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細胞老化に関与する細胞内情報伝達系の生化学的研究

老化のメカニズムを明らかにすることは生命現象の本質に迫る重要な課題である。老化細胞の特徴として、ある分裂回数を経過した後はいかなる増殖因子に対しても増殖応答を示さないこと、いかなる外来遺伝子導入によっても分裂回数の延長がみられても不死化することはほとんどないこと、若年時に不死化した細胞を有限寿命にさせるような優性因子が老化細胞内に存在すること等があげられる。そこで本研究は第一に述べた、老化細胞が増殖因子不応性である原因を明らかにすることを目的とし、若年細胞で活性化される正の増殖シグナルのどこのステップを老化細胞では積極的にダウンレギュレートしているのか老化細胞に特徴的な増殖抑制メカニズムの解析を行った。その結果これまでに血小板由来増殖因子(PDGF)で刺激した場合にみられる若年細胞でのホスホリパーゼC(PLC)活性化による細胞内IP_3産生が老化細胞では著しく低下していることを明らかにした。このとき受容体タンパクの発現量、リン酸化、親和性の強さは、若年、老年両者の細胞で差異はなく、また細胞内存性のPLC活性もin vitroのアッセイで両者に差は見られなかった。したがって受容体刺激に依存するPLC活性化に至るまでの経路のどこかにこの初期反応を阻害している原因が存在することが、当該年度の研究により明らかになった。現在、受容体活性化を経由するPLC活性化経路のうち少なくとも既知の経路が老化細胞でなんらかの変化を生じているか否かを詳細に検討している。さらにPLC下流に位置する各種タンパクキナーゼの活性を測定した結果、内在性キナーゼの活性そのものは老化細胞での特徴的な変化はみられなかった。最近、老化細胞に高発現されている遺伝子が複数報告された(wafl/Sdil)他、老化細胞ではサイクリン/CDK複合体の不活性化や非リン酸化型Rbの存在により核への増殖シグナルが伝わらない理由が示唆されている。しかしながらそれらの原因となる上流のシグナルの変化については未だ生化学的な報告は行われていないのが現状である。本研究により増殖シグナルの積極的な衰退と言う観点から、当該年度で明らかになった初期反応の変化が核への情報伝達経路にどのように関与しているかを今後明らかにしたい。
Al耐性を異にする植物根の有機酸分泌の調節機構

Al誘導性の有機酸分泌は、植物のAl毒性に対する耐性機構の最も重要なものの一つと考えられている。しかしながら有機酸のAlによる分泌誘導機構は十分に理解されていない。本課題では、Al誘導性有機酸分泌における原形質膜H^+-ATPaseの役割について研究した。得られた結果から、以下の事実が明らかになった。低濃度のAlはダイズ根原形質膜H^+-ATPaseの酵素活性を促進したが、高濃度のAlは逆に阻害した。H^+-ATPaseの阻害剤であるバナジン酸は、Al誘導性のクエン酸分泌を強く阻害した。一方、原形質膜H^+-ATPaseの活性化剤であるフシコクシンは、Alによるクエン酸分泌を若干促進した。原形質膜H^+-ATPase遺伝子を過剰発現している形質転換アラビドプシスは、野生株に比べてクエン酸分泌能が高かった。これらの結果は、H^+-ATPaseはAl誘導性クエン酸分泌に関与していることを示した。原形質膜H^+-ATPaseの抗体を用いて免疫沈降によりH^+-ATPaseの分布を調べると、Al(10μM)とアブシジン酸(ABA,5μM)は原形質膜H^+-ATPaseの蛍光発現の増加を認めた。しかしながらウエスタンブロッティング解析によると、Alは原形質膜H^+-ATPaseのタンパク量の増加を誘導していなかったが、原形質膜H^+-ATPaseのリン酸化を促進していた。原形質膜H^+-ATPaseのリン酸化はAl濃度と時間に依存して増加した。Alが原形質膜H^+-ATPase遺伝子の発現増加を誘導しているかどうかは不明であるが、原形質膜H^+-ATPaseの活性発現はAlとホルモンによって誘導されている。これらの結果から、ダイズ根原形質膜H^+-ATPaseのAl誘導性クエン酸放出への関与はタンパクリン酸化を介していることが明らかになった。これらの結果を現在、論文投稿準備中である。アルミニウム(以下、Alと記す)による有機酸分泌に関わるアニオンチャンネルの活性化は、Al誘導性の有機酸分泌の重要な機構として知られている。しかし、Alによるアニオンチャンネルの活性化の機構については分かっていない。そこで本研究では、ダイズ根のAl誘導性のクエン酸分泌についてシグナル変換が関与している可能性について解明した。クエン酸分泌はAlの濃度と処理時間に依存的であること、他のイオンではクエン酸分泌が殆ど見られないことを明らかにした。アニオンチャンネル阻害剤によりAl誘導性のクエン酸分泌は強く阻害されたが、Al誘導性のK+分泌は殆ど阻害されなかった。Al誘導性クエン酸分泌は、タンパクリン酸化とフォスファターゼの阻害剤により抑制された。特に、タンパクリン酸化の阻害剤であるK252aにより強く阻害されたので、クエン酸分泌にタンパクリン酸化が関与していることが明らかになった。Gタンパク調節剤によりクエン酸分泌は約50%阻害された。またATP-結合カセット阻害剤であるDPG (diphenylanine-2-carboxylic acid)とglibenclamideにより、Al誘導性クエン酸分泌が2656%程度阻害された。これらの結果はAl誘導性クエン酸の分泌の径路には複雑な制御機構が働いていることを示唆している。さらにAl処理によるアブシジン酸(ABA)の増加を認めたが、ABAそのものあるいはABA合成の阻害剤によってAl誘導性クエン酸分泌は影響を受けなかった。これらの結果はABAはAlのシグナル変換機構に関与しているが、直接Al誘導性のクエン酸分泌には関与していないことを示唆している。これらの結果から、ダイズ根原形質膜H^+-
中国歴史教育に関する実証的研究-1949年以降の教科書の歴史観・外国観を徹底分析

近年、中国国民の対日感情の悪化が注目されている。その原因の一つは中国政府によって推進された愛国主義教育だと言われている。しかし、研究代表者の研究を通じて、1990年以降の愛国主義教育の強化の目的は「反日教育」ではなく、祖国と共産党を愛し、社会主義現代化建設のために献身する気持ちを育てるための教育であるということを証明した。そこで、本研究は中国の歴史科の教学大綱(日本の学習指導要領に相当する)と教科書の記述内容に絞って、1949年から2005年までの中国政府が歴史教育を通じて学生に伝えたい歴史観と外国観を分析した。中国の歴史教育は、1949年の建国以降、一貫して国内外の政治環境によって大きく影響される傾向が指摘されている。そこで、本研究では、中国政府が制定している歴史科目の教育方針を詳細に記載している1949年から2004年までの『教学大綱』(日本の学習指導要領に相当)についての分析を試みた。中国側の研究協力者の協力を得て、北京市、上海市及び浙江省でフィールドワーク調査を4度実施した。また、『教学大綱』に基づいて、建国後60年間に各地で作成された歴史科の教科書(小学校高校)を収集Lた。本研究のフィールドワーク調査、収集した研究資料について、研究補助者の協力を得ながら、統計処理を行い、データベース化作業を実施しだ。これらの研究資料を分析した結果は以下の通りである。(1)建国初期の中国における歴史教育の特徴は、毛沢東が発動した独自の革命理論である「継続革命論」によって、政治闘争と連動しながら、それに大きく影響されたことである。しかし1978年の改革・開放政策によって、中国国内では階級闘争があまり強調されなくなった。(2)中国の愛国主義教育は、建国後の歴史教育の中で、一貫して強調されてきた事項である。愛すべき対象は、「祖国・人民」(1950年)から、「中国共産党、社会主義祖国」(1956年)、「中国共産党、毛沢墓と祖国」(1963年)、「共産党、無産階級の革命指導者、人民、祖国」(1978年)、「共産党、人民、祖国」(1980年)、「社会主義祖国、社会主義事葉、共産党」(1986年)「悠久な歴史、文化を有する偉大な中国、中華民族、中国共産党と社会主義」(1991年)という過程を辿って変化した。2000年以降では、「愛国主義教育を薄め、国際社会との共存を強調する教育」が施行されるようになった。(3)中国の歴史教育における主要敵国は、1950年代の「米帝国主義を中心とする侵略陣営」から、1960年代の「米帝国主義とその追随国」に変わり、1978年から1980年代の「社会帝国主義のソ連と資本帝国主義の米国」、1990年代の「帝国主義列強の資本主義国家」へと変化した。主要敵国に関する記述が削除されたのは、2000年代に入ってからである。本研究の目的は、一般人民向けの愛国主義普及キャンペーンではなく、中国政府は児童や生徒たちにどのような歴史観と外国観を伝えたいのかということについて分析することである。21年度では、小中高等学校の「教学大綱」(日本の学習指導要領に相当する)に対する調査、分析を中心に行い、中国政府が歴史教育を通じて生徒に伝えたい歴史観、外国観を明らかにした。22年度では、人民教育出版社と上海市の華東師範大学出版社、上海師範大学出版社によって出版された歴史教科書の収集と、その内容、字数データ分析を中心に行った。特に、歴史教科書の中の日本関連記述の分析を重点的に行った。その結論は以下の通りである。国内外の政治情勢に影響されて中国の歴史教育における日本や近代における日中両国の衝突の歴史に関する記述は変化してきた。文革前の一時期を除けば、中国建国後から1986年まで、歴史教育における日中戦争時の日本の侵略行為に対する批判姿勢はあまり強調されなかった。しかし、1988年以降、特に1990年代以降は、日本の具体的な侵略行為や、占領地の統治活動についても詳細に説明されるようになった。それは、日本に対する批判と読み取ることも可能である。とはいえ、教科書における日本記述、近代における日中衝突、抗日戦争に関する記述の字数の割合の下降傾向を勘案すると、侵略行為を詳細に説明した記述は日本のみに対して打ち出された方針ではなく、1840年以降の100年余りの苦難の時期に、中国を侵略、圧迫した帝国主義列強全体に対する記述方針であったことも留意しておかなくてはならない。また日本関連記述の変化は、日中関係の変化の時期とは一致していないことから、中国の歴史教育の変化は、中国の対米ソ関係と国内問題に影響されることが多く、個別の国との関係にはさほど影響されていないことがわかった。
グルタミントランスポーターによる脳内細胞生存調節機構

アストロサイトに発現するグルタミントランスポーター(GlnT)の生理学的あるいは病態生理学的役割を解明する目的で、GlnTがアストロサイトの酸化的ストレス抵抗性あるいは神経細胞の生存に及ぼす影響を検討した。その結果、アストロサイトに発現するGlnTは、アストロサイトの酸化的ストレス感受性を増大させる可能性、および神経細胞死に対しては神経栄養因子の放出による保護効果を発揮する可能性を示した。我々はラット大脳皮質由来培養アストロサイトには、神経細胞と同様にグルタミントランスポーター(GlnT)が機能的に発現すること、およびリポポリサッカライド(LPS)刺激による細胞活性化に伴い、GlnTプロモーター活性の低下を通じて、GlnT mRNA発現量低下とGln輸送活性減少が誘発されることを以前に報告した。一般的に、アストロサイトは脳虚血等の病態時に活性化されるが、酸化的ストレスには抵抗性を示すことが知られている。そこで本研究では、GlnTの病態生理学的意義を明らかにするため、アストロサイト活性化に伴うGlnTの負の調節が酸化的ストレス感受性に与える影響を検討した。アストロサイトをLPSで刺激後、過酸化水素曝露を行い、MTT assayにより細胞生存率を評価したところ、LPS刺激群では対照群と比較して濃度依存的に過酸化水素誘発性細胞死が抑制されることが明らかとなった。また、GlnT遺伝子をクローニングして、GlnT発現ベクターを作製し、アストロサイトに一過的な遺伝子導入を行ったところ、GlnT発現量の著明な増加とともに過酸化水素誘発性細胞死の有意な増強が観察された。さらに、C6グリオーマ細胞を用いてGlnT安定発現株の樹立を試みたところ、細胞内Gln量の著明な増加とともにやはり過酸化水素誘発性細胞死が有意に増強された。以上の結果より、ラット大脳皮質由来培養アストロサイトに発現するGlnTは、LPS刺激による細胞活性化に伴う酸化的ストレス抵抗性獲得に関与する可能性が示唆される。研究代表者は、神経伝達物質グルタミン酸の前駆物質であるグルタミン(GIn)輸送を担うグルタミントランスポーター(GInT)が、神経細胞だけでなくアストロサイトにおいても機能的に発現することを世界で初めて見出した。昨年度の研究成果から、アストロサイトやC6グリオーマ細胞(アストロサイト様細胞株)にGInTを過剰発現させることにより、それら細胞が酸化的ストレス脆弱性を示すことが明らとなった。そこで本年度はアストロサイトに発現するGInT発現量の変化がどのような生理的意義を持つのかをさらに追求する自的で、GInTを過剰発現させたC6グリオーマ細胞のコンディション培地を用いた条件下において、神経細胞にどのような機能的変化がもたらされるのかについて検討を加えた。その結果、GInT安定発現C6グリオーマ細胞のコンディション培地を用いることによリグルタミン酸誘発性神経細胞死が抑制されること、およびGInT安定発現細胞株ではNGFあるいはNT4/5といった神経栄養因子の発現が誘導されることが明らかとなった。したがって、アストロサイトにおけるGInTの発現量増加は、アストロサイトの酸化的ストレス脆弱性を惹起するだけでなく、神経毒性に対しては神経栄養因子の誘導を介した保護作用を発揮する可能性が示された。本研究成果より、GInTが神経細胞やアストロサイトといった中極神経系構成細胞の生存調節に重要な役割を担っていることが明らかとなったので、今後さらにその詳細なメカニズムを解明することにより、現在発症機構が不明な難治性神経変性疾患の発症機構やあるいは治療法に画期的な知見をもたらすことが期待される。
肝細胞内脂質顆粒蛋白のプロテオーム解析を基盤とした細胞内中性脂質貯蔵機構の解明

本研究課題では、中性脂質蓄積性疾患発症の基礎的なメカニズムの解明をめざし、脂肪滴の形成機構を解析している。昨年度までの本研究の成果から、脂肪滴形成には長鎖脂肪酸が重要であることを見いだしてきた。脂肪滴の主要成分であるトリアシルグリセロールの産生には、脂肪酸以外にグリセロール-3リン酸等のグリセロール系基質も重要であり、これは解糖系を介したグルコースからの経路や、細胞外からのグリセロール取り込みによって供給される。そこで今年度は、脂肪滴形成におけるグルコースおよびグリセロールの寄与を調べた。その結果、培地中グルコース濃度を0.1g/L(正常血糖濃度の約10%に相当)まで低下させても脂肪滴の形成に影響がみられなかったが、0.01g/Lまで低下させた場合には脂肪滴形成が停止した。この低栄養条件下ではグリセロールによって脂肪滴形成が回復した。したがって、脂肪滴形成においては、グルコースおよびグリセロールは一定の重要性を有するものの、その寄与の程度は脂肪酸に比べて低いものと考えられた。本年度の研究では、細胞内にすでに形成されてしまった脂肪滴を消失または退縮させる方法の探索も行った。その結果、培地へのオレイン酸添加によって誘導された脂肪滴は、その後培地からオレイン酸を除去しても長く細胞内に残存していたが、オレイン酸除去時に培地にアシルCoA合成酵素(ACS)阻害剤Triacsin Cを添加したところ、脂肪滴は経時的に退縮していった。ACSを阻害することで脂肪滴が消失したことから、ACSは細胞内で脂肪滴を維持するのに重要であると考えられた。細胞内では脂肪滴は静的な状態にあるのではなく、中性脂質の合成・分解のバランスの上に成り立っていると考えられるが、Triacsin Cはこの2つの過程のうち合成過程を阻害したために、中性脂質分解の方向にバランスが傾き、脂肪滴が退縮したものと考えられた。肝臓はリポ蛋白産生の中心となる臓器であり、生体における脂質供給基地として機能している。肝細胞は中性脂質を合成、貯蔵、分泌(および回収)する能力を有しているが、これらのバランスが崩れると高脂血症や脂肪肝などの疾患が惹起される。中性脂質は細胞内では主に脂質顆粒(脂肪滴)として蓄積されることから、本研究では肝臓における中性脂質蓄積機構の基盤となる情報を得る目的で、ヒト肝由来培養細胞HuH7から細胞内脂質顆粒を単離し、主要な蛋白をnano-LC MS/MS法により同定した。その結果、脂質顆粒に存在する主要蛋白17種が同定された。脂質顆粒蛋白の中では、75kDa、55kDa、35kDaの3種の蛋白の含量が高く、特に55kDaの蛋白が最も多く存在したが、55kDa蛋白は脂質顆粒特異的蛋白として知られるadipose differentiation-related proteinであり、35kDa蛋白は17β-hydroxysteroid dehydrogenase 11という酵素であり、75kDa蛋白はacyl-CoA synthetase 3という酵素であることが判明した。これらの蛋白以外には、脂質代謝酵素としてacyl-CoA synthetase 4、lanosterol synthetase、NAD(P)dependent steroid dehydrogenaselike proteinが、脂質結合蛋白としてTIP47とannexin IIが同定された。また、3種類の機能未知の蛋白と2種類のRas family small GTPaseも同定された。このように、細胞内脂質顆粒が特定の蛋白群により構成されていることが明らかとなったが、脂質顆粒の蛋白組成は既知のオルガネラのものとは異なっていることから、脂質顆粒が新たなオルガネラとして位置付けられる可能性が提示された。肝臓は主要なリポ蛋白産生臓器であり、全身への脂質供給に不可欠な臓器である。そのため、肝細胞は中性脂質の合成や分泌の能力を有しているが、それとともに中性脂質の貯蔵能力も発達させている。中性脂質の合成、分泌、貯蔵のバランスが崩れると高脂血症や脂肪肝などの疾患が惹起される。このような観点から、本研究では細胞内での中性脂質貯蔵機構の中心となる細胞内脂肪滴の形成機構を解析している。昨年度の研究成果によって、脂肪滴にはアシルCoA合成酵素(ACS)の一種であるacyl-CoA synthetase 3(ACS3)が多く存在することが判明した。そこで本年度はヒト肝由来培養細胞HuH7をモデル系としてもちい、脂肪滴形成におけるACSの役割を調べた。HuH7細胞をオレイン酸存在下で培養したところ、細胞内で脂肪滴が顕著に発達した。この培養系にアシルCoA合成酵素の特異的阻害剤であるTriacsin Cを添加したところ、脂肪滴の形成は効果的に阻害された。これらの培養条件において、脂肪滴に存在するACS3の量をイムノブロットにより解析したところ、ACS3はオレイン酸投与細胞では2.8倍に増加していたが、オレイン酸とTriacsin Cを同時に投与した細胞では対照レベルに抑えられていた。この知見に基づき、HuH7細胞から単離した脂肪滴がACS活性を有しているかどうかを調べた。その結果、脂肪滴にはACS活性が検出され、この活性はTriacsin Cによって濃度依存的に阻害された。脂肪滴画分のACS活性は細胞培養時にオレイン酸を添加した場合に2.2倍に上昇した。Triacsin Cを同時添加した細胞では脂肪滴のACS活性はきわめて強く抑制されており、何らかのダウンレギュレーションを受けている可能性が考えられた。以上のような結果から、脂肪滴の形成には脂肪滴上のACSが重要な役割をはたしていると考えられた。

本研究課題では、中性脂質蓄積性疾患発症の基礎的なメカニズムの解明をめざし、脂肪滴の形成機構を解析している。昨年度までの本研究の成果から、脂肪滴形成には長鎖脂肪酸が重要であることを見いだしてきた。脂肪滴の主要成分であるトリアシルグリセロールの産生には、脂肪酸以外にグリセロール-3リン酸等のグリセロール系基質も重要であり、これは解糖系を介したグルコースからの経路や、細胞外からのグリセロール取り込みによって供給される。そこで今年度は、脂肪滴形成におけるグルコースおよびグリセロールの寄与を調べた。その結果、培地中グルコース濃度を0.1g/L(正常血糖濃度の約10%に相当)まで低下させても脂肪滴の形成に影響がみられなかったが、0.01g/Lまで低下させた場合には脂肪滴形成が停止した。この低栄養条件下ではグリセロールによって脂肪滴形成が回復した。したがって、脂肪滴形成においては、グルコースおよびグリセロールは一定の重要性を有するものの、その寄与の程度は脂肪酸に比べて低いものと考えられた。本年度の研究では、細胞内にすでに形成されてしまった脂肪滴を消失または退縮させる方法の探索も行った。その結果、培地へのオレイン酸添加によって誘導された脂肪滴は、その後培地からオレイン酸を除去しても長く細胞内に残存していたが、オレイン酸除去時に培地にアシルCoA合成酵素(ACS)阻害剤Triacsin Cを添加したところ、脂肪滴は経時的に退縮していった。ACSを阻害することで脂肪滴が消失したことから、ACSは細胞内で脂肪滴を維持するのに重要であると考えられた。細胞内では脂肪滴は静的な状態にあるのではなく、中性脂質の合成・分解のバランスの上に成り立っていると考えられるが、Triacsin Cはこの2つの過程のうち合成過程を阻害したために、中性脂質分解の方向にバランスが傾き、脂肪滴が退縮したものと考えられた。
酸素化休止期腫瘍細胞の感受性をも加味した局所腫瘍制御向上の試み

サリドマイドは腫瘍血管正常化の間に急性低酸素領域を解除し、局所腫瘍からの遠隔肺転移を抑えた。p53が野生型及び変異型の腫瘍細胞を用いて、培養時の酸素濃度との関係を解析すると、常酸素下に比べ低酸素下培養では硼素-10の取込み量が有意に減少し、BSHよりもBPAの使用時に、p53変異型よりも野生型の腫瘍細胞において顕著に減少した。HIF-1α欠失腫瘍細胞を確立後、HIF-1αの欠損はグルコース枯渇下培養下でのメトフォルミンに対する感受性を増強させ、低酸素下培養におけるメトフォルミンへの感受性を顕著に増強させる事、メトフォルミンを併用する固形腫瘍の放射線感受性を顕著に増強することが判明した。腫瘍血管の内皮細胞のVEGF (Vascular endothelial growth factor)やVEGF受容体を標的とするBevacizumab投与などの血管新生阻害処置が「腫瘍血管正常化」を誘導する事が広く知られている。その「腫瘍血管正常化」期間中に、固形腫瘍内Q腫瘍細胞の感受性を選択的に検出する我々の手法を適応した解析では、腫瘍内の急性低酸素領域が効率的に解除される事がすでに明らかとなっている。さらには、腫瘍のシグナル伝達を阻害する事によって間接的にVEGFを標的とする、PI3K (Phosphatidylinositol-3-kinase)を介するtyrosine kinase receptor signalingの阻害効果を有するウォルトマンニンの投与でも同じく「腫瘍血管正常化」の期間が認められ、さらにはこの期間内に腫瘍内の急性低酸素領域が解除される事も我々の手法によってすでに明らかとなっている。今年度は、「腫瘍血管正常化」を引き起こす事がすでに報告されているサリドマイドを用いて解析したところ、ウォルトマンニンの場合と同様に、「腫瘍血管正常化」の期間中に急性低酸素領域が解除されることが明らかとなっており、さらには、局所腫瘍からの遠隔肺転移も抑えられた。固形腫瘍内酸素化Q腫瘍細胞の感受性へのサリドマイド投与の効果に関しては、直接的には解析はされなかったが、放射線照射後の大きな回復能への影響の解析を次年度に施行の予定である。さらには、殺癌幹細胞特性が報告されたビグアナイド系経口抗糖尿病薬のメトフォルミンや低グルコース環境下で殺腫瘍細胞効果が増強される同じくビグアナイド系経口抗糖尿病薬のフェンフォルミンによる放射線照射後の大きな回復能への影響の解析も次年度に解析の予定である。腫瘍血管の内皮細胞のVEGF (Vascular endothelial growth factor)やVEGF受容体を標的とするBevacizumab投与などの血管新生阻害処置が「腫瘍血管正常化」を誘導する事が知られている。この「腫瘍血管正常化」期間中に、固形腫瘍内Q腫瘍細胞の感受性を選択的に検出する我々の手法を適応した解析では、腫瘍内の急性低酸素領域が効率的に解除された。さらには、腫瘍のシグナル伝達を阻害する事によって間接的にVEGFを標的とする、PI3K (Phosphatidylinositol-3-kinase)を介するtyrosine kinase receptor signalingの阻害効果を有するウォルトマンニンの投与や、やはり血管新生阻害作用を有するサリドマイド投与でも同じく「腫瘍血管正常化」が認められ、さらにはこの期間中に腫瘍内の急性低酸素領域が解除される事も我々の手法によってすでに明らかとなっている。今年度は、固形腫瘍内Q腫瘍細胞の感受性を加味した局所腫瘍制御に及ぼす腫瘍細胞のp53 statusの影響をさらに詳しく解析し、ガンマ線照射後に認められる回復現象がp53変異腫瘍細胞ではほとんど認めない事、Q腫瘍細胞で顕著に認められた回復現象が、高LET(Linear energy transfer)放射線照射や原子炉熱外中性子線ビーム照射によって、効率よく抑えられる事が明らかとなった。さらに、中性子捕捉療法に必須とされる硼素-10化合物からの10Bの分布効率も腫瘍細胞のp53 statusに影響されることが明らかとなった。今後は、低グルコース環境にあるとも考えられているQ腫瘍細胞の特性も利用し、フェンフォルミンやメトフォルミンのようなビグアナイド系抗糖尿病薬剤の投与を組み合わせ、各腫瘍細胞分画における感受性を選択的により詳細に解析したい。独自に開発したQ腫瘍細胞の亜分画の酸素化Q腫瘍細胞の感受性を選択的に検出する手法は順調に確立されつつある。しかし、中性子捕捉療法のさらなる展開も大きな目的の一つとしていたが、2011年3月の東日本大震災時の福島第1原発事故対応後に見直された新規制基準への研究用原子炉の対応状況を審査する手続きに長期間を要し、平成27年度には原子炉が運転されなかった。このため、原子炉中性子線ビームを用いた担腫瘍実験動物への照射実験の施行が不可能な状況が続き、本研究課題の遂行状況の遅れの大きな原因の一つとなっている。p53が野生型及び変異型の腫瘍細胞を用いて、中性子捕捉化合物との共培養時の酸素濃度との関係を解析したところ、常酸素下に比べ低酸素下では、硼素-10の取込み量が有意に減少し、中性子捕捉化合物としてBSH (Sodium Mercaptoundecahydrododecaborate-10B)よりも、BPA (L-para-Boronophenylalanine-10B)を使用した際に、この低下が顕著であり、p53変異型よりも、野生型の腫瘍細胞において顕著に減少した。また、常酸素下では、BSHよりもBPAからの10Bが、低酸素下では、BPAよりもBSHからの10Bが、培養腫瘍細胞内に有意に多く取り込まれた。

以上より、P53が変異していることが多い腫瘍組織においては、野生型の正常組織と比べると、低酸素下における10Bの取込み能の低下の影響をやや受けにくく、より均一に10Bが分布でき得ると考えられ、低酸素下での10B分布を考慮すると、BSHを用いた方がより有用と考えられた。他方、HIF-1αをknock-outしたマウス扁平上皮癌SCCVII腫瘍細胞を確立させ、培養状態及び固形腫瘍作成後のメトフォルミンに対する感受性を解析したところ、HIF-1αの欠損が、グルコース枯渇下培養状態でのメトフォルミンに対する感受性を増強させ、常酸素下と比べ、低酸素下培養におけるメトフォルミンに対する感受性を顕著に増強させることが明らかとなった。さらには、HIF-1αの欠損が、固形腫瘍のメトフォルミンを併用した放射線感受性を顕著に増強することも明らかとなった。以上より、腫瘍細胞のHIF-1αの欠損が、グルコース枯渇下や低酸素下におけるメトフォルミンの抗腫瘍効果を増強し得ることが初めて明らかとなり、抗腫瘍効果を損ねると考えられている腫瘍内微小環境の影響を克服するための新たな手法を垣間見ることができた。サリドマイドは腫瘍血管正常化の間に急性低酸素領域を解除し、局所腫瘍からの遠隔肺転移を抑えた。p53が野生型及び変異型の腫瘍細胞を用いて、培養時の酸素濃度との関係を解析すると、常酸素下に比べ低酸素下培養では硼素-10の取込み量が有意に減少し、BSHよりもBPAの使用時に、p53変異型よりも野生型の腫瘍細胞において顕著に減少した。HIF-1α欠失腫瘍細胞を確立後、HIF-1αの欠損はグルコース枯渇下培養下でのメトフォルミンに対する感受性を増強させ、低酸素下培養におけるメトフォルミンへの感受性を顕著に増強させる事、メトフォルミンを併用する固形腫瘍の放射線感受性を顕著に増強することが判明した。固形腫瘍内の酸素化休止期腫瘍細胞の感受性を選択的に検出するための手法に関しては、順調に確立されつつある。しかしながら、中性子捕捉療法のさらなる展開を大きな目的の一つとしているが、2011年3月の東日本大震災後に見直された新基準への研究用原子炉の対応状況を審査する原子炉規制委員会における作業が遅れているために、所属部局の原子炉の運転再開時期に関しては未だに未定という状況である。このために、原子炉中性子線ビームを用いた担腫瘍実験動物への照射実験の施行不可能な状況が続いていることが、本研究課題の進捗状況の遅れの大きな原因の一つと考えられる。上記の今年度の「研究実績の概要」の後半部に記述されているように、平成27年度には、原子炉の運転再開が行われない場合であっても、一定の成果が得られるように、一般の放射線照射を含めた固形腫瘍内の腫瘍細胞のDNAを損傷する処置に対する酸素化休止期腫瘍細胞の感受性の増強を目指すことを目的とする計画に一部変更の予定である。上記の「現存までの達成度」に記載したように、平成27年度には原子炉は運転されなかったために、平成28年度まで研究期間を延長する手続きをすでに済ませている。さらには、ガンマ線照射などの一般的な放射線照射、抗癌剤投与などの腫瘍細胞のDNAを損傷する処置時における酸素化休止期腫瘍細胞の感受性増強を主な目的に変更することもあり得ると考えている。
液晶分子LB膜の配向制御と分子配向計測

1.液晶分子LB膜の分子配向の評価本研究経費を使って改良したLB膜作製装置を使って、液晶分子の表面密度と無水合成石英基板及びフッ化カルシウム基板の引上げ方向を制御した。液晶分子LB膜を作製して実験試料とした。液晶分子間及び液晶分子・配向膜間の微視的な局所場効果の寄与を調べるために基本光偏光角の関数としてSH光強度の試料回転角依存性を測定した。ラビングしたポリスチレン配向膜表面の分子配向の異方性とその上に吸着した液晶分子LB膜の分子配向の異方性をLB膜堆積方向と、液晶分子LB膜内の液晶分子間及び液晶分子・配向膜表面間の微視的な局所場効果を考慮して解析した。ラビング方向に対して平行に引上げた液晶分子LB膜と、垂直に引上げた液晶分子LB膜では、液晶分子の配向方向が変化していることが分かった。表面密度3×10^<14>molecule/cm^2の液晶分子LB膜をラビング方向に対して平行に引上げたものと垂直に引上げたものをそれぞれ作製した。ラビング方向に対して平行に引上げた液晶分子LB膜は、ラビング方向に対して垂直に配向しており、ラビング方向に対して垂直に引上げた液晶分子LB膜では、ラビング方向に対して平行に配向していることが分かった。このことから、液晶分子LB膜を作製する際に引上げ方向を制御することで、液晶分子LB膜の分子配向の制御が可能となることが示唆された。2.液晶セルの分子配向の評価1.で作製した液晶分子LB膜を使って液晶セルを作製し、偏光顕微鏡観察を行い、偏光赤外吸収スペクトルも測定して液晶セルの赤外2色比を決定した。液晶分子LB膜を吸着させないで直接液晶分子を注入した液晶セルも作製して比較した。その結果、液晶分子LB膜で見られた分子配向の強い異方性は液晶バルクで緩和されているように見受けられ、液晶セルとしての配向は、ほぼ同等であると結論した。本研究の目的は、2次の非線形電気感受率χ^<(2)>テンソル成分における微視的な局所場効果を考慮して配向膜の表面状態とその上に吸着した液晶分子ラングミュア・ブロージェット(LB)膜の表面密度と液晶分子の配向分布との関連を明らかにすることである。本研究で申請した、表面庄計を組み入れてLB膜作製装置を改良した。改良したLB膜作製装置を使用して表面密度を精密に規定した液晶分子LB膜の作製方法を確立した。液晶分子として分子構造が既知であるシアノビフェニル系液晶(5CB)分子を申請した分析天秤で精密に秤量して一定量のn-ヘキサンに溶かして、LB膜試料溶媒とした、基板として、紫外から赤外にかけて透明であるCaF_2平行平面基板と、良好な面精度・平行度及び紫外光領域での高い透過率が保証される合成石英平行平面基板を使用した。本年度は配向膜高分子材料として、ポリスチレンを準備して基板に塗布し、表面をラビングした。ラビングした配向膜表面とラビングしていない配向膜表面に5CB分子LB膜を作製して実験試料とした。配向膜の偏光赤外吸収スペクトルを予め測定して面内の異方性の尺度となる赤外2色比を評価した。5CB分子LB膜を表面密度と堆積方向を制御して配向膜上に吸着させた後、5CB分子LB膜の光第2次高調波の試料回転角依存性を測定して、χ^<(2)>テンソル成分における微視的な局所場効果を考慮して面内の異方性を評価した。表面密度3×10^<14>,3×10^<12>molecule/cm

^2では明らかに試料回転角依存性のパターンが異なっており、表面密度により面内の配向分布が変化していることが分かった。最終的に液晶セルを作製し、偏光赤外吸収スペクトルを測定して液晶セルの赤外2色比を決定した。得られた赤外2色比から面内の配向分布を評価したところ、表面密度3×10^<14>,3×10^<12>molecule/cm^2の試料両方で液晶セルとしての配向は、ほぼ同等であると結論した。本研究の目的は、2次の非線形電気感受率x^<(2)>テンソル成分における微視的な局所場効果を考慮して配向膜の表面状態とその上に吸着した液晶分子ラングミュア・ブロージェット(LB)膜の表面密度と液晶分子の配向分布との関連を明らかにすることである。(1)液晶分子LB膜の分子配向の評価昨年度の本研究経費を使って改良したLB膜作製装置を使って、液晶分子の表面密度と無水合成石英基板及びフッ化カルシウム基板の引上げ方向を制御して、液晶分子LB膜を作製して実験試料とした。液晶分子間及び液晶分子・配向膜間の微視的な局所場効果の寄与を調べるために基本光偏光角の関数としてSH光強度の試料回転角依存性を測定した。ラビングしたポリスチレン配向膜表面の分子配向の異方性とその上に吸着した液晶分子LB膜の分子配向の異方性をLB膜堆積方向と、液晶分子LB膜内の液晶分子間及び液晶分子・配向膜表面間の微視的な局所場効果を考慮して解析した。ラビング方向に対して平行に引上げた液晶分子LB膜と、垂直に引上げた液晶分子LB膜では、液晶分子の配向方向が変化していることが分かった。表面密度3×10^<14>molecule/cm^2の液晶分子LB膜をラビング方向に対して平行に引上げたものと垂直に引上げたものをそれぞれ作製した。ラビング方向に対して平行に引上げた液晶分子LB膜は、ラビング方向に対して垂直に配向しており、ラビング方向に対して垂直に引上げた液晶分子LB膜では、ラビング方向に対して平行に配向していることが分かった。このことから、液晶分子LB膜を作製する際に引上げ方向を制御することで、液晶分子LB膜の分子配向の制御が可能となることが示唆された。(2)液晶セルの分子配向の評価(1)で作製した液晶分子LB膜を使って液晶セルを作製し、偏光顕微鏡観察を行い、偏光赤外吸収スペクトルも測定して液晶セルの赤外2色比を決定した。液晶分子LB膜を吸着させないで直接液晶分子を注入した液晶セルも作製して比較した。その結果、液晶分子LB膜で見られた分子配向の強い異方性は液晶バルクで緩和されているように見受けられ、液晶セルとしての配向は、ほぼ同等であると結論した。
蚊に着目したデングウイルスの空間伝播動態の解明と生態学的防御

【課題3共生細菌ボルバキアによる蚊のデング感染抑制の検証と共生率の空間分布調査】前年度までにマニラで採取したネッタイシマカから抽出したDNAから,ボルバキア特異的なwspマーカーおよび16S rDNAマーカーと使ったPCR検出を行い,ネッタイシマカのボルバキア共生率を評価した。その結果,PCRを行った672個体のうち80個体(12%)がwspマーカーと16S rDNAマーカーの双方においてボルバキア陽性が確認された。また,PCR産物の塩基配列を解読したところ多様な系統のボルバキアが発見された。マニラにおいて,ネッタイシマカのボルバキア共生率が低く,また見つかったボルバキア系統がデングウイルスの増幅を蚊体内で抑制していないため,デング熱流行の抑制にはボルバキアが働いていないことが考えられた。【課題4気候変動下のデングリスク予測モデルの開発】前年度に引き続き,マニラにおける気象観測点の20092013年の日降水量・気温・湿度等の気象変数とデング熱罹患率(患者数/人口)の経週データを使って,デング熱罹患率の時間変化を気象変数に基づいて予測する機会学習モデルを作成した。また,マニラ広域の蚊個体数の空間分布データと洪水強度や土地利用変数などの環境変数の空間分布で説明する生息場適性指数モデルを作成した。【課題5効果的なデング感染リスク低減策の立案】課題1から4までの研究成果を集約し,現地のデング流行を緩和するための施策を考案した。具体的には,野外で採取したボルバキア共生蚊を実験室に持ち帰り,人工培養して野外に放虫するプログラムを提案した。そのために,現地で,蚊培養システムを構築した。また,本研究で開発したデング熱予測モデルを活用して,降雨が発生した1週間1ヵ月前に予測して地域へのアラートに活用する手法を提案した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。課題1「フィールド調査と蚊の採集」では、マニラとターラック等のデングが発生している都市で調査を行った。各都市の全域を網羅的にカバーするように蚊を採取した。各家庭の軒下や屋内に誘虫紫外線ランプと吸引ファンを備えた電動採捕機を設置する。採取個体は,ウイルスの分解を防ぐため,RNA安定化溶液(RNAlater)に入れて現地協力機関で冷凍保存し、その後、日本に持ち帰った。マニラでは、トラップに捕獲された蚊以外のすべての昆虫を99%エタノールに保管し、次年度以降に行う、昆虫共生細菌ボルバキアの検出に用いることとした。課題2「デングウイルスの空間伝播動態の評価」デング流行期の8-9月に,共同研究先の病院で,デング診断が確定した患者から同意を得た上で患者家庭を訪問し,課題1と同じ方法で蚊を採取した。患者から血液を採取して遺伝子解析まで冷凍保存した。採取した患者血液と媒介蚊のウイルスRNAをマルチプレックスリアルタイムPCRを使って、DEN1、2、3、4の4血清型を同時に検出した。蚊は個体ベースでウイルスを検出する実験プロトコールを確立した。媒介蚊の解析には,上記患者家庭からの個体と共に,課題1で採取した非感染家庭からの個体も使った。まず,患者血液と陽性蚊個体からRNAを抽出した。患者と蚊のRNAから,デングウイルスの4つの血清型に特異的なプライマーによるRT-PCRと増幅を行い,PCR産物の配列を解読した。その結果、ターラック市におけるネッタイシマカのデング熱陽性率は、359メス成虫個体のうち10個体(2.8%)が陽性であった。課題3「共生細菌ボルバキアによる蚊のデング感染抑制の検証と共生率の空間分布調査」は次年度以降に予定していたが,マニラでえられたネッタイシマカサンプルを使ってボルバキアの検出をPCRおよびシークエンシング解析により試みた。世界で初めてネッタイシマカからのボルバキア検出に成功した。ボルバキア感染率は約20%であった。課題1では順調にネッタイシマカサンプルを採取することができた。課題2では,データ解析(地理系統解析)は完了しなかったが,ネッタイシマカからのウイルス検出とシークエンシング解析に成功できた。また,課題3「共生細菌ボルバキアによる蚊のデング感染抑制の検証と共生率の空間分布調査」を予定を前倒しして行うことができた。【課題1フィールド調査と蚊の採集】マニラでネッタイシマカ成虫を採取した。成虫は電動採捕機で採取し,採取時間を記録して単位努力量当たり捕獲数(個体数/日)を評価した。採取した約500個体の成虫はRNA安定化溶液(RNAlater)に入れて現地協力機関で冷凍保存した。【課題2デングウイルスの空間伝播動態の評価】デング流行期にマニラ近郊のターラック市で採取したネッタイシマカメス成虫のウイルスRNAの配列を解析した。媒介蚊の解析には,患者家庭からの個体と共に非感染家庭からの個体も使った。解析した359蚊個体から10個体(=2.8%)のデング陽性個体が検出された。【課題3共生細菌ボルバキアによる蚊のデング感染抑制の検証と共生率の空間分布調査】メトロマニラから採取した672個体のネッタイシマカ成虫からボルバキア

特異的なwsp遺伝子をPCR検出した結果,113個体(16.8%)から検出された。これらボルバキア陽性個体はマニラ全体に広く生息していることが確認された。【課題4気候変動下のデングリスク予測モデルの開発】メトロマニラ都市圏内の660行政区の水文特性と土地利用様式に基づいて各行政区のデング罹患率(感染者数/人口)を予測する機械学習モデルを作成した。決定係数0.90という高い精度でデング罹患率の空間変動が説明された。モデルの重要な説明変数の一つとして降水強度が選択された。また,2009年から2013年におけるマニラの気象水文変数(降水量,気温,湿度,洪水エリア等)とデング罹患率の経週変動の関係性を説明する機械学習モデルも作成した。その結果,420週のラグタイムをおいて,気象水文変数がデング罹患率の時間変動を説明することが分かった。4つの個別課題共に,研究計画どおりのスケジュールで進捗した。【課題3共生細菌ボルバキアによる蚊のデング感染抑制の検証と共生率の空間分布調査】前年度までにマニラで採取したネッタイシマカから抽出したDNAから,ボルバキア特異的なwspマーカーおよび16S rDNAマーカーと使ったPCR検出を行い,ネッタイシマカのボルバキア共生率を評価した。その結果,PCRを行った672個体のうち80個体(12%)がwspマーカーと16S rDNAマーカーの双方においてボルバキア陽性が確認された。また,PCR産物の塩基配列を解読したところ多様な系統のボルバキアが発見された。マニラにおいて,ネッタイシマカのボルバキア共生率が低く,また見つかったボルバキア系統がデングウイルスの増幅を蚊体内で抑制していないため,デング熱流行の抑制にはボルバキアが働いていないことが考えられた。【課題4気候変動下のデングリスク予測モデルの開発】前年度に引き続き,マニラにおける気象観測点の20092013年の日降水量・気温・湿度等の気象変数とデング熱罹患率(患者数/人口)の経週データを使って,デング熱罹患率の時間変化を気象変数に基づいて予測する機会学習モデルを作成した。また,マニラ広域の蚊個体数の空間分布データと洪水強度や土地利用変数などの環境変数の空間分布で説明する生息場適性指数モデルを作成した。【課題5効果的なデング感染リスク低減策の立案】課題1から4までの研究成果を集約し,現地のデング流行を緩和するための施策を考案した。具体的には,野外で採取したボルバキア共生蚊を実験室に持ち帰り,人工培養して野外に放虫するプログラムを提案した。そのために,現地で,蚊培養システムを構築した。また,本研究で開発したデング熱予測モデルを活用して,降雨が発生した1週間1ヵ月前に予測して地域へのアラートに活用する手法を提案した。また,課題1,2,3を継続するとともに,当初の予定通り課題4「気候変動下のデングリスク予測モデルの開発」に着手する。最終年度となる次年度は以下のように進める予定である。課題1:引き続き蚊の調査を継続する。課題2:得られたウイルスの遺伝情報からデングウイルスの空間伝播動態を評価する。課題3:ボルバキア陽性個体が多い地域ほどデングウイルス陽性個体が少ないという仮説を検証する。課題
銀-スズ合金の耐硫化性及び電気伝導性に対するスズの傾斜組成化効果

高周波マグネトロンスパッタリング法を用いて,電気接点用Ag-Sn系合金薄膜を作製し,膜成長方向のSn濃度を階段的に傾斜制御することによって,耐硫化性および接点材料としての電気的特性を向上させることを試みた.X線光電子分光分析により,Ag-Sn合金薄膜の表面にはSnが偏析しており,大気中の酸素と結びついてSnO_2の皮膜が形成されていることがわかった.このSnO_2皮膜の存在によって,H_2Sなどの腐食性ガス分子は,Ag原子と反応できず,結果として耐硫化性が向上する.また,X線回折実験により,Ag-Sn合金薄膜はAg_4Snの金属間化合物をなっていることがわかった.この結晶構造を有していることも,純Agに比べて耐硫化性が高いことの要因の一つであると考えられる.Ag-Sn合金層は耐硫化性が高いものの,純Agに比べて電気伝導率が低いため,電気接点用材料としては不向きである.そこで,電気伝導性の良い純Ag膜上に,耐硫化層としてAg-Sn合金層を積層させた.その結果,高い耐硫化性を保ちながら,電気的特性にも優れた電気接点用材料を開発することができた.特に,[Ag-30Sn/Ag-20Sn/Ag]3層膜において,純Ag膜に匹敵する電気的特性(抵抗率2μΩcm)と,非常に高い耐硫化性(初期接触抵抗2.4mΩ,硫化試験後接触抵抗4.7mΩ)を同時に実現することができた.高周波マグネトロンスパッタリング法を用いて,電気接点用Ag-Sn系合金薄膜を作製し,膜成長方向のSn濃度を階段的に傾斜制御することによって,耐硫化性および接点材料としての電気的特性を向上させることを試みた.X線光電子分光分析により,Ag-Sn合金薄膜の表面にはSnが偏析しており,大気中の酸素と結びついてSnO_2の皮膜が形成されていることがわかった.このSnO_2皮膜の存在によって,H_2Sなどの腐食性ガス分子は,Ag原子と反応できず,結果として耐硫化性が向上する.また,X線回折実験により,Ag-Sn合金薄膜はAg_4Snの金属間化合物をなっていることがわかった.この結晶構造を有していることも,純Agに比べて耐硫化性が高いことの要因の一つであると考えられる.Ag-Sn合金層は耐硫化性が高いものの,純Agに比べて電気伝導率が低いため,電気接点用材料としては不向きである.そこで,電気伝導性の良い純Ag膜上に,耐硫化層としてAg-Sn合金層を積層させた.その結果,高い耐硫化性を保ちながら,電気的特性にも優れた電気接点用材料を開発することができた.特に,[Ag-30Sn/Ag-20Sn/Ag]3層膜において,純Ag膜に匹敵する電気的特性(抵抗率2μΩcm)と,非常に高い耐硫化性(初期接触抵抗2.4mΩ,硫化試験後接触抵抗4.7mΩ)を同時に実現することができた.
個別化医療の開発のための統計的方法論の構築とその実践に関する総合的研究

二年目にあたるH29年度は、初年度で同定した研究テーマのうち、基本的で扱いやすいテーマから順次取り組んだ。A)診断法の開発と評価については、診断法の開発について検討を開始し、ゲノムデータを用いた疾患関連遺伝子多型の検出、予後因子・治療効果予測因子の検出、多層オミクスデータの各種クラスター解析、ネットワーク解析において統計的手法・ツールの開発研究を行った。併せて、多発性骨髄腫のランダム化臨床試験での薬剤効果予測、心停止後症候群患者の神経学的予後予測、乳がんの予後予測、リウマチ、循環器、精神疾患等のゲノムワイド関連研究の事例研究を実施した。B)診断法を用いた治療法の有効性と安全性の評価(臨床試験)については、適応的デザイン、薬剤組合せの探索、中間解析の方法、試験後の治療効果の推定について統計的手法・ツールの開発を行った。併せて、非小細胞肺がん等の臨床試験の事例研究を実施した。C)診断法のエビデンス統合と医療現場での治療の意思決定に関しては、連続的マーカーを用いた診断法のメタ解析、多重傾向スコアモデルによる推定、がん登録での生存率推定、複雑なメタ解析のための統計的手法を開発した。一方で、より解決が困難と考えられるテーマ(疾患異質性のモデリング、学習曲線の推定等)については、基本的なアプローチについて検討を開始した。また、一部これと関連するが、がん領域に限定して国際ワークショップを開催し、診断法開発、臨床試験、メタアナリシス、疫学研究、オミクスデータ解析等の幅広い領域において、海外研究者と最新の研究動向と研究課題について共有し、一部の研究テーマ(疾患異質性のモデリング、観察研究での治療効果予測解析等)については国際共同研究として行うこととなった。二年目にあたる今年度は、初年度に同定した研究テーマの70-80%程度に着手できており、その半分程度については論文化、あるいは、その見通しが立っている。これに付随して多くの関連テーマの検討も進んでいる。本年度は、比較的扱いやすい研究テーマを優先したが、より困難なテーマについてもその解決に向けていくつかのアプローチを見いだすことができた。これは次年度以降の検討対象となる。特定の研究テーマに関する論文のみならず、研究分野全体に関する最新の動向をまとめた書籍の出版や国際ワークショップの開催を海外の研究者と共に行い、国際共同研究の立ち上げのみならず、国際的な業績を目に見える形で着実に蓄積できている。以上より、おおむね順調に進展していると判断する。次年度は5年間のプロジェクトのうち、丁度、真ん中の年にあたる。次年度までの3年間、つまり、プロジェクトの前半部分は、(プロジェクト当初には確立していなかった)個別化医療の臨床開発のための統計的方法論の基本を確立することが主な目標である。今年度着手した(比較的扱いやすい)研究テーマの多くがこれに該当するものであり、すでに論文化できているものもあわせて、大半のテーマを論文化(あるいは、その前段階)まで達成することで、プロジェクト後半への折り返しを迎えたい。一方、プロジェクトの後半は、前半で得られた研究成果をもとに、よりチャレンジングな研究テーマに取り組む。特に、A)診断法開発・評価における多層オミクスデータの統合解析、疾患異質性のモデリングと予測解析、判別・予測解析における学習曲線の推定等に対して一定のソリューションを得ることはこの分野のブレークスルーに結びつくはずである。B)診断法に基づく治療法の有効性・安全性の検証(臨床試験)については,診断法開発の方法論と仮説検証(検定)の方法論の融合、薬剤耐性への対処も含めた逐次的な治療変更を伴う動的治療レジメンを評価するための臨床試験のデザインと解析等がより高度な研究テーマの例である。また、C)エビデンス統合解析と臨床現場での治療の意思決定については、効用関数の定義と強化学習等を用いた効用最適化が含まれる(動的治療レジメンの評価とも関係)。また、プロジェクト後半では、事例研究の比率をより高め、開発した統計的方法論を現場でより使いやすく、より役に立つような形に変えていくような検討も本格化させる。初年度のH28年度は、研究テーマの整理と研究体制の構築が中心であったが、一部のテーマについては成果が得られた年であった。本研究では、診断法・治療法の探索から検証を行う臨床研究、さらに、これらの研究結果(エビデンス)の統合評価、医療現場での治療選択までを包括的に対象として統計的方法・ツールの開発研究を行う。シンポジウム、研究会の開催により、最新の研究を再調査した上で、重点分野と個別の研究テーマを同定した。また、研究テーマ間の関連性を踏まえ、研究の進め方を含めた研究戦略を策定した。A)診断法の開発・評価については、主要なテーマ分類として、ゲノムデータを用いた疾患関連遺伝子多型の検出と疾患リスク予測、予後因子の検出と予後予測、治療効果予測因子の検出と効果予測、多層オミクスデータの統合解析、疾患の異質性のモデリング、判別・予測解析における学習曲線の推定、脳画像データの関連・予測解析を同定した。B)診断法を用いた治療法の有効性と安全性の評価(臨床試験)については、早期探索的試験(適応的デザイン、薬剤組合せの探索、分子標的薬剤の疾患横断的評価)、及び、検証的臨床試験(診断法・治療法の検証のためのデータ解析プラン・中間解析法、試験後の治療効果の推定、動的治療レジメン開発(薬剤耐性対策含む))を同定した。C)エビデンスの統合と治療の意思決定については、効用関数の定義と最適化法、診断法のメタ解析での診断精度・臨床有用度の指標、ROC曲線の統合解析、研究間で異なるカットオフ値の扱いなどに関して基本的な検討を行った。

併せて、次年度以降に実施する事例研究に向けて、多発性骨髄腫、乳がん、大腸がん、肝がんの予後診断、大腸がん、膵がんの存在診断、多発性骨髄腫、大腸がん、糖尿病、リウマチに対する薬剤効果予測、リウマチ、循環器、精神疾患等の発症リスク診断に関して研究データの整理を完了した。5年間のプロジェクトの初年度であること、また、幅広い研究テーマを扱う本プロジェクトの性格から、研究領域全体で国内外の現状を把握し、重要な分野と研究テーマを同定し、さらに次年度以降の研究に向けてデータ基盤や解析体制を整えることができた。本年度に同定された幅広い研究テーマとその解決を系統的に行うための研究戦略・体制は世界的にみてもユニークなものであると考える。多層オミクスデータ解析や診断法研究のエビデンスの統合解析(領域C)などの一部のテーマでは研究成果が出始めている。併せて、A)診断法の開発と評価においては、ゲノムデータを用いた疾患関連遺伝子多型の検出、予後因子解析、治療効果予測因子解析、多層オミクスデータの統合解析、疾患の異質性のモデリング、脳画像データの解析、また、B)診断法に基づく治療法の有効性・安全性評価の臨床試験においては、薬剤組合せの探索、データ解析プラン・中間解析法、試験後の治療効果推定など、すでに論文化の目処がたっている研究テーマが少なからず認められる。以上より、おおむね順調に進展していると判断する。二年目にあたるH29年度は、初年度で同定した研究テーマのうち、基本的で扱いやすいテーマから順次取り組んだ。A)診断法の開発と評価については、診断法の開発について検討を開始し、ゲノムデータを用いた疾患関連遺伝子多型の検出、予後因子・治療効果予測因子の検出、多層オミクスデータの各種クラスター解析、ネットワーク解析において統計的手法・ツールの開発研究を行った。併せて、多発性骨髄腫のランダム化臨床試験での薬剤効果予測、心停止後症候群患者の神経学的予後予測、乳がんの予後予測、リウマチ、循環器、精神疾患等のゲノムワイド関連研究の事例研究を実施した。B)診断法を用いた治療法の有効性と安全性の評価(臨床試験)については、適応的デザイン、薬剤組合せの探索、中間解析の方法、試験後の治療効果の推定について統計的手法・ツールの開発を行った。併せて、非小細胞肺がん等の臨床試験の事例研究を実施した。C)診断法のエビデンス統合と医療現場での治療の意思決定に関しては、連続的マーカーを用いた診断法のメタ解析、多重傾向スコアモデルによる推定、がん登録での生存率推定、複雑なメタ解析のための統計的手法を開発した。一方で、より解決が困難と考えられるテーマ(疾患異質性のモデリング、学習曲線の推定等)については、基本的なアプローチについて検討を開始した。また、一部これと関連するが、がん領域に限定して国際ワークショップを開催し、診断法開発、臨床試験、メタアナリシス、疫学研究、オミクスデータ解析等の幅広い領域において、海外研究者と最新の研究動向と研究課題について共有し、一部の研究テーマ(疾患異質性のモデリング、観察研究での治療効果予測解析等)については国際共同研究として行うこととなった。