hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
嗅索形成への関与が期待される31C12抗原の発現解析および構造決定

発生時に、嗅球の僧帽細胞の軸索は終脳の外側表面を選択的に伸長し、嗅索を形成する。我々は、僧帽細胞の軸索伸長経路である予定嗅索領域に結合するモノクローナル抗体のスクリーニングを行い、嗅索周辺を特異的に認識するモノクローナル抗体MAblotl(31C2を改名)を得た。この抗体の認識する抗原分子(lotl抗原)は、僧帽細胞軸索伸長の時空間的なパターンに非常に良く一致して発現する。このような発現パターンをもつ分子はこれまでに知られておらず、本研究ではこのlot抗原分子の単離精製を目指した。当初計画していたように、様々な方法により可溶化した蛋白質から、MAblotlにより抗原分子の免疫沈降を試みたが、成功しなかった。失敗の原因はおそらく蛋白質を界面活性剤で可溶化する過程で抗原決定部位が変性してしまったためだと思われる。この結果から免疫沈降により抗原分子を精製することは不可能であると結論し、発現クローニングによるlot抗原分子の同定に戦略を変更した。MAblotlの抗原決定部位は非常に変性しやすいため、発現クローニングを行うためにはなるべくnativeに近い構造のlot抗原を発現させる必要がある。そこで、培養動物細胞(COS細胞)にcDNA発現ライブラリーを導入して強制発現させ、その中からMAblotlで染色される細胞を生じるクローンをスクリーニングする事にした。現在lot抗原が最も強く発現しているマウス14.5日胚の副嗅球からmRNAを調製して、cDNA発現ライブラリーを作成中である。我々は、僧帽細胞の軸索伸長経路である予定嗅索領域に結合するモノクローナル抗体のスクリーニングを行い、嗅索周辺の細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体MAb lot1(31C2を改名)を得た。今年度はこの抗体の認識する抗原(lot1抗原)の発現解析を行った。MAb lot1による染色はマウス胎生120日目(E12.0)から終脳表層の予定嗅索領域で観察され始め、E14.5で最大になった。しかしこの時期でもMAb lot1による染色部位は非常に限られており、嗅索のすぐ近傍の梨状葉第1層が最も強かった。他には間脳の1部でわずかに染色が認められた程度で、神経系以外にはまったく染色は認められなかった。更に発生が進むとMAb lot1による染色性は急速に弱まり、生後には完全に染色性が失われた。lot1抗原は細胞の中では核周辺に強く局在していおり、ゴルジ体との関連が考えられた。また嗅索周辺の細胞を培養してMAb lot1で染色してみたところ、lot1抗原の一部は細胞外に放出され細胞膜に結合していると思われた。lot1抗原の発現が最も強いと思われるE14.5嗅索周辺部から蛋白質を調整し、MAb lot1でWestem Blottingを行ったところバンドは検出されなかった。しかし終脳組織を蛋白分解酵素処理するとMAb lot1による染色性は減少することから、lot1抗原は蛋白質である可能性が高いと思われる。現在MAb lot1による免疫沈降を試みている。
DNAと三重らせんを形成する新規オリゴマー金属錯体の開発

我々の一貫した分子レベルでの塩基配列認識機構の解明と塩基配列認識能の高い低分子量化合物の開発研究のなかで、近年3重らせんによるDNA塩基配列認識に着目している。3重らせんはアンチセンス法と並び特異的に塩基配列を読むことが期待されるもので、転写阻害による遺伝子発現の制御、DNA複製の阻害が報告されている。しかし、3重らせんの形成はもとの二重らせんの片側がhomo-purine、もう片側がhomo-pyrimidine配列である場合に限られるという大きな制約がある。これを克服し任意の長い塩基配列を認識する3重らせん形成のためには、通常のオリゴヌクレオチド以外のパ-ツからできたポリマーを考える必要がある。本研究では、任意の塩基配列認識能をもつ3重らせん形成オリゴマーの設計を試みた。金属錯体のような全く新しい構造単位も有効であるが、その場合スムーズなbackboneの形成が難しくなる難点を克服しなくてはならない。今回はまずbackboneの形成がスムーズに行え、金属の配位子ともなり得る、塩基選択制の高い新規ヌクレオチド類似化合物をデザインした。合成にとりかかる前に分子力場計算を行い、新規化合物の塩基配列特異性を確認した。現在合成ルートの検討を終え、合成を開始したところである。さらに、錯体によるgroove内でDNAのchirality認識、相互作用の程度を、銅錯体をあらたに合成し、銅の酸化還元によるDNA切断からを推測した。また、grooveでの結合情報を得るために、誘起CDスペクトルを用いてポルフィリン金属錯体とDNAとのgrooveでの相互作用を定量的に研究する方法を開発した。われわれがこれまで蓄積してきたgroove結合化合物の研究成果と融合させ、3重らせんの研究をいっそう発展させていく予定である。本年度はDNAと3重らせんを形成する可能性のあるオリゴマーユニットのデザインに必要な実験を行なった。DNAはヌクレオチド単位が規則正しく連なったポリマーであるから、これを認識させるリガンドも塩基配列に対応したユニットが規則正しく配列し、かつ分子全体のかたちがDNAの溝にうまくフィットするようにデザインされていなければならない。我々は塩基配列に関する情報が豊富であるmajor grooveでトリプルヘリックスを形成させるためには分子の大きさとchiralityが特に重要であると考え、構成単位となるモノマーユニットの分子設計に必要な知見を得るために以下の実験を行なった。還元剤で1価に還元された銅錯体は、2価に戻るときに分子状酸素を還元的に活性化してDNA切断を引き起こす。銅錯体をプローブとしてchiralityの効果について検討した。銅にフェナントロリンまたはビピリジンがひとつ配位した錯体にアミノ酸またはchiralなジアミンを組み合わせ、これまでにエナンチオマーを含めて11種類の銅錯体を合成した。合成した銅錯体すべてについてDNA切断実験を行ない、chiralityの影響を調べた。円二色性スペクトルを用いた解析も進めており、さらにいくつかの錯体についてはX線構造解析も行なった。また、化合物自体がらせん構造をとると考えられるオリゴ-ピリジル誘導体の銅および銀錯体について、computer graphicsを活用し、エネルギー最小化計算等も行なって立体構造を予測している。これらの知見を統合し、疎水性の効果等も考慮に入れてヌクレオチド認識に必要なリガンドの大きさ、chiralなグループの位置などを適宜軌道修正しながらユニットのデザインを進めている。3重螺旋はアンチセンス法と並んで特異的に塩基配列を読むことが期待されるもので、転写阻害による遺伝子発現の制御、DNA複製の阻害が報告されている。

しかし,3重らせんの形成はもとの二重らせんの片側がhomo-purine、もう片側がhomo-pyrimidine配列である場合に限られるという大きな制約がある。これを克服し任意の長い塩基配列認識能を有する3重らせん形成のためには、通常のオリゴヌクレオチド以外のパ-ツからできたポリマーを考える必要がある。本研究では、任意の塩基配列を認識することのできる3重らせん形成オリゴマーの設計を試みた。金属錯体のような全く新しい構造単位も有効であるが、その場合スムーズなbackboneの形成が難しくなる難点を克服しなくてはならない。今回はまずbackboneの形成がスムーズに行え、塩基の選択制の高いヌクレオチドの類似化合物から検討した。水素結合のパターン、立体障害、平面性、化合物の安定性、合成のしやすさを考慮して、Cを認識する新規化合物をデザインした。合成にとりかかる前に分子力場計算を行い、新規化合物の塩基配列特異性を確認した。現在合成ルートの検討を終え、合成を開始したところである。さらに、grooveでの結合情報を得るために、誘起CDスペクトルを用いてポルフィリン金属錯体とDNAとのgrooveでの相互作用を定量的に研究する方法を開発した。
超短基線ニュートリノ振動でステライルニュートリノを探索する基礎研究

昨今、ニュートリノの性質がニュートリノ振動や2重ベータ崩壊の実験を通して明らかになって来た。特に3世代あるニュートリノ振動の混合角度は、最初(20年以上前)の予想に反しクォークのそれとは全く異なる大きさであったり、ニュートリノのマヨラナ性に期待が集まったり、第4世代のニュートリノの存在が示唆されたりと、ニュートリノの特異性が明らかになってきている。本研究は新たに浮かび上がってきたニュートリノの疑問に、カムランドというニュートリノ観測に実績のある装置で立ち向かい、第4世代のニュートリノの探索を最終目標とする基礎研究である。
工具摩耗量検出センサー内蔵型スローアウェイ工具の試作開発

本研究は切削工具の逃げ面摩耗量を検出するためのセンサーを内蔵したスローアウエイ工具を開発することを目的として行われ,以下の成果を得た.1.逃げ面摩耗量検出原理:工具逃げ面上に切れ刃に平行に抵抗薄膜回路を形成する.切れ刃の摩耗とともに回路も脱落し,その抵抗値が変化する.これより,回路の抵抗値を測定することにより逃げ面摩耗量を検出できる.2.逃げ面摩耗量検出センサーの設計および形成方法の確立:逃げ面摩耗量検出センサーすなわち抵抗薄膜回路を複雑な形状にする場合,その抵抗値は回路をいくつかの長方形ブロックに分割し,それらの抵抗値の和として得られる.抵抗薄膜回路はTiをスローアウエイーチップの表面上に蒸着し,その後エッチング処理を行い形成する.3.切削温度検出センサーの付加:Tiの抵抗率の温度依存性を利用し,切れ刃の平均切削温度を検出できる.切削温度検出センサーを付加した抵抗薄膜回路の設計および工具ホルダーの試作は終えている.4.センサー信号検出処理システムの開発:抵抗薄膜回路の抵抗値を定電流回路により電圧値に変換し, A/Dコンバータを介してマイクロコンピュータへ入力するシステムを開発した.その電圧値より逃げ面摩耗量を算出する.5.センサーの有効性の確認(基礎実験):逃げ面摩耗量検出センサーを形成した工具を試作し,摩耗実験によりそのセンサーと信号検出処理システムの有効性の確認を行った.6.インテリジェント切削工具における位置づけ:本研究において開発したセンサーは,研究代表者が昭和62年度科学研究費補助金奨励研究(A)(研究課題番号61750112)において行っているインテリジェント切削工具のセンサー部を構成しインテリジェント切削工具の最も重要な位置づけにある.7.まとめ:以上より初期の目的を達成本研究は切削工具の逃げ面摩耗量を検出するためのセンサーを内蔵したスローアウエイ工具を開発することを目的として行われ,以下の成果を得た.1.逃げ面摩耗量検出原理:工具逃げ面上に切れ刃に平行に抵抗薄膜回路を形成する.切れ刃の摩耗とともに回路も脱落し,その抵抗値が変化する.これより,回路の抵抗値を測定することにより逃げ面摩耗量を検出できる.2.逃げ面摩耗量検出センサーの設計および形成方法の確立:逃げ面摩耗量検出センサーすなわち抵抗薄膜回路を複雑な形状にする場合,その抵抗値は回路をいくつかの長方形ブロックに分割し,それらの抵抗値の和として得られる.抵抗薄膜回路はTiをスローアウエイーチップの表面上に蒸着し,その後エッチング処理を行い形成する.3.切削温度検出センサーの付加:Tiの抵抗率の温度依存性を利用し,切れ刃の平均切削温度を検出できる.切削温度検出センサーを付加した抵抗薄膜回路の設計および工具ホルダーの試作は終えている.4.センサー信号検出処理システムの開発:抵抗薄膜回路の抵抗値を定電流回路により電圧値に変換し, A/Dコンバータを介してマイクロコンピュータへ入力するシステムを開発した.その電圧値より逃げ面摩耗量を算出する.5.センサーの有効性の確認(基礎実験):逃げ面摩耗量検出センサーを形成した工具を試作し,摩耗実験によりそのセンサーと信号検出処理システムの有効性の確認を行った.6.インテリジェント切削工具における位置づけ:本研究において開発したセンサーは,研究代表者が昭和62年度科学研究費補助金奨励研究(A)(研究課題番号61750112)において行っているインテリジェント切削工具のセンサー部を構成しインテリジェント切削工具の最も重要な位置づけにある.7.まとめ:以上より初期の目的を達成逃げ面摩耗量を直接検出するセンサーを内蔵したスローアウェイ工具を試作開発するため、以下の五項目にしたがって研究を遂行し成果を得た。1.抵抗薄膜回路網の設計(岸浪,青山担当)切刃全域における逃げ面摩耗および欠損を検出するため、センサー形状は切刃に平行に帯状とした。したがって、逃げ面摩耗とともにセンサー部が細くなり回路抵抗値が増加することを利用し、逃げ面摩耗幅を検出する。また、回路を設計するうえで必要となる回路抵抗値の簡易な計算方法を確立した。2.抵抗薄膜回路網の形成方法の確立(斎藤,青山担当)スローアウェイチップの全面にPVDによりTi金属を厚さ2μm蒸着する。次に、回路を形成すべきところにフォトレジスト膜を形成する。レジスト膜の熱処理を行った後、240°Cのリン酸液により50秒エッチング処理を行う。3.抵抗薄膜回路の形成(浅野,青山担当)スローアウェイチップはアルミナチップと超硬チップを採用したが、超硬チップに対しては絶縁膜を形成しなければならないため、アルミナ膜とシリコン窒化膜により試みたが、完全な絶縁膜の形成はなされていない。しかしながら、アルミナチップに対しては上記2に述べた方法により抵抗薄膜回路を形成することができた。回路検査は画像入力装置(購入備品)により行う。4.工具ホルダーの設計・試作(青山,浅野担当)抵抗値を検出するための電極を内蔵した工具ホルダーを設計し、試作を終えた。また、電極も切削中の振動に影響を受けないパーツが選定されている。5.基礎実験(青山担当)摩耗実験により、逃げ面摩耗幅と回路抵抗値の関係を得た。回路抵抗値は定電流回路(購入備品)により電圧に変換されA/Dコンバータ(購入備品)を介してパソコンへ入力される。
新しい水素貯蔵材料の研究

フレームワークの相互貫通を防ぐのに有利な多連結金属クラスターとバルキな配位子を用いることによって、細孔径の大きなメソ孔金属錯体高分子(MOF)(In_3O)(OH)(ADC)_2(IN)_2-4.67H_2O(1)及びそのアミン修飾体(In_3O)(OH)(ADC)_2(NH_2IN)_2-2.67H_2O(2)の合成に成功した。金属錯体高分子(MOF)1の細孔径は、最大で3.39nmとなっており、大きな表面積を持ち、さらに高い水素吸蔵能を有する。また、アミン修飾によって、水素の吸蔵能が向上することが明らかになった。メソ細孔を有する金属錯体高分子を担体として用いて、メソ細孔内に内包・固定化した一連の金属ナノ粒子触媒を合成した。本触媒を用いて、高い水素含有量を有し、水素貯蔵材料として有望なギ酸の選択分解反応における活性評価を行った。その結果、金属錯体高分子(MOF)担持複合金属触媒及びアミン修飾金属錯体高分子(MOF)担持複合金属触媒はギ酸の脱水素・水素生成反応に高い触媒活性を示すことを見出した。一方、単金属のみを担持した触媒は触媒活性が著しく低いことが明らかになった。この結果は、メソ細孔内に内包・固定化した異種金属間との協同効果を示している。本液相水素発生反応によって、高い重量・体積密度の水素貯蔵が可能であり、且つ温和な反応条件下で、制御可能且つ効率よく水素を発生することができることが明らかになった。多連結金属クラスターと大きな配位子を用いることによって、フレームワークの相互貫通を防ぐと同時に、フレームワークの剛性を高め、細孔径の大きなメソ孔金属錯体高分子(MOF)の合成に成功した。本金属錯体高分子(MOF)は、大きな表面積を持ち、さらに高い水素(H_2)、二酸化炭素(CO_2)及びメタン(CH_4)の吸蔵能を有する。本研究結果は、新しい物質・エネルギー貯蔵材料や単分散金属ナノ粒子の固定化担体としての機能性メソ孔金属錯体高分子(MOF)の合成に新しい手法を提供する。さらに、メソ細孔を有する金属錯体高分子(MOF)を担体として用いて、メソ細孔内に内包・固定化した異重金属ナノ粒子触媒を合成した.本触媒を用いて、高い水素含有量を有し、水素貯蔵材料として有望なギ酸の選択分解反応における活性評価を行った。その結果、金属錯体高分子(MOF)担持異種金属複合触媒はギ酸の脱水素・水素生成反応に高い触媒活性を示すことを見出した。一方、単成分金属を担持した触媒は異種金属複合担持触媒と比べて触媒活性が低いことが明らかになった。この結果は、メソ細孔内に内包・固定化した異種金属間の協同効果を示している。
DNA修復の最終素過程であるDNA再結合の分子機構と制御

DNA鎖連結反応を触媒するDNAリガーゼは、哺乳動物細胞に於いては分子種I,II,IIIが存在し、Iは少なくともDNA複製、IIIは修復に関与しているものと推定されている。正常ラット肝細胞核から得られたリガーゼはIIIのタイプであり、IやIIは殆ど認められなかった。次に、色素性乾皮症A群相補遺伝子産物XPAC蛋白質とDNAリガーゼの相互作用を探究したが、XPACとDNAリガーゼの物理的結合を支持する結果は得られなかった。又、DNAリガーゼ反応に対しXPACやPCNAは何ら影響しなかった。最近、リガーゼIIIとXRCC1(CHOのDNA修復変異株EM9を相補するヒトの遺伝子)遺伝子産物が複合体を形成しているとの報告があり、種々の修復関連遺伝子産物とリガーゼの相互作用についての検討がさらに必要となっている。2本鎖DNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK)は、多くの複製/転写制御因子や酵素をリン酸化し、活性化にDNA末端を要求することから、DNAの修復や組換えにも関与している可能性が高い。DNA-PKはDNAリガーゼIをリン酸化したが、XPAC,PCNA,DNAポリメラーゼβはin vitroの基質とならなかった。さらに、Raji細胞からのDNA-PKの簡易精製法の確立、DNA依存性を与える調節成分としてのKu蛋白質の同定、第二の認識アミノ酸配列P-S/T-Xの発見、Raji細胞での増殖に非依存的な活性レベルの発見、等が今年度行われた。又、既にDNA-PKの基質となることを見いだしているc-Mycに関して、DNA-PKがN端側の^<58>Thr(転写活性化とトランスホーメーションに関与)をin vitroでリン酸化することや、基本転写因子TBPとTFIIBがDNA-PKによってリン酸化され、生物活性に変化の生じることも示された。
読解力・表現力を育成する多読を基にした言語活動のカリキュラム開発

学校図書館を広く活用し、児童の読解力・表現力を向上させることのできる授業を研究するにあたり、児童の主体性を引き出すことのできる「ブックトーク」「ビブリオバトル」「ライティングワークショップ」という3つの読書活のカリキュラム化の有効性と可能性について研究したものである。1.研究の概要(1)「ブックトーク」「ビブリオバトル」小学生の各学年の発達段階においてどのように取り組ませることが有効かを検討するため、教材文を学習する前や後に2つの活動を取り入れた。発達段階における適切な指導法、ルール設定などを児童のワークシートや対話から考察する。(2)「ライティングワークショップ」書くことへの苦手意識を取り除き、楽しんで書くことを継続できるように年間を通して「ライティングワークショップ」に取り組ませる。児童のアンケート調査からカリキュラム化の可能性を探る。2.研究の結果(1)「ブックトーク」「ビブリオバトル」教材を学習したあとに取り組む場合は、授業で獲得した知識を活用し主体的に活動に取り組むことができた。教材を読む前の場合は、例えば「やまなし」を学習する前に、宮沢賢治の本のブックトークをした6年生では「やまなし」を読んだときに「あの作品と似ているところがある」や「賢治が伝えたいことは変わっていない」など、作品と作品を結び付けて考える力がついていた。さらに、よい本と巡り合えないと、よいブックトークやビブリオバトルができないことから、多くの本に出会おうとする児童の姿が見られた。(2)「ライティングワークショップ」3年生、4年生、6年生で実践を行った結果、すべての児童が一人一冊本を発行することができた。原稿用紙を絵本型・文庫型・幼年童話型など工夫することで、どの子も進んで書くことができていた。また、書いた作品を教室の後ろに並べることで、作者と読者が本を介してコミュニケーションをとる姿も見られた。
複数のSEREX抗原を同時標的とした胃癌血清抗体診断法の研究

HSP70とKM-HN-1はp53と同様に生物学的悪性度を反映する分子であることから、両者を併用することで、治療感受性予測、治療後の予後や転移率などをより正確に推測することが可能となると考えられる。この解析法を開発することで、胃癌以外の固形癌の診断・治療へも応用可能であり、臨床上の有用性が高く発展性がある研究と思われる。昨年度は、ニボルマブが保険収載され、胃癌治療における新しい選択肢が増えた。しかしながらニボルマブの治療効果を予測するバイオマーカーの探索研究の分野では期待された結果は得られていない。我々はPD-L1を東邦大学医療センター大森病院で入院・加療した胃癌患者の血清を用いてELISAキットによる測定を行い、臨床データと併せて論文報告を行った。また、第118回外科学会にて胃癌症例におけるRalAの免疫染色の結果と臨床データを発表した。次年度は、HSP70、KM-HN-1ならびにp53の両者を固相化したELISAキットを作製して、血清抗体価を測定し両者を併用した場合の抗体価とそれぞれの標的抗原に対する単独抗原に対する抗体価との相関関係を検討する予定である。深達度、リンパ節転移、遠隔臓器転移との相関関係を検討する。また、化学療法施行症例においては、治療感受性との相関関係を検討する。再発症例においては、再発時期、予後との相関関係を検討する。いずれの臨床病理学的検討においても血清HSP70抗体や血清KM-HN-1抗体が独立した危険因子あるいは予後因子であるか否かについて検討する。研究計画4年間の1-3年目は、当初計画に基づく研究計画を順調に実施できた。しかしながら、4年目は血清中のHSP70抗体やKM-HN-1抗体は、当初期待したレベルの陽性率に達しなかったため、単独で新たな腫瘍マーカーとして利用できる可能性は少ないと判断された。他の血清抗体マーカーと併用することで、従来の抗体マーカーを凌駕する検査方法として開発できる可能性を現在探索中である。研究最終年度である令和元年度には、他の候補の血清抗体で胃癌切除標本の免疫染色を行いタンパクレベルでの発現を確認する。また最適の血清抗体併用方法を探索する予定である。腫瘍抗原に対する抗体反応を利用した腫瘍マーカーである血清p53抗体は、食道癌・大腸癌・乳癌の3種に対して2007年に保険収載されてから8年が経過した。現在、同様の手法を用いてHSP70、KM-HN-1、NY-ESO-1など複数の分子に関して臨床検体を用いた研究を行っている。HSP70およびKM-HN-1cDNAの塩基配列をアミノ酸配列に変換し、MHCPredウェブサイト(http://www.jenner.ac.uk/MHCPred/)を用いてクラスII抗原部位を検索し、その領域を含むペプチドを人工合成した。ウエスタンブロット法にて、HSP70およびKM-HN-1cDNAを標的とする血清抗体陽性率を検討した。次に、アミノ末端にビオチンを付加しておき、予めアビジンを固相化したプレートを用いて合成ペプチドを特異的に結合させ、洗浄後に血清抗体と反応させ、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG抗体を用いて血清抗体レベルを測定した(ELISA)。健常者血清に比べ患者血清の抗体レベルが有意に高いペプチドを選択した。東邦大学医療センター大森病院で入院・加療した胃癌患者の血清を文書により本人の了解を得てスクリーニング用いた。(「悪性腫瘍における新規腫瘍マーカーの探索と有用性の検討」承認番号:21-74)また、文書により了解を得た健常者の血清をコントロールとして用いた。健常者は、癌検診において固形癌を有していないと診断された50歳以上の100名である。解析対象の胃癌症例の血清は、治療前後に採取し、血清分離後にマイナス80度で凍結保存したものを使用した。Pilot studyの結果は後述の学会で発表してきたが、さらなる改良を行う。研究計画4年間の2年目であり、当初計画に基づく研究計画を順調に実施している。腫瘍抗原に対する抗体反応を利用した腫瘍マーカーである血清p53抗体は、食道癌・大腸癌・乳癌の3種に対して2007年に保険収載されてから10年が経過した。

健常者は、癌検診において固形癌を有していないと診断された50歳以上の100名である。解析対象の胃癌症例の血清は、治療前後に採取し、血清分離後にマイナス80度で凍結保存したものを使用した。Pilot studyの結果は後述の学会で発表してきたが、さらなる改良を行う。研究計画4年間の3年目であり、当初計画に基づく研究計画を順調に実施している。HSP70とKM-HN-1はp53と同様に生物学的悪性度を反映する分子であることから、両者を併用することで、治療感受性予測、治療後の予後や転移率などをより正確に推測することが可能となると考えられる。この解析法を開発することで、胃癌以外の固形癌の診断・治療へも応用可能であり、臨床上の有用性が高く発展性がある研究と思われる。昨年度はSEREX法による癌抗原スクリーニングで得られたNY-ESO-1抗原に関して、東邦大学医療センター大森病院で入院・加療した胃癌患者の血清ならびに病理標本を用いて独自に開発したELISAキットによる測定並びに免疫染色を行い、臨床データと併せて論文報告を行った。また、第117回外科学会にて胃癌症例におけるHSP70の免疫染色の結果と臨床データを発表した。今年度は、以下のことを予定している。1東邦大学で採取した胃癌患者血清を用いて、血清抗体の存在の有無を試作した血清抗体検出ELISAキットにて検討する。2深達度、リンパ節転移、遠隔臓器転移との相関関係を検討する。また、化学療法施行症例においては、治療感受性との相関関係を検討する。再発症例においては、再発時期、予後との相関関係を検討する。いずれの臨床病理学的検討においても血清HSP70抗体や血清KM-HN-1抗体が独立した危険因子あるいは予後因子であるか否かについて検討する。3HSP70、KM-HN-1ならびにp53の両者を固相化したELISAキットを作製して、血清抗体価を測定する。両者を併用した場合の抗体価とそれぞれの標的抗原に対する単独抗原に対する抗体価との相関関係を検討する。研究計画4年間の3年目であり、当初計画に基づく研究計画を実施している。しかしながら複数の分子をを固相化したELISAキットの作製が遅れている。昨年度は、ニボルマブが保険収載され、胃癌治療における新しい選択肢が増えた。しかしながらニボルマブの治療効果を予測するバイオマーカーの探索研究の分野では期待された結果は得られていない。我々はPD-L1を東邦大学医療センター大森病院で入院・加療した胃癌患者の血清を用いてELISAキットによる測定を行い、臨床データと併せて論文報告を行った。また、第118回外科学会にて胃癌症例におけるRalAの免疫染色の結果と臨床データを発表した。次年度は、HSP70、KM-HN-1ならびにp53の両者を固相化したELISAキットを作製して、血清抗体価を測定し両者を併用した場合の抗体価とそれぞれの標的抗原に対する単独抗原に対する抗体価との相関関係を検討する予定である。
Ｓｉｒｔ－１による異所性脂肪蓄積の制御メカニズムの解明

加齢に伴う骨格筋減少と異所性脂肪蓄積が代謝異常、骨格筋機能障害の基盤となりうる。この機序の解明は、高齢者における代謝性疾患、サルコペニアの治療の開発につながりうる。本研究の目的は、骨格筋脂肪蓄積にともなう骨格筋機能障害の機序を明らかにすることである。C2C12培養骨格筋細胞に高濃度飽和脂肪酸を添加することにより、脂肪滴形成が生じアポトーシスが誘導された。また、インスリンによるAktリン酸化が抑制された。ビタミンD3によりSirt-1発現レベルが増加し、ビタミンD3添加により、パルミチン酸によるインスリン抵抗性は改善した。イソプロテレノール刺激によりビタミンD受容体の発現が上昇した。サルコペニアを呈する骨格筋組織においては、異所性の脂肪蓄積が特徴的に認められ、インスリン抵抗性をしめすことが知られているが、その制御機構は必ずしも明らかになっているとはいい難い。平成24年度に本プロジェクトにおいて、C2C12培養骨格筋細胞に対して、パルミチン酸を添加することにより、脂肪滴形成が生じるとともに細胞レベルでのインスリン抵抗性(インスリン刺激によるAktリン酸化上昇レベルが抑制される)が誘導されることを明らかにした。本年は、骨格筋細胞におけるSirt-1発現について検討するとともにその生理学的、病理学的役割についても検討をくわえた。C2C12に対するパルミチン酸添加は、Sirt-1発現レベルには影響を及ぼさなかった。そこで、Sirt-1の発現レベルを上昇させる因子を探索的に検討したところ、イソプロテレノールによる交感神経ベータ受容体刺激では、効果が認められなかったが、骨格筋に対する効果が知られているビタミンD3の添加によりSirt-1発現レベルが増加した。ビタミンD3添加により、パルミチン酸による細胞レベルでのインスリン抵抗性は改善が認められた。また、C2C12細胞において、ビタミンD受容体が発現していること、またイソプロテレノール刺激によりビタミンD受容体の発現が上昇することも明らかになった。選択的ベータ2受容体刺激薬や受容体拮抗薬をもちいた検討により、ビタミンD受容体の発現制御には、交感神経ベータ2受容体が関与していることも明らかになった。サルコペニアをていする骨格筋組織においては、異所性の脂肪蓄積が特徴的に認められることが知られているが、骨格筋機能に対する意義は不明確である。われわれは、培養マウス骨格筋細胞に高濃度飽和脂肪酸(パルミチン酸)を添加することにより、Oil Red-O染色にて細胞内に脂肪がとりこまれ脂肪滴形成が生じるとともに、アポトーシスが誘導されることを見いだした。また、パルミチン酸添加により、インスリンによるAktのリン酸化反応が著明に抑制されており、細胞レベルでのインスリン抵抗性が誘導されたと考えられた。さらにパルミチン酸添加による遺伝子発現の変化をマイクロアレイ法にて検討し、2倍以上増減している遺伝子をそれぞれ304、279個同定した。なかでも骨格筋機能、サルコペニアとの関連が報告されているPGC-1alphaや細胞老化との負の制御因子であるTERTの遺伝子発現がパルミチン酸投与により低下していることを見いだした。C2C12培養骨格筋細胞に対して、パルミチン酸を添加することにより、脂肪滴形成が生じるとともにインスリン刺激によるAktリン酸化上昇レベルが抑制された。すなわち細胞レベルでのインスリン抵抗性が誘導されることを明らかにした。つづいて、骨格筋細胞におけるSirt-1発現について検討するとともにその生理学的、病理学的役割についても検討をくわえた。また、イソプロテレノール添加やビタミンD3添加により、C2C12細胞から、神経栄養因子であるGDNFや血管新生因子であるVEGFの発現・分泌が上昇していた。マウスに4週間の運動負荷(トレッドミル)をおこなったところ、ヒラメ筋におけるVEGFの発現は上昇していた。

一方、下肢懸垂による廃用性筋萎縮モデルにおいてVEGFの発現は低下していた。内科学培養骨格筋細胞におけるSirt-1の発現について様々な検討をおこない、ビタミンD3によってSirt-1発現が上昇する可能性を示唆する結果をえたことから、研究はおおむね順調に進展していると判断できる。飽和脂肪酸添加による培養骨格筋細胞への影響をさまざまな面から検討できたことから、研究はおおむね順調に進展していると判断できる。パルミチン酸添加による骨格筋細胞のインスリン抵抗性に対し、ビタミンD3投与によりインスリン抵抗性が改善すること、Sirt-1発現が上昇することを明らかにした。今後は、ビタミンD3の代謝改善作用にSirt-1がどのように関わっているのか、そのメカニズムについて、細胞レベルとともに個体レベルにおいても検討をくわえる。Sirt1の遺伝子過剰発現や活性化薬により、パルミチン酸添加により誘導される細胞内脂肪酸蓄積、アポトーシス、インスリンシグナルの減弱、遺伝子発現の変化などがキャンセルできるかどうかを確認する。また、下肢懸垂や座骨神経切断による骨格筋萎縮、異所性脂肪蓄積マウスモデルをもちいて、培養細胞でみとめられた結果が、個体レベルでも認められるかどうかを検証する。また、Sirt1活性化薬投与によりそれらが改善するかどうかについても検討する。H25年度に計画していた動物実験の施行がおくれたため、次年度使用額が生じた。培養細胞をもちいた検討にくわえて、動物実験をおこない、個体レベルでの検証をおこなう。該当なし
非ダイオキシン様ハロゲン化合物の新たな毒性評価法の開発

1.本研究では非ダイオキシン型PCBで、肝、脂肪組織、血液、母乳などに高濃度検出される2,4,5-三塩素置換PCBであるCB118、CB138およびCB187の実験動物(ラット、ハムスター、モルモット)肝ミクロゾームによるin vitro代謝を調べた。その結果、モルモットで代謝活性が最も高く、また代謝パターンもラットやハムスターと異なっていた。モルモット肝により、CB118から2種類(2-OH-CB126,2-OH-CB77)、CB138から4種類(2'-OH-CB157,3'-OH-CB138,2種のOH-pentaCB)、CB187から3種類(4'-OH-CB178,4'-OH-CB151,4-CH-CB187)の代謝物が生成された。実際、置換塩棄が6個以上になると代謝速度は著しく遅かったが、当初の予想に反して、代謝物を十分検出することができた。2,4,5-三塩素置換PCBのうち、CB118,CB138およびCB153は共通して2-OH体が主代謝物であった。これは2,3-エポキシドを酸化中間体とした反応であり、2位の塩素が3位に転位したことを示唆している。一方、CB187の場合、代謝に関与する酵素(CYP2B18)は共通であったが、2-OH体の生成は見られず、4-あるいは4'-OH体が主であった。この結果は、3,4-あるいは3',4'-エポキシドを経由して代謝が進行していることを示唆しているが、前三者との違いが何によるのか現在のところ不明である。次に、モルモットにおけるCB187代謝物の血中および糞中への分布を調べた。CB187代謝物のうち、4-OH-CB187は哺乳動物の血中で最も高濃度で検出される代謝物である。モルモットにCB187を単回腹腔内投与し、投与後4日間の糞および4日目の血液を採取した。その結果、血中代謝物は4'-OHおよび4-OH体であり、一方、糞中代謝物は、4'-OH-hexaCBと4'-OH体であった。以上のことから、3種の代謝物のうち、4-OH体は選択的に血中へ、4'-OH-hexaCBは糞中へ、また、4'-OH体は血中と糞中の両方へと分布することが示唆された。2.さらに本研究では非ダイオキシン型PCBの毒性評価法開発の一環として、胎児培養法を用いたCB52、CB77およびCB118の毒性評価、すなわち培義中の胎児心拍動数および培養終了時の胎児の形態形成を調べた。CB118は、CB77やCB126等のcoplanar PCBと同様に、毒性等価係数0.0001が設定されている2,4,5-三塩素置換PCBである。ラット胎齢11.5日目の胎児を母獣より取り出し、48時間培養を行った。培養開始2時間後に、各PCB異性体を培養液中に10あるいは100ppmになるよう添加した。対照群にはDMSOのみを添加した。その結果、培養中の胎児心拍動数において、すべての処理群は対照群と全く同じであった。培養481時間後、CB52(10ppm)処理群では後肢に浮腫が認められたのみで、また100ppmにおいても曲尾などの異常のみであった。一方、CB118処理群では10ppmにおいては顔面部の出血や短尾が観察されたのみであったが、100ppmでは、前頭部発育遅延、上顎の低形成、口唇裂さらに全身性の発育遅延が確認された。またCB77(10ppm)処理群でも上顎の低形成や口唇裂が誘発され、100ppmではさらに全身性の出血なども認められた。以上の結果から、3種類のPCB異性体のラット胎児への毒性の強さは、WHOの毒性評価と一致して、CB77>CB118>CB52であることが明らかとなり、非ダイオキシン型PCBの毒性を特に感度よく検出できる評価法とはならなかった。

一方、CB187の場合、代謝に関与する酵素(CYP2B18)は共通であったが、2-OH体の生成は見られず、4-あるいは4'-OH体が主であった。この結果は、3,4-あるいは3',4'-エポキシドを経由して代謝が進行していることを示唆しているが、前三者との違いが何によるのか現在のところ不明である。次に、モルモットにおけるCB187代謝物の血中および糞中への分布を調べた。CB187代謝物のうち、4-OH-CB187は哺乳動物の血中で最も高濃度で検出される代謝物である。モルモットにCB187を単回腹腔内投与し、投与後4日間の糞および4日目の血液を採取した。その結果、血中代謝物は4'-OHおよび4-OH体であり、一方、糞中代謝物は、4'-OH-hexaCBと4'-OH体であった。以上のことから、3種の代謝物のうち、4-OH体は選択的に血中へ、4'-OH-hexaCBは糞中へ、また、4'-OH体は血中と糞中の両方へと分布することが示唆された。2.さらに本研究では非ダイオキシン型PCBの毒性評価法開発の一環として、胎児培養法を用いたCB52、CB77およびCB118の毒性評価、すなわち培義中の胎児心拍動数および培養終了時の胎児の形態形成を調べた。CB118は、CB77やCB126等のcoplanar PCBと同様に、毒性等価係数0.0001が設定されている2,4,5-三塩素置換PCBである。ラット胎齢11.5日目の胎児を母獣より取り出し、48時間培養を行った。培養開始2時間後に、各PCB異性体を培養液中に10あるいは100ppmになるよう添加した。対照群にはDMSOのみを添加した。その結果、培養中の胎児心拍動数において、すべての処理群は対照群と全く同じであった。培養481時間後、CB52(10ppm)処理群では後肢に浮腫が認められたのみで、また100ppmにおいても曲尾などの異常のみであった。一方、CB118処理群では10ppmにおいては顔面部の出血や短尾が観察されたのみであったが、100ppmでは、前頭部発育遅延、上顎の低形成、口唇裂さらに全身性の発育遅延が確認された。またCB77(10ppm)処理群でも上顎の低形成や口唇裂が誘発され、100ppmではさらに全身性の出血なども認められた。以上の結果から、3種類のPCB異性体のラット胎児への毒性の強さは、WHOの毒性評価と一致して、CB77>CB118>CB52であることが明らかとなり、非ダイオキシン型PCBの毒性を特に感度よく検出できる評価法とはならなかった。1.本年度は、まず非ダイオキシン類の1つであるCB118(2,4,5,3',4'-五塩素化ビフェニル)につき、ラット、ハムスターおよびモルモット肝ミクロゾームによるin vitro代謝について検討した。その結果、モルモット肝ではラットあるいはハムスター肝の10倍以上の強い代謝活性を示し、1種類の代謝物M-1が生成された。この構造は、別途合成した2-水酸化(OH)-3,4,5,3',4'-五塩素化ビフェニルとGCの保持時間およびマスフラグメンテーションがほぼ完全に一致した。なお、3-OH体はごくわずか遅れて検出された。さらに、有名なチトクロムP450(P450)誘導剤であるフェノバルビタール(PB)を前処理したモルモットではM-1の生成が著しく増加した。次に、モルモット肝でのP450分子種を明らかにするため、モルモッPB誘導性CYP2B18に対する抗体を添加したところ、M-1の生成はほぼ完全に阻害された。この結果から、モルモット肝でのCB118の代謝にはCYP2B18が強く関与することが明らかとなった。これまでに2,4,5-三塩素置換PCBであるCB138およびCB153の代謝を報告してきたが、モルモット肝では全く同じ水酸化機構、すなわち2,3-エポキシドを経由し、2位の塩素のNIH転位を伴った機構で進行しているものと考えられる。
GATA-1転写因子複合体の分子機能と生理機能

今年度は、LHX2はいかなる細胞内蛋白因子と作用し、血液前駆細胞の増殖と分化多能性維待に寄与しているかを検討した。従来のタッグ抗体による免疫沈降法やTAP法での結合蛋白の検出に比べ、ビオチンとstreptavidinの強い結合アフィニティーの点に着目した。そこで、N末にビオチン化シグナルペプチドを有する融合蛋白Bio-LHX2を作成した。このシグナルペプチドは大腸菌由来のBirAによって、特異的に認識されビオチン化する事が知られているため、はじめに293T細胞でこの系を検討した。BirAとBio-Lhx2を共発現したあと、western blotでBio-Lhx2は強く特異的にビオチン化される事が確認できた。次に、streptavidin beadsで293T細胞エクストラクトと混ぜ合わせ沈殿し、ゲルに流し染色したら、いくつかコントロールと異なるパンドが見られた。従って、同様の手法で、BirAとBio-LHX2を共発現する血液前駆細胞から、LHX2と結合する蛋白をマス解析により解明する事が可能と考えた。BirA発現ES細胞株を用いて、OP9ストロマ細胞との共培養を行い血液前駆細胞の段階で、Bio-Lhx2レトロウィルスで細胞を感染した。そのご、細胞はサイトカインなしの状態で培養した。三日から四日置きに血液細胞を新しいOP9ストロマ細胞に移り植え直した。植え直しごとに、一部の細胞をサンプリングし、ギムザ染色とサイトフローメトリーで評価し、血液前駆細胞の存在を確認した。結果、Bio-LHX2による、長期維持可能な血液前駆細胞を得る事ができなかった。一つ大きな可能性としては、N末のLHX2にビオチン化をすることによって、タンパク質のコンフォーメーションに変化が生じ、一部の機能が阻害されたり、増殖、及び、未分化性を維持するに必須な細胞内因子との結合できなくなったとが考えられる。現に、LHX2はN末端のLIMドメインを介してほかの蛋白と結合して機能するとの報告があるため。今後の改善点として、C末にビオチン化シグナルペプチドに置き換えるか、LHX2に特異的に認識する抗体を用いての免疫沈降で行う事が考えられる。本研究の目的は、造血細胞の自己複製能と分化多能性獲得メカニズムを解明することにある。これまで、GATA-1欠損ES細胞の研究により、GATA-1のloss of functionは、未分化の赤血球の自己複製亢進と多分化能力再獲得をもたらすことがわかっている。また、特定のタンパクと結合できないGATA-1は血液細胞の自己複製能と分化の破綻から白血病を引き起こす報告から、いろいろな分化状態におけるGATA-1転写因子複合体形成が正常の血液分化に必須であることが考えられる。(1)LHX2によるGATA-1転写因子複合体の形成阻害OP9システムを用いてES細胞から血液前駆細胞への分化誘導し、その過程において、LXH2の過剰発現を行い、試験管内における自己複製能と分化能の変化を解析した。その結果、コントロールと比べて、LHX2を過剰発現することによって、血液前駆細胞をノーサイトカインの培養条件下で長期維持する事ができた。また、この血液前駆細胞は、サイトカイン刺激により、マスト細胞、好中球などのmyeloid系細胞にも分化する。同様のOP9システムで、赤血球分化への影響を調べた結果、LHX2が過剰発現した際も、コントロールと比べ、分化と成熟への影響は認められなかった。また、巨核球の分化においては、最終分化の段階に障害がみられ、血小板の形成が阻害されている事がわかった。(2)LHX2によるGATA-1転写因子複合体の形成阻害これまで、ヒト腎上皮がん細胞株293T細胞において、LHX2は、LMO2の分解を促進する事、および、GATA-1/SCL/LMO2の複合体形成を阻害しうることをみいだした。そこで、血液細胞においても同様な分解機構が存在するかを明らかにするため、現在、マウスの赤血球癌細胞株MEL細胞を用いて調べる事を計画中であります。MEL細胞には内在性のGATA-1、SCL、LMO2を発現している事から、GATA-1/SCL/LMO2の複合体が存在すると考えられる。したがって、LHX2を過剰発現する事によって、LMO2の分解促進とGATA-1/SCL/LMO2複合体形成阻害を引き続き調べる予定であります。BirA発現ES細胞株を用いて、OP9ストロマ細胞との共

培養を行い血液前駆細胞の段階で、Bio-Lhx2レトロウィルスで細胞を感染した。そのご、細胞はサイトカインなしの状態で培養した。三日から四日置きに血液細胞を新しいOP9ストロマ細胞に移り植え直した。植え直しごとに、一部の細胞をサンプリングし、ギムザ染色とサイトフローメトリーで評価し、血液前駆細胞の存在を確認した。結果、Bio-LHX2による、長期維持可能な血液前駆細胞を得る事ができなかった。一つ大きな可能性としては、N末のLHX2にビオチン化をすることによって、タンパク質のコンフォーメーションに変化が生じ、一部の機能が阻害されたり、増殖、及び、未分化性を維持するに必須な細胞内因子との結合できなくなったとが考えられる。現に、LHX2はN末端のLIMドメインを介してほかの蛋白と結合して機能するとの報告があるため。今後の改善点として、C末にビオチン化シグナルペプチドに置き換えるか、LHX2に特異的に認識する抗体を用いての免疫沈降で行う事が考えられる。
ＡＳＰＬ－ＴＦＥ３標的分子の同定による胞巣状軟部肉腫分子病態の解析

本研究課題では、ASPL-TFE3キメラ遺伝子の標的遺伝子を同定し、その肉腫発生における生物学的役割を検討した。その結果、ASPL-TFE3標的遺伝子としてp21とシグナル伝達関連因子を同定した。ASPL-TFE3はp21を介して細胞老化ならびに細胞老化関連分泌現象(SASP)関連因子の発現を誘導した。また、シグナル伝達関連因子を介して、シグナル伝達系の異常と細胞運動性の亢進を惹起した。以上より、ASPL-TFE3は標的遺伝子を介して細胞老化やシグナル伝達系の異常を誘導し、肉腫の発生および病態に寄与することが示唆された。本研究課題は、胞巣状軟部肉腫特異的融合遺伝子であるASPL-TFE3が転写因子として機能する点に着目し、ASPL-TFE3がその標的遺伝子の転写制御を介して腫瘍細胞に与える生物学的影響を解明することを計画している。本年度は、ASPL-TFE3標的遺伝子の同定を目指して以下の実験を実施し、結果を得た。1、ASPL-TFE3発現プラスミド(FLAGタグを有する)を培養細胞株にトランスフェクトし、抗FLAG抗体を用いて免疫沈降を行った。そして、これまでの研究により予想されている標的遺伝子候補群のプロモーター領域に対するプライマーで増幅、検出を行った(クロマチン免疫沈降法)。その結果、ASPL-TFE3が結合すると考えらえるプロモーター領域を有する遺伝子(標的遺伝子)2個を単離した。2、単離した標的遺伝子が実際にASPL-TFE3による転写制御を受けるか解析を行った。標的遺伝子のプロモーター領域をレポータープラスミドとして培養細胞にトランスフェクトし、ルシフェラーゼアッセイにより転写活性能を検討した。その結果、本研究課題で単離した2個の標的遺伝子プロモーターは、ASPL-TFE3によりコントロールと比較して転写活性が数倍程度上昇することが証明された。以上より、本年度の研究成果としてASPL-TFE3標的遺伝子2個を同定した。さらに、同定したこれら標的遺伝子に対しASPL-TFE3が転写制御活性を有していることを証明した。次年度以降は、本年度に単離した標的遺伝子がその下流シグナルや腫瘍細胞の生物学的動態に及ぼす影響について検討する予定である。本研究課題は、胞巣状軟部肉腫特異的融合遺伝子であるASPL-TFE3が転写因子として機能する点に注目してASPL-TFE3が標的遺伝子群の脱制御を導くことで腫瘍細胞に与える生物学的影響を解析し、胞巣状軟部肉腫の病態に対する理解を深めることを目的としている。本年度は、昨年度に同定したASPL-TFE3標的遺伝子候補群が、下流シグナルおよび腫瘍細胞の動態に与える影響について検討を行い、以下の結果を得た。1、ASPL-TFE3標的遺伝子のさらなる同定を試み、新たな候補遺伝子2個を同定した。2、ASPL-TFE3安定発現細胞株を用い、ASPL-TFE3の存在下または非存在下における標的遺伝子候補群の発現を、リアルタイムPCR法ならびにウエスタンブロット法で検討した。その結果、ASPL-TFE3存在下で増殖因子を含む幾つかのASPL-TFE3標的遺伝子候補の顕著な発現上昇を認めた。以上より、本年度の研究成果として新たなASPL-TFE3標的遺伝子候補を同定するとともに、ASPL-TFE3による標的遺伝子候補の発現誘導を実証した。また、ASPL-TFE3はMAPKおよびAktシグナル経路の活性亢進を導くことで、腫瘍の増殖や進展に寄与する可能性を確認した。本研究は、胞巣状軟部肉腫における特異的融合遺伝子ASPL-TFE3の標的遺伝子を明らかにすることで、胞巣状軟部肉腫の病態を解明することを目指している。昨年度までの研究によりいくつかのASPL-TFE3標的遺伝子群を同定したことから、本年度はASPL-TFE3標的遺伝子が腫瘍細胞の生物学的動態に与える影響について解析を行い、以下の結果を得た。1、ASPL-TFE3標的遺伝子として細胞周期関連因子を同定したことから、ASPL-TFE3が細胞増殖に与える影響について解析を行った。ASPL-TFE3発現誘導細胞株において、ASPL-TFE3発現細胞は非発現細胞に比べ、細胞の増殖が抑制され、細胞周期の遅延が認められた。また、ASPL-TFE3の発現により細胞老化が誘導されることを見出した。ASPL-TFE3がその標的遺伝子群の脱制御を介して、細胞周期の調節や細胞老化の誘導に関与することを見出した。さらにASPL-TFE3の標的遺伝子が、多くの癌において腫瘍化との関連が指摘されている増殖因子シグナルの増強を導くことを確認するなど、おおむね順調に進展している。前年度までに、胞巣状軟部肉腫特異的融合遺伝子であるASPL-TFE3が標的遺伝子を介して細胞老化誘導に関与するという、当初予想していなかった新たな知見を得ることができた。細胞老化は癌抑制機構として知られているが、近年では癌化の促進にも寄与することが報告されており、腫瘍病態への関与が予想された。そこで本年度は当初の計画を変更し、ASPL-TFE3による細胞老化誘導が腫瘍細胞に及ぼす生物学的影響を中心に解析を行った。間葉系幹細胞を用いたASPL-TFE3安定発現細胞株(UE7T/TR-AT細胞株)ではASPL-TFE3の発現により、p21の発現上昇ならびに、老化細胞に特徴的なSA-β-Gal活性の顕著な上昇が認められた。

一方、293細胞を用いたASPL-TFE3安定発現細胞株(293/TR-AT細胞株)では、ASPL-TFE3の発現によりp21発現は上昇したが、SA-β-Gal活性に変化は認められなかった。したがって、ASPL-TFE3は細胞背景依存的に細胞老化を誘導することが示された。さらに、UE7T/TR-AT細胞ではASPL-TFE3発現により、IL1やIL6、IL8など複数の炎症性サイトカインの発現が上昇しており、細胞老化関連分泌形質(SASP)と呼ばれるがん化の促進につながる現象が誘導されていることが示唆された。前年度までに同定したASPL-TFE3標的遺伝子が、腫瘍細胞の運動能に与える影響について検討を行った。ASPL-TFE3陽性細胞FU-UR1に標的遺伝子のsiRNAを導入し、migration assayを行ったところ、FU-UR1細胞の運動能が抑制されることが明らかになった。本研究課題の進展にともない、ASPL-TFE3融合遺伝子が細胞老化を誘導するという当初予想していたかった新たな知見を得ることができた。この知見を使用し、十分な研究成果を得るため、当初の研究計画を見直す必要が生じた。その準備や調整、実験条件の設定などに時間を要し、研究の進捗がやや遅れたことから、補助事業期間を延長した。胞巣状軟部肉および一部の腎細胞癌で認められるASPL-TFE3融合遺伝子は、転写因子として機能し、その標的分子は腫瘍発生に関与することが指摘されている。本研究課題では、ASPL-TFE3標的分子を同定し、その分子機能を解析することで腫瘍発生のメカニズムを明らかにすること目指している。これまでに、ASPL-TFE3がAktならびにMAPKシグナル伝達系に含まれるシグナル伝達関連因子を直接の標的分子とし、これらシグナル伝達系の活性に影響を及ぼすことを見出した。そこで本年度は、この標的分子が腫瘍の悪性度や転移能に与える生物学的影響について内因性ASPL-TFE3発現細胞(FU-UR1細胞)を用いて解析を行った。FU-UR1細胞にシグナル伝達関連因子のsiRNAを導入しその発現を抑制したところ、Aktのリン酸化レベルが低下し、下流シグナル因子の活性も減少した。さらに、シグナル伝達関連因子のsiRNAを導入したFU-UR1細胞では、コントロールsiRNAを導入した細胞と比べ、細胞遊走能および浸潤能が著しく低下していた。また、シグナル伝達関連因子の発現抑制によりFU-UR1細胞の細胞接着性と足場非依存性のコロニー形成能が抑制された。以上より、ASPL-TFE3融合遺伝子は直接の標的分子であるシグナル伝達関連因子を高発現に導くことにより、AKT/PI3kシグナル伝達系の異常を誘導することが明らかとなった。また、ASPL-TFE3は本シグナル伝達関連因子を介して、腫瘍細胞の運動能や転移能を促進することが明らかとなり、腫瘍の悪性度や転移能に寄与する腫瘍化促進メカニズムの1つであることが示唆された。本研究課題では、ASPL-TFE3キメラ遺伝子の標的遺伝子を同定し、その肉腫発生における生物学的役割を検討した。その結果、ASPL-TFE3標的遺伝子としてp21とシグナル伝達関連因子を同定した。ASPL-TFE3はp21を介して細胞老化ならびに細胞老化関連分泌現象(SASP)関連因子の発現を誘導した。
マウスケラチノサイトの合成するVIII型コラ-ゲンcDNAのクロ-ニング

培養マウスケラチノサイト(10^8個)より塩酸グアニジン法を用いて、total RNA約100μgを抽出した。さらにOligodTカラムによりpolyARNA約10μgを単離した。Gubler and Hoffmanらの方法を用いてλgt11をベクタ-として(cDNAライブラリ-を作製した。ライブラリ-のスクリ-ニングの方法として(1)ケラチノサイトの合成する110kdのコラ-ゲンの抗体作製を試みた。ケラチノサイトにより110kdコラ-ゲンが活発に培養ミディアム画分に分泌されているのでミディアム画分よりDEAEクロマトグラフィ-などを用いて精製を試みたが微量のため抗原として使用できる程回収されなかった。次の方法として(2)合成オリゴヌクレオチドの作製を試みた。110kdコラ-ゲンを含む粗精製画分をSDSアクリルアミドゲル電気泳動後、Immobilon-Pにブロットし、110kdコラ-ゲンバンドを切り出し直接、Matsudairaの方法によりアミノ酸配列を決定することを試みた。しかしN末端がブロックされていたため決定不可能であった。さらに110kdコラ-ゲンをペプシン処理して得られる50kdについて同様の方法を用いて、アミノ酸配列決定を試みている。もしアミノ酸配列(少なくとも5-6残基)が決定できればこれに対応するオリゴヌクレオチド(あるいはそのmixture)を合成でき、これをプロ-ブとしてcDNAライブラリ-をスクリ-ニングできると思われる。