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カルモデュリンと薬物, オリゴペプチドとの複合体の結晶学的研究

略号CaM=カルモデュリン(1)各種複合体の結晶化:a)Ca^<2+>-CaM-トリフルオペラジンまたはクロルプロマジンの三元複合体の再現性良い結晶化条件を確立した. b)Ca^<2+>-CaM-Xリチンの三元複合体の結晶化にも成功し,X線結晶学的な同定も行った.c)Ca^<2+>-CaM-マストパランの三元複合体については,球晶を得るに止った. d)上記a)の複合素について,数種の他の薬物も試み,別の結晶形に誘導しようとしたが,同形のものしか得られなかった.(2)Ca^<2+>-CaM-クロルプルマジン複合体結晶のX線解析の試み:a)この結晶の長いc軸(178A2F2(コード))が通常の自動回折計による強度測定に際して重大な障害となることを計算機シミュレーションによって予見したが,実際,使用に堪え得るデータは4A2F2(コード)分解能程度までであることを体験した.シンクロトロン放射光による発散性の少ないビームの使用も試みたが,実験ハッチの温度上昇のため良いデータはとれなかった.今後二次元的な検出器による測定に切りかえる予定である.b)重原子同型置換体としてはK_2PtCl_4とPb(CH_3COO)_2であることを確認した.(3)イオン交換HPLCによる複合体の分離:Ca^<2+>-CaM-メリチン複合体のみがDEAE-5PWカラムを用いたAPLCにより検出され,マストラパラン及びその誘導体では有免な結合が保持されていないことが示唆された.(4)メリチン,マストラパラン,マストラパラン誘導体(T'-14, T'-11)についての生化学的研究:a)メリチン,マストラパランはCaM-Sepharoseと同程度結合するが,同一条件下では,マストラパラン誘導体は結合が減少している.b)メリチンに見られる溶血活性は,マストラパラン及びその誘導体では顕著な活性は認めされなかった.略号CaM=カルモデュリン(1)各種複合体の結晶化:a)Ca^<2+>-CaM-トリフルオペラジンまたはクロルプロマジンの三元複合体の再現性良い結晶化条件を確立した. b)Ca^<2+>-CaM-Xリチンの三元複合体の結晶化にも成功し,X線結晶学的な同定も行った.c)Ca^<2+>-CaM-マストパランの三元複合体については,球晶を得るに止った. d)上記a)の複合素について,数種の他の薬物も試み,別の結晶形に誘導しようとしたが,同形のものしか得られなかった.(2)Ca^<2+>-CaM-クロルプルマジン複合体結晶のX線解析の試み:a)この結晶の長いc軸(178A2F2(コード))が通常の自動回折計による強度測定に際して重大な障害となることを計算機シミュレーションによって予見したが,実際,使用に堪え得るデータは4A2F2(コード)分解能程度までであることを体験した.シンクロトロン放射光による発散性の少ないビームの使用も試みたが,実験ハッチの温度上昇のため良いデータはとれなかった.今後二次元的な検出器による測定に切りかえる予定である.b)重原子同型置換体としてはK_2PtCl_4とPb(CH_3COO)_2であることを確認した.(3)イオン交換HPLCによる複合体の分離:Ca^<2+>-CaM-メリチン複合体のみがDEAE-5PWカラムを用いたAPLCにより検出され,マストラパラン及びその誘導体では有免な結合が保持されていないことが示唆された.(4)メリチン,マストラパラン,マストラパラン誘導体(T'-14, T'-11)についての生化学的研究:a)メリチン,マストラパランはCaM-Sepharoseと同程度結合するが,同一条件下では,マストラパラン誘導体は結合が減少している.b)メリチンに見られる溶血活性は,マストラパラン及びその誘導体では顕著な活性は認めされなかった.(A)各種複合体の結晶化:結晶化の条件を適宜変化させて良質の結晶を得るべく努力した。例えば、母液のPHを下げること、ポリエチレングリコール8000を用いることにより、【Ca^(2+)】-CaM-トリフルオペラジンまたはクロルプロマジンの結晶は生成速度が早くなるかあるいは粒が大きくなるなどの効果があった。既に、【Ca^(2+)】-CaM-メリチン複合体の結晶化に成功しているが、メリチンあるはマストパランとCaMの複合体結晶について、ペプチドと【Ca^(2+)】-CaMとの1:1(モル比)複合体を後述のようにHPLCによって大量に分取してから従来法により結晶化するなど改良を加えている。(B)【Ca^(2+)】-CaM-クロルプロマジン複合体結晶の重原子同型置換とX線構造解析:Soakingの条件等を確立した。【K_2】Pt【Cl_4】では0.2-0.5mM、Pb(【(CH-3C00)-2】では2-5mMで約2日間SoaKingした。格子定数はそれぞれ元の結晶とほとんど同じ、4【A!゚】分解能の回析強度データを集めた。構造因子の相対変化は13-14%程度であった。

(C)ペプチドと【Ca^(2+)】-CaMとの相互作用のCDスペクトルによる解折:マストパランT'-11とT'-14は30%-75%のTFE添加により新たに200-230nmに差スペクトルが観察された。(D)イオン交換HPLCによる【Ca^(2+)】-CaM-ペプチド複合体の分離:メリチンと【Ca^(2+)】-CaMのモル比を0,0.4,0.8,1.7と変えて混合しDEAE-5PWカラムに添加してから0-0.4Mの食塩濃度直線勾配により溶出した。【Ca^(2+)】-CaMに対するメリチンの相対比を増すに従い、CaMの溶出位置より前に複合体が溶出された。複合体の確認は当該画分の一部分をPhenyl-5PW(RP)逆相カラムにかけ、20-50%TFAで溶出し、メリチンとCaMに分離することにより行った。
大気大循環モデルを用いた北極振動の季節変化と夏季の北極振動の実態解明

北半球の気候変動を支配する大気現象として、北極振動(AO)が存在する。これまでAOに関する研究は冬季に限られており、夏季AOに関する研究はほとんど存在しない。そこで、本研究では夏季AOの存在と、冬季AOと夏季AOや夏季の大気循環の関係を研究することを目的とした。本年度は、大気大循環モデルや大気海洋結合モデルにより再現された、夏季AOのモデルでの統計的再現性を調べた。その結果、モデルの中でも夏季AOが存在することがわかった。さらに、今後地球温暖化した場合の夏季AOはどのように変化していくのかも解析するために、温暖化実験結果における夏季AOの存在を調べた結果、温暖化実験においても夏季AOが再現されていることがわかった。また、データ解析の中でも、2003年にヨーロッパを襲った猛暑や日本の冷夏について解析し、夏季AOが卓越したことによりヨーロッパの猛暑と日本の冷夏が同時に起こっていたという事実を明らかにすることができた。さらに、冬季AOと夏季大気循環との関係を調べた結果、冬季AOの変動が積雪や海氷などに影響し、その影響が春から夏へと待続し、夏季の大気循環と関係があることもわかった。特に日本に関していえば、日本の気候に影響を与える夏季オホーツク海高気圧と冬季AOが関係していることがわかった。なお、上記の研究結果を効率的に行うために、AOを発見した気候変動研究の世界の第一人者であるワシントン大学のProf.Wallace氏と議論するためにWallace氏の所へ訪問することができ、これまでの夏季AOの存在についての研究結果報告と今後の研究についての打ち合わせもすることができた。
磁場援用アーク放電プラズマによるダイヤモンドの気相合成に関する研究

アーク放電プラズマジェットCVD法はダイヤモンドを高速に合成できる特徴をもつが,厚さが不均一で結晶性の不均質な膜が生成しやすい欠点がある.この欠点を改善するためには,生成されるプラズマの状態を一様にすることが必要である.本研究は,イオンおよび電子を含む電離気体であるプラズマが磁場の影響を受けることを利用し,電磁コイルを備えたアーク放電プラズマジェットCVD装置を設計,試作し,アークおよびプラズマジェットに磁場を印加してダイヤモンド合成を行い,得られる膜の形状や結晶性について評価し,アーク放電プラズマジェットCVD法によるダイヤモンド合成に与える磁場の影響を検討したものである.試作した磁場援用アーク放電プラズマジェットCVD装置は直流プラズマト-チ,真空チャンバ,基板冷却ホルダおよび電磁コイルから構成され,最大830ガウスの磁場をプラズマジェット軸方向にその中心位置を変化させて印加できるようにした.まず,肉眼観察により,プラズマジェット生成部に磁場を印加するとプラズマジェット径は広がることを確認した.このときの基板の温度を熱電対で測定した結果,基板温度は基板中心部で一様になることがわかった.そして,磁場を印加してダイヤモンド合成を行うと,磁束密度の増加とともに膜厚および粒径が均一で,結晶の配向の変化が小さい均質な結晶性を有するダイヤモンド膜が合成されることを明らかにした.これらの基板温度や得られるダイヤモンドの均一化は,磁場の印加によりプラズマジェット内のアークが回転運動することにより,プラズマの温度が一様になり,ダイヤモンド合成に寄与する活性種の分布が均一になるためと考えられる.アーク放電プラズマジェットCVD法はダイヤモンドを高速に合成できる特徴をもつが,厚さが不均一で結晶性の不均質な膜が生成しやすい欠点がある.この欠点を改善するためには,生成されるプラズマの状態を一様にすることが必要である.本研究は,イオンおよび電子を含む電離気体であるプラズマが磁場の影響を受けることを利用し,電磁コイルを備えたアーク放電プラズマジェットCVD装置を設計,試作し,アークおよびプラズマジェットに磁場を印加してダイヤモンド合成を行い,得られる膜の形状や結晶性について評価し,アーク放電プラズマジェットCVD法によるダイヤモンド合成に与える磁場の影響を検討したものである.試作した磁場援用アーク放電プラズマジェットCVD装置は直流プラズマト-チ,真空チャンバ,基板冷却ホルダおよび電磁コイルから構成され,最大830ガウスの磁場をプラズマジェット軸方向にその中心位置を変化させて印加できるようにした.まず,肉眼観察により,プラズマジェット生成部に磁場を印加するとプラズマジェット径は広がることを確認した.このときの基板の温度を熱電対で測定した結果,基板温度は基板中心部で一様になることがわかった.そして,磁場を印加してダイヤモンド合成を行うと,磁束密度の増加とともに膜厚および粒径が均一で,結晶の配向の変化が小さい均質な結晶性を有するダイヤモンド膜が合成されることを明らかにした.これらの基板温度や得られるダイヤモンドの均一化は,磁場の印加によりプラズマジェット内のアークが回転運動することにより,プラズマの温度が一様になり,ダイヤモンド合成に寄与する活性種の分布が均一になるためと考えられる.
明治期文芸書の〈装い〉に関する研究――木版口絵を中心に――

本研究は、明治期に木版を用いて摺刷された口絵について、その在り様と意義を明らかにすることを目的とする。2018年度は、1.近代木版口絵のデジタル研究環境の整備、2.1を活用した近代木版口絵の制作過程と体制に関する考察を行った。具体的な研究内容や意義などは、以下の通りである。1.近代木版口絵のデジタル研究環境の整備近代木版口絵が〈扱いにくい〉資料として学界から長年敬遠されてきた点に着目し、その研究環境を整備すべく、国内外のコレクションについてデジタルアーカイブを構築することに着手した。デジタル撮影にあたっては立命館大学アート・リサーチセンターが蓄積してきたノウハウを応用し、その成果は同センターのデータベースシステムを活用して公開されている。研究環境基盤が整備されることは本研究にとって有益なだけでなく、今後、関連諸研究の発展を促進させるなど、様々な効果が期待される。2.1を活用した近代木版口絵の制作過程と体制に関する考察「さしあげ」と呼ばれる色指定のために画師が校合摺に手彩色したものと、実際に書籍へ付された口絵を比較し、作品のイメージ形成に関わるような差異を指摘、それらが生じた原因について考察した。また、同一絵柄口絵について版の検討を行い、『文芸倶楽部』の口絵制作にあたって複数組の板木が用意されていたことを実証した。以上について、国内外の学会での口頭発表や学術雑誌への論文投稿を行い、積極的に成果発信を行った。本研究では、大きく分けて以下の二つの視点から研究に取り組むことを予定していた。それぞれの進捗状況は以下の通りである。1.近代木版口絵の実態調査・分析近代木版口絵およびその周辺資料については、デジタルアーカイブ手法を用いて着実に資料収集を進めており、研究環境が整備されはじめた。とりわけ2018年は、個人蔵の近代木版口絵関連コレクション約3,000点のデジタル化を実施できた点が大きな成果として挙げられる。そのほかの機関所蔵資料のアーカイブも含め、現在はメタデータの整備に着手した段階である。また、蓄積された画像データを基に版の検討を通じた制作実態の分析などを行っている。2.明治口絵の同時代的価値の再検討2018年度末の段階ではほぼ未着手であるが、関連資料を含むと思われるコレクションの閲覧機会を得ることができた点は大きな進捗である。以上の進捗状況および成果発信の状況を踏まえ、1年目の経過としてはおおむね順調に進展していると評価した。1.近代木版口絵の実態調査・分析データベースについては、メタデータの整備が遅れているため、2019年度初頭に作業に注力したい。同時に、立命館大学アート・リサーチセンター内外の他データベースとの連携を図ることができるよう調整し、口絵と書物の物理的な関係を表現できるよう工夫する。また、当初予定していた書物への挿入法などについての分析は、メタデータの整備と同時にデータベースへ追記していくことで完成させたい。2.明治口絵の同時代的価値の再検討関連コレクションの閲覧のほか、既存の新聞記事データベースなどを活用した分析を行う。

以上の進捗状況および成果発信の状況を踏まえ、1年目の経過としてはおおむね順調に進展していると評価した。1.近代木版口絵の実態調査・分析データベースについては、メタデータの整備が遅れているため、2019年度初頭に作業に注力したい。同時に、立命館大学アート・リサーチセンター内外の他データベースとの連携を図ることができるよう調整し、口絵と書物の物理的な関係を表現できるよう工夫する。また、当初予定していた書物への挿入法などについての分析は、メタデータの整備と同時にデータベースへ追記していくことで完成させたい。2.明治口絵の同時代的価値の再検討関連コレクションの閲覧のほか、既存の新聞記事データベースなどを活用した分析を行う。
力学親和性および生体活性インターフェイスを有するインプラントマテリアル創製

本研究の目的は、チタン(Ti)表面に周囲生体組織の賦活化を促す性状を付与する表面改質を施すことにより、オッセオインテグレーションの早期獲得と、さらに生体力学的な適応を可能とする新規マテリアル開発を目指すものである。ウサギ脛骨およびラット大腿骨への埋入試験を行った結果、純TiおよびTi合金上にリン酸カルシウム膜を成膜することにより、骨親和性が向上し、医療用インプラント材料の表面処理法として有用であることが示唆された。生体分子と金属とを結ぶ表面酸化膜の性状は、インプラント体表面における周囲組織細胞の活動に影響することがわかっており、これを任意に制御する技術が東北大学金属材料研究所複合材料学研究部門において確立されている。今年度は、有機金属錯体化学気相析出(MOCVD)法により、cpTiおよび金属ガラス上にハイドロキシアパタイト(HA)膜を成膜し、成膜の有無による骨結合強度を比較検討した。直径3mm、長さ10mmの円柱状試料を、ウサギ脛骨に埋入し、4週、8週後に打ち抜き試験を行った。その結果、4週後の骨結合強度について、HA膜チタンはcpTiに比べ有意に高い値を示した。これにより、MOCVD法によりHAを成膜したチタン試料は、インプラント治療の成否において特に重要である埋入後早期の骨結合獲得に有用であることが示された。また、金属ガラスでは4週と8週の骨結合強度に有意差が見られず、本法によるHA成膜は、特にチタンにおいて有用であることが示唆された。今後は電子サイクロトロン共鳴(ECR)プラズマ法によるチタニア(TiO2)膜およびレーザー化学気相析出(LCVD)法によるチタン酸カルシウム(CaTiO_3)膜について同様の試験を行い、各種成膜法の骨結合強度を比較検討する。また、in vitroにおいて骨芽細胞を用いた培養試験により、表面性状の細胞に与える影響を検討するほか、in vivoにおいては、周囲骨組織新生の組織学的検討を行う予定である。本年度は、cpTiに加え、物理的性質および組成の異なる3種のTi合金(金属ガラス(BMG)、Ti-6Al-4V(Ti64)、Ti-29Nb-13Ta-4.6Zr(TNTZ))に、有機金属錯体化学気相析出(MOCVD)法によりハイドロキシアパタイト(HA)をターゲットとしてアモルファスリン酸カルシウム(ACP)膜を成膜し、生体親和性および成膜効果を比較検討した。直径1mm、長さ2mmの試料を作成し、ラット大腿骨遠位端より8mmおよび13mmの部位に埋入し、4週および8週の飼育期間後、打ち抜き試験を行った。その結果、TNTZに成膜を施した群で最も高い骨結合強度が得られた。また、ウサギ脛骨に試料を埋入した標本で、樹脂薄切切片を作製し組織学的観察を行った結果、ACPを成膜したcpTi上で新生骨の骨伝導が優れていた。TNTZは弾性率などの機械的性質がcpTiと比較して生体骨に近似しており、インプラント体が生体内で機能する際、インプラント体と骨との物理学的調和が期待される。今回の結果から、MOCVD法を用いたACP成膜により骨親和性にも優れることが証明され、新規インプラントマテリアルとして有望であることが示唆された。
若年発症肺癌(30歳未満)における分子生物学的特性と遺伝子異常の検討

岡山大学医学部附属病院,国立病院四国がんセンター,岡山労災病院で30歳未満の肺癌登録20例認められた。これらの症例を四国がんセンターの全肺癌患者1851例を対象に解析を行うと,男性,体重減少,PS(Performance Status),不良例,血清LDH高値,病期II・IV期の予後が有意に悪いことが示された。30歳未満の患者で4名が類表皮癌患者で,一般の対象症例より有意(p<0.001)に頻度が高いことが示された。この類表皮癌は早期癌,予後も非常に良好な特徴をもつため,解析からは外した。30歳以下の若年者肺癌群で非喫煙者(p<0.001),未分化癌(p=0.018)が有意に多かった。類表皮癌患者4例を除いた16例の解析では,臨床症状あり,LDH高値,PS不良は有意な予後不良因子となった。生存期間に一般の肺癌との差は認められなかった。LDHと臨床症状の有無で予後を解析するとI群LDH(正常)と臨床症状なし,II群LDH(正常)と臨床症状あり,III群LDH(高値)と臨床症状あり,の生存期間中央値は50.0ヶ月,13.4ヶ月,2.5ヶ月であった。当教室の肺癌登録の行われた912症例の背景(家族歴における癌患者の有無,重複癌の有無,喫煙歴,職業歴)の症例集積を終了し,現在第二外科の症例を調査中である.現在まで30歳未満の対象は男性4例,女性3例の計7症例で,組織型は腺癌3例,小細胞癌2例,扁平上皮癌1例,非小細胞癌1例,臨床病期はIIIA期1例,IIIB期2例,IV期4例(対象を40歳未満とすると男性9例,女性8例)であった。集積した症例を対象として随時Cytokeratin8/18,ivolucrin,surfactant protein A,CEA,synaptophisin,neurofilament,CD45,CD56,CD34,p53の免疫組織染色を実施中である。前年度に引き続き当教室で肺癌登録の行われた912例の背景(家族歴における癌患者の有無,重複癌の有無,喫煙歴,職業歴)を調査し,第二外科の症例を追加検討中である.30歳未満の対象は男性4例,女性3例の計7例であり,組織型は腺癌3例,小細胞癌2例,扁平上皮癌1例,臨床病期はIIIA期1例,IIIB期2例,IV期4例で(対象を40歳未満とすると男性9例,女性8例)であった.集積した症例を中心に随時HE染色・各種免疫組織染色(CAM5.2:Cytokeratin8/18,involucrin, surfactant protein A, CEA, synaptophisin, neurofilament, CD45,CD56,CD34,p53)を実施中である.前年度に引き続き当教室で肺癌登録912例の背景(家族歴における癌患者の有無,重複癌の有無,喫煙歴,職業歴)を調査が終了し,第二外科の症例を追加検討中である。30歳未満の対象は男性4例,女性3例の計7例であり,組織型は腺癌3例,小細胞癌2例,扁平上皮癌1例,臨床病期はIIIA期1例,IIIB期2例,IV期4例で(対象を40歳未満とすると男性9例,女性8例)であった.集積した症例を中心に随時HE染色・各種免疫組織染色(CAM5.2:Cytokeratin8/18,involucrin, surfactant protein A, CEA, synaptophisin, neurofilament, CD45, CD56, CD34, P53)を実施し,現在解析中である。

30歳未満の患者で4名が類表皮癌患者で,一般の対象症例より有意(p<0.001)に頻度が高いことが示された。この類表皮癌は早期癌,予後も非常に良好な特徴をもつため,解析からは外した。30歳以下の若年者肺癌群で非喫煙者(p<0.001),未分化癌(p=0.018)が有意に多かった。類表皮癌患者4例を除いた16例の解析では,臨床症状あり,LDH高値,PS不良は有意な予後不良因子となった。生存期間に一般の肺癌との差は認められなかった。LDHと臨床症状の有無で予後を解析するとI群LDH(正常)と臨床症状なし,II群LDH(正常)と臨床症状あり,III群LDH(高値)と臨床症状あり,の生存期間中央値は50.0ヶ月,13.4ヶ月,2.5ヶ月であった。
抜歯窩創傷治癒とサイトカイン

各種増殖因子を含むサイトカインは,マクロファージ,リンパ球,線維芽細胞,血管内皮細胞などから分泌される.このサイトカイン類が単独もしくは相互的に,どのような影響を与えて,治癒促進を惹起させるか,その要因を解明することを目的としている.これまでの研究結果より,何らかのサイトカイン類を抜歯窩内へ投与することにより,治癒を促進させることが考えられた.なかでも抜歯窩内での骨形成にもっとも関与すると思われるTGF-βと,従来より骨芽細胞の分化を促進するといわれているアスコルビン酸を使用した.投与時期は,以前免疫組織学的に検索した結果をもとに,TGF-βが増加する前後の術後4から5日目と9から10日目を選択した.マウスを用いて実験的に抜歯窩を作成し,5日目および10日目に抜歯窩周囲の歯肉にTGF-βを注入し,それぞれ5日後の抜歯後10日目,15日目に過麻酔死させ,下顎骨を摘出した.脱灰組織薄切標本を作製し,病理学的,酵素組織学的に観察した.対照として生食水のみを注入した.次にアスコルビン酸を用いて同様に行った.結果,TGF-βとアスコルビン酸は,それぞれ5日目,10日目と投与時期に違いがあるが,ともに対照群と比較して骨化傾向が早く,骨芽細胞や破骨細胞が多く認められた.次に,炎症性サイトカインといわれるIL-1βとTNF-α,肉芽組織形成に関与すると思われるEGFについて同様に行ったが,対照群と比較してほとんど差を認めなかった.以上のことより,TGF-βとアスコルピン酸は投与時期に違いがあるが,ともに創傷治癒促進に関与することが示唆された.今後の検討課題は,今回行えなかった複数のサイトカイン類を用いて観察し,この結果に基づき,創傷治癒過程でのサイトカインの作用などの影響を解明し,創傷治癒促進を施すメカニズムを分析,検討することである.各種増殖因子を含むサイトカインは,マクロファージ,リンパ球,線維芽細胞,血管内皮細胞などから分泌される.このサイトカイン類が単独もしくは相互的に、どのような影響を与えて,治癒促進を惹起させるか,その要因を解明することを目的としている.これまでの研究結果より,何らかのサイトカイン類を抜歯窩内へ投与することにより、治癒を促進させることが考えられた.なかでも抜歯窩内での骨形成にもっとも関与すると思われるTGF-βを選択した.効果的な投与時期は,免疫組織学的に検索した結果をもとに,TGF-βが増加する前後の術後4から5日目と9から10日目を選択したマウスを用いて実験的に抜歯窩を作成し,5日目及び10日目に抜歯窩周囲の歯肉にTGF-βを注入し,それぞれ5日後の抜歯後10日目,15日目に過麻酔死させ,下顎骨を摘出した.脱灰組織薄切標本を作製し,病理学的,酵素組織学的に観察した.対照として生食水のみを注入した.結果,抜歯後5日目に投与した症例では,対照群と比較して骨化傾向が早く,骨芽細胞や破骨細胞が多く認められた.抜歯後10日目に投与した症例では,対照群と比較して差を認めなかった.また,従来より骨芽細胞の分化を促進するといわれているアスコルビン酸を同様に使用したところ,抜歯後5日目に投与した症例では,対照群と比較してほとんど差を認めなかった.抜歯後10日目に投与した症例では,骨化傾向が早く,骨芽細胞や破骨細胞が多く認められた.これらの結果より,TGF-βとアスコルビン酸は投与時期に違いがあるが,ともに創傷治癒促進に関与することが示唆された.今後の検討課題は,引き続き同様の実験方法にて,効果的な単独もしくは複数のサイトカイン類を用いて観察したい.この結果に基づき,創傷治癒過程での効果的な骨化促進を誘導するサイトカインや他の生理活性物質の投与時期や組み合わせを知り,併せて創傷治癒でのサイトカインの作用を検討したい.各種増殖因子を含むサイトカインは,マクロファージ,リンパ球,線維芽細胞,血管内皮細胞などから分泌される.このサイトカイン類が単独もしくは相互的に,どのような影響を与えて,治癒促進を惹起させるか,その要因を解明することを目的としている.これまでの研究結果より,何らかのサイトカイン類を抜歯窩内へ投与することにより,治癒を促進させることが考えられた.なかでも抜歯窩内での骨形成にもっとも関与すると思われるTGF-βと,従来より骨芽細胞の分化を促進するといわれているアスコルビン酸を使用した.投与時期は,以前免疫組織学的に検索した結果をもとに,TGF-βが増加する前後の術後4から5日目と9から10日目を選択した.マウスを用いて実験的に抜歯窩を作成し,5日目および10日目に抜歯窩周囲の歯肉にTGF-βを注入し,それぞれ5日後の抜歯後10日目,15日目に過麻酔死させ,下顎骨を摘出した.脱灰組織薄切標本を作製し,病理学的,酵素組織学的に観察した.対照として生食水のみを注入した.次にアスコルビン酸を用いて同様に行った.

結果,TGF-βとアスコルビン酸は,それぞれ5日目,10日目と投与時期に違いがあるが,ともに対照群と比較して骨化傾向が早く,骨芽細胞や破骨細胞が多く認められた.次に,炎症性サイトカインといわれるIL-1βとTNF-α,肉芽組織形成に関与すると思われるEGFについて同様に行ったが,対照群と比較してほとんど差を認めなかった.以上のことより,TGF-βとアスコルピン酸は投与時期に違いがあるが,ともに創傷治癒促進に関与することが示唆された.今後の検討課題は,今回行えなかった複数のサイトカイン類を用いて観察し,この結果に基づき,創傷治癒過程でのサイトカインの作用などの影響を解明し,創傷治癒促進を施すメカニズムを分析,検討することである.
胞状奇胎後続発症のリスク因子と、臨床上有用な続発症予測マーカーの同定

<胞状奇胎後続発症のリスク因子の抽出>DNA診断済の全胞状奇胎症例のうち、続発症を発症した群、発症しなかった群について、臨床病理学的事項を比較検討し、結果を統計学的に解析し、初期治療時の最大の絨毛短径、胎児共存奇胎が続発症のリスク因子として重要であることをことを明らかにした。<続発症予測マーカーの同定>胞状奇胎症例のうち、続発症を発症した群、発症しなかった群について、細胞増殖能の指標として用いられるKi67抗体による免疫染色を行い、Ki-67labbeling indexと続発症の有無に相関関係がないことを明らかにした。<DNA遺伝子診断>最新の機器を用いた、より精度の高いDNA診断を行うため、キャピラリー電気泳動を用いたDNA多形解析法を導入し、新たなマイクロサテライトマーカーを用いて、PCR等の条件設定、精度管理を行い、この手法をほぼ確立した。全胞状奇胎、部分胞状奇胎、水腫化流産についてより正確な遺伝子診断を行うことができる。<新規胞状奇胎症例のDNA診断、免疫染色>採取した新規胞状奇胎症例に対し、嚢胞化絨毛よりDNAを抽出し、DNA多型診断により、DNA診断を行い、全胞状奇胎、部分胞状奇胎、水腫化流産の3群に分類した。また、パラフィン包埋ブロックより、p57KIP2、TSSC3の免疫染色を行い、全奇胎、部分奇胎の診断を行い、DNA診断との整合性があるか確認している、これらの手法により、より精度の高い診断を行い、症例を積み重ねている。<胞状奇胎後続発症のリスク因子の抽出>DNA診断済の胞状奇胎症例のうち、続発症を発症した群、発症しなかった群について、特に血中hCG値、初回治療時の妊娠週数、初期治療時の最大の絨毛短径に注目して、臨床病理学的事項を比較検討し、結果を統計学的に解析し、初期治療時の最大の絨毛短径がリスク因子として重要であることを学会発表した。<続発症予測マーカーの同定>胞状奇胎症例のうち、続発症を発症した群、発症しなかった群について、細胞増殖能の指標として用いられるKi67抗体による免疫染色を行い、Ki67-labbeling indexと続発症発症に関連がないことを明らかにした。今後、アポトーシスの指標であるM30 CytoDEATH抗体、多機能幹細胞のマーカーであり絨毛性疾患での高発現が報告されているNANOG抗体藤についても染色予定である。<DNA遺伝子診断>最新の機器を用いた、より精度の高いDNA診断を行うため、キャピラリー電気泳動を用いたDNA多形解析法を導入した。現在新たなマイクロサテライトマーカーを用いて、PCR等の条件設定、精度管理を行っている。この手法が確立できれば、全胞状奇胎、部分胞状奇胎、水腫化流産についてより正確な遺伝子診断を行うことができる。<胞状奇胎後続発症のリスク因子の抽出>DNA診断済の胞状奇胎症例のうち、続発症を発症した群、発症しなかった群について、特に血中hCG値、初回治療時の妊娠週数、初期治療時の最大の絨毛短径に注目して、臨床病理学的事項を比較検討し、結果を単変量ならびに多変量解析によって解析中である。<続発症予測マーカーの同定>胞状奇胎症例のうち、続発症を発症した群、発症しなかった群について、細胞増殖能の指標として用いられるKi67抗体による免疫染色を行っている。新たなマイクロサテライトマーカーを用いて、PCR等の条件設定、精度管理を行い、全胞状奇胎、部分胞状奇胎、水腫化流産についてより正確な遺伝子診断を行うことができようになった。

また、パラフィン包埋ブロックより、p57KIP2、TSSC3の免疫染色を行い、全奇胎、部分奇胎の診断を行い、DNA診断との整合性があることを確認した。現在、これらの手法により、より精度の高い診断を行い、症例を積み重ねている。<胞状奇胎後続発症のリスク因子の抽出>DNA診断済の胞状奇胎症例のうち、続発症を発症した群、発症しなかった群について、特に血中hCG値、初回治療時の妊娠週数、初期治療時の最大の絨毛短径に注目して、臨床病理学的事項を比較検討し、結果を統計学的に解析し、初期治療時の最大の絨毛短径が続発症のリスク因子として重要であることをことを明らかにし、学会で発表した。<続発症予測マーカーの同定>胞状奇胎症例のうち、続発症を発症した群、発症しなかった群について、細胞増殖能の指標として用いられるKi67抗体による免疫染色を行い、Ki-67 labbeling indexと続発症の有無に相関関係がないことを明らかにし、学会で発表した。現在、これらの研究内容について論文作成中である絨毛性疾患当初の計画より、一部の変更はあるが、現段階ではおおむね順調に、研究は進行している。当初の計画より、一部の変更はあるが、現段階ではおおむね順調に、研究は進行している。今後、更なる新規症例を集積し、解析症例数の増加を考えている。また、リスク因子となりそうな、新規の増殖マーカーについても、情報を集積していき、積極的に研究に使用して行きたいと考えている。得られた研究成果に関しては、学会発表、論文化の準備を進めていく。消耗品購入の予備費としていたが、使用しなかったため免疫染色用抗体、マイクロサテライトマーカー等の研究消耗品等に使用予定である。免疫染色用抗体、マイクロサテライトマーカー等の研究消耗品、解析用のPC等に使用予定である。
新規蛋白抗原検出による接合菌症の早期診断法の開発

接合菌症は主に血液疾患などの免疫抑制患者に発症する深在性真菌症であるが、現在その診断は培養と病理学的診断のみに頼らざるをえず、その予後も大変不良なため血清診断などの補助診断法の開発が期待されている。我々は接合菌症の早期診断に有用と考えられる血清診断法の開発研究を試みた。真菌研究における新しいアプローチであるシグナルシークエンストラップ法を利用し、接合菌(Rhizopus oryzae)の膜蛋白質および分泌蛋白質を網羅的に同定して、抗原蛋白の候補を選出した。最も多いクローンが検出された候補A抗原(26kDa蛋白)および2番目に多いクローンであった候補B抗原(46kDa蛋白)は、それぞれシグナルシークエンスを有し、候補Bはベータグルカン合成酵素に関連する遺伝子を有していた。本研究期間では候補A抗原を検出するELISAキットを作成し、その評価を行った。その結果、候補A抗原はR. oryzae、R microspores、R microspores var. rhizopodiformis培養上清中およびそれらの感染マウス血清中からも検出され、新たな抗原検出法となる可能性が示唆された。主に血液疾患などの免疫抑制患者に発症する深在性真菌症である接合菌症の早期診断に有用と考えられる血清診断法の開発研究を試みた。我々は、前年度に真菌研究における新しいアプローチであるシグナルシークエンストラップ法を利用し、接合菌(Rhizopus oryzae)の膜蛋白質および分泌蛋白質を網羅的に同定して、二つの抗原蛋白を候補に選出し、本年度はその蛋白精製を行った。その中から、最も多い163のクローンを占めた蛋白(候補A:hypothetical protein、226アミノ酸から構成される約23kDaの蛋白)および2番目に多い45のクローンが得られた蛋白(候補B:predicted protein、486アミノ酸から構成される約46kDaの蛋白)を蛋白抗原の候補として選出した。二つの候補蛋白はシグナルシークエンス配列を有し、後者はそのシークエンスの特徴から細胞壁のβグルカン合成酵素に関連するタンパク質である可能性が示唆された。今後、蛋白の精製抗体の精製を計画している。.主に血液疾患などの免疫抑制患者に発症する深在性真菌症である接合菌症の早期診断に有用と考えられる血清診断法の開発研究を試みた。現在、ポリクローナル抗体の作成を目的として免疫中である。また、現在候補Bに関しても、大腸菌による遺伝子発現を試みている。(個々のクローンの遺伝子名等は、今後の特許申請等にも関係があるため本稿には未記載。)主に血液疾患などの免疫抑制患者に発症する深在性真菌症である接合菌症の早期診断に有用と考えられる血清診断法の開発研究を試みた。我々は、真菌研究における新しいアプローチであるシグナルシークエンストラップ法を利用し、接合菌(最も分離頻度が多いRhizopusoryzae臨床株を使用)の膜蛋白質および分泌蛋白質を網羅的に同定して、抗原蛋白(候補A抗原)を候補に選出した。その結果、最も多い163のクローンを占めた蛋白(候補A:hypothetical protein、226アミノ酸から構成される約23kDaの蛋白)および2番目に多い45のクローンが得られた蛋白(候補B:predicted protein、486アミノ酸から構成される約46kDaの蛋白)を選出。その後、候補A抗原を検出するELISAキットを作成し、その評価を行った。その結果、候補A抗原は、R. oryzae、R microspores、R microspores var var. rhizopodiformis培養上清中に検出できることを確認した。一方、候補A抗原はAspergillus fumigatusやCandida albicans、Cryptococcus neoformans、他の接合菌種の培養上清中には検出されなかった。また、候補A抗原は、R. oryzae、R microspores、R microspores var var. rhizopodiformisの培養上清中に経時的に増加していた。また、それらの接合菌を免疫不全マウスに肺感染させ、数日後に採血して、ELISAキットにて検出を試みた。

その結果、血清中にも候補A抗原は検出可能であることが示唆された。現在、候補B抗原(46kDa蛋白)に関しても、ELISAキットの評価を開始している。今後、接合菌症の早期診断法としてのさらなる評価を試みる。抗体精製にやや時間がかかっている。24年度が最終年度であるため、記入しない。2種類の候補タンパク質に対する抗体が得られた後に、ELISA法を確立し、感染マウスや人血清や組織を用いて、本抗体の有用性を検討する。
バイオナノシートを活用した新しい眼科治療用デバイスの開発

生体分解性趙菲薄膜(バイオナノシート)の眼科領域における応用法を検討した。動物実験を用いた検討では、以下のテーマについて研究を進めた。1.創口の閉鎖促進。小動物の角膜や強膜に切開を作成、その上に、バイオナノシートを貼付、創口閉鎖促進について確認した。2薬剤運搬素材としての活用。バイオナノシートに3種の薬剤を担持させ、標的組織における薬剤の徐放を行うdrug deliverysystemの開発を進めた。今回の研究では、手術効果促進と薬剤の排出速度が早い硝子体術後眼内での活用、抗菌作用を持つ物質の担持などを検討した。3組織保護、組織間空隙維持剤としての活用。趙菲薄膜のため、組織透過性を障害させることなく透明組織への貼付が可能となるため、難治性の角膜上皮障害などに対する治療剤としての活用。濾過手術など非生理的房水排出路を作成した際の、組織癒着を防止し、房水排出路の閉鎖を予防するための材料としての有用性を検討した。4細胞培地素材としての活用。再生医療を念頭に細胞移植用の基底膜としての活用を検討した。5透明性を活用し、耐性菌の発生を予防するための抗菌剤を用いない角膜表面の抗菌性貼付剤の開発について検討した。いずれの検討も、基礎的一定の成果を挙げ、人体への応用が期待されているが、GMP基準でのバイオナノシートの作成、さらに臨床研究に向けての資金の課題があり、人体応用への展開に課題を有している。動物実験レベルの研究は一定の成果を挙げて進んでいる。しかしながら、臨床応用を前提とした開発に関してはヒトへ提供する製品の作成、さらに臨床研究に向けての費用などの環境整備が十分に進んでおらず展開が期待した状況に十分に達していない点が課題である。動物実験をさらに進め、実験結果の再現性などを高め、バイオナノシートの眼科応用の精度を改善していく。また臨床研究に向けて製品の作成、さらに費用などの調達など関係各所と連携を進めていく。超菲薄膜であり生体適合性の高いバイオナノシートの眼科領域への応用を以下の点を主に行った。1.濾過手術後の組織癒着を阻害する目的でマイトマイシンC(MMC)を含有したバイオナノシートの濾過手術後の投与経路として、強膜上への設置を行い、ウサギ眼を用いたin vivo実験を行い濾過量の維持効果への影響について検討を進めた。さらに、投与部位としてごく微量のMMCを含有したバイオナノシートの前房内投与によるモデルも作成し、有用性、安全性を確認した。2.接着剤不要の組織閉鎖剤としてのバイオナノシートの有用性を確認するため、離開結膜への被覆を行い組織修復への効果を検討した。3.血管内皮細胞増殖因子(VEGF)抗体は虚血後に発症する網膜新生血管の増殖や加齢黄斑変性症などの血管新生の抑制や黄斑部浮腫に対する臨床上の効果を有するが硝子体手術により無硝子体となった場合には、早期に眼外に排出されるため有効性が低いことが知られている。長期的に抗VEGFの放出を行い血管新生を抑制させることを目的にを抗VEGF抗体を含有したバイオナノシートを作成し、無硝子体眼の眼内に注入し血管新生、網膜浮腫の抑制を検討した。4.細胞移植シートとしてのバイオナノシートの可能性の探求。人工的細胞基底膜の開発は再生医療にとって非常に有用である。現有の人工基底膜にはまだ課題が多い。バイオナノシートを活用して従来よりより細胞接着性、生体適合性が高く、また細胞増殖因子など生着を促進する因子を含有した人工基底膜としての可能性を探求した。各実験用のバイオナノシートを作成し、実験を進めている。十分に目標通りの貼付性が確保されていない点、放出調整量について目標通りに作成がされていない点が現状の課題であるが、ほぼ全体としては目標に沿った研究成果が得られていると考えられる。1.創口の閉鎖促進。

しかしながら、臨床応用を前提とした開発に関してはヒトへ提供する製品の作成、さらに臨床研究に向けての費用などの環境整備が十分に進んでおらず展開が期待した状況に十分に達していない点が課題である。研究目標に沿って、実験を継続し、現在の課題を克服していくことを基本とする。最大の目標はすぐれたドラッグデリバリーシステムの開発であるが、その研究推進課程で生体移植材料の基盤素材の可能性など研究開始時とは異なる新たな活用性が見出されている。これらの可能性についても同時に探求していく。動物実験をさらに進め、実験結果の再現性などを高め、バイオナノシートの眼科応用の精度を改善していく。また臨床研究に向けて製品の作成、さらに費用などの調達など関係各所と連携を進めていく。当初予定していたin vivo実験においては、必要動物の確保と薬剤の購入が年度内に完了できなかった。このため、動物購入費用、実験用バイオナノシートの作成費用ならびに薬剤の購入費用についても次年度へ予算を移行することとなった。
ひずみ負荷による半導体デバイスの電気特性変動についてのナノメカニクス的検討

応力を受けるSiの電気特性変動について,バルクシリコンの移動度特性はよく表されているものの,nMOSFETについては実験結果から得られる移動度変化との乖離が残った.この応力によるnMOSFETの移動度の変化についての理論値と実験値の乖離について,真性キャリア濃度の変化と電子がnMOSFETのチャネル化の非常に薄い層に偏在することによる,二次元量子化の影響について検討を行った.その結果,ひずみによる真性キャリア濃度変化の電気特性変動に対する寄与は比較的小さいことが分かった.また,反転層における表面量子化の考慮も十分に現象を表現するには至らなかった.前年度までに,応力を受けるnMOSFETについて,デバイスシミュレーションによってその電流特性の変化を調べてきた.その中で,電子の存在確立の変化,電子の散乱確立の変化,電子の有効質量の変化を電子移動度の変化に考慮することによって,一軸,多軸引張の両方について,電流特性変化をかなり正確に表現できるようになっていた.しかし,これらの効果を考慮しても,バルクシリコンの移動度特性はよく表されているものの,nMOSFETについては実験結果から得られる移動度変化との乖離が残った.この応力によるnMOSFETの移動度の変化についての理論値と実験値の乖離について,真性キャリア濃度の変化と電子がnMOSFETのチャネル化の非常に薄い層に偏在することによる,二次元量子化の影響について検討を行った.二次元量子化の影響を調べるために,具体的には反転層における電子相対密度変化において表面量子化の効果を考慮した.その結果,ひずみによる真性キャリア濃度変化の電気特性変動に対する寄与は比較的小さいことが分かった.また,反転層における表面量子化を考慮した電子移動度モデルは,かえって解析結果を実験結果から乖離させた.そこで,基底サブバンドエネルギーを計算するためのパラメータを調整した結果,実験結果を定量的に再現するためには,反転層内の閉じ込め電界をより適切に与える必要があることが示唆された.今後は,本シミュレーション手法のさらなる精度向上のため,表面量子化による無ひずみでの有効質量の変化について検討したい.前年度までに,応力を受けるnMOSFETについて,デバイスシミュレーションによってその電流特性の変化を調べてきた.その中で,電子の存在確立の変化,電子の散乱確立の変化,電子の有効質量の変化を電子移動度の変化に考慮することによって,一軸,多軸引張の両方について,電流特性変化をかなり正確に表現できるようになっていた.しかし,これらの効果を考慮しても,バルクシリコンの移動度特性はよく表されているものの,nMOSFETについては実験結果から得られる移動度変化との乖離が残った.この応力によるnMOSFETの移動度の変化についての理論値と実験値の乖離について,真性キャリア濃度の変化と電子がnMOSFETのチャネル化の非常に薄い層に偏在することによる,二次元量子化の影響について検討を行った.二次元量子化の影響を調べるために,具体的には反転層における電子相対密度変化において表面量子化の効果を考慮した.その結果,ひずみによる真性キャリア濃度変化の電気特性変動に対する寄与は比較的小さいことが分かった.また,反転層における表面量子化を考慮した電子移動度モデルは,かえって解析結果を実験結果から乖離させた.そこで,基底サブバンドエネルギーを計算するためのパラメータを調整した結果,実験結果を定量的に再現するためには,反転層内の閉じ込め電界をより適切に与える必要があることが示唆された.このため,反転層内の閉じ込め電界を変えるなどして,解析値の合わせこみを試みたが,実験結果を精度良く表現できるような条件は見つからなかった.今後は,pMOSFETについての実験を行い,その応力による特性変動を明らかにするとともに,その変動特性を表すモデルを示すことが重要である。応力を受けるSiの電気特性変動について,バルクシリコンの移動度特性はよく表されているものの,nMOSFETについては実験結果から得られる移動度変化との乖離が残った.この応力によるnMOSFETの移動度の変化についての理論値と実験値の乖離について,真性キャリア濃度の変化と電子がnMOSFETのチャネル化の非常に薄い層に偏在することによる,二次元量子化の影響について検討を行った.その結果,ひずみによる真性キャリア濃度変化の電気特性変動に対する寄与は比較的小さいことが分かった.また,反転層における表面量子化の考慮も十分に現象を表現するには至らなかった.これまでのnMOSFETの応力による電気特性変動のデバイスシミュレーションでは,応力による電子移動度の変化について,バンドにおける電子の存在確率,バンド間の電子の散乱確率,電子の有効質量の変化を考慮した.これにより,結晶軸に対してせん断応力が生じる場合についても,かなり精度の良いシミュレーションが行えた.しかし,このシミュレーション結果は,ライトドープシリコンの文献値にほぼ完全に一致するものの,nMOSFETの場合にはある程度の乖離が見られた.そこで,nMOSFET中の電子存在密度の大きな部分について,それぞれに応力を負荷し,そのときの電気特性変動がどのようになるかをデバイスシミュレーションによって調べた.その結果,電子存在密度の大きな部分は,ソース・ドレイン電極下とゲート直下のチャネル部分であることが判明した.応力による電気特性変動もほぼこの部分に応力が負荷されるかどうかに関わっていた.このなかで,チャネル領域の電子存在密度は,チャネルの表面近傍に偏在していることが確認された.この部分は反転層になっており,2次元量子化が発生していることが予測され,このことがnMOSFETとライトドープシリコンの違いを生み出していると予測された.さらにpMOSFETの4点曲げ試験片を作成し,これに負荷を与えながら電流特性変動を計測しようとしているが,計測器の不具合によってまだ実現していない.

当初,バルクシリコンの応力による移動度変化を,ほぼ精度よく推定することができるようになったことから,nMOSFETの移動度変化についても,nMOSFETに特有の真性キャリア濃度の変化やチャネル下の反転層における二次元量子化の影響を考慮することによって精度よく推定できるようになると考えた.少なくとも,これらを考慮することによって,実測値により近づくことが予想された.しかしながら,実際に計算を行なってみると,真性キャリア濃度の変化はほとんど移動度の変化に影響を与えないことがわかった.また,反転層における二次元量子化の影響を考慮するために,電子相対密度変化において表面量子化の効果を考慮したが,かえって実験結果から乖離する結果となった.本研究の最初にpMOSFETを搭載した4点曲げ試験片に負荷を行いながら電気特性変動を測定することを計画していた.しかし,計測器の不具合が解消できず有意な計測値が得られていない.協力会社に依頼して,同pMOSFETの4点曲げ試験を行ったところ,問題無く電気特性変動を測定することができた.そこで,当研究室現有の装置の不具合についてもう一度精査を行い,大量の実験結果を取得できるようにしようと検討中である.この実験結果を基に,pMOSFETの正孔移動度の応力による特性変動モデルを構築する予定であるので,実験の実施を急ぐ必要がある.nMOSFETの応力による移動度変化がバルクシリコンの結果から乖離している原因が,チャネル下の反転層における二次元量子化の影響にあるであろうことは間違っていないと考えられる.しかしながら,現時点で見つけ出した二次元量子化を再現する物理モデルでは,その乖離を再現することができなかった.今後は,さらに別の物理モデルを調査し,デバイスシミュレーションに組み込んで行くことを目指してゆきたい.また,本研究の目的の2番めが,pMOSFETについても同様のモデルが構築できるかどうかを調べることにある.そこで,まず,pMOSFETについて,4点曲げ試験を行いながら,その電流特性を測定し,デバイスシミュレーションによる再現を目指す予定である.まず,現有の4点曲げ試験によるMOSFETの電気特性変動測定装置の不具合を解消し, pMOSFETの応力による特性変動の実験結果を大量に取得する.これを元に文献調査等を行い,pMOSFETの正孔移動度の応力による特性変動を予測できるモデルの構築を行う.必要であれば,第一原理計算を行い,そのパラメータ等の決定を行う予定である.nMOSFETについては,電子のチャネル領域での2次元量子化の影響を調査し,その影響によって応力による電気特性変動がどのような影響を受けるかを検討する.