hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
白血病マウスに対する分化・アポトーシス誘導剤の併用効果

ヒト白血病細胞に対し分化・アポトーシス誘導能の強い薬物を見いだすこと、およびin vitroおよびin vivoで分化・アポトーシス誘導剤どうし、または分化・アポトーシス誘導剤と癌化学療法剤を併用して作用させ分化・アポトーシス誘導に相乗効果のある薬物の組み合わせを明らかにすることを目的とした。株化された発生段階の異なるヒト白血病細胞(急性前骨髄球性白血病HL-60、骨髄芽球様U937,慢性骨髄性赤芽球様K562)を用いて、アポトーシス誘導能の強い薬物をスクリーニングした結果、以前報告したブファリンの他にイソプレノイド化合物であるゲラニルゲラニオールがアポトーシス誘導剤として適していることを見いだした。次に、分化・アポトーシス誘導剤と癌化学療法剤を併用して作用させた結果、ブファリン、エトポシド、レチノイン酸を併用したときが最も細胞増殖阻害能が大きかった。また処理したほとんどの細胞の核が断片化し、DNAフラグメンテーションが認められたので、これらの細胞にアポトーシスが誘導されたことが解った。U937細胞を用い、MAPキナーゼを測定した結果、上記三種の誘導剤の併用処理によりMAPキナーゼの異常で継続的な活性上昇が認められた。したがって、U937細胞においては、MAPキナーゼの異常な活性昂進がアポトーシス誘導のシグナルになっていることが示唆された。in vivoでは、HL-60をSCIDマウスの静脈に注入移植した白血病マウスに対し、ブファリン、エトポシド、レチノイン酸を併用し投与すると有為差のある延命効果が認められた。今後スケールを拡大した動物実験が必要である。株化された発生段階の異なる種々のヒト白血病細胞(急性前骨髄球性白血病HL60、骨髄芽球様ML1、単芽球様U937、慢性骨髄性赤芽球様K562)を用いて、アポトーシス誘導能の強い薬物をスクリーニングした結果、以前報告したブファリンの他にイソプレノイド化合物であるゲラニルゲラニオールがアポトーシス誘導剤として適していることを見いだした。そこで上記の白血病細胞に、種々の組合せの分化・アポトーシス誘導剤を組み合わせて作用させた結果、ブファリン、レチノイン酸、エトポシドを併用したときが最も細胞増殖阻害能が大きかった。また処理したほとんどの細胞の核が断片化し、DNAのフラグメンテーションが認められたので、これらの細胞にアポトーシスが誘導されたことが解った。U937細胞を用い、MAPキナーゼを測定した結果、上記3種の誘導剤の併用処理によりMAPキナーゼの異常で継続的な活性の上昇が認められた。したがって、少なくてもU937細胞に於ては、三種の薬物処理によるMAPキナーゼの異常な活性昴進がアポトーシス誘導のシグナルになっていることが示唆された。またビタミンK2とレチノイン酸、ビタミンK2カンプトテシンを併用したときは、分化誘導能の相乗効果が認められたが、アポトーシスの誘導は認められなかった。次にin vivoにおけるアポトーシス誘導剤の効果を調べる為、白血病HL-60細胞(10^7個/マウス)をSCIDマウスに移植し白血病マウスを作製し、それらの白血病マウスにブファリン、レチノイン酸、エトポシドを投与したところ有為差のある延命効果が認められ、完全に治癒したマウスも多かった。50μMのゲラニルゲラニオールは上記の白血病細胞に対し3時間でDNAフラグメンテーションを誘導した。また癌遺伝子に対しては、c-mycとbc12の発現を経時的に減少させた。タンパク質に対しては、ゲラニルゲラニオール処理により55kDaのタンパク質量が経時的に減少した。

このタンパク質をSDS-PAGEおよび逆相のHPLCにより精製し、部分アミノ酸配列を気相シークエンサーにより決定したところ、カルレチキュリンの部分アミノ酸配列と完全に一致した。したがって55kDaのタンパクはカルレチキュリンと同定された。次に上記の白血病細胞に、種々の組み合わせの分化・アポトーシス誘導剤どうし、あるいは分化・アポトーシス誘導剤と癌化学療法剤を併用して作用させた結果、ブファリン、エトポシド、レチノイン酸を併用したときが最も細胞増殖阻害能が大きかった。また処理したほとんどの細胞の核が断片化し、DNAフラグメンテーションが認められたので、これらの細胞にアポトーシスが誘導されたことが解った。U937細胞を用い、MAPキナーゼを測定した結果、上記三種の誘導剤の併用処理によりMAPキナーゼの異常で継続的な活性上昇が認められた。したがって、U937細胞においては、MAPキナーゼの異常な活性昂進がアポトーシス誘導のシグナルになっていることが示唆された。
遺伝子変異マウスを用いたWtapの選択的スプライシング制御機構の解析

Wilms' tumor-1 associating protein(以下Wtap)遺伝子は、選択的スプライシング機能やcyclinA2 mRNAの安定性、細胞増殖などに関与することが報告されている。私はWtapの生体内での機能を明らかにするためにWtap遺伝子変異マウスを作成し、Wtapはマウス胚とES細胞において内胚葉と中胚葉の分化に必要であることを明らかにした。しかし、マウス胚における内胚葉と中胚葉の分化は胚体外組織からのシグナルを受けて開始されることが知られており、Wtapが胚体外あるいは胚体組織のどちらで機能するかは不明であった。この疑問を解明するために本年度はキメラ解析を行った。『Wtap変異ES細包と野生型胚』、『Wtap変異胚と野生型ES細胞』の2つの組み合わせでキメラ胚を作成した。その結果、正常な胚体外組織はWtapホモ変異ES細胞の生体内での三胚葉への分化を誘導できた。しかし、ホモ変異胚由来の胚体外組織は野生型ES細胞の内胚葉と中胚葉への分化を誘導することができず、このキメラ胚は円筒胚が形成できないWtapホモ変異胚の形態と酷似していた。また、マウス胚におけるcycIin A2のタンパク質発現を免疫染色法により解析を行ったが、Wtap変異胚においてcyclin A2タンパク質発現はコントロール胚と変わらないことが分かった。さらに、細胞増殖マーカーであるリン酸化ピストンH3抗体を用いて解析したが、コントロール胚と明らかな差は見られなかった。以上の結果から、少なくともマウス初期胚におけるWtapは、これまで言われていたcyclin A2のmRNAの安定化や細胞増殖の制御よりも、内胚葉と中胚葉の分化に必要であることを明らかにした。Wilms' tumor-1 associating protein(以下Wtap)遺伝子は、ウイルムス腫瘍の原因遺伝子であり腎の発生に必須なWilms' tumor 1をベイトとした酵母two-hybrid法によって単離された。Wtapは、スプライシングを制御する役割があることが示唆されているが、生体内での機能は未だ解明されていない。私は当研究室で開発された改良遺伝子トラップ法を用いてWtap遺伝子変異マウスを作成し、これまでにWtap変異胚は原腸陥入期において中・内胚葉マーカーの消失を生じ,致死となることを明らかにした。本年度は、Wtap変異ES細胞を用いてin vitroにおける分化能力を解析した。また、他の研究グループからWtapがヒト臍帯血管内皮細胞(HUVEC)において細胞周期のG2/M期の転換に必要なcyclinA2のmRNA安定性に関与し、Wtap変異マウス胚はcyclinA2 mRNAの枯渇が原因で致死となるという仮説が提唱されたので(PNAS103:17278-83,2006)、細胞周期におけるWtapの機能についても、マウス胚及びES細胞を用いて検討を行った。1.Wtap変異ES細胞の分化能力の検討Wtap変異ES細胞から胚様体を形成させ、三胚葉全ての細胞種の分化誘導を試みた。その結果、変異ES細胞では前方神経外胚葉マーカーであるOtx2の発現は誘導されたが、Foxa2、Sox17、Brachyury、MixL1といった内胚葉と中胚葉形成に必要な遺伝子発現が誘導されなかった。さらに、Foxa2とBrachyuryの上流因子であるWnt3の発現も誘導されなかった。2.Wtap変異の細胞周期制御に対する影響の解析マウス胚におけるcyclinA2 mRNAの発現をRT-PCR法により解析を行ったが、Wtap変異胚においてcyclinA2 mRNAの発現はコントロール胚と変わらないことがわかった。さらに、Actinomycin DをES細胞で処理しcyclinA2 mRNAの安定性を解析したが、コントロールES細胞と明らかな差は見られなかった。昨年度及び1と2の結果から、Wtap変異胚は内胚葉と中胚葉の分化が誘導されないために致死となることが示唆され、これらの研究成果をDevelopment誌に投稿予定である。現在、Wtapの脳神経系における役割を解析するために、Wtap変異ES細胞を用いたキメラ解析により脳神経系細胞への分化能力の解析を始めている。

さらに、細胞増殖マーカーであるリン酸化ピストンH3抗体を用いて解析したが、コントロール胚と明らかな差は見られなかった。以上の結果から、少なくともマウス初期胚におけるWtapは、これまで言われていたcyclin A2のmRNAの安定化や細胞増殖の制御よりも、内胚葉と中胚葉の分化に必要であることを明らかにした。
光活性化アデニル酸シクラーゼ大量発現系の開発-活性化の分子機構解明をめざして-

本研究は、単細胞生物ミドリムシ由来の光センサー、光活性化アデニル酸シクラーゼ(PAC)の活性化の分子機構解明を目指すものであり、その第一段階としてミドリムシにおける薬剤感受性を明らかにし、さらにPACの遺伝子を単離してそれらの構造を明らかにした。これらは形質転換系確立の基本情報として重要であり、PACの大量取得と構造・機能解析へ向けての基礎となるものである。本研究は、申請者らが発見した青色光センサー、光活性化アデニル酸シクラーゼ(PAC)の活性化の分子機構を明らかにすることを最終目標とし、従来困難であったPAC試料の大量取得を目指してミドリムシにおける大量発現系の開発を行うものである。本年度は、大量発現系開発の基盤となるミドリムシ形質転換系を確立すべく以下2項に関して研究を進めた。1.薬剤感受性の検討ミドリムシにおいては、G418やハイグロマイシン等の真核生物用抗生物質を含めて系統的に薬剤感受性を調べた例は報告されていない。そこで、各種抗生物質を用意し、平板法および液体培養により、それぞれに対する最小生育阻害濃度を決定した。これにより、薬剤耐性スクリーニングの基盤が確立された。2.形質転換ベクターの開発形質転換を実現するためには、適切なプロモーターを選ぶことが必要だが、現在までにミドリムシで機能するプロモーターは全く知られておらず、そもそもコーディング領域全長が解明された遺伝子自体が僅かしかない。そこで、PAC遺伝子の構造を明らかにするために、ゲノムライブラリを構築し、PAC遺伝子のスクリーニングを行った。その結果、PACを構成する2種類のサブユニットをコードする遺伝子をそれぞれ単離することに成功した。それらの塩基配列を決定したところ、意外にもこれら2つの遺伝子のエクソン/イントロン構成は大きく異なることが明らかとなり、パラログ分化がごく早い時期に起こったことが示唆された。さらに、コーディング領域上流の配列決定を行い、薬剤耐性遺伝子と組み合わせたベクターを多数構築した。以上、本年度の研究において、形質転換実現に欠かせない重要な基礎情報を得ることができた。前年度において、大量発現系開発の基盤となるミドリムシ形質転換系を確立すべく、ミドリムシの薬剤感受性の検討、PAC遺伝子の単離と配列決定を行った。本年度は、これらの情報に基づいて実際に形質転換用ベクターを構築し、形質転換実現を試みた。前年度の検討により、ミドリムシはG418やzeocinに良好な感受性を示すことが明らかとなったので、neo遺伝子を導入したpZsGreen(Clontech)をベクターの基本骨格として用いた。これにミドリムシのrRNAをコードする環状DNAや、PAC遺伝子の上流部分を含むフォスミドクローンから得たDNA断片を挿入した形質転換ベクターを多数構築し、薬剤耐性ならびに蛍光をマーカーとしてスクリーニングした。しかしながら、結果としてこれまでに安定な形質転換体を得ることはできていない。このことはミドリムシにおいて本質的に形質転換が不可能であることを示すものではないが、相当の困難を要することは疑いなく、この努力を継続するよりは、むしろ現時点で遺伝子発現制御手法として実効性のあるRNAiに改良を加えていくことが早道のように思われる。そこで、今後は二本鎖RNA導入株のクローニング手法の確立に注力する。一方、本研究を背景として進めてきた共同研究により、PACの単一分子分光分析に成功し、最終目標であるPACの活性化機構解明に一歩近づくことができた。
有毛細胞不動毛におけるアクチン代謝制御に関する研究

PTPRQ(protein tyrosine phosphatase receptor Q)は内耳有毛細胞の不動毛に局在する膜蛋白であり,同分子の変異は不動毛の形態異常を生じる.本研究ではPTPRQが不動毛や微絨毛のようなアクチン突起の形成に及ぼす影響を,PTPRQの過剰発現ならびに異種性発現モデルを用いて検討した.GFPを結合した全長型PTPRQ,細胞外ドメイン欠失変異体,細胞内ドメイン欠失変異体の発現コンストラクトを作成し,蝸牛有毛細胞,支持細胞もしくはCOS7細胞に導入して,PTPRQの細胞内ターゲティングとアクチン突起形成に及ぼす影響を検討した.PTPRQの過剰発現により有毛細胞における不動毛の長さは変化しなかったが,全長型もしくは細胞内ドメイン欠失変異体を異種性発現した支持細胞において微絨毛は伸長した.PTPRQの異種性発現によるアクチン突起の伸長はCOS7細胞でも認められ,糸状仮足の長さおよび数が有意に増加した.本研究によりPTPRQの細胞外ドメインは支持細胞の微絨毛およびCOS7細胞の糸状仮足の伸長を促すことが分かった.PTPRQの細胞外ドメインは長く柔軟なファイブロネクチンドメインリピートで構成されているため,細胞膜で高分子ポリマーを形成して円柱状の曲面形成を安定させることでアクチン突起の伸長を促しているのではないかと考えられた.PTPRQの局在する不動毛基部では細胞膜の著しい曲面形成が見られ,PTPRQ欠失有毛細胞ではこのような特徴的な曲面形成が失われることから,PTPRQ細胞外ドメインは不動毛基部の形態維持に関わる可能性が示唆された.本研究で有毛細胞におけるPTPRQの機能の一端が示されたことにより,聴覚受容の分子機構の解明につながることが期待される.PTPRQ(protein tyrosine phosphatase receptor Q)は内耳有毛細胞の不動毛に局在する膜蛋白であり,同分子の変異は不動毛の形態異常を生じる.本研究ではPTPRQが不動毛や微絨毛のようなアクチン突起の形成に及ぼす影響を,PTPRQの過剰発現ならびに異種性発現モデルを用いて検討した.GFPを結合した全長型PTPRQ,細胞外ドメイン欠失変異体,細胞内ドメイン欠失変異体の発現コンストラクトを作成し,蝸牛有毛細胞,支持細胞もしくはCOS7細胞に導入して,PTPRQの細胞内ターゲティングとアクチン突起形成に及ぼす影響を検討した.PTPRQの過剰発現により有毛細胞における不動毛の長さは変化しなかったが,全長型もしくは細胞内ドメイン欠失変異体を異種性発現した支持細胞において微絨毛は伸長した.PTPRQの異種性発現によるアクチン突起の伸長はCOS7細胞でも認められ,糸状仮足の長さおよび数が有意に増加した.本研究によりPTPRQの細胞外ドメインは支持細胞の微絨毛およびCOS7細胞の糸状仮足の伸長を促すことが分かった.PTPRQの細胞外ドメインは長く柔軟なファイブロネクチンドメインリピートで構成されているため,細胞膜で高分子ポリマーを形成して円柱状の曲面形成を安定させることでアクチン突起の伸長を促しているのではないかと考えられた.PTPRQの局在する不動毛基部では細胞膜の著しい曲面形成が見られ,PTPRQ欠失有毛細胞ではこのような特徴的な曲面形成が失われることから,PTPRQ細胞外ドメインは不動毛基部の形態維持に関わる可能性が示唆された.本研究で有毛細胞におけるPTPRQの機能の一端が示されたことにより,聴覚受容の分子機構の解明につながることが期待される.
エネルギー回収型リニアックのための超伝導空洞の基礎研究

物質、生命科学探究のための次世代放射光光源や小型高輝度X線源として有望なエネルギー回収型リニアック(ERL)の基幹技術である超伝導高周波加速空洞に関する基礎研究を行った。新設計の9連型超伝導空洞の性能を調査するとともに周辺機器についても最適設計とその性能試験を行い、それらを収容し極低温での運転を可能にする専用の低温容器構造の概念設計も行った。大電流電子ビームを加速するエネルギー回収型リニアックを実現するために開発を要する構成要素には、エネルギー効率の良い超伝導加速空洞本体、高周波電力を供給するための入力結合器、加速ビーム自身が作る有害高調波を吸収減衰させるための高調波減衰器、およびこれらを収容するためのクライオスタットがある。研究1年目の主な研究成果は以下の通りである。・提案する加速効率の良い9連型空洞の性能計測をし、17MV/mという高い加速電場を得た。この結果、本課題で採用する空洞の基本形状が決定した。・加速電場を制限しているのは空洞内に発生している強い電子放出現象であり、より高い電場を得るためにはその放出源を特定し処置する必要がある。その手段として空洞壁に衝突する電子が発生するX線を検出するための空洞診断システムを考え、それを完成させた。次年度からはこれを用いた診断を開始する。・本空洞は9セル構造であり、他の研究所が採用している5連型、7連型に比べ空間の効率が良い反面、高調波の取り出しが難しくなるが、口径が大きいビームパイプと高調波減衰器を組み合わせることでそれを補っている。モデルを用いた高調波の計測では、計算通りに減衰させることができることが判明した。・高調波減衰器は80Kで運転されるため、80Kでの高周波吸収特性が優れた吸収材を探す必要である。そのため80Kでの吸収特性を計測する手法を完成し、数種類のフェライトとセラミックの特性を計測・比較した。その結果、TDK社の新IB004が低温領域でも15GHz以上の周波数範囲にわたって優れた吸収特性を示すことが判明したため、これを採用することにした。・新IB004の場合は、必要な吸収体は厚さ2mm、長さ80mm程度の円筒形であることが分かった。これを銅パイプ内面に完全に焼成・接合させる方法としてHIP法を採用、その施工試験を実施し、最適施工条件を決定した。研究2年目の主な研究成果は以下の通りである・1年次および2年次の結果をコーネル大学で開催されたERL09会議、およびベルリンで開催されたSRF2009会議で報告した。・空洞開発では、引き続きERLに最適化した9連空洞の性能評価試験を行い25MV/mの加速性能を確認したが、空洞内部の放電による電圧の劣化を観測した。空洞内部の現象とその場所を知るために温度と放射線の分布計測を行い、また小型CCDカメラによる内部観察を行い、内面に微小な突起を見つけ機械的に削り落とした。その後この低温を準備している。・入力結合器開発ではベローズ部の高周波発熱対策が重要であり、銅メッキの厚みを決定するためのメッキ試験を行いメッキ厚みの分布を調査した。また電力試験での放電からセラミック窓を保護するためにアークセンサーを購入して電力試験を実施し、所定の20kWを達成した。・高調波減衰器の開発では、クシ歯型ベローズ部のモデルを作り、その稼働寸法を計測した結果、クライオスタット設計の参考値を得た。・クライオスタット開発では、空洞冷却時の真空シール対策として、ニオブの線膨張率に近いチタン材を用いた実寸大のフランジを製作し、そのヘリウム冷却試験を行った。2Kまで冷却したところで実働時の荷重を模した試験を実施し、真空シール材やシール部寸法、冷却速度など、クライオスタット設計に必要な数値を得た。また、運転時に空洞にかかる応力を計測するために必要なロードセルの低温での動作特性を計測し、低温下で使用するロードセルを決定した。エネルギー回収型リニアックの基幹要素としては、エネルギー効率の良い超伝導加速空洞本体、高周波電力を供給するための入力結合器、有害高調波を吸収減衰させるための高調波減衰器、およびこれらを収容するクライオスタットなどである。研究3年目の主な研究成果は以下の通りである。1,これまでの研究で最適化された加速空洞の形状を実現するために、成形や溶接、機械表面処理など製作に関わるパラメーターを最適化して、形状や機械強度、加速性能を保証する製作手法を確立した。それにより28MV/mの加速電場を有する空洞が得られた。2,入力結合器開発では、試作した結合器を液体窒素で冷却して現実に近い条件で電力試験を行い、要求を上回る25kWのCW電力を安定に印加することに成功した。これにより、熱侵入対策や内外導体の冷却、セラミック窓のエージング手法などに関する基礎試験が完了した。

3,高調波減衰器では、HIP工法を用いて銅ダクト内面にフェライトを焼成しその冷却試験を行った。この結果、要求される高調波減衰特性と冷却性能、熱絶縁性能を検証するとともに、冷却速度など実用上の必要なパラメーターを得ることができた。4,空洞周波数を制御するための周波数チューナを試作し、精密調整するためのpiezo素子と昨年度試験したロードセルを組み込んで動作試験を行った。室温での試験では必要な動作精度が確認され、チューナーの基本設計指針が確立した。5,超伝導空洞には、地磁気が補足されてできる常伝導部とそこが発生するジュール損失を防ぐ目的で磁気遮蔽が必要であるが、低温で優れた遮蔽性能を示す決定的な材料は未確立である。このため材料とその焼鈍条件を試験し、遮蔽構造や板厚など設計に必要な基礎データーを得た。6,これらの基幹要素を含む9セル型空洞2台を収納するクライオモジュールを設計した。これらの成果をIPAClOや日本加速器学会などで発表した。
英語教育の質的向上を目指した実践研究法の整備と可能性の探究

本研究の目的は、実践研究において実践者(教師)が直面する研究方法に関わる課題を明らかにしながら、様々な目的に応じた適切な研究方法を整理し、英語教師が持続可能で実りある実践研究を行うための研究方法を提案することである。次の3つの観点から研究計画を立てている。(1)実践研究に関する先行研究の中で使われている研究手法について整理する。(2)実践研究での研究手法について実践者(教師)が直面する課題は何かを明らかにする。(3)英語教育における実践研究の研究手法のあり方(コツとポイント)を提案する。平成30年度の研究では、実践研究での研究手法について実践者(教師)が直面する課題を明らかにし、実践研究の方法論を整理し、精緻化するための検討を行った。そこで、以下の3つの段階で、役割分担のもと研究を行った。上記の実践研究を行いながら、全体ミーティングを数回実施し、各実践研究及び実践研究の方法論について意見交換を行った。【第1段階】<協働での実践研究>研究代表者、研究分担者と研究協力者が協働して実践研究に取り組んだ。各自が実践研究を行いながら、適宜全体でも振り返り、各実践研究について多角的に意見交換を行った。[研究代表者・研究分担者・研究協力者が担当]【第2段階】<実践研究における課題の明確化>第1段階で実践を行った実践者を対象に調査を実施する。実践研究を行った意義や、実践を行う中で生じた課題について明らかにした。[研究代表者・研究分担者・研究協力者が担当]【第3段階】<課題に対する解決策の探求>第2段階で明らかにした方法論的課題について先行研究から事例を収集したり[研究代表者・研究分担者が担当]、実際に実践研究を行ったり[研究協力者が主に担当]する中で課題の解決策を探求した。調査結果は研究会や学会で発表し論文化した。[研究代表者・研究分担者が担当]当初の計画どおりに、研究が進捗している。平成29年と30年度の研究成果を整理し、英語教育における実践研究法のあり方を提案する。以下の4つの観点で研究成果を整理し、役割分担のもと書籍の形にまとめ刊行する。【観点1】<各実践研究法の理論的な枠組み>実践研究の定義、科学的研究との違い、実践研究の種類(アクション・リサーチ、探求的実践、レッスン・スタディなど)の提示と各手法の特徴などを整理し提示する。その際には具体的な研究例を数多く取り上げ、具体例を踏まえた理論的枠組みを整理する。[研究代表者・研究分担者が担当]【観点2】<研究の進め方>実践研究における問いの探し方、問いの種類や整理の方法、データの種類、データの収集・分析における注意点などを平成30年度に実施した実践に基づき具体例とともに提示する。[研究分担者が担当]【観点3】<実践研究をめぐる諸問題の整理とその対策>実践者が直面した実践研究の課題について、整理し提示する。また、提示された課題についての対象方法について平成30年度に実施した実践に基づき具体例を取り入れながら提示する。[研究分担者・研究協力者が担当]【観点4】<実践研究を行った教師の語り>実践研究を行って教師が感じたことを、実践者自身の語りをとおして示す。具体的には、実践研究を行う意義や課題、実践者の意識の変化などについての語りを通して明らかにする。[研究分担者・研究協力者が担当]平成29年度の研究目的は、実践研究に関する先行研究の中で使われている研究手法について整理することであった。そこで、以下の3つの段階を設け、図のように役割分担し研究を行った。また、上記に加え、研究分担者及び研究協力者が協働しながら、実践研究に取り組んだ。これらの実践研究を行いながら、ミーティングの場において、適宜全体でも振り返り、各実践研究について多角的に意見交換を行った。【第1段階】実践研究法の理論的枠組みの整理過去の研究で探求した「実践研究の定義」を踏まえ、アクション・リサーチや探求的実践、レッスン・スタディなどこれまで提案されている実践研究法を比較し、理論的観点の整理を行った。【第2段階】先行研究文献の収集実践研究論文の収集を行った。これまで行ってきた英語教育における実践研究手法の調査を踏まえて、文献の収集範囲を英語教育だけでなく、日本語教育や教育心理学など、他領域に広めた。【第3段階】実践研究法の傾向の整理第2段階で収集した先行研究を調査し、第1段階で作成した方法論的観点から問いの絞り方、データのタイプ、データの収集方法、データ分析などの観点から実践研究で用いられている研究手法について分析した。当初の計画どおりに、研究が進捗している。

平成30年度の研究では、実践研究での研究手法について実践者(教師)が直面する課題を明らかにし、実践研究の方法論を整理し、精緻化するための検討を行った。そこで、以下の3つの段階で、役割分担のもと研究を行った。上記の実践研究を行いながら、全体ミーティングを数回実施し、各実践研究及び実践研究の方法論について意見交換を行った。【第1段階】<協働での実践研究>研究代表者、研究分担者と研究協力者が協働して実践研究に取り組んだ。各自が実践研究を行いながら、適宜全体でも振り返り、各実践研究について多角的に意見交換を行った。[研究代表者・研究分担者・研究協力者が担当]【第2段階】<実践研究における課題の明確化>第1段階で実践を行った実践者を対象に調査を実施する。実践研究を行った意義や、実践を行う中で生じた課題について明らかにした。[研究代表者・研究分担者・研究協力者が担当]【第3段階】<課題に対する解決策の探求>第2段階で明らかにした方法論的課題について先行研究から事例を収集したり[研究代表者・研究分担者が担当]、実際に実践研究を行ったり[研究協力者が主に担当]する中で課題の解決策を探求した。調査結果は研究会や学会で発表し論文化した。[研究代表者・研究分担者が担当]当初の計画どおりに、研究が進捗している。平成30年度の研究では、実践研究での研究手法について実践者(教師)が直面する課題を明らかにする。そこで、以下の3つの段階で、図に示すような役割分担のもと研究を行う。【第1段階】協働での実践研究開始研究代表者、研究分担者と研究協力者がペアで協働して実践研究に取り組む。各ペアでの実践研究を行いながら、適宜全体でも振り返り、各実践研究について多角的に意見交換を行う。【第2段階】実践者を対象とした本調査第1段階で実践を行った実践者を対象に調査を実施する。実践研究を行った意義や、実践を行う中で生じた課題について調査を行う。【第3段階】課題に対する解決策の探求第2段階で明らかにした方法論的課題について先行研究から事例を収集したり、実際に実践研究を行ったりする中で課題の解決策を探求する。調査結果は研究会や学会で発表し論文化する。平成29年と30年度の研究成果を整理し、英語教育における実践研究法のあり方を提案する。以下の4つの観点で研究成果を整理し、役割分担のもと書籍の形にまとめ刊行する。【観点1】<各実践研究法の理論的な枠組み>実践研究の定義、科学的研究との違い、実践研究の種類(アクション・リサーチ、探求的実践、レッスン・スタディなど)の提示と各手法の特徴などを整理し提示する。その際には具体的な研究例を数多く取り上げ、具体例を踏まえた理論的枠組みを整理する。[研究代表者・研究分担者が担当]【観点2】<研究の進め方>実践研究における問いの探し方、問いの種類や整理の方法、データの種類、データの収集・分析における注意点などを平成30年度に実施した実践に基づき具体例とともに提示する。[研究分担者が担当]【観点3】<実践研究をめぐる諸問題の整理とその対策>実践者が直面した実践研究の課題について、整理し提示する。
英国水法の比較法的研究(水環境を重視した水利用権の再構成と立法政策上の課題)

(1)イギリスの水利権の法律的構成、その多様な性格沿岸権(河岸所有者権)は河川の堤防の土地を所有することから発生し、またそれに付随する財産権である。他方この権利は、沿岸権者間に存する正義と衡平の原理を伴う自然の権利として、固有の性質を有する。それは、不法行為の訴訟に基づき、特定の損害を立証せずして保護されうる。さらに現代において、沿岸権は、水質を保持する効力の側面を除き、水資源の保護と涵養を目的とした立法による制限を受けている。しかし、従前の慣行的諸準則は制定法の諸条件と緊密な関係性を保ち、かつそれらに反映されていることが見い出される。(2)水の行政組織の体制の変遷とそこに見る法政策水の行政期間は、水系主義に基づき段階的に統合整備されてきた。それをリ-ドしてきた水政策は集中的河川流域管理であり、統合された行政機関は、水文学的循環に対応して多方面にわたる水事業の運営管理をし、水環境保護の役割も兼務してきた。その後水事業の民営化を契機として、行政機構が再構成され、取水、排水許可等の規制業務を留保した単一の全国組織、NRAが誕生した。現在の法律体制は、行政機関が、より効果的に水生環境保護の施策を実行できる体制であると言えよう。(3)水事業の民営化の社会的経済的背景民営化の議論は、従来のシステムに基づく財政状況の悪化がその端緒であった。それは、汚水処理能力の低下という欠陥において顕著であった。その後、議論は立法の過程を通じて水事業の民間部門への移行と規制部門の分離という形態に収斂する。結果として、民営化の立法は、水の管理に市場原理を適用すると共に、保水政策に重点を置いた新しい法制度の局面を作り出した。民営化を契機とした水の行政改革は、水事業が孕んでいる根本的な公法上の問題とそれに対する解決策の一つの例証となる。
好塩基球を標的としたアトピー性皮膚炎の新治療の試み

ヒト皮膚疾患における病変部好塩基球各種皮膚疾患のなかで、病変部に好塩基球の存在が確認される頻度の高い疾患は、アトピー性皮膚炎、痒疹、蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、好酸球性膿疱性毛包炎、アナフィラクトイド紫斑などであった。末梢血中の好塩基球の活性化状態をCD203c発現を指標に評価した。蕁麻疹、痒疹患者において健常人より有意に高いCD203c発現がみられた。好塩基球がその発症に必須とされているTNP-IgE依存性慢性アレルギー反応モデル(IgE-CAI)を用いてPGD2受容体の関与を検証した。PGD2受容体の一つであるCRTH2受容体を欠損させたマウスでのIgE-CAIはwild-typeマウスに比して減弱していた。Iアトピー性皮膚炎患者末梢好塩基球と表面のCRTH2発現の検討:アトピー性皮膚炎患者の末梢血を用いてFcεRI(+)/CD123(+)好塩基球とその細胞表面におけるCRTH2の発現をフローサイトメトリーで観察した。また同時に貨幣状湿疹、痒疹、蕁麻疹などの疾患患者においても同様の検討をおこなった。しかし、現時点では健常人と比較していずれの疾患においても統計学的に有意な差をもって末梢好塩基球数が増加している疾患はみられていない。またプロスタグランジンD2受容体であり細胞遊走にも関与するCRTH2の発現量においても有意な差はなかった。IIアトピー性皮膚炎病変部における好塩基球浸潤アトピー性皮膚炎患者病変部において好塩基球の浸潤がみられるか否かについて免疫組織学的に検討した。抗体は英国サザンプトン総合病院のWalls先生より供与いただいた好塩基球特異抗体(BB1)を用い、共同研究として行った。現在のところアトピー性皮膚炎病変部の一部において少数ながら好塩基球浸潤がみられることが確認されている。一方、尋常性乾癬の病変部においては好塩基球浸潤は全く認められていない。今後、アトピー性皮膚炎の急性病変や慢性病変を含めた種々の病変部、さらにダニ抗原などによって誘導される遅発反応における好塩基球浸潤を検討する予定である。IIアトピー性皮膚炎病変部における好塩基球浸潤アトピー性皮膚炎患者病変部において好塩基球の浸潤がみられるか否かについて免疫組織学的に検討した.抗体は英国サザンブトン総合病院のWalls先生より供与いただいた好塩基球特異抗体(BB1)を用い、共同研究として行った。研究成果1ヒト皮膚疾患における病変部好塩基球各種皮膚疾患のなかで、病変部に好塩基球の存在が確認される頻度の高い疾患は、アトピー性皮膚炎、痒疹、蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、好酸球性膿疱性毛包炎、アナフィラクトイド紫斑などであった。肥満細胞症、尋常性乾癬、腫瘍病変には全く認められなかった。アトピー性皮膚炎病変部における好塩基球数は他の疾患に比べてむしろ低い傾向にあったが、ダニ抗原でパッチテストを行った陽性反応部位では顕著に好塩基球が浸潤していた。2末梢好塩基球の活性化について末梢血中の好塩基球の活性化状態をCD203c発現を指標に評価した。尋常性乾癬患者の好塩基球では活性化はみられなかった。アトピー性皮膚炎患者では発現のばらつきが大きく、健常人との有意差を検出できなかった。しかし、アトピー性皮膚炎患者の中には明らかに高いレベルのCD203cを発現している群がみられた。

好塩基球がその発症に必須とされているTNP-IgE依存性慢性アレルギー反応モデル(IgE-CAI)を用いてPGD2受容体の関与を検証した。PGD2受容体の一つであるCRTH2受容体を欠損させたマウスでのIgE-CAIはwild-typeマウスに比して減弱していた。一方、もう一つの受容体であるDP受容体を欠損させたマウスでは反応に変化はみられなかった。またCRTH2/DP両受容体欠損マウスではCRTH2単独欠損マウスと同様に反応が減弱していた。さらにwild-typeマウスにCRTH2特異的アンタゴニスト(CAY-10471,2mg/kg)を経口投与したところ、反応が抑制された。耳介腫脹が減弱は組織中の好塩基球数減少と相関していた。
ドイツ・デンマークの市場活用型国際環境援助戦略の効果

ドイツ・デンマークが行った市場活用型の国際環境援助戦略は,日本の(公害対策)経験普及型援助や世界銀行の政策改革支援と比較して,中国及びタイでの再生可能エネルギーの普及に関しては,大きな効果を挙げた.また,気候変動と従来型の開発援助や環境援助との相乗効果を高めるようにデザインの変更をもたらしている.しかしこうした措置も,必ずしも援助効果,特に受取国の当事者意識の向上をもたらしたわけではなかったドイツ・デンマークが行った市場活用型の国際環境援助戦略は,日本の(公害対策)経験普及型援助や世界銀行の政策改革支援と比較して,中国及びタイでの再生可能エネルギーの普及に関しては,大きな効果を挙げた.また,気候変動と従来型の開発援助や環境援助との相乗効果を高めるようにデザインの変更をもたらしている.しかしこうした措置も,必ずしも援助効果,特に受取国の当事者意識の向上をもたらしたわけではなかった2009年度は,3つの点の研究を進めた.第1に,デンマーク及びドイツが環境援助を行う際に用いた環境言説(environmental discourse)の内容と,それを環境援助を活用して途上国に伝達する戦略を,世界銀行及び日本との比較から明らかにした.同時に,タイと中国の環境援助の事例を取り上げて,そのパフォーマンスの相違を,環境援助の言説,伝達戦略,受取国のオーナーシップの観点から検討した.そしてこの検討結果を論文として執筆し,英文学術雑誌に投稿した.第2に,デンマークとドイツがヴェトナムで行ってきた環境援助の内容について,現地調査と統計分析,ドイツの援助専門家への聞き取り調査を通じて把握し,その特徴を考察した.第3に,中国に対する環境援助の効果を検討する前提として,中国の環境政策の変遷と特徴を,財政面と先進国(及び国連環境会議)からの影響の観点から検討した.この結果,財政サイクルの各段階(中期財政計画・年次予算立案・予算執行・モニタリングと事後評価・歳入)で環境は考慮に入れられるようになっているものの,考慮のされ方は分断的で,かつモニタリングと事後評価からのフィードバックがほとんどないことから統合化は進んでいないこと,また環境援助は国家環境保護総局と国家発展改革倭員会の間での分断のために,統合的な政策の変化の駆動力にはなりにくくなっていることを明らかにした.そしてこの検討結果を,2010年7月にカナダ・モントリオールで開催された第4回環境資源経済学世界大会で報告した.第1に,昨年度までの研究の知見に基づいて英文論文を投稿し,Journal of Environment and Developmentに掲載された.これは主にタイと中国に供与された世界銀行,ドイツ・デンマーク,日本の環境援助プロジェクト・プログラムのうち類似のものを取り上げ,なぜ同じ問題に対して異なるアプローチ(援助)をとったのか,また異なるアプローチを、とることによって援助効果にどのような相違が生じたのかを検討した.この結果,異なるアプローチをとったのは,環境援助に固有の効果発現を阻む障壁を克服する際の政策施行,受取国との権力関係,資源動員能力の相違に起因できることを明らかにした.同時に,異なるアプローチをとったことによる援助効果の上昇効果は,検討した分野ではあまりみられず,むしろ受取国が環境保全を積極的に主導する誘因に大きく影響を受けてきたことを明らかにした.第2に,ヴェトナムでの聞き取り調査の結果,環境援助供与機関の間の競合はヴェトナム投資計画省が調整しているため,同じプロジェクトの間での直接的な競合は起こりにくくなっている.しかも,日本はヴェトナムにおいても水分野への援助では,従来型の大都市を対象とした大規模上下水道システムの整備とシステム管理能力向上,料金制度導入のための支援を行っているが,ドイツは政府方針として全ての援助に気候変動の要素(緩和ないし適応)を組み込むことになったために,従来型の大規模上下水道システムの導入から分散型・中規模システムに転換した.この点で,同一プロジェクトの競合から事業モデル間の競争へと転化していることが明らかとなった.本研究は,ドイツ及びデンマークが,自国で導入した「革新的」政策と自国で開発した「革新的」環境保全型技術を,環境援助を通じていかに一体的に途上国に普及させ,途上国の持続可能な発展にどのようなインパクトをもたらしたのかを,日本との対比において明らかにすることを目的とするものである.平成23年度は,ドイツ国際協力公社(GIZ)及びデンマーク外務省,コペンハーゲン大学にて研究成果の報告を行ってフィードバックを受けるとともに,2009年の気候変動枠組み条約に関するコペンハーゲン合意以降の両国の環境援助の進展に関する新たな知見を得た.要約すると,(1)援助を通じた「革新的」政策と「革新的」環境保全型技術のパッケージの国際的な普及は限定的な効果しか挙げておらず,グリーン経済・低炭素発展という新たな枠組み・目標の下で再編される必要があるとの認識に変化してきた.(2)グリーン経済・低炭素発展も,アフリカなどの後発途上国では経済的な便益を生まない環境保全と理解されているため,国家発展戦略として推進されているわけではない.そこで環境援助の内容を,開発目標と統合できるようなものに変更してきているが,まだその効果は発現していない.(3)同時に,気候変動に脆弱な分野・地域を同定し,気候変動への適応力を高める支援を増やしているが,効果の測定は容易ではなく,暗中模索状態である.本研究では,2011年3月に世界銀行,ドイツ・デンマーク,日本の環境援助の論理と戦略を比較した論文を,2013年3月にフランス政府の支援を受けたNGOによる環境援助の効果と課題を伝統的な環境援助と比較した論文を公表してきたが,必ずしも上記の知見を十分に活用できているわけではない.今後執筆する論文で,研究成果として公表してゆきたい.24年度が最終年度であるため、記入しない。
電磁気学的視点を加味した生体硬組織生成の解析と医用材料への応用

本研究では、アパタイトの電磁気学的な性質を明確にし、特異な表面特性をもつセラミックスを創出するのと同時に、アパタイトの電磁気学的な特異性が、生体の骨や歯牙などの硬組織の形成に対して与えている影響を明らかにし、医用材料設計の新たな指針を得ることを目的として研究を行った。その成果を概説すると以下のようになる。アパタイトの電磁気学的な検討熱刺激電流測定の結果から水酸アパタイトは分極が可能でありその大きさはチタン酸バリウムに匹敵していた。また、この分極はプロトンの移動によることを明らかにした。分極の緩和は室温では非常に遅く、エレクトレットを形成していたことがわかった。分極アパタイトにおける擬似体液中での結晶成長の検討分極により電荷が表面に誘起したアパタイト上では、擬似体液中での骨類似結晶の析出が負電荷面では促進、正電荷面では抑制され、生体活性が変調されていることを明らかにした。分極アパタイトが培養細胞系に及ぼす影響の検討分極により電荷が表面に誘起したアパタイト上では、骨芽様細胞の増殖が負電荷面では促進、正電荷面では抑制され、細胞に対する活性がコントロールできる明らかにした。分極アパタイトが動物実験系に及ぼす影響の検討分極により電荷が表面に誘起したアパタイト上では、骨芽様細胞の増殖が負電荷面では促進されセラミックス上に新生骨が通常の4倍以上加速されて生成した。また、正電荷面では抑制されるのではなく、線維性組織を介した部位の骨新生が加速されていた。以上より、水酸アパタイトセラミックスの骨誘導機能を分極処理により強化できることを実証した。水酸アパタイト(HAp)の焼結体を分極誘起し、その表面上での結晶成長、培養細胞ならびに生体組織に及ぼす効果を調べた。直流電界によって分極処理した焼結体をSBF中に浸漬したところ、未分極の試料と較べて試料表面上に生成するHAp結晶の成長速度に差が見られた。分極処理した正極側の面上と負極側の面上とでも結晶成長に差が見られ、負極に帯電した面上では結晶の成長が著しく、逆に正極に帯電した面上では結晶成長が抑制された。また、分極処理したHApコーティング膜についても同様の実験を行ったところ、焼結体の場合と同様に負極面上で結晶成長の促進効果が認められた。骨芽様細胞株を用いて分極HAp上の細胞挙動を観察した結果、負極に帯電した面上では成長した生成結晶の上で細胞が活発に増殖したのに対し、正極側の面上では増殖細胞の数がそれほど多くないことが明らかになった。さらに次年度以降の研究計画遂行のため、分極HApの動物組織反応の予備実験を行い、試料の周囲界面組織の脱灰および非脱灰標本により観察した。その結果、埋入した試料に接した組織は分極面によって局部的に変化を認めた。これらホモ結晶成長に対し、酸・塩基性ミョウバン水溶液を用いて硫酸カリウムおよび石膏の結晶成長すなわちヘテロ結晶成長についても検討を行なった。

結果、負極に帯電した面上では硫酸カリウム樹枝状結晶が多く観察され、逆に正極に帯電した面上では自形の結晶のみ観察された。骨芽様細胞株や神経細胞を用いて分極HAp上の細胞挙動を観察した結果、負極に帯電した面上では成長した生成結晶の上で細胞が活発に増殖したのに対し、正極側の面上では増殖細胞の数がそれほど多くないことが明らかになった。さらに分極HApの動物組織反応の予備実験を行い、試料の周囲界面組織の脱灰および非脱灰標本により観察した。その結果、埋入した試料に接した組織は分極面によって局部的に変化を認められ、未分極の試料周囲に比べ分極処理した試料周囲には新生骨が多く観察された。本研究では、アパタイトの電磁気学的な性質を明確にし、特異な表面特性をもつセラミックスを創出するのと同時に、アパタイトの電磁気学的な特異性が、生体の骨や歯牙などの硬組織の形成に対して与えている影響を明らかにし、医用材料設計の新たな指針を得ることを目的として研究を行った。本年度においては、分極特性の材料学的な検討、培養細胞系における検討、動物実験による検討を中心に行い、分極により電荷を表面に誘起したアパタイトセラミックスの骨誘導について検討した。本年度の成果としては以下の項目をあげることができる。アパタイトの電磁気学的な検討熱刺激電流測定の結果から水酸アパタイトは分極が可能でありその大きさはチタン酸バリウムに匹敵していた。また、この分極はプロトンの移動によることを明らかにした。分極の緩和は室温では非常に遅く、エレクトレットを形成していたことがわかった。分極アパタイトが培養細胞系に及ぼす影響の検討分極により電荷が表面に誘起したアパタイト上では、骨芽様細胞の増殖が負電荷面では促進、正電荷面では抑制され、細胞に対する活性がコントロールできる明らかにした。分極アパタイトが動物実験系に及ぼす影響の検討分極により電荷が表面に誘起したアパタイト上では、骨芽様細胞の増殖が負電荷面では促進されセラミックス上に新生骨が通常の4倍以上加速されて生成した。また、正電荷面では抑制されるのではなく、線維性組織を介した部位の骨新生が加速されていた。
新規ドーパ受容体の機能解析

ドーパは長らく単なるドパミンの前駆体として位置づけられてきた。我々は、1986年以来、ドーパ自体による薬理作用、ドーパの神経伝達物質様遊離、ドーパ拮抗薬の存在等を証明し、これらを通じて「ドーパ神経伝達物質仮説」を提起した(Misu and Goshima, 1993)。本研究は、眼白子症の原因遺伝子の1つocular albinism1 (oa1)がコードする蛋白質OA1がドーパ受容体として作動するとともに、中枢神経系及び末梢組織における発現を初めて明らかとした。薬理学あるいは生命科学領域において、新たな生理活性物質を発見し、その生体内における役割、および病態生理学的意義を明らかにすることは最も重要な課題の一つである。ドーパは従来、もっぱら神経伝達物質ドパミンの前駆体としてのみ位置付けられ、それ自体は活性がないと考えられてきた。我々は、ドーパが神経興奮に応じて遊離されること、ドパミンへの変換を介さずに一定の薬理学的応答を惹起すること、ドーパ作用を競合的に阻害する拮抗薬が存在することを示し、ドーパ神経伝達物質仮説を提起した(MisuandGoshima,1993)。従来までに、ラット孤束核(NTS)におけるOAIのshRNAによる発現抑制が、同部位に微量注入したドーパが惹起する血圧下降・徐脈応答を抑制する一方、グルタミン酸を微量注入した際の同様の心血管応答には無作用であることを証明した(論文投稿中)。またOAIに対する特異抗体を作製し、マウス脳における免疫組織か学的解析を行った。その結果、OA1のシグナルはNTS領域に発現すること、その他の脳部位、視床下部正中隆起、嗅球、大脳皮質、海馬、小脳などに広く分布することを見いだした。一方、3H-DOPAを放射性リガンドとしてOA1発現細胞株において結合実験を行った。3H-DOPAは、OA1発現細胞において高親和性結合を示し、この結合は、我々が既に見いだしているドーパ拮抗薬であるDOPAcyclohexylester(DOPACHE)により濃度依存的に置換されることを確認した。このDOPACHEをNTSの両側に微量注入すると、フェニレフリンの末梢投与による徐脈応答を抑制することを見いだした。これらの結果は、OA1がドーパを介して圧受容器反射応答を媒介することを示している。また3H-DOPA結合を阻害する化合物スクリーニングを行ったところ、新規化合物Xが同結合を置換することを見いだした。我々は、ドーパが神経興奮に応じて遊離されること、ドパミンへの変換を介さずに一定の薬理学的応答を惹起すること、ドーパ作用を競合的に阻害する拮抗薬が存在することを示し、ドーパ神経伝達物質仮説を提起した(Misu and Goshima, 1993)。従来までに、ラット孤束核(NTS)におけるOA1のshRNAによる発現抑制が、同部位に微量注入したドーパが惹起する血圧下降・徐脈応答を抑制する一方、グルタミン酸を微量注入した際の同様の心血管応答には無作用であることを証明した(Hiroshima et al, 2014)。またOA1に対する特異抗体を作製し、マウス脳における免疫組織化学的解析を行った。その結果、OA1のシグナルはNTS領域に発現すること、その他の脳部位、視床下部正中隆起、嗅球、大脳皮質、海馬、小脳などに広く分布することを見いだした(投稿準備中)。oa1遺伝子欠損マウスの作製に成功し、ドーパのNTSにおける血圧下降・徐脈応答が、OA1を介するものであるかどうかを確認した。同欠損マウスにおいて、NTSに微量注入したドーパの作用は全く見られなかった。一方、微量注入グルタミン酸応答は野生型と比較し、差が認められなかった。さらに、フェニレフリンの末梢静脈内投与による圧受容器反射機能を評価した。oa1遺伝子欠損マウスにおいては、フェニレフリンによる圧受容器反射機能が低下するとの結果が得られた。本結果は、OA1が生体内において血圧調節を含む自律神経系機能調節に一定の役割を果たす事を示す。

我々は、ドーパが神経興奮に応じて遊離されること、ドパミンへの変換を介さずに一定の薬理学的応答を惹起すること、ドーパ作用を競合的に阻害する拮抗薬が存在することを示し、ドーパ神経伝達物質仮説を提起した(Misu and Goshima, 1993)。従来までに、ラット孤束核(NTS)におけるOA1のshRNAによる発現抑制が、同部位に微量注入したドーパが惹起する血圧下降・徐脈応答を抑制する一方、グルタミン酸を微量注入した際の同様の心血管応答には無作用であることを証明した(Hiroshima et al, 2014)。当該年度においては、oa1遺伝子欠損マウスの作製に成功し、同マウスの表現型解析を行った。同欠損マウスにおいて、NTSにおけるドーパ応答が欠失していることを確認した。また野生型、oa1遺伝子欠損マウス個体間の比較を行い、抗OA1抗体による免疫染色陽性像が、海馬、大脳皮質、視床下部、手綱核、下位脳幹部などの中枢神経系のみならず、肝臓、腎臓、脾臓、肺などの末梢臓器にも存在することが明らかになった(Fukuda et al., 2015)。さらに、oa1遺伝子欠損マウスにおいては、フェニレフリンによる昇圧応答が減弱することを発見した。この知見を契機として、OA1が血管作動性物質に対する感受性を制御することを示唆する結果を得つつある。本結果は、OA1が生体内において血圧調節を含む自律神経系機能調節に一定の役割を果たす事が明らかとなってきた。26年度が最終年度であるため、記入しない。神経生物学、分子薬理学26年度が最終年度であるため、記入しない。本計画調書で予定していた研究計画のうち、1)孤束核のOA1がドーパ応答を介すること2)ドーパの新規リガンドのスクリーニング3)OA1を介する新たな作用の発見4)oal遺伝子欠損マウスの作製にいずれも成功した。oa1遺伝子欠損マウスの作製に成功した。この遺伝子改変マウスの表現型解析により、OA1が、NTSにおけるドーパ応答を媒介する受容体であることの確証を得ることができた。さらに、OA1に特異的抗体の作製に成功し、脳内を中心とする生体内局在を明らかにしつつある。こうした状況の中、新たにoa1遺伝子欠損マウスにおいてフェニレフリンによる昇圧と圧受容器反射低下が見出された。この知見は、OA1が血圧制御を担う分子として生体内で作動していることを示す。またOA1の広範な生体内分布は、従来の予想を超えたドーパーOA1シグナル伝達系の存在を示唆する。OA1の新規のリガンドを確定する。またOA1を介するシグナル伝達系を明らかにする。oa1遺伝子欠損マウスの表現型解析を行う。oa1遺伝子欠損マウスにおけるフェニレフリン昇圧・圧受容器反射機構の低下の責任部位を明らかとするため、中枢神経系と末梢神経系および血管平滑機能の各々のフェニレフリン応答を野生型と比較・検討する。OA1分布の認められた視床下部、海馬、大脳皮質、嗅球などの脳内部位が担う生理学的機能(学習記憶、内分泌機能、嗅覚、知覚神経機能など)を評価する。また、引き続き、OA1のリガンド探索、薬物依存への関与等についても検討を行う。OA1の両側ノックダウンにより、個体が致死に至るという予想外の状況が発生した。この現象のメカニズムを解明するため、当初予定していた以外の実験準備を行うべき状況が生じた。そのため、適正な選択を行った上、慎重に必要な消耗品などの手配が必要となり、次年度への助成金繰越が生じた。