hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
赤外線レーザ光弾性法による半導体用単結晶の光弾性物性の測定

赤外線光弾性実験法に光弾性変調器による高周波変調法を適用した装置を製作し,これを用いてSiおよびGaAsおよびエポキシ樹脂の光弾性特性を評価した.SiおよびGaAsの光弾性定数はいずれも結晶面および結晶方位に依存して変化することが実験結果より明らかになった.光弾性定数Cは主応力差と複屈折位相差の比例定数である.主ひずみ差と複屈折位相差の比例定数を仮にDとおけばDはSiおよびGaAsの結晶面および結晶方位にほぼ依存しないことが応力-ひずみ解析により確認された.また,応力-ひずみ解析により得られた主ひずみ方向は実験で得られた複屈折の主軸方向に一致した.このことから,複屈折の主軸方向は主応力の方向ではなく主ひずみの方向に一致することが確認された.主ひずみ差と複屈折位相差の比例定数がSiおよびGaAs以外の材料においても一定であることを確認するため,ガラス転移領域未満の様々な温度に保ったエポキシ樹脂のCおよびDをレーザ光弾性装置にて評価した.エポキシ樹脂は温度が上がれば軟化するためヤング率が減少する.このときCは増加したがDはほぼ一定であった.主応力差と複屈折位相差の比例定数である光弾性定数Cは,等方性材料では一定値をとるが異方性材料では力学的特性の変化に応じて変化する.しかし主ひずみ差と複屈折位相差の比例定数Dは,材料の力学的特性の変化にほぼ依存せず,同一材料であればほぼ一定値をとることが実験結果より明らかになった.また,複屈折の主軸方向は主応力ではなく主ひずみの方向に一致することが確認された.赤外線光弾性実験法に光弾性変調器による高周波変調法を適用した装置を製作し,これを用いてSiおよびGaAsおよびエポキシ樹脂の光弾性特性を評価した.SiおよびGaAsの光弾性定数はいずれも結晶面および結晶方位に依存して変化することが実験結果より明らかになった.光弾性定数Cは主応力差と複屈折位相差の比例定数である.主ひずみ差と複屈折位相差の比例定数を仮にDとおけばDはSiおよびGaAsの結晶面および結晶方位にほぼ依存しないことが応力-ひずみ解析により確認された.また,応力-ひずみ解析により得られた主ひずみ方向は実験で得られた複屈折の主軸方向に一致した.このことから,複屈折の主軸方向は主応力の方向ではなく主ひずみの方向に一致することが確認された.主ひずみ差と複屈折位相差の比例定数がSiおよびGaAs以外の材料においても一定であることを確認するため,ガラス転移領域未満の様々な温度に保ったエポキシ樹脂のCおよびDをレーザ光弾性装置にて評価した.エポキシ樹脂は温度が上がれば軟化するためヤング率が減少する.このときCは増加したがDはほぼ一定であった.主応力差と複屈折位相差の比例定数である光弾性定数Cは,等方性材料では一定値をとるが異方性材料では力学的特性の変化に応じて変化する.しかし主ひずみ差と複屈折位相差の比例定数Dは,材料の力学的特性の変化にほぼ依存せず,同一材料であればほぼ一定値をとることが実験結果より明らかになった.また,複屈折の主軸方向は主応力ではなく主ひずみの方向に一致することが確認された.
結晶成長における自発的対称性の破れ

結晶には右手型と左手型の二種類の鏡像対称な形を持つものがある。溶液からこのような結晶を成長させると普通は左右同量できるけれど、磨り潰しながら結晶成長すると、一方の鏡像体結晶だけが生き残るという実験がある。本研究はこの現象を理論的に研究し、右左の鏡像体結晶粒が接近して成長表面を覆い、互いの成長を阻害することによって起きることを解明した。これは、有機分子の右手型と左手型を分離することにも役立ち、生命の右左非対称性の起源の理解に繋がるかもしれない。熱平衡にある系の対称性の破れは自由エネルギー最小の原理から理解できる。しかし、平衡にない系での対称性の自発的破れの理解は進んでいない。結晶成長という非平衡系を具体的舞台として、対称性の破れを調べる。具体的には(1)結晶成長におけるキラル対称性の破れ、(2)ヘテロエピタキシャル系の形態形成とダイナミクスを研究する。ヘテロ基板への蒸着に見られるさまざまの現象を解明した。まず、半導体基板上に有機薄膜を蒸着する実験で二次元島の形態に異方性が認められていたが、それを、棒状の有機分子が表面で垂直に近い配向をとるという特性のために、基板上にステップがあると島の淵からの脱離に異方性が生じるということで説明した。また、低温で蒸着した平坦な単層膜が、昇温することで本来の部分濡れの状態に脱濡れ(dewet)していく動的過程を、二つのカテゴリーに分類できることを示し、夫々の場合のスケール則を発見、説明した。へテロエピタキシャル系に見られるさまざまの成長様式、つまり層状成長、島成長、層から島へのSK成長様式に対して、不整合転位の役割を研究し始めている。そのために弾性格子模型を構築し、本年度は手始めとして不整合転位の芯のエネルギーを求めた。連続弾性体で得られた転位間相互作用の解析結果良い一致を示し、連続体では求められない新エネルギーも求めることができた。また、ヘテロエピタキシャル系の蒸着島の形態を様々変えたときのエネルギーを比較し、可能な成長様式を合図にまとめた。キラリティの自発的破れに関しては、揺らぎの効果を鍵を握ることがあることを見出した。有機物の例が簡単であるが、結晶成長に対しても拡張を考えている。ヘテロエピタキシャル成長では、基板と吸着原子との格子不整合性により大きな歪みエネルギーが生じるので、歪みを取り入れることが必要である。そこで本年度は、歪み可能な格子模型に更に不整合転位を考慮して、ヘテロエピタキシャル成長に見られる様々の成長様式を解析した。被覆度や不整合度を増すことにより、層成長からSK成長様式を経て島成長へと移り変わる様子を調べ、不整合転位の有無を含めて相図にまとめた。また、転位網のある吸着層の上に更に別の吸着原子を堆積した時に、核形成がどこから始まるかについて、応力分布との関連から整理した。これらの結果は、実験と比較し、ナノドットの自己組織的形成などの理解に役立った。また左右の対称性の破れた二種類の結晶形が可能なキラル結晶の成長について、新たなモデルを提案し、考察した。実験的には、左右両タイプの混合した結晶粒の集まりを磨り潰しながら結晶成長させることで、片方のキラリティをもった結晶だけを選別できることが示されている。この状況を理論的に表すべく、同種原子間の結合のほかに、異種原子クラスタ上でのキラリティの変換とカットとシャッフルで表した磨り潰しの効果を考慮した格子気体モデルを提案し、それをモンテカルロ法でシミュレートして、動的にキラル対称性の破れが生じることを確かめた。これは、左右の対称性の破れが非平衡条件下で起きることを示しており、生命体における同様の左右の対称性の破れの理解にもつながる成果である。平坦な結晶表面に低温で薄膜を蒸着しても、濡れ性が悪いと一部がはがれ、乾いた領域濡れた領域の混じり合った非一様状態になる。この脱濡れ現象をシミュレートし、乾燥領域の広がる速さなどを理論に解析した。二領域間の界面では濡れ領域よりも更に高くなった淵(リム)が存在し、界面の移動はリム上での新しい層の核生成が支配することを見出した。このときフロントの後退速度は時間の平方根に反比例して徐々に遅くなることを説明した。また、基板表面に微細加工を施すと吸着層の濡れ性が変化することが期待される。本年度は基板上に平行な溝を掘った場合、吸着島が溝の上に乗るか中に落ちるかが、一次相転移のような履歴を伴うことを見出した。このシミュレーションの結果は、上に乗った島の様々な濡れモードに対する安定性から理解できることを示した。また、キラルな結晶成長に対し昨年度提案したモデルの熱平衡状態が、大きさ1のイジングスピンに対する既存のBEGモデルのそれと等価であることを見出した。それはキラル対称性の破れという熱平衡相転移を引き起こす。しかし、現実の系ではキラリティが変換する動的過程には制限がある。

この制限を加えたシミュレーションを行うと、ホモキラルになる時間が系のサイズに比例して大きくなることが示された。つまりこの場合、系は非エルゴード的である。そこに磨り潰し効果を取り入れると、系は平衡状態からは遠く離れて、しかもホモキラルを実現することが示された。磨り潰しながら溶液からキラルな結晶を成長させると、片方のキラリティを持ったものだけが生き残るという実験がある。この自発的対称性の破れを理解するため、結晶成長に対する格子気体模型に磨り潰しの効果を取り込んだモデルを提案し、モンテカルロ・シミュレーションを行った。その結果、磨り潰しがなければ結晶クラスターはキラル対称なラセミック混合物となり、磨り潰しがあれば片方のみが生き残ったホモキラルな状態となることが示された。完全にアキラルな初期状態から出発すると、途中ラセミックな状態を長く保持するが、そのときキラリティの異なる結晶クラスターが多数接触することが見出された。やがて揺らぎで片方が多数派になると、その差が拡大する。これは異種クラスターが接触するとき互いに表面を覆って成長を阻害する相互阻害効果で説明される。つまり、少数派の結晶クラスターにとっては阻害効果が相対的に大きく、クラスター数の差が拡大していく。キラル分子濃度に対する反応速度論の式に非線形効果をもたらし、数値積分するとシミュレーション結果を定量的に説明できた。また鏡像体過剰率に対する時間発展の式は時間依存のあるランダウ方程式と似た形式となる。ただし、変分関数は存在せず、係数は時間依存性を持っている点が本質的に非平衡系である。ヘテロエピタキシャル吸着系では基板と吸着層の格子定数の違いに起因する歪みを避けるため、基板表面に柱列という微細加工を施す実験が行われている。吸着層が柱の上に乗ったCB相から柱の間の溝に落ち込んだW相(真の平衡状態)へ緩和するかどうかをモンテカルロ法で調べた。そして濡れ性が低いとCB状態が準安定であることを見出し、エネルギー障壁を理論的に計算した。
シナプス可塑性におけるCa^<2+>/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼIIの役割-アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを用いた検討-

中枢神経系におけるシナプス可塑性は、学習・記憶といった脳の高次機能の基礎を成すものと考えられ、その基本的メカニズムの解明に向けて様々なアプローチが行われてきている。本申請者はこれまでに、機能蛋白のリン酸化を中心に可塑性な変化に関わる分子の検討を行い、細胞内Ca^<2+>の上昇によって活性化されるCa^<2+>/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII(カルモジュリンキナーゼII)の関与の可能性を示してきた。本研究においては、この点についてさらに理解を深めるために、生体内におけるカルモジュリンキナーゼIIの選択的な抑制を可能にするアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド(アンチセンスODN)の作製と応用を試みた。そのスクリーニングに用いるin vitroの系として、カルモジュリンキナーゼIIのαサブユニットを過剰発現する神経芽細胞を導入し、感度のよいアッセイ系を確立したが、生体内において十分にカルモジュリンキナーゼIIの発現を抑制できるようなアンチセンスODNを特定することはできなかった。しかしながら他方において、カルモジュリンキナーゼIIが重要な役割を果たすシナプス可塑性のモデルを広く探る目的で、自己リン酸化によって活性型となったカルモジュリンキナーゼIIのみを特異的に認識するリン酸化特異抗体の作成に成功し、生体内における種々の神経活動に伴って、カルモジュリンキナーゼIIの活性型が動的調節を受けていることを見い出した。今後は、動物個体への遺伝子変異導入技術を応用することによって、時期特異的に誘導のかかる形でカルモジュリンキナーゼII遺伝子の発現を抑制できる動物を作製し、そのシナプス可塑性における役割を追究して行きたい。記憶・学習の要素現象と考えられるシナプス可塑性には、蛋白のリン酸化が重要な役割を果たしていると提唱されている。本研究者らは、既に、シナプス可塑性のモデルのひとつであるキンドリングにおいて、その完成後に、能内のCa^<2+>/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII(カルモジュリンキナーゼII)の活性が上昇していることを明らかにし、このキナーゼがキンドリングにおけるシナプス可塑性の形成に関与することを示唆した。さらにその役割を明らかにするために、キンドリング完成後にアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド(アンチセンスODN)を能室内に注入し、カルモジュリンキナーゼIIの活性を抑制することを計画した。本年度は、その第一段階として、カルモジュリンキナーゼIIに対して有効に作用するアンチセンスODNのスクリーニングを開始した。カルモジュリンキナーゼIIの主要サブユニットであるαサブユニットをターゲットとしてアンチセンスODNを数種類ずつ作成し、in vitroならびにin vivoにおいて、その効果を検討した。しかし、特異的かつ有効にカルモジュリンキナーゼIIの発現を抑制するアンチセンスODNは、現在までのところ、特定できていない。今後さらにアンチセンスODNの種類を増やし、投与方法も含めて検討して行きたい。本申請者はこれまでに、機能蛋白のリン酸化を中心に可塑的な変化に関わる分子の検討を行い、細胞内Ca^<2+>の上昇によって活性化されるCa^<2+>/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII(カルモジュリンキナーゼII)の関与の可能性を示してきた。

その際スクリーニングに用いるin vitroにおける培養細胞系として、カルモジュリンキナーゼIIのαサブユニットを過剰発現する神経芽細胞を新たに導入することによって、これまで以上に感度のよいアッセイ系を確立し、効率よくアンチセンスODNのスクリーニングが行えるようにした。さらに、これまでに検討を行ってきたキンドリングに加え、カルモジュリンキナーゼIIが重要な役割を果たすシナプス可塑性のモデルを広く探る目的で、自己リン酸化によって活性型となったカルモジュリンキナーゼIIのみを特異的に認識するリン酸化特異抗体を作成した。この抗体は、イムノブロットのみならず免疫組織化学においても有効に作用することが確認された。中枢神経系におけるシナプス可塑性は、学習・記憶といった脳の高次機能の基礎を成すものと考えられ、その基本的メカニズムの解明に向けて様々なアプローチが行われてきている。本申請者はこれまでに、機能蛋白のリン酸化を中心に可塑的な変化に関わる分子の検討を行い、細胞内Ca^<2+>の上昇によって活性化されるCa^<2+>/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII(カルモジュリンキナーゼII)の関与の可能性を示してきた。本研究においては、この点についてさらに理解を深めるために、生体内におけるカルモジュリンキナーゼIIの選択的な抑制を可能にするアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド(アンチセンスODN)の作製と応用を試みた。そのスクリーニングに用いるin vitroの系として、カルモジュリンキナーゼIIのαサブユニットを過剰発現する神経芽細胞を導入し、感度のよいアッセイ系を確立したが、生体内において十分にカルモジュリンキナーゼIIの発現を抑制できるようなアンチセンスODNを特定することはできなかった。しかしながら他方において、カルモジュリンキナーゼIIが重要な役割を果たすシナプス可塑性のモデルを広く探る目的で、自己リン酸化によって活性型となったカルモジュリンキナーゼIIのみを特異的に認識するリン酸化特異抗体の作成に成功し、生体内における種々の神経活動に伴って、カルモジュリンキナーゼIIの活性型が動的調節を受けていることを見い出した。今後は、動物固体への遺伝子変異導入技術を応用することによって、期待特異的に誘導のかかる形でカルモジュリンキナーゼII遺伝子の発現を抑制できる動物を作製し、そのシナプス可塑性における役割を追究して行きたい。
頭頸部癌に対するヒト乳頭腫ウイルス遺伝子を標的とした集学的治療の開発

頭頸部癌の発癌要因として喫煙・アルコールの関与が知られているが、近年ヒト乳頭腫ウイルス(以下HPV)の関与が指摘されている。HPV癌遺伝子であるE6とE7遺伝子の抑制を効率的に行なうためにE6とE7遺伝子に対するアンチセンスRNAを組み込んだアデノウイルスベクターを作成し、HPV陽性の頭頸部癌細胞株に導入することで、その細胞殺傷効果が確認された。また、腫瘍移植マウスを用いた実験においては、シスプラチンの腹腔内投与に加えこのウイルスベクターの局所投与を併用することにより、シスプラチン単独投与に比べ腫瘍の増殖が抑制され相乗効果が認められることが確認された。すでにHPVに関連する子宮頸癌では癌化に主要な役割を果たしているのはE6、E7であることが明らかとなっている。これまで我々は、HPV16陽性頭頸部癌細胞株にin vitroでHPV癌遺伝子E6、E7に対するsiRNAを導入することによりpRbおよびp53の発現が回復し、結果として細胞増殖が抑制され、アポトーシスが誘導されることを示し、in vivo実験においてもE6、E7に対するsiRNAの腫瘍内投与により腫瘍増殖が有意に抑制されることを確認している。本研究では、E6、E7遺伝子の抑制をより効率的に行うためにE6、E7遺伝子に対するアンチセンスRNA遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターを作成しその細胞殺傷効果をin vitroで確認するために実験を行った。その結果、HPV16陽性頭頸部癌細胞株において、E6、E7遺伝子に対するアンチセンスRNA遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクター(Ad-AS-E6、Ad-AS-E7)に暴露することにより濃度依存性に細胞毒性が見られることがわかった。一方、HPV16陰性頭頸部癌細胞株では、明らかな細胞毒性効果は見られなかった。現在、腫瘍移植マウスモデルを用いてin vivo実験を行い、結果を解析中である。これまで頭頸部癌に対しては手術療法、放射線療法、化学療法を組み合わせた様々な集学的治療、分子標的薬による治療が試みられてきた。しかし、進行癌における生存率は未だに約50%前後で満足できる成果があげられていない。手術療法では根治が望めるものの、整容面はもちろん嚥下、発声障害など様々な機能的障害をきたしQOLの低下は避けられない。化学放射線療法においては嚥下障害や唾液分泌障害などの後遺症が問題視されている。抗EGFR抗体などの分子標的薬においては腫瘍特異的でないことから正常組織障害による副作用が必発であり、効果的かつ低侵襲な新たな治療法の開発が望まれている。これまで我々は、HPV16陽性頭頸部癌細胞株にin vitroでHPV癌遺伝子E6、E7に対するsiRNAを導入することによりpRbおよびp53の発現が回復し、結果として細胞増殖が抑制され、アポトーシスが誘導されることを示してきた。また、in vivo実験においてもE6、E7に対するsiRNAの腫瘍内投与により腫瘍増殖が有意に抑制され、E6とE7の両者を抑制するとその効果はさらに増強されることを示した。今回の研究では、より効率的に遺伝子導入を行なうために、E6、E7遺伝子に対するアンチセンスRNAを組み込んだアデノウイルスベクターを作成して、HPV16陽性頭頸部癌細胞株に対するその細胞殺傷効果をin vitroで確認している。今年度はin vivo実験においてE7遺伝子に対するアンチセンスRNAを組み込んだアデノウイルスベクターを腫瘍細胞に導入することで、抗癌剤であるシスプラチン単独で投与するよりも、同時併用した方が腫瘍増殖抑制効果を増強することがわかった。現在、in vitroの実験でシスプラチンの濃度の条件設定を変えて実験を行ない、腫瘍増殖抑制効果を確認している。HPV16陽性頭頸部癌細胞株にin vitroでHPV癌遺伝子E6、E7に対するsiRNAを導入することによりpRbおよびp53の発現が回復し、結果として細胞増殖が抑制され、アポトーシスが誘導されること、in vivo実験においてもE6、E7に対するsiRNAの腫瘍内投与により腫瘍増殖が有意に抑制され、E6とE7の両者を抑制するとその効果はさらに増強されることを既に報告している。今回は、E6とE7遺伝子の抑制をより効率的に行なうためにE6とE7遺伝子に対するアンチセンスRNAを組み込んだアデノウイルスベクターを作成し、その細胞殺傷効果を確認した。また、in vivo実験においては、シスプラチンの腹腔内投与に加えこのウイルスベクターの局所投与を併用することにより、シスプラチン単独投与に比べ腫瘍の増殖が抑制されることがしめされた。少量のシスプラチン投与により、アンチセンスRNAを組み込んだアデノウイルスベクターの局所投与の効果が増強され、臨床応用の可能性が示唆された。現在、論文投稿準備中である。

すでに、昨年度はE7遺伝子に対するアンチセンスRNAを組み込んだアデノウイルスベクターを使用してHPV16陽性頭頸部癌細胞株に対するその細胞殺傷効果をin vitroで確認している。今年度はin vivo実験は既に終了し、E7遺伝子に対するアンチセンスRNAを組み込んだアデノウイルスベクターを腫瘍細胞移植マウスに投与し、腫瘍細胞内に遺伝子導入を行なうことに成功した。さらに、腫瘍細胞移植マウスに抗癌剤であるシスプラチン単独で投与するよりも、E7遺伝子に対するアンチセンスRNAを組み込んだアデノウイルスベクター投与を同時併用した方が高い腫瘍増殖抑制効果が得られるという結果を得ている。現在、摘出した腫瘍の免疫染色を行ない、p53およびpRbタンパクの発現について解析中である。また、シスプラチンの濃度の変えてin vitro実験を行ない、腫瘍増殖抑制効果を確認している。耳鼻咽喉科学本研究は現在疫学的に増加傾向を示しているHPV16陽性頭頸部癌に対する治療を開発することを目的としており。より侵襲や副作用が少ないが、効果が得られる治療法が望まれる。よって、in vivo実験で得られた結果を詳細に検討して、HPV16陽性頭頸部癌に認められる癌遺伝子E6、E7の発現抑制によりシスプラチンの抗腫瘍効果を増強するメカニズムを解明するとともに、シスプラチン投与量について追加実験により検討したいと考えている。本年度に計画していたE6、E7遺伝子に対するアンチセンスRNA遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターを用いてHPV16陽性頭頸部癌細胞株に対する細胞殺傷効果をin vitroで確認する実験は終了し、腫瘍移植マウスモデルを用いてin vivo実験に取りかかっている。腫瘍移植マウスモデルを用いてin vivo実験の結果を解析し、E6、E7遺伝子に対するアンチセンスRNA遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクター(Ad-AS-E6、Ad-AS-E7)の局所投与の有効性を明らかにする。また、抗癌剤との併用により抗腫瘍効果が増強するか否かをin vitroおよび腫瘍移植マウスモデルを用いたin vivo実験で確認し、その抗腫瘍効果(増感効果)のメカニズムについて解明したいと考えている。
底層域における貧酸素水塊の発達とミズクラゲ大発生との関連

東京都品川区船の科学館内定点に吊下した付着板上のミズクラゲポリプ(以下ポリプ)個体数の追跡実験から、その変動が他の付着生物(ムラサキイガイ等)との競争によって強く影響されていることが判明した。すなわち、秋冬にかけてポリプと空間的に競合するムラサキイガイ等の成長が低下するとともにポリプの生存率が高くなることが明らかとなり、秋まで生存し産卵を行っているミズクラゲの個体数が翌年度のミズクラゲ発生数に大きな影響を及ぼしている可能性が示唆された。また昨年度に引き続き行われた同地点の桟橋支柱上におけるポリプの潜水による周年観察の結果、その分布は付着板同様にムラサキイガイ等の群集に大きく影響されていることが判明し、特にミズクラゲの産卵盛期である夏季には支柱表面はムラサキイガイ等によって覆われ、ポリプは全く観察されなかった。しかしながら底層付近にはムラサキイガイ等は生息しておらず、この空間にポリプ群集が認められた。同時に測定した溶存酸素濃度の結果から、底層付近には夏秋の始めにかけて貧酸素水塊が発達していることが判明し、これがムラサキイガイ等の生息を困難にしておりポリプに生息できる空間を供しているものと考えられた。一方、ポリプを様々な溶存酸素濃度の海水内で飼育し、貧酸素水塊に対する耐性を飼育実験によって検証した結果、溶存酸素濃度2.0ml/l以上であればポリプは正常に成長することが判明した。また、ポリプの呼吸速度の測定結果より、貧酸素水塊内では呼吸速度を低下させることによって適応していることが明らかとなった。さらに、プラヌラ幼生の着底実験の結果から、貧酸素水塊の存在がプラヌラ幼生の着底に不利にはたらくことはなく、逆に早期着底を促進させる効果があることが判明した。また、ムラサキイガイによるプラヌラ幼生捕食実験の結果、16-18cmの貝を用いた場合、1cm以内には濾過摂食によりプラヌラ幼生は着底できないことが明らかとなった。以上の結果より、ミズクラゲ大発生に強く関わってくる要因として前述した産卵の継続期間の他に貧酸素水塊の発達が考えられた。すなわち、最もミズクラゲの産卵が盛んな夏季には、プラヌラ・ポリプは沿岸底層域に出現する貧酸素水塊を利用することによって、ムラサキイガイ等による捕食をさけて増殖・成長しているものと考えられ、沿岸域の富栄養化の進行に伴う底層貧酸素水塊の発達がミズクラゲ大発生を誘引する一つの要因であることが明らかとなった。東京都品川区船の科学館内定点に吊下した付着板上のミズクラゲポリプ(以下ポリプ)個体数の定量的追跡結果から、その個体数は他の付着生物(ムラサキイガイ等)との競争の結果、付着直後から急激に減少したものの、秋冬に付着した個体はその個体数を増加させ、付着直後の最大約6倍のエフィラを遊離させることが明らかとなった。

これは、秋冬にかけてポリプと空間的に競合するムラサキイガイ等の活性が低下したためであると考えられ、秋まで生存し産卵を行っているミズクラゲの個体数が翌年度のミズクラゲ発生数に大きな影響を及ぼしている可能性が示唆された。同地点の桟橋支柱上におけるポリプの潜水による周年観察の結果、その分布は付着板同様にムラサキイガイ等の群集に大きく影響されていることが判明し、特にミズクラゲの産卵盛期である夏季には支柱表面はムラサキイガイ等によって覆われ、ポリプは全く観察されなかった。しかしながら底層付近にはムラサキイガイ等は生息しておらず、この空間にポリプ群集が認められた。同時に測定した溶存酸素濃度の結果から、底層付近には夏季から秋季の始めにかけて貧酸素水塊が発達していることが判明し、これがムラサキイガイ等の生息を困難にしておりポリプに生息できる空間を供しているものと考えられた。一方、ポリプが貧酸素水塊内に認められたことから、低い溶存酸素濃度に対する耐性が高いことが予想され、来年度は飼育実験によってこのことを実証する予定である。昨年度に引き続き、東京都品川区船の科学館内定点に吊下した付着板上のミズクラゲポリプ(以下ポリプ)個体数の定量的追跡実験を行い、その個体数変動が他の付着生物(ムラサキイガイ等)との競争によって強く影響されていることが判明した。すなわち、秋冬にかけてポリプと空間的に競合するムラサキイガイ等の成長が低下するとともにポリプの生存率が高くなることが明らかとなり、秋まで生存し産卵を行っているミズクラゲの個体数が翌年度のミズクラゲ発生数に大きな影響を及ぼしている可能性が示唆された。また昨年度に引き続き行われた同地点の桟橋支柱上におけるポリプの潜水による周年観察の結果、その分布は付着板同様にムラサキイガイ等の群集に大きく影響されていることが判明し、特にミズクラゲの産卵盛期である夏季には支柱表面はムラサキイガイ等によって覆われ、ポリプは全く観察されなかった。同時に測定した溶存酸素濃度の結果から、底層付近には夏秋の始めにかけて貧酸素水塊が発達していることが判明し、これがムラサキイガイ等の生息を困難にしておりポリプに生息できる空間を供しているものと考えられた。一方、ポリプが貧酸素水塊内に認められたことから、低い溶存酸素濃度に対する耐性が高いことが予想されたため、本年度はポリプを様々な溶存酸素濃度の海水内で飼育し、貧酸素水塊に対する耐性を飼育実験によって検証した。その結果、ポリプは溶存酸素濃度2.0ml/1以上であれば正常に成長することが判明した。また、ポリプの呼吸速度の測定結果より、貧酸素水塊内では呼吸速度を低下させることによって適応していることが明らかとなった。以上の結果より、最もミズクラゲの産卵が盛んな夏季には、ポリプは沿岸底層域に出現する貧酸素水塊を利用することによって、ムラサキイガイ等による捕食をさけて成長しているものと考えられた。来年度は、プラヌラ幼生の着底に及ぼす貧酸素水塊の影響とムラサキイガイ等のプラヌラ幼生に対する捕食圧について、その影響を評価し、沿岸域の環境変動の一つである貧酸素水塊の発達がミズクラゲ大量発生に対して及ぼしている影響についてまとめる予定である。東京都品川区船の科学館内定点に吊下した付着板上のミズクラゲポリプ(以下ポリプ)個体数の追跡実験から、その変動が他の付着生物(ムラサキイガイ等)との競争によって強く影響されていることが判明した。
腸管出血性大腸菌O157感染による腎障害の研究―機序の解明と治療法の確立―

腸管出血性大腸菌O157;H7(O157)による臓器障害にはリポ多糖(LPS)とベロ毒素(VT_2)が関与しているが、その病態は十分に解明されていない。そこで本研究では、それぞれを投与した際の病態学的特徴を検討した。1.LPSの時間毒性Wistarラットを用いてLPS(5mg/kg)を9:00あるいは21:00に1回投与し、投与時刻による臓器障害の差を検討した。その結果、臓器障害の程度は21:00投与の方が9:00投与よりも大であった。また炎症性サイトカインであるIL-6の血中濃度や臓器における産生能も21:00投与の方が大であった。以上より、LPSの投与時刻による臓器障害の差にIL-6反応性の差が関与しているものと思われる。2.VT_2による臓器障害におよぼす抗好中球抗体の影響C57BL/6マウスにVT_2(1,10,30,50あるいは100ng)を腹腔内に投与してLD_<50>を求めた。ついで生食水あるいはVT_2100ngを腹腔内に投与し、投与前、投与24および48時間後の末梢血中好中球数を調べた。さらに、VT_2100ngを腹腔内に投与し、その直後および24時間後に生食水あるいは抗マウス好中球抗体(0.01あるいは0.1mg)を静注してマウスの死亡を観察した。その結果、LD_<50>は31.7ngであり、VT_2投与後経過とともに体重は減少し、ヘマクリット値および好中球数は増加した。抗マウス好中球抗体の投与により、VT_2投与によるマウスの死亡率は有意に減少した。以上より、VT_2投与によってマウスが死亡する機序に好中球が関与しているものと思われる。腸管出血性大腸菌O-157;H7(O157)による腎障害にはベロ毒素(VT)とリポ多糖(LPS)が必要であるが、その機序は十分に解明されていない。そこで本年度は、O-157からVTおよびLPSを抽出・精製し、これを用いて毒性学的特徴を検討した。1.VT-BALB/cマウスを用いて、VT投与後3日間の生存曲線よりVTのLD50を求めた(LD50=41.6ng/マウス)。さらに、LD50量のVTを投与後、2日間の血液学的変化を検討したところ、血中白血球数および血小板数は減少し、ヘマトクリット値は上昇すること、すなわちDIC様所見を呈することを明らかにした。2.LPS-Wistarラットを用いてLPS(5mg/kg)を9:00あるいは21:00に1回投与し、投与時刻による肝腎障害の差を検討した。その結果、肝腎障害の程度は21:00投与の方が9:00投与よりも大であった。また、炎症性サイトカインであるIL-6の血中濃度や肝における産生能も21:00投与の方が大であった。以上より、LPSの投与時刻による肝腎障害の差にIL-6反応性の差が関与しているものと思われる。以上の成績は第72回日本薬理学会年会(札幌)で発表した。今後はVTとLPSを同時に投与して腎障害モデルを作成し、その病態の特徴を明らかにするとともに、抗好中球抗体を前投与することによってVT・LPSによる腎障害が予防できるか否かを検討する予定である。腸管出血性大腸菌0

-157感染症は溶血性尿毒症症候群(HUS)を惹起するが、その機序は十分に解明されていない。これまでの臨床研究により、0-157感染に伴うHUS患者では末梢血中の好中球数が増加しており、さらに腎組織にも集積することが明らかにされた。そこで本年度は0-157感染によるHUSと好中球との関係を明かにすることを目的に、まず最初に、腸管出血性大腸菌0-157産生毒素(verotoxin 2,VT_2)によるマウスの死亡におよぼす抗好中球抗体の影響を調べた。方法:8週齢の雄C57BL/6マウスにVT_2(1,10,30,50あるいは100ng)を腹腔内に投与してLD_<50>を求めた。ついで生食水あるいはVT_2100ngを腹腔内に投与し、投与前、投与24および48時間後の末梢血中好中球数を調べた。さらに、VT_2100ngを腹腔内に投与し、その直後および24時間後に生食水あるいは抗マウス好中球抗体(0.01あるいは0.1mg)を静注してマウスの死亡を観察した。結果:LD_<50>は31.7ngであった。VT_2投与後経過とともに体重は減少し、ヘマトクリット値および好中球数は増加した。抗マウス好中球抗体の投与により、VT_2投与によるマウスの死亡率は有意に減少した。以上の結果により、VT_2投与によってマウスが死亡する機序に好中球が関与しているもとの思われる。これらの成績は第74回日本細菌学会総会(平成13年4月、岡山市)で発表する予定である。腸管出血性大腸菌O157;H7(O157)感染は溶血性尿毒症症候群(HUS)を惹起するが、その発症にはベロ毒素(VT_2)とリポ多糖(LPS)が必要であり、さらに臨床研究によって、HUSの発症・進展に好中球が関与していることが示唆されている。これまで我々は抗好中球抗体を用いた研究によって、VT_2による腎障害の発症に好中球が関与していることを明らかにした。そこで本年度はVT_2とLPSを用いてより臨床例に類似した腎障害モデルを作成し、抗好中球抗体の効果を検討した。方法:8週令の雄C57BL/6マウスにVT_2(30あるいは50ng)およびLPS(5mg/kg)、あるいは生食水を腹腔内に投与し、投与前、投与24および48時間後の末梢血中好中球数を調べた。さらに、VT_2(50ng)およびLPS(5mg/kg)を腹腔内に投与し、その直後および24時間後に生食水あるいは抗マウス好中球抗体(0.01あるいは0.1mg)を静注してマウスの死亡を観察した。結果:VT_2およびLPS投与後経過とともに体重は減少し、ヘマトクリット値および好中球数は増加した。抗マウス好中球抗体の投与により、VT_2およびLPS投与によるマウスの死亡率は減少した。考察:以上の結果より、VT_2およびLPS投与によってマウスが死亡する機序に好中球増加が関与しているものと思われる。
歯髄幹細胞を用いた脳動脈瘤破裂予防の研究

近年画像診断法の進歩に伴い、未破裂脳動脈瘤が診断されるケースが増加しているが、脳動脈瘤破裂予防には、開頭下でのクリッピング手術や、血管内コイリング手術が行われている。しかし、それらの予防法は侵襲的であり、より低侵襲な治療法を確立する事が、喫緊の課題となっている。近年低侵襲治療法として、間葉系幹細胞を用いた疾患治療研究が注目を集めている。本研究は脳梗塞や脊髄損傷の治療において有用性が報告されている間葉系幹細胞のうち、安全、低侵襲かつ低コストに採取する事の出来る歯髄幹細胞を用いた、新しい脳動脈瘤破裂予防法の確立を目指す。
河川堤防の合理的構造検討に向けた礫混じり堤体材料の力学特性の再評価

河川堤防砂礫を用いて、原粒度の大型三軸試験と粒度調整した小型三軸試験を実施し、供試体寸法、供試体密度、排水条件、粒度調整の効果について検討した。その結果、同じ乾燥密度でも小型三軸試験結果は密詰め傾向の変形・強度特性を示すことがわかった。また、CD試験とCU試験で得られる内部摩擦角は、密詰めの場合にはほぼ同じになるが、ゆる詰めの場合には差が生じることが示された。さらに、礫分含有率を変えない粒度調整を行うことで、小型三軸で得られる変形・強度特性は、大型三軸の結果に近づくことが示された。本研究の目的は,広範な粒度を有する礫混じりの堤防材料の変形・強度特性を評価する手法を提案することと,慣用解析で用いる強度定数の合理的かつ経済的な設定法を示すことである。平成20年度は、国交省により詳細点検が実施されている実在堤防から採取した礫混じり砂試料を用いて室内試験により検討を実施した。大きな礫を含む原粒度試料のせん断特性を評価するために大型三軸試験を実施するとともに,通常の実務で採用される中型および小型供試体による三軸試験を行った。小型・中型供試体の場合には,それぞれの供試体径の1/5程度が最大粒径となるように粒度調整を行ったが,本研究では,大きな礫を単純に取り除く通常粒調試料と,新たな粒度調整手法として考案した礫分含有率を変化させない礫分粒調試料の2種類を用いた。せん断条件はCUバー条件であるが,実務の設計で用いられる全応力法のCU条件による評価も同時に実施している。試験結果は以下の通りである。通常粒調試料の場合,同じ現地堤防の乾燥密度で供試体を作製しても,供試体寸法により大きく有効応力経路は異なり,変形・強度特性に差が生じることが明らかになった。すなわち,供試体寸法が小さくなるほど,密詰め砂の傾向が強く表れる。一方,礫分粒調試料を用いた小型三軸試験の結果は,原粒度試料による大型三軸試験の結果と非常に近い結果となり小型三軸試験を用いても,原地盤の変形・強度特性をある程度評価可能であることを示すことができた。一方,堤防砂による不飽和せん断特性の評価も実施するために,不飽和三軸試験の予備実験も同時に開始した。浸潤・乾燥を繰り返す河川堤防の特殊性を評価するために,乾湿繰り返し履歴を与えた場合に,堤防砂の変形・強度特性が変化し,せん断強度に劣化が認められることが示された。本研究の目的は,広範な粒度を有する砂礫混じり堤防材料の変形・強度特性を評価する手法を提案することと,慣用解析で用いる強度定数の合理的かつ経済的な設定法を示すことである。平成21年度は,実在堤防から採取した砂礫試料を用いて室内三軸試験により詳細な検討を実施した。大きな礫から細粒分まで含む河川堤防土について,原粒度のままの堤防材料の変形・強度特性を求めるには,大型三軸試験を行うのが理想であるが,現実には,試料確保の面やコスト面から,大きな礫を除外した粒度調整試料を用いて室内小型三軸試験を実施することになる。本年度は,まず原粒度試料の大型三軸試験を実施することにより,供試体乾燥密度と排水条件が試験結果に及ぼす影響について検討した。さらに,粒度調整した小型三軸試験も実施し,供試体寸法の効果についても検討した。大型および小型三軸試験の結果を比較すると,同じ供試体乾燥密度であっても,供試体の寸法効果によって,小型三軸試験で得られる試験結果は密詰め傾向の変形・強度特性を示すことがわかった。これは,大きな礫を含む原粒度試料では,礫以外のマトリックス部分の密度が相対的にゆる詰めであるのに対して,小型供試体のマトリックス部分は逆に相対的に密詰めになることに起因する。そのため,砂礫試料では供試体が小型化するほど,実際の強度変形特性を過大評価する可能性を指摘した。また,大型軸,小型三軸ともに,CD試験で得られるφ_dとCU試験で得られるφ'は,供試体乾燥密度が大きい場合にはほぼ同じになるが,供試体乾燥密度が小さい場合には差が生じることが示された。さらに,本論文で提案する礫分含有率を変えない粒度調整を行うことで,小型三軸で得られる変形・強度特性は,大型三軸の結果に近づくことも示された。本研究の目的は,広範な粒度を有する砂礫混じり堤防材料の変形・強度特性を評価する手法を提案するとともに,慣用解析で用いる強度定数の合理的かつ経済的な設定法を示すことである。研究の最終年度である平成22年度は,前年度から引き続き,各種条件下で砂礫試料を用いて室内三軸試験を実施することにより,得られる強度定数が各種条件の違いによって受ける影響について検討した。本年度は得に,供試体作製法による試験結果の違いに注目した。

河川堤防土を含む砂質土の強度定数を室内試験で求めるには,供試体を再構成する場合が多いが,実務において供試体作製法までは明確に規定されていない。本研究では,河川堤防で採取した礫混じり砂を対象に,空中落下法と湿潤締固め法の2つの方法で供試体を作製し,三軸試験を実施した。両供試体は同一の有効応力状態において,ほぼ同一の間隙比を有している点が特徴である。結果として,供試体作製法の違いにより,単調ならびに繰返しせん断試験で得られるせん断特性(特にダイレイタンシー特性)が大きく異なることが示された。特に,湿潤締固め法による供試体には高位な構造を持つ土の特徴が認められた。これは供試体内の不均一性に起因し,両供試体の内部構造が異なるためであることが示された。一方,様々な試験条件下で得られた強度定数に対して,実務と同じ手法により堤防の安定性評価を実施した。同じ砂礫材料であるにも拘わらず,試験条件によって異なる強度定数を安定解析に用いることにより,得られる安全率は異なることが示された。以上の検討を通して,室内小型三軸試験で現場の砂礫堤防の強度定数を評価するには,粒度調整法,供試体作製法,供試体密度そして試験時の排水条件など,実際の原粒度試料のせん断特性に近づくように設定する必要があることが明確に示された。
サル頭頂連合野における認知地図の神経機構

ヒトも動物も自分の住む環境の空間的配置を認知地図として記憶に貯えていると考えられている。一般に動物の認知地図は海馬にあるとされているが、ヒトの臨床的研究で膨大後皮質を含む頭頂葉内側面の損傷で道順記憶の障害が起きることが知られている。海馬は新しい近時記憶が貯えられる領域であるから、動物でも永続的な認知地図は頭頂連合野に貯えられている可能性が高い。本研究はサルに三次元的な人工現実感(Virtual Reality)によるバーチャル空間の中のナビゲーション(道順)課題を訓練し課題遂行中に微小電極による単一ニューロン活動の記録を行って、認知地図関連ニューロンを探索するという目的で始めた。まずサルがバーチャル空間の中で認知地図を形成できるかどうかを行動学的に確かめるためにサル飼育研究施設をモデルにした2階建のビルディングの中をジョイスティックの操作で移動するナビゲーション課題を訓練し、ガイド付きの視覚誘導型課題から始めて、最終的にはゴールの部屋の内部の映像を提示した後出発点に戻って、そこから自分でゴールまで行く記憶誘導型課題の訓練に成功した。さらにすでに記憶した5つのゴールへ異なる出発点から行く道順を比較的短期間に学習できることを確かめた。2年目の後半に記録実験を始めてから間もなく5つのコースで合計16ヶ所あるチェックポイントのうちの1つを通過する時に選択的に発射活動を示す「場所細胞」が記録された。さらにある場所である方向に曲る時に選択的に活動するニューロンも記録された。海馬以外で「場所細胞」が記録されたのは本研究がはじめてである。なお、平行して幼若ニホンザルで実空間での道順記憶の発達を研究し、また頭頂連合野の視覚実験で立体視と遠近法の手がかりを統合して奥行を知覚するニューロン群を記録した。本研究はニホンザルに人工現実感(ヴァーチャル・リアリティー:VR)システムの中に設定した野外の仮想空間の道順記憶課題を学習させ、課題遂行中に頭頂連合野のニューロン活動を記録して特定の場所や野外の情景または道順の記憶に関連するニューロンを探索して、認知地図のニューロン機構を研究することを目的にして始めた。本年度は東に鉄道線路、南に海岸、西に富士山を望む日本大学生物資源科学部のキャンパスをモデルにした空間をVRのスクリーン上に提示しサルにその中をジョイスティックを使って車で移動する訓練を施した。サルは始め屋内の空間で廊下を移動するセットで基本的な訓練を受けた後に野外のセットの訓練を行った。最初はガイドの人形の後をついて移動する視覚誘導型の道順課題を学習させた後、ゴールの情景を見せて出発点に戻しガイドなしでゴール(終点)まで到達する記憶誘導型の道順課題を学習させた。ゴールとしては本館、図書館、体育館、ゲストハウスなどの建物と陸上競技場、野球場、テニスコート、牧場などがある。記憶誘導型の道順課題の訓練は予想以上に困難で静止したゴールの画面だけではなかなか憶えないので、始めは自動的に出発点からゴールまで移動する動画で道順を示してから同じ道順を辿る動画的手がかりによる訓練を施した後に静止画による記憶誘導型道順課題を訓練した。現在までに45ステップのルートを5コースまで憶えたがまだ34コースを憶えてから記録実験を始める予定で訓練を進めている。ニューロン記録は頭頂葉内側面のPGM野を中心に膨大後皮質と海馬傍回で行う。予想されるタイプは1)VRの仮想空間内を移動する時に前進、右折、左折などに対応する自己運動知覚ニューロン、2)仮想空間内の建物または風景を見た時に反応する情景認知ニューロン、3)道順記憶課題を遂行中にある特定の区域に行った時に活動する「場所細胞」4)道順課題遂行中に次の分岐点で曲がる方向またはゴールの方向を予測して活動する方向記憶ニューロンなどである。

目的:ヒトも動物も環境の空間的配置や道順を認知地図として記憶に貯えている。ラットやマウスの認知地図は海馬にあるといわれているが、ヒトの臨床的研究では頭頂葉の損傷で道順記憶の障害が起きることが知られている。したがって霊長類では認知地図が頭頂連合野に貯えられている可能性が高い。本研究の目的はサルに道順記憶課題を学習させ課題遂行中のニューロン活動を記録して空間的記憶に関連するニューロンを見つけ、認知地図の神経機構を解明することである。方法:大型の立体視ディスプレイを使った人工現実感(Virtual Reality)のシステムでサル研究施設をモデルにした2階建の建物を再現し、サルにジョイスティックの操作でその中を移動するバーチャル航法を学習させた。はじめにゴールの部屋のイメージを示した後、入口ホールに戻しあらかじめ記憶した道順をたどってゴールに達する記憶誘導型道順課題を学習させた。最終的に5つの異なる部屋への道順を習得した後、出発点を廊下の端に変えて5つの部屋に行くコースを訓練し、合計10コースを習得させた後に単一ニューロン活動を記録した。結果と考察:頭頂葉の内側面でPGM野(7m野)と呼ばれる領域にタングステン微小電極を刺入して記憶型道順課題遂行中の頭頂葉ニューロンの活動を記録した。各コースを812のブロックに分けてラスター、ヒストグラムを作成し5試行の平均をとるとその中の12箇所だけで活動するニューロンが見つかった。例えばエレベータの前、2階の廊下、各部屋の前、廊下の角を回る時などに活動するニューロンが記録された。これらのニューロンはあらかじめ記憶した個々の場所を同定するニューロンと見られるのでこれまで海馬で記録された「場所細胞」と同じカテゴリーの空間記憶ニューロンと推定される。連合野で「場所細胞」を記録したのは本研究がはじめてである。
新規AMPA受容体制御因子群によるシナプス機能制御の解明

シナプス間の情報伝達効率は使用状況によって柔軟に変化し、記憶や学習など脳高次機能の分子基盤を成す。この機構の破綻はてんかん等の神経疾患の重要な一因と考えられている。AMPA型グルタミン酸受容体(AMPA受容体)は脳内の興奮性神経伝達の大部分を司るので、AMPA受容体の輸送機構は現在の神経科学における極めて重要な命題である。本研究ではこの命題に対し、独自の生化学的手法により同定した1)パルミトイル化脂質修飾酵素および2)てんかん関連リガンドLGI1に着目して、AMPA受容体制御機構の全容を明らかにすることを目的としている。1)AMPA受容体の発現量はシナプスに存在する足場蛋白質PSD-95(パルミトイル化PSD-95)の量に依存する。今年度はパルミトイル化PSD-95を特異的に認識するプローブを開発し、内在性パルミトイル化PSD-95の動態を可視化することに成功した(Fukata Y et al,投稿中)。これは脂質修飾を受けた蛋白質を特異的に認識する抗体を得たという点でも画期的だと言える。2)一方、私どもは前年度に引き続きLGI1のノックアウトマウスの性状解析を行い、LGI1ノックアウトマウスにおけるAMPA受容体機能異常および、海馬組織における局在異常を見出した(Yokoi N et al,投稿準備中)。さらに、てんかんの焦点を明らかにするために脳の領域特異的な機能回復実験を進めている。このように今年度の研究計画は達成できたと考えている。AMPA型グルタミン酸受容体は脳内の興奮性神経伝達の大部分を司るので、この受容体がどのようにしてシナプス膜へ輸送され、機能が制御されているかは現在の神経科学における重要な命題である。本研究ではこの命題に対し、独自に同定した分子群1)パルミトイル化脂質修飾酵素P-PATおよび2)シナプス修飾リガンドLGI1に着目して、AMPA受容体制御機構の全容を明らかにする。本年度の研究実績は以下のとおりである。1)シナプスにおけるAMPA受容体発現量は足場蛋白質PSD-95によって規定されることが最近の研究から明らかになってきている。今回、私どもはPSD-95のシナプス局在がP-PATにより動的な制御を受けていることを見出した。P-PAT酵素はDHHC2,3,7,15の4種類の分子種からなるが、各分子種は外界刺激により異なる制御をうけていることが明らかとなった。中でもDHHC2は神経活動の低下に伴いシナプス近傍にダイナミックに移行することによりAMPA受容体の恒常性維持を制御していることが明らかとなった。2)一方、私どもが最近同定したシナプス修飾リガンドLGI1の作用機構を明らかにする目的で、LGI1複合体を精製、同定を行った。今年度はタグ付きLGI1を発現させたマウス脳より脳内LGI1複合体を特異的、かつ、定量的に同定した。これらLGI1複合体の結合様式を生化学的、構造生物学的に明らかにしつつある。さらに、LGI1およびその受容体ADAM22の脳内局在を電子顕微鏡レベルで検討している。脳内の興奮性神経伝達の大部分を司るAMPA型グルタミン酸受容体(MAPA受容体)は、記憶や学習など脳高次機能の分子基盤を成す。この制御機構の破綻はてんかんや認知症等の神経疾患の重要な一因と考えられている。本研究では私どもが独自に同定した分子群(パルミトイル化脂質修飾酵素P-PATとシナプス修飾リガンドLGI1)に着目して、1)パルミトイル化サイクルによるAMPA受容体動態制御機構、2)LGI1によるAMPA受容体機能制御機構を解明し、AMPA受容体制御機構の全容を明らかにする。今年度はPSD-95パルミトイル化酵素P-PATが神経活動抑制下で素早くシナプス近くに移動し、パルミトイル化PSD-95の量を増加させることによりAMAP受容体の恒常性維持を担っていることを明らかにした(Noritake et al, J. Cell Biol. 2009, Faculty 1000 Factor, 4.9)。本成果は世界的にも高く評価され、総説(深田らNature Rev. Neuroscience, 2010)にまとめられた。2)一方、私どもはLGI1の個体レベルでの生理機能を明らかにする目的で、LGI1遺伝子欠損マウスを作成し、全てのマウスが生後2-3週間で致死性のてんかん発作を呈することを見出した(深田らPNAS 2010)。さらに、LGI1遺伝子欠損マウスでは海馬においてAMPA受容体を介したシナプス伝達が低下していることを見出した。

本研究ではこの命題に対し、独自の生化学的手法により同定した1)パルミトイル化脂質修飾酵素および2)てんかん関連リガンドLGI1に着目して、AMPA受容体制御機構の全容を明らかにすることを目的としている。1)AMPA受容体の発現量はシナプスに存在する足場蛋白質PSD-95(パルミトイル化PSD-95)の量に依存する。今年度はパルミトイル化PSD-95を特異的に認識するプローブを開発し、内在性パルミトイル化PSD-95の動態を可視化することに成功した(Fukata Y et al,投稿中)。これは脂質修飾を受けた蛋白質を特異的に認識する抗体を得たという点でも画期的だと言える。2)一方、私どもは前年度に引き続きLGI1のノックアウトマウスの性状解析を行い、LGI1ノックアウトマウスにおけるAMPA受容体機能異常および、海馬組織における局在異常を見出した(Yokoi N et al,投稿準備中)。さらに、てんかんの焦点を明らかにするために脳の領域特異的な機能回復実験を進めている。このように今年度の研究計画は達成できたと考えている。
神経回路形成におけるCRMPの機能

CRMPはsemaphorinによる軸索ガイダンスに関与する細胞内タンパク質として同定されたが、その具体的な機能に関しては不明な点が多い。CRMPファミリーのメンバーとして現在5つの分子(CRMP1-5)が同定されているが、我々はそのうちの4つ(CRMP1-4)について、プロモーターの使い分けにより生じると考えられる別のアイソフォームが存在することを見出した。ゲノム構造解析の結果から、これらをCRMP-A type、またこれまでに知られているものをCRMP-B typeと命名した。CRMP-2A、-2Bをニワトリ視神経に強制発現させると、軸索の伸長、分岐に著しい影響を及ぼすことが判った。また、非神経細胞に発現させた場合、対照的な微小管パターンを形成し、細胞形態に変化を与えることが明らかになった。A、B両タイプはN末の構造だけが異なることから、この部分が微小管パターンの制御に重要な働きをしていると考えられる。また、今回、発生工学的アプローチによって、特定の神経回路を可視化することを試みたのでその成果を報告する。GAP-43タンパク質のN端20アミノ酸をb-galのN端に融合させたreporter分子(GAP-LacZ)を、網膜神経節細胞特異的なプロモーター(Brn3b)のコントロール下で発現するトランスジェニックマウスを作製した。その結果、意外にも、視覚、聴覚、嗅覚、橋-小脳系などの神経回路網を可視化することができた。特に視覚系においては、背側網膜由来の視神経及び腹側網膜由来の視神経をそれぞれ特異的にラベルしたマウスラインが得られた。このreporterは、プロモーターを選択することによって、特定の神経細胞集団の軸索伸長の解析や神経回路の形成機構の研究に有用であると思われる。得られたマウスラインは他の遺伝子変換マウスとの交配によって神経回路形成に関与する多様な遺伝子の機能解析への応用が期待できる。特異的神経結合形成の分子機構の1つにsemapholin/collapsin分子による神経軸索の成長円錐に対する反発作用が言われているが、その詳細な細胞内シグナル伝達経路は不明である。これまでにcollapsin response mediator protein(CRMP)が伝達分子の候補として同定され、CRMP14のファミリー分子が見つかっていたが、その個々の分子の機能の差異も不明のままである。我々はこれまでにCRMPにもう1つファミリーメンバーCRMP5が存在することを同定していた。また、CRMPはtetramerとして機能することが報告されていたが、今回、CRMP15の間の分子間親和性を解析した。その結果、CRMP1/2/4、2/3/5、2/4/5の組合せが可能であることが判明した。またPC12細胞が神経突起を伸長する時、CRMP4と5が特異的に発現の増加を示すことが判明した。更に、CRMP14には転写開始部位の異なると考えられるisoformが存在することが明らかとなった。今後、このisoformの機能を明らかにする研究を行う予定である。