hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞分化の制御を目指した糖鎖プレートの開発

DNA、タンパク質に次ぐ第3の生体高分子である糖鎖は、生体内で細胞間の認識や接着、ウイルスや毒素の感染など、分子や細胞の認識機能や、加齢や組織の分化などに密接に関与している。このように生命現象において非常に重要な役割を担っている糖鎖は、その生合成が遺伝子による直接支配を受けないため、糖鎖研究はポストゲノムにおける重要な研究分野である。そこで糖鎖の機能を簡便に解析出来るツールとして、種々の糖鎖を一枚のチップ上に固定化した糖鎖チップの開発を行うことにした。昨年度までに鶏卵より調製した4種類の糖鎖(高マンノース型、バイセクト型、シアロ型、アシアロ型)を96穴マイクロプレートに固定化し、糖鎖チップを合成することに成功した。本年度は糖鎖チップ上への基質の結合量を測定する方法の開発を試みた。具体的にはHRP修飾されたレクチンを用いたELISA法を用いた。しかし、糖鎖とレクチンとの相互作用はタンパクの抗原-抗体間の相互作用と比べ弱いためか、後処理の洗浄工程で相互作用したレクチンも糖鎖から解離してしまい再現性のない結果となった。しかし固定化した糖鎖はレクチンの種類によって相互作用の強弱が確認できたことから固定化糖鎖は糖鎖チップとして機能することが明らかと成った。次に溶液中での糖鎖の相互作用についての検討を行った。測定方法としては蛍光偏光法、及び一分子蛍光測定法を用いた。まず糖鎖アスパラギンのアミノ基にダンシル基やテトラメチルローダミン基などの蛍光基を導入した。これを基質にしてレクチンとの相互作用を測定したところ糖鎖はレクチンの種類によって相互作用の強弱が確認でき、蛍光偏光法、及び一分子蛍光測定法が糖鎖の相互作用解析に有用であることが確認された。特に一分子蛍光測定法は、固定化操作が不要、かつ用いる基質の量がフェムトモルと極微量ですむことから、糖鎖の機能解析に非常に有用な手法として期待される。DNA、タンパク質に次ぐ第3の生体高分子として糖鎖がある。糖鎖は生体内で細胞間の認識や接着、ウイルスや毒素の感染など、分子や細胞の認識機能に密接に関与している。このように生命現象において非常に重要な役割を担っている糖鎖は、その生合成が遺伝子による直接支配を受けないため、糖鎖研究はポストゲノムにおける重要な研究分野であるといっても過言ではない。そこで、糖鎖の機能を簡便に解析出来るツールとして、多種多様な糖鎖を一枚のチップ上に固定化した「糖鎖チップ」の開発を行うことにした。まず、卵白、及び卵黄より単離した高マンノース型、バイセクト型、アシアロ型の糖鎖を有する糖鎖アスパラギンのアミノ基をFmoc化し、原料となるFmoc糖鎖アスパラギンを合成した。これらのFmoc糖鎖アスパラギンをそれぞれDMT-MMを縮合剤として用いて、96穴アミノプレートへ固定化した。更に、基質の非特異的吸着を減少させるため、Fmoc基の除去を28%アンモニア水を用いて行った。次に、ジシアロ型糖鎖アスパラギンはアスパラギン部位の他にシアル酸部位にもカルボキシル基を有している。従って、BS^3試薬を用いアスパラギンのアミノ基を介して固定化を行った。このようにして、4種類(高マンノース型、バイセクト型、アシアロ型、ジシアロ型)の糖鎖が固定化された「糖鎖チップ」を合成することに成功した。次に、得られた糖鎖チップに対して、種々のレクチン(ConA、RCA-120、DSA、WGA)との相互作用をELISA法により測定したところ、糖鎖の種類によってレクチン間の相互作用の強度差が確認された。この結果より、固定化された天然糖鎖が糖鎖チップとして機能することが明らかとなった。

これを基質にしてレクチンとの相互作用を測定したところ糖鎖はレクチンの種類によって相互作用の強弱が確認でき、蛍光偏光法、及び一分子蛍光測定法が糖鎖の相互作用解析に有用であることが確認された。特に一分子蛍光測定法は、固定化操作が不要、かつ用いる基質の量がフェムトモルと極微量ですむことから、糖鎖の機能解析に非常に有用な手法として期待される。
中性子とX線を相補的に用いた蛋白質水和水の解析法の確立と構造的特長の解明

本研究では同一の単結晶からの中性子およびX線回折データを相補的に利用することで、研究者の恣意性を排した蛋白質水和水の構造決定を可能とする手法を開発した。更に、水和水が重要とされる不凍蛋白質の抗凍結活性について、変異体を用いた作用部位の特定と、中性子およびX線を相補的に用いた構造解析により、抗凍結活性に対する水和水の役割の解明に成功した。本研究では原子核を観測する中性子構造解析と電子を観測するX線構造解析を相補的に用いることで、タンパク質水和水の構造決定において恣意性を排した自動同定法の確立を目的としている。そこで21年度は、豚膵臓エラスターゼおよびHIV-1プロテアーゼについて同一の結晶から中性子およびX線回折データを測定し、両データを同時に用いて構造の精密化を行った。また、両データからそれぞれ得られる原子核密度分布および電子密度分布の差分となる"中性子-X線差密度分布(N-Xマップ)を計算するソフトを開発し、上述のタンパク質についてN-Xマップを計算した。その結果、水和水中の水素原子を強調して可視化されることで、恣意生を排した水和水の構造決定を可能にした。また、本研究では上述の手法を活用した、水和水が機能解明の鍵となるタンパク質の構造解析も目的としている。本研究ではこのようなタンパク質として、生体内で氷結晶の成長を抑制することで体液の凍結を防ぐ不凍タンパク質(ナガガジ由来: nfbAFP)に注目した。nfeAFPには抗凍結活性を持つアイソフォーム(QAE型)に加えて抗凍結活性を持たないアイソフオーム(SP型)の存在が知られているが、本研究ではSP型アイソフォーム中の1残基のみに変異を加えることで、抗凍結活性が発現することを明らかにした。現在、SP型およびその活性変異体のX線構造解析およびJRR-3原子炉(JAEA)の中性子回折計BLX-3を用いた中性子構造解析を進めている。更に本研究に関連して、J-PARCに建設され、平成22年度に中性子構造解析に用いる予定である新型中性子回折計iBLXについて、そのデータ処理ソフトの開発も進めている。本研究では昨年度までに、原子核を観察する中性子構造解析と電子を観察するX線構造解析を相補的に用いたタンパク質水和水の同定法(N-X解析法)を確立した。また、水和水が機能解明の鍵となるタンパク質であるナガガジ由来不凍タンパク質(nfeAFP)について、変異導入でAla19をValに変えることで抗凍結活性が大きく向上することを発見した。そこで平成22年度はN-X解析法を用いたnfeAFPの活性向上の機構解明を第一の目的として、変異導入前後のnfeAFPについてX線構造解析による構造比較を試みた。その結果、nfeAFP分子自身に大きな構造変化は無いものの、変異導入前にAla19近傍に存在した複数の水和水がA19V変異によって消失したことが判明した。そこでこれらの水和水の構造を詳細に調べるため、変異導入前のnfeAFPについて原子力機構JRR-3原子炉のBIX-3回折計を用いた中性子回折測定とN-X解析を行った。その結果これらの水和水は互いに水素結合で結ばれたクラスターを形成していることが判明した。不凍タンパク質は氷結晶の表面に結合することで抗凍結活性を発揮するとされるが、この結果から変異導入前のnfeAFPではタンパク質表面の水和水クラスターがnfeAFP分子の氷表面への結合を阻害するのに対し、A19V変異体ではこの水和水クラスターが除かれることで活性が向上するという機構が明らかとなった。これは不凍タンパク質の水和水が機能に果たす役割を示した初の成果であり、現在論文を執筆中である。また、本研究ではタンパク質水和水の構造を統計的に解析することを目指し、N-X解析法を恣意性を排して進めるためのツールとしてタンパク質の原子核/電子密度分布の形状から水和水を自動的に見つけるソフトの開発を行うと共に、本研究に関連して数多くのタンパク質の中性子構造解析を行うための装置としてJ-PARCのiBIX回折計の整備も行った。これらにより、より多くのタンパク質の中性子構造解析データから水和水の構造情報を迅速に行える環境が整いつつある。
円筒型放電容器内における準安定励起分子の実効励起寿命測定

円筒型放電管中における準安定励起分子の損失過程を調べるための実験として、軸方向の拡散については、互いに対向する電極上において、一次元問題で用いた著者の測定方法、即ち準安定励起分子の入射により放出される二次電子放出電流を測定することにより可能である。しかし、径方向への拡散、即ち円筒面に入射する準安定励起分子の検出に当たっては、電極を置くことは不可能となり、別の方法によらなければならない。そこで、蛍光体を用いる方法を検討することにした。まず、基礎実験として平行平板電極を用い、N_2の低ガス圧タウンゼント放電中で蛍光体が発光するかを観測した。その際、N_2放電と蛍光体の発光スペクトルも同時に測定し、その結果から蛍光体が発光していることを確認した。しかし、放電空間で生成された電子、イオン、光子、準安定励起分子等の中のどの粒子が蛍光体を発光させるか見極める必要が生じ、実験的に確認することにした。その結果、N_2中の放電室内において、蛍光体は放電による紫外線、電子線などによっても励起されていることが確認されたため、蛍光体の発光が準安定励起分子の検出器となるかは、更に検討を加え慎重に判断しなければならないと考えられる。放電容器中の準安定励起分子の理論的な解析結果の妥当性を調べ,放電空間中における準安定励起分子の損失過程を明らかにする目的で,放電容器中で生成されたN_2の準安定励起分子の実効励起寿命測定を行っている。今回は,準安定励起分子の実効励起寿命測定の新たな測定法として,ガラス板上に塗った蛍光体表面が準安定励起分子の検出器として有効であるか検討した。具体的には,蛍光体の発光に関する基礎実験を行った。まず,蛍光体の励起源としてN_2レーザー,D_2ランプ,パルス点灯Xeランプを用いて蛍光体の発光特性を観測し,励起源によって蛍光体の発光特性に違いがあることを確認した。次に,蛍光体を実際の放電にさらすことにより発光するかを観測した。その結果,蛍光体は,電流領域で10-^6A付近から発光することを肉眼で確認した。しかし,この電流領域では,目的とする準安定励起分子以外に,放電光,電子,イオン等がかなりの割合で存在しており,蛍光体が何によって発光しているのかを確認する必要が生じた。そこで今後は,放電空間に存在している放電光,電子,準安定励起分子,イオン等の中1から蛍光体の励起源となっている粒子を特定するための実験を進める。
計算機援用シーケンス制御系設計のための基礎研究-表現理論と動作解析手法の確立

並行・非同期動作を特徴とする複合シーケンス制御系の計算機援用設計・解析・運用に適合した数学モデルとしてペトリネットを取り上げ、実システムでの主要制御問題に対応するネットモデルでの可到達性・活性・耐故障設計ならびに階層表現に関する諸問題に一貫してネット理論的アプローチを試み、所期の目的である基礎的成果をおさめた。本研究費により構築されたワークステーション上にペトリネットに基づく並行システムシミュレータを塔載し、実システムに対するネットモデルの有効性の確認および動作検証を行った。本研究の成果をその目的により大別すると下記の通りになる。(1)離散事象システム制御問題に関係する可到達性・活性に関し、マークグラフ、拡張マークグラフについて詳細な研究を行い、実用上重要な理論的基礎を与えた。(2)シーケンス制御系の設計自動化の基礎となるネットモジュールへの仕様の変換規則・結合規則ならびにネットモデルの構造的性質を明らかにした。(3)ペトリネット階層表現機能を用い、逐次詳細化・ネット複合によるトップダウン・ボトムアップ設計方式の基礎を与え、各階層間での動的性質の保存性について理論的検討を加えた。(4)階層化機能を備えた並行システムシミュレータPCSSを開発し、実時間システムのペトリネットモデルに基づくシミュレーションを行った。以上の研究成果の大部分はすでに学会・研究会等で公表されているが、一部は現在研究続行中であり、研究完成後直ちに公表される予定である。
実験的脊髄損傷における脳由来神経栄養因子(BDNF)の作用およびMRIによる評価

(目的)実験的脊髄損傷において脳由来神経栄養因子(BDNF)がoligodendrocyteのapoptosisを抑制している可能性について検討すること。また、BDNFをはじめとする薬物療法の効果判定のためにMRI撮像の準備をすることが本研究の目的である。(方法)(1)ラット脊髄不全損傷モデルに対してBDNFを髄腔内投与し、損傷後時間経過を追ってパラフィン切片を作成した。(2)核染色および活性型caspase-3免疫染色-TUNEL染色にてapoptosisの証明をした。(3)TUNEL染色と細胞マーカーの二重染色をおこない、apoptosis細胞の種類を同定した。(4)TUNEL染色陽性細胞数をBDNF投与群とコントロール群で比較した.(結果)損傷後早期より損傷部にはapoptosis細胞が観察された。TUNEL染色陽性細胞は損傷部では灰白質に主にみられ、その数は損傷後3日でピークとなり以後漸減した。これに対し頭側・尾側では損傷後3日より白質のみに陽性細胞が出現し、損傷後1週でピークとなり以後漸減した。二重染色では、損傷部灰臼質の陽性細胞はニューロン・ミクログリアで、頭側・尾側の白質の陽性細胞はオリゴデンドロサイトだった。すなわち頭側・尾側において、遅発性にオリゴデンドロサイトのapoptosisがおこっていた。BDNF投与群とコントロール群でTUNEL染色陽性細胞数を比較すると、損傷部では両者に有意差はなかったが、頭側では損傷後1週・2週で、尾側では損傷後3日・1週でBDNF投与群の陽性細胞数が有意に減少していた。MRI撮像に関してはコイルを試作し、撮像の条件を検討している。(考察)BDNFは脊髄損傷後遅発性に生じるオリゴデンドロサイトのapoptosisを抑制していた。この作用が髄鞘の保護に働き、脊髄の機能保持・修復に役立っている可能性があると思われる。また同様のモデルでBDNF投与により、superoxide dismutaseのup-regulationが起こることを検討しており、これらもアポトーシス抑制機序の一つと考えられる。(2)核染色および活性型caspase-3免疫染色・TUNEL染色にてapoptosisの証明をした。(4)TUNEL染色陽性細胞数をBDNF投与群とコントロール群で比較した。(結果)損傷後早期より損傷部にはapoptosis細胞が観察された。二重染色では、損傷部灰白質の陽性細胞はニューロン・ミクログリアで、頭側・尾側の白質の陽性細胞はオリゴデンドロサイトだった。

BDNF投与群とコントロール群でTUNEL染色陽性細胞数を比較すると、損傷部では両者に有意差はなかったが、頭側では損傷後1週・2週で、尾側では損傷後3日・1週でBDNF投与群の陽性細胞数が有意に減少していた。(考察)BDNFは脊髄損傷後遅発性に生じるオリゴデンドロサイトのapoptosisを抑制していた。この作用が髄鞘の保護に働き、脊髄の機能保持・修復に役立っている可能性があると思われる。MRI撮像に関してはコイルを試作し、撮像の条件を検討している。(目的)実験的脊髄損傷において脳由来神経栄養因子(BDNF)がoligodendrocyteのapoptosisを抑制している可能性について検討すること。また、BDNFをはじめとする薬物療法の効果判定のためにMRI撮像の準備をすることが本研究の目的である。(方法)(1)ラット脊髄不全損傷モデルに対してBDNFを髄腔内投与し、損傷後時間経過を追ってパラフィン切片を作成した。(2)核染色および活性型caspase-3免疫染色・TUNEL染色にてapoptosisの証明をした。(3)TUNEL染色と細胞マーカーの二重染色をおこない、apoptosis細胞の種類を同定した。(4)TUNEL染色陽性細胞数をBDNF投与群とコントロール群で比較した。(結果)損傷後早期より損傷部にはapoptosis細胞が観察された。TUNEL染色陽性細胞は損傷部では灰白質に主にみられ、その数は損傷後3日でピークとなり以後漸減した。これに対し頭側・尾側では損傷後3日より白質のみに陽性細胞が出現し、損傷後1週でピークとなり以後漸減した。二重染色では、損傷部灰白質の陽性細胞はニューロン・ミクログリアで、頭側・尾側の白質の陽性細胞はオリゴデンドロサイトだった。すなわち頭側・尾側において、遅発性にオリゴデンドロサイトのapoptosisがおこっていた。また同様のモデルでBDNF投与により、superoxide dismutaseのup-regulationが起こることを検討しており、これらもアポトーシス抑制機序の一つと考えられる。
金融派生商品に対する価格付け理論の確率論的アプローチに関する研究

2006年度の前半は、2005年度後半に行った研究「条件付請求権とstrategyの価値の差のp次平均(p>1)が最小となるようなhedging](p-optimal hedging)に関して、成果を論文にまとめ学術論文雑誌に投稿(現在審査中)し、さらに国際学会等で研究発表を行った。2006年秋以降は、離散時間モデルに対するq-optimal martingale measureの密度関数の導出法に関する研究を行なった。さらに、q-optimal martingale measureが存在するための十分条件の導出にも成功した。上述のp-optimal hedgingの研究では、pの共役指数をqとした時、q-optimal martingale measureに関するいくつかの条件が満たされることを仮定した。しかし、与えられたモデルに対してq-optimal martingale measureの密度関数を具体的に計算することが不可能であることが多い。そのため、これらの仮定が満たされるかどうかをチェックすることが一般的に困難である。ところが、離散時間モデルにおいては、今回求めた存在のための十分条件が、p-optimal hedgingに関する研究における仮定に対しても十分条件となることが分かった。さらに、2007年1月にミュンヘン工科大学のKallsen教授の研究室を訪問し討論を行った。その際、p-optimal hedgingのさらなる拡張に関して多くの実りある議論を交わせた。p-optimal hedgingは条件付請求権とstrategyの価値の差だけに注目したhedging手法である。そのため、strategyの価値が条件付請求権を下回る場合と上回る場合を区別できない。そこで、非対称関数をベースにした最適化問題にp-optimal hedgingを拡張することを目指した。このことにより、リスク管理的視点も考慮に入れた新たなhedging手法のパラダイムを提唱できるであろう。現在、ドイツでの成果を元に研究を継続している。今年度の前半は、これまでに得られたmean-variance hedgingに関する結果の改良を行った。mean-variance hedgingを導出するために課したvariance-optimal martingale measure (VOM)に関する条件の十分条件を部分的に与えることに成功した。このことによって、与えられたモデルに対し、mean-variance hedgingの導出が可能か否かの判断がつき易くなったと言える。そして、2004年7月に、数理ファイナンス分野における最大の国際シンポジウム「Bachelier Finance Society World Congress」(米国、シカゴ)においてこの結果を発表した。また、この結果を論文「Some properties of the variance-optimal martingale measure for discontinuous semimartingales」にまとめ、学術雑誌に投稿した。ただし、VOMに関する条件の十分条件を完全に与えたわけではない。そのため、定数1の確率積分空間上への射影の導出に関する研究は来年度以降も継続して行いたいと考えている。また、今年度の後半は非完備市場モデルにおける条件付請求権の新しい評価法に関する研究を行った。それは、投資家の効用関数を用いた方法であり、条件付請求権を売買した場合としなかった場合それぞれの期待効用の最大値が等しくなるように価格付けを行う方法である。これを一般にutility indifference valuationと呼ぶ。近年、効用関数が指数型である場合の研究が盛んに行われている。しかし、指数型効用関数を用いると条件付請求権に強い可積分性条件を課す必要がある。そこで、この困難を克服するために指数関数をべき乗関数で近似する手法の提案を試みた。この近時法が、指数型効用関数を用いた場合の基本的性質を満たすことなどを示した。今年度の前半は、昨年度後半に取り掛かったUtility Indifference Valuationにおける近似法の研究を引き続き行った。これは、指数型効用関数をべき乗関数を用いて近似することにより、条件付請求権に対する可積分条件を緩めることができる。今年度は、べき乗関数を用いた近似法の漸近挙動を調べ、指数型効用関数のIndifference Valuationに確率収束していることを示した。このことにより、今回提案した近似法が指数型効用関数の拡張としての有効性を示せた。この結果を、いくつかの学会や研究集会で発表した。

そのため、strategyの価値が条件付請求権を下回る場合と上回る場合を区別できない。そこで、非対称関数をベースにした最適化問題にp-optimal hedgingを拡張することを目指した。このことにより、リスク管理的視点も考慮に入れた新たなhedging手法のパラダイムを提唱できるであろう。現在、ドイツでの成果を元に研究を継続している。
カソードルミネッセンス現象を利用した大気中における材料分析法の確立

本研究では、カソードルミネッセンス現象を利用して、磁石中の希土類元素および鉄鋼材料中の非金属介在物を分析する手法の確立を目指した。走査型電子顕微鏡(SEM)の電子銃を電子線源とし、測定試料の発光を分光器およびデジタルカメラを用いて測定した(SEM-CL法)。磁石の分析については、ネオジム磁石中に含まれる微量(1 wt.%以下)のTbおよびDyの検出に関しては、一般的な元素分析法であるSEM-EDXやSEM-WDXよりも感度が高いことがわかった。非金属介在物の分析については、CL像を撮影することで、数十マイクロメートル以上の介在物を1分以内で検出することができた。本年度は、磁石中の希土類元素を走査型電子顕微鏡を用いたカソードルミネッセンス法(SEM-CL法)によって検出する方法の確立を目指した。カソードルミネッセンス(CL)現象は絶縁体あるいは半導体しか示さないので、導体である希土類磁石はCL現象を示さない。そこで、磁石を塩酸溶液に浸漬して、磁石表面に絶縁体である塩化物層を形成させた。この磁石表面をSEM-CL分析すると、希土類元素による発光を検出することができた。この方法を用いると、スペクトルの違いから、ネオジム磁石とサマリウムコバルト磁石を識別することができた。また、ネオジム磁石中に含まれる高価な希土類元素であるジスプロシウム(Dy)とテルビウム(Tb)を検出することができた。本研究で確立したSEM-CL法による磁石中の希土類元素分析法の応用例としては、リサイクル現場における希土類磁石の分別や磁石中の希土類元素の特定が挙げられ、リサイクル産業に貢献できる成果と言える。本年度は、金属材料(特に鉄鋼材料)中の介在物を走査型電子顕微鏡を用いたカソードルミネッセンス法(SEM-CL法)によって検出する方法の確立を目指した。本研究では、アルミナおよびスピネル(MgO・Al2O3)の介在物を含む鉄鋼材料の測定を行った。走査型電子顕微鏡の電子線の照射によって介在物が発光する様子を焦点距離が100 mmのクローズアップレンズを装着したデジタルカメラを用いて撮影したところ、アルミナおよびスピネルがともに緑色に発光する様子を撮影することができた。アルミナは、粒径20マイクロメートル、スピネルについては、粒径3マイクロメートルの粒子の発光を捕らえることができた。従来、介在物の分析には、顕微鏡や電子線マイクロアナライザ(EPMA)が用いられており、測定に数十分から1時間程度の時間を要する。一方、本研究で行ったSEM-CL法では数十秒で介在物の位置および種類を特定することができるので、本手法は鉄鋼材料中の介在物の分析手法として利用できる可能性があると考えている。しかしながら、アルミナ粒子とスピネル粒子がともに緑色に発光しているために、介在物の同定が現状ではできないので、これらを識別する方法を考える必要がある。平成27年度の目標である、走査型電子顕微鏡を用いたカソードルミネッセンス法(SEM-CL法)による金属材料(特に鉄鋼材料)中の介在物(アルミナ、シリカ、スピネル粒子)を識別する手法を確立することができたため。昨年度は、試薬のアルミナ(Al2O3)やシリカ(SiO2)などの介在物粒子を鉄粉に埋め込んだ試料を用いて、走査型電子顕微鏡を用いたカソードルミネッセンス法(SEM-CL法)によってこれらの粒子を検出する方法を確立できた。本年度は、模擬的に脱酸処理を行った実試料に近い鉄鋼材料中の介在物の種類をSEM-CL法によって、識別する方法の確立を目指した。本研究では、アルミニウムーマグネシウム複合脱酸の模擬的な試料を作製して、生成した介在物をSEM-CL法で分析できるかについて調査した。試料のCL像を撮影したところ、緑色に発光する粒子と青色紫色に発光する粒子が存在し、エネルギー分散型X線検出器(EDX)による元素分析の結果、緑色に発光する粒子がMgAl2O4スピネル、青色紫色に発光する粒子がアルミナであることがわかった。以上のように、CL像の発光色によってアルミニウムーマグネシウム複合脱酸で生じた2種類の介在物粒子を識別できることがわかった。また、試料中には、Al2O3とMgAl2O4スピネルが凝集した粒子存在しており、CL像からこの凝集体中のAl2O3とMgAl2O4スピネルの部分を識別することができた。EDXによる元素マッピングでは凝集体中のアルミナとMgAl2O4スピネルを識別できなかったので、SEM-CL法は凝集体中の個別の介在物粒子の識別に関して有効な方法であることがわかった。平成26年度の目標である、走査型電子顕微鏡を用いたカソードルミネッセンス法(SEM-CL法)による磁石中の希土類元素を検出する方法を確立することができたため。

今後は、平成27年度に確立した鉄鋼材料中の介在物に関する基礎的なデータを取得する。具体的には、マンガンシリケート(MnSiO3)系の粒子を作製して、CLスペクトルを取得する。これらのデータを基にして、鉄鋼材料中の介在物の元素マッピングにおける識別精度を向上させる。また、異なる種類の介在物でも発光色が同じ場合に、これらの介在物を識別する方法についても考える。具体的には、カメラのレンズに波長を選択できるフィルターをつけて、識別を行う。また、これまでの成果を基にして、大気中でCL測定を行うことができる装置の製作を行う。具体的には、ネオジム磁石とサマリウムコバルト磁石を識別できる希土類磁石識別装置と、金属材料中の介在物の位置と種類を特定できる介在物マッピング装置の開発を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。材料分析化学今後は、平成26年度に確立した磁石中の希土類元素の分析法の検出感度を向上させ、希土類元素の定量分析に挑戦する。また、この研究とは別に以下の2つの研究を行う。1.走査型電子顕微鏡を用いたカソードルミネッセンス法(SEM-CL法)による金属材料中の介在物を特定する方法の確立金属材料中の介在物は材質低下の一因となるため、種類や形体を分析することは重要である。本研究では、CL現象を利用して真空中で介在物の元素マッピングを行うために必要な基礎データの収集および前処理条件の確立を行う。具体的には、様々なスラグをCL測定して、基礎データを収集する。2.大気中におけるCL分析法の確立テスラコイルを電子線源に、カメラを検出器として用いて、大気中で測定できる、希土類磁石識別装置および介在物マッピング装置を製作する。購入したスパッタ装置を当初の予定より安く購入することができた。また、購入を予定していた質量分析装置を取り付けるための真空装置の完成が遅れてしまったため、質量分析装置の購入を来年度に延ばすことにした。購入した分光器と走査型電子顕微鏡が当初の予定額より安く購入することができたため。また、平成27年3月に東北大学への異動が決まったため、装置の移設費用を削減するために、大型装置の購入を平成27年度以降に先延ばしした。大型装置としては、質量分析装置を購入する。大型装置として、スパッタリング装置、X線発生装置および質量分析装置の購入を検討している。
皮膚ランゲルハンス細胞における抗原提示制御分子の解析

平成16年度までに、ランゲルハンス細胞(Langerhans cell, LC)が成熟する際に発現が増強する遺伝子implantation-related RGS2-like protein (AF432916)をクローニングした。リンパ臓器(胸腺、リンパ節、脾臓)、非リンパ臓器(脳、腎臓、肝臓)、樹状細胞(LC,脾臓由来CD11c^+細胞、bone marrow-derived dendritic cell [BMDC])、マクロファージのcell line(J774.1、J774A.1、RAW264)におけるこの遺伝子の発現の変化をreal-time PCRを用いて解析したところ、免疫担当細胞では樹状細胞にこの遺伝子が特異的に発現していること、精製直後のLC、脾臓由来CD11c^+細胞では発現は認められなかったが、BMDCでは精製直後より強い発現がみられること、さらにLC以外の樹状細胞においても成熟に伴い発現が増強することがわかった。次にこの遺伝子にコードされている蛋白のうち、C末端側の18アミノ酸を合成し、ウサギに免疫してポリクローナル抗体を作製した。この抗体を用いてFACSを行い、LCとBMDCでは成熟に伴いAF432916の発現が増強していることを蛋白レベルでも確認した。また、BMDCではデキサメサゾン添加によりAF432916の蛋白発現が抑制されるが、IL-10やTGF-β添加では抑制されないこと、LPS、コルヒチン存在下では蛋白発現が増強することが示された。ランゲルハンス細胞(Langerhans cells ; LC)は成熟および未成熟といった2つの異なった分化状態をとることが知られているが、グラム陰性菌の細胞膜成分であるlipopolysaccharide(LPS)、単球調整培養液、およびtumor necrosis factor(TNF)-αなどの刺激によってLCの成熟は促進される。最初にマウスの表皮より95%以上の純度でLCを分離・精製したのち24ないしは48時間培養し、LPSを添加したLCとそうでないLCとの間でrepresentative differential analysis(RDA)を用い発現量が大きく変化する遺伝子のスクリーニングを行った。5倍以上の発現の変化がみられた遺伝子は約100個であったが、その中には未成熟LCのマーカーであるCD1a、成熟LCで発現が増強するCD80やCD86も含まれていたので解析の結果は信頼できると考えられる。その中でimplantation-related RGS2-like protein(AF432916)およびBC006707に着目し、現在これらの遺伝子のクローニングを行っている。次の段階ではマウスのマクロファージのcell lineであるRAW264およびJ774.A1においてこれらの遺伝子を発現させる予定であり、発現ベクターの作製も同時に行っている。またそれとは別に、RAW264に遺伝子を導入させる際の条件についても検討を行った。発現ベクターにまずEGFPを挿入しFuGeneを用いてトランスフェクトを行ったところ、EGFPの導入効率はわずか5%であったが、G418添加で2週間選別を行ったところ30%の細胞でEGFPの強い発現が確認された。従って、今後はこの系を用いて任意の遺伝子を発現させ、マクロファージにおける抗原提示能の変化を解析することが可能となった。その中でimplantation-related RGS2-like protein(AF432916)およびBC006707に着目し、これらの遺伝子をマウスのマクロファージのcell lineであるRAW264およびJ774.A1において発現させた。この2つの遺伝子を発現させたところ、活性化の分子マーカーであるCD80およびCD86の発現増強がみられた。

この抗体を用いてFACSを行い、LCとBMDCでは成熟に伴いAF432916の発現が増強していることを蛋白レベルでも確認した。また、BMDCではデキサメサゾン添加によりAF432916の蛋白発現が抑制されるが、IL-10やTGF-β添加では抑制されないこと、LPS、コルヒチン存在下では蛋白発現が増強することが示された。
災害時における複数のシステムの相補関係に関する研究-行動の相補関係論を合わせて-

現在、自然災害時における対応策は、各種期間において積極的に取り組まれている。しかし、自然災害の発生状況とその経過を考えると、ある限定された事態をもとに固定的な対応システテムを策定することは現実に即したものとはいえない。また、避難者に対する的確な指示を与える上においても、避難者の様々な行動を考慮することが重要である。以上の前提から、本研究では、政策として適度な相補関係を持った複数のシステムを検討するための資料を得ることを目的として、災害時における行動のシュミレーション・モデルの検討、および既存の自然災害時における対応システムの検討を行った。既存のシステムを見てみると、防災行動は総花的な取り扱いとなっており、より基本的な防災行動にかかわるものほど画一的なものとなる傾向がある。このことは、現状が、状況に応じた正確かつ柔軟な対応が求められるべきシステムとしては、不十分なものであり、早急に相補関係を持った複数のシステムの構築が求められているといえる。一方、災害時における行動の個人差に注目したものが、シュミレーション・モデルである。これまでの研究において、日常的には勿論、災害時においても個人差はみられるということが示唆されているが、これを明らかにするための実験としてい行った。その結果、災害時における行動については一様ではなく、いくつかのタイプが存在することが認められ、防災、避難行動に際して、画一的な対応では不十分であり、複数の行動に対応したシステムを作り上げなければならないことが示された。
神経回路形成に機能するシナプス前後細胞間認識の分子機構

脳の高次機能を司る中枢神経系は複雑かつ精密な神経回路から成る。神経回路が形成されるためには、その基本単位であるシナプス前神経細胞とシナプス後神経細胞が正確な場所と時期にマッチングする必要がある。しかし、シナプス前後細胞が決められた場所でお互いを認識し、正しく結合していく分子機構について未知な点を多く残す。この問題を解明するために、ショウジョウバエの一次視覚系神経節であるラミナの形成に着目した。ラミナは、主に視神経軸索(シナプス前)とラミナ神経細胞(シナプス後)から構成され、規則正しい構造を持つ神経節である。本研究では、ラミナ神経細胞が視神経軸索に会合する過程において働く実行因子を特定し、正確な神経ネットワークを構築する分子メカニズムを解明することを目的とした。そのために、シナプス前後細胞が相互認識できない変異体を用いてマイクロアレイによる網羅的なスクリーニングを行った。スクリーニングと解析の結果、脊椎動物のNephrinホモログである細胞接着因子、Hibris (Hbs)がラミナ神経細胞で機能することが明らかになった。ラミナ神経細胞で発現する細胞接着因子Hbsは、視神経軸索で発現するパートナー分子と結合する事で働いていると考えられた。Hbsのパートナー分子探索の結果、視神経で働く因子としてNEPH1ホモログであるRoughest (Rst)を同定した。本研究から、ショウジョウバエの視覚系中枢において、シナプス前後細胞の正確な位置関係が形成される際の細胞間コミュニケーションにNephrin/NEPH1ホモログの細胞接着が関与する事が示された。この成果は、脊椎動物の神経中枢におけるシナプス前後神経細胞間認識のさらなる理解に繋がる可能性がある。このように高度な神経回路形成に必要な分子機構を解明するために、ショウジョウバエの一次視覚系神経節であるラミナの形成に着目した。本研究では、ラミナ神経細胞が視神経軸索に会合する過程においてSim制御下で働く実行因子を特定し、シナプス後神経細胞がシナプス前神経軸索と相互作用して正確な神経ネットワークを構築する分子メカニズムを解明することを目的とした。そのために、野生型とsim変異体のラミナを用いてマイクロアレイによる網羅的な遺伝子発現プロファイルの比較を行った。スクリーニングと解析の結果、脊椎動物のNephrinホモログである細胞接着因子、Hibris(Hbs)がラミナ神経細胞で機能することが明らかになった。ラミナ神経細胞で発現するHbsは、視神経軸索で発現するパートナー分子と結合する事で働いていると考えられたため、ショウジョウバエのNephrinホモログ、NEPH1ホモログを解析した。これらの結果から、視神経で働く因子としてNEPH1ホモログであるRoughest(Rst)を同定した。Rstはラミナ神経細胞のHbsと直接相互作用することで、ラミナ神経細胞の会合に寄与していることが考えられる。
殺菌性アルカリイオン水による食品の保存試験

1、目的殺菌性アルカリイオン水を用いて食品を保存することを目的として、殺菌性アルカリイオン水のEcherichia coli、Pseudomonas aeruginosa、Bacillus subtilus、Bucillus cereus菌に対する抗菌効果と豆腐およびその他の食品の保存性向上効果を検討した。2、方法各菌を水道水または殺菌性アルカリイオン水に加え各菌に対する抗菌力を検討した。水道水または殺菌性アルカリイオン水で豆腐を製造し、半製品及び製品に対する抗菌効果を検討した。各種食品を水道水または殺菌性アルカリイオン水に浸し、抗菌効果を検討した。3、結果殺菌性アルカリイオン水は無芽胞菌であるEcherichia coli、Pseudomonas aeruginosaに対して強い抗菌効果を示したが、芽胞菌であるBacillus subtilus、Bucillus cereusに対してはほとんど効果を示さなかった。豆腐の半製品である加熱前の豆乳に対しては強い抗菌効果を示したが、加熱後の豆乳には効果がなく、その理由は耐熱性菌であるBacillusに対して効果が弱いことによるものと思われる。しかし殺菌性アルカリイオン水を漬け水として用いた豆腐に対しては保存性向上効果が確認された。この理由は漬け水として用いた大量の殺菌性アルカリイオン水が、無芽胞菌の生育を抑制したことに起因しているものと思われる。麦茶、芽ひじき、削りぶし、とろろこんぶに対しては殺菌性アルカリイオン水の保存性向上効果が認められたが、生中華麺、生エビ、コーヒー、コンソメスープ、インスタント味噌汁、ホイップクリーム、ゼリー、乾わかめ、煮千に対しては効果がみられなかった。しかし調理加工時の水の適用方法や保存温度などを検討することにより、殺菌性アルカリイオン水の抗菌効果を引き出すことができる食品もあると思われる。1、方法殺菌性アルカリイオン水(pH10.010.4以上、銀イオン濃度100109ppb)の、大腸菌(E.Coli)に対する抗菌効果を検討した。寒天培地で一夜培養したE.Coli一白金耳を滅菌蒸留水に懸濁した液の一定量を、殺菌性アルカリイオン水に添加し、0、30、60分後の生菌数を測定した。また殺菌性アルカリイオン水または水道水で液体培地を作り、ここに菌液を添加し一夜培養後、菌の増殖量を比較した。2、結果水道水には塩素が残留しているので、そこに菌液を添加すると菌はすぐに死滅するが、水を加熱すると塩素が揮散し、水道水の抗菌性はなくなる。殺菌性アルカリイオン水では加熱しても抗菌効果は失われず、加熱後の水に添加した菌も60分後には死滅した。殺菌性アルカリイオン水で作った液体培地中に添加した菌は増殖するものの、水道水で作った培地と比べ、菌の増殖量は少なかった。3、考察水道水には塩素が残留しているため、塩素が残留している場合には抗菌性があるが、加熱調理などにより塩素は揮散し水中の菌が増殖する事になる。しかし殺菌性アルカリイオン水の抗菌効果は、加熱調理により低下することがなく、また液体培地中での菌の増殖も抑制することから、調理加工後の食品の場合にも保存性を向上することができると考えられる。今後は他の細菌とかび、酵母についても増殖阻止効果を大腸菌と同様に検討し、殺菌性アルカリイオン水で調理加工した食品中での、微生物の増殖阻止効果、食品の保存効果を検討する。1、目的殺菌性アルカリイオン水(pH1011、銀イオン濃度約100ppb)の芽包菌、シュウドモナス、大腸菌に対する抗菌効果と豆腐の保存性向上効果を検討した。2、方法Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Pseudomonas aeruginosaを0から2時間水道水またはイオン水に添加し、生存菌数を測定し各菌に対する抗菌効果を検討した。E.coliを水道水またはイオン水で作成した液体倍地中で培養し、培地濃度の上昇に対するイオン水の抗菌効果を検討した。

水道水またはイオン水で豆腐を製造し、製造工程の各段階(呉汁:大豆絞り汁、豆乳:大豆絞り汁の加熱後、豆腐)での抗菌効果と豆腐の保存性向上効果を検討した。3、結果殺菌性アルカリイオン水中に各菌を添加したところ、芽包菌に対しては全く抗菌効果を示さなかった。しかしシュウドモナスに対しては強い抗菌効果を示した。イオン水で液体培地を作りE.coliの生育阻害効果を検討したところ、培地として通常使用する濃度の半分以下の濃度までは、生育阻止効果が認められが、培地濃度の上昇にともない抗菌効果が低下した。イオン水で大豆の絞り汁を作った場合、それを加熱する前の呉汁に対しては抗菌効果を示したが、加熱後の豆乳に対しては抗菌効果を示さなかった。しかしその後工程で製造した豆腐は漬け水が多いことから、イオン水に漬けた豆腐の保存性が向上し、殺菌性アルカリイオン水には豆腐の保存性を向上させる効果があることが明らかになった。1、目的平成8、9年度の実験により、殺菌性アルカリイオン水は大腸菌やシュードモナス菌に対し強い抗菌効果を示し、豆腐の保存性を向上させることが明らかになった。そこで本年度は、その他の食品に対する保存性向上効果を検討した。2、方法(1)試料a:生中華麺、解凍生エビ、個別包装麦茶、麦茶、乾わかめ、芽ひじき、煮干、混合削りぶし、とろろこんぶ。b:コーヒー、コンソメスープの素、インスタント味噌汁、粉末ホイップクリーム、粉末ゼリー、中華麺(小麦粉を対象水で混合し生麺を作成)(2)殺菌性アルカリイオン水の適用方法aグループは試料をそのまま水道水または殺菌性アルカリイオン水に浸漬する。bグループは水道水または殺菌性アルカリイオン水で溶解、調理または加工する。(3)効果判定方法水道水または殺菌性アルカリイオン水適用後の各食品を15゚Cで数日間保存し、一般生菌数の増加とpHの変化を測定し保存性向上効果を検討した。3、結果とろろこんぶ、芽ひじき、麦茶に対し明かな保存性向上効果が認められた。乾わかめに対してはわずかに効果が認められた。コンソメスープに対しては、調理の条件により保存性向上効果が得られる可能性がある。その他の食品に対しては殺菌性アルカリイオン水による保存性向上効果が認められなかったが、殺菌性アルカリイオン水の適用方法や食品の調理加工条件をさらに検討することが課題として残された。
前頭前野幼形成熟とドーパミンとの関連

前頭前皮質は複雑な高次脳機能を介在する脳領域である。しかし、その脳領域がどのように進化して高度な脳機能を発達させてきたのかは分かっていない。本研究では、前頭前皮質に投射している神経伝達物質の1つであるドーパミンに着目して、ドーパミンの社会認知機能、とりわけ、げっ歯類(マウス)や霊長類(マカクサル)といった動物が社会集団で生活している状況での役割を解明し、前頭前皮質に依存する脳機能の進化に知見をもたらした。前頭前野皮質は認知・情動機能に関わる情報処理において、中心的な役割を果たしている脳領域だが、その複雑かつ高度な機能獲得につながる前頭前野皮質神経回路がどのように進化してきたのかはわかっていない。本研究では、前頭前野中脳皮質ドーパミンが脳発達に作用することにより、発達期間を遅延させ、より長い可塑性の期間をもうけていることが、そのような機能の複雑性を進化させたことのではないか、という仮説を検討するため、ラットをもちいて、ドーパミン操作を行い、前頭前野皮質の発達・成熟への影響を調査するものである。初年度においては、幼弱ラットに対して、慢性ストレス暴露の操作により、発達初期段階で前頭前野皮質のドーパミン量が低下することにより、どのように発達が変化するのかを神経細胞の形態学的調査するための実験装置のセットアップ、ならびに予備的実験(活動量、物体認識記憶、不安傾向を調査するための行動実験)を行った。前頭前野皮質は認知・情動機能に関わる情報処理において、中心的な役割を果たしている脳領域だが、その複雑かつ高度な機能獲得につながる神経回路がどのように進化してきたのかわかっていない。本研究では、前頭前野中脳皮質ドーパミンが脳発達に作用することにより、発達期間を遅延させ、より長い可塑性の期間をもうけていることが、そのような機能の複雑性を進化させる一因になっているのではないか、という仮説を検討するため、ラットを用いて、ドーパミン操作を行い、前頭前野皮質の発達・成熟への影響を調査するものである。本年度では、幼弱期の前頭前野中脳皮質ドーパミン投射を6-OHDAを局所投与することにより、認知・情動機能がどのように変化するのかを行動実験を行い、調査した。現在までの達成度はおおむね順調といえる。その理由として(1)幼弱ドーパミン投射破壊の行動学的影響を調査した。(2)しかし、免疫染色によるドーパミン投射破壊による神経回路の変化等の調査は終わらなかった。本研究では、脳の進化の過程においてもっとも高度に発達し、複雑な脳機能を介在する前頭前皮質(Prefrontal cortex; PFC)におけるドーパミンの役割について、主にマウスやラットといったげっ歯類を用いて検討を行った。なかでも、動物のもつ社会性に着目してドーパミンの役割を検討したところ、認知機能の障害を起こすことが知られているドーパミンの受容体の1つであるD1受容体を阻害する試薬を社会集団を作って生活しているマウスに投与したところ、集団内での社会的地位があがるなどの利益的な側面が観察された。このような結果は、進化の過程においてドーパミンD1受容体は社会集団という背景において平行選択の状態にあることが示唆している。また、本研究では、この結果をさらに霊長類にも発展させ、ニホンザルの小集団において、同様の試薬を投与した場合に観察される社会行動も調査した。その結果、ニホンザルの場合においては、集団内において不利益な社会関係の変化は見られなかったが、マウスで見られたような社会順位の上昇などの利益的変化も観察されなかった。また、ドーパミンの別の受容体であるD2受容体を阻害する試薬を、同様に社会集団で生活するマウスとニホンザルに投与したところ、マウス、ニホンザルで共通して社会的順位の低下などの不利益な変化が観察されたが、ニホンザルにおいては、社会階級が集団内でより安定するなどの変化も見られた。このことより、霊長類ではD1とD2受容体機能障害に対する異常の選択圧はマウスとは異なることが示された。これらの結果はD1受容体異常などが関わると示唆されているヒトの精神疾患が進化の過程において淘汰されず残っている理論的解釈を与えることができる。その理由として、(1)免疫染色法を用いてのシナプス関連分子発現の装置(脳切片作成装置、顕微鏡等)の設置を完了した。(2)予備実験として、発達初期段階で継続してストレスを与えられたラットの行動学的変化を調査し、その効果を確認した。今後の推進方策としては、幼弱ストレスに晒された固体ならびに幼弱ドーパミン投射破壊された個体の脳組織切片を作成し、神経細胞の形態学的変化を調査する。神経精神薬理学今後の推進方策としては、幼弱ストレスにさらされた個体の脳組織切片を作成して神経細胞の形態学的変化を調査する。

また、幼弱ラットに6-OHDAを投与し、ドーパミン投射を破壊したもの、ならびに、継続してドーパミンアゴニストを投与した個体でも同様に前頭前野皮質の発達がどのように変化するのかを調査する。予定されていた人件費、旅費、消耗品購入費をその他の寄付金で代替したため。研究の立ち上げ初期段階にあったため、旅費の使用額がなかったことや実験推進のための人件費の調整で研究費使用に差額が出た。28年度の人件費として使用する予定。次年度において研究推進を加速するため、技術補佐員等の人件費ならびに消耗品購入費として使用する。
渦度を含む流れの解明とその計算法の開発

流体の運動を規定している物理法則には圧縮性と粘性の2つがある。このうち圧縮性の効果は、双曲型の方程式で記述され、この効果によって、流れ場の微小擾乱は衝撃波面に集積し、安定な流れ場を形成する傾向を持つ。流れの数値解析において現在用いられているスキ-ムの多くは、この双曲型方程式の安定解の存在にその基礎をおいている。これに反して、粘性の効果は流れ場の中に渦度を発生させ、発生した渦度はその3次元効果によってからみあい、複雑化する作用を持つ。この複雑化は数値的に流れ場の時間発展を解析する際に、その時間的・空間的分解能を時間経過とともに精密化することを要求し、これが渦度を含む流れ場の数値解析を著しく困難にしている。事実、何らかの平均化モデルによらなければ流れの全時間発展を数値的に相似することには成功していない。粘性には擾乱を滅衰させる効果もある。しかしこの効果は数値的解析の際に不可避的に入ってくる数値的な減衰と区別することが困難で、事実、初期の数値的解析においては、いわゆる人工粘性項を導入して、強制的に擾乱を減衰させる手法が行なわれた。この研究においては、まず十分な空間的・時間的分解能を持った流れ場の測定法を開発し、また基礎方程式を数理的に解析し、これらを裏付けとして、渦度を含む流れ場の解析を行なった。各分担者の研究範囲は広範囲にわたりかつ重複しているが、物体面における渦度の発生機構の研究を麻生・林・桜井が、せん断層や衝撃波面における渦度の発生・干渉を藤原・本間、流れ場の中での渦度の時間発展の追跡を赤松・井上・山田が分担した。
核膜形成機構の1分子解析

本研究は、分裂期終期に起こる核膜の再形成機構を1分子レベルで解析する基盤を作ることを目的とした。この中でも特に、'コア領域'と呼ばれる染色体上の特異的な構造に着目し、その形成因子であるLEMタンパク質の立体構造とBAFの染色体結合部位に関する研究を行った。LEMタンパク質の1つであるemerinの立体構造を核磁気共鳴法により解析し、LEMドメインと呼ばれる部分以外は特定の構造を取らないことを明らかにした。また、コア領域形成の主導的な役割を果たすBAFは、染色体上の転写活性の高い部位に結合することが示唆され、コア領域形成に関与する分子の動きが1分子レベルで明らかになりつつある。核膜再構成の第1段階である核膜小胞のターゲッティングには、核膜内膜に特異的に局在するLEMタンパク質(emerin、MAN1、LAPなど)とその結合タンパク質BAFの相互作用が重要であること、これらの複合体が"コア"と呼ばれる染色体上の特異的な構造を作ることが知られている。申請者のこれまでの研究から、LEMタンパク質とBAFの結合は、BAF結合領域であるLEMドメインから1次配列上非常に離れた"調節部位"で制御されていることが明らかになり、この調節部位のリン酸化がタンパク質全体の3次構造の変化を引き起こすことが示唆されていた。そこで本研究では、(I)LEMタンパク質の立体構造解析、(II)コア領域が形成される染色体部位の同定、(III)LEMタンパク質-BAF-染色体複合体の安定化メカニズムの解明を行う。これらのうち、本年度は(I)、(II)の項目について、以下に示す研究を実施した。LEMタンパク質emerinのリン酸化状態の立体構造を、核磁気共鳴(NMR)を用いて決定することを試みた。小麦胚芽を用いた無細胞タンパク質合成系を用いて、NMR測定に必要な精製度のemerinの作成を行ったが、この合成系においてemerinは不溶化してしまい、精製が困難であった。現在は、精製に使用するタグを替えるなど、精製条件の検討を行っている。(II)コア領域が形成される染色体部位の同定DNA adenine methyltransferase identification (DamID)法を用いてコア領域が形成される染色体部位を同定することを試みた。このためにDam融合BAFを作成した。本実験では細胞周期を正確に調節した均一な細胞集団を得ることが必須であるため、BAF-Damを安定に発現する安定発現細胞株の作成を試みたが、現在のところ細胞株は得られていない。今後、細胞種の変更を含め検討する必要がある。本研究はLEMタンパク質-BAF-染色体の結合安定化メカニズムを徹底した1分子解析により記述し、核膜の染色体ターゲッティング機構解明の基盤とすることを目的としている。今年度はLEMタンパク質であるemerinの細胞周期依存的な立体構造変化の検討と、BAF-染色体間の結合安定化のメカニズムを主に検討する予定であった。しかし、昨年度にemerinの精製条件や、BAFの染色体結合部位を検討するためのDam-BAF安定発現細胞株の取得が困難であったという問題が起こったため、これら問題の解決を優先した。本研究で立体構造の解析に用いるNMRは、高純度なタンパク質の精製を必要とする。昨年度はHisタグ付きのemerinの不溶化などにより精製条件の検討が必要となったため、この至適化を行った。その結果、NMRに利用可能なemerinの精製に成功した。これを用いて非リン酸化状態の立体構造を測定したところ、emerinはLEMドメインと呼ばれるLEMタンパク質に共通の部位以外、決まった構造を取らないことが分かった。この結果はemerinがリン酸化されると構造変化が起こり、BAFとの結合が阻害されるという申請者のモデルと矛盾しない。現在はemerinをアフリカツメガエル卵の分裂期抽出液で処理し、リン酸化状態における立体構造の測定を行っている。一方、Dam-BAFに関しては、一過的発現により細胞周期を通じて正しい局在を示すことは確認できたが、安定発現株を取得することはできなかった。GFP-BAFでは安定発現株を取得できたことから、Damタグが悪影響を及ぼすことが推察された。そこで、解析法をDamID法から通常のクロマチン免疫沈降法に変更し解析を進めている。