hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
水産種苗の健全育成技術開発に関する基礎的研究

本研究は、作り育てる漁業の技術的進展を意図し、ネックとなっている種苗期における大量減耗現象について、病原生物学、診断学、免疫学、生理学、栄養学、環境学の諸立場から基礎的に検討し、原因を究明するとともに、防除方法を編み出すことを目的とした。2か年における成果の概要は以下の通りである。まず、これまで原因不明とされてきた仔稚魚の疾病のうち、ヒラメ、シマアアジ、キジハタ、クロダイのそれらがウイルス性であることを明らかにし、原因ウイルスを同定した。また、マダイやクロダイの腹部膨漫症やイワナの水腫症が細菌性であることを明らかにした。そして、仔稚魚から得られる少量の細菌類を、迅速かつ簡便に同定するため、細菌構成遺伝子をクローン化し、それをプローブとしたハイブリダイザイゼーション法あるいはPCR法によって検出する方法を確立した。生理機能の発育に関しては、飢餓の全身的影響とそれによるcatch-up現象を解析し、摂取栄養が不足した場合の致死日数の客観的判定方法を提案した。また、栄養不良の場合には成長率が低下するものの、その後に摂餌することによって、摂餌量は同じであっても通常には見られないような高い成長率が示されることを明らかにした。この成長遅滞回復現象はcatch-up現象と呼ばれ、高等動物で知られているところであったが、このたびは魚類においても確認された。また、仔稚魚の免疫機能の発育に関し、マダイとナマズにおいて、リンパ球は孵化直後から生産されること、自己と非自己を識別するT細胞生産器官である胸線は孵化後間もなくして発育を開始することが明らかになった。これらのことは、孵化後に免疫構が発育するため、卵期や孵化直後に関しては母子免疫の存在する可能性を示唆しており、実際に卵内に免疫グロブリンと係わりのあるIgMが検出された。次に、病態発現に関しては、ヒラメ仔稚魚の色素異常症が網膜ロドプシン形成期における栄養不足であることをほぼ解明した。そして、仔稚魚餌料や育成環境には病原生物が常在することを細菌学的に実証し、低濃度オゾン(オキシダント)による浄化技法の基礎的知見を得た。増養殖対象魚介類の種苗を健全に育成する技術開発を意図し、専ら基礎的立場から考究した。その結果、平成3年度においては次のような重要な事象が確認された。(1)シマアジ仔魚の大量死亡をもたらすウイルス性神経壊死症の原因ウイルスが同定され、親から移る垂直感染であることが判明した。(2)キジハタ仔稚魚でも同症が発生するが、蛍光抗体法による診断技法が確立した。(3)ガザミ幼生に発生するビブリオ病原因菌は甲殻類固有の病原体であることが判明した。(4)シマアジ稚魚においてブリの類結節症と同じ細菌が感染することが認められた。(5)ヒラメ仔稚魚白血球の貪食能を、本研究で新たに購入した機器による化学発光法によって測定する方法を確立した。(6)海産魚のエドワジェラ症原因菌であるEdwardsiela tardaおよびビブリオ病原因菌Vibrioanguillarumの簡便、迅速な同定法を検討し、Polimerase Chain Reaction法が適用できることが判明した。

すなわち、病因菌から特定遺伝子を得て、その断片DNAを増幅し、本法によって感染魚の細菌を同定するもので、小型個体や飼育水からも病原体を迅速に検出できる。(7)マダイ卵仔稚魚における生体防御機構の解明を図るため、免疫グロブリン(IgM)を精製してこれに対する抗体を得て、卵や仔稚魚からIgMを抽出した。その結果、精製されたIgMは78Kと74KのII鎖、ならびに26KのL鎖からなること、卵や仔稚魚からに抽出物に抗IgM抗体と結合する分子が存在すること、胸腺原基は孵化後5日に出現し、30日目にはリンパ球が分化することなどが判明した。以上、本年度は仔稚魚における大量死亡原因が病源微生物によることを把握するために、明確な診断技法を確立した。また、仔稚魚における防御機能の発育程度を究明し、母子免疫機構の存在する可能性を明らかにした。一方、仔稚期における栄養要求がほぼ明らかになり、それらの欠陥によって疾病が誘発される可能性が高いことも示唆されている。次年度においては、健康診断技法の確立と母子免疫の活用方法、あるべき栄養条件や環境条件についてさらに解析し、健苗育成の基礎を築くことを計画している。本研究は、作り育てる漁業の技術を安定的に発展させるため、基礎的立場から魚介類幼若期における生理機能の発育ならびに病態に係わる機構を解明することを目的としている。平成3年度に引き続き、シマアジ、キジハタ、スズキ、ハタハタ等海産魚を中心として以下の事項を検討し、成果を得た。すなわち、生理機能の発育に関しては、飢餓時のcatch-up現象を解析し、摂取栄養が不足した場合には成長率が低下するものの、その後に摂餌することによって、摂餌量は同じであっても通常には見られないような高い成長率が示されることを明らかにした。この成長遅滞回復現象はcatch-up現象と呼ばれ、高等動物で知られているところであったが、このたびは魚類においても確認された。また、仔稚魚の免疫機能の発育に関し、マダイとナマズにおいて、リンパ球は孵化直後から生産されること、自己と非自己を識別するT細胞生産基地である胸腺は孵化後間もなくして発育を開始することが明らかになった。これらのことは、孵化後に免疫機構が発育するため、卵期や孵化直後に関しては母子免疫の存在する可能性を示唆しており、卵内に免疫グロブリンと係わりのあるIgMが検出された。次に、病態発現に関しては、これまで原因不明とされてきた仔稚魚の疾病のうち、ヒラメ、シマアアジ、キジハタ、クロダイのそれらがウイルス性であることを明らかにし、原因ウイルスを同定した。また、マダイやクロダイの腹部膨漫症やイワナの水腫症が細菌性であることを明らかにした。そして、仔稚魚から得られる少量の細菌類を、迅速かつ簡便に同定するため、構成遺伝子をクローン化し、それをプローブとして検出する方法を確立した。さらに、ヒラメ仔稚魚の色素集常症が網膜ロドプシン形成期における栄養不足であることをほぼ解明した。そして、仔稚魚餌料や育成環境には病原生物が常在することを実証し、オキシダントによる滅菌技法の基礎的知見を得た。
顎顔面形成における突起癒合と上皮間葉間での形質転換

二次口蓋の形態形成過程において、口蓋突起尖端に位置する上皮細胞(MEE細胞)は予定口腔上皮・予定鼻腔上皮とは異なる表現型を発現し、左右口蓋突起問での接着誘導に働く。左右側のMEE細胞同士が接着すると、MEE細胞間での再配列によって連続した上皮索が構築され、次いで、上皮索の分断化・消失のプログラムが起動して左右側間葉組織の合流へと導いていく。本研究課題では、上皮索の消失機構に関連してMEE細胞でのプログラム死の発現と問葉織への細胞移住と形質転換(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)に着目して、マウス胎仔から採取した口蓋突起試料のTrowell法による器官培養を行なった。本年度で得られた結果として、MEE細胞のアポトーシスは上皮索形成直後から誘起され、アポトーシス細胞を貪食したMEE細胞は運動能を高めることと、カスパーゼインヒビターを添加した培養実験では上皮索の断裂とMEE細胞の消失が阻害されることを確かめた。さらに、MEE細胞を蛍光標識剤(DiI、CCFSE)で標識して共焦点視野下でin situ観察することにより、運動能を高めた細胞はE-カドヘリンの発現を低下し、間葉織に移住したMEE細胞は上皮マーカ(サイトケラチン)を失うことを証明した。microdissection法により胎仔二次口蓋組織と培養試料から分離したMEE細胞のmRNA発現量をリアルタイムPCRで調べた結果では、snail遺伝子がMEE細胞の形質転換に関与しており、snailに対するアンチセンス法による器官培養実験では、snailおよび相同性の高いslug遺伝子の発現抑制にともないMEE細胞は細胞接着を弱めて個々に分散するが、間葉織での運動能の低下をきたすことを確かめた。これらの実験成果は国際学会で発表し、その一部は既に論文発表している。二次口蓋の形態形成過程において、口蓋突起尖端に位置する上皮細胞(MEE細胞)は予定口腔上皮・予定鼻腔上皮とは異なる表現型を発現し、左右口蓋突起間での接着誘導に働く。本年度においては、この上皮索の消失機構に関連してMEE細胞でのプログラム死の発現と間葉織への細胞移住と形質転換(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)を検証する目的で、マウス胎仔から採取した口蓋突起試料のTrowell法による器官培養を行なった。MEE細胞を蛍光標識剤(Dil、CCFSE)で標識し、上皮細胞の運動能を共焦点視野下でin situ観察することにより、一部のMEE細胞は間葉織に移住し、上皮マーカ(サイトケラチン)を失うことを証明した。さらに、これらの移住細胞は上皮索の内部において近隣のアポトーシス細胞を貪食することが引き金となり、運動能を高めることが想定された。この仮説を検証する目的で、カスパーゼインヒビターを添加した培養実験を行い、上皮索分断と間葉織への上皮細胞の移住が抑えられることを確かめている。現在、MEE細胞の動態を支配する遺伝子ネットワークを解明する目的で、胎仔二次口蓋組織と培養試料からmicrodissection法によりMEE細胞を分離し、接着関連分子(Eカドヘリン、βカテニン、アクチン、エズリン、CD44、シンデカン)、アポトーシス関連分子(caspases、サイトケラチン18)、細胞運動能の制御にかかわるSnailやSlug,細胞膜blebbingのエフェクターであるROCK-IのmRNA発現量をリアルタイムPCRで調べている。
口腔癌転移の接着分子発現とLPSを介したサイトカインの働き

実験1.マウス可移植性腫瘍細胞の中で、肝臓への遠隔転移能を有する腫瘍細胞: RL♂1を用いて、以下の転移抑制実験を行った。菌体成分であるLPS (Lipopolysaccharide)は、その投与によって、肝臓においてIL-1, IL-6, IL-12, TNF-αなどのサイトカインの産生が誘導されることが知られている。腫瘍細胞接種の24時間前にLPSを腹腔内投与し、2週間後、肝転移形成を非投与群と比較した。非投与群は、著明な肝転移を形成し、正常な肝臓と比較して、その重量は4倍であるのに対し、LPS投与群は、若干の転移巣は認めたものの、その重量は正常な肝臓の1.18倍と、有意に肝転移を抑制した。一方、IL-1, TNF-α、あるいはその両方を投与しても肝転移の抑制は全く認めなかったが、IL-12投与でLPS同様の転移抑制が認められた。また、Dichloromethylene bisphosphonateを封入したリポソーム製剤を作製し、尾静脈から投与すると、肝臓のマクロファージを枯渇する事ができるが、この様なマウスではLPSの肝転移抑制効果が全く認められなかった。マクロファージ枯渇マウスにおいてその転移形成性は、正常マウスとの相違は認められず、以上の結果から、LPSによってもたらされる転移抑制効果は、マクロファージを介した現象であると推測される。実験2.当病院を受診した口腔癌患者の組織を一部採取し、免疫組織学的にCD44の発現とその患者の予後について比較、検討した。採取された19症例(昨年報告した13症例を含む)の内、7症例は強陽性、8症例は弱陽性、4症例は陰性であった。19症例の内、7症例に遠隔転移を認めた。転移部位はいずれも所属頚部リンパ節で、5症例はCD44強陽性例、2症例はCD44弱陽性例であった。CD44陽性例においてリンパ節転移が高頻度に認められ、そのうち1症例は、再発とリンパ節転移により死亡した。原発部位、治療内容(放射線療法、化学療法を行ったもの、外科療法のみのもの)が症例によって異なるため、それらの要因も含めて追跡していく予定である。
面発光レーザを用いた並列光自由空間配線を有するロボット機構の研究

本研究の目的は,大量の実環境情報に対応した大規模ロボットシステムの実現に向けて,システム内の通信媒体を光とすることを基本とした自由空間光インターコネクションを有する新たなロボット機構を提案することにあり、特に,従来のロボット研究の多くで見られる,既存の機構の上に様々なセンサ及び通信系などを接続するという外神経型のシステム構築ではなく,並列光通信をベースとした構造を内包する機構という内神経型のシステム設計を提案する点に目的がある.具体的には、特に可動部に面発光レーザダイオードアレイを用いた並列光自由空間インターコネクションを有するロボット関節を試作することにより,その実現可能性を解明する.平成12年度は,平成11年度に行った並列光自由空間配線を内部に有する可動機構部のモデル,および可動部において超並列配線を維持可能とする並列光自由空間配線法を実際に実現可能とするために、以下の手順で研究を進めた。1)可動関節において、光インターコネクションの接続状態に対する解析を行った。2)並列光自由空間配線を持つ可動関節を用いた多関節システムの設計を進めた。3)可動関節において、光を並列接続可能とする光インターコネクション用LSIの基本的な設計を行った。4)ロボットシステムに必要とされる並列光自由空間配線の形態について総括的な議論をし、そのロボット関節の実現の有用性について検討した。本研究の目的は,大量の実環境情報に対応した大規模ロボットシステムの実現を向けて,システム内の通信媒体を光とすることを基本とした自由空間光インタコネクションを有する新たなロボット機構を提案することにあり,特に,従来のロボット研究の多くで見られる,既存の機構の上に様々なセンサ及び通信系などを接続するという外神経型のシステム構築ではなく,並列光通信をベースとした構造を内包する機構という内神経型のシステム設計を提案する点に目的がある.具体的には、特に可動部に面発光レーザダイオードアレイを用いた並列光自由空間インターコネクションを有するロボット関節を試作することにより,その実現可能性を解明する.平成11年度は,並列光自由空間配線を有するロボット機構の構成要素として,面発光レーザダイオードアレイを用いた可動部を有する並列光自由空間インターコネクションの設計を行った.具体的には,以下の手順で研究を進めた.1)並列光自由空間配線を内部に有する可動機構部のモデルを構築した.2)可動部において超並列配線を維持可能とする並列光自由空間配線法を提案した.3)2)で開発した並列光自由空間配線法について,振動などのノイズ,システム誤差に対する影響について解析を行った.4)3)の解析結果をもとに,2)で提案した並列光自由空間配線を有する可動機構部の設計を行った.5)並列光自由空間配線を有する可動機構部について,その基本的動作を確認し,動作時における光インターコネクションの接続状態に関する解析を行った.本研究の目的は,大量の実環境情報に対応した大規模ロボットシステムの実現に向けて,システム内の通信媒体を光とすることを基本とした自由空間光インターコネクションを有する新たなロボット機構を提案することにあり、特に,従来のロボット研究の多くで見られる,既存の機構の上に様々なセンサ及び通信系などを接続するという外神経型のシステム構築ではなく,並列光通信をベースとした構造を内包する機構という内神経型のシステム設計を提案する点に目的がある.具体的には、特に可動部に面発光レーザダイオードアレイを用いた並列光自由空間インターコネクションを有するロボット関節を試作することにより,その実現可能性を解明する.平成12年度は,平成11年度に行った並列光自由空間配線を内部に有する可動機構部のモデル,および可動部において超並列配線を維持可能とする並列光自由空間配線法を実際に実現可能とするために、以下の手順で研究を進めた。
生体分子/無機材料異種界面の動的制御を実現する第二世代のペプチドアプタマーの創製

本研究は、生体分子であるペプチドと無機材料の結合・乖離の動的制御を実現する生体分子素子の創製を目指し、ファージディスプレイ法を用いたコンビナトリアルエンジニアリングによる動的制御可能な第二世代のペプチドアプタマーを探索するためのZn-fingerモチーフ骨格を保存するライブラリーの作製と、従来のペプチドアプタマー・無機材料間相互作用の詳細な構造解析に成功し、その構造情報を元に人工ペプチド・人工タンパク質のデザイン合成をおこなった。本研究では、ペプチド-無機材料動的制御界面の創出を目的として、(I)進化分子工学の手法を用いたコンビナトリアルエンジニアリングによる動的制御可能な第二世代のペプチドアプタマーの探索をおこない、(II)第一世代のベプチドアプタマー・無機材料界面構造情報をもとにした人工ペプチド・人工タンパク質のデザイン合成を進め、生体高分子・無機材料異種界面の動的制御を実証することにある。生物界のタンパク質による動的界面制御は、タンパク質構造の動的変換を通しておこなわれる。そこで、生体内で亜鉛イオンに応答して構造変換を惹起することが知られているZn-fingerモチーフに注目し、この構造変換骨格を利用したファージライブラリーの作製をおこなった。Znf268と呼ばれるZn-finger配列の分子認識配列をランダム化したライブラリー及び、Zn-fingerモチーフのコンセンサス配列以外をランダム化したライブラリーの二種類のファージライブラリーの作製をおこなった。ライブラリーの作製と並行して、Znイオンの有無、点変異の導入に依るZn-fingerモチーフの二次構造情報の変化を、円二色性偏光測定によって検出することに成功した。また動的界面分子の検出に向けたタイムラプスイメージングシステムの構築をおこなった。さらに、第一世代のチタン結合ペプチドアプタマーであるTBP-1とチタンの界面構造情報の取得を、TBP-1変異体のSPMによる力学計測から進め、チタン表面の水酸基あるいは結合水分子とTBP-1の側鎖間の水素結合が、接着力に重要な役割を果たしていることを明らかにした。この知見を元に、ダイナミックな構造変化をするタンパク質ドメインヘのTBP-1配列の導入を進めている。本研究は、ペプチドー無機材料動的制御界面の創製を目指し、(I)進化分子工学の手法を用いたコンビナトリアルエンジニアリングによる動的制御可能な第二世代のペプチドアプタマーの探索と、(II)第一世代のペプチドアプタマー・無機材料界面構造解析をおこない、構造情報を元に人工ペプチド・人工タンパク質のデザイン合成を進め、生体高分子・無機材料異種界面の動的制御を実現するものである。昨年度作製した、亜鉛イオンに応答して構造変換を惹起するZn-finger骨格を持つライブラリーを用いて、チタンを標的とする第二世代のペプチドアプタマーのスクリーニングをおこなった。バイオパニングを繰り返したが、顕著なファージの結合能上昇が見られなかった。最初のライブラリーサイズが小さかったことに起因すると考え、Zif268骨格を持つライブラリーに焦点を絞って、スケールアップしたライブラリーの作製をおこなった。現在、この新しいライブラリーの評価をおこなっている。また、動的界面分子の検出に向けたタイムラプスイメージングシステムの改良を進め、微分干渉の導入と感度・応答速度の向上により、標準試料とした超高分子階層性ハイドロゲルの構造解析に成功した。さらに、第一世代のチタン結合ペプチドアプタマーであるTBP-1とチタンの界面構造の精密化をおこない、その結果を元に、ATP加水分解に伴ってダイナミックな構造変化が知られているループ構造に、TBP-1配列を導入したキメラタンパク質の構築と発現・精製に成功した。本研究は、ペプチド-無機材料界面を動的に制御できるような生体分子素子の創製を目指し、(I)ファージディスプレイ法を用いたコンビナトリアルエンジニアリングによる動的制御可能な第二世代のペプチドアプタマーの探索と、(II)従来のペプチドアプタマー・無機材料間の詳細な界面構造解析から、その構造情報を元に人工ペプチド・人工タンパク質のデザイン合成を進め、生体高分子・無機材料異種界面の動的制御の実現を目指すものである。本年度は、(i)亜鉛イオンに応答して構造変換を惹起するZn-finger骨格を持つファージライブラリー、ひとつは構造骨格以外をランダム配列にしたもの、もうひとつはZif268骨格を保存し、それ以外の配列をランダム配列にした二種類のライブラリー作製をおこなった。界面における生体分子の運動検出に向けたタイムラプスイメージングシステムの改良をさらに進め、標準試料とした超高分子階層性ハイドロゲルの運動解析に成功した。さらに、(ii)従来型のペプチドアプタマーであるチタン結合ペプチドアプタマー,TBP-1とチタンの界面構造モデルから、ATP加水分解に伴ってダイナミックに構造変化し、微小管の上をプロセッシブな運動することが知られているモータータンパク質、キネシンの微小管結合ドメインにTBP-1配列を導入したキメラタンパク質の創製に成功した。このキメラキネシンは、チタンへの親和性を獲得していた。一方、チタン表面での運動は観察できなかった。これはタンパク質と基板表面との間で一般的に見られるsurface induced conformational changeの影響によるものであると考えられる。
皮膚を用いたヒト胸腺organoid形成によるヒトMHC拘束性T細胞誘導の試み

T細胞分化を支持する胸腺上皮細胞に類似したヒト皮膚の細胞を用い、試験管内で機能的なヒトT細胞を分化させる試みを行った。その結果、胸腺様オルガノイドの形成には成功したものの、様々なサイトカインや細胞外基質の組み合わせを試すもT細胞の産生には至らなかった。ヒト化マウスにおけるヒトT細胞産生過程の解析では、負の選択を担う胸腺髄質構造に異常があることが明らかとなった。本研究は、胸腺上皮細胞に発生学的・細胞生物学的に類似した表皮細胞を用いて胸腺様organoidを形成し、これにより目的とするヒトMHCに拘束した機能的T細胞を生成することを目的としている。まず、既知の論文報告(J.Clin.Invest 2005 vol15, p3239)の再現性の確認を兼ねて、市販の支持体(3次元マトリックス)とヒト表皮細胞との共培養条件(サイトカインの組み合わせ.量、細胞数等)を検討した。その結果、様々なパラメータ・細胞の入手先等を変えたものの、少なくとも同様の条件によるorganoidでT細胞の産生は認められなかった。海外で同様のトライアルを行っているグループも類似した結果を発表しており、この方法では再現性よくin vitroでT細胞を分化させることは不可能であると判断した。そこで一度、マテリアルを得やすいマウスの表皮細胞を用いた系に戻り、また支持体を改めて検討することとした。そのためにまず胸腺内に豊富に存在する細胞外マトリックスをPCR・免疫染色法などにより検討を行った。その結果、胸腺上皮細胞が分泌し胸腺内に主要に発現するECMを絞り込むことが出来た。そこで現在これらのECMを組み合わせて人工的3次元支持体に結合させ、表皮細胞と共培養を行うことで胸腺組織に類似したoriganoid構造の形成を行っている。これまでの実験で、ECMの組み合わせ、支持体の表面構造などによりoriganoid形成の効率が顕著に異なることが明らかになった。今後いくつかの組み合わせ候補の中から、最適な条件を確立し、マウスの細胞を用いた培養が立ち上がり次第、この系をヒトの細胞を用いた培養系に移行させる予定である。前年度までに、同様のトライアルを行っている既知の論文報告(J.Clin. Invest2005 vol15, p3239)と同じ条件にて検討したところ、再現性が得られないことが判明しており、本年度は用いる細胞外基質、支持体表面構造、サイトカインの種類や量を様々に検討することによって、安定したorganoid形成に必要な条件の検討を行った。いくつかの条件でリンパ球と表皮細胞によるorganoid様の形成が認められたが、この中で完全にT細胞を分化させるには至っておらず、安定したorganoid構築が可能な培養系に対してさらに別の因子を添加することでT細胞の分化を促進させることができないか、さらに条件検討を行っている。同時に、humanCd34+細胞を免疫不全マウスに移植してT細胞を生成させる実験系(humanizedマウス作成)の立ち上げに着手した。humanCD34陽性細胞を1×10^5個2.5Gyの放射線照射した免疫不全マウスに移入し、末梢血へのhumanT細胞の出現を一定の間隔で検討している。現在の所、いくつかの個体で末梢血にT細胞が出現してきているが、死亡する個体も多いため、放射線照射の量などをもう少し検討する必要がある。最終年度には、この研究で構築したorganoidで得られたT細胞の機能を、humanized miceで発生させたT細胞の機能と比較検討する予定である。前年度までに、同様のトライアルを行っている既知の論文報告(J.Clin.Invest 2005 vol15,p3239)と同じ条件にて検討したところ再現性が得られないことが判明し、また液性因子や細胞外マトリックスなどの様々な条件でorganoidを形成するも成熟T細胞の誘導には至らなかった。そこで、並行して進めていた機能的な胸腺組織をex vivoで再構成するための基礎となる実験、すなわち胸腺上皮細胞の産生・維持に関わる細胞の同定を行うこととした。以前の研究で、発生過程における髄質上皮の前駆細胞を同定することに成功している。そこで、この前駆細胞分画をマウスに移植し一年後に解析を行ったところ、移植した胎児由来の前駆細胞が髄質上皮細胞を産生し続けていることが明らかになった。またこの胎児由来の幹細胞分画の移植によって、髄質上皮分化の異常によりおこる自己免疫疾患をレスキューすることができた。以上の結果は、胎児期の前駆細胞分画に一生涯自己寛容を担う髄質上皮細胞の産生を維持する幹細胞様の細胞が含まれていることを示唆している。

現在、胸腺上皮細胞のコロニーアッセイの系を立ち上げ、自己複製能を評価するとともに、皮質上皮にも同様に幹細胞様の細胞が存在する可能性を検証している。髄質・皮質両上皮幹細胞が同定でき、その性質・特質が明らかになれば、将来的に当初の目的であった機能的な胸腺organoid形成につながる可能性が期待できる。
単結晶・超伝導トンネル接合の創製と光デバイス応用

本研究は、超伝導トンネル接合素子(STJ)の新しい作製法を用いて究極感度の検出デバイス実現へ向けた技術的基礎を築くことにあった。具体的には、従来の多結晶成膜法(スパッタ法)に代わり、単結晶成膜法(分子線エピタキシー法)を導入し、原子層レベルで平坦なトンネルバリア界面を形成することで超低雑音特性をもつAl系STJ素子の作製技術を検討した。まず、Al単層膜の成膜時にはAl203(oool)とsi(111)の2種の基板を用いた。反射高速電子線回折(RHEED)や原子間力顕微鏡等を用いて薄膜の結晶性と平坦性を多角的に評価した結果、平坦性と結晶性の両立の観点から成膜時の基板温度は約100°Cが適していることが分かった。次に、MgOをトンネル障壁とする3層膜をSTJ素子に加工し0.3Kに冷却して電流電圧特性を評価した結果、STJ素子の臨界電流密度は15.5ll7A/cm2、素子品質の指標の一つであるR、g/R、は4.060.2であり、良好な特性を有する3層エピタキシャルSTJ素子を実現した。本研究の目的は、「スペーステラヘルツ天文学」という新たな観測領域を切り拓くべく、超伝導トンネル接合素子(STJ)の新しい作製法を用いて究極感度の検出デバイス実現へ向けた技術的基礎を築くことにあった。具体的には、従来の多結晶成膜法(スパッタ法)に代わり、単結晶成膜法(分子線エピタキシー法)を導入し、原子層レベルで平坦なトンネルバリア界面を形成することで超低雑音特性(=低い漏れ電流特性)をもつAl系STJ素子の作製技術を検討した。まず、Al単層膜の成膜時にはAl2O3(0001)とSi(111)の2種の基板を用い、特にSi基板では表面の酸化膜を除去するために成膜前に700°Cで10分間の熱洗浄を施した。その後、室温300°Cの様々な温度条件下、1080°Cに加熱したクヌーセンセルを用いて各60分間(約100nm厚)成膜し、反射高速電子線回折(RHEED)や原子間力顕微鏡等を用いて薄膜の結晶性と平坦性を多角的に評価した。その結果、平坦性と結晶性の両立の観点から成膜時の基板温度は約100°Cが適していることが分かった。次に、3層膜の成膜時にはAl2O3(0001)基板上にAl/MgO/Al (=50/1.5/25 nm)の3層構造を採用した。その結果、MgO成膜後の表面粗さは1.0 nmという高い平坦性を示し、MgOがトンネルバリア材料として適していることが分かった。さらに、各層成膜後にRHEED像を取得することにより3層全てがエピタキシャル成長したことを確認した。最後に、上記3層膜をSTJ素子に加工し0.3Kに冷却して電流電圧特性を評価した。その結果、STJ素子の臨界電流密度は15.5117 A/cm2、素子品質の指標の一つであるRsg/Rnは4.060.2であり、従来のスパッタ法に比べて素子特性のばらつきは見られるものの、良好な特性を有する3層エピタキシャルSTJ素子を実現した。本研究の目的は、「スペーステラヘルツ天文学」という新たな観測領域を切り拓くべく、超伝導トンネル接合(STJ)の新しい素子作製法を用いて究極感度の検出デバイス実現へ向けた技術的基礎を築くことにある。具体的には、2ヵ年の期間内に、従来の多結晶成膜法(スパッタ法)に代わり、単結晶成膜法(分子線エピタキシー法)を導入し、原子層レベルで平坦なトンネルバリア界面を形成することで超低雑音特性(=低い漏れ電流特性)をもつ素子作製技術の確立を目指している。1年目は単層膜の最適化を行った。具体的な研究項目は下記2点である。(1)Al膜とMgO膜それぞれの結晶成長条件の最適化まず、SiやAl2O3基板上でAl(導体)とMgO(絶縁体)薄膜それぞれの結晶成長条件の最適化を行った。その際、理研の分子線エピタキシー(MBE)装置を用いて成膜した。

MBE装置は、従来のスパッタ装置よりも遥かに高真空で動作できるため不純物混入の少ない高純度の薄膜形成が可能である。そうして出来た薄膜の結晶性については、MBE装置内での原料ビーム強度や基板温度に対する依存性を反射高速電子線回折(RHEED)により"その場観察"を行った。また、膜の平坦性については、原子間力顕微鏡を用いて薄膜の凹凸形状を評価することで、原子層オーダーで平坦な界面を実現した。(2)Al単層膜の電気的特性評価次に、平坦かつ結晶性に優れたAl薄膜のサンプルについては0.3K冷凍機システムに設置・冷却し、超伝導転移温度(Tc)の測定を行った。一般にAl薄膜のTcはバルク状AlのTcに比べて低くなることが予想されるが、温度0.3K冷却により超伝導特性を確実に把握することが可能である。また、結晶中の不純物や格子欠陥量の指標となる残留抵抗比の測定を行うことで結晶性を多角的に評価しており、2年目に行う3層膜構造の本作製に備えている。1年目のMBE装置における成膜条件の最適化によってAlおよびMgO単層膜のエピタキシャル成長が可能になり、2年目に行う3層膜構造をもつ単結晶STJ素子実現の準備が整っている。さらに他の超伝導材料として、当初の研究計画には無かったNb単層膜のエピタキシャル成長も達成しているため。研究代表者は平成24年度より名古屋工業大学へ転任したため、単結晶STJ素子作製に関しては距離的な制約から多少不便が発生することが予想される。しかし、代表者らは平成23年度すでに単結晶素子作製の見通しを立てており、また、今後も理研の客員研究員として継続在籍するため、埼玉大学との密接な共同研究、および効率的な出張によって単結晶素子開発を推進することが可能である。一方、本研究課題に関連する評価装置(0.3K冷凍機システム等)は代表者とともに名工大へ移設したため、今後の研究計画の推進に際して特に支障は無いと考えている。2年目は単結晶STJ素子実現を目指す。具体的な研究項目は下記2点である。(1)全エピタキシャル3層膜【Al / MgO (or AlN) / Al】をもつSTJ素子の作製Al膜とMgO膜(or AlN膜)双方の最適成膜条件を用いて3層膜構造をもつSTJ素子の本作製を開始する。3層ベタ膜はMBE装置で成膜し、その後の加工は理研が所有する共同利用の超伝導素子作製専用プロセスライン(フォトリソグラフィー、現像装置、ドライエッチング装置)を用いて行う。(2)STJ素子の電気的・光学的特性評価3層全てが平坦かつ結晶性をもつSTJ素子の残留漏れ電流を測定し、超伝導素子に関する理論(BCS理論)と比較することで本提案手法の優位性を検証する。その後、テラヘルツ波検出器の試作と評価に取り組みたい。検出器試作については、異なるSTJ素子サイズをもつ検出器を1枚のフォトマスク上に並べて設計・配置して加工する。次に、STJ検出器の電気・光学特性を評価する。特に光学特性の評価については、名工大のテラヘルツ帯フーリエ変換分光器を用いる。広帯域の高圧水銀灯を光源とすることで、テラヘルツ帯を含む広帯域の周波数スペクトル測定とともに、異なる接合形状をもつ検出器間の相対感度測定が可能である。1画素の検出性能NEPにして10(-20) W/√Hz以下というテラヘルツ領域での1光子検出レベルの達成を目指す。なお、平成23年度の経費削減により生じた未使用額は、代表者の機関変更に伴う経費および共同研究のさらなる促進のために使用する予定である。
ロマンス諸言語における音形の伝播と拡散のメカニズムに関する総合的研究

本研究の目的は,一般音声学の知識を基盤として全てのロマンス諸言語の古い文献資料と現代の方言資料の分析を徹底的に行うことにある。特に,言語間(方言間)の音形の伝播や拡散のメカニズムを明らかにすることにある。今回,考察の中心としたのは,ラテン語子音連続/kt/で,この変化に関しては,従来,様々な説が展開されている点で興味深い。今回,得られた個々の新しい知見,特に音形の伝播と拡散に関しては,例えば:ダルマティア語では,ptは類推による変化で,itを有する語はイタリア語ヴェネト方言からの借用語であるのに対し,固有の変化は生産的なtである:イタリア語ロンバルディア方言のtは.イタリア語ヴェネト方言またはイタリア語エミリア・ロマーニャ方言の侵入である:レト・ロマンス語のcやcはドイツ語から入って来た外来音である:スペイン語では,多くの方言において/kt/>cとなっているが,これには方言固有の変化とカスティーヤ方言の侵入という二通りの過程がある,等々の発見があるが,ロマニア全体を考察すると,/kt/>pt:/kt/>t:/kt/>tt:/kt/>itの四つの類型に分類できる。さらにit>cが生じた方言があり,これが他の方言に侵入したり,tが周辺や遠隔の方言に侵入するという音形の伝播と拡散が確認できた。当初,想定していたラテン語子音連続/ks/は子音連続の第二要素が摩擦子音/s/であり,第二要素が閉鎖子音である/kt/と異なり,また同じく/pt,ps/は,第一要素の/p/の扱い方が/kt/の/k/と異なることが判明したので必要最小限の言及に止めておいた。今後の課題としたい。今後の課題としたい。今年度は,主に東部ロマンス語におけるラテン語子音連続CT/kt/の変化を扱った。特に,ルーマニア語,ダルマティア語,イストロ・ロマンス語,レト・ロマンス語,イタリア語,およびアルバニア語におけるラテン語借用語,南イタリアに点在するギリシャ語におけるラテン語借用語を対象として考察した。ルーマニア語においてはダキア方言(モルドヴァ方言を含む),イストリア方言,マケドニア方言でCT>ptであるが,メグレン方言では,この変化の他にCT>tの変化も見られた。アルバニア語におけるラテン語借用語では,本来的にはCT>ftであり,jtまたはtを有する音形はイタリア語に由来するものである。また,qtまたはqの音形は,アルバニア語の南部トスク方言における変化からjtよりも古いことが判った。ダルマティア語では,CT>ptは類推による変化であり,生産的ではなく,jtを有する音形はイタリア語からの借用である。ダルマティア語固有の変化は,最も生産的なCT>tである。イストロ・ロマンス語においてもCT>tである。レト・ロマンス語では,フリウリ方言およびドロミティ方言においてCT>tである。これは,itを有する語形が見いだせない以上,従米から言われているような脱口蓋音化では説明できない。これらの方言に関しては,今後の課題である。イタリア語ヴェネト方言では,従来から言われているようなCT>tではなく,CT>itであろう。イタリア語中南部方言では,CT>ttである。南イタリアのギリシャ語におけるラテン語借用語におけるCTはstとなる。今年度は,主に中部ロマンス語および西部ロマンス語の一部(東端)におけるラテン語子音連続CT/kt/の変化を扱った。中部ロマンス語では、イタリア語の北部諸方言および中南部諸方言のラテン語子音連続CT/kt/の変化を考察した。

イタリア語の北部諸方言のヴェネト方言において現在では/t/で現れるラテン語子音連続CT/kt/の変化形が、1314世紀の初めの文献において/it/で現れることを確認すると共に、/t/と/it/の共存から,ヴェネト方言における/kt/>/it/>/t/という変化が生じたことと,1314世紀が/it/>/t/の変化時期であることを認定した。ロンバルディア方言では/kt/>/it/>/c/>/t∫/という変化系列が基本となり、これらの諸々の変化形がロンバルディア方言の下位方言に混在することと、この変化系列とは別種の/t/という変化形が存在することを再確認した。ピエモンテ方言ではすでに古文献において/it/と/c/(または/t∫/)が見られ,現代の方言でもトリノで/it/と/t/が併存しており,カナヴェーゼ地方やモンフェラート地方で/t∫/が現れ,ヴァルセシアでは/c/が見られる。エミリア・ロマーニャ方言では、ボローニャに代表されるように/t/であり,古文献でも常に/t/を示すが,エミリア方言の一部には/it/や/t∫/も散見される。リグリア方言においては、現代のサンレモにおける変化形と同じく古文献において/it/と/t/が共存するが,他の地方では/t/であり,/it/>/t/という変化が考えられる。西ロマンス語の東端に位置するフランス語におけるラテン語子音連続CT/kt/の変化形は,すでに古文献の時代から/it/を示しており,現代語において/it/以外の変化形を有する語は,多くの場合,起源的にCT/kt/>/it/であったものが音声的改変によって変化したものである。今年度は,西部ロマンス語に属するスペイン語およびガリシア・ポルトガル語におけるラテン語子音連続CT/kt/の変化を考察した。(西部ロマンス語の東端に位置するフランス語におけるラテン語子音連続CT/kt/の変化に関しては既に平成11年度科学研究費補助金実績報告書(研究実績報告書)にて報告済みである。)ガリシア・ポルトガル語において,ラテン語子音連続CT/kt/は/it/に変化したが,/u/が先行するとポルトガル語では/t/に縮約し,ガリシア語では/uit/は15世紀に/oit/に変化した。(ただし,ガリシア語領域の東部と南西端およびMazaricosやNegreira周辺で/uit/が保存されている。)スペイン語においては複雑で,各方言で多彩な様相を提示する。カスティーヤ方言では,ラテン語子音連続CT/kt/は/it/に変化し,11世紀よりも以前に/t∫/に変化した。レオン方言では,西部で古形の/it/を保存しているものの,中部や東部では/t∫/である。また,レオン方言領域の北端や西端に見られる/it∫/は/it/>/t∫/の中間段階であろう。アストゥリアス方言では,東部で/t∫/,西部で/it/である。アラゴン方言でも,/it/>/t∫/の変化を経験している。ナバラ方言では,固有の変化形である/it/の上にカスティーヤ方言の音形である/t∫/が覆いかぶさっている。また,今年度は科学研究費補助金による本研究の最終年度に当たるのでラテン語子音連続CT/kt/の変化を中心としたロマンス諸言語における音形の伝播と拡散のメカニズムに関する全体的な考察も行ったが,この総括に関しては別途,報告する。
電気化学分析による脂肪酸金属ナノ粒子のコアとシェルの特異性発現

前年度に達成できた成果の上に、水素吸蔵および触媒作用に注目を浴びている新しいパラジウム微粒子を合成した。本年度に達成できた成果は、(1)常温合成法により、パラジウム微粒子を合成した。(2)合成した微粒子を分離・濾過により粒径均一である200ナノメータのパラジウム微粒子ができた。(3)合成した微粒子の分散溶媒を選択した。アセトニトリルが最良の溶媒であった。(4)微粒子溶液の可視紫外スペクトル、対応する酢酸パラジウム分子の溶液のスペクトル、粒子分散溶液を展開乾燥した膜のスペクトルを測定し、バンドの帰属、対応関係を調べた。(5)電気化学測定(サイクリックボルタンメトリ)を行い、酢酸パラジウムを一種の表面活性剤の役割であることを分かった。粒子のボルタモグラムが以前測定したステアリン酸銀ナノ粒子と同等であるかどうか、定量的に検討した。酸化波および還元波共に拡散律速挙動であった。電流の比から、酢酸パラジウムと金属パラジウムの粒子数の比を算出した。(6)金属パラジウムを酸化滴定することにより、金属パラジウムと酢酸パラジウムの粒子数の比を算出した。(7)パラジウム微粒子を加熱することにより、300°C以上で金属パラジウムになることを見出した。その電気抵抗と昇温速度の関係から、活性化エネルギーを求めた。40kJ mol^<-1>であった。(8)ヒトラジンによりメチルブルーの還元速度を基準として、パラジウム微粒子の触媒作用を見積もったところ、パラジウム微粒子の触媒反応速度がヒトラジンより速い、一次反応であることが分かった。(9)触媒反応速度定数が粒子の表面積に比例し、表面触媒作用であることがわかった。それらの結果を、昨年度の成果を含めて、11報の論文に報告した。ナノテクノロジーの物質の代表格である金属ナノ粒子は、原子間に働く凝集力と粒子間に働く反発力をあわせ持つ二重構造の複合体である。低温分解から合成できる脂肪酸銀粒子は、均一粒径・量産可能・溶媒への分散可・高い安定性があると考えられる。その粒子の分析化学上の重要性を把握するため、分光学・電気化学・TEMなどを用いて、ナノ粒子の二重構造を溶液平衡による分析化学の観点から議論することを目指す。本年度に達成できた成果は、(1)低温分解法により、アルカンの炭素数が8から18までの脂肪酸銀ナノ粒子を合成した。(2)合成したナノ粒子の溶媒を選択した。シクロヘキサンが最良の溶媒であった。(3)ナノ粒子溶液の可視紫外スペクトル、対応する脂肪酸銀分子の溶液のスペクトル、ナノ粒子溶液を展開乾燥した膜のスペクトルを測定し、バンドの帰属、対応関係を調べた。(3)可視領域最大吸収バンドから、ミー理論から予想される平均粒径を算出した。(4)電気化学測定(サイクリックボルタンメトリ)を行い、種々のアルカン鎖長さをもったナノ粒子のボルタモグラムが以前測定したステアリン酸銀ナノ粒子と同等であるかどうか、定量的に検討した。電流の比から、金属銀と脂肪酸銀の粒子数の比を算出した。(5)金属銀を酸化滴定することにより、金属銀と脂肪酸銀の粒子数の比を算出した。(6)TGAを用いて、金属銀と脂肪酸銀の粒子数の比を算出した。そのデータを利用して、活性化エネルギーを求めた。活性化エネルギーはアルキル鎖長に一次であり、0に外挿すると、鎖長は7であった。つまり、7以下の鎖長をもつ脂肪酸銀はナノ粒子は生成できない。

(7)ナノ粒子を加熱することにより、220°C以上で金属銀になることを見出した。その電気抵抗と昇温速度の関係から、活性化エネルギーを求めた。TGAによる値の半分であった。前年度に達成できた成果の上に、水素吸蔵および触媒作用に注目を浴びている新しいパラジウム微粒子を合成した。本年度に達成できた成果は、(1)常温合成法により、パラジウム微粒子を合成した。(2)合成した微粒子を分離・濾過により粒径均一である200ナノメータのパラジウム微粒子ができた。(3)合成した微粒子の分散溶媒を選択した。アセトニトリルが最良の溶媒であった。(4)微粒子溶液の可視紫外スペクトル、対応する酢酸パラジウム分子の溶液のスペクトル、粒子分散溶液を展開乾燥した膜のスペクトルを測定し、バンドの帰属、対応関係を調べた。(5)電気化学測定(サイクリックボルタンメトリ)を行い、酢酸パラジウムを一種の表面活性剤の役割であることを分かった。粒子のボルタモグラムが以前測定したステアリン酸銀ナノ粒子と同等であるかどうか、定量的に検討した。酸化波および還元波共に拡散律速挙動であった。電流の比から、酢酸パラジウムと金属パラジウムの粒子数の比を算出した。(6)金属パラジウムを酸化滴定することにより、金属パラジウムと酢酸パラジウムの粒子数の比を算出した。(7)パラジウム微粒子を加熱することにより、300°C以上で金属パラジウムになることを見出した。40kJ mol^<-1>であった。(8)ヒトラジンによりメチルブルーの還元速度を基準として、パラジウム微粒子の触媒作用を見積もったところ、パラジウム微粒子の触媒反応速度がヒトラジンより速い、一次反応であることが分かった。(9)触媒反応速度定数が粒子の表面積に比例し、表面触媒作用であることがわかった。
単一分子によるタンパクと生体膜の結合解析:膜骨格タンパクと赤血球膜をモデルとして

これまで、4.1タンパクとPSリポソームを例に自己相関蛍光測定法(FCS)を用いて単一タンパク分子の「ゆらぎ」を測定することにより、タンパクと膜脂質の相互作用を解析することができることを初めて示した。本研究では、FCSを用いてこれらの相互作用に関わる調節因子、化学修飾の効果について検討し、従来の生化学的手法を用いた結果と比較した。実際には、rhodamine標識精製4.1タンパク(またはその30kDaドメイン)と人工脂質膜(PSリポソーム)または生体膜(赤血球反転小胞膜、肥満細胞顆粒膜)の結合におけるCa^<2+>-calmodulinの4.1タンパクへの結合、4.1タンパクのリン酸化、リポソームのphospholipase(PLA2など)処理の効果について解析した。1)Ca^<2+>-calmodulinの効果:4.1タンパクの「ゆらぎ」の拡散係数は分子量の大きな粒子(人工脂質膜、生体膜)に結合することで増大した。Ca^<2+>-calmodulinの添加により生体膜との結合は低下したが(拡散係数の低下)、人工脂質膜との結合は変わらなかった。また、予めCa^<2+>-calmodulinを結合させた4.1タンパクは生体膜に結合せず、人工脂質膜には結合した。これらの結果は、4.1タンパクと生体膜貫通タンパクとの結合がCa^<2+>-calmodulinにより抑制される従来の生化学的実験結果と合致した。2)phospholipase処理の効果:PSリポソームをPLA2処理することにより、一旦結合した4.1タンパクは遊離した。(拡散係数の低下)。遊離した4.1タンパクは脂肪酸を結合しており、pI、CDスペクトルの大きな変化から、構造変化が示された。3)リン酸化の効果:PKCによりリン酸化した4.1タンパクは、生体膜に結合せず、人工脂質膜には結合した(拡散係数の増大)。FCSによって得られる単一分子の「ゆらぎ」の情報から、タンパクと膜脂質および膜貫通タンパクとの相互作用、それらの調節について解析できることが4.1タンパクを例に示された。これらの結果に基づき、ひとつの細胞内での4.1タンパクの動態解析への応用を今後試みる予定である。平成10年度(初年度)は4.1タンパク質と膜の相互作用について、自己相関蛍光測定法(FCS)による基本的な検討を行った。ヒト赤血球膜から精製した4.1夕ンパク質とその膜結合ドメイン(30kDa)を蛍光標識(Rhodamine)し、種々のリポソーム(PSのみ、PCのみ、両者混合)、バンド3再構成PCリポソーム、赤血球膜の反転膜小胞と混合し、FCSを用いて"蛍光分子のゆらぎ"を記録し、拡散定数、分子の大きさを測定した。測定条件は赤血球内の生理的条件(130mMKCl,20mMNaCl,pH7.4)とし、蛍光標識タンパク質濃度はレーザーの共焦点領域に12分子存在する濃度(10^<-8>M)とした。4.1タンパク質をPSリポソームと混合すると"ゆらぎ"の振幅が増大し、両者の結合が示されたが、PCリポソームには結合せず、PS/PC混合リポソームではPSの割合の増加に伴い結合率が増加した。この4.1タンパク質-PS間の特異的結合は、さらなるPSリポソームの添加でも変わらず、その他の生化学的検討結果と合わせて疎水性結合であると考えられた。一方、4.1タンパク質はバンド3再構成PCリホポームおよび反転膜小胞に結合し、既知の4.1タンパク質-バンド3間の結合がFCSでも確認された。これらの結果は膜結合ドメイン(30kDa)でも認められ、30kDa上にPS、バンド3との結合部位の存在が明らかになった。FCSによる溶液中での単一分子の検出は、タンパク質分子と膜の相互作用解析にも十分適用できると考えられ、次年度は、タンパク質の修飾(リン酸化)、調節因子(カルモジュリン)の結合・解離の効果について検討する。

2)phospholipase処理の効果:PSリポソームをPLA2処理することにより、一旦結合した4.1タンパクは遊離した。(拡散係数の低下)。遊離した4.1タンパクは脂肪酸を結合しており、pI、CDスペクトルの大きな変化から、構造変化が示された。3)リン酸化の効果:PKCによりリン酸化した4.1タンパクは、生体膜に結合せず、人工脂質膜には結合した(拡散係数の増大)。FCSによって得られる単一分子の「ゆらぎ」の情報から、タンパクと膜脂質および膜貫通タンパクとの相互作用、それらの調節について解析できることが4.1タンパクを例に示された。これらの結果に基づき、ひとつの細胞内での4.1タンパクの動態解析への応用を今後試みる予定である。
低温繰返し塑性構成関係の実験的評価と構成式の提案

低温構造物の重要性が高まってきているが,低温構造物の構造材料が実際受けるような繰返し変形の実験は極めて少ない。本研究では、まず低温繰返し塑性変形の実験を引張、圧縮、ねじりの負荷状態で行い、繰返し塑性変形に及ぼす負荷方向、繰返し数、繰返しひずみ幅、予変形の影響を実験的に系統的に調べた.実験は液体窒素で冷却した薄肉円筒試験片に引っ張り、圧縮、ねじりの荷重、さらにそれらの組み合わせを加えた複合荷重を加えて行った。試験片に生ずるひずみの測定は新たに開発した液体窒素中でも計測可能な格子法によって行った。1.負荷方向が変化しない繰り返し負荷では,応力-ひずみ曲線のヒステリシス曲線の最大値は,負荷の繰り返しとともに増加する.その増加量は室温の場合より顕著である.2.負荷の繰り返し途中で負荷方向を変化させると,負荷方向を変化させない場合に比べて,サイクル数が同じであっても繰り返し応力-ひずみ曲線のヒステリシス曲線の硬化量が異なる.3.ねじり負荷の繰り返しでは,引張方向へひずみが累積するラッチェト現象が観察された.4.ねじり方向に繰り返し予変形を与えた後,引張の繰り返し負荷を与えると,繰り返しの応力-ひずみ曲線のヒステリシスループが遷移する.5.クリープ予変形は塑性変形に塑性ひずみと同じ硬化効果を持っている.6.繰り返し負荷による硬化過程は累積塑性ひずみをパラメタとして定式化できた.低温構造物の重要性が高まってきているが,低温構造物の構造材料が実際受けるような繰返し変形の実験は極めて少ない。1.負荷方向が変化しない繰り返し負荷では,応力-ひずみ曲線のヒステリシス曲線の最大値は,負荷の繰り返しとともに増加する.その増加量は室温の場合より顕著である.2.負荷の繰り返し途中で負荷方向を変化させると,負荷方向を変化させない場合に比べて,サイクル数が同じであっても繰り返し応力-ひずみ曲線のヒステリシス曲線の硬化量が異なる.3.ねじり負荷の繰り返しでは,引張方向へひずみが累積するラッチェト現象が観察された.4.ねじり方向に繰り返し予変形を与えた後,引張の繰り返し負荷を与えると,繰り返しの応力-ひずみ曲線のヒステリシスループが遷移する.5.クリープ予変形は塑性変形に塑性ひずみと同じ硬化効果を持っている.6.繰り返し負荷による硬化過程は累積塑性ひずみをパラメタとして定式化できた.
PPARγ内因性リガンド同定による肥満・インスリン抵抗性の新規診断・治療法の開発

合成のPPARγアゴニストによるPPARγの著明な活性化は、脂肪細胞分化を誘導して、白色脂肪組織での脂肪蓄積を強力に促進し肥満を助長するが、そのことによって骨格筋や肝臓における中性脂肪の蓄積を抑制し、インスリン抵抗性を改善させている。また脂肪細胞分化によって新たに生じた小型脂肪細胞の増加とアポトーシスによる大型細胞の減少により、脂肪細胞を小型化させることによって、インスリン抵抗性惹起分子である遊離脂肪酸やレジスチンを低下させ、インスリン感受性ホルモンであるアディポネクチン(Nature Medicine 7:941, 2001)を増加させて、インスリン抵抗性を改善させていることを報告した(J. Biol. Chem. 276:41245, 2001)。さらに欠損マウスを用いてCBPがPPARγの主要なコアクチペーターであり、PPARγによる脂肪細胞サイズ、インスリン感受性調節に重要な役割を果たしていることを示した(Nature Genetics 30:221, 2002)。また脂肪細胞分化にはIRS-1/IRS-2がPPARγの発現誘導を介して重要な役割を果たしていることを示した(Mol. Cell Biol 21:2521, 2001)。我々は脂肪細胞分化に伴ってインスリン感受性を獲得する3T3L1脂肪細胞よりPPARγ内因性リガンドの精製を試みた。PPARγの活性化\を指標にHPLC上1本のピークに精製した。そのピークのretention timeは既報のマクロファージの内因性リガンドの第一候補である15d-PGJ2や脂肪酸代謝産物と異なっていた。また、そのPPARγ活性化能はHPLC上認められるピークの高さからすると、合成リガンドとしては最も活性化能の高いロジグリタゾンと同程度かそれ以上と考えられた。質量分析計上10程度の候補分子が存在したので、精製材料をin vitroのものからin vivoのものへ変更し、毒性によって見かけ上活性を有するように見える分子などを除外し、現在さらに候補分子を絞り込んでいる。脂肪細胞分化に伴ってインスリン感受性を獲得する3T3L1脂肪細胞より内因性PPARγリガンドの精製を行った。PPARγligand binding domain(LBD)に対するアフィニティーカラムを用いて脂溶性の分画を精製した。この脂溶性分画をHPLCにより分離し、PPARγLBDに対する転写活性化能を測定して精製をすすめた。この方法により、精製したHPLC上の単一のピークは脂肪細胞分化が生じない種々の条件では認められず、また脂肪細胞分化の程度が減弱する種々の条件でその量が減少する事より、脂肪細胞分化とリンクしたリガンドであると考えられた。これは従来知られている内因性リガンド(15d-△^<12,14>PGJ_2etc)とHPLC上異なったretention timeを持つ事、及びPPARγLBD内に変異を持つ種々のmutantとの反応性が異なる事により、新規の分子であると考えられた。このリガンドはロジグリタゾン以上の活性化能を有すると考えられた。一方、in vivoにおいてはPPARγヘテロ欠損マウスの我々の解析より(Mol.Cell4:597-609,1999)高濃度の内因性リガンドは脂肪細胞分化が起こる発生段階に存在する可能性が示唆されていた。マウスの場合、白色脂肪細胞の分化が起こり、組織として形成される3日齢において実際に他の時期より高い内因性PPARγリガンド活性が認められた。これらとは別に我々はPPARγ遺伝子の活性が高いPro12