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シャペロニンの機能発現の速度論的解析

本研究の目的とするところは、X線小角散乱法などの物理的測定とストップトフロー法による速度論的測定を駆使して、シャペロニンの作用の分子機構を物理化学的立場から定量的に明らかにすることである。以下の成果が得られた。ATP存在下生理的条件下にて、大腸菌のシャペロニンGroELとGroESはGroEL/GroES複合体を形成するが、GroELとGroESのモル比1:1の弾丸型複合体とモル比1:2のフットボール型複合体のいずれが形成されるのかが明らかではなかった。X線溶液散乱法を用いて生理的条件下におけるGroEL/GroES複合体の溶液中構造を直接的に観測し、弾丸型複合体が主であり、フットボール型複合体は有意には存在しないことを明らかにした。シャペロニンGroELのATPによるアロステリック転移の速度定数はATP濃度に対して多重シグモイダルな依存性を示し、従来これは、GroELの二重リング構造に由来するとされていた。しかし、今回われわれは、GroELの単一リング変異体(SR1)においても同様の多重シグモイダルな依存性が存在することを見出した。これはGroEL上に少なくとも2つ以上のATP結合部があることに由来すると考えられる。ATPにより誘起されるGroELアロステリック転移のADPによる阻害実験から、100μM ADP-400 μM ATPの条件下では第二ATP結合部位がADPによって占有される。この条件下で、azido-ADPによる光親和性標識を行い、標識GroELを得た。蛍光性亜鉛錯体を用いて標識GroEL中のリン酸基の存在を確認できたので、第二ATP結合部位の存在が確認されたことになる。今後、第二ATP結合部位のアミノ酸配列上の位置を明らかにすることが必要である。シャペロニンは,分子シャペロンの代表として細菌から高等生物に至るまで普遍的に存在し,蛋白質の細胞内フォールディングのために特化した蛋白質分子機械として働いている。シャペロニンは分子量約6万の蛋白質分子が14個から18個会合した二重リング構造を取っており,リング内に形成される直径約80Aのキャビティ内に標的蛋白質が閉じこめられて構造形成する。シャペロニンのこの驚嘆すべき作用にはATP結合によるアロステリックな構造転移とATP加水分解などが必要とされるが,その分子機構の詳細はまだ全く不明である。本研究の目的とするところは,熱量計などによる熱力学的測定とストップトフロー法による速度論的測定を駆使して,シャペロニンの作用の分子機構を物理化学的立場から定量的に明らかにすることである。ATP存在下生理的条件下にて,大腸菌のシャペロニンGroELとGroESはGroEL/GroES複合体を形成するが,GroELとGroESのモル比1:1の弾丸型複合体とモル比1:2のフットボール型複合体のいずれが形成されるのかが明らかではなかった。X線溶液散乱法を用いて生理的条件下におけるGroEL/GroES複合体の溶液中構造を直接的に観測し,弾丸型複合体が主であり,フットボール型複合体は有意には存在しないことを明らかにした。しかし,ATP+BeFx共存下では安定なフットボール型複合体が形成されることも明らかとなり,これは,シャペロニンの反応サイクル中過渡的にフットボール型複合体が生成することを示唆している。シャペロニンGroELのATPによるアロステリック転移の速度定数はATP濃度に対して多重シグモイダルな依存性を示し,従来これは,GroELの二重リング構造に由来するとされていた。しかし,今回われわれは,GroELの単一リング変異体(SR1)においても同様の多重シグモイダル依存性が存在することを見出した。シャペロニンは,分子シャペロンの代表として細菌から高等生物に至るまで普遍的に存在し,蛋白質の細胞内

フォールディングのために特化した蛋白質分子機械として働いている。シャペロニンは分子量約6万の蛋白質分子が14個から18個会合した二重リング構造を取っており,リング内に形成される直径約80Åのキャビティ内に標的蛋白質が閉じこめられて構造形成する。シャペロニンのこの驚嘆すべき作用にはATP結合によるアロステリックな構造転移とATP加水分解などが必要とされるが,その分子機構の詳細はまだ全く不明である。本研究の目的とするところは,熱量計などによる熱力学的測定とストップトフロー法による速度論的測定を駆使して,シャペロニンの作用の分子機構を物理化学的立場から定量的に明らかにすることである。以下の成果が得られた。昨年度までの研究成果によりGroEL上に第二のATP結合部位のあることが強く示唆されている。そこで,蛋白質分子表面の形状と静電ポテンシャルの類似性検索を行い,GroEL頂上ドメインの残基250から280の領域にある凹みが第2の結合部位である可能性が高いことがわかった。この領域のAla251,Ala258,Ala175などのアラニンをよりかさ高いロイシンやイソロイシン変えて凹みを塞いだ変異体を作成し,変異体のATP結合特性を調べた。具体的には,GroEL-Y485W変異体およびその単一リング変異体(GroEL-SR1-Y485W)に上記の変異を導入し,これらの変異体のATPによるアロステリック転移の速度過程をストップトフロー蛍光法により調べた。その結果,いずれの変異体において転移の速度定数のATP濃度依存性プロフィールが大きく変化した。特に,三重変異(A251L+A258L+A275I)の導入によりATP濃度依存性プロフィールの二つめの相が消失し,変異導入部位に第二のATP結合部位が存在することが示された。シャペロニンは,分子シャペロンの代表として細菌から高等生物に至るまで普遍的に存在し,蛋白質の細胞内フォールディングのために特化した蛋白質分子機械として働いている。昨年度までの結果から、GroEL単一リング変異体を用いて、ATP結合によるアロステリック転移の速度論的解析を行い、GroELモノマーあたり二つのATP結合部位があることを示す結果を得ている。ATPにより誘起されるGroELアロステリック転移のADPによる阻害実験から、400μMATP-100μMADPの条件下では第二ATP結合部位がADPによって占有される。
建設日雇労働者の生活保障政策に関する研究

1.本研究では、「あいりん地域」の日雇労働市場の展開を中心として、労働市場の縮小が日雇労働者や職人層の労働・生活に与える影響を明らかにし、不安定就業層の生活保障政策において、雇用と福祉の交錯を視野に入れた施策のあり方を研究することが目的である。2.(1)リーマンショック以降の新規流入層の実態と従来の日雇労働者との相違点を明らかにするため、2008年に西成労働福祉センターが実施した「あいりん地域日雇労働者調査」のデータ再集計と分析を行った。(2)「あいりん地域」の日雇労働者を雇用する事業所の求人動向や雇用実態をとおして、1998年から2011年まで西成労働福祉センターで実施している「建設業作業員宿舎調査」の分析を行った。(3)不安定就労層(稼働層)の生活保障政策のあり方を明らかにするため生活保護受給者や労働災害被災者の就労支援策を展開している釧路市役所や宮崎県建設農林事業団への現地聞き取り調査を実施した。(4)建設労働や失業・貧困、社会的排除、ホームレス、生活保護(就労支援)に関する先行研究成果のレビューを行ない、学内外の研究会等で先行研究レビュー報告や意見交換を行った。3.(1)リーマンショック以降の新規流入層は、若年化しており、建設日雇に従事する労働者の就労経路の不明確化や社会保障の欠如が顕著となってきている。(2)90年代以降建設作業員宿舎に入る労働者の減少が続き、現場入場の手続きの厳格化(身元確認・健康管理・年齢制限など)が進み、雇用を抑制する事業所が増加している(3)就労支援プログラムでは労働条件の低位性や社会保障の欠如はあるが、当事者の社会的自立(適応)を促進するシステムが確立している。(4)本研究課題の成果をまとめて、2012年度に修士論文を執筆する。
精子セリンプロテアーゼによる選択的蛋白分解と精子生理機能調節に関する研究

精子と卵の相互作用で機能する精子セリンプロテアーゼの検索を行い,以下の研究成果が得られた。1)マウス精子にはアクロシンのほかに,42と41キロダルトンプロテアーゼが存在する。それらは等電点などの違いにより,アクロシンと明確に区別することができた。また,ラットやハムスター精子ではそれらのプロテアーゼに相当するものが見いだせないため,それらがマウス特異的に存在している可能性がある。2)42と41キロダルトンプロテアーゼはアクロソームマトリックスと膜に局在しており,トリプシン様のプロテアーゼによって活性化されることが明らかになった。アクロソーム反応直後に,アクロシンなどによって膜から活性化・放出されていることも考えられる。3)これらのプロテアーゼはADAM2や3と同様に細胞膜マイクロドメインに濃縮されており,精子の卵透明帯への接着・結合と脱着,あるいは精子と卵の融合で機能していることが示唆される。
様々な状況下でのポートフォリオ選択問題に関する数理的研究

本年度は,前年度に構築された確率的および曖昧さをもつファジィ的要因が含まれる状況下におけるポートフォリオ選択問題での数理的なリスク管理手法を,より複雑な投資環境や他の現実問題へ応用することを目的とした研究を行った。投資モデルに関しては,投資家の主観性を陽に取り扱い,主観性の投資パフォーマンスへの影響や資産価格モデルへの関係性を数理的かつ数値例による実証で示した.この研究成果で,安定定期な金融経済基盤への投資家の主観性を考慮する数理的基盤が開発された.また生産管理を含めた様々な制約条件を包含する一般的な意思決定問題に焦点をあてた研究を行った.近年の複雑な社会環境下でいかに制約を満たしつつ,最適な意思決定が行えるかが重要となっている.本研究によって,そのような複雑な要因を確率理論・ファジィ理論の両側面から多角的にとらえ,実現場での様々な状況に対応可能な汎用モデル・効率的解法の開発を行った.さらに,より多くの状況下を対象とし,起こりうる最悪の事態を回避可能なモデルとして,近年注目され始めているロバスト最適化モデルを考慮した.これまで確率的要因しか考察対象とされなかったモデルに対し,確率・ファジィの両要因を考慮することで数理的な拡張を行った.また数理的な基盤の拡張として,状況を問わない一般的な線形計画問題・整数計画問題に対し,確率・ファジィ状況下を考慮した数理モデルを提案し,その解析的かつ効率的な解法が構築された.これらの成果によって,意思決定者が必要な時に必要な解法の選択が可能となり,さらに確率・ファジィ要因をどこまで組み入れて考察するかといった実現場の状況に見合ったモデルが構築され,各意思決定場面に適切に利用可能な数理モデル・数理的解法が開発された.不確実性・不確定性両方が混在する状況下での金融資産選択(ポートフォリオ選択)問題を,実際の市場での多様な場面で適用可能な汎用モデル(ランダムファジィポートフォリオ選択問題)として定式化し,その非線形計画問題に対する効率的解法を提案した.特に,数学的厳密性と共に実社会での実用性を重視するため,最適解の等価性を保持しながら主問題を変換し,汎用ソルバーなどで容易に解くことが可能な線形計画問題,または線形計画法をベースとした効率的解法が構築可能な問題へと変換することに成功した.これにより,汎用モデルの構築のみならず実際に金融市場への適用性の向上が可能となった,上記により構築された効率的解法をより解法が複雑・困難となる不確実・不確定状況下での離散最適化問題に適用し,線形緩和問題と厳密最適化法の組み合わせにより,これまでよりも短時間で多くの問題を解くことが可能な厳密解法の開発に成功した.また生産企業が抱えるプロダクトミックス問題やプロジェクト選択問題に対し,より様々な状況に対応できるような数理モデルを構築し,その効率的,かつできうる限り厳密的な解法の様々なモデルの開発を行った.その際に,現実社会で利用され始めているボトルネック制約に着目した制約理論(TOC)を導入した数理計画問題を提案した.これらの問題は,上記のポートフォリオ選択問題と同様に,非線形計画問題として定式化されるが,等価変換をうまく加えることによって,線形計画問題に帰着させられることを示した.これにより,実際の生産現場への適用範囲の向上が期待できると考えられる.これら提案したモデルと既存モデルを実社会の様々な数値例を用いて比較した結果,提案モデルが,現在のような経済不安定の状況下で,安定してかつ高収益や低コストといった望ましい結果が得られることが示された.本年度は,前年度に構築された確率的および曖昧さをもつファジィ的要因が含まれる状況下におけるポートフォリオ選択問題での数理的なリスク管理手法を,より複雑な投資環境や他の現実問題へ応用することを目的とした研究を行った。投資モデルに関しては,投資家の主観性を陽に取り扱い,主観性の投資パフォーマンスへの影響や資産価格モデルへの関係性を数理的かつ数値例による実証で示した.この研究成果で,安定定期な金融経済基盤への投資家の主観性を考慮する数理的基盤が開発された.また生産管理を含めた様々な制約条件を包含する一般的な意思決定問題に焦点をあてた研究を行った.近年の複雑な社会環境下でいかに制約を満たしつつ,最適な意思決定が行えるかが重要となっている.本研究によって,そのような複雑な要因を確率理論・ファジィ理論の両側面から多角的にとらえ,実現場での様々な状況に対応可能な汎用モデル・効率的解法の開発を行った.さらに,より多くの状況下を対象とし,起こりうる最悪の事態を回避可能なモデルとして,近年注目され始めているロバスト最適化モデルを考慮した.これまで確率的要因しか考察対象とされなかったモデルに対し,確率・ファジィの両要因を考慮することで数理的な拡張を行った.また数理的な基盤の拡張として,状況を問わない一般的な線形計画問題・整数計画問題に対し,確率・ファジィ状況下を考慮した数理モデルを提案し,その解析的かつ効率的な解法が構築された.これらの成果によって,意思決定者が必要な時に必要な解法の選択が可能となり,さらに確率・ファジィ要因をどこまで組み入れて考察するかといった実現場の状況に見合ったモデルが構築され,各意思決定場面に適切に利用可能な数理モデル・数理的解法が開発された.
シアノバクテリアが生み出した太古代「酸素オアシス」における真核生物の進化

西オーストラリアのファレル珪岩層(30億年前)の複数地点から産出する微化石について詳細な研究を行った。その結果,内部に一個複数の大型娘細胞(あるいは胞子)を有する,真核細胞的な特徴を有する極めて貴重な標本を発見した。また高解像度の走査電子顕微鏡分析によってレンズ状微化石のつば状突起(フランジ)が微細なメッシュ構造を有し,細胞骨格の関与で形成された可能性を示すことができた。さらに個々の微化石の炭素同位体比の特徴(マトリクスの炭質物と異なる)やリンと窒素の濃集を明らかにし,その生物起源性を確固たるものとした。平成25年度は1)含微化石チャート、珪質ストロマトライトの主成分分析、微量元素分析(希土類元素と重金属元素)とCe同位体比分析、2)珪質ストロマトライトの薄片作成と微細構造観察、3)層序データと岩相解析にもとづく堆積環境の復元、4)名古屋大学で作成した薄片を用いて海外研究協力者であるフランスのリル第一大学のKevin Lepot博士が二次イオン質量分析計を用いた個々の微化石の炭素同位体を行った。また11月に関連する国際会議『International Biogeoscience Conference 2013 Nagoya, Japan』を主催した。それぞれの成果は、1)含微化石チャートはクロム、亜鉛、ニッケル等の重金属に富む一方で、珪質ストロマトライトはヒ素に富み、両者とも希土類元素パターンは非海成であった。また、セリウムの負異常は変質作用の影響を受けている可能性が高いことが示唆された。2)珪質ストロマトライトには有機物が粒状に分布するところ、繊維状に分布するところがあり、いずれも分解のすすんだ微化石の可能性が示唆された。一方、含微化石チャートにみられるストロマトライト状のコーン構造はその内部構造等から珪質シンターであると結論づけられた。3)含微化石チャートは海岸近くの入り江の様な閉じた海域の周辺(陸域)において熱水活動によって形成され、一方ストロマトライトはその熱水が流れ込むような浅い海域で形成されたというモデルを得た。4)個々の炭素同位体比を系統的に分析し、レンズ状微化石と球状微化石では異なる同位体比(ー30ー40‰)を持つことを明らかにし、ストロマトライトはー27‰程度であった。国際会議は好評であり、90名の参加者(うち外国人30名)を得、この成果をフルペーパーのプロシーディングスとして、GeobiologyからSpecial Issueとして発行予定である。平成24年度は既存標本の薄片作成と観察、地質調査と試料採集、そして二次イオン質量分析計を用いた個別同位体分析について予備的実験を行った。既存試料のうち微化石含有量の多いものから薄片を作成し、偏光顕微鏡で観察した。微化石の種類と量についてデータを収集し、分析可能な標本を杉谷がチェックしたのち研究協力者であるDorothy Z. Oehler博士、Chris House博士に送付した。両博士がその後、カリフォルニア大学ロスアンゼルス校の二次イオン質量分析計を用いて、微化石の同位体分析を行った。西オーストラリア・ピルバラクラトンの地質調査は9月中旬に杉谷と三村が行った。当初地質学の専門家であった共同研究者竹内も参加する予定であったが、直前の怪我のため断念した。そのため調査は目標とする精度で行われたとは言い難い。一方で、微化石の標本毎の同位体分析は成功裏に終わり、フランジを持つ微化石、小型球状微化石、そしてマトリクスの不定形の有機物の良好なデータが得られた。フランジをもつものと小型のものの炭素同位体比はほぼ同じで平均-37‰であったが、マトリクス有機物粒子は-33‰であった。このことより、「微化石」が微小な有機物粒子が続成作用等で再配列してできた「偽化石」でないことを改めて立証できた。またバルクでなく微化石の個別標本の炭素同位体が特定出来たことにより、その起源を特定する上で鍵となる制約条件を得ることができた。この成果は国際誌Geologyに投稿し、受理された。本研究の目的は、西オーストラリア・ピルバラクラトンのファレル珪岩層に含まれる太古代浅海性チャート(30億年前)から産出する微化石群について、“個体毎の"炭素同位体比を測定し,その生物起源性をさらに強固なものとすること、そして中期太古代における生物多様性と酸素オアシスにおける真核生物の存在を立証することにあった。そのために、顕微鏡観察にもとづいて形態学的に分類した微化石様構造物の群個別炭素同位体比を二次イオン質量分析計(SIMS)で測定するという新しい方法論を用いることとした。

申請者はペンシルバニア大学のC.ハウス博士、米航空宇宙局のD.アエラー博士との共同研究を遂行し、レンズ状微化石と小型球状化石、そしてマトリクスに存在する不定型の有機物(ケロジェン)を分析した。レンズ状微化石と小型球状微化石の同位体比はそれぞれー35.8ー40.5、ー34.4ー44.2パーミルであり、若干小型球状化石の方が軽い傾向が出たが、統計的に有意な差は得られなかった。一方でマトリクスはこれら微化石より有意に重く(平均でー32.9パーミル)、微化石様構造が母岩中に存在した有機物が移動濃集して形成された偽化石ではないことを確実なものとすることができた。またこれに引き続き、フッ化水素酸ー塩酸処理により分離した微化石様構造について、Nano-SIMS(SIMSより解像度が高い)を用いて分析し、炭素だけでなく、窒素やリンを濃集していることを明らかにした。この研究はフランス自然誌博物館のF.ロベール博士らとの共同研究であり、現在投稿準備をすすめている。さらに同国のピエール・マリ・キューリー大学のS.デレン博士と分離生成した有機物のキャラクタリゼーションをすすめている。地球生物学珪質ストロマトライトとそれに形状は類似するが形成プロセスが全く異なる珪質シンターを微細組織の観点と微量元素組成の観点から明確に区別出来た点は重要な成果である。また過去の調査によって得られた層序のデータ、岩相の水平方向の変化のデータから、堆積場をある程度特定することができた。推測される堆積場は、陸域も想定されるものであり、34億年前に既に陸域生態系が成立していた可能性を提示することができた。さらに珪質ストロマトライトの微細構造の観察により、その生物起源性は揺るぎないものになった言えよう。珪質ストロマトライトの同位体比は、その構築微生物がシアノバクテリアであったことを強く示唆し、本研究で提案した、酸素オアシスモデルを裏付けるデータである。微化石抽出実験により、それらが保存性の高い有機質の膜を有していることを立証した。以上のように本研究で様々な成果が得られているが、以下のような課題が残されている。1)酸素オアシスモデルをより信頼性の高いものにする為には、堆積場モデルの確実性を高めることが必要であり、追加調査が必要である。2)微化石が真核生物であった可能性はますます高まっているが、いまだ証拠は十分とはいえない。バイオマーカー分析の結果が待たれる。3)珪質ストロマトライトと微化石の関係性を明らかに必要がある。これらのことから、「おおむね順調に進展している」と判断した。微化石の個別同位体分析の第一段階は順調に進んだが、そのデータは形態の多様性を裏付けるものではなかった。ただし、フランジをもつ微化石の中には、内部に微小な球体を多く含むものがあり、前者は多分裂直前の母細胞である可能性が申請者によって以前から指摘されていたところではある。すなわち、今回の結果はフランジをもつ微化石と小型球状微化石がそれぞれ同じ生物の生活環における異なるステージに対応する可能性を裏付けることになるかもしれない。これは、太古代微化石研究における新たな展開を示唆するものである。現地調査については共同研究者が急遽参加出来なくなったことにより満足のいく成果は得られなかったが、これまでに蓄積したデータをもとに解析を進めることができた。また酸分解により微化石を抽出することに成功したことは今後の研究の展開に大いに期待がもてるところである。すでに集まっている多くのデータについては、解析を進め、なるべく早く論文化していく。
戦間期国際法学における「難民」と「国民」

初年度である本年度は、本研究課題採択以前の研究成果(国際法における難民の地位の歴史的形成過程に関する研究)を基に、戦間期に時間的範囲を限定し、隣接諸分野へと視野を拡張して、実証的研究を行う第一歩を踏み出した。具体的には、戦間期の次の4つの議論の文脈を特定し、その一部の研究を開始した。1戦間期に展開された国民性=国籍に関する国際規範の形成に向けた政府間・学者間の議論、2第一次大戦講和条約における国民性=国籍の規律に関する学説上の議論、3難民の地位と無国籍者の地位との異同に関する学説上の議論、4出移民国と入移民国との間の政府間交渉。公表の実績としては、まず、初年度の研究成果の一部を九州国際法学会例会の場で報告の機会を頂戴し、今後の研究のために極めて有益な御意見・御批判を頂いた。その際、特に、上記の2と3を取り上げ、「難民の地位」概念の構成における「国民性=国籍」概念の中心性と不確定性を論じた。報告後は、特に、歴史的事象を扱うための堅固な方法論という一般的レベルで自らの研究を反省する機会を頂いた。また、年刊雑誌『難民研究ジャーナル』に寄稿した論文では、歴史的研究を踏まえて得た認識枠組(特に、地位statusの確定と身分statusの解放との相剋)を、現代の国際法に関する事案の解釈に応用した。具体的には、バルカン半島の国家承継や武力紛争を経て(国籍と在留資格を含む)地位を次第に不安定化させたクロアチア在住のアルバニア難民の事案を詳細に検討し、現代国際法において地位の安定性如何が一つの法的論点として認識され始めていること、その法的根拠が厳密には人権理念との間に抵触を生じる可能性を孕むことを論じた。以上の概要は、今日の国家の成員資格に関する法的規律の基底的論拠を検討するための一歩であり、今後のさらなる研究の基礎を構成し、一貫した継続を必要としている。本研究課題採択以前の研究成果(国際法における難民の地位の歴史的形成過程に関する研究)を基に、戦間期に時間的範囲を限定した上で、隣接諸分野へと視野を拡張し、取り上げられるべき議論の文脈として、1戦間期に展開された国民性=国籍に関する国際規範の形成に向けた政府間・学者間の議論、2第一次大戦講和条約における国民性=国籍の規律に関する学説上の議論、3難民の地位と無国籍者の地位との異同に関する学説上の議論、4出移民国と入移民国との間の政府間交渉を特定した。現時点では上記14を本研究課題の構成要素の全体であると考えており、現在まで、2と3の分析・検討をそれぞれの8割程度まで完了することができた。その際、「研究実績の概要」に述べた報告・公表を除くほか、研究申請調書に構想した通り、スカイプを通じた「国籍とシティズンシップに関する研究会」をおよそ3週に1度のペースで定期的に開催し、長時間に亘り(各回約4時間)関連する論文を読み、議論を交わすことができた。同研究会の参加者は、本報告の執筆者自身の専門分野である国際法学に限定されず、憲法学や政治哲学、社会学の専門家を含んでおり、多角的・学際的に本研究課題に含まれる諸論点に取り組むことができた。本研究課題に含まれる諸論点の性質も、そうした多角的・学際的な取り組みを求めるものであった。具体的には、同研究会の論題には、国家の成員資格の生得(生地主義jus soli/血統主義jus sanguinis)の基底的論拠の探究や、それらと生得によらない国家の成員資格(jus educationisやjus laboris、jus nexi等)との比較検討、国家の成員資格と社会契約論やデモクラシーとの間の親和性の分析が含まれる。その詳細は、今年度中に公表するに至らなかったものの、研究課題全体の公表に向けた大きな成果を得ることができたと考えている。今後の研究の推進方策としては、当初の計画通り、本研究課題採択以前の成果から採択以後に拡張した隣接諸分野に関する実証的研究の成果を踏まえ、戦間期における難民の地位と(本研究課題採択以後の研究成果である)隣接諸分野との間の有機的な総合を試みるため、現在までの要収集文献の再整理を基に、フランスおよびスイスを訪問し、戦間期国際法における国民、難民、無国籍者に関して、新たに意義を見出した未収集の文献を収集する。戦間期の史料には日本国内では入手困難なものも少なくなく、こうした作業が必要であるためである。外国での関連資料収集を開始すると同時に、本研究課題全体の反省的再構成を継続して行う。そのための具体的な作業として、特に初年度までに進めた研究の部分的な公表を目指す。初年度までに進めた研究では、今日ではほとんど忘却されている幅広い構想を包摂した国家の成員資格に関する戦間期の国際法の議論の一端が見出された。それらが同じ国家の成員資格に関するものと想定される今日の国際法の規律との間でどのように/なぜ断絶しているのかにかかわる方法論的視座の設定に注意を払いながら、まず、当時の議論の全体的構成を全体的に明らかにすることを目指して研究を深めたい。今日ではもっぱら技術的な問題として認識されている国家の成員資格は、戦間期当時、各国の国家体制のみならず、多様な諸国家から構成される国際秩序全体がいかに形成されるのかにかかわる重要な論点であった。その形成を規律する際に

決定的に重要となる要素は、各国家の領域=「空間」に加え、(生得や親族関係の連続的系譜の擬制と遡行不可能性、領主・領民間の保護服従契約、真正連関の真正性等にかかわる)「時間」であったと推察される。それらの全体を正確に言語化し、公表に向けた準備を進めることを、本研究課題の今後の推進方策として計画している。初年度である本年度は、本研究課題採択以前の研究成果(国際法における難民の地位の歴史的形成過程に関する研究)を基に、戦間期に時間的範囲を限定し、隣接諸分野へと視野を拡張して、実証的研究を行う第一歩を踏み出した。具体的には、戦間期の次の4つの議論の文脈を特定し、その一部の研究を開始した。1戦間期に展開された国民性=国籍に関する国際規範の形成に向けた政府間・学者間の議論、2第一次大戦講和条約における国民性=国籍の規律に関する学説上の議論、3難民の地位と無国籍者の地位との異同に関する学説上の議論、4出移民国と入移民国との間の政府間交渉。公表の実績としては、まず、初年度の研究成果の一部を九州国際法学会例会の場で報告の機会を頂戴し、今後の研究のために極めて有益な御意見・御批判を頂いた。その際、特に、上記の2と3を取り上げ、「難民の地位」概念の構成における「国民性=国籍」概念の中心性と不確定性を論じた。報告後は、特に、歴史的事象を扱うための堅固な方法論という一般的レベルで自らの研究を反省する機会を頂いた。また、年刊雑誌『難民研究ジャーナル』に寄稿した論文では、歴史的研究を踏まえて得た認識枠組(特に、地位statusの確定と身分statusの解放との相剋)を、現代の国際法に関する事案の解釈に応用した。具体的には、バルカン半島の国家承継や武力紛争を経て(国籍と在留資格を含む)地位を次第に不安定化させたクロアチア在住のアルバニア難民の事案を詳細に検討し、現代国際法において地位の安定性如何が一つの法的論点として認識され始めていること、その法的根拠が厳密には人権理念との間に抵触を生じる可能性を孕むことを論じた。以上の概要は、今日の国家の成員資格に関する法的規律の基底的論拠を検討するための一歩であり、今後のさらなる研究の基礎を構成し、一貫した継続を必要としている。本研究課題採択以前の研究成果(国際法における難民の地位の歴史的形成過程に関する研究)を基に、戦間期に時間的範囲を限定した上で、隣接諸分野へと視野を拡張し、取り上げられるべき議論の文脈として、1戦間期に展開された国民性=国籍に関する国際規範の形成に向けた政府間・学者間の議論、2第一次大戦講和条約における国民性=国籍の規律に関する学説上の議論、3難民の地位と無国籍者の地位との異同に関する学説上の議論、4出移民国と入移民国との間の政府間交渉を特定した。現時点では上記14を本研究課題の構成要素の全体であると考えており、現在まで、2と3の分析・検討をそれぞれの8割程度まで完了することができた。その際、「研究実績の概要」に述べた報告・公表を除くほか、研究申請調書に構想した通り、スカイプを通じた「国籍とシティズンシップに関する研究会」をおよそ3週に1度のペースで定期的に開催し、長時間に亘り(各回約4時間)関連する論文を読み、議論を交わすことができた。同研究会の参加者は、本報告の執筆者自身の専門分野である国際法学に限定されず、憲法学や政治哲学、社会学の専門家を含んでおり、多角的・学際的に本研究課題に含まれる諸論点に取り組むことができた。本研究課題に含まれる諸論点の性質も、そうした多角的・学際的な取り組みを求めるものであった。
唐宋道教の心性思想研究

平成1314年度の本研究の成果は以下の通りである。山田は研究全体の統括を行うとともに、六朝唐代の道教の「国土」観の変遷と道教心性思想との関わりと変遷、「内教」の概念を軸に道教・仏教(禅宗)間の心性思想の交流を考察した。又、杜光庭を材料に、唐末五代の道教の心性思想を儒教及び禅宗思想との関わりから考察した。報告書では北宋道教の心性思想を唐から宋代への流れの上に位置づけ、全体として、六朝から宋までの心性思想の流れを検討し得た。麥谷は人文科学研究所での『茅山志』研究会を主催し、唐代道教の心性思想を理解する上での全体的背景の考察と理解に努める一方、「三經御註から見た唐・玄宗の三教理解」と題した口頭発表を行い、唐代道教思想上の重要人物である玄宗皇帝の三教理解について考察した。報告書としては、唐五代道教の道教文献『太上老君説常清靜經註』の索引を作成した。船山は、六朝期に起こり唐宋に盛んに行なわれた「捨身行」について調査し、その背景にある思想と戒律との関わり等を考察し、一方で、菩薩の十地思想を悟りとの関わりから考察した。報告論文集では、戒律に視点を据え、心性思想と深く関わる中国仏教戒律史の概要を考察した。坂内は、先ず、唐代の王損之の注釈である『玄珠心鏡』の序文に対して基礎的な検討を行い、続いて、報告論文集では『玄珠心鏡註』を材料に、唐代道教の心性思想と仏教思想、特に禅宗との交流を具体的に論じた。全体として、六朝、唐、五代、北宋の各時代の儒・仏・道三教交流の具体的諸相を解明するこが出来たと思われる。各研究者の個別研究に重きを置いた平成13年度の本研究の成果は以下の通りである。山田は研究全体の統括を行うとともに、六朝唐代の道教の「国土」観の変遷を、当該時代の道教の心性思想の変遷と関連付け、心性思想の広がりを論証した。又、「内教」の概念を軸に検討を進め、道教・仏教(禅宗)間の心性思想の交流を考察した。麥谷は人文科学研究所での『茅山志』研究会を主催し、唐代道教の心性思想を理解する上での、全体的背景の考察と理解に努めた。船山は、六朝期に起こり唐宋に盛んに行なわれ、社会現象ともなった「捨身行」について、その事例を調査し、その背景にある思想と戒律との関わり等を考察した。坂内は、唐代の女仙崔少玄が仙去する際に夫の盧陲に与えた「守一詩」に、王損之が注釈を加えた『玄珠心鏡』の序文に対しての基礎的な検討を行った。山田は現在、五代・杜光庭『道徳眞經廣聖義』の心性思想を北宋思想との関わりから考察中であり、坂内は『玄珠心鏡』の修心思想と天台止観及び初期禅宗の「看心」思想との関連についての考察を次年度に向けて準備中である。次年度はこれらの個別研究を軸としつつ、唐代から北宋へという歴史的展開に検討の重点を移し、中世から近世にかけての三教交流における心性思想の全体像の解明をめざす。最終年度にあたる平成14年度の研究成果は以下の通りである。

山田は研究全体の統括を行うとともに、「杜光庭の思想(上)-「道氣」と「樂記篇」-」、「杜光庭の思想(下)-「虚心」と「無心-」を著わし、前者では、唐末五代の道教の心性思想を儒教思想との交流の上に検討し、後者では、「虚心」「無心」の語を軸に禅宗との関わりから心性問題を考えた。「報告論文書」掲載の「曹道沖の思想について」では、北宋の『道徳経』注釈を材料に、その心性思想を唐から宋代への流れの上に位置づけた。昨年度の成果と併せることで、六朝から宋までの心性思想の流れを検討したことになる。麥谷は「三經御註から見た唐・玄宗の三教理解」と題した口頭発表を行い、唐代道教思想上の重要人物である玄宗皇帝の三教理解について考察した。本報告集では、山田「杜光庭の思想(上)」も取り上げた、唐五代道教の心性思想の重要資料である『太上老君説常清靜經註』の索引を作成した。船山は「龍樹、無著、世親の到達した階位に関する諸伝承」を著わし、菩薩の十地思想に於いて初地に至ることの意義を悟りとの関わりから考察した。「報告論文集」掲載の「五世紀中国における仏教徒の戒律受容」は仏教の「戒」に視点を据え、心性思想とも深く関わる中国仏教戒律史の概要を考察した。「報告論文集」掲載の坂内「『玄珠心鏡註』に見える修心思想」は、九世紀初頭の成立と推測される『玄珠心鏡註』を材料に、唐代道教の心性思想と仏教思想、特に禅宗との交流を具体的に論じたものであり、『玄珠心鏡註』の心性思想の背景に、道・仏二教の心性思想を巡る交流が有ったことを指摘している。全体として、六朝、唐、五代、北宋の各時代の仏・道二教の交流に関わる研究成果を得ることが出来た。
チーム・プロセスに焦点を当てた人材育成連携活動の形成的評価研究

看護学部と病院の連携による人材育成プログラムの多くは、個々の教員及び看護師の能力開発に焦点化されているが、個人の成長が看護チームへ全体の成長に活かされにくい現状がある。そこで本研究では、個人の成長を看護チームの成長へと紡ぎあげるチーム・プロセスを重視し、そこに着眼した継続教育プログラムを試行し、その効果を段階的に評価した。本研究の目的は、看護学部と病院の人材育成連携活動の長期的・組織的影響を評価する概念枠組みと評価指標を検討した上で効果的な継続教育プログラムを開発することである。平成22年度は、3年間にわたる本看護学部と病院の人材育成連携活動における相互影響を分析するとともに、評価枠組みと成果指標について文献検討を行った。本看護学部は、平成19年度より地域の中小規模病院と人材育成連携活動を開始した。主な活動内容は、研究支援、及び看護過程・カンファレンス他に関する講義・OJT (on-the-job-training)等の研修であった。看護学部と病院の相互影響を検討するため、(1)連携病院の看護師への質問紙調査、(2)看護過程・カンファレンス研修の参加者への記録調査、及び(3)看護学部と病院の連携活動参加者への面接調査を実施した。分析結果から、人材育成連携活動によって看護実践能力の基盤となる批判的思考力が向上することが示唆された。また批判的思考力の向上によって、普段の看護実践における新たな問題発見と解決法の考案が導かれる傾向がみられた。したがって、人材育成連携活動は、看護師の思考過程の洗練を通じて看護実践能力の向上に寄与することが示唆された。しかし、こうした看護師個人の成果がチームや組織に与えた影響、ならびに教員の看護実践力や教育力に与えた影響については、ほとんど認識されていなかった。看護師個人の成果が看護チームへと熟成されるプロセスとその促進要因、及び大学・病院のユニフィケーションの評価指標は確立しておらず、今後は簡便で信頼性・妥当性のある指標を明らかにする必要がある。次年度は、看護師個人の成果をチームの成果へと紡ぎ上げるプロセスを視野に入れた長期的な人材育成連携活動を捉えた概念枠組みに沿って、チーム・プロセスを促進する人材育成プログラムの開発をめざす。平成23年度は、これまでの調査結果を踏まえて看護師個人の成果をチームの成果へと紡ぎ上げるプロセスと促進・阻害要因、及び個人・集団のメタ認知を活性化する教育方法について検討した。これまでの3つの調査を統合した結果、人材育成連携活動により看護師個人の批判的思考力や自律性が向上することが示唆された。その一方で、看護師個人の成果が看護チームへと還元し難いことも確認された。したがって、看護の質改善は、看護師個人の看護実践能力に焦点化した研修だけでは達成困難であることが明らかとなった。看護は24時間を通して患者の生活と治療を支えるため、個々の看護実践能力の過不足をチームワークによって補完しあいながらその水準を維持・管理している。ところが、看護実践能力の継続教育は1対1の援助関係を前提に構成されたプログラムがほとんどであり、既存の看護チームを対象にしたプログラムは実施が難しいためか、ほとんどみられない。そこで、チームメンバーの継続教育プログラムとしてSSMベースのアクションリサーチを検討した。これは、出来事が生起している現場で、研究者が問題状況にいるチームメンバーと共に協働して、研究者自身がある役割を担って状況そのものにかかわることによって、現場を変えていこうとするものである。この方法論の理解を深めるため専門家を招き、本研究者らと協力病院の看護管理者は講義を受けた。その上で、両者で現状の問題を共有し今後の計画について協議を行った。次年度は、協力病院の1病棟に対してSSMベースのアクションリサーチを実施する予定である。A大学看護学部が市中病院と実施した人材育成連携活動の評価から明らかになった課題は、看護師個人の成果をチームの成果へと紡ぎ上げるチーム・プロセスが組織の成果を左右することであった。これまで人材育成は「個人の成長」を目標に教育が計画されてきたが、近年ではチームに焦点化した教育が重要視され、効果的なチーム・プロセスを体験できる研修づくりが課題となっている。チーム・プロセスの中心はメンバー間のコミュニケーションであるが、個人とチームが保有する知識・技術・経験、及び認識の枠組みなど様々な要素が相互作用してチーム独自のパターンを形成する。こうした組織の土壌的側面ともいえるチーム・プロセスを促進するには、メンバー自身がチームに潜む問題を協同で発見し、解決策を立案・実施することが肝要である。しかし、従来の人材育成プログラムは、あらかじめ設定した目標に沿って演繹的に立案されたプログラムのもと、過去の課題に対する行動変容を期待するフィード・バックであり、未来に向けた改善にはつながり難かった。そこで上記課題を解決するため、SSMベースのアクションリサーチを援用し、帰納的かつフィード・フォワードに主眼をおいたワークショップを企画・実施した。

ワークショップに参加した看護師らは、相互のコミュニケーションを通して問題発見するだけでなく、他者と自己の認知の類似点と相違点を受け入れ、相互の信頼感の強化、組織特性にあった解決策を立案するなど、チーム・プロセスの重要性に関わる「気づき」を得ていた。SSMベースのアクションリサーチを援用した継続教育プログラムは、チーム・プロセスに焦点をあてた教育プログラムとして有用であることが示唆された。チームワークを育成する継続教育プログラムは、現場でチームを対象にすると業務の支障となるため問題が多いことから、実用的な教育方法を選択するまでに時間を要した。検討の上、選択したSSMベースのアクションリサーチは、協力病院の個人情報やプライバシーに触れるため、協力者の理解を得るまでに方法論や話し合いに時間を要した。さらに、本研究者らがこの研究方法に精通していないため、実施までにはさらに訓練等の時間が必要である。24年度が最終年度であるため、記入しない。次年度は、研究者らが現場で病棟スタッフと協働してチームワークに関する問題解決にあたる。このため、連携研究者自身も研究チームメンバーとして十分にコミュニケーションをとりながらデータ収集や介入に取り組む必要がある。さらに研究チームは、協力病院および病棟の看護管理者と話し合いながら、現場の業務を妨げないように研究を進めていく必要がある。研究代表者は、研究チームと協力病棟の看護チームを視野に入れて、相互の協力関係を維持・促進するようサポートしていく必要がある。
人工ジヌクレオチドユニットによるCpGアイランド結合分子の創製

本研究では、遺伝子発現のエピジェネティック制御機構に関与するCpGアイランドに対して結合可能な新規人工分子の創製を目的とした。天然型3本鎖DNA形成のG/GC塩基対構造に着目して、グアノシンの2位に芳香環を有する人工核酸を分子設計した。化学合成に成功し、オリゴヌクレオチドに導入後、2本鎖DNAに対する相互作用を調べた結果、芳香環としてベンゼン環を含む人工核酸でGC塩基対を認識できる事を見いだした。天然型のグアノシンと錯体形成定数を比べることにより、安定かつ選択的に認識できる事を明らかにした。しかも、1つであればオリゴヌクレオチドのどの位置に組み込んでも認識能を有する事を見いだす事に成功した。2本鎖DNA中のCpG配列が繰り返し存在する領域(CpGアイランド)は転写の起点となるプロモーターに多く観測され、シトシン5'メチル化によって転写が抑制され、発生や分化誘導などのエピジェネテックな遺伝子制御の重要な役割を果たしている。また、過剰なメチル化は癌化と関連しており、配列特異的にCpGアイランドを標的化できる分子は、新しい創薬リードとしての展開が期待される。しかし、これまでに、CpGアイランドに特異的に結合する分子は開発されておらず、新規分子の開発が望まれている。本研究では、CpGアイランドではグアニン塩基が交互に配置されている点に着目し、糖部分がD-体、L-体のヌクレオチドを交互に連結した分子を設計し、グアニンと連続的にフーグスティーン塩基対形成により結合する特異的分子の開発を目指す。本研究では、最終的な目標として2本鎖DNA中のCpGアイランドに直接結合可能な人工ジヌクレオチドユニットの創製を目指す。具体的には、交互に配置されたグアニンに対してD-dGとL dGを交互に連結した、1GC-CG塩基対を認識可能なジヌクレオチドユニットの合成、2CpGアイランドへの結合親和性の確認と人工核酸の構造の最適化、を行う研究計画をした。本年度では、人工核酸のユニットの合成に成功し、オリゴヌクレオチドへの導入を行った。CpG配列を含む配列と相互作用を確認した結果、CDスペクトルで何らかの相互作用が観測された。転写の起点となるプロモーター領域の2本鎖DNA中のCpG配列が繰り返し存在する領域(CpGアイランド)は、シトシン5'メチル化によって転写が抑制され、発生や分化誘導などのエピジェネテックな遺伝子制御の重要な役割を果たしている。本研究では、CpGアイランドではグアニン塩基が交互に配置されている点に着目し、糖部分がD-体、L-体のヌクレオチドを交互に連結した分子を設計し、グアニンと連続的にフーグスティーン塩基対形成により結合する特異的分子の開発を目指した。昨年度に合成に成功した化合物を用いて、3本鎖DNAの形成能を、ゲル電気泳動で調べた結果、ベンゼン修飾体では相互作用が弱い事が明らかになった。そこで、水素結合を形成可能なユニットを導入した化合物を合成し、その性質を調べた結果、修飾が複雑だったためか、予想に反する結果が得られた。誘導体の合成には数多く成功し、機能評価を行う事で結果を得ているが、相互作用を強められるほどの化合物を見いだす事に成功していないため。これまでに、グアノシンを基本骨格として、その2位のアミノ基に、ベンゼン環導入体、ピリジン導入体、ピリミジン導入体、メチルピリミドン導入体を合成に成功した。さらに、それらの化合物を用いて、3本鎖DNA形成能の評価をゲルシフトアッセイにより行った結果、その詳細を調べることで、ベンゼンを有する人工核酸で骨格であるdGよりも安定で選択的に3本鎖DNAを形成する事を見いだした。この機能は、人工核酸を3本目の鎖のどの位置に組み込んでも同じ性質があるという、興味深い結果が得られた。また、連続して複数個導入することで、3本鎖DNAを形成しなくなること、自己鎖で高度な高次構造を形成する事を明らかにした。

化学合成に成功し、オリゴヌクレオチドに導入後、2本鎖DNAに対する相互作用を調べた結果、芳香環としてベンゼン環を含む人工核酸でGC塩基対を認識できる事を見いだした。天然型のグアノシンと錯体形成定数を比べることにより、安定かつ選択的に認識できる事を明らかにした。しかも、1つであればオリゴヌクレオチドのどの位置に組み込んでも認識能を有する事を見いだす事に成功した。初年度は、計画通りに進行し、目的の化合物の合成と初期検討を行う事ができたため。今後は、これまでの結果を参考に、より単純な修飾をかけた誘導体を合成しているので、その結果を出していく予定である。核酸化学今後も計画通りに研究を遂行する予定である。基本骨格の合成および初期検討まで、終了しているため、今後は誘導体の合成を予定通りに行う。少額(10千円未満)であるため、次年度への繰り越しとなった。1000円未満の端数のため、翌年度への繰り越しとなった。研究結果は多く得られているが、それらの結果を基に目的を達成するための更なる機能の向上を目指した誘導体の合成を行う計画をしているので、合成試薬に使用する予定である。1000円未満の繰り越しのため、使用計画の大きな変更はなく、予定通りに使用する。
分子認識能を有する両親媒性分子集合体としての機能性ベシクルの創製とその機能-DDSにおける癌治療をめざして-

目的癌細胞への"ミサイル装置"として、癌細胞の特異抗原としての糖鎖を認識するESA(トゲキリンサイ海藻由来のレクチン)を装着した、人工細胞(脂質ベシクル)を創製し、DDS(Drug Delivery System)に利用することを目的とした。標的分子のリガンドとしては、大別して二種類のリガンド、すなわち、1)、および2)癌細胞の特異抗原を認識する抗体(モデル抗体として抗IgM抗体を使用)、について研究を進める。結果このESAを、Span80を主成分とする脂質ベシクルに固定化して、癌細胞へのターゲッティングを主目的とする種々の実験的検討を行った。正常細胞モデルとしてMCF10(乳腺細胞)、Fibroblast(へその緒由来の繊維芽細胞)、および癌細胞としてMCF7(乳線癌細胞)、COL0201(大腸癌細胞)、ハイブリドーマ(HB4C5)を用いた。その結果、このESA固定化ベシクルは癌細胞に対して特異的に結合する傾向が見られた。またESAが癌細胞に対してアポトーシスを誘導することが示唆された。さらにESA、およびESA固定化ベシクルをラットに投与して検討した結果、ESA特異抗体が若干発現するものの、どのラットも体重減少も無く約5週間健康に生存し、現段階でのこのベシクルの安全性が確認された。次に、抗体のベシクル固定化については、プロテインAを媒介として、抗体のFabフラグメントを外方向に配向させて、固定化させることができた。さらに、Isothiocyanic Acid Dodecyl Ester(IADE)で表面修飾して疎水化したプロテインA用いるとともに、カチオンペプチド脂質(CPL)をSpan80中に混入させることにより、カチオン性イムノベシクルを調製した。このイムノベシクルが、IgMを産生するHB4C5に対し、標的的に結合し、ベシクル内に包括した遺伝子を効率良く目的細胞に導入することが出来た。目的癌治療を主目的として、標的指向機能(ミサイル機能)を有する、いわゆる癌細胞への“ミサイル装置"(リガンド)を装着した、人工細胞(脂質ベシクル)を創製し、DDS(Drug Delivery System)に利用することを目的とした。標的分子のリガンドとしては、大別して二種類のリガンド、すなわち、1)癌細胞の特異抗原としての糖鎖を認識するレクチン、2)癌細胞の特異抗原を認識する抗体、について研究を進める。本手法は癌治療だけにとどまらず、目的細胞への遺伝子導入などの利用法も考えられ、その応用目的価値は大きい。結果まず海藻から分離精製した数種のレクチンをスクリーニングした結果、ESA(トゲキリンサイ(Eucheuma serra由来)をレクチンリガンドとして選択した。このESAを、Span80を主成分とする脂質ベシクルに固定化して、癌細胞へのターゲッティングを主目的とする種々の実験的検討を行った。正常細胞モデルとしてMCF10(乳腺細胞)、Fibroblast(へその緒由来の繊維芽細胞)、および癌細胞としてMCF7(乳線癌細胞)、COLO201(大腸癌細胞)、ハイブリドーマ(HB4C5)を用いた。また癌細胞を死滅させる効果も見られた。このような固定化法により、ヒトハイブリドーマ(HB4C5)の表面に産出するIgM抗体を抗原とする抗IgM抗体を、ベシクル表面上に固定化した。

この固定化ベシクルはHB4C5に、特異的に結合した。またベシクル中に内包したBSAを、結合したヒトハイブリドーマ中へ導入することができた。以上の結果より、今後in vivoの実験を行い当該ベシクルの実用化をめざしたい。目的癌細胞への"ミサイル装置"(リガンド)を装着した、人工細胞(脂質ベシクル)を創製し、DDS(Drug.Delivery System)に利用することを目的とした。標的分子のリガンドとしては、大別して二種類のリガンド、すなわち、1)癌細胞の特異抗原としての糖鎖を認識するESA(トゲキリンサイ海藻由来のレクチン)、および2)癌細胞の特異抗原を認識する抗体(モデル抗体として抗IgM抗体を使用)、について研究を進める。結果まず、従来の二段階乳化法に代わり、新規な超音波処理法による簡便なベシクル調製法を開発した。このベシクルの粒径は約70120nmの範囲にあり、物質包括能はベシクル懸濁液中の全トレーサー濃度に対して、最大約8%の値となった。このベシクル膜のSpan80中に混入させたIsothiocyanic Acid Dodecyl Ester(IADE)とESAを共有結合させて、ESAをベシクル膜に活性劣化させることなく、かつ効率良くベシクルに固定化する事が出来た。このESA固定化ベシクルは癌細胞に対して特異的に結合すること、およびESAが癌細胞に対してアポトーシスを誘導することが示唆された。さらにESA、およびESA固定化ベシクルをラットに投与して検討した結果、ESA特異抗体が若干発現するものの、どのラットも体重減少も無く約5週間健康に生存し、現段階でのこのベシクルの安全性が確認された。次に、抗体のベシクル固定化については、またカチオンペプチド脂質(CPL)とIADEをSpan80中に混入させ、さらにそのIADEとプロテインAをアミド結合させた後に抗IgM抗体を固定化して、カチオン性イムノベシクルを調製した。このイムノベシクルが、IgMを産生するHB4C5に対し、標的的に結合し、ベシクル内に包括した遺伝子を効率良くHB4C5細胞に導入出来た。
相同組換えによる特異的細胞除去システムの開発

本研究は、ある標的分子を発現する細胞を特異的に除去した動物を遺伝子ターゲティングによって作製する方法を樹立することを目指した。モデル系として、NK細胞レセプターの1つであるNKR-P1を選び、NK細胞とNKT細胞を除去したマウスの樹立を試みた。NKR-P1の代わりにジフテリア毒素遺伝子を発現させるために、NKR-P1ゲノム遺伝子の単離とマッピングを行い、その転写開始点を明らかにした後、転写開始点直下をジフテリア毒素で相同組換えによって置換させることのできるベクターを作製した。NKR-P1の発現するC57BL/6マウス由来のES細胞株BL6-IIIにこのベクターを導入し、特異的相同組換えを有する2つのES細胞クローンを樹立した。これらを凝集キメラ法およびインジェクション法の両者によって、Balb/cマウスのblastcystに導入し、キメラマウスを作製した。トキシン遺伝子が発現すればキメラマウスにおいても特異的細胞除去が可能であるので、キメラマウスの脾細胞を、ES細胞(H-2^b)とホスト(H-2^b)由来の細胞をMHCに対する抗体で区別して、ES細胞由来のT・B・NK細胞を解析した。対照群として親株のES細胞のみを導入したキメラマウスでは、キメリズムによらず、一定の割合(平均3.3%)でNK細胞が検出されたのに対し、相同組換えを有するES細胞由来のキメラマウスでは全くNK細胞が検出されなかった。これに対して、ES細胞由来(H-2^b)のT細胞・B細胞は、対照群のキメラマウスにおける割合と同程度であったことから、NK細胞が特異的に除去されていることが強く示唆された。細胞数が少ないため、NK活性が全くないか、については、今後の解析となった。これらから、目的としたNKR-P1を発現する細胞を特異的に除去することに成功することができた。本方法は、今後更に、分化における系列等、より一般的な解析に応用可能であると思われる。