hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
金属錯体と量子ドットクラスターの超分子自由配列.ジンクフィンガーとDNAの利用

金ナノパーティクルを2次元平面上に自在に配列することは、多くの研究者が挑戦している目標であるが、従来の配列法では小型のナノパーティクルを設計パターンどおりに配列させることが出来なかった。本研究はこの問題に対して、重金属捕捉蛋白質MTとDNA結合蛋白質ZFの人工融合蛋白質ZFMTを合成し、金クラスター(Au11)と化学量論的に結合させた後、DNAの高次構造体上に定位することにより、幾何模様を描かせることに成功した。ナノドットを自由に配置するための基礎化学を開発意出来るなら、単一電子トランジスタや量子コンピューター等に応用できると期待される。しかし、通常の自己組織化に基づくナノドットの配列では、周期的な配列しか実現できない。本計画は、DNAに部位特異的に結合するジンクフィンガーモチーフ(以下ZF)に着目し、ナノドットと1:1複合体を形成させ、これをDNAの特定塩基上に結合させる事で、自由配列を行うことを計画した。平成18年度は、ナノドット性を持たないが安定性に勝ると予想されるAu_<11>(PPh_3)_8Cl_3(Au11)を選択し、ZFには5'-TGGTGG-3'を認識する2ドメインのZFを選択した。Au11-ZF複合化について次の2通りの手法を検討した。1)3-メルカプトプロピオン酸(MPA)で置換したAu11をZFに固相合成法で複合化。2)ナノ粒子結合サイトを持つ新規ZFにAu11を複合化。1)は通常金ドットとペプチドを結合させる方法であるが、実験の結果極めて収率が低い。2)による複合化法では、ZFとAu_<11>のリンカーとして生体中の重金属イオン補足蛋白質であるメタロチオネインをZFのC端側に導入した。分光学的手法と質量分析による詳細な検討の結果、この方法が有効であることを予備的にではあるが明らかにすることに成功した(成果は第57錯体討論会他に報告)。その後、改めてメタロチオネインとAu_<11>の結合について、精密な検討を加え、やはり1:1複合体を形成すること、および、金とP、Sの量論比等を明らかにした(2007日本化学会春季年会)。現在DNAへの結合性の高いZFモチーフの探索や、DNA格子への結合性の検討をおこなっている。ナノドットを自由に配置するための基礎化学を開発意出来るなら、単一電子トランジスタや量子コンピューター等の形成のための更に微細なリソグラフィーが開発できる期待される。本計画は、DNAの塩基配列情報とDNAに部位特異的に結合するジンクフィンガーモチーフ(以下ZF)に着目し、ナノドットと1:1複合体を形成させ、これをDNAの特定塩基上に結合させる事で、自在配列を行うことを計画した。平成19年度は、平成18年度の成果をもとにAu_<11>(PPh_3)_8Cl_3(Au11:ナノドット性を持たないが安定性に勝る)を、また、ZFとして2ドメインのZF(F2F2:5'-GGGGGG-3'を認識)を選択し,リンカーとしてメタロチオネイン(MT)を選択し、1)MT=Au_<11>1:1複合化の可能性を、HPLC,CD,UV-vis,TEM,EDS,電気泳動等を駆使して詳細に検討し、これが可能であることを明らかにした。(第58錯体討論会他に報告,投稿中)。2)その後、ZF:MT:Au11=1:1:1複合体の形成についても精密な検討を加え、形成条件、フリーシステイン数の割り出し、DNAとの結合性(現在電気泳動)を明らかにした(第58錯体討論会、2008日本化学会春季年会)。現在、DNA格子の形成条件の検討と、ZF-MT-Au11のDNA格子への結合性の検討をおこなっている。また、Au55の導入やアデニンメルカプタンを金ドットに導入し、これをDNA格子中に設置したTxループに結合させる検討も開始した。一方、[Ru(bipy)_3]を導入した金属錯体ZF複合体の形成にも成功しており、DNA上への自在配列にも成功しているので、今後、[Ru(bipy)_3]、AuXをDNA上に配列させることも可能になると考えている。ナノドットを自由に配置するための基礎化学の開発は、単一電子トランジスタや量子コンピューター等の形成のための極微なリソグラフィーの開発に繋がる。本計画はDNAに部位特異的に結合するジンクフィンガーモチーフ(以下ZF)に着目し、ナノドットと1:1複合体を形成させ、これをDNAの特定塩基上に結合させる事によって自在配列を行うもので、新しいDNAリソグラフィーの創始を計画したものである。

平成20年度は、平成18,19年度の成果(JCS Dalton in press)をもとにナノドットとしてAu_<11>(PPh_3)_8Cl_3(Au11)を、ZFとして2ドメインのF2F2(F2:5'-GGGGGG-3'を認識)を選択し,リンカーとしてメタロチオネイン(MT)を選択して、1)F2F2-MT-Au_<11>の1:1:1複合化の合成例を増やすとともに、HPLC,CD,UV-vis,TEM,EDS,電気泳動等を駆使して詳細に検討し、形成条件、フリーシステイン数の割り出し、DNAとの結合性(現在電気泳動)を明らかにした(投稿準備中)。現在、DNA格子の形成条件の検討と、ZF-MT-Au11のDNA格子への結合性の検討をおこなっている。一方、アデニンメルカプタンを金ドットに導入し、これをDNA中に設置したTxループに結合させることに成功した(投稿準備中)。現在さらにdouble crossover DNAの格子上への配列を目指してDNAリソグラフィー実現にむかって展開中。なお、量子ドットの入力装置としての[Ru(bipy)_3]-ZF複合体をDNAおよびdxDNA上へ自在配列することにも成功した(投稿準備中)ので、上記ドット系との合体に向けて準備中である。
高圧処理デンプンのガラス状態に関する研究

本研究の目的は、高圧処理が澱粉の状態変化に及ぼす影響について調べることであった。馬鈴薯澱粉-水混合物(澱粉含量10-80%w/w)を試料とし、様々な条件(400-1200MPa、20-70°C、1-66時間)で高圧処理した。高圧処理澱粉の状態変化は主に示差走査熱量計を用いて調べた。澱粉含量10-20%試料は、高圧処理温度の上昇と共に糊化度が増加し、糊化圧力(澱粉が完全に圧力糊化するのに要する圧力)が低下した。澱粉含量30-50%試料においても、高圧処理温度の上昇と共に糊化度は上昇したが、いずれの処理温度においても糊化圧力は一定であった。熱による糊化の場合、澱粉含量が30%以上の低水分試料では糊化に要する水分が欠乏するため、部分的な糊化が起こった後、残存するアミロペクチン結晶の融解が高温で起こることが知られている。この結果を踏まえると、高圧処理による糊化は処理温度の上昇と共に進行し易くなるが、アミロペクチン結晶の融解は処理温度に殆ど影響しない、と考えられる。また、澱粉含量20-60%の試料には老化が認められた。処理温度が低いほど、老化が促進されることが明らかとなった。高圧処理時間が圧力糊化及び老化に及ぼす影響は殆どなかった。しかし、高圧処理時間が長くなると共に糊化開始温度が上昇することが明らかとなった。これは澱粉粒子中のアモルファス相の密度が高圧処理中に高くなり、糊化する際の水分移動が停滞したためと考えられる。高圧処理が澱粉のガラス転移温度及びガラス転移に伴う熱容量変化に及ぼす影響は顕著ではなかった。ガラス状態にある澱粉の分子運動性は見かけ上凍結しているため、高圧処理に対してもその状態は殆ど変化することはなかったと考えられる。圧力応答の視点から、食品がガラス状態にあると分子運動性が低く、長期安定であるという見解を支持する結果が得られた。本研究の目的は、高圧処理による澱粉の糊化や老化、ガラス転移や構造緩和といった状態変化やそれに伴う諸物性の変化について検討し、加熱処理澱粉と比較する事で、高圧加工技術の有用性、特異性を探ることである。研究1年目となる本年度では、まず基礎的知見の集積を目的とし、処理圧力及び澱粉の水分含量が高圧処理澱粉の物性変化に及ぼす影響について検討した。本研究では馬鈴薯澱粉を試料として用いた。水分含量2090%(w/w)に調製した馬鈴薯澱粉を、40°Cの圧力媒体中で1時間、0.41.2GPaで高圧処理した。各高圧処理澱粉の糊化エンタルピー変化(ΔH)を示差走査熱量計にて、結晶構造の変化をX線回折によって調べた。水分含量4090%の澱粉は、処理圧力及び澱粉の水分含量が高くなるに従い、圧力糊化の進行を意味するΔHの低下、結晶性の低下を意味するX線ピーク強度の低下が顕著となった。1.2GPaまでの圧力処理によって水分含量5090%の澱粉が完全に糊化した。また、水分含量4060%の澱粉では、老化澱粉の再糊化を意味する約40°Cからのブロードな吸熱ピークも認められた。この結果は高圧処理直後から澱粉が老化していたことを示唆する。水分含量が30%の試料には1.2GPaの処理圧力でさえΔHやX線強度の変化は殆ど見られなかった。しかし水分含量が20%にまで低下すると、若干ΔHが低下する傾向が認められた。水分含量20%の澱粉は常温でガラス状態にあることが知られていることから、澱粉のガラス転移が高圧糊化特性に影響を及ぼすことが示唆される。以上の結果を踏まえ、高圧処理によってもたらされる澱粉の様々な物性変化を処理圧力対水分含量の状態図としてまとめた。

また、澱粉含量20-60%の試料には老化が認められた。処理温度が低いほど、老化が促進されることが明らかとなった。高圧処理時間が圧力糊化及び老化に及ぼす影響は殆どなかった。しかし、高圧処理時間が長くなると共に糊化開始温度が上昇することが明らかとなった。これは澱粉粒子中のアモルファス相の密度が高圧処理中に高くなり、糊化する際の水分移動が停滞したためと考えられる。高圧処理が澱粉のガラス転移温度及びガラス転移に伴う熱容量変化に及ぼす影響は顕著ではなかった。ガラス状態にある澱粉の分子運動性は見かけ上凍結しているため、高圧処理に対してもその状態は殆ど変化することはなかったと考えられる。圧力応答の視点から、食品がガラス状態にあると分子運動性が低く、長期安定であるという見解を支持する結果が得られた。
介入プログラムを活用した初発乳がん患者のレジリエンスを高める看護実践モデルの開発

乳がん患者のQOL向上を目指し、乳がん診断から周手術期及び術後治療の選択から治療過程に入る準備期の、がん診断・治療の早期に焦点をあてた看護介入プログラムを活用した初発乳がん患者のレジリエンスを高める看護実践モデルを開発した。準実験研究デザインによる看護介入・縦断調査の結果、看護介入群は対照群に比べて、全体的なQOLが時間経過に沿って向上していた。術後1年時点の看護介入群の面接より【見通し通りの治療過程を進む安堵】【選択した治療内容の満足】【治療をやり遂げる自分への自信】等が確認された。乳がんと初期治療の理解に関する認知的支援は、治療完遂に向けて眼前の困難を乗り越える力を高めることが示唆された。本研究は罹患率死亡率共に増加が著しい成人期女性乳がんに焦点をあて、看護介入プログラムを活用した治療過程に在る初発乳がん患者のレジリエンスを高める看護実践モデルの開発を目的とする。研究は段階的に実施し、看護実践モデルは初発乳がん患者の治療過程に沿った即戦力を有する汎用性のある内容とする。平成25年度(1年目)は、研究段階Iの初発乳がん患者のレジリエンスを高める介入プログラムを活用した準実験研究デザインによる看護介入・縦断調査[基礎調査]に着手した。調査の実施に先立ち、以下の2点について検討と確認を行なった。1.看護介入の等質性の確保、2.質問紙調査によるデータ収集時点。その結果、1.について、複数年に亘る基礎調査であることを鑑み、研究協力施設で展開される日常の看護業務に支障をきたさぬことを念頭に、研究参加者への介入内容の均質保持を目的として次のように整えた。初発乳がん患者のレジリエンスを高めるために考案した介入プログラムにおける支援内容である(1)乳がんと初期治療の理解に関する認知的支援、(2)がん罹患や治療に伴う困難な状況に屈しない情緒的支援、(3)初期治療過程に対する肯定的な見通しがもて治療中の生活過程を整える教育的支援について、視聴覚教材(DVD)に全内容を収め、これを媒体として活用することとした。併せて、乳がん診療に係る最新情報と照合した。介入時期については、当初計画通りの実施とした。2.について、治癒や長期に再発しないことを目的として初発乳がん患者が臨む初期治療において、術後治療(adjuvant therapy)過程の患者のレジリエンスを綿密に調査するため、調査時点を当初計画の5時点から6時点に増やすこととした。以上に加え、研究協力施設の乳腺専門医並びに乳がん看護認定看護師を協力者として新規投入し、研究環境を整備し基礎調査に向けて安定的に進めた。本研究は成人期女性乳がんに焦点をあて、看護介入プログラムを活用した治療過程に在る初発乳がん患者のレジリエンスを高める看護実践モデルの開発を目的とする。研究は実施計画に基づき段階的に展開中であり、平成26年度(2年目)は以下の研究実績が得られた。1.研究段階Iの基礎調査「初発乳がん患者のレジリエンスを高める介入プログラムを活用した準実験研究デザインによる看護介入・縦断調査」を継続し、新規研究参加者18名の協力を得て、術前期から手術後1年まで順次円滑に質問紙調査を実施した。2.看護介入群の研究参加者を対象として、1回目の面接時期である術後治療過程に入る準備期に半構成的面接調査を行ない、個別分析を実施した。3.上記2.に加えて、初発乳がん患者のレジリエンスを高める看護実践モデル案作成に向けた基礎資料とすることを目的に、次の2件の面接調査を実施した。(1)看護介入群・対照群の家族について、初発乳がん患者と共に在る家族の心理的状況を明らかにすることを目的として、配偶者及び娘・息子に半構成的面接調査を実施した。(2)初期治療完遂後、経過観察のために定期通院を続ける乳がん患者の心理的状況を明らかにすることを目的として、4名を研究参加者として非構造化面接調査を実施した。質的分析により、[生活に工夫・実行を重ね再発を避ける]、[女性として在り続ける]、[純粋に乳がん体験を役立たせる]、[自己の生存を確認する]等に整理された。治療完遂後に在る初発乳がん患者は日常生活に実効を課し、先ずは術後10年生存への強い意志を有している状況が明らかとなった。これらの結果からは、治療努力への報奨に向け、初期治療過程においては、初期治療後の経過観察期を踏まえた看護介入が必要と示唆された。本研究は罹患率死亡率共に増加が著しい女性乳がんに焦点をあて、看護介入プログラムを活用した治療過程に在る初発乳がん患者のレジリエンスを高める看護実践モデルの開発を目的とする。研究は実施計画に基づき段階的に展開中であり、平成27年度(3年目)は以下の研究実績が得られた。1.研究段階Iの基礎調査「初発乳がん患者のレジリエンスを高める看護介入プログラムを活用した準実験研究デザインによる看護介入・縦断調査」を継続した。(1)術前期から手術後1年迄の6時点において、調査票によるデータ収集を続行した(研究参加者43名)。(2)看護介入群の研究参加者を対象として、面接時期1回目(術後治療選択時点)及び2回目(手術後1年時点)に半構成的面接を行ない質的分析を実行した。2.研究段階II「患者の評価に基づく介入効果と介入プログラムの有用性の検討及び看護実践モデル案作成に係る課題の整理」に研究を進めた。(1)手術後

1年時点の面接内容の質的分析結果より、乳がん診断・治療の早期に焦点をあてた看護介入は、困難で脅威的な状況の中、眼前の困難を乗り越える力を高め、肯定的未来思考で意思決定する共に、患者は早期から医療者と「つながっている」実感をもてることが明らかとなった。よって患者の語りからはその効果が確認された。統計学的手法によるデータ分析を今後実施していく。(2)質的分析結果の検討より、術後抗がん剤治療を受ける初発乳がん患者の心理的状況として[予想を超えた体感の有害事象による身体的苦痛への苛立ち]、[治療開始前の脱毛準備では不満足な整容性への継続的関心]、[治療と就業両立の緊急的検討による社会的機能維持への意思]等が整理された。治癒を期待する治療完遂に向け、身体的苦痛軽減の対処、肯定的自己像の保持、社会的活動が果たせる役割維持に係る調整への支援が治療過程に在る患者のレジリエンスを高める看護課題と示唆された。本研究は研究目的の達成に向けて、臨床における円滑かつ連携のとれた安定した研究環境のもと、研究実施計画に基づいて段階的に展開できている。本研究は罹患率死亡率共に増加が著しい女性乳がんに焦点をあて、看護介入プログラムを活用した治療過程に在る初発乳がん患者のレジリエンスを高める看護実践モデルの開発を目的とする。研究は実施計画に基づき段階的に展開し、平成28年度(4年目)は以下の研究実績が得られた。1.段階I「初発乳がん患者のレジリエンスを高める看護介入プログラムを活用した準実験研究デザインによる看護介入・縦断調査」における全てのデータ収集を完了した。2.段階II「患者の評価に基づく介入効果と介入プログラムの有用性の検討及び看護実践モデル案作成に係る課題の整理」について:(1)看護介入群の研究参加者(29名)を対象とした面接調査内容の質的分析を実施した。その結果、初期治療完遂に向けて次の2点が整理された。術後抗がん剤治療選択時では、患者は体験の浅いなかで予後を左右する治療内容の選択となる。よって患者の情報的・情緒的な援助要請の内容を適切に把握し、意思決定できる速やかな支援が課題である。また、長期に亘る術後ホルモン療法では、治療体験における患者の努力の過程への情緒的支持並びにがん治療に関する最新情報提供への要望に係る応答等が看護課題である。(2)質問紙を用いた縦断調査について、統計学的手法によるデータ分析を開始した。3.段階III「介入プログラムを活用した初発乳がん患者のレジリエンスを高める看護実践モデルの開発」に研究を進めた。データ分析結果をもとに順次討議を重ね、看護実践モデル案の作成に向けて、介入プログラムを精錬中である。縦断調査についてデータ分析中であり、看護実践モデル案の作成および実用性の点検途上にある。本研究は、罹患率死亡率の増加が著しい成人期女性乳がんに焦点をあて、看護介入プログラムを活用した治療過程に在る初発乳がん患者のレジリエンスを高める看護実践モデルの開発を目的とした。研究実施計画に基づき段階的に実行し、最終年度は以下の研究成果が得られた。1.段階Iの「準実験研究デザインによる看護介入・縦断調査」により収集した質問紙調査データ(期間:術前から術後1年)について統計学的分析を進めた結果、看護介入群は対照群に比べて、1)全体的なQOLが時間経過に沿って向上していた、2)病状や治療に関する自分自身の知識について満足していた。
細胞・実空間スケールを統合した脳外傷バイオメカニクスの実験的研究

交通事故等の各種事故において頻度・重症度から脳外傷の予防が重要であるが,その評価は既存の頭部傷害基準では困難である.脳外傷を評価可能な傷害基準を制定するためには,(a)製品評価用ダミーで計測可能な頭部の剛体運動,(b)脳実質変形,(c)細胞スケール損傷までの空間的にスケールが異なる関係をシームレスに解明することが必要である.そこで本研究では,(a)頭部の剛体運動と(b)脳実質変形の関係について超精密頭部実体モデルの構築とその衝撃実験を実施し,頭蓋骨の剛体運動と脳深部変形挙動の関係を明らかにするとともに,(b)脳実質変形と(c)細胞スケール損傷の関係を解明するために,培養神経細胞としてPC12細胞をシリコーンゲル状に培養した神経細胞培養脳実体モデルを構築し,脳実質変形と細胞損傷との関係を解明することを目標とした.本研究の結果,特に側方衝突を模擬した衝撃条件下において,脳深部変形挙動のメカニズムとして,頭蓋骨-脳間の相対回転にともなう,左右大脳の逆向き回転による脳深部せん断変形が重要であることを明らかにした.さらに,脳実質モデルのせん断ひずみ,主ひずみともに0.25近傍にて,神経突起損傷率が急激に上昇することを明らかにした.交通事故等の各種事故において頻度・重症度から脳外傷の予防が重要であるが,その評価は既存の頭部傷害基準では困難である.脳外傷を評価可能な傷害基準を制定するためには,(a)製品評価用ダミーで計測可能な頭部の剛体運動,(b)脳実質変形,(c)細胞スケール損傷までの空間的にスケールが異なる関係をシームレスに解明することが必要である.そこで本研究では実人体と形状・材料特性が等価な培養細胞接着脳物理モデルに対して,実事故レベルの外力を与えることにより,頭蓋骨の剛体運動スケールから脳深部の細胞変形スケールに至る脳外傷メカニズムを実験的にシームレスに解明することを目標としている.本年度は,昨年度に引き続き,(b)脳実質変形と(c)細胞スケール損傷の関係を解明するために,培養神経細胞としてPC12細胞をシリコンゲル状に培養した神経細胞培養脳実体モデルを構築し,本モデルに対して回転衝撃を与え,脳実質モデルのひずみ分布をデジタル画像相関法により実施するとともに,神経細胞の形態変化観察を光学顕微鏡により実施した.コントロール条件下における神経突起損傷率を除外し,ロジスティック回帰モデルにより,神経突起損傷率を算出した.その結果,脳実質モデルのせん断ひずみ,主ひずみともに0.25近傍にて,神経突起損傷率が急激に上昇することを明らかにした.以上より,本研究は超精密頭部実体モデルを用いることにより,(a)頭部の剛体運動と(b)脳実質変形の関係において,頭蓋骨-脳間の相対回転にともなう,左右大脳の逆向き回転による脳深部せん断変形が重要であることを解明し,培養神経細胞モデルを用いることにより,(b)脳実質変形と(c)細胞スケール損傷の関係において,脳深部せん断変形と神経突起損傷率の関係を定量的に明らかにした.交通事故等の各種事故において頻度・重症度から脳外傷の予防が重要であるが,その評価は既存の頭部傷害基準では困難である.脳外傷を評価可能な傷害基準を制定するためには,(a)製品評価用ダミーで計測可能な頭部の剛体運動,(b)脳実質変形,(c)細胞スケール損傷までの空間的にスケールが異なる関係をシームレスに解明することが必要である.そこで本研究では,(a)頭部の剛体運動と(b)脳実質変形の関係について超精密頭部実体モデルの構築とその衝撃実験を実施し,頭蓋骨の剛体運動と脳深部変形挙動の関係を明らかにするとともに,(b)脳実質変形と(c)細胞スケール損傷の関係を解明するために,培養神経細胞としてPC12細胞をシリコーンゲル状に培養した神経細胞培養脳実体モデルを構築し,脳実質変形と細胞損傷との関係を解明することを目標とした.本研究の結果,特に側方衝突を模擬した衝撃条件下において,脳深部変形挙動のメカニズムとして,頭蓋骨-脳間の相対回転にともなう,左右大脳の逆向き回転による脳深部せん断変形が重要であることを明らかにした.さらに,脳実質モデルのせん断ひずみ,主ひずみともに0.25近傍にて,神経突起損傷率が急激に上昇することを明らかにした.交通事故等の各種事故において頻度・重症度から脳外傷の予防が重要であるが,その評価は既存の頭部傷害基準では困難である.脳外傷を評価可能な傷害基準を制定するためには,(a)製品評価用ダミーで計測可能な頭部の剛体運動,(b)脳実質変形,(c)細胞スケール損傷までの空間的にスケールが異なる関係をシームレスに解明することが必要である.

そこで本研究では実人体と形状・材料特性が等価な培養細胞接着脳物理モデルに対して,実事故レベルの外力を与えることにより,頭蓋骨の剛体運動スケールから脳深部の細胞変形スケールに至る脳外傷メカニズムを実験的にシームレスに解明することを目標としている.本年度は,(a)頭部の剛体運動と(b)脳実質変形の関係について超精密頭部実体モデルの構築とその衝撃実験を実施し,頭蓋骨の剛体運動と脳深部変形挙動の関係を明らかにした.特に側方衝突を模擬した衝撃条件下において,脳深部変形挙動のメカニズムとして,頭蓋骨-脳間の相対回転にともなう,左右大脳の逆向き回転による脳深部せん断変形が重要であることを明らかにした.加えて,(b)脳実質変形と(c)細胞スケール損傷の関係を解明するために,培養神経細胞としてPC12細胞をシリコンゲル状に培養した神経細胞培養脳実体モデルを構築し,本モデルに対して回転衝撃を与えた.本実験において,脳実質モデルのひずみ分布をデジタル画像相関法により実施するとともに,神経細胞の形態変化観察を光学顕微鏡により実施した.その結果,せん断変形による神経突起の断裂・退縮・膨張を確認するとともに,最大せん断ひずみの増加および衝撃付加後の時間経過によって神経突起の損傷率が上昇することを明らかにした.研究計画書記載の培養神経細胞脳モデルの構築も行えており,初年度に予定していた衝撃実験装置の構築とそれによる脳変形挙動計測と神経細胞の形態変化の観察も実施できているからである.加えて,超精密頭部実体モデルにより頭部剛体運動と脳実質変形の関係を可視化することができた.今年度は前年度に構築した培養神経細胞による衝撃実験系により,衝撃実験の回数を大幅に増加させ,脳実質ひずみと神経細胞レベル損傷との関係を明らかにする.特にひずみ,ひずみ速度レベルに関する実験条件をコントロールし,脳実質ひずみと神経細胞損傷率との関係を明らかにする.また,有限要素モデルによるシミュレーションによりひずみ計測領域内のマクロなひずみ分布と,神経細胞周辺の局所領域のひずみ集中との関係について検討する予定である.平成24年度は衝撃実験を多数実施するためにピペット,シャーレ等の消耗品の消費が多くなると予想される.また,脳実質モデル構築用消耗品も同様の理由で消費が大きい.したがって消耗品費が大半を占めるため,これに500千円を計上した.加えて,国内学会発表の旅費として2回分の100千円,論文投稿時の校閲料を100千円計上した.
デュアルファンクションポリマーによる持続的抗菌性発現技術の開発

平成29年度までに得られた結果から、作製したMDPB/BMA、MDPB/MPC/BMA、MPC/BMAのコポリマーをコーティングしたレジン試料のうち、MDPBとMPCを組み合わせたMDPB/MPC/BMAコーティングレジン試料が唾液存在下での抗菌効果の発現に最も期待できると考えられた。本年度は、上記3種のコーティング試料を用いて、各試料上でのバイオフィルム形成抑制効果を評価した。得られた三次元画像からバイオフィルムの厚みを測定したところ、MPCを含むMPC/BMAおよびMDPB/MPC/BMAのコーティング試料上では、MDPB/BMAや非コーティングのレジン試料に比べて、形成したバイオフィルムの厚みが小さくなることが分かった。また、各試料上でのバイオフィルム中の生菌・死菌の割合を画像解析によって算出したところ、MDPBを含むMDPB/BMAおよびMDPB/MPC/BMAでは死菌率がそれぞれ60.5%および62.5%と高い値を示したのに対して、MPC/BMAでは死菌率が37.5%と低かった。さらに、MDPB/MPC/BMAコーティング試料上でのバイオフィルムの付着状態を走査型電子顕微鏡にて観察したところ、非コーティングのレジン試料に比べて明らかに付着菌数が少なかった。各コーティング試料表面におけるタンパク吸着阻害効果を評価するため、Fluorescein isothiocyanate(FITC)ラベルウシ血清アルブミン溶液に試料を浸漬し、共焦点レーザー顕微鏡によりウシ血清アルブミンの吸着状態を観察した。また、各コーティング試料をウシ血清アルブミン溶液に浸漬後、ドデシル硫酸ナトリウム溶液を用いて吸着したウシ血清アルブミンを回収し、BCAプロテインアッセイにて、ウシ血清アルブミンの吸着量を測定した。その結果、MDPB/MPC/BMA = 15/15/70、5/25/70、0/30/70の3種のコーティング試料では、ウシ血清アルブミンの有意な吸着抑制が認められた。また、MPCの濃度が高くなるにしたがって、ウシ血清アルブミンの吸着量が減少することが分かった。平成28年度の研究実施計画に則り、MDPB/MPCコポリマーを合成し、その表面におけるタンパク吸着阻害効果の検討を行って、前述のような結果を得た。以上のことから本研究の進捗は、おおむね順調に進展していると判断できる。平成28年度までに得られた結果に基づいて、MDPB、MPC、およびBMAを重量比で30/0/70、25/5/70、15/15/70、5/25/70、0/30/70の割合で混合し、ラジカル重合させた後、未反応物の除去を行い、5種の精製コポリマーを得た。合成した各ポリマー粉末をエタノールに溶解させてコート液を作製し、PMMAレジンディスクを浸漬して、MDPB/MPC/BMAコーティング試料を作製した。作製した各コーティング試料のStreptococcus mutansの付着抑制効果を検討するため、各コーティング試料をS. mutansの菌液に浸漬し、24時間培養後、付着した細菌を回収し、コロニーカウント法により菌数測定を行った。その結果、MDPB/MPC/BMA =30/0/70、25/5/70、15/15/70の3種のコーティング試料上ではS. mutansが完全に死滅した。これらの結果と、MPCの濃度が高くなるにしたがってウシ血清アルブミンの吸着量が減少するという平成28年度の報告を踏まえて、作製した5種のうちMDPB/MPC/BMA =15/15/70のコーティング試料が唾液存在下での抗菌効果の発現に最も期待できると考えられた。そこで、MDPB/MPC/BMA =15/15/70のコーティング試料に唾液処理を施し、唾液タンパクの吸着阻害効果、およびS. mutansの付着抑制効果を評価した。BCAプロテインアッセイにてコーティング試料上での唾液タンパクの吸着量を測定した結果、コーティングを行っていないコントロールレジンに比べてタンパク吸着量が有意に減少した。また、上述の抗菌試験と同様に、唾液処理したコーティング試料のS. mutansの付着菌数をコロニーカウント法により測定したところ、コントロールレジン上では24時間培養後、菌数が増加したのに対して、コーティング試料上では唾液存在下でもS. mutansが完全に死滅することが分かった。平成29年度の研究実施計画に則り、作製したMDPB/MPCコポリマーの唾液存在下での口腔細菌の付着抑制効果の検討を行って、前述のような結果を得た。

また、各試料上でのバイオフィルム中の生菌・死菌の割合を画像解析によって算出したところ、MDPBを含むMDPB/BMAおよびMDPB/MPC/BMAでは死菌率がそれぞれ60.5%および62.5%と高い値を示したのに対して、MPC/BMAでは死菌率が37.5%と低かった。さらに、MDPB/MPC/BMAコーティング試料上でのバイオフィルムの付着状態を走査型電子顕微鏡にて観察したところ、非コーティングのレジン試料に比べて明らかに付着菌数が少なかった。平成28年度に得られた結果に基づいて、作製したMDPB/MPCコポリマーの唾液存在下での口腔細菌の付着抑制効果およびバイオフィルム形成抑制効果を検討する。平成29年度に得られた結果に基づいて、作製したMDPB/MPCコポリマーコーティング試料のバイオフィルム形成抑制効果を検討する。上述のように、ランダム共重合によって作製したポリマーをレジン試料にコーティングすることで、タンパク吸着阻害効果を発揮することが確認できた。そのため、十分なタンパク吸着阻害効果が得られなかった場合に予定していたブロック共重合体の作製や、その評価に係る試薬、消耗品を平成28年度に購入する必要がなかったため。上述のように、平成28年度と平成29年度前半までに得られた結果から、タンパク吸着および細菌付着に対する抑制効果をともに備えたコーティング試料として、作製した5種の試料のうち1種のコーティング試料に絞ることができた。そのため、唾液存在下でのタンパク吸着、および抗菌効果を評価した平成29年度後半の評価試験では、他の4種のコーティング試料の評価に係る試薬、消耗品を購入する必要がなく、当初の計画よりも効率的な経費の使用が可能であった。次年度は、MDPB/MPCコポリマーコーティング試料のバイオフィルム形成抑制効果を、その効果の持続性を含めて検討する予定であり、培地や試薬、また長期培養を行うための器材を購入する。また、これらの研究遂行に係る消耗品は、上記の研究計画に則り必要性を吟味し効果的に使用する。次年度は、MDPB/MPCコポリマーコーティング試料の口腔細菌の付着抑制効果およびバイオフィルム形成抑制効果を検討する予定であり、培地や試薬、また吸光度測定等のための器材を購入する。
美しい農村構造物のための研究

農村景観の美しさを検討するために、フラクタル理論を応用した景観評価手法を5種類開発し、風景画、農村写真集、我々で撮影した農村風景写真および河川を中心とした農村風景写真に対して適用した。解析対象とした風景画は、日本の浮世絵と、印象派の風景画である。解析結果は、フラクタル性が良く成立するというものであった。これは、フラクタル性の成立の良し悪しを景観の良し悪しの判断材料にすることができる可能性を示している。河川を中心とした風景に対しては、5種類すべての景観評価手法を適用した。その結果、1種類の評価手法のみによる場合よりも、幾つかの手法を組み合わせたときの方が、的確に景観の評価ができることが判明した。我々が撮影した農村風景写真95枚に対しても、5種類すべての景観評価手法を適用した。河川を中心とした風景よりも複雑な構造を持っていることが判明した。また、フラクタル理論による景観評価を行った河川を中心とした農村風景写真60枚に対して、アンケート調査を行い、フラクタル理論による客観的な景観評価と人間による主観的な景観評価の対応を検討した。アンケート結果による景観評価では、河川を中心とした農村景観は、整然とした人工的な景観、整然とした自然的な景観、雑然とした人工的な景観、雑然とした自然的な景観の4種類に分類されることが判明した。これらの分類とフラクタル解析結果との対応としては、整然とした人工的な景観のみが特徴的な分布を示し、その他の3種類は区別がつきにくいものが多かった。しかし、パワースペクトルを利用したフラクタル解析では、整然として安全を感じさせ好まれる自然的な景観が特徴的な分布を示した。したがって、我々の開発した5種類の景観評価手法を組み合わせれば、地域の風土を生かした修景や、景観へのインパクトを最小にした開発手法が検討できると思われる。本年度は農村景観の美しさを検討するために、フラクタル理論を応用した景観評価手法を5種類開発し、風景画、農村CD-ROM写真集、我々で撮影した農村風景写真および河川を中心とした農村風景写真に対して適用し、農村景観の評価を適切に行う方法を検討した。開発した評価法は、(1)写真のエッジを抽出し、その後ボックスカウンティング法でフラクタル性を検討するもの、(2)写真の色分布を色彩空間上に変換し、その空間でのフラクタル性を検討するもの、(3)写真の色分布の変化を、色彩空間上の距離で決定し、その変動をスケール変換してフラクタル性を検討するもの、(4)(3)と同じく写真の色分布の変化を決定し、その変動を空間周波数解析してフラクタル性を検討するもの、(5)(3),(4)と同じく写真の色分布の変化を決定し、その変化をセミバリオグラムで定義し、フラクタル性を検討するものである。一方解析対象とした風景画は、日本の浮世絵と、印象派の風景画である。ヨーロッパでは一般に風景画とは、田園風景を描いた絵と認識されているので、農村景観解析に適した対象である。しかし、美しい景観を撮影しているハズのCD-ROM写真集と、それよりは美しさが落ちると思われる我々の撮影した農村風景写真では、どちらかと言えば、我々の撮影した農村風景写真の方がフラクタル性が良く成立した。けれども、フラクタル次元による地域性の違いを示す結果も得られ、風土を生かした景観設計への一歩になっていると思われる。

その結果、1種類の評価手法のみによる場合よりも、幾つかの手法を組み合わせたときの方が、的確に景観の評価ができることが判明した。昨年度開発したフラクタル理論を応用した景観評価手法5種類を、我々が撮影した農村風景写真95枚に対して適用した。また昨年度フラクタル理論による景観評価を行った河川を中心とした農村風景写真60枚に対して、アンケート調査を行い、フラクタル理論による客観的な景観評価と人間による主観的な景観評価の対応を検討した。本年度行った95枚の写真に対する景観評価は、昨年度行った河川を中心とした農村景観評価より複雑な構造を持っていることが判明した。すなわち、河川を中心とした景観評価では大きく分けると、過度に整備された人工的な景観で好まれないものと、適度に整備された自然な景観で好まれるものの2種類に分類されたが、本年度の一般的な農村景観評価では、上記の2種類に加え、あまりに整備されていないために好まれない景観が存在した。アンケート結果による景観評価では、河川を中心とした農村景観は、整然として安全を感じさせるがあまり好まれない人工的な景観、整然として安全を感じさせ好まれる自然的な景観、雑然として危険を感じさせあまり好まれない人工的な景観、雑然として危険を感じさせ好まれる自然的な景観の4種類に分類されることが判明した。これらの分類とフラクタル解析結果との対応としては、整然として安全を感じさせるがあまり好まれない人工的な景観のみが特徴的な分布を示し、その他の3種類は区別がつきにくいものが多かった。しかし、パワースペクトルを利用したフラクタル解析では、整然として安全を感じさせ好まれる自然的な景観が特徴的な分布を示した。したがって、我々の開発した5種類の景観評価手法を組み合わせれば、景観の破壊を防いだり、景観へのインパクトを最小にした開発手法が検討できると思われる。
ＣＴエンテロクリーシスを用いた小腸炎症疾患の新たな画像分類の構築

我々は82例の消化管出血症例に対して、CTエンテロクリーシスを施行し、その中で薬剤性小腸粘膜障害と診断された11症例ついてのCT所見を解析した。薬剤性小腸障害のCT所見は多彩な所見を呈していたが、薬剤服用期間によって所見に違いがみられる事に着目し、画像所見を3typeに分類した。小さな粘膜濃染を呈する症例(Type1)は薬剤短期服用患者に多く、しばしば多発した。腸管壁が均一に濃染される症例(Type2)は長期服用患者に多くみられた。腸管壁が層構造を呈する症例(Type3)は短期服用と長期服用の両者において観察された。前年度から引き続き、薬剤性小腸粘膜障害のCT分類を進めている。これまでの結果から薬剤性小腸粘膜障害のCT所見はType 1 (粘膜型;粘膜の変化が主体で、強い壁肥厚を伴わない)、Type 2 (壁均一造影型;腸管壁全体が強く濃染される。周囲の炎症波及や腸管壁の肥厚を伴う)、Type 3 (壁多層造影型;腸管壁は各層の造影効果の差により層構造を呈する。活動性炎症と浮腫を反映。)の3typeに分類された。Type1は薬剤短期服用例に多くみられ、多発する傾向にあった。内視鏡では比較的小さな潰瘍やびらんに対応していた。このtypeはCTでの所見が軽微で、病変も小さいため、見逃さないように注意が必要であった。Type2は薬剤長期服用例にみられ、比較的強い炎症変化が示唆された。近傍の脂肪織炎やリンパ節腫大など周囲への炎症波及を合併することも多かった。内視鏡では比較的大きな潰瘍や粘膜障害に対応していた。Type3は短期服用例と長期服用例の両者にみられた。このtypeは粘膜下に低吸収域を認めるのが特徴であるが、短期服用例では浮腫を、長期服用例では線維化を反映していると思われた。特に長期服用例では高度な内腔の狭窄を伴うことが多く、カプセル内視鏡の長期停滞を来たした症例もみられた。内視鏡では強い浮腫を伴う潰瘍や輪状の潰瘍瘢痕に対応していた。これらの研究成果は第72回医学放射線学会総会、第44回日本消化器がん検診学会中国四国地方会にて発表した。放射線医学本研究の初期成果は第44回日本消化器がん検診学会中国四国地方会にて発表した。薬剤の服用期間によってCT所見が異なることに注目してCT分類が進んでおり、おおむね順調に進展していると評価した。薬剤の服用期間によるCT所見の変化、臨床的な意義など解析を進め、論文を作成していきたい。現在、本研究の初期検討で薬剤性小腸粘膜障害のCT所見の構築が進んでいる。今後、症例数を増やして、CT画像所見の臨床的意義や画像分類の構築を進めていきたい。画像整理が研究の主体となり、USB接続、外付けHDD2.0TB(9,975円)の購入のみにとどまりました。平成25年度の未使用分(190,025円)は1学会出張に伴う旅費(第22回消化器関連学会機構・神戸、2014.10.23ー26)、2パーソナルコンピュータ(NEC VALUESTAR N)、3メモリスティックDuoアダプタMSACーM2、ソニー、に使用予定です。平成26年度の予算(200,000円)は1CDR TDKデータ用CD-R 700MB、2デジタルカメラPowerShot G1X、3プリンタColorio IP-905Aおよび学会出張旅費(第50回日本医学放射線学会秋季臨床大会・神戸、2014・9・26ー28)にて使用予定です。該当なし
細胞起源よりみた脳下垂体腺腫の機能的病理分類の確立

下垂体腺腫の分類は、従来臨床内分泌的分類、免疫組織化学、電子顕微鏡による形態を重視する分類が用いられてきたが混沌としていた。我々はこれらを統合した国際的機能臨床分類を確立すべく、下垂体腺腫600例の手術時摘出組織を免疫組織化学、電顕、in situ hybridizationを用いて検索を行った。その結果、臨床内分泌所見と免疫組織学上のホルモン産生、in situ hybridization上のホルモン遺伝子発現の間に一致しない症例の存在が明らかとなった。特にsilent腺腫の中にgonadotropinの蛋白または遺伝子発現がそれぞれ50%,80%の頻度で見られた。そこでされに細胞起源に基づく分類が必要と考え、機能分化に関与するとされる下垂体特異的蛋白転写活性因子や転写因子としての核内受容体,すなわちEstrogen receptor,retinoid X receptor機能分化や細胞増殖を調節する視床下部ホルモンとそのレセプターの発現をin situ RT-PCR法を用いて検討し、下垂体ホルモン産生との関係を詳細に分析した。すなわちGH,PRL,TSH産生腺腫においてPit-1が、PRL産生腺腫にEstrogen receptor,TSH,GH産生腫瘍にretinoid X receptor,Gonadotropin産生腫瘍にGnRH,GnRH-R,GH産生腫瘍にGHRH,GHRH-Rが関与していた。これらの知見を踏まえ、新しい下垂体腺腫の臨床細胞機能分類を確立・提唱するに至った。平成8年度の研究実績を以下に示す。当施設では、年間約80例の脳下垂体腺腫を手術しており、また以前から採取保存中の腫瘍サンプルを含め手術標本の病理組織学的検索を行ってきた。平成8年度は免疫組織化学的検討に加え,in situ hybridization法を用いて各前葉ホルモンのmRNAの発現を検討した。1.下垂体腺腫における機能分化,腫瘍発生,増殖に関する因子として下垂体特異的蛋白転写活性因子Pit-1蛋白の発現を免疫組織化学およびin situ hybridization法を用いて分析した。2.細胞の分化増殖に関与する形質転換成長因子アクチビン,インヒビンのサブユニットの下垂体腺腫における局在を免疫組織化学を用い検討し,主にゴナドトロピン陽性腺腫に深く関わることを確認した。3.下垂体細胞におけるホルモン合成分泌に関わるとされるPC-1/3,クロモグラニン,Rab蛋白の局在を上記同方法に加え,電子顕微鏡的検索を行いその働きについても検討を加えた。以上の結果より,正常下垂体,下垂体腺腫における機能分化,増殖にかかわるいくつかの因子を明らかにした。さらに,遺伝子の発現にはin situ hybridization法に加え,細胞内で遺伝子増幅を行い,その検出を確認するin situ PCR法を下垂体腺腫標本に応用することを開始しており,この方法によって微量の遺伝子発現を検出することが可能となる。これらの基礎的知見に臨床内分泌学的所見を加えることにより,下垂体腺腫の新しい機能的病理分類を確立し,提唱していきたい。従来下垂体腺腫の分類は臨床内分泌的分類、免疫組織化学、電子顕微鏡による形態を重視する分類が用いられてきたが混沌としていた。その結果、臨床内分泌所見と免疫組織化学上のホルモン産生、in situ hybridization上のホルモン遺伝子発現の間に一致しない症例が予想以上に存在することが明らかとなった。特にsilent腺腫の中にgonadotropinの蛋白または遺伝子発現がそれぞれ50%、80%の頻度で見られた。そこでさらに細胞起源に基づく分類が必要と考え、機能分化に関与するとされる下垂体特異的蛋白転写活性因子や転写因子としての核内受容体、すなわちEstrogen receptor,retinoid X receptor機能分化や細胞増殖を調節する視床下部ホルモンとその受容体の発現を形態学的手法に加えてRT-PCR法を用いて検討し、下垂体ホルモン産生との関係を詳細に分析した。

すなわちGH,PRL,TSH産生腺腫においてPit-1が、PRL産生腺腫にEstrogen receptor,TSH,GH産生腫瘍にretinoid X receptor,Gonadotropin産生腫瘍にGnRH,GnRH-R,GH産生腫瘍にGHRH,GHRH-Rが関与していた。これらの結果を踏まえ、新しい下垂体腺腫の臨床細胞機能分類を確立・提唱するに至った。
結晶化ガラスの顎骨補填材としての臨床応用に関する研究

近年、顎骨欠損、歯槽堤の高度な吸収例に対する骨補填に各種セラミックス材料が開発され、臨床応用されている。今回われわれは、セラミックス材料の中でも物性や生体親和性に優れているとされている結晶化ガラスに着目し、人工骨として臨床応用する目的で、家兎を用いて基礎的検討を行った。実験には30羽の成熟家兎を用い、全麻下に家兎の下顎骨下縁に直径4mm深さ約3mmの骨欠損を2個作成し、一方に粒径0.5ー1mmのCaO-SiO_2-MgO-P_2O_5-CaF_2を組成とする結晶化ガラス顆粒(GCP群)、他方にハイドロキシアパタイト顆粒(HAP群)を填基した。術後2、4、8、12週で動物を屠殺し、光学顕微鏡、走査型電子顕微鏡による検討ならびにX線マイクロアナライザ-を用いて骨との界面の元素の動態について検討した。結果:2週ではGCP、HAP両群ともに母骨と顆粒の間に幼弱な新生骨が形成され、一部は顆粒表面に達していた。4週では多量の新生骨梁が顆粒間、顆粒表面に形成され、8週では母骨に近接した部位ではほぼ全周が骨梁で覆われていた。新生骨梁の発育肥厚および隣接骨梁との癒合が進行し、一部ではハバ-ス層板の形成も認められた。12週では顆粒周囲の骨梁は増加しているものの、ほかの部位では骨梁はやや粗となっていた。GCP群とHAP群を比較すると、わずかにGCP群のほうが周囲の骨形成状態は良好であった。SEM所見では顆粒表面に50μm前後の反応層がみられ、その表層において骨と結合している像が観察された。元素分析の結果では2週、12週ともに顆粒中央から骨の界面に向かうにつれ、Si、Mgは減少し、Pは増加、Caはほぼ一定で、反応層の表層にCa、Pが多く認められた。今回の研究でGCP群すなわち結晶化ガラス顆粒は組織親和性が良好で、早期に骨組織と結合することが確認された。今後更に長期埋入例の検討を行った後、臨床応用を行なう予定である。近年、顎骨欠損の修復、再建に各種セラミックス材料が開発され、一部臨床応用されている。今回われわれは、ハイドロキシアパタイトや三リン酸カルシウムに比べて、物性や生体親和性が同等かそれ以上に優れているとされている結晶化ガラスを、顎骨欠損補填や顎堤挙上術に臨床応用する目的で、家兎の下顎骨に埋入し、X線像ならびに組織像を検討した。実験には体重約3kgの雄家兎20羽を使用し、人工骨材料は直径約0.51mmの顆粒状結晶化ガラスおよび対照として市販の顆粒状アパタイトを用いた。実験方法は、全麻下に家兎の下顎骨下縁にトレフインバーを用いて直径4mm、深さ34mmの骨欠損をそれぞれ2個作成し、前方の欠損腔へは顆粒状結晶化ガラス、後方へは顆粒状アパタイトを埋入した。術後2、4、8、12週で動物を屠殺し、道法により未脱灰薄切切片を作製し、コンタクトマイクロラジオグラム撮影後、フクシン・トルイジンブルー染色を施して組織学的に検討した。

術後2週の所見では、結晶化ガラス群、アパタイト群ともに、母骨と顆粒間に幼若な新生骨が形成され、一部は顆粒表面に達していた。両群の骨形成状態を比較するとやや結晶化ガラス群の方が良い傾向であった。術後4、8週では、大量の新生骨梁が顆粒間および顆粒表面に形成され、これらの新生骨は各所で癒合、連絡し、母骨の骨壁とも連絡していた。8週目の一部では、新生骨梁の発育肥厚および隣接骨梁との癒合が進行し、ハーバース層板の形成も認められた。12週では顆粒周囲の骨梁は増加しているが、その他の部では骨梁は疎となり、骨髄が形成されていた。これらの期間での両群の骨形成状態は、わずかに結晶化ガラス群の方が良好な傾向を示した。今後は骨形態計測法を用いて、さらに検討する予定であるが、本材料が極めて組織親和性が良好で、人工骨材として有用な材料であることが示唆された。近年、顎骨欠損、歯槽堤の高度な吸収例に対する骨補填に各種セラミックス材料が開発され、臨床応用されている。今回われわれは、セラミックス材料のなかでも物性や生体親和性に優れているとされている結晶化ガラスに着目し、人工骨として臨床応用する目的で、家兎を用いて基礎的研究を行なった。実験には30羽の成熟家兎を用い、全麻下に家兎の下顎骨下縁に直系4mm深さ約3mmの骨欠損を2個作成し、一方に粒形0.5-1mmのCaO-SiO_2MgO-P_2O_5-CaF_2を組成とする結晶化ガラスを顆粒(GCP群)、他方にハイドロキシアパタイト顆粒(HAP群)を填塞した。術後2、4、8、12週で動物を屠殺し、初年度は未脱灰薄切切片を作成し組織学的に検討した。最終年度はさらに走査型電子顕微鏡ならびにX線マイクロアナライザ-を用いて骨との界面の結合状態、元素の動態についても検討した。結果:2週ではGCP、HAP両群ともに母骨と顆粒の間に幼弱な新生骨が形成され、一部は顆粒表面に達していた。4週では多量の新生骨梁が顆粒間、顆粒表面に形成され、8週では母骨に近接した部位ではほぼ全周が骨梁で覆われていた。新生骨梁の発育肥厚および隣接骨梁との癒合が進行し、一部ではハバ-ス層板の形成も認められた。12週では顆粒周囲の骨梁は増加しているものの、ほかの部位では骨梁はやや粗となっていた。GCPとHAP群を比較すると、わずかにGCP群のほうが周囲の骨形成状態は良好な傾向であった。SEM所見では顆粒表面に50μm前後の反応層がみられ、その表層において骨と結合している像が認められた。元素分析の結果では2週、12週共に顆粒中心から骨の界面に向かうにつれ、Si、Mgは減少し、Pは増加、Caはほぼ一定で、反応層の表層にCa、Pが多く認められた。今回の研究でGCP顆粒は組織親和性が良好で早期に骨組織と結合することが確認された。今後更に長期埋入例の検討を行なった後、臨床応用を行なう予定である。
セルラ-ゼの相乗効果を利用した直接発酵菌の育種

本研究はセルロ-ス分解に必要な新しい酵素遺伝子のクロ-ニングを行うとともに、これらの遺伝子を酵母に導入して、セルロ-スよりエタノ-ルを生成する酵母の育種を計ることを目的として計画され、本年度は下記の2項目の検討を進めた。Aspergillus aculeatusの生産するアクセラ-ゼの酵素群の中で膨潤セルロ-ス分解に大きな役割をするFI CMCaseのcDNAクロ-ンの取得をに成功した。ついで、大腸菌で成熟型FI CMCaseを生産させることを目標として、発現ベクタ-を構築した。この構築したプラスミドを大腸菌JM105などの株に導入したところ、大量の酵素生産が認められた。この大腸菌の培養液にグリシンを添加すると、酵素の漏出が起こり、大量の酵素が培地中に蓄積した。この培養液から硫安塩析、DEAEーセファデックスカラムクロマト、トヨパ-ルHW55F疎水クロマトという簡単な操作で収率よく、電気泳動的に均一な精製酵素標品を得た。FI CMCase遺伝子の酵母での発現を試みた。イントロンを含まないcDNAを用いて、シグナルペプチドを除いた成熟型のFIーCMCaseを酵母内で発現させるように発現ベクタ-の構築し、酵母S__ー.<cerevisiae>___ーを形質転換したところ、分子量的にも免疫学的にも標品と同一のタンパク質が発現していることが確認された。セルラ-ゼ活性は培養約50時間後に最高となった後、減少した。これは発現したタンパク質が、菌体内のプロテア-ゼにより分解されると考えられる。今後、生産性の検討が必要があると考えられる。翻訳産物の局在を調べたところ、発現した成熟型のFIーCMCaseは菌体内に存在していることが明らかとなった。