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植物の感染防御応答におけるNOと活性酸素種の協奏的作用機構の解明

病原体の感染に対する植物の防御応答において、細胞死を伴った一連の抵抗反応が誘導される。活性酸素と一酸化窒素(NO)は抵抗反応の誘導・増幅シグナルとして機能していると考えられ、植物体内でのそれらの生成系の解析を行った。また、スーパーオキシド(O2-)とNOとの反応物であるパーオキシナイトライト(ONOO-)が細胞死を誘導し、植物の基礎抵抗性に関与している可能性を示した。さらに細胞死を誘導するセラミド関連化合物を特定し、抵抗反応誘導機構の解明における有用性を示唆した。植物の感染防御応答において、活性酸素分子種の動的抵抗反応の始動を統御する機構を理解するためO_2^-生成機構の解明ならびにNOの生成機構の解明を図った。O_2^-生成は主にNADPH酸化酵素によると考えられ、その活性本体であるrboh (respiratory burst oxidase homolog)遺伝子として、先にジャガイモ塊茎からStrbohAとStrbohBを単離している。また、StrbohBのN末端領域のSer82をリン酸化する酵素のスクリーニングを抗リン酸化ペプチド抗体を用いて行い、2種のCa^<2+>依存性タンパク質リン酸化酵素(CDPK) StCDPK4およびStCDPK5を単離した。StCDPKの機能解析をNicotiana benthamianaを用いて行った結果、恒常活性型StCDPK5は、StrbohBのSer82とSer97をリン酸化することによりO_2^-生成を誘導すると推定された。一方、NO生成系として硝酸還元酵素(NR)が機能することを先に示したが、NO合成酵素(NOS)が植物においても機能する可能性がある。NOSの活性調節タンパク質をコードすると推定されるAtNOA1ホモログであるNbNOA1をN, benthamianaより単離した。ウイルスを介したジーンサイレンシングにより作製したNbNOA1サイレンシング葉において、INF1エリシターにより誘導されるNO生成ならびに防御関連遺伝子の発現が抑制され、INF1エリシターに応答したNO生成には、NRに加えてNOA1が関与することが示唆された。植物の感染防御応答において、活性酸素分子種の動的抵抗反応の始動を統御する機構を理解するため、1)O_2^-生成活性を持つエリシター分子の単離とその関連化合物の作用機構の解明、ならびに2)NOの生成機構の解明を図った。1)0_2^-生成エリシターの精製と関連化合物の抵抗反応誘導活性ジャガイモ疫病菌菌体のメタノール抽出物を材料として、O_2^-生成の活性測定を指標にO_2^-生成エリシターの精製を試みた。精製した活性物質の1つはセラミドであると推定された。次に、セラミド関連化合物10種についてジャガイモ懸濁培養細胞に対するO_2^-生成活性を調べたところ、いずれの化合物も活性を示さなかった。一方、調べた化合物のうちN, N-dimethylsphingosine(DMS)はジャガイモ塊茎に対してファイトアレキシンの生成蓄積を誘導した。DMSはジャガイモ懸濁培養細胞、Nicotiana benthamiana葉、タバコ懸濁培養細胞BY-2に対して細胞死を誘導し、DMSは過敏感細胞死を誘導するエリシター物質であることが示唆された。2)NO生成に関与する因子の単離とその機能解析NO生成系として硝酸還元酵素(NR)が機能することに加え、NO合成酵素(NOS)が植物においても機能する可能性がある。今回、NOSの活性調節タンパク質をコードすると推定されるAtNOA1ホモログであるNbNOA1をN, benthamianaより単離した。ウイルスを介したジーンサイレンシングにより作製したNbNOA1サイレンシング葉において、INF1エリシターにより誘導されるNO生成ならびに防御関連遺伝子の発現が抑制され、INF1エリシターに応答したNO生成には、NRに加えてNOA1が関与することが示された。1)植物の病害抵抗反応へのパーオキシナイトライトの関与O_2^-はNOと協調して細胞死誘導のシグナル因子として働いている可能性が高く、O_2^-とNOとの反応物であるパーオキシナイトライト(ONOO^-)の存在と機能が推定される。ベンサミアナタバコ葉において、ジャガイモ疫病菌由来のエリシタータンパク質INF1処理によりONOO^-生成が誘導された。O_2^-生成酵素であるNbRbohB、NO生成に関与するNbNOA1およびNbNRをベンサミアナタバコ葉においてサイレンシングしたところ、INF1処理により誘導されるONOO^-生成が抑制され、植物体内で生成されるO_2^-とNOからONOO^-が生成されることが示唆された。また、ベンサミアナタバコ葉に対して病原性を示さないインゲン炭そ病菌を接種したところ、病原性を示すウリ類炭そ病菌接種の場合と比較して、より多くのONOO^-生成が認められた。またNbRbohBおよびNbNOA1をサイレンシングしたベンサミアナタバコ葉にウリ類炭そ病菌を接種したところ、病斑数が上昇し、ONOO^-発生剤を処理することにより病斑数が減少した。

従って、ONOO^-は病原菌に対する植物の基礎抵抗性に関与する可能性が示された。2) S-ニトロソ化タンパク質の特定植物の抵抗反応誘導時に生成するNOの機能を明らかにするため、S-ニトロソ化により制御をうける標的タンパク質の特定を目的として、ジャガイモ葉抽出タンパク質にNO供与体GSNOを処理し、ビオチンスイッチ法を用いてS-ニトロソ化されるタンパク質の検出を行った。その結果、S-ニトロソ化タンパク質が認められ、ビオチン標識したS-ニトロソ化タンパク質をアビジンアガロースを用いて精製し、得られたタンパク質を質量分析計を用いた解析により同定した。
がん治療を指向する高機能性マイクロRNAの開発

「RNA創薬」においてマイクロRNAは最も有力な候補の一つに挙げられているが,天然型ヌクレオチドからなるマイクロRNAでは限界があると指摘されている。このような背景の下,抗がん性マイクロRNAの開発を目的に細胞膜透過性,ヌクレアーゼ耐性,タンパク質との結合能などを改善した人工核酸による高機能性マイクロRNA(miRNA)の創製を検討した。本年度の研究結果を下記に示す。1)昨年度には,ベンゼン誘導体又はピリジン誘導体を3'-末端に有する修飾オリゴヌクレオチドからなるマイクロRNA(大腸癌に係わるmir-143,mir-145)を合成し,その抗がん活性を細胞レベルで調べたところ顕著な生物活性を認めた。そこで本年度は,細胞膜透過性の向上を期待してベンゼン骨格に脂溶性置換基を導入した核酸オリゴマー合成用のアミダイト・ユニットやベンゼン誘導体結合型CPG樹脂を開発した。即ち,脂溶性置換基を有するベンゼン1,3-ジヒドロキシメチル体の合成法を確立し,次いで対応するアミダイト体に変換した。更に,スクシニル体に誘導した後,CPG樹脂との結合にも成功した。現在これらを用いて様々な3'-末端修飾型核酸オリゴマーの合成を実施している。今後これらのヌクレアーゼ耐性や細胞膜透過性などを詳細に検討する予定である。2)細胞レベルでの抗がん活性を認めたマイクロRNA(大腸癌に係わるmir-143)の配列特異性を確認するため,様々な修飾を加えた配列を有するマイクロRNAを作成中である。今後,開発したマイクロRNAの抗がん活性を中心とした生物活性の評価を,共同研究者(岐阜県国際バイオ研究所・赤尾部長)に依頼する予定である。「RNA創薬」においてマイクロRNAは最も有力な候補の一つに挙げられているが、天然型ヌクレオチド型マイクロRNAでは限界があると指摘されている。このような背景の下、抗がん性マイクロRNAの開発を目的に細胞膜透過性、ヌクレアーゼ耐性、タンパク質との結合能などを改善した人工核酸による高機能性マイクロRNA(miRNA)を創製する。既に申請者は、数種の人工核酸の創製に成功している。これらは、脂溶性が向上し、かつヌクレアーゼ耐性を示した。そこで、これら予備的知見を下に、抗がん活性を有する高機能性マイクロRNAを開発する。本研究では、化学修飾を施した高機能なマイクロRNAを開発し、がん細胞抑制活性を調べた。(1)ヌクレアーゼ耐性に着目した高機能性マイクロRNAの開発オリゴヌクレオチドの3'-末端にベンゼン誘導体又はピリジン誘導体が置換したマイクロRNAの合成を可能にするオリゴヌクレオチド合成用樹脂及びアミダイトユニットを分子設計・合成した。次いで、これら試薬をDNA/RNA自動合成機に適用して希望する配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。得られたオリゴヌクレオチド誘導体はヌクレアーゼ耐性を示した。また、大腸がん細胞中で発現量が低下しているmiR-143及びmiR-145を対象とするマイクロRNAを数種作成した。この際、マッチ配列とミスマッチ配列を各々合成した。これらの融解温度を測定したところ、マッチ配列と比べてミスマッチ配列は約20度低下していた。(2)合成したマイクロRNAのヒト大腸がんDLD-1に対する効果合成した4種のマイクロを用いて、ヒト大腸がん細胞に対する増殖抑制効果を予備的に調べたところ、期待するがん細胞増殖抑制効果を示した。その他の化学修飾したマイクロRNAを開発すると共に、開発したマイクロRNAのがん細胞増殖抑制効果について、今後詳細に検討する予定である。
伝統薬物の生理活性フェノール性成分に関する研究

1.抗腫瘍活性を指標とする研究(1)生薬・絡石藤のリグナン成分arctigeninとtrachelogeninはマウス耳を用いたTPA誘発炎症抑制効果試験において強い発癌プロモータ抑制作用を示した。またフラボノイド成分luteolinならびにその7-0-配糖体にDPPH試験で強いフリーラジカル捕捉作用を認めた。(2)薬草・ニチニチソウ(葉部)のフラボノイド成分mauritianinにTPAを用いたマウスの免疫抑制試験で顕著な免疫賦活効果を認めた。(3)ハ-ブ・ヒメツルニチニチソウ(葉部)の2,3-dihydroxybenzoic acidにDPPH試験で強いフリーラジカル捕捉作用を認め,さらに糖尿病合併症の発症原因の1つとされるAGE_sの生成も抑制した。(4)生薬・エゾウコギのリグナン成分syringaresinol-di-glucosideに水浸拘束ストレス負荷ラットを用いた試験で胃潰瘍抑制効果を認めた。2.抗アレルギー活性を指標とする研究(1)ハ-ブ・シャゼンソウのフェニルエタノイド配糖体plantamajoside,フラボノイド成分scutellarein,6-hydroxyluteolinに5-lipbxygenase阻害活性,フラボノイド成分にラット腹腔肥満細胞からのヒスタミン遊離抑制作用,フェニルエタノイド配糖体にアラキドン酸誘起耳急性炎症抑制作用を認めた。(2)生薬・レンギョウのフェニルエタノイド配糖体forsythiaside,suspensaside,acteosideに高い5-lipoxygenase阻害活性とDPPH試験で強いフリーラジカル捕捉作用を認めた。(3)生薬・シンピのクマリン成分esculetinに高い5-lipoxygenase阻害活性、aldose reductase阻害活性および血小板凝集抑制作用を認め、DPPH試験で強いフリーラジカル捕捉作用を認めた。抗腫瘍活性を指標とする研究1.生薬・絡石藤に含有されるリグナン成分のarctigeninとtrachelogeninはマウス耳を用いたTPA誘発炎症抑制効果試験において強い発癌プロモータ抑制作用を示した。またフラボノイド成分のluteolinならびにその7-0-配糖体にDPPH試験で強いフリーラジカル捕捉作用を認め、癌発症の原因の1つである活性酵素を除去する効果が期待できた。2.薬草・ニチニチソウ(葉部)からmauritianin (kaempferol-3-(0-rhamnosyl-(1→2)-0-rhamnosyl-(1→6) galactoside)とquercetin-3-(0-rhamnosyl-(1→2)-0-rhamnosyl-(1→6) galactoside)を単離した。このうちmauritianinにTPAを用いたマウスの免疫抑制試験で顕著な免疫賦活効果を認めた。このmauritianinはニチニチソウ中に0.5%含まれており、主要成分でもあった。3.ハ-ブ・ヒメツルニチニチソウ(葉部)から2,3-dihydroxybenzoic acidとその配糖体vincosideを単離した。両成分は定量分析の結果ヒメツルニチニチソウの主要成分であった。この2,3-dihydroxybenzoic acidにDPPH試験で強いラジカル捕捉作用を認め、さらに糖尿病合併症の発症原因の1つとされるAGEs (advanced glycation end products)の生成も抑制した。4.絡石藤、ニチニチソウ、ヒメツルニチニチソウいずれからも、それぞれ抗腫瘍作用の期待できる生理活性フェノール性成分を明らかとすることができた。抗アレルギー活性を指標とする研究1.対象とした伝統薬物シャゼンソウ,レンギョウおよびシンピについて検討を行った。

1.含有フェノール性成分の単離日本・中国産シャゼンソウからフェニルエタノイド配糖体11種,フラボノイド8種,イリドイド配糖体1種,ヨーロッパ産シャゼンソウからフェニルエタノイド配糖体6種,フラボノイド3種,イリドイド配糖体5種,レンギョウからリグナン8種,フェニルエタノイド配糖体4種,シンピからクマリン4種,フェニルエタノイド配糖体2種を単離し,それぞれ構造決定を行った。1.抗アレルギー活性のスクリーニング単離した成分について以下のスクリーニング試験を行った。(1)ヒスタミン遊離抑制作用:対象薬にbaicaleinとketotifenを用い,ラット腹腔肥満細胞から検体存在下Compound48/80により遊離されるヒスタミン量を蛍光法により定量し,抑制率を算出した。その結果,フェニルエタノイド配糖体やフラボノイドの配糖体には活性を認めなかったが,シャゼンソウからのフラボノイドのapigenin,luteolin,scutellarein,6-hydroxy-luteolinにそれぞれ活性を認めた。(2)5-lipoxygenase阻害活性:アラキドン酸代謝系でのロイコトリエン生成に関与する酵素である5-lipoxygenaseの阻害活性試験を行った。その結果,シャゼンソウおよびレンギョウからのフェニルエタノイド配糖体のplantamajoside,acteoside,forsythiaside,シャゼンソウからのフラボノイドのscutellarein,6-hydroxyluteolin,シンピからのクマリンのesculetinなどに高い阻害活性を認めた。(3)アラキドン酸誘起耳急性炎症抑制作用:アラキドン酸により誘発されるマウスの耳急性炎症モデルを用いた抗アレルギー試験を行った。その結果,シャゼンソウおよびレンギョウからのフェニルエタノイド配糖体のacteoside,plantamajosideに炎症抑制作用を認めた。本結果は5-lipoxygenase阻害活性の結果とよく一致した。
ペルオキシゾーム病のモデル糸における膜流動性変化について

C-6グリア細胞の膜流動性を測定する条件設定では、蛋白濃度やインキュベート時間による蛍光光度の変化を測定した。蛋白濃度が0.5mg/dlの時、最大の蛍光光度が得られた。又、インキュベート時間は、10分から40分後では一定の値を維持していた。以後の実験は、C-6グリア細胞のホモジネートを蛋白0.5mg/dlに調整し、インキュベート時間を20分間で行った。チオリダジンによる膜流動性変化を検討した。チオリダジンの濃度依存性に、蛍光偏光度の減少、すなわち膜流動性の増大が認められた。今までのグリア細胞の分化に関する研究で、チオリダジン依存下で、分化の指標であるCNPaseの阻害が認められており、流動性変化との関連が示唆された。同時にチオリダジンは、ペルオキシゾームでの脂肪酸β酸化と阻害することが知られており、C-6グリア細胞でもチオリダジンを培地に添加すると極長領脂肪酸の蓄積が認められている。極長領脂肪酸の増加は膜流動性の低下を引き起こすものであるが、今回の結果では逆に流動性は増加した。膜流動性に影響する他の要素としては脂肪酸の不飽和度やリン脂質とコレステロールの比があげられる。チオリダジンがリン脂質代謝に影響するという報告がありC-6グリア細胞のリン脂質とコレステロールの比を検討した。ナオリダジンは、リン脂質とコレステロールの比を変化させなかった。ペルオシシゾーム病におけるさまざまな代謝障害による神経細胞膜の性状変化はまだ明らかではないが、その機能異常が膜流動性が関与する可能性が示唆された。今後、チオリダジン存在下での、リン脂質のpolar-head-groupの変化や、in vitroでの膜流動性の変化の果たす役割について検索が必要である。1.膜の流動性:10%牛胎児血清を含むDMEM培地にて3日間培養したCー6グリア細胞をポリトロンにて破砕後、ホモジネ-ト液の蛋白濃度を変化させたところ,0.5mg/dlにて最大の蛍光強度が得られ,これ以上の濃度ではホモジネ-ト液の混濁度増大の為、測定値が不安定となった。また加えるプロ-ブ量は他の文献例などを参照した。Cー6グリア細胞を破砕せず、形質膜を出来るだけ生理的な状態に保ったまま膜の流動性を測定するため、プロ-ブをTMAーDPHに替えた。この場合、培養はディッシュに13×40mmのポリ-レ-リジンでコ-トしたマイクロプレ-トを置いて行なった。TMAーDPHをマイクロプレ-ト上のCー6グリア細胞とインキュベ-ト後、蛍光強度の時間変化をみたが、5分後より測定値がプラト-に達し、以後20分間測定中は安定していた。今回、TMAーDPHを用いた測定値は、DPHとホモジネ-トを用いたものと比べ、個々の変動が大きく測定方法の検討が必要と思われた。2.膜の脂質分析:ホモジネ-トしたCー6グリア細胞の総脂質の脂肪酸分析をガスクロマトグラフィ-で行なった。炭、数22以上の極長鎖脂肪酸の含量は総脂質の数パ-セント以下と低く、資料の量を増やしたり、予め薄層クロマトグラフィ-で分画したりして濃縮する必要があると思われた。近年、ペルオキシゾ-ム病のモデル系としてCHO細胞の変異株について分子生物学的な研究が報告されている。今後、Cー6グリア細胞にβー酸化系酵素阻害剤を加える系と併行して同様の実験をCHO細胞の野性株と変異株で比較して行なえれば新たな知見が得られると思われる。

C-6グリア細胞にチオリダジンを加えDPHをプローブとした蛍光偏光度を測定し以下の結果を得た。37°Cでは血清(+)の対照で偏光度は191±4(×1000)、無血清培地では189±2(×1000)、チオリダジン濃度を10、20、40μMとなるように加えた培地では各々、174±2,169±4,166±3(×1000)と、チオリダジンを加えることにより、蛍光偏光度の減少、即ち膜流動性の増加が認められた。次に、この膜流動性変化に対する温度の影響を調べた。25°Cでは、対照、無血清、チオリダジン濃度10、20、40μMの各培地で培養した細胞の偏光度は、順に238±4,199±4,200±6,207±4,209±2であった。15°Cでは各々260±2,226±3,231±3227±3,226±3となり、これらの温度では、チオリダジン添加の影響よりも、無血清培地での培養による何らかの膜変化の方が大きいことが推察された。チオリダジンは、ペルオキシゾームのβー酸化阻害剤であり、膜中の極長鎖脂肪酸の増加を引き起こすが、脂肪酸の炭素数の増加は、一般に膜流動性を減少させる。今回の結果では、膜の流動性は増加しており、今後更に、膜中のリン脂質とコレステロールの含量比や、極長鎖脂肪酸が、リン脂質、或はコレステロールエステル中にどのように分布しているかについて検討する予定である。チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)のDPHにる膜流動性の測定を、C-6グリア細胞と同様の方法で行ない、温度変化による偏光度変化を測定した。27°C付近に相転移温度が認められた。Zellweger病のモデルとして報告されている変異株が入手できれば、野性株との比較を行なう予定である。C-6グリア細胞を10%牛胎児血清を含むDMEM培地で2日間培養後、対照は以後2日間同様に培養を続けた。一方は無血清培地に変え、C-6グリア細胞の分化を促進させた。チオリダジンを20μMの濃度になるように無血清培地に加えたものと前2者とでC-6グリア細胞のリン脂質とコレステロールの含量および比を測定し比較した。おのおのの細胞は0.9%食塩水中で破砕しクロロホルム、メタノールを加え脂質の抽出を行いクロロホルム層を分離し測定に用いた。リン脂質はAmesの方法により、対照では57.1±3.8nmol/mgProtein、無血清培地、チオリダジン添加培地では、それぞれ44.6±2.4、72.6±4.1nmol/mgProteinの値を得た。チオリダジン添加によりリン脂質の増加が認められたコレステロールはコレステロールオキシダーゼを用いたキットで測定した。対照、無血清培地およびチオリダジン添加培地で培養した細胞においてコレステロール値は191±2.4、142±5.7、234±9.0nmol/mgProteinであった。チオリダジン添加によりリン脂質の増加と同時にコレステロールの増加が起こっており、リン脂質とコレステロールのモル比0.31は対照の0.30や無血清培地の0.31と差は認められなかった。前年度の結果でチオリダジンはC-6グリア細胞の膜流動性を増加させることが明らかとなっているがその機序はリン脂質とコレステロールのモル比変化を介するものではなく他の要素、例えばリン脂質のpolar head groupなどに関係しているのではないかと思われる。
地域福祉計画の策定・実施・改定を促進する複合的評価システムの開発に関する研究

社会福祉法の改正により、市町村には地域福祉計画の策定とその評価が求められるようになっている。しかし既存の研究においては、地域福祉計画の特性を踏まえた評価理論の未形成、評価手法の応用性・実用性の未検証等の課題があり、実践上も評価体制未構築の市町村が半数強に上るなど多くの課題がある。そこで本研究は、1.先行研究および先駆的事例を踏まえた複合的な評価枠組みの明確化、2.全国調査による現状と意向の把握、3.複数自治体との共同研究体制による評価システムの設計・試行的実施の3つの柱からなる研究を総合的に実施することを通して、有効かつ実行可能な地域福祉計画の評価システムのあり方を明らかにすることを目指す。
Ni-P-Bめっきを用いた高温繰返し応力測定法に関する研究

昨年度の結果として,インコネルの試験片にNi-P-Bめっきを施し,雰囲気温度400°C,450°Cにおいて応力振幅と繰返し数に依存した粒成長が確認できた.ただし,応力測定に必要な較正式を導くには十分な実験データ数とは言えなかった.そこで,本年度は,400°Cの雰囲気温度において,実験データ数を増やし,較正式を確立することを目的とした.繰返し負荷後の結晶粒径は,加熱のみの場合より成長したが,応力振幅と繰返し数依存性が明確に認められない結果となった.そこで,この原因について種々の検討を加えた.まず,この原因は試験によりめっき表面に疲労き裂が発生したため,めっきが試験片から剥離してひずみがめっき層に伝わっていないためであると考え,き裂密度を計測するとともに,き裂間隔の広い箇所の粒径を再計測した.しかしながら,き裂密度は,昨年度のめっきとほぼ同じであり,き裂間隔が広い箇所でも粒径の変化はない結果となった.したがって,表面のき裂の影響はないものと考えられる.次に,試験片は試験後に塑性変形して伸びていたため,試験後の試験片全長を計測すると,同じ試験条件でも昨年度の試験片に比べて本年度の試験片は明らかに塑性変形量が大きいことが明らかとなった.昨年度と本年度では試験片素材の製造ロットが異なるため,同じ試験条件でも,試験片の塑性変形量が異なり,本年度の試験片は大きな塑性変形を起こし,めっき層が繰返し負荷試験の途中で剥離して,ひずみが伝わらなくなり,繰返し数を増加しても粒径が大きくならなかったと考えられる.以上の結果から,繰返し負荷試験条件を応力(荷重)制御ではなくひずみ制御で行うことの重要性が示された.本研究課題の2年目以降の目標は,Ni-P-Bめっきを用いた応力測定を可能とするために,粒径,応力振幅,繰返し数および雰囲気温度の関係を表す較正式を導出することである.今回の実験では,較正式の導出には至らなかったが,試験方法の問題点について明らかにすることができた.したがって,今後は実験方法を修正し,新たな実験を実施すれば,較正式を導出することが可能であると考えられる.前年度の研究により,Ni-P-Bめっきを施した試験片の繰返し負荷試験は,荷重制御ではなくひずみ制御で行うことが重要であることが示された.そこで,本年度は,400°Cの雰囲気温度に対して,種々のひずみ振幅,繰返し数による片振り引張試験を実施し,EBSD法により試験後の結晶粒径を調査する.雰囲気温度が一定の場合,結晶粒径はひずみ振幅と繰返し数の関数になると考えられるので,これらの間の関係を明らかにし,較正式を導出する.また,得られた較正式の測定精度についても検討を加え,どの程度の精度で応力測定が行えるか明らかにする.まず,Ni-P-Bめっきの粒成長条件を見極めるために,インコネルにNi-P-Bめっきを施した試験片に対して,雰囲気温度350450°Cにおいて加熱処理を施して,加熱時間と粒成長との関係を調査した.すなわち,XRD法とEBSD法により,種々の条件で加熱処理したNi-P-Bめっきの粒径を調査した.初期の結晶粒径は微結晶であり,XRDのピークはブロードであるとともに,EBSDでも解析が不可能であるが,加熱処理を施すことで,XRDのピークは明瞭になり,EBSDでも粒径が把握できるほど成長する.また,加熱時間と加熱温度の増加とともに粒成長が促進されることも確認でき,通常の金属の再結晶と同様な傾向を確認することができた.次に,得られた結果をもとに,加熱温度,加熱時間および結晶粒径の関係を表す較正式を導いた.この関係を利用すれば,任意の加熱温度,加熱時間に対して粒径を見積もることができるので,この較正式を利用して繰返し負荷試験の条件を決定した.さらに,インコネルにNi-P-Bめっきを施した平滑試験片を用いて,油圧制御式疲労試験機にて,試験周波数1Hzのもとで,加熱温度を一定にした繰返し負荷試験を実施した.応力振幅を2種類に変えて繰返し負荷試験を実施した後,EBSDにより粒径を調査すると,加熱のみの状態よりもさらに粒成長が促進され,応力振幅が大きいほうがそれが顕著であった.したがって,粒成長の応力振幅依存性を確認することができた.以上のことから,Ni-P-Bめっきを用いれば,従来のCuめっきやNiめっきよりも高い雰囲気温度で応力測定が行える可能性があることが示唆された.本研究課題の初年度の目標は,Ni-P-Bめっきの粒成長条件を見極めて,粒径の応力依存性を確認することであった.現在までに,Ni-P-Bめっきに加熱処理した結果,雰囲気温度350400°Cで粒成長することが確認できたことと,雰囲気温度,繰返し数を一定にして応力振幅のみを変えた繰返し負荷試験を実施した結果,応力振幅が大きいほうが結晶粒径も大きくなることが確認できたので,ほぼ予定通り進捗しているといえる.昨年度の結果として,インコネルの試験片にNi-P-Bめっきを施し,雰囲気温度400°C,450°Cにおいて応力振幅と繰返し数に依存した粒成長が確認できた.ただし,応力測定に必要な較正式を導くには十分な実験データ数とは言えなかった.

そこで,本年度は,400°Cの雰囲気温度において,実験データ数を増やし,較正式を確立することを目的とした.繰返し負荷後の結晶粒径は,加熱のみの場合より成長したが,応力振幅と繰返し数依存性が明確に認められない結果となった.そこで,この原因について種々の検討を加えた.まず,この原因は試験によりめっき表面に疲労き裂が発生したため,めっきが試験片から剥離してひずみがめっき層に伝わっていないためであると考え,き裂密度を計測するとともに,き裂間隔の広い箇所の粒径を再計測した.しかしながら,き裂密度は,昨年度のめっきとほぼ同じであり,き裂間隔が広い箇所でも粒径の変化はない結果となった.したがって,表面のき裂の影響はないものと考えられる.次に,試験片は試験後に塑性変形して伸びていたため,試験後の試験片全長を計測すると,同じ試験条件でも昨年度の試験片に比べて本年度の試験片は明らかに塑性変形量が大きいことが明らかとなった.昨年度と本年度では試験片素材の製造ロットが異なるため,同じ試験条件でも,試験片の塑性変形量が異なり,本年度の試験片は大きな塑性変形を起こし,めっき層が繰返し負荷試験の途中で剥離して,ひずみが伝わらなくなり,繰返し数を増加しても粒径が大きくならなかったと考えられる.以上の結果から,繰返し負荷試験条件を応力(荷重)制御ではなくひずみ制御で行うことの重要性が示された.本研究課題の2年目以降の目標は,Ni-P-Bめっきを用いた応力測定を可能とするために,粒径,応力振幅,繰返し数および雰囲気温度の関係を表す較正式を導出することである.今回の実験では,較正式の導出には至らなかったが,試験方法の問題点について明らかにすることができた.したがって,今後は実験方法を修正し,新たな実験を実施すれば,較正式を導出することが可能であると考えられる.前年度までで,Ni-P-Bめっきを従来のCuやNiよりも高温環境下で繰返し負荷試験を実施した結果,粒成長の応力振幅依存性が確認できたので,本手法による応力測定の可能性が示唆された.そこで,本年度はさらに繰返し数を変えた繰返し負荷試験を継続して実施し,結晶粒径を調査する.結晶粒径は,雰囲気温度が一定の場合,繰返し数と応力振幅が大きいほうが大きくなると考えられるので,これを確認する.また,得られた結果をもとに結晶粒径から応力振幅を計測できる較正式の確立を目指す.すなわち,一般に加熱による再結晶粒は加熱温度と加熱時間の関数であり,これらの間の実験式は導かれているので,この実験式をもとに,加熱温度と加熱時間に代わり応力振幅と繰返し数を用いた較正式を導出する.さらに,雰囲気温度を変えた試験も実施して,粒成長の雰囲気温度依存性も確かめ,次年度以降では,雰囲気温度を考慮した較正式の導出を目指す.前年度の研究により,Ni-P-Bめっきを施した試験片の繰返し負荷試験は,荷重制御ではなくひずみ制御で行うことが重要であることが示された.そこで,本年度は,400°Cの雰囲気温度に対して,種々のひずみ振幅,繰返し数による片振り引張試験を実施し,EBSD法により試験後の結晶粒径を調査する.雰囲気温度が一定の場合,結晶粒径はひずみ振幅と繰返し数の関数になると考えられるので,これらの間の関係を明らかにし,較正式を導出する.また,得られた較正式の測定精度についても検討を加え,どの程度の精度で応力測定が行えるか明らかにする.
HPLC-PAD法による赤血球中の糖およびポリオールの定量分析法の開発

われわれは,特異性が高く簡便な測定法であるHPLC-PAD法を用いて,糖尿病性合併症の発症・進展に関与していると考えられる糖およびポリオール-斉分析を行う目的で本研究に着手した。赤血球に脱イオン水を加え凍結融解して得られた溶血液を,限外濾過器のCentricon-10で除蛋白した。赤血球中ソルビトールおよびミオイノシトールはSugar-PakPbカラム(カラム温度:80°C,移動相:脱イオン水)で分離し,PADで検出した。健常人(n=11)の赤血球中ソルビトール値17.27±9.12nmol/gHb(Mean±SD)に対し,細小血管合併症を伴わない糖尿病患者(n=16)では31.00±12.29nmol/gHb,合併症群(n=6)では,61.10±25.11nmol/gHbとなった。また,健常人(n=24)の赤血球中ミオイノシトール値91.58±27.45nmol/gHbに対し,細小血管合併症を伴わない糖尿病患者(n=41)では151.71±53.1nmol/gHb,細小血管合併症群(n=14)では,253.64±79.10nmol/gHbとなった。細小血管合併症を伴わない糖尿病患者の赤血球中ミオイノシトール値は健常人よりも有意に高く(p<0.01),細小血管合併症群のミオイノシトール値は細小血管合併症を伴わない糖尿病患者よりも有意に高く,血糖値やHbA_<1c>をマッチさせても有意差を認めた。これらの結果より,赤血球中ソルビトールおよびミオイノシトールの測定は糖尿病性細小血管合併症の一つの指標となりうることが示唆された。われわれは,特異性が高く簡便な測定法であるHPLC-PAD法を用いて,糖尿病性合併症の発症・進展に関与していると考えられる糖およびポリオール一斉分析を行う目的で本研究に着手した。平成6年度の赤血球中ソルビトールに続いて,平成7年度は赤血球中ミオイノシトールの検討を行った。赤血球検体のクロマトグラムには,10分から20分に未知のピークを認めた。このピークがミオイノシトールのピークに重なり影響を与える場合には,検体を2倍希釈することで影響を回避することができ,定量可能となった。本法の同時再現性は,1.62μg/mlのときCV3.80%,5.71μg/mlのときCV1.20%であった。添加回収率は,98.5%と良好であった。健常人の赤血球中ミオイノシトール値91.58±27.45(平均値±SD)nmol/gHbに対し,細小血管合併症を伴わない糖尿病患者では151.71±53.16nmol/gHb,合併症群では253.64±79.10nmol/gHbと有意に高値を示した。合併症群は血糖,HbA1cともに高値であったので,これをマッチさせて検討したが,この場合も合併症群で赤血球中ミオイノシトール値が有意に高値となった。このように赤血球中ミオイノシトール値は糖尿病性合併症の発症,進展の一つの指標となりうることが示唆された。引き続きポリオール代謝に関するデータの集積を行うとともに,まだ解明できていない未知のピークの同定にも力を注ぎたい。

われわれは,特異性が高く簡便な測定法であるHPLC-PAD法を用いて,糖尿病性合併症の発症・進展に関与していると考えられる糖およびポリオール一斉分析を行う目的で本研究に着手した。平成6年度の赤血球中ソルビトールに続いて,平成7年度は赤血球中ミオイノシトールの検討を行った。両ポリオールを同時に測定したデータが集積されていなかったので,今年度は赤血球中ソルビトールおよびミオイノシトール同時測定を主眼に実験計画を立てた。ところが,HPLCカラムのロット変更により,ミオイノシトールの分析が不良となり,別の良好なロットのカラムの入手に手間取ったため,充分なデータ集積ができなかった。しかし,これまでの成績と同様に糖尿病患者,しかも糖尿病性合併症群で赤血球中ポリオール濃度が高い成績を得た。ソルビトールとミオイノシトールを比較した場合,ミオイノシトールの上昇が大きい傾向があった。現在,良好なロットのカラムでデータを集積している。本研究では組織中のポリオール測定も目標としているが,その前段階として血漿中のポリオール測定も検討中である。健常人のミオイノシトール値は18.86【plus-minus】3.22μg/mlであっ従来から赤血球中ポリオールを分析する上で問題となっていた未知のピークについては,引き続き検討を行ったが,結論は得られなかった。血漿ではこのような大きなピークはみられないため,血球中に多く含まれる物質の可能性が高い。HPLC-PAD法(X)の検討と平行して,ミオイノシトールの酵素比色法(Y)についても検討を行い,回帰式Y=0.882X+33.95,r=0.925と良好な成績を得た。3年間で本研究を完了とまではいかなかったが,引き続きポリオール代謝に関するデータの集積していきたい。
SLC6A4遺伝子多型と機能性ディスペプシアおよび睡眠時ブラキシズムとの関連

本研究の目的はSLC6A4遺伝子多型と機能性ディスペプシアおよび睡眠時ブラキシズム(SB)との関連を解明、検証する事である。今回の研究において、先行研究により示唆されていた、SBと嚥下、胃食道逆流の関連性、を確認することが出来た。今後は関連研究において、今回の研究で得られたデータを活用しより精度の高い結果を出していきたいと考える。2013年、保険病名に加えられた機能性ディスペプシア(FD)と睡眠時ブラキシズム(SB)の疾患感受性にSerotonin transporter遺伝子のSLC6A4遺伝子多型が関与していることが報告されている。また、生活習慣や食生活指導やプロトンポンプ阻害剤(PPI)によって、睡眠時ブラキシズム(SB)の頻度が有意に減少することが報告されている。しかし、その効果に関しては大きな個人差があり、PPIの代謝に関係するCYP2C19遺伝子多型がPPIのSBに及ぼす効果に影響すると考えられた。さらに我々は、SBとFDとの間に密接な関連があることを最近見出した。そこで、SBとFDの両方に罹患している患者に対して生活習慣指導・食事療法等のFDの治療を行い、SBの改善率と遺伝子多型との関連性を明らかにし、SBのオーダーメイド医療に繋げることを目的とした。そこで、一般集団から、情報誌への募集広告の掲載等により被検者募集し、鹿児島大学病院臨床研究倫理委員会と生命倫理・遺伝子解析研究倫理委員会で承認を受けた説明・同意書を用いて説明を行い同意の得られた者中で、歯ぎしりの自覚があり、かつ自宅での簡易睡眠検査でブラキシズムが認められた者に対し、鹿児島大学睡眠実験室にて、SBの診断のための睡眠ポリグラフ検査(以下PSG検査)を行っている。PSG検査では、一般的な検査項目(眼電図、脳波、心電図、オトガイ筋筋電図、呼吸、SpO2)に加え、咬筋筋電図、喉頭部運動、食道内pH、上半身のビデオ撮影を行っている。これらにより、ブラキシズムエピソードの頻度、咬筋筋電図バーストの頻度、咬筋総活動量を解析し、研究用診断基準を満たす被験者を選出している。当初、情報誌への募集広告掲載等により、一般集団から約200名ほどの被検者を募る予定であったが、応募してくる者が少なく、応募してきた者でも除外基準に該当するなど被検者の確保が進んでいない。そこで、一般集団から、情報誌への募集広告の掲載等により被検者募集し、鹿児島大学病院臨床研究倫理委員会と生命倫理・遺伝子解析研究倫理委員会で承認を受けた説明・同意書を用いて説明を行い同意の得られた者の中で、歯ぎしりの自覚があり、かつ自宅での簡易睡眠検査でブラキシズムが認められた者に対して、睡眠時ブラキシズム(SB)、機能性ディスペプシア(FD)と胃食道逆流症(GERD)の確定診断を行う。しかし、当初の計画より被検者の獲得が困難であり、研究に必要な被検者の確保が進んでいない。公募方法を再検討し、被検者の数を増やすとともに現在確保できている被検者に対し、消化管症状の調査および内視鏡検査、PSG検査(眼電図、脳波、心電図、オトガイ筋筋電図、呼吸、SpO2)に加え、咬筋筋電図、喉頭部運動、食道内pH、上半身のビデオ撮影などを順次進めていく予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。矯正歯科学分野28年度が最終年度であるため、記入しない。
光リング共振器と微小共振球とを検出系とした走査型近接場光学顕微鏡の開発

SNOM顕微鏡システムはその近接場の形成方法の違いから数種類に分類されるが、高分解能と試料の多様性を両立させることは難しい。しかし、我々が開発した共振球を介した微小突起を有する共振球プローブでは、上の2つの条件を両立させることが可能である。光によるナノ微細加工には近接場の局在化,高強度化が欠かせない.この目的に添ったプローブとして,極微小突起を有する微小共振球プローブの試作を行なった.一連の実験結果より,共振球以外からの散乱光を取り除く必要が生じたため、直径100μm程度の共振球は,シングルモードファイバの先端を炭酸ガスレーザーによる溶融,伸延して作製したスポーク付のガラス球とした.このスポーク部をガラス基板に接着し,共振球を基板表面に接触,保持した.これにより、基板と共振球との接着部からの散乱光を抑えることが出来た。また、この共振球表面への極微小突起の製作は,i線露光用のフォトレジストを球表面に塗布し,HeCdレーザーの集光スポットを用いて感光させることにより実現した.露光スポットサイズ,露光時間の制御により,1μm程度の微小突起を再現性良く作製できた.この突起からの散乱光が、照明用のTi:サファイアレーザーの波長をスキャンし,共振球内に光リング共振状態を作り出すことで観察されたことで,SNOM用プローブとしての動作が期待できた.そこで,試作プローブの動作テストとして,市販のCDの表面に多数存在するピット(高さ100nm,幅500800nm,長さ8703180nm)の観察を行なった.その結果,ピット列が観察され,試作プローブの有効性が示せた.さらなる高分解能化,高感度化には,以下に述べる通り,極微小突起部の最適化設計とその微細構造の実現が必要となる.微小共振球プローブ構造のうち,共振球下部の極微小突起周りをモデル化し,三次元境界要素法による電磁場伝搬解析をおこなった結果,微小突起からの散乱光強度が,試料を近接させることにより急激に増加する様子がシミュレートできた.このシミュレーション結果は,定性的に実験事実とも良く対応した.さらに,微小突起の形状,材質の微妙な変化が,散乱光強度(プローブの共振状態)に非常に強く影響を及ぼす(つまりは波長オーダーの粒子におけるMorphology Dependent Resonanceのシミュレーション)ことがわかり,光による微細加工や微細構造解析のための高分解能・高感度プローブの最適化設計に対する指針が得られた.さらには,走査型近接場光学顕微鏡のプローブ部の高感度化が可能が可能であることがわかった.SNOM顕微鏡システムはその近接場の形成方法の違いから数種類に分類されるが、高分解能と試料の多様性を両立させることは難しい。また、この共振球表面への極微小突起の製作は,i線露光用のフォトレジストを球表面に塗布し,HeCdレーザーの集光スポットを用いて感光させることにより実現した.露光スポットサイズ,露光時間の制御により,1μm程度の微小突起を再現性良く作製できた.この突起からの散乱光が、照明用のTi:サファイアレーザーの波長をスキャンし,共振球内に光リング共振状態を作り出すことで観察されたことで,SNOM用プローブとしての動作が期待できた.そこで,試作プローブの動作テストとして,市販のCDの表面に多数存在するピット(高さ100nm,幅500800nm,長さ8703180nm)の観察を行なった.その結果,ピット列が観察され,試作プローブの有効性が示せた.さらなる高分解能化,高感度化には,以下に述べる通り,極微小突起部の最適化設計とその微細構造の実現が必要となる.微小共振球プローブ構造のうち,共振球下部の極微小突起周りをモデル化し,三次元境界要素法による電磁場伝搬解析をおこなった結果,微小突起からの散乱光強度が,試料を近接させることにより急激に増加する様子がシミュレートできた.このシミュレーション結果は,定性的に実験事実とも良く対応した.さらに,微小突起の形状,材質の微妙な変化が,散乱光強度(プローブの共振状態)に非常に強く影響を及ぼす(つまりは波長オーダーの粒子におけるMorphology Dependent Resonanceのシミュレーション)ことがわかり,光による微細加工や微細構造解析のための高分解能・高感度プローブの最適化設計に対する指針が得られた.さらには,走査型近接場光学顕微鏡のプローブ部の高感度化が可能が可能であることがわかった.本年度は、研究計画の初年度に際し、近接場相互作用実験装置の設計・製作を行なった。この装置は、実験試料の空間的な微動のためのXYZステージの各駆動軸に、ピエゾ素子からなるインチワームを採用した。

このため、XYZ各軸について光波長よりも十分短い空間分解能5nmでの試料の移動が±5mmにわたって可能となっている。実験装置内は、ロータリーポンプ(既存)により0.1Paという高真空度を達成することができ、微小共振球表面に対する空気中の様々な分子による吸着の影響、種々の音源より発せられ試料の位置決めに影響を与える音波による振動を除去することができる。さらに装置全体を防振台(既存)上に設置し、音波以外の機械的振動からも十分隔離している。相互作用実験に用いる狭帯域化半導体レーザー(既存)あるいはTi:サファイアレーザー(既存)の出力光は、チャンバー壁に設けた石英ガラス窓から入射し、チャンバー内でピグテイル型光ファイバに導入する。実験により発生するであろう光ファイバ内の光強度変化は、装置内でフォトディテクタを用いて光電変換し、電気信号としてチャンバー外へ取り出すことができる。この装置では、垂直方向と水平方向に、それぞれ倍率100倍、35倍の試料観測用顕微鏡を取り付けてあり、高感度冷却CCDカメラ(既存)を取り付けての観測も可能である。このため、共振球(φ50μm)像を十分な大きさと空間分解能により観察可能である。既述のXYZステージのコントロールは、専用コントローラまたはパソコンにより可能となっており、今後、実験の進行に会わせて、制御系およびデータ取り込みシステムを改良して行く。実験装置の性能チェックの後、基礎実験として微小球の光共振実験を開始した。光ファイバカプラハーフの上に設置したポリスチレン球(直径50m)に対し、光ファイバ内の光波を光の近接場により結合させた。この光波の周波数を数十nmにわたりスキャンしたところ、顕微鏡で観察される球像の縁に見えている輝点の強度が、周期的に明滅した。この周期は、光波長でほぼ2.7nm間隔で現われ、球の内表面に沿った進行波共振が基本モードに従って発生することが分かった。この実験結果に対応させるため、球内の光波伝搬状態について2次元の時間領域差分法(FDTD法)を用いて解析を行なった。ただし、計算精度と計算機メモリの制限から、直径5μmの微小球(正確には円柱)について計算した。その結果、実験結果に対応するような光共振状態が確認できた。この計算ではさらに、レーザー光入射角およびレーザー光の偏光状態をパラメータとしたシミュレーションも行ない、共振球プローブ内の光共振状態をレーザー光の照射条件で制御できる可能性を見いだした。本研究は、物質との近接効果が顕著に現れる可能性がある、μmオーダの微小球の共振状態に注目し、この微小球により光だけを検出系に用いたSNOMが、nm以下の空間分解能を達成できる可能性を探る。そして、従来の顕微鏡での評価が不可能な、光デバイス、光材料の極微小領域での量子光学的な特性評価ができる装置の開発を目指す。今年度は、上記の目的のために昨年度製作した「近接場相互作用実験装置」(実験用チャンバー)を用いて、(1)波長可変レーザー光を用いて、50μm程度のポリスチレン微小球内に進行波共振を発生させ、共振状態の観察を高感度冷却CCDカメラにより観察した。この結果、レーザー波長の微少変化が、共振状態に与える影響について調べることが出来た。(2)共振している微小球を試料表面と近接させた際の共振状態の変化を調べたところ、近接によって球内の光波が漏れ出すためか、共振球の発光強度が下がった。
慣習国際法論の変容――ヨーロッパ国際法の普遍化の帰結として

本研究は、当時の学説を渉猟し分析することで、19世紀以後の慣習国際法理論の変容過程を解明し、20世紀中葉に至るまでのヨーロッパ国際法の普遍化という過程の中で慣習国際法理論が果たした役割を明らかにすることを目的とするものである。かかる目的の達成のために、「国際社会」の脱欧州化が始まった同時代における慣習国際法理論とその変容を、概説書等から確認される学説状況及び国家実行の状況という2つの側面から、学説・国家実行間の緊張関係に着目して検討を進めてきた。具体的には、今年度は、(1)黙示の合意論はどのような状況の下で提示されるに至ったのか、(2)二要件論はどのような状況の下で提示されるに至ったのか、という2つの問への回答を通して、従来の「黙示の合意論」及び国内私法における慣習法論の類推に基づく「二要件論」(国家慣行+法的確信opinio juris)という当時の慣習国際法理論について、後者が支配的になる過程を解明することを試みた。主要な学説史の再検討及び一次資料の考察を通して、次のような結果を得た。まず、(1)については、ヴォルフやヴァッテル等による19世紀以前の黙示の合意論との関係に着目しつつ、19世紀の実証主義国際法理論において黙示の合意論が構想されるようになった背景を明らかにした。(2)については、以上で明らかになった黙示の合意論に対して、二要件論という新たな理論が提起されるようになった背景(主として、国内私法における慣習法論からの類推によるもの)を、当時の主要な学説及び常設国際司法裁判所規程の起草を担った国際連盟の法律家諮問委員会の議論を検討することで明らかにした。今年度は、(1)黙示の合意論はどのような状況の下で提示されるに至ったのか、(2)二要件論はどのような状況の下で提示されるに至ったのか、という2つの問への回答を通して、従来の「黙示の合意論」及び国内私法における慣習法論の類推に基づく「二要件論」(国家慣行+法的確信opinio juris)という当時の慣習国際法理論について、後者が支配的になる過程を解明することを計画していたが、両者ともに一定の回答を導き出すことができたため「おおむね順調に進展している」と評価できる。1873年に設立された万国国際法学会は、その最初の検討課題の1つとして「東洋諸国への国際法の適用」を選択した。本議題の報告者を務めた英国のトゥイス(T. Twiss)は、1880年に学会に提出した予備報告書において、「条約規定を遵守する義務に関する東洋人民の考えは、キリスト教人民のそれと実質的に異ならない」と記した上で、実行の中に困難がある旨を指摘し、その困難の解決の必要性を訴えた。以上のような事実に着目した上で、本予備報告書の準備に際して作成された質問票(questionnaire)やその後1883年9月のミュンヘン大会における決議採択までの議論過程を明らかにすることで、当時の具体的な問題状況を把握し、かかる実践的な問題において慣習国際法論がどのように位置づけられていたのかを検討する。以上の検討を終えた後、昨年度の研究成果と総合することで、学説における慣習国際法理論の変容過程の解明を目指すこととしたい。

今年度は、(1)黙示の合意論はどのような状況の下で提示されるに至ったのか、(2)二要件論はどのような状況の下で提示されるに至ったのか、という2つの問への回答を通して、従来の「黙示の合意論」及び国内私法における慣習法論の類推に基づく「二要件論」(国家慣行+法的確信opinio juris)という当時の慣習国際法理論について、後者が支配的になる過程を解明することを計画していたが、両者ともに一定の回答を導き出すことができたため「おおむね順調に進展している」と評価できる。1873年に設立された万国国際法学会は、その最初の検討課題の1つとして「東洋諸国への国際法の適用」を選択した。本議題の報告者を務めた英国のトゥイス(T. Twiss)は、1880年に学会に提出した予備報告書において、「条約規定を遵守する義務に関する東洋人民の考えは、キリスト教人民のそれと実質的に異ならない」と記した上で、実行の中に困難がある旨を指摘し、その困難の解決の必要性を訴えた。以上のような事実に着目した上で、本予備報告書の準備に際して作成された質問票(questionnaire)やその後1883年9月のミュンヘン大会における決議採択までの議論過程を明らかにすることで、当時の具体的な問題状況を把握し、かかる実践的な問題において慣習国際法論がどのように位置づけられていたのかを検討する。以上の検討を終えた後、昨年度の研究成果と総合することで、学説における慣習国際法理論の変容過程の解明を目指すこととしたい。