hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
2光子励起レーザー顕微鏡を用いた新たな肝移植後拒絶反応の時空間的メカニズム解析

本研究は、同所性肝移植モデル下で肝移植後拒絶肝組織での微小循環環境における血行動態と炎症細胞の動的変化を観察することで、拒絶反応の病態解明、臨床応用への足がかりとすることを目的とした。主に以下の2点について成果を得た。1小動物(マウス・ラット)を用いた同所性肝移植モデルの作製:マウスでのモデル作製の困難さからラットを用いてモデル作製を行った。2光子励起顕微鏡下でin vivoの移植肝の観察が可能であった。2マウス肝虚血再灌流障害時の好中球動態の解析:肝虚血再灌流障害時の好中球数、形態の変化、速度が経時的に観察でき、高倍率では鬱血、血栓形成の誘発、肝実質構造の破壊を経時的に捉えることができた。本研究は、小動物(マウス)を用いた同所性肝移植モデルにおいて2光子励起顕微鏡を用いて生存状態の移植肝組織における微小循環下の炎症細胞と肝組織の関係をreal timeに映像化・分析することで、肝組織における移植後の拒絶反応の病態解明を行い、最終的にそれらを臨床の場面での早期、非侵襲的な拒絶反応の診断に生かしていくことを目的としている。その前段階として我々は、肝移植後の拒絶反応の発症率と相関することが知られている肝虚血再灌流障害に注目した。具体的内容としては、全身麻酔下に開腹、全肝の70%にあたるMedian lobe+left lateral lobeへの門脈・肝動脈血流を非侵襲的な血管クリップにて途絶させ、45分ないしは60分後に解放し再灌流させた温虚血再灌流障害モデルマウスを用いて、その好中球動態を2光子励起顕微鏡を用いて観察している。この方法を発展させ、肝移植後の拒絶反応状態での肝組織を観察・解析することで、非侵襲的に拒絶反応の動的な病態(炎症細胞の浸潤の様子、静脈内皮炎のリアルタイムな変化など)を解明することが可能となると思われる。平成25年度は、主に以下の2点につき研究を遂行した。1.マウス同所性肝移植モデルの作成技術習得2.肝虚血再灌流時における好中球動態の詳細な解析に加え、薬物モデル投与によるケモタキシス抑制モデルマウスでの肝虚血再灌流時の好中球動態の観察(2光子励起顕微鏡を用いて)本研究は、小動物(マウス)を用いた同所性肝移植モデルにおいて、2光子励起レーザー顕微鏡を用いて生存状態の移植肝組織における微小環境下の炎症細胞と肝組織の関係をリアルタイムに映像化、分析することにより、肝組織における移植後の拒絶反応の病態解明を行い、最終的にそれらを臨床の場面での、早期、非侵襲的な拒絶反応の診断に生かしていくことを目標としている。平成25年度から26年度にかけては主に以下の点につき研究を遂行してきた。1.同所性肝移植モデルの作製平成25年度はマウスでのモデル作製に取り組んできたが、非常に高度の技術を要するため習得に非常に難渋することから、平成26年度に入ってからはラットでの同所性肝移植モデル作製に取り組んでいる。年度末になり移植後最長1週間の生存も得られるようになってきており、今後は肝移植後生存ラットの好中球動態を2光子励起レーザー顕微鏡で観察し、分析していく予定である。2.マウス肝虚血再灌流障害時の好中球動態の解析肝移植モデル作製と並行して、肝移植後の拒絶反応の発症率とも相関することが報告されている虚血再灌流傷害時の好中球動態を、薬物投与モデル下も含め2光子励起レーザー顕微鏡を用いて解析している。現時点では虚血再灌流群で接着好中球数や移動速度の経時的増加、うっ血/血栓形成の誘発過程、肝実質構造破壊を示すといった結果が得られている。虚血再灌流障害の病態解明に取り組むことで肝移植後拒絶反応のメカニズム解明へとつなげていく。本研究は、小動物(マウス)を用いた同所性肝移植モデルにおいて、2光子励起レーザー顕微鏡を用いて、生存状態の移植肝組織における微小環境下の炎症細胞と肝組織の関係をリアルタイムに映像化し分析することにより、肝組織における移植後の拒絶反応の病態解明を行い、最終的にそれらを臨床の場面での、早期かつ非侵襲的な拒絶反応の診断に生かしていくことを目標としている。平成27年度は過去2年の研究を継続する形で以下の項目について研究を遂行してきた。1同所性肝移植モデルの作成マウス肝移植モデルの作成の困難さから、平成26年度からラット肝移植モデルの作成に取り組んでいる。手術手技や肝移植後成績が比較的安定してきたため、本年度から2光子励起顕微鏡下でin vivoで移植後肝臓の観察に着手している。マウス肝の固定方法を応用することで肝類洞の観察は可能となった。現在は好中球・リンパ球を蛍光標識する方法を模索中である。2マウス肝虚血再灌流障害時の好中球動態の解析マウス肝虚血再灌流障害時の好中球動態に関しては、2光子励起顕微鏡を用いて解析を行っているが、虚血再灌流障害群においては血管壁への接着好中球数の増加、移動速度の経時的増加、うっ血/血栓形成の誘発過程、肝実質構造の破壊を示すところまでは結果が得られている。移植後の拒絶反応の発症とも関連が示されており、薬物投与モデル下での観察をさらに進めることで、肝移植後拒絶反応のメカニズム解明につなげていく。

本研究は、同所性肝移植モデル下で肝移植後拒絶肝組織での微小循環環境における血行動態と炎症細胞の動的変化を観察することで、拒絶反応の病態解明、臨床応用への足がかりとすることを目的とした。主に以下の2点について成果を得た。1小動物(マウス・ラット)を用いた同所性肝移植モデルの作製:マウスでのモデル作製の困難さからラットを用いてモデル作製を行った。2光子励起顕微鏡下でin vivoの移植肝の観察が可能であった。2マウス肝虚血再灌流障害時の好中球動態の解析:肝虚血再灌流障害時の好中球数、形態の変化、速度が経時的に観察でき、高倍率では鬱血、血栓形成の誘発、肝実質構造の破壊を経時的に捉えることができた。理由としては、マウス同所性肝移植モデル作製に難渋しラットでのモデル作製に方針転換した事、肝移植モデルの前段階の研究(虚血再灌流傷害時の好中球動態の解析)を並行している事が挙げられる。医歯薬学ラット肝移植モデル作製の成功率向上にむけての技術定着、2光子励起レーザー顕微鏡での肝移植後生存ラットの好中球動態の観察・分析、他薬剤投与モデル下での虚血再灌流障害時の好中球動態の解析を行っていく予定である。当研究では、2光子励起顕微鏡を用いた微小循環下の炎症細胞のreal timeな動態を観察することが目的である。顕微鏡を用いた観察に関しては、マウス肝移植モデルの作成技術の習得に難渋しているものの、その一方で薬物投与によるケモタキシス抑制モデルを作成し、肝虚血再灌流時における詳細な好中球動態の解析を行い、肝移植モデルの前段階での研究を遂行しているところである。マウス肝移植モデル作製から、ラットへの方針転換を行ったため。来年度以降は、まずはマウス肝移植モデルの作成技術の習得に努め、モデルができあがった段階で観察を始めることと、肝虚血再灌流時における好中球動態のさらなる解析も同時に進めていく予定である。来年度以降、ラット同所性肝移植モデル作製に向けての動物実験費に使用していく予定である。今年度中は、マウス同所性肝移植モデルの最終作成までには至らなかったため、予定使用額よりも少ない結果となった。来年度以降、マウス同所性肝移植モデルの作成に向けての動物実験費や薬品費等に使用していく予定である。
カルモデュリン依存性プロテインキナーゼIIのカルモデュリンによる不活性化機構の研究

Ca^<2+>/カルモデュリン依存性プロテインキナーゼII(CAMKII)を30°CでCa^<2+>/カルモデュリン(Ca^<2+>/CaM)とともにインキュベートすると酵素活性の速やかな不活性化が観察された。この不活性化の前後でCAMKIIの分解はSDS-PAGE上観察されず、またプロテアーゼ阻害剤の添加によって不活性化は全く抑制されなかった。これに対し、EGTAやCaMアンタゴニストであるトリフルオペラジン、W-7によって不活性化は完全に抑制された。これらのことから、この不活性化は確かにCa^<2+>/CaMに依存した過程であることが示された。不活性化反応速度はCa^<2+>/CaM濃度に依存し、最大不活生化速度の1/2を与えるCa^<2+>/CaM濃度は127μMと活性化に要するCa^<2+>/CaM濃度に比べると、はるかに高濃度を要した。また、キモトリプシン処理によってCa^<2+>/CaM結合部位を含む自己阻害ドメインを取り除いたCAMKIIフラグメントを用いても同様のCa^<2+>/CaMに依存した不活性化が観察された。以上のことから、この不活性化には従来考えられていたCa^<2+>/CaM結合部位とは異なる低親和性の第2のCa^<2+>/CaM結合部位が関与していることが示唆された。この結果不活性化は温度依存性であり、20μMのCa^<2+>/CaM存在下では20°C以上の温度における熱安定性が急激に低下した。500μM ADPおよび10mM MgCl_2はそれぞれ単独では不活性化に殆ど影響を及ぼさなかったが、同時添加によって不活性化を顕著に抑制した。本酵素の良好な合成ペプチド基質であるsyntide-2は304μMという高濃度で添加しても不活性化に全く影響を及ぼさず、また良好な蛋白質であるMAP2はむしろ不活性化を促進した。これらに対し、本酵素の自己阻害ドメインを模した合成ペプチド基質であるautocamtide-2は5μMという低濃度で不活性化を著明に抑制した。本研究の結果、CAMKIIの活性発現に必須であるCa^<2+>/CaMは、高濃度に存在すると逆に速やかな酵素の不活性化を引き起こすということが明らかとなった。このことは本酵素の活性が高親和性と低親和性の2つのCa^<2+>/CaM結合部位によって制御されている可能性を示唆しており、。その機構や生理的意義について興味が持たれる。
公職追放令の形成・決定過程, 実施過程, 終結過程研究

二年に及ぶ本研究は, 1946年1月4日,マッカーサー総司令部から日本政府に対して指令された公職追放令, SCAPIN-550(好ましからざる人物の公職からの除去及び排除)および同548(政党・協会その他の団体の廃止)の形成・決定過程,実施過程,終結過程の解明を目的とした.戦後期における日本の非軍事化・民主化の中で公職追放(パージ)は決定的な役割を果たしたにもかかわらず,従来日本やアメリカでは未研究状態にあった.その意味で本研究は限定されているとはいえ,学問的貢献を果たしたと思われる.まず追放令の形成過程では, (1)従来548が主体をなしていたが,総選挙が近ずくと逆転して550がより重要となった.(2)当初ドイツ案を模範とした追放案は最終的にはかなり異なった内容へと変化した.(3)超国家主義者に対する厳罰主義はGHQ内部の抗争も絡んで結局緩和されるに至った経緯が解明された.次に実施過程では,日本側審査委員会がGHQの監視の下に追放決定にあたり, 1948年3月までに約20万人もの日本人が公職追放に処せられた.この間には石橋淇山の事例のような政治的追放も存在した.そして終結過程では,冷戦の進展に伴なうアメリカの対日占領政策の転換が追放令の終結に影響を及ぼしたばかりでなく追放者の解除を促すに至り,日本政府は朝鮮戦争と対日講和問題を背景に旧軍人や政治家の追放解除を急速に実施し,ついに対日講和条約の発効した1952年4月,公職追放令は廃止され,その歴史に幕を終ろすまでの経緯を明らかにした.総じて,公職追放は単に日本対GHQないしアメリカ政府の枠内だけではなく,日本政界内部の確執としう観点からの研究視点の必要性を痛感した.二年に及ぶ本研究は, 1946年1月4日,マッカーサー総司令部から日本政府に対して指令された公職追放令, SCAPIN-550(好ましからざる人物の公職からの除去及び排除)および同548(政党・協会その他の団体の廃止)の形成・決定過程,実施過程,終結過程の解明を目的とした.戦後期における日本の非軍事化・民主化の中で公職追放(パージ)は決定的な役割を果たしたにもかかわらず,従来日本やアメリカでは未研究状態にあった.その意味で本研究は限定されているとはいえ,学問的貢献を果たしたと思われる.まず追放令の形成過程では, (1)従来548が主体をなしていたが,総選挙が近ずくと逆転して550がより重要となった.(2)当初ドイツ案を模範とした追放案は最終的にはかなり異なった内容へと変化した.(3)超国家主義者に対する厳罰主義はGHQ内部の抗争も絡んで結局緩和されるに至った経緯が解明された.次に実施過程では,日本側審査委員会がGHQの監視の下に追放決定にあたり, 1948年3月までに約20万人もの日本人が公職追放に処せられた.この間には石橋淇山の事例のような政治的追放も存在した.そして終結過程では,冷戦の進展に伴なうアメリカの対日占領政策の転換が追放令の終結に影響を及ぼしたばかりでなく追放者の解除を促すに至り,日本政府は朝鮮戦争と対日講和問題を背景に旧軍人や政治家の追放解除を急速に実施し,ついに対日講和条約の発効した1952年4月,公職追放令は廃止され,その歴史に幕を終ろすまでの経緯を明らかにした.総じて,公職追放は単に日本対GHQないしアメリカ政府の枠内だけではなく,日本政界内部の確執としう観点からの研究視点の必要性を痛感した.公職追放は占領史上きわめて重要な位置を占めているにもかかわらず、殆ど未研究状態にある。そこで初年度では戦後日本に決定的な影響を及ぼした公職追放令(SCAPIN-550&548)の形成・決定過程に焦点を紋り研究を進めた。ここ1ヵ年の研究結果では所期の目的を達成できた。以下、研究方法,資料収集状況,論文作成そして解明された内容について報告する。まず国会図書館にてパージ文書(マイクロフィッシュ約1.600枚)をコピーし、追放政策文書を抽出する作業を3ヵ月行なった。しかしこれはGHQ民政局の文書のため、米国政府内部における公職追放の構想を解明する必要が生じた。そこで米英両国への資料調査旅行を吉田国際教育財団の援助により8月に実施した。その結果SWNCC(国務陸海三省調整委員会)やJCS(統合参謀本部)等の追放関係文書を収集できた。また英国公文書館(PRO)の資料は同盟国として米国の対日占領政策を示唆しており意外な成果があった。さらに元GS公職追放課長ネーピアにインタービューできたことも貴重であった。帰国後日本国際政治学会機関誌掲載論文の執筆に取り掛かった。論文では、(1)国務省およびSWNCCでの公職追放の構想過程、(2)マッカーサ総司令部の追放計画とJCS1380文書指令に基づく公職追放政策の形成・決定過程、(3)追放指令への日本政府の対応と公職追放令の施行過程を順次明らかにした。そして米国政府の構想段階から日本政府の実施段階に至る過程での様々な政策主体(機関)と、それら政策主体間の政治的抗争,政策目標の変化,日独両国間でのパージの比較的相違などを考察できた。次年度ではこの成果を踏まえて、公職追放令の拡大過程と具体的に政治問題化したパージの事例を研究する予定である。
哺乳類概日時計の自律的に発振するリン酸化反応の創生

本研究では哺乳類概日時計の動作原理として考えられる自律性をもつミニマルなリン酸化振動子の試験管内再構成を目的としている。これまでの研究より概日時計の周期長を決定するCKIに脱リン酸化活性があることを見出している。可逆的リン酸化脱リン酸化サイクルを構成するためにCKIの新規脱リン酸化に着目した。しかしこの脱リン酸化活性はリン酸化活性と比較すると活性は小さいため、タンパク質やペプチドによって向上させなければいけない問題点があった。そこでこれらを解決するために本研究では、1.CKIの新規脱リン酸化活性を賦活化させるペプチドを、時計タンパク質由来のペプチドライブラリより探索して発見。2.時計タンパク質由来のペプチドライブラリを用いたスクリーニングよりCKIのリン酸化活性を向上させるペプチドを発見を達成した。さらにこれらの一連のペプチドはリン酸化セリン/スレオニンが含まれていると脱リン酸化を賦活化させる効果があることを見出している。さらに発見したペプチドとCKIの相互作用を等温滴定型カロリメトリ(ITC)を用いて測定した。これまで脱リン酸化に重要だと思われるCKI変異体と比較して結合定数を求めると、高い結合親和力とともにCKIの脱リン酸化活性に重要なアミノ酸残基が明らかになった。脱リン酸化活性の生物学的な意義を解明するために、CKI遺伝子変異体マウスを作製中である。さらに、これら1.2の発見は酵素活性(リン酸化/脱リン酸化)をタンパク質やペプチドによりアロステリックに制御する機構の解明につながるため、酵素活性一般性をもつ可能性を秘めている。時計タンパク質(PER1/2,CRY1/2,BMAL1,CLOCK)由来のペプチドを化学合成を行い、CKIの脱リン酸化活性を賦活化させる一連のペプチドを探索した。その結果、一部のペプチドが脱リン酸化活性を向上させることを見出した。またCKIの脱リン酸化活性のみならずリン酸化活性をアロステリックに向上させるペプチドも発見している。リン酸化/脱リン酸化と相互作用させるペプチドを用いて自律的なリン酸化振動子が構成しうるかを検討する。基質ペプチドや時計タンパク質由来ペプチド、ATPやADPなどの濃度条件の最適化を検討していく。長時間ののサンプリングは分注機による自動化を行い、実験の効率化を図る。培養細胞の実験で使用するディッシュの納期がメーカー都合により遅れてしまい、年度内に納品されることができなかった。そのため次年度に発注をして差額分を使用する。
重症敗血症後の長期認知機能障害機構の解明

本研究では、PICSの病態解明および治療薬開発を試みる為に、PICSの中で特に脳機能障害を再現するモデルを作成した。このモデル動物では、急性期に炎症性サイトカインの上昇、大脳中隔と海馬のグリオーシスなどが観察され、慢性期には短期記憶障害、大脳中隔のコリン作動性神経と海馬神経の減少、シナプス可塑性の低下が観察される。このモデルに対して、PICS治療薬シーズとして期待される神経保護因子、Humanin G (HNG)を投与すると、いずれのパラメータも改善され、脳機能障害が抑制された。重症敗血症後の長期認知機能障害(long-term cognitive impairment amongsurvivors of severesepsis,以下CISSと略す)は、頻度の高い合併症であり、致死的な急性期より回復した患者における長期的な要介護率、うつ病発症率、死亡率の増加が臨床上の大きな課題となっている(Iwashyna TJ et al., JAMA. 2010; 304(16): 1787-1794.)。しかしながら、その発症には敗血症に関連する多臓器不全が複雑に関与するとされ、病態は明らかでない。本研究では、重症敗血症に伴い生じる体内の炎症反応、特にSTAT3と貪食能の変化に注目し、中枢における長期的な神経・グリア回路網の破綻機構の解明を試み、CISSの予防、軽減ないし改善する方法の開発を行う。本年度は、CISSモデルとしてマウスに盲腸結紮穿刺cecal ligation and puncture(CLP)の処置を行い、経時的に記憶障害の評価と炎症反応の関係を検討した。結果、CLP処置後から脳神経での炎症性サイトカイン(TNFα、IL1β、IL6)の上昇および大脳中隔と海馬のGFAPとIba1陽性細胞の増加が観察された。CLP処置後14日目から行動学的には短期記憶を評価するY-maze試験において、その指標であるspontaneous alternation%の低下を認め、組織学的には大脳中隔におけるコリン作動性神経や黒漆・線条体におけるドーパミン作動性神経の減少が観察された。また、CLP処置後に脳内で生じている過剰な炎症性生体反応の抑制効果を示す薬剤候補としてアルツハイマー病関連神経保護因子Humanin G(HNG)に着目し、HNGの治療効果をCLPマウスで検討した。その結果、HNG投与によってCLP処置後の生存率の上昇、記憶障害の改善や炎症性生体反応に対する脳神経保護効果が確認された。本研究では、重症敗血症に伴い生じる体内の炎症反応に注目し、中枢における長期的な神経・グリア回路網の破綻機構の解明を試み、CISSの予防、軽減ないし改善する方法の開発を目的とした。具体的に平成27年度は、平成26年度に確立したCISSの脳機能障害を再現するモデルを用いて、治療薬シーズとして期待されるアルツハイマー病関連神経保護因子Humanin G (HNG)の効果を検討した。CISSの脳機能障害を再現するモデルにおいて、急性期の炎症性サイトカインの上昇、大脳中隔と海馬のGFAPとIba1陽性細胞の増加、また慢性期における大脳中隔のコリン作動性神経と海馬神経の減少、シナプス可塑性の低下及び短期記憶障害が観察された。一方、HNG投与によってそれらは改善されていた。その機序はHNGが急性期炎症性サイトカイン産生を抑制することで、脳保護作用を発揮するためと考えられた。ヒトで生じている重症敗血症後の長期認知機能障害(long-term cognitive impairment amongsurvivors of severesepsis,以下CISSと略す)を、マウスに対する盲腸結紮穿刺処置によって再現するモデルの確立ができたことで、敗血症後の急性期に生じている神経・グリア回路網の破綻機構と慢性期の記憶障害の関係を検討することができた。また、来年度に計画していたCISSの予防、軽減ないし改善する方法の検討を前倒しで着手することにも繋がった。27年度が最終年度であるため、記入しない。救急医学1)ヒト重度敗血症の血液を採取し、炎症性サイトカインの発現と記憶障害の関連性を検討する。2) CLPマウスに対するHNG治療効果の作用メカニズムを詳細に検討する。
核内受容体による薬物応答をモデルとしたエピゲノムセンサーの評価系確立と探索

ヒトは生体外のストレス(環境物質や薬物の曝露、低酸素・栄養)に応答し、様々な反応をする。このとき生体外の異物と細胞内の遺伝子発現の橋渡しをするのが核内受容体である。我々は、核内受容体を介したストレス応答性が、標的となる遺伝子のDNAメチル化状態により制御されることを見出し、「エピゲノムセンサー」のモデルとしての有用性に着目した。本研究では、このモデルを使って細胞内で起こる核内受容体と標的配列の結合応答性を評価する手法を確立するとともに、同様のメカニズムにより制御される他のエピゲノムセンサーの探索を試みる。
神経回路網のカオスを用いたヘテロ脳間及び脳内へテロコミュニケーションの原型モデル

リカレント型神経回路網モデルによる通信機能に関する計算機実験として,400個の二値(±1)神経細胞から成る神経回路網モデルを作り,それを3層結合させて準階層リカレント型とする。適切な方法でシナプス結合行列を決め,少数結合を導入して状態更新を行いカオスを発生させた。送信神経細胞を設け,信号入力を行い,別途設けた受信細胞との相関関数を評価し,送信信号がいったんカオス中に散って消えた後,時空間的に離れた点において再び信号が発現していることを発見した。今年度はそうした通信チャンネルを三系統設け,カオスを媒体として3点間同時通信を試み,系の動的神経発火パターンを変化させるパラメータについて,最適化を試みた非線形光電子デバイス結合系による通信機能に関する計算機実験として,動的自己電気光学効果素子(略称をDSEEDと称し申請者が考案したモデル)の示すパルス発振を擬似神経細胞モデルのハードウェア素子とみなし,二状態モデルと同様の計算機実験とその数値解析による研究を更に進め,生理学的モデルとして提案されているモデルと比較,検討を行った擬似神経細胞素子のネットワークに関して計算機実験を行い,二値神経細胞ネットワークと同様な同時多チャンネル通信の計算機機能実験を継続して試みた上記(1)で用いた単一神経回路網モデルを2システム準備し,それらを独立した巡回ロボットに搭載し,二者間の独立なカオスによる行動上の相互作用(追跡と逃走志向,相互邂逅志向)を行う計算機機能実験に関し,前年度からの発展として「学習」の導入による展開を図った25年度が最終年度であるため、記入しない。25年度が最終年度であるため、記入しない。今年度はそうした通信チャンネルを三系統設け,カオスを媒体として3点間同時通信を試み,系の動的神経発火パターンを変化させるパラメータについて,最適化を試みた非線形光電子デバイス結合系による通信機能に関する計算機実験として,動的自己電気光学効果素子(略称をDSEEDと称し申請者が考案したモデル)の示すパルス発振を擬似神経細胞モデルのハードウェア素子とみなし,二状態モデルと同様の計算機実験とその数値解析による研究を更に進め,生理学的モデルとして提案されているモデルと比較,検討を行った擬似神経細胞素子のネットワークに関して計算機実験を行い,二値神経細胞ネットワークと同様な同時多チャンネル通信の計算機機能実験を継続して試みた上記(1)で用いた単一神経回路網モデルを2システム準備し,それらを独立した巡回ロボットに搭載し,二者間の独立なカオスによる行動上の相互作用(追跡と逃走志向,相互邂逅志向)を行う計算機機能実験に関し,前年度からの発展として「学習」の導入による展開を図った(1)リカレント型神経回路網モデルによる通信機能に関する計算機実験として,400個の二値(±1)神経細胞から成る神経回路網モデルを作り,それを3層結合させて準階層リカレント型とする。そしてそのシナプス結合行列(1200行1200列)に周期アトラクターを埋め込んだシナプス結合行列を決め,少数結合を導入して状態更新を行いカオスを発生させた。そして適切に送信神経細胞を設け,信号入力を行い,別途設けた受信細胞との相関関数を評価し,また送信信号と同期するかどうかをこれも相関関数を計算することにより評価した。その結果,送信信号がいったんカオス中に散って表面上は見えなくなるが,時空間的に離れた点において再びその信号が発現していることを発見した。これは脳波実験やfMRI実験とも合致する現象であることを示し,そうした通信チャンネルを二系統設け,カオスを媒体として2点間同時通信を実現させた(2)非線形光電子デバイス結合系による通信機能に関する計算機実験として,動的自己電気光学効果素子(略称をDSEEDと称し申請者が考案したモデル)の示すパルス発振を擬似神経細胞モデルのハードウェア素子とみなし,二状態モデルと同様の計算機実験とその数値解析による研究を行った(3)擬似神経細胞素子のネットワークに関して計算機実験を行い,二値神経細胞ネットワークと同様な同時多チャンネル通信の計算機機能実験を試みた上記(1)で用いた単一神経回路網モデルを2システム準備し,それらを独立した巡回ロボットに搭載し,二者間の独立なカオスによる行動上の相互作用(追跡と逃走志向,相互邂逅志向)を行う計算機機能実験を行い,その成功率などのデータ収集と解析を行った当初掲げた「準階層リカレント型神経回路網におけるカオスを含む複雑なダイナミックスを通信媒体として用いた複数離点間同時多チャンネル通信の計算機実験とそれに基づく脳内コミュニケーション機能あるいはマルチタスク同時実行へのアプローチ」について,成功裡に計算機機能実験が進んでいる。また,非線形光電子能動素子を擬似神経細胞素子としてそのネットワークを形成した系においても同時2チャンネル通信の計算機機能実験が成功している。さらに双方向の場合も成功裡に進行中である。独立な巡回ロボット二体に独立なカオスを用いた行動的相互作用(追跡と逃走,相互邂逅志向)については計算機実験が進行中である。(1)本報告における研究段階では送受信神経群において振幅同期が実現されたが,さらに高性能な複数離点間同時多チャンネル通信を実現する最適パラメータを求めて計算機実験とそれに基づく脳内ヘテロコミュニケーション機能へのアプローチを行うこと,

(2)同時マルチタスクの計算機機能実験を行うことおよびその最適なパラメータを求めてそのときのカオスがどのような動的構造を有しているかを評価すること,(3)2体の自律ロボットに発生させた互いに独立なカオスを介して両者が機能的相互作用を行う計算機機能実験,およびそれに基づくより高度なへテロ脳間コミュニケーション機能へのアプローチへ向けての展開研究を行うこと,が今後の推進方策として考えられる。25年度が最終年度であるため、記入しない。
薬剤耐性緑膿菌の２つの生体膜を貫く異物排出タンパク質複合体システムの構造基盤

日和見細菌である緑膿菌が多剤耐性化する主な原因として、菌体内に進入した抗生物質を排出する異物排出タンパク質複合体が関わっている。異物排出タンパク質複合体は、内膜に存在するトランスポーター、膜間に存在するアダプタータンパク質、外膜に存在する外膜チャンネルタンパク質の3種類からなり、2つの生体膜を貫く巨大な膜タンパク質複合体である。本研究では、異物排出タンパク質複合体の試料調製を行い、複合体構成蛋白質の化学量比を決定し、電子顕微鏡3次元再構成法により構造解析に成功した。また、緑膿菌の薬剤排出に関わる主な外膜チャンネルタンパク質の構造解析に成功し、外膜チャンネルの開閉機構について明らかにした。本研究では、緑膿菌由来の異物排出タンパク質複合体システムMexAB-OprMの機能する現場で形成する構造をX線結晶構造解析で解明し、抗生物質を菌体外に放出するメカニズムを明らかにする。本年度はMexAB-OprM複合体システムの化学量比について調べる。そのために、以下のことを実施した。I.外膜チャンネルタンパク質OprMの安定化条件の検討:大腸菌の発現系を大量培養し、種々の界面活性剤を使ってOprMの可溶化を行った。界面活性剤で可溶化した試料を、カラムを用いて単離・精製を行い、すでに結晶構造解析に成功している界面活性剤OGを用いた試料の性状を基準として、種々の界面活性剤で可溶化した試料の性状を調べ、OprMを安定に保つ界面活性剤の探索を行った。OprMの収量やゲル濾過の溶出位置およびピークの形状、動的光散乱法を用いた単分散性について調べた結果、OG以外にマルトシド系の界面活性剤でOprMを安定に単離できることが分かった。II.内膜トランスポーターMexBの安定化条件の検討:OprMと同様に、大腸菌の発現系を大量培養し、様々な界面活性剤を使ってMexBを単離・精製し、MexBを安定に保つ界面活性剤の探索を行った。MexBについては、すでに結晶構造解析に成功している界面活性剤DDMを用いた試料の性状を基準として、種々の界面活性剤で可溶化した試料の性状を調べた結果、DDMを含むマルトシド系の界面活性剤だけが安定に単離できた。III.安定なMexAB-OprM複合体システムの再構成の検討:各膜タンパク質が安定な界面活性剤を用いてそれぞれを精製し、複合体形成実験を行った。複合体形成の確認については、ゲル濾過とSDS電気泳動法により確認を行った。MexAB-OprM複合体の形成を確認できたが、SDS電気泳動法を用いて各構成タンパク質の量比を決定するほどの量が得られなかった。複合体が構造解析に耐えうる結晶に成長するためには、複合体が均質な構造を保ち長期(最低1週間)にわたって安定である必要がある。そのため、塩の種類や濃度、界面活性剤の種類を変え、約80条件について、動的光散乱法や電子顕微鏡を用いて長期の構造安定性について調べた。その結果、低塩濃度の条件が比較的長期に構造上安定であることを示した。また、複合体が長期安定な条件下でゲル濾過を行い、得られた複合体画分をSDS電気泳動法によって、各構成タンパク質の量比を確認できた。II.結晶化条件の探索動的光散乱法や電子顕微鏡を用いて得られた長期に複合体を安定に保つ条件は低塩濃度の条件であったので、様々な長さのPEGを沈殿剤とし、数100種類にもおよぶ結晶化条件の探索を行ったが、結晶は得られていない。結晶化条件の多くの条件で沈殿も観察出来ていないことから、結晶化に用いる複合体の濃度が低い可能性が考えられる。複合体の濃度が低く結晶化に用いることができなかった試料を、電子顕微鏡を用いた低分解能での構造解析用試料として利用した。複合体試料をモリブデン染色し、電子顕微鏡像を撮影した。その中から特徴的な複合体の単粒子像約3000枚を収集することに成功した。本研究では、緑膿菌由来の異物排出タンパク質複合体システムの機能する現場で形成する構造をX線結晶構造解析で解明し、抗生物質を菌体外に放出するメカニズムを明らかにする。本年度は異物排出タンパク質複合体システムの立体構造の決定のために以下のことを実施した。I.結晶化条件の探索:動的光散乱法や電子顕微鏡を用いて得られた長期に複合体を安定に保つ条件は低塩濃度の条件であったので、様々な長さのPEGを沈殿剤とし、数100種類にもおよぶ結晶化条件の探索を行い、微結晶が得られた。しかし、回折実験に耐えうる結晶を得ることができなかった。界面活性剤の代わりに両親媒性のポリマーを用いて複合体の安定化を行い、結晶化を試みたが、結晶は得られなかった。また、リン脂質を利用した結晶化についても検討を行ったが、結晶は得られていない。II.電子顕微鏡像3次元再構成法:可溶化に用いた界面活性剤によって安定化した複合体試料をモリブデン染色し、電子顕微鏡像を撮影した。

その中から特徴的な複合体の単粒子像約2000枚を収集することに成功し、低分解能での複合体システムの全体構造を明らかにした。III.複合体システムの構造解析:緑膿菌には、MexAB-OprM以外に、2種類の主要な異物排出タンパク質複合体システム(MexCD-OprJ, MexEF-OprN)が存在することが分かっている。これら2種類の複合体システムの構造解析を進めるために、構成蛋白質の発現・精製系を構築し、それぞれの外膜チャンネル部(OprJ, OprN)について構造解析に成功した。これら外膜チャンネルの構造解析から、外膜チャンネルの開閉機構及び各複合体システムの構造形成過程における外膜チャンネルの選択性の理解を深めた。日和見細菌である緑膿菌が多剤耐性化する主な原因として、菌体内に進入した抗生物質を排出する異物排出タンパク質複合体が関わっている。異物排出タンパク質複合体は、内膜に存在するトランスポーター、膜間に存在するアダプタータンパク質、外膜に存在する外膜チャンネルタンパク質の3種類からなり、2つの生体膜を貫く巨大な膜タンパク質複合体である。本研究では、異物排出タンパク質複合体の試料調製を行い、複合体構成蛋白質の化学量比を決定し、電子顕微鏡3次元再構成法により構造解析に成功した。また、緑膿菌の薬剤排出に関わる主な外膜チャンネルタンパク質の構造解析に成功し、外膜チャンネルの開閉機構について明らかにした。動的光散乱法や電子顕微鏡を用いて、2つの生体膜を貫く異物排出タンパク質複合体システムが安定に長期(最低1週間)にわたって均質な構造を保つ条件を見つけることに成功した。得られた条件を元に、ゲル濾過を用いて複合体試料を再調整し、高純度の複合体を得ることに成功した。高純度の複合体試料をSDS電気泳動法により各構成タンパク質の量比を解析したところ、MexA:B:OprMが2:1:1であることが示唆できた。高純度の複合体試料は得られているが、さらなる結晶化条件探索を行うために絶対量を増やす必要があり、そのための培養および精製方法を確立しつつある。結晶化条件探索を行いつつ、複合体の濃度が低い試料から電子顕微鏡を用いた構造解析に向けた像の収集に成功した。27年度が最終年度であるため、記入しない。放射光構造生物学I.結晶化条件の探索:高濃度の複合体試料を用いて結晶化を行う。界面活性剤を用いた結晶化で出なければ、リン脂質を利用した結晶化を検討する。III.2層の膜を介した菌体外への異物排出機構の解明:各構成分子間の相互作用を調べ、アダプター分子MexAによる内膜トランスポーターMexBおよび外膜チャンネルタンパク質OprMとの連結機構を明らかにする。膜貫通領域がβバレル構造からなる外膜チャンネルタンパク質OprMとαヘリックス構造からなる内膜トランスポーターMexBを安定に精製できる界面活性剤の種類は異なると考えられていたが、両方の膜タンパク質を安定に精製できる界面活性剤を数種類見つけることに成功した。見つけた数種類の界面活性剤の中から一つ選んで、それぞれの膜タンパク質(OprM, MexB)を精製し、MexAB-OprM複合体の形成実験を行った。ゲル濾過では、各構成タンパク質(OprM, MexAB)の分子量より大きなところにピークが見られ、ピークをSDS電気泳動で確認したところ、各構成タンパク質が含まれており、複合体形成に成功した。
メラノーマにおけるペプチド抗原提示機構の分子基盤解析

これらの結果は細胞傷害性T細胞にペプチドを提示する場合にメラノーマ細胞におけるHLA Class Iは必須であるが、その発現に最も影響している分子はTAP-1とTAP-2であることが示唆された。これらの分子異常が免疫エスケープに深く関与することが示唆された。まず、正常皮膚組織のホルマリン固定パラフィン包埋切片標本を用いて検討した。抗原賦活化はマイクロウェイブ(citrate buffer pH6またはpH7)法やオートクレイブ法を用い、抗体の濃度設定を行い、それぞれの至適条件を決定した。その結果、HLA Class I, beta2-microglobulinは細胞膜、その他の分子群は細胞質に明瞭に陽性所見が得られた。従ってこれらの抗体を用いてレトロスペクティブな解析が可能となった。次年度はメラノーマ症例や色素細胞母斑症例を多数検討し、臨床病理学的因子との相関性を検討する予定である。さらには、培養メラノーマ細胞を用いてこれらの分子発現に及ぼすサイトカインの影響を検討する予定である。
近代初頭の大阪の貸家をめぐる空間・人間・社会的諸関係に関する建築史・都市史研究

本研究は新出の「井上平兵衛家文書」を素材に、これまで十分に明らかにされていない明治前期における大阪都心部の伝統的居住形態の実態と、その近代的変容を解明した。これにより先行研究の時間的、地域的な空白を補完することができた。また、貸家をめぐる社会的諸要素を分析して「居住」のもつ社会側面を考察し、都市社会の中で貸家を位置づけた。また、「井上家文書」の整理が進み、住居史、建築史の分野だけでなく、経済史や歴史学などと共有の研究資料が構築された。本研究は、新出資料である「井上平兵衛家文書」を素材として、近代大阪の都市居住システムを考察することを目的としている。「井上平兵衛家文書」は明治初期より大阪都心部で貸家業を営む一方、区会議員を務めるなど地域行政を担った井上平兵衛家に保存された膨大な文書群である。同文書の資料は近世末期から昭和戦前期まで及びその内容は、(1)土地売買契約書、(2)貸家賃貸契約書、(3)家賃収入帳、(4)借家建築請負契約書、(5)仕様書など貸家経営に関する資料が多数含まれている。さらに、区会議事録衛生組合関係資料、学校運営資料、選挙関係資料など、地域行政の実態を伝える資料も多数含んでいる。本研究で.はこのような「井上平兵衛家文書」の特徴を踏まえ、貸家を多角的に分析し、近代大阪の都市居住システムについて考察しようとするものである。具体的には(1)物理的居住環境(町の空間構造、宅地利用形態、貸家の建築構成)、(2)貸家の経営システム、(3)借家人の生活実態、(4)大工、建築業者と家主との関係、(5)貸家をめぐる人間関係、社会的諸関係、(6)居住環境の近代的変容、の6つをキーワードに居住システムとしての貸家を構造的に解明する.研究は(1)基礎調査と(2)分析・考察に大きく分かれる。このうち、21年度(21年12月22年3月)は分析・考察の基盤データを構築するための基礎調査(未整理資料の整理・調査・目録化)を集中的に実施した。未整理資料35箱のうち8箱、点数にして4,387点を新規に目録化し、データ入力を終えた。また、資料の劣化の激しいもの、貸家の間取図など特に重要と思われる150点余について写真撮影を行い資料内容の保存を図った。本研究により、これまで十分に明らかにされていない明治前期の大阪の都市居住の実態が解明されること、また、「井上平兵衛家文書」の整理が進み、住居史、建築史の分野だけでなく、経済史や歴史学の分野にとっても共有の研究資料が構築されることは意義深く、重要なことといえる。都市の居住形態のなかで、借家は近世から近代を通じ、一貫して高い水準で推移してきた。江戸、京都と並び、三都と称された大阪も、江戸時代中・後期を通して借家の比率が高く、近代にはいってもその傾向は続いた。したがって大阪の居住について考察するとき、借家の実態を解明することは重要な要素であるといえる。本研究は新出資料「井上平兵衛家文書」を基礎資料として、近代大阪の都市居住システムを解明することを目的としている。同文書を所蔵する井上平兵衛家は明治初期より大阪都心部で貸家業を営む一方、区会議員を務めるなど地域行政を担った名望家である。このような井上家の社会的・職業的な特徴から、井上平兵衛家文書には貸家経営に関する膨大な資料(土地売買契約書、貸家賃貸契約書、家賃収入帳、貸家建築請負工事契約書、同仕様書など)、および地域行政に関する資料(区会議事録、選挙、尋常小学校運営に関する記録など)が含まれ、近代大阪の居住システムを解明する絶好の資料といえる。本研究では「井上平兵衛家文書」を用いて、近代大阪の居住システムを具体的に把握するために、(1)物理的居住環境、(2)貸家経営、(3)借家人、(4)大工・建築業者、(5)貸家をめぐる人間関係・社会関係、(6)近代的変容の6つの指標を設定し、それぞれの局面からの分析を行った。これにより、物理的環境、社会的環境、地域社会構造など、居住をとりまく複数の局面から、総合的に都市の居住システム=貸家を捕らえることが出来た。
産業クラスターが海外研究開発拠点のイノベーションに与える影響

本研究の目的は、タイの自動車産業を事例に産業クラスターが海外研究開発拠点のイノベーションに与える影響の全体像を明らかにすることである。第1に先行研究の検討を通じて産業クラスターが海外研究開発拠点に与える影響を分析するためのフレームワークを提示した。その成果を紀要論文として公表している。第2に海外における日系自動車企業の研究開発の全体像の分析を行った。分析の結果、完成車メーカーの進出先とサプライヤーの進出先は概ね一致しており、サプライヤーの研究開発が完成車メーカーの研究開発を支えていると考えられる。その成果を学会発表と紀要論文として公表している。第3に完成車メーカーに対するインタビュー調査を行った。インタビュー調査を通じて、海外研究開発拠点の設立にはサプライヤーの集積とその能力向上が重要であること、現地の大学から十分な数のエンジニアを採用できていることが明らかになった。これらの成果を2019年度に学会発表と論文として公表する予定である。第4にタイにおいて完成車メーカーとサプライヤーに対するインタビュー調査を行った。インタビュー調査の結果、完成車メーカー・サプライヤーともタイにおいて日本と同様の製品を同一の方法で生産していることが明らかになった。すなわち、日本のものづくりと取引関係をタイでも再現しようとしているのである。これらの成果をシンポジウムの発表、調査報告書にして公表している。また、2019年度には共著して公表する予定である。本年度に計画していたのは以下の3点である。1.先行研究・文献サーベイ:G-Search等のデータベースを活用して、新聞記事、ビジネス雑誌等の収集を行う。また産業クラスター論に関する先行研究を収集する。2.日本企業に対するインタビュー調査:日本の親会社にインタビュー調査を実施する。3.日本の産業クラスター関係機関に対するインタビュー調査:ジェトロやタイ投資委員会の東京事務所等において、産業クラスター政策に関する資料収集や自動車産業の誘致政策に対する考えについて調査する。本年度は、1の先行研究と文献サーベイを中心に行った。タイにおける自動車メーカーの研究開発に関する新聞記事、ビジネス雑誌等の収集を行った。また、「自動車メーカーのタイ進出」「海外子会社のイノベーション」「産業クラスターにおけるイノベーション」に関する先行研究を収集した。1についてはある程度の調査を行うことができた。一方で、インタビュー調査を行うことができず、2と3については次年度に実施することとなった。なお、今年度はデータ収集に集中したため、本研究に関する成果の公表は行っていない。タイの投資環境の文献などはある程度収集することができたが、分析フレームワークを構築するためには更なる先行研究の調査が必要であった。そのため、インタビュー調査の準備を十分に行うことができなかった。また、大学へ転出することとなったため、予定していた時期にインタビュー調査を実施することができなかった。本研究の目的は、タイの自動車産業を事例に海外研究開発拠点のイノベーションに与える影響の全体像を明らかにすることである。本年度に計画していたのは、以下の2点である。1.日本企業に対するインタビュー調査:日本の親会社にインタビュー調査を実施する。2.日本の産業クラスター関係機関に対するインタビュー調査:ジェトロやタイ投資委員会の東京事務所等において、産業クラスター政策に関する資料収集や自動車産業の誘致政策に対する考えについて調査する。本年度は、日本企業の親会社と海外拠点に対するインタビュー調査を行った。研究を進めるに伴い、自動車メーカーだけでなくサプライヤーの役割も注目すべきと判断した。すなわち、自動車の製品開発においては自動車ーメーカーとサプライヤーの協力関係が重要となっているためである。そのため、日本及びタイにおいて自動車メーカーとサプライヤーに対するインタビュー調査を行った。また、サプライヤーの海外進出に関する統計資料の分析を行った。これらの成果を学会発表2回(単著1、共著1)、論文1本にして公表している。2については、産業クラスターに関する文献を追加で収集した。また、自動車メーカー及びサプライヤーに対して、タイの誘致政策の活用についてインタビュー調査を行った。しかしながら、産業クラスター関係機関に対するインタビュー調査が実施できておらず、これらの機関に対するインタビュー調査は次年度に実施することとした。現在の大学に移ってきたため、研究環境の整備が必要であり、研究計画に遅れが生じた。自動車メーカーとサプライヤーについてはある程度インタビュー調査をすることができた。しかし、産業クラスター関係機関に対するインタビュー調査が実施できなかった。本年度は、サプライヤーに対するインタビュー調査を行った。すなわち、自動車の製品開発においては自動車メーカーとサプライヤーの協力関係が重要となっているためである。そのため、日本においてサプライヤーに対するインタビュー調査を行った。分析の結果、トヨタ、マツダ、三菱自動車は国内と海外で調達構造に差があることが明らかになった。マツダ、三菱自は自社系列サプライヤーからの調達は少ないこと、海外での自社系列サプライヤーの調達品目は国内よりも少ないことを明らかにした。すなわち、海外における調達構造の再現度が低いことが明らかになった。一方で、トヨタは国内、海外とも自社系列サプライヤーからの調達が多くなっていた。すなわち、海外における調達構造の再現度が高いことが明らかになった。これらの成果を学会発表1回、シンポジウム1回、査読付き論文1本にして公表している。その他には海外製品開発に関する先行研究を追加で収集している。先行研究のレビューを行い、産業クラスターが海外研究開発拠点のイノベーションに与える影響の分析

フレームワークに関する論文を執筆中である。所属先において複数の教員が転出したことにより講義負担が増えた。そのため、研究調査に遅れが生じている。研究を進めるため延長申請を行った。本研究の目的は、タイの自動車産業を事例に産業クラスターが海外研究開発拠点のイノベーションに与える影響の全体像を明らかにすることである。第1に先行研究の検討を通じて産業クラスターが海外研究開発拠点に与える影響を分析するためのフレームワークを提示した。その成果を紀要論文として公表している。第2に海外における日系自動車企業の研究開発の全体像の分析を行った。分析の結果、完成車メーカーの進出先とサプライヤーの進出先は概ね一致しており、サプライヤーの研究開発が完成車メーカーの研究開発を支えていると考えられる。その成果を学会発表と紀要論文として公表している。第3に完成車メーカーに対するインタビュー調査を行った。インタビュー調査を通じて、海外研究開発拠点の設立にはサプライヤーの集積とその能力向上が重要であること、現地の大学から十分な数のエンジニアを採用できていることが明らかになった。これらの成果を2019年度に学会発表と論文として公表する予定である。第4にタイにおいて完成車メーカーとサプライヤーに対するインタビュー調査を行った。インタビュー調査の結果、完成車メーカー・サプライヤーともタイにおいて日本と同様の製品を同一の方法で生産していることが明らかになった。すなわち、日本のものづくりと取引関係をタイでも再現しようとしているのである。これらの成果をシンポジウムの発表、調査報告書にして公表している。また、2019年度には共著して公表する予定である。今年度は分析フレームワークの構築を完了し、タイ投資委員会および自動車メーカーへのインタビュー調査を実施する予定である。今後は産業クラスター関連機関へのインタビュー調査を行い、イノベーションを創出する環境要因について明らかにする。また、自動車メーカーへのインタビュー調査も追加で行う予定である。
モデル生物を用いた匂いに対する嗜好性が変化するしくみの解明

匂い経験や匂いの濃度によって嗜好性が変化する仕組みについて、線虫を用いた独自の系によって解析を行った。経験による嗜好性変化については、関与する介在神経を同定し活性変化をイメージングによって観察した。またニューロペプチドシグナル、Ras-MAPK経路の働く機構の解明を行った。匂いの濃度による嗜好性変化については、働く神経回路が変化することによって制御されていることを明らかにした。さらに、嗜好性変化に関わる因子の働きを時間、場所を同時に限定して制御する新しい技術の開発に成功した。線虫の匂いに対する嗜好性変化を医療技術に用いることを考案し、その検証も行った。1.直前の匂い経験による嗜好性変化のしくみ直前の匂い経験による嗜好性変化について、それを担う神経回路の同定および機能解析を行った。嗅覚神経から直接シナプス入力を受ける介在神経のうち、AIB、AIZ神経は単独、両方同時の機能阻害いずれにおいても嗜好性変化に影響がなかったことから、これらの介在神経は重要でないことがわかった。嗜好性変化に重要であることが既にわかっているAIY、AIA神経の匂い経験の有無による活性変化は、以前はYC3.60を用いたカルシウムイメージングにより観察していたが、ダイナミックレンジが小さく、活性変化を十分に捉えきれてない可能性があった。そこで、ダイナミックレンジの大きいGCaMP6を導入して解析を行うことにした。AIA介在神経にGCaMP6を発現させたところ、単純な匂い刺激に対してYC3.60より大きい活性化を観察することができ、匂い経験後はその活性化が抑えられることがわかった。AIA神経の匂い経験による活性変化にニューロペプチドシグナルが関与している可能性について検証した。その結果、NPR-11が嗜好性変化に重要な働きをすること、NPR-11はAIA神経で機能していることがわかった。2.匂いの濃度による嗜好性変化のしくみ匂いの濃度による嗜好性変化について、ジアセチルに反応する嗅覚受容体の同定を行った。その結果、ODR-10は低濃度ジアセチル受容体としてAWA感覚神経で、新たに見つけたSRI-14は高濃度ジアセチル受容体としてASH感覚神経では働いていることを明らかにした。さらに、介在神経AIA、AIY、AIB、AIYにカスパーゼを発現させて神経破壊を起こし、嗜好性変化に対する影響を調べた。その結果、これらの介在神経の働きは低濃度、高濃度の時で違っており、嗅覚神経の下流の神経回路は濃度によって異なることがわかった。1.直前の匂い経験による嗜好性変化の仕組み匂い経験による嗜好性変化に重要な働きをすることがわかったRas-MAPK経路が、下流でどのような機構を制御しているかがわかっていない。そこで、生化学的手法を用いてMAPKが結合するターゲット分子を同定することを試みた。活性化したMAPKが結合する分子を得るために、MEKおよびMAPKの活性化型タンパク質を線虫の神経系に発現させた。この株と野生型でリン酸化タンパク質を取得して比較し、活性化型MAPK発現株で有意に濃くなったバンドを切り出して、質量分析器にかけた。その結果142個のターゲット候補が得られた。MAPKは線虫の嗅覚系において、嗅覚受容、嗜好性変化の両方に機能していることが知られている。まず前者におけるターゲットを同定するために、候補遺伝子の変異体およびRNAiノックダウン株の匂いに対する反応を観察した。その結果異常を示すものとしてclp-7、icd-1、icd-2、vdac-1が得られた。vdac-1は電位依存性チャネルをコードしており、主にミトコンドリアで働いていることは知られているが、嗅覚系における働きは未知である。vdac-1ノックダウン株の嗅覚神経は匂いに対する反応が著しく低下していた。VDAC-1は嗅覚神経のミトコンドリアに局在が見られた。またVDAC-1はRas-MAPK経路の下流で機能していること、MAPKのリン酸化サイトThr175が活性化に重要であることがわかった。2.匂いの濃度による嗜好性変化これまでの解析により、匂いの濃度により働く嗅覚受容体のレパートリーが変化することがわかってきた。線虫は癌の匂いに対して、低濃度では誘引行動を、高濃度では忌避行動を示す(嗜好性変化)。そこで、癌の匂いに対応する嗅覚受容体の探索するために、本年度は1次スクリーニングを行った。得られた候補についてはさらに検証を行う。テーマ1、テーマ2ともに当初の計画通りに進展している部分が多く、さらに新たな展開が見られた。論文発表、学会発表、招待講演については計画以上に行うことができた。1.直前の匂い経験による嗜好性変化の仕組みこれまでの解析により、AIY、AIA介在神経が匂い経験による嗜好性変化に重要であることがわかってきた。さらにAIA神経においてニューロペプチド受容体であるNPR-11が機能していることが明らかとなった。そこでNPR-11のリガンドを探索するために、ニューロペプチドの変異体を用いて嗜好性変化の表現型を観察した。nlp-1、nlp-5、nlp-12、nlp-15、nlp-18、nlp-20、nlp-38について解析したところ、nlp-5、nlp-12、nlp-18変異体が有意に異常を示す結果が得られた。そのうちnlp-5、nlp-18はnpr-11変異体と同様にほとんど嗜好性変化が起こらない強い異常を示したことからリガンドとして働いている可能性が示唆された。2.匂いの濃度による嗜好性変化