hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
N次創作支援のための創作予測モデルを用いた派生誘発要因推定

本年度は、派生創作活動におけるクリエータ間のコラボレーションを分析し、AAAI ICWSM 2018にて「Collaboration in N-th Order Derivative Creation」というタイトルで発表した。派生創作活動の中で2万人以上のクリエータが制作した8万件以上のコラボレーション動画を対象として、コラボレーション活動が動画の人気度とクリエータの活動に与える影響を分析した。分析の結果、コラボレーションにより創作された動画は一人のクリエータが単独で創作した動画よりも再生数が多くなる傾向にあることや、コラボレーションを経験したクリエータは未経験のクリエータよりもクリエータとしての活動期間が長くなる傾向にあることなどを明らかにした。また、ユーザ生成コンテンツの推薦に関する研究に取り組み、ACM SIGIR 2019に「ABCPRec: Adaptively Bridging Consumer and Producer Roles for User-Generated Content Recommendation」というタイトルで採択された。ユーザ生成コンテンツを扱うWebサービス上では、一人のユーザが消費者としての役割と創作者としての役割の両方を持つことがある。コンテンツ推薦を行う既存モデルの大半は,ユーザの消費者としての役割しか考慮しておらず、推薦精度の改善のためにこれら二つの役割をどのように活用できるかは十分に検討されてこなかった。そこで本研究では、各ユーザの消費者・創作者それぞれの性質の類似度に基づいて適応的に二つの役割を対応づけることで、ユーザの消費者・創作者としての特徴をより柔軟に学習し、コンテンツのより高い精度での推薦を可能にした。二種類のデータセットを用いて推薦精度の評価実験を行い、提案手法が比較手法を統計的に有意に上回ることを示した。本年度は、派生コンテンツの創作要因を推定するモデルを元に開発・公開したWebサービス「Songrium派生要因分析」のインタフェースの有用性を議論し、その成果がIF付き論文誌IEICE Transactions on Information and Systemsに採択された。公開したWebサービスでは、N次創作活動におけるオリジナルコンテンツの特性の可視化、オリジナルコンテンツから派生コンテンツが創作される過程の可視化、クリエータが3つの各要因から受けた影響の大きさの可視化などの機能を提供する。動画コンテンツの探索や視聴をする際に、これまでは明らかではなかった、派生コンテンツ間の関係やクリエータの特性を可視化することで、ユーザやクリエータの新たなコンテンツとの出会いやN次創作現象のより深い理解の支援を実現した。また、派生創作活動のより基礎的な分析を行うため、派生創作活動におけるクリエータ間のコラボレーションを分析し、ARG第11回Webインテリジェンスとインタラクション研究会(WI2)にて発表した。具体的には、コラボレーションが動画の視聴のされ方に与える影響、コラボレーションがクリエータのアクティビティに与える影響、コラボレーション関係に基づくクリエータの特性、の3つの観点から分析を行った。分析の結果、コラボレーションによって制作された動画は再生数がより多くなること、コラボレーション動画を制作したクリエータはより長い期間N次創作活動を行うこと、コラボレーションをしたクリエータのペアの25%以上は複数回のコラボレーションをしており、コラボレーションには一定の継続性があることなどが明らかにした。その成果から、萌芽研究賞を受賞した。派生コンテンツの創作要因を推定するモデルを元に開発・公開したWebサービス「Songrium派生要因分析」では、サービスを公開しただけでなく、コンテンツを視聴するユーザ、コンテンツを創作するクリエータの双方にとって、サービスを利用することでどのような有益性があるかを整理し、英文論文誌に採択された点から、おおむね順調に進展している。派生創作活動におけるクリエータ間のコラボレーションの分析に関する研究は、当初の計画には含まれていなかったが、派生創作活動をより深く理解するうえで重要な研究テーマであると判断し取り組んだ。その成果はすでに国内会議において発表しており、新規性の高さと結果の有用性から萌芽研究賞も受賞した。以上の点から、当初の計画以上に進展している。創作支援のためのコンテンツ検索に取り組む予定である。

クリエータが派生コンテンツの創作のために、その元となるコンテンツを検索する際、再生数などの尺度だけではクリエータが意思決定をするうえで不十分である。提案する尺度のひとつとして、派生コンテンツの創作に与えた影響力の大きさが考えられる。コンテンツAの影響で派生コンテンツBが、Bの影響で派生コンテンツCが創作されているような場合、Aの影響力はBだけでなくCにも及んでおり、単純な親子関係を超えた再帰的な影響力の計算など、N次創作特有の課題に取り組む必要がある。複数の検索尺度を提案しながら、クリエータにとって有用なコンテンツ検索を実現する。研究開発用のPCを購入する予定であったが、当初の研究計画とは異なる研究テーマに取り組んだことから、本年度は高いスペックのPCを購入する必要がなくなり、次年度使用額が生じた。次年度は、大規模データを用いた分析を行う予定であるため、研究開発用PCの購入に使用する。
スピネル型酸化物および有機無機交互積層人工格子薄膜の作製およびその光誘起磁化

PLD (Pulsed-Laser-Deposition)法を用いて、非平衡系で酸化物と炭化物の交互積層を行うことにより、酸化物(MgO)-炭化物(TiC)交互積層人工格子の作製に成功した。X線回折測定から、明確な超格子ピークおよびサテライトピークが観測され、予想周期構造が実現しているものと考えられる。また、SIMS(2次イオン質量分析)測定においても、MgO層とTiC層が交互に積層していることが確認できた。さらに断面TEM観察により、より直接的に、積層構造を確認するとともに、TEDパターンから、TiC層とMgO層が互いにエピタキシャル成長していることも確認できた。現時点では各原子層数が(5:5)程度の人工格子作製に成功している。酸化物-炭化物の原子レベルでのエピタキシャル交互積層構造は初めてのものであり、今後様々な物質の組合せでの交互積層人工超格子作製の可能性を示唆するものである。また、2重交換相互作用により室温近辺で絶縁体-金属転移を伴って強磁性転移を示す、(La,Ba)MnO_3を、PLD法により薄膜化し、光照射による磁化変化に関する研究を行なった。基板として用いたSrTiO_3は、バンドギャップが3.2eVであることから、光源としてXeランプの紫外部分、もしくはGaNによる半導体レーザーを用いた。光照射による磁化および強磁性転移温度を、SQUID磁化測定および磁気光学Kerr効果により測定した。STO基板内において生じたホールが光起電力によりLBMO中へ注入され、LBMO内のキャリア数が増加することにより、強磁性転移温度が変化することが予測できる。熱平衡系において、酸化物-炭化物複合材料の作製は困難である。それは、酸化物炭化物の共存状態に比べ、酸化物あるいは炭化物が単独で存在するほうが熱力学的ポテンシャルが低いことに起因し、そのため酸化雰囲気中ではしばしば炭化物は酸化されてしまう。本研究ではPLD(Pulsed-Laser-Deposition)法を用いて、非平衡系で酸化物と炭化物の交互積層を行うことによりその困難を克服し、酸化物(MgO)-炭化物(Tic)交互積層人工格子の作製に成功した。さらに断面TEM観察により、より直接的に、積層構造を確認するとともに、TEDパターンから、Tic層とMgO層が互いにエピタキシャル成長していることも確認できた。また、電子輸送特性として、Tic層の層厚が比較的厚いとき(10原子層以上)は、TiC単相膜の場合と同様金属的挙動を示すのに対し、TiC層厚が105原子層程度に小さくなるに従い、半導体的挙動を示すことを確認した。これは、積層周期が小さくなるにつれTic-MgO界面の割合が増加し、界面における散乱の影響が大きくなるためと考えられる。以上に示したように、酸化物-炭化物の原子レベルでのエピタキシャル交互積層構造は初めてのものであり、今後様々な物質の組合せでの交互積層人工超格子作製の可能性を示唆するものである。
神経終末端の膜電位変化によるシナプス伝達修飾機構

SNARE蛋白質機能阻害ペプチドを用いたシナプス伝達効率修飾メカニズムの解明平成18年度は、SNARE蛋白質機能阻害ペプチドを用いたシナブス伝達効率修飾メカニズムの解明ついて、以下の研究を行った。方法:ラットの脳幹横断スライスを作成し(教室備品:スライサー)、シナプス後細胞と巨大シナプス前末端calyx of Heldを水浸対物レンズ(X63)によって直視下同定の後、電気生理学的記録を行った(備品:正立微分干渉顕微鏡)。シナプス後細胞と前末端から同時ホールセル記録を行い(備品:パッチクランプ増幅欝)、前末端に活動電位を誘発し、後細胞からEPSCを記録した。EPSCの振幅をシナブス伝達効率の指標とした。シナブス終末端への巨大分子注入の速度と効率の解析シナブス前末端内に巨大分子を効率よく注入するため、平成18年度は細胞内灌流によって注入される分子の注入量、および注入にかかる時間の定量を行った。終末端パッチクランプ用電極内液の陰イオンを、細胞内潅流により塩素イオンからグルコン酸に置換し、置換にかかる時問及び置換された量を観測した。置換量の同定のため、パッチクランプを適用した終末端にグリシンを局所投与し、終末端グリシン応答の反転電位を経時的に観測した。グルコン酸注入に伴い、グリシン応答反転電位の速やかな移行が観測され、注入開始1分から2分で、約80%90%の分子が置換されることが確認された。本実験により、注入分子の濃度をより正確にコントロールし、定量性の高い実験が可能となった。申詰者はシナプス前末端にピペット内灌流により前終末に直接小分子を注入する方法を用いて研究を行ってきたが、この改良により、巨大分子を速やかに前末端内に負荷することが可能になった。ひきつづき、シナプス伝達効率増強におけるSNARE蛋白質の役割とその修飾機構を明らかにする実験を継続する。シナプス前末端の膜電位と活動電位の振幅が伝達効率に及ぼす効果平成17年度は、シナプス前末端の膜電位と活動電位の振幅が伝達効率に及ぼす効果について、以下の研究を行った。方法:ラットの脳幹横断スライスを作成し(教室備品:スライサー)、シナプス後細胞と巨大シナプス前末端calyx of Heldを水浸対物レンズ(X63)によって直視下同定の後電気生理学的記録を行った(備品:正立微分干渉顕微鏡)。シナプス後細胞と前末端から同時ホールセル記録を行い(備品:パッチクランプ増幅器)、前末端に活動電位を誘発し、後細胞からEPSCを記録した。EPSCの振幅をシナプス伝達効率の指標とした。1.シナプス前末端活動電位の振幅がシナプス伝達効率に及ぼす効果:灌流液に低濃度のテトロドトキシンを加えて活動電位の振幅を減少させ活動電位の振幅とEPSCの振幅の関係を明らかにする研究を行った。活動電位の振幅の減少が弱いとEPSCは変化せず、活動電位の減少が0mVを超えるとEPSCが減少することを明らかにした。2.シナプス前末端の膜電位変化がシナプス伝達効率に及ぼす効果:シナプス前末端に電流を注入、または様々なK濃度の灌流液を投与することにより膜電位を系統的に変化させ、EPSCの振幅およびシナプス前末端活動電位の振幅を計測した。電流の注入、高K濃度溶液投与のどちらの方法でも、前終末を脱分極するとEPSCは増強した。また、前終末を-55mVより強く脱分極すると、活動電位の振幅が現弱し、それにともなってEPSCが減少した。シナプス前終末の課分極は、シナプス伝達効率変化を引き起こさなかった。3.シナプス前末端膜電位変化による前末端細胞内Ca濃度変化と、電位依存性Ca電流の修飾:ホールセルピペットからCa指示薬をシナプス前末端に注入しCa測光を行った(教室間共有備品:多光子レーザー顕微鏡)。静止膜電位に近い10mV程度の脱分極で、前終末内Ca濃度の上昇が観測された。前終末Ca濃度上昇に伴って、電位依存性Ca電流の増強が観測された。4.P/Q型Caチャネル欠損マウスを用いた、シナプス伝達効率変化に対する電位依存性Ca電流増強の寄与の検証:P/Q型Caチャネル欠損マウス脳幹スライスより、電位依存性Ca電流とEPSCを記録した。欠損マウスでは、電位依存性Ca電流の増強は観測されず、前終末脱分極によるEPSC増強の程度が通常動物に比べ著しく弱いことが確認された。

終末端パッチクランプ用電極内液の陰イオンを、細胞内潅流により塩素イオンからグルコン酸に置換し、置換にかかる時問及び置換された量を観測した。置換量の同定のため、パッチクランプを適用した終末端にグリシンを局所投与し、終末端グリシン応答の反転電位を経時的に観測した。グルコン酸注入に伴い、グリシン応答反転電位の速やかな移行が観測され、注入開始1分から2分で、約80%90%の分子が置換されることが確認された。本実験により、注入分子の濃度をより正確にコントロールし、定量性の高い実験が可能となった。申詰者はシナプス前末端にピペット内灌流により前終末に直接小分子を注入する方法を用いて研究を行ってきたが、この改良により、巨大分子を速やかに前末端内に負荷することが可能になった。ひきつづき、シナプス伝達効率増強におけるSNARE蛋白質の役割とその修飾機構を明らかにする実験を継続する。
地域生態系保全のための休耕田の人工湿地としての利用

本年度の目的は、実験対象となる休耕田で、まず炭素、窒素のマスバランスを把握できるようにし、来年度からの年間を通しての植生変化、生物相の変化、物質収支の検討のための準備を整えることにある。石川県金沢市辰巳町に休耕田を借用し、その一部を畔で囲って実験用湿地とした。実験用地の面積は112m^2である。この人工湿地に、用水路から水を導入し、水の入出流量、各種成分の濃度が測定できる様にした。また、雨水採取器、土壌溶液採取器(大起理化DIK-3900)を設置し、降水から供給される物質量、地下へ浸透する物質量を測定できるようにした。物質の流入流出量については、流入流出水量×濃度より、降水による供給量は降水量×濃度より、地下浸透量に関しては、浸透水量に土壌溶液採取器から得られた溶液の平均濃度を掛けて求めた。流入流出水量はサンプリング毎に容器に単位時間に流れ込む水量を測定することにより求めた。浸透水量は減水深より求めた。この人工湿地で、1993年11月から12月にかけての有機炭素、窒素、硫黄の物質収支を求めた。窒素に関しては、流入量の約4割が流出し、残り約6割が湿地内にデポジットされるか大気中に逃げていることが分かった。降水による流入量、地下への浸透量ともに無視できる程度だった。有機炭素については、窒素より約1オーダー高い流入量が得られた。流入した有機炭素の約6割が流出、約2割4分が地下へ浸透した。硫酸態硫黄に関しては、流入量の4割が流出し、6%が浸透し残り約50%が土壌中にデポジットあるいは大気に揮散している。これら3物質については、大気への揮散量、植物への吸収量を除いて物質収支を得ることができ、本年度の目的はほぼ達成されたと考える。来年度以降は、この人工湿地における生物相、植生の変化を追跡しながら、それと物質収支、炭素窒素動態との関係を検討し、休耕田転換人工湿地の評価を進める。
ヒト脂肪細胞の再生移植治療法の開発-脂肪萎縮性糖尿病ヌードマウスによる基礎検討ー

脂肪萎縮性糖尿病は高度なインスリン抵抗性、著明な糖脂質代謝異常を呈するが、その原因は先天性あるいは後天性の脂肪細胞の欠乏にある。よって、脂肪萎縮性糖尿病は、脂肪細胞の意義を解明する貴重な手掛かりとなる。脂肪萎縮性糖尿病は、インスリン抵抗性、糖代謝異常、脂質異常症、高血圧症など肥満症と共通の病像を呈しており、病態の基盤における肥満と脂肪萎縮性糖尿病の間の共通点が想定されている。本研究は肥満症のモデルとしての脂肪萎縮性糖尿病に着目する(Nat Clin Pract Endocrinol Metab 2009)。本研究は脂肪萎縮性糖尿病の研究においてヒトiPS細胞に着目する。代表者らは日本人の脂肪萎縮性糖尿病患者の大半の診療に関与しており、日本人の先天性脂肪萎縮性糖尿病でseipin遺伝子の新規の遺伝子変異を同定している(J Clin Endocrinol Metab 2004)。先天性脂肪萎縮性糖尿病の主要な病因遺伝子seipinの機能は不明であり、少なからぬ脂肪萎縮性糖尿病の症例において、病因遺伝子は未同定のままであるので、その解明を目指して、現在、脂肪萎縮性糖尿病の疾患特異的iPS細胞を樹立している。代表者らは、ヒトiPS細胞を用いた脂肪萎縮性糖尿病に対する細胞治療法の開発を目指して、世界に先駆けて、ヒトiPS細胞から脂肪細胞への分化誘導法を開発した(FEBS Lett 2009)。ヒトiPS細胞からの脂肪細胞分化法の確立により、肥満症を標的とした、ヒトiPS細胞由来脂肪細胞を用いた創薬スクリーニング系の開発などへの応用が期待される。
ユニバーサル卵子の構築に関する基礎的研究

本研究の最終目的は、核移植におけるユニバーサルなレシピエント卵細胞質を構築することである。種を超えて体細胞核を初期化するレシピエント卵細胞質を作り出すことができれば、優良家畜の育種・増産へ応用でき、さらに、異種間核移植が必要な希少動物種の再生・複製に大きく貢献する。また、卵子能力の増強は、ヒト生殖補助医療分野にも貢献する。卵細胞質が持つ体細胞核の初期化機構と全能性誘導機構は、エピジェネティクス修正の関与が大きな鍵となっていることは明らかであるが、全体像についてはほとんど解明されていない。そのため、本研究を実施する過程において卵細胞質が持つ初期化機構の全体像を知る一端になると考えられる。すなわち、老化卵子を蘇らせる手法開発(初期化強化)や未分化能力の高いiPS細胞を作出したり、iPS細胞の作出効率を向上させる手法へも応用できると考えられる。本年度は成体マウスとウシのサンプルを用いて、化学的処理により体細胞と成熟卵のミトコンドリア量を制御する手法を検討し、いくつかのミトコンドリア代謝阻害剤やDNA複製阻害剤を用いて至適条件の設定を試みた。体細胞を用いた検討では、7日間でミトコンドリア量を減少させる手法ができたが、生存率も低下したため、今後は生存性を安定して向上させる検討を行う。成体成熟卵では10nM100μMの阻害剤で処理すると濃度依存的に成熟率が低下したものの、ミトコンドリア量が減少した成熟卵を得ることができた。本年度の検討により、成体成熟卵と体細胞において、それぞれが持つミトコンドリア量の制御を行うことができた。成体マウスの成熟卵ではミトコンドリア複製がほとんど起きていないといわれているため、また、培養時間が限られているため、阻害剤感作によるミトコンドリア量の制御は容易ではない。本実験では、若干生存性を損ねたものの、ミトコンドリア量を減少させる手法が構築できた。また、体細胞においてもミトコンドリア量を減少させつつ継代培養する手法が構築できた。以上のことから、おおむね順調に実施できていると考える。これまでに、ミトコンドリア量を若干減少させた卵子と体細胞を作り出すことができたため、今後は、その生存性を向上させる検討を行う。すなわち、ミトコンドリアによるエネルギー産生に代わる培地添加物の検討などをおこなう。また、ミトコンドリアが活発に分裂を行なっている状態の卵子や体細胞を用いるなどして、より効率的に制御できるか、人工染色体等の導入が遅れた場合は、それに代わる対応策として、化学的阻害剤や細胞因子等の適用を検討する予定である。また、ミトコンドリアの初期化手法の検討についても実施する予定である。本研究では、体細胞核移植において利用可能なユニバーサルなレシピエント卵細胞質を構築することを最終目的として実施する。種を超えて体細胞核を初期化するレシピエント卵細胞質を作り出すことができれば、同種間核移植である優良家畜の育種・増産へ応用でき、さらに、同種間での体細胞核移植が困難で異種間核移植が必要な希少動物種の再生・複製に大きく貢献する。卵細胞質が持つ体細胞核の初期化機構と全能性誘導機構は、エピジェネティクスの修正ん関与が大きな鍵となっていることは明らかであるが、全体像についてはほとんど解明されていない。そのため、本研究により、種を超えて体細胞核を初期化させる卵子特有の初期化過程や、また、種による差異を知ることができれば、卵細胞質が持つ初期化機構の全体像を知る一端になると考えられる。さらに、研究の過程で得られる知見により、ヒトの不妊治療で必要な生殖補助医療技術や多能性幹細胞を用いた再生医療などの医療分野へも応用できる。すなわち、老化卵子を蘇らせる手法開発(初期化強化)や能力の高いiPS細胞を作出したり、iPS細胞の作出効率を向上させる手法へも応用できると考えられる。平成29年度の計画は、未受精卵由来と体細胞由来のミトコンドリアを操作して、ヘテロプラズミー状態を作り出す手法開発と生存性の検討、また、初期化関連因子を組み込んだ人工染色体ベクターを構築することである。これまでのところ、細胞の生存性をできる限り損なわずにミトコンドリア量を制御するいくつかの薬剤処理を検討しているところである。本年度は体細胞核移植に適した培養細胞株の作出、体細胞核移植実験系の構築に終始し、当初計画の卵子由来ミトコンドリアを持つ体細胞株の作出あるいは体細胞由来のミトコンドリアを持つ卵子を作出し、生存性を損ねない条件を確定するまでには至らなかった。また、初期化関連因子を含む人工染色体ベクターの構築を委託するに至っていない。これらのことから、当初予定より若干遅れていると判断するが、体細胞実験系は構築でき、核移植に用いる培養体細胞株も作出できたことから、本年度にペースアップして当初予定に追いつくことができると考える。

すなわち、老化卵子を蘇らせる手法開発(初期化強化)や未分化能力の高いiPS細胞を作出したり、iPS細胞の作出効率を向上させる手法へも応用できると考えられる。本年度は成体マウスとウシのサンプルを用いて、化学的処理により体細胞と成熟卵のミトコンドリア量を制御する手法を検討し、いくつかのミトコンドリア代謝阻害剤やDNA複製阻害剤を用いて至適条件の設定を試みた。体細胞を用いた検討では、7日間でミトコンドリア量を減少させる手法ができたが、生存率も低下したため、今後は生存性を安定して向上させる検討を行う。成体成熟卵では10nM100μMの阻害剤で処理すると濃度依存的に成熟率が低下したものの、ミトコンドリア量が減少した成熟卵を得ることができた。本年度の検討により、成体成熟卵と体細胞において、それぞれが持つミトコンドリア量の制御を行うことができた。成体マウスの成熟卵ではミトコンドリア複製がほとんど起きていないといわれているため、また、培養時間が限られているため、阻害剤感作によるミトコンドリア量の制御は容易ではない。本実験では、若干生存性を損ねたものの、ミトコンドリア量を減少させる手法が構築できた。また、体細胞においてもミトコンドリア量を減少させつつ継代培養する手法が構築できた。以上のことから、おおむね順調に実施できていると考える。平成29年度実施予定で遂行が遅れている項目を早期に完了する。すなわち、未受精卵由来と体細胞由来のミトコンドリアを操作して、ヘテロプラズミー状態を作り出す手法開発と作り出した卵子あるいは細胞の生存性を検討する。それらを用いた核移植を実施し、核移植卵の体外生存性を検討する。また、年度前期中に初期化関連因子を組み込んだ人工染色体ベクターを構築する。微小核細胞融合(MMCT:microcell mediated chromosome transfer)法を卵子に適用する予備的実験を行う。これまでに、ミトコンドリア量を若干減少させた卵子と体細胞を作り出すことができたため、今後は、その生存性を向上させる検討を行う。すなわち、ミトコンドリアによるエネルギー産生に代わる培地添加物の検討などをおこなう。また、ミトコンドリアが活発に分裂を行なっている状態の卵子や体細胞を用いるなどして、より効率的に制御できるか、人工染色体等の導入が遅れた場合は、それに代わる対応策として、化学的阻害剤や細胞因子等の適用を検討する予定である。また、ミトコンドリアの初期化手法の検討についても実施する予定である。平成29年度に予定していた人工染色体の委託を行わなかったため、平成30年度に繰り越した。平成30年度の前期早めに委託を行う予定である。成体由来卵子や体細胞を用いたミトコンドリア制御の実験を中心に行い、次年度との合算で委託によるサンプル作成を検討することにしたため。次年度早期にサンプル作成の委託を検討する。
インプラント周囲骨における三次元有限要素法による動的解析-上部構造による連結の力学的影響-

インプラント植立予定の本学外来患者について、患者の同意を得てCT撮影を行った。画像再構成を行い、得られた冠状断面像をイメージスキャナ取り込み、キ-ポイントをコンピュータ入力した。各2次元断面の輪郭はキ-ポイント群を通るスプライン近似による3次曲線で作成し、さらにスキニング手法によって各断面を滑らかな曲面で結び、下顎臼歯部の有限要素モデルが構築された。このモデルは非常に現実に近似した形態を再現しており、また要素分割は誤差評価法に基づいて行い3万程度と従来の研究に比較して十分に多く、誤差は少ない。さらに歯冠における隣接接触部には接触要素を用い現実に近似した接触関係をシミュレートした。加えて本研究のモデルは天然歯及びインプラントについて臨床的実測データと検証を行い妥当性を得ている。すなわち本研究はきわめて精度の高い結果に基づくものであると考える。咀嚼時を想定した三次元有限要素法による動的解析の結果、インプラントに加わる荷重は、主にインプラント頸部の皮質骨部で支持され、海綿骨部の支持はわずかであることが示唆された。よって長いインプラントを用いて海綿骨部の接触面積を増やすよりも、直径の大きいインプラントを用いて皮質骨部の接触面積を大きくした方が力学的に有利であることが示唆された。インプラント同士を上部構造で連結した場合、特に近遠心方向の衝撃に大きな効果がみられ、最大65%の応力緩和が示された。垂直荷重時には連結の効果が少なく、荷重の加わったインプラント周囲にのみ応力が集中した。天然歯とインプラントを連結した場合、天然歯側のインプラントに著明な応力集中を示し、さらに天然歯のみに加わる荷重を与えても、インプラント周囲に大きな負担を強いることが認められた。
高性能アンモニウムイオノホア分子の創製とそれを利用した高性能化学センサーの開発

ジベンジルエーテル(DBE)を用いた液膜型電極が高アンモニウムイオン選択性を示すことを見いだした。DBE中の酸素原子はアンモニウムイオンの水素原子と水素結合を形成すると考えられるので、先ず、DBEのベンゼン環に電子供与性又は吸引性の官能基を導入したDBEの類似化合物(モノエーテル化合物)を合成した。DBEのベンジル基のパラ位にこれらの官能基を導入すると、アンモニウムイオン選択性に影響を及ぼすことが明らかになった。この場合、アンモニウムイオンとイオノフォアの錯体形成においては、エーテル酸素の位置、骨格の柔軟性やベンジル基の芳香族π電子が重要な役割をすることがわかった。次に、モノエーテル化合物についての結果に基づきジエーテルやテトラエーテル化合物を設計・合成した。そして、それらのイオノフォア分子のアンモニウムイオン選択性と分子構造を詳細に検討した。ベンジル基の間にアルキレン基を導入したジエーテル化合物はDBEよりさらに高アンモニウムイオン選択性を示した。この場合、アルキン基としてブチレン基を導入したものが最良であった。また、エーテル酸素の隣の炭素にジメチル基を導入することもアンモニウムイオン選択性の向上に有効であった。それはジメチル基の立体効果で、アンモニウムイオン以外のイオンに対する安定度が低くなるためである。一方、テトラエーテル化合物では、アンモニウムイオンよりもイオン径の大きいカチオンに対する選択性の方が大きかった。これらの結果より、最終的にはジエーテル化合物であるdibenzyl-1,1,4,4-tetramethylbutyletherが最良のアンモニウムイオン選択性を示し、この化合物に基づくイオン選択性電極のNH4^+/K^+選択性は50で、現在までに報告されたアンモニウムイオノホアの中で最高の特性を示した。ジベンジルエーテルがアンモニウムイオノホア分子として優れていることを見いだしたので、この分子のアンモニウムイオンとの溶液中の配位構造を仮定した錯体分子についての分子メカニクス計算を行い、詳しいイオン配位場の3次元的情報を得た。そして、それらを整理し、基本的な分子の配位数や立体的配位サイト位置などを決定した結果、図1に示すようなベンジルジエーテル誘導体がアンモニウムイオノホア分子として最も有効な構造をもつことがわかった。図1の化合物1から4は合成に成功した分子である。これら1から4の分子をポリ塩化ビニル膜中に混合し、陰イオン性添加物(テトラフェニルボレイト)を加えてセンサー膜を作製し、銀-塩化銀電極を対極としたポテンシオメトリーによりアルカリ金属イオンおよびアルカリ土類金属イオンに対する応答を詳しく調べた。その結果、4の化合物が最も優れたアンモニウムイオン選択性を示し、この選択性はカリウムイオンに対して40倍、ナトリウムイオンに対して160倍と大変優れた化合物を得ることができた。このベンジルエーテル誘導体4のアンモニウムイオン選択性は、天然物のナクチンやジベンジルエーテルより優れている。このような結果を1年で達成できたことは、研究助成申請時の予想よりも早く研究が進められていることを示す。この化合物が現在までのアンモニウムイオノホア分子の中で、世界最良のものである。平成6年度もこれ以上の優れた選択性を有するアンモニウムイオノホア分子を継続して、設計、化学合成する予定である。本年度は先づ昨年までの研究でアンモニウムイオンに対して有効な配位分子(イオノホア分子)とわかったジベンジルエーテルとアンモニウムイオンとの配位を1対4型錯体と仮定して、分子力場計算から安定配座を推定した。

その結果、イオノホア分子中のエーテル酸素原子とアンモニウムイオンの水素原子との間で水素結合が生じ、その際ベンジル基の芳香族環がこのイオン錯体の安定配座に寄与することがわかった。そこで、モノエーテル化合物からさらに発展して、三次元的にイオンン取り込み、アンモニウムイオンと安定な錯体を形成すると考えられるベンジル型イオノホア分子を設計・合成し、それらの分子を利用したアンモニウムイオン選択性電極の開発を行なった。具体的には、ポリ塩化ビニルを膜担体として電極膜を作製し、電極の応答電位測定を行なった。各イオンに対する選択係数(Κ^<pot>)は、0.1Mカチオン塩化物の応答電位から単独溶液法により算出した。合成したイオノホアのうち代表的なイオノホアは6種である。これらは、四級炭素からドナー原子(エーテル酸素)を含む側鎖を3本有するTripodal型あるいは側鎖を4本有するTetrapodal型化合物である。これらに基づくイオン電極は、いづれもアンモニウムイオンに対して選択性を有していた。合成したイオノホア中で最も良好なアンモニウムイオン選択性を示したTripodal型イオノホアの選択係数はlogΚ^<pot>_<NH^+_4,K^+>=-0.8であった。一方、Tetrapodal型イオノホアはCs^+に対しての選択性が上がり、アンモニウムイオンに対しての選択係数はlogΚ^<pot>_<NH^+_4,K^+>=-0.5-0.7と低い値となった。昨年度合成されたのDiipodal型イオノホアに比べるとこれらのTripodal型およびTetrapodal型化合物のアンモニウムイオン選択性は劣っているが、これらの新規分子はいづれも設計通りのアンモニウムイオン選択性を示すことが確認された。
ディーゼル排気暴露動物体内での水酸化多環芳香族炭化水素の生成に関する研究

ディーゼル排気(DE)中には多環芳香族炭化水素(PAHs)が含まれ、その暴露により様々な生体影響が生じることが知られている。しかし、排ガス中濃度ではなく、実際に体内に取りこまれた量と生体影響との量-反応関係に関する知見は乏しい。また、PAHsは代謝の過程で水酸化・抱合化され体外へ排泄される。これら代謝産物を測定する事は、PAHsの暴露量を評価する上で重要であり、その方法を確立する必要がある。本研究では、DEに含まれるPAHs含量を測定し、その組成を明らかにした。さらに、DEを実験動物に一定期間暴露し、その体内に含まれるPAHs含量を測定し、体内動態に関する知見を得る事を試みた。その結果、肺においてDEの用量または暴露時間に依存したPAHsの増加が観察され、肺への蓄積が明らかとなった。一方、肝臓や脂肪組織ではPAHsの蓄積は観察されなかった。一方、DE暴露そのものによる酸化ストレスに加え、臓器内の代謝能力が高まると、体内での酸化ストレスも高まると考え、抗酸化物質であるビタミンA、およびDNAの酸化ストレスの指標である8-OHdGの測定を行なった。その結果、DE暴露が長期間にわたると、肝臓中のビタミンA濃度が低下することが観察された。しかし、肺、肝臓、腎臓いずれかにおいても、8-OHdGの有意な増加は観察されなかった。さらに、肝臓中で何らかの酸化ストレスが存在することが示唆されたため、肝臓中のPAHsの代謝物を測定することを試みた。肝臓を抗酸化物質共存下で過熱処理し、脱抱合酵素処理を施したところ、肝臓中からピレンの水酸化物が濃度依存的に検出され、DE暴露により、肝臓内で代謝酵素が誘導されていることが示唆された。以上から、PAHsの水酸化物を測定することで、その暴露量の推定が可能となった。ディーゼル排気(DE)曝露装置の曝露ガスに含まれる多環芳香族炭化水素類(PAHs)を、ローボリュームエアサンプラーを用いてフィルターおよびポリウレタンフォームに捕捉し、抽出と精製後、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)でその濃度を定量した。その結果、ディーゼル排気に含まれているPAHsは23環の揮発性の高いものが主要な構成成分で、主にガス態として存在していた。一方、ディーゼル排気粒子(DEP)には揮発性の低い4環以上のPAHsが多く含まれていた。そこで、マウスを粒子濃度の異なるDEにそれぞれ2ヶ月間暴露した後、解剖により臓器を摘出し、アルカリ分解と試料の精製を行い、HPLCで臓器中のPAHsの定量を行った。その結果、DE曝露マウスの肝臓や脂肪組織では、DE濃度依存的なPAHsの増加は観察されなかった。一方、DE曝露によってマウス肺には肉眼でも認められるほどDEPが沈着しており、そのPAHs含量はDEの濃度に依存して増加していた。マウスの呼気量と肺のPAHs濃度からPAHsの肺での残存率を算出したところ、0.36.2%であり、PAHsの多くは肺胞上皮から吸収され体内に取りこまれていることが示唆された。しかし、主要な臓器である肝臓でのPAHsの蓄積は認められず、肝臓でPAHsが代謝および排泄されていると考えられた。一方、これらPAHsの代謝酵素の誘導に伴い、肝臓での酸化ストレスが高まると考え、酸化ストレスの指標であるDNA塩基の酸化物8-OHdGの測定も行ったが、そのDE曝露による有意な増加は観察されなかった。
レドックス機能を有する集積型錯体の次元設計

本研究では、配位様式の制御に基づく遷移金属錯体の次元設計により、レドックス活性なπ-共役系配位子からなる新規レドックス活性集積型錯体を構築することを目的としている。本年度は、レドックス活性π-共役系二座配位子であるN,N'-ビス(4'-アミノフェニル)-1,4-ベンゾキノンジイミン(1)からなるπ-共役系パラジウム二核錯体2のレドックス特性を明らかにするとともに、キノンジイミン部位の配位様式の制御に基づくπ-共役系環状多核錯体の合成およびその構造について検討した。紫外-可視-近赤外スペクトルにおいて、π-共役系錯体2ではd-π^*に基づくMLCTバンドが800nm付近に見られたが、一電子還元体ではMLCTバンドが800nmから1200nmにかけてブロードな吸収として観測された。また、ESRスペクトルにおいて、g値が2.0041の超微細構造に基づくスペクトルが見られ、不対電子はキノンジイミン部位に局在化していると考えられる。キノンジイミン部位の配位様式制御の試みとして、シス型錯体であるエチレンジアミンパラジウム錯体を用い、キノンジイミン誘導体1との錯形成について検討を行ったところ、3:3環状錯体3が得られた。X線結晶構造解析より、キノンジイミンの窒素がシン型でパラジウムに配位した3:3環状錯体であることが判明した。三つのキノンジイミン部位からなるカップ形のキャビティーが形成されており、溶媒のメタノール分子がカップの上と下に位置していた。興味深いことに、末端のジメチルアミノフェニル部位がface to faceでπ-π相互作用しており、3:3環状錯体生成の要因の一つではないかと考えられる。以上の如く、次元設計に基づくレドックス活性π-共役系集積型錯体の開発、レドックス特性および構造の解明を行った。
慢性心不全に対する細胞移植治療効果向上のための検討

今回の実験の目的は、心筋細胞への分化能を有する骨髄由来や骨格筋芽細胞などの体性幹細胞をin vitroで効率良く心筋細胞に分化誘導できそして心筋組織にて効率よく定着できる方法を検討することであった。今回、in vitroの研究では、骨髄からの体性幹細胞を取り出しその心筋への分化に関して検討した。また、In vivoの研究ではマウス、ラットを用いて細胞移植による心筋梗塞後心不全に対する改善効果を検討した.具体的には、骨髄幹細胞にアデノウイルスを用いてVEGF導入を試みた幹細胞を用いて心筋梗塞後は左室リモデリング抑制を検討してその抑制改善効果が認められた。また、心筋保護作用や骨髄から幹細胞用誘導作用の有するエリスロポエティンを心筋梗塞後に用いても、心筋梗塞後左室利モデリングは抑制された。下肢動脈を閉塞させたモデルにおいて血管新生作用に関して超音波バブルを用いて血管新生増強作用を検討したが、このモデルにおいて幹細胞と超音波バブル剤を用いた実験系でもっとも血管新生が認められた。移植を希望するレシピエントの骨髄から得た細胞にて効率よく心筋細胞にできるとすれば、移植に伴う拒絶反応も原則として生じないものと考えられる。骨髄由来の体性幹細胞から心筋細胞を大量に増殖し、心臓に移植することができればこれらの問題は解決できると我々は考えており超音波とその超音波造影剤を使用することにより、その細胞移植効果が上昇することにより超音波の治療への新たな展開が広がる可能性を探れたと考えている。難治性心不全の治療の現状を考えると、ヒトにおける心筋細胞再生・新生の技術が今後大いに期待される。また、超音波とその超音波造影剤を使用することにより、その細胞移植効果が増幅する可能性があれば、その臨床応用は早まるものと思われる。今弼の研究はこれらの点において貢献できたと考えている。心血管病の病態の基礎的な理解が飛躍的に深まり、薬物治療がめざましく進歩しているにもかかわらず、心不全による死亡者数は年々増加の一途をたどっている。そして、心臓移植以外に治療法のない重症心不全患者が多数存在し、提供臓器を待ちきれぬまま死亡している。今日、臓器移植に代わる新しい有望な治療法として細胞移植治療が出現してきた。心筋細胞は受胎中に増殖し徐々に成熟するが、生後まもなく細胞周期のG1期に入り、最終分化を遂げる。つまり生後まもなく成熟心筋細胞として機能すると同時に増殖能を失う。ゆえに、一般的に心筋梗塞などの虚血性心疾患にて心筋組織がひとたび損傷をうけると、心筋細胞は自身で再生することができない。今回の実験の目的は、心筋細胞への分化能を有する骨髄由来の体性幹細胞をin vitroで効率良く心筋細胞に分化誘導できそして心筋組織にて効率よく定着できる方法を検討することであった。心臓は拍動と心電現象が心臓特有の環境であり、我々はこのような機械的因子が幹細胞の心筋細胞への分化誘導に関与している仮説を有する。今回、in vitroの研究では、骨髄からの体性幹細胞を取り出しその心筋への分化に関しての機械的因子の役割を検討し、一方、心筋分化に関与する転写因子を細胞内に導入することによる心筋細胞分化への効果も合わせて検討した。In vivoの研究ではマウス、ラットを用いて細胞移植による心筋梗塞後心不全に対する効果を検討し、その効果を超音波照射と超音波造影剤の同時使用により増幅されるかどうかを検討した。結果としては、細胞移植により心筋梗塞後心室リモデリングは抑制され、心機能低下を防ぐことができた。また、超音波照射と超音波造影剤の同時使用により細胞移植の定着率が向上した。

今回の実験の目的は、心筋細胞への分化能を有する骨髄由来や骨格筋芽細胞などの体性幹細胞をin vitroで効率良く心筋細胞に分化誘導できそして心筋組織にて効率よく定着できる方法を検討することであった。今回、in vitroの研究では、骨髄からの体性幹細胞を取り出しその心筋への分化に関して心筋分化に関与する転写因子を細胞内に導入することによる心筋細胞分化への効果も合わせて検討した。また、超音波照射と超音波造影剤の同時使用により心筋組織環境が変化して移植される細胞の生着率が向上することが判明した。In vivoの研究ではマウス、ラットを用いて細胞移植による心筋梗塞後心不全に対する改善効果をした。また今回の検討では、マウス、ラットに下肢の骨格筋芽細胞を用いて細胞移植試み、移植後3日から5日目にGATA4、Csx/Nkx25、MEF2などの心筋特異的な転写因子発現を見いだした。移植を希望するレシピエントの骨髄から得た細胞にて効率よく心筋細胞にできるとすれば、移植に伴う拒絶反応も,原則として生じないものと考えられる。骨髄由来の体性幹細胞から心筋細胞を大量に増殖し、心臓に移植することができればこれらの問題は解決できると我々は考えており超音波とその超音波造影剤を使用することにより、その細胞移植効果が上昇することにより超音波の治療への新たな展開が広がる可能性を探れたと考えている。ヒトを対象とした移植を想定した場合には、骨格筋芽細胞を用いて大量に心筋細胞が分化誘導できるのであれば、移植に対する倫理的なハードルは心臓移植よりはるかに低いものとなる。難治性心不全の治療の現状を考えると、ヒトにおける心筋細胞再生・新生の技術が今後大いに期待される。また、超音波とその超音波造影剤を使用することにより、その細胞移植効果が増幅する可能性があれば、その臨床応用は早まるものと思われる。今回の研究はこららの点において貢献できたと考えている。
中世・近世農・山・漁村の生業交流に関する研究

本研究は、農・山・漁村において営まれる生業に着目し、それをおのおの独立したものと捉えるのではなく、相互の交流関係を重視して実態の解明を行ったものである。また、領主の政策や村の特質が生業のありように与えた規定性や、生業を維持するための民衆運動にも留意した。対象とした地域のうち、出羽国村山地方と信濃国松代藩領においては、生業の特質とその相互連関、および生業を取り巻く諸要因のあり方について、とりわけ顕著な研究成果をあげることができた。平成21年度は、研究実施計画に沿って、伊豆国内浦地方と信濃国松代藩領の史料調査を集中的に進めた。内浦地方については、平成21年9月20日9月23日と平成22年3月12日3月14日に現地調査を行った。調査においては、長浜村大川家、重寺村秋山家、三津村日吉家(いずれも現沼津市)の三家を対象として、自宅に保存されている近世から近代の古文書について日録作成・封筒詰め・写真撮影等を行った。大川家と秋山家については調査を終了し、日吉家についても平成22年度の調査終了の目処をつけることができた。調査においては、近世漁村の生業交流に関する重要史料を多数発見・写真撮影することができ、平成22年度以降の本格的な分析・研究の基礎固めをすることができた。松代藩領については、平成21年10月17日10月18日に丹波島村(現長野市)柳島家の現地史料調査を実施し、同家所蔵の近世から近代の古文書の目録作成・封筒詰め・写真撮影等を行った。調査においては、近世農村の生業交流に関する重要史料を多数発見することができ、平成22年度の調査終了の目処をつけることができた。また、平成21年10月23日10月25日には、平成22年度の本格調査に向けて、阿波国麻植郡の予備調査を行った。調査では、徳島県立文書館や三ツ木村(現美馬市)三木家などにおいて、中世・近世の山村における生業交流に関する重要史料を多数発見し、一部はデータ収集することができた。平成22年度以降の本格的な調査・分析に向けて、確実な足がかりを築けたといえる。さらに、東京都においては定期的に研究会を行い、調査で得られた情報の共有化と研究の進展を図った。平成22年度は、研究実施計画に沿って、阿波国麻植郡(現徳島県美馬市)、伊豆国内浦地方(現静岡県沼津市)、信濃国松代藩領(現長野県長野市)、出羽国村山郡(現山形県天童市・東根市)の調査・分析を並行して進めた。阿波国麻植郡については、平成22年10月22日10月24日に現地調査を行った。調査では、22日に徳島県立博物館において三ツ木村三木家の中世文書の写真撮影を、23日には松茂町歴史民俗資料館・徳島城博物館・徳島県立図書館で情報収集を、24日には美馬市・吉野川市・徳島市においてフィールドワークを、それぞれ行った。この調査では、史料の記載内容とフィールドワークで得られた知見とを総合することによって、中世・近世の山村における生業交流についての研究を進展させることができた。伊豆国内浦地方については、平成22年9月17日19日に現地調査を行った。調査においては、平成21年度に引き続き、三津村日吉家に保存されている近世・近代文書について、目録作成・封筒詰め・写真撮影を行った。調査においては、近世漁村の生業交流に関する重要史料を多数発見・写真撮影することができ、研究成果をまとめるうえでの具体的なイメージを形成することができた。信濃国松代藩領については、平成22年9月25日26日に現地調査を行った。調査では、丹波島宿柳島家に保存されている近世・近代文書について、目録作成・封筒詰め・写真撮影を行い、今回で調査を完了した。調査においては、近世農村の生業交流に関する重要史料を多数発見・写真撮影することができた。出羽国村山郡については、平成22年8月23日25日に、現地でのフィールドワークを行った。平成23年度は、研究実施計画に沿って、阿波国山間部(現徳島県神山町周辺)、伊豆国内浦地方(現静岡県沼津市)、信濃国松代藩領(現長野県長野市)、出羽国村山郡(現山形県天童市・東根市)の調査・研究を並行して進めた。阿波国については、平成23年10月20日10月21日に現地調査を行った。調査では、徳島県立文書館・神山町郷土資料館において、所蔵史料の閲覧と写真撮影を行い、合わせて徳島市・神山町においてフィールドワークを行った。この調査では、史料の記載内容とフィールドワークで得られた知見とを総合することによって、近世の山村における生業交流についての研究を進展させることができた。伊豆国内浦地方については、平成23年9月17日19日に現地調査を行った。

調査においては、平成21・22年度に引き続き、三津村日吉家に保存されている近世・近代文書について、目録作成・封筒詰め・写真撮影を行い、調査・整理を完了した。調査においては、近世漁村の生業交流に関する重要史料を多数発見・写真撮影することができ、近世漁村の生業交流についての具体的なイメージを形成することができた。信濃国松代藩領については、国文学研究資料館(立川市)所蔵の松代藩真田家文書の分析を行い、大名家文書と既調査の村方文書の内容を突き合わせることによって、近世農村における生業交流の具体相と、生業構造に藩の政策が与えた影響について考察を深めた。この研究成果の一部は、荒武賢一朗・渡辺尚志編『近世後期大名家の領政機構信濃国松代藩地域の研究III』(岩田書院、平成23年5月)として刊行した。出羽国村山郡については、平成23年度までの研究成果を、渡辺尚志編『東北の村の近世』(東京堂出版、平成23年12月)として刊行した。平成24年度は、研究実施計画に沿って、阿波国山間部(現徳島県神山町周辺)、信濃国松代藩領(現長野県長野市)の調査・分析を並行して進めた。阿波国については、平成24年8月6日7日に現地調査を行った。調査では、神山町郷土資料館において、所蔵史料の閲覧と写真撮影を行い、あわせて神山町・徳島市などにおいてフィールドワークを行った。この調査では、史料の記載内容とフィールドワークで得られた知見とを総合することによって、近世の山村における生業交流についての研究を進展させることができた。なお、神山町郷土資料館に収蔵されている近世文書は厖大な量にのぼり、2日間ではとてもすべての閲覧・撮影が不可能だったため、別途、四国工業写真株式会社に近世文書のデジタルデータ作成業務を依頼し、必要なデータをすべて入手することができた。このデータの分析により、近世の山村における生業交流の具体相について、さらに多くの重要な知見を得ることができた。信濃国松代藩領については、平成25年3月2728日に現地調査を行った。調査では、北長池区の公民館に保管されている区有文書の閲覧・撮影を行った。また、国文学研究資料館(立川市)に所蔵されている松代藩真田家文書の分析を行い、村方文書と大名家文書の記載内容を突き合わせることによって、近世農村における生業交流の具体相と、生業構造に藩の政策が与えた影響についての考察を深めることができた。また、以上の調査・分析の成果を共有し、各自の研究をさらに進展させるために、インターネットを利用して頻繁に意見交換を行った。こうして、山村と農村を比較しつつ、生業交流という新たな視点から近世社会の特質を検討できたことは、近世史研究の進展にとって重要な意義を有するものである。本研究で設定した4か所の調査対象地のうち、伊豆国内浦地方(現静岡県沼津市)と出羽国村山郡(現山形県天童市・東根市)については、計画どおりに調査・研究が完了した。また、阿波国山間部(現徳島県神山町周辺)と信濃国松代藩領(現長野県長野市)については、調査・研究が順調に進展している。さらに、出羽国村山郡と信濃国松代藩領については、研究成果を論文集として刊行することができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は本研究の最終年度となるので、調査・研究に一応の区切りを付けて成果を出す。4か所の調査対象地のうち、伊豆国内浦地方と出羽国村山郡については調査・研究が予定通り完了しているので、平成24年度は、阿波国山間部と信濃国松代藩領の調査・研究に全力をあげる。現時点では、研究計画の変更や、研究遂行上の問題点等はない。
希少遺伝性疾患治療薬開発基盤技術創出

本研究開発提案では、独自に樹立した高感度・高精度のmRNA監視機構(Nonsense-mediated mRNA decay (NMD))評価システムの改良を行い、新規化合物のスクリーニング・バリデーションを行う。同時に、得られたリード化合物による希少遺伝性疾患治療のin vitroレベルでのPOC(概念実証)を取得し、開発を加速させる。平成30年度は1)平成29年度に作成した、HiBit(Split-NanoLucペプチド)にいくつかのアミノ酸コドンを含まないmutant-T4-Lysozyme (mT4L)を融合させたレポーター(Hibit-mT4L-wt/PTC)を用い、様々な細胞ストレス依存的なNMD活性の変化を解析した。その結果、これまで、ストレス依存的翻訳抑制によりNMDが抑制されていると考えられていたストレスにおいて、翻訳抑制非依存的にNMDが抑制されるということを発見した。また、Hibit systemにはDual luciferase kitが市販されていないが、プロトコールの改良により、これを可能とした。2)NMD抑制による遺伝性疾患治療モデルとして、ColVIにナンセンス変異を有するUllrich病患者由来細胞をHPV-E7/TERT高発現により不死化し、蛍光染色法により新規SMG1阻害剤依存的な変異ColVIタンパク質蓄積を証明した。さらに、動物モデルとして、嚢胞性線維症原因遺伝子であるmCFTRの変異のうち、ヒトで5番目に多い変異であるCFTR-W1282Xに相当するmCFTR-W1278XノックインマウスをCRISPR-CAS9systemにより作成した。mCFTR-W1278Xマウスは、mCFTRノックアウトマウスと同様、生後69週での致死であることが観察されたが、これについて、凍結受精卵の作成を行った。バリデーションを行う。平成29年度は1)新たに発表された、HiBit(Split-NanoLucペプチド)にいくつかのアミノ酸コドン(KVPE)を含まないmutant-T4-Lysozyme (mT4L)を融合させたレポーターを作成した。3'UTRにbeta-globinイントロン2を配置し、レポータータンパク質の終止コドンかエクソンジャンクションまでの距離が21塩基のコントロールレポーターと179塩基のNMDレポーターを設計し、NMDの抑制が特異的に検出できることを確認した。さらに、HiBitと結合しNanoLucを形成するLgBitを外部から供給する方法と、共発現させる方法を施行し、どちらの場合も良好な応答を示すことを確認した。HiBit-LgBitsystemにはDual luciferase kitが存在しないため、Firefly luciferaseによる補正を行うため、LgBitを共発現させる細胞の樹立も行う。2)NMD抑制による遺伝性疾患治療モデルとして、ColVIにナンセンス変異を有するUllrich病患者由来細胞をHPV-E7/TERT高発現により不死化し、蛍光染色法によりSMG1阻害剤依存的な変異ColVIタンパク質蓄積を証明した。mCFTR-W1278Xマウスは、mCFTRノックアウトマウスと同様、生後69週での致死であることをが観察された。1)新たに発表された、HiBit(Split-NanoLucペプチド)にいくつかのアミノ酸コドン(KVPE)を含まないmutant-T4-Lysozyme (mT4L)を融合させたレポーターを作成した。現在、繁殖を進めている。以上より、研究はおおむね順調に進展している。