hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
パネル単位根検定の計量理論: クロスセクションの次元が有限の場合

本研究では、動学的パネルデータの単位根検定について新しい方法を提案した。その特徴は2つある。第1は、モデル推定の際に、意図的にモデルの定数項を無視して推定すること。第2は、有限標本においても、検定統計量が正規分布で近似できるとして検定をすすめることである。有限標本実験の結果、正規近似に基づく検定は有効であり、また定数項を除く方法は検定の検出力の向上に役立つことが明らかにされた。その特徴は2つある。(1)大標本特性の導出まずN(クロスセクション方向のデータ数)が有限の場合に適用可能なパネル単位根の検定方法を考察した。具体的にはToda=Yamamoto(1995)のラグ変数追加法(Lag Augmented (LA) Method)に基づく検定方法を取り扱った。そしてNが有限で、T(時系列方向のデータ数)のみが大きくなる場合について、検定統計量の漸近特性を理論的に導いた。(2)モンテ・カルロ実験による検定統計量の小標本特性の検証モンテ・カルロ実験の結果、我々が考察した単位根検定の方法は、小標本において、(1)検定のサイズに歪みがあり、また(2)検出力が弱いことが分かった。なお時系列分析の経験から検定統計量の小標本特性が期待通りの結果を示さないことは、しばしば起こることが知られている。(3)小標本特性の改善についての若干の試み上記の弱点を克服するために、改善について若干の試みを行った。たとえば、Nabeya(1989)の結果にもとづく検定統計量の修正等である。これらの試みは部分的には成功したが、まだ十分とはいえず、より実用的な改善方法の提案は次年度の課題となる。平成20年度の研究においては、我々の提案した検定統計量は、(1)検定のサイズに歪みがあり、また(2)検出力が弱い、ということが分かった。そこで平成21年度の研究では、それらの弱点を克服すべく、検定統計量の小標本特性の改善(検定のサイズの歪みの是正と検出力の向上)を目指して、いくつかの方法を試み、一定の効果を確認した。具体的には、以下の3つのアプローチとその発展型を試みた。(1)動学的パネルモデルは時系列モデルの拡張版と考えることができるので、典型的な時系列モデルであるVAR(vector autoregressive)モデルについて提案されている方法の適用を試みた。すなわち、Kurozumi=Yamamoto(2000)で提案されている推定量のジャック・ナイフ型のバイアス修正の方法を適用した。(2)同様に時系列モデルにおける検定統計量のゆがみを調整するために提案された、推定量の分散を適度に拡大させる、Chigira=Yamamoto(2007)の方法を適用した。(3)検出力の向上のためには、モデルの表現の定数項の扱いを変更する方法、ならびに意図的に高次の項を加える方法を試みた。様々なモンテ・カルロ実験により、これらの方法は、検定統計量の小標本特性の向上に一定の効果があることを確認した。検定のサイズの歪みの改善には顕著な効果が認められたが、検出力向上については、既存の研究と比較して、さらなる改善が必要と思われる。平成20年度ならびに21年度の研究において、我々が当初提案し検討を重ねてきたラグ変数を追加する検定方法は、検出力が低くその改善は困難であった。具体的には、これまでの標準と考えられているIm,Pesaran and Shin (Journal of Econometrics、2003。以下、IPS)と比較して検定の検出力が明白に劣っていた。そこで22年度は、別のアプローチを探った。すなわち本年度は、IPS法に対する2つの変更を提案・検討した。(1)まず意図的にモデルにおける定数項を除いて検定統計量を構築する方法を考える。これは、推定するパラメーター数を減らすことで、推定の効率性を上げて、検出力を上げようする試みである。この方法は帰無仮説の下では問題がないが、対立仮説の下では定式化の誤りを含むモデルとなる。しかしながら、この状況下でも検定の一致性を持つことを示すことができる。(2)既存の方法では、検定のために独自の臨界値の数表が必要となるが、Abadir(Econometric Theory,1995)に従いIPSタイプの検定統計量についての近似的分布を考え、正規分布に基づいて検定することを考える。小標本実験により、正規近似は十分に正当化されることが明らかになった。結論として、上記の改善は効果があることが小標本実験により示された。すなわち、真の根が単位根の近傍にある時に、この方法はIPSより高い検出力を持つことが示された。したがって実用性は高いと思われる。同研究結果は、ISI 2011(Dublin)大会において報告の予定である。ただし、この方法はN(クロスセクションの次元)が大きいときに検定のサイズが下方にバイアスを持つので、この点については今後にさらなる改善の余地が残されている。
バルプロ酸の胎仔マウスの心臓に及ぼす影響とその分子生物学的メカニズムの解明

本研究では、心臓形態形成期にあたる妊娠初期の胎児がバルプロ酸ナトリウム(valproic acid:以下VPA)投与において示す心臓血行動態を、小動物用超音波高感度イメージングシステムを用いて評価した。妊娠マウスにVPAを投与することで、胎仔マウスの徐脈と内頚動脈血流量の減少が観察され、出生した仔マウスの体重は生後6週まで有意に低いことが示された。バルプロ酸(valproic acid:以下VPA)は、てんかんや片頭痛などに適応があり、妊娠可能な女性にも使用されることがある。先天性心疾患を含む胎児催奇形性が指摘されており、VPAの有するヒストン脱アセチル化酵素(Histone deacetylase:以下HDAC)阻害作用が関与しているとの報告があるが、その分子生物学的メカニズムは解明されていない。本研究は、妊娠マウスを用いてVPAが胎仔心臓に与える影響を検討する。分子生物学的評価はマイクロRNA(以下miRNA)に重点をおき、VPAが阻害するHDACの発現と、それに関わる標的miRNAを同定し,標的miRNAが発生段階における胎仔心臓にどのような影響を及ぼすかを検討する。実験は、CD1マウス雌雄の交配により得られた妊娠マウスを用いる。交配翌朝を在胎日齢(ED)0.5として、ED7.5の母マウスにVPA(700mg/kg)を腹腔内投与し、小動物用超音波高感度イメージングシステムを用いて心臓形態形成初期のED9.5から心臓内構造がほぼ完成するED13.5までの胎仔心血行動態を検討する。分子生物学的評価は、ED9.5とED13.5の胎仔心臓を用いてHDACの蛋白発現やmRNA、miRNAの発現解析を行う。蛋白発現はウェスタンブロッティングにて解析し、mRNAの発現解析についてはqPCRを用い定量的に評価する。miRNAについてはmiRNAデータベースを用いた検索で、35のmiRNAがHDAC1と関連があると報告されており、その35個のmiRNAと内因性コントロールを搭載し、本研究用にカスタマイズしたTaq Man Low Density Array Card(Applied Biosystems)を依託作成し、定量でアレイ解析を行う。本研究を行うにあたり、大学での動物実験計画の承認(承認番号:動第27108号)を得た。平成27年度は、母体VPA投与マウスの作製を行い、母体VPA投与群、非投与群での胎仔心血行動態の評価、胎仔心臓の採取と分子生物学的評価を行うことを計画した。VPA非投与群での胎仔心血行動態の評価を行い、心臓形態形成初期の在胎日齢(ED)9.5から、心臓内構造がほぼ完成するED13.5までMモード法を用いて心室壁運動を測定し、ドプラ法にて動脈幹・背側大動脈・内頚動脈・母マウスの臍帯動静脈・子宮動脈の血流を測定した。ED9.5とED13.5の心血行動態評価後に子宮内から胎仔、胎盤および子宮筋を採取した。胎仔、胎盤および子宮筋のHDACの蛋白発現やmRNAの発現解析目的にそれぞれ、蛋白の抽出とRNAの抽出作業を行った。mRNAの抽出にはRNeasy Mini Kit (QIAGEN)を用い、RNAの品質の客観的評価に2100バイオアナライザ(Agilent Technoligies)のRNA Integrity Number (RIN)を用いた。国際標準であるRIN値7.0以上となるRNAの抽出作業手技の取得に時間を要したため、計画に遅れを生じた。バルプロ酸(valproic acid:以下VPA)は、てんかんや片頭痛に適応があり、妊娠可能な女性にも使用される。また先天性心疾患を含む胎児催奇形性が指摘され、VPAの有するヒストン脱アセチル化酵素(Histone deacetylase:以下HDAC)阻害作用が関与している報告があるが、その分子生物学的メカニズムは解明されていない。本研究は、妊娠マウスを用いVPAが胎仔心臓に与える影響を検討する。分子生物学的評価はマイクロRNA(以下miRNA)に重点をおき、VPAが阻害するHDACの発現と、それに関わる標的miRNAを同定し,標的miRNAの発生段階における胎仔心臓への影響を検討する。実験は、CD1マウス雌雄の交配により得られた妊娠マウスを用い、交配翌朝を在胎日齢(ED)0.5として、ED7.5の母マウスにVPA(700mg/kg)を腹腔内投与し、小動物用超音波高感度イメージングシステムを用いて心臓形態形成初期のED9.5から心臓内構造がほぼ完成するED13.5までの胎仔心血行動態を検討する。分子生物学的評価は、ED9.5とED13.5の胎仔心臓を用いHDACの蛋白発現やmRNA、miRNAの発現解析を行う。蛋白発現はウェスタンブロッティングで解析し、mRNAの発現解析はqPCRを用い定量的に評価する。miRNAデータベースで、35のmiRNAとHDAC1との関連性が判明している。それらmiRNAと内因性コントロールを搭載し、本研究用にカスタマイズしたTaq Man Low Density Array Card(Applied Biosystems)を依託作成し、定量でアレイ解析を行う。コントロール群と比較し、2倍以上発現量が変化したmiRNAを標的miRNAと設定し、標的miRNAのmimic, inhibitorとnegative controlを経静脈投与する。本研究を行うにあたり、大学での動物実験計画の承認(承認番号:動第27108号)を得ている。

平成28年度は、母体VPA投与マウスの作製を行い、母体VPA投与群、非投与群での胎仔心血行動態の評価、胎仔心臓の採取と分子生物学的評価を行うことを計画した。VPA非投与群での胎仔心血行動態の評価を行い、心臓形態形成初期の在胎日齢(ED)9.5から、心臓内構造がほぼ完成するED13.5までMモード法を用いて心室壁運動を測定し、ドプラ法にて動脈幹・背側大動脈・内頚動脈・母マウスの臍帯動静脈・子宮動脈の血流を測定した。ED9.5とED13.5の心血行動態評価後に子宮内から胎仔、胎盤および子宮筋を採取した。胎仔、胎盤および子宮筋のHDACの蛋白発現やmRNAの発現解析目的にそれぞれ、蛋白の抽出とRNAの抽出作業を行った。mRNAの抽出にはRNeasy Mini Kit (QIAGEN)を用い、mRNAの発現解析に定量PCRにて評価した。miRNAの抽出には、miRNeasy Mini Kit(Quagen)を用いて行った。RNAの品質の客観的評価に2100バイオアナライザ(Agilent Technoligies)のRNA Integrity Number (RIN)を用いたが、品質の高いmiRNAの抽出作業手技の取得に時間を要しているために計画に遅れを生じている。バルプロ酸ナトリウム(valproic acid:以下VPA)はてんかんや片頭痛などに適応があり妊娠可能な女性にも多く使用されている。しかし、VPAの子宮内暴露により先天性心疾患を含む胎児催奇形性が指摘されている。VPAのもつヒストン脱アセチル化酵素(Histone deacetylase:以下HDAC)阻害作用が催奇形性に関与しているとの報告があり、本研究は妊娠マウスを用い、VPAが胎児心臓に与える影響を検討することを目的とした。生理学的評価に小動物用超音波高感度イメージングシステムを用いて胎仔心血行動態を観察した。分子生物学的評価にVPAが阻害するHDACの発現とそれに関わる標的マイクロRNA(以下miRNA)を同定し、標的miRNAが発生段階における胎仔心臓への影響の検討を計画した。妊娠在胎日齢(embryonic day:ED)7.0のマウスにVPA投与(投与群)し、VPA非投与群(生理食塩水)とED12.0の母体と胎仔の心血行動態の比較を行った。母体の心拍室量に差はなかった。胎仔心拍数と胎仔内頚動脈血流量がVPA投与群で有意に低かった。胎仔背側大動脈血流量と胎仔臍帯動脈血流量には両群間で有意差はなかった。出生仔マウスの生後1週、2週、3週、6週の体重はVPA投与群で有意に少なかった。超音波イメージングMモードでは両群とも心臓形態異常の所見は認められなかった。今回、妊娠初期マウスへのVPA投与により、心臓形態形成期の胎仔心血行動態に影響を与え、出生仔マウスの体重増加不良の原因となる可能性があることが示された。今後仔マウスの心臓の組織学的検索により心臓形態異常の有無を評価し、分子生物学的に妊娠初期の胎仔心血行動態の変化が心臓に与えた影響を検討する予定である。妊娠可能な女性へのVPA投与に関しては胎児への影響も考慮し、適正な使用方法を検討する必要性があると考えられた。
薬物の精神依存性に及ぼす身体依存の影響に関する研究

ヘロインやモルヒネなどの乱用事例では,身体依存が形成されると精神依存が著しく強まることが臨床的に知られている.本研究では,薬物の種類と身体依存の関与の程度,および身体依存の強さと増強の程度との関係を明らかにする目的で,アカゲザルを用いレバー押し比率累進試験法により薬物を静脈内に自己投与させて,薬物の強化効果に及ぼす身体依存形成の影響を検索し,併せて薬物の強化効果と密接な関係を有すると考えられる薬物の自覚効果をアカゲザルにおける薬物弁別実験により検索した.その結果,モルヒネ,ジヒドロコデイン,およびペンタゾシンではサルがこれらの薬物に身体依存の状態にあるときは,ないときよりもレバー押し最終比が大きくなること,すなわち強化効果の増強がみられることが明らかになった.この増強はジヒドロコデインで最も顕著にみられ,ペンタゾシンではジヒドロコデインやモルヒネの場合よりも弱かった.身体依存の強さとの関係では,ジヒドロコデインで比率累進試験開始前に同薬の3日間または2週間反復強制投与の前処置を施した場合の比較で2週間前処置のときの方が3日間前処置したときより明らかに大きな最終比が得られ,またモルヒネでも同様な結果が得られたことから,身体依存の強さは強化効果増強の程度に影響し,ある範囲内では両者は正に相関するであろうことが示唆された.しかし同時に,身体依存が強く形成された重度の退薬症候が発現される場合にはレバー押し行動は障害され,薬物欲求の強さがレバー押し最終比に正しく反映されていないと考えられる場合もあることが示唆された.ペントバルビタールでは退薬症候は認められたが,退薬症候に基づくレバー押し行動の障害があったことが考えられるので強化効果の増強の有無については結論は得られなかった.薬物弁別実験ではモルヒネの効果はコカインおよびペンタゾシンに般化された.ヘロインやモルヒネなどの乱用事例では,身体依存が形成されると精神依存が著しく強まることが臨床的に知られている.本研究では,薬物の種類と身体依存の関与の程度,および身体依存の強さと増強の程度との関係を明らかにする目的で,アカゲザルを用いレバー押し比率累進試験法により薬物を静脈内に自己投与させて,薬物の強化効果に及ぼす身体依存形成の影響を検索し,併せて薬物の強化効果と密接な関係を有すると考えられる薬物の自覚効果をアカゲザルにおける薬物弁別実験により検索した.その結果,モルヒネ,ジヒドロコデイン,およびペンタゾシンではサルがこれらの薬物に身体依存の状態にあるときは,ないときよりもレバー押し最終比が大きくなること,すなわち強化効果の増強がみられることが明らかになった.この増強はジヒドロコデインで最も顕著にみられ,ペンタゾシンではジヒドロコデインやモルヒネの場合よりも弱かった.身体依存の強さとの関係では,ジヒドロコデインで比率累進試験開始前に同薬の3日間または2週間反復強制投与の前処置を施した場合の比較で2週間前処置のときの方が3日間前処置したときより明らかに大きな最終比が得られ,またモルヒネでも同様な結果が得られたことから,身体依存の強さは強化効果増強の程度に影響し,ある範囲内では両者は正に相関するであろうことが示唆された.しかし同時に,身体依存が強く形成された重度の退薬症候が発現される場合にはレバー押し行動は障害され,薬物欲求の強さがレバー押し最終比に正しく反映されていないと考えられる場合もあることが示唆された.ペントバルビタールでは退薬症候は認められたが,退薬症候に基づくレバー押し行動の障害があったことが考えられるので強化効果の増強の有無については結論は得られなかった.薬物弁別実験ではモルヒネの効果はコカインおよびペンタゾシンに般化された.アカゲザルでの薬物静脈内自己投与法による比率累進実験において、昨年度はモルヒネ(M)処理により身体依存が形成されると最終比率が増大することから、Mの強化効果が増強されることを示唆する結果を得た。しかし身体依存の強さと最終比率との関係は明らかにできなかったので、今年度は実験条件を検討してMの単位用量を昨年の2倍の0.25mg/kg/inj.,Mの前処置用量を昨年の1/2の1および4mg/kg/dayとし、比率累進実験期間を前処置終了後48時間から開始することにした。実験は1頭あたり6試行として、最初と最後のセッションでは生理食塩水(S)前処置後にS摂取を行わせ、2番目と5番目はS前処置後にMを摂取させる試行、3番目と4番目はM低用量前処置後にMを摂取させる試行とM高用量前処置後にMを摂取させる試行のいずれかを2頭ずつ順番を入れ替えた。その結果、M前処置により身体依存が形成されると最終比率が増大することは明らかになった。現在のところ今回の実験に用いたM前処置の用量と最終比率との間には一定の相関はみられていない。Mの自覚効果に関する実験では、まずMとSの弁別行動形成を試みた。サルのケージ内に左右2個の砂糖水提示用の受皿を取りつけた。M0.5mg/kg皮下投与した実験日には投与15分後に左右2個の受皿のうち一方(M側)への10回毎の接触反応に、またSを皮下投与した実験日には他方(S側)への同様の反応にそれぞれ砂糖水を与えた。

このような条件下で反復訓練を行ったところ、4頭中3頭のサルでM投与後にはM側の、S投与後にはS側の反応のみが観察され、Mの弁別行動が形成された。そこでこれらのサルにコカインやペンタゾシンを投与したところ、サルはいずれもM側の反応を行い、Mの自覚効果は上記の2薬物に類似していることが示唆された。
イノラートを用いた機能性多環化合物の精密有機合成

イノラートと炭素炭素多重結合との環化付加反応について検討した。その結果、ベンザインとイノラートを反応させることで新規トリプル環化が進行しトリプチセンを合成することができた。さらに、3ーメトキシベンザインを用いることで酸素官能基が片面に揃ったトリプチセンが位置選択的に得られた。本研究過程で、不均一系金属触媒を用いた芳香族化合物の空気中酸化カップリング反応を見出した。イノラートを用いた連続反応を鍵反応とするステモナミンの不斉全合成に成功した。イノラートとベンザインとのトリプル環化付加反応による9ーヒドロキシトリプチセンの合成について検討した。ベンザインの生成法ではリチウムハロゲン交換法ではトリプチセンの収率は30%前後にとどまった。副生するブロモブタン由来の副生成物等が収率低下の原因と考えられたので、フッ化ベンゼンを原料とするオルトリチオ化法に変えたところ、収率は40%前後と若干改善された。次にmーフルオロアニソールを原料とするベンザインをイノラートと反応させたところシン置換トリプチセンが最高69%で選択的に得られた。酸素置換基による誘起効果によりレジオ選択的な付加反応が進行したと考えられる。そこでイノラートのアルキル置換基を種々変換したところ、嵩高いイソプロピル基やフェニル基でもトリプチセンが得られた。しかしtーブチル基では反応は進行しなかった。イノラートの特性を活用したステモナミンの合成研究を行った。原料となる不斉4級炭素を含むBoc-プロリン誘導体の合成では、文献記載の方法では大量合成での収率の再現性に問題があったため改良を施し、特にクエン酸による中和が特に効果的であることが分かった。光学活性ヒドロキシラクトンの原料にLーリンゴ酸およびDーリンゴ酸を用いて分子内アシル置換反応による7員環合成を試みた。Lーリンゴ酸の場合、環化させたときヘミアセタール構造となり開環のために工程数が余分にかかったが、Dーリンゴ酸ではヘミアセタールが開環しヒドロキシラクタムが直接得られた。ベンザインとイノラートとの3連続付加環化反応によるトリプチセンの合成に関してフローマイクロリアクターを用いて反応の時空間制御を検討した。予め調製したイノラートとベンザイン前駆体の混合溶液とアルキルリチウム溶液をシリンジポンプで送液し、マイクロミキサー内で混合、生じた混合物をNMRで分析しトリプチセンの収量を算出した。ベンザイン前駆体としてジハロベンゼンを用いた場合、0度、反応時間10秒で約30%の収率でトリプチセンを得ることができ、この結果はバッチ反応の結果(収率25%)よりも高収率であった。副生成物にアルキルリチウムとベンザインとの付加成績体が多く含まれていた。そこで次にアリールボロン酸エステルをベンザイン前駆体として検討した。まず、アリールボロン酸とブチルリチウムを送液しー78度で第2のマイクロミキサー内で混合し、約1分後に予め調製したイノラート溶液とをマイクロミキサー内で混合しトリプチセンをフロー合成した。詳細に実験条件を検討したところ、第2のマイクロミキサーでの混合温度を40度に設定した場合、最高33%でトリプチセンを単離することに成功した。フローマイクロリアクターでのトリプチセンの合成の特徴は副生成物の種類が格段に減少したことにある。バッチ反応では複雑な副生成物が生成し、トリプチセンの精製が極めて煩雑であったが、この方法により精製が容易となった。ステモナミンの全合成研究において鍵中間体の合成を精力的に行い、量的合成を達成した。その後の予備試験においてD環の構築を検討し、微量ではあるが全合成を達成した。フローリアクターによるトリプチセンの合成に関しては、バッチ反応と同等もしくはそれ以上の収率を達成し、副生成物の抑制にも成功したので、ほぼ順調に進展したと考えている。ステモナミンの全合成に関しては、鍵中間体の合成に多少手間取り、予定より時間がかかったものの、全合成に達した。イノラートとアラインとのトリプル環化反応による9ーヒドロキシ置換トリプチセンの合成と変換反応について検討した。3つのメトキシ基がシン配置となったトリプチセン(平成26年度報告済み)の9位水酸基をメチル化したところ、有機溶媒に対する溶解性が向上し精製が容易になった。2,7,14位にフッ素を導入したトリプチセンの合成にも成功した。そこからオルトリチオ化でトリプチセンアラインの生成を試みたが成功しなかった。しかし、フッ素のオルト位をヨウ素化したのちリチウムハロゲン交換で試みたところ、トリプチセンアラインの生成に成功した。この成果は今後、トリプチセンの環拡張に有効である。3ートリメチルシリルベンザインとイノラートとのトリプル環化付加を試みたところ、トリプチセンの生成に成功し、エックス線結晶解析からトリメチルシリル基が同一面に配置されたシン置換であること、立体障害のためベンゼン環に歪が生じていることが判明した。この歪エネルギーを駆動力として様々な変換反応を試みた。その結果、トリメチルシリル基のハロゲン置換反応においては一つ目のハロゲンの導入が速く、2つ目3つ目は順次遅くなることが分かった。この結果を利用して、1ーブロモー8ークロロー18ーヨードトリプチセンの合成にも成功した。この化合物はキラリティーを有していることから、キラルトリプチセンの原料として有用である。このトリストリメチルシリルトリプチセンを塩基処理をすることで脱シリルプロトン化反応が進行した。

これは9位の水酸基とシリル基がファンデルワールス半径内に接近しているため、5配位状態になっているためと考えられる。イノラートの特性を利用したステモナミンの不斉全合成に初めて成功した。これまではラクタムカルボニルの隣接位の脱酸素反応に6工程を要していたが、今回、ハロゲン化ー還元法を適用することで2工程に短縮することができたイノラートと炭素炭素多重結合との環化付加反応について検討した。その結果、ベンザインとイノラートを反応させることで新規トリプル環化が進行しトリプチセンを合成することができた。さらに、3ーメトキシベンザインを用いることで酸素官能基が片面に揃ったトリプチセンが位置選択的に得られた。本研究過程で、不均一系金属触媒を用いた芳香族化合物の空気中酸化カップリング反応を見出した。イノラートを用いた連続反応を鍵反応とするステモナミンの不斉全合成に成功した。イノラートとベンザインのトリプル付加環化反応の条件を詳細に検討し60%程度まで挙げることができた。また非対称ベンザインへの選択的付加も見出した。以上の成果はイノラートと炭素炭素多重結合との付加環化の初めての例であるとともに、その可能性を拡大した点で順調な研究進展と考えた。またステモナミンの合成に関しては原料の大量合成法の目途をつけることができた。全合成の達成が近づいたと考えられ、研究の進展度合いは順調と見なされる。トリプチセンの合成に関しては、官能基化したベンザインを用いて反応を検討し、官能基化トリプチセンの合成を行う。ステモナミンの合成に関しては、合成工程の短縮および最終生成物の光学純度の決定及び光学的安定性の検証を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。有機合成化学9-ヒドロキシトリプチセンの合成の展開を図る。多様なベンザインを基質として本反応の適用限界を探る。フローリアクターを用いた合成も検討し、ベンゾシクロブテノンやアントラセノール中間体の捕捉や、収率の改善を図る。ステモナミンのエナンチオ選択的全合成の達成を目指す。ABC環の構築は既定方針通りに進める。D環の構築はβーケトエステルの酸化方法を検討する。合成研究過程で中間体合成の再現性が取れないという予想外の事態が生じたためその解決に時間を要し、経費のかかる次の合成過程が次年度に持ち越されたことが主な理由である。機器のメンテナンスに伴う消耗品の購入を先延ばしにしたことで、本年度よりも次年度により経費が必要となることが最大の理由である。また少量の消耗品を用いる先端実験を前倒しで行い、大量の試薬を用いる原料合成実験を後ろ倒しにしたことも一因である。主に試薬や汎用器具などの消耗品に使用する。研究の進展を加速させるために研究補助員を臨時に雇用すること、先延ばしにした機器のメンテナンスに伴う消耗品の購入、大量合成のための試薬購入に充てる。
アミオダロンの血清リポタンパク質への分布を考慮した副作用モニタリング法の構築

アミオダロンを用いた不整脈治療では、間質性肺炎などの致死的な心外性副作用の発現により治療の継続がしばしば困難となる。しかし、アミオダロンの副作用は血清中総濃度(結合型+非結合型)との関連性が乏しく、その予測は難しい。アミオダロンは血清リポタンパク質に分布するため、その分布と副作用との関連性について検討し、アミオダロンの血清脂質への分布を考慮した効果的な副作用モニタリング法を構築する。
水中高周波プラズマによる金属ナノ粒子の生成とその構造化

水中高周波プラズマを利用して、金を中心としたナノ粒子生成を行った。プラズマの発生法式は2つあり、電極直上と電極から離れた絶縁板の貫通孔内である。また、ナノ粒子の生成法は金属イオンの還元と電極スパッタである。いずれの場合も、生成物は水溶液中の塩の種類と濃度に依存する。これらの制御により、金ナノワイヤーや金五角形粒子の生成が確認された。絶縁板の貫通孔内にプラズマを発生させる場合には、電極由来の金属混入がないことが特徴である。この方式では有限要素法より、プラズマの発生に気泡の生成が重要な要素となっていることが明らかとなった。水中高周波プラズマにより金を中心とした金属ナノ粒子の生成を行う。水中高周波プラズマとは水中に挿入された電極に高周波(13.56MHz)を印加し、電極上に発生した気泡の中にプラズマを発生させる技術である。26年度は電極のスパッタを利用した金ナノ粒子の生成を中心に研究を行った。ここでは、水に種々の物質を高濃度で溶かしても水中プラズマを発生させることができる特長を利用する。研究の最初の段階として、金単体のナノ粒子の形状や粒径の制御を試みた。併せて、電極スパッタによる鉄のナノ粒子作製を試み、磁性ナノ粒子の作製が可能であることを明らかにした。1)金ナノ粒子の生成:NaCl水溶液を中心に、ナノ粒子の作製を行った。電気伝導率が200mS/m付近で多角形粒子(三角形や五角形、六角形)が生成されることが明らかとなった。20mS/m未満では多角形粒子が生成できないことや200mS/mを超えると、粒子の生成が困難になることが明らかとなった。また、臭化物イオンの存在下でも同様の結果が得られ、硫酸イオンでは多角形粒子は得られていない。陰イオンがキーとなっていることが明らかである。2)鉄ナノ粒子の生成:金と同様、電極スパッタによるナノ粒子生成である。従来は純水中を中心に実験を行ったが、電極が腐食されてしまい、長時間の放電維持が困難であった。今回は、アルカリ下で実験を行うことで、磁性を有するナノ粒子の作製に成功した。組成分析などは今後の課題である。3)金ナノワイヤーの生成:金イオンを有する水溶液中で、水中高周波プラズマを発生させたところ、金ナノワイヤーの生成が確認された。詳細は今後の課題である。4)新方式に関する研究:電極から離れた位置での水中プラズマ発生に関し、純水中でのプラズマ発生を可能にした。27年度は電極のスパッタをはじめ、金イオン還元にも取り組んだ。1)金ナノ粒子の生成:金電極スパッタによる。基礎を固めるべく、ナノ粒子生成前後の電極先端部の変化を実体顕微鏡により観察した。電気伝導が小さい水溶液では電極先端部の溶解はあきらかで、電気伝導の大きい水溶液では電極の損傷は小さい。これらのことから、電気伝導の変化によって電極先端部に加わる高周波の損失が違い、それによってナノ粒子の生成量に変化が起きていることが明らかとなった。その他、エタノール水溶液を利用したナノ粒子生成にも取り組んだが、期待された炭素結合型の粒子は発見されなかった。2)鉄ナノ粒子の生成:電極スパッタによる鉄ナノ粒子の作製であり、本年度は組成の分析にも取り組んだ。EDSから鉄酸化物であることが分かっていたが、電子線回折から主にマグネタイトであることが明らかとなった。これらの組成はpHには依存しない。3)金ナノワイヤーの生成:金イオンのプラズマ還元による。プラズマのない状態でスパッタされた金属と過酸化水素による還元が観測されたため、電極金属の選定を行った。その結果、Zrが最適であることが分かった。4)新方式に関する研究:2つの電極を絶縁板で分離し、絶縁板に貫通孔を設けることで、貫通孔に水中プラズマ発生させることができる。有限要素法を用いて、計算した結果、貫通孔に生じる気泡がキーとなっており、純水(0.2mS/m)においても食塩水(7S/m)においても気泡の側面部の電場強度が強くなることが明らかとなった。水中高周波プラズマにより金を中心とした金属ナノ粒子の生成を試みた。26年度は電極のスパッタを利用した金ナノ粒子の生成の他、磁性を含む粒子(鉄)を対象として研究を行った。1)金ナノ粒子の生成:電極スパッタによる方法。26年度はNaCl水溶液を中心に、ナノ粒子の作製を行い、イオン濃度に対する生成物の形状や粒径、生成量の依存性といった基礎的な事項について研究を行った。陰イオンがキーとなっていることを明らかになっている。27年度は基礎を固めるべく、ナノ粒子生成前後の電極先端部の変化を実体顕微鏡により観察した。水の電気伝導率のよって、電極の損傷が大きく異なり、ナノ粒子の生成量の違いの一因となっている。2)金ナノワイヤーの生成:金イオンを有する水溶液中で、水中高周波プラズマを発生させたところ、金ナノワイヤーの生成が確認され、最適な電極材料が選定された。3)磁性ナノ粒子の生成: 26年度には、鉄電極スパッタによるナノ粒子生成において、磁性を有するナノ粒子の作製が確認された。

27年度はEDSから鉄酸化物であることが分かっていたが、電子線回折から主にマグネタイトであることが明らかとなった。4)新方式に関する研究:2つの電極を絶縁板で分離し、絶縁板に貫通孔を設けることで、貫通孔に水中プラズマ発生させることができる。純水(0.2mS/m)から食塩水(20S/m)の範囲でプラズマの発生が可能。この方法でも金イオンを有する水溶液の還元により、ナノ粒子生成が可能であることが確認された。純水においても食塩水においても気泡の側面部の電場強度が強くなることが明らかとなった。水中高周波プラズマを利用した金属ナノ粒子の生成に取り組んだ。水中高周波プラズマとは水中に電極を挿入し、高周波(13.56MHz)を印加することで、発生するプラズマである。電極スパッタ法とイオン還元法の両方を試みている。また、プラズマの発生についても、電極直上に発生させる方法と電極から離れた位置での発生の二種類がある。1)イオン還元法(電極直上):金イオンを還元する。金ナノワイヤーの成長と金イオン濃度の関係が調べられ、金イオンの減少とともにワイヤーの成長が止まることが確認された。2)イオン還元法(電極から離れたタイプ):電極間に絶縁板を配し、貫通孔を設けることで、その位置にプラズマを発生させる。この方式では電極材料が水中に溶出しないため、プラズマプロセス以外でのナノ粒子生成は起こらない。様々な塩を溶解し、金ナノ粒子の生成を試みた結果、食塩ではよく見られる多角形が得られたが、ミョウバンでは1nm程度の微細ナノ粒子を得ることができた。また、本方式において、透明の絶縁板を用いることで、プラズマ発生時の気泡形状やプラズマ発生位置を明らかにした。特に、気泡形状が明らかになったことで、プラズマ発生の定量的な検討に入ることが可能となった。3)電極スパッタ法:電極をスパッタすることで、ナノ粒子を作る方法である。金電極に対して、電気伝導率の変化に伴うプラズマ発生後の電極形状の変化が観測され、電気伝導率の低い場合に、電極の損傷が大きく、金の析出が多いことが明らかとなった。また、これまでに試みられてこなかったPt電極も利用され、析出量は少ないもの、ナノ粒子が生成可能であることが明らかとなった。水中高周波プラズマを利用して、金を中心としたナノ粒子生成を行った。プラズマの発生法式は2つあり、電極直上と電極から離れた絶縁板の貫通孔内である。また、ナノ粒子の生成法は金属イオンの還元と電極スパッタである。いずれの場合も、生成物は水溶液中の塩の種類と濃度に依存する。これらの制御により、金ナノワイヤーや金五角形粒子の生成が確認された。絶縁板の貫通孔内にプラズマを発生させる場合には、電極由来の金属混入がないことが特徴である。この方式では有限要素法より、プラズマの発生に気泡の生成が重要な要素となっていることが明らかとなった。水中高周波プラズマにより金を中心とした金属ナノ粒子の生成を試みた。26年度は電極のスパッタを利用した金ナノ粒子の生成の他、磁性を含む粒子(鉄)を対象として研究を行った。1)金ナノ粒子の生成:NaCl水溶液を中心に、ナノ粒子の作製を行い、イオン濃度(あるいは電気伝導率)に対する生成物の形状や粒径、生成量の依存性といった基礎的な事項について研究を行った。
環境要因と小学校教師の英語教師としての特徴：望ましい小学校英語教育の構築に向けて

本研究の目的は,小学校外国語活動に取り組んでいる小学校教師の内面を環境要因との関連において知ることである。それにより、望ましい小学校英語教育の構築のための方策を検討し,それにつながる英語教育全体への貢献することを目指している。そのために,日本における小学校教師の認知面,感情面,行動面に関して,彼らをとりまく地域環境要因とのかかわりにおいて,質問紙調査による量的研究とインタビューやグループ討議による質的研究を混合して用いて課題の解決を図っている。研究の1年目にあたる2017年は主にデータの収集を行った。具体的には北海道内の地域環境の違いに注目し,それらの地域の教師たちに対する質問紙調査と教師によるグループ討議を実施した。その際、比較データとして用いるため、webによる調査も行い全国的なデータも収集した。研究の2年目にあたる2018年は、主にそれらのデータの分析に時間をかけてきた。特に質的分析は複数の研究者間で議論して進めているため、多くの時間を擁している。分析の結果、グループ討議により環境の違いによる教師の特徴の違いを明らかにしたものは学会での口頭発表をするとともに、すでに論文化し、現在査読の結果を待っているところである。また、質問紙調査の結果を量的に分析したものもまた、学会での口頭発表を行い、現在投稿準備中である。それ以外に、本年度は本研究から得られた情報を適用し、「望ましい小学校英語教育の実現を目指す」というテーマのもと、各地で開催されている教員の研究会において、現場の教師に向けての講演を行ってきた。研究の2年目にあたる2018年は、主に前年度に収集したデータの分析を行った。その結果は学会で発表するとともに、2つの論文として纏めることができた。一つは、異なった環境にある教師にグループ討議を実施し、環境の違いによる教師の特徴の違いを質的に分析した。その結果、小学校教師に共有されている指導観とともに、グループによっていくつかの特徴的な傾向が見いだされ、それらを環境要因とのかかわりにおいて考察した。その結果は学会で口頭発表するとともに、論文化して学会誌に投稿済みであり、現在査読の結果待ちである。また、もう一つの質問紙調査による調査においては、筆者らによる2012年度のデータと、それと同じ質問紙によって得た2017年度のデータを比較することによって、この5年間で教師にどのような変化が見られるのかを分析した。分析の結果、5年というスパンでは全体としては大きな変化は見られないものの、英語指導経験の有無、担当学年、英語力の違い等といった教師の属性の違いに注目することで見られた幾つかの特徴が見られた。その結果は学会で口頭発表し、現在論文投稿準部中である。本研究を遂行していく中で、北海道という地域の教師に見られる特徴を明らかにするという新たな課題が浮かび上がった。先日の文部科学省による「英語教育実施状況調査」において、札幌市を除く道内の中3の英語力が都道府県内で最下位となっている。北海道における小学校教師の内面を他の地域との比較において知ることは学習者としての特徴の一面を知ることにつながり、彼らが今後英語教育を担当していくことを考えると、今後の英語教育の課題や可能性を探る一助となるものと考える。今後は、新たなデータの収集と分析を進め、そこから得られた知見から「小学校英語教育の早期化・教科化」への望ましい対応について、教師の視点から提言をしていく。本研究の目的は、小学校英語教育に取り組んでいる小学校教師の内面を環境要因との関連において知ることにより、望ましい小学校英語教育の構築のための方策を検討し、それにつながる英語教育全体へ貢献することである。具体的には、小学校教師の言語教師としての認知の特徴と教師をとりまく地域環境との関連を解明し、それによって現在一律に進められようとしている小学校英語教育の早期化・教科化により詳細で柔軟な視点を持ち込むための考察を目的とした基礎研究を目指している。課題解決のために、小学校教師の認知面(学習者ビリーフ及び指導観)、感情面(外国語学習動機及び国際的志向性)、行動面(授業実践及び専門性向上のための学び)に関して、彼らをとりまく地域環境要因とのかかわりにおいて、量的研究と質的研究を混合して用いることにより解明する。研究の1年目である本年度は、主にデータの収集を行ってきた。北海道内の特色のある地域を抽出し、郵送により質問紙調査への依頼をするとともに、比較データとするため全国の教師を対象としてインターネットによる調査を実施した。地域環境に関しては、これまでデータがなかった道北と道東地区からのデータを得ることができた。結果として359のデータを得て、現在分析中である。質的データとしては、本年度はまだ1地域のみであるが、グループ討議を実施した。ここでのグループ討議とは、特定のテーマについて参加者同士が自由に考えを述べあうものであるが、この手法は研究の対象者の本音や素直な意識を引き出すことができると考えられている。発言内容の文字化し、教師の認知がもつ複雑性、文脈性を理解し、その背景にある要因を明らかにするべく、発言の内容をカテゴリー化して分析をしてきた。今後は他の地域においても同様な調査を行う予定である。本年度は、予定していたインターネットと郵送による質問紙による調査を実施した。また、グループ討議による質的データの収集も1地域のみであったが実施した。今年度はこれらのデータの分析に多くの時間を費やしてきた。

それにより、望ましい小学校英語教育の構築のための方策を検討し,それにつながる英語教育全体への貢献することを目指している。そのために,日本における小学校教師の認知面,感情面,行動面に関して,彼らをとりまく地域環境要因とのかかわりにおいて,質問紙調査による量的研究とインタビューやグループ討議による質的研究を混合して用いて課題の解決を図っている。研究の1年目にあたる2017年は主にデータの収集を行った。具体的には北海道内の地域環境の違いに注目し,それらの地域の教師たちに対する質問紙調査と教師によるグループ討議を実施した。その際、比較データとして用いるため、webによる調査も行い全国的なデータも収集した。研究の2年目にあたる2018年は、主にそれらのデータの分析に時間をかけてきた。特に質的分析は複数の研究者間で議論して進めているため、多くの時間を擁している。分析の結果、グループ討議により環境の違いによる教師の特徴の違いを明らかにしたものは学会での口頭発表をするとともに、すでに論文化し、現在査読の結果を待っているところである。また、質問紙調査の結果を量的に分析したものもまた、学会での口頭発表を行い、現在投稿準備中である。それ以外に、本年度は本研究から得られた情報を適用し、「望ましい小学校英語教育の実現を目指す」というテーマのもと、各地で開催されている教員の研究会において、現場の教師に向けての講演を行ってきた。研究の2年目にあたる2018年は、主に前年度に収集したデータの分析を行った。その結果は学会で発表するとともに、2つの論文として纏めることができた。一つは、異なった環境にある教師にグループ討議を実施し、環境の違いによる教師の特徴の違いを質的に分析した。その結果、小学校教師に共有されている指導観とともに、グループによっていくつかの特徴的な傾向が見いだされ、それらを環境要因とのかかわりにおいて考察した。その結果は学会で口頭発表するとともに、論文化して学会誌に投稿済みであり、現在査読の結果待ちである。また、もう一つの質問紙調査による調査においては、筆者らによる2012年度のデータと、それと同じ質問紙によって得た2017年度のデータを比較することによって、この5年間で教師にどのような変化が見られるのかを分析した。分析の結果、5年というスパンでは全体としては大きな変化は見られないものの、英語指導経験の有無、担当学年、英語力の違い等といった教師の属性の違いに注目することで見られた幾つかの特徴が見られた。その結果は学会で口頭発表し、現在論文投稿準部中である。今後は本年度に得られたデータの分析をすすめるとともに、そこから得られた知見を補完し、さらに深い理解を得るための質的データの収集を継続して行う。分析の結果は、国内外の学会にて口頭発表するとともに、国内外の権威ある学会誌よる発表を目指す。さらには研究結果の分析のみならず、そこから得られた知見から、小学校英語教育の早期化・教科化に向けての望ましい教師教育の在り方について具体的な策を提言していく。
原始的な花粉媒介システムの解明とその応用に関する研究

被子植物の中で比較的原始的とされるバンレイシ科の果樹アテモヤを材料として、甲虫類を花粉媒介者として利用するための調査・実験を行った。石垣島の農家の畑においてはカタベニデオキスイ、クリイロデオキスイが高密度で訪花していた。しかし、沖縄本島で優占しているキイロチビヒラタケシキスイは見られなかった。一方三重県の畑ではハネカクシ科の二種の甲虫が訪花者の大半を占めていた。これらケシキスイ、ハネカクシは少数の花に集中して訪花する傾向があった。実際に甲虫の働きを人工受粉のかわりに利用できるか否かを調べるために、網で覆ったアテモヤを用意し、訪花していたクリイロデオキスイおよびカタベニデオキスイを実験室内で増殖したものを網の中に大量放飼した。しかし、いずれの虫の場合も訪花数、結実数ともに少なく、実用化にはまだ解決せねばならない問題がいくつかあると考えられた。特に、大量飼育した虫は花への選好性が低い傾向があり、これが訪花数の低下につながったと考えられる。一方、大量放飼した虫を含め、花に訪花した虫の行動を長時間ビデオ撮影して明らかにした。その結果、訪花者のうちハネカクシ類は滞在時間が30分から3時間程度と短く、約24時間の雌性先熟を示すアテモヤの花の花粉媒介者として好適な行動をとっていないことが確認された。一方でケシキスイ類は♀ステージの段階で訪花し、♂ステージなってから花を去ることが多く、花粉を運搬するのに適した行動を見せた。さらに、体表の花粉付着率もケシキスイで大きく、ハネカクシでは小さかった。このように、現時点では花粉媒介者としての利用が困難ではあるが、ケシキスイ類にはその潜在的な可能性があると考えられた。被子植物の中で比較的原始的な分類群に属する果樹チェリモヤとアテモヤを用い、その訪花昆虫相の解明を進めると共に、いくつかの種の花粉媒介能力を実験的に推定した。さらに、訪花行動の理解の基礎として、花の誘引力を実験的に調べた。これまでに得た標本も合わせ、マイクロスコープを用いて同定を行った。確認された訪花者は903個体におよび、そのうち302個体がハネカクシ科に属しており、この科の占める割合が最も大きかった。次にケシキスイ科が243個体、ヒメマキムシ科が224個体となった。全部で、44種の節足動物が確認され、その95%以上が昆虫綱コウチュウ目に属していた。本年度の現地調査は、おもに三重県御浜町および沖緯県名護市で栽培されているアテモヤを対象として行った。これらの場所での優占的な訪花者は、前者ではPhloeonomus属およびAleocbarinae亜科のハネカクシ、後者ではキイロチビヒラタケシキスイであった。これら以外の訪花者は少なく、両調査地とも訪花者の多様性は低かった。また、場所により訪花者群集が大きく異なることは、この植物が特定の昆虫と強固な関係を築いて花粉媒介を行わせるのではなく、日和見的な戦略をとっていることを示唆している。室内で増殖したモンチビヒラタケシキスイとクリイロデオキスイ(いずれもケシキスイ科)に花粉を付着させた後に、雌ステージの花に網をかけた中に放飼し、種子がいくつ得られるのかを調べたところ、クリイロデオキスイはモンチビヒラタケシキスイと比べて花粉媒介能力が高いことが示唆された。しかし、15匹を放飼した場合でも平均種子数は5個に過ぎず、人工受粉の35個と比べて不十分であることは明らかであった。T字型およびY字型の簡単な風洞装置を用いてモンチビヒラタケシキスイおよびクリイロデオキスイが花への選好性を持っていることが確かめられたが、いずれの部位に誘引されるのかはサンプル数が少なく有意な結果が得られなかった。被子植物の中で比較的原始的な分類群に属する果樹アテモヤを主に用い、訪花昆虫相と果実食昆虫相の比較を野外にて行うと共に、モンチビヒラタケシキスイおよびクリイロデオキスイの花粉媒介能力を実験的に推定した。野外比較調査は三重県御浜町および沖縄県名護市で栽培されているアテモヤを対象として行ったが、沖縄県恩納村でも訪花者の調査を行った。これらの場所での優占的な訪花者は、御浜では2種のハネカクシ、名護ではキイロチビヒラタケシキスイであった。恩納ではキイロチビヒラタケシキスイの他様々な甲虫が得られた。果実食昆虫は訪花者より多様な群集構成を示し、モンチビヒラタケシキスイ、クリイロデオキスイなどが果実で多く見られる一方で花では少なかった。しかし、2種のハネカクシャキイロチビヒラタケシキスイは果実食昆虫群集でも多く見られ、アテモヤの訪花者はその地域の果実食者群集の部分集合的存在であることが解明された。御浜において計169の花に網掛け処理を施し、甲虫を閉じこめて花粉媒介能力を確認しようとしたが、種子数を数えられるまで十分に果実が肥大したものはわずかに17で、しかもそのうちの7が人工受粉区であり、種子数に関しては得られたデータを解析に供することが出来なかった。網掛け後の甲虫の生存率はクリイロデオキスイで極めて高く、モンチビヒラタケシキスイに勝っていた。

もっとも、回収時に花粉の付着した個体が一頭でもいた割合には2種の間で有意な違いはなかった。ただし、虫の密度が高い方が花粉の付着している個体が見つかる可能性が高かったので、高密度で放飼することで死亡率の高さを補うことは可能かもしれない。花粉発芽率を御浜で調べたところ、ビニールハウス内と恒温室でほぼ同じで、6月下旬に最大値を示した。とはいえ、それでも25%ほどで、十分な発芽率とは言えないように思われる。名護では花粉が発芽しなかった。被子植物の中で比較的原始的とされるバンレイシ科の果樹アテモヤを材料として、甲虫類を花粉媒介者として利用するための調査・実験を行った。石垣島の農家の畑においてはカタベニデオキスイ、クリイロデオキスイが高密度で訪花していた。しかし、沖縄本島で優占しているキイロチビヒラタケシキスイは見られなかった。一方三重県の畑ではハネカクシ科の二種の甲虫が訪花者の大半を占めていた。これらケシキスイ、ハネカクシは少数の花に集中して訪花する傾向があった。実際に甲虫の働きを人工受粉のかわりに利用できるか否かを調べるために、網で覆ったアテモヤを用意し、訪花していたクリイロデオキスイおよびカタベニデオキスイを実験室内で増殖したものを網の中に大量放飼した。しかし、いずれの虫の場合も訪花数、結実数ともに少なく、実用化にはまだ解決せねばならない問題がいくつかあると考えられた。特に、大量飼育した虫は花への選好性が低い傾向があり、これが訪花数の低下につながったと考えられる。一方、大量放飼した虫を含め、花に訪花した虫の行動を長時間ビデオ撮影して明らかにした。その結果、訪花者のうちハネカクシ類は滞在時間が30分から3時間程度と短く、約24時間の雌性先熟を示すアテモヤの花の花粉媒介者として好適な行動をとっていないことが確認された。一方でケシキスイ類は♀ステージの段階で訪花し、♂ステージなってから花を去ることが多く、花粉を運搬するのに適した行動を見せた。さらに、体表の花粉付着率もケシキスイで大きく、ハネカクシでは小さかった。このように、現時点では花粉媒介者としての利用が困難ではあるが、ケシキスイ類にはその潜在的な可能性があると考えられた。
ユニークな組織発現・細胞内局在を持つM1アミノペプチダーゼの生理機能の解明

M1アミノペプチダーゼファミリーは様々な生理現象に関与する多機能は酵素群である。11種類のヒトM1酵素のうち、脂肪細胞由来ロイシンアミノペプチダーゼ、白血球由来アルギニンアミノペプチダーゼは小胞体局在型酵素であり、またリーベリンは胎盤特異的な発現を示すユニークな酵素である。本研究では、これらM1酵素の機能発現メカニズムを解明するため、各酵素の基質特異性に関与するアミノ酸残基の同定や遺伝子発現あるいは細胞内局在性発揮の理解を目指した解析を行った。ヒトLaeverinの遺伝子発現調節機構を明らかにする目的で遺伝子レポーターアッセイ用プラスミドを構築した。HeLa細胞より抽出したゲノムDNAを鋳型として、PCR法によりヒトLaeverin遺伝子のプロモーター領域(約2000 base)を増幅し、レポータープラスミドpGL3 basicに挿入した。その後、制限酵素処理によってプロモーター領域に欠損を加えた種々のレポータープラスミドも作製した。次年度、これらを用いた細胞レベルの遺伝子発現解析を行う予定である。また、マウスおよびラットを用いたLaeverinの発現解析の結果、ヒトLaeverinに対する特異的抗体がネズミLaeverinタンパク質には交叉しないという結果が得られた。その原因として、ヒトとネズミLaeverin間の一次構造上の相同性の乏しさが考えられた。そこで、マウス胎盤より調製したmRNAからPCR法を用いてマウスLaeverin cDNAのクローニングを行った。その後、マウスLaeverin cDNAをバキュロウイルス発現用ベクターに挿入した。次年度、組換え型マウスLaeverin、次いで特異抗体の作製を行い、マウス胎盤組織を利用したLaeverinの発現解析などを行う予定である。ヒト脂肪細胞由来ロイシンアミノペプチダーゼ(A-LAP)の酵素活性発現に重要なアミノ酸残基を同定するため部位特異的変異導入法を用いて行った。その結果、ヒトA-LAPの181番目のグルタミンが本酵素の基質特異性発現に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。Laeverinは胎盤の絨毛膜外栄養細胞(EVT)に特異的に発現するM1アミノペプチダーゼである。これまでのリコンビナントLaeverinを用いた解析の結果、本酵素はアミノペプチダーゼ阻害剤であるベスタチンに高感受性のロイシンアミノペプチダーゼであり、他のM1アミノペプチダーゼとは異なる酵素学的性状を持つことを明らかにしてきた。そこで、本年度は、Laeverinの特異な酵素学的性状が如何に発現するかについて生化学的な解析を行った。M1アミノペプチダーゼファミリー各酵素の一次構造中には、基質ペプチドの認識に重要であるエキソペプチダーゼモチーフ(GAMEN配列)が存在する。ところが、ヒトLaeverinでは本モチーフを構成するGlyがHisべと分子進化の過程で置換されており、HAMEN配列となっている。そこでヒトLaeverinのHis-379残基の酵素活性発現における役割を、部位特異的変異導入法を用いて作製した変異体酵素を利用して解析した。その結果、Phe変異体ヒトLaeverinでは、野生型酵素の酵素学的性状との差異は認められなかったが、Gly変異体ヒトLaeverinでは、酵素触媒数・基質親和性の低下が認められ、その酵素触媒活性が著しく低下していた。また、ヒトLaeverinの良い基質であるEndokinin Cの分解活性やベスタチンに対する感受性においても、Gly変異体では著しく低下していた。これらの結果から、ヒトLaeverinのHis-379残基は本酵素の酵素学的性状の発現に極めて重要な役割を果たしていることが明らかとなった。さらに、コンピュータシミュレーションの結果、His-379残基のGly残基への置換はヒトLaeverinの酵素触媒ポケットの構造変化を生じ、その結果として著しい酵素学的性状変化が認められた可能性が強く示唆された。抗原生成小胞体アミノペプチダーゼ(A-LAP/ERAP-1およびL-RAP/ERAP-2)ならびにLaeverin/APQの酵素触媒作用の発現機構についてさらに詳細な解析を行った。これまでの解析の結果、ヒトA-LAP/ERAP-1のGln-181残基がS1ポケット内に存在しており、本酵素の基質特異性に関与していることを明らかにしている。そこで、ヒトLaeverin/APQについても、一次構造上、同一位置に存在するGln-238残基がその基質特異性に関与しているかどうかを、部位特異的変異導入法によって作製した変異体酵素を利用して解析した。その結果、Laeverin/APQのGln-238をAlaに置換した変異体(Q238A)では、中性アミノ酸遊離活性の消失、塩基性アミノ酸遊離活性の増大が認められ、その基質特異性は野生型酵素と比較して大きく変化していた。また、拮抗型アミノペプチダーゼ阻害剤であるベスタチンの感受性はQ238A変異体では大きく低下していたことから、Laeverin/APQのGln-238残基が本酵素の基質特異性に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。