hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
層状ニューラルネットワークを用いた意識の数理モデル化

記憶,学習,注意,意識などの脳の高次機能の人工ニューラルネットワークを用いた研究は,高等動物の脳機能の理解や情報処理能力を解明する上で重要であり,人類の究極の研究謀題である.我々は,昨年度に続いて,視覚の選択的注意と意識に関する数理モデル化の研究を行った.まず,DesimoneとDuncanの仮説に基づき,FitzHugh-Nagumoニューロンを用いた2層ニューラルネットワークを構築し,視覚の選択的注意の研究を行った.すなわち,海馬体と視覚皮質に関する視覚の選択的注意の数理モデルを作り,数値実験により2層のニューロン集団間こ発火時間に関してガンマ振動の同期現象が起こることを示し,注意に対する一つの解釈を与えた.(ICONIP'02で発表,Proceedings of the ICONIP'02,Vbl3,1602(2002)).さらに,Hodgkin-Huxleyニューロンを用いた数理モデルを構築し,FitzHugh-Nagumoニューロンを用いた数理モデルとの比較を行った(信学技報,NC2002-120,19(2003)).注意や意識機構に対するCrickによる仮説の一部とDesimoneとDuncanの仮説を併せた数理モデルを提案し,数値実験を行い,その結果を学術雑誌に発表のための原稿を現在作成中である.また,記憶に関する海馬系の3層,4層,5層モデルを提案した(Proceeding of the ICONIP'02,Vol.1,343(2002),信学技報,NC2002-120,17(2003)).FitzHugh-Nagumoニユーロンを用いた2層ニューラルネットワークモデルを提案し,テータ振動とガンマ振動の発現に関する研究を行った(Proceedings of the ICONIP'02,Vo1.3,1597(2002)).現在,Crickのサーチライト仮説に基づき,意識の数理モデルを考案し,その性質を解明中である.記憶,学習,注意,意識などの脳の高次機能の人工ニューラルネットワークを用いた研究は,高等動物の脳機能の理解や情報処理能力を解明する上で重要であり,人類の究極の研究謀題である.我々は,昨年度に続いて,視覚の選択的注意と意識に関する数理モデル化の研究を行った.まず,DesimoneとDuncanの仮説に基づき,FitzHugh-Nagumoニューロンを用いた2層ニューラルネットワークを構築し,視覚の選択的注意の研究を行った.すなわち,海馬体と視覚皮質に関する視覚の選択的注意の数理モデルを作り,数値実験により2層のニューロン集団間こ発火時間に関してガンマ振動の同期現象が起こることを示し,注意に対する一つの解釈を与えた.(ICONIP'02で発表,Proceedings of the ICONIP'02,Vbl3,1602(2002)).さらに,Hodgkin-Huxleyニューロンを用いた数理モデルを構築し,FitzHugh-Nagumoニューロンを用いた数理モデルとの比較を行った(信学技報,NC2002-120,19(2003)).注意や意識機構に対するCrickによる仮説の一部とDesimoneとDuncanの仮説を併せた数理モデルを提案し,数値実験を行い,その結果を学術雑誌に発表のための原稿を現在作成中である.また,記憶に関する海馬系の3層,4層,5層モデルを提案した(Proceeding of the ICONIP'02,Vol.1,343(2002),信学技報,NC2002-120,17(2003)).FitzHugh-Nagumoニユーロンを用いた2層ニューラルネットワークモデルを提案し,テータ振動とガンマ振動の発現に関する研究を行った(Proceedings of the ICONIP'02,Vo1.3,1597(2002)).現在,Crickのサーチライト仮説に基づき,意識の数理モデルを考案し,その性質を解明中である.記憶,学習,注意,意識などの脳の高次機能の人工ニュートラルネットワークを用いた数理モデル化とその性質の研究は,高等動物の脳機能の理解や情報処理能力を解明する上で重要な課題であり,研究すべき問題点は多い.我々は,先ず学習速度に関する研究を行った.層状ネットワークに関して,教師ネットワークと生徒ネットワークのオンライン学習について,結合の切断による学習効果を研究し,教師ネットワークのランダム切断が生徒ネットワークの学習速度を改善することを明らかにした(日本物理学会欧文誌掲載予定,印刷中).次に,視覚の選択的注意に関する数理モデル化の研究をした.Crickによるサーチライト仮説に基づいた注意や意識機構の数理モデル化を行う前に,DesimoneとDuncanの仮説に基づき,Hodgkin-Huxleyニューロンを用いた,2層ニューラルネットワークによる注意の数理モデルを提案した.すなわち,海馬体と視覚皮質に関する視覚の選択的注意の数理モデルを作り,数値計算により,2層のニューロン集団間に発火時間に関してガンマ振動の同期現象が起こることを示し,注意に対する一つの解釈を与えた(日本物理学会2001年秋季大会発表,現在学術雑誌に発表のための原稿を作成中).また,FitzHugh-Nagumo方程式により2層ニュートラルネットワークを用いた選択的注意のモデルを提案し,その性質を解明した(日本物理学会2002年年会に発表予定).

現在,Crickのサーチライト仮説に基づき,意識や注意などの数理モデルを提案するために,ニューロンセルの集まりを基にしたニューラルネットワークのセル状態の発火に関する動的発展方程式を作成して,その性質を解明中である.記憶,学習,注意,意識などの脳の高次機能の人工ニューラルネットワークを用いた研究は;高等動物の脳機能の理解や情報処理能力を解明する上で重要であり,人類の究極の研究課題である.我々は,昨年度に続いて,視覚の選択的注意と意識に関する数理モデル化の研究を行った.まず,DesimoneとDuncanの仮説に基づき,FitzHugh-Nagumoニユーロンを用いた2層ニューラルネットワークを構築し,視覚の選択的注意の研究を行った.すなわち,海馬体と視覚皮質に関する視覚の選択的注意の数理モデルを作り,数値実験により2層のニューロン集団間に発火時間に関してガンマ振動の同期現象が起こることを示し,注意に対する一つの解釈を与えた(ICONIP'02で発表,Proceedings of the ICONIP'02,Vol.3,1602(2002)).さらに,Hodgkin-Huxleyニューロンを用いた数理モデルを構築し,FitzHugh-Nagumoニューロンを用いた数理モデルとの比較を行った(信学技報,NC2002-120,19(2003)).注意や意識機構に対するCrickによる仮説の一部とDesimoneとDuncanの仮説を併せた数理モデルを提案し,数値実験を行い,その結果を学術雑誌に発表のための原稿を現在作成中である.また,記憶に関する海馬系の3層,4層,5層モデルを提案した(Proceedings of the ICONIP'02,Vol.,1,343(2002),信学技報,NC2002-120,17(2003)).FitzHugh-Nagumoニューロンを用いた2層ニューラルネットワークモデルを提案し,テータ振動とガンマ振動の発現に関する研究を行った(Proceedings of the ICONIP'02,Vol.3,1597(2002)).現在,Crickのサーチライト仮説に基づき,意識の数理モデルを考案し,その性質を解明中である.
植物の可変的な器官プランの分子的基礎

重点領域研究『植物の可変的な器官プランの分子的基礎(略称;植物器官プラン)』は、植物器官の代謝機能発現と形態形成に関わる遺伝的プログラムを分子生物学、遺伝学的に追求して、これらのプロセスに重要な役割を担う制御遺伝子を単離してその実体を明らかにし、植物の成長生理における高次の調節機構解明のための分子的基礎を得ることを目的としたものである。本総合研究(B)では、広い視野と長期的展望にたって、重点領域研究『植物器官プラン』で重点的に推進すべき具体的な研究課題を絞り込むために、専門分野の異なる研究分担者が共同して、本重点領域研究に直接関わる分野のみならず、関連する周辺の領域における研究の現状と方向性を調査し、研究連絡会を開催して討議を行なった。その結果、分子生物学、遺伝学、それに植物生理学などの複合した新しい研究領域を目指すのが望ましいとの結論に達した。また、重点領域研究の円滑で充実したスタートを図るために、研究代表者と主要研究分担者よりなる作業グループ会を中心にして、研究組織とその具体的な運営方法などについても討議を進め、研究組織組み立ての骨格とその具体的運営方法について決定することができた。更に、研究計画発表会、研究成果報告会、公開セミナー、ワークショップ、ミニシンポジウムなどの開催やニュースレターの発行などの具体的な実施プランについてもほぼ固めることができた。以上のように、本総合研究(B)によって重点領域研究『植物器官プラン』の発足準備を完了することができた。
ICU関連筋力低下に対する関節他動運動を併用した神経―筋電気刺激療法の基盤創出

本研究の全体構想は,ICU関連筋力低下の病態メカニズムと,それに対する神経筋電気刺激(NMES),関節他動運動(PM)およびそれらの併用効果について検討することである.平成30年度は,脱神経(DEN)とデキサメタゾン(DEX)投与が,ラット腓腹筋内側頭(MG)の筋重量および収縮機能に及ぼす影響を比較検討した.実験にはWistar系雄性ラットを用い,それらを対照(CNT)群,DEN群,DEX(5 mg/kg/day)群に分けた.なお,処置期間は7日間とした.DEN群とDEX群では,MGの筋重量がほぼ同程度低下した(DEN群:-24%,DEX群:-17%),一方,最大等尺性足関節底屈トルクは,DENがDEXに比べ著しく低下した(DEN群:-74%,DEX群:-10%).この結果と一致して,MGから採取したスキンドファイバーにおける最大Ca2+誘引性張力(Fmax)は,DEN群がDEX群よりも著明に低下した(DEN群:-50%,DEX群:-16%).DENとDEXはいずれも筋萎縮を引き起こすが,特に脱神経によって著しい筋原線維の機能低下が生じることが明らかとなった.したがって,ICU関連筋力低下の病態メカニズムに,メカニカルストレスの欠如が重要な役割を果たすことが示唆された.これらの結果を受け我々は,メカニカルストレスとして,NMES(45 V,50 Hz,2 s on/4 s off,5x4セット毎日負荷)の効果を検証したところ,NMESはDENに伴うMGスキンドファイバーのFmaxの低下を防止するがin situにおける足関節底屈トルクを完全に防止しないことが明らかとなった.これらの知見から,NMESトレーニングは,ICU関連筋力低下に伴う筋原線維機能の低下に拮抗して作用するが,細胞膜の興奮性の低下を抑制しないことが示唆された.我々の予想通り,ICU関連筋力低下の病態メカニズムにメカニカルサイレンシングが重要な役割を果たすことを示すとともに,メカニカルストレスとして,神経筋電気刺激(NMES)を負荷することで,筋力低下が効果的に軽減されることを明らかにした.一方,NMESは,ICU関連筋力低下に伴う筋細胞膜の興奮性の低下を防止しないことも示された.なお,当初我々は,NMESに関節他動運動(PM)を併用した際の実験を実施する予定であったが,平成29年度の実験のみでは,ICU関連筋力低下の病態メカニズムおよびそれに対するNMESの効果を十分に明らかにすることができなかったため,平成30年度にはそれらの解明を優先して実施した.これらを除き,平成30年度に実施する予定であった実験は着実に遂行することができ,さらに,その結果は,おおむね我々の仮説を支持するものであったことから,現在までの達成度として,おおむね順調に進展していると判断した.当初の予定通り,平成31年度には,モデル動物における神経筋電気刺激(NMES)および関節他動運動(PM)の効果と作用機序の解明を目指すとともに,健常者およびICU患者に対するNMESおよびPMの効果を検証したい.本研究の全体構想は,ICU関連筋力低下の病態メカニズムと,それに対する神経筋電気刺激(NMES),関節他動運動(PM)およびそれらの併用効果について検討することである.平成29年度は,ステロイド・脱神経(S-D)ラットにおいて,酸化還元動態に着目し,筋力低下及びNMES作用の分子メカニズムについて検討した.9週齢のWistar系雄性ラットを対照群及びS-D群に分け,それらの左後肢をNMES側,右後肢を非NMES側とした.S-Dラットは,両側の坐骨神経を切断するとともに,デキサメタゾン(5 mg/kg/day)を毎日7日間投与した.また,NMESは,麻酔下において,足関節底屈筋群に表面電極を貼付し,最大上刺激の強度(45 V)で50 Hzの強縮刺激を,2 s on/4 s offのサイクルで5回4セット毎日負荷した.最終NMESトレーニングの24時間後に,腓腹筋を採取し生理学的・生化学的分析に供した.S-Dラットの腓腹筋から採取したスキンドファイバーにおいて,Ca2+誘引性最大張力の著しい低下が認められた.また,この変化は,ミオシンの選択的な減少とネブリンの酸化的修飾を伴っていた.さらに,S-Dラットの腓腹筋では,NADPHオキシダーゼ(NOX)2/gp91phox,NOX4,神経型一酸化窒素合成酵素(nNOS),内皮型一酸化窒素合成酵素(eNOS)の増加が認められた.一方,興味深いことに,NMESトレーニングは,nNOSおよびeNOSの増加以外の,S-Dラットにおける前述したすべての変化を防止した.これらの結果から,NMESトレーニングは,筋原線維タンパク質の退行性変化を防止することで,SDラットにおける筋原線維機能の低下を防止することが示唆された.当初,S-Dラットととも,盲腸結紮穿孔(CLP)ラットを対象に実験を行う予定であったが,我々の予想に反して,CLPラットでは,横隔膜における著しい筋力低下が観察されたものの,後肢骨格筋では筋機能が保たれていた.したがって,研究対象をS-Dラットに絞り実験を行った.これらを除き,平成29年度に実施する予定であった実験は着実に遂行することができ,さらに,その結果は,我々の仮説を支持するものであったことから,現在までの達成度として,おおむね順調に進展していると判断した.本研究の全体構想は,ICU関連筋力低下の病態メカニズムと,それに対する神経筋電気刺激(NMES),関節他動運動(PM)およびそれらの併用効果について検討することである.

平成30年度は,脱神経(DEN)とデキサメタゾン(DEX)投与が,ラット腓腹筋内側頭(MG)の筋重量および収縮機能に及ぼす影響を比較検討した.実験にはWistar系雄性ラットを用い,それらを対照(CNT)群,DEN群,DEX(5 mg/kg/day)群に分けた.なお,処置期間は7日間とした.DEN群とDEX群では,MGの筋重量がほぼ同程度低下した(DEN群:-24%,DEX群:-17%),一方,最大等尺性足関節底屈トルクは,DENがDEXに比べ著しく低下した(DEN群:-74%,DEX群:-10%).この結果と一致して,MGから採取したスキンドファイバーにおける最大Ca2+誘引性張力(Fmax)は,DEN群がDEX群よりも著明に低下した(DEN群:-50%,DEX群:-16%).DENとDEXはいずれも筋萎縮を引き起こすが,特に脱神経によって著しい筋原線維の機能低下が生じることが明らかとなった.したがって,ICU関連筋力低下の病態メカニズムに,メカニカルストレスの欠如が重要な役割を果たすことが示唆された.これらの結果を受け我々は,メカニカルストレスとして,NMES(45 V,50 Hz,2 s on/4 s off,5x4セット毎日負荷)の効果を検証したところ,NMESはDENに伴うMGスキンドファイバーのFmaxの低下を防止するがin situにおける足関節底屈トルクを完全に防止しないことが明らかとなった.これらの知見から,NMESトレーニングは,ICU関連筋力低下に伴う筋原線維機能の低下に拮抗して作用するが,細胞膜の興奮性の低下を抑制しないことが示唆された.我々の予想通り,ICU関連筋力低下の病態メカニズムにメカニカルサイレンシングが重要な役割を果たすことを示すとともに,メカニカルストレスとして,神経筋電気刺激(NMES)を負荷することで,筋力低下が効果的に軽減されることを明らかにした.一方,NMESは,ICU関連筋力低下に伴う筋細胞膜の興奮性の低下を防止しないことも示された.なお,当初我々は,NMESに関節他動運動(PM)を併用した際の実験を実施する予定であったが,平成29年度の実験のみでは,ICU関連筋力低下の病態メカニズムおよびそれに対するNMESの効果を十分に明らかにすることができなかったため,平成30年度にはそれらの解明を優先して実施した.これらを除き,平成30年度に実施する予定であった実験は着実に遂行することができ,さらに,その結果は,おおむね我々の仮説を支持するものであったことから,現在までの達成度として,おおむね順調に進展していると判断した.当初の予定通り,平成30年度には,神経筋電気刺激(NMES)に関節他動運動(PM)を併用した際の効果を検討し,臨床応用を見据えた最適NMES刺激条件を明らかにしたい.当初の予定通り,平成31年度には,モデル動物における神経筋電気刺激(NMES)および関節他動運動(PM)の効果と作用機序の解明を目指すとともに,健常者およびICU患者に対するNMESおよびPMの効果を検証したい.
レドックスモレキュラーイメージングによる非侵襲的NASH画像診断法の開発

成人疾患として、また小児疾患においても非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)の罹患率が上昇しており、非侵襲的に非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)への病態進行を評価するため、新規診断法の開発が重要な研究目的となっている。NASHの標準的な診断技術である肝生検には、侵襲的手技に伴う合併症のリスクが生じるなど、いくつかの欠点がある。今回我々は、carbamoyl-PROXYLを分子イメージングプローブとした生体動的核偏極磁気共鳴画像により、生体内のミトコンドリアレドックス代謝が組織病理学的変化の前の初期段階で劇的に変化していることを示し、NASH早期の病態変化を検出できることを明らかにした。メチオニン-コリン欠乏餌で飼育したNAFLD/NASHモデルマウスを作成し、病態の進行に伴ったレドックス状態の変化をDNP-MRIで非侵襲的に測定をした。これにより画像的な可視化及び、ニトロキシルラジカルの消失速度の算出による数値での客観的評価が可能となった。病態進行に伴った、ラジカルプローブの消失速度低下が観測され、実際の病理組織像(HE染色, masson trichrome染色, sudan III染色)、酸化ストレスを反映する免疫染色(8OHdG, 4HNE)、血液生化学検査(GOT, GPT)、酸化ストレスマーカーの増加、抗酸化ストレス酵素(total antioxidant capacity)の減少など病態進行を反映するバイオマーカーとの強い相関性も示し、臨床応用が可能となった場合の有用性が示唆された。さらに、過去の報告を参考にこのレドックス状態の変化がミトコンドリア内で起こっているとの仮説を立て、病態モデルマウスの肝臓組織より分離した単離ミトコンドリアを用いX-band EPRでのレドックス状態を計測し、in vivoでの結果を同じ変化が生じている事を証明し、ニトロキシルラジカル消失のメカニズムについても示すことができた。また、メチオニン-コリン欠乏餌から通常食に戻した際の病態の回復状況に関しても同様にレドックス状態の変化として観察可能であり、創薬における病態評価での有用性についても示すことができた。また、病態モデル作成用の餌の組成を変更させることで、レドックス状態に与える影響が異なることも示すことができた。研究開始当初に予定していたIn vivoDNP-MRIを用いた各種実験が予定通りに進展した。また、非アルコール性脂肪肝炎マウスモデルにおける実験も、当初の予定通りに進展した。本研究では生体内レドックス状態を動的核偏極磁気共鳴画像(DNP-MRI)で評価することで非アルコール性脂肪肝疾患/非アルコール性脂肪肝炎(NAFLD/NASH)の病態発症、進展を正確に診断するための技術開発を目的としている。平成28年度ではメチオニン-コリン欠乏食餌をあたえたNAFLD/NASH病態モデルマウスを対象にして病態の進行とともにマウスの生体内レドックス状態の変化をin vivo DNP-MRIで捉え、レドックス状態が病態を反映していることを示してきた。平成29年度はそのメカニズム解明を試みるために詳細な検討を行った。その結果、in vivo DNP-MRIで検出されたレドックス状態の変化が肝細胞レベルでも同様の変化が生じていることが確認され、統計解析の結果、病態モデルマウスの病態進行ならびにin vivo DNP-MRIで得られた結果と相関性が認められることを示すことができた。さらには、NAFLD/NASHの病態発現の原因として細胞内のミトコンドリアに機能異常が生じていることが示唆されているが、ミトコンドリア自体のレドックス状態についても肝細胞から単離したミトコンドリアを用いて評価を行った。電子伝達系に関連した基質の有無やKCN存在下でのミトコンドリアレドックス代謝に関する評価をおこない、電子伝達系の活性とレドックス代謝の相関性がしめされ、病態発現時にはミトコンドリア電子伝達系に機能異常がおこりレドックス代謝に影響を与えていることが示唆された。今年度得られた結果は概ね予測通りであったため、次年度も申請書に記載した通りの当初の予定通り推進したいと考えている。また、順調にデータが得られており、現在、英文雑誌への論文投稿を進めている。消化器外科実験動物や実験試薬の購入金額が想定より抑えられたため。主な支出は実験動物の管理と試薬の購入が考えられる。その他、研究成果発表のための論文掲載料及び国内外での学会参加旅費に充てられる。
新規ポリコーム群結合タンパク質ToporsのXY体形成過程における作用機序の解明

生体内における機能を解析することを目的として、Topors遺伝子欠損マウスを作製したところ、雌雄ともに不妊である事がわかった。雄のTopors遺伝子欠損マウスにおいては、精子の運動能が顕著に低下しており、さらに生殖行動にも問題があることがわかった。雌の欠損マウスにおいては、エストロゲンの血中濃度に影響はないものの、排卵不全及び性周期の長期化という現象が起こっていることが明らかとなった。マウスの配偶子形成過程において、雌雄ともにToporsが重要な機能を果たしていることが示唆された。減数分裂期における相同的遺伝子組換えは、遺伝情報の多様性を生み出すために重要なプロセスである。その際、性染色体は相同性の少ない部分で対合するが、不対合な部分はヘテロクロマチン化し、XY体という特殊な核内構造を形成する。我々はポリコーム群タンパク質複合体がXY体形成の維持に寄与していることを明らかにしてきたが、更にその分子機構を明らかにする目的で、ポリコーム群タンパク質に結合し精巣に強発現するタンパク質としてTopors(Topoisomerase I and p53 bindingRING finger protein)を同定した。生体内における機能を解析するため、Topors遺伝子欠損マウスを作製したところ、雄は不妊である事がわかった。更に詳細に調べるために精巣切片を観察してみると、成熱した精子は形成されており、IVF(体外受精)をした受精卵を野生型雌に移植すると子供が作る事ができた。これらの結果から精製形成過程そのものよりは、精子の運動能もしくは生殖行為に問題があると予想される。現在、精子の運動能の検討、及び生殖行為を起こさせるホルモン量の測定などを行っているところである。Topors遺伝子欠損マウスの表現型の解析から、マウスの精子形成過程において、ToporsはXY体形成への寄与とはまた別に、重要な機能があることが示唆された。今後、更なる表現型の解析を行い、作用機序を解明して行きたい。配偶子形成において、減数分裂期は遺伝情報の多様性を生み出すために重要なプロセスである。その際、雄の性染色体は相同性の少ない部分で対合するが、不対合な部分はヘテロクロマチン化し、XY体という特殊な核内構造を形成する。我々は、現在までにポリコーム群タンパク質複合体(PRC1)がXY体形成の維持に寄与していることを明らかにしてきた。更にその分子機構を明らかにする目的で、ポリコーム群タンパク質に結合し精巣に強発現するタンパク質としてTopors(Topoisomerase I and p53 binding RING finger protein)を同定した。Toporsは癌抑制遺伝子としての機能を持つ可能性もあったため、生体内における機能を解析することを目的として、Topors遺伝子欠損マウスを作製した。その結果、予想に反して雄だけでなく雌も不妊である事がわかった。まず雄のTopors遺伝子欠損マウスについて詳細な解析を行ったところ、精子数そのものに影響はないものの、精子の運動能が顕著に低下していることがわかった。更に、個体の生殖行動にも問題があることが明らかとなった。また、雌のTopors遺伝子欠損マウスの表現型の解析から、エストロゲンの血中濃度に影響はないものの、排卵不全及び性周期の長期化という現象が起こっていることが明らかとなった。
加工戦略に基づいた5軸制御加工CAMソフトウェアの開発

本研究では,製造者が設計したどのような製品形状も,確実かつ高品位に5軸制御加工するためのCAMソフトウェアの構築と,そのために不可欠となる基盤ソフトウェア技術の開発を目的としている.まず,これまでに作成してきたCAMソフトウェア開発用のライブラリを流用し,さらに形状特徴の自動認識,行程の自動計画,工具経路の生成など,新たに追加すべき機能について検討した.続いて,それぞれの機能を実現する計算アルゴリズムを設計し,それらをプログラムとして実装した後にライブラリとして整理し,CAMソフトウェア開発用パッケージとして利用可能なものとした.最後に,開発したライブラリを利用した5軸制御加工のための工具経路生成プログラムを開発するためのプラットホームを計算機上に構築した.本研究では,特に目的の加工対象形状に制限されることなく,製造者の意向を反映した加工を実現できるというような,加工に対する柔軟性・汎用性の向上を重視している.同時に,ソフトウェアの実用性の向上を図るために,計算幾何学の手法を適用するなどしてプログラム全体における処理の高速化についても十分に検討を重ねた.研究の最終的な成果を確認するために,開発した基盤ソフトウェアライブラリを用いてCAMソフトウェアを試作し,加工実験によりその有効性について検討したところ,所定の加工戦略に基づいた5軸制御加工のための工具経路を実用的な時間内で算出できたこと,工具干渉のない良好な加工が実現できたことなどから,提案した加工方法と開発したソフトウェアの有効性が確認された.本年度は,様々な製品の加工にも多用され,汎用性が高い,ボールエンドミル加工を対象として,ソフトウェアの基本部分の完成を目標に,以下の手順で研究を遂行した.○主要となる機能の検討まず,申請者がこれまでに作成してきた多軸制御加工CAM開発用のライブラリを転用し,その他,形状特徴の自動認識,自動行程設計,自由形状生成など,新たに追加すべき機能について検討した.○基本ライブラリの作成検討の結果,必要となった機能を実現する計算アルゴリズムについて設計し,それらをプログラムとして実装した後,ライブラリとしてまとめ,ソフトウェア開発用パッケージとして利用可能なものとした.○計算実験のための基本プラットホームの構築作成した基本ライブラリパッケージを用いて,計算機上に5軸工具経路生成用の基本プラットホームを構築し,同時に,各ルーチンの処理に計算幾何学の手法などを適用することによって,プログラム全体の高速化を図った.上記のように本年度の作業は,プログラムの開発が中心となった.効率的に作業を進め,迅速に計算データを収集するために,世界規格のCADデータフォーマット利用してプログラム作業の負担を軽減するために,消耗品費で幾何モデリングカーネルソフトウェアを購入した.同時に,より高度な機能を付加するために,計算幾何学ライブラリのライセンスも購入して活用し,開発作業の軽減を図った.国内旅費は,5軸制御加工法やアルゴリズム設計に関する調査や情報交換のために利用した.その他の経費は,成果報告のための資料,論文などの印刷料金として利用した.本研究では,製造者が設計したどのような製品形状も,確実かつ高品位に5軸制御加工するためのCAMソフトウェアの構築と,そのために不可欠となる基盤ソフトウェア技術の開発を目的としている.まず,これまでに作成してきたCAMソフトウェア開発用のライブラリを流用し,さらに形状特徴の自動認識,行程の自動計画,工具経路の生成など,新たに追加すべき機能について検討した.続いて,それぞれの機能を実現する計算アルゴリズムを設計し,それらをプログラムとして実装した後にライブラリとして整理し,CAMソフトウェア開発用パッケージとして利用可能なものとした.最後に,開発したライブラリを利用した5軸制御加工のための工具経路生成プログラムを開発するためのプラットホームを計算機上に構築した.本研究では,特に目的の加工対象形状に制限されることなく,製造者の意向を反映した加工を実現できるというような,加工に対する柔軟性・汎用性の向上を重視している.同時に,ソフトウェアの実用性の向上を図るために,計算幾何学の手法を適用するなどしてプログラム全体における処理の高速化についても十分に検討を重ねた.研究の最終的な成果を確認するために,開発した基盤ソフトウェアライブラリを用いてCAMソフトウェアを試作し,加工実験によりその有効性について検討したところ,所定の加工戦略に基づいた5軸制御加工のための工具経路を実用的な時間内で算出できたこと,工具干渉のない良好な加工が実現できたことなどから,提案した加工方法と開発したソフトウェアの有効性が確認された.
マウス胎仔内耳細胞の遺伝子改変技術の確立(先天性難聴の治療に向けて)

現在、1000出生に1例が高度難聴を来たし、この半数以上が遺伝子異常に起因するといわれている。また、老人性難聴なども何らかの遺伝的素因が関与していることが考えられ、難聴の診断、治療などの戦略に遺伝子は重要な位置を占めることとなった。難聴の原因遺伝子は100個くらいあるといわれるが、GJB2が最も頻度が高く、臨床的意義が大きい。GJB2の遺伝子変異は数多く報告されているが、この中でも日本人に多い235delC,V37I,R143Wについてin vitroで機能解析を行うため患者血液から変異体cDNAをクローニングした。また、蝸牛内で特異的に発現しているモーター蛋白質prestinが最近報告された。これに関係した疾患はまだ報告されていないが、将来的な遺伝子治療に応用する可能性を検討するため、この全長cDNAをスナネズミ蝸牛からクローニングした。これら遺伝子を蝸牛内細胞に遺伝子発現させるにあたり、遺伝子導入方法を検討する必要がある。導入に用いるべクターとしては、ウイルス性と非ウイルス性があるが、まず、高効率での発現が見込まれるアデノウイルスを用いることとした。導入に関する諸条件を検討するためのレポーター遺伝子として大腸菌ベータガラクトシダーゼをアデノウイルスベクターに組み込んだ。これには、クロンテック社のAdeno-X Expression Systemを用いた。モルモットを麻酔後、耳後部切開して蝸牛骨包を露出した。正円窓山来、あるいはcochleostomyを行い少量のウイルス液を注入した。48-72時間後、断頭しX-galにて発色反応を行ったところ、蝸牛管内に遺伝子発現が確認された。
発酵茶葉由来の抗酸化物質に関する総合的研究

我々は、食品の抗酸化力の簡便な指標として還元活性に着目し、各種食品抽出液中の還元活性のスクリーニングを行ったところ、従来ビタミンCを含まないとされる、紅茶、ウーロン茶、プーアール茶、阿波番茶の茶葉抽出液中に強い還元活性を見出し、VCRA(vitamin C like reducing activity)と命名した。基礎的な検討により、この還元活性はビタミンCや茶葉抽出液の主成分であるカテキンとは異なり、紅茶、ウーロン茶、プーアール茶、阿波番茶では各々異なる分子種であること、さらにラジカル除去能も有することを見出した。そこで各種食品抽出液の還元活性を複数の異なるクロマトグラムを組み合わせて分析し、その還元物質の単離同定を進める過程で、従来のHPLCによるカテキンやポリフェノールの分析とは異なり、複数のクロマトにより得られる多次元分画の活性を測定することにより物質(活性)を個々の物理的化学的正常の違いに基づき多次元平面上にピークが重ならないようにばら蒔く(ディスプレイ)することが可能であることを見出し、Functional Display Chromatography(FDC)と命名した。特に還元物質について、2種のクロマトの組み合わせと、2次元分画の還元活性の測定により得られるFDCを2次元レドグラムと命名し、これにより試料中の還元物質の全体像を網羅的に解析可能であることを実証した。この方法を、発酵茶由来の還元物質に応用したところ、VCRAは当初の予想以上に多数の分子種よりなることが明らかになった。2次元レドグラムにより還元物質は2次元分画として採取された各ピークのMNR分析が容易に可能である。本法により未知の還元物質も含めた試料中の還元物質の全体像がレダクトーム(reductome)として把握可能であり、新規物質の発見、製品の品質管理など広範囲な利用が考えられ、四国TLOの指導の下、特許出願を行った。我々は、食品の抗酸化力の簡便な指標として還元活性に着目し、各種食品抽出液中の還元活性のスクリーニングを行ったところ、従来ビタミンCを含まないとされる、紅茶、ウーロン茶、プーアール茶、阿波番茶の茶葉抽出液中に強い還元活性を見出した。基礎的な検討により、この還元活性はビタミンCや茶葉抽出液の主成分であるカテキン類とは異なり、紅茶、ウーロン茶、プーアール茶、阿波番茶ではそれぞれ異なる分子種であること、さらにラジカル除去能も有することを見出した。そこで我々は、各種食品抽出液中の還元活性を各種クロマトグラムを組み合わせて分析した結果、これらの還元活性をそれぞれ、VCRA_black (vitamin C like reducing activity of black tea), VCRA_oolong, VCRA_pu-er, VCRA_awaと命名した。現在、複数の強力な還元活性を網羅的に単離し、NMR,質量分析装置を用いて分子構造の決定が進行中である。この研究過程において、食品中に含まれる還元活性の全体像を視覚的かつ網羅的に解析することが可能な、レドグラム(redgram)法を開発した。この方法を2次元に拡張した2次元レドグラム法を発酵茶由来の還元物質に応用したところ、これらのVCRAはさらに多様な分子種よりなることが明らかになった。これらの事実は、特定の発酵茶葉の抽出液中の還元物質は非常に多様であること、2次元レドグラム法を用いることにより、これらの多様な分子種の還元物質の全体像がレダクトーム(reductome)として把握可能であることが明らかとなった。この「2次元レドグラム法によるレダクトーム解析」は四国TLOの指導のもと特許出願の予定である。
燃焼制御最適化のためのエーテル燃料の詳細反応機構構築

2018年に発表された衝撃波管を用いたジエチルエーテルの燃焼研究論文で,温度650-1100 K,圧力18,40 barの内燃機関に近い温度・圧力環境下において冷炎の熱発生が二段に分かれる現象が示唆され,昨年度までに構築した研究代表者らのジエチルエーテルの詳細反応機構が二段の冷炎を再現することが指摘された[Y. Uygun, Combust. Flame 194 (2018) 396-409].この事実は本研究で提案された反応速度定数や詳細反応機構の妥当性を支持するものであり,また,内燃機関の新たな燃焼制御を提案する上でヒントになり得るものである.そこで,詳細反応機構を用いて二段冷炎の要因の解析を実施した.ジエチルエーテルの反応はそのC-H結合解離エネルギーの特性から,ほぼ9割がエーテル酸素原子の隣にあるCH結合の反応により進むため,低温酸化反応機構に含まれる中間化学種は複数存在するものの,反応経路はほぼ1通りである.そのため,アルキルラジカル,ヒドロキシアルキルラジカルの低温から高温酸化への移り変わりが明確に発熱量として反映されるために二段の冷炎として観測されると推察された.また,ジエチルエーテルとメタンの混合燃料に対する燃焼反応機構の検証も実施した.一方,昨年度までに構築・改善した反応速度定数の一般則を広島大学の三好が開発中の詳細反応機構自動生成プログラム(KUCRS)のライブラリに登録し,様々な化学構造をもつエーテル燃料の詳細反応機構を自動生成に対する準備を進めている.H28年度(初年度)は,量子化学及び反応速度論的手法を用いて反応速度定数を求め,自着火過程を支配する低温酸化反応機構に対してエーテル結合が与える影響を考察した.計算対象とした素反応群は,アルキル型ラジカルのβ分解反応,アルキルペルオキシ型ラジカルの分子内水素移動反応および協奏的HO2脱離反応,ヒドロキシアルキル型ラジカルの環状エーテル生成反応である.エーテル系化合物は分子内水素結合が存在するため,当初,長距離間相互作用を考慮した構造最適化の必要性が予想されたが,いくつかの代表的な素反応の反応速度定数の検証結果,計算精度および計算コスト等を総合的に勘案して,その必要性はないと判断した.量子化学計算はCBSQB3法,反応速度定数計算には遷移状態理論を利用した.文献にあるアルカンの素反応の反応速度定数との比較から,α位が関与する反応にエーテル結合の影響が現れることを明らかにした.つまり,エーテル燃料の詳細反応機構の構築には,α位の関与する反応の反応速度定数が新たに必要であり,それ以外の反応については既に提案されているアルカンの反応速度定数が利用可能であることを示した.一方で,これまでに構築したジエチルエーテルの詳細反応機構を利用して反応経路解析および感度解析を行い,エンジン上死点付近の温度・圧力環境下ではアルキル型ラジカルのβ分解反応が着火遅れ時間の温度依存性に大きく効いていることを明らかにした.初年度に得ることのできたこれらの知見は,次年度以降のエンジン環境下を想定した着火シミュレーションに必要不可欠なものである.次世代のエンジン燃焼技術には,より高効率でクリーンな燃焼,様々な燃料利用に対応できることが求められている.エーテル燃料の混合によるガソリン及び軽油の燃焼制御の可能性について,理論計算から得られた学術的知見を基に考察することが本研究の最終目的である.初年度はエーテル燃料の詳細反応機構の構築に必要な素反応群の反応速度定数を求めた.また,これらを利用してジエチルエーテルの自着火機構の解析を行い,詳細反応機構の精度向上のために再検証が必要な素反応を明らかにした.計画書に記載した初年度の研究項目はほぼ終了している.また,当初の計画を大幅に上回る研究成果は出ていない.したがって,自己評価は「おおむね順調に進展している」と判断した.H28年度に求めたエーテル化合物の低温酸化反応機構の反応速度定数一般則を基に,ジメチルエーテル(DME),ジエチルエーテル(DEE),ジブチルエーテル(DBE),エチル-tert-ブチルエーテル(ETBE)の詳細反応機構の構築をして,実測値との比較から一般則の検証を行った.これら四種の燃料を選択した理由は,着火遅れ時間や層流燃焼速度などの基礎的な燃焼特性に関する実験値が報告されていること,代表者の過去の研究や文献から詳細反応機構を入手可能であることである.詳細反応機構に,これまでに求めた反応速度定数を反映させて,着火遅れ時間や層流燃焼速度と比較した.いずれの燃料についても,概ね着火遅れ時間の温度依存性などを再現することができたが,負の温度係数(NTC:Negative Temperature Coefficient)領域と呼ばれる温度800から1000 Kにおいて着火遅れ時間の再現性に難があることが確認された.反応経路解析や感度解析の結果,この温度領域においては,アルキル型ラジカルのβ分解反応,ヒドロキシアルキル型ラジカルの環状エーテル生成やβ分解反応に着火遅れ時間が大きく寄与していることが明らかにされた.そこで,内部回転子の分配関数の再評価,反応速度定数の炭素級数依存性の再検討を行い,反応速度定数一般則を更新した.修正した反応速度定数は,NTC領域の着火遅れ時間の温度依存性をほぼ定量的に再現できることを確認した.これらの反応速度定数の一般則は,H30年度に予定しているエーテル燃料の化学構造と着火に関する議論,エンジン燃焼環境下で着火及び火炎伝播に対する促進または抑制に有効なエーテル燃料の探索において必要不可欠なものとなる.次世代のエンジン燃焼技術には,より高効率でクリーンな燃焼,様々な燃料利用に対応できることが求められている.

エーテル燃料の混合によるガソリン及び軽油の燃焼制御の可能性について,理論計算から得られた学術的知見を基に考察することが本研究の最終目的である.初年度はエーテル燃料の詳細反応機構の構築に必要な素反応群の反応速度定数を求めた.また,これらを利用してジエチルエーテルの自着火機構の解析を行い,詳細反応機構の精度向上のために再検証が必要な素反応を明らかにした.二年度目は,さらにDME,ETBE,DBEなどの燃料に拡張して,内部回転子の分配関数の再検証などにより反応速度定数一般則の修正を行った.これら四種の燃料は,分子サイズや分岐構造を考慮すると特徴的な化学構造を有しており,エーテル燃料の反応速度定数の一般則として必要最低限の検証を終了したということができる.計画書に記載した二年度の研究項目はほぼ終了している.したがって,自己評価は「おおむね順調に進展している」と判断した.2018年に発表された衝撃波管を用いたジエチルエーテルの燃焼研究論文で,温度650-1100 K,圧力18,40 barの内燃機関に近い温度・圧力環境下において冷炎の熱発生が二段に分かれる現象が示唆され,昨年度までに構築した研究代表者らのジエチルエーテルの詳細反応機構が二段の冷炎を再現することが指摘された[Y. Uygun, Combust. Flame 194 (2018) 396-409].この事実は本研究で提案された反応速度定数や詳細反応機構の妥当性を支持するものであり,また,内燃機関の新たな燃焼制御を提案する上でヒントになり得るものである.そこで,詳細反応機構を用いて二段冷炎の要因の解析を実施した.ジエチルエーテルの反応はそのC-H結合解離エネルギーの特性から,ほぼ9割がエーテル酸素原子の隣にあるCH結合の反応により進むため,低温酸化反応機構に含まれる中間化学種は複数存在するものの,反応経路はほぼ1通りである.そのため,アルキルラジカル,ヒドロキシアルキルラジカルの低温から高温酸化への移り変わりが明確に発熱量として反映されるために二段の冷炎として観測されると推察された.また,ジエチルエーテルとメタンの混合燃料に対する燃焼反応機構の検証も実施した.一方,昨年度までに構築・改善した反応速度定数の一般則を広島大学の三好が開発中の詳細反応機構自動生成プログラム(KUCRS)のライブラリに登録し,様々な化学構造をもつエーテル燃料の詳細反応機構を自動生成に対する準備を進めている.H29年度には,セタン価,オクタン価の実測値があるエーテル燃料の詳細反応機構を構築する.詳細反応機構を利用して0次元の燃焼シミュレーションから着火の発生する限界圧縮比を求め,セタン価,オクタン価の実測値との比較を行い詳細反応機構の妥当性を検証する.この一連の過程の中で,初年度に求めた反応速度定数の再検証を行い,詳細反応機構の精度向上を目指す.H30年度には,燃料の化学構造と着火特性の相関関係を明らかにするために,H29年度に構築した詳細反応機構を利用して0次元反応計算を行い,炭素骨格や官能基の位置に着目して,燃料化学構造と着火遅れ時間の整理を行う.さらに,エーテル燃料の混合によるガソリン及び軽油の着火制御の可能性を検討するために,0次元エンジンモデルを利用した燃焼シミュレーションを実施する.ガソリン及び軽油の詳細反応
フィブリノーゲンと反応する血管内皮細胞上の新たなインテグリンの同定

血管内皮細胞は多くの抗血栓機能を有しているが、内皮細胞の損傷により内皮下組織が露呈すると、そこには血小板を主体とした凝集塊が形成され、血栓の形成へとつながる。フィブリノーゲン(Fg)は内皮が損傷を受けた部位に集積し、内皮細胞に対して粘着・伸展・遊走を促進することが知られており、内皮細胞のFgへの接着は、損傷血管の修復や血管新生などに関与すると考えられる。昨年度の研究により、Fgの血管内皮細胞への結合において、内皮細胞上の新たなインテグリンα5β1が関与することを明らかにした。本年度は、アフィニティカラムにより胎盤から精製したα5β1を用いて、Fgとの結合を詳細に検討し、Fg側の認識部位を同定した。まず精製α5β1をプレートに固相化し、ラベルしたFgとの結合を種々の陽イオン存在下で比較したところ、その結合はMn^<2+>+存在下でのみ認められた。Mn^<2+>+存在下でのFgの精製α5β1への結合は、RGD(Arg-Gly-Asp)ペプチドおよび抗α5β1抗体で完全に阻害された。またFgのAα鎖に2ケ所あるRGD配列に対するモノクローナル抗体(Anti-N,Anti-C)による抑制効果を調べたところ、C端側のRGD配列に対するモノクローナル抗体(Anti-C)で有意の抑制が認められた。さらに上記2ケ所のRGD配列をRGEに変換したrecombinant Fg(rFgD97E,rFgD574E)を用いてα5β1への結合を検討したところ、N端側RGD変異体(rFgD97E)では正常と同様の結合が認められたにもかかわらず、C端側RGD変異体(rFgD574E)ではほとんど結合がみられなかった。以上の結果より、FgのC端側RGD配列がα5β1との結合に関与することが明らかになった。種々の抗血栓的な機能を有している血管内皮細胞が損傷を受けると、露呈した内皮下組織には血小板を主体とした凝集塊が形成され、血栓の形成へとつながる。フィブリノーゲン(Fg)は内皮が損傷を受けた部位に集積し、内皮細胞に対して粘着・伸展・遊走を促進する。このように内皮細胞のFgへの接着は、損傷血管の修復や血管新生などに関与すると考えられる。Fgは内皮細胞表面レセプターの一つであるインテグリンと、RGD(Arg-Gly-Asp)依存性に結合することが知られており、主としてαvβ3(ビトロネクチン受容体)を介すると考えられていた。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)と^<125>IラベルしたFgとの結合を、種々の2価陽イオン条件下で比較したところ、その結合はMn^<2+>存在下で認められ、Ca^<2+>はその結合を阻害した。Mn^<2+>存在下でのFgのHUVECへの結合は、RGDペプチドで完全に阻害されたが、抗β3抗体および抗αvβ3抗体は全く抑制効果を示さなかった。このためαvβ3以外の種々の抗インテグリン抗体による抑制効果を検討したところ、抗α5β1抗体で完全に抑制されることより、α5β1(フィブロネクチン受容体)を介することが明らかとなった。FgはHUVEC表面のα5β1に特異的に高親和性に(Kd=65nM)結合した。FgのAα鎖にある2ヶ所のRGD配列に対するモノクローナル抗体での抑制効果により、C端側のRGD配列Aα572-574がFg側の認識部位と考えられた。このFgのα5β1への結合は、HUVECのみならず血小板でも認められた。また胎盤より精製したα5β1へのFgの結合を検討したところ、Mn^<2+>存在下で特異的な結合がみられた。以上の結果より、Fgと直接結合する血管内皮細胞上の新たなインテグリンα5β1を同定した。

またFgのAα鎖に2ケ所あるRGD配列に対するモノクローナル抗体(Anti-N,Anti-C)による抑制効果を調べたところ、C端側のRGD配列に対するモノクローナル抗体(Anti-C)で有意の抑制が認められた。さらに上記2ケ所のRGD配列をRGEに変換したrecombinant Fg(rFgD97E,rFgD574E)を用いてα5β1への結合を検討したところ、N端側RGD変異体(rFgD97E)では正常と同様の結合が認められたにもかかわらず、C端側RGD変異体(rFgD574E)ではほとんど結合がみられなかった。以上の結果より、FgのC端側RGD配列がα5β1との結合に関与することが明らかになった。
マクロライド系抗生剤によるオートファジー阻害機構の解明と多発性骨髄腫治療への応用

これまでに、研究代表者はマクロライド抗生剤のオートファジー阻害作用を明らかにし、ボルテゾミブ(BZ)などのプロテアソーム阻害剤との併用による「細胞内タンパク質分解機構の包括的制御」が、骨髄腫細胞株に強力な癌細胞死を誘導することを報告してきた。骨髄腫難治性の原因の一つに微小環境誘導性薬剤抵抗(CAM-DR: Cell adhesion mediated-drug resistance)がある。そこで、CAM-DRに対する本併用投薬法の有効性を検討するために、骨髄腫細胞株と間質細胞株の共培養実験を行ったところ下記の結果を得た。1間質細胞株と骨髄腫株を、セルカルチャーインサートを挟んで接着させ、共培養すると、BZの骨髄腫細胞株に対する殺細胞作用が減弱し、CAM-DRがin vitroでも再現された。2この共培養系にBZを投与した後に、骨髄腫株を分画採取して解析したところ、骨髄腫単独培養群と比較してCHOPなどのpro-apoptoticな小胞体ストレス遺伝子群の発現減弱が認められ、CAM-DRと小胞体ストレス負荷減弱の関連性が示唆された。3この共培養系にBZとマクロライドの併用投与を行うと、共培養系においても骨髄腫株に強力な細胞死誘導作用が認められ、本投薬法のCAM-DRに対する有効性を示唆する結果を得た。4BZとマクロライドの併用により、骨髄腫の小胞体ストレス負荷が一挙に高まり、これと連動して殺細胞効果が誘導されていることが共培養系においても認められた。以上の結果から、細胞内タンパク質分解機構の包括的制御が骨髄腫の小胞体ストレス負荷を増大させ、CAM-DRに対しても有効であり、骨髄腫の治療成績の改善につながることが期待できる。今後はin vivoでの薬理効果の検証を行うと同時に、マクロライドのオートファジー阻害活性の分子基盤解明を進める予定である。これまでの研究により、研究代表者らはクラリスロマイシン(CAM)を初めとするマクロライド抗生剤がオートファジーの阻害作用を持つこと、及び、プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブ(BZ)との併用により骨髄腫細胞に対して小胞体ストレス負荷を介した殺細胞増強効果を生じることを明らかにしてきた。(Moriya S. Int J Oncol. 2013, 2015)近年、骨髄間質細胞(骨髄微小環境)と骨髄腫細胞との相互作用が骨髄腫細胞の増殖・生存を促進し、BZへの抵抗性を生じることが報告されている。そこで骨髄微小環境下での本併用療法の有用性を検証するために、骨髄間質細胞株と骨髄腫細胞株の共培養実験系の構築を試みた。共培養系における細胞識別のために、まず、各種骨髄腫細胞株(RPMI8226, IM-9, KMS-12-PE)のEGFP安定発現株を樹立した。骨髄間質細胞株の単層培養上に各MM細胞株を共培養し、BZ添加後のEGFP陽性で示される骨髄腫細胞株の生細胞数をフローサイトメーターにより経時的に測定すると、骨髄腫単独培養系に比べてBZの殺細胞効果の減弱が観察された。しかし、ここにCAMを同時添加することで殺細胞増強効果が認められた。また、CAM単剤ではストローマ細胞株および骨髄腫細胞株への細胞毒性はほとんど認められなかった。この共培養系における殺細胞増強効果はアジスロマイシン等の他のマクロライドの併用添加でも再現された。以上の結果より、骨髄微小環境下でのBZ抵抗性の克服にマクロライド抗生剤が有用であることが示唆された。骨髄腫細胞株のEGFP安定発現細胞株を樹立したことにより骨髄間質細胞株と骨髄腫細胞株の共培養系において、薬剤添加時に両者を区分し骨髄腫の殺細胞作用を測定することが可能になった。また、この共培養系においてプロテアソーム阻害剤とマクロライドの併用による骨髄腫細胞株の殺細胞作用の増強が確認できた。現在、共培養系における小胞体ストレス、オートファジーのモニタリングシステムの確立も進行中である。そのため、本研究は「おおむね順調に進展している」と考えられる。プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブ(BZ)の登場により長期生存を視野に入れた治療が可能となった多発性骨髄腫であるが、依然完治不能である原因の一つに微小環境(癌細胞とストローマ細胞の相互作用)誘導性薬剤抵抗(CAM-DR)があり、新規治療法の開発ならびに分子病態の解明が求められている。現在までに研究代表者らは1プロテアソーム系とオートファジー系のクロストークを明らかにし、2クラリスロマイシンをはじめとする日常臨床で使用されているマクロライドがオートファジー阻害活性を持つことおよび、BZとマクロライドの併用が骨髄腫細胞株に対して小胞体ストレスを介した細胞死を誘導することを明らかにした。また、3アグリソーム(不良タンパク凝集体)形成阻害能を持つSAHA等をさらに併用することによる「細胞内タンパク分解系の包括的制御」が、従来の認識を遥かに超えて強力な癌細胞死を誘導することを示した。(Moriya S, etal. Int J Oncol. 2011, 2015.)当該年度においては、蛍光タンパク標識骨髄腫・ストローマ細胞株を樹立し、従来難しいとされていた骨髄腫・ストローマ細胞株を直接接着させた共培養系においての両細胞の区別を可能とし、これまでに報告してきた薬剤併用による殺細胞増強作用がストローマ存在下でも有効であり、CAM-DR改善を示唆する結果を得た。