hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
水田高度利用技術による人為的地下水位変動が流域の栄養塩類流出に及ぼす影響の解明

本研究は水田高度利用技術導入が流域の水・物質循環へ与える影響を解明するため、地下水位制御システム(FOEAS)が設置されたライシメーターを用いてダイズ及び冬コムギを作付けし、環境中への水・物質流出量を測定し、水文流出モデルによって評価を行った。ダイズ作付期間中は地下水位を1-60cm区、2-30cm区(FOEAS標準)、3水位変動区の2反復3パターンに区分し、冬コムギ作付期間中は全て-60cmとした。観測の結果、地下水位を高く設定した2の条件において排水中の硝酸濃度は低くなった。地下水中の酸化還元電位、重炭酸イオン濃度、硝酸の窒素・酸素安定同位体比分析の分析結果が脱窒反応を支持したことから、溶脱した施肥窒素が地下水面近傍で脱窒したことが硝酸濃度低下の要因と考えられた。窒素濃度に排水量を乗じた窒素流出量は、ダイズ作付期間中は3>1>2の順番で多い結果となった。3は最も多い結果となり、地下水位の変動に伴って土壌中での有機物分解が促進された可能性を示した。冬コムギ作付け時では、給水量および降水量が少ないため窒素流出量はダイズ作付け時よりも少なかった。以上の結果から、水田を畑地として利用した時に一般的な暗渠が設置された水田に近い地下水位に比べて、FOEASによって地下水位を高く保つことで、窒素流出量を抑制できることが確認された。そして、FOEASの地下水位制御機能を模したサブモデルを導入したSWATモデルを用いて流域スケールでの影響評価を行った結果、流域内の水田(単作)全てにFOEAS(標準地下水位設定-30cmを適用)を導入した場合、流域からの栄養塩流出量は輪作の導入に伴って69%の増加傾向を示した一方で、農作物収穫量は大きく増加した。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、水田輪作体系が流域の水・物質循環へ与える影響の解明を行うことを目的とし、水文流出モデルによる河川および地下水からの窒素・リン流出解析を行う。特に、高度化された水田生産基盤技術の一つである「地下水位制御システム(FOEAS)」導入に伴う下流への流出経路とそのタイミングの変化を明らかにする。初年度である平成25年度は、地下水制御型水田輪作サブモデル開発および輪作畑内の地下水位変動による水・栄養塩収支の解明に向けて以下のとおり進めてきた。1.地下水位制御型水田輪作サブモデル開発既存の水文流出モデルに、輪作サブモデルおよび地下水位制御機能を追加し、また、亀裂発達メカニズム、リン流出制御の改良を行った。2.地下水位制御システム設置ライシメータを用いた地下水位変動による水・栄養塩収支の解明(1)表面流出量および暗渠排水量の測定: FOEASライシメータ全6区画のうち、地下水位を1標準区(-30cm)、2低水位区(-60cm)、3水位変動区(週一度-30cmになるように灌水)の3パターン2反復に区分し、ダイズ・コムギを作付け時の栄養塩類の排水パターンの違いを明らかにしてきた。この結果、地下水位を低く設定した場合、栄養塩流出量が増加する可能性が示唆された。(2)土壌水分および土壌特性の測定:各区画において、給俳水量、土壌水分、地下水位、温度、電気伝導度を連続計測できる観測システムを構築し、モニタリングを継続している。また、土壌調査を作付け前後に実施した。この結果、設定した地下水位によって、土壌の物理・化学性が大きく変化した可能性が示唆された。以上で得られた成果を論文としてまとめ、また国際会議および国内会議において発表した。水田輪作体系が流域の水・物質循環へ与える影響の解明を目的とし、水文流出モデルによる河川および地下水からの窒素・リン流出解析を行う。特に、高度化された水田生産基盤技術の一つである「地下水位制御システム(FOEAS)」導入に伴う下流への流出経路とそのタイミングの変化を明らかにするため、2年目は輪作畑内の地下水位変動による水・栄養塩収支の解明に向けて以下のとおり進めてきた。【1.地下水位制御システム設置ライシメータを用いた地下水位変動による水・栄養塩収支の解明】1年目と同様にライシメータ全6区画(面積は13m2)のうち、地下水位を1-60cm区、2-30cm区(標準区)、3水位変動区の2反復3パターンに区分し、2014年7月上旬にダイズ「サチユタカ」を、同年12月に、コムギ「せときらら」を作付けし、水・窒素収支を評価した。ダイズ作において、2標準区では降水量がそのまま排水量に反映したのに対し、3水位変動区では降水量に比べ排水量は少なかった。最終的な給水量は両区に2倍以上の差があったが、収量に有意な差は見られなかった。管理方法の工夫により地下水位を一定に保つ標準的なFOEASの使用法(2標準区)に比べ、収量を低下させることなく灌漑水量を節約できる可能性が示唆された。一方、硝酸負荷量は2014年のダイズ作付け期間が最も多い結果となった。地下水位を高く設定して灌水している間、硝酸濃度は低下したが、地下水位を下げて灌漑を行わなかった間は、硝酸濃度は上昇したことから、前者は地下水中での脱窒を、後者は土壌からの溶脱が示唆された。【2.改良モデルによる流域影響評価】

FOEAS技術導入の影響評価を行うために、中国地方のいくつかの流域(旭川流域、芦田川流域、児島湖流域)において水文流出モデルSWATのセットアップおよびパラメータの調整を行い、解析の準備を整えた。本研究は水田高度利用技術導入が流域の水・物質循環へ与える影響を解明するため、地下水位制御システム(FOEAS)が設置されたライシメーターを用いてダイズ及び冬コムギを作付けし、環境中への水・物質流出量を測定し、水文流出モデルによって評価を行った。ダイズ作付期間中は地下水位を1-60cm区、2-30cm区(FOEAS標準)、3水位変動区の2反復3パターンに区分し、冬コムギ作付期間中は全て-60cmとした。観測の結果、地下水位を高く設定した2の条件において排水中の硝酸濃度は低くなった。地下水中の酸化還元電位、重炭酸イオン濃度、硝酸の窒素・酸素安定同位体比分析の分析結果が脱窒反応を支持したことから、溶脱した施肥窒素が地下水面近傍で脱窒したことが硝酸濃度低下の要因と考えられた。窒素濃度に排水量を乗じた窒素流出量は、ダイズ作付期間中は3>1>2の順番で多い結果となった。3は最も多い結果となり、地下水位の変動に伴って土壌中での有機物分解が促進された可能性を示した。冬コムギ作付け時では、給水量および降水量が少ないため窒素流出量はダイズ作付け時よりも少なかった。以上の結果から、水田を畑地として利用した時に一般的な暗渠が設置された水田に近い地下水位に比べて、FOEASによって地下水位を高く保つことで、窒素流出量を抑制できることが確認された。そして、FOEASの地下水位制御機能を模したサブモデルを導入したSWATモデルを用いて流域スケールでの影響評価を行った結果、流域内の水田(単作)全てにFOEAS(標準地下水位設定-30cmを適用)を導入した場合、流域からの栄養塩流出量は輪作の導入に伴って69%の増加傾向を示した一方で、農作物収穫量は大きく増加した。FOEAS技術導入による地下水位制御時のダイズ作およびコムギ作時の水・窒素収支が明らかになりつつある。2014年の冬に作付けしたコムギの栽培試験が今年7月上旬頃に終了するため、観測データの解析から構築するFOEASサブモデルの最終調整が必要ではあるが、本研究で目的としている、流域スケールでの評価のための水文流出モデルの構築を既に行っており、研究の進捗状況としては、おおむね順調に進展していると評価できる。27年度が最終年度であるため、記入しない。2014年12月に播種したコムギが現在も栽培中であり観測を続けていることから、コムギ試験が終了する7月上旬頃までを対象に、水・栄養塩収支の解明のための観測を実施する。研究期間中に栽培したダイズ2作およびコムギ2作の測定データを用いて、FOEAS技術導入に伴う、水・栄養塩流出量変化を明らかにし、水文流出モデルを用いた流域スケールでの技術導入時の影響評価を行う。初年度の計画通りにモデル改良およびライシメータ試験を実施している。これに加え、所内他圃場や他地域(千葉県、広島県、滋賀県)のFOEAS圃場においても調査を実施しており、現象の普遍性を確認すると共に流域規模へスケールアップする準備も進めている。以上から、研究はおおむね順調に進展していると評価できる。初年度の結果から、設定した地下水位の違いにより土壌の物理・化学性が変化し、その結果として栄養塩流出量にも影響を与えている可能性が示唆されている。このため、土壌の物理性の変化を再現する実験を行う。また、コムギ栽培時には比較的窒素濃度の高い暗渠からの流出が多く確認された。
微気圧・精密海洋底水圧観測に基づく常時地球自由振動の励起源の探求

微気圧データの収集については防災科学技術研究所が整備している三宅火山の微気圧データ1989年1月1999年12月までのデータを取得し、解読プログラム、加工プログラム、作図プログラムを整備した。海洋科学技術センターが整備している室戸沖の津波計データも1998年4月から1999年6月のデータを取得し、解読プログラム、加工プログラム、作図プログラムを整備した。地震研究所三陸沖の津波計データは1999年8月からの現在まで連続データをWINフォーマットで取りこみディスク状に保存するシステムを整備した。新しい微気圧観測点を増設するための微気圧データ収録装置を開発した。本装置は、Free-UnixをインストールしたPCに、商用カーナビゲーション用のGPSを取りつけ、微気圧データを取りこみ、時刻情報を付けてデータをファイルに書きこむ。地震研究所よりダイアルアップppp接続にて1日1回FTPファイル転送をおこなう。微気圧計、GPS時計のモニタリング、システム設定等もダイアルアップによる遠隔操作で行える。本システムは非常に安価であり、アナログ回路部がないのでアナログ回路に不慣れな素人にも製作管理が可能で、他の低速サンプリングデータの収集にも容易に転用が可能という特徴をもつ。ネットワーク使用運転として所内の2システムの同時並行観測を行い、機器のノイズレベルを明らかにしたのち、高知県室戸市、宮城県女川町へ設置する予定である。
たこつぼ心筋症における自律神経異常とカテコラミン受容体遺伝子変異の研究

たこつぼ心筋症(TCM)は、大災害や外科手術などの急激なストレス状態で左心室心尖部を中心とした収縮低下をきたす疾患である。我々はTCM患者17名(女性11名)と健常人5名(女性4名)についてストレス下のカテコラミンと自律神経反応について検討を行った。自律神経機能検査では、TCM患者は過呼吸後の収縮期血圧低下が強かったがバルサルバ比、洞性不整脈比は同等であった。精神的ストレス負荷前後でTCM患者は血漿ノルアドレナリン値の上昇が健常者と比して高い傾向にあった。現時点で5名のTCM患者においてカテコラミン受容体遺伝子の変異が確認されており、引き続き残る臨床データと関連させた検討を進める方針である。平成26年度は、当院におけるたこつぼ心筋症(Takotsubo cardiomyopathy, TCM)の既往患者、及び新規発症患者登録を行い、アドレナリン受容体の遺伝子多型タイプ抽出実験に着手した。まず2013年度までに東京女子医科大学東医療センターでTCMの診断名を持つ入院患者36名について診療記録より再評価を行った。このうち7名はTCMの診断基準を満たさないか、臨床経過としてTCMの可能性が低いために除外された。2014年度以降に新たに発症した当院のTCM患者は4名で、そのうち3名を本研究の患者データベースに登録した。現在まで登録されたTCM患者合計32名の平均年齢は74±12歳、うち27名が女性であった。基礎疾患として高血圧12名、糖尿病5名、心疾患11名、がん3名で、発症における精神・身体的な誘因を持つ者は8名であった。対象者に対して自律神経機能検査、ストレス負荷テストの実施を計画し、本学での臨床試験および遺伝子倫理委員会の承認を得た。ストレス課題としては、暗算ストレス負荷テストとスピーチテストを行い、その前後で心拍数、血圧、血漿カテコラミンを測定する。暗算ストレス負荷とスピーチテストを行う順番はランダムに割り付ける。スピーチの内容は、“自己紹介"、“最近あった面白い話"、“泣ける話"の中から自由に選択させ、3分間継続して聴衆役の白衣を着た医療従事者の前で話してもらう。また本研究では、初めにアドレナリンサブタイプα2B-AR遺伝子内にみられるグルタミン酸Glu(E:p.Glu301-303)リピート数にGlu12/12ホモ型、Glu9/9ホモ型、Glu9/12ヘテロ型の3つのタイプやβ2-AR遺伝子におけるArg16Gly, Gln27Glu, Thr164Ileの3つの遺伝子変異を中心に研究を行う。平成27年度は、前年度より登録したTCM患者のうち、研究参加に同意を得られた6名と健常人2名に対して自律神経機能検査、ストレステストとカテコラミン遺伝子の解析を行った。健常人と採血可能だったTCM患者においてストレステスト前後の血漿カテコラミンの比較では、ストレステスト前後における血漿ノルアドレナリン濃度差がTCM群において高い傾向を認めた(185.5±85.5 pg/ml vs 106.0±28.3 pg/ml)。また、同じく血漿アルドステロン濃度の差ではTCM群の方が低い傾向を認めた(12.6±12 pg/ml vs 43.4±6.5 pg/ml)。また同時に、TCM患者のカテコラミン遺伝子をイルミナMiSeqを使うことで網羅的解析を行った。カテコラミン関連遺伝子のうち15遺伝子(ADRA1A, ADRA1B, ADRA1D, ADRA2A, ADRA2B, ADRA2C, ADRB1, ADRB2, ADRB3, DRD1, DRD2, DRD3, DRD4, DRD5, GNAI1)についてハイスループットシーケンサーを用い、ターゲットリシーケンス解析を行った。対象遺伝子の全エキソン約70kbpについてマルチプレックスPCRにより目的領域を増幅し、KAPA HyperPlus Kit (KAPA Biosystems)を用いてライブラリー調製をした。合計13サンプルについてDNAライブラリーを調製し、MiSeq Reagent Kit Nano v2 300cycle (Illumina)を用いて、150bpのペアードエンドシーケンシングを施行した。その結果、約59万リードの塩基配列が得られた。各サンプルにおいては、平均4.5万リード得られ、そのうちターゲット領域に平均86.4%マップされ、リードカバレッジは平均x114.6、ターゲットカバー率は平均99.6%だった。このマッピングデータをもとに変異解析したところ、全体で354個のSNVs(single nucleotide variations)が検出された。そのうちアミノ酸置換を伴う変異は59個あり、DRD3遺伝子における自閉症に関連する変異(rs6280)が13サンプル中12サンプルで検出された。TCM患者に対する検討が遅れている。新規発症の患者においても全身状態が不良で研究対象として不適切と判断された症例が散見された。また、ストレステストの際に心電図波形と連続血圧波形より、low frequency component of systolic BP variability (LFSBP)による交感神経機能機能の評価を行うためのアルゴリズムを最適化するために時間を要した。たこつぼ心筋症(TCM)は、心筋梗塞様の胸痛と心電図変化、左心室心尖部を中心とする収縮低下をきたす疾患である。

その発生機序は未だ不明であるが、交感神経亢進によるものが最も有力である。今回我々はTCM患者において、ストレス下のカテコラミンと自律神経反応について検討を行った。TCM患者8名と健常人3名に対して自律神経機能検査(AFT)、精神的ストレス負荷時(暗算負荷、スピーチテスト)における血漿カテコラミン値を測定した。TCM患者は健常人に比べ洞性不整脈比が有意に低く, Valsalva比も有意な低下がみられた。ストレス負荷テストの前後において血圧、脈拍の変化は両者に有意差は認めなかったが、TCM患者は血漿ノルアドレナリン値、アドレナリン値とアルドステロン濃度上昇が健常者と比して有意に高値であった。以上より、TCM患者は精神的ストレス下での交感神経・副腎系の反応が強い可能性が示唆された。2017年2月までに臨床研究へ参加予定となっていた対象患者2名が、本人の都合で2017年4月以降に検査予定日の変更を希望された。本研究の対象となる患者は限られているため、当初予定されていた対象者によるデータが必要であるため、検査日並びにDNAシークエンス完了日の変更を余儀なくされた。たこつぼ心筋症(Takotsubo cardiomyopathy, TCM)は、大災害や外科手術などの急激なストレス状態で心筋梗塞様の胸痛と心電図変化及び心筋酵素の逸脱を呈し、左心室心尖部を中心とした収縮低下をきたす疾患である。急性心筋梗塞との鑑別には、冠動脈造影にて閉塞病変を認めないことを確認する。発生機序は未だ不明であるが、発症時の身体的/精神的ストレスと交感神経活動亢進に伴うカテコラミンの過剰分泌によるものが最も有力である。我々はストレス下で分泌される高濃度のアドレナリンが、β2アドレナリンレセプター(β2AR)におけるGs protein signalingからGi protein signalingへと移行し、陰性変力作用を生ずる作用に注目し、TCM患者17名(女性11名)と健常人5名(女性4名)を本研究に登録してストレス下のカテコラミンと自律神経反応について検討を行った。自律神経機能検査では、TCM患者は健常人に比べ過呼吸後の収縮期血圧低下が強かったが(-16.5mmHg vs. -5mmHg)、バルサルバ比、洞性不整脈比は同等であった。精神的ストレス負荷時(暗算負荷、スピーチテスト)の前後においても、TCM患者は血漿ノルアドレナリン値の上昇が健常者と比して高い傾向にあった(185.5pg/ml vs. 86pg/ml)。同じくTCM患者で、ストレステスト前後に血漿アルドステロン濃度の有意な上昇が認められた。TCM患者、健常人ともストレス検査の前後の血圧、心拍には有意差を認めなかった。現時点で5名のTCM患者においてカテコラミン受容体遺伝子の変異が確認された。特に変異が多く認められたものはADRA1A, ADRA2B, ADRB1, DRD2, DRD4であった。引き続き残るアドレナリン受容体の多型についても臨床データと関連させた検討を進める方針である。たこつぼ心筋症(TCM)は、大災害や外科手術などの急激なストレス状態で左心室心尖部を中心とした収縮低下をきたす疾患である。我々はTCM患者17名(女性11名)と健常人5名(女性4名)についてストレス下のカテコラミンと自律神経反応について検討を行った。
連鎖解析による食事性高コレステロール血症の性差原因遺伝子の同定

本研究の目的は食事性高コレステロール血症モデルラットであるExHCラットを用いて、食事コレステロールに応答し、血清コレステロール濃度を制御している雌特異的な遺伝子を同定することにある。昨年度に引き続き、雌ラットのみを用いたポジショナルクローニング法によってQTL領域を限局化し、原因遺伝子の探索を行った。本年度は遺伝子型の確認を行うマーカーを増やして解析を行った結果、6週齢における血清コレステロール濃度規定遺伝子座であるDihc1領域を約9Mbpから約6.2Mbpに限局した。この6.2Mbpの領域中には機能未知の遺伝子も含めて72の遺伝子が存在している。まず、マイクロアレイおよびreal-time PCRを用いて各遺伝子の肝臓におけるmRNA発現量を測定した。これによって、11遺伝子のmRNA発現量が対照系統であるBNラットと比較して有意に増減していること、なかでもGeneA mRNA発現量の変動が大きく、BNラットと比較しておよそ10倍の発現量を示すことを示した。また、平成23年度に作製したExHC/BNゲノムデータベース(BNラットのゲノムと比較した時の変異をリスト化したもの)を用いて候補遺伝子の構成配列中の変異情報を探索した。その結果、候補遺伝子中にはExHCラット特異的な挿入および欠失変異は存在しないことを明らかとした。また、アミノ酸の変異を伴う一塩基多型が存在する遺伝子のうち、脂質代謝に関与するものとしてGeneBが存在することを示した。以上より、Dihc1領域に存在する候補遺伝子から、発現量及び変異情報に基づき、2遺伝子を有力な候補として選抜した。(抄録なし)本研究の目的は食事性高コレステロール血症モデルラットであるExHCラットを用いて、食事コレステロールに応答し、血清コレステロール濃度を制御している雌特異的な遺伝子を同定することにある。そのために、雌ラットのみを用いたポジショナルクローニング法によってQTL領域を限局化し、原因遺伝子の探索を行った。ExHCラットの雌特異的原因遺伝子座であるDihc1領域に交配によりBNラットのゲノムを導入したISCLラットを用いて検討を行った結果、Dihc1領域を33.3Mbpから25.7Mbpの領域に限局し、領域中の候補遺伝子を370から245へ限定した。ポジショナルクローニングを行うにあたり、要する時間が長くなることへの対応策として候補遺伝子の選抜を行うため、また、原因遺伝子同定後の作用経路を解明する手段として、Dihc1領域が雌特異的であることから、本年度はExHCラットおよび対照系統のBNラットを用いてβ-エストラジオールの投与試験を行った。エストロゲンの投与により、ExHCラット特異的に血清総コレステロール濃度が有意に上昇した。この原因を明らかとするため、肝臓脂質・小腸粘膜脂質・糞中ステロイドの測定を行ったが、ExHCラット特異的なエストロゲンの効果はなかった。したがって、ExHCラット特異的に食事コレステロールへの応答性はエストロゲンによって制御されている可能性がある。今後は、エストロゲン投与時の遺伝子発現の測定などを行い、有力な候補遺伝子の選抜を行う計画である。ExHCラットの雌特異的食事性高コレステロール血症原因領域(Dihc1領域)のうちさまざまな領域を、交配によってBNラットのゲノムに組み換えたISCLラットを4系統作製し、コレステロール食摂食後の血清総コレステロール濃度の変化を調べた。その結果、6週齢における原因領域を約9Mbpの領域に限局し、領域内の候補遺伝子数を94に限定した。一方で、あるISCLラットにおいて血清総コレステロール濃度が6週齢では減少するが、10週齢ではExHCラットと同等まで増加するという結果を得た。これは、6週齢において血清総コレステロール濃度を規定する原因遺伝子と10週齢における原因遺伝子が異なっている可能性を示すものである。よって、この結果から、6週齢における原因領域とは別に、新たに7.4Mbpの領域を10週齢における原因領域(候補遺伝子数:96)とした。また、ExHCラットにおける食事性高コレステロール血症発症のメカニズムを明らかとするため、先に原因遺伝子として同定したSmek2が糖新生の制御に関与するという知見に基づき、ExHCラットにおける糖代謝の評価を行った。起源系統であるSDラットと比較して、ExHCラットの血糖値(9時間絶食時)有意に増加し、血清インスリン濃度がExHCラットにおいて増加傾向を示した(P-0.06)。この時のインスリン抵抗性の指標であるHOMA-IR値もExHCラットで有意に上昇した。これらの結果より、ExHCラットはインスリン感受性が低下しており、糖代謝に異常をきたしている可能性があることが示された。

まず、マイクロアレイおよびreal-time PCRを用いて各遺伝子の肝臓におけるmRNA発現量を測定した。これによって、11遺伝子のmRNA発現量が対照系統であるBNラットと比較して有意に増減していること、なかでもGeneA mRNA発現量の変動が大きく、BNラットと比較しておよそ10倍の発現量を示すことを示した。また、平成23年度に作製したExHC/BNゲノムデータベース(BNラットのゲノムと比較した時の変異をリスト化したもの)を用いて候補遺伝子の構成配列中の変異情報を探索した。その結果、候補遺伝子中にはExHCラット特異的な挿入および欠失変異は存在しないことを明らかとした。また、アミノ酸の変異を伴う一塩基多型が存在する遺伝子のうち、脂質代謝に関与するものとしてGeneBが存在することを示した。以上より、Dihc1領域に存在する候補遺伝子から、発現量及び変異情報に基づき、2遺伝子を有力な候補として選抜した。ラットの妊娠や産児数はコントロールできないため、交配による限局のスピードはラット側に依存する部分が大きい。そのため、ExHCラット雌特異的原因遺伝子座Dihc1領域の限局が進まない可能性があったが、今回限局に至ったため、おおむね順調と評価する。そのため、ExHCラット雌特異的原因遺伝子座Dihc1領域の限局が進まない可能性があったが、今回さらなる限局に至ることができた。また、本来の目的である原因遺伝子とは別に、性成熟後のコレステロール代謝を制御する遺伝子が存在する可能性を示せたため、『おおむね順調に進展している』と評価する。これまでと同様、交配を利用したDihc1領域の限局化を継続し、候補遺伝子の限定を行う。今回行ったエストロゲン投与試験によりExHCラットのコレステロール応答の制御にはエストロゲンが関与していることが示唆されたため、原因遺伝子の発現もエストロゲンによる制御を受けている可能性が高い。エストロゲン投与時のmRNA発現量をExHCおよびBNラット間で比較する。これを候補遺伝子選抜の一方法とすることで、自然交配のみによる限局の遅延に対する対応策の一つとする。コレステロール食摂食後の雌性ExHCラットおよびBNラット肝臓より採取したRNAをサンプルとして遺伝子の発現解析を行い、候補遺伝子の系統間での発現量の変化を調査する。発現に『変化あり』となった遺伝子について、変異情報の収集と合わせて解析を行うことで、原因遺伝子の同定を進める計画である。(抄録なし)
自閉症児者の「ライフプラン」(将来計画書)に関する研究:「親亡き後」に備えて

本研究の問題意識わが国の自閉症問題が顕在化して、40年ほどになる。自閉症問題は,児童・青年・成人期を経て、老人期に向かいつつある。親の高齢化は進み,亡くなった親も少なくない。現代の自閉症問題は,「親亡き後」に焦点が移りつつある。したがって本研究の目的は、「親亡き後」を視野に入れた「自閉症者のライフプラン(将来計画)のモデルの確立」である。本研究の目的本研究の具体的な周的は,次の4点を検討することにある。(1)米国版の「ライフプラン」(将来設計書)の作成、(2)日本版の「ライフプラン」(将来設計書)の開発、(3)上記を用いての自閉症児者をもつ親と専門職へのインタビュー調査の実施、(4)わが国の「ライフプラン」のあり方についての検討。最初の2つは,「ライフプラン」のツールの開発であり,後の2つは,このツールを用いてのわが国の自閉症児者をもつ親たちの「ライフプラン」に対する意識と実態の調査とその分析である。本研究の成果研究は粗さを残しつつもほぼ達成されたと考えられる。研究責任者の病気のために研究成果の発表は出来なかった。この報告書をベースに16年度中に相川書房から出版を決定していることを記しておきたい。2.施設での取り組みと親たちとのインタビューの実施・・・親亡き後の成年後見制度を検討している三重県のA学園でその取り組みを、また香川県では、「親亡き後」についての自閉症児をもつ親たちからの「生の声」を聴いた。また小数ではあるが「意向書」を用いての予備的なインタビューを行なった。3.自閉症研究会の開催・・・2002年度は、7回研究会を開催した(参加者は自閉症を持つ親を中心に、大学教員、施設職員など。参加人数は、平均12-13人の出席)。本研究のテーマをはじめ、親のライフヒストリーを聴いた。4.2002年度には、(1)引き続き「意向書」を用いた予備的なインタビューを行い、(2)わが国の実情に合った「意向書」の項目を作成し、(3)それに基づいてインタビュー調査を行なう予定である。*なお、今年度は、秋に久保の入院があり、予定していたインタビュー調査を大幅に縮小せざるをえなかった。そのため研究成果の発表もできていないことをお詫びしたい。1.日本版「意向書」の冊子の作成・・・2001年度はアメリカの文献(Russellの「意向書」)の訳を行なったが、今年度は、わが国での適用について以下の親たちと検討を行なう作業が中心となった。(1)学齢期の子どもをもつ親の「意向書」(2)学齢後の子どもをもつ親の「意向書」(3)自閉症成人施設における親の「意向書」2.上記の親たちとの「意向書」の検討・・・(1)は都内の親たち、(2)は神奈川県の親たち、(3)は三重県の自閉症成人施設A学園の親たちといっしょに、親にとっても施設にとっても「役に立つ意向書」の項目は何かについて検討した。また昨年に引き続いて香川県の自閉症協会の親たちからも「生の声」を聴いた。3.自閉症研究会の開催・・・2003年度も、研究会を9回開催した。参加者は自閉症児をもつ親が中心である。参加者は毎回約12-13人程度。4.2003年度は、これまでの検討をふまえて、全体の整理と報告書の作成を予定している。今年度は、学会発表や論文等刊行ができなかったので、2003年度にはいくつかの報告と刊行をする予定である。今年度の目標は、すでに作成した米国版の「ライフプラン」とりわけ「親の意向書」の日本への適用を中心に研究を進めることである。その際、(1)都市部の学齢期にある自閉症児の親、(2)都市部の成人期の人たちの親、(3)地方の成人の自閉症の人たちの親、(4)自閉症施設に入所の成人期に分け検討した。その結果(1)子どもの年代、

(2)都市部と地方の親の意識、(3)在宅と入所との間に明らかな差異が見られた。また次のような共通の課題があることがわかった。(1)自閉症への対応の保障、(2)後見について、(3)経済的な保障、(4)将来の子どもの生活をイメージできるような親への情報提供、以上の4点である。
異なる運動制御と学習に関わる小脳内部メカニズムとその汎用性に関する研究

本研究では,小脳の運動制御・学習の基本メカニズムとその汎用性の理解を目指して前庭動眼反射(VOR)運動学習と並進運動と傾き運動の識別という双方課題を実現しうる小脳数理モデルを構築するとともに,それらの計算機シミュレーションを実施した.VORに関する研究では,この運動学習にかかわるとされる小脳平行線維とプルキンエ細胞間の可塑性によって,VORに関連する入力信号が学習のゴールに対応するように調整されることで運動学習が成立していることを明らかにした.また,VOR運動制御にかかわる文脈のうち,頭部回転方向に着目し,左右頭部回転に対して異なる学習目標を提示し同時学習を行う頭部運動選択型運動学習のシミュレーションも実施し,サルで確認されている実験結果を再現できることを示した.頭部運動選択型運動学習時における小脳内部の信号処理を評価したところ,VORパフォーマンスの増加と減少が左右小脳半球に分かれて獲得されることを明らかにした.さらに,こうした文脈が絡む運動学習は単にゲインを再現可能な小脳の平行線維とプルキンエ細胞間の伝達効率特性では再現不可であり,文脈そのものを学習する必要があることが明らかになった.一方で,同小脳片葉モデルを小脳虫部モデルへ拡張し,虫部で実現されると考えられる並進・傾き運動の識別メカニズムについても評価を実施した.計算機シミュレーションから並進・傾き運動競合刺激に対して並進運動のみに選択的に応答するプルキンエ細胞応答の再現に成功した.このときの小脳内部の顆粒細胞の応答を詳細に評価したところ,並進・傾き運動の識別に関わる計算アルゴリズムを解く際に必要な情報が表現されていることを明らかにし,最終的にこうした情報がプルキンエ細胞へ統合されることで並進・傾き運動の識別が実現されることを示した.こうした結果から,小脳の運動制御・学習の基本メカニズムに高い汎用性が伴うことを示した.当該年度は,小脳の運動制御・学習の基本メカニズムとその汎用性の理解を目指して正弦波刺激を対象とした前庭動眼反射(VOR)時の眼球運動とその学習と並進運動と傾き運動の識別メカニズムの双方を実現しうる小脳数理モデルの構築を行うとともに,それらの計算機シミュレーションを実施した.VORに関する研究では,この運動学習にかかわるとされる小脳平行線維とプルキネ細胞間の可塑性によって,VORに関連する入力信号が学習のゴールに対応するように調整されることで運動学習が成立していることを明らかにした.また,VOR運動制御にかかわる文脈のうち,頭部回転方向に着目し,左右頭部回転に対して異なる学習目標を提示し同時学習を行う頭部運動選択型運動学習のシミュレーションも実施し,サルで確認されている実験結果を再現できることを示した.こうした進捗によりVOR運動学習に関する小脳内の信号処理様式を明らかにでき,さらに文脈が絡む同運動学習の評価まで研究を進めつつある.次年度以降は文脈が絡む同運動学習に関しても,前述した小脳平行線維とプルキネ細胞間の可塑性による入力信号調整の枠組みで説明可能か否かを評価することで,同信号処理様式の汎用性が明らかになるものと考えている.一方で,同小脳片葉モデルを小脳虫部モデルへ拡張し,虫部で実現されると考えられる並進・傾き運動の識別メカニズムについても評価を実施した.計算機シミュレーションから並進・傾き運動競合刺激に対して並進運動のみに選択的に応答するプルキンエ細胞応答の再現に成功した.今後は,並進・傾き運動の識別メカニズムが前述した信号調整の枠組みで説明可能か否か,構築した小脳モデルの内部解析などさらなる解析を行うことで,小脳運動学習メカニズムの汎用性に言及できるものと考えている.VOR運動学習やと並進運動と傾き運動の知覚を再現する数理モデルの構築は,本研究の目標の重要部分を占めており,本年度ほぼこれを達成している.さらに,VOR運動学習については,小脳内におけるその信号処理を示すことができた.また,並進運動と傾き運動の識別課題に関しては動物実験で確認されている現象を十分に再現できる状況にあり,今後のモデルの内部解析などさらなる解析を行うことで,小脳運動学習メカニズムの汎用性に言及できるものと考えている.本研究では,小脳の運動制御・学習の基本メカニズムとその汎用性の理解を目指して前庭動眼反射(VOR)運動学習と並進運動と傾き運動の識別という双方課題を実現しうる小脳数理モデルを構築するとともに,それらの計算機シミュレーションを実施した.VORに関する研究では,この運動学習にかかわるとされる小脳平行線維とプルキンエ細胞間の可塑性によって,VORに関連する入力信号が学習のゴールに対応するように調整されることで運動学習が成立していることを明らかにした.また,VOR運動制御にかかわる文脈のうち,頭部回転方向に着目し,左右頭部回転に対して異なる学習目標を提示し同時学習を行う頭部運動選択型運動学習のシミュレーションも実施し,サルで確認されている実験結果を再現できることを示した.頭部運動選択型運動学習時における小脳内部の信号処理を評価したところ,VORパフォーマンスの増加と減少が左右小脳半球に分かれて獲得されることを明らかにした.さらに,こうした文脈が絡む運動学習は単にゲインを再現可能な小脳の平行線維とプルキンエ細胞間の伝達効率特性では再現不可であり,文脈そのものを学習する必要があることが明らかになった.一方で,同小脳片葉モデルを小脳虫部モデルへ拡張し,虫部で実現されると考えられる並進・傾き運動の識別メカニズムについても評価を実施した.計算機シミュレーションから並進・傾き運動競合刺激に対して並進運動のみに選択的に応答するプルキンエ細胞応答の再現に成功した.

このときの小脳内部の顆粒細胞の応答を詳細に評価したところ,並進・傾き運動の識別に関わる計算アルゴリズムを解く際に必要な情報が表現されていることを明らかにし,最終的にこうした情報がプルキンエ細胞へ統合されることで並進・傾き運動の識別が実現されることを示した.こうした結果から,小脳の運動制御・学習の基本メカニズムに高い汎用性が伴うことを示した.今後は,すでにVOR運動学習の計算機シミュレーションで明らかにしている小脳平行線維とプルキネ細胞間の可塑性による入力信号のチューニングの枠組みで,並進・傾き運動の識別メカニズムが前述した信号調整の枠組みで説明可能か否か,構築した小脳モデルの内部解析などさらなる解析を行うことで,小脳運動学習メカニズムの汎用性に言及できるものと考えている.(理由)以下の理由により繰越が生じている.1.MATLABtおよびそのツールボックスの更新費用を計上していたが,所属大学によって包括ライセンスの利用が可能になったこと,2.本年度は主として計算機シミュレーションによる実験を進めたため,予算計上していた生理実験に伴う費用利用がなかったこと(使用計画)並進・傾き運動の識別にかかる小脳内部の信号処理メカニズムの評価に関しては,現行のワークステーションでは莫大なデータの保管と処理時間に難がある.処理速度向上やデータの保存性を鑑みてワークステーションのメモリ増設やHDD増設などに余剰費用を割り当てる予定である.
薬剤誘導性免疫寛容の大動物における展開と臨床への応用

我々はこれまで、抗癌剤であるCyclophosphamide(CP)をもちいたマウスにおける薬剤誘導性免疫寛容系について考案研究しその成果を報告してきた。この寛容系の原則は、抗原として同種脾細胞を用い経静脈投与(Day 0)後、200mg/kg(LD50)のCPをDay 2)に投与することにより抗原特異的寛容状態が誘導されるというものである。この実験系は、MHC抗原は一致しマイナー抗原のみ違う組み合わせでは皮膚移植片寛容状態とキメラ状態が誘導される(1984,Transplantation)が、MHC抗原の違う組み合わせでは一時的キメラ状態と中等度皮膚片生着延長が誘導される(1985,Transplantation)。この寛容系を大動物に応用するにあたり、Discordant異種の組み合わせにおける免疫反応性及び皮膚移植片拒絶におけるT細胞の果たす役割を解明することが必須である。その目的で、我々はDiscordant異種皮膚移植片拒絶におけるCD4+及びCD8+T細胞の役割をより明らかにするために、C57BL/6CrSLCマウスをバックグラウンドとしたCD4及びCD8ノックアウトマウスを用いて検討を行った。ヒトの皮膚をB6マウス及びCD8ノックアウトマウスに移植すると、共に移植後12日以内に拒絶された。しかしCD4ノックアウトマウスにおいてはヒトの皮膚移植片は有意に生着期間が延長した(平均19.3日、標準偏差1.6日、中央値19日)。完全に異系なC3H/He Slcマウスの皮膚移植片はCD4ノックアウトマウスにおいて14日以内に拒絶された。このことからCD4ノックアウトマウス中の非CD4+T細胞は異系移植片の拒絶能を有すると考えられる。これらのレシピエントマウスの脾細胞においてはCD4^+及びCD8^+T細胞はともにヒトの皮膚移植後10日目には活性化していた。CD4ノックアウトマウス中のCD8^+T細胞の役割をより詳細に検討するために、CD4ノックアウトマウスにヒトの皮膚移植後0日目、5日目、14日目に抗CD8抗体を投与した.抗CD8抗体の投与によりヒトの皮膚移植片は有意に生着が延長した。また、免疫組織染色で、CD4ノックアウトマウスに移植されたヒトの皮膚移植片においてマウスCD8^+T細胞の浸潤が明らかになった。これらの結果から1)discordant異種であるヒトの皮膚移植片の急性拒絶にはCD4^+T細胞が必須である。2)しかしCD8^+T細胞によってもdiscordant異種であるヒトの皮膚移植片は拒絶されうるということが解明された。今後は、さらにα-GALノックアウトマウスを用い、霊長類-豚間の移植において見られるような超急性拒絶の解明および我々の考案している薬剤誘導性免疫寛容系の応用を研究していく予定である。
マウス嗅覚入力調整におけるドーパミン系ニューロンの神経回路の解明

嗅覚の一次中枢である嗅球表面には糸球体と呼ばれる構造があり、匂い情報の入力調節を行う機能的単位と考えられている。我々は、糸球体を構成するニューロン群のうち、ドーパミン合成酵素tyrosine hydroxylase (TH)を発現しているTHニューロンに着目し、レーザー顕微鏡と電子顕微鏡による対応観察と3次元再構築によりTHニューロンのシナプス解析を行った。その結果、単一のTHニューロン上の空間的なシナプス分布を解析することで、より詳細な嗅覚神経回路が明らかになった。マウス嗅球の表面には糸球体と呼ばれる構造があり、匂い入力情報処理を行う機能的単位と考えられている。糸球体を構成するニューロンは様々な化学物質を含有しているが、なかでもドーパミン合成酵素tyrosine hydroxylase (TH)を発現しているニューロンに着目し、THニューロンが構成するシナプスを解析することでドーパミンと嗅覚機能との関わりを解明することが本研究の目的である。そこで、平成24年度は、THの発現をgreen fluorescent protein(GFP)で置き換えたトランスジェニックマウス(TH-GFPマウス)を用いて、THニューロンの免疫染色後、電子顕微鏡連続切片法により単一のTHニューロンの三次元再構築を行い、そのTHニューロンに見られるシナプスの空間的な分布と定量解析を行なった。定量解析の結果、入力シナプスのうち約60%がolfactory nerve (ON)からで30%がnon-ONからの興奮性シナプスであった。これらシナプスの空間的な分布をみると、多数のONからのシナプスはTHニューロン細胞体から約1530&#61549;m離れた突起上に見られた。これに対し、少数のnon-ONからの入力は、細胞体及び10&#61549;m以内の突起にシナプスしていた。これまでの結果から、シナプス数の多さがシナプス効果を示すものではなく、細胞体近傍突起への少数のnon-ONからの入力が効果的にシナプス電位を伝達することが推測された。また現在、non-ONのニューロン同定に向けてsindbis virus in vivo injection法を用いての解析を進めており、投射ニューロンであるmitral cellやtufted cellからの入力シナプスについても定性・定量解析を行っている。嗅覚の一次中枢である嗅球の表面には糸球体と呼ばれる構造があり、嗅細胞軸索からの情報を受けさらにその入力情報の調節を行う機能的単位と考えられている。糸球体を構成するニューロン群のうち、ドーパミン合成酵素tyrosine hydroxylase (TH)を発現しているニューロンに着目し、THニューロンが構成するシナプスを解析することでドーパミンと嗅覚機能との関わりを解明することが本研究の目的である。過去2年間で得られたシナプス定量解析の結果として、多数を占める嗅細胞軸索からTHニューロンへの興奮性シナプスは細胞体から離れた突起上に見られたのに対し、少数の嗅細胞以外からの興奮性シナプス(おそらく投射ニューロン;僧房細胞または房飾細胞)はTHニューロン細胞体近傍に見られ、嗅細胞よりも高いシナプス効果を示すことが示唆された。そこで、最終年度は嗅細胞以外の興奮性シナプスを形成する細胞として、投射ニューロンとTHニューロンとのシナプス解析を行った。方法は、細胞膜移行シグナルを連結した蛍光タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだsindbis virusを、単一の僧房細胞または房飾細胞に感染させて可視化させた。その後、レーザー顕微鏡による3次元解析でコンタクトの部位を確認し、電子顕微鏡連続切片法によるcorrelativeな観察を行った。その結果、ウィルス感染した僧房細胞からTHニューロンへの興奮性シナプスあり、さらにそのTHニューロンから感染していない別の投射ニューロンへの抑制シナプスが連続的に見られた。このことから、THニューロンを介した投射ニューロン間の側方抑制があり、THニューロンは匂いのコントラスト増強に関わることが示唆された。本研究の目的は、嗅覚の一次中枢嗅球において匂い情報処理の機能的単位と考えられている糸球体のシナプス神経回路の構造を明らかにする事である。なかでもドーパミン合成酵素tyrosine hydroxylase (TH)は、糸球体層に限局して発現が見られることから、THニューロンのシナプス結合を解析することでドーパミンが嗅覚機能と関わる機構の解明を目指すものである。そこで、平成23年度は、THの発現をgreen fluorescent protein(GFP)で置き換えたトランスジェニックマウス(TH-GFPマウス)を用いて、THニューロンの免疫染色後、電子顕微鏡ランダム及び連続切片法によりシナプス結合の定量解析を行なった。ランダム切片法の結果、THニューロンへの入力のうち65%がolfactory nerve (ON)からで32%がnonONからの興奮性シナプスであった。次に単一THニューロンが構成するシナプスの空間的な分布を調べるため、連続切片法を用いた電顕三次元再構築を行った。ONからのシナプスの約60%は、THニューロン細胞体から約30μm離れた突起上に見られた。

これに対し、少数のnonONからの入力は、細胞体から10μm以内の突起にシナプスしていた。これまでの結果から、細胞体近傍突起への少数のnonONからの入力は、細胞体から遠位の突起にシナプスする多数のONからの入力よりもさらに効果的にシナプス電位が伝達されることが推測された。現在、解析細胞数を増やすとともに、nonONプロファイルのニューロン同定に向けてSindbis virus in vivo injection法を用いての解析を進めている。現在、THニューロンの三次元再構築を行いシナプス分布の解析を行っている。さらに解析細胞数を増やし、これまでに報告された電気生理との結果を踏まえてTHニューロンが構成する神経回路について深く考察したい。また、Sindbis virusを用いた投射ニューロンへの感染実験も軌道に乗り、免疫電顕用にTHニューロンと投射ニューロンをそれぞれ標識するための条件検討も進行中である。平成23年度研究実施計画のうち、THニューロンの糸球体におけるシナプス定量については、順調に研究が進んでいる。さらに解析ニューロン数やシナプス定量数を増やすことで、THニューロン突起上に形成されるシナプス分布の傾向や、これまでに報告された電気生理による実験結果との対比からTHニューロンが構成する神経回路について深く考察することが可能となる。また、Sindbis virus in vivo injection法を用いた投射ニューロンの同定についても、おおむね順調に研究が進展している。感染実験のセットアップも平成23年度内には完了し、現在、投射ニューロンへの感染効率を向上させるための条件検討を行っている。平成25年度は、過去2年間で行ってきた実験結果の精度を上げ、成果をまとめることを目標とする。具体的には、嗅球糸球体内におけるTHニューロンの三次元再構築数とシナプス定量数を増やし、データの正確性を高めて行く。また、ウィルス感染法により単一の投射ニューロンを蛍光標識させてTHニューロンへ入力シナプスを形成するプレ側ニューロンの同定を行うことでより詳細な神経回路の解明を目指す。平成24年度も基本的には前年度と変わらず、継続して以下の2項目について研究を行うものとする。1.THニューロンの糸球体内におけるシナプス定量:TH-GFPマウスを灌流固定後、抗GFP抗体を用いたABC法による包埋前免疫染色を行い、電子顕微鏡標本処理後、80 nm厚の連続超薄切片を作製し電顕下でシナプスを定量する。さらにデジタル電子顕微鏡で連続撮影し各モンタージュ切片上のニューロン像とシナプスをNeurolucidaでトレースし、三次元再構築を行いシナプス分布の解析を行う。
ヘリカルペプチドを実用的なタンパク間相互作用阻害薬へと押し上げる方法論の開拓

我々の研究室では、抗アポトーシスタンパクBcl-XLの機能を阻害する架橋ヘリカルペプチドの開発に成功している。このペプチドはその架橋部位の存在に基づく高いエンドプロテアーゼ耐性を示すが、エキソプロテアーゼに対しては無防備であることが予想される。そこで今回、ペプチド末端へ非天然アミノ酸を導入し、そのエキソプロテアーゼ耐性を向上させることにした。非天然部位としては、Dーアミノ酸を用いることにした。Dーアミノ酸は、Lーアミノ酸と同様に固相合成法で簡便に導入できるため、実験結果に応じて、導入する残基の種類や数を自在に調整することができる利点を持つ。本研究では、最も単純なDーアミノ酸であるD-AlaをC末端に1-5残基導入したペプチドを合成し、評価を行った。D-Alaを残基導入したペプチドは元のペプチドと同等のヘリックス含有率および標的タンパクへの結合能を示した。次に、カルボキシペプチダーゼに対する耐性を評価したところ、D-Alaを導入したペプチドは元のペプチドの8倍程度高い耐性を示した。これらのペプチドを添加した液体培地でHCT-116細胞を48時間培養したところ、D-Alaを4残基導入したぺプチドが最も高いアポトーシス誘導能を示し、D-Alaを導入することでペプチドの生物活性が向上することが分かった。また、各ペプチドのアミノ末端を蛍光分子でラベル化し、ペプチドの細胞内挙動を解析した。各蛍光ペプチドを添加した液体培地でHCT-116細胞を48時間培養した後、蛍光顕微鏡で観測したところ、ペプチドは細胞内で蛍光のドットとして観測されることが分かった。また、このドットの数は、D-Ala導入数の多いペプチドほど多く観測されることが分かった。29年度が最終年度であるため、記入しない。細胞のアポトーシスを誘導する架橋ヘリカルペプチド2iの機能を高めるため、以下の異なる二つのアプローチによってペプチドの酵素耐性を向上させ、細胞内安定性のさらなる向上を目指した。架橋ペプチドのエキソプロテアーゼ耐性を向上させるために、ペプチド末端へ非天然部位としてDーアミノ酸を導入することにした。本研究では、最も単純なDーアミノ酸であるD-AlaをC末端に導入したペプチドを合成した。D-Alaを1残基もしくは3残基導入したペプチドは2iと同程度の強さで標的タンパクに結合した。次に、カルボキシペプチダーゼYに対する耐性を評価したところ、D-Ala導入ペプチドは2iの10倍程度高い耐性を示した。ペプチドを添加した培地で細胞を48時間培養した結果、2iはほとんどドットがみられなかったのに対し、D-Ala導入ペプチドでは多くのドットがみられた。すなわち、Dーアミノ酸を導入したペプチドは細胞内で長時間安定に存在することが分かった。さらに、D-Ala導入ペプチドは、2iよりも高いアポトーシス誘導能を示し、D-Alaの導入数が多いほどその効率は高いことが分かった。エンドプロテアーゼ耐性のさらなる向上を目指し、三点架橋ペプチドを設計した。三点で架橋することにより、ペプチド表面がより被覆されるため、さらに酵素耐性が向上すると考えた。クロスリンク剤であるイソフタル酸誘導体の5位とペプチド側鎖間を、スペーサーを介して連結することで三点架橋ペプチドとした。この三点架橋ペプチドとBcl-XLとの相互作用を評価した結果、三点架橋ペプチドは2iに匹敵する強さで相互作用することが分かった。また、トリプシン耐性を評価したところ、半減期が非架橋のペプチドと比較して26倍、2iと比較して2.6倍増加することが分かった。ペプチドの生理活性を底上げするという当初の目的に沿って、2つの異なるアプローチで酵素耐性を向上させる研究を行い、どちらの系においてもしっかりと酵素耐性を向上させることに成功した。特に、D-アミノ酸を導入したペプチドの系においては、酵素耐性の向上がペプチドの細胞内安定性およびアポトーシス誘導能の向上へと反映されることが分かった。これまでに、ペプチドの酵素耐性向上をエキソペプチダーゼ耐性のみに焦点を当てた研究はあまり例がなく、D-アミノ酸を数残基導入するのみで簡便にエキソペプチダーゼ耐性および細胞内安定性を向上させることが可能な本手法は、新規性および汎用性の両面において秀でた手法であるといえる。

これらのペプチドを添加した液体培地でHCT-116細胞を48時間培養したところ、D-Alaを4残基導入したぺプチドが最も高いアポトーシス誘導能を示し、D-Alaを導入することでペプチドの生物活性が向上することが分かった。また、各ペプチドのアミノ末端を蛍光分子でラベル化し、ペプチドの細胞内挙動を解析した。各蛍光ペプチドを添加した液体培地でHCT-116細胞を48時間培養した後、蛍光顕微鏡で観測したところ、ペプチドは細胞内で蛍光のドットとして観測されることが分かった。また、このドットの数は、D-Ala導入数の多いペプチドほど多く観測されることが分かった。D-アミノ酸の導入数とアポトーシス誘導能の相関関係を詳細に調査し、最も効果が高くなる導入数を求める。また、アルギニンなど他の種類のD-アミノ酸も試し、エキソペプチダーゼ耐性と細胞膜透過性両方向上を目指す。また、三点架橋ペプチドの細胞内挙動を解析する。三点架橋により細胞膜透過性が低下するなどの問題が現れた場合に、リンカー部分の脂溶性を調節することで、問題解決を試みる。これらの研究を平行して行い、最終的にはペプチドのエキソペプチダーゼおよびエンドペプチダーゼ両方の耐性と細胞膜透過性を底上げする汎用性の高い方法論を確立する。29年度が最終年度であるため、記入しない。