hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Foxp2とFoxp2分子種がマウス超音波音声と運動機能を制御する大脳領域の解析

ヒト言語障害の原因遺伝子である転写因子FOXP2の言語障害変異を導入したFoxp2(R552H)ノックイン[Foxp2(R552H)-KI]ホモマウスはヒト言語に対応するマウス超音波音声(USV)障害、運動障害や小脳のプルキンエ細胞樹状突起形成障害を示す。結節性硬化症の原因遺伝子TSC1とTSC2は遺伝的に自閉性障害を引き起こすことで知られている。TSC2-KOヘテロマウスのUSVの変化は複雑であるものの、Foxp2(R552H)-KIホモマウス同様に、仔のUSV数を野生型と比較するとTSC2-KOヘテロにおいて減少が見られる。そこで、共同研究にてUSVを制御する分子機能においてFoxp2とTSC2間で相互関連が認められるかどうかFoxp2(R552H)-KIヘテロマウスとTSC2-KOヘテロマウスを掛け合わせ、生まれた仔のUSVを測定し、USVを構成するsyllableの種類を比較した。その結果、野生型マウスに比べ、TSC2ヘテロ-Foxp2ヘテロ、Foxp2ヘテロ、TSC2ヘテロマウスにおいては、簡単なsyllableから構成されるSimple syllableの割合の方が複雑なsyllableから構成されるMulticomponentに比べ約4-5倍増加していることが確認された。この結果はSimple syllableとMulticomponentの適切な割合がUSVに対して重要である可能性を示唆している。現在、共同研究にてFoxp2のプロモーター制御下にmCherryをつなげた(Bac-Foxp2)-mCherryTgマウスとTSC2-KOマウスを掛け合わせ、mCherryを指標としFoxp2の発現領域を調べるとともにTSC2欠損により変化の見られる大脳領域を解析し、マウスUSV機能を制御する脳領域や神経回路の解析を進めている。
電気化学的に創製した活性種の含フッ素強酸-塩基溶液系での反応挙動とその制御

本年度は、種々のカルボニル化合物のHF-Et_3N錯体中での電極酸化反応によるフッ素化合物合成を検討した。その結果、脂肪族アルデヒドの電解フッ素化により対応するアシルフルオライドを合成できることを見いだした。また、本反応で使用した5HF-Et_3N錯体は電極酸化条件下で安定性なため、他の錯体よりも電解質として優れていることを明らかにした。さらに、この方法はケトンの電解フッ素化反応にも有効であり、環状ケトンを用いて5HF-Et_3N錯体中で電極酸化反応を行うとケトンのα-位の炭素-炭素結合の開裂とともにフッ素化反応が起こり、ω-フルオロカルボン酸フルオライドが選択的に生成することを見いだした。この、生成物は単離することなく、対応するω-フルオロカルボン酸エステルに変換した。この反応は種々の置換基を持つ五員環や六員環のケトンに適用でき、対応するω-フルオロカルボン酸エステルを収率良く得ることが可能である。この様な炭素-炭素結合開裂を伴う開環フッ素化反応は電極反応のみならず一般の反応でも類を見ず、新しいフッ素化合物合成法として有用であるのみならず、今後種々のカルボニル化合物の電解フッ素化反応によるフッ素化合物合成への展開が期待できる。
心臓流出路を形成する細胞の発生分化と相互作用を制御する分子機構

心臓流出路の発生には、おもに二次心臓領域と心臓神経堤由来の2種類の心臓前駆細胞の働きが必須であるが、これらの細胞の相互作用によって正常な流出路が形成される機序はいまだ明確でない。私たちは、二次心臓領域に発現し、心臓神経堤細胞の遊走に関与する神経血管誘導因子・Sema3Cの発現制御機構を明らかにすることにより、流出路発生における両細胞間相互作用に関与する分子機構を解明した。Sema3CのenhancerにlacZ遺伝子を連結・導入したtransgenicマウスの解析とChIPおよびluciferase assayを組み合わせ、Sema3Cの上流直接活性化因子としてFoxc1/c2を、上流抑制因子としてTbx1を特定した。遺伝子改変マウスの解析によって、Tbx1の発現低下によりSema3Cが神経堤細胞に異所性に発現し、その遊走を障害することが示唆された。さらに両細胞間相互作用を担う候補タンパクの検討により、Tbx1のSema3C抑制機構は、心臓神経堤細胞において分泌因子Fgf8を介することが推定された。先天性心疾患は、出生約1%におこる最も頻度の高い先天異常の一つで、心臓発生の異常に起因する。近年、心臓の各領域の発生には、いくつかの由来の異なる前駆細胞が協調的に働くことが判明してきた。流出路の発生には2種の前駆細胞、二次心臓領域細胞(SHF)と心臓神経堤細胞(CNC)の働きが必須であるが、それらの細胞の相互作用によって正常な流出路が形成される機序はいまだ明確でない。研究代表者らは、転写因子Tbx1がSHFに発現し、Fox転写因子の制御を受け、Fgf8/10を介して、心臓流出路の発生に機能することなどを解明してきた今回、SHFに発現し、CNCの遊走に関与すると推測される神経血管誘導因子・Sema3cの発現制御機構を明らかにすることにより、流出路発生における細胞間相互作用の分子機構を解明することを目的として研究に着手した。Sema3c遺伝子の非翻訳領域にある保存性の高い配列をenhancer候補として抽出し、同配列に結合する転写因子をChIPおよびluciferase assayにより解析した。また、同定されたSema3cのenhancerにlacZ遺伝子を連結・導入したtransgenicマウスを作製し、胎生期のlacZ発現パターンを検討した。その結果、転写因子Foxcl/c2およびSox4がSema3cの5'enhancer領域に直接結合して転写を活性化し、Tbx1がSema3cの3'enhancer領域を介して転写を抑制した。また、Sema3cの3'enhancer配列にlacZ遺伝子を連結・導入したマウスでは、SHFに一致してlacZが発現し、Tbx1発現低下マウスとの交配により胎生10.5日に咽頭弓中胚葉におけるlacZの異所性発現亢進が認められた。よって、Tbx1によるSema3c発現抑制機構がin vivoでも確認された。研究代表者らは、SHFに発現し、CNCの遊走に関与すると推測される神経血管誘導因子・Sema3cの発現制御機構を明らかにすることにより、流出路発生におけるSHFとCNCの細胞間相互作用の分子機構を解明することを目的として研究を計画した。Sema3cのenhancerにlacZ遺伝子を連結・導入したtransgenicマウスの解析とChlPおよびluciferase assayを組み合わせ、Sema3Cの上流直接活性化因子としてFoxc1/c2およびSox4を、上流抑制因子としてTbx1を特定した。さらに、Foxc1/c2によるSema3Cの活性化機構とTbx1によるSema3Cの抑制機構に関して、Foxc1/2ノックアウトマウスおよびTbx1発現低下マウスを用いてin vivoで解析した。Foxc1/2はSema3CのSHFにおける正常な発現を活性化する一方、Tbx1の発現低下により、Sema3Cは正常で発現するSHFだけでなく、CNCにも異所性に発現し、その結果CNCの遊走が停止し、心臓流出路へ到達できないことが示唆された。

さらに、Sema3C、Fgf8、Bmp4タンパクおよび抗体を胚に添加する実験の結果、Tbx1によるSema3Cの抑制機構は、SHFによる直接的作用と、CNCではFgf8を介する作用であることが推定された。先天性心疾患は、出生約1%におこる最も頻度の高い先天異常の一つで、心臓発生の異常に起因する。流出路の発生には2種の前駆細胞、二次心臓領域細胞(SHF)と心臓神経堤細胞(CNC)の働きが必須であるが、それらの細胞の相互作用によって正常な流出路が形成される機序はいまだ明確でない。研究代表者らは、SHFに発現し、CNCの遊走に関与すると推測される神経血管誘導因子・Sema3cの発現制御機構を明らかにすることにより、流出路発生におけるSHFとCNCの細胞間相互作用の分子機構を解明することを目的とした。Sema3cのenhancerにlacZ遺伝子を連結・導入したtransgenicマウスの解析とChIPおよびluciferase assayを組み合わせ、Sema3Cの上流直接活性化因子としてFoxc1/c2を、上流抑制因子としてTbx1を特定した。Tbx1の発現低下によりSema3CがCNCに異所性に発現し、その結果CNCの遊走が停止することが示唆された。Tbx1はSHFでは直接作用により、またCNCに対しては分泌因子Fgf8を介してSema3Cの発現を抑制した。これらの結果により以下の時間・空間特異的遺伝子発現による前駆細胞制御機構が明らかになった:1)咽頭弓SHFないし心臓流出路遠位では、Tbx1が発現してSema3Cの発現を抑制する。2) SHFから分泌されるTbx1の下流標的因子Fgf8が、周辺のCNCを未分化、遊走状態に維持する。3)一方、流出路近位部では、Gata6とFoxc1/c2によりSema3Cの発現が活性化され、遊走してきたCNCを流出路近位部へと誘導する。4) Sema3C陽性の流出路近位部に到達したCNCは、流出路中隔細胞に分化し、同時にSema3Cを発現し、次々にCNCを誘導する。以上の機構により、正常な流出路中隔の形成が進行することが推定される。研究目的に沿って研究計画・方法にかかげた平成22年度分については、概ね達成し、平成23年度以降分としてかかげた計画に関連する部分を残すのみである。平成23年度以降分の研究計画の中でTbx1に関連する部分は達成している。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は、平成2223年度に得られた実験結果を発展させ、Sema3Cの上流因子の検索および分子機序解明に焦点して推進する。Tbx1に関連する部分がオーバーラップするため、網羅的解析よりも候補遺伝子に特化した実験に重点を置き、確固たる成果を得る。GATA6と相互作用する因子の同定、小型魚類の心臓流出路形成細胞の解析をすでに開始しており、年度中に実験を終了し論文投稿できるよう推進する。
新規アコニターゼX酵素の機能解析

本最終年度は、さらなるAcnXの性質や反応触媒機構の解明を目的としてX線結晶構造解析を行った。大腸菌の系を用いて調製したアグロバクテリウム由来AcnXについて結晶化に成功し,得られた結晶から大型放射光施設SPring-8にて回折データを収集した。セレノメチオニンを利用したSAD法により位相を決定し,最終的に1.6 Å分解能での構造決定に成功した。予想外なことに、一次構造も基質構造も全く類似点がないのに、AcnXの立体構造は既知のアコニターゼ酵素と驚くほど似ていた。一方で、既知のアコニターゼ酵素が活性中心に[4Fe-4S]クラスターを保持しているのに対し,AcnXには予想外にも[2Fe-2S]クラスターが存在することが明らかになった。また、他のアコニターゼとの比較からAcnXのS70が塩基触媒としてC3LHypのα-プロトンを引き抜く役割を担うことが示唆された。さらに,AcnXのSer70Ala不活性変異体とC3LHypの共結晶を作製し,C3LHyp結合型AcnXの結晶構造を2.0 Å分解能で決定した。C3LHypのα-炭素はAla70の近くに位置し,3位ヒドロキシ基は[2Fe-2S]クラスターの鉄原子に配位していた。以上のことから,AcnXのS70によりC3LHypのα-プロトンが引き抜かれ,3位ヒドロキシ基が[2Fe-2S]クラスターの鉄原子の一つに移る,という反応触媒機構が示された。本年度は、以下の3項目について研究を遂行した。1シス-3-ヒドロキシ-L-プロリン(C3LHyp)脱水酵素の触媒メカニズムの解明:アコニターゼX(AcnX)には他のアコニターゼ酵素における4Fe-4S鉄硫黄クラスター結合部位である3つのシステインが保存されていない。そこで、連携研究者である田嶋邦彦氏(京都工芸繊維大学)と共同でESR測定を行った結果、単核鉄の存在を示唆する結果を得た。また、部位特異的変異体の結果から、推定結合部位として2個のシステインと1個のグルタミン酸残基を同定した。2AcnX遺伝子の生理学的意義の解明:AcnX遺伝子を持つ緑膿菌は、トランス-4-ヒドロキシ-L-プロリン(T4LHyp)を唯一の炭素源とする最少培地ではよく生育するが、C3LHypでは増えない。リアルタイムPCRの結果、C3LHypはAcnX遺伝子は誘導するが、次の反応を触媒するPyr2C還元酵素遺伝子がほとんど発現していないことが分かった(この遺伝子はT4LHypで誘導される)。T4LHypとの共存下では培地中のC3LHypの消費が促進されることから、この仮説は裏付けられた。3真核微生物と古細菌由来のAcnXの機能解析:本年度はまず、Trichoderma reesei(糸状菌)のAcnX遺伝子の解析を行った。組み換えタンパク質の解析の結果、C3LHyp脱水酵素として機能することが分かった。成果として、トップジャーナルであるScientific Reportsへ掲載された。トップジャーナルであるScientific Reportsへ掲載された。1アコニターゼX(AcnX)には、単一ポリペプチド鎖からなるタイプIと、大小2本ポリペプチド鎖からなるタイプIIが存在する。これまでの機能解析はタイプIに限られていたが、本年度は窒素固定細菌Azospirillum brasilenseNBRC 102289の持つタイプII型AcnXに注目した。この遺伝子がトランス-4-ヒドロキシ-L-プロリン(T4LHyp)代謝遺伝子クラスターからは遠く離れた位置にある。大腸菌を用いて発現させニッケルアフィニティカラムで精製した組み換えタンパク質を用いた解析の結果、タイプIと同じシス-3-ヒドロキシ-L-プロリン(C3LHyp)脱水酵素として機能することを明らかにした。2A. brasilenseNBRC 102289が、T4LHypとT3LHypだけでなく、C3LHypを唯一の炭素源とする最少培地でも良好に生育することを見出した。これはC3LHypの生物学的分解の世界で初めての報告例である。定量PCRの解析の結果、AcnX遺伝子はC3LHypで誘導され、その破壊株では生育能が消失したことから、C3LHyp代謝における重要な生理学的意義が証明された。また、同一の還元酵素の関与するT3LHyp・D-プロリン・D-リジン代謝とも密接にリンクしていることが明らかとなった。3いくつかのタイプI酵素を用いて、結晶化を試みた。この結果、アグロバクテリウム菌由来のもので良質な結晶を得ることに成功した。この結晶は精製酵素と同様に茶色であり、活性中心に鉄イオンが保持されたホロ型であると考えられる。現在は、大型放射光施設SPring-8でX線回折データ収集を行っている。これまでのタイプIに加えタイプIIの機能解析に成功したこと、そしてその機能がC3LHyp代謝に実際に関わっていることを証明できた点が大きい。細菌由来のタイプIIはアミノ酸配列の相同性からみると実はタイプIに近いので、同じC3LHyp脱水酵素活性を持つことは自然であるといえる。これで、機能が分からないものは古細菌の持つタイプIIのみとなった。AcnXの持つC3LHyp脱水酵素の触媒機構を明らかにするため、類推した鉄イオン結合部位や基質結合部位に対する部位

特異的変異体を多数作製し解析を行ってきた。しかしアミノ酸配列に基づく試みには限界があることから、立体構造決定が不可欠であると考え、当初計画にはなかったものの結晶化に着手し予想以上の速さで良質な結晶を得ることができた。最終年度である次年度には世界で初めてAcnXの構造を決定できるだろう。本最終年度は、さらなるAcnXの性質や反応触媒機構の解明を目的としてX線結晶構造解析を行った。大腸菌の系を用いて調製したアグロバクテリウム由来AcnXについて結晶化に成功し,得られた結晶から大型放射光施設SPring-8にて回折データを収集した。セレノメチオニンを利用したSAD法により位相を決定し,最終的に1.6 Å分解能での構造決定に成功した。予想外なことに、一次構造も基質構造も全く類似点がないのに、AcnXの立体構造は既知のアコニターゼ酵素と驚くほど似ていた。一方で、既知のアコニターゼ酵素が活性中心に[4Fe-4S]クラスターを保持しているのに対し,AcnXには予想外にも[2Fe-2S]クラスターが存在することが明らかになった。また、他のアコニターゼとの比較からAcnXのS70が塩基触媒としてC3LHypのα-プロトンを引き抜く役割を担うことが示唆された。さらに,AcnXのSer70Ala不活性変異体とC3LHypの共結晶を作製し,C3LHyp結合型AcnXの結晶構造を2.0 Å分解能で決定した。C3LHypのα-炭素はAla70の近くに位置し,3位ヒドロキシ基は[2Fe-2S]クラスターの鉄原子に配位していた。以上のことから,AcnXのS70によりC3LHypのα-プロトンが引き抜かれ,3位ヒドロキシ基が[2Fe-2S]クラスターの鉄原子の一つに移る,という反応触媒機構が示された。AcnXには、単一ポリペプチドのタイプIと2つのポリペプチドからなるタイプIIがある。本年度は細菌とカビのタイプIについて解析が終了したが、タイプIIの機能および生理学的意義についてはいまだ未解明である。最近になって、C3LHypを唯一の炭素源に非常によく生育する細菌を発見し、それがタイプII型AcnXを持つらしい証拠を得ている。上述のようにタイプI型を持つ緑膿菌では生理学的役割が不明瞭であるため、この細菌を用いることでさらなる研究の深化が可能になると考えている。予想以上の進捗により申請当初の計画はおおむね達成の見込みとなったことから、最終年度はAcnXのX線結構構造解析に全力を挙げる。PDBにはAcnXとアミノ酸配列の相同性を示す構造は登録されておらず、分子置換法は使えないと考えられる。そこで、活性中心の鉄あるいはセレノメチオニンを用いたSAD法のいずれかを用いる。すでに両方の方法に使うことのできる良質な結晶を得ていることから実験には支障がなく、ネイティブ構造については間違いなく決定できると考えている。結晶が茶色であることからみて活性中心の鉄は保持されている。前年度に、京都工芸繊維大の田嶋邦彦教授と共同でさらに精度の高い電子スピン共鳴(ESR)測定を行った。立体構造がこうした分光学的データをよく説明できるかどうか検証する。
分光光度計測に基づく河川水中の有機物と栄養塩の総合モニタリング手法の開発

河川等における有機物や栄養塩等の水質計測・モニタリングは水圏・地圏の物質動態に関わる科学分野から公共用水域の環境管理分野に至る幅広い場面で必要とされる基本的技術である。従来の水質計測・モニタリングには定期的採水等に基づく室内分析や現場設置型の自動分析装置が用いられてきたが、前者は多大な労力を要するにもかかわらず現象の動的変動特性が十分に把握できず、また、後者は装置の設置・維持に多大な費用がかかるため多項目の総合的計測が困難という課題があった。そこで、本研究では、近年、小型化が進み現場利用が可能となってきた分光測定技術(spectroscopy)を活用して、高時間解像度で精度よく河川水中の有機物、リン、窒素の溶存態および懸濁態の濃度をモニタリングする新たな水質計測・定量化手法の確立を目指す。平成30年度においては、前年度に引き続き、霞ヶ浦の流入河川と多摩川を対象に、携帯型紫外可視分光光度計による吸光度スペクトルの現地計測、室内での吸光分析及び有機物・リン・窒素・浮遊物質に関する水質分析を行った。また、各種の多変量解析手法を用いて、吸光度スペクトルデータからSS及びCOD・総リン・総窒素・硝酸態窒素等の濃度を定量する手法の検討を行った。最初に検討した手法は、Lasso、主成分回帰法、Stepwise法で、入力には計測された吸光度スペクトル(220nm735nm, 2.5nm間隔)の微係数を与えた。これらの手法により学習データに対して良好な回帰結果が得られることがわかったが、未学習データに対しては再現性が劣っていたことから、未学習データに対する再現性を確保できる新たな手法を検討した。その結果、予め定めた最適スペクトルバンド数の吸光度の生データにPLSR(部分最小二乗法)を適用することで、学習データによる回帰結果と同等程度で未学習データの再現性が得られることを明らかにした。当初、実河川に計測機器を据え置きして長時間のモニタリングを予定していたが、機器の設置許可上の問題から、据え置きを断念せざるを得なかった。一方、機器のレンタル期間中、台風24号の上陸に伴う出水イベントを捉えて高い濁度のときの計測データが得られたことから、このデータを解析に有効活用することができた。このように、当初想定していた計画どおりとはならなかった点はあるが、来年度、短期間だけの連続計測であればまだ実施可能性は残されているので、この点については来年度検討を行うという判断をした。よって、現段階では概ね順調に進んでいると判断される。今後は、再度、機器をレンタルして計測を行い、検証データを増やすとともに、吸光度スペクトルの時系列データから、有機物、リン、窒素の溶存態・懸濁態の濃度を定量化する。また、これまで霞ヶ浦流入河川流域等に適用してきた分布物理型の水・物質循環モデルの解析結果やニューラルネットワークによる推定結果とも比較しながら、新たな手法により作成される時系列情報の優位性について検証を加える。最後に、3年間の検討成果をとりまとめ、分光光度計測に基づく河川水中の有機物と栄養塩の総合モニタリング手法を提案する。平成29年度においては、水質特性の異なる複数河川を対象に吸光度スペクトルの現地計測と室内分析及び各種水質分析を行い、吸光度スペクトルの現地計測性能を評価するとともに、吸光度スペクトルデータから浮遊物質及び溶存態と懸濁態の有機物・リン・窒素を定量する手法の検討を行った。対象河川としては、霞ヶ浦に流入する富栄養化河川(7河川)に加えて、多摩川と相模川を対象とした。これらの河川で平水時と洪水時に携帯型の紫外可視分光光度計による吸光度スペクトル計測を行うとともに、河川水試料の栄養塩・有機物・浮遊物質濃度について分析を行った。また、室内での吸光分析も実施した。これらのデータをもとに、重回帰分析(部分最小二乗法)を用いた水質の定量化を試みた。その結果、適切にキャリブレーションを行うことでいずれの水質項目も良好に同定できることが明らかとなった。比較的濁りの少ない平水時のみならず高濁度を呈する洪水時のサンプルも台風時の計測で取得され、幅広い条件で多様な河川のデータが得られた。得られたサンプル数には限界があったものの、データ解析手法の適用性について予定通り検討を行うことができた。

従来の水質計測・モニタリングには定期的採水等に基づく室内分析や現場設置型の自動分析装置が用いられてきたが、前者は多大な労力を要するにもかかわらず現象の動的変動特性が十分に把握できず、また、後者は装置の設置・維持に多大な費用がかかるため多項目の総合的計測が困難という課題があった。そこで、本研究では、近年、小型化が進み現場利用が可能となってきた分光測定技術(spectroscopy)を活用して、高時間解像度で精度よく河川水中の有機物、リン、窒素の溶存態および懸濁態の濃度をモニタリングする新たな水質計測・定量化手法の確立を目指す。平成30年度においては、前年度に引き続き、霞ヶ浦の流入河川と多摩川を対象に、携帯型紫外可視分光光度計による吸光度スペクトルの現地計測、室内での吸光分析及び有機物・リン・窒素・浮遊物質に関する水質分析を行った。また、各種の多変量解析手法を用いて、吸光度スペクトルデータからSS及びCOD・総リン・総窒素・硝酸態窒素等の濃度を定量する手法の検討を行った。最初に検討した手法は、Lasso、主成分回帰法、Stepwise法で、入力には計測された吸光度スペクトル(220nm735nm, 2.5nm間隔)の微係数を与えた。これらの手法により学習データに対して良好な回帰結果が得られることがわかったが、未学習データに対しては再現性が劣っていたことから、未学習データに対する再現性を確保できる新たな手法を検討した。その結果、予め定めた最適スペクトルバンド数の吸光度の生データにPLSR(部分最小二乗法)を適用することで、学習データによる回帰結果と同等程度で未学習データの再現性が得られることを明らかにした。当初、実河川に計測機器を据え置きして長時間のモニタリングを予定していたが、機器の設置許可上の問題から、据え置きを断念せざるを得なかった。一方、機器のレンタル期間中、台風24号の上陸に伴う出水イベントを捉えて高い濁度のときの計測データが得られたことから、このデータを解析に有効活用することができた。このように、当初想定していた計画どおりとはならなかった点はあるが、来年度、短期間だけの連続計測であればまだ実施可能性は残されているので、この点については来年度検討を行うという判断をした。よって、現段階では概ね順調に進んでいると判断される。来年度は、より多くの実河川におけるスペクトルデータと水質分析の結果を得ることで、重回帰分析手法の検討を更に進めて行く。また、当初の計画通り、実河川にセンサーを設置して、比較的長期間のモニタリングを行う予定である。今後は、再度、機器をレンタルして計測を行い、検証データを増やすとともに、吸光度スペクトルの時系列データから、有機物、リン、窒素の溶存態・懸濁態の濃度を定量化する。また、これまで霞ヶ浦流入河川流域等に適用してきた分布物理型の水・物質循環モデルの解析結果やニューラルネットワークによる推定結果とも比較しながら、新たな手法により作成される時系列情報の優位性について検証を加える。最後に、3年間の検討成果をとりまとめ、分光光度計測に基づく河川水中の有機物と栄養塩の総合モニタリング手法を提案する。吸光光度計のレンタル費用を想定よりも安く抑えることができたこと、および、当初想定した規模の出水が数多くは生起しなかった分、予定の調査費用が出費されなかったため。この分はH30年度の調査等で支出されるとともに、成果の発表等でも使用する予定である。
地中海都市におけるイスラムと「ヨーロッパ」

当該課題についての研究第一年次にあたり、まずわが国における研究経過とその現段階について精査を行った。予想されたとおり、国内における研究成果は僅少であるが、なかんずく痛感されたことは、海外において蓄積された研究とその文献についても、十分の参照が行なわれてこなかったことである。そのため、重要な作業として、国の内外における関連文献目録を作成することが必須と認められた。この作業自体、膨大なものと予想されるが、幸いパーソナル・コンピューターの機能的向上によって達成が可能との見通しがついたため、当初の交付申請書による予定を急拠変更して、パソコンを設備備品として購入し、予備的、試験的作業を開始した。同作業は第二年次に本格的に遂行されるはずである。また同パソコンは、同時に重点領域研究の全国ネットワークと接合させ研究成果の交換に資している。研究計画は、ほぼ予定どおりの日程で進行した。研究代表者・研究協力者は、それぞれの役割分担に即して資料の収集・分析にあたった。これに並行して共同研究会を催し、報告と討議を行った。研究会は前後5回にわたり、研究グループ外のメンバーを含めてのべ40数名の参加をみて予想外の成果を収めた。当面の課題は、イスラームとヨーロッパとが接触した歴史的経過につき、研究史上の総括、および分析視角の吟味であった。初期イスラームによるヨーロッパ支配の進行,十字軍・東西貿易等による相互接触,近代以降におけるヨーロッパの植民地化政策の、以上3者を基本テーマとみなし、最後に現在における実状把握を加えることとした。前者については、これまでの資料整理の不足、分析視角についての基本的差異が認識された。後者については、別途実施された現地調査が行われ、実状調査と歴史研究との接合の必要性と可能性とが見出され、有用な情報が提供された。
ダイレクトリプログラミング法を用いて作製した肝細胞様細胞の成熟化とその応用

肝臓を構成するする細胞のうち、肝細胞は7-8割を占めており、生体の恒常性維持に極めて重要な機能を担っている。しかしながら、初代肝細胞を機能維持させたまま長期培養することは極めて困難である。よって、肝細胞を用いたin vitroにおける基礎研究や創薬、疾患解析、再生医療には初代肝細胞に替わる新たな細胞供給源が必要である。これまでに我々はiPS細胞などを介すことなく、マウス線維芽細胞に転写因子であるHnf4αとFoxa1-3(いずれか一つ)の二因子を導入することで、直接的に肝細胞様細胞(induced hepatocyte like cells : iHep細胞)を誘導することに成功した。詳細な解析の結果、平面培養下におけるiHep細胞は肝細胞特有の機能や増殖能を有するが、初代肝細胞に比べて肝機能マーカーの発現が十分でなく、また胎仔肝細胞マーカーを発現していることが明らかになった。今後の応用性から、iHep細胞のより高度な肝機能の獲得が望まれる。そこで本研究では新規培養法によるiHep細胞の成熟化を試みた。その結果、胎仔肝細胞マーカーの顕著な発現低下だけでなく、肝機能遺伝子の発現を大幅に上昇させることに成功した。次に我々は新規培養法によるiHep細胞の成熟化メカニズムの解明を試みた。これまでにいくつかのシグナル分子に注目して解析を行ったところ、成熟化を制御する因子の同定に成功した。現時点までに細胞生物学的及び分子生物学的手法を用いることで成熟化の一連の流れを明らかにした(論文投稿準備中)。この因子が関わるシグナル伝達経路は生体の恒常性維持に極めて重要であり、その破綻は疾患と密接に関わることから、今後もさらに詳細な解析が必要である。28年度が最終年度であるため、記入しない。初代肝細胞は肝機能維持させたまま長期培養することが困難である。よって、肝細胞を用いた基礎研究や創薬、疾患解析、再生医療には初代肝細胞に替わる新たな細胞供給源が必要である。我々はマウス線維芽細胞に転写因子であるHNF4αとFoxa1-3(いずれか一つ)の二因子を導入することで、iPS細胞などを介すことなく直接的に肝細胞様細胞(induced hepatocyte like cells : iHep細胞)を誘導することに成功した。平面培養下におけるiHep細胞は肝細胞特有の機能や増殖能を有するだけでなく、in vivoにおいては致死性肝障害モデルマウスの致死率を改善する。しかしながら、平面培養下ではマウス初代肝細胞に比べて肝機能マーカーの発現が低く、胎仔肝細胞マーカーを発現していることから、より高度な肝機能の獲得が望まれる。また、in vivoにおける解析では新規移植法を確立し、肝組織を再構築することも可能であった。この因子が関わるシグナル伝達経路は生体の恒常性維持に極めて重要であり、その破綻は疾患と密接に関わる。今後はシグナル分子の過剰発現やノックダウンを行うことで、どのように成熟化を制御しているのかを解析する。本研究ではiHep細胞の新規培養法を確立することによって肝機能マーカーの発現を顕著に上昇させることに成功した。さらにこのメカニズムの解析においては、成熟化を制御する新規因子を同定した。現在、この因子がどのように成熟化を制御しているのかを詳細に検証中である。以上のように、これまでにiHep細胞の課題点を克服することに成功した。また、成熟化メカニズムの解明にも取り組めていることから、進捗状況はおおむね順調といえる。

この因子が関わるシグナル伝達経路は生体の恒常性維持に極めて重要であり、その破綻は疾患と密接に関わることから、今後もさらに詳細な解析が必要である。これまでにiHep細胞を成熟化させるための方法を検証をしてきた。現在では最適な新規培養法を確立できているため、今後は成熟化のメカニズムの解析を詳細に行う予定である。方法としては同定した新規因子の細胞生物学的および分子生物学的解析を行う。同定した因子は生体の恒常性維持に極めて重要であるため、iHep細胞内における挙動を詳細に解析することで今後は創薬、疾患解析など様々な領域への応用を試みる。28年度が最終年度であるため、記入しない。
モンゴル語母音調和の音声学・音韻論的研究－その獲得・類型をさぐる－

本年度の成果としてまず挙げられるのは,昨年度から引き続き行っているモンゴル語の母音調和の音声的側面からの追究である。具体的には,実験によってより詳細に母音調和とそれに関わる音韻的現象がどのように音声的に現れているかを調べるということである。本年度内においてはこれについて本実験を行うまでには至っていないが,先行研究でも明らかにされている部分は決して多くはなく,未だ研究の余地の大きい領域であると言える。これに加え,本年度はモンゴル語諸方言間の比較を中心とする言語類型論的側面からの追究も試みた。具体的には,各方言においてどの母音・素性が調和の対象となるか,あるいは調和を阻害する要因となるかを比較することである。しかしながらモンゴル語の諸方言は未だ十分な調査をなされていない方言も多く,公表に値する成果とするには継続した調査・研究が必要と考えられる。また,本年度は本研究課題の最終年度であるため,この3年間の研究のまとめを試みた。具体的には,研究開始当初から明らかであった課題と研究を進めていくうちに発見された課題を挙げ,現時点でその課題に対してどのような解決が見つかっているか,あるいは見つかっていないかということをまとめることである。本年度中には2013年12月に東京音韻論研究会においてモンゴル語の母音の基底表示についての発表をしたのみにとどまっているが,それ以外の部分についても今後論文等の形式で公表することを目指している。(抄録なし)申請書にもあるように,本研究は理論的枠組として現代の音韻論において主流となっている理論の1つである最適性理論(以下OT)を採用するとしているが,より研究の目的に適った枠組みの探求を放棄しているわけではない。特に本年度ではミニマリスト・プログラム(以下MP)の枠組みに基づく母音調和の分析に対して検討を加えた。この成果については2011年11月に東京音韻論研究会で発表を行ったが,さらに日本英語学会からの懲懸を受けて執筆したLocality in Vowel Harmony(Nevins 2010)の書評という形でもまもなく発表される予定である。子どもの言語の獲得についての研究は非常に盛んに行われているが,その中でも母音調和の獲得についての研究は非常に少ないというのが現状である。本年度は現地調査およびその後の分析に向けた理論的側面の研究,とりわけOTに基づいた文法獲得のアルゴリズムから予測される子どもの獲得のパターンについて分析を行った。この成果については2012年2月に第7回音韻論フェスタにて発表を行った。2012年の3月に本助成事業の補助を受けて約2週間の現地調査をモンゴル国ウランバートル市にて行った。渡航前に予測できなかった事象や準備不足もあり,今回の調査単独で発表できる成果は得られなかったと言わざるをえないが,今回の反省等を次年度以降に予定している調査に生かして成果としたいと考えている。本年度の成果として挙げられるのは本研究の主な対象言語であるモンゴル語の音韻的解釈,特に韻律についての新たな解釈の提案である。モンゴル語は日本語や英語のように韻律による語の意味の対立が見られないため,様々な分析が提唱されている。本研究ではこのモンゴル語の韻律的な側面をより詳細まで明らかにすることでモンゴル語の分析,さらには本研究の主な目的である母音調和の研究に役立てることとした。具体的には,従来は語の最初の母音が比較的強くはっきりと発音されることで多くの研究においてストレスがあるとみなされてきたが,これは母音調和が最初の母音の性質を基準に調和を起こすという機能的な要請からそのように発音されているのであり,語の韻律として重要なのはむしろピッチの方であると分析した。この解釈については2012年8月に日本音韻論学会の音韻論フォーラム2012において発表したが,未だ論文という形式での発表には至っていない。また,前年度は本研究の主な研究の枠組みである最適性理論(Optimality Theory :以下OT)以外の研究枠組みによる分析の可能性を追求したが,本年度は主に最新のOTによる分析を中心とした理論的研究を試みた。具体的には近年最適性理論の新たな枠組みとして提案された調和直列モデル(Harmonic Seriahsm)を用いた母音調和の分析である。このモデルは従来の並列的な計算のみによるOTでは解決できなかった問題を解決すべく発展しているものであるが,年度内にこのモデルを用いた独自の分析を提案するには至っていない。

具体的には,研究開始当初から明らかであった課題と研究を進めていくうちに発見された課題を挙げ,現時点でその課題に対してどのような解決が見つかっているか,あるいは見つかっていないかということをまとめることである。本年度中には2013年12月に東京音韻論研究会においてモンゴル語の母音の基底表示についての発表をしたのみにとどまっているが,それ以外の部分についても今後論文等の形式で公表することを目指している。研究実績の概要欄に述べたように,現地調査については準備不足などにより当初予定していたよりも成果を得ることが出来なかったが,それ以外の理論研究の部分については順調に進行していると考えている。またその現地調査についても次年度以降の調査への反省として生かせると考えられるので,研究全体としてはおおむね順調に進展していると評価できる。主な遅れとしては現地調査ができなかったことが挙げられる。これは現地協力者との折衝がうまくいかず渡航の日程調整ができなかったことが主な原因である。また,研究成果の発表も学会発表1件に留まり,論文という形での発表ができていないことも研究の遅れであると言える。モンゴル語の母音調和および子どもの母音調和の獲得についての理論的側面の研究は引き続き進めていく。そしてその理論的研究の成果を生かし,より成果のある現地調査を遂行したいと考えている。また,その研究の中で得られた成果の発表も積極的に行なって行きたい。従来行なってきた研究は引き続き行なっていくが,加えて次年度は研究を学会の場や論文の形で発表することに主眼をおいていきたい。また,現地調査により成果を挙げることも狙いたい。(抄録なし)
新しい筋電位駆動モータを用いた介護用ロボットアームの開発に関する研究

利用者の意思に沿って動作するパワーアシストスーツや筋電義手への利用を目的として、計測した筋電図から筋収縮のトリガーとなる活動電位(AP)を推定する方法を検討した。本研究では、筋収縮力を詳細に計算できるヒト骨格筋モデルを取り入れリアルタイムに信号処理をすることを目指した。マルチスレッドプログラミングを用いて実時間処理という形で行うことができた。実用化を検層する際には、PCよりも小規模な計算機でも処理できるようにモデルの計算を簡略化する必要があることが明らかになった。推定の政策差を向上さえるためのAP推定と筋肉群の分類方法を改善し定量的な評価が必要であることが明らかとなった。従来、ロボットは、主に工場などで産業用として利用されてきた。今後、少子高齢化が進む日本では、“老老介護"の支援など家庭で人間を対象とした需要が高まる。訓練を受けていない高齢者が操作できるためには、ヒトの動きにより近いコントロールシステムが不可欠である。我々の研究グループは、従来困難であったヒトの運動を十分再現できる新しい筋肉モデルを論文・国際会議で既に報告している。弾性要素と収縮要素の直列接続で構成されるHillらによるモデルは、簡易的に筋肉の収縮動作を近似できるために広く用いられている。しかし従来のモデルでは、実際の骨格筋の応答性を十分に再現することができない。研究分担者の田村らは、並列接続された二つのMaxwell要素からなる粘弾性的筋収縮モデルを提案し、従来までのバネを主体とした筋肉モデルとは異なり、ほとんどのヒト生体筋が示す非線形応答を統一的に再現できることを示してきた。本研究では多チャンネルSEMG測定回路を製作し、それらの信号強度から各筋肉群の活動単位(Motor Unit)の活性化率を推定する方法の確立をめざす。この推定された活動電位(Action Potential)を新しい筋肉モデルの入力とし、ヒトの運動を再現する。最終的には、よりヒトの動きに近い介護補助用ロボットアームの実現を目指す。人間が骨格を動かし身体活動をする時、関節を介して筋肉が収縮することで運動を行っている。この筋収縮過程は、脳から運動神経を伝搬し筋肉へ電気パルス刺激信号が到達することで生じる。この筋電位は、筋電義手や外骨格型パワーアシストスーツの入力として用いられ始めている。共同研究者の田村・斉藤は今までに、人間の複雑な非線形運動を再現できる筋肉モデルを今までに報告している。本研究は、新たに小型表面電極(電極径φ1mm)を用いた4チャンネルの表面筋電位(SEMG)測定回路を製作し干渉波形である筋電位波形から骨格筋運動単位(Motor Unit: MU)への電気刺激パルス(活動電位)を正確に検出することをめざし研究を行った。2行2列に配置された4チャネルSEMG測定波形から、運動神経に沿って伝搬する活動電位の遅延時間と、チャネル間の信号強度比を比較した。最大随意収縮力の15%程度の力を上腕二頭筋に発揮した時、測定されたSEMG波形の中に3つのMUからの信号を分離することができた。1秒間あたりの刺激パルスの発生割合(発火頻度)から、そのうちの一つは遅筋からの信号で、残り二つは速筋からの信号であると推測された。また、現有している多関節ロボットアーム(KINOVA社製、全長: 90cm, 6軸,最大可搬重量: 1.5kg, USB接続にてPCから制御可能, APIがメーカから提供)をパソコン(OS Windows8)から制御するための予備実験として、Visual Studio C++を用いた基本的な駆動プログラムの製作と動作の検証を行った。今後、得られた各MUからの活動電位波形を筋肉モデルの入力として数値計算を行い、それぞれの筋収縮力の総和を求め、ロボットアームへの出力指令値を計算しロボットアームを駆動する予定である。本研究では筋収縮力を詳細に計算できるヒト骨格筋モデルを取り入れリアルタイムに信号処理することを目指した。実用化を検討する際には、PCよりも小規模な計算機でも処理できるようにモデルの計算を簡略化する必要があることが明らかとなった。推定の正確さを向上させるためのAP推定と筋肉群の分類方法を改善し定量的な評価が必要であることが明らかとなった。ヒト筋肉変位の計測信頼性を高めるための実験手法を再検討し、そのシステムを試作するために外部業者へ装置の製作依頼をしたところ、設計・製作に予想以上に時間がかかり当初の予定内に製作が完了しなかった。

最終年度には、上腕二頭筋の筋収縮状態を非接触に評価するために、LEDを用いた13本のライン光を照射できるスリット光投影機を外部業者に作成を依頼し、最終年度にウェブカメラを用いた画像処理プログラムをOpenCVとPythonをもちいて自作し、ひずみゲージを用いた筋収縮力との相関を評価した。随意収縮の実験から、マルチレーザ光を用いた非接触筋表面高さ変化の定性評価は行うことができたが、定量評価を行うためには、今後治具を用いるなどの簡便なcalibration方法の検討がひつようである。定量評価が可能となることで、骨格筋モデルのパラメータを決定するために必要な、筋肉の低周波での粘弾性測定を非接触に行うことが可能となる可能性がある。さらに、スポーツトレーニングの指導や、筋肉の疲労評価などの分野でも利用が期待できると思われる。この成果は、論文誌(計測自動制御学会教育工学論文集Vol.40)へ現在投稿中である。利用者の意思に沿って動作するパワーアシストスーツや筋電義手への利用を目的として、計測した筋電図から筋収縮のトリガーとなる活動電位(AP)を推定する方法を検討した。本研究では、筋収縮力を詳細に計算できるヒト骨格筋モデルを取り入れリアルタイムに信号処理をすることを目指した。マルチスレッドプログラミングを用いて実時間処理という形で行うことができた。実用化を検層する際には、PCよりも小規模な計算機でも処理できるようにモデルの計算を簡略化する必要があることが明らかになった。推定の政策差を向上さえるためのAP推定と筋肉群の分類方法を改善し定量的な評価が必要であることが明らかとなった。平成26年度の研究計画は、『Recruitment Orderを考慮した複数の筋肉群からの活動電位の分離』であった。骨格筋を構成する二種類の筋肉である遅筋(slow twitch muscle)と速筋(fast twitch muscle)は、疲労耐性が異なる。遅筋の方が疲れ難く、速筋寄り身筋収縮に早く参加しする。より大きな筋収縮力を得るために、遅筋が収縮参加した後に速筋が収縮に参加する。このRecruitment Orderを筋電位波形からの活動単位推定を行う際に考慮することとした。4チャンネルのSEMG測定回路を設計・製作し、ヒト上腕二頭筋の等尺性随意収縮時の筋電位波形を測定した。最大随意収縮力(MVC)の15%程度の力を上腕二頭筋に発揮した時、3つのMUを推定した。上腕は遅筋と速筋の構成割合がほぼ等しく、Recruitement Orderが速く最初に収縮参加する遅筋は皮膚表面から深い位置に存在し、速筋は浅い所に存在することが既に知られている。本研究の実験結果でも、最初に観測されるMUからのSEMG信号波形の強度は小さいことから遅筋が先に運動参加していることが確認できた。大きな力を出すとともに参加し始めるSEMGは信号強度が高く、これは速筋であることが推測され既に報告されている結果と矛盾しない。また、本研究で推定された遅筋と速筋の発火頻度(パルス発生頻度)はそれぞれ約10Hzと約20Hzであった。これは、随意収縮時に脳から生成される電気刺激パルスが、遅筋と速筋とで異なるためであると考えらえる。
食後脂質代謝に対する希少糖プシコースの効果に関する研究

本研究は、果糖や果糖ブドウ糖液糖(HFS)による食後高脂血を防止する方策を明らかにすることを目的とした。果糖、HFSによる食後高脂血の増悪・遅延を、これらの甘味料を希少糖アルロースで置き換えて検討した。糖質代謝については脂肪と同時にアルロースを摂取した場合には、果糖やHFSと比べて優れていたが、脂質代謝については、これらと同様に食後代謝の遅延・増悪をきたした。市販の希少糖含有シロップ(RSS)では、HFSと比べて食後糖・脂質代謝に差は見られなかった。さらに、果糖やHFSによる食後高脂血に対する水溶性食物繊維、難消化性デキストリン(RMD)の効果を検討したが、有意な抑制効果は見られなかった。食生活の欧米化に伴い、日本人の脂肪摂取量は増加している。とくに食後脂質代謝の増悪および遷延、即ち、食後の血中トリグリセライド値は、空腹時の値よりも動脈硬化性疾患の危険因子として重要であることが示されている。これまでの我々の研究では、甘味料として広く用いられている果糖および果糖ブドウ糖液糖が食後脂質代謝の有意な増悪・遷延因子として働くことを示した。一方、希少糖プシコース(アルロース)には、糖代謝を改善し、糖尿病を予防する効果が期待されている。本研究では、果糖や果糖ブドウ糖液糖の健康に対する影響、取り分け、若年者の健康に対する悪影響を防止するためにプシコースを活用することを目的とする。H27年度は、プシコースの食後脂質代謝に対する影響を、果糖、ショ糖と比較検討した。健常若年女性を対象に、前日の22時以降、12時間以上絶食とし、翌朝、以下の試験飲料の1つを順不同、無作為交差法で摂取させた。1脂肪クリーム(1 g/kg、脂肪として0.35 g/kg)、2脂肪クリーム+プシコース(0.5 g/kg)、3脂肪クリーム+果糖(0.5 g/kg)、4脂肪クリーム+ショ糖(0.5 g/kg)。4回の試験は、性周期を考慮して、4週間隔で実施した。試験飲料摂取前(0)、0.5、1、2、4、6時間後の計6回採血し、血液成分を分析した。結果として、脂肪と同時にプシコースを摂取した場合には、脂肪と同時にフルクトースを摂取した場合と同様に、食後リポ蛋白および脂質代謝の遅延を引き起こす可能性が示唆された。一方、脂肪と同時にプシコースを摂取した場合には、脂肪のみを摂取した場合と比べて、血中グルコース、インスリン濃度に有意な影響はなく、果糖やショ糖と比べて、食後糖質代謝に対しては明らかに優れていた。当初の計画どおり、研究を遂行できた。現在、結果の詳細な検討を行っており、研究成果は本年の日本動脈硬化学会で発表し、英文論文としてまとめる予定である。とくに食後脂質代謝の増悪・遅延、即ち、食後血中トリグリセライド(TG)値は、空腹時の値よりも動脈硬化性疾患の危険因子として重要であることが示されている。これまでの研究で、甘味料として広く用いられている果糖および果糖ブドウ糖液糖(HFS)が食後脂質代謝を著明に増悪・遅延させることを示した。一方、希少糖のD-プシコース(アルロース)は、糖代謝を改善し、糖尿病を予防する効果が期待されている。本研究は、果糖やHFSの、とくに若年者の健康に対する悪影響を防止するためにプシコースを活用することを目的とした。昨年度の研究では、食後脂質代謝に対するプシコースの影響を果糖およびショ糖と比較検討したが、脂肪と同時にプシコースを摂取した場合には、脂肪と同時に果糖を摂取した場合と同様に、食後リポ蛋白及び脂質代謝の遅延を引き起こす可能性が示唆された。一方、糖質代謝については、脂肪と同時にプシコースを摂取した場合には、脂肪のみを摂取した場合と比べて、血糖及びインスリン濃度に有意な影響はなく、果糖やショ糖に比べて明らかに優れていた。そこでH28年度は、一般に市販されている希少糖含有シロップ(RRS)を用いて検討を行った。健常若年女性を対象に、前日の夜から12時間以上絶食とし、1脂肪クリーム、2脂肪クリーム+RSS、3脂肪クリーム+HFS、4脂肪クリーム+ショ糖の4回の摂取試験を4週間ごとに無作為交差法で実施した。摂取前と0.5、1、2、4、6時間後に採血し、血液成分を分析した。結果として、2、3、4では、血糖とインスリンが有意に上昇したが、3群間で有意差はなかった。また、食後TGの上昇も3群間で有意差はなく、1に比べて有意に高値で遅延を示した。以上、HFSやショ糖と比べて、RSSには食後糖・脂質代謝に対する優位性は認められなかった。当初の計画どおり、研究を遂行することができた。現在詳細な分析および検討を行っており、研究成果は希少糖研究会、日本動脈硬化学会等で発表し、論文としてまとめる予定である。食後脂質代謝、即ち、食後の血中トリグリセライド(TG)値上昇は、空腹時の値よりも動脈硬化性疾患の危険因子として重要であることが示されている。これまでの我々の研究で、甘味料として広く用いられている果糖および果糖ブドウ糖液糖(HFS)が食後脂質代謝を著明に増悪・遅延させることを示した。一方、希少糖の一つ、D-プシコース(アルロース)については、糖代謝を改善し、糖尿病を予防する効果が期待されている。

本研究は、果糖やHFSの、とくに若年者の健康に対する悪影響を防止するための方策を明らかにすることを目的とし、これまで2年間の研究で以下のことを明らかにした。1食後脂質代謝に対するプシコースの影響を、果糖およびHFSと比較検討した。糖質代謝については、脂肪と同時にプシコースを摂取した場合には、脂肪のみを摂取した場合と比べて血糖及びインスリン濃度に有意な影響はなく、果糖やショ糖に比べて明らかに優れていた。一方、脂肪と同時にプシコースを摂取した場合には、脂肪と同時に果糖を摂取した場合と同様に、食後リポ蛋白代謝の遅延・増悪を来すことを示した。2市販の希少糖含有シロップ(RSS)を用いて、同様にHFSやショ糖と比較検討を行ったが、RSSの優位性を見出すことはできなかった。そこで最終年度には、果糖の食後脂質代謝に対する害を、果糖をプシコースで置換することによって防止しようとするこれまでの発想を転換し、果糖の害を他の物質で予防できるか否かを検討した。食後の高血糖・高脂血を軽減できる可能性が示唆されている水溶性食物繊維である難消化性デキストリン(RMD)に注目し、1脂肪クリームのみ、2脂肪クリーム+RMD、3脂肪クリーム+果糖、4脂肪クリーム+果糖+RMDの計4回の摂取試験を行い、果糖による食後高脂血に対するRMDの効果を検討した。しかし、RMDは果糖による食後TG値上昇の増悪を抑制できなかった。本研究は、果糖や果糖ブドウ糖液糖(HFS)による食後高脂血を防止する方策を明らかにすることを目的とした。果糖、HFSによる食後高脂血の増悪・遅延を、これらの甘味料を希少糖アルロースで置き換えて検討した。糖質代謝については脂肪と同時にアルロースを摂取した場合には、果糖やHFSと比べて優れていたが、脂質代謝については、これらと同様に食後代謝の遅延・増悪をきたした。市販の希少糖含有シロップ(RSS)では、HFSと比べて食後糖・脂質代謝に差は見られなかった。さらに、果糖やHFSによる食後高脂血に対する水溶性食物繊維、難消化性デキストリン(RMD)の効果を検討したが、有意な抑制効果は見られなかった。H28年度は、実際に甘味料として頻用されている果糖ブドウ糖液糖(HFS)やショ糖と、新たに開発された希少糖含有甘味料(RSS)とを比較検討する。H27年度と同様に、脂肪クリームと同時にこれらの飲料を摂取した場合の食後糖・脂質代謝を検討する。健常若年女性を対象に、前日の22時以降、12時間以上絶食とし、翌朝、以下の試験飲料の1つを順不同、無作為交差法で摂取させる。1脂肪クリーム(1 g/kg、脂肪として0.35 g/kg)、2脂肪クリーム+RSS(0.5 g/kg)、3脂肪クリーム+HFS(0.5 g/kg)、4脂肪クリーム+ショ糖(0.5 g/kg)。4回の試験は、性周期を考慮して、4週間隔で実施する。試験飲料摂取前(0)、0.5、1、2、4、6時間後の計6回採血し、血液成分を分析する。H28年度は、実際に甘味料として用いられている果糖ブドウ糖液糖やショ糖と、新たに開発されて市販されている希少糖含有甘味料である希少糖含有シロップ(RSS)とを比較検討した。しかし、食後の糖代謝および脂質代謝に対して、RSSの優位性を見出すことはできなかった。そこで、最終年度となるH29年度には、少し軌道修正する必要が生じた。
視床下部におけるプロテアーゼ阻害活性異常としての肥満病態の解明

視床下部は食欲だけでなく、自律神経遠心路を介して末梢臓器の糖・脂質代謝を調節する代謝制御中枢であり、肥満により生じる視床下部ニューロンのレプチン応答性障害(レプチン抵抗性)は肥満に伴う代謝異常の原因となる。申請者らは、高脂肪食による種々の程度の肥満マウスや遺伝性肥満ob/obマウスの視床下部のRNA-Seq解析を行い、遺伝子発現レベルがレプチン抵抗性と強い相関を示す、内在性セリンプロテアーゼ阻害分子、SerpinA3を同定した。本研究では、in vitroレプチン感受性評価システムと、遺伝子改変マウスを用いて、SerpinA3がエネルギー代謝恒常性と肥満病態の発症に及ぼす影響の解析を目指した。さらに、SerpinA3の分子機能とレプチン抵抗性を結ぶ分子機序を解明し、視床下部機能異常としての肥満の病因・病態の解明を目指した。当初の研究計画のうち、SerpinA3の発現分布をマイクロダイセクションサンプルの定量PCRと免疫染色により解析し、弓状核のニューロン、特にPOMCニューロンとドパミンニューロンの一部にSerpinA3が発現していることを蛍光二重染色により解明した。さらにSerpinA3の発現亢進が活性の亢進を伴うのか、またレプチン抵抗性発症の原因となるのかを解析する目的で、SerpinA3の遺伝子改変マウスの作製を行い、floxマウスラインの樹立や過剰発現トランスジェニックマウスのコンストラクトの作製に成功した。第3に培養細胞株へのリコンビナントSerpinA3タンパク質の添加実験を行い、SerpinA3によるニューロン機能等への影響を明らかにした。本研究はこれまで順調に進捗し、予定通りの成果を挙げてきた。しかし、研究代表者が公的学術研究機関での研究員職を離職することとなったため、止む無く研究機関途中での廃止に至った。