hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物由来化合物ピペロングミンによる活性酸素種代謝異常と腫瘍細胞特異的致死の解析

そこで、低グルコース下でメトフォルミン処理した細胞からDNA抽出を行い、抗topoisomerase抗体でtopo-DNA complexの同定を試みたが、少なくともDT40細胞ではその存在を認めることが出来なかった。このことは、topo-DNA complexはメトフォルミン誘発のDNA損傷の可能性が薄いことを暗示している。2種類のビグアノイド薬剤のうち、メトフォルミンについては解析が平成28年度から順調に進んでいる。臨床利用されている細胞濃度においても、fanc欠損下では細胞死をもたらすことについてニワトリリンパ細胞を用いた系を用いた解析を行い、29年度にPlos Oneに投稿、発表済みとなっている。メトフォルミンの臨床への基礎データへの展開のために、従来のトリリンパ細胞由来のDT40からヒトリンパ細胞TK6への転換を進めた。これまでの相同組み換えによる遺伝子破壊手法から、CRISPR Cas9を用いた遺伝子編集の方向に転換した。トリ細胞での結果を元に、メトフォルミンに特に強い感受性を示すfancc及びfancl欠損細胞をヒトリンパ細胞TK6を用いて試み、fancc欠損細胞を作成することが出来た。既存のfancd2欠損細胞を加えてメトフォルミン感受性の解析を進めている。さらにfancl欠損細胞の作成の試みも継続している。メトフォルミンにより無グルコース下で誘発するDNA損傷の同定も進めている。最終的にはヒト細胞を用いた実験系を完成させることで、臨床応用への基礎データを蓄積できればと考えている。メトフォルミンによるDNA損傷修復機構について詳細な解析を行うため、損傷の特定を試みた。ファンコニー経路欠損細胞群とTDP1欠損細胞が、メトフォルミンに対する強い感受性を示すことから、タンパクーDNAクロスリンク損傷(DPCs)とトポイソメラーゼDNAトラッピングの2つに焦点を絞り、実験を行った。薬剤処理した細胞をセシウム密度勾配遠心にかけることによりDNAを分離精製し、DNA分解酵素による処理後にFITC標識(DPCs定量)、または抗トポイソメラーゼ抗体で標識することで、それぞれの損傷量の確認と定量する実験系を立ち上げた。この一年においては、少なくともメトフォルミン処理ではDPCsは生じないことは確認できた。トポイソメラーゼDNAトラッピングについては新規採択課題に引き続いて解析を継続する。従来、ビグアノイド薬剤の低栄養下特異的細胞死誘導について、この薬剤自体でDNA損傷が生じることは全く知られていなかった。今年度のDT40遺伝子破壊細胞パネルを用いた集中的解析においてDNA損傷を誘発するとの結果を示せたことと、この薬剤が腫瘍細胞特異的微細環下で強い致死効果を与えるという特徴を考慮すると、化学療法あるいは放射線療法における増感剤としての基礎データを提供しうるものと期待している。さらにこの損傷がファンコニ経路の特定
セメント芽細胞マーカー遺伝子f-spondinの機能解明

F-spondin(SPON1)の歯周組織における機能を解明するために、in vivoおよびin vitroで検討を行った。In vivoでは、トランスジェニックマウス(SPON1-Tg)を作製し、根尖部のセメント質形成量をwild typeと比較し、SPON1-Tgにおいて軽度の増加が認められた。In vitroではヒトセメント芽細胞(HCEM)にBMP7を添加するとOPNおよびBSPの発現の増加が認められ、これまでの我々の結果と併せ、SPON1はBMP7を分泌させ石灰化を誘導することが示された。一方、歯周病原細菌由来LPS刺激により、歯周靭帯細胞と比較してHCEMおよびSPON1過剰発現株ではIL-6およびPGE2の産生が有意に抑制された。よって、SPON1は石灰化だけでなく、炎症も制御する可能性が示された。F-spondin(SPON1)はセメント芽細胞マーカー遺伝子として我々が注目してきた遺伝子で、これまでにin vitroでSPON1がセメント芽細胞分化を促進することを報告してきた。そこで、本研究ではSPON1のセメント質形成における役割をin vivoで明らかにするため、本年度は発現部位を特定せずにSPON1を過剰発現させたトランスジェニックマウス(SPON1-Tgマウス)を作製した。まず、発現コンストラクトを作製し、このコンストラクトをマウス受精卵にマイクロインジェクションして、ファウンダーマウスを得た。さらに、交配を行い、現在、Tgマウスの系統化を行っているところである。SPON1は主に脳で発現し、軸索部での分泌や接着に関るとの報告があるため、神経系への影響が予測されたが、繁殖中のSPON1-Tgマウスに行動異常は認められていない。今後は、SPON1-Tgマウスを用いて組織学的検討を行っていく予定である。また、近年、SPON1発現は関節炎組織で発現し、炎症との関連が示唆された事から、歯周組織の炎症にも関与する可能性がある。そこで、SPON1を発現しているセメント芽細胞を用い、歯周病原細菌由来LPS刺激によるSPON1発現と炎症性サイトカイン発現についてin vitroにおいて検討を行った。LPSはSPONIの発現を著しく増加させ、IL-1bやTNF-aの発現は軽度に増加したが、有意差は認められなかった。一方、IL-6の発現はLPS刺激により著しく減少した。また、石灰化関連遺伝子であるタイプIコラーゲンやアルカリフォスファターゼ、オステオカルシン、BMP-7の発現は増加した。LPSはSPON1の発現を増加させたことから、LPS・TLR4経路がSPON1の発現に関与する可能性が示唆された。現在、LPSの誘導するSPON1発現増強と炎症性サイトカインや石灰化遺伝子の発現との関連性についてsiRNAを用いて詳細に検討しているところである。以上の結果より、SPON1は石灰化促進だけでなく、炎症時においても機能している可能性があることが示された。今後は、TLR4経路を介したSPON1の発現のメカニズムやSPON1による炎症性サイトカインの発現調節機構について解析を進めていく。F-spondin過剰発現によるセメント質形成能への影響をin vivoで検討するために、昨年度はF-spondinトランスジェニック(SPON1-Tg)マウスを作製した。今年度は作製したSPON1-Tgマウスの組織学的検討を全身の各臓器(脳,舌,甲状腺,肺,心臓,胃,肝臓,膵臓,脾臓,腸,腎臓)において行ったが、wild typeマウスと比較して明らかな違いは認められなかった。次に、セメント質形成を比較するために、10-12週齢のwild typeおよびSPON1-Tgマウスの下顎臼歯の歯根を用いて検討した。HE標本ではSPON1-Tgマウスの下顎臼歯歯根は、wild typeマウスに比較して有細胞性セメント質の形成促進がみられたが、有意な差は認められなかった。次に、ノックアウトマウスを作製する予定でコンストラクトの作成を検討していたが、トランスジェニックマウスで有意差が認められなかったことより、本研究ではノックアウトマウスの作製を中止し、in vitroでのsiRNAを用いたF-spondinノックダウンによる検討を行った。我々はこれまでの研究でF-spondinがAa-LPS刺激において発現が増強すること明らかにしている。

そこで、F-SpondinのSiRNAによる炎症性サイトカイン(TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-8)の発現を検討したが、いずれのサイトカインのmRNA発現においてもF-spondinノックダウンによる有意な差は認められなかった。一方、F-spondinを過剰発現させた歯周靭帯細胞株である(HPL-SPON1)では、親株であるHPLと比較して炎症性サイトカインのうちIL-6の発現が有意に抑制され、F-spondinを発現しているヒトセメシト芽細胞株でもHPLと比較してIL-6の発現低下が認められた。Aa-L内刺激によるPGE2のタンパク産生量は、HPLおよびHPL-SPON1いずれにおいてもAa-LPSにより促進されたが、HPLと比較するとHPL-SPON1ではPGE2産生量は低かった。以上の結果より、セメヒト芽細胞マーカー遺伝子であるF-spondinはセメント質組織形成だけでなく、炎症性サイトカインの発現においても関与し、歯周組織の恒常性維持に関わっている可能性が示された。
テラヘルツ波による細胞の物理的特徴の非侵襲計測

本研究は、次世代の構造材料である細胞の未だ解明されていない物理特性を工学的なアプローチで解明することにより、細胞の非侵襲計測を初めて実現するものである。本研究は、テラヘルツ波のスペクトルが物質のプラズマ周波数や電子散乱時間などに依存する特徴を利用して、細胞に透過するテラヘルツ波のスペクトルを計測し、細胞内物質のキャリア濃度、移動度、導電率、誘電率などを計測することにより、細胞固有の物理特徴を実時間で特定する技術を開発した。生きたままの細胞の電気的な物性を定量的に評価することによって、細胞種類の判別および細胞機能の特定を非侵襲かつリアルタイムで実現することが期待できる。本研究は、半導体素子の光伝導効果によるテラヘルツ波の発生および検出に関する研究の成果を生かして、細胞を透過したテラヘルツ波の周波数スペクトルから、細胞内物質のキャリア濃度、移動度、導電率、誘電率などを計測することにより、細胞固有の物理情報を実時間,非侵襲で特定する技術の開発を目的とした。本年度は以下の実績を得た。(III)生きた細胞の固有物理特徴の計測評価固定された細胞での計測評価の手法を生かして、培養液中生きたままの細胞のテラヘルツ電磁波透過測定を行い、導電率、誘電率、キャリア濃度、移動度、プラズマ周波数、緩和時間といった細胞の固有物性を計測した。さらに、分子構造に応じてテラヘルツ領域で吸収スペクトルが顕著に表れることを利用して、骨髄幹細胞に化学的、電気的、力学的な刺激を与えて、細胞周期の各段階における細胞核内部の構造変化を透過測定で得られたテラヘルツ波スペクトルにより解析し、細胞固有の物理的情報を実時間,非侵襲で特定する技術を確立した。本研究は、半導体素子の光伝導効果によるテラヘルツ波の発生および検出に関する研究の成果を生かして、細胞を透過したテラヘルツ波の周波数スペクトルから、細胞内物質のキャリア濃度、移動度、導電率、誘電率などを計測することにより、細胞固有の物理情報を実時間、非侵襲で特定する技術の開発を目的とした。(I)細胞計測用テラヘルツ波スペクトル測定システムの開発時間領域分光法に基づくテラヘルツ電磁波の測定システムを構築した。フェムト秒パルスレーザを光伝導アンテナに照射することにより、パルス状のテラヘルツ電磁波の発生、検出を行い、電磁波の時間変化を測定し、その測定信号をフーリエ変換することによりテラヘルツ領域の電場スペクトルの振幅強度と位相の周波数成分を得た。このシステムの構成により、周波数0.12.5 THz帯域のテラヘルツ波スペクトルの計測を実現した。(II)細胞の固有物理特徴の計測評価上記で開発したテラヘルツ波スペクトル測定システムを用いて、骨髄幹細胞および力学刺激により分化された腱細胞など生細胞のテラヘルツ電磁波透過測定を行った。テラヘルツ電磁波の伝播経路に配置して試料を透過したあとの電場の時間変化を測定し、試料がないときの電場と比較することにより、テラヘルツ電磁波のスペクトルの振幅および位相変化を算出した。スペクトルの振幅および位相変化は透過した試料の光学定数に依存するため、この測定値から生細胞の複素屈折率、複素誘電率を評価し、生細胞の固有物理特徴の定量評価を実現した。研究計画の通り本年度に予定していた細胞計測用テラヘルツ波スペクトル測定システムの開発および固定された細胞の固有物理特徴の計測評価を実現した。さらに、次年度に予定している生細胞のテラヘルツ波計測も実施し、生細胞の誘電率評価に成功した。(III)生きた細胞の固有物理特徴の計測評価培養液中生きたままの各種の細胞のテラヘルツ電磁波透過測定を行い、導電率、誘電率、キャリア濃度、移動度、プラズマ周波数、緩和時間といった細胞の固有物性を計測する。さらに、分子構造に応じてテラヘルツ領域で吸収スペクトルが顕著に表れることを利用して、骨髄幹細胞に化学的、電気的、力学的な刺激を与えて、細胞周期の各段階における細胞核内部の構造変化を透過測定で得られたテラヘルツ波スペクトルにより解析する。細胞固有の物理的情報を実時間、非侵襲で特定する技術を確立する。また、研究計画を遂行するにあたり、連携研究者および研究協力者との連携をさらに強化し、伸展調節による骨髄幹細胞の増殖・分化による腱/靭帯の線維芽細胞の生成過程中における各段階での生細胞の非侵襲計測を実現する。XYZ軸精密位置決め装置600千円マイクロ波部品300千円調査・研究旅費(国内) 100千円成果発表旅費(国内) 100千円成果発表旅費(外国) 300千円消耗品として計上したXYZ軸精密位置決め装置は、レーザ光をテラヘルツ発振器および検出器に集光する位置を調整するため、レーザ光のビームを走査するものである。また、消耗品として計上したマイクロ波部品は、細胞に電気的な刺激を与えるため必要なものである。
超伝導性黒鉛層間化合物の新展開～ＣａＣ６の解析からＭｇＣｘ等新化合物の創製へ～

高い超伝導転移温度で注目を集めるカルシウム-黒鉛層間化合物(Ca-GIC)の特性を調べ、K-GIC等の従来から知られるGICと比較した。Ca-GICはK-GICよりもゼーベック係数が小さいなど金属的性質が強い。しかし、黒鉛結晶構造の乱れが大きいため、熱伝導率は低かった。また、生成過程で用いたリチウム(Li)が残存した場合、超伝導転移温度が低下することが判明した。Ca-GICよりも高い超伝導転移温度が期待されるMg-GICの創製を試みたところ、ゼーベック係数測定より、極僅かにMg-GICが形成した兆候が観測された。しかし、構造変化等の明らかな変化は認められていない。H25年度の実施計画は[1]77K室温における物性測定、[2]4K室温における電気伝導率・ゼーベック係数測定、[3]c軸方向の電気抵抗等測定の準備であった。しかし、4Kを実現する極低温測定装置の温度制御が不安定なため、[2]および[3]の本格実施を見送り、H2627年度で実施予定であった「新規超伝導GIC創製」の主要部分である[4]Mg-GICの合成を先行した。[1]に関しては、数種類の黒鉛をホストとしたK-GIC、Li-GIC、CuCl2-GIC等の従来型GICを用いてデータを取得した。当初計画では、これらは単にCa-GICと比較する基準データと位置付けていたが、ホスト黒鉛やインターカレート物質によるGICの大気安定性の違いを明らかにし、分解メカニズム解明のヒントを得ることができた。その分、Ca-GICの測定に遅れが生じているが、今後、Ca-GICのデータ取得および解析に着手する。[4]に関しては、H24に気相法を用いて検討した結果、生成物のゼーベック係数測定によりMg-GIC形成の徴候が見られている。よって、H25年度は気相法とメカノケミカル法を用いた合成検討を行なった。H24年度の気相法は真空加熱であったが、H25はAr封入により加圧状態で加熱する方法を採用した。その結果、H24年度と同様に、気相法においてMg-GIC形成の徴候が確認された。大気下におけるXRD構造解析ではMg-GIC形成は証明できなかったが、Ar下におけるゼーベック係数測定において、K-GIC等と同等のー30μV/K程度の値を示す試料も存在した。よって、Mg-GICが試料表層のみに形成した可能性もあるため、今後、最適条件の探索等が必要となる。メカノケミカル法においては、様々な条件を検討したが、Mg-GIC形成の明らかな徴候を得ることはできなかった。H24年度の実施計画は、[1]物性測定用GIC試料の合成、[2]77K室温用物性測定装置改良と測定、[3]4K室温用測定装置製作、であった。都合により、[3]の本格的開始をH25年度以降にずらし、H25年度以降に開始する予定であった「新規超伝導性GICの創製」の主要部分である[4]Mg-GICの合成、に着手した。[1] GrafoilおよびPGSをホストとして、Ca-GIC、Ca-Li-GIC、Li-GICおよびK-GICを合成した。X線回折の理論計算を取り入れ、Ca-GICとCa-Li-GICの詳細な組成決定を可能とした。これにより、従来法でCaC6と同定した試料の中にも微量のLiが残存することが判明した。また、Liの残存程度はホスト黒鉛に依存することも明らかとなった。[3] 4K室温の電気抵抗率測定装置の構築を始め、調整と予備測定を行なった。超伝導転移温度を調べるため小数点以下1桁の精度の温度測定が必要であるが、予定していた熱電対での実現は困難と判断し、抵抗温度計を採用することとした。この改良はH25年度に実施予定である。[4]気相法によるMg-GIC合成を試みた。Mg粒とPGSを真空下400°Cー850°Cに加熱した結果、X線構造解析ではMg-GICの形成は確認できなかったが、600°C前後で加熱した試料で大きなゼーベック係数が観測された。挿入量が僅かであってもゼーベック係数には大きな変化が生じることを確認済みなので、期待している。ただし、熱・電気伝導率の値が一定しない等の問題もあり、慎重に検討する必要がある。本研究では、従来型の黒鉛層間化合物(GIC)と異なり、比較的高い温度11.5Kで超伝導転移を示すカルシウム黒鉛層間化合物(CaC6)の熱・電気特性を中心に調べることを目的としている。CaC6はアルカリ金属-GICと同様に電子伝導であることが期待されるが、事前研究において、CaC6が常温で正のゼーベック係数を取りうること、つまりホール伝導である可能性を確認していた。よって、26年度はCaC6の常伝導機構を調べることを目的とし、ホール係数および磁気抵抗測定を行い、キャリア密度や移動度の算出を試みた。CaC6の電気伝導率はホスト黒鉛の約10倍であり、従来型のGICと同様またはやや低い値であり、さらに大気安定性も低かった。しかし、磁気抵抗は測定されず、さらに、ホール係数は従来型GICよりもはるかに小さく、測定の度に正や負に不規則に偏った。磁気抵抗が観測されないということは、電子またはホールのみによる1キャリアの伝導である。

しかし、ホール係数の符号が度々変化するため、キャリアの種類を特定することができていない。この現象は、従来型のGICとは全く異なるものであり、現在、解釈を行っている最中である。CaC6との比較用として、代表的な従来型GICである金属塩化物-GICの伝導機構を調べるために、同様の測定を行った。金属塩化物-GICは電気伝導性が比較的高いが、現在まで、超伝導性を示すものは報告されていない。本研究の結果、CaC6またはアルカリ金属-GICと異なり、キャリア密度が低めである傾向が確認された。さらに、本研究のような大気下における物性測定に際しては、GICの大気下安定性が問題となる。より正確な測定を行うためには安定性の高いGICを用いるべきである。よって、代表的なカリウム-GICを用いて、安定なGICの生成機構を解明した。本研究は、比較的最近知られるようになったカルシウム黒鉛層間化合物(Ca-GIC;組成CaC6)の解析を行い、従来から知られるK-GIC等との相違点を明らかにすることで、GICの新たな展開を狙うものである。Ca-GICは11.5Kという従来型よりも10K以上高い超伝導転移温度をもつことで注目を集めたが、我々は、その他にも、ゼーベック係数が小さい特徴をもつことを既に明らかにしている。本年度は大気安定性の面でもCa-GICが従来型GICと異なることを、X線回折やラマン分光測定による構造変化の他、電気伝導率、ホール係数、磁気抵抗等の物性測定から明らかにした。試料表面の色変化や構造解析からは、Ca-GICは従来型よりも安定性が高いと判断できるが、物性測定からは不安定で、大気接触直後に分解すること、さらに、分解挙動がK-GIC等とは異なることが明らかとなった。ポリイミドフィルムの熱分解黒鉛シートを用いて合成したCa-GICの超伝導性を確認した。その結果、超伝導転移を生じるのは78Kであり、報告されている11.5Kよりも低かった。これは、Ca-GICをLi-Ca溶融合金と黒鉛を反応させて合成しているため、試料組成が純粋なCaC6ではなく、Liが残存している影響であると考えられる。また、複数の試料を測定すると、超伝導転移の認められない試料もあった。転移温度のさらなる上昇が見込まれるMg-GICの創製も試みた。これまでにMg-GIC形成の兆候が確認された反応条件により、上記の黒鉛シートを用いて反応を行ったところ、今年度は兆候を得ることはできなかった。以上のように、Ca-GICが従来型GICとは異なる新型GICであることは明らかになったが、その詳細を完全に理解するまでは至っていない。引き続き、Ca-GICの理解およびMg-GICの創製の検討を続ける予定である。高い超伝導転移温度で注目を集めるカルシウム-黒鉛層間化合物(Ca-GIC)の特性を調べ、K-GIC等の従来から知られるGICと比較した。Ca-GICはK-GICよりもゼーベック係数が小さいなど金属的性質が強い。しかし、黒鉛結晶構造の乱れが大きいため、熱伝導率は低かった。また、生成過程で用いたリチウム(Li)が残存した場合、超伝導転移温度が低下することが判明した。Ca-GICよりも高い超伝導転移温度が期待されるMg-GICの創製を試みたところ、ゼーベック係数測定より、極僅かにMg-GICが形成した兆候が観測された。しかし、構造変化等の明らかな変化は認められていない。当初計画していた各種GICの極低温における電気伝導率測定は遅れている。
動的パスウェイへの高機能ペトリネットを用いた視覚的モデル検査手法の開発と適用

高機能ペトリネット(Hybrid Functional Petri net以下HFPNe)とその実用に耐えうる実装を行い成果を挙げてきている。本研究では、HFPNeにモデル検査の手法を導入するための定式化を行った。さらに、線虫の細胞分化にかかわるシグナル伝達を含む細胞間の制御モデルのシミュレーションモデルを、HFPNeを用い作成するとともに、そのモデル検査を行い妥当な細胞分化の規則の同定に成功した。また、HFPNeでモデル化されたパスウェイについて動的に変化する部分グラフの遷移構造を抽出する技術開発を行い。概日リズムのパスウェイモデルに適用し有用性を示した。蛋白質の強制発現、遺伝子破壊、活性型あるいは抑制型変異蛋白質の発現、強制リン酸化、移行シグナルドメインの削除、薬剤の投与などの一般的な生物実験によってでてくる、タンパク質の相互作用、局在情報、タンパク質・DNA相互作用情報のさまざまな計測結果が、どのよらな生物学的な特性を計測したものであり、どの程度の信頼度に分類され、どのよらな制限規則として利用ができるのかを数学的に定式化し整理することを推進した((1))。さらに、この定式化された情報を元にペトリネソトのもつ視覚的に表現できるという特徴を最大限に活かしてこれらの事実を簡潔にパスウェイの制限規則として表現できる方式と理論((2))を申請者が開発した高機能ペトリネットHFPNeを発展させることで推進した。具体的には、まず、線虫の細胞分化の観測データを、(1)の成果に基づき整理をおこなった。さらに、(2)に基づき、線虫の細胞分化にかかわるシグナル伝達を含む細胞間の制御モデルを、HFPNeを用いてモデル化した。さらに、そのモデルに対して、速度パラメータにノイズをいれた状態のもとで、動的シミュレーションを繰り返し実行するモンテカルロシミュレーションを基礎理論とするパスウェイ検証を行い、先行研究の、規則ベースのパスウェイモデルにおいて、モデル検査の方式では解析することのできない現象を検証し本研究の有用性を議論した。また、これらの枠組みを実装を整理するために,継続して研究を行った。また、高機能ペトリネットを用い、オントロジー言語の規格の1つOWLを用いて動的なパスウェイをモデル化し、そのモデルをOntologyに基づく規則ベースの整合性を検証することができる方式を研究開発を行った。マウスのサーカディアンクロックの系について、その動的な制御関係の構造変化のパターンを追うための方式をActive State Transition Dialog(ASTD)という手法を開発し、数学的に定式化をおこなった。簡単には、ASTDの各ノードはサブネットワークを表しており、これらのノードの接続関係は、これらのサブネットワークの状態の遷移を表す。ASTDでは、各サブネットワークはもとのネットワークのHFPNeの部分構造であり、シミュレーションを行うことができる。また、そのサブネットワークを実行した結果と、もとのネットワークを実行した結果は、その時点でのパラメータを与えると同じ結果になることを保証しているという数学的に性質のよい特長をもつ。この方式により、(1)生体内パスウェイで共通して制御を行うサブネットワーク群を抽出し、(2)あるパスウェイモデルについて、各々のサブネットワークの状態がどの程度、実際の制御で利用しているかを持続度・頻度という2つの指標で抽出することができようになった。また、ネットワーク上の発現状態をこのASTD上でトレースすることでユーザが興味をもつ生物学的な情報と、ネットワークの構造変化との関係を明快に視覚的に表示しまた統計的に解析できる枠組みを提案することに成功した。さらに、このASTDを用いることで、我々が開発した高機能ペトリネットHFPNeで作成されたモデル対して、視覚的に表現可能な構造変化のパターンをモデル検査の対象として組み入れることができるようになった。また、線虫の細胞運命決定のネットワークについて、HFPNeを用いて初めて動的なパスウェイモデルを構築し、Horvitzら分子生物学者によって観測されている生物学的な事実とより適合する細胞運命の決定のルールをモデル検査の手法を用いて推定を行った。これらの成果は、開発を行っているCell Illustrator Online(http://cionline.hgc.jp)でモデル化・視覚化・解析できるようにCSML形式で実装を行った。
壁面進行波を用いた乱流摩擦抵抗低滅デバイスの開発研究

壁乱流における摩擦抵抗は同じレイノルズ数の層流に比して格段に大きいが,これは壁面近傍のレイノルズせん断応力に起因することが数学的に示されている(FIK恒等式;Fukagata et al.,Phys.Fluids,2002).したがって,乱流摩擦抵抗を低減させるには,壁面近傍のレイノルズせん断応力を低減させれば良い.本研究ではこのアイデアを,壁面の変形によって実現する.本研究により,フィードバック制御に比して大幅に単純で制御効果も大きく,実用化可能性も高い乱流摩擦抵抗低減デバイスを開発できることが予想できる.本年度は2次元チャネル層流を取り上げ,この壁面にぜん動運動を加えたものと,これと同じ速度を持つ吹出し・吸込み速度を持つ壁面進行波を加えた系の数値シミュレーションを行い,その摩擦抵抗低減効果を比較した.どちらの場合にも通常のポンプによる流量がゼロで一方向の流速が得られ,これは摩擦抵抗低減というより壁面からのポンピング効果であることが説明された.また,ぜん動運動と吹出し・吸込みでは誘起される流れが逆方向となることが示され,その機構が弱非線形理論を用いて境界条件を展開した際に現れる2次の項の影響であると説明された,また,通常のポンプ動力と制御に必要な動力の和の観点から抵抗低減効果を再定義し,層流に対して壁面のぜん動運動あるいは進行波状吹出し・吸込みを行った場合には,同じ流量を得るための制御エネルギーが大きくなることが示された.またその制御動力に対するレイノルズ数の影響はぜん動運動と進行波状吹出し・吸込みでは異なる傾向になることが分かり,これらより既存の吹出し・吸込みを用いた乱流の3次元直接数値シミュレーションの結果はそのまま進行波状壁面運動デバイスの設計には用いることができないことが結論づけられた。壁乱流における摩擦抵抗は同じレイノルズ数の層流に比して格段に大きいが,これは壁面近傍のレイノルズせん断応力に起因することが数学的に示されている(Fukagata, et. al.,Phys. Fluids,2002).したがって,乱流摩擦抵抗を低減させるには,壁面近傍のレイノルズせん断応力を低減させれば良い.本研究ではこのアイデアを,壁面の変形によって実現する.本研究により,フィードバック制御に比して大幅に単純で制御効果も大きく,実用化可能性も高い乱流摩擦抵抗低減デバイスを開発できることが予想できる.同様の壁面近傍レイノルズせん断応力低減による乱流摩擦抵抗の低減の原理を検証するため,本年度はまず進行波状の壁面変形による効果を単純化した制御を加えた系の数値シミュレーション及び解析を行った.数値シミュレーションを行うためには,壁面の大変形を考慮し,これを物理空間から計算空間への適切な座標変換として扱うMatlabコードを開発した.数値シミュレーションの結果,壁面が大変形する場合には,いわゆるぜん動運動を同様の効果により,圧力が駆動力となって流体が押し出されるが,順方向の圧力勾配と逆方向の圧力勾配のアンバランスにより,正味の流量を生み出すことが分かった.また,流れ場の解析結果及び考察をもとに,この効果を表現する数学モデルを構築し,数値シミュレーションによって得られた流量のレイノルズ数依存性が高精度に予測できることを示した.壁乱流における摩擦抵抗は同じレイノルズ数の層流に比して格段に大きいが,これは壁面近傍のレイノルズせん断応力に起因することが数学的に示されている(FIK恒等式;Fukagata et al.,Phys.Fluids,2002).したがって,乱流摩擦抵抗を低減させるには,壁面近傍のレイノルズせん断応力を低減させれば良い.本研究ではこのアイデアを,壁面の変形によって実現する.本研究により,フィードバック制御に比して大幅に単純で制御効果も大きく,実用化可能性も高い乱流摩擦抵抗低減デバイスを開発できることが予想できる.本年度は2次元チャネル層流を取り上げ,この壁面にぜん動運動を加えたものと,これと同じ速度を持つ吹出し・吸込み速度を持つ壁面進行波を加えた系の数値シミュレーションを行い,その摩擦抵抗低減効果を比較した.どちらの場合にも通常のポンプによる流量がゼロで一方向の流速が得られ,これは摩擦抵抗低減というより壁面からのポンピング効果であることが説明された.また,ぜん動運動と吹出し・吸込みでは誘起される流れが逆方向となることが示され,その機構が弱非線形理論を用いて境界条件を展開した際に現れる2次の項の影響であると説明された,また,通常のポンプ動力と制御に必要な動力の和の観点から抵抗低減効果を再定義し,層流に対して壁面のぜん動運動あるいは進行波状吹出し・吸込みを行った場合には,同じ流量を得るための制御エネルギーが大きくなることが示された.またその制御動力に対するレイノルズ数の影響はぜん動運動と進行波状吹出し・吸込みでは異なる傾向になることが分かり,これらより既存の吹出し・吸込みを用いた乱流の3次元直接数値シミュレーションの結果はそのまま進行波状壁面運動デバイスの設計には用いることができないことが結論づけられた。
成熟後の小脳におけるダイナミックなシナプス形成と改変を担う分子機構の解明

神経細胞同士の繋ぎ目である「シナプス」は発達期に形成され、神経回路を構築する。近年のイメージング研究の結果、いったん完成したシナプスは成熟後もダイナミックに変化することによって、記憶・学習の基盤として働くことが分かってきた。また、この過程の障害によって様々な精神・神経疾患が引き起こされることも分かってきた。しかし、成熟後の神経回路において、どのシナプスがどのような分子機構で改変されるのかについては、未解明な点が多く残されている。そこで本研究では、成熟後のマウス小脳をモデル系として、神経回路の改変を担う新たな分子基盤の解明を図る。
合成生物学における人工遺伝子回路を用いた細胞内代謝制御による物質生産効率の向上

本研究の目的は、微生物を用いた物質生産の効率化に向けて、菌体増殖過程と物質生産過程でそれぞれ異なる理想的な表現型を動的・可塑的に制御するための人工遺伝子回路を構築することにある。一般に、物質生産過程に余剰の菌体増殖やこれに寄与する代謝活性が維持されると、標的物質の生産効率の低下を招く。特にTCA回路は様々な物質生産経路の起点となるAcetyl-CoAを消費するため、物質生産の直接的な競合経路とみなせる一方で、菌体増殖に必須な代謝経路でもあるため、従来の代謝工学的手法では競合経路として削除することはできなかった。そこで初年度は、誘導剤の添加によって任意のタイミングでTCA回路を遮断し、余剰の代謝流束を物質生産経路への代謝流束に転換する代謝トグルスイッチを構築した。これを大腸菌によるIsopropanol生産に応用したところ、生産量を従来の3.7倍に向上させることに成功した。上記の回路では、培養プロセスの進行度を把握するために菌体密度をモニタリングし、最適なタイミングで誘導剤を添加する必要があった。しかし、実際の発酵過程において菌体密度をモニタリングするためには、断続的なサンプリングを行う必要があり、サンプリングに伴う汚染を防ぐための無菌操作設備への投資や運営コストが問題となる。この様な問題を解決するためには、培養過程において人為的な誘導操作を必要としない、菌体自律的な制御誘導システムの構築が必要となる。そこで、本年度は、細菌が互いの菌体密度を感知し、集団で遺伝子発現制御を行うシステムであるクオラムセンシング(Quorum Sensing: QS)に着目し、QSを人為的に改変することで、任意の菌体密度で目的の遺伝子発現の自律的誘導を可能とする菌体密度センサーを構築した。これを遺伝子トグルスイッチに統合することで、大腸菌による菌体密度感知とそれに伴う自律的な遺伝子発現制御・代謝流束制御に成功した。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、人工的な遺伝子発現制御システムである人工遺伝子回路を、代謝工学に応用することを目的としている。人工遺伝子回路を用いることで、従来成し得なかった動的な代謝流束制御を可能とし、バイオ燃料生産における大幅な生産性の改善を目指す。1年目では動的な代謝流束制御を可能とする回路の構築に取り組む。二年目では、クオラムセンシング機構と呼ばれる、微生物が自身の菌体密度を感知するためのシステムを人為的に再構築し、菌体密度に依存して自律的に回路の機能を制御するシステムを開発する。今年度は人工遺伝子回路による局所的・動的代謝流束制御として、大腸菌において菌体増殖に重要な代謝経路であるTCA回路を、誘導剤添加に伴って動的に遮断する回路の構築に取り組んだ。これによって大腸菌の菌体増殖を担保しながら、バイオ燃料生産期にはTCA回路を遮断することで余剰の菌体増殖や生理活性を抑え、目的生産物であるイソプロパノールの生産性を従来に3.7倍に向上させることに成功した。イソプロパノール生産の前駆体となるアセチルCoAは、イソプロパノール以外の様々な有用化合物生産においても前駆体として利用されるため、本システムは微生物による物質生産全般において、生産性向上のに向けた応用が期待される。上記の研究成果は特許出願申請の後、原著論文として国際学術誌に掲載された。さらに、本年度は二年目に計画していたクオラムセンシング機構の再構築にも取り組み、ビブリオ菌由来のクオラムセンシング機構を大腸菌おいて機能させ、さらに任意の菌体密度においてその機能が誘導されるように改変した。このシステムを上記の代謝流束制御システムに組み込むことで、大腸菌自身が適切な菌体密度に達すると物質生産とTCA回路の遮断を自律的に誘導するシステムを構築することに成功した。上記の研究成果は、原著論文として国際学術誌に投稿し、すでに掲載が確定している。本研究では初年度に代謝工学のための人工遺伝子回路とそのバイオ燃料生産に取り組み、2年度目において人工的なクオラムセンシング機構と組み合わせることを研究計画としている。第1の課題である代謝流束制御担う人工遺伝子回路は、既にその構築に成功し、これを大腸菌によるイソプロパノール生産に応用することで大幅な生産性の向上を達成することに成功した。この研究は、既に特許申請、国際学術誌への掲載に至っていることから十分な実績を挙げているものと思われる。上記の研究においては、メタボローム解析を実施し、動的代謝流束制御が細胞内代謝に与える影響を精査するとともに、新たな代謝改変候補の推定に取り組んだ。この結果に基づき、新たな代謝改変に取り組み、イソプロパノール生産性をさらに22%向上させることに成功した。上記の研究成果は現在、国際学術誌に投稿中である。上記のように、初年度での目標を順調に達成することが出来たことから、申請者は当初2年度目に計画していた課題にも既に取り組んでいる。第2の課題としている大腸菌におけるクオラムセンシング機構の再構成に取り組み、任意の菌体密度において自律的に標的遺伝子発現を誘導するシステムの構築に成功した。さらに、これを上記の代謝流束制御システムと組み合わせることで自律的な代謝流束制御と、それに伴うイソプロパノール生産性の大幅な向上に成功している。この成果は国際学術誌に投稿し、既に掲載が確定している。さらに上記のシステムの機能改善に関する知見も得ており、次の課題に向けた研究を推進している。

このように、2年間に計画していた大きな2つの課題において、既に原著論文2報、特許申請一件の成果を上げていることから、本研究は当初の計画以上に進展していると言える。本研究の目的は、微生物を用いた物質生産の効率化に向けて、菌体増殖過程と物質生産過程でそれぞれ異なる理想的な表現型を動的・可塑的に制御するための人工遺伝子回路を構築することにある。一般に、物質生産過程に余剰の菌体増殖やこれに寄与する代謝活性が維持されると、標的物質の生産効率の低下を招く。特にTCA回路は様々な物質生産経路の起点となるAcetyl-CoAを消費するため、物質生産の直接的な競合経路とみなせる一方で、菌体増殖に必須な代謝経路でもあるため、従来の代謝工学的手法では競合経路として削除することはできなかった。そこで初年度は、誘導剤の添加によって任意のタイミングでTCA回路を遮断し、余剰の代謝流束を物質生産経路への代謝流束に転換する代謝トグルスイッチを構築した。これを大腸菌によるIsopropanol生産に応用したところ、生産量を従来の3.7倍に向上させることに成功した。上記の回路では、培養プロセスの進行度を把握するために菌体密度をモニタリングし、最適なタイミングで誘導剤を添加する必要があった。しかし、実際の発酵過程において菌体密度をモニタリングするためには、断続的なサンプリングを行う必要があり、サンプリングに伴う汚染を防ぐための無菌操作設備への投資や運営コストが問題となる。この様な問題を解決するためには、培養過程において人為的な誘導操作を必要としない、菌体自律的な制御誘導システムの構築が必要となる。そこで、本年度は、細菌が互いの菌体密度を感知し、集団で遺伝子発現制御を行うシステムであるクオラムセンシング(Quorum Sensing: QS)に着目し、QSを人為的に改変することで、任意の菌体密度で目的の遺伝子発現の自律的誘導を可能とする菌体密度センサーを構築した。これを遺伝子トグルスイッチに統合することで、大腸菌による菌体密度感知とそれに伴う自律的な遺伝子発現制御・代謝流束制御に成功した。既に本研究は、当初計画していた課題をおおよそ達成しているため、今後は本研究においてこれまでに構築した人工遺伝子回路を用いた動的・局所的な代謝流束制御システムと、クオラムセンシング機構を人工的に改変した菌体密度センサーを、大腸菌によるイソプロパノール生産以外の以外の有用物質生産系に展開し、その汎用性と有用性の向上に努める。所属研究室で構築されている大腸菌におけるその他のバイオアルコール生産やバイオケミカル生産経路と組み合わせる他、新たなホスト微生物として光合成微生物であるシアノバクテリアを用いた二酸化炭素からのバイオ燃料生産への展開を図る。このため、研究指導委託の形式を取り、カリフォルニア大学デービス校のAtsumi研究室に滞在し、シアノバクテリアの遺伝子組み換え技術およびバイオ生産培養に関する技術習得を実施する。それと並行して目的の組換えシアノバクテリア株を樹立し、シアノバクテリアによる動的・自律的な代謝流束制御の実現に向けた技術基盤の構築を目指す。まず、申請者が構築している遺伝子回路をシアノバクテリアにおいて再構成する。また、クオラムセンシング機構についても、大腸菌からシアノバクテリアに移築する。
ライソゾーム病におけるオートファジーの病態解明と治療薬スクリーング法の開発研究

ライソゾーム病は希少難病であるが特定疾患にも認定されており、わが国における難病医療における大きな対象疾患の一つである。しかしながら、今までの治療法は酵素補充療法、造血幹細胞移植など対象患者が限られたり、患者への侵襲の大きなものが多い。本研究ではクラッベ病、ガラクトシアリドーシス、ファブリー病などに対する低分子量の経口薬剤の開発を目指す研究を行った。それにより、細胞レベルでの病態が明らかになり、シャペロン薬剤の有効性とその原理について知見を得ることができた。今後、この知見をもとにシャペロン薬の有効性を細胞レベルで確認したり、変異ごとの有効性の検索に応用可能と思われる。ライソゾーム病の中で、本年はゴーシェ病、ファブリー病、Tay-Sachs病、異染性白質ジストロフィーの皮膚線維芽細胞を用いて、オートファジー、マイトファジーの状態を調べるために、通常の培養条件とともに42度の高温状態で数日間培養したときの、各疾患の細胞ごとにマーカー蛋白の動きを調べた。高温状態では24時間頃にオートファジーの亢進を認める細胞が多かったが、その程度は様々であった。また3日以上の培養ではかえってその傾向はわかりにくくなることが判明した。またクラッベ病においては、日本人における高頻度変異の発現実験を行ない、変異の重症度と酵素蛋白質のプロセッシングの効率に大きな関係があることを見いだして、これを報告した。また、この発現実験においていくつかのシャペロン候補物質を負荷して、そのプロセッシングに与える影響を解析した。これにより、若年発症に寄与すると考えられる残存活性の高い変異に対して、特にシャペロン効果として、酵素活性の上昇、プロセッシングの効率化が観察された。今後はこれらの観察を更に多くの疾患に広げて観察し、ライソゾーム病の中でそれぞれの疾患の特徴を明らかにし、またクラッベ病、I-cell病に対する治療開発を行なって行く予定である。ライソゾーム病の一つであるクラッベ病に関して、患者皮膚線維芽細胞を用いて、オートファジーに関する因子の解析を、Western、免疫染色で行い、軽度オートファジーの亢進を認めた。また、6種類の患者変異を発現したCOSI細胞において、酵素活性、Western blotによる解析を行い、変異による変化をタンパクレベル、活性レベルで解析した。またこの変化がシャペロン候補物質NOEVによりどのような影響を受けるかを解析した。その結果、NOEVの効果により変異タンパク質の安定性が著しく改善し、タンパク質の量が増加し、酵素活性が軽度上昇した。この乖離はNOEVの阻害によるものか、変異タンパクの運搬の問題によるものか、今後解析の予定である。また、ムコリピドーシスの患者細胞において、オートファジーの亢進はすでに確認しているため、現在モデルマウスとして、日本人に最も多い変異R1189Xのノックインマウスとノックアウトマウスを作出した。このマウスの解析を行っているが、ノックインマウスは胎性致死になるようで確認できず、ノックアウトマウスの方もホモで出生する確率は大変低く、胎性致死になる可能性が高いことが確認された。現在少数の出生マウスにおける解析を行っている。ライソゾーム病は希少難病であり、酵素補充療法、造血幹細胞移植などが応用されているが、その治療は患者への負担も大きく、またその効果も充分ではない。われわれの研究は、細胞レベルでライソゾーム病の病態を現代的なオートファジー、マイトファジー、ミトコンドリア機能などを含めて解析し、様々な薬剤投与によるその表現型の改善を解析して、新規薬剤のスクリーニング系の確立を目指した。本研究期間中には、疾患としてクラッベ病、ガラクトシアリドーシス、ファブリー病を取り上げて、細胞レベルでの解析を行った。クラッベ病においてはCOS細胞に種々の変異タンパクを発現させて、その変異タンパクの酵素活性、熱安定性を解析し、シャペロン候補物質としてあげられているNOEVを付加することにより、細胞内での搬送の効率がどう変化するか、また変異ごとの効果がどうなっているかについて解析して報告した。またガラクトシアリドーシスについてはCTSA遺伝子の変化により2つの酵素活性が低下することが知られており、患者細胞にNOEVを付加することにより、その片方の酵素βgalactosidaseの酵素活性の上昇を見ることを確認し、報告した。ファブリー病においては疾患の症状として重要な不整脈剤としてのアミオダロンがライソゾーム酵素の運搬にたいする影響を患者細胞において確認し、細胞外からの酵素の取り込み効率にも影響することを確認した。これらのデータは、ライソゾーム病に対する治療として、欠損している酵素を補充することにも、様々な問題があり、酵素補充以外にシャペロンなど低分子薬剤の開発が有効であることを示すことになった。モデルマウスの作成において、胎性致死になる可能性が高く、生仔を得ることが困難であり、十分な解析マウスを得ることが困難であるため。

小児科学細胞を使った実験についてはオートファジーの解析を継続し、モデルマウスについては更に妊娠マウスを増やすことにより生仔を更に集める予定である。オートファジー解析は実験条件の最適化に時間がかかり、対象疾患が十分でない面があるが、ある程度の目安はついたと考えられる。またクラッベ病のシャペロン効果については2種類の薬剤の効果が確認でき、当初の予定より早めである。更に多くのライソゾーム疾患の細胞を用いて、オートファジー、マイトファジーの解析をすすめることと、クラッベ病についてはシャペロンの効果について更に詳しく解析をすすめたい。予定していた培養液などの試薬の消費が実験の遅れから遅かったため、次年度に使用することとした。次年度の前記に培養液などの消耗品として使用予定
T細胞刺激因子(TLTF)と組み合わせた遺伝子組換え型MSP-1ワクチンの試み

本課題では、アフリカトリパノソーマ原虫(Trypanosoma brucei)を利用したマラリアワクチン開発の基礎研究を行った。研究成果の概要は以下の通りである。1:MSP-1遺伝子(msp-1)を組み込んだT.brucei用発現ベクターを作製した。これらのベクターを導入し、T.bruceiプロサイクリック型原虫での発現を試みたが、MSP-1の発現は確認できなかった。発現ベクターに組み込んでいる薬剤耐性遺伝子は正常に発現・機能していることと他の遺伝子を組み込んだ場合には問題なく発現されることから、タンパク質のフォールディングなどmsp-1自体に何らかの原因があると推察している。そこで、T.brucei血流型原虫の変異型細胞表面糖タンパク質(VSG)のアジュバント効果を利用したマラリアワクチン開発へと研究の方向を転換した。2:ヒスチジンタグ・VSGN-末端保存領域・MSP-1・VSGC末端保存領域の融合タンパク質(VSG-MSP)とヒスチジンタグ・MSP-1の融合タンパク質をバキュロウイルス・昆虫細胞系を用いて発現させた。組換え融合タンパク質はグアニジンを用いて可溶化し、Ni-アガロースアフィニティカラムで精製した。3:マウスは組換えタンパク質を腹腔内投与することで免疫し、最初の免疫から3週後と6週後に追加免疫をした。最終免疫から3週間後、10^6のマラリア感染赤血球をマウスへ腹腔内接種し、チャレンジを行った。その結果、治癒効果は認められなかったもののVSG-MSPでは、虫血症の遅延効果が認められた。本課題では、アフリカトリパノソーマ原虫(Trypanosoma brucei)を利用したマラリアワクチン開発の基礎研究を行っている。現在までの研究実績は以下の通りである。1:MSP-1遺伝子(msp-1)を組み込んだT.bruceiで発現可能なplasmidベクターを構築した。まず、MSP-1を単独で発現させるために相同組換え型ベクター(pXS2)とエピソーマルベクター(pTbsc)へmsp-1をクローニングした。また、MSP-1をVSGのN-およびC-末端領域との融合タンパク質として発現させる(GPIアンカーリングを介して細胞表面へ発現させる)ためにpXS2へvsg117n/msp-1/vsg117cをクローニングした。2:電気穿孔法でT.brucei昆虫型原虫(PCF)へ1で作成したベクターを導入し、G418による薬剤選択培養を行った。得られた遺伝子導入PCFでのMSP-1の発現をウエスタンブロットで調べた結果、いずれのベクターを導入した細胞でも目的のバンドは得られなかった。細胞外への分泌も確認できなかった。3:msp-1をバキュロウイルスに組み込み、バキュロウイルス・昆虫細胞系での発現を行い、ウエスタンブロットでMSP-1の発現を確認できた。4:2の問題点を調べるために、MSP-1をGFPとの融合タンパク質として発現させるためpXS2とpTbscへmsp-1/egfpを、新規に開発した相同組換え型ベクター(pKH4001)へebfp/msp-1をクローニングし、得られたベクターをPCFに導入して融合タンパク質の発現を調べたが、発現は確認できなかった。5:msp-1はAT-rich(68%)な遺伝子であるが、T.bruceiのcodon usageに大きな偏りがないことと3の結果からMSP-1の発現が確認できないのはcodonの問題ではないと考えている。興味深いのは、msp-1が一部のサイトカインmRNAで報告されているdecay signal(UUAUUUAUU)を完全ではないものの数カ所に有している点である。いずれにしても問題点を早急に解決すべく研究を継続している。本課題では、Trypanosoma bruceiを利用したマラリアワクチン開発の基礎研究を行っているが、現在までに次のような問題点が確認された。

MSP-1遺伝子(msp-1)を組み込んだT. brucei用発現ベクターを作製し、T.bruceiプロサイクリック型原虫(PCF)での発現を試みたが、MSP-1の発現は確認できていない。発現ベクターに組み込んでいる薬剤耐性遺伝子は正常に発現・機能していることと他のタンパク質の遺伝子を組み込んだ場合には問題なく発現されることから、タンパク質のフォールディングなどmsp-1自体に何らかの原因があると推察している。そこで、時間と費用の観点から上記の問題点を解決するのは一旦保留し、「PCFを用いた生ワクチン効果」から「MSP-1とVSG(T.burcei血流型原虫の変異型細胞表面糖タンパク質)の融合タンパク質における後者のアジュバント効果」の利用へと研究の方向を転換した。発現系としては、バキュロウイルス・昆虫細胞系を用いた。まず、ヒスチジンタグ・VSG N末端領域・MSP-1・VSG C末端領域の融合タンパク質とヒスチジンタグ・MSP-1の融合タンパク質を発現させるべく組換えバキュロウイルスの作製を行い、ウエスタンブロットにて目的のタンパク質の発現を確認した。そこで、組換え融合タンパク質の大量分取のため、可溶化と精製の検討を行ったが、これらタンパク質は用いた界面活性剤では可溶化できず、不溶性の膜画分に存在することが判明した。そこで、緩和な条件での可溶化はあきらめ、タンパク質を一部変性させる条件下での可溶化を試みた。その結果、アフィニティーカラムを用いた精製過程を含めて、グアニジンを用いて可溶化した場合に回収率が最も良好であることがわかった。現在、MSP-1組換え融合タンパク質の大量精製を行っており、引続き、これらのワクチンとしての効果をマウスを用いた感染系で検討する予定である。
新しい選択的有機化学プロセスの開発と生理活性分子の高効率合成への応用に関する研究

1有機合成に有用なキノンの新光付加反応の開発-2-ヒドロキシン、2-アミノ、または2-メルカプトナフトキノンと種々のオレフィンとの新奇[3+2]光付加反応を見い出し、該反応によりマチュリノン、キナマイシン骨格、イソタンシノン骨格等の新合成を達成した。また2-アリールアミノ-、2-アルキルアミノナフトキノンの光アルキルならびに光アシル化反応など有機合成化学に有用な新プロセスを開発した。2 ROIの光分解により発生せしめたアルコキシルラジカルの選択的ベータ開裂反応を利用する有機合成法の開発-標記開裂反応をキーステップとするビシクロ[5.4.0]ウンデカン骨格の一般合成法、含酸素複素環の一般合成法、フタリド類、γ-ならびにδ-ラクトンの合成法等を開発した。これらの方法を用いて(±)-カリオフィレン、(±)-イソカリオフィレン、(±)-ヒマチャレンなどのセスキテルペン、(±)-ルシフェイオリドなどのマクロリド、(±)-オイデスミン、(±)-ピペリトール、(±)-ヤンガンビンなどの天然リグナンの全合成を達成した。3オキシム類の光による新分子変換-多数のステロイド系α,β-不飽和ケトンオキシムを新たに合成し、β,γ-不飽和ケトンオキシムへの光異性化、立体特異的メタノール付加などの新たな反応を見い出し、構造の生成物の相関を明らかにした。4不飽和アミンの環化による2,5-ジ置換ピロリジン類の立体選択的合成法の開発-δ-アルケニルアミンのアニオン的環化または電極反応による環化では2,5-シス-ジ置換ピロリジンが、ラジカル環化では2,5-トランス-ジ置換ピロリジンが生成することを明らかにした。5その他-電解調製活性亜鉛によるアルデヒドおよびケトンの簡便なイソプレニル化反応を開発し、昆虫フェロモンであるイプセノールとイプスジエノールを合成した。1・〔2+3〕光付加によるフロキノンならびにフロイレド-ルキノン類の合成ヒドロキシまたはアミノナフトキノンとオレフイン類の新奇〔2+3〕光付加反応を見出し、この反応を用いて、多数のフロキノンならびにフロインド-ルキノンを合成し、さらに天然ナフトキノンであるマチュリノン、抗生物質であるキナマイシン骨格などを合成し、一部は、米国オレゴン州で開催された第13回国際複素環化学会議で発表した。2・1,2ーナフトシクロブテン誘導体の熱分解で生成するオルトキノンジメチドの電子環状反応によるオキサステロイドの合成主法により、AB環が芳香族環である16ーオキサステロイドの高効率簡易全成を行い、成果を印刷公表した。3・アルコキシルラジカルの位置選択的βー開裂反応の有機合成への応用アルコキシルラジカルの選択的βー開裂を応用して、不飽和マクロリドであるルシフェイオリドの新合成、天然リグナンであるセサミンの合成のほか、多数のフタリド、γーならびにδーラクトンの合成を行った。4・オキシム類の光による分子変換ステロイド素α、βー不飽和ケトンオキシムについて、新奇な光によるβ、γ体への光異性化、立体特異的メタノ-ル付加などを見出し、その一部は、反応化学討論会で口頭発表し、また印刷公表した。5・電極反応を用いる各種テンペン類の高効率合成電極反応によるアルデヒドおよびケトンの簡便なイソプレニル化反応を開発し、この新手法を用いて、昆虫フェロモンであるイプセノ-