hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
横紋筋肉腫の組織学的分類と予後推測のための臨床病理学的研究

6例の両眼網膜芽腫の患者に続発した横紋筋肉腫の臨床病理学的検討を行った。腫瘍は全て網膜芽腫の放射線照射野内の側頭筋内に発生していた。組織学的に腫瘍は全て小円形細胞が密に増殖し、不完全な胞巣パターンを示す胞巣型横紋筋肉腫であった。免疫組織学的に、myogeninを含めた筋原性マーカーが全てに陽性で、retinoblastoma(RB) proteinは陰性だった。遺伝子学的研検索において、胞巣型横紋筋肉腫、Ewing肉腫にそれぞれ特異的なPAX3/7-FKHR、EWS-FLI1の有無を検索したが、いずれのキメラ遺伝子の検出されなかった。以上の結果から、長期間生存する遺伝子性網膜芽細胞腫の患者には放射線治療後に横紋筋肉腫が続発する症例がまれにではあるが存在し、網膜芽腫の再発あるいはEwing肉腫などの他の小円形細胞腫瘍と組織学的に鑑別を要することが明らかにされた。さらに二次性横紋筋肉腫の発生におけるRB geneの関与が推測された。様々な組織型を含んだ77例の骨・軟部肉腫において細胞接着因子E型カドヘリンの細胞外成分に対するモノクローナル抗体HECD-1を用いて免疫組織化学的に検討したところ、1例の多形型横紋筋肉腫、2/5例のびまん性中皮腫、4/5例の淡明細胞肉腫、1/5例の類上皮肉腫、10例全ての滑膜肉腫にその発現が認められた。その他の骨・軟部肉腫はE型カドヘリンが完全に陰性であった。この研究結果から滑膜肉腫などの上皮様形態をとる軟部肉腫において、その上皮様形態を形成する上でE型カドヘリンは一定の役割を果たしているものと推測された。さらに紡錘型横紋筋肉腫と鑑別を要する24例の胸腔外孤立性線維性腫瘍について臨床病理学的研究を行い、その組織学的多様性と潜在的悪性度を明らかにした。また3例の横紋筋肉腫を含めた成人の四肢、体幹に発生した95例の軟部肉腫を核内増殖関連抗原Ki-67(MIB-1)を用いた新しい客観的な組織学的悪性度評価を行い、その独立した予後因子としての有用性を明らかにした。遺伝性網膜芽細胞腫の患者には治療後に二次性原発性腫瘍が発生する危険性が高く、骨肉腫がその中でもっとも発生頻度が多く、次いでその他の軟部肉腫の発生が知られている。本年度の研究において6例の両眼網膜芽腫の患者に続発した横紋筋肉腫の臨床病理学的、免疫組織化学的検討を行った。患者は男性2人、女性が4人で、二次性腫瘍発症時年齢が1歳4ヶ月7歳11ヶ月(平均5歳9ヶ月)であった。24ヶ月から72kヶ月のfollow-upで、患者に腫瘍の再発・転移は認められていない。組織学的に、腫瘍は全て小型円形細胞が密に増殖し、不完全な胞巣パターンを示す胞巣型横紋筋肉腫であった。特徴的な所見として4例に血管周囲性のロゼット形成が目立っていた。

免疫組織化学的に、myogeninを含めた筋原性マーカーが6例全てに陽性で、その他vimentinが6/6例,neurofilament l50KD(NF)が6/6例,cytokeratinが2/6例に陽性で、S-100,synaptophysin,GFAP,CD99,RBgene protein(pRB)は全て陰性だった。対照として通常の横紋筋肉腫では、NFは75%(15/20例),pRBは82%(14/17例)に陽性反応を認めた。遺伝子学的検索において3例の凍結材料を用いたRT-PCR法で、胞巣型横紋筋肉腫、Ewing肉腫/PNETにそれぞれ特異的なPAX3/7-FKHR、EWS-FLIlの有無を検索したが、いずれのキメラ遺伝子も検出されなかった。以上の結果から、長期間生存する遺伝性網膜芽細胞腫の患者には、放射線治療後に横紋筋肉腫が続発する症例がまれではあるが存在し、網膜芽腫の再発あるいはEwing肉腫/PNETなどの他の小型円形細胞腫瘍と組織学的に鑑別を要することが明らかにされた。さらに二次性横紋筋肉腫の発生におけるRBgeneの関与が推測された。カドヘリンによる細胞同士の接着機構はがん細胞の形態形成と浸潤抑制に重要な役割を担っていることが知られている。しかしながら、上皮細胞の主なカドヘリンであるE型カドヘリンの骨・軟部肉腫における発現パターンについては知られていない。本年度の研究で様々な組織型を含んだ骨・軟部肉腫においてE型カドヘリンの発現を検討した。E型カドヘリンの細胞外成分に対するモノクローナル抗体HECD-1を用いて免疫組織化学的に検討したところ、1例の多形型横紋筋肉腫、2/5例のびまん性中皮腫、4/5例の淡明細胞肉腫、1/5例の類上皮肉腫、10例全ての滑膜肉腫にその発現が認められた。4例の骨肉腫、4例の軟骨肉腫、3例の原始外胚葉性腫瘍、1例の線維肉腫、4例の悪性線維性組織球腫、5例の脂肪肉腫、4例の平滑筋肉腫、6例の胞巣型および5例の胎児型横紋筋肉腫、4例の血管肉腫、4例の悪性末梢神経鞘腫瘍、2例の骨外性軟骨肉腫、2例の骨外性骨肉腫、3例の胞巣状軟部肉腫などその他の骨・軟部肉腫はE型カドヘリンが完全に陰性であった。今回の研究結果から滑膜肉腫などの上皮様形態をとる軟部肉腫において、その上皮様形態を形成する上でE型カドヘリンは一定の役割を果たしているものと推測された。今後、肉腫の組織診断、特に単相線維型滑膜肉腫と他の紡錘形細胞肉腫を鑑別する上でE型カドヘリンが免疫染色マーカーとして有用かどうかを検討するための研究が必要になるものと思われる。
不正咬合者における舌運動パターンの解析

平成4年度は、平成3年度の検討において有用性が示された舌運動解析装置、すなわちエレクトロパラトグラフとX線ビデオの同時記録装置を用いて、その臨床応用とデータの蓄積を行った。また、あわせて舌圧とX線ビデオの同時記録法の開発も行った。エレクトロパラトグラフとX線ビデオの同時記録法については平成3年度に引続き、舌小帯異常を有する患者について被験者を増やし検査を進めた。その結果、舌小帯の強い症例では舌運動に円滑さを欠き、全体として波動状の運動を示しており、そのような所見は従来のペーストパラトグラフの結果と対応していた。また舌小帯異常の強い症例の中にも安静時における舌背の位置が高位にあるものについては、比較的スムースな舌運動を示すものもあり、これらは安静時の舌の位置と関係があることが示唆された。舌圧とX線ビデオの同時記録については、被験者の上顎に2個の圧センサーを埋め込んだプレートを装着し、嚥下時の口蓋への圧力変化を経時的にペンレコーダに記録し、その時の舌の運きをX線ビデオと同時記録した。本解析方法を用いて舌小帯異常を有する患者において舌小帯伸展術前後での検査を行ったところ、術後口蓋後方正中部での圧力が大きくなり、舌運動もスムースになった症例も認められた。これらの解析結果から舌小帯伸展術を行うことにより、実際に口蓋への圧力分布が変化することが確かめられ、このことからも舌小帯異常が嚥下時の舌運動に関して大きな影響を及ぼしていることが明らとなった。このように舌圧とX線ビデオの同時記録法も不正咬合の舌運動パターンを解析していく上で有用であることが示された。平成3年は、実施計画に基づき、舌運動解析装置の開発およびその有用性について検討を行った。即ち、舌小帯異常を有する患者の嚥下時の舌運動パタ-ンについて当教室において開発してきた舌運動解析装置を用いて分析し、その特異な舌運動のパタ-ンを明らかにするとともに本装置の有用性を明確にする事を目的とした。今回開発した舌運動解析装置はエレクトロパラトグラフとX線ビデオを同時に記録するものであり、患者の口腔内に装着した10個の端子をもつ人工口蓋板により嚥下時の舌の口蓋への接触様相を1/64秒ずつ表示するとともに、その時の舌の動きを側方からのX線ビデオによって捉え、その両方の記録を同時に一画面に表示できるようにしたものである。本装置により舌小帯異常を有する患者の嚥下時の舌運動の様相を調べたところ、小帯の異常の程度が大きい症例では舌の口蓋への接触様相は正常者と異なり、特に口蓋後方部での舌の接触が弱く、かつ接触時間も短いことが明らかとなった。この事は同時に記録したX線ビデオによる舌運動の解析から、これらの患者においては嚥下時に舌背の挙上が正常者に比べてスム-ズさに欠け、舌背部が波をうつような運動をすることと対応する事が示された。これらの解析結果より、舌小帯の異常は、単に小帯の付着部位である舌尖部の運動を障害するのみでなく嚥下時の舌の運動パタ-ンに大きな影響を及ぼす事が明らかとなった。このように本解析システムは従来の解析装置に比べて舌の運動をより詳細に解析することができ、今後、不正咬合の舌運動パタ-ンを解析する研究を行っていくうえできわめて有用であることが示された。
培養血管内皮細胞の老化に関する分子生物学的・生体工学的解析

本年度は主として血管内皮細胞の刺激・応答反応における加齢の影響について検討した。具体的には年齢(累積細胞分裂回数)の異なる培養牛胎児大動脈内皮細胞をATP、アセチルコリン(ACh)、ブラディキニン(BKN)、などのアゴニスト及びカルシウム・イオノフォア(A23187)で刺激し細胞内Ca^<++>濃度反応とそれに引き続く内皮由来血管平滑筋弛緩因子(EDRF)の放出反応を検索した。細胞内Ca^<++>濃度はCa^<++>蛍光指示薬のFura-2を細胞に取り込ませ、その蛍光変化を蛍光測光顕微鏡で測定した。また内皮の産生するEDRFについてはヒーズ上に培養しカラムに詰めた内皮細胞を刺激したときのeffuluentを兎大動脈平滑筋切片にかけ、その張力変化から、またeffuluentを培養牛胎児大動脈平滑筋細胞にかけたときの細胞内cGMPの変化から評価した。内皮にATPを作用させると細胞内Ca^<++>濃度はATP濃度依存性に上昇し、血管切片の弛緩と平滑筋細胞内cGMPの上昇即ちEDRFの放出の増加が観られた。BKNでは初回刺激で明らかなCa^<++>上昇とEDRF放出が起こったが、その後の刺激ではそれ以上の反応は出現せず脱感作現象が観られた。ACh刺激ではCa^<++>変化、EDRF放出が共に生じなかった。またA23187刺激ではATPと同様に濃度依存性に細胞内Ca^<++>の上昇とEDRF放出が認められた。これらの刺激-EDRF放出反応は加齢細胞では若年細胞に比較して明らかに低下していた。この加齢細胞に観られた反応性の低下がATPに対するpurinoceptorあるいはBKN receptorの数や機能が低下したためなのか、Ca^<++>動員など細胞内情報伝達系に問題があるのか、あるいはEDRF産生系、例えばNO合成酸素の活性や量に変化が起きているのかは現在の所不明である。今回得られた結果は血管内皮細胞の血管トーヌスの調節機能が加齢により低下する可能性を示唆している。今回観察された事実と動脈硬化症を含む各種血管病との因果関係は今後検討すべき重要な問題と思われた。平成2年度には実験システムの整備を中心に行った。血管老化モデルとして内皮細胞のCell lineを確立するために長期間内皮細胞を培養・継代し各年齢の細胞を凍結・保存した。細胞年齢は継代毎にコウルタ-カウンタ-により細胞数を正確に数え累積細胞数倍加回数(CPD)として計算した。現在までにCPDが60,70,150以上の3つのCell lineを得ることができた。またヒトの腸骨動脈の内皮細胞を米国ペンシルバニア州ウィスタ-研究所のLevine教授から供与を受けそのCell lineを同様に凍結・保存した。また本研究では血行力学的応力に対する内皮細胞の反応から老化の評価を行う予定であるがそのための血行力学的応力負荷装置を改良し従来よりも多く多量の細胞に負荷ができる装置を作製した。ちなみに従来のものでは負荷できる細胞の数は1回に約4×10^5個であったが、改良されたものでは約3.4×10^6個である。さらに細胞機能の測定に用いる蛍光測光法に関しより精度の高いシステムを確立するために,Fwaー2を用いる細胞内Ca^+濃度の測定ではマイクロコンピュ-タ-を用い励起光のフィルタ-の高速切り替えや蛍光強度の時系列的変化のdisplay表示等を自動化した。また光電子増倍管による螢光の測定の他にSilicon intensifived target camera(SIT管)を用いFuraー2を螢光面像として記録しその空間分布的変化を検討できるようにした。当該年度に設備備品として高速冷却遠心機が購入されたがこのことにより細胞培養に必要な細胞増殖因子の牛の脳からの分離抽出が可能となり、かつ種々の生化学的測定のための試料作成が簡便・迅速となった。以上当該年度に目指した実験システムの整備は予定通り進行し,次年度の研究・実験への準備は整った。平成3年度では加齢に伴う内皮細胞機能変化に関する実験を主として行った。具体的には内皮細胞の増殖能や再生能及び接着能の面から加齢の影響を検討した。また刺激に対する細胞の反応性に及ぼす加齢の影響に関してはATPなどの化学的刺激に対する内皮由来平滑筋弛機因子(EDRF)の分秘の面から検索した。これらの実験から得られた知見としては初代培養から継代をくり返した多数のcell lineの中でCPD(累積細胞分裂回数)が50を越えると増殖能が著明に低下して来るcell lineが認められたがこうしたcell lineでは内皮層を一部剥離した後の遊走・再生能が低下する傾向が認められた。またコラ-ゲン、フィアブロネクチン,ラミニン,ファイブリノ-ゲンなど各種の細胞外マトリックスに対する接着能に関しては加齢に伴いとくにラミニンに対する接着能が変化し,ラミニン上での細胞のspreadingが亢進している所見が認められた。このことから内皮細胞のラミニン受容体の発現あるいは機能が加齢により何らかの影響を受けた可能性が示唆された。またATP刺激に対するEDRF放出反応が加齢細胞で低下する傾向が観られ、このような細胞においてはATP刺激の際の細胞内カルシウム上昇反応が若年細胞群に比較して抑制されていることが分かった。

EDRF放出が細胞内カルシウム濃度に依存する事実を観察しているがこの事を考え併せると加齢に伴う内皮のEDRF放出反応の低下傾向は刺激に対する細胞内カルシウム反応が抑制されているためである可能性が考えられ,加齢により細胞内情報伝達系に何らかの異常が生じているのかも知れない。この点は平成4年度においても引続き検討を加える予定である。本年度は主として血管内皮細胞の刺激・応答反応における加齢の影響について検討した。具体的には年齢(累積細胞分裂回数)の異なる培養牛胎児大動脈内皮細胞をATP、アセチルコリン(ACh)、ブラディキニン(BKN)、などのアゴニスト及びカルシウム・イオノフォア(A23187)で刺激し細胞内Ca^<++>濃度反応とそれに引き続く内皮由来血管平滑筋弛緩因子(EDRF)の放出反応を検索した。細胞内Ca^<++>濃度はCa^<++>蛍光指示薬のFura-2を細胞に取り込ませ、その蛍光変化を蛍光測光顕微鏡で測定した。また内皮の産生するEDRFについてはヒーズ上に培養しカラムに詰めた内皮細胞を刺激したときのeffuluentを兎大動脈平滑筋切片にかけ、その張力変化から、またeffuluentを培養牛胎児大動脈平滑筋細胞にかけたときの細胞内cGMPの変化から評価した。内皮にATPを作用させると細胞内Ca^<++>濃度はATP濃度依存性に上昇し、血管切片の弛緩と平滑筋細胞内cGMPの上昇即ちEDRFの放出の増加が観られた。BKNでは初回刺激で明らかなCa^<++>上昇とEDRF放出が起こったが、その後の刺激ではそれ以上の反応は出現せず脱感作現象が観られた。ACh刺激ではCa^<++>変化、EDRF放出が共に生じなかった。またA23187刺激ではATPと同様に濃度依存性に細胞内Ca^<++>の上昇とEDRF放出が認められた。これらの刺激-EDRF放出反応は加齢細胞では若年細胞に比較して明らかに低下していた。この加齢細胞に観られた反応性の低下がATPに対するpurinoceptorあるいはBKN receptorの数や機能が低下したためなのか、Ca^<++>動員など細胞内情報伝達系に問題があるのか、あるいはEDRF産生系、例えばNO合成酸素の活性や量に変化が起きているのかは現在の所不明である。今回得られた結果は血管内皮細胞の血管トーヌスの調節機能が加齢により低下する可能性を示唆している。今回観察された事実と動脈硬化症を含む各種血管病との因果関係は今後検討すべき重要な問題と思われた。
口腔癌の診断・治療に応用しうる「がんの個性」診断法の確立

癌の診断・治療は、これまで臨床的な病期や臨床病理学的情報に基づき行われてきたが、ほぼ同様な癌であっても異なる臨床経過、治療に対する異なる感受性や予後を示すことがある。この理由については、治療法の選択に際し、現時点において癌の生物学的性格を十分かつ客観的に把握することが困難であることに起因すると考えられる。われわれは、この様な問題を解決し得る「癌の個性診断」を可能とすべく、レーザーマイクロダイセクション法と、マイクロアレイ法を用いて、組織標本上から回収された癌細胞の遺伝子発現プロファイルの解析を行った。また、このシステムを用いた癌の生物学的性格の客観的評価法確立に向けた「癌の生物学的性格」に対応した「遣伝子発現プロファイル」がいかなるものであるのかその検討を行った。その結果、口腔扁平上皮癌症例間で共通して発現量の増加ないし減少がみられた遺伝子や転移陽性症例間と転移陰性症例間において共通した挙動を示した遺伝子が明らかとなった。前者は、癌の組織発生や浸潤・増殖能の獲得などに関わる癌が成立する上で重要な因子であることが推察されることから、「癌か否か」の判断の根拠や腫瘍マーカーとしての応用への可能性があると考えられ、後者については、癌の転移に大きな役割を果たす遺伝子であることが示唆された。一方、転移陽性症例と転移陰性症例の平均化遺伝子発現プロファイルが見いだされたことは、「癌の生物学的性格」の重要な要素である癌の転移能を評価し得る「遺伝子発現プロファイル」の一端が明らかになったと考えられた。今後、解析症例数を積み重ねることによって、レーザーマイクロダイセクション法とマイクロアレイを用いた本システムは癌の診断・治療や癌患者のquality of lifeの向上に大きく寄与することを期待し得ると考える。【研究の経過】1)口腔扁平上皮癌手術材料の形態学的解析:ホルマリン固定手術材料をパラフィン標本作製し、臨床病理学的解析を行った。必要に応じ、特殊染色や免疫染色を行い、分子生物学的解析結果との対比のためのデータを揃えた。また、解析に用いた症例は、臨床経過・検査データ・手術所見・経過に関するデータを保存した。2)Laser microdissection (LM)標本作製:LMに用いるための処理を施したスライドグラスを使用し、8μmで凍結切片の薄切を行った。ステップセクシヨンで一枚おきにHE染色標本を作製しておく。薄切標本は-40°Cで保存した。3)Laser microdissection (LM)とReal time PCR法による解析:Microarrayの結果がLaser microdissectionによるサンプリングにより影響を受ける可能性があるため、適正なサンプリング数・部位の検討を行った。すでに申請者により第11回日本口腔病理学会で報告された、口腔癌において発現が確認されている転写産物を用いて、口腔癌手術材料よりDissectionされた細胞よりReal time PCRを行った。4)Laser microdissection (LM)とMicroarrayを用いた解析:前項で検討された最適なサンプリング数・部位を用いてLaser microdissectionにより得られたmRNAを用いて網羅的解析を行った。【研究結果】口腔扁平上皮癌の組織発生あるいは浸潤・増殖・転移に大きな役割を果たしている可能性を示唆する様々な遺伝子が明らかとなりつつある。今後は症例数を積み重ねることにより、さらにデータの信頼性を高める必要性があると考えられる。【学会発表】1)第91回日本病理学会総会ワークショップ2)第27回日本頭頚部腫瘍学会ミニシンポジウム3)第14回日本口腔病理学会総会4)第62回日本癌学会総会ランチョンセミナー5)第23回日本口腔腫瘍学会総会ワークショップ【研究の経過】1)口腔扁平上皮癌手術材料の形態学的解析:ホルマリン固定手術材料をパラフィン標本作製し、臨床病理学的解析を行った。

必要に応じ、特殊染色や免疫染色を行い、分子生物学的解析結果との対比のためのデータを揃えた。また、解析に用いた症例は、臨床経過・検査データ・手術所見・経過に関するデータを保存した。2)Laser microdissection (LM)標本作製:LMに用いるための処理を施したスライドグラスを使用し、8μmで凍結切片の薄切を行った。ステツプセクションで一枚おきにHE染色標本を作製しておく。薄切標本は-40°Cで保存した。3)Laser microdissection (LM)とReal time PCR法による解析:Microarrayの結果がLaser microdissectionによるサンプリングにより影響を受ける可能性があるため、適正なサンプリング数・部位の検討を行った。すでに申請者により第11回日本口腔病理学会で報告された、口腔癌において発現が確認されている転写産物を用いて、口腔癌手術材料よりDissectionされた細胞よりReal time PCRを行った。4)Laser microdissection (LM)とMicroarrayを用いた解析:前項で検討された最適なサンプリング数・部位を用いてLaser microdissectionにより得られたmRNAを用いて網羅的解析を行った。【研究結果】口腔扁平上皮癌の組織発生あるいは「癌の個性」を規定し得る癌の生物学的性格を反映する可能性を示唆する様々な遺伝子がさらに明らかとなりつつある。今後は症例数を積み重ねることにより、さらにデータの信頼性を高めることを目的として解析を進める。【学会発表】1)第20回「歯科医学を中心とした総合的な研究を推進する集い」2)第92回日本病理学会総会ランチョンセミナー3)第92回日本病理学会総会ワークショツプ4)第63回日本癌学会総会5)第48回日本唾液腺学会6)第58回日本口腔科学会総会ミニシンポジウム【研究の経過】1)口腔扁平上皮癌手術材料の形態学的解析:ホルマリン固定手術材料をパラフィン標本作製し、臨床病理学的解析を行った。2)Laser microdissection(LM)標本作製:LMに用いるための処理を施したスライドグラスを使用し、8μmで凍結切片の薄切を行った。ステップセクションで一枚おきにHE染色標本を作製しておく。3)Laser microdissection(LM)とReal time PCR法による解析:Microarrayの結果がLaser microdissectionによるサンプリングにより影響を受ける可能性があるため、適正なサンプリング数・部位の検討を行った。
新規グルタミン酸アンタゴニストの開発を指向したカイトセファリンの効率的全合成

カイトセファリンは天然より初めて見出されたイオンチャンネル型グルタミン酸受容体(iGluRs)アンタゴニストである。高活性・低毒性であることから脳保護薬のリード化合物として注目され、詳細な薬理学的挙動の解明が望まれているが、菌体培養による供給が困難であるため、化学合成による量的供給を待つ状態にある。我々は前年度までの研究により、三つのアミノ酸誘導体を用いたフラグメントカップリングにより、報告例中最短となる12段階でのカイトセファリンの効率的全合成を達成し、その量的供給への道を拓いた。そこで、本合成経路を用いてカイトセファリンの各種誘導体を合成し、構造活性相関研究へと展開した。前述の効率的合成経路を用い、カイトセファリンの3位異性体、ヨウ素体、9-デカルボキシル体およびデアシルアミド体を合成した。これらに加え、カイトセファリン並びに前年度までに合成したカイトセファリン7位・9位に関する異性体と鏡像異性体のiGluRsに対する結合活性試験を行った。その結果、カイトセファリンは三種類に分類されるiGluRsのうち、NMDA型受容体に選択的にかつ強力に結合することが分かった。カイトセファリンを超える結合活性を有する誘導体は存在しなかったが的7位・9位に関する異性体は比較的活性を維持し、さらに7位異性体は受容体選択性が向上していた。カイトセファリン3位異性体・9-デカルボキシ体およびデアシルアミド体は結合活性がカイトセファリンに比べ大幅に低下し、これら官能基が受容体との結合に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。現在、合成した誘導体のアゴニスト・アンタゴニスト活性を評価している。我々はこれまでにカイトセファリンの全合成を報告しているが、その量的供給には課題が残されていた。また、iGluRsサブタイプ選択的アゴニスト、ダイシハーベインとカイトセファリン鏡像体に構造的類似性を見出し、カイトセファリン鏡像体にサブタイプ選択性が期待できると考えた。そこで、(1)カイトセファリンの効率的合成経路の確立及び(2)カイトセファリン鏡像体の合成および活性評価に向けて研究を開始した。(1)天然物の全合成では、酸化段階の調節が工程数増加の一因である。そこで、1-[N-Cbz-(1R)-1-アミノ-2-オキソエチル]-4-メチルー2,6,7-トリオキサビシクロ[2,2,2]オクタンとN-Boc-(5R)-5-シロキシメチルプロリンメチルエステルのアルドール反応によりカイトセファリン右側ユニットを構築した。生成物の立体化学は(3R,4R)となり、3位不斉中心が天然物と異なると予想した。事実、アルドール反応は予測した生成物を与えた。そこで酸化・還元により3位の立体化学の反転を行い、望むS体に導くことができた。シリル基の除去・オルソエステルの加水分解とエステル交換、一級水酸基の選択的酸化を行った後、Honor-Emmons反応によってカイトセファリンデヒドロ体を合成した。現在、二重結合の立体選択的還元を試みている。(2)カイトセファリン鏡像異性体は先に確立した合成法を用いて合成した。現在、化合物の精製と活性評価を行っている。そこで、(1)カイトセファリンの効率的合成経路の確立及び(2)カイトセファリン鏡像体を含む各種類縁体の合成および活性評価に向けて研究を開始した。(1)我々は前年度までにZ-8,9-デヒドロカイトセファリン保護体の合成に成功している。本化合物の不斉水素化は、触媒の立体化学に関係なく望まない9R体を与えた。そこで、安藤法を基盤とした新規E-デヒドロアミノ酸合成法を確立し、これを用いてE-8,9-デヒドロカイトセファリン保護体を合成した。E-デヒドロ体の水素化は望む9S体を高立体選択的に与えた。保護基を塩化アルミニウム・ジメチルスルフィドにより一挙に除去しカイトセファリンを得た。最終生成物に至る全工程においてグラムスケールでの再現性を確認し、これにより、既知物より12段階・全収率6.97%と報告例中最も効率的なカイトセファリンの合成経路が確立された。

(2)カイトセファリン鏡像体は結合阻害活性試験によりNMDA受容体に選択的に結合することが明らかになった。現在、その他類縁体について順次活性評価を行っている。カイトセファリンは天然より初めて見出されたイオンチャンネル型グルタミン酸受容体(iGluRs)アンタゴニストである。高活性・低毒性であることから脳保護薬のリード化合物として注目され、詳細な薬理学的挙動の解明が望まれているが、菌体培養による供給が困難であるため、化学合成による量的供給を待つ状態にある。我々は前年度までの研究により、三つのアミノ酸誘導体を用いたフラグメントカップリングにより、報告例中最短となる12段階でのカイトセファリンの効率的全合成を達成し、その量的供給への道を拓いた。そこで、本合成経路を用いてカイトセファリンの各種誘導体を合成し、構造活性相関研究へと展開した。前述の効率的合成経路を用い、カイトセファリンの3位異性体、ヨウ素体、9-デカルボキシル体およびデアシルアミド体を合成した。これらに加え、カイトセファリン並びに前年度までに合成したカイトセファリン7位・9位に関する異性体と鏡像異性体のiGluRsに対する結合活性試験を行った。その結果、カイトセファリンは三種類に分類されるiGluRsのうち、NMDA型受容体に選択的にかつ強力に結合することが分かった。カイトセファリンを超える結合活性を有する誘導体は存在しなかったが的7位・9位に関する異性体は比較的活性を維持し、さらに7位異性体は受容体選択性が向上していた。カイトセファリン3位異性体・9-デカルボキシ体およびデアシルアミド体は結合活性がカイトセファリンに比べ大幅に低下し、これら官能基が受容体との結合に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。現在、合成した誘導体のアゴニスト・アンタゴニスト活性を評価している。
根分泌物質を介した植物と土壌微生物の相互関係に関する研究

(1)イネ科,マメ科,キク科,アブラナ科に属する作物4科22種について,根から分泌する糖類を定量的に解析した。人工気象室でポットにシリカサンドをつめ各種を栽培し,56回定期的にサンプリングし,シリカサンドに分泌された糖をエタノールで回収し,エバポレーターで濃縮後,HPLCにより,糖の組成と各糖の量を定量した。分泌糖量と各収穫時の根乾物重は高い相関を示したので,両者の回帰を求め,その傾き(回帰係数)を根分泌糖量の指標として比較した。(2)生育初期には,根からソルビトールが分泌されたが,根の生長が指数関数的に増える頃には,分泌糖がグルコースとフルクトースに変化し,ソルビトールの分泌は見られなかった。ラフィノースは,マメ科に見られたが,その他の科の作物には検出できなかった。(3)科間には,分泌糖量に大きな差が見られ,マメ科が最も量が多く,次いでイネ科,キク科,アブラナ科となった。特にアブラナ科では,生育が増しても糖の増加は顕著に見られなかった。科間の差は,根における土壌微生物の共生関係と密接に関係しており,根粒菌と菌根菌と共生関係を持つマメ科で分泌糖量は最高に,土壌部生物と共生関係をもたないアブラナ科で最小となった。(4)施与肥料を低くして栽培したところ,葉に蓄積された炭水化物や根の量が低下したにもかかわらず,分泌糖量は増加した。このことで,植物は根から糖を受動的に分泌しているのでなく,能動的に分泌していることが示唆された。(1)これまで,根分泌物質の定量は同位体を利用して行われてきたが,この方法は,時間と施設の制約のため多くの植物間の比較には適さない。今年度は,まず。多くの植物の根分泌量を同時に測定できる方法を確立した。(2)人工気象室に,ペットボトルを半分に切り取り,上半分にシリカサンドを詰め,植物を栽培することにより,根からの分泌物質を回収する方法を試みた。容器から物質が漏れないように工夫し,ある一定期間植物を栽培した後,サンドから根を分離し,サンドから80%のエタノールを用い,分泌物質を回収した。回収後エバポレーターで濃縮して物質の定量を行った。(3)植物生育量とともに,分泌物質量も変化するために,生育段階の異なる植物をサンプリングし,植物生育量に対する一次回帰の傾きにより,植物種間の比較を行った。植物生育量として,根乾物重,地上部乾物重,根長を用いたが,根乾物重が最も高い適合度を示した。(4)用いた植物は,イネ科,マメ科,キク科,アブラナ科の4科に属する作物である。各科最低5作物種を用いた。今年度は根分泌糖を分析した。分析には液体クロマトグラフィーを用い,グルコース,フルクトース,ソルビトール,シュクロース等の各糖の量を測定した。(5)用いた種間には,根から分泌される糖の全量に大きな差が見られた。作物種間の変異の多くは,科間の差に還元できた。一般に最も分泌糖量が多かったのはマメ科であり,最も少なかったのは,アブラナ科であった。イネ科とキク科は両科の中間にあった。また,分泌糖の組成も種や生育時期で変化していた。
プラスチック廃棄物の回収再利用促進に適合するモノマー再生産技術の研究

環境中に投棄され焼却されるプラスチックは、環境破壊のみならず貴重な有機資源の枯渇や地球温暖化につながる世界規模の問題である。この問題解決には、廃棄プラスチックを設置容易な簡便装置を使って原料モノマーへ戻すサイクルを効率よく編成することが重要である。本研究では、重縮合系高子の代表としてポリエチレンテレフタレート(PET)を主たる研究対象にとりあげ、原料モノマーへ解重合し再利用するケミカルリサイクル法の開発を行った。ポリカ-ポネートについても同様の検討を行った。1,穏和な条件下、PETは無水エチレングリコール(EG)中150180°Cで短時間にアルカリ分解して、テレフタル酸ナトリウムとEGに解重合する。テレフタル酸ナトリウムは個体粉末として析出するのでろ過によって容易に分離でき、これを少量の水に溶解し、濃硫酸を加えてテレフタル酸(TPA)を晶析させる。この方法を実際に回収した廃PET試料へ適用したところ、回収試料に含まれる不純物や色素及び未分解物などは精製の過程で除かれ、高純度のTPAが高い回収率で分離できた。さらに本法をスケールアップして技術的実験を進め、PETの工業的また社会的リサイクル法としての実用化の可能性を探りたいと考える。2,1,の方法よりさらに低い温度でPETを加アルカリ分解する方法として、アルコールとエーテルの混合溶媒系についても今回新たに検討した。アルコール中でPETの加アルカリ分解が少量のジオキサン、テトラヒドロフラン等のエーテル溶媒の添加によって大幅に促進された。この方法によって室温70°Cの温度範囲でPETが約1時間でモノマーに分解し、TPAを定量的に回収できることがわかった。3,PETに類似のポリエステル系プラスチックであり、現在製造量が急増中のポリカーボネート(PC)について、同様にアルカリ系触媒を用いた解重合反応を開発し、定量的にビスフェノールAと炭酸ジメチル(いずれもPCのモノマーとなるもの)を得るケミカルリサイクル法を見出した。
合理的選択論の展開－1946～60年代のRANDと経済学者の役割から－

合理的選択論(Rational Choice Theory, RCT)は、経済学のミクロ経済学的アプローチを政治学や社会学などの社会科学分野に応用しようとした研究の総称である。この展開に強い影響を与えたのは、第二次世界大戦後60年代に経済学の分析ツールを他分野に応用した経済学者たちであった。合理的選択論者といわれたアロー、ベッカー、ブキャナンといった経済学者は、それぞれ個別に、経済学のツールを他の社会科学分野へ応用していった。それは、当時においてミクロ経済学が「科学」的研究であるという側面に支えられていた。平成25年度は、戦後の合理籍選択論の展開の1つとして、ケネス・J・アローの『社会的選択と個人的評価』執筆時の彼の理論と思想の関係を考察した。アローは、周知のように20世紀の現代経済学における中心人物である。彼はJ. R.ヒックスと同時に1972年にノーベル経済学賞を受賞した。こうした授賞理由から、アローは一般的に現代経済学の市場原理システムを信頼した静学的な経済学の発展に貢献した人物とみなされている。しかし、彼はこれらの功績のほかに不確実性の経済学、経済の動態的側面、組織の経済学、そして健康保険といった具体的な制度設計に関するものまでさまざまなテーマに関心をもち考察を進めてきた人物でもある。アローは市場システムの有効性を認めながらも、市場だけでは調整は不十分と考えていた。こうしたアローの多面的な思想の一端として、『社会的選択と個人的評価』執筆時の彼の理論と思想の関係をみた。同書は、本研究全体を貫通する合理的選択論の1つの源流として知られる著作で、その後の社会的選択論の研究の広がりをもたらす経済学においても重要な著作の1つである。これを考察することで、合理的選択論の歴史の一端を明らかにするのが今年度の研究の目的である。本研究は、選択理論の理論内容に加えて社会的背景も検討するものであり、アローの初期の思想に影響を与えているものとして、同書をめぐる1940年代後半から50年代の冷戦時代の社会的背景も考察した。アローのその成果は、オーストラリア経済学史学会等で報告した。本年度の研究実績の概要は以下のとおりである。・1951年出版『社会的選択と個人的評価』の再考本年度では、アローが1951年に出版した『社会的選択と個人的評価』の第1版を議論の出発点にすえ、アローの初期経済思想を考察した。同書は不可能性定理を証明した部分に該当する1章から5章が有名で、6章と7章はあまり注目されてこなかった。しかし6章、7章に注目し、そこから社会の在り方もしくは社会秩序についての当時の彼の思想を考察した。その結果、次のような成果が得られた。『社会的選択と個人的評価』では、個人の集合体としての社会は社会的厚生関数(Social Welfare Function)として定式化される。このアイディアはすでに30年代にA.バーグソンにみられるが、6、7章でアローは2度にわたってバーグソンの社会的厚生関数との違いを強調している。この点はこれまで指摘されてこなかった。しかし、アローの初期経済思想を考えるうえでバーグソン流の社会的厚生関数とアローのそれとの違いは重要である。なぜならアローの関数のしくみでは、社会が存在しており、個人と個人ないし個人と社会との間の比較によって個人が意見を再検討できる余地がある。6、7章では不可能性定理を乗り越える方策が議論されるが、この関数の認識の違いにアロー独特の社会認識があり、ここからアローの社会観と現代経済学に留まらない思想の射程の広さを示すことができた。本年度は、K. J.アローやW. H.ライカーの経済思想や方法論をそれぞれ考察し、50年代から60年代にかけての選択理論の歴史を明らかにすることを目的とした。本年度の研究は、アローの最初の著作である『社会的選択と個人的評価』がRAND研究所において行われており、本研究の重要な部分を占めている。また、ライカーは政治学者であるが、経済学方法論と類似の方法論を政治学で応用しようとした点で、50年代当時の選択理論のバックボーンになるとの考えから、考察を進める予定であった。しかし、本年度は出産に係る産休・育休により、本年度のほぼ全ての期間で休業することとなった。したがって、本年度の研究成果は、第20回進化経済学会東京大会での研究成果に限られる。本報告では、K. J.アローの『社会的選択と個人的評価』から出発し、その第6章、第7章における彼の言説から彼にとって個人の選択から社会的選択を導出するうえで、それが単なる個人ないし個人の選択の集合体という意味ではなく、有機的なつながりを持つ「社会」であることを示した。そしてその後アローが出版する『組織の限界』にもその思想は受け継がれ、同書にも同様の有機的なつながりとしての「社会」(ただし、同書ではこの社会は組織として描かれている)が説明されていることを指摘した。このような、アローの1950年代から60年代にかけての思想が本年度の成果である。そのほか共著論文も執筆したが、本年度には成果として発表されなかった。研究実績の概要でも記入したとおり、本年度は出産に係る産休・育休により、本年度のほぼ全ての期間で休業することとなったため。平成28年度の研究実績の概要は以下のとおりである。

本年度は、アロー『社会的選択と個人的評価』とブキャナン、タロック『公共選択の理論』の比較を通じて、彼らの経済学観の異同に関する研究を行った。先行研究にあるように、アローは『社会的選択と個人的評価』において、社会的選択論で議論されるような不可能性定理を超えた、倫理的な観点からの選択行為と社会秩序の結びつきの可能性を示していた。それは、選択肢と直接関係のない市民の「社会的態度の類似性」という非経済学的な要素であった。『社会的選択と個人的評価』で扱われた第6章と第7章の言説は散逸的で彼の結論といえる内容ではなくアイディアの1つと述べた方がよいかもしれない。しかしこれらの章で述べられていることは、彼が後年「市場がどんな問題にとっても十分な解決策となっているとは思えない」と言及するように、同書における現代経済学を前提にした不可能性定理の結論に留まらない思考の射程の広さを示しているといえる。他方、ブキャナンとタロックによる『公共選択の理論』は、従来アロー以降の社会的選択論とは一線を画すとの指摘がされてきた。それは、彼らが自らの研究を新古典派経済学と異なるものとして位置付けると同時に、アローとも異なる位置に置いてきたことからも見て取ることができる。しかし、本研究では、前述のアローの広範な経済学観とブキャナンとタロックにおける市場や個人主義の見方にはある共通項があり、社会的選択論と公共選択論の枠組みに相互対話する可能性があるという指摘を行った。研究課題進行中に産休育休が入ったことにより、およそ1年遅れたことに加え、本年度は研究成果の発表として学術論文を発表する予定が発表までに至らず、予定していた成果を十分に上げることができなかったため。今年度は、研究期間の最終年度として、これまでの研究を総合した。合理的選択論は、経済理論の他の社会科学分野での総称として用いられ、1950年代から使用し始められた用語であるが、その中で他分野に影響を与えたアローやブキャナン、ベッカーを対象にその他分野への影響を分析した。今年度の研究成果としては、次のものがある。まず、共著の著作物として、経済学史の専門教科書『経済学とはどのような学問であったのかーアリストテレスからセンまでー』(松嶋敦茂編)のうち、1章分の「合理的選択と社会性(ソーシャリティ)ーK.J.アローの社会的選択論」を担当した。著書全体の目的は、経済学を科学史的な視点で分析することに照らして、各時代の科学と経済学のあり方を各章で取り上げることにある。本稿は、アローの社会的選択論を取り上げ、彼が考えた社会的選択論は、経済学の科学的研究を目指し1930年当時の新厚生経済学批判にあったことを説明した。また、今年度は、「社会秩序と行為選択をめぐる史的検証ー19世紀から20世紀の経済学を対象とした一考察ー」(査読付、共著)『立命館大学産業社会学部論集』第53巻第2号、31-42頁も発表した。本稿では19世紀後半から20世紀にかけての経済学者ないし時代を3つ取り上げ、経済学とその周辺領域における社会秩序と行為選択のとらえ方について考察した。担当節では、アローが著した『社会的選択と個人的評価』(1951)を題材に、個人の選択問題が社会の選択に移行するまでのプロセスの問題点がどこにあるのか、また行為選択が社会的選択に移行するような社会体制としてアローが想定していたのは何であったのかを考察したものである。
礼拝像・祭具制作における素材選択の心性史：材質とその聖性の喧伝に関する調査・研究

本研究は、仏像や神像等の礼拝対象となる聖像や仏具・法具や彜器・礼器等の祭祀具・供養具、さらには銅鏡等のように礼拝対象と供養具両者の性格を兼ね備えた美術工芸品等の製作に際し、どのような素材をなぜ選択したのかを探るとともに、その素材自体に聖性を認める場合には、どのような過程で素材に聖性を見出したのか、そしていかなる方法でその聖性を喧伝してきたのかを追求することを目的としている。本年度は助成を受ける初年度で、木彫像、金銅仏や青銅器・銀器、銅鏡等の調査をおこなうとともに、調査対象の材質およびその聖性について触れる銘文や文献資料等の収集を目的とする調査をおこなった。いずれも礼拝像や祭祀具の制作における素材選択とその聖性の喧伝に関する心性の史的展開を明らかにするための準備段階と位置付けていたが、次の通りいくつかの成果を上げることができた。まず、吹田市立博物館で開催された特別展「西村公朝芸術家の素顔」における講演会で「樹に祈り木を彫るー木彫仏像の文化誌」と題して日本の木彫像の素材をテーマに講演をおこなった。また、埼玉県松伏町より刊行された『松伏町史文化財編仏像』において総論として「松伏町の仏像」を執筆した。いずれも木彫仏像を中心とする本研究の成果の一部を含んでいる。さらに、『東大寺の思想と文化』に「白銀の転生ー銀仏の造像と銀器の転用ー」と題する論文を発表し、銀仏の造像に際して愛用の銀器等が再利用されることのあったことを主に文献史料をもとに明らかにしたほか、『大阪市立美術館紀要』に「館蔵《鉄天命「極楽律寺」銘尾垂釜》の銘文について」と題する小論を発表し、銘文を再検討することで従来とは異なる釈読案を提示し、本品の伝来に関して新たな解釈を加えることができた。一定の成果をあげることができ、順調に進んでいると考える。ただし、当初研究計画の一部に含んでいた京都・清凉寺釈迦像の木材樹種が従来考えられていた中国産サクラ材ではなくクスノキ科ではないクスノキ属であることが他の研究グループによって明らかとなった。日本の礼拝像の歴史における同像の重要性はかわらず、引き続き同像に用いられた樹種木材の意味を探るとともに、他の造像にあたえた影響等についても検討することとしたい。特定の樹種木材の使用が喧伝される木彫像を中心とした木彫像の調査を継続したい。ただし、当初研究計画の一部に含んでいた京都・清凉寺釈迦像の木材樹種が従来考えられていた中国産サクラ材ではなくクスノキ科ではないクスノキ属の木材であることが他の研究グルーブによって明らかにされた。日本の礼拝像の歴史における同像の重要性はかわらず、引き続き同像に用いられた樹種木材の選択の意味を探るとともに、他の造像にあたえた影響等についても検討することとしたい。また、銅鏡をはじめとする青銅器等の銘文に見られる素材に関する記述の抽出とした銅鏡等の調査を引き続き実施するほか、銀仏等銀製品の調査を継続して実施したい。

日本の礼拝像の歴史における同像の重要性はかわらず、引き続き同像に用いられた樹種木材の意味を探るとともに、他の造像にあたえた影響等についても検討することとしたい。特定の樹種木材の使用が喧伝される木彫像を中心とした木彫像の調査を継続したい。ただし、当初研究計画の一部に含んでいた京都・清凉寺釈迦像の木材樹種が従来考えられていた中国産サクラ材ではなくクスノキ科ではないクスノキ属の木材であることが他の研究グルーブによって明らかにされた。日本の礼拝像の歴史における同像の重要性はかわらず、引き続き同像に用いられた樹種木材の選択の意味を探るとともに、他の造像にあたえた影響等についても検討することとしたい。また、銅鏡をはじめとする青銅器等の銘文に見られる素材に関する記述の抽出とした銅鏡等の調査を引き続き実施するほか、銀仏等銀製品の調査を継続して実施したい。当初予定していたよりも実施した調査件数が少なかったため、旅費の支出が少なかった。調査は次年度以降に持ち越して実施する予定である。また、海外製年輪計測用ソフト等の購入が遅れているため、物品費に未使用額が生じた。次年度以降に購入を期したい。
含水率低下に伴う流動性変化を考慮した乾式メタン発酵モデルの構築

混合材料の有機固形物を用いた乾式メタン発酵実験を行った結果,同一試験区におけるサンプル間のばらつきが大きくなった。反応槽内を撹拌させる実験を行ったところ,ガス発生速度は劇的に改善され,ばらつきも小さくなった。これより,乾式メタン発酵では主に加水分解の前段階において,内容物の物理的崩壊が低速もしくは不均一に行われるために初期の発生速度が遅くなっていることが示唆された。当該年度ではまず.グルコース粉末添加時の乾式メタン発酵による累積バイオガス生成量の経時変化について調べた。実験開始より約3時間後からバイオガスの発生が見られた。ガスの発生速度は, 1日目では湿式メタン発酵試験区より大きい傾向が見られたが,その後発生速度は減少した。しかし,湿式メタン発酵試験区では3日目以降にガス発生量がほほ横ばいになったのに対し,乾式メタン発酵試験区ではガス発生速度は実験開始から100時間を経過しても極端に小さくなることはなかった。最終的なガス蓄積量は乾式メタン発酵試験区の方がやや大きかった。なお.同一試験区におけるサンプル間のばらつきは,特に3日目以降で湿式メタン発酵に比べて大きく,バイアル瓶内での一連のメタン発酵反応が不均一な条件下で行われたことを示唆していた。続いて,混合材料の有機固形物を用いた乾式メタン発酵実験を行った。本実験では,最初のガス発生までに約三日を要し,実験期間中のガス発生速度は湿式試験区より大きくなることはなかった。また,同一試験区におけるサンプル間のばらつきも大きかった。実験システムを改良し,反応槽内を撹拌させる実験を行ったところ,ガス発生速度は劇的に改善された。また,サンプル間のばらつきも小さくなった。これらの結果から,乾式メタン発酵では主に加水分解の前段階において,内容物の物理的崩壊が低速もしくは不均一に行われるために初期の発生速度が遅くなっていることが示唆された。これは, ADM1モデルに,内容物の物理的崩壊に関するパラメータを加えることで表現できると考えられる。当該年度ではまず,セルロース粉末添加時のメタン発酵による累積バイオガス生成量の経時変化について調べた。試験区は,含水率90%の区,85%,80%,75%及び70%の区を設け,それぞれ,平振盪恒温水槽を用いて35°Cに維持し,十分な日数馴養した後に,7日間の回分培養実験を行った。回分培養実験では,ミリガスカウンターを用いて連続的にガス発生量を測定し,さらに一日2回ガスの採取を行い,ガスクロマトグラフを用いてバイオガスの組成を測定した。実験開始より約30分後からバイオガスの発生が見られた。ガスの発生速度は,1日目では含水率の高い試験区がより大きい傾向が見られ,含水率の低い試験区では発生速度が小さかった。その後,含水率が高い試験区でも発生速度は上昇したが,実験終了時の蓄積バイオガス発生量は70%試験区が最小であった。バイオガス組成については,85%試験区が最もメタンの割合が大きく,70%試験区ではメタンの割合が最も小さかった。なお,同一試験区におけるサンプル間のばらつきは,前年度と同様含水率の低い試験区ほど大きくなる傾向が見られ,メタン発酵反応が不均一な条件下で行われたことを示唆していた。続いて,混合材料の有機固形物を用いて同様のメタン発酵実験を行った。基質投入後,90%試験区は速やかにガス発生を開始したが75%および70%試験区ではガス発生まで約3時間を要した。その他の発生ガス経時変化の各試験区の特徴は最初の実験結果とほぼ同様の傾向を示した。なお,80%,75%および70%試験区については,基質の形状の大小を変化させた実験,反応槽内を撹拌する実験も行った。その結果,形状の小さな基質を用いて,撹拌速度を高くした試験区ほど,ガス発生速度が高く蓄積発生量も大きくなった。これらの結果から簡易なモデルを作成し,嫌気性消化モデルに導入したところ,シミュレーション結果は実測結果を良く再現することができた。
次世代シークエンサによる細胞核mRNA動態解析基盤と品質管理因子の作用機序の解析

mRNAの細胞核での品質管理については未解明の部分が多く残されている。本研究は、核内におけるmRNA品質管理に関わる因子の作用機序を明らかにするために、次世代シーケンサーを用いた細胞核mRNA動態の網羅的解析を行う。加えてコンベンショナルな方法によりその重要性を提示する。エキソソームの構成因子の一つRRP45とMTR4をそれぞれノックダウンしたヒト細胞からその内容を次世代シーケンサーによって網羅的に解析した。読まれた全シーケンスをゲノム上にマッピングし、転写物の存在比の変化をコントロール細胞由来の解析結果と比較した。RRP45とMTR4によって顕著に発現の上昇する遺伝子を特定した。次いでコンベンショナルな方法によるヒトTRAMP(PAPD5-ZCCHC7-MTR4)複合体の同定と局在の解析を行った。エキソソームやMTR4は、核質に局在していることを観察した。またPAPD5、ZCCHC7は、いずれも核内に局在することを確認した。さらにヒトTRAMP複合体の候補因子が細胞内で相互作用していることを免疫沈降実験により確認した。タンパク質の分解が主としてプロテアソームによって行われているように、mRNAの分解(品質管理)は主としてエキソソームが担当している。しかしmRNAの様々なプロセシングが行われる細胞核での品質管理については未解明の部分が多く残されている。これらの解析により核内のmRNA品質管理の分子機構を解明する基盤を構築する。エキソソームの構成因子の一つRrp45とhMtr4、をそれぞれノックダウンしたヒト細胞からpolyA RNAをオリゴdTを用いて精製し、その内容を次世代シーケンサーによって網羅的に解析した。読まれた全シーケンスをゲノム上にマッピングし、各領域由来の転写物の存在比の変化をコントロール細胞由来の解析結果と比較した。Rrp45とhMtr4によって顕著に発現の上昇する遺伝子を特定した。リアルタイムPCRによる検出を目指してプライマーセットを作成した。次いでコンベンショナルな方法によるヒトTRAMP(PAPD5-ZCCHC7-Mtr4)複合体の同定と局在の解析を行った。エキソソームやMtr4は、核質に局在していることを観察していた。またPAPD5、Trf4は、いずれも核内であることを確認した。さらにヒトTRAMP(PAPD5- ZCCHC7-Mtr4)複合体の候補因子が細胞内で相互作用していることを免疫沈降実験により確認した。これに加えPABPN1も弱いながら相互作用していることを見いだしている。さらにヒトTRAMP(PAPD5-ZCCHC7-Mtr4)複合体の候補因子が細胞内で相互作用しているかについて免疫沈降実験により確認した。これらの結果は、申請者が当初想定していた結果となっている。

よって研究は順調に進行している。エキソソームの構成因子の一つRrp45とhMtr4、をそれぞれノックダウンしたヒト細胞のpolyA RNAを次世代シーケンサーによって網羅的に解析し、蓄積しているRNA種のデータを解析した。予定通りに進行している。またヒトTRAMP(PAPD5-ZCCHC7-Mtr4)複合体候補因子がお互いに相互作用していることを確認した。これについても予定通りに進行している。1.標的RNA分子の同定と作用点の解明ー次世代シーケンサーによる解析で抽出された標的mRNA候補と作用点について、個別にノザンブロットやリアルタイムPCRなどの手法を用いてその妥当性を検証する。2.ヒトTRAMP(PAPD5-ZCCHC7-Mtr4)複合体の活性測定ー核内のmRNA品質管理をうけるmRNAは、短いポリAの付加をTRAMP複合体によって受ける。これら3者を大腸菌で発現し精製した標品、32Pで標識したオリゴAとATPを用いてポリAの付加活性を観察する。3.ヒトTRAMP(PAPD5-ZCCHC7-Mtr4)複合体の同定ー免疫沈降により取得した複合体を、電気泳動で分離し、その全構成因子を質量分析により同定することで新たな因子の発見に努める。新規因子が見つかれば、上記と同様の解析を進める。当初計画に大きな変更点はなく、主たる経費は物品費である。この他に旅費、人件費等を計上している。ただし物品費の中では、当初予定にはなかったが、タンパク質精製に使用する冷却遠心機の購入を検討している。冷却遠心機の購入によって今後の推進方策2と3を速やかに進展させることが出来る。