hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
量子多成分系分子理論システムの構築およびプロトニクス・ポジトロニクスへの展開

これまで我々は、従来の第一原理計算だけでは取り扱えない未知の領域を研究対象とするために、様々な多成分系分子理論を展開してきた。本研究では、(1)量子多成分系分子理論システムを構築した。具体的には、1高精度・大規模系に適用できる手法を開発すると同時に、2効率的並列計算のためのシステムを実装した。それにより、(2)高精度・大規模計算を実現した。具体的には1水素・陽子が関わるプロトニクスや2陽電子が関わるポジトロニクスに対して基盤情報を与えた。これまで申請者は、水素原子核の量子揺らぎや陽電子系にも適用可能な量子多成分系分子理論を開発し、最近では陽電子化合物エネルギーの世界記録樹立といった成果を得た。本研究課題では、当該分野をリードし続けるため、(1)量子多成分系分子理論システムの構築と、(2)高精度・大規模計算の実現といった研究項目を実施する。本年度の研究実績の概要を以下に示す。(1)量子多成分系分子理論システムの構築: 1主に高精度化を目的とし、以下の手法開発を行った。(1A)量子多成分系MO法では、従来のCI法の拡張(多成分行列要素の効率的な導出等)を行った。(1B)量子多成分系QMC法では、高精度物理量の算出のために、初期試行関数の拡張を行った。2システム実装として、量子多成分系分子理論プログラムの統合を図った。入出力を共通化すると共に、マニュアル整備も始めた。(2)高精度・大規模計算の実現: 1プロトニクスへの展開として、経路積分分子動力学方を用いて、主に低障壁水素結合をターゲットとした高精度計算を実現した。水素原子核の量子効果の影響、H/D同位体効果を探り、論文として報告した。2ポジトロニクスへの展開として、(1)で開発した量子多成分系MO法や量子多成分系QMC法を用いて、陽電子吸着能に関する高精度計算を実現し、論文として報告した。なお、研究分担者には(1)12のシステム構築や、(2)1のプロトニクスへの展開に分担いただいた。研究協力者として、横浜市立大学学生に、(2)全般の計算補助をお願いした。本研究課題の第一の目的は、我々が展開してきた手法を深化させ、(1)量子多成分系分子理論システムを構築することにある。具体的には、1高精度・大規模手法を開発すると同時に、2効率的並列計算のためのシステムを実装する。第二の目的は、(2)核の量子効果や陽電子を含んだ系の高精度・大規模計算を実現する。これにより1水素・陽子が関わるプロトニクスや2陽電子が関わるポジトロニクスに対して基盤情報を与え、得られた結果を実験グループにフィードバックすることで、それら基盤技術の推進に寄与する。最終年度にあたる本年度は、(1)量子多成分系分子理論システムのさらなる構築、および(2)核の量子効果や陽電子を含んだ系の計算結果のまとめを実行した。(1)量子多成分系分子理論システムの構築では、手法開発として、核の量子効果と周囲環境の効果を併せて取り入れた、新しい高精度量子化学計算手法の開発を実施した。システム実装としては、入出力部分の改良をはかると共に、一時ファイルの共通化をはかった。(2)高精度・大規模計算の実現として、picolinic acid N-oxideの化学シフトの解析を行い、(i)核の量子効果と溶媒効果はともにOH結合距離を伸長させ、化学シフトを増大させる寄与を持つこと、(ii)その両方の寄与を考慮することで同位体シフトの実験値を定性的に再現できること、(iii)計算された同位体シフトには幾何学的同位体効果が強く影響していること、の三点を明らかにした。また、様々な陽電子化合物の計算を実現することに成功した。(1)量子多成分系分子理論システムの構築: 1主に大規模化・高精度化を目的とし、以下の手法開発を行った。(1A)量子多成分系MO法では、大規模計算を可能とするプログラムの実装を行った。(1B)量子多成分系QMC法では、高精度物理量の算出のために、初期試行関数の拡張、および振動状態への適用拡張を行った。2効率的並列化計算のため、特に経路積分に関する並列化を実装した。

(2)高精度・大規模計算の実現: 1プロトニクスへの展開として、(1)で開発した量子多成分系MO法や経路積分分子動力学法を用いて、主に低障壁水素結合をターゲットとした計算を実現した。水素原子核の量子効果の影響、H/D同位体効果に焦点を絞り、論文として報告した。2ポジトロニクスへの展開として、(1)で開発した量子多成分系MO法や量子多成分系QMC法を用いて、陽電子吸着能に関する高精度計算を、さらには振動状態を考慮した計算も実現し、論文として報告した。(1)量子多成分系分子理論システムの構築と、(2)高精度・大規模計算の実現といった研究項目を具体的に実施でき、多くの論文を報告することができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。予想以上に論文も報告することができ、順調に進展できたと考えている。本年度も同じペースで進める予定である。引き続き、理論開発と具体的計算を並行して実施していきたい。
続 縄文時代の広域編年と交流-東北・北海道・サハリン-

本研究では続縄文時代の土器群の広域編年を、併行する東北地方及びサハリン以北の土器群を含めて構築することを目的としている。以下、本年度の成果を北海道とサハリンに分けて述べる。北海道地域では前年度にデータ収集を行っていなかった釧路地域を主体として調査を行った。その上で、続縄文時代前半の北海道東部における、釧路地域と網走地域の土器群を対比し、背景にある人の動きを考察した。その結果、続縄文時代前半の北海道東部では、a.はじめは釧路地域(興津式土器)と網走地域(「元町2式土器」)で地域差があり、かつ東西でも地域差があるb.次の時期には釧路(下田ノ沢I式土器)・網走(宇津内IIa式土器)地域差は目立たなくなるc.さらに続く時期では再び釧路(下田ノ沢II式土器)・網走(宇津内IIb式土器)間の地域差は拡大する、という変遷が認められた。これまで、続縄文前半期の北海道東部においては、釧路/網走地域という地域差が存在することは知られていたが、その地域差は通時的に変化しない固定的なものと考えられていた。本研究ではそれら釧路/網走間の地域差が時期によって変動することを明らかにした。このことは、これまで「北海道東部」として一くくりにされてきた当該期の地域性、具体的にはヒト・モノ・情報のコミュニケーションのあり方が、北海道東部地域内においても細かく変動していることを示すものである。一方、サハリン以北の地域に関しては、東北大学・東京大学・国立歴史民俗博物館の所蔵する東北地方およびサハリン資料のデータ収集を継続した。これまで実体の不明瞭であったサハリンの土器群、特に鈴谷式土器、江の浦A式土器について、ある程度の見通しが得られた。前年度の研究対象が北海道地域では続縄文時代後半、サハリン以北ではアムール河口部であったので、本年度の成果とあわせると東北・北海道・サハリンの広域編年の見通しが一応ついたことになる。本研究は、続縄文時代後半期以降の土器群の広域編年を目的にしているが、本年度は北海道中央部(道央)に分布する後北C2・D式、サハリンに分布する鈴谷式・江の浦式・南貝塚式についてデータ収集を行い、そのデータと、これまで筆者が蓄積してきた北海道北部(道北)・東部(道東)地域の併行する時期の土器群のデータと比較し分析を試みた。後北C2・D式土器については、土器器面の文様単位数としてこれまで4単位・2単位の存在が指摘され、さらに筆者は道東に「単位なし(なりゆきの割付)」が存在することを明らかにしてきた。今回のデータ分析によって、道央においても「単位なし」の例は存在するが、道東より著しく少数であることが明らかになった。その一方で、その他の土器の製作技法に関しては道央・道東で著しい差がないことも確認された。これらのデータによって、土器型式伝播の具体的なメカニズムの一端を明らかにすることができる。すなわち、文様割付単位の情報が失われていることから、後北C2・D式の「故地」とされる道央から、道東へ土器型式が伝播する背景として、人の直接移住の可能性が薄いことがまず想定できる。しかしながら、土器づくり・文様施文の詳細な技法が道央・道東で共有されている背景としては、土器づくりの場で両者の密接なコミュニケーションが存在することを念頭に置かねばならない。現代の観察者の目から見れば摸倣しやすいと思われる「文様割付の単位」という情報が、より模倣が困難であると考えられる土器成形・調整・施文の技法よりもたやすく失われてしまう事実は、「土器型式の伝播」のモデルを考える上で重要な問題を提起すると思われる。一方、サハリンの土器群に関しては口縁部形態と文様要素についてデータ収集を行った。また、ロシア・ハバロフスク地方の研究者より、サハリン・アムール河口の土器のデータについてレクチャーを受けた。

これまで実体の不明瞭であったサハリンの土器群、特に鈴谷式土器、江の浦A式土器について、ある程度の見通しが得られた。前年度の研究対象が北海道地域では続縄文時代後半、サハリン以北ではアムール河口部であったので、本年度の成果とあわせると東北・北海道・サハリンの広域編年の見通しが一応ついたことになる。
地球規模の炭素循環に及ぼす方解石の役割

本研究では弱酸性域における方解石の溶解速度に及ぼすリン酸イオンおよびフタル酸イオンの影響について実験を行い、その結果、方解石が溶解する際に方解石表面および反応境膜内において起きる主な現象についての概要を把握することができた。以下に本研究によって得られた知見を示す。1.pH5においてリン酸イオン濃度が10^<-5>mole/dm^3以下では化学吸着による表面被覆により方解石の溶解速度は減少する。2.pH5においてリン酸イオン濃度が10^<-3>mole/dm^3以上では方解石の溶解速度は増大する。3.方解石の溶解反応は水素イオンおよびフタル酸イオンの拡散によって支配されている。4.フタル酸イオンを付加することにより、溶解速度の水素イオン濃度依存性は大きくなり、これは、反応境膜内で起きるフタル酸イオンの緩衝作用による。なお、リン酸イオンによる方解石の溶解速度の増加も同じ原因によるものと考えられる。天然水中のリン酸イオン濃度は平均的に10^<-7>mole/dm^3程度であるが、生活排水などによりその濃度が10^<-6>mole/dm^3付近に、あるいは局所的にはさらに高い値に達することもあり富栄養化などの問題を引き起こす原因となっている。本研究では、土壌や湖底堆積物中に含まれる主要鉱物の一つである方解石が、弱酸性領域において引き起こす様々な現象を検討することで、地球規模の炭素循環において炭酸塩岩とリン酸イオンには密接な関わりがあることを示した。本研究では炭酸塩鉱物として方解石(CaCO_3)を取り上げ、弱酸性溶液中における方解石の溶解速度を求めることにより酸性環境下における地球規模の炭素循環に及ぼす方解石の役割を考える。以下は本年度の研究において得られた知見である。(a)燐酸イオンの溶解速度に及ぼす影響溶解速度を求めるためには固液反応、溶液における炭酸の逐次酸解離、溶液中のCO_2濃度および雰囲気におけるCO_2分圧についての検討のみならず、不純物として湖沼や河川中に存在する様々な化学種について、さらには温度変化についての影響を考える必要がある。本実験では湖沼、河川等への家庭排水の混入を考慮し、共存イオンとして燐酸イオンを選び、その濃度を調整した希塩酸溶液に秋吉台産石灰岩を回分系にて溶解させ以下の結果を得た。(1)燐酸イオン濃度が1×10^<-5>mol/lの場合、その濃度に応じて溶解速度が減少する。(2)燐酸イオン濃度が1×10^<-4>mol/l以上の場合、溶解速度が増加傾向になる。(3)溶解速度の減少は燐酸イオンの試料表面へのラングミュアー型の吸着による。(4)燐酸イオン濃度を増加するにつれて溶液の緩衝作用が顕著になる。(b)SEM観察燐酸イオン濃度が増加するにつれて溶液の緩衝作用が大きくなる。これが境膜内でも起き、溶解速度を増加させていることを明かにするために試料表面のSEM観察を行った。その結果、緩衝作用により試料表面が激しく反応しながら溶解したのが確認できた。これは、弱酸性域での方解石の溶解速度の律速段階が境膜内の化学種の拡散過程から試料表面の反応過程に移行する為と考えられる。(c)解析(a)および(b)の結果をもとに、固体表面の境膜における水素イオン濃度の拡散過程を考慮した数学モデルを作成した。次年度では溶解実験を継続するとともに(c)のモデルにより実験結果を解析しその妥当性を考察する。本年度は弱酸性域における方解石の溶解速度に及ぼす緩衝剤の作用について検討した。天然水中の緩衝剤としてはリン酸などがあり、その濃度は平均10^<-7>mol/l程度である。しかし、生活排水などによりその濃度が10^<-6>mol/l付近に、あるいは局所的にさらに高い濃度になるため、そのような場合、いわゆる富栄養化などの問題を引き起こす可能性がある。

本研究では、土壌や湖沼堆積物中に含まれる主要鉱物の一つである方解石が、弱酸性領域において引き起こす様々な現象を検討することで、地球規模の炭素循環において炭酸塩岩とリン酸イオンの密接な関わりについて検討した。以下に得られた知見をまとめる。(1)pH5においてリン酸イオン濃度が10^<-3>mol/l以上では方解石の溶解速度が大きくなる。(2)pH5においてリン酸イオン濃度が10^<-5>mol/l以上ではリン酸の化学吸着により方解石の溶解速度が小さくなる。(3)方解石の溶解は水素イオンおよびリン酸イオンの拡散に支配される。(4)リン酸と同様の緩衝作用を持つと考えられるフタル酸を添加することにより、溶解速度の水素依存性は大きくなる。これは固液境膜におけるフタル酸の緩衝作用による。なお、上に述べた(1)もリン酸の境膜内の緩衝作用によるものと考えられる。
東南アジア医療福祉にみる看護・介護人材送出実態の実証研究：対日ＥＰＡ問題を中心に

本研究は保健医療人材の国際移動に関する学際共同研究であり、日本・東南アジア間で2008年より開始した経済連携協定(EPA)による外国人看護師・介護福祉士候補の送り出し・受け入れを軸として、送出諸国(インドネシア・ベトナムなど)の保健医療・教育・移住労働を先進モデル国であるフィリピンと比較つつ課題を分析した。送出諸国は、1990年代の中東・英米での受け入れ開放政策や2015年末のASEAN経済統合をうけて人材育成・学歴引き上げを急ぐが、受け入れ諸国との疾病構造や医療・教育制度の相違などから必ずしも即戦力にはならず、ポストコロニアル的紐帯が薄い日本では職場適応・定住化にも困難があるとわかった。交付申請書の計画に従い、まずEPAの制度的変遷と問題点を整理する国内研究会を開催し(2012年1月21日、於:天理大学梅田サテライト)、研究協力者の佐藤千鶴子(アジア経済研究所研究員)、岡田智幸(奈良東病院事務長)、野村愛(聖隷福祉事業団)の3氏を招聘して研究報告・意見交換を実施した。また、EPA候補者の学習・就労状況の研究分析を行うため、.研究協力者の尾形直子(NPO国際保健医療支援・研究センター事務局長)、有路智恵(上尾看護専門学校副学科長)、奥田尚甲(岡山大学客員研究員)らにより、外国人看護師候補の関西在住者30名に対して学習指導対策を行った(1月22日)。上記2つの活動をふまえて、外国人看護師候補・看護師12名と、厚生労働省・JICWELS・AOTS・JICA・受け入れ機関(3病院)・日本語学習指導者の18名を招聴し、プロジェクト・サイクル・マネジメント(PCM)手法を用いたワークショップを開催(2月26日)。EPA制度の当事者たちによる学習・就労問題の解決法模索を試みた。得られた成果は、PCMの専門ファシリテーターによってまとめられ、参加者全員にも還元された。海外での研究調査としては、2012年23月にかけて、東南アジア諸国で医療福祉制度と人材育成の現状調査が行われた。インドネシアでは奥島、池田光穂、研究協力者の合地幸子(東京外国語大学大学院博士課程)がジャカルタとジョグジャカルタの保健省・看護学校・介護施設を中心に、フィリピンでは奥島、鈴木伸枝、連携研究者の高畑幸(静岡県立大学)、研究協力者の野村愛がマニラ、スービック、サンボアンガの介護施設・看護栄校を、そして昨年11月にEPAによる介護福祉士候補派遣が決定されたベトナムでは、研究協力者の新美達也(中央大学大学院博士課程)がナムディン、ラムドン、ホーチミンの保健省・保健学校を中心に調査を実施した。最終年度にあたり、補足研究調査を継続するとともに、学会報告・執筆その他の成果の社会還元に努めた。まず、研究会議を6月に開催し、成果の取りまとめと今後の方向性の検討、継続研究課題の整理を行った。これに基づき、本年度はフィリピン政府機関における介護研修の実態を把握するとともに(鈴木)、これまで手薄だった東南アジア大陸部(タイ・ベトナム)における看護教育制度の研究調査・教材翻訳を進めた(永井、新美、奥田)。主な研究成果は、業績一覧にある池田・石川・奥島などの論文・書籍・学会報告で報告されたとおりである。また、アジア政経学会西日本大会では、連携研究者・研究協力者の数名により企画分科会2「保健医療人材のアジア域内移動」(2013年11月9日、大阪市立大学)を開催し、ASEANからの送り出し概況、インドネシア・ベトナムの現状と課題を報告した(奥島、永井、新美ほか)。その他の社会還元としては、HIDAで日本語研修中のEPA看護師候補を対象に、国家試験対策会(9月2829日、大阪市立大学)を実施し、日本的自立学習・受験準備を身につけるとともに、すでに就労中の合格者も講師やサポーターに招いて体験を語ってもらった。外部からの依頼に応じて、日本語教育学会・国際交流基金主催「看護・介護分野における日本語教育集中研修講座」や首都大学東京主催「看護と介護の日本語教育研究会」、静岡県内保健医療機関「ふじのくにEPAネットワーク」主催の会議などにおいて、講師・コーディネーターを務めた(有路、石川、尾形、奥島、奥田、高畑、野村)。本年度は、EPAによる保健医療人材の派遣をすでに開始したインドネシア・フィリピン調査(石川、池田、奥島、鈴木)に加えて、来年をめどに開始するベトナム(奥島、奥田、新美)、および依然検討中のタイ(永井)での現地調査を実施した。その結果、ASEAN職業互換認定制度の発効(2015年)をめざして、各国の保健医療分野が教育制度・資格制度の引き上げ、見直しを進めており、その一方で急激な変化に現場がついてゆけず問題も抱えていることが明らかになった。

また、国内では春秋2回の研究会議を開催し、研究成果をまとめるとともに、ゲスト講師として、現場でEPA看護師・介護福祉士候補を育成する権平美佐(フィリピン、トロピカル・ビレッジ・パラダイス職員)、瀧永哲(足利赤十字病院医師)、および来日した候補者の労働問題の助言・対処を引き受けている酒井恭輔(連合大阪ハートフルユニオン書記長・インドネシア総領事館労働問題顧問)の3名を招聘した。初年度は追加採択のため、実質的な活動期間が3か月ほどであったが、連携研究者・研究協力者11名の協力を得て、交付申請時の計画内容をすべて遂行することができた。また、EPAの所轄・受け入れ機関・候補者の積極的な協力を得て、当初の計画より多人数の意見を反映させて有意義なPCM分析を行うことも叶った。25年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の目標は、初年度にあまり進まなかった海外調査でフィリピン・ベトナム・タイの保健医療制度の概要とEPAの進行状況を把握することであったが、各メンバーにより順調に現地調査が行われた。また、国内調査でも、すでに国家資格を取得した元EPA候補者たちが抱える問題(日本語学習の継続、労働トラブル)や、日本での結婚・出産・家族呼び寄せなどの家族形成の問題について、候補者および現場関係者からの聞き取り調査を進めた。2012年度は、フィリピンとベトナムにおける保健医療分野の基礎データ収集・取材、およびまだEPAによる人材受け入れが開始されていないタイの現状調査を優先的に進める。また、国内においては外国人保健人材の定住化に伴う雇用契約トラブル、帰国費用・住民税の負担、家族呼び寄せなどの社会問題が徐々に増えており、その研究調査を進める。本研究の最終年度にあたり、国内外での補足調査を進めると同時に、研究成果の吟味とまとめ方の検討を進めてゆく予定である。国内調査として、労働トラブルに比べてメディアなどでもとりあげにくい家族形成の問題を引き続き聞き取り調査などから収集する。家族形成と職場の方針の齟齬(結婚や出産による休暇申請を雇用種側が嫌がる、禁止するなど)、本国の配偶者・家族との交渉(単身赴任を続ける、断念する、日本に呼び寄せるなど)についての事例をさらに集め、国・民族間のライフプランやキャリア形成に関する意識の違いを明らかにしたい。また、時間・費用負担の大きいEPAに比べて、中国人などの看護生の留学・就学を好む医療・福祉機関が増えてきているが、個別のケースだけでなくある程度全国的な動向としてとらえる方法を模索したい。海外調査としては、日本語教育が始まったベトナムにおけるEPAの選抜・養成課程を引き続き観察するとともに、他のASEAN諸国の新たな動向などがあれば、随時補足してゆく。最終成果のまとめとしては、年23回の研究会議を開催するとともに、日本におけるEPA候補者の学習に関する改善案をまとめたり、移民政策や日本語教育などの学会においてパネルないし個人発表を行う予定である。
イスパノアジアとしてのフィリピン諸島：物質資料と文献資料によるメキシコとの比較史

本研究では、アジア地域において唯一のスペイン領であったフィリピン諸島で生じたイスパノ化のプロセスが、メキシコの場合とどう類似し、どう異なるのかを検討する。そうすることで、「フィリピン諸島における信仰と物質文化が、スペイン統治下で多様な担い手によって取捨選択あるいは翻案、受容されるプロセスを物質資料と文字資料の両面から解明する。その際に、スペイン人と現地住民だけではなく、商人から奴隷まで交易ルートを介して往来する者たちによる複雑な関係の中で植民地構築のプロセスを捉え直すメキシコ植民地史研究の新潮流の知見を援用し、フィリピン諸島の場合を分析する。
細胞内イオン環境の時空間変動による細胞可塑性の光制御

本年度はこれまでに構築した光刺激することができる神経筋接合部(NMJ)モデルを用いて、細胞活動に対するNMJ形成の変化を調べた。神経細胞もしくは筋芽細胞に個別に光応答性イオンチャネルスイッチ(CatCh+)遺伝子を組み込み、筋管細胞を形成後、神経細胞を共培養していくつかの条件の異なる光刺激を加えた。免疫蛍光染色によるアセチルコリン受容体(AChR)の局在を調べたところ、筋細胞刺激群においてAChRクラスターの総数の増加が認められた。一方、神経細胞刺激郡においてはAChRクラスター数、面積、長さに関して刺激との相関は見られなかったが、神経突起と隣接して局在するクラスターの割合が上昇していた。また神経細胞を刺激し、生じる筋収縮を観察すると神経細胞刺激郡において刺激に対する応答性が向上していた。以上から前シナプスである神経細胞と後シナプスである筋細胞をそれぞれ特異的に任意の時間やパターンで独立して光刺激することができるNMJ形成モデルの系を構築することができた。神経筋共培養下でのAChRの集積は筋細胞特異的に、NMJの形成は神経細胞特異的にそれぞれの活動依存性に亢進することが示唆された。今後刺激の強度や頻度、時期、持続時間などの条件検討を行う。また活動を抑制する光スイッチ等を用いて、NMJの形成や維持に対して細胞の電気的活動がどのような分子を制御しているのかなど、その分子機構についてさらなる検討を進める。細胞内外環境の恒常性維持が細胞の生存、活動にとって本質的意味を持っているが、細胞の運命決定における細胞内イオン動態との連関については明らかとなっていない。本研究課題は細胞の内外を隔てる原形質膜と細胞質内を隔てる小器官膜を介したイオン輸送による細胞内イオン動態が細胞機能の可塑性に果たす役割を明らかにすることを目的とする。本年度はイオン輸送を生じさせる刺激を与えた時の遺伝子発現やカルシウム応答を検討した。光受容イオンチャネル・チャネルロドプシン(ChR)遺伝子を筋芽細胞に導入し光刺激を与えると、いくつかの筋分化制御因子の発現の量やパターンの変化が見られた。また細胞融合に関与する転写調節因子の発現亢進が認められた。そこで、誘導初期にパルス状の光を2時間照射し、分化培養5日目に免疫染色により形成されている筋管細胞の評価を行った。形成された細胞はコントロール群と比較して、取り込まれた核の数や太さが増加しており、肥大化してることが認められた。ChRを用いた光刺激が筋芽細胞の融合を促進させることで筋管細胞の成長、肥大化を引き起こしていることが示唆された。部位特異的に局在する光スイッチを細胞に導入し、原形質膜と細胞質内を隔てる小胞体膜を介するイオン輸送を選択的に制御できるか検討を行った。同一細胞における細胞質内および小胞体内カルシウム変化をカルシウム感受性蛍光プローブYCaMPおよびR-CEPIA1erを用いて定量的に解析を行った。形質膜型ChRを導入した細胞において、細胞質カルシウム濃度の上昇が観察された。小胞体膜局在型ChRを導入した細胞においては、光の照射に伴って細胞質カルシウム濃度の上昇および小胞体内カルシウム濃度の低下が観察された。光照射により細胞外からのイオン輸送と細胞内のイオン輸送を区別して操作することができたと考えられる。当初予定していた研究計画について、上述の通りの研究成果を挙げることができている。本研究では細胞活動を規定する細胞内イオン動態をコントロールし、細胞機能の調節機構を明らかにすることを目的としている。本年度は神経細胞を特異的に光刺激することができる神経筋接合部(NMJ)形成モデルを構築し、NMJ形成の神経細胞活動に対する変化を調べた。成熟した筋の性質の維持と同様に、NMJの形成・維持の過程においても神経細胞と筋細胞間の活動依存的な調節機構が働いていることが考えられる。In vitroで筋管細胞(C2C12)を形成後、光受容イオンチャネル・チャネルロドプシン(ChR)遺伝子を導入した神経細胞(NG108ー15)を共培養し、4日間の青色光刺激を与えた。カルシウム蛍光タンパク質R-GECO1を用いてカルシウム変化を観察したところ、光照射に同期した細胞内カルシウム濃度の上昇が観察された。また、その応答は照射した光の強度依存的に変化し、シグナルの大きさを光強度によってコントロールできることを確認した。免疫蛍光染色によりアセチルコリン受容体(AChR)の局在を調べたところ、刺激群においてAChRクラスターの総数の増加と、Neurofilament-H(NF-H)陽性の突起に隣接するクラスターの割合の上昇が認められた。一方、クラスターの面積、長さについては差異は見られなかった。また神経細胞への光刺激により誘導される収縮応答性が向上していた。神経筋共培養下での光刺激による神経細胞特異的な電気的活動の変化は、筋細胞におけるAChRの集積を促進することが示唆された。

一方、神経細胞刺激郡においてはAChRクラスター数、面積、長さに関して刺激との相関は見られなかったが、神経突起と隣接して局在するクラスターの割合が上昇していた。また神経細胞を刺激し、生じる筋収縮を観察すると神経細胞刺激郡において刺激に対する応答性が向上していた。以上から前シナプスである神経細胞と後シナプスである筋細胞をそれぞれ特異的に任意の時間やパターンで独立して光刺激することができるNMJ形成モデルの系を構築することができた。神経筋共培養下でのAChRの集積は筋細胞特異的に、NMJの形成は神経細胞特異的にそれぞれの活動依存性に亢進することが示唆された。今後刺激の強度や頻度、時期、持続時間などの条件検討を行う。また活動を抑制する光スイッチ等を用いて、NMJの形成や維持に対して細胞の電気的活動がどのような分子を制御しているのかなど、その分子機構についてさらなる検討を進める。平成29年度は筋芽細胞の分化を促進した細胞内イオン輸送の光制御の実験系を幹細胞の分化に適用する。光照射による律動性、非律動性の生理的刺激を与え、形態や遺伝子発現、タンパク質量、電気生理特性などを指標に形態的、機能的な側面から細胞分化機構を検証する。シグナル伝達経路の解析およびシナプス後細胞の電気的活動に対する変化を調べる。また細胞活動に伴い細胞内のイオン変化が生じるが、異なる経路を介したイオン輸送が異なる細胞機能を調節していることが考えられ、原形質膜と細胞内小器官膜を介するイオン輸送を選択的に制御する必要がある。これまでに開発を進めている小胞体特異的に発現する光スイッチ分子の機能解析と応用を試みる。刺激条件の検討が順調に進んだこと、検討する遺伝子群を効率的に絞りこむことができたことから消耗品費を節約することができ、未使用額が生じた。当初の予定通りに予算を執行することができたが、全て使い切らなかったため、次年度使用額が生じた。残額は翌年度の本研究推進に必要な消耗品の購入費やDNAアレイ、ELISAアレイ、定量PCR用酵素も含めた合成オリゴの費用にあてる。幹細胞分化における細胞活動の人為的介入を検証するため、遺伝子スクリーニングのためのDNAアレイ、サイトカインやケモカインの定量解析のためのELISAアレイ、定量PCR用酵素も含めた合成オリゴの費用にあてる。
激甚型高温酸化利用経年強化傾斜機能遮熱コーティング

昨年までの研究で,遮熱コーティング(TBC)における基材との界面強度向上には,ボンドコートの化学組成を最適化することにより,ボンドコート(BC)内部で高温酸化が進行する内方拡散酸化物の形成が有効であり,金属セリウムやセラミックスであるセリウム酸化物をボンドコート材料であるCoNiCrAlYに添加することが有効であることを示してきた.また,溶射条件の最適化により酸化物の形成を制御可能か否かに関し,検討を行い,溶射プロセスによって,内方拡散TGOの生成度合いが異なり,これまで耐酸化の観点から使用されてこなかった大気圧プラズマ溶射法による成膜が最も良好な内方拡散TGOを生成させることを明らかにした.また,同様の化学組成を有する粉末粒子であっても粒径が細かくなるほど表面積の割合が増え,内方拡散TGOが生成しやすいことを明らかにした.これらのプロセス,粒子を用いたTBCに関し,4点曲げ試験による界面強度評価を実施し,はく離が生じないといった極めて良好な結果を得ることができた.以上の結果から,BC粒径および溶射方法を変化させることによって,セリウム酸化物添加同様の内方拡散酸化物を形成させることに成功した.しかし,熱処理条件によっては,酸化皮膜が厚くなりすぎ,基材まで酸化する場合が確認された.そこで,今年度は耐酸化を目的とした緻密なBCと耐はく離性を目的とした内方拡散酸化物を含むBCの2層化技術の開発を行った.その結果,内部酸化の少ないBC上に内部酸化の多いBCを成膜し,高温曝露を行った場合,内部酸化の少ないBCは酸化し難いことを明らかにした.また,二層BCを有するTBCは,縦割れの基材への到達を抑制でき,引張に対して高い耐はく離特性を有することを示した.以上の結果から,本研究で開発したBCを使用することで,使用することで酸化が顕著になり,界面強度が向上する可能性が考えられる.今年度は,遮熱コーティング(TBC)の高温長時間利用によるはく離を抑制する目的で,ボンドコート材料へ活性なセリウム(Ce)を微量添加し,激甚型高温酸化を積極的に生成・成長させることで耐はく離性の向上を試みた.Ce添加により,TBC/ボンドコート界面からボンドコート側へ生成・成長する熱影響酸化物を得ることに成功し,Ce添加量を増加させることにより,熱成長酸化物が厚くなることも明らかとなった.しかし,Ce添加ボンドコートを用いた場合,内方拡散する厚い熱成長酸化物(激甚型高温酸化物)は,TBCが使用されるガスタービン動翼の実機使用温度よりも高い1000°C以上の環境でないと生成しないことがわかった.そこで,実機使用温度においても激甚型高温酸化物が生成するよう金属CeからCe酸化物粒子に変更し,Ce酸化物添加ボンドコート材料を開発した.その結果,実機使用温度以下でも激甚型高温酸化物を生成させることに成功した.このCe酸化物添加ボンドコートを用いたTBCの界面はく離強度は,従来から使用されているボンドコート材を用いたTBCに比べ,顕著に高い界面強度を示し,4点曲げ試験によるひずみ量で3%以上の負荷においてもはく離が発生しなかった.これまでのTBCでは,ボンドコート材料の化学組成を最適化し,熱成長酸化物層を生成させないことが重要とされていたが,本研究の成果はそれとは全く異なる逆転の発生であり,激甚型高温酸化層に微細なき裂が入りやすいことによるはく離応力の緩和が効果的であることを世界で初めて示したものである.また,このCe酸化物添加ボンドコートとトッポコート材料であるイットリア安定化ジルコニアを混合させ,配合比を変化させた傾斜機能TBCの開発に着手しており,コールドスプレー法という粒子を固相のまま基材へ衝突させ成膜する手法を用いることで成膜の目処を得ている.従来の遮熱コーティング(TBC)においては,トップコートとボンドコートの界面に生成する熱成長酸化物が,ガスタービンの起動/停止により,熱応力を発生させるために界面はく離の主要因とされていた.そのため,熱成長酸化物を如何に生成させない材料を開発するかに注目が集まっていた.本研究では,逆転の発想により,熱成長酸化物を木の根状にボンドコート内部へ積極的に生成・成長させることにより,応力負荷による縦方向の微細き裂を多く発生させ,内部応力を緩和させることで耐はく離特性の飛躍的な向上に成功している.さらに,熱成長酸化物層を得るためには,Ce添加が効果的であることを示し,さらにCe酸化物粒子の添加がより酸化物生成に有効であることを明らかにした.その結果,ガスタービン実機使用温度以下であっても十分に厚い熱影響酸化物を生成させることに成功している.この厚い熱成長酸化物(激甚型高温酸化物)により,4点曲げ試験による界面強度評価において3%以上のひずみを負荷してもTBCのはく離は発生せず,信頼性の高いTBCの開発に成功している.また,このボンドコート材料とトップコート材料の混合比を徐々に変化させた傾斜機能TBCの開発を試み,コールドスプレー法による成膜の目処を得ている.これには,ボンドコート材料にナノオーダーのトップコート材料を造粒法で混合・製造した粉末を用いることが成膜性に有効であることも示した.

これまでの代表らの研究によって,遮熱コーティング(TBC)の皮膜界面強度向上には,ボンドコート(BC)内部に成長する酸化物が有効であり,この内方拡散酸化物が厚くなればなるほど,界面強度が増加する傾向にあることを示してきた.昨年度はこの内方拡散酸化物の形成に内部酸化促進効果の高いセリア(CeO2)を添加することが効果的であることを明らかにした.今年度は,希土類元素であるCe等を含む酸化物の添加の他に,溶射条件の最適化により酸化物の形成を制御可能か否かに関し,検討を行った.種々の粒径のBC材料およびBC溶射方法を用いることにより,BCに内部酸化を導入したTBC試験片を作製し,これらのTBC試験片の内部酸化導入量および耐はく離特性を評価した.溶射プロセスによって,内方拡散TGOの生成度合いが異なり,これまで耐酸化の観点から使用されてこなかった大気圧プラズマ溶射法による成膜が最も良好な内方拡散TGOを生成させることを明らかにした.また,同様の化学組成を有する粉末粒子であっても粒径が細かくなるほど表面積の割合が増え,内方拡散TGOが生成しやすいことを明らかにした.これらのプロセス,粒子を用いたTBCに関し,4点曲げ試験による界面強度評価を実施し,試験治具の限界までひずみを与えてもはく離が生じないといった極めて良好な結果を得ることができた.以上の結果から,BC粒径および溶射方法を変化させることによって,CeO2添加同様の内方拡散酸化物を形成させることに成功した.しかし,熱処理条件によっては,酸化皮膜が厚くなりすぎ,基材まで酸化する場合が確認された.そこで,今後は耐酸化を目的とした緻密なBCと耐はく離性を目的とした内方拡散酸化物を含むBCの2層化技術を開発する必要があると考える.傾斜機能TBC(Functionally Graded TBC : FG-TBC)は,ボンドコート(BC)/トップコート(TC)比率を徐々に変化させ,熱応力の緩和を目的としたTBCである.BC材料のCoNiCrAlY合金とTC材料のイットリア安定化ジルコニア(YSZ)はそれぞれ成膜プロセス,成膜条件といった成膜性が異なるが,傾斜機能化させる場合はこれらを一つのプロセスで成膜する必要がある.そこで,本研究では金属ならびにセラミック成膜で実績のあるコールドスプレー(CS)法を適用した.CS法は,窒素ガス等により加速させた固相粒子を基材へ衝突させることによって成膜を行う技術であり,粒子の融点以上の温度で成膜を行う溶射法に比べて,熱影響が小さく,成膜速度も速いという特徴がある.本研究においては,成膜性の向上の観点から,昨年度の研究でCoNiCrAlYとYSZそれぞれの微小粒子を混合させて焼結させた配合比の異なる数種のサーメット粒子開発し,CS法によってFG-TBCの成膜に成功してきた.しかし,配合比の異なるサーメット層間の強度が十分ではなく,今年度の研究においては,酸化物の積極的利用による界面強度の改善に着手した.活性なセラミック粒子であるセリアの添加,さらには溶射条件や粒子径の最適化により,層間にくさび的に作用する酸化物を生成させ,良好な界面強度を得ることに成功しており,概ね順調に進展している.ただし,界面強度にはばらつきが大きく,次年度はこの改善も進める予定である.昨年までの研究で,遮熱コーティング(TBC)における基材との界面強度向上には,ボンドコートの化学組成を最適化することにより,ボンドコート(BC)内部で高温酸化が進行する内方拡散酸化物の形成が有効であり,金属セリウムやセラミックスであるセリウム酸化物をボンドコート材料であるCoNiCrAlYに添加することが有効であることを示してきた.また,溶射条件の最適化により酸化物の形成を制御可能か否かに関し,検討を行い,溶射プロセスによって,内方拡散TGOの生成度合いが異なり,これまで耐酸化の観点から使用されてこなかった大気圧プラズマ溶射法による成膜が最も良好な内方拡散TGOを生成させることを明らかにした.
門脈内脂肪酸注入の腎血行動態に及ぼす効果

昨年度の本研究において,門脈内へ投与したオレイン酸が糸球体瀘過値(GFR)を増加させることを明らかにした.本年度は,肥満において血中濃度の上昇が認められるレプチンの腎機能ならびに腎交感神経活動への効果を検討した.麻酔下雄性Sprague-Dawleyラットの左腎神経束にステンレス電極を装着し腎交感神経活動および単位時間あたりのバースト数をコンピュータに記録した.併せて,膀胱尿,動脈血を経時的に採取し,腎クリアランス実験を行った.リコンビナントマウスレプチン1mg/kg BWを静注し,尿量,尿中電解質排泄量,イヌリンクリアランスによるGFRを測定し,腎交感神経活動を記録した.平均血圧,心拍数,GFRに有意な変動は認められなかった.腎交感神経活動はレプチン投与開始後0-30,30-60,60-90,90-120分において,前値の23,29,43,61%増加し,120-150,150-180分でも前値の54,52%の増加が持続した.一方,尿中ナトリウム排泄量は,前値の707nEq/100gBW/minからレプチン投与後の0-30,30-60分ではそれぞれ2056,2517nEq/100gBW/minへ増加したが,その後は1343,948,784,683nEq/100gBW/minと漸減した.ナトリウム排泄分画もこれと平行して変化した.以上よりレプチンは尿細管でのナトリウム再吸収を抑制する一方,腎交感神経活動を亢進させ,両者のバランスによりナトリウム排泄が規定されるものと推測された.肥満においてはレプチン,遊離脂肪酸等の液性因子が複合的に腎に作用して,GFRの増加,腎交感神経活性の亢進,ナトリウム貯留という特異な腎機能の変化をもたらし,高血圧の発症に関与する可能性が考えられる.バルビタール麻酔下雄性Sprague-Dawley系ラットに,腸間膜静脈を介して門脈内へ生理食塩水に溶解した10mMオレイン酸ナトリウムを0.45ml/100gBW/hrの速度で注入し,イヌリンの持続静注下に腎クリアランス実験を行った.門脈内へのオレイン酸素投与により,尿量,糸球体濾過値,尿中ナトリウム排泄量は,生理食塩水単独投与に比してそれぞれ170,165,129%増加した.一方,前処置として両側腎除神経を行ったラットでは,オレイン酸を門脈内へ投与しても,上記のパラメータはいずれも変化しなかった.別のSprague-Dawley系ラットを同様に麻酔し,側腹切開にて左腎神経を露出し,電極を装着し,腎交感神経活動を血圧,心拍数とともに連続記録した.単位時間あたりのバースト数で示される腎交感神経活動は,オレイン酸の門脈内投与により前値の約60%へ減少した.以上より,門脈内へのオレイン酸投与は,糸球体濾過値を増加させることが確認され,その機序として腎交感神経の抑制を介する腎血管拡張作用の関与が推測された,肥満者では,代謝回転の速い内臓脂肪の蓄積により,門脈内へのオレイン酸を含めた遊離脂肪酸の流入が増加していると考えられる.今回の検討で明らかになった,遊離脂肪酸による糸球体濾過の増加とナトリウム排泄の増加は,それ自体は高血圧に拮抗すると考えられる.一方,臨床においては,肥満,とくに内臓脂肪型肥満では,高血圧を合併する頻度が赤いことが知られている.今後は,オレイン酸素の慢性投与の効果,交感神経賦活作用を有し,肥満において脂肪組織での産生が増加するレプチンとの相互作用を含めて,肥満と高血圧の関連についてさらに検討を進めたい.昨年度の本研究において,門脈内へ投与したオレイン酸が糸球体瀘過値(GFR)を増加させることを明らかにした.本年度は,肥満において血中濃度の上昇が認められるレプチンの腎機能ならびに腎交感神経活動への効果を検討した.麻酔下雄性Sprague-Dawleyラットの左腎神経束にステンレス電極を装着し腎交感神経活動および単位時間あたりのバースト数をコンピュータに記録した.併せて,膀胱尿,動脈血を経時的に採取し,腎クリアランス実験を行った.リコンビナントマウスレプチン1mg/kg BWを静注し,尿量,尿中電解質排泄量,イヌリンクリアランスによるGFRを測定し,腎交感神経活動を記録した.平均血圧,心拍数,GFRに有意な変動は認められなかった.腎交感神経活動はレプチン投与開始後0-30,30-60,60-90,90-120分において,前値の23,29,43,61%増加し,120-150,150-180分でも前値の54,52%の増加が持続した.一方,尿中ナトリウム排泄量は,前値の707nEq/100gBW/minからレプチン投与後の0-30,30-60分ではそれぞれ2056,2517nEq/100gBW/minへ増加したが,その後は1343,948,784,683nEq/100gBW/minと漸減した.ナトリウム排泄分画もこれと平行して変化した.以上よりレプチンは尿細管でのナトリウム再吸収を抑制する一方,腎交感神経活動を亢進させ,両者のバランスによりナトリウム排泄が規定されるものと推測された.

肥満においてはレプチン,遊離脂肪酸等の液性因子が複合的に腎に作用して,GFRの増加,腎交感神経活性の亢進,ナトリウム貯留という特異な腎機能の変化をもたらし,高血圧の発症に関与する可能性が考えられる.
細胞間コミュニケーションを指向した1次元MOFによる細胞膜間物質輸送系の構築

本研究では、複数の細胞を繋ぐことによる細胞間コミュニケーションにより行うことを究極の目標とし、その目標に向かい、本挑戦的萌芽研究では、新たな細胞間コミュニケーションを生み出すために細胞間を繋ぐ分子カニューレとしての「1D MOF」を合成することを目的とした。本研究では、数種類の大環状金属多核錯体を合成し、それらを架橋配位子で連結することで、1D MOFを合成した。1D MOFは、内部にイオンや分子を透過できるサイズの孔を持つため、細胞を繋ぐ分子カニューレとしての展開が期待できる。細胞間の情報や物質の伝達は、細胞間のシグナルや物質の放出・受容を介して行われるが、細胞間を物理的に繋ぎ、選択的な物質輸送を可能にすれば、新しい複合的な細胞系を生み出すことができるかもしれない。例えば、2つの細胞間でそれぞれの酵素反応系を結びつけることにより、効率的な有用物質生産が期待できる。現在のバイオテクノロジーで遺伝子組み替えを経て行っている人為的な生物的物質合成を、複数の細胞を繋ぐことによる細胞間コミュニケーションを創出することで行うとする目標のもと、本挑戦的萌芽研究では、新たな細胞間コミュニケーションを生み出すために細胞間を繋ぐ分子カニューレとしての「1D MOF」を合成し、二つの細胞膜間物質輸送系の構築を目的としている。多孔性配位高分子(MOF)のチャネル構造を1次元(1D)的に切り出した構造とみなせる、Paddle-Wheel型錯体をもとにした中空カラム状分子1D MOFを合成し、ディスクリートなナノチューブ状の構造であることを明らかとした。金属イオン、配位子、チャネルサイズや長さ、チャネル内部官能基を可変パラメータとし、多種類の1D MOFを合成した。本年度予定をしていたとおり、多孔性配位高分子(MOF)のチャネル構造を1次元(1D)的に切り出した構造とみなせる、Paddle-Wheel型錯体をもとにした中空カラム状分子1D MOFを、金属イオン、配位子、チャネルサイズや長さ、チャネル内部官能基を可変パラメータとし、多種類合成した。また、ナノチューブ内部へのゲスト分子導入についても検討を行った。本挑戦的萌芽研究では、新たな細胞間コミュニケーションを生み出すために細胞間を繋ぐ分子カニューレとしての「1D MOF」を構築することを目的とし、研究を進めた。本年度は、1ナノメートルサイズの物質透過が期待できる、新しい1D MOFの合成を検討した。我々はこれまでに、イミン形成反応を用い、4つのジベンゾチオフェンを4つのサレン金属配位子で連結した大環状分子の合成に成功した。本研究では、この大環状化合物のサレン配位子にそれぞれ五配位型や六配位型の金属イオンを導入し、大環状金属錯体同士を架橋配位子によって架橋することにより、ケージ型錯体やチューブ型錯体の生成が期待できると考え、亜鉛イオンを導入した大環状亜鉛錯体を合成した。この大環状亜鉛錯体と架橋配位子DABCOから、1D MOFのモデルとなるケージ型錯体を合成した。1H NMR、元素分析および側鎖の短い大環状亜鉛錯体のX線結晶構造解析より、ケージ型錯体の形成を明らかとした。さらに、亜鉛イオンを導入した大環状金属錯体とケージ型錯体の構造解析および、その内部空間への分子導入を検討するために、ホスト分子としての分子認識能について詳細に検討した。1D MOFの空孔内への分子集積・透過および、その選択性の平衡論的な解析を行うとともに、空孔の構造制御による分子選択性の制御の検討を行う。また、1D MOFを用いた細胞膜モデルを介した物質輸送についても検討を行う。分子組織化学
スキルス胃がんの浸潤及び腹膜播種に関与する新規チロシンリン酸化タンパクの同定

スキルス胃がんの進展に関与するチロシンリン酸化タンパク質を新規に同定することを目標に実験を進めた。当初は胃がんと周辺細胞との共培養によるリン酸化タンパク質を探索したが検出することができなかった。そこでびまん性胃がんでの遺伝子増幅が高頻度に認められているFGFR2とMetに着目し、下流のリン酸化標的タンパク質を探索した。抗受容体抗体と抗リン酸化抗体で段階的に精製したタンパク質を質量分析法で解析した結果、各々の細胞株から約200の候補タンパク質を同定した。検出スコアや細胞株間比較から絞り込んだ候補タンパク質は、スキルス胃がんの増殖や運動に深く関与していることが明らかになった。難治がんであるスキルス胃がんの浸潤や腹膜播種に関わるリン酸化タンパク質を新規に同定することを目的とした実験を行った。研究計画の通りにスキルス胃がん細胞株と間質線維芽細胞との共培養によってチロシンリン酸化の亢進が認められるタンパク質を検出することを試みた。現在のところまだ再現性良く共培養でのみリン酸化が認められるような条件を定めることができていないため、今年度も引き続き培養条件の改良を行っている。一方、一部のスキルス胃がんではFGF受容体の増幅によりFGFシグナルが亢進していることが知られており、それががん細胞の増殖や浸潤転移に深く関わっていると考えられる。実際にFGFR2の増幅がみられるスキルス胃がん細胞株で受容体のノックダウンを行うとアポトーシスが誘導されて細胞の増殖が強力に抑制された。そこで、これらFGFシグナルが亢進しているスキルス胃がん細胞で特異的にチロシン残基がリン酸化されるタンパク質の探索を試みた。FGF受容体の阻害剤処理を行った細胞をネガティブコントロールとし、チロシンリン酸化抗体の免疫沈降で濃縮されるタンパク質のバンドを質量分析法で同定し、複数の候補分子を見出した。その中でもFGFシグナル下流で重要な機能を有する可能性のある2つの新規タンパク質に注目しており、現在これらの機能解析を進行中である。難治がんであるスキルス胃がんの増殖や浸潤、腹膜播種等に関与するチロシンリン酸化タンパク質を新規に同定することを目標に実験を進めている。昨年度はFDFR2の増幅及び活性化の見られる複数のスキルス胃がん細胞株におけるチロシンリン酸化タンパク質を同定した。スキルス胃がんではFGFR2シグナルと同様にMetシグナルの高活性化も高頻度に認められることから、今年度はこの2つの受容体活性化細胞株をそれぞれ用いて比較を行いながらさらに探索を進めた。それぞれの受容体に結合してかつリン酸化制御を受けているタンパク質を2段階免疫沈降法にて精製し、質量分析で同定を行った。その結果、両受容体に共通するリン酸化タンパク質は少数であり、重要と考えられる多くの新規のタンパク質はFGFR2もしくはMet高活性化細胞株にて特異的にリン酸化制御を受けていた。最終年度である次年では、これまでに同定した複数のタンパク質についてスキルス胃がんの生存や悪性度への寄与をvitro及びvivoにて解析し、がん治療に対する標的分子と成り得るかどうか検証を進める予定である。難治がんであるスキルス胃がんの増殖や浸潤、腹膜播種等に関与するチロシンリン酸化タンパク質を新規に同定することを目標に実験を進めた。研究開始当初はスキルス胃がんと線維芽細胞を共培養することで新規にリン酸化するタンパク質の発見を目指して様々な条件下での共培養を試みたが、ウェスタンブロットや銀染色レベルでは共培養特異的な変化を検出することができなかった。そこでスキルス胃がんでの遺伝子増幅と活性化亢進が高頻度に認められている膜型チロシンキナーゼFGFR2とMetに着目し、これらの遺伝子増幅のある胃がん細胞株でのリン酸化標的タンパク質を探索する方針へと変更した。FGFR2活性型胃がん細胞株とMet活性型胃がん細胞株をそれぞれ2種類ずつ用いて抗受容体抗体と抗リン酸化抗体の段階的なタンパク質精製を行った。質量分析法で精製タンパク質を解析した結果、それぞれの細胞株で約200の候補タンパク質を同定することができた。検出スコアのしきい値を上げて細胞株間比較を行い、FGFR2活性化型は25、Met活性化型は42の候補タンパク質まで絞り込んだ。なお、今回FGFR2型の候補とMet型の候補で共通するタンパク質は同定されなかった。同定した個々の候補タンパク質を評価した結果、スキルス胃がんの増殖に関与しているタンパク質Aと運動に関与しているタンパク質Bが明らかとなり、現在これらの詳細な機能解析を進行し論文執筆の準備に入っている。当初予定していたスキルス胃がん細胞株とがん関連線維芽細胞(CAF)との共培養については実験系が安定しないための条件検討の段階で停止しているが、代わりに行ったFGFR2とMetの下流分子の探索は順調に進行し、重要と考えられる分子を既に見出している。

分子細胞生物学同定した複数のタンパク質についてスキルス胃がん進展に対する重要性を検討する。まずは発現量やリン酸化部位の欠損による影響を観察し、影響の認められる分子について作用メカニズムの解明を行う。また創薬標的などがん治療への可能性について検討する。計画していたスキルス胃がん細胞とがん関連線維芽細胞(CAF)の共培養の条件が定まっていないために遅れが出ている。当初予測していた以上に共培養によるリン酸化の検出が困難であり、もし仮説通り2種の細胞の物理的な接触によって新たにリン酸化されるタンパク質が存在していたとしても、それを再現良く検出できる培養条件を定めるのはとても難しいことが判明した。そこで途中から予定を変更し、共培養と並行してスキルス胃がんを含む一部のがんで重要と考えられるFGF受容体の増幅に注目することにした。FGF下流のチロシンリン酸化タンパク質の探索は順調に進行している。抗体の購入など概ね予定通りの使用であったが、次年度も高額の使用を予定しているため繰り越しを行った。今後はFGF受容体増幅による亢進するリン酸化タンパク質の探索によって同定した2つの分子ががん悪性度増進にどのような形で寄与しているかを明らかにすることをまずは目標とする。細胞株間比較によりこれらタンパク質の発現量はどのがん細胞株でもほぼ同様に発現しているのも関わらず、FGFR2の増幅がある細胞株でのみ強いチロシン残基のリン酸化が観察されており、FGFシグナルの下流でのリン酸化が何らかの役割を担っていると考えられる。リン酸化部位の特定やその部位の変異体を用いて機能解明を進める予定である。抗体やRNAiやマウスの購入など同定したタンパク質の機能解析を行うために使用する。また、論文の執筆にも充てる。当初の研究計画では質量分析法で同定した分子の確認実験のために多くの抗体を購入する予定であったが、研究が予定通りに進展していないため。前年度に予定していた抗体等の試薬の購入に充てる。