hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非均質な膜モデルにおける相転移とその応用法に関する研究

膜を構成する脂質分子の流動性を摸擬したfluid膜モデルと流動性を持たないcrystalline膜モデルを3角形分割された球面上で定義し,膜骨格や穴の存在といった非均質成分がその形態変化の相転移に与える影響および形態変化に果たす役割等について研究した。その結果「これらの非均質成分は従来の均質な膜モデルに起こる形態変化の相転移に大きな影響を与える」ことが明らかになった。例えば,膜骨格と脂質分子の流動性は膜の形態変化の多様性に関わること,さらに,膜がつぶれるcollapsing相転移と膜揺らぎ相転移は一般には2つの別のものであること,などが分かった。1.多数の穴の空いた球面状の膜では,表面揺らぎの相転移は起こらず,1次の崩壊相転移のみが起こる。このとき,穴の大きさは熱力学的極限において,膜のサイズと同等の大きさであるものが仮定される。2.膜骨格をモデル化したある球面状の膜モデルでは,1次の表面揺らぎの相転移と1次の崩壊相転移が同時に起こる。このとき,骨格には1次元曲げエネルギー,骨格のjunction部には2次元の曲げエネルギーを仮定した。3.内部的曲率エネルギーに支配された流動性のある球面状の膜は,2点を引っ張ると1次の相転移が起こり,そのとき,弦張力は平滑相で有限の値,乱雑相でゼロになる。4.外部的曲率エネルギーに支配されたドーナツ面の膜では,1次の表面揺らぎの相転移と1次の崩壊相転移が同時に起こる。5.内部的曲率エネルギーに支配された流動性のあるディスク面状の膜では,1次の表面揺らぎの相転移と1次の崩壊相転移が同時に起こる。6.内部的曲率エネルギーに支配された流動性のない膜は,2点を引っ張ると2次の相転移が起こり,1次の相転移は起こらない。1.膜構成分子(lipids)の3次元的な構造はcollapsing相転移には影響を及ぼさず,fluctuation相転移を弱める。2.膜骨格をモデル化した流動性を持つ球面状の膜モデルでは,球状相ばかりでなく,柱状相,平面相,その他様々な形が現れる。3.流動性を持たない場合でも面積エネルギーを持つNambu-Gotoの膜モデルは1次元曲げエネルギーを持つ場合、球状相ばかりでなく,平面相,その他様々な形が現れる。4.流動性を持つ球面状の膜モデルで面積エネルギーを持つNambu-Gotoの膜モデルは,2次元の内部的曲率エネルギーに支配されている場合,球状相は現れないが,棒状相,ブランチポリマー相など様々な形が現れる。5.ボンドと頂点から構成され面を持たない球面状のメッシュワークモデルは,通常の2次元面の膜モデルと同じようにcollapsing相転移とfluctuation相転移を持つ。6.1次元の曲げエネルギーに支配される流動性を持たない膜モデルは1次のcollapsing相転移と2次のfluctuation相転移を持つ。7.膜骨格に対応するcompartment構造を持つ膜モデルは,流動性がある場合,膜骨格に力学的な強さがない場合でもcollapsing相転移とfluctuation相転移を持つ。compartment構造を持つ膜モデルは,流動性がない場合,膜骨格にのみ力学的が強さがあればcollapsing相転移とfluctuation相転移を持つ。8.膜骨格をモデル化した流動性を持つ球面状の膜モデルで膜骨格が交差するjunction部を剛体と仮定したとき,球状相,平面相,その他様々な形が現れる。1.通常は無視される面内変形に対する弾性エネルギーを持つモデルにおいて,形態変化の相転移がその面内変形弾性から受ける影響ついてMonte Carloシミュレーションの方法で研究した。その結果,面内変形弾性は表面揺らぎの相転移を強める働きがあることを明らかにした。(Euro. Phys. J.B 2008)2.膜骨格によって支えられるモデルの形態変化を研究し,平板や棒状など,球面状以外に多様な形態が現れることを示した。この研究では膜骨格が実際の細胞膜等に見られる多様な形態変化の一つの要因である可能性を指摘した。(Euro. Phys. J.B 2008)3.流動性を持たない膜の一部を固定するという境界条件で膜の表面張力を計算した。相転移点の付近で,曲げ剛性パラメータの少しの変化で表面張力の値が不連続に変化する可能性を指摘した。(J. Stat. Mech. 2008)4.小さな穴の開いた球面状の膜モデルの相構造をMonte Carloシミュレーションの方法で研究し,膜がつぶれるcollapsing相転移と表面揺らぎのfluctuation相転移について,穴が無い場合に知られている結果(=2つの相転移は1次相転移)と比較した。穴の大きさは十分に小さなものと仮定した。

その結果,穴があってもcollapsing相転移の強さは変わらずその相転移次数は1次のままであるが,fluctuation相転移は穴の影響によって弱まり相転移次数は1次から2次に変化することを明らかにした。(Euro. Phys. J.E 2008)
外国語修得者の労働市場における優位性に関する実証分析

今回の研究では、大卒ホワイトカラーに関して彼らの外国語能力が所得および職位に与える影響を可能な限り正確に捉え、外国語、特に、英語の経済活動における価値を経済学的に分析することを目的とした。外国語能力のレベルをできるだけ具体化するために、言語の種類に加え英語検定やTOEFULのスコアーも調査項目に含めるとともに、会話能力のみならず読み書き能力も調査した。また、履修成績および大学院卒等の要因も探ることで、大学教育の効果も測定可能な形で調査を行った。調査対象は、教育の内容をコントロールするために、特定大学の特定学部卒業生とした。アンケート調査から得られたデータは、稼得関数を推定するという方法で分析された。特にこれまで他の研究で使用されてきた、教育年数、年齢、企業内経験年数等の変数に加えて、新たに英語能力という技能変数を追加して分析を試みた点に本研究の特徴がある。分析の結果次のようなことが明らかになった。現在の国際経済社会における英語の重要性を考えると、たとえ日本国内の経済活動においても、英語を身につけているかどうかにより経済的地位に大きな差が出る可能性がある。より具体的には1)現在英語を仕事で使用している者たちは、就職後仕事をしながら習得している。2)彼らのうち10%ほどは、かなり高い英語能力を身につけている。3)彼らは昇進においてかなり優位にある。4)また、推定結果は英語能力のない者よりも2030%も高い所得を得ている可能性を示している。ただし、調査対象が比較的レベルの高い大学卒業生に限られていること、キャリア形成のプロセスに関する変数が不十分であること等の課題が今後の研究に残されている。研究成果は平成12年度に日本教育社会学会、日本経済学会で発表される予定である。今年度は、当初の計画通り大阪大学卒業生を対象に行った言語能力と稼得能力および仕事のキャリアに関するアンケート調査をデータベース化する作業が進められた。まず、大阪大学経済学部同窓会の協力を得て卒業生全員を対象に行われたアンケート調査(配布数約6500、回収率約20%)を入力し、統計ソフトで解析できる形で記憶した後、基礎的な統計分析を行なった。分析が可能な約1200サンプルを単純集計した後、重要な変数の分布および変数間の相関を測り、英語能力と所得の間に強い関係があることを確認した。さらに、重回帰分析を行い、十分なレベルの会話能力を収得すると平均して年間所得が1020%上昇することを発見した。また、副次的な作業として、卒業生の標準的キャリアとその分布を図式化した。一方、経済学部以外で卒業生の所在を把握できる幾つかの学部同窓会の了解を得、送付先を入力し調査の配付先リストを作成した。その後、各学部卒業生の特徴が十分反映され、かつ、先に行われた経済学部卒業生を対象とした調査との比較が可能となるようにアンケート内容を再検討し、理科系卒業生に関しては職務の内容に関する項目の変更、文学部卒業生に関しては女性の就業状況が把握できるようにな項目の追加が行われた。それらのアンケートは、郵送により配布回収された。回収率は約20%であった。これらのサンプルに関しては、幾つかの変数を分析が可能な形に数値化しながら入カ作業が進むように準備を行った。さらに、卒業生を受け入れる側の状況を把握するために、民間企業および就職対象となる諸団体の採用および人事政策に関する調査も同時に進められた。今年度は昨年度に行われたアンケート・データの統計分析、追加的資料の収集・分析が行われた。4月から5月にかけて、回収データの整理とデータベース化が行われた。6月から9月にかけて、アンケート・データの解析が行われ、98年度の後半には論文が作成された。アンケート・データの分析およびその結果は以下のように要約される。

現在の国際経済社会における英語の重要性を考えると、たとえ日本国内の経済活動においても、英語を身につけているかどうかにより経済的地位に差が出る可能性がある点に注目し、英語能力が昇進や所得にどのような影響を与えているかを分析した。具体的には、これまで稼得能力測定で使用されてきた、教育年数、年齢、企業内経験年数等の変数に加えて、新たに英語能力という技能変数を追加して稼得能力の分析を試みた。結果、次のようなことが明らかになった。1)現在、学部卒業までに十分な英語能力を身につけている学生はかなり少ない。よって、現在英語を仕事で使用しているものたちは、就職後仕事をしながら習得している。2)彼らのうち10%ほどは、かなり高い英語能力を身につけている。3)彼らは昇進においてかなり優位にある。4)また、推定結果は英語能力のない者よりも数10%も高い所得を得ている可能性を示している。ただし、調査対象が比較的レベルの高い大学卒業生に限られていること、キャリア形成のプロセスに関する変数が不十分であること等の課題が今後の研究に残されている。研究成果は平成12年度に日本教育社会学会、日本経済学会で発表される予定である。
水クラスタ―を利用したナノリアクター循環・再利用型ナノ粒子連続合成システムの開発

高圧二酸化炭素流体中に水クラスターを利用したナノ粒子合成を行うため、まず水クラスターを安定化させる親水基フリーフッ化炭素ー炭化水素両親媒性分子Nohead FC6-HCn(C6F13-Ph-CO-CH2-2CnH(2n+1), Ph=phenylene, n = 3 or 4)の合成を行った。また、連続的にナノ粒子合成を行うための高圧流通系合成分離装置を作製し、ZnS、Ag及びAuのナノ粒子の合成を試験した。ナノ粒子の原料を溶解させた水を高圧二酸化炭素流体中でナノクラスター化させ、安定に存在する温度・圧力条件を探索し、相図を明らかにした。そして、ナノクラスターが安定に存在した45°C、250bar条件において、反応時間を変化させて、ナノ粒子合成と分離を行った。得られたナノ粒子は、数十nm程度であり、反応時間の増加に伴い、結晶性が高くなり、本来の各化合物のナノ粒子としての光学的性質(紫外可視光吸収特性および蛍光特性)を表した。興味深いことに、球状粒子だけではなく、ファイバー状ナノ粒子やそれが網目状発達したナノ構造体の形成も確認された。さらにナノ粒子合成後、簡単にNohead FC6-HCnをナノ粒子から分離して回収できることが確かめられた。したがって、このナノ粒子合成では、クラスター安定化剤を回収・再利用でき、そして、原料以外にイオン性物質は存在しないため、ナノ粒子の性能を著しく落とす不純物が入りこまないナノ粒子の高効率製造技術になると期待される。H29年度では、1年間で(1)ナノリアクター循環・再利用型ナノ粒子連続合成システムの装置の作製とNohead FC6-HC4の大量合成、(2)ナノ粒子合成の条件最適化、(3)ナノ粒子回収の条件最適化を行うことを予定していたが、実際は6月30日からの研究開始であり、3か月間少ない実施期間であったため、(1)および(2)のみを行った。(1)では、合成装置を完成させ、Nohead FC6-HC4の大量合成を行い、それらを利用して、ZnSナノ粒子およびシリカナノ粒子の合成を行った。ZnSに関しては、Nohead FC6-HC4により硝酸亜鉛と硫化ナトリウムの水溶液を超臨界CO2中に分散させ、混合することでZnSの析出反応を起こさせた。その結果、200nm程度の単分散な立方体状のZnSナノ粒子が多く生成していることが、透過型電子顕微鏡観察や動的光散乱測定により明らかにされた。シリカに関しては、テトラメトキシシラン(TMOS)をNohead FC6-HC4により調製したアンモニア水/CO2ナノ分散系に加え、TMOSの加水分解・重縮合反応を生じさせた。残念ながら、合成後にはマクロメーターサイズのシリカ凝集体のみが観察されるのみで、良好なシリカナノ粒子は得られておらず、最適合成条件の探索を進めているところである。なお、本研究成果に関して、国際学会EMN Hawaii meeting 2018にて口頭発表(招待講演)を行った。申請書では、H29年度は1年間の研究期間があると考え計画を立てていた。しかし、実際は3か月間少なく、申請書中のH30年4月時点の計画よりは研究が遅れている。また、微粒子合成の要となるNoheadFC6-HC4の大量合成を進めたが、収率が低く、大量に得るために多くの時間を費やした。その結果、微粒子合成実験の開始が遅れ、当初予定していたナノ粒子合成を十分に実施できなかった。Nohead FC6-HC4の大量合成は、収率が低く、合成にかかる費用も高いため、時間および研究費にかかる負担が大きかった。そこで、収率が高く、合成が容易でかつ、安価な材料で合成できるNohead FC6-HC4代替物の開発を行う。見つかった際には、それを合成・利用して、本研究を加速させる。なお、H30年度で目標達成が十分にできなかった場合は、さらに1年間の研究期間の延長申請を行う予定である。

H29年度では、研究を加速させるために実験補助者を雇用する予定であった。しかし、適切な人材が確保できず実験補助者を雇用することができなかったため、11万円程度の未使用額が発生した。現在は、実験補助者を確保できているため、H29年度の未使用額は、H30年度の実験補助者への謝金に費やす予定である。
ディープラーニングによるEnd-to-End日本古典籍くずし字認識の研究

本研究はディープラーニングによる、くずし字認識システム、サービスを開発する研究である。応募者が中間手順が不要の新しい手法を提案し、モデルを開発した。この手法は生物医療分野の細胞画像で領域検出に成功しており、実験を行ったところ、精度が70%93%までたどり着いた。さらに、2019年に人文学オープンデータ共同利用センター(CODH)が主催する、くずし字認識国際コンペティションの参加者からアルゴリズムアイディアを取り入れてくずし字認識モデルを改善し、CODHの所持している日本古典籍データセットを翻刻して一般公開する。さらに、くずし字に関するさまざまなサービスを公開する。
テロメラーゼ阻害剤による制癌と癌細胞におけるテロメラーゼ活性制御機構

テロメラーゼは9割以上の癌で活性が検出され、殆どの正常体細胞では検出されない理想的な癌分子標的である。本計画では、テロメラーゼを分子標的とした癌治療法の確立を目指し、テロメラーゼ阻害剤およびテロメラーゼ結合蛋白質について基礎的検討を行った。その結果、以下の点が明らかになった。1.TRAP-COMPARE解析により、強力なテロメラーゼ阻害効果(IC50=2microM)を示す化合物としてFJ5002を同定した。白血病U937細胞を非致死的濃度のFJ5002存在下で継代培養すると、population doublingの増加に応じてテロメアの短縮が認められた。テロメアが限界付近まで短縮した細胞では、染色体異常・老化形質・crisisなどの特徴的な変化が認められた。以上のように、テロメラーゼが癌化学療法の新たな分子標的として実質的に有用である可能性が示された。2.酵母two hybrid法によりテロメラーゼ触媒サブユニットhTERT結合蛋白質を探索したところ、hTERTのカルボキシル末端と特異的に結合する因子として14-3-3蛋白質が単離された。hTERTと14-3-3は実際のヒト細胞内においても複合体を形成していることが確認された。14-3-3は自身のアミノ末端を介して二量体を形成するが、同アミノ末端部位を欠いた変異(dominant negative)型14-3-3を293T細胞に発現させると、hTERTの核内移行が顕著に阻害された。同様に、14-3-3非結合型hTERT(hTERT-3A)は、細胞内において核内移行の効率低下を示した。なお、hTERT-3Aは野生型hTERTと同レベルのテロメラーゼ活性を示した。以上より、14-3-3はhTERTの細胞内局在を調節することによりテロメラーゼの機能を制御している可能性が示唆された。
直接水分供給によるPEFC膜の含水促進とMRI計測に基づく水分浸透現象の解明

固体高分子形燃料電池(Polymer Electrolyte Fuel Cell, PEFC)は次世代の自動車用動力源として注目されている.しかしながら,電解質であるPEFC(固体高分子形燃料電池)膜のプロトン導電性は,乾燥すると大きく減少するため,PEFC膜を常に含水状態に保つ必要がある.本研究課題では,我々が提案している,従来までの加湿ではなく,膜表面から直接,液体水を供給する手法について,直接水分供給時におけるPEFC膜内への水分浸透過程を磁気共鳴イメージング(MRI)を用いて計測し,基礎的に明らかにする.本年度は,電解質膜内の水分輸送機構の解明を試みた.具体的には,電解質膜内の水分輸送は,(1)水素イオンの移動に伴う随伴水,(2)酸素極での電気化学反応による水の生成,(3)濃度拡散,(4)膜表面からの水分の流入・流出,などが関係し,複雑な現象であることから,特に,膜表面から供給する液体水の流入流束を評価するための数値解析コードを新たに開発した.その際,電解質膜のアノード側の一部から液体水を供給した実験結果との比較検討を行うために,アノード側においては,電解質膜への液体水の流入とガス供給チャネルからの水分の流入・流出を考慮した解析モデルの構築を行った.その上で,実験結果との比較・検討を行うことで,液体水供給時の水分浸透現象に関して明らかにし,電解質膜内で供給水がどのように拡散していくのかについても検討を加えた.固体高分子形燃料電池(Polymer Electrolyte Fuel Cell, PEFC)は次世代の自動車用動力源として注目されている.しかしながら,電解質であるPEFC(固体高分子形燃料電池)膜のプロトン導電性は,乾燥すると大きく減少するため,PEFC膜を常に含水状態に保つ必要がある.本研究課題では,我々が提案している,従来までの加湿ではなく,膜表面から直接,液体水を供給する手法について,直接水分供給時におけるPEFC膜内への水分浸透過程を磁気共鳴イメージング(MRI)を用いて計測し,基礎的に明らかにする.本年度は,MRI計測可能な直接水分供給型燃料電池セルの製作を行った.その上で,直接水分供給時のPEFC膜への水分浸透過程のMRI計測を行うために,磁場勾配強度,エコー時間などの様々なMRI計測パラメーターの最適化を行い,直接水分供給時においても高S/N比でMRI計測が可能となる方法を開発した.その結果,水分供給開始後,電解質膜の含水が促進され,燃料電池出力が増加することが明らかになった.その一方で,燃料電池内において電解質膜が水分供給側(アノード側)に局所的に変形することがMRI計測より明らかになり,直接水分供給による含水にともなう電解質膜の局所的な膨潤が要因であることが示された.固体高分子形燃料電池(Polymer Electrolyte Fuel Cell, PEFC)は次世代の自動車用動力源として注目されている.しかしながら,電解質であるPEFC(固体高分子形燃料電池)膜のプロトン導電性は,乾燥すると大きく減少するため,PEFC膜を常に含水状態に保つ必要がある.本研究課題では,我々が提案している,従来までの加湿ではなく,膜表面から直接,液体水を供給する手法について,直接水分供給時におけるPEFC膜内への水分浸透過程を磁気共鳴イメージング(MRI)を用いて計測し,基礎的に明らかにする.本年度は,電解質膜内の水分輸送機構の解明を試みた.具体的には,電解質膜内の水分輸送は,(1)水素イオンの移動に伴う随伴水,(2)酸素極での電気化学反応による水の生成,(3)濃度拡散,(4)膜表面からの水分の流入・流出,などが関係し,複雑な現象であることから,特に,膜表面から供給する液体水の流入流束を評価するための数値解析コードを新たに開発した.その際,電解質膜のアノード側の一部から液体水を供給した実験結果との比較検討を行うために,アノード側においては,電解質膜への液体水の流入とガス供給チャネルからの水分の流入・流出を考慮した解析モデルの構築を行った.その上で,実験結果との比較・検討を行うことで,液体水供給時の水分浸透現象に関して明らかにし,電解質膜内で供給水がどのように拡散していくのかについても検討を加えた.
自己免疫疾患の病態におけるエフェクターB細胞と制御性B細胞の役割

関節リウマチ(RA)におけるB細胞標的療法の結果によって、B細胞の抗体非依存性機能が着目されるようになった。本研究では、RAにおけるRANKL産生性エフェクターB細胞(Beff)とIL-10産生性制御性B細胞(Breg)を同定し、これらのサブセット誘導の分子機構ならびに病態における役割について明らかにした。本年度の研究は、エフェクターB細胞(Beff)関連の以下の3点を中心に行った。(2)RANKL産生Beffの特異的マーカーの同定:RANKL産生は、未刺激状態でわずかに見られるT細胞共刺激分子(CD80+CD86+)発現B細胞において高いことが判明した。さらに、BCR/CD40刺激にてCD80+CD86+B細胞分画は著明に増加し、同時にRANKLを強く産生していた。(3)BeffのRANKL発現へのサイトカインの作用:RANKL産生にCD40, CD80/CD86の必要性を示す上記の知見はT細胞の関与を強く示唆するため、活性化T細胞サイトカインのRANKL産生への効果について検討した。その結果、Sw-m B細胞のBCR/CD40誘導RANKL発現をIFNγは増強し、一方IL-21は抑制することが判明した。また、IFNγはB細胞のCXCR3発現も増強させ、CXCR3+Sw-m B細胞ではRANKL産生が高く、さらにCXCR3リガンドCXCL10もRANKL産生を増強した。骨破壊関連分子RANKLを産生するBeffとして機能するヒトB細胞サブセットを絞り込むことができたと同時に、このBeff誘導に必要な刺激条件が明確になった。以上より、本研究の達成度としてはおおむね順調に進展しているといえる。(1)BeffにおけるRANKLとOPG発現:H27年度の研究からヒトswitched-memory (Sw-m)B細胞がRANKLを主に発現することが判明したが、B細胞はRANKL-RANK結合を阻害するosteoprotegerin (OPG)も発現しうる。よって、RANKL/OPG発現のバランスが破骨細胞の分化・活性化に重要といえる。抗原受容体(BCR)/CD40による共刺激下でSw-mB細胞はRANKLに加えてOPGを発現するが、IFNγが併存するとRANKL発現増加と逆にOPG発現は著明に低下し、RANKL/OPG比が上昇することで破骨細胞の分化・活性化に傾くことが判明した。一方、RANKL発現を抑制するBCR/CD40/IL-21刺激下ではOPG発現も低下するが、形質細胞分化に重要な転写因子Blimp-1発現は著明に増加することが判明した。(2)関節リウマチ(RA)患者滑液B細胞におけるRANKL発現:RA患者滑液においては末梢血に比べてCD80+CD86+ならびにCXCR3+B細胞が多く存在し、これらの分画ではRANKL発現が高いことをフローサイトメトリーで確認した。さらに、このRANKL発現が高いサブセットはSw-mBとdouble-negative (DN)B細胞であることも判明した。(3)Breg誘導の分子機構:非B細胞のIL-10産生に関与する種々の転写因子について、ヒトBreg誘導での関与について検討を行った。まずは、BCR/TLR9刺激によるIL-10発現とパラレルな発現パターンを示す転写因子に絞り込んだ後、これらの各転写因子についてsiRNAによるノックダウンを行うことで評価を行った。その結果、B細胞の形質細胞分化に関与するIRF-4とBlimp-1が候補として残り、この中でもBlimp-1がBreg誘導に最も関与していることが示唆された。抗体非依存性に機能しうるRANKL産生Beffの特徴ならびにRA患者滑液に存在することを証明できた。加えて、Breg誘導の分子メカニズム(転写因子)についても明らかにできた。(1)BeffにおけるRANKL発現の分子機構: B細胞のRANKL発現に重要なBCR/CD40下流のシグナル経路を明らかにするために、MAPK (ERK, JNK, p38 MAPK)、NFκB、CyAなどの選択的阻害薬を使用し、RANKL mRNAの発現変化を評価した。その結果、ERKとNFκB経路の阻害薬では濃度依存的にRANKL発現の抑制を認めた。一方、JNK阻害薬とCyAでは抑制効果を認めず、p38 MAPK阻害薬ではごくわずかの抑制であった。以上より、RANKL発現にはBCR/CD40下流のCa2+非依存性経路の重要性が示唆されるが、これらのシグナル経路はOPG発現にも作用する可能性があり、RANKL/OPG発現比という形でさらなる検討が必要である。(2)Beffによる破骨細胞分化の誘導: BeffはRANKL以外にも様々な分子(サイトカインなど)を産生しているため、BeffのRANKL自体が破骨細胞分化を誘導できるかを検討した。RAW-Venus1細胞にて破骨細胞分化を簡便にモニターできる系を使用し、BCR/CD40刺激、さらにはIFN-γ追加による活性化B細胞との共培養が破骨細胞分化を誘導し、この現象は抗RANKL抗体(デノスマブ)で阻害できた。以上より、Beff由来のRANKLが直接破骨細胞分化を誘導することが判明した。(3)RA患者Breg(B10)の機能異常: RA患者のBreg機能について検討した。RA患者由来B細胞のCpG刺激によるIL-10

産生能は健常人と比較して低下し、その変化はmemory B細胞で著明に見られた。また、共培養による活性化T細胞のIFN-γ産生変化としてBreg機能を評価した結果、RA患者由来B細胞ではBreg機能が著明に低下していた。今後、この機能低下の分子機構のさらなる解明が必要である。関節リウマチ(RA)におけるB細胞標的療法の結果によって、B細胞の抗体非依存性機能が着目されるようになった。本研究では、RAにおけるRANKL産生性エフェクターB細胞(Beff)とIL-10産生性制御性B細胞(Breg)を同定し、これらのサブセット誘導の分子機構ならびに病態における役割について明らかにした。RANKL産生性Beffのさらに詳細な解析を進めると同時に、関節リウマチ(RA)での意義についても明確にする。また、制御性B細胞(Breg)についても研究計画を進める。RANKL産生Beffの破骨細胞の分化・活性化への効果やRAにおけるBreg機能の質的変化についても研究計画を進める。リウマチ学
ミルクに免疫制御システムは存在するか？

ミルクには未知の免疫抑制因子が存在するのではないかという筆者独自の考えに基づき検討したところ、牛乳より新たに分離したミルクペプチド画分がアレルゲンや自己抗原に特異的なマウスT細胞応答を抗原特異性やMHC拘束性に依存することなく、完全に抑制できることを見出した。これらの知見はミルクペプチド画分がアレルギーや自己免疫疾患の予防や治療に応用できる可能性を示唆するものであるといえる。ミルクには未知の免疫抑制因子が存在するのではないかという申請者独自の考えに基づき検討した結果、牛乳ペプチド画分であるMKFがマウスT細胞の抗原特異的および抗CD3抗体刺激による増殖応答を抗原やMHCの種類に依存することなく、完全に抑制できることを平成23年度に見出した。そこで平成24年度はナイーブなBALB/cマウス脾臓細胞のサイトカイン応答に及ぼすMKFの抑制効果を検討したところ、LPS刺激により誘導されるIL-6やIL-10応答は全く抑制されないものの、ConAや抗CD3抗体刺激によるIL-4、10、17、IFN-γ応答はMKFの添加により大きく低下することが明らかとなった。このような傾向はBALB/cマウスをあらかじめ主要な鶏卵アレルゲンであるオボアルブミンで免疫した場合にも認められ、それぞれ鶏卵アレルギー、1型糖尿病の動物モデルであるOVA-IgEマウス、NODマウスでも観察された。すなわちMKFはB細胞やマクロファージなどの抗原提示細胞のサイトカイン応答は抑制できないものの、T細胞のサイトカイン応答は強く抑制できるものと結論づけられた。次にあらかじめNODマウスにMKFを4日間間隔で2回腹腔内投与し、1型糖尿病の発症原因となる自己免疫応答(主要な自己抗原であるグルタミン酸デカルボキシラーゼに特異的なT細胞応答)を測定したところ、それが強力に抑制されることが見出された。さらにMKFを2週間間隔で腹腔内投与し続けたところ、1型糖尿病の発症率がMKF未投与群と比較して低下することが明らかとなった。すなわちMKFの免疫抑制効果はin vitroばかりでなく、in vivoでも有効であることが確認された。これらの平成2324年度における本研究の成果は、MKFが新規免疫抑制剤として、特に鶏卵アレルギーや1型糖尿病の予防や治療に応用できる可能性を示唆する知見であるといえる。ミルクには未知の免疫抑制因子が存在するのではないかという申請者独自の考えに基づき、各種実験動物を用いて検討したところ、牛乳ペプチド画分であるMKFがマウスT細胞の抗原特異的および抗CD3抗体刺激による増殖応答を抗原やMHCの種類に依存することなく、完全に抑制できることを平成23年度に見出した。さらにMKFは、鶏卵アレルギーモデルマウスであるOVA-IgEマウスの脾臓細胞のアレルゲンに特異的な増殖応答やIgE産生応答、1型糖尿病モデルであるNODマウスの自己抗原に特異的なT細胞応答も強力に抑制できることを明らかにした。平成24年度には、MKFがナイーブなBALB/cマウスT細胞のConAや抗CD3抗体刺激によるIL-4、10、17、IFN-γ応答などを大きく低下できることを見出し、このような抑制現象がBALB/cマウスをOVA(主要な鶏卵アレルゲンであるオボアルブミン)で免疫した場合にも、またOVA-IgEやNODマウスでも認められることを明らかにした。さらに、MKFをNODマウスに腹腔内投与することにより、1型糖尿病の発症原因となる自己免疫応答のin vivoにおける誘導や1型糖尿病の発症が抑えられることも示した。平成25年度はMKFに含まれる活性成分の同定を目指し、MKFをHPLCにより20画分に分画し、そのうちの一つに抑制活性が存在することを見出した。さらにこの画分に含まれる物質の同定も行い、完了しているため、現在それらを順次化学合成し、その抑制活性を調べることにより活性成分の最終的な確認を試みている。本研究のこのような成果は、MKFが新規免疫抑制剤として、特に鶏卵アレルギーや1型糖尿病の予防や治療に応用できる可能性を示唆する知見であるといえる。ミルクには未知の免疫抑制因子が存在するのではないかという申請者独自の考えに基づき実験動物を用いて検討したところ、牛乳ラクトパーオキシダーゼ(LPO)が自己免疫疾患やアレルギー疾患の予防や症状緩和に有効である可能性を見出し、それがLPOによる優先的なマウスIL-10産生細胞の誘導効果などによるものであることを明らかにしてきた。本研究では、まず最初にLPOのIL-10産生細胞誘導促進効果に対する牛乳のペプチド画分であるMKFの効果をin vitroで測定したが、興味深いことに、MKFがLPOによるIL-10産生細胞への誘導を完全に抑制できることが見出された。この理由を多方面から検討したところ、MKFがマウスT細胞の抗原特異的な増殖応答や抗CD3抗体刺激による増殖応答を強力に抑制することが明らかとなった。このようなT細胞応答に対するMKFの抑制効果は抗原やMHCの種類に依存することなく、汎用的に認められた。そこで鶏卵アレルギーのモデルマウスであるOVA-IgEマウスの脾臓細胞の抗原

特異的なIgE産生応答に及ぼすMKFの効果をin vitroで測定したところ、MKFは主要な鶏卵アレルゲンであるOVA(オボアルブミン)に特異的なIgE応答を完全に抑制した。さらにMKFは1型糖尿病のモデルマウスであるNODマウスの自己抗原(グルタミン酸デカルボキシラーゼ)に特異的なT細胞応答(1型糖尿病の発症原因となる自己免疫応答)も強力に抑制できることが見出された。T細胞は免疫系を制御する上で中心的な役割を果たしているため、これらの結果はMKFが新規免疫抑制剤として、特に鶏卵アレルギーや1型糖尿病の予防や治療に応用できる可能性を示唆する知見であるといえる。農学平成24年度の研究の推進方策は1)新規免疫抑制剤の同定、2)新規免疫抑制剤の免疫系に及ぼす影響の検討、3)新規免疫抑制剤の鶏卵アレルギー、1型糖尿病、慢性関節リウマチの発症に及ぼす影響の検討の3点であるため、それぞれについてその達成度を以下に記す。1)新規免疫抑制剤の同定:平成24年度末時点では新規免疫抑制剤の同定が完了していないため、「3やや遅れている」と判断せざるを得ない。2)新規免疫抑制剤の免疫系に及ぼす影響の検討:平成24年度は主にサイトカイン応答に及ぼす牛乳ペプチド画分(MKF)の影響を検討することを目的としたが、「9.研究実績の概要」に記載したように、その全貌を解明することができたため、「2おおむね順調に進展している」と判断できる。3)新規免疫抑制剤の鶏卵アレルギー、1型糖尿病、慢性関節リウマチの発症に及ぼす影響の検討:「9.研究実績の概要」に記したように、1型糖尿病の発症に対する牛乳ペプチド画分(MKF)の抑制効果はin vitroおよびin vivoで確認しており、鶏卵アレルギーの発症に対する抑制効果も少なくともin vitroで有効であることを見出している。慢性関節リウマチに関しては「9.研究実績の概要」には記さなかったものの、MKFがその発症に大きな影響を与えないことを明らかにしている。これらの観点から、「2おおむね順調に進展している」と判断できる。以上の1)3)の状況を総合的に判断して、「3やや遅れている」と記載した次第である。このため補助事業期間延長を申請し、それが承認されたため、平成25年度も上記1)新規免疫抑制剤の同定を目的として研究を続行する予定である。1.本研究の計画段階では、対象として選択した牛乳のペプチド画分であるMKFが免疫賦活活性を有していると想定していたが、本研究を実施した結果、T細胞応答を抗原やMHCの種類に依存することなく、完全に抑制できる免疫抑制剤として有効であることを実験動物レベルで見出した。さらに、代表的な自己免疫疾患である1型糖尿病や最も主要な食物アレルギー疾患である鶏卵アレルギーの予防や治療にMKFが有効である可能性を明らかにした。すなわち、本研究は計画段階と進展方向がやや異なるものの、本研究の目的として設定した我が国における深刻な健康問題の一つであるアレルギーや自己免疫疾患の対策を構築する上で大いに役立つものであり、特にMKFがT細胞をターゲットとしていることが明らかになったことは「1当初の計画以上に進展している」と判断できるものである。2.当初の研究計画では平成23年度中にMKFの活性成分の同定を終えることを予定していた。
インスリン標的細胞に対するプラズマ効果とその治療的応用

大気圧プラズマジェットを生体に照射するとさまざまな生体応答が惹起されるが、その詳細は未解明な点が多い。本研究では、我々が発見した「プラズマ誘導性の[Ca2+]i応答現象」についてより深く探索することにより,生細胞に対するプラズマ作用の分子機構を解明することを目標とした。特に、インスリン反応性を有する細胞を研究対象とした。そして3T3L1細胞が発現するTRPチャネルがプラスマ作動性カルシウム透過性チャネルであること、さらに、極めて短寿命のプラズマ生成活性種がTRPチャネルの直接的な活性化に関わることを見出した。さらに、プラズマによるインスリン標的細胞の機能制御が可能であることを明らかにした。プラズマは、固体・液体・気体の3状態とも異なる第4の状態であり、原子と電子とイオンに電離した物理的にも、化学的にも他の物質状態は見られない特性を持っている。近年開発された大気圧プラズマのユニークな特性から、プラズマを用いた生命機能調節や医療応用への展開が期待されている。研究代表者らは、特定の細胞種において「プラズマ誘導性の細胞質Ca2+上昇現象」が存在することを発見しており、本研究ではこのプラズマ誘導性の細胞応答に注目した研究を推進している。これまでの検討から「プラズマ誘導性の細胞質Ca2+上昇現象」は3T3L1細胞において顕著に認められることから、この高感度プラズマ応答性細胞を活用することにより、生細胞に対するプラズマ作用のメカニズムの探索を行っている。H28年度は、プラズマ反応性Ca2+透過性チャネルの特性解析を達成し、TRPチャネルファミリーメンバーが重要な役割を果たしていることを明らかにした。さらに、このチャネルの活性化を誘導していると考えられる特殊な活性種(プラズマにより産生される未知の短寿命活性種)が存在することを見出した(Sci. Rep.25728, 2016)。さらに、3T3L1細胞は細胞分化することにより脂肪細胞となるが、脂肪分化した3T3L1細胞では「プラズマ誘導性の細胞質Ca2+上昇」のプロファイルが大きく変化することを見出した。このことから、プラズマ応答性は細胞の分化度や細胞種によって変化し、細胞の高次機能(分化・増殖やインスリン反応性など)にも影響を与える可能性が高いと考えられた。大気圧プラズマ刺激により良好に細胞質内Ca2+濃度([Ca2+]i)の上昇が認められる線維芽細胞(3T3L1細胞)のプラズマ応答性について、各種パラメーターを設定した上で間接照射法を用いた詳細な解析を行った。その結果、3T3L1線維芽細胞のプラズマ依存性[Ca2+]i応答はルテニウムレッド(RR)感受性及びSKF96365感受性を示すことを明らかにし、この特性からTRPチャネルファミリーが関与することが示唆された。また、プラズマ照射時間・強度・保持時間などを制御した解析より[Ca2+]i応答を惹起する物質は、プラズマ照射により溶液中に産生される各種活性種のなかでも比較的短寿命の特殊成分であり、未知のプラズマ生成短寿命活性種の存在が上記の生命応答に関与している可能性を明らかにした。また、3T3L1細胞を脂肪細胞へと分化させると、プラズマ依存性[Ca2+]i応答に変化が認められることを見出している。大気圧プラズマの医療応用を最終目的として、大気圧プラズマがもたらすさまざまな生命応答を探索するとともに、生体に対するそれらのプラズマ作用のメカニズムの解明に向けた研究を推進した。特に、H28年度に研究代表者らが発見した「プラズマ誘導性の細胞質Ca2+上昇現象」(Sci.Rep.25728,2016)に焦点をあて、プラズマ誘導性に惹起される細胞内Ca2+上昇応答に注目した研究を推進した。本研究では糖尿病や肥満に対するプラズマ医療の可能性を鑑み、インスリン標的細胞(脂肪細胞)に対するプラズマ応答性について調べた。未分化な線維芽細胞ではプラズマ照射バッファー添加刺激により細胞内カルシウムイオン濃度の周期的な上昇応答を示すが、分化した脂肪細胞では比較的ゆっくりで持続的な細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が誘導された。また、線維芽細胞から脂肪細胞への分化過程におよぼすプラズマ照射の影響について発現遺伝子変動と細胞内蛋白質リン酸化変動により検討したところ、プラズマ照射は脂肪細胞への分化に対して抑制的な作用があり、この作用にはプラズマによって誘導される「細胞質Ca2+上昇」に加え、細胞内シグナル伝達関連酵素(Erk1/2,Erk5など)の活性化が関与する可能性を明らかにした。プラズマ誘発性の細胞質Ca2+上昇応答を司るカルシウム透過性チャネル分子を同定すべく、その候補チャネルとして、TRPV1を外来性に発現させた培養細胞を用いた分子レベルでの解析を推進した。TRPV1分子の機能性システイン残基の置換変異体を作製しプラズマ応答性に対するチャネル分子構造ー機能協関を引き続き解析している。本研究により明らかにされた「プラズマ応答性のTRPチャネルを介した細胞質Ca2+上昇作用」は、大気圧プラズマがもたらす多くの生命現象に深く関与すると考えられる。

H28年度に得られた成果に基づき、H29年度は1プラズマ作用の細胞生物学的解析と2プラズマ応答性カルシウム透過性チャネルの分子生物学的解析を推進する。具体的には、13T3L1線維芽細胞は脂肪細胞へと分化することにより、そのインスリン反応性や代謝能が成熟する特徴があるため、未分化細胞と分化した脂肪細胞におけるプラズマ依存性[Ca2+]i応答の差異について詳しく解析する。さらに、脂肪細胞の高次機能(インスリン反応性や糖取込)に対するプラズマ作用の有無について生化学的に解析する。未分化線維芽細胞との比較検討を行うことにより、生物機能に対するプラズマ作用の多様性とその作用メカニズムについての理解を深める。2また、プラズマ依存性[Ca2+]i応答にはTRPチャネルファミリーの関与が示唆されるため、各種TRPチャネル(TRPV1, TRPV2,TRPA1, TRPC4, etc)を外来性に発現させた培養細胞を用いた分子レベルでの解析を推進する。特にTRPV1分子には活性窒素種で化学修飾されるシステイン残基が多数存在するため、各種の置換変異体を作製することにより、プラズマ応答性に対するチャネル分子構造ー機能協関について明らかにする。分子糖尿病学若干の端数が残金となった。H29年度に使用予定である。
多様なマイトファジーの分子機構と生理的意義の解明

マクロオートファジーによる選択的ミトコンドリア分解はマイトファジーと呼ばれ、ミトコンドリア恒常性維持に関わる極めて重要な現象である。マイトファジーの分子機構は生物種ごとに特異性があるため、その分子機構や生理的意義には不明な点が多い。本研究では、複数の生物種(酵母、線虫、哺乳類)をモデル生物とし多面的な解析を行い、マイトファジーの統合的な理解を目指す。特に、マイトファジーを、「レセプター依存的マイトファジー」と「ユビキチン依存的マイトファジー」に大別して分子機構と生理的意義の解明を進める。
原子間力顕微鏡による超高速細胞レオロジー分離技術の開発

生細胞の力学特性は、細胞運動、細胞分裂、細胞間情報伝達等の細胞機能と密接に関係している。従って、細胞で構成されるバイオ材料を開発するためには、その細胞力学特性を精密に計測することが重要である。また、細胞を集積化し、3次元細胞システムであるバイオアセンブラを構築するためには、細胞素単位の力学特性を超高速に計測することが不可欠である。本研究では、細胞システム構築に有用な膨大な数の細胞素単位を力学的・統計的に分離する高速AFM細胞粘弾性(レオロジー)計測技術を開発し,細胞レオロジーの高速な統計解析を可能にした.高速AFM細胞レオロジー装置の操作を簡便にし、再現性のある細胞判定・分離が可能なシステムの自動化を行った。これにより、AFM装置開発に携わる研究者と3次元細胞システム構築に携わる研究者との密接な連携が可能となり、AFM技術による細胞判定・分離を行うための基礎技術が確立された。25年度が最終年度であるため、記入しない。細胞システムを構築するためには、細胞システム構築に有用な膨大な数の細胞素単位を計測し、評価する必要がある。本研究では、そのような細胞素単位を力学的・統計的に分離する超高速AFM細胞粘弾性(レオロジー)計測技術を開発する。特に、主要技術として、(1)超高速AFM細胞レオロジー計測技術を開発し、(2)異種細胞の複素弾性率と周波数依存ポアソン比の統計分布を計測し、in vitro環境で機能する3次元細胞システム構築に有用な細胞群を統計解析から抽出する細胞分離技術を確立することを目的とする。倒立型光学顕微鏡および正立型光学顕微鏡に搭載した原子間力顕微鏡およびFPGA用いた計測システムのプロトタイプを作製し、現在、実装評価中である。また、細胞種の異なる細胞レオロジーの差異を精密に計測するために、異なる種類の細胞マイクロパターン基板を作製した。そして、複数種類の細胞を用いて、細胞レオロジーと細胞内骨格構造との関係、および細胞レオロジーの細胞内分布を調べた。また、細胞レオロジー物性評価を行う過程において、細胞膜上部の運動性から細胞素単位を分離できる可能性に着目し、高速に細胞膜揺らぎを計測する手法を考案し、実証した。細胞シートの一軸延伸測定装置を開発した。ガラスニードルを力センサーとして用いることにより、長時間の細胞レオロジーを精密に計測することが可能になった。そして、細胞弾性量と細胞内骨格構造との関係に関する基礎データを取得することができた。これらの成果は、現在、2編の論文として投稿し、また、3編の論文として投稿準備中である。細胞分離の基本技術が構築され、超高速AFMレオロジーの開発もAFM本体とFPGA制御部との調整段階である。細胞表面物性による細胞分離技術という新規な方法論を提案し、細胞シートの延伸計測技術の順調に伸展している。超高速AFM細胞レオロジー装置を用いて、異種細胞の複素弾性率・ポアソン比の超高速周波数統計解析を行う。また、AFMの操作が容易で、再現性のある細胞判定・分離が可能なAFMシステムの自動化の開発を行う。さらに、細胞シートを用いたアンサンブル細胞レオロジー計測法を用いて、細胞素単位の細胞レオロジーとアンサンブル平均を比較解析する。そして、細胞システム構築に適した細胞素単位の細胞力学活性の評価基準を定義し、AFM計測と細胞システム構築との研究者の密接な連携を可能にする。
ナノポーラス球を利用した光-分子強結合反応場の構築

本研究では、単分散ナノポーラスシリカ球とアゾベンゼン誘導体を複合化し、さらに球表面に局在プラズモンを誘起できる金ナノ構造を形成させた光反応場の構築を目的とした。研究実施計画に従い、複合体作製に必要な細孔径が6nmと3nmの2種類のナノポーラスシリカ球の合成し、また多フッ素化アルキルアゾベンゼン誘導体を合成した。作製したホストおよびゲスト材料を溶液中で複合化させ、光応答するハイブリッドシリカ球の作製に成功した。複合化の手法として、ナノポーラスシリカ球合成時に用いる界面活性剤分子を焼成により除去した後に複合化させる方法や酸抽出を利用する方法などを検討し、鋳型分子とアゾベンゼン誘導体のイオン交換による複合化を行うことで分子の共同的反応の誘起が期待出来る細孔内へ最密にアゾベンゼン誘導体を導入された構造を作製できることを熱重量析により明らかにした。また、複合体を反応場として利用する場合に極めて重要な細孔内の極性環境を推定した結果、2種類の異なる極性環境が存在することを明らかにした。一方、作製したハイブリッドシリカ球表面に数種の方法で金ナノ構造を作製した。金ナノ粒子を球表面へ化学吸着させる方法や球表面で還元析出させる方法、イオンスパッタリングなどを検討し、イオンスパッタリングによる方法が最も均一にかつ局在プラズモンによる電場増強が期待できる金の微細構造を作製っできることを明らかにした。本研究成果は、特定領域研究「光-分子強結合反応場」の目指す局在プラズモンによる多光子反応を実現する反応場構築として重要であり、これまでの光化学反応の研究で目指してきた高効率,高選択的な光反応を実現する新しい化学反応場として大いに期待出来き、21世紀の光科学技術を支える基盤的研究としてもその意義は大きい。
Ｃ型肝炎ウイルス持続感染培養肝細胞を用いた持続感染と代謝異常の機構解明

本研究ではHCVの持続感染による代謝異常を解明するために、HCV持続感染培養肝細胞(HPI細胞)を樹立した。この細胞では著しい脂肪滴の蓄積が認められたので、マイクロアレイとメタボロームの統合的解析を試みた。その結果、HPI細胞では律速酵素の発現亢進を伴うコレステロール、脂肪酸の増加が認められた。また、ペントースリン酸経路が亢進し、NADPHの産生亢進も認められた。TCA回路も亢進しており著しい代謝亢進状態にあった。また、転写因子Nrf2の恒常的リン酸化が糖脂質代謝を恒常的に亢進させていると考えられた。以上よりHPI細胞はHCVのウイルス学的解析および肝代謝解析のツールとして有用である。キメラC型肝炎ウイルスの持続感染培養肝細胞株における著明な脂肪滴増加を実際に脂質分析によって分析したところ、遊離コレステロール、コレステロールエステル、トリグリセリドの増加が確認され、脂肪滴の増加を裏付けることができた。LC-TOFMS解析の結果、持続感染細胞においてはコレステロールのみならずコレステロールの前駆体レベル(デスモステロール)での増加が認められた。また、CE-TOFMSによるメタボローム解析の結果、HCV持続感染細胞においてペントースリン酸経路の亢進が確認された。すなわちペントースリン酸経路の亢進により脂肪合成のための還元的生合成の亢進が示唆された。また、TCAサイクルおよびこれから派生するアラニン・アスパラギン系も亢進しており、全体的な過剰なエネルギー産生の結果脂肪滴の蓄積がおき、これらの代謝異常がHCVによる肝発がんの一因となっていることが示唆された。また、VLDL産生・分泌に関わるDGAT1の発現低下等が見られ、肝細胞内トリグリセリドが増加し、脂肪滴が蓄積される可能性が示唆された。また、CYP1AやFOS遺伝子などの酸化ストレス系、一部の脂質合成系の亢進が持続感染細胞で特異的に認められ、持続感染細胞における発がん性亢進の原因の一つである可能性が示唆された。以上より、HCVの持続感染により肝細胞はトリプトファン経路、TCAサイクル、アラニン・アスパラギン系などの代謝経路を亢進させ、過剰なエネルギーを脂肪滴の形で蓄積していると考えられた。特に、脂肪酸やコレステロールの還元的生合成のために、ペントースリン酸経路が積極的に利用されている可能性が示唆された。慢性炎症と糖、脂質代謝異常、発癌とが相互に関連することが明らかになりつつある。一方、C型肝炎ウイルス(HCV)に関するウイルス学的研究は遺伝子型2a型HCV感染性株JFH1の樹立により飛躍的に進み、HCVの感染も脂質代謝に密接に関連することが明らかになってきた。本研究ではHCVの持続感染機構やその代謝異常、発癌との関連を解明することを目的とし、遺伝子型1b型と2a型からなるキメラHCVを培養肝細胞Huh7.5へ感染させ、長期培養と感染細胞クローン化によるキメラHCV持続感染培養肝細胞の樹立を試みた。また、この細胞を用いてマイクロアレイとメタボロームの統合的解析により分子生物学的変化の解明を試みた。その結果、HCV RNAトランスフェクション後2年以上持続感染する培養肝細胞株HPI細胞を樹立することができた。この細胞では著しい脂肪滴の蓄積が認められ、律速酵素の発現亢進をともなうコレステロール、脂肪酸(トリグリセロール)の増加が認められた。また、ペントースリン酸回路およびプリン合成系に関する酵素の発現が亢進し、NADPHの産生亢進が認められた。また、TCA回路の代謝産物とおよびほとんどのアミノ酸が増加しており、HPI細胞が著しい代謝亢進状態にあることが示された。転写因子Nrf2は抗酸化、細胞増殖および糖脂質代謝にかかわる多くの標的遺伝子の発現を制御している。HPI細胞では転写因子Nrf2が恒常的にリン酸化されており、糖脂質代謝を恒常的に亢進させていると考えられた。HPI細胞はHCVを2年以上持続的に感染維持させておりHCV持続感染培養肝細胞としてウイルス学的に利用できるだけではなく、肝代謝解析のツールとして意義があると考えられた。申請者が樹立したキメラHCV持続感染培養肝細胞は、樹立後も500日以上キメラHCVの感染を維持した。その間、溶解感染時とほぼ同等の感染性ウイスルを培養上清中に放出し続けた。持続感染培養肝細胞では全長のキメラHCV RNAゲノムが維持さてており、HCV蛋白質の産生も認められた。

産生されたHCVを密度勾配法で分離すると、ウイルス粒子自体の分画よりも軽い分画に感染性ウイルスの分画が認められ、溶解感染によって産生されるウイルスと同様に、VLDLなどの脂質成分との会合が示唆された。一方、産生されたウイルスは細胞溶解をきたすこと、および、その治癒細胞にキメラHCVを再接種させると再持続感染が成立することから持続感染細胞自体に生じた変化が持続感染に必要であると考えられた。実際マイクロアレイ解析により、溶解感染細胞と持続感染培養肝細胞との間に著しい遺伝子発現の相違を認めた。また、持続感染培養肝細胞には臨床的な持続感染と同様に著明な脂肪滴の蓄積が認められ、その原因の解明のためにメタボローム解析を行った。LC-TOFMS解析の結果、持続感染培養肝細胞では中長鎖の脂肪酸をはじめ各種脂質成分の含有量が多く脂肪滴の蓄積を裏付けるものと考えられた。また、CE-TOFMS解析の結果、持続感染培養肝細胞ではアミノ酸の取り込みが増加、および、細胞内での代謝亢進の結果、過剰なエネルギーの蓄積として脂肪滴が増加している可能性が示唆された。マイクロアレイの大きなデータとメタボローム解析で得られたデータを統合する際に非常に時間を要した。東北震災後の実験停止や節電のための実験時間短縮のため、実験の変更や培養の中断などを余儀なくされ予定した計画より遅れが生じた。また、持続感染の成立およびその後の培養実験には月単位の継続培養が必要なため、個々の実験およびその再現実験を行う際に多くに時間を要した。さらに、マイクロアレイ解析で予想以上の遺伝子変異が明らかとなりその確認に時間を要している。マイクロアレイで得られた膨大な情報とLC-TOFMSおよびCE-TOFMSで得られたメタボローム解析とを統合的に分析し、また、遺伝子発現を蛋白レベルで確認するためにかなりの時間を要した。また、変化のみられた代謝系を実際に生化学的に分析、確認するのに時間を要したため、予定よりも研究達成が遅れている。また、遺伝子レベルでの変異を明らかにするために細胞ゲノムのシークエンスを確認する。これまでの研究の結果、感染性ウイルス粒子の密度は非感染性粒子より低いことが明らかとなった。今後、無血清培地中の急性感染ウイルスおよび持続感染ウイルスを密度勾配法により分離し、ウイルス蛋白質、ウイルスRNAに加えVLDLなどの脂質成分などのより詳細な定量的分析を行ない、急性期の溶解感染との共通点と相違を明らかにする。さらにクライオ電顕によりウイルス粒子の構造を明らかにする。一方、メタボローム解析で明らかになった持続感染細胞における代謝異常経路を焦点に、生化学的にも確認実験を行う。また、マイクロアレイ解析のデータも同時に得られているので、GSEAなどのデータベースを用いパスウェイ解析を行うことによってその代謝異常の原因遺伝子を絞り込み、ノックアウトまたはノックダウンの実験によって分子生物学的に確認を行う。これらによって、持続感染に必要な分子機構を明らかにし、肝発がん遺伝子、慢性炎症発癌の原因となる遺伝子を明らかにする。また、キメラHCV持続感染培養肝細胞をサイクロスポリンで処理して作製した治癒細胞に他のHCV感染株を感染させて様々な持続感染細胞を樹立し、新たな抗HCV薬のスクリーニング系として利用を行う。未使用額の発生は効率的な物品調達を行った結果であり、翌年度の消耗品購入に充てる予定である。上記研究における代謝産物の増減をみるために代謝産物測定用試薬を購入、使用する。また、重要な遺伝子発現を転写レベルで確認するための定量PCR用試薬を購入、使用する。