hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
協同学習活動を促進するぺダゴジカルエージェントに関する実験とその応用

本研究ではweb上で利用可能な教育用対話エージェントの開発とその評価を行った.本システムを利用する学習者は,webブラウザ上で本システムにログインし,エージェントと会話をすることができる.ここでは,大学生の学習者が専門領域で学んだ概念について,エージェントに説明活動を行うことで理解を深めていくことができるか検討した.本システムを利用した大規模な調査を行い,学習者の発話をもとに概念への理解度の分析を行った.語彙ネットワーク分析を行った結果,エージェントへの説明活動を通じた概念への理解が深まるプロセスを確認することができた.本研究では,大学教育の現場で利用可能な教育用対話エージェント(Pedagogical Conversational Agent)を用いた協同学習支援システムの開発を行っている.ここでは,認知科学の領域で重要性が指摘されてきた他者によるメタサジェスチョンの効果に注目し,対話エージェントにそれを振舞わせることによって,学習活動の促進を行う.特に本研究では,グループ学習における有効な方法として,ジグソー型の協同学習場面をwebベースにより構築し,学習者の学びをエージェントベースで育成することを目標としている.平成25年度は,擬人化対話エージェントの設計デザインを得るために複数の実験を実施した.実験ではこれまで申請者が開発してきた実験装置(林・小川,2012)を用いて,大学生が専門科目について他者にチャットベースで説明を行う場面を設定し,どのようなエージェントの振る舞いや対話環境が学習活動を促進できるのかを検討した.具体的には,(1)協同活動におけるコミュニケーションのチャンネルと(2)学習者と対話エージェント性別との関係,(3)対話エージェントの数等についての検討を行った.本研究では,大学の授業などで利用可能な教育用の対話エージェント(Pedagogical Conversational Agent)のデザインについて検討している.ここでは,これまで認知科学や学習科学の領域で重要性が指摘されてきた「説明活動」に注目し,特に授業で学習した概念の理解を助ける上で効果的な学習支援システムの開発を目指して取り組んでいる.システムの開発において,実際にどのようなエージェントによる支援方法が効果的なのかを知ることが必要である.これより,人間同士の説明活動において,エージェントが介入してファシリテーションを行う場面を実験的に設定し,そこで得られた有効なファシリテーションの要因を探る.初年度は,エージェントの有効なデザインを導出するための実験を行った.具体的には,説明活動における学習者が積極的に発話を促すために,どのようなエージェントの表情やファシリテーションの提示方法が有効なのかを検討した.今年度は,そこで得られた知見を学習システムのデザインの指針とし,より実践的な学習場面でも利用可能な説明活動の学習支援システムの開発を行った.ここでは,多人数の学習者がいつでもどこでも学習活動に従事できるよう,webベースで行える学習システムを開発し,システム利用に関する予備的な調査も行った.本研究では,大学授業で利用できる教育用対話エージェント(Pedagogical Conversational Agent)のデザインと開発に関する検討を行っている.ここでは,認知科学や学習科学の領域で有効性が指摘されてきた説明構築活動に着目している.そして,エージェントを用いて大学生が授業で学習した専門用語の概念理解を促進できるのかを検討している.最終年度では,これまで開発してきたwebベースの学習支援システムの有効性を検討した.具体的には,学習者がエージェントに直接的に説明活動を行う学習場面を取り上げ,学習パフォーマンスの促進が確認されるのかを大規模なデータを対象に検討した.また,本研究を通じて,学習者が概念に対する説明を通じて理解がどのように進むのかを語彙ネットワークを用いて分析し,本学場面における概念の理解構築過程を形式的に分析する手法に関しても新たな示唆を提供することができた.本研究ではweb上で利用可能な教育用対話エージェントの開発とその評価を行った.本システムを利用する学習者は,webブラウザ上で本システムにログインし,エージェントと会話をすることができる.ここでは,大学生の学習者が専門領域で学んだ概念について,エージェントに説明活動を行うことで理解を深めていくことができるか検討した.本システムを利用した大規模な調査を行い,学習者の発話をもとに概念への理解度の分析を行った.語彙ネットワーク分析を行った結果,エージェントへの説明活動を通じた概念への理解が深まるプロセスを確認することができた.今年度は,webベースによる擬人化エージェントを利用した説明活動を対象とした学習システムの開発を中心に行った.システムの開発は,申請者の先行研究や関連するプロジェクトの研究から得られた知見をもとにデザインを行った.本システムの特徴として,エージェントに対して直接的に説明活動を行うことを要件とし,データベースに蓄積されていく他の学習者であるクラスメイトの説明状況もフィードバックされる機能を有している.本システムの実践的な運用を見据えて,本年度は本システムの利用に関する予備的な調査も行い,学習者の概念理解のパフォーマンスの向上を観察することができた.次年度は,このシステムを大規模な大学生数を対象とした実践的な検討を行っていく.認知科学今後の推進方法として,昨年度までに構築したwebベースによる説明活動による学習支援システムを用いて実践的な検討を行っていく.大規模な人数の学習者を対象として検討していく予定だが,その際にサーバに多くの負荷がかかることも考えられる.これより,複数のサーバを用意するなどして,円滑なシステム運用を行っていく予定である.今年度は,主に擬人化対話エージェントのインタフェースや機能のデザインについての実験的検討を行った.申請者は,この点について複数の実験を実施し,webベースの学習支援システムに向けてのデザインの指針をいくつか得ることができた.具体的には,(1)エージェントによるフィードバックの方法や(2)学習者とエージェントの性別,

(3)エージェントの数などが学習者の学習のパフォーマンスに影響することが確認された.また,実験を遂行する過程で対話エージェントのデザインが学習パフォーマンスに影響するであろうと考えられる多数の要因が見つかった(例えば,エージェントの話し方や感情の表出方法など).従って,これらの要因については今後も実験を追加し,多角的に検討していく必要性があるといえる.システム開発作業において,当初は実際にサーバを構築して進める予定であった.しかし,今年度は効率よく作業を行うために仮想サーバを利用して進めてきた.このため,物品費として計上していたサーバの費用は次年度に購入し,実質的な運用と評価実験を行うことにした.また,アルバイト費用に関しては,研究者自身がデータ解析のプログラムを開発して進めたこともあり,あまり利用する必要性がなかった.しかし,検討を進める中で人手でしか分析できない事項も発生してきたため,今後は一部の作業をアルバイトを雇って行う予定である.今後は,これまでに得られてきた知見を統合し,教育用のエージェントシステムのデザインに向けてシステムの開発および運用を行う.但し,「現在までの達成度」でも述べたように,擬人化対話エージェントの振る舞いがパフォーマンスに影響するであろう要因は多数存在し,平行して知見を蓄積していく必要性がある.平成26年度は,システムの開発を中心に行い,平成27年度はそのシステムを用いた運用を行っていく予定である.物品費に関しては,今年度から実施するwebシステムを利用した実践的な検討のためにサーバを購入する.また,研究室のアルバイトを雇い,得られたデータの解析も行っていく予定である.さらに,研究の予想以上の進展に伴い,国外での研究発表に一部の予算を旅費に充てる予定である.次年度への繰越が発生した費用は,国際会議(CHI2014)での発表のために利用する予定だった旅費である.当該会議に投稿していた論文が不採録になった関係により,昨年度は使用しなかったが,次年度には再チャレンジする予定である.昨年度使用しなかった国際会議の費用を次年度に使うこととする.具体的には,不採録になった論文を査読者の指摘に従って,加筆・修正し,次年度の会議へ投稿する予定である.そして,採録されれば,国際会議への旅費として本予算を利用する予定である.また,研究を進めていく過程で追加実験を行う可能性があるため,本予算を謝金等にも割り当てる予定もある.
ニンニクとアスパラガス無病株の育成・増殖と収穫までの作業体系の確立に関する研究

ニンニクとアスパラガスの無病株の育成・増殖および順化のための種々の条件について検討したところ,得られた最適条件の内の幾つかについて述べる.ニンニク:1.3°Cと20°Cで貯蔵した球を用い, in vitroでの茎項の活性を調べたところ, 3°Cで球は茎項の活性は低下せず,維持され続けた. 20°C球では7月15日から8月1日の間に一度活性がおち,休眠と関係があると思われた. 8月15日以降は又活性が高まり,休眠が完全に破れたと思われた.2.茎項培地で,初期培養には基本培地にNAA,BAを10^<-2>mg/l添加した培地で,移植用培地として基本培地に+10^<-1>mg/lNAA+10^<-2>mg/lBA添加培地で幼植物の生長がよく,球が形成された.3.増殖にためには,花床を分割し,基本培地に10^<-1>mg/lNAAを添加した培地に植付け, 105日間培養をおこなうと菌糸がよくできた.4.茎項を置床した6ヶ月後,できた幼植物体をロックウールに植え出し, 20°Cで1月間順化すると括着化が高かった.その時の植物体の大きさは球径6mm,生体重500mgぐらいであった.アスパラガス:1.発根促進培地又は処理として色々検討したところ次の結果を得た.(1)MSにNAA0.3mg/lとBA0.1mg/l添加培地に23週間える芽を置床し,その後MS培地に移植すると,発根促進効果が高かった. 3週間以上に置床するとカルス形成が見られた.(2)MSに1BA1mg/l添加した培地に雄の基部側のえる芽由来の小植物体を植え付けると70%の発根を誘導した.他の材料では発根率が低かった. (3)基部側のえる芽由来の小植物体にルートン処理をおこなうと,雌で80%,雄で70%の発根を誘導し,これらは良い生長を示した. (4)アニンシドール0.01mg/l又は0.1mg/l添加培地上で培養すると,雄の菌糸伸長が良かった.ニンニクとアスパラガスの無病株の育成・増殖および順化のための種々の条件について検討したところ,得られた最適条件の内の幾つかについて述べる.ニンニク:1.3°Cと20°Cで貯蔵した球を用い, in vitroでの茎項の活性を調べたところ, 3°Cで球は茎項の活性は低下せず,維持され続けた. 20°C球では7月15日から8月1日の間に一度活性がおち,休眠と関係があると思われた. 8月15日以降は又活性が高まり,休眠が完全に破れたと思われた.2.茎項培地で,初期培養には基本培地にNAA,BAを10^<-2>mg/l添加した培地で,移植用培地として基本培地に+10^<-1>mg/lNAA+10^<-2>mg/lBA添加培地で幼植物の生長がよく,球が形成された.3.増殖にためには,花床を分割し,基本培地に10^<-1>mg/lNAAを添加した培地に植付け, 105日間培養をおこなうと菌糸がよくできた.4.茎項を置床した6ヶ月後,できた幼植物体をロックウールに植え出し, 20°Cで1月間順化すると括着化が高かった.その時の植物体の大きさは球径6mm,生体重500mgぐらいであった.アスパラガス:1.発根促進培地又は処理として色々検討したところ次の結果を得た.(1)MSにNAA0.3mg/lとBA0.1mg/l添加培地に23週間える芽を置床し,その後MS培地に移植すると,発根促進効果が高かった. 3週間以上に置床するとカルス形成が見られた.(2)MSに1BA1mg/l添加した培地に雄の基部側のえる芽由来の小植物体を植え付けると70%の発根を誘導した.他の材料では発根率が低かった. (3)基部側のえる芽由来の小植物体にルートン処理をおこなうと,雌で80%,雄で70%の発根を誘導し,これらは良い生長を示した. (4)アニンシドール0.01mg/l又は0.1mg/l添加培地上で培養すると,雄の菌糸伸長が良かった.ニンニクとアスパラガスのウィルスフリー株の育成および順化のための種々の条件を検討した。特にニンニクについては供試材料の休眠について、アスパラガスでは発根促進培地についても検討した。その結果明らかになった点について述べる。ニンニク:1.休眠;子球の休眠程度を植付け後の発芽率と、到発芽日数でみたところ、5月堀上げ時から2月間は深い休眠状態にあり、その後徐々に休眠が浅くなり9月中旬には完全に打破された。

生長点を切り出して培地に植付けると、発芽までの日数はどの時期でもほとんど変らず10日前後であったが、ほう芽率は収穫直後から徐々に低下し8月上旬最低となり、9月中旬には100%となって生長点植付けでも9月中旬以降が適していることが明らかとなった。2:培地;ムラシゲ・スクーグ培地に0.8%寒天,3%しょ糖を添加した基本培地に種々の濃度のNAAとBAを添加して生長の最適培地をみたところ、0.01mg/l NAAとBA添加培地で最もよい生育がみられた。3:順化培土;試験管からとり出し鉢に植付けるための順化用培土として、砂.バーミキュライト.ロックウールを検討した。夏季高温時はいずれの培土でも生存率が低く、秋春にかけての冷凍期には、室温でいずれの培土でも生存率が高かった。しかし定植がかんたんで植痛みが少い点から、ロックウールが最適培土であった。アスパラガス:1.培地;地上部の生長はムラシゲ・スクーグ培地に0.8%寒天,3%しょ糖,0.01mg/l NAAとBA添加培地で最もよかった。えき芽培養を実用化に移した時、一番問題になるのは発根培地である。そこで種々の発根促進処理をくり返したところ、継代1月後の小植物体の基部にルートで処理をしてホルモン無添加の基本培地に移植すると、最も発根率が高かった。2.材料の性と令;♀は老化が早く、生長点は伸長が早いが、発根せず、基部側のえき芽がよく発根した。
ATLAS実験におけるタウ粒子崩壊モードを用いたHiggs粒子探索法の研究

本研究では、標準理論から予測される軽いHiggs(100-150GeV)と、超対称性理論から予想される中性Higgsに関して、タウ粒子に崩壊するモードを用いて方法についてHiggs粒子を捉える方法の研究を、東大竹本、神戸大川越を加えて行い、また京都大野尻等の理論研究者とも議論をすすめた。標準理論から予測される軽いHiggsのタウ粒子に崩壊するモードに関して、特にWW/ZZ fusionによるHiggs生成についての研究を行なった。タウ粒子の再構成については、Higgsからの2つのタウ粒子のうち、共にレプトンに崩壊するもの(di-lepton mode)及び一方のみがレプトンに崩壊するもの(hadron-lepton mode)に関して、解析の方法・手順を研究した。計算機環境上で、PYTHIAイベント・ジェネレータ、ATLFASTシュミレーションを用いたシミュレーションのよる分岐比、アクセプタンス等についての研究の結果、30fb^<-1>の積分ルミノシティで、標準理論Higgsシグナル及びバックグラウンドに関する両解析モードについて予測結果を得ることができた。今後バックグラウンドの評価を更にすすめる必要があるが、タウ粒子に崩壊するモードでHiggs粒子十分に発見が期待できることが判った。PC-Linuxシステムを採用した新たな計算機設備として、サーバーとして850MHz Dualクラスの計算機及び大容量ディスクとして約100Gbyte、またクライアントとして800MHz Singleクラスの計算機(ディスク容量約20Gbyte)を導入し、その上で従来からのPYTHIAイベント・ジェネレータ、ATLFASTシュミレーション及び解析プログラムを移植した。この計算機環境上で、標準理論から予測される軽いHiggs(100-150GeV)と、超対称性理論から予想される荷電Higgsを対象として、タウ粒子に崩壊するモードに関して、分岐比、アクセプタンス等の基礎的な量についての研究を行なった。シグナルに関して、従来の解析方法を試した結果、概ね再現することがわかった。現在、タウ粒子再構成について、より効率の良い方法を検討、研究中である。またバックグラウンドについては、大量のイベントを発生させ、解析を行っている。この中には、今までには正確に見積もられていない効果(ミニジェットなどによるもの)や違ったイベント・ジェネレーター(主にハドロン生成仕様が異なるもの)による解析も行おうと検討しており、現在方法などを考案中である。本研究では、標準理論から予測される軽いHiggs(100-150GeV)と、超対称性理論から予想される中性Higgsに関して、タウ粒子に崩壊するモードを用いて方法についてHiggs粒子を捉える方法の研究を行った。今年度は、標準理論から予測される軽いHiggsのタウ粒子に崩壊するモードに関して、特にWW/ZZ fusionによるHiggs生成についての研究を行った。タウ粒子の再構成については、Higgsからの2つのタウ粒子のうち、di-lepton mode共にレプトンに崩壊するもの」hadron-lepton mode一方のみがレプトンに崩壊するもの」に関して、解析の方法・手順を研究した。計算機環境上で、PYTHIAイベント・ジェネレータ、ATLFASTシュミレーションを用いたシミュレーションのよる分岐比、アクセプタンス等についての研究の結果、標準理論Higgs(質量100GeV)シグナルに関して、30fb^<-1>の積分ルミノシティで、が期待できることが判った。今後バックグラウンドの評価をすすめる必要があるが、タウ粒子に崩壊するモードでHiggs粒子を捉えられる可能性が示された。
外科的胆汁うっ滞病変における胆汁酸及びグルタチオン代謝変動の意義に関する研究

安全性とQOLを考慮した外科手術適応の拡大を目指して、大侵襲下手術後に生じる黄疸・胆汁うっ滞の病態解明を目的とした。1.グルタチオン(GSHとGSSG)測定の精度と安定性を高めるため、HPLCに電気化学検出器を具備したシステムを完成し、GSHをn mol/ml、GSSGをp mol/mlのオーダーで血漿にても測定が可能となった。また、HPLC用ポンプと専用の蛍光検出器および脱気装置(デガッサー)を従来のHPLCシステムに具備し、15種類の胆汁酸の一括同時測定システムを完成した。2.雄性ラット(300g体重)を用い、胆管結紮(BDL)にて黄疸モデルを作り、Higgins-Andersonの方法で70%肝切除(HR)を行い、夫々1、3、5、7日後、1、3、5、7、14日後に血液、肝組織、胆汁を採取した。また、BDL3日目に70%肝切除を行い(BDL+HR)1、3、5日後にサンプルを採取した。
紫外線照射水処理における生成物質とそのバイオインデックスによる評価

今年度は、紫外線照射処理における殺菌力の残存性について実験をおこなった。使用したランプは低圧紫外線ランプと中圧紫外線ランプの2種類である。水道原水として使用される河川水を用いて、紫外線の殺菌残存効果を調べた。細菌としてE.ccliを、ウイルスとして大腸菌ファージQβをモデル微生物として用いた結果、紫外線照射を通常の殺菌処理の1020倍程度に行った場合でも、これらの微生物に対する殺菌効果の残存性は確認されなかった。また、同じ河川水を0.1μmの膜孔径を持つ精密濾過膜で濃縮した試料水においても実験を行ったが、殺菌効果の残存性は確認されなかった。また、フミンの分解をTHMFP(トリハロメタン生成能)によって評価した。また、様々な触媒の存在下での変化を比較した。触媒としては二酸化チタンと鉄を用いて行った。結果としては中圧ランプ単独照射、二酸化チタンによる反応においてTHMFPが一旦増加し、減少する現象が観測された。これは、オゾン酸化においても観測される現象であり、有機物の低分子化が起こったことを示唆するものと考えられる。本研究では、紫外線照射後の副生成物について有機塩素化合物の場合と、自然水を用いた場合について調べた。特に自然水を対象として用いた実験では、紫外線殺菌効果の残存性について調べた。有機塩素化合物は紫外線によって光分解を受けやすい。これら数種の有機塩素化合物を用いた実験においては、反応生成物として脱塩素による塩素イオンの生成とそれにともなうpHの低下が確認された。しかし、TOCの減少がおそく、完全酸化にはいたっていないと考察された。自然水中に含まれるフミン質を対照とする実験では、標準物質を対象とした系での、フミンの分解はほとんど確認されなかった。既存の研究ではフミンを含む自然水に紫外線照射を行った場合、殺菌効果が残存するという報告がなされている。そこで本研究では、水道原水として使用される河川水を用いて、紫外線の殺菌残存効果を調べた。殺菌としてE.coliを、ウイルスとして大腸菌ファージQβをモデル微生物として用いた結果、紫外線照射を通常の殺菌処理の1020倍程度に行った場合でも、これらの微生物に対する殺菌効果の残存性は確認されなかった。また、水中微量有機物の評価手法として微生物の増殖量を用いるBRPによる測定法を確立した。この手法を用いて、紫外線照射後の溶存微量有機物の挙動を、把握する可能性が示された。細菌としてE.coliを、ウイルスとして大腸菌ファージQβをモデル微生物として用いた結果、紫外線照射を通常の殺菌処理の1020倍程度に行った場合でも、これらの微生物に対する殺菌効果の残存性は確認されなかった。また、フミンの分解をTHMEP(トリハロメタン生成能)によって評価した。
骨髄細胞の高密度大量培養に関する研究

1.骨髄細胞の高密度大量培養のためにホローファイバー培養法を応用して基本条件の設定を行った。すなわち、2-5X10^7個の骨髄細胞を容量15mlのカートリッジ中で培養し、その前後の細胞数およびコロニー形成細胞数の変化を指標として、(1)カートリッジの材質、(2)培養液の選定、(3)培養期間、(4)培養システムによる差を検討した。材質はポリピレンカートリッジを、培養液はIMDMを選定し、培養可能な期間を検討した。培養システムはCel1-Pharm MiniとCel1max^<TM>で効率を比較し、Cel1-Pharm Miniが優れていた。さらに、ホローファイバー培養法の効率向上を計るため、造血因子添加の影響を各種組合せで検討しSCF、IL-3、GM-CSF、IL-6、IL-1の5者併用が良好であった。この結果、2-5X10^7個の大量骨髄細胞を小容量(15ml)のカートリッジ中で高密度培養し2週間まで維持が可能であった。2.次年度の研究に備え、骨髄支持細胞クローンの培養を行った。健常人骨髄細胞よりIL-1また、FGFおよびIGF-1添加の2方法で骨髄支持細胞クローンを分離培養し、培養上清のサイトカイン産生能、コロニー形成細胞の接着能、またLTC法による長期支持能でその機能を検討すると共に、コロニー形成細胞を5週間にわたり長期維持できる良い骨髄支持細胞クローンを選別した。以上、本年度はホローファイバー培養に適したカートリッジの材質、培養システム、造血因子の添加条件、を明かにしたこと、さらに骨髄支持細胞クローンの分離培養できたことなどの成果を得た。現時点では14日間培養後の骨髄細胞数、コロニー形成細胞数の増幅効果はまだ不十分であるが、骨髄支持細胞クローンを樹立できたので両者を組み合わせ次年度の骨髄細胞の高密度大量培養を進めることが可能になっている。
C型肝炎ウイルス治療抵抗性における自然免疫の関与と難治要因の病態解明

【背景と目的】HCV 1b型におけるPEG-interferon(IFN)/ribavirin(RBV)併用療法の約20%はnull responderで抵抗性を示す。しかし、本治療開始前における効果予測は困難で、また治療抵抗性の機序も不明である。HCV排除には自然免疫が重要であるとされる。また、最近genotype 1bに対するPEG-IFN/RBV併用48週治療における治療抵抗性に宿主のIL28Bの遺伝子多型(SNPs)が関与していることが報告されたが、宿主自然免疫とIL28B遺伝子の関連は明らかではない。そこで本研究の目的は、これらの関連を解明することとする。【方法】α型PEG-IFN/RBV施行例を対象とし、治療前肝組織における自然免疫系に係わる遺伝子発現を解析し、IL28B SNPと治療効果との関連を検討した。【成績】IL28Bminor例の自然免疫系遺伝子のRIG-I、ISG15の発現はmajorに比し有意に高値であったが、アダプター分子のIPS-1及び抑制系遺伝子のRNF125はIL28B minorで低かった。治療効果別では、不応例では治療中ウイルス反応(VR)が得られた症例に比し有意にRIG-I、ISG15の遺伝子発現が高値、IL28B minorに限っても不応例ではVR例に比し有意に高値で、多変量解析ではRIG-I高発現が不応例に独立して関与していた。【結論】自然免疫系はPEG-IFN/RBV併用療法における治療抵抗性にウイルス因子と独立して関与していた。PEG-IFN/RBV併用療法を施行したGenotype 1b高ウイルス量のC型慢性肝炎14例を対象とし、SVR例(n=7)と治療中HCVが減衰しないNVR例(n=7)でPBMC中における治療中の上記遺伝子の発現動態を検討した。その結果、NVR例ではSVR例に比し、PEG-IFNの投与によるRIG-IなどのIFN誘導遺伝子の発現誘導が有意に低いことが分かった。すなわち、NVR例では、治療前におけるRIG-IなどのIFN誘導遺伝子の高発現を認めるが、治療による反応性は低いことが治療抵抗性の一要因と考えられた。また、HCV遺伝子変異との統合的解析からは、この現象はHCVコア変異と独立してNVRと関連していることが多変量解析から示され、今後治療成績向上を目指した対策を講じる際には、宿主要因とウイルス要因それぞれに対する対策が必要と考えられた。【方法】α型PEG-IFN/RBV施行例を対象とし、細胞内ウイルスセンサー(RIG-I)、IFN誘導遺伝子(ISG15)、アダプター分子(IPS-1)、抑制系遺伝子(RNF125)及びIFNλ(IL28)の治療前肝組織における遺伝子発現を解析し、IL28B SNPと治療効果との関連を検討した。またTVR単独投与例(n=5)では、治療前・中におけるHCV動態を経時的に解析し、さらにPBMC中の遺伝子発現プロファイルをリアルタイムPCR法およびDNAマイクロアレイを用い25,000の遺伝子発現について網羅的に解析した。【成績】IL28B minor例のRIG-I、ISG15の遺伝子発現はmajorに比し有意に高値であったが、IPS-1及びRNF125はIL28B minorで低かった。一方、IFNλ遺伝子の肝内発現にはIL28B SNP別に有意差がなかった。治療効果別では、NVR例では治療中ウイルス反応(VR)が得られた症例に比し有意にRIG-I、ISG15の遺伝子発現が高値、IL28B minorに限ってもNVR例ではVR例に比し有意に高値で、多変量解析ではRIG-I高発現がNVRに独立して関与していた。DNAマイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現解析において、発現変化量

>1.2かつp<0.01を条件とした599プローブのパスウェイ解析では、TVR投与により抗原提示、NK細胞およびToll-like receptorシグナル伝達に関わる遺伝子群の発現の低下を認めた(p=1.2×10^<-4>, 5.6×10^<-3>, 2.3×10^<-3>)。
マルクス口述・エンゲルス筆記説に基づく『ドイツ・イデオロギー』テキストの再構成

『ドイツ・イデオロギー』第1章オリジナル草稿の精細画像と、Marx-Engels-Jahrbuch 2003(新MEGA先行版)及び新MEGA第I部門第5巻(2017)の本文テキスト及び異文一覧の即時異文、後刻異文のテキストとの照合精査を行い、両版の即時異文の補完と後刻異文表記の補正を進めた。これに基づいて、『ドイツ・イデオロギー』のオンライン版作成のためのドイツ語版デジタルテキストを整備した。また日本語版デジタルテキストの作成及び翻訳にも着手し、同時並行で従来の研究史の整理と批判検討を進めた。ドイツ語版デジタルテキストはいくつかのレイヤーから成るが、最も重要なのは、1基底稿+即時異文、2基底稿、3基底稿+後刻異文の3つのレイヤーである。新MEGAテキスト部は3と同一である。この新MEGAテキスト部のテキストから、新MEGAの異文一覧を参照して、「削除」、「置換」、「挿入」、「順序変更」を復活・削除・元に戻すことを行い、2基底稿を作成した。そして、この2基底稿に、即時異文の削除箇所を組み入れ、1基底稿+即時異文を編集した。この即時異文および後刻異文の批判的検証作業の結果、『ドイツ・イデオロギー』第1章「フォイエルバッハ」草稿がマルクスの口述をエンゲルスが筆記したとする我々の研究仮説の正しさが証明できた。また、今年度作成したドイツ語版デジタルテキストを元に『ドイツ・イデオロギー』のオンライン版プロトタイプを作成した。これは2019年度に公開予定である。本研究成果は、2018年10月に武漢大学(中国)で開催された国際シンポジウムでも発表し、高評価を得た。『ドイツ・イデオロギー』第1章オリジナル草稿の精細画像と、Marx-Engels-Jahrbuch 2003(新MEGA先行版)及び新MEGA第I部門第5巻(2017)の本文テキスト及び異文一覧の即時異文、後刻異文のテキストとの照合精査を概ね終え、ドイツ語版デジタルテキストの整備を行っている。これらの作業は予定通り進捗しており、『ドイツ・イデオロギー』のオンライン版の2019年中の公開の目処もついた。今年度に概ね作業を終えている『ドイツ・イデオロギー』第1章草稿オリジナルの精細画像と、Marx-Engels-Jahrbuch 2003(新MEGA先行版)及び新MEGA第I部門第5巻(2017)の本文テキスト及び異文一覧の即時異文、後刻異文のテキストとの照合精査・補完・補正を今後行い、順次公開する予定である。今年度は、ドイツ語版デジタルテキストに基づいて、日本語版デジタルテキストの作成及び翻訳作業を本格的に開始する。また、オンライン版『ドイツ・イデオロギー』の円滑な運用に向けてのテストを行う。
動脈硬化形成過程における単球浸潤部位への内皮細胞PECAM-1局所輸送機構の解析

動脈硬化形成過程における単球の血管内皮下への蓄積機構には不明な点が多い。培養内皮細胞へのヒト単球の2段階添加実験を行ったところ、1度目に比べて2度目の添加で単球浸潤率が有意に上昇していた。また、単球添加により、内皮細胞間隙のPECAM-1が有意に増加、VE-cadherinが有意に減少していた。以上より、単球の浸潤によって起こる内皮細胞間隙分子の変化(PECAM-1増加、VE-cadherin減少)が次の単球の浸潤を促進し、このことが動脈硬化における長期的な単球の蓄積につながっている可能性が考えられた。動脈硬化形成の初期過程では,血中の単球が酸化LDL等により傷害された血管内皮細胞に接着・内皮下組織へ浸潤(Trans-endothelial migration; TEM)してマクロファージとなり,内膜に蓄積することで病巣形成が始まる.我々は,生細胞分子イメージングにより,単球の浸潤後,内皮細胞の膜蛋白であるPECAM-1が浸潤部位へ持続的に集積することを確認した.また,予備検討において,PECAM-1の細胞内ドメインに結合するシグナル分子であるSHP-2をsiRNAによりノックダウンするとPECAM-1集積が抑制されたことから,PECAM-1の集積がSHP-2を介した機序により起こることが示唆された.一方,単球-内皮細胞間のPECAM-1同士の結合は浸潤を促進すると考えられる為,PECAM-1の浸潤部位への集積は同一部位での次の単球浸潤(repeated-TEM)を促し,結果として慢性病巣形成を促進すると考えられる.ライブイメージングによる詳細な解析の結果,50%(n=20 cells)の単球が以前に別の単球が浸潤したのと同一又は類似の部位で浸潤していた.以上より,単球の浸潤が,SHP-2を介した内皮細胞PECAM-1の浸潤部位局所への持続的集積を引き起こし,これが同一部位での次の単球の浸潤(repeated-TEM)を誘発していると考えられた.このことがマクロファージ蓄積におけるpositive feedback系として働き,長い時間をかけて進行する慢性炎症疾患である動脈硬化の病巣進展に関与する一因子であることが想定された.動脈硬化病変形成の初期過程においては、血中を循環する白血球の一種である単球が、傷害を受けた血管内皮細胞に接着し、内皮下組織へ浸潤・蓄積することで病変が形成される。単一の単球接着・浸潤プロセスについては徐々に分子機構の解明が進んでいるが、一つの浸潤イベントがその後の単球の浸潤活性に与える影響については殆ど知られていない。本研究では、培養血管内皮細胞へのヒト単球の2段階添加実験を行ったところ、1度目の単球添加に比べて2度目では有意に浸潤率が上昇していた(約1.5倍)。フローサイトメーターを用いた解析では、単球の添加により内皮細胞間隙において間隙分子であるPECAM-1の発現が有意に増加、VE-cadherinの発現が有意に減少しており、このことが単球の添加2度目における浸潤率の上昇を招く機構であることが示唆された。PECAM-1について,その局所分子動態を詳細に解析する為、GFPを付加した融合組換えベクターを構築して内皮細胞内に発現させて解析したところ、単球の浸潤完了後、浸潤部位周囲に内皮細胞PECAM-1が徐々に集積することが明らかとなり、このことが同一部位での次の単球の浸潤を促進していることが示唆された。以上より、単球の浸潤によって起こる内皮細胞間隙分子の構成変化(PECAM-1の増加、及びVE-cadherinの減少)が次の単球の浸潤を促進し、このことが動脈硬化における長期的な単球の蓄積につながっている可能性が考えられた。
情報化に対応した技術教育カリキュラムの体系化

小学校から高等学校段階に至るK-12において、もの作りと情報教育に関わる内容を学習指導要領並び学に教科書をもとに抽出し、その内容の関連性について分析した。もの作りに関しては、小学校においては図画工作、中学校は技術家庭科などで単独に行われているが、系統性や情報技術との関連性が全くない。もの作りと情報教育の先進国である英国の事例を調査した結果、小学校段階からのもの作り教育が中学校、高等学校と連続し、特に高等学校普通科においても技術とデザイン、情報とコンピュータなどの授業の充実が図られている。特に小学校でのもの作りのための基礎教育として、子ども向けの安全な旋盤や切削加工機が開発され、道具に対するリテラシー教育の面でも日本のもの作り教育の改善が示唆された。日本のもの作り教育と情報教育は内容的には決して少なくないが、各教科の中に点在しているために、学習内容の系統性や小学校から高等学校に至る連続性が保たれていない点が明らかになった。特に中学校の技術教育に関しては、2003年度からの学習指導要領改訂にともない、もの作り教育と情報技術教育が重要視されてきているが、それぞれ、木材加工、金属加工、電気などといった従来からの内容を引きずっていて、もの作りという視点の統合的な学習活動とその基礎になる学問体系との整合性が取れていない。そこで、本研究の中で、総合的な技術教育カリキュラムを提言し、各教科の中で点在していた、技術教育に関係する学習要素を明らかにして、体系的に学べる実施可能な授業デザインを行い、実施可能性についても検証した。現行の中学校の技術教育の時間枠の中で、領域別学習項目をもの作りの中で体系化できる可能性が明らかになった。さらに、近年問題になってきたインターネットなどの情報技術に関わる情報モラル教育の必要性の高まりから、小学校から高等学校まで発達段階に応じた学習内容についても開発した。小学校段階から高等学校段階に至るK-12において、もの作りと情報教育に関わる内容を学習指導要領並びに教科書をもとに抽出し、その内容の関連性について分析した。本問題を明らかにすると同時に、実施可能な形のカリキュラム開発を行うために、小学校で修得したもの作りと情報にかかる基礎技術の整理を行った。また、これら調査した各教科の中に点在している学習項目に関して、情報教育の視点で見直しし、体系化の検討を行った。英国でのもの作り教育の実態と問題点を分析し、日本の技術教育と比較検討し、実施可能な形でのカリキュラムや教材開発を行った。実証実験可能なように、カリキュラムの構成要素である単元内容の開発と教材の成果をサーバ上に蓄積し、現職教員の協力を得て、授業の中での実施可能性を検討した。また、個別に開発した単元内容を小学校から高等学校までの発達段階に対応させ、情報化に対応した技術教育の系統性という観点から、特に他教科との関連性を分析した。本分析結果は、日本教育工学会第21回全国大会で報告した。さらに、体系化したカリキュラムを小学校関連教科、中学校の技術家庭科、高等学校の情報のなかで利用し、カリキュラムの実施可能性や問題点を分析した。

そこで、本研究の中で、総合的な技術教育カリキュラムを提言し、各教科の中で点在していた、技術教育に関係する学習要素を明らかにして、体系的に学べる実施可能な授業デザインを行い、実施可能性についても検証した。現行の中学校の技術教育の時間枠の中で、領域別学習項目をもの作りの中で体系化できる可能性が明らかになった。さらに、近年問題になってきたインターネットなどの情報技術に関わる情報モラル教育の必要性の高まりから、小学校から高等学校まで発達段階に応じた学習内容についても開発した。
電荷リレーを誘起する脱炭酸触媒抗体の作成と新しい反応系の開発

オルトおよびメタ置換ニトロおよびアミノ安息香酸誘導体をハプテンとして種々の電荷リレーの方向性を有する触媒抗体の作成と種々の基質に対する反応性を検討した。次いでバイオセンサー(BIAcore)を用いハプテンに対する抗体の速度論的解析を行い、最も有効な抗体を用い新しい脱炭酸反応について検討した。以下に、各検討結果をまとめて示す。1.オルトニトロ安息香酸誘導体より誘導した抗体群より、2-carboxycyclohexane(基質)の脱炭酸反応を効率よく触媒する抗体c-13(k_<cat>=2.60×10^3)を得ることが出来た。本抗体は、メタニトロ安息香酸誘導体より得られた抗体a-22に比較して基質を顕著に脱炭酸反応を触媒し、さらに基質のメチルエステル体においても反応が進行する(k_<cat>=78.2)し、トレーサー実験で抗体がラベル化される事から、抗体の触媒活性部位において基質分子との間に電荷リレーが誘起されているものと考えられる。2.抗体c-13およびa-22の各ハプテンに対する結合・解離反応を、表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサー(BIAcore)を用いて速度論的に解析を行い、抗体のハプテン認識における親和力(K_<aff9>ΔRU)と基質反応性との間に非常に良い相関があることを証明した。3.新しい脱炭酸反応の開発を目指し、別々のハプテンより誘導した抗体c-13およびa-22を用いて、trans-およびcis-mesyloxycyclohexylcarboxylicacidに対する反応性を検討した。これらの抗体は、いずれの基質に対しても有効に反応を触媒することが明らかとなった。また上記抗体の反応活性の差は、バイオセンサーを用いる事により、抗体の各ハプテンの親和力の差とほぼ一致することが明らかとなった。
先進複合材料の高機能化を指向したメゾスコピック損傷評価・制御システムの構築

菊池は複合材料の高機能化のため複合材料の破壊シミュレーションを行う数値解析コードを開発し,それによって破壊シミュレーションを試みた.数値解析モデルの構築の簡素化のため,粒子法とMLPG法,重合メッシュ法に着目し,解析コードの開発を行った.町田は複合材料界面の強度評価のため,混合モードのエネルギ解放率,応力拡大係数を仮想き裂進展法,き裂閉口積分法,変位外挿法で評価できるFEM解析コードを作成し,界面での破壊力学パラメータの高精度の評価を可能としたまた,相関関数に基づくパターンマッチング法による変位解析ソフトを開発し,ナノスケールの変位解析を可能とした.福田は繊維強化複合材料の損傷の初期過程における損傷機構の解明のため,実験および数値解析を行った.単繊維を1本もしくは数本樹脂に埋めたマイクロコンポジット繊維/樹脂界面特性の評価および破壊の初期過程を追跡した.その結果,従来界面の特性をあらわす物性値(一定の値)と見られてきた「臨界繊維長」が繊維間隔の関数であることを見いだした.向後はセラミックス系複合材料Si-Ti-C-O繊維結合型セラミックスと,宇宙用構造材料として実用化されているC/C複合材料(C/C)の熱衝撃損傷挙動に注目し,損傷の挙動を定量的に予測する手法を検討した.巨視的熱衝撃損傷への破壊力学的基準の適用,微視的な破壊によって材料定数が変化する事を仮定し,実験と解析結果が良く一致することより微視的損傷進展の予測を可能とした.荻原は航空宇宙用CFRP積層板における,従来型エポキシ系複合材料と耐熱型ビスマレイミド系複合材料の,静的引張負荷下,宇宙環境を模擬した熱サイクル負荷下での,メゾスコピック損傷発生,進展プロセスを実験的に評価し,そのモデル化を行った.稲垣はFRASTA解析のき裂破面への適用を行い,介在物付近の疲労き裂の進展挙動につて検討し,球状黒鉛鋳鉄の疲労破壊の際の黒鉛のはく離のメカニズムを明らかにした.菊池は複合材料の高機能化のため複合材料の破壊シミュレーションを行う数値解析コードを開発し,それによって破壊シミュレーションを試みた.数値解析モデルの構築の簡素化のため,粒子法とMLPG法,重合メッシュ法に着目し,解析コードの開発を行った.町田は複合材料界面の強度評価のため,混合モードのエネルギ解放率,応力拡大係数を仮想き裂進展法,き裂閉口積分法,変位外挿法で評価できるFEM解析コードを作成し,界面での破壊力学パラメータの高精度の評価を可能としたまた,相関関数に基づくパターンマッチング法による変位解析ソフトを開発し,ナノスケールの変位解析を可能とした.福田は繊維強化複合材料の損傷の初期過程における損傷機構の解明のため,実験および数値解析を行った.単繊維を1本もしくは数本樹脂に埋めたマイクロコンポジット繊維/樹脂界面特性の評価および破壊の初期過程を追跡した.その結果,従来界面の特性をあらわす物性値(一定の値)と見られてきた「臨界繊維長」が繊維間隔の関数であることを見いだした.向後はセラミックス系複合材料Si-Ti-C-O繊維結合型セラミックスと,宇宙用構造材料として実用化されているC/C複合材料(C/C)の熱衝撃損傷挙動に注目し,損傷の挙動を定量的に予測する手法を検討した.巨視的熱衝撃損傷への破壊力学的基準の適用,微視的な破壊によって材料定数が変化する事を仮定し,実験と解析結果が良く一致することより微視的損傷進展の予測を可能とした.荻原は航空宇宙用CFRP積層板における,従来型エポキシ系複合材料と耐熱型ビスマレイミド系複合材料の,静的引張負荷下,宇宙環境を模擬した熱サイクル負荷下での,メゾスコピック損傷発生,進展プロセスを実験的に評価し,そのモデル化を行った.稲垣はFRASTA解析のき裂破面への適用を行い,介在物付近の疲労き裂の進展挙動につて検討し,球状黒鉛鋳鉄の疲労破壊の際の黒鉛のはく離のメカニズムを明らかにした.菊池はSiC粒子分散強化アルミニウム合金の破壊解析を行い、粒子間の塑性拘束が母在であるアルミニウム合金の損傷・破壊挙動にどのように影響するかを定性的に考察した大きなディンプルの発生、成長は粒子間の塑性拘束に強く支配されていることが、数値解析と実験結果の考察より明らかとなった。澤は複合材料の衝撃波による衝撃破壊を調べるために、複合材料中の衝撃波の挙動を知る目的で、ヤング率の異なる2種の光弾性材料を接着してCranz-Schardin型閃光カメラを用いた光弾性実験による基礎研究を行った.まだ結論には至っていないが、異種材料の境界層での衝撃波による破壊条件を調べる予定である.町田はICパッケージのリフロークラックなどの初期欠陥をダイパッドと封止樹脂界面のダイパッドコーナー部に想定し、3次元有限要素法を用い熱応力負荷下における応力拡大係数を仮想き裂進展法により評価した。また、き裂先端の要素依存性が報告されているき裂閉口積分法との精度を比較し、混合モード応力拡大係数評価法としての有効性を検討した。荻原はCFRP積層板について、熱サイクル試験を行い、熱サイクル負荷下における損傷発生・進展挙動を実験的に明らかにした。積層構成はクロスプライ、アングルプライ、擬似等方性積層板とした。これにより、次年度行う熱サイクル負荷下におけるこの材料の耐久性評価および寿命予測手法構築への基礎が固まった。向後は、Si-Ti-C-O繊維結合型セラミックス(FBC)ならびにC/C複合

材料の熱衝撃試験として、熱衝撃温度差(・T)が2001000Kの範囲での実験を実施した。FBCでは、・T=600Kでマクロな亀裂が発生し、試験片表面近傍にミクロな損傷の発生が確認された。C/C複合材料は高い耐熱衝撃性を示し、表面近傍にミクロな損傷の発生が確認された。これらのミクロな損傷は熱応力緩和機構となっていることが推測される。福田は高分子基複合材料の破壊のメカニズムの解明および強度予測を目標とし、(1)単繊維の強度を求めるループ試験法の開発、(2)単繊維を1本もしくは数本樹脂に埋めたマイクロコンポジットによる繊維/樹脂界面特性の評価、(3)複合材料のボルト継手の静的および疲労試験の3つの研究を行い、損傷メカニズムの解明に一定の寄与ができる成果が得られた。澤は、衝撃光弾性法により、複合材料中の衝撃波の挙動を調べ、衝撃破壊メカニズムを検討した。菊池は、介在物が非均一に分布する材料のディンプル破壊シミュレーションを行い、き裂進展経路、破壊靭性値などに及ぼす介在物の分布の影響について考察した。また、拘束条件の変化により破面形成の様相がどのように影響されるかを調べた。数値解析結果は、定性的に実験結果と一致し、材料中の介在物が破壊過程に及ぼす影響が解明できた。町田は、粒子分散強化アルミニウム合金のき裂先端のメゾスコピック特異応力場解明の為、走査型電子顕微鏡内でのその場観察により、相互相関関数に基づくデジタルスペックル写真法により、き裂先端の変位場を測定した。それを基に破壊力学パラメータを評価した。福田は、高分子基複合材料の破壊のメカニズムを解明するために、マイクロコンポジットの試験及び複合材料の試験法の研究を行った。単繊維のループ試験では、従来の引張試験との相関を明らかにし、またマイクロコンポジットの研究では、いわゆる臨界長さが繊維間隔の関数であることを見いだした。向後は、繊維結合型セラミックスの破壊形態観察から、臨界温度以上での巨視的なき裂の発生と臨界温度いかでの繊維・マトリックス界面でのはく離による微視的な破壊を認めた。有限要素法による熱応力解析の結果、巨視的き裂の発生条件が試験片表面からのき裂の進展条件で予測可能であることを明らかにした。荻原は、炭素繊維強化プラスチック複合材料積層板の熱サイクルによる損傷挙動のモデル化を行った。菊池は複合材料の高機能化のため複合材料の破壊シミュレーションを行う数値解析コードを開発し、それによって破壊シミュレーションを試みた。数値解析モデルの構築の簡素化のため、粒子法とMLPG法,重合メッシュ法に着目し、解析コードの開発を行った。町田は複合材料界面の強度評価のため、混合モードのエネルギ解放率、応力拡大係数を仮想き裂進展法,き裂閉口積分法,変位外挿法で評価できるFEM解析コードを作成し、界面での破壊力学パラメータの高精度の評価を可能とした。また相関関数に基づくパターンマッチング法による変位解析ソフトを開発し、ナノスケールの変位解析を可能とした。福田は繊維強化複合材料の損傷の初期過程における損傷機構の解明のため、実験および数値解析を行った。単繊維を1本もしくは数本樹脂に埋めたマイクロコンポジット繊維/樹脂界面特性の評価および破壊の初期過程を追跡した。
自己寛容誘導と骨破壊抑制・標的組織指向性を併せ持つ新規生物学的製剤の創製

種々の生物学的製剤の開発によって、関節リウマチの治療成績は向上しているが、骨破壊抑制や寛解達成率に関しては未だ不十分な側面もある。本研究では、T細胞の活性化を抑制して関節炎を抑制すると同時に、滑膜線維芽細胞などに高発現するRANKL細胞外ドメインに結合し、成熟破骨細胞形成を阻害する生物学的製剤の創製を目指して検討を行った。その結果、CTLA-4細胞外ドメイン、IgG1 Fcドメイン、抗RANKL scFvの三者をタンデムに融合したコンストラクトを用いる事で、関節リウマチ動物モデルにおいて、関節局所における炎症増悪を、より効率的に抑制すると共に、軟骨破壊・骨破壊を効率的に抑制できる事が示された。関節リウマチは最も頻度の高い自己免疫疾患の一つであり、滑膜組織の腫瘍様増殖と成熟破骨細胞の過剰形成によって、関節の破壊が進行する特徴がある。種々の生物学的製剤の開発によって治療成績は向上しているが、骨破壊抑制や寛解達成率に関しては未だ不十分な側面もある。生物学的製剤併用の必要性も指摘されているが、免疫応答を全身性に強く抑制した場合、感染症リスク増大や癌細胞に対する免疫監視低下など、深刻な副作用も懸念される。本研究では、自己反応性T細胞の活性化を抑制して関節における慢性炎症を抑制すると同時に、滑膜線維芽細胞やTh17細胞に高発現するRANKL細胞外ドメインに高親和性に結合し、成熟破骨細胞形成を直接阻害すると共に全身暴露の軽減も図った生物学的製剤の創製を目指して検討を行った。平成29年度は、まず、前年度に構築した生物学的製剤に関して、in vitroの薬理活性およびin vivoの血中滞留性の観点から評価を行った。最終的に、IgG1抗体のFc領域のN末端側にCTLA-4の細胞外ドメインを、C末端側に抗RANKL単鎖化抗体(scFv)を配置した融合タンパク質をin vivo薬理活性の評価に進む候補として選択した。コラーゲン関節炎マウスモデルに対して、四肢関節の腫脹が一定のレベルに達した状態から、投与を開始することで、治療効果を評価した。比較対象としては、既存のアバタセプトと同構造を有するコンストラクトを作成して用いた。その結果、新規デザインの生物学的製剤は、関節腫脹の増悪・関節軟骨の破壊・関節周囲の骨組織破壊のいずれに関しても、アバタセプト型の対照と比較して、有意な薬理活性の増強が認められた。本研究では、自己反応性T細胞の活性化を抑制して関節における慢性炎症を抑制すると同時に、滑膜線維芽細胞やTh17細胞に高発現するRANKL細胞外ドメインに高親和性に結合し、成熟破骨細胞形成を直接阻害すると共に全身暴露の軽減も図った生物学的製剤の創製を目指している。初年度は、PD-L1及びCTLA4の細胞外ドメインと抗RANKL単鎖化抗体フラグメントを同一分子内に有する種々の融合タンパク質のデザインと発現ベクターの構築、及び取得した組換えタンパク質を用いた、標的分子への結合活性とマウスに投与した際の血中滞留性などの活性特性の評価を行った。その過程で、PD-1への結合親和性がPD-L1の細胞外ドメインより高い、PD-L2の細胞外ドメインも候補に加えることとした。また良好な血中滞留性を達成するためには、融合タンパク質内にIgGのFc領域を組み込むことが有用であることも明らかとなった。さらに、融合タンパク質を取得するためのホスト細胞の選択によっても、取得したタンパク質の血中滞留性に大きな影響が生じることも明らかとなった。これは、融合タンパク質に複数付加されるN型糖鎖に置いて、シアル酸含量などの違いがホスト細胞の違いによって生じるためと考えられた。最終的に、最適と考えられるホスト細胞で、それぞれの候補融合タンパク質に関して、恒常的に高発現する細胞株の取得を行なった。初年度は、候補融合タンパク質の高発現株取得までをマイルストーンとしており、血中滞留性の良好な融合タンパク質を高発現する細胞株の取得に成功している。骨軟骨代謝学・リウマチ学前年度に構築した高発現株を用い、薬理効果の評価に必要となる組み換えタンパク質の大量調製を行う。取得した組み換えタンパク質を用い、まずin vitroモデル系を用いて薬理作用の確認を行う。

マウスより単離したナイーブT細胞を、同種異系の樹状細胞と共培養し、ナイーブT細胞の増殖活性を3Hチミジン取り込み活性で評価すると共に、IL-2, IFN-γ, TNFαなどのサイトカイン分泌をELISA手法で定量することで、各融合タンパク質の添加によってT細胞の活性化と増殖が抑制されるか否かを検証する。また、マウス骨髄由来マクロファージを、GST-RANKLで刺激して成熟破骨細胞形成を誘導する実験系を用い、各種融合タンパク質の添加によって、成熟破骨細胞の形成が抑制されるか否かを検証する。次いでin vivo薬理効果の評価を行う。動物モデルはコラーゲン関節炎を誘導したマウスを用いる。ウシII型コラーゲンによる初回免疫の3週後に追加免疫によるブーストを行う。薬理効果の評価対象とする組み換えタンパク質は、ブーストと同時に投与を開始することとし、投与量および投与間隔は、前年度の薬物動態学的検討の結果を踏まえて設定する。経時的に四肢関節の関節炎指数および関節腫脹を追跡評価する。また、また、経時的に血液サンプリングを行い、TNFα, IFN-γ, IL-2, 6など炎症性サイトカインの血清中濃度をELISA手法で測定することで、炎症の活動性を反映する指標として用いる。さらに、骨破壊に対する影響の評価には、血清中TRAP5b値の経時的な変動をELISA手法で測定すると共に、単離した四肢の関節部位を中心にμCTを用いて解析し、骨微細構造の変化を測定する。さらに病理組織切片を作成し、パンヌス・軟骨障害に関してスコア化して評価を行う。また、骨形態計測を行って、骨吸収の変化に関して定量的な評価を行う。組換えタンパク質の保存安定性の観点から、大規模培養による組換えタンパク質の取得を、次年度の動物実験の直前に行う計画に変更したため本年度に動物モデルを用いた薬効評価を行う際に用いる、大量の組み替え融合タンパク質の取得を実施する為に使用する計画である
植物遺伝子発現の柔軟性

植物における遺伝子発現の柔軟性の見地から興味あるのは、植物ホルモンを含む因子群により遺伝子発現制御の動態はいかなるものかという点にある。この点から研究発足の初年度にあたり、基礎固めをすべく植物ホルモンとしてはオ-キシンなどに着目した解析を行なったところオ-キシンにより細胞周期のGoーS期に密接に関連して発現する遺伝子の一群parA,parB,parCが誘導されることがわかったが、parBはグルタチオンSートラスフェラ-ゼ遺伝子であった。これは、オ-キシンで誘導される遺伝子の中で機能が同定された最初の例となり、その他は一群の遺伝子ファミリ-を構成し、様々なシグナルに様々に応答することが判明し、標記の目的に好適な系であることが判明した。また、シロイヌナズナで花芽形成の変異を示す突然変異はオ-キシンの輸送に変異があることも示され、このところ研究の停滞していたオ-キシン研究に突破口を開いた。一方、蔗糖およびポリガラクツロン酸に応答することが報告されているベ-タアミラ-ゼの発現に関するシス、トランスの因子の解析が進み遺伝子発現は確かに柔軟といってよい状況にあることが示され、より詳細な機構の解析が待たれる状況でもある。多重遺伝子族の例としてはフェニルアラニンアンモニアリア-ゼが、傷害により誘導されるものがあるとともにオ-キシンで誘導されるものがあることが分かり、その使い分けの分子機構も詳しく知りたいところである。更に、ヒャクニチソウ葉肉細胞で見られる仮導管要素の分化でも関与する遺伝子群が判明しつつあることも標記の課題にある解答を準備する状況といえる。班全体としてはなお目標にむけ鋭意邁進する必要であるが、明らかにされた成果には見るべきものがあると考える。