hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高感度Ｘ線観測によるブラックホールと銀河の共進化の解明

本年度は、銀河中心ブラックホールから周辺環境へのエネルギー供給現象である「相対論的ジェット」および「超高速アウトフロー」を研究することで、本研究の課題である「ブラックホールと銀河の共進化」の謎の解明へ大きく前進した。・超高速アウトフロー近年、複数の活動銀河核において超高速アウトフローと呼ばれる現象が発見されており、共進化において重要な役割を果たしているとされている。その重要性にも関わらず、形成機構や物理的性質は全くわかっていない。私は、アウトフローの精密なX線スペクトルモデルを構築し、そのモデルを複数の観測データに適用することで、超高速アウトフローの物理的性質を探った。その結果、超高速アウトフローは定常的に存在し、激しい時間変動はアウトフローの局所的な不安定性に起因しているという描像を得た。この結果は、今年度論文[1]として出版された。・相対論的ジェット多数の銀河団において、銀河団ガスが中心銀河からの相対論的ジェットによって多大な影響を受けていることが確認されている。しかし、これまで研究されてきた銀河団と相互作用するジェット天体の多くが、パワーの小さなFR-I型電波銀河であった。私は、ジェットパワーの大きなFR-II型電波銀河を中心銀河として持つ銀河団Abell 578のX線観測データを解析した。その結果、この銀河団はまさに進化の途上にあることを示す兆候が数多く見つかった。さらに、詳細なスペクトル解析によって電波銀河近傍のガスの圧縮と加熱の証拠を捉え、相対論的ジェットに起因する衝撃波の存在を示唆する結果を得た。この衝撃波の存在は、質量降着率に比べて、ジェットパワーが極めて大きいことを要求する。これは、ジェットへのエネルギー変換効率が極めて高い状態であること、または、ジェット・質量降着活動が急激に変動したということを意味する。この結果は論文[2]として投稿し、受理された。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度はASTRO-H衛星搭載の硬X線撮像検出器(HXDの試験に主に携わり、2015年の打ち上げに向けて着実にHXIの開発を進めることができた。衛星搭載品と同じ構成で初めて製作された5段積層のHXI主検出器の性能評価試験をおこなった。試験においては、高圧電源や電源供給から読み出しシステムに至るまで、衛星搭載品と同等のシステムを用いた。これらの結果は秋季天文学会にて報告した。さらに、打ち上げ時や軌道上での環境を模擬した試験も行った。軌道上の環境を模擬した熱真空環境試験では、正常に動作することを確認し、軌道上で予想される検出器の温度分布の情報も得ることができた。また、打ち上げ時の振動を模擬した振動試験においては、テルル化カドミウム(CdTe)半導体検出器の電極と読み出し基盤との間の接合に問題が判明したが、その後の複数回のCdTe検出器単層での振動試験により解決に向かっている。以上の試験だけでなく、軌道上で優れた性能を実現するために不可欠な応答関数の構築を行った。平成23年度に行ったSpring-8の放射光ビームを用いた較正実験のデータ解析により、応答関数モデルのパラメータを決定することに成功した。この結果は国際会議にて報告した。さらに、2013年夏に最新の応答関数を公開するために、現在改良を行っている。また、以上の検出器開発以外にも、銀河団とブラックホールとの相互作用があると考えられる電波銀河をターゲットとして、Chandra衛星による観測データの解析にも取り組んでいる。高感度硬X線観測を実現するためのASTRO-H衛星搭載硬X線撮像検出器(HXI)の試験に携わると同時に、ブラックホールから周辺環境へのフィードバックプロセスに関わる天体解析を進めた。衛星搭載品と同じ設計のHXI主検出器の実験データをもとに検出器内の物理パラメータを決定する方法を確立し、HXI主検出器の応答関数を構築した。HXI主検出器をアクティブシールドと組み合わせ、高圧電源や電源供給から読み出しシステムに至るまで衛星搭載品と同等のシステムを用いて、性能評価試験を行った。アクティブシールドと組み合わせても性能の悪化はなく、軌道上での高感度実現に重要なバックグランド除去機能が動作することを確認した。衛星に搭載されるHXI主検出器で使用されるSi素子、CdTe素子の基礎性能測定及び選別を行った。選び出した素子を用いたHXI主検出器は、解析スレッショルドが5keV以下という要求性能をみたしており、スペクトル、イメージング性能も今までの試作品と同等以上の性能を満たすことが確認できた。この検出器は衛星搭載品のアクティブシールドと組み合わされ、2台で構成されるHXIのうち1台が完成した。昨年度に続き、Chandra衛星による銀河団内の電波銀河の観測データを解析した。結果、銀河団の中心からずれた位置に最も活動の活発な電波銀河が存在していることが明らかになった。また電波銀河のジェットにより銀河団のガスが暖められていることがわかり、ジェットによる衝撃波で加熱されたことを示唆している。結果は論文に纏める予定である。Durham大学のChris Done教授と共に、モンテカルロシミュレーションを用いてブラックホールからの超高速アウトフローの解析を行っている。この解析によってアウトフローの幾何学的な構造を含む物理パラメータに制限が与えられた。結果を来年度の国際会議で発表し、論文に纏める予定である。・超高速アウトフロー

近年、複数の活動銀河核において超高速アウトフローと呼ばれる現象が発見されており、共進化において重要な役割を果たしているとされている。その重要性にも関わらず、形成機構や物理的性質は全くわかっていない。私は、アウトフローの精密なX線スペクトルモデルを構築し、そのモデルを複数の観測データに適用することで、超高速アウトフローの物理的性質を探った。その結果、超高速アウトフローは定常的に存在し、激しい時間変動はアウトフローの局所的な不安定性に起因しているという描像を得た。この結果は、今年度論文[1]として出版された。・相対論的ジェット多数の銀河団において、銀河団ガスが中心銀河からの相対論的ジェットによって多大な影響を受けていることが確認されている。しかし、これまで研究されてきた銀河団と相互作用するジェット天体の多くが、パワーの小さなFR-I型電波銀河であった。私は、ジェットパワーの大きなFR-II型電波銀河を中心銀河として持つ銀河団Abell 578のX線観測データを解析した。その結果、この銀河団はまさに進化の途上にあることを示す兆候が数多く見つかった。さらに、詳細なスペクトル解析によって電波銀河近傍のガスの圧縮と加熱の証拠を捉え、相対論的ジェットに起因する衝撃波の存在を示唆する結果を得た。この衝撃波の存在は、質量降着率に比べて、ジェットパワーが極めて大きいことを要求する。これは、ジェットへのエネルギー変換効率が極めて高い状態であること、または、ジェット・質量降着活動が急激に変動したということを意味する。この結果は論文[2]として投稿し、受理された。26年度が最終年度であるため、記入しない。打ち上げの予定が2015年に延期となったが、順調にASTRO-H衛星の硬X線撮像検出器(HXI)の開発が進んでいるため。HXIの開発は概ね予定通りに進んでいる。天体のデータ解析も順調である。これまではASTRO-H衛星の硬X線撮像検出器の開発を中心におこなってきたが、今後は、現在運用中の衛星を使った観測データの解析もより積極的に進めていく。ASTRO-H衛星の打ち上げが研究期間に間に合わないので、ASTRO-H衛星を使わずに研究を行う。今後は、今まで多くの時間を割いてきたHXIの開発ではなく、モンテカルロシミュレーションを用いたアウトフローの研究を中心に行う。
流体可視化技術による水中へのイメージ生成法の開発と提案

2018年度は,水素気泡の技術的基盤のうち、電極構造のプロトタイピングの期間であると位置付け、水素気泡を発生させる接液電極の形状と、配線構造等の検討と実験を行った。ガラスエポキシ基板上のパターン+ソルダーレジストから構成される電極を複数試作したが、流体の粘性を要因とする、電極ボディ後方の気泡の出現の遅れが顕著であった。そこで、粘性の影響を抑制するような門型の電極構造、すなわち極細の接液電極部を、電極ボディから数十ミリ離れた箇所に併置するような構造を考案した。現在は、細線加工のための治具や溶接装置を製作し、門型電極での実験の整備を実施している。また、水槽であるが、当初は回流水槽を準備する予定であったが、諸般の事情により静置式水槽+掃引式の環境を整備した。(1)接液電極のプロトタイピングにおいて、電極形状を変更したことによる。(2)気泡発生のタイミングを制御するソフトウェアと電子回路の開発は平行して実施しており、これらの開発遂行は概ね順調であることによる。試作電極の工作や調整には、当初想定したよりも微細な作業を要している。また、そのための治具の製作も必要である。電極の諸寸法は、気泡のサイズ(浮上速度)や掃引速度から必然的に決まるが、電極の工作性を優先して水槽と電極ボディのサイズを再度確認する。
見過ごされていた立体選択的反応の開発を起点とする薬剤耐性菌克服に関する研究

本研究では新規な3つの立体選択的反応を開発することを初年度の第1の仮題として設定していた。1)まず、不斉ジヒドロキシ化による立体選択的ヒドロキシ基の導入と炭素鎖伸張法の開発においては、末端にヨウ化ビニル部位を有する化合物の不正ジヒドロキシ化を検討した。その結果、ヨウ化ビニル部位の構築に関して高いトランス選択的な反応条件を見いだすことができた。次に、合成した末端ビニルヨージドに対してSharpress不斉ジヒドロキシ化、続いて生じたアルデヒド基に対する炭素鎖の伸長反応は円滑に進行し、非常に高い鏡像体純度を有するアリルアルコール類を合成可能であることを示すことができた。続いて、本反応の基質一般性および立体選択性について明らかにすることができた。2)次に、αーリボフラノシドの立体選択的合成法の開発については、リボース5位にアシル基を導入した基質を用いることにより、その置換基効果が期待通りに働き、簡便な操作によるαー選択的リボフラノシド合成法を確立することができた。特に5位にPiv基を導入した基質は合成収率、立体選択性共に満足のいくものであった。ただし、5位Piv基を持つ基質では、続いて検討すべきamphidinin類の全合成研究において脱保護に問題を抱えることになることが予想されることから、脱保護条件の検討を行っている。また、開発した反応を用いていくつかの天然物合成について検討を重ねており、いくつかの問題を抱えた段階を克服すれば全合成を達成可能であるという知見をえることができた。当初の予定では、酵素を用いた光学分割により既知のケトンから容易に調製可能なラセミ体のヒドロキシエステルを分子の左右で酸化段階が異なる、かつてなかった便利な分子を創製することを目指していた。しかしながら酵素反応の立体選択性が必ずしも十分ではないことから、さらなる反応条件の検討を要する。まずは、酵素反応について様々な酵素、反応条件のスクリーニングを行い、最適な条件を探索する。次に、開発に成功した2つの反応を用いてpeniciacullin類およびamphidinin類の全合成に着手する予定である。反応開発において当初想定したよりも円滑に研究が進捗したことから消耗品の購入が予定よりも少なかったため。次年度は開発した反応を基に天然物の全合成研究に着手するため、当初の計画よりも増額した研究費が必要となることが見込まれる。
気液・液々混相流における相界面の滑りのPTV計測

初年度には,シリコン油中を沈降する球形の水滴の境界面に近接した内外の領域の定常速度分布を計測した.液滴に近接した領域をPTVで精密に計測するために,液滴の界面近傍と内部領域の画像化と球形の液滴界面での光の屈折による歪みの補正法やトレーサ粒子混入による相界面のコンタミネーション間題などの実験技術上の課題を解決し,液滴内部と界面上の速度分布の計測に成功した.また,液滴界面の性状の変化と抗力係数の関係を明らかにし,既存の実験結果と比較できる事を示した「相界面に接した部分の速度分布」と「界面上の剪断力分布」の計測データは本研究によってはじめて得られた結果であり,コンタミネーションの影響で液滴の表面に特異な剪断応力分布が現れることを発見した.初年度の研究では定常流中の液滴界面に近接した領域の速度分布計測技術を開発できたが,平成13年度には変形しつつ浮上する気泡近傍の非定常かつ移動・変形境界に接した領域の速度分布を計測する技術を開発した.変形しながら浮上する気泡周りの非定常流動現象を計測することは工学的にはより有用であるが,二次元的運動に限定しても計測技術的には未解決の困難な問題が多い.非定常の流れ計測では平均化処理による精度向上法を使用できないため,PTV解析ソフトの性能を強化して,PTV計測の精度を向上させ,1画面で数千ベクトルが得られるようになった.上昇しつつ変形する気泡の境界近傍の速度を計測するために,a)気泡境界の曲線の数式化,b)速度の計測時刻に対応した気泡像の確定,c)速度計測点との相対位置の決定方法などの問題を解決できた.その結果,シリコン油中を変形しながら上昇する気泡の近傍と接した領域の速度の計測に成功した.計測対象は球形の気泡に変形しながら追突する気泡近傍の流動を計測できた.初年度には,シリコン油中を沈降する球形の水滴の境界面に近接した内外の領域の定常速度分布を計測した.液滴に近接した領域をPTVで精密に計測するために,液滴の界面近傍と内部領域の画像化と球形の液滴界面での光の屈折による歪みの補正法やトレーサ粒子混入による相界面のコンタミネーション間題などの実験技術上の課題を解決し,液滴内部と界面上の速度分布の計測に成功した.また,液滴界面の性状の変化と抗力係数の関係を明らかにし,既存の実験結果と比較できる事を示した「相界面に接した部分の速度分布」と「界面上の剪断力分布」の計測データは本研究によってはじめて得られた結果であり,コンタミネーションの影響で液滴の表面に特異な剪断応力分布が現れることを発見した.初年度の研究では定常流中の液滴界面に近接した領域の速度分布計測技術を開発できたが,平成13年度には変形しつつ浮上する気泡近傍の非定常かつ移動・変形境界に接した領域の速度分布を計測する技術を開発した.変形しながら浮上する気泡周りの非定常流動現象を計測することは工学的にはより有用であるが,二次元的運動に限定しても計測技術的には未解決の困難な問題が多い.非定常の流れ計測では平均化処理による精度向上法を使用できないため,PTV解析ソフトの性能を強化して,PTV計測の精度を向上させ,1画面で数千ベクトルが得られるようになった.上昇しつつ変形する気泡の境界近傍の速度を計測するために,a)気泡境界の曲線の数式化,b)速度の計測時刻に対応した気泡像の確定,c)速度計測点との相対位置の決定方法などの問題を解決できた.その結果,シリコン油中を変形しながら上昇する気泡の近傍と接した領域の速度の計測に成功した.計測対象は球形の気泡に変形しながら追突する気泡近傍の流動を計測できた.球形を保ちながら一定速度でシリコン油中を沈降する直径約15mmの水滴の境界面に近接した内外の領域の速度分布を計測した.液滴に近接した領域をPTVで精密に計測するために必要な実験技術上の課題,たとえば,流れの可視化と球形の液滴界面での光の屈折による歪みの補正法やトレーサ粒子の混入による界面のコンタミネーションの問題などに対処できた.また,液滴界面の性状の変化を抗力係数によって表現することによって既存の実験結果と比較できる事を示した.0.01mm/1pixelの拡大率で撮影し,これをPTVによって液液界面に極めて接近した多数の速度ベクトルを計測し,これを用いて界面内外の速度と法線方向速度勾配を精密に計測できた.本実験のように低いレイノルズ数範囲ではアダマールの理論解が実験値と良く一致すること,界面上では内側と外側の速度が一致しているが,速度勾配にはかなり大きな差が有ることが分かった.さらに,今まで如何なる実験データも存在しなかった「外部の流れが界面に及ぼす剪断力の分布」を計測できた.水滴の前面ではアダマールの理論解と良く一致するが,ある点を境にして急増する特異な剪断応力分布である事が分かった.初年度には球形の液滴が一定速度で直線状に沈降する低レイノルズ数条件下で行なった.球形の液滴周りの流動と気泡の周りの流動は,物性値は異なるものの,定常流れに関する限り界面のすべりなどの基本的な現象は変わらない.初年度に開発・蓄積した計測を基にして,今年度は工学的にはより重要な非定常な運動をする非球形気泡の界面状態の計測を試みた.二次元的な運動に限定しても,変形しながら運動する気泡の界面状態を計測するにはいくつかの技術的課題を解決しなければならなかった.

まず,非定常の流れ計測では平均化による精度向上法は使えないため,計測精度の向上と1画面での計測ベクトル数を増やす必要がある.そのためトレーサの分布密度を高めても正確に追跡できるようにPTVソフトの性能を強化して,1画面で5千本以上の速度ベクトルが正確に得られるようになった.また,2画面間で対応つけられた粒子位置から移動量の算出方法を改善して計測精度を向上させた.上昇しつつ変形する気泡の境界に接した領域の速度計測では変形する気泡境界を正確に抽出し,速度の計測点との相対位置を決定する必要がある.計測した速度は2画面の中間の時刻の速度に相当するため,その時刻における気泡形状と比較する必要がある.そのために,a)気泡境界の曲線の数式化,b)速度の計測時刻に対応した気泡像,c)速度計測点との相対位置の決定方法などの問題を解決した.以上の計測技術を開発し,シリコン油中を変形しながら上昇する気泡の近傍と接した領域の速度の計測に成功した.
初修中国語教育における母語話者との遠隔交流がもたらす効果と実践方法の研究

本研究は、大学教養課程初修中国語教育の初年度学習者を対象に中国語母語話者との遠隔交流を伴う実験授業を行い、1.遠隔交流が学習意欲・動機づけに及ぼす影響と中国語習得度への影響を測定し、2.初年度学習での実践として一般化可能な教授設計を研究し、3.社会構成主義的に学ぶ学習成果の定着と習得の確認・評価方法を検討・検証し、日本で最多の中国語学習者を擁する大学教養課程初年度中国語教育の充実を目指す。本研究は、コミュニケーション言語力の習得と真正な言語活動の拡充、複言語主義に呼応した教育活動の活性化、国際理解と国際協調の学びの進展に寄与し、新時代に対応した外国語教育の新たな展開と意義を生み出すであろう。
界面における分子超構造の構築と光機能発現

これまでに、レゾルシンとアルデヒドから容易に合成されるカリックス[4]レゾルシンアレン(CRA)の特異な環状構造に着目し、この種の分子がラングミュア吸着によってシリカ表面に単分子膜を形成することを見いだした。この湿式単分子膜形成による表面超構造構築を図るために、アゾベンゼン基で置換されたCRA誘導体を合成し、その吸着挙動と光機能性を調べ、次のことが明らかにした。1)アセタール基を有するアゾベンゼンとレゾルシンから、4つのアゾベンゼン基で置換されたCRAを合成し、さらに、フェノール性水酸基をカルボキシメチル基に変えた誘導体(AzCRA-CM)を合成した。これらはいずれもクラウン型であることを確認した。これらの稀薄溶液に石英板を浸漬して吸着挙動を解析したところ、典型的なラングミュアー型の吸着曲線を与え、しかも、最密重点に近い高密度で単分子膜を形成することが分かった。2)AzCRA-CMの単分子吸着膜にネマチック液晶を接触させた結果、アゾベンゼン基が垂直配向に変化することが吸収スペクトルから明らかとなった。また、紫外線照射による光異性化は溶液中と同程度の高効率で起こることも判明した。これは、CRA環が最密重点構造をとりながらも、その上部に結合したアゾベンゼンに異性化に必要な自由体積が確保されていることを意味する。3)AzCRA-CMで表面修飾した石英基板に光照射することによって、ネマチック液晶層が垂直・平行配向間で可逆的に変化することが分かった。さらに、直線偏光紫外線照射によって、ホモジニアス配向が誘起されることも明らかとなった。
プロテアソーム阻害剤によって誘導されるアポトーシスのメカニズムに関する研究

ユビキチン/プロテアソーム蛋白質分解系は、多様な生体反応を急速かつ不可逆的に触媒し、その破綻は様々な疾患の原因となる。アポトーシスにはカスパーゼを中心として多くのプロテアーゼが関与しているので、プロテアソーム阻害剤誘導アポトーシスの機序を解明を目指した。ヒトグリオーマ細胞株2種類(野生型p53蛋白発現U-87MG、変異型p53蛋白発現T98G)にプロテアソーム阻害剤であるラクタシスチン、AcLLNalを作用させ、以下を観察し得た。1.位相差顕微鏡では細胞の半月状変形・縮小、細胞膜表面のblebbing形成、蛍光顕微鏡では核の凝縮、断片化等、アポトーシスに特徴的な変化が観察された。アガロースゲル電気泳動ではDNA断片化を認め、Ac-DEVD.fmk、z-VAD.fmkで断片化は抑制されたがAc-YVAD.cmkでは抑制されなかった。2.U-87MG株ではp53、p21、Mdm2、p27の蛋白発現上昇を認め、T98G株ではp53、Mdm2の蛋白発現量の変化なしにp21、p27の蛋白発現上昇を認めた。一方Bcl-2ファミリー蛋白の発現量の変化はなかった。カスパーゼ-3では活性型の出現を認めたが、カスパーゼ-1では認めなかった。PARPの特異的分解はカスパーゼ-3の活性型の出現と同期したが、カスパーゼ阻害により完全に抑制された。3.細胞死は経時的に進み、カスパーゼ阻害剤およびシクロヘキシミドにより遅延した。この細胞死抑制効果はz-VAD.fmkでより強く認めた。また、カルパイン特異的阻害剤では細胞死は誘導されなかった。4.細胞死の過程でチトクロームCのミトコンドリアから細胞質への放出は認めず、ミトコンドリア内膜機能の低下も認めなかった。結論として、プロテアソームの阻害によりヒトグリオーマ細胞株にアポトーシスが誘導され、p21、p27、カスパーゼ-3の活性化が関与していた。その細胞死実行シグナルはp53蛋白質の発現型、Bcl-2ファミリー、カスパーゼ-1には依存せず、ミトコンドリアを介さなかった。1.プロテアソーム阻害剤処理によりグリオーマ細胞株にアポトーシスが誘導される。2.このアポトーシスはp53蛋白質が変異型で正常に機能していなくても、誘導される。つまり、p53蛋白質非依存性である可能性が示された。3. p53蛋白質による転写活性を受けるp21蛋白質、p27蛋白質が、p53蛋白質が変異型で正常に機能していなくても蛋白レベルで増加し、細胞周期の停止を伴って、アポトーシスが誘導された。この事は、上記2.を支持すると共に、p21蛋白質、p27蛋白質が、ユビキチン/プロテアソーム系によって分解制御されている可能性を示している。現在、免疫沈降法を用いて両蛋白質のユビキチン化を証明する実験を進行中である。

4. p21蛋白質、p27蛋白質とは逆に細胞周期回転を促進するC-Myc蛋白質も蛋白レベルで増加しており、このユビキチン化を証明する免疫沈降法を用いた実験も進行中である。5.アポトーシス抑制・促進に働くBcl-2ファミリー蛋白質の発現量に変化はなく、Bcl-2ファミリーによるコントロールを受けない新たなアポトーシスの存在が示された。6.アポトーシス進行過程において、チトクロームCのミトコンドリアから細胞質への放出が起こらず、ミトコンドリアの内膜機能の低下も起こらない。つまり、アポトーシス実行シグナルは、ミトコンドリアを介さないことが示された。7.複数のCaspaseの活性化がイムノブロットや蛍光基質を用いた活性測定の実験で証明された。この事から、アポトーシス実行シグナルがミトコンドリアを介さないにも関わらず、Caspaseの活性化が起こりアポトーシスが誘導されるという、新たなアポトーシス・シグナル経路の存在が示された。ユピキチン/プロテアソーム蛋白質分解系は、多様な生体反応を急速かつ不可逆的に触媒し、その破綻は様々な疾患の原因となる.アポトーシスにはカスパーゼを中心として多くのプロテアーゼが関与しているので、プロテアソーム阻害剤誘導アポトーシスの機序を解明を目指した。ヒトグリオーマ細胞株2種類(野生型p53蛋白発現U-87MG、変異型p53蛋白発現T98G)にプロテアソーム阻害剤であるラクタシスチン、AcLLNalを作用させ、以下を観察し得た。1.位相差顕微鏡では細胞の半月状変形・縮小、細胞膜表面のblebbing形成、蛍光顕微鏡では核の凝縮、断片化等、アポトーシスに特徴的な変化が観察された。アガロースゲル電気泳動ではDNA断片化を認め、Ac-DEVD.fmk、z-VAD.fmkで断片化は抑制されたがAc-YVAD.cmkでは抑制されなかった。2.U-87MG株ではp53、p21、Mdm2、p27の蛋白発現上昇を認め、T98G株ではp53、Mdm2の蛋白発現量の変化なしにp21、p27の蛋白発現上昇を認めた。一方Bcl-2ファミりー蛋白の発現量の変化はなかった。カスパーゼ-3では活性型の出現を認めたが、カスパーゼ-1では認めなかった。PARPの特異的分解はカスパーゼ-3の活性型の出現と同期したが、カスパーゼ阻害により完全に抑制された。3.細胞死は経時的に進み、カスパーゼ阻害剤およびシクロヘキシミドにより遅延した。この細胞死抑制効果はz-VAD.fmkでより強く認めた。また,カルパイン特異的阻害剤では細胞死は誘導されなかった。4.細胞死の過程でチトクロームCのミトコンドリアから細胞質への放出は認めず、ミトコンドリア内膜機能の低下も認めなかった。結論として、プロテアソームの阻害によりヒトグリオーマ細胞株にアポトーシスが誘導され、p21、p27、カスパーゼ-3の活性化が関与していた。その細胞死実行シグナルはp53蛋白質の発現型、Bcl-2ファミリー、カスパーゼ-1には依存せず、ミトコンドリアを介さなかった。
急性肺傷害におけるロイコトリエンB4第二受容体BLT2の肺保護作用

ロイコトリエンB4第二受容体(BLT2)の肺における役割を明らかにする目的で、BLT2欠損マウスを用いた病態モデルとして肺炎球菌毒素ニューモライシン(PLY)誘導性急性肺傷害モデルを作成し、BLT2欠損マウスの表現型を解析した。肺におけるBLT2シグナルの存在がシステイニルロイコトリエン受容体CysLT1の肺血管内皮における発現を抑制し、PLYによって大量に産生されたシステイニルロイコトリエン類への感受性を低減させることにより保護的な役割を示すことを明らかにした。加えて、肺炎球菌性肺炎の早期における急性肺傷害の新たな治療戦略としてCysLT1拮抗薬の可能性を提起した。ロイコトリエンB4(LTB4)第二受容体(BLT2)を欠損させたマウスでは、肺炎球菌毒素であるニューモライシン(PLY)を気管内投与した際、野生型マウスと比較して顕著に高い致死率および肺の血管透過性亢進、気管支収縮を呈することが認められたため、以下の内容について解析を行った。マウスの肺においては、肺胞上皮2型細胞および血管内皮細胞でBLT2の発現が認められた。野生型マウスとBLT2欠損マウスの定常状態における比較では、肺の構造に明らかな変化は認められず、肺サーファクタント産生、ムチン、接着因子、増殖・分化に関わる細胞内シグナル分子の発現にも差を認めなかった。一方、PLY投与後の肺では、野生型と比較してBLT2欠損マウスでより重篤な肺傷害を生じ、気道抵抗および弾性抵抗はBLT2欠損マウスでのみ上昇を示した。また、BLT2のリガンドである12-HHTの産生をNSAIDs投与により阻害したところ、野生型マウスでもPLY投与による致死率が上昇し、12-HHT/BLT2シグナルがPLY誘導性急性肺傷害に対し保護的役割を示すと考えられた。PLY投与後の野生型およびBLT2欠損マウスの肺組織および肺胞洗浄液を、質量分析計を用いたエイコサノイド一斉定量法により解析したところ、大量のシステイニルロイコトリエン類(cysLTs)の産生が認められた。cysLTsはシステイニルロイコトリエン受容体CysLT1を活性化することにより肺において気管支収縮および血管透過性亢進をきたすことが知られており、PLY投与後のBLT2欠損マウス肺で野生型マウスと比較して重度の血管透過性亢進および気管支収縮が認められる機序の一端として、CysLT1シグナルを増強する可能性が示唆された。マウス肺の肺胞上皮2型細胞においてBLT2の発現が認められたため、当初は、定常状態における肺胞構造や、サーファクタントやムチンの組成および産生量など、肺胞上皮の物理的バリア形成がBLT2欠損により不十分となっている可能性を第一に想定したが、構造の観察やサーファクタントタンパク質およびサーファクタント脂質、ムチンの解析結果からは野生型と比較して明らかな変化を認めなかった。一方で、BLT2は血管内皮にも発現が認められた上、過去の報告および本研究の予備検討においてPLY投与による血管透過性亢進も認めた。さらに気管支収縮と併せて、BLT2欠損マウスにおいてPLY投与後の肺で生じる変化が気管支喘息の病態で生じる変化に類似していることに着目し、さらなる解析を行った結果、PLY投与後の肺で大量のシステイニルロイコトリエン類が産生されていることが明らかとなった。PLY投与後にBLT2欠損マウスで顕著な血管透過性の亢進と気道抵抗の上昇を生じ、結果として高い致死率を呈する機序の一端を示唆しており、全体として概ね順調に進行していると評価する。ロイコトリエンB4第二受容体(BLT2)を欠損させたマウスでは、肺炎球菌毒素ニューモライシン(PLY)の気管内投与により、野生型マウスと比較して顕著に高い致死率、肺の血管透過性亢進、気管支収縮を呈することが認められ、さらに野生型、BLT2欠損マウスともにPLY投与により大量のシステイニルロイコトリエン類(cysLTs; LTC4, LTD4, LTE4)の産生が認められたことより、以下の内容について前年度の結果を踏まえ詳細に解析した。PLY刺激により骨髄由来マスト細胞から大量のcysLTsが産生されることが認められたが、BLT2欠損マウスと野生型マウスの肺におけるマスト細胞の細胞数および分化には差が認められなかった。マウス肺から単離した血管内皮細胞において、cysLTs受容体であるCysLT1の発現がBLT2欠損マウスで上昇していることが定量的PCR法により認められた。内在性にBLT2およびCysLT1を発現するヒト臍帯静脈血管内皮細胞HUVECをBLT2アンタゴニスト存在下で培養すると、CysLT1発現量の増加が認められ、さらにLTD4投与による抵抗値TERの低下、すなわち透過性亢進が認められた。これらより、BLT2欠損あるいはシグナル遮断により血管内皮細胞においてCysLT1発現が上昇することで、PLY刺激により産生されたcysLTsへの反応性が増強されるものと考えられた。CysLT受容体拮抗薬モンテルカストを前投与すると、PLY投与後のBLT2欠損マウスにおける致死率は有意に改善し、血管透過性亢進、気道抵抗の上昇はいずれもほぼ消失することが認められた。ロイコトリエンB4第二受容体(BLT2)の肺における役割を明らかにする目的で、BLT2欠損マウスを用いた病態モデルとして肺炎球菌毒素ニューモライシン(PLY)

誘導性急性肺傷害モデルを作成し、BLT2欠損マウスの表現型を解析した。肺におけるBLT2シグナルの存在がシステイニルロイコトリエン受容体CysLT1の肺血管内皮における発現を抑制し、PLYによって大量に産生されたシステイニルロイコトリエン類への感受性を低減させることにより保護的な役割を示すことを明らかにした。加えて、肺炎球菌性肺炎の早期における急性肺傷害の新たな治療戦略としてCysLT1拮抗薬の可能性を提起した。PLY投与後のマウス肺において大量のシステイニルロイコトリエン類cysLTsの産生が認められたが、その産生量には野生型マウスとBLT2欠損マウス間で差を認めなかった。野生型マウスと比較して、BLT2欠損マウスで顕著な血管透過性亢進、気道抵抗の上昇、および高い致死率を示す機序を解明するため、cysLTsの産生細胞であると推察されるマスト細胞や、システイニルロイコトリエン受容体CysLT1についてさらなる解析を行う必要がある。野生型とBLT2欠損マウスでマスト細胞の性質や数、局在に変化があるかどうかを確認する。マスト細胞の実験については、協力者の了解を得ている。CysLT1は過去の報告で、他のGタンパク質共役型受容体GPCRであるCysLT2やGPR17との相互作用が示されており、同じくGPCRであるBLT2とも相互に関連している可能性はあると考える。血管内皮細胞を用いて、BLT2とCysLT1が共発現しているか確認し、BLT2リガンドである12-HHT存在・非存在下、あるいはBLT2アンタゴニスト存在条件下でLTD4投与を行い、CysLT1のシグナルについて解析を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。生化学28年度が最終年度であるため、記入しない。
培養ニュ-ロンおよびシナプトニュ-ロソ-ムを用いたGABAの受容体複合体の研究

SR95531[2ー(3'carbetoxyー2'ーpropyl)ー3ーaminoー6ーparamethoxyーphenylーpyridazinium bromide]のアンタゴニスト作用と受容体結合を調べた。SR95531とビククリンメチオダイド(BMI)は、大脳皮質シナプトニュ-ロソ-ム画分でのムシモ-ルによって増強される^<35>Cl^ーuptakeを濃度依存的に抑制した。SR95531のアンタゴニスト作用は、BMIの作用に比べ、15倍強力であった。この大脳皮質シナプトニュ-ロソ-ム画分におけるムシモ-ルによって増強される^<35>Cl^ーuptakeに対するSR95531のIC_<50>値は、前皮質における^3HーSR95531結合の低親和性部位のK_D値とほぼ同じであった。SR95531とBMIは、GABAの^<35>SーTBPS結合の抑制に対しても拮抗作用を示し、SR95531の効果はBMIよりも強力であった。脳膜標品をPLase A_2で前処置すると、^3HーSR95531結合は常に抑制された。しかし、PLase A_2処置により、大脳皮質の^3HーGABAの結合は濃度依存的に増大した。小脳においては、低濃度のPLase A_2処置で^3HーGABA結合は変化を受けなかったが、比較的高濃度のPLase A_2処置で結合は増大した。また、大脳皮質におけるPLase A_2処置による^3HーGABA結合の増大率は小脳の場合よりも大きかった。また、小脳神経細胞の初代培養系においても、^3HーSR95531の特異的結合認められた。PLase A_2処置は、この小脳神経細胞の初代培養系より得られた膜標品の^3HーGABAと^3HーSR95531結合に対しても小脳の場合と同じような影響を与えた。これらの結果は、SR95531は、低親和性部位を介してGABAアンタゴニスト作用を発揮すると共に、外因性に加えたPLase A_2がGABA_A受容体をアゴニストが結合しやすい型へ変換することを誘発することを示唆している。また、小脳神経細胞の初代培養系は、in vitro系で各種薬物の長期暴露によるGABA_A受容体への影響を調べる系として有用であると思われる。研究計画書に記載した通り、小脳の初代培養系を実験系として用いるため卓上型クリ-ンベンチを設備備品として購入した。これにより培養実験が可能となり、培養した神経細胞を以下の実験に用いた。最初に受容体結合実験からGABA受容体の性質をアゴニストの^3HーGABAと最近合成されたGABAアンタゴニストの一つである^3HーSR 95531を用いて検討した。

膜標品をphospholipase A_2(PLase A_2)で前処置したときの両リガンド結合に及ぼす影響を前皮質、小脳および小脳神経細胞の培養系で検討した結果、外因性のPLase A_2はGABA_A受容体をアゴニストが結合しやすい型へ変換することを誘発し、これが膜リン脂質の代謝産物であるarachidonic acidやlysophosphatidylーcholineによるものであることが明らかとなった。次にラット大脳皮質のシナプトニュ-ロソ-ム(SNS)を調製し、GABA受容体に共役する^<36>Clイオンの取り込み系実験を調べた。SNSへの^<36>Clイオンの取り込みはGABAアゴニストのmuscimolにより増大した。この増大した^<36>Clイオンの取り込みに対し、従来から用いられてきたGABAアンタゴニスト、bicucullineのmethohalide塩の1つであるbicuculline methiodide,BMIとSR 95531の効果を比較検討したところ、両アンタゴニストともに濃度依存的な抑制を示した。両アンタゴニストのIC_<50>値の比較から、SR 95531の抑制効果はBMIの15倍強力であった。以上の結果からSR 95531は強力なGABAアンタゴニストであるが、その受容体結合の性質は従来から報告されてきたアゴニストのものとはかなり異なっていることが判明した。培養細胞におけるGABA受容体に共役する^<36>Clイオンの取り込み機構については現在検討を行ないつつある。来年度についても当初の計画の通り行なう予定である。本年度の研究実施計画に記載した通り、GABA_A受容体複合体ピクロトキシン結合部位への^<35>SーTBPS結合に対するGABAの抑制作用を指標として、新しいGABAアンタゴニストSR95531の作用を従来のアンタゴニストと比較検討した。大脳皮質膜標品でのGABAの^<35>SーTBPS結合抑制作用に対し、SR95531とビククリンのメトハライド塩の一つであるビククリンメチオダイド(BMI)は拮抗作用を示したが、アンタゴニストによるGABAの阻害曲線のシフトから求めたIC_<50>値の比較から、SR95531のGABA拮抗作用はBMIに比べて2.5倍強いことが明かとなった。昨年度の研究から、大脳皮質シナプトニュ-ロソ-ム画分でのムシモ-ルによって増加される^<35>Cl^ーuptakeに対するSR95531とBMIの阻害曲線から求めた両者のIC_<50>値の比較から、SR95531はBMIに比べて約15倍強力であることが明らかとなっており、GABAの^<35>SーTEPS結合抑制作用に対するSR95531とBMIのGABAアンタゴニスト作用の強度に^<35>Cl^ーuptakeの場合ほどの差がないことも明らかになった。この原因を調べるため、^<35>SーTBPS結合に対するSR95531、ビククリンおよびBMIの直接の効果を検討すると、ビククリンとBMIが濃度依存的に^<35>SーTBPS結合を増大したのに対し、SR95531は低濃度で抑制したが、それ以上濃度をあげても変化は認められなかった。このことから、ピクロトキシン結合部位に対して、SR95531は弱いGABAアゴニスト作用を持つことが明かとなり、このアゴニスト作用のため、^<35>SーTBPS結合におけるGABA拮抗作用が他の系の場合よりも弱いことの一因となっていることが示唆された。また、小脳神経細胞の初代培養系を用いた実験では、^<35>SーTBPS結合のScatchard plotから、K_D値は19nM、Bmax値は1pmole/mg proteinであった。
Cat-ablation法による低次元導電性高分子の合成及び構造・物性評価

本年度は、Nd:YAGレザーの355nmを用い、ペリレン誘導体(PTCDA)とCoとの混合ターゲット(PTCDA/Co)のアブレーションにより低次元グラファイトであるポリペリナフタレン(PPN)ナノ微粒子の合成を試みた。PTCDA/Coターゲットを0.10.5Jcm^<-2>pulse^<-1>のフルエンスでアブレーションすることにより、数十百nmのナノ微粒子からなる薄膜を得た。得られた薄膜に対してIR測定を行ったところフルエンスの上昇と共に側鎖に由来したピークの強度が減少していく様子がみられ、0.5Jcm^<-2>pulse^<-1>でPTCDA側鎖が完全に脱離している事がわかった。一方、同条件で作製した薄膜のラマン測定より若干のブロード化が見られるものの、いずれのフルエンスにおいてもペリレンに由来するピークが検出された。これらの結果より355nmでPTCDA/Coをアブレーションした場合、0.5Jcm^<-2>pulse^<-1>においてペリレン骨格を保持しつつ、側鎖が脱離したフラグメント種が基板上に堆積していることが明らかとなった。Coを加えることで側鎖の脱離反応が促進されることから、レーザー光を吸収したCoからイオン化により生成した電子がPTCDAに衝突し側鎖の脱離を誘起する、あるいは光熱的過程などの可能性が考えられる。27°Cで作製した薄膜の[H]/[C]を調べたところ0.403という値となり、側鎖が脱離したPTCDAの理論値である0.400にほぼ一致し、脱離反応を支持する結果が得られた。また、300°Cで作製した薄膜を調べたところ、1290cm^<-1>に鋭いピークを有するラマンスペクトルが得られ、その電導度は、27°Cのものに比べ二桁ほど高い値を示した。これは温度上昇により重合反応が促進されπ共役系が発達した為であり、PPN生成を示唆する結果と言える。我々は,有機デバイス材料として期待される擬一次元導電性高分子であるポリペリナフタレン(PPN)の薄膜をペリレンテトラカルボン酸二無水物(PTCDA)をターゲットとしたエキシマーレーザーアブレーション(ELA)法により作製している。この方法はPPN作製法として極めて有効な方法であるが,側鎖脱離効率が低いなど解決すべき点もある。そこで本研究ではPTCDAにCo粉末を混合させたターゲット(PTCDA/Co)のXeClエキシマーレーザーを用いたアブレーションにより効率的にPTCDAの側鎖基を解離させPPN薄膜を作製することを試みた。その結果、フルエンス1.0Jcm^<-2>以上で側鎖基が効果的に脱離したフラグメント種が生成することが分かった。これらの薄膜に対してラマン測定を行ったところ,Coを混合させることにより,側鎖基を効率的に脱離させると同時にペリレン骨格が保護されることが分かった。酸無水物基の脱離促進に対してCoがどのような働きをしているかについては検討中であるが、単なる熱的な効果だけでなくCo触媒効果が重要な働きをしており、本法をCat-ablation法と名づけた。PTCDA/Coをターゲットとして20°Cで作製した薄膜の電導度は10^<-6>Scm^<-1>以下であった。そこで,薄膜作製後,真空を保ったまま基板温度を350°Cまで上昇させ,30分アニーリングを行い再び20°Cに戻した。その結果,20°Cにおける電導度は10^<-3>Scm^<-1>のオーダーとなりアニーリング前と比べて2桁以上上昇した。これはペリレン骨格を保持しつつ側鎖が解離した活性種がアニーリングにより重合しPPNが形成されたためと考えられる。

また、300°Cで作製した薄膜を調べたところ、1290cm^<-1>に鋭いピークを有するラマンスペクトルが得られ、その電導度は、27°Cのものに比べ二桁ほど高い値を示した。これは温度上昇により重合反応が促進されπ共役系が発達した為であり、PPN生成を示唆する結果と言える。
体色および行動を成熟に伴って変化させるアオハダトンボ成虫の情報入力システムの解析

アオハダトンボは、成虫期に表面色の区別可能な2つの期間を有する。羽化してから生殖に入るまでの前生殖期と、生殖可能な生殖期である。前生殖期の成虫を未成熟個体(immature)、生殖期の成虫を成熟個体(mature)と呼ぶ。アオハダトンボでは、成熟雄個体の翅が青く輝き、未成熟雄、未成熟雌および成熟雌の翅は灰色に鈍く反射する。雄の未成熟から成熟個体への移行は顕著だといえる。本種は、水辺に縄張りをオスがつくり、流れ着いた水草などに産卵する。羽化した未成熟個体は水辺の周囲で数日間を過ごし、その期間は主に採餌に時間を費やす。雄の未成熟個体の目立たない薄灰色の翅は、生殖期になるにつれて翅膜部分にメラニンと考えられる黒い色素が蓄積し、翅脈部分の多層膜構造が強調されることで緑色に輝くことがわかった。つまり、成熟期の劇的な翅色の変化は、構造色の新たな形成ではなく、すでに未成熟個体の翅脈に備わっている多層膜による構造色が、翅膜の透過光が現象することによって強調されていたのである。また、成熟雄個体は縄張りをもち、縄張り内に入る成熟雄個体を積極的に威嚇するが、未成熟雄個体や、未成熟及び成熟雌個体には威嚇行動を示さないことが、行動学的に観察された。これらの翅の表面色を修飾すると、強い反射の翅をもつ個体に対しては雌雄共に対して、成熟雄の威嚇行動が示され、反射を鈍くした翅をもつ個体に対しては威嚇行動が示されないことがわかった。色や形態に関わる視覚情報は、複眼で受容される。均翅亜目に属するアオハダトンボでは、これまでの報告と同じように、レチナール(A1)と3-ヒドロキシレチナール(A3)が確認されたが、未成熟から成熟個体への移行に伴いA3が増加していた。網膜微細構造のうち特に反射層が顕著に成熟に伴って大きくなっていることも確認され、成熟個体の視覚情報の優位性が暗示された。本研究は、アオハダトンボの視覚コミュニケーションが成虫期間で変化する現象をモデルとして、末梢の情報受容システムである複眼の長期的適応現象の過程を明らかにし、適応的な行動と情報処理システムの関連を明示するものである。アオハダトンボ成虫の複眼の成熟に伴う変化に伴った体色及び行動の変化を観察した.アオハダトンボ雄では,未成熟個体および成熟個体の翅脈に多層膜構造が存在し、その構造によって特徴的な構造色を発色し,雌の翅脈には多層膜構造が存在してない.未成熟個体の翅脈の多層膜構造は,成熟個体に比べて各層がところどころ途切れているような部分が観察され構造的に未発達といえるが,理論的には構造色を発色するだけの構造が完成しているといえる.それにも関わらず,未成熟個体の翅の発色が雌のそれに似ており,縄張り雄からの攻撃を回避できる.これは,翅膜内に成熟過程に伴ってメラニンが蓄積され、翅脈の構造色の発色が翅の裏側からの透過光によってコントラストが消失されることによって,結果的に雌のように視覚上認知されていることが強く想像された.アオハダトンボの個眼の微細構造の観察では,成熟個体が未成熟個体に比べて視細胞のサイズが大きく細胞内小器官の密度が高いことがわかり,成熟に伴う視細胞内視覚情報処理の変化があることが推定される.また,雌雄共に遠距離の餌に反応していることを行動

学的に明らかにした.また高速液体クロマトグラフィーにより視物質発色団の同定を行ったところ,成熟・未成熟個体の雌雄全部にレチナール(A1)と3-ヒドロキシレチナール(A3)が検出され,定量的測定をした結果,成熟個体に含まれるA3の総量が,未成熟個体のそれに比べておよそ2倍の増加が観察された.本研究は、アオハダトンボの視覚コミュニケーションが成虫期間で変化する現象をモデルとして、末梢の情報受容システムである複眼の長期的適応現象の過程を明らかにし、適応的な行動と情報処理システムの関連を明示する。アオハダトンボ成虫の複眼の成熟に伴う変化に伴った体色及び行動の変化を観察すると、雄では、未成熟個体および成熟個体の翅脈に多層膜構造が存在し、その構造によって特徴的な構造色を発色し、雌の翅脈には多層膜構造が存在してない。未成熟個体の翅脈の多層膜構造は、成熟個体に比べて各層がところどころ途切れているような部分が観察され構造的に未発達といえるが、理論的には構造色を発色するだけの構造が完成しているといえる。それにも関わらず、未成熟個体の翅の発色が雌のそれに似ており、縄張り雄からの攻撃を回避できる。成熟雄では、翅膜内に成熟過程に伴ってメラニンが蓄積され、翅脈の構造色の発色のコントラストが増強されていることがわかった。アオハダトンボの個眼の微細構造の観察では、成熟個体が未成熟個体に比べて視細胞のサイズが大きく細胞内小器官の密度が高いことがわかり、成熟に伴う視細胞内視覚情報処理の変化が生じている。この複眼構造から推定される成熟に伴う視覚情報処理能力の向上が、行動学的な実験による飛翔追尾行動の正確さの向上と関連があることがわかった。また高速液体クロマトグラフィーにより視物質発色団の同定を行ったところ、成熟・未成熟個体の雌雄全部にレチナール(Al)と3-ヒドロキシレチナール(A3)が検出され、定量的測定をした結果、成熟個体に含まれるA3の総量が、未成熟個体のそれに比べておよそ2倍の増加が観察され、情報処理能力の行動と視物質量との関連も考えられた.アオハダトンボは、成虫期に表面色の区別可能な2つの期間を有する。羽化してから生殖に入るまでの前生殖期と、生殖可能な生殖期である。前生殖期の成虫を未成熟個体、生殖期の成虫を成熟個体と呼ぶ。アオハダトンボでは、成熟雄個体の翅が青く輝き、未成熟雄、未成熟雌および成熟雌の翅は灰色に鈍く反射する。雄の未成熟から成熟個体への移行は顕著だといえる。本種は、水辺に縄張りをオスがつくり、流れ着いた水草などに産卵する。羽化した未成熟個体は水辺の周囲で数日間を過ごし、その期間は主に採餌に時間を費やす。雄の未成熟個体の目立たない薄灰色の翅は、生殖期になるにつれて翅膜部分にメラニンと考えられる黒い色素が蓄積し、翅脈部分の多層膜構造が強調されることで緑色に輝くことがわかった。つまり、成熟期の劇的な翅色の変化は、構造色の新たな形成ではなく、すでに未成熟個体の翅脈に備わっている多層膜による構造色が、翅膜の透過光が現象することによって強調されていたのである。また、成熟雄個体は縄張りをもち、縄張り内に入る成熟雄個体を積極的に威嚇するが、未成熟雄個体や、未成熟及び成熟雌個体には威嚇行動を示さないことが、行動学的に観察された。これらの翅の表面色を修飾すると、強い反射の翅をもつ個体に対しては雌雄共に対して、成熟雄の威嚇行動が示され、反射を鈍くした翅をもつ個体に対しては威嚇行動が示されないことがわかった。色や形態に関わる視覚情報は、複眼で受容される。
微小循環生理学による肥満パラドックスの病態解明への挑戦

肥満は生活習慣病等、多くの疾患の原因となり、肥満そのものが疾患の危険因子である。一方で肥満患者は重症病態での生存率が高いという肥満パラドックスが存在する。そこで、生体顕微鏡によるin vivoイメージング技術を用いて肥満マウスとコントロールマウスの微小環境における循環動態、血管内皮細胞上のグリコカリックス(GCX)の構造的相異を明らかにすることを目的とし前年度まで実験を行ってきた。最終年度の実験では高脂肪食(H)群、中脂肪食(M)群、低脂肪食(L)群の脳軟膜上の微小血管のグリコカリックスの厚みに着目し、H群、M群、L群の3群に対し脳血管透過窓を作成し、蛍光色素を投与し脳軟膜上の微小血管のグリコカリックスの観察、測定を行った。中脂肪食群及び高脂肪群は低脂肪食群と比較しグリコカリックスが有意に厚い結果が得られた。また中脂肪食群においてのみ血管径とグリコカリックスの厚みに相関が認められた。GCXが血管透過性のコントロールに重要な役割を持ち、重症病態下で脱落が起こる事実を考慮すると、肥満パラドックスの病態の一部が、GCXの厚みの違いにある可能性がある。M群においてのみ血管径とGCXIに相関があったことは、他の多くの肥満パラドックスに関する研究で中等度肥満患者の予後が最も良好となっている事実と関係があるのかもしれない。このようなグリコカリックスの厚みの差異が重症病態において有利に働くことは容易に想像ができ、さらなる今後の研究が期待される。これまで肥満パラドックスに関する報告は疫学的なものがほとんどであり、本研究のようにその病態生理を解明しようとし、基礎実験、特に血管内皮細胞上のグリコカリックスに着目したものは世界初の報告であると考えられ、学術的、社会的意義は大きかったと考えられる。本研究は、生体顕微鏡によるin vivoイメージング技術を用いて微小環境における循環動態血管内皮細胞の機能・構造的変化を明らかにし、酸化ストレス可視化トランスジェニックマウスを使用して、肥満パラドックスの新たな科学的根拠を提示することに挑戦している。年度前半でマウスの動物モデルを確立した。市販の種々の高脂肪食を活用し、また餌のタイミング、アクセス方法などを検討し4種類のマウス群(高脂肪食群、中脂肪食群、自由食群、制限食群)を作成し、CTによる体脂肪率の測定を行い肥満度の比較を行った。血管の観察に必要なDSC(背部皮膚血管透過窓)の作成は年間を通じて行い、安定したDSCが作成可能となった。年度後半で各群のマウスにストレスを加えた際の各群への微小循環への影響の違いを観察した。ストレスには脱血による出血性ショック、LPS投与による敗血症を加え、微小循環を観察している。肥満モデルのDSC作成において、肥大した脂肪細胞が微小血管の上に乗り上げ、顕微鏡での観察が困難であった。これに対しては、脂肪細胞の存在する層よりも上の層の血管を観察することで解決できたが、解決までに時間を要した。肥満マウスの微小循環を観察することで肥満パラドックスの病態生理の解明を目的とし実験を行ってきている。平成28年度までにマウス肥満モデルを確立することができた。平成29年度に肥満マウスの微小循環をDSCにて観察を試みたが、増加、増大した脂肪細胞によって、血管内の鮮明な顕微鏡画像を得ることは困難であった。そこで脂肪細胞の増加のない頭蓋内の血管に着目し、頭蓋骨を一部外し、ガラスをつけることで頭蓋内血管の観察が可能になる、クラニアルウインドー(CW)で観察することとした。作成技術の獲得に時間を要したが、現在、観察可能なCWは作成可能となっている。BL6系統のマウスでは安定した死亡率が得られず、検討を要した。そこでマウスの結紮した虫垂に穴を開け腹腔に戻し閉腹するCLPモデルを採用することとした。こちらのモデルでは安定した死亡率が得られている。

最終年度の実験では高脂肪食(H)群、中脂肪食(M)群、低脂肪食(L)群の脳軟膜上の微小血管のグリコカリックスの厚みに着目し、H群、M群、L群の3群に対し脳血管透過窓を作成し、蛍光色素を投与し脳軟膜上の微小血管のグリコカリックスの観察、測定を行った。中脂肪食群及び高脂肪群は低脂肪食群と比較しグリコカリックスが有意に厚い結果が得られた。また中脂肪食群においてのみ血管径とグリコカリックスの厚みに相関が認められた。GCXが血管透過性のコントロールに重要な役割を持ち、重症病態下で脱落が起こる事実を考慮すると、肥満パラドックスの病態の一部が、GCXの厚みの違いにある可能性がある。M群においてのみ血管径とGCXIに相関があったことは、他の多くの肥満パラドックスに関する研究で中等度肥満患者の予後が最も良好となっている事実と関係があるのかもしれない。このようなグリコカリックスの厚みの差異が重症病態において有利に働くことは容易に想像ができ、さらなる今後の研究が期待される。これまで肥満パラドックスに関する報告は疫学的なものがほとんどであり、本研究のようにその病態生理を解明しようとし、基礎実験、特に血管内皮細胞上のグリコカリックスに着目したものは世界初の報告であると考えられ、学術的、社会的意義は大きかったと考えられる。脱血による出血性ショックをストレスとして与え、肥満度による微小循環の違いを観察する。酸化ストレストランスジェニックマウスを用いて、肥満モデルを作成し、ストレス負荷による違いを明らかにする。肥満マウスに対し、CLPによりストレスを与え、その死亡率、CWの微小循環を観察することで、肥満パラドックスの病態生理を解明する手がかりを見つける。消耗品が想定よりも安価に購入できたため。実験が当初の予定よりも遅れたため、学会発表などに使用予定であった予算を使用しなかった。肥満マウスの微小循環観察のために時間を要したが、現在は観察が可能となっており次年度に使用できると考えられる。血管内皮細胞観察のための蛍光色素を購入する。