hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒストンH3K36メチル化酵素に着目した転写解剖

一方で、NSD2タンパク質はクロマチンに高塩濃度でも安定に結合するタンパク質であり、次世代シークエンサーを用いたクロマチン免疫沈降実験解析の結果、特に転写活性が高いクロマチン領域に多く分布していることが明らかになった。以上の結果は、転写活性領域に集積するNSD2が転写以外のDNA代謝反応に関与する可能性を示唆している。NSD2欠損マウスにおけるV(D)J組み換え異常から、二本鎖切断修復応答への関与が考えられる。以上の結果から、ヒストンH3K36のメチル化が転写活性領域のゲノム維持を担う転写とDNA修復の分子共役モデルを提唱する。初年度に確立した複合体精製法で、再度複合体精製を繰り返し、Whsc1複合体構成因子として再現性を確認する。また、調整した新生RNAの次世代シークエンサーによる解析の結果を待っている。野性型とWhsc1欠損B細胞で進行中の転写を比較し、Whsc1のゲノム局在を照らし合わせて、転写異常を具体的に解明する。さらにターゲット遺伝子座を絞り込んで、分化段階を追って、同定したWhsc1複合体因子の結合解析して、新規の転写サイクルモデルを提示する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
近世日本社会における経済発展と死亡構造の関係に関する研究

本研究の研究目的は、近世日本の経済的先進地を対象に、基礎構造の分析結果を踏まえた上で飢饉の実態と原因を明らかにすること、具体的には紀ノ川流域における飢饉下の死亡構造(=死亡者の年齢別・男女別・月別分布)の解明とその特質・形成要因の追求を行うことである。本年度は主に、紀ノ川中流域で収集した資料の分析を行う予定であったが、下流域(沿岸部)で収集した資料において非常に興味深い事実が明らかになったため、そちらの分析を優先して行った。また、上流域での追加調査で良好な条件の資料を発見することはできなかったが、高野山における調査は昨年度に引き続き順調に行うことができた。具体的な内容を以下に記す。前者については、まず紀ノ川下流域におけるコレラ流行や安政南海地震による人的被害の実態を分析した。そして、コレラ流行や安政南海地震による死亡クライシスは発生しなかったことや安政南海地震の経験から、津波の高さを表現する際の基準の明示と津波によって発生したがれきの流路の予測が、現代の防災・減災対策を考える上で参考となることなどを指摘した。また、和歌山藩領と広島藩領を事例として、幕末期沿岸部における死亡構造の比較分析も共同で行った。広島藩領の方が死亡クライシスの発生回数が多かったことを明らかにした上で、その要因は隣接・周辺地域への移動・接触機会の濃度の差であったと仮説的に解釈した。なお、中流域については現在分析を進めており、それが終わり次第紀ノ川流域全体を対象とした一連の研究成果として取りまとめる予定である。後者については、高野山の塔頭寺院において寺院文書を調査した。その中には日牌・月牌帳という死亡者情報を得られる資料も含まれており、今後はそれらを利用して死亡研究を一層深めていきたいと考えている。28年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、特に紀ノ川下流域の沿岸部を対象に調査・研究を進めた。死亡構造研究に必要な寺院文書については当該地域の寺院、基礎構造研究に必要な村方文書については和歌山県立文書館や海南市教育委員会等において調査を行い、いずれについても十分な量の史料を得ることができた。これらを利用して研究を進め、さらに既に分析を行った紀ノ川上流域の内陸部の農村の事例と比較した。それにより明らかになった多くの点の中から、特に重要と考えられる2点を以下に示す。(なお、これらの成果は研究発表を行い、現在論文としてまとめている。)第一に、基礎構造に関わる点として、沿岸部と内陸部は共に日々の食料を購入して生計を立てる雑業層が地域の大部分を占め、彼らが地域の死亡構造を規定したことである。ただし、沿岸部では主に漁業や廻船業に関わる雑業に従事したのに対し、内陸部では主に農業に関わる雑業に従事し、雑業の性格は大きく異なっていた。第二に、死亡者数が最多を記録したのは共に天保クライシスであったが、両地域は雑業層の存在形態が異なっていたために、その被害の大きさには差があり、沿岸部の方が内陸部より相対的に軽微であったことである。これにより同一藩領内という狭い領域内での地域差の実態を分析し、その要因を指摘することができた。本年度は主に、昨年度に紀ノ川下流域で収集した資料の分析と紀ノ川中流域や高野山における調査を行った。まず前者についてだが、昨年度から進めていた紀ノ川下流域(沿岸部)と上流域(内陸部)の比較分析を一層深めることができた。それによって明らかになった諸点の中から特に重要と考えられる点として2点挙げたい。すなわち、食料移入地域である沿岸部と食料移出地域である内陸部の双方で疫病(感染症)流行の背景には、凶作や当該地域周辺との価格差を要因とした食料事情の悪化や食料不足の発生による栄養状態の悪化があったことと、天保クライシス下の大量死亡について、疫病の流行による病死だけを主な要因とする型と、それと餓死の双方を主な要因とする型の2つのパターンを検出でき、しかもそれらは同一藩領内という狭い領域内でも発生したことである。次に後者についてだが、紀ノ川中流域の資料調査では死亡構造研究に必要な寺院文書を当該地域の寺院において、基礎構造研究に必要な村方文書を和歌山県立文書館や各自治体の教育委員会において調査を実施し、いずれも十分な量の史料を得ることができた。また、高野山では山上の一塔頭寺院において資料調査を開始した。現時点までの調査によって、当該寺院には研究利用されたことがない九州・中部・東北地方の日牌・月牌帳が多数あることが明らかとなっている。これらの地方には本研究が対象とする経済的先進地とはいえない地域も含まれるが、紀ノ川流域と比較することで経済的先進地における飢饉の特質を一層明確にできると考えられるため調査を実施した。

本研究は紀ノ川流域全域を対象としており、本年度は特に中流域において調査・研究を行うことを予定していた。この予定に関しては資料調査までにとどまり、その分析は次年度に持ち越すことになったが、昨年度に収集した下流域の資料を深く分析することで、天保クライシス下の大量死亡について重要な知見を得ることができ、また高野山上の塔頭寺院では新たに資料調査を開始することができた。そのため、当初の計画以上に進展したと考えている。本研究の研究目的は、近世日本の経済的先進地を対象に、基礎構造の分析結果を踏まえた上で飢饉の実態と原因を明らかにすること、具体的には紀ノ川流域における飢饉下の死亡構造(=死亡者の年齢別・男女別・月別分布)の解明とその特質・形成要因の追求を行うことである。本年度は主に、紀ノ川中流域で収集した資料の分析を行う予定であったが、下流域(沿岸部)で収集した資料において非常に興味深い事実が明らかになったため、そちらの分析を優先して行った。また、上流域での追加調査で良好な条件の資料を発見することはできなかったが、高野山における調査は昨年度に引き続き順調に行うことができた。具体的な内容を以下に記す。前者については、まず紀ノ川下流域におけるコレラ流行や安政南海地震による人的被害の実態を分析した。そして、コレラ流行や安政南海地震による死亡クライシスは発生しなかったことや安政南海地震の経験から、津波の高さを表現する際の基準の明示と津波によって発生したがれきの流路の予測が、現代の防災・減災対策を考える上で参考となることなどを指摘した。また、和歌山藩領と広島藩領を事例として、幕末期沿岸部における死亡構造の比較分析も共同で行った。広島藩領の方が死亡クライシスの発生回数が多かったことを明らかにした上で、その要因は隣接・周辺地域への移動・接触機会の濃度の差であったと仮説的に解釈した。なお、中流域については現在分析を進めており、それが終わり次第紀ノ川流域全体を対象とした一連の研究成果として取りまとめる予定である。後者については、高野山の塔頭寺院において寺院文書を調査した。その中には日牌・月牌帳という死亡者情報を得られる資料も含まれており、今後はそれらを利用して死亡研究を一層深めていきたいと考えている。本研究は紀ノ川流域全域を対象としており、本年度はその下流域を対象に調査・研究を行うことを計画していたが、その通りに進めることができた。それにより、漁業・廻船業に関わる雑業で生計を立てる雑業層が多数を占める沿岸部の村々における天保クライシスの実態を明らかにすると同時に、狭い領域内での地域差の実態とその要因についても分析することができた。次年度はまず本年度に収集した紀ノ川中流域の資料の分析を予定している。ここでは特に先行研究がきわめて少ない高野山寺領を対象とし、その死亡構造上の特質を明らかにしたい。また、紀ノ川上流域における追加調査も行う予定である。紀ノ川上流域については、19世紀以降の死亡実態は既に分析しているため、それ以前を含む長期間のデータが得られる寺院文書を収集できた場合には、それに基づいて死亡構造を分析したい。なお、高野山における調査も本年度に引き続き進めたい。そして、紀ノ川上流域・中流域・下流域の研究結果を比較・総合することにより、各流域における飢饉の特質や地域差を明らかにし、基礎構造からその形成要因を分析する。
子宮頸癌の悪性形質に関与する転写因子HOXD9の機能解析と治療法の開発

子宮頸癌細胞株のSKG3B株でHOXD9を抑制したことにより活性化する調節因子としてP53が選択された。SiHaとSKG3B株でHOXD9を抑制すると、p53遺伝子の発現には変化せず、P53タンパク発現が増強した。SiHaおよびSKG3B株でHOXD9を抑制すると、E6/7プロモーターを結合したluciferase活性は有意に低下した。SiHa株を用いたChip assayではHOXD9がP97プロモーターに結合することが示された本研究の初年度である平成27年度はHOXD9発現子宮頸癌細胞株を用いてHOXD9抑制実験を行った。準備実験として、HOXD9のsiRNAの選択、抑制方法を検討し、HOXD9抑制株として、Lentivirus感染によるshort hairpin HOXD9安定発現細胞株(shHOXD9)および対照としてshnegative細胞株(mock)を作出した。元の細胞株はHPV16型感染細胞株として、SiHaおよびSKG-3bを使用し、HPV非感染細胞株として、C33Aを用いた。上記細胞株のうち、HOXD9抑制効率が70%以上のものを用いて、細胞周期の比較、細胞増殖に関する影響、およびP53発現量に関する影響を検討した。細胞周期について、mock群と比較して、shHOXD9群ではG2期の細胞が多く存在する傾向があり、死細胞分画が増加している傾向も認められた。細胞増殖に関する影響について、SiHaおよびSKG-3bにおいて、shHOXD9群では細胞数が減少する傾向が認められた。C33Aにおいて、mock群と比較して、shHOXD9群は有意に細胞増殖が抑制された。P53発現量について、RNA発現量はmock群と比較して有意な差は認められなかった。しかし、タンパク発現量において、shHOXD9群で明らかな発現量増加が認められた。以上よりHOXD9を抑制することにより、HPVによるP53分解を抑制し、細胞のアポトーシスを誘導するものと考えられた。さらにC33Aにおいても、細胞増殖が抑制され、死細胞が増加したことについて、HOXD9は多くの細胞増殖機構に関与していることが考えられた。現在はHPV18型細胞株についても同様の結果が得られるか検討中である。今後はP53分解に関与しているE6、E7発現量を検討し、マウスを用いた研究も予定している。HOXD9ががん細胞のアポトーシス抑制に関与していることが認められ、P53関連実験も順調に進捗している。HPV16型が感染している子宮頸癌細胞株SKG-1,SKG-3BにおいてHOXD9を抑制すると、E6/E7の発現が著明に抑制された。E6/E7はともにP97プロモーターで制御されている。このため、前年度で明らかとなったHOXD9の抑制によってP53タンパクの発現が増強するメカニズムとして、HOXD9がP97プロモーターに作用してE6/E7の発現を制御するのではないかと考えられた。HOXD9を抑制することによってP97プロモーターの活性が低下し、E6/E7の発現が低下することでP53の分解が抑制される、という仮説が成り立つ。この仮説を検証するため、P97プロモーターを導入したpGL3-P97を作成した。このプラスミドを用いてSiha株とSKG-3B株でluciferace assayを行ったところ、HOXD9を抑制することで、2つの細胞株ともに有意にP97プロモーターの活性が低下した。これらのことから、HOXD9がP97プロモーターを介してE6/E7の発現を制御し、子宮頸癌細胞の悪性化に関与することが明らかとなった。また、最新のTAGAデータベースを用いて根治術を行った子宮頸癌IB1期の症例を対象として、HOXD9の発現量と臨床病理学的因子の関連を検討したところ、HOXD9の発現量とリンパ管侵襲およびリンパ節転移に有意な相関を認めた。すなわち、HOXD9が高発現している症例では、リンパ管侵襲の頻度が高く、リンパ節転移率も高い結果であった。この結果は、我々が以前おこなった検討と一致していた。昨年度明らかとなったHOXD9の抑制によってP53タンパクの発現量が増強するメカニズムの解明ができた。昨年度、申請者はHOXD9がHPV16型のプロモーターであるP97プロモーターを介して癌遺伝子であるE6/7の発現を制御することを示した。本年度はHOXD9が直接P97プロモーターに結合するのか、何らかの因子を介して間接的に作用するかを検討した。HPV16型陽性細胞であるSiHa細胞株を用いてChromatin immunoprecipitation assay (ChIP assay)を行った。当初、抗HOXD9抗体を用いて免疫沈降を試みたが、HOXD9を検出することができなかった。このため、SiHa細胞株にc-Mycで標識したHOXD9を遺伝子導入し、2日後にanti-c-Myc antibodyを用いてChoromatin Immunoprecipitation assayを行ったところ、HPV16型のE6 E7プロモーターであるP97プロモーターを検出した。以上より、HOXD9はHPV16型およびHPV18型のE6/7プロモーター領域に直接結合して、E6/7遺伝子の発現を促進することが示された。次に、HOXD9が単独でP97プロモーターに結合するかを検討した。

HOXD9を発現していない細胞株293T細胞にHOXD9を強制発現させ、pGL3-P97を導入してプロモーターアッセイを行った。結果、HOXD9を強発現させてもlusiferase活性は低いままであり、P97プロモーターは活性化されなかった。すなわち、HOXD9は単独でP97プロモーターに結合するのではなく、なんらかの因子と複合体を形成して結合し、E6/7遺伝子の発現を促進すると考えられた。子宮頸癌細胞株のSKG3B株でHOXD9を抑制したことにより活性化する調節因子としてP53が選択された。SiHaとSKG3B株でHOXD9を抑制すると、p53遺伝子の発現には変化せず、P53タンパク発現が増強した。SiHaおよびSKG3B株でHOXD9を抑制すると、E6/7プロモーターを結合したluciferase活性は有意に低下した。SiHa株を用いたChip assayではHOXD9がP97プロモーターに結合することが示されたP53分解に関与しているE6、E7発現量を検討し、P53増加の理由を探る。その他高リスク型HPV感染細胞株を用いて、同様の結果が得られるかを検討する。in vivo研究も視野に入れ、研究を進める。実際にHOXD9がP97プロモーターと直接結合するかをChromatin immunoprecipitationによって検討する婦人科腫瘍学計画していた学会発表をしなかったこと、および効率的な経費運用ができたためである。研究は順調に進捗している。学会への参加をせず、旅費を使用しなかった。また、効率的に研究を推進できた。HPVとHOXD9の発現を検討するため、E6,E7のP97プロモーターを有するルシフェラーゼアッセイのためにプラスミド作成に使用する。
高専型実践教育の、発展的高度化のためのシステム構築と実行

本研究は、教育および研究を有機的に連結し、電磁場に関する実践的教育とグロー放電基礎過程研究を並列的に遂行することを目的とする。その主要実験研究を「電磁場総合実験装置」を用いて13,14年度にわたり、総合的に進め、以下の成果、知見を得た。本研究では教育課程における電気電子基礎、電磁場、気体・固体電子工学、電子物性、計算機ハード・ソフト、等の分野において網羅的に体験学習および研究することを意図している。1.平行平板電場における気体電離過程の実験研究。グロー放電プラズマの生成過程における電場、電位、放電電流の計測とその解釈。大気汚染浄化基礎研究としてNOxガスを含む混合気体プラズマの生成過程、挙動を追及した。その基本として、N_2,O_2,N_2/O_2混合ガス、室内空気における印加電圧の変動と立ち上がり特性の相関測定を行った。そのために四重極質量分析法を用いたガス分圧時間変化の測定,可視光分光測定によろ放電初期過程における放電電流と分圧,可視光放射スペクトルとの相関についての新しい知見を得,内外で発表した。2.高周波プラズマ(13.56MHz)を用いたNOxガスの処理に関する基礎実験。容量結合型高周波プラズマ生成において、高周波電力電源からのプラズマへの高効率電力注入を目指し、電気回路的解析、生成プラズマの分光計測、高周波電磁場の電力、位相測定により、電力最適化を図った。卒研、特別研究、等に成果を得た。3.混合ガスプラズマの特性と不純物ガスとの関連解明を目的に、プラズマ容器壁からの脱ガスに関する解析、計算機シミュレーションを実施した。この課題は高温プラズマの生成・閉じこめに必須な研究であり、他分野研究者との協力を得た。以上の成果を、他大学、研究所、海外協力者との連携により実施した。本研究の主目的は、高専における卒業研究、専攻科特別研究、更にその指導教員の専門研究を一体として進め、大学、研究所等との連携をも含めて、教育研究の高度化を意図するものである。13年度においては、そのための実験装置「電磁場総合実験装置」を整備し、初期実験における成果を得た。本システムの構成は、1真空容器と排気系および四重極質量分析計、2直流・高周波電力放電プラズマ生成電源とその制御系、3電磁場計測とデータ処理系,4関連物性計測器(静電探針、高電圧測定、可視分光計測、ガス分析計、等)に大別出来る。本研究では電気電子基礎、電磁場、気体・固体エレクトロニクス、電子物性、計算機ハード・ソフト、等の課題を体験的に学習し、更にその関連研究の遂行へと発展し得る。本年度における研究成果は以下である。(1)酸素、窒素およびその混合ガスの放電形成に関する研究。特にその放電前駆現象の詳細実験研究において、ガス混合比、過電圧率にたいする前駆現象出現条件の追及、放電立ち上がり電流および発光特性の計測、によりパルス性放電形成と無パルス性放電形成の関連を明白にした。「電気学会、国際学会発表」。(2)大気成分ガス放電の基礎研究。Nox系ガスを含む混合気体プラズマ挙動とその分光測定、四重極質量分析法を用いた分圧時問変化の測定、マイナスイオンの測定。「卒業研究、研究会発表」。(3)真空容器壁からのガス放出特性の解析に関するする大学、研究所との連携研究。ステンレス鋼からの水素放出を拡散方程式により解析した。高温プラズマ閉じ込め真空容器壁における水素挙動において、容器層中の水素分布とその拡散特性が、ガス放出に大きな影響を及ぼすことの知見を得た。「論文発表、国際学会発表」。

その主要実験研究を「電磁場総合実験装置」を用いた13年度に引き続いて、総合的に進め、以下の成果、知見を得た。本研究では教育課程における電気電子基礎、電磁場、気体・固体電子工学、電子物性、計算機ハード・ソフト、等の分野において網羅的に体験学習および研究することを意図している。1、平行平板電場における気体電離過程の実験研究。グロー放電プラズマの生成過程における電場、電位、放電電流の計測とその解釈。大気汚染浄化基礎研究としてNOxガスを含む混合気体プラズマの生成過程、挙動を追及した。その基本として、N_2,O_2,N_2/O_2混合ガス、室内空気における印加電圧の変動と立ち上がり特性の相関測定を行った。そのために四重極質量分析法を用いたガス分圧時間変化の測定、可視光分光測定による放電初期過程における放電電流と分圧、可視光放射スペクトルとの相関についての新しい知見を得、内外で発表した。2、高周波プラズマ(13.56MHz)を用いたNOxガスの処理に関する基礎実験。容量結合型高周波プラズマ生成において、高周波電力電源からのプラズマへの高効率電力注入を目指し、電気回路的解析、生成プラズマの分光計測、高周波電磁場の電力、位相測定により、電力最適化を図った。卒研、特別研究、等に成果を得た。3、混合ガスプラズマの特性と不純物ガスとの関連解明を目的に、プラズマ容器壁からの脱ガスに関する解析、計算機シミュレーションを実施した。この課題は高温プラズマの生成・閉じ込めに必須な研究であり、他分野研究者との協力を得た。以上の研究を、高専、他大学、研究所、海外協力者との連携により実施した。
チタン酸ストロンチウム結晶中の転位に形成させたナノ細線デバイスの作成

結晶中の一次元欠陥の一つである転位は、転位コアを中心とした数ナノメートルの領域に応力場が存在するため、転位線に沿って高速な拡散を示すことが知られている。この特異な現象を利用して転位コアへ添加物などを優先的に拡散させるとバルク中に転位コアを中心としたナノ細線を作製することが可能となる。本研究では、この現象を利用してチタン酸ストロンチウムや化合物半導体の転位へドーパントを添加してナノ細線を作製し、その物性について調べた。チタン酸ストロンチウム(以下STO)の小傾角粒界における粒界転位配列の制御、解析を行った。傾角が28゚の範囲内において粒界には主に刃状転位が配列することが分かった。その転位間隔は傾角に依存して変化し、傾角が増大するとともに転位密度が増大することが明らかとなった。転位コアへのドーパント添加に先立ち、転位コアおよびその近傍における陽イオン比変化に関する基礎的データーについて調べた。まず、高温下での熱処理により、転位近傍がSr過剰となる領域と化学量論比から大きくは変化しない領域とに分類できることが見出された。さらに、この陽イオン比の変化に伴いSr過剰領域では粒界の一部にワァセット化が認められることを突き止めた。この陽イオン比変化は熱処理中に生じる陽イオン空孔の形成挙動と密接に関連すること、また、それら空孔形成エネルギーの差が不定比性をもたらすことを理論計算により明らかにした。このような不定性の発現は、ドーパントの種類に依存する可能性があることについても突き止めた。一方、転位コアへのドーパント添加については、基礎実験で明らかとなった陽イオン比変化をもとにTiサイト置換型のイオンを選択する必要がある。その候補としてLaイオンを用いることとし、粒界上へLa水溶液を塗布後高温下で熱処理を行ったところ転位コア中へのLaの拡散が認められた。この拡散したLaは転位コア部にのみ存在するわけではなくその近傍にも分布していることが明らかとなった。本年度は昨年度に得られた基礎データをもとにチタン酸ストロンチウム結晶中に転位を高密度に導入する熱処理条件ならびに塑性変形条件を検討した。さらに、結晶中に導入された転位の原子構造解析を行った。その結果、ある種の転位は転位コアが分解すること、そのバーガースベクトルは1/2a[001](aはチタン酸ストロンチム格子の格子定数)であることなどを確認した。一方、このような転位導入について小傾角粒界を用いた双結晶の作成についても行った。まずその接合条件を検討した。試料には機械研磨の後にメカノケミカル研磨処理を行ったチタン酸ストロンチウム[001]単結晶基板を用いた。接合面を洗浄した後に、互いに重ね合わせ大気中にて高温熱処理を行った。その結果、重ね合わせた単結晶基板が完全に接合する温度範囲は、11001300°Cであることを確認した。接合後の断面観察(クロスセクション)を主に透過型電子顕微鏡を用いて行ったところ粒界部は原子レベルで接合されており、アモルファス層や第二層などの析出物などについては確認されなかったことから接合条件については適切であるこもと判断できる。一方、その粒界面に対して垂直方向(プランビュー)から観察を行ったととろ粒界部には粒界転位網が形成されていることを確認した。これらの転位は、完全転位で構成されており、全て螺旋転位であることがわかった。さらに、互いの回転角度を僅かに変化させた試料を種々作成し、その転位構造の変化について調べたところ、回転角度が大きくなるに従い転位網の転位間距離が減少することくを確認した。これらの知見をもとに、転位中への原子拡散を行っていく予定である。一次元の結晶格子欠陥である転位コアは、周囲の結晶と比較して格子歪やそれに伴う応力場を有しており、添加元素などの高速拡散現象であるパイプ拡散を示すことが知られている。この高速拡散を利用すると転位コア部分へのみ添加元素を拡散させたユニークな転位細線を作製することが可能となる。本研究ではこのような転位へ元素を拡散させた転位細線の作製を目標として、SrTiO3結晶における特に陽イオン空孔の形成メカニズムと格子不整合領域の原子構造との相関性を明らかにすること、格子不整合領域の点欠陥形成挙動の制御法の確立をおこなうこと、特異な物性を発現する粒界転位原子構造を探索し、コア構造と物性との相関性を明らかにする。SrTiO3結晶における転位コアへの他種イオンの拡散による転位ナノ細線の作製に挑戦することを目的として研究を進めてきた。まず、陽イオン比の制御については実験手法の簡便さからPLD法を用いた薄膜において陽イオン比変化とその原子構造変化との相関を調べ、Sr過剰ではSrO層が形成されること、Ti過剰ではSr空孔がクラスタリングすることを突き止めた。

また、粒界転位導入を念頭において各種方位関係における粒界原子構造形成について調べたところ、非常に対称性のよいΣ3粒界においても粒界に陽イオン比の不定比を有する独特の粒界構造ゴニットが現れることを明らかにした。最終的にSrTiO3小傾角粒界において粒界転位を導入し、その転位コアにおける陽イオン比の不定比性を利用した転位細線の作製を行った。
カルパインが関与する胃粘膜防御機構と食・薬剤ストレスとの関連についての解析

カルパインは、特定の基質タンパク質を限定分解し、その構造や機能を制御・修飾するモジュレータープロテアーゼで、様々な発現様式を有する14種の遺伝子がヒトに存在する。カルパインの活性不全が筋ジストロフィー症、糖尿病など種々の病態の要因になること、組織普遍的に発現するカルパイン遺伝子のノックアウトマウスは胚性致死になることから、その生理機能は多様で、非常に重要であると考えられる。これは、食物の消化・吸収という生体の構成・維持の根本を担う胃腸でも例外ではなく、現代のヒトの死因の多くを占める胃癌との関与が示唆されている。申請者は、14種の分子種のうち、胃特異的に発現する分子種nCL-2に着目し解析を開始した。その結果、昨年度までに、組織内局在解析から胃粘膜の表層粘液細胞に限定して発現することと、nCL-2のプロテアーゼ活性をもたないノックインマウス作出し、これらがストレス性の胃粘膜出血傾向にあること、nCL-2の基質としてβ-COP(輸送小胞コートタンパク質)を同定し、nCL-2がβ-COPの限定分解を通じて粘液細胞内における粘液分泌小胞・顆粒の輸送・分泌を制御している可能性を見出した。これらの生理的意義、詳細な分子機構の解明には至ってないが、本年度は、生化学的手法によりnCL-2の酵素学的性質について、(1)nCL-2は5EFハンドドメインを持つ典型的カルパインであるにも関わらず、カルパイン潜性制御サブユニット(30K,30K-2)を活性に必要としないこと、(2)nCL-2は活性の主体はモノマーであるがホモダイマーあるいはホモオリゴマーも形成しうること、(3)5EFハンドドメインではなく、C2様ドメインがnCL-2多量体形成に重要である、という興味深い知見を見出した。C2様ドメインはカルパインの膜結合に関与することが明らかにされており、nCL-2の細胞内膜系を介した多量体形成とβ-COP等の膜系タンパク質の限定分解を通じた生理機能を示唆するものである。カルパインは、特定の基質タンパク質を限定分解し、その構造や機能を制御・修飾するモジュレータープロテアーゼで、様々な発現様式を有する14種の分子種が存在する。しかし、その分子機構を含め、胃腸におけるカルパインの機能は不明である。その結果、組織内局在解析から胃粘膜の表層粘液細胞に限定して発現することと、nCL-2のプロテアーゼ活性をもたないノックインマウス作出し、これらがストレス性の胃粘膜出血傾向にあることを明らかにした。その分子機構を明らかにする目的で、酵母two-hybrid法、マウス胃粘膜タンパク質を用いたpull-down法によってnCL-2相互作用因子・基質の同定を目指した。その結果、β-COP(輸送小胞コートタンパク質)が基質であることを見出し、nCL-2がβ-COPの限定分解を通じて粘液細胞内における粘液分泌小胞・顆粒の輸送・分泌を制御している可能性を見出した。またその他に、ミトコンドリアタンパク質、ユビキチンリガーゼなども相互作用因子として同定した。そして上記ノックインマウスと野生型マウスの胃粘膜タンパク質の二次元電気泳動解析を行い、両者で発現量に差があるタンパク質を数種見出し、Mass spectrometryによる同定を進めている。同定したタンパク質についてはnCL-2との相互作用の生理的意義を解明していきたい。

これらの生理的意義、詳細な分子機構の解明には至ってないが、本年度は、生化学的手法によりnCL-2の酵素学的性質について、(1)nCL-2は5EFハンドドメインを持つ典型的カルパインであるにも関わらず、カルパイン潜性制御サブユニット(30K,30K-2)を活性に必要としないこと、(2)nCL-2は活性の主体はモノマーであるがホモダイマーあるいはホモオリゴマーも形成しうること、(3)5EFハンドドメインではなく、C2様ドメインがnCL-2多量体形成に重要である、という興味深い知見を見出した。C2様ドメインはカルパインの膜結合に関与することが明らかにされており、nCL-2の細胞内膜系を介した多量体形成とβ-COP等の膜系タンパク質の限定分解を通じた生理機能を示唆するものである。
生体酵素の機能を模倣したナノ物質変換システムの開発

本研究では、ナノ材料の特異な物性を利用し、通常は困難な化学反応を穏和な条件下で実現する手法の開発を目的としている。3人の研究者がそれぞれ、項目(1):構造および機能を制御したナノ多孔体の開発および基礎物件評価、項目(2):サイズ選別したナノ粒子の作製、ナノ多孔体への担持、および触媒能の基礎評価、項目(3):ナノ多孔体/ナノ粒子複合材料を電極とする電気化学リアクタの作製と反応評価、の各項目を分担する。平成19年度の研究実績は以下の通りである。項目(1)については、層状物質Mo03の層間にNa、K、Fe(Phen)3などのイオンを挿入した多孔体を合成、項目(3)とも合わせて、これらのナノ多孔による、硝酸イオンや亜硝酸イオンの電解還元活性を評価した。項目(2)については、表層(シェル)にのみ白金を有し、内部(コア)を異なる金属で置換したコア・シェル型ナノ粒子の作製に取組み、精密にサイズ制御した金・白金コア・シェルナノ粒子および銀・白金コア・シェルナノ粒子の作製に成功した。項目(3)については、カーボンブラックに担持した金ナノ粒子触媒について、水溶旅中での酸素の電解還元に対すろ活性を評価し、過酸化水素の合成に高い選択性を示すことを発見した。また、同じくカーボンブラッグに担持しだ金-白金コア・シェルナノ粒子触媒について、純白金触媒に迫る性能を有することを確認した。このほか、タングステンナノ粒子上での窒素活性化機構を理論的に解明した。本研究は、ナノ材料の特異な物性を利用し、通常は困難な化学反応を穏和な条件下で実現することを目的とする。平成17年度は、項目(1):ベースとなるナノ多孔体の選定、構造・機能制御の手法確立、項目(2):ナノ粒子の構成元素の選定、作製条件の決定、ナノ多孔体への坦持法の確立、項目(3):ナノ材料の電極化プロセスの確立、反応評価法の決定、の3項目を柱とする研究計画に沿って研究を実施した。項目(1)については、層状物質の層間に遷移金属錯体を挿入することにより層間隔を拡張、ナノ細孔として利用する手法を採用した。挿入する錯体によって細孔の大きさを制御できる上、錯体や層状物質の構成元素を適切に選ぶことで、多孔体自体に触媒機能を付与できる可能性がある。本年度は、層状物質MoO3にFe(Phen)3などを挿入した多孔体を合成し、ナノ細孔を系統的に制御できることを確認した。項目(2)については、Auナノ粒子を分散した溶液にナノ多孔体を浸潤することにより、ナノ細孔中にナノ粒子を坦持できることを確認した。Fe、Mo、V、Wなどの遷移金属ナノ粒子については、湿式法による合成を試みているが、これまでのところ成功していない。項目(3)については、水溶液系電解セルの作用電極としてカーボンペーストにナノ材料を混合して用いる方法、グラッシーカーボンの表面にナノ材料のキャスト膜を作製して用いる方法などを採用した。評価法としては回転リング/ディスク電極法などを採用した。NOの還元反応などを予備実験として行い、十分な検出感度が得られることを確認した。この他、パイライトFeS2のFeサイトの一部をVで置換した材料の湿式合成を行い、系統的に組成制御ができることを確認した。また、Wナノ粒子の触媒機能による窒素活性化機構について量子化学計算により重要な知見を得た。本研究では、ナノ材料の特異な物性を利用し、通常は困難な化学反応を緩和な条件下で実現する手法の開発を目的としている。3人の研究者がそれぞれ、項目(1):構造および触媒能を制御したナノ多孔体の開発および基礎物性評価、項目(2):サイズ選別したナノ粒子の作製、ナノ多孔体への担持、および触媒能の基礎評価、項目(3):ナノ多孔体/ナノ粒子複合材料を電極とする電気化学リアクタの作製と反応評価、の各項目を分担する。平成18年度の研究実績は以下の通りである。項目(1)については、前年度に有効性を検証したナノ多孔体の構造・機能制御の手法を用いて、より具体的な機能発現を狙ったナノ多孔体の合成に取り組んだ。層状物質Mo03の層間にNa、K、Fe(Phen)3などのイオンを挿入した多孔体を合成、イオンの比率を変化させることで細孔サイズを精密制御できることを確認した。また項目(3)とも合わせて、これらのナノ多孔体の電気化学的水素吸蔵能を評価した。項目(2)については、精密にサイズ選別した、金ナノ粒子担持触媒のCO酸化活性に関して、4.5nm6.5nmの領域での評価をおこない、1.56.5nmの粒径領域でのサイズ効果を明らかにした。また、エアロゲル担持金触媒の高担持領域での性能評価、および幅広い温度域(200350K)での反応速度の温度依存を明らかにした。項目(3)については、作製したナノ材料の電気触媒としての機能評価に取り組んだ。層状化合物Mo03をベースに作製したナノ多孔体については、水溶液中での電気化学的水素吸蔵能を評価し、層間に挿入した陽イオンの種類と密度に対する依存性を明らかにした。また、活性炭に担持した金ナノ粒子触媒の電極化手法を開発するとともに、予備実験として行った金バルク電極による電解実験において、アルドール反応の室温下でのon/off制御に成功した。

3人の研究者がそれぞれ、項目(1):構造および機能を制御したナノ多孔体の開発および基礎物件評価、項目(2):サイズ選別したナノ粒子の作製、ナノ多孔体への担持、および触媒能の基礎評価、項目(3):ナノ多孔体/ナノ粒子複合材料を電極とする電気化学リアクタの作製と反応評価、の各項目を分担する。平成19年度の研究実績は以下の通りである。項目(1)については、層状物質Mo03の層間にNa、K、Fe(Phen)3などのイオンを挿入した多孔体を合成、項目(3)とも合わせて、これらのナノ多孔による、硝酸イオンや亜硝酸イオンの電解還元活性を評価した。項目(2)については、表層(シェル)にのみ白金を有し、内部(コア)を異なる金属で置換したコア・シェル型ナノ粒子の作製に取組み、精密にサイズ制御した金・白金コア・シェルナノ粒子および銀・白金コア・シェルナノ粒子の作製に成功した。項目(3)については、カーボンブラックに担持した金ナノ粒子触媒について、水溶旅中での酸素の電解還元に対すろ活性を評価し、過酸化水素の合成に高い選択性を示すことを発見した。また、同じくカーボンブラッグに担持しだ金-白金コア・シェルナノ粒子触媒について、純白金触媒に迫る性能を有することを確認した。このほか、タングステンナノ粒子上での窒素活性化機構を理論的に解明した。
免疫学的測定法に及ぼす異好抗体の干渉とその回避法の開発

ヒト抗マウス抗体(HAMA)検出用ELISAシステムを作製し、患者検体290例のHAMA保有率を調べた。個々の測定値は、(検体の吸光度-blank)/(陽性コントロールの吸光度-blank)で表し、検討症例全体の平均値+2SDをカットオフ値とした。なお、陽性コントロールにはラビット抗マウスIgGを用いた。その結果、IgG型18例(6.2%;抗IgG1:14例、抗lgG2a:5例、抗lgG2b:4例)、IgM型20例(6.9%;抗IgG1:11例、抗IgG2a:9例、抗IgG2b:9例)が陽性であった。また、IgG型とIgM型の両者が陽性は4例(1.3%)であった。次に、本測定系の特異性を確認するため、各種マウスIgGをSDS電気泳動し、ELISAで陽性と判定された患者血清3例を用いてimmuno-blottingを行ったところ、全例でバンドが検出された。ところで、HAMAの影響を回避する方策として、試料または測定試薬に精製マウスIgGからなるHBR(異好性阻止薬)を添加する方法がある。そこで、IgM型HAMAが陽性の2症例を用い、HBR(Scanti-bodies社製)が実際にマウスIgGとの反応を阻害できるか否かELISAで調べた。その結果、試料100μlにHBRを10または15μl添加すると、吸光度が明らかに低下した。一方、5μl添加時には、吸光度が有意に上昇した。この機序は不明であるが、HBRをHAMA回避策として用いる際には、その添加量の設定が重要であることが明らかになった。ヒト抗マウス抗体(HAMA)検出用ELISAシステムの作製にあたり、まず、固相化するマウスIgG1、IgG2aおよびIgG2bの選定を試みた。すなわち、DAKO社およびSigma-Aldrich社製の各種IgGを4°C、over nightで固相化し、horseradish peroxidase(HRP)標識抗マウスIgGを反応させた後、o-ohenyl diamineを添加し吸光度を測定した。測定値の同時再現性、日差再現性および固相化するIgGのロット間差を検討したところ、いずれもSigma-Aldrich社製のIgGが優れていた。次に、ブロッキングバッファーによる洗浄回数について検討した。マウスIgGを固相化していないウェルにHRP標識抗ヒトIgGあるいはIgMを添加し、ブロッキングバッファーで36回洗浄後、発色させた。その結果、洗浄回数3回では明らかな吸光度上昇がみられ、4回以上の洗浄が必要なことが明らかになった。これらの基礎検討に基づき、患者検体171例のHAMA保有率を調べた。健常者血清(10名)の平均吸光度+2SDをカットオフ値とすると、IgG型22例(抗IgG1:9例、抗IgG2a:6例、抗IgG2b:7例)、IgM型18例(抗IgG1:7例、抗IgG2a:5例、抗IgG2b:6例)が陽性であった。そこで、本測定系の特異性を確認するため、各種マウスIgGをSDS電気泳動し、ELISAで陽性と判定された患者血清3例を用いてimmuno-blottingを行ったところ、全例でバンドが検出された。現在、症例数を増やしHAMAの陽性率を検討すると同時に、その回避法の開発に着手している。

個々の測定値は、(検体の吸光度-blank)/(陽性コントロールの吸光度-blank)で表し、検討症例全体の平均値+2SDをカットオフ値とした。なお、陽性コントロールにはラビット抗マウスIgGを用いた。その結果、IgG型18例(6.2%;抗IgG1:14例、抗IgG2a:5例、抗IgG2b:4例)、IgM型20例(6.9%;抗IgG1:11例、抗IgG2a:9例、抗IgG2b:9例)が陽性であった。また、IgG型とIgM型の両者が陽性は4例(1.3%)であった。次に、本測定系の特異性を確認するため、各種マウスIgGをSDS電気泳動し、ELISAで陽性と判定された患者血清3例を用いてimmuno-blottingを行ったところ、全例でバンドが検出された。ところで、HAMAの影響を回避する方策として、試料または測定試薬に精製マウスIgGからなるHBR(異好性阻止薬)を添加する方法がある。そこで、IgM型HAMAが陽性の2症例を用い、HBR(Scanti-bodies社製)が実際にマウスIgGとの反応を阻害できるか否かELISAで調べた。その結果、試料100μ1にHBRを10または15μ1添加すると、吸光度が明らかに低下した。一方、5μ1添加時には、吸光度が有意に上昇した。この機序は不明であるが、HBRをHAMA回避策として用いる際には、その添加量の設定が重要であることが明らかになった。
脳内神経伝達物質遊離調節における興奮性アミノ酸受容体の関与について

脳内神経伝達物質遊離調節における興奮性アミノ酸受容体の関与について、平成5年度および6年度の研究計画に従って実験を行い以下の知見が得られた。1)NMDAの全身投与(10-30mg/kg,i.p.)により、海馬および線条体における細胞外タウリン(TAU)濃度の有意な増加が観察されたが、グルタミン酸(GLU)、アスパラギン酸(ASP)およびドーパミン(DA)関連物質濃度には有意な変動は認められなかった。2)NMDAの短時間(10分間)局所適用により、用量に依存したアミノ酸およびDAの上昇が引き起こされた。TAUは低濃度のNMDA(0.03mM)適用により、有意な増加が観察されたが、GLU、ASPおよびDAは高濃度のNMDA(>1mM)を適用したときのみ有意な増加が認められた。3)NMDA(1mM)およびnon-NMDA受容体興奮薬であるAMPA(1mM)の持続局所適用により、上記アミノ酸およびDAの著明な増加が認められた。NMDA持続適用1時間以降において、その作用に脱感作現象が観察された。とくに、DAにおいて顕著であった。4)NMDAによるTAUおよびDA増加作用は、NMDA受容体拮抗薬のAP-5(1mM)存在下において強く抑制された。non-NMDA受容体拮抗薬のDNQX(0.1-0.3mM)処置により、NMDAによるTAU増加作用は全く抑制されなかったが、DA増加作用は強く抑制された。AMPAのTAUおよびDAに対する作用は、AP-5処置では全く影響を受けなかったが、DNQX処置によりTAUおよびDAに対する両作用は強く抑制された。5)高張リンゲル液(150mM蔗糖を加えたもの)潅流下において、NMDAおよびAMPAによるDA増加作用は強く減弱された。しかしながら、TAU増加作用は全く抑制されなかった。6)NMDA(1mM)の持続局所適用により、アセチルコリン濃度の増加が認められた。7)以上の結果より、脳内神経伝達物質の細胞外濃度調節機構にNMDA受容体の活性化が重要な役割を果たしていること、およびTAUが外因性NMDA投与に対し鋭敏に反応することが明らかになった。また、高濃度のNMDA適用によるDA増加は、細胞障害に伴う細胞膨張あるいはそれに伴う他の伝達物質(GLU?)の遊離増加を介して引き起こされる可能性が示唆された。脳内神経伝達物質遊離調節におけるNMDA受容体の関与を明らかにする目的で、平成5年度の研究計画に従って実験を行い以下の知見が得られた。1.NMDAの全身投与(3-30mg/kg,i.p.)により、海馬CA1領域および線条体における細胞外タウリン濃度を有意に上昇(投与前の3-5倍)した。線条体におけるその増加作用は海馬における増加作用と比し、持続的であった。一方、グルタミン酸あるいはアスパラギン酸などの他のアミノ酸濃度には著明な変化が認められなかった。

2.NMDA(300muM)の両部位へのプローブを介した脳内局所投与(20分間)により、全身投与と同様な作用が観察された。3.上記のNMDAによる両部位における細胞外タウリン濃度増加作用は、NMDA受容体の非競合型拮抗薬であるMK-801(1mg/kg,i.p.)前処置および競合化型拮抗薬であるAP-5(1mM)存在下においてNMDAの作用は消失した。4.高張溶液(150mM庶糖を含むリンゲル液)灌流下において、両部位におけるNMDAによるタウリン増加作用には変化は認められなかった。5.線条体における細胞外ドーパミン濃度はNMDAの全身投与(10-30mg/kg,i.p.)により著明な変動を認めなかった。一方、高用量のNMDA(3mM)の脳内局所投与により、ドーパミンの著明な増加(投与前の約10倍)と持続的なドーパミン代謝産物(DOPACおよびHVA)の減少が観察された。これらのNMDAの作用は、AP-5(1mM)の存在下で強く抑制された。以上の結果より、NMDA受容体の活性化がタウリンおよびドーパミンの遊離を引き起こすことが示唆された。しかしながら、それぞれ遊離の増加を引き起こすに必要な外因性NMDA濃度に差があると思われることから、用量-反応相関を調べる必要性やNMDAの作用機構をさらに詳細に検討することが必要であると考えられる。脳内神経伝達物質遊離調節におけるNMDA受容体の関与を明かにする目的で、平成6年度の研究計画に従って実験を行い以下の知見が得られた。1)NMDA(0.03-10mM)ラット線条体に短時間(10分間)局所適用することにより、用量に依存したタウリン(TAU)、アスパラギン酸(ASP)、グルタミン酸(GLU)などのアミノ酸およびドーパミン(DA)濃度の上昇が認められた。TAU濃度は低濃度(0.03mM)のNMDA適用により有意な増加が認められたが、ASP、GLUおよびDAは高濃度のNMDA(>1mM)を適用した時のみ有意な増加が観察された。2)高濃度NMDA(1mM)持続適用によりTAU、ASP、GLUおよびDAの著明な増加が認められた。NMDA持続適用によるこれら反応に脱感作現象が観察されたが、DAにおいて最も顕著に認められた。3)non-NMDA受容体興奮薬であるAMPA(1mM)持続適用によっても、細胞外アミノ酸およびDAが有意に上昇した。4)NMDAによるTAU増加作用は、AP-5(NMDA受容体拮抗薬;1mM)前処置により拮抗されたが、DNQX(non-NMDA受容体拮抗薬;0.1-0.3mM)処置では影響されなかった。AMPAによるTAU増加作用は、DNQXにより拮抗されたが、AP-5処置では影響されなかった。一方、AMPAによるDA増加作用は、DNQX処置によってのみ抑制されたが、NMDAによるDA増加作用はAP-5およびDNQX処置により、強く抑制された。5)NMDAおよびAMPAによるTAUの増加作用は、高張溶液(150mM蔗糖を加えたもの)潅流下においても全く影響を受けなかったが、DAの増加作用は強く減弱された。6)NMDA(1mM)持続適用により、線条体アセチルコリン濃度の有意な増加が観察された。7)以上の知見より、TAUは低濃度の外因性興奮性アミノ酸(NMDA or AMPA)適用に対し、GLUやDAなどと比し鋭敏に反応することが明らかになった。また、高濃度のNMDAあるいはAMPA
神経幹細胞の血管性nicheの解明および血管－神経相互作用物質の研究

成体脳において神経幹細胞の存在が知られているが、脳梗塞後の神経機能再生に足る神経前駆細胞誘導能は著しく低い。我々は新規血管-神経インタラクション分子を同定し、神経幹細胞の効率良い賦活化誘導を目的として研究を行った。血管内皮細胞由来小胞に含まれるmicro RNAが神経幹細胞の分化抑制に重要であることを見出した。さらに血管内皮細胞由来リガンドによって、神経幹細胞の増殖を活性化することも明らかにした。これらの結果から、脳血管内皮細胞は、神経幹細胞の分化増殖に対して、ブレーキとアクセルを使い分けており、それこそが血管内皮細胞が提供する神経幹細胞のniche factorであると考えられた。これまでに我々は、新規血管ー神経インタラクション物質を同定・解析するために、血管内皮細胞と神経幹細胞を用いたin vitroでの評価系を構築し、評価系として耐えうるか研究を行ってきた。その過程で、血管内皮細胞由来のE-EVsに包含されるmicro RNAs (miRNAs)を多数発見し、その中の数種類が神経幹細胞から神経への分化抑制に重要な働きを有する可能性を見出してきた。昨年度の進捗として、in vitroでの評価系の確立と解析の施行によって、新規血管ー神経インタラクション物質について数種類の絞り込みを完了した。本物質は血管内皮細胞で高発現しているが、神経幹細胞での発現は低レベルか皆無であった。また、神経幹細胞に高発現しているreceptor type tyrosine kinase (RTK)に作用し、神経幹細胞の増殖に対して正に作用していると考えられた。興味深いことに、これら物質の細胞内シグナルによって発現増加する転写因子が異なっており、血管内皮細胞での発現が一番高かった物質が最も転写因子の誘導が高いことを見い出した。さらに、これまでに明らかにしてきた血管内皮細胞由来miRNAsが、神経幹細胞から神経への分化を抑制している可能性についてもreal-time PCR解析などを施行し、血管内皮細胞が神経細胞に提供するniche factorとして、細胞増殖を司るシグナル、細胞分化を抑制するシグナルとが存在することを示唆するデータを得た。これまでに我々は新規血管-神経インタラクション分子を同定・解析するために血管内皮細胞と神経幹細胞を用いたin vitroでの評価系を構築し、評価系として耐えうるか研究を行ってきた。その過程で、血管内皮細胞由来E-EVsに包含されるmicro RNA (miRNA)を多数発見し、その中の数種類が神経幹細胞から神経への分化抑制に重要な働きを有する可能性を見出した。また、血管内皮細胞が産生する因子が神経幹細胞に高発現しているreceptor type tyrosine kinase (RTK)に作用し、神経幹細胞の増殖に寄与していることを示唆するデータを得ている。昨年度の進捗としては、本因子が作用するRTKに対するリガンドとして、多くの因子が報告されているが、大変興味深いことに血管内皮細胞の種類によって産生するリガンドの種類が異なることが明らかとなった。神経幹細胞が存在するSVZやSGZには脳血管が近接しているが、脳血管内皮細胞には本因子が高発現していることがin vitroでの検討で明らかとなったとともに、免疫組織化学的検討でも同様の結果を得ることができた。In vitro、in vivoでのniche物質の解析が進んでいるため、おおむね順調に進展していると判断した。研究実施期間において、血管内皮細胞由来miRNAsが、神経幹細胞から、神経への分化を抑制している可能性についてもreal-timePCR解析などを施行し、血管内皮細胞が神経細胞に提供するniche factorとして、細胞分化を抑制する因子であることを示唆するデータを得た。また、血管内皮細胞の種類によって、産生されるRTKに作用するリガンドの種類が異なることが明らかとなった。さらに、脳血管内皮細胞で高発現しているリガンドを直接神経幹細胞に作用させた場合、容量依存的にRTKの発現量が増加し、転写因子の発現量が亢進し、さらに増殖にかかわるサイクリン遺伝子群の発現上昇が観察された。一方で、神経分化にかかわる転写因子の抑制はそれほど強くないことが示された。従って、RTKシグナルによって細胞増殖に対し正の調節を行い、血管内皮細胞由来miRNAsによって神経分化に対し負の調節を行っていることが示唆される結果となった。。

さらに血管内皮細胞由来リガンドによって、神経幹細胞の増殖を活性化することも明らかにした。これらの結果から、脳血管内皮細胞は、神経幹細胞の分化増殖に対して、ブレーキとアクセルを使い分けており、それこそが血管内皮細胞が提供する神経幹細胞のniche factorであると考えられた。In vitroでの評価系の確立と評価の開始、およびniche物質の同定が進んでいるため、おおむね順調に進展していると判断した。血管-神経インタラクションの系の構築・解析から明らかになった血管内皮細胞由来のniche物質の解析が進行していることから、本研究はおおむね順調に進行しており、研究の大きな変更はない。血管生物学、神経幹細胞学血管ー神経インタラクションのin vitroの系の構築とそれに続く評価の進行により、新規血管ー神経インタラクション物質の絞り込みができた。今後は、細胞増殖を司るシグナル、細胞分化を抑制するシグナルが存在することを阻害物質添加実験や強制発現実験などにより、より信憑性のあるデータ取得を行う予定です。本研究はおおむね順調に進行しており、研究の大きな変更は無い。端数余剰となったため。余剰金947円を次年度有効活用します。余剰金89円を次年度有効活用します。