hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
B型肝炎ウイルス遺伝子型毎の薬剤耐性メカニズムの解明

1、ガイドラインの検証:多施設ランダム化比較臨床試験を実施、短期的にはエンテカビル(ETV)切り替えが推奨された。2、キメラマウスを用いたin vivo感染実験:(1)ETV耐性株に対する低分子化合物の同定。(2)潜在性HBV感染患者の血清を用いた感染実験によりその感染性を証明。3、ETV耐性メカニズムの解明:ETV耐性変異(180M,202G,204V)に伴い逆転写酵素の立体構造が変化しETVとの結合能が低下。1)多施設共同研究:3年以上エンテカビル(ETV)が投与された症例における耐性変異の頻度を検討した結果、ラミブジン耐性(LVDr)患者(41例)で0週、48週、96週、144週でそれぞれ4.9%、14.6%、24.4%、44.8%であった。一方、未治療群(59例)からは耐性変異を検出しなかった。2) ETV耐性変異:2つのLVD耐性変異(180M,204V)に加えて、184あるいは202番目の変異よりETV耐性を獲得し、Breakthrough (BT)を引き起こすことが示された。3) ETV耐性メカニズムの解明:専用解析ソフトを用いて3次元ドッキングシュミレーションを行った。LVDr (180M,204V)に加えて202Gまたは184Lが入ることにより、ETVとの推定結合部位の立体構造が変化し、結合能が落ちることがわかった。4) Genotype(欧米型Ae, Dとアジア型Bj, C)に対応したLVDr, ETVrクローンの作成した。現在、In vitro複製モデルを用いて、変異株のウイルス複製や蛋白発現の違いに関する検討を開始している。5)キメラマウスを用いたin vivo実験:耐性変異株の感染・複製効率の検討及び薬剤感受性試験感染実験を開始した。1)エンテカビル(ETV)耐性メカニズムの解明:多施設共同研究により、ラミブジン耐性(LVDr)患者(41例)において3年で44.8%にETV耐性変異(LVDr+202G or 184L)を認めた。専用解析ソフトを用いて3次元ドッキングシュミレーションを行った結果、LVDr (180M, 204V)に加えて202Gまたは184Lが入ることにより、ETVとの推定結合部位の立体構造が変化し、B型肝炎ウイルス(HBV)の結合能が落ちることがわかった。2)ラミブジン投与例におけるエンテカビル切り替え無作為割り付け試験:当院及び研究協力施設においてLVDを3年以上継続投与しHBV-DNAが2.6 logcopies/mL未満であった27例(男性17例、平均年齢55±9歳、LAM平均投与期間は57±27ヶ月)を各施設ごとにA群:LAM継続群(15例)、B群:ETV切り替え群(12例)へ無作為に割り付け、平均治療観察期間は13ヶ月であった。B群の1例で副作用によりETVを中止したため除外した。ウイルス学的再燃の出現頻度は、A群:5/15例(33%)でB群:0/11(0%)に比し、高い傾向であり、さらに詳細に検討していく予定である。3)キメラマウスを用いたin vivo実験:耐性変異株の感染・複製効率の検討及び薬剤感受性試験感染実験を開始した。特に、ETV耐性クローンを作成し、感染実験を施行。感染力は弱いが、一旦感染するとETV耐性であることを確認した。新規薬剤(化合物)を用いた感受性試験を行う準備は整った。1.エンテカビル(ETV)耐性メカニズムの解明:ETV耐性変異(180M,202G,204V)に伴い、逆転写酵素(RT)の立体構造が変化し、ドッキングシュミレーションによりETVとの結合能が低下することが証明できた。2.ガイドラインの検証:3年以上ラミブジン(LVD)単独投与により効果が得られている(HBV-DNA<2.6)B型慢性肝炎症例に対して、LVD継続投与群とETV切り替え投与群でのランダム化比較臨床試験を実施した。その結果、LVD継続群では高率にbreakthroughを認めたが(40%)、ETV切り替え群では平均13カ月の観察で1例もbreakthroughを認めなかった。短期的にはETV切り替えが推奨された。3.キメラマウスを用いたin vivo感染実験:(1)HBVワクチンエスケープ変異株(VEM)に対する中和実験:HBVに対するモノクロナール抗体を用いてヒト肝細胞キメラマウスにおけるHBV中和試験を行った。現在日本で使用されている遺伝子型CのHBワクチン由来のS抗体で遺伝子型AのHBV感染防御が可能であった。また、VEM株の感染実験においても、複数のS抗体を組み合わせることにより、感染防御が可能であった。(2)潜在性HBV感染【HBsAg感度以下、HBV DNA陽性】患者の血清を用いた感染実験:免疫不全状態にあるヒト

肝細胞キメラマウスに接種したところ、感染が成立するマウスが存在した。献血スクリーニングをすり抜けて、輸血後B型肝炎が発生する可能性を示唆する重要なデータと思われる。
リスクマネジメントに関する経営工学的研究

技術発展は人類に富と幸福をもたらすだけではなく,その技術を前提に構築された生活基盤を混乱に陥れるリスクも内包している.2007年に起こったJR東日本の発券障害,NTT東西間の接続障害,全日空の予約システム障害などは,その典型例といえるだろう.このようなシステム障害だけではなく,医療,財務,生産などの様々な分野で,近年信頼性を損なうような現象が頻発しており,高信頼性システムの設計の前に,リスクマネジメントを研究する必要がある.我々は,このような視点にたって,多様な分野について,経営工学という共通のアプローチでリスクマネジメントに関する研究を行った.その成果は,雑誌論文67件,学会発表75件,図書18件に上る.その成果の一部を簡単に列挙すると次のようになる.情報システム分野では組織IQがIT投資や生産性に影響を与えること,情報システム開発における形式仕様記述の自動化,顧客視点に立ったシステム開発方法論の提案などを行った.医療分野では医療安全マネジメントに人間工学の視点を導入し,顧客視点の必要性や安全文化形成に何が必要かを明らかにした.品質管理および応用統計の分野では等SN比検定やロバストパラメータ設計の精緻化を行い,財務分野では企業固有の組織資本の重要性やコーポレート・ガバナンスのあり方を明らかにした.さらに,オペレーションズ・リサーチの分野では,最適な,あるいは効率的な判別問題の解法や判別規則の解析を行った.技術発展は人類に富と幸福をもたらすだけではなく,その技術を前提に構築された生活基盤を混乱に陥れるリスクも内包している.2007年に起こったJR東日本の発券障害,NTT東西間の接続障害,全日空の予約システム障害などは,その典型例といえるだろう.このようなシステム障害だけではなく,医療,財務,生産などの様々な分野で,近年信頼性を損なうような現象が頻発しており,高信頼性システムの設計の前に,リスクマネジメントを研究する必要がある.我々は,このような視点にたって,多様な分野について,経営工学という共通のアプローチでリスクマネジメントに関する研究を行った.その成果は,雑誌論文67件,学会発表75件,図書18件に上る.その成果の一部を簡単に列挙すると次のようになる.情報システム分野では組織IQがIT投資や生産性に影響を与えること,情報システム開発における形式仕様記述の自動化,顧客視点に立ったシステム開発方法論の提案などを行った.医療分野では医療安全マネジメントに人間工学の視点を導入し,顧客視点の必要性や安全文化形成に何が必要かを明らかにした.品質管理および応用統計の分野では等SN比検定やロバストパラメータ設計の精緻化を行い,財務分野では企業固有の組織資本の重要性やコーポレート・ガバナンスのあり方を明らかにした.さらに,オペレーションズ・リサーチの分野では,最適な,あるいは効率的な判別問題の解法や判別規則の解析を行った.研究代表者飯島は,リスクマネジメントに関する総合的アプローチのフレームワークを与え,各分担者はそれぞれ担当する領域でのリスクに関する現状分析を行った.具体的な研究実績は以下の通りである.1.情報システムリスク:研究代表者飯島は,ビジネス情報システムの統合における障害発生の事例を調べ,それらの持つ共通点についてまとめ,障害発生を分析するための枠組みを構築した.研究分担者矢島は,超大規模データに適用可能な,サポートベクトルマシンによる判別アルゴリズムの開発を行った.2.医療リスク:研究分担者伊藤は,医療リスクを解明する方法論・アプローチとして,実際のタスクを観測して,そこから医療業務のリスクを抽出する方法論を構築した.3.事故・災害リスク:研究分担者村木は,産業エコロジーの促進に不可欠な,資源由来の原材料の代替として産業廃棄物(残余物)を二次原材料へ転換させるシステムの枠組みを提案した.4.金融・財務リスク:研究分担者水野は,金融リスク最小化問題のモデル化について研究した.指標としてVAR(バリューアットリスク),条件付VAR,トラッキングエラーを取り扱ったリスク最小化問題や,データの不確かさを考慮したより現実で複雑な問題のモデル化を行った.研究分担者蜂谷,永田は,企業価値の創造に寄与することを目的にリスク特性に応じた最適なリスク・マネジメント手法を開発した.5.リスクマネジメントの共通的方法論:研究分担者宮川は,因果ダイアグラムを用いた統計的因果推論の理論を発展させた.研究分担者妹尾は,他業種にまたがる約220社を対象とし,企業にとって問題となる不確実性の高い出来事が発生した(リスクが顕在化した)際のリスク対処組織に関するアンケート調査の実施と結果分析を行った.研究代表者飯島は,リスクマネジメントに関する総合的アプローチのフレームワークを与え,各分担者はそれぞれ担当する領域でのリスクに関する現状分析を行った.(1)情報システムリスク:研究代表者飯島は,ビジネス情報システムの統合における障害発生の主因である,ビジネスアーキテクチャと情報システムアーキテクチャの間の不整合に注目し,変化に強い情報システムのアーキテクチャについて考察した.研究分担者矢島は,16年度に引き続き,アルゴリズムの実装を行った.また,実データを用い,アルゴリズムの効率性や,判別精度に関して実証的な研究を行った.(2)医療リスク:研究分担者伊藤は,医療リスクを解明,そして安全管理の方法論・アプローチとして,事故・インシデント報告を分析する方法,ならびに航空産業などではよく利用されている「人間信頼性解析」の医療への適用方法を検討し,そのプロトタイプを構築した.(3)事故・災害リスク:研究分担者村木は,16年度に構築した設備保全のように計画されたEventにおける安全確保のために,アイソレーション計画システムにおける残存リスクを最小にする運用システムを構築した.(4)金融・財務リスク:研究分担者

水野は,指標としてVAR,条件付VAR,トラッキングエラーを取り扱ったリスク最小化問題やデータの不確かさを考慮したロバスト最適化問題のモデル化について研究し,内点法を利用したアルゴリズムの開発を行った.研究分担者蜂谷,永田は,個々のリスクマネジメント手法により達成される効果および複数の手法を組み合わせた場合の効果を推定することにより,企業価値への影響を検証した.(5)リスクマネジメントの共通的方法論:研究分担者宮川は,リスク要因の変動抑制効果の推定理論を財務リスク問題へ適用し,その有効性を実証した.研究分担者妹尾は,事例研究を実施し,リスク対応組織と企業競争力の関係についての仮説構築を行った.研究代表者飯島は,リスクマネジメントに関する総合的アプローチのフレームワークを与え,各分担者はそれぞれ担当する領域でのリスクに関する現状分析を行った.(1)情報システムリスク:研究代表者飯島は,ビジネス情報システムの統合における障害発生の主因である,ビジネスアーキテクチャと情報システムアーキテクチャの問の不整合に注目し,変化に強い情報システムのアーキテクチャについて考察した.研究分担者矢島は,17年度に引き続き,アルゴリズムの実装を行った.また,実データを用い,アルゴリズムの効率性や,判別精度に関して実証的な研究を行った.(2)医療リスク:研究分担者伊藤は,医療リスクを解明,そして安全管理の方法論・アプローチとして,事故・インシデント報告を分析する方法,ならびに航空産業などではよく利用されている「人間信頼性解析」の医療への適用方法を検討し,そのプロトタイプを構築した.(3)事故・災害リスク:研究分担者村木は,リース販売を主とする生産システムについて考察をし、販売履歴、設計情および保守管理情報から推定される返還製品に含まれる部品の品質(主に余寿命)、タイミングを含む量に関する情報に基づき、部品リユースを考慮し新規投入部品量を目的関数とする生産計画モデルを構築した。(4)金融・財務リスク:研究分担者水野は,指標としてVAR,条件付VAR,トラッキングエラーを取り扱ったリスク最小化問題やデータの不確かさを考慮したロバスト最適化問題のモデル化について研究し,内点法を利用したアルゴリズムの開発を行った.研究分担者蜂谷,永田は,個々のリスクマネジメント手法により達成される効果および複数の手法を組み合わせた場合の効果を推定することにより,企業価値への影響を検証した.(5)リスクマネジメントの共通的方法論:研究分担者宮川は,リスク変動要因の変動抑制効果の定式化とその推定理論を導き,その結果を製品製造工程の品質安定化問題へ適用し,その有効性を実証した.研究分担者妹尾は,事例研究を実施し,リスク対応組織と企業競争力の関係についての仮説構築を行った.技術発展は人類に富と幸福をもたらすだけではなく,その技術を前提に構築された生活基盤を混乱に陥れるリスクも内包している.2007年に起こったJR東日本の発券障害,NTT東西間の接続障害,全日空の予約システム
加リン酸分解酵素が関与する酸化的多糖分解経路の解明

澱粉やキチンなどの糖質の分解・代謝は,加水分解酵素の反応を中心に考えられてきたが,セルロース分解同様,酸化還元酵素による酸化的分解反応が関与する可能性が示唆されている。本研究では,この新規代謝経路の全貌を解明するために,酸化的分解の中間産物である酸性オリゴ糖を加リン酸分解する酵素ホスホリラーゼを,ゲノム情報やメタゲノムライブラリーを利用し網羅的に探索し,酵素学的,速度論的および構造学的特性の解明を目指す。当年度は,(1)ゲノムライブラリーおよびメタゲノムライブラリー作製,(2)ゲノム情報を基盤とした網羅的なホスホリラーゼの探索,(3)酸性オリゴ糖の調製,(4)高感度糖1-リン酸定量法の確立について,当初予定通り検討を加えた。その結果,ホスホリラーゼ遺伝子を多く持つ微生物のゲノムDNAおよび環境中から回収したヘテロなゲノムDNAを断片化,クローン化することでゲノムライブラリーおよびメタゲノムライブラリーが作製できた。また,ゲノム情報を基に網羅的にホスホリラーゼ遺伝子を探索・クローニングした結果,数種の機能未知タンパク質の取得に至った。基質となる酸性オリゴ糖の調製は,各種オリゴ糖の調製,オリゴ糖の酸化の手順で行なうが,現在各種オリゴ糖の調製が完了している。糖1-リン酸の高感度定量法の検討については,予算減額により機材調達が不可となったため,反応システムの再構築による新たな定量法の考案を行なうに留まった。本研究では,ライブラリーからのスクリーニング,既知遺伝子情報からのクローニングにより,酸性オリゴ糖に作用するこれまで知られていないホスホリラーゼの発見を目指している。(1)では,ホスホリラーゼ遺伝子を多く持つ微生物のゲノムDNAおよび環境中から回収したヘテロなゲノムDNAを断片化,クローン化することでゲノムライブラリーおよびメタゲノムライブラリーが作製できた。ライブラリー調製手法が確立したことから,スクリーニングステップへの移行,更なるライブラリーの拡大が可能となった。(2)では,ゲノム情報を基に網羅的にホスホリラーゼ遺伝子を探索・クローニングした結果,酸性オリゴ糖に対して作用するものかは不明であるものの数種の機能未知タンパク質の取得に至った。(3)では,基質となる酸性オリゴ糖の調製方法として各種オリゴ糖の調製,オリゴ糖の酸化のステップのうち,各種オリゴ糖の調製が完了しており,現在酸化ステップの条件検討中である。(4)では,予算減額により機材調達が不可となったため,反応システムの再構築による新たな定量法の考案を行なうに留まっており,若干遅れが生じている。全体として,おおむね順調に進展しているものと考えられる。当初予定に準拠し,当年度調製したライブラリーを用いた酵素スクリーニング,遺伝子情報から得られた機能未知酵素遺伝子によってコードされるタンパク質の酵素学的・速度論的・構造学的解析を順次遂行する。

(3)では,基質となる酸性オリゴ糖の調製方法として各種オリゴ糖の調製,オリゴ糖の酸化のステップのうち,各種オリゴ糖の調製が完了しており,現在酸化ステップの条件検討中である。(4)では,予算減額により機材調達が不可となったため,反応システムの再構築による新たな定量法の考案を行なうに留まっており,若干遅れが生じている。全体として,おおむね順調に進展しているものと考えられる。当初予定に準拠し,当年度調製したライブラリーを用いた酵素スクリーニング,遺伝子情報から得られた機能未知酵素遺伝子によってコードされるタンパク質の酵素学的・速度論的・構造学的解析を順次遂行する。
レム睡眠中における急速眼球運動と夢見過程に関する精神生理学的検討

本研究の目的は,レム睡眠中の急速眼球運動に伴う脳電位を用いて大脳皮質活動を検討し,夢の発生メカニズムを検証することである.具体的には,覚醒中の急速眼球運動(サッカード)前後に出現する脳電位とレム睡眠中のREMs前後に出現する脳電位の比較を行う.最終年度である本年度は,これらの脳電位比較の結果をまとめ(学術雑誌SLEEP受理),実際の夢見聴取内容,レム睡眠の神経機構および急速眼球運動の発生機構における生化学的な知見を踏まえた上で,夢の発生メカニズムについて総合考察を行った.本年度,新たに検討した内容は,レム睡眠中にはREMsの開始に同期して中心部優勢に陽性電位(P200r)が出現し,その発生源は,感情的なイメージ体験や注意に関連する帯状回,および運動イメージに関連する運動前野に同定されたことである.覚醒中にはP200rに相当する脳電位は観察されなかった.これまでの研究結果より,レム睡眠中の急速眼球運動の役割および夢の発生メカニズムについてまとめると,(1)急速眼球運動の役割:レム睡眠中には覚醒中のサッカードとは異なる発生機序により急速眼球運動が出現し,眼球運動が生じることで夢の内容がより印象的になることを示唆した.この結果は,レム睡眠中の夢と急速眼球運動の関連から示された,夢の「活性化-合成化仮説」・「感覚映像・自由連想仮説」を支持する.(2)夢の発生メカニズム:レム睡眠中には,急速眼球運動が出現することで,それに連動して脳内で,情動・運動イメージ感覚が形成され,そこに眼球運動の終了に伴って生じる視覚イメージが統合されることで特有の鮮明な夢見体験が出現することを示唆した.今後の展望今度は,このメカニズムを手がかりに,生成された夢とは一体何か,夢を体験する意識とは何か,について大脳皮質活動の重要性に着目した検討を行う.本年度購入した統計ソフト・大容量ハードディスク等を用いたことで,より効率的に実験研究のデータ蓄積・処理を行うことができた.本研究内容は,広島大学総合科学部実験倫理委員会行動科学部門で承認を得ており,実験の際には,実験参加者から書面でのインフォームドコンセントを得ることで,参加者の人権と利益の保護を行っている.本研究の目的は,レム睡眠中における急速眼球運動(REMs)と夢見過程に関する精神生理学的検討を行うことである.具体的には,覚醒中に生じる急速眼球運動(サッカード)前後に出現する脳電位とレム睡眠中のREMs前後に出現する脳電位を比較すること,両眼球運動の運動形態に関する比較を行うことである.これらの検討により,レム睡眠中のREMsの発生メカニズム,REMsが脳内に及ぼす影響について言及し,REMsと夢見体験の関連性を述べ,レム睡眠中の夢見発生メカニズムを解明する.本年度の研究実施内容とその成果については,以下の通りである.1.レム睡眠中のREMs発生中に夢見聴取を行い,この時点における脳内活動と夢見体験との関連性を検討した.その結果,夢の有無により後頭部の脳電位活動(ラムダ様反応)に違いが見られた.夢見報告があったときはラムダ様反応が出現したが,夢をみなかったと報告があったときには出現しなかった.さらに,夢内容に聴覚的な要素が含まれた場合よりも,視覚的な要素のみの場合でラムダ様反応の振幅は有意に増大し,夢の活動性とは負の相関傾向を示した.これは,レム睡眠中の夢とREMsとの直接的な関連を示唆するものであり,夢の発生メカニズムを解明する上で重要な手がかりになると考えられる.2.レム睡眠中のREMsの眼球運動形態について,通常終夜睡眠におけるレム睡眠中の夢見体験と比較を行った.その結果,REMsの密度と夢の活動性,印象性との間に左の相関が認められた.これは,中途覚醒法を用いて誘発した入眠直後のレム睡眠中で検討した先行研究と一致した.この結果より,レム睡眠中のREMsと夢見内容との関連性が示唆された.以上の成果については,本年度購入したパーソナルコンピュータを用いて分析検討を行った.実験を行った際には,実験参加者には事前に実験内容を説明し,書面でのインフォームドコンセントを得ることで,参加者の人権と利益の保護を行った.本研究の目的は,レム睡眠中における急速眼球運動(REMs)と夢見過程に関する精神生理学的検討を行うことである.具体的には,覚醒中の急速眼球運動(サッカード)前後に出現する脳電位とレム睡眠中のREMs前後に出現する脳電位の比較を行う.本年度は,これらの脳電位比較から,夢の発生メカニズムについてまとめ,国際誌に投稿し,現在最終審査中である.さらに,新たな視点として,レム睡眠中の脳電位と夢見内容との関連を検討するため,11名の例数を加え,昨年度と合わせて計20名の実験参加者から夢見体験を聴取した.1.レム睡眠中のREMs前にはサッカード前に出現する準備電位は出現しなかった.これはREMsがサッカードとは異なる発生メカニズムを持つことを示す.REMs後にはラムダ様反応が出現した.これは,レム睡眠中にも覚醒中と同様に何らかの視覚情報処理活動が生じる可能性を示す.以上より,夢の発生メカニズムに関して,まずREMsが生じそれをきっかけに脳内活動(視覚イメージの生成)が生じ,それを夢として体験すると考えられる(学術雑誌SLEEP投稿中).ラムダ様反応の発生源を3次元的に検討し,REMs後に視覚野で活動が生じることも確かめた.

2.夢見内容とラムダ様反応との関係を検討した結果,夢を見たと報告があった場合にのみラムダ様反応が観察され,ストーリー性がない・音があまり印象に残らない場合でより明瞭なラムダ様反応が観察された.これは,ラムダ様反応が夢見体験の客観的指標となりうる可能性を与える.(日本睡眠学会第29回大会で発表)本年度購入したパーソナルコンピュータモニタや大容量ハードディスク等を用いたことで,より効率的に実験研究のデータ蓄積・処理を行うことができた.本研究内容は,広島大学総合科学部行動科学実験委員会で承認を得ており,実験の際には,実験参加者から書面でのインフォームドコンセントを得ることで,参加者の人権と利益の保護を行っている.本研究の目的は,レム睡眠中の急速眼球運動に伴う脳電位を用いて大脳皮質活動を検討し,夢の発生メカニズムを検証することである.具体的には,覚醒中の急速眼球運動(サッカード)前後に出現する脳電位とレム睡眠中のREMs前後に出現する脳電位の比較を行う.最終年度である本年度は,これらの脳電位比較の結果をまとめ(学術雑誌SLEEP受理),実際の夢見聴取内容,レム睡眠の神経機構および急速眼球運動の発生機構における生化学的な知見を踏まえた上で,夢の発生メカニズムについて総合考察を行った.本年度,新たに検討した内容は,レム睡眠中にはREMsの開始に同期して中心部優勢に陽性電位(P200r)が出現し,その発生源は,感情的なイメージ体験や注意に関連する帯状回,および運動イメージに関連する運動前野に同定されたことである.覚醒中にはP200rに相当する脳電位は観察されなかった.これまでの研究結果より,レム睡眠中の急速眼球運動の役割および夢の発生メカニズムについてまとめると,(1)急速眼球運動の役割:レム睡眠中には覚醒中のサッカードとは異なる発生機序により急速眼球運動が出現し,眼球運動が生じることで夢の内容がより印象的になることを示唆した.この結果は,レム睡眠中の夢と急速眼球運動の関連から示された,夢の「活性化-合成化仮説」・「感覚映像・自由連想仮説」を支持する.(2)夢の発生メカニズム:レム睡眠中には,急速眼球運動が出現することで,それに連動して脳内で,情動・運動イメージ感覚が形成され,そこに眼球運動の終了に伴って生じる視覚イメージが統合されることで特有の鮮明な夢見体験が出現することを示唆した.今後の展望今度は,このメカニズムを手がかりに,生成された夢とは一体何か,夢を体験する意識とは何か,について大脳皮質活動の重要性に着目した検討を行う.本年度購入した統計ソフト・大容量ハードディスク等を用いたことで,より効率的に実験研究のデータ蓄積・処理を行うことができた.本研究内容は,広島大学総合科学部実験倫理委員会行動科学部門で承認を得ており,実験の際には,実験参加者から書面でのインフォームドコンセントを得ることで,参加者の人権と利益の保護を行っている.
定量的一塩基多型解析技術の開発と医療への応用

プールDNAを用いた,飛躍的に低コスト且つ信頼出来る疾患遺伝子の関連解析法を開発・確立した.本法はマイクロアレイ法,定量的SSCP法の2段階からなり,これを用いて全身性エリテマトーデスのゲノムワイド関連解析を行い,多数の疾患関連遺伝子を同定した.また,多数の全胞状奇胎のゲノムを解析し,SNPおよびコピー数多型に関する確定ハプロタイプを決定し,日本人ゲノムの連鎖不平衡構造の情報基盤を「D-HaploDB」として公開した.プールDNAを用いた,飛躍的に低コスト且つ信頼出来る疾患遺伝子の関連解析法を開発・確立した.本法はマイクロアレイ法,定量的SSCP法の2段階からなり,これを用いて全身性エリテマトーデスのゲノムワイド関連解析を行い,多数の疾患関連遺伝子を同定した.また,多数の全胞状奇胎のゲノムを解析し,SNPおよびコピー数多型に関する確定ハプロタイプを決定し,日本人ゲノムの連鎖不平衡構造の情報基盤を「D-HaploDB」として公開した.(1)windows上で独立に作動するSNP同定、アレル頻度定量解析ソフトウエア「QSNP lite」を開発した。これは、SSCP解析によるSNPタイピング及びアレル頻度決定とシークエンシングによるSNP配列の同定、確認を統合して行うものである。また、多数サンプルの解析を行うことを可能とするための実験手順の設定、キャピラリーアレイシークエンサーからのデータ管理等を行う機能を有している。実地使用で更なる操作性の向上を図っている。(2)単一精子由来の胞状奇胎74試料のDNA(九州大学倫理委員会で承認済み)を用いて約28万個のSNPをタイピングした。これにより74セットのゲノムワイドな確定ハプロタイプを得た。これをもとに情報学的解析を行い、日本人ゲノムのハプロタイプブロック構造を決定した。また、関連解析を効率よく行うために不可欠なステップであるtagSNPの選定を行った。さらにこれらの結果と、HapMap Projectで統計的に推定された日本人集団のハプロタイプを比較し、同projectのデータの問題点を検討した。これらの結果を高度検索機能を有するデータベース「D-Haplo-DB」(http://orca.gen.kyushu-u.ac.jp)に集約し、公開した。さらに、種々のシミュレーションから、ここで得られたtagSNPを用いたゲノムワイドな関連解析を行った場合、約60%の確率で原因遺伝子を相関係数(r^2)0.8以上として検出しうることが推定された。この検出感度はHapMap国際プロジェクトでの感度より優れていると結論した。(3)全身性エリテマトーデス(SLE)の要因遺伝子を探索する目的ですでに500例以上の患者サンプルを収集している。先行研究として約260サンプルから作製した患者群および対照群のDNAプールを用いて53候補遺伝子約300SNPsについて関連解析を行った。そのうち両群間のアレル頻度の差が最も大きかった3遺伝子については更にハプロタイプ解析を行い、頻度の違いが有意であることを確認した。1.PLACE-SSCP及びシークエンシングの反応を96ウェルプレートで行い、キャピラリーアレイ装置で解析、SNP同定とアレル頻度推定を完了するまでを一貫して管理するWindows上で稼動するソフトウェア「QSNPlite」を開発し、公開した。2.プールDNAを被検材料としてAffymetrix社100K及び500K SNP chipを用いた定量的解析を行い、プールDNAによるゲノムワイド関連解析を行う方法論を確立した。3.すでに我々は280K個のSNPに関する日本人確定ハプロタイプと、これに基づいたSNP間連鎖不平衡ビン及びtagSNPを決定し、これらをデータベース(DHaploDB)化して公開している。今回は更に500K個のSNP情報を追加し、このデータベースでの検索法、連鎖不平衡ビン表示法等を改良した。4.SLEの病態等を根拠に選定した約200個の遺伝子内及びその近傍に在るSNPについて、「pooled DNAのPLACE-SSCP解析」を行い、極めて有力な候補遺伝子を見出した。5.家族性滲出性硝子体網膜症では、細胞外シグナル分子norrin及びこれの受容体-シグナル伝達系蛋白質であるFrizzled4,Lrp5に突然変異が頻繁に起きていること、及びこの疾患にはエピスタティックな要因が関与していることを発見した。6.転写開始点を起点とした場合のSNPの分布に周期性があることを発見した。この周期性が146bpであり、CpGアイランドを有する多くの遺伝子の転写開始点付近にヌクレオソームが整然と並んで存在する可能性を提示した。1.DNAプールを用いたマイクロアレイによるゲノムワイド関連解析の先行研究として、SLE患者群・対照群のプールDNAを被検材料として500Kアレイによる定量的SNP解析により疾患関連SNPの一次スクリーニングを行った。二次スクリーニングには定量的PLACE-SSCP法を用い、アレイでの定量による擬陽性を除去した。これら2段階の検討で非常に強い関連が示された複数のSNPについてプールに含まれる全試料のタイピングを行い、大部分が疾患と強く関連していることを確認し、この手法の有用性を示した。2.候補遺伝子アプローチとして、SLEへの関連が疑われる約200個の遺伝子上のSNPについてdbQSNP実験管理システムを利用したDNAプールのPLACE-SSCP解析によりSLEとの関連を検討した。その結果、転写因子IRF5および補体C3の遺伝子等のSNPが疾患と関連していることを見出した。

3.日本人確定ハプロタイプの公開データベース(D-HaploDB)に50万個のSNP情報を追加し更新し、国際ハップマップ計画における日本人ハプロタイプ構造との比較検討を行った。4.SNP同定とアレル頻度推定のためのPLACE-SSCP及びシークエンシング解析プロセスを一貫して管理するソフトウエア「QSNPlite」を改良し、各実験で得られたアレル頻度データを出力ファイルから収集する機能を追加した。5.家族性滲出性硝子体網膜症の患者においてWntシグナル伝達系の複数の遺伝子での突然変異を検出した。これらの変異が同経路標的遺伝子の発現へ与える影響を定量し、同経路の阻害と表現型が単純には相関せず発症要因が複合的であることを明らかにした。6.PLACE-SSCP解析を髄膜腫組織でのヘテロ接合性欠失(LOH)解析に応用し、がん化への関連が示唆される高頻度LOH領域を決定した。1.単一精子由来全胞状奇胎DNAをCNVを含む約180万個の多型マーカーについてタイピングした。このうちSNPジェノタイプをD-Haploデータベースに追加し、100万個のSNPからなる確定ハプロタイプを公開した。さらにCNVプローブを含めた解析により日本人ゲノムのCNV領域を探索し、新規CNV領域と推定される領域を多数見出した。2.全胞状奇胎DNAのSNP解析から得た日本人確定ハプロタイプ構造(D-HaploDB)と国際HapMap計画による日本人推定ハプロタイプ構造とを比較することにより、推定ハプロタイプの精度に関する問題点を見出した(印刷中)。3.プールDNAを用いたゲノムワイド関連解析(P-GWAS)により全身性エリテマトーデス(SLE)感受性候補遺伝子を特定した。即ち、疾患/対照各群のプールDNAの500K SNPアレイを用いた定量解析による候補領域の特定(一次スクリーニング)、各プールDNAの定量的PLACE-SSCP解析を用いた関連性の確認と候補ゲノム領域の絞り込み(二次スクリーニング)、上記各群及び追加試料群DNAの個別タイピングによる関連性の確定(三次スクリーニング)を経て非常に強い関連を示す複数のSNPを特定した。複数のサンプル群からの結果をメタアナリシスした場合の有意差はマーカー数での多重検定の補正後も十分に有意であった。同定されたSNPの中には新規なものに加えて、欧米のグループによりSLE関連遺伝子として同定されたものも含まれており、この手法の有用性を示した。4.マイクロアレイデータの定量的解析により、マイクロダイセクションによって得た脳腫瘍DNAでのヘテロ接合性欠失(LOH)解析を行った。その結果同腫瘍では残存アレルの倍加を伴うLOH現象が高頻度で生じていることを発見し、このような特異な染色体変化が癌化に関わっている可能性を示した。1.単一精子由来のゲノムを持つ全胞状奇胎DNAをタイピングすることにより、確定ハプロタイプ、すなわちSNPおよびコピー数多型(CNV)の染色体上での実際の並びを決定した。
都市ならびに農村における地域活性化政策ののモデルケースの日米比較研究

地域活性化政策のモデルケースとして、米国ペンシルバニア州ピッツバーグ市の都市再開発について調査と分析をした。かつての鉄鋼都市ピッツバーグは典型的な斜陽産業都市であったが、今では企業投資の活発な、しかも住みやすい街として再生した。ピッツバーグの再生の鍵は、その活性化の捉え方と担い手に求められる。企業にとっても、住民にとっても、魅力的な都市となるには、都市基盤整備や産業刺激策だけでは不十分で、良好で安全な住環境づくりや近隣商業地区の発展といったコミュニティー開発が不可欠であるということを、ピッツバーグの経験は示していた。とりわけコミュニティー開発の担い手としての住民自治組織CDC(Community Development Corporations)の存在と役割は重要で、しかもこれまで日本ではほとんど紹介がされてこなかったものである。行政と企業のパートナーシップ(官民協力)だけでなく、行政と住民のパートナーシップが都市活性化政策で重視されていることが、日本の都市活性化政策との大きな相違であった。ここで得た知見を基礎として比較分析を展開するためには、戦後資本主義諸国の地域活性化=地域開発政策を理論的なパースペクティブから整理する必要があると考えるにいたった。そこで戦後の典型的な地域開発政策をフォーディズム的地域開発政策と理論的に整理し、その行き詰まりが明白となった段階で登場してきたのが開発戦略のオルタナティブとしての内発的発展論(内発的開発)であると位置づけ、内発的発展論との距離、親和性の度合いが近年の各国・各地域の活性化政策の相違の根底に存在していることを提起した。今後はこのような理論的フレームワークに基づいた事例研究をさらに進めていく予定である。
新しい抗腫瘍性分子標的としてのアラキドン酸代謝関連分子の有用性

卵巣癌細胞株を用いた腹膜播種モデルにおいて、可溶性プロスタグランジンE2受容体(FuEP2/Ex2)は腫瘍重量と血性腹水産生量の抑制をもたらし、腫瘍組織内でのCD31、CD163陽性細胞数が減少していた為、腫瘍血管新生と免疫抑制性マクロファージ集積の抑制が増殖抑制機序の一端を担っていると考えられた。マイクロアレイ解析により、FuEP2/Ex2発現細胞由来の腫瘍片で発現上昇が認められる遺伝子が6つ同定された。このうちTMPRSS4の阻害はFuEP2/Ex2発現細胞の腫瘍増殖を更に抑制した事から、TMPRSS4はFuEP2/Ex2による増殖抑制環境で生存因子として機能している可能性が示唆された。膵臓癌細胞の同所移植腫瘍モデルを用いて、FuEP2/Ex2の膵内腫瘍増殖に対する影響を検討した。BxPC-3 (COX-2陽性、EP4強陽性)を用い、FuEP2/Ex2発現ベクターを導入後、薬剤選択を行い安定発現株を得た。この細胞をヌードマウス膵内に直接移植し、8週後の腫瘍重量を比較したが、FuEP2/Ex2の腫瘍増殖抑制作用は見られなかった。この点より、FuEP2/Ex2によるEP受容体シグナリング阻害が奏効しない種類の癌がある事が示された。膵臓癌臨床検体においての15-PGDH発現の頻度を明らかにし、申請者がこれまでに示した膵臓癌細胞(COX-2、EP2/4陽性)での15-PGDH強制発現がもたらす細胞増殖能の減少、血清除去時の生存細胞数の減少、インスリン、EGFによる細胞増殖刺激に対する負の制御、TRAILによるアポトーシス誘導の増強が実際の膵臓癌で起こりえるかを検討した。現在、臨床検体のパラフィンブロックから薄切切片を作製し、COX-2、EP2/4、15-PGDHの免疫染色を行っているが、15-PGDHの特異性の高い染色像が得られる抗体または処理条件の決定に至っていない。今後も条件検討を継続し、目的の達成を目指していく。ヌードマウスを用いた卵巣癌細胞腹膜播種モデルにおけるFuEP2/Ex2の抑制効果メカニズムの精査を行った。腫瘍部の組織切片を用いた免疫組織染色によって、FuEP2/Ex2によって増殖が抑制された腫瘍片はCD31、CD163陽性細胞数が有意に減少していた。更に、FuEP2/Ex2発現細胞の培養上清中におけるVEGF、CXCL1、IL-6及びIL-8産生量が顕著に減少していた。以上から、FuEP2/Ex2によるPGE2受容体シグナリング阻害は腫瘍細胞のサイトカイン産生を抑制する事で腫瘍血管新生及び免疫抑制性マクロファージの集積を減少させるという腫瘍増殖抑制メカニズムの一端を明らかにする事ができた。腫瘍片から得たmRNAを用いて、cDNAマイクロアレイ解析を実施した。その結果、FuEP2/Ex2発現細胞由来の腫瘍片で明らかな発現上昇(cut off :4倍以上)が認められた遺伝子が6つ同定された。この中の3つ(MMP-7、TMPRSS4、CYP1B1)に着目し、それぞれに対する阻害剤及びsiRNA処理が腫瘍増殖に与える影響を検討した。その結果、TMPRSS4に対する阻害剤及びsiRNA処理がFuEP2/Ex2発現細胞の増殖を有意に抑制した。以上から、MMP-7、TMPRSS4、CYP1B1はFuEP2/Ex2によって増殖が阻害された腫瘍で生存因子として機能するため発現が上昇し、この内TMPRSS4を標的とした薬剤処理を行う事で一層の腫瘍退縮が期待できる事を示した。卵巣癌細胞腹膜播種モデルにおけるFuEP2/Ex2の抑制効果メカニズムの一端を示す事ができた。この結果は国際誌に投稿し、受理されている。また、膵臓癌細胞の同所移植モデルを用いた解析及び15-PGDHの癌細胞増殖抑制作用の解析も現在順調に遂行している。研究計画は上記の通りおおむね順調に進展しているので、申請書に記してある計画にそって研究を遂行していく。なお、乳癌細胞の全身転移モデルを用いるにあたっては、本施設に導入されたバイオイメージング装置を駆使し、より詳細な解析を行っていく予定である。次年度への繰越額は平成25年度研究実施計画における物品費の購入に充てる予定である。
NMDA受容体チャンネルを介するCa^<2+>流入と海馬シナプス伝達

海馬CA1領域の長期増強、長期抑圧の誘発において条件刺激の持続時間や回数といった時間因子が持つ役割を検討した.ラット海馬切片標本を用い,条件刺激としてMg^<2+>を除いた人工脳脊髄液(Mg^<2+>-free溶液)灌流中に1Hzで刺激を与えることで、CA1領域のシナプス可塑性を誘発した.Mg^<2+>-free溶液灌流中に1回から600回の刺激で長期増強が誘発された.このことから長期増強の誘発は,十分なCa^<2+>流入がありさえすればよく、条件刺激の時間因子にはほとんど依存しないことが示唆される.これに対し、Mg^<2+>-free溶液灌流中の刺激1回あたりのCa^<2+>流入量を減らすためMg^<2+>-free溶液にAMPA受容体阻害剤である10μMのCNQXを加えシナプス後細胞の脱分極を抑制し電位依存性Ca^<2+>チャネルからのCa^<2+>流入を減少させたところ,1Hz刺激で増強率が減少した長期増強が観測されたのみで,長期抑圧が見られることはなかった.さらに2μMのD-AP5を加えNMDA受容体チャネルを部分ブロックして同じ実験を行ったところ1Hz1回から120回の刺激では有意な変化はなく200回以上ではじめて長期抑圧が誘発された.以上のことからNMDA受容体チャネルを介するCa^<2+>流入が十分大量である場合長期増強が誘発され、これは条件刺激の時間因子には依存しない。またCa^<2+>流入が中等量の場合長期抑圧が誘発されうるが、誘発されるか否かは条件刺激の時間因子に依存することが示唆される.ラット海馬切片標本を用い、Schaffer側副路/交連線維がCA1錐体細胞上に作るシナプスの可塑性誘発における条件刺激の時間因子の役割について詳細に検討した。Mg^<2+>を含まない人工脳脊髄液(Mg^<2+>-free溶液)灌流中の単一回の入力線維刺激によっても確かにCa^<2+>流入が起きることをホールセル記録により確認した。フィールド記録で、Mg^<2+>-free溶液灌流中、単一回および1Hz2回から600回の入力線維刺激で長期増強(LTP)が誘発されるのが観察された。1回の刺激あたりのCa^<2+>流入量を減らすためAMPA受容体阻害剤の6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione(CNQX)10μMをMg^<2+>-free溶液に加え、シナプス後細胞の脱分極を抑制し電位依存性Ca^<2+>チャネルからのCa^<2+>流入を減少させたところ同じく1Hzの刺激ではLTPが誘発されにくくなるものの、長期抑圧(LTD)は1から600回の刺激で観察されなかった。さらにこの溶液に2-amino-5-phosphonoate(D-AP5)2μMを加え、NMDA受容体を部分ブロックし同受容体を介するCa^<2+>流入を減少させろと、1Hz1回から120回の刺激では有意な変化はなく、200回以上ではじめてLTDが誘発された。D-AP5を50μMに増量すると、このLTDは完全に消失した。以上より、LTPは条件刺激の持続時間に依存することなく高度なCa^<2+>流入があればよいが、LTDの誘発には条件刺激がある程度以上持続することが必須であることが示唆される。またCa^<2+>流入が中等量の場合長期抑圧が誘発されうるが、誘発されるか否かは条件刺激の時間因子に依存することが示唆される.
マングローブ生態系の微生物相の解明とその培養株の収集保存

本研究では、マングローブ域に生息する糸状菌、酵母、細菌、放線菌などの微生物を対象に、その微生物相の把握とそこに生息する微生物の生理的および生態的特性を明らかにすること、さらに研究で得られた微生物培養株を遺伝子資源として収集保存することを目的として調査研究を行った。調査地は沖縄県西表島後良川のマンブローブ林とし、平成8年度10年度にかけ4回の採集を行い、マングローブ落葉、土壌、河川水など様々な基質から微生物の分離を試みた。研究分担者それぞれの研究成果の概要は下記のとおり。1.マングローブ汽水域に生息する鞭毛菌Halophytophthora属菌は種によってそれぞれ異なる成長や生殖の特性を持ち、それらに対応した地域的・季節的分布を示すことが明らかになった。2.後良川流域におけるオヒルギ生葉の内生菌(真菌類)フロラを調査した結果、上流域での菌の出現頻度は高いが、下流域の方が多様な菌が感染していることが明らかとなった。3.マングローブ土壌、落葉および河川水より107株の細菌を分離し、16SrRNAの後半約500塩基の部分塩基配列に基づいて分離株の系統分類学的位置を推定した結果、約14%の菌株が未知の菌種であると推測された。4.マングローブ土壌および落葉からMicromonospora属、Streptomyces属を中心に、新属や新種を含む多くの放線菌が分離された。5.様々な基質よりSaccharomyces属およびその類縁属に含まれる子嚢菌酵母を集積培養法によって分離した。分離株よりSaccharomyces complexに含まれる7新種が見いだされた。本年度は、マングローブ汽水域に生息する糸状菌、酵母、細菌、放射菌などの微生物相を把握することを目的に研究を実施した。試料収集のため、1996年10月に沖縄県西表島、石垣島のマングローブ域で採集を行った。微生物の分離源として、各種マングローブ樹の生葉および落葉、土壌などを採取し、対象とする微生物ごとにさまざまな前処理を行った後、培養を行い、出現した微生物の分離を行った。現在、各研究分担者は分離株の同定や分離株を用いた分類、生態学的研究を進行中であるが、これまでに得られた研究結果の概略を以下に示す。1.マングローブ6種の生葉から、表面殺菌法および洗浄法により、20種の糸状菌類が検出された。葉の生長段階に伴い、菌相が変化すること、また、樹種により優占する菌類が異なることが明らかになった。2.マングローブ落葉の分解の進行に伴って、鞭毛菌類→ラビリンチュラ生物→土壌菌、海生菌という、糸状菌類相の遷移が見られることが確認された。また、出現する菌類間に菌寄生現象が観察された。4.マングローブ落葉、土壌、水、海藻などから、72株の細菌類を分離した。なお、分離のための培養を、採集直後と実験室に移送後とに行ったところ、前者の方が多様な細菌類が出現することが分かった。5.マングローブ落葉および土壌から、直接法、希釈平板法、毛細管捕集法を用いて放線菌の分離を行い、35株の放線菌を得た。落葉からは、Streptomyces,Micromonospora属菌が多く出現した。マングローブ汽水域の微生物相を把握し、出来るだけ多様な微生物株を収集することを目指して、本年度は西表島後良川を中心に2回(高温期7月および低温期2月)の試料採集を行った。特に、後良川の上流から下流にかけて環境条件の異なる地点から試料を採取した。昨年度検討した分離法、培養法を元に、マングローブ樹の生葉、落葉および土壌などから菌の分類を行った。

現在、各研究分担者は分離株の同定や分離株を用いた分類、生態学的研究を進行中である。本年度得られた研究成果の概要は下記の通り。1.後良川の上流河口4地点にleaf trapを設置し、仕掛けたマングローブ葉から分離される鞭毛菌を調査したところ、菌相は塩分環境によって異なること、季節によって菌の出現頻度が変動すること、基質特異性を示す菌種が存在することが明らかになった。3.落葉、土壌などから361株の細菌を分離した。このうち、25株は窒素固定能を有する菌であり、101株は海洋性細菌であった。5.マングローブ落葉、土壌などから61株の放線菌を分離した。その中には、Cryptosporangium(新属)、Dactylosporangium,Kineopolyspora,Micromonospora,Microbispora,Streptosporangium,などの希少放線菌が多く含まれていた。本年度は9月に西表島後良川を中心に採集を行い、多様な微生物株の収集を目指すと共に、これまでに分離された微生物の同定を進め、マングローブ汽水域の微生物相の全体像を把握することを目指して研究を行った。現在も各研究分担者は分離株の同定や分離株を用いた分類、生態学的研究を進めている。本年度得られた研究成果の概略は下記の通り。1.2月(低温期)に引き続き、9月(高温期)に後良川の上流河口4地点にleaf trapを水中に設置し、仕掛けたマングローブ葉から分離される鞭毛菌を調査して菌相を比較したところ、季節によって菌の出現頻度が変動すること、菌相が塩分環境によって異なること、基質特異性を示す菌種が存在することが明らかになった。また、マヤプシキ落葉のみから出現するHdophytophthora属菌の新種を発見した。2.後良川の上流域から下流域に生育するオヒルギの生葉の内生菌を調査したところ、上流域ではColletotrichum属菌が、下流域ではPhyllosticta属菌の出現頻度が高いことが明らかになった。3.9月に採取した河川水などから88株の細菌を分離した。これまでに落葉や土壌から分離された361株と共にL-乾燥または凍結保存した。これらの分離株のうち98株の16SrDNA後半部分の塩基配列を決定し、BLASTを用いたhomology serachを行ったところ、既知種との相同性が95%以下と低い未知の属と考えられる菌が2株見いだされた。
家禽における内分泌攪乱化学物質に対する感受性とバイオアッセイ法の確立

1.日齢に伴うダイオキシン受容体(AhR) mRNAの発現孵化後から390日齢にいたるニワトリ雌におけるダイオキシン受容体(AhR)の発現をRT-PCRにより検討した。その結果、筋胃、肝臓、肺、腎臓および心臓においては、全日齢を通してAhR mRNAの発現が確認された。しかしながら、卵管および骨髄では孵化直後ではAhR mRNAの発現は観察されず、30-90日齢でもその発現は低かった。これらの結果より、ニワトリ雌では卵管および骨髄でダイオキシンに対する感受性が日齢で変化することが示唆された。2.産卵鶏雌の卵管におけるAhRの局在卵管卵白分泌部、峡部および卵殻腺部にAhRがタンパク質レベルで発現していることが確認され、その局在は峡部ならびに卵殻腺部の粘膜上皮細胞細胞質に強くみられた。このことは、ダイオキシンは峡部および卵殻腺部の上皮細胞に作用して卵殻の脆弱化を引き起こすものと推測される。3.骨髄骨を用いたバイオアッセイ法の確立雄ウズラへエストロジェン様内分泌撹乱化学物質であるDDE (10mg/day)を7日間投与したところ、大腿骨骨髄腔内に骨髄骨の形成が観察された。また、これらの形成に伴い血中ビテロゲニン濃度も上昇した。このことは、鳥類における骨髄骨形成が感度の高い内分泌撹乱化学物質に対する有用なバイオアッセイ法となることを示している。4.内分泌撹乱化学物質受容体の発現と局在産卵鶏骨髄骨の骨芽細胞に、内分泌撹乱化学物質受容体であるアンドロジェン受容体、エストロジェン受容体αが発現していることが観察された。このことより、内分泌撹乱化学物質は骨形成に作用していることが示唆された。5.ウズラ肝臓でのビテロゲニン(Vt) mRNAアッセイ法の確立ウズラ肝臓におけるVt mRNAのRT-PCR法によるアッセイ法を確立した。また、Vt mRNAの発現は、エストロジェン受容体αを介していることが明らかとなった。ダイオキシンは、ダイオキシン受容体を介してその作用が発現することが知られている。近年、野生鳥類において、生殖機能異常および孵化能力の低下といった現象が数多く報告されており、生息環境に存在するダイオキシンの影響が原因として指摘されている。最近、ニワトリを始めとした家禽において、ダイオキシンが体内脂肪に蓄積していることが報告され、家禽においてもダイオキシンが悪影響を及ぼしていることが危惧されている。本研究では、鳥類におけるダイオキシンの影響を明らかにすることを目的とし、産卵鶏の各組織におけるダイオキシン受容体のmRNAレベルでの発現をRT-PCR法で検討した。また、産卵鶏の卵管におけるダイオキシン受容体の発現と局在をタンパク質レベルで検討した。(1)ダイオキシン受容体mRNA発現の検討産卵鶏の筋胃、卵管、骨髄、肺、腎臓、肝臓および心臓においてダイオキシン受容体mRNAの高い発現が観察された。このことは、産卵鶏においてダイオキシンに対する高い感受性が存在することを示唆しており、胚発生期だけではなく成熟後においてもダイオキシンによってニワトリの内分泌機能が撹乱される可能性が示唆された。(2)卵管におけるダイオキシン受容体タンパク質の発現と局在

産卵鶏の卵管卵白分泌部、峡部および卵殻腺部において、約95kDaのダイオキシン受容体がタンパク質レベルで発現していることがウェスタンブロット法により明らかとなった。また、その局在は峡部ならびに卵殻腺部の粘膜上皮細胞細胞質に強かった。このことは、ダイオキシンが卵管峡部ならびに卵殻腺部における粘膜上皮細胞を介して作用し、卵殻脆弱化に関与している可能性を示唆している。また、本研究により、ニワトリダイオキシン受容体と特異的に結合する抗体が見出され、ウェスタンブロット法と免疫組織学的手法が確立された。本研究では、家禽における内分泌撹乱化学物質に対する感受性を明らかにするとともに、内分泌撹乱化学物質のバイオアッセイ系の確立を目的として以下の実験結果が得られた。1.日齢に伴うダイオキシン受容体の発現孵化後から30日間隔の390日齢にいたるまでのニワトリ雌の筋胃、卵管、肝臓、肺、腎臓、心臓および大腿骨骨髄よりでRNAを調整し、RT-PCRを用いて日齢に伴うダイオキシン受容体の発現を検討した。その結果、筋胃、肝臓、肺、腎臓および心臓においては全日齢を通じてダイオキシン受容体の発現が確認された。しかしながら、卵管および骨髄では孵化直後ではダイオキシン受容体の発現は観察されず、30-90日齢でも他の組織と比較すると低い傾向を示した。とりわけ、骨髄でその傾向が強く観察された。これらのことは、ニワトリ雌においては組織によっては日齢に伴ってダイオキシンに対する感受性が変化していることが示唆された。2.内分泌撹乱化学物質バイオアッセイ系の検討成熟オスに内分泌撹乱化学物質であるプラスチック可塑剤のビスフェノールA(BPA)、殺虫剤のDDT代謝産物であるDDEを7日間浅胸筋に投与した結果、DDE10mg投与において大腿骨骨髄腔内に網状に発達した骨髄骨の発現が観察された。一方、DDE5mg、DDE1mg、DDE0.2mgおよび対照(溶媒のみ)では骨髄骨の発現は観察されなかった。しかしながら、DDE5mg投与では骨内膜細胞の一部が肥大しており、前骨芽細胞に分化していた。また、BPA10mg投与では、骨内膜細胞の肥大化がみられ、一部では骨髄骨の形成が観察された。これらのことから、骨髄骨の形成は内分泌撹乱化学物質に強い感受性を示し、DDEはエストロジェン様作用を示すことが明らかとなった。また、骨髄骨形成のモニタリングが内分泌撹乱化学物質の指標となりえることが示唆された。本研究では、家禽における内分泌撹乱化学物質に対する感受性を明らかにするとともに、内分泌撹乱化学物質のバイオアッセイ法の確立を目的として以下の実験結果が得られた。1.骨髄骨を用いたバイオアッセイ法の検討雄ウズラに殺虫剤であるDDEを投与した結果、DDE 10mg投与において大腿骨内に網状に発達した骨髄骨の発現が観察された。一方、DDE 5mg-0.2mg投与および対照区では、骨髄骨の形成が観察されなかった。また、各区の血清中のビテロゲニン濃度をELISA法にて測定したところ、DDE 10mg投与においてのみ、ビテロゲニン濃度の上昇が観察された。このことは、骨髄骨がエストロジェン様内分泌撹乱化学物質のバイオアッセイ法となりえるとともに、その化学物質に対する感受性は、すでに確立しているビテロゲニンアッセイ系と同等あるいはそれ以上であると考えられる。2.受容体の発現と局在についての検討内分泌撹乱