hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
官庁統計におけるサンプリング法の改善と個票データとしての開示に関する諸問題の研究

現在は3統計とも総務省内で下審査の段階にある。特に家計調査と全国消費実態調査については,近く本申請ができるものと思われる。本年度は目的外申請が許可されることを想定して,調査事項の内で個人を特定するために利用される変数であるキー変数の選定や,個票データを公開する際にデータに含める調査事項の優先順位について議論を行った。また労働力調査の個票データの公開では,ローテーションサンプリングの情報を併せて公開することによりデータとしての利用価値を高めることが可能と考えられるが,疑似データを用いてその点に関する検討を行った。本研究参加者以外の意見を取り入れるために,本研究のテーマに関して他の研究グループと共同で11月29,30日に統計数理研究所でシンポジウムを開催するとともに,内部的な研究会も開催した。また統計数理研究所の論文誌「統計数理」に個票データ開示関連の特集を組むことが決定し,本研究参加者も既に投稿したところである。労働力調査,家計調査,全国消費実態調査の目的外使用が本年度認められ,個票データとしての公開のリスク評価について検討を行った。労働力調査については13年分のデータを用い,リスクを表す指標である一意な個体数に季節変動があることが示されたが,これは短期間のデータについての検討では不十分なことを示している。また利用する超母集団モデルによって母集団寸法指標の推定結果に大きな違いがあることも明らかになったが,部分母集団の情報を用いることにより,その差を縮小する方法を提案した。補助的な検討として,ローテーションサンプリングの調査結果への影響についても検討を行った。通算調査回数によって異なる調査票を用いていたことの問題が指摘されたが,その検証には更なるフォローアップが必要である。家計調査については5年分,全国消費実態調査については1回分のデータについて,世帯に属する個人属性も考慮に入れて公開可能な個票データのひな形を示した。リスク評価方法についての理論的な研究も進め,母集団寸法指標の制約付きノンパラメトリック推定では,寸法指標の探索方法などについて改善を図った。また制約条件として一般化Zipfモデルを用いる方法ではパラメータの追加についての検討を行った。本年度,他の科学研究費補助金の研究グループや統計数理研究所の共同利用研究グループと共同で,論文誌「統計数理」に特集「個票開示問題の統計理論」を組んだ。本研究分担者の論文等も掲載されている。また上記のグループと共同で,2003年11月27日29日にシンポジウムを,2004年1月10日に研究会を開催し,同じ分野や周辺領域の研究者との意見交換を行った。統計関連学会連合大会などでも研究成果を公表している。
内リンパ嚢の内リンパ静水圧調節機能についての検討

前庭と蝸牛の内外リンパ静水圧は同程度で、イソプロテレノールは前庭及び蝸牛の電位をそれぞれ変化させることなく、有意に前庭と蝸牛の内外いリンパ静水圧を上昇させた。イソプロテレノールによる前庭の内リンパ静水圧の最大変化量は蝸牛と比較して有意に小さかった。内リンパ嚢を閉塞した動物では、前庭内リンパ静水圧におけるイソプロテレノールの効果は蝸牛と同様に消失した。前庭と蝸牛では、イソプロテレノールは異なった方法で内リンパ静水圧を上昇させていると考えられる。カテコールアミン投与時の蝸牛・前庭の各部位での内リンパ静水圧・外リンパ静水圧の測定には成功し、それぞれの例数は徐々に増えてはいる。各部位の電極を挿入する方法として、正円窓にガラス電極を挿入する方法と骨壁に小孔を作成してガラス電極を挿入する方法を採用し、各部位で使い分けているが、正円窓からのアプローチに対して骨壁からのアプローチは電極挿入後に電極刺入部をシールする必要があり、その作業によりガラス電極が不具合を起こす事が多く、骨壁からアプローチして測定している蝸牛鼓室階および前庭階での外リンパ静水圧の測定が遅れている。カテコールアミン投与時の聴覚・平衡機能の検査等を行っている。これまでの研究よりカテコールアミン投与時には各部位での内リンパ静水圧及び外リンパ圧が上昇することが予想され、それに伴い、何かしらの聴覚及び平衡機能に変化を来すことが予想される。しかしながら、正常動物では代償作用が働くためカテコールアミンによる聴覚及び平衡機能への変化は軽微であると予想され、測定条件を変えながら測定しているが、現在のところ明らかな変化は測定できていない。昨年度の実施状況報告書で遅れていると報告したカテコールアミン(イソプロテレノール)投与時の蝸牛骨壁からのアプローチでの蝸牛鼓室階及び前庭階での外リンパ圧の測定に成功し、予定の例数に達した。カテコールアミン投与時の蝸牛及び前庭での反応の差異についての論文原稿の作成終了し、現在投稿中である。また、カテコールアミン投与時の聴覚及び平衡機能検査については測定条件を変更しながら施行中であるが、現在のところ、明らかな変化は測定できていない。おそらくは正常動物では何らかの大小作用が働き、明らかな異常が認められないものと考える。今後は、さらに測定条件を変更もしくは内リンパ水腫動物での聴覚及び平衡機能検査を実施し、カテコールアミン投与時の変化を測定予定である。また、可能であれば、他の薬剤での蝸牛及び前庭での内リンパ静水圧及び外リンパ静水圧の測定を行う予定である。カテコールアミン投与時内リンパ及び外リンパ静水圧の測定は手技が難しく、予定数に達するまでに時間がかかった。聴覚・平衡機能検査での異常を検出するための条件設定が難しく時間がかかっている。また、内リンパ水腫モデル作成および静水圧の測定はさらに困難で時間がかかっている。平成27年度にカテコールアミン投与時の内リンパ及び外リンパの静水圧の測定についての論文を投稿していたが、平成28年度は論文修正のための追加実験を行い、受理された。本論文は、前庭・半規管の内リンパ・外リンパ静水圧を測定し、カテコールアミン投与により静水圧が上昇することを実証した初めての論文となった。また、カテコールアミン投与により、蝸牛と前庭・半規管における静水圧の上昇に差があることも示し、メニエール病の病態解明につながると思われる。カテコールアミン投与時の聴覚や平衡機能についても検討を行ったが、有意な結果が得られなかった。正常動物での実験であり、代償作用などにより変化が得られにくいと考えられる。カテコールアミン投与時の内リンパ及び外リンパの静水圧の測定を各部位で行い、それぞれの例数を増やすことを目標に行っているが、手技が難しく、予想以上に例数が増えていない。また、カテコールアミン投与時の聴覚・平衡機能の変化を測定行っているが、予想される変化は軽微であると思われ、軽微な変化を測定するための測定条件の設定に時間がかかっている。正常動物での聴覚・平衡機能検査では代償作用が働くと予想されるため、内リンパ水腫モデルでのカテコールアミン投与時の聴覚・平衡機能検査測定の方が代償作用が働かずに異常を測定できる可能性が高いと考えられるため、実験を予定している。耳科学各部位での静水圧の測定に関しては、各部位での例数を増やすためには施行数を増やすしかなく、これまで通り行っていく。聴覚・平衡機能の測定に関しては、様々な条件設定でもカテコールアミン投与時の変化を測定できない場合は、他に予定している実験を前倒しして行う。消費税等の端数消費税等による端数H28年度の予算とあわせて、物品等に使用する予定である。H27年度の予算と合わせて、物品等に使用する予定である。
実験歴史学の構築に向けて

本研究「実験歴史学の構築に向けて」は、歴史研究に社会科学の成果である経済学実験の手法を取り入れることを目指している。そのために、実験と歴史を結びつける方法を構築すること、実験歴史学を計画・実施・評価するための一連の具体的な手続きを確定すること、各国・地域における社会経済的制度の形成について試験的な実験を行うことを目的としている。本年度は前年度に行った経済学実験の結果を分析・検討するとともに、歴史実験を構築するためのデータ収集と入力を行った。前年度、小田秀典(研究分担者)を中心に行った試験的な実験であるタカ・ハトゲーム結果を拠点校(京都産業大学経済学部)において、数回の研究会を通じて分析し、歴史学実験を行うため、歴史事象から抽出したモデルを作成するための諸条件を検討した。その結果、タカ・ハトゲームを近世および近代史における争議のためのモデルとすることとし、齊藤健太郎(研究代表者)は19世紀末から20世紀初頭のイギリスにおける争議資料調査のためにイギリス出張を行った。労働組合及び企業連合による資料をウォーリック大学近代資料センターModern Record Centreで、政府資料を国公文書館において調査した。前者の資料が多量であったため、2回にわたる資料収集(撮影)を行ったほか、歴史研究の文献的資料を収集した。また、山内太(研究分担者)は近世期における百姓一揆情報のデータを継続して作成している。具体的には、青木虹二『百姓一揆の年次研究』(新生社1966年)に記載された内容をもとに、藩名、地域名、一揆の原因・要求、一揆の形態等の情報をデータベース化している。全体の約八割が終了している状況である。このデータベース完成の暁には、日本史における歴史実験のための基礎的情報提供を行い、歴史実験を行う。また、日本の文書館・図書館等においても、資料調査および収集を行った。今年度は、昨年度に行った実験の結果をもとに、歴史実験を行うためのデータ収集および、モデル構築のための検討を行った。齊藤は争議資料収集の調査と歴史研究の文献的資料を収集するため2回のイギリス出張を行った。山内は、近世日本の争議データの調査及び入力を行った。進捗状況を「やや遅れている」とした理由を、第1に研究が「おくれている」点について、第2にそれが「やや」であった点について述べる。まず、これらの過程を「遅れている」としたのは、データ収集と入力などの作業に時間がかかり、実験モデルを作成し、今年度は歴史学実験をすることができなかったからである。次に、その遅れが「やや」であったのは、実験をすることはできなかったが、資料収集を通じて、日本の近世およびイギリスの近代の争議についての分析を進め、データベース化する過程が確実に進行しているからである。また、歴史学実験の基礎となる様々な歴史学の枠組みに関する整理も進めている。以上の諸点から、進捗状況につき上記のように評価した。上の「現在までの進捗状況」で示したように、今後の研究の推進方策として以下の3点を考えている。第1に、進行中の争議データの分析と入力を完了し、歴史実験を行うための実験モデルを構築する。特に、争議発生率が変化する時期・内容を実験可能な形で数値化する。争議発生率の計算には、争議内容の分類を行い、それを全争議数で除することによって得ることを検討している。これは次年度上半期7月までに完成する計画である。第2に、上記のようにして作られた歴史実験モデルをもとに、実際の歴史学実験を遂行する。これは、タカ・ハトゲームをもとにこれを修正した実験であり、日本(京都産業大学)および、外国の大学で実験する。引き続き、実験施設を有する中国の大学での実験を9月に行う計画である。第3に、以上の計画のために、今年度同様、年3回程度の研究会開催を通じて、それぞれの進捗を確認し、研究内容の検討を行う。また年度末には学会発表および関連研究者を招聘しての小コンファレンスを計画している。29年度は、歴史学実験を試行するための理論的整理・準備を進める一方、経済学実験から歴史学実験へ接近するための試験的実験を行う計画であった。一般の経済学実験の中にどのような歴史的含意を見出すことができるかを検討するためである。まず、試験的実験として、小田秀典および周艶は、再分配実験を日本および中国で実施した。実験では,まず互いに匿名の2人の被験者の初期所得を決定し,次に両人にそれをどう再分配したいかを尋ね,いずれかの提案を無作為で採用し,それに従って両人に謝金を支払うという手続きでおこなった。初期分配としては,(a)被験者の能力あるいは努力に応じる分配,(b)被験者の危険受容度と偶然による分配,(c)まったく偶然による分配の3通りがためされた。実験結果は,1.初期分配がもっとも尊重されたのは(a)のときであったのは予想通りであったが,2.日本の被験者の方が利己的な再分配提案をする傾向が高かったことと,3.平等分配の提案の割合は,(c)においても,初期分配に依存したことが,新たな発見であった。特に3は既得権や既存秩序の尊重に含意があり,これは、組織や集落が持つ秩序の形成やそれへの依存という歴史実験が検証しようとしている対象への実験の適用を示唆するものである。これは30年度に、日本およびイギリスに関する歴史実験を計画への寄与として大きい。

また、歴史学実験を試行するための理論的整理・準備として、齊藤は実験を歴史研究に適用するための理論的な前提として、歴史研究の方法論の整理を行った。また、30年度の実験計画のために、イギリスの労働争議資料について文献調査を行った。山内は近世日本の一揆についての実験計画を設計するための資料調査を行った。これらは、すべて国内の大学図書館・資料館などで行った。また、グループ内で定期的に研究会を開き、上記の内容について検討を行った。29年度は、上記のように計画していた国内と国外における実験を行い、その結果を歴史研究に適用できるかを検討する研究会を持ち、また、30年度における実験設計のための事前調査の一部をおこなったという点で、研究は「順調に」進展している。これが、「おおむね」である一つの理由は、事前資料調査として年度内の海外調査を予定していたことが実現できなかった点などである。また一方で、研究計画では「進捗に応じて、実験経済学・経済史の研究者と本研究について論じるため、内外の学会に参加・報告する」としていたが、内外の学会で報告するほどに研究が熟したとは言い難い。このような諸点から、進捗として、「区分」から選択したような状況になった。本研究「実験歴史学の構築に向けて」は、歴史研究に社会科学の成果である経済学実験の手法を取り入れることを目指している。そのために、実験と歴史を結びつける方法を構築すること、実験歴史学を計画・実施・評価するための一連の具体的な手続きを確定すること、各国・地域における社会経済的制度の形成について試験的な実験を行うことを目的としている。本年度は前年度に行った経済学実験の結果を分析・検討するとともに、歴史実験を構築するためのデータ収集と入力を行った。前年度、小田秀典(研究分担者)を中心に行った試験的な実験であるタカ・ハトゲーム結果を拠点校(京都産業大学経済学部)において、数回の研究会を通じて分析し、歴史学実験を行うため、歴史事象から抽出したモデルを作成するための諸条件を検討した。その結果、タカ・ハトゲームを近世および近代史における争議のためのモデルとすることとし、齊藤健太郎(研究代表者)は19世紀末から20世紀初頭のイギリスにおける争議資料調査のためにイギリス出張を行った。労働組合及び企業連合による資料をウォーリック大学近代資料センターModern Record Centreで、政府資料を国公文書館において調査した。前者の資料が多量であったため、2回にわたる資料収集(撮影)を行ったほか、歴史研究の文献的資料を収集した。また、山内太(研究分担者)は近世期における百姓一揆情報のデータを継続して作成している。具体的には、青木虹二『百姓一揆の年次研究』(新生社1966年)に記載された内容をもとに、藩名、地域名、一揆の原因・要求、一揆の形態等の情報をデータベース化している。全体の約八割が終了している状況である。このデータベース完成の暁には、日本史における歴史実験のための基礎的情報提供を行い、歴史実験を行う。また、日本の文書館・図書館等においても、資料調査および収集を行った。今年度は、昨年度に行った実験の結果をもとに、歴史実験を行うためのデータ収集および、モデル構築のための検討を行った。齊藤は争議資料収集の調査と歴史研究の文献的資料を収集するため2回のイギリス出張を行った。山内は、近世日本の争議データの調査及び入力を行った。
中国仏教美術における観仏思想と造形表現に関する研究

本研究は、中国の仏教美術において、仏あるいは仏の浄土を"観る"という思想が、造形表現にいかなる影響を及ぼしたのかという問題について、阿弥陀の西方浄土に関わる作例を題材に調査と研究を行った。特に、初唐から北宋の敦煌莫高窟の西方浄土変に描かれた十六観図について『観無量寿経』の記述と照合し、分類と分析を試み、時代ごとの変遷を明らかにするとともに、それらを生み出した思想的・歴史的背景について考察を加えた。その作業の一環として、敦煌莫高窟・ベゼクリク石窟・キジル石窟を対象とした石窟関連資料のデータ整備を行い、「中国石窟データベース」として構築・公開した。また、敦煌の諸作例との比較から、日本に伝来する綴織当麻曼荼羅の図様が経典に厳密に合致している点について、関連する文献資料を収集し、その制作背景の分析を試みた。本研究の目的は、中国の仏教美術において、仏あるいは仏の浄土を"観る"という思想が、造形表現にいかなる影響を及ぼしたのかという問題について、現存作例が集中する敦煌莫高窟の壁画や絹本画を中心とする作品研究と、関連する文献研究によって具体的に浮き彫りにすることにある。初唐期に突如として現れる大画面の西方浄土変には、(1)大画面、(2)奥行き、(3)緻密さ、という現在のバーチャルリアリティ技術とも通じる一種の造形的仕掛けが施されており、それによって観者の眼前にあたかも阿弥陀の西方極楽浄土そのものが存在するかのような感覚を呼び起こす造形表現が採られている。こうした新種の西方浄土変が生み出された唐代の作品には、仏菩薩と同一空間に供養者をあらわすという、それまでの作品には見られなかった新しい表現が見出せる,それはすなわち、仏世界と人間世界との空間認識が唐代に大きく変化したことを物語るものと考えられ、文献にもそうした新たな認識の存在をうかがわせる記事が見出せる。そこで研究初年度にあたる本年度は、公刊されている図録等を中心に、関連作例の収集を行った。その際、資料整備として、国立情報学研究所のディジタル・シルクロード・プロジェクトの技術支援のもと、石窟データベース(http://dsr.nii.ac.jp/china-caves/)を構築した。これは、同プロジェクトの「東洋文庫所蔵」図像史料マルチメディアデータベースに収められている石窟関連のデジタル・リソースを活用し、石窟寺院のなかでも特に重要な(1)敦煌莫高窟、(2)ベゼクリク石窟、(3)キジル石窟について、関連する画像データを収集・整理したもので、複数の編号が存在することから資料の探索が困難であったこれらの石窟について、既存の石窟番号対応表を修正・追加して作成した。今年度は、敦煌研究院(樊錦詩院長)の許可を得て、10月26日から29日の3日間、中国・敦煌莫高窟の中唐以降の11窟(第15窟、第92窟、第118窟、第134窟、第144窟、第145窟、第154窟、第180窟、第197窟および付属窟、第237窟)を実見して調査ノートを作成し、あわせて未刊行の十六観図9点についてスケッチをとり、図像研究のもととなる描き起こし図を作成した。この結果、これまでに得られた敦煌の十六観図は、海外流出の蔵経洞将来絹本画を含め計64点にのぼり、現存する敦煌十六観図の七割をカバーしたことになる。これにより、元来阿弥陀浄土の観想に関わる絵画表現である十六観図について、敦煌における具体相の全体像を描きうるだけの材料が得られたといえる。これらのデータの整理・検討は現在進行中であり、研究の成果として最終年度に公刊する予定である。また、前年度に引き続き、敦煌莫高窟・ベゼクリク石窟・キジル石窟を対象に、石窟関連資料のデータ整備を行い、今年度はとくに、前年度に作成していた石窟番号および名称の対照表の追加・修正と、関連資料の補充に重点を置き、さらに石窟地図検索システムを新たに整備した。その成果は6月に「中国石窟データベース」として一般公開した(http://dsr.nii.ac.jp/china-caves/)。

加えて、学術的価値の高いペリオの莫高窟図録(Pelliot, Paul. Les Grottes de Touen-houang, 6vols.)の全図版に中国の研究者が付した図版解説文を、莫高窟の窟番号によって整理し、「中国石窟データベース」ともリンク構造をもたせて「ペリオ敦煌図録図版解説」(http://dsr.nii.ac.jp/reference/pelliot/)として構築した(2010年5月公開)。また、観想の意義と内容を十全に備えた唐代西方浄土変の作例として、これまで研究を進めてきた当麻曼荼羅について、調査で得られた知見を取り入れてまとめた小論3篇を、週刊朝日百科『国宝の美』9号に発表した。今年度は本研究課題の最終年度として、敦煌莫高窟の中唐以降の作例を中心に、これまでに行ってきた実地調査の結果を整理・分析した。その結果、中唐吐蕃期の十六観図は、盛唐期に出現する作例群のうち、『観無量寿経』から逸脱した図像を多分に含んだ図案的で簡略な系統の図を継承していることが明らかとなった。加えて、中唐吐蕃期のほとんどの作例に見られる配列の乱れから、制作にあたって『観無量寿経』等のテキストは全く参照されていなかったことは明らかで、十六観の順を考慮せず諸図像を寄せ集めた晩唐期の白画粉本(P.2671v)が蔵経洞から見つかっていることから、中唐吐蕃期においても同様の粉本が転写に用いられていたことが推測される。したがって、初唐期に認められた、観想念仏の実践と造形表現との関係は、盛唐期には早くも崩れ始め、その後、この傾向は改められることなくむしろ加速度的に乖離が進み、帰義軍期にまで至ったことが作例から跡づけられた。この成果は、『仏教学部論集』95号にて公刊された。また本年度は、敦煌の諸作例との比較から、日本に伝来する綴織当麻曼荼羅図についても検討した。綴織当麻曼荼羅図は、敦煌の諸作例とは異なり図様が経典に忠実であり、もとになった下絵は、高僧らによる一種の校訂作業を経たものであったと考えられる。したがって、仏教美術においても仏典における所謂「長安宮廷写経」と同様の制作形態が唐代に存在したことが推定される。蔵経洞発現の写経群をみると当時の写経の目的や写経主は一様でなく、ために仕上がりに差があることが見て取れる。同様に仏教美術においても、制作の目的や制作主によって図様の正確さや仕上がりが大きく異なったことが想定されるのであり、敦煌莫高窟の諸作例と綴織当麻曼荼羅図にみられる差は、そうした面から説明することが可能となる。この成果は、『第13回日中佛教学術交流会議発表論集』にて公刊された。
変形性膝関節症の簡易スクリーニング検査の開発

本研究の目的は一般住民検診の中の膝関節検診における問診で得られた項目および医師の診察による理学的所見と整形外科医師の読影によるレントゲン所見について評価し、住民検診におけるレントゲンを用いないで、変形性膝関節症を検出するための膝関節検診の必須の検査項目を明らかにすることである。研究方法は1997年から2011年の15年間に、北海道八雲町の毎年の一般住民検診を受診した40才以上の11,227例を調査した。最終的に複数回受診者の重複を避けるために初回受診時の1,868例(平均年齢63.9±7.9歳、男性708例、女性1160例)を対象とした。膝関節単純レントゲンは、膝屈曲位Rosenberg法に従って撮影した。変形性膝関節症の評価は、Kellgren-Laurence分類に基づいて行った。グレード0および1を正常群とし、グレード2以上を変形性膝関節症群とした。得られたデータからスクリーニング項目を決定し、感度と特異度を算出した。結果としては、変形性膝関節症と診断したのは469例で全体の25.1%であった。性別、年齢、BMI、各問診項目、理学的所見について多変量ロジスティック回帰分析を行った結果、4週間以上持続する現在または過去の膝関節痛、過去の膝関節手術歴、手指のヘバーデン結節有り、関節水腫あり、膝関節伸展制限の5項目で有意差を認めた。変形性膝関節症を検出するスクリーニングの必須検査3項目を4週以上持続する現在または過去の膝関節痛、手指のヘバーデン結節、膝関節伸展制限とした場合、3項目のうち1項目でも陽性であると感度90.5%、特異度41.3%の結果を得た。今後としてはKOACADを用いて変形性膝関節症と診断するための関節裂隙と骨棘面積のカットオフポイントを策定し、客観的診断ツールを用いてスクリーニング検査が妥当であるか検討する必要がある。
グレリンの中枢作用

グレリンはGHS(growth hormone secretagogue)受容体の内因性リガンドとしてラットの胃から同定された。グレリンは胃のみならず視床下部および下垂体にも発現されて,おり、その受容体GHS-Rは視床下部と下垂体に存在する。従って、グレリンには末梢作用とともに中枢作用が存在することが想定される。本研究ではまずグレリンの中枢作用について検討した。グレリンを72時間にわたりラットに中枢投与すると、視床下部に存在する摂食促進ペプチドであるNeuropeptide YとAgouti-related proteinの遺伝子発現は増加し、摂餌量と体重が対照ラットに比べ有意に増加した。一方、GH分泌調節に関与するGHRHとソマトスタチンの遺伝子発現に変化はなく、GHの分泌も変化しなかった(Diabetes)。次に下垂体グレリンの遺伝子発現について検討し、下垂体グレリンの遺伝子発現が、日齢およびGHRH依存的な制御を受けていることを報告した(Endocrinology)。視床下部弓状核のGHS-Rを選択的に合成阻害する組織特異的GHS-Rアンチセンストランスジェニックラットを作製し、このラットは成長障害をきたすことを報告し、その機序についても検討し、視床下部グレリン/グレリン受容体系の生理的意義について明らかにした(J Clin Invest 2002)。また視床下部弓状核欠損ラットでは外因性グレリンのGH分泌促進作用は保たれるが、摂食促進作用は消失することを報告し(Endocrinology 2002)、グレリンの摂食促進作用発現には視床下部弓状核の存在が不可欠であることを明らかにした。さらにStreptozotocin誘発糖尿病ラットでみられる過食にグレリンの過剰分泌が関与していることを報告し、グレリンの病態生理学的意義に付いても明らかにした(Endocrinology 2002)。グレリンは胃のみならず視床下部および下垂体にも発現されており、その受容体GHS-Rは視床下部と下垂体に存在する。グレリンを慢性的にラットに中枢投与し、GHの分泌動態、摂食量、発育や行動を観察し、GHの分泌調節にかかわる神経ペプチドや摂食関連ペプチドの遺伝子発現を検討した。グレリンを72時間にわたりラットに中枢投与すると、視床下部に存在する摂食促進ペプチドであるNeuropeptideYとAgouti-related protein(AGRP)の遺伝子発現は増加し、摂餌量と体重が対照ラットに比べ有意に増加した。次に下垂体グレリンの遺伝子発現について検討した。我々は、下垂体グレリンの遺伝子発現が、日齢およびGHRH依存的な制御を受けていることを見出し報告した(Endocrinology)。更に、下垂体グレリン受容体(GHS-R)の遺伝子発現について検討し、甲状腺ホルモンにより下垂体グレリン受容体の遺伝子発現は正の調節を受けていることを明らかにした(J Neuroendocrinol)。グレリンはGHS (growth hormone secretagogue)受容体の内因性リガンドとしてラットの胃から同定された。本研究ではグレリンの中枢作用について検討した。視床下部弓状核のGHS-Rを選択的に合成阻害する組織

特異的GHS-Rアンチセンストランスジェニックラットを作製し、このラットは成長障害をきたすことを報告し、その機序についても検討し、視床下部グレリン/グレリン受容体系の生理的意義について明らかにした(J Clin Invest 2002)。また視床下部弓状核欠損ラットでは外因性グレリンのGH分泌促進作用は保たれるが、摂食促進作用は消失することを報告し(Endocrinology 2002)、グレリンの摂食促進作用発現には視床下部弓状核の存在が不可欠であることを明らかにした。さらにStreptozotocin誘発糖尿病ラットにおいては過食が認められるが、この過食ラットの血中グレリン濃度は上昇しており、グレリン受容体の括抗薬の投与によりこの過食が一部解除されることを示し、糖尿病過食にグレリンの過剰分泌が関与していることを報告し、グレリンの病態生理学的意義に付いても明らかにした(Endocrinology 2002)。
重粒子線によるがん細胞殺傷機序・治療抵抗性機序の解明とその治療応用

重粒子線によるがん治療は格段に優れた線量分布や高い生物学的効果など、従来の光子線に比べて極めて有利な特徴を有しており、今後のがん放射線治療においてますます大きな役割を担うものと考えられる。しかしながら重粒子線といえども万能ではなく、今後より多くのがん種で満足のゆく治療成績を得るためには、重粒子線によるがん細胞殺傷機序を理解し、その知見に基づきがん細胞に対してより選択的・効果的な重粒子線治療を可能にする新たな方法論を模索することが重要である。本研究課題では主にグリオーマ細胞を用いて、重粒子線(炭素線)照射により誘導される細胞死のメカニズム解析を行った。その結果、重粒子線により誘発されるグリオーマ細胞の細胞死は、少なくとも照射後早期に誘導されるものについては主にカスパーゼ依存的なアポトーシスにより生じていること、また、カスパーゼの活性化がミトコンドリア経路を介しておきていることが明らかになった。さらにMEK-ERK経路に抑制的に作用する阻害剤やsiRNAが重粒子線によるミトコンドリア経路依存的なアポトーシス誘導を抑制したことから、ミトコンドリアの上流域での細胞死シグナル伝達にMEK-ERK経路が関与していることが示唆された。これらの結果はMEK-ERK経路ミトコンドリアカスパーゼと至るシグナル伝達経路上の分子を標的としそのシグナル伝達を促進するような薬剤が重粒子線の増感剤となりうる可能性を示唆するものである。実際、例えば、EGF添加によりMEK-ERK経路を活性化させた状態で重粒子線を照射してみたところ、EGFがMEK依存的に細胞死を増強することが判明した。さらにこのような細胞死シグナル伝達が重粒子線に特異的なものか、X線のような光子線にも共通するものか検討を行ったところ、MEK-ERK経路依存的な制御は重粒子線特有なものであることが明らかとなった。その結果、重粒子線により誘発されるグリオーマ細胞の細胞死は、少なくとも照射後早期に誘導されるものについては、主にカスパーゼ依存的なアポトーシスにより生じていること、また、カスパーゼの活性化がミトコンドリア経路を介しておきていることが明らかになった。さらにキナーゼに対する阻害剤が重粒子線によるミトコンドリア経路依存的なアポトーシス誘導を抑制したことから、ミトコンドリアの上流域での細胞死シグナル伝達にこの阻害剤により抑制されるシグナル伝達キナーゼが関与していることが示唆された。これらの結果はシグナル伝達キナーゼーミトコンドリアーカスパーゼと至るシグナル伝達経路上の分子を標的としそのシグナル伝達を促進するような薬剤が重粒子線の増感剤となりうる可能性を示唆するものである。
活性酸素消去剤としての水溶性フラーレン誘導体に関する検討

本研究は、研究代表者が既に明らかにしたフラーレン誘導体の活性酸素消去能に着目し、新たな作用機構に基づくフラーレンの医薬品への応用を検討するものである。以下に本年度の研究実績の概略を説明する。前年度に明らかにしたように、ポルフィリン錯体ならびにフラーレンを包含するハイブリッド化合物に強いスーパーオキシド消去活性が認められた。しかしながらこの誘導体の活性は、各々の総和でしかなく、当初期待した相乗的な効果は認められなかった。この誘導体はスペーサーが短くポルフィリンとC_<60>分子とが近接して固定された状態のものである。そこでスペーサーの長さを調節して分子内での自由度を増やし、最適化することによる活性の向上を目指した。まず、スペーサーを介して水溶性ポルフィリン誘導体をC_<60>に導入する化学変換法を検討した。種々検討した結果、ω-bromoalkanal dimethyl acetalをスペーサー中間体に用いることにより、ポルフィリンとはphenol性水酸基のアルキル化、C_<60>とはアゾメチンイリド法により、それぞれスペーサーを結合することに成功した。この合成法は簡便でかつ収率も良好であり一般性の高い手法である。さらに前年度と同様に、ピリジル基の四級化、金属イオンとの錯形成反応を行い、一連の所期の目的化合物を得ることに成功した。現在in vitroでのスーパーオキシド消去活性との構造活性相関を検討中である。フラーレンとポルフィリンは活性酸素関与の生理活性に関する興味のみならず、光化学的な挙動からも高い関心がもたれている。実際に分子内にスペーサーを介して両者を包含する化合物も合成され興味深い物性結果が得られているが、水溶性誘導体は開発されていなかった。今回合成に成功した化合物は予想通り非常に高い水溶性を有しており、上記の興味も含め種々の生理活性試験に適用可能である。今後検討する予定である。本年度においては、in vitroでのスーパーオキシド消去活性を指標とした水溶性フラーレン誘導体の構造活性相関を行った。以下に概略を説明する。強いスーパーオキシド消去活性を有する低分子錯体がポルフィリン誘導体をはじめいくつか報告されている。これらの錯体をC_<60>に導入することにより、金属イオンによるスーパーオキシドとの静電的相互作用によるフラーレン部位のスーパーオキシド消去活性の増大が期待され、かつ錯体部位とフラーレン部位での両者でのスーパーオキシド消去活性が期待できる。まず、水溶性ポルフィリン誘導体をC_<60>に導入する化学変換法の確立を行った。水溶性ポルフィリンをC_<60>に導入することにより、一挙にC_<60>の水溶性を高めることができる。また、ポルフィリンのメソ位置換基および中心金属イオンを種々検討することにより、活性に影響をおよぼすことが期待できる。市販の原料から3行程を経て、メソ位にピリジル基およびホルミルフェニル基を有するポルフィリン誘導体に導いた。その後、ホルミル基を利用してアゾメチンイリド法により、ポルフィリンが結合したC_<60>誘導体を得た。さらにピリジル基の四級化、金属イオンとの錯形成反応を行い、所期の目的化合物を得ることに成功した。これらの化合物は予想通り非常に高い水溶性を有しており、種々の生理活性試験に適用可能である。次いでin vitroでのスーパーオキシド消去活性との構造活性相関を、シトクロムc法により検討した。その結果、C_<60>誘導体のスーパーオキシド消去活性には静電的相互作用が重要である事が,あらためて明らかになった。

実際に分子内にスペーサーを介して両者を包含する化合物も合成され興味深い物性結果が得られているが、水溶性誘導体は開発されていなかった。今回合成に成功した化合物は予想通り非常に高い水溶性を有しており、上記の興味も含め種々の生理活性試験に適用可能である。今後検討する予定である。
液晶相形成物質の結晶多形と相転移挙動

さまざまな秩序度をもつ液晶相を規定している分子間相互作用を解明するために,結晶多形の構造とその液晶相への転移挙動について以下の研究を行った。(1)初めて反強誘電性が示されたMHPOBCと略する物質について,構造および熱挙動の検討を行い,報告した。(2)直鎖部とキラルなアルキル基が互いに入れ替った関係にある2つの異性体物質の結晶構造解析を行い,それぞれの物質が全く異なる液晶相をとることが結晶構造と密接な関係をもつことを明らかにした。(3)比較的簡単な分子構造をもつアルコキシシアノビフェニルのヘプチルおよびオクチル同族列について,単結晶の育成を行い,前者には3つの結晶形,後者には4つの結晶形が存在することを見いだした。(4)ヘプチルオキシシアノビフェニルの板状晶について構造解析を行い,既に解析済みの針状晶との比較を行った。両者は,シアノ基の配列が異っており,前者ではシアノ基が網目状に近接しているが,後者では,二量体的に近接している。またそれぞれの結晶多形について,一定速度で昇温しながら,赤外ラマンスペクトルの測定を行い,転移機構および各相間の関連を検討した。(5)オクチルオキシシアノビフェニルの平行四辺形板状晶について構造解析を行った。この結晶ではヘプチル同族列の2つの多形とは異り,シアノ基とビフェニルが近い関係にある。他方,正方形板状晶および針状晶は,ヘプチル同族列の対応する結晶形と同形であることが示唆された。さらに,示差走査熱量測定により,各結晶形の転移挙動を検討した。
MRIによる認知症病原蛋白質のオリゴマー構造の解析

レヴィ小体型認知症患者の脳内では、αシヌクレイン(a-Syn)蛋白質が、可溶性のオリゴマーを経て不溶性線維へと重合すると推定される。In vitroで生成したa-Synオリゴマーは、不溶性線維と異なる二次構造を形成し、高い神経毒性を示す。in vivoにおいて、a-Synオリゴマーが実際に生じているのか、また、どのような構造を形成するのかを解明することは、病態の解明や創薬に向けて極めて重要である。本研究は、13C標識a-Syn蛋白質を動物の脳に注入し、13C検出磁気共鳴スペクトロスコピー法(MRS)を用いて、a-Synオリゴマーの生成を検出し、その二次構造情報を得る事を目的とする。H30年度は、a-Synをマウスの脳神経細胞内に導入する計画を立てていた。動物の脳に電極を刺してパルスを与えることで、タンパク質を細胞に効率よく導入する方法が利用できる可能性を考えた。その展望のもと、電気穿孔法を用いたHeLa S3細胞に対するa-Synの導入実験を実施した。15N標識したa-Synを細胞に導入後、In-cell NMR測定を行い細胞内に導入されたa-Synを直接観測すした。細胞内に導入したa-SynのNMRスペクトルは、試験管内のものと比べて、化学シフト変化・広幅化が生じていた。これらは、N末端のアセチル化、細胞内分子との相互作用に由来すると考えられる。今後、a-Synを生きたマウスの脳神経細胞に導入してスペクトルを得る予定である。そのため、神経培養細胞を用いて導入パルスの強度などの最適化を進める。また、今回得られた培養細胞内のa-Synのスペクトルは、培養細胞内と生きた個体の神経細胞内の環境がa-Synに及ぼす影響がどのように変化するかを調べる際に、重要な比較対象となる。H30年度は、a-Synをマウスの脳神経細胞内に導入する計画であった。当初、マウス脳にa-Synを注入することを計画していたが、培養細胞に対する導入検証を行い段階的に進めていく形に変更した。神経培養細胞を用いてパルス強度の検討を行い、電気穿孔法によるa-Synの導入効率の最適化を図る。その後、マウス脳に電極を刺して、13C標識タンパク質を注入し最適化されたパルスを与えて、MRIによる検出を試す。レヴィ小体型認知症患者の脳内には,αシヌクレイン(α-Syn)タンパク質のオリゴマーが生じる。α-Synオリゴマーは強い神経毒性を持つため、その立体構造の解明は、病態解明や創薬に向けて重要な研究課題となる。これまで、α-Synオリゴマーの立体構造については、CD、NMRによるin vitroでの解析が進められてきた。しかし、α-Synのin-cell NMR研究では、細胞内に導入したα-Synモノマーが、in vitroに比べよりコンパクトな構造をとる事が報告された(Nature (2016)530,45)。そのため、α-Synオリゴマーも細胞内ではin vitroと構造が異なるると想定される。本課題では13C標識を施したaSynをマウス脳に移植・注入し、MRS法によりaSyn由来の13Cシグナルを検出することで、in vivoにおけるα-Synのオリゴマー形成を検出し、その二次構造情報を得ることを目的とする。今年度は、マウス脳に導入したaSynを実際に検出する事が可能かMRS装置の検出感度の点から可能か調べた。均一13C標識したα-Syn溶液を大腸菌発現系を用いて発現し、実際の神経細胞内濃度に相当する50μMのファントム(標準試料)を作製した。13C極低温検出器を備えた7テスラMRI装置を用いて、同ファントムの13C MRS測定を行った。その結果、1時間の積算でα-Synに由来する13Cシグナルを検出出来た。生体内におけるα-Synの半減期は50時間と報告されているので、α-Synが分解を受けずに信号を観測することが可能と考えられる。得られたシグナルの線幅は、溶液NMRにより得られたスペクトルと比較して広幅化していたが、個々のシグナルは分離していた。本研究成果は、第25回国際磁気共鳴医学総合会議(ISMRM)、第45回日本磁気共鳴医学会大会、第55回生物物理学会において発表した。H29年度は、α-Synファントム(標準試料)を用いた13C MRS検出感度の検討実験を予定していた。当初の計画通り、13C標識を施したaSynタンパク質溶液を大腸菌発現系を用いて調製し、神経細胞内濃度のファントムを用いて13C MRS測定を実施する事が出来た。

動物の脳に電極を刺してパルスを与えることで、タンパク質を細胞に効率よく導入する方法が利用できる可能性を考えた。その展望のもと、電気穿孔法を用いたHeLa S3細胞に対するa-Synの導入実験を実施した。15N標識したa-Synを細胞に導入後、In-cell NMR測定を行い細胞内に導入されたa-Synを直接観測すした。細胞内に導入したa-SynのNMRスペクトルは、試験管内のものと比べて、化学シフト変化・広幅化が生じていた。これらは、N末端のアセチル化、細胞内分子との相互作用に由来すると考えられる。今後、a-Synを生きたマウスの脳神経細胞に導入してスペクトルを得る予定である。そのため、神経培養細胞を用いて導入パルスの強度などの最適化を進める。また、今回得られた培養細胞内のa-Synのスペクトルは、培養細胞内と生きた個体の神経細胞内の環境がa-Synに及ぼす影響がどのように変化するかを調べる際に、重要な比較対象となる。H30年度は、a-Synをマウスの脳神経細胞内に導入する計画であった。当初、マウス脳にa-Synを注入することを計画していたが、培養細胞に対する導入検証を行い段階的に進めていく形に変更した。次の段階として、マウス脳に13C標識を施したα-Synを注入して13C MRSによる検出を試す。当初の計画段階では、aSynを脳内に単に注入するだけでなく、如何にして脳内の神経細胞内に移行させるかを検討課題と挙げていた。しかし、最近のα-Synの脳注入実験の報告に基づくと、外部から注入されたα-Synが、細胞内移行ペプチド等の助けがなくても神経細胞内に取り込まれる事例が報告されている(Nature (2015) 522, 340)。そのため、マウス脳にα-Synを直接注入し、13C MRS測定によりその経時変化を調べる。神経培養細胞を用いてパルス強度の検討を行い、電気穿孔法によるa-Synの導入効率の最適化を図る。その後、マウス脳に電極を刺して、13C標識タンパク質を注入し最適化されたパルスを与えて、MRIによる検出を試す。今年度予定していた安定同位体標識αーSynの調製を次年度に一部もちこしたため、安定同位体の購入を次年度に繰り越す形になった。次年度、同試料の調製時に使用する予定である。当初予定していた膜透過性ペプチドを利用した実験から、電気穿孔法を用いた実験へと内容を変更し、当初予定していたマウス脳への注入実験が次年度に見送る形となった。次年度に行うマウス脳への導入実験に本経費を使用する。
唾液腺における開口分泌とCa2+、cAMP及びSNARE動態のリアルタイム解析

アデノウイルスやレンチウイルスベクターを用いてCa2+バイオセンサー並びにcAMPバイオセンサーをラット顎下腺に発現させ、顎下腺細胞におけるCa2+シグナルとcAMPシグナルのライブイメージングに成功した。ムスカリン受容体アゴニストのピロカルピンの前投与により、唾液分泌量並びにアミラーゼ分泌量が増加した。さらに、ピロカルピン刺激により唾液腺及び脳における遺伝子発現の顕著な変化が認められた。このことから、ピロカルピンはムスカリン受容体活性化を介して、遺伝子発現と水及びタンパク質分泌を調節する可能性が示唆された。本研究は、唾液腺細胞における開口分泌と、Ca2+ならびにcAMPシグナル、SNAREタンパクの関わりを明らかにし、唾液腺における開口分泌の分子基盤を解明する事を目指す。1)アデノウイルスベクターを顎下腺開口部から逆行性に注入し、Ca2+センサー(YC-Nano50)をラット顎下腺に発現させ、in vivoでCa2+応答を解析した。アセチルコリンやピロカルピンなどのムスカリン受容体アゴニスト刺激によりCa2+応答が観察されたが、開口分泌を起こすβ受容体アゴニスト(イソプレナリン)刺激によるCa2+応答は、現在の解析システムでは検出されなかった。同様の方法でcAMPセンサー(Nano-lantern-cAMP)を顎下腺に発現させ、酵素処理により単離顎下腺腺房細胞を調製した。この細胞をイソプレナリンで刺激するとcAMPシグナルの上昇が認められ、唾液腺細胞におけるcAMPシグナルのリアルタイム解析に初めて成功した。2)顎下腺と同様の手法で耳下腺にアデノウイルスを用いて蛍光タンパク質を発現させることに成功した。顎下腺での発現と異なり、蛍光は耳下腺組織の一部にのみ認められた。3)アデノウイルスより組織ダメージが少なく、長期的遺伝子発現が期待されるアデノ随伴ウイルス(AAV)を用いてCa2+センサーを発現させる事を試みた。その予備実験として、唾液腺由来培養細胞(HSY, A5)にAAVを用いてYC-Nano50を発現させ、その発現効率を蛍光強度およびWestern Blotにより解析した(研究協力者:高橋亜友美)。次に、AAV導入により唾液腺由来培養細胞を用いてYC-Nano50の恒常発現細胞を作製した。この細胞の長時間Ca2+イメージングを行ったところ、無刺激でのCa2+オシレーションが観察された(研究協力者:村田佳織)。逆行性注入法によりAAVを用いてYC-Nano50を顎下腺に導入した。現在の方法では、YC-Nano50の発現は認められず、ムスカリン受容体刺激による明確なCa2+応答も検出されなかった。1)ムスカリン受容体アゴニストであるピロカルピンを前投与すると、非前投与群のコントロールと比較して、唾液分泌量が増加した。さらに唾液中のアミラーゼ量を測定すると、ピロカルピン前投与により唾液分泌量に比例してアミラーゼ量も増加していた。このことから、ムスカリン受容体刺激により水分泌とともにアミラーゼ分泌が起こることが示された。このアミラーゼ分泌はCa2+依存性リン酸化酵素(PKC)の活性化を介している可能性が考えられる。アセチルコリンの持続的静脈内投与による顎下腺からの唾液分泌を、顎下腺開口部に挿入した微小圧力センサーによりリアルタイムで測定した。ピロカルピン前投与群では、低濃度のアセチルコリン刺激による唾液分泌の亢進が観察された。この結果は、ピロカルピン前投与により唾液腺腺房細胞の感受性が亢進した結果と考えられる。2)セルソーターを用いて、Ca2+センサー(YC-Nano50)の恒常発現細胞(HSY)を作製した。この細胞の長時間Ca2+イメージングを行ったところ、無刺激でのCa2+オシレーションが観察されたが、Ca2+オシレーションの頻度は容量性Ca2+流入を阻害するLa3+の添加により抑制された。3)アデノ随伴ウイルス(AAV)と同様に長期的遺伝子発現が期待され、AAVよりも発現効率が高いとされるレンチウイルスを用いてCa2+センサーを発現させる事を試みた。レンチウイルスベクターを用いて唾液腺由来培養細胞(HSY)にYC-Nano50を発現させ、蛍光を観察した。蛍光強度及び発現細胞数は導入後徐々に増加し、導入1か月後でも蛍光が観察されたことから、長期的発現実験に使用できることが示された。1)蛍光FRETを用いたcAMPセンサーのプラスミドベクターを現在作製中である。このプラスミドベクターの完成後、アデノウイルスベクターならびにレンチウイルスベクターの作製に移る予定である。2)超高感度Ca2+センサーのプラスミドベクターを作製した。このウイルスベクターの作製に取りかかっており、完成次第動物に導入する。3)組織スライス標本を用いたシグナル解析の実験系が確立されておらず、この部分の研究が遅れている。5)ムスカリン受容体アゴニストのピロカルピンの前投与により、水分泌だけでなくアミラーゼ分泌も増加していることが示され、この部分の研究が計画より進展している。本研究は、唾液腺細胞における開口分泌と、Ca2+ならびにcAMPシグナル、SNAREタンパクの関わりを明らかにして、唾液腺における開口分泌の分子基盤を解明することを目的とする。1)Ca2+センサー(YC-Nano50, G-GECO, R-GECO)を発現するレンチ

ウイルスベクターを作製し、これらを用いて唾液腺由来培養細胞(HSY)に上記のCa2+センサーを発現させた。蛍光強度および発現細胞数はベクター導入後徐々に増加し、導入1か月後でも発現していた。このレンチウイルスベクターをラットの顎下腺から逆行性に注入し、顎下腺にCa2+センサーを発現させた。約5か月後、in vivoにおいてアセチルコリン刺激によるCa2+応答が観察されたことから、レンチウイルスベクターを用いた長期的発現実験が可能であることが示された。2)cAMPセンサー(Flamindo2)を培養細胞に発現させ、β刺激によるcAMPシグナル変化の測定に成功した。このFlamindo2とR-GECOを同時に発現させることで、cAMPとCa2+シグナルの同時解析が可能となった。3)ムスカリン受容体アゴニストのピロカルピンを前投与(1週間前および1日前)すると、非前投与のコントロールと比較して、唾液分泌量およびアミラーゼ分泌量が増加していた。顎下腺にYC-Nano50を発現させ、in vivoでCa2+応答を測定すると、ピロカルピン前投与群ではコントロールに比べてアセチルコリン感受性が増大する傾向にあった。4)この亢進作用には遺伝子発現変化を介することが考えられたため、次世代シークエンスによる遺伝子発現の網羅的解析を行った。非前投与群に比べて前投与群で2倍以上発現変化する遺伝子が顎下腺で120、脳で50遺伝子検出された。いくつかの遺伝子に対して定量PCRを行い、発現量変化の再現性を確認した。アデノウイルスやレンチウイルスベクターを用いてCa2+バイオセンサー並びにcAMPバイオセンサーをラット顎下腺に発現させ、顎下腺細胞におけるCa2+シグナルとcAMPシグナルのライブイメージングに成功した。ムスカリン受容体アゴニストのピロカルピンの前投与により、唾液分泌量並びにアミラーゼ分泌量が増加した。さらに、ピロカルピン刺激により唾液腺及び脳における遺伝子発現の顕著な変化が認められた。このことから、ピロカルピンはムスカリン受容体活性化を介して、遺伝子発現と水及びタンパク質分泌を調節する可能性が示唆された。1)アデノウイルスを用いてcAMPセンサー(Nano-lantern-cAMP)を顎下腺組織に発現させ、その単離腺房細胞においてβ受容体アゴニスト刺激によるcAMPシグナルのリアルタイム解析に成功した。しかし、このcAMPセンサーは発光プローブであるためシグナル検出には発光基質を必要とし、シグナル強度も比較的弱い。in vivoにおけるcAMPシグナル解析には問題点があるため、蛍光FRETを用いたセンサーを用いるなどのシステムの改良が必要と考えられる。2)アデノウイルスを用いて耳下腺組織に蛍光タンパク質を発現させる事に成功した。しかし、この発現は耳下腺組織の一部にのみ見られたことから、単離耳下腺細胞やスライス標本を用いた解析、さらにin vivoにおける解析において実験効率の著しい低下が予測される。そのため、導入・発現効率を高める改良が必要である。3)組織スライス
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンPTPζの情報伝達と小脳皮質の形成機構

PTPζは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとして生合成される脳特異的受容体型チロシンホスファターゼである。昨年度我々は、本分子がDelta様の細胞外領域を持つ膜蛋白質、DNERと相互作用することを見い出した。本年度は、PTPζの情報伝達がDNERとどのような共役関係にあるかを検討した。我々は既に、PTPζがヘパリン結合性成長因子プレイオトロフィンをリガンドとして情報伝達することを明らかにしている。そこで、PTPζ陽性のNeuro-2A神経芽細胞にDNERを強制発現させ、プレイオトロフィン刺激の効果を解析した。その結果、プレイオトロフィンは、DNERのエンドサイトーシスを抑制し、本分子の細胞膜への蓄積を促進することが明らかになった。また、DNERはNeuro-2A細胞のレチノイン酸依存的な細胞分化を抑制したが、プレイオトロフィン刺激は、これを脱抑制し、細胞分化を促進した。DNERはNotchのリガンドとして機能し、神経細胞の分化に重要な役割を果たしていることが知られている。PTPζ-プレイオトロフィン情報伝達は、DNERのチロシン燐酸化状態を規定することによって、本分子の細胞膜への提示とエンドサイトーシスを調節し、DNER-Notch情報伝達の強度を制御している可能性が考えられる。また、PTPζのコンドロイチン硫酸部分は、PTPζ-プレイオトロフィン情報伝達の必須構成要素となっており、今後、コンドロイチン硫酸の除去あるいはその構造改変が、DNERの情報伝達にどのような影響を及ぼすかを解析する予定である。PTPζは脳に選択的に発現する受容体型チロシンホスファターゼであり、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとして生合成される。PTPζは、ヘパリン結合性成長因子プレイオトロフィン(PTN)をリガンドとして情報伝達するが、この際、PTNはPTPζのコンドロイチン硫酸部分に結合する。PTNはコンドロイチン硫酸鎖内の特定の構造を認識して結合すると想定されてきたが、その詳細は明らかになっていなかった。そこで今回我々は、鮫コンドロイチン硫酸D(CSD)を分画し、PTN結合に寄与する糖鎖構造の解明を試みた。CSDをコンドロイチナーゼABCで部分分解した後、Superdex 75pgカラムを用いたゲルろ過により分画した。各フラクションのPTNとの結合をBIAcoreシステムを用いて解析したところ、18糖以上の鎖長が結合に必要であることが明らかになった。さらに22糖画分をSAXイオン交換クロマトグラフィーで分画し、同様に各フラクションのPTN結合活性を測定した。その結果、コンドロイチン硫酸のPTNに対する親和性は、D構造(GlcA(2S)β1-3GalNAc(6S))および、E構造(GlcAβ1-3GalNAc(4S,6S))の含量に依存し、22糖内のDあるいはE構造の数が1から3に変化すると、PTNに対する親和性が数十倍以上強くなることが明らかになった。このことは、コンドロイチン硫酸の構造変異がPTPζ-PTNの情報伝達に重要な役割を果たしていることを示している。