能訓練を実施し、その評価から国民の健康維持・増進に貢献ができる新しい機能訓練プログラムの模索に努める。本年度の研究で健常成人を対象としたガム咀嚼トレーニングの継続が口腔機能の向上に効果的であることが示されたため、次年度は対象者の年齢や背景に配慮したプログラムの模索と検証を行い、国民の健康維持・増進に貢献できる新しい機能訓練プログラムの確立に努める。補綴系歯学トレーニングに採用していた訓練用ガムの販売中止による対象者数の制限に加え投稿論文は未だ掲載に至っていないため、次年度使用額が生じた。成果発表のための国内旅費、およびその他として論文投稿料に使用する予定である。
う蝕細菌の耐酸性因子に対する阻害剤を用いたう蝕予防法の開発

本研究の目的はう蝕細菌の耐酸性能に関与する因子を分子レベルで解明し、これに基づいた新しいう蝕予防法を開発することである。このため、う蝕細菌の耐酸性に関与する遺伝子の特定を目指して、S.mutansGS5にトランスポゾンTn916を導入し、耐酸性能を欠失した変異株を分離した。このようにして得られた変異株のトランスポゾン挿入点に近接した染色体DNAの塩基配列を解析したところ、挿入点の上流部にはdiacylglycerol kinase遺伝子が存在していた。また、この下流部分に位置した遺伝子がコードするタンパク質は大腸菌のsignal伝達に重要な役割を果たしているRAS類似タンパク質と相補性を示すことから、このタンパク質がGTPase活性を持つGTP結合タンパク質であることが明らかとなった。これらの遺伝子の転写をNorthern blot分析で解析したところ、いずれの遺伝子も同一のmRANに転写されており、これらの遺伝子がオペロンを構成していることが明らかとなった。さらに、この部分のDNA塩基配列を広範囲に解析したところ、このオペロンは約10kbpのmRNAからなり、その中には遺伝子の修復に関係しているformamidopyrimidine-DNA glycosylase遺伝子が含まれると推測された。このオペロンにはsignal伝達機構に重要な遺伝子をよび外来からの侵襲に対応した遺伝子がコードされていることから、このオペロンの転写レベルが外環境の変化に対応するものと思われた。そこで、外環境の推移に対してこのオペロンの転写レベルがどの様に変化しているかを、プロモーターを持たないchloramphenicol acetyltransferase遺伝子を用いて調べたところ、pHの低下や高浸透圧によってこのオペロンの転写が誘導されることが明らかとなった。現在、このオペロンのプロモーター領域を解析し、これらのストレス受容体がどの様な機序で本プロモータを活性化しているかについての研究を進めている。これにより解明される受容体に対して阻害的に働く化学製剤をう蝕予防に応用することが本研究の当初の目的である。今後得られる本研究の成果から、画期的なう蝕予防法が実現するものと確信される。
小学校から大学までの学習活動における分散知に基づいた自己効力感の発達に関する研究

前年度までに行った実践による、インターネットサーバに蓄積された学習のプロトコル及び諸データや、授業時間に記録されたビデオテープ、適宜実施したインタビュー、そして、質問紙による調査などのデータを分析し、考察を行った。都内Y小学校の実践では、13年度から、参与観察を行い、膨大なデータを収集してきた。この実践では、特に、Web検索に注目し、検討してきた。結果、Web検索には、領域固有知識に加えて、文章読解能力や発達段階などの関連も示された。また、Webブラウジング時の注視時間に注目すれば、児童の発達に応じて、注視時間が長くなることが示された。このことから、注視時間と検索方略の関係も示唆された。千葉県N中学校の実践では、知識マップ付きWeb掲示板「Naksun」を使用し、協調学習を行った。その結果、学習への効果に加えて、やる気など、自己効力感と密接に関連すると推測される面においても、促進が見られた。T市教育センターの実践では、15年度、不登校児童生徒に、電子掲示板を使用したコミュニケーションを行ってもらったところ、普段はなかなかコミュニケーションのできない児童生徒でも、電子掲示板上では、他者と活発な議論が見られた。また、自分のことを明らかにする自己開示も、いくつか見られた。電子掲示板を使用した実践から、児童生徒の意欲などの促進も示された。このことが、児童生徒の自信につながっていく可能性も、自由記述アンケートから示唆された。平成13年度は、以下のように小学校・中学校・大学等にてフィールドリサーチを行い、分散的ネットワーク上の学習コンテンツのもたらす学習者への情意面での影響を主に研究した。このことは、自己効力感と人の情意的側面とが密接な関連をもつと考えたことによる。【東京都大田区立雪が谷小学校】コンピュータ利用の授業に関して半年にわたり、参与観察を行った。その結果の1つとして、協同学習は良い情報検索方略を見つける上で有効であることが明らかになった。その学習の過程で子ども達は、アイデンティティを確立しコミュニティの一員として意欲的に活動することができた。【干葉県袖ケ浦市立長浦中学校】知識マップ付きWeb掲示板を用いた数学科での協同学習を行った。その結果、学習者個人の意見や考えを他者と関係付けることが多く行われ、議論が活性化し学習意欲の向上を導いた。【日本女子大学】Web掲示板での議論を通して課題を追求することをさせたが、逼常の口頭での議論と比べ、内容が構造化し冗長な部分や欠落する部分がなくなった。また、学習者の計画性と編集能力が高く,思考における注意散漫が低いことが示唆された。【所沢市教育センター】E-mailを用いた、不登校児童へのカウンセリングを継続的に実施した。その中で、学校に行くことができなかった児童が、カウンセラーとのコミュニケーションをきっかけに、対人関係に関して自信がもてるようになり、学校に登校するようになった事例が観察された。平成14年度は、以下のような小学校・中学校・大学・教育機関にてフィールドリサーチを行い、分散的ネットワーク上の学習コンテンツのもたらす学習者の情意面や理解面への影響を主に研究した。このことは、自己効力感と人の情意的側面や理解活動とが密接な関連をもつと考えたことによる。【東京都公立Y小学校】Web探索の授業を対象とした参与観察から、1,3,5年生の児童のWebブラウジング時の注視時間を分析したところ、以下の可能性が示唆された。(1)学年が上がるにつれてWebページの注視時間が長くなる。(2)注視時間の差には文章読解能力、領域固有知識、検索方略の発達が影響している。【東京都私立T小学校】【干葉県公立N中学校】

これまで,筆者らが開発した知識マップ付きWeb掲示板「NakSun」を用いて,中学校数学科の授業で協同学習を展開してきた.本年度は,学習への動機付けを図り一層の討論の活性化を目途とし,協同学習支援システムへ形成的評価がフィードバックされる機能を新たに付与した.すなわち,外部の評価者が携帯端末から学習者のノートを評価するとその結果が知識マップ上に反映されるシステムを開発実装した.これにより,形成的評価で高く評価されたノートには多くの参照が集まり,学習意欲が高まる傾向が見られた.【T市教育センター】不登校児童生徒のための電子掲示板を作成し、電子掲示板を使用したコミュニケーションをT市立教育センターに通う不登校児童生徒11名とカウンセラー3名で実施した。ログを分析した結果、体験学習の約1時間の実践で投稿が199あり、ほぼ全ての投稿が質疑応答などコミュニケーションを形作っていた。また、実践後アンケートに回答した児童生徒のほとんどが「楽しかった」、「また使ってみたい」と回答した。カウンセラーからは、「子どもたちのコミュニケーションの幅が広がった」、「子どもたちが真剣だった」という電子掲示板カウンセリングの可能性を示唆する観察結果が得られた。前年度までに行った実践による、インターネットサーバに蓄積された学習のプロトコル及び諸データや、授業時間に記録されたビデオテープ、適宜実施したインタビュー、そして、質問紙による調査などのデータを分析し、考察を行った。都内Y小学校の実践では、13年度から、参与観察を行い、膨大なデータを収集してきた。この実践では、特に、Web検索に注目し、検討してきた。結果、Web検索には、領域固有知識に加えて、文章読解能力や発達段階などの関連も示された。また、Webブラウジング時の注視時間に注目すれば、児童の発達に応じて、注視時間が長くなることが示された。このことから、注視時間と検索方略の関係も示唆された。千葉県N中学校の実践では、知識マップ付きWeb掲示板「Naksun」を使用し、協調学習を行った。その結果、学習への効果に加えて、やる気など、自己効力感と密接に関連すると推測される面においても、促進が見られた。T市教育センターの実践では、15年度、不登校児童生徒に、電子掲示板を使用したコミュニケーションを行ってもらったところ、普段はなかなかコミュニケーションのできない児童生徒でも、電子掲示板上では、他者と活発な議論が見られた。また、自分のことを明らかにする自己開示も、いくつか見られた。電子掲示板を使用した実践から、児童生徒の意欲などの促進も示された。このことが、児童生徒の自信につながっていく可能性も、自由記述アンケートから示唆された。
生体高分子の振動工学による酵素活性制御

本研究では、酵素分子に周期的な運動を強制的に起こさせる外部力として超音波を用いて酵素揺らぎを任意にかつ選択的に誘起し、酵素機能そのものを人為的に操作することを目的としている。本年度は、照射超音波として、可聴領域を含む低周波と、数百kHz、さらにはMHzあるいは10MHz程度の高周波の超音波をパルス的に酵素溶液に照射する二つの方法により酵素活性制御の検討を行った。低周波領域を発振する素子では発振時に熱が発生することがわかったが、温度の効果を超えて10KHz程度の音波がリゾチーム活性を向上させることがわかった。特に20°C程度の条件では、酵素に対する基質の拮抗阻害剤が音波の効果により脱離し易くなり、2.5倍程度活性が上がった。また同じ酵素反応系において、1MHz、および14MHzの高周波超音波をパルス的に照射した揚合、パルス頻度が100kHzでは活性が4割程度上昇し、300kHzでは逆に2割程度反応活性が抑制されるということがわかった。また、DNAポリメラーゼに対してもパルス超音波が、頻度依存的に酵素活性を変化させうるということも見出した。これは同じ物理的な摂動を用い、その時間スケールの変調によって、正にも負にも効果を分子論的に与え、酵素活性を任意に制御させることに成功した初めての例であり、酵素機能解明を目指した科学、もしくは酵素工学において独創的かつ重要な発見であると考えられる。本研究では、酵素分子に周期的な運動を強制的に起こさせる外部力として超音波を用いて酵素揺らぎを任意にかつ選択的に誘起し、酵素機能そのものを人為的に操作することを目的として以下の研究を行った。今年度は、酵素に超音波を照射するための装置を作成した。超音波発生システムの構築超音波は超音波発振素子に電気的な交流信号を入力することで発生させるが、本研究においては、発振周波数全域にわたって、入力信号強度に対して出力強度が一定である素子を用いることが望ましい。そこで、発振振幅をÅオーダーで測定できるレーザードップラー法により発振子の振動をモニターすることで実測し、その出力強度をフィードバックして交流信号の強度を変えることで、周波数に依存しない一定強度の超音波出力を実現するシステムを構築した。
骨格筋量変化を反映する血中バイオマーカーの探索

サルコペニアは加齢を要因とする骨格筋萎縮であり、運動器不全症や様々な内科的合併症の発症リスクを高める。したがって、超高齢化社会に突入した我が国において、その克服は喫緊の医学的課題といえるが、その病態は未だ不明であり有効な薬物療法もない。成体においては、骨格筋量はタンパク質の分解と合成経路のバランスによって規定されるが、各々の経路別の解析に比較し、両者のクロストークやバランスを制御し、様々な状況下における個体にとって最適な骨格筋量を規定する因子などは明らかになっていない。研究代表者の所属する研究室では、臨床的にアンメットニーズであるステロイド(グルココルチコイド)誘発性筋萎縮に焦点を当てた。その理由は、ステロイド服用患者の高齢化に伴い筋萎縮は今後さらに重要な医学的課題となり、敗血症、癌悪液質、飢餓、糖尿病、慢性腎不全など多様な原疾患に伴う筋萎縮にステロイドとその受容体であるグルココルチコイドレセプター(GR)が共通の分子基盤である可能性が指摘されているからである。研究代表者は、ステロイド筋萎縮に対する分岐鎖アミノ酸の治療効果を検証する医師主導型臨床試験およびそのフォローアップに骨格筋量評価者として参加し、骨格筋量を推定可能な汎用性を有する非侵襲的方法が未確立であることに驚いた。本研究では、第一に、CTスキャン、バイオインピーダンス法による体組成解析法を発展させ、骨格筋量の定量的解析に応用することに成功した。その結果、臨床的にも分岐鎖アミノ酸の大量投与が筋量と筋力の回復に有効である可能性が示唆された。また第二に、骨格筋量を反映する血中バイオマーカーとして、複数の候補分子を見出しており、より侵襲性の低い検査方法を開発する研究を今後も推進する予定である。
点頭てんかんの発症、進展における抗カジオリピン抗体の関連に関する基礎的研究

申請者らは抗カルジオリピン抗体(aCL)が点頭てんかんおよびその既往のある続発全般てんかん患者では有意に陽性率が高いこと(p=0.002)を初めて見い出したが、より大きな集団での本抗体の陽性率とその意義について検討した。対象:当院通院中のてんかん患者87名、非てんかん性の神経疾患患者37名について、同意下に血清aCLの測定をMBL社のkitにて測定した。てんかん患者においては同時に抗核抗体、抗DNA抗体も測定した。てんかんの分類としては、特発性全般てんかん(IGE)3名、症候性全般てんかん(SGE)34名、うち点頭てんかんは10例だった。潜因性または症候性部分てんかん(C/SPE)40名、未決定てんかん8名であった。また、既往にepileptic spasmが認められた症例は25例あった。結果:てんかん患者中18名(21%)、非てんかん患者中7名(19%)に15U/ml以上の上昇を認めた。てんかん患者の平均値は10.9+/-18.1で、また非てんかん患者の平均値は8.7+/-14.4であり、有意差はみられなかった(p=0.48)。てんかん患者の症候群分類では、点頭てんかんを含む症候性全般てんかんのグループが症候性または潜因性部分てんかんのクループに比べ、陽性率が有意に高かった(p=0.014)。年齢とカルジオリピン値の相関をみたものでは、年齢が低いほど陽性例は多い傾向があり、これは非てんかん患者でも同様の傾向を示した。また、てんかん患者においては性別、抗核抗体、抗DNA抗体、服用薬剤(PHT, CBZ, ZNS, VPA, BZP derivatives)、多剤併用との間には相関はみられなかった。しかし、局在関連てんかんでは有意に陰性になる傾向がり、症候性全般てんかんでは有意に陽性となる傾向がみられた。さらに、点頭てんかん患者は陽性になりやすく、過去にcpileptic spasmsの既往をもった症例を加えて検討すると有意に陽性率が高かった。考察:aCLが異常高値の症例において、MRIにて梗塞の所見がないことから、てんかん患者におけるaCLの意義がもしあるとすると血栓症/梗塞とは異なる機序と考えられる。近年、aCLがシナプトソーム膜の透過性を亢進させ、膜電位を脱分極させることが示され、aCLが直接的に種々の神経症状の発現に関与している可能性が出てきた。申請者らは抗カルジオリピン抗体(aCL)が点頭てんかんおよびその既往のある続発全般てんかん患者では有意に陽性率が高いこと(p=0.002)を初めて見い出し、乳児期のてんかんにおける本抗体の関連について検討を加えることを目的として以下の実験を行いつつある。1)対照ヒト大脳のホモゲナイズを電気泳動し、ニトロセルロース膜にブロット後、aCL陽性の患者血清を一次抗体(1:500)としてwestern blottingを行った。これまでにところ、明らかなバンドは見られていない。

今後は二次抗体をHRPlabeled-抗ヒトIgM抗体に変えて再度検討予定である。2)aCL陽性の患者血清を用いてマウス脳の凍結切片をABC法により免疫組織化学的に染色し、特異的な結合部位があるかを検討した。この試みもこれまでの所有意な所見を得ていない。今後は、血清IgGを精製して同様に検討してみる予定である。3)生検筋の神経筋接合部を含んだ切片を用いた患者血清とバンガロトキシンによる蛍光二重免疫組織化学:神経筋接合部へのaCL陽性の患者血清の結合。患者血清を各濃度に変えて検討した結果、一部の症例では接合部への結合が有意と考えられる所見を得た。バンガロトキシンとの局在ではよりpresynaptic側に結合が見られた。このことは中枢においてもpresynaptic siteに本抗体が結合する可能性を示唆するものか今後検討する。次年度は今年度の結果をふまえてさらに実験系を改良してゆくとともに、以下のような検討を加えてゆく。1)培養PC12細胞のaCL抗体陽性患者血清または精製IgGによる免疫組織化学2)パッチクランプ法による、急性単離(acute dissociation)したラット大脳神経細胞をもちいたaCLの静止膜電位および各種イオンチャネルに及ぼす影響の検討申請者らは抗カルジオリピン抗体(aCL)が点頭てんかんおよびその既往のある続発全般てんかん患者では有意に陽性率が高いこと(p=0.002)を初めて見い出したが、より大きな集団での本抗体の陽性率とその意義について検討した。対象:当院通院中のてんかん患者87名、非てんかん性の神経疾患患者37名について、同意下に血清aCLの測定をMBL社のkitにて測定した。てんかん患者においては同時に抗核抗体、抗DNA抗体も測定した。てんかんの分類としては、特発性全般てんかん(IGE)3名、症候性全般てんかん(SGE)34名、うち点頭てんかんは10例だった。潜因性または症候性部分てんかん(C/SPE)40名、未決定てんかん8名であった。また、既往にepileptic spasmが認められた症例は25例あった。結果:てんかん患者中18名(21%)、非てんかん患者中7名(19%)に15U/ml以上の上昇を認めた。てんかん患者の平均値は10.9+/-18.1で、また非てんかん患者の平均値は8.7+/-14.4であり、有意差はみられなかった(p=0.48)。てんかん患者の症候群分類では、点頭てんかんを含む症候性全般てんかんのグループが症候性または潜因性部分てんかんのグループに比べ、陽性率が有意に高かった(p=0.014)。年齢とカルジオリピン値の相関をみたものでは、年齢が低いほど陽性例は多い傾向があり、これは非てんかん患者でも同様の傾向を示した。また、てんかん患者においては性別、抗核抗体、抗DNA抗体、服用薬剤(PHT,CBZ,ZNS,VPA,BZP derivatives)、多剤併用との間には相関はみられなかった。しかし、局在関連てんかんでは有意に陰性になる傾向がり、症候性全般てんかんでは有意に陽性となる傾向がみられた。さらに、点頭てんかん患者は陽性になりやすく、過去にepileptic spasmsの既往をもった症例を加えて検討すると有意に陽性率が高かった。考察:aCLが異常高値の症例において、MRIにて梗塞の所見がないことから、てんかん患者におけるaCLの意義がもしあるとすると血栓症/梗塞とは異なる機序と考えられる。