hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
天草諸方言の形態音韻現象に関する基礎的研究―方言類型論の構築を目指して

5.天草牛深方言の音節構造を調査し,超分節音の面から,一部の語に超重音節が認められることを明らかにすると共に,同方言の話者同士の自然談話を録音した。6.天草諸方言と同じく2型語声調言語である北薩摩方言の語形成を分節音と超分節音との両面から分析し,その音節が[ [ [Initial Medial] Nucleus][Coda] ]から成ると考えられることを国際学会で発表した。計画していた音韻現象,形態現象について順調に調査を進め,研究発表および論文の形で成果を発表している。分担者がそれぞれ音韻・形態に関する記述を進めていく予定である。また,その分析を随時行い,学術大会や打ち合わせ会議において成果を報告する予定である。研究計画の中間段階に達したので,その成果を発表すべく中間発表会を開催する。また,引き続き各自の調査と研究成果の発表を進めていく。繰越理由は,2018年3月下旬に使用する予定であったが、手続きの都合上、2019年度の執行となったことによる。これらは海外で研究発表を行なうための旅費として、2018年3月下旬に既に使用している。予定していた調査が行えなかったこと,ならびに,3月中旬に開催され,本科研費で参加した国際学会(LAL2019)の旅費の処理が2018年度内に終わらなかったため。
ヒト免疫不全ウイルス感染ランゲルハンス細胞の免疫学的機能の検討

ヒトランゲルハンス細胞(LCs)がHIVに感染後、どのようにHIV特異的免疫応答を変調するかは明らかにされていない。本研究では、in vitroまたはex vivoでHIV感染させたLCsはHIV非感染LCsと比較して、ナイーブCD4陽性T細胞からエフェクター制御性T細胞への誘導能が有意に低下していた。一方で、in vitroまたはex vivoでHIV感染させたLCsは、ナイーブCD8陽性T細胞からIFN-γ産生能を有するHIV特異的CD8陽性T細胞を誘導した。以上の結果より、HIV感染LCはHIV特異的免疫応答を誘導し、後天性免疫不全症候群の発症を遅延させている可能性が示唆された。本研究の目的は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染ランゲルハンス細胞(LC)の免疫学的機能を調べ、HIV感染LCがHIV感染患者の免疫機能に与える影響を検討することにある。有償ボランティアからの採血検体を7日間培養して作製した、ヒト表皮LCの特徴を有するヒト単球由来LC様樹状細胞を用いて、現在までに以下の結果を得ている。1, HIV非感染LCに比べHIV感染LCのIndoleamine 2,3-dioxygenase(IDO)、PD-L1、PD-L2、IL-10、TGF-βなどの免疫抑制分子の発現は有意差を認めなかった。2, HIV非感染LCに比べHIV感染LCによるnaive CD4+T細胞からのnaive Treg細胞誘導能は有意差は認めなかったが、HIV感染LCによるnaive CD4+T細胞からのeffector Treg細胞の誘導能は有意に減少した。3, allo mixed lymphocyte reaction (MLR)を行い、誘導されるTreg細胞の抑制機能を検討したところ、HIV感染LCにより誘導されるTreg細胞の抑制機能は、HIV非感染LCにより誘導されるTreg細胞の抑制機能と比べ有意差は認めなかった。4, HLA-A*0201陽性有償ボランティアからのヒト単球由来LC様樹状細胞とnaive CD8+T細胞を用いた実験において、HIV感染LCはnaive CD8+T細胞からHIVgag特異的CD8+T細胞を誘導することができた。さらに誘導されるHIVgag特異的CD8+T細胞はIFNγ産生能を有していた。以上の結果は、HIV感染において、LCはeffector Treg細胞の誘導を減少させ、HIVgag特異的CD8+T細胞を誘導することで、抗HIV特異的免疫応答を高め、後天性免疫不全症候群の発症を遅延させている可能性が示唆された。最終年度に実施した研究の成果として、HLA-A*0201陽性有償ボランティアから採取した表皮シートにex vivoでHIV BaLを曝露後、3日後に表皮シートから培養液に遊走し回収したLCを、同一のボランティアからのnaive CD8+ T細胞と1週間共培養後、さらに1週間HIVgag抗原で刺激したところ、HIV感染表皮LCはHIVgag特異的CD8+ T細胞を誘導することができた。さらに、誘導されるHIVgag特異的CD8+ T細胞はIFN-γ産生能を有していた。一方で、有償ボランティアから採取した表皮シートにex vivoでHIV BaLを曝露後、3日後に表皮シートから培養液に遊走し回収したLCを、同一のボランティアからのnaive CD4+ T細胞と6日間共培養したところ、HIV非感染表皮LCと比較しHIV感染表皮LCによるnaive制御性T細胞(Treg細胞)誘導能は有意差はなかったが、HIV感染表皮LCによるeffector Treg細胞の誘導能は有意に減少した。研究期間全体を通じて実施した研究の成果として、HIV感染LCはIFN-γ産生能を有するHIVgag特異的CD8+ T細胞を誘導し、一方HIV感染LCは細胞増殖抑制能を有するeffector Treg細胞の誘導能が低下した。LCは初期HIV感染細胞の一つとして重要であるばかりでなく、HIV感染LCはHIV抗原特異的CD8+ T細胞を誘導し、さらにeffector Treg細胞の誘導を減少させることでHIV特異的免疫応答を高め、後天性免疫不全症候群の発症を遅延させている可能性が示唆された。現在までのところ本研究は概ね順調に進んでいる。研究の目的が明確であり、さらに学内掲示板を活用することで採血検体を提供していただく有償ボランティアの募集を定期的に行えていること、購入した培養のためのサイトカインやフローサイトメトリーの抗体、naive CD8+T cell Isolation kitなどが効率的に機能していること、培養過程でのコンタミネーションがないことも本研究が順調に進んでいる理由として考えられる。HIV感染におけるランゲルハンス細胞の免疫学的機能現在までに行ったヒト表皮LCの特徴を有するヒト単球由来LC様樹状細胞による実験と同様の実験を、有償ボランティアの表皮LCを用いて行っていく。学内掲示板を活用し、表皮シートを提供していただく有償ボランティアを募集していく。

表皮シートを採取するにあたり、表皮シートの採取後に創傷被覆材を用いて苦痛を軽減し有償ボランティアが応募しやすい環境を整える。
集積化GaN系面発光素子の基礎検討

高効率発光ダイオードがダブルへテロ構造および量子井戸、pn接合により実現されているが、マイクロディスプレイ応用の観点から、製作コストの点からデバイス構造の抜本的改革が必要とされている。本研究ではショットキー型発光ダイオードに着目し、低コスト集積化応用およびその発光効率向上を検討してきた。本素子は、逆方向リーク電流が少ないことが、素子の動作原理上要求される。窒化物上に蒸着したアルミニウム薄膜の大気中酸化およびその大気中エッチングにより低リーク電流を実現した高効率発光ダイオードがダブルへテロ構造および量子井戸、pn接合により実現されているが、マイクロディスプレイ応用の観点から、製作コストの点からデバイス構造の抜本的改革が必要とされている。窒化物上に蒸着したアルミニウム薄膜の大気中酸化およびその大気中エッチングにより低リーク電流を実現した化合物原料分子線堆積法(CS-MBD)により低温堆積したAl基板上GaNの紫外発光エレクトロルミネッセンス素子の製作と3原色発光蛍光体を利用したRGB発光画素の検討および、GaN系集積型紫外発光素子の製作検討を行った。第1に、GaN系紫外発光薄膜型エレクトロルミネッセンス素子(TF-ELD)の光出力を向上させるために発光層であるGaN薄膜のCS-MBDにおける分子線条件について検討を行った。Al基板に堆積させるため、低温堆積が不可欠であるが、この際に薄膜中に含まれる過剰なGaの低減を行うために分子線発生に必要なGaNセル温度についての検討を行い、比較的低いセル温度で堆積を行うと余剰なGaを低減できることを確認した。また、Al基板上にGaN系TF-ELDの製作を行った。さらに、3原色蛍光体(赤、緑、青)(RGB)酸化物蛍光体との組み合わせによる三原色発光画素について輝度を推定し、平面型ディスプレイ(FPD)への応用における問題点を検討した。この結果、低温堆積GaN薄膜を用いた紫外EL素子の電圧印可動作時、発光ピーク波長370nmを実現し、RGB蛍光体励起が可能なことがわかった。さらに、GaN薄膜を利用した紫外EL素子を励起限としたRGB発光画素の製作およびその光出力について検討を行った。この結果、RGB蛍光体(赤、緑、青)の輝度は、それぞれ、3.2,7.9および10.9kcd/m^2と推定された。これは、小型高輝度平面型ディスプレイを実現できる可能性を示している。第2に、有機金属気相成長法により製作した窒化ガリウム(GaN)薄膜を利用し、集積型紫外発光ダイオードの提案およびその構造の製作を行った。ショットキー型並びに金属・酸化物・半導体接触型(MOS)発光ダイオードについての提案を行っている。単純な構造であるn-GaN層と金属のみで構成されたショットキー型LED(ST-LEDs : Schottky-type LEDs)およびMOS-LEDsの製作を行った。MOS-LEDsは、ST-LEDsと比較して電極における光吸収を抑えることが可能なため、高い量子効率が期待できることがわかった。発光機構などについてH19年度に検討する。集積型GaN系紫外発光素子の試作を(1)化合物分子線堆積法による低温堆積技術を用いた薄膜型エレクトロルミネッセンス素子(TF-ELD)および(2)有機金属気相成長法により製作したGaN薄膜を利用したショットキー型紫外発光ダイオード(ST-LED)を平成18年度に引き続き検討を行った。TF-ELDについては、ガラス基板およびAl基板上に素子製作を行った結果、放熱性が寿命に大きく影響を与えることとともに、低温堆積ではあるが、非晶質よりも多結晶に近卵方が発光特性向上につながる可能性を見いだした。詳しい検討を平成20年度に行う。また、ST-LEDについては、発光がインパクトイオナイゼーションにより起こるモデルを提案した。本素子についても発熱の影響が非常に発光特性、特に出力に与えることが明らかとなった。出力の制限要因は、発光に寄与しないGaN層の吸収であることも明らかになった。このため、平成20年度は、紫外発光領域に透明なMgZnO電極の検討と電極側からの光出射を検討する。MgZnO電極の形成方法は、低コストに製作できるスピンコート法を利用する。また、発光領域とそれ以外の部分の3次元組成変化構造の基礎検討も併せて行う。フラット・ディスプレイパネルに要求されるGaN系発光素子は、大面積に配置することが必要であることが不可欠であると共に大幅な低価格化が要求される。そこで、本研究では、「(1)集積化LEDを用いたmicro-LED arrayの製作」、および「(2)シンプルな製作プロセスによる新規集積化発光素子の製作」の2方法を用いた発光素子によるディスプレイ製作の要素技術を検討した.(1)の方法は、紫外LEDの集積化とRGB蛍光体を組み合わせる方法である。この方法の大きな問題点はLEDの光出射方向にある。通常LEDは、発光層(活性層)とその周辺(クラッド層)との屈折率差により、薄膜構造と平行に導波される光成分が大きく,各発光素子間の干渉につながる。そこで、電極の反射を制御したショットキー型LED周辺に有する構造の製作を試みた。

ショットキー型LEDは,発光層自身の光吸収が大きいことが想定される.実験の結果,ショットキー界面にAl酸化層を挿入し,発光層と電極間の距離を制御するこどにより,電極による発生光子の吸収を低下させることに成功した.この結果,室温において比較的強い紫外線発光を実現することに成功した.この素子を用い, RGB蛍光体を励起し,画素として使用することが可能であることを実証した.(2)の方法は、LEDよりも発光素子の構造をシンプルにした「GaN系発光コンデンサ(LECs)」を利用する方法である。この素子の最大の利点は,大面積化が容易なことである.しかしながら,低コスト化を実現するためには,放熱性のよい低コスト基板の選択が必要である.本研究では,アルミニウム基板に着目し,アルミニウムの融点である660°C以下での低温成長を用いたGaN薄膜の製作技術について検討した.実験の結果,原料にGaN粉末を用いる「化合物原料分子線体積法」により,基板温度650°CにてGaN結晶を製作することに成功し,室温におけるフォトルミネッセンス測定により,バンドギャップ付近のエネルギーに対応する紫外線発光を確認した。
歯周疾患関連菌に新しく発見された挿入配列の病原性への関与

(2)転移活性について:以前にISAa1の標的配列を、TTATTと推測した。しかし、上記挿入箇所の塩基配列を検討してみると必ずしもこの配列に従っていない。基本配列がTTTTTであり、そのうち1ないし2塩基が他の塩基と入れ代わることが許容されている可能性が高い。しかし、現時点で実験的根拠はなく、現在このことを証明する実験をおこなっている。なお、TTTTTあるいは類似した配列は同菌のゲノム中には多く存在し、このことが菌株によってはISAa1が多コピー存在する理由であろう。(1)ISAa1のコピー数の変異:当初血清型の異なる7株においてISAa1のコピー数について調べたところ、血清型とISAa1のコピー数には相関性が見られた。そこで臨床分離株を含めた27株を用いてRFLP法により再検討をおこなった。また、血清型特異抗体を用いて血清型を調べた。結果、RFLPのパターンから27株は7グループに分類された。血清型では5グループに分類された。RFLPのパターンによる分類と血清型による分類との間に相関性はなかった。しかし、ISAa1を用いたRFLPの疫学調査等への応用の可能性は示された。(2)ISAa1の挿入部位について:Y4株について挿入部位を検討したところ、ISAa1 4コピーのうち2コピーはリボゾーム蛋白質遺伝子クラスター中に挿入していた。その結果、S10オペロン、spcオペロン、alphaオペロン間の並びが近縁であるActinobacillus influenzaeと大きく異なっていた。A.influenzaeとEscherichia coliでは同じ並びをしている。このことがA.a.菌にとってどの様な意味があるかは今のところ不明である。(3)他の口腔内常在菌におけるISAa1の存在:口腔に常在するStreptococcus属、Porphyromonas属、Actinomyces属の数菌種について、サザン法により、ISAa1の存在を検討したが、今回調べたいずれの菌種においてもISAa1と相同性の高い配列は見出せなかった。
B細胞の初期分化を制御するZnフィンガー因子の遺伝子単離と解析

本研究では、B細胞の初期分化を制御するKruppelタイプと呼ばれるZnフィンガー因子の遺伝子を単離・解析することを目的として、保存された配列を標的とした高感度なRT-PCR法を用いた遺伝子単離を試みた。モデル系としてLPSとIL-4で刺激したマウス脾細胞からRNAを抽出しcDNAを合成後、保存された配列に対応する混合プライマーを用いてRT-PCRを行なった。さらに予め混合プライマーに付加しておいたアンカー配列を利用したAnchored PCRを行うことで、極微量のRNA(約0.1μg:細胞10^3-10^4個に相当)に由来するcDNAから効率よくZnフィンガー因子の遺伝子断片を増幅可能にした。また遺伝子断片の単離に際し、プラスミドベクターを改変して挿入する遺伝子断片とLacZ遺伝子の読み枠を合わせ、目的とする組み換え体は青色コロニーを形成させ、より効率よく選別できるようにした。現在までに92クローの塩基配列を決定したところ、それらはすべてZnフィンガー因子遺伝子に由来すると考えられ、重複するものをまとめると65種類に分類され、そのうち62種は未知であった。それらを含む多くのクローンの中から、刺激により特異的に発現するようなものを選択するために、刺激あるいは無刺激のマウス脾細胞から調製したRNAからそれぞれ同様にZnフィンガードメイン遺伝子断片をRT-PCRにて調製したものをプローブとして、刺激したマウス脾細胞由来の遺伝子断片のプラスミドライブラリーをスクリーニングした結果、刺激で有意に発現が増強されるクローンが単離できた。今回我々が確立したZnフィンガー因子の遺伝子単離法は、B細胞の初期分化をin vitroで誘導できる、骨髄細胞あるいは胚性幹細胞のストローマ細胞共培養系のような少ない細胞を取り扱う系からの遺伝子単離を可能にするに十分なほど高感度かつ簡便であり、さらに分化の各段階に特異的な遺伝子発現をスクリーニング的に多数同時に検索することができる点でも非常に有意義であるといえる。
血小板CD36抗原に関する臨床病理学的検討

新しく得られた抗CD36モノクローナル抗体(MoAb)である131.4、131.5、131.7はコラーゲン刺激による血小板凝集および細胞質遊離Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]i)の増加を濃度依存性に抑制するとともに、Mg^<2+>非依存性のコラーゲン粘着を特異的に抑制した。以上からCD36は血小板のコラーゲンレセプターの一つである可能性が示唆された。健常人130例、各種疾患患者111例について、血小板表面に発現されているCD36について検討した。健常人130例中血小板CD36は123例(94.6%)に発現されており、陰性は7例(5.4%)であった。この陰性の頻度は、わが国における従来の報告の37%と類似した結果であった。CD36陽性者についてCD36発現のピーク値をみると、血小板1個あたりのCD36発現量の多いhigh peak群とlow peak群の2群に分かれる傾向が認められた。一方各種疾患患者での血小板のCD36の発現は多様であり、血小板のCD36とGPIbをフローサイトメトリー2カラー法で測定しそのピーク値の比をとると、疾患群ではその比が大、すなわちCD36発現が亢進している群と、比が小、すなわちCD36発現の低下している群とに分かれた。CD36ピーク値とMPVとの間には相関関係はなく、トロンビンなどで刺激するとCD36発現量は増大することから、発現の亢進は容積よりも血小板活性化が関係していると考えられた。またCD36発現の低下には一部抗血小板抗体の関与も推定された。低比重リポ蛋白(LDL)自体(n-LDL)には血小板を活性化したり、活性化を促進したりする作用はみられなかったが、LDLを硫酸銅によって酸化した酸化LDL(ox-LDL)は、高濃度で血小板を凝集させ、血小板表面へのCD62P (GMP-140)およびCD63の発現を惹起させるとともに、低濃度ではトロンビン刺激による血小板凝集を惹起させた。また[Ca^<2+>]iを増加させ、トロンビンによる[Ca^<2+>]iの増加を亢進させた。抗CD36MoAbは、ox-LDLの血小板結合を50%抑制した。またこのMoAbは、ox-LDLによる[Ca^<2+>]i増加作用、[Ca^<2+>]i増加亢進作用、トロンビン凝集促進作用、および血小板表面へのCD62P、CD63発現惹起作用を約50%抑制した。以上から、血小板CD36抗原はox-LDLの血小板結合のレセプターの一つであると推測した。またこのMoAbは、ox-LDLによる[Ca^

<2+>]i増加作用、[Ca^<2+>]i増加亢進作用、トロンビン凝集促進作用、および血小板表面へのCD62P、CD63発現惹起作用を約50%抑制した。以上から、血小板CD36抗原はox-LDLの血小板結合のレセプターの一つであると推測した。静置系での血小板のコラーゲン粘着の測定系を確立した。洗浄血小板を^<51>Crで標識し、I型コラーゲンをコーティングしたマイクロタイタ-ウェルに静置し一定時間インキュベート後、洗浄しSDSで可溶化しRIカウントすることにより血小板の粘着を測定した。次に5種類の抗CD36モノクローナル抗体(MoAb)を用いて、上記方法による血小板のコラーゲンへの粘着、血小板凝集、血小板内Ca^<2+>動態におよぼす影響を検討した。このうち2種のMoAb(131.1、131.2)はそれ自体で細胞内Ca^<2+>を増加させ、血小板凝集を惹起し、コラーゲンへの血小板粘着を増強する傾向が認められた。これらの抗CD36MoAbによる血小板活性化は、他の抑制性の抗CD36MoAbによって一部、FcγRIIに対するMoAbによって完全に抑制されることから、FcγRII依存性であるが、CD36抗原も刺激伝達に重要な役割を果たしていると考えられた。これに対して、これとは異なるエピトープを認識する3種の抗体(131.4、131.5、131.7)は、血小板のコラーゲンへの粘着のうち特にMg^<2+>非依存性の粘着を濃度依存性に抑制した。しかしこの抑制はCD36陰性血小板では明らかではなかった。またこれらの抗体は血小板のフィブリノゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチンなどの他の接着蛋白への粘着に対しては影響を与えなかった。この3種のMoAbは、多血小板血漿(PRP)および洗浄血小板浮遊液(WPS)でのコラーゲン凝集を抑制し、コラーゲン刺激による細胞内Ca^<2+>の増加を濃度依存性に抑制した。しかしPRPでのADPおよびエピネフリン凝集、WPSでのトロンビン凝集に対しては影響を与えなかった。以上より血小板のCD36は血小板-コラーゲン反応に関わっていると考えられた。健常人101例、各種疾患患者20例についてフローサイトメトリーを用いて血小板表面のCD36を測定した。健常人のうち6例(5.9%)でCD36が陰性であり、ITP症例の一部でCD36発現の低下がみられた。現在CD36陰性例と陽性例での血小板機能について検討中である。健常人130例、各種疾患患者111例の計241例について、血小板表面に発現されているCD36について検討した。健常人130例中血小板CD36は123例(94.6%)に発現されており、陰性は7例(5.4%)であった。この陰性の頻度は、わが国における従来の報告の37%と類似した結果であった。CD36陽性者についてCD36発現のピーク値をみると、血小板1個あたりのCD36発現量の多いhigh peak群とlow peak群の2群に分かれる傾向が認められた。一方各種疾患患者での血小板のCD36の発現は多様であり、血小板のCD36とGPIb(CD42b)をフローサイトメトリー2カラー法で測定しそのピーク値の比をとると、疾患群ではその比が大、すなわちCD36発現が亢進している群と、比が小、すなわちCD36発現の低下している群とに分かれた。CD36発現の亢進している群には、高脂血症、高血圧症、一過性脳虚血発作(TIA)などの疾患が含まれ、CD36発現の低下している群には特発性血小板減少性紫斑病(ITP)などであった。CD36発現ピーク値とMPVとの間には相関関係はなく、トロンビンなどで刺激するとCD36発現量は増大することから、発現の亢進は容積よりも血小板活性化が関係していると考えられた。またCD36発現の低下には一部抗血小板抗体の関与も推定された。
超越数の代数的・解析的研究

1.今年度行われた学会、シンポジウム、研究集会等において、超越数論の研究発表、情報交換、交流および資料収集の面で多くの成果があった。2.特に、平成5年10月に京都大学で行われたシンポジウムでは、マーラー関数、多様体と超越性及び整数点の分布等についての講演が行われた。3.次に、当研究費補助金を運営その他の費用として、平成6年1月に学習院大学で行われた第4回超越数論研究集会では、16名の講演者により、超越数論の種々の結果の紹介や新しい研究の発表があり、非常に有意義な会であった。その研究集会の主なテーマは、(1)マーラー級数、空隙級数、幾何級数などの値の超越性、(2)連分数の種々相と超越数、(3)楕円関数、楕円曲線と超越理論、(4)有理近似と超越測度、等があげられる。これらはいづれも、更に研究が続けらるべきテーマである。4.これまでの研究集会と同じく、当研究費補助金によって、今回も上記研究集会の報告集を出すことができた。この特色の一つである文献集も、引き続いてのせられている。
革新的金属ナノ中空球および金属ナノチューブの創製と機能性解明

ナノ微粒子およびナノワイヤーの被膜酸化層と金属構造体との相互拡散によって移動した空孔の集合体を利用して金属および酸化物のナノ中空球およびナノチューブを創製した.それらの熱安定性を調べると共に,中空化機構の解明を透過電子顕微鏡を用いて行った.さらに,酸化物ナノ中空球粒子の磁気および制振特性を評価した.ナノ微粒子およびナノワイヤーの被膜酸化層と金属構造体との相互拡散によって移動した空孔の集合体を利用して金属および酸化物のナノ中空球およびナノチューブを創製した.それらの熱安定性を調べると共に,中空化機構の解明を透過電子顕微鏡を用いて行った.さらに,酸化物ナノ中空球粒子の磁気および制振特性を評価した.金属ナノ粒子の酸化に関連する中空化現象を透過電子顕微鏡(TEM)を用いて調査した。ZnおよびCu酸化物ナノ粒子の中空化現象を見出したので、主にその結果を報告する。1.蒸発によるZnナノ粒子の中空化TEM(真空度:5×10^<-5>Pa)中にてアモルファスカーボン基板上にZnナノ粒子を蒸着させ、その後、大気に曝した。再度TEMに戻し、300°Cまで加熱したときのZn粒子の変化をその場観察した。250°C付近にて、瞬時に粒子が中空化する様子が観察された。電子線回折パターンの解析結果から、(1)大気酸化におけるZnを覆う表面酸化物ZnOの生成、(2)真空焼鈍における内部Znの蒸発、というメカニズムにより数nmの厚さを有するZnO中空粒子が形成することが明らかとなった。これはZnの表面酸化および高い蒸気圧に起因する現象である。2.酸化によるZnナノ粒子の中空化1と同様の手順で作製したZnナノ粒子を大気中において150°C,1h酸化させたところ、直径20nm程度の中空状ZnOが形成した。この現象は1と異なり、Zn/ZnO/O_2という反応系における原子移動に伴うものである。内部のZnが表面ZnOを通じて外向きに移動する速度が、ZnO表面から内部へ侵入していく酸素イオンの速度よりも速いため、結果として内部に原子空孔の集合体としてのナノ孔が形成したものと考えられる。3.醸化によるCuナノ粒子の中空化Cuナノ粒子を大気中において150°C,1h酸化させたところ中空状Cu_2Oナノ粒子が形成することが確認された。この現象は2と同様に、酸化過程において内部のCu原子が外方へ移動する速度が速いことに起因すると考えられる。2および3の結果は、酸化によるナノ粒子の中空化において、酸化物中の金属イオンの拡散が速いことが重要であることを強く示唆している。4.ナノ組織制御によるロータス型ポーラス金属の作製と特性評価金属を溶解凝固時に、凝固組織をナノスケールで制御することによって高品質のロータス型ポーラス金属および金属間化合物の作製を行った。機械的性質、超弾性特性、磁気抵抗を調べ、ポーラス特有の物性を見出した。前年度、金属ナノ粒子の酸化反応によって中空状酸化物が形成する現象を見出した。今年度は、数種の金属ナノ粒子の酸化過程をTEMによって観察し中空化機構を詳細に調べた。また、中空状酸化物粒子をTEM中の高真空下でアニールし、中空構造の安定性をその場観察した。1.酸化反応を利用した金属ナノ粒子の中空化Cu,Al,およびNiナノ粒子を室温400°Cで酸化させ、酸化後の形態変化を観察した。いずれの金属ナノ粒子も酸化によって中空状酸化物に変化することがわかった。この現象は、金属/酸化物/酸素という反応系における原子移動に伴うものであると結論づけた。これらの金属の酸化過程では、内部の金属原子が表面酸化物を通じて外向きに移動する拡散が、酸化物表面から内部へ侵入していく酸素イオンの拡散よりも圧倒的に速い。その結果として過剰空孔が内部に流入し、酸化物粒子の内部の金属部に原子空孔の集合体としてのナノ孔が形成されたものと考えられる。Alは酸化しやすく、その酸化物は非常に安定であるため、粒径の小さい粒子は大気にさらすだけで瞬時に中空化されるが、粒径が大きい粒子は高温で長時間加熱しても酸化が進行せず中空化しない。Ni粒子の酸化過程ではボイドの偏在化が起こり、NiO粒子内部に形成される孔も粒子の中心よりずれた位置に偏在する特異な傾向が見られた。2.中空状酸化物粒子の熱的安定性Cuナノ粒子を酸化させて得られる中空状Cu_2O粒子をTEM中の高真空下(5×10^<-5>Pa)で加熱し、形態変化をその場観察した。中空粒子の粒径および酸化物殻の厚さに依らず、200°C付近でCu_2OからCuへの還元反応が起こった。還元反応の進行に伴い中空粒子が収縮する様子が観察された。還元反応が完了するとナノ孔は消滅し元の緻密なCu粒子へと戻ることが明らかとなった。3.ナノ組織制御によるロータス型ポーラス金属の作製と特性評価ガス原子を溶解させた溶融金属を一方向凝固させてロータス型ボーラス金属や金属間化合物の作製を行った。特に,凝固時の気孔の核生成および成長過程におけるナノ凝固組織の形成が,気孔の形態に決定的な影響を及ぼすことが明らかとなった。さらに,この材料の諸物性を解明した。前年度までに金属ナノ粒子の酸化反応によって酸化物ナノ中空粒子が形成する現象を見出した。

今年度は、酸化物ナノ中空粒子を還元および酸化雰囲気でアニールした場合の中空構造の熱的安定性を調査し,中空粒子の収縮が起こる条件を明らかにした.また,新たなロータス型ポーラス金属の作製プロセスを確立した.1.酸化物ナノ中空粒子の真空アニールによる収縮Cu_2OおよびNiO中空粒子をTEM中の高真空下(5×10^<-5>Pa)で加熱し、形態変化をその場観察した。Cu_2Oは200°C付近で,NiOは350°Cで金属に還元される反応が始まった。還元反応が始まる温度で,中空粒子が収縮する様子が観察された。還元反応の進行に伴って中空粒子の収縮は進行し,最終的にナノ孔は消滅して,元の中実な金属粒子へと戻ることが明らかとなった。金属ナノ粒子の酸化と還元を繰り返すと,形態および結晶構造は可逆的に変化することがわかった.2.酸化物ナノ中空粒子の高温酸化による収縮酸化雰囲気においては,Cu_2OおよびNiO中空粒子の収縮は,それぞれ400°Cおよび650°Cで観察された.これらの温度における両酸化物中の拡散の遅い成分の拡散係数は,いずれも10^<-22>m^2s^<-1>程度であった.これより,酸化雰囲気での中空粒子の収縮は,遅い成分の拡散に律速され,その拡散係数は10^<-22>m^2s^<-1>程度であると結論づけられ,中空構造の維持・消滅の条件が見出された.3.化合物粉末を用いた新しいロータス型ポーラス金属の作製プロセスの解明従来の高圧ガス法に代わって,化合物粉末の熱分解反応によって解離したガスを利用したロータス型ポーラス金属の作製手法を開発し,気孔形成メカニズムを明らかにした.1.相互拡散とカーケンドール効果を利用した金属中空ナノ粒子の作製拡散係数の大きいAuナノ粒子(直径10nm)を拡散係数の小さいPd(厚さ20nm)で被覆したコアシェル型Au/Pdナノ粒子を300400°Cでアニールすると,粒子中心部にボイドが形成され中空構造となった.ボイドの大きさは,Au粒子のサイズと同等であり,AuがPd側へ外方拡散したと考えられる.拡散係数の差が大きく,かつ,互いの固溶度が大きいような異種金属のコアシェル構造において,相互拡散により中空粒子が得られる可能性が示唆された.2.金属ナノワイヤーの酸化による酸化物ナノチューブの形成直径約50nmのCuナノワイヤーを大気中150°C1hr,Feを300°C1hr酸化させると,それぞれCu_2OおよびFe_3O_4ナノチューブが形成された.一方,Niナノワイヤーを400500°Cで酸化させると断片化された内部ボイドを有する構造体となった.Fe_3O_4ナノチューブを400°C以上で酸化させると,酸化層の内壁に沿ってナノボイドが配列したユニークな2重ポーラス構造体が得られた.3.酸化鉄ナノ中空およびナノポーラス粒子の作製と磁気特性の評価Fe_3O_4ナノ中空粒子の磁気特性を評価するため,Feナノ粒子からFe_3O_4ナノ中空粒子を得るための酸化条件の検討を行った.Feナノ粒子を400°Cで酸化させるとFe_3O_4ナノ中空粒子が,500°C600°Cで酸化させるとγFe_2O_3ポーラスナノ粒子が形成された.現在,これらの条件に基づいて作製したナノポーラス粒子の磁気特性をSQUIDを用いて測定している.1.異種金属コア-シェル構造における相互拡散とカーケンドール効果による金属ナノチューブの形成
メカニカルストレスによる歯周組織から誘導されるヒト歯根吸収因子の解析

メカニカルストレスモデルとして、ヒト歯根膜細胞に遠心力により重力を負荷する実験系およびピペッティングによるシェアストレスを負荷する実験系を用い、MAPキナーゼの一つであるERKのリン酸化を主な指標として、シグナル伝達経路を解析した。【目的】歯科矯正における歯の移動は、圧迫、牽引に伴う力学的負荷(メカニカルストレス)によって起き、圧迫側では骨吸収が、牽引側では骨形成が起きる。しかし、その正確なメカニズムは明らかではない。最近の研究によると、歯周組織に存在する細胞がメカニカルストレスを感知し、何らかのシグナルを骨関連細胞に送っているのではないかと考えられるようになってきた。本研究では、メカニカルストレスによりヒト歯根膜細胞に生じるシグナルを同定・単離し、その機能を解析することを目的とした。【試料および方法】矯正治療のため抜去した小臼歯からヒト歯根膜細胞を分離し使用した。分離したヒト歯根膜細胞を伸展および圧縮可能なシリコンチャンバーにて培養後(37継代)、CO2インキュベーター内にて10%の伸展・圧縮力を負荷した。伸展・圧縮力を負荷後、ヒト歯根膜細胞からISOGEN reagentを用いてtotal RNAを抽出した。次にRT-PCR法によって、伸展・圧縮力に誘導される遺伝子群を骨関連遺伝子に絞って、配列特異的プライマーを用いて解析した。さらに、誘導が確認された遺伝子の発現量を定量するために、配列特異的プライマーとTaqman Probeを用いて、mRNA発現の定量を行った。【結果および考察】伸展負荷においては、負荷3時間でCOX-2とIGF-1が著しく誘導され、controlと比較してmRNA発現が16倍に増加した。また、圧迫負荷では5時間でIGF-1のmRNA発現量が4倍に増加した。【結論】ヒト歯根膜細胞はメカニカルストレスに応答して、IGF-1およびCOX-2を誘導した。【目的】歯に加えられた矯正力(メカニカルストレス)は、歯根膜細胞を介して何らかの情報が歯槽骨等に伝達され、歯周組織のリモデリングの結果、歯の移動を生じる。本研究では、メカニカルストレスの一つである重力負荷に対する歯根膜細胞のシグナル応答を、細胞内にリン酸化シグナルを伝えるMAPキナーゼの一つである、ERKのリン酸化を指標として検討した。【資料および方法】矯正治療のため抜去した小臼歯からヒト歯根膜細胞を分離し使用した。今回の実験には、58継代目の細胞を使用した。分離したヒト歯根膜細胞を12wellプレートにて、コンフルエントになるまで培養した。その後、低速遠心機によりCO2インキュベータ内で重力を7G25Gで5分間負荷し、ERKのリン酸化を抗リン酸化抗体を用いウエスタンブロット法にて検討した。また同時に、ATP(10μM)の添加によるERKのリン酸化の検討も行った。【結果および考察】歯根膜細胞に重力を負荷すると、加重と負荷時間に依存してERKのリン酸化が認められた。5分間重力負荷によるERKのリン酸化は、ATPaseであるapyrase、およびプリン受容体阻害剤のsuraminによって阻害され、また培養液にATPを加えても同様の反応が見られた。ERKのリン酸化はイオノマイシンでも認められたが、培養液からCa^<2+>を除いても重力とATPによるERKのリン酸化には影響しなかった。ATPは細胞膜上のプリン受容体に結合し、シグナルを細胞内に伝達する。プリン受容体には、P2X(カルシウム流入)とP2Y(Gプロテインシグナル)の二つがある。以上のことから、重力負荷によるERKのリン酸化シグナルには、P2Y受容体の関与が示唆された。【結論】歯根膜細胞における重力負荷は、細胞からATPを放出しP2Yタイプのプリン受容体を介してERKのリン酸化を促進していることが示唆された。
染色体の機能領域

本研究は、1)染色体の高次構造の形成と維持に係わる諸因子の同定とその作用機構、および2)染色体上の機能領域の構造とそこに作用する因子の作用機構、についての解析を目的とする。それぞれの分野において得られた成果は以下の通りである。1)染色体の構築:(1)真核細胞中から初めて見い出した超ねじれ化因子を用いて活性クロマチンの構築に成功した(広瀬)。(2)ヌクレオソーム構成に必須なアッセンブリー蛋白質の遺伝子の単離に成功した(菊池)。(3)真核細胞で見つけたプラスミド(L因子)を用い、複製、転写および維持の機構を解析した(大石)。(4)分裂酵母全ゲノムの動原体領域を同定しそれらの全体像および機能領域を明らかにした(丹羽)。2)染色体の機能領域:(5)増殖状態により発現が制御されるLDH遺伝子の転写制御領域について構造解析を行った(竹家)。(6)細胞周期に依存して発現する遺伝子(cーmyc,cーfos)の発現調節機構を解析した(高井)。(7)酵母の接合過程に係わる情報伝達経路およびCaが果たしている役割を解析した(大隅)。(8)リン脂質やcAMPなどのセカンドメッセンジャーによる細胞周期調節機構を明らかにした(宇野)。(9)酵母から細胞周期変異株を分離し、その形質を担う遺伝子の単離、解析を行なった(菊池淑子)。(10)枯草菌を用いてdnaA遺伝子が細菌の複製開始調節において本質的な役割を果たしていることを明らかにした(小笠原)。
抑制性シナプスの長期増強を仲介する分子機構の解明

GABAシナプス制御機構を研究するための二つの実験系を構築して、受容体間クロストークの分子基盤を明らかにした。脊髄後根神経節のニューロンを急性単離して、パッチクランプ記録法によって、代謝型グルタミン酸受容体mGluR1およびGABA_B受容体の相互作用が再現することを明らかにした。この実験系を用いて、実験が比較的容易に行える末梢ニューロンに着目して研究を開始した。そこで、最初に一次求心性ニューロンに機能的なmGluR1が存在する可能性を検証した。これらの二種類のGABAシナプスにおける増強の分子的基盤をさらに深く理解するため、GABAシナプスを可視化して分子イメージング法を可能にするための新しい実験系を構築することを試みた。このため、Yanagawaら(2009)によって作出されたVGAT-Venusトランスジェニック・マウスの海馬から分散培養して、GABA作動性ニューロンを可視化した。シナプス後部は、GABA_A受容体の足場蛋白であるgephyrinを蛍光標識した。その結果、図に示すようにVenus蛍光を示すGABAニューロン終末ボタンと赤色蛍光を示すmChery-gephyrinのクラスターが密接に重なり合ってシナプス結合する部位を明瞭に観察できるようになった。現在、このシナプス部位の形成過程と機能的GABA_A受容体の分布と培養ニューロンに可塑性刺激を加えて抑制シナプス結合の動態を観察している。先に小脳皮質の抑制性GABAシナプス伝達が新しい機構で制御されていることを見出した。本研究課題では、その中でも後シナプス性機序による長期増強機構と、前シナプス性機構によるGABA伝達の抑制について研究を進めた。また、抑制性および興奮性シナプスの間で起こる新しい受容体間クロストーク現象の分子的基盤を明らかにすることを試みた。このため、今年度は代謝型グルタミン酸受容体mGluRlの応答がGABAB受容体の活性化で顕著に強化される受容体分子間クロストークの分子機構を明らかにするための実験系を確立した。脊髄後根神経節のニューロンを急性単離して、パッチクランプ記録法によって、代謝型グルタミン酸受容体mGluRlおよびGABAB受容体の相互作用が再現することを明らかにした。この実験系を用いて、以下の二つの仮説を検証している。(1)最初にGABA_B受容体と代謝型グルタミン酸受容体mGluRlによって活性化されるG蛋白サブユニットが相補的に機能を共有し、それに伴い一方の受容体機能(つまりmGluRl受容体の働き)が著しく促進される。(2)GABABおよびmGluRl受容体が、別の蛋白、たとえば足場蛋白(BDNF・NGF受容体)に連結して相互作用を起こし、mGluRl受容体機能を発現させる。すなわち「異なる複数の受容体が両者に共通した別の統合分子装置の役割を担う標的受容体インテグレーターに共役して受容体間trans-activationを起こし、受容体機能の最終出力を調節する」という可能性を検証している。これによってmGluRl-GABAB受容体間クロストークの細胞内シグナル伝達系を明らかにしたい。
マウス白血病における固有抗原および拒絶抗原の解析

1.固有抗原分子の本態モノクローナル抗体(mAb)NU7ー99はマウス白血病B6RV2細胞表面上の固有抗原を認識し、この腫瘍以外のいかなる腫瘍とも、またいかなる正常細胞とも反応しない。NU7ー99mAb反応分子を精製しラットに免疫してモノクローナル抗体を得、B6RV2固有抗原分子の本態を解析した。1)抗原の抽出はB6RV2をビオチン化NU7ー99mAbと反応させ、先條後NPー40で可溶化し、プロテインAセファロースカラムに吸着させ、溶出後、アビジンカラムにかけて抗原分画を得た。こうして得た抗原でラットを免疫し、その脾細胞を用いてハイブリドーマを作製し、UR49、UR330の2つのクローンを得た。2)UR49、UR330エピトープは種々の白血病細胞で異なる程度に発現していた。正常では胸腺細胞に発現し、特にUR49は末梢T細胞にも発現し分化抗原としての性質を持つことがわかった。これらの結果は、固有抗原は正常胸腺細胞に発現するxenotropic gp70分子の何らかの変異に由来することを示唆している。2.リポソーム組込み細胞膜蛋白による抗腫瘍効果の増強DMPC:DDPCリポソームは新たに開発したリポソームでBALBRVD細胞と混合すると細胞膜蛋白がリポソーム表面に移行する。これによる免疫はマイトマイシンC処理BALBRVDよりも強い傷害性T細胞を誘導し、腫瘍拒絶を引き起こす。このリポソームは腫瘍ワクチンとして有効であるだけでなく、アッセイの難しい拒絶抗原の解析に有効である。
薬剤耐性に伴う抗がん剤ドキソルビシン排出におけるオートファジーの関与

抗がん剤排除などの薬剤耐性は、処方した抗がん剤の無力化に直結する、重大な問題である。抗がん剤がどのよう経路で細胞外へ排除されるかという謎に対しては、ほとんど分かっていない。本研究課題では、抗がん剤ドキソルビシンを用いてオートファジーによる薬剤排除機構を解明することを目指した。本研究によって、核に蓄積したドキソルビシンを直接オートファジーによって排出することが判明した。本研究の成果は、単に抗がん剤をリソソームに隔離して薬効を無力にするだけでなく、核内の物質の排除に細胞質側から積極的に関与する新規のシステムの存在が明らかとなったことである。本研究の目的は、薬剤耐性に伴って核から細胞質に排出される抗がん剤ドキソルビシンのリソソームへの輸送にオートファジーの関与を明らかにすることである。H25年度では、排出されるドキソルビシンの蛍光輝点の動態と局在を明らかにし、オートファジー制御因子との関連を明らかにすることを目的として研究を遂行した。(1)細胞質に出現するドキソルビシン蛍光輝点のライブ解析:細胞質に排出されるドキソルビシンがオートファゴソームに取り込まれるのか明らかにするため、1オートファジーマーカーLC3とGFP融合遺伝子の安定発現細胞株を取得し、2この細胞株を用いて蛍光顕微鏡を駆使してライブ解析を行ない、核から排出されたドキソルビシンとLC3-GFPが頻繁に共局在することが分かった。Atg14ノックダウン細胞ではこれがほとんど見られないことも分かり、従来提唱されている薬剤トランスポーターを介する薬剤排出の定説に疑義を提案することができた。(2)光顕電顕対応法によるドキソルビシン分布の細胞内微細構造解析:光顕で得た画像を電顕で重ね合わせる実験手法は、ドキソルビシンの分布場所近辺のオルガネラの膜微細構造の詳細を明らかにできる。実際に行なったところ、細胞質に存在するドキソルビシンの蛍光は、電子密度の濃い領域に含まれることが判明した。今後、抗LC3抗体を用いてこの領域の免疫電顕を行なったり、3Dトモグラム解析による立体構築を行なったりすることで、さらなる飛躍的な研究発展が期待され、現在更なる研究を進めている。この抗がん剤排除は、細胞膜に存在する薬剤トランスポーターを介することが知られているが、抗がん剤がどのよう経路でトランスポーターまでたどり着くのか、さらに、抗がん剤単独でトランスポーターまで運ばれるのかといった謎に対しては、ほとんど分かっていない。本研究課題では、オートファジーによって、核に蓄積した抗がん剤ドキソルビシンが細胞質に排出されリソソームに隔離される分子メカニズムを明らかにすることによって、薬剤排除による耐性機構を解明することを目指している。本研究による、オートファゴソームマーカーであるGFP-LC3のライブ解析やAtg5やAtg14などのオートファジー制御因子のノックダウン細胞を用いた細胞生物学的解析から、核に蓄積したドキソルビシンの細胞質への排出にオートファジーが関わることを明らかにした。そこで、核から排出される際の核の構造を形態学的に解析し、オートファジー制御因子のノックダウンによって核の構造がどう影響するのかを解析した。その結果、ドキソルビシン排出時に核膜が内側に管が陥入した構造が認められ、ノックダウンによって、管構造の異常が観察された。管形成とオートファジーの関係が明らかになってきた。本研究で明らかとなったオートファジーによるドキソルビシン排除機構は、単に抗がん剤を酸性化区画であるリソソームに隔離して無力化するシステムであるだけでなく、核内の物質の排除に細胞質側から積極的に関与する新規のシステムの存在が明らかとなった。細胞生物学本研究の目的は、薬剤耐性に伴う抗がん剤ドキソルビシンの核外排出とリソソームへの輸送はオートファジーを介することを明らかにすることである。薬剤トランスポーターを介して輸送されるといった定説に対して、オートファジーが関与するという挑戦的考えで本研究は遂行され、その分子機構を解明するための研究である。特筆すべきは、H25年度の研究において、ドキソルビシンがLC3-GFPと共局在することをライブで捕らえることに成功したことである。定説のみでは説明できない大きな実験結果を得た意味で、達成度は高いと考えられる。今後、H25年度の実験をさらに引き続き推進し、Atg14以外のオートファジー制御因子についても同様にライブ解析をしてドキソルビシン排出の分子機構の詳細を明らかにする。計画通り、細胞質に排出されたドキソルビシンの局在の詳細も免疫電顕などを駆使して細胞生物学的に明らかにする。

LC3-GFPと共局在することが判明したので、当初の計画通り、LC3-GFPと相互作用する因子の探索と同定を生化学的に行なう。現在、研究計画の大幅な変更は考えていない。当初計画通りに進められていることから、研究を遂行する上での課題等は現時点で見つけられず、H26年度研究計画通りに推進したい。
生体・人工発動分子によるエネルギー変換過程の１分子計測法の開発

(1)金属ナノプローブ1分子計測法の開発(飯野):金属材料の最適化や照明光学系の改善により、粒径40nmの金ナノ粒子で、1Åの位置決定精度と1msの時間分解能を達成した。また、より小さな粒径30nmの金ナノ粒子を1.9Åの位置決定精度と1ミリ秒の時間分解能でイメージングすることに成功した。さらにこの実験を利用し、リニア分子モータープロセッシブキチナーゼの作動機構を解明した。(2)金属ナノプローブと蛍光の1分子複合計測(飯野):金属ナノプローブ表面のプラズモン共鳴による局所的電場増強を利用した、金属ナノプローブと蛍光プローブの1分子複合計測法を開発した。具体的には、いわゆる全反射型蛍光顕微鏡のダイクロイックミラーとバリアフィルターを穴あきミラーに交換し、金ナノ粒子の散乱光とCy3の蛍光を同時にイメージングする複合計測装置を開発した。金ナノ粒子表面の電場増強により2倍の蛍光強度が得られた。さらに開発した実験系を回転分子モーターV1-ATPaseに適用し、蛍光標識ATP(ADP)の結合(解離)と回転運動の同時観察に成功した。(3)蛍光複合計測による1分子動態観察(笠井、飯野):細胞膜中で働く人工チャネル分子の機能を直接に蛍光計測するためのツールの検討を行った。具体的には、細胞膜の電位を測定するツールを用いて、生理的な条件で細胞を刺激した際に、測定可能なシグナル変化をとらえることができるかを調べた。その結果、蛍光共鳴エネルギー移動法を用いた膜電位プローブによって、ドーパミン受容体の刺激に伴う細胞応答をとらえることができた。(4)高速AFMによる1分子観察・操作(飯野、内橋):我々が以前開発した高速AFM/1分子蛍光顕微鏡複合機の1分子蛍光のS/Nを、金コートしたカンチレバー表面の電場増強を用いてさらに改善することに成功した。(1)金属ナノプローブ1分子計測法の開発(飯野):粒径40nmの金ナノ粒子で、1Åの位置決定精度と1msの時間分解能を達成できた。さらに、より小さな粒径30nmの金ナノ粒子を1.9Åの位置決定精度と1ミリ秒の時間分解能でイメージングすることに成功した。(2)金属ナノプローブと蛍光の1分子複合計測(飯野):金ナノ粒子の散乱光とCy3の蛍光を同時にイメージングする複合計測装置の開発に成功した。また、金ナノ粒子表面の電場増強により、蛍光強度を2倍に改善することができた。(3)蛍光複合計測による1分子動態観察(笠井、飯野):蛍光共鳴エネルギー移動法を用いた細胞膜内層の膜電位状態を測定するプローブ(MCS+, Ma et al., Nat. Biotechnol., 2017)により、ドーパミン受容体の刺激に伴う細胞応答をとらえることに成功した。すなわち、ドーパミン受容体の刺激によって、細胞膜内層側の膜電位状態が変化すること、さらにこの反応は数十秒以上持続することを明らかにできた。(4)高速AFMによる1分子観察・操作(飯野、内橋):金コートしたカンチレバー表面の電場増強を用い、高速AFM/1分子蛍光顕微鏡複合機の蛍光シグナルを改善することに成功した。開発した1分子計測法の改良を継続しつつ、生体・人工・ハイブリッド発動分子の計測に取り組む。尚、来年度からは内橋は研究協力者から外れ、公募班代表者として本新学術領域に参画する。このため今後は、本課題の高速AFM部分は内橋が公募研究で担当する。(1)金属ナノプローブ1分子計測法の開発(飯野):リニア型生体発動分子のダイニンは、キネシン-1やミオシンVと異なり構成部品間の協調性がなくても一方向に運動できると考えられている。これらの非協調性生体発動分子の運動とエネルギー変換の仕組みを明らかにする。さらに、DNAオリガミ上を動く非天然ダイニン(A01-2班が創成)の計測を行い、運動素過程やエネルギー変換の機構を解明する。(2)金属ナノプローブと蛍光の1分子複合計測(飯野):異方的な環境場である生体膜でエネルギー変換を行う回転型生体発動分子V-ATPaseの1分子複合計測を行う。V-ATPaseは、回転運動を介してATPの化学エネルギーをイオンの電気化学ポテンシャルに変換する。回転運動とイオン輸送の素過程を可視化してその仕組みを明らかにする。さらに、A01-2班が創成する非天然型V-ATPaseの1分子複合計測を行う。(3)蛍光複合計測による1分子動態観察(笠井、飯野):生体膜中に組み込んだ人工発動分子を蛍光1分子観察し、発動分子が機能発現する過程を明らかにする。A01-1班の人工イオンチャネルの会合形成やA01-3班の人工分子針の伸縮運動と物質輸送を同時に計測して、仕組みを理解する。発動分子と輸送プローブを二色同時蛍光1分子観察し、ダイナミックな会合体形成や構造変化が物質輸送に繋がる仕組みを解明する。

(2)金属ナノプローブと蛍光の1分子複合計測(飯野):金属ナノプローブ表面のプラズモン共鳴による局所的電場増強を利用した、金属ナノプローブと蛍光プローブの1分子複合計測法を開発した。具体的には、いわゆる全反射型蛍光顕微鏡のダイクロイックミラーとバリアフィルターを穴あきミラーに交換し、金ナノ粒子の散乱光とCy3の蛍光を同時にイメージングする複合計測装置を開発した。金ナノ粒子表面の電場増強により2倍の蛍光強度が得られた。さらに開発した実験系を回転分子モーターV1-ATPaseに適用し、蛍光標識ATP(ADP)の結合(解離)と回転運動の同時観察に成功した。(3)蛍光複合計測による1分子動態観察(笠井、飯野):細胞膜中で働く人工チャネル分子の機能を直接に蛍光計測するためのツールの検討を行った。具体的には、細胞膜の電位を測定するツールを用いて、生理的な条件で細胞を刺激した際に、測定可能なシグナル変化をとらえることができるかを調べた。その結果、蛍光共鳴エネルギー移動法を用いた膜電位プローブによって、ドーパミン受容体の刺激に伴う細胞応答をとらえることができた。(4)高速AFMによる1分子観察・操作(飯野、内橋):我々が以前開発した高速AFM/1分子蛍光顕微鏡複合機の1分子蛍光のS/Nを、金コートしたカンチレバー表面の電場増強を用いてさらに改善することに成功した。(1)金属ナノプローブ1分子計測法の開発(飯野):粒径40nmの金ナノ粒子で、1Åの位置決定精度と1msの時間分解能を達成できた。さらに、より小さな粒径30nmの金ナノ粒子を1.9Åの位置決定精度と1ミリ秒の時間分解能でイメージングすることに成功した。(2)金属ナノプローブと蛍光の1分子複合計測(飯野):金ナノ粒子の散乱光とCy3の蛍光を同時にイメージングする複合計測装置の開発に成功した。また、金ナノ粒子表面の電場増強により、蛍光強度を2倍に改善することができた。(3)蛍光複合計測による1分子動態観察(笠井、飯野):蛍光共鳴エネルギー移動法を用いた細胞膜内層の膜電位状態を測定するプローブ(MCS+, Ma et al., Nat. Biotechnol., 2017)により、ドーパミン受容体の刺激に伴う細胞応答をとらえることに成功した。すなわち、ドーパミン受容体の刺激によって、細胞膜内層側の膜電位状態が変化すること、さらにこの反応は数十秒以上持続することを明らかにできた。(4)高速AFMによる1分子観察・操作(飯野、内橋):金コートしたカンチレバー表面の電場増強を用い、高速AFM/1分子蛍光顕微鏡複合機の蛍光シグナルを改善することに成功した。開発した1分子計測法の改良を継続しつつ、生体・人工・ハイブリッド発動分子の計測に取り組む。尚、来年度からは内橋は研究協力者から外れ、公募班代表者として本新学術領域に参画する。このため今後は、本課題の高速AFM部分は内橋が公募研究で担当する。(1)金属ナノプローブ1分子計測法の開発(飯野):リニア型生体発動分子のダイニンは、キネシン-1やミオシンVと異なり構成部品間の協調性がなくても一方向に運動できると考えられている。これらの非協調性生体発動分子の運動とエネルギー変換の仕組みを明らかにする。さらに、DNAオリガミ上を動く非天然ダイニン(A01-2班が創成)の計測を行い、運動素過程やエネルギー変換の機構を解明する。