hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
洋楽導入期から現在に至る異文化適応の歴史的体系的研究-日本人の身体と音感の変遷-

本年度は研究の第2年目として初年度の成果を踏まえながら歴史的及び体系的研究グループ合同の研究会を頻繁に企画し、双方の研究成果を公表し合いながら学際的な研究体制で研究を推進した。歴史的研究グループではこれまでの研究成果から、洋楽の受容過程、とりわけ歌声の獲得の過程に、指導された場所や指導の内容によっていくつかの道筋があったという仮説をたて、文献資料及びSPレコードに残された音源資料の両側面からの検証を行った。その結果、当初は同じように「口を開けて」という文言で開始された歌唱の指導でありながら、ミッションスクールと、東京音楽学校系列で行われていた洋楽の指導の結果としての歌声には明らかに異なる二つの道筋が存在していたことが明らかとなった。体系的研究グループでは、平成16年度は,平成15年度に引き続き、音声分析機「SUGI Speech Analyzer(V1.0.7.8ANIMO)」及び「CSL(KAY CSL4400)」を用いて、歴史的研究グループによって収集された唱歌集の中から任意の楽曲を抽出し、ピッチ抽出と波形分析をおこなって、先行研究結果との比較分析をおこなった。その結果、これまで指摘されてきた「3度音程」の不安定歌唱(=狭・低現象)の様相が確認され、先行研究のデータの有効性が支持された。しかしこの解釈に関しては、楽曲独自の旋律進行(G-C-D-E)と、歌い手である松井須磨子の「換声点」の不安定さによって説明すべきではないか等の議論があり、仮説の構築に向けて更なる分析をおこなう予定である。併せて、大正期から昭和初期に録音されたSPレコードの中から音源を抽出し、SD法を用いた聴取実験をおこなった。大学生を対象とした聴取実験の結果からは、歴史的研究グループが提出した「東京音楽学校系発声:雅楽の伶人による指導」と「ミッション系発声:宣教師による指導」の違いがとらえられ、仮説を支持する結果が得られた。本年度は研究の最終年度として本課題である洋楽導入期からの目本人の身体と音感の変遷という大きなテーマを総体的にとらえることを目的として研究を推進した。過去2年間においては、歴史的及び体系的研究グループが双方の研究成果を公表しあいながら研究を行ってきたが、本年度においては歴史的、体系的という枠組みを超えたユニットにより、あらたな研究手法による研究を試みた。その成果の一つが、嶋田・小川・安田の三名による研究成果として「洋楽導入による異文化適応としての日本人の歌声の変化」という研究論文にまとめられた。また、日本人の音感の変遷という側面から行つた村尾の研究(「明治30年代『唱歌調』スキーマによる記憶の変形とその再生」)も、嶋田が提示した「唱歌調」理論の枠組みに基づいて行われたものであり、この研究においても従来の歴史的・体系的という枠組みによる研究成果では得られなかった学際的な研究による貴重な成果が得られた。ここでは日本人が唱歌を記憶する際に生じる変形の問題を「唱歌調旋律スキーマ」という視点から解明しており、日本人の音感の変遷の解明に向けた示唆的な研究成果を得ることができた。一方、北山は洋楽受容期に日本人がどのようにして西洋音楽を受け入れてきたのかという問題を、SPレコードに残された歌声の分析により明らかにした。その結果、このような音源を駆使した研究のあり方が今後のこの分野での音源に基づいた研究の開発にも有効なものであることが証明された。
IL-10.IL-4の単球・好中球に対する抗炎症効果発現の分子機構

1. IL-10とIL-4は単球・マクロファージさらには好中球を標的として多彩な向炎症性物質産生を抑制し抗炎症作用を発揮することを明らかにした。とくに、シクロオキシゲナーゼ(COX)活性とプロスタノイド産生を観察し、両サイトカインの作用機構を細胞内シグナル伝達の系を通して明らかにした。2.単球・マクロファージならびに好中球の活性化におけるMAPキナーゼ(MAPK)の同定と機能発現への関与(1) LPSによる活性化にて、MAPK中のERK2とP38MAPKのリン酸化ならびにキナーゼ活性が上昇した。(2)サイトカインとプロスタノイド産生においてこれらのMAPKの活性化が関与していることが判明した。(3) IL-10とIL-4によるMAPK活性化への異なる制御機構が判明した。3.ヒト単球に対するLPS刺激時にはSTAT5が活性化され、GM-CSF遺伝子発現などの関連している。IL-10はSTAT5を抑制することによって、COX-2遺伝子発現を制御している可能性がある。4. RA患者の好中球における機能変化(1) RA患者において末梢血ならびに関節液中の好中球からのサイトカインならびにプロスタノイド産生が健常人に比べて増強していることが判明した。(2)その機能発現にMAPK経路の関与が示唆された。5. IL-10等のサイトカインのシグナル伝達系が疾患発症の感受性に影響する可能性を今後検索していくために、RT-PCR-RFLPによる多型解析を行い、実験系を確立した。現在、自己免疫疾患を中心に解析し興味ある結果が得られてきた。1)ヒト単球のCOX2遺伝子の発現を促進するLPS/IL-2/IL-7の作用について、チロシンキナーゼの重要性を明らかにした。IL-4とIL-10はともにLPSによるCOX2遺伝子の誘導的発現を抑制した。しかし、IL-10はIL-2による誘導を抑制するものの、IL-7による誘導には抑制活性をもたなかった。COX2遺伝子の誘導・制御に関わるこれらのサイトカインの作用機構について各種阻害剤を用いてさらに検討中である。2)LPSあるいはTPAはいずれもCOX2遺伝子発現を誘導するが、発現量の時間的経過ならびにプロスタノイド産生にいたる酵素活性に相違点が存在した。両刺激下におけるMAPKファミリーならびに各種転写因子の活性化について検討した。IL-4とIL-10は活性化したERK1/2ならびにp38に対して異なった作用をすること、転写因子の活性化に対しても異なった機序で制御していることを明らかにした。結果をまとめて投稿中である。3)慢性関節リウマチ患者の末梢血・関節液より単球・好中球を分離し、COX2遺伝子発現が誘導されていることを確認した。現在、COX2遺伝子発現に関連するシグナル伝達因子の活性化状態を検討中である。4)IL-10およびIFN-γのそれぞれのレセプターにおける多型の存在を明らかにした。これらの多型と自己免疫疾患発症との関連について遺伝学的解析を行い、論文を発表した。とくに、シクロオキシゲナーゼ(COX)活性とプロスタノイド産生を観察し、両サイト力インの作用機構を細胞内シグナル伝達の系を通して明らかにした。(2)サイト力インとプロスタノイド産生においてこれらのMAPKの活性化が関与していることが判明した。

(3) IL-10とIL-4によるMAPK活性化への異なる制御機構が判明した。3.ヒト単球に対するLPS刺激時にはSTAT5が活性化され、GM-CSF遺伝子発現などの関連している。IL-10はSTATSを抑制することによって、COX-2遺伝子発現を制御している可能性がある。4. RA患者の好中球における機能変化(1) RA患者において末梢血ならびに関節液中の好中球からのサイト力インならびにプロスタノイド産生が健常人に比べて増強していることが判明した。(2)その機能発現にMAPK経路の関与が示唆された。5. IL-10等のサイトカインのシグナル伝達系が疾患発症の感受性に影響する可能性を今後検索していくために、RT-PCR-RFLPによる多型解析を行い、実験系を確立した。現在、自己免疫疾患を中心に解析し興味ある結果が得られてきた。
犬におけるストレス・腫瘍診断マーカーとしてのクロモグラニンAに関する研究

1.健常犬を用いた血中CgA濃度の正常範囲ならびに日内変動に関する検討健常ビーグル成犬20頭より採取した血漿中のCgA濃度(平均値±標準偏差)は0.482±0.233μg/mlであった。これらから健常犬における基準上限値(平均値+2×標準偏差)を0.948μg/mlと設定した。健常ビーグル成犬8頭を用いて血中CgA濃度の日内変動について検討した結果、有意な日内変動を認めなかった。2.手術前後における血中CgA濃度の変化に関する検討外科手術適応となった77症例における手術前後の血中CgA濃度は手術前の値と比較し、手術後の血中CgA濃度は有意に上昇した。手術時間によって症例を分類したところ、手術時間が長くなるほど手術後のCgA濃度は増加する傾向にあった。また、卵巣子宮摘出術を行った8症例において、鎮痛剤の投与の有無による術後のCgA濃度の変化について検討した結果、鎮痛剤を投与した群において未投与群と比較し術後の血中CgA濃度は有意に減少した。3.腫瘍症例犬における血中CgA濃度の変化についての検討腫瘍に罹患した症例34例について血中CgA濃度を測定した結果、褐色細胞腫(副腎髄質腫瘍)2症例において基準上限値を大きく逸脱する血中CgA濃度(症例113.9μg/ml症例211.4μg/ml)を認めた。症例1に関して、剖検時に採取した腫瘍組織における抗犬CgA抗体を用いた免疫組織化学染色の結果、腫瘍細胞細胞質が穎粒状に染色された。これらの結果より、犬の血中クロモグラニンAは手術侵襲によって上昇することが判明し、外科手術におけるストレスマーカーとして有用であることが示された。また、褐色細胞腫の症例において血中クロモグラニンAは顕著な上昇を示したことから、犬における褐色細胞腫のマーカーとして有用であることが示唆された。最初に犬CgAの分子生物学的特性を明らかとするため、犬副腎組織より、total RNAを抽出後、cDNAを作成した。これを基に犬CgA cDNAをクローニングし、その塩基配列(開始コドンを含む1293bp)を解析した(DDBJ accession No.AB201291)。塩基配列をもとに推測されたアミノ酸配列(407残基)をすでに報告されている他の動物種(人、牛、馬)と比較したところN末端領域(1-77)並びにC末端領域(314-407)において保存性が高い事が確認された。次に、犬CgAに反応性の高い抗体の作成を試みた。過去に報告されている方法を参考に,採材した副腎組織をホモジナイズ後,熱処理を加え,イオン交換クロマトグラフィおよびゲル濾過クロマトグラフィなどを用いて,イヌCgA蛋白を,分離・精製し、精製後の蛋白質は,既存の抗ヒトCgA抗体を用いたWestern Blotting法およびN末端アミノ酸配列解析により,イヌCgAである事を確認後,抗体作成のための抗原としウサギに免役する事により抗イヌCgAポリクローナル抗体を作製した。同時に同定したイヌCgAアミノ酸配列より抗原性の高いと予測される部位を選択しペプチドを合成し,キャリアー蛋白と結合後,ウサギに免役する事により抗CgAペプチド抗体を作製した。作成した抗犬CgAペプチド抗体ならびに抗イヌCgAポリクローナル抗体は犬CgAに対して抗人CgA抗体よりも高い反応性を持つことが確認された。作成した抗体の中で最もイヌCgAに対して反応性の高かった抗イヌCgAポリクローナル抗体を用いて犬血中CgA濃度測定のためのサンドイッチELISA系を確立した。

また、褐色細胞腫の症例において血中クロモグラニンAは顕著な上昇を示したことから、犬における褐色細胞腫のマーカーとして有用であることが示唆された。
変調分光法によるワイドギャップI-III-VI_2族半導体ヘテロ接合の評価に関する研究

本研究では、主にGaAsおよびGaP基板上に有機金属気相成長法により成長したCuAlSe2エビタキシャル層のフォトリフレクタンス(PR)法による評価を行った。得られた結果は次の通りである。1)化学両論的組成とバンドギャップ(E_g)との関係を調べた。III-VI比を変化させた場合、III族組成の低下に対してE_gは大きく低下する。また、I族組成に対してIII族組成を増加させてもE_gは低下する。2)GaAs基板上に成長したCuAlSe_2に対し、膜厚に対するE_g、価電子帯の結晶場分裂エネルギー(△_<of>)、スピン軌道相互作用エネルギー(△_<so>)を調べた。膜厚減少に伴いE_gは低下-△_<of>は増加を示したが△_<so>は変化を示さなかった。また、△_<of>は膜厚増加に伴いバルクCuAlSe_2の値に近づいた。この結果は、CuAlSe_2に二軸性の引っ張り歪の存在とエピ膜厚増加に伴う格子の緩和を示している。モデル計算との比較より、実験で用いた最小の膜厚(0.2mum)において殆どの歪が緩和されており、結果は計算で推定された臨界膜厚(0.1mum)により良く説明された。3)PRスペクトルにおけるブロードニングパラメータはエピ層の結晶性を大きく反映しており、これを用いた結晶性の評価手法を確立した。4)PRスペクトルの偏光依存性より、CuAlSe_2エピ層の配向性の評価技術を確立した。また、GaP基板上に成長したCuAlSe_2におけるオリエンテーションドメインの存在を示した。以上の結果より、PR方法がI-III-VI_2族カルコパイライト化合物のヘテロ接合評価に対して非常に効果的な評価方法であることがわかった。
CAGE法を用いた子宮体癌におけるリンパ節転移予測マーカーの同定

子宮体癌リンパ節転移陽性群と陰性群でがん原発巣の遺伝子発現を、Cap Analysis of Gene Expression法を用いて、遺伝子発現の高解像度測定をゲノム全体に渡って実施した。SEMA3DとTACC2新規アイソフォームが子宮体がんのリンパ節転移診断のバイオマーカーになりうることを明らかにした。この結果は子宮体がんの簡便・高精度・低侵襲なリンパ節転移診断を可能とし、リンパ節郭清術の適応を症例ごとに決定する個別化医療の実現に貢献する。子宮体癌のリンパ節転移を術前に予想することで余剰なリンパ節郭清を省略し、合併症を軽減する目的で、子宮筋層浸潤が1/2以下の子宮体癌G1(高分化型腺癌)でリンパ節転移なし(10例)と転移あり(5例)をCAGE(Cap Analysis Gene Expression)法で網羅的に比較解析した。その結果約30マーカー候補を同定した。さらにほかの臨床検体100検体を用いて、マーカー候補上位から順にRTーPCR法でその発現量の検討を行った。その結果遺伝子Xと遺伝子Y(特許の関係で現在はXとYとする。)を同定した。2候補遺伝子の発現量を組み合わせによる診断精度の最も期待できるマルチバイオマーカーは感度特異度ともに高いことが分った。リンパ節転移診断において問題となるのは、リンパ節転移陽性症例の偽陰性判定であり、診断結果に基づく不十分な治療により再発リスク増大という患者不利益を生じうる。本マルチバイオマーカーで偽陰性率が0%となる極限(感度100%、陰性的中率100%)にカットオフ値を設定した場合、低&#12316;中リスク群ではリンパ節転移陰性症例の88%を正しく判定し、偽陽性率もわずか12%であった。今後これらの候補遺伝子の機能解析を行って行く予定である。CAGE法での検索がスムーズに行われた。2009年4月から2015年8月に当院で手術施行115症例の子宮体癌組織を収集した。筋層浸潤1/2以下の子宮内膜癌と診断されたリンパ節転移陰性(LNー)10症例と陽性(LN+)5症例に対してCAGE法を用いてLNー/LN+の識別に有効な可能性を有する候補遺伝子群を抽出した。これら候補遺伝子の発現量を全115症例に対してqRT-PCRで検証し、診断精度の高いバイオマーカー遺伝子を同定した。CAGE法によるプロモーター解析からリンパ節転移状態と発現量が相関する6遺伝子を抽出し、最も診断精度の高いSEMA3Dと既知遺伝子のイントロンに新規転写開始点を有するTACC2新規アイソフォームを同定した。SEMA3Dはリンパ節転移陰性群で高発現し(P<0.001)、対照的にTACC2新規アイソフォームは転移陽性群で高発現を示した(P<0.05)。これら2遺伝子の発現量差を用いたリンパ節転移識別能評価では、高い識別性能を認めた(AUC = 0.929)。ただし、新規TACC2は、そのシーケンス結果から非常に多くのvariantが存在することが示唆され、その機能やバイオマーカー的精度の検証が必要であると考えられた。そこで次世代シーケンサーの一つであるnanoporeを用いて、一度に多数のvariantのシーケンスを実施し、その存在比率や多様性の評価を行っている。また新規TACC2の発現量の高い子宮体癌細胞株を用いて、その機能解析を試みた。多様なvariantの存在から、機能解析に先行してシーケンスによるvariantの配列決定を行い、機能解析を進めた。子宮体癌においてリンパ節転移は重要な予後因子であるが、術前の確実なリンパ節診断法は未確立である。再発低リスク群と思われる症例においてもリンパ節転移が稀に存在するため、診断目的にリンパ節郭清術を実施せざるを得ない。その結果、過剰なリンパ郭清は患者の術後QOLを著しく低下させる。CAGE(Cap analysis of gene expression)法は、RNAの5'端の配列を網羅的に補足し、転写開始点ごとの発現解析が可能な方法である。この方法を用いて未知遺伝子を含めた遺伝子発現をゲノム全域で測定し、リンパ節転移診断を可能とするマーカーの同定を試みた。(方法)倫理委員会承認後、115例の子宮体癌組織を収集した。筋層浸潤1/2以下の子宮内膜癌G1でリンパ節転移陰性(LNー)10例と陽性(LN+)5例に対してCAGE法でLNー/LN+の識別に有効な候補遺伝子群を抽出した。これら候補を115症例に対してqRT-PCRで検証した。(結果)最も診断精度の高いバイオマーカーとしてSEMA3Dと新規転写開始点を有するTACC2アイソフォーム(novel TACC2)を同定した。SEMA3DはLN転移陰性群で高発現し(P<0.001)、novel TACC2はLN転移陽性群で高発現であった(P<0.05)。これら2遺伝子の発現量差は、非常に高いリンパ節転移識別能を認めた(AUC = 0.929)。これら2つを組み合わせることでリンパ節転移を高精度に検出した。(結論)リンパ節転移診断マーカーとしてSEMA3D、novel TACC2を同定した。このリンパ節転移診断法は、原発巣の遺伝子発現定量に基づく診断法であり、転移リンパ節を同定する他の診断法とは一線を画す新しい手法である。今後このマーカーを利用した個別化術式を実現する術前リンパ節転移診断の確立を目指したい。

子宮体癌リンパ節転移陽性群と陰性群でがん原発巣の遺伝子発現を、Cap Analysis of Gene Expression法を用いて、遺伝子発現の高解像度測定をゲノム全体に渡って実施した。SEMA3DとTACC2新規アイソフォームが子宮体がんのリンパ節転移診断のバイオマーカーになりうることを明らかにした。この結果は子宮体がんの簡便・高精度・低侵襲なリンパ節転移診断を可能とし、リンパ節郭清術の適応を症例ごとに決定する個別化医療の実現に貢献する。当初の計画通り、今回同定した遺伝子Xと遺伝子Yの機能解析を行っていく予定である。variantの多様性を検証し、転移に最も関連するvariantの同定を試み、またその機能解析を行っていく予定である。婦人科腫瘍CAGE法により同定したマーカー候補遺伝子が多数あり、その絞り込みに多数の臨床検体を用いて頻回にRTーPCRを行ったため。機能解析に先行してシーケンスを実施したため。シーケンス結果に基づいて機能解析を実施する。
ウミユリにおけるキャッチ結合組織の役割

東大三崎臨海実験所で、雨宮昭南氏がウミユリ(トリノアシMetacrinus rotundus)を水槽内で長時間(6か月以上)飼育することに成功した。その動物を用い、ウミユリの行動を世界で初めてビデオ撮影し解析した。これまでの推測によると、ウミユリはほとんど動かないとされてきた。理由は、柄や巻枝には筋肉がないこと、また、腕には筋肉はあるが、関節の口側のみであり、反口側には筋肉はないので、腕を動かせたとしても、ぎこちない運動となって、とても這ったり泳いだりは難しいだろうということである。ところが実際に観察してみると、トリノアシは、かなり活発に動き回ることが分かった。海底に横たえておく、流れのより強い場所に這っていき、岩によじのぼり、柄を垂直に持ち上げて、腕をのばして摂食姿勢をとる。這う速度は、最大、30分で35cmであった。這うときには、腕を使った。腕の動きには2種類観察できた。一つは、ピンとのばした腕を進行方向に倒し、先端が地面に着いたら腕を反口側に曲げて体を引っ張るやり方。もう一つは、反口側に湾曲した腕の先端を地面に着け、腕をのばすことにより、体を押すやり方。腕の形態を調べたが、他の種で言われてきた通り、筋肉は腕の関節の口側にしか存在しなかった。そこで、反口側への運動は靭帯の弾性によるものと考え、力学試験を行った結果、靭帯は高いレジリアンスを示した。柄や巻枝の変形能は、状態により変わった。たとえば、垂直の金網に登った状態では、巻枝は金網にしっかり巻き付いているが、光刺激により、巻き枝の関節はやわらかくなり、自重を支えきれなくなり、金網から個体が落ちてしまう。柄や巻枝の関節は靭帯のみでできているので、この変形能の変化は、靭帯がかたさの変わる結合組織(キャッチ結合組織)でできていることを示唆する。腕の運動から、腕にもキャッチ結合組織が存在することが示唆された。
患者由来XGマウスを用いたIGBP1関連miRNA の肺癌治療における機序の検討

肺腺癌において、IGBP1は癌の進行に関与しており、miRNAによって制御されている事が知られている。今回我々は、miRNA34b、とmiRNA3941がIGBP1と関連している事を解明し、これらのmiRNAを用いた治療が、肺癌細胞株において有用である事を示した。特に、miRNA3941はIGBP1の制御に非常に特異的であった。miRNA3941に関してはacutelymphoblastic leukemiaで報告があるものの、固形がんに関する報告はなく、今回の我々の報告は、世界で初めての報告となった。研究の目的に記載した通り、microRNA34bのtransfectionがIGBP1を制御し、抗腫瘍効果があることを肺癌細胞株を用いた実験により明らかにしていたが、IGBP1を制御するその他のmicroRNAも抗腫瘍効果があることが確認され、現在ルシフェラーゼアッセイを用いて、実際の結合を確認している。細胞株で治療効果が確認され次第「患者腫瘍由来のXenograftマウス」を用いた治療実験に移行する予定であり、現在35例の肺腺癌外科材料を皮下に移植し、12例の生着が確認されている。細胞株を用いた実験でmicroRNA添加による抗腫瘍効果が認められているが、microRNAが実際に結合しているかどうかの確認の為に行っている、ルシフェラーゼアッセイに難渋し、時間がかかってしまった。今後はルシフェラーゼアッセイにてmicroRNAの結合が確認され次第「患者腫瘍由来のXenograftマウス」を用いた治療実験に移行する予定である。研究の目的に記載した通り、miRNA-34bのtransgectionがIGBP1を制御し、抗腫瘍効果があることを肺癌細胞株を用いた実験により明らかにしていたが、miRNA-34bは既にMYCなどいくつかの癌関連遺伝子と関連している事が分かっている有名なmicroRNAであり、IGBP1との関連は薄い可能性があった。しかし、研究を進めてい行くに連れ、IGBP1を制御するその他のmicroRNA、具体的にはmiRNA-3941にも抗腫瘍効果があることが可能性を示す結果を得る事ができた。この現象に対しては、ルシフェラーゼアッセイにより、結合も確認された。本研究はXenograftマウスを用いた治療実験を目指したものであったがその過程において非常に興味深いmiRNAが見つかったため、その確認に移行した。そのおかげで、miRNA-3941という非常に興味深いmi-RNAを発見する事ができた。肺腺癌細胞株に対するmiR-3941を介したIGBP1抑制による抗腫瘍効果は、今までに報告されておらず、非常に新規性の高い発見となった。細胞株を用いた実験で、microRNA添加実験で抗腫瘍効果が認められたが、microRNA結合の有無を確認するために行ったルシフェラーゼアッセイに難渋していた。しかし、市販のIGBP1のplasmidを使用する事によりこの問題を解決する事ができており、現在順調に実験が進行している。IGBP1とmicroRNAの結合が確認され次第、「患者腫瘍由来のXenograftマウス」を用いた治療実験に移行する予定である。診断病理学
蛍光標識少糖による蛋白質の糖鎖構造認識の解析

水解酵素やレクチンの分子認識を精度良く解析するには、種々の天然に存在する糖鎖又はそれに類似した複雑な構造の糖鎖を出来るだけ多種類取り揃える必要があり、酵素の場合得られた生成物を精度良く解析する必要がある。この様な蛋白質と糖鎖の結合特異性を解析するためには高感度な解析方法が要求される。ピリジルアミノ(PA-)糖鎖は、分子サイズで分かれるHPLC(サイズフラクショネ-ション)と糖鎖構造で分かれるHPLC(逆相)の二種のカラムを用いる事により、非常に複雑なPA-糖鎖でも微量で分離精製出来る事が今までに明らかとなった。このような構造解析システムは上記目的に適していると思われる。このためウズラの輸卵管をホモジナイザ-を用いてすりつぶし30,000xg上澄を粗酵素標品とし、粗酵素標品中にある、pnitrophenyl αーmannopyranoside等の簡単な構造の基質のみでは検出されない、高度の基質特異性を持ったコバルト依在性αーマンノシダ-ゼの検索を行い分離精製した。このための酵素活性の測定は前年度調製したMan_9GlcNAc_2ーPAやMan_5GlcNAc_2ーPAを基質として用い、酵素反応後、生成物をサイズフラクショネ-ションHPLCを用い蛍光検出器を用いて定量を行った。ここで検出されたαーマンノシダ-ゼについてMan_9GlcNAc_2ーPAMan_1GlcNAc_2ーPA等の出来るだけ種々の基質を用い、酵素消化物をサイズフラクショネ-ションHPLCと逆相HPLCで分離解析し、その基質特異性を明らかにした所、Man_9GlcNAcを水解してMan_5GlcNacにする、新しい酵素であることが分った。ニワトリ輸卵管よりウズラと同様な酵素を各種クロマトグラフィ-を用い精製し単一な蛋白質とし、酵素の基質特異性の解析を行なう予定である。
自己き裂治癒能力の応用による機械加工されたセラミックス要素の信頼性保証

き裂治癒能力とは材料自身がき裂を感知・修復するという機能であり,脆性材料であるセラミックスに適用する利点は極めて大きい.なぜなら,セラミックスは破壊靱性が極めて低く,機械加工時に発生するき裂が信頼性低下の最大の要因となるからである.また,加工中に発生するき裂を全て治癒できたならば,加工能率および加工コストの抜本的な改善が可能となる.本研究では,申請者が開発した,優れたき裂治癒能力を有する窒ケイ素/炭化ケイ素,アルミナ/炭化ケイ素粒子およびアルミナ/炭化ケイ素ウィスカー複合材を供試材として選択した.供試材に様々な一回切込み深さ(機械加工条件)で粗研削を行い,構造用部材を模擬した様々な形状の機械加工材を作製した.その結果,以下の点が明らかとなった.1アルミナ及び窒化ケイ素複合材を粗研削すると,粗大なき裂が無数に発生し,その曲げ強度はJIS規格に準拠し精密研磨を施した平滑材に比べ5080%程度の値にまで低下することが分かった.これら試料の曲げ強度は1400°Cで10時間き裂治癒を施すことにより平滑材と同等以上にまで回復することが分かった.2アルミナ/炭化ケイ素粒子およびウィスカー複合材を粗研削後,1400°C10時間き裂治癒処理を施した試料の曲げ強度は室温1300°Cまで表面が平滑な試料と同等の値であった.さらに,900°C及び1100°Cにおける繰り返し及び静・疲労強度も表面が平滑な試料と同等の値であった.3窒化ケイ素/炭化ケイ素粒子複合材を粗研削後,1400°Cで10時間き裂治癒処理を施した試料の曲げ強度は室温1400°Cまで約700MPaの高い値を示した.さらに,その繰り返し疲労強度は800°C,1000°C,1200°C及び1300°Cにおいてそれぞれ700MPa,650MPa,600MPa及び550MPaの非常に高い値を示した.以上の結果より,窒ケイ素/炭化ケイ素,アルミナ/炭化ケイ素粒子およびアルミナ/炭化ケイ素ウィスカー複合材において,き裂治癒は非常に厳しい条件の機械加工により発生したき裂に対しても有効であることが分かった。さらにき裂治癒した試料は実環境である高温疲労環境においても高い信頼性を有することが明らかとなった.したがって,セラミックスの機械加工工程にき裂治癒処理を導入することにより,セラミックス機械加工材の信頼性を高温まで確保できることが明らかとなった.本研究の成果はセラミックスの信頼性確保とともに加工能率・加工コストの抜本的な改善に大きく寄与するものと期待できる.き裂治癒能力とは材料自身がき裂を感知・修復するという機能であり,脆性材料であるセラミックスに適用する利点は極めて大きい.なぜなら,セラミックスは破壊靱性が極めて低く,機械加工時に発生するき裂が信頼性低下の最大の要因となるからである.また,加工中に発生するき裂を全て治癒できたならば,加工能率および加工コストの抜本的な改善が可能となる.本研究では,申請者が開発した,優れたき裂治癒能力を有する窒ケイ素/炭化ケイ素,アルミナ/炭化ケイ素粒子およびアルミナ/炭化ケイ素ウィスカー複合材を供試材として選択した.供試材に様々な一回切込み深さ(機械加工条件)で粗研削を行い,構造用部材を模擬した様々な形状の機械加工材を作製した.その結果,以下の点が明らかとなった.1アルミナ及び窒化ケイ素複合材を粗研削すると,粗大なき裂が無数に発生し,その曲げ強度はJIS規格に準拠し精密研磨を施した平滑材に比べ5080%程度の値にまで低下することが分かった.これら試料の曲げ強度は1400°Cで10時間き裂治癒を施すことにより平滑材と同等以上にまで回復することが分かった.2アルミナ/炭化ケイ素粒子およびウィスカー複合材を粗研削後,1400°C10時間き裂治癒処理を施した試料の曲げ強度は室温1300°Cまで表面が平滑な試料と同等の値であった.さらに,900°C及び1100°Cにおける繰り返し及び静・疲労強度も表面が平滑な試料と同等の値であった.3窒化ケイ素/炭化ケイ素粒子複合材を粗研削後,1400°Cで10時間き裂治癒処理を施した試料の曲げ強度は室温1400°Cまで約700MPaの高い値を示した.さらに,その繰り返し疲労強度は800°C,1000°C,1200°C及び1300°Cにおいてそれぞれ700MPa,650MPa,600MPa及び550MPaの非常に高い値を示した.以上の結果より,窒ケイ素/炭化ケイ素,アルミナ/炭化ケイ素粒子およびアルミナ/炭化ケイ素ウィスカー複合材において,き裂治癒は非常に厳しい条件の機械加工により発生したき裂に対しても有効であることが分かった。さらにき裂治癒した試料は実環境である高温疲労環境においても高い信頼性を有することが明らかとなった.したがって,セラミックスの機械加工工程にき裂治癒処理を導入することにより,セラミックス機械加工材の信頼性を高温まで確保できることが明らかとなった.本研究の成果はセラミックスの信頼性確保とともに加工能率・加工コストの抜本的な改善に大きく寄与するものと期待できる.

き裂治癒能力とは材料自身がき裂を感知・修復するという機能であり,脆性材料であるセラミックスに適用する利点は極めて大きい.なぜなら,セラミックスは破壊靱性が極めて低く,機械加工時に発生するき裂が信頼性低下の最大の要因となるからである.また,加工中に発生するき裂を全て治癒できたならば,加工能率および加工コストの抜本的な改善が可能となる.本研究では,申請者が開発した,優れたき裂治癒能力を有するアルミナ/炭化ケイ素粒子およびウィスカー複合材を供試材として選択した.供試材に様々な一回切込み深さ(機械加工条件)で粗研削を行い,構造用部材を模擬した様々な形状の機械加工材を作製した.これら機械加工材は11001400°Cの大気中において1または10時間熱処理を行った.熱処理後の試験片の室温曲げ強度を測定し,発生した加工き裂に対するき裂治癒挙動を調査した.また,き裂治癒部の高温強度特性を調査した.その結果,以下の点が明らかとなった.1粗研削の際発生するき裂の大きさは一回の切込み量が増加するに従い拡大し,この結果,その曲げ強度はJIS規格に準拠し精密研磨を施した平滑材に比べ5080%程度の値にまで低下することが分かった.これら試料の曲げ強度は1400°C,10時間の熱処理を施すことにより平滑材同等以上にまで回復することが分かった.2セラミックスに研削工具が損傷してしまうような非常に厳しい条件で機械加工したとしても,その際発生したき裂を完全に治癒することが可能であることが分かった.3粗研削後,1400°C10時間き裂治癒処理を施した試料の曲げ強度は室温1100°Cまで1000MPaの非常に高い値を示した.また,室温1300°Cまで表面が平滑な試料と同等かそれ以上の値であった。さらに,全ての温度域において,全ての試料の破壊起点がき裂治癒部外であった。以上の結果より,き裂治癒は非常に厳しい条件の機械加工により発生したき裂に対しても有効であることが分かった.したがって,セラミックスの機械加工工程にき裂治癒処理を導入することにより,セラミックス機械加工材の信頼性を高温まで確保できることが明らかとなった.また,き裂治癒処理は低コストな工程であるにもかかわらず,信頼性を確保する上で,従来の精密研磨等の工程よりも優位であることが確認された.したがって,本研究の成果はセラミックスの信頼性確保とともに加工能率・加工コストの抜本的な改善に大きく寄与するものと期待できる.き裂治癒能力とは材料自身がき裂を感知・修復するという機能であり,脆性材料であるセラミックスに適用する利点は極めて大きい.なぜなら,セラミックスは破壊靭性が極めて低く,機械加工時に発生するき裂が信頼性低下の最大の要因となるからである.また,加工中に発生するき裂を全て治癒できたならば,加工能率および加エコストの抜本的な改善が可能となる.本研究では,申請者が開発した,優れたき裂治癒能力を有する窒ケイ素/炭化ケイ素,アルミナ/炭化ケイ素粒子およびアルミナ/炭化ケイ素ウィスカー複合材を供試材として選択した.供試材に様々な一回切込み深さ(機械加工条件)で粗研削を行い,構造用部材を模擬した様々な形状の機械加工材を作製した.その結果,以下の点が明らかとなった.1アルミナ及び窒化ケイ素複合材を粗研削すると,粗大なき裂が無数に発生し,その曲げ強度はJIS規格に準拠し精密研磨を施した平滑材に比べ5080%程度の値にまで低下することが分かった.これら試料の曲げ強度は1400°Cで10時間き裂治癒を施すことにより平滑材と同等以上にまで回復することが分かった.2アルミナ/炭化ケイ素粒子およびウィスカー複合材を粗研削後,1400°C10時間
臨床指向型三次元歩行評価システムの開発

歩行パフォーマンスの評価として臨床的に良く使われている評価としては、歩行速度が挙げられる。歩行速度はストップウォッチ1つで簡便に計測可能で、臨床的意義も大きく一般的に広く普及している。一方で、歩行の遊脚時間などの時間因子や距離因子といった定量的な歩行パターンの評価(歩容の評価)を臨床で行うには、大掛かりな機器や解析に時間がかかるため制約が多いのが現状である。片麻痺者や片側下肢関節疾患の歩行では、至適速度やゆっくり歩いた歩容では良好な歩行パターン(ここでは左右対称性を指す)であるが、急いで歩くと代償動作の出現にともない、歩行パターンが悪化することがある。そのため、ある歩行速度のみで歩行パターンを評価するのではなく、歩行速度を変化させた条件で歩行パフォーマンス=量と、歩行パターン=質を抽出し、歩行を包括的に評価することが重要と考えている。当該年度に実施した研究としては、包括的な歩行指標を自動的に算出するアプリケーションの開発に着手した。また、実験室手法により得られたデータ(以下、従来法)と本システムで得られたデータとの差異、および誤差を検討した。本研究は4年の計画で実施する予定である。現在のところ当初の計画通り、おおむね順調に進展している。今後は従来法と本システムとの関係性を分析し、統計学的見地から補正アルゴリムの確立を目指す。また、実際の高齢者および障害を持った方を対象とした臨床評価を行い、低歩行能力患者データを算出する。また、臨床で働く評価者にとっても本システムが臨床で運用可能であるか、質問紙法を用いて本システムの利点や問題点を明らかにする予定である。Kinect v2センサを用いて、身体合成重心の軌跡および身体合成重心の力学的エネルギー変換率をリアルタイムに表出するシステムを構築した。既存のシステムである三次元動作解析装置(VICON-T10カメラ8台+MX3カメラ6台)を用いたシステムと歩行動作を同時計測し、身体合成重心の検出精度を検討した。結果として、Kinect v2センサを用いたシステムの誤差率は0.520.66%であった。この結果から脳卒中片麻痺患者における身体合成重心の左右差などを指標としてリハビリテーションの効果判定を検討する際には十分活用可能であると考えられた。歩行過程における運動学的・運動力学的データおよび本研究でテーマとしている身体合成重心の力学的エネルギー変換率を計測するには、現状では大規模な計測空間と高価な三次元動作解析装置を有する実験室環境が必要である。脳卒中片麻痺のような重度の障害を呈する患者にとっては、これらの検査を行うために、わざわざ大学や大学病院の実験室に出向いて測定を行うことは現実的ではなく、理学療法や補装具の客観的な効果判定は普及していない。本研究で提案したKinectセンサを活用したシステムは既存システムと比較して誤差はあるものの、誤差率はリハビリテーションの介入や補装具の効果判定などの評価に支障のない範囲にとどまっており、ポータブルかつ低コストなシステムである。さらに、今後はKinectセンサ以外のセンサも活用し、より包括的な歩行評価システムも検討する予定である。Kinect v2センサを用いて、身体合成重心の軌跡および身体合成重心の力学的エネルギー変換率をリアルタイムに表出するシステムを構築することが出来た。計測精度に関しては、脳卒中片麻痺患者における身体合成重心の左右差などを指標としてリハビリテーションの効果判定を検討する際には十分活用可能であると考えられた。今後はKinectセンサ以外のセンサも活用し、より包括的な歩行評価システムも検討する予定である。(理由)研究成果発表のための学会旅費が当初の予定より多かったが、次年度使用額は3,503円と少額で、ほぼ計画通り支出した。(使用計画)健常者を対象とした臨床評価を計画している。人件費・謝金、学会発表旅費などを中心に支出する計画である。当初の予定より物品費を抑えることができたため。
性同一性障害の子どもへ対応する教員への支援法の確立

教員を対象として,性同一性障害に関する授業を行うことへの意識,必要な教材などについてのインタビュー調査,質問紙調査を実施した.この調査結果は,公開シンポジウム,教育関連,小児科医,精神神経科医,産婦人科医などの学会にて発表した.全国の教員に対するアンケート調査結果や性同一性障害に関する専門家や性同一性障害当事者からの助言なども参考とし,教員が効果的に生徒に性同一性障害に関する情報を提供するための資料,また,より深く議論ができるようなワークを作り,テキスト,DVDを制作した.人権教育担当教員,養護教員,その他の教員を対象にインタビュー調査を行い,性同一性障害に関する知識,学校の中の性同一性障害の子どもの存在の認識,その対応の実態,学校で「多様な性のあり方」に関する教育を行う場合の課題を議論した.講演会などで,医師や臨床心理士などへ,ジェンダークリニックを受診する性同一性障害の子どもへの学校での対応の実態について質問紙調査を行い,解析した.岡山大学病院ジェンダークリニックを受診する当事者やその家族などへ性同一性障害の子どもへの学校での対応の実態,「多様な性のあり方」に関して効果的に生徒に情報を提供するために必要なことなどについて質問紙調査を行い,解析した.教育者用に,この結果や文科省の全国調査の結果も含めたリーフレットを作成した.全国の教員を対象として,性同一性障害に関する知識,学校の中の性同一性障害の子どもの存在の認識,その対応の実態,生徒への教育への意識,学校で「多様な性のあり方」に関する授業等を行うために必要と考える資料や,医療スタッフなどの専門家や当事者に求めることなどについて調査した.全国各地で,性同一性障害に関する授業を行うことを希望する教員を対象にインタビュー調査を行った.性同一性障害に関する知識を持ち,生徒に対応,情報提供することのできる教員の育成のための研修会を各地で行った.また,文部科学省における人権教育担当指導主事連絡協議会においても講演を行った.また,文部科学省が作成した「性同一性障害や性的指向・性自認に係る、児童生徒に対するきめ細かな対応等の実施について(教職員向け)周知資料」の作成に協力した.全国の教員に対するアンケート調査結果や性同一性障害に関する専門家や性同一性障害当事者からの助言などを参考とし,教員が効果的に生徒に性同一性障害に関する情報を提供するためのテキストを作成,DVD作成の企画を完成させた.性同一性障害に関して効果的に生徒に情報を提供するために行う「モデル授業」のシナリオを作成した.教員が実践的な授業を行うため,教員を支援する講師やサポーターを確保するため,専門家,当事者,その家族などによる人材バンクをリスト化した.全国の教員に対するアンケート調査を修了し,結果や性同一性障害に関する専門家や性同一性障害当事者からの助言などを参考とし,教員が効果的に生徒に性同一性障害に関する情報を提供するためのテキストを作成,DVD作成の企画を完成させた.性同一性障害に関して効果的に生徒に情報を提供するために行う「モデル授業」のシナリオを作成した.教員が実践的な授業を行うため,教員を支援する講師やサポーターを確保するため,専門家,当事者,その家族などによる人材バンクをリスト化した.2016年度も,性同一性障害に関する知識を持ち,生徒に対応,情報提供することのできる教員の育成のための研修会を各地で行った.また,性同一性障害に関する授業を行うことを希望する教員を対象として,2015年度までに全国各地で行ったインタビュー調査,質問紙調査の結果を解析した.この調査結果は, 5月,日本学術会議法学委員会「社会と教育におけるLGBTIの権利保障」分科会が開催した公開シンポジウム「教育におけるLGBTIの権利保障ー現状と課題」にて報告した.また,教育関連,小児科医,精神神経科医,産婦人科医などの学会にて,教育講演,シンポジウム,ワークショップ,一般演題の形で発表した.また,文部科学省が2016年4月に公表した「性同一性障害や性的指向・性自認に係る、児童生徒に対するきめ細かな対応等の実施について(教職員向け)周知資料」の作成に協力した.全国の教員に対するアンケート調査結果や性同一性障害に関する専門家や性同一性障害当事者からの助言などを参考とし,教員が効果的に生徒に性同一性障害に関する情報を提供するための資料,また,より深く議論ができるようなワークを作り,テキスト,DVDを制作した.教員が実践的な授業を行うため,教員を支援する講師やサポーターを確保するため,専門家,当事者,その家族などによる人材バンクのリストを作成した.さらに,自治体や当事者団体の作成するパンフレット等の作成に,データ提供や監修の形で携わった.教員を対象として,性同一性障害に関する授業を行うことへの意識,必要な教材などについてのインタビュー調査,質問紙調査を実施した.

この調査結果は,公開シンポジウム,教育関連,小児科医,精神神経科医,産婦人科医などの学会にて発表した.全国の教員に対するアンケート調査結果や性同一性障害に関する専門家や性同一性障害当事者からの助言なども参考とし,教員が効果的に生徒に性同一性障害に関する情報を提供するための資料,また,より深く議論ができるようなワークを作り,テキスト,DVDを制作した.人権教育担当教員,養護教員,その他の教員に教育者の課題,医師や臨床心理士などへ子ども,また,教育者への支援の状況と課題,さらに,性同一性障害当事者やその家族などが実体験した子どもの頃の,特に,学校における課題,「多様な性のあり方」に関して効果的に生徒に情報を提供するために必要なことなどについて質問紙調査を行い,解析した.教育者用に,この結果や文科省の全国調査の結果も含めたリーフレットを作成した.2015年度に作製した教材を使用して,性同一性障害に関するモデル授業を協力の得られる学校において試行する.この時,授業のみを評価するのではなく,それを行うまでの過程についても評価する.モデル授業を受けた児童や生徒の性同一性障害に関する理解度,意識の変化などを調査する.また,教員が感じた授業展開における問題点,講師として参加した専門家や当事者が感じた問題点などを調査する.これらを参考に内容を改善する.テキストやDVDなどの教材を改善し,何種類かのモデル授業を完成する.全国に展開するため,テキストやDVDなどの教材の配付,各地で,専門家や性同一性障害当事者である講師と学校(養護教諭)とマッチングするなど,実現性のあるシステムを構築する.また,各地の教育委員会や,養護教諭の団体などへ啓発し,モデル教材・授業の普及を行う.生殖医学ジェンダー今回,作成したリーフレットを使用し,これを読み基礎的な理解をしたうえでの調査が可能になると考える.全国から無作為に抽出した学校や養護教諭の職能組織等に依頼し,リーフレット等を送り,郵送法により無記名自記式質問紙調査を行う.性同一性障害に関する知識が正しかったかどうかを明らかにし,学校の中の性同一性障害の子どもの存在の認識,その対応の実態,生徒への教育への意識,学校で「多様な性のあり方」に関する授業等を行うために必要と考える資料や,医療スタッフなどの専門家や当事者に求めることなどについて調査する.全国の教員に対する無記名自記式質問紙に同封した別封筒の記名式の希望調査から,「性同一性障害に関する授業や情報提供を行いたい」と希望のある教員を明らかにし,研究への協力を依頼する.それらの教員を対象にインタビューの後,研修会を行うなどにより,不足している知識の充実を図る.全国の教員に対するアンケート調査や性同一性障害に関する専門家や性同一性障害当事者からの助言,研修を受けた教員の意見も参考とし,教員が効果的に生徒に性同一性障害に関する情報を提供するためのテキストやDVDなどを作製する.並行して,教員がリアルで実践的な授業を行うため,教員を支援する講師やサポーターを確保するため,専門家,当事者,その家族などによる人材バンクを構築する.さらに,性同一性障害に関して効果的に生徒に情報を提供するために行う「モデル授業」のシナリオを作成する.性同一性障害に関するテキストやDVDなどを使用し,当事者である講師の話を聞く機会を含めるなどによりモデル授業を作成する.研究分担者のうちの1名が,2016年3月19日,20日に東京で開催されたGID(性同一性障害)学会に参加し,情報収集を行う予定であったが,急遽,参加できなくなったため,経費の残余が生じた.2016年度中の関連学会にて,引き続き,情報提供や研究成果の報告を行う予定であるため,そのための旅費などに使用する計画である.
細胞がネクローシスで死ぬかアポトーシスで死ぬかを決定づける因子の探索と機能解析

本研究は、細胞がネクローシスで死ぬかアポトーシスで死ぬかを制御する因子の探索とその機能解析を行い、細胞死の決定機構を明らかにすることを目的としている。本研究から、ネクローシスとアポトーシスの細胞死を制御するmicroRNA(miRNA)を見出した。アポトーシスを起す細胞で多く発現しているmiRNAを、本来ネクローシスを起す細胞に過剰発現させるとその細胞死がアポトーシスに変化することを明らかにした。また、このmiRNAを過剰発現した細胞では核膜の構造タンパク質であるlamin-B1がタンパク質レベルで減少することを明らかにした。本研究は、細胞がネクローシスで死ぬかアポトーシスで死ぬかを制御する因子の探索とその機能解析を行い、細胞死の決定機構を明らかにすることを目的として実施した。我々は抗がん剤5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR)を作用させるとネクローシスを起す哺乳動物細胞FM3A細胞F28-7株とその変異株でアポトーシスを起すF28-7-A株を細胞死の解析モデルとして研究を行い、これまでに細胞死を決定づける因子として核膜構造タンパク質Lamin-B1、細胞骨格タンパク質Cytokeratin-19、分子シャペロンHsp90、転写因子ATF3(Activating transcription factor 3)を見出している。平成25年度は以下の研究成果を得た。(2)これまでの研究から見出しているネクローシスを起す細胞とアポトーシスを起す細胞で発現量の異なるmicroRNA(miRNA)について、miRNA mimic及びmiRNA inhibitorを用いて細胞死の表現系に与える影響を調べた。その結果、アポトーシスを起す細胞で多く発現しているmiRNAを、本来FUdR作用によりネクローシスを起す細胞に過剰発現させると、その細胞死がアポトーシスに変化することを明らかにした。(3)細胞のネクローシスとアポトーシスを決定づけるmiRNAについて、Lamin-B1、Cytokeratin-19、ATF3の発現における役割を調べた。ネクローシスを起す細胞に、このmiRNAを過剰発現させると、タンパク質レベルでLamin-B1が減少することを明らかにした。Cytokeratin-19及びATF3の発現は、このmiRNAを過剰発現しても影響を受けないことが明らかになった。本研究は、細胞がネクローシスで死ぬかアポトーシスで死ぬかを決定づける因子の探索とその機能解析を行い、細胞死の制御機構を明らかにすることを目的としている。我々は抗がん剤5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR)を作用させるとネクローシスを起こす哺乳動物細胞FM3A細胞F28-7株と変異株でアポトーシスを起こすF28-7-A株を細胞死の解析モデルとして研究を行い、これまでに細胞死を制御する因子としてLamin-B1、Cytokeratin-19、Hsp90を見出している。平成24年度は以下の研究成果を得た。(1)これまでの研究から見出している細胞死制御因子の候補について、siRNAを用いて機能解析を行なった。ネクローシスを起こしている細胞で発現が増加する2つの転写因子を、それぞれノックダウンすると、本来ネクローシスを起こす細胞がアポトーシスを起こすことを明らかにした。(2)FUdRを作用させるとネクローシスを起こす細胞に、Hsp90阻害剤であるGeldanamycinを併用すると、アポトーシスを起こす。この時、Hsp90の阻害により、ネクローシスで増加するこれら2つの転写因子の発現がmRNAレベルで抑制されていることを明らかにした。(3)マイクロアレイを用いて、これら細胞株で発現しているMicroRNA (miRNA)を調べた。その結果、ネクローシスを起こす細胞とアポトーシスを起こす細胞でそれぞれ特徴的に発現しているmiRNAを見出した。今後、新たに細胞死の制御因子として同定した転写因子と、これまでに明らかにしている制御因子との関連性を調べることで、細胞死の制御機構の一端が明らかになると考える。また、候補因子として見出したmiRNAの機能解析を行なうことで、ネクローシスとアポトーシスを制御するmiRNAを明らかに出来ると考える。平成24年度に計画していた研究を順調に実施しており、現在までに以下の研究成果が得られている。(1)これまでの研究から見出している細胞死制御因子の候補について、siRNAを用いた機能解析を行い、新たにネクローシスとアポトーシスの制御因子として2つの転写因子を見出した。(2)Hsp90の機能阻害により、ネクローシスで増加する転写因子の発現がmRNAレベルで抑制されていることを明らかにした。(3)細胞死を制御する可能性のある候補因子として、ネクローシスを起こす細胞とアポトーシスを起こす細胞でそれぞれ特徴的に発現しているMicroRNAを見出した。このように、おおむね順調に研究が進展していると考える。平成24年度の研究成果を基にして、ネクローシスとアポトーシスの細胞死制御機構における制御因子の役割を明らかにする。今後の研究の推進方策としては以下の研究を計画している。

(1)平成24年度までの研究から見出している細胞死の制御因子(転写因子、Lamin-B1、Cytokeratin-19、Hsp90)間の関連性を調べる。(2)分子シャペロンであるHsp90と細胞死制御因子(転写因子、Lamin-B1、Cytokeratin-19)との相互作用の有無を解析する。(3)細胞死制御因子をそれぞれ過剰発現させ、ネクローシスとアポトーシスの細胞死表現系に与える影響を検討する。(4)細胞死制御因子の候補として見出しているMicroRNAの細胞死における役割を調べる。該当無し
低分子量G蛋白質Rasを介するシグナル伝達機構とその病態

低分子量G蛋白質Rasは複数の標的蛋白質を介して、種々の細胞機能を制御することが明らかになりつつある。私共はこれまでにRasの標的蛋白質であるRafが14-3-3蛋白質と結合することを明らかにしている。本研究において、COS細胞内でRasと14-3-3蛋白質はRafの異なる部位に結合することが明らかになり、Rasと14-3-3蛋白質の両蛋白質がRafに同時に結合することによりRafが活性化される可能性が示唆された。私共はRalGDSがRasの新しい標的蛋白質であることを提唱している。EGFの濃度依存性にRalGDSはRasと結合した。RalGDSもRafと同様にAキナーゼによりリン酸化されたが、Aキナーゼの活性化はEGF依存性のRasとRalGDSの結合には影響しなかった。また、Rasの標的蛋白質結合部位の変異体を用いて、RalGDSを介するシグナル伝達系がRafとは異なることが明らかになった。さらに、RalGDSはRafと相乗的に作用してc-fos遺伝子の発現を促進した。これらの結果から、RalGDSはRafとは異なるRasのシグナル伝達系を構成することが決定的になった。脂質による翻訳後修飾を介して細胞膜に存在するRasがRalGDSを細胞質画分から細胞膜画分へトランスロケ-トさせた。また、RalGDSは非翻訳後修飾型のRalよりも翻訳後修飾型のRalに強く作用した。したがって、RasとRalの翻訳後修飾はRalGDSを介するRasのシグナル伝達機構を構成する分子を膜上に集合させることにより、シグナルを効率的に伝えるために重要であると考えられる。以上の結果から、RalGDSを介するシグナル伝達機構はRasの下流において、Rafを介するシグナル伝達機構と独立した機能および相乗的に作用する機能を有することが明らかになった。本研究は予定通り進行したと判断しているが、今後もさらに詳細な検討を続けて、Rasを介するシグナル伝達機構の全貌を明らかにし、その異常による病態を解析したいと考えている。本研究ではRasのシグナル伝達機構の全貌を明らかにすることを目的としている。本研究において、COS細胞内でRasはRaf(1-135)(Rafのアミノ酸1から135番)と、14-3-3蛋白質はRaf(136-322)と結合し、Sf9細胞内でRafはRasと14-3-3蛋白質に同時に結合した。これらの結果から、RafのRas結合部位と14-3-3蛋白質結合部位は異なっており、Rasと14-3-3蛋白質の両蛋白質がRafに同時に結合することによりRafが活性化される可能性が示唆された。私共はRalGDSがRasの新しい標的蛋白質であることを提唱しているが、本研究において、c-RasとRalGDSをトランスフェクションしたCOS細胞をEGFで刺激すると、EGFの濃度依存性にRalGDSはc-Rasと結合した。