hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アクティブソフトウェアの設計検証手法に関する研究

(2)XMLアクセス制御における静的解析法:XMLデータベースにおける要素レベルアクセス制御について,データベースへの問合せがアクセス制御ポリシーに違反しないかどうかを静的に解析する手法を,木オートマトン理論を用いて判定するアルゴリズムを提案した.(1)実行履歴に基づくアクセス制御系の検証法:昨年度我々が提案した実行履歴に基づくアクセス制御系のモデルHBAC(History-Based Access Control)に対し,本年度は検証器の実装を行った.検証器は,与えられたHBACプログラムの実行系列を生成する文脈自由文法(CFG)Gを構成し,Gの生成する言語L(G)が検証性質を表す正則言語L(R)に包含されるかどうかを判定する.単純な実装ではGのサイズがアクセス権の種類に対して指数的となり実用的でない.そこで,(a)Gの開始記号から生成規則によって到達可能な非終端記号のみを幅優先探索で構成する,(b)Gの各非終端記号Aには,Aの表す実行区間の先頭と末尾においてプログラムのもつアクセス権集合が埋め込まれているが,実行区間末尾におけるアクセス権集合を先行計算(部分計算)することにより,構成すべき非終端記号の個数を減らす,という2種の最適化を実装した.これにより,オンラインバンキングシステムをモデル化したHBACプログラムにおいて,アクセス権の総数が24のとき,最適化(a)のみでは検証に約71秒要したのに対して,(a)(b)を共に行うことにより0.24秒に短縮できた.(2)XMLアクセス制御における静的解析法:昨年度に引き続き,XMLデータベースにおける要素レベルアクセス制御について木オートマトン理論を用いて考察した.本年度は我々の問合せモデルがNevenのquery automatonより真に表現能力が大きいことを示した.また,スキーマ変換Φとその入力/出力スキーマにおけるアクセス制御ポリシーPin.Poutが与えられたとき,「Pinによって保護されるデータは,Φによる変換後もPoutによって保護されること」を検証する問題が判定可能であることを示した.(3)内部状態を考慮した信用管理システム:PKI(公開鍵基盤)ディジタル証明書の認証に基づく信用管理システムにおいて,システムの内部状態を考慮した形式モデルならびにそのモデル検査法を提案した.さらに,モデル検査器SPINとPrologを組み合わせた検証法とPrologのみを用いた検証法を実装し,後者の方が検証効率が良いことを実証した.
医薬資源としての持続的利用のためのインドネシア海洋生物調査

日本とインドネシアの天然物化学者を中心とする共同研究チームにより、海綿を中心とする底生海洋生物の調査、採集、調査地域での生物種の分布・生息状況に関する情報を収集するとともに、医薬シーズ資源として利用するための採集試料の抽出物ライブラリーの構築を行った。また、資源の継続的な利用を目的として、採集した生物試料から共棲微生物の分離を行い、それらの培養抽出物ライブラリーを構築した。具体的には、本年度は、ジャワ島西部のパナイタン島周辺を調査地域として、以下の調査研究を実施した。1.パナイタン島周辺のサンゴ礁域をスキューバダイビングにより広範に探索し、底生海洋生物の水中写真、生育状況の調査と50サンプルの生物試料の採集を行った。また、生物試料については抽出エキスとして、その写真とともに整理し、ライブラリー化した。2.作成した抽出エキスについて、生物活性スクリーニング試験を実施するとともに、その成分分析を開始した。さらに生物試料の遺伝子抽出を行うため、試料の一部を保存した。3.生物試料から共棲微生物の分離を行い、65種類の海洋微生物の分離に成功した。また、これら微生物の培養抽出物をライブラリー化するとともに、産生成分の分析を開始した。研究計画通り、日本とインドネシアの共同研究チームにより、底生海洋生物の水中写真の撮影、生息状況の調査、ならびに生物試料の採集を実施した。さらに65種類の共棲微生物の分離にも成功している。また、生物試料の抽出エキスおよび微生物の培養抽出物のライブラリー化を終え、成分分析を開始している。今年度、採集した生物試料および共棲微生物培養物の抽出エキスについて、成分分析を継続して実施する。また、これらの結果と生物活性スクリーニング試験の結果等を合わせて整理を進め、パナイタン島周辺地域の底生海洋生物資源に関するデータベースを構築して行く。
モリブデン,タングステンのポリ酸イオンクラスタ-の抗腫瘍作用

すでに〔NH_3Pr^i〕_6〔Mo_7O_<24>〕・3H_2O(PM8)で代表されるポリモリブデン酸イオンが固形腫瘍に対し強い増植抑制作用を示すことを見い出してきた。本研究はPM8の抗腫瘍メカニズムを検討するため,テラボ蛋白質の構成要素であってNADH→ユビキノンへの電子伝達系キャリアであるフラビン色素との相互作用,及びPM8の腫瘍マウス波の体内分布測定等を検討することによりポリ酸イオンの酸化還元反応に基づく抗腫瘍機構の裏付けを行った。まず,PM8はフラビンモノヌクレオチド(FMN)と1:1の会合体(生成定数8.9×10^3M^<ー1>)を形成し,会合体の還元電位はFMN自身に比べて約100mVだけ正方向にシフトし,電気化学的に可逆の一電子酸化還元反応を示した。会合体の一電子還元過程は,〔Mo_7O_<24>〕^<6ー>成分の一電子還元種〔Mo_7O_<23>(OH)〕^<6ー>(PM17)を生成し強い細胞毒性を示した。PM8を単独に電気化学的に還元してもPM17は生じず2電子還元種のみが不可逆に生成した。次にMM46を移植した腫瘍マウスについても,PM8を投与後PM8の生体内分布を測定した結果,PM8は腫瘍および腎臓に集中し,i・P・投与後約30分でその分布は最大となることが示され,6時間後には殆ど腎臓を通じて尿中に排泄されることが判明した。このような,PM8が腫瘍に集中することは,FMNとの相互作用の結果を合わせて,PM8の酸化還元サイクルが腫瘍細胞内のミトコンドリアフラボ蛋白質上で発現する可能性を明示しておりポリ酸イオンの酸化還元反応による抗腫瘍機構を強く支持している。一方,ポリタングステン酸イオンはポリモリブデン酸に比べ還元電位はより負であり,生体内でのd^1状態の生成が比較的困難である故,多くのポリタングステン酸イオンに抗腫瘍活性が認められないものと推定された。
海綿体神経損傷モデルにおけるオートファジーと神経栄養因子の分子相互作用の解明

本研究でEDモデルでの海綿体神経・陰茎海綿体における神経栄養因子neurturin発現の変化とそれに影響を及ぼす因子としてオートファジー活性と内分泌環境を分析し、勃起能回復低下のメカニズムを解明する。26年度は代表的なオートファジーマーカーであるLC3A-B I/II、BECN1について陰茎の幹部、根部、骨盤神経節での発現をWesternブロッティングにて確認したが、EDモデル、正常モデル、PDE5阻害薬モデルの各検討時期で有意な差を認めなかった。27年度は糖尿病ラットを用いてEDモデルを作成し、オートファジー活性マーカーからヒト色素上皮由来因子(PEDF, Pigment epithelium-derived factor glycoprotein)まで検索範囲を広げて各変化を確認した。Masson Trichrome染色を用いて陰茎海綿体の平滑筋とコラーゲン線維の比を確認したところ有意な平滑筋量維持効果も確認できた。NO活性を評価する目的にeNOS、nNOSの発現を陰茎の幹部、根部、骨盤神経節において確認したところWesternブロッティングにてEDモデル、正常モデル、PDE5阻害薬投与モデルにおいてnNOSのみ骨盤神経節での有意な変化を認めた。また、PEDFは陰茎海綿体において糖尿病モデルでは発言が増強し、PDE5阻害薬によって減弱した。以上よりPDE5阻害薬はPEDFによる虚血性血管新生阻害を抑制し、血管新生を促している可能性が考えられた。この結果は今後、海綿体神経障害後のリハビリテーションにおけるPDE%阻害薬の新しい役割を位置づけるものと考えられた。26年度は糖尿病ラットを用いてEDモデルを作成し、オートファジー活性マーカーの各変化を確認した。新しい海綿体内圧測定機器を用いて正常ラットとEDラットにおける1ヶ月目と2ヶ月目の海綿体内圧が変化することを確認した。PDE5阻害薬を用いた勃起能温存効果も確認したが、1ヶ月、2ヶ月両者で有意な勃起能温存効果を確認した。代表的なオートファジーマーカーであるLC3A-B I/II、BECN1について陰茎の幹部、根部、骨盤神経節での発現をWesternブロッティングにて確認したが、EDモデル、正常モデル、PDE5阻害薬モデルの各検討時期で有意な差を認めなかった。今後、オートファジーの上流遺伝子の変化についても検討を広げていく予定である。勃起能とオートファジーの研究はこれまでにもほとんどなく、研究方法を模索している段階である。次年度はさらに検討方法を他の遺伝子まで広げ、行っていく予定である。今後もオートファジーについて、関連遺伝子の評価をWestern blotting,免疫染色で継続して行っていく。EDモデルも神経損傷モデルの作成によりさらに拡大していく。また、オートファジー関連としてNAD、Sirt-1などミトコンドリア関連遺伝子についても検討を広げていく。
STM/AFMによる層状物質基板上への超微細構造の作製

本研究は、ファンデアワールス・エピタキシ-法によって作製された層状美質超薄膜表面に,走査型トンネル顕微鏡(STM)や原子間力顕微鏡(AFM)を用いて超微細加工を施し,更に加工位置への選択的成長による有機分子や金属原子等の微細構造形成を目指している。本年はまず,加工・選択成長の基板として必要なMoS_2基板上のGaSe薄膜の最適成長条件を求めた。の結果MoS_2基板表面をほぼ完全に覆うGeSe単層膜の形成に成功し,理想的な基板上での加工・選択成長実験が可能となった。次にMoS_2基表面を部分的にGaSe単層膜で覆った基板上そのC_<60>分子の成長実験を行い,基板温度180°C250°C程度の範囲内ではC_<60>分子がMoS_2基板上にのみ成長し,最小で20nm幅程度の超微細C_<60>領域が形成可能であることを見いだした。以上の結果を元に,MoS_2基板上GaSe単層膜を先ずAFMのカンチレバ-を用いて加工し,nmスケールのMoS_2露出領域を形成した後にC_<60>分子の成長を行い,加工した形状通りのC_<60>ナノ構造を形成することを試みた。AFM加工では,最小で幅7.5nm程度の溝を切削し,MoS_2表面を露出することに成功した。そこでC_<60>分子を基板温度180°CでAFM加工表面へ照射したところ,C_<60>分子はGaSe未被履のMoS_2露出領域のみならず,AFM加工により露出したMoS_2表面にも選択成長できることが確認された。現在他の分子,原子の選択成長の実験を進めている。
砕波を伴う大気・海洋相互作用の実験及び格子ボルツマン法による数値解析

大気・海洋界面での運動量・熱・物質の輸送は気象・海象の変化へ強い影響を与える.そのため,海面での交換過程を明らかにし,交換量を正確に見積もることは,気象モデル・海洋モデルの精度を向上する上で重要である.平成16年度は,気・液界面問題へ適用できる2相流の格子ボルツマン法の理論展開,数値モデルの構築を実施した.そして,層流での気流と風波の相互作用を2相流格子ボルツマン法により調べ,風波の発達率を求めた.また,3次元直接数値計算により乱流状態での気流と風波の相互作用を調べた.波齢を変化させ,それぞれについて計算を実施した.そして,風波の発達過程に関する古典力学理論であるMilesの理論の乱流場での適用可能性を検討した.また,風波が気流中の物質輸送へ与える影響を明らかにした.その結果,気流中の物質輸送と運動量輸送に相似性があることがわかった.平成17年度は,気・液界面でのCO_2交換に影響を与える,水面直下の熱対流について,数値実験及び室内実験により調べた.液層表面の冷却により気・液界面直下の液層側に生じる熱対流の乱流構造,及び熱・物質輸送を調べた.そして,水面直下で発達する熱対流の乱流構造を示し,固体壁面上の熱対流との相違を明らかにした.さらに,熱対流に伴う熱・物質輸送を調べ,水面直下で発達する熱対流は固体壁面上のそれと比べて,1.5から2.0倍の熱・物質の混合効果を持つことを示した.その結果,冬期の東シナ海における熱対流によるCO_2交換量は,風速が4-5m/sの状態に匹敵することがわかった.大気・海洋間の運動量・熱・物質(水蒸気)の輸送は異常気象・海象の発達を支配する.そのため,海面での交換過程を明らかにし,交換量を正確に見積もることは,気象モデル・海洋モデルの精度を向上する上で重要である.平成16年度は,気・液界面問題へ適用できる2相流の格子ボルツマン法(LBM)の理論展開,数値モデルの構築を実施した.このモデルの特徴は,これまで2相流LBMでは困難であった密度差が大きい2流体へ適用できることである.この層流での気流と風波の相互作用を2相流格子ボルツマン法により調べ,風波の発達率を求めた.また,3次元直接数値計算により乱流状態での気流と風波の相互作用を調べた.波齢(c/μ_*)を変化させ,それぞれについて計算を実施した.この結果,風波が気流へ与える影響,及び気流中の乱流構造に与える影響は,波齢に依存していることがわかった.また,気流による風波の発達,及び物質交換への影響を明らかにした.平成17年度は,気・液界面でのCO_2交換に影響を与える,水面直下の熱対流について調べる.この現象に3次元直接数値計算を適用することにより,熱対流の乱流構造及び物質輸送過程を明らかにする.また,以上で求めた風波による大気・海洋間での運動量・熱・物質輸送,及び熱対流による物質輸送の素過程についてモデル化を行う.モデル化した大気・海洋相互作用を,気象モデル・海洋モデル・波浪モデルのインターフェースとし,それぞれのモデルをカップリングすることにより,大気・海洋総合モデルを構築する.大気・海洋界面での運動量・熱・物質の輸送は気象・海象の変化へ強い影響を与える.そのため,海面での交換過程を明らかにし,交換量を正確に見積もることは,気象モデル・海洋モデルの精度を向上する上で重要である.平成16年度は,気・液界面問題へ適用できる2相流の格子ボルツマン法の理論展開,数値モデルの構築を実施した.そして,層流での気流と風波の相互作用を2相流格子ボルツマン法により調べ,風波の発達率を求めた.また,3次元直接数値計算により乱流状態での気流と風波の相互作用を調べた.波齢を変化させ,それぞれについて計算を実施した.そして,風波の発達過程に関する古典力学理論であるMilesの理論の乱流場での適用可能性を検討した.また,風波が気流中の物質輸送へ与える影響を明らかにした.その結果,気流中の物質輸送と運動量輸送に相似性があることがわかった.平成17年度は,気・液界面でのCO_2交換に影響を与える,水面直下の熱対流について,数値実験及び室内実験により調べた.液層表面の冷却により気・液界面直下の液層側に生じる熱対流の乱流構造,及び熱・物質輸送を調べた.そして,水面直下で発達する熱対流の乱流構造を示し,固体壁面上の熱対流との相違を明らかにした.さらに,熱対流に伴う熱・物質輸送を調べ,水面直下で発達する熱対流は固体壁面上のそれと比べて,1.5から2.0倍の熱・物質の混合効果を持つことを示した.その結果,冬期の東シナ海における熱対流によるCO_2交換量は,風速が4-5m/sの状態に匹敵することがわかった.
擬一次元白金錯体におけるソリトンの動力学特性に関する分光学的研究

擬一次元白金錯体結晶をレ-ザ-光または紫外光で照射すると、電子・格子結合の強い擬一次元半導体に特有のソリトンまたはポ-ラロンと考えられる、メソスコピックなサイズを持つ価数不整状態が効率的に励起される。もしもソリトンならばそれは単結晶において価数不整ソリトンが生成できる最初の実例であり、学術的にも応用的にも極めて重要である。そこで本研究では高圧顕微赤外線分光とラマン散乱分光に電子スピン共鳴法を併用し、[Pt(en)_2][Pt(en)_2Cl_2](C10_4)_4(en=エチレンジアミン)単結晶中に光誘起される価数不整状態がソリトンであるか否か、そして運動や衝突の過程においてどのようなダイナミックな性質を示すかを総合的に調ベた。顕微分光スペクトルと電子スピン共鳴スペクトルを詳細に検討した結果、光誘起された常磁性価数不整状態は白金原子の二量体構造を持つスピンソリトンであることが証明された。これらのソリトンは単結晶中の任意の場所に生成でき、その大きさはおよそ1nmであることが分かった。極低温では巨視的運動をせず平衡位置の周りで揺らいでいるが、温度の上昇につれて一次元結合上でホッピング運動をし始める。その活性化エネルギ-はおよそ13meVであり、相関速度は室温で10^9sec^<ー1>に達する。また一次元結合間でも移動してゆき、結晶表面から内部へと拡散する。二つのスピンソリトンが衝突しても対消滅を起こさず、非磁性状態との相互変換を通して熱平衡を保つ。高圧顕微分光とラマン散乱分光測定で得られた定量的知見に基づく解析より、この非磁性状態は荷電ソリトンであるとの結論を得た。荷電ソリトンとスピンソリトンのエネルギ-差は高々14mnVと小さいため、100K以上では多くのスピンソリトンが荷電ソリトンに変換される。このように、擬一次元白金錯体におけるソリトンのダイナミックスについての基本的な性質も明らかとなり、本研究の目的をほぼ達成できた。擬一次元白金錯体単結晶におけるソリトン励起分光スペクトルを低温高圧下で測定するために、落射・透過両用の励起光源としてILCを社製高輝度キセノン.イルミネーターシステムを購入し、光ファイバーとコリメーターを用いて既有の赤外線顕微鏡に接続させた。また、アルゴンレーザー光をシングルモード光ファイバーで赤外線顕微鏡の落射鏡筒に導入し、直径10μmのスポット照射を行えるようにした。更にオックスフォード社製液体ヘリウム連続フロー式温度制御装置を購入して赤外線顕微鏡のステージ上で試料を任意の温度に冷却できる光学セルを製作した。この顕微鏡システムを用いて撮影したビデオ画像のコンピューター処理装置も本年度経費により完成させた。このような装置製作と並行して、塩素架橋型白金錯体結晶の光吸収スペクトルに対するレーザー光照射効果の予備実験を行った結果、スポット照射の断続に伴うソリトンの生成・消滅の過渡的変化を実時間スケールで初めて観測することが出来た。また、圧力領域をこれまでの最高である3GPa以上に拡大することを試み、良好なな静水圧性を保ちながらおよそ6GPaにまで上昇させることに成功した。そこで上述の顕微分光装置を用いて光吸収スペクトルとラマン散乱スペクトルを同時に測定したところ、およそ4GPaで両スペクトルに劇的な変化が生じることが見出された。

これは、これまで知られていなかった何らかの高圧相が一次相転移によって圧力と共に結晶内でもザイク状に成長してゆくためと推定された。本年度製作した顕微鏡画像処理装置の立ち上げを兼ねてこの高圧相の体積分率を測定した結果、分光スペクトルの強度と完全な相関のあることが確認され、我々の推定が証明された。以上により、装置製作、予備実験共に本年度の研究目的をほぼ達成できたと思われる。昨年度の予備実験で見出された高圧下での相転移は、ソリトンの生成機構と密接に関連する重要な問題であると思われる。そこでこの点を詳しく調べるために、ダイアモンド・アンビル・セルの圧力領域を最大6GPaまでに拡張し、昨年度製作した赤外線顕微分光装置を用いて光吸収とラマン散乱スペクトルの同時測定を行なった。種々の圧力媒体液を用いて高圧ラマン散乱を精密に測定することにより、相転移圧は室温で3.0±0.1GPaと決定された。偏光顕微鏡下で観察するとこの相転移圧で高圧相の核が発生し、圧力増大と共に高圧相は結晶内でモザイク状に成長してゆく。この相転移の特徴は6GPaにおいても体積比でおよそ30%の低圧相が残存していることである。一次の構造相転移において二相共存圧領域がこのように広範なことは極めて異例である。これはおそらく結晶構造の擬一次元性と強く関連する新しい現象であると思われる。一方、ソリトンによるギャップ内光吸収帯は圧力増大と共に顕著に増大し、相転移圧直下では大気圧下での強度の数十倍にまで増大することが見出された。これより、ソリトンの生成エネルギ-は圧力と共に著しく減少し、相転移点で最小となった後高圧相では不連続的に増大するものと結論された。更に、このソリトンの熱的挙動を調べるために、光誘起電子スピン共鳴の温度依存性を測定したところ、スピンの運動による共鳴線幅の減少を観測することが出来た。これより、ソリトンは15meVの活性化エネルギ-を持って一次元鎖上を拡散運動していることが分かった。擬一次元錯体結晶中のソリトンの運動を実験的に確認出来たのは、これが初めてである。以上により、本年度の研究目的をほぼ達成できたものと思われる。擬一次元白金錯体結晶をレ-ザ-光または紫外光で照射するとメソスコピックなサイズを持つ価数不整状態が効率的に励起される。この状態は電子・格子結合の強い擬一次元半導体に特有のソリトンによるものと我々は考えてきた。しかしながら、これまでの研究で主眼を置いていたギャップ内吸収線の分光スペクトルのみに基づく限り、この状態が単なるポ-ラロンである可能性を完全に否定することができなかった。そこで本年度はこの状態がソリトンか否かという問題の解決に重点を置き、高圧顕微分光やラマン散乱分光に加えて電子スピン共鳴法を併用して[Pt(en)_2][Pt(en)_2Cl_2](C10_4)_4(en=エチレンジアミン)単結晶中に光誘起される価数不整状態のスピン構造と、それらの運動形態や衝突・変換過程などのダイナミックな性質を系統的に調べた。電子スピン共鳴スペクトルに現れる超微細構造と極超微細構造を詳細に検討した結果、低温で光誘起された価数不整状態は白金原子の二量体構造を持つスピンソリトンであることが確認された。これらのソリトンは極低温では巨視的運動をせず平衡位置の周りで揺らいでいるが、温度の上昇につれて一次元結合上でホッピング運動をし始め、その相関速度は室温で10^9 sec^<-1>に達する。
ケーブルの臨界レイノルズ数付近過渡的流れ場の安定化と低抗力化に関する研究

斜張橋の長大化により、斜張橋は設計条件だけではなく動的な特性ともに、特殊な性格を持つようになってきている。特に、風荷重の影響は顕著になり、最近の斜張橋の基本的なプロポーションを構成する多数の斜ケーブル、高い塔、非常にスレンダーな桁の関係から、スパンが伸びるにつれケーブルに対する抗力が桁に対するものを上回るようになり、ケーブルの抗力係数のわずかな変化が斜張橋全体の風荷重に対し大きな影響を与えるようになっている。本研究では、いくつか例が見いだされた抗力が低く、空力的に安定なケーブルについて、最適化を行い、かつ層流剥離と乱流剥離の混合が意図通りであるかを含め、低い抗力をもたらす流体力学的な機構の検討を行った。平成7年度は次の2点からの検討を行った。1)広範囲の風速で低い抗力を示す表面粗度分布の最適化。2)低い抗力をもたらす周辺流れ場からのメカニズムの検討。周辺流場の検討が主たるものとなるが、提案するケーブル表面が一様な粗度をもつものではないこと、また検討対象とする風速が40m/s前後と非常に周辺流を考える風速としては非常に高いこと、さらに時間的に変化する非定常な現象である可能性が高いことを考慮して、主として低抗力ケーブルの最適化を行った。および同時多点圧力計の実験システムへの組み込み、校正を行った。平成8年度は、平成7年度の成果を受けて、試験風洞の改作を行い、より高いレイノルズ数領域での、周辺流場特性並びに抗力特性の検討を実施した。その結果、滑らかな表面を持つ円柱の臨界レイノルズ数にごく近い4×10^5程度の領域まで議論を拡張することができ、前年度の成果をそのまま拡張できることを確認した。本研究では、いくつか例が見いだされた抗力が低く、空力的に安定なケーブルについて、最適化を行い、かつ層流剥離と乱流剥離の混合が意図通りであるかを含め、低い抗力をもたらす流体力学的な機構の検討を行う。周辺流場の検討が主たるものとなるが、提案するケーブル表面が一様な粗度を持つものではないこと、また検討対象とする風速が40m/s前後と非常に周辺流を考える風速としては非常に高いこと、さらに時間的に変化する非定常な現象である可能性が高いことを考慮して、主として抵抗力ケーブルの最適化を行った。および同時多点圧力形の実験システムへの組み込み、校正を行った。平成7年度は、抗力を指標として、ケーブル表面粗度の調整による影響を調べ、平均的流場を議論するために代表的な断面での平均圧力分布を測定した。その結果、粗度の配置による臨界レイノルズ数付近での流れに明確な違いを見いだし、粗度密度を変化させ模様化することでの剥離せん断層のコントロールが可能なことを見いだすことができた。

特に、風荷重の影響は顕著になり、最近の斜張橋の基本的なプロポーションを構成する多数の斜ケーブル、高い塔、非常にスレンダーな桁の関係から、スパンが伸びるにつれケーブルに対する抗力が桁に対するものを上回るようになり、ケーブルの抗力係数のわずかな変化が斜張橋全体の風荷重に対し大きな影響を与えるようになっている。本研究では、いくつか例が見いだされた抗力が低く、空力的に安定なケーブルについて、最適化を行い、かつ層流剥離と乱流剥離の混合が意図通りであるかを含め、低い抗力をもたらす流体力学的な機構の検討を行う。平成8年度は次の2点からの検討を行った。1)広範囲の風速で低い抗力を示す表面粗度分布の最適化。2)低い抗力をもたらす周辺流れ場からのメカニズムの検討。周辺流場の検討が主たるものとなるが、提案するケーブル表面が一様な粗度を持つものではないこと、また検討対象とする風速が40m/s前後と非常に周辺流を考える風速としては非常に高いこと、さらに時間的に変化する非定常な現象である可能性が高いことを考慮して、主として抵抗力ケーブルの最適化を行った。および同時多点圧力計の実験システムへの組み込み、校正を行った。平成8年度は、平成7年度の成果を受けて、試験風洞の改作を行い、より高レイノルズ数領域での、周辺流場特性並びに抗力特性の検討を実施した。その結果、滑らかな表面を持つ円柱の臨界レイノルズ数にごく近い4×10^5程度の領域まで議論を拡張することができ、前年度の成果をそのまま拡張できることを確認した。
WT1ペプチドワクチンを中心とした悪性神経膠腫幹細胞標的療法の探索

悪性神経膠腫における治療抵抗性および腫瘍幹細胞の免疫逃避現象を解明するために、ALCAM knock down株、sALCAMの強制発現株を作成し、それを免疫不全マウスの脳内に移植し、mouse xenograft modelの作成を確立した。また、ルシフェラーゼ遺伝子導入WT1過剰発現細胞株細胞株(GL261-WT1-Luc)を作成し、生体での免疫療法効果判定が可能なマウスグリオーマモデルを作成し動物実験における免疫療法研究を確立にした。腫瘍幹細胞とWT1発現との関係を明らかにするため、成人および小児の悪性脳腫瘍、特に神経膠腫における病理組織学的検討、悪性神経膠腫幹細胞分画におけるWT1発現解析とALCAM/WT1の関係を確認したところ、腫瘍幹細胞成分にもWT1蛋白は多く発現していた。また、WT1療法前後の脳腫瘍組織内解析により、PD-1、PD-L1の発現に有意差は認めなかったが、TGFβの発現増加、CD4陽性Tリンパ球の低下および腫瘍細胞のHLA class I分子発現の低下を認めた。また、腫瘍血管正常化因子と免疫療法の併用が、腫瘍内リンパ球浸潤を増加させ腫瘍抑制効果を増強させた。これらの知見を基に、WT1免疫療法に分子標的治療、免疫チェックポイント阻害剤やTGFβ阻害剤など他の免疫療法を併用することにより、免疫逃避現象を克服し、より高い腫瘍抑制効果を期待できる可能性が考えられた。さらに、腫瘍幹細胞成分への影響とその周囲の免疫反応を検証することにより免疫逃避機構の一端を明らかにできる可能性が示唆された。また、悪性神経膠腫での網羅的な遺伝子解析では、予後に影響する分子マーカーなどによる分子分類の手法が確立してきている。免疫応答関連遺伝子発現との関係を調査し、次年度からの研究において、複合的免疫療法およびメーラーメイドな免疫療法の開発を目的として研究を進めていく予定である。悪性神経膠腫における治療抵抗性の一因と考えられる腫瘍幹細胞の新たなマーカーとして細胞表面抗原ALCAM(Activated leukocyte cell adhesion molecule)を同定し、その機能的役割(浸潤、血管新生、免疫応答)を検討してきた。また、悪性神経膠腫に対する新たな免疫療法として、脳腫瘍におけるWT1の役割解明とともに、WT1ペプチドワクチン療法の安全性と有効性についての検討を行ってきたが、初発神経膠芽腫に対してテモダール併用WT1ペプチドワクチン療法の安全性と有効性を報告した(Hashimoto N et al. Cancer Immunol Immunother. 2015)。また、WT1ペプチドワクチンの効果と相関する指標として、WT1ペプチドに対する特異的IgG抗体の産生が良好な予後に関係していることを証明した(Oji Y et al. Int J Cancer. in press)。さらに、腫瘍細胞株や臨床検体の初代培養などを用いた細胞生物学的な実験、確立された動物モデルの作成などを確立させた。さらに、悪性神経膠腫における新たな腫瘍幹細胞マーカー候補としてのALCAM発現の意義、ALCAM発現と腫瘍発生母地、再発形態と関係していることを学会などで発表してきており、論文作成中の段階である。次に、神経膠腫内のALCAM発現と腫瘍内免疫担当細胞の関係について解析を行っており、近く学会および論文にて発表予定である。また、神経膠芽腫の病理組織標本を用いて、腫瘍幹細胞と微小血管増生との因果関係を明らかにするために解析を行った。また、神経膠芽腫の分子マーカーとして、MGMTメチル化、IDH1/2、1p/19q LOH、TP53、TERT、H3F3Aなどとの因果関係を解析し、学会などで発表予定である。また、また、WT1ペプチドワクチン療法の腫瘍幹細胞標的性の確認、網羅的な免疫応答関連遺伝子発現のクラスター解析およびALCAMの発現と腫瘍免疫との関係については検討中の段階である。上記理由により、当初の計画よりやや異なるが、進捗状況は概ね順調と考えている。ALCAM knock downの細胞及びsALCAMの強制発現株を作成し、それを免疫不全マウスの脳内に移植し、mouse xenograft modelの作成を確立している。次に、ALCAM発現と治療抵抗性の検討を行うために、抗がん剤や放射線照射の影響について検討している。また、腫瘍幹細胞とWT1発現との関係を明らかにするため、WT1ペプチドワクチン療法の腫瘍幹細胞標的性を確認している。悪性神経膠腫幹細胞分画におけるWT1発現解析とALCAM/WT1の関係、およびALCAM/WT1発現とimmune activatorおよびimmunosuppressorとの関係を明らかにしており、治療抵抗性との関連について解析中である。また、網羅的な免疫応答関連遺伝子発現のクラスター解析にてALCAMの発現が腫瘍免疫に及ぼす影響について解析する。

さらに、上記の免疫応答とTGCAの分子遺伝学的な神経膠腫の分類との関係性を明らかにすることで、新たな治療反応性因子の同定を行っている。このように、平成28年に得られた治療抵抗性、腫瘍内免疫応答に与える影響などの知見を基に、症例数の蓄積を図り、WT1ペプチドワクチン療法のモデルを確立し、ALCAMがWT1ペプチドワクチン療法での治療反応性に与える影響、腫瘍幹細胞に対する分子標的治療とWT1ペプチドワクチン療法併用の効果について検証していく予定である。平成27年から28年にかけて、悪性神経膠腫幹細胞分画におけるWT1発現解析とALCAM/WT1の関係、およびALCAM/WT1発現とimmune activatorおよびimmunosuppressorとの関係を明らかにした。さらに、平成28年は症例数の蓄積を図り、mouse xenograft modelおよびマウスグリオーマモデルを作成し、WT1ペプチドワクチン療法のモデルを確立しようとしている。悪性神経膠腫における治療抵抗性および腫瘍幹細胞の免疫逃避現象を解明するために、ALCAM knock downの細胞及びsALCAMの強制発現株を作成し、それを免疫不全マウスの脳内に移植し、mouse xenograft modelの作成を確立している。次に、ALCAM発現と治療抵抗性の検討を行うために、抗がん剤や放射線照射の影響について検討している。また、腫瘍幹細胞とWT1発現との関係を明らかにするため、WT1ペプチドワクチン療法の腫瘍幹細胞標的性を確認している。悪性神経膠腫幹細胞分画におけるWT1発現解析とALCAM/WT1の関係、およびALCAM/WT1発現とimmune activatorおよびimmunosuppressorとの関係を明らかにしており、治療抵抗性との関連について解析中である。また、網羅的な免疫応答関連遺伝子発現のクラスター解析にてALCAMの発現が腫瘍免疫に及ぼす影響について解析する。さらに、平成28から29年にかけては症例数の蓄積を図り、mouse xenograft modelおよびマウスグリオーマモデルを作成し、WT1ペプチドワクチン療法のモデルを確立しようとしている。
2D画像を用いて3D的に耳介を認証する捜査支援システム

本研究の特色は,生体認証にその有用性にもかかわらず研究が進んでいない「耳介」を用いることにある。耳介のパターンは個人により異なりかつ,指紋や虹彩より大きいため,機器への接触なしに遠くから個人を識別できる利点がある。申請者はGabor Jetや判別分析等を利用し首を左右に振る,ないしは傾けたときに生じる耳介の角度変化にロバストな耳介認証の研究を行ってきた。この研究を発展させ,下記4項目1.撮影角度が異なる画像の推定手法改良によるロバスト性向上の可能性2.耳介の撮影角度を推定するアルゴリズム3.耳介の検出・特徴点探索手法の改良によるロバスト性向上の可能性4.耳介特徴点の発生異常や事故での欠落,髪の毛や耳介自身による遮蔽を自動的に判断するアルゴリズムについて検討し,防犯カメラの耳介画像から捜査対象者リストを作成する捜査支援システムの実用化を研究目的としている。交付申請書では具体的内容として,「1-(a)法線を立てる特徴点の検討」,「1-(b)法線モデルの計算方法,数の検討」,「1-(c)漸近展開精度向上の検討」,「1-(d)耳介データベースの大規模化の検討」,「1-(e)特徴量強調方法の検討」,「2-(a)入力画像中の耳介角度を推定する手法の検討」,「2-(b)耳介の張り出し角度の統計的調査検討」,「3-(a)特徴点抽出の改良」,「4-(a)特徴点の有効性の自動判断」の9項目を調査研究対象としていた。この9項目のうち1-(a),1-(b),1-(d),3-(a),4-(a)の5項目について研究に具体的な進展があり,3件の国内学会発表(内1件2019年度発表確定)と,2件の国際会議発表と1件の学術論文(印刷中)を公表した。本研究の特色は,生体認証にその有用性にもかかわらず研究が進んでいない「耳介」を用いることにある.耳介のパターンは個人により異なりかつ,指紋や虹彩より大きいため,機器への接触なしに遠くから個人を識別できる利点がある.申請者はGabor Jetや判別分析等を利用し首を左右に振る,ないしは傾けたときに生じる耳介の角度変化にロバストな耳介認証の研究を行ってきた.この研究を発展させ,下記4項目1.撮影角度が異なる画像の推定手法改良によるロバスト性向上の可能性2.耳介の撮影角度を推定するアルゴリズム3.耳介の検出・特徴点探索手法の改良によるロバスト性向上の可能性4.耳介特徴点の発生異常や事故での欠落,髪の毛や耳介自身による遮蔽を自動的に判断するアルゴリズムについて検討し,防犯カメラの耳介画像から捜査対象者リストを作成する捜査支援システムの実用化を研究目的としている.交付申請書では,1,2年次に研究の目的に挙げた4項目のうち認証精度改善に関係する項目1,2の研究を,3年次に概ね検出精度改善に関係する項目3,4をしていた.そして1,2年次研究の具体的内容として,「1-(a)法線を立てる特徴点の検討」,「1-(b)法線モデルの計算方法,数の検討」,「1-(c)漸近展開精度向上の検討」,「1-(d)耳介データベースの大規模化の検討」,「1-(e)特徴量強調方法の検討」,「2-(a)入力画像中の耳介角度を推定する手法の検討」,「2-(b)耳介の張り出し角度の統計的調査検討」の7項目を調査研究対象としていた.この7項目のうち1-(c),1-(e), 2-(a),2-(b)の3項目について研究に具体的な進展があり,平成27年度8件の学会発表(内3件国際会議)と2件の技術報告と2件の国際会議論文を公表した.交付申請書で最初の2年間に研究する旨記載した7項目のうち3項目に進展があり,研究はおおむね順調に進展している.以下、各項目の進展を具体的に記載する.1-(c)漸近展開精度の検討:研究代表者らはGabor特徴が特徴点周辺に局所化されていることに着目し,姿勢の異なる画像のGabor変換の積分核を漸近展開し,異なる姿勢のGabor特徴間の1次対応関係を求めている(渡部他,映情学誌,65,7,1016-1023,2011).そこで、さらに対応関係の次数を上げると認証精度が上がるか検討した.本手法の類似手法となる重回帰において精度を比較したところ,サンプル数がGabor特徴の成分の数より十分多い場合は2次対応のほうが高精度であることが分かった.2-(a)入力画像中の耳介角度を推定する手法の検討:研究代表者らはこれまで様々な撮影角度のデータをあらかじめ作成しておくことで撮影角度が未知の入力画像に対応してきた.しかし,もし撮影角度がわかれば角度の異なる数多くのデータと比較しないで済むのでより精度向上が図れ,大量の作成データを検索しなくてよいので高速化も図れる.本年度は耳介の周辺画像のGabor特徴を利用して耳介の撮影角度を推定する手法の開発を試み,推定した角度を利用して認証実験をした.撮影角度の推定精度は大分検討の余地があるにも関わらず認証精度は研究代表者らの従来手法に近い精度があることが分かり,撮影角度を推定し登録画像の撮影角度に補正する方針の有望性が確認できた.2-(b)耳介の張り出し角度の統計的調査

検討:HOIPデータベースの300人600耳介中,耳介特徴点が全て見える耳介の張り出し角度は統計的に60°程度であることが研究代表者らの研究でわかっている.今回新たにUND collection J2 415人830耳介で調査したところ角度はやはり約60°であることが分かった.本研究の特色は,生体認証にその有用性にもかかわらず研究が進んでいない「耳介」を用いることにある.耳介のパターンは個人により異なりかつ,指紋や虹彩より大きいため,機器への接触なしに遠くから個人を識別できる利点がある.申請者はGabor Jetや判別分析等を利用し首を左右に振る,ないしは傾けたときに生じる耳介の角度変化にロバストな耳介認証の研究を行ってきた.この研究を発展させ,下記4項目1.撮影角度が異なる画像の推定手法改良によるロバスト性向上の可能性2.耳介の撮影角度を推定するアルゴリズム3.耳介の検出・特徴点探索手法の改良によるロバスト性向上の可能性4.耳介特徴点の発生異常や事故での欠落,髪の毛や耳介自身による遮蔽を自動的に判断するアルゴリズムについて検討し,防犯カメラの耳介画像から捜査対象者リストを作成する捜査支援システムの実用化を研究目的としている.交付申請書では,1,2年次に研究目的に挙げた4項目のうち認証精度改善に関係する項目1,2を,3年次に概ね検出精度改善に関係する項目3,4の研究を計画していた.そして1,2年次研究の具体的内容として,「1-(a)法線を立てる特徴点の検討」,「1-(b)法線モデルの計算方法,数の検討」,「1-(c)漸近展開精度向上の検討」,「1-(d)耳介データベースの大規模化の検討」,「1-(e)特徴量強調方法の検討」,「2-(a)入力画像中の耳介角度を推定する手法の検討」,「2-(b)耳介の張り出し角度の統計的調査検討」の7項目を調査研究対象としていた.この7項目のうち1-(a),1-(e) , 2-(a)の3項目について研究に具体的な進展があり,昨年度5件の学会発表(内1件国際会議)と1件の技術報告と1件の学術論文を公表した.1-(e)特徴量強調方法の検討:特徴量の個人差を上げられれば識別精度が上がり有益である.本年度は撮影角度に応じてGabor関数自体を変形することで識別精度が上げられることを明らかにし,学術論文として発表した.2-(a)入力画像中の耳介角度を推定する手法の検討:被疑者が後ろから撮影されていて顔は判別できないが耳介は明瞭に映っている場合に,耳介画像が犯罪捜査へ利用されることがある.しかし,これらの耳介画像の照合精度は現状ではあまり高くない.その理由は,耳介の張り出し角度の個人差が大きく,背後からの撮影でも明瞭に耳介が観察される人物がある一方で,特徴点が明瞭に捉えられない人物が多く混在するためである.もし耳介角度正規化の方法が明らかになれば,背後からでも明瞭に撮影されている耳介は照合可能になるので,防犯上大変有益である.本年度は,昨年度に引き続き耳介の周辺画像のGabor特徴を利用して,耳介の撮影角度を推定する手法の開発を試みた.PCAを利用することで撮影角度の推定精度を昨年度の精度から20%改善できることを明らかにし,国際会議で発表した.1-(a)特徴点の検討:3次元点群特徴量であるSHOTによる耳介認証を検討した.SHOTでは特徴点(キーポイント)は3次元座標系において構成したボクセルグリッドの重心に定める.この点は点群の撮影角度によって変わりうる.本年度はUNDデータベースを利用して,撮影角度の異なる耳介点群間で照合実験を行った.結果,照合精度は同じ撮影角度の点群に比べごくわずか(2%)程度しか下がらないことを確認した.
AIDSウイルスに対する新受容体の構造・機能からの新しい原理による治療薬の開発

エイズウイルス(HIV)は人Tリンパ球膜上のCD4レセプタ-に結合するが、ウイルスによる膜融合と細胞内侵入プロセスにはCD4とは別の細胞膜蛋白の関与が推定されていた。我々はHIVの外膜糖蛋白gp120のV3領域と特異的に結合するCD4とは別の人Tリンパ球膜蛋白TryptaseTL_2を見出した。V3領域はウイルスの細胞性トロピズムの決定や膜融合に関与し、この部位に対する抗体は強いウイルス中和活性を持つことから、HIVの感染機序の解明と、HIVの治療の面から注目されている領域である。本研究ではV3領域とTryptase TL_2との特異的結合を阻止することによる、HIVの治療薬の開発を試みてきた。1つはTryptase TL_2のプロテア-ゼ作用を、プロテア-ゼインヒビタ-で抑制することにより、HIVの初期感染を阻止する試みである。そのため両者の結合を阻害するプロテア-ゼインヒビタ-がスクリ-ニングされ、Kunitz型インヒビタ-のトリブスタチンが有効であることが判明した。現在トリプスタチンの大腸菌による発現系の作成と、Tryptase TL_2との結合部位の解析による低分子ペプチド性インヒビタ-のドラックデザインを行っている。またV3領域とTryptase TL_2との結合は、抗HIV活性を持つデキストラン硫酸でも抑制されることから、種々の誘導体の結合阻止能と抗HIV作用の相関関係を追求している。第二はV3領域と結合するTryptase TL_2の32kDaサブユニットに対する抗体を利用した治療薬開発の試みである。この抗体はHIVによるT細胞の膜融合を著明に抑制した。V3領域は高度可変域であるが、種々のHIV株のV3は共通してTryptase TL_2に結合することから、HIVの変異に影響されることなく、治療効果が期待された。今後この抗体の抗HIV活性を詳細に検討すると同時に、モデル動物を使った有効性の検定を進めてゆく。エイズウイルス(HIV)が人T_4^+リンパ球やマクロテァ-ジに感染するさいに、これらの細胞の膜上に局在するCD4受容体だけでは感染が成立しないこと、さらにCD4受容体によらない感染機構が存在することが判明し、CD4以外の受容体の発見に多くの努力がなされている。我々は世界に先がけてHIVの外膜蛋白gp120と特異的に結合するCD4とは別の受容体の精製に成功した。この受容体は、gp120のV3領域のKunitz型インヒビタ-ドメインと特異的に結合するセリン・プロテア-ゼで、32KDaの二量体と28KDaの四量体からなる分子量198KDaの膜局在プロテア-ゼであることが判明し、これをトリプタ-ゼTL_2と命名した。32KDaのサブユニットは細胞膜の外膜に露出し、28KDaのサブユニットは膜の中に局在すると思われる。gp120のV3領域は、HIVが細胞に侵入するさいの膜融合活性を示す部位であるばかりでなく、この領域を抗原とする抗体が強いHIV中和能力を示すことからHIVの感染機序の解明と、免疫療法の開発の上で最も注目されている領域である。従ってこのV3領域を特異的に認識して結合するトリプタ-ゼTL_2は、HIVの細胞侵入プロセスに深くかかわっていることが推定される。現在両サブユニットの一次構造の解析が進行中である。

また我々はトリプタ-ゼTL_2と特異的に結合し、HIVによる合胞体形成を強く抑制するKunitz型プロテア-ゼインヒビタ-のトリプスタチンの大腸菌による発現系を作成している。この計画は現在進行中であるが、大腸菌により精製されたリコンビナントトリプスタチンが正しくRefoldingしないために今までのところ活性を持たない。これはトリプスタチン内部でのSーS結合が天然型と同じように結合していないためで、Refoldのための種々の試みを行っている。我々はCD4レセプタ-とは異なる新しいAIDSウイルスレセプタ-、Tryptase TL_2を見出しこのレセプタ-の機能を抑制することによるAIDSウイルスへの新治療薬の開発を試みてきた。これまでの研究により、人Tリンパ球の膜上に存在するTryptase TL_2はその32kDaサブユニットを介して、人免疫不全ウイルス(HIV)の外膜糖蛋白gp120のV3領域と特異的に結合することが解明された。さらにこの両者の結合はV3領域に対する抗体や、Tryptase TL_2のプロテア-ゼ作用を阻害するKunitz型インヒビタ-で阻害されることを明らかにした。平成3年度ではgp120のV3領域とTryptase TL_2との結合の様式をさらに詳細に検討した。その結果両者の結合の解離定数は、3.8×10^<-8>Mと計算され生理的に意味のある強い親和性が確認された。またこれまで検討してきた両者の結合を阻害する物質の他に、強い抗HIV活性の報告されているデキストラン硫酸の誘導体もTryptase TL_2とgp120との結合を阻害することが判明した。さらにこれらの阻害剤はHIVによるTリンパ球の膜融合も抑制した。現在これら阻害剤の中で著明な効果を示した阻害剤の一つ、トリプスタチンのDNAクロ-ニングと、その大腸菌での発現を試みている。もう1つの有望な阻害剤は、Tryptase TL_2の32kDaに対する抗体を利用したワクチン開発の可能性である。HIVはたえずその変異株を作り抗原性を変化させるが、Tryptase TL_2との結合性はよく保たれていることが確認されている。このことはHIVの変異に影響されないレセプタ-に対する抗体を作ることで、HIVの治療が可能であることを示している。現在CD4レセプタ-とは異なる新しいレセプタ-、Tryptase TL_2に対するモノクロ-ン抗体の作成と、このレセプタ-のプロテア-ゼ機能を抑制するTrypstatinを大腸菌に発現させ、大量精製するシステムの確立を急いでいる。
アンカリングプロテインに制御されたA-キナーゼによるイオン輸送担体の機能調節

1.ラット3大唾液腺(顎下腺,耳下腺,舌下腺)のAKAP-150およびA-キナーゼのRII調節サブユニットの発現量を調べると耳下腺に顕著であった。2.3大唾液腺から得た細胞膜にcAMPを添加すると,耳下腺のNa^-,K^+-ATPaseのリン酸化が顕著に認められた。よって,AKAP/PKA複合体によるNa^+,K^+-ATPaseのリン酸化機構は3大唾液腺では耳下腺に特徴的であることを明らかにした。1.Na^+/K^+/2Cl^-共輸送体の機能調節に関与するN-末端部分のリン酸化はPKAによって直接リン酸化されると考えられてきたが,in vitroの系で直接PKAを作用させても,N-末端部分はリン酸化されなかった。2.パーメアビライズした耳下腺遊離細胞にcAMPを添加し,細胞内でPKAを活性化するとN-末端のリン酸化が認められた。したがって,N-末端はPKAをトリガーとするリン酸化カスケードによってリン酸化されることを明らかにした。3.Na^+K^+/2Cl^-共輸送体の機能調節に関与するリン酸化部位と予想される合成ペプチドを添加し,競合的にリン酸化を阻害した結果,イオン輸送担体の機能はN-末端部分のThr-208のリン酸化によって調節されることを明らかにした。4.Na^+/K^+/2Cl^-共輸送体のクローニングに取り組み,トランスフェクトされたE.coliを得ることができた。Thr-203,Thr-208,Thr-221にあたる部分をA1aに変異させたプラスミドを作製し,これらのプラスミドを発現ベクターに挿入し,宿主細胞に組み込む準備を整えることができた。ラット耳下腺から得た遊離細胞を放射性無機リンで標識後,βアドレナリン受容体を刺激すると,Na^+,K^+,2Cl^-の共輸送活性およびブメタナイドの結合量を調節するN-末端部分のリン酸化が同時に促進されることを報告してきた(Am. J. Physiol.(Cell Physiol.)277:C1184-C1193,1999)。このリン酸化はこれまでPKAによって直接リン酸化されると考えられてきたが,in vitroの系でNa^+-K^+-2Cl^-cotransporにPKAを直接作用させると,N-末端部分のリン酸化は全く認められず,Na^+,K^+,2Cl^-の共輸送活性およびブメタナイドの結合量も全く変化しなかった。したがって,PKAによって直接リン酸化されるリン酸化部分は機能に関与しないことが示唆された。一方,遊離細胞をジギトニンでパーメアビライズした遊離細胞にcAMPを添加し,受容体を介さず直接PKAを活性化すると,機能調節に関与するN-末端のリン酸化が認められた。したがって,Na^+-K^+-2Cl^-cotransporterterの機能調節に関与するリン酸化部位はPKAによって活性化されるPKA依存性のリン酸化カスケードによってリン酸化されることを明らかにでき,今年度Am.J. Physiol.(Cell Physiol.)282:C817-C823,2002を報告できた。遊離細胞をジギトニンでパーメアビライズした実験系に,機能調節に関与するリン酸化部位を予想し,そのアミノ酸配列を含む種々の合成ペプチドを添加し,競合的にリン酸化を阻害した結果,Thr184-202を含む合成ペプチドによってN-末端のリン酸化が抑制される傾向を得た。以上より,これらのThrのいずれかが機能調節に関与するリン酸化部位と考えられる。

さらに詳細な検討を続けたい。ラット耳下腺のNa^+-K^+-2Cl^-共輸送体の機能を調節するリン酸化部位はPKAによって活性化されるカスケードによってリン酸化されることを報告してきた(Am.J.Physiol.,2002)。今年度,機能を調節するリン酸化部位のアミノ酸配列を含む種々の合成ペプチドによって競合的にリン酸化を阻害した結果等を含め,日本唾液腺学会誌(2003)の総説をまとめることができた。一方,共輸送体をリン酸化するカスケードを活性化するPKAはアンカリングプロテインによって膜に固定されている可能性が考えられる。このアンカリングプロテインとPKAの複合体を詳細に調べた。耳下腺の基底側膜にcAMPを添加すると,膜由来のA-キナーゼ(PKA)によって膜蛋白質がリン酸化された。耳下腺に発現しているアンカリングプロテインのmRNA,蛋白質を調べた結果,AKAP-150サブタイプが検出された。PKAのRII調節サブユニットは基底側膜でAKA-150と複合体を形成して機能していた。AKAP/PKA複合体のマーカーとなる膜結合型PKAのRII調節サブユニットは耳下腺に顕著に存在したが,顎下腺,舌下腺では顕著でないことから,3大唾液腺では耳下腺に特徴的なリン酸化機構と推測される。Na^+-K^+-2Cl^-共輸送体やNa^+-K^+-ATPaseを含む唾液腺のイオン輸送担体の機能を調節するリン酸化に,アンカリングプロテインによって膜に結合したPKAが多大に関与していると考えられた。以上の結果を図書Recent Research Developments in Biochemistry (2003), The New York Academy of Sciences (2003),原著論文Biochemical Pharmacology (2003)に掲載できた。イオン輸送担体(Na/K/2C1共輸送体,NKCC1)の機能はN-末端部分の複数のリン酸化部位のうち,^<208>Thrのリン酸化によって調節される可能性を明らかにしてきた。この結果は遺伝子の変異部位をピンポイントに絞るための重要な結果である。よって,イオン輸送担体の機能調節を分子レベルでの検討に進めることができた。イオン輸送担体の機能調節部分を変異させ,宿主細胞に過剰発現させ,機能の変化を調べるために蛋白質翻訳部分のクローニングに取り組んだ。ラット耳下腺からtotal RNAsを採取し,高活性逆転写酵素で全長cDNAsを作った。これらのcDNAsを鋳型にし,目的とするイオン輸送担体の全長cDNAsを作成した。塩基配列の5'側にCACCの4塩基を付加した読み出し部分(ATG---)のフォワードプライマーおよびストップコドンを含むリバースプライマーを用いて,3700bpのイオン輸送担体のORF部分を高活性,高精度のポリメラーゼを用いて増幅した。増幅産物が電気泳動で単一シグナルであること,およびDNAシークエンサーで正しい塩基配列であることを確認した。TOPOクロナーゼ反応でイオン輸送担体のcDNAを含むTOPOpENTRベクター作成し,コンピテント細胞へ,ヒートショックでトランスフェクトした。目的の遺伝子が導入されたE.coliのコロニーをPCRで検索し,トランスフェクトされたE.coliの3つのコロニーを得た。