hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
小児例に対する無肝期における体外循環シシステムに関する研究

バイパス後,動脈圧は1020%減少し,収縮期圧は120140mmHgで維持された.腎動脈血流量は約10%の減少であった.平均バイパス流量は1520ml/kg/min,平均回転数は10001500RPMであった.無肝期バイパス下において最低2時間の循環動態の安定化が認められた.次にBioーPumpによるバイパス下にて11回の肝移植実験を行った.チューブの屈曲,回転数の上げすぎによる脱血量の低下,空気の混入によるari eriboliなどの問題点が生じたが,チューブの工夫や,チームワークの強化により,これらの問題は解消された.バイパス流量,回転数は方法(1)と同様であった.バイパス回路より1520ml/kgの急速輸血により,血圧の変動は全く認められなくなった.現在バイパス時の腸管のうっ血は全くみられず,血液ガス,凝固能,血清生化学検査値において,無肝期1時間の変化はほとんど問題になっていない.又,バイパスチューブ中に,臨床的に問題となる程の血栓は一例も認められなかった.シャントの不調は腸間膜のうっ血をひきおこし,これは移植後のアシドーシスを助長させる.BioーPumpの回路中にリザーバーを置くことにより,流量メーターとリザーバーのチェックによって事前に腸間膜うっ血を回避することが可能となるのである.今後本実験にPGI_2付加時についての検討を加え,さらにrecipient体重10kg前後を目標としたBioーPumpによる理想的体外循環法を追求する予定である.1.対象および方法:(1)体重15kg前後の雑種ブタを用いてveno-venous bypass下にシレピエント手術手技に従い、肝全摘を行う。バイパス流量を5ml/kg-45ml/kgまで変化させたときの無肝期の各循環動態指標(平均動脈圧;MAP、心拍数、中心静脈圧;CVP平均肺動脈圧:MPA、肺動脈せつ入圧:PWP、心拍出量;CO、体血管抵抗;SVR、心室仕事量;LVSW)を測定した。(2)ドナー手術手技に従い、肝摘出し、4°C乳酸加リンゲル液に単純冷却浸漬した。1時間後常温下に門脈、肝動脈より37°C生理食塩水を注入し、肝静脈より得られた潅流液を採取した。また肝移植実験時、門脈循環再開前に10ml/kg肝静脈脱血を行い、最初と最後の血液を採取した。(3)以上の結果にもとずき、前年度に引続き、新たに、イヌ(n=7)およびブタ(n=9)の同所性肝移植を行った。2.結果:(1)MAPはバイパス流量(BF)20ml/kg以上で100mmHgを越え、以後漸増した。COはBF増加に伴い、同様に増加し、R=0.66、P<0.01で単回帰直線として表された。SVRはBF20ml/kg以後、減少率は低下し、20ml/kg以上の範囲では著名な変動はみられなかった。MPA、LVSWは漸増したが、バイパス前値以下であった。心拍数、CVP、PWPはほとんど変化はみられなかった。以上よりバイパス流量は20ml/kg以上が望ましいと考えられた。(2)潅流実験ではカリウム濃度を5meq/1へさげるには600ml以上のflush outを必要としたが、肝移植実験において10-15ml/kgの脱血により、肝静脈血中のカリウム濃度は10.8から6.4meq/1へと有意に減少した。以上より10-15ml/kgの脱血により門脈循環再開後のhyperkalemiaは緩和されうると考えられた。(3)イヌ肝移植では、術後自発呼吸の比較的長く(10時間以上)認められたものについてはGOTが高値となる傾向が認められた。ブタ肝移植では術後12-18時間にGOTの低下、凝固能の回復がみられており、この間がgraft failureに移行するcritical pointである可能性が示唆された。
三次元収束型自己磁場絶縁大強度パルス軽イオンビームダイオードの開発と動特性評価

本研究は、本学に設置されている大電力パルスパワー発生装置“ETIGO-II"を用いて、我々が開発した新型自己磁場絶縁イオンビームダイオード(“三次元収束型プラズマフォーカスダイオード(SPFD)")の動作特性をはじめて実証したものである。本研究を通じて、次の結果が得られた。1.SPFDを“ETIGO-II"に取り付け動作特性を調べたところ、時間的に非常に安定であり、パルスパワー発生装置の特性インピーダンス(6.5OMEGA)にほぼ一致する。2.ピンホールカメラ及びシャドウボックスを用いて、イオンビームの収束性を測定したところ、イオンビームは直径0.5mm、長さ2.5mmの円筒領域に三次元的に収束する。3.バイアスイオンコレクター及び核放射化法を用いて、イオン電流を測定したところ、実験的に求められたイオンビーム電流効率は3040%である。4.二次元の静電的粒子シミュレーションを行い、SPFDギャップ間の電荷、電流及び電磁界の空間分布を明らかにし、イオンビームの偏向は主にギャップ間の電磁界分布の不均一に起因することが判明した。又、電極形状を最適化することにより、イオン電流効率及びイオンビームの収束性を更に改善できることが分かった。今後の課題としては、イオン種の評価及び収束性の向上が挙げられる。
内耳高発現ミオシン6アイソフォームの機能解析を起点した不動毛形成機構の解明

ヒト/マウスの難聴原因遺伝子であるミオシン6(Myo6)は複数のアイソフォームが存在する。我々は、内耳有毛細胞で高発現する9塩基のマイクロエクソン(miExon)が挿入されたMyo6アイソフォームを同定し、そのアイソフォームのみを欠失したマウスが重度難聴を生じることを明らかにした。本研究は、樹立したマウスの詳細な病態を解明し、その機能を明らかにすることを主要な目的として、本年度は以下の実験を実施した。Myo6-miExon欠失マウスの聴力を聴性脳幹反応(ABR)および歪成分耳音響放射(DPOAE)で測定することにより評価した結果、ABR波形はわずかに得られるものの、野生型と比較して振幅の低下および潜時の遅延が認められた。さらに、外有毛細胞の音刺激に対する反応をDPOAEで調査した結果、その値は検出できなかった。これらのことから、Myo6-miExon欠失マウスの難聴は外有毛細胞の障害を起因とし発症することが示唆された。次に、走査型電子顕微鏡を用いて生後4日齢のMyo6-miExon欠失マウスの不動毛を観察した結果、内有毛細胞の不動毛は野生型と類似していたが、外有毛細胞の不動毛はMyo6突然変異体マウスが示す不動毛の融合や不動毛基底部のtaper領域の消失は認められないものの、不動毛の配向パターンに限定して異常が認められた。さらに、外有毛細胞の平面内極性を制御するPCP(planar cell polarity)の異常が原因で不動毛形態異常を生じることが示唆されたため、線毛マーカーを用いてその形成位置を生後0日齢で調査した。その結果、Myo6-miExon欠失マウスからは野生型では認められないMedial側への移行を示唆するデータが得られた。以上の結果から、3残基挿入MYO6は外有毛細胞の不動毛形成に関与する必須のアイソフォームであり、その発生に重要な役割をもつことが強く示唆された。本研究で計画当初に予定していたMyo6-miExonのタンパク質の精製は、既に用意していたユビキタスに発現するMYO6タンパク質を用いた解析でタンパク精製を再検討する必要があることが判明したため、進行が遅れている。また、Myo6-miExonはマウスにおいて胎齢期での発現が認められ、幼齢期を含む有毛細胞の表現型を中心として解析を進めたため、予定していた有毛細胞で発現する新規MYO6アイソフォームの同定および変異体マウスの作製を本年度は実施できなかった。本年度の解析によってMyo6-miExonが内耳外有毛細胞において特徴的な役割をもつことが示唆された。次年度はその役割をより詳細に明らかにするため、継続して感覚毛形態の詳細な表現型および発現解析を実施する。また、Myo6-miExonの分子モーターとしての機能を調査するためタンパク質精製後、キネティクス解析を試みる。加えて、新規MYO6アイソフォームの同定は他生物種間のシークエンスアライメントの結果から有毛細胞での発現を確認し、ゲノム編集個体の樹立を目指す。

また、Myo6-miExonはマウスにおいて胎齢期での発現が認められ、幼齢期を含む有毛細胞の表現型を中心として解析を進めたため、予定していた有毛細胞で発現する新規MYO6アイソフォームの同定および変異体マウスの作製を本年度は実施できなかった。本年度の解析によってMyo6-miExonが内耳外有毛細胞において特徴的な役割をもつことが示唆された。次年度はその役割をより詳細に明らかにするため、継続して感覚毛形態の詳細な表現型および発現解析を実施する。また、Myo6-miExonの分子モーターとしての機能を調査するためタンパク質精製後、キネティクス解析を試みる。加えて、新規MYO6アイソフォームの同定は他生物種間のシークエンスアライメントの結果から有毛細胞での発現を確認し、ゲノム編集個体の樹立を目指す。本年度に実施予定としたタンパク質精製および新規MYO6アイソフォームの同定およびゲノム編集個体作製に着手できなかったため、次年度使用額が生じた。次年度使用額は、表現型および発現解析のための試薬等の消耗品購入に使用し、タンパク質精製およびキネティクス解析のための消耗品購入、およびゲノム編集個体作製に使用する。
C型肝炎治療抵抗性を示すウイルス因子と宿主因子の解析

C型肝炎ウイルス(HCV)の治療効果因子としてインターフェロン(IFN)により誘導されるIFN誘導遺伝子(ISG)からコードされる宿主蛋白に注目し解析を行った。研究者は(1)新たなHCVレプリコン増殖細胞(Huh7/Rep-Feo)を樹立することに成功し、次に(2)ISG:GBP-1,IFI-6-16,IFI-27がHCV増殖を制御することを確認した。ISG発現蛋白とHCV蛋白との相互作用について解析を行い、(3)GBP-1蛋白とNS5B蛋白が相互作用を示した。さらに解析を進めGBP-1のGTPaseドメインとNS5B fingerドメインが相互作用をすることを確認することを確認した。1.新たなHCVレプリコン増殖細胞の作成:ネオマイシン耐性遺伝子とルシフェラーゼリポーター遺伝子の融合遺伝子を発現するキメラリポーターHCVレプリコン(Rep-Feo)RNAをHuh7細胞に導入し,G418選択によりFeoレプリコン恒常発現細胞株を(Huh7/Rep-Feo)を樹立した。細胞株樹立の確認には、細胞から抽出した蛋白をもとにルシフェラーゼアッセイを行った。2.HCVレプリコンHuh7/Rep-Feo細胞については、HCVジェノタイプ1bと2aの2種類を作成することができた。レプリコンRNAは、northern blottingにて確認し、ウイルス蛋白発現はwestern blottingよりHCV非構造蛋白NS5A蛋白の存在にて確認した。3.インターフェロン誘導遺伝子(ISG)発現プラスミドベクターの構築:Human Liver cDNA library発現プラスミドを用いて,PCR法により遺伝子を増幅し,ISG発現プラスミドベクターを構築した。構築したISG:IP10, IL8, MxA,PKR,GBP-1,IFI-56K,25OAS,IFP35,IRF-9,IFI-6-16,ISG15,IFI-27,PLSCR1,TRAIL,LMP7-E,9-27,RIG-G,IRF-1。それぞれのプラスミドベクターを培養細胞へ遺伝子導入したあと、細胞から蛋白抽出して、western blottingを行って、それぞれの蛋白発現を確認した。HCVレプリコン細胞でHCV増殖に対して抑制的に作用したISG (GBP-1, IFI6-16, IFI-27)が、HCV感染培養系でも抑制的に作用することが確認された。HCV感染倍養系は、in vitroでHCVウイルス粒子を産生する培養系であるので、このシステムで増殖抑制作用があることが確認できたことの意義が大きい。・ISGに対するHCV非構造蛋白の作用機序の解析HCV増殖を抑制するISGとしてGBP-1,IFI6-16,IFI-27を研究者たちが確認したので、これらのISG発現蛋白とHCV非構造蛋白(NS3/4A,NS4B,NS5AおよびNS5B)と相互作用を示すかをそれぞれの蛋白発現プラスミドを用いて免疫沈降法にて解析した。その結果、ISGのGBP-1とHCV非構造蛋白NS5Bが相互作用を示すことが確認された。ISG蛋白への作用エピトープを特定するため,GBP-1のtruncate plasmidを作成し、GBP-1 truncate発現プラスミドとHCV非構造蛋白NS5B発現プラスミドとをHuh7細胞へcotransfectionし,蛋白を回収して,免疫沈降法で相互作用を解析した。その結果、GBP-1のGTPaseドメインがHCV-NS5Bに直接結合することが確認された。さらに、NS5AのどのドメインとGBP-1のGTaseドメインが結合するかを確認するためにNS5B truncate発現プラスミドとを用いて免疫沈降法で確認したところ、NS5B finger domainとGBP-1が結合することが確認された。GBP-1がHCV増殖に対して抑制的な作用を示すのは、HCV-NS5Bに直接結合することによるものと示唆されたが、NS5BがGBP-1に結合して、GBP-1の抗ウイルス作用を阻害する可能性も示唆された。この解明については今後の課題である。HCVレプリコン細胞としてキメラリポーターHCVレプリコン細胞を作成することができた。またHCVジェノタイプ1b由来のキメラリポーターHCVレプリコン細胞に加えて、HCVジェノタイプ2aについても作成することが出来た。HCV増殖を制御するISGとして、研究代表者らはGBP-1, IFI6-16, IFI-27を同定していたが、今回、HCVレプリコン増殖細胞にて、HCV増殖抑制効果があることを確認することが出来た。

2.ISG蛋白とHCV非構造蛋白との相互作用の解析(免疫沈降法,Two hybrid法):HCV非構造蛋白を発現するプラスミドベクターを作成する。作成するHCV非構造蛋白:NS3, NS4B, NS5A, NS5B。申請者らが同定したGBP-1, IFI-6-16及びIFI-27を発現するプラスミドベクターとHCV非構造蛋白発現プラスミドベクターを293T細胞へ遺伝子導入し,蛋白質を回収する。回収した蛋白質を用いて,免疫沈降法にて解析する。さらに免疫沈降法の他に,酵母two-hybrid systemを利用したmammalian two-hybrid systemを用いる。HCV非構造蛋白をDNA結合ドメインと融合させた蛋白発現プラスミドベクターと,ISG発現蛋白を転写活性ドメインと融合させた蛋白発現プラスミドベクターを構築する。両者とルシフェラーゼ発現ベクターを,Huh7細胞へ導入する。ISGとHCV非構造蛋白が相互作用を示せば,ルシフェラーゼがレポーターとして発現するので,レポーターアッセイを行い解析する。肝臓病学1.ISG発現を抑制するsiRNAの作成ととHCV感染培養系への影響:ISG mRNAを標的とするsiRNA(shRNA発現プラスミド)を作成する。作成したsiRNAをISG発現プラスミドベクターとともにHuh7細胞へ遺伝子導入し,western blottingにより,蛋白発現抑制について確認する。作成したsiRNAをGenotype2a JFH1株由来HCV感染培養細胞に導入して,培養上清中のHCVコア抗原を測定する。2.ISGに対するHCV非構造蛋白の作用機序の解析:HCV非構造蛋白と相互作用を示すISGが同定できたら,ISG蛋白への作用エピトープを特定するため,ISGのtruncate plasmidを作成する。ISG truncate発現プラスミドベクターとHCV非構造蛋白とをHuh7細胞へcotransfectionし,蛋白を回収して,免疫沈降法で相互作用を確認する。免疫沈降法で,相互作用を示すものを,mammalian two-hybrid systemでも確認する。免疫沈降法やmammalian two-hybridsystemで相互作用を示したISGに対して,HCV非構造蛋白が,ISG蛋白合成に影響を及ぼしているかを解析する。Huh7細胞へHCV非構造蛋白発現プラスミドベクターを導入し,細胞外にIFNを一定時間作用させ,細胞蛋白やRNAを回収する。ISGの蛋白合成や転写活性に影響を与えているかどうかをwestern blottingやRT-PCR法で確認する。試薬等が計画当初より廉価で購入可能であったため。検討する数・種類を拡大して解析を行うため、試薬を増量して購入する予定である。
大豆イソフラボンの食欲抑制効果の消化管を介した新規機構の解明

ダイゼインを摂取した際、エコールは血中よりもはるかに多く胆汁中に存在することが見出された。ダイゼイン摂取時の胆汁を、他のラットの十二指腸より注入したところ、飼料摂取量が低下する傾向が見られた。この際、食欲抑制ホルモンコレシストキニンの小腸粘膜遺伝子発現が有意に上昇し、プレプログルカゴンおよびペプチドYYにも上昇の傾向が見られた。しかしコレシストキニン感受性欠損ラットでもエコールの摂取により飼料摂取量が有意に低下した.我々は、大豆イソフラボン・ダイゼイン腸内細菌代謝産物エコールが雌特異的に飼料摂取量を減少させることを見出し、その機構解明を目指している。これまでの検討より我腸肝循環エコールが直接、小腸粘膜で食欲抑制を指令する消化管ホルモンの分泌を増加させ、飼料摂取量を減少させるという仮説を立て、無麻酔無拘束下でダイゼイン摂取時に採取したエコール高含有胆汁をダイゼイン無摂取ラットの十二指腸に直接注入し、飼料摂取量や小腸粘膜遺伝子発現に与える影響を検討している。本研究では腸肝循環モデルを精査することを目論んでいたが、これらの研究過程で一部研究ロットでダイゼインの効果が十分に確認できない事例が見られ、研究に支障が出てきた。これについてデータを検証したところ搬入するラットの生育所によりダイゼイン→エコールの変換能が大きく異なる可能性が示唆された。本研究では複数の異なる生育所よりラットを入手しダイゼインの効果および血中エコール濃度を比較し、実験に支障の無いラットの入手の確保を試みた。またこの間当初の予定の代替案として、ダイゼイン摂取ラットより採取したエコール高含有胆汁の代わりに純粋なエコールによる胆汁モデル溶液を用いた実験を試みた。ダイゼイン→エコールの変換能の低い生育所が特定され、その後はこの生育所以外よりラットを入手することにより、良好な結果を得ることができた。代替案として行った胆汁モデル溶液の注入実験では、驚いたことにダイゼインを摂取させたラット胆汁と同じ濃度の純粋エコールが含まれているにもかかわらず、飼料摂取量が低下することは無く、注入初期(3時間まで)には有意ではないが、飼料摂取量が逆に増加する傾向が見られた。同様の実験を繰り返したが再現された。胆汁中のエコールの存在形態(抱合型)が作用に重要であるか、ダイゼイン摂取時に胆汁中に現れるエコール以外の物質が作用していると推測された。先の研究で、エコールは腸肝循環し小腸に比較的多量に存在すること、ダイゼイン混餌投与によって小腸粘膜のコレシストキニン(CCK)mRNA量が増加することが示された。これらから我々は、腸肝循環エコールが直接、小腸粘膜で食欲抑制を指令する消化管ホルモンの分泌を増加させ、飼料摂取量を減少させるという仮説を立てた。そこで無麻酔無拘束下でダイゼイン摂取時に採取したエコール高含有胆汁をダイゼイン無摂取ラットの十二指腸に直接注入し、飼料摂取量や小腸粘膜遺伝子発現に与える影響を検討した。しかし、この際血中エコール濃度も短時間で高い値となってしまい、作用点が小腸であるか、体内の他の部位であるか判断できなかった。本研究ではエコールを非経口投与した場合に短期的な食欲抑制効果をもたらすか、小腸以外の重要な作用点である脳に食餌されたエコールが到達し得るかを検討するとともに、腸肝循環モデルを精査し、エコール高含有胆汁注入量を先の試験の約3分の1に改め、先の高含有エコール胆汁注入実験を再検討し、エコールの腸肝循環が食欲抑制効果に関与するか検証することにした。またCCK感受性欠損動物により、エコールの作用がCCKを解しているか検証した。ダイゼイン摂取により血液中のエコール濃度は上昇したが脳脊髄中ではエコールは検出できなかったことより、エコールは中枢に達していないことが示唆された。エコールを皮下投与しても4日間では飼料摂取量に影響は見られなかったことより、エコールは腸肝循環してはじめて作用する可能性が示唆された。一方で小腸よりの食欲抑制シグナルの最有力候補であったCCKの感受性が欠損したラットにおいてもダイゼインは飼料摂取量を低下させ、CCKの機構への関与は否定された。我々は大豆イソフラボン・ダイゼイン腸内細菌代謝物エコールがメスラット特異的に飼料摂取量を減少させることを見出し、その機構解明を目指している。これまでの検討により、腸肝循環エコールが直接、小腸粘膜で食欲抑制を指令する消化管ホルモンの分泌を増加させ、飼料摂取量を減少させるという仮説を立て、無麻酔無拘束下でダイゼイン摂取時に採取したエコール高含有胆汁をダイゼインを摂取していないラットの十二指腸に直接注入し、飼料摂取量や小腸粘膜および視床下部遺伝子発現に与える影響を検討している。

本研究では腸肝循環モデルを精査することを目論んでいたが、これらの研究過程で一部研究ロットでダイゼインの効果が十分に確認できない事例が見られ、研究に支障が出てきた。これについてデータを検証したところ、搬入するラットの生育所によりダイゼイン→エコールの変換能が大きく異なる可能性が出てきた。昨年度の研究で複数の異なる生育所よりラットを入手しダイゼインの効果および血中エコール濃度を比較し、ダイゼイン→エコール変換能が高いラットを生育している生育所を見出し、良好な結果を複数回確認した。本年度はこのラットを用いて、ダイゼイン摂取時の胆汁を取得し、先に述べた十二指腸注入実験を行った。また、一昨年の検討で用いた投与量では血中エコール濃度が注入開始から短時間で、混餌投与実験では見られなかった高濃度になり、投与量が高すぎると考えられたため、投与量を1/3にして再検討した。しかし、予想外なことに、本年度の実験において、エコール高含有胆汁を与えても、飼料摂取量の変更を再現することはできなかった。実験系をさらに精査する必要がある。栄養科学研究実績の概要で述べたラット入手先の生育所の違いの効果発現への影響の確認に時間を要した。また、この検証を行っている間に当初計画の代替案として行った検討により、作用物質の特定につながる新たな可能性が浮上し、実験計画の変更が必要となった。作用部位の特定作業は順調に進み、消去法も交えながら「腸肝循環しながら消化管で作用する」機構が確立されつつある。一方で同一メーカー、同一系統のラットでも供給施設の違いにより食欲抑制効果の発現に差異が見られた。血中イソフラボン代謝物濃度にもこれと符合する差異が見られたことから、イソフラボンの腸内細菌代謝が異なる可能性が浮上した。これについて過去数年のデータの照会作業によりやや進度が遅れ、また、詳細な遺伝子発現等の解析を次年度に繰り越した。当初より企画していた無麻酔無拘束下でダイゼイン無摂取ラットの十二指腸に試験溶液を直接注入し、飼料摂取量や小腸粘膜遺伝子発現に与える影響を検討する系において、ダイゼイン摂取時に採取したエコール高含有胆汁と、純粋エコールを用いエコール高含有胆汁と同じエコール濃度で調製した胆汁モデル溶液について効果を比較する。エコール高含有胆汁については、エコールの存在形態をLC-qTOF等で探るとともに、エタノール抽出や固層抽出等の簡便な精製処理により抱合型エコールの組成製を行い、先と同様のラット十二指腸注入実験を行う。上述の効果の差異と生育所の関係について検証実験を行ない、生育所を指定して動物を安定化させる必要がある。予定外の1から2試験を設定する必要がある。実績報告に述べた一昨年度に生じた研究遂行上の不具合を解消するための追加実験により、実験計画が当初より若干遅れたため、当初予定していた実験の遂行が次年度に持ち越しとなったため。前年度より持ち越された実験計画を遂行するために使用する。当初の当該年度計画と並行して行うが十分遂行可能と判断している。ラット納入業者が所有する3箇所の生育所よりそれぞれラットを入手し、大豆イソフラボンを混時投与し、食欲抑制効果の発現を比較するとともに、血中イソフラボン濃度を測定し、最適な生育所を決定する。これについては大きな費用は伴わない。生育所を決定次第、昨年度予定の腸肝循環する大豆イソフラボン代謝物が小腸および中枢の食欲関連因子の発現に与える影響を詳細に解析する。
聴覚受容に関与するイオンチャネルの解析と難聴モデルマウスの作成

我々は内耳の有毛細胞にASIC1b(Acid sensing ion channel 1b)が発現していることを見いだした。in situハイブリダイゼーション法による解析ではASIC1bは、外有毛細胞に強く発現し、内有毛細胞にも発現が認められた。さらに、免疫組織化学法を行ったところ、ASIC1bイオンチャネルは有毛細胞において感覚毛がクチクラプレートに接する部分にのみ限局して分布していることが分かった。そこでASIC1bのノックアウトマウスを作成し聴覚検査を行ったところ、まだ予備実験の段階ではあるが部分的な難聴を示した(東京医科歯科大学喜多村教授との共同研究)。感覚器は微小な器官であるがゆえ生化学的な研究が難しく、感覚器に特異的に発現する遺伝子の多くは重要な機能を担っているにも関わらずその研究が立ち遅れてきた。本研究では内耳の有毛細胞の感覚毛に特異的に局在する聴覚の受容に関与する遺伝子の同定を目指す。さらに、これらのチャネルの有毛細胞における分布の微細構造を明らかにすると同時に機械刺激に応答するイオンチャネルとしての機能を解析する。そして、この遺伝子のノックアウトマウスを作成し、実際に聴性脳幹反応(ABR)、耳音響放射(OAE)を測定し、難聴をきたしているかどうか解析し、難聴モデルマウスの作成を目指す。我々は、感覚器に特異的な遺伝子の解析を進めてきた。その過程で内耳のcDNAライブラリーを作製し、内耳特異的な遺伝子の検索を行ってきた。また、内耳特異的候補遺伝子について、内耳でのin situハイブリダイゼーション法によりmRNAの発現部位を検索した。その結果、内耳の有毛細胞に発現するイオンチャネル遺伝子(ASIC1b)を見いだした。さらに細胞内局在を検討するため、このイオンチャネルに対する抗体を作製し免疫組織化学法を行ったところ、ASIC1bイオンチャネルは有毛細胞において感覚毛がクチクラプレートに接する部分にのみ限局して分布していることが分かった。この領域は感覚毛が振動するときに、機械刺激の負荷がかかる部分なので興味深い。ASIC1bはASIC1aのスプライシングバリアントであるが、ASIC1aの方は内耳では、ラセン神経節に発現していてるが、コルチ器の有毛細胞には発現していなかった。そのため、ASIC1bを特異的にノックアウトするマウスを作成するためASIC1bのcDNAの配列を元にゲノムデータベースより、目的の遺伝子のゲノム上の位置を特定し、マウスゲノムライブラリーからASIC1の遺伝子のゲノムを得た。ASIC1bを特異的にノックアウトするベクターを構築し、エレクトロポレーションによってES細胞にベクターを導入しG418による選択培養を行い、相同組換えの起こったクローンを選出し、マイクロインジェクション法によりキメラマウスを作成した。このキメラマウスの交配後、ジャームライントランスミッションを確認し、ヘテロマウスを作成した。現在このF1マウスを交配中である。今後、C57BL/6とバッククロスを行い、聴覚検査を行う予定である。内耳の有毛細胞に局在する聴覚受容に関与する分子として酸感受性イオンチャネル遺伝子ファミリーに属する2つのサブタイプを同定した。まだ、予備実験の段階ではあるが、東京医科歯科大学耳鼻咽喉科学教室の喜多村先生のグループとの共同研究でこれらのノックアウトマウスに、軽度から中等度の難聴を生じる結果を得た。今後、聴性脳幹反応(ABR)、耳音響放射(OAE)などの聴覚機能検査の詳しい解析を行う必要がある。両者のダブルノックアウトマウスはさらに重篤な聴覚障害をきたす可能性があるが、この2つのサブタイプの遺伝子が隣接して染色体上に並んでいるため、様々な工夫をしてダブルノックアウトマウスの作成に取り組んでいる。これらの酸感受性イオンチャネルが聴覚の受容にどの様に関与するかを生理学的に内耳有毛細胞を用いて解析するためには、酸感受性イオンチャネル対する選択的な阻害剤を用いる必要がある。しかし、酸感受性イオンチャネルに特異的な阻害剤はあまり存在していないので、我々は、酸感受性イオンチャネル(ASICs)の選択的阻害剤を検索するために、各種サブタイプを発現させたアフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いて電気生理学的にスクリーニングした。その結果、6-amidino-2-naphthyl p-guanidinobenzoatedimethanesulfonateが選択的阻害薬として作用することを証明した。今後この薬剤を用いて聴覚の機械刺激応答性イオンチャネルの電流がブロックされるかパッチクランプ法を用いて検討する予定である。内耳の有毛細胞に局在する聴覚受容に関与するイオンチャネルとして酸感受性イオンチャネル遺伝子ファミリーの2つのサブタイプASIClbとASIClaを同定し、両者のイオンチャネルがコルチ器の有毛細胞に発現していることを示した。また、これらのイオンチャネルが、低浸透圧などの細胞膜の張力を増加させる条件下で、活性化することを示した。

この二つのサブタイプの中でも内耳の内有毛細胞や外有毛細胞に発現している最も主要なサブユニットと考えられるASIClbのノックアウトマウスを作成し聴覚検査を行ったところ、部分的な難聴を示した(東京医科歯科大学喜多村先生との共同研究)。走査電子顕微鏡や共焦点レーザー顕微鏡を用いてASIClbのノックアウトマウスの内耳の有毛細胞を形態学的に観察したところ、感覚毛、チップリンク、ホリゾンタールトップコネクターなどの内耳の微細構造は正常に保たれていたので、部分的な難聴の原因はASIClbのチャネル機能が消失したことが、主な原因ではないかと考えられた。そこで、現在ASIClaとASIClb遺伝子の共通部分に挿入部を入れたベクターを構築し、ASIClaとASIClbのダブルノックアウトマウスを作成中である。また、このイオンチャネルと協力して聴覚受容に関わると考えられるT型カルシウムチャネルが内耳の有毛細胞に発現していることを明らかにし、その特性を電気生理学的に解析した。我々は内耳有毛細胞で聴覚受容に関連するイオンチャネルとしてASIC1bを同定したが、さらに実験を進めることにより、このASIC1bと共役するサブユニットとしてASIC1aが考えられた。ASIC1aとASIC1bは同一遺伝子から生じるスプライシングバリアントなので両者の共通領域を標的にノックアウトマウスを作成することにより、両者のダブルノックアウトマウスを作成することができる。その方法として、マウスゲノムライブラリーをスクリーニングし目的のASIC1遺伝子のゲノムを得、ベクターのデザインを決め、ゲノム配列を元にベクターを構築した。エレクトロポレーションによってES細胞にベクターを導入し、G418による選択培養を行い、相同組換えの起こったクローンを選出し、マイクロインジェクション法によりキメラマウスを作成し、キメラマウスの交配後、ジャームライントランスミッションを確認し、ヘテロマウスを作成した。C57BL/6とバッククロスを行い、最終的にホモのASIC1a/ASIC1bダブルノックアウトマウスを作成した。このASIC1bとASIC1aのダブルノックアウトマウスを用いて、ABR(Auditory Brainstem Response;聴性脳幹反応)とDPOAE(Distortion Product Otoacoustic Emission;歪成分耳音響放射)の二通りの方法で他覚的聴覚検査を行ったところ、まだ予備実験の段階ではあるがASIC1b単独のノックアウトマウスよりも重篤な聴覚障害を示すマウスが一部存在した(東京医科歯科大学喜多村先生との共同研究)。今後、ダブルノックアウトマウスの繁殖を進め、さらに詳細な解析を進める。
計算画像診断から展開する先進複合材料の複雑系力学

複合材料構造生産の高度化のためには,繊維・樹脂から成る力学微視構造に依存する三次元微視的変形を追跡し,製造後の残留応力低減や強度・長期耐久性向上の観点から,複合材料の力学微視構造を最適化することが必要不可欠である.そこで,赤外線サーモグラフィに基づく複合材料の疲労損傷累積過程の評価法,および,イメージベース計測に基づく織物プリフォームの賦形に伴う局所変形の評価法を確立した.これらの評価法により,材料の疲労損傷累積過程および基材の賦形過程に影響する微視力学因子を明らかとした.さらに,材料内の繊維配置等の微視力学的情報を考慮して複合材料の巨視的力学特性を解析する繊維変形シミュレーションを構築した.複合材料構造成形におけるプリフォーム技術の高度化のためには,繊維・樹脂から成る力学微視構造に依存する三次元微視的変形を追跡し,製造後の初期微視構造を制御し残留応力低減を図る試みや強度・長期耐久性の観点から力学微視構造を最適化する試みが必要不可欠である.そこで本研究では,先進複合材料の製造から強度・信頼性までをマイクロメカニクスの観点から系統的に評価することを目的に,近年著しく発達してきた可視化計測技術と画像処理技術を複合材料分野への導入を図り,構造の成形や賦形および構造強度や長期耐久性に影響を及ぼす微視力学因子について明確にすべく,研究を遂行した.1.平織複合材料を対象として,長期耐久性の指標の一つである疲労損傷累積過程に関して,赤外線サーモグラフィによる散逸エネルギ計測法に基づいて定量化する手法を検討した.疲労サイクル数の増加に伴い,温度とひずみの変化が現れ,両者の定性的な傾向が一致することが示された.2.平織複合材料の力学微視構造を三次元均質化法解析を用いてモデル化し,損傷力学に基づく構成式を用いることで,疲労損傷累積過程と微視構造の関係について議論する力学モデルを構築した.3.プリフォーム複合材の微視構造変化と樹脂硬化に伴う残留応力との関係について,繊維束間変形に着目して,実験および有限要素解析により検討した.繊維束交差部と樹脂に発生する残留応力の関係,および,硬化ひずみの異方性に関する知見が得られた.4.ステレオ撮影法を基礎とした三次元画像再構築技術により,繊維の三次元立体構造を二次元画像から再構築する方法を提案した.ナイロン繊維不織布を用いた実験により得られた繊維の三次元立体画像は,引張試験により変形した繊維の形状を再現できていることが確認できた.本手法により,繊維基材中の繊維位置を評価することが可能となった.複合材料の構造成形におけるプリフォーム技術の高度化のためには,繊維・樹脂から成る力学微視構造に依存する三次元微視的変形を追跡し,製造後の初期微視構造を制御し,残留応力低減を図る試みや強度・長期耐久性の観点から力学微視構造を最適化する試みが必要不可欠である.本年度は特に,複合材料構造製造時のプリフォーム(繊維基材)の賦形に着目して,残留変形低減の検討に重要となる賦形時の基材の非線形変形特性をステレオ画像計測による三次元変形評価技術(イメージベース計測)により評価するとともに,それらを予測するための力学モデルについて検討した.1.織物プリフォームに対して先端の曲率半径の異なる圧子を用いて角部の賦形を模擬した押込み試験を実施した.繊維束同士の滑りが生じる際に織物プロフォームに生じるひずみが急増し,この滑り変形開始は圧子先端の形状にあまり依存しないことが分かった.2.織物プリフォームの引張弾性率と曲げ弾性率を試験により求め,それらを考慮できる織物プリフォームの三層モデルを構築した.さらに接触解析により圧子押込み試験をモデル化し,実験で見られたひずみ増加の傾向を概ね表現できた.賦形時のブランクホルダーの把持力の違いは,プリフォーム中の初期のひずみ増加にはほとんど影響せず,最終的な圧子先端のひずみ量に主に影響すること等が明らかとなった.3.上記の実験および力学モデルにより,圧子形状について,先端の曲線部と直線形状部との境界で圧子との摩擦状態の違いから繊維束間隔の大きな拡がりが見られることが確認でき,圧子形状との関係が重要であることが明らかとなった.複合材料の構造成形におけるプリフォーム技術の高度化のためには,繊維・樹脂から成る力学微視構造に依存する三次元微視的変形を追跡し,製造後の初期微視構造を制御し,残留応力低減を図る試みや強度・長期耐久性の観点から力学微視構造を最適化する試みが必要不可欠である.本年度は特に,昨年度より実施している炭素繊維織物プリフォームの賦形時の変形に関する力学モデルについて検討を加え,モデルにおける材料特性(特に曲げ特性)を評価する方法について評価した.また,材料の微視構造の賦形時の変形への影響を評価するため,異なる4種類の織物に対して実験的に変形特性の評価を実施し,一定の知見を得た.最後に,不連続繊維強化複合材料を対象として,複合材料内部の繊維長・繊維配向と非線形力学特性の関係について評価するための三次元繊維変形シミュレーションを構築した.これにより,複合材料の製造によって得られる初期微視構造の予測から,初期微視構造に対する力学特性の把握に至るまでを包括的に評価するための研究が前進したと言える.具体的な成果は以下の通りである.1.賦形時の変形を三層モデルにより表現し,織物特有の引張剛性と曲げ剛性の違いを考慮できることを解析により検証した.2.構成因子の異なる

4種の炭素繊維織物についてFAST法およびKES法の2種類の曲げ試験を行うことで,面積密度や織り構造,繊維方向の曲げ剛性への影響を明らかにするとともに,繊維束同士の滑りにより曲率の変化に伴って非線形変形を示すことが分かった.3.繊維長・繊維配向の異なる不連続繊維複合材料について実験的に引張特性,曲げ特性の評価を行い,繊維長の長い材料では,繊維長の短い材料で見られる塑性変形(非線形特性)が消失した.この状況を模擬可能な三次元繊維変形シミュレーションを構築し,複合材料全体の塑性変形に与える微視構造の影響について定性的な傾向を明らかとした.複合材料構造生産の高度化のためには,繊維・樹脂から成る力学微視構造に依存する三次元微視的変形を追跡し,製造後の残留応力低減や強度・長期耐久性向上の観点から,複合材料の力学微視構造を最適化することが必要不可欠である.そこで,赤外線サーモグラフィに基づく複合材料の疲労損傷累積過程の評価法,および,イメージベース計測に基づく織物プリフォームの賦形に伴う局所変形の評価法を確立した.これらの評価法により,材料の疲労損傷累積過程および基材の賦形過程に影響する微視力学因子を明らかとした.さらに,材料内の繊維配置等の微視力学的情報を考慮して複合材料の巨視的力学特性を解析する繊維変形シミュレーションを構築した.複合材料構造成形時のプリフォーム基材の賦形において繊維束の幾何学的配置は変化し,それにより最終的に得られる構造強度に影響を及ぼす.このような賦形時の材料内部構造(繊維束配置)の変化をイメージベース計測により実験的に評価することが可能となった.また,賦形時における材料の複雑な非線形変形を有限要素解析モデルによって簡便に予測し,賦形したい形状との関係について検討可能なモデルを構築した.これらの評価法を利用して,実際に織物プリフォームを用いた賦形を模擬した圧子押込み試験を実施し,一定の知見を得ている.27年度が最終年度であるため、記入しない。先進材料強度学複合材料の構造強度や長期耐久性に及ぼす材料内部の力学微視構造の影響について評価するため,初年度は,特に繊維と樹脂から成る複合材料内部の樹脂部の損傷を評価する手法に着目し,サーモグラフィを用いた散逸エネルギ評価法による実験的計測と,そのモデル化法として均質化法を利用した解析について検討した.今年度は,賦形時において想定される強化繊維の幾何学配置変化を評価するためのイメージベース計測と,賦形を模擬した有限要素モデルに基づく接触解析について取り組んだ.最終年度は,今年度の力学モデルをさらに深め,賦形時における材料非線形変形を繊維束間滑り等の微視的状況を反映したモデルに発展させ,より詳細な解析により知見を得ることを検討している.また,強化繊維の幾何学配置と強度の関係を解析可能とする三次元繊維変形シミュレーションの構築により,材料内部の力学微視構造の変化を反映した強度解析・評価法について検討する予定である.複合材料構造の長期耐久性評価という観点から,疲労損傷累積に及ぼす材料内部の微視構造の影響を評価することが重要である.この点に関して,力学モデルの構築を行うとともに,サーモグラフィ計測を用いた散逸エネルギー法に基づく評価法の有用性が確認され,一定の成果を得た.一方,構造成形時に生じる内部の残留ひずみは製造後の構造強度に影響する.この残留ひずみの評価を目的として,樹脂の硬化収縮に伴う残留ひずみの評価の観点から力学モデルを構築した.また,三次元画像再構築
次世代高速鉄道のためのトンネル圧縮波変形メカニズムの数理科学的研究

トンネル微気圧波の形成・発展メカニズムの解明に向けた数値的研究とデータ解析的研究を鉄道総研との協働により推進した.特に今年度,ほぼ毎月一回のペースで鉄道総研との定期的な研究検討会を行い,より密度の高い数理連携探索の推進に成功した.その結果,微気圧波予測の実用に耐えうる有望な数値計算法や解析法などを見いだすことができた.1.小澤方程式に含まれる-1/2階微分に対応する特異積分作用素の高精度数値計算について,昨年度までに提案された手法は鉄道総研の従来手法で得られる結果に比べて,圧縮波の不連続面の位置や,応用上重要な量である圧力時間微分の最大値の変動において違いが見られた.そこで,小澤方程式の持つ移流項と特異積分による散逸項の二つの非線型項を分離して二つの非線型方程式とし,移流項部分は特性曲線にそった解析解を使い,散逸項部分は圧縮波を区分的に一次関数近似を行うことによって得られる解析解を利用して交互に空間積分を行うことで数値解を構成するSplitting法を提案し,鉄道総研でこれを実装し従来の手法と遜色ない成果が得られることを見いだした.新しい解法は今後の小澤方程式の数値解析における代替手法として利用できる可能性が高い.また,この新しい数値解法は数学的構造が明確であるため,この解法を用いた圧縮波形成メカニズムの理論研究の基盤となるものである.2.圧縮波のデータ解析的研究では,1の手法との組み合わせによるUQ(不確実性定量化)の研究へと進んだ.特に,generalized Polynomial Chaosと上記Splitting法を用いた小澤方程式の解析手法の研究に着手し,現在予備的な成果が得られつつある.また,近年活発になっている時系列解析やデータサイエンス研究の成果を微気圧波の現地データへの適用を進めるべく国際研究集会での発表や関連する研究者との情報交換を進めた.小澤方程式の数値的研究における最大の課題であった特異積分の数値的取り扱いにおいて,微気圧波予測の実用に耐えうるSplitting法に基づく数値計算法へと到達したことは,本研究における大きな成果である.今後はこの方程式の理論的研究をこの数値解法に基づいて数学にも安心できる精度保証を持った数値的研究を進めることが可能になっている.この数値解法による小沢方程式の数値解析とデータサイエンスの研究手法の一つである不確実性定量化の数理的手法の併用により,圧縮波切り立ちに関する予測が定量的に行えるようになってきた.これは,今後の微気圧波研究に新しい展開をもたらすものと考えている.連携探索を目的とした本特設分野の趣旨に照らして,鉄道総研との定期的なミーティングを行うことによって,研究進捗状況の確認,問題意識の共有,さらに成果の検討などがリアルタイムで進んだことも重要である.鉄道総研からのフィードバックを随時得ながら,数理的手法の開発が進んでおり,常に応用可能性を意識した方向へ進めたことがこうした研究成果を得る上で非常に有益であった.この成果を受けて,本研究費での支援終了後も,継続して鉄道総研との共同研究が計画されており,本格的な数理・企業研究が継続することになったことは,特設分野(連携探索)の成果として順調に進展した証であると考えている.本研究研究計画は当初,平成30年度で終了予定であったが,同年度に発生した台風21号や大阪北部地震などの突発的な自然災害のため,一部予算を予定通り執行できず,平成31年度に繰り越しせざるをえなくなった.しかしながら,平成30年度の成果として,小澤方程式の新しい数値解法であるSplitting法が得られ,これを基盤にした新しい不確実性定量化による微気圧波研究の方向性も見いだされた.また,これらの学術的成果を受けて,関係する研究集会での研究発表や鉄道総研との研究打ち合わせなどを継続的に行う必要も生じている.そのため,繰り越された研究費は関連する研究集会への参加経費として,また,鉄道総研との継続的な議論のための打ち合わせの経費として有効に利用する予定である.なお,研究成果の概要にあるように,鉄道総研と夏頃を目処にして共同研究契約を締結する方向で準備が進んでおり,その締結までの必要な研究資金としても大切に利用したいと考えている.本共同研究では,企業との共同研究であるという性質上,本研究に関連する基礎研究の成果が学術論文として公表された以外は,鉄道総研との共同研究報告書などの内部資料としてまとめられており外部への公開は少ないが,最終年度において,Splitting法とUQおよびデータサイエンス研究との融合を進めることで,微気圧波の形成・発展に関する当該分野の学術的に新しい研究成果として公表することを目指す.研究実施計画に基づいて,本年度は「連携研究の強化」を推進した.まずは基礎研究として,小沢方程式について関連する先行研究の調査を行った.非整数階微分を含む1次元移流方程式に関する研究と関係があり,小沢方程式の解の漸近挙動は1/sqrt(t)となることが予想されることがわかり,この知見は鉄道総研のこれまでの現実のトンネルでの観測ともよい一致を見せることが確認された.スラブ軌道トンネルの場合は,ショックを初期値とした解の挙動が大切であるという知見を得た.また,非線形波動の方程式を解の持つ複素空間内でのpoleの挙動として捉える手法でこの方程式が扱えないか検討を加え,非整数階微分の扱いの部分で困難があることが確認されたが,近年微圧縮流体に対する渦力学理論が完成しつつあることがこの過程で明らかになったので,こちらに有望な解決手段があると考えられる.

これに平行して,3次元の圧縮性の流体方程式から一次元の小沢方程式の導出過程を,なされた物理的仮定とともに丹念に追いながら鉄道総研の宮地氏より解説を受け,一次元モデルの妥当性について検討するとともに,将来的には流体方程式の数値計算との比較も行う必要があることも確認できた.次に連携研究では,鉄道総研が持つトンネル微気圧波の実地観測結果の開示を受けるための共同研究契約の締結に向けて大学および鉄道総研側の知財担当者の間での条件面での交渉が行われた.来年度6月の締結を目指して最終段階に入っている.また,鉄道総研の米原風洞センターの見学会を行うなど鉄道技術に関する現在の状況について実地説明を受けた.流体力学としての本研究に関連する研究動向を確認するためにアメリカ物理学会の流体力学分科会へ参加した.鉄道総研との連携が雑誌などにとりあげられた.基礎研究は概ね予定通りに研究が進んでいる.一次元の方程式であるため様々な先行研究があるので,その成果の中での位置づけが済み,何が知られていて何が知られていないかということが明らかになったため,今後の研究の方向性がはっきりしてきた.関数論との関係では,当初の目論見はうまくいかなかったものの,その過程で微圧縮流体の渦力学による新しい研究の方向性が見えてきた.連携研究については,データ開示を受けるため,共同研究契約の締結は不可欠であり,企業と大学の間の条件の調整に時間がかかっているが,これも想定の範囲内であり.もうすぐ締結が行われることで,より緊密な連携が可能になると考えている.平成28年6月に関係者の間で共同研究契約が完了し,鉄道総研側からの微気圧波の実データの提供をうけ,これを元にトンネル開口部の形状の微気圧波への影響を調べた.鉄道総研とは定期的に情報交換をする会合を実施,日本数学会や台湾での国際研究集会に参加して,数値解析に関する研究者との研究打ち合わせを行った.以下の二点の成果を得た.1小澤方程式の数値解法:大縄は方程式の差分陰解法を提案し,それが安定的に解の正値性を保証する形で計算できることを示した.このスキームによりトンネル入り口における緩衝口の開け方が微気圧波に及ぼす影響を評価した.その結果,数km程度以下のトンネルであれば入口で窓が塞がっている方が強い微気圧波が出るという予想しやすい結果が得られる一方,トンネルが10km程度を超えると,入口で窓が塞がっている方がむしろ微気圧波が弱くなるという意外な結果を得た.また,定常摩擦項をなくした場合でも波形の急峻化には限界があり,伝播距離が10km程度を超えると微気圧波が減衰することが見出された.加えて,トンネル入り口において圧力およびその微分値も同一の値を持つ単純な入口波形に対して,微気圧波の強さを数値的に評価した.特に前半に圧力が急上昇し,後半に上昇速度が緩和される場合とその逆のケースを比較すると,前半に圧力が急上昇するケースの方が格段に高い微気圧波を生ずることが分かった.これは履歴効果によるものと考えられ,列車形状が大きく影響を及ぼすことを示唆する.2トンネル微気圧波のデータ解析:中野はトンネル微気圧波の実データを主成分分析を用いたデータ解析を行い,主成分の特徴から微気圧波の特性の理解を可能にした.
化学物質誘発腎糸球体障害における細胞外基質の動態に関する研究

抗癌剤ジノスタチン・スチマラマー(ZS)をラットの単回静脈投与し、糸球体の荒廃過程を観察し、以下の知見を得た。1)ZS誘発腎糸球体障害では早期に内皮細胞腫大、内皮下腔の拡大、メサンギウム(M)の水腫性拡大が起こる。2)トレーサーを用いた実験により糸球体障害初期より血中の高分子がM流路に過剰に流入し、その後の細胞外基質蓄積、硬化といった不可逆的変化に先行する事が明らかになった。3)ZS誘発腎糸球体障害では、早期にアルブミンを主体とする蛋白質が発現し、これは糸球体基底膜の陰性荷電の減少が原因と考えられ、糸球体基底膜の細胞外基質の一つであるヘパラン硫酸プロテオグリカンの質的、量的変化が示唆された。4)ZS誘発ラット腎糸球体障害ではM細胞に内皮増殖因子の発現が増加した。5)ZS誘発ラット腎糸球体障害ではメサンギウムの浮腫とmesangiolysisが見られると同時、糸球体内にED-1陽性細胞が浸潤し、さらにM細胞に形質転換が認められ、また、これらに続いて、一部の糸球体にIV型コラーゲンの増加、III型コラーゲンの形成があり、投与2025週後の腎臓では、IV型コラーゲンの増加のため硬化した糸球体や、III型コラーゲンの出現を伴う糸球体荒廃像が認められた。以上から、本モデルではメサンギウムの崩壊と共に単球浸潤とM細胞の形質転換が起り、糸球体内での固有細胞と単球間のサイトカインネットワークを介し、IV型やIII型コラーゲンなどの細胞外基質が蓄積することが示唆された。6)ZS誘発ラット腎糸球体障害におけるIL-1bete、IL-6およびTGF-bete動態を免疫組織学的、分子病理学的に検討したところ、本モデルにおいては、障害初期に糸球体に単球/マクロファージ系細胞が浸潤し、それら浸潤細胞及び糸球体細胞においてIL-1beta、IL-6等の炎症生サイトカインの分泌、それに引き続きM細胞の増殖、形質転換がおこり、細胞外基質の増加が誘導されると考えられた。また、TGF-beta1およびLTBP(Latent TGF-beta binding protein)の遺伝子発現については対照ラットと差を見いだすには至らなかったが、免疫組織学的にTGF-beta isoforms(13)の発現及び局在のパターンが病期により異なり、本モデルの特徴を示していると考えられた。6週齢、雄のF344ラットに、抗癌剤ジノスタチン・スチマラマ-(ZS)を単回静脈投与し、糸球体の荒廃過程を投与後525週まで観察した。投与後5週より糸球体メサンギウムの浮腫とmesangiolysisが頻繁に認められた。10週からは一部の糸球体にIV型コラーゲンの増加、III型コラーゲンの形成が認められた。15週後には病変が進行し糸球体の腫大が顕著になった。2025

後語の腎臓では、IV型コラーゲンの増加のため硬下した糸球体、IV型コラーゲンの増加に加えIII型コラーゲンの出現を伴う糸球体mesangiolysisを示す糸球体が混在して認められた。M細胞におけるα-平滑筋アクチン(α-SMA)の発現を、メサンギウム細胞(M細胞)の形質転換の指標として観察したところ、非投与コントロール(Cr)ラットにはα-SMAの発現はほとんどなく、ZS投与ラットではM細胞の形質転換が5週後より認められ、以後糸球体における形質転換細胞数と陽性領域が広範となった。一糸球体当りのED-1陽性細胞の数は、すでに投与後5週よりCrラットと有意差を認め、15週後にピークに達した。ED-1陽性細胞の糸球体における推移はM細胞の形質転換の経時的変化とほぼ相関していた。また、糸球体内増殖細胞核抗原陽性細胞も投与後5週よりCrラットと有意差を認め、10週後にピークに達し、以後漸減した。以上から、本モデルではメサンギウムの崩壊と共にED-1陽性細胞の浸潤とM細胞の形質転換が起り、それ以後IV型やIII型コラーゲンなどの細胞外基質が蓄積することが明らかになった。また、この進行過程には、糸球体局所における単球/マクロファージと糸球体細胞、特にM細胞の相互作用が重要であることが示唆された。この他、腎臓全体からRNAを抽出しRT-PCRによりIV型コラーゲンやパールカンのmRNAを定量化する方法を検討した。6週齢、雄のF344ラットに、抗癌剤ジノスタチン・スチマラマー(ZS)を単回静脈投与し、糸球体の荒廃過程を投与後525週まで観察した。投与後5週より糸球体メサンギウムの浮腫とmesangiolysisが頻繁に認められ、糸球体内のED-1陽性細胞の数は、投与後5週よりコントロールラットと有意差を認めた。さらにメサンギウム細胞(M細胞)に形質転換、すなわちα-平滑筋アクチン(α-SMA)の発現が認められ、これは糸球体内浸潤単球からのサイトカインを介したM細胞の変化と考えられた。10週からは一部の糸球体にIV型コラーゲンの増加、III型コラーゲンの形成があり、2025週後の腎臓では、IV型コラーゲンの増加のため硬化した糸球体や、III型コラーゲンの出現を伴う糸球体荒廃像が認められた。また、糸球体内増殖細胞核抗原陽性細胞も投与後5週よりコントロールラットと有意差を認め、10週後にピークに達し、以後漸減した。以上から、本モデルではメサンギウムの崩壊と共に単球浸潤とM細胞の形質転換が起り、糸球体内での固有細胞と単球間のサイトカインネットワークを介し、IV型やIII型コラーゲンなどの細胞外基質が蓄積することが示唆された。とくにこの過程に関与するサイトカインの一つとして、transforming growthfactor-β(TGF-β)に注目し、単離糸球体からの遺伝子発現を検索した。まず、単離糸球体からのインタクトなRNAを分離する方法を検討し、分離にはseiving法が最適で、1頭分の腎皮質から十分量のRNAが分離出来る事を確認した。RT-PCR法にて正常なラット腎糸球体体において、TGF-βおよびこのサイトカイン不活化性と局在に関与するLTBPの遺伝子発現が確認され、正常ラットの腎糸球体に潜在型TGF-βが存在することが確認され、糸球体内サイトカインの遺伝子発現を確認する手法が確立された。現在、その他PDGT、IL-1、IL-6、IIFN-γ、TNF-αなどのサイトカイン、コラーゲン、アポトーシスに関与する各遺伝子および遺伝子の糸球体内発現を検討している。