hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本型ダークツーリズムの確立と東北の復興を目指して

この3年間で、一般にはあまり知られていなかったダークツーリズムという名称と概念が広く知られるようになり、研究の認知度は飛躍的に高まったといえる。また、学術界においてもダークツーリズムの名を冠した研究会や研究プロジェクトが見られるようになり、研究の深化も進んだと言ってよい。研究メンバーも、アカデミックのみならず一般社会への研究のアウトリーチにも心を砕いてきた。3年間の成果としては、「日本型ダークツーリズム」と言う概念が、慰霊や共感に軸足をおいたもので、これをヨーロッパに対してもっと強力に発信していくべきではないかという確信を持つに至った。ダークツーリズム概念をより一般に浸透させるべく奮闘しているが、ネットメディアはもちろんのこと、かなり多くの新聞・雑誌に取り上げられるとともに、ラジオ等の電波メディアでも紹介されてきた。但し、高齢者層への浸透度がまだ十分では無いようで、より一層の奮起が必要であると考えている。2015年度は大きく研究が進んだ年であったが、同時に当該研究テーマのゴールと目指すべき具体的方向性が明確になってきた年でもあった。戦争や災害の後を巡る悲劇の旅をダークツーリズムと呼ぶヨーロッパ起源のこの概念は、日本では観光学が果たして観光学が扱うべき領域なのか否かという点で再考が迫られている状態であると言って良いであろう。日本で観光といえば、楽しい営為を想像することが通例であり、ダークツーリズムのように胸に突き刺さるような経験を「観光」と言う言葉で扱うことは無理があるといえるかもしれない。それ故、研究代表者の体験においても、観光系の学会でダークツーリズムに関連した発表を行うと、多くの批判を浴びることがあった。一方、当該研究テーマを情報系、経済系、芸術系などの学会で発表すると、その意味内容や趣旨は広く支持を受けることになり、賛同者を増やすことが出来た。このように考える時、ダークツーリズムがもはや観光学の一分野を構成すると考えるのではなく、もっと別の学際的な存在なのではないかと確信するに至っている。研究の最終年度では、「別の学際的な存在」というものの内実を、より詳細に解き明かしたいと考えている。観光学より一層の現地調査を重視し、机上の空論に陥らないように研究を続けていく所存である。問題になるのは、震災遺構の保存等で現在の被災者の要望と乖離した学説を出さなければならい点であるが、これに関しては、学術上の論理的帰結としての必然性を関係者に説明していきたいと考えている。研究者メンバーの一人が、大学で重要な役職についてしまい、予定通りの研究をすることができなかった。その部分については、他のメンバーが補っている。急遽学内の研究費を一部使用できることとなり、科研費分に関しては余力が生じたが、研究テーマが広がりつつあるので、残額は翌年に使わせていただきたい。観光学の研究である以上、現地の状況を踏まえた掘り下げを重視している。
芸術NPOへの新たな公的支援:芸術法人(仮称)創設に向けて

本研究は、民間の芸術NPO(非営利組織)に焦点を当て、NPOと他の経営形態との相違点や特徴を探り、芸術NPOへの公的支援の問題点を明らかにし、芸術活動にとって望ましい法人格として芸術法人(仮称)の創設と公的支援の拡充を検討した。チリ(2001年)、トルコ・韓国(2002年)、ブラジル(2003年)等現地のNPO・NGO(非政府組織)を実地に訪問して、芸術系NPO・NGOの法的基盤や経営等について調査した。その結果、ひとくちに芸術NPOといっても設立経緯・歴史・経営のあり方等は国によって、また活動分野によって様々ではあるものの、どのNPOも資金調達と聴衆獲得に苦労している姿が浮き彫りとなった。芸術NPOへの公的支援については、芸術組織を国や自治体が直接経営する西欧型と、税制優遇により間接的に支援するアメリカ型の2つのタイプがあるものの、景気低迷下、両者とも経営に苦労している。芸術法人の創設については、現在、すすめられている公益法人改革ではNPO法人と財団・社団法人を統合して、届け出制による「非営利法人」を新設する動きがある。これまでわが国の芸術NPOは、その「非営利性」を強調するあまり、「公益性」についての認識が乏しかった。今後は、「公益性」概念の再構築により、芸術活動にふさわしい法人格として芸術法人を創設するとともに、「社会変革の担い手としてのアートNPO」の意義を再認識する必要がある。チリの国際NPOセミナーにおいて座長を務め(2001年)、韓国NGO学会に招聘され国際セミナーにて講演を行い(2002年)、日本NPO学会で国際シンポジウムに参加する(2002年)など、合わせて5回の学会発表を行った。また、苅谷剛彦編『創造的コミュニティのデザイン』有斐閣、等図書4冊や、「地域におけるNPOの役割と行政との連携」『月刊ESP』内閣府、等論文3本を刊行した本研究は、民間の芸術NPO(非営利組織)に焦点を当て、NPOと他の経営形態との相違点や特徴を探り、芸術NPOへの公的支援の問題点を明らかにし、芸術活動にとって望ましい法人格として芸術法人(仮称)の創設と公的支援の拡充を検討した。また、苅谷剛彦編『創造的コミュニティのデザイン』有斐閣、等図書4冊や、「地域におけるNPOの役割と行政との連携」『月刊ESP』内閣府、等論文3本を刊行した(1)芸術NPOの多様性の解明『芸能白書』『演奏年鑑』等により、芸術団体のうち約4分の3が財団・社団法人、NPO法人(特定非営利組織)、任意団体等のNPO(民間非営利組織)であることがわかった。日本フィルハーモニー交響楽団、読売日本交響楽団、東京交響楽団、東京シティフィルハーモニック管弦楽団の広報・マーケティング担当者へのインタビューの結果、ひとくちに芸術NPOといっても設立経緯・歴史・経営のあり方等は様々であることがわかった。(2)芸術NPOへの公的支援の現状と問題点の検討アメリカ交響楽団連盟(ASOL)のマーケティング担当者へのインタビューの結果、芸術NPOへの公的支援は、アメリカでは補助金交付による直接支援よりも税制優遇による間接支援が主流であること、各オケは聴衆開拓とその維持、寄附金等の資金調達に専任部署を設けており、互いに競争していることがわかった。また、ユナイテッド・ウェイ(United Way)の担当者へのインタビューの結果、2001年9月11日の「テロアタック」後は、募金団体は寄附金集めとその配分に忙殺され、芸術NPOへ寄附する余裕のないことがわかった。また、上記の在京オーケストラへのインタビューから、我が国では芸術NPOへの公的支援はわずかな直接支援に限られ、各オケの奪い合いになっていること、税制優遇による間接支援がほとんどないこと、さらに、マーケティングや顧客開発という考え方が希薄であり、わが国では未だ未開拓であること等の問題点が明らかになった。(1)芸術NPOの多様性の解明昨年度の日本フィルハーモニー交響楽団等在京オーケストラの広報・マーケティング担当者へのインタビュー等の結果を、「在京オーケストラの聴衆について」(共同)として2002年度文化経済学会<日本>(秋田県田沢湖町)で発表した。芸術NPOといっても設立経緯

・歴史・経営のあり方等はさまざまであること、不況下、聴衆獲得と資金獲得に困難を来していること等を報告した。(2)芸術NPOへの公的支援の現状と問題点の検討イスタンブール(トルコ)での国際フィランソロピー会議に出席して、芸術への公的支援といっても国によりさまざまであることがわかった。H.Anheier(ed.), Global Civil SocietyやD.Throsby, Economics and Culture等によれば、芸術支援には大きく2つのタイプがある。それは税制によりNPOを間接支援するアメリカ型と、芸術を国家が直接経営するヨーロッパ型である。しかし、両タイプとも資金調達に苦労していることが明らかとなった。(3)芸術法人(仮称)創設の準備芸術法人(仮称)の創設にあたって、芸術NPOの「公益性」と「非営利性」について考察した。総務省編『平成14年版公益法人白書』等により、財団・社団法人、NPO法人、中間法人をあわせた「非営利法人制度」創設に向けて、特に、「公益性」が厳しく問われていることがわかった。芸術NPOは、これまで活動の「公益性」について自らを問うことが少なく、NPOとして存続するためには今後「公益性」概念の構築が必要である。(1)芸術NPOの多様性の解明サンパウロ、リオ・デ・ジャネイロ(ブラジル)の芸術NPO(非営利組織)・NGO(非政府組織)を実地に訪問して、法的基盤や経営等について調査した。そこでは芸術NPOにありがちな独善性を廃し、活動内容をわかりやすく人々に広報する努力を惜しまず、子供たちや青少年の教育にも力を注ぐ姿が浮き彫りにされた。また、横浜市が歴史的建築物の管理運営を芸術NPOへ委託することについて、日本NPO学会第6回大会でのパネル「社会変革の担い手としてのアートNPO」で座長を務めた。このように、ひとくちに芸術NPOといっても設立経緯・歴史・経営のあり方は国によって、また活動分野によって様々である。(2)芸術NPOへの公的支援の現状と問題点の検討サンパウロでの国際フィランソロピー会議に出席した。どの国も不況下の税収低迷により芸術NPOへの公的支援が減少傾向にある中、芸術NPOは聴衆獲得と資金獲得に困難を来しており、活動内容の市民や企業へのマーケティングやアウトリーチ活動が今後重要となることが明らかとなった。(3)公益法人改革と芸術法人(仮称)創設の課題現在、進められている公益法人改革では、NPO法人と財団・社団法人を統合して、届け出制による「非営利法人」を新設する動きがある。芸術NPOはその「非営利性」を強調するあまり、これまで「公益性」についての理解が乏しかった。今後は「公益性」概念の再構築により、芸術NPOの意義を再認識する必要がある。
緊縮応答による百日咳菌の病原性発現調節機構

細菌が栄養飢餓に曝されると細胞内で(p)ppGppが蓄積し遺伝子発現が変化する。本研究では(p)ppGppの百日咳菌病原性発現における役割を明らかにするためグルタミン酸(Glu)飢餓を中心にその影響を解析した。Glu枯渇時に百日咳菌体内の(p)ppGppは蓄積し、3型分泌機構(TTSS)遺伝子のmRNA量は有意に増加するがこれはBtrSによる転写の段階で調節されると考えられた。また、マクロファージへの付着率は(p)ppGpp欠損およびGlu飢餓により変化しなかったが、生残性には顕著に違いがみられた。以上の結果から(p)ppGppはマクロファージとの相互作用に重要である可能性が示唆された。1.培地中グルタミン酸の消費パターンの解析:これまでグルタミン酸濃度を低下させた培地を用いて百日咳菌3型分泌機構(T3SS)の細胞外分泌タンパク質であるBsp22量が増加したことを示した。そこで増殖する際の培地中グルタミン酸濃度を測定し、百日咳菌のグルタミン酸の利用について検討を行った。その結果、カザミノ酸添加培地で培養した場合、アミノ酸枯渇後、グルタミン酸を主たる炭素源として利用することが明らかとなった。アミノ酸の枯渇によりT3SSは誘発されたが、その程度はグルタミン酸枯渇によるものより弱かった。2.臨床分離株およびワクチン株を用いたグルタミン酸濃度低下によるT3SS誘発への影響:百日咳菌の各菌株におけるグルタミン酸枯渇による影響を検討した結果、全ての株で低グルタミン酸によるT3SSの誘発を認めた。3.T3SS遺伝子の転写解析:百日咳菌のT3SS遺伝子群にはその装置およびエフェクターの遺伝子が含まれるbsc locusとこれらの発現を制御する遺伝子群であるbtr locusがある。btr locusにはこれら全ての遺伝子の転写に必須であるBtrSの遺伝子が含まれている。グルタミン酸およびppGppによる制御機構を明らかにする目的でbsc locusの遺伝子およびbtr locus遺伝子のmRNA量をqRT-PCRにより測定した。その結果、グルタミン酸の枯渇によりbsc locus遺伝子は顕著に増加していたが、btr locusにある遺伝子の転写量の変化は顕著ではなかった。一方、ppGpp欠損変異株においてグルタミン酸枯渇によりbsc locus遺伝子の誘発される傾向がみられ、これはタンパク質レベルでも確認された。4.T3SSの発現におけるBvgASの役割:BvgASが不活性環境下T3SSの産生は消失し、グルタミン酸を枯渇によっても誘発されなかった。これらの結果よりT3SSの発現にはBvgASの活性化が不可欠であることが明らかとなった。当該研究は百日咳菌の病原性発現制御における緊縮応答の役割を明らかにするものである。これまで当研究室ではグルタミン酸枯渇により3型分泌装置(T3SS)の発現が誘発することを明らかにした(Hanawa et al.,2015)。さらに平成27年度にはppGppの定量系を構築し、グルタミン酸枯渇が百日咳菌細胞内ppGpp濃度を約10倍増加させることを明らかにした。このことは、ppGppの欠損により3型分泌装置(T3SS)の発現が顕著に低下するばかりでなく、ppGppの蓄積により亢進することを示唆している。また、アミノ酸枯渇でもT3SSの発現が誘発されるが、グルタミン酸枯渇による誘発の方が、より顕著であることも見出している。しかしながら今回、カザミノ酸非添加培地を用いた培養によるアミノ酸枯渇細菌内でも約10倍の上昇がみられたことから、グルタミン酸枯渇によるT3SS発現量の亢進にはppGpp以外の因子が関与するものと考えられた。ppGpp欠損株(PMK21)を用いてppGppのマクロファージへの感染に与える影響を検討したところ、マクロファージ系培養細胞株J774感染時、貪食率は野生株と同等であったのに対して16時間後の生残率はppGpp欠損により顕著に低下した。さらにppGppの蓄積を誘発するグルタミン酸枯渇では、感染後16時間後におけるマクロファージ内生存率が約3倍亢進した。これらの結果は、ppGppがマクロファージ内殺菌能抵抗性に関与していることを示唆している。一方、ppGppとグルタミン酸枯渇による応答を解析する目的でプロテオーム解析を行ったところ、グルタミン酸枯渇によりリボゾームタンパク質、ストレスシャペロン(GroEL、DnaKJ、Clp等)の量が顕著に増加していることが明らかとなった。緊縮応答による百日咳菌病原性発現制御における役割を明らかにすることを目的とした本研究において、そのモデュレーターであるppGppの定量系確立は実施計画の中で重要な位置を占めている。百日咳菌のギ酸抽出物を平成26年度の当該助成金で購入した機器を用いて凍結乾燥し、再懸濁したサンプルを限外濾過などの処理後した後、越智らの方法(Ochi et al., 1986)を参考に陰イオンカラム(SAX)を用いてヌクレオチドを分離した。この保持時間とスペクトラムからppGppのピークを同定し、そのピーク面積からppGppの定量を行うことができた。さらにその手法を用いて栄養が十分に残存している培養液中百日咳菌細胞と比較して、グルタミン酸およびアミノ酸枯渇によりppGppの蓄積が生じていることを明らかにした。

一方、百日咳菌とマクロファージとの相互作用を検討する実験においては、百日咳菌をMOI=100でマクロファージに感染させ、細胞内に取り込まれた生菌数を測定したところ、およそ1つの細胞に1つの細菌が貪食されることが明らかとなった。その後、16時間後にはマクロファージ内の生残菌数は貪食された菌数の約5%にまで減少し、24時間後には検出限界以下となることを明らかにした。これらの百日咳菌のマクロファージ内動態に関する情報は、百日咳菌のマクロファージ感染実験における基礎的データとなる。さらにppGpp欠損およびグルタミン酸枯渇による貪食能および生残率への影響を検討した。ppGpp欠損および亢進によるタンパク質発現への影響についてはプロテオーム解析を実施した。その結果、今回用いた手法では細胞内に微量存在するタンパク質量の比較が難しいことが明らかとなった。緊縮応答は栄養枯渇に対する細菌の応答であり、細胞内に蓄積したアラモン(p)ppGppが転写等を調節し、種々の遺伝子発現を調節することにより適応する機構である。本研究では百日咳菌病原因子の発現が緊縮応答により制御されている可能性を検討している。これまで緊縮応答のモジュレーターである(p)ppGpp合成酵素欠損株を用いた検討と、百日咳菌の主たる炭素源であるグルタミン酸およびカザミノ酸濃度を低下させて培養し、(p)ppGppを定量した結果から緊縮応答により線毛およびIII型分泌系が転写レベルで制御されることを明らかにした。一方、前年度までにグルタミン酸枯渇環境下のタンパク質発現を検討する目的でプロテーム解析を行ったが、発現に変化がみられたタンパク質中にストレスタンパク質およびグルタミン酸利用タンパク質が含まれていたものの病原因子は検出されなかった。そこで本年度は、バイオフィルム形成と緊縮応答との関連について検討を行った。百日咳菌のバイオフィルム中細胞外マトリックスに対する抗体が患者血清中に存在することが報告されている。これまで当研究室では(p)ppGpp欠損株では固体表面に形成するバイオフィルム量が顕著に低下することを明らかにしており、固層バイオフィルムの形成には(p)ppGppが必須であると考えられる。緊縮応答によるIII型分泌装置の発現亢進がバイオフィルム形成亢進に関与している可能性を検討する目的で分泌装置の機能発現に必須であるATPaseをコードするbscN遺伝子を欠損させたところバイオフィルム形成能は消失した。以上の結果よりIII型分泌装置介在のバイオフィルム形成制御は(p)ppGppにより調節されているものと推定された。細菌が栄養飢餓に曝されると細胞内で(p)ppGppが蓄積し遺伝子発現が変化する。本研究では(p)ppGppの百日咳菌病原性発現における役割を明らかにするためグルタミン酸(Glu)飢餓を中心にその影響を解析した。Glu枯渇時に百日咳菌体内の(p)ppGppは蓄積し、3型分泌機構(TTSS)遺伝子のmRNA量は有意に増加するがこれはBtrSによる転写の段階で調節されると考えられた。また、マクロファージへの付着率は(p)ppGpp欠損およびGlu飢餓により変化しなかったが、生残性には顕著に違いがみられた。以上の結果から(p)ppGppはマクロファージとの相互作用に重要である可能性が示唆された。本課題ではT3SSのグルタミン酸欠乏等の栄養枯渇により誘発される緊縮応答による百日咳菌病原性発現における役割を明らかにすることを目的としている。
価数制御と格子欠陥由来の自己組織化による特異な酸化物表界面の構築と新物質創製

鏡面研磨サファイアc面基板を1273 Kで熱処理すると、その表面には高さ0.22 nmのステップ&テラス構造が形成される。その基板上にLixNi1-xO薄膜を堆積後、赤外集光加熱でわずか60秒熱処理することで周期的なナノ溝構造(回折格子構造)が自己組織化形成されることをこれまでに見出していた。当該年度では、この現象の機構解明を試みた。そのために、この自己組織化形成された回折格子構造の断面透過型電子顕微鏡観察を行った結果、隣り合う薄膜テラス同士で結晶ドメインが鏡像関係にあることが、薄膜テラス同士の癒合を妨げて周期的に溝を形成する推進力となっていることが予想された。サファイアc面上への酸化ニッケルの結晶成長に関して、基板と膜の格子ミスマッチを最表面原子層の幾何の相似性から考察する、レイヤーマッチングエピタキシー(LME)モデルを新たに立てた。このモデルにより、サファイアの隣り合うテラス同士でNiOの結晶ドメインが鏡像関係になるように結晶成長する原因は、NiOが、サファイア単位胞の1/6周期に現れる酸素原子層と格子整合することだと考えた。このモデルから、サファイアの原子ステップの高さが2倍になれば、サファイア上にNiOはバイエピタキシャル成長せずにユニエピタキシャル成長することが予想された。サファイアの原子ステップを一様に2倍の高さにする報告はこれまでなかったが、その形成熱処理条件を見出し、その基板上にNiOを堆積した結果、LMEモデルから予想される通り、NiOはサファイア上にユニエピタキシャル成長した。この結果は、立方晶の機能性薄膜をサファイア上に結晶成長させたときに、双晶面(欠陥)を完全になくすことができる可能性があることを示唆しており、今後、様々な立方晶の機能性酸化物がバイステップサファイア基板上に堆積されることで、新機能創出や性能向上がもたらされると考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。鏡面研磨されたサファイアC面基板を1000°Cで熱処理すると、その表面には高さ0.2nmのステップ&テラス構造が形成される。そのサファイアのステップ&テラス構造上にパルスレーザー堆積法によってLiNiO薄膜を堆積後、赤外集光加熱で瞬間的に(60秒)1200°Cで熱処理することによって、深さ60nmの回折格子構造が自己組織化的に形成される。この自己組織化現象では、Nio薄膜よりもLiNiO薄膜の方が回折格子の溝は深くなることがわかっているが、熱処理後にLiが膜内にどのように分布しているかはわかっていなかった。そこで、透過型電子顕微鏡によって、光学材料として重要な材料の均質性を評価した。その結果、Liは熱処理後に膜中で一部凝集したり、サファイア基板と反応層を作ったりしていることが観察された。また、この回折格子構造の自己組織化では、LiNiO薄膜の一部がLiNiO2へ構造相転移していることがわかっている。赤外集光加熱等の熱力学的非平衡プロセスによってLiの蒸発を抑制しながら構造相転移させ、LiNiO2の単相化を目指した。赤外集光加熱時にサンプル同士を向かい合せたり、赤外集光加熱の保持時間・保持温度の調節を試みたりすることでLiの蒸発を大きく抑制できたが、LiNio2の単相化は実現しなかった。そこで、これまで大気中で行っていた赤外集光加熱を酸素気流中で試みた。その結果、LiNiO2の単相化の兆候がX線回折測定から得られた。

26年度が最終年度であるため、記入しない。サファイアのステップ&テラス構造で誘起された面欠陥由来の回折格子構造を光学材料として利用できるか検討するために当初の計画通り、透過型電子顕微鏡を利用して回折格子の断面構造を観察することができたため。この自己組織化現象における溝は、立方晶LiNiOがステップサファイア上に双晶成長することによって発生した面欠陥を熱処理で拡散させることで形成されると推察される。このことを明らかにするため、溝で区切られたNiOの結晶方位が隣同士で180。回転していることを制限視野電子回折法で観察し、サファイアC面基板上の特異な結晶成長機構を明らかにする。
炭水化物による遺伝子の転写促進機構の解析

糖代謝系酵素のL型ピルビン酸キナーゼ(PKL)遺伝子と脂質代謝系酵素であるS14や脂肪酸合成酵素(FAS)遺伝子のプロモーター領域内には炭水化物応答性エレメントが存在し、肝臓では血中グルコース濃度の上昇に依存して転写が促進される。このエレメントに特異的に結合する因子であるL-IIIBPのcDNAのクローニングを行い、炭水化物による遺伝子の転写促進機構を解明することを目的として本研究を行った。次に、PKL遺伝子の炭水化物応答性エレメントを用いて、前述のcDNAライブラリーをスクリーニングしたところ、肝cDNAライブラリーからhaematopoietically expressed homeobox(Hex)と呼ばれる転写因子をクローニングした。Hexの発現ベクターをPKL遺伝子プロモーター/ルシフェラーゼリポータープラスミドとともにラット分化型肝癌細胞MH_1C_1細胞にトランスフェクションを行ったところ、HexはPKL遺伝子プロモーターからの転写を抑制する事が明らかになった。現在、グルコース濃度に依存して転写活性が変動するかどうかを初代培養肝細胞の系を用いて検討中である。また、FAS遺伝子の炭水化物応答性エレメントを用いて、肝cDNAライブラリーをスクリーニングしたところ、basic helix-loop-helix型転写因子をクローニングした。本因子は、絶食ラット肝では発現が低下し、高炭水化物食により発現が誘導された。また、糖尿病ラットにおいても発現が低下し、インスリン投与により誘導が認められた。現在、この因子についても詳細に検討中である。糖代謝系酵素のL型ピルビン酸キナーゼ(PKL)遺伝子と脂質代謝系酵素であるS14遺伝子のプロモーター領域には炭水化物応答性エレメントが存在し、グルコース濃度の上昇に依存して転写が促進される。L-IIIBPは、350匹のラット肝核抽出液から、26kDaと24kDaの2本のバンドとして精製された。しかし、量的な問題で精製蛋白質からアミノ酸配列が得られなかったため、至適化した炭水化物応答性エレメントを餌にして、イーストのone-hybrid systemを用いて、ラット肝および顆粒膜細胞cDNAライブラリーのスクリーニングを行った。その結果、肝cDNAライブラリーからはポジティブクローンを得られなかったが、顆粒膜細胞cDNAライブラリーからは、Upstream Stimulatory Factor 2(USF2)がクローニングされた。ラットUSF2 cDNAに関しては完全長の報告がなかったため、クローン化したcDNAの塩基配列の決定、ホルモン処理を行った卵巣における遺伝子発現の検討、ゲルシフト法によるDNA結合特性、ならびにHepG2細胞へのコトランスフェクション法による転写活性化能の検討を行い、USF2は346個のアミノ酸配列から成り、E box配列に依存してDNA結合ならびに転写活性化を行うことを報告した。次に、PKL遺伝子の炭水化物応答性エレメントであるL-IIIエレメントを餌にして、前述のcDNAライブラリーをスクリーニングしたところ、肝cDNAライブラリーからのみ8つのポジティブクローンが得られた。これらのポジティブクローンはすべてHaematopoietically expressed homeobox(Hex)とよばれる転写因子をコードしていた。現在、HexがPKL遺伝子の転写にいかなる影響を及ぼすかについて、ラット分化型肝癌細胞株を用いて、Hexの発現ベクターとPKL遺伝子のリポーターベクターをコトランスフェクションを行うことにより、検討中である。
音楽学習における体ほぐし・心ほぐしの研究

本研究では、体ほぐし・心ほぐしを音楽学習の中で実践するための指導方法と指導プログラムを開発した。そして小中学校の教育現場で実践を行いその効果の検証に取り組んだ。実践の結果、本研究で開発した指導方法や指導プログラムが、学習者の体や心をほぐし、音楽活動に楽しく取り組める効果を挙げ、さらに呼吸の改善、歌唱における発声の改善、器楽演奏における響きの改善、音楽表現の改善に効果を挙げるという示唆を得ることができた。本研究は、体ほぐし・心ほぐしの研究を通して、学習者が楽しく有意義に音楽学習に取り組める指導方法を確立しようとするものである。本年度は次の二点について取り組んだ。1.音楽学習における体ほぐし・心ほぐしの現状調査と問題点の把握調査は、実際に小中学校の市場を訪問し、音楽授業や部指導の場面を観察する方法で行った。横浜国立大学附属鎌倉中学校では3年選択音楽の指導場面を、鎌倉市立手広中学校では3年生の音楽授業と吹奏楽部の指導場面を、横浜市立大岡小学校では4、5、6年生の音楽授業の場面を調査できた。各校の指導者は児童・生徒とのやりとりを大事にしており、また授業構成にも工夫を見ることができた。しかし、効果的に体を動かれほぐしたり、活動に臨む児童・生徒の心をほぐしたりという場面は少なかった。本研究で開発を目指している指導方法が大いに活用できると考えられた。2.体操や身体論について文献調査や実地体験調査を行った。甲野善紀氏の古武術における身体操法、ナンバ身体論、ゆる体操、アレクサンダーテクニークについては、講座、ワークショップ、個人レッスンに参加し体験することができた。体験の結果、音楽学習における体の使い方、体や心のほぐしに有効なく点を多く発見できた。また体験者本人の歌声が明らかに改善するという体験もあった。特にゆる体操やアレクサンダー・テクニークはほぐしの効果が大きいと考えられた。また鈴木成夫氏の合唱指導は、入念なストレッチ等を取り入れており、積極的な活動の様子が見られ、さらに合唱の経響きも柔らかくなる等の効果を実感できた。本年度の取り組みの第一は、前年度に行った文献調査・現状調査・体験調査の成果をもとに音楽学習の中での体ほぐし・心ほぐしについて方法論を考察したことである。アレクサンダー・テクニークから示唆された身体への意識の向け方の改善や、ゆる体操から示唆された擬態語の使用による心ほぐしの効果を活かすことで、体と心をほぐし苦痛を感じない音楽活動の展開が可能であると考えられた。また低い難易度で学習効果を実感できることで、音楽学習が楽しく続けられるという効果も期待できると思われる。取り組みの第二は、特に体ほぐし・心ほぐしに効果が高いと考えられる、ゆる体操についての研究を中心に、研究成果の中間的な発表を行ったことである。発表後の質疑応答では、特に高齢者の学習活動に有効な点に関する賛同が得られた他、具体的指導プログラム作成への示唆、ゆる体操の商標権への対応等、貴重な意見を得ることができた。また指導プログラムの開発では、短時間で呼吸と発声に効果的な体ほぐしの方法や学習者に親しみやすい例えを使った発声指導の方法等を開発している。さらに加えて指導方法の試行に協力いただける音楽科教諭が転勤した横須賀市立田浦中学校に追加調査にうかがい、選択授業生徒に対する発声指導や合唱指導の場面を調査することができた。本年度の取り組みの第一は、前年度に考案した体ほぐし・心ほぐしを音楽学習の中で実践するための指導方法と指導プログラムについて、音楽学習の中でより効果的に実践するための方法、プログラムに改良したことである。指導方法としては、呼吸に関するもの、姿勢に関するもの、口の中を広げることに関するもの、体を楽器にすることに関するもの、歌声や響きの方向性に関するもの、息の使い方に関するもの等、計30点を開発することができた。そして体や心の準備不足を解消することや、学習活動に障害が生じた場面を楽しく積極的に乗り切ることを目的として指導方法を複数組み合わせて指導することを考察し、5点の指導プログラムを提案することができた。取り組みの第二は、開発した指導方法、指導プログラムについて、小中学校の教育現場で実践を行いその効果を検証したことである。実践は、協力をお願いした学校の音楽担当教諭に行っていただいたり、研究者本人が直接行ったりして取り組んだ。本実践では、普通学級における音楽授業での歌唱指導、学年全員や有志対象の特別指導、合唱クラブ、吹奏楽部等、音楽科教育における多様な場面での資料収集を行うことができた。

実践の結果、本研究で開発した指導方法や指導プログラムが、学習者の体や心をほぐし、音楽活動に楽しく取り組める効果を挙げ、さらに呼吸の改善、歌唱における発声の改善、器楽演奏における響きの改善、音楽表現の改善に効果を挙げるという示唆を得ることができた。
シアノバクテリア由来光化学II複合体の高磁場ESRによる研究

昨年度に引き続き、酸素発生過程の解明に向けてシアノバクテリア由来PSII反応中心のW-bandパルスESR分光法による研究を行った。まず、primary electron donor(P680)とMn_4クラスターとの間に位置し、水酸化-酸素発生過程で生じるプロトンおよび電子移動に深く関わっているチロシン残基D1-Tyr161 (Tyr-Z)の単結晶および凍結溶液を対象とした。253Kに温度設定したESR共振器内でキセノンランプによる光照射後(20秒間)、直ちに測定温度(80K)まで試料を凍結させることでチロシンラジカルTyr-Zをトラップした。共振器サイズに合わせた直径0.5mmの光ファイバーでサンプル直上まで光を誘導し、効率の良い光照射を可能とした。自作のシミュレーションプログラムを用い解析を行った結果、結晶軸に対するチロシンTyr-DおよびTyrZの分子配向ならびにg値を決定することができた。これまでに報告されている結晶構造解析ではTyr-DおよびTyr-ZはC_2対称の関係にあるとされてきたが、ESRによる精度の高い測定の結果、それらはC_2対称からずれた相対配向であることがわかった。また、得られたgテンソルに対して密度汎関数法を用いた量子化学計算による考察を行った結果、Tyr-Zの方がより強い水素結合を有していることを明らかにした。今後、酸素発生に関わる水分子の情報を得るためパルスESR装置のさらなる改良を行い、Eletron-electron Double resonance-detected NMR (EDNMR)測定を行っていく予定である。本研究では、酸素発生過程の解明に向けて、シアノバクテリア由来PSII反応中心の単結晶および凍結溶液試料を対象としたX-, Q-, W-band ESR分光法による以下の研究を行ってきた。まず、primary electron donor(P680)とMn_4クラスターとの間に位置し、水酸化-酸素発生過程で生じるプロトンおよび電子移動に深く関わっているチロシン残基D_1-Tyr_161(Tyr-Z)の単結晶ESRスペクトルを、Q-およびW-bandにおいて初めて観測することに成功した。結果、Tyr-Zがもう一つのチロシン残基D_2-Tyr_<160>(Tyr-D)と完全なC_2対称にないことを明らかにした。単結晶スペクトルの完全解析を行うには、マイクロ波による飽和の影響を排除したパルスESR測定が不可欠である。また、Mn_4クラスターそのものの構造決定には、Mn_4クラスターの正確なgテンソルの決定、ならびに各Mn核についての磁気パラメータを決定する必要があり、これにパルスESR法が有力な測定手法となることが期待される。そこで我々は本年度、W-bandにおけるパルスESR装置の開発も行った。得られた装置を用いて、凍結溶液試料中のMn_4クラスターに対して測定を行ったところ、市販のW-balldパルスESR装置よりもひと桁以上S/N比の高いシグナルを観測することができ、微小な単結晶試料に対しても十分適用可能であることを確認した。
１分子蛍光観察手法を用いた分化初期化の単一細胞エピジェネティクス

本研究の目的は生細胞内1分子蛍光イメージング手法を用い、エピジェネティカル変化の可視化を目指すことである。本研究では、核タンパク質動態変化の一分子観察と、ヒストンアセチル化のレポーターの一分子観察、の二つのアプローチによって達成した。分子動態の変化に関しては、蛍光タンパク質ダイマーの移動度が、iPS細胞とPartial-iPS細胞で変わることを見出した。ヒストンアセチル化レポーターに関してはHistacを改変し、一分子観察を行った。トリコスタチンA処理によってFRET効率が上昇したことから、この改変Histacはエピジェネティカルな変化を捉えることが可能であることが示された。ヒストンのアセチル化を捉えることが出来るプローブHistacを1分子観察に適合させるため、蛍光ドナー側をphoto activatable GFP (PAGFP)に、アクセプター側を様々な色素に対応させるためにSNAP tagを付与したコンストラクトを作製した。Histacは理化学研究所の佐々木和樹博士が開発したFRETプローブであり、アセチル化したヒストンに結合するブロモドメインとHistonH4複合体が蛍光色素VenusとCFPで挟まれた構造をしている。このHistacを蛍光一分子観察に対応させるため、Venusを光誘起性のPAGFPに、CFPをSNAP tagに置き換えた。この遺伝子を発現させた細胞に外部からSNAPタグに結合する赤色蛍光色素を導入しPAGFPを誘起したところ、青色励起によって細胞核から赤色の蛍光を観察した。アクセプターを退色させるとPAGFPの蛍光が増加したことから、蛍光エネルギー移動が起きていることが確認された。非常に弱くPAGFPを誘起し青色励起光で観察したところ、緑色の蛍光を発する輝点と赤色の蛍光を発する輝点の双方が観察された。すなわち、緑色の蛍光を発する輝点は蛍光エネルギー移動が起きておらずヒストンがアセチル化されている部位、赤色の蛍光を発する輝点は蛍光エネルギー移動が起きていてヒストンがアセチル化されていない部位と考えられる。現在はモデル細胞であるHeLaを使い、また、固定細胞を使って観察を行っているが、今後はESを用い、生細胞で観察を行う予定である。本研究の目的は細胞のエピジェネティカルな変化を、1分子蛍光観察手法を用いて捉えることにある。最終的な目標は細胞初期化時のエピジェネティカルな変化を、1分子蛍光観察手法を用いて核タンパク質の動きの変化として捉えることであるが、本年度は実際にエピジェネティカルな変化が核タンパク質の動きの変化として現れるかをモデル細胞系を用いて調べた。筋芽細胞C2C12は分化誘導に伴い筋管細胞を形成するが、この分化過程で大きなエピジェネティカルな変化が起きることが知られている。そこで、本年度はH2B-GFPを発現したC2C12細胞を用い、分化に伴いヒストンタンパク質H2B動態に変化が起きるかを調べた。細胞核内でのH2B分子の移動度を調べるために光褪色後蛍光回復法(FRAP)を、局所でのH2B分子の揺らぎの大きさを調べるために蛍光相関分光法(FCS)を行った。すると、FRAPでは筋管形成後の分化誘導7日目に大きな変化が観察されたが、一方、FCSを用いた場合は分化誘導3日目に大きな変化が観察された。以上の結果から、エピジェネティカルな変化により核タンパク質の動きに変化はあるが、移動度の変化と局所でのゆらぎは別の事象を反映していることが示唆された。以上の結果をBiochemical and Biophysical Research Communications誌に発表した(Higuchi et al., BBRC, 2012)。以上の結果を踏まえ、ヒストン分子の動きではなく蛍光分子そのものの動きが核内状態を反映する可能性を考え、核以降シグナルを付与した蛍光タンパク質を恒常的に発現するES細胞を作成中である。エピジェネティカルな変化を一分子蛍光観察で捉えるため、理研で開発されたヒストンのアセチル化を観測可能なプローブHistac(BRDTのブロモドメイン両端にそれぞれCFPとVenusを融合したFRETプローブ)のVenusを光活性化が可能なPAGFPに、CFPをSNAP-tagに置き換えたプローブを作成した。このプローブを恒常的に発現するHEK293T細胞を作成し、TMRSTAR(SNAP-tagに結合する赤色色素)によって染色した。PAGFPーTMRSTAR間でFRETが起きていることを確認するため、PAGFPを活性化させたのち、TMRを褪色させたところGFPの蛍光が増大することが確認され、作成したプローブ内でFRETが起きていることが確かめられた。この改変したHistacがヒストンアセチル化のプローブとして働いているかどうかを確認するため、細胞を1μMのトリコスタチンA(TSA)にて3時間処理したところ、FRET効率の上昇が確認されたことから改変Histacがヒストンアセチル化のレポーターとして使えることが確かめられた。

次に、このプローブが1分子観察可能であるかを調べるため、染色した改変Histac発現HEK293T細胞をPALM顕微鏡により観察したところ、4000以上の輝点が単一核中に観察された。GFPの蛍光はTMRによる染色によって有意に落ちることから、FRETが起きているここがわかる。次に、ES細胞分化によるエピジェネティカルな変化を捉えるため、改変HistacをマウスES細胞に導入した。TSA処理によってFRET効率の上昇が見られたことから、開発したプローブはES細胞内においてもヒストンアセチル化状態を観察可能であることが確認された。一方、観察される輝点の数はHEK293T細胞よりも少なく、核あたり1000個程度であった。ES細胞の培養はLIFを加えた状態と、分化後の状態としてLIFを除いた環境下で1週間培養したものを用意し、FRET効率の違いを調べたが有意な差は見られなかった。生物物理Histacを用いることにより、ヒストンのアセチル化を一分子で観察することに成功した。現在は実験の容易さからモデル細胞を用いており、観察も細胞を固定後に行っているがエピジェネティカルな変化のダイナミクスを見るためには生細胞観察が必須である。現在、作製したプローブを恒常的に発現するES細胞を準備中であり、準備でき次第生細胞観察を行う予定である。本研究は細胞のエピジェネティカルな変化を核タンパク質動態を1分子蛍光イメージングによって捉えることを目標とする。このためには、細胞のエピジェネティカルな変化を反映する核タンパク質の候補が重要であり、研究提案時はヒストンタンパク質を提案していた。筋芽細胞を用いた予備的な実験により、細胞の分化に伴ってH2B動態に変化があることがわかったが、分化の程度によってその動態変化の質が異なりエピジェネティカルな変化をどのように反映しているかの解釈が難しい。ヒストン分子動態は細胞のエピジェネティカルな変化を反映する可能性が高いが、1分子観察実験に入る前に他の分子種についても細胞分化によって動態が変化するかどうかを調べることが重要と考え、現在その準備を行っている。また、クロマチンのパッキング状態が変われば、一定の大きさ以上の核内分子の拡散に影響が出るはずである。そこで、蛍光タンパク質単量体、または蛍光タンパク質2量体の拡散が細胞分化によってどのように変わるかをES細胞を用いて調べている。この実験は当初計画にはなかったが、目標達成に必要なことである。現在、レンチウイルスを用いてES細胞に恒常的にプローブを発現させるべく実験を行っているが、培養を続けるとプローブがサイレンシングされてしまうといった問題がある。これについては今後、導入方法を変える(Piggy bacシステムの使用など)ことで対処する。ヒストンのアセチル化だけでは真にエピジェネティカルな変化を見たとは言いがたい。そのため、ヒストンのメチル化を可視化することも検討中である。初年度における研究でヒストンタンパク質と結合させた蛍光タンパク質の細胞核内での動きは細胞の分化度によって大きく異なることが示唆された。
接触行動、個性、遺伝子から見たゾウの社会に関する研究

25年度はアジアゾウの接触行動の機能や個体間関係についてまとめ、ゾウの仕会について総合的な結論を導き出すことを目的として研究を進めた。したがって、これまでに収集したデータの分析、まとめと発表を中心に行った。まず、24年度から進めていたアジアゾウの接触行動について分析を進めた。観察の結果、アジアゾウのメス同士で最もよく観察された鼻先で相手の口を触る行動には、触り方によって2タイブあることが分かった。普段から頻繁に観察された鼻がU字型になって相手の口を触るUタイプと、触る際に鼻がねじれてS字型になるSタイプである。この2タイプの機能を分析すると、それぞれが異なる機能を持っている可能性が明らかになった。これまで鼻先で他個体を触る際の触り方による機能の違いに注目した研究は行われておらず、本研究で初めて明らかになった。口で鼻先を触る行動は、本研究においてもいくつかの先行研究でもゾウ間で最も頻繁に見られる社会行動の一つであり、この行動の機能を正確に把握することは、ゾウ間の社会関係を解明する上で非常に重要と考えられる。この成果については、6月に国際セミナー、9月と2月に国内学会またはシンポジウムで発表を行った。さらに、現在英語論文を作成し、投稿準備中である。上記の結果を使用して、メスアジアゾウ間の個体間関係についても分析を行った。その結果、多くの個体は集団内に12頭、特に強い親和的関係を結んでいる相手がいることが明らかになった。さらに、ゾウは集団内で、他個体が自分以外の個体とどのような関係を結んでいるかということに影響を受けながら、このような個体間関係を形成している可能性が示唆された。また、ゾウ使いとの結びつきが強い個体は、ゾウ同士の結びつきが弱くなる傾向があることが示された。これらの結果についてはさらに詳細な分析が必要だが、アジアゾウの社会性の本質を知るうえで重要な知見と考えられる。(抄録なし)24年度の主な研究目的は、アジアゾウにおける接触を伴う社会行動の機能を明らかにすることであった。そのため、まずタイのスリン・ゾウ研究センターでの行動調査を中心に行った。合計で約半年間スリンに滞在し、ゾウの行動データを収集した。現地でもともと組織されていたメスゾウの集団に加え、センターにいるゾウの中から計11頭のゾウのゾウ使いを雇い、村内の放飼場に連れてきてもらうことで、観察を行うこともできた。この調査では、個体識別に基づき、個体間交渉における行為者と受け手、交渉時の体勢、交渉のタイプなどをビデオカメラ、ボイスレコーダーなどを使用して記録した。このような詳細な観察は、森林性のアジアゾウの場合、野生下でデータを取ることが非常に難しく、飼育下で行うことに意義があると考えられる。またセンターには約200頭のゾウがおり、24年度の調査を通して約40頭分の観察データを集めることができた。ゾウは大型動物であるゆえ、1か所にこれだけ多くの個体がいる環境は他にはなく、本研究を遂行する上で非常に効率的に調査が進められる適切な調査地で調査を行うことができた。また、11月にはスリンで収集してきたデータの一部をまとめて、日本動物行動学会で発表を行った。10月にはブラジルにおいて国際ワークショップで国内の動物園で観察した結果をポスター発表し、インドの野生アジアゾウの研究者をはじめ、多くの研究者や学生と意見交換を行うことができた。また、本研究の目的である遺伝子からみるゾウの社会という点においては、修士課程で行ったゾウの性格と遺伝子との関連についての研究成果をまとめ、Zoo Biologyに掲載された。さらに、現在の調査地であるスリン・ゾウ研究センターの紹介を、Animal behavior and Managementに資料として投稿中である。

また、ゾウ使いとの結びつきが強い個体は、ゾウ同士の結びつきが弱くなる傾向があることが示された。これらの結果についてはさらに詳細な分析が必要だが、アジアゾウの社会性の本質を知るうえで重要な知見と考えられる。24年度は、タイでの調査は順調に進み、アジアゾウの社会行動に関する十分なデータを収集することができた。また、研究成果のまとめに関しても、学会発表2件、論文2本(1本投稿中)と、調査期間が長かったことを考慮すると順調に進んでいると考えられる。タイで収集したデータの分析、まとめはまだこれからの部分が大きく、今後早急に進める必要がある。まず、24年度に収集したデータの分析を最優先して行う。さらに本年度は主に24年度に収集したデータをまとめて、英語論文や博士論文の執筆に力を入れて研究を遂行する。また、不足しているデータの収集のためのタイへの渡航や、野生アジアゾウや飼育下または野生のアフリカゾウの調査に向けて、インドやタンザニア・ケニアへの渡航も計画する予定である。(抄録なし)
T細胞の抗原認識様式のパラダイムシフト樹立を目指した研究およびその展開

T細胞はT細胞受容体(TCR)を用いて、標的細胞表面の主要組織適合抗原(MHC)分子に抗原ペプチドが結合した、MHC/ペプチド複合体を認識し活性化される(transの相互作用)。我々は、近年、T細胞上のTCRが同じT細胞上のMHC分子/ペプチド複合体と相互作用してT細胞を活性化する新しい相互作用“cisの相互作用"を見出した。本研究では、TCRとMHC分子/ペプチド複合体との"cisの相互作用“が実際の免疫系で起こりうることを実証し、さらに、"cisの相互作用“を応用した次世代TCR抗原同定法を開発することを目的とした。まず、in vivoでの実験を行うために、T細胞内でdoxycyclineにて自己抗原(OVA)の発現を調節できるシステムを構築した。このベクターを、OVAを認識するOT-I TCRトランスジェニックマウスのTリンパ球に遺伝子導入した。今後、このリンパ球をC57BL/6マウスに移入し、doxycycline投与によりOVAを発現させた時の免疫応答を解析する予定である。また、内在性TCRを発現しないBW T細胞株にOT-I TCRおよびH-2Kb分子を発現させたT細胞株(OT-I_H-2Kb_BW)を作製した。このT細胞株にOVAペプチドをパルスすると、IL-2産生が誘導されることを確認した。この細胞にOVA発現ベクターを遺伝子導入すると、IL-2の産生が誘導される。そこで、インサートを含まない空の発現ベクターに1:105クローンの割合でOVA発現ベクターを混ぜたものを、OT-I_H-2Kb_BW細胞に遺伝子導入し、IL-2の発現を指標にOVA遺伝子導入細胞が濃縮されるかを検証した。その結果、OVA遺伝子の濃縮が観察された。現在、抗原未同定のTCRを用いて、その抗原が同定できるかを検証しようと準備している。T細胞にて、自己抗原が発現した際、そのT細胞上のMHC分子に抗原ペプチドが提示され、同じ細胞上のTCRが"cisの相互作用"をすることにより、反応すると考えられる。本研究では、TCRとMHC分子/ペプチド複合体との"cisの相互作用“が実際の免疫系で起こりうるかを実証するために、OVAを認識するOT-I TCR T細胞内でdoxycyclineにて自己抗原(OVA)の発現を調節できるシステムをレトロウイルスベクター系を用いて構築した。この発現ベクターはOVAと同時にGFPを発現できるようになっている。このベクターを用いてレトロウイルスを作製し、OVAを認識するOT-I TCRトランスジェニックマウスのTリンパ球に感染させ、遺伝子導入した。また、TCRとMHC分子/ペプチド複合体との"cisの相互作用“を用いた、抗原同定法を作製するために、内在性TCRを発現しないBW T細胞株にOT-I TCRおよびH-2Kb分子を発現させたT細胞株(OT-I_H-2Kb_BW)を作製した。そこで、インサートを含まない空の発現ベクターに1:105クローンの割合でOVA発現ベクターを混ぜたものを、OT-I_H-2Kb_BW細胞に遺伝子導入し、IL-2の発現を指標に細胞をソーティングし、OVA遺伝子導入細胞が濃縮されるかを検証した。TCRとMHC分子/ペプチド複合体との"cisの相互作用“が実際の免疫系で起こりうるかの実証については、doxycyclineにより発現が制御されるOVA遺伝子を導入したOT-I TCRトランスジェニックマウスのTリンパ球をC57BL/6マウスに移入し、doxycycline投与によりOVAを発現させた時の免疫応答を解析する予定である。また、TCRとMHC分子/ペプチド複合体との"cisの相互作用“を用いた、抗原同定法の作製に向けては、内在性TCRを発現しないBW T細胞株に抗原未同定のTCRを発現させ、標的細胞より作製したcDNAライブラリーを用いて、実際に抗原が同定できるか、検証していく予定である。

このT細胞株にOVAペプチドをパルスすると、IL-2産生が誘導されることを確認した。この細胞にOVA発現ベクターを遺伝子導入すると、IL-2の産生が誘導される。そこで、インサートを含まない空の発現ベクターに1:105クローンの割合でOVA発現ベクターを混ぜたものを、OT-I_H-2Kb_BW細胞に遺伝子導入し、IL-2の発現を指標にOVA遺伝子導入細胞が濃縮されるかを検証した。その結果、OVA遺伝子の濃縮が観察された。現在、抗原未同定のTCRを用いて、その抗原が同定できるかを検証しようと準備している。T細胞にて、自己抗原が発現した際、そのT細胞上のMHC分子に抗原ペプチドが提示され、同じ細胞上のTCRが"cisの相互作用"をすることにより、反応すると考えられる。本研究では、TCRとMHC分子/ペプチド複合体との"cisの相互作用“が実際の免疫系で起こりうるかを実証するために、OVAを認識するOT-I TCR T細胞内でdoxycyclineにて自己抗原(OVA)の発現を調節できるシステムをレトロウイルスベクター系を用いて構築した。この発現ベクターはOVAと同時にGFPを発現できるようになっている。このベクターを用いてレトロウイルスを作製し、OVAを認識するOT-I TCRトランスジェニックマウスのTリンパ球に感染させ、遺伝子導入した。今後、このリンパ球をC57BL/6マウスに移入し、doxycycline投与によりOVAを発現させた時の免疫応答を解析する予定である。また、TCRとMHC分子/ペプチド複合体との"cisの相互作用“を用いた、抗原同定法を作製するために、内在性TCRを発現しないBW T細胞株にOT-I TCRおよびH-2Kb分子を発現させたT細胞株(OT-I_H-2Kb_BW)を作製した。そこで、インサートを含まない空の発現ベクターに1:105クローンの割合でOVA発現ベクターを混ぜたものを、OT-I_H-2Kb_BW細胞に遺伝子導入し、IL-2の発現を指標に細胞をソーティングし、OVA遺伝子導入細胞が濃縮されるかを検証した。TCRとMHC分子/ペプチド複合体との"cisの相互作用“が実際の免疫系で起こりうるかの実証については、doxycyclineにより発現が制御されるOVA遺伝子を導入したOT-I TCRトランスジェニックマウスのTリンパ球をC57BL/6マウスに移入し、doxycycline投与によりOVAを発現させた時の免疫応答を解析する予定である。また、TCRとMHC分子/ペプチド複合体との"cisの相互作用“を用いた、抗原同定法の作製に向けては、内在性TCRを発現しないBW T細胞株に抗原未同定のTCRを発現させ、標的細胞より作製したcDNAライブラリーを用いて、実際に抗原が同定できるか、検証していく予定である。