hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
PIXE分析によるダイナミックMRIと高速螺施CTでの腫瘍血管、血流の画像評価

昨年同様、(株)イオン加速器のサイクロトロンのアクシデントにより、測定が不可能となったため、日本アイソトープ協会仁科記念サイクロトロンセンターにて、測定を依頼し施行した。血中濃度の他、唾液への造影剤の移行が測定されれば、今後非侵襲的に最適撮像タイミングが予測されうることを昨年発見し、唾液での測定を試みたが、実際のMRI検査時に30秒間隔で唾液を採取する事は手技的にも、体位的にも困難であった。そこで血液を30秒間隔で採取し実際の造影時の血中濃度を想定したGd造影剤を極微量混入し、試料作成しPIXE分析を行った。GdについてはLaのスペクトルを測定した、サイクロトロンでの測定自体は岩手医科大、世良先生、アイソトープ協会二ツ川先生より、FUTATUGAWAの方法に準じて行った。結果-唾液と違い、血液中においてK、Clが非常に高値であり、KaスペクトルがGdのLaスペクトルに近いFeが妨害金属となりうるが、経時的に血中濃度のGd造影剤は滅少しても、測定では1μg/g以下の濃度でも測定可能であり、実際の検査時の血中濃度の変動を考慮しても充分に測定可能であることがわかった。しかし、内部標準にはIn標準液を用いGd自体とSeraによる自己標準法を使用したところ、In濃度のばらつきが多かったため、今後In濃度の濃度を高くし、再度正定量を行う必要があると考えられた。実際の検査時においては30秒間隔で血液を採取し素早く試料作成を行い、極薄の膜で保持する必要がある。またそれにより、患者の体動が懸念されるため、今後試料作成には検討が必要であると考えられる。当初、試料のPIXE測定を依頼する予定であった(株)イオン加速器ではサイクロトロンのアクシデントにより、測定が長期にわたり休止することになり、そのため日本アイソトープ協会仁科記念サイクロトロンセンターにて、測定を行うことになった。また予定していた血液材料による造影剤の血中濃度の他、唾液への造影剤の移行が測定されれば、今後非侵襲的に最適撮像タイミングが予測されうることを発見した。そこで同センターにて予備実験として、血液と、唾液腺からカテーテル法により採取した唾液にGd造影剤を極微量混入させ、PIXE分析を行った。GdについてはLaのスペクトルを測定した。試料作成を同センターで行い、サイクロトロンでの測定自体は岩手医科大、世良先生、アイソトープ協会二ツ川先生より、FUTATSUGAWAの方法に準じて行った。結果-血液においてはK、Clが非常に高値であったが、KaスペクトルがGdのLaスペクトルに近いFeが妨害金属となった。実際の測定では1μg/g程度は検出されたが、この程度が限界と思われた。唾液へのGd造影剤移行濃度は血液よりもはるかに低いが、妨害金属が少ないため、検出限界が低く、充分実用になりうると示唆された。実際の測定では40μg/gでも充分に測定可能であり、1μg/g以下も可能であることが示唆された。内部標準には今回の実験ではGd自体とSeraによる自己標準法を使用したが、今後In標準液によるさらに正確な定量を行う必要も示唆された。また採唾はカテーテルによるものであり、口腔内に排出した唾液でも可能であるかは今後の検封課題となった。PIXE分析は実行可能な施設が限られるため、試料の輸送が不可欠である。試料は妨害元素スペクトルを出さず、自己吸収の少ない極薄の膜で保持する必要がある。このため特に血液試料の保管、輸送がかなり困難であり、今後、改良が必要であることが考えられた。
非可分無限次元多様体と写像空間、冪空間の位相に関する研究

本研究は、非可分LF-多様体の位相的性質と、写像空間、冪空間の位相的構造を探求し、非可分無限次元多様体論を発展させることを目的とした。研究期間中、コンパクト部分集合からなる冪空間が非可分ヒルベルト空間と、有限部分集合からなる冪空間が非可分ヒルベルト空間の標準正規直交基底で張られる部分空間と、各々同相になるための同値条件を与えた。LF-多様体の基本定理に関する研究と、写像空間の無限次元多様体性に関する研究については、良い成果を上げることができなかったが、今後の研究に向けて新たな知見を得た。無限次元多様体論は、写像空間や冪空間の位相構造の研究とともに発展してきたが、非可分無限次元多様体に関しては未解明の点が多い。本研究の目的は、非可分LF-多様体や写像空間、冪空間の位相幾何学的な構造と性質を解明して、非可分無限次元多様体の理論を充実させることである。距離付け可能空間Xの空でないコンパクト部分集合からなる冪空間にVietoris位相を導入したComp(X)と、空でない有限部分集合からなる冪空間Fin(X)の位相型に関する研究を行った。D.W. CurtisやN.T. Nhuらの研究によって、Comp(X)が可分ヒルベルト空間l2(ω)と、Fin(X)がl2(ω)の標準正規直交基底で張られる部分空間l2f(ω)と、それぞれ同相になるための必要十分条件が与えられたが、本研究ではそれらを非可分の場合も含めて一般化した。実際に、Fin(X)が稠密度κを持つl2f(κ)と同相であるための必要十分条件は、Xが連結、局所道連結、可算局所コンパクト、強可算次元距離付け可能空間で、その空でない開集合の稠密度がκに等しいということを示し、論文にまとめ投稿した(審査中)。また、Comp(X)が稠密度κを持つヒルベルト空間l2(κ)と同相になるための必要十分条件が、Xが連結、局所連結、完備距離付け可能であり、任意の点でコンパクト近傍を持たず、空でない開集合の稠密度がκに等しいということを証明した。さらに、距離付け可能空間Xとその完備化Yに対して、冪空間組(Comp(Y),Fin(X))が空間組(l2(κ),l2f(κ))と同相になるための同値条件も与えた。これらの結果についても論文にまとめ、国際学術雑誌に掲載が受理された。また、国内外の学会、国際会議、研究集会において、その研究成果を発表した。当初の目標であった、冪空間から非可分無限次元多様体の具体例を得ることに成功した。一方、LF-多様体に関する研究については考察中であるが、特筆すべき成果は得られていない。無限次元線形位相空間の一般化として登場した無限次元多様体論は、写像空間や冪空間の位相構造が解明されていくにつれ、一般及び幾何学的トポロジーの分野において活発に研究されてきた。実際に、可分無限次元多様体に関しては、その位相幾何学的な性質や分類について一応の完成が見られるが、非可分無限次元多様体については未解決の点が多い。本研究は、様々な非可分無限次元多様体や写像空間、冪空間の位相的な構造を解明していき、その理論をより進展させることを目的とした。位相空間の種々の部分集合からなる冪空間へVietoris位相を導入したものに関する研究を行い、その位相型を決定した。前年度に、距離付け可能空間の空でないコンパクト部分集合からなる冪空間が非可分ヒルベルト空間と、空でない有限部分集合からなる冪空間が非可分ヒルベルト空間の標準正規直交基底で張られる部分空間と、それぞれ同相になるための同値条件を与えたが、それらの結果をまとめた論文が国際学術雑誌に掲載された。さらに、距離付け可能空間の空でない連結なコンパクト部分集合からなる冪空間が(非可分の場合も含む)ヒルベルト空間と同相になるための必要十分条件も与えた。位相空間上の連続写像からなる空間とその部分空間に一様収束位相を導入したものについて、その位相構造を研究した。A.Yamashitaによる先行研究によって、コンパクトでない局所コンパクト可分距離空間上の実数値連続関数のなす空間は、非可分ヒルベルト空間と同相になることが示される。この結果を受けて、その部分空間である局所Lipschitz関数(または、さらに条件を強めた関数)からなる空間が、非可分ヒルベルト空間の標準正規直交基底で張られる部分空間とヒルベルト立方体との積空間と同相になると予想を立て、考察を重ねた。非可分LF-多様体の研究については、非可分ヒルベルト空間l2(κ)とユークリッド空間の増大列の帰納極限R∞の積空間l2(κ)×R∞をモデルとする多様体について引き続き研究を進めていき、その単体分割定理と開埋蔵定理の解明を目指す。

写像空間に関しては、連続写像空間やその部分空間から、非可分ヒルベルト空間やその部分空間を見出すことを目標に、冪空間の研究で得られた知見を活かして研究を推進していく。位相幾何学国際会議出席のための海外旅費を確保するため、物品等の購入を抑えた結果、次年度使用額が生じた。当該年度に購入予定であった図書等の購入に充てる。
各種条件下における湛水土壌中のメタン生成菌の計数と分布

水田土壌等の湛水土壌中の生物的メタン生成を制御するためには、メタン生成菌を初めとする嫌気性細菌の生理・生態を知ることが重要である。我々は、湛水土壌中のメタン生成に関わる嫌気性細菌の生態を明らかにし、さらに各種湿生植物による湛水土壌中からのメタンの放出について検討することを目的とした。有機物として稲藁または稲藁堆肥を混合した土壌を湛水して実験室で嫌気的にインキュベ-トすると、稲藁を添加した土壌では湛水初期にH_2や脂肪酸が生成され、これはメタンの生成にともなって間もなく消失したが、堆肥を添加した土壌ではこのような変化は認められなかった。メタンの生成量は、稲藁を添加した土壌が無添加の土壌よりかなり多く、堆肥を添加した土壌からのメタン生成量は、無添加土壌よりやや多い程度であった。メタン生成している湛水土壌中のメタン生成菌数をH_2と酢酸を基質としてそれぞれ計数したところ、H_2を基質とした場合で1.5×10^5cells/ml,酢酸を基質とした場合で5.0×10^6cells/mlが計数された。稲藁を含む湛水土壌でヨシを栽培中の土壌のメタン生成菌の計数でも、酢酸を基質とした方が約50倍高い値が得られた。これらの計数に用い、メタン生成が確認された液体培地を出発材料として新鮮な培地に継代し、酢酸およびH_2をそれぞれ基質とするメタン生成菌の集積培養を行った。イネ、ヨシ、マコモ、タイヌビエ、イヌビエ、タウコギ、ヘラオモダカを種々の栽植密度で全期間湛水下に土耕栽培し、生育途中で根際から地上部を切除した。6月から10月頃までの期間、定期的に湛水土壌中に封じ込められているガスを棒でつついて水上置換法で捕集し、ガス濃度を測定した。すべての植物種でポット当りの植物体重の増加に伴って土壌ガス中のCH_4濃度が顕著に低下した。生育途中の地上部切除後には、土壌ガス組成は一変し、CH_4濃度が顕著に上昇し、逆にN_2濃度が顕著に低下し、無栽培ポットの組成に近づいた。
ヒト末梢神経神経内膜由来内皮細胞培養系の確立とヒト血液神経関門培養モデル作成の試み

血液脳関門(BBB)と比較して末梢神経系のバリアーシステムである血液神経関門(BNB)の研究は遅れをとっているが、その原因の一つは、BNBの主座である末梢神経神経内膜由来内皮細胞(PnMEC)の培養がその技術的困難から長らく成功していかったことにある。研究者らはこの数年来ウシPnMECを用いてBNBのモデルを作成し、いくつかの業績をあげてきたが、分子レベルでのバリアー破綻・修復機序の解明にはヒト細胞の入手が急務と考え、この2年間の目標をBNBを構成するヒト末梢神経神経内膜微小血管内皮細胞(HPnMEC)の大量純培養法の確立においた。培養液を含む培養条件の調整の結果、剖検材料を用いての同細胞の培養が可能となった。剖検坐骨神経または馬尾神経の神経内膜組織を分離し、我々の開発したウシPnMEC培養法(J Neurosci Res 1997)を一部改変した手法に基づいて酵素処理を行った。10-21日後に純粋なHPnMECのみからなるコロニーをクローニングし、これからHPnMECのmassを得た。HPnMECはcontact inhibitionを示す単層を成し、Dil-Ac-LDLとりこみおよびvon Willebrand抗原陽性で、ウシ脳毛細血管由来内皮細胞(BMEC)やウシPnMECと同じく細長いfibroblastに類似した形態を示した。培養条件の調整により、ヒトPnMECも純培養が可能であることが初めて示されたが、純粋なコロニーの収率が充分ではなく、cell massを使っての生化学的分析までは未だ至っていない。しかし、ある程度の長期にわたって培養可能な、ほぼ純粋なヒトPnMECが得られた意義は大きく、今後のBNBの細胞学的研究や炎症性ニューロパチーの治療法の開発にあたって大きな寄与をなすものと考えられる。今年度は、ヒト血液神経関門(BNB)のin vitroモデルを構成する細胞としてより適当と考えられるヒト末梢神経神経内膜微小血管由来内皮細胞(PnMEC)の純培養法の確立に成功した。方法は研究者が開発したウシ末梢神経神経内膜由来内皮細胞の培養法(J Neurosci Res 1997)に準じて行ったが、培養条件には若干の改訂が必要であった。剖検、あるいは生検腓腹神経のいずれからも培養可能であった。本細胞は、ウシ脳微小血管由来内皮細胞(BMEC)やPnMECと同じく細長いfibroblastに類似した形態を示し、時に多角形に近い形を呈するが、培養皿上でconfluentとなるに従い、明らかなcontact inhibitionを示す単層を形成した。内皮細胞のマーカーであるDil-Ac-LDLの細胞内取込み能を有し、抗von Willebrand抗体を用いた免疫染色でも細胞質内に明らかな陽性顆粒を認めた。より若年の患者から得られた細胞ほど優れた増殖能が得られる傾向があった。電顕的には細胞接着部位にelectron denseなtight junctionが観察され、in vitroでもバリアーとしての機能が維持されるであろうことが示唆された。このヒトPnMECの純培養法の確立により、BNBの分子細胞学的研究の可能性が飛躍的に広がることが期待される。現在、本細胞の生化学的な解析並びに他臓器由来のヒト内皮細胞と比較したmRNA発現パターンの解析が進行中である。
グリアアセンブリ構築・恒常性維持におけるPax6下流分子ネットワークの機能解析

出生後マウスの脳の発達におけるグリア細胞での転写因子Pax6の機能を明らかにするため、細胞・時期特異的にPax6を欠損させた遺伝子改変マウス(hGFAP-cre;Pax6-floxedマウス、Pax6cKOマウス)を作成した。出生直後のステージでは、Pax6cKOマウスに外見的な異常は観察されなかったが、出生後約4週では、野生型に比べて顕著な発育不良を示した。同腹の対照マウスの体重が約13gであったのに対して、Pax6cKOの体重は約6gであった。さらに、Pax6cKOマウスは歩行困難などの重度の運動失調を示した。脳の解剖学的所見では、小脳の発達不良もしくは萎縮が観察された。クリューバー・バレラ染色によって、脳のより詳細な構造を解析したところ、側脳室の顕著な拡大、脳梁の発達異常、および小脳の発達不良と層構造の異常が観察された。そこで、hGFAP-cre;ROSA26R-EYFPマウス(EYFPレポーターマウス)を用いて、cre活性のある脳の領域を解析したところ、交連下器官においてEYFPの強いシグナルが観察された。EYFPレポーターマウスの抗Pax6抗体による免疫染色を行ったところ、交連下器官におけるPax6の強い発現が観察され、その発現領域はEYFPのシグナルと一致していた。交連下器官は脳脊髄液の恒常性に重要な役割を持つと考えられており、交連下器官におけるPax6の発現とhGFAP-creの活性、およびPax6cKOマウスににおける側脳室の拡大という表現型を考えると、交連下器官におけるPax6の欠損によって交連下器官の機能が破綻したことにより、脳脊髄液の恒常性に異常をきたし、脳室の拡大という異常に繋がったと考えられる。今後、交連下器官におけるPax6が制御する因子を解析することで、交連下器官の生後脳の発達における役割についての理解を深めることができると期待される。28年度が最終年度であるため、記入しない。
原子間力顕微鏡を用いた転写因子/DNA相互作用の解析

1.約2万塩基対からなるβグロビン遺伝子のエンハンサー領域(Locus Control Region(LCR))において、調節タンパク質Bach1/MafK複合体は塩基配列により予想される複数の結合部位にそれぞれ同時に結合し三重DNAループを形成すること、そのためには、Bach1分子中のタンパク質会合領域(BTBドメイン)が必要であることを示した(投稿中)。2.数千塩基対からなるDNAとコアヒストン(ヒストンH2A、H2B、H3およびH4各2)とからヌクレオソームを再構成し、1つのヌクレオソームあたり146塩基対のDNAが取り込まれることを定量的可視化により示した。また、Xenopus 5S RNA遺伝子とコアヒストンとからヌクレオソームを再構成すると、ヌクレオソームが5S RNA遺伝子のポジショニング配列に相当する部位に形成されること、さらに、この系にヒストンHlを加えるとヌクレオソーム上のDNAの巻きかたが更にtightになることを示した(Sato et al,1999)。近年、“DNAから染色体へ"の間をつなぐものとして「ヌクレオソームのポジショニング」といったヌクレオソームレベルの事象が注目を集めている。このクロマチンレベルでの転写機構解明に向けて、分子生物学的手法(ヌクレオソーム再構成)と構造生物学的手法(AFM)との組み合わせは強力なアプローチとなると期待される。
レット症候群モデルES/iPS細胞のグリア細胞分化と病態メカニズムの解明

レット症候群(RTT)は、X染色体上のMeCP2遺伝子変異が主因の女児で発症する発達障害である。本研究ではRTTモデル(Mecp2欠損)ES細胞から様々なグリア細胞を分化誘導後、そのグリア細胞の機能評価を行った。Mecp2欠損ES細胞は、それぞれの分化マーカーを発現するアストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリアに分化した。特にES細胞から効率良く分化するミクログリアにおけるマーカー分子やサイトカインの発現を調べた結果、いくつかの遺伝子発現がMeCP2の有無で変化することを見出した。更に、種々の活性化刺激に対する反応性や貪食能を解析し、Mecp2欠損ミクログリアの性状を評価した。本研究課題で利用するMeCP2欠損ES細胞、およびRTTモデルマウス由来のMeCP2欠損iPS細胞は既に樹立しており、ニューロンなどへの多分化能を有することは検証済みである。そこで、初年度は主に、RTTモデルES/iPS細胞によるグリア細胞(アストログリア、オリゴデンドロサイト、ミクログリア)分化誘導法の確立を行った。1)アストロサイトの分化誘導:ES/iPS細胞から神経幹細胞、グリア幹細胞を分化誘導することが可能であり、神経幹細胞、グリア幹細胞の誘導を介したアストロサイトの分化誘導を試みた。2)オリゴデンドロサイトの分化誘導:McDonald-JWらによって、ES細胞からオリゴデンドロサイトの分化誘導法が示されている(PNAS `00)。そこで本方法、ならびに1)のグリア幹細胞誘導法を応用してES/iPS細胞におけるオリゴデンドロサイトの分化誘導を行った。3)ミクログリアの分化誘導:Neumann-HのグループによってマウスES細胞からミクログリアの分化誘導法が報告されており(Nat. Protocol `10)、このNeumann-Hらの方法を参考にES/iPS細胞によるミクログリアの分化誘導を行った。以上の種々のグリア細胞の分化誘導を行い、分化マーカー遺伝子、蛋白質の発現を解析することで分化の有無、効率を検討し、効率は良くないがそれぞれの方法で、分化マーカーの発現が確認できた。昨年度までに、RTTモデル(Mecp2欠損)ES細胞、iPS細胞を用いたグリア細胞の性状解析を行なうために、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリアの分化誘導系の確立を行なっており、それぞれの分化マーカーを発現することを確認している。近年、ミクログリアの脳の発達、精神神経活動に及ぼす影響に付いてはトピックとなっており、本年度は、RTTモデルES細胞のミクログリアの分化誘導とその性状に関する研究を中心に進めることにした。その結果、RettモデルES細胞よりマクロファージ/ミクログリアマーカーを発現する細胞を分化誘導し、その分化マーカーの発現やマクロファージ/ミクログリアにおけるサイトカインの遺伝子発現を比較検討し、いくつかの遺伝子発現がMeCP2欠損の有無で変化することを見出した。また現在、分化誘導したマクロファージ/ミクログリアの性状を解析する目的で、サイトカインに対する反応性やサイトカインの分泌能に関する解析を進めている。研究目的:これまでRett症候群(RTT)モデル(Mecp2欠損)ES細胞を用いたグリア細胞の性状解析を行なうために、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリアの分化誘導を行なってきた。しかし近年、RTT病態におけるミクログリアの役割が注目されており、昨年度より、RTTモデルES細胞のミクログリアの分化誘導とその性状に関する研究を中心に進めることとした。既に、RTTモデルES細胞より分化誘導したマクロファージ/ミクログリアマーカーの分化過程や種々のサイトカインの発現を調べた結果、いくつかの遺伝子発現がMeCP2欠損の有無で変化することを見出しており、本年度は、MeCP2欠損マクロファージ/ミクログリアの性状を解析するために、MeCP2欠損ミクログリアにおける種々の活性化刺激に対する反応性や機能を評価した。研究成果:その結果、MeCP2欠損ES細胞由来ミクログリアは、野生型ES細胞由来ミクログリア細胞と同様に、様々な免疫刺激などによる基本的な反応性、貪食作用を有しているものの、反応の異なる因子があることが明らかとなった。現在、MeCP2欠損マウス由来の初代培養ミクログリアとの機能をはじめとする比較やin vivoにおける解析を進めており、MeCP2の有無で反応の異なる因子の役割を明らかにして行くことで、MeCP2欠損ミクログリアによる病態機構が明らかになると期待される。コントロールのWild-typeとMecp2欠損ES細胞から、マクロファージ/ミクログリアマーカーを発現する細胞を分化誘導後、その分化マーカーやマクロファージ/ミクログリアにおけるサイトカイン遺伝子の発現を比較検討し、いくつかの遺伝子発現がMeCP2欠損の有無で変化することを見出した。小児神経学RTTモデルES細胞より分化誘導したマクロファージ/ミクログリアマーカーを発現する細胞のサイトカインに対する反応性、サイトカイン分泌能、食作用など機能的な評価を進めることで、Mecp2欠損がES細胞由来ミクログリアに及ぼす影響を更に詳細に解析する。

また、変化の認められた分子の病態における役割を明らかにするために、RTTモデル(Mecp2欠損)マウスの脳組織を解析を進める。本年度は主に、ES細胞によるミクログリアとオリゴデンドロサイトの分化誘導法の確立を行い、以前に報告された方法でそれぞれのグリア細胞の分化が確認される状態にある。しかしながら、ES細胞から分化誘導した目的のグリア細胞それぞれについて、RTT病態の評価が可能な純度、効率を満たす分化誘導法の確立には至っていない。実験の進捗状況により、モデル動物の標的臓器のDNAマイクロアレイを実施する予定であったが、実験結果の考察により検討の末、更に実験を行なった後、解析を行なうのが望ましいとの判断で、次年度以降のマイクロアレイのための外注や試薬の購入費として繰り越すことにした。分化効率の良い分化誘導法の確立を引き続き続けるとともに、初代培養細胞による実験を平行して行い、ES/iPS細胞で得られた結果を比較検討しながら、グリア細胞からみたRTT病態メカニズムを明らかにするとともに、病態モデルとしてのES/iPS細胞の有用性を評価する。判断材料となる実験を実施後、マイクロアレイやプロテオミクス解析を行なうため予算として使用予定である。ほぼ計画通り研究を行い、研究費を有効利用できたたが、わずかな未使用金がでてしまった。最終的な年度末の調整のためだけに無理な支出を行うよりは、繰り越しして少しでも次年度有効に使用するのが良いと考えた。次年度交付助成金分とあわせて、研究用試薬を購入するための物品費として利用を考えている。
環境変動に対する気孔開閉制御の分子機構

植物の表皮に存在する気孔は、一対の孔辺細胞により構成され、様々な環境シグナルに応答してその開度を調節し、光合成に必要な二酸化炭素の取り込み、蒸散や酸素の放出など植物と大気間のガス交換を制御している。本研究では、気孔開閉のシグナル伝達の分子機構の解明を目的として、新奇の気孔開度変異体の解析や気孔孔辺細胞を用いた生理・生化学的解析を進めた。さらに、気孔開度を人的に制御した植物体の作出し、植物の成長・生存における役割の解析を進めた。本研究のスクリーニングによって単離した気孔開度変異体の解析により、scs1-1の原因遺伝子を明らかにし、これまでフロリゲンとして知られていたFTの多様な機能を証明する結果を得た(Kinoshita et al., Curr. Biol. 2011)。この成果は、多くのメディア(読売新聞、中日新聞、NHKニュースなど)で取り上げられ、一般への紹介が行われた。また、r1t1の解析を行い、アブシジン酸(ABA)の受容体として報告されていたCHLHは、ABAシグナル伝達には影響を与えるものの、ABA受容体としては機能していないことを証明し、これまで混沌としていたCHLHのABAシグナル伝達における機能を明確に示した(Tsuzuki et al.,J. Plant Res. 2011)。今後は、これら遺伝子の気孔開閉における機能解析やこれら遺伝子のプロモーターを利用した人為的な気孔開度制御にも取り組む予定である。また、免疫組織化学染色により、孔辺細胞の細胞膜H^+-ATPaseの活性化(リン酸化)状態を検出する方法を確立し、青色光によるH^+-ATPaseの活性化は、気孔を閉じさせるABAによって、生理的濃度範囲で完全に阻害されることを明らかにした。この結果は、気孔開口と気孔閉鎖のシグナル伝達のクロストークを明確に示すものであり、掲載誌の表紙を飾った(Hayashi et al.,Plant Cell Physiol.2011)。さらに、細胞膜H^+-ATPaseの進化的起源について、苔類ゼニゴケを用いた解析を行い、維管束植物の持つH^+-ATPaseは、植物が陸上に進化する過程で獲得され、リン酸化による活性制御が始まったことを明らかにした。また、ゼニゴケでは、光合成に依存してH^+-ATPaseが活性化されることを見出し、この反応がH^+-ATPaseの進化上初めての制御機構であることを示した。これらの結果は、国際誌Plant Physiologyに掲載予定である。本研究のスクリーニングによって単離した気孔開度変異体の解析により、scsl-1の原因遺伝子を明らかにし、これまでフロリゲンとして知られていたFTの多様な機能を証明する結果を得た(Kinoshit et al., Curr. Biol. 2011)。また、rlt1の解析を行い、アブシジン酸(ABA)の受容体として報告されていたCHLHは、ABAシグナル伝達には影響を与えるものの、ABA受容体としては機能していないことを証明し、これまで混沌としていたCHLHのABAシグナル伝達における機能を明確に示した(Tsuzuki et al., J. PlantRes. 2011)。この結果は、気孔開口と気孔閉鎖のシグナル伝達のクロストークを明確に示すものであり、掲載誌の表紙を飾った(Hayashi et al, PlantCell Physiol. 2011)。これまでの気孔開度変異体の解析の結果、フロリゲン・花成ホルモンとして知られているFLOWERING LOCUS T (FT)が気孔孔辺細胞にも発現しており、気孔開口の調節因子として機能することが明らかとなった。

そこで、光周性花成誘導経路においてFTの最も近いホモログであるTWIN SISTER OF FT (TSF)、光周性経路の光受容体クリプトクロム、FTの発現を直接制御することが知られている上流因子CONSTANS (CO)、さらにCOの発現制御を行うことが知られている概日時計因子GIGANTEA (GI)の気孔開度調節への関与について、これら因子の突然変異体や形質転換植物を用いて詳細な解析を行い、TSFはFTと同様に気孔開度制御に関与していること、さらに、クリプトクロム、GI、COは、孔辺細胞におけるFTやTSFの発現量を調節することによって気孔開度制御に関わっていることを明らかにした。さらに、気孔開度を人為的に制御した植物体の作出と表現型の解析を進め、気孔開口の駆動力を与えている細胞膜プロトンポンプの発現量をシロイヌナズナの孔辺細胞のみで増やすことで気孔開口、光合成活性や生産量が増加することを見出し、気孔開度が光合成と生産量の制限要因となることを初めて実証した。一方、アブシジン酸(ABA)による気孔閉鎖に関与するMg-キラターゼHサブユニット(CHLH)をシロイヌナズナの孔辺細胞に過剰発現する形質転換体を作出し、表現型の解析を行った結果、この植物体では、野生株では枯死してしまう水ストレス条件下においてもCHLH過剰発現株は生存することが可能であることが明らかとなった。本結果は、気孔開度を調節することで実際に乾燥に強い植物体を作出することができることを実証するもので、今後、実用的な植物への展開が期待される。植物の表皮に存在する気孔は、一対の孔辺細胞により構成され、様々な環境シグナルに応答してその開度を調節し、光合成に必要な二酸化炭素取り込み、蒸散や酸素の放出など植物と大気間のガス交換を制御している。本研究では、気孔開閉のシグナル伝達の分子機構の解明を目的として、新奇の気孔開度変異体の解析や気孔孔辺細胞を用いた生理・生化学的解析を進めている。赤外線サーモグラフィを用いたスクリーニングにより、新奇の気孔開度変異体lost1とlost4を単離し、lost1変異体の原因遺伝子がクロロフィル合成酵素であるMgキラターゼIサブユニットであることを明らかにした。詳細な解析の結果、Mg-キラターゼは複合体として気孔のABAシグナル伝達に影響することが明らかとなった。さらに関連変異体を用いた解析により、葉緑体におけるクロロフィルやフィトクロモビリンのテトラピロール色素の生合成が、気孔のABA応答に影響する可能性が示唆された。lost4変異体については、原因遺伝子が新奇の気孔開度制御因子であることが明らかとなったため、現在その機能解析を進めている。また、これまでの研究により、光周性花成誘導に関与する因子が、間接的に気孔開口を正に制御していることが示された。光周性花成誘導では、茎頂分裂組織において遺伝子の発現制御が行われていることが知られている。そこで、気孔開度制御に関わることが新たに明らかとなったSOC1の過剰発現株の孔辺細胞における網羅的な遺伝子発現解析を行い、気孔開口に関与する既知因子を含め多くの遺伝子の発現が変動していること見出た。加えて、青色光に依存した気孔開口のシグナル伝達機構の解明に向け、遺伝学的スクリーニングとケミカルスクリーニングを進め、多くの突然変異体と候補化合物を同定した。現在、シグナル伝達の解明に向け、原因遺伝子や化合物標的の同定を進めている。本研究のスクリーニングによって単離した気孔開度変異体の解析により、新たに5系統の原因遺伝子を同定した。そのうちの一つであるlost1変異体の原因遺伝子はCHLI1であり、クロロフィル合成に関わる酵素であるが、気孔開度調節への関与が明らかとなった。
界面活性剤の界面における多重ラメラ膜形成に関する研究

1.エチレングリコールモノドデシルエーテル(C12E1)の空気/水界面吸着膜の相転移の外部反射FTIRによる構造解析を昨年度に引き続き行った。相転移領域でのスペクトルの2次元相関解析により、相転移領域の低濃度側では膨張膜中に凝縮膜ドメインが形成され、溶液濃度の上昇と共にその割合が増大し、約20μM付近では、均一な凝縮膜となることが明確となった。表面張力の濃度依存性からは明確に示すことができなかった相転移付近の吸着膜の状態をメゾスコピックレベルで示すことができた。さらに陽イオン性界面活性剤との混合系についても測定し、表面張力の時間依存性にプラトー領域が現れる濃度および界面活性剤の混合組成領域では、膨張膜領域の減少と凝縮膜領域の増大の相関が明確に示された。またC12E1の混合組成が1%程度までの非常に広い混合組成で相転移が観測され、イオン-双極子相互作用が凝縮膜形成に有効に作用していることが裏付けられた。2.テトラエチレングリコールモノオクチルエーテル(C8E4)の動的表面張力を濃度および温度の関数として測定した。0.4mM程度までの低濃度では、吸着機構は純粋に拡散律速であるが、この濃度付近から高濃度での拡散-吸着律速へのスイッチオーバーが起きていることが明らかとなった。温度依存性から計算された吸着の活性化エネルギーは表面濃度(吸着量)の増加とともに上昇するが、温度の上昇により低下することが示された。そのエネルギーの大きさは、吸着しているC8E4分子間の引力的相互作用に打ち勝って、フリーな吸着サイトを形成するために必要なものに対応していることが示された。我々の予備実験により、臭化ジドデシルジメチルアンモニウムと臭化ドデシルトリメチルアンモニウム混合系では、溶液中ではミセルやラメラなどの会合体形成も起こらない非常に希薄な濃度領域であるにもかかわらず、界面では、固体状態に近い程度に分子が凝縮した単分子層→3分子層(単分子層+単層2分子層)→7分子層(単分子層+3層2分子層)のような状態変化がおきていることが吸着量の計算から示唆されている。ただこれが真の平衡状態であるのか、純安定状態であるのか結論は出ていない。そこで現在、外部反射IRを、表面密度の分光学的定量と吸着分子の状態に関する情報の抽出に応用するための基礎実験を以下の二つの系につき、行っている。1.水溶液表面における臭化ドデシルトリメチルアンモニウム吸着膜吸着した分子の炭化水素鎖の密度を得るために、C-Hの伸縮振動の波数の吸収強度を外部反射IRにより、溶液濃度の関数として定量している。表面張力測定から得た基準濃度での吸着量で装置定数を決め、臨界臨界ミセル濃度(cmc)以上の濃度まで吸着量をFTIRで定量できるようになった。またcmc近傍での吸収強度の増大(これは全反射XAFS法による対イオン濃度の定量結果とも一致する)が、溶液中からのバックグラウンドによるものでないかどうか、フルオロカーボン系活性剤を用いて検証中である。2.水溶液表面におけるエチレングリコールモノドデシルエーテルの吸着膜相転移外部反射IRにより、吸着が膨張膜から凝縮膜へ相転移することを示した。相転移前後で吸着量および吸収波長が大きく変化し、1次相転移にちかいことが示された。現在SおよびP偏光により、二つの状態の共存状態に関する情報の抽出を行っている。空気/水表面におけるエチレングリコールモノドデシルエーテル(C12E1)吸着膜の相転移界面で多重膜が形成されるための必要条件の一つは、界面吸着膜が凝縮膜のように非常に密な膜を形成することである。本研究では、C12E1がその水溶液から表面に吸着し、膨張膜から凝縮膜へ相転移を起こすことを、表面張力の濃度依存性、外部反射FTIR測定、エリプソメトリにより明らかにした。一定濃度における表面張力の時間依存性では、相転移に対応する表面張力値で一定時間プラトーとなることが示された。ある濃度以上の時間依存性ではつねに同じ表面張力でプラトーとなった。したがって、この表面張力が相転移に対応していることが明らかとなった。次に相転移を分子レベルで明らかにする目的で、外部反射FTIR測定装置を組み立てた。実験条件の設定にいくらか経験を要したが、解析に十分の反射スペクトルがえられた。相転移近傍でのメチレン基の対称および非対称伸縮振動の、相転移近傍での吸収波長のシフトと吸収強度の変化に注目して実験を進めた。この結果、相転移付近の濃度で、透過スペクトルでの液体状態に対応する波長から固体状態に対応する波長への大きな変化が観測され、明らかに炭化水素鎖の運動の制限が観測された。さらに2次元FTIR解析により、相転移近傍での波長の変化は、液体および固体状態のスペクトルの重ね合わせから生じることが明確示され、相転移が証明された。エリプソメトリの結果も、界面での厚みが相転移近傍で急激に変化することを示した。したがって、表面張力、FTIR測定、エリプソメトリすべての測定から相転移が示され、その状態も明らかとなった。

相転移領域でのスペクトルの2次元相関解析により、相転移領域の低濃度側では膨張膜中に凝縮膜ドメインが形成され、溶液濃度の上昇と共にその割合が増大し、約20μM付近では、均一な凝縮膜となることが明確となった。表面張力の濃度依存性からは明確に示すことができなかった相転移付近の吸着膜の状態をメゾスコピックレベルで示すことができた。さらに陽イオン性界面活性剤との混合系についても測定し、表面張力の時間依存性にプラトー領域が現れる濃度および界面活性剤の混合組成領域では、膨張膜領域の減少と凝縮膜領域の増大の相関が明確に示された。またC12E1の混合組成が1%程度までの非常に広い混合組成で相転移が観測され、イオン-双極子相互作用が凝縮膜形成に有効に作用していることが裏付けられた。2.テトラエチレングリコールモノオクチルエーテル(C8E4)の動的表面張力を濃度および温度の関数として測定した。0.4mM程度までの低濃度では、吸着機構は純粋に拡散律速であるが、この濃度付近から高濃度での拡散-吸着律速へのスイッチオーバーが起きていることが明らかとなった。温度依存性から計算された吸着の活性化エネルギーは表面濃度(吸着量)の増加とともに上昇するが、温度の上昇により低下することが示された。そのエネルギーの大きさは、吸着しているC8E4分子間の引力的相互作用に打ち勝って、フリーな吸着サイトを形成するために必要なものに対応していることが示された。
乳牛の放牧飼養における草地管理への野外観測用可視・近赤外分光計測器の応用

野外観測用可視・近赤外分光放射計(ポータブルスペクトロメータ)は、比較的近距離から地表面の物体の350-1050nmの分光反射率、反射輝度、放射照度を測定する携帯型の機器である。現在、この機器は地上設置、およびヘリコプターや軽飛行機を利用した移動測定など、人工衛星等を利用したリモートセンシングの各種分析のバックアップに用いられている。本研究は、この機器を放牧草地の草量や植生などの草地構造の評価に応用しようとするものである。本年度は、放牧草地の草量や植生など草地構造のパラメータとポータブルスペクトロメータ(FieldSpec Pro,測定範囲350-1050nm)で測定した分光反射率との回帰式を作成し、草地構造の簡便な調査法を確立することを目的とした。回帰式作成に用いたデータは、17年度(北大農場)および18年度(北海道十勝管内4町公共育成牧場)調査で得た各波長の分光反射率とコドラート法で測定した草地の植生および構造のパラメータである。1.可視赤(630-690nm)および近赤外(760-860nm)での分光反射率および正規化植生指数(NDVI)は生草収量、乾物収量および牧草乾物率のいずれとも有意な相関関係(P<0.01)がみられたが、可視緑-黄(520-600nm)は関連がなかった。2.生草収量(Y_1)および乾物収量(Y_2)とNDVI(X)との間に、以下の回帰式を得た。3.同一地点で測定したFieldSpecとASTER(衛星画像データ)の分光反射率を比較するとその反射特性はほぼ同様であった。4.道内酪農家(上川管内旭川市および網走管内興部町)で草量の実測値と推定値を比較し、回帰式はおおむね良好である結果を得た。5.これらのことから、FieldSpecの測定データから牧草収量を推定できると考えられ、衛生データと組み合わせることによって、より大面積の草地について正確な収量を簡易に推定できる可能性が示された。6.FieldSpec測定データによる牧草成分および土壌成分の推定については今後の研究課題である。これまで、放牧草地の草量や植生等の草地構造の検討は、コドラートを用いた刈取り法など、多大な労力を必要とする直接測定で行ってきた。本研究は、比較的近距離から地表面の物体の350-1050nmの分光反射率測定することができる携帯型の機器である野外観測用可視・近赤外分光放射計(ポータブルスペクトロメータ)を用いて、非破壊的に放牧草地の草地構造を評価しようとするものである。すなわち、草地構造のパラメータとポータブルスペクトロメータで測定した分光反射率との回帰式を作成し、草地構造の簡便な調査法を確立することを目的とする。本学生物生産研究農場内の0.66ha乳牛放牧地を3つ用い、放牧強度および放牧開始時草高の組み合わせが異なる3つの試験処理(HL:6.1,15、HH:7.6,15、およびLL:6.1頭/ha,8cm)を設定し、それぞれ、4、5および4頭の泌乳牛を5月から10月まで1日5時間定置放牧した。これらの草地において、2週間間隔で各供試牧区内5点でポータブルスペクトロメータを用いて分光反射率を測定した。同場所に50×50cmのコドラートを置き、草高、イネ科・マメ科および雑草の植被率、イネ科分げつ密度およびマメ科茎数密度などを測定した後、刈り取り法により現存草量を測定した。結果として、全放牧期間を通じて180点の草地構造とその分光反射率のデータセットを得た。今年度実績は、回帰式を作成するための基本データ収集が主であったが、草地構造と各波長での分光反射率との関係について、以下の傾向が認められた。1.草量が多いほど480580nm(青緑緑黄緑)の波長の反射率が大きい。2.枯死物が多いと580695nm(黄橙赤)の波長の反射率が大きい。3.ほぼ700nmを境に反射率は急激に上昇し、赤外部(750nm以上)での草地構造の違いによる反射率の差は、可視部のそれにくらべ非常に大きい。本研究は、放牧草地の草量や植生など草地構造のパラメータと野外観測用可視・近赤外分光放射計(ポータブルスペクトロメータ)(FieldSpec Pro,測定範囲350-1050nm)で測定した分光反射率との関連を検討することで非破壊的に放牧草地の草地構造を評価する方法を確立するとともに、衛星画像データ(ASTER)との関連についても検討する。調査は2006年9月19日-21日、北海道十勝管内4町(浦幌、豊頃、池田、幕別)の公共育成牧場で行った。各牧場内で植生が「良い」および「悪い」牧区を5か所ずつ選定し、各牧区内5点でFieldSpecを用いて分光反射率を測定した。その後、同場所で草地構造パラメータとして、コドラート法により草高、冠部被度(イネ科、マメ科、雑草、裸地)を、刈り取り法により現存草量を測定した。FieldSpecで得られた分光反射率データをASTERのバンド帯毎に平均しそれらの関連を検討するとともに、草地構造パラメータとの関連を検討した。本年度得られた結果は以下の通りである。

1.同一地点で測定したFieldSpecとASTERの分光反射率を比較するとその反射特性はほぼ同様であった。2.ASTERから得た可視赤(630-690nm)および近赤外(760-860nm)での分光反射率および正規化植生指数(NDVI)は生草収量、乾物収量および乾物率のいずれとも有意な相関関係(P<0.01)がみられたが、可視緑-黄(520-600nm)は関連がなかった。これらのことから、FieldSpecの測定データから牧草収量を推定できると考えられ、衛星データと組み合わせることによって、より大面積の草地について正確な収量を簡易に推定できる可能性が示された。なお、草地構造パラメータとFieldSpecによる分光反射率との回帰式作成に向けての解析は現在進行中である。野外観測用可視・近赤外分光放射計(ポータブルスペクトロメータ)は、比較的近距離から地表面の物体の350-1050nmの分光反射率、反射輝度、放射照度を測定する携帯型の機器である。現在、この機器は地上設置、およびヘリコプターや軽飛行機を利用した移動測定など、人工衛星等を利用したリモートセンシングの各種分析のバックアップに用いられている。本研究は、この機器を放牧草地の草量や植生などの草地構造の評価に応用しようとするものである。本年度は、放牧草地の草量や植生など草地構造のパラメータとポータブルスペクトロメータ(FieldSpec Pro,測定範囲350-1050nm)で測定した分光反射率との回帰式を作成し、草地構造の簡便な調査法を確立することを目的とした。回帰式作成に用いたデータは、17年度(北大農場)および18年度(北海道十勝管内4町公共育成牧場)調査で得た各波長の分光反射率とコドラート法で測定した草地の植生および構造のパラメータである。1.可視赤(630-690nm)および近赤外(760-860nm)での分光反射率および正規化植生指数(NDVI)は生草収量、乾物収量および牧草乾物率のいずれとも有意な相関関係(P<0.01)がみられたが、可視緑-黄(520-600nm)は関連がなかった。2.生草収量(Y_1)および乾物収量(Y_2)とNDVI(X)との間に、以下の回帰式を得た。3.同一地点で測定したFieldSpecとASTER(衛星画像データ)の分光反射率を比較するとその反射特性はほぼ同様であった。4.道内酪農家(上川管内旭川市および網走管内興部町)で草量の実測値と推定値を比較し、回帰式はおおむね良好である結果を得た。5.これらのことから、FieldSpecの測定データから牧草収量を推定できると考えられ、衛生データと組み合わせることによって、より大面積の草地について正確な収量を簡易に推定できる可能性が示された。6.FieldSpec測定データによる牧草成分および土壌成分の推定については今後の研究課題である。
光安定性超分子型 蛍光色素の開発と生体イメージングへの応用

近年、一分子イメージングや超解像イメージングなどの高輝度レーザーを用いる技術が注目を集めているが、解決すべき最大の問題点の一つが、観察時の蛍光色素の光退色である。本研究課題では、蛍光色素の光退色を抑制する新技術の開発に取り組んだ。初年度は、蛍光色素をホスト分子に包摂させることで、光退色が抑制されるか検討した結果、ある種の色素とホストの組み合わせでは劇的に光退色抑制効果が見られた。次年度は、希土類イオンを用いて光退色が抑制できることを見出し、そのメカニズムについて考察した。蛍光色素の光安定性を向上させる戦略として、超分子化学を利用した超分子型蛍光色素の開発を行った。これは、有機ホスト分子がゲストである蛍光色素分子を包接した超分子複合体を形成することにより、物理的に酸素などの反応性分子から保護し、色素の光安定性を向上させるという試みである。本年度は有機ホスト分子として、cucurbit[n]urilを用いて、検討を行った。様々な蛍光色素とcucurbit[7]uril (CB7)およびcucurbit[8]uril (CB8)を共存させ、その吸収スペクトルを測定した。CB類は水素結合のアクセプターとして働く複数のカルボニル基を有していることから、カチオン性の色素において良い取り込みが観察された。特に立体的に包接されやすい構造のpyronine YはCB7およびCB8の双方に強く取り込まれ、550 nm付近の吸収極大値が減少し、550 nm付近のに吸収極大値が上昇するという顕著なスペクトル変化が観察された。続いて、これらのpyronine Y-CB錯体の緩衝溶液にXeランプで光照射を行い、その光安定性を調べた。大気下およびアルゴン雰囲気下の双方で、光退色性を評価した結果、大気条件下でCB7錯体が顕著な光安定性の向上を示した。一方、CB7よりも強く錯体を形成したCB8においては、大気下、アルゴン雰囲気下の双方において、目立った光安定性の向上は見られなかった。pyronine Yがホスト分子(cucurbit[7]uril)に包摂されることによって、特に大気条件下で光安定性が向上することを明らかにした。また、ホスト分子のサイズを変えることで、蛍光色素の光安定性の向上の程度に差が出ることを見出した。近年、生体分子を詳細に解析する為に一分子イメージングや超解像イメージングなどの技術が注目を集めている。しかしながら、これらのイメージング法は、高輝度のレーザーを用いるため、観察時における蛍光色素の光退色が大きな問題となっている。よって、蛍光色素の光退色を抑制する汎用的な手法の開発は光を利用する現代生物学の進展に大きく貢献すると考えられる。蛍光色素が光退色を起こす主な原因は、長寿命の励起三重項状態が起点となり、一重項酸素の生成やそれによる色素酸化などが生じるためと考えられる。それゆえ、長寿命の励起三重項状態を素早く基底状態へと戻すことにより、色素の光安定性の向上が達成できると期待される。そこで本年度はこれらの励起状態寿命を考慮した新しい蛍光色素の光退色抑制法の開発を行った。一般的に、三重項状態の色素を緩和し基底状態へと戻す物質はTriplet State Quencher (TSQ)と呼ばれるが、本研究では希土類イオンがその発光メカニズムからT1状態の色素のエネルギーアクセプターとして働くことで、T1寿命を短縮させ、その結果光退色を抑制するのではないかという仮説を立てた。複数の希土類イオンを蛍光色素溶液に添加し、実際に色素の光安定性を向上させるかどうかについて検討した結果、ある種の希土類イオンを溶液中に添加したときに蛍光色素の光安定性が増加した。また、希土類金属イオンの配位子が蛍光色素の光退色に与える効果についても検討した。ある種の希土類金属イオンの蛍光色素の光退色抑制効果については、過渡吸収スペクトル測定など様々な物理化学特性を検討することで考察を行った。光安定性向上のメカニズムの考察を行い、さらなる光安定性向上を目指す。また、異なる原理に基づく光安定性向上戦略の開発も合わせて行う。ケミカルバイオロジー年度内に購入予定であった物品(光照射装置)の選定に時間がかかり、購入が次年度にずれ込んだため。平成28年度に予定していた物品購入の為に使用する。
廃棄物ゼロをめざした地域資源環境型社会システムの構築

【研究目的】これまで産業及び生活から発生する廃棄物は焼却もしくは埋立てを行ってきた。しかし、環境保全の関連から産業廃棄物ならびに生活廃棄物の処理に対して大きな課題を抱えている。本課題では、「屋久島」を対象とした。ここは(1)農業、水産業及び生活から発生する廃棄物の処理に困難をきたしていること、(2)屋久島は閉鎖系の環境にあること等が大きな理由である。屋久島における「ゼロエミッション構想」の実現に向け、「廃棄物ゼロをめざした地域資源循環型社会システム」を構築することにある。(1)屋久島に発生する廃棄物は年間27,467トンである。これらの約1%がコンポスト化されているが、大部分が焼却もしくは埋立てられている。そこで、これらをメタン発酵させることにより得られるエネルギーは重油換算で835m^3、LPG換算で647トン、電力換算で2,700Mwhと膨大なエネルギーに変換できる。更に、残さ物を炭化するシステムを構築することにより建材、農業資材が提供できる。(2)森林資源(間伐採、製材端材等)はわずかながら発生しており、大部分がコンポスト資材に回されている。(3)産業・生活複合化廃棄物等回収型処理システムによる新エネルギー及び各種エコマテリアルの創製技術を活用し、メタン発酵により発生したメタンガスをエネルギー化し、工場内の装置の動力源とし、発酵残さは炭化することにより農業資材への活用が可能であることを屋久町に提言した。以上のように平成11年度の科学研究費の成果にもとづき、「廃棄物ゼロをめざした地域資源循環型社会システムの構築の構想」と「屋久島エコタウン構想」を屋久町当局に提案した結果、平成11年度の成果に踏まえ、平成12年度の科学研究費研究を継続するとともに、企業、鹿児島大学の共同研究により平成12年度中にパイロットプラントを設置し、実用化に向けた準備に入る方向で検討することができた。
血管内留置カテーテルの副作用防止に関する基礎的研究

血管内留置カテーテルが血管壁に及ぼす影響を明らかにするため、以下の検討を行った。体重2-3kgの正常家兎の耳介動脈および体重30-35kgの雑種成犬の腸骨動脈にテフロン製、ポリウレタン製カテーテルを留置し、留置後の血管壁および末梢動脈の変化を血管造影写真にて観察した。留置2週間後では、いずれの素材のカテーテルでも、留置血管および末梢動脈に変化は認められなかった。留置5週間後では、若干の血管内腔の狭小化を認める場合があったが、素材による有意な差は認められなかった。次に留置6週間後に屠殺し、カテーテルを留置した動脈壁の状態を組織学的に検討した。いずれの素材のカテーテルにおいても、カテーテルが接触していた血管壁に内膜肥厚を認めたほか、カテーテル留置部より末梢の動脈においても、内膜肥厚像が認められた。次に家兎耳介動脈に留置した24Gテフロン製カテーテルより、ファルモルビシン2mg、マイトマイシンC 1mg、シスプラチン5mgを2週毎に注入し8週後の留置血管の状態を観察した。血管造影では、いずれの薬剤においても軽度(30%以下)の血管内腔の狭小化が認められた。組織学的には、血管壁に浮腫状変化・硝子様変性を伴う内膜肥厚、血管内皮細胞の増生が認められ、これらの病理学的変化は注入薬剤の種類により差は認められなかった。今回の実験的検討による血管変化は、注入薬剤の化学的刺激による惹起される血管内皮障害のみならず、留置したカテーテル自体にも原因があると考えられた。また、カテーテル留置部より末梢に生じた内膜肥厚の原因としては、留置カテーテルによる乱流のため生じた微小血栓の器質化による変化あるいは、カテーテルの物理的刺激により血管内皮細胞の剥離がおこり末梢に播種性増殖が生じた可能性が考えられた。今後これらの変化が少ないより血管内留置に適したカテーテルの開発が必要である。
c-Jun NH_2 terminal kinaseの抑制による心不全治療の試み

細胞内情報伝達系のmitogen-activated proteinkinase(MAPK)はERK、JNK、p38MAPKがあり、細胞増殖因子、サイトカイン、機械的刺激などで活性化され、細胞の肥大、増殖、分化、アポトーシス、遺伝子発現制御などに関係する。我々の検討では、ラットの心筋梗塞の心筋MAPKは、ERK、JNK、p38MAPKのすべてが、梗塞部位と非梗塞部位の両方で活性亢進が認められた。この結果より心筋でのMAPKの活性化が心筋梗塞後心臓リモデリングに関与していると考えられた。さらに、JNKの下流に位置するc-Junのdominant negative mutantをアデノウイルスベクターをもちいて培養心筋細胞に遺伝子導入し、シグナルを抑制することによりエンドセリンやフェニレフリンによる心筋肥大を検討した。その結果、c-Junのdominant negative mutantは転写因子activator protein-1(AP-1)の活性化を抑制し、さらにcell sizeの増大、タンパク合成促進、ANP、BNPのmRNA発現亢進を抑制した。このことより、JNKの下流のc-Junを抑制することで、AP-1の転写活性を阻害し、生体でも心筋細胞肥大を抑制できる可能性があることが判明した。又、ACE阻害薬、アンギオテンシンI型受容体拮抗薬はJNK、AP-1の活性を阻害し心筋梗塞後心臓リモデリングの抑制に関与していると考えられた。mitogen-activated protein kinase(MAPK)ファミリーは代表的な細胞内情報伝達系であり、extracellular signal-regulated kinase(ERK)、c-Jun NH2-terminal kinase(JNK)、p38MAPKが含まれる。MAPKは細胞増殖因子、サイトカイン、機械的刺激などで活性化され、細胞の肥大、増殖、分化、apoptosis、遺伝子発現制御など基本的な生命現象に関係することが知られている。循環器領域では心臓肥大でのMAPKの重要性が示唆され、今回の研究でラツトを用いた心筋梗塞モデルでの心筋MAPKは、ERK、JNK、p38MAPKのすべてが、梗塞部位と非梗塞部位の両方で活性亢進が認められた。その結果、c-Junのdominant negative mutantは、エンドセリンとフェニレフリンによる転写因子activator protein-1の活性化を抑制し、さらにcell sizeの増大、タンパク合成促進、ANP、BNPのmRNA発現亢進を抑制した。このことより、JNKの下流のc-Junを抑制することで、activator protein-1の転写活性を阻害し生体でも心筋細胞肥大を抑制できる可能性があることが判明した。