hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マンガン増感MRIを用いた放射線照射による腫瘍細胞変性評価

放射線照射後の腫瘍細胞の変性をIn-vivoで早期に、また非侵襲的に評価をする手法を確立することを目的とした。X線照射腫瘍細胞のMn^<2+>の取り込みは非照射細胞に比べ減少し、G2期での細胞周期の停止が確認された。腫瘍細胞の生存度、細胞周期の変化、細胞増殖能とMn^<2+>の取り込みの相関が示唆され、マンガン造影MRIは放射線治療後の腫瘍細胞の生体内評価に有用と考えられた。放射線照射後の腫瘍細胞の変性をIn-vivoで早期に、また非侵襲的に評価をする手法を確立することを目的に実験を行った。放射線照射後24時間後の腫瘍細胞において、Mn^<2+>の取り込みが細胞の生存能、細胞周期の変化と相関するか、マンガン造影MRI、各種免疫染色を用いて検討した。Colon26細胞にX線20Gyを照射し、フローサイトメトリーによりアポトーシスおよび細胞周期の評価を行った。照射24時間後の細胞にて、MnCl_2含有培養液の下で30分間培養し、7T-MRIにおいてT_1値計測によりMn^<2+>の取り込みを評価した。マウスの両腰部に腫瘍細胞を皮下移植し7日間増殖させ、左側腫瘍にX線20Gy照射を行い、24時間後にGd-DTPAおよびマンガン造影MRIを用いて評価した。MRI撮影後、以下の4種類の免疫染色を行った(Laminin,Cyclin-D1,Activated Caspase-3,Ki-67)。X線照射腫瘍細胞のMn^<2+>の取り込みは非照射細胞に比べ減少し、アポトーシスの増加、G2期での細胞周期の停止が確認された。担がんマウスにおいて、放射線照射後3日目からX線照射側腫瘍の成長の有意な減少が観察された。Gd-DTPAの取り込みは照射群および非照射群では有意な差が確認できなかった。また、Laminin染色において、腫瘍細胞の血管内皮細胞の照射群および非照射群では有意な差が確認できなかった。放射線照射24時間においては、血管内皮の変化は示唆されなかった。一方、X線照射24時間後において照射側腫瘍でのMn^<2+>の取り込みは、非照射側に比べ減少した。Activated caspase-3によるアポトーシスの評価では有意な差は確認できなかったが、放射線照射腫瘍におけるKi-67陽性細胞およびCyclin-D1陽性細胞密度の有意な減少が確認された。照射24時間後の細胞にて、MnCl2含有培養液の下で30分間培養し、7T-MRIにおいてT_1値計測によりMn^<2+>の取り込みを評価した。MRI撮影後、以下の4種類の免疫染色を行った(Laminin, Cyclin-D1, Activated Caspase-3, Ki-67)。Activatedcaspase-3によるアポトーシスの評価では有意な差は確認できなかったが、放射線照射腫瘍におけるKi-67陽性細胞およびCyclin-D1陽性細胞密度の有意な減少が確認された。
動物モデルによる多動・学習障害のメカニズムを探る生理心理学的研究

本研究は,Tsukuba情動系ラットの中で特に低情動系(L系)ラットの多動性に注目し,これらのラットの一般活動性や様々な学習習得過程を詳細に観察することにより,L系ラットの多動・学習障害動物モデルとしての妥当性を検討すると同時に,これらの障害発生メカニズムを明らかにすることを目的とした.その結果,L系ラットは作業記憶を必要とする8方向放射状迷路を用いた空間学習課題において明瞭な空間学習障害を示すことが明らかとなった.また,L系ラットの多動性に伴い特異な概日リズムが観察され,L系ラットの多動・学習障害モデルの妥当性が確認された.そこで,空間記憶にとって重要な海馬を中心とした形態学的検索を行った結果,海馬全体に対する吻側部背側海馬の容積比がL系ラットで有意に減少しており,特に,歯状回容積比が他のラットと比べて有意に減少していることが判明した.さらに,L系ラットの空間学習成績と歯状回容積比との間に負の相関傾向が認められた.従って,空間学習障害の背景に,背側海馬歯状回の形態学的変容が示唆された.本研究は,Tsukuba情動系ラットの中で特に低情動系(L系)ラットの多動性に注目し,これらのラットの一般活動性や様々な学習習得過程を詳細に観察することにより,L系ラットの多動・学習障害動物モデルとしての妥当性を検討すると同時に,これらの障害発生メカニズムを明らかにすることを目的とした.その結果,L系ラットは作業記憶を必要とする8方向放射状迷路を用いた空間学習課題において明瞭な空間学習障害を示すことが明らかとなった.また,L系ラットの多動性に伴い特異な概日リズムが観察され,L系ラットの多動・学習障害モデルの妥当性が確認された.そこで,空間記憶にとって重要な海馬を中心とした形態学的検索を行った結果,海馬全体に対する吻側部背側海馬の容積比がL系ラットで有意に減少しており,特に,歯状回容積比が他のラットと比べて有意に減少していることが判明した.さらに,L系ラットの空間学習成績と歯状回容積比との間に負の相関傾向が認められた.従って,空間学習障害の背景に,背側海馬歯状回の形態学的変容が示唆された.本研究は、Tsukuba高情動系(H系)及び低情動系(L系)ラットを用いて、多動・学習障害のメカニズムを明らかにすることを目的としている。本年度はこれらのラットの種々の学習習得過程の実態を明らかにすることを目的とした。得られた結果をまとめると、まず、T迷路による白黒弁別学習課題において、L系ラットはH系ラットに比べて学習基準(連続3試行正反応)に達するまでの試行数が有意に延長することが明らかとなった。さらに、作業記憶と参照記憶を必要とする8方向放射状迷路課題においても、L系ラットは同様に学習基準(8連続正選択ないしは12選択以内で7連続正選択が3試行連続)達成までの試行数が有意に延長する結果が得られた。これらのことから、L系ラットは弁別能力や空間記憶能力を要する学習に対して明瞭な障害を呈することが判明した。しかし、空間記憶能力に関しては、作業記憶か参照記憶のどちらの記憶障害が主な原因であるかについては明らかではない。そこで、次に、参照記憶のみを必要とするモーリス水迷路学習課題を行ったところ、場所学習時及びプローベテスト時(プラットホームを取り除いた試行)において、L系ラットは、水泳逃避潜時が短く、基礎集団である雑種のWistar系ラットと比較しても有意差は全く認められなかった。従って、8方向放射状迷路課題で観察されたL系ラットの空間学習障害は作業記憶障害が主な原因であることが明らかとなった。一方、水迷路課題において、H系ラットはWistar系やL系ラットと比べて水泳逃避潜時が有意に長く、参照記憶障害を思わせる結果を示した。しかし、H系ラットの結果は、高い情動反応性のため水の嫌悪刺激に対するストレスによる二次的影響の可能性が考えられ、今後、水迷路以外の装置を用いてH系ラットの参照記憶能力を厳密に測定することが必要である。本年度は、Tsukuba低情動系(L系)ラットの一般活動性と日内活動量を詳細に観察し、Tsukuba高情動系(H系)ラット及び雑種のWistar系(W系)ラットの行動量と比較検討することによって、多動性障害の動態を明らかにすることを目的とした。具体的には、まず、一般活動性は、オープンフィールド(80cm×80cm;20cm×20cmの区画)内での5分間の区画通過数や移動距離の他に、立ち上がり回数、洗顔・毛づくろい回数、脱糞・脱尿回数を測定した。その結果、L系ラットの活動量(区画通過数と移動距離)はH系ラットに比べて有意に多く(約5倍以上)、しかも若齢(30日齢)群でその傾向が特に強いことが明らかとなった。次に、今回計上した回転式運動量測定装置(KN-78)を用いて、1日の活動量を2時間毎に測定し、30日間継続して観察した。その結果、H系ラットは、統制群である雑種のW系ラットの活動パターンとほぼ同様であったのに対して、L系ラットは、H系やW系ラットとは明らかに異なる活動パターンを示した。すなわち、L系ラットは実験開始から徐々に活動量が増加し、活動ピークに達するまでに期間が有意に延長し、最終的な総活動量はH系ラットより約4倍、W系ラットより約3倍に達していた。

また、暗期での活動ピークが、W系やH系ラットでは、暗期の各時間帯に分布しているのに対して、L系ラットでは暗期直後の2時間(20時22時)に活動ピークが集中する傾向が認められた。さらに、ほぼ毎日、暗期に移行する2時間前の明期(18時20時)から活動が増加することがすべてのL系ラットで観察された。これらの結果から、L系ラットの多動性と同時に特異な概日リズムの証拠が得られた。今後は、これらのL系ラットの概日リズムの特異性を明らかにするために、脳内中枢と言われている視交叉上核の構造的変化と同時に、恒暗条件下での光刺激に対する概日リズムの位相反応などを検討する必要がある。本年度は,Tsukuba情動系ラットの中で,特に,Tsukuba低情動系(L系)ラットの空間学習障害と脳内,特に海馬内の形態学的変容過程との関連を調べ,さらに,飼育環境条件により,空間学習や海馬の神経構造にどのような影響が見られるかを検討した.その結果,まず,豊環境飼育条件でのTsukuba低情動系ラット(RL群)の空間学習成立までの試行数が,標準環境で飼育されたTsukuba低情動系ラット(SL群)と比較して有意に減少し,飼育環境条件により明瞭な学習改善効果が認められた.そこで,これらのラットの海馬の形態学的検索を行った結果,海馬全体に対する吻側部背側海馬の容積比がSL群で有意に減少していることが認められ,特に,SL群の歯状回容積比が他の群と比べて有意に減少していることが明らかとなった.さらに,L系群(RL群とSL群)の空間学習基準達成までの試行数と歯状回容積比との間に負の相関傾向が認められた.以上のことから,SL群で見られた空間学習障害やRL群での学習改善効果の背景には海馬歯状回を中心とした神経ネットワークが重要な役割を果たしていることが示唆された.
集団生活における個体間相互作用の差が幼生の発達と社会的選好性に及ぼす影響について

本研究は「集団生活における個体間相互作用の差が幼生の発達と社会的選好性に及ぼす影響について」明らかにするために,生活史の異なる両生類2種(Rana ornativentirsとBufo japonicus)を用いて実証的に検証する.個体群密度と遺伝的多様性に違いを設けることにより種内関係を変化させ,同時に他種の有無により種間関係も調整し,個体間相互作用の差を与えた実験グループ間で個体の発達(発生速度とサイズ)および社会的選好性(血縁・種認識)を比較する.本研究は,「集団レベル」と「個体レベル」を統合的に扱った独創的の高い行動生態学の研究である.本研究は「集団生活における個体間相互作用の差が幼生の発達と社会的選好性に及ぼす影響について」明らかにするために,生活史の異なる両生類2種(Rana ornativentirsとBufo japonicus)を用いて実証的に検証する.個体群密度と遺伝的多様性に違いを設けることにより種内関係を変化させ,同時に他種の有無により種間関係も調整し,個体間相互作用の差を与えた実験グループ間で個体の発達(発生速度とサイズ)および社会的選好性(血縁・種認識)を比較する.本研究は,「集団レベル」と「個体レベル」を統合的に扱った独創的の高い行動生態学の研究である.
難聴モデル動物の病態解明を志向した内耳ナノ振動の新規計測プラットフォームの構築

単一の赤外光を使うレーザ振動計は、一点に対し高精度の振動計測ができる。市販されている一般のレーザドップラー振動計は高価なため、本研究では経費節約の目的で全く普及していないSinusoidal Phase Modulating法(SPM法)を活用した。この方法は、Khannaらが標本の「交流的な振動の振幅」を定量する方法として記述している。一方で、Sasakiらは、「直流的な位置ずれ」の計測法として報告している。任と太田は、崔と共にアルゴリズムを開発し、振動の「振幅」と振動中心の「位置ずれ」を同時にリアルタイム測定できる“Dual SPM法"を創出した。位置ずれは、市販品では捉えられないパラメータである。振動振幅および振動中心の位置ずれの度合いをあらかじめ既知とするピエゾ素子を用いて動作確認を行った。40 pmの振動振幅限界を確認すると共に、位置ずれ最小値約1 nmを達成した。今後はこの装置を用いて、計画通り動物実験を行なっていく。計画書通り、新規レーザー微小振動計測装置の開発を終え、さらに無生物(ピエゾ)を用いてその動作を確認できた。当初の計画通り、装置の動物実験への最適化を進める。対象は正常マウスを用いる。
活動制限に伴う骨格筋リボソーム量の減少は、廃用性筋萎縮の原因となりうるか？

怪我や疾患による身体活動量の低下により骨格筋は萎縮(廃用性筋萎縮)する。しかし、その詳細なメカニズムは未だ不明な点が多い。本研究では、このメカニズムに対して、筋量を正に制御する筋タンパク質合成に影響を与えるリボソームの量の変化が関与している可能性を考え、これらに着目して検討を行うことで廃用性筋萎縮メカニズムを解明する。
液体ヘリウム中での結晶成長メカニズムに於ける巨視的量子トンネリング機構の発現

本年度は現有の希釈冷凍機の改造増強から着手した。本機は以前に研究グループ内で自作した物であり老朽化に伴い数々の問題点が露見していたので、問題部分の取り替え改良などを行い今後の使用に耐えうる物にした。それに伴い超低温度用温度測定装置や温度制御回路を新たに自作した。これらの改良の結果希釈冷凍機は本研究を行うのに十分な性能(最低温度30mK以下冷凍力20μW@100mK)を保持するようになった。これに引き続き実験の鍵となる高感度圧力計(分解能1Pa@3MPa)および余分な容積を排除した試料容器を作成した。固体ヘリウム生成のための仕掛けとして先端の曲率半径を0.1μm程度に尖らせたタングステン針を用意し1000Vまでの高電圧をかける用意をした。これらの用意をして行った実験では以下のことが確かめられた。1.4Kで試料容器に閉じこめた液体ヘリウムを温度制御しながらゆっくり冷やしていくことにより1.0Kで臨界圧力2.5MPaより数KPa高い圧力の液体ヘリウムを準安定状態として数十分にわたって保持することに成功した。このとき希釈冷凍機内の温度分布によって試料の圧力が大きく影響を受け試料室近辺のみならず冷凍機の各部分の温度まで制御しなければ安定に保持できないことがわかった。この準安定状態の液体ヘリウムに対して針状電極の回りに与えた強電界による選択的な固体ヘリウムの生成を試みたところ、残念ながらほとんどの場合が予期していない場所からの偶発的な生成により安定状態である固液共存状態へと移行してしまった。針の形状と電圧より推定される電界強度は過去の知見からも十分な強度であり、なぜ電界による固体の生成がうまく起こらないのか原因を探っているところである。現在は形状を変えた針や別構造の強電界発生装置などを使って原因を探っているところである。また冷凍機内の温度分布の影響を排除するため試料室入り口へのコールドバルブの設置を検討している。
大腸菌の産生する遺伝子組換え蛋白(RecA)による遺伝子治療法の開発

遺伝子組み替えに関与するRecA(大腸菌由来)と、強い核指向性を持つSV40 large Tantigenのnuclear location signalを融合させた合成酵素(RecA-T)の構造遺伝子を作製した。この融合構造遺伝子を導入したRecA(-)大腸菌は、導入前に比し、紫外線への抵抗力が増加していることが確かめられた。したがって、RecA-Tが、本来の活性を保持しているものと考えられたので、この合成酵素の大量生成を試みた。今回、RecA-T遺伝子の構築に使用したベクターpMAL-c2は、マルトース結合蛋白をコードしており、RecA-Tの構造遺伝子を、マルトース結合蛋白構造遺伝子の直下に挿入し、両者の融合蛋白が産生されるようにした。1lの培養液から、大腸菌を回収し、超音波処理後、細胞残渣を遠心除去し、上清をアミロースレジンで精製して、約20mgの融合蛋白を得た。この融合蛋白をFactor Xaで処理し、マルトース結合蛋白と、RecA-Tに分解した。こうして得られたRecA-Tの、一本鎖DNA結合能とDNA鎖交換能を検討するため、n-H-ras遺伝子の第一エクソンをPCRで増幅し(この際、片方のプライマーをリン酸化しておく)この一部をlambdaエクソヌクレアーゼで処理して、一本鎖DNAを作製した。まず、精製RecA-Tを、一本鎖DNA溶液中に加え、一定時間のインキュベート後、gammaS-ATPを添加して一本鎖-RecA-T結合物を安定化した。続いてlambdaエクソヌクレアーゼ処理をしていないPCR産物(一本鎖DNAと相同な二本鎖DNAということになる)を加え、さらにインキュベートした。この反応物を、PCR産物と共にアガロースゲル電気泳動し、泳動度の差を観察した。この結果、得られたRecA-Tの活性が非常に低いことが判明した。この原因として、大腸菌を破壊する際に用いた界面活性剤、あるいはFactor Xaによる長時間のインキュベートなどによって、RecA-Tが不活化された可能性が考えられた。現在、使用する界面活性剤の検討(不使用を含む)、低温でのFactor Xa処理、あるいは、Factor Xaを使用する必要が無いベクターの検討などを同時に進行させている。
Slow Breathing Exerciseは副交感神経活動リザーブを高めるか

本研究は、深くゆっくりとした呼吸活動を毎日繰り返して実施する方法「Slow Breathing Exercise:SBE」が副交感神経活動リザーブを高めるかどうかを明らかにすることを目的に、若年健常男性と慢性疾患患者を対象に自律神経活動指標と循環動態指標を用いて検討した。その結果、若年健常男性においては十分にSBEを実施することでSBE実施後は副交感神経活動リザーブが高まり、末梢循環が促進される可能性を認めた。慢性疾患患者においては実施率以外の要因も関連することを認めたため、今後SBEのさらなる検討の必要性が明らかになった。本研究の目的は深くゆっくりとした呼吸活動を毎日繰り返して実施する方法「Slow Breathing Exercise:SBE」が副交感神経活動リザーブを高めるかを明らかにすることである。研究実施計画は、はじめに若年健常男性を対象とした基礎的研究として、SBEの継続効果を自律神経活動指標と循環動態(とくに末梢循環指標)により評価する。さらに、それらの結果をもとに自律神経活動に変調をきたしている心臓血管系の疾患や糖代謝異常、脂質代謝異常症などの慢性疾患患者を対象に、SBEが彼らの症状改善の一助となるか臨床効果の検討を行う。いずれもSBEの実施は通常4週間(約1か月間)を予定している。4週間のSBE前後における測定指標の比較を行うことで、SBEが副交感神経活動リザーブを高めるかどうかを評価する。これまでの研究成果として、2014年度は研究計画のとおり若年健常男性を対象としたSBEの継続効果を測定した。研究施設の許可および研究対象者の許諾を得る手続きに関しては研究計画のとおりに実施した。研究対象者のなかには、対象者自身で4週間継続することが困難であると判断し研究参加を辞退する場合が1症例のみあったが、それ以外の点においては測定全般において問題はなかった。これらの結果はSBEの臨床効果を検討するうえで基礎的研究として位置づいており、現在関連学会誌への投稿準備をすすめている。また、有疾患患者を対象としたSBEの臨床効果を検討していくために、その研究協力施設の選定をし決定した。現在、今後の研究活動を実施するために病院スタッフとの調整を行っている段階である。来年度以降は上述した臨床効果の検討を実施していく予定である。研究実施計画は、はじめに若年健常男性を対象とした基礎的研究として、SBEの効果を自律神経活動指標と循環動態(特に末梢循環指標)により評価する。さらに、それらの結果をもとにSBEが自律神経活動に変調をきたしている慢性疾患患者の副交感神経活動リザーブを高め、症状改善の一助となるか臨床効果の検討を行う。SBEの実施は通常4週間(約1か月間)とし、SBE前後における測定指標の比較を行うことで評価する。平成27年度の研究実施状況として、平成26年度より検討を続けていた若年健常男性におけるSBEの効果について、対照群とくらべて実施群(平均実施率71.4%)では副交感神経活動指標であるHFが高まり、末梢皮膚血流量が増加傾向を示すことを確認した。すなわち、若年健常男性においては指示された約70%の実施率のSBEが副交感神経活動リザーブを高めるといえる。これらの結果はSBEの臨床効果を検討するうえで、非常に重要な結果である。この研究結果については関連国際学会(43rd International Congress on Electrocardiology, 2016)にて演題発表を行った。また、前年度に決定した研究協力機関との連絡調整を行い、対象とする慢性疾患を慢性腎臓病とし、それに罹患している患者の安静時の生理学的指標を測定した。。研究対象者の選定および承諾を得る手続きは研究計画のとおりに実施した。さらに先行して数名においてSBE実施を依頼し、SBE実施前後で測定、評価を実施した。これらの結果をふまえて、もう一つの年次計画である「慢性疾患患者の副交感神経活動リザーブと病態との関連因子の探索」については現在検討中である。平成27年度研究実施計画である「慢性疾患患者の副交感神経活動リザーブと病態との関連因子の探索」については現在検討中ではあるが、研究協力機関との連絡調整を十分に行い、数例のSBE実施介入を開始することができた。平成28年度もこれまでの調査・検討で得た様々な情報をもとに研究協力機関との連携を図ることで、年次計画遂行が可能であると考えられるため。平成28年度は、若年健常男性を対象としたSBEの効果について、4週間の期間における実施群と非実施群の比較検討を行った。その結果、非実施群に比べてSBE実施群では4週間後に安静時の副交感神経活動指標が増大し、末梢循環指標が増加した傾向を有した。これらのことから、若年健常男性を対象とした4週間のSBEは副交感神経活動リザーブを高めることが分かった。次に、若年健常男性を対象とした上記の結果をもとに、SBEの臨床効果についても検討を行った。対象は外来通院している慢性腎臓病患者とし、外来受診日から次回の外来受診日までの期間にSBEを実施する方法を用いた。その結果、SBE実施前より実施後において副交感神経活動指標が高まる症例と変化しない症例と両方を認めた。

SBEの実施状況は症例間で差異を認めたが、実施頻度が高くても副交感神経活動指標が変化しない症例も認めた。これらのことから、慢性疾患患者においてはSBEの実施頻度だけではなく、その他要因によってもSBEの効果に違いが生じていることが考えられ、今後の検討課題となっている。以上のように、慢性疾患患者への臨床効果として、SBEが副交感神経活動リザーブを高めて症状の改善に有効かどうかについて結論は出なかったが、これまで得た知見をもとに平成29年度から新規採択された次の研究課題において詳細に検討していく。本研究は、深くゆっくりとした呼吸活動を毎日繰り返して実施する方法「Slow Breathing Exercise:SBE」が副交感神経活動リザーブを高めるかどうかを明らかにすることを目的に、若年健常男性と慢性疾患患者を対象に自律神経活動指標と循環動態指標を用いて検討した。その結果、若年健常男性においては十分にSBEを実施することでSBE実施後は副交感神経活動リザーブが高まり、末梢循環が促進される可能性を認めた。慢性疾患患者においては実施率以外の要因も関連することを認めたため、今後SBEのさらなる検討の必要性が明らかになった。初年度の研究計画は「基礎疾患のない若年健常男性を対象としたSBEの効果の検討」および「研究協力機関の選定」であったが、いずれも順調にすすめることができたため。臨床効果を検討することについては、研究協力機関における倫理審査委員会の承認も得ている。今後の研究計画の推進に関して、交付申請時の研究計画に変更はない。対象とする慢性疾患を慢性腎臓病とし、平成28年度は以下の点を中心に研究を推進していく。1.慢性腎臓病患者の副交感神経活動リザーブと病態との関連因子の探索上述したように、現在慢性腎臓病患者における副交感神経活動リザーブと病態との関連については検討中である。慢性腎臓病は腎機能と検査異常によってステージ分類されており、副交感神経活動リザーブと病態の進行度や治療状況などの関連について継続して検討する。2.慢性腎臓病患者への副交感神経活動リザーブを高める積極的看護介入方法の実証1.の検討結果をもとに積極的看護介入方法が適応可能であると考えられる慢性腎臓病患者を対象にSBE介入を実施する。その際、若年健常男性を対象としたSBEの基礎的研究結果を参考にし、副交感神経活動リザーブの変化に対象者のSBE実施状況等がどのように関連しているか評価し、確実な実施方法について検討する。看護学今後の研究計画の推進に関して、基本的な研究計画の変更はない。今後「慢性疾患患者を対象としたSBEの臨床効果」を検討するうえで、平成27年度は以下の点を重要な推進方策とする。1.慢性疾患患者の安静時の生理学的指標の測定慢性疾患患者に対するSBEの有効基準を設定するため、安静時における生理学的指標を測定し、副交感神経活動リザーブと病態の重症度の関連を検討する。研究対象者は外来通院している慢性疾患患者を予定しているが、疾患や病態、重症度、治療状況などについては主治医と相談し、主治医が研究対象者として妥当であると判断したうえで決定する。
脳内在性神経毒を用いたパーキンソン病発症に関与するタンパク質の探索

1-Benzyl-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline(1BnTIQ)は、脳内在性であり、パーキンソン病患者脳脊髄液中で増加傾向が認められている。更に、1BnTIQを実験動物に投与するとパーキンソニズムを引き起こすことが明らかにされているが、その作用機構は不明である。そこで毒性発現機構を明らかにする目的で、ヒト由来の株化細胞であるSH-SY5Y細胞を用いて1BnTIQによる発現変動遺伝子を解析し、細胞死への関与の検討を行った。0.5mM,1BnTIQ 5h処置後メディウムから1BnTIQを除去しても引き続き細胞死が認められたところから、この条件で細胞を死に誘導する変化が起きている事が考えられた。そこでディファレンシャルディスプレイ法やcDNAマイクロアレイを用いて発現変動遺伝子を検討したところ、NMDA受容体、アポトーシス関連遺伝子をはじめ、数多くの発現変動遺伝子が認められた。更にNMDAアンタゴニストであるMK-801によって1BnTIQ毒性が軽減されたところから、1BhTIQ毒性におけるNMDA受容体の関与が強く示唆された。以上、脳内在性神経毒1BnTIQ毒性発現にNMDA受容体が関与し、細胞死にアポトーシスが関与していることを明らかにした。このことは1BnTIQ毒性発現機構およびパーキンソン病発症原因を明らかにする手がかりになると考えられる。本研究の主な目的は、パーキンソン病における神経細胞死に関与するタンパクを検索し、その分子機構を解明することである。本研究の結果見いだされたタンパクはパーキンソン病における神経変性に重要な役割を果たしている可能性が高いと考えられる。1-ベンジル-TIQによるドパミン量の詳細な時間変化と不可逆性の検討内在性神経毒1-ベンジル-TIQ添加後のドパミン量の時間変化を詳細に検討した。また、一定時間経過後に1-ベンジル-TIQ無添加培溶液に交換して3日後のドパミン量を測定した結果、12時間を境にドパミン量の回復が観察されなくなった。この点が細胞死シグナルのスイッチがオンになる時間(コミットメントポイント)であると考えられ、細胞死シグナル解明の点からも興味深い。即ち、ドパミン減少が始まってもコミットメントタイムより前であれば、細胞死を防御することが可能であると考えられる。コミットメントポイント前後の遺伝子発現差異の検討細胞死シグナルのスイッチがオンになる前後の培養細胞を用いてディファレンシャル・ディスブレイ法により遺伝子発現差異を検討した。これにより細胞死シグナルがオンになる時に発現しているタンパクは、1-ベンジル-TIQのみならずある種の神経毒の毒性発現に関わる重要なタンパクである可能性が考えられる。現在数種の候補タンパク質に関して、その性質を検討している。さらに、1BnTIQを実験動物に投与するとパーキンソン病様症状を引き起こすことが明らかにされているが、その作用機構は不明である。そこで毒性発現機構を明らかにするため、ヒト由来の株化細胞であるSH-SY5Y細胞を用いて、1BnTIQによる発現変動遺伝子を解析し、細胞死への関与の検討を行った。500μM 1BnTIQ 5h処置後メディウムから1BnTIQを除去しても引き続き細胞死が認められたことから、この条件で細胞を死に誘導する変化が起きていることが考えられた。そこでディファレンシャルディスプレイ法やcDNAマイクロアレイを用いて発現変動遺伝子を検討したところ、N-methyl-D-aspartate receptor(NMDAR)、アポトーシス関連遺伝子をはじめ、数多くの発現変動遺伝子が認められた。さらに、NMDARアンタゴニストであるMK-801によって1BnTIQ毒性が軽減されたことから、1BnTIQ毒性におけるNMDARの関与が示唆された。また、アポトーシスシグナルを調節しているCaspase-3活性が1BnTIQにより上昇したことから、1BnTIQ細胞死におけるアポトーシス関与が示唆された。

以上申請者らは脳内在性神経毒1BnTIQ毒性発現にNMDARが関与し、細胞死にアポトーシスが関与していることを明らかにした。このことは、1BnTIQ毒性発現機構およびパーキンソン病発症原因を明らかにする手がかりになると考えられる。
移植臓器長期生存に果たすGraft側の適応の機序の解析とその誘導に関する研究

本研究の目的は、graftの血管に対する慢性炎症を抑えるためにmacrophageの出すcytokineを抑制、もしくは血管内皮細胞にanti-apoptotic genesを誘導し、慢性拒絶を抑えることである。成果として[A]chronic rejectionのモデル作成;AlloではACI to Lewis,xenoにおいてはHamster to ratの系がChronic rejectionのモデルとして使用可能であった。Hamster to ratにおいてはSplenectomyもしくはBrequinarとCyAを投与することによって長期生存を得るが、次第にグラフとの機能は低下してChronic rejectionに陥り、廃絶にいたった。これを押さえるには、CyAの投与量を3倍量にするなどのTreatmentが必要なことも判明した。抗graft抗体または抗graft抗体のFabフラグメントを投与する方法を試み抗graft抗体を作成した。抗graft抗体にはIgGとIgMのものがあり、移植したラットからその血清を採取する時期をによりIgMとIgGそれぞれの分画の抗体を作成した。これらの抗体を移植したラットに投与したところ、IgMではdilutionを加えることによりaccommoodationが誘導が可能だが、IgGではごく微量の抗体を投与することにより拒絶が起きた。macrophageを選択的に消去するClodronateを投与し、macrophageを抑制してchronic rejectionを起こす系に投与してみたところ、Clodronate投与した群は長期生存し、グラフト機能の低下もなく、chronic rejectionを回避できた。この長期生存したグラフトにはchronic rejectionの際見られるマクロファージの浸潤が見られず、血管壁の肥厚もなく、形態学的に良好に保たれていた。[A]chronic rejectionのモデル作成;Alloではtoの系がxenoにおいてはHamster t oratの系がChronic rejectionのモデルとして使用可能であった。H amster tor atにおいてはSplenectomyもしくはBrequinarとCyAを投与することによって長期生存を得るが、次第にグラフトの機能は低下してChronic rejectionに陥り、廃絶にいたった。[B]protective genesの誘導するために微量の抗graft抗体または抗graft抗体のFabフラグメントを投与する方法が考えられ、現在、抗graft抗体を作成中である。抗graft抗体にはIgGのものとIgMのものがあり、IgG抗体は移植後2週間以降に産生され、IgM抗体は2-7日後に産生され2週間以降は産生が抑制されることが判明した。現在これらの時期の抗血清より抗graft抗体を作成中である。[C]macrophageの抑制macrophageを選択的に消去するClodronateをrecipientに投与し、macrophageを抑制してchronic rejectionを起こす系に投与してみたところ、Clodronate投与した群は長期生存し、グラフト機能の低下もなく、chronic rejectionを回避できた。現在このメカニズムを検討中である。抗graft抗体を作成した。抗graft抗体にはIgGのものとIgMのものがあり、移植したラットからその血清を採取する時期を帰ることによりIgMとIgGそれぞれの分画の抗体を作成した。これらの抗体を移植したラットに投与したところ、IgMではdilutionを加えることにより拒絶が起きない濃度が判明、その濃度以下ではaccommoodationが誘導されている。IgGではごく微量の抗体を投与することにより拒絶が起きてしまい、accommodationの誘導は不可能であることが判明した。[B]Adenovirus vectorを使ったProtective genesの誘導はAdenovirus vectorを使用する技術を修得中であり、virusを使用する幾多の制約があり未だ実現していない。[C]macrophageの抑制とprotective genes誘導の相乗効果ハムスターからラットへの実験系において[B]において作成した微量の抗グラフトを投与、さらにmacrophageを選択的に消去するClodronateをrecipientに投与した。同様に良好なグラフト機能であったが、各々単独で投与した場合と比べて有為の差は見られなかった。

肝臓はrejetionの起きにくい臓器であり、chronic rejectionの系を作れなかった。すなわち、拒絶されるものは早期に拒絶され、拒絶されないものはacuterejectionの段階を乗り越えると拒絶されず長期生存する。さらに動脈吻合を加えたratの肝移植モデルでないと長期生存の際の胆管の変成が拒絶によるものか動脈血流の不足によるものか判別がつかなかった。
薬物性歯肉肥大における線維芽細胞の増殖とカルシウムに対する反応

平成11年度における科学研究費補助金による研究の実績は以下のとうりである.1.in vivo歯肉肥大誘発実験:生後15日齢のFischerラットにシクロスポリン(CsAと略:50-300μg/g),ニフェジピン(200-800μg/g)あるいはジルチアゼム(600-6000μg/g)含有粉末飼料(CE-2)を与え40日間飼育した.また,薬物複合投与の影響をみるため,CsAと二種類のCa拮抗薬を複合投与して,歯肉肥大の程度と血圧の変動,血中薬物濃度との関係を調べた.その結果,CsAが最も顕著な歯肉肥大を誘発し,次いでニフェジピン,ジルチアゼムの順であった.CsAとCa拮抗薬との併用投与においては,いずれも歯肉肥大の程度は重症化していた.これらはどの組み合わせてみても,単独投与群の肥大を加算した(相加的)効果と考えられた.2.臨床的観察:最も新しいCa拮抗薬のアムロジピン服用者について,経時的な歯周組織の変化を臨床的に検索した.その結果,アムロジピンの服用によって薬物誘発性の歯肉肥大が生じること,それが服用中止により軽減し,再開によって再発することがわかった.しかし再発性の歯肉肥大は,プラークコントロールを中心とした歯周疾患の初期治療によって症状を軽くできることがわかった.3.in vitro実験:ヒト歯肉線維芽細胞を分離,増殖し,5-8代継代の細胞を使用した.歯肉線維芽細胞の増殖とアポトーシスは,培養液にニフェジピン(500ng/g:1.5μM)を添加することによって抑制された.アポトーシスのほうが,薬物による影響を強く受けており,歯肉組織リモデリングの変調が歯肉肥大発生の一因であることが明らかになった.さらに,Ca拮抗薬はマクロファージ様細胞RAW364のLPS刺激による誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)の誘導を阻害することによって,細胞死を抑制することが,炎症時における組織傷害に対して,防御的に作用することが示された.平成11年度における科学研究費補助金による研究の実績は以下のとうりである.1.in vivo歯肉肥大誘発実験:生後15日齢のFischerラットにシクロスポリン(CsAと略:50-300μg/g),ニフェジピン(200-800μg/g)あるいはジルチアゼム(600-6000μg/g)含有粉末飼料(CE-2)を与え40日間飼育した.また,薬物複合投与の影響をみるため,CsAと二種類のCa拮抗薬を複合投与して,歯肉肥大の程度と血圧の変動,血中薬物濃度との関係を調べた.その結果,CsAが最も顕著な歯肉肥大を誘発し,次いでニフェジピン,ジルチアゼムの順であった.CsAとCa拮抗薬との併用投与においては,いずれも歯肉肥大の程度は重症化していた.これらはどの組み合わせてみても,単独投与群の肥大を加算した(相加的)効果と考えられた.2.臨床的観察:最も新しいCa拮抗薬のアムロジピン服用者について,経時的な歯周組織の変化を臨床的に検索した.その結果,アムロジピンの服用によって薬物誘発性の歯肉肥大が生じること,それが服用中止により軽減し,再開によって再発することがわかった.しかし再発性の歯肉肥大は,プラークコントロールを中心とした歯周疾患の初期治療によって症状を軽くできることがわかった.3.in vitro実験:ヒト歯肉線維芽細胞を分離,増殖し,5-8代継代の細胞を使用した.歯肉線維芽細胞の増殖とアポトーシスは,培養液にニフェジピン(500ng/g:1.5μM)を添加することによって抑制された.アポトーシスのほうが,薬物による影響を強く受けており,歯肉組織リモデリングの変調が歯肉肥大発生の一因であることが明らかになった.さらに,Ca拮抗薬はマクロファージ様細胞RAW364のLPS刺激による誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)の誘導を阻害することによって,細胞死を抑制することが,炎症時における組織傷害に対して,防御的に作用することが示された.薬物誘発性歯肉肥大における線維芽細胞の増殖とカルシウムに対する反応に関する研究は,以下の二つの実験を企画し行ってきた.1. in vivo実験:我々が確立した方法に従って15日齢Fischerラットにフェニトイン,シクロスポリンあるいはニフェジピン含有粉末飼料(CE-2)を与え,25から55日間飼育した.投与開始から7日間は低濃度で,その後2mg/g,50mg/gあるいは200mg/gの濃度で薬物を与える.投与終了時にラット下顎を摘出し歯肉肥大の程度を測定した.さらにシクロスポリンとCa拮抗薬の相互作用についても検討した.単独あるいは複合薬物投与による歯肉肥大の程度と血中薬物濃度との関係を調べた.その結果,シクロスポリン投与によって歯肉肥大は濃度依存性に発現していた.カルシウム拮抗薬のニフェジピンあるいはジルチアゼムをシクロスポリンと同時に投与すると,いずれの薬物の血中濃度も単独投与に比べて低下していたが,歯肉肥大の程度は単独投与のものを加算した様態で増強されていた.2. in vitro実験:ヒト歯肉組織から線維芽細胞を分離,増殖し5-8代の細胞を使用した.コンフルエントの培養線維芽

細胞にカルシウム拮抗薬(ニフェジビン2mg/ml)を添加し,トリパンブルーによる細胞死,アポトーシスの判定および細胞の^3Hチミジンの取り込みを調べた.その結果,ニフェジピン添加により細胞死は減少し,アポトーシスは濃度依存性に抑制され,低カルシウム培地の^3Hチミジンの取り込みは低下し,高カルシウム培地の^3Hチミジンの取り込みは増加していた.このことから,カルシウム拮抗薬は歯肉線維芽細胞の増殖過程で細胞死を抑制し,それには細胞内カルシウム動態の関与が示唆された.1.in vivo歯肉肥大誘発実験:Fischerラットにシクロスポリン(CsAと略:50-300μg/g),ニフェジピン(NF:200-800μg/g)あるいはジルチアゼム(DIL:600-6000μg/g)含有の粉末飼料を与え40日間飼育した.また,薬物複合投与の影響をみるためCsAと二種類のCa拮抗薬を複合投与して,歯肉肥大の程度と血圧の変動,血中薬物濃度との関係を調べた.その結果,CsAが最も顕著な歯肉肥大を誘発し,次いでNF,DILの順であった.CsAとCa拮抗薬との併用投与においては,いずれも歯肉肥大の程度は重症化していた.これらはどの組み合わせてみても,単独投与群の肥大を加算した(相加的)効果と考えられた.2.臨床的観察:最新のCa拮抗薬アムロジピン(AML)服用者の歯周組織の変化を臨床的に検索した.その結果,AMLの服用によって薬物誘発性歯肉肥大が生じ,それが服用中止により軽減し,再服用によって再発することがわかった.しかし再発性歯肉肥大は,プラークコントロールと歯周初期治療によって症状を軽減できることがわかった.3.in vitro実験:ヒト歯肉線維芽細胞を使用した.歯肉線維芽細胞の増殖とアポトーシスは,培養液にNF(1.5μM)を添加することにより抑制された.アポトーシスのほうが,薬物の影響を強く受けていた.歯肉組織リモデリングの変調が歯肉肥大発生の一因であること,さらにCa拮抗薬はマクロファージ様細胞RAW364のLPS刺激による誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)の誘導を阻害して,細胞死を抑制することから,炎症による組織傷害に対して防御作用のあることが示された.
赤方偏移1<z<2に於ける楕円銀河の構造形成と空間分布

すばる望遠鏡による光学撮像と欧州南天天文台(ESO)のNTT望遠鏡による近赤外線撮像によって、楕円銀河の祖先と考えられるBzK銀河(1.4<z<2.5)を多数同定し、それらの銀河には二つの種類があることを明らかにした。即ち、星形成を行っている銀河(sBzK)と静的に進化している銀河(pBzK)である。前者は楕円銀河の形成途上の姿であり、後者は既に星形成を終了した楕円銀河である。これらの銀河には10^<11>太陽質量という大質量のものが多数あり、銀河の星質量の集積が既に宇宙進化のこの段階で終了している場合が希ではないことを示唆する。その物理量の推定から星形成を行っている銀河はダストに覆われた星形成領域を中心に持ち、星形成率は平均して200太陽質量/年、星質量は10^<11>太陽質量、金属量はほぼ太陽と同じということを明らかにした。MAMBO望遠鏡による中間赤外での観測から星生成率を求めると、UV光から求めた星生成率とほぼ同じであり、これから、sBzK銀河での星形成はやや広がった領域で行われていると推測できる。近傍でよく楕円銀河の先駆的段階と言われているULIRGという天体に比べると、中間・遠赤外での光度が低く、sBzKはサブミリ銀河やULIRGといった超高光度の星形成銀河というよりは、その時期を過ぎてなお家内高い星生成率を示す、銀河であろうと考えることができる。この後、この銀河では超新星爆発による銀河風の発生か、或いは、AGNによるフィードバックによってガスが吹き飛ばされ、星形成が終了するものと考えられる。その後は、静的に進化するERO(z<1)となり、更には、近傍の楕円銀河となるであろう。一方pBzKは既にこのフェイズをより遠方で終了した天体であり、その前進はDRGといった非常に赤い遠方の星形成銀河(z>2.5)であろう。クラスターリングの様子を見ると、EROとsBzKとは良く似ており、一般の銀河に比べて集中の度合いが強い。また、pBzKはこの二者よりも更にクラスターリングが強く、銀河の数密度は高いところ(たとえば銀河団のような)では銀河質量の集積と星形成の進行がより急速に進んだことを示唆する。また、空間数密度をみると、sBzKは近傍の明るい楕円銀河のほぼ半分であり、pBzKはそれとほぼ同数である。即ち、これらの銀河の数密度を合わせたものは明るい楕円銀河のそれとほぼ等しい。ということは、z>1.4のBzK銀河はこの時期に星形成を終了し、z1でのEROとなり、更にz0での巨大楕円銀河になるという道筋を明らかにしたと言えよう。この研究で発見したBzK銀河は現在は1.4<z<2.5にある大質量銀河の代表的な存在であると広く認識されており、遠方宇宙における楕円銀河の構造形成と空間分布の詳細を明らかにするという本研究の目的は達成されたと考えている。ESO-NTT望遠鏡によって近赤外線で観測された領域をカバーするように、すばる望遠鏡Suprime-Camを用いて非常に深く、広い天域(900平方分×2)を撮像した。この観測によってこの天域はUBVRIzJKの8つのバンドのデータを持つ事になり、以前に作成した色から赤方偏移を求めるプログラムから、比較的高い信頼性で銀河の測光赤方偏移を求める事ができた。これらの銀河の中から、B,z,Kの3バンドで決める新しい定義を用いて、高赤方偏移(1.4<z<2.5)にある大質量星形成銀河(BzK銀河)を600個、V-K>5等級で定義される非常に赤い天体(ERO銀河)を500個抽出した。これらBzK銀河のクラスタリング(空間分布)を、同領域にあるERO銀河と比べたところ、どちらも暗くなるに従って、より集積している事を明らかにした。BzK銀河の空間分布はERO銀河と似通った物である事を初めて示した。紫外線光度、測光による赤方偏移、ダスト吸収量を用いる事で、BzK銀河の中に、星生成率が200太陽質量/年でKバンドで明るく光る星生成銀河が多く存在する事を明らかにした。さらに、UBVRIzJKバンドのSEDと星の種族合成モデルとの比較により、これらの銀河の質量は10の11乗太陽質量程度であると見積もった。z2にある明るいBzK銀河は大質量・高い星生成率・高い金属量であり、強いクラスタリングを示しており、この事はこれらの銀河がz1で静的に進化しているERO銀河や近傍の早期型銀河の過去の姿であり、z2で見られるLBG銀河・DRG銀河とは違う種類の銀河であると結論できる。その物理量の推定から星形成を行っている銀河はダストに覆われた星形成領域を中心に持ち、星形成率は平均して200太陽質量/年、星質量は10^<11>

太陽質量、金属量はほぼ太陽と同じということを明らかにした。MAMBO望遠鏡による中間赤外での観測から星生成率を求めると、UV光から求めた星生成率とほぼ同じであり、これから、sBzK銀河での星形成はやや広がった領域で行われていると推測できる。近傍でよく楕円銀河の先駆的段階と言われているULIRGという天体に比べると、中間・遠赤外での光度が低く、sBzKはサブミリ銀河やULIRGといった超高光度の星形成銀河というよりは、その時期を過ぎてなお家内高い星生成率を示す、銀河であろうと考えることができる。この後、この銀河では超新星爆発による銀河風の発生か、或いは、AGNによるフィードバックによってガスが吹き飛ばされ、星形成が終了するものと考えられる。その後は、静的に進化するERO(z<1)となり、更には、近傍の楕円銀河となるであろう。一方pBzKは既にこのフェイズをより遠方で終了した天体であり、その前進はDRGといった非常に赤い遠方の星形成銀河(z>2.5)であろう。クラスターリングの様子を見ると、EROとsBzKとは良く似ており、一般の銀河に比べて集中の度合いが強い。また、pBzKはこの二者よりも更にクラスターリングが強く、銀河の数密度は高いところ(たとえば銀河団のような)では銀河質量の集積と星形成の進行がより急速に進んだことを示唆する。また、空間数密度をみると、sBzKは近傍の明るい楕円銀河のほぼ半分であり、pBzKはそれとほぼ同数である。即ち、これらの銀河の数密度を合わせたものは明るい楕円銀河のそれとほぼ等しい。ということは、z>1.4のBzK銀河はこの時期に星形成を終了し、z1でのEROとなり、更にz0での巨大楕円銀河になるという道筋を明らかにしたと言えよう。この研究で発見したBzK銀河は現在は1.4<z<2.5にある大質量銀河の代表的な存在であると広く認識されており、遠方宇宙における楕円銀河の構造形成と空間分布の詳細を明らかにするという本研究の目的は達成されたと考えている。
Fe(III)塩を利用する低沸点有機塩素化合物の光分解処理に関する研究

本研究の対象とする光化学処理法の原理はpH:3前後において安定に存在するFe(III)-ヒドロキシ錯体の光解離によって生成するヒドロキシルラジカル(OHラジカル)の強い酸化力を利用して水中に存在する有害有機物を分解処理しようとするものである。最初に基礎的研究として、2-クロロフェノールなどをプローブとし、1-オクタノールをラジカル捕捉剤とする単色光照射実験により、OHラジカルおよびFe(II)イオンの生成速度、それらの生成量子収率を求めた。量子収率は0.02-0.03とかなり大きいことが示された。なお、Fe(III)塩として過塩素酸鉄(III)、pH調整試薬として過塩素酸を用いた。ついで、対象有害有機物としてクロロホルム、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレンを選び、その低濃度水溶液に対して500W超高圧水銀灯による光分解実験を実施した。その結果、3種の物質とも3時間以内に90%以上が分解すること、有機塩素が効率よく塩化物イオンとして脱離すること、Fe(II)イオンの生成挙動は化合物の種類によって大きく異なることなどが明らかになった。また、分解速度はUV-光触媒系よりも速いことも示された。さらに313nmの単色光照射実験により光分解の動力学を検討し、競争反応の原理から導かれる簡単な動力学モデルと実験結果がよく一致することが示された。その他、温度依存性、溶存酸素濃度依存性および過酸化水素の添加効果についても検討した。特に溶存酸素が反応に消費されることが明らかになり、その重要性が認められた。以上、本年度の研究により、本法は新しい光化学処理法として実用化の見込みが十分あることが明らかになった。
上丘-脳幹網様体-脊髄系における視覚-運動変換機構の解析

視野中心の柱視点が消灯した後数百ミリ秒のギャップを導入して注意をいったん周辺視野に拡散させてから周辺にターゲットを呈示すると70-80ミリ秒という短い反応時間のサッケード運動(express saccade)が誘発されることが知られている。我々はexpress saccadeの発現機構は、上丘浅層-中間層という視覚運動変換過程の短絡路が促通されることによるのではないかと考え以下の研究を行なった。(1)上丘局所神経回路の構造と動作特性の解析ラット上丘スライスにおいてをホールセルパッチクランプ法による記録とバイオサイチンによる細胞内染色を用いて、視神経から上丘浅層または視神経層のニューロンを経て、中間層のニューロンによる興奮性伝達経路の存在を証明した。この経路の興奮性シナプス伝達はAMPA型及びNMDA型のグルタミン酸受容体を介する。この経路の伝達は通常GABA系による強い抑制を受けている。また上丘中間層には脚橋被蓋核由来のアセチルコリン作動性入力があることが知られているが上丘中間層のニューロンはニコチン受容体の活性化により顕著な脱分極応答を示し、その結果、ニコチン投与によりこの上丘浅層-中間層への信号伝達は顕著に増強された。このように、上丘浅層から中間層への信号伝達はGABA系による抑制、アセチルコリン入力による促通というダイナミックな修飾を受けていることが明らかになった。(2)サル上丘中間層へのニコチン投与の影響眼球運動課題を訓練したニホンザル2頭の上丘中間層にニコチン1mMを1mL注入した。注入前はギャップなしでの視覚誘導性サッケードの反応時間は140-150ミリ秒だったが注入後、注入部位が符号するベクトルのサッケード運動の反応時間は大半が100ミリ秒以下となり中間層のニコチン受容体の活性化が実際にexpress saccadeの発現を促進することが明らかになった。上丘内の局所神経回路の構造を明らかにするために生後3週のラットの上丘の厚さ250μmのスライスを作成し,上丘中間層および視神経層の様々な細胞からwhole-cell patch clamp法による記録を行い,(1)定常電流通電に対する活動電位生成パターンによる細胞の分類とそのパターンの基盤となる各種コンダクタンスの同定.(2)記録後の形態学的解析.(3)アセチルコリンおよびそのagonist,antagonist投与の効果の解析、を行った。その結果、中間層および、視神経層の細胞は定常電流に対する活動電位の生成パターンにより,7群に分類され,それぞれに特徴的な形態を示すことが明らかになった.特にその一群で,Regularでfrequency adaptationの弱い発火特性を示し,過分極がで内向き整流性のH電流を生じる細胞は視神経層(SO)に存在し,表層(SGS)に広範に樹状突起を派生し,さらにより深い層に軸索側枝を投射し,終末していることから,浅層に入力する視覚情報をより深い層に伝えるのに重要な役割を果していると考えられた.また,上丘中間層の細胞にニコチン30μMを投与するとCurrent clamp記録では強い脱分極と活動電位の生成,Voltage clamp記録では内向き流の生成を生じた.ニコチン応答のIC50は12μMで、Hill係数は1.06だった。そしてこのニコチンによる脱分極作用により,視神経ないしは浅層刺激に体する中間層細胞の応答は著明に促通を受けた.このように上丘中間層におけるニコチン受容体の刺激は上丘内での信号伝達を修飾する作用があることが明らかになった.

視野中心の注視点が消灯した後数百ミリ秒のギャップを導入して注意をいったん周辺視野に拡散させてから周辺にターゲットを呈示すると70-80ミリ秒という短い反応時間のサッケード運動(express saccade)が誘発されることが知られている。我々はexpress saccadeの発現機構は、上丘浅層-中間層という視覚運動変換過程の短絡路が促通されることによるのではないかと考え以下の研究を行なった。(1)上丘局所神経回路の構造と動作特性の解析ラット上丘スライスにおいてをホールセルパッチクランプ法による記録とバイオサイチンによる細胞内染色を用いて、視神経から上丘浅層または視神経層のニューロンを経て、中間層のニューロンによる興奮性伝達経路の存在を証明した。この経路の興奮性シナプス伝達はAMPA型及びNMDA型のグルタミン酸受容体を介する。この経路の伝達は通常GABA系による強い抑制を受けている。また上丘中間層には脚橋被蓋該由来のアセチルコリン作動性入力があることが知られているが上丘中間層のニューロンはニコチン受容体の活性化により顕著な脱分極応答を示し、その結果、ニコチン投与によりこの上丘浅層-中間層への信号伝達は顕著に増強された。このように、上丘浅層から中間層への信号伝達はGABA系による抑制、アセチルコリン入力による促通というダイナミックな修飾を受けていることが明らかになった。(2)サル上丘中間層へのニコチン投与の影響眼球運動課題を訓練したニホンザル2頭の上丘中間層にニコチン1mMを1mL注入した。注入前はギャップなしでの視覚誘導性サッケードの反応時間は140-150ミリ秒だったが注入後、注入部位が符号するベクトルのサッケード運動の反応時間は大半が100ミリ秒以下となり中間層のニコチン受容体の活性化が実際にexpress saccadeの発現を促進することが明らかになった。