hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
冠動脈プラーク破裂後の血栓形成における単球サブセットの関与と治療法の確立

単球は急性冠症候群の発症に密接に関与しているが、最近の研究により単球は多様性を有することが明らかになっている。一方、単球の活性化は血栓形成に関与するP-selectin glycoprotien-1(PSGL-1)の発現増強に関与することが明らかにされているが、その病態的意義は不明である。当該年度、我々は特定の単球サブセット上のPSGL-1の増強が血栓形成に関与するか否かを検討する臨床研究を行った。対象は急性心筋梗塞患者25名、不安定狭心症患者20名、安定狭心症患者35名、健常人20名であった。3つの異なる単球サブセットおよびPSGL-1の発現をフローサイトメトリー法で測定した。責任冠動脈の病変形態(血栓を含む)はoptical coherence tomography (OCT)で評価した。AMI群のCD14++CD16+単球上のPSGL-1発現は他の群に比し有意に高値であった。また興味深いことにCD14++CD16+PSGL-1+単球の発現増強は冠動脈プラーク破裂の頻度と有意に関連していた。更に自然免疫反応の際に中心的に作用するToll-like receptor (TLR)4との関連を検討したところ、CD14++CD16+上のTLR-4の発現はPLSG-1の発現と有意な正相関を呈することを明らかにした。以上よりCD14++CD16+単球上のPSGL-1の発現増強効果はプラーク破裂後の血栓形成に関連していた。このPSGL-1の発現増強には自然免疫反応が関与する可能性が示唆された。Toll様受容体Toll-like receptor (TLR)などの認識受容体の細胞表面上の発現を増強することにより、病変局所の炎症および血小板との相互作用(P-selectinとその受容体であるP-seectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1))により、血栓形成を促進する。また、冠動脈内を観察する血管内光干渉断層法(optical coherence tomography; OCT)が臨床応用され、ACSの責任病変におけるプラーク破裂や冠動脈内血栓などの同定が可能となった。本研究ではACSにおける末梢血および責任冠動脈血の単球上のPSGL-1の発現と冠動脈内血栓の関係についてOCTを用いて検討した。急性心筋梗塞(AMI)25症例、不安定狭心症(UAP)20症例、安定狭心症(SAP)35症例、コントロール20症例の計100症例を対象とした。入院時に末梢血を採取し、AMI症例ではカテーテルインターベンション施行時に血栓吸引カテーテルを用いて責任冠動脈内血を採取し,単球上のPSGL-1の発現を測定した。カテーテルインターベンション治療の施行前にOCTイメージングを施行、責任病変のプラーク破裂、冠動脈内血栓の有無を評価した。結果を示す。単球をCD14+CD16+, CD14++CD16+, CD14++CD16-の3つのサブセットに分類して検討した結果、CD14++CD16+単球上のPSGL-1の発現頻度はAMIにおいてUAP, SAP,コントロール群と比較して有意に上昇していた。さらにAMIにおいてCD14++CD16+単球上のPSGL-1の発現は責任冠動脈内血で末梢血と比較して有意な上昇がみられた。以上より単球上のPSGL-1のup-regulationがプラーク破裂後の冠動脈内血栓形成に重要な役割を担っていることが示唆された。循環血中の単球は、自然免疫反応の際に中心的に働くToll-like receptor (TLR)などのパターン認識受容体の細胞表面上の発現を増強することにより、病変局所の炎症および血小板との相互作用により、血栓形成を促進することが明らかにされている。当該年度は循環血中および責任冠動脈血栓形成病変部位における単球サブセットとTLR-4の発現頻度との関連を明らかにする臨床研究を施行した。研究対象は65名の虚血性心疾患患者(急性心筋梗塞(22名)、不安定狭心症(16名)、安定狭心症(27名))および15名の健常人(対照群)であった。急性心筋梗塞患者において、CD14+CD16+単球上のTLR-4の発現は循環血中のCD14+CD16-単球に比し、有意に大であった。CD14+CD16+単球上のTLR-4の発現は、急性心筋梗塞患者において他の3群に比し有意に大であった。急性心筋梗塞患者群においては、血栓吸引術により冠動脈血栓より得たCD14+CD16+単球上のTLR-4の発現は循環血中に比し、責任冠動脈病変部において有意に上昇していた。また急性心筋梗塞患者の入院時におけるCD14+CD16+単球上のTLR-4の発現増強効果は心筋梗塞発症12日後の著明に低下していた。更に、急性心筋梗塞患者において、血中のtumor necrosis factor-αは循環血中単球のTLR-4の発現レベルと有意な正の相関関係を認めた。以上より、急性心筋梗塞患者におけるCD14+CD16+単球上のTLR-4の発現増強効果は、循環血中および冠動脈血栓形成病変部位の両者でみられることを明らかにした。従って、特定の単球サブセット上の自然免疫反応の増強効果は急性心筋梗塞の発症機転に関与する可能性が推察され、我々の作業仮説を支持した。

今回の研究課題の作業仮説は、"特定の単球サブセットは冠動脈プラーク破裂部位において、自然免疫反応を介して種々の程度に活性化され、その破裂部位の血栓形成に関連する"である。当該年度、冠動脈プラーク破裂とその後の血栓形成、および急性冠症候群の発症機序に関することを目標にしした。我々は当該年度において、CD14++CD16+単球上のPSGL-1の発現増強効果はプラーク破裂後の血栓形成に関連することを明らかにし、当初の目的を達成した。従って、本作業仮説の妥当性が示唆され、今後の予定を変更・修正することなく進めていけるため、順調に進展していると判断した。当該年度において、どの特定の単球サブセットが冠動脈プラーク破裂部位において、自然免疫反応を介して活性化されているかを明らかにすることを目標にした。我々は当該年度において、CD14+CD16+単球におけるTLR-4の発現は冠動脈血栓部位で増強することが明らかにし、当初の目的を達成した。従って、本作業仮説の妥当性が示唆され、今後の研究計画を変更・修正することなく進めていけるためである。研究体制は研究代表者1名と研究分担者1名、および研究協力者3名の構成を維持する。今後症例を重ねて、単球サブセット、TLR-4, PLSG-1のクロストークによる増強効果の病態的意義をより詳細に明らかにする予定である。また、基礎研究についても遺伝子欠損マウスおよび野生型マウスに深部静脈血栓モデルの作成を進めている。準備環境が整い次第、分子生物学的機序の比較・検討に関する研究を施行する予定としている。研究分担者および協力者と緊密に連携し、常に情報を共有し、定期的に研究成果について話し合う機会を設ける。今後研究計画の変更の必要性が生じれば、迅速に対応する協力体制を強固にする。現在単球サブセットと以下の2項目との関連について比較検討中である。(1)臨床パラメーターおよびバイオマーカー、(2)急性冠症候群の病変形態(プラーク破裂、血栓、びらん、thin-cap fibroatheroma、線維性被膜厚)の2項目である。また、病変局所の炎症および血小板との相互作用に関与するP-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1)の発現は冠動脈血栓内のCD14+CD16+単球で増強していることを少数例で確認している。今後、症例を重ねてCD14+CD16+単球およびTLR-3およびPSGL-1のクロストークと急性冠症候群の病変形態との関連を明らかにするように研究を推進する予定である。更に単球サブセットの質的変化の機序解明および予防に向けて、対象患者由来のCD14陽性単球におけるTLR-4シグナルの活性化機構、および炎症性サイトカイン・ケモカインの分泌能の評価と、心血管作動薬の影響の有無についても研究環境を整えていく予定にしている。また基礎研究に関しても遺伝子欠損マウスおよび野生型マウスに深部静脈血栓モデルの作成に着手している。現在、血栓形成の程度の再現性を検討している段階である。準備状況が整い次第、分子生物学的機序の比較・検討に関する研究を施行する予定としている。
整数問題の計算アルゴリズムの研究

数値計算系の言語(たとえばFortran,C)にくらべ数式処理系の言語は(当然ながら)数値計算は比較的遅い。何故なら数式処理ははじめから任意精度の計算能力を持っているので高速性はある程度犠牲にされるのである。この欠点はは四則よりも関数値計算によりはっきりする。この研究の目的は初等超越関数の任意精度高速計算は上述の欠点を補うためのものである。現在普及している計算機では小数float)計算より整数(int)の計算が速い。そこでfloat計算よりint計算をより使う関数計算アルゴリズムを研究した。工夫をすればいくつかの方法があるがここでは歴史のある連分数の方法を改良して用いることにした。その理由は計算を殆ど整数の加減乗算で行い割り算(floatの計算)はほんの僅か(殆どの場合1回)にできる。また誤差の評価が比較的容易でStirlingの公式などを用いればかなり厳密に誤差評価ができる。連分数を用いた関数表示は歴史的な結果であるがその高速計算性は最近のものである。更に我々が示したように入力を有理数としたとき分子,分母の2つの整数で最終結果が求まるように表現した文献はまだ表れていないように思われる。理論をprogramした結果はかなり良好で詳細は本論に譲るが計算速度は数式処理のなかでは関数計算が高速と評判のあるPari GPよりexp,tanは一桁atanは数割高速である。残念ながらlogはPari GPより遅いが連分数の計算を工夫すれば数倍高速化できる見通しがありこれは今後の課題である。今回の研究は初等超越関数の高速な任意精度計算を目指した.まずで以下の文献で計算アルゴリズムを調べた.桁数が固定されていれば関数値の計算は近次式で行えばよいが任意桁数ではこの方法は用いる事ができない.従って所謂展開式または漸化式を使うことになる.展開式には著明なTaylor展開,連分数展開,また各種の直交関数展開がある.漸化式にも関数により数種類ある.この内高速計算に適するものはTaylor展開,連分数展開,有理式で表された漸化式である.この研究ではTaylor展開によるものは良く使われているので連分数を使ったものを扱った.まだ素朴なプログラムであるので十分に検討されていないが三角関数,指数関数はTaylor展開によるものより一割以上速く計算できる.残念ながら逆三角関数,対数関数は望み通りの速度になっていない.数値計算系の言語(たとえばFortran,C)にくらべ数式処理系の言語は(当然ながら)数値計算は比較的遅い。昨年度に引き続き初等超越関数の高速な任意精度計算方法を研究した.昨年度に完成ののめどをつけた指数関数,三角関数のプログラムは一応完成した.これらは富士通研究所で開発された数式処理言語Risa/Asirで書かれておりその速さは数学者の間で使われていて速さには定評がある計算ソフトPari GPの数倍から100倍程度速い.方法はAnalytic Theory of Continued Fraction,H.S.Wall,Chelseaさらに関数の範囲をひろげ対数関数,逆三角関数の計算アルゴリズムをやはり連文数からもとめRisa/Asir上に実現した.ただし逆三角関数(Arctan)はPari GPの数割から数倍はやくなるが,残念ながら対数関数はPari GPのそれより数割遅い.これからの研究課題はこの対数関数の計算高速化にある.これは計算方法を連分数に限定しないで考えてみたい.
部位特異的な口腔環境診断法の確立-無線によるpH測定-

(1)pH計の開発に関しては、17年度に立ち上げた、センサーモジュールとネットワークモジュールで構成される、センサーモジュール用微弱無線モジュールを用いた装置を改良するまでにはいたらなかった。この無線モジュールとpHセンサーの両方を組み込んだ装置は大きさがおおきいこと(24mmx24.5mm)と、電源が少なくなるとノイズが大きくなるなどの欠点があった。ボタン型の小型リチウムイオン2次電池1個でセンサーモジュール、送信モジュールの消費電力をまかなうために、どうしても容量に限界があった。今後はこの点の改善が必要と考えられた。(2)硫酸アトロピン服用前後のpH変化を下顎前歯部舌側、上顎前歯部唇側、上顎臼歯部頬側の3箇所においてモニターした。硫酸アトロピン服用40分から60分後に、安静時唾液は各被験者とも服用前の約50%に減少することを確認した。その間のpHモニタリング結果は各部位ともpHが硫酸アトロピン服用前より低下する減少が認められた。その低下率は、下顎前歯部舌側が最も大きく、唾液分泌速度の影響を最も強く受けていることが伺われた。(3)口腔内一箇所にpHセンサーを取り付けて、ガム咀嚼中のpHをモニターした結果では、ガム咀嚼後、約2分後にpHは最大(約8.2)になり、約5分後にはpH7以下に下がり、徐々に下降することが示された。分泌量の影響はガム咀嚼中は効果があることが示された。今年度は(1)無線pH計の開発と(2)そのpH計を用いて試験的に口腔内pHの計測を行った。(1)無線pHの開発:センサーモジュールとネットワークモジュールで構成される、センサーネットワークモジュール用微弱無線モジュールを用いて、無線モジュールとpHセンサーの両方を組み込んだ装置を口腔内の歯に装着し、唾液pHの継時的変化の測定データをネットワークモジュールに無線通信した。測定データを受信したネットワークモジュールからは、USBケーブルでパソコンに測定データを転送させた。センサーモジュールとネットワークモジュールの間は303.825MHz帯の微弱無線で通信し、通信距離は標準で約15mと電波法の規制範囲に収めている。開発したセンサーモジュールは、CPUなどの実装したベースボードとRF(無線)ボードのプリント基板2枚を重ねたもので、アーキテクスチャーをシンプルにすることによって寸法を24mm x 24.5mmと超小型化した。起動時間を短くするためOSは使わず、そのために消費電力を大幅に下げることに成功し、ボタン型の小型リチウムイオン2次電池(CR2032)1個でセンサーモジュールなどの消費電力をまかなえる。(2)口腔内pH測定:既知のpH溶液でキャリブレイション後、口腔内3箇所で同時にpHをモニターした。安静時、およびレモンジュースで口腔内洗口後のpHを測定し、有線のpH計にて測定した結果と比較したところ、ほぼ同様な変化を示し、無線pH計の感度、正確さを確認することが出来た。硫酸アトロピン服用後、唾液分泌量が約50%に低下した時点で同様の実験を行うと、pHの回復は正常時に比べ著しく遅延した。次年度においては、症例数を増して検討を行う予定である。(1)今年度はpH計の開発に関しては、以前に立ち上げた、センサーモジュールとネットワークモジュールで構成される、センサーモジュール用微弱無線モジュールを用いた装置を改良するまでにはいたらなかった。この無線モジュールとpHセンサーの両方を組み込んだ装置は大きさがまだおおきいこと(24mmx24.5mm)と、電源が少なくなると、ノイズが大きくなるなどの欠点があった。(2)口腔内一箇所にpH

センサーを取り付けて、ガム咀嚼中のpHをモニターした結果では、ガム咀嚼後、約2分後にpHは最大(約8.2)になり、約5分後にはpH7以下に下がり、徐々に下降することが示された。分泌量の影響はガム咀嚼中は効果があることが示された。(3)フッ素洗口後のフッ素の口腔内停滞時間は睡眠時は昼間覚醒時にフッ素洗口を行った場合の約6.5倍になることが示された。これは唾液のクリアランスの影響であることは明らかである。このときのpHの変化については、有線のpH計にてモニターしたところ、pH5.9まで低下する被験者もいたが、今後無線によるpH形での測定が期待される。(4)口腔内微生物の部位特異性について調査した結果、下顎前歯部には唾液の影響で微生物の検知率が最も少なかった。上顎前歯部唇面は一部の微生物の検知率が高かった。これらのことから微生物の検知率にも部位特異性がみられ、pHの変化にも影響が及ぶことが考えられた。
単体フッ素の純科学的合成に関する研究

本研究は単体フッ素を用いることなく合成できる金属フッ化物の熱分解により、電気化学的手法を用いずに単体フッ素を合成することを目的とした研究である。今回は2成分系の金属フッ化物としてその生成エンタルピーがもっとも低いフッ化銀AgFを対象にその熱特性を検討した。熱分析用の純粋なAgFの合成法が検討され、フッ酸溶液と酸化銀の反応により得られたAgFを光による還元を避けながら無水フッ化水素中で何度も処理することにより、きわめて純粋なAgFを得ることに成功した。最初にモネル金属反応容器中で真空中での白金坩堝にいれられたAgFの加熱試験を行ったが、融点とされている435°Cでの溶融が起こらず、僅かながら圧力上昇が見られた。さらに加熱後の残留物が金属銀であり、白金坩堝の重量変化もないことが確認された。この結果AgFの熱分解により、フッ素発生が起こっている可能性がきわめて高くなった。この試料を用いて示差熱分析を行ったところ、昇温時435°C付近に2つの吸熱ピークが現れ、降温時は高温側の発熱ピークのみが現れることが確認された。現在熱重量分析により、分解反応の詳細な解析、および発生ガスの捕集および分析による再確認実験が進行中であるが、発生するフッ素ガスがきわれて腐食性の高いガスであり、特に高温では反応管壁と反応しやすく、定量的な実験を行うには、なおしばらくの時間を要すると思われる。
慢性喫煙曝露により誘導されるマウス気道リモデリングの解析

高齢者疾患との関連性が示唆される加齢指標蛋白質(Senescence Marker Protein-30 ; SMP30)に着目し、SMP30ノックアウト(SMP30Y/-)マウスの加齢に伴う肺カルボニルタンパク質の変化、慢性喫煙負荷による酸化ストレスの影響と肺病理変化を検討した。SMP30Y/-マウスでは対照野生型マウス(SMP30Y/+マウス)に比べて、加齢に伴い肺カルボニル蛋白質が、早期に、かつ有意に多くのカルボニル化蛋白質を検出した。抗DNPH抗体による免疫組織染色では、蛋白質のカルボニル化は肺組織内にびまん性に認められ局在性はなかったが、SMP30Y/-マウス肺でやや強く発現がみられた。肺組織のカルボニル化蛋白質は、両マウスでタバコ煙曝露により増加する傾向を示したが、統計学的有意差はなかった。しかし、タバコ煙曝露群を比較するとSMP30Y/-マウスはSMP30Y/+マウスに比べて有意に高値であった。SMP30Y/-マウスでは、8週間のタバコ煙曝露によってMLIが23.3%増加し、DIは10%以上と有意な肺胞破壊を認め肺気腫が誘導されたが、対照SMP30Y/+マウスでは肺気腫は生じなかった。肺組織の過酸化脂質はSMP30Y/+マウスではタバコ煙曝露による有意な変化はなかったが、SMP30Y/-マウスで曝露後有意に上昇していた。SMP30Y/-マウス肺組織では、喫煙により中枢気道から肺実質のすべての領域で有意にアポトーシス細胞が増加していた。SMP30は酸化ストレスから肺を保護し肺気腫発生に防御的に作用すると考えられた。喫煙による酸化ストレスは肺気腫を誘導するが気道炎症は両群において有意な差は認めなかったことから、内的加齢因子は気道炎症にとっての寄与度は肺気腫発生に対するそれより少ないものと考えられた。一方、SAMP1(加齢肺モデルマウス)とSAMR1(正常加齢を示す対照マウス)を用いて肺の加齢にとって重要な遺伝子発現を解析する目的で、3、6、12ヶ月例の両群マウスの肺組織での加齢に伴う遺伝子発現をマイクロアレイにより網羅的に検討したところ、約2%の遺伝子発現に変化があった。このうち、加齢に伴いストレス応答遺伝子(heat shock protein 68)の発現低下、炎症性サイトカインのIL-1βの発現上昇、薬物代謝酵素系では肺胞の再生や肺構造維持に大切は増殖因子であるレチノイン酸代謝に関与しうるcytochrome p450 isozyme(CYP2C39)の発現亢進、等の興味ある遺伝子の動きを捉えることができた。SMP30やこれらの機能分子は気道炎症や肺気腫の今後の重要な研究対象と考える。

SMP30やこれらの機能分子は気道炎症や肺気腫の今後の重要な研究対象と考える。加齢促進マウス(SAMP1マウス)と対照マウス(SAMR1マウス:SAMP1と同系統マウスであるが正常加齢を示すマウス)(雄、3ヶ月齢、4匹)を用い、ケンタッキー大学研究用タバコ1R1を使用し1.0%タバコ煙を1目30分、週5日間、8週間継続して吸入曝露させた。BAL液中の総細胞数は、SAMP1とSAMR1の両群において喫煙による有意な増加を認めなかった。一方、定圧固定した肺組織標本では、SAMP1では平均肺胞径(MLI)が喫煙群で有意に増加したが(平均±SE、86.4±1.4μmvs.78.5±1.2μm、p=0.0079)、SAMR1では喫煙群と非喫煙群に有意差を認めなかった(75.2±1.7μmvs.73.8±2.7μm、p=0.604)(図2)。肺胞破壊指数(DI)はSAMP1の喫煙群で14.3%と有意な破壊が検出されたが、SAMP1の非喫煙群、SAMR1の喫煙・非喫煙群では有意な肺胞破壊(DI≧10%)を検出しなかった。慢性喫煙曝露前後でのBAL液中のTNFαやエラスターゼ活性はSAMP1の喫煙群・非喫煙群間において有意差を認めなかったが、グルタチオン濃度は喫煙により有意に低下した。喫煙前後での気道炎症に関しては、HE染色では喫煙群で気道上皮細胞の剥脱、扁平化が認められ、定量的評価を行う予定である。ニトロチロシン抗体を用いて免疫染色を行ったが、喫煙群・非喫煙群間において有意差を認めなかった。アルシアンブルー・PAS染色を行い杯細胞や粘液産生細胞数を検討したが、過形成は認めなかった。鍍銀染色により基底膜肥厚の有無、Masson-Trichrome染色により気道周囲平滑筋細胞の過形成を検討する予定である。気道上皮細胞の増殖動態を検討するため、Ki67、TTF-1、HHF-1などの増殖マーカーの免疫染色を施行中である。COPD発症の危険因子として加齢と慢性タバコ煙曝露の両因子を重視し、加齢促進マウス(SMP30-KOマウスおよびSAMP1マウス)に2ヶ月間の喫煙を負荷後に気道炎症、肺気腫形成を検討した。喫煙群と非喫煙群の気道病理所見をHE染色、鍍銀染色、Azan Mallory染色、アルシアンブルー・PAS染色により検討したが、扁平上皮化生、杯細胞化生はあまり検出されなかった。また、基底膜や気道周囲の平滑筋細胞の過形成も顕著な所見は得られなかった。気道上皮の傷害・再生の指標としてTTF-1、Ki67等の核内転写因子や増殖マーカーを検討したが顕著な変化は認められなかった。喫煙期間が2ヶ月間と比較的短期間で肺気腫が発生するのに対し、気道病変の成立には期間としては不十分な可能性、あるいはマウス気道はCC10で染色すると60-70%がクララ細胞でしめられヒト気道上皮の主要構成成分である繊毛上皮細胞が非常に少ないことが原因と思われた。喫煙に伴う炎症マーカーとしてカルボニル化蛋白質、シトルリン化蛋白質等の分子修飾を検討した結果、SMP30-KOマウスでは月齢と共に肺内カルボニル化蛋白質が増加することが明らかとなり、現在喫煙暴露後の変動を検討する予定である。一方、SAMP1(加齢肺モデルマウス)とSAMR1(対照マウス)を用いて喫煙負荷により肺で発現が亢進あるいは減少する遺伝群をマイクロアレイにより網羅的に検討するため、3,6,12ヶ月例での加齢に伴う遺伝子発現を比較検討した結果、約2%の遺伝子発現に変化があり、さらにこのうち喫煙でどのような変動が生じるか検討中である。
電気刺激による内喉頭筋の再運動化と筋萎縮の抑制に関する研究

本研究では、喉頭麻痺によって障害された呼吸機能や耐運動能を回復させるための電気刺激の有効性と安全性について検討した。イヌ両側喉頭麻痺モデル動物を作成し、声門開大筋の表面に刺激電極を留置して、埋め込み型電気刺激装置に接続した。神経再支配が完了するまでは電気刺激で誘発される声帯運動が非常に小さかった。しかし、神経再支配が完了すると電気刺激で誘発される声門開大運動が大きくなり、正常とほぼ同等の運動が観察された。誘発される声門開大運動によって喉頭麻痺モデル動物の呼吸機能や耐運動能がほぼ正常の状態に回復した。長期間の電気刺激をおこなったが、誤嚥は誘発されず、筋線維の障害もほとんど観察されなかった。本研究の目的は、障害された喉頭機能を回復させるために、麻痺している喉頭の筋に電気刺激を加えて筋収縮を誘発し、固定している声帯を再運動化させることにある。まず、声門閉鎖運動を誘発する甲状披裂筋を長期間刺激するための埋込型電極をデザインした。電極は縦8mm、横10mm、厚さ1mmのシリコンシートに直径1mmの電極を3mm間隔で2列に8個配置した。この電極で実際に声門閉鎖運動が誘発できるのか検討するために、イヌの声帯麻痺モデルを作成した。実際の声帯麻痺患者では、喉頭筋に神経再支配がおこっていても、声帯運動は回復せず、声帯が固定したままとなる。これは、喉頭筋に生じる神経再支配が本来の神経支配とは異なる過誤支配となるためである。本研究では喉頭の再運動化に対する神経再支配の影響を確認するために、モデル動物を反回神経を切断した直後に再吻合した喉頭筋再支配モデルと反回神経切断後に吻合をおこなわない喉頭筋脱神経モデルの2群に分け、電気刺激によって誘発される声門閉鎖運動の違いについて検討した。神経切断から3ヶ月後に、声帯が固定していることを内視鏡で確認して、麻痺側の甲状披裂筋の表面に埋込型刺激電極を留置した。口から内視鏡を挿入し、電気刺激で誘発される声門閉鎖運動を観察した。切断後に神経吻合をおこなった再支配群の動物では、小さな電気刺激で大きな声門閉鎖運動が誘発され、その調節は容易であった。一方、神経吻合をおこなわなかった脱神経群の動物でも電気刺激によって声門閉鎖運動を誘発することはできるが、より大きな電気刺激が必要であり、その調節も容易ではなかった。この結果から、喉頭筋の神経再支配の程度にかかわらず、電気刺激による声門閉鎖運動の誘発は可能であるが、喉頭筋が神経再支配を受けているほうが、より効率的に声帯運動を誘発することが可能であり、その調節も容易であると考えられた。本研究の目的は、障害された喉頭機能を回復させるために、麻痺している喉頭の筋に電気刺激を加えて筋収縮を誘発し、固定している声帯を再運動化させることである。まず、声門閉鎖筋である甲状披裂筋を長期間刺激するための埋込型電極をデザインした。モデル動物は反回神経を切断した直後に再吻合した喉頭筋再支配モデルと反回神経切断後に吻合をおこなわない喉頭筋脱神経モデルの2群に分け、電気刺激によって誘発される声門閉鎖運動の違いについて検討した。神経切断から3ヶ月後に、声帯が固定していることを確認して、麻痺側の甲状披裂筋の表面に埋込型刺激電極を留置した。口から硬性内視鏡を挿入し、電気刺激で誘発される声門閉鎖運動をビデオに記録して解析した。長時間の強制的な筋収縮は筋の疲労現象を誘発する。今回の電気刺激では120秒を越えて十分な声帯運動を誘発できることが確認された。さらに筋の疲労現象による声帯運動の低下は、我々が目的とする喉頭機能の回復には影響しないものと推察された。

本研究の目的は、障害された喉頭機能を正常に近い状態に回復させるために、機能しなくなった喉頭の筋肉に電気刺激を加えて筋収縮を誘発し、喉頭の運動機能を回復させることにある。喉頭の運動機能は声門閉鎖運動と声門開大運動に分けられる。はじめに、声門閉鎖運動に関与する甲状披裂筋を長期間にわたって刺激するための新しい埋込型電極をデザインした。甲状披裂筋は甲状軟骨のすぐ裏側にある板状の筋肉である。この筋の位置と形状から刺激電極の形状をシート状のものに工夫した。電極は縦8mm、横10mm、厚さ1mmのシリコンシートに直径1mmの電極を3mm間隔で2列に8個配置した。次に、この電極を使って実際に声門閉鎖運動が誘発できるのか検討した。実験にはイヌを用いた。麻酔下でイヌの頸部を切開して甲状軟骨を露出した。甲状軟骨の表面に5mm×7mmの長方形の開窓をおこない、甲状披裂筋の表面を露出して、軟骨と甲状披裂筋の間に埋込型電極を留置した。まず、正常の神経支配がある甲状披裂筋を用いて、電極の適切な位置と効果的な刺激パラメーターについて検討した。声帯の運動は口腔より挿入した内視鏡で観察した。埋込型電極には8つの電極があるが、その中でも甲状披裂筋の外側部分に位置している電極ほど、小さな電気刺激で大きな声門閉鎖運動が誘発できていた。刺激頻度は40Hzが最も効果的であった。本研究の目的は、障害された喉頭機能を回復させるために、麻痺している喉頭の筋に電気刺激を加えて筋収縮を誘発し、固定している声帯を再運動化させることである。まず、声門閉鎖筋である甲状披裂筋を長期間しげきするための埋め込み型電極をデザインした。電極は縦8mm、横10mm、厚さ1mmのシリコンシートに直径1mmの電極を2列に6個配置した。この電極で実際に声門閉鎖運動が誘発できるのか検討するために、イヌの声帯麻痺モデルを作成した。モデル動物は反回神経を切断した直後に再吻合した喉頭筋再支配モデルと反回神経切断後に吻合をおこなわない喉頭筋脱神経モデルの2群にわけ、電気刺激によって誘発される声門閉鎖運動の違いについて検討した。神経切断から3ヶ月後に声帯が固定していることを確認して、麻痺側の甲状披裂筋の表面に埋め込み型電極を留置した。口から硬性内視鏡を挿入し、電気刺激で誘発される声門閉鎖運動をビデオに記録して解析した。切断後に神経吻合をおこなった再支配群の動物では、小さな電気刺激で大きな声門閉鎖運動が誘発され、その調節は容易であった。一方、神経吻合をおこなわなかった再支配群の動物でも電気刺激によって声門閉鎖運動を誘発することはできるが、より大きな電気刺激が必要であり、その調節も容易ではなかった。長時間の強制的な筋収縮では筋の疲労現象が誘発される。我々のモデル動物では、電気刺激が120秒を越えても十分な声帯運動を誘発できていた。最終年度に実施した研究では、この機能的電気刺激による声帯運動の誘発を声帯麻痺の治療として臨床応用するために、長期間埋め込まれた電極が損傷されることなく、有効に作用し続けるのか確認した。その結果、長期間の埋込によって電極は損傷することが多く、電極の形状や留置する位置についてはさらなる改良と工夫が必要であると思われた。医歯薬学喉頭運動機能の回復を目指した機能的電気刺激の応用には、まず目的とする筋を確実に刺激することができる電極が必要不可欠である。昨年度は新しい電極を開発し、それが実際に使用可能であるかを検証し、使用に耐えうるものであることを確認した。本年度はその電極を用いて麻痺している筋を電気刺激した。
脳の組織形成および膵内分泌における細胞内膜融合の分子機構の解明

本研究は、細胞内において膜蛋白質や分泌蛋白質を輸送する小胞と細胞膜との融合に働くSNARE分子であるSNAP23の個体における機能を解明することを目的とし、組織特異的遺伝子欠損マウス(KOマウス)の解析を行った。神経特異的SNAP23 KOマウスでは大脳皮質や小脳の形成不全が観察され、SNAP23が胎生期の脳の組織形成に必須の分子であることが示唆された。一方、膵内分泌腺特異的SNAP23 KOマウスではグルコース刺激後の膵β細胞からのインスリン分泌が増加することが明らかとなり、SNAP23がインスリン分泌に抑制的に働いていることが示唆された。本研究は、細胞内において膜蛋白質や分泌蛋白質を輸送する小胞と細胞膜との融合に働くSNARE蛋白質であるSNAP23の遺伝子欠損マウス(KOマウス)を用いて、脳の組織形成や膵内分泌におけるSNAP23の機能を解明することを目的としている。神経特異的SNAP23 KOマウスでは大脳皮質や小脳の形成不全が生じることから、胎生期の大脳皮質における神経発生について形態学的な解析を行った。その結果、SNAP23 KOマウスでは神経前駆細胞の形態異常が見られ、それに伴って新生ニューロンの遊走異常や細胞死が起きていることが明らかとなった。膵内分泌腺特異的SNAP23 KOマウスでは、グルコース刺激後の血糖値がコントロールマウスに比べて低値となり、2光子励起顕微鏡や全反射顕微鏡を用いたインスリン顆粒の開口放出の観察によって、KOマウスの膵β細胞でインスリン分泌頻度が増加していることを明らかにした。この結果から、膵β細胞においてSNAP23の作用を抑制することでインスリン分泌を亢進させることが可能であると考えられたことから、SNAP23に特異的に結合する低分子量化合物の探索を理研ケミカルバイオロジー研究基盤施設と共同で行い、数種類の候補化合物を得た。この候補化合物を用いて、膵β細胞株であるMIN6細胞やマウスから単離した膵β細胞からのインスリン分泌を解析したところ、1つの化合物がインスリン分泌を促進することが明らかとなった。このことは、SNAP23結合化合物が糖尿病治療の新規薬剤候補となり得ることを示唆している。本研究は、細胞内において膜蛋白質や分泌蛋白質を輸送する小胞と細胞膜との融合に働くSNARE分子であるSNAP23の遺伝子欠損マウス(KOマウス)を用いて、脳の形成や膵内分泌におけるSNAP23の機能を解明することを目的としている。前年度までの解析により、膵内分泌腺特異的SNAP23 KOマウスでは、グルコース刺激後の血糖値がコントロールマウスに比べて低値となり、2光子励起顕微鏡や全反射顕微鏡を用いたインスリン顆粒の開口放出の観察によって、インスリン分泌頻度が増加することを明らかにした。また、SNAP23に特異的に結合する低分子量化合物の探索を行い、数種類の候補化合物を得た。この化合物をマウス個体へ投与したところ、グルコース刺激後の血糖上昇がPBS投与個体に比べて抑えられ、血中のインスリン濃度の上昇が見られた。以上の結果から、この化合物が個体においてもインスリン分泌を促進する作用があることが示唆された。現在、これらの成果を論文にまとめ投稿中である。一方、神経特異的SNAP23 KOマウスではこれまでに大脳皮質や小脳の形成不全が観察されていたため、胎生期の大脳皮質の形態学的な解析を行った。その結果、SNAP23 KOマウスでは神経前駆細胞の形態異常が見られ、それに伴って新生ニューロンの遊走異常や細胞死が生じていた。この神経前駆細胞の形態異常は、細胞膜に局在する細胞間接着分子の減少に起因することが示唆された。そのため、細胞間接着分子であるN-cadherinが細胞膜へ局在化する際にSNAP23と結合するSNARE分子を免疫沈降法によって探索し、いくつかの候補分子を得たため、現在それらの解析を進めている。本研究では脳と膵臓という2つの組織におけるSNAP23の機能を解明するため、それぞれの組織特異的KOマウスを並行して解析している。その内、膵内分泌特異的KOマウスの解析はおおむね計画通りに進展し、SNAP23の機能を抑制するとみられる低分子化合物の同定に至った。この化合物は膵β細胞からのインスリン分泌を促進することが明らかとなり、糖尿病の新しい治療薬の候補になることが考えられた。現在はこれまでに得られた結果をまとめ、論文投稿の準備中である。

また、神経特異的KOマウスの解析についても、神経前駆細胞における細胞間接着分子N-cadherinの細胞内輸送の解析や、細胞膜への局在化の際にSNAP23と複合体を形成するSNARE蛋白質の同定に着手しており、これらの結果が得られ次第、論文作成に移る予定である。細胞生物学膵内分泌腺特異的SNAP23 KOマウスの解析は概ね完了しているため、今後は神経特異的SNAP23 KOマウスの解析に重点を置く。神経特異的SNAP23 KOマウスの発生期大脳皮質における神経前駆細胞の形態異常が、細胞間接着の欠失によるものであると考えられたため、SNAP23およびそのパートナーとなる他のSNARE分子が細胞間接着分子の細胞膜への輸送・局在化に働いていることが推測された。この仮説を証明するため、神経前駆細胞の初代培養系を用いてGFP融合N-cadherinの細胞内輸送のライブセルイメージングを行う。また、siRNAスクリーニングを用い、神経前駆細胞の細胞間接着やN-cadherinの細胞膜局在に影響を及ぼすSNARE蛋白質を同定し、N-cadherin輸送におけるSNAP23のパートナー分子を決定する。本年度は研究に使用するノックアウトマウスがすでに作製済みであったことや、共同研究者との打ち合わせの回数が少なかったことなどがあり、当初の予定金額と実際の執行額が異なってしまったが、研究計画に変更はなく、次年度に全額執行予定である。次年度は共同研究者との打ち合わせや学会発表の旅費、抗体やELISAキットなどのやや高額の消耗品の購入により予算を執行する予定である。
動脈硬化発症・進展の分子機構

動脈硬化発症、進展における血管内皮細胞活性化につき注目し研究し、それに関わる酸化LDL、さらに酸化LDL生成過程で生じるリゾフォスファチルジルコリン(Lyso-PC)の重要性を示すと共に、酸化LDLの新たな受容体Lox-1を見出した。動脈硬化初期病変においては血管内皮細胞表面への接着分子の発現及び血管平滑筋細胞増殖因子の遺伝子発現が見出される。そこで、オーストラリア、米国に出張し研究発表ならびに研究の打ち合せを行った。中でも、接着分子(Athero-ELAM)の発見者であるGimbrone,Cybulsky博士と共同してLyso-PCによる接着分子発現機構を明らかにし、さらにIn Vivoにおける酸化LDL、Lyso-PCの存在様式の解明を行いまた、内皮細胞、平滑筋細胞増殖作用に有するthrombinの受容体をClomingしたCoughlin博士と共同して、酸化LDL、Lyso-PCによるthrombin受容体の遺伝子発現の分子機構を検討し、動脈硬化の発症、進展の分子機構について研究を行い新たな知見を得た。申請者らは従来より血管内皮細胞の活性化に酸化LDLの生成過程で生じるリゾフォスファチジルコリン(Lyso-PC)が深く関与することを明らかにする目的で、血管構成細胞とりわけ血管内皮細胞、マクロファージ、Tリンパ球におけるLyso-PCによる接着分子、増殖因子群の発現誘導様式ならびに、これらの現象をきたす細胞内情報伝達経路につき解析を行なってきた。なかでも最近粥状動脈硬化の進展に関与するとされてきているTリンパ球については、Lyso-PCのサイトカイン、増殖因子の生成、放出への影響を、INF-γ、HB-EGFの発現様式につきヒトTリンパ球を用いて検討した.今年度は新たにLyso-PCが血管内皮細胞におけるPECAM-1(Platelet endo thelial cell adhesion mo1ecule-1)のチロシンリン酸化をきたすことを明らかにした。今後さらにその分子機構を解明するとともに、生物学的意義につき解析する予定である。粥状動脈硬化の初期病変の形成過程にはマクロファージ由来の泡沫細胞が多数集簇することが知られる。この泡沫細胞の形成機構には従来よりスカベンジャー受容体による酸化LDLの取り込みが関与するとされてきたが、申請者らは最近酸化LDL受容体であるLOX-1を新たに同定し報告した。今年度はさらにそのリガンド結合の特異性の解析を行なうとともに、その発現誘導がいかなる刺激で生じるかを追求しており、現在その詳細につき検討中である。
男性不妊症における体細胞異常の解明と次世代に伝播しない新たな遺伝子治療への応用

平成30年度は、当初の研究計画に基づき精巣組織からのSertoli細胞とLeydig細胞の分離方法の確立を試みた。思春期後の精巣の状態を評価するため、8週齢のC57BL/6Jマウスを対象とした。精巣を摘出し、酵素処理により細胞を分離した。分離した細胞を5% Percoll溶液に静置し、上層と下層に分けた。上層の細胞を超遠心し、回収したものをLeydig分画とした。また下層の細胞を培養し、DSA (チョウセンアサガオ)lectinに接着したものをSertoli分画とした。Sertoli細胞マーカー(SOX9)およびLeydig細胞マーカー(STAR)を用いた蛍光免疫染色により、各分画における陽性細胞率を算出し、分離前と比較した。また、定量PCRでSertoli細胞に特異的な遺伝子(Sox9、Wt1、Rhox5)、Leydig細胞に特異的な遺伝子(Star、3b-HSD、Calb2、Lhr)の発現量を比較した。DSA lectinとPercollを用いた本方法では、Sertoli細胞の分離は困難であったが、Leydig細胞を効率よく分離できることが明らかとなった。Sertoli細胞はtight junctionで強固に接着していることが、分離を困難にした原因と考えられた。当初の計画どおり精巣の体細胞分離の方法を、Leydig細胞に関しては確立している。Sertoli細胞に関しても検討がすすんでいる。平成31年度は、各種の病態に応じた男性不妊症モデル動物の作成にとりかかる。具体的には、LH-RHアナログを投与しアンドロゲンを去勢レベルとしたホルモン異常モデル、ブスルファン40mg/kgを投与した精細胞異常モデル、外科的に停留精巣を作成した後天的不妊モデル、の3種類の作成を予定している。次年度使用額が無いため、記入しない。
ヘテロクロマチン領域で転写を維持する核内テリトリーとクロマチン構造の多角的解析

本研究では、哺乳類のX染色体上で不活性化を免れる遺伝子EIF2S3と近傍で不活性化される遺伝子KLHL15の遺伝子間領域で不活性化を免れ転写を維持する機構に迫った。その結果、12つの遺伝子間領域にあるMatrixattachmentregion(MAR)が核マトリクスに結合し、2つの遺伝子を別ループに配置していること、2不活性化を免れる遺伝子領域ではユークロマチンに特徴的な、不活性化される遺伝子領域ではヘテロクロマチンに特徴的なヒストン修飾が見られた、3SATB1遺伝子が上記2つの現象に深く関わっていることを示した。本研究では染色体テリトリー内のクロマチンヒストンの修飾や核内におけるクロマチンのループ構造と遺伝子の転写調節の関わりを統合的に理解するために哺乳類の不活性X染色体上で不活性化を免れる遺伝子をモデルにクロマチンレベル、核構造レベルでの転写制御を解析した。ほ乳類では雌(XX)雄(XY)間の性染色体の遺伝子量を補正するために雌で2本あるX染色体の一方を不活性化する。この不活性X染色体の核内局在を三次元FISH法により解析した結果、不活性X染色体が核膜近傍の外周部に局在する一方、不活性化を免れる遺伝子領域は不活性Xのテリトリーの外側に局在することが分かった。これらのクロマチン領域の局在変化には染色体を核マトリクス(核内骨格)に固定する領域Matrix attachmentregion (MAR)が重要である考え、不活性化を免れる遺伝子の1つEIF2S3とその近傍で不活性化を受ける遺伝子間の領域のMARを探索したところ、EIF2S3の1kb、14Kb、16Kb上流付近に3つのMAR候補配列が検出された。このMAR候補領域のヒストン修飾を調べた結果、1kb上流のMAR領域ではH3K9、K27、およびH4K20のメチル化レベルが急激に変化していた。この結果は、不活性化を免れる遺伝子が不活性クロマチンのテリトリーからループアウトし、転写を維持するためには近傍のMAR配列周辺のクロマチン構造が変化し、核マトリクスにMARが固定される必要性を示唆している。本研究では細胞核での遺伝子発現を統合的に理解するために哺乳類の不活性X染色体上で不活性化を免れる遺伝子をモデルにクロマチンレベル、核構造レベルでの転写制御を明らかにするために研究を行ってきた。ほ乳類では雌(XX)雄(XY)間の性染色体の遺伝子量を補正するために雌細胞では2本あるX染色体の一方を転写レベルで不活性化する。しかしヒトでは例外的に不活性化を免れる遺伝子が存在しており、昨年度は不活性化を免れる遺伝子EIF2S3と近傍で不活性化を受ける遺伝子の間の領域にあるMatrix attachment region(MAR)と呼ばれる核マトリクス(核の骨格)に結合する配列に着目し、この領域のピストン修飾が不活性化を免れるのに重要である可能性を示した。本年度はEIF2S3の近傍で不活性化される遺伝子KLHL15領域におけるMAR配列とヒストン修飾に関して解析を行った。その結果、1)KLHL15遺伝子内には5つのMAR候補配列があり、4箇所は不活性X特異的に核マトリクスに結合し、2)SATB1がこれらの4箇所のMARに結合すること、3)核マトリクスに結合しているMAR周辺ではヘテロクロマチンマーカーであるH3K9やH3K27がtriメチル化されている事などが明らかになった。以上の結果から不活性化を免れる遺伝子はMARにより近傍の不活性される遺伝子とは別のクロマチンループに配置され、それがヒストン修飾を含むクロマチン構造の境界となり、転写を維持する構造を形成していると考えられる。しかしヒトでは例外的に不活性化を免れる遺伝子が存在しており、昨年度までに不活性化を免れる遺伝子EIF2S3と近傍で不活性化される遺伝子KLHL15の間でクロマチン構造の境界が形成される事、そして2つの遺伝子の遺伝子間領域にあるMatrix attachment region (MAR)が核マトリクス(核の骨格)に結合し、それぞれの遺伝子を別のループに配置していることを明らかにした。本年度は、このクロマチンループの構造を形成するのに重要であると考えられるSATB1遺伝子を一過的にノックダウンすることで、不活性化を免れるEIF2S3と不活性化されるKLHL15領域のクロマチン構造、および転写状況がどのように変化するかを調べた。その結果、SATB1をノックダウンした雌細胞では、1)昨年度までに検出された、EIF2S3とKLHL15

遺伝子間領域にあるMAR配列の核マトリクスへの結合が失われ、2) EIF2S3の領域でもヘテロクロマチンに特徴的なヒストン修飾であるヒストンH3K9のトリメチル化が検出され、3) EIF2S3の転写が有意に抑制される傾向が認められた。このような変化は雄の細胞では認めら無かったことからヒト不活性X染色体上の変化であると断定した。以上の結果から、不活性化を免れる遺伝子は、MAR配列を介して不活性化を受ける遺伝子とは別のクロマチンループに配置される事で、ヘテロクロマチン化する不活性X染色体上で転写を維持している事実を証明できたと考える。核内での転写制御の理解という課題に対して各年度に設けた研究計画に関して、1)活性Xと不活性Xの核内局在変化、2)不活性化を免れる遺伝子領域のクロマチン構造の解析の2点はすでに予定通り達成できていることから、おおむね順調に進呈していると評価した。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後の予定として、不活性化を免れる遺伝子領域が他の常染色体の特定の領域と相互作用をしている可能性を3Cアッセイ法で検討を行う、クロマチン構造を人為的に破壊した場合の不活性化を免れる遺伝子の挙動の解析を等を計画通り行う予定である。
社会認知を介した意思決定に関わる神経ネットワークの解明

<最初期遺伝子を検索・同定>本年度はメダカの個体記憶を介した配偶者選択に関わる神経ネットーワークを包括的に同定する目的で、メダカ脳で最初期遺伝子を検索・同定した。方法はPTZ(GABA阻害剤)添加によって誘導される癲癇依存に発現が誘導される遺伝子群をマイクロアレイによって検索した。約15,000遺伝子について発現量を比較したところ、18種類の遺伝子が有為に発現上昇することを定量的RT-PCRで確認した。そのうち2つの遺伝子を用いて脳活動のマッピングを行ったところ、メダカメスがオスと長時間見ていた時に活性化している脳領域(終脳背側の一部)を同定した。<脳領域特異的な条件的遺伝子操作法の確立>これまでに、メダカの条件的遺伝子操作法を確立し、成体脳において細胞系譜単位(単一の神経幹細胞から発生したニューロン群)を遺伝学的にラベルすることに成功している。さらに一部の細胞系譜単位は終脳背側ではブロック化していることを見出している(PLoS One 8:e66597,2013)。本年度は終脳背側の一つの細胞系譜単位が(1)で同定した活性化脳領域に対応することを見出した。<個体記憶を介した行動を定量化する新規行動実験系の確立>本年度は新規な行動実験系を2つ確立し、以下の2点を示した。(1)メダカの三角関係(オス、オス、メス)において、オスはライバルオスに配偶者防衛行動を示すことで、メスがライバルオスを記憶することを妨害している(Frontier in Zoology in press)。メダカメスはそばにいたオスを記憶して、配偶者として選択する傾向があるので、メスがライバルオスを選択することを妨害していると考えられる。(2)メスは排卵前には視覚記憶したオスに選択的に近づき行動を示すが、排卵後はオスに対する選択性がなくなる(Zoological Science in press)。27年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに私たちはメダカは個体認知に基づく高度な社会性を持つことを発見した。例えば、メスの配偶者選択の際に「新規に出現したオス」と「見知ったオス」を識別して、後者の求愛を受け入れる現象(Science,2014)や、集団採餌の際に、餌場情報を記憶した学習個体を、未学習の個体が認知して追従することで採餌効率が上がる現象(PLoS One, 2013)を発見した。本年度はメスの配偶者選択に異常が生じる変異体をスクリーニングした結果、新たに2種類の変異体を同定することに成功した。一つの変異体の原因遺伝子はペプチドホルモンをコードしており、「新規に出現したオス」と「見知ったオス」の両方をすぐに受け入れる表現形を示す。さらに当該ペプチドホルモン受容体をコードする遺伝子変異体も同様の表現形を示すことも見出した。また当該ペプチドホルモン受容体遺伝子を発現するニューロンの形態や神経活動を可視化する目的で、当該遺伝子プロモーターの単離にも成功した。もう一つの変異体の原因遺伝子はbHTH型のDNA結合型転写因子をコードしており、「新規に出現したオス」と「見知ったオス」の両方を拒絶する表現形を示す。また視覚刺激に対して野生型と比較して、過剰に逃避行動を示す傾向が見つかった。当該転写因子は性行動に関わると予想される視索前野及び終脳の一部などに発現していることを見出した。

研究開始当初は、すでに同定していたメスの配偶者選択に異常が生じる変異体(GnRH3変異体)の解析を中心に進める予定であったが、本年度は新たに2種類の変異体を同定することに成功した。新たに同定した原因遺伝子(ペプチドホルモン及び転写因子をコード)の脳内での発現様式も同定できたことから、これらの原因遺伝子発現ニューロン群とGnRH3発現ニューロン群との間のネットワークを解析することで、研究目的の達成が可能になった。27年度が最終年度であるため、記入しない。行動異常の原因遺伝子(ペプチドホルモン受容体及び転写因子)プロモーターの下流にカルシウムインジケーターまたは神経毒素をつなげたコンストラクトを作成して、遺伝子導入個体を作製する。これにより、当該遺伝子を発現するニューロンの神経活動と行動との関連を解析する。また筋肉麻酔して固定したメダカに様々な社会刺激(同種個体、見知った(視覚記憶した)個体、異性・同性)を提示する実験装置の開発を行い、二光子DSLMを用いて、広範囲の脳領域を同時にイメージングする27年度が最終年度であるため、記入しない。
低含水率ポリビニルアルコール人工椎間板の椎間板変性抑制効果

人工椎間板は一部の外国で既に臨床応用され、椎間板の再建手術として注目されているが、その治療効果を示せた動物実験はこれまでになかった。本研究の目的は、人工椎間板置換術の動物実験モデルを作成し、その治療効果を動物実験で評価することである。人工椎間板モデルとして、日本白色家兎の腰椎に側方からアプローチし、K-wireで椎間板を側方から貫通後、同部にロッド型のポリビニルアルコール(PVA)製インプラントを留置した(PVA群)。使用したPVAは平均分子量8800、含水率約35%であった。アプローチしただけのsham群、アプローチ後K-wireで貫通したcontrol群(変性モデル)とレントゲン的、組織学的に比較した。計30羽60椎間板を評価したところ、神経損傷、深部感染、インプラント脱転例は無かった。レントゲン写真で椎間板高を計測したところ、PVA群およびsham群はcontrol群に比べて有意に椎間板高を保っていたことが分かった。組織学的にみると、control群は髄核組織量が激減し、術後1か月から線維輪において高度の変性を示したのに対し、PVA群では線維輪の変性は6ヶ月経過しても中等度までにとどまっており、有意な差を示していた。しかし術後6か月の時点ではインプラントの終板への沈下を生じた例があった。含水率60%の同型のインプラントを用いた場合でも組織像におけるインプラントの形状はほぼ同じで、椎間板内では内圧によってPVAが十分に膨潤できていない可能性が示唆された。本研究では、ウサギを用いた人工椎間板の実験モデルを確立することが出来た。また、その治療効果として椎間板高維持および髄核腔の充填効果が得られたため、ひいては変性を遅延させ得たと考えられた。すなわち人工椎間板は、椎間板切除後の髄核腔の再建手術として有用である可能性が示せた。より効果的に椎間板の再建を行うためには、材料の選別や形状の工夫などがさらに必要と思われた。PVAハイドロゲル(平均分子量8800、含水率30-40%)を原料として径約1.9mm、長さ約20mmの丸鉛筆型に加工したインプラントを動物実験に使用した。椎間板へのアプローチのみを行う手術をsham、アプローチ後椎間板にKirschner wireで貫通孔を作成し、変性をおこさせる手術をcontrol(変性モデル)、さらにKirschner wireで作成した孔にインプラントを挿入し、椎間板を貫通させた状態で留置する手術をPVA(人工椎間板モデル)とし、日本白色家兎の腰椎椎間板に対していずれかの手術を行った。実験動物は術後1,3,6ヶ月のいずれかで安楽死させ、採取した椎間板(sham群15、control群15、PVA群30椎間板)に対してレントゲン的、組織学的評価を行った。術前および屠殺時にレントゲン透視撮影を行い、椎間板高の変化を評価した。また、サンプルの正中面での凍結薄切切片を組織観察し、線維輪の変性度を5段階評価した(変性度0:変性なし変性度4:高度の変性)。神経損傷、深部感染、インプラント脱転例はなかった。レントゲン的にはPVA群の椎間板高はcontrol群のそれより有意に高く、sham群と同等であった。