hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新機能包材のための微細孔ガス透化モデル構築と食品包材の熱特性の解明

ミクロン単位の大きさの孔を開けた微細孔フィルムによる包装は、青果物の呼吸量に合わせて孔の大きさと数を調整できるために、ニラをはじめとする多くの青果物で鮮度保持効果が認められている。しかし微細孔フィルムの利用においては、あらかじめフィルムに加工が必要であり、価格が高くなること、水滴の付着によりガス透過度が低下することなどが指摘されてきた。昨年までは、厚さ25μm、大きさ85mm×600mmのOPP袋で、シール幅を4mmとして、0.4mmのシール部と0.6mmの非シール部を繰り返し、袋あたりの空隙数を600ヶ所とするパーシャルシール包装にニラの鮮度保持効果があることがわかった。これを他の青果物にそのまま利用しようとしても、青果物の呼吸特性が異なるため十分な鮮度保持効果を得ることができない。そこで本年度は包装材料の種類、歯形の形状を変えることにより空隙部のサイズ及びシール部の強度を自在に変更することができることを確認した。例えば、ポリスチレンフィルムを使った場合は空隙部が大きく、シール強度も強くなることがわかった。また、シール形状を縦目から斜め目に変えることにより空隙部の面積を増やし、強度もあるシールを作ることができた。これにより小ネギなどニラより呼吸量の多い青果物へもパーシャルシール包装が適応可能であることを確認できた。さらに、OPPフィルムであってもメーカーやタイプの違いにより熱特性(最適ヒートシール温度帯やシール強度)が大きく異なり、それによりシール機の設定温度やシール速度などを調整する必要があることがわかった。ヒートシール条件(温度、ロール圧、運転速度など)と空隙間隔、シール強度などのフィルムの加熱特性について十分把握されていない。そこで、ヒートシールを行う際の容着面(現状ではヒートバーの温度で制御を行っているだけで、実際の容着面の温度や圧着圧を計測している報告、機械は皆無である)での熱特性の解明を行い、新しい機能性を有した包装資材の低コストで効率的な製造手法を確立することを目的とした。1.シール形状とヒートシール強度の関係について検討した。シール部0.4mm、空隙部0.6mmの標準タイプに対して、シール部と空隙部の割合を同じにしてシール部1.6mm、空隙部2.4mmまで広げてもヒートシール強度にはほとんど影響はなかった。また、空隙部を0.6mmとしてシール部を0.4mmから大きくしてもヒートシール強度にはほとんど影響はなかった。2.シール幅とヒートシール強度の関係について検討した。シール幅に比例してヒートシール強度は大きくなった。3.異なるメーカで同程度の4種類のOPPフィルムのヒートシール強度を測定した。立ち上がりの温度、ヒートシール強度ともにフィルムにより大きく異なることがわかった(カタログ値とはかなり異なっていた)。4.空隙部分の形状は温度、ロール圧、運転速度で一義的に決定されるものと考えていたが、ローラー表面凸部のエッジによる圧力により開口部が形成されることがわかり、ロール表面形状にも大きく依存することが明らかとなった。
芸術家との協働によるワークショップ型授業における教師の実践力育成プログラムの開発

本研究は、ワークショップ型授業を実践できる教師の育成方法について明らかにすることを目的としている。「正解のない課題を参加者が全員で探究する」というワークショップにおける学びの特性を踏まえ、このプロセスが可視化されやすい芸術家との協働による授業を対象として、ワークショップ型授業を行う教師に求められる力、教育実践の意味づけ、コミュニケーション観について検討した。また、教師を目指す学生及び現職教員を対象として、ワークショップ型授業の実践力育成プログラムを開発した。「正解のない課題を参加者が全員で探究する」というワークショップにおける学びの特性を踏まえ、このプロセスが可視化されやすい芸術家との協働による授業に焦点を当てて、ワークショップ型授業における教師の実践力を明らかにするとともに、ワークショップ型授業の実践力を育成する方法について検討を行う。今年度は3年間の研究期間の中で準備段階に相当する年度であり、1.ワークショップ的な授業実践の事例収集、2.教員養成系大学での体験的な学習活動における学習過程の検討を行った。1.ワークショップ的な授業実践の事例収集総合的な学習や伝統文化の教育として現在実施されており、ワークショップ型授業に類似する授業実践について、現地調査や研究会等を通して情報収集を行った。2.教員養成系大学での体験的な学習活動における学習過程の検討(1)授業担当者として関わっている「表現」の授業を対象として事例研究を行った。芸術家との協働による授業を計画、実施し、振り返りレポートの分析から学生の学習過程について検討した。(2)体験学習を重視した教員養成プログラムについて、プログラム内容や成果、体験による学生の学びの過程について情報収集を行った。今年度は3年間の研究期間の中で、プログラムを開発する段階と位置付けており、1.ワークショップ的な授業実践の事例収集、2.教員養成系大学での体験的な学習活動における学習過程の検討、3.現職教員が自身の教育実践を振り返るプログラムの開発を行った。2.教員養成系大学での体験的な学習活動における学習過程の検討授業担当者として関わっている「表現」の授業を対象として事例研究を行った。芸術家との協働による授業を計画、実施した。今年度は学生の振り返りを促すため、従来のレポートに加えて、最終回に相互インタビューの活動を導入し、その効果について検討した。3.現職教員が自身の教育実践を振り返るプログラムの開発ワークショップの手法を取り入れ、現職教員が自身の教育実践の根底にある価値観、強みや課題に気付き、これからの取り組みを明確にすることを目的とした、半日のプログラムを計画、実施した。今年度は3年間の研究期間の中で、プログラムを実施し評価する段階と位置付けており、1.ワークショップ的な授業実践の事例収集、2.教員養成系大学での体験的な学習活動における学習過程の検討、3.教員養成系大学でのワークショップへの理解を促す授業の開発を行った。芸術家との協働による授業を計画、実施し、振り返りレポートの分析から学生の学習観の変容について検討した。3.教員養成系大学でのワークショップへの理解を促す授業の開発教員を目指す学生を対象として、ワークショップ型授業における学びについて理解することを目的とした授業を計画、実施し、プログラムの評価を行った。3年の研究期間の前半は、ワークショップ型授業の実践力育成プログラムの開発に向けた準備段階と位置付けている。2年目である本年度は、ワークショップ的な授業実践の現状把握に加え、学生と現職教員に対してワークショップの手法を取り入れたプログラムを開発し実施することができたため、おおむね順調に進展しているといえる。教育心理学今後は、ワークショップ型授業を実施する教師に求められる能力やリソースについての調査結果を、論文にまとめ発表する。また、調査結果に基づいて、ワークショップ型授業の実践力育成プログラムを実施し、プログラム評価を行う。

研究3年の研究期間の前半は、ワークショップ型授業の実践力育成プログラム開発に向けた準備段階と位置付けている。1年目である本年度は、ワークショップ的な授業実践の現状把握と、教員や教員志望の学生を対象としたプログラム開発のための予備的な分析を実施できたため、おおむね順調に進展しているといえる。教員向けのプログラムにおいて芸術家の招聘を予定していたが、今年度は教育実践の振り返り手法に焦点を当ててプログラム設計を行ったため、プログラム実施協力者及び芸術家の旅費と謝金の使用がなかった。また、研究の進捗状況に鑑み、研究成果を公表するためのホームページの作成を次年度に行うこととしたため。今後は、ワークショップ型授業の実践者へのインタビューやワークショップ実践家養成プログラムの訪問調査などを通して、ワークショップ型授業を実施する教師に求められる能力やリソースについて分析を行う。また、教師や教師を目指す学生がワークショップについて学ぶプログラムを開発し、試行する。810月頃に芸術家を招聘してプログラムの実施を予定しており、旅費と謝金として使用する。また、10月以降に研究成果を公表するためのホームページを開設する予定である。3月中に資料整理の謝金として使用する予定であったが、諸事情により作業が4月以降にずれこんだため。資料整理の作業を4月中に実施し、謝金として使用する予定である。
口腔病変におけるオーダーメイド医療実現化に向けての研究

頭頸部の癌は世界の癌の6番目に多い癌である。癌による死の主な原因は化学療法に抵抗性を示す転移を形成する原発巣からの散布である。cDNAマイクロアレイは新しいマーカや治療の標的分子を発展させる遺伝子を同定する有力な方法である。よって我々は9729スポットしたcDNAマイクロアレイを作製した。さらに,新しく樹立した歯肉癌細胞株も含めていくつかの口腔癌細胞株の転移能を同所性移植法にて検討した。我々はcDNAマイクロアレイのスライドを使用し,非転移性癌細胞のmRNAと転移性癌細胞のmRNAを比較検討した。我々は非転移性癌細胞に発現し,転移性癌細胞に発現しない9つの遺伝子を同定した。転移性癌細胞に発現し,非転移性癌細胞に発現しない3つの遺伝子を同定した。数回解析をおこない同様の結果を得た。同じ検体を使用し,アフィメトリクス製の54525種類遺伝子がのったオリゴヌクレオチドのマイクロアレイ解析を行った。206遺伝子が非転移性癌細胞のみに発現し,434遺伝子が転移性癌細胞のみに発現した。発現の様式と臨床病態の比較検討を行い,転移に関与する遺伝子の選定を行っている。これらのゲノムの広い解析は特定の腫瘍マーカや治療の標的分子を同定し,オーダーメイド医療の確立に有用な情報を与えてくれる。ヒト肝臓由来のアレイ(15000個)ならびにヒト白血球由来のアレイ(15000個)によるマイクロアレイ解析を行った。本研究者樹立の同所性移植法にて浸潤・転移能に相違のあるヒト舌癌由来の癌細胞株間のマイクロアレイ解析を行い,約200種類の遺伝子の発現の相違を認めたので,シークエンスを行った。転移関連分子同定のために,患者のリンパ節転移巣におけるそれらの遺伝子ならびにそのタンパク質の発現について現在検討を行っている。患者の検体よりTotal RNAを抽出しマイクロアレイ解析を行ったが,RNAの収率が悪いため条件等を検討し,解析可能なレベルまで達した。上記マイクロアレイ解析にて解析した結果,病変部(癌部等)と正常組織での遺伝子の発現は個人によりかなり相違(個性)があることがわかったので,上記30000種類のアレイの塩基配列を明らかにする必要性が生じた。ヒトの遺伝子は約30000種類と言われ,その中で機能をしているものは,1500017000種類と考えられる。そこで,配列のわかった15000種類のアレイを作製し,重要な遺伝子をすべて網羅することによりマイクロアレイ解析システムの充実をはかることとした。現在ほぼ完成に近ずいているので,この新しいシステムにて患者の口腔病変部のマイクロアレイ解析を行う。同所性移植法にて浸潤・転移能に相違のある舌癌細胞株と歯肉癌細胞株のマイクロアレイ解析を行った。舌癌細胞株においては転移性癌細胞株群と非転移性癌細胞株群ではそれぞれの群で遺伝子の発現パターンが類似していたが,舌癌細胞株と歯肉癌細胞株では発現パターンが違っていた。非転移性癌細胞株にて発現し転移性癌細胞株にて発現していない遺伝子(転移抑制候補遺伝子)のほうが,転移性癌細胞株で発現し非転移性癌細胞株にて発現していない遺伝子(転移関連候補遺伝子)よりはるかに多かった。また患者の検体でも原発の部位(舌,歯肉等)により発現パターンが違うことや個人により遺伝子の発現に相違があること,採取時の条件にてRNAの破壊を認めるものがあり,マイクロアレイ解析ができない症例もあったので,共通性を検出するためにはかなりの症例数が必要であった。患者の検体からの転移抑制候補遺伝子の検出は,上記癌細胞株間の解析と比較し容易ではなかった。これは原発巣での採取部位の問題と転移巣ではこれらの遺伝子は検出できないことによると考えられた。また解析結果から得られた遺伝子(デスモコリン3,HOXD3等の遺伝子)の機能的解析のためにトランスフェクタントを作製し,癌細胞株の形質の変化を検討している。

なお我々のマイクロアレイ解析システムは昨年より配列のわかった15000種類のアレイシステムにきりかえていたが,オリゴの質的問題のため作製が遅延したので,当初施行していたヒト肝臓由来のアレイ(15000個)とヒト白血球由来のアレイ(15000個)を使用し,得られた有用な遺伝子はシークエンスにて同定した。
小脳特異的分子欠損マウスを用いた脳システム階層的相互作用の解析

本研究では小脳選択的に障害を持つミュータントマウス(GluRδ2 KO mice)を用いて海馬依存的な運動学習(瞬目反射条件付け)を研究し、小脳と上位中枢(大脳皮質、海馬)の階層的相互作用を明らかにすることを目的とした。GluRδ2 KO miceにおける海馬θ波の異常については、解析をさらに進め、その成果を発表した(Takatsuki et al. Brain Res.)。また、NMDA受容体阻害薬であるMK-801によるGluRδ2 KO miceの学習の阻害について研究を進め、その成果を発表した(Kato et al., Neuroscience)。さらに、GluRδ2 KO miceと同様の小脳非依存的学習メカニズムが、野生型マウスにおいても見られるかどうかを調べるために、小脳破壊(中位核の電気破壊もしくは小脳の吸引除去)した野生型マウスの学習能力を検討した。その結果、記憶獲得後に小脳破壊した場合には形成された記憶が大きく障害されるが、その後、再学習することが明らかとなった。学習前に破壊した場合には、破壊後の回復期間が3日間の場合には記憶獲得が大きく障害されるが、回復期間が2週間の場合には対照群と同等の学習能力を示すことが明らかとなった。以上の結果は、野生型マウスは小脳が機能している場合には小脳依存的に学習するが、小脳機能が大きく障害されている場合には、それ以外の学習メカニズムを用いることを示唆している。この学習に対する海馬の関与を調べるために、小脳破壊を行った野生型マウスを学習させ、その後に海馬を破壊し、記憶の保持を検討した。その結果、対照群と同等の記憶の保持が見られた。この結果は、海馬は少なくとも記憶の保持および想起には関与していないことを示唆している。現在、海馬以外の部位の関与の検討を行っている。
MSMDの新規責任遺伝子同定と多発性骨髄炎発症に関与する分子病態解析

本研究課題では、MSMD(mendelian susceptibility to mycobacterial diseases)患者を対象に既知の責任遺伝子群の解析、次世代シーケンサーを用いたエクソーム配列解析による新規責任遺伝子の同定、慢性再発性多発性骨髄炎(CRMO)患者を対象にMSMDの責任遺伝子群の解析を試みたが、研究期間の短縮のため、多発性骨髄炎を認めるMSMDの1家系5症例において、STAT1新規遺伝子変異(G250E)を同定できたのみであった。本変異は慢性皮膚粘膜カンジダ症(CMCD)をフェノタイプとする症例で報告が多いCoiled Coilドメインに変異を認めていたが、これまでに報告されているMSMD-STAT1異常症と同様にIFN-γ刺激に対するGAS転写活性の優性阻害効果を認めた。本症例では病変部よりBCGが検出されており、GAS転写活性の障害による細胞内寄生菌(マイコバクテリウムやBCG)への易感染性が示唆された。MSMD患者における多発性骨髄炎の病態解析に関しては、これまでに当院で同定しているMSMD患者(STAT1異常症、IFNGR1異常症)の末梢血より分離したCD14陽性細胞を用いて、破骨細胞への分化を確認した。IFN-γ存在下で、正常検体では破骨細胞の分化が抑制されたが、患者検体ではIFN-γ存在下でも破骨細胞の分化は抑制されず、IFN-γシグナル伝達障害による破骨細胞の活性化が示唆された。
胎児プログラミングのエピゲノミクスを中心としたオミックス解析による探索的研究

低出生体重児群(LBW)36例と正常出生体重児群120例の2群に分け、グリコブロッティング法により糖鎖発現プロファイルを網羅的に比較することで、低出生体重児の特徴を検討した。全部で35種のN-グリカンが検出された。これらのうち、G3414はロジスティック回帰でLBWとSGAの両方と相関していた。G1915, G2744, G3049、G3719はLBWと関連していた。前向きの追跡調査で、これら5種の全てが生後6ヶ月と18ヶ月での速い体重増加と関連しており、構造的に2つの異なるカテゴリーに入るものであった。劣悪な胎児環境や生後の急峻な体重増加の予測因子として有用と考えられた。以下の2つの実験系の試料を対象として、エピゲノミクスを中心にオミックス解析を網羅的に解析していくことによって、妊娠時に形成される胎児プログラミングの実態、成長過程における変化を追跡検討することを計画した。実験系1の対象は、既に糖負荷試験結果を含めて得られた表現型の特徴が判明している111人である。市中病院の出生記録データベースから、19801990年に極低出生体重児(出生時の体重が1500g未満)として生まれた628人の中で現在も生存している399人に手紙で本研究への参加を依頼した。その結果、98人が住所の変更などで手紙が届かないなどの理由で、最終的に被験者として111人から同意が得られた(年齢構成:1930歳)。この保存検体を使用する計画であったが、学内工事中の事故により予期せぬ停電が発生し、保存試料が被害を受けてしまったため、解析ができなかった。実験系2としては、前向きコホート研究を実施するための研究試料収集を計画した。すなわち、出生体重を含めた母胎側因子、胎児側因子を詳細に検討して、それぞれの個体で前向きに解析する。周産母子センターの協力を得て、アンケート調査票および計測結果の記載票を作成する。母体の身長、体重、血圧などを定期的に計測し、食習慣、喫煙習慣、飲酒週間についても調査する。試料としては、分娩時に胎盤、臍帯血を採取する。児の出生後は成長曲線を追跡しつつ、隔年で採血検査を行う。このうち、児の採血は諸般の事情から無理であることがわかった。別途、胎盤などの組織があることがわかったので、倫理委員会の承諾を得て、パイロットスタディとして開始することとした。胎児期の環境が出生後の生活習慣病の素因を形成するという胎児プログラミング仮説がある。出生時、低体重だった子供は体脂肪が増えやすくなり、また大人になってからも2型糖尿病、高血圧などといった病気を引き起こしやすくなるというものである。そのメカニズムとして、子宮内環境を反映し、胎児体内でエピゲノムの変化により倹約遺伝子を発動するため、出生後もそれが持続し生活習慣病になりやすいという仮説を構築した。そこで我々は低出生体重児の成人後の耐糖能の研究を発展させオミックス解析を行うと共に、新しく出産から児の成長過程を追跡する前向きコホート研究を計画した。昨年度の報告書に記載したように、予定していた保存検体が事故による停電で使用できなくなってしまったため、別の研究室から出生体重の情報の付随した臍帯血を使用させてもらい、その時に既に表現型として異なる性質が発現していないかどうかを調べる実験系を計画し、グライコミクスを検討対象とした。北大の西村教授の開発したグライコブロッティング法によって、糖鎖のみを特異的に回収し、N-グリカンに焦点を絞って、低出生体重児群(出生時体重2500g未満)36例と正常出生体重児群(出生時体重27503250g)120例の2群に分けて、グライコブロッティング法により糖鎖発現プロファイルを分析した。現在、結果を臨床情報などとも照合しつつ、解析している。低出生体重児(LBW; <2500 g)、不当軽量児(SGA),急峻な体重増加のような、将来に心臓・内分泌疾患になる危険性を示す定量的なバイオマーカーは、先制医療や予知医療に役立つ。糖鎖構造は細胞基質相互作用、蛋白質の立体構造、受容体との結合、蛋白質の生物学的半減期などで重要な役割を有しているため、臍帯血のN-グリカンのプロファイルはそのバイオマーカーとして期待される。そこで、臍帯血のN-グリカンが幼児期のLBWやSGA、体重増加を含めた胎児の劣悪な環境を規定する因子としての関連性を、網羅的なグライコミクス解析で調べた。

今回は、低出生体重児群(出生時体重2500g未満)36例と正常出生体重児群(出生時体重27503250g)120例の2群に分け、2群間の母体の年齢に有意差はないようにランダムに選択し、グライコブロッティング法により糖鎖発現プロファイルを比較検討した。本法は、糖鎖を選択的に捕捉し回収した後、MALDI-TOF-MSによって大規模に網羅的に糖鎖を解析できる。全部で35種のN-グリカンが検出された(m/z 1362.481-3865.407)。これらのうち、G3414はロジスティック回帰でLBWとSGAの両方と相関していた。G1915, G2744, G3049、G3719はLBWと関連していた。前向きの追跡調査で、これら5種のN-グリカンは全てが生後6ヶ月と18ヶ月での速い体重増加と関連していた。これらのN-グリカンは構造的に2つの異なるカテゴリーに入るものであり、フコシル化された2または3アンテナ型N-グリカンとフコシル化のない3または4アンテナ型N-グリカンであった。これらの生理学的意義については不明であるが、劣悪な胎児環境や生後の急峻な体重増加の予測因子として有用ではないかと考えられた。26年度が最終年度であるため、記入しない。臨床検査医学26年度が最終年度であるため、記入しない。当初予定していた一つの柱である既存の保存検体を使用した実験は、学内工事中の事故により予期せぬ停電が発生し、保存試料が被害を受け解析ができなかったため。当初予定していた保存検体が不慮の停電で使用できなくなってしまったため、計画していたゲノム、エピゲノムの解析は中止とし、別途、他の研究室で研究目的に保管されていた出生時の記録のある臍帯血の血清をいただいて、グライコミクス解析を行った。膨大な生データが得られている。学内の他グループに適当と考えられる保管試料があることが判明したため、倫理委員会の承認の元、その保管試料を使わせてもらって共同研究を行う。生合成経路における個々の糖鎖の関係を考慮したグライコミクスは、疾患バイオマーカーとしての糖鎖の探索のみならず、それぞれの病態による糖タンパク質生合成メカニズムへの影響を考察する上でも重要であり、糖鎖の生合成に関わる酵素の増減をも推察させ、酵素蛋白量のバランス、すなわちプロテオミクスの解析、トランスクリプトミクスの解析にも繋がるものと期待される。最終年度であるため、得られた成果をとりまとめ、成果の発表を論文として行う。前年度使用できなかった予算も含めて、保存検体を用いたオミックス解析に使用する。当初予定していた保存検体が不慮の停電で使用できなくなってしまったため、計画していたゲノム、エピゲノムの解析を行うことができなくなった。従ってそれらに使用する予定であった消耗品などの購入は控えてグライコミクス解析に使用したが、若干予算が少なくてすんだため。最終年度に押さえと確認の実験にあてる予定である。
がんや慢性疾患患者のための色彩映像によるストレス緩和媒体の開発

好みの色彩映像は非活動的快などのポジティブな感情を有意に上昇し(p<0.05),抑うつ・不安などのネガティブな感情を有意に抑え(p<0.05),ストレス指標の(CgA)の有意な低下(p<0.05)をもたらして,感情状態を副交感神経優位な状態にする効果が示唆された。また、好みの単色彩光も「非活動的快」の有意な上昇(p=0.025)や,CgA値の有意な減少をもたらし,感情状態をポジティブに変えることが示唆された。本研究はがんや骨髄移植など慢性的ストレスやうつ状態下にある患者のストレスを色彩映像を用いて緩和し、治癒力の消耗を抑えるためのセルフケア媒体を開発することを最終目的としている。本年度はまず、1)自然の色彩映像のデータベースを作成すること2)感情状態に適した映像選択ができる選択プログラムソフトの開発3)ストレス下にある成人被験者へのパイロットスタディの実施4)パイロットスタディの結果の分析を主な研究実施内容とした。1)に関しては2名の自然の写真家によってそれぞれDVD7枚の自然の映像が撮られ、それらを色彩分類し、5彩色の映像データベースがほぼ目標に達成した。また2)の色彩映像を被験者のその時の感情状態に合わせて選択できるプログラムソフトの開発を進め、パイロットスタディの実施に供した。しかし選択時の操作の簡素化や映像表出のスムーズさなどの点で、まだまだソフト開発には改善すべき点が明らかになった。次年度の継続課題とする。3)のパイロットスタディは24人の学生に被験者内計画で色彩映像を選択できる実験群、映像がランダムに現れるコントロール群関で心理的反応及びストレスホルモンの変化を調べた。事前の被験者のSTAIによるストレス評価は一般人より高く、状態不安の平均は43.2、特性不安の平均得点は47.9であった。このような被験者に疲労ストレスを負荷した後の実験群における映像暴露前後のPOMS値は5つのストレス感情状態に有意な変化はなかった。唯一ポジティブな感情状態である活気の得点が有意に低下していた。この結果はコントロール群においても同様であった。一方、IgAにおいてはストレス負荷後において実験群、コントロール群とも有意に上昇していたが、両群とも映像暴露後においての値の変化は見られなかった。また、ストレスの生化学的指標であるクロモグラニンAの映像暴露後の有意な変化も見られなかった。今回のパイロットスタディではPOMS値の結果やストレスの生化学指標の値をみると、被験者に対する事前のストレス負荷が強すぎたため、色彩映像を見たことによるストレス緩和への影響を明らかにすることができなかったと判断できる。結果的にはパイロットスタディの実験計画が不十分であったことになったが、しかし、このことから、次年度の実験計画の改善点が明らかとなった。本研究の最終目的はがんなどの慢性疾患患者の慢性的ストレスやうつ状態を改善して、治癒力の消耗を抑制する色彩映像によるストレス緩和媒体の開発である。21年度は慢性疾患患者を対象とした色彩映像のストレス緩和効果についての実証研究を遂行する予定であった。I.色彩映像のデータベースの完成に関しては色彩分類の科学的根拠及び技術面の課題に対して研究協力企業と連携してその解決を図った。結果的に色彩映像の分類は基準色別面積によるよけ、研究者の感性に基づく分類のほうが適切であることが判明し、その結果に基づいて色彩映像のデータベースを完成させることになった。II.色彩映像のストレス緩和効果の実証に関しては慢性疾患患者にとってより少ない刺激での感情状熊の改善に関して、更に基礎研究を追加した。その結果、好みの単色彩による軟らかい光刺激でも感情を静め,うつ状態や倦怠感などのネガティブを抑制し,ストレスや緊張状態を緩和する傾向が示唆ざれ、特に特性不安の低い被験者では生化学的指標においてこの傾向が顕著であることが判明した。この基礎研究の結果によって、状態が良くない患者の感情状態を軟らかい色彩光によっても緩和できることが分かったことで、本研究の目的達成に一歩近づくことができた。研究の進行は多少遅れているが、21年度の研究結果から、22年度は、がん患者会やがんサポートグループに参加している患者や家族の研究協力者に対して、色彩映像や単色彩光によるストレス緩和のパイロットスタディを実施し、さらにその結果を評価することによって、ストレス緩和のセルフケア媒体の実用化に向けて研究を遂行したい。22年度は本研究期間の最終年度である。特に以下3点において研究を進めた。I.色彩映像は2名の自然写真家による千枚以上のオリジナル写真によってデータベースを完成させた。II.色彩映像の特に脳の感情状態に関する影響について調べるために前頭部の脳波を測定する基礎実験を行うた。被験者は41人の健康な大学生・大学院生で、色彩映像を見ている間の左右の前頭部のα波の出現時間、および脳波電位の強さを測定した。

その結果、色彩映像を見る前より後においてα波の出現時間の増加と脳波電位の上昇が見られたが、有意な差は認められなかった。また、前頭部の左右での比較では、左右ともにα波の出現時間と電位の上昇傾向が見られ、やや右側の方が高い傾向があったが有意な差は見られなかった。プラスの感情状態刺激において左側の前頭部が活性化される、との先行研究があり、本実験では色彩映像に感情状態をプラス向ける刺激効果があるかどうかについて実証する目的で行ったが、そのような結果にはならなかった。この方面の研究では相対立する研究結果が報告されており、まだ緒に就いたばかりであると考えられるため、今後も研究を進めていく必要がある。III.本研究の色彩映像によるストレス緩和媒体を臨床に於ける実際の患者さん使用して戴くため、病室で簡単に使用できるシステムにするべく検討を重ねた。映像の選択を簡易にするためにタッチパネル上での操作システムを作成したが、タッチパネル画面をディスプレイ装置に組み込むための技術的課題が解決できず現在も検討を重ねている。但し、臨床研究のための研究計画はすでに京都大学医の倫理委員会に提出しており、親委員会の承認を待つだけになっている。装置上の課題が解決されれば、臨床での使用評価について研究結果を明らかにしたいと考えている。
白化した有藻性イシサンゴの回復過程で生じる褐虫藻獲得に関する細胞応答機構の解明

2016年は,世界の有藻性イシサンゴにとって過去最悪の白化に見舞われた年となった。サンゴの死滅は沿岸地形の崩壊や漁業資源の減少をもたらすことから,白化研究や保全活動が活発に推進されてきたが,有効な打開策は皆無である。申請者らは,その原因が環境修復策の検討に不可欠な白化からの生理的回復過程の理解が進んでいない点にあると考えている。本研究では,白化が短期間で回復する温帯域の特徴を最大限に活かし,褐虫藻の取り込みに加え,その細胞内での共生維持や細菌の侵入防御に関する細胞応答機構について,バイオインフォマティクスをはじめとする生命科学的研究手法を駆使して解明することを目的としている。平成29年度は,造礁サンゴの白化および回復過程で生じるサンゴ自体および共生微生物の挙動について調べるため,サンゴ試料収集フィールドと研究室に厳密な温度管理が可能な飼育水槽を設置し,白化およびそこからの回復の再現条件について検討した。対象種としては,わが国のサンゴ礁生息域に広く分布するクシハダミドリイシを選定し,最低でも一片3cm以上のサイズの群体を採取時の生息温度より5°C以内で数日間順化した。飼育は25°Cで行ない,白化区は28°Cまで12週間程度かけて上昇させ,その後は28°Cでキープした。多少褐虫藻の色が残る程度まで白化させることに成功した。また,その後25°Cで数週間保持することにより,色が回復することが観察された。白化およびそこからの回復過程における微生物相の変遷を知るための予備実験として,サンゴ群体の表面から細菌等の培養を試みたところ,複数の菌が分離された。本研究の肝となる白化ならびにそこからの回復過程について,一部の種に限られるものの水槽内での再現が可能となりつつあることから。白化およびそこからの回復過程について,約2ケ月をかけることにより,再現可能性が高いことを示すことができたが,様々な実験区を設定して,微生物の種構成の変遷や遺伝子・タンパク質の発現解析を行なうには,もう少し短期間でコントロールできる必要がある。そこで,より厳密な飼育条件の設定を行なった上で,それぞれの解析を本格化する。
光線力学治療の高度化に向けた腫瘍組織の光学特性値の算出およびデータベース化

がんの低侵襲な治療法の一つである光線力学療法(PDT)の治療計画において,生体組織内の光の侵達度や照射線量分布を定量的に把握することは,治療成績を向上させるために重要である.生体組織内の光の侵達度は,生体組織の光学特性である吸収係数[ mm^<-1>],換算散乱係数[ mm^<-1>]等により理解できる.一般的に,レーザー照射により生体組織の光学特性は変化する.そこで,我々は, PDT前後の腫瘍組織の光学特性を算出することを目的として基礎的検討を行った. PDTをマウス皮下腫瘍モデルに対して行い,双積分球光学系とInverse Monte Carlo法を用いて波長3501000nmにおける腫瘍組織の光学特性を算出した.がんの低侵襲な治療法の一つである光線力学療法(PDT)の治療計画において,生体組織内の光の侵達度や照射線量分布を定量的に把握することは,治療成績を向上させるために重要である.生体組織内の光の侵達度は,生体組織の光学特性である吸収係数[ mm^<-1>],換算散乱係数[ mm^<-1>]等により理解できる.一般的に,レーザー照射により生体組織の光学特性は変化する.そこで,我々は, PDT前後の腫瘍組織の光学特性を算出することを目的として基礎的検討を行った. PDTをマウス皮下腫瘍モデルに対して行い,双積分球光学系とInverse Monte Carlo法を用いて波長3501000nmにおける腫瘍組織の光学特性を算出した.光線力学治療(Photodynamic Therapy;PDT)はがんの低侵襲な光治療法であり、現在臨床で行われているが、ドージメトリーの管理が曖昧なことが問題点である。がん組織の光学特性値およびPDTによるその変化をデータベース化することにより、より詳細な治療計画の決定および科学的に制御された治療が可能となる。平成22年度は、マウス腫瘍組織に対してタラポルフィンナトリウム(レザフィリン、明治製菓)と波長664nmの赤色半導体レーザーを用いたPDTを行い、レーザー照射直後および1、2、7日後の腫瘍組織の光学特性値について検討を行った。光学特性値の算出は、双積分球光学系を備えた可視・近赤外分光光度計(測定波長域は3501000nm)を用い正確な総透過率T_tおよび拡散反射率R_dの測定を行い、T_tおよびR_dから逆モンテカルロ法を用い吸収係数μ_aおよび換算散乱係数μ_s'を算出した。結果。PDT直後はμ_aおよびμ_s'の変化は観測されなかったが、PDT7日後において波長350550nmにおけるμ_aおよび波長3501000nmにおけるμ_s'の増加が観測された。μ_aおよびμ_s'の変化から、PDT7日後の腫瘍組織において光侵達深さが減少することが見積もられた。また、PDT7日後の腫瘍組織の組織学的評価から、腫瘍細胞の減少とその空隙の繊維組織への置換が認められ、これが光学特性値の変化に影響を与えていると考えられた。PDT後の光学特性値および光侵達深さの変化は現在臨床では考慮されておらず、PDT後の光線力学診断(Photodynamic dianosis;PDD)やPDTの再照射治療にとって重要な情報となる。がんのレーザーを用いた低侵襲治療法の一つである光線力学治療(Photodynamic Therapy; PDT)において、がん病変組織内をレーザーがどのように伝搬しているかを理解するために、がん組織の光学特性値およびPDTによる光学特性値の変化、また光学特性値の変化と組織学的な変化の関係性を明らかにすることを目的とし、研究を行った。C57/BL6マウスにLewis肺がん細胞株を背部皮下移植し得られる腫瘍組織に対し、光感受性物質・タラポルフィンナトリウムと励起光源・波長664nm半導体レーザーを用いたPDTを行い、PDTされた腫瘍組織を得た。それらを試料とし、双積分球光学系を備えた可視・近赤外分光光度計を用いて、正確な総透過率および拡散反射率の測定を行った。得られた総透過率と拡散反射率から、逆モンテカルロ法を用い、光学特性値の吸収係数、換算散乱係数を算出し、算出された光学特性値から光侵達深さを見積もった。PDTによる腫瘍組織の光学特性値および光侵達深さの変化を理解するために、PDTを行った腫瘍組織の組織学的評価を行い、それぞれの変化を関連付け、光学特性値の変化を考察した。結果、PDT実施7日後、検討波長全域で換算散乱係数の増加が観測された。すなわち、波長664nmの励起レーザーは、PDT初回に比べてPDT7日後は侵達しにくくなることが定量的に分かった。組織学的評価から、換算散乱係数の増加は腫瘍細胞の死滅と繊維組織への置換による散乱形態の変化、すなわち細胞の密な状態から細胞が疎でコラーゲン繊維中心の状態への変化によると考えられた。本研究により得られた知見を利用することにより光学特性値変化を考慮したレーザー照射計画の作成が可能であり、確実なPDTの再治療(PDT後同じ病変部位への2回目のPDT)に貢献することができる。
皮膚内部の微細構造を利用したMEMS触覚センサに関する研究

本年度の研究成果としては,人がなぞり動作によって物体表面の微小な起伏を計測する際に皮膚表面の指紋や触覚受容器の構造が与える影響を検証するため,MEMS技術を用いた皮膚状触覚センサを実現し,その特性計測を行った.触覚センサは,剛性が異なる2層のシリコーンゴムを積層することで構成しており,剛性が高い表面部位に指紋状の凹凸構造を作成した.微小起伏が存在する物体表面をなぞった際,指紋型構造と起伏とが接触することで触覚センサ内部にせん断変形が生じる.このせん断変形を弾性体中に埋め込んだ直立ピエゾ抵抗カンチレバーを用いて計測することで,物体表面に存在する起伏の周期を計測することが可能となる.作成した指紋型構造の効果を検証するため,幅0.1mm,高さ0.01mmの起伏を0.3mm間隔で配置したシリコン基板表面を,表面に指紋型構造を触覚センサ及び,表面が平坦な触覚センサを用いてなぞった際のセンサ出力を比較した.この結果,指紋型構造が存在することで,センサ出力が8倍程度増幅し,なぞり動作における指紋型構造の有効性を示すことができた.また,皮膚状構造を構成する弾性体中に粘性を持つ液体を封止し,その内部に直立ピエゾ抵抗カンチレバーを配置することで,皮膚のマイスナー小体と同様に力の時間変化をメカニカルに検出することが可能な構造を実現した.この構造を皮膚状触覚センサ中に配置し,微小な起伏が存在する物体表面をなぞった場合,物体の土台形状によらず起伏の周期のみを抽出することが可能となる.このため,布などの表面に存在する1μm程度の微小な起伏を計測する上で有効な構造であると考えられる.これらの結果から,本研究によって実現した指紋型構造を持ち,液体封止した皮膚状触覚センサは,人の触覚機能を解明する上で有効なプラットフォームとなると考えられる.本年度は研究目標のうち、弾性体中に薄膜シリコンセンサの作成プロセスの確立および自動ステージを用いたなぞり動作システムの構築し、これを用いて皮膚構造がセンサに与える影響を検証した。薄膜シリコンセンサを作成する手法として、シリコン転写プロセスを導入した。本手法はフッ酸蒸気にてSilic on onInsulator(SOI)基板表面に作成した微小ピエゾ抵抗カンチレバーをリリースし、これにシリコーンゴム基板を押し付けることで微小カンチレバー郡を転写するという手法である。本手法は、転写作業を繰り返すことで微小な基板上に作成したデバイスを広いシリコーンゴム上に展開できるという利点があり、広面積の触覚センサシートを作成する上で有効である。また曲げに強い素材のみを用いることで、曲面の多いロボットハンドを覆う上で有効となる。これは、厚み2mm、7×7mm2の構造に8対のカンチレバーが配置されており、人親指と同様の半径10mm程度の曲面に貼り付けることが可能である。この成果はAPCOT2008およびRoManSy2008にて発表する予定である。またなぞり動作のパラメータとして、押し付け力、なぞり速度、センサと押し付け位置の関係の3点をパラメータとして設定したシステムを構築し、これを用いて皮膚形状がなぞり動作に対してどのような影響を与えるかの検証を行っている。皮膚形状をモデル化し、各パラメータを変化させた際の影響を調査した。皮膚形状の影響を検証するに当たっては、SOI基板上に作成したピエゾ抵抗カンチレバーのチップをフレキシブル基板上に配置したものを用いている。試作したなぞりセットアップおよび触覚センサにて、幅0.6mmの凸形状を押し付け力0.5N,速度5mm/sでなぞり、作成したセットアップおよびセンサを用いることで前述した通り、0.6mmピッチまでの形状を検出することが可能であることを確認した。今年度には、同セットアップを用いることで皮膚状構造がセンサ応答に与える影響を確認し、その結果を元になぞり動作を実現する触覚センサを実現する。本年度の研究成果としては,人がなぞり動作によって物体表面の微小な起伏を計測する際に皮膚表面の指紋や触覚受容器の構造が与える影響を検証するため,MEMS技術を用いた皮膚状触覚センサを実現し,その特性計測を行った.触覚センサは,剛性が異なる2層のシリコーンゴムを積層することで構成しており,剛性が高い表面部位に指紋状の凹凸構造を作成した.微小起伏が存在する物体表面をなぞった際,指紋型構造と起伏とが接触することで触覚センサ内部にせん断変形が生じる.このせん断変形を弾性体中に埋め込んだ直立ピエゾ抵抗カンチレバーを用いて計測することで,物体表面に存在する起伏の周期を計測することが可能となる.作成した指紋型構造の効果を検証するため,幅0.1mm,高さ0.01mmの起伏を0.3mm間隔で配置したシリコン基板表面を,表面に指紋型構造を触覚センサ及び,表面が平坦な触覚センサを用いてなぞった際のセンサ出力を比較した.この結果,指紋型構造が存在することで,センサ出力が8倍程度増幅し,なぞり動作における指紋型構造の有効性を示すことができた.また,皮膚状構造を構成する弾性体中に粘性を持つ液体を封止し,その内部に直立ピエゾ抵抗カンチレバーを配置することで,皮膚のマイスナー小体と同様に力の時間変化をメカニカルに検出することが可能な構造を実現した.この構造を皮膚状触覚センサ中に配置し,微小な起伏が存在する物体表面をなぞった場合,物体の土台形状によらず起伏の周期のみを抽出することが可能となる.

このため,布などの表面に存在する1μm程度の微小な起伏を計測する上で有効な構造であると考えられる.これらの結果から,本研究によって実現した指紋型構造を持ち,液体封止した皮膚状触覚センサは,人の触覚機能を解明する上で有効なプラットフォームとなると考えられる.
非平衡開放系の伝搬性相分離から形成される銀・アンチモン時空間パターンのモデル化

実験系において発生する、銀・アンチモンの動くパターンの形成メカニズムは、従来使用してきた、反応拡散系モデルで説明することができない。メカニズムを明らかにするため、銀とアンチモンの導電率の違いに着目し、そのモデルとして、導体絶縁体混合系に定電流が印加されている系を仮定した。その系の、電流印加による散逸エネルギーを、Onsagerの変分原理を利用してCahn-Hilliard方程式に追加し、数値シミュレーションを行った結果、一様混合系が空間的に2相(導体相、絶縁体相)に分離することを確認した。このことから、従来のモデルとは違うメカニズムで、動くパターンが形成可能であることが明らかになった。従来、振動反応に伴う時空間パターンは、反応拡散メカニズムで説明されてきた。このメカニズムでは、物質の酸化・還元の状態の違いがパターンとして観測され、その時間変化が、伝搬パターンになると理解されている。近年発見された、電極表面上に発生する銀とアンチモンで形成される時空間パターンは、白い縞は銀リッチで、黒い縞は酸化アンチモンリッチになっており、物質の濃度の違う2相が縞を形成して伝搬することで、時空間パターンが形成されている。この現象は従来の反応拡散メカニズムでは説明できない。そこで本研究では、非平衡開放系で生じる「伝搬するパターンを誘起する相分離(異種物質間の空間的な分離)」としてこの現象を捉え、モデルを構築し、数値シミュレーションによりモデルの妥当性を確認することを目的としている。本年度は、銀は導体で、酸化アンチモンは絶縁体であるため、電極表面上の時空間パターンの基本モデルとして「定電場が印可された、導体絶縁体混合系」を仮定し、Onsagerの変分原理とCahn-Hilliard方程式を組み合わせた独自のモデルを導出した。その式を、コンピューター上での数値シミュレーションにより、定電場の2つのモード、定電流モードと定電圧モードで、相分離の時間発展を考察した。その結果、定電流モードでは、電場の印加が、相分離を誘起するのに対し、定電圧モードでは、電場が印加されても、相分離が誘起されないというシミュレーション結果を得た。この結果は、銀とアンチモンの時空間パターンが定電流モードで発生し、定電圧モードではほとんど発生しないという実験結果と一致しており、モデルの妥当性を支持した結果となった。銀は導体で、酸化アンチモンは絶縁体であるため、電極表面上の銀とアンチモンの時空間パターンの基本モデルとして「定電場が印可された、導体絶縁体混合系」を仮定し、Onsagerの変分原理とCahn-Hilliard方程式を組み合わせた独自のモデルを、前年度導出した。また、その結果、定電流モードで相分離が誘起されることがわかった。今年度は、その、「定電流モードでの相分離」の数値シミュレーション結果の振舞を、細かく調査するため、導体絶縁体混合系における、導体及び絶縁体の濃度比や、各物理定数(電極に印加される定電流値など)を変化させて数値シミュレーションし、相分離の傾向を調べた。銀は導体で、酸化アンチモンは絶縁体であるため、電極表面上の銀とアンチモンの時空間パターンの基本モデルとして「定電場が印可された、導体絶縁体混合系」を仮定し、Onsagerの変分原理とCahn-Hilliard方程式を組み合わせた独自のモデルを、前々年度導出した。その結果、定電流モードで相分離が誘起されることがわかった。さらに前年度では、その、「定電流モードでの相分離」の数値シミュレーションの結果を、細かく調査するため、導体絶縁体混合系における、導体及び絶縁体の濃度比や、各物理定数(導体及び絶縁体の抵抗率比、電極に印加される定電流値など)を変化させて数値シミュレーションし、相分離の傾向を調べた。その結果、導体・絶縁体の相分離では、絶縁体濃度がゼロになる箇所を形成して相分離する傾向があることがわかった。今年度は、これまでに構築したモデルにおいて、さらに絶縁体に荷電が付加されていることを仮定して、数値シミュレーションを行い、荷電が相分離を抑える傾向をもつことがわかった。

また、今年度においては、これまでに得られた結果をまとめた2つの英語論文のうち、1本を海外雑誌に既に投稿しており、現在、査読者との意見交換を行っている。実験系において発生する、銀・アンチモンの動くパターンの形成メカニズムは、従来使用してきた、反応拡散系モデルで説明することができない。メカニズムを明らかにするため、銀とアンチモンの導電率の違いに着目し、そのモデルとして、導体絶縁体混合系に定電流が印加されている系を仮定した。その系の、電流印加による散逸エネルギーを、Onsagerの変分原理を利用してCahn-Hilliard方程式に追加し、数値シミュレーションを行った結果、一様混合系が空間的に2相(導体相、絶縁体相)に分離することを確認した。このことから、従来のモデルとは違うメカニズムで、動くパターンが形成可能であることが明らかになった。今年度は、研究代表者(当報告者)の異動があり、新しい職場で研究室を構えることになった。研究室の立ち上げに時間が掛り、当初予定していた計画より、やや遅れることになった。しかしながら、遅れながらも研究をすすめ、新しい結果を得ることはできた。非線形現象の物性研究本年度(平成26年度)では、前年度(平成25年度)に得られた結果(モデル式の導出、及び、定電場の2つのモード(定電流モードと定電圧モード)での相分離挙動の考察)を英語論文にまとめ、英文校閲会社の校閲に出しており投稿準備はほぼ完了している状態にある。次年度では、即、投稿するつもりである。また、本年度の研究では、提案したモデルで誘起される、「定電流モードでの相分離」の数値シミュレーション結果の振舞を、細かく調査するため、導体絶縁体混合系における、導体及び絶縁体の濃度比や、各物理定数を変化させて数値シミュレーションし、結果を得たため、その結果を別の英文論文にまとめるに至っている。次年度では、この論文を推敲し、次年度中に投稿することを目指している。平成25年度及び平成26年度にまとまった研究成果が得られたので、次年度では国内学会だけでなく、国際学会にも発表する予定である。今後の研究内容としては、平成26年度以降の研究計画に記述した、「定常的に動き続ける性質に寄与している“定ストライプ幅の保持"のシミュレーション」を行うため、平成25年度に構築したモデルに荷電の効果を加えて、数値シミュレーションし、相分離の挙動を考察する予定である。本年度(平成25年度)では、「定電場下における導体絶縁体の相分離の理論式の構築とそのシミュレーション」を実行するため、基本モデルとして「定電場が印可された、導体絶縁体混合系」を仮定し、Onsagerの変分原理とCahn-Hilliard方程式を利用してモデルを導出すること、及び、その式を、コンピューター上での数値シミュレーションにより、定電場の2つのモード(定電流モードと定電圧モード)で、それぞれの相分離の時間発展を考察することを、研究内容として計画していたが、その研究内容はほぼ遂行できたと考えられる。さらに、本年度は、その研究成果を英文論文にまとめるに至っている。本年度は、研究代表者(当報告者)の異動があり、新しい勤務先での研究室の立ち上げに時間がかかったため、当初予定していた、国際学会及び国内研究打ち合わせに行くことができなかった。
サーカディアンリズム発現に関わる神経ペプチドPDFの受容体同定と前駆体局在の解析

PDF(Pigment-Dispersing Factor)は、昆虫脳において概日リズムに関わる神経ペプチドである。最近、このPDFが神経伝達物質として働くことや、神経終末のみならず細胞核でも時計機構に関与することなど、新たな事実が明らかにされた。本研究の目的は、コオロギPDFの存在様式、受容体等について解析し、概日リズム発現の分子機構を明らかとすることである。コオロギPDF前駆体はN端側からPAS、PDF領域からなる。今年度は、神経細胞内におけるPDF、PAPおよび前駆体タンパク質の存在様式を解析する目的で、PDF前駆体タンパク質の各領域に特異的な抗体を用いた解析を実施した。現在、PDFとPAPが切断を受けていない、つまり前駆体のみを特異的に認識するモノクローナル抗体(前駆体認識抗体)、前駆体から切り出しを受けた成熟PDFのみを認識する抗体(成熟PDF認識抗体)、PDF-C端アミド構造を特異的に認識する抗体(PDFアミド認識抗体)、PAP領域を特異的に認識する抗体(PAS認識抗体)を得るのに成功している。これら一連のモノクローナル抗体を用いて、コオロギ脳-視葉における免疫染色を試みた。その結果、成熟PDF認識抗体、PDFアミド認識抗体、PAP認識抗体では、いずれもlaminaおよびmedullaと呼ばれる部位に存在する時計ニューロンの細胞体および軸索を明確に染色されることが判明した。さらに興味深いことに、前駆体認識抗体では、それらのニューロンの細胞体のみしか染色されなかった。このことは、PDT前駆体は時計ニューロンの細胞体に局在しており、そこでプロセシングを受けることを示唆する。また、前駆体認識抗体と他の抗体との組み合わせによる共免疫染色を行って、前駆体ペプチドや成熟PDF、PAPペプチドの局在部位の相互関係を調べたところ、プロセシング後の成熟PDFおよびPAPペプチドはともに軸索に局在する(輸送される)ことが初めて明らかとなった。また、時間帯による各々のペプチドの存在量(免疫染色性の強度)には、有意の差は見られなかったことから、PDFのリズム発現は、プロセシング段階で起きているわけではないことが示唆された。一方、PDF受容体の同定は、放射ラベルPDFを用いた昆虫脳ホモジネートに対する結合試験を実施予定であり、現在、結合試験系確立のための条件検討中である。最近、このPDFが受容体を介した神経伝達物質として働くことや、神経終末のみならず細胞核でも時計機構に関与することなど、新たな事実が明らかにされた。コオロギPDF前駆体はN端からPAP、PDF領域からなる。昨年度、PDFとPAPが切断を受けていない、つまり前駆体のみを特異的に認識するモノクローナル抗体を得るのに成功した。引き続き今年度、この抗PDF前駆体抗体を用いて、コオロギ脳-視葉における免疫染色を試みた。その結果、PDFmRNAの発現するlaminaおよびmedullaと呼ばれる部位のうち、laminaでのみ染色が確認されることが判明した。このことは、PDF前駆体はlamina細胞で優先的に生産されること、また、medulla細胞に前駆体が存在しないことより、部位におけるPDFの存在様式が異なる可能性を示した。このように、前駆体、PAPが切断された状態など、PDFの存在様式に局在部位特異性があるのは初めての例であり、この発現特異性が、概日リズム発現とどのように連関しているのか非常に興味深い。現在、こうした概日リズム性発現を検討するため、このPDF前駆体のlamina局在が時間によって変化があるかを詳細に解析している。また、より詳細なPDFの存在様式を明らかにするため、PAPが切り出された成熟PDFのみを認識する抗体、すなわちPDFのαアミノ基を含むN端側領域を認識する抗体を作製している。並行して、PAP領域を特異的に認識する抗体も作製中である。これまでに、こうした抗体を産生するハイブリドーマを得るのに成功し、得られる各抗体種の有用性を様々なペプチドを用いて確認し、PDF前駆体局在の解析に必須な分子ツールの全てをほぼ手中にすることができた。一方、PDF受容体の同定は、放射ラベルPDFを用いた昆虫脳ホモジネートに対する結合試験を実施予定であり、現在、コオロギ脳-視葉のサンプリング中である。

現在、PDFとPAPが切断を受けていない、つまり前駆体のみを特異的に認識するモノクローナル抗体(前駆体認識抗体)、前駆体から切り出しを受けた成熟PDFのみを認識する抗体(成熟PDF認識抗体)、PDF-C端アミド構造を特異的に認識する抗体(PDFアミド認識抗体)、PAP領域を特異的に認識する抗体(PAS認識抗体)を得るのに成功している。これら一連のモノクローナル抗体を用いて、コオロギ脳-視葉における免疫染色を試みた。その結果、成熟PDF認識抗体、PDFアミド認識抗体、PAP認識抗体では、いずれもlaminaおよびmedullaと呼ばれる部位に存在する時計ニューロンの細胞体および軸索を明確に染色されることが判明した。さらに興味深いことに、前駆体認識抗体では、それらのニューロンの細胞体のみしか染色されなかった。このことは、PDT前駆体は時計ニューロンの細胞体に局在しており、そこでプロセシングを受けることを示唆する。また、前駆体認識抗体と他の抗体との組み合わせによる共免疫染色を行って、前駆体ペプチドや成熟PDF、PAPペプチドの局在部位の相互関係を調べたところ、プロセシング後の成熟PDFおよびPAPペプチドはともに軸索に局在する(輸送される)ことが初めて明らかとなった。また、時間帯による各々のペプチドの存在量(免疫染色性の強度)には、有意の差は見られなかったことから、PDFのリズム発現は、プロセシング段階で起きているわけではないことが示唆された。一方、PDF受容体の同定は、放射ラベルPDFを用いた昆虫脳ホモジネートに対する結合試験を実施予定であり、現在、結合試験系確立のための条件検討中である。