hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
網膜色素上皮形成メカニズムに関わる転写因子Pax6の多面的機能の解析

Pax6は眼の「マスターコントロール遺伝子」とも呼ばれ、その所以の一つは、ショウジョウバエやアフリカツメガエル胚においてPax6遺伝子やmRNAの強制発現によって異所的な眼の形成が誘導されたという知見によるものである。脊椎動物の場合、眼の複数の組織の正常形成がPax6遺伝子の機能喪失によって乱されることから、Pax6は眼の形成過程で多面的な機能を担っていると考えられている。従って、眼の形態形成過程を理解し、また将来の展開が予想される眼の組織再生に発生学的な知見を活かす上でも、Pax6のin vivoでの機能解析は必須の課題と言える。本研究では、共通の発生起源から形成される網膜色素上皮(RPE)と神経網膜の2つの眼の組織の形成過程に着目し、1)Pax6という1つの因子が、異なる2種類の組織の形成に関わっているかどうか、2)またその過程でPax6がどのような分子メカニズムを介して機能するのかを解析した。解析の結果、1)については、Pax6が実際にRPEと神経網膜の両方の形成を促すことを、一つのin vivo実験系内で観察できた。RPEと神経網膜の発生過程では、それぞれのプロセスを異なる転写因子が動かしている。本解析では、構成的活性化状態のPax6をコードする遺伝子を眼杯に導入することで、Pax6の機能が亢進した場合にRPEと神経網膜のそれぞれで特異的に発現する転写因子の両方が発現誘導されることが分かった。さらに2)について、RPEと神経網膜のそれぞれで働く転写因子の発現誘導が、Pax6タンパク質内の異なるドメインを介して活性化されることも明らかにした。これらのデータはPax6の多面的な機能メカニズムの一端を明らかにするものであり、現在論文投稿の準備中である。単純なかたちをした眼の原基(眼胞)から、成体の完全なかたちの眼を作り上げるには、眼胞の中をいくつかの領域に適切に分け、またそれらの領域が自身の位置に応じて神経網膜や網膜色素上皮(RPE)などの組織を適切に形成するように導く、パターンやプログラムが必須であると考えられる。このような眼の発生に関わるパターンやプログラムの実体を明らかにすることは、眼のそれぞれの組織がいかに成り立つかという問題だけでなく、眼全体の形態形成を明らかにするためにも不可欠である。この問題の解明にあたって本研究では、発生中の眼において時間的にも空間的にも幅広く発現する転写因子Pax6に着目し、その機能解析から、特にRPEの領域やその特徴づけにPax6がどのように関わるのかを詳細に明らかにした。さらにPax6がRPE発生においてこのような複数の機能を担うメカニズムについて解析を進めた。Pax6は眼の発生段階ごとに発現領域が刻々と変化し、特にRPEでは特徴的な一過的な発現パターンが観察された。Pax6がこのように発生段階ごとに異なる発現パターンを持つことを考慮し、発生段階の早いタイミングから遅いタイミングにかけての各発生段階にあるニワトリ胚の眼にPax6の強制発現実験を行った。その結果、Pax6が眼発生のそれぞれの段階ごとに異なる機能を持ち、それに応じてRPEの領域や特徴がコントロールされ、眼全体の形態形成にも影響を与える可能性が強く示唆された。Pax6タンパク質の構造は、DNA結合ドメインや転写活性化ドメインなどの数種類のドメインから構成されている。これらのドメインのいずれかの機能を損なわせるように変異させたPax6遺伝子を作製し、これをニワトリ胚の眼に強制発現させた。その結果、RPE形成過程で見られたPax6の複数の機能のそれぞれが、Pax6タンパク質の各ドメインに依存する可能性存示唆する結果が得られた。本研究は、脊椎動物の眼の組織のひとつである網膜色素上皮(RPE)の形成メカニズムの解析を目的としている。特に本研究では、転写因子の一つPaired-box 6 (Pax6)の機能解析を行っている。Pax6は眼発生において中心的な役割を果たす因子だが、その遺伝子変異体の眼は重篤な形態形成異常を呈するため、Pax6のin vivoにおける機能解析を困難にしている。とりわけ、RPEの形成に関してはPax6の機能が関与していることがいくつかの研究から示されているものの、具体的な作用機序に関しては分かっていない。これまで我々は、RPE形成過程においてPax6がMitf(RPE形成において不可欠な転写因子)の発現と機能の2つを制御する可能性を明らかにしてきた。現在、この2つの働きをPax6という1つの因子がどのようにして同時にコントロールするのか、またその働きがRPEの正常な形成にどのように貢献しているのか、という問題に焦点を当てて解析している。解析の結果、Pax6が複数の機能を同時に果たすメカニズムが、Pax6タンパク質の構造や他の遺伝子との相互作用に起因していることが分かってきた。また、Pax6のin vivoにおける詳細な機能解析から、Pax6はMitfを介さずにRPE形成に関与する可能性も見出している。具体的には、RPEの細胞形態やある種の遺伝子発現にPax6が関わっていることを新たに明らかにした。このような報告はこれまでなく、今後、in vivoとin vitroの両面での解析から、Pax6の機能やその下流因子に関する新たな知見が得られる可能性が高い。本研究成果によって、未だ不明な点の多いRPE発生の分子メカニズムやPax6の作用機序について新たな知見を提供できると考えているが、それだけでなく近年研究が加速している眼やRPEの再生医療分野に本研究の知見を応用することが期待できる。

Pax6は眼の「マスターコントロール遺伝子」とも呼ばれ、その所以の一つは、ショウジョウバエやアフリカツメガエル胚においてPax6遺伝子やmRNAの強制発現によって異所的な眼の形成が誘導されたという知見によるものである。脊椎動物の場合、眼の複数の組織の正常形成がPax6遺伝子の機能喪失によって乱されることから、Pax6は眼の形成過程で多面的な機能を担っていると考えられている。従って、眼の形態形成過程を理解し、また将来の展開が予想される眼の組織再生に発生学的な知見を活かす上でも、Pax6のin vivoでの機能解析は必須の課題と言える。本研究では、共通の発生起源から形成される網膜色素上皮(RPE)と神経網膜の2つの眼の組織の形成過程に着目し、1)Pax6という1つの因子が、異なる2種類の組織の形成に関わっているかどうか、2)またその過程でPax6がどのような分子メカニズムを介して機能するのかを解析した。解析の結果、1)については、Pax6が実際にRPEと神経網膜の両方の形成を促すことを、一つのin vivo実験系内で観察できた。RPEと神経網膜の発生過程では、それぞれのプロセスを異なる転写因子が動かしている。本解析では、構成的活性化状態のPax6をコードする遺伝子を眼杯に導入することで、Pax6の機能が亢進した場合にRPEと神経網膜のそれぞれで特異的に発現する転写因子の両方が発現誘導されることが分かった。さらに2)について、RPEと神経網膜のそれぞれで働く転写因子の発現誘導が、Pax6タンパク質内の異なるドメインを介して活性化されることも明らかにした。これらのデータはPax6の多面的な機能メカニズムの一端を明らかにするものであり、現在論文投稿の準備中である。当初の計画にあった、各種の変異型Pax6遺伝子の作製は概ね完了しており、それを用いた遺伝子導入実験も適宜進行している。また、これまでの結果をまとめて論文として発表する予定で、そのためのデータ等も集まってきており、投稿に近い段階まで来ている。今後の推進方策に関しては、当初の研究計画からの大きな変更点はない。Pax6の多面的機能が、RPEの形成過程で担う分子メカニズムに関して、in vivoとin vitroの両面から解析を進めていく予定である。ただ、これまでの研究結果で、Pax6に関してのこれまで予想していなかった機能や、他の因子との関連性が認められてきている。これらのテーマも追加の形で進めることで、本研究の大きなテーマであるPax6の「多面的機能」をより正確に把握できるものと考えられるため、今後研究目標の一つとして組み込んでいく予定である。
水にかかわる信仰の儀礼と表現様式の総合的研究

前年度にひきつづき、研究者各自が役割分担する研究テーマについて、若干の補充調査と蓄積された二次資料の整理を行い、年度末に研究報告書そ作成した。(報告書は別便で送付する)それぞれの研究テーマと検討課題、及び報告概要は以下のとおりである。分担1.水の祭儀に関連する考古資料の調査研究については、「水と和鏡の関連が知られる二・三の遺例」として、本研究をつうじて得た新知見資料を紹介した。分担2.安曇川流域における水神信仰の伝来と展開の分析については、「安曇川流域におけるシコブチ伝承」について論じた。分担3.請雨経法を中心とした祈雨修法関連の絵画の調査研究については、「准胝観音像の新出作品について」として、考察を加えて資料紹介を行った。分担4.古代から中世にかけての文献・経典等に見られる請雨儀礼の分析については、「早魃時の融通念仏宗における宗教儀礼について-文政九年の事例を中心に-」として、近世に残るその伝統儀礼について考察した。分担5.水利に関する儀礼、祭祀組織の歴史民俗学的分析については、「水利と祭祀組織-貝塚市水間の寺座と水利関係文書-」として、考察を加えた資料紹介を行った。今後の課題として、こうした基礎研究資料の持ち寄りによる共同研究、及び基礎資料の相互活用による研究成果が望まれるが、そのことについては、今後可能な限り早急に、論文、報文として公表してゆきたいと考えている。研究者各自が役割分担する研究テーマについて、関係資料を保有する博物館・美術館・図書館・文献センター・寺院・社寺とその周辺地域及び収蔵個人宅を調査し、写真撮影を行い、調書作成を行った。それぞれの研究実績の概要及び検討課題は以下のとおりである。分担1.水の祭儀に関連する考古資料の調査研究については、鏡を用いた水の祭儀に注目して、関連すると考えられる遺跡・遺講・遺物の集成を行い、その時代を通じた伝統と表現様式の変遷を探った。分担2.安曇川流域における水袖信仰の伝来と展開の分析については、志古淵神の信仰にまつわる伝承を調査して、水の神に対する人々の観念の実態を探った。分担3.請雨経法を中心とした祈雨修法関連の絵画の調査研究については、仏教絵画における水と信仰の表現形式の諸相を収集し、その分析を行った。分担4.古代から中世にかけての文献・教典等に見られる請雨儀礼の分析については、仏教の影響を受けて展開した請雨儀礼を、教典・聖教を用いての考察研究を進めた。分担5.水利に関する儀礼、祭祀組織の歴史民俗学的分析については、水利慣行、水田への中路、引水の優先権・管理組織等を探り、その儀礼及び祭祀組織について考察した。
一般健常集団における心血管リスクとしての血小板・内皮マイクロパ-ティクル

一般健常人における血小板由来および内皮由来マイクロパーティクル(PDMPおよびEMP)の意義を、田主丸健診において、検討を試みた。既報(旧式フローサイトメトリー[FCM]測定装置を使用)のFCM法に従い、高感度の最新式BD社製FacsCantoIIで用いてPDMP・EMP定量測定を行ったが、測定値の再現性に欠けていた。そこで、種々の実験条件適正化を試み、PDMPについては比較的再現性のある定量測定が可能となった。一方、EMPは現時点のFCM法では測定限界以下であることが示唆された。従来法によるマイクロパーティクル分画が非特異的ノイズを高めていた。本研究の目的:一般健常人における血小板由来マイクロパーティクル(PDMP)および内皮由来マイクロパーティクル(EMP)の意義については、現在、知られていない。本研究では、申請者の所属する久留米大学心臓・血管内科が50年間追跡研究中である田主丸コホートにおいて、(1)末梢血PDMP数とEMP数の規定因子、特に他の心血管危険因子との関係、(2)心血管疾患サロゲートマーカー(頸動脈エコーIMTや血圧脈波検査AI)との関係、(3)3年次に予後追跡調査を行い、縦断的研究により心血管疾患発症・死亡との関係を明らかにすることである。以上、横断的研究(1)(2)および縦断的研究(3)を通じて心血管リスクとしての意義を明らかにすることを具体的目的とする。平成22年度は、田主丸住民健診のデータベース構築・基礎解析、ならびに高感度かつ高精度なEMP測定法開発を行った。1.田主丸健診:平成21年5月11月に大健診を10年間隔で定期施行した。一般住民健診に参加した約2,100名の一般健診、採血、栄養聞き取り調査、心電図、心エコー図、頸動脈エコー図、血圧脈波測定augmentation indexなどのデータを整理、入力し健診データベースを構築した。受診者が多く、入力項目が多いためこの作業に予想を上回る労力・経費が必要であった。末梢血より純度の高いマイクロパーティクル分画を得る方法を確立した。すなわち、多血小板分画(platelet-rich plasma)さらに無血小板分画(platelet-poor plasma)を遠心分離法により精製。さらに超遠心を2回行った。健診サンプルは超遠心で得られたペレットを冷凍保存した。平成23年度は下記の研究を行った。1.検診結果解析:昨年度入力終了した田主丸健診のデータベースの入力確認と検証を終了。各項目につき記述統計量等、基礎統計解析を行った。(1)高感度・高特異性PDMP・EMP定量測定法の確立前年度確立したBD社製FacsCantoIIを用いたEMP・PDMPのフローサイトメトリー法による測定法の感度、特異性、定量性を確認した。具体的には、これまで血中EMP・PDMP数の増加が報告されている急性心筋梗塞患者のサンプルの倍数希釈系列を作成し、本法の定量性、測定限界を検討した。電子顕微鏡を用いて形態学的にマイクロパーティクルを確認。しかしながら、計測値の再現性に欠き、非特異的シグナルが多いことが明らかとなった。本研究の目的は、一般健常人における血小板由来マイクロパーティクル(PDMP)および内皮由来マイクロパーティクル(EMP)の意義を明らかにすることである。具体的には、田主丸コホートにおいて、1末梢血PDMP数とEMP数の規定因子、特に他の心血管危険因子との関係、2心血管疾患サロゲートマーカー(頸動脈エコーIMTや血圧脈波検査AI)との関係、33年次に予後追跡調査を行い、縦断的研究により心血管疾患発症・死亡との関係を明らかにすることであった。健診で採血した全血サンプルを既報に基づいたプロトコール(従来法)で超遠心を行いマイクロパーティクル分画を冷凍保存した。このマイクロパーティクル分画を再浮遊しフローサイトメトリー法を用いてPDMPおよびEMPの定量測定を試みた。

前年度までに既報によりPDMPおよびEMP増加がしられている急性心筋梗塞(AMI)患者を対象に予備実験を行ったが従来法では非特異的シグナルが高いことが明らかとなっていた。そこで、AMIサンプルを用いて種々の条件適正化を試み、PDMPについては比較的再現性のある定量測定が可能となった。一方、EMPに関しては最終的にシグナル/ノイズ比の改善が得られず現時点のフローサイトメトリー法では測定限界以下である可能性が示唆された。さらに従来法によるマイクロパーティクル分画が非特異的ノイズを高めている可能性を見出した。従来法に基づいた予備実験においては一定の結果が得られたが、それは旧式フローサイトメトリー測定装置を用いた実験であり、ノイズ(特にマイクロバブルなど)を拾っていた可能性がある。フローサイトメトリー法の進歩によって測定限界下限が拡がったことで、それがノイズであった可能性が示唆された。今後、さらに分画採取法、フローサイトメトリー法の適正化を行い、既報の確認実験を行い、PDMPおよびEMPの真の意義を明らかにしたい。PDMP・EMP定量測定において、再現性に問題があり、その原因として非特異的シグナルをノイズとして多く含んでいる可能性がある。24年度が最終年度であるため、記入しない。PDMP・EMP定量測定において、非特異的シグナルノイズを出来るだけ減少する方策をとる。具体的にはフローサイトメトリー法に使用する抗体の変更、組み合わせの変更、サンプル再浮遊法の変更などをオプティマイズする。
「放課後子どもプラン」の実態と地域における児童育成プログラムの開発

平成19年度(2009年)よりスタートした「放課後子どもプラン」は、厚生労働省の管轄下にある「放課後健全育成事業(学童保育)」と文部科学省の「放課後子ども教室推進事業」との省庁協同事業としてその成果が期待されている。本研究はこのような統合事業がどのように展開されているのか、各地の実態調査を踏まえその課題を明らかにするとともに、放課後空間における子ども本来の社会性を育成するプログラムの開発をおこなった。第1年次は、全国学童保育連絡協議会(東京・本郷)への聞き取り調査、ならびに、大阪、鳥取における地域学童保育の現状踏査を実施した。また学童保育関連の先行研究を分析することにより、今次研究の研究仮説を策定した。その内容は、日本の子どもの放課後空間はここすこぶる狭小化しており、子どもの多くは、家庭内あるいは学習塾、習い事に収容されており、従来からの少年期の発達ラインと異なる課題を抱えだした。したがって多くの子どもが、いわゆる「中間世界」(地域生活)を経験しないで思春期を迎える。その結果、「新たな思春期の課題」=「関係性の喪失」現象をもたらすのではないか。【順仮説】対人不安、ひきこもり、突発的攻撃行為などが顕著にみられるが、しかしながらこのようなマイナス状況とは反対に放課後の「中間世界」の再構築の動向も見られる。【対抗仮説】その一つが学童クラブの拡大である.もう一つが昨年度スタートした「放課後子どもプラン」による全児童型保育である。これら二つの異種の空間が子どもの生活意識や生育にどのような影響を及ぼしているのか。異なる空間における指導員の「プログラム」ならびに「指導力」がどのような構造を有しているのか、2年次は明らかにしなければならない。第2年次は、全国学童保育連絡協議会(東京・本郷)・学習院大学川口研究室・九州大学八尾坂研究室への「地域学童保育の現状」に関する聞き取り調査ならびに2次仮説設定に関して協議を行った。その内容は、現代の子どもはいわゆる「中間世界」(地域生活)を経験しないで思春期を迎える。その結果、「新たな思春期の課題」=「関係性の喪失」現象をもたらす。【第2・順仮説】しかしながらこのようなマイナス状況とは反対に放課後の「中間世界」の再構築の動向も見られる。【第2・対抗仮説】この点は1年次に確認したが、本年次研究においてはさらに仮説の深化を図ることができた。しかしながら8月の政権交代以降のいわゆる仕分け作業において「放課後子どもプラン」そのものが財政的削減の対象となり、各地でプランニングの変更が迫られている。そこで2年次後半にかけては、このような年度途中での急激な政策転換が地域の学童クラブにどのような影響を及ぼすのか、その点にも注目して調査をおこなった。その結果、次年度の調査計画に変更を加えざるを得なくなった。たとえば、放課後子どもプランという理想のモデルであっても、財源の縮小により十分な実績をあげることができずその教育効果が皆無の状態に陥る地域も少なからず見られる。したがって3年度はこれらの影響の大きい問題も勘案して研究の深化を図る所存である。いずれにしてもプログラム開発のために全力を投入する。最終年度は22年度であったが東日本大震災等の影響で23年度に持ち越して研究を終了した。結果的には以下の3点の成果を得た。第一に、学童クラブに通う子どもの社会性には、遊び経験を媒介とした子どもの相互コミュニケーションの育成がコアとして機能していることを明らかにした。他方、放課後子ども支援教室においても、学習課題中心ではない遊び活動に主眼をおいて活動する教室では、学童クラブと同様の傾向がみられたものの、そうでない教室においては、社会性のコアが十分に育成されておらず、集団準拠能力、規範形成力においても十分ではない状況が観察された。第二には、放課後子どもプランにおいては放課後支援教室と学童クラブとの連携型の取組が有効であることを明らかにした。第三には、子どもの放課後における居場所概念を中間世界概念に置き換えることにより、子どもの身体的、精神的余力・対応力・企画力の育成に資するプログラムを開発できることを示した。なお中間世界とは、社会学上の通念として使用される「国家と家族との間にある組織」という概念ではなく、正解・不正解、あるいは黒白といった二分化されない半正解、グレーな世界といった世界をさして「中間世界」として操作的に概念規定している。この「中間世界」こそが今後の重要な研究領域であり、いじめ研究家の内藤朝雄がいうように「中間集団全体主義」化させるのかそれとも、子ども・大人が多様な関係性を取り結ぶコミュニティーを形成できるのかがポイントになる。本研究はこの問題の指摘にとどまったが今後の視座を提供したと考える。なお日本学童保育学会(2011年6月)に招待講演で報告をおこなった。
超顕微法によるNdFeB磁石材料の最適粒界構造の探索と制御

製法の異なる4種類のN仕Fe-B系磁石材料について最新の電子顕微鏡技術を駆使した超顕微法によるマルチスケール構造解析を行い, 1.マクロな磁区構造とナノ組織を直結する解析手法, 2. Tb改質焼結磁石におけるTbの役割, 3. PLD厚膜磁石の添加元素と保磁力, 4HDDR磁石粉末の粒界構造と保磁力, 5.水素劣化磁石の微細構造と保磁力,の5つの課題に取り組んだ.特筆すべき成果は, N仕Fe-B系磁石材料ではNd2Fe14B結晶粒を覆う極薄アモルファス粒界相が存在し,これが保磁力発現に寄与することを見出したことである.製法の異なる4種類のN仕Fe-B系磁石材料について最新の電子顕微鏡技術を駆使した超顕微法によるマルチスケール構造解析を行い, 1.マクロな磁区構造とナノ組織を直結する解析手法, 2. Tb改質焼結磁石におけるTbの役割, 3. PLD厚膜磁石の添加元素と保磁力, 4HDDR磁石粉末の粒界構造と保磁力, 5.水素劣化磁石の微細構造と保磁力,の5つの課題に取り組んだ.特筆すべき成果は, N仕Fe-B系磁石材料ではNd2Fe14B結晶粒を覆う極薄アモルファス粒界相が存在し,これが保磁力発現に寄与することを見出したことである.まず、Tb改質処理により高保磁力化させたNd-Fe-B系焼結磁石について、カー効果偏光顕微鏡(MOKE)観察を行って優れた保磁力を有する単磁区粒子を選定し、その粒界部を集束イオンビーム(FIB)マイクロサンプリング法で切り出して透過電子顕微鏡(TEM)観察を行った。Nd_2Fe_<14>B主相同士ならびにNdO粒界相との粒界にNd-Cu-Tb極薄界面層の存在が確認でき、マクロな磁区構造とナノレベルの微細構造を直接結びつけた解析手法を確立した。続いて、保磁力に及ぼす重希土類元素の影響を調べるために、Dyを全く含まない試料を用意してTEM解析を行った。Nd_2Fe_<14>B主相の三重点にCaF_2構造のNdO_2相、NaCl構造のNdO相およびhcp構造のNd_2O_3相の生成が観察され、さらにNd-Cu極薄界面層が形成されていることが確認できた。この結果は、Tb改質処理を施すことで、Nd_2Fe_<14>B主相結晶粒の表面近傍のみへの選択的なTb粒界拡散が生じ、それに伴って保磁力が大きく向上することを示唆している。GaあるいはNb元素の添加により高保磁力化させたパルスレーザー蒸着(PLD)成膜Nd-Fe-B系厚膜磁石についてもTEM解析を行った。Nb添加試料では、Nd_2Fe<14>B主相結晶粒が大幅に微細化(40nm程度)され、粒度分布も狭く均一粒になることがわかった。Nbは粒界に偏在し、これがNd_2Fe_<14>B粒の粗大化を抑制して保磁力を向上させたものと推察できる。Ga添加の場合には、各々のNd_2Fe_<14>B結晶粒の周囲に幅3nm程の薄いNd-Ga粒界層が形成されていることを見出した。この薄いNd-Ga粒界層が主相粒周囲を滑らかに覆うことで粒界パッシベーションが改善されて高保磁力化したものと結論できる。前年度に引き続き、カー効果偏光顕微鏡(MOKE)や走査電子顕微鏡(SEM)と透過電子顕微鏡(TEM)を組み合わせた超顕微法によるナノ組織解析を行った。本年度は特に、水素処理により保磁力を失ったNd-Fe-B系焼結磁石、ならびにパルスレーザー蒸着(PLD)法により作製したNd-Fe-B系積層型ナノコンポジット磁石について解析を行った。Nd-Fe-B系焼結磁石をCaH_2粉末の還元熱処理により300°Cで水素化させた試料では、Nd_2Fe_<14>B主相周囲に存在していた極薄のNd-Cu界面相に亀裂が入り、主相表面から一部剥離することで保磁力が悪化することがわかった。同様の方法により700°Cで水素化させた試料では、Nd_2Fe_<14>B主相粒界に楕円状Nd水素化物相の生成が認められ、これに伴って主相周囲に存在する粒界相がCuを主体するものに変化していた。以上の結果は、保磁力の発現には主相粒表面を滑らかに覆う粒界パッシベーションが重要であるが、Cu主体の粒界相で覆っただけでは不十分であり、界面相にNdを含む必要があることを示唆している。軟磁性相にFe_3Bあるいは純Feを用いたNd-Fe-B系積層型ナノコンポジットPLD厚膜磁石についても解析を行った。Fe_3Bを用いた厚膜では、Nd_2Fe_<14>B強磁性層と軟磁性層が約50nmと18nm幅で交互に積層した厚膜が得られたが、Fe_3Bがα-FeとFeBに相分解して連続的に連なった層を形成していた。一方、α-Feを用いた厚膜では、Nd_2Fe_<14>B強磁性層とα-Fe軟磁性層が約30nmと17nm幅で積層しており、わずかにNdO粒の生成も認められた。

ただし、α-Feは長さ100nm程の異方的な形状を有しており、これが不連続に途切れて強磁性層が層間を超えて繋がってしまうことが明らかとなった。Nd-Fe-B系磁石材料において更なる高保磁力化を実現する極微粒界構造制御の指針を得るために、主に走査電子顕微鏡と透過電子顕微鏡を組み合わせた超顕微法によるナノ組織解析を行った。本年度は特に、水素処理により保磁力を失ったNd-Fe-B系熱間加工磁石、ならびに種々の処理条件で作製したNd-Fe-B系HDDR磁石について解析を行った。市販のNd-Fe-B系熱間加工磁石をCaH_2粉末の還元処理により1073Kで水素化させた試料では、Nd_2Fe_<14>B主相周囲に存在していた極薄粒界相中のNdが水素化され、主相粒界部に微細なNdH_2粒が生成することで保磁力をほぼ失うことが判明した。この試料に1123Kで脱水素処理を施すと保磁力は9割程度まで回復するが、これに伴いNdH_2粒が消失し、再び主相周囲に極薄粒界相が生成してくることが明らかとなった。これらの結果は、保磁力発現には主相周囲にNdに富んだ極薄粒界相を生成させることが重要であり、これが磁化反転を効果的に抑制することを示唆している。NdFeB系HDDR磁石では微量のAlを添加することで、粒界三重点に存在するNd-rich粒界相は減少するが、Nd_2Fe_<14>B主相粒周囲の極薄粒界相はより均一な幅て・各粒を覆うようになり、これに伴って保磁力を1割程度向上できることか・わかった。さらに、Alに加えてNd組成を増加させると、粒界三重点のNd-rich粒界相が大幅に増加して、さらに保磁力を1割程度向上できることか・判明した。以上のように、主相周囲にNdに富んた・粒界相を均一に形成させて隣接する主相間の磁気的分断を高めることで、希少な重希土類元素を用いることなく更に高保磁力化できる可能性が示された。
看護ネットワークの構築による訪問看護ステーションの経営基盤強化に関する研究

本研究は、訪問看護ステーションの脆弱な経営基盤を、様々なネットワークの構築によって強化する方法を研究した。そして、訪問看護ステーションは、利用者の紹介元となる病院や診療所との緊密なネットワークの構築、利用者同士の口コミによるネットワークの活用、さらに訪問看護ステーション同士でネットワークを形成し資源を共有化することによって、利用者を増やし経営基盤を強化できるということを明らかにした。本年度は、訪問看護ステーション(以下、VNSと略)の経営および看護の実態、および連携の実態を明らかにするため、都市部(医療法人立2か所、その他法人立2か所)および山間部・島嶼部など地方(医療法人立1か所、その他法人立6か所)にあるVNSでのインタビュー調査を中心に研究を行った。また、これと並行してVNSの経営実態に関する文献の収集および分析を行った。インタビュー調査の結果、都市部と山間部・島嶼部とでは、VNSの連携に違いが見られることが明らかになった。都市部は、他の機関との連携が容易で設置する法人による明確な違いは見られなかったのに対して、山間部では、移動手段に制限が多いため、他の医療機関と連携するのは非常に厳しく、特に医療法人立ではない場合は、このことが顕著であった。島嶼部の場合、山間部よりはVNS間での連携や、VNSと他の医療機関との連携が行われおり、中には営利企業とも積極的に連携を図っているVNSが存在していた。このように、本研究ではVNS間のネットワークや他の医療機関等との連携の実態を明らかにし、今後の調査・研究の基礎を築くことができて、大変有意義であったと言える。また、収集した文献や資料を詳細に分析した結果、VNSは制度や環境、技術の点からみると機械的構造を採用すべきであるが、多くのVNSは小規模であるため有機的構造となっていた。この矛盾はVNSの経営実態に大きな影響を与えており、VNS間のネットワークの形成や他の医療機関との連携により、早急に解決する必要があることが明らかになった。このように、VNS間のネットワークの形成や連携の重要性が理論的に明らかにできたという点で、本研究は大変有意義であると言える。本年度は、第一に訪問看護ステーション(以下、VNSと略)の組織および財務の実態、および連携の実態を明らかにするため、これまでに収集したインタビュー調査の内容や既存の文献を分析・検討した。その結果、訪問看護師は、物理的な環境がそれぞれ異なる療養者の居宅を訪問して看護活動を行うため、VNSは有機的構造を採用する必要があることが明らかになった。また、VNSを運営している医療法人の協力によって得られた財務諸表を詳細に分析した結果、同一法人が運営するVNSの場合、地域間の地理的格差や経済的格差よりも、VNSの運営努力の方が収益などに大きな影響を及ぼしていることが明らかになった。加えて、VNSと同一地域内にある病院の規模が、VNSの収益に影響を与えることも明らかになった。これら二つの研究成果は、訪問看護ステーションをネットワーク化し経営基盤を強化する際に、個々のVNSは有機的構造を採用しているため、ネットワーク化する際に所長だけでなく各看護師も含めた形でネットワーク化しなければならないことを明らかにし、さらに、連携する際に病院との連携が重要であることを明らかにしたことから、大変有意義であったと言える。さらに、他国における訪問医療の実態と比較し分析するために、訪問医療を行っている中国天津市の大学付属病院の協力を得て、数名にインタビュー調査を行った。調査の結果、中国では各診療所が通常の診察だけではなく、疾病の予防のためにも訪問医療を行っているということが明らかになった。このような内容は、日本におけるVNSの事業領域を拡大して経営基盤を強化する上で大いに参考になり、大変有意義であったと言える。本年度は、訪問看護ステーション(以下VNS)の経営基盤を強化するためにどのような経営戦略をとれば良いか、特に、他の医療機関などとの連携によるネットワーク化を中心に明らかにするため、前年度までに行ったインタビュー調査や理論的考察を基にアンケート調査を行った。本アンケート調査は、平成23年9月1日から17日にかけて、全国訪問看護事業協会に所属する3,344箇所のVNSにFAXで質問票を送付し、このうち、1,015箇所から回答を得た。回答を集計・分析した結果、以下の点が明らかになった。第一に、VNSは他のVNSとの連携を重視している、という点である。主な連携先として30.0%が「他のVNS」と回答しており、次いで「同一法人の病院」が26.3%であった(複数回答可、以下同様)。また連携内容について尋ねたところ、「利用者に関する情報の共有」が最多で44.4%を占めており、次いで「講習会・勉強会の共催」が31.6%となっていた。これらの結果は、VNSが他のVNSと競争せずに、地域内で協調・連携しながら成長することを目指していることを明確に示している。第二に、訪問看護ステーションは連携の強化を目指す一方で、連携する際に連携先との連絡・調整で問題が発生しやすい、という点である。

回答したVNSの81%が、今後他の機関との連携を強化すべきであるとしていた。一方で、連携する際の課題として最も多かったのは「連携先との連絡・調整が困難」であり、69.4%があげていた。これまでの研究では、本研究のように訪問看護ステーションの連携戦略の重要性や、さらに踏み込んでネットワークを構築する際に連携先との連絡・調整に工夫が必要であることを実証的に明らかにした例はない。そのため本研究の研究結果は、VNSが看護ネットワークを構築し、経営基盤を強化する上で大変有意義である。
米国における障害児の養子縁組の制度化に関する理論的研究

本研究は、「障害児の養子縁組」を現在の日本の養子縁組の制度的、規範的な限界点の一つと仮定し、これを克服する議論の基盤を構築するため、米国を事例に障害児の養子縁組に関わる制度化とその理論を考察することを目的とする。米国では、人工妊娠中絶を合憲と認めた1973年のロウ判決以降、出生前診断後の中絶を法律で禁止するのは女性の身体と人生に関する自律性と選択の自由の原則に反すると考えられ、出生前診断が普及していった。このため、米国の障害者施策はその積極性にもかかわらず、「生まれた者」に限定的したものであると指摘されてきた。しかし、米国のフェミニストの言説では、女性の選択の権利の中に障害のある子を産む選択も入れなければならないという自律性の枠組みが提示されている。個々の女性の選択ではなく、その選択を構築する社会システムによるコントロールに注目する必要が説かれ、女性自身の自律性と自由の原則のもとで、障害児を産む選択を可能にするような社会システムや政策の実施が求められている。1970年代以降、米国の養子制度をめぐる規範では、障害のある子どもを「特別なニーズをもつ子ども」として受容し、彼らと「選択的」に家族形成をすることが許容・奨励されてきた。障害や疾病をもった出生児の家族形成を生親に限定せず、親が養育できない「特別なニーズをもつ子ども」を社会的に受け入れる制度を整備することは、出生前診断の普及と障害者施策の拡充をめぐる単純なダブルスタンダードにとどまらない規範形成の可能性があると考えられる。本研究は「障害児の養子縁組」を現在の日本の養子縁組の制度的、規範的な限界点の一つと仮定し、これを克服する議論の基盤を構築するため、養子縁組の先進国である米国を事例に、障害児の養子縁組に関わる制度化とその理論を考察することを目的とする。米国の児童福祉法体制における特別なニーズをもつ子どもの養子縁組の制度の変遷と課題を検討し、障害児の養子縁組に関する社会的合意と政策的意図の理論的な立脚点を明らかにした上で、ソーシャルワークの課題、理論的矛盾を批判的に考察する。2016年7月8月に、ワシントンD.C.にある米国議会図書館等で文献調査を実施した。米国の連邦・州レベルの児童福祉法体制における特別なニーズをもつ子ども(children with special needs)の養子縁組の位置づけを精査するため、生親・養親・養子縁組仲介者の具体的な手続き、障害児を養子縁組した家庭を対象とする公的扶助制度(Adoption Assistance and Child Welfare Law of 1980)の詳細と発達に関わる文献を収集、調査した。米国の連邦・州レベルの児童福祉法体制のなかで、特別なニーズをもつ子ども(children with special needs)の養子縁組がどのように位置づけられているのか、法文・各種ガイドラインを精査し、生親・養親・養子縁組仲介者の具体的な手続き、障害児を養子縁組した家庭を対象とする公的扶助制度(Adoption Assistance and Child Welfare Law of 1980)の詳細と発達に関わる文献を収集、調査した。成果発表に向けて、2017年度に行う調査で収集する文献とあわせて検討、考察する準備をすすめている。「障害児の養子縁組」を現在の日本の養子縁組の制度的、規範的な限界点の一つと仮定し、これを克服する議論の基盤を構築するため、米国を事例に障害児の養子縁組に関わる制度化とその理論を考察することを目的とする。米国の児童福祉法体制における特別なニーズをもつ子どもの養子縁組の制度の変遷と課題を検討し、障害児の養子縁組に関する社会的合意と政策的意図の理論的な立脚点を明らかにした上で、ソーシャルワークの実践と課題を批判的に考察する。これらの作業を通して、新生児・乳児の養子縁組、障害児の養子縁組、障害者の生殖・家族形成に関する諸議論に通底する構造的な問題を示し、日本の子ども・生殖・家族をめぐる福祉政策について障害児の養育に関する規範的考察を行なう。28年度に実施したワシントンD.C.の米国議会図書館等における調査で収集した生親・養親・養子縁組仲介者の具体的な手続き、障害児を養子縁組した家庭を対象とする公的扶助制度(Adoption Assistance and Child Welfare Law of 1980)の詳細と発達に関わる文献を検討した。本務校の業務多忙により29年度中に補完的調査を行うことができず、十分な考察と成果発表に至らなかったため、研究期間の延長を行った。成果発表に向けて、30年度に行う調査で収集する文献とあわせて検討、考察する準備をすすめている。

個々の女性の選択ではなく、その選択を構築する社会システムによるコントロールに注目する必要が説かれ、女性自身の自律性と自由の原則のもとで、障害児を産む選択を可能にするような社会システムや政策の実施が求められている。1970年代以降、米国の養子制度をめぐる規範では、障害のある子どもを「特別なニーズをもつ子ども」として受容し、彼らと「選択的」に家族形成をすることが許容・奨励されてきた。障害や疾病をもった出生児の家族形成を生親に限定せず、親が養育できない「特別なニーズをもつ子ども」を社会的に受け入れる制度を整備することは、出生前診断の普及と障害者施策の拡充をめぐる単純なダブルスタンダードにとどまらない規範形成の可能性があると考えられる。今後は、養子となった子どもの障害の有無をめぐる訴訟を調査し、障害児養子縁組の制度化の変遷と課題を考察する。これらの作業を通して、日本の新生児・乳児の養子縁組、障害児の養子縁組、障害者の生殖・家族形成に関する諸議論に通底する構造的な問題を明らかにし、日本の子ども・生殖・家族に関わる諸福祉政策において、障害児の養育をめぐる規範的考察を行なう。本務校の業務多忙により29年度中に補完的調査を行うことができず、十分な考察と成果発表に至らなかったため、次年度使用額は補完的調査に充てる。
脳血流の自己調節機構(AR)を非侵襲的に評価できる数理モデルの開発

昨年度に引き続き臨床検討においては、成人重症脳障害患者5人(B群:頭部外傷2、クモ膜下出血1、蘇生後脳症2)および非脳障害患者6人(NB群:呼吸不全2、心不全4)を対象とした。人工呼吸中の非動化された状態において、橈骨動脈の直接圧波形および経頭蓋超音波ドプラ法を用いた(障害側)中大脳動脈血流速度波形の連続モニタリングを定常状態で10分間行った。それぞれの波形はデジタル変換してPCに取込み解析した。1動的脳血流自己調節におけるAaslidらの理論では、外的に急激な血圧変動に対する脳血流速度の変動から計算されたdCVRおよびdRORは脳血流自己調節の指標となる。本検討では、1心拍毎の脳血管抵抗の変動率dCVRおよびdCVRをその脈圧で除した値dRORを計算した。dCVRは10.5±15.3(B群)、24.3±30.5(NB群)、dRORは5.3±4.2(B群)、23.6±33.6(NB群)であった(平均±標準偏差)。これより脳障害群では、血圧変動に対する脳血管抵抗の変化量が少ない傾向が解った。外的に血圧を変動させなくても1心拍毎のdCVRおよびdCVRを計算することにより脳血流の自己調節能の障害度の差を検出できる可能性はある。しかし、今回の検討では、症例による値のばらつきは大きく、これは臨床病態および重症度に相違があるためと考えられ、今後の検討を必要とする。2時間進み系の伝達関数モデルを当てはめた解析では、パラメータ解析の結果、脳障害群では血圧の変動に対する中大脳動脈血流速度の変動の反応性が低下している、つまり「もどり」が遅いことが判明した。これは脳障害群では急激な血圧変動に脳血管抵抗の変化がついてゆけないことによると考えられ、1の結果と一致する。臨床検討を行った。倫理委負会の承認の下、橈骨動脈の直接圧波形と経頭蓋超音波ドプラ法を用いた(障害側)中大脳動脈血流速度波形の連続モニタリングを人工呼吸中の成人集中治療患者に行い、それぞれの波形をデジタル変換してPCに取込み解析して、脳血流の自己調飾能の評価を行った。1周波数解析重症脳障害患者(頭部外傷、蘇生後脳症、脳血管障害、代謝性脳症)と非脳障害患者において、血圧波形と血流速度波形の周波数分析を連続して行った。また、これを従来の外的血圧変動時の中大脳動脈血流速度変動値から計算した自己調節能の障害度と比較し、自己調節能の障害度と患者予後との関係を検討した。非侵襲的方法においても臨床的重症度に差がある場合、脳血流の自己調節能の障害度の差を検出できることが解った。2持続脳血管抵抗脳障害患者7人(B群:脳梗塞2、クモ膜下出血3、脳出血2)と非脳障害患者8人(NB群:呼吸不全3、手術後5)で検討した。非動化された状態で、定常状態で10分間測定し、1心拍毎の脳血管抵抗の変動率dCVRおよびdCVRをその脈圧で除した値dRORを測定した。dCVRは9.0-18.0 (B群)、17.0-40.0 (MB群)、dRORは4.5-7.0 (B群)、5.0-40.0 (MB群)であった。動的脳血流自己調節におけるAaslidらの理論では、外的に急激な血圧・変動に対する脳血流速度の変動から計算されたdCVRおよびdRORが脳血流自己調節の指標となる。われわれは、外的に血圧を変動させなくても1心拍毎のdCVRおよびdCVRを計算することで脳血流自己調節の指標を計算できる可能性を示した。救急集中治療患者で使用可能な脳血管抵抗モニタを開発し、その有用性を報告した。

しかし、今回の検討では、症例による値のばらつきは大きく、これは臨床病態および重症度に相違があるためと考えられ、今後の検討を必要とする。2時間進み系の伝達関数モデルを当てはめた解析では、パラメータ解析の結果、脳障害群では血圧の変動に対する中大脳動脈血流速度の変動の反応性が低下している、つまり「もどり」が遅いことが判明した。これは脳障害群では急激な血圧変動に脳血管抵抗の変化がついてゆけないことによると考えられ、1の結果と一致する。
極限貧栄養環境下で増殖する細胞の創出

実験室内進化により、環境中の微少資源成分に対し、最大利用効率を示す細胞を創出した。複数系列の実験室内進化の結果、祖先型大腸菌は培地中の栄養源が高濃度でないと、細胞増殖が観測されないのに対して、進化型大腸菌はnMオーダー以下の低濃度栄養源条件下でも増えるようになった。ゲノム変異解析の結果、膜輸送に関連する制御因子やタンパク質合成に関わる遺伝子に変異が見られた。これらの変異による栄養源の取り込み効率と使用効率が変化したと示唆された。以上により、増殖能を落として、外部資源の効率的利用を実現する戦略が自然界の極限環境微生物の生態を示唆する発見である。細胞は環境資源を利用して生きるが、その資源濃度が極限まで下がると、資源利用ができなくなり、生存不可となる。それは、細胞が増殖速度と資源利用のバランス(反比例関係)を取っているためだと言われている。増殖と資源利用のトレードオフのバランス点をずらせば、少ない資源成分に対し、効率的利用能力をもつ細胞の誕生が可能である。ここで、資源濃度が極めて低くても、その資源の利用ができ、増殖する細胞の創出を目的とする。平成26年度は、栄養素アミノ酸を資源として、野生型大腸菌を用いて、枯渇ー蘇生のサイクルを繰り返すことにより、進化実験の再現を行った。その結果、集団レベルの植え継ぎでもアミノ酸利用効率のよい大腸菌細胞が得られたが、系列ごとに程度の違いが観察された。また、ゲノム配列解析から、ゲノム変異の蓄積が飢餓ストレスによって、顕著になる傾向が観察された。これからは、複数系列の進化結果と途中経過株をゲノム配列解析し、観察された進化結果の一般性を評価する。また、進化前後の細部の集団動態ダイナミクスを評価した。最大増殖速度と最大集団数の相関関係を提携数理学的に評価した。ほかの系列を同様評価することにより、得られた相関関係が普遍的かどうかが分かる。最後に、一細胞の進化実験の条件検討を行い、96穴プレートでの植え継ぎがうまくいくことが確認された。上記、集団進化のゲノム変異解析結果が出てから、一細胞レベルの進化実験をどこまで行うのかを決める。本研究は、実験進化により、富栄養条件下のみ増える既知細胞から極少栄養環境下でも増殖する細胞の創出を試みる。速い増殖から資源の効率的利用への機能変化のプロセス(適応進化)を解析することにより、僅かな栄養資源を巧みに使う極限環境微生物の生存機構の解明を目的とした。、そこで、我々は厳しい自然界で生きる微生物の生存戦略を注目し、実験室内で、栄養源の枯渇と緩和を繰り返す自然環境を疑似し、大腸菌に対する自然選択を行った。これまでの結果として、大腸菌細胞が飢餓に強い耐性の獲得と引き換えに、富栄養下での適応度が下がることが明らかとなった。そして、その増殖速度の低下が翻訳マシンナリーであるリボソームの失活に相関することも分かった。必須なリボソームタンパク質が失われることにより、環境中の僅かな栄養成分の効率的利用が実現されたのではと考えられ、環境微生物の省エネ的な生き残り戦略がうかがえる。ここまでの成果に関しては学会や論文で公表した。次に、複数系列の進化実験をすべて調べた結果、系列ごとに適応の仕組みが異なっているようであった。そのため、進化実験に獲得されたすべての大腸菌集団に対して、ゲノムリシーケンスを行うことにした。これは、当初の計画外の内容であるため、外部協力を得て、実施することができた。現在、遅い増殖を示す進化型の大腸菌がどのようなゲノム進化を経て、極小栄養環境下でも生存できるようになったのかを解明している。最終的に、極貧環境下での微生物の生存戦略およびその普遍性を明らかにする。実験進化の結果、大腸菌は、増殖能を落として、栄養成分の効率的利用を実現し、極めて低い濃度の栄養下でも生存できようになった。この現象を進化生態学的、分子生物学的に解明するため、ゲノム配列を解読することにした。当初の計画に含まれていない内容であるため、H27年度ゲノム支援プログラムに申請した。課題が採択され、全進化過程に対するゲノム変異解析が可能となった。そこで、九州大学の林哲也教授と大阪大学の松田秀雄教授の研究グループらの協力により、現在ゲノムリシーケンス及びゲノム変異解析が進められた。以上、当初の研究成果を公表したうえで、計画以上にゲノム解列解析が可能となったため、計画以上の成果が期待できる。今年度は実験進化で得られた大腸菌に対して、生化学的な解析を行い、枯渇栄養環境下での生存機構を検討した。具体的には、極少資源下での生きる進化型の複数菌株に対して、細胞内ATP濃度の測定、遺伝子発現の定量化、タンパク質合成の評価、特定の代謝産物の計測など多方面での生化学的解析を行い、極少資源下で生きる細胞内状態を同定した。祖先型と比較することにより、極限環境下に生息する微生物の特徴を抽出し、関連する分子機構の解明に繋ぐ。

1.貧栄養環境下での死滅曲線をCFU基準で作製し、進化前後の死滅速度に違いがあるのかを調べた。その結果、意外にも死滅速度に違いが見られなかった。2. LC-MSMSを用いて、進化前後の菌株の細胞内アミノ酸の濃度に違いがあるのかを評価した。その結果、高い菌体密度の時に、一細胞あたりのアミノ酸量が進化型菌株のほうが高いことが観察された。つまり、栄養枯渇状態では、進化型菌株が細胞内アミノ酸をより効率よく保持することができた。3.フローサイトメトリーを用いて、細胞内タンパク質量を見積った。すべての菌株はゲノム上に恒常的に発現するリポーターたんぱく質GFPをコードする発現カセットを導入しており、緑色蛍光強度により、細胞なタンパク質濃度を見積ることができる。同じサイズの細胞同士を比較したところ、進化後の菌株により高いタンパク質濃度が検出された。さらに、粒度分布系を用いて高精度に細胞の大きさを測定したところ、進化後の菌株が細胞サイズを縮小しているのを発見した。以上を踏まえて、進化後の菌株が細胞タンパク質合成に変化をさせたことが示唆された。以上の結果から、昨年度で得られたゲノム変異解析結果と足し合わせると、非常に説明しやすい仮説を立てることができた。今後、RNAseqによる発現解析の結果を追加し、投稿論文を準備していく。当初の予定になかったゲノム配列解析まで行った。初期的な解析だったのが、極限環境の疑似進化によって、必須遺伝子の欠失が認められた。今後、大きな展開が予想される。進化前後の性質(ゲノム配列、遺伝子発現、適応度など)を解析し、適応進化に関わる既存理論の検証または新規メカニズムの提案を目指す。具体的には、この進化実験で獲得されたすべての大腸菌集団に対して、ゲノムリシーケンスを行い、スローライフを営むようになった大腸菌がどのような遺伝子型によって決められているのか、極小栄養環境下で生存戦略の普遍性を明らかにする。以上により、生命の持続性や環境微生物生態の理解に有益なヒントを与える。また、表現型の変化(つまり、遅い増殖)がゲノム変異による分子機構(つまり、翻訳機構)の最適化原理を調べ、分子生物学的にも関連付けることを目標とする。ゲノム微生物平成26年度に得られた進化結果の一般性を評価する。1)初期的なゲノム配列解析により、必須遺伝子の欠失が認められたため、生化学的手法で、生体分子の変化と適応度(飢餓耐性)との関連性を明らかにする。2)複数系列の進化集団に対し、ゲノム配列解析と集団動態解析を行い、これまでに得られた進化結果の普遍性を評価する。3)以上の結果から、検証実験を検討する。
発がん性化学物質が選択的スプライシングに及ぼす影響の評価

本研究は、発がん物質として知られる様々な化学物質の曝露がスプライシング反応に及ぼす影響を調べるとともに、それによって産生される選択的スプライシング変異体を検出・解析し、スプライシング変異体の生成と発がんとの関連性を評価するものである。本年度には以下の実験を行った。1.ミニ遺伝子を用いたin vitroスプライシング反応系で、発がん性有害重金属の投与がスプライシング効率に及ぼす影響を調査した。10μM Cdの投与は亜鉛キレート剤の投与で停止した第2段階スプライシング反応を約72%回復させ、50μM以上の濃度では再び阻害した。10μMHgでは約4%回復されたが、Co,Cu,Mg,Mnによる回復は見られなかった。このようなCd特有の作用は、スプライシングの恒常性を混乱させ、選択的スプライシング変異体を生成するなど、スプライシング撹乱作用をもたらす可能性を示唆する。2.Cd投与HeLa細胞におけるスプライシング関連因子Slu7、SF3a60、SF3a66、SF1、ZNF269のmRNA発現量の変化を調べた。このうち、SF1とZNF269 mRNAは10μMCd投与により経時的に増加した。ZNF269は選択的スプライシングと関連していることが報告されており、Cdによる発現量の増加はスプライシング変異体の生成を誘導する可能性があると考えられる。3.さらに、differential display法を用いて、Cd投与により発現量が変化する数種のホメオボックス遺伝子を検出した。10μMCdによりHOXA7,HOXA9遺伝子の発現が減少し、HOXB8の発現は増加した。これらホメオボックス遺伝子の発現変動は発がんとの関連性が報告されており、Cdの発がん作用に関わる可能性を示唆した。研究者らは発がん性化学物質が選択的スプライシングに及ぼす影響を評価するための研究を行った。本研究は、(1)発がん物質として知られる様々な化学物質の曝露により産生される選択的スプライシング変異体を検出・解析するとともに、(2)スプライシング変異体の生成機転を調査し、発がん機転への関連性を評価するものである。(1)改良されたdifferential display法であるSAFM法を用いて、発がん物質の暴露により発現量が増加する選択的スプライシング変異体を検出する実験を行った。すでに、カドミウム暴露により著しく発現が増加する数十種類の遺伝子をクローニングし、シーケンス解析を行った。(2)ミニ遺伝子を用いたin vitroスプライシング反応系で、発がんの関連が示唆されている有害重金属(カドミウム、コバルトなど)の暴露がスプライシング効率に及ぼす影響を調査した。in vitroスプライシング反応系において、亜鉛存在下では比較的安定したスプライシング効率が見られ、重金属の影響は少なかった。一方、亜鉛特異的キレート剤を投与し、第2段階スプライシング反応が停止した状態では、カドミウムあるいは水銀の暴露がスプライシング反応を回復させる結果が得られ、その回復効率は10μMカドミウムで約70%、10μM水銀で約4%であった。このようなスプライシングに対する作用は、スプライシングの恒常性を混乱させ、選択的スプライシング変異体を生成するなど、スプライシング撹乱作用をもたらす可能性を示していると考えられた。

1.ミニ遺伝子を用いたin vitroスプライシング反応系で、発がん性有害重金属の投与がスプライシング効率に及ぼす影響を調査した。10μM Cdの投与は亜鉛キレート剤の投与で停止した第2段階スプライシング反応を約72%回復させ、50μM以上の濃度では再び阻害した。10μMHgでは約4%回復されたが、Co, Cu, Mg, Mnによる回復は見られなかった。このようなCd特有の作用は、スプライシングの恒常性を混乱させ、選択的スプライシング変異体を生成するなど、スプライシング撹乱作用をもたらす可能性を示唆する。2.Cd投与HeLa細胞におけるスプライシング関連因子Slu7、SF3a60、SF3a66、SF1、ZNF269のmRNA発現量の変化を調べた。このうち、ZNF269 mRNAは10μM Cd投与により経時的に増加した。ZNF269は選択的スプライシングと関連していることが報告されており、Cdによる発現量の増加はスプライシング変異体の生成を誘導する可能性があると考えられる。3.さらに、differential display法を用いて、Cd投与により発現量が変化する数種のホメオボックス遺伝子を検出した。10μM CdによりHOXA7,HOXA9,HOXB6,HOXC8,HOXC4,HOXC9,HOXC10遺伝子の発現が減少し、HOXB8の発現は増加した。これらホメオボックス遺伝子の発現変動は発がんとの関連性が報告されており、Cdの発がん作用に関わる可能性を示唆した。