hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
3-メルカプトピルビン酸イオウ転移酵素の生理的機能の解明

1.PCR法で単離した31kd分子種の3-MST cDNAクローン(MS-1.2)をプローブとし用い、34kd 3-MSTcDNAのクローニングをヒト肝臓cDNAライブラリーより行い、34kd 3-MSTcDNAをコードすると思われる2クローン得、塩基配列を決定した。その結果、最長のクローン(MS-1.25)は1340bpでMS-1.2と比較し、5'側の塩基配列が異なっていた。それより予想されるアミノ酸配列は、MS-1.2と比べ20残基長く297残基であった。大腸菌中で31kd分子種の3-MSTを過剰発現させ3-MSTに対するモノクローナル抗体を作製し複数のクローンを得、性格付けを行った結果、同じイオウ転移酵素群のヒトロダネ-ゼと交差反応を示すものを含め異なったエピトープを認識する抗体を得た。クローニングした両分子種の3-MST(31kd、34kd)に対応するcDNAクローンを哺乳類で発現可能なベクター(pRc/CMV)中に構築し、サル腎臓細胞(Cos-7)中で一過性的に発現させ、細胞分画後の抽出物を活性測定及び特異的モノクローナル抗体でウエスタンブロット法により31kd、34kd3-MSTの分子種を同定した結果、31kd 3-MSTはミトコンドリア、サイトゾール両画分に、34kd 3-MSTはサイトゾール画分のみに局在しヒト細胞中で見出されている局在性、分子サイズとも同一であった。両分子の発現メカニズムを明らかにする目的で、得たcDNAをプローブとしヒトゲノムDNAクローニングを行い10クローンを得た。現在、そのクローンより転写開始点を含む上流部をサブクローニングし、CATをレポーターとするベクターを用い様々なサイズのDNAを挿入し、その発現を検討中である。2.同じイオウ転移酵素群の一つであり細胞内機能の相補性も考えられるヒトロダネ-ゼについてcDNAクローニング・全塩基配列決定と発現を行った。H7年度研究は、34kd分子種のヒト3-メルカプトピルビン酸イオウ転移酵素(3-MST)cDNAクローニング、分子間相互作用の解析及び血球分化と3-MSTの関係に注目しその生理的機能を明確にする目的で以下に示すように検討を行った。1.大腸菌中で31kd分子種の3-MSTを過剰発現させ3-MSTに対するモノクローナル抗体を作製し複数のクローンを得、性格付けを行った結果、同じイオウ転移酵素群のヒトロダネ-ゼと交差反応を示すものを含め異なったエピトープを認識する抗体を得た。今後、3-MST抗体を用い3-MSTの検出を行なう予定である。2.GST融合3-MSTを用い、共沈降法で相互作用する細胞内タンパク質の検出をK562細胞を用い行ったところ、再現性良く相互作用するタンパク質を数種同定したがいずれもその量は極めて少なかった。3.単離した31kd分子種の3-MST cDNAクローン(MS-1.2)をプローブとし用い、まだ単離していなかった34kd 3-MSTcDNAのクローニングをヒト肝臓cDNAライブラリーより行い、34kd 3-MSTcDNAをコードすると思われる2クローン得、塩基配列を決定した。その結果、最長のクローン(MS-1.25)は1340bpでMS-1.2と比較し、5′側の塩基配列が異なっていた。

その特長としてアルギニンが3残基、セリン/スレオニンが5残基含まれ蛋白質リン酸化酵素の認識するモチーフを形成することより、34kd 3-MSTの細胞内で見出される等電点の異なるアイソフォームがリン酸化による可能性を示唆した。4.血球系ガン細胞(K562)を用い分化誘導時の3-MSTの機能を明らかにするため、誘導的に発現能可能なベクターにより3-MSTを発現させたが、発現させたクローンは親株に比べ、40倍3-MST活性が上昇したにもかかわらず赤芽球分化・増殖に対する影響は観察されなかった。なお、アンチセンス鎖発現において3-MST活性は変動しなかった。1.前年度クローニングした両分子種の3-MST(31kd、34kd)に対応するcDNAクローンを哺乳類で発現可能なベクター(pRc/CMV)中に構築し、サル腎臓細胞(Cos-7)中で一過性的に発現させ、細胞分画後の抽出物を活性測定及び、前度作製したリコンビナント3-MSTに対する特異的モノクローナル抗体でウェスタンブロット法により31kd、34kd3-MSTの分子種を同定した結果、31kd 3-MSTはミトコンドリア、サイトゾール両画分に、34kd 3-MSTはサイトゾール画分のみに局在しヒト細胞中で見出されている局在性、分子サイズとも同一であった。更に、34kdに対応する3-MST cDNAクローンを哺乳類で発現一過性的に発現させ、ヒトで見出だされるような等電点の異なるアイソフォーム(pI6.3,pI6.8,)の存在が確認できた。また、修飾を明らかにする目的で脱リン酸化酵素を作用したところ等電点の変化は見られた。2.前年度クローニングした両分子種の31kd、34kdに対応する3-MST cDNAクローンの特異的部位を用いヒト各種臓器での発現量をノーザンブロットで解析したが、特異的配列でのノーザンブロットでの検出はできなかった。更に発現メカニズムを明らかにする目的で、得たcDNAをプローブとしヒトゲノムDNAクローニングを行い10クローンを得た。現在、そのクローンより転写開始点を含む上流部をサブクローニングし、CATをレポーターとするベクターを用い様々なサイズのDNAを挿入し、その発現を検討中である。4.同じイオウ転移酵素群の一つであり相補性も考えられるヒトロダネ-ゼについてcDNAクローニング・全塩基配列決定と発現を行った。
インドミゾラム州における竹類の大面積一斉開花枯死が地域の生態系と焼畑に及ぼす影響

インド、ミゾラム州で、竹(Melocanna baccifera)が大面積一斉開花枯死した地域において、開花後の当該種の回復過程を、植生の変化、群落内のクローン構造の変化を追跡する他、開花範囲の広域レベルでの把握、焼畑農業の生産と開花のタイミングとの関係の検討、ネズミ個体群の変化を調査した。その結果、自生地域の開花が数年にわたって波状に起こっていること、焼畑農業の実施がこの種の回復にプラスに利いていること、ネズミ個体群の変動は数年で収束すること、等が明らかになった。本研究は、2005年度より基盤A(海外)の研究経費により行ってきた竹類Melocanna bacciferaの一斉大面積開花の生態的特性および焼畑地における挙動に関する研究をさらに継続し、開花後の本種の回復過程を植生の変化、群落内のクローン構造の変化、などの視点からの追跡、48年に一回起こる今回のような大面積にわたる開花がどの程度の範囲にわたって繰り返されているのかの広域レベルでの把握、焼畑地において開花時に焼畑を行ってから何年目の休閑地であったかに応じたM.bacciferaの回復状態の追跡と回復状態が焼畑地における収量に及ぼす影響の把握、さらには開花によってネズミの個体数の増加が認められつつあるがこれが開花後何年間継続するのかの把握、を行い、開花後数年間のM.bacciferaの回復過程を通して、開花地域の生態系と焼畑地に対する影響を解析しようとするものである。本年度は、対象とする竹類であるMelocanna bacciferaの開花・結実から一年を経過した年にあたった。生態学的な調査を通して、開花後の竹林では実生成長による次世代の生育が確認されたが、想定していた以上の前世代の枯死個体による攪乱が発生しており、次世代群落の再生には想像以上の時間がかかる可能性が示唆された。再生した次世代の稈に関しては、固定調査地において全稈の葉の採取を行い、その分子生態学的解析を通して、次世代のクローン配置に関する解析を行うための試料の十分な採集が行えた。一方、現地調査を通じて得られた情報に基づいて、数十万km^2規模での衛星データを用いた、開花枯死域の特定を行い、ミゾラムを含むインド北東部のみならず、隣接するミャンマーやバングラデシュにおける開花の発現年を推定することができた。この解析により、政治的な理由等により実際に入域が困難な地域に関する開花情報も抽出することができた。その結果、自生域と推定されている地域において2005年から2009年の間にほぼすべての竹林が開花枯死し、開花域の経時的な変遷が解析できた。焼畑農業が卓越する地域においては、竹の開花のタイミングと焼畑のための火入れを行うタイミングとの関係から、現地で高い生産量を得る上で重要とされる竹植生の継続的な存続を維持するための、竹類開花時の取り扱い方に関する情報を得ることができた。また、開花が及ぼすネズミ個体群への影響に関しても重要な知見が得られた。これらの情報は、これまで経験値としては現地等で伝えられてきたものであるが、それを実際的な数値化ができた初めての例である。本年度は、対象とする竹類の一斉開花枯死後二年目の年にあたり、固定調査地における継続調査と新たに出現した全稈の葉の採取によるDNA解析を通した新たな群落形成に関する分子生態学的解析を行った。固定調査地においては、開花枯死によって生じた親稈の倒伏が顕著であり、これらの枯死個体が次世代の群落回復には想定以上の障害となることが判明しつつある。また、多くの親世代の遺伝子を持つ次世代の個体群が形成するクローンレベルでの初期の推移も明らかになりつつある。本種の広域的な開花域の解析に関しては、調査対象地であるインドミゾラム州ではほとんどすべての群落が開花枯死に至ったことから、近隣地域及び国に調査域を拡大した。すなわち。本年度はインド北東州のナガランド及びバングラデシュ・チッタゴン地域における開花状況に関する調査を行い、バングラデシュでミゾラム州よりも一年遅れで開花した地域があることを確認した。焼畑農業の生産量に与える竹類の開花の影響に関しては、開花後二年目の植生回復地における焼畑農業が農業の生産量に与えた影響に関する聞き取り調査を行った。調査結果の解析はまだ行えていないが、大きな収量を得る上で、開花後何年目まで焼畑を目的とした火入れが行われるべきでないか、を示唆するデータが得られた。収量に影響を与えると考えられるネズミの個体群に関しては、明確な情報は得られなかったが、現地においてはネズミ個体群が徐々に減少しつつあることが把握された。全体として、Melocanna bacciferaの開花が地域に与える影響に関する知見は多く得られたといえる。全体の研究計画のうち、「開花後の竹林生態学的見地からの追跡調査」に関しては、ミゾラム州サイランにある生態調査地において追跡調査を継続した。

開花後3年目に入った調査地では、1年目に発芽した実生個体の数はさらに減少し、一部では実生が全く認められない場所も生じていた。しかし、生残している実生の一部は、群落を覆っている蔓植物を中心とする被服を突き破って新稈を出し始めており、群落の再生は想定よりは遅かったものの、着実に予想できるようになりつつあった。群落におけるクローン構造に関しては、本年度の調査においてもすべての生存稈から葉を採取し、現在その解析を実行中である。また、開花翌年に急増したネズミ個体群は、再び開花前と同様の少ない状態になっており、ネズミの増殖は一時的なものであることが推定できた。「広域的にみた開花状況の把握とその前後の食性の変化の把握」に関しては、前年度の衛星画像を用いた解析を行った地域からははずれているインド北東部のナガランドにおいて実態調査を行った。これらの地域では、対象竹種は半自生状態で生存すると考えられるが、本年度にいまだに開花している群落が時折認められ、人為による対象竹種の拡大の可能性が示唆された。「竹類の開花が焼畑地に及ぼす影響把握と収量の変化の把握」に関しては、開花後の焼畑地では収量が減少することを学んだ農民が焼畑の実施を控える動きが確認されたほか、焼畑そのものを放棄する農民も確認された。これらの農民の動きは今回の開花による対象竹種の再生に大きな影響を与える可能性を示唆しているといえる。開花後竹林の変遷の生態的把握に関しては、予想していた回復過程は観察できず、数多くの実生クローンはツル植物の被圧によって枯死した。しかし今年度は、一部の生残した実生から高い新桿の発筍が認められ、群落再生の本格的な開始が観察されるようになった。被圧の結果失われた実生に関するクローンマップは、膨大なサンプル量のためまだ完成していないが、近い将来完成させる予定である。広域的に見た開花状況の把握については、シッキムにおける現地調査を行ったが、全般としては明らかに植栽と考えられる小規模の群落を除いては一斉開花枯死は見いだせなかったため、メロカンナの自生地及び周辺地域における一斉開花枯死は終了したと考えられた。メロカンナの開花が焼畑に与える影響は、焼畑のタイミングによっては大きなものであった。開花当年あるいはその翌年に火が入った焼畑では竹植生の回復は遅れることが示唆された。一方、休閑後三年以上を経たタイミングで開花が起こった焼畑地では、竹の順調な回復が認められた。これらのことからメロカンナは焼畑農業の拡がりに応じて分布域を広げてきた主であることが推定された。開花とのタイミングの中で、焼畑の生産量に関する情報も収集した。また、開花翌年から増加したネズミ個体群は、開花前の状況に戻った。以上の他、ミゾラム州政府の竹に関する政策や各集落の対応に関する調査も行った。開花の過程において農民の焼畑農業離れの傾向も認められ、この大規模な開花現象が農業社会に与える影響についても考察を行うことができた。さらに、詳細な広域調査の結果、今回あるいは前回には開花しなかった群落の存在が確認できた。このような非開花群落の存在は竹類の開花生態を理解する上で貴重な事例であり、植物としての進化に関する考察を行う上でも重要な情報であった。今後、このような群落に焦点をあてた研究の必要性が高まっている。
基底膜の動態と局在を制御する遺伝子の同定と分子機構の解明

基底膜は細胞外マトリックスの一つであり、進化的に保存されたタンパク質群から構成されたシート状の構造である。モデル生物である線虫C. elegansを用いて基底膜動態に異常を示す変異体の変異遺伝子を同定したところ、GPIアンカーの修飾に関わるpigN遺伝子の変異である事を明らかにした。pigNは、GPIアンカーの基本骨格のマンノースにエタノールアミンを転移する働きが知られている。我々は、pigNには従来知られているGPIアンカーへの修飾機能とは異なる機能があること(Non-canonicalと定義)、またその機能が進化的に保存されていることを明らかにした。細胞外マトリックスは、時間軸や状況に応じて構成分子の発現亢進や構造変化が観察される。時期・場所特異的な細胞外マトリックスの構成タンパク質の発現差異は、細胞に空間情報の提示や行動(増殖、分化、死滅)を積極的に制御する情報デバイスとして作用する。例えば、細胞外マトリックスの構成タンパク質の一つであるヘパリン硫酸プロテオグリカンは、様々な成長因子と結合することで、細胞外の成長因子の量と局在を制御する。細胞外マトリックスの一つである基底膜は進化的に保存されたタンパク質群から構成されたシート状の構造をしており、細胞極性の維持や代謝を制御する。また基底膜の恒常性は厳密に制御されており、破綻は疾患を引き起こす。アルポート症候群は腎不全を引き起こす基底膜タンパク質の変異であり、基底膜への自己免疫疾患として、グッドパスチャー症候群が知られている。平成27年度は、基底膜動態に異常を示すmde-2変異体の解析をおこなった。共焦点顕微鏡と電子顕微鏡を用いた観察により、mde-2変異体で基底膜分子の分泌が異常になること、またその蓄積が小胞体で観察されることをあきらかにした。またmde-2変異体の変異遺伝子は、GPIアンカーの修飾に関わるpigNの遺伝子変異である事を明らかにした。pigN遺伝子変異は、MCAHS1症候群とよばれる遺伝病を引き起こし、精神遅滞、顔貌や手指の異常などを示し、幼児期に死亡する重篤な遺伝子疾患であるが、その分子機構は全く不明であるが、pigNが従来知られているGPIアンカーへの修飾とは異なる機能があることを明らかにした。当初の計画通りに、変異体の遺伝子同定及び機能解析を行うことができた。細胞外マトリックスの一つである基底膜は進化的に保存されたタンパク質群から構成されたシート状の構造をしており、細胞極性の維持や代謝を制御しています。また基底膜の恒常性は厳密に制御されており、破綻は疾患を引き起こします。例えばIV型コラーゲンの変異は、アルポート症候群と呼ばれる腎不全を引き起こし、基底膜タンパク質への自己免疫疾患として、グッドパスチャー症候群などが知られています。モデル生物である線虫C. elegansは分子イメージングが容易であり、基底膜をライブ観察することが可能です。これまでに、この実験モデルを用いて基底膜動態に異常を示す変異体の探索を行い、多数の変異体を確立しました。一つの変異体の変異遺伝子を同定したところ、GPIアンカーの修飾に関わるpigN遺伝子の変異である事を明らかにしました。pigN遺伝子は、GPIアンカーの基本骨格のマンノースにエタノールアミンを転移する働きが知られていますが、基底膜タンパク質の動態に関与することはこれまで報告されていません。また、ヒトではpigN遺伝子変異によりMCAHS1症候群とよばれる重篤な遺伝病(幼児期に死亡)を引き起こすことが報告されています。これまでに線虫C. elegansとヒト培養細胞を用いて解析を行い、pigNには従来知られているGPIアンカーへの修飾機能とは異なる機能があること(Non-canonicalと定義)を明らかにしました。この知見はpigN遺伝子変異により引き起こされるMCAHS1症候群の病態を理解するための知見になると考えています。当初の予定通りに、変異体の変異遺伝子の同定及び機能解析を行い、論文を提出した。基底膜は細胞外マトリックスの一つであり、進化的に保存されたタンパク質群から構成されたシート状の構造をしている。基底膜の機能は多岐に渡り、細胞集団の区分けや細胞極性の維持や代謝を制御している。例えばIV型コラーゲンの変異は、アルポート症候群と呼ばれる腎不全を引き起こし、基底膜タンパク質への自己免疫疾患として、グッドパスチャー症候群などが知られている。申請課題ではモデル生物である線虫C. elegansを用いて、基底膜の動態をライブ観察する実験系を確立した。これまでに、この実験モデルを用いて基底膜動態に異常を示す変異体の探索を行い、多数の変異体を確立した。遺伝子マッピングと次世代シークエンスを用いて、一つの変異体の変異遺伝子を同定したところ、GPIアンカーの修飾に関わるpigN遺伝子の変異である事を明らかにした。pigNは、GPIアンカーの基本骨格のマンノースにエタノールアミンを転移する働きが知られていますが、基底膜タンパク質の動態に関与することはこれまで報告されていない。またヒトではpigNの遺伝子変異によりMCAHS1症候群とよばれる重篤な遺伝病(幼児期に死亡)を引き起こすことが報告されている。

本研究課題では線虫C. elegansとヒト培養細胞を用いて解析を行い、pigNには従来知られているGPIアンカーへの修飾機能とは異なる機能があること(Non-canonicalと定義)、またその機能が進化的に保存されていることを明らかにした(Ihara, et al., JCS 2017)基底膜は細胞外マトリックスの一つであり、進化的に保存されたタンパク質群から構成されたシート状の構造である。モデル生物である線虫C. elegansを用いて基底膜動態に異常を示す変異体の変異遺伝子を同定したところ、GPIアンカーの修飾に関わるpigN遺伝子の変異である事を明らかにした。pigNは、GPIアンカーの基本骨格のマンノースにエタノールアミンを転移する働きが知られている。我々は、pigNには従来知られているGPIアンカーへの修飾機能とは異なる機能があること(Non-canonicalと定義)、またその機能が進化的に保存されていることを明らかにした。基底膜タンパク質の動態異常を示す他の変異体の変遺伝子を同定する。また異なる基底膜タンパク質に注目して、新規変異体を同定する予定である。基底膜タンパク質の動態異常を示す変異体に関する最初の論文を提出できたので、今後は残りの変異体の解析を行い、順次論文提出を目指す予定である。あわせて、異なる基底膜タンパク質に注目して、基底膜の動態以上を示す新規変異体の獲得を目指す。細胞生物学
染色体構造調節因子複合体の機能解析

染色体構造調節因子複合体について、新規複合体の同定及び構成因子の検索や機能調節を調べる事を目的として、15年度は、前年度の13の課題を継続するとともに、特に課題4に焦点を当て、研究を進めた。1.新規ゲノム発現制御複合体の同定:in vitro転写系及びクロマチンヌクレオソーム再構成系(当研究室で研究済み)を用いてHeLa細胞核抽出液から精製し、精製された複合体構成因子群をMALDI-TOFMASSにより同定した。更にcDNAスクリーニングにより各々の構成因子の機能を調べた。2.細胞種特異的複合体構成因子の同定:これら核内複合体の機能は細胞種特異的と考えられる。そこで既知複合体の既知構成因子を各種組織株に高発現させ、複合体を精製することで細胞種特異的構成因子を同定した。3.染色体構造調節複合体の機能調節の分子メカニズムの解明:最近ではアセチル化、ユビキチン化などの各種タンパク修飾によって機能調節される例が報告されているが、染色体構造調節複合体の構成因子のタンパク修飾による機能調節は全く不明である。そこで、既知核内レセプターコアクチベーター(p160、p68/ファミリー)を用い、各種培養細胞での他の複合体構成因子を同定し、構成因子の複合体構成能とタンパク修飾による機能調節の可能性を検討した。4.ショウジョウバエを用いた新規染色体構造調節のスクリーニング:申請者らは既に、ヒトアンドロゲン(男性ホルモン)レセプターを組織特異的に発現するショウジョウバエのラインを確立し、リガンド依存的な転写促進をGFPで検出することに成功した。本システムを用いることで哺乳類特異的染色体構造調節因子を発現する各種ラインを確立し、次に特定染色体部位を欠失した各種変異体を交配することで、染色体構造調節因子機能に必須な因子を分子遺伝学的にスクリーニングを行った。更に同定された因子をプローブに複合体を同定及び解析した。染色体構造調節因子複合体について、新規複合体の同定や構成因子の検索や機能調節を調べる事を目的として、本年度は下記の3点に焦点を当て、研究を進めた。1.新規ゲノム発現制御複合体の同定:染色体構造調節因子は単独で作用することなく、巨大複合体として機能する。現在までに染色体構造調節因子複合体として精製及び同定に成功した例ではHeLa細胞核抽出液もしくは酵母あるいはショウジョバエ胚核抽出液からの複合体精製による。そこで、in vitro転写系及びクロマチンヌクレオソーム再構成系(当研究室で研究済み)を用いることで、HeLa細胞核抽出液から精製した。精製された複合体構成因子群をMALDI-TOFMASSにより同定し更にcDNAスクリーニングにより各々の構成因子の機能を調べた。3.染色体構造調節複合体の機能調節の分子メカニズムの解明:細胞種特異的あるいは疾態特異的なゲノム発現制御には、いずれも転写制御因子及び転写共役因子自身の機能調節が知られている。最近ではアセチル化、ユビキチン化などの各種タンパク修飾によって機能調節される例が報告されている。しかしながら、染色体構造調節複合体の構成因子のタンパク修飾による機能調節は全く不明である。

染色体構造調節因子複合体について、新規複合体の同定及び構成因子の検索や機能調節を調べる事を目的として、15年度は、前年度の13の課題を継続するとともに、特に課題4に焦点を当て、研究を進めた。1.新規ゲノム発現制御複合体の同定:in vitro転写系及びクロマチンヌクレオソーム再構成系(当研究室で研究済み)を用いてHeLa細胞核抽出液から精製し、精製された複合体構成因子群をMALDI-TOFMASSにより同定した。更にcDNAスクリーニングにより各々の構成因子の機能を調べた。2.細胞種特異的複合体構成因子の同定:これら核内複合体の機能は細胞種特異的と考えられる。そこで既知複合体の既知構成因子を各種組織株に高発現させ、複合体を精製することで細胞種特異的構成因子を同定した。3.染色体構造調節複合体の機能調節n分子メカニズムの解明:最近ではアセチル化、ユビキチン化などの各種タンパク修飾によって機能調節される例が報告されているが、染色体構造調節複合体の構成因子のタンパク修飾による機能調節は全く不明である。そこで、既知核内レセプターコアクチベーター(p160、p68/ファミリー)を用い、各種培養細胞での他の複合体構成因子を同定し、構成因子の複合体構成能とタンパク修飾による機能調節の可能性を検討した。4.ショウジョウバエを用いた新規染色体構造調節のスクリーニング:申請者らは既に、ヒトアンドロゲン(男性ホルモン)レセプターを組織特異的に発現するショウジョウバエのラインを確立し、リガンド依存的な転写促進をGFPで検出することに成功した。本システムを用いることで哺乳類特異的染色体構造調節因子を発現する各種ラインを確立し、次に特定染色体部位を欠失した各種変異体を交配することで、染色体構造調節因子機能に必須な因子を分子遺伝学的にスクリーニングを行った。更に同定された因子をプローブに複合体を同定及び解析した。
胎仔期循環血液内の間葉系幹細胞を利用した遺伝性・難治性皮膚疾患の新規治療法の確立

本研究の最終目的は、マウス胎仔期から血液内間葉系幹細胞を回収するシステムを構築し、さらに回収した間葉系幹細胞を難治性疾患モデルマウスに投与することで、新規治療法の研究基盤を確立することである。今回、投与される側の難治性皮膚疾患モデルマウスの解析に重点を置いて研究を行った。新規に作製したDermokine β/γKOマウスの胎仔期・新生仔期の恒常状態の皮膚を詳細に解析した。本研究は、1マウス胎仔期E12.5-13.5の血液内のみに存在する万能性が高いPDGFRα陽性の胎仔期血液内間葉系幹細胞(Dorsal Aorta Mesenchymal Stem Cells(DAMSCs)(以下PDGFRα+DAMSCsと略す)を効率よく血液中から回収するシステムを構築し、さらに2難治性疾患のモデルマウスに、回収したDAMSCs細胞を投与することで通常のMSCよりも高い治療効果が得られることを明らかにし、難治性疾患の新規治療法の研究基盤を確立することである。現在、PDGFRα+DAMSCsは効率良く分化誘導が懸かることが報告されており、さらに申請者らのグループは、大人のマウスの循環内に皮膚抽出液を投与することで血中のPDGFRα+間葉系幹細胞が血中に動員されることを以前に報告している。このため、E12.5-14.5胎仔時の循環系に皮膚抽出液またはPDGF-AA, BB等の遊走活性のある蛋白質を投与すれば、血中にPDGFRα+DAMSCsがより多く動員され、効率よくこの細胞が回収できることが考えられる。本研究では、PDGFRα+DAMSCsを様々な難治性疾患モデルに投与して、その治療効果を検討したい。本研究の目的は、1マウス胎仔期E12.5-13.5の血液内のみに存在する万能性が高いPDGFRα陽性の胎仔期血液内間葉系幹細胞(Dorsal Aorta Mesenchymal Stem Cells(DAMSCs)(以下PDGFRα+DAMSCsと略す)を効率よく血液中から回収するシステムを構築し、さらに2難治性疾患のモデルマウスに、回収したDAMSCs細胞を投与することで通常のMSCよりも高い治療効果が得られることを明らかにし、難治性疾患の新規治療法の研究基盤を確立することである。本実験では、マウス胎仔期末梢血から単核球を単離し、FACSを行い胎仔末梢血幹細胞の存在を確認する手技を獲得してから、応用研究(AMG3100、SDF-1、migration活性のあるrb等をマウス胎仔循環内に投与することで血中内間葉系幹細胞の増加させる)を行うことを主題としている。本年度も、本研究に使用する手技・条件設定を主眼に研究を施行した。昨年度は、回収した間葉系幹細胞をskin graft modelマウスに投与後に、植皮片の生着を左右する血管新生および炎症細胞浸潤などへの影響をFACSで解析するための手技確認を施行した。炎症を惹起した皮膚を回収し、コラーゲナーゼ・ヒアルロニダーゼ・DNaseで90min、37°Cで処理し、皮膚片を細かく切り刻み皮膚片中に浸潤している細胞を回収、フィコールを利用して皮膚片中に浸潤している細胞のみを回収した。その後、Lineage, CD3, CD11bでFACS解析、ほぼ回収した細胞はLineage陽性であった。さらに、炎症を惹起した皮膚からtotal RNAを回収し、qRT-PCRを施行する条件設定(CXCL1,2,3,5,CCL2,20,CXCL1,IL-17A等)を行った。さらに、浸潤してきた炎症細胞をsortingする条件設定を現在行っている。すべて今後に本研究および教室の研究に使用する手技である。過去にPDGFRα+DAMSCsは効率よく分化誘導が懸ることが既に報告されており、さらに申請者らのグループは、成人マウスの循環内に独自に作製した遊走活性を有する蛋白質を含む皮膚抽出液などを投与することで、血中のPDGFRα+DAMSCsがより多く動員され、効率よく目的の細胞が回収できるのではないかと考えている。

さらに効率よく採集されたPDGFRα+DAMSCsを様々な難治性疾患モデルマウスに投与して、その治療効果を検討するところまで到達したい。本研究の最終目的は、マウス胎仔期から血液内間葉系幹細胞を回収するシステムを構築し、さらに回収した間葉系幹細胞を難治性疾患モデルマウスに投与することで、新規治療法の研究基盤を確立することである。今回、投与される側の難治性皮膚疾患モデルマウスの解析に重点を置いて研究を行った。新規に作製したDermokine β/γKOマウスの胎仔期・新生仔期の恒常状態の皮膚を詳細に解析した。本年度は、本研究に使用する手技・条件設定を主眼に研究を施行した。まずは、回収した間葉系幹細胞をskin graft modelマウスに投与した後に、植皮片の生着を左右する血管新生および炎症細胞浸潤などへの影響をFACSで解析するための手技確認を施行した(Foxp3,IL-17A,IL-6,INF-γ,TNF-α等)。また、免疫染色の条件設定(CD3,CD4,CD8,F4/80,SMA,MPO等)も合わせて施行した。1、妊娠13日目マウス胎仔(P13 embryo)より末梢血を回収し、dish上で分化誘導(脂肪・骨・軟骨)をかけ、胎仔末梢血中のPDGFRα陽性間葉系幹細胞(PDGFRα+DAMSCs)の存在を確認する。2、P13embryoの末梢血を回収し、胎仔末梢血中のPDGFRα+DAMSCsのpopulationをFACS(CantII)にて測定する。3、P13 embryoから、胎仔末梢血PDGFRα+DAMSCsをsorting(Area)し、dish上で分化誘導(脂肪・骨・軟骨)をかけ、胎仔血液内間葉系幹細胞(DAMSCs)がPDGFRα+cellであり、分化能力が高いことを確認する。4、以前に報告した新生児マウス皮膚抽出液を精製する。市販されているmigration活性を有する蛋白質(PDGF-AA、PDGF-BB、bFGF、VEGF、IGF-1、BMB2、BMB4、TGF-β1、TGF-β3、HGF、IL-3、SDF-1a)を購入する。5、皮膚抽出液及び市販蛋白質をP13-14 embryoの循環血液内に投与し、PDGFRα+DAMSCsが血中に動員されて血液内に増えるか確認する(FACS CantII)。6、皮膚抽出液及び市販蛋白質をP13 embryo(GFP mouse)の循環血液内に投与し、PDGFRα+DAMSCsをsorting(Area)し、1週間程dish上で培養し細胞数を増やす。皮膚遺伝子治療1、妊娠13日目マウス胎仔(P13 embryo)より末梢血を回収し、dish上で分化誘導(脂肪・骨・軟骨)をかけ、胎仔末梢血中のPDGFRα陽性間葉系幹細胞(PDGFRα+DAMSCs)の存在を確認する。市販されているmigration活性を有する蛋白質(PDGF-AA、PDGF-BB、bFGF、VEGF、IGF-1、BMB2、BMB
円偏波を放射する高利得・伝送線路アレーアンテナに関する研究

高利得・伝送線路アレーアンテナの円偏波放射特性を、理論と実験の両面から明らかにすることができた。すなわち,高利得を得るためにアンテナ高を徐々に変化させる手法を伝送線路アレーアンテナに導入し、本手法が従来の伝送線路アレーアンテナの円偏波放射特性を損なうことなく,利得増加に寄与する事を数値解析上から明らかにした。数値解析結果に基づいてアレーアンテナを設計・試作し,軸比3dB以下の良好な円偏波を放射する利得30dBのアレーアンテナを実現した。本研究の手順と方法および詳細な結果は以下の通りである。1.放射特性の数値解析:任意形状線状アンテナに対して導出された積分方程式に,モーメント法を適用して伝送線路アレーアンテナ上の電流分布を算出した。算出した電流分布を用いて伝送線路アレーアンテナの放射特性(放射パターン,軸比,利得,入力インピーダンス等)を評価した。結果として,30dBの利得を得るのに必要なアンテナ素子数を,従来の10素子から8素子に減らすことが可能である事を明らかにした。2.アレーアンテナの試作:伝送線路アレーアンテナを,一枚の銅箔フィルムからフォトエッチングにより製作した。伝送線路アレーアンテナの給電回路には、給電損失の少ない方形導波管を用いた。方形導波管に挿入するプローブの位置と挿入長を調整し,各伝送線路アンテナ素子を等振幅・等位相で励振した。3.解析結果の検証:伝送線路アレーアンテナの放射特性を,マイクロ波測定器を用いて測定した。アンテナ給電線路の入力端において電圧定在波比1.3が得られ,アンテナの近傍界測定から、各伝送線路アンテナ素子が等振幅・等位相で励振されていることを確認した。軸比と利得の周波数特性から,周波数帯域3%にわたって3dB以下の軸比と30dBの利得の得られることを実証した。
マルチスペクトル画像のバンド間差分とウェーブレット変換を用いる情報圧縮

TMセンサによる6バンドのリモートセンシング画像の無損失情報圧縮を次の二方法により研究した。テスト画像として石川県小松空港周辺ならびに畑地、山林の画像を用いた。第1法:まず、各バンド内相関除去のため、各画素を周辺画素により2次元可逆予測符号化した。画像のエントロピーは平均25%減少した。次に各バンドの予測誤差画面間の相関除去のため、最短波長バンドと隣のバンドの同一位置画素を2点ウェーブレット変換(WLT)し、高周波信号は伝送、低周波信号は隣の長周波バンドと2点変換という風に全バンドを変換し、最後の低周波信号は伝送する。これにより平均0.11bppエントロピーが減少した。第2法:まず、各バンド画面を2階層可逆WLTし、それぞれ7つのサブバンドを得た。次に6枚の変換画面について、同一のサブバンドごとに、同一位置のサブバンド信号を6点カルーネンレーベ変換(KLT)し、変換係数を整数化すると、3種の画像とも0.3bpp程度エントロピーが減少した。これは非可逆変換であるが、可逆変換の参考にする。次にKLT行列より可逆KL変換式を求めるさい、35個の可逆KLT係数により36個のKLT係数を近似する。KLT行列の主対角要素の絶対値が大きくなるように行を並べ換え、かつ主対角の最下行要素以外の行列要素をすべて可逆KLT係数により正確に実現すると、最良近似となることを見出した。次に分散の大きい階層2の固有画面を8×8のブロックに分け、それらを分散の大きさにより8クラスに分け、エントロピーを平均0.2bpp減少させた。他に元画面および最低周波サブバンド画面の局所状況適応予測符号化法として、画素をその近傍の画素値の勾配により勾配変数平面上のセルに分類し、セルをさらに画素のブロックに分割し、ブロック毎に16種の予測式から最小自乗誤差式を選択する方法を開発した。TMセンサによる6バンドのリモートセンシング画像の無損失(可逆)情報圧縮を次の二方法により研究した。テスト画像として石川県小松空港周辺の画像を用いた。第1法:まず各バンド内の相関を除去するため、左、上、右上画素を用いる2次元可逆予測符号化を行なった。その結果、画像のエントロピーは平均4.826bppから3.601bppに減少した。各バンドの予測誤差画面を比較すると同一位置にエッジが現れていた。この相関を除去するため種種検討した結果、最短波長バンドと次のバンドの同一位置画素を2点ウェーブレット変換し、高周波信号を伝送、低周波信号は隣の長周波バンドと2点変換という風に全バンドを変換し、最後の低周波信号は伝送する。第2法:各バンド内の相関を除去するため、2階層可逆(整数入力、整数出力)ウェーブレット変換し、それぞれ7つのサブバンドを得た.変換式は小松らの方式6を用いた。次に各変換画面からの同一のサブバンド画面について6点カルーネンレーベ変換を行ない、6個の固有画面を形成した。変換行列をサイド情報として送らねばならないが、それは1画素あたり0.007bPPと少ない。変換係数を整数化したとき、エントロピー3.241bppを得た。今後整数の変換係数を与える可逆的カルーネンレーベ変換を開発する必要がある。また高周波サブバンド固有画面をベクトル量子化、ランレングス符号化により情報圧縮することが残されている。TMセンサによる6バンドのリモートセンシング画像の無損失情報圧縮を平成10年度に引き続き研究した。

テスト画像として石川県小松空港周辺ならびに畑地、山林の画像を用いた。まず、各バンド画面を2階層可逆ウェーブレット変換し、それぞれ7つのサブバンドを得た。次に6枚の変換画面について、同一のサブバンドごとに、同一位置のサブバンド信号の6点カルーネンレーベ変換(KLT)を行ない、変換係数を整数化し、固有画面ごとにエントロピーを求め、総和を取ると、3種の画像とも0.3bpp程度エントロピーが減少した。これは非可逆変換であるが、可逆変換の参考にする。次にKLT行列より可逆KL変換式を求めるさい、35個の可逆KLT係数により36個のKLT係数を近似しなければならない。KLT行列の主対角要素の絶対値が大きくなるように行を並べ換え、かつ主対角の最下行要素以外の行列要素をすべて可逆KLT係数により正確に実現すると、最良近似となることを見出した。次に分散の大きい階層2の固有画面を8×8のブロックに分け、それらを分解の大きさにより8クラスに分け、エントロピーを平均0.2bpp減少させた。他に最低周派サブバンド画面の局所状況適応、無損失予測符号化法を2種開発した。弟1法は画素をその近傍の画素値の勾配により勾配変数平面上の37個のセルに分類し、セルをさらに256画素のブロックに分割し、ブロック毎に16種の予測式から最小自乗予測誤差を与える式を選択する方法である。弟2法は画面を8×8のブロックに分割し、それぞれに対し30種の予測式から最小自乗予測誤差を与える式を選択し、式によりブロックをクラス分けする。次にクラス毎に、予測式をウイーナ・ホッフ法で最適化する。最後にブロックを予測誤差の分散の大きさによりクラス分けし、クラス毎にエントロピー符号化する方法である。
逆運動学・発熱荷電交換反応による不安定核のスピン応答

不安定核ビーム(^(12)Be)を用い、従来不可能であった逆運動学による発熱型(p,n)型荷電交換反応測定を世界で最初に遂行し、中性子過剰な不安定核のスピン応答研究を進めた。特に、(1)中性子過剰核^(12)Beを標的とするガモフ・テラー(GT)巨大共鳴の測定と遷移強度の導出、(2)低励起に現れるスピン・ダイポール共鳴測定による閉殻構造の破れの検証、に関する結果を得た。より中性子過剰核である8Heについてもデータを取得することができた。不安定核ビーム(^<12>Be)を用い、従来不可能であった逆運動学による発熱型(p,n)型荷電交換反応測定を遂行し、中性子過剰な不安定核のスピン応答の研究を推進する。特に、以下の二つ(1)中性子過剰核^<12>Beを標的とするガモフ・テラー(GT)巨大共鳴の測定と遷移強度の導出、(2)低励起に現れるスピン・ダイポール共鳴測定による閉殻構造の破れの検証、に焦点を絞り研究を進める。実験は、理研RIビームファクトリー(RIBF)施設に我々が特別推進研究で建設した高分解能磁気分析装置(SHARAQ)に、大立体角低エネルギー中性子検出アレーを建設・設置し遂行する。本研究の目標は、逆運動学を使った新たな核分光学的手段を開発することである。本年度は1.実験の全体計画を詳細に詰め、理研RIBFに実験プロポーザルを提案した。優先度Aで提案した実験は受理され平成23年度中に目的とする実験が実現できることとなった。2.中性子検出器アレイの検討を進め、30台のプラスチックシンチレータを標的の左右に配置(合計60台)できるように設計した。検出器としての基本性能テストを行った。3.低エネルギー中性子検出用の専用散乱槽ならびに液体水素標的の設計を進めた。4.不安定核ビームに起因する実験上の問題点、例えば中性子のバックグランドなどを検討するために、不安定核^<56>Niビームによる吸熱型(p,n)型荷電交換反応測定の測定を、研究協力者(R.Zegersと笹野匡紀)と米国ミシガン州立大学国立超電導サイクロトロン研究所に於いて遂行した。現在データ解析中ではあるが、中性子のバックグランドは問題にならないことが明らかになった。今年度は1.実験実施上最も中心となる検出器である、60台のプラスチックシンチレータによる中性子検出器アレイ(WINDS)を組み上げ、検出器としての基本性能を確認した。2.不安定核(^<12>Be)ビームが利用できる理化学研究所仁科加速器研究センター(RIBF)に於いて計画した実験、^1H(^<12>Be,n)^<42>B反応測定をSHARAQ電磁スペクトロメータとWINDSを使い遂行した。尚、不安定核^<12>Beビームのエネルギーは200MeV/u、標的は液体水素である。3.計画した測定ができ、世界初の不安定核についてのスピン・アイソスピン応答を求めることができた。4.現在、詳細なデータ解析中であるが、実験中のオンライン解析で、すでにGT巨大共鳴が観測され、二山に分離していることが明らかになった。一方、不思議なことに、強度の強いスピン・ダイポール共鳴は発見できなかった。5.これに先駆け、実験技術習得のために、不安定核^<56>Niビームによる吸熱型(p,n)型荷電交換反応測定の測定を、研究協力者(R.Zegersと笹野匡紀)と米国国立超電導サイクロトロン研究所(NSCL)に於いて遂行した。この結果は、国際学術誌Phys.Rev.Lett.に掲載された。不安定核ビーム(12Be)を用い、従来不可能であった逆運動学による発熱型(p,n)型荷電交換反応測定を遂行し、中性子過剰な不安定核のスピン応答の研究を推進する。特に、以下の二つ(1)中性子過剰核12Beを標的とするガモフ・テラー(GT)巨大共鳴の測定と遷移強度の導出、(2)低励起に現れるスピン・ダイポール共鳴測定による閉殻構造の破れの検証に焦点を絞り研究を進める。今年度は1.理化学研究所仁科加速器研究センター(RIBF)に於いて、不安定核(12Be)ビームによる、1H(12Be,n)12B反応測定をSHARAQ電磁スペクトロメータとWINDSを使い遂行した。

詳細なデータ解析中であるが、大ざっぱな解析から、すでにGT巨大共鳴が観測され、二山に分離していることが明らかになった。一方、不思議なことに、強度の強いスピン・ダイポール共鳴は発見できなかった。2.定量的解析に若干時間を要しているが、計画した測定が完了し、世界初の不安定核についてのスピン・アイソスピン応答を求めることができた。3.これに先駆け、実験技術習得のために、不安定核56Niビームによる吸熱型(p,n)型荷電交換反応測定の測定を、研究協力者(R. Zegersと笹野匡紀)と米国国立超電導サイクロトロン研究所(NSCL)に於いて遂行した。この結果は、昨年は国際学術誌Phys. Rev. Lett.にそして今年度は本論文がPhys. Rev.Cに掲載された。理論で予測されていない、GT巨大共鳴の二山分離や、高強度スピン・ダイポール共鳴が観測されないなど、予想外の発見があり、大きな成果が上がったため。24年度が最終年度であるため、記入しない。詳細な解析を進め、論文として出版するのが、来年度の目標である。
ヒト歯根膜DNAチップを用いた根尖性歯周炎の遺伝子病態解析

1)ヒト歯根膜DNAチップの作製当研究室において単離・同定して冷凍保存されているヒト歯根膜組織3'末端cDNAライブラリの遺伝子クローン約1500個を、pUC119ライブラリベクター特異的プライマーを用いたPCR法にて遺伝子増幅を行った。これらPCR増幅cDNAを、マイクロアレイスポッターにてガラススライド上に高密度固定し、ヒト歯根膜組織由来の約1500個の遺伝子が固定化されたヒト歯根膜DNAチップ(PerioGen Chip)を作製した。炎症性サイトカインであるIL-1β、また歯周組織の修復・再生に関与しているFGF-2で培養ヒト歯根膜細胞の刺激実験を行い、in vitroで根尖性歯周炎の炎症期および創傷治癒期を再現した場合の遺伝子発現を解析した。FCS不含α-MEM培地にて24時間培養後、IL-1β(100ng/ml)あるいはFGF-2(100ng/ml)で刺激を行い、刺激12時間、24時間、48時間でそれぞれRNAを抽出した。蛍光色素にてサンプルを標識し、PerioGen Chipにて遺伝子発現解析を行った。その結果、IL-1βおよびFGF-2ともに、刺激24時間において著明な発現上昇を示す遺伝子群が検出された。次に、ヒト歯根膜DNAチップの根尖性歯周炎病態診断へ応用に向けたin vivoでの遺伝子発現解析を試みた。歯周外科手術時に採取した歯肉組織と培養歯肉線維芽細胞とにおける遺伝子発現をPerioGen Chipを用いて解析した。その結果、患者からの歯周組織で高い発現を示す遺伝子としてイムノグロブリン遺伝子やケモカイン遺伝子等の免疫担当細胞に特徴的な遺伝子が検出され、炎症組織での遺伝子発現解析の可能性が示された。そして、これらPCR増幅cDNAをマイクロアレイポッターにて、ガラススライド上に高密度固定し、ヒト歯根膜組織由来の約1500個の遺伝子が固定化されたヒト歯根膜DNAチップ(PerioGen Chip)を作製した。培養ヒト歯根膜細胞の培養系に炎症性サイトカインを添加し、歯根膜細胞を刺激した際の経時的な遺伝子発現変化をPerioGen Chipを用いて解析した。ヒト歯根膜細胞をIL-1あるいはTNF-αで48時間刺激し、細胞を回収しRNAを抽出した。サンプルRNAをCy3蛍光色素にて、無刺激の歯根膜細胞からのRNAをCy5蛍光色素にて逆転写反応時に標識した。これら標識試料をPerioGen Chipにハイブリダイズした。余剰の標識試料を洗浄除去した後、アレイディテクターにてPerioGen Chipの各遺伝子スポットの発光強度を検出し、コンピュータ解析した。その結果、炎症性サイトカイン刺激でその発現量が上昇あるいは下降する遺伝子群が同定された。現在、これら変化を示した遺伝子群の解析を進めている。
細胞社会における細胞死制御機構としてのギャップ結合コミュニケーションの研究

ギャップ結合細胞間コミュニケーションが、多数の細胞から構成される細胞社会において、どのように細胞死に関与するかは不明である。本研究では、ギャップ結合の細胞死における役割を解明するため、細胞死の代表であるアポトーシスとネクローシスにおける、ギャップ結合細胞間コミュニケーションについての解析を行った。1.紫外線誘導アポトーシス過程でのギャップ結合プラークの局在変化ギャップ結合プラークの局在を生きた細胞で可視化するために、コネキシン43(Cx43)と蛍光蛋白質EGFPとの融合遺伝子をHeLa細胞に導入して得られた細胞株Cx43-EGFPHeLa細胞を用いた。180mJ/cm^2の紫外線(254nm)をCx43-EGFPHeLa細胞に照射した。紫外線照射後2時間のアポトーシス初期では、約1/3の細胞がミトコンドリア膜電位の喪失を示したが、これらの細胞間にも、線状の長いCx43-EGFPギャップ結合プラークが存在していることを確認した。アポトーシスが進行した紫外線照射後4時間では、ミトコンドリア膜電位喪失細胞が増加し、ギャップ結合プラークが断片化し、びまん性の細胞質への局在に変化した。核の断片化を示しアポトーシス後期(紫外線照射後8時間)では、Cx43-EGFPの細胞質の局在も減少していた。以上の結果より、ギャップ結合プラークの断片化と細胞質への局在の変化が、アポトーシス過程の中期に起こることを明かにした。2.ネクローシス過程における細胞死の拡大心房筋の性格を有する細胞株HL-1細胞にミトコンドリア機能阻害剤であるrotenoneを投与し、その後正常な培地に戻すことによって、一時的なエネルギー欠乏に依るネクローシスを誘導した。ネクローシスの解析は、LIVE/DEAD viability/Cytotoxicityキット(Molecular Probe社)を用いた。rotenone(5μM)を2時間投与し、その後3時間正常な培地に戻すことによって、細胞が十数個の集団を作ってネクローシスに陥る像が確認された。この結果に基づいて、ギャップ結合細胞間コミュニケーションが、細胞集団でのネクローシス誘導に関わっているという仮説を提唱したい。本研究では、ギャップ結合の細胞死における役割を解明するための基礎データとして、細胞死の代表のひとつである紫外線で誘導されるアポトーシスの過程で、ギャップ結合蛋白質コネキシンがどのような局在の変化を起こすかを解析した。コネキシンの局在を生きた細胞で可視化するために、コネキシン43(Cx43)と蛍光蛋白質EGFPとの融合遺伝子をHeLa細胞に導入して得られた細胞株Cx43-EGFPHeLa細胞を用いた。254nmの紫外線を180mJ/cm^2の強さで細胞に照射した。アポトーシス初期の指標として、ミトコンドリア膜電位の喪失を可視化するため、tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE)を用いた。一方、アポトーシス後期の指標として、核の断片化をHoechst 33342による染色で解析した。紫外線照射後2時間では、約1/3の細胞がTMRE陰性でミトコンドリア膜電位の喪失を示したが、これらの細胞間にも、TMRE陽性細胞間と同様に、線状の長いCx43-EGFPギャップ結合プラークが存在していた。

紫外線照射後4時間では、TMRE陰性のミトコンドリア膜電位喪失細胞が増加し、それらの細胞ではCx43-EGFPギャップ結合プラークが断片化し、びまん性な細胞質への局在が目立った。紫外線照射後8時間では、TMRE陰性のミトコンドリア膜電位喪失細胞が核の断片化を示し、Cx43-EGFPの細胞質の局在も減少していた。細胞をCaspase阻害剤であるZ-VAD-FMKで処理することによって、ミトコンドリア膜電位の喪失や核の断片化だけでなく、Cx43-EGFPギャップ結合プラークの断片化も部分的に抑制された。以上の結果より、紫外線で誘導されるアポトーシスの過程で、ギャップ結合プラークの断片化と細胞質への局在の変化が、ミトコンドリア膜電位の喪失よりも後で、しかし核の断片化より先行して、起こることを明かにした。さらに、これらのアポトーシスにおける変化に、caspaseが関与していることが示唆された。ギャップ結合細胞間コミュニケーションが、多数の細胞から構成される細胞社会において、どのように細胞死に関与するかは不明である。本研究では、ギャップ結合の細胞死における役割を解明するため、細胞死の代表であるアポトーシスとネクローシスにおける、ギャップ結合細胞間コミュニケーションについての解析を行った。1.紫外線誘導アポトーシス過程でのギャップ結合プラークの局在変化ギャップ結合プラークの局在を生きた細胞で可視化するために、コネキシン43(Cx43)と蛍光蛋白質EGFPとの融合遺伝子をHeLa細胞に導入して得られた細胞株Cx43-EGFPHeLa細胞を用いた。180mJ/cm^2の紫外線(254nm)をCx43-EGFPHeLa細胞細胞に照射した。紫外線照射後2時間のアポトーシス初期では、約1/3の細胞がミトコンドリア膜電位の喪失を示したが、これらの細胞間にも、線状の長いCx43-EGFPギャップ結合プラークが存在していることを確認した。アポトーシスが進行した紫外線照射後4時間では、ミトコンドリア膜電位喪失細胞が増加し、ギャップ結合プラークが断片化し、びまん性の細胞質への局在に変化した。核の断片化を示しアポトーシス後期(紫外線照射後8時間)では、Cx43-EGFPの細胞質の局在も減少していた。以上の結果より、ギャップ結合プラークの断片化と細胞質への局在の変化が、アポトーシス過程の中期に起こることを明かにした。2.ネクローシス過程における細胞死の拡大心房筋の性格を有する細胞株HL-1細胞にミトコンドリア機能阻害剤であるrotenoneを投与し、その後正常な培地に戻すことによって、一時的なエネルギー欠乏に依るネクローシスを誘導した。ネクローシスの解析は、LIVE/DEAD viability/Cytotoxicityキット(Molecular Probe社)を用いた。rotenone(5μM)を2時間投与し、その後3時間正常な培地に戻すことによって、細胞が十数個の集団を作ってネクローシスに陥る像が確認された。
真社会性昆虫の個体群統計学的研究

昆虫の真社会性進化の研究は殆ど行動学的ないし遺伝学的研究に限られており、進化を許した生態的条件の研究は極めて少ない。本研究では伊藤が蓄積してきたデータと初年度に集めたデータを個体群統計学的手法で解析し、不妊カストの産出条件や多女王制成立の条件を解明することをめざした。本年度の結果は次の通りである。1.オキナワチビアシナガバチの多女王制成立の個体群統計学的条件(1)沖縄本島で6年間調べた創設雌数、巣の生存率・再建率、次世代繁殖雌を出せた巣の数などの全データを整理・解析した。その結果、巣は捕食や台風により高率で失敗するが本種は巣の再建能力が高く、これを考慮すると50%近くの巣が次世代を産出でき、その結果創設巣数は毎年安定していることがわかった。(2)個体マークした創設雌の殆ど全ては8月末までに死亡した。次世代繁殖雌の大部分はこのあとで生まれるので、本種は事実上2化性であることが初めて判明した。(3)沖縄本島では本種の約50%の巣が多雌創設され、創設雌数が多いほど、巣の生存率、再建率が上昇すること、多雌創設巣は働きバチを早く羽化させること、また同種他個体による巣の乗っ取りを避けられることが判明した。これらが本種の多雌創設性および1巣で複数の雌が繁殖に加わる性質の進化と維持に関係していると考えられた。(4)以上の結果について英文論文を作成中で、表は完成した。この表を見て意見をいってもらうため、中間報告書を印刷し、国内外の間連研究者に送付した。2.真社会性アブラムシの不妊カスト率と個体群統計学的条件沖縄県および鹿児島県下のタケツノアブラムシの調査を実施し、従来のデータとあわせて解析を開始し、論文執筆を開始した。次世代繁殖雌の大部分はこのあとで産まれるので、本種は事実上2化性であることが初めて判明した。この表を見て意見をいってもらうため、中間報告書を印刷し、國内外の関連研究者に送付した。2.真社会性アブラムシの不妊カスト率と個体群統計学的条件