hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ハムスターをモデルとした哺乳類の「雌」におけるＰＩＷＩ－ｐｉＲＮＡの機能解明

本研究の目的は,哺乳類の「雌の生殖細胞」におけるPIWI-piRNAの分子機能解明である.本研究はハムスターをモデルとして(1)個体レベルおよび(2)分子レベルの2つの側面から「雌の生殖細胞」におけるPIWI-piRNAの機能に迫る.【個体レベルの成果】CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用いて,ハムスターの卵巣で発現する3種類のPiwi遺伝子; Piwil1,Piwil2,Piwil3について遺伝子改変ハムスターの作製を実施し,Piwil1およびPiwil3について複数系統のファウンダーを得ることに成功した.Piwil1改変ハムスターでは不妊の表現型が示唆された.一方Piwil3改変ハムスターは出産するものの,一腹あたりから生まれる仔の数が減少する表現型が観察された.さらにPiwil3改変ハムスターから採取した受精卵をin vitroで培養すると,胚盤胞まで正常に発生する胚は全体の約10%であり,90%は発生が途中で停止することが明らかとなった.発生が停止した胚は3細胞や5細胞など,異常な形態が観察された.これらの結果からPiwil1とPiwil3は卵子において異なる機能を有している可能性が示唆された.【分子レベルの成果】抗PIWIL1, PIWIL2, PIWIL3モノクローナル抗体を作製し,これらを用いて免疫沈降法により各PIWIに結合するpiRNA群を卵巣,排卵された卵細胞および2細胞期の初期胚,それぞれにおいて濃縮したところ,(1. PIWIL3には19-21塩基長の非常に短いpiRNAが排卵された卵細胞でのみ結合している(2. PIWIL3はpiRNAが結合する時期でのみ質量が40 kDaほど増加する(3. PIWIL1はPIWIL3のように質量は変化しない一方で,結合しているpiRNAの塩基長が発生の進行に伴い短くなる,という3つの現象を新たに発見した.(1)個体レベルおよび(2)分子レベルの両者において,研究計画書に記述した通りに実験を実施し,一定の成果が得られているため.前述した研究実績を踏まえ,今後の方策を以下に示す.【個体レベル】Piwil3を欠損した系統に関して,排卵から初期発生における表現型の有無をより詳細に観察することを計画している.またPiwil2についても同様にファウンダーを得たのち,交配によって遺伝子改変ハムスターを系統化する.さらにこれらの系統を交配させることにより,ダブルミュータントの個体を作製する.【分子レベル】(1. PIWIL1およびPIWIL3に結合する各piRNAの配列を決定する:超並列シーケンサーを用いて解読し,解析を現在おこなっている段階である.(2. PIWIL3の質量が大きくなる原因を明らかにする:質量が増大する原因は糖鎖やユビキチン化など何らかの修飾によるものだと仮説を立て,その検証実験をしている段階である.(3.卵細胞における遺伝子発現プロファイルの取得:排卵された卵細胞は,卵巣および初期胚とは細胞内の状態が異なることが予想される.そのため排卵された卵細胞における遺伝子発現プロファイルを取得するべく,超微量サンプルからライブラリ調整をおこなう実験系を確立し,現在は超並列シーケンサーによる配列解読,データが得られたサンプルから解析を進めている.各PIWI遺伝子欠損ハムスターのサンプルについても準備が整い次第,配列解析を進める準備が出来ている.(4.リファレンスゲノムの品質向上:現在公開されているリファレンスゲノムは全体の20%が「N(ギャップ)」となっている.このギャップを埋めることで,超並列シーケンサーで得られたデータをより有効に解析する.本研究の目的は,哺乳類の「雌の生殖細胞」におけるPIWI-piRNAの分子機能解明である.本研究はハムスターをモデルとして(1)個体レベルおよび(2)分子レベルの2つの側面から「雌の生殖細胞」におけるPIWI-piRNAの機能に迫る.【個体レベルの成果】CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用いて,ハムスターの卵巣で発現する3種類のPiwi遺伝子; Piwil1,Piwil2,Piwil3について遺伝子改変ハムスターの作製を実施し,Piwil1およびPiwil3について複数系統のファウンダーを得ることに成功した.Piwil1改変ハムスターでは不妊の表現型が示唆された.一方Piwil3改変ハムスターは出産するものの,一腹あたりから生まれる仔の数が減少する表現型が観察された.さらにPiwil3改変ハムスターから採取した受精卵をin vitroで培養すると,胚盤胞まで正常に発生する胚は全体の約10%であり,90%は発生が途中で停止することが明らかとなった.発生が停止した胚は3細胞や5細胞など,異常な形態が観察された.これらの結果からPiwil1とPiwil3は卵子において異なる機能を有している可能性が示唆された.【分子レベルの成果】抗PIWIL1, PIWIL2, PIWIL3モノクローナル抗体を作製し,これらを用いて免疫沈降法により各PIWIに結合するpiRNA群を卵巣,排卵された卵細胞および2細胞期の初期胚,それぞれにおいて濃縮したところ,(1. PIWIL3には19-21塩基長の非常に短いpiRNAが排卵された卵細胞でのみ結合している(2. PIWIL3はpiRNAが結合する時期でのみ質量が40 kDaほど増加する(3. PIWIL1はPIWIL3のように質量は変化しない一方で,結合しているpiRNAの塩基長が発生の進行に伴い短くなる,という3つの現象を新たに発見した.

(1)個体レベルおよび(2)分子レベルの両者において,研究計画書に記述した通りに実験を実施し,一定の成果が得られているため.前述した研究実績を踏まえ,今後の方策を以下に示す.【個体レベル】Piwil3を欠損した系統に関して,排卵から初期発生における表現型の有無をより詳細に観察することを計画している.またPiwil2についても同様にファウンダーを得たのち,交配によって遺伝子改変ハムスターを系統化する.さらにこれらの系統を交配させることにより,ダブルミュータントの個体を作製する.【分子レベル】(1. PIWIL1およびPIWIL3に結合する各piRNAの配列を決定する:超並列シーケンサーを用いて解読し,解析を現在おこなっている段階である.(2. PIWIL3の質量が大きくなる原因を明らかにする:質量が増大する原因は糖鎖やユビキチン化など何らかの修飾によるものだと仮説を立て,その検証実験をしている段階である.(3.卵細胞における遺伝子発現プロファイルの取得:排卵された卵細胞は,卵巣および初期胚とは細胞内の状態が異なることが予想される.そのため排卵された卵細胞における遺伝子発現プロファイルを取得するべく,超微量サンプルからライブラリ調整をおこなう実験系を確立し,現在は超並列シーケンサーによる配列解読,データが得られたサンプルから解析を進めている.各PIWI遺伝子欠損ハムスターのサンプルについても準備が整い次第,配列解析を進める準備が出来ている.(4.リファレンスゲノムの品質向上:現在公開されているリファレンスゲノムは全体の20%が「N(ギャップ)」となっている.このギャップを埋めることで,超並列シーケンサーで得られたデータをより有効に解析する.
ベクターを用いたヒト骨形成因子遺伝子導入による骨誘導

BMP発現ベクターによるBMP遺伝子導入は、宿主自身の細胞にBMPを作らせるという、今までのBMP研究の発想を大きく転換した独創的なものである。アデノウイルスベクターを利用した方法は遺伝子導入効率が良く、有効な手法であるが、アデノウイルスベクターには免疫反応への対処という問題が残されていた。この問題を解決すべく、免疫抑制剤の全身投与および局所投与、免疫防御生体材料の応用、免疫抑制作用を有する間葉系幹細胞の組織工学的利用などの検討を進めた。従来の研究成果から、免疫系が上記の方法で一時的に抑制出来れば、技術的にも費用的にも容易に臨床の場へ供給出来得ると考えた。独自に作製したBMP発現アデノウイルスベクターによるBMP遺伝子導入に際する免疫抑制剤の全身投与および局所投与の検討を行い、有用な結果を得た。また、免疫系から保護する生体材料(コラーゲン)応用の検討を行い、同様に局所的な免疫抑制作用を得ることに成功した。これらの研究成果から、免疫系の一時的な抑制が可能であり、アデノウイルスベクターを介して宿主(臨床においては患者)自身の細胞にBMPを作らせるという画期的な方法での骨誘導が可能となった。本手法は、技術的にも費用的にも容易に臨床の場へ供給出来得ると考えてる。また、生体為害作用のないプラスミドベクターにも着目し、BMP発現プラスミドベクターのエレクトロポレーション法での遺伝子導入法の検討も合わせて行った。本法は余分なベクターを使用しておらず、裸のプラスミドDNAの直接注入によるものであり、エレクトロポレーション法で宿主への遺伝子導入が有効に行え、理想的方法と考えられる。本法は近い将来臨床での骨組織再生において、非常に有用なものとなり、治療困難であった骨形成性疾患や骨再建における新治療法の開発に寄与するものと思われる。BMP発現アデノウイルスベクターによるBMP遺伝子導入は、宿主自身の細胞にBMPを作らせるという、今までのBMP研究の発想を大きく転換した独創的なものである。ただし、免疫反応への対処という問題が残されている。この問題を解決すべく、免疫抑制剤の全身投与および局所投与、免疫系から保護する生体材料応用、免疫抑制作用を有する間葉系幹細胞の組織工学的利用などの検討を進めている。従来の研究成果から、免疫系が上記の方法で一時的に抑制出来れば、技術的にも費用的にも容易に臨床の場へ供給出来得ると考え、独自に作製したBMP発現アデノウイルスベクターによるBMP遺伝子導入に際する免疫抑制剤の全身投与および局所投与の検討を行い、有用な結果を得た。また、免疫系から保護する生体材料(コラーゲン)応用の検討を行っており、同様に局所的な免疫抑制作用が得られそうな目処が立っている。この研究成果から、免疫系がこれらの方法で一時的の抑制出来、BMPを現在一般的に行われている蛋白(サイトカイン)として直接使用するのではなく、アデノウイルスベクターを介して宿主(臨床においては患者)自身の細胞にBMPを作らせるという画期的な方法での骨誘導が可能であり、技術的にも費用的にも容易に臨床の場へ供給出来得ると考えられる。さらに、最近注目を集めている生体為害作用のないプラスミドベクターにも着目し、BMP発現プラスミドベクターのエレクトロポレーション法での遺伝子導入法の検討も合わせて行った。本法は近い将来臨床での骨組織再生において、非常に有用なものとなり、治療困難であった骨形成性疾患や骨再における新治療法の開発に寄与するものと思われる。BMP

発現ベクターによるBMP遺伝子導入は、宿主自身の細胞にBMPを作らせるという、今までのBMP研究の発想を大きく転換した独創的なものである。中でもアデノウイルスベクターを利用した方法は遺伝子導入効率が良く、有効な手法である。しかし、アデノウイルスベクターには免疫反応への対処という問題が残されている。この間題を解決すべく、免疫抑制剤の全身投与および局所投与、免疫系から保護する生体材料応用、免疫抑制作用を有する間葉系幹細胞の組織工学的利用などの検討を進めている。従来の研究成果から、免疫系が上記の方法等で一時的に抑制出来れば、技術的にも費用的にも容易に臨床の場へ供給出来得ると考え、独自に作製したBMP発現アデノウイルスベクターによるBMP遺伝子導入に際する免疫抑制剤の全身投与および局所投与の検討を行い、有用な結果を得た。また、免疫系から保護する生体材料(コラーゲン)応用の検討を行い、同様に局所的な免疫抑制作用を得ることに成功した。これらの研究成果から、免疫系の一時的な抑制力が可能であり、BMPを現在一般的に行われている蛋白として直接使用するのではなく、アデノウイルスベクターを介して宿主(臨床においては患者)自身の細胞にBMPを作らせるという画期的な方法での骨誘導が可能となった。また、生体為害作用のないプラスミドベクターにも着目し、BMP発現プラスミドベクターのエレクトロポレーション法での遺伝子導入法の検討も合わせて行った。本法は余分なベククーを使用しておらず、裸のプラスミドDNAの直接注入によるものであり、エレクトロポレーション法で宿主への遺伝子導入が有効に行え、理想的方法と考えられる。本法は近い将来臨床での骨組織再生において、非常に有用なものとなり、治療困難であった骨形成性疾患や骨再建における新治療法の開発に寄与するものと思われる。
高感度(e,3e)分光の開発による導電性有機分子の電子相関の研究

本研究では、分子軌道形状と電子の相関運動との関係性を探るため、基本的なπ電子系分子を対象に、π軌道の三次元的形状(核間距離、位相、広がりなど)の情報を電子運動量分布から抽出することを試みた。その結果、電子運動量分布に現れる振動構造からπ軌道の位相が一目瞭然に視覚的に捉えられ、また、電子運動量分布をフーリエ変換して自己相関関数を得ることで、軌道の空間的な広がりに関する情報が得られることが分かった。さらに、芳香族分子の時間分解電子運動量分光実験を行い、πーπ*電子励起状態における任意の分子軌道イメージングが原理的に可能であることを実証した。本研究では、電子相関運動を直接的に可視化する新規実験手法を開発し、有機半導体材料の基本単位の一つである単純な芳香族分子のπ電子を対象として、電子相関と物性・反応性との関係を明らかにすることを目的とする。そのために、1電子の運動量密度分布を与える(e, 2e)電子運動量分光を、二重電離過程をも対象とする形に発展させ、物質内2電子の運動量二体分布関数を与える高感度(e, 3e)電子運動量分光として開発・確立する。これにより、原子分子物理学における電子状態研究の核心および固体物理学における電子物性の本質に迫る。平成27年度は、(e, 2e)電子運動量分光の高エネルギー分解能化および電子運動量分布に現れる干渉効果に関する研究を行った。前者については、芳香族分子の二重電離状態を(e, 3e)分光により分離して観測する目的のために、(e, 2e)分光装置のアナライザー部および電子銃の高エネルギー分解能化について検討を行った。その結果、強度に関しては課題を残すものの、従来と比べて桁違いにエネルギー分解能を改善できる示唆を得た。一方、後者に対しては、二酸化炭素分子やエチレン分子のπ軌道を対象に、分子構造(原子核間距離)や分子軌道の位相や広がりといった、分子軌道の三次元的形状の情報を電子運動量分布から抽出することを目的とした。実験の結果、電子運動量分布における干渉パターンから反結合性および結合性π軌道の位相が一目瞭然で視覚的に捉えられることが分かった。こうした干渉効果のユニークな特性を利用することで、電子相関と分子軌道の三次元的形状との関連性を明らかにできると期待される。本年度の研究で、芳香族分子の高感度(e, 3e)分光の実現へ向けたエネルギー分解能向上に対する一つの指針、およびπ軌道の三次元的形状に関する基礎的知見を得ることができた。(e, 2e)電子運動量分光の実験および解析の精度を向上させれば、電子運動量分布に表れる干渉パターンからπ軌道の位相のみならず化学結合の効果をも可視化できる可能性があることが分かり、分子軌道形状の精密分光へ向けてさらに一歩前進した。この成果は、本研究で実現を目指す高感度(e, 3e)分光で捉える電子相関運動を立体的に理解するのに役立つため、研究はおおむね順調に進んでいると判断する。平成28年度は、昨年度に開始した(e, 2e)電子運動量分光の高エネルギー分解能化および電子運動量分光による分子軌道の三次元的形状に関する研究を引き続き進める一方で、2電子原子であるHeを対象とした(e, 3e)分光実験を試みた。分子軌道の三次元的形状の情報を実験データから抽出するため、二酸化炭素、エチレン、およびブタジエンの最高被占軌道(π軌道)の電子運動量分布をdensity oscillation解析とフーリエ解析の2通りで解析を行った。その結果、いずれの分子に対しても、電子運動量分布の干渉パターンから反結合性および結合性π軌道の位相が一目瞭然で視覚的に捉えられることが分かった。さらに電子運動量分布のフーリエ解析からは、位相に関してdensity oscillation解析と同様の結果が得られるのみならず、分子軌道の空間分布に関してより直接的な情報が得られる示唆を得た。一方、Heの(e, 3e)分光の極めて予備的実験として、既存の(e, 2e)分光装置のみを用い、電子衝撃二重電離で生成する散乱三電子のエネルギーが全て等しく、かつ、散乱角が45°のものを検出することを試みたが、同時計測信号を得るには至らなかった。これにより、(e, 3e)信号を得るには低速散乱電子の観測など、異なる実験配置が必要となることが分かった。このほか、時間分解(e, 3e)電子運動量分光の実現へ向けた検討を開始した。

さらに、芳香族分子の時間分解電子運動量分光実験を行い、πーπ*電子励起状態における任意の分子軌道イメージングが原理的に可能であることを実証した。今後は、平成27年度に開始した高エネルギー分解能化および電子運動量分布に現れる干渉効果の研究を引き続き進める一方で、2電子原子であるHeを対象とした(e, 3e)分光実験を試み、高速電子衝突電離で生成する散乱3電子の運動量ベクトル相関から電離前の二電子運動量相関を調べる予定である。電子相関を調べるのに最適な実験条件を見いだし、有機半導体の基本分子の一つであるベンゼンのπ電子を対象として、2電子運動量密度分布の測定を試みる。またナフタレンや、アントラセンなどの多環芳香族炭化水素分子について系統的な実験を行い、分子サイズや縮合パターンとπ電子相関運動との関係を明らかにする。さらに、実験が順調に進めば、フェムト秒レーザーにより光励起した不安定過渡状態の電子運動量相関の観測も試みる。その際にはまず予備実験として、研究代表者らが所有するフェムト秒レーザーシステムを用いて、連続電子線による実験を行う予定である。その結果を受けて、時間分解(e, 3e)電子運動量分光の開発へ向けた検討を始める。物理化学当初の研究計画では低速電子用の運動量画像観測分光器を試作する予定であったが、本研究が目的とする(e, 3e)分光を実現するためにはまず、(e, 2e)分光のエネルギー分解能の改善および既存装置を用いた分子軌道形状の精密分光を優先して進める必要が生じたため。こうした研究計画の修正に伴い、平成27年度の使用額を変更した。次年度は、幾つかの単純分子に対して既存装置を用いた(e, 3e)実験を行うとともに、時間分解測定へ向けた検討を開始する予定である。そのため今年度の未使用分および次年度の助成金を合わせたものを主に、実験サンプル、既存装置の消耗品、および光学部品を新たに購入するために割り当てる。
シナプスにおけるCaMKII結合タンパク質のスクリーニング

カルシウム-カルモデゥリンキナーゼII(以下CaMK IIと省略)はシナプス伝達効率をカルシウムイオン依存性に変化させるのに重要な役割を果たしている。この分子の後シナプスにおける基質、結合タンパク質を網羅的に検索するために、酵母2ハイブリッド実験系を用いた。まず後シナプス膜におけるCaMK IIのアンカーとなるとされるNMDA受容体2Bサブユニットの細胞内ドメインと自己リン酸されて活性化型キナーゼを模倣する変異型であるCaMK II T286Dを同時発現させたベートを酵母に発現させた。ここにマウス大脳cDNAライブラリーを共発現させて結合するタンパク質のスクリーニングを行った。このうち現在までに受容体やCaMK IIとの結合が報告されてない2つの分子を見いだした。これらの分子はNMDA受容体サブユニットにCaMK II T286Dの同時発現依存性に結合し、野生型のCaMK IIを発現させた場合その結合はみられなかった。そのうちの一つの分子はタンパク質脱リン酸化酵素2Aであった。CaMK II、NMDA受容体、との結合を培養細胞に発現させて検討したところ3者は共沈されることが観察された。受容体機能にどのような影響を与えるのかが今後の検討課題である。また、カルシウム結合タンパク質カルレティキュリンもNMDA受容体-CaMK IIに結合することが観察された。その細胞内での動態については現在検討中である。ごこにマウス大脳cDNAライブラリーを共発現させて結合するタンパク質のスクリーニングを行った。これらの分子はNMDA受容体サブユニットにCaMK II T286Dの同時発現依存性に結合する。これらは既に配列が報告されて分子の機能は報告されているものであった。現在これらの分子とCaMK II、NMDA受容体、との結合様式、細胞内分布の検討、受容体、キナーゼ活性に対する作用などの検討を行っている。カルシウム-カルモデゥリンキナーゼII(以下C aMK IIと省略)はシナプス伝達効率をカルシウムイオン依存性に変化させるのに重要な役割を果たしている。まず後シナプス膜におけるC aMK IIのアンカーとなるとされるNMDA受容体2Bサブユニットの細胞内ドメインと自己リン酸されて活性化型キナーゼを模倣する変異型であるC aMK IIT286Dを同時発現させたベートを酵母に発現させた。ここにマウス大脳cDNAライブラリーを共発現させて結合するタンパク質のスクリーニシグを行った。このうち現在までに受容体やC aMK IIとの結合が報告されてない2つの分子を見いだした。これらの分子はNMDA受容体サブユニットにC aMK II T286Dの同時発現依存性に結合し、野生型のC aMK IIを発現させた場合その結合はみられなかった。C aMK II、NMDA受容体、との結合を培養細胞に発現させて検討したところ3者は共沈されることが肝さっsつされた。また、カルシウム結合タンパク質カルレティキュリンもNMDA受容体-C aMK IIに結合することが観察された。
植物ゲノムを支える遺伝的冗長性を解析する技術基盤

pythonを利用した各遺伝子を破壊するためのソフトウェアを発展させ,長鎖欠失用のソフトウェアを作成し,発表を行った(田井ら,2018年植物学会).具体的には,各遺伝子の上流,下流のgRNAのうち,オフターゲットが最も少ないgRNAを10本取り出し,リスト化した.また,シロイヌナズナにおいて知られている全タンデム重複遺伝子に対して,タンデム重複遺伝子をそれぞれ欠失させるようなgRNAのセットを構築し,リスト化した.リスト化したgRNAセット(2本)を同時に発現させるために,tRNAとgRNAを結合させて複数gRNAを同時発現させるシステムを利用した.本システムを利用することで,1つのオリゴDNAの中に2つのgRNA配列を含むような170 bpのオリゴDNAを設計した.オリゴDNAは超並列遺伝子合成によってプールとして合成した.プールとして合成したオリゴライブラリをベクターに導入するには至っていないが,プルーフオブコンセプトとして,1つのオリゴに対してベクター構築を行い,合成したオリゴを導入するためのベクター構築のプロトコールを作成した.in silicoデザイン用のソフトウェアの構築は終了し,リスト化されている全タンデム重複遺伝子を欠失させるためのオリゴライブラリーも構築し終えた.植物体の作製ができていないので,その点は当初の予定より遅れているが,これは,立命館大学の共通植物部屋の温度管理システムの不具合により,植物が健全に育たなかったためである.「今後の研究の推進方策」で述べる通り,2019年度に関してはこの問題は起こらないと予想される.研究代表者は,産業技術総合研究所・生物プロセス部門・植物機能制御研究グループに異動した.本研究グループは,シロイヌナズナの転写因子をほぼ網羅するCRES-Tラインを作出した実績を持つ.本研究グループが有するリソースを利用すれば,タンデム重複遺伝子をひとつずつ破壊していき,変異体ライブラリー化していくことも容易であると推察される.2018年度に構築したソフトウェア,およびライブラリーに加えて,各タンデム重複遺伝子群を破壊するためのベクターを構築し,順次植物体の作出を行っていく予定である.pythonを利用した各遺伝子を破壊するためのソフトウェアを発展させ,長鎖欠失用のソフトウェアを作成し,発表を行った(田井ら,2018年植物学会).具体的には,各遺伝子の上流,下流のgRNAのうち,オフターゲットが最も少ないgRNAを10本取り出し,リスト化した.また,シロイヌナズナにおいて知られている全タンデム重複遺伝子に対して,タンデム重複遺伝子をそれぞれ欠失させるようなgRNAのセットを構築し,リスト化した.リスト化したgRNAセット(2本)を同時に発現させるために,tRNAとgRNAを結合させて複数gRNAを同時発現させるシステムを利用した.本システムを利用することで,1つのオリゴDNAの中に2つのgRNA配列を含むような170 bpのオリゴDNAを設計した.オリゴDNAは超並列遺伝子合成によってプールとして合成した.プールとして合成したオリゴライブラリをベクターに導入するには至っていないが,プルーフオブコンセプトとして,1つのオリゴに対してベクター構築を行い,合成したオリゴを導入するためのベクター構築のプロトコールを作成した.in silicoデザイン用のソフトウェアの構築は終了し,リスト化されている全タンデム重複遺伝子を欠失させるためのオリゴライブラリーも構築し終えた.植物体の作製ができていないので,その点は当初の予定より遅れているが,これは,立命館大学の共通植物部屋の温度管理システムの不具合により,植物が健全に育たなかったためである.「今後の研究の推進方策」で述べる通り,2019年度に関してはこの問題は起こらないと予想される.研究代表者は,産業技術総合研究所・生物プロセス部門・植物機能制御研究グループに異動した.本研究グループは,シロイヌナズナの転写因子をほぼ網羅するCRES-Tラインを作出した実績を持つ.本研究グループが有するリソースを利用すれば,タンデム重複遺伝子をひとつずつ破壊していき,変異体ライブラリー化していくことも容易であると推察される.2018年度に構築したソフトウェア,およびライブラリーに加えて,各タンデム重複遺伝子群を破壊するためのベクターを構築し,順次植物体の作出を行っていく予定である.「研究の進捗」にも記載したが,2018年度,立命館大学において植物の培養室の状況が悪化した.気温が50°Cになり植物がすべて枯死したり,30°Cになりシロイヌナズナの種子の発芽率が著しく低下したり,といった問題が発生した.したがって,今年度の研究のほとんどは,in silicoによるコンピューターでの実験であり,消耗品などを購入する必要が無かった.それに加えて,2018年度の中旬には,研究代表者が2019年度に産業技術総合研究所に異動し,そこで植物の培養を大量に行えるとわかった.したがって,次年度に予算を移した方が,研究計画の実行をスムーズに行えると判断したため.
玉ネギ鱗茎の貯蔵中における休眠と休眠打破時の炭水化物の生化学および生理学的研究

玉ネギ鱗茎中には栄養特性を有した機能性オリゴ糖の一種である重合度が3約10のフルクトオリゴ糖が多く含まれている。このフルクトオリゴ糖は鱗茎育成中には肥大因子の一つとして働き、成熟期には貯蔵炭水化物として貯えられ、休眠期には抗凍結および発芽時期にはエネルギー供給源としての役割を果たしているとされている。平成14年度は玉ネギ鱗茎生育時期、休眠期(貯蔵期)におけるグルコース、フルクトース、シュクロース、各種オリゴ糖含量とこれらの糖質の代謝に関連する酵素〔(sucrose : sucrose 1-fructosyltransferase(SST), 1^F-fructosyl-transferase(1^F-FT),6G-fructosyltransferase(6^G-FT), fructooligosaccharide-hydrolase(FH), invertase(Inv)〕活性を調べた。本研究では玉ネギ鱗茎を20°C、10°C、で貯蔵した時の糖含量、糖質関連酵素活性の変動を調べ発芽(休眠打破)との関係を明らかにした。玉ネギ鱗茎を10°Cおよび20°Cで25週間貯蔵した時のグルコース、フルクトース、シュクロース含量とインベルターゼおよびフルクトシルトランスフェラーゼ活性の変動を調べ、休眠覚醒との関係を検討した。グルコース含量は貯蔵4週後、10°Cと20°Cの場合14.6mgと17.7mgに達した。フルクトース含量は21.7mgと14.8mgに達し、両糖の増加および減少パターンはほぼ一致した。ところが、シュクロース含量の変動はグルコースとフルクトース含量の変動パターンとほぼ一致したが、13週から14週にかけて再度増加した。インベルターゼおよびフルクトシルトランスフェラーゼ活性は12週から14週にかけて増加した。これらの変動時期と休眠覚醒とほぼ一致した。ショ糖の増加、インベルターゼおよびフルクトシルトランスフェラーゼ活性の増加と休眠覚醒との間になんらかの関係があることが推定された。玉ネギ鱗茎中には栄養特性を有した機能性オリゴ糖の一種であるフルクトオリゴ糖が多く含まれている。このフルクトオリゴ糖は重合度が3約10の1-ケストースおよびネオケストース系列の多種の糖の混合物から成り、鱗茎育成中には肥大因子の一つとして働き、成熟期には貯蔵炭水化物として貯えられ、休眠期には抗凍結および発芽時期にはエネルギー供給源としての役割を果たしているとされている。・玉ネギ鱗茎生育時期(6月9月):フルクトオリゴ糖含量は生育すると共に増加し8月で最高となった。中でもネオケストースおよびネオケストースシリーズの糖は1-ケストースおよび1-ケストースシリーズの糖より多かった。ショ糖およびグルコース含量についても同様の傾向が認められた。逆にフルクトースは減少した。SST活性は6月、7月で高くその後急激に減少した。1^F-FT, 6^G-FT活性もともに6、7月で高くその後両活性とも最高値の約1/3に減少した。FH、Inv活性は生育初期に高く、その後徐々に減少した。・玉ネギ鱗茎貯蔵期(10月2月):グルコース、フルクトース、シュクロース含量は貯蔵2ヶ月(8月)後急激に減少したがその1週間後もとのレベルに近く増加し一定となった。フルクトオリゴ糖類は9週10週後に急激に減少した。その12週後に34糖類もやや増加の傾向にあったが、より重合度の高い糖は更に減少した。各酵素活性は各糖の増減と呼応関係にあった。

ショ糖の増加、インベルターゼおよびフルクトシルトランスフェラーゼ活性の増加と休眠覚醒との間になんらかの関係があることが推定された。
シンプレクティック代数幾何

代数多様体には特異点がしばしば現れる。その中でもシンプレクティック構造をもつ特異点はシンプレクティック特異点とよばれ、超ケーラー多様体の研究や幾何学的表現論で重要な働きをする。多くの場合、シンプレクティック特異点は1次元代数トーラスの作用をともなって現れる。こうしたものをコニカルシンプレクティック特異点と呼ぶ。本研究ではコニカルシンプレクティック特異点の普遍ポアソン変形とクレパント特異点解消の間係さらにはコニカルシンプレクティック特異点の分類に関する研究をおこなった。ある種の有限性定理、複素半単純リー環のべき零軌道閉包の特徴付けなどが主な成果である。1) Xの非特異部分の代数的基本群は有限である.研究代表者は2013年に出版された論文"Equivalence of symplectic singularities"において一連の問題群を提示した。そのうちの一つが、Xの非特異部分の基本群は有限であろうという予想であった。今回の結果は、その部分的解決を与えている。2)Xのポアソン変形と、Xのクレパント特異点解消の双有理幾何の関係を考察した: Xのクレパント特異点解消Yの第2コホモロジー空間H^2(Y, C)は、Yの普遍ポアソン変形の底空間とみなせる。とくにH^2(Y,C)の各点には、Yを変形して得られるポアソン多様体が対応する。H^2(Y, C)の中でアファインでないポアソン多様体をパラメーター付けしているローカスをdiscriminant locusとよびDであらわす。Dは有理数体上定義された有限個の超平面の和集合になる。とくにこれらの超平面は、H^2(Y,R)の中にchamber構造を定義する。一方、H^2(Y,R)の中には、Xの相異なるクレパント特異点解消のample coneから決まるchamber構造が存在する。これら2つのchamber構造が完全に一致するというのが主結果である。この結果は、ここ数年、研究代表者が研究してきたポアソン変形の理論を、双有理幾何に応用したものである。アファイン複素シンプレクティック(特異点つき)多様体で、1次元代数トーラスの良い作用を持ち,この作用に関してシンプレクティック形式が斉次的になっているもののことを、conicalシンプレティック多様体とよぶ. Xの座標環Rは,定義より次数付き環の構造をもつ.座標環Rの極小斉次生成元の最高次数を,Xの極大ウエイトとよぶ. conicalシンプレクティック多様体は,代数幾何や幾何学的表現論で重要な働きをする多様体である.今年度は、もっとも素朴で自然な問い「Conicalシンプレクティック多様体はどれぐらい多く存在するのか?」について研究し、次の結果を得た:「次元2d,極大ウエイトNのConicalシンプレクティック多様体は、同型を除いて,高々有限個しか存在しない」証明は、i)Xに付随した射影的な接触Fanoorbifold P(X)を考えると,このようなP(X)が有界族をなすこと,ii)Xが1次元代数トーラス作用つきポアソン変形で剛的(rigid)であること,の2点を示すことによって達成される. i)ではlog Fano多様体に対するHacon-McKernan-Xuの有界性定理, ii)では、研究代表者が数年前に証明したPoisson変形の基本定理を用いる.シンプレクティック特異点は、代数幾何や幾何学的表現論に頻繁にあらわれる。知られているシンプレクティック特異点は、半単純リー環のべき零軌道閉包,Slodowy切,Quiver多様体,商特異点等,すべて良い1次元代数トーラスの作用がはいる。良い1次元代数トーラス作用によって,シンプレクティック多様体をアファイン多様体とみなしたものを, conical symplectic varietyと呼ぶ。Conical symplectic varietyの座標環Rは,次数付き環になるが,Rの極小斉次生成元を考え,この生成元の次数のうち最大のものを,極大ウエイトと呼ぶ。この時,次の有限性結果を証明した。この結果は、Compositio Mathに掲載予定である。さらに、極大ウエイトが1のconical symplectic varietyも完全に決定した:「定理:極大ウエイトが1であるようなconical symplectic varietyは、偶数次元のアファイン空間と標準シンプレクティック形式の組か、複素半単純リー環のべき零軌道とKostant-Kirillov形式の組のいずれかに同型である。」この結果は、2016年3月にarXivに投稿されている。有限性定理に関しては、ポアソン変形と、klt対数的ファノ多様体の有界性を組みあわせれば導出できることは、かなり前から気が付いていた。一方、極大ウエイト1のconical symplectic varietyの分類に関しては、複素リー環の余随伴軌道であることは、比較的容易に示せたものの、このリー環が実際に半単純であることが長い間示せなかった。今年度の最後に、この部分が解決でき、分類が完成した。Conical複素シンプレクティック多様体に関して、不変量として次元およびアファイン環の極大ウエイトを用いて分類問題に着手した.前年度の成果により、これらの不変量を一つ固定すると、conical複素シンプレクティック多様体の同型類は有限個であることが知られていた.本年度は、極大ウエイトが1の場合の分類を完成させた。主結果は次のように述べられる:

「極大ウエイトが1のconical複素シンプレクティック多様体は半単純リー環のべき零軌道閉包で正規多様体になるものと一致する.」証明の方針は、まず、極大ウエイトが1であれば、ある複素リー環のcoadjoint軌道の閉包であることを最初に示し、次に、これがシンプレクティック特異点を持つならば、あらわれるリー環は半単純であることを示す.最後の部分が本質的に新しい部分で、リー環の半単純性とシンプレクティック特異点の性質を結び付けた点で面白い.数年前の結果とあわせると、次の結果も成り立つ:「極大ウエイトが1のconical複素シンプレクティック多様体で完全交差特異点を持つものは、半単純リー環のべき零錐に等しい」.このべき零錐の特徴付けを最初に証明したときには、クレパント特異点解消を1次元代数トーラスの作用に関して射影化して、複素射影接触多様体の幾何を用いていたが、今回の証明は、それにくらべると、やや代数的である.これらの結果を、ドイツOberwolfach研究所で開催された研究集会等で発表した.代数多様体には特異点がしばしば現れる。その中でもシンプレクティック構造をもつ特異点はシンプレクティック特異点とよばれ、超ケーラー多様体の研究や幾何学的表現論で重要な働きをする。多くの場合、シンプレクティック特異点は1次元代数トーラスの作用をともなって現れる。こうしたものをコニカルシンプレクティック特異点と呼ぶ。本研究ではコニカルシンプレクティック特異点の普遍ポアソン変形とクレパント特異点解消の間係さらにはコニカルシンプレクティック特異点の分類に関する研究をおこなった。ある種の有限性定理、複素半単純リー環のべき零軌道閉包の特徴付けなどが主な成果である。今回証明したconicalシンプレクティック多様体の有限性定理は、研究代表者が数年にわたって研究してきた2つのテーマ(1つ目は、conicalシンプレクティック多様体のポアソン変形、2つ目は、conicalシンプレクティック多様体に付随する接触構造)が、うまく融合してできた結果である.有限性定理によって、conical symplectic varietyの分類がようやく始まった段階である。この方向では、Slodowy切片の特徴付けが面白い課題である。さらに、シンプレクティック特異点には、かならず良い1次元代数トーラス作用が入るだろうという、Kaledin予想も長年の懸案問題である。一方で、最近、Braden, Licata, Proudfoot, Websterによって,シンプレクティック特異点解消の間の「シンプレクティック双対性」とよばれる現象が定式化されてきている。シンプレクティック特異点を、シンプレクティック双対性の観点から研究することが、今後の研究の主流になる気がしている。28年度が最終年度であるため、記入しない。代数幾何,複素シンプレクテイック幾何今までは、ポアソン変形、双有理幾何の視点から複素シンプレクティッく多様体を研究してき[。その中で、新たな未解決問題が見えてきた。それと同時に、従来とは違う視点から、複素シンプレクティック多様体を研究すべきであると考えるようになった.
コエンザイムQの新規生合成経路の解明

コエンザイムQ(ユビキノン、CoQ)は、グラム陽性菌等メナキノンを有する細菌類を除いて、ほぼ全ての生物が有する電子伝達系の成分としてATP合成に必要な生体内物質である。CoQは、UMP合成経路のデヒドロオロテートデヒドロゲナーゼや硫化水素生成に関わるサルファイドキノンレダクターぜなどの酸化還元酵素の補酵素としても働く。イソプレン10単位の側鎖を有するCoQ10は人は自身で合成できるが、その量は加齢とともに減少することから、サプリメントとして補うと効果的である。一方、CoQ10の合成量が低下している患者がミトコンドリア脳筋症になるということが報告され、CoQ生合成と遺伝病との関連性が非常に注目されている。CoQ生合成の解明にはモデル生物である酵母での解析を進めることが重要で、その知見を人のCoQ生合成経路の理解へと発展させることを目標としている。分裂酵母はCoQ10を合成し、CoQ生合成に関わる遺伝子を破壊した時に反応直前の前駆体らしき物質が蓄積することがあり、研究対象としての分裂酵母には大きな利点がある。本研究では、ミトコンドリに局在するタンパク質をコードする遺伝子の破壊株、約400株のCoQ量を測定したところ、既知のCoQ合成に関わる遺伝子(dps1, dlp1, coq2-coq9)以外に新たな生合成に関わる遺伝子を発見した。それらの遺伝子をcoq11,coq12と命名し解析を進めたところ、それらの遺伝子欠損株では、少量のCoQ10を合成し完全には欠損にはならないが、coq12破壊株では上流のPHBを添加することによりCoQ10の合成量が回復し、coq11遺伝子破壊株ではそのような表現型は観察されなかった。CoQ10合成経路に関わる新規な遺伝子を発見することに成功した。分裂酵母は、人と同じ種類のCoQ10を合成する酵母として、かつ遺伝学的な解析が容易な微生物として、CoQ10生産を考える上でも、生合成経路を理解する基礎的な側面においても重要な研究対象である。分裂酵母の生合成には、dps1, dlp1, coq2-coq9遺伝子が関わることをこれまでに明らかにしているが、それぞれの遺伝子欠損株での中間体の蓄積を詳細に解析した結果を得ている。本研究では、ミトコンドリに局在するタンパク質をコードする遺伝子の破壊株、約400株のCoQ量を測定したところ、既知のCoQ合成に関わる遺伝子とCoQ結合タンパク質をコードするcoq10以外に、新たな生合成に関わる遺伝子を発見した。それらの遺伝子をcoq11,coq12と命名し解析を進めところ、いずれの欠損株でも、少量のCoQ10を合成し完全にはCoQ欠損にはならなかった。coq11遺伝子破壊株では、最小培地での生育が良く、他の欠損株と表現型が異なっており、coq12破壊株では上流のparahydorxy安息香酸(PHB)を添加することによりCoQ10の合成量が回復した。PHBはCoQ生合成の上流に位置し、Coq2タンパク質によって、イソプレノイド鎖と縮合される際の基質となる。PHBの合成経路に関しては、著しく知見が不足しており、チロシンから何段階を経て合成されるのかも解明されていない。今回の発見により、これまでに知られていないPHBの上流の合成経路の解明が可能になると考えている。今回、CoQ10合成経路に関わる新規な遺伝子を発見することに成功したことから、CoQ10の生合成の解明に大きな進展があり、順調に研究は進展している。コエンザイムQ(CoQ)の生合成に関する知見は大腸菌と酵母の変異株の解析から進展してきている。大腸菌は原核生物の代表として、基本的な代謝経路は明らかにされているが、酵母においては代謝経路の不明な点が残っており、真核生物の基本的な合成経路は完全には解明されていない。分裂酵母はCoQ10を合成する生物種であることから、人の生合成を理解する上でも、将来生産菌として使用する点においても他の真核生物よりも優位性がある。分裂酵母の各種CoQ合成欠損株(dps1, dlp1, coq2-coq7)において、人の相同遺伝子(PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ3, COQ4, COQ5, COQ6, COQ7)を発現させたところ、ほぼ同等の機能を有していることを証明してきたが、COQ8やCOQ9遺伝子は機能的な保存性が低いことがわかっている。本研究において発見した分裂酵母のcoq11, coq12遺伝子は人において相同性の高い遺伝子は見出されないが、おそらく機能的には補完的に働く遺伝子が存在するのであろうと推測している。それらの研究も含めて今後発展させていきたい。さらにCoQ生合成を解明するために、分裂酵母において、それぞれのCoQ生合成遺伝子の欠損株において蓄積する前駆体の解析を発展させていきたい。変異体を多数誘導することにより、部分的な機能を喪失させて、質量分析機を駆使して、化合物の同定を進めて行きたい。分裂酵母でCoQ生合成を解明し、そこで判明してきた知見を活用し、人の遺伝病との関連に役立て行くことを研究の大きな展望としている。コエンザイムQ(ユビキノン、CoQ)は電子伝達系の必須成分としてATP合成に重要な機能を果たしていると同時に、抗酸化物質としての機能がある。

イソプレン10単位の側鎖を有するCoQ10は人間の体内でも合成されているが、その量は加齢とともに減少することから、食品サプリメントとして補うと効果的である。一方、CoQ10の合成量が低下している患者がミトコンドリア脳筋症になるということが報告され、生合成と遺伝病との関連性が注目されている。CoQ生合成の解明にはモデル生物である酵母での解析を進めることが重要で、その知見を人間のCoQ生合成経路の理解へと発展させることができる。しかしながらCoQ生合成には不明な点が多々残っている。研究が進展しにくい理由はCoQ生合成経路途中の中間体が蓄積しないため、特定の反応に関わる酵素の遺伝子を同定することが困難であることによる。幸い、分裂酵母でCoQ生合成に関わる遺伝子を破壊した時に反応直前の前駆体らしきものが蓄積することがあり、分裂酵母を研究対象とする大きな利点である。そこで、生合成に関与する遺伝子、dps1, dlp1, coq2-coq9の欠損株を構築し、それらの株で蓄積する中間体を質量分析器で同定したところ、いくつかの株で前駆体化合物を同定することに成功した。coq7欠損株においてはDemethoxy Q10が蓄積するのに対して、coq5欠損株においてはDemethylDemethoxyQ10が蓄積しており、合成系が推定通り進んでいることがわかった。coq6欠損株においては直近の物質Decaprenyl hydroxyl benzoateが蓄積する以外に、4-decaprenyl hydroxy phenolの合成が見られた。このような結果により、CoQ生合成の理解に進展が見られた。分裂酵母の生合成には、dps1, dlp1, coq2-coq9遺伝子が関わることをこれまでに明らかにしているが、それぞれの遺伝子欠損株での中間体の蓄積を詳細に解析した。前駆体物資を添加することにより、CoQ10生合成の中間物質の蓄積がみられることから、調べる遺伝子の破壊株にp-hydroxy benzoate (PHB)とp-amino benzoate(pABA)を添加することで、中間体の有無や増減を確認し、それを質量分析機で同定した。さらに、13C-PHBや13C-pABAの安定同位体を用いて、質量の増減を調べることにより、中間体物質の変動を質量分析機で測定した。分裂酵母のcoq7欠損株においてはDemethoxy Q10が蓄積するのに対して、coq5欠損株において、2種類の前駆体を検出し、1つは直近の物質DemethylDemethoxyQ10であったが、もう1つはさらに反応が進んだ化合物Demethyl Q10が検出された。Coq7は水酸化酵素として機能し、Coq5はメチル化酵素として働くことを支持している。coq6欠損株において、2種類の前駆体を検出し、1つは直近の物質Decaprenyl hydroxyl benzoate (DHB),もう1つはさらに反応が進んだ化合物4-decaprenyl hydroxy phenolが検出された。Coq6は初期の段階でプレニルPHBの水酸化酵素として働くが、coq6が欠損しても反応が少し先へ進行することが分かった。coq3欠損株、coq8欠損株、coq9欠損株においては、DHBが検出された。coq4欠損株にpABAを添加した時に、アミノ基が付加された化合物が検出された。これらの結果は、それぞれの遺伝子の機能を推定することができ、CoQ10の生合成の解明に進展をもたらせたことから順調に研究は進展している。
超音波治療法の深部血管内血栓に対する臨床応用

血栓溶解剤静注時に、塞栓部に対し体表から超音波照射することで深部血管内血栓溶解時間を短縮し、早期血流再開を可能とする。低侵襲早期血管開存法についてin vitro in vivo実験を通してその基本的有効性を確認した。超音波周波数は200KHz300KHz、再開通時間は30分前後、rt-PA投与時間の短縮に伴う使用量の軽減などを確認し、経胸的冠動脈再開通や経頭蓋的脳血流再開通などの深部血管への適用の基礎検討を行った。(1)超音波プローブの試作と同ビーム音場内組織温度上昇分布超音波周波数200KHzを用い、0.8W/cm^2暴露時の組織内温度上昇を肉片(厚さ580mm)を用いたシュミレーション実験で確認した。サーモグラフィーを用いた結果は3°C以下(プローブ表面から5mmの深さ)であり、深さ50mm以上では0.5°C以下であった。また、5mm間隔での比較では、局所的な高温スポットが見つからず、温度は深さ方向に指数関数的に減衰した。ただし、プローブとの接触面では熱傷があった。針型(0.5mm)サーミスタ温度計を用いて、局所高音圧領域の温度上昇を経時的に測定した。上昇温度は最大でも23°Cに留まり、試作プローブは体内にhot spotを形成しないことを経時的にも確認した。(2)冠動脈血栓溶解における超音波照射併用の有効性犬の自家血(一定量)を用いた人工血栓を冠動脈前下行技末梢に注入し、心筋梗塞モデルを作り、rt-PA0.5mm/kg点滴静注下で超音波併用(200KHz、0.25W/cm^2)による再開通時間の短縮程度を評価した。rt-PA単独投与(非併用)例7頭、超音波併用療法例6頭で比較した結果、併用例では非併用例より再開通時間が20分早まり31.7分となった(P=0.022)。投与量は35%減少し、0.29g/kgで有効であった(p=0.022)。(3)深部血管内陳旧化血栓への有効性検討深部血管内の陳旧化血栓に対する有効性についてヒト血液による24時間血栓(3ml)を作成し検討した。超音波照射併用の有効性が認められ、血栓溶解剤単独投与時の約1/2の時間でFDP-DD増加が進み、再開通時間の短縮、また予後の良好なことを予測させるものとなった。超音波治療法としての深部血管内血栓溶解に関連する安全性の確認を終了し、また陳旧化血栓への有効性も確認したことで、十分な超音波パワーを照射しながら早期血流再開を行う超音波併用血栓溶解療法の深部血管への臨床的適用性を示した。

超音波治療法としての深部血管内血栓溶解に関連する安全性の確認を終了し、また陳旧化血栓への有効性も確認したことで、十分な超音波パワーを照射しながら早期血流再開を行う超音波併用血栓溶解療法の深部血管への臨床的適用性を示した。超音波が血栓溶解剤の効果を増強させることを活用し、深部血管内血栓の溶解を溶解剤rt-PAの点滴静注下に経胸壁的超音波照射する。早期血流再開通法に関する基礎検討を行った。1.超音波周波数200KHzを用い、0.8W/cm^2曝露時の組織内温度上昇を肉片(厚さ580mm)を用いたシミュレーション実験で確認した。サーモグラフィーを用いた結果は3°C以下(プローブ表面から5mmの深さ)であり、深さ50mm以上では0.5°C以下あった。また、5mm間隔での比較では、局所的な高温スポットが見つからず、温度は深さ方向に指数関数的に減退した。ただし、プローブとの接触面では、熱傷があった。2.犬の自家血(一定量)を用いた人工血栓を冠動脈前下行枝末梢に注入し、心筋梗塞モデルを作り、rt-PA0.5mg/kg点滴静注下で超音波併用(200kHz、0.25W/cm^2)による再開通時間の短縮程度を評価した。rt-PA単独投与(非併用)例7頭、超音波併用療法例6頭で比較した結果、併用例では非併用例より再開通時間が約20分早まり、31.7分となった。(p=0.022)。投与量は35%減少し、0.29g/kgで有効であった(p=0.022)。今後、深部血管への適用を拡大するため、超音波プローブ近傍の組織安全対策を考慮した生体適用プローブを設計し、心筋梗塞以外への適用調節(あるいは制御)法を検討する。血栓親和性の高い血栓溶解剤静注時に、塞栓部に対し体表から超音波照射することで血栓溶解時間を短縮し、早期血流再開が可能な低侵襲早期血管開存法はin vitro in vivo実験を通してその基本的有効性が確認されてきた。超音波周波数は200KHz300KHz再開通時間は30分弱、rt-PA投与時間の短縮に伴う使用量の軽減などを確認し、経胸的冠動脈再開通や経頭蓋的脳血流再開通などの深部血管への適用の基礎検討を行った。(1)超音波プローブによるhot spotの探索前年度は超音波音場内の組織音響吸収温度上昇分布解析をサーモグラフィを用いて行った。これに加え本年度は針型(0.5mm)サーミスタ温度計を用いて、局所高音圧領域の温度上昇を測定した。牛肉片内の音場分布をシュミレーションした結果から予想される高音圧スポットにサーミスタを留置し、経時的な上昇温度を測定した。上昇温度は最大でも23°Cに留まり、試作プローブは体内にhot spotを形成しないことを再確認した。(2)陳旧化血栓への有効性深部血管内の血栓は陳旧化することも少なくなく、それに対する有効性についてヒト血液24時間血栓(3ml)を作成し検討した。陳旧化の進んだ血栓に対しても超音波照射の有効が認められ、血栓溶解剤単独投与時の約1/2時間でFDP-DD増加が進み、再開通時間の短縮、また予後の良好なことを予測させるものとなった。超音波治療法としての深部血管内血栓溶解に関連する安全性の確認を終了し、また陳旧化血栓への有効性も確認することができ、十分な超音波パワーを照射しながら早期血流再開に関する有用な臨床成績の上げうることを確認した。