hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
拡散反射レ-ザ-ホトリシスによる金属錯体の多結晶固体における励起状態

金属錯体の多結晶固体における励起状態の新しい研究手段として、ナノ秒の時間分解能を持つ拡散反射反射レ-ザ-ホトリシスシステムの製作を行った。現有のYAGレ-ザ-を励起光源(波長532nm,355nm)とし、モニタ-光源としてXe増強ランプを製作し、検出部はポリクロメ-タ-をとうして低速掃引タイプのストリ-クカメラとした。このシステムにより溶液試料はもとより不透明微結晶試料の時間分解吸収スペクトル、発光スペクトルがナノ秒からサブミリ秒にわたって波長を掃引することなく瞬時に測定することが可能となった。錯体試料は可視部に強い吸収を持つものが多く、固体状態の場合、溶液系とは異なり試料の分解や励起分子間相互作用をできるだけ防ぐ意味においても、吸光係数が小さい吸収帯の裾付近で励起し、励起状態密度をある程度下げることが必須であり、色素レ-ザ-(出力最大2mJ)を自作した。金属錯体の多結晶状態の光励起状態の吸収スペクトルとそのダイナミックスの測定。溶液系で大変よく研究されているRu(bpv)^<3+>錯体塩とその誘導体をまずモデル系として取り上げ、微結晶粉末の過渡吸収スペクトルを測定している。この手法はまだ発展途上であり正しいスペクトルを得るための測定条件、粉末希釈法の有効性などを現在検討している。このシステムにより透明グラスにならない溶液の低温マトリックスでの拡散反射レ-ザ-ホトリシスを試み、溶液中と固体状態での光物理光化学過程を比較しその特徴を明らかにする。結晶を溶媒に溶かすことにより配位子の光脱離交換が起こり、固体状態でないと安定でない化合物も多く、本手法による無機金属錯体の励起状態の研究は必須であり、期待されるものと考えている。さらに固体無機錯体系において電子移動など興味ある反応系を探索する予定である。
ポジトロンCTを用いた心筋局所の嫌気性・好気性糖代謝の研究

健常心筋では脂肪酸のβ酸化が主なエネルギー源であるのに対し、虚血心筋では脂肪酸の代謝が抑制され、ブトウ糖代謝にスイッチされることが知られている。ポジトロン断層法(PET)により非侵襲的に心筋エネルギー代謝の測定が可能となった。本研究で用いたC-11酢酸は、投与後アセチルCoAとなり、TCA回路で酸化され排泄される。そこで心筋からの洗い出しをPETにて計測することにより心筋局所の酸素代謝を計測した。また酸素代謝を糖代謝と対比することによって好気性および嫌気性糖代謝の鑑別も試みた。健常例では安静空腹時でもブドウ糖負荷時でも酸素代謝に変化はなく、ジピリダモール負荷時には心筋血流の増加に対して酸素代謝の増加は僅かであった。他方ドブタミン負荷時にはダブルプロダクトの増加と共に心筋酸素代謝は著明に増大した。またその増加は左室よりも右室の方が著明であった。健常例ではいずれの場合においても左室内の心筋酸素代謝は均一であった。一方慢性期梗塞例では、血流の低下と共に心筋酸素代謝も低下した。ただ中等度の血流低下領域では酸素代謝が比較的保たれている場合があり、そのような区域はFDGの集積が高く、虚血心筋と考えられた。他方血流も酸素代謝も著明に低下した領域ではFDGの集積もみられず、従ってそのほとんどが梗塞心筋であり、嫌気性糖代謝を示唆する領域はみられなかった。このようにこれまでPETで用いられた心筋血流スキャンとFDGによる糖スキャンに加えて、C-11酢酸を用いた酸素代謝スキャンを追加することにより、心筋エネルギー代謝を多角的に解析でき、心筋のviabilityの解析にも役立つものと考えられた。
早期免疫寛容の導入によるミニブタにおける同種舌移植

(1)ミニブタの新鮮屍体における解剖によって舌周囲および顎下部の血管および神経の走行を検索した。舌下面の両側に一対ずつの動静脈が存在し、頚部の動静脈から分岐していた。これらを舌への栄養血管と類推し、血管造影および色素注入によりこの血管が舌全体を栄養し得ると思われたため、これを血管柄として用いた舌移植は可能であると判断した。神経についても同様に一対の神経が舌下面に同定された。この神経はその走行より脳神経と考えられ、これを内舌筋および外舌筋の支配神経と考えた。(2)次にミニブタの生体において舌全体を支配する栄養血管一対のみを残して周囲組織から切り離し、粘膜、筋肉、神経を各々切断後に再縫合して同所性自家舌移植を行なった。術後、移植組織の血行障害は発生せず粘膜の創治癒は良好であった。移植直後の発声の状態は術前と比較して変化なかったが、舌の運動は失われ嚥下機能は大きく障害された。術後の生検材料による検討では、粘膜組織には特別な変化は認めなかったが、筋組織には萎縮を認めた。(3)同種舌移植術後の経過観察では、術後6ヶ月以上の生存例が得られず、神経の再支配による舌の運動も認められなかったため、粘膜、筋肉などの組織学的な検討および同種舌移植後の発声、嚥下などの機能の評価は引き続き行なったが、筋電図による移植舌内の筋肉の機能評価、major histocompatibility complex(MHC)の一致した動物間および一致しない動物間で免疫抑制剤の短期間投与による免疫寛容の導入は行なえなかった。(4)移植片による宿主への障害(GVHD)、移植組織へのリンパ球浸潤の状態、末梢血におけるリンパ球のchimerism、同種皮膚移植に対する反応などについて検討、免疫寛容状態について分析も検討の対象となりうる検体数の制約から分析には至らなかった。術後3ヶ月の時点では神経の再支配による舌の運動は認められなかったため、筋電図による移植舌内の筋肉の機能評価は今年度は行なえず、次年度の課題となった。(3)major histocompatibility complex (MHC)の一致した動物間および一致しない動物問で免疫抑制剤の短期間投与による免疫寛容の導入も今年度内には着手できず、次年度の課題となった。

(1)ミニブタにおける同種舌術後の経過観察では、術後6ヶ月以上の生存例が得られず、神経の再支配による舌の運動も認められなかったため、粘膜、筋肉などの組織学的な検討および同種舌移植後の発声、嚥下などの機能の評価は引き続き行なったが、筋電図による移植舌内の筋肉の機能評価は行なえなかった。本来、実験動物の咀嚼、嚥下機能に大きく影響する手技であるため、手術後の厳重かつ継続的な管理が必要であると思われるが、今回の実験ではそれが充分ではなかったと考えられる。術後評価可能な長期生存例が得られる手技および設備の確立が必要であろう。(2)major histocompatibility complex (MHC)の一致した動物間および一致しない動物間で免疫抑制剤の短期間投与による免疫寛容の導入も、実験動物の長期生存例が得られなかったことから、予定していた実験期間内には着手できず、その条件の確立は今後の課題として残った。(3)移植片による宿主への障害(GVHD)、移植組織へのリンパ球浸潤の状態、末梢血におけるリンパ球のchimerism、同種皮膚移植に対する反応などについて検討、免疫寛容状態について分析も検討の対象となりうる検体数の制約から分析には至らなかった。(4)移植舌の術後1年以上の長期的な機能、肉眼的および組織学的な形態についても同様に検討の対象となる検体が得られなかった。従って、結果的には評価は行なえなかった。
野性遺伝子および外来遺伝子のDNA導入マウスの系統化システムの開発とその基礎的研究

1.研究の目的現代のバイオサイエンスの知識と技術を用いて作成された遺伝子導入動物は、生物機能モデルやヒト疾患モデルとして研究に重要な役割を果たすに至った。本研究は、このように新しく開発された遺伝子導入動物を、実験動物として使い得るようにするため、系統の維持保存システムを確立し、品質管理と実験条件の一定化のため遺伝的モニタリングおよび微生物モニタリングのシステムを確立することを目的とする。2.研究の成果数多く作成されたトランスジェニックマウスにおける導入遺伝子の染色体上の組み込まれた部位をinsitu法によって調べる方法を確立した。その結果、ヒトIL2遺伝子導入マウス4系統はすべて異なる染色体上に導入遺伝子を組み込んでいることが明らかにされた。これらのマウスはすべて運動失調を示すことから、ヒトIL2遺伝子は機能的に働き、新しい自己免疫疾患モデルの可能性を示した。さらに、体外受精、卵巣移植等の発生工学技術を用いて生殖行動をとれないトランスジェニックマウスから、子孫を得ることに成功し、受精卵や胚の凍結によって任意の時期に大量の子孫を得る方法も確立した。これらの技術の完成は、従来の動物実験の方法を一変したものである。次に、自然界には存在しないヒト遺伝子を導入されたマウスにおける導入遺伝子の経世代的安定性を調べた結果、ほとんどの系統でメンデルの法則に従って安定に伝達されることが明らかとなった。いくつかの例外については現在その原因を検討中である。以上の結果、新しい遺伝子導入動物の系統の維持保存方法が確立し、導入遺伝子を指標としたモニタリングシステムも確立した。今後は、これらの方法を動物実験に応用し、問題を探っていきたい。
C4光合成を可能にしたプロトン駆動力制御の進化

1.C4光合成におけるサイクリック電子伝達の機能の解明: CRISPER/Cas9によるゲノム編集技術を用いて、PGRL1またはNdhOのノックアウト株の作成を行い、gRNAのターゲット配列であるPGRL1に14bpのdeletionを、NdhOについては15bpのinsertionを確認した。また、C4種Flaveria NPQ7-RNAiノックダウン株の解析結果から、NPQ7は光化学系IIの非化学的消光(NPQ)だけでなく光化学系II複合体形成に関わる可能性が示唆された。2.CP12-3によるC4代謝制御システムの解明: CP12-3機能抑制株と野生株それぞれからの抽出タンパク質において、PRK、MDHおよびGAPDHの複合体構成を2次元展開によって検討した。その結果、GAPDHの複合体構成に異常を見いだした。これはGAPDHがCP12-3と単独で結合しうることを示している。Bass4機能抑制株の光合成を測定し、光合成がとても低くなることに加え、とくにこの傾向が弱光条件下で顕著なことがわかった。3.無機炭素濃縮機構と連動したプロトン駆動力制御機能の解明:海洋性珪藻2種、P. tricornutumおよびT. pseudonanaからBestrophin様膜タンパク質遺伝子を2つずつ単離し、GFP標識および免疫TEMによる局在決定を行った結果、これらがチラコイド膜因子であることが分かった。また、両珪藻からPyshell遺伝子をやはり2つずつ単離したが、それぞれ同一配列だった。この2種のPyshellの局在はピレノイドであり、またこの過剰発現とノックダウンは光合成の無機炭素親和性に大きな影響を与えることが分かった。一方、珪藻が有する葉緑体、細胞膜共局在型アクアポーリンが、CO2/NH3チャンネルとして働き、強光耐性をもたらすことが分かった。1.CRISPER/Cas9によるゲノム編集技術を用いたノックアウト株の作成は順調に進展している。確認されたdeletionにより、PGRL1遺伝子にストップコドンが入ることが予測され、現在のヘテロ系統から、次世代においてホモ系統のノックアウト株を取得することが期待できる。NPQ7ノックダウン株の解析を進めることで光化学系II複合体形成に関わるシステムを解明することが期待できる。2.BN-PAGE/SDS-PAGEの2次元電気泳動法によるタンパク質複合体構成の調査手法を確立し、CP12-3機能抑制株と野生株それぞれから抽出したタンパク質に適用することで、PRK、MDHおよびGAPDHの挙動の変化を調査した。Bass4機能抑制株の光合成を測定し、光合成が20%程度まで低くなることに加え、とくにこの傾向が弱光条件下で顕著なことがわかった。高光量においてわずかに光合成活性が見いだされた。Bass4を介さない物質輸送とBass4を解する物質輸送の二つが存在し、Bass4依存的な回路が主として働くことと介さない回路が高光量領域で機能する可能性を示唆する。3.これまで見つかっている重要因子の単離と局在解析は順調に進んでいる。また、RNA干渉による特異的発現抑制も結果が出始めている。CRISPR/Cas9およびTALEN法によるゲノム編集株が得られ始めているほか、CRSPR/Cas9nickaseを使ったより特異性の高いDNAダブルカットによるゲノム編集に使用の目途が立った。1.C4光合成におけるサイクリック電子伝達の機能の解明: CRISPER/Cas9ゲノム編集技術を用いて作成した株は、ヘテロでの遺伝子deletionまたはinsertionが確認されているため、次世代でホモ系統を選抜する。さらにこれらを用いて、細胞特異的プロモーターにより細胞特異的に遺伝子発現を相補した系統を作成し、葉肉細胞または維管束鞘細胞それぞれにおけるサイクリック電子伝達の重要性を明らかにする。2.CP12-3によるC4代謝制御システムの解明: GAPDHとCP12-3がin vitroで結合することを示す再構成実験を行う。GAPDHはA2B2複合体を構成するうえに、葉肉細胞と維管束鞘細胞のそれぞれの細胞に発現する。CP12-3との結合は、CP12-3が局在する維管束鞘細胞葉緑体で起こっていると推定されるので、(1)維管束鞘細胞葉緑体で機能するGAPDH分子種をまず特定し、ついで(2)in vitroでの複合体再構成実験を行う。Bass2が60kDaの2量体のサイズを示した一方で、Bass4が240kDaの大きな複合体を構成すると推定された。この複合体組成を確認する。3.無機炭素濃縮機構と連動したプロトン駆動力制御機能の解明: BestおよびPyshell等の重要因子の機能決定を行うとともに、これらに相互作用する因子、および新奇ピレノイド因子の探索と単離、機能決定を行い、無機炭素濃縮とプロトン駆動力制御の関りを解明する。1.C4光合成におけるサイクリック電子伝達の機能の解明C4種フラベリアを用い、二つのサイクリック電子伝達経路のそれぞれ活性を抑制した形質転換体、NdhO-RNAi株、PGR5-RNAi株またはPGRL1-RNAi株の解析を行い、C4光合成ではNDH経路が主な経路として働き、C4光合成に必要なATPを供給するためのプロトン駆動力形成に関与することを明らかにした。また、細胞特異的な遺伝子発現プロモーターを用いて、発現抑制のための遺伝子導入を行った。2.CP12-3によるC4代謝制御システムの解明

C4種フラベリアに高発現したCP12-3の生理機能を示すため、機能抑制形質転換株を作成した。光合成活性を測定し、低二酸化炭素濃度・高光量の条件において光合成活性が低下することが判明した。これはC4光合成のCO2濃縮能力においてこの因子が機能することを示している。CP12-3はタンパク質と結合する能力を持つと考えられるので、その結合相手を求めることで、代謝上の位置を同定できる可能性がある。3.無機炭素濃縮機構と連動したプロトン駆動力制御機能の解明珪藻細胞の無機炭素濃縮機構に関わる2つの重要な因子の機能同定に成功した。細胞膜局在型重炭酸イオン輸送体2種の機能同定を行った。一方、水中光合成の必須因子と考えられるピレノイドを貫通するチラコイド内腔に局在する新規θ型炭酸脱水酵素(Pt-θCA1)を同定した。このタンパク質の過剰発現およびRNAiは、光合成親和性および細胞生育に影響したことから、チラコイドルーメンの無機炭素平衡が珪藻の高親和性光合成に深く関わることが分かった。1.C4種フラベリアにおいてサイクリック電子伝達活性を抑制した形質転換株の解析を行い、C4光合成における機能の重要性を明らかにすることができた。また、細胞特異的プロモーターを使った、遺伝子導入用コンストラクトの作製および植物の形質転換は予定通りに進んでおり、現在形質転換体を育成中である。2.CP12-3と結合するタンパク質の検討のために、CP12-3を結合させたカラム担体を用意し、親和性を持つタンパク質の検出を行っている。ホスホリブロキナーゼ(PRK)が再現よく検出されており、有力な結合候補である。C4光合成に関与する酵素のBN-PAGEでの挙動観察から、PRK以外にも候補タンパク質を見いだした。3.初年度は、珪藻細胞における無機炭素濃縮機構に関わる重要な因子の同定を行うことができた。さらに、海水に特化した高親和性光合成とチラコイド機能との関わりの解明に向け、ピレノイド関連因子の網羅的解析にも着手している。1.C4光合成におけるサイクリック電子伝達の機能の解明: CRISPER/Cas9によるゲノム編集技術を用いて、PGRL1またはNdhOのノックアウト株の作成を行い、gRNAのターゲット配列であるPGRL1に14bpのdeletionを、NdhOについては15bpのinsertionを確認した。また、C4種Flaveria NPQ7-RNAiノックダウン株の解析結果から、NPQ7は光化学系IIの非化学的消光(NPQ)だけでなく光化学系II複合体形成に関わる可能性が示唆された。2.CP12-3によるC4代謝制御システムの解明: CP12-3機能抑制株と野生株それぞれからの抽出タンパク質において、PRK、MDHおよびGAPDHの複合体構成を2次元展開によって検討した。その結果、GAPDHの複合体構成に異常を見いだした。これはGAPDHがCP12-3と単独で結合しうることを示している。Bass4機能抑制株の光合成を測定し、光合成がとても低くなることに加え、とくにこの傾向が弱光条件下で顕著なことがわかった。
tRNAの四塩基複合体によるアミノ酸分子認識機構の実験的検証

遺伝暗号は3つの塩基(例えばtRNA上のアンチコドン3塩基)と1つのアミノ酸の間の対応関係を示している。このことが物理化学的基盤によって立っているものかどうかについては議論が分かれており、未だ結着がついていない。我々はtRNA上の4つの塩基の複合体(アンチコドン3塩基プラス識別位塩基)を作るとその上に穴ができ、それが対応するアミノ酸を鍵と鍵穴の関係で受容することを分子モデルを用いて発見した。さらに半経験的な長大な計算が実行されこの事実が再確認された。このモデルでは、アスパラギン酸、ダルタミン酸などの場合、それらのtRNAとアミノ酸の間に特異的相互作用のあること、またフェニルアラニン、チロシン、バリンなどでは相互作用が特異的にならないことを予言する。【tRNA^(Asp)】の場合には第一アンチコドンはキューオシンであり、【tRNA^(Glu)】では第一アンチコドンがmn【m^5】【S^2】Uと修飾されている。これらの塩基はそれぞれ蛍光および円二色性偏光のシグナルを持っているので、アミノ酸を加えていけば特異的相互作用のある場合には飽和効果を見ることによって検出が可能になる。この方法で決められた親和性定数は約200【M^(-1)】であった。一方【tRNA^(Phe)】などについて西独のペルシュケらの実験が独立に行われ、この場合には予言通り特異的相互作用は見つからなかった。我々は更にアンチコドンに対応するオリゴヌクレオチド(主として2塩基)に対してアミノ酸,アミノ酸アミド,アミノ酸メチルエステルを加え、塩基側の紫外吸収を精密測定し、この場合にも特異的相互作用がみられることを示した。ただしアミド、メチルエステルの場合には分子が荷色を持つので塩基との非特異的相互作用が混って特異性はかなり悪くなる。このことは多くの研究者がアミノ酸の代用にこれら化合物を用いることへの警告になる。以上を通じて遺伝暗号の実体としてのC4Nモデルは実験的に基礎づけられたと思われる。
ウスタビガ繭シルクプロテインとiPS細胞による歯槽骨再生技術の開発

歯周組織は、常に口腔内の感染にさらされており、慢性的な炎症が惹起されているので、歯周組織の再生には他の組織再生とは異なり、常に炎症の制御が必要とされる。この研究の目的は、昆虫産物A(物質名は秘匿)がもつ独特の治癒促進効果、抗炎症作用、抗菌性に関する科学的エビデンスを確立するとともに、昆虫産物Aをスキャホールドとして活かすことによって、さらにiPS細胞と併用することによって新規の歯槽骨再生技術を考案することである。そこで、初年度の研究計画でまず昆虫産物Aの治療促進効果、組織学的解析、炎症性メディエーターの発現、鎮痛作用を指標に評価する実験系の確立のためのマウス皮膚炎モデルの作製を行った。マウス背側皮膚内にビオスタADを100mg/dayで週2回、合計6回投与し、皮膚炎を惹起させた。その後、皮膚の発赤や潰瘍の状態を3段階にスコアー化してコントロール群と実験群とを経時的に比較することで治療効果を判定する系を確立した。次に、昆虫産物Aをこの皮膚炎モデルに投与してコントロール群と比較したところ、炎症抑制効果を認めた。この結果から、昆虫産物Aが抗炎症効果をもつことが示唆された。現在この炎症抑制効果について、組織学的解析ならびに生化学的な解析を進めている。一方で、ヒトiPS細胞を神経堤様細胞(NCLC)を経由して間葉系幹細胞に分化誘導する系、さらには骨芽細胞に分化させる実験系を確立した。これらの細胞と昆虫産物Aをコートしたハイドロキシアパタイトあるいはβ-TCPとの混合したものをヌードマウス頭部に移植して骨形成の評価を検討している過程である。まず今回の研究において昆虫産物Aが抗炎症作用を有することを証明するための皮膚炎症モデルマウスの作製については計画通りに進行している。さらにこれらの実験モデルに対して昆虫産物Aを適応した結果、予測通りに抗炎症結果を得ることができたことは初年度の成果としては順調である。この抗炎症効果についての分子メカニズムについては組織学的解析や生化学的な解析を進めている途中であり、今後十分な成果が期待できる。この昆虫産物Aの応用としてスキャホールドへの適応について現在検討中であり、抗炎症効果の再実験と合わせて実施する予定である。またiPS細胞についてはマウスiPS細胞からヒトiPS細胞を用いた実験への転換を進めているために、間葉系幹細胞への分化誘導、骨芽細胞への分化誘導方法について若干時間を有してしまった。しかし、基本的分化誘導については概ね予定取りに成功しており、今後この実験の再現性についての検証とスキャホールドへの細胞接着等を検討する実験を行う準備を進めている。以上の成果より、進捗状況は概ね良好であると判断した。炎症モデルマウスに対しての昆虫産物A抽出物投与法・投与量の検討について検討を行う。投与法として、凍結乾燥粉末、あるいはさらに重要成分を生成した物を直接塗布するなどの検討を行う。さらにiPS細胞移植に伴うスキャホールド(ハイドキシアパタイトあるいはβ-TCP)へのコーティング作用による細胞の接着、移植効果、抗炎症効果等を検討する予定である。抗炎症効果における分子メカニズムの解明として組織標本を作製しH-E染色、炎症性メディエーター(IL-1β, IL-6, TNFα, MMPs, PGE2, MPO, COX-2など)の免疫染色を行う。治癒促進効果などの指標としてM1マクロファージとM2マクロファージの組織内比率を免疫組織学的に検討する。また培養炎症性細胞に対して昆虫産物Aを加えることでどのような反応が生じるかについても検討する。次にin vitroにおける昆虫産物Aの抗炎症メカニズムを調べるために、培養口腔粘膜上皮細胞を使った実験を行う。炎症性サイトカインにて刺激し、炎症性メディエーターの解析をELISA法で、細胞増殖アッセイや細胞遊走アッセイ細胞内活性酸素(ROS)測定(CellROX染色による)を行う。また歯周病菌を寒天培地に植え付け、その上に様々な濃度の昆虫産物Aを浸み込ませたペーパーディスクをのせ抗菌活性の有無を検討する。さらに骨組織再生能と抗炎症効果を評価するためにヒトiPS細胞由来のNCLC、あるいはNCLC由来間葉系幹細胞、骨芽細胞と昆虫産物Aコートスキャホールドの混合物をFLK1-GFP皮膚炎モデルの皮下に移植する。その後、2週間後から10週間後における骨組織の再生状況と炎症反応の変化を観察する。これに関してはμCTを用いて骨再生の経時的形態学的に評価する。また血管新生の組織学的評価や骨基質タンパクの発現などを評価する。

次に、昆虫産物Aをこの皮膚炎モデルに投与してコントロール群と比較したところ、炎症抑制効果を認めた。この結果から、昆虫産物Aが抗炎症効果をもつことが示唆された。現在この炎症抑制効果について、組織学的解析ならびに生化学的な解析を進めている。一方で、ヒトiPS細胞を神経堤様細胞(NCLC)を経由して間葉系幹細胞に分化誘導する系、さらには骨芽細胞に分化させる実験系を確立した。これらの細胞と昆虫産物Aをコートしたハイドロキシアパタイトあるいはβ-TCPとの混合したものをヌードマウス頭部に移植して骨形成の評価を検討している過程である。まず今回の研究において昆虫産物Aが抗炎症作用を有することを証明するための皮膚炎症モデルマウスの作製については計画通りに進行している。さらにこれらの実験モデルに対して昆虫産物Aを適応した結果、予測通りに抗炎症結果を得ることができたことは初年度の成果としては順調である。この抗炎症効果についての分子メカニズムについては組織学的解析や生化学的な解析を進めている途中であり、今後十分な成果が期待できる。この昆虫産物Aの応用としてスキャホールドへの適応について現在検討中であり、抗炎症効果の再実験と合わせて実施する予定である。またiPS細胞についてはマウスiPS細胞からヒトiPS細胞を用いた実験への転換を進めているために、間葉系幹細胞への分化誘導、骨芽細胞への分化誘導方法について若干時間を有してしまった。しかし、基本的分化誘導については概ね予定取りに成功しており、今後この実験の再現性についての検証とスキャホールドへの細胞接着等を検討する実験を行う準備を進めている。以上の成果より、進捗状況は概ね良好であると判断した。炎症モデルマウスに対しての昆虫産物A抽出物投与法・投与量の検討について検討を行う。投与法として、凍結乾燥粉末、あるいはさらに重要成分を生成した物を直接塗布するなどの検討を行う。さらにiPS細胞移植に伴うスキャホールド(ハイドキシアパタイトあるいはβ-TCP)へのコーティング作用による細胞の接着、移植効果、抗炎症効果等を検討する予定である。抗炎症効果における分子メカニズムの解明として組織標本を作製しH-E染色、炎症性メディエーター(IL-1β, IL-6, TNFα, MMPs, PGE2, MPO, COX-2など)の免疫染色を行う。治癒促進効果などの指標としてM1マクロファージとM2マクロファージの組織内比率を免疫組織学的に検討する。また培養炎症性細胞に対して昆虫産物Aを加えることでどのような反応が生じるかについても検討する。次にin vitroにおける昆虫産物Aの抗炎症メカニズムを調べるために、培養口腔粘膜上皮細胞を使った実験を行う。炎症性サイトカインにて刺激し、炎症性メディエーターの解析をELISA法で、細胞増殖アッセイや細胞遊走アッセイ細胞内活性酸素(ROS)測定(CellROX染色による)を行う。また歯周病菌を寒天培地に植え付け、その上に様々な濃度の昆虫産物Aを浸み込ませたペーパーディスクをのせ抗菌活性の有無を検討する。
ナノ機能元素解析のフロンティア開拓

本研究では,表面,界面,点欠陥などのナノ構造に局在し機能を発現するナノ機能元素の構造-機能相関を本質的に解明するため,その構造解析フロンティアを開拓した.具体的には最先端原子直視型走査透過型電子顕微鏡を更に高度化・定量化し,他班との連携研究に即応用することによって,ナノ機能元素構造情報取得を行った.その結果,種々の酸化物,窒化物においてナノ機能元素の表面,粒界,転位,点欠陥における原子構造を解明することに成功した.また,粒界インフォマティクスとも呼ぶべき新たな手法開発にも成功した.平成25年度は下記に示す成果が得られた。A原子分解能STEM法の定量化:走査透過型電子顕微鏡(STEM)に広範な角度に渡る信号を検出可能な装置を組み込み、各種試料・観察条件下での実験像の取得を行った。さらに理論計算を併用し詳細な像解釈を試みた。解析の結果、これまで議論されていた信号の角度依存性だけではなく、検出器上での信号の異方性を考慮する必要性が提起された。このことはSTEM法による定量化を高精度に行う上で重要である。Bモデル界面・表面の作製とナノ構造機能評価:他班との連携により機能元素単一界面の作製と評価を行った。特にチタニア表面に関する研究において重要な成果が得られた。本研究では清浄なチタニア表面に白金原子単原子吸着させ、原子分解能STEMおよび電子状態計算により詳細に解析した結果、白金原子の吸着サイトの解明に至った。本研究成果は白金触媒への応用が期待される。Cその場観察法の開発:透過型電子顕微鏡その場観察用の試料ホルダーの設計・開発を行った。機械主要部分はほぼ完成しており、今後は装置の動作試験へ向けて更なる改良を施すとともに実験手法の詳細を検討していく。D他班とのナノ構造連携研究:研究領域の全体会議での研究発表・議論の他、研究グループ間での訪問、来訪を積極的に行い、共同研究に関する議論を積極的に行った。アルミナ粒界のドーパント偏析とその拡散挙動の解明やイットリウム安定化ジルコニア粒界の偏析挙動の解明といった共同研究を推進した。また、領域主催の「若手の会」への参加や研究グループへの短期滞在により大学院生、ポスドクの交流・育成を図った。これらは次年度以降も継続的に行う予定である。当該年度は下記の成果が得られた。A原子分解能STEM法によるナノ機能元素の定量化:エネルギー分散型X線検出器による試料中の機能元素の定量解析手法の開発に重点的に取り組んだ。実験および理論の両面から系統的に検討を行い、定量解析可能なデータを取得するための実験条件に関する知見が得られた。これを用い、一部の粒界において詳細な元素定量マップの取得が可能となっている。B TEMその場観察法を用いたナノ機能元素と界面特性の定量評価:TEMその場機械試験の高精度化のため、制御装置の一部を再設計・改良した。装置開発に時間を要したため、当初予定よりも導入に遅れが生じた。動作試験の結果、装置性能は大幅に上昇したことを確認した。また、改良装置の開発が完了するまでの間は既存設備にてアルミナの粒界破壊実験に取り組み、粒界破面の原子構造を同定するに至っている。Cモデル粒界・界面の作製とナノ構造・機能評価:他班との連携により各種モデル粒界の作製と物性評価を行った。特にアルミナにおける粒界における拡散挙動は、粒界における電子状態に強く影響されることが示唆された。このことは、拡散メカニズムを理解するためには対象の電子状態を検討する必要があることを示しており、非常に重要な結果であるといえる。D他班とのナノ構造連携研究:本研究領域が主催している全体会議、公開シンポジウム、学会シンポジウムにおいて研究発表、議論を積極的に行うことに加え、個々のグループとの交流を継続的に行ってきた。学生、ポスドクをはじめとする若手研究者にも他グループとの議論の場を設けており、人的交流・育成を図っている。A原子分解能STEM法によるナノ機能元素の定量化、Cモデル粒界・界面の作製とナノ構造・機能評価、D他班とのナノ構造連携研究の項目については計画通り滞りなく進んでいると判断できる。B TEMその場観察法を用いたナノ機能元素と界面特性の定量評価については装置開発に遅れが生じたが、既存設備で対応することにより、実験の中断等は生じていない。また、改良した装置は高い性能を有しており、今後の実験精度向上が期待できる。A原子分解能STEM法の精密化技術の開発と応用:原子分解能STEM観察にて問題となる弾性波を中心とした外乱を遮断するシステムを設計・整備し、その性能について検証実験を実施した。いくつかのモデル試料を対象に取得データを評価したところ、STEMの総合的な安定性が向上したことが認められ、精度の良い計測実験が可能となった。B TEMその場観察法を用いた粒界・界面における機能元素効果の解明:TEMその場機械試験に用いる試料ステージコントローラーの導入により、その場観察実験がより精密に実施可能となった。Al2O3のその場粒界破壊実験においては、機能元素の粒界偏析の有無により粒界破面および亀裂先端の破壊挙動が大きく異なることが明らかとなった。C機能元素を利用した機能性ナノ構造の作製と物性評価:他班との連携により各種モデル粒界の作製と構造評価を行った。

特にイットリウム安定化ジルコニア粒界における原子分解能元素マッピングを系統的に行った結果、特定の粒界においてイットリウムの規則的な偏析構造が認められた。この特異な粒界偏析構造を理論計算により解析した結果、イットリウムと酸素空孔の相互作用が粒界構造を決定づける支配的な因子であることが明らかとなった。このことは粒界偏析構造を理解する上で重要な知見であるといえる。D他班とのナノ構造連携研究:本研究領域では全体会議、公開シンポジウム、学会シンポジウム等を定期的に開催している。当班では一部のシンポジウムの運営全般を取り仕切るなど、本領域の諸活動に積極的に寄与してきた。また、他班の学生、ポスドクをはじめとする若手研究者の短期滞在を通して、議論および共同実験を実施してきた。これらにより、連携研究の円滑な遂行と人的交流・育成を図ってきた。A原子分解能STEM法の精密化技術の開発と応用、B TEMその場観察法を用いた粒界・界面における機能元素効果の解明、C機能元素を利用した機能性ナノ構造の作製と物性評価、D他班とのナノ構造連携研究のいずれの項目についてもおおむね計画通りに進行していると判断できる。A、Bにおいては装置性能の向上を優先させた。これは通常の計測研究の遂行に支障のない範囲で行っており、かつ装置性能向上による加速度的な研究の進展を期待したためである。当該年度は下記の成果が得られた。A原子分解能STEM法による解析精度の評価と応用:精密断面試料作製装置(冷却仕様)を導入したことにより、STEM試料の作製精度が向上し、STEM解析精度が顕著に向上した。また、STEMによる定量的評価手法開発の一環として、電子線入射方向における原子位置決定精度を検討した結果、現行の装置では電子線入射方向の原子位置決定精度はおおむね1nm程度と評価された。これを原子レベルの精度まで引き上げ、3次元的な機能元素原子観察を実現するためには、新しいレンズ系の構築が必要であることがわかった。B STEMその場観察法を用いた粒界・界面の力学的応答の評価:STEM用電圧印加ホルダーに適合する小型荷重印加デバイスを試作・試用した。本デバイスはSTEM内にて十分な安定性を有することが確認された。また、TEMその場ナノインデンテーション装置によりSrTiO3双結晶に荷重を印加し、転位および粒界の動的相互作用の解明に成功した。C機能元素を利用した機能性ナノ構造の作製と物性評価:他班との連携により、各種界面等格子欠陥の解析研究を行った。特に、LiNbO3結晶中の転位に電気伝導性が発現することを見出し、それは転位特有の原子構造に起因することが明らかとなった。また、情報科学的な手法を粒界構造モデル構築へと応用し、金属材料を中心とした粒界構造を高速に予測する手法の開発に成功した。D他班とのナノ構造連携研究:他班の学生、ポスドク、PIの短期滞在を通して、共同で実験および議論を進めた。また、定期的にPI同士が連絡を取り合うことで、連携研究が滞りなく円滑に進むよう務めた。A原子分解能STEM法による解析精度の評価と応用、B STEM
針状試料を用いる必要のない新しい3次元アトムプローブの原理検証

針状構造の試料作製が必要なアトムプローブトモグラフィにおいて、平坦な試料を用いることのできる手法について検討した。試料を針状とする代わりに、平坦な試料に対向電極を近接させることで極めて短焦点距離の発散性静電レンズを形成することで、アトムプローブに匹敵する高い静電拡大投影の倍率が得られることが計算機実験を通して明らかとなった。またこれを実現するための電極を設計・製作し、予備的な実験を行った。二枚の平面電極の片側に穴をあけた単孔静電レンズにおいて、電極間隔を極端に小さくすることで大きな拡大率が得られることを実際に荷電粒子軌道の計算機シミュレーションにより確認した。特に、穴径を一定にしたときの倍率の電極間隔依存性を調べた。単孔レンズの穴径よりも広い電極間隔では解析解に近い倍率となり、解析表現と同様に距離に反比例した。電極間隔が単孔の半径よりも小さくなると倍率は解析表現よりも低い値となり、電極間隔が極めて近接すると一定の倍率となることが明らかとなった。また、平面電極から放出される荷電粒子のおんどなどによる横方向速度の効果についても検証した。単孔電極側に絶縁膜を形成した場合の特性についても計算を開始している。絶縁膜の膜厚を変化させて倍率や電界強度の計算を行った結果、膜厚の小さい場合に興味深い現象が見られたため、現在その原因を追究している。実際に絶縁体膜の形成とパターニングを行うための準備として、フォトリソグラフィーに必要な薬品等を購入し、パターニングの準備を行った。大きな拡大率が得られることを実験的に示すために、ピエゾ素子を用いた電極の位置及び間隔の精密制御装置の改良を行った。予めピエゾ素子を用いた2次元の位置制御方法における問題点などを予備実験により抽出し、それを踏まえて制御部分のユニットを製作した。この改造により電極の精密な位置制御が可能であることを検証した。現在より直線性を高めるための調整を行っている。我々が提案している単孔レンズを短焦点化することで大きな倍率で平面電極上の位置の違いを拡大できることが計算機シミュレーションによっても確認することができた。この点は最も大きな成果である。絶縁体を単孔電極側に形成した場合の計算についても問題なく実施することができた。絶縁体を電極に形成したときの電界分布の変化について、当初予想をしていなかった興味深い知見がシミュレーションで得られたため、現在その理解に取り組んでいる。電極のパターニングの準備も整えた。電極の位置および間隔の精密制御を行う装置の改良も順調に進み、予定の性能が出せる見込みが立っている。これらの2点は本年度の研究遂行上、最も重要な点であるので、それが順調に進んでいるということは、全体としておおむね順調に進展しているといってよい。二枚の平面電極の片側に穴をあけた単孔静電レンズにおいて、電極間隔を極端に小さくすることで得られる位置情報の拡大投影手法について、拡大率、空間分解能の電極構造パラメータ依存性を計算機シミュレーションにより調べた。数値計算により得られた空間分解能の電極パラメータ等(電極間隔、試料温度、印加電圧)の依存性から、電極間隔の大きい領域での空間分解能を評価する式を導いた。またゲート電極側に絶縁体膜を設けることで、広い電極間隔において強電界を得るアイディアについては、荷電粒子軌道を支配する電極中央付近における効果が小さく、残念ながらわずかな改善効果しかないことが明らかとなった。しかし、このことは、ゲート電極側の電界の低減を図ったうえで、絶縁膜のない時と同等の特性が得られるということであり、実用上期待することができる。これらの結果の一部は平成29年度に国内学会およびドイツにおいて開催された国際会議で発表し、好評を博した。現在原著論文の作成準備を行っている。ピエゾ素子を用いた電極の位置及び間隔の精密制御装置については、当初位置制御ができることは確認したが、絶縁体で作製した一部の部品の強度的な問題があり、精密な制御を行うことが難しいことが明らかとなった。この部分の作り直しを行い改めて位置制御の検討を進めている。単孔電極側に形成した絶縁膜の予期せぬ効果について検討を進め、当初期待した絶縁膜の効果と背反しないようであれば、高い誘電率を持つ絶縁体を単孔電極側に形成した場合の荷電粒子の軌道計算をさらに進め、本提案の効果を検証する。電極の位置及び間隔を精密に制御する装置の実際の位置制御の効果を検証する。平面電極からの荷電粒子放出に取り組む前に、比較的荷電粒子を放出しやすい針状の試料を用いて電子ないしはイオンを生成し、対抗電極の位置の変化によりこれらの荷電粒子放出がどのように変化するかを見極める。位置制御の装置の効果が出せることを確認したうえで、実際に絶縁体を形成した単孔電極を形成し、絶縁体の効果を検証する。真空電子工学絶縁膜形成が当初予定よりも数が少なくなったことがあり、洗浄や材料、部品などの費用が当初予定より若干少なくなったため。今年度、薄膜作製を当初予定数まで実施するため、それに必要な材料費等の購入に充てる。
エディット・シュタインの手紙公開をめぐる論争に関する調査と文献研究

1933年春にエディット・シュタインが教皇ピオ11世に宛てて記したとされる手紙が、2003年に公開されたことを受けて、カトリックとユダヤ教の間で展開された論争について調査した。関連文献の収集、研究を通して、「手紙」執筆の内的動機を探るとともに、エディット・シュタインの自己理解に見られるユダヤ人としてのアイデンティティとユダヤ民族との連帯感の特性、カルメル修道会の霊性に基づく「殉教」への意志の特性について考察した。本研究の第一の目的は、公開されたエディット・シュタインの手紙をめぐるカトリックとユダヤ教の論争の内容と経緯を広範囲において調査することであり、本年度は件の論争に関する2003年2月以降の各種メディアの反響を調査した。この論争の論点の一つは、彼女がピオ十一世に送った嘆願の手紙が、1937年の回勅の公布を促したか否かという点にあることが知られている。この論点に関するカトリックとユダヤ教の双方で論じられる内容を正しく理解し、考察の対象とするためには、同回勅に関わる論争の特性を、戦後たびたび繰り返されるピオ十二世に対するユダヤ教諸団体からの非難と比較しつつ明らかにする必要があり、そのための資料収集と翻訳、読解に多くの時間を割いた。本研究の第二の目的は、公開された手紙に関連するエディット・シュタインの文献研究を通して、手紙を記した内的動機を検証することである。本年度は検証に先立つ資料収集に着手するとともに、実際にエディット・シュタインが生まれ生活し亡くなった場所を訪ねた。エディットが晩年生活したエヒト(オランダ)にあるエディット・シュタインミュージアム、プロツワフ(ポーランド)の生家(現在は改修され文化交流館となっている)では、現地スタッフと情報交換を行い、今後研究を進める上での連絡体制を構築できた。またアウシュヴィッツ強制収容所跡地(ポーランド)では、エディット・シュタインらが到着した1942年8月当時の鉄道引き込み線位地について新しい知見を得た。本年度は主に資料収集・調査と読解に重点を置き、成果の公表は論文一件であった。1933年春にエディット・シュタインが教皇ピオ11世に宛てて記したとされる手紙が、2003年に公開されたことを受けて、カトリックとユダヤ教の間に見られた論争に平成19年度に引き続き調査・研究を行った。平成20年度は、エディット・シュタインの既刊の著作のうち、「私はどのようにしてケルンのカルメル会に入ったか」1938年執筆)を中心テキストとし、その他の関連文献の研究を通して、1933年春の「手紙」執筆の内的動機を探るとともに、エディット・シュタインの自己理解に見られるユダヤ人としてのアイデンティティとユダヤ民族との連帯感の特性と、カルメル修道会の霊性に基づく「殉教」への意志の特性について考察した。カルメル修道会の霊性に関しては、エディット・シュタインの著作に見られる理解だけでなく、一般的な見地からカルメル修道会特有の修道生活の理念と伝統的な霊性の特性を知るための資料収集・研究を行った。公開された「手紙」をめぐる論争について、ユダヤ教の家族の視点(スザンヌ・バッツドルフ)と教会擁護に基づく視点(ウィリアム・ドイノ)とを比較検討した。この上記二者の議論は内容的に対立するが、両者とも問題意識の根底に政治的次元に向かう傾向が見られる点において共通する。一方でエディット自身における手紙執筆の内的動機には純粋な宗教的次元に向かう傾向が見られた。これらの次元的区別を明確にすることにより、件の論争の内実を批判的に考察する地平が開けたと考えられる。
Round Studyの有効性の検証と評価シートの開発・効果検討

事後検討会は教師個人の成長(授業改善)と集団としての成長(同僚性の構築)を導く場となることが求められている。本年度は、その対応策の一つとしてのRound Studyに注目し、その効果(教師個人の成長)について検証することを目指した。Round Studyを導入して数年経つ小学校1校と中学校1校で調査を行った。どちらもRound Studyの進め方を学校にあったものになるよう工夫しており、独自性がみられた。小学校では、Round Studyを通してまとめられた意見を発表するだけではなく、それに対して授業者が意見を述べ、授業の意図の確認や授業のさらなる工夫のための議論が全員でなされている点が特徴的であった。中学校では、ホワイトボードを利用しながら議論が進められ、展開している議論を共有しやすくなっていた。さらに、Round Studyでまとめられた意見は職員室に掲示され、教師が意識しやすい状況があった。両校で授業を見学するとともに、その後の事後検討会であるRound Studyを記録した。このデータは文字化し、そこでの教師個人の学びについて検討した。ワークショップ型の研修でみられるようにRound Studyでも学んだ気になり、具体的な成果が曖昧になる可能性がある。両校のようにRound Studyの実施回数が多く定着していると、Round Studyによる教師の参加姿勢や学びも洗練されていると考えられる。教師には議論の目的を意識し参加するとともに、自身の学びにつなげる道筋が形成されるであろう。そのため、Round Studyによる教師個人の成長について考えるということができ、両校での調査は有意義であった。本年度はRound Studyの効果(個人の変化)に関する調査を予定しており、東京都内の小学校で2回、愛知県内の中学校で1回、授業見学と事後検討会におけるRound Studyの観察を行った。両校では、ビデオとICレコーダーでRound Studyを記録することができ、議論を文字化し分析を進めた。これにより、席替えをしながら議論を進めるRound Studyの特徴を明確に捉えることができた。様々な発言が個人の一意見と認識されるのではなく、グループのものとなり、共有されていく様子がみられた。これにより、自由に発言ができる環境が強化されるとともに、他者の意見を受け入れ自分の意見に取り入れることが捉えられた。また、小学校では、2人の教師の実践に基づくRound Studyを見学することができ、基本的に同じメンバーで実施されているRound Stduyの調査を行うことができた。これは、Round Studyによる教師の学びやそこでみられる議論ののバリエーションを捉えるという点で有効であった。しかしながら、Round Studyの実践を十分に分析できた訳ではなく、教師の学びをより具体的に捉えるためさらに分析を進める必要がある。本年度の調査記録をさらに詳細に検討し、授業者と参加者の学びの違い等、教師の学びを明らかにする必要があろう。Round Studyの効果(個人の変化)に関する調査を継続して行う。本年度の調査では、Round Studyが教師の学びに有効である可能性や、Round Studyのワークショップとしての特徴が示唆されたが、その効果が十分に把握された訳ではない。調査の結果をさらに分析し、教師の学びを具体的に把握していく必要がある。本年度は2校で合計3回の調査を行ったが、さらに、同校での調査を継続し、さらに教師の変化に関する検討を行いたい。これにより、さらに教師個人の変化(学び)の多様性をとらえることができると考える。可能であれば、Round Studyを実施している他の学校でも調査を行い、教師の学びを導くためににどのようような工夫がなされているのかについても明らかにしたい。また、Round Studyの効果(同僚性)に関する調査を行う。Round Studyでは継続して実施することにより、日常の教師間コミュニケーションにも変化を与え、同僚性が構築されることを想定している。その効果は実際には調査されていないため、Round Study参加者にその効果についてインタヴュー調査を行う事後検討会は教師個人の成長(授業改善)と集団としての成長(同僚性の構築)を導く場となることが求められている。

両校では、ビデオとICレコーダーでRound Studyを記録することができ、議論を文字化し分析を進めた。これにより、席替えをしながら議論を進めるRound Studyの特徴を明確に捉えることができた。様々な発言が個人の一意見と認識されるのではなく、グループのものとなり、共有されていく様子がみられた。これにより、自由に発言ができる環境が強化されるとともに、他者の意見を受け入れ自分の意見に取り入れることが捉えられた。また、小学校では、2人の教師の実践に基づくRound Studyを見学することができ、基本的に同じメンバーで実施されているRound Stduyの調査を行うことができた。これは、Round Studyによる教師の学びやそこでみられる議論ののバリエーションを捉えるという点で有効であった。しかしながら、Round Studyの実践を十分に分析できた訳ではなく、教師の学びをより具体的に捉えるためさらに分析を進める必要がある。本年度の調査記録をさらに詳細に検討し、授業者と参加者の学びの違い等、教師の学びを明らかにする必要があろう。Round Studyの効果(個人の変化)に関する調査を継続して行う。本年度の調査では、Round Studyが教師の学びに有効である可能性や、Round Studyのワークショップとしての特徴が示唆されたが、その効果が十分に把握された訳ではない。調査の結果をさらに分析し、教師の学びを具体的に把握していく必要がある。本年度は2校で合計3回の調査を行ったが、さらに、同校での調査を継続し、さらに教師の変化に関する検討を行いたい。これにより、さらに教師個人の変化(学び)の多様性をとらえることができると考える。可能であれば、Round Studyを実施している他の学校でも調査を行い、教師の学びを導くためににどのようような工夫がなされているのかについても明らかにしたい。また、Round Studyの効果(同僚性)に関する調査を行う。Round Studyでは継続して実施することにより、日常の教師間コミュニケーションにも変化を与え、同僚性が構築されることを想定している。その効果は実際には調査されていないため、Round Study参加者にその効果についてインタヴュー調査を行う本年度の計画では2校を3回ずつ(合計6回)訪問し、調査を行う予定であったが、学校の実施スケジュール等により、調査を3回しか行うことができなかった。そのため、旅費やテープ起こし、さらにそれに必要な物品の費用分が差額となった。
薬物代謝能制御におけるRNA編集の意義と医薬品によるADARの機能変動の解析

薬物代謝酵素は、医薬品有効成分の血中濃度を規定し、薬効や副作用発症を左右する因子として重要であり、その発現変動要因を解明する研究は、医薬品開発の効率化および医薬品適正使用の観点から社会的ニーズが高い。我々は薬物代謝酵素の発現制御にmicroRNAが重要な役割を担っていることを先駆的に明らかにしてきた。遺伝子発現の転写後調節の重要性が明らかになるにつれ、mRNAとmicroRNAのRNA編集(塩基の修飾による性質変化)の影響を解明する必要性が示唆された。本研究では、肝臓に発現するシトクロムP450 (P450, CYP)などの薬物代謝酵素の発現制御におけるRNA編集の寄与を明らかにし、創薬や薬物治療に役立てるための情報基盤を構築することを目的としている。次世代シークエンス解析により、ヒトP450のいくつかの分子種がRNA編集を受ける可能性が示されているが、繊維芽細胞など肝臓以外の組織から得られた情報が多く、肝臓におけるRNA編集の機能的解明は進んでいない。本年度は、薬物代謝酵素の発現量が正常ヒト肝臓に近いレベルに維持されているヒト肝がん由来HepaRG細胞を用いて、肝臓におけるADAR発現量の変動がP450の発現量や酵素活性に及ぼす影響を検討した。ADAR1とADAR2それぞれに対する特異的なsiRNAのHepaRG細胞への導入によりADARsをノックダウンしたところ、CYP2B6およびCYP2C8 mRNA発現量の有意な低下が認められ、肝臓における主な転写因子であるHNF4αの発現量低下に起因するものであることを明らかにした。一方、ADAR1のノックダウンによりCYP3A4 mRNA発現量は有意に増加したことから、HNF4α以外の因子の影響を大きく受けていることが示唆された。以上の研究成果はDrug Metab Disposに発表した。肝臓に発現する主な薬物代謝酵素であるP450の発現がRNA編集によって変動することを明らかにし、国内外での学会で発表し、国際学術雑誌へも発表した。1肝臓におけるADAR発現量の変動が薬物代謝酵素のRNA編集の程度や発現量に及ぼす影響ヒト肝臓中の主な薬物代謝酵素であるシトクロムP450の各分子種の発現を、RNA編集を担う酵素であるADARが制御していることを明らかにしたことから、引き続き、その他の薬物代謝酵素として、UDP-グルクロン酸転移酵素やアルドケト還元酵素等の発現に及ぼすADARの影響を明らかにする。具体的には、ADARに対するsiRNAを細胞に導入し、各代謝酵素の発現量や機能が変化するかウェスタンブロットおよび酵素活性評価により検討する。発現量や活性の変化が、当該mRNAの塩基置換によるものかダイレクトシークエンス解析を行い、ゲノムDNA配列との比較によりRNA編集の有無を明らかにする。2肝臓におけるADAR発現を制御する因子の解明:遺伝子多型解析ヒト肝臓におけるADAR1発現量には数百倍もの大きな個人差が認められることを明らかにしており、その原因を解明する。ADARには遺伝子多型が認められ、複数の一塩基置換(single nucleotide polymorphism, SNP)が同定されている。がんなどの疾患感受性との関連が示唆されているものの、各遺伝子変異の機能解析は行われていない。アミノ酸置換が起こるものもあるため、遺伝子変異がRNA編集活性にどの程度影響を及ぼすか、ADAR発現系を構築してRNA編集能を評価する。また、ADARの5'-上流領域に遺伝子変異があるかは未だ解析されていない。発現量の個人差解明につながる可能性もあるため、プロモーター領域の遺伝子多型解析を進める。

1肝臓におけるADAR発現量の変動が薬物代謝酵素のRNA編集の程度や発現量に及ぼす影響ヒト肝臓中の主な薬物代謝酵素であるシトクロムP450の各分子種の発現を、RNA編集を担う酵素であるADARが制御していることを明らかにしたことから、引き続き、その他の薬物代謝酵素として、UDP-グルクロン酸転移酵素やアルドケト還元酵素等の発現に及ぼすADARの影響を明らかにする。具体的には、ADARに対するsiRNAを細胞に導入し、各代謝酵素の発現量や機能が変化するかウェスタンブロットおよび酵素活性評価により検討する。発現量や活性の変化が、当該mRNAの塩基置換によるものかダイレクトシークエンス解析を行い、ゲノムDNA配列との比較によりRNA編集の有無を明らかにする。2肝臓におけるADAR発現を制御する因子の解明:遺伝子多型解析ヒト肝臓におけるADAR1発現量には数百倍もの大きな個人差が認められることを明らかにしており、その原因を解明する。ADARには遺伝子多型が認められ、複数の一塩基置換(single nucleotide polymorphism, SNP)が同定されている。がんなどの疾患感受性との関連が示唆されているものの、各遺伝子変異の機能解析は行われていない。アミノ酸置換が起こるものもあるため、遺伝子変異がRNA編集活性にどの程度影響を及ぼすか、ADAR発現系を構築してRNA編集能を評価する。また、ADARの5'-上流領域に遺伝子変異があるかは未だ解析されていない。発現量の個人差解明につながる可能性もあるため、プロモーター領域の遺伝子多型解析を進める。