hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
水道原水中に含まれる微生物の除去に関する研究

水中に棲息する微生物は、生育に適した生物化学的条件が満たされれば増速を始め人間環境に有害な作用を及ぼす。本研究では、低栄養の水中における細菌の生育挙動及び有機有害物の溶除去存状態を明らかにし、これら細菌及び有機有害物を紫外線殺菌装置または機能性高分子材料であるイオン交換樹脂を用いて、水中から効果的に分離することを目的とする。1.貧栄養水中に棲息する細菌の同定及び各種純水中での生育挙動:実験室用超純水製造装置により製造したTPC60ppbの貧栄養純水中から細菌A、Bの2種類を単離し、各種生理活性試験により、細菌AをP.aeruginosaと細菌BをP.diminutaと推定した。TOCが250ppbの脱イオン水と132pp瑞の注射用水各20Lに、単離した細菌A、Bを10cells/mLで接種した。両細菌は接種後、直ちに対数増殖し、約1週間で静止期に達した。静止期における細菌数はTOCの高い水中でより大きくなることが分かった。またエンドトキシンは始め検出限界以下であったが、死菌の寄与により水中に数ng/mLレベルで発現してきた。2.エンドトキシンのイオン交換樹脂による吸着除去及び紫外線照射による失活:試薬エンドトキシンを注射水中に1100ng/mLの濃度に溶解しイオン交換樹脂によるバッチ吸着を行った。また、上記エンドトキシン溶液1Lを流速一定で紫外線殺菌装置により循環処理した。実質的に孔のない強塩基性陰イオンGel型樹脂と孔を有するMR型樹脂では、単型の後者の樹脂が最も効果的であった。エンドトキシンは水中では-数mV-25mVで負に帯電し会合体を形成しているが、上記MR型樹脂の孔及び樹脂表面では一部サブユニットまで解離した状態で吸着除去されるものと考えられる。エンドトキシン溶液に184.9nm及び253.7nmの紫外線を照射したところ、紫外線照射時間の増加につれエンドトキシン濃度は低下し、その粒子径は小さくなり、またリムルス活性も低下した。低波長の紫外線は、エンドトキシンのリムルス活性を不活性化する効率の高いことが分かった。水中に棲息する微生物は、生育に適した生物化学的条件が満たされれば増殖を始め人間環境に有害な作用を及ぼす。本研究では、水中における微生物の生育挙動及び有機有害物の溶存状態を明らかにし、これらの微生物及び有機有害物を機能性高分子材料であるイオン交換樹脂を用いて、水中から効果的に分離除去することを目的とする。1.エンドトキシン(ET)のバッチ吸着:試薬ETを1100ng/mLの濃度に溶解し、強塩基性陰イオン交換樹脂(SBAER)50mgを加え、25°Cにおいて吸着試験を行った。その結果、トリメチルアミン基を有するI型樹脂の方がジメチルアミノエタノ-ル基のII型樹脂より効果的にETを除去した。また、I型、II型とも孔を有するMR型樹脂の方がETの除去に効果的であった。ETは、水中では-数mV-25mVで負に帯電しており、MR型樹脂では静電的及び孔に、Gel型では樹脂表面で静電的に吸着除去されたものと考えられる。2.貧栄養水中で増殖する細菌の除去:2種のグラム陰性細菌、Achromobacter ruhrandii IAM 12600、Pseudomonas diminuta JCM 02788を貧栄養水(TOC:60ppb、電気抵抗率:18MΩcm)中に1010^2cell/mL接種した。この液を外部からの汚染を受けないポリプロピレン容器に入れ、容器外部に再生型SBAERと強酸性陽イオン交換樹脂の混合樹脂(体積比で2:1、全量20mL)のカラムとポンプをつけ液を循環(初めはカラムをby pass)した。細菌は直ちに増殖を始め、約一週間後に静止期に達した。ETは23日後より発現し、46ng/mL濃度レベルで一定となった。12日後に流路を樹脂カラム側に切り換えたところ、細菌及びETは樹脂に効果的に吸着除去された。生理的食塩水で樹脂から細菌を脱着させ、細菌の生理活性をPlate試験及びOxidase試験をした結果、negativeであった。上記試験並びに細菌のイオン交換樹脂によるバッチ吸着試験及び樹脂上での細菌の生理活性試験より細菌は高度に再生された両樹脂近傍にある濃厚な酸及び塩基との連続的な接触により、殺菌されたものと考えられる。

またエンドトキシンは始め検出限界以下であったが、死菌の寄与により水中に数ng/mLレベルで発現してきた。2.エンドトキシンのイオン交換樹脂による吸着除去及び紫外線照射による失活:試薬エンドトキシンを注射水中に1100ng/mLの濃度に溶解しイオン交換樹脂によるバッチ吸着を行った。また、上記エンドトキシン溶液1Lを流速一定で紫外線殺菌装置により循環処理した。実質的に孔のない強塩基性陰イオンGel型樹脂と孔を有するMR型樹脂では、単型の後者の樹脂が最も効果的であった。エンドトキシンは水中では-数mV-25mVで負に帯電し会合体を形成しているが、上記MR型樹脂の孔及び樹脂表面では一部サブユニットまで解離した状態で吸着除去されるものと考えられる。エンドトキシン溶液に184.9nm及び253.7nmの紫外線を照射したところ、紫外線照射時間の増加につれエンドトキシン濃度は低下し、その粒子径は小さくなり、またリムルス活性も低下した。低波長の紫外線は、エンドトキシンのリムルス活性を不活性化する効率の高いことが分かった。水中に棲息する微生物は生育に適した生物化学的条件が満たされれば増殖を始め人間環境に有害な作用を及ぼす。本研究では、機能性高分子材料による微生物の分離除去に先立ち、水中における微生物の生育挙動及び有機有害物の溶存状態を生化学的及び界面科学的に検討した。
デュアル元素粒界偏析を活用したマグネシウム合金の高速変形能化

マグネシウムの欠点である脆さと乏しい変形能を改善する室温粒界すべりは、粒界構造に極めて敏感である。これは、粒界すべりを補完する効果的な付随調整機構「補助」を結晶粒界に導入することによって、室温粒界すべりの更なる高速化の可能性を示唆している。本研究課題では、加工熱処理をともなう金属材料創製では回避できない『粒界偏析』に着目し、付随調整機構補助として活用する。特に、単一溶質元素ではなく、複数溶質元素の粒界偏析によって、粒界構造の再制御化と変形の補助化を図り、高速域を含めた幅広い変形速度(ひずみ速度)域にて延性能の付与を目指す。
多次元フォトニック結晶構造を有する反強磁性結合体の超高速空間光変調素子への応用

本研究課題では、高性能空間光変調素子の実現に必要な基盤技術の確立を目的として、短波長磁気光学材料、および、多次元の磁性フォトニック結晶に関する検討を実施した。遷移-貴金属系磁性薄膜の研究では、[CoPt/ZnO/Ag]積層膜が、大きな磁気光学特性と良好な垂直磁気特性の両立が可能であることを見出した。さらに、反強磁性結合を有する垂直磁化膜への2次元周期のナノ構造の付与と、光干渉用の誘電体層とを組み合わせることで、3次元的な磁性フォトニック結晶を作製した。本積層ナノ構造体における磁気光学性能の向上が、磁気光学効果の非相反性と、光干渉層部でのキャビティ効果によって説明可能であることを明らかとした。本研究課題では、反強磁性結合を有する垂直磁化積層膜に対して、ナノレベルでの周期的な一次元の積層構造および二次元の微細加工を施すことで多次元の磁性フォトニック結晶の実現を目的としている。これにより、可視光領域の短波長光に対して実用的な光変調性能と既存の製品に比較して1000倍以上の超高速動作とを合わせ持つ革新的な空間光変調素子が実現可能となる。本研究の成果は、次世代の大容量光ディスクとして期待されているホログラム光情報記録システム、あるいは、光の並列性・高速性を活かすことで情報の飛躍的な演算処理能力の向上が期待できる光情報処理システム等の飛躍的な性能向上に繋がるものである。多次元の磁性フォトニック結晶と反強磁性結合体との組み合わせによる磁気光学性能の向上を目的とした本研究はこれまでに無い新たな取組みであり、今年度は特に、昨年度に構築した磁気光学特性の評価システムを用いることで、反強磁性結合を有する2次元周期ナノ構造体の磁気物性の把握に注力した。電子線描画装置およびArイオンエッチング装置により作製した2次元周期構造を有する[CoPt/Ru/CoPt]反強磁性結合体では、100nm程度の微細加工後においても厚さが数原子程度のRu層を介した反強磁性結合が維持可能であることが確認できた。特に、周期的なナノホール構造に対しては微細加工による磁気特性の変化も少なく、磁性フォトニック結晶として有用であることが分かった。さらに、昨年度に見出した[CoPt/ZnO/Ag]積層膜における磁気光学性能の増大に関しては、挿入層としてZnO以外の材料との比較、あるいは、反射率などの光学物性等に関する更なる検討を行い、学術論文として報告した。本内容に関しては、可視光領域での特性改善を目的として、局在プラズモン効果を利用した新たな取り組みについても次年度に計画している。本研究課題では、反強磁性結合を有する垂直磁化積層膜に対して、1次元周期の積層構造と2次元周期の微細加工とを組み合わせることで、ナノレベルの多次元の磁性フォトニック結晶を実現することを目標としている。その成果は、可視光に対して実用的な光変調性能と超高速動作とを合わせ持つ、革新的な空間光変調素子の実現につながるものである。本年度は、反強磁性結合を有する垂直磁化膜に対して、2次元周期構造の付与が磁気物性に与える影響について詳細な検討を行った。その結果、反強磁性結合体を構成する上部磁性層のみへ微細加工を施すことで、膜構造に起因した特徴的な磁化反転過程が観測できることなどが分かり、学術論文として報告した。また、2次元周期のナノホール構造では、微細加工による磁気特性の変化も少なく、磁性フォトニック結晶への応用に有用であることも分かったので、実際に3次元の磁性フォトニック結晶の作製を試みた。反強磁性結合を有する垂直磁化膜と、光干渉用の誘電体層から構成された積層構造体に対して、2次元周期のホールアレイ加工を行った。測定光の1/2波長の光学膜厚に相当する光干渉層を有する積層構造体では、ホールアレイ加工によって磁気光学性能の向上を見出すことができ、学術論文として報告した。本現象は、磁気光学効果の非相反性によって説明することが可能であり、現在、磁化配列状態との関係などについて引き続き検討中である。さらに、本研究課題で見出した[CoPt/ZnO/Ag]積層膜に対して、新たな取り組みを行い、ナノ構造に起因すると思われる磁気光学特性を観測し、次年度の科研費事業に応募した。なお、本研究課題では、空間光変調素子の作製までには至らなかったが、光変調素子として必要な大きな磁気光学性能は実現できているので、駆動方式あるいは素子構造などデバイス開発に係る検討を、引き続き実施していく予定である。本研究では、反強磁性結合を有する垂直磁化積層膜に対して、ナノレベルでの周期的な一次元の積層構造および二次元の微細加工を施すことで多次元の磁性フォトニック結晶の実現を目的としている。

これにより、可視光領域の短波長光に対して実用的な光変調性能と既存の製品に比較して1000倍以上の超高速動作とを合わせ持つ革新的な空間光変調素子が実現可能となる。本研究の成果は、次世代の大容量光ディスクとして期待されているホログラム光情報記録システム、あるいは、光の並列性・高速性を活かすことで情報の飛躍的な演算処理能力の向上が期待できる光情報処理システム等の飛躍的な性能向上に繋がるものである。多次元の磁性フォトニック結晶と反強磁性結合体との組み合わせによる磁気光学性能の向上を目的とした本研究はこれまでに無い新たな取組みであり、今年度は、反強磁性結合を有する積層構造体の磁気光学物性の把握、ならびに、微細加工技術を用いた磁性金属薄膜のナノ加工および微小加工領域の磁気光学特性の評価システムの構築に注力した。反強磁性結合体に関しては、垂直磁気異方性を有するCoPt膜、磁気結合の制御が可能なRu膜、および、ZnO誘電体膜を組み合わせた積層構造体を構築することで、本構造に特有の磁気光学特性の向上を見出すことができた。さらに、磁気分光特性に関する詳細な検討の結果、本現象が積層構造体の内部における磁気光学的なキャビティ構造に起因することが分かった。一方、磁性金属薄膜の微細加工に関しては、電子線描画装置を用いることで可視光に対してフォトニック結晶としての作用が期待できる100nmレベルの微細加工技術を確立すると共に、微細加工を施した10μm以下の微小領域の磁気光学特性を10kOe以上の印加磁場下において測定可能は評価システムを開発することができた。本研究での開発を目標としている磁気光学効果を用いた光変調素子では、入射光の偏光角を磁性体の磁化方向によって変化させることで、その後に偏光板を透過する光の強度を制御する。したがって、高性能の光変調素子の開発には、使用する波長の光に対して大きな磁気光学効果を有する材料の開発が不可欠である。昨年度は、磁性フォトニック結晶の実現を目標として、磁性金属膜に対して100nmレベルで2次元の周期ナノ構造を付与することが可能な微細加工技術を確立すると共に、[CoPt/ZnO/Ag]積層膜において、紫外光領域での偏光角を目標値である±1度以上に増大することができた。本年度は、実際に、2次元周期構造を有する[CoPt/Ru/CoPt]反強磁性結合体を作製し、微細加工後においても厚さが数原子程度のRu層を介した反強磁性結合が維持可能であることを確認した。特に、周期的なナノホール構造においては、微細加工による磁気特性の変化も少ないことが分かり(山根他、第73回応用物理学会学術講演会)、積層構造体と組み合わせた磁性フォトニック結晶に関する検討を次年度に計画している。一方、[CoPt/ZnO/Ag]積層膜に関しては、Ag下地層およびZnO挿入層を他の材料と比較することで性能向上の要因解明を図った。その結果、磁気光学特性の改善は、Agのプラズマ共鳴とZnOのバンド間遷移との相乗効果であること、また、垂直磁気特性の改善は、[CoPt/ZnO]積層界面での電子状態が起因している可能性が見出された(H.Yamane, Appl. Phys. Lett. 102)。本研究内容に関しては、可視光領域での特性改善を目的として、局在プラズモン効果を利用した新たな取り組みについても次年度に計画している。以上、本研究に関しては、当初の目標通りおおむね順調に進展している。
神経活動依存性遺伝子発現活性化機構の研究

mitogen-activated protein kinase(MAPキナーゼ)は、もともと細胞増殖因子受容体のチロシンキナーゼ活性化反応後に、細胞内に惹起される反応のカスケードの中で活性化され、遺伝子発現に関与している。本研究では、MAPキナーゼ活性化反応を介して、神経活動依存性に促進する遺伝子発現機構の解明を目指した。Sweattら(アメリカ)は、海馬CA1領域におけるシナプス伝達長期増強(LTP)誘導時に、MAPキナーゼ活性化反応が惹起されることを報告した。私達は以前から、神経細胞において、グルタミン酸受容体刺激に続いてMPAキナーゼ活性化反応を観察した。したがって、本研究では、LTP誘導時におけるMAPキナーゼ活性化反応との相関性を解析した。1)成熟ラット海馬切片を用い、CA1領域への入力線維に100Hz、1秒間の電気的高頻度刺激を与え、LTPを誘導した。MAPキナーゼ活性は、LTP誘導後3分でピークを示し、その後、急速に減少した。2)100Hz、0.12秒間の短時間高頻度刺激および50ng/ml脳由来神経栄養因子(BDNF)は、それぞれ単独ではLTP誘導を惹起できなかったが、両者を同時に作用させると、LTPを誘導させることができた。MAPキナーゼ活性は、それぞれ単独刺激および両方の刺激下のいずれにおいても、活性化されなかった。一方、CaMキナーゼII活性は、BDNF単独のみにおいても、わずかの上昇がみられ、両方の刺激において、さらに上昇した。以上の結果は、LTP誘導にはMAPキナーゼ活性は相関せず、CaキナーゼIIが密接に相関していることを示している。MAPキナーゼはLTP維持に関与していることを示唆している。海馬CA1領域での長期増強には,mitogen-activated protein kinase(MAPキナーゼ)活性化反応が伴うことが報告され,私達の研究においても同様の研究を行った。MAPキナーゼ活性化反応は,細胞増殖因子によって惹起される経路は詳しく研究されている一方,グルタミン酸,アセチルコリンなどの神経伝達物質によって活性化される経路については不明な点が多い。後者の機構を明らかにすることで,神経活動依存性に促進する遺伝子発現機構を明らかにし,学習,記憶の成立機構を解明する糸口が得られると考えられる。1)海馬初代培養細胞を用い,イムノブロット法により,42-,44-kDaMAPキナーゼの存在を確認した。2)成熟ラット海馬切片を用い,CA1領域への入力線維に電気的高頻度刺激を与え,長期増強(LTP)を誘導した。LTP誘導後,CA1領域を切り出し,組織抽出液中のCaMキナーゼIIとMAPキナーゼ活性化反応をin-gelassay法を用いて測定した。MAPキナーゼ活性は,LTP誘導後3分でピークを示し,その後急速に減少し,60分で元のレベルに戻った。2)MEK阻害薬PD098059を用いて調べた。50μMPD098059はLTP誘導を阻害し,CaMキナーゼII,MAPキナーゼ活性化反応ともに阻害した。しかし,濃度を30μMに減少させると,LTP誘導を阻害しなかった。酵素活性ではCaMキナーゼII活性化反応を認め,それに対し,MAPキナーゼが阻害された。LTP誘導とCaMキナーゼII活性化反応は相関しており,MAPキナーゼ活性化反応は相関していないことが明らかになった。
細胞周期制御蛋白を分子標的とした抗がん剤の探索と創製

本研究では、サイクリン依存性キナーゼ4(cdk4)阻害活性ならびに培養腫瘍細胞に対する殺細胞活性を指標にして、海洋生物より活性成分の検索を行った結果、種々の活性物質を見い出した。1).新規ブロモチロシンアルカロイドの単離とcdk4阻害作用:沖縄産の海綿Suberea sp.の抽出物よりMa'edamineAとBを単離し、構造を帰属した。Ma'edamineAとBには、cdk4阻害作用(IC_<50>20μg/mL)およびL1210細胞(IC_<50>4.3、3.9μg/mL)およびKB細胞(IC_<50>5.2、4.5μg/mL)に対する細胞毒性が認められた。
超微細プロセス用低エネルギ-粒子ビ-ム源の開発

高性能の超微細プロセスを可能にするには、基板へ入射するイオンの速度ベクトルの向きと大きさがそろっており、大口径で一様なビ-ムであること、また、損傷を与えない程度に低エネルギ-であること、などの条件を満たす必要がある。これらの条件をクリアするには放電の低圧力化、大口径化、低プラズマ電位化、高プラズマ密度化が求られる。このような要請に応えるために、本研究では表面磁場(磁気壁)中の誘導型高周波放電プラズマを提案し、その開発を行った。表面磁場の解効果として次の点が期待できる。電離生成に寄与する高エネルギ-電子が磁気壁で反射されるのでプラズマの発生率が向上し、低エネルギ-のバルク電子の拡散も抑制されるので電子損失も減少する。このことは両極性拡散電界の減少、すなわちプラズマ電位の低下を導き、また、大口径の一様性の良いプラズマが生成される条件が整ってくる。本研究において試作した表面磁場装置では、期待される通り、次のような有望な実験結果が得られた。1.2×10^<-5>Torrの低圧力においても放電維持が可能になった。2.直径約40cmの一様性の良い大口径プラズマを生成できた。3.プラズマ電位は表面磁場によって20Vまで低下できた。4.10^<10>10^<11>cm^<-3>の高密度のプラズマが得られた。なお、ここで用いた放電形式は誘導型高周波放電であり、アンテナ導体表面の絶縁の重要性も明らかになった。また、プラズマ中の小さな電極にバイアスを印加することにより、広範囲にプラズマ電位を制御できた。一方、イオン・表面相互作用の結果、分子イオンが固体表面に衝突すると同時に小さなフラグメントに分解して、ラジカルビ-ムが表面から飛び出す現象を詳細に調べた。このプラズマ界面過程は、将来、新しいラジカルビ-ム源に発展する可能性を示す興味深い現象である。反応性非平衡プラズマを用いる薄膜技術はマイクロエレクトロニクスの発展に大きく貢献してきた。そして今や、超LSIデバイスの最小パタ-ン幅はサブミクロンという微細加工を必要とする時代に入り、わずか数原子層の薄い膜を堆積する超格子素子が研究されている。このような次世代デバイスを実現するには、低い圧力でプラズマを生成し、低いエネルギ-で鋭い指向性を持つ粒子ビ-ムをつくり出すことが必要とされている。そこで本年度の研究は、従来にない低圧力下で高周波放電プラズマを生成する技術を開発することを主眼として研究を行った。(1)低圧力RF放電プラズマ生成従来、高周波放電は0.1Torrから10Torr程度の高い圧力でしか生成できなかったが、我々は永久磁石をはりめぐらした“表面磁場"を利用することにより、10^<-5>Torrという低い圧力でも高周波プラズマを生成できることを実証した。さらに、プラズマ電位も制御できることを見出し、その理論的な説明も行った。(2)低エネルギ-電子ビ-ム源の生成ダブルプラズマ法の原理を用いて、ビ-ムエネルギ-を030eVの低い領域で自由に制御できる大面積の電子ビ-ム源を実現した。これは電子サイクロトロン共鳴を利用するマイクロ波放電で行った。が、上記(1)のRFプラズマを用いて実現することもできる。(3)その他メタン放電によるアモルファスカ-ボン薄膜の生成を行って、高エネルギ-イオンビ-ムによる表面現象を詳細に調べ、フラグメンテ-ションとスパッタリングの機構を明らかにした。

また、メタンプラズマ中の中性ラジカル種の絶対密度の測定と、空間分布の測定に世界に先駆けて成功した。高性能の超微細プロセスを可能にするには、基板へ入射するイオンの速度ベクトルの向きと大きさがそろっており、大口径で一様なビ-ムであること、また、損傷を与えない程度に低エネルギ-であること、などの条件を満たす必要がある。これらの条件をクリアするには放電の低圧力化、大口径化、低プラズマ密度化が求められる。このような要請に応えるために、本研究では表面磁場(磁場壁)中の誘導型高周波放電プラズマを提案し、その開発を進めた。初年度の研究において、永久磁石を用いる表面磁場によって放電が2×10^<-5>の超低圧まで維持できること、プラズマ電位が20V程度まで低くできること、直径40cm程度の一様なプラズマが得られること等を明らかにした。本年度は、プラズマ中に挿入された小さな電極にバイアスを印加して、広い範囲でプラズマ電位を制御できることを実験的に見い出し、この結果を理論的に説明した。また、高周波の投入電力を増強してプラズマの高密度化を試み、10^<10>10^<11>/cm^3の密度を得ることに成功した。さらに、アンテナ導体の表面を絶縁することが重要と分った。一方において、研究の途上で見い出された特異な現象、すなわち、プラズマ・表面相互作用によって電極近傍が異常に発光する現象の解明もおこなった。その結果、異常発光は高エネルギ-で入射した粒子が表面衝突と同時に小さなフラグメントに分解して、励起状態のラジカルビ-ムが表面から飛び出すためと判明した。このプラズマ異面過程は、薄膜の堆積やエッチングの機構解明において重要であるばかりでなく、将来、新しいラジカルビ-ム源を開発する研究に結びついていく可能性を秘めた興味深い現象である。
ゲノム編集技術を用いた微小脳学習システムの解析

本研究の目的はCRISPR/Cas9法を用いて標的遺伝子をノックアウトしたフタホシコオロギ作成技術を確立し、学習・記憶メカニズム研究を加速させることである。Dop1ドーパミン受容体遺伝子のノックアウト個体を用いた研究により、Dop1は仲間の行動を罰と結びつける罰性の社会学習に関わることがわかった。一方、OA1オクトパミン受容体のノックアウト個体作成を試みたが十分な成果は得られなかった。また遺伝子ノックアウト実験の前段階としてRMAiによってAC1、AC8アデニル酸シクラーゼ、FoxP転写抑制因子の遺伝子発現をノックダウンする実験を行い、これらの分子の学習・記憶への関与について新規知見を得た。実験1.OA1オクトパミン受容体ノックアウトコオロギの作成:報酬学習に関わると考えられるオクトパミン受容体OA1のノックアウトコオロギをCRISPR/ Cas9法を用いての作成を数度にわたって試みたが、現在のところは変異コオロギ系統の作出には成功していない。今後も条件を変えながら粘り強く実験を続けていく。実験2. Dop1ドーパミン受容体ノックアウトコオロギの行動学的解析:すでに作出に成功しているDop1ドーパミン受容体ノックアウトコオロギを用いた行動解析は進展があった。この系統を用いてDop1ドーパミン受容体の学習に果たす役割についての解析を行った結果、Dop1ドーパミン受容体ノックアウトコオロギは仲間の存在から報酬の存在を予期する報酬性の社会学習はできるが、仲間の行動から罰の存在を予期する罰性の社会学習ができないことが明らかになってきた。この成果は社会学習の神経基盤についての新規な知見をもたらす重要な成果である。実験3. AC1及びAC8アデニル酸シクラーゼのノックダウンコオロギの作成と解析:次の研究課題としてAC1及びAC8アデニル酸シクラーゼのノックダウンコオロギを作成し解析を進めた。アデニル酸シクラーゼは学習に深く関わる酵素で、コオロギには8つのアイソフォームがある。そのうちAC1とAC8は、カルシウム/カルモジュリンとGタンパク質の両方によって活性化されるという性質があり、ショウジョウバエやアメフラシの古典的条件付けにおいては条件刺激と無条件刺激が同時に到達したことを検知する分子として働くとの報告がある。本研究では、この分子のコオロギでの匂い学習における役割を明らかにするために、RNAi法を用いてAC1及びAC8アデニル酸シクラーゼのノックダウンコオロギの作成し、学習への影響について調べた。これまでのところは、これらのコオロギにおいて学習障害は確認されていない。初年度の第一の目標としたのはゲノム編集技術を用いたOA1オクトパミン受容体ノックアウトコオロギの作成であったが、現在までのところは変異系統の作出には成功していない。これには受精卵へのRNAインジェクション操作の不良、ゲノム編集の設計の不備など幾つかの理由が考えられるが、条件を変えながらそれらの可能性を1つ1つ調べていきたい。その一方では、すでに作成に成功しているDop1ドーパミン受容体ノックアウトコオロギについての解析では、他者の行動から学ぶ社会学習に障害が起こるという予想外の発見があった。これは社会学習の遺伝子機構を明らかにすることに繋がる画期的な発見であるといえる。またゲノム編集技術を用いた研究の次のターゲット遺伝子として着目したAC1及びAC8アデニル酸シクラーゼについては、RNAiによるAC1及びAC8ノックダウンコオロギについての行動解析が進展した。これまでのところ、当初の予想とは異なり明確な学習障害が確認されていないが、さらにそれらの遺伝子のダブルノックダウンコオロギを作成して、解析を進めていける状況が生まれている。それらを総合すると、本年度の進ちゃく度はおおむね期待どうりであると評価したい。実験1。タイプ1オクトパミン受容体OA1ノックアウトコオロギの作成。昨年度に引き続いて、ゲノム編集技術(Crisper/Cas9)を用いたノックアウトコオロギの作成を試みたが、ノックアウト個体を得る方法を確立させることができていない。その理由についても明確な結論が得られなかったため、この研究は一旦中断し、以下の研究に集中することとした。実験2。タイプ1ドーパミン受容体Dop1ノックアウトコオロギを用いた社会学習におけるDop1ドーパミン受容体の役割の解明。コオロギ社会学習におけるDop1ドーパミン受容体の役割の解明した結果、Dop1ドーパミン受容体ノックアウトコオロギでは、社会か学習においても報酬学習は成立するが、罰学習が成立しないことが明らかになった。実験3。FoxP遺伝子の長期記憶形成に果たす役割の解析。新たにFoxPと呼ばれる転写制御因子に着目した解析を開始した。この遺伝子は哺乳類や鳥類において音声学習に関わるなど重要な機能を果たす遺伝子であるが、コオロギなどの昆虫もその遺伝子を持っており、その機能的な役割が注目される。まずRNAiによりこの遺伝子のノックダウンコオロギを作成した結果、匂いと水の連合学習における長期記憶形成に障害が起こることがわかった。さらにゲノム編集技術を用いたノックアウトコオロギの作成を進めてきた。それらの研究を通してRNAiによる遺伝子ノックダウンコオロギやゲノム編集技術による遺伝子ノックアウトコオロギを用いた学習研究に格段の進展をもたらすことができたと考える。一方、OA1

オクトパミン受容体のノックアウト個体作成を試みたが十分な成果は得られなかった。また遺伝子ノックアウト実験の前段階としてRMAiによってAC1、AC8アデニル酸シクラーゼ、FoxP転写抑制因子の遺伝子発現をノックダウンする実験を行い、これらの分子の学習・記憶への関与について新規知見を得た。まずは初年度に始めた研究の完成をめざす。まずOA1ノックアウトコオロギの作成を粘り強く進める。またDop1ノックアウトコオロギを用いた社会学習におけるDop1ドーパミン受容体の役割についての解析をさらに進める。それに加えてAC1とAC8のダブルノックダウンオロギを作成して学習行動への影響を調べる研究を進める。ダブルノックダウンコオロギにおいて学習障害が確認された場合は、速やかにゲノム編集技術によるダブルノックアウトコオロギの作出に着手したい。それらに加え次年度からは新たにFoxPという転写制御因子に着目した解析を始めたい。この遺伝子は哺乳類や鳥類において音声学習に関わる遺伝子であるが、コオロギもその遺伝子を持っており、その役割が注目される。まずRNAiによりこの遺伝子のノックダウンコオロギを作成して、匂いと水の連合学習における刺激のタイミングの情報の処理に障害が起こるかを調べる。もし興味深い学習障害が確認されれば、ゲノム編集技術を用いたノックアウトコオロギの作成へと研究を展開していく。それらの研究を通してRNAiによる遺伝子ノックダウンコオロギやゲノム編集技術による遺伝子ノックアウトコオロギを用いた学習研究に格段の進展をもたらすことが本研究の目的であり、研究期間中に確たる成果を導けるよう努力したい。北海道大学大学院理学研究院水波誠研究室神経行動学実験に必要な消耗品代が予想よりもやや少なかったため、ごく少額の次年度繰り越し金が生じた。次年度の年度当初の消耗品代の一部として使用する。
低分子量Gタンパク質群のクロストークによる神経軸索伸張制御

低分子量Gタンパク質であるRacは、細胞骨格アクチンの重合・脱重合を制御する中心的シグナル分子である。神経細胞においても、Racは軸索伸張からシナプス形成に至るまでの様々な形態変化に関与する。昨年度までの研究から見出した、新規のRacエフェクター分子である線虫RIN-1の細胞学的機能と分子遺伝学的機構を明らかにする事を目指し、以下の解析を行った。1、神経細胞移動および軸索伸長における低分子量Gタンパク質群とRIN-1タンパク質とのクロストークの関係野生型および恒常活性化型変異を入れたGタンパク質遺伝子として、CED-10/Rac1とRAB-5を作成し、野生型あるいはrin-1変異体の線虫に発現させた。野生型、変異体どちらにおいても、恒常活性化型CED-10の発現により発生過程にある線虫神経の糸状仮足の数が増加したが、特にrin-1変異体においてその数が有意に増加する事、また軸索を伸長する細胞サイドのみではなく、反対側にも異所的に糸状仮足が見える事を見出した。この結果は、RIN-1タンパク質は、活性化型Racと特異的に結合し、その活性を細胞領域特異的に制御している事が明らかになった。Rab5の影響や、これらのタンパク質の活性化が生体内でどの様に制御されているのかについては、形質転換体の作製に時間を要し、結果を得るまでには至らなかった。2、軸索誘導を制御しているガイダンス分子とRIN-1タンパク質活性化の関係。昨年度までの遺伝学的解析から、反発性シグナルslitおよびその受容体Roboの下流でRIN-1が機能している可能性を明らかにしている。このシグナル経路の分子機構を明らかにするために、各分子の挙動と相互作用を解析した。線虫のRoboをコードしているSAX-3とGFPとの融合遺伝子を発現させた形質転換体を作製し、発生中の神経におけるSAX-3の発現や局在を観察したところ、SAX-3は細胞膜上、特に糸状仮足に強く局在していた。ただし、伸長方向に勾配を持って局在している様子は観察されなかったので、細胞内では一様に局在していると推測された。興味深い事に、この糸状仮足への強い局在とRIN-1の細胞内集積がリンクしているように観察される。今後この2つのタンパク質の細胞内動態を詳しく解析する予定である。これらの結果は、RIN-1タンパク質がガイダンス分子特異的に細胞内のRacの活性を制御することで、軸索伸長に必須な糸状仮足の形成を領域特異的に制御している事を示す最初の発見であり、現在論文投稿中である。本研究では、細胞骨格制御に関わる低分子量Gタンパク質「Rac」の新規エフェクターとして単離したRIN-1の機能解析を通して、このタンパク質を介した複数の低分子量Gタンパク質群の活性化や空間的配置のクロストークの実態を明らかにする。さらに、神経細胞の移動や軸索伸張といった形態形成において、これらのクロストークがガイダンス分子特異的な細胞骨格の制御を導いている新規メカニズムを確立することを目的としている。今年度は、RIN-1、CED-10/Rac、Rab-5、アクチン、ガイダンス分子受容体であるUNC-40/DCCおよびSAX-3/Robo等を蛍光タンパク質に融合させ、線虫神経細胞に発現させた形質転換体を作成した。これらの形質転換体を用いて、各タンパク質群の挙動を正常個体あるいは各遺伝子の突然変異体内で観察した。その結果、RIN-1はRacやRab-5、両ガイダンス分子の局在には影響しないが、アクチンの勾配分布を制御している事が分かった。したがって、RacとRab-5の間の局在に関しての機能的クロストークは現時点では明らかでない。また、活性型変異を導入したRAB-5の発現によるrin-1変異体の表現型が回復されない事から、機能的にもRIN-1はRAB-5の活性化を必要としていない事が示唆された。各変異体における軸策伸長の表現型の解析から、反発性因子のSlitの下流でRIN-1が機能している事を明らかにした。この結果は、反発性ガイダンス分子を受け取る細胞領域で、RIN-1はアクチンの集積を抑制することでその方向への細胞移動や軸策伸長を抑えていると推測できる。この結果は、RIN-1による細胞移動の新規メカニズムを明らかにした初めての報告となる。

この結果は、RIN-1タンパク質は、活性化型Racと特異的に結合し、その活性を細胞領域特異的に制御している事が明らかになった。Rab5の影響や、これらのタンパク質の活性化が生体内でどの様に制御されているのかについては、形質転換体の作製に時間を要し、結果を得るまでには至らなかった。2、軸索誘導を制御しているガイダンス分子とRIN-1タンパク質活性化の関係。昨年度までの遺伝学的解析から、反発性シグナルslitおよびその受容体Roboの下流でRIN-1が機能している可能性を明らかにしている。このシグナル経路の分子機構を明らかにするために、各分子の挙動と相互作用を解析した。線虫のRoboをコードしているSAX-3とGFPとの融合遺伝子を発現させた形質転換体を作製し、発生中の神経におけるSAX-3の発現や局在を観察したところ、SAX-3は細胞膜上、特に糸状仮足に強く局在していた。ただし、伸長方向に勾配を持って局在している様子は観察されなかったので、細胞内では一様に局在していると推測された。興味深い事に、この糸状仮足への強い局在とRIN-1の細胞内集積がリンクしているように観察される。今後この2つのタンパク質の細胞内動態を詳しく解析する予定である。これらの結果は、RIN-1タンパク質がガイダンス分子特異的に細胞内のRacの活性を制御することで、軸索伸長に必須な糸状仮足の形成を領域特異的に制御している事を示す最初の発見であり、現在論文投稿中である。
敗血症性脳症に対する新規脳保護法確立への試み

プロポフォールは投与量によりミトコンドリア膜透過性亢進の誘発及び呼吸鎖に影響を認めた。ミトコンドリアの細胞死、呼吸鎖の停止を誘発する可能性が示唆された。それに比して、セボフルレン、ミダゾラム、デクスメデトミジンは投与量に関わらず影響を認めなかった。また、プロポフォール、セボフルラン、ミダゾラムはミトコンドリアのCa取り込み能を抑制させる一方で、デクスメデトミジンは、影響を認めなかった。敗血症性脳症の病態をミトコンドリアの観点からの解析を目指しているが、本研究結果は鎮静薬がせん妄などを呈する敗血症性脳症メカニズム解析の第一段階として、各種鎮静薬が脳ミトコンドリア機能に及ぼす関連結果を導いた。敗血症性脳症(Septic Encephalopathy:SE)の脳障害発症機序は特定されておらず、その標的分子も明らかではない。本研究では、SEによる脳障害の実態を明らかにするために、従来の神経細胞中心的の考えを基礎にしつつ、力点を敗血症に伴う脳機能障害に当て、従来の申請者らが解析してきた脳内ミトコンドリア機能に対して、酸素代謝およびCa2+代謝の観点から解析を遂行し、さらに新たな実験系であるmiRNAを導入し、新規脳保護法確立を目指す。本年は、敗血症性脳症誘発とMPTを介した脳内ミトコンドリア機能不全の連関解析を行った。敗血症性脳症モデルを用いて、24時間後に脳内ミトコンドリアのswellingの状況をCa2+overloadによって分析した。24時間後に、swellingもコントロールに比較して誘発されやすい状況であることが判明した。このことから、敗血症性脳症モデルに伴うミトコンドリアの膨化が、SEの病態形成に重要な役割を担っていることが明らかとなり、Ca代謝のさらなる解析をしていきたい。また、敗血症モデルへの麻酔薬の影響に対する脳内ミトコンドリア解析においては、デクスメデトミジンは正常ラットの脳ミトコンドリアの膨化を他麻酔薬(プロポフォール、ミダゾラム)に比べて、抑制することが示唆された。この結果を基盤にして、敗血症モデルに展開することで鎮静薬のSEに対する解明に今後展開をしていきたい。平成25年度の脳内ミトコンドリアCa2+取り込み能、ミトコンドリア膨化率の評価の結果をふまえて、麻酔薬のミトコンドリア呼吸鎖の評価を高感度ミトコンドリア酸素呼吸測定装置にてさらに詳細に評価した。ラットから脳ミトコンドリアを分離し、酸素消費量を測定した。ミトコンドリア呼吸鎖に作用する試薬を順次添加し、機能を解析することで鎮静薬の影響を検討した。結果として、ミダゾラム群、デクスメデトミジン群は高用量投与にもミトコンドリア呼吸鎖に影響を生じなかったが、プロポフォール群は濃度変化により有意に呼吸鎖を抑制した。高用量プロポフォールは、他鎮静薬と比較してもミトコンドリアの変化からミトコンドリア電子伝達系への関与が考えられた。この結果は日常に頻用されている鎮静薬プロポフォールは重症患者、特に脳疾患の使用においては警鐘を鳴らす結果であると示唆された。敗血症モデルでのミトコンドリア呼吸鎖の各鎮静薬の影響は、現時点では実験の途中段階ではあるが、上記の結果を敗血症の脳保護麻酔薬ミトコンドリアに焦点をおき、平成27年度は解析を加え、敗血症脳症患者への最善の麻酔薬使用に展開したい。本研究は、敗血症性脳症の解明のために脳組織のミトコンドリアを直接臓器より抽出し、ミトコンドリアに焦点を置いた組織呼吸点から解析することを目的としてきた。平成26年度の各鎮静薬の脳ミトコンドリアに与える影響をふまえて、更なる詳細なターゲットの影響を解析した。高用量プロポフォールでは、オリゴマイシン投与による酸素消費量の影響が強く、脳ミトコンドリア膜の透過性亢進が大きく関与することが示唆された。同様の実験系を肝ミトコンドリアで行ってみたが、脳と同様にオリゴマイシン投与が影響することを認めた。以前の報告で指摘されてきた呼吸鎖Complex1及びComplex2の障害は認めることはなかった。さらに、高用量ミダゾラム・デクスメデトミジンにおいては、呼吸鎖での好気的代謝経路の下流に位置する代謝経路の入力には悪影響を及ぼさないことを認めた。これは、両鎮静薬が呼吸鎖での主な反応である電子伝達とATP産生とは別の作用機序が関与していることを示唆している。以上の結果は正常ラットによるものではあるが、集中治療における鎮静薬使用の今後の参考になる結果が導かれたと考えている。敗血症モデルにおいては各鎮静薬の有意な影響の差は認めなかった。敗血症モデル作成の安定化も今後の課題であり、さらに各鎮静薬の濃度変化のより詳細な設定によって、新たなターゲットの解析ができる可能性があると考えられ、今後の実験の展開に期待したい。

敗血症性脳症の病態をミトコンドリアの観点からの解析を目指しているが、本研究結果は鎮静薬がせん妄などを呈する敗血症性脳症メカニズム解析の第一段階として、各種鎮静薬が脳ミトコンドリア機能に及ぼす関連結果を導いた。平成25年度に行った脳内ミトコンドリアCa2+取り込み能、ミトコンドリア膨化率の検討結果の鎮静薬の評価をさらに詳細に展開したために、平成26年度分の予定実験計画に遅れが生じた。また、敗血症モデルの安定化と新たな実験系である高感度ミトコンドリア酸素呼吸測定装置の確立に予定より時間を要した。麻酔・集中治療確立された敗血症モデルを使用し、高感度ミトコンドリア酸素呼吸測定装置において、麻酔薬ならびに様々な薬剤の細胞保護作用もしくは細胞障害作用を、ミトコンドリア呼吸鎖の機能の観点から検証することが可能となった。当初の実験計画に加えて、平成27年度はその実験系を使用することで、敗血症性脳症に対する敗血症モデルでのミトコンドリア呼吸鎖の各鎮静薬の影響を解析し、敗血症性脳症のメカニズムに新しい解釈を加えることができると考えられる。平成25年度は、(1)敗血症モデルの脳内ミトコンドリアCa2+取り込み能、ミトコンドリア膨化率の評価、(2)敗血症モデルの脳血流、呼吸能の評価を予定したが、平成26年度予定の敗血症モデルへの麻酔薬の影響に対する脳内ミトコンドリア解析を予定より早めて施行したため、(2)の実験遂行が遅れる形となった。また、SEモデル作成が安定するまでに予定より時間を要した。そのため、平成26年度においては(2)の研究課題を再度施行する予定である。実験計画がやや遅れていたために、予定していた国際学会及び国内学会の経費、論文作成の経費分の次年度使用額が生じた。(2)敗血症モデルの脳血流、呼吸能の評価においては、モデル作製12時間後、1、2日後にの凍結切片(25μm)を作製し、脳内及び脳血管における血管内皮細胞増殖因子(Vascular Endotherial Growth Factor:VEGF)発現の変動をTUNEL染色,HE染色ならびに免疫染色にて検討を行う。またレーザードップラー血流計を用い脳血流(測定位置を一定にする)を同じ解析時間に脳を取りだす前に測定する。(3)敗血症性脳症に存在するmiRNAの同定、エキソソーム/microvesicleの蛋白解析においては、敗血症モデルより血液を採取し、これらのmiRNAに関して、ショ糖密度勾配で遠心分離し、その後miRNAを単離し、Agilent社のマイクロアレイ法によって解析する。(4)敗血症モデルへの麻酔薬の影響に対する脳内ミトコンドリア解析においては、平成25年度は正常ラットの解析を行った。引き続き、敗血症脳症モデルにおいて酸素代謝を中心に脳ミトコンドリア解析を遂行したい。平成27年度の研究費は、物品費として、採血のための必要物品(シリンジ、採血針、採血用スピッツ等)、実験用器具(ガラス器具、手術器具等)、薬品(試薬薬品および研究器材・消耗品)の購入に充てる。また、旅費としては、予定している国際学会および国内学会での発表時のものとする。その他、印刷費等に使用する。使用予定額の人件費において、予想より支出が少なく、次年度使用額が生じた。次年度は実験計画の遅れからも、予想より物品費がかかると予想されるために、次年度使用額を使用したいと考えている。
低負荷施肥体系の確立を目標とした積雪地域の樹園地における窒素動態の解明

青森県内の灰色低地土のリンゴ園(青森県藤崎町)と褐色森林土のリンゴ園(青森県弘前市)および青森県内の黒ボク土のリンゴ園(青森県鶴田町)の各調査リンゴ園において、体積含水率・電気伝導率・地温を計測するための土壌センサーを任意の深度に埋設し、体積含水率・電気伝導率および地温の同時連続計測を3年間にわたり実施してきた。また、2016年6月より2週間に約1度の頻度で調査リンゴ園地に出向き、任意の深度から土壌間隙水を採取し、採水試料のpH、電気伝導率、無機態窒素濃度、各イオン種濃度を3年間にわたり定量してきた。さらに、調査リンゴ園地の各深度から採取した土壌試料を用いて、土壌理化学的性質を把握するための諸試験や、無機態窒素に関する吸着試験をバッチ法により行い、吸着等線を作成することで、土壌理化学性の特徴や固相ー液相における無機態窒素の吸着特性を把握した。このことを受け、灰色低地土・褐色森林土・黒ボク土の3種類の土壌型の調査対象リンゴ園地から溶脱する無機態窒素量を数値解析的に把握するための各種パラメータを整備できた。そして、融雪時期における硝酸態窒素の溶脱挙動に着眼し、体積含水率、間隙水電気伝導率および硝酸態窒素濃度の実測値を用いることにより、改良した樹園地土壌の物質移動に関する数理モデルの検証に成功した。本研究の特色は、リンゴの休眠期間の積雪時期においても土壌間隙水の化学組成分析やフィールドモニタリングシステムを用いた土壌環境観測を実施しているところにある。土壌センサーを用いた電気伝導率等の諸観測と各種陰陽イオン濃度定量結果から、融雪期間中において短期間のうちに各イオン種が一挙に溶脱することが明らかになった。以上のことから、多雪地域では溶脱の観点で秋肥施用の意義が非常に小さく、環境に対する負にインパクトの方が大きいという、低負荷施肥体系を確立する上で重要な知見を見出すことができた。青森県内の灰色低地土のリンゴ園(青森県藤崎町)と褐色森林土のリンゴ園(青森県弘前市)において土壌断面調査を行い、深度10, 30, 50, 70, 90, 100 cmより攪乱土と不撹乱土壌を採取すると同時に、土壌間隙水を採水するための採水管を埋設した。採取した土壌試料の透水性・保水性・粒度等の土壌物理性を測定することで、リンゴ園における土壌物理性の鉛直プロファイルを作成した。また、土壌中の無機態窒素含量、交換性陽イオン含量、陽イオン交換容量およびリン酸吸収係数等の土壌化学性も測定し、物理性と同様の鉛直プロファイルを作成することで傾向を把握した。さらに、各深度から採取した土壌試料を用いて、無機態窒素に関する吸着試験をバッチ法により行い、吸着等線を作成することで、固相ー液相における無機態窒素の吸着特性を把握した。これらの検討を行うことにより、リンゴ園土壌における無機態窒素の溶脱量を算定するための数値解析に使用する各種パラメータを整備することができた。両圃場において、体積含水率・電気伝導率・地温を計測するための土壌センサー(5TE, DECAGON)を任意の深度に埋設し、体積含水率・電気伝導率および地温の同時連続計測を行っている状況にある。なお、土壌センサーによる体積含水率および電気伝導率は、現地で採取した試料を用いて校正済みである。積雪深が1mを超える冬期において、一時的に諸量を測定できないトラブルに見舞われたものの、ほぼ全期間の土壌環境観測データを得ることができたため、土壌間隙水の水質測定結果と数値解析結果との整合性を検証するための検討材料を確保することができた。研究1年目に計画していた検討事項を確実に遂行できたため、上記の区分のように判断した。したがって、研究2年目も引き続き本研究計画に沿った形で検討する予定である。併せて論文・報文の執筆準備を進めている状況にある。青森県内の黒ボク土のリンゴ園地(青森県鶴田町)の深度4, 8, 16, 32, 64, 100cmの6深度(採水管埋設深度)から撹乱土を採取し、陽イオン交換容量およびリン酸吸収係数の土壌化学性を把握した。また、前年度より、当リンゴ園地の採水管埋設深度における体積含水率・バルク電気伝導率・地温を土壌センサー(5TE, DECAGON)により観測するとともに、隔週で当該深度より土壌間隙水を採取し、各種陰陽イオンの濃度をイオンクロマトグラフ法により定量した。今年度は、特に、融雪時期における硝酸態窒素の溶脱挙動に着眼し、体積含水率、間隙水電気伝導率および硝酸態窒素濃度の実測値を用いることにより、改良した数理モデルの検証を行った。土壌センサーを用いた電気伝導率等の諸観測と各種陰陽イオン濃度定量結果からは、融雪期間中において短期間のうちに各イオン種が一挙に溶脱することが明らかになった。

また、数理モデルの検証結果からは、土壌間隙水の硝酸態窒素濃度の実測値と計算値が非常に良く一致し、融雪期間中の硝酸態窒素の溶脱挙動を精度良く推定することができた。研究2年目において、黒ボク土リンゴ園の窒素溶脱に関する数理モデルの検証が完了したことと、積雪および融雪を勘案した灰色低地土リンゴ園の窒素溶脱に関する基本的な検討課題が解決されたため、上記のように判断した。青森県内の灰色低地土のリンゴ園(青森県藤崎町)と褐色森林土のリンゴ園(青森県弘前市)および青森県内の黒ボク土のリンゴ園(青森県鶴田町)の各調査リンゴ園において、体積含水率・電気伝導率・地温を計測するための土壌センサーを任意の深度に埋設し、体積含水率・電気伝導率および地温の同時連続計測を3年間にわたり実施してきた。また、2016年6月より2週間に約1度の頻度で調査リンゴ園地に出向き、任意の深度から土壌間隙水を採取し、採水試料のpH、電気伝導率、無機態窒素濃度、各イオン種濃度を3年間にわたり定量してきた。さらに、調査リンゴ園地の各深度から採取した土壌試料を用いて、土壌理化学的性質を把握するための諸試験や、無機態窒素に関する吸着試験をバッチ法により行い、吸着等線を作成することで、土壌理化学性の特徴や固相ー液相における無機態窒素の吸着特性を把握した。このことを受け、灰色低地土・褐色森林土・黒ボク土の3種類の土壌型の調査対象リンゴ園地から溶脱する無機態窒素量を数値解析的に把握するための各種パラメータを整備できた。そして、融雪時期における硝酸態窒素の溶脱挙動に着眼し、体積含水率、間隙水電気伝導率および硝酸態窒素濃度の実測値を用いることにより、改良した樹園地土壌の物質移動に関する数理モデルの検証に成功した。本研究の特色は、リンゴの休眠期間の積雪時期においても土壌間隙水の化学組成分析やフィールドモニタリングシステムを用いた土壌環境観測を実施しているところにある。土壌センサーを用いた電気伝導率等の諸観測と各種陰陽イオン濃度定量結果から、融雪期間中において短期間のうちに各イオン種が一挙に溶脱することが明らかになった。以上のことから、多雪地域では溶脱の観点で秋肥施用の意義が非常に小さく、環境に対する負にインパクトの方が大きいという、低負荷施肥体系を確立する上で重要な知見を見出すことができた。本研究を進めていく上での準備(土壌調査・計器類の設置・土壌理化学性の測定等)は研究初年度の10月末までに完了し、現在は約12週間に1回の頻度でリンゴ園土壌の間隙水を採水(冬期間においては積雪も採取)し、試料のpH、電気伝導率、無機態窒素濃度、各イオン種濃度の定量を継続している。採水試料の分析の結果、施肥・無施肥条件における間隙水窒素濃度の差異が確実に現れていることから、今後は硝化・脱窒・根による吸収等の現象を含めたリンゴ園における物質収支を解析する予定である。本研究を推進する準備(土壌調査・計器類の設置・土壌理化学性の測定等)や基本的な検討(数理モデルの改良・検証)が完了した。前年度から引き続き約12週間に1回の頻度で、積雪期間も含めてリンゴ園地の土壌間隙水を採取し、試料のpH、電気伝導率、無機態窒素濃度、各イオン種濃度の定量を継続している。採水試料の分析の結果を受けて、施肥・無施肥条件における土壌間隙水の各イオン種濃度に明らかな違いが見られること、施肥した肥料の種類や降水パターンの相違によって土壌間隙水中の無機態窒素濃度に差異が認められたことを受け、今後も引き続き、硝化・脱窒・根による吸収等の現象を含めたリンゴ園地における物質収支を把握する。リンゴ園
体細胞クローンの分化のレパートリー

1.組織細胞クローンの分化能、分化転換については、両生類淋巴芽細胞及び色素胞、哺乳類及び鳥類松果体細胞、哺乳類副腎髄質細胞などのほか、とりわけニワトリ胚色素上皮細胞で研究が進展した。前年までに水晶体細胞で特異的に発現されるδ-クリスタリン遺伝子の分化転換過程における転写様式が明らかにされたが、色素上皮細胞に特異的なメラノソーム構成蛋白質遺伝子のクローン化にも成功し、色素上皮細胞の分化転換過程におけるこの遺伝子の発現様式についても重要な知見が得られた。また、分化転換を調節する細胞環境因子について、培養液に添加することで色素上皮細胞の脱分化と分化転換とを格段に促進するヒアルロニダーゼの分析から、この酵素のフラクションに有望な調節因子の含まれていることが示唆された。一方、同細胞の多能的脱分化状態においては、2種の細胞膜糖蛋白質が特異的に発現することも明らかにされ、少くとも色素上皮細胞の分化転換についてはその調節機構の分子的基礎が確立された。また、一定の細胞組成を以って構築される組織において、異種細胞相互間の分化転換がその組織の細胞組成を一定化するという重要な発見が細胞性粘菌の子実体形成の解析を通じてなされた。2.多細胞体制の形成機構の研究にきわめて有用な実験系として、上記の各細胞種の分化転換系のほかに、両生類のキメラ個体による解析が進み、初期胚細胞の発生能と細胞系譜を明らかにするためのシステムが完成した。また、鳥類胚について細胞分化とカップルしない形態形成を成立させる有効な器官培養実験系が完成した。3.高等植物については、タバコ不定胚による個体形成誘導の過程とその調節機構の概要が明らかにされると共に、植物細胞の特異的産物を多量に生産させるためのプロトプラスト融合体培養による技術開発が進められ、応用への基礎が確立された。