hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
地理疫学を応用した健康の地域格差と社会経済的要因の研究

GIS(GeographicInformation System)を応用した地理疫学を本研究では採用し、幾つかの健康指標を取り上げ地域格差について社会経済的要因との関連を検討した。特に日本人死因第1位であるがんについて、罹患を図る唯一の計測指標である「地域がん登録」データの有効活用、社会経済的指標の1つとしてソーシャル・キャピタル(Social Capital)指標を取り上げその関連性について検討し、疾病地図の作成、地域集積性の視覚化を試みた。本研究の目的は、今後とも増加が予想されるがん罹患・死亡について地域格差を明らかにすることとその要因について社会経済的要因との関連検討することである。本研究では死亡状況のみならず地域がん登録データを活用し、死亡と罹患状況から神奈川県の乳がんについてメッシュ単位での地域格差、罹患の分布状況、死亡と罹患の集積地域の比較検討など空間疫学的手法、GISを応用した地理情報を採用し新たな形でアプローチすることができた。意義:乳がん標準化死亡比(SMR)は、47都道府県中最下位は東京都の118.7、4位が神奈川県114.3であった(2006)。東京都など都会地域において乳がん死亡が多いということはこの地域の乳がんに関する医療が貧困なのかあるいは早期発見が不十分なのか、都会地域にエンデミックに発症しているのか、死亡データのみの評価では不十分である。最終年度では、SMRおよびSIRを詳細に検討した。SMRやSIRは人口の少ない地域では不安定な値になり、人口の異なる地域間比較には適していないことが指摘されている。そこで神奈川県全体でSMRが高いのかを小単位の地域で検討した。またこれまで死亡評価のみでがん対策を立案してきた我が国にとって、死亡と罹患状況が異なることを明らかにすることは大きな意義がある。本研究ではがん罹患集積性の検討を空間スキャン統計手法を用い、合わせて同定された集積地域と社会経済的要因との関連を検討した。重要性:生存率の高い部位である乳がんは、死亡評価によるがん対策では不十分であり罹患状況、集積地域の検討は非常に重要である。本研究でSMRとSIRの地理分布は異なっており、SMRに関しては統計的に有意な集積は認められなかったが、SIRでは有意はクラスターを形成していることが明らかとなった。この集積地域の社会経済的要因を検討したところ、女性特有のライフスタイルとの関連が示唆された。具体的内容: GIS(Geographic Information System)を応用した地理疫学を本研究では採用し健康の格差、特にがん罹患・死亡の状況から検討した。神奈川県では女性のがん罹患第1位は依然として乳がんであり、これは関東を含め大阪などの都市域では共通の特徴とである。そこでがん罹患を図る唯一の計測指標である地域がん登録データの有効活用の検討も含め本年度は神奈川県における乳がん罹患の地域格差の状況を詳細に検討することとした。意義:2006年の乳がん標準化死亡比(SMR)は、47都道府県中最下位は東京都の118.7、4位が神奈川県114.3、大阪府が5位110.8という順位であった。東京都・大阪府の都会地域において乳がん死亡が多いということはこの地域の乳がんに関する医療が貧困なのかあるいは早期発見が不十分なのか、都会地域にエンデミックに発症しているのか、乳がん死亡データ状況からのみの結果評価では不十分であることは明らかである。そこで本年度は、2006年度地域がん登録データを使用し乳がん患者の住所地を元にGISを応用した地理情報システムプログラムを用いて罹患状況を視覚的に捉えた。疾病の発生状況などの空間分布に関して解析を行う地理(空間)疫学は罹患分布の様子を観察することが解析の第一歩である。点データ(乳がん罹患発生点)Mapと都道府県、市区町村単位の集計データMapを利用し地理疫学的な乳がん罹患の集積性の有無、さらに集積があるのであればその地域はどこかについて統計学的に決定する分析方法について検討した。重要性:がん対策を立案する際は、その地域の現状を詳細に把握してこそ有効な対策ができるはずである。本研究結果から集積地域の同定を示し、それらの地域の特定の要因(社会的、環境的要因)分析に繋げ、その結果を地域のがん対策や地域保健活動に生かすこと可能である。これまでの疫学研究における地域間格差研究では一般的には都道府県別あるいは行政区域を単位として比較されることが多く、本来の相違が平均化された値となり、地域差の解析を行う際の隘路となっていたが、GIS(Geographic Information System)を応用した地域情報を本研究では採用することで、これまでの地域格差の研究に新たな形でアプローチすることができた。また近年、地域メッシュを単位とする社会経済指標の資料が整いつつある。GISを利用したメッシュ単位での解析も含め、がん罹患の唯一の計測指標である地域がん登録データを活用し、罹患状況とメッシュ単位での地域格差、あるいは罹患の分布の集積性の検討など新たな手法による解析結果は貴重な報告となると思わる。

神奈川県内での乳がんの罹患状況を詳細に把握することができたので、次のステップとしてメッシュ法による解析結果、地域の集積性(CDT: Cluster detection test)の解析結果をもとに、地域の要因分析に繋げていく予定である。分担研究者はヘルスプロモーションの専門家であり、これまでの研究と行政との関係をより連携させるためのフィールド活動を得意としている。市区町村の健康増進計画における支援的な環境整備と部門間連携を地域社会との連携も含み検討していく。地理疫学研究は、分析の目的にあわせ道路網や患者分布のように地理情報をその種類に応じて分類しそれぞれを別々のレイヤ(層)として管理する。GISを特徴づける機能の1つは、属性情報に基づき分布図を作成するコンピュータ・マッピングである。この機能により、表形式の情報の羅列に埋もれている地理的な分布特性が明らかにされる。具体的には、属性情報に応じて空間情報である点、線、面の図形式シンボル表現を指定できる。このような情報提供は、研究者以外の視点から見ても興味深くわかりやすい。またその次のステップとして、男性の胃がん罹患にも取り組みたいと考えている。性別部位別がん罹患はまた違う集積性と要因を持つはずであり、解析結果を乳がん同様に有効活用していきたいと考えている。23年度の研究成果を発表していきたいと考えている。その1つにUICC(国際対がん連合)が主催する2012国際がん会議(カナダ)に出席する予定である。UICCは1933年に結成され、がん研究、対がん運動の振興、がん知識普及、フェローシップ運営、国際的統計の作成、世界記共通のがん診断法、分類法の設定など多くの活動を展開している。欧米先進国の地域がん登録は非常に進んでおり法制度化されていることもあり、かなり正確ながん罹患率、生存率が公表されている。その点日本のがん登録は未熟であるが、今後の日本のがん罹患計測指標の発展のためにはどのような視点が大切になってくるのか、各国のがん研究者と交流をはかりたいと考えている。また国内外の学会には積極的に参加していく予定である。そのため今年度の56割は旅費としての使用を想定しているところである。その他、地域でのヘルスプロモーション活動諸費用に使用する予定である。
体系的遺伝子異常解析に基づく乳癌・甲状腺癌の遺伝子診断法の開発

1.「乳癌・甲状腺癌の遺伝子診断の開発と技術移転」:乳癌術後5年間の追跡調査と遺伝子解析により、n0乳癌群、n1・2乳癌群、高容量化学療法乳癌群のについて術後予知因子となる染色体欠失(LOH)を同定したが、これに基づき、毎週約10症例(約2年間で約1000症例)の遺伝子診断を継続し、遺伝子診断による症例の層別化と高危険群の予測を実施し、基礎研究から臨床実施への技術移転を行なった。2.「体系的遺伝子発現解析」乳癌・甲状腺癌の新鮮凍結保存検体から高純度RNAを抽出し、RNA増幅を行い、高密度cDNAマイクロアレイを用いて、約2万5千種の遺伝子の癌組織での発現プロファイル解析を行い、乳癌および甲状腺乳頭癌において術後予後と関連して発現異常を呈する遺伝子群を同定した。(1)乳癌;a)ER陰性乳癌、b)n0乳癌、c)T2乳癌、d)ER陽性乳癌の4群について予後良好群と予後不良群に分類し、予後に関与する遺伝子の発現異常を検討し、ER陰性乳癌、n0乳癌、T2乳癌、ER陽性乳癌でそれぞれ18種、10種、10種、10種の予後予測遺伝子を選択した。これらの遺伝子セットを用いて予後予測システムを構築した。テスト症例の予後は、これらのシステムにとよる予後予測と高い精度で一致した。(2)甲状腺癌:a)甲状腺乳頭癌15例、およびb)甲状腺未分化癌11例についてcDNAマイクロアレイ解析とreal-time RT-PCRおよび免疫組織学的染色を行ない、乳頭癌では、TIMP-1(Tissue Inhibitor of Metalloproteinase 1)、転写因子E2F1等の遺伝子群の、また、甲状腺未分化癌では、GDI2、StathminおよびDestrin等の遺伝子群の癌部での強発現を同定した。後者群は甲状腺癌の未分化転化への関与機序を細胞機能レベルで検討している。1.「新規がん関連遺伝子の同定」1-cM以内に原因遺伝子の存在位置を限局化したのち、ショットガンシークエンシングを行うとともに、同領域のESTを用いて、cDNA発現プロファイル解析を行い、がん関連遺伝子をクローニングした。17q25.1領域からDMC1,UBE2,DMHC,SRP68,4q21領域からJNK3など、種々のヒトがんにて発現消失を示す新規遺伝子をクローニングし、甲状腺癌におけるELKS融合遺伝子を同定した。2.「乳癌・甲状腺癌の遺伝子診断の開発と技術移転」乳癌および甲状腺癌の多形性DNAマーカーを用いた解析から癌の悪性度、再発、生命予後に関わる遺伝的変化の特定と臨床応用を進めた。乳癌手術5年間の追跡調査と遺伝子解析により、no乳癌、n1・2乳癌において術後予知因子となる染色体欠失を同定した。これらの結果を踏まえて、平成12年夏より、研附属病院および長野県下の主幹病院と連携し、毎週約12症例(年間600症例)の乳癌の遺伝子診断を実施し、臨床サイドへ遺伝子診断の結果を報告し、遺伝子診断による症例の層別化と高危険群の予測法を検討し、基礎研究から臨床実地への技術移転を試みている。3.「体系的遺伝子発現解析」cDNAマイクロアレイ解析実験の条件検討を詳細に行うため、T7RNAポリメラーゼによるRNA増幅を種々の条件にて行い、2回のRNA増幅で約100倍のポリ(A)RNAの得られる条件を設定した。約1万種類のcDNAを高密度にスポットしたマイクロアレイ・スライドグラス上でハイブリダイゼーションを行った。スキャニング・データのコンピュータ解析を行い、約1万種の遺伝子の癌組織における発現プロファイル解析を行うことが可能となった。乳癌手術後5年間の追跡調査と遺伝子解析により、no乳癌群、n1・2乳癌群、高容量化学療法乳癌群の各々において術後予知因子となる染色体欠失を同定し、特に、no乳癌を主体に毎週約12症例(年間600症例)の乳癌の遺伝子診断を実施し、遺伝子診断による症例の層別化と高危険群の予測法を検討し、基礎研究から臨床実地への技術移転を試みた。cDNAマイクロアレイ解析実験の条件検討を詳細に行うため、乳癌・甲状腺癌・新鮮凍結保存検体の癌部および非癌部よりRNA抽出し、T7RNAポリメラーゼによるRNA増幅を種々の条件にて行い、2回のRNA増幅で約100倍のポリ(A)RNAの得られる条件を設定した。さらに、各々のRNAを異なる蛍光にて標識しつつcDNAプローブを合成し、約1万種類のcDNAを高密度にスポットしたマイクロアレイ・スライドグラス上でハイブリダイゼーションを行った。スキャニング・データのコンピュータ解析を行い、約1万種の遺伝子の癌組織における発現プロファイル解析を行っている。現在までに乳癌50症例および甲状腺乳頭癌30例を解析し、種々のoncogeneやMatrix-metaloproteaseなどの遺伝子にて発現過剰または減弱を同定した。現在、統計数理解析の適正化・手法向上を集中的に進めており、さらに症例を追加し大規模なクラスターリング解析を行う。昨年度詳細に実験条件の検討を行ったcDNAマイクロアレイ解析法によって、乳癌・甲状腺癌の新鮮凍結保存癌部および非癌部検体より高純度RNAを抽出し、T7RNAポリメラーゼによるRNA増幅を2回行い、約10000倍のポリ(A)RNAを得た。癌部および非癌部由来のRNAを、2種類の蛍光色素にて標識してcDNAプローブを合成し、約2万5千種類のcDNAを高密度にスポットしたマイクロアレイ上でハイブリダイゼーションを行った。

マイクロアレイ上のシグナルデータのコンピュータ解析を行い、約2万5千種類の遺伝子の癌組織における発現プロファイル解析を行った。2色の蛍光色素量の正規化に用いるため各々のマイクロアレイ上にはそれぞれ384種のハウスキーピング遺伝子をスポットし、これらのハウスキーピング遺伝子に基づいて正規化を行った。数理統計解析の適正化・手法向上の結果、信頼性の高い実験結果を得ることが可能となった。1)エストロゲン受容体陰性乳癌における5年以内再発死亡群と5年以上健存群の比較、2)T2乳癌における同様の比較、3)n1β乳癌における同様の比較、また、4)n0乳癌における5年以内再発群と5年以上健存群間の比較、5)甲状腺乳頭癌における再発群と健存群の比較、6)甲状腺未分化癌の特性の検討、の各々の課題についてcDNAマイクロアレイを用いた体系的遺伝子発現解析を行ってい、各々の群において発現異常を呈するDVL-1,XBP-1などの遺伝子を同定した。さらに、これら遺伝子についてRT-PCR法にて多検体で確認、抗原・抗体作製による臨床診断法の開発を進めている。「体系的遺伝子発現解析」cDNAマイクロアレイ解析実験の条件検討を詳細に行い、組織RNAの検定、T7RNAポリメラーゼによるRNA増幅の条件設定をし、ヒト遺伝子の約2/3を一度に解析できる25,344種のcDNAを高密度にスポットしたマイクロアレイの作成を行い、ハイブリダイゼーション、スキャニング・データの数理解析の実験条件を最適化し、種々の癌組織における発現プロファイル解析を行った。乳癌では1995年から1997年の2年間で癌研究会附属病院で根治術を受けた約1,000症例の新鮮凍結標本を用いて(1)n0乳癌(リンパ節転移陰性乳癌)の中で5年再発群と5年健存群間の体系的遺伝子発現の相違の比較検討、(2)ER(エストロゲン受容体発現)陰性乳癌の中での5年癌死群と5年生存群間の体系的遺伝子発現の相違の比較検討、(3)T2(腫瘍径2cm以上5cm未満)進行乳癌の中での5年癌死群と5年生存群間の体系的遺伝子発現の相違の比較検討、(4)n1β<(リンパ節転移4個以上の高転移群)乳癌の中での5年癌死群と5年生存群間の体系的遺伝子発現の相違の比較検討という臨床応用において極めて重要な課題についてcDNAマイクロアレイを用いた体系的遺伝子解析を用いてそれぞれに実験を行った。各検討において体系的遺伝子発現の相違をMann-Whitney testおよびRandom permutation testを用いて統計解析を行った。発現異常を認めた各遺伝子群に関してはRT-PCR法にてその発現を確認した。さらに発現確認できた遺伝子群を組み合わせることにより予後予測システムの構築を試みた。RT-PCBで特に二群間(再発群と健存群または癌死群と生存群)で発現差異の大きい遺伝子をn0乳癌においては10個組み合わせスコア化(各遺伝子の発現比=各遺伝子の発現量/各遺伝子のGAPDHの発現量)することにより、再発群と健存群が有意差を持って群別できる再発予後予測可能な結果が得られた。同様にRT-PCRで特に二群間(癌死群と生存群)の中において発現差異の大きい遺伝子をT2進行乳癌で10個。ER陰性乳癌では20個の発現異常を認めた遺伝子群をそれぞれ組み合わせスコア化することにより、各臨床条件における予後予測可能である良好な結果を得られた。
霊長類の認知的老化にみられる個体差の脳内基盤

本研究課題においては、認知的老化の脳内基盤を明らかとすることを目的として、(1)マカク属サルにおける空間記憶能力の加齢性変化の大規模調査と、(1)で良くも悪くも高齢群の平均から外れた高齢個体について(2)形態MRI・fMRI・pharmacological MRIの撮像を行い、その画像を高齢群内および非高齢群と比較することを計画し、平成20年度は、まず(1)を完了し(2)に入ることを目標に実験を行った。空間記憶能力を測定する課題として、空間記憶容量課題の1つである食物回収課題を用いた(Kubo,Kato&Nakamura,2006)。各試行で初めて誤アプローチ(すでに報酬を回収した穴に対するアプローチ)が生じるまでにサルが起こした正アプローチの数を成績の指標とし、実験開始時の年齢が20歳未満の非高齢個体38頭、高齢個体(20歳以上)23頭、計61頭についておのおの30試行分のデータを採取した。非高齢群・高齢群で成績を比較したところ有意差は見出せなかった。先行研究において、この課題を遂行する際にサルが自発的に独自の反応ルーを構築し、記憶能力を補完していることが示唆されている。各個体の方略についてさらに詳細な検討を行い、加齢によってどんな能力が失われるのかを明らかにする必要がある。さらに今年度は、fMRI実験の被験体を選択するためのスクリーニング(脳の器質的病変が課題成績に影響を与えている可能性を排除すること)を目的として、脳構造MRI撮像を実施した。本年度終わりまでに、それぞれの撮像条件を決定した上で、メス18頭についてT1-3D、T2、拡散テンソル、MRA画像の撮像が完了した。本研究課題においては、認知的老化の脳内基盤を明らかとすることを目的として、(1)マカク属サルにおける空間記憶能力の加齢性変化の大規模調査と、(1)で良くも悪くも高齢群の平均から外れた高齢個体について(2)形態MRI・fMRI・pharmacological MRIの撮像を行い、その画像を高齢群内および非高齢群と比較することを計画し、計画初年度である平成19年度は、まず(1)の実験を完了することを目標に実験を行った。空間記憶能力を測定する課題として、空間記憶容量課題の1つである食物回収課題を用いた。サルは9つある報酬穴のすべてから食物報酬を回収することを求められた。しかしテスト課題において報酬穴は、サルが指で支えていないと報酬穴を隠してしまうようデザインされた不透明なブタで覆われているため、サルが効率よく報酬を得るためには、試行中に自らがすでに報酬を回収した穴(あるいはまだ回収していない穴)がどの位置の穴かを記憶しなければならない。記憶している位置の数が、その個体の記憶容量の限界に達したとき、サルは誤アプローチ(EA:すでに報酬を回収した穴に対するアプローチ)をすると考えられる。この仮説に基づき、(1)その試行で初めてEAが生じるまでにサルが起こした正アプローチ(CA)の数、(2)1試行に9回生じるCAそれぞれの間にサルが起こしたEAの数を成績の指標とし、年度終わりまでに非高齢個体25頭、高齢個体11頭、計36頭についてデータを採取した。現在までに解析を終えた個体の成績を、非高齢群・高齢群で比較したところ、(1)(2)いずれの成績指標についても有意差は見出せなかった。しかしこれは、解析がまだごく少数の個体でしか完了していないことや、いずれの群の個体でも、試行ごとの成績の変動が非常に大きいことが原因と考えている。次年度、さらにデータ数を増やし、また解析を進めることによって、当初の目標としていたサルの認知的老化の傾向が明確になると考えている。
加熱前処理による植物性食品の硬さの制御 -冷凍・予備加熱処理の新規利用-

野菜を短時間で冷凍処理することにより物性および化学成分がどのように変化し、.保存を目的としない調理加工への応用可能性について検討した。試料としてダイコン(1cm×1cm×1cm)およびキャベツ(1.5cm×1.5cm)を用い、フリーザーバックにいれ、-5、-10、-20°Cの各温度で0,2,15h冷凍処理し、20°Cで1または4h解凍した後、成分および物性を測定した。その結果、色調は冷凍処理により明度が低下し、透明感が増し、ゆでたような外観になった。レオナーによる物性測定では冷凍処理により破断荷重と破断距離が低下、しんなりとした漬物様の食感になった。これらの結果は冷凍温度、時間に依存しなかった。ドリップ量はいずれの温度も2h冷凍、1h解凍が最も少なく、冷凍時間と解凍時間が短いほどドリップ量が少なかった。HPLCによるアスコルビン酸量の測定結果は-5°Cにおける残存総アスコルビン酸量が最も多く、特に2h冷凍、1h解凍のものが多かった。還元型アスコルビン酸量の割合が最も高いのが-5°Cにおける2h冷凍、1h解凍であった。一方、-20°Cではすべての条件において還元型アスコルビン酸が存在しておらず、特に15h冷凍、4h解凍の総アスコルビン酸量が最も少なかった。カリウムイオンは-5°C群の浸出量が最も少なく、アスコルビン酸同様2h冷凍、1h解凍のものが最も残存量が多かった。以上の結果より、短時間冷凍処理の影響は-5°Cが最も小さく、-5°Cで2h冷凍後、1h解凍したものは生と冷凍処理の中間的な位置づけにあり、特にアスコルビン酸量の残存は-5°Cにおいてのみみられた。このことから冷凍処理により漬物様のテクスチャーが得られつつ、アスコルビン酸の保持が期待できる温度として-5°Cが効果的であるといえる。
胎生期ラットにおける前駆破骨細胞の分化に関する研究

高度に分化した多核巨細胞である破骨細胞の起源は造血幹細胞、中でも単球-マクロファージ系の前駆細胞に由来すると考えられている。しかし、その分化過程は明かではなく、その前駆細胞は単核細胞であるため、形態学的に同程することが非常に困難である。そこで、前駆破骨細胞のマーカーとして酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)、炭酸脱水酵素アイソザイムII(CAII)を用いて、胎生期ラットの造血の場(卵黄嚢→肝→脾)と骨原基において、前駆破骨細胞を同定すると共に、これらの酵素が分化のいつの段階(どの造血の場)に発現するかを検討した。なお、単球・マクロファージ・破骨細胞系の共通のマーカーとしてモノクローナル抗体(ED1)がより特異的であることがわかり、個体発生と共に分化する破骨細胞のマーカーとして用いた。また、ラットの炭酸脱水酵素アイソザイムII(CAII)は平成5年度科研費にて得られたモノクローナル抗体にて免疫組織化学的に、TRAPは酵素組織化学的に染色し、上記三種のマーカーで三重染色を行った。その結果、15日目の肝臓にEDI陽性細胞を認めたが、CAIIとTRAPは陰性であった。15日目の骨原器では、軟骨支柱(cartilage core)の周囲の軟骨膜(perichondrium)に血管侵入が見られるが、ED1、CAII、TRAP陽性細胞は見られなかった。16日目の肝臓ではED1陽性細胞がさらに増加したが、これらED1陽性細胞はCAIIとTRAPには陰性を示した。16日目の骨原器には、軟骨膜(perichondrium)の血管周囲にEDI、CAII、TRAP陽性単核細胞が出現し、17日目ではその数の増加が見られた。さらに骨原器内の骨様構造物に接して多核のED1、CAII、TRAP陽性細胞が認められ、これらは破骨細胞であると考えられた。なお、胎生期ラットの造血は脾臓でも行われるが、今回は未検索である。以上から、単球から前駆破骨細胞への分化は、脾臓を除くと、おそらく軟骨膜(perichondrium)内で起こると考えられるがさらに検討中である。
金属ビスアミドを利用するテルル含有化合物半導体の新合成法に関する研究

原料ケミカルとして金属ビストリメチルシリルアミドを用いる液相法に基づく新しいテルル含有化合物半導体の合成方法の検討が行われた。実験では、この方法によりPbTeおよびBi_2Te_3が合成された。PbビスアミドおよびBiビスアミドは、1,4-ジオキサンとジエチルエーチル混合の合成溶媒に対する溶解度が低く,液相前駆体として各ビスアミド溶液を得ることができなかった。しかし、Teビスアミドの存在下においてはPbビスアミド及びBiビスアミドの溶解度が増加するため、Teビスアミドの合成系に、PbあるいはBiの金属ソースであるPbCl_2あるいはBiCl_3を添加して連続的に各ビスアミドを合成することにより、PbTe及びBi_2Te_3の合成に適した混合ビスアミド溶液を得ることができた。また、これらの混合ビスアミド溶液にn-ブチルアルコールを添加することにより対応する混合ブトキシド溶液を得ることができた。これらの混合ビスアミド溶液或いは混合ブトキシド溶液を加水分解することにより、それぞれアモルファスのPbTe前駆体粒子及びBi_2Te_3前駆体粒子が得られた。PbTe前駆体粒子は、水素雰囲気下400°Cで熱処理することにより立方晶PbTeへと転位した。また,Bi_2Te_3前駆体は水素雰囲気下300°Cで熱処理することにより菱面体晶Bi_2Te_3へと転位した。混合ビスアミド溶液中のPb/Te比及びBe/Te比は、加水分解によって得られた各前駆体粒子や水素還元後の化合物半導体粒子においても良く保たれていた。平成16年度は対象材料をPbTeとし、その原料ビスアミドの合成プロセスについて研究を行なった。Pbビスアミドは通常1,4-ジオキサン、ジエチルエーテル混合溶媒を用いて合成される。しかしながら、その溶解度は10^<-4>mol/lオーダーと極めて低く、実際的な合成には溶解度改善が不可欠である。そこで本研究では本研究の目的化合物構成元素のTe共存下で次のような合成プロセスの検討を行なった。TeCl_4(0.004mol)を1,4-ジオキサン(200ml)、ジエチルエーテル(100ml)混合溶媒に加え溶解させた。これを氷浴中で3°Cに冷却し、LiN[Si(CH_3)_3]_2(0.024mol)をゆっくりと加えた後、58.5°Cで1h加熱かくはん還流を行った。室温まで放冷した後、これにPbCl_2(0.004mol)加え、58.5°Cで2h加熱かくはん還流を行った。デカンテーションにより溶液から副生成物であるLiClを分離し、PbTe混合ビスアミド(PbTe{N[Si(CH_3)_3]_2}_6)の1,4-ジオキサン、ジエチルエーテル溶液を得た。更に、LiN[Si(CH_3)_3]_2存在下のTeビスアミド中におけるPbCl_2の反応率を測定するため、TeCl_4を0.001mol、0.003mol、0.005mol、0.007mol、0.01mol、0.015molに変えて上述の同様の操作を行った。この時、PbCl_2及び:LiN[Si(CH_3)_3]_2のモル量はPbTe合成が化学量論的に進行するようにPbCl_2はTeCl_4と等モルに、LiN[Si(CH_3)_3]_2は6倍モルにした。この結果、共存Teビスアミド濃度を0.017mol/l以下にすればPbビスアミドが全量溶解し、PbTe合成に適した原料溶液が調製できることが明らかになった。前年度の研究でPbTe合成の前駆体であるPbTeビスアミド溶液の調製技術について確立した。

本年度はそれを原料溶液として、(1)PbTe混合ビスアミドの直接加水分解によるPbTe合成、また(2)PbTe混合ビスアミドとブタノールのアルコリシス反応によってえたPbTe混合ブトキシドの加水分解によるPbTe合成を行った。この結果、どちらの方法によってもPbTe合成が可能であることがわかった。従って、プロセッシングの観点からは三成分系などの多元素化合物半導体の合成を行う際には系の化学的なコンパティビティーを得るため、アルコキシドあるいはビスアミドのどちらかのケミカル系を択一的に選択するというよりも,構成金属元素に応じて両者の混合系を選択することが可能である。すなわち,スピンコーティングのような溶媒の揮発が関与する系では加水分解で生じるアルコールやオルガノシラザンの種類や組成を制御することによって合成系の最適化が可能であることが明らかになった。また、本年度は金属ビスアミド法による半導体合成を他のテルル化金属に拡張するため、Bi、SnおよびZnビスアミドを含む混合Teビスアミドの合成についても検討を加えた。BiおよびZnについてはPbTeビスアミド同様、LiN(SiMe_3)_2存在下におけるTeビスアミドと金属塩化物の反応によってBiTeビスアミドおよびZnTeビスアミドの合成を確認した。ZnTeビスアミド合成の反応手順に従つた反応式は次の通りである。なお、Znビスアミドは単独での合成利用が可能であった。本年度は前年度に引き続き金属ビスアミド法による半導体合成をPbTeから他のテルル化金属に拡張するためにBi、Sn及びZnビスアミド溶液の合成について検討を行った。Biビスアミドは単独での合成が困難であったが、Pbビスアミドと同様にTeビスアミド存在下におけるBiCl_3とLiN{Si(CH_3)}_2と反応によりBi_2Te_3混合ビスアミドの合成が可能であった。Bi_2Te_3混合ビスアミド合成の反応式は以下のようである。Sn及びZnビスアミドは単独での合成が可能であり、Teビスアミドと混合することにより目的組成のTe含有原料ケミカル溶液を容易に調製することができた。また「Bi_2Te_3混合ビスアミドの直接加水分解によるBi_2Te_3合成」及びrBi_2Te_3ビスアミドとメタノール、エタノール、i-プロポキシド、n-ブトキシドとのアルコリシス反応により得られたBi_2Te_3混合アルコキシドの加水分解によるBi_2Te_3合成」も行った。この結果、どの合成条件においてもBi_2Te_3の合成が可能であった。合成した5種類の原料ケミカルの内,Bi_2Te_3混合ビスアミド及びBi_2Te_3混合n-ブトキシドは合成溶蝶である1,4-ジオキサン、ジエチルエーテル混合溶媒に溶解し、Bi_2Te_3混合メトキシド、エトキシド、i-プロポキシドは合成溶媒に溶解せず析出した。このことから溶液系の原料ケミカルであるBi_2Te_3混合ビスアミド溶液を用いてBi_2Te_3の膜化の検討を行い、混合ビスアミド溶液をスピンコーティングするプロセスによりBi_2Te_3膜を形成することが可能であることが明らかになった。
組織間安全文化評価ツールの開発

申請者が開発してきた組織内の安全文化評価ツールの評価内容や評価構造を基に、組織間の相互評価によってグループ企業の安全文化を評価する質問票を開発した。従来の研究では発注組織、受注組織、協力組織のコミュニケーション状態を評価する質問票が多くみられたが、「安全活動の評価、見直し」や「安全声明に沿った行動、態度」等の項目を3組織が相互評価することでグループ企業の安全文化を評価する新たな評価方法を示した。本研究では,従来,申請者らが開発してきたSCATの評価内容や評価構造等を基に,1)組織間の相互評価によってグループ企業の安全文化を評価する質問票(組織間関係の安全文化評価ツール)を開発することを目的としている。平成24年度は,妥当性の検証および改良版の作成というテーマで,1.試作版の実施と構成妥当性の検討,2.内容妥当性の検証および実施に向けての課題抽出をすることであった。前年度,東日本大震災の影響で各種調査が遅くなり,前年度の当初目標であった試作版の作成が平成24年度にずれ込んでいる。さらに,前年度の質問紙調査および面接調査では電力業界の企業が対象であったが,あらゆる業種の組織間を評価する質問票の作成のために,今年度,電力以外の業種での調査も追加して実施した。その結果,質問紙調査において結果の芳しくなかった事業所では,発注組織,受注組織,協力組織各々の安全活動のPDCAサイクルが回っていない(D(実行)しっぱなしで,CAが出来ていない),もしくは,発注組織,受注組織,協力組織,3者による安全活動のPDCAサイクルが回っていないことが確認された。逆に,結果の良い事業所では,C(評価),A(改善)のステップを定期的に実施しており,機能している様子が窺えた。両者の相違点は,安全活動に対する受注組織の関わり具合にあり,結果の良い事業所は,受注組織がP(計画)時点から積極的に参加できる体制があり,協力組織の発言を促しながら,自ら安全活動の中心的な役割を担っていたが,結果の芳しくなかった組織では,協力組織ともにそれを実施だけするという体制になっていた。なお,試作板の検証については,調査実施可能性のある事業所と協議をしている段階であり,平成24年度での実施には至らなかった。前年度,あらゆる業種の組織間を評価する質問票の作成のために電力以外の業種での調査を追加して実施した。今年度も鉄鋼業や科学製造などを中心に,面接調査を実施し,組織間を評価する質問票の作成を行った。面接調査の結果,既存のSCATの「安全声明の認識」という項目内容に関して,複数の面接調査対象者から同類の意見が挙がった。「安全に関する方針が出されていることを知っている」という質問内容に対して,協力会社から発注組織を評価する場合,協力会社が発注組織の従業員に接している時の対応(発言,態度)から,「その方針に沿っているか」という内容であれば容易に評価できるが,従来通りの内容では評価が難しく,発注組織の自己評価と協力会社からの評価にギャップが生まれた場合でも,そのギャップが実態を示しているのかが評価しづらい。そこで,「安全に関する方針にそった態度行動がとれているか」といった質問内容に修正した。また,前年度の質問調査により,PDCAサイクルの実行が安全文化醸成に影響を与えていることが把握できた。そこで,「安全活動結果を定期的に評価し,内容を見直しているか」という質問内容を追加した。以上の内容を従来のSCATの評価内容に追加,修正をし,質問票を作成した。本研究では、従来、申請者らが開発してきたSCATの評価内容や評価構造等を基に、1)組織間の相互評価によってグループ企業の安全文化を評価する質問票(組織間関係の安全文化評価ツール)を開発することを目的としている。平成23年度は1)申請者らが開発しているSCAT(10分野36項目)を実施し、それに加え、自由記述欄を設け、グループ企業の安全文化を醸成するために必要と考えられる組織間の関連性についての内容を幅広く収集、2)組織間関連性要因の網羅性検討および試作版の作成することであった。1)の質問紙調査は実施時期が予定よりも遅れたが、本調査を実施し、自由記述欄の質的データを現安全文化評価の内容毎に分類し、いずれにも当てはまらない内容については新たに要因名を設けた。新たな要因名の1つの例としては、「緊急時における対応」である。東日本大震災において、原子力発電所の緊急時の対応が話題になったことも影響しているが、緊急時の対応について発注組織、受注組織、協力組織が果たす役割等の記述が目立った。さらに、組織間関連要因データの拡充を図るべく、予定にはなかったが、質問紙調査の対象組織に発注組織、受注組織、協力組織別々に面接調査を実施した。

各要因を抽出するだけであれば、自由記述欄のデータでも十分ではあるが、直接、多くの関係者と議論することで、2)要因の網羅性を確認することができることから、調査を追加実施した。なお、各組織の面接調査では、管理者、現場責任者、作業者の3層に別れて実施し、調査対象者に発言によるプレッシャーを少しでも軽減して貰えるよう、心がけた。本研究では、従来、申請者が開発してきた安全文化評価ツールの評価内容や評価構造を基に、組織間の相互評価によってグループ企業の安全文化を評価する質問票(組織間関係の安全文化評価ツール)の開発を目的としている。前年度、質問票の改良版を作成するために、鉄鋼業や科学製造業など複数の業種を対象に面接調査を実施し、既存の安全文化評価ツールの質問内容を修正した。最終年度はこの安全文化評価ツール改良版を作成し、事故・トラブルが発生したグループ企業を対象に実施するとともに、並行して発生した事故・トラブルの事例分析を実施し、質問票の結果が組織間の関連性を抽出できているか信頼性を検証した。その結果、質問票結果について「コミュニケーション」や「安全優先性」に関する項目の結果が低い、かつ発注組織と協力組織の評価差が大きく、課題として取り上げた。一方で、直近のトラブル事例を分析すると、「安全優先性」に関しては、従来よりも細々した部品発注などの業務が多くなる一方で、予算減額が行われており、結果として納期に間に合わないなどのトラブルが発生していた。また、「コミュニケーション」に関しては、事故が発生した現場で以前から改善提案をしていたが、対応が遅く、対策が取られないまま、事故に至ってしまったということが確認された。今回、対象組織の数が限られており、統計上の検証まで至らなかった。産業心理学前年度,東日本大震災の影響で各種調査が遅くなり,当初目標であった試作版の作成が平成24年度にずれ込んでいる。さらに,前年度の質問紙調査および面接調査では電力業界の企業が対象であったが,あらゆる業種の組織間を評価する質問票の作成のために,今年度,電力以外の業種での調査も追加して実施したため,試作版の作成に留っている。試作板の検証については,調査実施可能性のある事業所と協議をしている段階であり,平成24年度での実施には至らなかった。予定していた電力業関連の組織での質問票調査が平成25年度の実施への同意が得られず,作成した質問票の実施が行えなかった。平成23年度の計画では、1.SCAT実施および組織間関連性要因の収集と、2.組織間関連性要因の網羅性検討および試作版の作成の2つのテーマを実施する予定であった。いずれも組織間関連性の要因を抽出することが目的であったが、1の質問紙調査の実施が東日本大震災の影響により、実施自体が半期以上ずれ込む形となった。さらに、質問紙調査に留まらず、組織間関連要因のデータの拡充をすべく、複数の事業所において発注組織、受注組織、協力組織それぞれに面接調査を実施した。質問紙調査実施の遅れと予定以外の面接調査の実施により、試作版の作成まで至らなかった。まずは平成24年度に予定してできなかった試作版を現在,協議中である事業所で実施し,構成妥当性の検討,内容妥当性の検証する。さらに,対象事業所において安全担当部署の関係者(1グループ企業から計5名程度×2業種以上)を対象とし,面接調査を実施する。
亜臨界水による食品成分の無触媒合成

高温高圧下で液体状態を保った亜臨界水中では,水のイオン積が常温の水の時の1000倍程度も上昇し,種々の反応が無触媒的に進行する.この特長を活かした環境への負荷を軽減した食品加工プロセスの構築を目的として,亜臨界水中での食品成分の無触媒合成について検討を行った.まず,薬や化粧品合成の出発物質となる5-ヒドロキシメチル-2-フルフラル(HMF)を糖から亜臨界水中で生産する変換反応を試みた.各種単糖の分解過程はいずれもWeibullの式で整理することができた.HMFへの変換率はフルクトースからが最も高く48%であることを見出した.次に,100140°Cの亜臨界水中で,無触媒的にペプチドであるアンジオテンシンIIと3種類のジカルボン酸との間にペプチド結合が形成されることをLC-MSおよびMALDI-TOFで確認した.温度が高いほど,縮合物の生成量が増加した.また,ジカルボン酸の水酸基が少ないほど,高い変換率を与えることが明らかになった.最後に,亜臨界水中での異性化反応に着目した.200260°Cの亜臨界水中で,リノール酸から異性体である共役リノール酸が生成することを,標準物質と比較することで確認した.処理時間が長いほど,温度が高いほど異性体の転換率が大きくなった.しかし,その転換率は高々1%未満であった.また,いずれの条件でも,異性体の転換率がcis-9,trans-11 CLA/trans-10,cis-12 CLA=1.0/0.6と一定であることも明らかとなった.上述のように,亜臨界水中での無触媒的な分解・合成・異性化反応により,食品成分の合成が可能であることを示した.これらの成果を3つの論文として公表し,所期の目的をほぼ達成した.高温高圧下で液体状態を保った亜臨界水中では,水のイオン積が常温の水の時の1000倍程度も上昇し,種々の反応が無触媒的に進行する.この特長を活かした環境への負荷を軽減した食品加工プロセスの構築を目的として,亜臨界水中での食品成分の無触媒合成について検討を行った.まず,薬や化粧品合成の出発物質となる5-ヒドロキシメチル-2-フルフラル(HMF)を糖から亜臨界水中で生産する変換反応を試みた.各種単糖の分解過程はいずれもWeibullの式で整理することができた.HMFへの変換率はフルクトースからが最も高く48%であることを見出した.次に,100140°Cの亜臨界水中で,無触媒的にペプチドであるアンジオテンシンIIと3種類のジカルボン酸との間にペプチド結合が形成されることをLC-MSおよびMALDI-TOFで確認した.温度が高いほど,縮合物の生成量が増加した.また,ジカルボン酸の水酸基が少ないほど,高い変換率を与えることが明らかになった.最後に,亜臨界水中での異性化反応に着目した.200260°Cの亜臨界水中で,リノール酸から異性体である共役リノール酸が生成することを,標準物質と比較することで確認した.処理時間が長いほど,温度が高いほど異性体の転換率が大きくなった.しかし,その転換率は高々1%未満であった.また,いずれの条件でも,異性体の転換率がcis-9,trans-11 CLA/trans-10,cis-12 CLA=1.0/0.6と一定であることも明らかとなった.上述のように,亜臨界水中での無触媒的な分解・合成・異性化反応により,食品成分の合成が可能であることを示した.これらの成果を3つの論文として公表し,所期の目的をほぼ達成した.高温高圧下で液体状態を保った亜臨界水中では,例えば10MPa,250°Cの条件では,水のイオン積も常温の水から3桁程度上昇し種々の反応が無触媒で進行する.この特長をいかし環境への負荷を軽減した食品加工プロセスの構築を目的とし,まず,薬や化粧品の合成の出発物質となる5-ヒドロキシメチル-2-フルフラル(HMF)を,糖から生産する変換反応を亜臨界水中で試みた.グルコース(Glc),フルクトース(Fru),ガラクトース(Gal),マンノース(Man)の4種類の単糖を,流通型反応器中で10MPa,180260°Cの条件のもと滞留時間を変えて処理しその分解過程を解析した.その分解過程はいずれもWeibullの式(C/C_0=ex[-(kτ)^n])で整理することができた.その分解反応の活性化エネルギーはGal>Glc>Fru>Manの順で大きかった.HMFへの変換率は,滞留時間や温度に依存せず糖の種類によってほぼ一定になった.Fruが48%で最も高く,他の3種類は同程度の変換率であった.生成したHMFの腸管吸収速度の測定は来年度に継続して行うこととした.生成したHMFとクエン酸の亜臨界水中での合成は来年度に再び検討する.次に,糖脂肪酸エステルの無触媒合成を試みたところ,エリスリトールとオクタン酸から2または3種のエステルと思われる生成物がHPLCによって確認された.さらに,ペプチドであるアンジオテンシンIIと3種のジカルボン酸(コハク酸・りんご酸・酒石酸)とのエステル合成が100140°Cの亜臨界水中で進行することをLC-MSを用いて確認した.

ジカルボン酸の水酸基の和が少ないほど,アンジオテンシンIIとの縮合物の収率が高かった.また,アンジオテンシンII類縁ペプチドの大半もジカルボン酸と反応して対応する縮合物を与えることをLC-MSで確認した.高温高圧下で液体状態を保った亜臨界水中では,水のイオン積が常温の水の時より上昇し,種々の反応が無触媒で進行する.この特長を活かした環境への負荷を軽減した食品加工プロセスの構築を目的とし,本年度はまずペプチドであるアンジオテンシンIIと3種のジカルボン酸(コハク酸・りんご酸・酒石酸)との合成反応について検討した.100140°Cの亜臨界水中で,アンジオテンシンIIのN末端のアミノ基とジカルボン酸のカルボキシル基の縮合反応が無触媒的に生じ,ペプチド結合を有した縮合物が形成されることをLC-MSおよびMALDI-TOFで確認した.縮合物の生成量は温度の上昇と共に増加した.また,ジカルボン酸は,水酸基の少ない物質の方が高い転換率を与えた.これらの結果は論文にて公表した.さらに,アンジオテンシンIIのN末端のアミノ酸をアスパラギンに改変したペプチドや,アスパラギン酸を除去しアルギニンとなったアンジオテンシンIIIの方が,縮合物の生成量が多かった.次に,亜臨界水中でのリノール酸からの共役リノール酸(CLA)への異性化反応について検討した.通常,エチレングリコール等の有機溶媒中に溶解したアルカリによって異性化反応が進行するが,200240°Cの亜臨界水中でもCLAへの異性化反応が進行することを,ガスクロのチャートの標準物質との比較によって確認した.しかし,その収率は1%未満であった.生成した2種類のCLAへの転換率は,いずれの場合もc9t11CLA/t10c12CLA=1/0.6であった.これらの結果についての論文は準備中である.高温高圧下で液体状態を保った亜臨界水中では,水のイオン積が常温の水の時の1000倍程度も上昇し,種々の反応が無触媒的に進行する.この特長を活かした環境への負荷を軽減した食品加工プロセスの構築を目的として,亜臨界水中での食品成分の無触媒合成について検討を行った.本年度は,食品成分の合成反応として重要な反応である,異性化反応に着目した.リノール酸の異性体である共役リノール酸は,その生理的意義から近年注目されている.共役リノール酸は一般にエチレングリコール等の有機溶媒中に溶解したアルカリによって,リノール酸から合成される.この異性化反応が亜臨界水中でも進行することを確認した.0.1mLのリノール酸と2.0mLの蒸留水を耐圧ステンレス容器(5mL容)中に封入し,200260°Cで24120時間維持した.本処理で生じた物質を,標準物質と比較し,2種類の共役リノール酸(cis-9, trans-11 CLAとtrans-10, cis-12CLA)が生成していることを確認した.200260°Cの温度領域では処理時間が長いほど,また温度が高いほど異性体の転換率が大きくなった.しかし,その転換率は高々1%未満であった.亜臨界水処理に用いる水とリノール酸の比率は転換率に影響を与えなかった.また,いずれの条件でも,異性体の転換率がcis-9, trans-11 CLA/trans-10, cis-12CLA = 1.0/0.6と一定であることも明らかとなった.転換率は小さいが,水とリノール酸のみから無触媒的に共役リノール酸が生じることを確認したこの成果は,雑誌Japan J.Food Eng.で公表した.
遺伝子改変マウスを用いた象牙質の石灰化メカニズムの解明

本研究では歯質の石灰化の状態に影響する要因として細胞内での小胞輸送および分泌に着目し、小胞輸送において小胞がターゲットとなる膜に特異的に融合する機構に関与するタンパク質として知られているSNARE(Soluble NSF Attachment protein Receptor)タンパク質の1つであるSnap23がエナメル芽細胞に特異的に発現することを明らかにした。このことから、エナメル芽細胞特異的にSnap23を欠損するコンディショナルノックアウトマウスを作製し、表現型解析を行った結果、同腹のコントロールマウスと比較し、第一臼歯におけるエナメル質の形成量が少ない傾向がみとめられた。小児歯科領域では歯の形成異常を主訴とする患者も多い。そのなかには明白な家族歴や基礎疾患等がないにもかかわらず、う蝕の急速な進行や著しい咬耗、歯の破折を示す患者がいる。このような臨床的背景から、単に基質タンパク質の質的または量的な異常ではない、いまだ明らかにされていない石灰化異常の原因があるのではないかと考えた。さらに、基質タンパク質についても、細胞表面や細胞外、細胞内でゴルジ体、エンドソーム、リソソームに輸送される際、まず小胞体に輸送される。細胞内のタンパク質の細胞内小器官の間の移動は、輸送小胞によって行われる。このため、小胞輸送および分泌が、歯質の石灰化の状態に影響するのではないかと考えた。そこで、本研究において着目したのがSNARE(Soluble NSF Attachment protein Receptor)タンパク質である。SNAREタンパク質は、小胞輸送において小胞がターゲットとなる膜に特異的に融合する機構に関与するタンパク質として知られている。本研究では、in vitro実験に先行し、歯と同様に硬組織である骨芽細胞の株化細胞であるMC3T3の定量RTーPCR、初代骨芽細胞におけるマイクロアレイ、さらに、オンラインデータベースにおいても、Snap23が骨において有意に発現していることを確認したため、in situ hybridization法により歯での発現を確認したところ、エナメル芽細胞において発現がみられたため、まずはエナメル芽細胞をターゲットとすることにした。そこで、エナメル芽細胞特異的なコンディショナルノックアウトマウスを作製し、現在、同マウスの表現型解析を進めており、それにより歯質の石灰化における小胞の輸送メカニズムの解明を行う。その代表的なものとして象牙質形成不全症やエナメル質形成不全症があげられる。これらは遺伝性疾患であるため、責任遺伝子やその変異部位の同定などが進んでいる。しかし、明白な家族歴や基礎疾患がないにもかかわらず、う蝕の急速な進行や著しい咬耗、歯の破折を示す患者もいる。このような臨床的背景から、単に責任遺伝子の異常ではない、いまだ明らかにされていない石灰化異常の原因があるのではないかと考えた。昨年度中に作製したマウスから、S23fl/fl;K14-Creマウスが得られたため、8週齢および3日齢のマウスについて2次元マイクロCT解析を行った結果、S23fl/fl;K14-Creマウスでは、同腹のコントロールマウスと比較し、第一臼歯において石灰化物の形成量が少ない傾向がみとめられた。ただし、得られるノックアウトマウスの数が少なく、データ数が少ないため今後も検討を続ける予定である。エナメル芽細胞と象牙芽細胞の分離培養についてはマウスより摘出した歯胚に酵素処理を行い、上皮系細胞層と間葉系細胞層に分離後、さらに酵素処理を行い単一の歯原性上皮細胞および間葉系細胞を得た。ケラチン14-Creマウスの歯胚から細胞を分離し、X-gal染色を行うことにより、分離した細胞が、上皮系細胞と間葉系細胞に分けられていることを確認した。また、免疫染色を行い、上皮系細胞がアメロジェニンおよびSnap23を発現し、間葉系細胞がDSPPを発現していることを確認した。小児歯科領域では歯の形成異常を主訴とする患者も多く、その代表的なものとして遺伝性象牙質形成不全症やエナメル質形成不全症があげられる。このような臨床的背景から、単に責任遺伝子の異常ではない、石灰化異常の原因があるのではないかと考えた。本研究では歯質の石灰化の状態に影響する要因として細胞内での小胞輸送および分泌に着目し、歯質形成細胞における小胞輸送および分泌に関連する遺伝子の同定と、細胞特異的なコンディショナルノックアウトマウスの作製と表現型解析により、歯質の石灰化メカニズムの解明することを目的とした。そこで、小胞輸送において小胞がターゲットとなる膜に特異的に融合する機構に関与するタンパク質として知られているSNARE(Soluble NSF Attachment protein Receptor)タンパク質の歯での発現を確認するため、歯胚においてin situ hybridizationをおこなった結果、エナメル芽細胞にSnap23の特異的な発現を認めた。そのため、エナメル芽細胞特異的にSnap23を欠損するコンディショナルノックアウトマウスを作製し、表現型解析を行うこととした。S23fl/fl;K14-Creマウスが得られたため、マイクロCT解析を行った結果、S23fl/fl;K14-Creマウスでは、同腹のコントロールマウスと比較し、第一臼歯においてエナメル質の形成量が少ない傾向がみとめられた。

本研究では歯質の石灰化の状態に影響する要因として細胞内での小胞輸送および分泌に着目し、小胞輸送において小胞がターゲットとなる膜に特異的に融合する機構に関与するタンパク質として知られているSNARE(Soluble NSF Attachment protein Receptor)タンパク質の1つであるSnap23がエナメル芽細胞に特異的に発現することを明らかにした。このことから、エナメル芽細胞特異的にSnap23を欠損するコンディショナルノックアウトマウスを作製し、表現型解析を行った結果、同腹のコントロールマウスと比較し、第一臼歯におけるエナメル質の形成量が少ない傾向がみとめられた。ケラチン14-creマウスとR26Rマウスの交雑により得られたマウスの歯胚から細胞を分離し、X-gal染色を行うことにより、上皮系細胞と間葉系細胞を区別して分離できていることを確認した。また、分離した上皮系細胞の免疫染色において、アメロジェニンの発現を確認できたことから、得られた細胞はエナメル芽細胞であると同定でき、さらに、この細胞はSnap23を発現していた。また、エナメル芽細胞と同様に上皮系細胞であり、増殖や継代が困難であるとされている初代表皮細胞専用の培養液を用いると一定期間培養できることがわかった。今後、表皮細胞におけるsiRNAノックダウン法やインフェクション法を流用することでin vitro実験をすすめていく方針である。また、コンディショナルノックアウトマウスについても、歯の石灰化領域の減少傾向がみとめられた。小児歯科学出生後のマウス歯胚より細胞を分離してきたが、胎生期のマウス歯胚より細胞を分離することで、より分化度の低い細胞が得られる可能性があるため、歯胚の採取時期についても現在検討を行っている。適切な時期の歯胚から分離し、適切な培地で培養することにより、現在分離している細胞より増殖能を有する細胞を分離培養できる可能性があり、石灰化誘導のみならず、今後は、表皮細胞の培養方法を参考にsiRNAノックダウンやインフェクションの方法を検討し、in vitroでの機能解析を進める予定である。これに並行し、細胞を分散させないことにより細胞密度に依存せず培養でき、酵素処理やピペッティングなどの物理的刺激を避けられることから、ノックアウトマウスとコントロールマウスの歯胚をそれぞれ上皮系細胞層と間葉系細胞層にわけ培養を行っており、それらについても石灰化能の検討や、メカニズムの解析を進める予定である。コンディショナルノックアウトマウスについては、サンプルの回収時期を35日齢とすることで、効率的にサンプル数を増やしていく予定にしている。in vitroについては、歯原性上皮細胞ならびに歯原性間葉細胞の分離はできたものの、まだ安定した培養条件を定めるため試行錯誤の状態であるが、歯、特にエナメル芽細胞においてSNAREタンパク質であるSnap23が発現することをin situ hybridization法により確認できた。その結果をもとにまずはエナメル芽細胞特異的に発現するケラチン14-CreマウスならびにSnap23-floxマウスの作製は済んでおり、現在コンディショナルノックアウトマウスを得るため交配を続けている。