hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経変性疾患の病態解明に関する研究

平成9年,10年度の科研費の補助を受け,筋萎縮性側索硬化症(ALS),脊髄小脳変性症(SCA),アルツハイマー病などの神経変性疾患について多面的な研究を行い,以下の成果を得ることができた.(1)今回新たにMG160とhuman trans-Golgi networkに対するポリクロナール抗体を作成した.これらの抗体はホルマリン固定パラフィン切片に応用可能であり,現在種々の神経変性疾患の剖検脳で神経細胞のGolgi装置の形態的変化を検討中である.(2)16ALS剖検脳のBetz細胞でもGolgi装置のfragmentationがみられること(ALSで13.2%,非ALSで0.6%)を初めて明らかにした.その出現頻度は脊髄前角細胞での出現頻度に比して軽度であった.(3)ALSに特徴的な封入体であるBunina小体は抗Golgi装置関連抗体で免疫組織学的に陰性であることを報告した.(4)30例のALS剖検脳を検討し,痴呆を伴うALSの側頭葉病変の特徴を明らかにした.(5)英国のInstitute of Pschiatryに保存されていた72例のALS剖検例を検討した結果,英国においても痴呆を伴うALSが稀ならずみられることを明らかにした.(6)髄液中のタウとアミロイドβ蛋白の測定がアルツハイマー病の診断マーカーとして使用可能なことを多施設共同研究で明らかにした.(7)群馬県における13例のSCA2のCAG延長と臨床徴候を解析した.(8)16例のSCA6のCAG延長と臨床徴候との関連を明らかにした.(9)コドン291の欠失を示す副腎白質ジストロフィーの1家系の詳細を報告した.(10)高CK血症,高γ-グロブリン血症を伴うFriedreich病類似疾患の1家系を報告した.(8)活性化されたミクログリアはフェリチンの存在下で鉄依存性の脂質過酸化反応を起こすことを明らかにした.平成9年,10年度の科研費の補助を受け,筋萎縮性側索硬化症(ALS),脊髄小脳変性症(SCA),アルツハイマー病などの神経変性疾患について多面的な研究を行い,以下の成果を得ることができた.(1)今回新たにMG160とhuman trans-Golgi networkに対するポリクロナール抗体を作成した.これらの抗体はホルマリン固定パラフィン切片に応用可能であり,現在種々の神経変性疾患の剖検脳で神経細胞のGolgi装置の形態的変化を検討中である.(2)16ALS剖検脳のBetz細胞でもGolgi装置のfragmentationがみられること(ALSで13.2%,非ALSで0.6%)を初めて明らかにした.その出現頻度は脊髄前角細胞での出現頻度に比して軽度であった.(3)ALSに特徴的な封入体であるBunina小体は抗Golgi装置関連抗体で免疫組織学的に陰性であることを報告した.(4)30例のALS剖検脳を検討し,痴呆を伴うALSの側頭葉病変の特徴を明らかにした.(5)英国のInstitute of Pschiatryに保存されていた72例のALS剖検例を検討した結果,英国においても痴呆を伴うALSが稀ならずみられることを明らかにした.(6)髄液中のタウとアミロイドβ蛋白の測定がアルツハイマー病の診断マーカーとして使用可能なことを多施設共同研究で明らかにした.(7)群馬県における13例のSCA2のCAG延長と臨床徴候を解析した.(8)16例のSCA6のCAG延長と臨床徴候との関連を明らかにした.(9)コドン291の欠失を示す副腎白質ジストロフィーの1家系の詳細を報告した.(10)高CK血症,高γ-グロブリン血症を伴うFriedreich病類似疾患の1家系を報告した.(8)活性化されたミクログリアはフェリチンの存在下で鉄依存性の脂質過酸化反応を起こすことを明らかにした.1,171個のアミノ酸からなるMG160の3箇所と,human trans-Golgi networkの18-35アミノ酸残基(TGN46)に対するポリクロナール抗体を作成し,ALS例と非ALS例の腰髄および中心前回のパラフィン切片を免疫染色した.(1)今回新たに染色性の良好な二種類(MG160の590-605アミノ酸残基とTGN46)の抗体を作成できた.(2)ヒト脊髄に対する染色性は,Gonatasらが作成した抗MG160抗体とほぼ同様であった.(3)ALS前角細胞では,この二種類の抗体でもGolgi装置のfragmentationが高頻度に認められ,さらにGolgi装置の数の減少や分布の異常も観察された.(4)ALS前角内の小型神経細胞および長期生存例の残存する前角神経細胞のGolgi装置は比較的よく保たれる傾向を示した.(5)Bunina小体はこの二種類の抗体でも陽性所見は得られなかった.(6)ALSの一次ニューロンである中心前回Betz細胞のGolgi装置の検討では,ALS例・非ALS例の中心前回のBetz細胞のGolgi装置は脊髄前角細胞と同様に顆粒状紐状に明瞭に染色された.非ALS10例ではGolgi装置のfragmentationの頻度は約0.6%と極めて少なかった.

17ALS例では,症例毎に差はあるものの,全Betz細胞の約15%にfragmentationを認め,その出現頻度は脊髄前角細胞に比して軽度であった.今回の検討より,ALS例のBetz細胞でも脊髄前角細胞と同様にGolgi装置の異常が生じていることが確認できた.筋萎縮性側索硬化症(ALS),脊髄小脳変性症(SCA),アルツハイマー病などの神経変性疾患について多面的な研究を行い,以下の成果を得ることができた.(1)16ALS剖検脳のBetz細胞でもGolgi装置のfragmentationがみられること(ALSで13.3%,非ALSで0.6%)を初めて明らかにした.その出現頻度は脊髄前角細胞での出現頻度に比して軽度であった.(2)ALSに特徴的な封入体であるBunina小体は抗Golgi装置関連抗体で免疫組織学的に陰性であることを報告した.(3)30例のALS剖検脳を検討し,痴呆を伴うALSの側頭葉病変の特徴を明らかにした.(4)英国のInstitute of Pschiatryの保存されていた72例のALS剖検例を検討した結果,英国においても痴呆を伴うALSが稀ならずみられることを明らかにした.(5)髄液中のタウとアミロイドβ蛋自の測定がアルツハイマー病の診断マーカーとして使用可能なことを多施設共同研究で明らかにした.(6)群馬県におけるSCA2のCAG延長と臨床徴候を解析した.(7)SCA6のCAG延長と臨床徴候との関連を明らかにした.(8)コドン291の欠失を示す副腎白質ジストロフィーの1家系の詳細を報告した.(9)高CK血症,高γ-グロブリン血症を伴うFriedreich病類似疾患の1家系を報告した.(10)活性化されたミクログリアはフェリチンの存在下で鉄依存性の脂質過酸化反応を起こすことを明らかにした.
一酸化窒素による網膜神経節細胞のアポトーシス抑制と正常眼圧緑内障治療への応用

申請者は平成17年度において次の実験を行い以下の結果を得た。ラット褐色細胞腫から確立され、血清非添加培地でアポトーシスを誘導できるPC12細胞を、血清を添加したRPM1640培地で培養し、血清非添加培地に交換したのち0,01、0.1、1または10μMのニプラジロールまたは一酸化窒素供与能力を持たず一酸化窒素供与の影響を除くことができる脱ニトロ・ニプラジロールを添加して12、24、48時間培養して、血球計算盤を用いて生存細胞数を計数した。さらに染色体DNAを抽出しアガロースゲル電気泳動でラダー形成を確認してアポトーシスの程度を検討した。また細胞からRNAを抽出し、Bax、Bcl-2、Fas、FasL、Caspase-1、2、3と9、P53とSmac/DIABLOの遺伝子発現を定量的リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応法(リアルタイムPCR)によって調べた。PC12細胞を血清非添加培地で培養すると48時間でアポトーシスが誘導され細胞死がみられたが、0.1と1μMのニプラジロールによって細胞死が抑制された。脱ニトロ・ニプラジロールは細胞死を抑制しなかった。染色体DNAのラダー形成は12または24時間でははっきりしないが、48時間では2%のアガロースゲル電気泳動で約300から1200塩基対の間で明らかに見られ、0.1または1μMのニプラジロールによって抑制された。脱ニトロ・ニプラジロールは、DNAラダー形成を抑制しなかった。Bax、Caspase-9とSmac/DIABLOの遺伝子発現は血清非添加培地で12時間後に上昇し、ニプラジロールを添加することによって低下した。脱ニトロ・ニプラジロールでは低下しなかった。ニプラジロールは一酸化窒素供与を介したメカニズムでPC12細胞における血清非添加培地でのアポトーシスを抑制し、アポトーシス関連分子の遺伝子発現を制御することが示された。
染色体微細構造異常による神経発達障害の成因解明

ヒトゲノムの一次構造情報を応用したマイクロアレイや次世代シーケンス技術が広まってきたことによって、微細なゲノム構造異常を同定することが可能となった。特に、神経発達障害患者においては、このようなゲノム構造異常がしばしば発症に関わっていることが明らかになってきた。中には、リピート配列やレトロトランスポゾン挿入等、一次構造の特徴から生じたものもあるが、今のところメカニズムが明らかでない複雑なゲノム構造異常も存在する。今年度、原因不明の神経発達障害患者について、マイクロアレイ染色体検査や次世代シーケンスによってゲノムコピー数を解析することによって、様々な染色体構造異常を明らかにしてきた。それらの異常は、デジタルPCRで確認する系を確立させた。ただ、それだけでは、切断端がどの部分と融合して染色体を再構成しているかを明らかにすることができない。これまでにすでに明らかにしてきた複雑な染色体構造変化が予想されるサンプルについて、切断端が融合していると予想される融合先の配列にプライマーを設計してlong PCRを試みるも、まったく増幅が得られなかった。デジタルPCRで切断端ギリギリまで解析を試みたが、そのような領域にはrepeat配列が多く存在しており、プライマーの設計すらうまくできなかった。そこで、Nanopore sequenceによるlong sequenceを行うこととした。1回のRunで5 Gb程度のデータが得られたが、全ゲノムを網羅するためには最低でも30 Gbが必要である。そのため、現在データを積み増ししているところである。必要なデータが得られ次第、アノテーションを行い、切断端を同定する計画である。現在データ収集が中途の段階であり、切断端の同定には至っていないが、概ね順調に研究を進めることができている。計画通り、データ収集を進め、データが揃った段階でアノテーションなど、配列の分析に入る。それによって切断端の確認と、構造異常の同定ができるものと考える。当初予定していた解析が年度内に終了できなかったが、想定の範囲内であり、全体的な研究の進捗に遅れは生じていない。
1p36のBACコンティグを用いた神経芽腫の癌抑制遺伝子の探索とその臨床応用

神経芽腫において1番染色体短腕(1p)のp35-36領域をカバーするBACコンティグにより、神経芽腫の細胞株(NB-1)にホモ欠失領域を検出し、7個の既知の遺伝子(E4,KIF1B, SCYA5,PGD, Cortistatin, DFF45,PEX14)を同定した。これらの遺伝子のうちキネシンfamilyであるKIF1B-βのゲノム構造を決定した。またPCR-SSCP法による変異解析とヘテロ接合体欠失(LOH)解析から、KIF1B-βは神経芽腫の候補癌抑制遺伝子の可能性は低いと考えられた。またCharcot-Marie-Tooth disease 2A型(CMT2A)の患者検体でミスセンス変異を検出し、この遺伝子がCMT2Aの原因遺伝子であることをみいだした。さらにKIF1B-βのmajor isoformであるKIF1B-αを単離し、神経芽腫で検討したが、神経芽腫の原因遺伝子ではないことを明らかにした。NB-1株でホモ欠失がみられたDFF45は、神経芽腫において腫瘍特異的な多数のisoformがみられたが、神経芽腫の癌抑制遺伝子の可能性は低いと思われた。今年度は1p36に座位するcaspase 9の検討を行ったが、変異はみられず、神経芽腫の原因遺伝子ではないと思われた。さらにCancer arrayを用いて神経芽腫の進展例と早期例で発現プロファイルの検討を行い、発現パターンに差のみられる遺伝子を約500個検出した。Real-time PCR法を用いて発現に差のみられた遺伝子の定量解析を行ったところ、API2、p19INK4Dは非進展例で高発現が認められ、BAF60cは進展例で高発現が認められた。これらの遺伝子は神経芽腫の新たな予後因子として臨床的に応用できる可能性が示唆された。神経芽腫において1番染色体短腕(1p)のp35-36領域には、発生・進展に重要な役割を果たす遺伝子が座位すると推測される。この領域の大部分をカバーするBACコンティグを作成し、これを用いて神経芽腫25細胞中1株(NB-1)に約480kbのホモ欠失領域を同定し、この領域より7個の既知の遺伝子(E4, KIF1B, SCYA5, PGD, Cortistatin, DFF45, PEX14)、3つのEST、2つのマイクロサテライトマーカーを同定した。これらの遺伝子のうちキネシンfamilyであるKIF1B-β遺伝子のcDNAとexon-intron配列を決定し、少なくとも47exonを有することをみいだした。この遺伝子は一部の神経芽腫の新鮮腫瘍で発現の低下がみられた。またpolymerase chain reaction(PCR)-single strand conformationpolymorphism(SSCP)による変異解析ではframe shift mutationはみられなかったが、3カ所でmissense mutationが、2カ所で遺伝子多型みられた。またヘテロ接合体欠失(LOH)は16例中6例(38%)にみられた。これらのことより、KIF1B-β遺伝子は神経芽腫の候補癌抑制遺伝子の可能性は低いと考えられた。さらに家系のマッピングより、Charcot-Marie-Tooth disease 2A型(CMT2A)の原因遺伝子が1p36.2にあることが推測されたので、CMT2Aの患者検体を用いてPCR-SSCP法で変異を検討したところ、motorドメインにmissense mutationを検出した。この変異により、この遺伝子のin vitroでのATP活性の低下が認められた。

またこの遺伝子のヘテロ欠失マウスは生後CMT2A同様の神経症状がみられ、この遺伝子がCMT2Aの原因遺伝子であることをみいだした。さらにKIF1B-α遺伝子を単離し、神経芽腫で検討している。DFF45はcaspase 3がアポトーシスを誘導するのに必要な蛋白である。NB-1株でホモ欠失がみられたので、神経芽腫でreverse transcriptase(RT)-PCRによる発現の、PCR-SSCP法による変異の検討を行ったが、発現の減弱や変異はみられず、alternative splicingによると思われる多数のisoformがみられた。これらのisformは腫瘍のみにみられるものもあった。これらのことよりDEF45遺伝子は神経芽腫の癌抑制遺伝子の可能性は低いと思われた。神経芽腫において1番染色体短腕(1p)のp35-36領域をカバーするBACコンティグにより、神経芽腫細胞株(NB-1)にホモ欠失領域を検出し、7個の既知の遺伝子(E4,KIF1B, SCYA5,PGD, Cortistatin, DFF45,PEX14)を同定した。これらの遺伝子のうちキネシンfamilyであるKIF1B-βのゲノム構造を決定した。この遺伝子は一部の神経芽腫の新鮮腫瘍で発現の低下がみられた。またpolymerase chain reaction (PCR)-single strand conformationpolymorphism (SSCP)による変異解析とヘテロ接合体欠失(LOH)解析により、KIF1B-βは神経芽腫の候補癌抑制遺伝子の可能性は低いと考えられた。さらにKIF1B-βのmajor isoformであるKIF1B-αを単離し、神経芽腫で検討したが、変異はみられず、神経芽腫の原因遺伝子ではないことを明らかにした。NB-1株でホモ欠失がみられたDFF45は、神経芽腫において、腫瘍特異的な多数のisoformがみられたが、神経芽腫の癌抑制遺伝子の可能性は低いと思われた。今年度は1p36に座位するcaspase 9の検討を行ったが、変更はみられず、神経芽腫の原因遺伝子ではないと思われた。さらにCancer arrayを用いて神経芽腫の進展例と早期例で発現プロファイルの検討を行い、発現パターンに差のみられる遺伝子を約500個検出した。Real-time PCR法を用いて発現に差のみられた遺伝子の定量解析を行ったところ、API2、p19INK4Dは非進展例で高発現が認められ、BAF60cは進展例で高発現が認められた。これらの遺伝子は神経芽腫の新たな予後因子として臨床的に応用できる可能性が示唆された。
ロシア帝国のアムール川流域進出における極東情勢と欧州秩序、1847-1860年

本研究は、ロシアの19世紀半ばの極東進出にかかわる外交政策を分析することにより、東アジアおよび欧州の国際関係理解を深めることを目的とする。本年度開始までに、研究に必要な資料および関連文献の中核部分は、ロシアおよびイギリスなどで収集を終えており、本年度では、分析・理解に必要な、最近の関連研究を主に収集した。イルクーツクの文書館での史料収集を予定していたが、事前の調査では十分な成果を見込めることが確信できなかったため、入手済の刊行文献の分析で代えることとし、予算は図書購入などに振り替えた。主な成果は、本研究を単行本として刊行する骨格が整ったことである。構成は、まず問題設定や、史料などの背景説明から入り、ロシアにとって重大な欧州国際関係でのロシア外交の動きを論じ、ムラヴィヨフによる極東進出政策推進、プチャーチンとイグナチエフによるそれぞれの現地「仲介」外交を詳述したのち、分析的に結論を述べる、というものである。このうち一部は発表あるいは報告済であり、一部は平成19年中に『ロシア史研究』誌に投稿した(現在審査中)。これを京都大学人間・環境学研究科に博士論文として提出し、学位を得た。審査の過程で得た指摘などに基づき、現在刊行の準備を進めている。このほか、依頼を受けて、20世紀および現代のロシア政治に関わる論文を執筆し、共著にて発表した。このことにより、時代間の比較の観点から、さらに19世紀のことがらに関する視野・理解が深まった。ロシア外交は、時代を通じて、世界の列強に対峙する強い意志を持ち、アジアに対しては国益を主張して要求を出す一方、他の欧米とは異なる穏健な中間的態度を示すのである。
ファウラー位で機械浴中の高齢者の心臓自律神経活動の経時的変化と季節性変動の検討

入浴は日本人にとって欠かせない日常生活行動であるが,生体にとっては負荷となることが知られている.自由行動下で入浴中の高齢者の心拍数と自律神経指標の変化を,防水型ホルター心電計を用いて検討した.自由行動下の入浴動作中,高齢者では,心拍数の低下傾向を認めた.これは,先に我々が報告した統制条件下での温水頸下浸水時の心拍数変化と同様の結果であった.心拍数低下は,心拍変動解析の結果から,心臓交感神経活動の活性作用が弱いことが一因であると考えられた.入浴は日本人にとって欠かせない日常生活行動であるが,生体にとっては負荷となることが知られている.自由行動下で入浴中の高齢者の心拍数と自律神経指標の変化を,防水型ホルター心電計を用いて検討した.自由行動下の入浴動作中,高齢者では,心拍数の低下傾向を認めた.これは,先に我々が報告した統制条件下での温水頸下浸水時の心拍数変化と同様の結果であった.心拍数低下は,心拍変動解析の結果から,心臓交感神経活動の活性作用が弱いことが一因であると考えられた.入浴は日本の重要な生活習慣の一つであるが,生体にとっては大きな負担となることが知られている.入浴中の死亡事故は国内で数多く報告されており,安全な入浴方法の検討が求められている.本研究は,医療・福祉施設で一般に行われているファウラー位による機械浴中の心臓自律神経活動の経時的変化,季節性変化について,非侵襲的、な検査方法である心拍変動解析を用いて評価し,生体変化に基づく安全な入浴援助方法の検討を行うことを目的としている.平成20年度は,以下の予備的な検討を行った.1.文献検討では,医学中央雑誌並びにPubMedの検索ホームページを用いて入浴関連の文献検索を行い,検討した.心拍変動解析を用いた検討は近年盛んに行われているが,入浴中の経時的な連続変化について検討しているものはほとんど無く,本研究で得られるデータは入浴中の生体反応を理解する上で重要であると思われた.2.今回導入した本体を浸水可能なデジタルポルター記録器について,浴室内での安全な使用方法,記録中の被験者の不自由さを最小限にする装着の工夫,心電図記録に対する入浴援助の影響について検討した.結果,通常の入浴援助動作では記録が乱れることはなく,施設での入浴援助中の記録が可能と考えられた.3.男性の同一被験者1名に対して,同一条件(湯温,浸水時間,浸水姿勢)下で,6回記録を行い,得られた心拍変動データの整合性を検討した,結果,いずれの記録からも,同等の傾向を有する心拍変動データが得られた.平成21年度は,本予備検討を基に,データの採取と検討を行っていく.入浴は日本の重要な生活習慣の一つであるが,生体にとっては大きな負担となることが知られている.入浴中の死亡事故は国内で数多く報告されており,安全な入浴方法の検討が求められている.平成21年度は,昨年度の基礎的な検討を踏まえ福祉施設での入浴中の心拍変動データ評価を予定していたが,依頼施設より一般高齢者での評価がまだ不十分であるとの指摘を受けたため,自宅での自由行動下における入浴動作中の心拍数・心臓自律神経活動の変化を一般高齢男性で検討した.対象は,67歳から80歳の自宅で生活する入浴行動が自立した高齢男性4名.防水型ホルター心電計(FM-180,フクダ電子株式会)を用いて連続心電図記録を行った.入浴は,被験者の自宅の浴室にて,平素の入浴手順,入浴時間で行うよう教示した.得られた心電図記録よりRR間隔データを抽出後,心拍変動解析ソフト(MemCalc/Win ver. 2.0諏訪トラスト)を用いて,心臓副交感神経活動を反映する高周波成分(HF),心臓交感神経活動の指標である低周波成分(LF)とHFの比(LF/HF)を算出した.結果,60歳代被験者を除き,他の3名では浴室入室後,僅かに心拍数増加を認めた後,心拍数の減少傾向を認めた.また,70歳代被験者では,浴室入室後初期の心臓交感神経活動の活性が弱い傾向を認めた.数分間で20拍/分以上の心拍数変動を生じた被験者も認められた.以上の結果から,自由行動下の入浴動作中も,高齢者では,心拍数の低下傾向を認めた.これは,先に我々が報告した統制条件下での温水頸下浸水時の心拍数変化と同様の結果であった.心拍数低下は,心臓交感神経活動の活性作用が弱いことが一因であると考えられた.高齢者や循環薬剤服用患者では,温水浸水時だけでなく,一連の入浴動作中も,循環不全による入浴事故発生に注意が必要と考えられた.
ユビキチン化による高次クロマチン構造形成機構の解明

ヘテロクロマチンは発生や疾患におけるエピジェネティックな遺伝子発現抑制など、様々な生命現象に重要な役割を果たす最も代表的な高次クロマチン構造であるが、その形成の仕組みの詳細は未だに不明な点が多い。本研究により、申請者は哺乳類でもヘテロクロマチン形成にノンコーディングRNA(ncRNA)が関与していることを明らかにし、保存性の高い因子であるRNAポリメラーゼIIの構成因子がCul4ユビキチンリガーゼによってユビキチン化修飾されることを見出した。このヘテロクロマチン形成にユビキチン化が関与することを示唆する知見が2004年に発表されたが、ユビキチン化修飾をうけるヘテロクロマチン因子は現在に至るまで不明なままである。さらに、最近ではユビキチン化修飾は関係ないのではないかという議論までが起こっている。本研究では、申請者が見出したユビキチン化修飾を受けるヘテロクロマチン関連因子に注目し、ヘテロクロマチン形成におけるユビキチン化が果たす役割の解明を目的としている。本年度は、前年度までに見出したヘテロクロマチン関連ユビキチン化タンパク質の候補25種類の中からCul4ユビキチンリガーゼの構成因子をコードするrik1やclr4を破壊した約200株を作製し、Cul4ユビキチンリガーゼによってユビキチン化されるタンパク質の同定を行った結果、2種類のタンパク質を基質の候補として見出した。そのうちの一つはRNAポリメラーゼII複合体の構成因子であった。ヘテロクロマチン領域に限らず転写を担っているRNAポリメラーゼIIだが、ヘテロクロマチン領域での活性の制御については不明なままである。今後、ヘテロクロマチン領域でのユビキチン修飾によるRNAポリメラーゼIIの転写活性の制御について検討したい。本研究では、ヘテロクロマチン形成におけるユビキチン化が果たす役割の解明を目的とした。まず、先行する研究より申請者が構築した迅速にユビキチン化タンパク質を同定するGST-Ub法から見出したタンパク質のユビキチン化の検証を行い、ユビキチン化タンパク質25種類を同定した。更に25種類の中からCul4ユビキチンリガーゼの構成因子をコードするrik1やclr4を破壊した約200株を作製し、Cul4ユビキチンリガーゼによってユビキチン化されるタンパク質の同定を行った結果、RNAポリメラーゼIIの構成因子を基質の候補として見出した。しかし、哺乳類ではヘテロクロマチン領域から転写されるRNAの存在は報告されているが、何によって転写されているかや、その機能も明らかになっていない。そこで、最終年度はCul4ユビキチンリガーゼおよびRNAポリメラーゼIIが哺乳類のヘテロクロマチン形成に関与しているか検証する過程で、Cul4ユビキチンリガーゼ構成因子のヒストンメチル化酵素Clr4のマウスホモログSuv39h1がRNA結合能を有することを見出した。今後、これにユビキチン化が関与しているかを明らかにしていく予定であるが、当該年度に実施した研究によって、哺乳類でもヘテロクロマチン形成にncRNAが関与していることを明らかにし、保存性の高い因子のユビキチン化修飾を見出したことは、ヘテロクロマチン形成機構の解明のブレークスルーになると予想される。本研究では、申請者が見出したユビキチン化修飾を受けるヘテロクロマチン関連因子に注目し、これらのタンパク質のユビキチン化部位を置換した変異株を作製してヘテロクロマチン形成への影響を検討することで、ヘテロクロマチン形成におけるユビキチン化が果たす役割の解明を目的としている。本年度は理化学研究所吉田化学遺伝学研究室の未発表の分裂酵母全タンパク質が受ける翻訳後修飾のデータと、先行する研究より構築した迅速にユビキチン化タンパク質を同定するGST-Ub法から見出した複数タンパク質のユビキチン化が本当にユビキチン修飾を受けるか、変性条件下で各タンパク質を精製し、結合タンパク質を除去した後、抗GST抗体で検出を試みることで検証した。

さらに、同定したタンパク質のE3ユビキチンリガーゼがCul4-Rik1-Clr4複合体であるかどうかを検証するため、rik1, clr4各破壊株を作製し、各タンパク質のユビキチン化レベルが変動するかどうかを検討し、候補と考えられるタンパク質を見出している。Cul4ユビキチンリガーゼの構成因子Rik1やClr4によって制御されている、タンパク質を見出すことができたため。当初予定していたCul4ユビキチンリガーゼの構成因子をコードするrik1やclr4を破壊した約200株の作製と各タンパク質のユビキチン化レベルの変動を検出するスクリーニングを終え、Cul4-Rik1の基質と考えられるタンパク質を見出すことができたため。動物細胞では、Cul4ユビキチンリガーゼ複合体によってヘテロクロマチン形成が制御されているか未だ不明なままである。そこで、本研究で明らかにしたCul4-Clr4/Suv39H1によって制御されるRNAポリメラーゼII複合体の構成因子のユビキチン化修飾が動物細胞でも保存されているかヒトおよびマウス細胞株を用いて、検討する。また、RNAポリメラーゼIIの構成因子のユビキチン化部位をMS/MSを用いて同定した後、その変異体を作製して、クロマチン免疫沈降法(ChIP)により各タンパク質のヘテロクロマチン局在やヒストンH3 K9のメチル化の有無を確認することで、ユビキチン化がヘテロクロマチンへのターゲティングに関与しているかどうかを検証する。さらに、GFPを融合したmajor satelliteをFlp-inシステムを利用してゲノムに挿入して、Cul4ユビキチンリガーゼ複合体をshRNAを用いてノックダウンすることにより、ヘテロクロマチン形成に影響を与えるか検討する。前年度までに同定したCul4によってユビキチン化されるタンパク質がどのように高次クロマチン構造形成に関与しているかを解明する。まず、in vitroのユビキチン化アッセイを行い、直接Cul4-Rik1複合体によってユビキチン化されていることを証明する。その後、実際に同定したタンパク質のユビキチン化が、ヘテロクロマチン構造形成に関わる可能性を調べるため、同定した各タンパク質のユビキチン化部位を置換した株を作製し、ヘテロクロマチン領域であるセントロメアや接合型遺伝子座にマーカー遺伝子を挿入した株と掛け合わせを行い、その発現抑制(サイレンシング)が解除されるかどうかを検討する。この実験によりヘテロクロマチン構造形成に関与していることが示唆された場合、各変異株を用いて、クロマチン免疫沈降法(ChIP)により各タンパク質のヘテロクロマチン局在やヒストンH3 K9のメチル化の有無を確認することで、ユビキチン化がヘテロクロマチンへのターゲティングに関与しているかどうかを検証する。該当なし現在注目している標的タンパク質はポリユビキチン化されることから、SDS-PAGEで幅広い範囲の分子量をカバーする必要性や検出する抗体が必要になるため、次年度の研究費を使用してグラジエントゲルおよび抗体を購入する予定である。さらに、ポリユビキチン化の検出感度を上げるために、プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブを購入する予定であり、この薬剤は抗がん剤として認可されていることもあり、高価である。
遅発性神経細胞死と低体温の保護作用.-虚血後の遺伝子発想からみた検討-

前年度の研究により,低体温は海馬CA1一過性脳虚血後の神経細胞死を抑制することが明らかとなった.本年度は脳虚血後の即初期遺伝子産物およびストレス蛋白HSP70の発現に対する低体温の影響を検討し,低体温の神経細胞死抑制効果と併せて考察した.またこれらの遺伝子発現に関与する細胞内情報伝達系の脱燐酸化酵素の発現をmRNA,蛋白レベルで虚血負荷前後で検討した。Fosは低温群と常温群で発現に有意差は認められなかったが,Junは常温群では海馬CA1での発現が減弱していたのに対して,低温群では発現が増強しており,細胞死の抑制とJunの発現の関与が推察された.2.低体温のHSP70発現に対する影響常温群では海馬CA3と歯状回にHSP70の発現を認めたが,低温群では発現が消失していた.さらにautoradiographyを用いて蛋白代謝を検討したところ,低温群では蛋白代謝が早期に回復しており,低体温のストレス蛋白発想消失のメカニズムは,翻訳レベルの障害ではなく,低体温自体がストレス反応を減弱し転写レベルでの発現が減弱しているためと考えられた.3.虚血後の脱燐酸化酵素(PP)の発現PPのsubtypeによる検討を行った.Northern blotでは虚血後のPP1α、PP1γの発現が増加していたが,PP1δ、PP2Aは不変であった.Western blotでは,虚血後PPの各subtypeの発現は不変,あるいは減少していた.これは虚血後の翻訳障害がmRNAと蛋白レベルでの発現解離に大きく影響しているためと考えられた.これらの実験により、低体温は虚血に対して遺伝子レベルでストレス反応自体を減弱する一方,神経細胞の生存に関わる即初期遺伝子Junの発現を増加させ細胞死を抑制すると考えられた.これらの遺伝子は細胞内情報伝達系により抑制されているが,この系のkey enzymeの一つである脱燐酸化酵素の発現に対する虚血の影響を初めて報告した.今後低体温の脱燐酸化酵素の発現に対する影響を検討する予定である.本年度は即初期遺伝子産物および脱燐酸化酵素の脳虚血後の発現と低体温の虚血に対する保護作用を検討し、さらに予備実験として低体温が遺伝子発現に及ぼす影響を検討した。(1)即初期遺伝子産物ならびに脱燐酸化酵素(PP)の発現Fos,Junの免疫組織学的検討の結果、Fosは2分虚血後1時間から3時間にかけて海馬歯状回、CA3に発現したが、CA1には発現しなかった。5分虚血でも1時間から6時間にかけて同様の発現をした。Junは2分虚血後3時間から6時間にかけて海馬歯状回、CA3に発現し、興味深い事にCA1で6時間後に発現した。5分虚血では3時間から12時間にかけて海馬歯状回、CA3で同様の発現をしたが、CA1では発現しなかった。この結果、FosはCA1では発現せず、細胞死との関連は少ないと考えられた。一方Junは細胞死を免れる2分虚血でCA1に発現していた事により、逆に細胞の生存に必要な遺伝子である可能性が示唆された。(2)虚血中低体温の保護作用の組織学的検討5分間前脳虚血において、虚血中35°Cに維持した低体温群ではCA1における神経細胞死の抑制効果が認められた。(3)低体温が即初期遺伝子産物発現に及ぼす影響Fos,Junの発現に関して、5分間の前脳虚血中の低体温負荷を行った。その結果、本来5分虚血ではCA1においてはJunの発現は認められなかったが、低体温負荷後では発現が認められた。以上の結果より、低体温は海馬CA1における神経細胞死を抑制する。この機序に即初期遺伝子産物Junの発現が関与していると考えられた。またPPはsubtypeによって虚血後の発現に差があり、今後免疫組織学的検討を含め、さらに検討が必要と考えられた。Fosは低温群と常温群で発現に有意差は認められなかったが,Junは常温群では海馬CA1での発現が減弱していたのに対して,低温群では発現が増強しており,細胞死の抑制とJunの発現の関与が推察された.2.低体温のHSP70発現に対する影響常温群では海馬CA3と歯状回にHSP70の発現を認めたが,低温群では発現が消失していた.さらにautoradiographyを用いて蛋白代謝を検討したところ,低温群では蛋白代謝が早期に回復しており,低体温のストレス蛋白発想消失のメカニズムは,翻訳レベルの障害ではなく,低体温自体がストレス反応を減弱し転写レベルでの発現が減弱しているためと考えられた.3.虚血後の脱燐酸化酵素(PP)の発現PPのsubtypeによる検討を行った.Northern blotでは虚血後のPP1α、PP1γの発現が増加していたが,PP1δ、PP2Aは不変であった.Western blotでは,虚血後PPの各subtypeの発現は不変,あるいは減少していた.これは虚血後の翻訳障害がmRNAと蛋白レベルでの発現解離に大きく影響しているためと考えられた.

これらの実験により、低体温は虚血に対して遺伝子レベルでストレス反応自体を減弱する一方,神経細胞の生存に関わる即初期遺伝子Junの発現を増加させ細胞死を抑制すると考えられた.これらの遺伝子は細胞内情報伝達系により抑制されているが,この系のkey enzymeの一つである脱燐酸化酵素の発現に対する虚血の影響を初めて報告した.今後低体温の脱燐酸化酵素の発現に対する影響を検討する予定である.
非対称、非線形単分子電気特性を示す有機・無機混成分子系の合成と機能集積化

整流性、負の微分抵抗など、種々の非線形・非対称な電流-電圧単分子特性を示す分子系の研究を行った。単一分子電導度が構成部分の透過確率の積で表すことが可能である事を明らかにした。また、ポリオキソメタレート分子の中で、一定電圧下でのコンダクタンスの変化が大きなダイナミクス信号を発生する系を見出し、その現象のモデル化を行った。このモデルに基づき、リザーバー計算を行ったところ、入力信号を効率よく学習できることが明らかとなった。(1)ポルフィリンアレイは、光応答性や電気伝導性など、様々な機能が期待されている分子群である。ポルフィリンアレイのエネルギー準位配列を設計することで、整流性やメモリ機能など多様な単一分子電気特性を発現するのではないかと考えた。これまでにポルフィリンアレイの合成方法は多数提案されているが、今回必要とされるような複雑なポルフィリンアレイを合成することは未だに困難であるため、より優れた合成法が求められる。本研究では、逐次合成による非常に設計性に優れたポルフィリンアレイの合成法を開発した。この方法を用いて多彩な配列を有するポルフィリンアレイの合成し、それらについて光・電気特性測定、単一分子電気測定を行った。(2)MCBJ法による単一分子の電気特性計測装置を開発し、MPorIm単一分子の電気特性を測定した。ポルフィリンの中心金属(M)として亜鉛またはロジウム(M=Zn, Rh)を用い、金電極間架橋を可能にするために分子末端にヒドロキシル基を配した。まずMCBJ法により室温減圧下で分子吸着した電極の破断を複数回行い、その際の電気伝導度の変化を測定することで、統計的に単一分子のコンダクタンスを求めた。続いて単一分子架橋時の電流電圧(I-V)特性について測定を行ったところ、得られたI-V曲線は非対称であり、MPorImが単一分子ダイオードとして働くことが確認された。また、プラスマイナス1.5V時の電流量の比を整流比と定義したとき、亜鉛体の整流比は27であったが、ロジウム体の整流比は8であり、ポルフィリンの中心金属を換えることで分子の整流特性が変化することが示された。この整流比はSWNT架橋MPorImの測定結果と一致しており、単一分子ダイオードの配線にSWNTを用いた場合であっても、分子由来の電気特性を示すことが確認された。1.単一分子磁石(SMM)の走査トンネル顕微鏡(STM)による単一分子書き込みの実現。テルビウム・ポルフィリンダブルデッカー錯体は、単一分子でスピンの反転が遅くなる単一分子磁石(SMM)としての性質を持っており、このSMM性はプロトンが付いた形の中性体では存在しないが、アニオン体では現れることを既に報告している。今回、Au(111)上にプロトンを持つオクタエチルポルフィリンダブルデッカー型錯体(OEP-DD)の単層膜を作成し、STMでの電子注入で、SMM性を有するラジカル体のOEP-DD (Radical form)を一分子単位でAu(111)上にパターニングする事に成功した。プロトンを持つ中性のOEP-DDの単分子膜の観察を行ったところ、正のサンプルバイアスでは、一様な明るさのSTM像が観測された。この中の一分子に、STMチップからサンプル側へ電子注入を行ったところ、標的とした分子のみが明るく観測された。電子注入前後で走査トンネル分光法(STS)測定を行ったところ、電子注入には、πラジカルスピンに由来する近藤共鳴が観測され、STMパルスを用いることにより、単分子レベルで表面上にSMMsをパターニングすることに成功した。2.末端にチオール基を持つ自由な配列のポルフィリンアレイを合成する手法を開発し、これらのアレイの単一分子電気特性を計測した。その結果、ポルフィリン自体がアンカーとして機能し、単一分子でスライドスイッチ的振る舞いをする分子が実現出来た。3.種々にポリオキソメタレート(POM)/有機分子複合体を合成し、その単一分子電気特性を計測した。その結果、再現性良く負の微分抵抗が観測されることがわかった。4.POM/単層カーボンナノチューブネットワークにおいて、観測されるパルス発振現象が、POM濃度により制御できることが分かった。(1)設計性に優れたポルフィリンアレイの合成法を開発した。この方法を用いて多彩な配列のポルフィリンアレイを合成し、それらの光・電気特性、単一分子電気特性を行った。末端にチオール基を持つ自由な配列のポルフィリンアレイを合成する手法を開発し、これらの単一分子電気特性を計測した。(2)メタル・ポルフィリンイミド単一分子ダイオードの電気特性を測定した。ポルフィリンの中心金属を変えることで分子の整流比が変化することが明らかになった。この整流比は、単層カーボンナノチューブに同じ分子を架橋したときとほぼ同じ値であり、混合物の単層カーボンナノチューブを用いても、間に入る分子が全体の電気特性を支配することが明らかになった。(3)テルビウム・ポルフィリンダブルデッカー錯体は、プロトンが付いた形の中性体では単一分子磁石性(SMM)が存在しないが、アニオン体では現れることを報告している。この分子は、単一分子でメモリ機能を持つ可能性があり興味深い。

今回は、平面性の高いオクタエチルポルフィリン(OEP)を用いて、このテルビウム錯体を合成し、中性体、アニオン体、ラジカル体を別途に合成して、そのバルクでの磁性とHOPG表面での自己組織化を研究した。また、Au(111)上にプロトンを持つOEPダブルデッカー型錯体の単層膜を作成し、STMでの電子注入で、SMM性を有するラジカル体を一分子単位でAu(111)上にパターニングする事に成功した。(4)種々にポリオキソメタレート(POM)/有機分子複合体を合成し、その単一分子電気特性を計測し、再現性良く負の微分抵抗が観測された。POM/単層カーボンナノチューブネットワークにおいて、観測されるパルス発振現象が、POM濃度により制御できた。実験は予定通りに進展している。現在、これまでの研究成果を論文として投稿中である。これらのことから、概ね順調に進展していると判断した。1.縮環型ポルフィリン二核テルビウムダブルデッカー錯体・単分子磁石の電子状態、磁性の解明:単分子磁石をスピントロニクスに用いるためには、磁性中心が二つ以上隣り合うことが必要であるが、単核錯体を用いると偶然分子が隣り合う必要が有り、そのような確率は低い。二核錯体を用いると、必ず2つのテルビウムイオンが隣り合うため、そのような問題が解決できる。二つ目の問題点は、伝導電子とテルビウムのスピンの相互作用が弱く極低温でしか相互作用が観測できないという点である。テルビウムのスピンと分子内の電子の相互作用をチューニングすることで、この問題を解決できないかと考えて、ジプロトン体、ジアニオン体、ジラジカル体、ジカチオン体の電子状態の化学種を合成した。この中で、ジプロトン体以外は単分子磁石になる事を確認した。ジラジカル体は、もし二つのラジカルの相互作用が弱ければ、フェルミ準位付近に非共有電子が存在することになり、同じくフェルミ準位付近に存在するテルビウムの電子との相互作用が期待できる。このジラジカル体は、ΔEが1440KのS-Tエネルギー差を持つビラジカル構造を持つ事が明らかとなった。2.ポルフィリンアレイを用いた単分子電導の研究:フェニレンでつながったポルフィリンアレイを合成し、それらの分子の単分子電導度を計測した。分子の各パーツの部分透過確率をTiと表すと全体のコンダクタンスGは、Π(Ti)と表せることを実証した。この分析から、フリーベースのポルフィリンは電導度の高いアンカーとして働く事も明らかになった。3.金属ポルフィリンを用いた単分子電導の研究:ポルフィリンは、中心金属の種類によりHOMO-LUMOを制御することが可能である。この事を利用して、一連の金属ポルフィリンを合成し単分子計測を行うことで、分子に結合している金属のフェルミ準位と、分子ー電極相互作用の大きさを実測することに成功した。研究目標は、下記の通りである。高次に集積化することで新たな機能を発現することが期待できる機能単位(例えば、整流、負の微分抵抗、メモリ効果、積分発火素子など)を単一分子で実現するための分子設計と合成を行う。それらの単一分子での電気特性を計測し、集積化することでの高機能発現をカーボンナノチューブ電極などを用いた多探針計測で実証するまた、他班からの提案に基づく機能を実現するための分子構造を設計、合成する。浅井(哲)グループとの共同研究により、それらを統合して新たな情報処理方法の可能性を探る。到達内容:
老齢期の骨格筋における退化と瞬発性トレーニングの影響

本研究は老化に伴う骨格筋を中心とする運動器系の退化に対して、瞬発性の運動がいかなる影響を及ぼすかを検討することを目的とした。実験動物として成熟期、老齢初期、老齢期と考えられる6,20,24ヶ月齢ラットを対照群として用いた。また、瞬発性運動の影響を観察するため予め8週間のジャンプ運動を行った運動等を設け対照群と比較した。老化に伴う形態的変化として筋重量を測定した結果、成熟期以降、筋は萎縮傾向を示した。しかしながら、瞬発性運動を負荷することによってその萎縮傾向が有意ではないが迎えられた。生理学的特性としての強縮張力は筋の萎縮に応じ老化に伴い低下を示した。瞬発性の運動を行うことによって強縮張力の低下は迎えられたが、老齢初期に比べて老齢期では運動の効果は少なかった。組織化学的特性である筋線維組成は、老化に伴い速筋線維の占有率が低くなった。瞬発性運動を負荷した場合、成熟期においては速筋線維の占有率が高くなり、運動様式に適応した変化が観察されたが、老齢初期、老齢期においては運動を行った場合でも筋線維組成に違いは観察されなかった。筋線維本数は老化に伴い特に速筋線維の本数が減少する傾向にあった。以上の結果から、老齢期であっても比較的早期であれば瞬発性の運動効果が期待できることが示された。昨年度の当科学研究費の補助を受けて行った老齢期で持久性運動を行った結果と比較した場合、老齢期において持久性運動の効果が比較的得られ易いと考えられるが、本年度の研究結果の分析がすべて終了してはいないため今後更に検討を加えていきたいと考えている。
競争吸着によるホタテガイ中腸腺からのカドミウム除去に関する研究

【I.吸着剤の調製】腐食物質であるフミン酸は金属イオンに対して強い錯体形成能力を有するが、水溶性であるためそのままでは吸着剤として用いることはできない。そこで、このフミン酸をカルシウム塩の沈殿とした後、330°Cで加熱する(卓上型マッフル炉使用)ことによりpH11以上、また沸騰水中においても不溶な吸着剤(IHA)を調製した。【II.中腸腺からのカドミウム脱着機構の解明】ホタテガイ中腸腺を一種の吸着剤と考え、カドミウムおよび水素イオン濃度の異なる水溶液中でのカドミウム吸着実験を行った(pHメーター使用)。報告者が提案した吸着モデルを用いた解析から、中腸腺のカドミウム吸着容量、カドミウム吸着サイトの酸解離定数および錯体形成定数を決定した。さらに、酸処理法によるカドミウム吸着実験の結果とモデルによる推算値の比較から、脱着を迅速に行うために中腸腺を細かく刻んだ場合、中腸腺中のカドミウム結合タンパク質の46%が液相に溶出することが明らかとなった。【III.「競争吸着法」によるカドミウム除去実験】本研究の最終目的である「不溶化フミン酸を用いた競争吸着法によるカドミウム除去実験」を行った。その結果、従来の酸処理法では処理液のpHをpH3付近まで下げる必要があったのに対し、「競争吸着法」では乾量基準で中腸腺の1/3以下の吸着剤(IHA)を添加することによりpH5付近で十分な除去効果が得られた。また、酸処理法では処理後、液相のカドミウムを除去するために2次処理が必要であったのに対し、「競争吸着法」ではそのほとんどがIHAに吸着され、処理液中のカドミウム濃度は排水基準値以下であった。これらの結果から、報告者が提案した「競争吸着法」は従来の酸処理法に比べ、より穏和な条件下において中腸腺および処理液からのカドミウムの同時除去が可能な優秀な方法であることが明らかとなった。また、実験結果はモデルによる推算値とよく一致しており、実操作における操作線の作成が可能であることが明らかとなった。※これらの研究結果については化学工学会第27回秋季大会において口頭発表を行った。
間接的方法を用いた、「ドラマ」がもつ心理臨床学的意味に関する研究

本研究では,人間の内的世界の表現を動きのある劇的なもの,すなわち「ドラマ」としてとらえた。そして,「ドラマ」を法則定立的,個性記述的側面から検討することにより,心理療法におけるクライエントの表現が生じるメカニズムと意味を把握する手掛かりを得ることを目的とした。「ドラマ」をとらえる手続きとして,Shneidman(1947)が開発したMake a Picture Story (MAPS)のミニチュアの舞台と人形を用いた表現を被験者に行ってもらった。まず,調査に基づいた基礎的研究を行い,「ドラマ」という現象やその生起するメカニズムを主に数量的にとらえること,そして「ドラマ」の背後に存在する人間の内的世界を探求することを試みた。次に,心理療法に近い枠組みに則り,「ドラマ」と振り返り面接からなる調査を縦断的な形で実施し,数量的には測り得ない「ドラマ」のメカニズムや「ドラマ」を表現する意味について個性記述的検討を行った。調査は毎週1回同曜日の同じ時間に設定し,各被験者につき10回の調査を行った。これらの基礎・調査的研究と事例的研究から得られた示唆をもとに,「ドラマ」の背後には人間のダイナミックな心性,すなわち「ドラマ性」の存在が推察できること,「ドラマ性」と「ドラマ」は絶えず刺激し合い影響を与え合っていることが推察された。また,「ドラマ」のメカニズムやその意味探求のモデルとして本研究で採用したミニチュアの舞台と人形による表現が,カタルシスやプレイフルネスを賦活する機能などの治療的機能などを有することが推察された。そしてこのようなミニチュアの舞台と人形を用いた表現を心理療法場面で活用することを今後の展望として据えた。
高空間・高エネルギー分解能電子状態マッピング

本研究計画では球面収差補正器を装備した高空間分解能走査型透過電子顕微鏡とモノクロメーターを装備した高エネルギー分解能電子エネルギー損失分光法を組み合わせて、電子状態を実空間で可視化することを目的とし、主に以下の二つのトピックスについて研究を行う。1つは高温銅酸化物超伝導体における原子分解能でのホール分布研究。もう一つは電子状態マップにおける電子遷移終状態効果の検証である。
コンピュータにより知能化された高次複合分析法の研究

本研究においては、LC-FTIR,LC-ICPおよびSFC-FTIR,SFC-ICPの有機的なインターフェーシングを実現しスペクトル分析法のデータ解析の一部として保持予測システムを使用することにより、コンピュータにより知能化された高次複合分析法の確立を目的としている。本年度は、LC-FTIR,SFC-ICPの基本的インターフェーシングの検討ならびに各種化合物群,PAH,PTH-アミノ酸ペプチドに対する構造保持相関の研究を行った。LC-FTIRにおいては、溶媒除去法である「バッファメモリ法の実用化をめざし、新しいインターフェースデバイスを製作し長時間のLCクロマトグラムをKBrの円板の上に捕集し、そのクロマトグラム中の各種成分の赤外スペクトル,赤外クロマトグラムを得るのに成功した。この方法により数百ng程度の試料のLC-FTIRが可能となった。SFC-ICPについては、新しくSFCシステムおよびインターフェース部を製作した。内径1mmのマイクロカラムを用い、圧力と温度を移動相の【CO_2】が超臨界状態になるように設定し、カラムからの溶出流体をクロスフロー型気化法によりアルゴンガスとともにプラズマトーチの中へ導入し、このプラズマ内での元素の発光線をモニターすることにより特異的元素クロマトグラム測定ができた。このシステムでは、クエロセンに対して数ngのクロマトグラムがICPで測定できた。保持予測システムについては、PAHについてのシステムを完成し、PTH-アミノ酸についてはシステム化を現在行っており、アミノ酸とペプチドについては、基礎データの収集を終え、システム化を開始する段階である。
小児例に対する無肝期における体外循環シシステムに関する研究

1.対象および方法:(1)veno-venous bypass下にレシピエント手術手技に従い、肝全摘を行い、無肝期バイパスモデルを作製。4匹の雑種成犬を用い無肝期最低2時間の動脈血圧の安定化を確認した後以下の実験を行った。体重15Kg前後の雑種ブタにバイパスモデルを作製し、バイパス流量を5ml/kg-45ml/kgまで変化させたときの無肝期の各循環動態指標(平均動脈圧;MAP、心拍数、中心静脈圧;CVP、平均肺動脈圧;MPA、肺動脈せつ入圧;PWP、心拍出量;CO、体血管抵抗;SVR、心室仕事量、LVSW)を測定した。(2)ドナー手術手技に従い、肝摘出し、4°C乳酸加リンゲル液に単純冷却浸清した。1時間後常温下に門脈、肝動脈より37°C生理食塩水を注入し、肝静脈より得られた灌流液を採取した。また肝移植実験時、門脈循環再開前に10ml/kg肝静脈血脱血を行い、最初と最後の血液を採取した。(3)以上の結果にもとずき、イヌ(n=18)およびブタ(n=9)の同所性肝移植を行った。2.結果:(1)MAPはバイパス流量(BF)20ml/kg以上で100mmHgを越え、以後漸増した。COはBF増加に伴い、同様に増加し、R=0.66,p<0.01で単回帰直線として表された。SVRはBF20ml/kg以後、減少率は低下し、20ml/kg以上の範囲では著明な変動はみられなかった。以上によりバイパス流量は20ml/kg以上が望ましいと考えられた。(2)灌流実験では600ml以上のflush outにてK濃度は5meq/lとなったが、肝移植実験において10-15ml/kgの脱血により、肝静脈血中のK濃度は10.8から6.4meq/lへと有意に減少した。以上より10-15ml/kgの脱血により門脈循環再開後のhyperkalemiaは緩和されうると考えられた。(3)イヌ肝移植では、術後自発呼吸の比較的長く(10時間以上)認められたものについてはGOTが高値となる傾向が認められた。ブタ肝移植では、術後12-18時間にGOTの低下、凝固能の回復がみられており、この間がgraft failureに移行するcritical pointである可能性が示唆された。1.対象及び方法:15kgの雑種成犬を用いて従来行われている同所性肝移植のrecipientの手順に従い,肝摘出後,BioーPumpを用いた門脈ー外頸静脈及び下大静脈ー外頸静脈間のバイパスを行う.(1)無肝期の大腿動脈圧,腎動脈血流量の測定,血液ガス,凝固能,血清生化学検査の施行.(2)バイパス下に同所性肝移植の施行,測定項目は(1)に同じ.2.結果:方法(1)に従い,4回の実験を行った.