hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝子ノックアウトから見えてきたマイクロRNAが寄与する生命現象の解明

タンパク質をコードしない機能性RNAであるマイクロRNAについてノックアウトマウスを作製し解析したことによって、任意のmiRNAが生物の種を保存し繁栄させるための生命機能である生殖機能を司っていることを見出した。さらに、表現型を示す組織に絞り込んでマイクロRNAの標的遺伝子を解析したことによって、数百あると言われている標的遺伝子の中から生命現象に直結した標的遺伝子を明らかにすることができた。miRNAは20塩基程度の短いnon-coding RNAであり標的となるmRNA会子を認識しそのmRNAからタンパク質への翻訳を阻害することで、遺伝子の発現を転写後に調節していると考えられている。研究代表者は,とれまでに、任意のmiRNAノックアウトしたマウスを作製し、そのマウスの表現型の解析を通して、miRNAが寄与する生命現象を明らかにすることができた。より詳細に解析をすすめるために、in vitroの培養系での解析を行った。まず、標的となりうるmANAをmiRNAのseed配列をもとに解析したところ、約1000遺伝子がその候補としてあがってきた。すべての遺伝子について検討することは不可能であることから、(1)ヒトとマウス間で共通(2)1つの標的遺伝子内に複数の標的配列をもつことに着目し順位を付けた。次に、miRNA発現ベクターとDsRed2をレポーターとしてその下流に標的配列を含む標的配列解析ベクターを構築した。これらのベクターを任意のmiRNAが発現していないことを確認しているHEK293細胞に導入し、miRNAによる標的遺伝子の翻訳抑制効果をDsRed2の蛍光を指標として蛍光プレートリーダーを用いて計測した。その結果、10遺伝子内の標的配列の内8遺伝子について標的遺伝子である可能性が示唆された。さらに、その内2つの遺伝子が強く抑制されていることがわかり、miRNAの標的候補遺伝子を絞り込むことができた。これらのin vitroの培養系で絞りこんだ遺伝子について、生体内での生命現象に寄与しているか否かを検討するために、表現型が見られた組織での発現を確認した。その結果、1つの遺伝子が標的組織で強く発現していることを見出した。マイクロは20塩基程度の短いノンコーディングRNAであり標的となるメッセンジャーRNA分子を認識しそのメッセンジャーRNAからタンパク質への翻訳を阻害することで、遺伝子の発現を転写後に調節していると考えられている。研究代表者はこれまでに、任意のマイクロRNAノックアウトしたマウスを作製し、そのマウスの表現型の解析を通して、マイクロRNAが寄与する生命現象を明らかにすると同時に、in vitroの培養系で標的候補遺伝子を明らかにした。in vitro系を検証するために、マイクロRNAノックアウトマウスの下垂体の可溶化物を用い標的候補遺伝子について、ウエスタンブロット法を行った。その結果、1つの遺伝子産物であるタンパク質が優位に減少していることを明らかにした。その他のものについては次の2つのグループに分かれることがわかった。(1)下垂体で発現しておりタンパク質レベルでも確認できるが、マイクロRNAの有無で変化がないもの(2)標的組織である下垂体で発現していないもの。こららのことから、seed配列を出発点としてPC上で候補遺伝子として数百以上の遺伝子があがってくるが、マイクロRNAが生命現象を制御する組織でゲートをかけることで、マイクロRNAが調節する生命現象に関わる標的遺伝子はほんの数個しかないことが示唆された。この結果は、マイクロRNAノックアウトマウスを作り、そのマウスで見られた表現系を詳細に解析することで初めてわかったことであり、強制的な発現系など人工的な実験系ではわかり得ない情報をもたらすことができた。
HIV-1のゲノム二量体の分子構造とそのメカニズムの解明

HIV-1の二量体結合シグナル(DLS)の構造解析を行うために、その必要十分領域である144塩基をin vitro転写反応にて大量合成した。合成したDLSを電気泳動により分離・精製した。精製されたDLSをゲルろ過クロマトグラフィーより脱塩処理した。一方、DLS単独のみならず、核酸とタンパク質の相互作用を利用した共結晶化の検討を行うために、His-Tagを付加したHIV-1のヌクレオキャプシドタンパク質(NC)を大腸菌にて発現後、アフィニティ及び陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。市販のキットを組み合わせた576種類の結晶化緩衝液の条件にNCの有無の条件を組み合わせた計1,152条件下で検討を行った。しかしながら、以上の条件下では結晶が形成されないことが明らかになったため、今後は結晶化に向けたDLS側の最適化が必要と考えられた。HIV-1のゲノムRNA二量体形成の時期を明らかにするため、構造タンパク質Gag前駆体(Pr55)のプロテアーゼによる切断の段階を酵素反応速度論に即して模倣する変異体を作成した。各連続変異体のノザン解析の結果、Pr55の最初の切断が起こるときにゲノムRNA二量体の形成が起こることが考えられた。しかしながら、野生型同様の二量体形成にはそれ以降の切断も必要であった。また、電子顕微鏡による各変異体ウイルス粒子の形態観察の結果から、ゲノムRNA二量体化の開始には必ずしもコア形成を伴わないことが考えられた。以上の結果をまとめると、ゲノム二量体化はその開始から終了までPr55の成熟化と平行して起こり、従来考えられていた形成されたコアの中でゲノムRNA二量体化が起こるという可能性が低いことが推測された。本研究で得られた知見は、ゲノムRNA二量体化の意義の全容解明に貢献できることが期待される。
アルキンの選択的直鎖状多量化反応によるオリゴエン類の効率的合成法の開発

ジルコノセン錯体と銅塩を用いた反応によって、異なるアルキンをワンポットで直鎖状に連結し、単一のトリエンおよびテトラエン誘導体のみを高選択的に得ることに成功した。また、この方法で得られるトリエン誘導体を用いた興味深い7員環生成反応を見出すことができた。これらの反応は、様々な置換基を有する基質について適用可能であった。本研究では、異なるアルキンをワンポットで直鎖状に連結することで、単一のトリエンおよびテトラエン誘導体のみを高選択的に得ることに成功した。2種類の異なるアルキンから非対称なジルコナシクロペンタジエンを調製し、これに1.1当量のN-クロロスクシンイミド(NCS)を加え室温で1時間かくはんした後、CuCl存在下第3のアルキンを加えてかくはんすると、3種のアルキンが直鎖状に連結したヘキサトリエン誘導体を良好な収率で得ることができた。ジルコナサイクルを形成するアルキンとして、3-ヘキシン、4-オクチンなどの脂肪族アルキン、ジフェニルアセチレン、ジチエニルアセチレンなどの芳香族アルキンを用いることが可能であった。第3のアルキンとしては、エステルやアシル基など電子求引基を有するアルキンを用いることが必須であった。反応機構は、2つのアルキンから調製したジルコナサイクルの一方のジルコニウム-炭素結合がNCSによって切断され、残ったジルコニウム-炭素結合が銅へのトランスメタル化後に第3のアルキンに付加することで進行したと推測される。これは、反応をヨウ素、ハロゲン化アリル、酸塩化物などで捕捉すると、それぞれ対応するヨウ化物、アリル化物、およびアシル化物を与えたことからも支持される。さらに、第4のアルキンとしてトシルアセチレンを加えると、更なる付加反応が進行し、対応するテトラエン誘導体を合成することができた。トリエン、およびテトラエン生成物の一部は、X線結晶構造解析からもその構造を確認することができた。昨年度に開発した効率的オリゴエン合成法から得られる基質を用いて、興味深い7員環生成反応を見出すことができた。ジルコノセン錯体を用いて、2種類のアルキンと塩化アリルの高選択的3成分カップリング反応から、1-ブロモヘプタトリエン誘導体を合成した。これに低温下でtert-ブチルリチウムを作用させると、リチウム-ハロゲン交換と引き続く環化反応が速やかに進行し、加水分解の後に対応するシクロヘプタジエンが高収率で得られた。通常、カルボリチオ化による環化反応では6員環が生成する反応がほとんどであるため、この結果は、オリゴエン骨格に由来する興味深い反応性であると推測された。この反応は、種々の置換基を有するヘプタトリエン誘導体で進行し、それぞれ対応する7員環生成物を良好な収率で与えた。また、加水分解の代わりにクロロトリメチルシラン、臭化ベンジルなどの求電子剤を加えると、対応する捕捉生成物が良好な収率で得られた。この反応のメカニズムとして複数の機構が考えられたため、参照化合物を用いた反応から候補となる機構の妥当性を検証した。共役ジエン骨格を持たないヘプタジエン誘導体での反応では、7員環生成は観測されず、6員環生成物が低収率で得られるのみであった。また、ハロゲンを持たないヘプタトリエンを用いた場合には、超塩基の使用によって同様の7員環生成反応が進行した。以上の結果は、本反応がリチウム-ハロゲン交換の後に他の部位に転位し、そこから環化することで進行していることが明らかとなった。
S-RNaseの立体構造と機能の解析

ナス科やバラ科植物に見られる配偶体型自家不和合性では、雌しべのS遺伝子産物がRNaseT_2型のリボヌクレアーゼ(S-RNase)であることが確認され、トランスジェニック植物を用いた研究から不和合性にはRNase活性が必須であることが示された。しかし、S-RNaseと作用する花粉側のS遺伝子産物はまだ発見されず、自家不和合性の分子機構は依然解明されないままである。本研究は、ナス科タバコおよびバラ科ニホンナシのS-RNaseのX線結晶解析を行い、立体構造を明らかにして、S-RNaseが介する不和合性機構を分子レベルで解明することを目的とする。タバコS1-RNaseは共同研究者であるオーストラリアメルボルン大学クラーク博士の協力により、タバコ10,000花より50mgの精製標品を得た。この標品を用いて、ハンギングドロップ蒸気拡散法により約150種の結晶化条件をスクリーニングした結果、沈殿剤としてPEG-6000を用い、pH6.0、蛋白質濃度12mg/mlの条件下で、X線結晶解析に適した結晶を得ることに成功した。初期的なX線実験の結果、得られた結晶は単斜晶系に属し、空間群P21、a=80.3Å、b=77.9Å、c=68.3Å、β=90.0^。と決定され、原子レベルでの構造解析が期待できることが判明した。回折強度測定はイメージングプレートを用いた高速回折計で行い、native結晶に関して2.7Å分解能までの回折強度データを収集した。重原子同型置換法による立体構造解析を行うために、種々の重原子誘導体結晶をソ-キング法で調整したところ、水銀原子のソ-キングに成功した。現在、もう1種類の重原子誘導体結晶の調整を検討している。初期的なX線実験の結果、得られた結晶は単斜晶系に属し、空間群P21、a=80.3Å、b=77.9Å、c=68.3Å、β=90.0°と決定され、原子レベルでの構造解析が期待できることが判明した。回析強度測定はイメージングプレートを用いた高速回析計で行い、native結晶に関して2.7Å分解能までの回析強度データを収集した。
ナノグラム摩耗量の動的測定

本研究は膜厚モニターとして使用されている水晶振動子(QCM;Quartz Crystal Microbalance)の共振周波数変化を測定することによって極微小量の重量変化をオンラインで算出し、ナノグラムオーダの摩耗量を検出するトライボロジー技術を開発しようとするものである。QCMとしては光学研磨を施したATカット水晶板を用い、この基板上にスパッタコーティングによって金及びニッケル薄膜を作製した。水晶振動子と相対すべり運動を行わせる相手材は電解研磨によって作製したニッケル及びタングステンのマイクロポイントティップとし、水平及び垂直方向の駆動はピエゾ素子を用いて行った。また、垂直力及び水平力の検出はティップに取り付けた金薄板の変位を静電容量型非接触変位計を用いて行った。なお、測定ふん囲気はターボ分子ポンプによって10^<-6>torr以上の真空に排気した後、ソープションポンプによる排気で得られる10^<-3>torrとした。金薄膜とニッケルティップの組合わせで、垂直荷重5μN,すべり速度50μms^<-1>,すべり距離90μmの条件で実験を行った結果、累積の摩耗量として8ngが算出され、本測定法がナノグラム摩耗量を検出できる超高感度測定であることが実証された。また、同一の組合わせで垂直荷重のみを約10倍の5.4μNに増加させて実験を行った結果、40ngの摩耗量を検出したことから、垂直荷重の影響も著しいことが判った。PFPE系潤滑剤をスピンコートした試料では、水晶振動子の周波数変化が0.1Hz以下の場合が多く、この場合はサブナノグラムの摩耗量以下であることが明白となった。磁気記憶やマイクロメカニクスにおいて目標とされているニアゼロ摩耗、すなわち設定されたすべり回数以下では全く摩耗しない、というトライボロジー設計を現実のものとするためには本研究のような測定法は極めて有効であるものと評価される。また本測定法は大気中で作動できることから、さらに広い応用が確実である。
厚さが数分子層以下の有機半導体層における電界ドーピング効果の分光学的測定

電界ドーピング現象を理解する礎を提供する目的で,金属/絶縁体/半導体/金属という平行4層構造のモデルに多くの近似を適用して簡単化し,フェルミ分布とガウスの法則を連立方程式として解析的に解いた。その解にラングミュア・ブロジェット(LB)膜を半導体層及び絶縁体層として用いた場合に想定される物性常数を代入し,その振る舞いを調べた。その結果,半導体層の膜厚と伝導帯の状態密度の両方が極端に小さい場合には電界ドーピング現象に非線形性が生じるものの蓄積層の厚さが膜厚に比して十分小さいという状況は保持されると期待されること,並びに,それ以外の場合はそもそも電界ドーピング現象が無機の場合と大きくは異ならないと期待されることがわかった。一方,電界ドーピング効果の実験的評価を行うことを計画した。測定法としては,電界変調型の反射吸収分光法を中赤外領域に適用することとした。この目的で,フーリエ変換赤外分光光度計の改造を行い,スキャン毎に電界のon/offを切り替える疑似ダブルビーム型と,スキャン速度に比べて充分速い周期で電界のon/offを行うLock-in検出型の二手法が可能となるようにした。試料としては,金蒸着膜上にアルキル置換TCNQのLB膜,脂肪酸のLB膜,BO-脂肪酸の混合LB膜を順次積層した4層構造デバイスを用いることとした。上述の四層デバイスに疑似ダブルビーム型手法を適用したところ,電界のon/offに伴う赤外吸収スペクトルの変化が検出された。但し,観測された変化は可逆性が不完全で,電界印加に伴う電流も予想外に大きかった。従って,このスペクトル変化は電界ドーピング効果の他に電気化学的効果をも反映していると考えられる。現在,疑似ダブルビーム型の適用や,印加電界の最適化などにより,スペクトル変化を電界ドーピング効果による成分と電気化学的効果による成分とに分離することを試みている。一方,電界ドーピング効果の分光学的測定を行うため,フーリエ変換赤外分光光度計の改造を行った。そして,ガラス基板上の金蒸着膜上にアルキル置換TCNQのLB膜,脂肪酸のLB膜,BO-脂肪酸の混合LB膜を順次積層した試料を試作し,本装置を用いて下部電極である金蒸着膜と上部電極であるBO-置換脂肪酸の混合LB膜との間に電圧を印加する前後のスペクトルを測定し比較した。しかし,現在のところは半導体層であるアルキル置換TCNQのLB膜に対する電界ドーピング効果の分光学的検出には至っていない。その原因として試料の側と装置の側の両方に問題があると考えられ,その解決は今後の最大の課題である。試料の側の問題点の検討の一環として,アニオン性の長鎖アルキル置換TCNQのLB膜とカチオン性のBO-脂肪酸の混合LB膜とを積層した試料における化学的安定性を検討した。

その結果,両者を直接接触させて累積するとその界面で化学反応が起こること,及び両者間に脂肪酸のLB膜を4分子層以上の厚さにして挟みこむことで(少なくとも数日間の間は)その反応を抑制できることが分かった。電界ドーピング現象を理解する礎を提供する目的で,金属/絶縁体/半導体/金属という平行4層構造のモデルに多くの近似を適用して簡単化し,フェルミ分布とガウスの法則を連立方程式として解析的に解いた。その解にラングミュア・ブロジェット(LB)膜を半導体層及び絶縁体層として用いた場合に想定される物性常数を代入し,その振る舞いを調べた。その結果,半導体層の膜厚と伝導帯の状態密度の両方が極端に小さい場合には電界ドーピング現象に非線形性が生じるものの蓄積層の厚さが膜厚に比して十分小さいという状況は保持されると期待されること,並びに,それ以外の場合はそもそも電界ドーピング現象が無機の場合と大きくは異ならないと期待されることがわかった。一方,電界ドーピング効果の実験的評価を行うことを計画した。測定法としては,電界変調型の反射吸収分光法を中赤外領域に適用することとした。この目的で,フーリエ変換赤外分光光度計の改造を行い,スキャン毎に電界のon/offを切り替える疑似ダブルビーム型と,スキャン速度に比べて充分速い周期で電界のon/offを行うLock-in検出型の二手法が可能となるようにした。試料としては,金蒸着膜上にアルキル置換TCNQのLB膜,脂肪酸のLB膜,BO-脂肪酸の混合LB膜を順次積層した4層構造デバイスを用いることとした。上述の四層デバイスに疑似ダブルビーム型手法を適用したところ,電界のon/offに伴う赤外吸収スペクトルの変化が検出された。但し,観測された変化は可逆性が不完全で,電界印加に伴う電流も予想外に大きかった。従って,このスペクトル変化は電界ドーピング効果の他に電気化学的効果をも反映していると考えられる。現在,疑似ダブルビーム型の適用や,印加電界の最適化などにより,スペクトル変化を電界ドーピング効果による成分と電気化学的効果による成分とに分離することを試みている。
鉄硫黄タンパク質の酸化還元電位制御機構の研究

ミトコンドリア型シトクロムP-450の電子伝達系はフラビン酵素であるNADPH-アドレノドキシン還元酵素、アドレノドキシン及びシトクロムP-450より構成されており、主に副腎皮質においてステロイドホルモンの生合成に携わっている。本年度の研究では、アドレノドキシン還元酵素からアドレノドキシンへの電子伝達の機構を解明することを目的として、アドレノドキシン還元酵素とアドレノドキシン及びNADP^+との相互作用の動的及び静的性質を^1H-NMRを用いて明らかにすることを試みた。1.NADP^+の^1H-NMRシグナルの線幅は還元酵素の添加によって広がる。この線幅の広がりは還元酵素とNADP^+との混合比率に依存する線幅はフリーのNADP^+の寿命に依り、Kd値を考慮するとNADP^+の還元酵素からの解離速度を約15-20s^<-1>と求めることが出来た。2.NADP^+の静的な結合様式はNOEスペクトルより決定した。還元酵素の存在下ではニコチンアミド部分のN2プロトンは糖部分のN1'プロトンとの間に強いNOE信号が見られ、N6プロトンはN2'プロトンとの間に信号が見られた。同様にアデニン部分ではA8プロトンとA2'プロトンとの間に信号がみられた。このことより、NADP^+の糖-塩基結合のコンフォメーションは両者ともアンチ構造をとることが分かった。アドレノドキシン還元酵素はニコチンアミド環4位炭素上のS位水素と特異的に反応する。従って、NADP^+のニコチンアミド環はアンチ構造をとり、S位水素側をFADのイソアロキサジン環に向けて結合している。従来相同な酵素だと考えられていたFNRのNADPH結合様式とは全く異なることが判明した。3.還元酵素に対して過剰なアドレノドキシンの存在下、緩和時間の塩強度依存性を測定した。塩強度が上がると共に緩和時間が短くなるが、低イオン強度ではフリーのアドレノドキシンの緩和時間と同等であり、アドレノドキシンの解離速度の上限は緩和時間より4s^<-1>と計算された。この速度は低イオン強度条件でのアドレノドキシン還元速度と同等であり、還元酵素からアドレノドキシンへの電子伝達の律速がアドレノドキシンの解離過程にあると結論された。
次世代細胞系譜追跡法の開発による幹細胞探索

幹細胞は重要な生命現象の鍵となる重要な細胞であるが、幹細胞の定義に照らして正確に同定されていると言える成体幹細胞・がん幹細胞はごく少数に留まる。細胞系譜追跡法は汎用性が大きいが、同時に1種類の幹細胞マーカーしか使えないため非常に特異性の高いマーカーが既知でなければ幹細胞の存在を証明できないという欠点がある。本研究では旧法を改良し、12種類の幹細胞マーカーが共発現した細胞に蛍光蛋白質を発現させるレポーターマウスを構築した。2また、さらに、単一幹細胞の動態をより正確に追跡し、幹細胞クローナリティ解析の統計的確度向上のために超多色(5-35色レインボーマウス)を構築した。初年度の研究によって、12種類のマーカー遺伝子共陽性細胞を特異的に標識するレポーターコンストラクトを作製した。このコンストラクトをRosa26tkneoベクターに組み込み、コンストラクトが機能することをCos7細胞に一過性発現することで確認した。またこのコンストラクトをR1 ES細胞のRosa26領域にノックインしたクローンを得た。2GFP, mCerulean, mOrange, mCherryに加えmKeima有する5色レインボーコンストラクトを作成した。このコンストラクトをRosa26tkneoベクターにノックインしたR1 ES細胞を得た。当初の予定ではこのコンストラクトをRosa26領域を含むBACクローンに挿入しBACトランスジェニックマウスを得る予定であったが、この方法が機能しなかったため、方針を転換し、同じコンストラクトを、制限酵素サイトを利用して2つ、ないし3つ直列に結合したコンストラクトを構築し、全体をRosa26tkneoベクターに組み込んだコンストラクトを作成した。これをR1 ES細胞のRosa26領域にノックインし、個体化すればそれぞれ15色、ないし35色レポーターマウスとなる。本学動物実験施設にて感染事故が起こり、約6ヶ月に渡り実験マウスの使用が制限されたことにより、作成したコンストラクトの個体化の部分に遅れが生じている。しかしコンストラクトの作成自体はほぼ順調であり、予定通りに進行している。Cre-loxpシステムを用いて幹細胞とその子孫細胞を蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子によって標識する細胞系譜追跡法は、単細胞レベルで生体外に単離して移植する等の研究手法が使えない成体幹細胞にとって非常に強力かつ有用な研究手法である。細胞系譜追跡法を用いれば幹細胞を生体外に取り出すこと無く標識し、in situにてその命運を視覚化することが可能である。しかしながら、現在一般的に行われている方法では、レポーター分子が1種類であるために、異なる幹細胞由来クローンを区別できず、また、研究対象組織の幹細胞に非常に特異的なマーカーが存在する場合には有用であるが、そうでない場合には使えなかった。一方、フローサイトメトリーを用いた成体幹細胞単離においては、複数の幹細胞マーカーを組み合わせる事で単離する幹細胞の純度を上げる事が一般的になっている。今回の研究プロジェクトではフローサイトメトリーの利点を細胞系譜追跡法に導入し、2種類のマーカー陽性細胞を始めて標識するレポーターマウスを作製した。すなわち、12種類のマーカー遺伝子共陽性細胞を特異的に標識するレポーターコンストラクトををRosa26tkneoベクターに組み込み、をR1 ES細胞のRosa領域にノックインしたクローンを得た。また、22種類のマーカーを使って2段階に細胞を標識するコンストラクト(double lineage tracing)のコンストラクトを作製した。このコンストラクトをやはりR1 ES細胞のRosa領域にノックインしたクローンを得た。以上の2クローンを個体化しマウスラインを得、現在これらが機能することを確認中である。本学動物実験施設の感染事故は既に終息し、実験マウスを用いた研究を実施できる体制を再構築したため、平成27年度に作成したレポーターマウスのコンストラクトをES細胞にノックインし、得られたクローンをC57/BL6マウス由来の胚盤胞に注入し、偽妊娠マウスの子宮に移植することでキメラマウスを得、このキメラマウスをC57/BL6マウスと交配することで個体化する。樹立したレポーターマウスをRosa26-CreERT2マウス, Rosa26-Flpeマウスなどと交配し、コンストラクトが個体レベルにて機能する事を証明する。幹細胞生物学平成26年7月に関西医科大学動物実験施設にて研究代表者グループの飼育するSPFマウスの飼育室にて他室から伝搬した消化管原虫の感染事故が発生し、新規マウス作成に関わる実験が中断した。当該SPFマウス室のマウスの殺処分、飼育室の消毒過程を経て平成26年12月より順次研究に必要なマウスの再立ち上げを施行中であり、その後は順調に推移している。しかし5ヶ月の飼育室使用中断とマウスの再立ち上げなどで研究計画が遅れた。

上記感染事故は鎮静化し、マウス再立ち上げが順調に進んでおり、現在では研究の施行に問題は無い。平成26年度の後半に行う予定であった、作成したベクターをノックインしたES細胞の個体化作業から順次進行中である。
フラボノイド類の新しい薬理作用の検索:特に交感神経機能に対する作用を中心として

フラボノイドはアスコルビン酸と共に壊血病による出血に有効な因子として古くから良く知られているが、その薬理作用については今日までのところ特筆すべき作用は報告されていない。初期の研究において、ある種のフラボノイド化合物が高濃度でカテコ-ルアミン代謝酵素を競合的に阻害し、その結果として外因性のカテコ-ルアミンの作用を増強することが報告されているに過ぎない。そこで本研究では、フラボノイド類の薬理作用、特に交感神経系機能に対する作用を明らかにする目的で、培養ウシ副腎髄質クロマフィン細胞におけるカテコ-ルアミンの生合成及び分泌に対するフラボノイド化合物の作用について検討を加えた。その結果、副腎髄質クロマフィン細胞からのカテコ-ルアミン分泌がクエルセチンによって抑制されること、この抑制作用が細胞内へのカルシウムの流入以後の過程、即ち細胞内分泌機構に対する直接的な阻害作用に基づくことをジギトニン処理細胞を用いて明らかにした。更に、細胞内分泌機構にプロテインキナ-ゼCが関与している可能性を示し、クエルセチンによるカテコ-ルアミン遊離の抑制がプロテインキナ-ゼCの阻害によるものであることを見いだした。一方、培養細胞を用いてカテコ-ルアミン生合成に対するフラボノイド類の作用について検討を加え、カテコ-ルアミン産生がクエルセチンによって抑制されることを見いだし、この抑制が生合成過程の律速酵素であるチロシン水酸化酵素の阻害に基づくことを明らかにした。更に細胞へのチロシンの取り込みがフラボンによって著しく促進されることを見いだし、その結果、カテコ-ルアミンの産生が増加することを報告した。これら研究結果より、フラボノイド化合物が神経伝達物質であるカテコ-ルアミンの生合成及び分泌に対する作用を介し、交感神経機能に何等かの影響を与える可能性が示唆された。
エジプト、メンフィス・ネクロポリスの文化財保存面から観た遺跡整備計画の学際的研究

本研究は、エジプト・アラブ共和国の世界遺産メンフィス・ネクロポリスの遺跡整備計画を提示することを目的とする。「遺跡の重要性の理解」、「将来的に遺跡に及ぼす要素」の調査を行い、遺跡保存整備計画の策定を提示した。この整備計画は考古学、保存科学、建築史学、地質学、観光学、衛星画像解析などの学際的成果がベースにあり、メンフィス・ネクロポリスの各遺跡の具体的な整備方針に資するモデル・ケースとなるものである。エジプト・アラブ共和国、メンフィス・ネクロポリスはギザの大ピラミッドなど、世界でも最も重要な遺跡が集中する地区であり、1970年代に世界遺産に登録されている。近年、この遺跡群でも人口増加による環境汚染、地下水の上昇、観光客の増加、開発による遺跡破壊など様々な遺跡劣化の問題が表面化しつつあるが、全体的な遺跡整備計画に関しては議論が遅れており、整備計画の必要性が高まっていた。これらの遺跡劣化の問題を受けて、メンフィス・ネクロポリスの遺跡整備計画(Site Management Plan)を提示することを研究の目的とした。特に考古学、保存科学、観光学、地質学など、様々な側面から学際的な研究を実施し、整備計画を策定することを目指した。エジプト・アラブ共和国、メンフィス・ネクロポリスは、ギザの三大ピラミッドなどのピラミッド群など、世界で最も重要な遺跡が集中する地区であり、1979年にユネスコの世界遺産として登録されている広大な遺跡群である。近年、この遺跡群では隣接都市である首都カイロの人口増加による環境汚染、地下水の上昇、観光客の増加、開発による遺跡破壊などのさまざまな問題が表面化しつつある。早稲田大学古代エジプト調査隊は、1987年よりメンフィス・ネクロポリスの主要な遺跡にて科学研究費補助金などの助成を受け、調査を継続している。これらの調査は考古学的調査のみならず、保存修復、遺跡整備に関する調査を実施してきた。このような過去20年間に培った経験をメンフィス・ネクロポリスの遺跡整備計画に還元することが責務と考えている。2007年度は、メンフィス・ネクロポリスの遺跡整備計画の学際的研究の予備作業として、遺跡整備の現状を把握するための踏査を実施した。今年度は、8月から9月に実施したアブ・シール南丘陵遺跡第16次調査において、考古学・保存修復学の見地から、アブ・シール地区、サッカラ地区、ダハシュール地区を中心に踏査を実施した。この踏査によって来年度以降の調査の方針が策定された。2008年2月のダハシュール北遺跡第13次調査では、エコ・ツーリズムの観点から観光学の専門家、メンフィス・ネクロポリスの遺跡の地質の現状を認識する上で地質学、岩盤工学の専門家、そして木製出土遺物の保存修復の専門家などが参加し、メンフィス・ネクロポリスの主要遺跡の視察を行った。これらの踏査、視察に平行して、遺跡・遺物の将来的な管理、展示、活用を目的として、出土遺物の保存修復作業、材料分析、発掘調査を実施した。なお、以上の成果の一部は、『エジプト学研究別冊』第12号、早稲田大学エジプト学会、2008年3月に掲載されている。エジプト、メンフィス・ネクロポリスは世界で最も遺跡が集中する地域であり、1970年代からユネスコの世界遺産に登録されている。しかし、この遺跡群は近年さまざまな遺跡劣化の問題が表面化しつつあり、遺跡の保存修復、整備に関する要請が高まっている。本研究はこのような状況を踏まえ、当該遺跡群の遺跡の重要性を理解し、将来的に影響を及ぼす要素の現状を把握し、最終的には遺跡整備計画を提示することを目的とする。2008年度では、メンフィス・ネクロポリスにおいて早稲田大学が実施している2つの遺跡、アブ・シール南丘陵遺跡とダハシュール北遺跡を中心に調査を行った。まず、アブ・シール南丘陵遺跡では、7月下旬から9月下旬までと2009年2月に調査を実施した。調査の内容は遺跡の重要性の理解のための考古学的発掘調査、地下埋蔵文化財の探査、周辺遺跡の保存修復の現状を理解するための踏査、人工衛星からのリモート・センシングによる遺跡の観測結果との照合のための調査、三次元測量実施のための予備調査、出土遺物の保存修復作業および管理、出土遺物のX線化学分析等を実施した。ダハシュール北遺跡では、考古学的発掘調査、劣化・崩壊が危ぶまれる緊急の保護作業、地下遺構の環境、害虫などの現状調査、地質学・岩盤工学的観点から観た遺跡の地盤調査、地下埋蔵文化財の探査等を実施した。これら調査の成果については、2回の研究会が開催され、刊行物が準備された。国内では、上記の調査の成果を有機的に統合し、最終的な目的とする遺跡整備計画策定の核となる地理情報システム(GlS)の導入、データ・ベース構築に向けた検討作業を行った。今年度は、アブ・シール南丘陵遺跡とダハシュール北遺跡の重要性、遺跡の保存修復上の問題の現状把握をさらに進めることができた。本研究が他のメンフィス・ネクロポリス地域の遺跡管理計画のモデルとなることが期待される。本研究は、エジプト、メンフィス・ネクロポリスの遺跡保存整備計画策定のための学際的な研究である。

2009年度もこれまでに継続し「遺跡の重要性の理解のための調査」および「将来に影響を及ぼす要素の調査」を実施した。まず、前者では、早稲田大学が調査を実施しているアブ・シール南遺跡およびダハシュール北遺跡における遺跡保存整備のための地理情報システム(GIS)の導入を可能にするためUTM座標が設定され、それに基づく三次元地形測量が実施された。これにより以前より正確かつ詳細な地図を作成することができた。また、アブ・シール南丘陵遺跡においては未知の地下埋蔵文化財の分布を把握するために物理探査を実施した。同時に、既に発見された遺構に関しては三次元レーザー・スキャンによる測量を行い、基礎データを入手した。これらのデータは今後の遺構の保存修復に役立てられる。さらにマクロなレベルでは、人工衛星からのリモート・センシングによる遺跡の観測結果との照合のための調査が実施され、当該地区の遺跡の分布や古環境の復元で重要な知見を得ることができた。アブ・シール南丘陵遺跡の考古学調査では、2008年度に発見された新王国時代第19王朝のトゥーム・チャペルから北へ約10mの地点から土器を納めたピットが発見された。ピット内の土器は、出土状況や器種組成などから埋葬儀礼に使用された土器である可能が高い。その他には、ラメセス2世の孫娘イシスネフェルトの保存修復作業、埋葬室で出土した人骨の人類学的研究、保存修復に向けた出土遺物の材料の化学分析等が実施された。ダハシュール北遺跡の考古学調査では、新たに10基のシャフトの発掘を行い、中王国時代および新王国時代の埋葬を発見した。出土した副葬品の中には、これまでメンフィス・ネクロポリスであまり発見されていない類の遺物があり、当該地区の遺跡の理解に新たな情報を提供することができた。本研究は、エジプト、メンフィス・ネクロポリスの遺跡保存整備計画策定のための学際的な研究である。2010年度のエジプト現地における調査は、2011年1月から2月に予定していた調査が革命の影響で延期となったので、2010年8月から10月にかけて実施された第19次ダハシュール北遺跡調査のみとなった。ダハシュール北遺跡はほとんどが地下の遺構で占められており、保存整備計画ではこうしたアクセスが難しい遺構を保存していく一方で、調査によって得られたデータを効果的に開示していく方法を検討することが課題となっていた。その1つの試みとして、インターネットのコンテンツを用いて地下の遺構を公開するシステムを構築した。Google Earthと写真データを含むデータ・ベースを連携させ、視覚的に分かりやすい形で遺跡の情報を提示し、検索機能を付加することで条件にマッチする遺構のみを表示させることを実現した。また、インターネットにデータ・ベースがあることを利用し、QRコードを利用した遺跡の案内表示が可能となった。QRコードを使用することで、遺跡の景観を損なう表示を排除することができ、常に最新の案内表示をインターネットから取得することが可能になった。ダハシュール北遺跡のように地下の遺構で占められる遺跡に対して、有用な整備方法の一端を提示することができた。また、ダハシュール北遺跡から出土した中王国時代の人型木棺の保存修復作業を行った。
四量体分泌型IgA抗体形成機構の解明

生体内において最も産生量の多い抗体であるIgA抗体はインフルエンザ等の粘膜組織を標的とした感染症に対する生体防御の最前線防御因子として機能している。ヒトでは、血清中のIgAはほぼ全てが単量体で存在するが、粘膜に存在する分泌型IgA抗体(SIgA)は多量体を形成しており、多くのSIgAは二量体として存在することが良く知られている。さらに、その量は限定的ではあるもののヒト粘膜には二量体よりも大きな四量体IgA抗体が存在しており、単量体や二量体抗体よりも効率よく病原体を不活化できることが明らかになっている。しかしながら、四量体SIgAの形成機構に関してはほとんど何も分かっていない。我々はこれまでSIgAを構成するHeavy chain (HC)とLight chain (LC)、J chain (JC)およびSecretory component (SC)の哺乳類培養細胞へ共発現させることで効率良く四量体SIgAが作製できることを見出してきた。この方法においてSIgAの四量体化は、SCの共発現により促進されていることから、SCがIgAの四量体形成に関与していると考えられている。そこで本研究では、SCによる四量体SIgA形成促進の分子機構を明らかにすることを目的とし、SC上の責任領域を探索した。SCは3つの抗体分子の相補性決定領域に類似した領域(CDR)をもつドメインIVまでの5つのドメインから構成されていることから、SCのドメインおよびCDR欠失変異体を作成しHCとLC、JCと共発現させ、各変異体の四量体SIgAの形成促進割合を比較することにより、SIgAの四量体化はSCのドメインIが主要な役割を担っていることを明らかにした。我々が確立した四量体IgAの作製方法では、SCの有無によって四量体IgA抗体の産生量に大きな差があることから、SCはIgA抗体の四量体化に寄与していることが示唆された。そこで、SCのドメイン構造に着目しtSIgA形成促進機構の解明に着手した。これらの解析より、SCによる四量体IgA形成促進機構はSCのドメイン間相互作用及び、ドメイン1のCDR様領域によって制御されていることが示唆され、さらに、効率の良い四量体IgAの作製方法を明らかにすることができた。しかしならが、これらの結果は、変異体を用いた間接的な観察結果に基づくものであることから、X線結晶構造解析を用いて、IgAとSCの相互作用を原子レベルで明らかにする必要がある。そこで、昨年度に引き続き分析系の構築を進めるとともに分析に供する高純度の四量体IgAの合成を進めた。抗体は可変領域の可動性が高く、分子全体での結晶化は困難であると考えられる事から、可変領域を取り除き定常領域のみにした四量体型IgA抗体の合成を行った。その結果、十分な量の四量体型IgA抗体を合成することに成功した。今後、精製方法を至適化することにより、X線結晶構造解析に供することが可能な純度の四量体型IgA抗体を作成していく予定である。今後は、X線結晶構造解析に供することが可能なサンプルの作製が最も重要な課題である。今年度までの研究により、四量体型IgA抗体合成効率の高いSC変異体の作製に成功し、さらに四量体型IgA抗体の大量合成系を構築できた。次年度中に四量体型IgA抗体の精製工程を至適化することにより、純度の高い四量体型IgA抗体の作製が可能となることが期待できる。また、SCだけでなく、IgAの重鎖変異体を作製することにより、さらに四量体型IgA抗体の合成効率を高めることができると考えられる。これらの技術を駆使して、X線結晶構造解析用サンプルを調整し、原子レベルでの構造情報を得ることにより、研究計画の最終年度である今年度中に四量体IgA抗体形成の分子機構の解明が期待できる。粘膜免疫の主要なプレーヤーであるIgA抗体の性状を理解することは基礎的な分子生物学研究の側面を持つだけでなく、新たなバイオ医薬品候補の研究としての側面を持ち抗体医薬という歴史と実績のあるバイオ医薬品の可能性をさらに大きく広げることが期待される。しかしながら、多量体SIgAを医薬品として開発するためには分子性状の詳細な理解が不可欠であり、作製技術開発だけでなく多量体形成機構に関する分子レベルの基礎的知見を積み上げることが必要である。また、SIgA抗体の最も大きな特徴である多量体形成機構を解明することは、抗体というタンパク質の持つ特性の新たな側面を明らかにすることであり、医薬品開発だけでなく免疫学やタンパク質科学など基礎科学研究分野においても重要である。そこで、本研究では、サイズ排除クロマトグラフィー、表面プラズモン共鳴法、高分子量域質量分析計、X線結晶構造解析、高速AFM装置などの分析機器を使って四量体SIgAの分子構造を解析することにより四量体SIgA抗体の形成機構を明らかにすることを目的とする。本年度の研究では質量分析装置を用いた新規ヒトIgA定量分析法と多量体化によるインフルエンザウイルスHAに対する結合特性を表面プラズモン共鳴法を用いて評価する系を構築した。さらに、これらの系を有用性について哺乳類培養細胞系を用いたリコンビナントIgAと精製したヒト粘膜IgA試料を用いて評価した。

今後、SIgA抗体の変異体を作成し、これらの解析系を用いて評価する事により四量体化に寄与する責任因子の同定を試みる予定である本研究では、バイオ医薬品の分析で用いられるサイズ排除クロマトグラフィー、表面プラズモン共鳴法、高分子量域質量分析計、X線結晶構造解析、高速AFM装置などを用いて四量体分泌型IgA抗体形成機構の解明を目指している。研究の進展には適切な分析系の構築が不可欠であるが、本年度の研究においては予定通り、分析系の構築が進んでおり、おおむね順調に進展していると考えられる。今年度の研究では、構築した分析系を評価するために経鼻インフルエンザワクチン接種後の健康成人から採取した鼻腔洗浄液を用いてヒト粘膜抗体性状をサイズ排除クロマトグラフィーと質量分析装置によるヒトIgA定量分析法、高分子量域質量分析計、Surface Plasmon resonance (SPR)を用いて解析した。被験者の鼻腔洗浄液検体から精製したIgAをサイズ排除クロマトグラフィーにより分画することにより抗体の高次構造毎に分取し、各分画に含まれる抗体について分析を行った。その結果、それぞれの分析系の有用性を確認するとともに、鼻腔粘膜に存在する多量体IgAの比率が鼻腔洗浄液検体の中和価と正の相関を示し、ウイルス中和において主要な役割を担っていることを明らかにすることに成功した。このことから本成果は抗体医薬の開発だけでなく、現在既に開発が進んでいる経鼻インフルエンザワクチンにおいてワクチン有効性を評価する方法にも応用可能であると考えられた。生体内において最も産生量の多い抗体であるIgA抗体はインフルエンザ等の粘膜組織を標的とした感染症に対する生体防御の最前線防御因子として機能している。ヒトでは、血清中のIgAはほぼ全てが単量体で存在するが、粘膜に存在する分泌型IgA抗体(SIgA)は多量体を形成しており、多くのSIgAは二量体として存在することが良く知られている。さらに、その量は限定的ではあるもののヒト粘膜には二量体よりも大きな四量体IgA抗体が存在しており、単量体や二量体抗体よりも効率よく病原体を不活化できることが明らかになっている。しかしながら、四量体SIgAの形成機構に関してはほとんど何も分かっていない。我々はこれまでSIgAを構成するHeavy chain (HC)とLight chain (LC)、J chain (JC)およびSecretory component (SC)の哺乳類培養細胞へ共発現させることで効率良く四量体SIgAが作製できることを見出してきた。この方法においてSIgAの四量体化は、SCの共発現により促進されていることから、SCがIgAの四量体形成に関与していると考えられている。そこで本研究では、SCによる四量体SIgA形成促進の分子機構を明らかにすることを目的とし、SC上の責任領域を探索した。SCは3つの抗体分子の相補性決定領域に類似した領域(CDR)をもつドメインIVまでの5つのドメインから構成されていることから、SCのドメインおよびCDR欠失変異体を作成しHCとLC、JCと共発現させ、各変異体の四量体SIgAの形成促進割合を比較することにより、SIgAの四量体化はSCのドメインIが主要な役割を担っていることを明らかにした。我々が確立した四量体IgAの作製方法では、SCの有無によって四量体IgA抗体の産生量に大きな差があることから、SCはIgA抗体の四量体化に寄与していることが示唆された。
株式市場における税金情報の有用性に関する実証分析

本研究は税金情報の有用性を分析し、その結果、主として次の3点を明らかにした。第1に経営者は予想利益を達成するための手段として繰延税金資産に係る評価性引当額を利用している可能性があることを発見した。第2に著しく正(または負)の会計利益と課税所得の差額は利益平準化行動に起因する可能性があることを示した。第3に日本の株式市場は利益の質に関する指標として税金情報を織り込んでいることが示された。本研究の目的は、株式市場における税金情報の有用性を実証的に分析することである。平成24年度は、まず前年度に主として行った繰延税金資産に係る評価性引当額の情報内容に関する分析結果を編著書の中にまとめた。次に、税金関連の情報の1つである会計利益と課税所得の差額(以下、BTD)に着目した分析を行った。BTDは利益の質を評価する上で有用な指標であり、両者の乖離が著しく大きい企業の利益の質は相対的に低いと考えられている。しかし、なぜBTD情報が利益の質を評価する上で有効であるのかは必ずしも明らかにされていないため、BTDの大きさと企業属性の関係を分析した。その結果、会計利益の水準はBTDの大きさによってそれほど変化しないが、課税所得の水準はBTDが負であるほど大きく、それが正であるほど小さいことが明らかとなった。これは、企業が業績好調時に利益を圧縮し、業績悪化時に利益を捻出していることを示唆する。実際、BTDが負であるほど、売上高成長率は高く、それが正であるほど売上高成長率は低くなることが確認された。また、BTDが著しく負の企業は特別損失を多額に計上しており、BTDが著しく正の企業は不規則に特別損失を計上していないことも明らかとなり、BTD情報は経営者による特別損益項目を活用した利益平準化行動を補足する可能性があることが示唆された。さらに、株式市場はこうしたBTDに含まれる情報内容を価格に織り込んでいることも示された。また、本研究で予定していた限界税率を用いた分析はデータベースの構築の遅れにより有効な分析結果を得ることができなかった。そのため、これについては継続的な研究課題としたい。本研究の狙いは、株式市場における税金情報の有用性を、企業の税務環境の実態に留意しながら、税効果会計情報の観点から実証的に分析することである。こうした目的を達成するためには、企業の税務環境を分析するためのデータベースを構築する必要があり、平成23年度においては、有価証券報告書の中に税効果会計の注記情報として開示されている「繰延税金資産および負債の発生原因別内訳」を収集した。なお、対象企業は日経平均採用銘柄(225社)であり、対象期間は2000年から2010年までとした。また、平成23年度では、これらの情報のうち、とりわけ繰延税金資産に係る評価性引当額に焦点をあて、経営者がそれを会計政策の手段として利用しているのか否かを分析した。具体的には、当期の利益水準がベンチマーク(ゼロ、前期利益、直近の予想利益)を上回る場合とそれを下回る場合で評価性引当額の設定行動に変化が見られるのか否かを分析した。その結果、いずれのベンチマークにおいても、当期の利益水準がベンチマークを上回る企業は評価性引当額を増加させており、それを下回る企業は評価性引当額を減少させていることが明らかとなった。これは先行研究と整合的な結果である。さらに、どのような場合に評価性引当額を活用して利益の捻出を図っているのかを分析するために、当期の利益水準がベンチマーク(ゼロ、前期利益、直近の予想利益)を若干下回る企業が評価性引当額をシステマティックに減少させているのか否かを分析した。その結果、ベンチマークを直近の予想利益とした場合にのみ、システマティックな評価性引当額の減少が観察された。これらの結果は、経営者が直近の予想利益を達成するための会計政策の手段として評価性引当額を設定していることを示唆する。これらの分析結果は、税効果会計の注記情報の価値を指摘したという点において貢献があったと考える。投資家にとって企業が直面する将来の税率に関する情報は重要である。将来の税率は欠損金や税額控除の利用度、あるいは経営者の税金に対する意識などによって変化するため、企業の税務環境の実態を正確に把握することが必要となる。このような目的のもと、本研究では大きく2つのことを明らかにしたいと考えている。1つは、税務環境の実態と資本市場の関係を明らかにすることである。財務諸表の情報からどの程度企業の税務実態を浮き彫りにすることができるのか、またそれらが投資家からどのように評価されているのかを明らかにすることである。いま1つは注記情報を利用して推定された限界税率と資本市場の関係を分析することである。

欠損金や繰延税金資産(及び負債)の影響を考慮した税率が投資家の意思決定に資する情報になるのか否かを明らかにすることである。これらの分析を行うためには、次の作業が必要となる。(1)企業の税務環境を分析するためのデータベースの構築(税効果会計の注記情報の入力)、(2)資本市場との関係を分析するためのデータベースの構築(株式リターンや資本コスト等の推定)、(3)企業の税務環境の実態に影響を与える諸要因と資本市場との関係に関する実証分析である。このうち、企業の税務環境を分析するためのデータベースについては平成23年度において実施済みであり、これを利用した限界税率の推定も当初の計画どおり本年度実施予定である。ただし、税効果会計の注記情報の収集に予想以上に時間がかかったため、資本市場関連のデータベースの構築が遅れている。株価や株式リターン、資本コストなどの資本市場の変数を早期に収集したいと考えている。本研究課題を遂行するためには、(1)企業の税務環境を分析するためのデータベースの構築(税効果会計の注記情報の入力)、(2)資本市場との関係を分析するためのデータベースの構築(株式リターンや資本コスト等の推定)、(3)企業の税務環境の実態に影響を与える諸要因と資本市場との関係に関する実証分析が必要である。(1)の作業は実施済みであるため、本年度は、平成23年度に実施できなかった(2)の資本市場関連のデータベース構築を早急に行いたいと考えている。資本市場関連のデータベースの構築を行ってから、(3)の企業の税務環境の実態に影響を与える諸要因と資本市場との関係に関する実証分析を行う。具体的には、繰延税金資産及び負債の変動に関するボラティリティと、資本市場の変数(予想利益の精度や修正回数、資本コスト、株価、リターンなど)との関係を分析することを予定している。なお、本年度は(1)の税務環境に関するデータベースを活用して限界税率の推定も行う予定である。推定された限界税率が企業の税務環境によって異なるのか否かを分析し、企業の税務環境を外部から分析ための指標になりうるのか否かを考察する。本研究は、本年度が研究期間の最終年度であるため、国内の研究会および学会で研究成果を随時報告する予定である。また、研究成果を論文にまとめ、学術雑誌に投稿する。平成23年度は、企業の税務環境を分析するためのデータベースの構築(税効果会計の注記情報の入力)に予想以上に時間がかかったため、研究の進捗が若干遅れている。当初の研究計画を遂行するためには、資本市場との関係を分析するためのデータベースの構築(株式リターンや資本コスト等の推定)を早急に実施する必要がある。『NEEDS-FinancialQUEST』(日経メディアマーケティング株式会社)などのオンライン・データベースを契約して、必要なデータを収集・加工する。なお、株式リターンや資本コストは複数の推定方法によって測定する予定であり、これらの測定には時間がかかると予測される。このため研究補助員を雇用して作業の効率化を図る。この作業には専門的な知識が必要となるが、実証研究を専門とする大学院生に研究協力を打診している。またデータベースの構築作業を可能な限り標準化するなどして、作業に混乱をきたさないよう工夫している。また、平成24年度は国内の研究会および学会で研究成果を随時報告するため、そのための費用を旅費として使用する。