hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
IL-4,IFN-γのヒト歯肉および歯根膜線維芽細胞におけるPGE_2産生制御機構

ヒト歯肉線維芽細胞(HGF)、ヒト歯根膜線維芽細胞(HPLF)およびヒト肺線維芽細胞様株化細胞(MRC-5細胞)においてIL-1βが誘導する、遅延型PG_2産生に関与するPLA_2とCOXアイソフォームの影響を確認した。このIL-1β依存的PGE_2産生およびPLA_2とCOXアイソフォーム発現に及ぼすIFN-γおよびIL-4の作用を検討したところ、以下に示す結果を得た。(1)IL-1βはこれらの細胞における遅延型PGE_2産生を促進した。(2)恒常的なCOX-1の発現がmRNAと蛋白レベルで確認されたが、これらの発現はIL-1βの刺激により促進されなかった。(3)IL-1βはCOX-2とcytosolic PLA_2(cPLA_2)の発現をmRNAおよび蛋白レベルで促進した。(4)恒常的およびIL-1β依存的なtypeII secretory PLA_2(sPLA_2)のmRNA発現は認められなかった。(5)cPLA_2インヒビター(AACOCF3)とC○X-2インヒビター(NS398)は、IL-1β依存的なPGE_2産生を有意に抑制したが、typeII sPLA_2インヒビター(LY311727)はこれに影響を与えなかった。(6)IFN-γとIL-4はIL-1β依存的な遅延型PGE_2産生を著しく抑制した。(7)IFN-γとIL-4はIL-1β依存的なCOX-2mRNAと蛋白発現およびcPLA_2 mRNA発現を明らかに抑制し、IL-1β依存的なcPLA_2蛋白発現をわずかに抑制した。以上の結果をまとめると、IL-1βは、HGF、HPLおよびMRC-5細胞における遅延型PGE_2産生を促進し、これには同時に誘導されるCOX-2とcPLA_2が関与していた。また、IFN-γとIL-4は、主としてCOX-2発現の抑制を介して、これらの細胞におけるIL-1β依存的な遅延型PGE_2産生を抑制した。以上の結果は、炎症局所において、主としてマクロファージが産生するIL-1βは、ヒト線維芽細胞におけるPGE_2産生を促進することにより炎症反応を亢進し、一方、このPGE_2産生は、主としてThリンパ球が産生するIFN-γとIL-4により抑制的に制御されることを示している。プロスタグランディンE_2(PGE_2)はアラキドン酸カスケードを経て産生される炎症性メディエーターであり、その生物学的活性、特に骨吸収活性は歯周炎の病態形成に深く関与している可能性がある。ヒト歯肉線維芽細胞(HGF)と歯根膜線維芽細胞(HPLF)に炎症歯周組織中において高濃度に存在するサイトカインであるIL-1βを添加すると、時間的(0-24時間)、濃度依存的(0.025-25ng/ml)にPGE_2産生を促進した。また、Th1,2細胞が産生するIFN-γとIL-4のHGFやHPLFに及ぼす影響を調べたところ、IFN-γとIL-4の単独添加はPGE_2産生に影響を与えなかったが、IFN-γあるいはIL-4とIL-1βとを同時に添加した場合は、IL-1β単独添加で誘導されたPGE_2産生は有意に抑制された。このPGE_2産生に至る過程において、細胞膜のリン脂質に結合するアラキドン酸は、そのエステル結合がホスホリパーゼA_2(PLA_2)により加水分解されることで細胞内に遊離してくる。その後シクロオキシゲナーゼ(COX)やリポキシゲナーゼによってさらに代謝され、PGE_2やロイコトリエン、リポキシンなどへ変換される。そのカスケードの中で、PLA_2とCOXは律速酵素としてPGE_2の産出量を調整していることが知られている。PLA_2には分泌型ホスホリパーゼI、・型(sPLA_2)と細胞質ホスホリパーゼ(cPLA_2)の2種類の存在が知られており、COXにも1と2の2種類のタイプが存在することが知られている。そこで、HGFとHPLAにおけるこれら酵素の発現をノーザンブロット法にてmRNAレベルで検討したところ、IFN-γあるいはIL-4とIL-1βとを同時に添加し、PGE_2産生がIL-1β単独添加で誘導された時より抑制されている条件では、COX-2のmRNA発現が有意に抑制されていた。しかしながら、COX-1はメッセージ発現レベルが低く、またsPLAとcPLA_2はその発現に変化が見られなかった。現在までのところ、IFN-γとIL-4はIL-1β刺激により誘導されるPGE_2産生をCOX-2発現を制御することにより調整していることが分かった。

(2)恒常的なCOX-1の発現がmRNAと蛋白レベルで確認されたが、これらの発現はIL-1βの刺激により促進されなかった。(3)IL-1βはCOX-2とcytosolic PLA_2(cPLA_2)の発現をmRNAおよび蛋白レベルで促進した。(4)恒常的およびIL-1β依存的なtypeII secretory PLA_2(sPLA_2)のmRNA発現は認められなかった。(5)cPLA_2インヒビター(AACOCF3)とC○X-2インヒビター(NS398)は、IL-1β依存的なPGE_2産生を有意に抑制したが、typeII sPLA_2インヒビター(LY311727)はこれに影響を与えなかった。(6)IFN-γとIL-4はIL-1β依存的な遅延型PGE_2産生を著しく抑制した。(7)IFN-γとIL-4はIL-1β依存的なCOX-2mRNAと蛋白発現およびcPLA_2 mRNA発現を明らかに抑制し、IL-1β依存的なcPLA_2蛋白発現をわずかに抑制した。以上の結果をまとめると、IL-1βは、HGF、HPLおよびMRC-5細胞における遅延型PGE_2産生を促進し、これには同時に誘導されるCOX-2とcPLA_2が関与していた。また、IFN-γとIL-4は、主としてCOX-2発現の抑制を介して、これらの細胞におけるIL-1β依存的な遅延型PGE_2産生を抑制した。以上の結果は、炎症局所において、主としてマクロファージが産生するIL-1βは、ヒト線維芽細胞におけるPGE_2産生を促進することにより炎症反応を亢進し、一方、このPGE_2産生は、主としてThリンパ球が産生するIFN-γとIL-4により抑制的に制御されることを示している。
癌の転移におけるマクロファージの役割に関する研究

腫瘍細胞RL♂1を尾静脈より接種し、各群生存日数で抗腫瘍効果を評価した。リポソーム製剤は、CI2MBPを封入したCI2MBP-LiposomeとPBSを封入したPBS-Liposomeの2種類を作製し、腫瘍接種48時間前に尾静脈から投与、IL-12とLPSは24時間前に腹腔内投与した。生存日数は、非投与群:13.0±1.0日、CI2MBP-Liposome投与群:12.7±0.8日、PBS-Liposome投与群:13.0±1.0日で、生存日数にリポソーム製剤投与は関与しなかった。一方、IL-12投与群:25.7±5.3日、LPS投与群:18.4±1.5日といずれも抗腫瘍効果を認めた。CI2MBP-Liposome+IL-12投与群:24.9±5.5日に対し、CI2MBP-Liposome+LPS投与群:13.2±1.3日とLPSの抗腫瘍効果は全く認めなかった。以上の結果から、LPSはKupffer細胞に作用し、抗腫瘍効果を発現していると考えられる。次に、LPSとCI2MBP-Liposomeを非担癌マウスに投与し、その血清中のIL-12とInterferon g(IFN γ)をELIZAで定量した。IL-12は、いずれの群でも検出できなかった。IFN γは、非投与群、CI2MBP-Liposome投与群では検出されず、LPS投与群:743.8±230.0pg/mlと産生を認めた。しかしCI2MBP-Liposome+LPS投与群:1367.0±1448.3pg/mと予想に反しLPS単独投与より高値を示した。以上の結果からKupffer細胞の役割は解明できなかったが、さらに担癌状態での、サイトカイン及び遺伝子の発現に関し検索中である。1) Dichloromethylene bisphosponate (CI2MBP)を封入したリポソーム製剤を作成、マウス尾静脈から投与し、肝臓を摘出した。マクロファージ系細胞のモノクロール抗体であるF4/80で免疫組織染色をしたところ、肝臓においてマクロファージ系細胞が完全に消失した。2) IL-12およびLPSを予め腹腔内投与し、肝転移性腫瘍細胞RL♂1を尾静脈から接種したところ、いづれの群においても対照群と比較して著明な延命効果を認めた。また、腫瘍細胞接種後14日目に肝臓を摘出し、その重量を測定したところ、対照群が平均3.01gと肝転移により腫大していたのに対し、IL-12投与群は1.63g、LPS投与群は1.77gと著明な肝転移抑制効果を認めた。3) IL-12の主な作用として、インターフェロン_γ(IFN_γ)の産生が知られている。CI2MBP-リポソーム投与群、非投与群にIL-12およびLPSを腹腔内投与し、血清中のIFN_γをELIZAキットで測定したところ、リポソーム非投与群ではIL-12およびLPSいづれにおいても著明なIFN_γ産生の亢進が認められた。一方、リポソーム投与群、すなわちマクロファージ系の細胞を除去した群ではIL-12投与ではIFN_γの産生の亢進を認めたが、LPS投与では全く検出できなかった。4)リポソーム投与群、非投与群におけるLPS, IL-12の抗腫瘍効果を生存日数で比較検討した。リポソーム非投与群ではLPS, IL-12いづれにおいても抗腫瘍効果が認められた.リポソーム投与群ではIL-12投与で抗腫瘍効果を認めたがLPS投与群では全く認められなかった。以上の結果からLPSの抗腫瘍効果は、マクロファージ系の細胞を介した反応であり、その効果はIL-12によってもたらされていることが示唆された。口腔癌の多くは扁平上皮癌である。現在、扁平上皮癌由来の肺転移性腫瘍細胞を用いて実験を遂行中である。

次に、LPSとCI2MBP-Liposomeを非担癌マウスに投与し、その血清中のIL-12とInterferon g(IFN γ)をELIZAで定量した。IL-12は、いずれの群でも検出できなかった。IFN γは、非投与群、CI2MBP-Liposome投与群では検出されず、LPS投与群:743.8±230.0pg/mlと産生を認めた。しかしCI2MBP-Liposome+LPS投与群:1367.0±1448.3pg/mと予想に反しLPS単独投与より高値を示した。以上の結果からKupffer細胞の役割は解明できなかったが、さらに担癌状態での、サイトカイン及び遺伝子の発現に関し検索中である。
AGEs特異抗体を用いた糖代謝異常の早期検出とその治療に関する研究

メイラード反応前期生成物(AGEs)であるペントシジン(Pent)は酸加水分解に安定で腎症のマーカーとして期待されている。しかし、既存のPent測定法では血清の加熱処理によってPentが人工的に生成してしまうこと、塩酸の添加によって生成が抑制され、正確な血中Pentの測定が可能となることが明らかとなった。またN^ω-carboxymethylarginine(CMA)は不安定で測定が困難であったが、モノクローナル抗CMA抗体を用いてCMAがコラーゲン特異的に生成すること、そのメカニズムが明らかとなった。2SCに対するポリクローナル及びモノクローナル抗体の作製:脂肪細胞では新規翻訳後修飾構造であるS-(2-succinyl)cysteine(2SC)が生成する(Nagai R et al.J.Biol.Chem.282 : 34219-34228, 2007)。今回、ウシ血清アルブミン(BSA)を還元して遊離のSH基を2SCに化学修飾した後、ウサギ2羽に免疫してポリクローナル抗体を作製した。また、還元したBSAをフマル酸と保温して得られた2SC化BSAをマウスに免疫し、2SC化卵アルブミン陽性の株をスクリーニングし、モノクローナル抗2SC抗体が得られた。現在、これら抗体がウェスタンブロッティングでも使用可能か検討中である。病態の進展に関与するAGEsの同定:様々な抗AGEs抗体のライブラリーおよび機器分析を用いた解析から、Glyoxalase Iを高発現したマウスではAGE構造の一つであるNe-(carboxyethyl)lysine(CEL)の蓄積が減少すること、ヒトの膀胱や皮膚のコラーゲンではCMAが蓄積することが明らかとなった。また、ケトン体の代謝物であるアセトールからCELが生成することを見出した。1型糖尿病ラットではケトーシスを発症するが、クエン酸を投与することによって、ケトーシスが改善し、眼の水晶体中CEL蓄積が低下、さらに糖尿病性腎症の発症が改善したことから、クエン酸の摂取は糖尿病合併症の予防に有効であることが示された。2SCに対するポリクローナル及びモノクローナル抗体の作製:今年度の予定通り、S-(2-succinyl)cysteine(2SC)を合成後、グルタルアルデヒドで2SCをウシ血清アルブミンにコンジュゲートすることによって2SCに対するモノクローナル抗体3株およびウサギポリクローナル抗体が得られた。両者とも2SC化蛋白が高感度に検出できることをELISAおよびウェスタンブロット法で確認された。しかし、3T3-L1細胞を脂肪細胞に分化した後、脂肪細胞内2SC化蛋白の検出をウェスタンブロット法で試みたが検出されなかった。脂肪細胞を培養時、2SC生成の基質となるフマル酸を入れて培養すると(陽性コントロール)、ウェスタンブロット法で2SC蛋白が検出されたことから、今回得られた抗体は2SCを明らかに検出しているが、感度的に低いことが示された。多検体測定系の確立:メイラード反応前期生成物の一つであるヘモグロビンAlcが血糖コントロールのマーカーとして臨床的に測定されることから、血中や尿中のメイラード反応後期生成物(AGEs)を測定して糖尿病合併症等のマーカーとして応用する試みがなされている。しかし我々は、アルカリや加熱処理を伴う既存のAGEs測定法では、試料の前処理に伴って人工的に生成したAGEsを測定している危険性を見出している。本年度はAGEs構造のうち、N^ω-carboxymethylarginine(CMA)、ペントシジン(Pent)の測定系を確立し、生体における意義を検討した。生体におけるCMAの意義:CMAがコラーゲン特異的に生成するメカニズムを解析する目的でCMAが生成するアミノ酸配列の同定を行った。ウシのTypeIIIコラーゲンをglyoxalでAGEs化した後、トリプシン消化してモノクローナル抗CMA抗体アフィニティカラムにかけた。吸着画分を回収しイオントラップLC-MS解析によってCMA化部位の同定を行った。さらに、CMA化部位の確認実験として、CMAが同定された配列のペプチドを合成した後、riboseで修飾しCMA生成を確認した。その結果、LC-MS解析よりコラーゲン上のCMA化部位のペプチド配列が数種検出され、その中には細胞接着に関与するインテグリンが結合する配列もあった。Pentの正確な測定法の確立:Pent値は、血清クレアチニン値がほとんど上昇していない腎症の発症早期から上昇するため、早期腎症の診断マーカーとしての可能性が報告されているが、現在の測定法は加熱処理が行われている。血清試料は加熱に伴いPent含量が増加するが塩酸の添加によって抑制され、正確な血中Pentの測定が可能となることが明らかとなった。
視床下部のレプチン感受性に対する運動トレーニングの影響

運動トレーニングが、脳の視床下部に備わるレプチン感受性を上昇もしくは改善させるか否かを検証し、そのメカニズムについて検討した。その結果、運動トレーニングはレプチン感受性を上昇させることはなく、レプチン感受性が低下した状態(肥満)であっても感受性の改善はみられなかった。一方、視床下部において、栄養条件の変化により代謝の応答を制御するタンパク質(Sirt1)の発現は、運動を負荷した場合に減少していた。脂肪細胞から分泌されるレプチンは、視床下部にはたらき、食欲を抑制するとともに、生体の活動量を増加させる等、エネルギー消費量を増加させる機能を持つ。また、脂肪細胞の増加にともないレプチンの放出量は増加するため、レプチンは生体内に蓄積されたエネルギー(脂肪)量を調節する役割も担うと考えられている。一方、視床下部でのレプチン感受性の低下は、過食とそれにともなう肥満を誘発すると言われている。平成20年度は、このレプチン感受性低下が運動によって予防・改善できるか否かを、脳室投与の手法を用いて検討した。まず、健常のWistar系ラットを用い、一過性の走行運動群(20m/分で6時間)と、非運動群とでレプチン感受性の変化を比較した。運動の効果によるレプチン感受性の変化は、レプチン脳室投与後の摂食量で判定した。その結果、両群の摂食量に統計学的な有意差は検出されず、この実験条件でレプチン感受性は上昇しないと推察された。続いて、先天的に過食し肥満を呈する遺伝性肥満ラット(OLETFラット)に対し、1日90分で2週間にわたる継続的な走行運動を負荷した。この時の走行速度は、乳酸性作業閾値(LT :ヒトの場合、ジョギングに相当)となる20m/分とした。なおLTは、速度を漸増して走行させたOLETFラットの血中乳酸値を経時的に測定し決定した。2週間の運動終了直後、運動群および非運動群にレプチンの脳室投与をおこない、投与後の摂食量および活動量から、レプチン感受性の変化を判定した。その結果、運動群・非運動群間で統計学的有意差は認められず、この実験の運動条件はレプチン感受性に影響しないと推察された。以上の実験から、運動によるレプチン感受性の変化に統計学的な有意差はなかったが、レプチンを脳室投与した場合の摂食量は、非運動群に比べ運動群が少ない傾向であったため、今後は新たな運動条件下での検討が必要と考えられた。視床下部のレプチン感受性低下が過食を引き起こすことから、これが肥満の原因と考えられている。このレプチン感受性の低下が持続的運動によって改善するかを調べ、その機序について検討した。平成20年度に実施した健常なWistar系ラットを用いた実験では、運動によるレプチン感受性の変化に統計的な有意差は認められなかった。このため、先天的に過食し、過度の肥満を呈する遺伝性肥満ラット(OLETFラット)を用いて、レプチン感受性改善効果を検討した。この実験は、脳室投与の手法を用いておこない、レプチンの脳室投与後における摂食量の変化を運動群・非運動群間で比較した。その結果、投与後の摂食量は、非運動群に比べ運動群で統計学的に有意に減少した。しかし、運動群の摂食量をレプチン投与の有無で比較した場合、統計学的有意差は得られなかった。したがって、本実験の運動条件(乳酸性作業閾値強度による走行運動、90分/日を2週間)では、レプチン感受性の改善効果は認められなかった。運動による摂食量の低下は以前から報告されているが、この原因が運動によるレプチン感受性の変化によるとの証明には至らなかった。現在、各種の飼育・運動条件を経たラットの視床下部(および脳各部位)において、近年長寿関連遺伝子として注目されているsirtuinタンパクファミリーがどのように発現しているか調査している。視床下部は摂食量や体重の決定をコントロールすると考えられ、ここにレプチンは強く関与するが、sirtuinファミリーが視床下部のレプチン感受性にも影響している可能性が想像されるためである。また、脳各部位におけるsirtuinファミリー発現状況を示した報告は少なく、これらの発現量の解析は、脳とレプチンに代表される生体のエネルギー収支の調節メカニズムを検討する上で重要と考えられる。なお、この解析は近日中に終了する予定である。
前立腺がんスフェロイド形成に関与する遺伝子の機能解析と治療への応用

本研究は,スフェロイドという環境におけるplk2強された遺伝子群の基礎的解析及び治療への応用展開を図ることが目的である。その中でもPlk2遺伝子に着目し、RNAiを利用して、その発現を抑制することで、前立腺がん細胞株DU145のスフェロイド形成への影響等を含めた同遺伝子の機能解析を目的とした。これら遺伝子群は、スフェロイド成長の抑制あるいは抗がん剤併用による抗がん剤の効果増強を確認した。本研究は,スフェロイドという環境におけるplk2を含む発現が増強された遺伝子群の基礎的解析及び治療への応用展開を図る。1.plk2遺伝子の機能解析,2.他の抗がん剤とsiRNA(plk2)の組み合わせで,抗がん剤効果の検討,3.メチル化を含めた同遺伝子の発現機構の解析,4.臨床検体での発現解析及び臨床病理学的検討,5.他の候補遺伝子についてもsiRNAを用いて,同様の解析を行い臨床への応用展開を図ることを目的とした。本年度,plk2をノックアウトすることにより,前立腺癌細胞株のスフェロイド成長が抑制され,併用による抗がん剤の効果増強も再確認された。また,前立腺がん細胞株により,その抑制の程度は異なる事が明らかにされた。スフェロイドの抗癌剤抵抗性の獲得機構の一つとして,ATP-binding Cassette(ABC)トランスポーターの再発現が考えられる。今回,multidrug resistance-associated protein 2(MRP2)遺伝子の発現動向を解析した。単層培養に比べ,スフェロイドで同遺伝子の発現は増強し,plk2をノックアウトすることにより再び低下する事を認めた。このように,ABCトランスポーターの発現がスフェロイド形成に伴うことが明らかになった。また,同遺伝子発現の抑制はスフェロイド形成抑制あるいはplk2遺伝子発現に関連する機構によるものかは今後検討していく。本年度,前年度のsiRNA導入試薬に細胞障害性が認められたため,異なるsiRNA導入試薬を用いた。plk2は約76%のノックダウンが確認された。plk2をノックダウンすることにより,前立腺癌細胞株のスフェロイド成長が抑制されなかったが,併用による抗がん剤の効果増強は再確認された。また,前立腺がん細胞株(LNCaPおよびDU-145)により,その抑制の程度は異なる事が明らかにされた。抑制の程度は,siRNA(plk2)濃度に依存的であった。plk2をノックダウンは肺がん細胞株A549においても同様の結果を得た。また,単層培養とスフェロイド培養の遺伝子発現比較から抽出された遺伝子群に含まれるSEPTIN6,ACPPについて同様の解析を行った。SEPTIN6では,スフェロイド成長の抑制および併用による抗がん剤の効果増強を確認した。ACPPに関しては,併用による抗がん剤の効果増強のみを確認した。本研究は,スフェロイドという環境におけるplk2を含む発現が増強された遺伝子群の基礎的解析及び治療への応用展開を図ることが目的である。画像解析にて、siPlk2添加後のスフェロイドの体積はControlに比べて減少した。スフェロイド中心部の面積は有意な変化は認められなかった。siPlk2を添加したスフェロイドの辺縁部は全体に粗となり、境界より細胞が散乱する像を認めた。これらの結果より、細胞増殖帯を中心に表層細胞への影響、特に接着および増殖に影響している可能性が推察された。しかしながら、E-Cadherinやintegrinの発現に変化は認めなかった。siPlk2と抗がん剤ドセタキセル(DTX)を組み合わせた実験では、DTX単剤よりも生存率の減少を認めた。ABC輸送体の発現に関して、MRP2の発現がsiPlk2曝露時に減少することを認めた。また、単層培養で、siPlk2とDTX暴露の各種組み合わせ時で、siPlk2併用時においてSub G 1期(Apoptosis)の増加が確認され,Apoptosisの誘導が確認された。これらの結果より、siPlk2曝露により,細胞増殖やABC輸送体等に複雑に影響している可能性があり,さらなる解析が必要と考えられた。また,単層培養とスフェロイド培養の遺伝子発現比較から抽出された遺伝子群に含まれるSEPTIN6、ACPP、NF1について同様の解析を行った。SEPTIN6およびNF1では,スフェロイド成長の抑制および併用による抗がん剤の効果増強を確認した。
血友病Ａ分子病態の解明と第VIII因子高機能化に関する研究

出血症状に関する様々なフェノタイプを有する中等症/軽症血友病A患者の遺伝子異常の解析結果に基づき、BHK細胞で発現した変異第VIII因子蛋白と活性型第IX因子、第X因子およびリン脂質との結合性、および3次元構造解析により高機能型第VIII因子を探索するシステムを構築した。さらに、活性型第IX因子との親和性が高い高機能型変異第VIII因子の候補を創製できたことは重要な研究成果と考えられる。高機能型第VIII因子(FVIII)を創製するために、より、多数のアミノ酸変異を有する変異蛋白を精製する。3次元構造解析も加えて、より効率的に機能必須アミノ酸を探索する。さらに、BHKおよびHEK細胞で発現した変異FVIIIをFVIII欠乏血漿や全血に添加することにより血友病Aのex vivoモデルを作成し、凝固波形解析、FXa生成、トロンビン/プラスミン生成試験などの包括的凝固線溶機能解析も実施して、変異FVIIIを評価し、より高機能な第VIII因子の創製をめざす。今後はさらに、抗FVIIIインヒビターを発生しにくく、インヒビター存在下でも有効な低免疫原性高機能型第VIII因子の作製も行う。本研究は異常第VIII因子を有する中等症/軽症血友病A患者の分子生物学的および生化学的解析により第VIII因子機能に必須のアミノ酸残基を同定して、様々な変異を導入発現することにより高機能型第VIII因子の創出を目的とする。本年度は異常第VIII因子を有する中等症/軽症血友病A患者の遺伝子解析を行い、活性型第X因子生性能について血漿検体を用いた高感度な測定系の確立をめざした。奈良県立医科大学小児科通院中の軽症・中等症血友病A患者38例に対してF8遺伝子解析を施行し、新規変異2例(Asp361Val, His693Asn)を含む28種類の異なるミスセンス変異を同定した。そのうち、17例の血漿を用いたFXa生成における反応速度論的解析を施行した。結果、FIXa、PLまたはFXとの親和性が低下する例がそれぞれ5、6、5例であり、トロンビン開裂部位であるArg372に変異(Arg372His)をきたす症例では、FIXa、PL、FXのいずれに対する親和性も低下した。更に、反応測定の過程で析出するフィブリン結晶に伴う影響を除去する目的で、レプチラーゼによる前処置を加えて、上記のうち10例について評価検討した結果、7例において、FIXa、PL、FXに対する親和性がレプチラーゼ処理前後で一致し、レプラーゼ添加によっても評価可能であることが示された。一方、2例は処理後のFXa生成量が低下したため評価困難であり、残る1例は、処理前後で結果が不一致を示し、その原因について検討中である。本年度は、軽症・中等症血友病A患者38例に対してF8遺伝子解析を施行し、新規変異2例を含む28種類の異なるミスセンス変異を同定し、そのうち、17例の血漿について、特異的な合成発色基質を用いたFXa生成における反応速度論的解析を施行した。その結果、FIXa、PLまたはFXとの親和性に基づき、FVIII変異の特性をいくつかのタイプに分類することができ、その成果を第39回日本血栓止血学会学術集会(愛知県)にて報告した。さらに軽症・中等症血友病A患者症例数を増やしてF8遺伝子解析を施行し、血漿を用いたFXa生成における反応速度論解析を進行する。一方、FXa生成反応測定条件の更なる改良を加えるとともに、レプチラーゼを用いた血漿試料の脱フィブリン化処理による評価検討を進行し、より高感度な測定系の確立を目指すとともに次年度の研究計画を進める。
６脚ロボットの歩行環境適応型胴体６自由度運動制御手法の開発

6脚ロボットの胴体6自由度(胴体重心位置x,y,ヨー角,胴体高さ,ピッチ角,ロール角)を制御する手法の検討を行った。胴体重心位置x,yヨー角を制御する手法として歩行方向制御手法,胴体高さ,ピッチ角,ロール角を制御する手法として姿勢制御手法を支持脚の脚リンクに与えることで目標軌道に対する追従性能の向上をはかった。提案する胴体6自由度制御手法の有効性は6脚ロボットの3DCADモデルを用いた3Dシミュレーションにより,高さ50mmの段差を乗り越える歩行により確認した。平成25年度は,第1の課題,“仮想インピーダンスを設定した6脚ロボットの全方向(歩行方向x,yおよびヨー角)歩行制御手法の開発"について,3Dシミュレーションでの検討を行った。数式モデルは支持脚旋回部に仮想的なインピーダンスを設定している。平成24年度までの研究では,この仮想的なインピーダンスを設定しない状態でx,yおよびヨー角を制御するモデルを導出していた。しかし,この手法では,旋回部リンクのアクチュエータの特性(リンクの慣性,不感帯,飽和)を考慮していないため,追従性において偏差が生じていた。このインピーダンスを設定する手法の導入目的は,数式モデルは6次増えるが,アクチュエータのダイナミクスを考慮したFBシステムとなるため追従性の改善が期待できることと,支持脚切り換え時のダイナミクス変動(初期外乱)について,報告者らは,これまでの研究において腿部リンクを制御することで支持脚切り換え時のダイナミクス変動を小さくすることを示したので,同様に旋回部においても小さくする効果が期待できることである。提案手法の有効性は,Virtual Lab Motion上にH22年度に構築した3Dモデルにおいて検証を行った。具体的には,支持脚旋回部に仮想的に作用する力をバネとダンパを用いてモデル化し,アクチュエータのダイナミクスを考慮したロボット胴体位置(x,y)および姿勢(ヨー角)モデルを導出した.胴体位置(x,y)および姿勢角(ヨー角)に対して,1型のサーボ系を設計するLQI制御系を設計した。提案する軌道追従制御手法の有効性は6脚ロボットの3Dモデルを用いたシミュレーションにより,半径0.5mの旋回歩行を行うことで検討した。仮想的な力を考慮しない手法と比較して,振動的な現象が抑えられ,胴体重心位置および姿勢角(ヨー角)が目標軌道に追従することを示し,提案する制御手法の有効性を確認した。平成26年度は,平成25年度に引き続き第1の課題,“仮想インピーダンスを設定した6脚ロボットの全方向(歩行方向x,yおよびヨー角)歩行制御手法の開発"について,3Dシミュレーションでの検討を行った。また,歩行実験では,歩行方向制御手法の検証をレーザーレンジファインダー(LRF)で,6脚ロボットの絶対座標系における歩行位置x,yおよびヨー角を検出して行う手法について行った。フィードバック(FB)制御系の設計方法としては,目標値(歩行方向制御ではx,yおよびヨー角,姿勢制御では,ピッチ角,ロール角および胴体高さ)に対して,1型のサーボ系を設計するLQI制御系を設計した。提案する軌道追従制御手法の有効性は6脚ロボットの3Dモデルを用いたシミュレーションにより,段差を昇降する直線歩行を行うことで検討した。前年度までは,支持脚時に歩行方向制御のFB入力のみで制御を行っていたが,目標軌道がランプ関数であるため,入力が大きくなり,胴体が振動してしまう結果となっていた。そこで,平成26年度は,支持脚時の制御入力として,歩行を実現する足先軌道を逆運動学で解いて求められる目標軌道に追従するPD制御入力と歩行方向制御から計算されるFB入力を足し合わせることで追従性能を向上することを試みた。歩行方向制御はインピーダンスを設定しないモデルで行った。この結果,目標軌道を円軌道とする歩行方向制御においてPD制御入力を付加しない場合と比較して,支持脚時の振動的な応答が小さくなり,追従性能が向上することを3Dシミュレーションで確認した。歩行実験においても支持脚時にPD制御入力と歩行方向制御によるFB入力を足し合わせる方法で直線歩行の検証を行った。その結果,PD制御のみでは,ヨー角方向のずれが増加してしまう結果となっていた歩行が,歩行方向制御+PD制御では,ヨー角方向の偏差を小さくする歩行を実現した。平成27年度は,第3の課題,“姿勢制御(胴体高さ,ピッチ角,ロール角)と全方向歩行制御(歩行方向x,yおよびヨー角)手法の協調制御"について6脚ロボットの3Dモデルを用いて検討を行った。前年度までに姿勢制御手法と全方向歩行制御手法についてはそれぞれ有効性を確認しているのでその協調制御手法について検討した。しかし,全方向歩行制御手法については,3脚支持歩行の場合,支持脚旋回部のみの入力で全歩行方向制御を実現する手法であったので,進行方向(y)については,制御性能が良かったが,進行方向に対して垂直方向(x)については,特異点近傍となり制御性能が悪かった。そこで,平成27年度は支持脚腿部および脛部で生成する駆動トルクの反力を入力とする6入力の数式モデルを新たに設計し,全方向歩行制御に適用する手法について6脚ロボットの3Dモデルを用いて検討した。制御系は,数式モデルに対して,1型のサーボ系を設計するLQI制御とした。直線歩行において,全方向の3軸について目標軌道に追従するようにFB系が修正動作を行い,提案手法の有効性を確認した。また,FB系のロバスト性について検討を行い,支持脚旋回部の入力が変動する場合にもFB系が有効に働き,目標軌道に追従することを確認した。

さらに,段差を昇降する直線歩行では,姿勢制御と全方向歩行制御手法がともに有効に働き,胴体6自由度の制御を実現することを確認した。また,歩行実験では,前年度に引き続き,全方向歩行方向制御手法の検証をレーザーレンジファインダー(LRF)で,6脚ロボットのx,yおよびヨー角を検出して行う手法について検討を行った。自己位置の検出方法としてランドマークを2点検出し,その位置から自己位置およびヨー角を算出する手法で行い,直線歩行での全方向歩行制御手法(支持脚旋回部のみ)の有効性を確認した。歩行実験については,細かい制御手法の改善を行った。6脚ロボットの胴体6自由度(胴体重心位置x,y,ヨー角,胴体高さ,ピッチ角,ロール角)を制御する手法の検討を行った。胴体重心位置x,yヨー角を制御する手法として歩行方向制御手法,胴体高さ,ピッチ角,ロール角を制御する手法として姿勢制御手法を支持脚の脚リンクに与えることで目標軌道に対する追従性能の向上をはかった。提案する胴体6自由度制御手法の有効性は6脚ロボットの3DCADモデルを用いた3Dシミュレーションにより,高さ50mmの段差を乗り越える歩行により確認した。第1の課題,“仮想インピーダンスを設定した6脚ロボットの全方向(歩行方向x,yおよびヨー角)歩行制御手法の開発"については,平成26年度の検討でインピーダンスを設定しないモデルでの3Dシミュレーションで,支持脚時に歩行方向制御手法で得られるFB入力だけでなくPD制御の入力を足し合わせることで目標軌道への追従性能が向上する結果が得られた。歩行実験においても,LRFで6脚ロボットの歩行空間における絶対座標とヨー角を計測し,歩行方向制御手法の有効性の検証を行った。当初の予定では,平成25年度中にインピーダンスを設定したモデルで実験までの有効性を検証する予定であったが,制御手法の変更,LRFでの位置およびヨー角検出に時間がかかり,平成26年度での目標到達となった。インピーダンスの設定については,設定していないモデルでの検証となっているが,数学モデルの次数が6次元小さくなり,ソフトウェアの負担は軽減されているので,追従性能の観点からは当初の目標は達成している。第3の課題,“姿勢制御(胴体高さ,ピッチ角,ロール角)と全方向歩行制御手法の協調制御"については,平成25年度に引き続き,平成26年度も6脚ロボットの3Dモデルを用いて検討を行った。現在までは,全方向歩行制御と姿勢制御ともに仮想インピーダンスを設定した数学モデルで両制御手法を協調して,段差がある不整地での直線歩行のみの段階となっている.この手法での全方向歩行制御手法においては,歩行方向制御手法から得られるFB制御のみで支持脚旋回部の制御を行っているため,十分な制御結果とは現時点ではなっていない。姿勢制御については,段差の昇降において有効に働いている。この点では,目標の50%程度の達成となっている。また,脛部を制御することで,横方向の移動量を制御する方法については,引き続き検討中である。ロボット工学,制御工学第1の課題,“仮想インピーダンスを設定した6脚ロボットの全方向(歩行方向x,yおよびヨー角)
統合失調症を合併した22q11欠失症候群のiPS細胞の解析

22q11.2欠失と統合失調症を合併した2人から、iPS細胞を樹立した。対照群としては、精神疾患の既往歴のない2人からiPS細胞を樹立した。さらに、iPS細胞から神経幹細胞塊(NS: neurosphere)へと分化させた。NSの段階でcNDAマイクロアレイ解析をしたところ、DGCR8というmiRNAのプロセッシングに関与する遺伝子の発現が患者サンプルで低下していたので、miRNAの網羅的解析を行ったところ、NSから神経系の細胞分化に必要なmiRNAの発現に異常が認められた。統合失調症は一旦発症すると完治が困難であるため、発症機序解明と発症予防開発が疾患研究にとって重要な目標と言える。統合失調症の原因については、種々の状況証拠から神経発達障害仮説が、遺伝子研究では22q11.2との関係が古くから知られているが、決定的な発症機序解明には至っていない。本研究では、統合失調症を合併した22q11.2欠失症候群患者様について、1)ゲノム欠失領域をCGHアレイを用いて決定する、2)健常者および患者様由来iPS細胞を用いてトランスクリプトーム解析を行い、mRNA, miRNAの発現制御異常の観点から、神経細胞への分化・発達に与える影響を明らかにすることを目的とした。対象の22q11.2欠失と統合失調症を合併した2人の方は、一方の染色体の22q11.2領域に2.6 Mbの欠失があることが確認できた。この2人の方からは、iPS細胞の樹立が成功し、かつそれらを神経幹細胞塊(NS: neurosphere)へ分化させることができた。さらに、NSを神経細胞まで分化させることに成功した。疾患サンプル同様、それらをNSー神経細胞へと分化させることができた。解析はNSの段階で行った。cNDAマイクロアレイ解析をしたところ、DGCR8というmiRNAのプロセッシングに関与する遺伝子の発現が患者サンプルで低下していたので、miRNAの網羅的解析を行ったところ、NSから神経系の細胞分化に必要なmiRNAの発現に異常が認められた。本研究では、統合失調症を合併した22q11.2欠失症候群患者からiPS細胞を樹立し、神経系細胞への分化誘導や欠失遺伝子の導入による機能解析を行い、22q11.2欠失症候群における統合失調症発症機序解明および新規治療法開発の糸口を探ることを目的としている。平成23年度の研究では、2例の22q11.2欠失症候群患者(SA001、KO001)を対象として、ゲノム欠失範囲の解析、iPS細胞の樹立、神経系細胞への分化誘導を行った。欠失範囲の解析には、Flurescence in situ hybridization法とArray CGH法を用いた。SA001では22q11.2領域の2.5 Mbが欠損し、この欠損領域には56個の遺伝子が存在することがわかった。現在、同様の解析をKO001について行っている。疾患由来iPS細胞は、22q11.2欠失症候群患者(SA001、KO001)の線維芽細胞にOCT3/4, SOX2, KLF4, C-MYCをレトロウイルスにより導入することで作製した。遺伝子導入後、フィーダー細胞上で20日間培養しiPS細胞の形態を示すコロニーを複数単離した後、継代培養してセルライン化した。セルライン化したiPS細胞の中で、導入遺伝子がサイレンシングされ、未分化マーカー(Nanog、Tra-1-60)が発現し、神経幹細胞への分化効率が高いiPS細胞を選び出し、疾患由来iPS細胞とした。SA001は、統合失調症の発症に関わる因子として22q11.2領域の欠損の他に、GLO1遺伝子の変異を持っていた。GLO1遺伝子は、カルボニルストレスの除去に関わることが知られており、SA001のiPS細胞を用いて、カルボニルストレスに注目して解析を行った結果、カルボニルストレスが神経幹細胞の分化に関わっていることが示唆された。当初の計画では、iPS細胞の樹立・解析対象とする22q11.2欠失症候群患者は1例(SA001)だけであったが、共同研究先の慶應義塾大学・岡野研究室の紹介により、2例目の22q11.2欠失症候群患者(KO001)を得ることができた。平成23年度の研究計画では、欠損領域・遺伝子の同定とiPS細胞の樹立を予定していたが、1例目のSA001では、欠損領域・遺伝子の同定とiPS細胞の樹立を共に達成しており、2例目のKO001でもiPS細胞の樹立について達成している。また、2人の22q11.2欠失症候群患者からiPS細胞を樹立できたことで、22q11.2欠失症候群に共通するデータを取れる可能性が出てきた。

また前述のように、SA001が持つGLO1遺伝子の変異によるカルボニルストレスが神経幹細胞の分化に関わっていることを示唆するデータも得られた。以上のことから、当初の計画以上に進展していると考える。(1) iPS細胞を用いた候補遺伝子のknockdown実験・過剰発現実験各22q11.2欠失症候群患者(SA001、KO001)の欠失遺伝子群をリスト化し、精神症状発症に関係する可能性のある遺伝子に関して、種々の情報を調査し、解析のプライオリティーをつける。プライオリティーの高い遺伝子から順に(10遺伝子程度)、健常者由来iPS細胞を用いてknockdown実験を行い、神経系細胞(グリア細胞も含む)への分化に及ぼす影響を調べる。Knockdown実験で絞り込んだ遺伝子については、樹立した疾患由来iPS細胞に対して当該遺伝子を強制発現させ、神経系細胞分化が正常化するかを検討する。(2)神経幹細胞の分化におけるカルボニルストレスの影響平成23年度の研究によって、GLO1遺伝子の変異を持つ22q11.2欠失症候群患者(SA001)のiPS細胞では、カルボニルストレスによって神経幹細胞への分化効率が低下することが示唆された。そこで、カルボニルストレスによって産生する終末糖化産物(ペントシジン)の量を測定し、SA001のiPS細胞が、他のiPS細胞(GLO1遺伝子の変異を持たない22q11.2欠失症候群患者(KO001)や健常者由来)と比べ、どの程度カルボニルストレスの影響があるのか解析する。更に、健常者由来iPS細胞を用いてGLO1遺伝子のknockdown実験を行い、神経幹細胞への分化に及ぼす影響や、SA001のiPS細胞に対してGLO1遺伝子を強制発現させ、神経幹細胞への分化が正常化するかを検討する。平成24年度の研究費の大半は、細胞培養操作、分子生物学的実験操作、遺伝子発現解析に必要な試薬等の消耗品の購入にあてられる。特に、遺伝子導入用のウイルスベクターの作製やiPS細胞の培養、神経系細胞への分化に必要な試薬等を購入する。なお、本研究を滞りなく行うに足る消耗品以外の設備・装置等は確保しており、平成24年度の研究費では、高価な設備備品等は購入しない。研究遂行上必要な、他機関の研究者との打ち合わせ、情報収集、成果発表のために、国内学会(日本人類遺伝学会、日本生物学的精神医学会等)および国際会議(北米神経科学学会等)への出席が必要なため、旅費として使用する。また、英語論文発表のために必要な英文校正料に使用する。
膵臓β細胞の細胞分化に関わる遺伝子群の同定と糖尿病モデル動物による前臨床的研究

本研究の目的は、β細胞増殖に関わる遺伝子群を単離し、その組織内発現解析することである。1)大量処理型in situハイブリダイゼーション法を確立することによって、多くの遺伝子のISHによる組織発現同定が再現よく行えるようになった。2)KKAy特異的遺伝子およびBALB特異遺伝子(KKAyでは発現低下している)をサブトラクション法によってそれぞれ11個と10個単離した。両系統マウスの経時的発現変化を比較したところ、KKAyで7個、BALBで4個の遺伝子の発現が加齢とともに異なることが分かった。KKAy特異遺伝子には、β細胞の再生に関与しているとして報告されている、regI、regII、regIIIβが含まれていた。また、1個の未知の遺伝子も含まれていた。3)ISHによって、10週と27週マウスにおけるregファミリー遺伝子の組織内局在を解析した。これらの遺伝子は膵外分泌細胞に発現していたが、稗島では全く発現がなかった。10週のBALBでは全ての発現が認められなかったが、同齢KKAyでは全てが発現していた。27週BALBではregIのみが顕著に上昇していたが、regIIは弱陽性程度の発現だった。しかし、regIIIβは、発現を認めなかった。30週のKKAyでは、これらの発現が更に増していた。面白いことに膵島を囲んでいる一層の外分泌細胞はregIIIβは陰性であった。4)定量的RT-PCR法によって、ストレプトゾトシン投与によるI型糖尿病モデルマウスにおけるそれぞれ特異的に単離した遺伝子について解析したところ、特異的な遺伝子発現の変化は観察できなかった。一方、regファミリー遺伝子発現の組織内局在を検証したところ、これらは27週BALBの膵臓と同様な発現プロフィールであった。以上、regファミリー遺伝子は、II型糖尿病の膵島β細胞の増殖に重要な役割を演じていることが示唆された。1.II型糖尿病関連遺伝子の探索のため、糖尿病発病前後(6、10週)のKKAyマウスと10週の正常マウスの膵臓から夫々mRNAを調整し、これらよりサブトラクションライブラリーを作成した。各サブトラクションライブラリーから各々約1500コロニー、合計約6000コロニーを分離し、1ライブラリー当たり約250個、合計で約1000個のプラスミドをシークエンスし、ホモロジー検索を行った。現在、各クローンの病因との関連について検討中である。2.BALB/cA-CSAコンジェニックマウスを用いてES細胞の樹立を目指した。現在、細胞株の安定化の為の培養を継続中である。3.糖尿病発症前後KKAyマウス、8週齢(尿糖-)および12週齢(尿糖+)の膵臓の形態学的解析を行った。その結果、このマウスの膵島は8週で既に肥大していた。これは機能更新したインスリン分泌細胞(B細胞)の増生によるものであった。一方、膵島内におけるグルカゴン分泌細胞(A細胞)は減少傾向を示したが、膵島外組織で多数出現し、細胞小塊を形成するものもあった。12週では、膵島中心部でのB細胞の退行と辺縁部における機能亢進像が観察された。電顕観察からこの退行像はネクローゼであることが解った。このような膵島内の変性とは反対に、膵島外組織においては多くのB細胞が小塊状に観察できた。ソマトスタチン分泌細胞や膵ポリペプチド分泌細胞は、各膵導管上皮や腺房細胞間に多く出現し、AおよびB細胞と細胞小塊を形成するものも観察できた。

一方、膵組織に囲まれた総胆管上皮には、膵島外組織よりも各内分泌細胞が多く観察された。特に、総胆管上皮下の結合組織内にネスチン陽性の膵内分泌細胞の小塊が多数出現していた。これらの観察は、KKAyマウスでは、内分泌細胞の変性によって、代償性に膵導管系および総胆管系から内分泌細胞が再生して、膵島の新生が起こっていることを強く示唆している。1)H14年度作製したサブトラクションライブラリー(SL)にはDNA断片の混在が多いことが、シーケンスの結果判明したので、10週齢(糖尿病発病後)のKKAyマウス(K)と10週齢正常マウス(B)の夫々の膵臓からmRNAを調整し、これらよりK-BとB-KのSLを作成した。K特異的SL(K-B)から1200クローン、B特異的SL(B-K)から1248クローンを採取し、メンブレンに貼り付けマクロアレイを作製した。これらの遺伝子の特異性を検討するため、1次スクリーニングとして、夫々のSLをプローブとして、また、2次スクリーニングとして、組織から調整したcDNAをプローブとして夫々のアレイと相互にハイブリさせた。二つのスクリーニングの結果からK特異的なもの162クローン、B特異的なもの153クローンを選抜し、それらの塩基配列を決定した。その塩基配列を基にクラスター解析およびホモロジー解析を行ったところ、K特異的28遺伝子、B特異的21遺伝子を抽出した。その後、3次スクリーニングとして選抜した夫々の遺伝子についてPCR用プライマーを設計して、KおよびBの膵臓から調整したcDNAを用いて段階的RT-PCRによって発現量の違いを検討した。その結果、Kでは9遺伝子がBに比べて発現が高く、Bでは9遺伝子の発現がKより高いことがわかった。残りの遺伝子は、PCRの結果からは発現量に差を見ることができなかった。これら差のある遺伝子名をみると、Kでは組織再生関連遺伝子が、Bでは代謝系の遺伝子が多い傾向にあった。一方、夫々特異的として検出されたもののシーケンスの結果、機能が明確でない遺伝子を計8個検出することができた。2)来年度は、本年度取った遺伝子の組織発現プロフィールを解析する予定である。そのため解析用のISH技術を確立し、その結果を国際マウスゲノム学会にて報告した。平成15年度選択した特異的発現遺伝子KKAy特異的(10個)、BALB特異的(11個)の各々について、各系統マウスの各週齢(5、7、8、9、12および35週齢)における発現量の比較を行ったところ、KKAyでは7個、BALBでは4個の遺伝子の発現プロフィールが、系統および経時的に異なることを発見した。その内、regI、regII、regIIIβについては、ISHにて組織内における発現部位を比較した。これらの遺伝子発現は全て膵臓外分泌部に局在しており、ランゲルハンス島の内分泌細胞には、その発現を認められなかった。10週齢のKKAyにおいては、regI、regII、regIIIβともに発現が認められたが、BALBでは、それらの発現は認められなかった。一方、35週齢KKAyでは、これらの強い発現を観察したが、面白いことにランゲルハンス島に隣接する一層の細胞は陰性であった。27週齢
左右非対称性決定遺伝子(inv)の機能解明-個体と細胞の極性-

脊椎動物の内部器官は心臓をはじめとして左右非対称性を形成する。我々はほぼすべてのホモ接合マウスにおいて内臓逆位を示す変異体(inv)を発見し、その原因遺伝子をクローニングした。マウスinv遺伝子は1062個のアミノ酸より成る蛋白をコードし,15回の繰り返しを持つアンキリン・モティフを持つ。この遺伝子は新規の遺伝子であり、その機能、そして機能制御に関しては全く不明であった。我々は、Yeast two hybrid systemを用い、inv遺伝子のアンキリン・モティフ部分をbaitとして腎臓のライブラリーをスクリーニングしたところ、calmodulinが結合することを見いだした。inv蛋白をシークエンスを再検したところ、calmodulinと結合すると考えられるモティフ(IQ motif)が2カ所に見いだされた。さらに、Gel overlay assayにてcalmodulinとinv蛋白の結合が確認され、この結合はカルシウムによって制御されていることが明らかとなった。inv遺伝子をcos細胞に導入し、過剰発現をさせることによってどの様な効果が生じるかを調べたところ、長期培養の細胞において細胞の形態が拡大することが認められた。そこで、これらの細胞をFACSにてDNAと細胞の比率を調べたところ、hyperploidとなっている細胞が増加していることが判明した。この結果はinv蛋白は細胞分裂に関与している可能性を示唆した。さらに、inv遺伝子がXenopusにおいて作用している可能性を探るため、Xenopus inv遺伝子のクローニングを試みた。その結果、2つのホモローグのクローニングに成功した。我々は、内部臓器の左右非対称性が逆転するマウスの変異体(inv)よりその原因遺伝子を同定した。inv蛋白は1062個のアミノ酸をコードし、15個の繰り返しのアンキリン・ドメインを持つ。しかしながら、inv遺伝子は以前には報告のない遺伝子であり、その左右決定機構における役割は全く不明である。また、inv遺伝子がマウス以外の他の種で同様の機能を持つかも不明である。このinv遺伝子の左右決定における機能解明を目指し、inv蛋白と結合する蛋白をYeast two hybridにてスクリーニングした結果、calmodulinが結合することがわかった。さらに、蛋白配列を調べたところ、2カ所でcalmudulinと結合することが考えられ、yeast two hybridにて確かめられた。さらにこの結合はカルシウムによって制御されていることが明らかになった。calmodulinとの結合がinv機能に必要であるかどうかを知るため、Xenopus embryoへinv mRNAを注入実験を試みた。その結果、マウスのinv mRNAを右側割球への注入において左右軸の逆転が認められた。さらに、inv遺伝子の様々な領域を欠失させた変異体を作製し、そのRNAを注入した。inv mRNA注入による左右の逆転はcalmodulin結合部位を除くとなくなり、calmodulinとの結合がinv遺伝子の機能に重要であることがわかった。inv蛋白をシークエンスを再検したところ、calmodulinと結合すると考えられるモティフ(IQ motif)が2ヵ所に見いだされた。