hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
反芻家畜の繊維消化を促進する繊維サプリメントの開発

稲わらに代表される難分解性繊維の消化に関わるルーメン細菌を賦活化できる天然の易分解性繊維を見つけ出し、それを稲わらに少量補給することで繊維消化の起爆剤(ブースター)とできるかどうかの仮説検証を行った。稲わらの消化を主導しているのはFibrobacter succinogenesであり、供した補給繊維源のうち、この菌種を活性化したのはフジ豆外皮およびヒヨコ豆外皮であると特定できた。また稲わら給与ヒツジへこれら外皮を10%補給することで、酸性デタージェント繊維の消化率が3-6%向上した。以上より、豆外皮が反芻家畜の繊維サプリメントとして活用できることが明らかとなった。稲ワラに代表される難分解性繊維の消化に関わるルーメン細菌を賦活化できる天然の易分解性繊維を見つけ出し、それを稲ワラに少量補給することで繊維消化の起爆剤(ブースター)とできるとの仮説検証を研究目的とした。候補補給繊維源8品目をヒツジルーメン内で培養し、各々の繊維源の消失率とともに付着増殖する菌群を同定した。稲ワラについても同様にした。付着菌群の同定は16S rRNA遺伝子解析により行った。また各々の菌群定量はreal-time PCR法で実施した。培養初期の検出頻度およびその後の増殖速度が大きく、菌体量が試料のルーメン内消失最大時までに平衡に達している場合、分解を主導する菌群であると判断できる。この基準から、稲ワラの消化を主導しているのはFibrobacter succinogenesであり、供した補給繊維源のうち、本菌種を活性化したのはフジ豆外皮およびヒヨコ豆外皮であると特定できた。一方、従来補給繊維として重宝されてきたビートパルプはまったく本菌の増殖にはかかわらないことが明らかとなった。次に、初年度照合できた補給繊維源と稲ワラの組み合わせによる繊維消化率向上の可能性について、実際の動物給与試験で実証することを2年目のタスクとした。照合一致した組合せは、具体的には稲ワラとフジ豆外皮、さらに稲ワラとヒヨコ豆外皮である。まず、候補繊維源の最適補給レベルを明らかにするため、簡易な培養試験にて異なる補給レベルで消化率の向上程度を評価し、10%補給を適切な補給レベルとして採用した。次に、ヒツジ4頭を該当の飼料(最少量の濃厚飼料に加え、稲ワラの10%を補給繊維源で代替もしくは非代替のもの)で飼養し、全糞採取の消化試験を実施した。これにより、フジ豆外皮とヒヨコ豆外皮はいずれも消化率向上を促す傾向にあることを見出し、仮説を実証した。候補補給繊維源8品目をヒツジルーメン内でin situ培養し、各々の繊維源の消失率とともに付着増殖する菌群を同定した。同時に稲ワラについても同様に培養、分析に供した。培養時間は24時間までは4-6時間おき、それ以後は24時間おきとした。この際、焦点となるのは、各々の試料上で検出される菌叢の多様性と主要構成員の増殖速度であり、初期検出頻度およびその後の増殖速度が高く、菌体量が試料のルーメン内消失最大時までに平衡に達している場合、分解を主導する菌群であると判断できる。このような基準から、稲ワラの消化を主導しているのはFibrobacter succinogenesであり、供した補給繊維源のうち、この菌種を活性化したのはフジ豆外皮およびヒヨコ豆外皮であると特定できた。以上のように、初年度は候補繊維源全てについて分解を主導する菌群を特定し、稲ワラのそれと照合ができるリストがほぼ完成できた。試験に供する候補繊維源について、計画では約20品目としていたが、代表的なものや未利用のものをふくめ8品目にとどまった。ただし、その後の解析はきわめて順調に進行しており、稲ワラ消化のブースターとして活用できそうなものをほぼ特定できたといえる。とくに稲ワラの分解を主導するFibrobacter succinogenesについては、系統的に異なる多くの菌株がフジ豆外皮およびヒヨコ豆外皮で賦活化され、これら豆外皮の効能が高く評価できている。さらにこれら豆外皮は日本も含め多くの先進国では未活用のものであり、東南アジアや南アジア、さらには西アジアの産出国からの新たな天然飼料源の発掘につながる可能性が高まった。

以上のような理由より、本挑戦的萌芽研究はおおよそ順調に進展できており、新たな可能性を提示できつつあると判断している。ヒツジへの給与試験にて、初年度照合できた補給繊維源と主粗飼料の組み合わせによる繊維消化率向上について実証するのが2年目のタスクである。照合一致した組み合せは、具体的には稲ワラとフジ豆外皮、さらに稲ワラとヒヨコ豆外皮である。補給繊維源は国内生産されていないので適宜国外より調達するか、国内で類似のものを探すこととする。まず、候補繊維源の最適補給レベルを明らかにするため、簡易な培養試験にて異なる補給レベルで消化率の向上程度を評価する。最も消化率の向上する補給レベルを給与試験での補給レベルとして採用する。同時に培養ルーメン内容を採取し、初年度に特定した分解主導菌群が賦活化されているかを検証する。発酵産物も分析する。すなわち、特定の細菌や代謝産物の絶対定量が可能という培養試験の長所を活かし、ブースター理論実証のためのサポートデータとする。なお、イノキュラムは、あらかじめ該当する主粗飼料主体で飼養してあるヒツジのルーメン液とする。次に、ヒツジ4頭(ルーメンカニューレ装着)を該当の飼料(最少量の濃厚飼料に加え、主粗飼料に補給繊維源を適正レベルで添加もしくは無添加のもの)で飼養し、全糞採取の消化試験を実施する。これにより上の研究概要に記した理論が消化率向上に反映されているかを確認する。最後に、2年間の成果をとりまとめ、情報発信(学会および論文発表)を実施する。未使用経費の発生は、当初予定にあったルーメン菌種の定量系の確立が遅れたことで定量に使用する試薬購入を控えていたことに由来する。なぜなら長期保存にむかない試薬であるからである。本未使用額は24年度で当該の定量系が確立され次第、予定試薬を購入し、定量を進めることで消費する予定である。
基質硬度に起因する肺および気道リモデリング制御機構と細胞基質力学検知機構の解明

細胞が足場として利用している基質の硬度を感知する基質力覚検知機構を明らかにし、肺や気道の線維化やリモデリングの病態機序を解明することを目的とした。正常ヒト肺線維芽細胞を異なる硬さのゲル上で培養する実験を行った。軟らかなゲル上で培養した細胞と比較すると、硬いゲルやプラスチック上で培養した細胞では筋線維芽細胞のマーカーであるα-smooth muscle actin (α-SMA)蛋白発現が有意に増強していた。硬いゲル(25kPa)上で培養した細胞は軟らかなゲル(2kPa)で培養した細胞と比べ細胞遊走能の増強を認めた。α-SMAのsiRNA導入により、細胞遊走が抑制された。以上より、硬い基質の環境では線維芽細胞が活性化し、筋線維芽細胞へ分化し、α-SMA発現を介して遊走能が増強することが示された。肺線維症の病態機序として、線維化に伴う肺の硬化が線維芽細胞の活性化を介して線維化を更に促進する、正のフィードバック機構が存在することが示唆された。PD-L1を強発現するヒト肺がんHCC827細胞株における基質硬度のPD-L1発現への影響を検討した。細胞を軟らかなゲル上もしくは浮遊した状態で培養すること、アクチン重合を阻害することによりPD-L1発現が抑制された。以上より、肺がんではがん組織の硬さが微小環境として肺がん細胞のPD-L1発現を制御しており、その機序として細胞接着を介したアクチン細胞骨格が関与することが示唆された。ヒト気道平滑筋細胞をコラーゲンゲル内で3次元培養し、組織工学的な平滑筋組織作成を試みた。細胞伸展装置を用いて細胞を含有したゲルに繰り返し伸展刺激を与えることにより、細胞は伸展方向に伸長配向し、平滑筋組織様の形態を呈しα-SMA発現も増強した。この3次元組織を用いて細胞内Ca2+応答を捉えることにも成功した。本法を細胞機能解析研究へ応用することが今後の目標である。本研究の目的は、呼吸器系細胞が足場として利用している基質の硬度を感知する「基質力覚検知機構」を明らかにし、肺や気道の線維化やリモデリングの病態機序を解明することである。正常ヒト肺線維芽細胞を用いた実験において、異なる硬さのゲル上で細胞培養を行った。軟らかなゲル(1kPa, 2kPa)上で培養した細胞と比較すると、硬いゲル(25kPa, 50kPa)やプラスチック上で培養した細胞の形態はより胞体が広がっておりかつ紡錘形を呈していた。加えて、細胞内のα-smooth muscle actin蛋白発現が有意に増強していた。更には、硬いゲル(25kPa)上で培養した肺線維芽細胞は軟らかなゲル(2kPa)で培養した細胞と比べ、細胞遊走能の増強を認めた。以上の結果から、硬い基質の環境では線維芽細胞が活性化し、筋線維芽細胞へ分化することが示された。肺線維症の病態機序として、線維化に伴う肺の硬化が肺線維芽細胞を活性化し、更に線維化が促進される正のフィードバック機構が存在することが示唆された。また、ヒト肺線維芽細胞を用いた実験において、細胞をシリコン膜上に接着させた後、機械的ストレッチ刺激や低浸透圧刺激を与えたところ、細胞外へのATP放出を誘導することを見出した。更に、細胞からのATP放出をルシフェリンールシフェラーゼ反応の発光として高感度カメラで捉え、リアルタイムイメージ(動画)撮影を行うことに成功した。細胞外ATPは肺線維症の病態に関わる炎症性メディエーターとして考えられていることから、過剰な機械的刺激により誘導されたATP放出が線維化に寄与している可能性が示唆される。培養ヒト肺線維芽細胞を用いた課題に関しては、基質硬度依存性の研究、ATP放出に関する研究いずれにおいても学会発表を行っており、順調に進んでいる。これら2つの研究プロジェクトについても現在英文原著論文を投稿中である。軟らかなゲル(1kPa, 2kPa)上で培養した細胞と比較すると、硬いゲル(25kPa, 50kPa)やプラスチック上で培養した細胞では活性化した線維芽細胞(筋線維芽細胞)のマーカーであるα-smooth muscle actin蛋白発現が有意に増強していた。硬いゲル(25kPa)上で培養した肺線維芽細胞は軟らかなゲル(2kPa)で培養した細胞と比べ細胞遊走能の増強を認めた。α-smooth muscle actinに対してsiRNAを導入して発現を抑制することにより、細胞遊走が抑制された。以上の結果から、硬い基質の環境では線維芽細胞が活性化し、筋線維芽細胞へ分化し、遊走能が増強すること、α-smooth muscle actinが遊走能の亢進をを制御することが示された。また、PD-L1を強発現するヒト肺がん細胞株(HCC827細胞)を用いた実験を行い、異なる硬さのゲルに培養した時のPD-L1発現への影響を検討した。

がん細胞を軟らかなゲル(2kPa)上もしくは接着できないFalconチューブ内で培養することで、PD-L1発現が有意に抑制された。更に、PD-L1発現はcytochalasin Dによるアクチン重合阻害により抑制された。以上より、肺がんではがん組織の硬さが微小環境として肺がん細胞のPD-L1発現を制御しており、その機序として細胞接着を介したアクチン細胞骨格が関与することが示唆された。培養ヒト肺線維芽細胞を用いた課題に関しては、基質硬度依存性の研究、ATP放出に関する研究いずれにおいても英文原著論文が掲載された。また、肺がん細胞株のPD-L1発現に関する研究についても英文原著論文が掲載された。引き続き肺線維芽細胞と気道平滑筋細胞に関する研究を実行中である。細胞が足場として利用している基質の硬度を感知する基質力覚検知機構を明らかにし、肺や気道の線維化やリモデリングの病態機序を解明することを目的とした。正常ヒト肺線維芽細胞を異なる硬さのゲル上で培養する実験を行った。軟らかなゲル上で培養した細胞と比較すると、硬いゲルやプラスチック上で培養した細胞では筋線維芽細胞のマーカーであるα-smooth muscle actin (α-SMA)蛋白発現が有意に増強していた。硬いゲル(25kPa)上で培養した細胞は軟らかなゲル(2kPa)で培養した細胞と比べ細胞遊走能の増強を認めた。α-SMAのsiRNA導入により、細胞遊走が抑制された。以上より、硬い基質の環境では線維芽細胞が活性化し、筋線維芽細胞へ分化し、α-SMA発現を介して遊走能が増強することが示された。肺線維症の病態機序として、線維化に伴う肺の硬化が線維芽細胞の活性化を介して線維化を更に促進する、正のフィードバック機構が存在することが示唆された。PD-L1を強発現するヒト肺がんHCC827細胞株における基質硬度のPD-L1発現への影響を検討した。細胞を軟らかなゲル上もしくは浮遊した状態で培養すること、アクチン重合を阻害することによりPD-L1発現が抑制された。ヒト気道平滑筋細胞をコラーゲンゲル内で3次元培養し、組織工学的な平滑筋組織作成を試みた。細胞伸展装置を用いて細胞を含有したゲルに繰り返し伸展刺激を与えることにより、細胞は伸展方向に伸長配向し、平滑筋組織様の形態を呈しα-SMA発現も増強した。この3次元組織を用いて細胞内Ca2+応答を捉えることにも成功した。本法を細胞機能解析研究へ応用することが今後の目標である。培養ヒト肺線維芽細胞における基質硬度依存性の細胞分化と活性化に関する論文、ならびに機械的刺激によって誘導されるATP放出に関する論文の受領を目指し、必要に応じて追加実験を行う。引き続き、肺線維芽細胞の機能における基質硬度による制御機構に関する研究を行い、細胞力覚検知機構として働くメカノセンサーの同定を目指す。本研究で得られた知見および結果が、肺線維症の病態機序につながることが今後の目標である。
清代中期の制銭供給政策からみた清朝支配の構造的特質と中国社会との相互影響の研究

平成21年度は、『別冊環(16)清朝とは何か』(藤原書店、2009年5月)に、清代貨幣史の概説論文「貨幣史から描く清朝国家像-清朝の複合性をめぐる試論-」を書き下ろした。また、社会経済史学会第78回全国大会において、清代中期貨幣史に関して「清代乾隆年間の各省における公項財政と制銭鋳造政策」(東洋大学、2009年9月26日)と題して研究報告を行った。そして、平成18年度に筑波大学に提出した論文「清代前期制銭供給政策史の研究」にPD採用後の研究成果を盛り込んで再構成を施し、著書『清朝支配と貨幣政策-清代前期における制銭供給政策の展開-』を上梓した。その内容は、順治元年(1644)から乾隆40年(1775)頃までに清朝政府が実施した制銭供給の政策過程を分析し、複数の政策課題に包括的に取り組んでいた清朝支配の実情に即して当該政策を整合的に理解するとともに、論理を異にする国家と市場との相互影響という観点から清代前期における貨幣史の推移を歴史的かっ動態的に跡付けるものである。この他に本年度は、満族史研究会第24回大会、社会文化史学会第45回大会、第46回日本アルタイ学会、明清史夏合宿2009、藤原書店「叢書《清朝史》の会」、清朝時代史懇話会などの各種学会・研究会に参加し、情報収集と意見交換に努めた。また、著書にまとめた研究をさらに継続・発展させるべく、10月30日11月2日、12月47日の2度にわたって筑波大学中央図書館において「宮中档朱批奏摺財政類」「内閣漢文題本戸科貨幣類」『雍正朝内閣六科史書・戸科』の調査を実施した。平成19年度は,まず,中国社会文化学会2007年度大会(7月7日,於東京大学)にて,清代雍正年間の江南における銭貴(銅銭の対銀レート騰貴)に関する研究報告をおこなった。ついで,8月27日から9月7日,および11月18日から同月28日の2度にわたって,中国・北京市の中国第一歴史档案館において清朝時代の貨幣政策に関する档案史料(行政文書)『戸科史書』『内閣題本』『軍機処録副奏摺』『議覆档』等の調査を実施した。また国内では,筑波大学において,数次にわたって同じく清代档案の『宮中档朱批奏摺財政類』『宮中档乾隆朝奏摺』等の調査を行った。それらの史料調査の成果をもとに,『一橋経済学』2巻2号に論文「清代康煕後半の京師における貨幣政策と銭貴の発生」を発表,また,『満族史研究』6号に研究ノート「中国第一歴史档案館所蔵「議覆档」について」を投稿し掲載許可を得た。中国社会文化学会での報告,および『一橋経済学』所掲論文で考察を加えた銭貴は,本研究の主題である清代中期の貨幣史をとらえる上で起点となる現象であり,従来の研究ではほとんど看過されていた供給サイドの重要性を明示した。これにより,乾隆年間における制銭供給量の地域差と銅銭流通の混乱を政治史的側面から分析するための足掛かりが得られた。また,『満族史研究』所掲ノートは,これまで利用されることが皆無に近かった『議覆档』の内容を分析し,今後の自身の研究で同史料を活用していくための準備とするとともに,広く清代史研究者に便宜を供するものである。この他,満族史研究会第22回大会,第44回日本アルタイ学会,社会文化史学会第43回大会,明清史夏合宿2007等の学会に参加し,情報収集と意見交換に努めた。また,東洋文庫内国史院档研究会(隔週開催)に常時出席し,「崇徳三年档」等の満洲語史料の訳注作成に加わった。加えて1月からは,藤原書店「清朝の歴史を学ぶ会」に参加した。平成20年度は,6月911日,12月13日に筑波大学中央図書館において,「宮中档朱批奏摺財政類」「内閣漢文題本戸科貨幣類」『宮中档雍正朝奏摺』『宮中档乾隆朝奏摺』などの档案史料の調査を行い,9月1420日には中国第一歴史档案館において「内閣漢文題本(北大移交部分)」「軍機処漢文録副奏摺」などの档案史料の調査を実施した。それらの成果などをもとに,『史境』第57号に論文「清代雍正年間の各省における貨幣政策と江南の銭貴」を発表した。ここにおいて分析を加えた銭貴は,本研究の主題である清代中期の貨幣史をとらえる上で起点となる現象であり,当該論文は,従来の研究がほとんど閑却してきた銅銭の供給サイドの問題が貨幣史上にもつ重要性を明示したものである。これによって,乾隆年間における制銭供給量の地域差と銅銭流通の混乱を政治史的観点から分析することが可能になり,平成20年度の後半は当該時期の財政状況に関する新たな史料調査と分析を重点的に進めた。また平成20年度には,既発表論文「清,康煕末年から乾隆初年の京師における制銭供給と八旗兵餉」が中国国家清史編纂委員会『清史訳叢』第10輯に翻訳・掲載されることが決定し,その漢語訳作業に従事した。

この他に,中国経済学会第7回全国大会,満族史研究会第23回大会,中国社会文化学会2008年度大会,第45回日本アルタイ学会,明清史夏合宿2008,社会経済史学会第77回全国大会,歴史人類学会第29回大会,東洋文庫内国皮院档研究会(隔週開催)等の学会・各種研究会に参加し,清朝史・経済史研究に関する情報収集と意見交換に努めた。平成21年度は、『別冊環(16)清朝とは何か』(藤原書店、2009年5月)に、清代貨幣史の概説論文「貨幣史から描く清朝国家像-清朝の複合性をめぐる試論-」を書き下ろした。また、社会経済史学会第78回全国大会において、清代中期貨幣史に関して「清代乾隆年間の各省における公項財政と制銭鋳造政策」(東洋大学、2009年9月26日)と題して研究報告を行った。そして、平成18年度に筑波大学に提出した論文「清代前期制銭供給政策史の研究」にPD採用後の研究成果を盛り込んで再構成を施し、著書『清朝支配と貨幣政策-清代前期における制銭供給政策の展開-』を上梓した。その内容は、順治元年(1644)から乾隆40年(1775)頃までに清朝政府が実施した制銭供給の政策過程を分析し、複数の政策課題に包括的に取り組んでいた清朝支配の実情に即して当該政策を整合的に理解するとともに、論理を異にする国家と市場との相互影響という観点から清代前期における貨幣史の推移を歴史的かっ動態的に跡付けるものである。この他に本年度は、満族史研究会第24回大会、社会文化史学会第45回大会、第46回日本アルタイ学会、明清史夏合宿2009、藤原書店「叢書《清朝史》の会」、清朝時代史懇話会などの各種学会・研究会に参加し、情報収集と意見交換に努めた。また、著書にまとめた研究をさらに継続・発展させるべく、10月30日11月2日、12月47日の2度にわたって筑波大学中央図書館において「宮中档朱批奏摺財政類」「内閣漢文題本戸科貨幣類」『雍正朝内閣六科史書・戸科』の調査を実施した。
MST法による卵細胞質機能低下克服への挑戦：次世代への安全性の担保も目指して

昨年に引き続き、MST法の代替手段として確立した前核期胚における大量細胞質移植(PN期大量細胞質移植:以下PNCT)を施行。前年度確立した2段階法を用いた新鮮胚における検討は前年からの合計として9周期を施行し、最終的には対照群64個とPNCT群93個における検討にて、胚盤胞率(胚盤胞/2細胞)はそれぞれ76.2%と94.6%で優位にPNCT胚において高く、ATP量も高い傾向にあった。また、PNCT胚の移植により、F1マウスの獲得とF1マウスの交配によるF2産仔の獲得が確認できた。次にレスキュー実験としてBDF1マウスの加齢卵モデルとして卵管内加齢卵を用いて、卵管内加齢正常受精卵(2PN)を自己の異常受精卵細胞質(卵管内加齢異常受精卵によるPNCT:aPNCT)と他者の新鮮異常受精卵(通常IVFの異常受精卵によるPNCT:hPNCT)によるレスキューを行なった。しかしながら、胚盤胞率は卵管内加齢正常受精卵(2PN)が46.3%(n=183)であったのに対し、aPNCTとhPNCTはそれぞれ39.2%(n=185)と33.8%(n=153)でレスキュー効果を認めながら、通常の新鮮IVF卵における自己細胞質移植FRESH aPNCTの結果と矛盾していた。しかし、胚盤胞到達胚におけるATP量は優位に増加していた。そこで原因検索を行なったところ、新鮮卵においては、異常受精は3PN(ほとんどが多精子受精)が多く、卵管内加齢では1PN(単為発生)が大多数であった。その発生能は1PN胚が3PNに比して優位に低いことがわかった。つまり、1PN胚の細胞質は細胞質ドナーとして適さず、3PN胚に限定する必要があることがわかった。本研究は残念ながら本年がサポートの最終年度であるが、自己資金による研究継続を行なって研究を完結に導いていく予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の研究計画においては1加齢卵子、および低細胞質機能卵の作成と評価、および2ミトコンドリア遺伝子ハプロタイプのスクリーニングとアッセイの確立を掲げ、C57/B6雌70匹、雄28匹を使用し、11周期の顕微操作実験(MST法、MII期大量細胞質移植、PN期大量細胞質移植)、69周期のIVFを行った。1については細胞質機能低下の評価確立のため、体外受精による胚発生能の検討、細胞数の検討、胚呼吸量測定、ATPの定量を行った。加齢卵子については、卵子数確保の観点から加齢マウスよりの採卵ではなく、排卵後加齢卵子を用いた。非侵襲的胚評価法である胚呼吸量測定が胚の質や生存性と関連する細胞数、ATP量と相関すると考え、胚呼吸量を細胞質機能、胚の質の評価とする予定であった。しかしながら、呼吸量と細胞数やATPとの相関が認められず、マウス胚においては呼吸量測定を細胞質機能低下や胚の生存性の評価として用いる事に問題があると考えた。他の評価法として、ミトコンドリア遺伝子コピー数や遺伝子変異の定量的PCR法を検討している。しかし、予備実験段階で単一胚から解析に必要なGenomic DNAが得られないことがわかり、全ゲノム増幅(WGA)を行なってからの解析準備を進めている。XYCloneレーザー穿孔システムは平成28年7月に納品され、同年8月以後は細胞質置換が可能となった。マウス未受精卵においてもMST法を用いて細胞質の置換は可能であることが明らかとなった。しかし、IVFによる受精に問題があることがわかり、現在受精法の検討を続けている。また、代替手段として、卵細胞質の約1/3の大量の細胞質移植(MII期大量細胞質移植)を未受精卵で行い、成功している。若干の受精率の改善が認められるが、十分ではないため条件の検討を行なっている。また、受精直後の前核期胚における大量細胞質移植(PN期大量細胞質移)についても成功しており、こちらもその後の胚発育を確認できている。非侵襲的検査は、同一胚を移植実験に供することが可能となるので非常に有用である。当学にてヒト胚評価に有用な新規デバイスとして開発した受精卵呼吸測定装置により、マウス胚においても非侵襲的に加齢卵や低細胞質機能卵子の評価が可能と考えていた。しかしながら、マウス胚はサイズや呼吸量がヒトよりも小さく、評価のパラメーターとして問題がある可能性がわかり、他の分子生物学的パラメーターによる評価法確立を先行させている。条件設定が揃わない場合には、侵襲的検査のみでの評価とする。条件設定が決まれば解析の準備が整っているため、現時点では致命的な遅れはないと判断している。なお、細胞質置換方法としてはMST法から派生する応用技術である大量細胞質移植法を選択する必要があるかもしれない。しかし、研究の趣旨としては細胞質機能低下の克服法としての細胞質置換の有効性と安全性を検証するという目的と評価方法は変わらない。本年度の研究計画においては3細胞質移植によるレスキュー実験、4胚移植実験、および5次世代の検証を掲げており、C57/B6(B6)マウス雌20匹、雄8匹、B6D2F1(BDF1)マウス雌29匹、雄10匹を使用し、19周期の顕微操作実験、ICR雌マウス10匹を使用して2周期の胚移植を行った。

昨年に引き続き、MST法の代替手段として前核期胚における大量細胞質移植(PN期大量細胞質移植:以下PNCT)に照準を合わせて手技の確立を目指した。顕微操作10回、使用前核期胚156個を使用し、媒精後6-10時間で異常受精胚(3前核胚等)の細胞質を正常授精胚へ移植し細胞癒合を行った。まず内径の異なるピペットで直接ドナー細胞質の単離を試みたが、細胞質の破綻が約6割に生じた。そこで、卵子を脆弱な近交系B6から交雑群のBDF1へ変更し、2段階操作をおこなった。具体的にはドナーの異常胚からは小径ピペットにて前核と極体を除去し、レシピエントの正常授精胚からは極体のみを除去し1:2の割合で準備。その後大径ピペットにて細胞質移植を行ったところ、高い生存性を確認し、再構築胚は胚盤胞へ発育した。これまで9周期、240個の前核期胚を使用、胚盤胞到達率の平均は対照群、PNCT群それぞれ49.48%と66.39%(P=0.28)であり、統計学的に差を認めなかった。PNCT胚の安全性の検証としては、胚移植による産仔回復と次世代の作出を試るため2周期の胚移植を完了しているが、まだ満期に達していないため産仔は得られていない。他の胚盤胞はATP測定(66個)、ミトコンドリア遺伝子コピー数解析(10個)を現在行っている。細胞質機能低下卵子のモデルとしては、B6マウス卵子を用いてFCCPの濃度決定を行って100mMで対照群と比較して胚発育が阻害されることを見出している。細胞質移植方法が確立しPNCTにて安定した胚発育が得られている。PNCT胚の胚発育はコントロールと同等であり、現在移植による産仔の回復も見込んでいる。ミトコンドリアコピー数解析については、すでにサンプリングを終了しているため、全ゲノム増幅(WGA)や定量PCR測定を行って、細胞質移植胚におけるミトコンドリア遺伝子コピー数の増加を確認する段階に至っている。細胞質機能低下の方法としてMST法からPNCTへ変更しているが、細胞質の移植による低細胞質機能卵子のレスキューの試みとしての目的は変わらない。また、他個体からの卵子(若い卵子)提供を必要とするMST法とは異なり、PNCTは1自身の異常受精胚(廃棄される胚の細胞質)をドナーとして量的レスキューを行う方法と、2細胞周期の一致した他者の廃棄される前核期胚(異常受精胚もしくは、凍結廃棄前核期胚)の細胞質を用いた量的、質的レスキューのいずれも可能である。いずれのケースでも本法のために健常卵子ドナーを必要とせず、廃棄される胚の細胞質を利用するという点で倫理的にも優れている可能性がある。昨年に引き続き、MST法の代替手段として確立した前核期胚における大量細胞質移植(PN期大量細胞質移植:以下PNCT)を施行。前年度確立した2段階法を用いた新鮮胚における検討は前年からの合計として9周期を施行し、最終的には対照群64個とPNCT群93個における検討にて、胚盤胞率(胚盤胞/2細胞)はそれぞれ76.2%と94.6%で優位にPNCT胚において高く、ATP量も高い傾向にあった。また、PNCT胚の移植により、F1マウスの獲得とF1マウスの交配によるF2産仔の獲得が確認できた。次にレスキュー実験としてBDF1マウスの加齢卵モデルとして卵管内加齢卵を用いて、卵管内加齢正常受精卵(2PN)を自己の異常受精卵細胞質(卵管内加齢異常受精卵によるPNCT:aPNCT)と他者の新鮮異常受精卵(通常IVFの異常受精卵によるPNCT:hPNCT)によるレスキューを行なった。
薬剤性腎障害におけるクロライドチャンネルの役割についての解析

本研究は薬剤性腎障害におけるクロライドチャンネルの役割を明らかにするために企画された。腎臓において腎毒性物質に対して最も感受性が高い部位は近位尿細管の終末部(S_3部)であり、我々はまずこの部位のクロライド輸送機序についてウサギの単離尿細管を用いて主に電気生理学的に解析を試みた。その結果、S_3部の細胞内クロライド濃度は細胞内電位の変化に対応して変化すること、さらにカリウムチャンネルを阻害した状態で基底側のクロライドを除去すると脱分極を起こし、またこの反応がクロライドチャンネル阻害剤によって阻害されることを発見した。以上の観察より、我々はこの部位の基底側膜には確かにクロライドチャンネルが存在することを確認し既に報告した(J.Clin.Invest.92:1229-1235,1993)。次にサイクロスポリンなどの腎毒性物質は容量調節性クロライドチャンネルを阻害するといわれているため、我々が発見したクロライドチャンネルの性質をさらに詳しく検討した。本科学研究費により購入したビデオミクロメーターによる細胞容量の測定実験などからこのチャンネルは生理的条件下で働いており、細胞容量の変化とは直接関係なしに細胞内cAMPの増加によって活性化されることが示され、また容量調節性クロライドチャンネルの阻害剤によっても影響を受けないことも確認した。ただし我々はこうした一連の実験の過程で、上記のチャンネルとは異なった性質を持つクロライドチャンネルが同一部位に存在することを発見しており、後者のチャンネルと細胞容量調節機構および腎毒性物質との関連について今後検討する予定である。
極短時間パルス放電による高活性流動場形成過程のマルチフィジックス解析と応用

本研究では,極短時間パルス放電による内燃機関の燃焼促進効果を明らかにすることを目的とし,放電形成モデルとプラズマ化学反応モデルを統合した解析モデルを構築し,内燃機関における着火時の条件である10気圧,600 Kにおけるメタン・空気希薄混合気中の誘電体バリア放電もしくは針状電極間ナノパルス放電を対象として二次元数値シミュレーションを行った。本研究により,極短時間パルス放電構造および放電により生成されるラジカル種の数密度分布などの基礎特性やラジカル生成における電子エネルギー分配機構が明らかとなった。さらに,放電により生成されたラジカルにより,着火遅れが大幅に改善されることが示された。本研究では,ナノ秒パルス放電による高活性化学種の生成過程ならびに流動による高活性化学種の輸送・拡散過程という異なる時間スケール有するマルチフィジックス現象を統合的に解析する手法を創出し,内燃機関およびガスタービンでのプラズマ燃焼促進を目的として高温・高圧の極限環境下における高活性化学種の生成および輸送特性を明らかにするものである。平成25年度においては,米国オハイオ州立大学のAdamovich教授との共同研究により,窒素や空気・メタン混合気を対象とした極短時間パルス放電実験を行い,電子衝突に伴う分子解離過程,放電による気体の高速加熱,化学的高活性種の生成過程および燃料酸化反応をCARSやTALIF等の最先端レーザー計測により明らかにし,プラズマ素反応モデルの妥当性を評価するとともに,高精度プラズマ燃焼反応モデルを確立した。次いで,平成24年度に開発したプラズマ燃焼促進解析コードおよび実験との統合解析から,圧力や温度および誘電体の誘電率等の作動条件がラジカル生成に与える効果を解明した。得られた数値計算結果をもとに,プラズマ燃焼促進に関する基礎実験装置および計測系を確立し,得られた一連の成果をスペインのグラナダにおいて行われた電離気体現象に関する国際会議において招待講演として発表するとともに,国内および国際誌に投稿し,掲載された。研究の初年度である平成24年度では,空気・メタン混合気中でのプラズマ化学反応モデルを構築し,ナノ秒パルス放電におけるDBD(誘電体バリア放電)シミュレーション手法を確立した。プラズマ化学反応や光電離過程を考慮したDBDストリーマの詳細シミュレーションにより,ナノ秒パルス電圧印加時におけるストリーマの進展過程およびラジカル生成過程を明にし,非平衡プラズマによる内燃機関の燃焼促進のための圧力および温度に対するラジカル生成特性を示した。さらに,放電エネルギーの定量評価も行い,ラジカル生成のための最適作動条件を示した上で,メタン・空気予混合気の燃焼促進効果を検証した。その結果,印加電圧を増加させると,誘電体表面における荷電粒子の蓄積により,放電電圧がより急速に低下するため,誘電体部でのエネルギー損失が大きくなることや,印加電圧に対し,放電エネルギーに対する酸素ラジカル濃度に最適値が存在することが明らかとなった。また,メタン・空気希薄予混合気における着火遅れ時間は,印加電圧が高く,放電による酸素ラジカルの生成量が大きいほど短くなり,高温・高圧条件下においても,極短時間パルス放電による明確な着火促進効果が得られた。本年度により得られた一連の成果は,招待講演および国内外での学会において発表されたとともに,国内学会誌に掲載された。本研究は,ナノ秒という極短時間に高電圧を印加し,非平衡プラズマを生成するナノ秒パルス放電による高活性化学種の生成過程ならびに流動による高活性化学種の輸送・拡散過程という異なる時間スケールを有するマルチフィジックス現象を統合的に解析する手法を創出し,内燃機関およびカスター便でのプラズマ燃焼促進を目的として高温・高圧環境下における高活性化学種の生成および輸送特性を明らかにするものである。平成26年度においては,研究協力者である米国オハイオ州立大学のAdamovich教授との共同研究により,平成25年度に確立したメタン・空気混合気におけるプラズマ素反応モデルを用い,金属電極間に生成されるプラズマの生成過程および電子衝突反応を起点として形成される反応性化学種を定量的に評価した。また,プラズマに投入されたエネルギー収支を明らかにすることにより,高活性化学種生成のための最適条件を示した。さらに,プラズマにより生成された高活性化学種により,着火遅れが最大で70%程度改善することが明らかとなり,ナノ秒パルス放電による燃焼促進の有用性が示された。平成26年度において得られた一連の成果は国内および国際学会において発表されるとともに,国際論文誌に掲載された。電磁流体工学当初の研究計画に基づき順調に研究が行われ,国内外での学会発表や招待講演,学術論文誌掲載されるなどの研究成果が得られたため当初の研究計画に基づき順調に研究が行われ,国内外での学会発表や招待講演,学術論文誌掲載されるなどの研究成果が得られたため。

平成26年度においては,本研究により確立されたナノパルス放電解析コードを用い,より広い範囲における圧力・温度条件下での気体加熱効果および高活性種の生成特性を明らかにし,プラズマ燃焼促進に対する作動条件の最適化を行う。さらに,平成26年度の下半期においては,これまで得られた知見を基にし,多点プラズマリアクターの設計および開発を行う。本研究で提案する多点プラズマリアクターは,円周方向に多点の高活性プラズマジェット生成部を有しており,プラズマにより生成される高濃度の高活性化学種をより効率的かつ集中的に対象部に供給することが可能となることから,格段の高性能化が期待できる。米国オハイオ大学との共同研究により,多点プラズマリアクターにおける燃焼促進効果を明らかにするとともに,その有用性を評価する。本研究に得られた成果を取りまとめ,国際・国内会議および論文発表等により成果を発信する。今後は,米国オハイオ州立大学において,Adamovich教授との共同研究により,窒素や空気・メタン混合気を対象とした極短時間パルス放電実験を行い,電子衝突に伴う分子解離過程,放電による気体の高速加熱,化学的高活性種の生成過程および燃料酸化反応をCARSやTALIF等の最先端プラズマレーザー計測により明らかにし,プラズマ素反応モデルの妥当性を評価するとともに,高精度プラズマ燃焼反応モデルを確立する。さらに,平成24年度に開発したプラズマ燃焼促進解析コードおよび実験との統合解析から,圧力や温度および誘電体がラジカル生成に与える効果を解明する。さらに,得られた数値計算結果をもとに,プラズマ燃焼促進に関する基礎実験装置および計測系を確立する。国際会議ならびに国内学会に参加し,本研究課題に関する世界ならびに国内における研究動向を調査し,本研究の位置付けを明確にするとともに,得られた成果を適宜発表する。共同研究先である米国オハイオ州立大学のAdamovich教授を訪問予定であったが,先方の都合により訪問することが不可能となったため。本研究課題の最終年度である平成26年度において,共同研究先であるAdamovich教授を訪問し,前年度の研究成果を報告するとともに,さらに研究を深化させるべく綿密な研究計画の策定と討論を行う予定である。次年度における研究費は,主に共同研究のための米国オハイオ大学訪問および研究成果発表および研究動向調査のための旅費に使用される予定である。また,計算機の購入も予定してる。
下垂体腺腫におけるインプリント異常を含むDNAメチル化脱制御の解析

正常組織でのインプリント機構は厳密に制御され、その領域の遺伝子は細胞増殖や分化に重要な役割を果たすとされるが、下垂体腺腫におけるインプリント機構が維持されているのか不明である。MEG3が位置する14q32.2に位置するインプリントDLK1-DIO3領域内に位置するmiRNAクラスターもFSH/LH産生腺腫で発現低下を確認している。NNAT遺伝子発現はACTH産生腺腫で増加しているが、H19から産生されるmiR-675により抑制される可能性がある(miRDB, TargetScanによる予測)。ACTH産生腺腫におけるH19の低下に伴うmiR-675の低下が、NNAT発現上昇に影響した可能性も考えられる。また、マイクロアレイ解析でACTH産生腺腫/ナルセル腺腫におけるmiR129a-5pの発現低下を認めているが、NNATがmiR-129a-5pの標的候補でもあるため、今後、miR-675およびmiR-129a-5pによるNNAT発現調節の検討が必要である。下垂体腺腫におけるインプリント遺伝子発現に各タイプで差異を見出した。このことは各タイプの下垂体腺腫では正常下垂体に比してインプリント遺伝子発現制御の破綻が存在することを示唆する。インプリント遺伝子発現はアレル間でメチル化状態の異なる領域(DMR: differentially methylated region)により調節されているが、各タイプの下垂体腺腫でDMRのメチル化状態が異なることが予想される。このメチル化状態はMS-MLPA法、パイロシークエンス法、バイサルファイトシークエンス法などで検討を開始している。各タイプの下垂体腺腫におけるインプリント遺伝子発現量の解析(リアルタイムPCRによる)について、さらに下垂体腺腫の例数を増やすことが必要である。また、各タイプの下垂体腺腫においてゲノム全体の低メチル化(ゲノム不安定性を誘発し発がんに関与するとされる)が認められるか否かを、LINE-1の5'非翻訳領域のDNAメチル化状況をパイロシークエンス法により解析する。ゲノム全体の低メチル化はLINE-1のメチル化レベルが指標となることが知られている。さらに正常下垂体に比べて各タイプの下垂体腺腫において発現の差異が認められるインプリント遺伝子においては、インプリント遺伝子発現調節領域のメチル化異常の有無について、MS-MLPA法、パイロシークエンス法、バイサルファイトシークエンス法で解析する。各下垂体腺腫におけるインプリント遺伝子の発現解析に焦点を当てたので、当初予定した遺伝子発現調節領域のメチル化解析にまでは至らなかった。このため高額であるMS-MLPAキットを購入しなかったことより次年度使用額が生じることになった。平成31年度にはMS-MLPAキットを購入する予定であり、物品費が多くなる予定である。
溶融シリコン中のリンの熱力学的研究

平成7年度に作製したリンガス発生器により制御された一定のリン分圧下で溶融シリコンを平衡させることにより、シリコン中へのリンの溶解の自由エネルギー変化を求めた。一定温度でリン分圧を変化させた実験ではリン濃度が0.1mass%以下ではヘンリー則が成立することが明らかになり、温度依存性から溶解の自由エネルギー変化としてΔG^0=-139,000+43.5T(kJ/mol)が得られた。平成8年度は、太陽電池用シリコン中の不純物元素について熱力学的考察を行った。太陽電池シリコンの不純物の中でチタンや鉄の熱力学的性質について、シリコンと相互溶解度の非常に小さい鉛を用いて測定を行った。まず、チタンの濃度を変えてシリコン-鉛間のチタンの1723Kにおける分配比を測定し、回帰分析によりシリコン中チタンの無限希薄状態における活量係数としてγ^0_<Ti(I)-Si>=4.48x10^<-4>、相互作用係数としてε^<Ti>_<Ti in Si>=3.97、ε^<Ti>_<Pb in Si>=13.2を得た。またシリコン-チタン二元系溶液の混合自由エネルギー変化として以下の関数を得た。同様にして鉄濃度を変化させてシリコン-鉛間の鉄の分配比を同温度で測定し以下の分配比を測定し、回帰分析によりシリコン中鉄の無限希薄状態における活量係数としてγ^0_<Fe(I)-Si>=2.85x10^<-2>、相互作用係数としてε^<Fe>_<Fe in Si>=3.17、ε^<Fe>_<Pb in Si>=14.1を得た。以上、溶融シリコン中でのリン、チタンおよび鉄の熱力学的性質を明らかにし、その除去の検討に非常に有用な知見を得た。本年度は太陽電池用シリコンの精製においてその除去が困難とされるりんがシリコン中に溶解する際の標準自由エネルギー変化を一定のりん分圧下で溶融シリコンを平衡させることにより測定した。まず、一定のりん分圧を制御するためのりんガス発生器を作製し、固体りんがアルゴンガスに飽和する最適条件を模索し、所定のりん分圧に制御されるガス発生条件を確認しアルゴンガスの流量を190mlとした。また、シリコンに先立ち溶融銀を平衡させ、既存の銀中へのりんの溶解反応の自由エネルギー変化からりん分圧を求め、制御している分圧と一致することを確認することにより本実験方法の妥当性を明らかにした。次に、1550°Cにおいて種々のりん分圧下で溶融シリコンを用いて実験を行い、りん分圧と実験後のシリコン中のりん濃度との関係を得た。P2ガスの分圧の平方根とシリコン中のりん濃度は0.1mass%以下では比例関係にあることから、本濃度域ではヘンリー則が成立していることがわかり、また同温度でのシリコン中へのりんの溶解反応の自由エネルギー変化が求められた。さらに実験温度を14501600°Cの範囲で変化させて実験を行い、上記自由エネルギー変化と温度の間には直線関係が得られ、次のような温度関数が求められた。ΔG^0=-139,000+43.5T(J/mol)また、この値は銀に比べて大きいものの鉄やマンガン等へのりんの溶解反応の値に比べて小さい値であり、鉄では困難である真空精錬がシリコンでは可能であることを示唆しており、報告されている事実と一致している。現在は、真空精錬の定量的評価を検討中であり、今後本シリコンにマンガン等のシリコンと親和性の高い元素を添加した実験を計画している。

昨年度のリンに引き続き、太陽電池用シリコン中の不純物元素について熱力学的考察を行った。太陽電池シリコンの不純物の中でチタンや鉄の熱力学的性質について、シリコンと相互溶解度の非常に小さい鉛を用いて測定を行った。原理的には、溶融鉛と溶融シリコンを平衡させ、鉛とシリコン中の鉄およびチタンの分配比を測定することにより得られるが、鉛およびシリコン中にそれぞれ不純物元素以外に僅かにシリコンおよび鉛がとけ込むためそれらの相互作用を無視できない。そこで本研究ではそれぞれの相互作用についても明らかにした。まず、チタンの濃度を変えてシリコン-鉛間のチタンの1723Kにおける分配比を測定し、回帰分析によりシリコン中チタンの無限希薄状態における活量係数としてγ^0_<Ti(1)-Si>=4.48x10^<-4>、相互作用係数としてε^<Ti>_<Ti in Si>=3.97、ε^<Ti>_<Pb in Si>=13.2を得た。またシリコン-チタン二元系溶液の混合自由エネルギー変化として以下の関数を得た。同様にして鉄濃度を変化させてシリコン-鉛間の分配比を同温度で測定し以下の分配比を測定し、回帰分析によりシリコン中鉄の無限希薄状態における活量係数としてγ^0_<Fe(I)-Si>=2.85x10^<-2>、相互作用係数としてε^<Fe>_<Fe in Si>=3.17、ε^<Fe>_<Pb in Si>=14.1を得た。以上の結果から、リンに引き続き1723Kにおけるシリコン中のチタンおよび鉄の熱力学的性質を明らかにし、その除去の検討に非常に有用な知見が得られた。
抗IgE自己抗体の病態生理学的意義

氣管支喘息患者血清中にIgEに対する自己抗体である抗IgE自己抗体が高率に証明される。この抗体はIgGクラスに属し血清中において自己のIgEと免疫複合体を形成している。新たに開発した固相酵素抗体法により、大量の検体についてこの抗IgE自己抗体の存在の有無を測定することを可能にした。その結果、この抗IgE自己抗体は、氣管支喘息のみならず、アトピー性皮膚炎,アレルギー性鼻炎,川崎病,食物アレルギー,寄生虫感染症などの疾患患者血清中に存在した。本年度の研究ではIgGクラスに属する自己抗体がいかなるサブクラスに属するかを検討した。氣管支喘息患者12名,アトピー性皮膚炎患者10名および高IgE症候群患者4名の血清を用いた。血清中の抗IgE自己抗体のIgGサブクラスの測定は、マイクロタイター・プレートに精製したヒトIgE骨髄腫蛋白を固相に固着し洗條後被検血清を添加してIgGクラスの抗IgE自己抗体を反応固着させる。次いでマウスモノクローナル抗ヒトIgGサブクラス(G1,G2,G3,G4)抗体を反応させ洗浄する。さらに、アルカリホスファターゼ標識抗マウスIgG抗体を反応させた後、基質を添加してアルカリフォスファターゼを発色させ吸光度405nmにて測定しIgGサブクラスの抗IgE自己抗体を測定した。(結果)氣管支喘息,アトピー性皮膚炎,高IgE症候群における抗IgE抗体のIgGサブクラスは、IgG1,IgG3,IgG4が認められ疾患群間に出現頻度,力価の違いは認められなかった。しかし、IgG2に属する自己抗体は、氣管支喘息と高IgE症候群の各1例に検出されたのみである。正常者血清中のIgGサブクラスの濃度を考慮すると、IgG4に属する自己抗体に検出濃度が比較的高いと推定される。IgG2に属する抗体がほとんど検出されない原因は現在不明である。
先端ナノプローブ分光測定によるトポロジカル物質の解明

新規開発したダイヤモンドNVセンターを用いた局所磁場測定システム磁場の空間分解測定に関する研究を実施した。広視野光学顕微鏡を用いてダイヤモンドNVセンターESRイメージングに成功し、高速sCMOSカメラを用いた独自の方式の広視野マイクロ波周波数変調イメージングにより磁場分解能が向上することを示した。温度可変クライオスタット中のトポロジカル候補物質を評価するためのダイヤモンドNVセンターESRイメージングシステムを構築した。ヘリウムクライオスタット試料ステージのマイクロ波照射による温度上昇を最小限とするため、A02班柏谷氏と共同で2.9 GHzにインピーダンスマッチングしたマイクロ波アンテナを設計、製作し、クライオスタットの外部から試料にマイクロ波を照射するシステムを開発し、超高感度磁場測定に十分な性能を達成した。トポロジカル絶縁体薄膜に外部磁場を印加して磁化させた後に、その磁化によって生じる磁場ベクトルを、4方向の結晶軸のNVセンターの電子スピン共鳴位置から再構成された。複数の試料温度において薄膜試料に水平、垂直方向の磁場を印加して磁化させたそれぞれの場合について、磁化により生じた磁場ベクトルを得た。その結果、バルクではc軸方向であった磁化ベクトルが薄膜ではc軸と垂直の面内方向であることが示された。さらにA01班前野氏、A02班柏谷氏と共同でSQUIDを用いたp波超伝導体Sr2RuO4-Ru共晶の渦糸の分布の研究を実施した。本研究で得られた成果は、新奇トポロジカル物質中の電流密度・磁場分布の空間分解測定を通じた新規な物性の開拓研究に寄与するものである。29年度が最終年度であるため、記入しない。(1) Nb弱結合走査型ナノSQUID顕微鏡を用いて、集束イオンビームで形成したタングステンカーバイド膜の周りの磁場イメージングをヘリウム温度において行い、タングステンカーバイド膜の超伝導特性の評価を行った。その結果、タングステンカーバイド膜上での磁場の低下は0.9%と小さいことが見いだされた。この結果は、渦糸が侵入していることを仮定したモデル計算で定性的に理解された。(2)低温から室温の広い範囲で動作するためトポロジカル物質の評価に適したダイヤモンド窒素不純物-欠陥(NV)センターからの発光を用いた局所磁場測定システムを開発した。連携研究者の協力を得て超高純度ダイヤモンドにイオン注入して作製したダイヤモンドNVセンターを磁場センサーとして用いた。マイクロ波周波数変調法を適用し、マイクロ波周波数を変調しない定常マイクロ波を用いた場合と比較して磁場感度を向上させることに成功した。磁場感度と関わる電子スピン共鳴のコントラストと線幅のマイクロ波強度、レーザー励起強度依存性を調べ、測定に用いた励起光強度領域ではNVセンター中スピンの横緩和時間で制限されていることが明らかになった。レーザーリソグラフィーで作製した金ワイヤを流れる電流によって生じる磁場を検出し、そのイメージングに成功した。(3) BiSbTeSe系のトポロジカル候補物質に電極を形成し、基礎的電気伝導特性の評価を行った。得られた磁気コンダクタンス特性はHikami-Larkin-Nagaokaの式でフィットされ、トポロジカル物質の特性の一つである弱反局在効果が生じていることが示された。当初の計画通り(1)Nb弱結合走査型ナノSQUID顕微鏡を用いて集束イオンビームで形成しタングステンカーバイドのまわりの磁場分布を測定してその超伝導特性の評価を行った点、(2)低温から室温の広い範囲で動作するトポロジカル物質の評価に適したダイヤモンド窒素不純物-欠陥(NV)センターを用いた局所磁場測定システムの開発に成功し、高感度の磁場の空間分布測定を行い、電流によって生じる磁場の分布を得た点、さらに、(3)トポロジカル候補物質BiSbTeSe系の物質に電極を形成し、基礎的電気伝導特性を評価してトポロジカル物質を特徴づける弱半局在効果を観測した点、以上において概ね当初計画通りに進んでいると判断される。

本研究で得られた成果は、新奇トポロジカル物質中の電流密度・磁場分布の空間分解測定を通じた新規な物性の開拓研究に寄与するものである。現時点で概ね当初計画通りに進んでいると判断されるため、平成29年度も当初計画にのっとり新奇トポロジカル候補物質中を流れる電流密度の空間分布測定、候補物質に誘起される磁場の空間分布測定を行い、新奇物性の探求を遂行していく。磁場の空間分布測定法により、新奇トポロジカル物質の理解と新奇物性の探求を進めていく。29年度が最終年度であるため、記入しない。
腰椎椎間板ヘルニアの吸収促進と疼痛コントロールについて

SDラット36匹を用い、次の3群を作成した。髄核+線維輪群(n=12):麻酔下ラットの尾椎を切断し、髄核と線維輪を含む椎間板を3x3mmの鋭利な円形刃で切り抜いて、それを同じラットのL5/6椎弓間からL5椎体の後硬膜外腔(左側のL5神経根上)に自家移植した。L5/6間の黄色靱帯は硬膜外腔への外部からの肉芽組織の進入を防止する目的で縦切開のみ行い温存した。線維輪群(n=12):同様に摘出した尾椎椎間板から線維輪のみを3x3mmの大きさで切り抜き。これを「髄核+線維輪群」と同じ方法でL5椎体の後硬膜外腔に自家移植した。Sham群(n=12):同様にラットの尾椎を切断し、L5/6間の黄色靱帯の切開のみを行った。各群ともに処置後7、14、21、28日で3匹ずつ屠殺(4%パラホルムアルデヒドで灌流固定)した。L5椎を摘出し椎間板を移植した部の脊柱管を観察すべく脱灰組織標本を作成し、H-E染色での形態計測と抗マクロファージ、抗IV型コラーゲン(新生血管の基底膜を認識)抗体を用いての免疫組織化学染色を行った。また、処置前と処置後1、3、7、14、21、28日に生存する全てのラットに対して10gのvon Freyフィラメントを用いてアロディニアの観察を行った。髄核+線維輪群においては、後硬膜外腔に移植された自家椎間板組織は処置後2週より新生血管に囲まれて細片化し、マクロファージによる貧食と線維芽細胞の浸潤によって経時的に縮小、線維化した。炎症細胞の浸潤は2週が最も強くアロディニアの最大発現時期と一致していた。線維輪群では血管増生と炎症細胞の浸潤は比較的弱く、アロディニアの発現も弱かった。Sham群では硬膜外腔の炎症反応とアロディニアはいずれも観察されなかった。以上の結果は、椎間板ヘルニアの吸収過程は炎症反応そのものであり、神経因性疼痛と相関することを実証するものである。【目的】ヘルニアの自然消退過程と神経根性疼痛の関係を明らかにすべく,体重300-350gのSDラット30匹を用い、以下の実験を行った.【方法】尾椎の2椎間に圧迫が加わるようにイリザロフタイプの圧迫装置を4週,8週,12週間装着した(4週群,8週群,12週群,それぞれn=6).装着解除後,ただちに尾椎を切断し,圧迫椎間の髄核のpHをマイクロpHメーターで計測した.計測後,髄核を線維輪と共に摘出し,椎弓下に左側L4,L5神経根上に留置した.対照は無処置ラットの尾椎で同様にpH計測の後,髄核+線維輪モデルを作成した(対照群,n=6).経時的に処置後3週まで両足部の圧,熱刺激に対する感受性の変化を観察した.統計学的にはt検定を用いて,P<0.05で有意差ありと判定した.【結果】4週群,8週群,12週群のpHはそれぞれ685,6.90,7.07であり,対照群のpH7.18と比較すると,4週群,8週群で有意に低下していた.対照群を含めた全ての群で処置後2日目から患側足部に圧刺激に対する痛覚過敏が出現したが,圧迫群は対照群に比し痛覚過敏の程度は大き<,4週群では処置後11日まで,8週群では処置後7日まで,12週群では処置後4日まで痛覚過敏の増強を認めた.運動麻痺,熱刺激に対する痛覚過敏の発現は観察されなかった.【考察】本研究は(1)動物モデルで圧迫により変性を受けた髄核が正常の髄核よりも強く疼痛反応を引き起こすこと,(2)圧迫を受けた変性髄核の中でpHが低い4週群,8週群の方が,pHがそれほど低くない12週群よりも長期にわたって疼痛反応を増強させること,の2点を初めて明らかにした.しかしながら,椎間板組織そのものの形態学的な縮小度と痛覚過敏反応は統計学的な相関を認めなかった.今後消退過程にあるヘルニア組織の形態学的,免疫組織化学的所見と疼痛反応の関係について調べる予定である.SDラット36匹を用い、次の3群を作成した。