hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
上皮細胞の分化過程を担う細胞内メカニズムの解析

1.昨年度までに、上皮細胞におけるDLGとAPCの相関関係を探るために上皮細胞株MDCK細胞における両タンパク質の細胞内局在を検討し、極性を形成しない培養条件では、細胞の突起部先端で両者が共存していることを明らかにし、この結果をHistochemistry and Cell Biologyに発表した。2.DLG蛋白質の、生体内における機能を究明する目的で、DLG null mutantマウスの発生段階の泌尿器の形態形成過程を観察した。具体的には、幼弱な組織構造を同定・可視化するため、発生期の泌尿器を摘出し、泌尿器細胞のマーカーであるPax2および上皮細胞の分化マーカーであるcytokeratinのホールマウント免疫染色を行い、蛍光像を観察した。各遺伝型、各発生段階についてサンプルを集め各種計測値を統計解析することにより以下の結果を得た。(1)DLG(-/-)マウスの腎臓は有意な低形成を呈するが異形成は認められない。(2)DLG(-/-)マウスの尿管は正常マウスと同じ高さで中腎管から出芽するが、その後共通腎管(尿管分岐部より下部の中腎管部分)の短縮および尿管開口部の下降が正常に進行しないために出生時の尿管異所開口(尿管が膀胱でなく尿道に開口する)が引き起こされ、その結果として巨大尿管や水腎症が発症する。(3)DLG(-/-)マウスの尿管では胎生11.5日頃までに後腎領域外での異常分岐が起こることがあり、その場合は出生時の分岐尿管(重複尿管)として観察される。(4)DLG(-/-)マウスの尿管は伸長開始直後(胎生12.5日)から伸長不全となり、その後の胎生期を通じて尿管の長さが正常マウスよりも有意に短い。これらの結果から、DLGが中腎管や尿管を構成する上皮細胞の増殖、細胞移動、・細胞死などの制御に関わっている可能性が考えられる。腎臓の上皮細胞分化におけるDLGタンパク質の役割を明らかにするため、今年度は当初の研究計画に基づき、第一に正常マウス腎臓におけるDLGの発現パターンの解析を行った。まず始めに、成体マウス腎臓におけるDLGの発現部位を、組織特異的マーカーを用いて検討したところ、DLGタンパク質は、集合管、近位尿細管、遠位尿細管を構成する上皮細胞の、基底部または基底側壁部に分布していた。そこで、発生途上の腎臓で、これらの上皮細胞の発生段階のどの時期にDLGの発現が開始するかを追跡したところ、集合管での発現は、その原基である尿管芽が後腎原基に侵入する時期(胎齢12.5日)から一貫して強い発現が見られるのに対し、尿細管を構成する間充織細胞由来の細胞では、尿管芽先端周囲に間充織細胞が凝集する時期にmRNA発現の亢進およびタンパク質レベルでの細胞膜への凝集が開始することが確認された。第二に、DLGノックアウトマウスの解析から、DLG遺伝子の欠損により、腎臓の矮小化が見られることが明らかになった。このことは、腎臓発生初期の尿管芽の生育にDLGが深く関与することを示唆するものと考え、現在さらに解析を行っている。さらに、in vivoの解析とは別に、上皮細胞におけるDLGとAPCの相関関係を探るため、イヌ腎臓由来の上皮細胞株MDCK細胞における両タンパク質の細胞内局在を検討中である。現在までに、極性を形成しない培養条件では、細胞の突起部先端にAPCタンパク質が局在することを確認している。今後、さまざまな培養条件下で両者の細胞内分布を検討し、既に報告されているDLGとAPCとの結合能が、上皮細胞内のどのような局面で機能しうるのか、考察していく予定である。(1)上皮細胞におけるDLGとAPCの相関関係を探るため、イヌ腎臓由来の上皮細胞株MDCK細胞における両タンパク質の細胞内局在を検討した。極性を形成しない培養条件では、細胞の突起部先端にAPCタンパク質が局在し、そこでDLGと共存していることが明らかになった。これまでに、APCとDLGの共存は極性化した上皮細胞の側壁部で観察されていたが、上皮細胞突起部分での両者の共局在は知られていなかった。このAPC,DLGの共局在について、細胞骨格への依存性および形態的な相関関係を解析した。その結果、APCの集積、局在化にDLGが関与することを支持する観察結果が得られた。DLGは足場蛋白質としての構造をもちながらも、脊椎動物においては上皮細胞での具体的な機能が示されていない。今回の結果は、このDLG蛋白質が、APCの膜近傍での局在に関わっている可能性を示唆するものとして大変興味深い。現在、この結果を投稿中である。(2)DLG遺伝子KOマウスを用いて腎臓発生におけるDLG分子の機能を解析するため、胎児期の腎臓(後腎)の組織培養系を確立し、培養系における尿管芽の伸長、分岐を確認した。この系で、発生時上皮細胞層の形態形成を再現し、野生型マウスとの比較を行うことで、DLG蛋白質の機能を詳細に解析することができる。(3)哺乳類のDLGは、DLG subfamilyと呼ばれる類縁遺伝子群の一員である。これらのsubfamily遺伝子産物もまた、DLGと同様、足場蛋白質としての構造をもっていることから、DLGと協同して上皮細胞の分化過程を担っている可能性がある。この可能性を検証するため、現在これらDLG subfamily遺伝子群が発生中の後腎における詳細な発現パターンを解析中である。

1.昨年度までに、上皮細胞におけるDLGとAPCの相関関係を探るために上皮細胞株MDCK細胞における両タンパク質の細胞内局在を検討し、極性を形成しない培養条件では、細胞の突起部先端で両者が共存していることを明らかにし、この結果をHistochemistry and Cell Biologyに発表した。2.DLG蛋白質の、生体内における機能を究明する目的で、DLG null mutantマウスの発生段階の泌尿器の形態形成過程を観察した。具体的には、幼弱な組織構造を同定・可視化するため、発生期の泌尿器を摘出し、泌尿器細胞のマーカーであるPax2および上皮細胞の分化マーカーであるcytokeratinのホールマウント免疫染色を行い、蛍光像を観察した。各遺伝型、各発生段階についてサンプルを集め各種計測値を統計解析することにより以下の結果を得た。(1)DLG(-/-)マウスの腎臓は有意な低形成を呈するが異形成は認められない。(2)DLG(-/-)マウスの尿管は正常マウスと同じ高さで中腎管から出芽するが、その後共通腎管(尿管分岐部より下部の中腎管部分)の短縮および尿管開口部の下降が正常に進行しないために出生時の尿管異所開口(尿管が膀胱でなく尿道に開口する)が引き起こされ、その結果として巨大尿管や水腎症が発症する。(3)DLG(-/-)マウスの尿管では胎生11.5日頃までに後腎領域外での異常分岐が起こることがあり、その場合は出生時の分岐尿管(重複尿管)として観察される。(4)DLG(-/-)マウスの尿管は伸長開始直後(胎生12.5日)から伸長不全となり、その後の胎生期を通じて尿管の長さが正常マウスよりも有意に短い。これらの結果から、DLGが中腎管や尿管を構成する上皮細胞の増殖、細胞移動、・細胞死などの制御に関わっている可能性が考えられる。
γ-γ摂動角相関による高濃度KONDO効果の研究

高濃度Kondo効果を示すLa-Ce金属間化合物におけるCe4fスピンのゆらぎをα-α摂動角相関法によって研究した。この方法は中性子非弾性散乱とNMRがもつ種々な制約なしにCeスピンのダイナミックスを研究できる利点がある。研究課題の一つは時間的微分法による四検出器測定装置の改良であった。主な改良点は検出器として11/2"のNaI(Tl)シンチレーター付きのRCA8575と2"のシンチレーター付きのフィリップスXP2020を各2本混用していたのを2"のシンチレーター付きのXP20204本に揃えたこと、システムをパーソナルコンピューターFM-7で制御するようにしたこと、2チャンネルディジタル波高分析器を試作したことである。このような改良により測定の精度と効率が向上しただけでなく、回路の時間変動を自動的に補償できるようになり安定度と時間分解能が増した。これまで研究してきた高濃度Kondo系,(La-Ce)Si系,(La-Ce)AL2系をさらにくわしく測定するとともに、(La-Ce)Ni2系を新たに測定した。(La-Ce)Ni2系では全濃度,温度領域で強いゆらぎが観測され、かなり高いKondo温度をもつことが分った。またCe濃度が高い領域では価数揺動による強い摂動が観測された。これらの系で測定された相関時間の温度変化を多重軌道アンダーソンモデルによって解析した。高温では摂動理論の結果と一致し、0Kでは半沢,山田の理論に一致するような補間式を結晶場の影響も取入れて作った。この補間式を用いてKondo温度Tkをパラメーターとして実験値に合わせた。得られたTkの絶対値は従来他の方法で決められた値よりかなり低い値となった。超微細相互作用定数に対するKondo効果の影響が問題で、今後の興深い問題である。
CCL-1の神経細胞およびグリア細胞との連関の解明、および疼痛発現との連関の解明

本研究では、CCL-1の神経およびグリア細胞に対する影響について様々な手法を用い評価を行い、総合的にCCL-1の神経障害性疼痛における新たな役割を解明し、新しい疼痛治療法開発を研究目的とし、研究を遂行した。平成24年度は、特にCCL-1のミクログリア細胞への影響について検討を行った。そこで、平成25年度はCCL-1の神経細胞への影響を検討した。CCL-1の神経細胞への影響を検討するため、CCL-1の受容体であるCCR-8が神経細胞上に存在するのかを免疫染色で確認したところ、CCR-8は脊髄の神経細胞上に正常マウスでも多く発現が認められ、また坐骨神経損傷後にはこれらの発現が増加することが確認された。また、坐骨神経損傷後に脊髄後根神経節においてCCL-1の発現が増加することを、CCL-1抗体を使用した免疫染色によって確認された。次にCCL-1の神経伝達機構への影響を検討するため、電気生理学的な検討を行った。その結果、CCL-1は脊髄後角において、興奮性伝達物質であるグルタミン酸の放出を促進すること、また、NMDA受容体の感受性を増大させることが示唆される結果が得られた。これらの研究より、CCL-1が坐骨神経損傷により引き起こされる慢性疹痛発現に関与していることが示された。これらの研究から、癒痛発現の予防薬や治療薬が開発されるよう、今後も研究を進展させていく予定である。昨年度には検討が行えなかった電気生理学検討が、今年度においては生理学研究所において検討できた。申請時に予定していた検討は、ほとんど確認でき、またこれらの成果は2報の学術論文として投稿し、受理された。本研究課題は、今後も継続して研究を遂行する予定である。特に、疼痛発現メカニズムだけでなく、神経損傷によって引き起こされる内臓機能変化についても注目し研究を進展させる。(1)CCL-1の神経細胞への影響:・正常マウスの脊髄腔内にCCL-1を投与したところ脊髄NMDA受容体サブユニットのうち特にNR-1,2Bのリン酸化を引き起こすことが確認された。・電気生理学的手法を用い、CCL-1の神経伝達への影響を検討したところEPSCのfrequencyの上昇が観察された(2)CCL-1のミクログリア細胞への影響:・CCL-1を髄腔内に直接投与した後、ミクログリア、アストロサイトの発現数、形態学的な変化について免疫染色を用い確認した。その結果、CCL-1髄腔内投与はcontrol投与群に比べミクログリア、アストロサイトの細胞数、形態の肥大化、また活性化の指標であるであるp38 MAPKのリン酸化が引き起こされていることが示された。・初代培養ミクログリアにCCL-1を作用させた時のサイトカイン、ケモカインの発現をRT-PCRによって定量的に検討したところBDNFおよびIL-6 mRNAの発現上昇、またNOの放出の増加が確認された。(3)CCL-1の疼痛発現への影響:・CCR-8 siRNAを正常なマウスに投与後、Electroporation法を用いCCR-8をノックダウン後、結紮により発現する疹痛にどのような影響があるのか、von Frey testを用い行動学的な検討を行ったところ、CCR-8ノックダウンマウスでは結紮により引き起こされる疼痛が有意に抑制されることが示された。本研究成果より、CCL-1が神経障害性疼疹痛に関与しているということが詳細に裏付けされた。平成25年度ではCCL-1の神経細胞への影響についてより詳細な検討を行う。平成24年度では、CCL-1のグリア細胞への影響についての実験が予定通り遂行でき、予定していなかった検討(グリア細胞の活性化の指標であるであるp38 MAPKのリン酸化の検討)なども行うことができた。

しかし、電気生理学的手法を用いたCCL-1の神経細胞への検討がすべて完了していない。しかし、平成25年度中に実験を遂行することとなっている。昨年度には検討が行えなかった電気生理学検討が、今年度においては生理学研究所において検討できた。申請時に予定していた検討は、ほとんど確認でき、またこれらの成果は2報の学術論文として投稿し、受理された。平成25年度は王に電気生埋学的手法を用い、CCL-1の神経伝達に対する影響について検討する。この実験が平成24年度に完全に遂行できなかった理由として、実験装置を他の研究所に借りなくてはならないという点にあった。しかし、本年度は長期でその実験措置を使用できることとなっている。そこで平成25年度は、特に平成24年度に検討できなかったIPSCおよびEvoked EPSC、また神経損傷モデルを用いたこれらの検討を中心に行う。本研究課題は、今後も継続して研究を遂行する予定である。特に、疼痛発現メカニズムだけでなく、神経損傷によって引き起こされる内臓機能変化についても注目し研究を進展させる。
非定型抗精神病薬はノルアドレナリン神経系に影響し精神分裂病の症状を改善するか

中枢神経系のノルアドレナリントランスポーター(NAT)と類似し、ヒトNATとの相同性が約95%以上と高い、ウシ副腎髄質細胞を用いて、非定型抗精神病薬(clozapine, risperidone, olanzapine, zotepine)のノルアドレナリン(NA)作動性神経におけるNAT活性に及ぼす影響について検討した。その結果clozapine, resperidone, olanzapine, zotepineはすべて臨床治療濃度においてNAT活性を抑制した。次にclozapine長期投与のNAT活性に対する影響を検討した。これらの結果よりclozapineの長期投与を行うと、まずNATのdown-regulationが生じ、引き続いて新たな蛋白合成を伴ったup-reguationが生じることが示された。更に我々は、臨床研究としてrisperidoneのカテコールアミン神経系への影響を検討した。その結果、(1)臨床症状(特に陰性症状)と血漿3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol(pMHPG)の変化(増加)との間に相関が認められた。pMHPGの変化と血中9-hydroxyrisperidone濃度との間に相関が認められた。risperidoneへの反応良好群では非良好群に比べて投与前の血漿homovanillic acid(pHVA)濃度が高値であった。(4)risperidone投与によるpHVA濃度の変化(減少)と陽性症状(特に幻覚・妄想、興奮の項目)の改善には相関が認められた。以上の基礎研究と臨床研究の結果から、以下の可能性が推定された。(1)非定型抗精神病薬の陰性症状あるいは認知機能の改善作用はこれらの薬物がNAT活性を抑制することにより、前頭皮質でのNAやドーパミンを増加させることに関連する。(2)非定型抗精神病薬の急性期の陽性症状に対する効果はドーパミン神経系の抑制作用と関連する。精神分裂病の薬物療法において、陽性症状のみならず認知障害・陰性症状にも効果をもつとされている非定型抗精神病薬のノルアドレナリン(NA)作動性神経におけるNAトランスポーター(NAT)活性に及ぼす影響について検討した。本年度は、基礎研究として中枢NA神経系のNATと類似し、かつヒトのNATとの相同性が約94%と高いウシ副腎髄質細胞のNAT活性に対するclozapine, risperidone, zotepine,そしてolanzapineの4種の非定型抗精神病薬の影響について比較検討した。その結果、(1)培養副腎髄質細胞への^3H-NA取り込みに対してclozapine, risperidone, zotepine,そしてolanzapineはすべて濃度依存的に抑制した。そのIC_<50>値は各々、110ng/ml、220ng/ml、10ng/mlそして14ng/mlであった。^3H-NA取り込みにおけるEadie-Hofstee分析を行ったところ、clozapineはKm値を増加させ、Vmax値を減少させるいわゆる混合型阻害を示し、zotepineとolanzapineはVmax値は減少させるがKm値には変化を起こさない非拮抗阻害であった。(2)次にこれら薬物による、副腎髄質細胞膜のNATへの^3H-desipreamine結合に対する影響を調べた。その結果、clozapine, risperidone, zotepine,そしてolanzapineはともに^3H-desipreamine結合を抑制し、各々のIC_<50>値は、48、248、50そして120ng/mlであった。さらにScatchard分析を行ったところ、clozapineは混合型阻害を示したが、zotepineとolanzapineは非拮抗型阻害であった。以上の結果から、今回使用した非定型抗精神病薬の4種類全ては、臨床治療濃度においてNAT活性を抑制した。

この事は、これら薬物の臨床作用機序の1つとしてNAT活性の抑制が示唆されるが、薬物によりその阻害機序に若干の差が見られる事から、今後臨床効果との関係においてもう少し注意深く検討する必要がある。clozapine長期投与のノルアドレナリントランスポーター(NAT)活性、合成、NAT mRNAに対する影響を検討した。(1)clozapineで長期処理を行うと^3H-NA取り込みは2相性の変化を示した。すなわち、clozapine処理2-48時間では^3H-NA取り込みは減少したが、続く72-168時間では^3H-ノルアドレナリン(NA)取り込みは増加した。(2)clozapineで6時間処理すると^3H-NA取り込みのV_<max>値が40%低下したがK_m値は変化しなかった。一方、clozapineで96時間処理すると^3H-NA取り込みのV_<max>値が56%増加したがK_m値は変化しなかった。(3)clozapineの副腎髄質細胞膜の^3H-desipramine結合に対する影響に関してScatchard分析を行ったところ、clozapine処理6時間でB_<max>が減少したがK_d値は変化しなかった。一方、clozapine処理96時間ではB_<max>が増加したがK_d値は変化しなかった。蛋白合成阻害剤のactinomycin Dとcycloheximideはclozapineの96時間処理による^3H-NA取り込みの増加を抑制した。clozapine処理12-96時間ではノルアドレナリントランスポーターmRNAを濃度依存的に増加させた。これらの結果よりclozapineの長期投与を行うと、まずノルアドレナリントランスポーターのdown-regulatiohが生じ、引き続いて新たな蛋白合成を伴ったup-regulationが生じることが示された。更に我々は、臨床研究としてrisperidoneのカテコールアミン神経系への影響を検討した。その結果、(1)臨床症状(特に陰性症状)とpMHPGの変化(増加)との間に相関が認められた。pMHPGの変化と血中9-hydroxyrisperidone濃度との間に相関が認められた。risperidoneへの反応良好群では非良好群に比べて投与前のpHVA濃度が高値であった。(4)risperidone投与によるpHVA濃度の変化(減小)と陽性症状(特に幻覚・妄想、興奮の項目)の改善には相関が認められた。以上の結果から、risperidoneの統合失調症の陽性症状に対する作用はドーパミン神経系を、陰性症状に対する作用はノルアドレナリン神経系も介している可能性が示唆された。
ラット肝臓からの肝細胞増殖因子の精製

我々は既に新しい肝細胞の強力な増殖因子である肝細胞増殖因子(HGF)が高濃度にラット血小板中に存在することを見つけ単一標品にまで純化した。この因子は分子量69Kと34Kから成る二量体の熱および酸に不安定な蛋白性の物質である。その後、ラットにおけるHGFの臓器分布を初代培養肝細胞のDNA合成を促進する活性を測定することにより検討したところ肝臓に多くさん含まれていることがわかった。そこで肝臓からのHGFの精製を試みた。まず80gの肝臓に2容量の0.25Mショ糖を含むPH8.5の緩衝液を加えホモジネ-ト後、105000×g、1時間の遠心で得た抽出液をS-Sepharoseカラムにかけると大部分の蛋白は非吸着画分に溶出した。その後、0.15Mから1Mの塩濃度勾配で溶出すると0.68MでHGFが溶出した。次にこのHGF活性があった画分をHeparin-Sepharose-CL-6Bカラムにかけ0.3Mから2Mの塩濃度で溶出すると1M付近にHGF活性がみられた。さらにHGF活性のあった画分をMono-S,FPLCカラムで前記のS-Sepharoseカラムと同じ条件で再クロマトグラフイ-を行った。この段階のHGFはS-Sepharoseカラムにかけた直後のHGFに比べて41倍精製されており回収率は20.5%であった。さらに、このHGFを逆相カラム、RP-304 HPLCにかけ0.1%トリフルオロ酢酸存在下、アセトニトリル40%から50%の濃度で溶出すると42%でHGFが溶出した。肝臓由来のHGFの各種クロマト上の挙動および蛋白化学的、生物学的特性は血小板由来のHGFと全く同じだった。しかし、肝由来のHGFは血小板由来ののHGFと違って逆相クロマト後でも単一標本品にはなっていなかった。今後、Hydroxylapatite,Affi-Gel Blue等のクロマトを行い完全に純化し、分子量およびサブユニットの構成、種々の性質を調べ血小板由来のHGFと同じであるかどうか明らかにしたい。
DNA損傷応答を介した心不全病態形成における分子機構解明

DNA損傷応答(DNA Damage Response: DDR)は、細胞のゲノム恒常性維持および癌抑制メカニズムの一つとして重要な役割を担っている。一方で近年、不適切なDDRが心不全増悪の要因の一つとして注目されている。しかし、心不全増悪に関わるDDRのメカニズムや制御機構については十分な解明がなされていない。申請者は圧負荷誘導心不全モデルを用いた心不全病態形成初期におけるプロテオーム解析より、DNA修復に関与するHmgb2遺伝子を同定した。本申請研究は心不全形成におけるHMGB2とDDRの分子学的メカニズムを解明することで、新規の心不全治療ターゲットを模索するための基盤研究となる。
少数デ-タに基づく統計デ-タ解析に関する研究

製品の寿命予測や環境問題において、デ-タ数が少ない場合や異常値(外れ値)デ-タを含む場合でも精度のよい分布の推定法の必要性が叫ばれている。そこで、本年度はまず異常値デ-タを含む場合について、その異常値デ-タの検定方法の提案を行った。次にデ-タ数が少ない場合や異常値デ-タを含む場合における分布の推定について検討した。分布の推定では、順序統計量の期待値を用いたKernel Methodによる分布の推定法を提案し、従来の方法とMSEにより比較検討し、特に裾の部分の推定に提案の方法が効果のあることを示した。また、異常値デ-タの検定では正規分布において異常値の検出におけるマスク効果の問題を解決するために順範囲を用いた方法を提案し、数値計算により従来の方法と比較し検出力の点および実用性の点から優れていることを確認した。さらに、信頼性解析によく用いられるワイブル分布の母数の推定に関して、少数デ-タあるいはセンサ-ドデ-タを対象とし、異常値の混入に対して頑健性があり、しかも簡便な二点推定法とBootstrap法を応用した方法を提案した。これは二重指数分布とワイブル分布の関係を用いたもので、MESの点から従来の同様な方法より優れていることを計算機シミュレ-ションにより示した。また、Bootstrap法を応用した方法に対しては推定のための係数を種々のサンプルサイズに対して数値計算により求めた。そしてさらに、正規分布の母数の推定に対してもBootstrap法を用いた推定方法を提案し、推定のための係数を種々のサンプルサイズに対して数値計算による求めた。そして、計算機シミュレ-ションにより特に少数デ-タのときに、推定精度の頑健性の点で従来の同様な方法より優れていることを示した。今後は、さらに信頼性デ-タ解析に重点をおき、たとえば、加速試験デ-タ、センサ-ドデ-タなどに対する推定問題を検討して行く予定である。
炎症と骨吸収に関与するIL-34は関節リウマチの治療の標的分子となりうるのか？

Interleukin(IL)-34はColony-Stimulating Factor-1 Receptor (CSF-1R)の第2のリガンドとして発見された慢性炎症と骨吸収に関与するサイトカインである。ILー34のRAの病態における役割を明らかにする目的で実験を行なった。血清IL-34は変形性関節症(OA)に比べRAで有意に増加していた。対照群としてOA以外にもANCA関連血管炎や全身性エリテマトーデス(SLE)、シェーグレン症候群(SjS)、乾癬性関節炎(PsA)、SAPHO症候群などの患者血清ではIL-34の産生を認めず、RAに特異的に血清IL-34が増加していることがわかった。今後例数を増やし検討する予定である。活動性関節炎を有するRA患者で血清IL-34産生は増加していた。さらにこれまでの報告とは異なり、RA患者の血清IL-34は約半数でELISAの感度以下と減少しており、全例で増加しているわけではなかった。炎症反応陰性であっても画像所見で活動性が確認されたRA患者血清でIL-34増加を認めた一方、画像で活動性があっても血清IL-34が増加していない症例も存在し、RAの病態が一律ではないことを示唆する興味深い所見であると考えた。さらにリンパ球やマクロファージ様滑膜細胞を含む初代RA滑膜細胞の培養上清で自発的にIL-34の産生を認めた。RA線維芽細胞様滑膜細胞(FLS)は非刺激状態でも自発的にIL-34を産生しており、さらにIL-1,TNFα刺激でIL-34産生が亢進した。IL-1で刺激したRAFLSから産生されるIL-6は抗IL-34抗体,抗CSF-1R抗体で抑制された。RA患者ではIL-34産生が亢進しており、滑膜病変でIL-34が産生され、病態形成に関与していることが明らかになった。ELISA法によるサイトカンの動態を主に検討しているため、PCR法による検討はまだ行っていない。同時に血清におけるIL-34の測定を先に行っており、全体としては順調である。患者血清を用いた検討をさらに進め、より多くの症例を用い、また対照群の疾患や症例数を増やし、検討予定である。また疾患活動性などの臨床データとの相関も検討したい。滑膜組織を用いて組織学的にIL-34産生の検討やIL-34の受容体の発現などを検討していく予定である。PCR実験を後に回したためPCR機器の購入を今年度は行わなかったため次年度使用額が生じた。次年度もELISA法による実験を優先的に行い、データ裏付けが必要な際にPCR実験を行う予定である。
前立腺癌におけるcyclooxygenase-2の発現の検討とその臨床応用

目的)腎細胞癌には様々な免疫療法剤や抗癌剤が使用されているものの奏功率は低く、進行性腎細胞癌症例では治療に難渋することが多い。そこで我々は大腸癌においてその有効性を報告されている選択的COX-2阻害剤(JTE-522)について腎細胞癌におけるその影響および他薬剤との併用効果の検討を行った。方法)標的細胞としてCaki-1、NC65、ACHN腎癌株化細胞および本学で樹立した3種類の初期培養細胞を用いた。また、比較対照の正常細胞としてヒト近位尿細管上皮細胞RPTEC5899を用いた。RT-PCR法によりそれぞれの細胞のCOX-2の発現を評価し、細胞障害活性はMTT assay法により測定した。さらに,CDDP、ADR、5-FU、IFN-αおよび抗Fas抗体について、選択的COX-2阻害剤との併用効果について検討した。結果)今回用いたすべての腎癌細胞においてRPTEC5899に比してCOX-2の強い発現が認められた。選択的COX-2阻害剤(100μM)を投与によって腎癌細胞では細胞障害活性が認められ、RPTEC5899では認められなかった。他薬剤との併用効果について検討したところ抗Fas抗体との併用によって相乗的細胞障害活性がみられ、CDDP、ADR、5-FU、IFN-αとの併用では相加効果を認めた。以上の結果より腎細胞癌に対する選択的COX-2阻害剤の臨床応用の可能性および抗Fas抗体との併用療法の可能性が示唆された。さらに,DNAチップを用い,選択的COX-2阻害剤の腎癌に対する作用機序について,現在検討中である.プロスタグランジン(PG)が発癌に関連する可能性が示唆されており、PG合成酵素であるcyclooxygenase(COX)も腫瘍発生に関与し、NSAIDsがそれを抑制することにより抗腫瘍活性を示す可能性があることが報告されている。CoxにはアイソザイムとしてCOX-1、COX-2がある。大腸癌におけるCOXの発現レベルの検討では、COX-1は癌と正常粘膜で差は認められず、COX-2の発現は大腸癌において有意に亢進していた。他の癌細胞でも、COX-2の発現が亢進していた報告されている。私たちは前立腺全摘術を施行した組織よりCOX-2の発現を免疫組織染色により確認した。この結果に基ずき、前立腺癌細胞株であるLnCap、PC-3、DU-145を用いてCOX-2による細胞増殖抑制効果を検討すると濃度依存性に増殖を抑制していた。さらに膀胱癌細胞株にても同様の結果が得られた。また膀胱癌細胞株にて5-FUやアドリアマイシンなどとの相乗効果を検討した結果、5-FUとの相乗効果が認められた。今後、COX-2の発現をRT-PCR法などで検討し、COX-2 inhibitorが前立腺癌の発癌予防に有効であるかどうか、また抗腫瘍効果を有するかどうかを検討する。さらに,DNAチップを用い,選択的COX-2阻害剤の腎癌に対する作用機序について,現在検討中である.目的)腎細胞癌には様々な免疫療法剤や抗癌剤が使用されているものの奏功率は低く、進行性腎細胞癌症例では治療に難渋することが多い。

結果)今回用いたすべての腎癌細胞においてRPTEC5899に比してCOX-2の強い発現が認められた。選択的COX-2阻害剤(100μM)を投与によって腎癌細胞では細胞障害活性が認められ、RPTEC5899では認められなかった。他薬剤との併用効果について検討したところ抗Fas抗体との併用によって相乗的細胞障害活性がみられ、CDDP、ADR、5-FU、IFN-αとの併用では相加効果を認めた。以上の結果より腎細胞癌に対する選択的COX-2阻害剤の臨床応用の可能性および抗Fas抗体との併用療法の可能性が示唆された。
幼児期における外的表象としての“人形”理解の発達

本研究では、幼児が人形やぬいぐるみを生きた実在ではなく、単なる物質として理解できるようになるまでの過程を実験的に調べた。人形の課題では、人形がモノの隠し場所を見て、その知識を他者に伝えることができるか、また、ぬいぐるみの課題では、ぬいぐるみがモノの温かさを触知し、それを他者に伝えることができるかについての子どもの認識を調べた。その結果、人形・ぬいぐるみとも実物との類似性に関係なく、多くの幼児に人形やぬいぐるみを実在視するかのような反応が見られた。このことから、幼児期では人形やぬいぐるみを完全には物質として理解していないことがわかった。平成24年度は、幼児が人形の表象性を理解するようになる過程で、人形と実物との類似性の差異の大きさによって、その理解に違いがあるか否かを調べるために、異なるタイプの人形を多数用意し、観察および実験を行った。平成25年度は、ここから得られたデータを分析するために、データの整理の方法について検討し、実際に整理を行った。その結果、幼児の中には人形を生きている人間のように扱う反応(実在視的反応)を見せる子どもが有意に多く存在することがわかった。こうした反応が人形の種類によって異なるか否かを調べたところ、有意な差は見いだされなかった。この結果をもとに、新たな実験条件を検討するために、予備実験的な観察を行った。すなわち、実在視的反応を子どもに起こさせる要因は何か、なぜ実物との類似性の高低が、子どもの反応に影響を与えなかったのか、等を調べるための実験をデザインすることが目的であった。この結果から次の実験には、人形の志向性の要因を操作する条件を加える必要があることが考えられた。また、本年度では、データ分析の結果から、三段階モデルの適合性についても検討し、モデルの精緻化に努めた。さらに、人形に対する実在視的反応の解釈について理論的な見識を深めるために、子どものふり遊びや、外的表象理解に関する国内外の文献にあたって研究会で報告し、検討を行った。次年度はさらに、データの分析、発達モデルの精緻化を進め、また志向性を操作する条件や、実験場面の文脈を操作する条件を加えた実験を行うことを予定している。そして、これらの結果を基に、国際的な学会誌への投稿を視野に、論文作成を進める予定である。本研究は、主に2つのことを目的としている。第1に、幼児期の子どもが“人形(ぬいぐるみも含む)"を、外的表象として明確に理解するようになるまでにどのような過程をたどるのか、主に実験的手法を用いて検討する。第2に、その知見に基づき、これまで申請者たちが提唱してきた映像の表象性理解の三段階発達モデルを外的表象全体の理解の発達モデルへと拡張し,その精緻化を図る、である。平成24年度は、本研究課題の最初の年度であるので、まずは幼児がどのように人形を扱うか、またそれらの種類の違いによって理解が異なることがあるかを調べるため、実物との類似性が異なるタイプの人形を多種類用意し、観察も含めた予備的実験を行った。課題の種類は、人形が、視覚や皮膚感覚を有すると子どもが考えているか否かを問うものや、人形が話すことが出来ると考えているかを問うものなどである。これらの結果、幼児が人形を実在物のように扱うことがあること、また、生きている人間や動物のような感覚や能力を、人形が有していると考えているかのような反応が見られた。しかしそのような反応は、一人の子どもの中で常に見られたわけではなく、人形の種類によって異なる反応を見せる場合もあった。すなわち、幼児はひとくくりに人形を外的表象の一種として理解しているわけではなく、種類の違う人形に対して、異なる理解を有していることが示唆された。また、人形を外的表象として理解するようになる過程には、映像理解の発達に見られたようなゆらぎの段階が存在する可能性が示された。今年度は人形の側の要因を主に操作して観察実験を行ったので、次年度はさらに人形を操作する際の文脈的要因を加えて、本格的な実験を行う予定である。また、今年度は、目的の第2に示した三段階モデルの精緻化のため、文献を収集し、映像の表象性理解の発達との差異や、〈心の理論〉の発達との関連について検討を行った。筆者らはこれまで、幼児を対象に、映像などの2次元に表現された外的表象の理解の発達を調べてきた。その結果、実在と混同せず表象として理解するまでには、幼児期を通じて長期にわたる“ゆらぎ"の段階が存在することがわかった。そこで本研究では、外的表象の中でも、3次元的に表現されている人形やぬいぐるみを表象として理解する過程を調べることとした。1年目は、人形を表象として理解する過程を分析するための理論的枠組みを検討するため、研究会等で積極的に研究発表を行い、幅広い知見を集めた。

それをもとに、実物との類似性の異なる3種類の人形と3種類の犬のぬいぐるみを使用して、5歳児を対象とした実験を実施した。人形の課題では、人形がモノの隠し場所を見て、その知識を保持できるか、またぬいぐるみの課題では、ぬいぐるみがモノの温かさを触知し、それを他者に伝えることが出来るかについて、子どもの認識を調べた。その結果、人形・ぬいぐるみとも実物との類似性に関係なく、多くの5歳児に人形やぬいぐるみを実在視するかのような反応が見られ、3次元的な外的表象に対しても、その理解の過程には“ゆらぎ"の段階が存在することが確かめられた。2年目は、1年目の結果を踏まえ、新たな実験を考案するために、子どもが日常生活の中でどのように人形やぬいぐるみで遊んでいるかを観察した。3年目には、これまでに行った実験の結果をまとめ、二つの学会で発表した。そして、この結果と観察をもとに新たな実験を考案し、実施する予定であったが、年度内に終了しなかった。期間中、人形の認知的側面を付与した際の子どもの理解を調べる研究を実施したので、次には人形に情動的側面を付与した場合を調べる研究に発展させたい。認知的側面の付与より情動的側面の付与の方がより実在との混同が容易に起こると予測される。今後、実験の計画を立て、さらに追求したい。発達心理学平成24年度に行った実験を基に、平成25年度はデータの分析とモデルの精緻化、理論的基盤の検討と深化に努め、一定の成果が得られたと考えている。一方で、申請当初に予定していた実験条件、すなわち、幼児と人形の関係を規定する文脈的要因を操作する条件を盛り込んだ実験を行うことができなかった。本年度はこれを行い、平成24年度の実験結果と合わせてデータの整理、分析を行う必要があると考えている。初年次である本年度は、二年次の本格的な実験を行うために、子どもの観察と予備実験を行う計画を立て、それを実行した。この予備実験によって、本実験の手続きや条件を確定するための知見が得られたと考えている。ただし、詳細な分析は本年度中に完了することが出来なかった。モデル精緻化のための文献収集と検討は、さらに広く、より深く進める必要性を感じている。本年次はまず、追加の実験の計画・実行・分析および実験結果のデータ整理・分析を行う。実験の実施と結果の整理での主研究者は木村であり、分析は木村と加藤が協同で担当する。実験の実施にあたっては、研究協力者として瀬野由衣(愛知県立大学)が加わる。また、本年次は最終年次であるので、実験結果をまとめ、論文執筆、報告書の作成、国内外の学会での研究報告を行う。実験結果のまとめは、加藤と瀬野が中心に行い、モデルの精緻化作業については木村と加藤が主に行う。また論文の執筆、報告書の作成は木村が、学会発表は木村と加藤が中心となって行う。二年次は、初年次の予備的実験の結果をもとに本実験を組み立て、実行し、その結果の整理および分析・解析を行う。本実験の実施と結果の整理での主研究者は木村であり,分析・解析は木村と加藤がで共同で担当する。実験の実施にあたっては研究協力者として瀬野由衣(愛知県立大学)が加わる。最終年次は実験結果のまとめと論文執筆,報告書の作成,国内外の諸学会での研究成果の発表を行う。実験結果のまとめを加藤と瀬野が,モデルの精緻化作業を木村と加藤が,論文執筆を木村がそれぞれ中心となって行う。
妊娠高血圧の新しい病態モデルマウスの開発と解析

妊娠に伴い、ホルモンや体液バランスは非妊時に比べ大きく変動する。ヒトでは、妊娠に伴う母体の内的環境の劇的な変化にも巧みに順応し、致命的な障害を受けずに妊娠・分娩を行うことができるよう恒常性維持機構が備わっている。ところが、妊娠という負荷に母体が対応できず、適応不全が原因となって発生すると考えられる"妊娠中毒症"は、現在も尚、周産期死亡や母体死亡の主要原因の一つとなっている。妊娠時における高血圧、タンパク尿や浮腫を伴う、最も重篤な場合には痙攣発作を伴う本症発症の分子機構は不明である。それは、発症の分子メカニズムが把握されていないだけでなく、本症候群を総括的または側面的に理解するための遺伝的背景が明確なモデル動物が存在しないのが一因である。そこで本研究の目的は、妊娠高血圧の新しいモデル動物の開発を目指し、以下の3点に焦点を絞ることとした。(1)妊娠高血圧発症におけるAII受容体シグナル伝達系の役割の解明:AII受容体を介するシグナル伝達系の病態発生への関連性を、以下のようにAT1a遺伝子欠損マウスを用い発生工学的に解析した:AT1aヘテロ欠損/ヒトレニンまたはヒトアンジオテンシノーゲン遺伝子ヘテロ導入マウスを作製したので、これらをさらに交配させることによってAT1aホモ欠損/ヒトレニンまたはヒトアンジオテンシノーゲン遺伝子ホモ導入マウスを作製中して、これらにヒトレニン遺伝子またはヒトアンジオテンシノーゲン遺伝子導入マウスとを交配させた。(2〉妊娠高血圧の発症時における臓器障害発生の解明:妊娠中の短期間に発生する心肥大を含む臓器疾患の情報伝達系に関連する分子を同定・解析した。細胞内ドメインのC-末端領域を用い1×10^8のスクリーニングをした結果、候補遣伝子をクローン化することができた。その結果、低分子量Gタンパク質であるRab5ファミリーがクローニングされた。(3)妊娠高血圧マウスの病態発生の解析:妊娠のどの時期から、心肥大やタンパク尿を含む腎臓疾患が発生するかを病理学・生理学的に明らかにした。ところが、妊娠という負荷に母体が対応できず、適応不全が原因となって発生すると考えられる“妊娠中毒症"は、現在も尚、周産期死亡や母体死亡の主要原因の一つとなっている。そこで本研究の目的は、申請者らが創作した妊娠高血圧を発症する新しいモデル動物を用い、短期間に発症する妊娠高血圧と臓器障害の発生の分子メカニズムを明らかにするため、以下の3点に焦点を絞ることとした。(1)妊娠高血圧発症におけるAII受容体シグナル伝達系の役割の解明:AII受容体を介するシグナル伝達系の病態発生への関連性を、ATla遺伝子欠損マウスを用い発生工学的に解析する。現在、ATla欠損マウスのホモ接合体とヒトレニン遺伝子またはヒトアンジオテンシノーゲン遺伝子導入マウスとを交配させて、ATlaヘテロ欠損ヒトレニンまたはヒトアンジオテンシノーゲン遺伝子ヘテロ導入マウスを作製中である。

今後、これらにヒトレニン遺伝子またはヒトアンジオテンシノーゲン遺伝子導入マウスとを交配させていく予定である。(2)妊娠高血圧の発症時における臓器障害発生の解明:妊娠中の短期間に発生する心肥大を含む臓器疾患の情報伝達系に関連する分子を同定・解析する。細胞内ドメインのC-末端領域を用い1×10^8のスクリーニングをした結果、候補遺伝子をクローン化することができた。現在、クローニングした遺伝子の全長の塩基配列を決定中である。今後、生化学的な結合活性を検討する予定である。妊娠高血圧マウスの病態発生の解析:妊娠のどの時期から、心肥大やタンパク尿を含む腎臓疾患が発生するかを病理学・生理学的に明らかにする。(3)のマウスの作製が完了後、病態発生の時期を明らかにする予定である。妊娠に伴い、ホルモンや体液バランスは非妊時に比べ大きく変動する。ヒトでは、妊娠に伴う母体の内的環境の劇的な変化にも巧みに順応し、致命的な障害を受けずに妊娠・分娩を行うことができるよう恒常性維持機構が備わっている。ところが、妊娠という負荷に母体が対応できず、適応不全が原因となって発生すると考えられる“妊娠中毒症"は、現在も尚、周産期死亡や母体死亡の主要原因の一つとなっている。妊娠時における高血圧、タンパク尿や浮腫を伴う、最も重篤な場合には痙攣発作を伴う本症発症の分子機構は不明である。それは、発症の分子メカニズムが把握されていないだけでなく、本症候群を総括的または側面的に理解するための遺伝的背景が明確なモデル動物が存在しないのが一因である。そこで本研究の目的は、申請者らが創作した妊娠高血圧を発症する新しいモデル動物を用い、短期間に発症する妊娠高血圧と臓器障害の発生の分子メカニズムを明らかにするため、以下の3点に焦点を絞ることとした。(1)妊娠高血圧発症におけるAII受容体シグナル伝達系の役割の解明:AII受容体を介するシグナル伝達系の病態発生への関連性を、ATla遺伝子欠損マウスを用い発生工学的に解析する。ATlaヘテロ欠損/ヒトレニンまたはヒトアンジオテンシンーゲン遺伝子へテロ導入マウスを作製したので、これらをさらに交配させることによってATlaホモ欠損/ヒトレニンまたはヒトアンジオテンシンーゲン遺伝子ホモ導入マウスを作製中である。その結果、低分子量Gタンパク質であるRab5ファミリーがクローニングされた。今後、生化学的・細胞生物学的結合活性を検討する予定である。(3)妊娠高血圧マウスの病態発生の解析:妊娠のどの時期から、心肥大やタンパク尿を含む腎臓疾患が発生するかを病理学・生理学的に明らかにする。(1)のマウスの作製が完了後、病態発生の時期を明らかにする予定である。
臍帯上皮を使用した培養表皮シート移植

これまで我々は、臍帯上皮には表皮に類似した構造をもつ領域が存在し、その領域においては表皮同様の分化関連蛋白の発現を認め、さらに臍帯から上皮細胞を分離培養し、コラーゲンゲル上で三次元培養を行うことにより、表皮角化細胞同様に重層化させることが可能であることを報告した。また、コラーゲンゲル上で単層培養した臍帯上皮細胞をヌードマウスの皮膚欠損部に移植したところ、角化細胞同様に10層前後に重層化し、また、各種ケラチン、角化の最終分化マーカー、基底膜構成蛋白に対する抗体を用いた免疫染色においても、表皮角化細胞とほぼ同様の染色パターンを示した。興味深いことに、移植直後の臍帯上皮細胞においては、表皮分化型ケラチンK1/10に加えて単純上皮型ケラチンK8/18及び粘膜型ケラチンK4/13を同時に発現しており、これらの発現は移植2週間後には減少していることが確認された。以上の結果から、臍帯上皮細胞は生体に移植することにより、in vitroと比較して、より表皮に近い分化を誘導することが可能であることが示唆された。以上のin vitro及びin vivoにおける臍帯上皮細胞の性状についてJournal of Dermatological Scienceに報告した。これらの結果は、臍帯上皮細胞を用いて表皮シートを作製し、臨床応用することが可能であることを示すものであり、現在、さらに移植後の長期的な観察を行っている。これまで我々は、臍帯上皮では表皮に類似した分化関連蛋白の発現を認め、さらに臍帯から上皮細胞を分離培養し、コラーゲンゲル上で三次元培養を行うことにより、表皮角化細胞同様に重層化させることが可能であり、顆粒層、角層を伴った培養表皮シートの作成が可能であることを報告した。そこで15年度は、コラーゲンゲル上で単層培養した臍帯上皮細胞をヌードマウスの皮膚欠損部に移植し、形態学的、免疫学的に表皮角化細胞と比較検討を行った。その結果、移植後の臍帯上皮細胞は、角化細胞同様に10層前後に重層化し、また、表皮分化型ケラチンK1/10を発現し、上層部においてトランスグルタミナーゼ、インボルクリン、ロリクリン等のcornifiedcell envelope associated proteinの発現を認めた。さらに、in vitroにおいては断片的にしか発現を認めなかった基底膜構成蛋白は基底細胞下に線状に発現を認め、電顕的にもhemidesmosome、lamina densa、anchoring fibrilの形成を認めた。興味深いことに、移植後の臍帯上皮細胞においては、表皮分化型ケラチンK1/10に加えて単純上皮型ケラチンK8/18及び粘膜型ケラチンK4/13を同時に発現しており、これらの発現は時間が経つにつれ減少していくことが確認された。これらの結果は、臍帯上皮細胞を用いて表皮シートを作製し、臨床応用することが可能であることを示すものである。さらに現在、経時的な解析を進めている。
痴呆性高齢者の環境行動の理解に関する基礎的研究

本研究は痴呆性高齢者の環境行動を「問題行動」ではなく、人間・環境系における環境との関わりとして如何に捉え、記述し理解するかをテーマとした。知見から物理的環境のデザイン、及び痴呆性高齢者の環境行動のサポート(介護等に対して)という観点からの示唆を得ることを目的とする。研究では、「食事」の場面のビデオを用いた微細な観察による情報から環境行動を分析する試みを行っている。デプスインタビューによる知見の裏付けと共に、誰もが行うことのできる環境行動の評価の仕方を開発を試みるものである。この手法はコミュニケーションの困難な痴呆性高齢者の環境行動を理解する上で有用と思われる。現在、対象者の動きから注意の分散を捉えること、滞在の時間という二つの視点からの分析を試みている。例えば、周辺との環境との関わりをその場にいる人の頭の動き方等をスケールにすることを試行している。また、食堂に人が集まり立ち去るまでの時間、及び行為内容に着目した分析を行った。来年度の建築学会大会(2002.8)で発表の予定である(「高齢者居住施設における食事行動」)。研究ではこの他に、痴呆性高齢者の日常生活の一部始終を追う調査を実施し当事者が「説明できることの可能な環境」の重要性を明らかにした。説明の可能性には個人的な「もの」の環境が大きな意味を持つ。施設での痴呆性高齢者の「もの」環境は痴呆の程度が高いほど豊かとは言えない事が確認されたが、これは環境との関わりの可能性を小さくすることも意味する。研究論文としては「もの」の基礎的な分類、ADLや痴呆程度と分類されたものの量的な相関に関してまでを、日本建築学会計画系論文集551号(2002.1)に「環境移行における「もの」の意味に関する研究」として発表した。(この論文は本奨励研究上の成果であるが、調査データは今年度調査ではない。)さらに本年度調査(最終調査は2002.1)結果を分析考察し、続報の予定である。本研究は痴呆性高齢者の環境行動を理解するための基礎的な知見を得ることが目的である。環境行動全般を捉えることは不可能と考え、「食事」に着目した調査と分析を試みることにした。研究にあたり、痴呆性高齢者の日常生活を客観的に捉えるために、(1)高齢者居住施設に住まう痴呆性高齢者の一日の環境行動の追跡記述調査(昨年度から継続。調査は2000.3)を行った。また、在宅の痴呆性高齢者の日常の概要を知るためにグループホーム入居予定の高齢者と家族に日常生活全般に関するインタビューを行った。次に、「食事」行動に着目した調査として、(3)特別養護老人ホーム2ケ所(うち一つはユニットケアタイプ)とグループホームーケ所において、食事時間を中心としたビデオによる環境行動の記録を試みた。同時に、(4)会話可能な居住者に対して日常的な「食」に関する環境行動に関するアンケート調査を行っている。記録を概観すると観察を行った特別養護老人ホームにおける痴呆性高齢者の多くは、対人的環境、物的環境ともに関係を持つことが少なく、食事の時間は通常の時間帯よりもかえって関わる対象が希薄である人も多い。(5)施設における食事は個人的な生活様式や世代の持つ様式との違いや人びとの食をめぐる記憶を知り、以上の結果と併せて分析をするために、現在その点に関するインタビュー調査を進めているところである。
聴力維持への鍼電気刺激の作用機序

進行性難聴を示すp75KOマウスを用いてこれらのマウスにおける鍼電気刺激(EA)による聴力維持の作用機序について外有毛細胞に対する遠心性抑制経路並びにATP依存的な作用に焦点をあて、その機能解析を行った。6ヶ月令のp75KOマウスのEA非処置群では蝸牛第1、第2回転の外有毛細胞における神経終末の脱落が認められる一方、EA処置群では明瞭な異常は認められなかった。以上の結果は加齢による遠心性経路の破綻がEAにより保護されていることを意味する。またEAによりp75の有無にかかわらず蝸牛内のATPの上昇が認められた。以上の結果は内耳においてもATP依存的なEAの作用機序が存在することを示唆している。東洋医学においては、鍼電気刺激が、耳鳴りや難聴の自覚症状の改善に効果があることが多数報告されている(Wang k et al. Comlement Ther Med. 2010; 18(6): 249-55.)。しかしながら、鍼電気刺激の聴力改善の作用機序(分子メカニズム)については、全く明らかにされていない。申請者らは、進行性難聴を示すp75ノックアウトマウスを用いて、鍼電気刺激により1)聴力が減退せず維持されること、2)外有毛細胞及びラセン神経節細胞の細胞数の減少が抑制されること、3)神経節細胞においてtrks受容体が発現増強すること、の3点について報告してきた(Maeda T et al. Acupunct Med. published on line 2013; 18)。そこで、本研究では、p75ノックアウトマウスにおける鍼電気刺激による聴力維持の作用機序について、trks受容体経路の観点からその機能を明らかにする。初年度においては、本研究に使用するp75ノックアウトマウス(B6.129S-4-Ngfr<tm1Jae>/J )系統の凍結受精卵よりマウス(仮親)に凍結胚移植を行いp75ノックアウトマウスの個体化を行った。現在、鍼電気刺激の聴力維持効果及びtrks受容体経路の検討をおこなうことを視野にいれて、そのp75ノックアウトマウスの繁殖を行なっている。本研究課題を推進するにあたり進行性難聴のモデルマウスを作製する目処がついたことで今後、この研究課題を進めていく上で基本的な要件を達成したと考えている。そこで本研究では、p75ノックアウトマウスにおける鍼電気刺激による聴力維持の作用機序について、trks受容体経路及び外有毛細胞に対する遠心性抑制経路の観点からその機能を明らかにする。27年度においては、鍼電気刺激の聴力改善効果が遠心性抑制経路に見いだせるかどうかについて組織学的な検討を行った。その結果、6ヶ月令のp75ノックアウトマウスにおいては、外有毛細胞の脱落及びシナプスの脱落が多く認められた。これに対して難聴の進行が始まる2ヶ月令より4ヶ月間、鍼電気刺激を行ったマウスでは外有毛細胞に対する遠心性抑制経路のシナプスの異常は認められなかった。以上のことは加齢による遠心性経路の破綻が、鍼電気刺激により回復していることを意味する。28年度においては、鍼電気刺激の聴力維持効果をtrks受容体経路及び遠心性抑制経路に着目して、より詳細な検討をおこなうことを視野にいれて、引き続きp75ノックアウトマウスの針電気刺激のモデルマウスの作製及び組織学的な検討を行う予定である。27年度においては、本研究に使用するp75ノックアウトマウス(B6.129S-4-Ngfr<tm1Jae>/J )系統の繁殖及びこれらのマウスを用いて組織学的な実験を行った。申請者らは、既にこのマウスが、内耳の有毛細胞や蝸牛神経節細胞の変性及び細胞死により、4ヶ月令より徐々に難聴が進行し、6ヶ月令でほぼ聾になることを明らかにしている。本年度は、加齢による進行性難聴を示すp75ノックアウトマウスに対する鍼電気刺激の聴力改善効果が遠心性抑制経路に見いだせるかどうかについて組織学的な検討を行った。その結果、3ヶ月令のp75ノックアウトマウスにおいては、外有毛細胞の脱落及びシナプスの脱落は認められなかった。しかしながら、6ヶ月令のp75ノックアウトマウスにおいては、外有毛細胞の脱落及びシナプスの脱落が多く認められた。これに対して難聴の進行が始まる2ヶ月令より4ヶ月間、鍼電気刺激を行ったマウスでは外有毛細胞に対する遠心性抑制経路のシナプスにおいて異常は認められなかった。以上のことは加齢による遠心性経路の破綻が鍼電気刺激により回復していることを意味する。