hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ガウス写像の性質に基づく曲面の大域的性質の研究

これらの結果は,曲面の等角計量のオーダに着目することで統一的に導くことができるのだが,この原理をGauss写像の分岐定理や一意性定理といった他の値分布論的性質にも適用することで,幾何学的意味が明確なこれらの性質を統一的に導く結果を与えることができた。また,この視点により,複素平面上の有理型関数の値分布論との関係も明確になった。もう1つの成果は複素2次元空間内の極小Lagrangian曲面のGauss写像の値分布の研究である。複素2次元空間内の極小Lagrangian曲面にはWeierstrass型の表現公式が知られており,そのGauss写像の値分布論的性質が期待される。そこで,報告者は筑波大学の相山玲子氏と東京工業大学の芥川和雄氏との共同研究でこのことを調べ,有限全曲率完備極小Lagrangian曲面のGauss写像の除外値数の上限は「2」であることや除外値数が「3」の完備極小Lagrangian曲面のGauss写像は他の値を無限回取るといったことを示すことができた。これらの結果は,3次元Euclid空間内の極小曲面のときとは異なり,すべて最良の結果となり,曲面のGauss写像の値分布の研究の更なる進展を与えることができた。幾何学初年度で得られた結果の精密化および応用を与えることができ,この分野の研究の進展に大きな影響を与えることができた。初年度に目標としていた内容を達成でき、さらにその成果は発展性に富んだものとなり、今後の研究の進展も期待できそうだから。今年度は最終年度であるので,これまで得られた結果を,より次元の高いユークリッド空間内の完備極小曲面のガウス写像の値分布論にも応用したいと考えている。また,向き付け不可能な場合の結果やブラウン運動への応用とした内容の研究にも着手したいと考えている。また,九州大学の小磯深幸氏と研究を進めている,非等方的平均曲率一定曲面のベルンシュタイン型定理や剣持-ワイエルシュトラス型表現公式の研究も進めていきたいと考えている。今後は、今年度得られた成果を、より次元の高いユークリッド空間内の極小曲面のガウス写像の値分布論にも応用していきたいと考えている。また、これまで世界的に研究が進展していなかった、向き付け不可能な極小曲面のガウス写像の研究にも着手したいと思う。そして、九州大学の小磯深幸氏との共同研究で、非等方的平均曲率一定曲面のクラスのベルンシュタイン型定理及び剱持-ワイエルシュトラス型表現公式の研究も進めていきたいと考えている。海外で開催される研究集会において研究発表するための旅費として使用する予定していたが、今年度はそのような機会がなかったので,その分の未使用額が生じた。次年度は所属が山口大学から金沢大学に異動になったので,旅費や研究室の設備整備に使用する費用が当初の予定よりも多く必要になるので,その分に充てたいと考えている。研究成果発表及び小磯深幸氏との共同研究の研究打ち合わせのための旅費として研究費を使用する予定である。また、本研究の内容は幾何学、函数論両分野の他の研究課題にも応用することが期待できるので、このことに関する勉強会や研究集会の会議費、研究打ち合わせのための旅費としても使用したいと考えている。さらに、最新の知見を得るための図書の購入にも使用したいと考えている。
トリブチル錫によるラット脳のミエリン形成障害

トリブチル錫(TBT)はテストステロンをエストラジオールに変換するアロマターゼ活性を抑制し、アンドロゲン様内分泌攪乱物質として認識されている。この研究の目的は、ラットが胎児期および新生児期にTBTに被曝した場合の、ミエリン(神経髄梢)形成が受ける影響を生化学的に明らかにすることである。A.胎児期の被曝妊娠ラットにTBT投与をし、出生後21日目の仔ラット脳を採取した。脳ミクロソーム画分のP450量とオリゴデンドログリア細胞に特異的なCNP(2',3'環状ヌクレオチド3'水解酵素)活性の測定をすると、TBT投与群と対照群で差がなかった。母体がTBTに被曝しても、胎仔の神経発達に影響を及ぼさないことが示された。B.新生仔期の被曝生後1日目のラットにTBT投与をし、3,5、7週齢に脳を採取、ミエリン画分を調製した。(1)TBT被曝ラットのミエリンCNP活性は全週齢で対照群より低く、ウエスタンブロットでも同様の結果が得られた。(2)主要ミエリンタンパクmRNA発現を測定した。CNPとPLPのmRNAが、5週齢までは対照との差がないが、7週齢で対照に比して発現が低下した。ミエリン形成期のタンパク合成過程に問題が生じることが考えられる。(3)糖脂質合成の各種糖転移酵素mRNAの発現解析を行った。GlcCer合成のグルコース転移酵素とCSE合成の硫酸基転移酵素mRNAが7週齢で対照に比して著明に低下した。脂質組成を調べると、mRNAの結果が裏付けられた。結論胎児は胎盤によってTBTの影響を免れるが、新生児はTBTにより神経ミエリン膜の形成に障害が起こることが明らかになった。本研究は,胎児期および新生児期にトリブチル錫に被曝した場合、トリブチル錫がミエリン形成に及ぼす影響を,ラットを使って生化学的に明らかにすることを目的としている。16年度の実績を示す。1.新生児時期(生後1日)にトリブチル錫(TBT)に被曝した仔ラットの生後3.5.7週齢の脳のミエリンを,Norton法にて調製した。2.大脳を正中線に平行にカットした切片を固定・包埋。薄切し、クリューバーバレラ染色(ミエリン、ニッスル小体、細胞核を染色)を行った。海馬領域に注目して検討したが、TBT被曝脳の光顕レベルでの組織異常は観察されなかった。3.ミエリンのSDS-電気泳動を行い。主要ミエリンタンパク質(PLP, MBP, CNP, MAG)についてのウエスタンブロット解析を行った。その結果、TGT脳では正常に比してCNPの減少が見られた。これは、予備実験で、TBT被爆新生仔の脳CNP酵素活性の減少と合致する結果であった。NOGOについても解析の予定だったが、抗体を入手できなかったので、来年度に実施したい。3.ミエリンタンパク質のmRNA発現を調べるため、定量PCRを試みた。TBTとコントロール脳から総RNAを抽出し、ミエリンタンパク質のプライマーを用意して、ABI-7700リアルタイムPCR装置でSYBR-Greenで解析した。MAGとCNPのmRNAがコントロールに比してかなり減少するという結果が得られた。糖脂質合成糖転移酵素のmRNAも含めて、現在慎重に再実験を行っている。論文投稿まで持ち込めなかったが、8月の国際神経化学会で発表予定である。胎仔期および新生仔期にトリブチル錫(TBT)に被曝したラットの脳ミエリン形成に及ぼす影響を調べる研究である。

胎仔期のTBT被曝の解析は16年度に終了し、ミエリン形成に影響を及ぼさないことを見いだし、新生仔期のTBT被曝の解析では、CNP発現がトリブチル錫によって抑制されることが、リアルタイムPCR(qPCR)によるmRNA解析、およびウエスタンブロットにより明らかになった。17年度の成果について記す。ミエリンは軸索と相互関係をもって、軸索内のシグナル伝達に関与している。そこで、軸索と相互関係のあるミエリンタンパク質で重要なMAGとNOGO、軸索側のNOGO受容体、さらに、シグナル伝達のメディエーターとなる糖脂質に焦点を絞って解析を行った。(1)TBT被曝ラットのMAGとPLPのmRNA発現(7週齢)がコントロールに比して有意に低下していた。一方、オリゴデンドロサイトの細胞質側に由来するMBPとCNPはTBT被曝とコントロールで差がなかった。以前に糖尿病性神経障害ラットのミエリンで観察されたのと同じ結果である。昨年度のCNPに続いて、PLP、MBP、MAGについてもウエスタンブロットで確認をした。(2)NOGOとFynのmRNA発現にはTBTは影響を及ぼさなかったが、NOGOレセプターの発現はTBT被曝で有意に抑制され、加齢とともに正常状態に近づいた。(3)8種類の糖脂質合成糖転移酵素のmRNA発現を調べた。ミエリン主要糖脂質であるセレブロシド合成酵素は変化ないが、ガングリオシドに続く糖転移酵素はTBTで抑制された。成果は、第20回国際神経化学会、第78回生化学会、第48回神経化学会で発表した。学会で指摘された項目についてのデータも補足して、投稿論文を作成中である。胎仔期および新生仔期に、男性ホルモン様内分泌撹乱物質であるトリブチル錫(TBT)に被曝したラットの脳ミエリン形成に及ぼす影響を調べる研究である。既に、胎仔期のTBT被曝は、ミエリン形成に影響を及ぼさないこと、新生仔期のTBT被曝で、ミエリンタンパクとNOGOレセプター発現に影響があることを明らかにしている。18年度の成果について記す。(1)スフィンゴ糖脂質合成に関与する糖転移酵素の脳におけるmRNA発現を調べると、ミエリン主要構成成分であるガラクトセレブロシド(Ga1Cer)合成のガラクトース転移酵素の発現に有意な変化はなかったが、Ga1Cerからスルファチド(CSE)を合成する硫酸基転移酵素発現が減少した。また、Ga1Cer以外の糖脂質の基本であるグルコセレブロシド合成のグルコース転移酵素の発現が大きく抑制された。(2)TBT被曝とコントロールラット脳からリン脂質と糖脂質を抽出して、それぞれの組成を比較検討した。リン脂質については、被曝群と対照群で全く差が無かった。糖脂質では、TBT被曝群のCSE量の低下が認められ、(1)のCSE合成酵素のmRNA発現低下の結果が裏付けられた。ガングリオシド構成には著明な変化は認められなかった。(3)TBTの神経に及ぼす影響を分子レベルで詳細に解析する必要があると考え、培養神経細胞でTBTの影響を検討した。細胞培地にTBTを添加した揚合、神経栄養因子NGFの存在下で添加した場合の神経突起の伸展に及ぼす影にっいて、現在(2007年2月)検討中である。(4)本研究の成果は平成18年度生化学会と神経化学会で発表した。これまでの成果をまとめて論文を作成しており、3月には投稿予定である。また、このテーマに関して、分担者ではないが、共同で研究を行ってきた成果を2報発表した。男性ホルモンのHPLC分析とミエリンタンパクに関する基礎研究である。
胎生期肺組織移植による肺気腫治療の実験的検討　－豚肺気腫モデルを用いて－

胎生期肺組織移植による肺気腫の治療の可能性についての実験的検討を行った。豚では、正常成体肺内に移植した胎生期肺組織は免疫抑制下に生着分化した。豚肺気腫モデルは引き続き検討を必要する。関連研究では、pallid mouse気腫肺に移植した胎生期肺組織は生着分化した。また、ラットでは、レシピエントへのグルココルチコイド投与で、移植胎生期肺組織の分化生着が促進し、この効果は投与期間依存性であった。肺の再生は、他の臓器と比較して研究は進んでいない。その理由は肺を構成する細胞の種類が他の臓器と比較して多いことと、ガス交換を行う場としての換気、拡散および血液循環といった肺胞レベルでのデリケートな構造にある。我々は肺胞レベルでの肺の再生・修復を目指している。我々が胎生期の肺組織に着目している理由は、胎性期肺組織のもつ次の特徴にある。すなわちi)肺への分化の方向付けがなされている,ii)増殖能が旺盛である,iii)いわゆる“足場"となる間質組織が含まれている点である。これまで、豚での胎生期肺移植では、移植肺組織は成体肺内に生着はするものの、ラットやマウスのそれと比較して生着が良好とは言えない。その要因の一つが、サイクロスポリンによる免疫抑制を加えているが、allograftによる拒絶反応の影響があると言える。ただし、サイクロスポリンの投与量の増量による免疫抑制の強化だけで解決するとは考えていない。そこで、この問題を解決すべく周術期のステロイド投与について検討を行った。臨床において、早産は胎児のRespiratory distress syndrome (RDS)発症率が高まるが、母体へのGlucocorticoid投与でRDSのリスクを大幅に下げることができる。母体に投与されたステロイドにより胎児肺の分化が促進されるわけである。この事実に着目した。まず、ラットのモデルにおいて胎仔肺組織移植後2日間recipientにベタメタゾンを投与(0.2mg/kg, day0 & day1, i.m)した。その結果、生食を投与した群と比較してステロイドを投与した群において、胎生期肺組織の生着と分化を促進した。さらに、ステロイドの投与を移植後7日間にすると、2日間投与群と比較してさらに移植胎仔肺の分化が促進された。この結果を踏まえて豚の実験でもステロイド併用使用を計画している。肺の修復・再生への実験的アプローチの一つとして我々は、胎生期肺組織移植の実験的検討を行ってきた。正常の成体動物への胎生期肺組織移植では、ラット、マウス、ブタにおいて細切した胎生期肺組織が、胸膜表面より注入移植した成体肺内で生着することを示してきた。ラット、マウスでは同一の近交系動物関での移植が可能であるため、拒絶反応による影響は除外できる実験系が準備できたが、我々が用いているSPFブタに置いては、移植に際しては免疫抑制剤の使用が必須となり、免疫抑制を十分に行う必要があることが判明した。そこでステロイド投与による本モデルにおける影響を、小型動物であるラットを用いて検討した。その結果、術後レシピエントへのステロイド投与は成体肺内に移植した胎生期肺組織移植の生着・分化を促進することがわかった。移植胎仔肺組織の分化の程度をTTF-1およびSP-Aを用いて検討すると、ステロイド投与群においてはコントロール群に比べて移植後1週、2週の時点でTTF-1の発現の増強が認められ、特に移植後2週目以降では肺胞に分化している領域の辺縁部でTTF-1の発現の増強を認めた。実験群において肺胞へ分化している領域でSP-Aの発現増強が見られた。Glucocorticoidの投与が移植片の肺胞への分化を加速させ、その領域でのTTF-1とSP-Aの発現が促進したと考えている。肺気腫病変への胎生期肺組織移植に関して、我々は肺気腫自然発症モデルであるpallid mouseの肺機能に関する報告(Lab Invest. 2009)をした経緯があり、このマウスの特徴を理解しているため、C57BL/6GFP胎仔肺組織を、1年齢に達して肺気腫を生じたpallid mouse: C57BL6/J pa+/pa+)に移植した。その結果、移植後1週から4週にかけて、正常胎仔肺組織が肺気腫肺に生着分化することを示した。これまで胎生期肺組織に着目した,胎生期肺組織移植による肺組織再生・修復に関する実験的検討をラット、マウスおよび豚を用いて行ってきた。胎生期肺組織片が成体肺への移植により生着し、分化するのは、胎性期肺組織のもつ次の特徴が関係していると考えられる。すなわち1)肺への分化の方向付けがなされている,2)増殖能が旺盛である,3)いわゆる"足場"となる間質組織が含まれている点である。移植後胎生期肺組織内に多く認められる立方状細胞は扁平化し、I型様肺細胞が増え、postnatal lungに類似した組織形態を示すようになる。

病的肺に対して胎生期肺組織を移植した場合に、正常成体肺に移植した場合と同様に移植胎生期肺組織が生着しえるかどうかは次のステップとして検討すべき重要な課題である。ラット肺線維症モデルでは移植した胎生期移植肺は肺内に生着し、移植肺でのTTF-1とCCSPの発現を指標として肺の分化をみると、経時的に両者の発現は増加し、CCSPは主に気管支や細気管支に、TTF-1は細気管支から肺胞領域に発現を認めた。pallidマウス肺気腫モデルでは、GFP-C57BL/6マウスの胎生期肺を,肺気腫を生じたpallidマウスに移植すると、肺気腫肺においても移植組織片の生着を認めた。豚における検討では、豚胎仔肺組織を採取し、DMEM培地で細切し、移植用胎仔肺組織液を準備した。胎仔肺組織液を全身麻酔下の成体豚肺に開胸下に移植を行った。肺表面より肺実質内に,胎仔肺組織浮遊液を数カ所に注入した。移植後にサイクロスポリンによる免疫抑制を行った。移植した胎仔肺移植組織は肺内に生着したが、小動物の場合より壊死に陥っている部分も多く認めた。現在、病的肺としての肺線維症モデルの作成中である。豚の実験を遂行してゆく過程で生じる技術的問題点の解決のために、適宜ラットやマウスを用いた予備実験を行った。これまで我々が行ってきた、ラットやマウスで得られた知見を踏まえた豚での研究であるが、小動物の結果をそのまま大動物に挿入しがたい問題点がいくつか見つかった。この点に関しては究極的には本研究のコンセプトを臨床での応用の可能性を探るものであり、本研究を通して浮かびあがる問題点はむしろ有用な情報ではと考えている。この点に関しては究極的には本研究のコンセプトを臨床での応用の可能性探るものであり、本研究を通して浮かびあがる問題点はむしろ有用な情報であと考えている。豚での実験を進めて行く過程において生じた問題点をラットやマウスを適宜用いて問題解決の糸口を探る方法は有用であると思われた。従って、今年度も、この方法を用いて豚での実験を遂行する予定である。特に今回は胎生期肺組織移植後のステロイド(デキサメサゾン)の投与が、移植胎生期肺組織の成体肺内での生着および分化を促進するという結果は、有用であると思われる。また、ステロイドはサイクロスポリンとの併用により、allograftに対する拒絶反応の抑制という相乗効果も期待できる。臓器として血管吻合を行い移植後直ちに血流が再開される肺移植と異なり、胎生期の組織移植では、移植された組織は毛細血管が構築されるまでは、周囲からの拡散により酸素や栄養素を受け取ることになる。この点が臓器移植とは異なる点であり、豚の系ではただ単に免疫抑制を強化するのみでは解決しないと考えている。その点でステロイドの分化を促進するという効果は、今回の豚の実験系において何らかの新たな知見をもたらす可能性に期待している。豚に対するステロイドの持続投与には、皮下埋め込み型の浸透圧ポンプの利用を考えている。ラットでの検討により約1週間の持続投与を予定している。
日本文化の普遍性と特殊性に関する文化人類学的比較研究

本研究は、近世以降日本文化との恒常的接触、交渉がみられた国々ないし地域における日本文化の伝播、受容、変容などの実態を歴史的、構造的、比較的に追究することによって、日本文化の性格の普遍性と特殊性を明らかにすることを目的としており、昭和63年度の研究では、問題の所在の確認と先行研究の整理分析を研究分担者が個々または共同で行い、セミナー形式の全体研究会で共同討議を行うことによって次のような研究実績をあげることができた。(1)日本文化とは何かを、言語(日本語)、文学・音楽・芸能、宗教・価値観、技術、食物、社会組織の6項目に分け、その各々について日本文化とよびうるものについてカテゴリーを「人間関係領域分類」(Human Relation Area File)と照合をおこないつつ設定した。(2)先行研究の整理分析と問題の所在:日本文化の伝播、受容に関する内外にわたる先行研究を、全般にわたって整理しなおし、問題の所在の確認をおこなった。この場合エドワード・サィードの「オリエンタリズム」の思想はきわめて示唆に富むものであった。(3)国別事例の研究:西ドイツ、フランス、アメリカ、ハワイ、韓国、台湾、中国、ブラジル、タイ、フィリピンなど11ヶ国ないし地域の文化と日本文化との接触交流について、各研究分担者がこれまでそれぞれの専門地域について集積した知見にもとづき研究報告をおこない、討議を重ね理解を深めた。(4)文化項目別事例研究:国別事例研究により得られた材料を整理し、上記6項目について、その伝播、受容、変容のプロセスを各研究分担者が分析することによって、みるべき成果を得た。前後18回にわたる研究会及び各研究分担者の調査・資料収集分析にもとづいた研究実績の概要は下記の通りである.(1)日本文化の定義と概念についての研究:日本文化の"普遍性と特殊性"を考える場合の前提となる"日本文化"の定義については,固定的・実態的なものと,相対的・抽象的なものとが考えられるが,国際化現象の著るしい現今の日本文化のありようを捉えるためには前者の定義を念頭におきながらも,後者の立場で考えていくことが望ましい.(2)先行研究の整理分析と問題の所在の確認:日本文化に関する先行研究はいうまでもなく数多く存在する.しかし,これが世界の諸文化との関係で,どのような"普遍性"をもちまたどのような意味で"特殊性"をもつかを体系的論じた先行研究は稀である.日本経済の進出との関連で,日本的経営や技術の普遍性についての散発的研究があり,他方,ジャポニズム(日本趣味)やジャパネスク(日本的様式)的視点にたって,日本の芸術・美術を中心とした他文化への影響についての論考がみられる.日本文化の"特殊性"については,その「集団性」「甘えの構造」「タテ社会」といった特色を捉えて同質性を突出させるよりも,多〓性を考え,固定化され閉ざされたシステムとしてよりも,開かれたダイナミックなシステムとしての視点を導入しようとする方向が強く打ちだされた.(3)国別事例の研究:アメリカ,カナダ,ブラジル,中国,台湾,タイ,フランス,フィリピンにおける日本文化の伝播・受容・変容について各研究分担者が中間的報告をおこなった.日本文化の普遍性と特殊性の視点からその実態について興味ある考察がなされた.(4)文化項目別事例研究:国別事例研究によって得られた資料を,言語,文学,音楽,芸能,宗教,価値観,技術,食物,社会組織の9項目について,それぞれその伝播,受容,変容のプロセスを分析しているが,未だ結論を得ていない.本研究は、近世以降日本文化との恒常的接触、交渉がみられた国々ないし地域における日本文化の伝播、受容、変容などの実態を歴史的、構造的、比較的に追究することによって、日本文化の性格の普遍性と特殊性を明らかにすることを目的としており、昭和63年度の研究では、問題の所在の確認と先行研究の整理分析を研究分担者が個々または共同で行い、セミナー形式の全体研究会で共同討議を行うことによって次のような研究実績をあげることができた。
植物NB-LRR受容体による免疫活性化と病原菌による宿主転写制御の分子基盤

植物は、病原菌を認識して多様な防御反応を誘導する。一方、病原菌はエフェクターを植物細胞内に分泌し、植物の防御反応を抑制する。それに対し、植物は、エフェクターを認識して強い免疫を誘導するNB-LRR受容体を獲得している。NB-LRR受容体は、重要な免疫因子であるが、NB-LRR受容体による免疫活性化機構は不明である。また、病原細菌がもつTALエフェクターは、核で植物遺伝子の転写を制御し、菌の増殖環境を整える最強の病原性因子であるが、植物の転写をハイジャックする分子機構は不明である。本研究では、NB-LRR受容体による免疫活性化機構およびTALエフェクターによる植物遺伝子の転写制御機構を解明する。植物は、病原菌の感染を認識し多様な防御反応を誘導する。病原菌はエフェクターを植物細胞内に分泌し、その防御応答を制御する。本研究では、TALエフェクターを認識するNB-LRR受容体Xa1を研究モデルとして、植物のNB-LRR受容体を介した免疫活性化機構およびエフェクターによる植物遺伝子の転写制御機構を解明する。NB-LRR受容体は、病原菌だけにとどまらず、害虫の認識にも関わる重要な受容体であり、育種学、植物病理学、害虫学に渡る農学研究に広く意義のある成果が得られると期待される。本研究成果は、将来、病害抵抗性育種や防除技術の開発など農業生産基盤の強化にも貢献できると期待される。
CFD解析を用いた球状塞栓物質の動態シミュレーション

球状塞栓物質の動態をシミュレーションをする方法について検討した。流体力学の関連学会に参加し、血管内の流れのシミュレーションや可視化について、最先端の方法論について情報を収集した。流体力学の専門家と打ち合わせを行い、実際に使用するソフトウェアの検討をおこなった。今後、シミュレーションをする解析環境を構築し、多血性腫瘍における球状塞栓物質を用いた動脈塞栓術の症例で、ソフトウェアを用いて臨床例でのCFD解析を試みる予定である。球状塞栓物質の分布をフローモデルで検討するin vitroでの実験に関しては、フローモデルの構築について情報収集をおこなった。実際にフローモデルを作成して、塞栓物質を注入して動態観察の方法を模索した。また、ex vivoモデルの構築についても模索した。今後、フローモデルやex vivoモデルを構築して、in vitroでの実験を行う予定である。臨床例においては、子宮筋腫に対する球状塞栓物質を使用した子宮動脈塞栓術において、梗塞率が不十分になる要因について検討した。シミュレーションの方法論の確立や、in vitroの実験系の構築に時間がかかっている。球状塞栓物質の動態解析を行うために、CFD解析のソフトウェアを購入する。実際の臨床例のデータを用いて、球状塞栓物質がどのように分布するのか解析し、臨床的なアウトカムとの比較を行う。in vitroの実験系としては、実際に実験を行うためのフローモデルやex vivoモデルを構築する。順調に構築ができれば、解析を行うことができるかどうか予備実験を行う。最適なCFD解析用のソフトウェアの選定に時間を要したため、購入を次年度に行う予定である。また、in vitroの実験系の構築にも時間がかかり、次年度にモデルの作成に使用する予定である。
心不全の発症・進展に関わる分子機構の解明および心不全の新規分子標的療法の開発

本年度我々は、心不全モデルマウスの心臓において、その発現が上昇している可溶性Wntリガンド(soluble Wntligand:SWL)を同定し、そのWntシグナル活性化のメカニズムを解明した。古典的なWntligandは非常に疎水性が強く、autocrine,paracrine的にWnt蛋白が作用することによってシグナルが伝わるとされている。しかし我々は、慢性圧負荷モデルマウス、拡張型心筋症モデルマウスの血清が高いWnt活性化能を有していることを発見し、このよう血清中に存在する(つまり可溶性の)新規Wnt ligand:SWLが何らかの形で心臓に働き、心臓にWntシグナルを伝えることで心不全を誘導するのではないかと考え研究を進めている。我々は、2種類の心不全モデルマウス血清より、免疫グロブリン、アルブミンを除去した後、古典的Wnt ligandの受容体であるFrizzled蛋白とIgGの融合タンパクを用い、免疫沈降法によってSWL候補を抽出、SDS-PAGEによって展開し、MS/MS法によって、通常のマウス血清に比べ、心不全モデルマウスで発現が上昇しているFrizzled結合蛋白を同定した。4種類の候補のうち一つがWnt活性化能を有しており、SWLと命名し、その特性を解析した。SWLはFrizzledタンパクと結合し、Wntシグナルを濃度依存性に活性化することを確認した。SWLは心不全マウスの血清中でその濃度が約2倍に増加しているが、SWLは心臓自体から産生されていることが分かった。今後は、心不全にともなう心臓でのSWLの産生増加が、心不全発症の分子機構に関与するか、心不全によるSWL増加がendocrine的に遠隔臓器に作用し、心不全に伴う多臓器の機能不全に関与していないかについて実験を進める予定である。本年度、我々は、心臓においてp53を抑制する遺伝子や薬剤を探索することにより、p53を標的とした、心不全に対する新規分子標的療法を開発することを目的として研究を行った。ヒト心臓cDNAライブラリーからexpression cloning法によってp53の機能を抑制する遺伝子CHIPを同定した。CHIPは心臓に強く発現しており、p53と結合、ユビキチン化することによってp53蛋白の分解を促進することを発見した。In vitro,In vivoにおいて、内因性のCHIPはp53の蛋白発現量を規定する重要な遺伝子であることがわかった。我々は以前より心筋梗塞後にp53の発現レベルが上昇することを確認しており、心筋梗塞後のp53上昇にCHIPが関与していないか検討した。In vitroでは低酸素刺激に対し、In vivoでは心筋梗塞後、CHIPの発現が低下しており、これは、CHIPプロモーター上に存在する低酸素応答領域による調節をいけているためということがわかった。これらの結果より、低酸素刺激後、あるいは心筋梗塞後のp53上昇には低酸素刺激によるCHIPの発現低下、CHIPによるp53蛋白分解の現象、結果p53蛋白レベルが上昇するという新たな分子的既往の存在が示唆された。心臓特異的にCHIPを過剰発現したマウスにおいては心筋梗塞後のCHIP発現低下、およびp53蛋白の上昇がおこらず、p53誘導性のアポトーシスおよび心筋梗塞後のリモデリングも抑制することができることが明らかとなった。またCHIPによる標的蛋白分解を促進するという報告がある薬剤、geldanamycinを心筋梗塞後投与することによっても同様にp53上昇およびp53誘導性のアポトーシスを防ぎ、心筋梗塞後の心不全発症を抑制することができた。このようにCHIPによるp53分解は新たな心不全治療の標的として有望であることが明らかとなった。
産後4か月までの母親「母親として自信」を醸成する看護の開発

妊娠後期から産後4か月までの母親を縦断的に調査することから、母親としての自信への影響要因を検討し、産後4か月までの母親が母親としての自信を獲得する看護プログラム【母親としての自信を醸成する看護】を開発した。産後1か月までの母親に対して、"デブリーフィング""育児の保証"という看護を提供することで有効であることが示唆された。初産婦を対象にした面談を用いた自信を付けるケアは、効果を示した。しかし、初経産を問わない電話による介入は、効果を明らかにすることはできなかった。【目的】産後4か月までの母親としての自信の獲得に影響する要因に対する仮説モデルを立て、産後4か月までの母親としての自信の獲得に影響する要因の関係性を検討した。【方法】育児に関して特異的と考えられる3地域を対象地域とし、研究協力の承諾の得られた病院・診療所を調査対象施設とした。研究対象者の選択基準は、調査期間内に出産し出産した子どもを育てる女性であり、研究の同意が得られるものとした。データ収集方法:妊娠35週以降の妊婦健康診査受診時、施設から質問紙の配付を行い、郵送法にて回収し、その後は個別に郵送し、回収した。測定用具:1.楽観主義尺度、2.人生の志向性に関する質問紙、3.母親の愛着質問紙、4.母親としての自信質問紙、5.母親の受けたケアの認識質問紙、6.主観的幸福感調査票、7.母性意識尺度、デモグラフィックデータ。1・2は妊娠期、3から7は産後に用いた。分析は妊娠末期、産後1か月、産後4か月の3回の調査に返答し、それぞれの質問紙に対して85%未満の回答率のものを除外した341名(有効回答率97.7%)を対象とし、共分散構造分析を実施した。【結果】平均年齢32.0歳(SD±4.6)、初産婦193名(56.6%)、経産婦148名(43.3%)。産後4か月の母親としての自信に強く影響する要因は、産後1か月の「母親としての自信」であった。そして産後1か月の母親としての自信には、妊娠中に「育児の知識がある」「育児ができる」と思う「育児の経験」が最も強く影響し、次に「産後1か月までのケア」が影響していた。「産後1か月までのケア」の中では、母親の話を傾聴する"デブリーフィング"、"育児の保証"が強く影響していた。つまり産後4か月までの【「母親としての自信」を醸成する看護ケア】として、産後1か月までの母親に対して、"デブリーフィング""育児の保証"という看護を提供することで有効であることが示唆された。平成21年度の共分散構造分析の結果、産後1か月までの母親に対して、母親の話を傾聴すること、母親の行っている育児を保証するという看護を提供することは、母親としての自身に影響を与えることが明らかとなった。平成22年度の研究目的は、初めて育児をする母親を対象に、助産師による母親の自信をつけるケアの効果を検証することである。時系列準実験研究デザインを用い、【母親としての自信をつける介入】を実施した。介入は、助産師が母親の話す育児や気持ちを良く聴き、承認し、保証と肯定的な評価を伝えることである。時期と方法は、退院後12週後に電話訪問、3週後に面談を行った。比較群は36名、追跡できたものは35名(追跡率97.2%)、介入群は39名、追跡できたものは34名(追跡率87.2%)であった。測定用具は、日本語版母親としての自信質問紙(以下,J-MCQ)を用い、事前テストを退院前日、事後テストは産後1か月に実施した。事前テストにおけるJ-MCQ平均得点は、介入群34.12点(SD=8.15)、比較群34.54点(SD=7.87)で有意差は認められなかった(t=0.220, p=.862)。事後テストのJ-MCQ平均得点は、介入群47,24点(SD=8.69)、比較群42.83点(SD=7.52)で有意に介入群が高値を示した(t=2.253, p=.028)。また、両群とも事前テストより事後テストで優位に得点上昇が認められた(介入群:t=11.68, p=.000,介入群:t=6.28, p=.000)。助産師が母親の話す育児や気持ちを良く聴き、承認し、保証と肯定的な評価を伝える母親としての自信をつけるケアは、産後1か月の母親としての自信をつけることに効果を示した。目的:助産師が母親の話す育児や気持ちを良く聴き、承認し、保証と肯定的な評価を伝える母親としての自信をつけるケアを臨床ベースで実施し、その効果を検証すること。方法:研究デザインは、時系列準実験研究とした。

研究協力者は、産科クリニックで出産した母親(初経産を問わず)である。対象群は、6月末から10月上旬に出産した母親で、現行のケアを提供した。介入群は、10月下旬から2月上旬に出産した母親であり、産後2週間頃を目処に電話訪問にて自信をつけるケアを行った。日本語版母親としての自信質問紙を、退院時、産後1か月健診、4か月頃の3時点で縦断調査した。メインアウトカムは、1か月時点での母親としての自信質問紙得点の現行ケア群と自信をつけるケア群の2群の差とした。セカンドアウトカムは、電話訪問に対する母親の評価を記述的に明らかにした。さらに、4か月時点での母親としての自信質問紙の得点を比較する。結果:対照群として65名の母親をリクルートし、退院時59名、産後1か月51名(86.4%)、産後4か月39名(66.1%)の回答を得た。比較群として65名の母親とリクルートし、退院時55名、産後1か月51名(92.7%)の回答を得た。4か月は現在回収中である。介入群として、退院時に調査表に回答した55名中50名には平均15日目に電話訪問を行った。電話をしなかった5名は、3名が電話を希望せず、2名は受診するため面談した。セカンドアウトカムとして、「産後電話があったらよいと思うか」の問に、対照群は21名(41.1%)が「よいと思う」、22名(43.1%)が「思わない」と回答した。一方、介入群では、電話訪問を行った50名中、46名(88.5%)が「よい」、3名は「思わない」と回答した。「思わない」と回答した3名は、電話を希望しなかったものと、受診時面談したものであった。
育児ストレスによる情動調節機能低下の機序－睡眠不足・ホルモン動態・脳波の関係

本研究は、乳幼児の母親の情動調節機能が、睡眠不足といった育児ストレスに阻害される可能性を検討することを目的とした。また、育児ストレスが情動調節機能を阻害する生理的背景として、情動調節機能とオキシトシンやプロラクチンといったホルモンとの関連についても検証することとした。本年度は、上記の目的を達成するために、情動調節機能とオキシトシン・プロラクチンの関連を検討した。妊娠や出産、授乳による生理・心理的経験の影響を制御するために、対象は妊娠経験のない女性とした。正常な月経周期を有する女性では、月経周期のフェーズによってオキシトシン・プロラクチン濃度が変動することを利用し、卵胞期と黄体期のそれぞれで計測を行った。解析では、衝動的な行動の制御とオキシトシン・プロラクチンの関連の検討に重点を置いた。具体的には、幼児の顔表情を阻害刺激として用いた行動抑制課題時の脳波・行動成績と、血漿オキシトシン・プロラクチン濃度との関連を検証した。幼児怒り顔による一部の抑制に関する脳処理の遅延と、プロラクチン濃度との関連を認めた。また、行動抑制課題の成績の良さとオキシトシン濃度に関連があった。これは、幼児怒り顔による一部の抑制処理の阻害がプロラクチンと何らかの関連がある一方で、衝動的な行動の制御はオキシトシンと関連する可能性を示す。衝動的な行動の制御は、子ども虐待のリスクと関連することが報告されている。本研究の示すオキシトシンと行動抑制課題成績の関連は、子どもの養育におけるオキシトシンの役割を示唆する有用な知見である可能性がある。本年度は、妊娠経験のない女性を対象とした実験と学会等での成果発表、および乳幼児の母親を対象とした実験準備を予定していた。妊娠経験のない女性を対象とした実験は終了し、いくつかの解析は残っているものの、情動や行動制御に関連するプロセスとオキシトシン、プロラクチンの関連を示す研究成果を得た。また、乳幼児の母親を対象とする実験にも着手した。昨年度に引き続き、母親群を対象とした実験を行う。実験終了後は、情動や衝動抑制とオキシトシン・プロラクチン、睡眠不足を含む育児ストレスとの関連についての統計解析を予定している。
奇形腫を介した骨髄線維症モデルの構築

骨髄増殖性腫瘍(MPN)では、著しいQOL低下や急性白血病へ移行する可能性があるが、唯一、完治する骨髄移植においても、ドナー不足や高頻度の移植関連死、重篤な合併症など多くの課題がある。MPN発症メカニズムの解明による新規治療法の開発に向けて、MPNのドライバー遺伝子CALR変異をもつ本態性血小板血症(ET)の患者からiPS細胞を樹立し、MPNにおける巨核球の形成の病態モデルをin vitroで再現することに成功した。ここから、CALR変異をもつETの造血幹細胞では、転写因子GATA1とGATA2の高発現が見られたことから、造血幹細胞が巨核球に分化が偏ることで、血小板が増加することが示唆された。本研究では、骨髄増殖性腫瘍の病態モデル作出のために、疾患iPS細胞を用いて、その発症メカニズムの解明に取り組んだ。これまでの進捗として、以下の3つが挙げられる。1.変異型CALR iPS細胞の樹立:変異型CALRは、骨髄線維症を引き起こすドライバー遺伝子変異の一つである。骨髄線維症の患者由来の細胞は、初期化されにくいことが報告されているため、まずCALR変異をもつ血小板血症患者の末梢血からiPS細胞を樹立した。その効率は、健常者の末梢血から樹立した場合と同等であった。2.CALR変異をもつiPS細胞をin vitroで分化誘導:CALR変異を持つiPS細胞から造血幹細胞・前駆細胞であるCD34陽性細胞へ分化誘導したところ、その効率は健常者と同等であった。次に、CD34陽性細胞から巨核球系の細胞系列へ分化誘導を行ったところ、健常者由来の細胞に比べて、巨核球マーカーCD42b陽性細胞が多く見られた。これは、巨核球の異常増殖である血小板血症の病態を再現していると考えられる。次に、赤血球系列の細胞へ分化誘導を行ったところ、健常者に比べて、赤芽球マーカーCD235a陽性細胞が少なかった。これは、CALR変異の患者に、赤血球の異常増殖である真性多血症が見られない理由が、造血幹細胞の赤芽球系への分化抵抗性であることを示唆している。3. CALR変異をもつ造血幹細胞における遺伝子発現解析:CALR変異をもつ造血幹細胞では、転写因子GATA1やGATA2の発現が健常者に比べて有意に高いことを発見した。これは、CALR変異における巨核球への分化の偏りと赤芽球系への分化抵抗性を引き起こしている可能性がある。さらに、巨核球の形成及び成熟を抑制するアナグレリドによって、巨核球への分化が阻害されることを確認した。以上から、CALR変異による血小板血症の病態をin vitroで再現することができた。本研究では、骨髄増殖性腫瘍の病態モデル作出のために、疾患iPS細胞を用いて発症メカニズムの解明に取り組んだ。現段階における進捗として、大きく以下の3つが挙げられる。1.骨髄線維症を引き起こす遺伝子変異の一つであるCALR変異をもつ患者の末梢血からiPS細胞の樹立に成功した。2.CALR変異をもつiPS細胞をin vitroで分化誘導することによって、血小板血症の病態を再現することに成功した。3.CALR変異をもつ造血幹細胞では、転写因子GATA2の発現が健常者に比べて高いことを発見した。骨髄線維症の患者由来の細胞は、その遺伝子変異によって初期化されにくいことが報告されている。CALR変異をもつ患者の末梢血から、健常者の末梢血と同様の効率で体細胞を初期化することができた。また、CALR変異を持つiPS細胞から造血幹細胞・前駆細胞であるCD34陽性細胞へ分化誘導し、そこから巨核球系の細胞系列へ分化誘導を行ったところ、健常者のiPS細胞と比べて、巨核球マーカーCD42b陽性細胞が多く見られた。同様に、CD235a陽性細胞への分化は、健常者に比べて少なかった。これは、CALR変異の患者には赤血球の異常増殖である真性多血症が見られないことと一致する。さらに、CALR変異iPS細胞から分化誘導したCD34陽性細胞では、健常者の場合と比べて、転写因子GATA2の遺伝子発現が高かった。これは、CALR変異における巨核球への分化の偏りと赤芽球系への分化の抑制を引き起こしている可能性がある。CALR変異をもつiPS細胞を予定通り樹立することに成功した。これまでに、骨髄線維症の患者から樹立したiPS細胞の報告において、体細胞の初期化が困難であることが知られている。この報告では、骨髄線維症の病態を示す結果がin vitroの解析のみになっていることから、骨髄線維症の病態をiPS細胞で再現することが難しいことが予想された。そこで我々は、はじめにCALR変異をもつ血小板血症患者の末梢血からiPS細胞の樹立し、その病態を再現できること確認したのちに、血小板血症から骨髄線維症へ移行させることを目指した。その理由として、骨髄線維症は、巨核球の異常や血小板の増加など血小板血症と似た兆候を示すこと、さらに血小板血症から二次的に骨髄線維症へ移行するが、血小板血症と骨髄線維症を共通して引き起こすドライバー変異がCALRであるためである。我々は、エピソーマルベクターを用いて、CALR変異をもつiPS細胞の樹立に成功した。

これは、既報のレトロウイルスベクターを用いた骨髄線維症iPS細胞に比べて、ゲノムへの挿入変異がほとんどないため、発ガンなどのリスクが低く、安全性が高いと言える。また、上述の通り、樹立したCALR変異をもつiPS細胞をin vitroにおける分化誘導系を用いることで、CALR変異による表現系を再現できた。さらに、CALR変異をもつiPS細胞から分化誘導したCD34陽性細胞では、健常者由来のiPS細胞から分化誘導したCD34陽性細胞に比べて、優位にGATA2の発現が高いことを確認しており、現在はこの転写因子に着目して、CALR変異による骨髄増殖性腫瘍の分子メカニズムの解明に向けて研究を進めている。以上のことから、現在までの進捗状況は、概ね順調に進展していると考えている。骨髄増殖性腫瘍(MPN)では、著しいQOL低下や急性白血病へ移行する可能性があるが、唯一、完治する骨髄移植においても、ドナー不足や高頻度の移植関連死、重篤な合併症など多くの課題がある。MPN発症メカニズムの解明による新規治療法の開発に向けて、MPNのドライバー遺伝子CALR変異をもつ本態性血小板血症(ET)の患者からiPS細胞を樹立し、MPNにおける巨核球の形成の病態モデルをin vitroで再現することに成功した。ここから、CALR変異をもつETの造血幹細胞では、転写因子GATA1とGATA2の高発現が見られたことから、造血幹細胞が巨核球に分化が偏ることで、血小板が増加することが示唆された。これまでに我々は、CALR変異を持つ血小板血症の患者からiPS細胞の樹立に成功した。今後は、骨髄線維症患者由来のiPS細胞をin vitroで分化誘導することによって、以下の3つの仮説の検証に取り組む。はじめに、CALR変異をもつ骨髄線維症の患者からiPS細胞を樹立する。樹立したiPS細胞を用いて、骨髄線維症発症のメカニズムが造血幹細胞からの線維芽細胞に分化が偏ることで起こるのか(仮説1)、または巨核球に分化が偏るために起こるのか(仮説2)を検証する。具体的には、骨髄線維症患者由来のiPS細胞をサイトカイン刺激で造血幹細胞へ分化誘導し、その分化傾向をフローサイトメトリーで評価する。造血幹細胞マーカーとしてCD34、巨核球マーカーとしてCD42bを用いる。また、巨核球による炎症性サイトカインによる炎症反応が骨髄線維症を引き起こすか(仮説3)検証するため、骨髄線維症患者由来のiPS細胞から分化誘導した造血幹細胞を巨核球へ分化誘導し、炎症性サイトカインの発現をqRT-PCRやサイトカインパネルを用いて評価する。また、ライトギムザ染色によって巨核球の異常が見られるか形態を評価する。iPS細胞のコントロールとして、健常人または血小板血症患者由来のiPS細胞を用いる。造血幹細胞のコントロールとして、骨髄線維症患者の骨髄または末梢血から分離したCD34陽性細胞を用いる。また、iPS細胞のin vivo分化誘導を行うために、免疫不全マウスへiPS細胞を移植することによって、奇形腫を形成させる。形成された奇形腫から造血幹細胞を分化誘導できる系を確立するために、まずは奇形腫を効率よく形成させられる方法を確立する。血液学本研究を進めていく上で必要になる消耗品を購入する際に、一括で購入することによって割引された。そのため、予想していた経費よりも安く入手することができたため、結果として、余剰金が生じてしまった。本研究を進めていく上で必要になる消耗品を追加で購入する予定である。
RASopathiesの網羅的遺伝子解析による新規原因遺伝子同定と臨床的特徴解明

Noonan症候群は低身長、特徴的顔貌、先天性心疾患、精神運動発達遅滞などを伴う先天性症候群である。Noonan症候群を含む「RAS/MAPK経路の調節異常を引き起こす生殖細胞変異によって引き起こされる症候群」はRASopathiesと呼ばれる。近年、次世代シークエンサーを用いた解析により、LZTR1を含む複数の原因遺伝子が同定されている。しかし、その報告数はまだ少なく、その病的意義、臨床的特徴、LZTR1の機能については不明な点が多い。本研究は、次世代シークエンサーを用いた解析により、近年同定された原因遺伝子や新規原因遺伝子を同定し、その臨床的特徴を明らかにすることを目的とする。
関節軟骨修復に寄与するマイクロRNAの探索

自己修復能が低い関節軟骨組織の損傷治療において、間葉系幹細胞(MSC)治療は詳細な作用機序については明らかになっていないものの、組織修復・再生を促進する治療として期待されている。申請者は、先行研究において、骨髄細胞由来MSCの軟骨分化度を定量予測するmicroRNA(miRNA)の一つとしてmiR708-5pを抽出した。さらに他のmiRNAの関与も示唆され、本研究課題では、軟骨分化能を規定するそれらmiRNA遺伝子群の絞り込みを行うことを目的とした。本研究申請時は、MSCの特定細胞群であるMuse細胞の利用を計画していたが実験系が複雑なことから再検討を要し、Muse細胞の利用は保留とした。また使用するMSCの細胞源について、現在、膝関節治療分野で保険外診療による脂肪由来細胞が普及しつつある社会的背景を勘案し、骨髄細胞から脂肪由来幹細胞(ADSC)に変更した。また、miRNAを内包する分泌小胞体であるエクソソームの解析を、核酸医薬・創薬研究の観点から本研究に加えた。過去の報告および、申請者がこれまで骨髄細胞で行ったbFGF添加による実験と同様に、ADSCでもbFGF添加による細胞の縮小紡錘形への形態的変化が顕微肉眼的に観察された。さらに増殖促進作用についても、bFGF添加による増殖速度は0.35 PD/dで非添加の2-3倍という骨髄細胞とほぼ同等(0.36±0.13 PD/d)の結果を得た。さらに軟骨分化誘導実験でのbFGF添加による未分化能維持を確認した。また、分化誘導前の培養上清をエクソソーム解析用に回収した。今後これら一連の実験を別ドナーで繰り返し行い、軟骨分化度に関連するエクソソームおよびmiRNAの解析を行う予定である。本研究内容について、既に実験を行うための設備は整っていたが、申請者含め実働人員のスケジュール調整などが困難で、研究体制の構築および環境整備に時間を要した。そのような背景の中、Muse細胞を利用した実験系は複雑で現在の研究体制では実現困難であると考え保留した。またADSC利用への変更や、エクソソーム解析の着想など、実現可能性の検討に時間を要した。ADSCはLONZA社から購入し専用の培地にて培養した。購入時、凍結されたP1の細胞を解凍しT150フラスコで生着・増殖を確認した後10ng/ml bFGF添加の有無で、さらに細胞を増殖させた。前課題の骨髄細胞由来MSCを用いた実験と同様に、ADSCでもbFGF添加による細胞の縮小紡錘形への形態的変化が顕微肉眼的に観察された。増殖促進作用については、bFGF非添加とbFGF添加による増殖速度はそれぞれ0.14PD/d、0.35 PD/dであり、骨髄細胞の値とほぼ同等だった。また、エクソソーム解析用に、分化誘導前に36時間無血清培地で培養し、その上清を回収・処理後、-80°Cで保存した。得られた細胞はペレットカルチャーによる軟骨分化誘導実験に用いた。bFGF添加後のADSCが初期から細胞塊を形成し、未分化能維持が高いことが示唆され、これまでの結果と同様と考えられたが、前課題で観察された細胞塊より小さいものだった。今後、できた細胞塊の組織学的および分子生物学的解析を行う予定である。さらに保存した無血清培地からエクソソームを回収し解析する予定である。今後これら一連の実験を別ドナーで繰り返し行うが、bFGF添加のタイミングおよび分化誘導前の継代数および無血清培地の暴露時間などに検討を要する可能性がある。上述の通り、細胞増殖からエクソソーム解析用サンプル採取および、その後の軟骨分化能実験をドナー変更の上、繰り返し行う。さらにできた軟骨塊の組織学的および分子生物学的解析を行う予定である。しかし得られた軟骨塊が十分なものでない場合はbFGF添加のタイミングおよび分化誘導前の継代数および無血清培地の培養時間などの検討を行う。また軟骨分化誘導の実験系を、マイクロマスカルチャーに変更し、アルシアンブルー染色およびOD595nmでの比色定量を行うことも検討している。分子生物学的解析にはsox9、2型コラーゲン、アグリカンなどの遺伝子発現量をRT-PCRにて定量解析を行う予定である。また、エクソソーム解析用サンプルは遠心分離にて余剰細胞を除去したのち、0.2umフィルターに通したのち-80°Cで保管してあるが、解析前に解凍し、超遠心機でエクソソームを抽出し、主にエクソソームの内包するmiRNAについて、microarrayシステム(EXIQON社miRCURY LNA miRNA array)で網羅的に解析する。解析には、Targetscan/microT-cDsやmirTarBase/TarBaseなどの公開されたデータベースを用い、標的遺伝子の絞り込みを行うことを検討している。

また使用するMSCの細胞源について、現在、膝関節治療分野で保険外診療による脂肪由来細胞が普及しつつある社会的背景を勘案し、骨髄細胞から脂肪由来幹細胞(ADSC)に変更した。また、miRNAを内包する分泌小胞体であるエクソソームの解析を、核酸医薬・創薬研究の観点から本研究に加えた。過去の報告および、申請者がこれまで骨髄細胞で行ったbFGF添加による実験と同様に、ADSCでもbFGF添加による細胞の縮小紡錘形への形態的変化が顕微肉眼的に観察された。さらに増殖促進作用についても、bFGF添加による増殖速度は0.35 PD/dで非添加の2-3倍という骨髄細胞とほぼ同等(0.36±0.13 PD/d)の結果を得た。さらに軟骨分化誘導実験でのbFGF添加による未分化能維持を確認した。また、分化誘導前の培養上清をエクソソーム解析用に回収した。今後これら一連の実験を別ドナーで繰り返し行い、軟骨分化度に関連するエクソソームおよびmiRNAの解析を行う予定である。本研究内容について、既に実験を行うための設備は整っていたが、申請者含め実働人員のスケジュール調整などが困難で、研究体制の構築および環境整備に時間を要した。そのような背景の中、Muse細胞を利用した実験系は複雑で現在の研究体制では実現困難であると考え保留した。またADSC利用への変更や、エクソソーム解析の着想など、実現可能性の検討に時間を要した。ADSCはLONZA社から購入し専用の培地にて培養した。購入時、凍結されたP1の細胞を解凍しT150フラスコで生着・増殖を確認した後10ng/ml bFGF添加の有無で、さらに細胞を増殖させた。前課題の骨髄細胞由来MSCを用いた実験と同様に、ADSCでもbFGF添加による細胞の縮小紡錘形への形態的変化が顕微肉眼的に観察された。増殖促進作用については、bFGF非添加とbFGF添加による増殖速度はそれぞれ0.14PD/d、0.35 PD/dであり、骨髄細胞の値とほぼ同等だった。また、エクソソーム解析用に、分化誘導前に36時間無血清培地で培養し、その上清を回収・処理後、-80°Cで保存した。得られた細胞はペレットカルチャーによる軟骨分化誘導実験に用いた。bFGF添加後のADSCが初期から細胞塊を形成し、未分化能維持が高いことが示唆され、これまでの結果と同様と考えられたが、前課題で観察された細胞塊より小さいものだった。今後、できた細胞塊の組織学的および分子生物学的解析を行う予定である。さらに保存した無血清培地からエクソソームを回収し解析する予定である。今後これら一連の実験を別ドナーで繰り返し行うが、bFGF添加のタイミングおよび分化誘導前の継代数および無血清培地の暴露時間などに検討を要する可能性がある。上述の通り、細胞増殖からエクソソーム解析用サンプル採取および、その後の軟骨分化能実験をドナー変更の上、繰り返し行う。さらにできた軟骨塊の組織学的および分子生物学的解析を行う予定である。しかし得られた軟骨塊が十分なものでない場合はbFGF添加のタイミングおよび分化誘導前の継代数および無血清培地の培養時間などの検討を行う。また軟骨分化誘導の実験系を、マイクロマスカルチャーに変更し、アルシアンブルー染色およびOD595nmでの比色定量を行うことも検討している。