hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
「アプローチ・カリキュラム」を用いた幼保小の接続に関する研究

現状としては、「個別就学」と「集団就学」の2つのシステムが併存する形が採られており、2018年度中に「一斉就学」について具体的な方向性が示される運びとなっている。勤務校の異動が関係し、今年度はニュージーランドでの実地調査が叶わなかったが、代わりに日本での調査に重点を置いたことに加え、前年度に収集した情報の整理に努めたことで当初予定していた研究計画に大きな支障は出ないと判断したため。2018年度は、論文執筆を通しての成果報告に加え、ニュージーランドと秋田県で継続調査を行った。論文ではニュージーランドの保育・幼児教育を取り巻く状況を、カリキュラムと小学校への移行過程に着目して検討した。まずカリキュラムについては、ニュージーランドのナショナル・カリキュラムと「質保障」との関連について検討し、ニュージーランドの幼児教育は知識経済に依拠した幼児教育政策の展開を試みようとする政府側の勢力と、確固たる哲学や展望を抱きそれを実現させようとする研究者・実践者側の勢力との対立軸を背景に色づけられてきたことが示された。次に保育施設から小学校への移行過程については、伝統的な「個別就学」から「集団就学」が採用されはじめた状況と課題について検討し、ニュージーランドにおける就学システムの移行過程は、地域が有する自主性や自立性を尊重する形で進められていることが明らかとなった。継続調査について、秋田県の調査では、小学校との連携についてカリキュラム作成の点から児童センターの関係者にインタビュー調査を行った。ニュージーランドでは、移行過程の実際、及び、その際用いるカリキュラムについて保育施設で調査を行うと共に、小学校で滑らかな移行を目的に設置されているNew Entrance Class(以下、NEC)を訪問した。ニュージーランドでは、小学校へ就学するとNECと呼ばれるクラスに所属する。NECの担当教員は就学前までに、保育施設への訪問や体験訪問での子どもの観察、保育関係者や保護者との意見交換、保育施設で作成されたポートフォリオやラーニング・ストーリーなどの保育記録の閲覧を通して、子どもが抱く興味や関心事、文化背景、発達段階を把握することが求められる。また就学後6週間が経った頃には関係者が集まり、子どもの小学校での生活状況や解決していくべき課題などが改めて話し合われることが示された。所属先の変更の変更に伴い、調査対象地域、特に秋田県での調査回数が当初の予定よりも少なくなっているものの、複数の連絡ツールを通して情報の共有を行っていることで、当初の予定通り研究が進められていると判断したため。秋田県鹿角市での幼保小連絡協議会に引き続きオブザーバーとして参加し、初年度の研究で得られた情報と合わせながら縦断的に当連絡協議会の「運営体制」について検討を進める。特に児童クラブの職員がどのような形で会に参加し、幼保小の連携に携わっているのかについては主たる検討課題として位置付ける。
確率過程母数モデルの統計的推測決定とその漸近的構造の研究

近年,数理ファイナンスや環境統計という実際分野において、確率過程の母数モデルが統計解析のための重要な方法として研究されている.従来,統計的推測理論は観測と母数が双対関係にある指数型分布族,さらには,一般の分布に対して大標本において局所漸近指数型分布族として研究されてきた。本研究では,指数型確率過程,さらには,確率過程の局所漸近指数型分布族の導入により統計的推測理論の数学的構造を解明し発展させることが研究目的である.我々は指数型分布族・曲指数型分布族の理論や情報量幾何学的方法などを確率過程母数モデルに適用し統計的推測理論の研究を発展させた.ポアソン点過程や拡散過程なを具体的な指数型確率過程に対する尤度を通して,十分統計量や情報量の計算を行った.曲指数型分布族の統計的曲率と情報量損失との問題では,エフロンの母数化モデルについて検討し,エフロンの方程式が極形式モデルというものを定義しているということを示した.そのことから,情報量損失と漸近2次有効性の違いを指摘したといわれる「エフロンの反例」が実は反例になり得ないことを証明した(Kumagai, Inagaki and Inoueの論文).また,多次元曲指数型モデルとして,多次元球面モデルを導入し,その統計的曲率と情報量損失との正確な関係式を得た.それからエフロンによる漸近的関係式が成り立つ漸近的速度を示した(Inoue, Inagaki and Kumagaiの論文).統計的推測決定問題において,従来は独立同分布からのデータに基づく手法と考えられていたものを積極的に従属データにも適用することを推し進め,そのための前提条件の検討やその結果の検討を行った.大偏差理論を時系列データで展開した(Taniguchiの論文)ことやマルコフ過程従属性を持つデータに対する連の分布の計算を行った(Akiの論文)こともその成果である.多変量空間データは,非常に多くの情報を含み多変量解析や時系列解析の手法を駆使する必要があるが,等方向性変換のもとで標本バリオグラムとバリオグラム関数の適合を行い,空間データの解析を行った。三つの研究課題をもうけ研究協力を行い,次のような研究成果を得た.(1)確率過程母数モデルにおける統計推測の研究(稲垣,熊谷):これまで行ってきた指数型分布族における自然母数と観測の凸共役性やチャーノフ情報量による大偏差の指数評価,一般の分布においては大標本に対する局所漸近指数性を研究を,確率過程母数モデルの指数型分布において研究した.さらに,情報量損失と統計曲率の関係をフィッシャー円周モデル,球面モデルで正確に計算してきたが,新たに,つるまき(helix)モデルを考えその半径と上昇母数の統計的推測決定について情報量損失と統計曲率の関係を計算した.これらの方法を確立過程指数型モデルや一般の確率過程母数モデルに適用して統計的推測理論の研究を行っている.(2)非線形指数型モデルの研究(白旗,安芸):ロジットモデル,プロビットモデル,比例ハザードモデルなど一般線形回帰モデルやセミパラメトリックモデルについて研究した.実用上の観点にたって、コンピュータ実験を行いこれらのモデルの有効性と実行性を研究し,さらに統計的倉ひっくひょうげんについて研究した.(3)多変量解析,時系列解析の研究(磯貝,谷口):多変量解析の手法を実際データに基づいて実行し,主成分・主因子の意味付けや次元の決定や判別が手法とどのように関係しているかを研究した.

また,時系列解析の手法から出発しすうリファイナンスの研究を行った.三つの研究課題をもうけ研究協力を行い,次のような研究成果を得た.(1)確率過程母数モデルにおける統計推測の研究(稲垣,熊谷):稲垣,熊谷は指数型分布族における自然母数と期待母数の凸共役性やチャーノフ情報量による大偏差の指数関数的評価を行ってきたが,一般の分布族に対しては局所漸近指数性を利用して漸近的な凸共役構造や大偏差の指数的評価を研究し,さらに,確率過程に対しては確率過程の指数型構造と凸共役性や大偏差についての研究を行った.特に,最尤推定量の情報量損失と尤度関数の統計曲率の関係を高次球面モデルで正確に計算し論文として公表した.また,離散指数型モデルの1つである多項分布において,少数観測のグルーピング法を情報量を用いた母数選択モデル基準によって提案し,赤池情報量基準との比較を行い論文として公表した.新たに,弦巻き(helix)モデルを提案し最尤推定量の情報量損失と統計曲率の関係を計算した.また,エフロン方程式による螺旋モデルに着目し,その最尤推定量の情報量損失と統計曲率の関係を論文としてまとめ投稿した.(2)非線形指数型モデルの研究(白旗,安芸):ロジットモデル,プロビットモデル,比例ハザードモデルなど一般線形回帰モデルやセミパラメトリックモデルについて研究し,コンピュー夕実験やグラフィックス表現によりモデルの有効性と実行性を研究した.(3)多弯量解析,時系列解析の研究(磯貝,谷口):実際データに対して主成分分析や因子分析を適用し,主成分・主因子の意味付けと次元の決定や判別の関係を研究した.また,時系列解析の手法から出発し,数理ファイナンスにおける数理モデルの研究を行った.さらに,地理統計におけるバリオグラムやクリギングの手法による線形予測量とその誤差評価を行った.近年,数理ファイナンスや環境統計という実際分野において,確率過程の母数モデルが統計解析のための重要な方法として研究されている.従来,統計的推測理論は観測と母数が双対関係にある指数型分布族,さらには,一般の分布に対して大標本において局所漸近指数型分布族として研究されてきた.本研究では,指数型確率過程,さらには,確率過程の局所漸近指数型分布族の導入により統計的推測理論の数学的構造を解明し発展させることが研究目的である.我々は指数型分布族・曲指数型分布族の理論や情報量幾何学的方法などを確率過程母数モデルに適用し統計的推測理論の研究を発展させた.ポアソン点過程や拡散過程など具体的な指数型確率過程に対する尤度を通して,十分統計量や情報量の計算を行った.曲指数型分布族の統計的曲率と情報量損失との問題では,エフロンの母数化モデルについて検討し,エフロンの方程式が極形式モデルというものを定義しているということを示した.そのことから,情報量損失と漸近2次有効性の違いを指摘したといわれる「エフロンの反例」が実は反例になり得ないことを証明した(Kumagai, Inagaki and Inoueの論文).また,多次元曲指数型モデルとして,多次元球面モデルを導入し,その統計的曲率と情報量損失との正確な関係式を得た.それからエフロンによる漸近的関係式が成り立つ漸近的速度を示した(Inoue, Inagaki and Kumagaiの論文)
電気化学検出型タンパクチップによるタンパクのハイスループットスクリーニング

ヒトゲノムプロジェクトの終焉を迎えつつある今日,ポストゲノムプロジェクトを支える技術としてタンパクチップが注目されている。タンパクチップは,基板上に異なったタンパク質を固定化したものでタンパク質の機能をハイスループットに調べる手法として期待されている。本研究では,申請者らがこれまで確立してきた電気化学的DNAチップの技術をタンパクチップに応用することを目的とする。具体的には,マルチ金電極にタンパク質のシステインのイオウ原子を利用して固定化し,分析物を電気化学的に分析しようとするものである。まず予備的検討として,ペプチドを固定化した金電極を作成し,本手法が実証できることを証明した。金電極表面に荷電数の異なるペプチドを修飾し,フェロセンカルボン酸との相互作用を電気化学的に検出した。カチオン性ペプチドを固定化した電極の場合,アニオン性ターゲットであるフェロセンカルボン酸が静電的相互作用により電極上に濃縮され,フェロセンの酸化還元ピークが増大した。逆にアニオン性ペプチドの場合,ピークは減少し,ペプチドによるターゲットの阻害効果が示された。次に,DNAの1本鎖と2本鎖を識別するL2-GペプチドのL2部位,Helix G部位などを金電極に固定化させ,フェロセン化した1本鎖または2本鎖DNAとの相互作用を電気化学的に識別できるかどうか検討した。これが達成できれば,DNA結合性タンパクのスクリーニングに利用できる。電気化学的手法に加え分光学的手法や水晶発振子(QCM)を用いた検討からL2-GペプチドのL2部分がDNA結合に関与していること,Helex Gが1本鎖,2本鎖識別に重要なことが明らかとなった。これらの結果により電気化学的タンパクチップの可能性を開くことができた。今後,走査型電気化学顕微鏡に適用すればさらに異なったタンパク質やペプチドのスクリーニングに利用可能である。タンパクチップはポストゲノムプロジェクトを支える技術として注目されている。タンパクチップは、チップ上に固定化された他種類のタンパクとの相互作用をハイスループットで分析する技術である。本研究では、タンパクチップの作成とタンパク相互作用を電気化学的に検出する手法を確立するのが目的である。まず、タンパクチップ作成の前に予備的検討として、ペプチドを固定化した金電極を作成した。金電極表面に荷電数の異なるペプチド(Ac-CWKKKKKK-NH2、Ac-CWGGGGGG-NH2、Ac-CWDDDDDD-NH2)を合成した。ペプチドのアミノ酸配列には、溶液中で正電荷を持つLys、電荷を持たないGly、負電荷を持つAspを選んだ。また、チオールと金との相互作用を利用して電極表面に固定化するためにN末端にCysを導入した。さらにTrpを導入し、Trp残基の最大吸収波長280nmにおける吸光度を用いて、ペプチドの固定化量を決定することとした。上記のペプチドを金電極表面に修飾し、フェロセンカルボン酸との相互作用を電気化学的に検出した。カチオン性ペプチド(Ac-CWKKKKKK-NH2)を固定化した電極の場合、アニオン性ターゲットであるフェロセンカルボン酸が静電的相互作用により電極上に濃縮され、フェロセンの酸化還元ピークが増大した。逆にアニオン性ペプチド(Ac-CWDDDDDD-NH2)の場合、ピークは減少し、ペプチドによるターゲットの阻害効果が示された。さらに、ペプチド中にフェロセンを導入したものも合成し、ペプチド固定化電極を用いて酸化還元応答を調べた。その結果、ペプチド間の静電的相互作用が強いものほどフェロセンの応答電流が増加し、ペプチド同士の相互作用を電気化学的に検出することができた。ヒトゲノムプロジェクトの終焉を迎えつつある今日,得られた塩基配列情報を人類の福祉に役立てるために研究が活発化してきた。ポストゲノムプロジェクトを支える技術としてタンパクチップが注目されている。

タンパクチップは,基板上に異なったタンパク質を固定化したものでタンパク質の機能をハイスループットに調べる手法として期待されている。しかしながら,基板上に固定化する一般的手法がないことや,タンパクチップに結合した分析物を高感度に検出する手法が確立されていないことから一般的利用はなされていなかった。本研究では,申請者らがこれまで確立してきた電気化学的DNAチップの技術をタンパクチップに応用することを目的とする。具体的には,マルチ金電極にタンパク質のシステインのイオウ原子を利用して固定化し,分析物を電気化学的に分析しようとするものである。昨年度は,モデルペプチドを用いて,本手法が実証できることを証明した。当該年度では,DNAの1本鎖と2本鎖を識別するL2-GペプチドのL2部位,Helix G部位などを金電極に固定化させ,フェロセン化した1本鎖または2本鎖DNAとの相互作用を電気化学的に識別できるどうか検討した。これが達成できれば,DNA結合性タンパクのスクリーニングやDNA識別ペプチドのコンセンサス配列などの検索に利用できると考えられる。電気化学的手法に加え分光学的手法や水晶発振子(QCM)を用いた検討からL2-GペプチドのL2部分がDNA結合に関与していることHelex Gが1本鎖,2本鎖識別に重要なことが明らかとなった。これらの結果により電気化学的タンパクチップの可能性を開くことができた。今後,走査型電気化学顕微鏡に適用すればさらに異なったタンパク質やペプチドのスクリーニング利用できることを示唆する結果も得ており,ここでの成果の社会的貢献は高いものと考えられる。
β型グロビン遺伝子のエピジェネティック制御におけるDNAメチル基転移酵素1の役割

βサラセミアや鎌状赤血球症などのβグロビン異常症の治療には、胚型あるいは胎児型のβ型グロビンの発現誘導が有効であるが、そのための技術開発には、これらの遺伝子の成人における不活性化機構の解明が重要である。本研究では、DNAメチル基転移酵素1(DNMT1)が胚型β型グロビン遺伝子の不活性化に必要であることを示した。さらに、核内受容体TR2とTR4が、胚型及び胎児型のβ型グロビン遺伝子不活性化と、DNMT1のこれら遺伝子プロモータへの結合に必要であることを示した。これらより、TR2とTR4による、胚型及び胎児型β型グロビン遺伝子不活性化において、DNMT1が重要な役割を担うことが示された。βサラセミア等の遺伝性βグロビン異常症には、胎児型γグロビン誘導療法が有効であるが、そのような治療法開発にはγグロビン遺伝子の出生後の不活性化機構の解明が不可欠である。本研究では、γグロビン遺伝子不活性化におけるDNAメチル基転移酵素1 (DNMT1)の役割を明らかにするために、組換え酵素Creの作用によりDNMT1遺伝子(Dnmt1)を欠損するDnmt1 Floxアレル、内在性エリスロポイエチン受容体遺伝子(Epor)からCreを発現するEpor Creアレル、およびヒトβ型グロビン遺伝子座を導入したマウスにおいて、初期発生に必須なDnmt1遺伝子を赤血球系特異的に欠損させる。このマウスでヒトγグロビンmRNAの発現とともにその遺伝子座のDNAメチル化、ヒストン修飾などのクロマチン構造を分析する。これらの研究により、γグロビン遺伝子不活性化における抑制性クロマチン形成へのDNMT1の役割と、γグロビン誘導療法開発のための分子標的が明らかになると期待される。24年度にはこの計画に必要なマウスを得るための交配・繁殖を行った。Dnmt1遺伝子とEpor遺伝子とは同じ染色体上に存在するため、減数分裂組換えによってDnmt1 FloxアレルとEpor Creアレルとが同一染色体上に連結したハプロタイプを持つマウスの作成が必要である。両遺伝子間の距離は、わずか1メガ塩基であるため、代表者らは1年以上にわたる交配によりこの様なマウスを取得し、その凍結受精卵を保存していた。しかし技術的トラブルにより凍結卵からマウスを回収することができなかったため、Dnmt1 Floxアレルを持つマウスとEporCreアレルを持つマウスとの交配を再度行った。一方、代表者らはDnmt1 FloxアレルからDnmt1欠損アレルを作成しているが、これとヒトβ型グロビン遺伝子座とを持つマウスを取得するための交配・繁殖も行った。鎌状赤血球症等のβグロビン異常症の治療法として、胎児型γグロビン誘導療法の有効性が示されているが、そのような作用を持つ薬剤として広く使用されているのはヒドロキシ尿素のみである。しかし本薬剤が効果を示す鎌状赤血球症患者は約半数に過ぎ無いうえ、骨髄抑制等の副作用が課題である。より効果的で安全なγグロビン誘導剤の開発が望まれるが、そのためには胎児型γグロビン遺伝子の、出生後の不活性化機構の解明が重要である。本研究ではDNAメチル基転移酵素1 (Dnmt1)のγグロビン遺伝子不活性化における役割を明らかにするために、以下の3種の変異を導入したマウスの解析を行う。1)組換え酵素Creの作用でDnmt1を欠失する変異Dnmt1遺伝子(Dnmt1 Floxアレル)、2)Creを赤血球系でのみ発現するCreノックインEpor遺伝子(Epor Creアレル)、3)ヒトβ型グロビン遺伝子座の挿入変異、以上の3種の変異である。これらを全て保有するマウスでは、初期発生に必須なDnmt1の欠失を赤血球系特異的に誘導できると期待され、Dnmt1のγグロビン遺伝子不活性化における役割の解明と、γグロビン誘導剤開発のための分子標的としてのDnmt1の意義が解明されると期待される。このような解析のためには、Dnmt1 FloxアレルとEporCreアレルとが同一染色体上に連結したハプロタイプを持つマウスの作成が必要である。このために、平成27年度の1年間にわたって、Dnmt1 FloxアレルとEpor Creアレルとを異なる染色体上に持つ複合変異マウスと、野生型マウスとの間の交配を継続した。また、代表者らはDnmt1 FloxアレルからDnmt1欠損アレルをすでに作成しているが、これとヒトβ型グロビン遺伝子座の挿入変異とを持つマウスを取得するための交配・繁殖も行った。平成27年度には赤血球系細胞において、Dnmt1遺伝子のFloxアレルがCreによる配列特異的DNA組換えによって欠損アレルへと変換される効率を測定する計画であった。すなわち、Dnmt1遺伝子Floxアレルと欠損アレルの複合ヘテロ接合体変異マウスに、Epor遺伝子を利用してCreを赤血球系特異的に発現させた上で、胎児肝及び成体脾より抽出したDNAを用いて、Creによる欠失領域を検出する定量PCR解析により、Floxアレルから欠損アレルへの変換効率を確認する計画であった。前年度から引き続いて、平成27年度も、この計画を実施するのに必要なマウスを得るための交配・繁殖を行った。Dnmt

1遺伝子とEpor遺伝子とは同一染色体上に存在するため、減数分裂組換えによってDnmt1 FloxアレルとEpor Creアレルとが同一染色体上に連結したハプロタイプを持つマウスの作成が必要であるが、両遺伝子間の距離は、わずか1メガ塩基であるため、それらの遺伝学的距離はわずか約0.6センチモルガン程度である。つまり、Dnmt1遺伝子とEpor遺伝子との間での減数分裂組換えが生じるのは、およそ170減数分裂に1回であることから、Dnmt1 FloxアレルとEporCreアレルとを異なる染色体上に持つマウスと野生型マウスとの交配で得られる仔マウス340匹に1匹が、期待するハプロタイプを持つマウスであると予測される。27年度には、約380匹の仔マウスの遺伝子型判定を行ったが、期待するハプロタイプのマウスは取得できなかった。このため、上記計画にそってDnmt1遺伝子のFloxアレルから欠損アレルへの変換効率を測定することができなかった。一方、Dnmt1欠損アレルとヒトβ型グロビン遺伝子座の挿入変異とを持つマウスは取得できた。サラセミアや鎌状赤血球症等のβグロビン異常症の治療として、胎児型γグロビン誘導療法が有効であるが、そのような効果の薬剤として広く使用されるのはヒドロキシ尿素のみであり、しかも本剤が有効なのは鎌状赤血球症患者の約半数に過ぎず、サラセミアに対しては殆ど無効である。骨髄抑制等の副作用により投与が制限されることも問題である。より安全で有効なγグロビン誘導剤の開発が望まれるが、それには胎児型γグロビン遺伝子の、出生後の不活性化機構の解明が重要である。本研究ではDNAメチル基転移酵素1 (Dnmt1)のγグロビン遺伝子不活性化における役割を明らかにするために、以下の3種の変異を導入した複合変異マウスの解析を行う。(1)配列特異的組換え酵素Creの作用でDnmt1を欠失する変異Dnmt1遺伝子(Dnmt1 Floxアレル)、(2)赤血球系でのみCreを発現するCreノックインEpor遺伝子(Epor Creアレル)、(3)ヒトβ型グロビン遺伝子座の挿入変異、以上の3種の変異である。これら全てを保有する複合変異マウスでは、初期発生に必須なDnmt1の欠損を赤血球系特異的に誘導できると期待され、Dnmt1のγグロビン遺伝子不活性化における役割と、γグロビン誘導剤開発のための分子標的としての意義を解明できる。このような解析のためには、減数分裂組換えによって、Dnmt1 FloxアレルとEpor Creアレルとが同一染色体上に連結したハプロタイプのマウスを取得する必要がある。しかし、この組換え効率が当初予測より低かったため、当初計画通りに前年度中にこのような減数分裂組換え体を取得できなかった。このため平成28年度も、このような組換え体の取得を目的として、Dnmt1 FloxアレルとEpor Creアレルとが異なる染色体上に存在する複合変異マウスと、野生型マウスとの間の交配を継続した。平成28年度には赤血球系細胞において、Dnmt1遺伝子のFloxアレルがCreによる配列特異的DNA組換えによって欠損アレルへと変換される効率を測定する計画であった。具体的には、Dnmt1遺伝子Floxアレルと欠損アレルの複合ヘテロ接合体変異マウスに、Epor遺伝子を利用してCreを赤血球系特異的に発現させた上で、胎児肝及び成獣脾より抽出したDNAを用いて、Creによる欠失領域を検出する定量PCR解析により、Floxアレルから欠損アレルへの変換効率を確認する計画であった。前年度から引き続いて、平成28年度も、この計画を実施するのに必要なマウスを得るための交配・繁殖を行った。Dnmt
肝細胞癌肝外転移に対する免疫細胞治療の有効性と安全性の評価

肝細胞癌肝外転移症例を対象として、自己活性化γδT細胞を用いた免疫細胞治療を施行した。さらに対象を拡大し、同じ原発性肝癌である肝内胆管癌切除後症例に対してGemcitabineを用いた全身化学療法にγδT細胞免疫療法を併用して施行した。研究期間中に前者3例、後者8例のエントリーがあった。安全性は確認されたが、無増悪期間については従来の治療法と比較して優越性は認められなかった。評価対象数が少ないため、さらなる症例蓄積が必要と思われた。肝細胞癌の肝外転移を有する患者は、従来は生命予後不良で、明瞭な有効性を有する治療が存在しなかった。活性化自己γδT細胞療法は、癌免疫において重要な役割を果たしているγδT細胞を、患者より採取した血液中から採取、培養し、再び患者体内に注入するものである。本治療法は、他分野の癌に対する有効性と安全性が実証されつつあり、肝細胞癌肝外転移患者に対しても生命予後が改善する可能性が期待されている。本研究の目的は、肝細胞癌肝外転移を有する患者に活性化自己γδT細胞免疫療法を実施し、有効性と安全性を評価・検討することである。主評価項目は無増悪生存期間、副評価項目は全生存期間、腫瘍縮小効果、生存率、腫瘍マーカー抑制効果、免疫学的反応性である。平成21、22年度は対象患者のエントリーを10例予定していたが、現時点での切除不能肝細胞癌に対する標準治療と考えられるソラフェニブが市販されたために各々わずか2例(うち1例は細胞培養が不十分で実施中止)のエントリーとなった。しかし、数は少ないながらも研究の実施により、実務の十分、不十分な点が認識でき、今後の実施には大きな意味を持った。また、この経験をもとに学会での発表を行い、他の専門家と討議する中で今後の注意点、着目点が浮かび上がった。治療効果の判定基準としてある程度観察時間を要する無増悪生存期間を用いているが、短い観察期間で腫瘍の縮小効果(RECIST)を評価することで、これまで切除不能とされてきた肝細胞癌肝外転移に対する切除治療を施す可能性も確立できる。従来確立された治療法がなかった肝細胞癌肝外転移患者に対する標準治療と出来る可能性があり、ひいては我が国の肝細胞癌患者全体の予後を向上させうる。肝細胞癌の肝外転移を有する患者は、従来有効な治療法が存在しなかった。活性化自己γδT細胞療法は、癌免疫において重要な役割を果たしているγδT細胞を、患者より採取した血液中から採取、培養し、再び患者体内に注入することで癌免疫の活性を上昇させるものである。平成21、22年度は対象患者のエントリーを10例予定していた。しかし、切除不能肝細胞癌を適応疾患とし、スペインで行われた大規模無作為化比較臨床試験で有効性の証明された分子標的治療薬ソラフェニブが平成21年に市販され、いまだ本邦の患者での有効性は証明されてはいないものの、一般的には現時点での肝外転移合併肝細胞癌患者に対する標準治療と捉えられている。このためにわずか3例(うち1例は細胞培養が不十分で実施中止)のエントリーとなった。一方、同じ原発性肝癌である肝内胆管癌に関しては、術後補助療法のセッティングで治療患者を募ったところ、順調に患者のエントリーが進み、現時点で8例となった。この経験をもとに学会での発表を行い、他の専門家と討議する中で今後の注意点、着目点が浮かび上がった。特に、同じ患者でも担癌状態には段階的なステージがあり、どの段階で当治療を導入するかが重要なポイントである可能性がうたわれている。研究期間中に切除不能肝細胞癌を適応疾患とし、スペインで行われた大規模無作為化比較臨床試験で有効性の証明された分子標的治療薬ソラフェニブが平成21年に市販され、一般的には現時点での肝外転移合併肝細胞癌患者に対する標準治療と捉えられている。このため対象疾患範囲を拡大させ、同じ原発性肝癌である肝内胆管癌に関して術後補助療法として活性化自己γδT細胞療法を実施することにした。

この結果、順調に患者のエントリーが進み、全体で11例となった。肝細胞癌肝外転移ではエントリー患者3人中2人が全身状態や肝機能が投与開始基準に抵触してしまい投与開始に至らなかった。また、投与出来た一人に関しても治療開始後1ヶ月で新規肝外転移が出現し、全身状態が悪化している。一方、肝内胆管癌に関しては同様の術後補助療法プロトコールで行っている膵癌に比較して良好に治療が開始されており、8人中7人が治療開始となっている。長期予後に関しては、多発、リンパ節転移陽性、切除断端陽性、という予後不良群を対象としているため長期観察患者では全例再発があり、他の治療に移行している。この結果から、現時点では必ずしも術後予後の改善に寄与しているとは言えない。今後のさらなる症例の蓄積が必要と考えられた。
細菌III型分泌の構造動態

病原細菌の多くは、III型分泌系を用いて病原性分子を宿主細胞へ直接送り込み、宿主の生理機能を制御することで感染する。我々はIII型分泌の分子機構を明らかにするため、べん毛III型輸送装置を対象とし、電子顕微鏡解析、結晶構造解析、AFM、反転膜小胞(IMV)を用いた機能解析によりIII型分泌の構造動態の解明を目指した。その結果、輸送ATPase複合体の構造と新規の役割、輸送シャペロンがダイナミックな構造変化により輸送を制御するしくみ、輸送ゲート形成過程の解明、輸送スイッチングが起こる新規分子機構、輸送基質どうしによる輸送制御といった、III型輸送における新たな概念、知見を明らかにした。病原細菌の多くは、III型分泌系と呼ばれる超分子複合体を用いて病原性分子を宿主細胞へ直接送り込み、宿主の生理機能を制御することで感染する。本研究ではIII型分泌の分子機構を明らかにするため、III型分泌系で最も研究が進んでいるべん毛III型輸送装置を対象とし、III型分泌の構造動態の解明を目指している。輸送基質/シャペロンと輸送ATPase複合体/輸送ゲートとの相互作用を、電子顕微鏡解析、結晶構造解析、反転膜小胞(IMV)を用いた機能解析結果を統合し、III型分泌系の構造基盤をを明らかにすることを目的としている。以下に今年度の成果を記す。・電子線トモグラフィー撮影のため、IMV試料作成条件の検討と撮影条件の検討を進めた。また、輸送ATPase複合体を構成するFliIとFliHを保持する菌体と欠く菌体から作成したIMVそれぞれの電子線トモグラフィーを行った。両者の比較から輸送ATPase複合体に起因すると考えられる密度を同定できた。この密度は、べん毛形成が最終段階にあるミニセルを用いたこれまでのトモグラムと明らかに異なり、輸送段階による構造の違いを示唆する。・輸送ATPase複合体を構成するFliIとFliHフラグメントの結晶構造解析に成功した。FliHはV-ATPaseのstalkと同様の構造であった。結晶構造に基づきATPase複合体モデルを作成し、ミニセルから得られたクライオ電子顕微鏡像と比較したところ、両者はきれいに重なった。また、結晶構造に含まれないN末領域がコイルドコイルを形成すると仮定すると、N末領域の先端はC-リングと相互作用できることが示された。電子顕微鏡解析については、輸送ATPase複合体を構成するFliIとFliHを保持する菌体と欠く菌体からIMVを作成し、輸送能を確認したIMVについて、試料作成とトモグラフィー撮影条件の検討を進めた。ミニセルを用いたこれまでのトモグラムではべん毛繊維があるため基部体を発見しやすいが、IMVではロッドまで、もしくはMS-ringのみであるため、IMV中に基部体を見出すのに熟練を要する。そのため、像数を稼ぐのが難しい。途中、電子顕微鏡の故障により長期にわたり像取得ができなくなるアクシデントがあったが、IMV中にフックを形成させて発見しやすくしたり、low pass filterの掛け方を工夫するなどにより、画像収集ができるようになった。輸送ATPaseの構造解析については、FliIとFliHフラグメント複合体の結晶構造解析に成功し、た。得られた結晶構造はFliH2-FliI複合体を形成していたが、FliI部分はリング複合体を形成していなかった。そこで、F1-ATPaseの構造をテンプレートにしたリング構造モデルを作成し、低分解能電子顕微鏡像に当てはめたところ、良い一致を示した。これらの成果について、PDBに登録、論文発表を行った。一方、6量体リング構造の解析を目指して、好熱菌由来FliIの発現/精製/キャラクタリゼーションを開始した。順調に進んでいる。輸送シャペロンおよび輸送基質/シャペロン複合体の構造解析については、FlgNの構造解析、FlgN-FlgK複合体, FlgN-FlgL複合体、FliT-FliD複合体の精製/結晶化を進めている。複合体については、まだ結晶が得られていないため、フラグメント化する等の工夫が必要である。病原細菌の多くは、感染するためにIII型分泌系と呼ばれる超分子複合体を用いて病原性分子を宿主細胞へ直接送り込む。本研究ではIII型分泌の分子機構を明らかにするため、III型分泌系で最も研究が進んでいるべん毛III型輸送装置を対象とし、電子顕微鏡解析、結晶構造解析、反転膜小胞(IMV)を用いた機能解析結果を統合し、III型分泌系の構造基盤をを明らかにすることによりIII型分泌の構造動態を解明することを目指している。・IMV実験からFliH-I複合体を加えると輸送が著しく増加することが明らかになった。そこで、FliH-I複合体を加えたIMVの電子線トモグラフィーを行い、像の平均化を試みた。しかし、像数が少ないこととIMVの膜形状に平均像が引きずられることから、鮮明な像は得られていない。一方、IMVを温和な条件で可溶化した後に基部体を精製し、負染色像を観察した。すると、基部体のEnd-on viewにおいて、FlhAに相当すると思われる構造を持つ基部体が多数見つかった。・好熱菌由来の輸送ATPaseFliIの精製に成功した。Monomer画分は安定で結晶化にも成功した。しかし、6量体は解離しやすいため、サルモネラFliIの構造を参考にシステインをNドメインの2カ所に導入し、6量体の安定化を図った。この試料を用いて結晶化を行っているがまだ結晶は得られていない。

また、高速AFMによる観察を行い、3回回転対称をもつリング構造を確認した。・輸送ゲート膜蛋白質FliPの発現・精製に成功し、結晶化を行った。微結晶が析出している。・べん毛キャップ蛋白質FliDとそのシャペロンであるFliT複合体の結晶が得られ、回折データーを収集した。FliTの構造を用いた分子置換法を試みたが、解は得られなかった。Se-Met体もしくは同型置換体結晶が必要である。電子顕微鏡解析については、IMVをおだやかな条件で界面活性剤を用いて処理して可溶化して基部体を精製し、輸送ゲートを保持した単粒子試料の作成を行った。IMVは外膜とペプチドグリカン層がないことから温和な条件で基部体の可溶化できるため、これまでできなかった輸送ゲートを保持した単粒子試料の作成ができる可能性がある。精製試料を負染色で観察したところ、Cリング内に輸送ゲート蛋白質FlhAの細胞質側リング構造と思われる密度を観察した。この試料の大量作成に成功すれば、単粒子解析により分解能の高い輸送装置複合体構造を明らかにできる可能性がある。輸送ATPase複合体については、好熱菌試料を用いたFliI単量体試料について結晶が得られたが、複合体試料は収量が少なく、解離しやすいことが問題であった。そこで、システインを2カ所導入して複合体の安定化を試みたところ、複合体を安定して精製できた。また、高速AFMを用いた観察を行ったところ、3回回転対称をもつリング構造を確認した。しかし、ATP添加による構造変化は観測できていない。好熱菌であるため、常温ではATPase活性が低いことが原因として考えられる。輸送ゲート蛋白質については、FliPの大量精製が進み、結晶化スクリーニングを行ったところ、いくつかの条件で微結晶が析出した。X線を当てたところ、タンパク結晶であることを確認した。FliOは収量が少なく、大きな複合体が生じる。電子顕微鏡観察では、形の異なるリング様構造があるが一様ではないため、精製法のさらなる検討、または電子顕微鏡による単粒子解析へとシフトする必要がある。輸送シャペロン複合体については、FliT-FliD複合体について結晶が得られ、3.15A分解能の回折強度データーを収集した。しかし、FliTの構造を用いた分子置換では解析できなかったため、Se-Met体結晶を作成する必要がある。病原細菌の多くは、III型分泌系と呼ばれる超分子複合体を用いて病原性分子を宿主細胞へ直接送り込み、宿主の生理機能を制御することで感染する。本研究ではIII型分泌の分子機構を明らかにするため、III型分泌系で最も研究が進んでいるべん毛III型輸送装置を対象とし、III型分泌の構造動態の解明を目指している。輸送基質/シャペロンと輸送ATPase複合体/輸送ゲートとの相互作用を、電子顕微鏡解析、結晶構造解析、反転膜小胞(IMV)を用いた機能解析結果を統合し、III型分泌系の構造基盤をを明らかにすることを目的としている。以下に今年度の成果を記す。(1)FliPのペリプラズムドメイン(PD)の構造解析に成功した。
超対称性の破れの起源の現象論的・宇宙論的考察

破れた超対称性は、標準模型の自然さの問題を解決するものとして、その存在が期待されている。この考えが正しければ、次に超対称性の破れの機構を解明することが素粒子物理にとって非常に大きな問題となる。本研究の目的は、超対称性に破れに付随する素粒子現象や宇宙論的現象を調べることで、超対称性の破れを探るてがかりとなるような新しい知見を得るというものである。本研究の成果として主なものをあげると、低いエネルギースケールの超対称性の破れのシナリオに固有の軽いグラビティーノ(重力子の超対称対)が宇宙の暗黒物質をなす可能性があるが、その場合の宇宙の構造形成を調べ、グラビティーノ暗黒物質によって形成される宇宙の構造(銀河、銀河団など)が、現実に観測されている構造を再現しないことを示した。また、超弦理論の強結合領域の研究の発展は、弦理論のもつ構造の豊かさを明らかにしてきたが、超弦理論の示唆する素粒子の統一模型の研究も、こうした発展を受けて従来の枠をこえた可能性を模索しはじめている。例えばE_8×E_8ヘテロ型弦理論の強結合領域を記述するヘテロ型M-理論においてゲージ結合の統一を自然に説明する可能性が提唱されている。我々はこのヘテロ型M-理論においてゲージーノ凝縮による超対称性の破れの機構について詳細な検討を加え、その理論的な構造と、実際の超対称粒子の持つ質量スペクトルについて研究した。また、そうしたパターンが現象論や宇宙論にどのような影響を与えるか議論した。その他、アクシオンの性質などに関して、興味深い知見を得た。超対称性は、標準模型に内在する諸問題を解決するものとして、その存在が非常に有力視されている対象性である。現実には超対称粒子がこれまで発見されていないことから、超対称性は破れていなければならない。この超対称性の破れの機構として、これまで次の2つの考え方が提唱されている。1つは超対称性が高いエネルギースケールで破れて、それが重力相互作用で伝播するという考え方であり、2つ目は低いエネルギースケールで超対称性が破れ、それがゲージ相互作用で伝播するという考え方である。本研究の目的は、この2つの考え方を現象論的、宇宙論的視点から総合的に比較検討し、新しい知見を得ることである。今年度は、低いエネルギースケールでの超対称性の破れのシナリオで現れるグラヴィティーノ(重力子の超対称対)が宇宙の暗黒物質になる場合に、宇宙の構造形成について調べた。そして、グラビティーノ暗黒物質によって形成される宇宙の構造(銀河、銀河団など)が現実に観測されている構造を再現しないことを示した。これはグラビティーノ暗黒物質の大きな困難であると考えられる。また、最近理論的にも現象論的にも注目される強結合ヘテロティック弦理論(M理論)における超対称性の破れと、その結果現れる超対称粒子の質量について、興味深い知見を得た。これらは、論文としてまてめてある。この場合、超対称性の破れの機構を解明することが素粒子物理にとって非常に大きな問題となる。本研究の目的は、超対称性に付随する素粒子現象や宇宙論的現象を調べることで、超対称性の破れを探るでかかりを探すというものである。本年度は、昨年に引続き、まず超弦理論におけるゲージーノ凝縮によって超対称性が破れる場合について、強結合弦理論と従来の弱結合理論の場合の様々な現象論宇宙論的帰結を検討し、ニュートラリノの残留密度などについて大きな違いがあることを示した。さらに将来超対称粒子が発見された時にその質量スペクトルなどから高エネルギーの物理を推測する際にこれら二つのシナリオは区別できる可能性があることを議論した。また、アクシオン模型の性質は超対称性の破れの仕方にかなり依るものであるが、重力により超対称性の破れが伝搬している場合と、ゲージ力よって行なわれている場合それぞれについて、その宇宙論的な諸問題について詳しく議論した。

特に後者の場合について、興味深い模型を構築し、その性質について詳しく調べた。こうした成果は論文としてまとめてある。この研究課題による研究はある程度満足のいく成果をあげることができたと考えている。
ニューラルネットワークを融合した多次元知的信号処理に関する基礎的研究

「ニューラルネットワークを融合した多次元知的信号処理に関する基礎的研究」に関連して平成6年度に得られた成果は以下の通りである。1.多次元信号処理とニューラルネットワークの融合白色性雑音とインパルス性雑音を含むボケ画像を対象に、前段に階層形ネットワークを用いて、白色性及びインパルス性雑音を除去するフィルタを用い、後段にホップフィールドネットワークを用いたぼけ画像復元フィルタを用いる複合形画像復元フィルタを開発した。特に前段のフィルタにはDW-MTMフィルタを拡張したニューラルフィルタを、後段にはラインプロセスを考慮した2種類のホップフィールドネットワークを用いる画像復元手法を開発し、良好な結果を得た。2.ニューラルネットワークの多次元信号処理への適用多次元FIR、IIRフィルタの有限精度設計への応用を主眼として、ホップフィールドネットワークによる設計手法の開発を試みた。ある程度の設計精度と設計時間削減のめどが得られた。しかし、従来手法との比較において、一層の性能向上が必要である。3.多次元状態空間モデルによる新しいニューラルネットワークの開発各ニューロン状態空間モデルを含む新しい階層形ニューラルネットワークを考案し、バックプロパゲーション法を拡張した学習法を開発した。応用として、システム同定の問題に適用して成果を得ることができた。これらの成果により当初予定した研究目的はほぼ達成されたと考える。
自己修復性防食機能を有する金属・酸化物ナノコンポジット薄膜の創製

1.金属クラスターの組成を傾斜させた薄膜の作製ナノコンポジット薄膜は金属クラスターの酸化作用によって自己修復性能を発現するため、酸化物・金属の平均的な組成比ばかりでなく、厚さ方向での金属クラスターの分布状態にも依存して自己修復性が変化する。そこで、金属クラスターの組成を傾斜させた薄膜を作製し、それらの薄膜の自己修復性を昨年度作製したスクラッチ試験装置を用いて測定した。溶液には、Na_2SO_4およびNaCl溶液を用いた。スクラッチ入れ直後にナノコンポジット薄膜中の金属クラスター部分が溶液に曝されることにより、カップリング電流の増加が観察されるが、被膜の自己修復作用の進行に伴って電流が減衰すると考えられる挙動をした。また、電位はスラッチ入れ直後に活性部分が露出するために卑な電位になるものの、金属クラスターの酸化によってスクラッチ入れ前の電位に回復した。なお、これらの挙動は薄膜組成や傾斜部分の膜厚により大きく依存し変化した。2.薄膜の欠陥評価薄膜作製時に導入されるピンホール欠陥数が薄膜の組成により変化する傾向が認められたので、各組成におけるピンホール欠陥数を評価した。その結果、Al_2O_3-Nb系ナノコンポジット薄膜では、単体のAl_2O_3、Nb薄膜よりピンホール欠陥数が増加することが分かった。3.傾斜組成薄膜を中間層にもう多層膜の作製ピンホール欠陥の少ない自己修復性防食被覆を開発するために、ピンホール欠陥の少ないNb層を最下層に、中間層に最も良い耐食性を示した傾斜組成のナノコンポジット薄膜、最外層には環境遮断性の、Al_2O_3薄膜を配置した多層膜を作製し、その耐食性を評価した。その結果、Na_2SO_4およびNaCl溶液中でも良い耐食性を示す薄膜が作製できた。4.最も優れた自己修復機能を有するナノコンポジット薄膜の組成や構造傾斜組成薄膜を中間層にもつ多層膜が良い耐食性を示すことが分かった。さらに、各層の界面部分での密着性を改善することが必要であると考えられる。1.IBSD法による酸化物・金属ナノコンポジット薄膜の作製現有するイオンビームスパッタ蒸着装置を用いて酸化物・金属ナノコンポジット薄膜の作製を行った.酸化物にはAl_2O_3,金属にはNbを用いた.また,酸化物と金属の割合を種々変えた薄膜を作製した.作製したナノコンポジット薄膜の組成や構造はX線光電子分光法,オージェ電子分光法を用いて検討した.2.自己修復性評価装置の作製ナノコンポジット薄膜の自己修復性の評価を行うために,その場測定用スクラッチ試験装置を作製した.本装置は試料を溶液に浸漬した状態で規定した加重のスクラッチを試料表面に入れることができる.また,Au対極と試料の間のカップリング電流とカップリング電位を,ゼロシャント電流計と電位差計でそれぞれモニターできる機構を有している.一方,スクラッチ近傍の腐食形態の経時変化をその場観察するために,現有する顕微鏡に新たに購入したデジタルカメラを取りつけ,リアルタイムでモニターするように設置した.しかし,デジタルカメラで得られた画像のコンピュータによる画像処理をプログラムの開発は次年度の課題となっている.3.ナノコンポジット薄膜の自己修復性の評価スクラッチ試験装置を用いてNa_2SO_4およびNaCl溶液中でのAu対極と試料の間のカップリング電流とカップリング電位の経時変化を測定し,ナノコンポジット薄膜の自己修復性の評価を行った.スクラッチ入れ直後にナノコンポジット薄膜中の金属クラスター部分が溶液に曝されることにより,カップリング電流の増加が観察されるが,被膜の自己修復作用の進行に伴って電流が減衰すると考えられる挙動をした.また電位はスラッチ入れ直後に活性部分が露出するために卑な電位になるものの,金属クラスターの酸化によってスクラッチ入れ前の電位に回復した.なお,これらの挙動は薄膜組成に大きく依存し変化した.1.金属クラスターの組成を傾斜させた薄膜の作製ナノコンポジット薄膜は金属クラスターの酸化作用によって自己修復性能を発現するため、酸化物・金属の平均的な組成比ばかりでなく、厚さ方向での金属クラスターの分布状態にも依存して自己修復性が変化する。

その結果、Na_2SO_4およびNaCl溶液中でも良い耐食性を示す薄膜が作製できた。4.最も優れた自己修復機能を有するナノコンポジット薄膜の組成や構造傾斜組成薄膜を中間層にもつ多層膜が良い耐食性を示すことが分かった。さらに、各層の界面部分での密着性を改善することが必要であると考えられる。
RND型排出システム群の生体内作動を基盤にした緑膿菌多剤耐性および病原性の解析

緑膿菌は重篤な難治感染症を引き起こす日和見感染症の重要な起因菌のひとつである。本感染症の化学療法の問題点は、種々の抗菌薬や消毒薬に対する本菌の高度自然耐性を示すところにある。緑膿菌の染色体上には、少なくとも12種類のマルチコンポーネント型多剤排出(Mex)システムがコードされている。これらのMexシステムのうち、いくつかのものが抗菌薬、消毒薬や色素の排出に機能し、異物に対する自己防衛機構として働くことが明らかにされてきた。本研究ではMexシステムの欠損株を作成し、その性状を解析することによって、(1)排出システムの発現がQuorum sensing機構によって制御され、逆に排出システムがQuorum sensing機構の発現にも機能していること;(2)in vitro内因感染症モデルであるMDCK細胞モノレイヤ透過実験での透過性の減少;(3)swimming,swarming, twitchingなどの運動性、プロテアーゼ産生、エラスターゼ産生、エキソトキンA産生などの緑膿菌の種々の病原性因子の産生に機能していることが分かった。また、別の実験でMexシステムの発現を容易に検出するシステムを開発し、臨床分離株での発現を調べ、Mexシステムの発現は臨床分離株の性状にも大きな貢献をしていることを明らかにした。以上の結果から、12種類のMexシステムの多くが主として抗菌薬耐性に働くのではなく、細胞内で合成した病原性発現を誘導する化合物を細胞外へ排出することで緑膿菌の病原性発揮に機能することが本来の生理的機能であることが明らかになった。本研究の目的は、生育環境下の異物からの自己防衛に働くマルチコンポーネント型異物排出システム発現制御機構から多剤耐性および病原性の発現の機構を明らかにすることにある。緑膿菌の病原性(毒素産生、バイオフィルム形成や運動性)発揮など生理的機能に重要な役割を果たしているQuorum-sensing機構によるマルチコンポーネント型多剤排出システム(Mexシステム)の発現を調べたところ、MexCD-OprJ、MexJK, MexHI-OpmD、PA1435-PA1436、PA2528-PA2527-PA2526-PA2525およびCzcABCの発現がQuorum sensingによって制御されていることが分かった。また、マルチコンポーネント型排出システムの発現がQuorum sensing機構の発現にも機能していることが分かった。私どもはすでに緑膿菌の排出システムが本菌の抗菌薬耐性に機能するのみならず、本菌の内因性感染の成立に重要な役割を果たしていることを明らかにした。さらに、本年度の研究によって、排出システムの発現がQuorum sensing機構によって制御されていること、また逆に排出システムがQuorum seinsing機構の発現にも機能していることが明らかとなった。これらの知見を総合すると、排出システムの阻害は抗菌薬耐性の軽減のみならず、緑膿菌の病原因子の産生を軽減させることにもつながり、新しい抗感染症薬創生への標的である可能性が示された。院内感染の起因菌であり、抗菌薬多剤耐性化が問題となっているグラム陰性菌の緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)の感染症を克服することを目的として本菌染色体上にコードされた12種類のRND排出システムの機能および発現の簡易検出法について研究し、下記の結果を得た。1)12種類の排出システムのノックアウト株を作成し、さらにRND排出システム遺伝子群をクローン化することにより、高発現システムを構築した。2)12種類の排出システムのノックアウトにより、抗菌薬耐性度の減少が観察された。

3)12種類の排出システムのノックアウトは、クォーラムセンシングに関与するオートインデューサー化合物の細胞外輸送の減少および緑膿菌の病原因子(運動性、プロテアーゼ、エラスターゼ)の減少をもたらした。さらに、in vitro内因感染症モデルであるMDCK細胞モノレイヤ透過実験での透過性の減少も引き起こした。4)RND排出システムの阻害化合物を利用し、ディスク法を応用してRND排出システムの発現を簡便迅速に検出する方法を考案した。以上の結果から、12種類のRND排出システムは、抗菌薬耐性のみならず、本菌の細胞間情報伝達機構であるクォーラムセンシングに関与し、さらにその結果、本菌の病原性発現に影響することが明らかとなった。これらの知見から12種類のRND排出システムの阻害や発現の制御によって本菌感染症の克服が可能であることが示唆された。また、ディスク法を応用したRND排出システムの発現を簡便迅速検出法によって臨床検査レベルでの耐性菌の出現状況についてのサーベイランスを容易にするものと考えられる。緑膿菌の染色体上には、少なくとも12種類のマルチコンポーネント型多剤排出(Mex)システムがコードされている。これらのMexシステムのうち、MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN, MexXY-OprMおよびMexJK-OpMなどが様々な抗菌薬、消毒薬や色素の排出に機能し、異物に対する自己防衛機構として働くことが明らかにされてきた。しかし、なぜ12種類もの自己防衛機構が必要なのかという疑問に対する明確な答えはなかった。そこで、私どもは12種類のMexシステムの存在意義を明らかにするため、それぞれの排出システム欠損株を作成し、排出システムの発現量や抗菌薬耐性および病原性への関与について調べ、次の結果を得た。多くのMexシステムの欠損が抗菌薬感受性に影響を与えなかったのは、それらの発現量が低いことと主要な排出システム遺伝子群であるMexAB-OprMが発現することによって、他のMexシステムの機能が隠されていることに起因していると考えられる。一方、発現量が低いMexシステムの欠損によって病原因子の産生低下やMDCK細胞モノレイヤの透過度の減少が起こったことから、12種類のMexシステムの多くが主として抗菌薬耐性に働くのではなく、細胞内で合成した病原性発現を誘導する化合物を細胞外へ排出することで緑膿菌の病原性発揮に機能することが本来の生理的機能であることを明らかにした。