hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
閉経後骨粗鬆症の臨床・実験的研究

ビーグル犬での卵巣摘出実験によれぱ、卵摘後の骨動態は当施設で得たヒトの閉経後の骨変化と本質的には同一であるようにおもわれたが、卵摘直後に骨芽細胞機能、とくに基質の産生障害が起きる時期が在ることが示唆された。ヒトにおける骨組織形態計測の結果では、閉経周辺期の骨芽細胞機能の障害は基質の産生のみならず石灰化においても認められた。このような変化は女性のみに認められ男性には認められなかった。2)閉経後は石灰化や基質産生に障害は認められず、閉経周辺期よりも多く青年期に近い状態であった。したがって骨量の減少は閉経周辺期に多く閉経後は安定していると考えられ、骨組織形態計測によっても同じ結果が得られた。3)骨粗鬆症の患者群でも、男性は極めて小数であることや初発症状は閉経周辺期に出現すること、治療によっても骨量の増加はほとんど見られないことなどから、発症原因は閉経周辺期前の骨量の多少、閉経周辺期の骨芽細胞機能障害による骨減少、閉経後の骨芽細胞の機能回復の障害などが考えられる。上記の結果について1991年第11回日本骨形態計測学会、1992年第XI回International Conference on Calcium Regulating Hormones(Florence、Ialy)、1992年第1回日本骨粗鬆症研究会で発表し、一部では既に「特発性骨粗鬆症2例の骨形態計測」日本骨形態計測学会雑誌Vol2、p125-129、1992として発表、他は投稿中である。閉経の骨に与える影響を閉経後骨粗鬆症の動物モデルにより組織計測学的に解明し,ヒトでの組織形態学的変化を解明することを目的とした本研究においては当初の研究予定を終了してほぼ目的を達成することができた。結果1)ビーグル犬での卵巣摘出実験によれば、卵摘後の骨動態は当施設で得たヒトの閉経後の骨変化と本質的には同一であるようにおもわれたが、卵摘直後に骨芽細胞機能,とくに基質の産生障害が起きる時期が在ることが示された。ヒトにおける骨組織形態計測の結果では,閉経周辺期の骨芽細胞機能の障害は基質の産生のみならず石灰化においても認められた。2)閉経後は石灰化や基質産生に障害は認められず,閉経周辺期よりも青年期に近い状態であった。したがって骨量の減少は閉経周辺期に多く閉経後は安定していると考えられ,骨組織形態計測によっても同じ結果が得られた。3)骨粗鬆症の患者群でも,男性は極めて小数であることや初発症状は閉経周辺期に出現すること,治療によっても骨量の増加はほとんど見られないことなどから,発症原因は閉経周辺期前の骨量の多少,閉経周辺期の骨芽細胞機能障害による骨減少,閉経後の骨芽細胞の機能回復の障害などが考えられる。4)骨粗鬆症では骨皮質が菲薄化し,骨強度が減少して骨折を生じることが知られている。ビーグル犬の肋骨を用いた実験ではオステオン単位で骨基質の産生が低下し,皮質骨から粗な海綿骨へと変化して粗鬆化が生じるというメカニズムが判明した。上記の結果について1991年第9回日本骨代謝学会,第11回日本骨形態計測学会,1992年第11回International Conference on Calcium Regulating Hormones(Florence,Italy),第1回日本骨粗鬆症研究会,第11回骨代謝学会,第12回日本骨形態計測外科学会,1993年第13回日本骨形態計測外科学会発表した。
性染色体の起源と性スペクトラム関連遺伝子

1)組換え抑制を招く性スペクトラム関連遺伝子の同定(i)性決定遺伝子座周辺の参照ゲノム配列の完成:これまでに1魚種(ブリ)のZ染色体について、性決定遺伝子周辺の参照ゲノム配列を得ている。しかし、ペアとなるW染色体、および他の2魚種の性染色体については、その参照配列は得られていなかった。そこで2017年度は、長鎖ターゲットエンリッチメント法による参照配列構築を試みた。その結果、1魚種のZおよびW染色体の参照ゲノム配列を得ることができた。(ii)多個体のハプロタイプフェージング:上記で開発した長鎖エンリッチメント法は、濃縮度に領域依存的なバラツキがあるため、少数個体の高被覆度解析には適しているが、多個体の低被覆度解析には適していないことが判明した。これを改善するため、通常のPCRをエマルジョン法に置換した後、得られた濃縮産物を長鎖シーケンシングに供した。(iii)性決定遺伝子:性スペクトラム関連遺伝子が組換え抑制を招くためには、それら遺伝子と性決定遺伝子の距離がある程度近い必要があると予想されている。この距離を知るための前提として、上記3魚種の性決定遺伝子のゲノム上の位置を同定した。3魚種の性はすべてHsd17b1遺伝子第3エクソン上の一塩基多型により決定されていることが示された。2)組換え抑制をつくりだすエピゲノム構造変化の解明(i)組換え抑制とヘテロクロマチン化の関連をさぐる:解析材料を得るため、2017年度は秋から冬にかけて2歳ブリの卵巣から卵細胞を分離・濃縮することを試みた。顕微鏡下の観察の結果、よりはやい段階の卵細胞のほうが後の解析に適していることがわかった。(ii)組性決定遺伝子周辺の組換え抑制とメチル化状態の関連を明らかにするため、2017年度はブリ卵巣より分離・濃縮した卵細胞からDNAを抽出し、全ゲノムバイサルファイトシーケンシングをおこなった。1)組換え抑制を招く性スペクトラム関連遺伝子の同定については、当初の計画以上に進展している。一方で、2)組換え抑制をつくりだすエピゲノム構造変化の解明についは、若干、遅れている部分もある。1)組換え抑制を招く性スペクトラム関連遺伝子の同定(i)性決定遺伝子座周辺の参照ゲノム配列の完成:2017年度に長鎖エンリッチメント法の有効性が確認できたので、2018年度はまず、組換え抑制が強い1魚種(ブリ)のWW型ダイプロイド個体を染色体操作により作出し、次にこれをエンリッチメント法に供してW染色体の参照配列を作製する。(ii)多個体のハプロタイプフェージング:2017年度に通常のPCRをエマルジョン法に置換したサンプルを長鎖シーケンシングに供した。2018年度はこのデータのアセンブルをおこない、エマルジョンPCRの有効性を検証する。別途、W染色体の個体差を効率的に検出するため、雌性発生法によりW型ハプロイドを得て、これを上記の改変版長鎖エンリッチメント法に供する。2)組換え抑制をつくりだすエピゲノム構造変化の解明(i)組換え抑制とヘテロクロマチン化の関連をさぐる:2017年度にサンプリングした卵細胞は、その発達段階が若干すすみすぎていた。2018年度は、全雌ブリを作出し、これを経時的に観察して最適なサンプリング時期を決定する。別途、卵細胞の分離・濃縮法の最適化もおこなう。(ii)組換え抑制とDNAメチル化の関連をさぐる:2017年度に全ゲノムバイサルファイトシーケンシングをおこなったが、野生型ブリの多型データがないため、メチル化サイトを判定することができなかった。そこで、まず今年度は野生型ブリの多型データを取得し、つぎに昨年のデータとあわせることでメチル化サイトの検出をおこなう。

顕微鏡下の観察の結果、よりはやい段階の卵細胞のほうが後の解析に適していることがわかった。(ii)組性決定遺伝子周辺の組換え抑制とメチル化状態の関連を明らかにするため、2017年度はブリ卵巣より分離・濃縮した卵細胞からDNAを抽出し、全ゲノムバイサルファイトシーケンシングをおこなった。1)組換え抑制を招く性スペクトラム関連遺伝子の同定については、当初の計画以上に進展している。一方で、2)組換え抑制をつくりだすエピゲノム構造変化の解明についは、若干、遅れている部分もある。1)組換え抑制を招く性スペクトラム関連遺伝子の同定(i)性決定遺伝子座周辺の参照ゲノム配列の完成:2017年度に長鎖エンリッチメント法の有効性が確認できたので、2018年度はまず、組換え抑制が強い1魚種(ブリ)のWW型ダイプロイド個体を染色体操作により作出し、次にこれをエンリッチメント法に供してW染色体の参照配列を作製する。(ii)多個体のハプロタイプフェージング:2017年度に通常のPCRをエマルジョン法に置換したサンプルを長鎖シーケンシングに供した。2018年度はこのデータのアセンブルをおこない、エマルジョンPCRの有効性を検証する。別途、W染色体の個体差を効率的に検出するため、雌性発生法によりW型ハプロイドを得て、これを上記の改変版長鎖エンリッチメント法に供する。2)組換え抑制をつくりだすエピゲノム構造変化の解明(i)組換え抑制とヘテロクロマチン化の関連をさぐる:2017年度にサンプリングした卵細胞は、その発達段階が若干すすみすぎていた。2018年度は、全雌ブリを作出し、これを経時的に観察して最適なサンプリング時期を決定する。別途、卵細胞の分離・濃縮法の最適化もおこなう。(ii)組換え抑制とDNAメチル化の関連をさぐる:2017年度に全ゲノムバイサルファイトシーケンシングをおこなったが、野生型ブリの多型データがないため、メチル化サイトを判定することができなかった。そこで、まず今年度は野生型ブリの多型データを取得し、つぎに昨年のデータとあわせることでメチル化サイトの検出をおこなう。
2-オキサゾリン類を出発原料とする新しい機能性高分子の合成

本研究では, 2-オキサゾリン類の開環重合ポリマーが今までの高分子にみられない特性をもつことを利用して,新しい"複合材料"ならびに"複合化材料"の分子設計と合成を行なうことを目的とし,部分加水分解-架橋法および共重合法を用いて,新規非イオン性ハイドロゲルを合成した.まず, 2-メチルー2-オキサゾリンを異性化開環重合させて得たポリオキサゾリンをアルカリ水溶液により部分加水分解を行ない,二級アミノ基を数%有するプレポリマーを合成した.次に, 1, 6-ヘキサメチレンジイソシアナートを用いて,ウレア結合による架橋を行ないゲルを得た. DBUを触媒としてDMF溶液中で反応を行なうと,より温和な条件でゲルを生成することができる.得られたゲルについて,その吸水特性を検討したところ,純水及び5%食塩水ともに架橋点間平均分子量が増大するに従い,吸水倍率は大きくなる傾向が見られた.また,非イオン性ハイドロゲルの特徴として,純水及びイオンに対する吸水倍率がほぼ同じ値を示した.一方, 2-メチルー2-オキサゾリンと1, 4-テトラメチレンー2, 2-ビスオキサゾリンとのメチルトリフレートを開始剤として共重合法によってもポリオキサゾリンを基本骨格とした非イオン性ハイドロゲルが合成できた.ビスオキサゾリンに対してメチルオキサゾリンの量を多くするほど,ゲルの架橋点間平均分子量が増大し,吸水倍率の上昇が見られた.この共重合法を用いてオキサゾリンのアルキル基を変えると,有機溶媒に膨潤するリポゲル,或いは水と有機溶媒の両方に膨潤する両親媒性ゲルも合成することができた.今後は上述の非イオン性ハイドロゲルの合成を更に進展させ,官能基の化学変換等により,光,熱, PHなどに応答する,いわゆる高機能性ハイドロゲルへと導き,更に他の汎用有機高分子や無機高分子と組み合わせた複合ハイドロゲルの合成を試みる計画である.本研究では, 2-オキサゾリン類の開環重合ポリマーが今までの高分子にみられない特性をもつことを利用して,新しい"複合材料"ならびに"複合化材料"の分子設計と合成を行なうことを目的とし,部分加水分解-架橋法および共重合法を用いて,新規非イオン性ハイドロゲルを合成した.まず, 2-メチルー2-オキサゾリンを異性化開環重合させて得たポリオキサゾリンをアルカリ水溶液により部分加水分解を行ない,二級アミノ基を数%有するプレポリマーを合成した.次に, 1, 6-ヘキサメチレンジイソシアナートを用いて,ウレア結合による架橋を行ないゲルを得た. DBUを触媒としてDMF溶液中で反応を行なうと,より温和な条件でゲルを生成することができる.得られたゲルについて,その吸水特性を検討したところ,純水及び5%食塩水ともに架橋点間平均分子量が増大するに従い,吸水倍率は大きくなる傾向が見られた.また,非イオン性ハイドロゲルの特徴として,純水及びイオンに対する吸水倍率がほぼ同じ値を示した.一方, 2-メチルー2-オキサゾリンと1, 4-テトラメチレンー2, 2-ビスオキサゾリンとのメチルトリフレートを開始剤として共重合法によってもポリオキサゾリンを基本骨格とした非イオン性ハイドロゲルが合成できた.ビスオキサゾリンに対してメチルオキサゾリンの量を多くするほど,ゲルの架橋点間平均分子量が増大し,吸水倍率の上昇が見られた.この共重合法を用いてオキサゾリンのアルキル基を変えると,有機溶媒に膨潤するリポゲル,或いは水と有機溶媒の両方に膨潤する両親媒性ゲルも合成することができた.今後は上述の非イオン性ハイドロゲルの合成を更に進展させ,官能基の化学変換等により,光,熱, PHなどに応答する,いわゆる高機能性ハイドロゲルへと導き,更に他の汎用有機高分子や無機高分子と組み合わせた複合ハイドロゲルの合成を試みる計画である.
高速構造化照明顕微鏡の開発と動的ソフトナノマテリアルのリアルタイム観察

高繰り返しナノ秒レーザーを光源として,高速度カメラを検出器として用い,照明光パターンの位相を変調させるためにポッケルスセルを導入することにより,電気的に照明光パターンの位相を変調させながら,それぞれの位相での蛍光画像を高速に連続して取得可能な構造化照明顕微鏡を構築した。これによって,縦横それぞれ位相を変化させながら5枚の画像を連続して取得することによって,合計5ミリ秒に1枚の超解像画像を得ることができる。また,構造化照明光によって得られた3枚の蛍光画像から深さ方向の分解能が高いオプティカルセクショニング画像を3ミリ秒ごとに取得することに成功した。27年度には、高繰り返しナノ秒レーザーを新たに導入し、従来の顕微鏡と組み合わせ光源として用いることで蛍光顕微鏡の光学系を構築した。また、Ouzo効果を示し、高分子を含まずにマイクロエマルジョンを形成することが知られているエタノール/水/オクタノール三成分混合溶液についてラマン散乱測定、および動的光散乱測定を行った。さらに、下部臨界点を持ち、温度上昇に伴って相分離するイソブトキシエタノール(iBE)/水混合溶液の相分離過程における相の成長過程について散乱法によって調べた。エタノール/水/オクタノール三成分混合溶液系のラマンスペクトルの濃度依存性から、三成分混合系では水の濃度が高くなるに従って、水と水素結合しているエタノールが増え、オクタノールはエタノール層に囲まれるように存在し、溶液中にナノ構造を形成することがわかった。また、iBE/水混合溶液に近赤外光を照射し相分離過程を誘起すると、Early stageと呼ばれる濃度変化を伴う相の成長過程が温度ジャンプの大きさによって異なり、温度ジャンプの幅が小さい時には500 nm程度と比較的大きな相が100マイクロ秒程度かけて生成し、その後時間とともに成長していくことがわかった。このような不均一な溶液系における溶液内ナノ構造や過渡的に現れる溶液内構造が、本研究において構築を目指す早い時間分解能と光学限界を超える超分解能を持った高速構造化照明顕微鏡の観測対象として適していると確認した。本研究は高繰り返しレーザーを光源として用い、ハイスピードカメラ、蛍光顕微鏡と組み合わせることで、時間分解能1ミリ秒以下、光学限界を超える空間分解能を持った高速構造化照明顕微鏡を構築し、それを用いて溶液内に存在するメゾスコピックな柔構造や性細胞の実時間観測を行うことを目的にしている。27年度には光源として重要な役割を担う高繰り返しナノ秒レーザーを導入し、既存の顕微鏡と組み合わせた。さらに、28年度においてハイスピードカメラを導入することによって高速構造化照明顕微鏡を構築する予定である。また、その観測対象として申請書に挙げた、Ouzo効果を示すエタノール/水/オクタノール三成分混合系や相分離過程にあるイソブトキシエタノール/水混合溶液について種々の分光法や光散乱法を用いて調べることにより、これらが高速構造化照明顕微鏡の観測対象として適当であることも確認できた。構造化照明顕微鏡の光源の構造化にはポッケルスセルを用いた高速での周期構造の変化を行う予定であるが、ポッケルスセル自身は導入済みであり、照明光の構造化については28年度のハイスピードカメラを導入後に実際の画像を観測しながら光学系の構築、最適化を行う予定であり、進捗状況は概ね順調であると言える。28年度には,高繰り返しナノ秒レーザーを励起光源とした蛍光顕微鏡に回折格子を導入し,励起光ビームを複数に分け,対物レンズを通して試料上で再びビームを結合し,干渉縞を作ることで構造化照明を可能にした。さらに,ハイスピードカメラを導入することで,構造化照明顕微鏡を構築した。また,ナノ秒レーザーを用いて水溶液中の金ナノ粒子を励起することによって,可視光領域にブロードな発光が観測されること,さらにこの発光強度が圧力に依存して大きく変化することを見出した。これらの結果は,ナノ秒レーザーパルス励起に伴う金ナノ粒子およびその周辺の溶媒の急激な温度上昇によって,そのパルス幅内においてナノバブルが形成していることを示唆していると考えられる。さらに,発光に対するレーザー強度閾値や観測された発光寿命からナノバブルの発生メカニズムやその崩壊過程まで含んだダイナミクスについて考察した。また,下部臨界温度を持つイソブトキシエタノール(iBE)-水混合溶液の相分離ダイナミクスについて,ナノ秒レーザー温度ジャンプ法と時間分解光散乱測定を用いてその温度依存性を詳細に調べ,温度ジャンプの大きさが小さく,到達温度が低いほど,Early stageと呼ばれる濃度変化を伴う相の形成過程を含む相分離初期過程に要する時間が長く,その時に形成される相の大きさが大きいことがわかった。構造化照明顕微鏡の光源として使用していたナノ秒レーザー装置の修理とそれに伴う再調整のために実験が遅れたが,概ね順調と言える。28年度の研究では,励起光源となるレーザー光の光路上に回折格子,あるいは格子縞構造を持ったマスクを導入することで,励起光ビームを複数に分割し,そのうちの2つ,あるいは4つのビームを対物レンズを通して試料内において再び結合することで,干渉縞を作成することで構造化照明を可能にした。また,ハイスピードカメラを導入することによって,構造化照明顕微鏡を構築した。構造化照明顕微鏡の分解能を決定する重要なパラメータである干渉縞の間隔は,光学系にプリズムを導入し設置したマイクロメータを調整し,対物レンズに入射する際のビーム間の距離を変更することで簡単に調整できるように構築した。

また,照明光パターンの位相の高速変調を可能にするために導入するポッケルスセルについてハイスピードカメラを用いてその応答速度の評価を行い,数100μsでの位相制御が可能であることを確認した。さらに,高速構造化照明顕微鏡の観測対象として予定している,相分離過程にある溶液中に過渡的に現れる微小柔構造について,レーザー温度ジャンプ法と光散乱法を用いてその構造のサイズの温度依存性を調べ,相分離を開始する温度が低いほど,相の成長が遅く,また初期過程に形成される相のサイズが小さいことを確認した。また,細胞内の小機関についてもラマン顕微鏡を用いた観測を開始し,ラマン散乱光を用いて細胞をイメージングすることで,細胞内の水や生体分子の濃度を画像化できることを確認し、構築している構造化照明顕微鏡の観測対象となりうると結論した。進捗状況は概ね順調であると言える。最終年度である29年度には,28年度までに構築した構造化照明顕微鏡にポッケルスセルを導入し,電気的にレーザーパルスの位相を制御することによって,300マイクロ秒程度ごとに照明光パターンの位相を変調することができることを確認した。さらに,照明光パターンの1方向の位相を変えながら連続して3枚の画像を取得し,それらの画像の差の2乗和を計算することで,深さ方向の分解能が高い,オプティカルセクショニング画像を得ることに成功した。膜染色色素で染色した神経細胞については,1 ms毎に照明光パターンの位相を変調させることで3 msごと,つまり3 msの時間分解能でオプティカルセクショニング画像を得た。また,1つのレーザー光を3つのビームラインに分け,そのうちの2つのビームの光路にポッケルスセルを導入し,独立に位相を変調させることで,縦と横,2軸方向の位相を独立に制御し,得られた画像をフーリエ空間で結合することで,超解像画像を得た。試料としては,膜染色色素で染色した細胞を用い,それぞれ1 msの露光時間で画像を得,5枚の画像から超解像画像を作成した。このことから今回構築した構造化照明顕微鏡は,200 fpsでの撮影が可能であり,その時間分解能は5 ms程度であると言える。蛍光強度が低いため,露光時間が長く,またノイズを含む画像となったが,より蛍光量子収率が高く,染色密度が高い蛍光色素を使用することで,より早い時間分解能での測定が可能になると考えている。さらに,多共焦点ラマン顕微鏡を用いることで,細胞内の水の空間分布をラベルフリーで観測できることを示した。その結果から,細胞質に比べて細胞核は水の濃度が高く,生体分子の密度が低い,疎な環境であることがわかった。さらに,細胞質では高濃度の生体分子によって,細胞核や細胞培地とは異なる水素結合ネットワークを形成していることが分かった。高繰り返しナノ秒レーザーを光源として,高速度カメラを検出器として用い,照明光パターンの位相を変調させるためにポッケルスセルを導入することにより,電気的に照明光パターンの位相を変調させながら,それぞれの位相での蛍光画像を高速に連続して取得可能な構造化照明顕微鏡を構築した。
分散配置レーザスキャナによる歩行者や車両のリアルタイムトラッキング手法

1)駅構内でめ実験を行い、レーザスキャナデータから人を抽出、追跡するための基礎的な手法を開発した。合わせて、広い地域をカバーするために多数のスキャナをネットワークで結合し、時刻同期やデータのリアルタイム転送を達成する手法も検討した。実験の結果、人間に関しては、比較的良好な精度でトラッキングできることが示された。2)上記の実験を通じて、空間に存在する人の密度の多寡という観点からレーザスキャナの適用可能性を評価した。その結果、1平方メートルあたり0.8名程度(駅などにおいて、旅客が一応人の流れに沿って歩くことが可能な程度)であれば、人数のカウントは99%程度の精度で可能であることがわかった。なお、一人一人のトラッキングは8割程度に落ちてしまう。そのため、人数カウント用アルゴリズムとトラッキング用アルゴリズムを分離しそれぞれを改良することが必要であることがわかった。電子タグやCCDカメラなどとの連携可能性も探ることの重要性が認識された。実験にあたってはCCDカメラも併用し、両者を融合したデータを作成し、その有効性を確認したので、来年度以降、具体的な抽出への適用を進める予定である。
殺虫菌スギエダタケにおける被食防衛形質の適応進化の実証に向けて

スギエダタケと菌食性トビムシの相互作用の地理的な違いを明らかにするために野外調査を行った。今年度は再調査も含めて、6地点で野外調査を行い、これまでの調査結果と合わせて、合計16地点で相互作用に関するサンプルを得ることができた。また、これまで得られたサンプルの解析を行った。その結果、地域によってスギエダタケを摂食する種の有無や組成、食べ方が異なることが明らかになった。秋田ではCeratophysella sp. 1がスギエダタケのひだを摂食し、Ceratophysella sp. 2が傘と柄の内部の組織を摂食していた。山梨、京都、和歌山、隠岐の島、島根、高知ではオオオニムラサキトビムシ(Ceratophysella pilosa)あるいはその近縁種が子実体内部の組織を摂食していた。宮城と屋久島ではスギエダタケを選好的に利用するトビムシ種はみられなかった。また、同じトビムシ種でも地域によりスギエダタケに対する選好性に違いがあることが明らかになった。Ceratophysella sp. 3は静岡と和歌山ではスギエダタケを選好し、高知では選好しなかった。また、これまでに採集されたトビムシの分類学的検討を行ったところ、秋田で発見された種が未記載種であることがわかり、新種として記載した(投稿中)。本年度は昨年度に加え、6地点でスギエダタケを摂食するトビムシ相の調査を行い、生物間相互作用の地理的な違いについてのデータを取得することができた。ただし、降雨がないと調査ができないため、12地点では十分な標本が得られなかった。また、子実体の形態的変異を観察する目的で、子実体を採集していたが、十分な数が得られない地点があった。そのため、形態観察目的での子実体は、湿湿培養法で得ることに切り替えた。スギエダタケとトビムシの相互作用が特徴的な地点がわかったので、今後はそれらのなかから代表的な地点を選び、スギエダタケ子実体の形態的な違いや、トビムシがスギエダタケの胞子散布に及ぼす影響を、観察していく予定である。殺虫作用をもつ菌類スギエダタケの菌食者(トビムシ類)に対する適応進化の可能性を探るために、野外調査および標本採集を行なった。子実体食トビムシ類の地理分布の解明のために、今年度は宮城県、新潟県(佐渡島)、富山県、京都府、和歌山県、島根県(本土および隠岐島)の7地点で野外調査を実施した。宮城県、新潟県(佐渡島)、和歌山県、島根県(本土および隠岐島)の調査では、スギエダタケを摂食するトビムシ相および子実体を摂食するトビムシ相の調査ができ、宮城県と新潟県(佐渡島)の調査地では子実体食性のトビムシが存在するもののスギエダタケを摂食する種がいないこと、和歌山県、島根県(本土および隠岐島)の調査地ではスギエダタケを摂食する種がいることがわかった。京都府ではスギエダタケを摂食するトビムシ種の存在は確認されたものの、天候に恵まれず、子実体を節食するトビムシ相の調査はできなかった。富山では2回調査を試みたが、トビムシが十分に得られなかった。トビムシ類がスギエダタケの胞子散布に与える影響の評価のために、子実体から得られたトビムシ類の体表に胞子が付着しているかを調べるための方法を検討した。また、スギエダタケを摂食するトビムシが見つかった和歌山県、島根県(本土および隠岐島)のうち、島根県(隠岐島)で十分な数の標本を得た。スギエダタケ子実体形質の地理的変異の解明に向けて、上述の7地点でスギエダタケの子実体を採集し、エタノールの固定して標本とした。また、室内培養(基質培養法)により各産地のスギエダタケの子実体サンプルをいくつか得た。一部の産地のものについては殺虫力を評価するための試験を実施した。調査地点を増やすために野外調査に力を注いだ分、室内での実験観察がやや遅れた。

本年度は昨年度に加え、6地点でスギエダタケを摂食するトビムシ相の調査を行い、生物間相互作用の地理的な違いについてのデータを取得することができた。ただし、降雨がないと調査ができないため、12地点では十分な標本が得られなかった。また、子実体の形態的変異を観察する目的で、子実体を採集していたが、十分な数が得られない地点があった。そのため、形態観察目的での子実体は、湿湿培養法で得ることに切り替えた。引き続き野外調査を継続し、調査地点数を増やし、基盤データを固める。未記載のトビムシ種が多数得られたので、それらの種を記載する。重点的に実験観察を行う地点を絞り込む。スギエダタケとトビムシの相互作用が特徴的な地点がわかったので、今後はそれらのなかから代表的な地点を選び、スギエダタケ子実体の形態的な違いや、トビムシがスギエダタケの胞子散布に及ぼす影響を、観察していく予定である。
精神障がい者の家族のFamily Resilienceを促すガイドラインの活用

本研究の全体目的は、精神障がい者を内包する家族のFamily Resilienceを促進・強化する支援方法を開発することである。今年度は、精神障がい者の家族のFamily Resilienceを促進する支援について検討し、臨床で活用しやすいガイドラインへと修正することを目標とした。先行研究、精神科に勤務する看護師へのインタビュー、文献検討から精神障がい者の家族のFamily Resilienceを促進する41の支援を導き出した。これらの支援を質問項目として、精神科を有する病院に勤務する看護師の実践状況と必要性の認識を問う無記名自記式質問紙を作成し、調査を行った。11病院の看護師781人に配布、回収390、有効回答382であった。精神障がい者の家族のFamily Resilienceを促進する41項目の支援について5件法で質問し、「ほとんど必要でない」または「あまり必要でない」と回答した人の割合は、0%から3.4%の範囲であった。また、無回答であった人の割合は、1.0%から2.6%の範囲であった。一方、「とても必要だ」または「やや必要だ」と回答した人は、68.6%から90.3%の範囲であった。このことから、これら41項目の支援は、Family Resilienceを促進する支援として概ね妥当なものだと判断した。臨床で活用しやすいガイドラインにするためには、支援方法が具体的に表現されることが望ましい。今回の調査で看護師が実践していると記述した自由記述の回答、文献、看護師へのインタビュー結果を参考にしながら、精神障がい者を内包する家族のFamily Resilienceを促進する支援に具体性を持たせる修正について研究者間で検討を行った。本研究の目的は、精神障がい者を内包する家族のFamily Resilienceを促進・強化する支援方法を開発することである。これまでに精神障がい者の家族のFamily Resilienceの特性とFamily Resilienceを促進するために精神科看護師が行っている看護介入について、質的記述的研究デザインで明らかにしてきた。平成28年度は、家族のFamily Resilienceの関連要因を明らかにする予定であったが、これまでに研究協力を得た施設に成果報告した結果を踏まえて研究者間で検討した結果、臨床現場で用いやすいガイドラインを作成する為に、看護介入部分を強化することとした。精神障がい者の家族のFamily Resilienceを促進・強化する看護介入に関する質問紙を作成中である。精神科看護師を対象に実施する予定であった精神障がい者の家族のFamily Resilienceを促進・強化する為の看護介入に関する質問紙作成が遅れている。昨年度、臨床現場で用いやすいガイドラインを作成するために、家族のFamily Resilienceの関連要因でなく、看護支援部分を強化することとした。これを受け、平成29年度は、精神看護学分野で当事者のセルフマネジメントや家族のレジリエンス研究を行っている研究者を共同研究者に加えた。その上で、国内外の文献検討からFamily Resilienceの促進・強化に役立つと考えられる支援の抽出結果と精神科看護師を対象に行ったFamily Resilienceの促進・強化に向けた看護支援に関するインタビュー結果を統合し、質問紙を作成した。質問紙作成にあたり、表現の検討や項目数の決定に時間を要した。平成29年度は、精神科看護師を対象として、精神障がい者の家族のFamily Resilienceを促進するための看護介入に関する質問紙調査を実施する。具体的な介入方法やその用いられ方の特徴、関連要因等を明らかにすることを目指す。現在、精神科看護師へのインタビューから抽出された看護介入、家族のFamily Resilienceに関する研究成果、書籍等より看護介入を抽出している。倫理審査を受けた後、複数県、複数施設の精神科看護師を対象に質問紙調査を実施する予定である。エキスパートナースへのプレテストと本調査に関する倫理審査は終了し、承認が得られている。

現在行っている施設への研究依頼を順次進めると共に、プレテスト修了後、本調査を実施する。精神障がい者の家族を対象とした質問紙調査を実施する予定であったが、精神科看護師を対象として看護介入に関する質問紙調査を行うこととした。しかし、今年度調査が行えなかったため、調査用紙の送返信にかかる通信費が発生しなかった、また分析に用いるためのソフトの購入を行わなかった。質問紙の発送が遅れているため、送返信にかかる通信料が発生しなかった。また、分析に用いる統計ソフトの購入を行わなかった。平成29年度に実施する質問紙調査の送返信費用、および分析ソフト購入費用に充てる。
FIB加工による微小切り欠き深さを指標とする浸炭歯車の表面性状の定量化

本研究は浸炭歯車の歯元に加工した微小切欠きで,材料中に含まれる潜在欠陥を模して表現し、疲労強度を律する欠陥の影響を切欠き寸法を用いて定量化することを目的とする.これまでの研究で,モジュール5の浸炭歯車については,深さ20μmより大きい場合には切欠き深さの増加に伴い強度が低下するけれども,20μmより小さい切欠きでは破壊の起点にならず,強度に影響を及ぼさないことがわかっている.これを限界切欠き深さという.一方,浸炭歯車の曲げ疲労き裂進展では,まず浸炭異常層の内部で酸化物や粒界を応力集中源として微小き裂が多数発生し,それらの一部が硬化層内に進入して深部へ進展するモデルが提案されている.このモデルに従うと,表面性状のうち,最も強度に及ぼす影響が大きいと考えられる因子は表面異常層厚さである.そこで,本年度はモジュール1.0と1.5の小モジュール浸炭歯車を用い,疲労強度と限界切欠き深さを求める実験を行った.その結果,モジュール1.0の歯車に対して,1050MPa,6μm,モジュール1.5の歯車に対して976MPa,7μmという値が得られた.異常層厚さは,両系統の歯車とも約5μmであった.これまでにモジュール5の歯車に対して得られた結果と合わせ,限界切欠き深さは浸炭異常層厚さと良い相関があることが知られた.欠陥寸法,硬さ,残留応力をパラメータとした強度評価法に対して,欠陥寸法として限界切欠き深さを与えた場合,異常層厚さを与えた場合共に,モジュールによらず良好な強度評価を行うことができた.本研究は浸炭歯車の歯元に加工した微小切欠きで,材料中に含まれる潜在欠陥を模して表現し,疲労強度を律する欠陥の影響を切欠き寸法を用いて定量化することを目的とする.以前の研究で,深さ20μmよりも大きい場合には,切欠き深さの増加に伴い,強度が低下するけれども,20μmよりも小さい切欠きは,破壊の起点にならず,強度に影響を及ぼさないことがわかっている.これを限界切欠き深さと名付けた.ところで,疲労過程をき裂生成過程とき裂進展過程とに分けた場合に,人工切欠きは,主にき裂生成過程に作用して強度低下を招くと考えられる.そこで,疲労試験時にアコースティックエミッション(AE)計測を行い,き裂生成過程と進展過程との分離,並びにき裂生成に必要なエネルギーの定量化を試みた.その結果,疲労負荷開始直後(ステージ1),き裂が生成して浸炭硬化層を通過するとき(ステージ2),折損直前(ステージ3)において,顕著なAEが観測されることが知られた.切欠きがある場合に,ステージ2からステージ3までに必要な負荷繰り返し数に違いはないが,ステージ1からステージ2に至る繰り返し数が短縮される傾向にあることが知られた.また,ステージ2において計測されるAEエネルギーがき裂生成に必要なエネルギーに比例すると考えられる.切欠きがき裂生成を促進するとの立場に立てば,切欠きによってステージ2でのAEエネルギーが減少することが予想されたが,現時点では切欠きの有無によるAEエネルギーに大きな差異は見られていない.今後は超清浄鋼により歯車を製作して,限界切欠き深さを知る実験を行い,潜在欠陥の減少による強度向上と限界切欠き深さとの関係を定量化する予定である.本研究は浸炭歯車の歯元に加工した微小切欠きで,材料中に含まれる潜在欠陥を模して表現し、疲労強度を律する欠陥の影響を切欠き寸法を用いて定量化することを目的とする.これまでの研究で,モジュール5の浸炭歯車については,深さ20μmより大きい場合には切欠き深さの増加に伴い強度が低下するけれども,20μmより小さい切欠きでは破壊の起点にならず,強度に影響を及ぼさないことがわかっている.これを限界切欠き深さという.一方,浸炭歯車の曲げ疲労き裂進展では,まず浸炭異常層の内部で酸化物や粒界を応力集中源として微小き裂が多数発生し,それらの一部が硬化層内に進入して深部へ進展するモデルが提案されている.このモデルに従うと,表面性状のうち,最も強度に及ぼす影響が大きいと考えられる因子は表面異常層厚さである.そこで,本年度はモジュール1.0と1.5の小モジュール浸炭歯車を用い,疲労強度と限界切欠き深さを求める実験を行った.その結果,モジュール1.0の歯車に対して,1050MPa,6μm,モジュール1.5の歯車に対して976MPa,7μmという値が得られた.異常層厚さは,両系統の歯車とも約5μmであった.これまでにモジュール5の歯車に対して得られた結果と合わせ,限界切欠き深さは浸炭異常層厚さと良い相関があることが知られた.欠陥寸法,硬さ,残留応力をパラメータとした強度評価法に対して,欠陥寸法として限界切欠き深さを与えた場合,異常層厚さを与えた場合共に,モジュールによらず良好な強度評価を行うことができた.
効率的な赤肉生産のためのMyostatin遺伝子による骨格筋形成機構の解明

ウシにおける効率的な赤肉生産の確立に向け、骨格筋成長の抑制的調節因子として注目されているMyostatin遺伝子を軸とした骨格筋形成について、黒毛和種生体および細胞を使用し、遺伝子およびタンパク質の発現解析を中心に分子レベルでの検討を行った。黒毛和種生体レベルでの研究実績の概要黒毛和種の胎子期においてMyostatin遺伝子の強発現が認められたことから、この時期における骨格筋組織のプロテオーム解析を実施した。胎齢5、8ヵ月齢および出生後22ヶ月齢の異なる3ステージの骨格筋組織を対象に、発現タンパク質の網羅的解析を実施し、一部の発現スポットについて、タンパク質の同定を行った。骨格筋タンパク質を可溶性および不溶性画分に分画し、2次元電気泳動法による分離展開した結果、それぞれ発現強度が異なる39および27スポットを検出した。この中で、胎子期に特異的に発現しているスポットとして、トランスフェリンおよび抗トリプシンなどが質量分析法またはアミノ酸シークエンス法から同定できた。質量分析法で推定が可能となったタンパク質の70%以上は骨格筋の構造タンパク質であった。また、アミノ酸シークエンス法からウシ骨格筋組織の60%以上はN末端が修飾されていることが明らかとなった。黒毛和種細胞レベルでの研究実績の概要筋芽細胞の分化後に形成される筋管において、Myostatin遺伝子の強発現が認められたことから、同遺伝子の機能阻害法による機能解析を実施した。Myostatin遺伝子の発現を約70%ノックダウンできるsiRNAを使い、筋芽細胞分化後の形態変化および関連遺伝子の発現解析を行った結果、分化誘導後の筋管の形態について、顕著な変化は認められなかった。関連遺伝子の発現解析について、筋芽細胞の分化に関与しているMyogeninの発現増加が認められ、Myostatinとの関与が示唆された。ウシにおける効率的な赤肉生産の確立に向け、骨格筋成長の抑制的調節因子として注目されているMyostatin遺伝子を軸とした骨格筋形成について、黒毛和種生体および細胞を使用し、遺伝子の発現解析を中心に分子レベルでの検討を行った。黒毛和種生体レベルでの研究実績の概要胎子期から肥育完了時(28ヵ月齢)までの発達過程の骨格筋組織において、Myostatin遺伝子の発現は胎子期で最も強く、出生後はその発現量は減少するが肥育中期に再び強い発現が認められた。ドライアイス凍傷後の再生骨格筋では、Myostatin遺伝子の発現抑制およびMyoD、Myf5、MyogeninおよびMRF4などの骨格筋形成関連遺伝子の発現増加が認められた。また、2次元電気泳動法による発現タンパク質の網羅的解析から、正常組織と比較して再生組織において新たに約40スポットのタンパク質発現を認め、さらに、再生組織においてタンパク質発現が倍量以上または半分以下へと変化した多数のスポットが認められた。黒毛和種細胞レベルでの研究実績の概要胎齢5および8ヵ月の黒毛和種骨格筋組織から単離、培養した筋芽細胞において、その増殖速度は両細胞群で異なっており、Myostatin遺伝子の発現パターンも異なっていた。胎齢5ヵ月由来の細胞の増殖初期においてMyostatinおよびMyf5遺伝子の強い発現が認められた。分化誘導後の筋管形成期においてはMyostatin遺伝子の強い発現が認められ、免疫染色から筋管での同タンパク質の強い発現が認められた。筋管形成の分子マーカーであるMyogeninおよびMRF4遺伝子の発現は両細胞群の筋管形成期において強い発現が認められた。
グルタミン酸合成系酵素群の機能デザインと炭素・窒素同化系の制御因子の探索

光合成生物における炭素と窒素の同化反応は、共に還元力やATPを用いる代謝系であり、両者には統御のとれたクロストークがある。グルタミン酸合成系酵素とそれに還元力を供給する電子キャリアーを中心に以下の研究を行った。1.ラン藻の一種P.boryanumのFd依存性とNADH依存性のグルタミン酸合成酵素(GOGAT)の遺伝子破壊株を作製した。いずれの破壊株も生育可能であったが、強光で炭酸ガス濃度の高い環境条件下では、炭酸同化と窒素同化の協調性がFd-GOGAT欠損株でのみで消失することが判明した。この株では炭酸同化が優先的に進行し、窒素欠乏に応答して、a)細胞内のアミノ酸プールの変動、b)光合成色素蛋白質の遺伝子の転写産物の減少、c)硝酵からアンモニアへの還元過程の活発化、を突き止めた。2.C4植物であるトウモロコシでは葉肉細胞(MC)と維管束鞘細胞(BSC)では炭素と窒素の同化が分業している。これら細胞に特異的な電子キャリアーであるフェレドキシン(FdIとFdII)が、Fd:NADP^+還元酵素(FNR)との電子授受の特性が異なるり、MCのFdIは非循環型の電子伝達で効率よく機能してNADPHの生産や窒素同化系酵素群への還元力配分能力に優れること、一方、BSCのFdIIは循環型の電子伝達に寄与し、窒素同化の駆動には劣ることを明らかにした。Fdを介した電子配分が窒素同化の制御要因である可能性を指摘した。3.これについての構造生物学的情報を得るため、FdとFNRの電子伝達複合体の結晶構造を決定し、蛋白質間の相互作用部位および電子授受を行う補欠分子族の立体的位置関係を明らかにした。今後、窒素や硫酸同化系酵素とはどのような相互作用形式をとっているのか解析を進め、代謝間のクロストークの構造基盤の詳細を明らかにする予定でいる。光合成生物における炭素と窒素の同化反応は、共に光エネルギー転換系で生じる還元力やATPを直接あるいは間接に用いる代謝系であり、統御のとれた物質代謝を行うためには、両同化反応が互いに密接に関わりながらバランスが保たれることが重要である。本研究は、炭素と窒素の同化反応過程の接点に位置してアンモニアとケト酸からグルタミン酸の生合成を司るグルタミン合成酵素(GS)とグルタミン酸合成酵素(GOGAT)に焦点を当てた。それらの遺伝子をノックアウトしたり改変分子を導入した細胞を作製し、炭素、窒素の同化反応の効率やバランスを人工的に変動させることにより新たに生じる表現型を解析し、両方の代謝系の動的過程を制御している因子とその作用機構を明らかにすることを目的とする。本年度はラン藻の一種P.boryanumのFd依存性とNADH依存性のグルタミン酸合成酵素(GOGAT)遺伝子をクローニングし、それらの遺伝子破壊株を作製した。いずれの破壊株も生育可能であったが、還元力供給の違いと窒素同化の駆動状況を詳細に調べたところ、強光で炭酸ガス濃度の高い環境条件下では、炭酸同化と窒素同化の協調性がFd-GOGAT欠損株でのみで消失することが見い出された。この株では炭酸同化が優先的に進行し、窒素欠乏に応答した細胞の生理状態がもたらされた。Fd-GOGAT欠損により炭酸同化と窒素同化に関わる表現型がダイナミックに変化するとき、光合成色素蛋白質等、細胞内窒素のリザーバー的な蛋白質の遺伝子発現も変動することを示す予備データも得ており、この遺伝子発現能制御を今後具体的に進めることができよう。

光合成生物における炭素と窒素の同化反応は、共に光エネルギー転換系で生じる還元力やATPを直接あるいは間接に用いる代謝系であり、統御のとれた物質代謝を行うためには、両反応が互いに密接に関わりながらバランスが保たれることが重要である。前年度の研究では、炭素と窒素の同化反応過程の接点に位置してアンモニアとケト酸からグルタミン酸合成を司るグルタミン酸(GOGAT)の遺伝子をノックアウトしたラン藻(P.Boryanum)株を作製し、炭素、窒素の同化反応の効率やバランスを人工的に変動させることにより両方の代謝系のバランスが崩れる条件を見い出し、動的過程を制御している因子とその作用機構を解析できる実験系を構築した。本年度は、フェレドキシン(Fd)依存性とNADH依存性のGOGATの遺伝子破壊株の代謝生理実験を行い、強光で炭素ガス濃度の高い環境条件下では、Fd-GOGAT欠損株でのみ炭酸同化と窒素同化の協調性が崩れ、このアンバランスによる窒素欠乏の表現系を示すことを確立した。さらにこの影響を詳細に解析し、1)細胞内のアミノ酸プールの顕著な変動があること、2)光合成色素蛋白質等、細胞内窒素のリザーバー的な蛋白質の遺伝子の転写産物の蓄積レベルが減少すること、3)硝酸からアンモニアへの還元過程は活発に進行していること、を突き止めた。これらの結果は、アンモニア同化の中間代謝産物の量的変動が細胞内の窒素検知機構により認識され、細胞内要因による窒素欠乏への応答があることを示していると思われる。今後、シグナル分子の同定を目指した研究の展開が待たれる。また、Fd-GOGATとNADH-GOGATの組み換え酵素の作製に成功しつつあり、酵素の反応特性に基づいた代謝系の駆動の評価も具体的に進めることができる段階に到達した。光合成生物における炭素と窒素の同化反応は、共に還元力やATPを直接あるいは間接に用いる代謝系であり、統御のとれた代謝のためには、両反応が互いに密接に関わりながらバランスが保たれることが重要である。C4植物であるトウモロコシでは葉肉細胞(MC)と維管束鞘細胞(BSC)では炭素と窒素の同化が分業しており、窒素同化の割合はMCで多い。この2種の光合成細胞で電子キャリアーでるフェレドキシン(Fd)が分子種の異なるイソ蛋白質(FdIとFdII)として分布し、Fd:NADP^+還元酵素(FNR)との電子授受の特性が異なる。この2種のFd遺伝子をシアノバクテリアPlectonema boryanumに形質転換し、細胞内での炭素と窒素への電子配分や光化学系Iからの電子の流れを解析した。その結果、MCのFdIは非循環型の電子伝達で効率よく機能し、NADPHの生産や窒素同化系酵素群への還元力配分能力に優れること、一方BSCのFdIIは循環型の電子伝達に寄与し、窒素同化の駆動には劣ることが判明した。そして、Fdを介した電子配分が窒素同化を制御するステップの一つであることを証明した。この代謝間の還元力をめぐるクロストークは、Fdとそれぞれの代謝系で機能する還元酵素との蛋白質間の電子授受が制御要因であると考えられる。これについての構造生物学的情報を得るため、FdとFNRの電子伝達複合体の結晶構造を決定し、複合体を安定化する蛋白質間の相互作用部位および電子授受を行う補欠分子族の立体的位置関係を明らかにした。また、非光合成組織でも窒素代謝が活発に行われており、そこへの還元力供給系は光合成組織とは異なるFdやFNRの分子種が機能していることも明らかにした。
繁殖干渉下における在来近縁植物種の共存機構の解明‐ツユクサ・ケツユクサ系を用いて

植物の多種共存機構の解明は生態学における中心的議題であり、伝統的には、それらは異なる送粉者に適応した花形態や開花期のずれといった、ニッチ分割理論によって説明されてきた。本研究の目的は、送粉者を介した繁殖干渉が存在しているにも関わらず、野外で同所的に分布するツユクサとケツユクサの共存機構を調査し、「自殖による他品種花粉の影響の軽減」と「送粉者の花粉媒介距離制限による同品種内送粉の増加」の2つを、ニッチ分割を伴わずに近縁植物種の共存を促進する仮説として検証することである。昨年度から継続して、「先行自家受粉率の進化が繁殖干渉下の2種共存を可能にする」という仮説について、数理モデルによる検証を行った。本年度では、送粉者量や近交弱勢等のパラメータについて、共存を可能にするパラメータ領域について詳細な解析を行った。さらに、共存に関わる個体群動態と先行自家受粉率の進化動態に関して、様々なパラメータ下でのそれぞれの挙動を詳細に調査することで、共存を促進するメカニズムについて考察を行った。分子生態学手法を用いた研究については、昨年度までに開発していたケツユクサのマイクロサテライトマーカーを用いて、種子を解剖し取り出した胚からのDNA抽出方法の確立と、自殖率推定のための実験条件の検討を行った。さらに本年度は、本研究の基板部分である野外共存集団での繁殖干渉の詳細について調査した研究を査読付国際誌へ投稿、受理されている。分子生態学的手法、マイクロサテライトマーカーを用いた野外集団の自殖率推定に関する研究については、実験行程に予想外に困難な部分があったこともあり、当初の計画からは少し遅れがでている。しかし、既に解決方策についても決定しており、現在は樹雲頂に作業工程を進めているところである。数理生態学的手法を用いた仮説の検証に関する研究については、当初計画していた3年分の解析について、2年目の本年度中に終えることができており、極めて順調であるといえる。さらにその内容についても、当初の期待以上に興味深い結果が得られている。この研究は現在、査読付国際誌への投稿に向けて論文の執筆を行っている最中である。さらに本年度は、今後の研究の基盤となる論文についても執筆し、査読付国際誌へ受理されている。上記のように、全体的に見て、現在までの進捗状況はおおむね順調であるといえる。今後はまず、分子生態学的手法を用いた検証である、自殖率と繁殖干渉の強さの関係について解析を行う。所属研究室では分子生態学的な解析を行う設備や知見が不足するので、共同研究者の下で実験を進めていくことを計画している。研究を進めていく上で課題や困難に直面した際には、分子生態学的な手法の専門家である共同研究者に協力を仰ぐことを快諾していただいている。数理生態学的手法を用いた仮説の検証については、予定していた解析については終了しており、現在すでに論文の執筆を開始しており、本年度中査読付き国際誌へ投稿することを計画している。今後執筆を進める上で新たな解析が必要になる可能性はあるが、その場合についても数理生態学的手法の専門家である共同研究者に協力を仰ぐことを快諾していただいており、柔軟に対応していくことが可能であると考えている。本年度はまず、野外集団でのツユクサ・ケツユクサの自殖率の推定を行うために、共同研究者と共にケツユクサのマイクロサテライトマーカーの開発を行った(ツユクサのマイクロサテライトマーカーに関しては他の研究者らによって開発済み)。さらに、ツユクサとケツユクサの共存集団において、調査日ごとに各品種の開花量・送粉者量の調査と花へのマーキングを行い、開花期間終了後に種子のサンプリングを行った。これらの種子の自殖率を算出することで、自殖率と繁殖干渉の強さの関係について明らかにすることが可能である。さらに、「先行自家受粉率の進化が繁殖干渉下の2種共存を可能にする」という仮説について、数理モデルによる検証を行った。開発したモデルでは、先行自家受粉率(先行自家受粉による自殖種子数/胚珠数)を進化しうる形質として扱い、送粉者量や近交弱勢(自殖のコスト)の程度を変化させた複数のシナリオで解析を行った。結果、先行自家受粉率が進化しないと仮定した場合には、これまでの知見通り、繁殖干渉による速やかな競争排除が発生した。しかし、先行自家受粉率が進化すると仮定した場合には、2種の先行自家受粉の共に進化することによって共存が促進される条件が存在することが示唆された。当初の計画では、一年目には、マイクロサテライトマーカーの開発を終えたのちに、野外集団での自殖率の推定についても実験を開始している計画であった。しかし、マイクロサテライトマーカーの開発が想定より遅れてしまったことと、資金的な制限から、本年度の進捗はマーカーの開発までにとどまってしまった。その点に関しては、現在までの進捗状況は研究開始時の計画からは遅れているといえるかもしれない。

しかし、理論生物的手法に関して、数理モデルを用いた検証については、当初の計画を大幅に上回る速度で研究が進展しており、2年度目以降になると考えていた解析について既に順調に進められている。さらに結果についても、当初期待していた以上のものが得られており、今後の新たな研究への発展の可能性が十分に考えられるという点についても、順調な進捗が得られていると考えている。上記のように、全体的に見て、現在までの進捗状況はおおむね順調であるといえる。植物の多種共存機構の解明は生態学における中心的議題であり、伝統的には、それらは異なる送粉者に適応した花形態や開花期のずれといった、ニッチ分割理論によって説明されてきた。本研究の目的は、送粉者を介した繁殖干渉が存在しているにも関わらず、野外で同所的に分布するツユクサとケツユクサの共存機構を調査し、「自殖による他品種花粉の影響の軽減」と「送粉者の花粉媒介距離制限による同品種内送粉の増加」の2つを、ニッチ分割を伴わずに近縁植物種の共存を促進する仮説として検証することである。昨年度から継続して、「先行自家受粉率の進化が繁殖干渉下の2種共存を可能にする」という仮説について、数理モデルによる検証を行った。本年度では、送粉者量や近交弱勢等のパラメータについて、共存を可能にするパラメータ領域について詳細な解析を行った。さらに、共存に関わる個体群動態と先行自家受粉率の進化動態に関して、様々なパラメータ下でのそれぞれの挙動を詳細に調査することで、共存を促進するメカニズムについて考察を行った。分子生態学手法を用いた研究については、昨年度までに開発していたケツユクサのマイクロサテライトマーカーを用いて、種子を解剖し取り出した胚からのDNA抽出方法の確立と、自殖率推定のための実験条件の検討を行った。さらに本年度は、本研究の基板部分である野外共存集団での繁殖干渉の詳細について調査した研究を査読付国際誌へ投稿、受理されている。分子生態学的手法、マイクロサテライトマーカーを用いた野外集団の自殖率推定に関する研究については、実験行程に予想外に困難な部分があったこともあり、当初の計画からは少し遅れがでている。しかし、既に解決方策についても決定しており、現在は樹雲頂に作業工程を進めているところである。数理生態学的手法を用いた仮説の検証に関する研究については、当初計画していた3年分の解析について、2年目の本年度中に終えることができており、極めて順調であるといえる。さらにその内容についても、当初の期待以上に興味深い結果が得られている。この研究は現在、査読付国際誌への投稿に向けて論文の執筆を行っている最中である。さらに本年度は、今後の研究の基盤となる論文についても執筆し、査読付国際誌へ受理されている。今後はまず、サンプリング済み種子の親子解析から自殖率の算出を行い、自殖率と繁殖干渉の強さの関係について解析を行う。所属研究室では分子生態学的な解析を行う設備や知見が不足するので、共同研究者の下で実験を進めていくことを計画している。研究を進めていく上で課題や困難に直面した際には、分子生態学的な手法の専門家である共同研究者に協力を仰ぐことを快諾していただいている。数理モデルを用いた仮説の検証については、本年度中に論文としてまとめ、査読付き国際誌へ投稿することを計画している。