hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肝臓免疫系細胞のビタミンD受容体による炎症及び代謝の調節機構

ビタミンD受容体(VDR)は、活性型ビタミンD3と胆汁酸であるリトコール酸に反応する。肝臓における免疫系細胞のVDRの解析を行った。胆汁鬱滞マウスにおける肝臓の代謝・炎症関連遺伝子の発現変化に対してVDRの役割は限定的であった。興味深いことにVDR欠損マウスの小腸では炎症反応が抑制されていた。VDR欠損マウスから単離した肝臓単核球の分析において、NK細胞及びiNKT細胞の増加を認めた。VDRの小腸-肝臓経路における役割が明らかになった。肝障害モデルマウスにおけるVDR欠損の影響を明らかにするために、VDR欠損マウスに総胆管結紮(BDL)を行い、血液生化学(血漿トランスアミナーゼ、ビリルビン、胆汁酸)、ELISAによる血漿炎症性サイトカインの定量、肝臓及びVDR発現臓器における胆汁酸関連遺伝子、サイトカインなどの炎症関連遺伝子の発現の解析を行った。BDLのコントロールは、開腹手術のみとした。野生型とVDR欠損マウスにそれぞれの手術操作を行い、計4群の比較を行った。1.BDLによって上昇する血漿ビリルビンは、野生型マウスよりもVDR欠損マウスの方が高値であった。直接ビリルビンがほとんどであった。野生型マウスに比較して、VDR欠損マウスでは、腎臓における生体異物排出担体MRP3の遺伝子発現が低下していた。MRP3は、肝臓におけるビリルビン排泄に関与すると報告されており、VDR欠損マウスの腎臓MRP3の発現低下が、血液中に蓄積した直接ビリルビンの尿中排泄障害を誘導すると示唆された。2.BDLは、小腸粘膜のIL-6のmRNA発現を誘導した。興味深いことに、VDR欠損マウスでは、このBDLによるIL-6発現上昇が見られなかった。血漿IL-6タンパク量も同様の変化であった。TNFαのmRNAは、VDR欠損マウスで若干低下したが、INFγの変化は無かった。肝臓でのサイトカインの発現変化は、ほとんどなかった。BDLにより、腸管への胆汁分泌が障害され、腸内細菌の異常増殖が起こると言われている。腸管-門脈-肝臓経路での炎症応答にVDRが関与していることを示唆しており、現在解析を進めている。1.肝障害モデルマウスの病態におけるVDRの役割を明らかにするため、VDR欠損マウスに総胆管結紮(BDL)を行い、野生型マウス及び開腹手術のみのコントロールを比較検討した。昨年度の研究で、BDLは野生型マウスにおいて血清IL-6濃度及び小腸IL-6遺伝子発現を増加させるが、VDR欠損マウスではこれらの増加が起こらないことを見いだした。解析を続けた結果、VDR欠損マウスからの単離マクロファージにおけるIL-6発現は、LPS刺激の有無にかかわらず亢進していること、VDR欠損マウスの小腸においてIL-6発現誘導性転写因子NK-κBを抑制するIkBαのタンパク発現が亢進していることを見いだした。VDR欠損マウスの腸管におけるIL-6の発現は、IkBαの発現増加などの代償的な制御機構により調節されており、BDLによる影響を受けにくくなっていることを示唆している。2.肝臓免疫系細胞の単離及び分析の予備実験を行った。マウス肝臓より単離したマクロファージの培養系において、活性型ビタミンD3はVDR標的遺伝子CYP24A1の発現を誘導した。一方、マウスに活性型ビタミンD3を投与した場合は、腎臓CYP24A1の発現は増加したが、肝臓組織及び肝臓由来単離マクロファージでのCYP24A1の発現増加は認めなかった。肝臓マクロファージのビタミンD応答性がin vivoとin vitroでは異なるということは、肝臓マクロファージと肝細胞などの周辺の細胞・組織との相互作用の存在を示唆している。次年度は、病態モデルにおいて、VDR欠損マウスと野生型マウスとの比較解析を予定している。1.肝障害モデルマウスの病態におけるビタミンD受容体(VDR)の役割を明らかにするため、総胆管結紮(BDL)による胆汁鬱滞モデルの解析を行い、昨年度までに肝臓における炎症・代謝関連の遺伝子発現におけるVDRの影響は限定的であること、VDR欠損マウスの下部小腸においてNK-κBを抑制するIkBαの発現が増加しており、BDLによるインターロイキン-6の遺伝子発現が抑制されていることなどを見出していた。これらの知見を原著論文として報告した(Ishizawa et al., PLoS ONE 2012)。2.肝臓免疫系細胞の解析を進めた。活性型ビタミンD3は、Kupffer細胞を含む肝臓単核球におけるリポポリサッカライド依存性のTNF、IL-12p40、IL-6遺伝子の発現誘導を抑制しなかった。これまでの報告と異なる結果であり、薬剤の濃度や処理時間などの実験条件のさらなる検討が必要と考えている。

野生型マウスとVDR欠損マウスとの比較において、肝臓単核球におけるKupffer細胞、T細胞、B細胞の数に差は認めなかった。VDR欠損マウスにおいて、NKT細胞、iNKT細胞が増加していた。NK細胞の数には差はなかったが、VDR欠損マウスにおいてCD69陽性の活性化NK細胞が増加していた。3.以上の結果と、VDRが肝臓よりも腸管に多く発現していること、活性型ビタミンD3投与による標的遺伝子変化は、肝臓よりも腸管においてより顕著に見られること、非ビタミンD性のVDRリガンドであるリトコール酸は腸内細菌によって産生されるがほとんど吸収されないことなどの知見からVDRの腸管機能の解析へ発展させた。ビタミンDの作用部位は上部腸管であるがリトコール酸は下部腸管であることを見出した。VDRを介する腸管・肝臓の免疫と代謝調節といった今後の研究に発展させる予定である。BDLにおける小腸のIL-6発現に関する結果が予想外であったため、メカニズムの解明にあたり、VDR欠損マウスの調製と解析に時間がかかった。しかし、実績欄に記載した通りの結果を得ることができ、現在論文準備中である。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、BDL以外の肝障害マウスモデルにおけるビタミンD投与の炎症及び代謝に対する影響とVDR欠損マウスにおける肝臓免疫系細胞の解析を中心に研究を行う予定である。
ＣＶＤ法・環化反応によるｎ型有機半導体ナノロッド形成技術の開発と太陽電池応用

n型有機半導体であるオクタシアノ金属フタロシアニン(MPc(CN)8)のナノロッドを有機薄膜太陽電池に応用するために、金属極薄膜上での化学気相成長(CVD)法によるテトラシアノベンゼン(TCNB)の環化反応を検討した。原料TCNBの蒸発・昇華過程に着目し、大気圧から真空下でのTCNBの熱物性の測定を行った。銅(Cu)、鉄(Fe)、ニッケル(Ni)の極薄膜(6nm)上での気固相反応により、それぞれの金属を中心金属とするMPc(CN)8が生成しロッドが形成された。金属種により、生成量、ロッド成長に違いが見られ、Cu極薄膜上で高密度かつ均一なロッドを作製することができた。今年度は、新規反応装置作製のための基礎データの収集として、CVD法で用いる原料テトラシアノベンゼン(TCNB)の真空中での加熱蒸発・昇華過程を重量/示差熱(真空TG-DTA)分析により測定した。真空度1.5×10-3Pa大気圧での測定より、高真空になるほどTG曲線は低温側にシフトし、昇華開始温度は低下した。1.6×104Paより高真空では昇華に伴う吸熱のみを示し、その温度は高真空化とともに低下した。一方、大気圧および5.0×104Paでは融解および蒸発に起因する吸熱が見られ、真空度とともに蒸発温度は変化するのに対し、融解温度はほぼ同じ温度を示した。これらの測定から反応容器で想定している真空度である数Paでは原料は溶解せず昇華することが明らかとなった。新規反応装置での測定の予備実験として封管中でのTCNBとKClとをの反応を行い、得られた生成物の分離・分析を行った。反応温度により、副生成物の生成が確認されたが、UV-Vis測定、およびFT-IR測定によりKClとTCNBの気固相反応で、オクタシアノフタロシアニン(OcPc)が生成していることが確認され、反応中のその場UV-Visスペクトル測定に向けて必要な吸収スペクトルの情報を得ることができた。またセルを自作し大気圧下でのTCNBとKClとの反応のその場UV-Visスペクトル測定を行った。反応速度論に則った解析により、TCNBとKCl蒸着基板との反応の活性化エネルギーを67.7 kJ/molと算出した。電極上へのナノロッドの生成に向け、メタルマスクを用いて作製したギャップ長25μmのAu櫛型電極上にCuを蒸着し、TCNBと封管中で300°Cで加熱反応後の電極上の生成物のSEM観察を行った。電極上にはCuとの反応によりロッド状のOcPcが観察されたが、ロッド長は長くCu蒸着量を含め反応条件の最適化が必要であると考えられた。今年度は昨年度作製した新規反応装置を用いて、テトラシアノベンゼン(TCNB)と金属蒸着膜との気固相反応を試みた。また電極上へのナノロッド形成に向けて、金属極薄膜とTCNBの反応を試み、オクタシアノ金属フタロシアニンの生成とナノロッド成長の金属種依存について検討した。洗浄した石英基板上にCu、Fe、Al、Niを6 nm真空蒸着し、この基板とTCNBをアルゴン雰囲気下で封管に封入し300°Cで所定の時間加熱した。加熱後、金属極薄膜上には緑色の薄膜が生成し、紫外可視吸収(UV-Vis)スペクトルと赤外吸収(IR)スペクトルよりオクタシアノ金属フタロシアニンの生成が、X線光電子分光(XPS)測定より金属極薄膜との反応によりフタロシアニン環の中心に金属が配位していることが確認できた。薄膜の走査型電子顕微鏡(SEM)観察より、オクタシアノ金属フタロシアニンは金属極薄膜との反応よりロッド上に成長することがわかったが、オクタシアノ金属フタロシアニンの生成とロッド成長には金属種により違いが見られた。Cu極薄膜との反応が最も進みやすく、ロッド径40-100nm、ロッド長100-700程度の高密度なロッド成長が見られた。Fe、Al、Ni上では、Cuに比べてオクタシアノ金属フタロシアニンの生成量は少なく、ロッド密度は低く長さ方向へのロッド成長が進む傾向にあった。気固相反応の金属種依存について、錯体形成、金属の結合エネルギーなどから考察を行い、太陽電池応用に向けて適切な金属種についての知見を得ることができた。また新規反応容器での反応では封管中での反応と比べて系全体の温度制御が難しいことがわかった。最適な制御にむけて装置の改良が必要であることがわかった。1年目、2年目の成果をもとに、今年度はより簡便な反応条件でのオクタシアノ金属フタロシアニンの生成とナノロッド成長を検討するために、大気圧下での化学気相成長法(CVD)とイオン液体中での反応と反応その場観察を行った。大気圧下のCVD法では、反応基板に銅を蒸着した石英基板用い、スペーサーを介して、反応基板とTCNBを成膜した石英基板を接着して密封し測定セルとした。セルをTCNBが融点以下で昇華する温度で加熱しながらその場観察と紫外可視(UV-vis)スペクトル測定を行った。反応基板温度180240°Cで緑色薄膜が得られ、UV-visスペクトルから、フタロシアニン環のπ-π*遷移に基づく吸収ピークが観察された。

銅蒸着基板温度225°Cでの反応その場観察より、TCNBが銅蒸着膜上で選択的に反応する様子が観察された。得られた薄膜の走査型電子顕微鏡(SEM)観察を行ったが、大気圧下で作製したオクタシアノ金属フタロシアニン薄膜にはロッド状の成長は観察されず、ロッド形成の真空度依存が明らかとなった。イオン液体中での反応では、TCNBと金属塩をイオン液体中に分散させ加熱した。加熱によりイオン液体中に緑色の固体が生成し、UV-visスペクトル測定、赤外吸収スペクトル(FT-IR)測定より、イオン液体中でのオクタシアノ金属フタロシアニンの生成が示唆された。イオン液体中の反応においてもオクタシアノ金属フタロシアニンのロッド状の成長は観察されなかったが、イオン液体中での有機半導体の結晶成長が報告されていることから、今後反応条件を検討することで新たな結晶成長が期待できると考えられた。また、透明電極ITO上で真空蒸着法より銅フタロシアニン(CuPc)のロッド状の結晶成長を試み、CuPcロッドを実装した素子を作製、光電変換特性評価を行った。n型有機半導体であるオクタシアノ金属フタロシアニン(MPc(CN)8)のナノロッドを有機薄膜太陽電池に応用するために、金属極薄膜上での化学気相成長(CVD)法によるテトラシアノベンゼン(TCNB)の環化反応を検討した。原料TCNBの蒸発・昇華過程に着目し、大気圧から真空下でのTCNBの熱物性の測定を行った。銅(Cu)、鉄(Fe)、ニッケル(Ni)の極薄膜(6nm)上での気固相反応により、それぞれの金属を中心金属とするMPc(CN)8が生成しロッドが形成された。金属種により、生成量、ロッド成長に違いが見られ、Cu極薄膜上で高密度かつ均一なロッドを作製することができた。金属極薄膜との気固相反応でも、オクタシアノ金属フタロシアニンが生成し、ロッド状に成長することが確認できた。金属種によっては高密度なロッド成長が観察されたことから、反応条件を検討することにより太陽電池応用に向けた電極上へのナノロッド形成が可能であると考えられる。応用物理化学平成26年度の結果をもとに、太陽電池応用に向けた電極上でのn型有機半導体ナノロッド成長制御を目指す。新規反応容器での反応と反応観察に関しては、装置の温度制御の改良を含めて検討し、最終的に最適化されたオクタシアノ金属フタロシアニンナノロッドの電気特性評価・光電変換特性評価を行う。今年度の研究計画に挙げていた真空下でのTCNBの重量/示差熱(真空TG-DTA)分析を行い、真空中でのTCNBの蒸発・昇華過程を明らかにすることができた。この結果をもとにその場測定に向けた反応装置を作製した。自作セルを用いた大気中でのその場測定を行い真空中での測定に向けた基礎データの収集を行うことができた。また電極上でのOcPcのロッド状成長も確認することができた。研究費の効率的な使用により次年度使用額生じた。平成25年度の結果をもとに、今後は真空中での反応とその場UV-Visスペクトル測定による反応の解析を進めていく。各真空度、反応温度で各種基板上での環化反応を試み、得られた生成物の評価は紫外可視分光光度計(UV-Vis)、フーリエ変換赤外分光光度計(FT-IR)、による分光学的評価、走査型電子顕微鏡(SEM)、原子間力顕微鏡(AFM)、表面段差計による形態、膜厚の評価、X線回折法、透過型電子顕微鏡(TEM)による電子線回折法による結晶構造評価を行う。OcPcナノロッド作製の最適化を目指すとともに、太陽電池作製に向けてナノロッドの電気特性評価および素子構造の検討を行う。この予算により新規反応容器の改良が可能となり、より適切な条件での環化反応を行うことができる。
ポリオキソメタレート三次元配列制御による特殊反応場を目指したナノ空間の創製

親水チャネルを有するイオン性固体の構築と分子収着特性制御ポリオキソメタレートの負電荷が3の[α-PW12040]^<3->から6の[α-CoW_<12>O_<40>]^<6->に至る範囲で,マクロカチオン[Cr_3O(OOCH)_6(H_2O)_3]+及びアルカリ金属イオンとの複合化を行った結果,Na_2[Cr_3O(OOCH)_6(H2O)_3][α-PW_<12>O_<40>]・16H2O [1a],K_3[Cr_3O(OOCH)_6(H_2O)_3][α-SiW_<12>O_<40>]・16H_2O[2a],Rb_4[Cr_3O(OOCH)_6(H_2O)_3][α-BW_<12>O_<40>]・16H_2O [3a],Cs5[Cr_3O(OOCH)_6(H_2O)_3][α-CoW_<12>O_<40>]・7.5H_2O[4a]が得られた.1a-4aは結晶水を含む親水チャネルを有し,室温で真空排気すると対応する無水物(ゲストフリー相)1b-4bが得られた.1a-4a及び1b-4bの構造を単結晶及び粉末XRDにより解析した結果,格子体積は1a(1b)>2a(2b)>3a(3b)>4a(4b)の順に減少した.これは,イオン性固体の構成要素であるポリオキソメタレートの負電荷が1a(1b)<2a(2b)<3a(3b)<4a(4b)の順に増加し,構成イオン間のイオン結合が強くなってパッキングが密になったためと考えられる.ゲスト分子として直鎖アルコールを例にとり,1b-4bの分子収着特性を検討した.ポリオキソメタレートの負電荷が3と最も小さい1bはブタノールを収着し,負電荷の増加に伴い,収着できるアルコール分子の炭素数は減少した.さらに,1b-4bは有機極性ゲスト分子(アルコール,ニトリルやエステル)の炭素鎖一つ分の違いを識別し,混合物の分離にも応用可能であった.(Inorg. Chem. 2006)親水チャネルを有するイオン性固体の構築と分子収着特性制御ポリオキソメタレートの負電荷が3の[α-PW12040]^<3->から6の[α-CoW_<12>O_<40>]^<6->に至る範囲で,マクロカチオン[Cr_3O(OOCH)_6(H_2O)_3]+及びアルカリ金属イオンとの複合化を行った結果,Na_2[Cr_3O(OOCH)_6(H2O)_3][α-PW_<12>O_<40>]・16H2O [1a],K_3[Cr_3O(OOCH)_6(H_2O)_3][α-SiW_<12>O_<40>]・16H_2O[2a],Rb_4[Cr_3O(OOCH)_6(H_2O)_3][α-BW_<12>O_<40>]・16H_2O [3a],Cs5[Cr_3O(OOCH)_6(H_2O)_3][α-CoW_<12>O_<40>]・7.5H_2O[4a]が得られた.1a-4aは結晶水を含む親水チャネルを有し,室温で真空排気すると対応する無水物(ゲストフリー相)1b-4bが得られた.1a-4a及び1b-4bの構造を単結晶及び粉末XRDにより解析した結果,格子体積は1a(1b)>2a(2b)>3a(3b)>4a(4b)の順に減少した.これは,イオン性固体の構成要素であるポリオキソメタレートの負電荷が1a(1b)<2a(2b)<3a(3b)<4a(4b)の順に増加し,構成イオン間のイオン結合が強くなってパッキングが密になったためと考えられる.ゲスト分子として直鎖アルコールを例にとり,1b-4bの分子収着特性を検討した.ポリオキソメタレートの負電荷が3と最も小さい1bはブタノールを収着し,負電荷の増加に伴い,収着できるアルコール分子の炭素数は減少した.さらに,1b-4bは有機極性ゲスト分子(アルコール,ニトリルやエステル)の炭素鎖一つ分の違いを識別し,混合物の分離にも応用可能であった.(Inorg. Chem. 2006)
現代日本における青少年のボランティア活動に関する調査研究

豊かな地域環境づくりと青少年の人間形成のために、ボランティア活動がいかに重要であるかを実証的調査研究によって明確にし、今後青少年のボランティア活動を促進していくための視点と実践的な提言を行うことを本研究の目的にしているが、その目的に沿って本年度(平成4年度)は、以下の研究活動を実施した。1.青少年のボランティア活動に関する先行研究・文献・関連資料の収集・整理・分析を平成3年度に引き続き行った。2.平成3年度に実施した青少年(高校生・大学生・勤労青年)を対象とした全国的規模のアンケート調査(「やってみませんかボランティア活動」サンプル数1997票)の集計・分析を進めた。青少年はボランティア活動という言葉は知っているが、実際の活動経験は少い。ボランティア活動経験の有無によって社会参加意識がちがう。青少年のボランティア活動の障害になっているのは、機会・情報不足と青少年当人の勇気のなさである。等の結果が得られた。3.アンケート調査を踏まえて補足調査も兼ね、青少年のボランティア活動の指導者・識者に聴き取り調査を実施した。4.青少年のボランティア活動に力を入れている地域社会への実態調査を行った。5.研究会を開き、各調査の報告・検討をし、アンケート調査をもとにして調査報告書を作成した。6.研究代表者(渡辺博史)を中心として、文献研究、各調査の結果、研究会での検討・議論から集約された青少年のボランティア活動を促進していくための今後方向への提言をまとめ、調査報告書に発表した。成果の一部は平成5年の日本教育社会学大会で発表の予定である。本年度の研究実施計画は、青少年のボランティア活動に関する先行研究・文献資料の収集・整理・分析、全国的視野に立ったボランティア活動の実践に関する情報収集・聴き取り調査、青少年を対象にしたボランティア活動に関するアンケ-ト調査の実施の三本柱であった。青少年のボランティア活動に関する先行研究・文献資料は、収集し整理中であり、まだ分析の段階まで至っていない。研究代表者の個人的なつながりからのものが多いが、多くの文献資料を収集することができた。ボランティア活動の実践に関する情報収集・聴き取り調査は、団体・施設・組織を訪ねて主宰者にインタビュ-を実施し、多くの知見を得た。青少年を対象にしたボランティア活動に関するアンケ-ト調査については、調査の準備段階でボランティア活動とはどんな活動かについて研究分担者間で議論となり、本研究の目的である「豊かな地域環境づくりと青少年の人間形成のために、人びとの役に立つボランティア活動がいかに重要であるかを実証的に調査研究によって明確にし、今後青少年のボランティア活動を促進していくための豊富な視点と実践的な提言をおこなう」という主旨から「ボランティア活動とは、自分の得意な知識、趣味、娯楽および能力を進んで世の人びとに役立て、そうすることによって自分自身の生きがいをいっそう高めていこうとする積極的な社会参加の活動のことである」という合意を得た。その上で調査票を作成した。アンケ-ト調査は、青少年(高校生・大学生・勤労青年)を対象に、ボランティア活動への参加の有無、ボランティア活動への関心、ボランティア活動への参加意欲、ボランティア活動の阻害要因、地域社会への関心等を内容として、平成三年十二月から平成四年三月にかけて、全国的規模で実施した。調査票の回収が遅れている地域もあり、成票数はまだ確定できないが、約二千となっている。現在、集計作業中である。等の結果が得られた。
MOCVD選択成長による単電子トンネル素子の試作に関する研究

本研究では、まずGaAs/AlGaAs系量子ドット素子の作製を有機金属気相成長法(MOCVD法)を基本とした選択成長法により試み、最小で横方向閉じ込めサイズが25nm以下のものを作製することに成功した。また、それらの素子における励起子の3次元閉じ込め効果を低温(4.2K)におけるフォトルミネッセンス特性やフォトルミネッセンスの磁場効果により確認した。一方、分子線エピタキシ-法(MBE法)を用いGaAs基板上に作製したGaAs/AlGaAs系の高電子移動度トランジスター(HEMT)基板に、電子ビームリソグラフィー法とシャロウウエッチング法により有効チャネル幅約60nmの量子細線を作製した後、リフトオフ法を用いて細線部分に二つのトップゲートと一つのサイドゲートを形成することにより、新しいタイプの量子ドット素子を試作した。そして、試作した量子ドット素子において、ゲート電圧変化により量子ドット内の電子数を変化させたときコンダクタンスが振動する現象いわゆるクーロンブロッケード振動を観測したところ、従来型の素子においては実現できなかった良好な特性を観測することができた。また、同素子を用いたターンスタイル操作により、4桁以上の精度を有する量子化電流の実現に成功した。さらに、この素子について光励起単電子トンネル効果についても試みてみたところ、マイクロ波領域の光(電磁波)を素子に照射したときのクーロンブロッケード振動の変化のようすが理論計算と非常に良い一致を示していることを見いだし、光励起単電子トンネル効果が実際に実現可能であることを示した。
オリゴシランの物性制御を目指したケイ素主鎖の立体配座制御方法の開発

双環構造を有するトリシランユニットを構成単位として用いて,立体配座がオールアンチに制御されたペンタシラン(aa-Si_5),オクタシラン(aa-Si_8)をモデル化合物として合成し,それらの構造解析ならびに物性測定をおこなった。X線結晶構造解析により,得られたオリゴシラン類におけるケイ素主鎖中のSiSiSiSi二面角は全てほぼ180°であることを確認し,当初の予測通り本ユニットが主鎖を完全オールアンチ配座に制御するためにきわめて有用であることを確認した。また,溶液中でのUV吸収測定の結果,ペンタシランaa-Si_5は吸収極大λ_<max>=253nm(ε40,000)と,立体配座が制御されていないペルアルキルペンタシラン(n-Si_5Me_<12>,λ_<max>=250nm,ε20,000)に比べて極大波長はほとんどかわらないものの,吸光係数がほぼ倍増していた。また,オクタシランaa-Si_8は吸収極大λ_<max>=288nm(ε85,000)と,ペルアルキルオクタシラン(n-Si_8Me_<18>,λ_<max>=273nm,ε30,000)に比べて長波長かつ強い吸収を示した。さらに,温度可変UV吸収スペクトルを測定した結果,オクタシランaa-Si_8の極大吸収波長はほとんど変化しないものの,吸光係数εが200,000と,大幅に増大することも明らかとなった。MCD(磁気円二色性)スペクトル測定結果を併せると,ペンタシランaa-Si_5は構造が強固にオールアンチに固定されているのに対し,オクタシランaa-Si_8では室温溶液中では多少の立体配座の乱れがあるものの,やはり主鎖がオールアンチ構造のものが大多数を占めていることが明らかとなった。以上のように本研究では,オリゴシランの立体配座をσ共役の拡張に有利な完全オールアンチ配座に制御する方法の開発に成功した。オリゴシランにおけるケイ素鎖の立体配座を精密に制御すべく、2本のテトラメチレン鎖を有する双環式トリシラン、すなわち11,11-ジメチル-1,6,11-トリシラ-ビシクロ[4.4.1]ウンデカンを構成ユニットとしたオリゴシランの合成について検討した。この化合物の環構造は、ルテニウム-カルベン錯体(いわゆる第2世代Grubbs触媒)を用いた閉環メタセシスにより効果的に構築されることが明らかとなった。このユニットを用いたペンタシラン化合物(11,11-ジメチル-1,6-ビス(トリメチルシリル)-1,6,11-トリシラ-ビシクロ[4.4.1]ウンデカン)は、X線結晶構造解析の結果5つのケイ素がすべてanti配座で配列した、all-anti配座を有することが明らかとなった。また、この化合物の常温におけるUV吸収を測定すると、極大吸収波長λ_<max>=253nm、吸光係数ε=37,700M^<-1>cm^<-1>、半値幅HBW=22,000cm^<-1>であり、立体配座が制御されていないペルメチルペンタシラン(n-Si_5Me_<12>;λ_<max>=250nm、ε=19,000M^<-1>cm^<-1>、HBW=33,000cm^<-1>)に比べて、若干長波長シフトしたシャープかつ強い吸収極大を示すことが明らかとなった。また、本all-antiペンタシランはUV吸収に対応するMCD(磁気円二色性)のシグナルを与えないことから、本ペンタシランの立体配座は溶液中でも精密かつ強固にall-antiに固定されていることが確認された。以上のように本研究では、双環式トリシランユニットはオリゴシランの立体配座を厳密にanti配座に制御し、σ共役の延伸に有用であることを見いだした。

さらに,温度可変UV吸収スペクトルを測定した結果,オクタシランaa-Si_8の極大吸収波長はほとんど変化しないものの,吸光係数εが200,000と,大幅に増大することも明らかとなった。MCD(磁気円二色性)スペクトル測定結果を併せると,ペンタシランaa-Si_5は構造が強固にオールアンチに固定されているのに対し,オクタシランaa-Si_8では室温溶液中では多少の立体配座の乱れがあるものの,やはり主鎖がオールアンチ構造のものが大多数を占めていることが明らかとなった。以上のように本研究では,オリゴシランの立体配座をσ共役の拡張に有利な完全オールアンチ配座に制御する方法の開発に成功した。
生物由来燃料生産のための機能性酵素カクテル合成と対応フォーミュラの創成

近年、化石燃料消費に伴う地球温暖化および化石資源枯渇、化石資源由来製品多用による環境汚染が国内外で広がっている。これらの問題を総合的に打破する解決策の一つとして未利用バイオマスによるエネルギー生産が注目されている。現在盛んにエネルギー生産の研究として行われているのが、食料との競合がない未利用木質バイオマスからのバイオエタノール生産である。未利用木質バイオマスからのバイオ燃料生産においては、セルロースの加水分解(グルコースへの糖化)の効率を上げることが最も重要な鍵である。本研究では、現在法で製造不可能な理想的特性を持つ加水分解酵素(セルラーゼ)群の製造・利用プロセス(最適な新規酵素種の選定、カクテル比の決定、算式化)開発に挑戦することにより、未利用バイオマスを原料とした効率的バイオ燃料生産システムの創成を行った。酵素としてPyrococcus furiosus DSM3638由来のβ-グルコシダーゼBGLPf0073(BG)、Pyrococcus horikosii OT3由来のエンドグルカナーゼEGPh1171(EG)、Caldicellulosiruptor saccharolyticus由来のセロビオハイドロラーゼCBH001(CBH)のセルロース糖化に必要な3種類を用いた。未処理の酵素と精製した酵素(熱処理後の酵素)をSDS-PAGEで比較した結果、EGとBGは90°C、CBHは80°Cで15 minの熱処理で目的酵素以外のタンパク質をほとんど除去することができた。熱処理のみで精製可能であり、クロマトグラフィーなどの複雑な操作を必要としないので、コストの削減や精製時間の省略が可能であった。反応温度80°Cで行ったセルロース繊維ベンコットの糖化では、酵素を精製せずに(熱処理なしの)菌体添加でも糖化反応が進む、90%以上の糖化率が得られることがわかった。セルロース繊維ベンコットの酵素糖化率は90%以上であったが、実バイオマス(稲ワラ)の酵素糖化率が20.4%であったため、糖化率を向上するための方策が今後の課題であるため。実バイオマス(稲ワラ)の糖化に関しては酵素糖化率20.4%にとどまった。これについてはバイオマス中のリグニンの存在、セルロースの重合度や結晶化度などが原因であると思われるので、リグニンの分解・除去やセルロースの重合度や結晶化度を下げることができる前処理法や酵素カクテルの割合を検討することにより、酵素糖化率の向上を図る予定である。近年、化石資源の枯渇、地球温暖化等の問題を解決するための技術開発や未利用生物資源の有効利用による循環型社会の構築が求められる中、稲わら、バガス(砂糖黍の絞り粕)等の農作物の未利用部分やスギ、ヒノキ間伐材等のセルロース系バイオマスを低コストで効率的にエネルギー物質(生物由来燃料)に変換する技術開発が急務となっている。地球上に最も豊富に存在する有機資源であるセルロースからの生物由来燃料生産においては、セルロースの加水分解(酵素によるグルコースへの糖化)の効率を上げることが最も重要な鍵である。本研究では、理想的特性を持つ酵素(セルラーゼ)群は現在法では製造不可能のため、最適な新規酵素群の選定とその新規製造・利用プロセスの創製に挑戦した。本年度は、Archaea系超耐熱性菌由来の3種類のセルラーゼ(エンドグルカナーゼ、セロビオハイドロラーゼ、β-グルコシダーゼ)の人工合成酵素発現遺伝子を発現プラスミド(pET15-bベクター)に乗せ発現大腸菌(BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL)に導入し、その組換え大腸菌の培養を行い、セルラーゼの効率的生産法を確立した。次に、酵素の精製は超音波処理とそれに続く種々の温度での高温処理を行い比較すると共に、組換え大腸菌の高熱処理精製(直接加熱90°C)を行った。その結果、高熱処理精製のみでも高活性を持つ酵素の抽出が可能であり、高温条件下では細胞壁溶解による酵素活性発現可能性があるため組換え大腸菌の直接投入処理も可能であった。pHや温度などの培養条件を種々変化させることにより、高活性な耐熱性酵素を得るための組換え大腸菌の効率的培養法を確立できただけでなく、高熱処理精製で高活性を持つ酵素を抽出することにより一般には手間のかかるタンパク質抽出操作を省略できたため。さらに、3種類の酵素を種々の割合で混合し、混合酵素によるベンコット(セルロース物質)の加水分解における相乗効果を立証できたため。酵素としてPyrococcus furiosus DSM3638由来のβ-グルコシダーゼBGLPf0073(BG)、Pyrococcus horikosii OT3由来のエンドグルカナーゼEGPh1171(EG)、Caldicellulosiruptor saccharolyticus

由来のセロビオハイドロラーゼCBH001(CBH)のセルロース糖化に必要な3種類を用いた。未処理の酵素と精製した酵素(熱処理後の酵素)をSDS-PAGEで比較した結果、EGとBGは90°C、CBHは80°Cで15 minの熱処理で目的酵素以外のタンパク質をほとんど除去することができた。熱処理のみで精製可能であり、クロマトグラフィーなどの複雑な操作を必要としないので、コストの削減や精製時間の省略が可能であった。反応温度80°Cで行ったセルロース繊維ベンコットの糖化では、酵素を精製せずに(熱処理なしの)菌体添加でも糖化反応が進む、90%以上の糖化率が得られることがわかった。セルロース繊維ベンコットの酵素糖化率は90%以上であったが、実バイオマス(稲ワラ)の酵素糖化率が20.4%であったため、糖化率を向上するための方策が今後の課題であるため。バイオマスを生物由来燃料に変換するまでの水熱前処理、耐熱性セルラーゼ発現大腸菌の直接添加、可溶化・酵素糖化および高温発酵からなる製造プロセスを創製する。実バイオマス(稲ワラ)の糖化に関しては酵素糖化率20.4%にとどまった。これについてはバイオマス中のリグニンの存在、セルロースの重合度や結晶化度などが原因であると思われるので、リグニンの分解・除去やセルロースの重合度や結晶化度を下げることができる前処理法や酵素カクテルの割合を検討することにより、酵素糖化率の向上を図る予定である。ガラス器具や試薬が所属実験室にあるもので賄うことができたため。バイオマスを生物由来燃料に変換するまでの水熱前処理、耐熱性セルラーゼ発現大腸菌の直接添加、可溶化・酵素糖化および高温発酵からなる製造プロセスを創製するために使用する。研究遂行上、セルロース加水分解酵素エンドグルカナーゼ(EGPh)、β-グルコシダーゼ(BGLPf)、セロビオハイドロラーゼ(CelB)の3種類酵素生産が不可欠であるがコンピテントセル(大腸菌由来)での発現に際しCelBの活性が低く使用可能なまでに至っておらずその生産が滞っているため期間の延長が必要である。現在知見者の助言によりオリゼによる発現を試行しており、その実験に次年度使用額を充てることにより、研究が速やかに遂行できると考える。
クロマチン・レベルの制御シグナル

本年度、村松はマウスリボソーム遺伝子の欠失および点突然変異体について細胞抽出液による前孵置を行ない、野生型の転写の競合実験を行なった。その結果、5′欠失体では転写因子結合能と転写能とはほぼ並行するが、3′欠失体では転写能の方が先に低下し、この部分は転写因子結合とは無関係に転写に必要な領域であることが示された。又、リボソームRNA転写の種依存性を決めているプロモーター上の領域を決定するため、各種のヒト・マウスキメラ遺伝子を作って検討した。その結果-32から-14迄がマウスの種特異性を担っている部分であることがわかった。岩淵はTiプラスミッドによりコムギヒストン【H_3】【H_4】遺伝子をシロイヌナズナ細胞に導入し、遺伝子移入植物を作出して、これら遺伝子の発現を調べた。遺伝子上流にエンハンサー領域を見出し、且つそこに結合するタンパク質の存在をゲルシフト法により証明した。大野は【Ca^(2+)】依存性プロテアーゼの遺伝子をクローン化し構造を決めたのみならず、CキナーゼのcDNAクローンも取ることに成功した。その解析の結果、このタンパク質にはキナーゼドメインと調節ドメインがあり、且つそれぞれの中に機能的分担のある領域が存在することが明らかとなった。Cキナーゼに少くとも4種類あることも初めて明らかにされた。竹家はMLVのLTRをプラスミッドに組込み、この部分の「ひねり力」による変形と転写調節の関係を追求しているが、ZDNAの存在は今迄の所あまり影響はないらしい。大西はメンケス縮れ毛病の生因を追求しているが患者細胞は【Cu^(2+)】の投与によりメタロチオネイン遺伝子を強く発現することを見出した。サザンブロットでこの遺伝子は十数本のバンド(EcoRI)がみられるが、この患者で少し異なるバンドが見られた。
生体における神経細胞死実行機構の解析

Bcl-2ファミリーは、神経細胞死の制御に重要な役割を果たしている蛋白質群である。研究代表者はこれまでにショウジョウバエの細胞死促進型Bcl-2ファミリー分子Drob-1を同定し、その機能を明らかにした(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000)。Drob-1はin vitro及びin vivoにおいてCaspase非依存的に細胞死を誘導する。このCaspase非依存的な新規細胞死実行経路に関わる分子を網羅的に同定するため、Drob-1をショウジョウバエ複眼特異的に過剰発現するトランスジェニックフライを用いた大規模な遺伝学的スクリーニングを行った。Gal4/UASシステムを利用した機能獲得型異所発現スクリーニングを行うことにより、Drob-1によるrough eyeを強く抑制あるいは促進する複数の系統を得た。さらにこれらの原因遺伝子を同定し、現在、これら分子のCaspase非依存的細胞死経路における役割の遺伝学的解析を行っている。一方、このスクリーニングの過程で、JNK経路の活性化を介してCaspase非依存的な細胞死を誘導するショウジョウバエTNFファミリー分子、Eigerの同定にも成功した(EMBO J., 2002)。今後、Drob-1及びEigerによる細胞死実行機構の生体レベルでの解析を通して、Caspase非依存的な細胞死の基本メカニズムの解明を目指していく予定である。
飲食物の微生物汚染と胆嚢がん発症の関係及び本症早期診断のための血液検査体系の確立

胆嚢がん患者宅井戸水中に生息している細菌叢メタゲノム解析を用いて患者宅井戸水中に生息している細菌叢を明らかにすること、胆嚢がん患者、胆石症患者、健常者の血清アフラトキシンB1濃度をELISA法により測定し、比較することである。さらに、胆嚢がんを早期発見・診断するための既存血液検査項目(ALP、γGTや腫瘍マーカーなど)が本症診断のためにどの程度有用であるかを、感度、特異度を指標として評価することである。
単純ヘルペスウイルスによる侵入および核膜通過過程の解析

本研究では、単純ヘルペスウイルス(HSV)による膜通過機構に焦点を当てて解析した。その結果、HSVによる膜通過に貢献する新規ウイルス因子および宿主因子を同定し、その分子機構の一端を明らにした。ウイルス感染環の中で膜通過は必要不可欠なステップであり、これらの成果は、新しい抗ウイルス戦略構築の一助になると考えられる。単純ヘルペスウイルス(HSV)はヒトに口唇ヘルペス、脳炎、性器ヘルペス、眼疾患といった多様な病態を引き起こし、関連する医療費はアメリカ合衆国で年間30億ドルと試算されるほど大きな問題となっている。HSVには核酸アナログであるアシクロビルという治療薬が存在するが、公衆衛生上は不十分であり、まったく異なる機序の薬剤が期待されている。生きた宿主細胞の中でしか増えることができないウイルスにとって、宿主細胞の膜通過は必要不可欠なステップである。同時にいずれもウイルス感染に特異的な現象であり、そのメカニズムの解明は新しい抗ウイルス戦略に寄与すると考えられる。本研究は、HSVによる宿主細胞の膜通過のメカニズムを、宿主因子に注目することで明らかにすることを目的としている。平成26年度は、HSVがコードし、ウイルスによる細胞侵入過程、特に膜融合過程において必須の働きを行う糖タンパク質gBに注目した。我々はこれまでに、gBと特異的に会合し、HSVによるfusionを仲介する宿主receptorとして、PILRaおよびNMHC-IIAを報告してきた。これらがHSVマウス感染モデルにおいても重要な役割を担っていることを示してきたが、PILRaは主に免疫細胞に強く発現し、NMHC-IIAは主に上皮細胞に強く発現するタンパク質である。HSVは、三叉神経節に潜伏を起こし、まれながら致死的な脳炎を引き起こすなど、神経指向性が強いことが知られており、神経細胞に強く発現するgB receptorの存在は謎であった。研究代表者らは、神経細胞に強く発現するNMHC-IIBもHSVのgB receptorであることを明らかにした(J. Arii et. al, J Virol. 89(3):1879-1888, 2015.)。ウイルスがどのような細胞に感染するのか、多くの場合ウイルスの病態を説明することができるため、ウイルス学にとって根源的な命題といえる。HSVの場合、ほとんどの培養細胞に感染可能であるものの、生体内においては上皮系および神経系細胞に強い指向性を持ち、脳炎、角膜炎、皮膚炎、性器ヘルペスといった多彩な病態の原因となる。しかし、これらの指向性は、ほとんど分子レベルで説明されていない。本研究では、HSVの細胞侵入に必須である糖タンパク質gBに結合し、HSVによるfusionを仲介する宿主因子として、神経系組織に特異的に強く発現するNMHC-IIBを同定した。興味深いことに、これまでに報告したNMHC-IIAは、生体内においては上皮系組織に強く発現するものの、培養細胞においてはさまざまな細胞に普遍的に強く発現している。すなわち、これらのタンパク質が、培養細胞と生体内におけるHSVの指向性を規定する可能性が考えられる。本研究結果は、HSVが引き起こす多彩な病態を分子レベルで説明する重要な第一歩になると考えられる。平成27年度は、HSVがコードし、ウイルスによる細胞侵入過程に必須の糖タンパク質gDに注目した。gDは過剰発現によって細胞膜の変性を誘導することができ、さらにその原因が細胞内領域のアルギニンクラスターにあることを明らかにした。この部位に変異を導入した組換えHSVを作成し、その性状を評価することで、gDによる膜変性能がHSV粒子形成過程やウイルス増殖にどのように寄与するのかを解析した。gDアルギニンクラスターに変異を導入した組換えHSVは、細胞質におけるウイルス粒子形成に阻害が認められ、さらにHSV感染細胞表面において誘導される突起構造の形成が有意に減少していた。gDアルギニンクラスターに変異を導入した組換えHSVは、培養細胞における増殖能が、特に低MOIで感染させた場合に著しく低下していた。すなわち、gDアルギニンクラスターはHSVの粒子形成過程、感染細胞表面の突起形成、そしてウイルス増殖に寄与していることが明らかとなった。ウイルスは細胞内で自律的に増殖し、無数の子孫を放出する。ウイルスの粒子形成は、ウイルスタンパク質同士の結合によって引き起こされると考えられているが、同時に宿主細胞機構に大きく依存している。特にHSVのようにエンベロープを持つウイルスは、粒子形成の過程で宿主由来の膜を変形させ、切断する必要がある。HSVは多くのタンパク質をコードしており、その中で宿主膜と相互作用することで粒子形成過程に直接寄与するものは、これまで知られていなかった。本年度の結果により、そのうちの一つがgDであることが明らかとなり、さらにその責任が細胞内領域のアルギニンクラスターであることが明らかとなった。

ウイルス粒子形成過程は、魅力的な抗ウイルス薬のターゲットであり、その詳細な分子機構の解析の必要性は疑いの余地がない。本研究は、HSVウイルス粒子形成機構の解明に向かう第一歩といえ、将来的な抗HSV戦略確立に寄与すると考えられる。単純ヘルペスウイルス(HSV)はヒトに口唇ヘルペス、脳炎、性器ヘルペス、眼疾患といった多様な病態を引き起こし、関連する医療費はアメリカ合衆国で年間30億ドルと試算されるほど大きな問題となっている。HSVには核酸アナログであるアシクロビルという治療薬が存在するが、公衆衛生上は不十分であり、まったく異なる機序の薬剤が期待されている。生きた宿主細胞の中でしか増えることができないウイルスにとって、宿主細胞の膜通過は必要不可欠なステップである。同時にいずれもウイルス感染に特異的な現象であり、そのメカニズムの解明は新しい抗ウイルス戦略に寄与すると考えられる。本研究は、HSVによる宿主細胞の膜通過のメカニズムを、宿主因子に注目することで明らかにすることを目的としている。平成28年度は、HSVがコードし、ウイルスによる細胞侵入過程に必須の糖タンパク質gDによる細胞膜の変性能に注目し解析を行った。膜変性能の責任が細胞内領域のアルギニンクラスターにあることを昨年度に明らかにしている。gDアルギニンクラスターに変異を導入した組換えHSVは、細胞質におけるウイルス粒子形成に阻害が認められ、さらにHSV感染細胞表面において誘導される突起構造の形成が有意に減少し、培養細胞における増殖能が低下していた。すなわち、gDアルギニンクラスターはHSVの粒子形成過程、感染細胞表面の突起形成、そしてウイルス増殖に寄与していることが明らかとなった(J. Arii et. al. 2016 J. Virol. 90: 10170-10181)。また、核内で複製するHSVは、細胞質で粒子形成を行うために、核外に輸送される必要がある。この過程は核膜通過と呼ばれているが、その詳細なメカニズムは不明である。核膜通過の責任因子とされているウイルス因子NECと相互作用する宿主因子に注目して解析を行っている。ウイルスは細胞内で自律的に増殖し、無数の子孫を放出する。ウイルスの粒子形成は、ウイルスタンパク質同士の結合によって引き起こされると考えられているが、同時に宿主細胞機構に大きく依存している。特にHSVのようにエンベロープを持つウイルスは、粒子形成の過程で宿主由来の膜を変形させ、切断する必要がある。HSVは多くのタンパク質をコードしており、その中で宿主膜と相互作用することで粒子形成過程に直接寄与するものは、これまで知られていなかった。本年度の結果により、そのうちの一つがgDであることが明らかとなり、さらにその責任が細胞内領域のアルギニンクラスターであることが明らかとなった。
舌痛症発症に対するＳａｔｅｌｌｉｔｅ　ｇｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓの関与

C57/BL6雄性マウス(7w)の舌背にTNBSを投与すると、舌背に熱痛覚過敏が生じたが組織学的変化は認められなかった。抗Artemin中和抗体およびTRPV1アンタゴニストの投与により舌背の熱痛覚過敏が抑制された。また三叉神経節における舌投射Artemin受容体陽性かつTRPV1陽性神経細胞数が増加した。また、三叉神経節内TRPV1タンパク量が有意に増加した。さらにArtemin舌投与後5日目に舌背に熱痛覚過敏が生じ、TRPV1アンタゴニストの舌投与により舌背の熱痛覚過敏が抑制された。さらに、TNBS投与後、舌投射三叉神経節ニューロンのcapsaicinに対する反応性が増大した。舌痛症は、舌に炎症や腫瘍などの器質的な変化が認められないにもかかわらず痛覚異常を生じる疾患である。本研究では2,4,6-trinit robenzene sulfonic acid (TNBS)舌投与により舌痛症モデルマウスを作製し、同モデルに生じる舌熱痛覚過敏に対するArteminの役割について検討した。C57/BL6雄性マウス(7w)の舌背にTNBS (10 mg/ml, 1h)を投与すると、投与後1日目より舌背に熱痛覚過敏が生じた。TNBS舌背投与後5日目、舌に組織学的変化は認められなかったが、舌背粘膜においてArtemin発現量が増加し、抗Artemin中和抗体およびTRPV1アンタゴニスト(SB366791)の投与により舌背の熱痛覚過敏が抑制された。また三叉神経節における舌投射Artemin受容体(GFRalpha3)陽性かつTRPV1陽性神経細胞数が増加した。一方、三叉神経節におけるリン酸化TRPV1タンパク量に変化は見られなかった。さらにArtemin舌投与後5日目に舌背に熱痛覚過敏が生じ、SB366791の舌投与により舌背の熱痛覚過敏が抑制された。TNBS舌背投与後5日目、急性単離した三叉神経節細胞のTRPV1アゴニスト(Capsaicin)により誘導される内向き電流が増加し、抗Artemin中和抗体の舌投与により内向き電流の増加が抑制された。以上の結果から、TNBS舌背投与により生じる舌背の熱痛覚過敏は、舌背粘膜で増加するArteminによる舌投射ニューロンにおけるTRPV1の増加が関与していることが示唆された。本研究では2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)舌投与により舌痛症モデルマウスを作製し、同モデルに生じる舌熱痛覚過敏に対するArteminの役割について検討した。また三叉神経節における舌投射Artemin受容体(GFR&#61537;3)陽性かつTRPV1陽性神経細胞数が増加した。舌痛症は難治性口腔内異常疼痛の中で最も発症率が高いことが知られているが、その発症機構に関しては全く研究がなされておらず、不明である。舌は味覚だけでなく痛覚や触覚などの体性感覚機能や咀嚼嚥下機能にも重要な役割を果たしていることから、舌痛症発症は即患者のQOLの破たんを招くと考えられる。

C57/BL6雄性マウス(7w)の舌背にTNBS (10 mg/ml, 1h)を投与すると、投与後1日目より舌背に熱痛覚過敏が生じた。TNBS舌背投与後5日目、舌に組織学的変化は認められなかったが、舌背粘膜においてArtemin発現量が増加し、抗Artemin中和抗体およびTRPV1アンタゴニスト(SB366791)の投与により舌背の熱痛覚過敏が抑制された。また三叉神経節における舌投射Artemin受容体(GFR alpha3)陽性かつTRPV1陽性神経細胞数が増加した。さらにArtemin舌投与後5日目に舌背に熱痛覚過敏が生じ、SB366791の舌投与により舌背の熱痛覚過敏が抑制された。TNBS舌背投与後、三叉神経節における舌投射神経細胞のcapsaisinに対する興奮性が増強されたが、その増強は抗Artemin中和抗体の舌投与により抑制された。さらに、TNBS舌背投与後、satellite cellsの活性化が認められた。これら得られたデータをまとめて論文を作成し、海外英文誌に投稿中である。口腔生理学現在までに、交付申請書に記載した「研究の目的」に沿っておおむね順調に研究が進んでいる。しかしながら、ATP受容体アゴニストの三叉神経節内投与による行動薬理学的解析がまだ完全に終わっていない。実験終了にさきがけて、その成果を発表すべく論文執筆中である。交付申請書に記載した「研究の目的」に沿って今後も研究を推進する。ATP受容体アゴニストの三叉神経節内投与による行動薬理学的解析あらかじめ頭頂部よりカニューレを刺入し三叉神経節内に留置し、ATPもしくはP2Y受容体アゴニストであるADPを三叉神経節内に連続投与する。投与開始後1日、7日、14日目に浅麻酔下にて機械的および熱刺激に対する逃避閾値の計測を行い、ATP受容体アゴニストの三叉神経節内連続投与により痛覚過敏がおこるかを検索する。薬剤を確実に三叉神経節内に頭蓋骨上より投与するためには脳定位固定装置が必須であり、設備備品費に計上した。あらかじめ逆行性トレーサーであるFluoro goldを舌に投与し、TNBS塗布後1日、7日、14日目に潅流固定を行い、三叉神経節を摘出する。Glial fibrillary acidic protein (GFAP)をSatellitecellのマーカーとして用い、免疫組織化学的手法にて活性化Satellite cellを定量する。さらに、三叉神経節におけるP2Y受容体の局在を確認する。本教室ではさまざまな疼痛モデル動物を使って三叉神経節の免疫組織学的染色および定量解析がルーチン化している。本教室ポストドクター(2名)、大学院生(5名)とGFAPの免疫組織学的染色および解析を分担して行い、効率的に解析を進める。おおむね順調に研究が進んでいるが、若干各種アンタゴニストによる行動薬理実験の遅れがあるため各種アンタゴニストを購入しなかった。
外因系血液凝固阻害因子TFPIとヘパリンの相互作用機構

外因系血液凝固阻害因子TFPIはXaおよびVIIa因子の活性を阻害することにより外因系血液凝固反応を阻害するプロテアーゼインヒビターである。TFPIは硫酸化多糖であるヘパリンと相互作用することにより、その活性が増強されるが、両者の相互作用にはヘパリン糖鎖に不規則に結合している硫酸基が関与していると考えられる。本研究は、ヘパリンによるTFPIの活性増強のメカニズムを解明することを目的としている。ヘパリン中のN位、6位および2位の3種の硫酸基をそれぞれ位置選択的に脱離させた脱硫酸化ヘパリンを調整した。ヘパリンの脱硫酸化は硫酸基の定量およびNMR法により確認した。まず、ヘパリンの位置選択的脱硫酸化と生体分子間相互作用解析装置(SPR)の組み合わせによる測定方法を確立した。続いて、脱硫酸化ヘパリンをリガンドとして固定化したキュベットを用いたSPRによる測定により、それぞれのヘパリンとTFPIとのk_<ass>、k_<diss>及び解離定数を測定した。さらに、ネイティブヘパリンを固定化したキュベットを用いて、脱硫酸化ヘパリン共存下でのネイティブヘパリンとTFPIとの結合を測定した。これにより、ネイティブヘパリンとTFPIとの結合に対する各種脱硫酸化ヘパリンによる阻害効果を解析した。以上の結果より、ヘパリン中のN位、6位および2位の3種の硫酸基いずれもがTFPIとの結合に関与しているが、その寄与は6位の硫酸基が一番大きい事が分かった。また、いずれかの硫酸基1種類を残したヘパリンでも、TFPIの活性増強が可能であることを見いだした。限定条件下での亜硝酸分解によりヘパリンを断片化し、ゲル濾過により2糖18糖までのヘパリン断片を得た。それぞれの断片をリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーおよびSPRによる測定により、TFPIと相互作用する最小糖鎖が18糖であることを明らかにした。外因系血液凝固阻害因子TFPIはXaおよびVIIa因子を阻害する事により外因系血液凝固反応の開始反応を阻害するプロテアーゼインヒビターである。TFPIは硫酸化多糖であるヘパリンと相互作用することにより,その活性が増強される。その相互作用にはヘパリン糖鎖に不規則に結合している硫酸基が関与していると考えられる。本研究は,ヘパリン中のどの構造がTFPIと相互作用しているのかを明らかにし,ヘパリンによるTFPIの活性増強のメカニズムを解明することを目的としている。ヘパリン中の硫酸基のN位,6位および2位の1種を化学的方法で位置選択的に脱離させた脱硫酸化ヘパリンを調製した。脱硫酸化ヘパリンの構造はNMR法により確認した。脱硫酸化ヘパリンをリガンドとしたアフィニティーカラムよりTFPIが溶出される食塩濃度を測定した。また,脱硫酸化ヘパリンを固定化したキュベットを用いた生体分子間相互作用解析装置(LAsys)による測定により,それぞれのヘパリンとTFPIとの解離定数,k_<ass>およびk_<dis>の値を測定した。その結果,TFPIとヘパリンの結合にはN位,6位および2位の全ての硫酸基が関与しており,1種の硫酸基を脱離させるとその結合速度が減少することが分かった。しかし,N脱硫酸化ヘパリンとネイティブヘパリンの解離速度は同程度であったことから,TFPIとヘパリンの相互作用にはN位の硫酸基の寄与が一番小さいと考えられた。