hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
過疎地域における高齢者の食生活に関する実証的研究

本研究の目的は、高齢者が独りであるいは高齢者のみで生活するのが厳しい、北海道の過疎地域での生活実態を把握することであった。調査地として最も人口規模の小さい北海道上川管内音威子府村とその近隣中核都市である名寄市の二つの市村を選択した。名寄市の調査は64人を対象に1999年7月8月に行い、音威子府村ではすべての高齢者のみ世帯を対象に(157名)、2000年7月9月に行った。調査は訪問聞き取りで、食生活を中心に生活全般について質問している。まず、社会的な生活手段の充足についてみると、医療の選択肢が少なく、通院が著しく不便、住宅もバリアが多い、商店の品揃えが少ないなど想像以上に不十分である。しかし、ここを住み良くするために、高齢者自身が主体的に近所と仲良く、助け合っていこうとしている。また、食事や健康に気をつけて、自立した生活を保つ努力もしている。食生活は、ほとんどの人が、規則的に食事をしている。和食中心で、ごはん、みそ汁、焼き魚、漬け物が典型的で、変化が少ないが、ほとんどが手づくりである。家庭菜園をやっているので新鮮な野菜が使われている。但し、塩分摂取が多いことが問題ではある。健康状態は約80%の高齢者に持病があり、健康な人でも、疲れやすい、足腰が痛いなどの訴えがある。症状が悪い人ほど遠くの大病院に通院しなければならない。このことは高齢者の定住にとって大きな障害になっている。音威子府村は過疎地に住む高齢者の生活条件の厳しさの典型である。早急な対策が望まれる。過疎地域は、高齢化が急速に進行しているにもかかわらず、保健医療施設や福祉サービス、道路や商店などの生活条件は厳しい。高齢者が独立して生活する時に日々の食生活の質がどのように保たれているかは、暮らしやすさの度合を測る尺度となる。この生活状況を見るために食生活を中心に調査を行った。今年度は、過疎地域に囲まれた人口28,000人の名寄市の高齢者世帯46世帯を、老人クラブに所属し高齢者のみの独立した世帯で公的な援助を受けていない層(A)と社会福祉協議会のヘルパーの援助を部分的に受けている層(B)に分けて聞き取り調査を行った。A層は、健康状態は万全ではなくても地域で友人や趣味をもち、戸外で積極的に活動している高齢者たちである。一方、B層は、健康状態がかなり悪化して買い物にも不自由している。A層は食生活にも意欲を見せ、規則的で若者よりもかなり質の高い日本的食生活を送っている例が多い。それに対して、B層は食生活にかなりの問題が散見された。同じ高齢者と言っても、両層の二極分解が見られる。小さな街の利点として、家庭菜園をほとんどの世帯がもち、趣味と実益を兼ねて楽しんでいるが、少数ながら「菜園の管理が苦痛である」という女性(妻)もいる。いずれの層においても、買い物の不便さ、道の歩きにくさなど生活上の苦情や要望等があったが、生活費増額の要求は少なかった。一部で配食サービスへの期待は大きい。来年度以降は、さらに過疎化が進み、交通不便な周辺自治体での聞き取り調査を行う予定である。今後は配食サービスに焦点をあてた調査、さらに、高齢者特有の消費者問題(健康食品の無料サービスを行い、高価な布団などの商品を販売するなどの新たな生活問題の事例)にも焦点をあてていきたい。本年度は、さらに過疎化が進行している地域で、在宅高齢者の比率の高い音威子府村において、65歳以上の高齢者のみで構成されている世帯(110戸)の悉皆調査を行った。音威子府村は、人口1,334人(2000年12月現在)の北海道で最も人口規模の小さい村のひとつである。

農業主体の山村で、ほとんどの高齢者世帯は在宅である。村の高齢者生活福祉センター(施設の一部が夫婦あるいは単身高齢者の居住区になっている)を始め、公営住宅の入居、村が遠隔地で農業をやっていた人のために用意した土地など、居住条件は都市部よりも恵まれている面もある。また、交通が不便なので、自立している在宅高齢者の通院介護のためのヘルパー派遣などを村独自で行っている。調査は食生活を中心に、健康で自律的なリズムをもった生活が送れているか、家族や近所の人との関わり方はどうか、日常生活で困難なことや楽しみは何か、生活環境にどんな要望があるのかなど、訪問して聞き取りをした(94世帯、147人の協力が得られた)。概述すると、食生活は全体的に塩分が多め、変化は少ないが昔ながらの手づくりの和食で、ほとんどが食事を中心にして生活のリズムを規則正しく作っている。しかし、独り暮らしの数人については、食事の不規則さから生活のリズムが失われ、次第に人ともつき合わなくなって、アルコール漬けにまで進んでいるケースもある。健康状態は深刻な病気や慢性的病気に悩んでいる人が85%で、必要な水準と現実の医療水準とは乖離している。将来の健康状態と生活についての不安も大きい。しかし、生活環境や生活条件に対する関心は高く、生活向上志向を失っていない高齢者が多いことは、よく馴染んだ地域で在宅で生活できていることと深く関連していると思われる。本研究の目的は、高齢者が独りであるいは高齢者のみで生活するのが厳しい、北海道の過疎地域での生活実態を把握することであった。調査地として最も人口規模の小さい北海道上川管内音威子府村とその近隣中核都市である名寄市の二つの市村を選択した。名寄市の調査は64人を対象に1999年7月8月に行い、音威子府村ではすべての高齢者のみ世帯を対象に(157名)、2000年7月9月に行った。調査は訪問聞き取りで、食生活を中心に生活全般について質問している。まず、社会的な生活手段の充足についてみると、医療の選択肢が少なく、通院が著しく不便、住宅もバリアが多い、商店の品揃えが少ないなど想像以上に不十分である。しかし、ここを住み良くするために、高齢者自身が主体的に近所と仲良く、助け合っていこうとしている。また、食事や健康に気をつけて、自立した生活を保つ努力もしている。食生活は、ほとんどの人が、規則的に食事をしている。和食中心で、ごはん、みそ汁、焼き魚、漬け物が典型的で、変化が少ないが、ほとんどが手づくりである。家庭菜園をやっているので新鮮な野菜が使われている。但し、塩分摂取が多いことが問題ではある。健康状態は約80%の高齢者に持病があり、健康な人でも、疲れやすい、足腰が痛いなどの訴えがある。症状が悪い人ほど遠くの大病院に通院しなければならない。このことは高齢者の定住にとって大きな障害になっている。音威子府村は過疎地に住む高齢者の生活条件の厳しさの典型である。早急な対策が望まれる。
智歯歯胚からの組織幹細胞の樹立と分化・増殖能の評価

研究計画に従い、以下の成果を得た。岐阜大学医学部附属病院・歯科口腔外科を受診し智歯抜歯を行い、倫理審査委員会の指針に従って研究協力の同意の得られた方の抜歯後の材料より130ラインの組織幹細胞培養株を樹立し解析を行った。・増殖能の評価得られた歯胚細胞株を用いて、智歯の形成状態(歯冠完成期・歯根形成期・歯根完成期)に分けて増殖能を比較した所、培養開始30daysまでは各段階の細胞増殖に差は認められなかったが、それ以降観察した100daysまでの間で最も幼若と考えられる歯冠完成期のものの増殖が良好に維持されるのに比べ、歯根形成期、歯根完成期のものでは順になだらかな低下が観察された。・分化能の評価研究計画に従い、本年度は以下の成果を得た。「組織幹細胞株の樹立」岐阜大学医学部附属病院・歯科口腔外科を受診した者のうち、歯列不正改善などのため智歯抜歯が必要で、かつ、その歯が未完成である患者(歯胚を有する者)を対象とし、倫理審査委員会の指針に従って研究協力の同意の得られた方の通常抜歯後の材料より歯嚢および歯胚を採取し100ラインの培養株を樹立し、今後の解析試料を得た。「樹立細胞の分化・増殖能の評価」・増殖能の評価(歯の形成状態と増殖能の対比)得られた歯胚細胞株30系を用いて、それをオルソパントモ写真で観察される智歯の形成状態・分化能の評価分離・培養された細胞のプロフィールを明らかとするために、DNAアレイにて解析した所、BMP-2 mRNAの異常な高発現とPDGFの高い発現が観察された(その他20程の高いmRNAの発現が観察され、今後RT-PCRでの解析を行いプロフィール観察のための有望な候補遺伝子を得た)。また、骨誘導培地にて分化誘導を行った所、継代により分化能が低下したが、これにBMP-2を添加して継代すると高い分化能を維持することが示された。今年度は、細胞株の樹立と骨への誘導能のみの解析に終始したため、神経・脂肪等他の細胞への分化能の解析が出来なかった。このため、次年度はこれらを含めた包括的な分化能の評価を早急に行う予定とした。・分化能の評価
経典目録よりみた古代国家の宗教編成策に関する多面的研究

8-10世紀の経典目録群を類別・整理し、データベースを作成した。それをふまえ古代国家の仏教を軸とした宗教編成策を教学面・組織面より検討した。その結果、当該期に東アジア諸国から将来された知的財産たる経典群の管理方法と書写・流布の特徴を概括的に示すことができた。そのうえで8世紀の南都六宗から10世紀初頭の諸宗への推移を詳細に解明した。なお目録群のデータはWEB上に限定公開した。1今年度は、9世紀の経典目録群の記載内容の電子データ化を実施した。ただし正倉院文書中の目録断簡の復原・データ化はあまり進展させることができず、次年度以降の課題とした。2学会での研究報告を2回行った。(1)7世紀の朝鮮半島諸国-倭国間の対等的外交関係と、関係定立の背景となる僧侶同士の「師友」関係が存在したことを指摘。2011年度中に『歴史科学』に掲載予定。(2)2011年5月開催予定の歴史学研究会大会古代史部会報告の準備報告で、東アジア全域での仏教の受容の特質の解明をめざした。(1)(2)ともに経典目録に記載されている経典類請来とその学習の背景にある、東アジアでの僧侶集団の共同組織の実態について教学面を含めて解明するもめで、その意義は大きい。3論文(共著)を1本公表し、寺院における経典群を含む資財管理のあり方の日唐比較を行い、東アジア世界での仏教受容の偏差を浮き彫りにした。1.今年度は、経典目録類の検討をふまえ、それを学会発表・論文として公表することに注力した。この点では大きな成果があがったが、反面、経典目録のデータベース化作業・web上への公表へ向けた作業は、充分には進展させることができなかった。よってこの点は、最終年度の課題となる。2.全国規模での学会で大会報告を行った。すなわち、歴史学研究会大会の古代史部会にて口頭発表を行った。前近代の人間集団の政治的凝集に、世界宗教が果たした役割について、古代の仏教を事例として東アジア規模で考えた。その課程で、当初は充分に展望できていなかった、東アジア的規模での仏教的<政治-宗教>関係の広がりを「都」と「山」の集積・総和として把握するという視座や、外典の流布と仏教との関係、さらには前近代における宗教を介した遠隔地交易のしめる比重の高さについての大枠的な見通しことができた点は、大きな収穫であった。3.論文を2本公表した。一つは上記の歴史学研究会大会古代史部会報告を活字化したものである。東アジアでの仏教を軸とした<政治-宗教>関係の形成と広がりや、日本を含む各地域ごとの受容形態の偏差について考えた。もう1点は、昨年度の学会発表をもとに活字化したもの。7世紀の朝鮮半島諸国と倭国との対等的外交関係の定立の背景に東アジアでの僧侶同士の「師友」関係が存在したことを指摘した。いずれも経典目録群に記された経典類の請来とその修学の背景にある東アジア規模での僧侶集団の共同組織の実態を政治関係や教学面を含めて解明するもので、その意義は大きいと考える。最終総括年度である本年度は、前年度から継続していた810世紀の経典目録群の分類・整理・データ入力をさらに進めた。またそれらをふまえた総括研究を進め、I研究の成果(概要)・II論考編・IIIデータ編からなる研究成果報告書をまとめることが出来た。報告書では、研究代表者が、1当該期の寺院・僧侶の所蔵する経典類の管理とその国家的捕捉の大枠を俯瞰する論考と、2南都六宗の作成した「布施勘定帳」と10世紀初頭の「五宗録」とを比較検討し、国家主導で整備された学僧組織たる六宗が、平安期の自律性を有した諸宗へと変容していく過程やその教学的特徴の推移を明らかにした論考を提示した。また研究分担者の遠藤慶太は、漢籍および仏典の、資財としての管理の特質を示す論考をまとめた。さらに、研究分担者の後藤真は、IIIデータ編に収録された目録群の諸データを活用しそれをWEB上に公開するために、SOMODA(正倉院文書データベース)に替わる新たなデジタルアーカイブ手法(正倉院文書トピックマップ)の構築に取り組み、その意義・方法・課題を提示する論考をまとめた。なお、IIIデータ編収録のデジタルデータについては、後藤が主導して試験的・限定的にWEB上に公開することが出来た。以上の結果、経典目録群の検討から古代国家の仏教を軸とした宗教教学編成策の大枠的推移を明らかにするという当初の目的はおおむね達成できた。また経典目録群の内容データのWEB上の公開という目標も、部分的・試行段階ではあるが一応成し遂げた。ただし目録群の整理作業とその公開はまだその途上である。

また本研究の成果を踏まえると、古代中世の知識・思想的リソースとその系譜・国際的環境の大枠的把握と、その成果の学会での共有のために、当該期の史料にみえる目録・書籍群の悉皆的調査とそのデジタルアーカイブ化の必要性が、さらなる課題として浮かび上がってきた。この間の研究を通して、古代国家の宗教編成策について考えるという当初の目的を越えて、国家に凝集しきれない前近代の人間の宗教を介した政治的諸関係の実態について、東アジア規模の見通しを得るという大きな成果をあげることができた。しかしながら、経典目録群・正倉院文書の目録の復原やデータベース化、およびその公開作業についてはやや遅れており、全体的として評価した場合、(2)に落ち着くと考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。やや遅れている、経典目録群とりわけ正倉院文書に関するデータ整理と公表について、研究分担者とも密に相談しつつ精力的に進める。同時に、これまでの成果や最終年度の研究成果をもとに、研究成果報告書を作成し、広く学会に公表していく。
東北地方の地域経済悪化による雇用構造の変化と新規高校卒者の就業動向に関する研究

本研究は、東北地域で問題化している地域経済の後退に伴う雇用構造の大幅な変化との関連で、新規高校卒業者の就業動向の実状について統計的かつ個別的な事例調査手法による全体的な解明に取り組んだ。東北経済の後退は若年世代の労働市場を狭隘化させ、新規高校卒業者の就職に大きな制約を与え、さらに彼らの就業にも深刻な問題をもたらしている。特に、新規高卒就職者の多くは製造業、卸小売業、サービス業など単純労働に従事し、しかも労働条件も低下を期待し、地域労働市場の底辺に置かれている。このことは、若年世代の仕事および職場への定着を妨げる大きな要因となり、その解決が急がれる。一方、東北地域で就職志望する高校生を対象としたアンケート調査(今回は、宮城県11高校、約800名)からも、彼らの就職に対する不安が窺える。特に、職場の仕事への対応、人間関係への順応をめぐる不安が高くなっている。しかし、安定した職場への就職、仕事の継続などに対する願望は強くみられる点からも、就職に向けた高校での進路指導、たとえば働くことの社会的意義、事観の形成などをめぐる計画的、体系的な教育的指導法、カリキュラムの編成が改めて重要になってくる。さらには行政機関、企業はじめ地域全体として働く意欲をもつ若年世代の就業機会、安定した就業状況の構築に取り組むことが求められる。同時に、若年世代の安定した持続的な就業は地域経済とともに地域社会の発展に貢献するという観点からも急務な課題である。1.総じて、東北地方の新規高校卒者の就職状況は、採用内定者率という点からみるならば、改善に向っている。しかし、東北の南3県(福島、山形、宮城)での内定者率は北3県(秋田、岩手、青森)に比べて高く、地域間格差が明確にみられる。また、前者で地元就職者が多数を占めているのに対し、後者では県外就職者が以前よりも増加傾向にある。地元における就業機会の多寡が東北地方を南北に分断する形で形成されている。2.採用内定者率は上昇傾向にあるが、職種に関してはサービス業、事業所規模では中小規模に集中する傾向を強めている。高校卒者は一段と単純労働者化し、地域サービス業を低賃金で支える役割を担う状況にある。こうした就業状況が新規高校卒就業者の離職を促す大きな要因となっている。離職者率は依然として高いが彼らの再就職の機会は制約され、地域で不労者として滞留する問題が深刻化している。3.したがって、東北地方において特に北3県を中心に、新規高校卒者の就職問題は深化する低賃金・単純労働者化、それに伴う離職者率の上昇、そして地域不労者としての滞留という若年世代に間に形成されつつある構造にどのように対応していくかにある。4.各県労働局、職業公共安定所さらに各県行政機関などが状況把握しながら、新たな対応策の構築に取り組んでいる。高校による進路指導の範囲を超えた、地域および地方全体にとって積極的な取り組みが求められる、若年世代の新たな就業問題として位置づけられる。継続的な職業教育・訓練システムの構築と若年世代の参加機会の拡大をいかに確立していくかは、その一つの課題として改めて指摘できる。5.アジアの若者世代をめぐる多様な課題について、研究成果の交流機会を韓国でもち、相互理解とともに共同研究に向けたネットワークを設けることができた。平成19年度の調査活動は、高校卒新規就業者に関する状況把握を各県労働局、教育委員会、職業安定所などを訪問し、担当者からの説明および関連資料の収集に努めた。また、高校を訪問し、進路就職指導教員より卒業生の就職状況、学校として行った教育的就職指導の内容と成果、近年の就職をめぐる雇用者側の要望や条件、それらに対する就職志望高校生の受け止め方などをインタビューによって把握に努めた。全般的な傾向として、近年は高校卒者に対する雇用動向も改善に向かい、就職内定率も上向傾向にあると言われる。しかし、県内企業からの求人件数および求人数は横ばい状況にある点から、高校卒後に地元での就職を希望する生徒にとっては以前と同様に厳しい環境にある。

工業高校および地元に就業機会が絶対的に限られている高校においては、就職志願高校生は関東圏はじめ県外への就職は逆に改善に向っている。もう1つの調査活動は、就職志願高校生を対象にしたアンケート調査の実施である。就職志願高校生は、いつ就職を進路して決めたのか、就職を決めた理由、働くことの目的、仕事観、就職活動をめぐる諸問題、働くことへの期待と不安などを内容としたアンケート調査票を作成し、宮城県内にある工業、商業、農業そして普通高校あわせて9高校を抽出し、調査を実施した。800名からの回答調査内容を分析し、高校生の就職観の傾向的な把握を行った。多くの高校生は、就職にあたり堅実かつ意欲的な考えをもちながら就職活動に取り組み、一般にいわれているような仕事からの離脱や無規則的な仕事への従事などを求める傾向はきわめて少ない。同時に、就職後の職場での人間関係や仕事をめぐる指導、助言のありかたに不安を抱えている点からも、高校での就職に関する教育的指導内容および企業はじめ事業所、行政機関などへの理解と協力などが課題として指摘できる。
2型糖尿病感受性レジスチン遺伝子プロモーター特異的転写活性化因子の同定

本計画の目的は、2型糖尿病感受性を高めるレジスチンSNP-420にGを有するプロモーターにおいて、特異的な転写活性化因子を同定し、新たなインスリン抵抗性改善薬の標的を見出すことである。2型糖尿病感受性レジスチンプロモーター活性化DNAエレメント及び結合転写因子の同定を目指して、主としてレジスチンプロモーター活性及びmRNAについての各分子の効果を検討した。種々の長さのレジスチンの5' flanking領域について、SNP-420がCとGを有する2種ずつのレポーターを作成した。これらをヒト単球培養細胞のTHP-1に導入し、レジスチンの5' flanking領域がプロモーター活性を有することを確認した。一方、インスリンやLPSなどの分子が内因性レジスチンmRNAに及ぼす効果をRT-PCRで検討した。その結果、レジスチンmRNAを増減させる分子を複数見出し、いずれも用量依存性、時間依存性を確認した。一方、-450bまでを含むレポーターを用いて、上記の分子のプロモーター活性への効果を検討したが、明らかな影響を認めなかった。ELISAにより、培養上清へのレジスチン分泌をヒト単球においては検出したが、培養細胞では困難であった。培養細胞でのWesternでもレジスチン蛋白は検出できなかった。以上より、レジスチンの発現は、mRNAにより最も感度よく解析可能であった。一方、健常人より単離した単球のレジスチンmRNAは、採血時の血中レジスチン濃度と正に相関し、SNP-420遺伝子型がG/G>C/G>C/Cの順に高かつた。また、2型糖尿病患者において、糖尿病合併症が進行すると血中レジスチン膿度が高くなることを見出した。このことは、レジスチン発現抑制薬が、2型糖尿病発症のみならず合併症進展の抑制をもたらす可能性を示唆する。今後更にレジスチンの転写調節機構の解析を続ける必要があると考えられる。本計画の目的は、申請者らが同定した2型糖尿病感受性を高めるレジスチンSNP-420にGを有するプロモーター環境において、特異的に転写を活性化する因子を同定し、感受性SNP特異的に作用する新たなインスリン抵抗性改善薬の標的を見出すことである。実験は、1)2型糖尿病感受性レジスチンプロモーター活性化DNAエレメント及び結合転写因子の同定、2)2型糖尿病感受性DNA配列認識因子"Sp1/3"結合蛋白の同定、3)同定した転写・共役因子の機能解析の3つに沿って進める予定である。本年度は主に1)について、トランスフェクションによるレジスチンプロモーター活性及びに内因性レジスチンmRNAについて検討した。特にヒトの主要発現部位である単球を実験系として用いた。SNP-420にGを有するレジスチン遺伝子プロモーターの転写活性化に重要なDNAエレメントを同定をする目的で、?種類の5' flanking領域を有するレジスチンプロモーターをSNP-420にCを有するものとGを有するものの2種類ずつをPCRで増幅し、ルシフェラーゼレポーターに導入した。シークエンスにより塩基配列を確認し、種類のレポーターを作成した。単球培養細胞であるTHP-1にトランスフェクションする条件を検討し、レジスチンの5' flanking領域がプロモーター活性を有することを確認した。-420に近い-450までを含むコンストラクトを用いて、インスリンやLPSのプロモーター活性への効果を検討した。並行して、これらの刺激が内因性のレジスチンmRNAに及ぼす効果を検討した。一方、健常人の単球においては、レジスチン血中濃度とレジスチンのmRNAが正に相関することを見出した。

さらに、SNP-420が、G/G>C/G>C/Cの順にレジスチンのmRNAが高くなっていることを証明した。本計画の目的は、2型糖尿病感受性を高めるレジスチンSNP-420にGを有するプロモーターにおいて、特異的な転写活性化因子を同定し、新たなインスリン抵抗性改善薬の標的を見出すことである。2型糖尿病感受性レジスチンプロモーター活性化DNAエレメント及び結合転写因子の同定を目指して、主としてレジスチンプロモーター活性及びmRNAについての各分子の効果を検討した。種々の長さのレジスチンの5' flanking領域について、SNP-420がCとGを有する2種ずつのレポーターを作成した。これらをヒト単球培養細胞のTHP-1に導入し、レジスチンの5' flanking領域がプロモーター活性を有することを確認した。一方、インスリンやLPSなどの分子が内因性レジスチンmRNAに及ぼす効果をRT-PCRで検討した。その結果、レジスチンmRNAを増減させる分子を複数見出し、いずれも用量依存性、時間依存性を確認した。一方、-450bまでを含むレポーターを用いて、上記の分子のプロモーター活性への効果を検討したが、明らかな影響を認めなかった。ELISAにより、培養上清へのレジスチン分泌をヒト単球においては検出したが、培養細胞では困難であった。培養細胞でのWesternでもレジスチン蛋白は検出できなかった。以上より、レジスチンの発現は、mRNAにより最も感度よく解析可能であった。一方、2型糖尿病患者において、糖尿病合併症が進行すると血中レジスチン濃度が高くなることを見出した。このことは、レジスチン発現抑制薬が、2型糖尿病発症のみならず合併症進展の抑制をもたらす可能性を示唆する。今後更にレジスチンの転写調節機構の解析を続ける必要があると考えられる。
トレシルクロリドを利用した生理活性物質固定化チタンの開発

本研究では,まず,歯科用チタンインプラントの骨適合性および上皮付着性向上のために,チタンインプラント表面に細胞接着タンパク質を固定化する手法を確立することを目的とした.その結果,トレシルクロリド(CF_3CH_2SO_2Cl)でチタン表面の塩基性水酸基を活性化させることによって,細胞接着タンパク質が簡便に固定化されることを見出した.また,タンパク質の固定化にチタンの酸化状態の違いはほとんど影響しないことも判明した.トレシルクロリドによるチタン表面の塩基性水酸基の活性化およびタンパク質の固定化は赤外分光分析,X線光電子分光分析などの表面分析法によって確認した.また,水晶発振子マイクロバランス法によってフィブロネクチンの吸着を定量的に評価したところ,トレシルクロリド処理によってフィブロネクチンの吸着量が有意に増加しており,トレシルクロリド法がチタンへのタンパク質固定化に有効であることが判明した.また,半経験的分子起動計算からトレシルクロリド処理がフロンティア軌道エネルギーに影響することも示唆された.トレシルクロリド法で接着タンパク質を固定化したチタン上でのヒト歯肉由来線維芽細胞の初期付着について検討したところ,細胞接着タンパク質であるコラーゲン固定化チタンでは付着細胞数が有意に向上することを見出した.以上,トレシルクロリド法はチタン表面への細胞接着タンパク質固定化法として非常に有効であり,歯科用チタンインプラントの新規な表面改質法として今後有望であることが明らかとなった.本研究では,まず,歯科用チタンインプラントの骨適合性および上皮付着性向上のために,チタンインプラント表面に細胞接着タンパク質を固定化する手法を確立することを目的とした.その結果,トレシルクロリド(CF_3CH_2SO_2Cl)でチタン表面の塩基性水酸基を活性化させることによって,細胞接着タンパク質が簡便に固定化されることを見出した.また,タンパク質の固定化にチタンの酸化状態の違いはほとんど影響しないことも判明した.トレシルクロリドによるチタン表面の塩基性水酸基の活性化およびタンパク質の固定化は赤外分光分析,X線光電子分光分析などの表面分析法によって確認した.また,水晶発振子マイクロバランス法によってフィブロネクチンの吸着を定量的に評価したところ,トレシルクロリド処理によってフィブロネクチンの吸着量が有意に増加しており,トレシルクロリド法がチタンへのタンパク質固定化に有効であることが判明した.また,半経験的分子起動計算からトレシルクロリド処理がフロンティア軌道エネルギーに影響することも示唆された.トレシルクロリド法で接着タンパク質を固定化したチタン上でのヒト歯肉由来線維芽細胞の初期付着について検討したところ,細胞接着タンパク質であるコラーゲン固定化チタンでは付着細胞数が有意に向上することを見出した.以上,トレシルクロリド法はチタン表面への細胞接着タンパク質固定化法として非常に有効であり,歯科用チタンインプラントの新規な表面改質法として今後有望であることが明らかとなった.本研究では、歯科用チタンインプラントの骨適合性および上皮付着性向上のために、チタンインプラント表面に細胞接着タンパク質を固定化する手法を確立する。すなわち、チタン表面の酸化状態およびトレシルクロリドとの反応温度の違いが、トレシルクロリドとチタンとの反応およびトレシル化チタンとタンパク質とのカップリング反応に与える影響についてX線光電子分光(XPS)を用いて検討した。チタン表面は、鏡面研磨、鏡面研磨後H_2O_2/リン酸緩衝液(PBS)処理、および鏡面研磨後H_2O_2/NaOH混合水溶液処理の3条件とした。これらのチタン表面とトレシルクロリドとの反応を37°Cまたは70°Cで2日間行った。XPSにてトレシルクロリドのF1原子の強度を測定することによって反応性を比較したところ、いずれの処理でも37°Cで反応させた場合が、70°Cで反応させた場合よりもトレシルクロリドとの反応性が向上することが判明した。また、チタンの表面処理としてはH_2O_2/PBS溶液処理が最も反応性が高かった。これは、H_2O_2処理によってチタン表面が酸化され、その結果、塩基性水酸基の反応性が増したためと思われた。次にトレシルクロリド処理した各チタン表面とフィブロネクチンとの反応を行ったところ、いずれのチタン表面処理でも効率よくフィブロネクチンが固定化されていることが分かった。タンパク質の固定化にチタンの表面状態の違いはほとんど影響しなかった。水晶発振子マイクロバランス法によってフィブロネクチンの吸着を定量的に評価したところ、トレシルクロリド法がチタンのタンパク質固定に有効であることが判明した。トレシルクロリド法を用いて細胞接着タンパク質を固定化したチタン上でのヒト歯肉由来線維芽細胞の初期付着について検討した.まず,スライドグラスにマグネトロンスパッタリング法を用いてチタンをコーティングした試料(Ti-glass)を作製した.次に,Ti-glassの表面にトレシルクロリドを37°Cで2日間反応させた,トレシル化された試料をコラーゲンまたはフィブロネクチンのPBS溶液(100ppm, pH=7.4)に37°Cで1日間浸漬して,細胞接着タンパク質を固定化し,コラーゲン固定化ディスク(Collagen/Ti)およびフィブロネクチン固定化ディスク(Fn/Ti)を作製した.線維芽細胞を1x10^4個ずつ,Collagen/TiおよびFn/Ti試料に播種した.培養液には10%FBS含有Dulbeco's Modified Eagle Mediumを用いた.

37°C,5%CO_2雰囲気下で90分間培養した後に,付着細胞数を計測した.対照として,Ti-glassおよび細胞培養用well(TCPS)に付着した細胞数を計測した.FT-IR-RASスペクトルから,接着タンパク質の固定化が判明した.初期付着細胞数の測定結果では,Ti-glassに付着した細胞数はTCPSと同程度であった.Collgen/Ti試料では付着細胞数はTi試料の3倍以上と有意に増加しており,コラーゲン固定化の効果が確認された.一方,Fn/Ti試料では付着細胞数は有意に低下し,フィブロネクチン固定化の効果は見られなかった,フィブロネクチンの活性部位が有効に働かなかったためと推察される.以上の結果から,トレシルクロリドを用いてチタン上に細胞接着タンパク質を固定化した場合,コラーゲン固定では初期の細胞付着数が有意に向上したが,フィブロネクチン固定化ではその効果が見られないことが判明した.
ヒト骨化性筋炎は、幹細胞病か？：変異ＡＬＫ２遺伝子による筋幹細胞の骨分化誘導

進行性骨化性繊維異形成症(FOP)は、骨形成因子BMPの受容体ALK2の遺伝子変異が原因となって、骨格筋が骨組織に置き換わってしまうという特異な優性遺伝病である。FOP型変異ALK2をマウス筋前駆細胞Ric10に発現させて、骨分化の誘導機序を検討した。FOP型変異ALK2を発現させても、Ric10は骨分化しなかった。しかし、さらに炎症性サイトカインIL6で刺激すると、下流因子STAT3の活性化を介してFOP型変異ALK2による微弱なSmadシグナルが増幅され、異所性の骨分化が誘導された。FOP型変異ALK2とIL6の協調作用によって筋前駆細胞に骨分化が誘導されうることが明らかになった。1.炎症性サイトカインとBMPシグナル経路のクロストーク・ポイントの解明:(1) H23年度の本研究において、FOP型変異ALK2を発現しているRic10にIL6刺激を加えると骨分化が誘導されることを明らかにした。IL6の作用が、FOP型変異ALK2に依存するか否かを検討するため、IL6を様々な濃度のBMPとともにマウス筋前駆細胞Ric10に作用させた。閾値以下のBMP2(10 ng/ml)単独で刺激すると、骨分化マーカーであるアルカリ性フォスファターゼ(ALP)は、ほとんど誘導されなかった。しかし、BMP2とIL6で刺激すると、ALPの発現は顕著に増大した。より低濃度あるいは高濃度のBMP2では、IL6による増幅は認められなかった。この結果は、IL6は、BMP-ALK2-Smad経路を直接活性化しないものの、微弱なSmadシグナルを増幅することを示している。IL6はFOP型変異ALK2に直接作用するのではなく、IL6の下流因子がALK2-Smadシグナルを増強に関与する可能性が考えられる。(2)従来の活性染色法およびALP酵素活性比色定量法に替わる、蛍光基質を用いたALP活性の高感度検出系を確立した。(3)上記(2)のアッセイ系を用いてIL6の下流で活性化される転写因子STAT3の阻害剤5,15-DPPが、IL6中和抗体と同様に「IL6依存的骨分化誘導」を抑制することを明らかにした。IL6によるSmadシグナル増幅作用は、変異型ALK2に依存するのではなく、転写因子STAT3を介していることが示された。2. FOP型変異ALK2を発現する筋前駆細胞の樹立:筋前駆細胞Ric10に、FOP変異型ALK2遺伝子発現プラスミドを導入し、恒常的発現細胞株を分離した。対照として、野性型ALK2、活性型ALK2を導入した細胞を分離・樹立した。FOP型変異ALK2をマウス筋前駆細胞Ric10に発現させたところ、骨分化マーカーであるアルカリ性フォスファターゼ(ALP)の発現は、きわめて低く、FOPの発症機序は、遺伝子変異だけでは説明できなかった。そこで、FOP型変異ALK2発現Ric10細胞を、炎症性サイトカインIL6で刺激したところ、ALP発現レベルは、著しく増大し、骨分化が誘導された。Ric10を閾値以下のBMP2(10 ng/ml)単独で刺激しても、骨分化は誘導されなかったが、さらにIL6刺激を加算すると、骨分化が誘導された。また、IL6の下流で活性化される転写因子STAT3の阻害剤を作用させると、閾値以下のBMP2存在下における「IL6依存的骨分化誘導」は、抑制された。In vivoにおいて、FOP変異型ALK2遺伝子を発現する筋前駆細胞がIL6依存的に骨分化するか否かを検証するため、FOP変異型ALK2遺伝子を恒常的に発現する筋前駆細胞株の樹立を試みたが成功せず、ALK2の過剰発現は、マウス筋前駆細胞の機能を破綻させることが示唆された。本研究の結果、IL6は、筋前駆細胞に作用すると、下流因子STAT3の活性化を介してFOP型変異ALK2による微弱なSmadシグナルを増幅し、異所性の骨分化を誘導するものと考えられる。我々は、筋前駆細胞のALK2/Smadシグナル系の応答性が、ヒトとマウスでは異なっていることを見いだしている。FOPの発症機構を解明するうえで、ヒト筋細胞固有の性質を明らかにすることは、今後のきわめて重要な課題である。

FOP型変異ALK2は、単独では筋前駆細胞に骨分化を誘導する能力は有さないが、IL6刺激が加算されると下流のSmadシグナル経路の活性が著しく亢進し、骨分化マーカーの発現を誘導した。ALK2遺伝子変異と炎症性サイトカインの加算的効果によって引き起こされた筋幹細胞系譜の分化制御異常が、FOPの発症に関与している可能性が示唆された。【研究結果】(1)FOP型変異によるALK2の機能変化の解明(1) FOP型変異ALK2をマウス筋前駆細胞Ric10に発現させたところ、骨分化マーカーであるアルカリ性フォスファターゼ(ALP)は検出されたが、きわめて低レベルにとどまった。(2) FOP型変異ALK2をマウス筋前駆細胞Ric10に発現させ、種々の濃度のBMP2で刺激した。BMP2感受性に関しては、野生型ALK2とFOP型変異ALK2との間に差はなかった。(3) BMP-responsiveelement (BRE)を用いたレポーターアッセイによって、FOP型変異ALK2によるSmad経路の活性化は、BMP2刺激を与えた場合の20%以下にとどまった。これらの結果は、FOP型変異ALK2は、「活性化型変異体ではない」ことを示しており、FOPの発症機序は、遺伝子変異だけでは説明できないと考えられる。(2)炎症性サイトカインによるFOP型変異ALK2の作用増強機構の解明(1) FOP型変異ALK2発現Ric10細胞を、炎症性サイトカインIL6、IL1β、TNFαで刺激したところ、IL6刺激によってのみ、ALP発現レベルは著しく増大した。(2) FOP型変異ALK2発現Ric10細胞にIL6刺激を加えると、FOP型変異ALK2の下流に位置するSmad経路の活性が亢進した。これらの結果から、ALK2遺伝子変異にIL6刺激が加わることによって、骨分化が誘導されうることが示された。研究実施計画で平成24年度に予定していた研究項目のうち、「細胞特異性の解析」については、予備的検討の結果、マウス線維芽細胞のBMP2刺激に対する応答性がマウス筋前駆細胞とは大きく異なっていたため、その後の解析は中止した。その他の項目についてはほぼ計画どおり実施することができた。研究計画段階では想定していなかったが、IL6とBMPのクロストークを解析するために、微弱な内因性ALP活性を再現性よく検出できる解析系が必要となった。蛍光基質を用いたALP活性の高感度検定系を独自に確立し、それを用いて、IL6の作用は変異型ALK2に依存するのではなく、転写因子STAT3を介していることを明らかにした。研究実施計画で平成23年度に予定していた研究項目は、ほぼ計画どおり実施することができ、研究成果が得られた。その結果、ALK2遺伝子変異と炎症性サイトカインが加算的に作用することによって、筋前駆細胞の発生運命を変更させ、異所的な骨分化を誘導できることが明らかになった。当初の研究実施計画(下記)に大きな変更は予定していない。研究推進方策として以下の二点について検討したい。1「in vivoにおける骨形成能の解析」は、適切な実験条件の設定に時間がかかると予想されるので、移植実験に用いる予定の「FOP型変異ALK2を発現する筋前駆細胞」の性質(特に応答性)については、事前にin vitroで慎重に解析する。また、移植後の生着率を高めるため、Ric10とは異なる遺伝的背景を有するマウス筋前駆細胞へのFOP変異型ALK2遺伝子導入についても検討する。2マウスIL6中和抗体MR16-1(ヒトのリュウマチ治療薬として用いられているトリシズマブに相当する。
地域農業活性化におけるアコモデーション的合意形成手法の確立と有効性の検証

農村集落の計画づくりにおいて、地域自らが計画を作成しそれを実行するために、合意形成は必須の要件である。しかし、農業者・住民は多様化し、参加形態が多様化しているため、合意形成に至らない状況にある。このような現状を鑑み、参加者の価値観の相違を前提としたアコモデーション(他者の価値観が自らのそれとは違っていることを認め理解する状況)下での合意形成の手法確立とその有効性について研究することを目的とした。2年間をかけてアコモデーション的合意形成モデルを作成し、3年目に鶴岡市内3集落を試験対象に選定し、適用試験を実施することとし、関係機関との調整を行い、実験を行った。2集落で実験の最終段階まで実施し、そのうち1集落では対象者を拡大し、複数回の実施要請があり、3回の実験を行い、モデルの再検討を行った。これらの研究成果から、本研究で取り組んだアコモデーション的合意形成モデルは地域づくりの立ち上げ時にもっとも効果的であること、会合等に参加しない住民に対しての意識付けにも効果が期待できること、そして比較的短時間でそれらの作業が可能であることを確認した。加えて、このモデルによって盛り上がった意識を実際の行動に展開するための2段階目のモデルが必要であることも明らかとなった。当初計画に沿って,以下の研究を実施した.地域農業活性化の先行研究の整理として,農村計画,地域計画等の分野における先行研究を整理し,研究の位置付けを再確認するとともに,農村計画の先進事例の情報を収集した.地域農業活性化の先進地域の調査として,農業生産,環境問題で注目されている徳島県上勝町,集落営農組織作りを活発に行っている兵庫県加西市・福崎町の合意形成の手順や特徴を調査し,そこでの農業者・住民参加の量的・質的変化を調査した.合意形成について研究実践している森本秀樹氏及び門間敏幸氏に対して取り組んでいる地域づくり手法の特徴とそれに至った経緯,その中での合意形成のあり方,実践方法等を聞き取り調査した.研究対象地域として山形県遊佐町及び山形県金山町を選定し,農業者を対象とした調査によって両町の農業の問題点を抽出し,関係機関の聞き取り調査で地域農業の問題点を抽出するとともに,従来の地域の協議方式,合意形成の方法を調査し,その特徴と改善点を検討した,上記の調査研究からの情報をもとに,アコモデーション概念を取り入れた合意形成のあり方,加えて「出席」を強制しない「参加」のあり方(「参加」動機の誘因)を検討し,アコモデーション的合意形成手法の初期モデルについて検討した.当初計画に沿って,昨年度検討したアコモデーション的合意形成手法の初期モデル作成に着手した。また,初期モデルの施行を行うための試験地域の選定に取り組んだが,当初予定で想定していなかった新たな農業政策によって,与件変更が必要になり,初期モデルの再構築に取りかかるとともに,試験地域の選定方法を再検討した。また,鹿児島県,岩手県において地域農業活性化に関する現地調査を行い,地域農業の問題点の抽出,地域での協議方式,合意形成の方法について情報収集を行った。さらに,東京大学,鹿児島大学,東北農業研究センターで合意形成手法,農村計画,地域計画,農業経営に関する資料収集を行うとともに,これら専門知識を持つ研究者からの聞き取り調査を行った。なお,この間の研究から生まれた成果を,フードシステム学会において「農産物直売活動における交流とその効果」というタイトルで指導学生と連名で報告するとともに,「産物直売活動における生産者と消費者との距離-般販売活動の主体の違いに着目して-」を農業経済研究別冊に投稿し掲載され,「求められる優れたマネジメント」が経営実務に掲載された。さらに,「米の産直と農家」を『消費行動とフードシステムの新展開』の1章として出版した。当初計画に沿って,2年度に作成した初期モデルをもとに、アコモデーション的合意形成モデルを作成した。次に、鶴岡市内3集落を試験対象に選定し、適用試験を実施することとし、関係機関との調整を行い、実験を行うこととした。しかし、3集落のうち1集落は辞退の申し出があり、2集落で実験を実施した。そのうち1集落では対象者を拡大し、複数回の実施要請があり、3回の実験を行い、モデルの再検討を行った。

また,宮城大学,秋田県立大学,東北大学、つくば国際センターで合意形成手法,農村計画,地域計画,農業経営、フードシステム、住民参加に関する資料収集を行うとともに,これら専門知識を持つ研究者からの聞き取り調査を行った。これらの研究成果から、本研究で取り組んだアコモデーション的合意形成モデルは地域づくりの立ち上げ時にもっとも効果的であること、会合等に参加しない住民に対しての意識付けにも効果が期待できること、そして比較的短時間でそれらの作業が可能であることを確認した。加えて、このモデルによって盛り上がった意識を実際の行動に展開するための2段階目のモデルが必要であることも明らかとなった。この間の研究から生まれた成果として,「農産物直売活動における交流とその効果」を農業経済研究別冊に投稿し掲載され,「エサ米とこめ育ち豚が紡ぐ協同の和」が社会運動に掲載された。さらに、3年間の研究成果をまとめて、科研費報告書を作成した。
次世代シーケンサーを用いたスキンマイクロバイオームの解析と新規治療法の開発

NGSを用いた高解像度メタゲノム解析手法に関する検討を行い、高い再現性をもって細菌叢解析を行う一連の解析フローを構築する事に成功した。また、ファージ接種に対し広く耐性を示すアクネ菌亜種の高精度ドラフトゲノム配列解析の結果から、耐性メカニズムの獲得に寄与すると考えられる特徴的な遺伝子配列を見出すことに成功した。近年、ヒト共生細菌が健康状態の維持にも重要な役割を担っていることが明らかになり、欧米を中心にヒト共生細菌叢の解析とカタログ作成が急速に進行している。本研究では、次世代シーケンサー(NGS)を用いて、日本人の皮膚共生細菌叢(スキンマイクロバイオーム)を解析し皮膚疾患の発症メカニズムにおける細菌叢の役割を解明するとともに、新規治療法の検討を行う事を目的としている。平成26年度はNGSを用いた高解像度スキンマイクロバイオーム解析手法を確立するとともに、ファージを用いた新規治療法の検討を行った。NGSを用いた高解像度メタゲノム解析手法に関しては、1サンプルからのゲノムDNA抽出手法(粘着テープ採取法・綿棒採取法)、2高解像度の細菌叢解析を行う最適なプライマー領域の検討、3データ処理パイプラインの最適化、について検討を行ってきた。その結果、高い再現性をもって細菌叢解析を行う一連の解析フローを構築する事に成功した。また新規治療法に関する研究として、患者サンプルから得られたファージライブラリーを用いて、代表的なアクネ菌亜種に対し、溶菌作用に対する感受性と耐性の網羅的な解析を行った。これらの結果をまとめた論文を専門誌に投稿し受理が認められている。これらの結果をまとめた論文を専門誌に報告した。平成27年度は当初メタゲノム解析手法を用いたサンプル解析を予定していたが、7月の移動に伴い一連の解析環境に生じた変更に対応するために研究の遅延が認められたため、研究期間の延長を行った。解析フローに関しては一部解析パイプラインの修正・追加を行うことで、精度の向上が認められた。一方、ヒト共生細菌に影響を及ぼしうる因子として宿主であるヒトゲノムの解析を進めている過程でNGSを用いた解析により精度良くケラチン遺伝子異常を解析出来ることを見出し、これらの結果をまとめて専門誌に報告を行った。研究期間中に生じた所属機関の変更にともない、サンプル収集に関しては遅れが生じた為、研究期間の延長を行った。一方で、解析手法の確立、新規治療の検討に関しては計画通り順調に推移した。新規治療法に関する検討としては、ファージを用いた研究から極めて興味深い結果が得られた。溶菌作用に対する感受性と耐性の網羅的な解析、および、耐性を示すアクネ菌のゲノム解列解析の結果について論文として報告するに至っている(ISME Journal 2015)。またヒト共生細菌とヒトとの相互作用を解析する上で重要となるヒトゲノム解析パイプラインの構築を行い、精度良くケラチン遺伝子異常を解析出来ることを見出し、これらの結果をまとめて専門誌に報告を行った(Br J Dermatol. 2016)。平成26年度はNGSを用いた高解像度メタゲノム解析手法に関する検討を行い、高い再現性をもって細菌叢解析を行う一連の解析フローを構築する事に成功した。また、ファージ接種に対し広く耐性を示すアクネ菌亜種の高精度ドラフトゲノム配列解析の結果から、耐性メカニズムの獲得に寄与すると考えられる特徴的な遺伝子配列を見出すことに成功し、これらの結果をまとめた論文を専門誌に報告した。平成27年度は7月の移動に伴い一連の解析環境に生じた変更に対応するために研究の遅延が認められたため、研究期間の延長を行った。また細菌叢解析のトレンドが、時系列に採取したサンプルの恒常性・再現性に注目が集まっていることから、同一症例から複数回サンプルを採取し、その恒常性の解析を行った。

平成28年度は臨床現場でのサンプリングを想定し、洗顔の影響やサンプリング箇所の検討を実施し、再現性をもってサンプルの抽出を行える条件の検討を行った。またアクネ菌ゲノム解析を目的に開発した比較ゲノムプログラムを改良し、他の細菌ゲノム解析への展開を検討した。環境中の常在菌であり、アクネ菌の約2倍の大きさをもつ細菌ゲノムを対象に比較ゲノム解析を実施したところ、亜種特異的なゲノム配列の抽出に成功した。またパンゲノム解析も実施し、プログラムの汎用性を示すとともに、これらの結果を専門誌に報告した。NGSを用いた高解像度メタゲノム解析手法に関する検討を行い、高い再現性をもって細菌叢解析を行う一連の解析フローを構築する事に成功した。また、ファージ接種に対し広く耐性を示すアクネ菌亜種の高精度ドラフトゲノム配列解析の結果から、耐性メカニズムの獲得に寄与すると考えられる特徴的な遺伝子配列を見出すことに成功した。解析手法の確立に関しては計画通り順調に、また新規治療の検討に関しては当初計画以上に進展した(含む論文報告)一方で、サンプル収集に関してはやや遅れている側面があるので、全体としては概ね計画通りに進展している。NGSを用いた高解像度スキンマイクロバイオーム解析手法の確立に関しては、サンプルの採取方法、ゲノムDNA抽出手法、プライマー領域の検討、データ処理パイプラインの最適化、等の検討が計画通り順調に進んでおり、平成27年度は構築した解析フローに従って、サンプルの解析を行っていく予定である。一方でサンプル収集に関しては研究協力者との連携を進め、より一層の加速度をもって当初研究計画したサンプル数の収集に努める。新規治療法に関する検討としては、ファージを用いた研究から極めて興味深い結果が得られた。溶菌作用に対する感受性と耐性の網羅的な解析、および、耐性を示すアクネ菌のゲノム解列解析の結果について論文として報告するに至っている(ISME Journal, in press)。研究期間を延長した平成28年度はサンプルの収集を加速し、当初目標の達成を目指す。アクネ菌の全ゲノム解析から得られた病原性のサブグループに注目し、特徴的なアクネ菌のゲノム配列解析を進め、モデル生物を用いた検証実験系の構築を検討する。また天然物由来の抽出物質などを用いた、プロバイオティクスの効果や増殖抑制効果等の検討も進めていく。亜種(strain, isolate)レベルでの解析をアクネ菌以外にも応用し、特徴的なゲノム配列の解明や分類手法の開発を検討する。バイオインフォマティクス平成27年度は構築した解析フローに従って、サンプルの解析を行っていく。サンプル収集に関しては、研究協力者との連携をより一層進め、サンプル収集を加速する。ファージを用いた新規治療法に関する検討としては、耐性を示すアクネ菌のゲノム解列解析結果に基づき、分子レベルでの確認作業と耐性解除のメカニズムに関しても検討を行う。
脳損傷後の神経回路再建および臨床応用への統合的研究

中枢神経の再生を促すべく、再生を阻害しているチロシン脱リン酸化酵素(SHP-1)を抑えるとともに、運動によって神経回路の再建を強化することで、脳損傷後の有効な治療手段の確立を目指した。脳損傷モデルマウスを作製し、脳損傷の2週間前から6週間にわたって運動を実施した。その結果、SHP-1抑制に運動を加えることで神経再生数の増大や運動機能の顕著な回復がみられ、効果的に神経回路が再建された可能性が示唆された。SHP-1の抑制と運動を融合させることで、これまで以上に脳損傷後の神経回路の再建を増強することができた。本研究は、脳障害患者の機能回復における効果的な治療法に繋がる重要な知見である。中枢神経は、軸索伸長阻害因子の存在や軸索自体の伸長能力の欠如によって、一旦損傷を受けると回復が困難であることが知られている。本研究では、上記要因に関与することで軸索伸長を負に制御しているチロシン脱リン酸化酵素SHP-1の抑制に加え、神経再生を促しうる運動を行うことで、脳損傷後の神経再生がより強化されるか否かを検証している。本研究では、脳損傷モデルマウスの非損傷側大脳皮質および皮質脊髄路の代償的な神経再生に着目している。平成27年度はまず、非損傷側大脳皮質における変動因子を経時的に探索した結果、損傷早期にPro-inflammatoryサイトカインが増加した後、Anti-inflammatoryサイトカインが増加することが示された。また、軸索伸長の重要なシグナルとされる脳由来神経栄養因子BDNFの発現が徐々に減少することを見出した。そこで、抗炎症効果があると報告されているRunning wheelを用いた持続的な運動介入を、脳損傷の2週間前から脳損傷後4週間にわたって実施した。まずは、持続的運動が脳損傷後の神経再生に効果的であったか評価するため、非損傷側の皮質脊髄路を順行性トレーサーBDAによって標識し、軸索の側枝形成を評価した。その結果、頚髄における皮質脊髄路の側枝の数は、非運動群と比較して運動群において顕著な増加が認められた。また、脳損傷後から4週間にわたり前肢の運動機能を評価した結果、非運動群より運動群の回復が良好なことが示された。さらに、Pro-/ Anti-inflammatoryサイトカインについては解析中であるが、運動群においてBDNFの発現が減少に転じないことやSHP-1の発現が低下傾向にあることを見出す事が出来た。平成27年度は、Running wheelによる持続的な運動は、脳損傷後の代償的な神経再生を促すことで運動機能の回復を向上させることを明らかにできた。さらに、非損傷側大脳皮質におけるPro-/ Anti-inflammatoryサイトカインおよびSHP-1の発現変動と運動が関連性を示唆する結果も得ている。これらは、初年度の当初計画にほぼ沿った内容に関する成果であり、平成28年度以降に計画に沿ってさらに詳細な解析を行う予定である。以上より、研究はおおむね順調に進展している。脳が損傷を受けると運動障害が生じるが、損傷を免れた皮質脊髄路が代償的に神経回路を再建させることで運動障害はある程度回復するが、中枢神経の再生能は非常に限定的である。本研究では、軸索再生を負に制御しているチロシン脱リン酸化酵素SHP-1の抑制によって神経再生を促すとともに、運動療法によって神経回路の再建を強化することで、脳損傷後の機能回復に向けた有効な治療手段の確立を目指した。脳損傷後の非損傷側大脳皮質において、軸索伸長に重要なシグナルである脳由来神経栄養因子BDNFの発現が徐々に減少することを見出した。そこで、BDNFの増加が期待されるRunning wheelを用いた持続的な運動療法を脳損傷の2週間前から4週間後にわたって実施し、運動量を算出した。非運動群、運動群、SHP-1ノックアウト(KO)+運動群を設定し、片側の大脳皮質運動野の損傷モデルを作製した。まず、持続的運動が脳損傷後の神経再生に効果的であったか評価した結果、運動群における頚髄での皮質脊髄路の側枝の数は顕著な増加が認められた。また、脳損傷後の前肢の運動機能においても、運動群では良好な回復が示された。さらに、脳損傷後のSHP-1 KO+運動群においては、皮質脊髄路の再生数の増大や前肢の運動機能の回復が顕著であった。次に、再生神経が麻痺筋を支配する二次ニューロンと神経回路を形成していることが明らかになったが、数的問題により各群間のシナプス形成数の統計学的解析は困難であった。しかし、持続的な運動群の脊髄において神経活動のマーカーであるc-Fos陽性細胞の増加がみられ、効果的に神経回路の再建が増大した可能性が高いことが示唆された。SHP-1のKOによる神経軸索の再生やシナプス形成をターゲットとした分子的介入と神経活動を高める運動療法を融合させることで、脳損傷後の神経回路の再建をこれまで以上に増強することができた。