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脳虚血後の神経細胞傷害と傷害抑制に関する研究 -アポトーシスおよび非アポトーシス性傷害の検討-

脳虚血後の遅発性神経細胞死におけるアポトーシスの関与が注目されている。In vitroの研究では、細胞情報伝達因子の1つであるRasが、Pl 3-kinaseおよびAktを介してアポトーシスの発現に抑制的に働くと報告されている。今回われわれは、in vivoにおける現象を捉えるため、ラット前脳虚血・再灌流後の海馬にみられるアポトーシスの発生に基づき、遅発性神経細胞死におけるRasの関与を検討した。《実験1》【方法】雄ウィスターラットによる15分間の前脳虚血モデルを用い、虚血条件は両側頸動脈遮断に脱血性低血圧を加えた。組織学的検査としてTUNEL染色およびHE染色を行い、また免疫ブロッティング法を用いてRas、Pl 3-kinase、Akt、Bcl-2、α-fodrin分解産物を測定した。【結果】Ras、Pl 3-kinase、Akt、およびBcl-2は対照群と比較し再灌流3日後で有意に減少する一方、α-fodrin分解産物は有意に増加した。虚血再灌流3日後の脳標本では、海馬の神経細胞でHE染色で空胞化や核の濃縮が認められ、TUNEL染色は同部位で陽性を示した。《実験2》【方法】同様の10分間虚血モデルを用い、虚血前にmanumycin Aを脳室内投与し、虚血・再灌流3日後に、組織学的検査としてTUNEL染色およびHE染色を行い、また免疫ブロッティング法を用いてα-fodrin分解産物を測定した。対照群として、生理的食塩水ないし2%DMSO脳室内投与後の虚血・再灌流群と比較した。【結果】いずれの検査でもmanumycin A投与群が、対照群よりも海馬の神経細胞傷害が少なかった。《考察・まとめ》実験1から前脳虚血によるRasの低下とBcl-2の低下が神経細胞のアポトーシス発生に関わっている可能性が考えられるが、実験2から遅発性神経細胞死は非アポトーシス的細胞死が主である可能性が示唆された。ラット前脳虚血モデルを用いた海馬の遅発性神経細胞死におけるアポトーシスおよび非アポトーシス的細胞死の発生について研究した。ウィスターラット(雄、体重250350g)にイソフルラン麻酔下で手術操作を行った後、笑気70%、酸素30%の条件下で両側総頸動脈閉塞および脱血性低血圧による一過性の前脳虚血モデルを作製した。虚血時間は10分間または15分間とした。総頸動脈閉塞解除・返血(再灌流)の後に麻酔から覚醒させ抜管した。再灌流後3日または6日に再度イソフルランを用いて麻酔導入、経口挿管し、イソフルラン4%の深麻酔下で4%ホルマリンによる灌流固定を行い、直ちに脳を摘出した。この標本をヘマトキシリン-エオジン(HE)染色およびTUNEL染色を行い、前者で海馬の神経細胞の傷害の程度、アポトーシス発生の評価を行った。10分虚血・再灌流3日後および6日後では、神経細胞の傷害およびTUNEL染色陽性の結果は得られなかった。15分虚血・再灌流3日後では、海馬ではHE染色から神経細胞の減少と配列の乱れ、およびTUNEL染色陽性を示すものがみられた。本研究におけるラット前脳虚血モデルでは10分間の一過性前脳虚血では海馬の神経細胞死はみられず、15分以上の虚血侵襲で海馬の神経細胞傷害、とくにアポトーシスを疑わせる傷害が発生することが判明した。

今後さらに検討を続け、15分虚血の侵襲に対するアポトーシスおよび非アポトーシス的細胞死の発生の割合をHE染色、TUNEL染色およびDNA電気泳動により確認し、さらに免疫ブロット法により、この2種類の細胞死に関係すると推測される細胞情報伝達因子の1つRasの発現との関連を明らかにする予定である。ラット前脳虚血モデルによる海馬の遅発性神経細胞死における、アポトーシスおよび非アポトーシス的細胞死の発生について研究した。ウィスターラット(雄、体重295370g)にイソフルラン麻酔下で手術操作を行った後、笑気70%、酸素30%で両側総頸動脈閉塞および脱血性低血圧による一過性前脳虚血を作成した。実験(1):虚血時間は10分間ないし15分間とし、再灌流3日後にイソフルラン4%の深麻酔下で4%ホルマリンの灌流固定を行い脳標本を取り出し、ヘマトキシリン-エオジン(HE)染色とTUNEL染色を行った。この結果、虚血10分間と比較して15分間ではTUNEL陽性神経細胞が海馬CA1で増加し、HE染色も同部位で神経細胞の脱落を示唆する細胞の空胞化が増加した。実験(2):虚血15分間で再灌流2日後と3日後にそれぞれ深麻酔下に液体窒素を頭部に注ぎ脳を急速冷凍・断頭した後に、-20°C下で海馬を摘出した。これから電気泳動用試料を作成し、電気泳動と免疫ブロッティングを行った。アポトーシス的細胞死の調節に関与すると推察されるH-RasとR-Ras、およびアポトーシス発生の抑制に関与するBcl-2を測定した。対照群と比較して再灌流後2日ではいずれも有意な変化を認めなかったが、3日ではH-RasとBcl-2が有意に減少した。Bcl-2の減少は、再灌流後3日でのアポトーシス的細胞死優位な神経細胞傷害を示唆すると考えられた。また、R-RasはRasファミリーの中でも神経細胞に特有とされるが、本研究では一般的に細胞内に存在するH-Rasのアポトーシス的細胞死への関与が示唆された。今後は、Rasシグナルカスケードの下流に存在するPI3kinaseとAktを免疫ブロッティング法で測定し、さらにRas阻害剤投与モデルを作成して同様の測定を行い、神経細胞死の機序とRasカスケードとの関係をさらに詳細に解明する予定である。前年度の結果から、一過性脳虚血・再灌流後3日で、H-Rasが海馬で減少し、TUNEL染色結果からアポトーシス的細胞死が優位な神経細胞傷害が起きている可能性が示唆された。この結果から、Rasの阻害薬であるManumycin Aの脳室内投与でH-Rasのさらなる減少と、アポトーシス的神経細胞死増加を予想した。脳虚血・再灌流後の一過性の体重減少が術後3日の生存率に影響を及ぼすことから、この脳室内投与モデルを確立するため、Manumycin Aの脳室内投与後の神経学的スコアを確認した。イソフルランで麻酔を導入し、気管挿管した後、Manumycin A溶液(0.2mM,0.5mM,1.0mM,2.0mM、溶媒はDMSOと生理的食塩水)をそれぞれ50mlを約5分間かけて脳室内投与した。対照はDMSO20%溶液とした。脳室内投与後7日目のまで体重を測定し、Knockらの神経学的スコアのうち、「スクリーン回転」のカテゴリーを用いた(良好であれば0、最悪は3)。神経学的スコアは、投薬後の体重減少に伴い一過性にスコア1を示した例を2例認めたが、全体としてほぼスコアは0のままであった。
単一分子磁石をはじめとする分子性磁性体の開発

電導性、磁性、光特性を複合的に兼ね備えた物質群は、スイッチ、メモリー、演算素子、表示材料などさまざまな分野で活躍すると考えられる。分子性物質が、その多様性、加工性、軽量性、柔軟性など従前の無機物質にない特性をもつことから、分子性磁性材料開発においては従来の無機材料とは異なる方向性を目指すべきである。また、磁気記録材料のダウンサイジングに向けて、分子一つあるいは鎖状分子一本に由来する磁気ヒステリシスは昨今のホットな研究テーマであるが、この材料群に対して、4f-3dヘテロスピン系を適用して、新規性の高い物質の合成開発を目指した。1.機能性低次元磁石:ラジカルーコバルト系単一次元鎖磁石からバルクの磁性との共存の見られる系が見つかり、世界最高の保磁力(52k0e)を有する「硬い」磁性材料を開発した。2.単分子磁石・単鎖磁石:いくつかの4f-3d系単分子磁石を合成開発し、磁気ヒステリシスを描くことにより単分子あるいは単一次元鎖磁石の性能を有することを明らかにした。量子トンネル効果に基づく磁化のジャンプが見られ、ヒステリシスが単分子由来であることがわかった。3.4f-3d間の磁気カップリングの決定:4f-3d系単分子磁石において、そのエネルギー準位図を正確に描くことにより磁化の量子トンネル効果を説明した。高周波ESRを用いて4f-3d間交換相互作用を決定した。(1)単分子磁石、単鎖磁石の開発直線3核(Dy-Cu-Dy)および有中心5核錯体(Gd_4Cu)錯体を合成し、構造決定、磁性を明らかにした。Dy_2Cu錯体で、単分子磁石特有の磁化曲線のステップが0.5Kで観測された。この現象はゼーマン分裂による、レベル間の交差するところで、トンネル効果が起っていることで説明できた。また、フタロシアニン環の周辺にオクチルチオおよびステアリルチオ基を導入して、液晶性単分子磁石を開発した。有機溶媒に対する溶解性が格段に向上した。ニトロニルニトロキシドラジカルとCo(II)との鎖状錯体は単鎖磁石の性能を示し、磁化反転のためのエネルギー障壁は350Kと、従来知られているCo(II)錯体に比べて、非常に大きいことを見つけた。(2)1次元フェリ磁性鎖錯体Gd(III)とCu(II)を含むGd_2Cu_2錯体は、1次元鎖構造を示し、Gd(III)とCu(II)の間の反強磁性的相互作用によるフェリ磁性的挙動を示した。(3)磁気ヒステリシスの大きいスピンクロスオーバー錯体配位子部分に長鎖アルキル基を導入したFe(III)錯体は、スピンクロスオーバー現象を示し、中にはヒステリシス幅が100Kにも達するものを見つけた。磁気双安定性を利用したメモリー材料につながる可能性がある。(4)弱強磁性体の圧力効果ピリミジン・Fe(II)錯体は弱強磁性体転移を示すが、圧力により弱強磁性体→常磁性体転移を示した。(5)伝導性単分子磁石種々のドナー分子の電解結晶法で、支持電解質に4f金属錯アニオンを導入する検討を進めた。得られたイオンラジカル塩には、単分子磁石挙動が見られた。(6)天然有機化合物由来の電荷移動錯体の開発天然ルシフェリンに含まれるイミダゾピラジノン骨格に着目し、それらのドナー性とCT錯体形成能を明らかにした。オキシマートを配位子とし、希土類イオンDyと銅を1分子中に含む錯体を合成し、極低温で磁気物性を測定した。その結果、2個のDy同士の磁気モーメントは平行であり、Dyと1個の銅との間に、反強磁性的相互作用が見られた。交流帯磁率の測定から、単分子磁石の挙動を観測した。更に、0.5K1.5Kで、パルス磁場による磁化曲線を求めると、単分子磁石特有の磁化のジャンプが見出された。

この現象はゼーマンレベル同士のレベルの交差のところで起こるトンネル効果に起因することを、理論的に解明した。これは、3d-4f系の単分子磁石の理論解析の最初のものである。また、ニトロニルニトロキシドラジカルとコバルトを含む1次元錯体で、単鎖磁石を見つけた。X線結晶構造解析により、鎖状ポリマーであることを見出し、交流帯磁率からx''の周波数依存による単鎖磁石の挙動を見つけた。また、極低温での磁化曲線の測定からも、磁化ジャンプを見つけ、単鎖磁石の挙動を確認した。この系は、磁気反転に要するエネルギー障壁の高さが193Kと、単鎖磁石としては比較的高いことを見出した。これら以外にも、生体発光物質がドナー分子として電荷移動錯体を生じることを見つけたり、有機ラジカルで、同一温度で低スピンと高スピン状態を示す磁気双安定物質の発見、金属イオンを取り込むことにより、分子の構造変化に伴う磁性の制御、希土類イオンを含む伝導性有機錯体の物性、遷移金属錯体の磁性の光制御、キュバン構造をもっ有機分子の両側にコバルトを配位させ、コバルト同士の磁性軌道の直交による分子内強磁性的相互作用の実現、などの研究を行った。これらを含めて、レフリー付き学術雑誌に13報の論文を発表した。電導性、磁性、光特性を複合的に兼ね備えた物質群は、スイッチ、メモリー、演算素子、表示材料などさまざまな分野で活躍すると考えられる。分子性物質が、その多様性、加工性、軽量性、柔軟性など従前の無幾物質にない特性をもつことから、分子性磁性材料開発においては従来の無機材料とは異なる方向性を目指すべきである。また、磁気記録材料のダウンサイジングに向けて、分子-つあるいは鎖状分子-本に由来する磁気ヒステリシスは咋今のホットな研究テーマであるが、この材料群に対して、4f-3dヘテロピン系を適用して、新規性の高い物質の合成開発を目指した。1.機能性低次元磁石:ラジカルーコバルト系単一次元鎖磁石からバルクの磁性との共存の見られる系が見つかり、世界最高の保磁力(52kOe)を有する「硬い」磁性材料を開発した。2.単分子磁石・単鎖磁石:いくつかの4f-3d系単分子磁石を合成開発し、そのエネルギー準位図を正確に描くことにより磁化の量子トンネル効果を説明した。高周波ESRを用いて4f-3d開交換相互作用を決定した。
開瞼時眼球運動を用いた精神分裂症診断の妥当性の検討

分裂病患者の表情や視線の動きが精神内界を反映する重要な指標の一つであることは日常の臨床において常に経験することであり、立津は分裂病者に最も特徴的なのは目を中心とした顔の表情の変化が乏しいことであると述べている。我々はこの視線の動きを客観的に把握し、これらの眼球運動の特徴が分裂病に特異的かどうかを明らかにするために、これらを用いて分裂病を非分裂病から判別できるかどうかを検討した。対象は精神分裂病患者41名(平均年齢35.8±9.1歳)、非分裂病者73名(平均年齢41.0±11.0歳)で、その内訳は正常者20名、覚醒剤患者11名、てんかん患者17名、うつ病患者10名、アルコ-ル精神病患者10名、強迫神経症患者5名である。被験者にNacV型アイマ-ク・レコ-ダを装着し、横S字型の標的図を見ている時、及び標的図とそれに類似した図とを比較・照合している時の注視点の動きを分析した。以上により、注視点の運動数、平均移動距離、総移動距離、反応的探索スコア、再認時の探索スコアの5つの眼球運動に関する指標を抽出し、これらを用いて判別分析を行った。まずStepweise selectionにより、注視点の運動数と反応的探索スコアの2つの指標が有効な変数として抽出され、これらにより感受性73.2%、特異性76.7%で分裂病を非分裂病から判別できた。さらにこの結果の妥当性を検討するために、得られた判別関数を用いて、別の新しい対象である分裂病患者64名(平均年齢36.2±8.2歳)非分裂病患者125名(平均年齢39.9±11.4歳)について検討したところ、感受性76.6%、特異性81.6%で分裂病を非分裂から判別できることがわかった。従って、反応的探索スコアと運動数という眼球運動の指標を用いて、分裂病を非分裂病からかなり判別できることが分かった。以上より、これらの指標は分裂病という疾患では特異的な値を示すことがわかり、臨床診断の補助的役割を果たすと共に、分裂病の本態の解明にも役立つものと考えられる。
壁装におけるカビの生育特性に関する研究

住宅内カビ汚染の対策,とりわけ,湿度対策の一つとして調湿材が用いられるケースは多く見られる。しかしながら,空中ではなく,基材で増殖するというカビの生態を勘案すれば調湿材を使用することによって,カビの増殖と直接関係しない室内居住域の空中水分をカビの増殖可能な基材となる壁装材に取り込むことになり,カビの増殖を助長させる結果をもたらす可能性があると考えられる。本研究では,調湿剤を施した実際環境の実態調査を行ったほか,諸湿度環境条件における吸湿材表面でのカビ増殖特性について定量的な検討を行った。実態調査の結果より,高湿環境中での調湿材の使用は,その表面での高湿性カビAcremonium sp.の増殖を助長することが明らかになった。また,実験的な検討においては,本研究で提案したカビ増殖指数(MGI)が,カビの成長曲線に対応した定量的な指標であることが明らかになった。今年度は当初計画の通り,調湿建材を用いたチャンバー実験(基礎実験)を行い,諸条件における調湿建材でのかびの生育状況を定量するとともに,かびの生育過程で放出される揮発性有機化合物質(MVOC)の発生特性について検討を行った。予備実験と位置づけた今年度の実験では,壁材として使用される調湿建材を用いたほか,それと比較するため、一般家庭で使用されるフローリング材と押入れボード材の計3種類を用いた。これらは建材の品質のばらつきを抑えるため,建材試験センターの協力のもと,建材の養生の過程が明らかなものを使用した。また,住居に使われる建材のため防かび剤が添加されていた。実験では,建材の含水量の調整、かびを発生させることを容易にするため、各建材のサイズを150mm×150mmとし、測定に必要な上面以外はアルミホイルで覆って,断湿処理を施した。試験に一般居住環境に分離される頻度の最も高いCladosporium cladosporioides, Aspergillusniger,およびPenicillium pinophilumを用い,菌液に寒天を含む場合と含まない場合,またチャンバー内の湿度を変えて実験を行った。なお,MVOCの成分分析はGC/MSによった。上記の予備実験により,調湿建材に抗菌剤、防腐剤を施したものの,建材表面でのかびの増殖や,増殖の過程でMVOCの発生が確認された。また,実験の条件や菌液の塗布方法などについて必要なノウハウを取得し,次年度(平成22年度)の本実験に大いに参考できる資料を得た。今年度は,調湿建材を用いたチャンバー実験(基礎実験)を行い,諸条件における調湿建材でのかびの生育状況を定量するとともに,かびの生育過程で放出される揮発性有機化合物質(MVOC)の発生特性について検討を行った。また,吸放湿材を施した地熱利用地下ピット(空調ダクト兼用)内のかび汚染の実態及びそれによる室内環境への影響についても検討を行った。本年度の研究で得られた主な結果は以下の通りである。(1)恒温恒湿チャンバー内において湿度95%で養生された木材においてC. cladosporioides, P. pinophilum, A. nigerの増殖が認められた。(2)実環境での調湿材の表面においてAcremonium sp.の増殖が確認されたことから,好湿性かびの生育にとって好環境になっていることが明らかになった。(3)実環境で,調湿材の表面において増殖したAcremonium sp.が,給気と室内空気中から高濃度で検出されたことから,ピット内の調湿材で増殖したかびが室内に侵入したことが明らかになった。上記の研究成果を踏まえて,次年度は下記の実験を実施し,3年間の成果を報告書にまとめる。・調湿材の調湿性能性能別のかび増殖への影響に関する実験・調湿材でのかび生育状態とMVOCsの関係を把握するための実験近年、日本では調湿建材と呼ばれる内装材料が注目されている。調湿建材については既往の研究により、室内温湿度の変化や、調湿材を用いることによる室内かび汚染の制御効果の検証といった調湿材の性能を評価した研究結果は報告されているが、調湿材自体のかびの汚染源になるとの報告はほとんど見当たらない。本研究では、諸条件における調湿建材表面でのかび増殖特性を把握するために一連の実験的な研究と実態調査を行っている。

今年度は当初計画の通り、調湿建材を用いたチャンバー実験(基礎実験)を行い、諸条件における調湿建材でのカビ(Cladosporium cladosporioides,Aspergillus niger,Penicillium ponophilum)の生育状況を定量するとともに、カビの生育過程で放出される揮発性有機化合物質(MVOC)の発生特性について検討を行った。今年度とこれまでの研究成果を踏まえて,今年度では建材表面での真菌の増殖速度を定量的に評価できるカビ増殖指数(Mould Growth index、を提案した。MGIを用いることによって,建材評価でのカビ増殖速度は微生物の成長曲線と一致することが明らかになった。一方,本研究の実験条件でのMVOCの発生量が微量であったため,そのMVOCの特定ができなかった。これまで、建材表面での微生物汚染の評価方法には、JISに規定されたものがあるが、これはかびの発育部分の面積によって評価するものであり、かびの増殖特性に対応した評価方法ではないため、半定量法とされている。本研究で提案する評価指標MGIは建材表面でのかび増殖速度を定量的に評価できるものである。
抗癌剤による嗅覚障害の実態とその早期発見による栄養状態の維持を指向した探索的研究

嗅覚障害は食欲低下の原因の一つであり,癌化学療法による嗅覚障害が癌患者の栄養状態に影響をおよぼしている可能性が考えらえる.そこで,本研究課題では,外来癌化学療法施行患者の嗅覚障害の実態調査および栄養状態との関連を解析した.外来化学療法施行患者の36%に嗅覚障害が生じていた.また,嗅覚障害を自覚していない癌患者は,その自覚がある癌患者と比較して, BMI,血中総タンパク質が有意に低下していた.本研究により,嗅覚障害は癌化学療法の副作用として注意すべき症状であり,化学療法施行患者の栄養状態に影響をおよぼすことが示唆された.嗅覚障害は食欲低下の原因の一つであり,癌化学療法による嗅覚障害が癌患者の栄養状態に影響をおよぼしている可能性が考えらえる.そこで,本研究課題では,外来癌化学療法施行患者の嗅覚障害の実態調査および栄養状態との関連を解析した.外来化学療法施行患者の36%に嗅覚障害が生じていた.また,嗅覚障害を自覚していない癌患者は,その自覚がある癌患者と比較して, BMI,血中総タンパク質が有意に低下していた.本研究により,嗅覚障害は癌化学療法の副作用として注意すべき症状であり,化学療法施行患者の栄養状態に影響をおよぼすことが示唆された.本年度は、金沢大学医学部倫理審査委員会に当該臨床研究を実施するために研究内容の倫理審査申請を行い、承認された。がん化学療法による嗅覚障害の実態を明らかにするために、嗅覚障害、味覚障害の発現頻度およびこれらを誘発しやすい化学療法レジメンの調査と味覚障害と嗅覚障害の関連を解析した。がん化学療法を施行した19%に嗅覚障害、55%に味覚障害がみられた。嗅覚障害の発現リスクが有意に高いレジメンは特定できなかったが、パクリタキセル、ドセタキセル、FOLFOX(オキサリプラチン、5-フルオロウラシル、ロイコボリン)、FOLFIRI(イリノテカン、5-フルオロウラシル、ロイコボリン)、FEC(5-フルオロウラシル、エピルビシン、シクロホスファミド)、ビノレルビンを施行した患者で嗅覚障害がみられた。一方、味覚障害については、ゲムシタビンで有意に発現リスクが高かった。さらに、味覚障害を有する患者では、味覚障害がない患者に比べ、嗅覚障害の発現リスクが有意に高かった。以上のことから、嗅覚障害はがん化学療法により生じる頻度が高い有害事象であることが示唆された。また、味覚障害を有する患者では、嗅覚障害を合併するリスクが高いことが示唆されたため、味覚障害の訴えがあった患者では嗅覚障害の合併も考慮したケアが必要であると考えられた。これらの結果は、がん化学療法を行う患者の適切なケア、薬学的管理を行う上で、非常に重要な成果である本年度の予定に栄養状態と嗅覚異常の関連を解析することも加えていたが、栄養状態の評価を患者に断られることが多く、症例数が十分ではないため、この解析は次年度に再検討することとした。本年度は,簡易型嗅覚検査キットOpen Essence (OP)を用いた嗅覚異常の評価を行い,聞き取り形式による調査とOPによる調査の一致率を検討した.また,栄養状態との関連の解析に取り組んだ.抗癌剤が投与された癌患者94例よりデータを得た.OPにより嗅覚異常と判定された患者は36%であり,聞き取り形式では25%であった.このことから,聞き取り形式の調査では,嗅覚異常に気づいていない患者を見過ごす可能性があることが明らかとなった.嗅覚異常の発現リスクが統計学的に高い化学療法レジメンは特定できなかったが,パクリタキセル,ゲムシタビン,ペメトレキセド,セツキシマブ+イリノテカン併用療法を行った患者では30%以上の患者で嗅覚異常がみられた.これらの化学療法レジメンを施行する患者では,嗅覚異常のモニタリングを行う必要があることが示唆された.栄養状態の評価として,当初は,皮下脂肪の厚み,腕周囲径などの計測に取り組んだが,本研究の対象とした進行癌の患者から,上記による栄養状態の評価を行うことを拒絶されることが多いため,通常診療で得られるデータの中からBMI,血中総タンパク質,血中アルブミン値で代用して栄養状態を評価することとした.その結果,OPで嗅覚異常と判定された患者のうち,嗅覚異常の自覚症状のない患者では,自覚症状のある患者と比較して,BMIと血中総タンパク質量が有意に低下していた.一方で,抗癌剤による食欲低下は,嗅覚異常の自覚のある患者で高い傾向がみられた(50%vs31%).これらのことから,嗅覚異常を自覚している患者の半数は食欲の低下も自覚しており,自発的に食事内容の工夫をすることで,食事による摂取カロリーが維持されたことが推察された.本研究を通して,嗅覚異常は抗癌剤により誘発されやすい副作用の一つとして認識する必要があり,その自覚の有無が栄養状態に影響をおよぼす可能性があることが示唆されたことは意義あるものである.
びまん性肺疾患における新規疾患特異的自己抗体

これまでの研究で我々は、びまん性肺疾患の網羅的自己抗体検索により特発性肺線維症(IPF)、特発性非特異的間質性肺炎(INSIP)、自己免疫性肺胞蛋白症(aPAP)、サルコイドーシス(SAR)、それぞれの疾患特異的自己抗体を同定した。INSIP特異的自己抗体の一つ、抗MX-1抗体測定ELISAを開発した。抗MX-1抗体は慢性特発性間質性肺炎の17.5%で陽性となり、また抗ARS抗体と同時陽性となるケースはほとんどないことを示し、抗MX-1抗体は多様な慢性特発性間質性肺炎中のサブグループを認識するクラスタリング抗体である可能性を示唆した。本年度我々は、GM-CSFプローブを用いて、aPAP患者末梢血単核球より、抗GM-CSF抗体を産生するB細胞単離の条件を確立した。この結果、aPAP患者末梢血よりリコンビナント・モノクローナル抗体を多数作成することが可能となった。REDCapシステムを用いたIPF治療薬の有効性・安全性を評価するコホート研究では計50例の症例登録、血清保存、ゲノム保存を行い、自覚症状、血液検査、QOL、肺機能等の入力を継続している。aPAP研究では、GM-CSF結合性B細胞濃縮に関する条件設定に時間を要したが、本年度は前進があった。REDCapシステムを用いたREDCapを用いたIPF治療薬の有効性・安全性を評価するコホート研究では症例登録を加速させる。GM-CSFプローブを用いたGM-CSF反応性B細胞濃縮一細胞由来の抗GM-CSFモノクローナル抗体作成については大きな前進があった。今後、AI技術を用いたクラスター化と臨床経過との対比、エピトープマッピング、in vitro GM-CSFシグナル阻害実験、モデルマウス作成などを通じて病原性抗GM-CSF抗体の同定を行う。REDCapを用いたIPF治療薬の有効性・安全性を評価するコホート研究では症例登録を加速させる。先行研究で我々はINSIP特異的自己抗体、抗MX1抗体を発見した。本年度は、国立病院機構近畿中央胸部疾患センターで2005-2009年に登録された慢性線維化性IIPsコホート155例を用いて抗MX1抗体と臨床像、予後との関連を検討した。REDCapシステムを用いた抗線維化剤使用症例の多施設前向き登録も開始した。1)抗線維化薬投与症例の多施設症例登録は既に開始できているが、症例数はまだ少なく、進捗は遅れている。3)今年度は自己免疫性肺胞蛋白症患者の末梢血提供を受けることができなかった。これまでの研究で我々は、びまん性肺疾患の網羅的血清自己抗体検索により特発性肺線維症(IPF)、特発性非特異的間質性肺炎(INSIP)、自己免疫性肺胞蛋白症(aPAP)、サルコイドーシス(SAR)特異的自己抗体をそれぞれ同定した。次に、INSIP特異的自己抗体の一つである抗MX1抗体に着目し、血清抗MX1抗体を測定するELISAを開発し、横断的研究を行ったところ、抗MX1抗体は慢性特発性間質性肺炎の17.5%で陽性となり、また抗ARS抗体と同時に陽性となるケースはほとんどないことを示した。さらに国立病院機構近畿中央胸部疾患センターのレトロスペクティブコホートを用いた研究で、抗MX1抗体陽性症例は同コホート内non-IPF症例中、予後良好群であることを示し、以上の結果を論文報告した(Scientific Reports 2017)。近年提唱されているInterstitial Pneumonia with Autoimmune Features (IPAF)と抗MX1抗体陽性慢性特発性間質性肺炎との関係を検討したところ、IPAFに含まれない抗MX1抗体陽性症例が相当数存在することが判明した。抗MX1抗体がIPAFの概念を拡張する自己抗体であることを示した(第3回日本骨免疫学会2017)。REDCapシステムを用いた抗線維化剤使用症例の多施設前向き登録研究も開始され、これまでに計34症例を登録し、血清、ゲノム保存を行い、自覚症状、血液検査、QOL、肺機能等を継続調査登録している。aPAPにおける病原性自己抗体(モノクローナル抗体)を作成する研究を開始した。GM-CSF反応性B細胞を患者末梢血より濃縮するためのプローブを作成した。国立病院機構近畿中央胸部疾患センターaPAP患者5名より採血を行い、血漿及び末梢血単核球を保存した。REDCapシステムを用いた抗線維化剤使用症例の多施設前向き登録研究については一定数の症例登録はなされたが、未だ症例登録が遅れている。aPAPにおける病原性自己抗体(モノクローナル抗体)を作成する研究については、GM-CSF反応性B細胞を末梢血単核球より濃縮する条件設定に時間を費やした。

本年度我々は、GM-CSFプローブを用いて、aPAP患者末梢血単核球より、抗GM-CSF抗体を産生するB細胞単離の条件を確立した。この結果、aPAP患者末梢血よりリコンビナント・モノクローナル抗体を多数作成することが可能となった。REDCapシステムを用いたIPF治療薬の有効性・安全性を評価するコホート研究では計50例の症例登録、血清保存、ゲノム保存を行い、自覚症状、血液検査、QOL、肺機能等の入力を継続している。aPAP研究では、GM-CSF結合性B細胞濃縮に関する条件設定に時間を要したが、本年度は前進があった。REDCapシステムを用いたREDCapを用いたIPF治療薬の有効性・安全性を評価するコホート研究では症例登録を加速させる。1)積極的な症例登録を呼びかけていく。2)HLA class IIとGM-CSF複合体を表出する安定発現株樹立が不可能な理由は不明であるが、樹立困難な場合は研究計画を変更する必要がある。3)研究分担者、井上義一先生とミーティングを継続する。REDCapシステムを用いた抗線維化剤使用症例の多施設前向き登録研究については今後も積極的に登録を呼びかけていく。aPAPにおける病原性自己抗体(モノクローナル抗体)を作成する研究については、GM-CSFプローブを用いたGM-CSF反応性B細胞を濃縮する方法と並行して、バイオインフォマティクスによるクラスター技術を用いる方法を取り入れていく。GM-CSFプローブを用いたGM-CSF反応性B細胞濃縮一細胞由来の抗GM-CSFモノクローナル抗体作成については大きな前進があった。今後、AI技術を用いたクラスター化と臨床経過との対比、エピトープマッピング、in vitro GM-CSFシグナル阻害実験、モデルマウス作成などを通じて病原性抗GM-CSF抗体の同定を行う。REDCapを用いたIPF治療薬の有効性・安全性を評価するコホート研究では症例登録を加速させる。今年度は症例集積が遅れたため、患者末梢血を使用した遺伝子解析やin vitroの実験を行うことができなかった。GM-CSF反応性B細胞濃縮のための条件設定に時間を費やしたため、次のステップへ進めなかった。本年度はB細胞レパトア解析を中心とした研究に使用する予定である。GM-CSF結合性B細胞濃縮のための条件設定に時間を費やしたため、次のステップへ進めなかった。本年度は自己免疫性肺胞蛋白症患者の体内に存在する病原性抗GM-CSF抗体同定を目的とした研究、IPF治療薬の有効性・安全性を評価するコホート研究におけるDNA単離などに使用する予定である。症例集積を加速し、次年度以降に患者末梢血を使用した遺伝子解析やin vitroの実験を行うために、繰越し金を使用する。
東洋医学的視点を導入したセルフヘルスアセスメント法の研究

1.研究目的:東洋医学はいわば疫学に立脚した診断治療学であり、西洋医学とは体系を異とする。しかしセルフケアを要する患者の病状把握においては自他覚所見を重視する東洋医学が貢献できる領域は大きいと考える。本研究では東洋医学体系を導入したセルフアセスメントの実現可能性の検討、および継続的な自己健康管理の道具として、パソコンによる自動弁証システムの構築を試みた。2.健康調査票への弁証理論の導入:健康調査票は東洋医学的弁証スコア(MOS),SDS,HPIなどから構成した。京都府下の12公立高校の生徒6,251人を対象に調査し、5,846人(有効回答率93.5%)について分析した。(1)MOSの各11病証の結果は気血陰陽弁証では陽虚(84.9%)、陰虚(54.5%)が、臓腑弁証では肺(60.1%)、脾(48.2%)の病証が多くみられ、呼吸器、消化器系機能の失調や冷え性が多いと考えられた。(2)陽虚、血虚、血おで弁証がある人でBMI値が有意に低く、やせている傾向が示された。高校生におけるやせ傾向が冷えや栄養不足状態などからくる可能性が考えられた。事実、朝の欠食など食習慣の乱れがある場合にやせ傾向が強くみられた。(3)MOSの各証で弁証がある人のSDSが有意に高く、MOSは身体的健康のみならず精神的健康も含めた評価が可能であることが示唆された。(4)MOSやSDSなどの調査項目を用いて因子分析を行った結果、「身体的健康度」「精神的健康度」「生活の充実感」の3因子が抽出された。進路別のクラス編成をとっているある高校では、これら3側面からとらえた健康度に進路別および学年進行による差が見られた。進学クラスでは3年生は受験を目前に控えた時期に調査を実施した関係もあり、「身体的健康度」「精神的健康度」ともに高学年になるほど低くなり、これに反して「生活の充実感」は高くなる傾向を示した。3.自己健康管理へむけてのコンピュータ導入の可能性:MOSの弁証がパソコン上で簡単にできるシステムを構築した。約50の設問入力に要する時間は35分、弁証結果出力は即時可能であった。また、一時点の弁証結果の表示だけではなく、個人の時系列的な心身健康状態の変化を自動グラフ化するなど、視覚的に提示可能にし、自己健康管理の道具としてのシステム構築を検討した。今年度は東洋医学体系を導入したセルフアセスメントの実現可能性を検討した。2.健康調査票への弁証理論の導入:健康調査票は東洋医学的弁証スコア(MOS)、SDS、HPIなどがら構成した。(1) MOSの各11病証の結果は気血陰陽弁証では陽虚(84.9%)、陰虚(54.5%)が、臓腑弁証では肺(60.1%)、脾(48.2%)の病証が多くみられ、呼吸器、消化器系機能の失調や冷え性が多いと考えられた。(3) MOSの各証で弁証がある人のSDSが有意に高く、MOSは身体的健康のみならず精神的健康も含めた評価が可能であることが示唆された。約50の設問入力番こ要する時間は35分、弁証結果出力は即時可能であった。現段階では一時点の弁証結果しか表示できず、継続管理の道具としてはデータベース部の再構築が必要である。4.平成11年度の予定:今後MOSと医学的データとの関係を検討し、身体的健康状態の把握におけるMOSの有効性を確認した上で、個人の時系列的な心身健康状態の変化を自動グラフ化などにより視覚的に提示可能にし、自己健康管理の道具としてのシステム構築を検討する。

(1)MOSの各11病証の結果は気血陰陽弁証では陽虚(84.9%)、陰虚(54.5%)が、臓腑弁証では肺(60.1%)、脾(48.2%)の病証が多くみられ、呼吸器、消化器系機能の失調や冷え性が多いと考えられた。(2)陽虚、血虚、血おで弁証がある人でBMI値が有意に低く、やせている傾向が示された。高校生におけるやせ傾向が冷えや栄養不足状態などからくる可能性が考えられた。事実、朝の欠食など食習慣の乱れがある場合にやせ傾向が強くみられた。(3)MOSの各証で弁証がある人のSDSが有意に高く、MOSは身体的健康のみならず精神的健康も含めた評価が可能であることが示唆された。(4)MOSやSDSなどの調査項目を用いて因子分析を行った結果、「身体的健康度」「精神的健康度」「生活の充実感」の3因子が抽出された。進路別のクラス編成をとっているある高校では、これら3側面からとらえた健康度に進路別および学年進行による差が見られた。進学クラスでは3年生は受験を目前に控えた時期に調査を実施した関係もあり、「身体的健康度」「精神的健康度」ともに高学年になるほど低くなり、これに反して「生活の充実感」は高くなる傾向を示した。3.自己健康管理へむけてのコンピュータ導入の可能性:MOSの弁証がパソコン上で簡単にできるシステムを構築した。約50の設問入力に要する時間は35分、弁証結果出力は即時可能であった。また、一時点の弁証結果の表示だけではなく、個人の時系列的な心身健康状態の変化を自動グラフ化するなど、視覚的に提示可能にし、自己健康管理の道具としてのシステム構築を検討した。
抗体欠乏をきたす原発性免疫不全症候群の包括的解析:診断と治療への展開

抗体産生は生体防御において主要な役割を演じている。原発性免疫不全症の中で、抗体欠乏を主徴とする免疫不全症はかなりの割合を占め、臨床的にも重要な疾患群となっている。本症おける病因を解明とともに、その責任遺伝子を応用して臨床的に有用な診断や治療法を開発した。全国から収集したX連鎖無ガンマグロブリン血症患者やX連鎖高IgM血症患者の遺伝子解析に加え、新たに臨床導入されたフローサイトメーターによる診断法の有用性を検証した(Gombart et al. Blood 2001)。X連鎖高IgM血症II型については、責任遺伝子AIDの機能解析を行うとともにAIDノックアウトマウスを用いた解析を行った。病因不明の分類不能型免疫不全症に関しては、CD27、ICOS, B7hなどの分子群を中心に多角的な解析を行った(Agematsu et al. Clin Immunol 2002)。また、抗体産生のない重症複合免疫不全症(SCID)のB細胞機能解析(Agematsu et al. Clin Exp Immunol 2001)、ならびにその責任遺伝子、Artemisの本邦初の変異を4家系で同定し報告した(Kobayashi et al. Hum Genet in press)。さらに、NGFR(nerve growth factor receptor)/TNFR(tumor necrosis factor receptor)ファミリーに属するCD27分子をメモリーB細胞のマーカーとして用いて、新生児における抗体産生低下や分類不能型免疫不全症の病因・病態について解析した(Nagumo et al. Blood 2002)。本研究によって、抗体欠乏をきたす既知ならびに原因不明の免疫不全症の病態解析、簡易法を含む診断法の開発、新たな治療法の試みを行なうことができた。抗体欠乏をきたす免疫不全症は、原発性免疫不全症の中で最も多く、主要な位置を占めている。今年度はその病因・病態を解明し、責任遺伝子を応用して臨床的に有用な診断法や治療法の開発を進めた。全国から収集したXLA患者やXHIM患者の遺伝子解析に加え、新たに臨床導入されたフローサイトメーターによる診断法の有用性を検証した。特にブルトン型無ガンマグロブリン血症(XLA)の責任遺伝子Btkの解析を行い、遺伝子解析とともに抗体を用いた簡便かつ正確な診断法の開発をさらに進めている。病因不明の分類不能型免疫不全症に関しては、CD27分子を中心に多角的な解析を行い(南雲:Blood 15:567, 2002)、その病因を解明した(上松:Clinical Immunology in press)。好中球二次顆粒欠損症においては、その責任遺伝子、C/EBPεを同定し(Gombart,小宮山:Blood 97:2561, 2001)、変異および正常遺伝子の導入によって機能障害からの回復を検討している。これらの遺伝子解析、蛋白レベルでの解析、ならびに機能解析の結果を総合的に検討し、将来の遺伝子治療を含む新治療法開発に向けて基礎的データを集積している。また、抗体産生のないX連鎖重症複合免疫不全症(X-SCID)のB細胞機能解析を行い、欧米で開発され良好な成績をあげているcommonγchain遺伝子導入による遺伝子治療について、他施設とともにその遂行にむけて推し進めている。さらに最近は、重症複合免疫不全症の責任遺伝子artemisの変異同定を本邦の4例で初めて行い、遺伝子治療を視野においてartemisの機能解析を行っている。

全国から収集したX連鎖無ガンマグロブリン血症患者やX連鎖高IgM血症患者の遺伝子解析に加え、新たに臨床導入されたフローサイトメーターによる診断法の有用性を検証した(Gombart et al. Blood 2001)。X連鎖高IgM血症II型については、責任遺伝子AIDの機能解析を行うとともにAIDノックアウトマウスを用いた解析を行った。病因不明の分類不能型免疫不全症に関しては、CD27、ICOS, B7hなどの分子群を中心に多角的な解析を行った(Agematsu et al. Clin Immunol 2002)。また、抗体産生のない重症複合免疫不全症(SCID)のB細胞機能解析(Agematsu et al. Clin Exp Immunol 2001)、ならびにその責任遺伝子、Artemisの本邦初の変異を4家系で同定し報告した(Kobayashi et al. Hum Genet in press)。さらに、NGFR (nerve growth factor receptor)/TNFR (tumor necrosis factor receptor)ファミリーに属するCD27分子をメモリーB細胞のマーカーとして用いて、新生児における抗体産生低下や分類不能型免疫不全症の病因・病態について解析した(Nagumo et al. Blood 2002)。本研究によって、抗体欠乏をきたす既知ならびに原因不明の免疫不全症の病態解析、簡易法を含む診断法の開発、新たな治療法の試みを行なうことができた。
制御システムのリスクベースデザイン

制御システムのリスクベースデザインに関して、基礎と応用の両面より研究を行った。逐次的ランダマイズドアルゴリズムについては、ロバスト凸最適化、ロバストBMI最適化、確率近似最適化などを対象に、リスク解析を行い、厳密な停止則を与えた。また、可変サンプリング周期をもつ制御システム設計に、ランダマイズドアルゴリズムが有用であることを明らかにした。さらに、ネットワーク上でのモデルベール制御を取り上げ、ネットワークを介したフードバック制御系の確率的安定性解析手法を検討した。本研究課題「制御システムのリスクベースデザイン」は、研究代表者らがこれまでに行ってきたランダマイズドアルゴリズムや確率的解析を制御システムの解析や設計に導入するというアプローチをさらに発展させ、リスクベースデザインという切り口で体系化することにより、システムやデータが内包する不確かさに伴うリスクを定量的に(確率的に厳密に)デザイン可能なシステム制御理論の構築を目指すものである。そのために、基礎と応用の両面から、研究を実施している。計画1年目にあたる平成26年度は、リスクベースデザインの基礎として、ランダマイズドアルゴリズムそれ自身の理論的拡充を目指し、逐次的ランダマイズドアルゴリズムのリスク解析について、研究成果をまとめた。ここでは、確率的解析中心に基づく切除平面法を取り上げ、指定された求解リスクと確率的解精度を達成する反復回数を明確化するとともに、多重切除アルゴリズムの有効性を示した。一方、リスクベースデザインの応用としては、制御システム設計への確率的手法の新たな適用先として、可変サンプリング周期をもつ制御系の設計を取り上げ、研究を進めた。そこでは、サンプリング周期が時々刻々変化するような状況のもとで、H∞ノルムやH2ノルムに従って指定された制御性能を達成し続けるような制御系の設計に、ランダマイズドアルゴリズムが有用であることを明らかにした。これらの成果は、雑誌論文および学会発表として研究発表している。計画2年目にあたる平成27年度は、リスクベースデザインの基礎として、ランダマイズドアルゴリズムそれ自身の理論的拡充を目指し、逐次的ランダマイズドアルゴリズムのリスク解析について、さらなる研究成果をまとめた。ここでは、確率近似法を取り上げ、指定された求解リスクと確率的解精度を達成する反復回数を明確化するとともに、逐次的ランダマイズドアルゴリズムがロバスト凸最適化に有用であることを示した。一方、リスクベースデザインの応用としては、制御システム設計への確率的手法の新たな適用先として、センサネットワークを取り上げた。そこでは、分散状態監視アルゴリズムの確率的性能解析を行い、コミュニケーションゲインの設計法を検討した。また、可変サンプリング周期をもつ制御系についても、ランダマイズドアルゴリズムを用いる設計法の研究を進めた。リスクベースデザインの基礎について、複数の研究成果を論文発表している。また、リスクベースデザインの応用について、研究成果を論文発表するとともに、萌芽的な研究成果を得て学会発表を実施している。以上より、現在までの達成度はおおむね順調であると考える。計画3年目にあたる平成28年度は最終年度であり、これまでの研究成果をまとめることに注力するとともに、今後の展開につながる新たなアイデアの発掘を行った。まず、リスクベースデザインの基礎として、ロバスト最適化のためのランダマイズドアルゴリズムについて研究成果をまとめた。ここではロバストBMI最適化を対象に、求解リスクが明確なアルゴリズムを構築した。また、逐次的ランダマイズドアルゴリズムのリスク解析として、確率最適化を取り上げ、指定された求解リスクと確率的解精度を達成する反復回数を導出し、研究を完成させた。一方、リスクベースデザインの応用としては、データベース制御に関する研究を進めた。ここでは、デュアルレートシステムに対するデータ駆動型追従制御アルゴリズムを構築するとともに、データに基づいて導出されたモデルの信頼性解析について、基礎的考察を行った。また、制御システム設計への確率的手法の新たな適用先として、ネットワーク上でのモデルベース制御を取り上げ、ネットワークを介したフィードバック制御系の確率的安定性解析を行い、安定化制御則の設計法を検討した。さらに、可変サンプリング周期をもつ制御系について、これまで実施してきたランダマイズドアルゴリズムを用いる設計法の研究を完成させた。

さらに、ネットワーク上でのモデルベール制御を取り上げ、ネットワークを介したフードバック制御系の確率的安定性解析手法を検討した。リスクベースデザインの基礎について、一つ目の研究成果を雑誌論文としてまとめている。また、リスクベースデザインの応用について、萌芽的な研究成果を得て学会発表を二度実施している。以上より、現在までの達成度はおおむね順調であると考える。最終年度となる計画3年目も,制御システムのリスクベースデザインについて、基礎と応用の両面から研究を進める。特に、基礎については、計画2年目に研究成果を論文発表した逐次的ランダマイズドアルゴリズムのリスク解析を精密化するとともに、他の枠組みも含め、さらに体系化を進める。また、応用については、計画2年目に萌芽的な研究成果が得られた分散状態監視アルゴリズムの確率的性能解析について研究を進めるとともに、他の設定についても検討を進める。工学計画2年目も,制御システムのリスクベースデザインについて、基礎と応用の両面から研究を進める。特に、基礎については、計画1年目に研究成果をまとめた逐次的ランダマイズドアルゴリズムのリスク解析を精密化するとともに、ロバスト最適化と平均最適化を統合する枠組みについて、検討を進める。また、応用については、計画1年目に萌芽的な研究成果が得られた可変サンプリング周期をもつ制御系の設計のためのランダマイズドアルゴリズムについて研究を進めるとともに、他の設定についても検討を続ける。研究を実施しながら必要に応じて研究費を逐次執行したため、当初の見込額と執行額に若干のずれが生じた。全体としての研究計画に基本的な変更点はなく、これまでの研究費も含め、全体として当初予定通りとなるよう計画を進めて行く。全体としての研究計画に基本的な変更点はなく、前年度の研究費も含め、全体として当初予定通りとなるよう計画を進めて行く。
膵島機能に関連するマイクロ分子の同定と機能解析

本研究にはヒトおよびラットのEST(expressed sequence tag)データを供した。先ず解析対象として、ヒト4,481種類、ラット3,403種類の未知のESTを用いてそれぞれの生物種のゲノムに対して相同性検索し、相同率90%以上である配列のゲノム上の位置を特定した後、5'側のゲノム位置から転写方向側の上流2kbを含む配列を取得した。そして既知miRNAデータベース(miRNA DB)(ヒト474種類、ラット234種類)や予測miRNA DB(ヒト743種類、ラット236種類)に対して相同性探索施行した。その結果、既知のmiRNA DBからヒト3種類、ラット3種類、予測miRNA DBからヒト15種類、ラット1種類を獲得した。次に既知のヒト3,134種類、ラット3,950種類のESTを用いてそれぞれのゲノム位置をUCSCのデータベースから取得後、上記と同様の既知および予測miRNA DBに対して探索を行った。その結果、既知のmiRNA DBからヒト54種類、ラット8種類、予測miRNA DBからヒト112種類、ラット17種類を獲得した。in silicoで同定されたmiRNAのうち、ヒト57種類、ラット10種類が実際に発現しているか各種臓器でTaqmanシステムを用いて定量したところ、ヒトで15種類、ラットで4種類のものの発現が確認された。そのうちhsa-mir-7-1は膵島と下垂体のみで発現が認められており興味深い。既に同発現ベクターを作成しインスリン分泌産生株で発現させることに成功した。現在、種々のブドウ糖濃度におけるインスリン分泌への影響を検定しているところであり、miRNAの新たな役割が開発される可能性がある。先ず膵島ESTを探索ソースとし、相当するヒト4,481遺伝子、ラット3,403遺伝子を対象とした。EST配列をそれぞれの生物種のゲノムに対して相同性検索し、相同率90%以上である配列のゲノム上の位置を特定する。平行して視床下部ESTについても同様の作業を行う予定である。5'側のゲノム位置から転写方向の上流2 kbを含む配列を取得した。5 base毎に設定した110 base連続配列に対して二次構造解析を行ない、最も自由エネルギーの低い配列を選択する。以下の3つの条件をもってmiRNAと判断した。1)hairpin構造をとること、2)16base以上の塩基対をつくること、3)大きなインターナルループやバルジがないことの3条件である。検出作業の結果、既知のmiRNAについてヒト474種類、ラット234種類を獲得した。次いで予測miRNAとして、ヒト743種類、ラット236種類の候補を獲得した。この内、当該年度ではヒト15種類とラット1種類について確認作業を行った。新たな候補の選別と共に、これらのマイクロ分子によるインスリン分泌の制御効果の解析に着手した。
新規薬物送達法に関する研究 : 毛嚢を用いる薬物送達

薬物の全身送達を目的とする経皮吸収剤が多数開発されている。しかしヒト皮膚の薬物透過は一般に低いため、経皮吸収に利用できる薬物は限られている。皮膚の毛嚢、皮脂腺などは薬物の初期透過に対し大きな役割を果たすことが知られている。このような観点から、経皮吸収改善を目的として、毛嚢の多い頭皮からの薬物吸収とその製剤化の可能性について検討した。脂溶性と水溶性薬物のヒト頭皮in vitro透過をヒト腹部皮膚からのそれと比較した。脂溶性のメラトニン(MT)、ケトプロフェン(KP)の頭皮を経る透過は、腹部皮膚からのそれより有意に大きく、透過速度(Js)、透過係数(Kp)は腹部皮膚の2-30倍であった。水溶性のフルオロウラシル(5-FU)、アシクロビル(ACV)も頭皮を速やかに透過した。5-FUの頭皮のJsは腹部皮膚の10-120倍であった。上記薬物の頭皮透過のパラメータは用いた頭皮によって大きな変動が認められた。頭皮透過ではJs等に大きな差がみられたので、その理由を知るため、MTとACVについて毛嚢数とJsとの相関関係を調べたところ、両者の間に有意な相関(MT, r=0.651;ACV, r=0.850,P<0.05)が認められた。二三の吸収促進剤(イソプロピルミリステート、N-メチルピロリドン)の促進効果についても検討した。これら吸収促進剤は、頭皮透過を若干高めたが、促進効果は比較的小さかった。頭皮の透過ルートを蛍光物質を用いて調べたところ、適用3h後に色素は毛嚢内に浸透すること、また水溶性の蛍光色素は毛嚢から真皮に迅速に拡散することを認めたので、上記薬物は毛嚢ルートを経て吸収されることが証明された。以上の結果、薬物の頭皮透過速度は腹部皮膚より有意に大きく、特に水溶性薬物の頭皮吸収は著しく大きいので、頭皮を用いる薬物送達は、経皮吸収されにくい水溶性薬物に適する投与ルートと判断される。ドラッグデリバリーシステムの一分野である経皮吸収製剤は多くの利点を有するので、薬物治療に用いられているが、経皮吸収量が少ないことからそれに適用できる薬物は限られている。薬物は毛嚢を速やかに透過できるので、頭皮を吸収経路として利用すれば、かなりの量の薬物を経皮吸収させることが可能となり、新しい投与ルートとして期待できる。この観点からヒト頭皮吸収をin vitroで検討した。初めに松果体ホルモン、メラトニンの頭皮吸収を調べた。また頭皮とヒト腹部皮膚の透過の比較も行った。メラトニン3%含有のエタノール/プロピレングリコール混液(Rp.1)とそれにd-リモネンを4%添加した(Rp.2)両液からのメラトニンの頭皮吸収を測定した。Rp.1のメラト二ンはヒト頭皮がら比較的速やかに(lag timeは5-8h、ヒト腹部皮膚透過のlag timeは24-30h)吸収された。頭皮吸収はヒト腹部皮膚からの透過より速く、透過速度(Js)は腹部皮膚のそれの1.6-15倍であったが、用いた頭皮によって透過速度に大きな差が認められた。吸収促進剤のd-リモネシを配合するとJsは2倍以上に増加した。

上述のようにヒト頭皮の透過速度は用いた頭皮の間でかなり変動が見られたので、その原因を知るため、毛嚢数を測定したところ、Jsと毛嚢数の間に良好な相関(r=0.82)が認められた。従って毛嚢数の少ないヒト頭皮では吸収される量が少なくなると判断される。現在5-フルオロウラシルの頭皮吸収を測定しているが、メラトニンと同様に頭皮から吸収されることを確認している。今後の計画として、リポソーム化した薬物(生理活性ペプチドを含む)について頭皮吸収をヒト皮膚と比較する。また毛嚢内薬物透過とその量を蛍光顕微鏡を用いて観察する。さらに薬物透過と基剤の関係についても検討する。