hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
鉄堆積作用:鬼界カルデラの熱水活動場から紐解く太古代海洋環境への制約条件

鬼界カルデラにおける熱水に関連する鉄沈殿物について,1)長浜湾における海底・チムニーの長期観測と堆積物コア試料の解析,2)カルデラ内部の構造と堆積物の解析,3)硫黄島周辺部の熱水活動とサンゴ生息の関連,の研究を行い.鉄沈殿の時期・鉄酸化菌によるチムニーマウンド形成,カルデラ内部での鉄沈殿作用,サンゴに残される熱水活動の記録を紐解くことができた.鬼界カルデラにおける熱水に関連する鉄沈殿物について,1)長浜湾における海底・チムニーの長期観測と堆積物コア試料の解析,2)カルデラ内部の構造と堆積物の解析,3)硫黄島周辺部の熱水活動とサンゴ生息の関連,の研究を行い.鉄沈殿の時期・鉄酸化菌によるチムニーマウンド形成,カルデラ内部での鉄沈殿作用,サンゴに残される熱水活動の記録を紐解くことができた.鬼界カルデラは6300年前に破局噴火をおこして形成した海底カルデラで,その外輪山が薩摩硫黄島,竹島に残っている.特に薩摩硫黄島では活火山である硫黄岳が活動しており,周辺部に熱水を流出している.ここでは赤褐色の鉄沈殿物がみられ,この沈殿物が鉄沈殿作用の鍵を握っていると考えられる.22年度は3つの事について行った.1)鬼界カルデラの音響探査:これによりカルデラ内の構造を明ちかにし,深部での堆積層を明らかにした.2)硫黄島周辺部のサンゴ掘削:浜サンゴについて,硫黄島北部,南部についておこない,普通真っ白のサンゴだが黒い縞々を含むサンゴが取得できた.現在解析中である.3)温度分布・流水量の観測:長浜湾において熱水活動の長期観測を行った.4)長浜湾における堆積物,チムニー,鉄浮遊物,トラップをおこない,それぞれの化学分析を行っている.気象データから,長浜湾に沈殿した堆積物の10年間の挙動が明らかになってきており,鉄沈殿と地層形成の関連性が解明されつつある.鬼界カルデラは7300年前に形成した海底カルデラで,その影響は日本各地にアカホヤ火山灰として影響を与えている.カルデラの外輪山は薩摩硫黄島,竹島に残っており,薩摩硫黄島では硫黄岳が現在でも活発に活動しており,周辺部に熱水を流出している.ここでは赤褐色の鉄沈殿物がみられ,この沈殿物が鉄沈殿作用の鍵を握っていると考えられる.23年度における.1)鬼界カルデラの音波探査:カルデラ内の構造および古い埋没カルデラを明らかにし,南部におけるリフト状凹みを明らかにした.2)硫黄島周辺部のサンゴ掘削:3m大の浜サンゴについて,硫黄島北部地域で取得に成功した.普通真っ白のサンゴだが黒い縞々を含むサンゴが取得できた.火山の周りは通常の海水よりpHが低く酸性にもかかわらずサンゴが生育していることが明らかになった.3)温度分布・流水量の観測:長浜湾において熱水活動の長期観測を行った.現在流水計を設置しており,4月に第一回目のデータの取得を行う.4)長浜湾における堆積物,チムニー,鉄浮遊物,トラップ設置を新たに行っている,それぞれの化学分析を行っている.気象データから,長浜湾に沈殿した堆積物の10年間の挙動を解明し,天候・潮の満干・鉄沈殿と地層形成の関連性が明瞭になった.鬼界カルデラは7300年前に形成した海底カルデラで,日本各地にアカホヤ火山灰として広域に影響与えた巨大爆発を起こしたものである.カルデラの外輪山は薩摩硫黄島,竹島に残っており,薩摩硫黄島では硫黄岳が現在でも活発に活動しており,周辺部に熱水を流出している.研究は,1)熱水活動に伴う赤褐色の鉄沈殿物の堆積機構を求める,2)鬼界カルデラの音波探査解析:音波探査データによりカルデラ形成時の堆積物の分布を把握する.2)硫黄島周辺部のサンゴ掘削:3m大の浜サンゴについて,硫黄島北部地域で取得に成功した.普通真っ白のサンゴだが黒い縞々を含むサンゴが取得できた.火山の周りは通常の海水よりpHが低く酸性にもかかわらずサンゴが生育していることが明らかになった.3)温度分布・ヒートフローの長期観測:長浜湾において熱水活動の長期観測を行った.4)長浜湾における熱水活動の観測:長期観測による海底が透明になる時期を明らかにし,ダイビングにより熱水流出を確かめる.周辺部はバイオマットが形成しており,初期チムニーが形成し始めている.5)堆積物,チムニー,鉄浮遊物,トラップ設置を新たに行っている,それぞれの化学分析を行っている.特に長期pHおよび水素イオン濃度変動を海底の深さごとにデータの取得を行っている.チムニーに関しては,ガリオネラspの鉄還元菌により形成していることが明らかになった.気象データから,長浜湾に沈殿した堆積物の10年間の挙動を解明し,天候・潮の満干・鉄沈殿と地層形成の関連性が明瞭になった.サンゴ掘削が天候と日程により中途半端に終わっていたが,本年度は天候にも恵まれ,また一度見失っていた巨大珊瑚を改めて確認し,掘削できたことが大きい.また,流水計については,昨年4月の調査で故障が判明し半年遅れの9月設置となった.また,海底長期観測カメラである潜りビューの1台を回収できておらずデータが見えていないこと以外は,比較的順調にデータ回収が行われている.24年度が最終年度であるため、記入しない。

現在,多角的に長浜湾内の鉄沈殿物を調べるために,いろいろな計測器を設置している.今まではカメラや温度計の連動性などデータセットが機器の不調で揃わなかったが,本年度後半になり機器類が整備されたので,来年度に向かって多角的な写真や温度のデータセットが揃う.このデータの解析により今後短期間の堆積機構を明らかにしていく.また,すでに回収している鉄沈殿物コア,チムニーマウンド,および鉄浮遊物に対してそれぞれの永酸化鉄の違いを観察・化学分析により明らかにしていく.24年度が最終年度であるため、記入しない。
覚醒剤による脳内ドーパミンニューロンの経時的変化に関する免疫組織学的研究

覚醒剤による逆耐性現象の背景を明らかにするために、覚醒剤反復投与ラットにおける脳内カテコールアミンニューロンの変化について、カテコールアミンニューロンの活動の指標となる酵素であるThyrosine Hydroxylase(TH)に対する抗体及び、変性ニューロンに対するアストロサイトの反応の指標となるGrial Fibrillary Acidic Protein(GFAP)に対する抗体を用いて、免疫組織学的に調べた。ラットに覚醒剤を23日おきに5mg/kgを腹腔内に投与した。この投与法により逆耐性現象が形成されることは従来の研究により明らかである。これらラットを用いて、覚醒剤最終投与から1日、3日、7日と経時的に脳を取り出し、免疫組織学的に調べた結果、ドーパミンニューロンの終末が多数存在する線条体において、ニューロンの変性は覚醒剤最終投与から1日目に既に生じており、それに対するアストロサイトの増加、肥大も観察された。またこれら変化は、3日、7日の時間経過後も明らかであった。さらに、線条体以外にも、中脳辺縁系ドーパミンシステムに属する大脳皮質において、特に前前頭葉領域におけるドーパミンニューロンの変性、アストログリアの増加、肥大が明らかであった。これらのことから、覚醒剤による逆耐性現象の形成には、従来から言われている線条体における、レセプターを含めたニューロンの変化以外に、大脳皮質のニューロンの変化が関与していると考えられ、特に中脳辺縁系ドーパミンニューロンの関与の重要性が示唆された。
プロテオミクス解析データとTMA解析による胆道癌特異的早期発見マーカーの同定

胆管癌症例から切除された腫瘍組織のプロテオミクス解析より、正常組織よりも癌組織で過剰発現する遺伝子産物38種のうち、特に発現量の変化が大きいもの4因子(actinin-1、actinin-4、DJ-1、cathepsinB)について、癌細胞株19株を用いて発現状況をウエスタンブロット法でスクリーニングし、低発現株と過剰発現株を同定した。Tissuemicroarrayを用いて胆管癌症例96例の免疫染色を施行した。DJ-1の過剰発現は発現低下症例に比して予後良好な傾向が見られた(p=0.0604)胆管癌症例から切除された腫瘍組織のプロテオミクス解析より、正常組織よりも癌組織で過剰発現する遺伝子産物38種のうち、特に発現量の変化が大きいもの4因子(actinin-1、actinin-4、DJ-1、cathepsinB)について、癌細胞株19株を用いて発現状況をウエスタンブロット法でスクリーニングし、低発現株と過剰発現株を同定した。DJ-1の過剰発現は発現低下症例に比して予後良好な傾向が見られた(p=0.0604)平成23年3月までに、Tissue Microarray(TMA)切片の作製と候補遺伝子のスクリーニングによる絞り込み、および発現評価のための適切な解析系の構築を行った。切除された胆道癌95症例分、膵癌98症例分のパラフィン包埋組織を材料に直径0.6mmの組織を1スポットとして、各症例の癌部4スポット、正常上皮部2スポットずつ組織を抽出し1枚のスライドグラスに最大50症例分の組織を搭載したTMA切片を作製した(他に食道癌症例99例、肺癌症例249例のTMA切片を作製した)。本切片をもちいることで、一度の解析で多数症例の遺伝子発現解析が可能となった。一方で、胆道癌細胞株と膵癌細胞株を材料として、これまでにプロテオミクス解析で同定された候補遺伝子のうち特に正常組織と腫瘍組織間で発現に差を認めた4つの遺伝子産物についてWestern Blot法(WB法)でスクリーニングを行った。これらの候補遺伝子の発現を多数症例で調べるために、適切に評価するための免疫組織染色(IHC)の系を構築した。具体的には、SCIDマウスに移植した上記癌細胞株の腫瘍組織(Xenograft)を切除してパラフィン包埋切片を作製し、WB法によるスクリーニングデータと一致するIHCの条件を模索した。以上より、候補遺伝子4種のうち、癌細胞株で過剰発現の有無を調べ、かっ適切に評価可能なIHC条件が存在するものを選別した結果、有用と思われる候補を2つにしぼった。胆管癌症例から切除された腫瘍組織のプロテオミクス解析より、正常組織よりも癌組織で過剰発現する遺伝子産物38種のうち、特に発現量の変化が大きいもの4因子(actinin-1、actinin.4、DJ-1、cathepsin B)について、癌細胞株19株を用いて発現状況をウエスタンブロット法でスクリーニングし、低発現株と過剰発現株を同定した。これらをSCIDマウスに移植して得られた腫瘍組織を外科的に切除してパラフィン切片を作製して、それぞれの抗原に特異的なモノクローナル抗体を用いて免疫染色を施行し、ウエスタンブロットでのタンパク発現データと整合性のある染色条件を探し出した。一方で、北海道大学病院第二外科で切除された胆管癌症例96例のパラフィン切片から、腫瘍部分4箇所と正常部分2か所を打ち抜いてTissue Microarray(TMA)パラフィンブロックを作製し、これを材料にTMA切片を作製した。1枚のTMA切片には約50症例分の組織片が搭載されているため、2枚のTMA切片の処理で全ての症例を同時に染色することが可能となった。先に作製したSCIDマウス移植腫瘍の切片のうち、過剰発現株を陽性対照、低発現株を陰性対照とし、更にアイソタイプIgGを一次抗体として処理した陰性対照を用い、胆管癌症例の免疫染色を施行した。4つの因子のうち、actinin-4とDJ-1は正常細胞ではほとんど染色が見られなかったのに対し、癌細胞の細胞質で要請となる症例が有意に多く(それぞれp<0.0001、p=0.0009)、特異度はそれぞれ93.9%と87.9%であったことからも胆管上皮における非癌細胞と癌細胞を鑑別する有力なマーカーとなる可能性が示唆された。さらに、癌細胞におけるactinin-4の過剰発現は症例の生存率には相関しなかったが、DJ-1の過剰発現は発現低下症例に比して予後良好な傾向が見られた(p=0.0604)。胆管癌症例から切除された腫瘍組織のプロテオミクス解析より、正常組織よりも癌組織で過剰発現する遺伝子産物38種のうち特に発現量の変化が大きいもの4因子(actinin-1,actinin-4,DJ-1,cathepsinB)について癌細胞株19株を用いて発現状況をウエスタンブロット法でスクリーニングし低発現株と過剰発現株を同定した。これらをSCIDマウスに移植して得られた腫瘍組織を外科的に切除してパラフィン切片を作製して、それぞれの抗原に特異的なモノクローナル抗体を用いて免疫染色を施行しウエスタンブロットでのタンパク発現データと整合性のある染色条件を探し出した。一方で、北海道大学病院第二外科で切除された胆管癌症例96例のパラフィン切片から腫瘍部分4箇所と正常部分2か所を打ち抜いてTissueMicroarray(TMA)パラフィンブロックを作製しこれを材料にTMA切片を作製した。

1枚のTMA切片には約50症例分の組織片が搭載されているため、2枚のTMA切片の処理で全ての症例を同時に染色することが可能となった。先に作製したSCIDマウス移植腫瘍の切片のうち過剰発現株を陽性対照、低発現株を陰性対照とし更にアイソタイプIgGを一次抗体として処理した陰性対照を用い、胆管癌症例の免疫染色を施行した。4つの因子のうち、actinin-4とDJ-1は正常細胞ではほとんど染色が見られなかったのに対し、癌細胞の細胞質で陽性となる症例が有意に多く(それぞれp<0.0001、p=0.0009)特異度はそれぞれ93.9%と87.9%であったことからも胆管上皮における非癌細胞と癌細胞を鑑別する有力なマーカーとなる可能性が示唆された。さらに、癌細胞におけるactinin-4の過剰発現は症例の生存率には相関しなかったが、DJ-1の過剰発現は発現低下症例に比して予後良好な傾向が見られた(p=0.0604)。プロテオミクス解析データが胆道癌マーカー探索に応用可能であることが示され、少なくとも2つの因子が非癌細胞と癌細胞を鑑別する有用なマーカーであることが示されたことから、当初の最低目標は既に到達している。24年度が最終年度であるため、記入しない。今回同定された2種類のタンパクは細胞外に分泌されづらいため、これを血清学的検査によって検出する手法の開発が困難であることが判明している。今後は同様の手法を継続し、さらなる因子の同定と、既に同定済みの因子の生物学的解析を行うことで目標達成が可能である。また、これらの因子が免疫学的に抗原性を有するかなどの探索を行う。
AFM機構によるLSI多重配線層の単一層表出診断法の研究

本研究では,LSIの故障解析手法として,加工用AFMカンチレバーを用いた多重配線層の単一層除去加工法の可能性を検討した.具体的には,切れ刃先端形状や剛性の異なる加工用カンチレバーを用いてLSI表面の除去加工を行い,薄層除去加工特性を調査した.その結果,高剛性カンチレバーを使用することにより,3.0μm以上の加工深さが得られた.また,荷重制御により積層された任意の配線層の表出・観察が可能となり,従来のエッチングや研磨による異常部表出法に比べて信頼性の高い故障解析が可能となった.平成24年度(最終年度)は,次の2つの項目について研究を実施した.(1)複数のチップ群が1本のレバーに装着された多刃カンチレバーの製作:レバー先端に5つの四角錐形状のダイヤモンド切れ刃が規則正しく並んだ多刃カンチレバーを製作し,Ni-Pめっきを被削材として加工性を評価した.その結果,加工箇所のオーバーラップや加工ピッチの調整により,加工面積や加工深さの増加を図ることが可能となった.(2)たわみ剛性の異なるレバーを複数本有するマルチカンチレバーの製作:たわみ剛性の異なるレバーを3本具備したマルチカンチレバーを製作した.単結晶シリコンを被削材として,たわみ剛性の高いレバーから低いレバーへと重畳加工を行った結果,単一レバーによる加工溝と比べて,良好な加工溝が得られることがわかった.本研究では,微細で複雑な多層構造を有する複合材料に対して,加工用AFMカンチレバーによる単一層除去加工を行い,その微細加工特性や,高精度加工における問題点の明確化を行った.その結果,多層構造を有するLSI回路に対して,積層された各配線層の表出・観察が可能となり,従来のエッチングや研磨による異常部表出法に比べて,信頼性の高い故障解析手法を創出できた.本研究では,LSIの故障解析手法として,加工用AFMカンチレバーを用いた多重配線層の単一層除去加工法の可能性を検討した.具体的には,切れ刃先端形状や剛性の異なる加工用カンチレバーを用いてLSI表面の除去加工を行い,薄層除去加工特性を調査した.その結果,高剛性カンチレバーを使用することにより,3.0μm以上の加工深さが得られた.また,荷重制御により積層された任意の配線層の表出・観察が可能となり,従来のエッチングや研磨による異常部表出法に比べて信頼性の高い故障解析が可能となった.本研究では,微細で複雑な3次元構造を持つLSI回路の故障解析手法として,AFM機構と加工用カンチレバーによるLSI多重配線層の単一層表出加工・診断法を提案している.まず,各層で異なる材質を有するLSIの微細加工を可能にするため,切れ刃先端形状や剛性の異なる加工用カンチレバーを設計し,その製作手法を確立した.本手法は,(1)円形パターニングされたSi基板への異方性エッチングによって四角錘型Siモールドを作製し,ダイヤモンド膜を成膜後,再びエッチングによりモールドを溶解させる「ダイヤモンド切れ刃作製工程」,(2)レバー形状にパターニングされたSi基板への異方性エッチングによって,必要に応じた剛性を有するレバーが作製可能な「レバー作製工程」,および(3)エポキシ樹脂によって切れ刃をレバーに装着する「加工用カンチレバー組立工程」からなる.このようにして製作した加工用カンチレバーをAFMに装着し,SiO2絶縁膜,Al配線,W配線の積層されたLSIに対して表層からの除去加工を試みた.その結果,たわみ剛性の低いレバーを用いたマイクロニュートンオーダの低荷重域では,加工深さが小さく,また切れ刃の摩耗により,目的とする層までの加工は困難であることがわかった.そこで,ミリニュートンオーダの高荷重域での加工が可能となるよう,剛性の高いレバーを用いて同様の加工を行った.その結果,荷重変化によって加工深さが大きく増加し,例えば1層目のAl配線と2層目のAl配線,或いは2層目のAl配線及び下層のW配線を表出することが可能となった.加工部の底面は,表面よりも凹凸が小さく,表面形状の影響を低減することができた.切れ刃先端をSEMで観察すると,低荷重時の加工距離が長い切れ刃よりも摩耗が進んでいたが,低荷重時に見られたような加工深さの急激な減少は見られず,工具摩耗の影響を低減することができたと考えられる.交付申請書の研究実施計画に記載した各項目,すなわち,加工用カンチレバーの設計と製作,ならびに製作したカンチレバーを用いたLSIの微細加工特性の調査は既に実施されている.現在は,これまでに得られた知見に基づいて,高精度かつ効率的な薄層除去加工を行うためにカンチレバーが具備すべき条件を検討している段階にあり,当初の計画は概ね順調に進展していると判断できる.昨年度に得た成果と知見に基づき,LSIの段階的薄層除去加工における特異現象の抽出とその要因解明を行う.また回路パターンを分解能よく,十分平滑な状態で表出させるための原理を確立する.これらの結果から,より高能率で高精度な単一層表出加工を実現するに最適な加工用AFMカンチレバーの提案と試作を行う.具体的には,剛性の異なる複数のレバーからなるマルチカンチレバーや,複数のチップ群が1本のレバーに装着された多刃カンチレバー,さらにこれらを組み合わせた多刃マルチカンチレバーを試作し,加工実験を行う.

最終的には,これらの知見を統合し,LSIの故障診断システムを完成させるとともに,成果の取り纏めと公表を行う.上述の方針で研究を進めるため,以下の項目に対して研究費を使用する(単位:千円).・各種表面分析料(2回×100=200)・リソグラフィ設備使用料(10回×20=200)・測定用カンチレバー(30個×5=150)・加工用LSI(30枚×5=150)・成果発表用旅費(2回×50=100)
リポソームから組み上げる骨疾患治療用バイオマテリアルの開発

本研究では、骨疾患治療用バイオマテリアルの開発を目的とし、生体膜由来のベシクルであるリポソーム表面に多糖、DNAなどの生体由来高分子を交互に積層化し、さらにその表面へリン酸カルシウム(CaP)を析出することによって、有機・無機ハイブリッドリポナノカプセルを作製した。この際、反応条件を変化することにより、CaP結晶構造(結晶種、厚みなど)の調節を行い、ナノカプセルからの物質の放出とナノカプセルの骨組織内への取り込みについて制御を試みた。さらに、CaP層表面にDNAを骨標的リガンドとして提示させたところ、骨のモデルであるハイドロキシアパタイトに対して高い集積性を示すようになった。本年度は主に、骨標的指向性薬物送達システムの開発に向けたハイブリッドリポナノカプセルの作製において、以下の1、2について研究を行った。有機無機ハイブリッドリポナノカプセルの作製リポソームまたはリポソーム表面に多糖を被覆した多糖リポナノカプセルの内外から異種イオンを相互拡散させる方法(Counter-diffusion法)により、リン酸カルシウム(CaP)とのハイブリッドリポナノカプセルを作製し、析出したCaPの結晶構造を電子線回折、赤外吸収分光法を用いて検討した。CaCl2とNaH2PO4/Na2HPO4を用いてCaP層の析出を試みたところ、反応条件に加え、反応場となるナノカプセルの種類によって生成する結晶構造が異なることがわかった。反応場がリポソーム表面またはDNAであるときに表面にCaP層を有するハイブリッドナノカプセルを作製することができた。さらに、DNAの場合には結晶化度が高いCaPが得られた。また、反応時間によってCaP層の厚みの調節が可能であった。これらのことから、リポナノカプセル表面の多糖の種類や化学的改質を施すことにより析出するCaPの結晶質を制御することで、キャリアの骨再生能の最適化につながると考えている。ハイブリッドリポナノカプセルの薬物送達キャリアとしての機能化ハイブリッドリポナノカプセル表層の骨標的指向性を検討するため、骨のモデルである粉末状のハイドロキシアパタイトへの集積化を観察したところ、CaP層表面にDNAを標的リガンドとして提示させたリポナノカプセルが高い集積能を示すことを見出した。このことより、DNA提示による骨へのターゲティングの可能性が示唆された。本年度は、骨疾患治療用バイオマテリアルの開発にむけて以下の1,2について検討を行った。1.骨標的指向性薬物送達システムの開発に向けたハイブリッドリポナノカプセルの作製多様なリン酸カルシウム(CaP)層の創製と骨疾患への最適化を目指して、カチオン性多糖であるキトサンのリン酸化を行いCaP親和性の付与を行った。まず、P2O5をキトサンと反応させることで、リン酸化キトサン(P-CHI)を合成し、リポソーム表面へ積層化を行った。次に、ナノカプセルのハイブリッド化に向けて、リポナノカプセルの内外から異種イオンを相互拡散させる方法(Counter-diffusion法)により、リポナノカプセル表面でCaPの析出を行い、電子顕微鏡による形状観察およびX線回折を用いたCaPの結晶構造解析を行った。得られたナノカプセルについて、表面特異的なCaPの析出がみられた。また、P-CHIのリン酸化度によって結晶構造の異なるCaPが得られた。これらのことから、P-CHIの吸着量やリン酸化度の調節によって、CaP層の厚みや結晶構造の調節、また溶解性といった物性を制御することが可能であり、キャリアの骨形成能の最適化につながると考えている。2.骨修復能を有する骨補填材の開発に向けたリポナノカプセルの組織化カプセル型骨補填材として、ナノカプセル表層と架橋剤を反応させることで、リポナノカプセルの組織化を目指した。P-CHIを表面に有するリポナノカプセルに架橋剤を加えて、キトサン由来のアミノ基間の架橋を促したところ、散乱強度の増大がみられリポナノカプセルの会合が示唆された。このとき、pHやP-CHIのリン酸化度によって会合体のサイズを調節することが可能であった。以上より、骨欠損部において、ハイブリッドリポナノカプセルを集積化および組織化させることが可能であり、骨形成を誘導する骨補填材の作製につながると考えている。1.有機無機ハイブリッドリポナノカプセルの作製については、リポソーム表面に多糖類を被覆したカプセルの内外から異種イオンを相互拡散する手法を発案するに至り、CaPカプセルの新しい生成方法を確立することができた。この際、反応場となるナノカプセルの多糖類の種類によって結晶の生成速度および得られる結晶の質が異なることを見い出した。素材自体が骨再生を促すといった新規薬物キャリアの創製に確実に近づきつつある段階にある。

2.ハイブリッドリポナノカプセルの薬物送達キャリアとしての機能化については、表面に骨標的リガンドとしてDNAを提示させたハイブリッドリポナノカプセルが、骨の主無機成分であるハイドロキシアパタイトへ集積することを確認した。さらなるターゲット能の向上を目指して、骨標的リガンドとしてポリアスパラギン酸や破骨細胞への標的リガンドであるRANKLの表面提示を試みる。また、骨組織環境(酸性pHなど)におけるCaP層の溶解性、およびそれに伴う薬物放出機能の創出については現在検討中である。25年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、以下の(1)、(2)を行う。(1)骨標的指向性薬物送達システムの開発に向けたハイブリッドリポナノカプセルの作製および機能化本年度は、多様なCaP層の創製と骨疾患への最適化を目指して、カチオン性多糖であるキトサンのリン酸化を行いCaP親和性の付与を行う。この際、リン酸化キトサンのリン酸化度によりCaP層の厚み、形態、結晶構造などの調節を目指す。得られたCaP層の溶解性を調節することによって薬剤放出挙動の制御に取り組んでいく。CaPの溶解性についてはイオンクロマトグラフィを用いて溶出したカルシウムイオン濃度を定量することによって検討を行う。また、ハイブリッド化および表面へのリガンド提示による破骨細胞や骨芽細胞などへのターゲティング能の付与、サイズ・形状を含めた細胞への取り込み能の検討、骨再生サイクルにおける骨吸収と骨形成の制御を行う。(2)骨修復能を有する骨補填材の開発に向けたリポナノカプセルの組織化およびゲル化カプセル型骨補填材として、内部に架橋剤を封入し、さらに表層を架橋剤と反応してゲル化するポリマーで被覆したハイブリッドリポナノカプセルの作製を行う。この時、破骨細胞周辺にみられるような低pH条件において、CaP層の溶解に伴って内部から架橋剤が放出されるようなリポナノカプセルの創製を行う。
南米など三大陸におけるEBウイルス関連胃癌の疫学的研究

本研究の目的は、南米、北米、ユーラシア大陸の中で信頼に足る胃癌の罹患率または死亡率が得られている地域を中心に対象国を選び、EBウイルス関連胃癌の疫学的、病理学的、ウイルス学的特徴を明らかにしようとするものである。研究期間に調査・収集された胃がん症例は、コロンビア179例、メキシコ135例、チリ185例、ブラジル(日系人)149例、中国265例、マレーシア86例、インド115例、ロシア522例、ウズベキスタン172例である。すべての症例についてin situ hybridizationによるがん細胞中のEpstein-Barr virus encoded small RNA(EBER)の同定を行い、その陽性率と性、年齢、がんの発生部位、診断年、地域などの因子との関係について検討を行った。女性よりも男性の胃癌症例においてEBウイルス陽性胃癌の占める割合が大きく、年齢と共にEBウイルス陽性胃癌のリスクが低くなる傾向を認めた。胃癌の発生部位別にEBウイルス陽性胃癌の分布を比較すると、日本、コロンビアの男性、メキシコの女性などいくつかの例外はあるものの、多くの地域ではEBウイルス陽性胃癌の占める割合が最も高い部位は噴門部であり、続いて胃体部、幽門部の順であった。またEBウイルス陽性胃癌のリスクと診断年との間に有意な関係は認めなかった。性、年齢とがんの発生部位で補正を行った上でEBウイルス陽性率の地域差を検討したところ有意差を認め、日本を含むアジア地域やブラジル(日系人)よりもロシアや南米地域においてEBウイルス陽性率が高いことが示唆された。本年度は、コロンビア、マレーシアから病理学者を招聘して共同研究を行うとともに、チリと中国へ訪問して研究の打ち合わせを行った。またメキシコとロシアからも胃がん症例を入手した。収集症例はコロンビア118例、メキシコ114例、チリ46例、マレーシア86例、ロシア548例で、このうちコロンビア、マレーシア、ロシアの症例についてはEBウイルスの同定を完了した。ロシアの方は少数民族の症例があるなど人種的に多彩であったため、比較的人数が多いコーカソイド、ウズベキスタン住民を対象とし、マレーシアの方は中国系住民のみを解析対象とした。がん発生部位が同定されている症例に限ったEBウイルス陽性率は、ロシア:男16%女3%、ウズベキスタン:男15%女6%、サハリン:男12%女8%、マレーシア:男8%女0%となっており、人種による差がある可能性を示している。また、これまでの結果から予想されたように性・胃がんの部位で陽性率は大きく異なっていた。この性・部位パターンが国によって異なるか否かを検討するためには各国の症例数をもう少し増やす必要がある。コロンビアとメキシコからはさらに少なくとも100症例が入手できる予定であり、中国からも症例を入手すべく交渉中である。また、今年度は対象とできなかったインドなどとも交渉を進める予定である。今後は各国の生活習慣などがエティオロジカルな背景に関与している可能性などについても検討できるように努力したい。本研究では、これまでEBウイルス関連胃癌の充分な調査が行われていない南米、北米、ユーラシア大陸の中で信頼に足る胃癌の罹患率または死亡率が得られている地域を中心に対象国を選び、EBウイルス関連胃癌の疫学的、病理学的、ウイルス学的特徴を明らかにしようとするものである。今年度までに調査収集された胃がん症例は、コロンビア95例、メキシコ135例、チリ143例、中国265例、マレーシア86例、インド115例、ロシア52例、ウズベキスタン172例である。すべての症例についてin situ hybridizationによるEpstein-Barr virus encoded small RNA(EBER)の同定を完了した。いずれの地域でも女性よりも男性の胃癌症例においてEBウイルス陽性胃癌の占める割合が大きく、特にアジア地域、ウズベキスタンでその傾向が強く認められる。一方、ロシアや北・南米の地域ではその性比が小さい。さらに胃癌の発生部位別にEBウイルス陽性胃癌の分布を比較すると、日本、コロンビアの男性、メキシコの女性などいくつかの例外はあるものの、多くの地域ではEBウイルス陽性胃癌の占める割合が最も高い部位は噴門部であり、続いて胃体部、幽門部の順となっている。地域差に関しては、女性の胃体部の胃癌において若干の地域差を認めたもののその他の性・がんの発生部位別では明らかな地域差は認めなかった。いずれの地域においても男性においてEBウイルス関連胃癌の占める割合が高く、さらに噴門部に発生した胃癌の中で多いという傾向を示していることから、喫煙習慣などの男女で異なる生活歴がEBウイルス関連胃癌の発生段階で関与している可能性が考えられる。

胃癌の発生部位別にEBウイルス陽性胃癌の分布を比較すると、日本、コロンビアの男性、メキシコの女性などいくつかの例外はあるものの、多くの地域ではEBウイルス陽性胃癌の占める割合が最も高い部位は噴門部であり、続いて胃体部、幽門部の順であった。またEBウイルス陽性胃癌のリスクと診断年との間に有意な関係は認めなかった。性、年齢とがんの発生部位で補正を行った上でEBウイルス陽性率の地域差を検討したところ有意差を認め、日本を含むアジア地域やブラジル(日系人)よりもロシアや南米地域においてEBウイルス陽性率が高いことが示唆された。
記憶・学習における情報伝達物質としての脂質の役割：神経幹細胞に対する影響について

記憶・学習における情報伝達物質としての多価不飽和脂肪酸の役割を解明するために研究を行った。ω-3多価不飽和脂肪酸を投与したラットの海馬では脳由来神経栄養因子の増加とともに、記憶学習能の向上が認められた。神経幹細胞からニューロンへの分化はドコサヘキサエン酸だけでなくエイコサペンタエン酸でも促進された。しかし、その機構は両者で異なる様式であった。遊離多価不飽和脂肪酸受容体GPR40作動薬により、神経幹細胞からニューロンおよびアストロサイトへの分化が促進された。これらの結果より、ω-3多価不飽和脂肪酸は記憶学習能の向上に神経幹細胞の分化促進を介して作用すると考えられる。脳はその重量の約40%が脂質である。その脂質の中にはドコサヘキサエン酸(DHA)やアラキドン酸(ARA)などの多価不飽和脂肪酸(PUFA)が多く含まれる。PUFAは脳の発達や機能維持に重要であるが、脳内での生合成量は少なく、食餌などからの摂取が必要である。また、脳内でPUFAは細胞膜の成分となるだけでなく、PUFA未変化体または細胞内で代謝され生成するプロスタグランジン類やプロテクチンは、情報伝達物質として働き、神経細胞の保護、神経細胞の成熟や細胞死などに関与している。PUFA摂取の過不足は、脳の細胞膜の脂肪酸組成を変化させる。この変化は、脳の正常機能に影響を与えるとともに、神経変性疾患や精神疾患の発症との関連が指摘されている。PUFAによる神経幹細胞の増殖、分化の調節は記憶・学習能の向上に関与することを明らかにし、その詳細な機構の解明を目指した。神経幹細胞のニューロンへの分化はエイコサペンタエン酸(EPA)によっても促進されるが、その機構はDHAのものとは異なることを明らかにした。また、PUFA受容体のGタンパク質共役受容体(GPR)40と120作動薬を神経幹細胞に作用させると、ニューロンのみならずグリアへの分化も促進されることが明らかとなった。また、n-3PUFAを投与したラットでは記憶学習能が向上するとともに、n-3PUFA代謝産物が増加した。以上のことから、外因性のn-3PUFAによる記憶学習能向上の一因として、神経幹細胞のニューロンへの分化促進作用と、n-3PUFA代謝物による脳機能更新作用が関与していることが示唆された。多価不飽和脂肪酸は、記憶学習能力を向上させることが知られている。我々の研究室では、この作用には神経幹細胞のニューロンへの分化促進作用が関与していると仮定した。神経幹細胞のニューロンへの分化に対する多価不飽和脂肪酸の影響について培養神経幹細胞を用いて検討した。その結果、オメガ3系の多価不飽和脂肪酸(ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸)はニューロンへの分化を促進するが、オメガ6系の多価不飽和脂肪酸(アラキドン酸)は促進しなかった。また、同じオメガ3系の多価不飽和脂肪酸でも、ドコサヘキサエン酸とエイコサペンタエン酸では促進の作用機序は異なっていた(これらの結果は国際誌へ投稿し、受理された)。この結果は、同じ系統の多価不飽和脂肪酸でも異なる作用を持つことを示している。既知の多価不飽和脂肪酸受容体(GPR40, GPR120)の神経幹細胞での発現量、特異的な阻害剤、作動薬を用いた薬理学的な検討を行った。その結果、未分化な状態の神経幹細胞ではGPR40の発現は認められないが、分化と共にニューロンだけでなくグリアにも発現の増加が認められた。GPR40アゴニスト処置によってニューロンマーカーのTuj-1陽性細胞、グリアマーカーのGFAP陽性細胞はともに増加した。このことから、GPR40は神経幹細胞のニューロン、グリア両方への分化に関与している可能性が示唆された(これらの結果は学会で報告した)。一方、GPR120はいずれの状態の神経幹細胞でも発現は認められなかった。しかし、成体の海馬、大脳皮質ではmRNAの発現を認めた。神経幹細胞の脂肪酸組成を分析した。神経幹細胞には飽和脂肪酸や一価不飽和脂肪酸(オレイン酸)の含量が多かった。成体の脳内では多価不飽和脂肪酸のドコサヘキサエン酸やアラキドン酸が多いことと比較すると、成体とは異なる脂肪酸維持機構が機能していると考えられた。オメガ3系多価不飽和脂肪酸は神経幹細胞からニューロンへの分化を促進させることと、その機構を解明した。現在、この作用に対する既知の多価不飽和脂肪酸受容体の関与について検討している。多価不飽和脂肪酸受容体の候補としてGPR40とGPR120について神経幹細胞における発現量と受容体作動剤、阻害剤の作用について検討はおおむね終了した。

これまでの結果の一部は、学会(国際・国内)で発表を行い、国際誌にも投稿・受理された。その他の受容体に関しても検討を継続する。未分化な神経幹細胞の脂肪酸組成のと共に、分化後の測定も行った。しかし、多価不飽和脂肪酸の代謝物の分析は行えていない。多価不飽和脂肪酸代謝物約15種の測定系を確立できているため、今後順次測定を行う。既知の細胞内情報伝達系に対する多価不飽和脂肪酸の影響については、一部の解析は終了した。今後マイクロアレイを用いて検討する。本研究では、多価不飽和脂肪酸またはその代謝物は情報伝達物質として作用するという仮説を立てた。まず、多価不飽和脂肪酸未変化体による直接的な作用を検討するために以下の研究を行う。1)既知の多価不飽和脂肪酸受容体の神経幹細胞に対する機能を検討する。標的受容体としては神経幹細胞にも発現していることが確認されているペルオキシソーム増殖剤活性化受容体(PPAR)、レチノイドX受容体(RXR)、脂肪酸結合タンパク質(FABP)を想定している。2)マイクロアレイを用いて既知の細胞内情報伝達に与える多価不飽和脂肪酸の影響を検討する。3)神経幹細胞の中にある多価不飽和脂肪酸に親和性のあるタンパク質を同定し、その機能を調べる。次に神経幹細胞中での多価不飽和脂肪酸の代謝産物を同定する目的で、LC/MSを用いて網羅的に測定する。これにより同定された代謝物の神経幹細胞の増殖・分化に対する影響を検討し、さらに未変化体の時と同様に、結合する受容体、親和性のあるタンパク質の同定とその機能を解析する。最終段階として、同定された多価不飽和脂肪酸の活性代謝物をラットの脳室内へ投与し、記憶学習能に対する影響を観察する。H24年度は効率よく研究を遂行できたために未使用金が生じた。この未使用金はH25年度の研究費と合わせて以下の使用を計画している。1、培養神経幹細胞を用いた検討1-1多価不飽和脂肪酸の神経幹細胞内での動態解析。昨年度、培地に添加した多価不飽和脂肪酸は細胞内に取り込まれることは確認した。次年度はこれらの代謝物を測定する。必要に応じて、代謝酵素阻害剤の影響も検討する。予備的な検討から、研究を遂行するための問題点として、多価不飽和脂肪酸代謝物の測定のためには多くの細胞を必要とすることが明らかとなった。そのため、当初想定していたよりも多くのラット、培地を使用することで対処する。1-2既存の細胞内情報伝達系に対する多価不飽和脂肪酸の影響。多価不飽和脂肪酸に対する既知の細胞内情報伝達系に対する作用の検索を継続する。次年度は神経幹細胞に照準を合わせたPCRアレイを用いる。これにより神経幹細胞の増殖・分化を制御する情報伝達系のうちどの経路に多価不飽和脂肪酸は影響を与えるのか絞り込む。1-3プロテオミクス解析。申請書には、多価不飽和脂肪酸処置と未処置の比較を行うとしていたが、変化するタンパク質が多かったため、多価不飽和脂肪酸結合タンパク質と相互作用するタンパク質の同定から開始し、徐々に範囲を広げる。2、動物を用いた検討。ラットの側脳室内に多価不飽和脂肪酸代謝物を一回投与し、1週間後に海馬内の代謝物量を確認した後に行動実験を開始する。行動実験としたは、放射状迷路、シャトルアボイダンンス試験を予定している。
教育経済学における実験的手法の適用に関する研究

実験的手法を用いた計量経済学的政策評価をさまざまな教育段階にかかわる政策について実施した。第1に、学級規模縮小は、小6・中3の国語と数学の中では小6の国語だけ統計的に有意な正の効果が見つかり、かつ効果は、初期時点に有利な地位にある学校において大きかった。第2に、学校規模縮小の効果は、生徒個人の学力データを用いると、学校単位のデータを用いた場合よりも小さく出ることが分かった。第3に、幼児教育の拡充は最終学歴にプラスの影響を与えることが確認された。第4に、学校外教育バウチャーを一部ランダムに配布した1年後に受給者と非受給者で比較しても、学力テストに大きな差は出なかった。近年、我が国の教育政策現場において、教育政策の経済学的評価に対する理解は進んだが、政策と成果の間の因果関係をバイアスなく推計するための制度設計に関する理解はいまだ十分とは言えない。本応募課題では、諸外国の教育政策評価で広範に利用されている実験的手法(自然実験、社会実験)を用いた研究を推進することとした。社会実験アプローチとしては、当初の予定通り、東日本大震災で被災した子どもに対し学校外教育で利用可能なバウチャーの配布を行うNPOと連携し、バウチャーを得た子どもと得なかった子どもの双方を追跡調査している(共同研究者は荒木宏子、中室牧子、田中隆一)。特に、バウチャー受給者の一部を抽選により決定し、受給者群と非受給者群の双方を追跡している点で、我が国では画期的な政策実験である。まず5-6月にかけて、バウチャー受給者と非受給者の全員を対象に、平成23年に実施した事前テストと同等の内容の第2回調査を実施した。しかしながら予定通りの回収率が上がらなかったため、調査内容を精選し、第3回目調査を予定よりも前倒しし11月に実施した。現在、実際のバウチャー利用記録データの確認を行いながら、バウチャーを受け取って塾等の外部教育機関を利用した子どもと、選考からもれて外部教育機関の利用が困難のままとなった可能性のある子どもの学力等の「伸びの差」の分析を行っている。自然実験アプローチについては、赤林・中村(2011)を改訂し、少人数学級が学校間格差へあたえる影響の考察を加えたAkabayashi and Nakamura(2012)とし、現在英文専門誌に投稿し2回目のリバイスが終わったところである。また、一昨年より取り組んできた幼児教育の長期効果の論文(Akabayashi and Tanaka2013)を完成させ、英文専門誌に投稿したところである。さらに12月に教育経済・教育政策コンフェレンスを慶應義塾大学で実施した。特に、実験的な手法による教育政策分析の発表が多く集まり、活発な議論が行われた。自然実験アプローチについては、少人数学級が学校間格差へあたえる影響の考察を加えたAkabayashi and Nakamura (2012)がJapanese Economic Review誌に受理され出版が決定した、また、3年前より取り組んできた幼児教育の長期効果の論文(Akabayashi and Tanaka 2013)を大幅に改訂し、英文専門誌に再投稿の準備を行っている。また本年新たに、子どもが利用した就学前教育施設のタイプ(幼稚園か保育園かなど)が学力や非認知能力に与える影響を推計した論文(共同研究者は敷島千鶴、山下洵)を執筆している。特に、実験的手法による教育政策分析の発表が多く集まり活発な議論が行われた。我が国の教育政策現場において、政策の経済学的評価に対する理解は進んだが、政策と成果の間の因果関係をバイアスなく推計するための制度設計に関する理解は十分とは言えない。本課題では、諸外国の教育政策評価で広範に利用されている実験的手法(自然実験、社会実験)を用いた研究を推進した。社会実験として、東日本大震災で被災した子どもに対し学校外教育で利用可能なバウチャーの配布を行うNPOと連携し、バウチャーを得た子どもと得なかった子どもの双方を追跡調査し(共同研究者は荒木宏子、中室牧子、田中隆一)、得られたデータの分析を行った。結果、単純な推計では、バウチャーの受給者が非受給者に比べて、学力や非認知能力の伸びにおいて有意に異なるという結果を見いだすことはできなかった。分析結果、平成26年度の日本経済学会春季大会(6月)、および一橋大学(7月)で発表した。今後、慶應義塾大学内でも発表予定である。

自然実験アプローチについては、少人数学級が学校間格差へあたえる影響の考察を加えたAkabayashi and Nakamura (2012)がJapanese Economic Review誌に出版された。また、4年前より取り組んできた幼児教育の長期効果の論文(Akabayashi and Tanaka 2013)を大幅に改訂し、英文専門誌に再投稿の準備を行っている。静岡県のデータに基づく論文も進展を見せた。また本年新たに、子どもが利用した就学前教育施設のタイプ(幼稚園か保育園かなど)が学力や非認知能力に与える影響を推計した論文(共同研究者は敷島千鶴、山下絢)を執筆している。さらに12月に教育経済・教育政策コンフェレンスを慶應義塾大学で実施した。特に、実験的手法による教育政策分析の発表が多く集まり活発な議論が行われた。26年度が最終年度であるため、記入しない。経済学26年度が最終年度であるため、記入しない。H24年5-6月にかけて、バウチャー受給者と非受給者の全員を対象に、事前テストと同等の内容の第2回目調査を実施したが、必ずしも予定通りの回収率が上がらなかったため、調査内容を精選し、第3回目調査を予定よりも前倒しし11月に実施した。その結果、第2回調査を上回る回収数を得ることができ、現在(H25年)そのデータを分析中である。H25年3月をもって、社会実験対象者(バウチャー受給者と非受給者)の追跡調査が終了し、予定通り分析を開始した。当初はより長期の追跡調査も検討していたが、回収率の低下により断念せざるを得なかった。自然実験の論文(Akabayashi and Nakamura forthcoming)がレフェリー雑誌に無事受理されたものの、別の論文(Akabayashi and Tanaka 2012)は初回投稿においては受理されず、現在大幅な改訂を行っているため、予定よりもやや出版が遅れている。現在(H25年)、クーポン利用開始から1年後に行われた学力調査等のデータを分析しており、平成25年度中に論文にまとめる予定である。追加的長期調査について、支援団体と協議を行う。また、同様の事業を行っている自治体等との連携を模索する。H24年に引き続き教育経済学に関する研究集会を実施する。現在(H26年)、バウチャー社会実験の論文を日本経済学会で発表するために改訂を行っている。特に、代替的な分析手法による結果の頑健性の確認に焦点を当てている。幼児教育の長期効果の論文も改訂中で、夏までに再投稿したいと考えている。また、ある県の学校データを提供していただて実施中の計量分析も早急にまとめたいと考えている。さらに、過去2年に引き続き教育経済学に関する研究集会を実施する。直接経費次年度使用額が生じたのは、第3回目調査で調査対象者への謝礼を引き上げ、最大限の回収率(80%)を想定した調査予算を前提として前倒し支払い請求を行ったためである。結果的にはそれよりも低い回収率(53%)となったため、その差額が繰り越しとなった。H25年度は、現在のクーポン利用者への継続調査をどのように行うか、支援団体と協議中である。
悪性脳腫瘍のエピゲノム異常が誘導するネオアンチゲンを標的とした新規治療戦略の開発

本研究では脳腫瘍のオルガノイドモデルを作成し、詳細な分子解析を行うことで、脳腫瘍の悪性性質に関わるエピゲノム異常とネオアンチゲン形成のクロストークメカニズムの解明を目指す。悪性脳腫瘍の免疫治療研究の第一人者である米国University of California, San Francisco (UCSF)岡田秀穂教授、脳腫瘍の分子解析研究の第一人者であるカナダ・トロントのLabatt Brain Tumor Research Centre(LBTRC)Michael Taylor教授との共同研究にてエピゲノム治療と免疫治療を組み合わせた治療法の前臨床研究を目指す。
活性化抗体を用いての生体内神経細胞死におけるカスパーゼファミリー活性化の解析

目的)システィンプロテアーゼであるカスパーゼは脊椎動物のプログラム細胞死に関係しており、現在までにヒト、マウスを含め、約12-14種類の存在が知られている。本研究はこれら細胞死に関係する各種カスパーゼの活性型を特異的に認識する抗体の作製と生体内での細胞死とカスパーゼ活性化の分子機構の解析を目的としている。プログラム細胞死、神経変性疾患、小胞体(ER)ストレス細胞死に関与するカスパーゼの活性型に特異的な抗体の作製を目的とした。結果、考察)脳プログラム細胞死ではカスパーゼ3、9依存性と非依存性細胞死の経路が存在していることが明らかになった。また、ERストレスによりカスパーゼ12はオートプロセッシング部位であるD318と他のカスパーゼで切断されるD341で切断された。この結果はカメパーゼ12の2つの切断点に対する抗体m12D318とm12D341によっても示唆された。ハンチントン病などの神経変性疾患の原因であるポリグルタミン凝集はERストレスを活性化し、カスパーゼ12をD318とD341で切断活性化することが明らかとなった(Kouroku et al.,2002)。ポリグルタミン凝集がERストレスを誘導し、ポリグルタミン凝集がIreを介して、ASKを活性化することを報告している(Nishitoh et al.,2002)。ERに局在しない核周辺の凝集、細胞質の凝集体がERストレスを誘導する分子機構については幾つかの仮説が提出されているが、現在のところいずれも確立されていない。しかし、直接か間接かは別にしてもERストレスによる細胞死がポリグルタミン凝集による細胞死と深く関係しており、ERストレスを抑制することにより、ハンチントン病などの神経変性疾患の治療の可能性が示された。哺乳類での細胞死の機構が実際の発生過程での神経系のプログラム細胞死の実行に関与するカスパーゼ3の上位に位置するカスパーゼ9の活性化とその制御機構に注目し、カスパーゼ9の活性型を特異的に認識する抗体を作成し、神経細胞へと分化するマウスのP19EC(embryonal carcinoma)細胞、およびBcl-2ファミリーの一つであるbcl-xノックアウトマウスを用いて、カスパーゼ9の活性化とBcl-xLによる制御について検討した。その結果、1)レチノイン酸(RA)によるP19EC細胞の神経分化過程での細胞死ではカスパーゼ3の上位のカスパーゼ9が活性化されること、またbFGFはP13K/Aktを活性化して、カスパーゼ9、3の活性化を抑制し、細胞死を抑制すること、2)BMP-4は逆に、RAと協調してP19EC細胞のカスパーゼ9、3の活性化を促進すること、3)2種類のマウスカスパーゼ9をクローニングした結果、ヒトと異なり、マウスカスパーゼ9にはAktのリン酸化部位が存在せず、Aktによる直接のリン酸化によるカスパーゼ9の制御機構はないことが明らかとなった。また、4)カスパーゼ9の活性化に必須なプロセッシング部位の特異抗体を作成し、カスパーゼ9の活性型を特異的に認識することに成功した。5)これら抗体を用いて、bcl-xノックアウトマウスの神経系での細胞死を解析することにより、発生過程での神経系では、Bcl-xLがカスパーゼ9、3依存性の細胞死を抑制している領域とカスパーゼ9、3非依存性の細胞死を抑制している領域が存在することが明らかになった。カスパーゼはアポトーシスの過程において重要な因子である。

カスパーゼ9はApaf-1/cutpchromecの経路によってオートプロセッシングを引き起こし、この一連のカスパーゼカスケードの上位において活性化する。一方、Bcl-2ファミリーの抗アポトーシスのメンバーの一員であるBcl-xLがIn vitroにおいてカスパーゼの活性化の抑制に関与している。しかしながら、神経発生過程におけるカスパーゼ9とBcl-xLの関係は明らかにされていない。本研究では、マウスカスパーゼ9の切断部位である2箇所に特異的に認識する抗体(anti-m9D353,anti-m9D368)を作成し、これらの抗体を用いてBcl-x欠損マウス胎児における神経発生過程でのカスパーゼ9の活性化について検討を行った。その結果、マウスカスパーゼ9のアスパラギン酸部位D353,D368においてプロセッシングしていることが明らかになった。しかしながら、多様な細胞死の過程やBcl-x欠損マウス胎児における神経発生過程ではD368において、より切断されることがわかった。Bcl-xLが後脳、前脳、後根神経節カスパーゼ9/カスパーゼ3依存性の細胞死に対して抑制すること、またBcl-xLが後脳、前脳、後根神経節におけるカスパーゼ9/カスパーゼ3依存性の細胞死に対して抑制すること、また後脳、前脳、後根神経節においてカスパーゼ9の活性化が観察されることから、Bcl-xLがミトコンドリアからcytochrome cの流出を妨げることを示した。近年、小胞体に局在するカスパーゼ12が変性タンパクおよび異常タンパクの蓄積によるストレス(ERストレス)により活性化し、細胞死を誘導することが報告されているが、その活性化機構およびカスパーゼカスケードにおける位置関係は不明である。マウスカスパーゼ12活性化に必要と考えられる切断部位、D318およびD341の切断点に特異的に反応する抗体12D318,12D341抗体を作成し、ERストレスによる細胞死におけるカスパーゼ12の活性化機構を解析した。マウスカスパーゼ12の過剰発現によるオートプロセシングによるではD318で切断されたのに対し、糖鎖修飾阻害剤(ツニカマイシン)を用いたERストレスではD318部位とD341の部位でプロセシングされていることが明らかになった。また、神経変性疾患の原因となるポリグルタミン凝集が細胞質や核内でおこると、ERストレスが誘導され、ERに局在するシャペロンであるBipや細胞死に関連するCHOPの発現増大、JNKの活性化がおこり、カスパーゼ12が活性化されることが明らかとなった。ポリグルタミン凝集ではカスパーゼ8が共凝集とともに活性化することが、神経細胞死の原因と考えられていたが、カスパーゼ8の活性化は必ずしも細胞死と一致しないことから、別の細胞死の経路の存在が示唆されていた。カスパーゼ12の活性化はカスパーゼ8と異なり、ポリグルタミン凝集の外で活性化されることから、明らかに異なった経路での活性化であると考えられる。ポリグルタミン凝集によるERストレスの誘導とそれにともなうカスパーゼ12の活性化がポリグルタミン凝集により神経細胞死に関連している可能性が考えられた。目的)システィンプロテアーゼであるカスパーゼは脊椎動物のプログラム細胞死に関係しており、現在までにヒト、マウスを含め、約12-14種類の存在が知られている。本研究はこれら細胞死に関係する各種カスパーゼの活性型を特異的に認識する抗体の作製と生体内での細胞死とカスパーゼ活性化の分子機構の解析を目的としている。本年度は小胞体(ER)ストレス細胞死に関与するカスパーゼ12の活性型に特異的な抗体の作製を目的とした。