hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
レポーター遺伝子を用いた胚性幹細胞のDNA修復能

これまで考えられている若年性における放射線高感受性を検証するために、本研究では、胎児および新生児の代表として胚性幹(ES)細胞を材料にDNA修復能と増殖・分化能との関係を検証できる実験系の構築を目的として、ES細胞のゲノムDNAの特定座位に相同組み換え(HR)と非相同末端再結合(NHEJ)レポーター遺伝子を導入した細胞を作成した。作成できたES細胞で特異領域に二重鎖切断修復を誘導すると、NHEJ活性を測定でき、また繊維芽細胞への分化能を有していたことから、目的とした実験系の構築に成功したといえる。原爆被ばく者の疫学調査研究は被ばく時年齢がゼロ歳では成人の約2倍の放射線感受性を示すことから胎児を含めた年少者の放射線高感受性と考えられている。しかし、マウスでは異なる報告あり、本研究では、胎児及び新生児の放射線高感受性の原因と見なされる分裂能力の最も大きい細胞の代表として胚性幹(ES)細胞を取り上げ、ゲノムDNAの特定座位に導入した相同組み換え(HR)と非相同末端再結合(NHEJ)レポーター遺伝子を用いて、それぞれのDNA修復能を分裂能力が低い分化細胞と比較検証するのが目的である。研究初年度である25年度は全身で蛋白質産物を発現できる遺伝子ROSA26のプロモーター領域を利用したDNA修復測定コンストラクトを、それぞれHR修復、NHEJ修復について作製して、ES細胞に導入することとした。そしてNHEJでは、Jochen Dahm-Daphi博士らが開発したpEJベクターのCMVプロモーター領域をROSAプロモーターに交換したコンストラクト(ROSA-NHEJ)を作製することができた。作製コンストラクトはES細胞に導入して薬剤マーカーでセレクションした後、サザンブロット法で確認することにより、ROSA-NHEJが1コピーのみ導入されたES細胞を複数得られた。そのうち、4クローンについてI-SceIによりDNA二重鎖切断を発生させてGFP陽性細胞のflow cytometerによりROSA-NHEJの正常な機能を確認するとこれら4クローンともGFP陽性細胞が出現し、これら4つのES細胞の樹立が確認でき、平成26年度の分化実験に使用する予定である。また、HRについてはM. Jasin博士らによって開発されたDR-GFPコンストラクトのCMVプロモーター領域をROSAプロモーターに交換したコンストラクト(ROSA-DRGFP)を作製することができ、現在これらコンストラクトをES細胞への導入を行っている。原爆被ばく者の疫学調査研究は被爆時の年齢がゼロ歳であると成人の2倍程度の放射線感受性を示すことから、胎児を含めた年少者の放射線高感受性が一般に受け入れられている。しかし、マウスを用いた研究では、生後直後の感受性は認められず、逆に胎仔は成体マウスより放射線抵抗性を示す結果が得られている。放射線感受性は細胞のDNA修復能力と密接にかかわっており、本研究では、胎児および新生児の放射線高感受性の原因と見なされる分裂能力の最も大きい細胞の代表として胚性幹(ES)を用い、細胞ゲノムDNAの特定座位に導入した相同組み換えと非相同末端再結合(NHEJ)レポーター遺伝子を導入し、その後、組織分化誘導により組織特異的なDNA修復活性を測定できるES細胞を作製することとした。本研究では、全身でタンパク質を発現できる誘導できる遺伝子ROSA26のプロモーター領域の下流にNHEJ修復活性測定のためのpEJコンストラクトを導入したカセットを作製し、ES細胞に導入した。薬剤選択を経て得られたクローンから4クローンにNHEJ修復を誘導するためのI-SceI(制限酵素)を発現するpCBASプラスミドをエレクトロポレーション法で導入し、その後NHEJ修復により発現したGFPタンパクの蛍光をフローサイトメーターで解析すると、GFP陽性細胞が4クローンともで確認でき、NHEJ活性を測定できる4株のES細胞を樹立することができた。また、これらES細胞を通常の培地に交換して培養を続けると繊維芽細胞用の細胞が出現し、細胞分化が確認できた。以上から、組織分化誘導後にDNA修復活性を測定できるES細胞が作製することができた。放射線生物学本研究では、原爆被ばく者の疫学調査研究で得られている被ばく時の年齢がゼロ歳であると成人の2倍程度の放射線感受性を示すことから胎児を含めた年少者の放射線高感受性が一般に受け入れられている事実について、マウスでは異なる結果も報告されていることから、胎児および新生児の放射線高感受性の原因と見なされる分裂能力の最も大きい細胞の代表として胚性幹(ES)細胞を取り上げ、ゲノムDNAの特定座位に導入した相同組み換えと非相同末端再結合得ポーター遺伝子を用いて、それぞれのDNA修復能を分裂能力が低い分化細胞と比較検証するのが目的である。放射線DNA損傷の修復はNHEJ及びHRの主に二つの機構で修復されるが、これらの修復機構の利用割合は細胞の状況や細胞の種類で変わることが示唆されている。それ故、まず最初にNHEJ、HRそれぞれ独立して客観的に修復活性を測定するシステムを作製する必要があるが、本研究では既にNHEJについてはES細胞へのコンストラクトの導入を終えており、さらにはそれら樹立細胞が修復活性測定に使えることが確認できている。

また、HRについても既にコンストラクトの作製は順調に終えており、達成度の評価として、概ね順調に進展していると言える。平成25年度研究においては既にNHEJ活性測定用のES細胞は作製完了している。HR活性測定についてはまだ細胞作製途上であるので、ROSA-DRGFP導入細胞を薬剤選択、サザンブロット法で1コピー導入を確認し、その後、I-SceIによりDNA二重鎖切断を発生させてGFP陽性細胞のflow cytometerにより、樹立細胞が正常にHR活性測定をできるか、確認する。これにより、NHEJ, HR測定用ES細胞が樹立できた後は、ES細胞からの分化誘導(心筋細胞、ドーパミン作動性ニューロン等)への方法を確立した後、それらの細胞に制限酵素I-SceI発現ヘベクターを導入して、二重鎖切断を誘導し、HR、あるいはNHEJ修復により、GFP陽性となった細胞をフローサイトメーターで解析する。このことにより、未分化ES細胞と分化細胞でのDNA修復活性の変動の有無を明らかにしたい。相同組換え修復活性測定用ES細胞(ROSA-DRGFP)の作製完了の予定が少し繰り延べになったため、ES細胞の機能確認のために使う試薬剤に予定した金額に少し残額が生じた。相同組換え修復活性測定用ES細胞(ROSA-DRGFP)作製は26年度初頭に完了する予定であり、この作製できた細胞の機能確認実験のために、25年度で残った額を使用するつもりである。
大規模コホートによる前立腺がん、尿路上皮がんおよび腎がんの血清リスク要因の探索

本研究では文科省科研費・大規模コホート研究(JACC Study)の保存血清を使用して血清中抗酸化作用物質の尿路上皮がん(膀胱癌、尿管癌、腎孟癌)に対する予防効果を明らかにした。JACC Studyのベースライン調査参加者で保存血清のある40歳以上の男性14,105人を最長1999年末まで追跡して把握された尿路上皮がん罹患・死亡者(42症例、膀胱癌34例、尿管癌3例、腎孟癌6例)と、症例と年齢および地域をマッチさせた124対照を解析対象として条件付きロジスティック回帰でオッズ比(OR)を求めた。αカロテンの高位群でOR=0.63、p=0.41、傾向性p=0.38、βカロテンの高位群でOR=0.28、p=0.07、傾向性p=0.08、総カロテノイドの高位群でOR=0.31、p=0.06、傾向性p=0.09と尿路上皮がんのリスクを下げる傾向がみられたが、キサントフィル、レチノール、α・βトコフェロール、superoxide dismutaseではリスク低下を示さなかった。前立腺がんに関しては、昨年の報告後、全対象者(52症例、151対照)、総テストステロン正常値者(40症例、101対照、昨年報告)、さらに前立腺特異抗原(PSA)が症例10ng/ml以下、対照4ng/ml以下の者(28症例、69対照)のデータセットについて解析を行い、いずれのデータセットでも、おおむね植物エストロゲン(ゲニスティン、ダイゼイン、エクオール)の血清濃度が高いほど前立腺がん予防効果が示された。
新規ビタミンK合成酵素UBIAD1の骨特異的欠損マウスの作出と生理的意義の解明

我々は、骨芽細胞に特異的に発現するosterixプロモーターの下流にCreを発現するマウスを用いて、骨芽細胞特異的なUbiad1遺伝子ノックアウトマウスを作出した。作出したマウスは、体長や体重が野生型と比較して著しく低値を示した。また、UBIAD1タンパク質の機能解析を行った。その結果、UBIAD1は種を超えて高度に保存された領域が4ヶ所存在することが明らかとなった。さらに、UBIAD1の点変異解析からコレステロールの合成量やUBIAD1の細胞内局在が変化するアミノ酸を見い出した。以上のことから、骨に対するUBIAD1の役割やUBIAD1タンパク質の構造機能的特徴の一端を明らかにした。ヒトが主に食事から摂取するビタミンKはphylloquinone(PK)であるが、体内の組織中に存在するビタミンKの大部分はmenaquinone-4(MK-4)である。これまでに我々は、PKを摂取後、小腸で側鎖が切断され側鎖を持たないmenadione(MD)となり、各組織中でUbiA prenyltransferase domain containing protein 1(UBIAD1)によってMK-4へ変換されることを科学的に証明した。これまでに、骨に対するUBIAD1の役割は全く報告されていないが、我が国では骨粗鬆症治療薬としてMK-4が臨床応用されているように、ビタミンKと骨との関係はこれまでに多くの報告がある。そこで本研究では、ビタミンKの標的組織である骨に対するUBIAD1の生理的機能を明らかにする目的で、骨特異的なUbiad1遺伝子欠損マウスを作出し詳細な表現型解析を行った。これまでに我々は、全身性のUbiad1遺伝子欠損マウスを作出するため、Ubiad1遺伝子を2個のloxP配列で挟んだUbiad1 flox/floxマウスを作出した。このマウスと骨芽細胞に特異的に発現するosterix(osx)プロモーターの下流にCreを発現するosx-Creマウスを交配し、骨芽細胞特異的なUbiad1遺伝子ノックアウト(Ubiad1 osx-/-)マウスの作出に成功した。現在、作出したUbiad1 osx-/-マウスの表現型解析を行っており、各週齢における体重の変化やリン、カルシウム、オステオカルシンなどの骨に関連する血液マーカーの挙動、動物用マイクロCTを用いた骨組織の形態計測等を行っている。これまでに我々は、PKを摂取後、小腸で側鎖が切断され側鎖を持たないmenadione(MD)となり、各組織中でUbiA prenyltransferase domain containing 1(UBIAD1)によってMK-4へ変換されることを科学的に証明した。本研究では、ビタミンKの標的組織である骨に対するUBIAD1の生理的機能を明らかにする目的で、骨特異的なUbiad1遺伝子欠損マウスを作出し詳細な表現型解析を行うとともに、Ubiad1遺伝子の欠損に伴うMK-4生合成の破綻に起因する骨芽細胞および破骨細胞の発生・形態異常などを解析した。これまでに我々は、骨芽細胞に特異的に発現するosterix(osx)プロモーターの下流にCreを発現するosx-Creマウスを用いて、骨芽細胞特異的なUbiad1遺伝子ノックアウト(Ubiad1-cKO)マウスの作出に成功した。作出したUbiad1-cKOマウスは、体長や体重が野生型と比較して、著しく低値を示した。現在、摘出骨の組織標本を作製しオステオカルシンなどの骨関連タンパク質の蛍光免疫染色など骨形態計測を行っている。また、Ubiad1-cKOマウスの作出中にUBIAD1タンパク質の機能解析を合わせて行った。UBIAD1の酵素反応特性を検討した結果、pH8.59.0の塩基性条件下、0.1 mM以上のDTT存在下においてMK-4合成活性が最も高いことが分かった。そこで、UBIAD1の相同性解析を行った結果、UBIAD1には種を超えて高度に保存された領域が4ヶ所存在することが明らかとなった。さらに、UBIAD1の点変異解析からコレステロールの合成量およびUBIAD1タンパク質の細胞内局在が変化する変異体を見い出した。本研究から、骨に対するUBIAD1の役割やUBIAD1タンパク質の構造機能的特徴の一端を明らかにした。骨芽細胞特異的なUbiad1遺伝子ノックアウト(Ubiad1 osx-/-)マウスの作出に成功し、表現型の解析から興味深い知見が得られたため。

また、UBIAD1自身のの酵素活性ドメインや基質認識領域など、本酵素の構造的特徴および酵素活性中心を解明するため、UBIAD1のpoint mutantおよびdeletion mutantを作製し、酵素としての構造的特徴の解明を行った。変異体には、生物種を超えて高度に保存されているアミノ酸やこれまでにUBIAD1の変異によって角膜の白濁を引き起こすシュナイダー角膜ジストロフィー(SCD)に関連することが報告されているアミノ酸に対する変異体を作製した。変異を導入したアミノ酸をターゲットにmutationを行い、バキュロウイルス発現系ベクターに導入したのち、昆虫細胞(Sf9細胞)にバキュロウイルスを感染させ、ビタミンK合成活性を評価した。本年度には、変異体を用いたUBIAD1の構造機能解析の結果がまとまり論文化出来たため。分子栄養学骨芽細胞特異的なUbiad1遺伝子ノックアウトマウスの表現型解析を詳細に行う。また、骨芽細胞を用いて、siUbiad1によりUbiad1遺伝子ノックダウンした細胞およびCRISPR/Cas9システムを用いたUbiad1遺伝子ノックアウト細胞を樹立し、骨芽細胞の発生、形態異常、機能異常にUbiad1およびMK-4がどのような役割を有するかを評価する。さらに、骨吸収に対するUBIAD1の役割を明らかにするため、初代培養したマウスの大腿骨由来骨髄細胞およびマウスマクロファージ由来株化細胞(RAW264.7細胞)にM-CSFおよびRANKL、活性型ビタミンD等を加え破骨細胞を形成し、TRAP染色を行い評価する。この破骨細胞にUbiad1遺伝子ノックダウンプラスミドをエレクトロポレーション法により導入し、Ubiad1遺伝子をノックダウンした破骨細胞を樹立することで、破骨細胞に対するUbiad1およびMK-4の役割を明らかにする。本年度は2年の研究期間を設けた1年目であり、研究費を全て消費するよりも次年度に必要なものを購入するために、少額ではあるが残高として12339円を残した。本年度の残高と次年度配分予定の研究経費は、実験試薬等に使用する。また、学会発表や論文発表を通じて研究成果を公表するためにも研究費を使用する。
トランスクリプトーム関連解析によるコムギうどんこ病菌非病原力遺伝子の網羅的単離

うどんこ病菌の宿主特異性を決める遺伝子を同定するために、コムギに感染するうどんこ病菌(コムギ菌)とカモジグサに感染するうどんこ病菌(カモジグサ菌)をいろいろな種類の栽培コムギと野生コムギの葉に接種し、感染の有無を調査した。ほとんどのコムギ系統において、コムギ菌とカモジグサ菌に対して感染を許さなかったが、一粒系コムギのTriticum urartuと野生コムギAegilops umbellulataでは、コムギ菌とカモジグサ菌に対する抵抗性と罹病性が分離した。F1菌系を感染したコムギ葉のRNAシークエンシングをおこない、F1菌系間の転写産物の比較解析から宿主特異性を決める候補遺伝子を絞り込んだ。平成26年度は、コムギに感染するうどんこ病菌(コムギ菌)とカモジグサに感染するうどんこ病菌(カモジグサ菌)をいろいろな種類の栽培コムギと野生コムギの葉に接種し、感染の有無を調査した。2倍体の一粒コムギTriticummonococcum, T. urartuと野生近縁種T. boeoticum, Aegilops umbelulataを中心にコムギ菌とカモジグサ菌に対する病害抵抗性を調べた。その結果、当初の予想と異なり、調査したT. monococcumとT. boeoticumのほとんどの系統が、コムギ菌とカモジグサ菌に対して感染を許さなかった。一方、T. urartuのいくつかの系統では、コムギ菌とカモジグサ菌の両方の感染が観察された。Ae. umbelulataは、コムギ菌、カモジグサ菌に対して、感染を許す系統と許さない系統に分離した。Ae. umbellulataにおいて、コムギ菌、カモジグサ菌に対する病害抵抗性の程度に多様性があることがわかった。コムギ菌とカモジグサ菌を交配したできたF1菌系のうち、宿主抵抗性に関与する非病原力エフェクター遺伝子を全て持たない菌系、1つもつ菌系、2つもつ菌系、3つもつ菌系に着目した。感染葉でこれらの菌系で発現している宿主特異性に関与する非病原力エフェクター遺伝子を同定するために、感染葉からRNAを抽出した。抽出するにあたって、より多くのRNAが、宿主由来でなく、菌由来にするため、RNA抽出法を検討した。その結果、コムギ菌をオオムギの裏表皮に感染させ、18時間から20時間後に裏表皮細胞を剥がし、その裏表皮細胞のみを使うことで菌由来のRNAの割合を高めることができた。現在、RNAシーケンシングを実施するために、ライブラリーを作成中である。コムギに感染するうどんこ病菌(コムギ菌)とカモジグサに感染するうどんこ病菌(カモジグサ菌)をいろいろな種類の栽培コムギと野生コムギの葉に接種し、感染の有無を調査した。これらの分離した系統を用いることで、コムギ菌とカモジグサ菌を交配したできたF1菌系の抵抗性と罹病性を評価することが可能になった。F1菌系のうち、宿主抵抗性に関与する非病原力エフェクター遺伝子を全て持たない菌系、1つもつ菌系、2つもつ菌系、3つもつ菌系に着目した。抽出するにあたって、より多くのRNAが、宿主由来でなく、菌由来にするためにRNA抽出法を検討した。その結果、F1菌系をオオムギの裏表皮に感染させ、18時間から20時間後に裏表皮細胞を剥がし、その裏表皮細胞のみを使うことで菌由来のRNAの割合を高めることができた。抽出したRNAを用いてRNAシークエンシングを実施した。また、F1菌系を感染したコムギ葉からもRNAを抽出し、RNAシークエンシングをおこなった。F1菌系間の遺伝子発現量の比較解析を実施し、候補遺伝子を絞り込んだ。更に、コムギに感染するいもち病菌に候補遺伝子を形質転換し、形質転換いもち病菌を利用して非病原力エフェクター遺伝子であるかを評価する実験系を確立した。当初の研究計画に比べて遅れている。まず、カモジグサ菌の感染性が弱く、感染の程度を評価するのに時間がかかってしまった。また、2倍体の一粒コムギにおいて、コムギ菌とカモジグサ菌への感染の程度に多様性がなかったため、関連解析を実施するのに十分なデータを得ることができなかった。RNA抽出法では、考えていた以上に菌側由来のRNA量が少ないために、RNA抽出法を検討する必要がでてしまった。そのため、当初予定したよりもライブラリー作成までの時間がかかった。

27年度が最終年度であるため、記入しない。植物病理学、植物遺伝学RNAシーケンシングライブラリーが完成後、ただちにRNAシーケンシングを実施し、候補遺伝子を絞り込む。バックアップ実験として、1つの非病原力遺伝子をもつF1菌系に紫外線を照射し、非病原力遺伝子を破壊した変異体を同定する。当初、EMSを変異源に使う予定であったが、扱い易さから紫外線に変更する。計画通り、親菌系とF1集団46菌系のエフェクター候補遺伝子のアンプリコンシーケンシグを実施する。ただし、候補遺伝子数が少ない場合は、アンプリコンシーケンシグ法にこだわらず、PCR法も検討する。また、得られた候補遺伝子について、バクテリアのタイプIII分泌タンパク質の系(Sharma et al. 2013)を利用して、非病原力エフェクター遺伝子であることを確かめる予定であったが、コムギに感染するいもち病菌に候補遺伝子を形質転換し、形質転換コムギいもち病菌を利用して非病原力エフェクター遺伝子であるかを評価する方法に変更する。
農村高齢者の生活問題に関する社会経済的研究

日本の高齢化率は従来「西高東低」の傾向を示していたが、しだいに均等化しつつある。代わりに、大都市圏と小規模市町村で高齢化が進むという形の地域分布に変わってきている。特に、後者の高齢化は急速である。しかも、過疎地ほどそのピークは早く、地域社会の早期崩壊が予測されるほどの危機的状況に至っている。そうした状況下にある農村高齢者の生活問題は、経済的・社会的・身体的自立の観点から総合的に捉えないと解明できない。本研究ではその一歩として、主に鳥取県東伯町を対象にアンケート調査と聞き取り調査を実施し、「高齢者の増加による問題」ではなく「高齢者自身の問題」を明らかにすることに努めた。その結果わかった主要な点は以下の通りである。第1に農村高齢者の生活問題は家族形態によって異なっている。単身世帯及び夫婦世帯の場合には経済的自立が重要である。年金の不十分さのゆえに、働かざるをえない。第2に、高齢化問題一般に関する意識は、40歳代以下と50歳代以上で明瞭な違いがある。特に、「いえ」の「扶養共同体」的性格の評価や高齢者介護の担い手について、そうした傾向が認められる。第3に、「元気な高齢者」を対象とするケアハウスであっても、地元ではなお入居に対する忌避感が根強い。世間体や施設への無理解などが、その要因である。第4に、ケアハウス入所者は、労働や体を動かす機会を強く求めている。調査地では「JAとうはく」がケアハウスを設置したため、農園や温室も整えられている。ここに、農協主導型の高齢者福祉の強みがある。1本年度の研究実施内容本研究は交付の決定が11月末と遅かったため。本年度に実施した研究結果を深める時間的な余裕がなく、基本的に次年度の準備に終わった。本年度は以下の4点について研究を進めた。(1)農村高齢者対策の制度的枠組みの把握。厚生省、農林水産省、全国農協中央会などによる高齢者対策といくつかの「市町村老人保健福祉計画」を検討した。その結果、高齢者の生活問題は多面的であるにも関わらず、施策の枠組みは医療・福祉・介護、所得・就業・生きがい・社会関係などに分断されており、相互の関係が弱いことが分かった。(2)高齢者対策先進地域の施策理念。岩手県沢内村を対象に、資料を収集したが、その詳細な分析は今後に残している。(3)農村高齢者の全国動向の分析。農村高齢化の地域性に着目し、その差を生み出す社会経済的条件を統計的に分析中である。(4)次年度における本調査のための地域予備調査。とくに鳥取県東伯町の農協主導による高齢者福祉と徳島県貞光町における退職者農業に焦点を合わせて、基礎調査を実施した。2次年度の計画高齢者福祉対策を農協主導型と行政主導型の2類型に分け、前者の例として鳥取県東伯町を、後者の例として岩手県沢内村を取り上げ、それぞれについてアンケート調査とライフヒストリーの聞き取りを行う。また、本年度の調査の中で、高齢者施策と農業との関連の薄さが明らかとなったが、そうした一般的傾向と異なる取り組みをしている徳島県貞光町で聞き取りを行い、その普及条件を探る。農村高齢者が抱えている生活問題は、医療や福祉の観点あるいは農業生産力の観点からだけでは解けない。農村高齢者自身の立場にたって、経済的・社会的・身体的自律を総合的に可能とするような地域経済社会構造が必要なのではないか。このような問題意識にたって、実態調査を行ってきた。今後分析を急ぎ、さしあたり平成9年度の地域農林経済学会大会シンポジウム及び日本村落研究学会大会の口頭発表と学会誌投稿によって、研究成果を公表する予定である。現段階において明らかになっていることは次のとおりである。(1)農村高齢者の生活問題は家族形態によって異なる。

ことに、単身世帯及び夫婦世帯の場合には、経済的自立が依然として大きな問題として残る。年金の不十分さのゆえに、働かざるを得ない状況が存在している。(2)農業従事者の高齢化は否定的に捉えるべきでなく、地域によっては定年退職者の組織的リクルート活動を行うことによって、経営体としてばかりでなく、地域農業の担い手としても成長する可能性がある。ただし、農協や行政の支援システムが重要である。(3)ケアハウスのような比較的元気な高齢者を対象とするものであっても、農村高齢者の中には入所を厭うきらいがある。一方、在宅介護は農業労働・家事労働とともに中高年女性に集中しがちで加重負担をもたらす。そこで、施設介護と在宅介護を結ぶ地域的システムが必要である。
流動中の溶融金属中の温度履歴計測による金属凝固時の特性評価

本研究は,湯の充填挙動や凝固後の組織に大きな影響を与える溶湯の流動初期段階から凝固完了までの温度履歴を計測するシステムの開発を行うとともに,溶湯の任意の位置における温度履歴を直接測定することにより,鋳造プロセスの高度化を目指すことを目的とした.温度測定には光ファイバ式温度計を用いて,溶湯中に埋没させて測温部である光ファイバの周辺を黒体状態とすることにより,測定時の応答性と精度を確保した.流動中の溶湯の状態は,光ファイバ温度計により溶湯中の温度を測定し,その結果から固相率を算出することにより実施した.また,温度から算出した固相率の妥当性を確認するため,溶湯の焼入れ試験を実施して画像処理により固相率を算出し,その結果と比較することにより実施した.溶湯の流動中のその場観察の結果,最終的な流動長に対しておよそ8割程度まではほぼ一定の速度で流動するが,その後は急激に速度が低下して流動停止した.また,流速の大きさは金型温度により変化したが,流速が低下し始める箇所はいずれも流動長に対しておよそ8割の位置であった.その結果から光ファイバ温度計を溶湯中に埋没させて,流動中の温度変化を取得した結果,固相が徐々に成長しながら流動している様子を確認できた.流速が低下し始める箇所では急激に固相率が増加し,その値はおよそ0.3であった.しかし,その後は固相率は若干低下し始めて,最終的に流動停止した湯先の固相率はおよそ0.2であった.この結果を用いて温度と固相率の関係を算出し,コンピュータシミュレーションにより湯流れ解析を実施した.その結果,流動溶湯の肉厚方向での固相率の分布が確認でき,金型に近い箇所では溶湯内固相率が流動に伴って大きく変化していることを明らかにできた.本研究は,凝固完了後の製品から推定するしかなかった湯流れ・凝固過程における溶融金属の状態の変化を詳細に評価し,それが最終的な鋳物の特性にどのように影響するかを明らかにする.そのための方法として,流動中の溶湯温度変化の連続的取得とその結果をもとにしたコンピュータシミュレーションによる総合的な検討を実施する.H28年度は,観察装置の開発および温度履歴の取得を目的として実施した.流動中の溶湯を高速度カメラにより撮影し,その画像解析結果をもとにしてファイバ温度計により流動中の溶湯の任意の位置を連続的に取得することができた.また,その測定結果の妥当性を評価するため,流路中に複数の熱電対(素線径0.32mm)を配置して定点計測を実施した.その結果,温度の測定値に最大で5°C程度の違いがあった.この値の違いは型内を流動する溶湯の測定位置の違い,つまり測定する位置に対する計測器の位置決め精度に起因すると推察されるため新たに設計をして対応している.連続的に温度を計測した結果を観察すると,溶湯先端の流動が停止した瞬間において溶湯先端部より若干根元側の箇所において最も温度が低かった.つまり,流動時の溶湯先端部より固相率が高い結果となった.この結果は,熱電対を用いた定点計測結果でも同様の結果であった.今回実験に使用したアルミニウム合金は,従来からマッシー型の流動停止機構であるといわれている.しかし,本結果は必ずしもマッシー型のみで決定するものではないことを示唆するものであった.現在,この結果の裏付けとなるデータの信頼性を高めるべく継続して実験を実施している.H28年度は,流動する溶融金属の先端位置から溶湯内温度履歴を連続的に取得する計測装置の開発とそれによる温度履歴の取得を到達目標とした.まず,計測装置の開発については実験の過程で課題を見出し,その課題を解決するための新たな対策方法とそのための設計が完了した.当初想定した計測装置の仕様を十分に満足はしていないものの,おおむね満足する結果となっている.次に,本装置を使用して流動中の温度履歴を計測することに成功した.また,その結果は十分に妥当なものであると判断している.本研究は,溶融金属のある任意の位置における湯流れ・凝固過程での温度履歴をリアルタイム計測し,その結果から鋳物の湯流れ時における限界固相率および機械的特性への影響を総合的に評価することを目的としている.初年度の成果として,開発した計測システムにより温度履歴を取得することができた.しかし,湯流れ時の溶融金属中の計測目標位置の位置決め精度が不十分であると推測された.そこで,新たに装置を改造して再度計測実験をした結果,従来装置と比較して目標とする計測位置の精度が向上した.この結果から温度測定結果を検証した結果,K熱電対(素線径0.32mm)による定点観察結果と比較して±3°C程度のずれとなった.この測定結果のずれの要因を様々な点から検討したが,明確な理由が不明であり,光ファイバ温度計を移動させながら計測する本システムの限界であろうと考えている.今回改良した計測システムを使って湯先の流動停止時の温度分布を測定した結果,やはり湯先部より根元側の箇所での温度低下が最も高かった.つまり,流動停止時の固相率は先端部より根元側に近い位置で最も高くなることが明らかとなった.

この結果は従来から言われているマッシー型の流動停止機構とは異なるものである.取得した鋳物の材料試験を実施し,特に硬さと温度履歴の関係を検討した.しかし,現時点では流動中の温度履歴より流動停止から完全に凝固するまでの冷却速度のほうが影響する結果となっている.温度履歴を考慮した評価方法を検討する必要がある.初年度の課題を解決するために,2年度は装置の改造に注力した.その結果,測定位置の位置決め精度を向上させることができた.しかし,温度履歴と機械的特性の関係を十分に考察できていない.本研究は,湯の充填挙動や凝固後の組織に大きな影響を与える溶湯の流動初期段階から凝固完了までの温度履歴を計測するシステムの開発を行うとともに,溶湯の任意の位置における温度履歴を直接測定することにより,鋳造プロセスの高度化を目指すことを目的とした.温度測定には光ファイバ式温度計を用いて,溶湯中に埋没させて測温部である光ファイバの周辺を黒体状態とすることにより,測定時の応答性と精度を確保した.流動中の溶湯の状態は,光ファイバ温度計により溶湯中の温度を測定し,その結果から固相率を算出することにより実施した.また,温度から算出した固相率の妥当性を確認するため,溶湯の焼入れ試験を実施して画像処理により固相率を算出し,その結果と比較することにより実施した.溶湯の流動中のその場観察の結果,最終的な流動長に対しておよそ8割程度まではほぼ一定の速度で流動するが,その後は急激に速度が低下して流動停止した.また,流速の大きさは金型温度により変化したが,流速が低下し始める箇所はいずれも流動長に対しておよそ8割の位置であった.その結果から光ファイバ温度計を溶湯中に埋没させて,流動中の温度変化を取得した結果,固相が徐々に成長しながら流動している様子を確認できた.流速が低下し始める箇所では急激に固相率が増加し,その値はおよそ0.3であった.しかし,その後は固相率は若干低下し始めて,最終的に流動停止した湯先の固相率はおよそ0.2であった.この結果を用いて温度と固相率の関係を算出し,コンピュータシミュレーションにより湯流れ解析を実施した.その結果,流動溶湯の肉厚方向での固相率の分布が確認でき,金型に近い箇所では溶湯内固相率が流動に伴って大きく変化していることを明らかにできた.まず,計測方法の一部改良を実施する.H28年度に明らかとなった課題に対する対応策を計測装置に組み込んだうえで計測装置を完成させる.次に,本装置を使用して各種鋳造条件による温度履歴を取得する.また,その温度履歴が鋳物の機械的特性に及ぼす影響を引張試験,硬さ試験により評価するとともに,凝固組織の観察を実施することによって温度履歴が鋳物の特性に及ぼす影響について調査,検討を行う.引き続き,温度履歴取得実験を実施し,得られた鋳物の組織観察と材料試験を行うことによって温度履歴との関係を考察する.また,コンピュータシミュレーションにより今回得られた温度履歴をシミュレートできるようなパラメータを検討するとともに,その結果を使って鋳物の構造解析を実施することによって総合的に評価する.
エンテロウイルスレセプター分子の構造と機能

ウイルス感染による種特異的組織特異的病原性の発現は、第一義的には細胞表面に発現しているレセプター分子の有無で決定される。エンテロウイルス70(EV70)はヒトの、しかも眼結膜にのみ感染し、急性出血性結膜炎をおこすウイルスであるが、レセプター分子の構造と機能を解明することが本ウイルスの病原性を理解するうえで重要である。はじめにEV70感受性ヒト由来細胞の表面に結合し、EV70感染阻止能をもつモノクローン抗体(mAb)と放射能ラベルした精製EV70ウイルス粒子を用い、種々の細胞での結合活性と結合阻止能を調べた。mAb存在下では50%の結合阻止が見られたが、この阻止活性はmAbの濃度を上げていっても、通常エンテロウイルスレセプター抗体で観察されている90%以上の阻止能は見られず、阻止効果は部分的であった。ウイルス粒子との結合能をより直接的に調べるため、本mAbが認識していると思われる分子のクローニングを行った。HeLa細胞由来mRNAを真核細胞発現ベクターに組み込みライブラリーを作製し、mAbによるパニング法でスクリーニングした結果一ヶのクローンを得た。塩基配列の解読から、本分子は細胞表面にあって、補体の活性発現の制御に重要な役割を演じている蛋白と同一の塩基配列をもっていた。マウスおよびブタ由来細胞を用い安定な形質転換細胞を作出した。また、リコンビナントバキュロウイルスを作製して昆虫細胞で蛋白を発現した。現在、これらの細胞とウイルス粒子との結合活性について実験が進行中である。
関数方程式と特殊関数の大域的研究

2.Painleve方程式について,そのPainleve propertyの証明を統一的な方法で与えた。3.III型およびV型のPainleve方程式の解をそのuniversal covering上で考え,その増大度を評価した。4.I型Painleve方程式の高階版についての解の増大度を下から評価した。これにより,極,α-点についての頻度を評価することができた。5.I型Painleve方程式の高階版に関して、一つの新しい連立系表示を与えた。またそのPainleve propertyを証明した。6.二重周期係数をもつRiccati型方程式について,その解の増大度の評価を与えた。1.Pain leve超越関数I, II,IVについて,その位数の上からの評価を得ることができた.さらに,Iについては下からの評価も得ることができ,位数5/2であることが証明された.また,II,IVについては,別の方法で下からの評価を得ることに成功した.なおこれらの評価は位数自身よりも精密なT(r,f)そのものに関するものである.2.Pain leve方程式の解がすべて有理型であることの統一的な証明を得ることができた.つまり,IVIまでのすべてのPain leve方程式について適用される方法で証明することに成功した.さらに,この方法は,より弱いPain leve的性質をもつ方程式にも応用されることが期待される.3.二重周期関数を係数にもつRiccati型方程式について,その周期解を決定することができた.また,その周期は必ず二重周期であり,単周期解は存在しないことが証明された.4.高階Pain leve方程式でI型に相当するものについて,その有理型関数の極の個数を下から評価することができた.Painleve方程式およびその高階版についての研究をおこなった.以下の成果を得た.1.III型およびV型のPainleve方程式の解の増大度をuniversal covering上で考え,ある種の有限性をもつことを示した.2.II型およびIV型のPainleve方程式の解の増大度の下からの評価を求めた.それらは,それぞれ,3/2以上,2以上であることを証明した.3.I型Painleve方程式の高階版についてその解の増大度を下から評価した.これにより,極,α-点についての頻度を評価することができた.これらの結果はI型Painleve方程式の解についての結果の拡張になっている.4.I型Painleve方程式の高階版に関して,一つの新しい連立系表示を与えた.またそのPainleve性を証明した.5.その他,二重過期係数をもつRiccati型方程式について,その解の増大度の評価を与えた.
気泡ウエイク構造を利用した溶融塩浴活性金属液滴エマルジョン化による高速共還元法

溶融塩中で電析した液体金属Me(Me = Ca、Li、またはそれらの合金)を用いた、酸化物XOx-1(X = Ti、Zrなど還元が困難な元素)の直接熱還元において、酸化物とMeとの反応界面の制御は重要な要素である。溶融塩浴中のMeエマルジョン化現象を理解するために、Me-溶融塩界面の高速顕微鏡によるその場観察と多相系SPHモデルによる力学解析を実施した。不活性気泡流のみならず、電極界面付近での微小領域対流の影響が無視できないことが新たにわかった。本現象と制御された電位との相関を新たに見出し、これはコロイドMeの空間的な不均一性が、局所溶解性や界面張力分布形成に寄与する可能性を示唆した。鉄鋼業などから排出される高温CO2の大気放散を低減させる技術として、CO2を電気化学的に他の物質に転換する方法がある。申請者は、還元反応が高速で、比較的低温で溶融するLiCl-KCl溶融塩を用いたCO2分解に成功しており、本法では、自然エネルギー由来の電力で十分還元できる。しかし、低温では結合力の強いCO2の化学反応速度は著しく遅くなることが課題であり、還元剤の液体Liは、反応後に自身が固体酸化物として析出し、熱還元反応を阻害する問題も同時に顕在化する。そこで本研究では、気液対流場を最適化し、電解析出したLiをエマルジョン化することで反応界面積を著しく増大する着想に至った。CO2気泡ウエイクを用いた気液対流場による液体Liとの接触界面積増大をねらいとし、還元速度向上を試みたが、大きな向上はみられず、気泡運動量の界面積向上への寄与は限られることがわかった。これについて、分散相に適用可能な数値流体力学シミュレーションであるSPH法を用いた力学解析により、溶融塩中の金属液滴の分散特性は、液相間界面エネルギー、密度比によって比較的簡便に記述できるが、気泡通過時の界面曲率に対して鋭敏な感度をもつことを明らかにした。また、融体界面の直接観察により気-液-液界面にはミクロンオーダーの薄い金属液膜が生じることが分散の一因となることが明らかとなった。以上の得られた知見より、気泡流に加え補助的な遠心力による攪拌効果を付加した懸濁流動場中での電気化学測定を実施したところ、電流特性が流速に対して鋭敏な感度を持つことがわかった。本補助金の申請と並行しながら行った独立行政法人石油天然ガス・金属鉱物資源機構JOGMECとの共同研究で得た知見を有効に活用し、流動場のその場観察ならびに数値解析を実施できた。計画していた実施内容が実行できたものと判断した。溶融塩中の酸化物イオンO2-の溶解性は酸化物還元速度に強く影響するので、溶融CaCl2はO2-イオンと液体Ca金属の両方が高い溶解度を示す魅力的な溶媒とされ広く用いられている。純粋なTiにおける液体Ca金属脱酸を例に挙げると、100mass ppmO未満の非常に低い酸素レベルを達成することが報告されているが、電解Caを用いた直接共還元法ではそのレベルに達するのは未だ困難である。溶融塩中Me(= Ca、Liまたはそれらの合金)を用いた酸化物XOx-1(s)の熱還元の場合、陰極近傍に溶解したMe(l)を伴うことが必須であり、XOx-1(s)はカソードその近くに配置される。このメカニズムでは、陰極と酸化物が直接電子的に接触しなくても還元が進行する。したがって、この方法の還元効率は、電解析出Me(l)および溶融塩界面の形態によって大きく影響される。723K、Li-LiCl-KCl-Li2O系の場合、Li2Oの溶解度はLi2Oの含有量とともに増加することが見出されており、真の溶解に加えてLiのコロイド微粒子溶解が起こることを示唆している。最近では、コロイドLiの生成は線形電流密度に強く依存し、電流密度はその形成を引き起こすことが示唆されている。さらに、ラマン分光法によるその場観察により、電析Liと溶融LiCl界面に生成する物質がリチウムクラスターLi8と一致しているとの報告もある。溶融塩界面で生じるコロイド状Liが電流集中によって影響を受けるならば、本現象には、二融体界面のモルフォロジーが影響を及ぼすことが示唆される。本年度は、数値流体力学的手法の開発の進展、溶融塩中での溶融金属電析時における電気化学的応答、ならびに高速顕微鏡で得られた結果を広く解析することにより二融体界面の分散形態の調査を行った。主に電気化学測定とその場観察実験で進展があった。LiCl-KCl-Li2O溶融塩における生成液滴Liの形態を検討するために、まず、本系におけるCV測定から0.0、0.1 mol% Li2Oのいずれの場合も、約-2.5 V vs. Ag+/Ag付近で、カソード電流および対応するアノード電流の急激な増加が観察され、それぞれLiの析出と析出物の溶解に起因すると考えられるが、大きな変化は見られなかった。瞬間的な電流効率はLi2O添加によって増加した。コロイドLiの生成量がLi2Oの添加によって減少したことを確認し、これは従来知見と一致する。金属Liの溶解量は浴中のLi2Oの含有量の増加に依存しないことが報告されているので、コロイドLiの生成は真のLi溶解量との関係性を見出されなかった。また、機械的攪拌によりTiO2を流動化したときの電気化学的挙動を調査した。

流速増加により-1.5V付近からの電流増加が生じた。しかしながら、回転速度の増加に伴って、溶解に対応する電流ピークは減少傾向を示した。この原因として液体Liの電極からの離脱が考えられる。電析液体Liの一時的な界面挙動を理解するために、Moカソード上で-2.55Vまたは-2.75V vs. Ag+/Agで1.00秒間のCA測定および電極の高速撮影を行った。電流-時間曲線に対応する電極表面画像よりMo電極の表面に液滴が形成されて成長することが判明した。液相析出物はMo表面上で不均質に成長する。電気毛細管現象を考慮すると、液滴の電荷と電極内の電荷との間の静電引力のために、界面のエネルギーが減少し、電極の濡れ性が向上するはずであるが、液滴は電極表面上に完全には濡れなかった。この知見は、二融体間界面張力が分極中であっても液滴形成の支配的要因と成りうることを示している。以上の知見を収集できたため、おおむね順調に進んでいると判断した。溶融塩中に電解生成する金属液滴特性について力学的に検討するために、定電位電解時の電極付近の高速顕微鏡観察および液-液界面に働く力とその流動モデル構築に取り組んだ。溶融LiCl-KCl共晶塩(m.p: 626K)について、Moカソード上で電解析出した液体Liと溶融塩との界面挙動の詳細な可視化を行った。電位の印加とともに初期に微小液滴が生成、時間の経過に従って液滴同士が集まり成長していく様子、滴の成長と電流値の対応、コロイダルメタル(金属霧)の拡散が確認されたが、コロイダルメタルによる液滴界面形状への直接的な影響は十分に明らかにはならなかった。これは、融体液滴と生成したコロイダルメタルとの相互作用が見出される必要があり、そのためにはより観察に適した系を探索する必要がある。そこで、CaCl2-LiCl共晶塩を対象に析出金属挙動のその場観察を行った。電極表面は金属性の光沢と同時に黒色のコロイダルメタルに覆われ、析出したCa-Li合金は銀白色の析出物と黒色コロイダルメタルの2種類の形態として存在し、自発的に六角形のセル状となり電極表面を移動することが明らかとなった。この対流メカニズムとして、分散相同士が電気的中性を保持するための電気的凝集、あるいは電解反応による急激な温度勾配あるいは濃度勾配により生じる対流の影響が示唆される。一方、密度比、粘性比、液相間界面エネルギーおよび界面曲率に依存した力をSmoothed Particle Hydrodynamics(SPH)モデルに導入し、時間発展的に液-液界面変形を記述することができた。気泡導入による対流場形成に加え、上述の電極近傍セル状マイクロスケール流は、わずかな界面張力差でも相対的に大きな流速が生じることが示唆された。この流速に起因した流動は、電極付近での混合過程に効果的な寄与をもたらすことが期待される。溶融塩中で電析した液体金属Me(Me = Ca、Li、またはそれらの合金)を用いた、酸化物XOx-1(X = Ti、Zrなど還元が困難な元素)の直接熱還元において、酸化物とMeとの反応界面の制御は重要な要素である。溶融塩浴中のMeエマルジョン化現象を理解するために、Me-溶融塩界面の高速顕微鏡によるその場観察と多相系SPHモデルによる力学解析を実施した。不活性気泡流のみならず、電極界面付近での微小領域対流の影響が無視できないことが新たにわかった。本現象と制御された電位との相関を新たに見出し、これはコロイドMeの空間的な不均一性が、局所溶解性や界面張力分布形成に寄与する可能性を示唆した。
ABO式血液型遺伝子の転写調節の解明と上流域の突然変異に基づく血液型亜型の検索

フコース転移酵素FUTの産生物であるH抗原が、ABO式血液型合成酵素が触媒する反応の基質となるため、ABH抗原の生合成にはABO遺伝子とFUT遺伝子が共発現することが要求される。本研究結果から、ABO遺伝子の上流域にはN-boxがあり、このN-boxに蛋白が結合し、転写抑制に関わることが示された。N-boxにはbHLH型の転写抑制因子が結合することが知られている。ところで、FUT遺伝子の上流域を検索するとE boxがあり、bHLH型の転写因子が転写の活性化に関わっていることが推測された。N-boxに結合する転写抑制因子は他のbHLH型の転写活性化因子とヘテロダイマーを形成し、転写を抑制することが知られているので、FUT遺伝子においてはbHLH型の転写抑制因子がbHLH型の転写活性化因子とヘテロダイマーを形成し転写を抑制し、ABO遺伝子ではbHLH型の転写抑制因子が上流域に結合して転写を抑制することが予想された。逆に、このbHLH型の転写抑制因子が減少すれば、FUT遺伝子においてはbHLH型の転写活性化因子により転写が活性化され、ABO遺伝子ではbHLH型の転写抑制因子による転写抑制が解除され転写が活性化され、ABO遺伝子とFUT遺伝子が共発現することが予想された。以上のような血液型抗原の合成における、連続して触媒作用を行う糖転移酵素は遺伝子発現レベルで協調して発現・作用するというモデルに到達した。フコース転移酵素FUTの産生物であるH抗原が、ABO式血液型合成酵素が触媒する反応の基質となるので、ABH抗原の生合成にはABO遺伝子とFUT遺伝子が共発現することが要求される。平成15年度にはABO遺伝子の上流域にはN-boxがあり、このN-boxに蛋白が結合し、転写抑制に関わることを示した。N-boxに結合する転写抑制因子は他のbHLH型の転写活性化因子とヘテロダイマーを形成し、転写を抑制することが知られているので、FUT遺伝子においてはbHLH型の転写抑制因子がbHLH型の転写活性化因子とヘテロダイマーを形成し転写を抑制し、ABO遺伝子ではbHLH型の転写抑制因子が上流域に結合して転写を抑制する。逆に、このbHLH型の転写抑制因子が減少すれば、FUT遺伝子においてはbHLH型の転写活性化因子により転写が活性化され、ABO遺伝子ではbHLH型の転写抑制因子による転写抑制が解除され転写が活性化され、ABO遺伝子とFUT遺伝子が共発現することが予想される。以上のような血液型抗原の合成における、連続して触媒作用を行う糖転移酵素は遺伝子発現レベルで協調して発現・作用するというモデルを考案した。平成16年度には、ABO遺伝子の上流域のN-boxに結合する蛋白を同定することを目標とする。方法はN-boxに結合する転写抑制因子に関する情報があることから特異抗体を用いたスーパーシフト法を用いる。また、N-boxに結合する蛋白を簡単なカラムを用いて分離し、電気泳動した後にプロテオーム解析も予定している。

N-boxに結合する転写抑制因子は他のbHLH型の転写活性化因子とヘテロダイマーを形成し、転写を抑制することが知られているので、FUT遺伝子においてはbHLH型の転写抑制因子がbHLH型の転写活性化因子とヘテロダイマーを形成し転写を抑制し、ABO遺伝子ではbHLH型の転写抑制因子が上流域に結合して転写を抑制することが予想された。逆に、このbHLH型の転写抑制因子が減少すれば、FUT遺伝子においてはbHLH型の転写活性化因子により転写が活性化され、ABO遺伝子ではbHLH型の転写抑制因子による転写抑制が解除され転写が活性化され、ABO遺伝子とFUT遺伝子が共発現することが予想された。以上のような血液型抗原の合成における、連続して触媒作用を行う糖転移酵素は遺伝子発現レベルで協調して発現・作用するというモデルに到達した。
超音波エネルギーが細菌のバイオフィルム形成に及ぼす影響の研究

表皮ブドウ球菌が生成したバイオフィルムに対し超音波を照射すると、これまで報告されてきた超音波強度よりも弱い強度でも、24時間照射すればバイオフィルムは破壊されることがわかった。さらに、培養皿に表皮ブドウ球菌液と液体培地を混和し、ここに超音波を照射することによって、超音波照射はバイオフィルム生成阻害にも寄与することが判明した。また、バイオフィルム生成の初期段階に超音波を照射すれば、より短時間の照射でも(20分)バイオフィルム形成阻害効果があることが証明された。これらより、カテーテル関連バイオフィルム血流感染症の発症予防に超音波照射が有用でありさらに実現可能であることが示唆された。バイオフィルムの形成は、当大学附属病院入院患者から分離された菌株で行った。入院患者より分離されたStaphylococcus epidermidisを3株入手し、どの株がもっとも多くのバイオフィルムを形成するか検討した。また、バイオフィルム形成の至適条件も検討した。まず、至適培地の検討を行った。Trypric Soy Broth (TSB), TSB+Horse Serum (HS), Brain Heart Infusion (BHI), BHI+HSの4種類の培地で検討し、TSB単独でそれを生理食塩水で3倍に希釈したものがもっとも適した培地であることがわかった。さらに、培養時間についても検討した。24時間・48時間・72時間の培養時間で比較した。24時間ではバイオフィルムの形成には短すぎ、72時間の培養では溶菌することがわかり、36時間程度が至適培養時間であることがわかった。培養方法は、振盪しながらふ卵器内で培養・ふ卵器内で静置して培養の2方法で検討したが、ふ卵器内で静置して培養したほうがより多くのバイオフィルムを形成することができた。その後、上記でえられた結果をもとに、バイオフィルムを6穴wellのひとつに形成し、超音波を照射した。超音波照射機器は当教室にすでに設置されている超音波照射機器を用いた。超音波照射条件は、周波数は1MHz,連続波,照射時間は24時間,超音波強度は12W/cm2とした。この条件のもとでは、超音波照射群は非照射群と比較して有意にバイオフィルム定量値が低下した。以上のことから、超音波照射によってバイオフィルムを破壊できる可能性が示唆された。また、人体への安全性が確認されている、骨折治療に使用する「セーフス」(帝人ファーマ株式会社)を超音波照射機器として、同様の実験を行った。(超音波強度30mW/cm2,パルス波,照射時間20分)セーフス照射群とセーフス非照射群とではバイオフィルム定量値に有意差はなく、セーフスはこの条件下では、バイオフィルムを破壊することは困難であることがわかった。平成26年度は、バイオフィルムの形成はバイオフィルム産生株Staphylococcus epidermidis ATCC35984を輸入して行った。平成25年度と同様にバイオフィルムを6穴wellのひとつに作成し超音波を照射した。超音波照射条件は周波数は1MHz、連続波、照射時間は24時間で、超音波照射強度は平成25年度よりも下げ、5 W/cm2と2.5W/cm2で検討した。両条件でも超音波照射群は非照射群と比較して有意にバイオフィルム定量値が低下した。平成25・26年度の結果より超音波照射によってバイオフィルム量が減少したと判断できる。また、超音波照射群のバイオフィルム定量値は5 W/cm2・2.5 W/cm2で変化がなかった。以上よりある一定の超音波強度以上の強度では、バイオフィルムを減少させる力が変化ない、すなわちバイオフィルムを減少させる超音波強度の閾値の存在が示唆された。well内のバイオフィルムはある程度の超音波強度によって減少することが明らかになったため、実際に臨床で使用されている中心静脈カテーテル内に超音波を照射するため、まずカテ内にバイオフィルムを作成し、それを定量する方法を考案した。中心静脈カテーテルに菌液を注入し30時間37°Cの孵卵器に入れる。その後カテーテル内を30mlの生理食塩水で洗浄し、バイオフィルム非形成菌を排除する。もう一度カテーテル内に生理食塩水を充填する。生理食塩水を充填したカテーテルを超音波洗浄装置に5分かけ(カテーテル内壁にバイオフィルムとともに付着している菌を剥離する)、回収した生理食塩水中の生菌数をバイオフィルム定量値とした。また、昨年度研究の推進方策としてあげた、「バイオフィルムを産生する株の同定」については前実験において良好な結果を得られなかったため、本実験は行っていない。平成26年度同様、「細菌の培養とバイオフィルムの作成」に約3日要し、更に手元にある超音波照射機器を用いると1回の照射(24時間)につき1wellのみしか照射できないため、統計的処理に必要な実験数を得るために時間を要した。したがって電子顕微鏡による形態評価が未施行である。また、バイオフィルムを破壊しうる最小の超音波強度の決定は未だできていない。しかし、手元の超音波照射機器では2.5W/cm2以下の超音波強度の照射は不可能であるため、wellでの実験を終了し、臨床の現場で実際に使用されている中心静脈カテーテル内への超音波照射(in vitro)に移行することとした。これにあたり、平成27年度の後半には中心静脈カテーテルへのバイオフィルムの作成方法とその定量的評価方法の確立を行った。