hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肺がんの髄膜がん腫症における分子標的薬耐性を克服する研究

ALK肺がん株をマウス髄腔内に移植したLMCモデルで、ALK阻害薬であるアレクチニブを約100日間連日経口投与し、再発した腫瘍から耐性株を樹立した。in vitroにおける解析で親株と比較し、耐性株はEGFRリガンドであるアンフィレグリンを高発現することでEGFRを活性化し、アレクチニブに耐性化していることを明らかにした。興味深いことに、この耐性株はアレクチニブ以外のALK阻害薬(クリゾチニブ、セリチニブ、ロルラチニブ)にも交叉耐性を示した。また、アレクチニブにEGFR阻害薬を併用することで、耐性株の増殖を阻害できることをin vitroにおいて示した。さらに、耐性株をマウスの髄腔に移植した髄膜がん腫症モデルでは、アレクチニブ単剤やEGFR阻害薬単剤は無効であったが、アレクチニブとEGFR阻害薬を併用することで髄膜がん腫症の進行を著明に抑制できた。以上より、EML4-ALK肺がんの髄膜がん腫症のALK耐性のメカニズムの一つとしてアンフィレグリン発現上昇を同定し、EGFR阻害薬の併用で耐性を克服できる可能性を示した。同様に、EGFR肺がんのLMCモデルでオシメルチニブ耐性を誘導し、耐性株を得た。耐性株において耐性を誘導しうる2つの遺伝子変異を同定した。さらに、髄液臨床検体を収集し、EGFR阻害薬耐性を示したEGFR肺がん患者の髄液と比較し、アレクチニブ耐性を示したALK肺がん患者の髄液中には高濃度のアンフィレグリンが存在することを見出した。以上より、われわれのLMCモデルを用いることにより臨床的に意義のある分子標的薬に対する耐性因子が同定できることが明らかになった。また、本研究で同定されたアンフィレグリンは臨床的にも重要な治療標的になることが示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。肺がんにおける髄膜がん腫症は、分子標的薬が一旦は奏効するが、高頻度に獲得耐性による病勢増悪の場となり患者のQOLを著しく低下させる重篤な病態である。髄膜がん腫症における分子標的薬耐性の分子機構は、これまで全く明らかにされていない。本研究では、独自に確立した髄膜がん腫症のin vivoイメージングモデルを用い、EGFR変異肺がんおよびEML4-ALK肺がんの髄膜がん腫症における分子標的薬の獲得耐性の分子機構を解明し、治療標的を同定するとともに、耐性克服に向けた治療法のproof of conceptを示すことを目的に検討を行い、本年度は下記の成果を挙げた。EGFR変異肺がん細胞株PC-9,をSHOマウスの髄腔に移植したのち、ゲフィチニブを連日経口投与することで、髄膜がん腫症において獲得耐性となった細胞株PC-9/LMC-GRを樹立した。PC-9/LMC-GRは、MET受容体遺伝子コピー数増加によりMETのリン酸化が亢進し、ゲフィチニブに中等度耐性を示した。MET阻害薬を併用することでPC-9/LMC-GRのゲフィチニブ感受性を回復させることができた。次に、in vivoで髄膜がん種症におけるゲフィチニブ耐性がMET阻害薬併用により解除できるか否かを検討した。PC-9を移植した髄膜がん種症マウスにゲフィチニブを連日投与し耐性を誘導した後、MET阻害薬(クリゾチニブ)による治療を上乗せすることにより髄膜がん種症は著明に改善した。以上より、in vivoにおいても髄膜がん種症におけるゲフィチニブ耐性をMET阻害薬併用により解除できることが明らかとなった。H28年度の研究計画のとおり成果をあげられたため。なお、上記の内容はMol Cancer Ther doi: 10.1158/1535-7163に掲載された。髄膜がん腫症や脳転移などの中枢神経系(CNS)転移は肺がんの2030%に発生し、頭痛や神経障害などを惹起して患者のQOLを著しく低下させる。EGFR変異肺がんやEML4-ALK肺がん(ALK肺がん)では、髄膜がん腫症や脳転移に分子標的薬が一旦は奏効するが、高頻度にCNS転移が耐性獲得による病勢増悪の場となることから、CNS転移は分子標的治療のsanctuary siteとよばれている。今年度は、ALK肺がんの髄膜がん種症モデルを確立し、ALK阻害薬耐性を誘導し耐性株を樹立した。さらに耐性株がEGFRリガンド発現の上昇などにより耐性を獲得していること、EGFR阻害薬を併用することでALK阻害薬耐性を克服しうることを明らかにし、現在投稿準備中である。また、肺がんや大腸がんを含む様々ながん種で検出されるNTRK1融合遺伝子異常を有するがん細胞株(KM12SM)を用い、脳転移モデルを作成した(Kita et al, Cancer Med 2017)。さらに、脳転移モデルにおいてTRK阻害薬(エントレクチニブ)耐性を誘導し、耐性株(KM12SM-ER)を樹立した。耐性株はNTRK1-G667C変異によりエントレクチニブ耐性を獲得していた。キナーゼ阻害薬ライブラリーを用いたスクリーニングでフォレチニブを耐性克服薬として抽出した。フォレチニブは、キナーゼ阻害プロファイルアッセイでTRK-A阻害活性を有し、ドッキングシミュレーションで野生型よりもG667C変異陽性のTRK-Aに親和性が高いことが示された。

エントレクチニブが無効なKM12SM-ERの脳転移モデルにて、フォレチニブは脳転移抑制効果を示すことを見出した(Nishiyama et al, Clin Cancer Res 2018)。以上のように、肺がんでも検出されるNTRK1融合遺伝子陽性がんの脳転移における分子標的薬耐性の分子機構を明らかにし、耐性克服薬の同定に成功した。平成29および30年度に予定していたALK肺がんの髄膜がん種症モデルの確立とALK阻害薬耐性の解明を行うこと平成29年度内にほぼ終了するとともに、NTRK1融合遺伝子異常陽性がん細胞の脳転移における分子標的薬耐性の研究も実施できたため。ALK肺がん株をマウス髄腔内に移植したLMCモデルで、ALK阻害薬であるアレクチニブを約100日間連日経口投与し、再発した腫瘍から耐性株を樹立した。in vitroにおける解析で親株と比較し、耐性株はEGFRリガンドであるアンフィレグリンを高発現することでEGFRを活性化し、アレクチニブに耐性化していることを明らかにした。興味深いことに、この耐性株はアレクチニブ以外のALK阻害薬(クリゾチニブ、セリチニブ、ロルラチニブ)にも交叉耐性を示した。また、アレクチニブにEGFR阻害薬を併用することで、耐性株の増殖を阻害できることをin vitroにおいて示した。さらに、耐性株をマウスの髄腔に移植した髄膜がん腫症モデルでは、アレクチニブ単剤やEGFR阻害薬単剤は無効であったが、アレクチニブとEGFR阻害薬を併用することで髄膜がん腫症の進行を著明に抑制できた。以上より、EML4-ALK肺がんの髄膜がん腫症のALK耐性のメカニズムの一つとしてアンフィレグリン発現上昇を同定し、EGFR阻害薬の併用で耐性を克服できる可能性を示した。同様に、EGFR肺がんのLMCモデルでオシメルチニブ耐性を誘導し、耐性株を得た。耐性株において耐性を誘導しうる2つの遺伝子変異を同定した。さらに、髄液臨床検体を収集し、EGFR阻害薬耐性を示したEGFR肺がん患者の髄液と比較し、アレクチニブ耐性を示したALK肺がん患者の髄液中には高濃度のアンフィレグリンが存在することを見出した。以上より、われわれのLMCモデルを用いることにより臨床的に意義のある分子標的薬に対する耐性因子が同定できることが明らかになった。また、本研究で同定されたアンフィレグリンは臨床的にも重要な治療標的になることが示唆された。当初の研究計画に従い、EGFR変異肺がんの第3世代EGFR-TKI耐性髄膜がん腫症のモデルにおける耐性克服治療、ALK肺がんの髄膜がん腫症のin vivoイメージングモデル確立、ALK肺がんの髄膜がん腫症のモデルにおけるALK-TKI獲得耐性機構の解明の研究を推進する。EGFR変異肺がん細胞株PC-9のin vivoイメージング髄膜がん腫症モデルにおける第3世代EGFR-TKIの耐性の分子機構を検討する。PC-9以外のEGFR変異肺がん株でも髄膜がん腫症モデルが確立された場合には、それらのモデルを用いて同様の検討を行う。2ALK肺がんの髄膜がん腫症のモデルにおけるALK-TKI獲得耐性機構の解明平成29年度に得た結果をもとに英語論文を執筆し発表を行う平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
窒素クラスタ位置制御によるSiと格子整合する直接遷移III-V-N規則混晶の創成

本研究では,Si上に発光デバイスを自在に組み込んだ光電子融合システムの実現に向けて、Siと格子整合させることで無転位且つ高品質・高効率発光素子用の直接遷移型半導体材料の実現を目指し、直接遷移型のIII-V-N混晶活性層材料の開発を目的とした。まず、GaPN系材料を候補として、成長層表面に窒素クラスタを形成し,これを規則的に積層したGaP/GaP:N疑似規則混晶の成長実現するため、PBN熱分解窒素を用いたMBE法および有機金属気相成長法を用いてGaPNの成長を行った。この結果、PBNの熱分解を用いたMBE法では、十分な活性窒素が得られず良好な結晶性を有するGaPNを得るためには、有機金属気相成長法を採用した。次に、GaP表面への窒素クラスタ形成を、成長中の表面反射分光法を用いてその場観察を行い、表面窒化・窒素脱過程を調べ、650°Cという高温においてもGaP表面に形成された窒素デルタドープ層が安定であり、急峻なGaPN/GaPデルタドープ超格子構造が得られた。この条件にて、窒素原料の間欠供給により窒素クラスタ形成を進めたところ、GaPNを連続成長した場合より窒素の取り込み効率の向上と同時に、平均窒素組成が同一の連続供給したバルク試料に比べて窒素のデルタドープ超格子では発光の温度消光特性が改善された。以上を踏まえて、短周期GaP/GaPN超格子を作製しバンド構造の検討を行ったが、直接遷移型のバンド構造が得られたとの確証を得ることはできなかった。本研究では,Si上に発光デバイスを自在に組み込んだ光電子融合システムの実現に向けて、Siと格子整合させることで無転位且つ高品質・高効率発光素子用の直接遷移型半導体材料の実現を目指している。今年度は、結晶成長に注力し、GaPN系材料を候補として、成長層表面に窒素クラスタを形成し,これを規則的に積層したGaP/GaP:N疑似規則混晶の成長に向けて基礎的な知見を検討した。窒素クラスタ形成法として、従来のrfプラズマによる窒素ラジカルに代わるPBNの熱分解による原子状窒素を用いた分子線エピタキシー法とジメチルヒドラジンを用いた有機金属気相エピタキシー法の両者を適用し、検討を行った。まず、PBNの熱分解による原子状窒素を供給可能な高温セルを作製し、GaP表面の窒化を試みた。その結果、基板表面の窒化が可能であるものの、そのレートが非常に遅くセルからの不純物に依る汚染が問題となった。次に、有機金属気相エピタキシー法による窒化を行うため、ジメチルヒドラジン由来の残留C濃度について検討を行った。この結果、基板温度600°C以上で在留C濃度がSIMS分析の検出限界まで下げられ、急峻なGaPN/GaP量子井戸構造が得られた。現在、この成長条件を基に、窒素のデルタドーピング超格子の作製を進めている。
ボルナ病ウイルス感染による神経突起伸張因子の機能阻害と脳成熟への影響

ボルナ病ウイルス(BDV)は、ヒトを含む多くの動物に感染が認められる神経細胞親和性のRNAウイルスである。本研究では、BDVの神経病原性とその発現機序を詳細に解析することに加え、ヒトにおけるBDV関連疾患を明らかにすることを目的とした。これまでに、BDVの主要ウイルス抗原であるリン酸化(P)蛋白質が宿主の多機能蛋白質amphoterin(HMGB1)と特異的に結合し、その機能を強く阻害することを明らかにした。しかし、中枢神経系(CNS)におけるamphoterinの役割とその異常による病態は不明である。そこで、BDVのP蛋白質をグリア細胞で発現するトランスジェニックマウス(Tg)ならびにBDVが脳内に持続感染しているラットを用いて動物脳内におけるamphoterin機能阻害の影響を解析した。P蛋白質を脳内で高発現しているTgでは、生後約4ヶ月齢以降より、攻撃性の上昇、空間記憶能力の低下そして自発運動の上昇を示した。Tg脳の病理組織学的解析では、Pが海馬の神経網に蓄積している像が観察され、それと同時に、神経細胞からのBDNF発現低下、シナプス数の減少、セロトニンレセプターの発現異常が認められた。また、神経細胞の脱落やアストロサイトの活性化は検出されなかった。一方、BDV持続感染ラットは、脳内でのamphoterinの受容体である糖化最終産物レセプター(RAGE)の発現が顕著に低下しており、脳内ストレスを誘導するLPSの腹腔内接種により、神経細胞死と後肢麻痺などの激しい神経症状を発現した。これら結果は、グリア細胞内におけるamphoterinの機能が神経細胞の活動やCNSの恒常性維持に影響を与えている可能性を示すのと同時に、amphoterin-RAGEを介したシグナルが神経細胞のストレス回避能力にも関与していることを強く示唆した。以上により、脳内でのamphoterinの機能阻害がBDVの病原性発現と深く関与している可能性が示された。ボルナ病ウイルス(BDV)は、その感染自体では細胞を破壊しない非細胞障害性のウイルスである。また、容易に持続感染を成立させるのもBDVの特徴である。これまでに、BDVの持続感染の成立には、その主要抗原であるヌクレオ蛋白質(p40)とリン酸化蛋白質(p24)の感染細胞内での存在比が重要であることを示してきた。また、BDV持続感染細胞ならびに感染脳内では、p24蛋白質が顕著に蓄積を起こしていることも解明している。そこで、感染細胞内でのp24蛋白質の蓄積が、神経細胞の機能維持に影響を及ぼしている可能性を考え、p24蛋白質と特異的に結合する宿主側因子の同定を行った。その結果、p24蛋白質が脳内の神経突起伸長因子であるアンフォテリンと特異的に結合することを明らかにした。アンフォテリンは、胎生期から成長期の脳で強く発現し、成熟期の中枢神経回路網の形成に重要な役割をしている蛋白質である。また、成熟した脳では、ストレス下においてその発現が増強され、神経細胞の生存維持に関わっていると考えられている。私たちは、アンフォテリンの機能がBDV感染細胞で顕著に阻害されていることを突き止めている。そこで、BDV感染によるアンフォテリンの機能阻害が、脳神経成熟へどのような影響を及ぼしているのかを、(1)p24蛋白質をグリア細胞で発現するトランスジェニックマウスの作成、(2)BDV持続感染新生仔ラットの脳病理学的、生化学的解析、(3)の新生仔ラットへの抗アンフォテリン抗体接種による神経病理学的解析、などの方法を用いて検討を行っている。これまでに、BDV p24トランスジェニックマウスの研究において、脳内でのp24蛋白質の発現のみで神経栄養因子の発現低下を伴うシナプス数の減少が観察され、攻撃性の上昇や学習能力の低下などの神経症状が誘発できるという結果を得ている。

これら結果は、グリア細胞内におけるamphoterinの機能が神経細胞の活動やCNSの恒常性維持に影響を与えている可能性を示すのと同時に、amphoterin-RAGEを介したシグナルが神経細胞のストレス回避能力にも関与していることを強く示唆した。以上により、脳内でのamphoterinの機能阻害がBDVの病原性発現と深く関与している可能性が示された。
臨床検査法として有用なトリグリセリド測定法の開発

本研究では,各種血清リポタンパク質に含まれるトリグリセリド(TG)を選択的に簡易測定する方法を検討した。その結果,測定に使用する酵素や界面活性剤の組合せを工夫することで, HDLに含まれるTGを選択的に測定できる可能性が見つかった。本法はさらなる改良を加えることで,臨床検査法としての実用化が期待できる。ヒト血中リポタンパク質(CM、VLDL、LDL、HDL)に含まれるTGの簡易分画定量法を検討するために、研究計画書に沿って実験を行った。(1)精製リポタンパク質を用いた検討総TG測定で一般的に用いられている測定系(リポプロテインリパーゼを用いる系)に界面活性剤などの化学物質を共存させ、段階的超遠心法で分離精製した各リポタンパク質[VLDL+CM(d<1.006)、IDL(d:1.006-1.019)、LDL(d:1.019-1.063)、HDL(d:1.063-1.21)]に対する反応性を評価した。各種界面活性剤を一種類あるいは数種類組み合わせて検討したが、各リポタンパク質に対して特異的に反応する候補は見つからなかった。次に、リポプロテインリパーゼの代わりにコレステロールエステラーゼ(CE)を使用して同様に検討したところ、界面活性剤を加えなくてもPseudomonas由来(COE311、東洋紡)やMicroorganism由来(COE313、東洋紡)のCEは各リポタンパク質に対する反応性に違いが現れ、特にHDLとLDLに対する反応が著しく低下した(反応率350%)。現在、界面活性剤をこの反応系に共存させることで、より高い選択性を持たせるよう検討を継続して行っている。(2)HPLCを用いた検討上記(1)で調べた試薬をゲル濾過カラムからの溶出液に直接オンライン注入し、その溶出パターンから試薬の反応性を確認した。その結果、用いる酵素の種類によって明らかに反応性が異なることがHPLCパターンからも確認できた。以上のことから、CEはリポプロテインリパーゼ活性も有しており、リポタンパク質に対するその反応特性は酵素の由来に関係していることが示唆された。現在検討している測定系では、反応タイムコースがエンドに到達せず、吸光度が上昇し続けるため、これを抑える工夫が今後必要である。昨年度の実験では,測定の第一反応で作用するTG加水分解酵素にコレステロールエステラーゼ(CE)を用いることで各種リポタンパク質に対する反応性に違いが生じる可能性が示唆された。今年度はHDL中のTG測定に焦点を絞り,研究計画書に沿って実験を進めた。(1)界面活性剤を用いた検討CEを使用する測定系に各種界面活性剤を共存させ,HDL-TG測定を試みた。その結果,非イオン性界面活性剤であるエマルゲンA60,エマルゲンB66,エマルゲンLS114が候補にあがり,さらに,これらの界面活性剤の組み合わせとCEの種類を検討した結果,Pseudomonas由来のCEであるCOE-311(東洋紡)と0.8%A60,1.6%B66,0.8%LS-114を同時に用いた場合,HDL分画の発色率が80%,nonHDL分画の発色率が12%と良好な結果であった。その結果、HDLの溶出位置に明瞭なピークが確認でき良好な結果が得られた。(3)他法との相関同意が得られた血清(n=26)について,沈殿法で分離したHDL分画のTG値(従来法)と比較して本法の定量性を評価した。本法の測定値(12.7±2.5mg/dL)は従来法の測定値(12.0±2.5mg/dL)と有意な差は認められなかったが、相関係数が予想よりも小さかった(r=0.636)。しかし,血清総TG値やHDL-C値などの他の脂質値に依存したバイアスは認められなかった。以上のことから、本研究はリポプロテインリパーゼ活性を有するCEと適切な界面活性剤の使用により,HDL-TGの選択的測定が可能であることを示唆しており,さらなる改良を加えることで臨床検査法としての実現が期待される。
コラーゲン分解酵素前駆体としてのヒラメフィブロネクチン様タンパク質に関する研究

ゼラチンザイモグラフィーを用いて結合組織コラーゲン分解の原因酵素を検索し、筋肉、皮、血液に複数の活性を検出した。この結果は、これらのゼラチン分解活性が複数の酵素に起因する可能性を示唆していた。この活性バンドを示す酵素の中には、分子量20万以上の前駆体として存在すること、貯蔵中に容易に低分子化すること、広い組織分布を示すこと、ゼラチンやヘパリンに親和性を示すことなどから、細胞接着タンパク質であるフィブロネクチンである可能性が示唆されるものが存在した。そこで、ヒラメ血漿からフィブロネクチンをゼラチンアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、そのゼラチナーゼ前駆体としての可能性を検討した。ヒラメ血漿から精製されたタンパク質は、抗ニワトリフィブロネクチン抗体と交叉すること、ヒラメ胚由来初代培養細胞やコイ上皮腫由来の株化細胞であるEPに対して強い細胞伸展活性を示すこと、及びこの細胞伸展活性はいわゆるRGDペプチドにより阻害されることから、フィブロネクチンであると同定された。一方これまでの研究から、ヒラメを含む各種魚類組織中にはフィブロネクチン様タンパク質以外にもゼラチン分解活性を有する種々のプロテアーゼが存在することが明かとなってきた。そこで、キンギョ、マダイ、ブリについてザイモグラフィーを用いてゼラチン分解酵素の検索を行い、いずれの魚種にも共通して70kから120kのセリン型ゼラチナーゼが、また100k以外のメタロ型ゼラチナーゼが検出された。分子量は異なるがラットでもほぼ同様の活性が検出された。しかしその活性はいずれも魚類と比較して弱く、魚類組織においてコラーゲン代謝の盛んなことが示唆された。ヒラメ血漿より、DEAE-セルロースとゼラチンアフィニティーによりフィブロネクチン様タンパク質を精製し、その細胞伸展活性をコイ上皮腫由来細胞EPCを用いて検討したところ、0.5μg/ml以上の濃度で強い伸展活性を示した。この伸展活性は、RGD(Arg-Gly-Asp)ペプチドにより阻害されたとから、今回精製されたフィブロネクチン様タンパク質は細胞との接着にRGD配列が関与していることが明らかとなった。ゲルろ過により決定したこのタンパク質の分子量は約130万であった。SDS-PAGEでは、非還元下では分子量40万以上と20万にバンドが検出され、還元下では20万のバンドが検出された。CnBr処理によるペプチドマッピングを行ったところ、非還元下で検出された2種類のタンパク質は異なるものであることが示された。ウエスタンブロット法によりこのタンパク質の組織分布を調べたところ、筋肉、皮、肝臓にその存在が認められた。特に肝臓には多量に存在していることを示す結果が得られ、血漿中のフィブロネクチンが肝臓由来であることが推察された。ゼラチンザイモグラフィーを用いて結合組織コラーゲン分解の原因酵素を検索する過程で、筋肉、皮、血液に複数のゼラチン分解活性を示すバンドが検出された。ヒラメ血漿からゼラチンアフィニティークロマトグラフィーにより精製されたタンパク質は、抗ニワトリフィブロネクチン抗体と交叉すること、ヒラメ胚由来初代培養細胞やコイ上皮腫

由来の株化細胞であるEPCに対して強い細胞伸展活性を示すこと、及びこの細胞伸展活性はいわゆるRGDペプチドにより阻害されたことから、フィブロネクチンであると同定された。一方これまでの研究から、ヒラメを含む各種魚類組織中にはフィブロネクチン様タンパク質以外にもゼラチン分解活性を有する種々のプロテアーゼが存在することが明らかとなってきた。そこで、キンギョ、マダイ、ブリについてザイモグラフィーを用いてゼラチン分解酵素の検索を行い、いずれの魚種にも共通して70kから120kのセリン型ゼラチナーゼが、また100k以下のメタロ型ゼラチナーゼが検出された。分子量は異なるがラットでもほぼ同様の活性が検出された。しかしその活性はいずれも魚類と比較して弱く、魚類組織においてコラーゲン代謝の盛んなことが示唆された。
電子商取引の制度的プラットフォーム構築に関する研究

電子商取引の成立条件をセキュリティ、プライバシー、コスト、利便性の4要素であると仮定し、電子政府サービスの普及には法制度としてのプライバシー保護策が必要であることを生産可能性フロンティアの拡大という形で論証する論文などをまとめ、それぞれ学術雑誌等において発表した。Session 3: Panel Discussion : E-business New Trends and Possibility of New Restrictionsではパネリストとして参加し、これまで技術的な発表が中心であったSAINT会議において、制度的側面に関する国際的に意見を交換するWorkshopとして制度研究者と情報技術者が対話する機会を提供した。柱間の連携研究のほかに、国際共同研究として経済協力開発機構OECDで電子商取引の法制度整備に関する研究を推進している担当官との協力関係を構築した。2002年11月にはOECDパリ本部を訪問し、電子商取引における個人情報保護など消費者法制に関する政策担当者、電子商取引などのセキュリティポリシーに関するOECD勧告の立案担当者、アフリカなどの発展途上国における電子商取引の普及に関する政策担当者らとの間で、電子商取引の制度設計についての意見交換の機会を得た。国内においては、電子情報通信学会による高等教育機関におけるネットワーク運用ガイドライン制定作業に参加し、成果は文部科学省およびIT戦略本部に報告され、同学会会長より感謝状を授与された。
凍結細胞からの魚類個体の再生:新たな魚類遺伝子資源保存技術の開発

現在魚類では、凍結細胞から個体を再生する技術が確立されていないため、遺伝子資源を保存するには、個体を継代飼育するしか方法がない。しかし、卵と精子の両者に分化可能な始原生殖細胞をあらゆる魚種から摘出し、液体窒素中で凍結保存する「魚類始原生殖細胞バンク」を設立すれば、植物の種子バンクや哺乳類の胚バンクのように、魚類遺伝子資源を細胞として、半永久的に保存することができよう。また、凍結保存した始原生殖細胞を借り腹生産により個体に変換すれば、絶滅危惧魚種の再生も可能となる。さらに本法は、水産上有用な様々な系統の維持・保存にも応用が期待される。そこで、本研究では、「魚類始原生殖細胞バンク設立のための基礎技術の確立」を目的とした。これまでの研究では、ニジマスを用いて、魚類の始原生殖細胞を凍結保存する方法を検討した結果、エチレングリコール(1.8M)を凍結保護剤として用いて、50%以上の始原生殖細胞が生残する凍結保存方法を確立した。さらに、同法により凍結保存したニジマス始原生殖細胞を同種宿主の生殖腺へ導入し、機能的な卵を作出した。宿主より得られた凍結始原生殖細胞に由来する卵と凍結精子を受精することで、液体窒素中で保存した細胞から次世代を生産しうる正常なニジマス個体を得た。以上のように、液体窒素中に保存した資源から正常な魚類個体が得られたのは、本研究が世界で初めての報告である。今後、本研究によって確立した方法を多くの魚種に応用し、魚類の遺伝子資源の保存に貢献したいと考えている。さらに、同法により凍結保存したニジマス始原生殖細胞を同種宿主の生殖腺へ導入することにも成功している。現在、絶滅危惧魚種への応用として、イトウ(北海道に生息する日本最大のサケ科の魚;絶滅危惧IIB)および台湾陸封サーモン(台湾の天然記念物)を用いたプロジェクトを進めている。
発達障害を危惧した「気になる子ども」の早期療育・虐待予防支援に関する基礎的研究

乳幼児健診等で発達障害の可能性を危惧された「気になる子ども」と育児者に対する、保健師の家庭訪問等の個別支援の特質を検討した。熟練保健師7名による個別支援過程において、保健師の意図302件、保健師の行為1,575件を記述・内容分析し7分類45項目に統合した。また全国市町村1,650の母子保健担当保健師に質問紙を郵送し、実践者の意見を把握した。740件(45.8%)回収し、各項目で「自分もよく実施する」「実施したことがある」の回答者80%未満が16項目、「非常に重要と思う」「重要と思う」の回答者90%未満が2項目と概ね支持され、早期対応・虐待防止のための指針案として提案できる可能性を確認した。本研究は、乳幼児健康診査や子育て相談の場で発達障害の可能性を危惧された「気になる子ども」と育児者へ支援における、家庭訪問を中心とした個別支援の特質を明確にし、発達障害の早期対応・子ども虐待防止のための指針を得るための基礎的研究を行う。発達障害の可能性を危惧した「気になる子ども」と育児者への、熟練保健師(原則5年以上の実務経験)による家庭訪問を中心とした個別支援過程における、1保健師の意図と2保健師の行為を調べる。昨年度までに、母子保健活動を担っている保健師(7名)から、保健師自身による記述、内容確認のためのインタビュー、その後の文章推敲・加筆修正により、保健師が内面で考えたことをも含む詳細な記述データを得た。保健師の意図295件、保健師の行為1,576件を記述・内容整理・分析し、支援指針を検討した結果、1)育児を今後どうしたいか語られるよう、信頼関係を形成する、2)育児を放棄する可能性も想定しつつ、育児者の対応能力を引出し、療育生活を継続できるようにする、3)育児者の児への肯定的な捉えを認め、正しい知識に基づいた療育対応ができるようにする、4)障害の診断時の気持ち、関係機関・職種に対する思いを受け止める、5)関係機関・職種の支援方針を理解して、より専門的な療育支援サービスを継続利用できるようにする、6)健診や予防接種、医療機関定期受診の機会と特徴を事後支援に活用する、7)ケア会議で関係職種と育児者とで支援の方向性を統一する、8)療育関係機関・職種へのつなぎ方と、適切な時期について検討する、となった。この支援指針を評価するため、またより多くの市町村の保健師の意見を得るために、リカート式と自由記述の質問紙調査を郵送法により実施した。東日本大震災被災地(岩手・宮城・福島)を除く全国市役所・町村役場1,650の母子保健担当者に送付し、昨年度末までに754件の回答を得たところである。次に研究者がその記述内容を理解するため、内容確認のためにインタビューする。ここでの記述表現は、保健師が内面で考えたことをも、事実に忠実に伝えられるものでなければならない。記述データは、情報提供保健師に文章推敲・加筆修正をしてもらい、さらに研究者が確認をするというやりとりを重ねる。その後、保健師の行為と、その行為を方向づける意図の内容構成分析と、視点をあてた詳細な分析を行う。詳細な分析の視点は、申請者の実践経験と文献検討により設定し、先行研究により妥当性が確認できている。これらの視点は、今までの研究経過から修正を重ねて採用してきたもので、1看護援助を提供する者と受ける者との相互作用、2家庭・地域生活を含めた援助提供、3援助ニーズの優先度の判断と援助提供方法の選択、4対象の過去の経験に対する援助提供、5看護援助の他事例や保健事業・施策への反映、6関係職種との連携、である。今年度は、発達障害児支援の先進地として五歳児健診を実施している自治体(長野、鳥取、栃木)で、母子保健活動を担っている保健師(4名)による支援過程を調査した。本研究は、乳幼児健康診査や子育て相談の場で発達障害の可能性を危惧された「気になる子ども」と育児者へ支援における、保健師の家庭訪問を中心とした個別支援の特質を明確にし、発達障害の早期対応

・子ども虐待防止のための指針を得る基礎的研究である。五歳児健診を実施する先進地等で、母子保健活動を担う熟練保健師7名による個別支援過程において、1)保健師の意図と2)保健師の行為を面接調査した。保健師の意図295件、保健師の行為1,576件を記述・内容整理・分析し、支援内容項目として統合した。すなわち、1)育児を今後どうしたいか語られるよう、信頼関係を形成する、2)育児を放棄する可能性も想定しつつ、育児者の対応能力を引出し、療育生活を継続できるようにする、3)育児者の児への肯定的な捉えを認め、正しい知識に基づいた療育対応ができるようにする、4)障害の診断時の気持ち、関係機関・職種に対する思いを受け止める、5)関係機関・職種の支援方針を理解して、より専門的な療育支援サービスを継続利用できるようにする、6)健診や予防接種、医療機関定期受診の機会を事後支援に活用する、7)ケア会議で関係職種と育児者とで支援の方向性を統一する、8)療育関係機関・職種へのつなぎ方と、適切な時期について検討する、であった。これをもとに指針案を検討するため、リカート式と自由記述の質問紙調査で、郵送法により実践者の意見を把握した。東日本大震災被災地三県を除く全国市町村1,650の母子保健担当保健師に送付し740件(45.8%)の回答を得た。各項目で「自分もよく実施する」「実施したことがある」の平均回答件数(割合)は615件(83.1%)、「非常に重要と思う」「重要と思う」の平均回答件数(割合)は718件(97.0%)であった。本研究で検討してきた支援内容項目の重要性は概ね支持され、指針案として提案できる可能性があると確認した。地域看護学発達障害児支援の先進地として五歳児健診を実施している自治体(長野、鳥取、栃木)で、母子保健活動を担っている保健師(7名)による支援過程を調査した。保健師の意図295件、保健師の行為1,576件を記述・内容整理・分析し、支援指針も検討でき、理論的飽和も近いと考えられた。あと23人のデータを得たいところであるが、並行してリカート式質問紙の作成に入れると判断でき、各自治体母子保健担当者に質問紙を配布し回収も終えている。今年度は、入力・集計・分析をし、学会等で成果報告できる見込みである。以上は当初計画どおりの進捗状況である。発達障害児支援の先進地として五歳児健診を実施している自治体(長野、鳥取、栃木)で、母子保健活動を担っている保健師(10名)予定のところ、保健師(4名)による支援過程を調査した。保健師(2名)の内容分析を終え、あと保健師(2名)については分析の途中にある。これまでにも保健師(2名)による支援過程が得られており、この内容に追加できる新たなデータも得られているが、理論的飽和も近いと考えられた。今年度はあと23人のデータを得る予定でいるが、保健師(4名)による支援過程の分析ののち、並行してリカート式質問紙の作成に入れると判断できた。従って、今年度中には各自治体母子保健担当者に質問紙を配布できる見込みである。(1)発達障害の可能性を危惧した「気になる子ども」と育児者への家庭訪問援助の方法の調査:今年度はあと保健師(23名)による支援過程を調査する。(2)発達障害の早期対応・子ども虐待防止のための指針の評価:最終年度であり、これまでの分析結果と個別支援指針についての評価のため、全国市町村の母子保健担当者の指針案に対する認識についてリカート式質問紙調査を実施したので、入力・集計分析し、学会等で成果報告する。
土木音環境工学の構築 ―河川・海岸環境の自然環境音による評価―

平成14年度の研究は,(1)河川環境音の快適性指標の決定と快適性を現場で計測するシステムの構成,(2)土木環境音としての波による海岸環境音の計測である.河川環境音の快適指標を1/f^nゆらぎで評価する.n<<1のとき白色雑音に近づき,n>>1のとき,特定の音に近づくことが知られている.平成13年度の研究では,集録したデータをパーソナルコンピュータに転送してプログラムを実行させて処理していた.本年度の研究では,オンライン処理可能な快適音処理システムを完成させた.河川や海岸の現場にこのシステムを持ち込み,マイクロフォンを音源に向けるだけで,快適音指標nが表されることになり,分析の効率が高くなった.河川環境音の計測の結果,一般的に,上流の河川環境音は高音域が卓越している.河川景観が良いために,河川環境音が良く聞こえている.中流域から下流域の流水があるところが河川環境音が良好になる.河川の瀬と淵の関係により微妙に変化している.また,河川軸と直行する方向(幅方向)の河川快適音の変化を調べた.河川流水地点より距離を取ったほうが,n=1の値に近くなることが分かった.平成14年度は,海岸環境音を集録した.岩場に打ち上げる波,風の強い砂浜の波,風の弱い砂浜の波等を比較した結果,波の弱い日の砂浜に打ち上げる波が,n=1に近くなることが分かった.本研究を終わるに当たり,土木環境音には快適な音が含まれ,土木環境デザインにおいて重要な因子になることが分かった.さらに,河川環境音の利用として,快適な音を発生させる,せせらぎや,魚道などの設計が今後の課題である.土木分野の関連する環境において、不快な騒音から川のせせらぎの快適な音まである。土木環境に関連する音の問題を解決するためには、音の質特に快適な音を研究する必要がある。このような視点から、本研究では、「土木音環境工学」を提案した。本年度の研究では、長崎県本明川を事例に、河川環境音を収録し、上流から下流にかけて、また河川から離れた空間の河川音場空間を想定し、河川環境音の音特性の変化と快適音に関する心理的調査を行った。現場調査に基づいて河川音場空間の収録ポイントを設定した。さらに、変動要因として、四季、推量、周辺からの音(虫の声、鳥の声、自動車騒音等)を配慮しながら、平成13年8月から平成14年2月にかけて環境音の収録を行った。音の収録には、本研究費で購入したDAT(デジタル録音機)とステレオマイクを用いた。また、音の処理は、パーソナルコンピュータによりデジタル処理を行った。収録した環境音に基づいて、環境音の評価を行った。上流の音は流速が早いために高音域成分が多い。下流域は流速が遅く低音域成分が多く、ゆったりとした音のために、快適な音に聞こえる。河川から離れると、周辺の音に川の音が吸収される。これらの評価を周波数分析から、河川環境音の1/fノイズ評価を行ったところ1付近にn=1付近に位置し快適な音であることが評価できた。また、30人の被験者に対するアンケート調査の多変量分析においても、河川環境音の快適さが評価できた。本研究の前半である、河川環境音の評価はほぼ終了した。萌芽的研究であったために、論文発表の準備が遅れているが、順次研究成果の論文を公表する予定である。平成14年度の研究は,(1)河川環境音の快適性指標の決定と快適性を現場で計測するシステムの構成,(2)土木環境音としての波による海岸環境音の計測である.河川環境音の快適指標を1/f^nゆらぎで評価する.n<<1のとき白色雑音に近づき,n>>1のとき,特定の音に近づくことが知られている.平成13年度の研究では,集録したデータをパーソナルコンピュータに転送してプログラムを実行させて処理していた.本年度の研究では,オンライン処理可能な快適音処理システムを完成させた.河川や海岸の現場にこのシステムを持ち込み,マイクロフォンを音源に向けるだけで,快適音指標nが表されることになり,分析の効率が高くなった.河川環境音の計測の結果,一般的に,上流の河川環境音は高音域が卓越している.河川景観が良いために,河川環境音が良く聞こえている.中流域から下流域の流水があるところが河川環境音が良好になる.河川の瀬と淵の関係により微妙に変化している.また,河川軸と直行する方向(幅方向)の河川快適音の変化を調べた.河川流水地点より距離を取ったほうが,n=1の値に近くなることが分かった.平成14年度は,海岸環境音を集録した.岩場に打ち上げる波,風の強い砂浜の波,風の弱い砂浜の波等を比較した結果,波の弱い日の砂浜に打ち上げる波が,n=1に近くなることが分かった.本研究を終わるに当たり,土木環境音には快適な音が含まれ,土木環境デザインにおいて重要な因子になることが分かった.さらに,河川環境音の利用として,快適な音を発生させる,せせらぎや,魚道などの設計が今後の課題である.
Shh-Ang-Tie2を標的とした眼内血管新生疾患に対する新規治療戦略

眼内の血管新生は創傷治癒過程や虚血性眼疾患、加齢性黄斑変性症など様々な病体によって引き起こされる。糖尿病網膜症や加齢性黄斑変性症、血管新生緑内障においては血管新生が著しい視機能の低下をもたらし,放置すると失明につながる場合がある。現在、眼内血管新生に対する治療法として、薬剤としては血管内皮成長因子(VEGF)に対する中和抗体が用いられている加齢性黄斑変性症に対してのみの適応であり、硝子体投与の副作用に関しても未だよくわかっていない。アンジオポエチン(以下Angと略す)は血管新生に関連する物質の一つで、VEGFとは異なり、血管内皮細胞の増殖には関わらず、血管新生の開始、終了、血管構造の安定化、余剰血管の退縮に関与する分子であると言われている。AngはSonic hedgehog(以下Shh)により誘導されるとの報告もある。レーザー光凝固を用いて動物(Brown Norway Rat)に実験的に脈略膜新生を誘発した。レーザー照射直後にShhの阻害剤であるシクロパミンを結膜下注射した。レーザー瘢痕部では早期にはシクロオキシゲナーゼ2や誘導型NO合成酵素の局在とNF kappa Bの活性化がみられた。またソニックヘッジホッグ(Shh)の局在もレーザー照射部周囲の神経網膜及び網膜色素上皮細胞等に免疫染色性がみられ、そのシグナル伝達に関わるGli3やShhの標的遺伝子であるPtcの蛋白も検出された。これらの結果からShhがAngを介して脈略膜血管新生に関与している可能性が示唆される。またShhの阻害剤であるシクロパミンを結膜下駐車することにより脈略膜血管新生が阻害された。このことからShhが脈略膜血管新生に重要な役割をしておりShhのシグナル制御が脈略膜血管新生の治療として応用できる可能性がある。角膜ポケット法でソニックヘッジホッグ(Shh)を添加したものとしないものでは角膜血管新生において添加した方が有意に血管新生が促進され、また、Shhの阻害剤であるシクロパミンではその効果を抑制することができた。同様に血管内皮細胞-線維芽細胞の共培養系でもShh添加で血管内皮細胞の管腔形成が促進され、シクロパミンで抑制されることが確認できた。これらの結果からShhは血管新生に関与しており、それを抑制することにより血管新生を抑制することが示された。今後、眼内血管新生動物モデル(角膜電気焼灼、実験的脈絡膜血管新生等)を用いてAng1,2及びTIE2の発現に関して検討する。Ang1及びAng2強制発現ウイルスベクターあるいはAng1及びAng2に対するsiRNAを用いてAng1及びAng2を強制発現あるいはノックダウンすることにより眼内血管新生時のAng1及びAng2の役割を明らかにする。Ang1及びAng2はNF kappa B抑制を介し抗炎症的にも作用すると予想されるので、その効果について、マクロファージなどの炎症細胞への影響やCOX2などのアラキドン酸代謝に関わる酵素、プロスタグランジンE2(PGE2)の産生量などに焦点をあてて検討する。また、Shhとの関係を明らかにするためにShhの存在下でのAng1またはAng2ノックダウンを行いShhとAng1,2-TIE2系との関連について検討する。血管新生には主に血管内皮成長因子(VEGF)の作用が重要であるとされているがその系意外にも様々な血管新生を促進する系がしられている。ソニックヘッジホッグ(Shh)は血管新生に促進的に働くことが知られているがその作用機序がVEGFの下流で働くものか、あるいは単独で別の系で働くものかは明らかにされていない。

我々はShhの下流で働くとされているアンギオポイエチン(Ang)がShhの血管新生に作用する際の鍵を握る分子であると仮定し研究を進めている。角膜ポケット法でShhを添加したものとしないものでは角膜血管新生において添加した方が有意に血管新生が促進され、また、Shhの阻害剤であるシクロパミンではその効果を抑制することができた。同様に血管内皮細胞-線維芽細胞の共培養系でもShh添加で血管内皮細胞の管腔形成が促進され、シクロパミンで抑制されることが確認できた。これらの結果からShhは血管新生に関与しており、それを抑制することにより血管新生を抑制することが示された。今後、眼内血管新生動物モデル(角膜電気焼灼、実験的脈絡膜血管新生等)を用いてAng1,2及びTIE2の発現に関して検討する。Ang1及びAng2強制発現ウイルスベクターあるいはAng1及びAng2に対するsiRNAを用いてAng1及びAng2を強制発現あるいはノックダウンすることにより眼内血管新生時のAng1及びAng2の役割を明らかにする。Ang1及びAng2はNF kappa B抑制を介し抗炎症的にも作用すると予想されるので、その効果について、マクロファージなどの炎症細胞への影響やCOX2などのアラキドン酸代謝に関わる酵素、プロスタグランジンE2(PGE2)の産生量などに焦点をあてて検討する。また、Shhとの関係を明らかにするためにShhの存在下でのAng1またはAng2ノックダウンを行いShhとAng1,2-TIE2系との関連について検討する。角膜ポケット法でソニックヘッジホッグ(Shh)を添加したものとしないものでは角膜血管新生において添加した方が有意に血管新生が促進され、また、Shhの阻害剤であるシクロバミンではShhの血管新生促進効果を抑制することが確認できた。同様に血管内皮細胞-線維芽細胞の共培養系でもShh添加で血管内細胞の管腔形成及び分岐形成が促進され、シクロパミンで管腔形成及び分岐形成ともに抑制されることが確認できた。また、脈絡膜血管新生モデルにおいても血管新生発現部位でのShhの発現を免疫組織科学的に確認した。現在、眼内血管新生動物モデル(角膜電気焼灼、実験的脈絡膜血管新生等)を用いてAng1,2及びTIE2の発現に関して検討中である。Ang1及びAng2強制発現ウイルスベクターあるいはAng1及びAng2に対するsiRNAを用いてAhg1及びAng2を強制発現あるいはノックダウンすることにより眼内血管薪生時のAng1及びAng2の役割を明らかにする。
マランゴニ効果による限界熱流束促進機構の研究

本研究の目的は、プール沸騰の限界熱流束を大幅に向上させる有効な方法を検討することである。具体的には、簡便で受動的な方法でありながら限界熱流束の向上が期待できる、作動流体にpositive混合液を用いたマランゴニ効果による促進法に注目し熱流束の促進機構を明らかにすることが目的である。実験に用いた沸騰面は直径12mmの銅製上向面であり,伝熱面中央には3次元方向に移動可能な触針プローブが設置されている.作動流体としては,2-プロパノール水溶液を用いた.実験は大気圧から0.05気圧の範囲で行なった.昨年度の研究で,2-プロパノール水溶液の限界熱流束は,いずれの圧力でも水に比べて1.7倍から2.2倍促進されること,伝熱面を覆う蒸気塊下に存在する液層の厚さは水に比べて2-プロパノール水溶液では非常に厚くなること,が明らかとなった.この要因として,2-プロパノール添加による表面張力の低下および気泡微細化の影響が考えられた.そこで,同様の効果をもたらす(ただし,2-プロパノールとは異なり濃度差マランゴニ効果は生じない)表面活性剤を添加した実験を行なった結果,限界熱流束の促進は得られないことが判明した.次いで,伝熱面上の気液構造の2次元分布を測定した.その結果,2-プロパノール水溶液では,伝熱面中央部で気泡の発生がほとんど無く,周辺部で沸騰が促進されていることが判明した.この沸騰状態の顕著な違いは,蒸気塊周囲に発生するマランゴニ効果による伝熱面周辺部への液供給によってもたらされている可能性が高い。これによって,伝熱面径方向に2-プロパノールの濃度分布が形成され,濃度の低い伝熱面中央部で沸騰が抑制されることにより蒸気塊下の厚い液層の形成をもたらし,限界熱流束を促進させていると考えられる.本研究の目的は、プール沸騰の限界熱流束を大幅に向上させる有効な方法を検討することである。具体的には、簡便で受動的な方法でありながら限界熱流束の向上が期待できる、作動流体にpositive混合液を用いたマランゴニ効果による促進法に注目し、伝熱面近傍の気液微細構造の詳細な測定を通して限界熱流束の促進機構を明らかにすることが目的である。本年度は,実験装置の製作と,高精度触針法を用いた伝熱面近傍の気液挙動の測定を行った.沸騰容器は内径150mmの耐熱ガラス製であり,沸騰容器底部には直径12mmの銅製上向き伝熱面が設置されている.伝熱面中央には垂直方向に0.5μmの精度で移動可能な触針プローブが設置されている.プローブの先端径は5μm以下である.作動流体としては,代表的なpositive混合液である2-プロパノール水溶液を用いた.実験は大気圧(100kPa)から0.05気圧(5kPa)の範囲で行なった.2-プロパノール水溶液の限界熱流束は,5kPaから大気圧のいずれの圧力でも水に比べて1.7倍から2倍促進され,positive混合液を用いた限界熱流束促進法の工学的有用性が確認された.大気圧近傍での触針プローブによる測定の結果,水,2-プロパノール水溶液とも伝熱面を覆う合体泡下に液層の存在が確認された.

ただし,液層厚さには非常に大きな差があり,水は従来の測定値と同程度であったが,2-プロパノール水溶液では数mmにも及ぶ液層領域の存在が明らかとなった.低圧(10kPa)の測定では,水では巨大な一次気泡が形成されその下に10μm程度の薄液膜の存在が確認された.一方,2-プロパノール水溶液での液層厚さは50100μmであり,大気圧近傍と同様に水とは大きな差異が認められた.これらの気液挙動の違いが,2-プロパノール水溶液の限界熱流束を促進させていると考えられる.本研究の目的は、プール沸騰の限界熱流束を大幅に向上させる有効な方法を検討することである。具体的には、簡便で受動的な方法でありながら限界熱流束の向上が期待できる、作動流体にpositive混合液を用いたマランゴニ効果による促進法に注目し、限界熱流束の促進機構を明らかにすることが目的である。実験に用いた沸騰面は直径12mmの銅製上向面であり,伝熱面中央には垂直方向に0.5μm,水平方向に10μmの精度で移動可能な触針プローブが設置されている.作動流体としては,代表的なpositive混合液である2-プロパノール水溶液を用いた.実験は大気圧(100kPa)から0.05気圧(5kPa)の範囲で行なった.昨年度の研究で,2-プロパノール水溶液の限界熱流束は,いずれの圧力でも水に比べて1.7倍から2.2倍促進されること,および伝熱面を覆う蒸気塊下に存在する液層の厚さは,水に比べて2-プロパノール水溶液では非常に厚くなることが明らかとなった.この要因として,2-プロパノール添加による表面張力の低下および気泡微細化の影響が考えられた.そこで,同様の効果をもたらす(ただし,2-プロパノールとは異なり濃度差マランゴニ効果は生じない)表面活性剤を添加した実験を行なった結果,気液構造は水と大差なく限界熱流束の促進も得られないことが判明した.次いで,伝熱面からの高さと径方向位置を変えて,伝熱面上の気液構造の2次元分布を測定した.その結果,2-プロパノール水溶液では,伝熱面中央部では気泡の発生がほとんど無く,周辺部で沸騰が促進されていることが判明した.このような伝熱面中央と周辺部での沸騰状態の顕著な違いは,伝熱面上の大きな蒸気塊周囲に発生するマランゴニ効果による伝熱面周辺部への液供給によってもたらされている可能性が高い.これによって,伝熱面径方向に2-プロパノールの濃度分布が形成され,濃度の低い伝熱面中央部で沸騰が抑制されることにより蒸気塊下の厚い液層の形成をもたらし,限界熱流束を促進させていると考えられる.
乳癌細胞のホルモン依存性喪失過程におけるアポトーシスの関与について

ER発現とBc12,p53発現との関連から,アポトーシス・アポトーシス関連遺伝子とERの関連性につきDMBA誘発SDラット乳癌を用いて経時的解析を試みた。(1)乳腺組織内におけるER,p53,bcl2の発現の推移ER発現は経過中ほぼすべての細胞で発現しているが、その発現強度は極めて微弱であった。p53蛋白の発現はほとんどなかった。Bc12蛋白の発現についてはDMBA投与後1週の時点から乳癌触知までにわずかな減少をみた。(2) DMBA乳癌組織内におけるER,p53,bcl2の発現の推移乳癌組織内ERは腫瘍触知時で腫瘍細胞の8090%で明瞭に発現し腫瘍が3cm以上になると発現細胞頻度が有意に低下した。p53蛋白は経過中有意な発現はみられなかった。Bcl2蛋白は腫瘍触知の時点では腫瘍細胞の4060%で明瞭に発現しており腫瘍が2cm以上になるとその発現細胞の頻度が有意に低下した。また種瘍の増大に従いみられたERおよびbcl2の発現減少には有意な相関をみた。(3)アポトーシス細胞の検索アポトーシス発現は乳腺組織に比べ腫瘍組織内で低くかつ腫瘍の増大とともに低下した。(4)腫瘍組織・正常乳腺組織におけるERmRNA,p53mRNA局在の検索経時的観察では、腫瘍細胞の核内に当初多くみられたERmRNAは経時的に低下した。正常乳腺細胞では経時的一定して核内にERmRNAの局在がみられたが終末乳管から腺房において観察された。その発現レベルはERmRNA陽性腫瘍細胞に比して有意に低かった。以上からDMBA誘発ホルモン依存性ラット乳癌モデルにおけるホルモン依存性喪失機構にはp53遺伝子異常とは直接関連のないbcl2遺伝子蛋白の発現が関与していると思われる。しかし、bcl2遺伝子蛋白とアポトーシスの発現が概して正相関なのはDMBA誘発ホルモン依存性ラット乳癌におけるbcl2遺伝子蛋白の役割がアポトーシス抑制とは異なる可能性がある。乳癌組織内ERは腫瘍触知時で腫瘍細胞の8090%で明瞭に発現し腫瘍が3cm以上になると発現細胞頻度が有意に低下した。SD雌ラットに対する7,12-DMBA誘発乳癌モデルでは、経時的に腫瘍細胞のestrogen依存性が低下することが観察される。乳腺上皮細胞ではapoptosisにより細胞の分化、増殖が進むとされ、ホルモン依存性喪失機構にapoptosisが強く関与することが推察される。SDラットDMBA誘発乳癌モデル系のホルモン依存性喪失機構におけるapoptosis関与の仕組みを明らかにすることが本研究の目的である。今年度はapoptosisの抑制因子とされるbcl2遺伝子、およびapoptosisにdependentな系により作用を発現し得るとされるp53遺伝子の発現・消長とEstrogen Receptorの変化の関係を検討した。1)腫瘍発生までのDMBA暴露乳腺の採取およびDMBA乳癌の採取7週齢のSD雌ラットにDMBA(15+10mg/body)を投与後1週間から腫瘍発生時期の投与後10週まで1週毎にそれぞれ2匹犠牲死させ、乳腺組織を採取した。また、腫瘍触知後からDMBA投与後30週までの間、癌腫の大きさが非触知のもの,0.5cm,1.0cm,1.5cm,2.0cm,3.0cm,5.0cmのものを摘出採取した。採取組織に対し、ERおよびP53,Bcl-2蛋白発現を免疫組織化学的に腫瘍細胞単位で検索し、その陽性細胞率を画像解析装置を用いて算出した。

また、断片化したDNAを高感度に検出するApop Tag Kitを用いてapoptosis細胞を検出した。結果、乳腺組織内におけるP53蛋白の発現やBcl2蛋白の有意な発現の変化はみられなかったが、腫瘍細胞内ではERの発現と明らかな相関をみた。またapoptosisの発現は乳腺組織に比べて腫瘍組織内で低く、かつ腫瘍の増大とともに低下した。7,12-dimethylbenz[a]anthraccne(DMBA)誘発Sprague-Dawley(SD)ラット乳癌モデルは腫瘍発生初期の腫瘍細胞にホルモン依存性がみられるが、その増殖過程においてホルモン依存性が低下・消失する。前年度の科研費研究により、癌抑制遺伝子蛋白p53およびアポトーシス抑制遺伝子蛋白Bcl-2の発現を腫瘍細胞と正常乳腺細胞において観察した。結果、腫瘍細胞ではホルモン依存性の低下・消失とともにp53は発現を強め、Bcl-2は発現を低下させたが、正常乳腺細胞では有意な経時的変化がみられなかった。腫瘍の増大に伴った経時的観察では、腫瘍細胞の核内に当初多くみられたERmRNAは経時的に低下したが、個体による変動が多く、3cm大の腫瘍においても核内にERmRNAがみられるものもあった。(2)正常乳腺組織におけるERmRNA局在の検索正常乳腺細胞では経時的一定して核内にERmRNAの局在がみられたが、とくに終末乳管から腺房においてよく観察された。その発現レベルはERmRNA陽性腫瘍細胞に比して有意に低かった。