hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
実用的な多機能型筋電義手制御システムの開発

本研究は,前腕部筋電位によるロバスト動作認識に基づく筋電義手制御システムの開発を目的として実施し,主に前腕部動作識別法,義手制御法,筋電操作訓練法の開発を具体的課題として挙げた。動作識別法については,ダミー変数型特徴量や腕姿勢変動モデルを導入した手法を提案し,90%以上の高精度識別を実現した。義手制御については,主に物体の把持・移動動作に注目し,その作業効率を効率化するための義手速度設計,LEDによる把持力の視覚フィードバック,一連の作業訓練方法等を検討し,タイムトライアル実験により有効性を示した。切断者による評価実験は今後の課題としたが,研究期間全体として目標の90%程度を達成した。本研究は前腕部筋電位信号によるロバスト動作認識に基づく筋電義手制御システムの開発を目的としている。研究期間は3年であり平成25年度はその1年目となる。3年間の研究期間全体として,1最適測定位置推定法の開発,2前腕部動作のロバスト識別法の開発,3筋電操作の訓練支援法の開発,4筋電義手制御法の開発と実験,5被験者実地評価を具体的課題として挙げており,25年度は1と2について取り組んだ。1は前腕切断者の残存筋の状況により異なる最適電極位置を推定する手法の開発であり,コスト面の優位性やユーザごとのきめ細かい支援も期待できる。前年度までの研究成果であった統計的な電極選択手法の再検討,また電極位置の全ての組合せについて認識率を算出するなどの検証などを行い被験者ごとに異なる最適位置を発見した。いずれの被験者も3個程度の電極で90%程度の認識率が得られた。2についてはダミー変数を用いた特徴量生成法の開発と,肩・肘の姿勢角度変化対応型動作認識手法の開発を行った。前者については1で選択された3つの電極から得られた筋電位の実効値に対し,互いに誤認識しやすい何組かの動作対に注目し,それぞれに対し特徴量間の距離が広がるようなダミー変数を追加した特徴量を生成し,認識精度向上を実現した。後者については,肩と肘をそれぞれ0,30,60,90度と変化させた16通りの姿勢における筋電位を解析し,姿勢変動により筋電位が変化することを確認した。その上でこれらを線形補間することにより任意の姿勢角度における学習データを仮想的に作成する手法を案した。肩と肘にそれぞれセンサを装着し姿勢角度を読み取り仮想学習データを参照することで,90%程度の高い認識率を維持することが可能となった。このように3年計画の1年目は,少数電極の筋電位信号から計算量の少ない簡潔な識別法を用いて高精度な動作認識を実現するというほぼ当初計画どおりの成果を得た。研究期間は3年であり平成26年度はその2年目となる。3年間の研究期間全体として,1最適測定位置推定法の開発,2前腕部動作のロバスト識別法の開発,3筋電操作の訓練支援法の開発,4筋電義手制御法の開発と実験,5被験者実地評価を具体的課題として挙げており,平成26年度は主に2,3,4について取り組んだ。2については肩・肘の姿勢角度変化対応型動作認識手法の開発を行った。肘を0度から90度へ連続的に変化させた際の筋電位を解析し,姿勢変動により筋電位が変化することを確認した。これらを基にファジィ推論を応用した識別法を構築し,測定した任意の姿勢角度において動作識別を可能にする手法を提案した。これまでの基礎的検証では90%程度の高い認識率を実現できた。3については,LabVIEWを利用し,被験者の筋電情報や動作認識結果をリアルタイムに画面上に提示し視覚フィードバックによる操作訓練を行うシステムを構築した。被験者はまだ少ないものの,数日単位の操作訓練により動作認識率が向上することを確認できた。4については,平成26年度までに購入した義手装置とコントローラ等を元に全体の制御システムを構築し,制御プログラムの開発,基礎的な動作実験などを行えた。このように3年計画の2年目は,姿勢変動を含む実地環境における高精度な動作認識を実現し,さらに筋電操作の基本的な訓練システムの開発,義手制御システムの開発という最終研究年度につながる,ほぼ計画どおりの成果を得た。本研究は研究期間3年の最終年として,前腕部筋電位信号によるロバスト動作認識に基づく筋電義手制御システムの開発を目的として実施した。研究期間全体として,1最適測定位置推定法の開発,2前腕部動作のロバスト識別法の開発,3筋電操作の訓練支援法の開発,4筋電義手制御法の開発と実験,5被験者実地評価を具体的課題として挙げており,本年度は25について取り組んだ。2については前年度からさらに改善と検討を繰り返し,腕姿勢変化を伴う小量の学習データを近似モデル化することで任意の腕姿勢に対応可能なファジィ推論型動作識別手法を提案し,高い認識精度が得られることを実証した。3についてはPC画面を通した視覚フィードバック訓練に加えて,義手装置自体を介しリアルタイムに動作を視認しながら筋電操作を訓練する方法を検討した。4については8種の手先動作をリアルタイム制御するシステム全体を製作・構築し,筋電義手制御の様々な実験を行った。

今回は主に物体を把持して運ぶ動作を対象とし,そのような作業を効率化するための義手動作速度の設計,センサによる把持力測定とLEDによる使用者への視覚フィードバック,作業訓練方法などを検討・実現し,例えば物体3個を順に移動させる作業のタイムトライアル実験により有効性を示した。5についてはそのような実験を,健常者ではあるが筋電操作の習熟度が異なる被験者を用意し行うことができた。実際の切断者による実験は今後の課題となった。研究期間全体を通して,ロバストな動作認識に基づく筋電義手制御システムの開発,およびいくつかの具体的作業による評価実験などを一通り実施し,当初目標としていた15の目標を90%程度達成することができた。動作認識手法や操作訓練方法のさらなる検討,様々な日常生活動作を想定した制御方策の検討,実際の切断者による実地評価は今後行っていきたいと考えている。本研究は,前腕部筋電位によるロバスト動作認識に基づく筋電義手制御システムの開発を目的として実施し,主に前腕部動作識別法,義手制御法,筋電操作訓練法の開発を具体的課題として挙げた。動作識別法については,ダミー変数型特徴量や腕姿勢変動モデルを導入した手法を提案し,90%以上の高精度識別を実現した。義手制御については,主に物体の把持・移動動作に注目し,その作業効率を効率化するための義手速度設計,LEDによる把持力の視覚フィードバック,一連の作業訓練方法等を検討し,タイムトライアル実験により有効性を示した。切断者による評価実験は今後の課題としたが,研究期間全体として目標の90%程度を達成した。本研究は3年間の実施期間を設けており,平成26年度はその2年目にあたる。平成26年度における研究計画について,当初の予定では,2前腕部動作のロバスト認識手法の開発,3筋電操作の訓練支援法の開発,4筋電義手制御法の開発と実験の三つを設定していた。2については前年度から検討していた姿勢変動に対応した動作認識手法の開発を目指し,肘角度が0度から90度へ連続的に変化する際の筋電データを基にファジィ推論を応用して動作識別を行う手法を提案し,90%を超える高精度な認識を実現した。被験者を増やしての検証やファジィ設計の改善などを行う余地は残るが,2に関しては90%程度,当初の計画を遂行できたと言える。3については,被験者の筋電情報や動作認識結果をリアルタイムに画面上に提示し視覚フィードバックによる操作訓練を行うシステムを構築でき,数日単位の訓練により動作認識率が向上することを確認できた。被験者を増やし,提示情報もさらなる検討を行う必要があるが,50%程度遂行できたと言える。4については,義手制御システム全体を構築し基礎的な動作実験などを行える段階に至り,今後様々な制御手法を組み込んでいくことになり,50%程度遂行できたと言える。これらを総合して研究達成度は80%程度であり,「おおむね順調に進展している」と判断した。システム制御工学今後は平成27年度の1年間を研究期間として残しており,平成25,26年度までの成果を基とし、2前腕部動作のロバスト識別法の開発に関する最終検討,3筋電操作の訓練支援法のさらなる検討,4筋電義手制御法の開発と実験,5被験者実地評価,を実施していく。2については現在開発中の姿勢変動対応のためのファジィ推論型動作識別法について,肩の姿勢角度変化やファジィ設計の細部も含めた最終検討を行う。3については,ディスプレイ上に筋電位波形やその目標値,識別結果などを提示し,被験者がそれを見ながら操作を繰り返すという視覚フィードバックにより訓練を行う基本的システムは構築できた。
災害研究に基づいた生活環境特性と地域力を考慮した新しい地域完結型生活支援システム

本研究は、自然災害被災地高齢者が生活機能の低下や認知症があっても、地域完結型暮らしの実現ができるよう、地域完結型高齢者自立生活支援システムの提案を目的としている。30年度は、昨年度に引き続き「高齢者の地域完結型暮らしの実現に向けた生活環境」の枠組みに基づき、過疎モデル(京都府福知山市)、復興中期モデル(宮城県気仙沼市・岩手県陸前高田市)地域において、支援者を対象としたインタビュー調査・地区踏査等フィールドワークを実施した。過疎モデルでは、エンゲストロームの活動理論を用いて、研究協力者とともに「地域完結型高齢者自立生活支援システム」の草案を作成した。これに基づき、日中韓看護学会およびEAFONSでポスター発表を行い、参加者とのディスカッションをパブリックコメントとし、さらに研究班で議論を行う予定である。復興中期モデルでは、震災から8年を経て、生活環境は災害公営住宅や高台移転地での自宅再建と新たな段階へと移ってきている。高齢者は、震災時より歳を重ねてきており、地域の高齢化率はさらに高くなり、35%前後になってきている。災害公営住宅では、入居者の高齢化が進み、40%を超えるところも珍しくない状況である。今年度は、高齢者の健康課題、支援者がみた生活環境の変化に伴う高齢者支援の課題が浮き彫りになったが、陸前高田市で進む高齢者支援に向けた関連職種連携ネットワークのあり方が、この地域の特性を反映した「地域完結型高齢者自立支援システム」を考えるにあたりコアとなるのではないかと考える。これについては、次年度の課題としたい。本研究は、2012年度2014年度に実施した基盤C(245009139)の成果を継承し、発展させる形で、研究活動を行っている。2018年度は、昨年度に引き続き都会モデル(兵庫県尼崎市)で研究会を1回、過疎モデル(京都府福知山市)でフォーカスグループインタビューを1回実施し、作成した「地域完結型高齢者自立生活支援モデル」案について、検討を行った。復興中期モデル(岩手県陸前高田市、宮城県気仙沼市)では、先の科研以降、定点協力者に対して、被災後8回目のインタビュー調査を実施し、時間経過とともに変化する高齢者の健康と生活の現状と課題について整理した。これらの結果については、国内学会で4題、国際学会で4題発表することができ、会場で参加者とディスカッションすることができた。以上より、概ね順調に進展していると判断した。今年度は、案の作成を行った「地域完結型高齢者自立生活支援モデル」について、さらに精査し、学会発表および論文投稿を行っていく。それとともに、過疎モデル・復興中期モデル地域において、研究協力者との議論を重ね、さらにパブリックコメントを取りながら、「地域完結型高齢者自立生活支援モデル」の提言を行っていく予定である。本研究では、被災地高齢者が生活機能の低下や認知症があっても地域完結型暮らしを実現できるよう、地域完結型自立生活支援システムの提案を目的としている。28年度は、まず研究班会議を年度当初に4回開催し、研究者間でこれまでの研究成果に基づき、「高齢者の地域完結型暮らし実現に向けた生活環境」について検討し、枠組みを整理した。調査計画を決定し、所属機関の倫理審査を受け、承認された。それに基づき、過疎モデルとなる京都府福知山市において、高齢者福祉施設管理者・職員、隣接自治会長とともに2回のブレーンストーミングを行い、あるべき姿の確認と現状および課題を整理した。ここでは、自治会の高齢化率が高くなる中で、自治会が独自に高齢者が扱いやすい道具類を配備したり、顔の見える関係づくりのために公共料金の集金や日用品の販売等を行なっていた。さらに高齢者福祉施設と協働し、避難訓練やイベントを行ない、関係性を深めていた事が特徴的であった。復興中期モデルとなる宮城県気仙沼市、岩手県陸前高田市において、復興を進める行政担当職員、流失した施設を高台移転し再建したグループホーム職員、被災者支援にあたってきた高齢者福祉サービスを複合的に展開する施設職員、復興住宅LSAおよび自治会長にインタビューまたはグループフォーカスインタビューを実施した。震災から6年が経ち、住民の多くは復興住宅に転居していたが、未だ仮設住宅に残る人もあり、高齢者が抱える経済事情が浮き彫りになった。盛土による街の変化によりふるさと喪失感を高めていた高齢者もいた。都市モデルについては、兵庫県尼崎市において保健医療福祉専門職と開いている勉強会で、研究者間で話し合い整理した概念枠組みに基づき、現状と課題を整理して行く予定である。さらに、28年度活動成果については、29年8月に開催される日本災害看護学会(鳥取県倉吉市)にて、4題報告の予定である。本研究は、科研基盤C 24500913「災害復興に挑む過疎地域の高齢者の主体的な生の全うを支援する生活環境モデルの構築」(野呂・日比野・中村・城,2012年度2014年度)の成果を継続し発展させる形で、研究活動を行っている。そのため、研究者間の信頼関係は厚く、体制が整っていた。また、研究フィールドについても信頼関係ができており、順調に調査活動を進める事ができている。都市モデルの基盤となる尼崎市の保健医療福祉専門職で開催している勉強会であるが、研究代表者が2年間参加している会であり、研究趣旨を説明したところ、今後協働で地域の高齢者の課題解決に向けて取組むことおよび研究協力についての快諾を得ている。本研究は,被災地高齢者が生活機能の低下や認知症があっても地域完結型暮らしを実現できるよう,地域完結型自立生活支援システムの提案を目的としている。

29年度は,昨年度研究班で整理した「高齢者の地域完結型暮らしの実現に向けた生活環境」について枠組みに基づき,都市モデル(兵庫県尼崎市),過疎モデル(京都府福知山市),復興中期モデル(宮城県気仙沼市・岩手県陸前高田市)地域において,支援者を対象としたインタビュー調査・地区踏査等フィールドワークを実施した。都市モデルでは,保健・福祉専門職と月1回勉強会を開催し,地域の高齢者の現状や,全国の被災地で起こったことをもとに被災時に予測される事態について先進事例の状況を参考にしながら整理した。独居高齢者で低所得者が多く居住する地域の特性から,生活上の課題を洗い出し,生活支援の在り方について日常の支援の現状から検討を行った。過疎モデルでは,2017年8月に昨年度同様ブレーンストーミングを行い,ひとり完結ではなく地域完結の考え方のもと,対象地域に居住する高齢者の買い物の利便性を図るため,長年誘致してきたスーパーの移動販売が,自治会と高齢者施設の協働により実現した。買い物拠点まで住民が外出することは,交流を生み,自ら買い物することも生きがいになること,また支援が必要な人には共助が自然に働くことが地域完結型のメリットとして整理できた。復興中期モデルでは,震災から7年がたち,住民の災害公営住宅への転居も進んでいる。慣れない集合住宅の生活に戸惑う高齢者像が浮き彫りになり,またうつ傾向や引きこもりの問題も顕在化してきた。福祉施設の人材不足も深刻化しており,そのことが高齢者支援にも影響してきている実態が把握できた。専門職からは,地域の強みをいかした支援の在り方検討が提案された。29年度には,日本災害看護学会において28年度実績を中心に4報発表した。本研究は,2012年度2014年度に実施した基盤C(24500913)の成果を継続し発展させる形で,研究活動を行っている。そのため,研究班の教員間の信頼関係は厚く,一堂に会しての研究班会議だけでなく,必要時メール会議または電話でのディスカッションを行いながら,合意形成を図ったうえで調査活動を続けている。また,フィールドとの信頼関係もすでに築いてきており,インタビューやディスカッションを円滑進める基盤が確立してきている。現在,インタビューではカードを用いて可視化しながら進めているが,その手法により参加者は自らが課題を整理しながら,次の目標を明確にしているといえる。本研究は、自然災害被災地高齢者が生活機能の低下や認知症があっても、地域完結型暮らしの実現ができるよう、地域完結型高齢者自立生活支援システムの提案を目的としている。30年度は、昨年度に引き続き「高齢者の地域完結型暮らしの実現に向けた生活環境」の枠組みに基づき、過疎モデル(京都府福知山市)、復興中期モデル(宮城県気仙沼市・岩手県陸前高田市)地域において、支援者を対象としたインタビュー調査・地区踏査等フィールドワークを実施した。過疎モデルでは、エンゲストロームの活動理論を用いて、研究協力者とともに「地域完結型高齢者自立生活支援システム」の草案を作成した。これに基づき、日中韓看護学会およびEAFONSでポスター発表を行い、参加者とのディスカッションをパブリックコメントとし、さらに研究班で議論を行う予定である。
ヒト由来ニューロンの非侵襲シナプス機能計測技術の開発とその薬効評価応用

これまで平面微小電極アレイ(MEA)計測法を用いて、ヒトiPS細胞由来ニューロンからの活動電位を細胞外で記録し、薬剤応答の検出等を行ってきた。このMEA計測法を用いて、プレシナプス機能である神経伝達物質の放出やポストシナプス機能であるシナプス電流の情報も同時計測できれば、ヒト疾患ニューロンの機能評価や薬効評価の精度向上につながる計測技術となる。本年度は、カーボンナノチューブ平面微小電極アレイを用いたヒトiPS細胞由来ドーパミンニューロンからの活動電位とドーパミン放出の同時計測を試みた。神経ネットワークの同期的活動に伴うドーパミン放出が電気化学計測法により検出され、細胞外電位波形からスパイク成分が検出された。また、250Hz以下の低周波数に着目し、同期バースト発火の周波数解析を実施したところ、GABA受容体の阻害剤投与により、β波やHigh-γ波が増強される結果が得られ、低周波成分にシナプス後電流の成分が反映されている可能性が示唆された。ヒトiPS細胞由来ニューロンを用いたカーボンナノチューブMEA計測は、活動電位、プレシナプス機能、ポストシナプス機能を同時に評価できる可能性がある。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。このMEA計測法を用いて、神経ネットワークの情報伝達場であるシナプス部位で放出される神経伝達物質をリアルタイム計測できれば、神経伝達物質の放出異常で起こる統合失調症などのヒト神経疾患の解析や神経伝達物質の放出量を指標とした新しい薬効評価系の創出につながる。そこで本年度は、ヒトiPS細胞由来ニューロンを用いた薬効評価系の構築に関する研究を実施した。具体的には1神経伝達物質の非侵襲リアルタイム計測技術に関する開発、2シナプス後電位計測のための3次元培養技術の開発、3活動電位を指標としたシナプス関連薬剤に対する応答計測に関する研究を行った。神経伝達物質の非侵襲リアルタイム計測技術に関しては、カーボンナノチューブ(CNT)微小電極を作製し、10nMのドーパミンに対して、電気化学計測できることを明らかとした。シナプス後電位計測技術の開発においては、温度感受性基板を用いた3次元神経細胞シート化技術を開発した。剥離した3次元神経シートを平面微小電極アレイにのせたところ、ゆったりとしたシナプス後電位(脳スライスで見られる集合シナプス後電位)様の波形が見られた。しかしながら、この波形がシナプス電位由来のものであるかは不明であり、同定は今後の課題となった。活動電位を指標としたシナプス関連薬剤に対する応答計測に関する研究については、痙攣誘発剤によるてんかん様発火の検出と抗てんかん薬による作用を見出した。また、末梢神経系であるヒトiPS細胞由来感覚ニューロンにおける培養プロコトルの確立および平面微小電極アレイを用いた痛み応答の検出に成功した。ヒトiPS細胞由来ニューロンの非侵襲シナプス機能計測技術の開発とその薬効評価応用において、本年度は、1神経伝達物質の非侵襲リアルタイム計測技術に関する開発、2シナプス後電位計測のための3次元培養技術の開発、3活動電位を指標としたシナプス関連薬剤に対する応答計測に関する研究を行った。12はおおむね順調に進展しており、3は当初の計画以上に進展している。ヒトiPS細胞由来ニューロンの非侵襲シナプス機能計測技術の開発とその薬効評価応用において、本年度は、神経伝達物質の非侵襲リアルタイム計測技術に関する開発と活動電位を指標としたシナプス関連薬剤に対する応答計測に関する研究を中心に進めた。平面微小電極アレイ(MEA)計測法は電極上に培養した神経ネットワークから発生する活動電位を細胞外で記録する手法であるが、神経ネットワークのシナプス部位で放出される神経伝達物質をリアルタイム計測できれば、神経伝達物質の放出異常で起こる統合失調症などのヒト神経疾患の解析や神経伝達物質の放出量を指標とした新しい薬効評価系の創出につながる。昨年度は、電気化学反応による神経伝達物質計測を可能とするカーボンナノチューブ(CNT)を電極材料とした平面微小電極アレイチップの開発を行った。今年度は、作製条件を更に検討し、ドーパミンの濃度を数nMレベルで定量的に検出できる高感度MEAチップの開発に成功した。作製したCNT-MEAチップ上に、ヒトiPS細胞由来ドーパミンニューロンを培養したところ、長期間の培養を確認し、自発活動において、ドーパミンニューロンから放出されるドーパミンを電気化学的にリアルタイム計測することに成功した。活動電位を指標とした薬効評価系の構築に関しては、ヒトiPS細胞由来中枢ニューロンを用いて各種シナプスのアゴニスト、アンタゴニストの投与法と計測時間等のプロコトルを構築し、濃度依存的な活動変化を検出した。また、末梢神経系であるヒトiPS細胞由来感覚ニューロンを用いて、各種痛み分子に反応するTRIPチャネル依存的な誘発応答を検出すると共に、抗癌剤であるオキサリプラチン、ビンクリスチンに対する応答性、および抗がん剤(オキサリプラチン)投与による冷過敏応答などの検出に成功した。これらの成果により、第44回日本毒性学会で優秀研究発表賞を受賞した。本年度の目的であったカーボンナノチューブ微小電極アレイ上に培養したヒトiPS細胞由来ドーパミンニューロンから、ドーパミン放出の検出に成功したこと、および活動電位を指標とした各種シナプス関連薬剤の応答をヒトiPS細胞由来中枢ニューロンから検出することができた。また、ヒトiPS細胞由来感覚ニューロンから各種TRIPチャンネル依存的な痛み応答の検出および抗がん剤に対する応答を検出できたことからも、本研究は、順調に進展していると言える。

これまで平面微小電極アレイ(MEA)計測法を用いて、ヒトiPS細胞由来ニューロンからの活動電位を細胞外で記録し、薬剤応答の検出等を行ってきた。このMEA計測法を用いて、プレシナプス機能である神経伝達物質の放出やポストシナプス機能であるシナプス電流の情報も同時計測できれば、ヒト疾患ニューロンの機能評価や薬効評価の精度向上につながる計測技術となる。本年度は、カーボンナノチューブ平面微小電極アレイを用いたヒトiPS細胞由来ドーパミンニューロンからの活動電位とドーパミン放出の同時計測を試みた。神経ネットワークの同期的活動に伴うドーパミン放出が電気化学計測法により検出され、細胞外電位波形からスパイク成分が検出された。また、250Hz以下の低周波数に着目し、同期バースト発火の周波数解析を実施したところ、GABA受容体の阻害剤投与により、β波やHigh-γ波が増強される結果が得られ、低周波成分にシナプス後電流の成分が反映されている可能性が示唆された。ヒトiPS細胞由来ニューロンを用いたカーボンナノチューブMEA計測は、活動電位、プレシナプス機能、ポストシナプス機能を同時に評価できる可能性がある。1年目に開発したカーボンナノチューブ微小多電極アレイ上に各種ヒトiPS細胞由来ニューロンを培養し、細胞から放出される神経伝達物質のリアルタイム計測、および薬剤投与による変化の抽出を行い、神経伝達物質放出量の定量解析法を検討する。本年度得られたカーボンナノチューブ平面微小電極アレイによるドーパミン計測技術を用いた薬剤応答の検出、活動電位を指標としたシナプス関連薬剤応答の解析法の検討、ポストシナプス後電流の計測および解析法を検討する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
小児の肺動脈性肺高血圧症における新規原因遺伝子の探索と同定

小児肺動脈性肺高血圧症を対象に、新規病原遺伝子の探索を行った。以前報告したsmad8の変異は患者数を増やしたが、やはり1例でしか検出できなかった。smad8変異の頻度はBMPR2やALK1と比較すると非常に低いものと考えられた。さらに、smad遺伝子について1から5まで解析の幅を広げたものの、これまでに変異を検出できなかった。そこで、HIVEP1について変異を検討全症例に対して解析を行い、2人の患者において、HIVEP1の変異を検出した。この変異の病原性を確認するため、機能解析を行ったが、ウェスタンブロット法とルシフェラーゼアッセイで検出された変異の病原性を証明することはできなかった。小児PAH(65例)を対象に、BMPR2、ALK1、SMAD遺伝子の異常の有無を直接シークエンス法及びMLPA法で解析した。直接シークエンス法で検出できていなかったBMPR2の遺伝子変異が2家系で確認できた。SMAD8については以前に1例報告済みであったが、その後症例を増やして検討しても新たな変異は発見できなかった。また、smad1,2,3,4,5についても変異はみられなかった。我々が検出したSMAD8のナンセンス変異は、その機能解析によりTGF-β/BMPシグナル伝達において機能低下型の異常を引き起こすことを明らかになっている。さらにその後、米国の研究グループがSmad8ノックアウトマウスではPAHの特徴的病変を持つ肺血管の異常が生じることを報告したことにより、SMAD8遺伝子がBMPR2、ALK遺伝子に次ぐ3番目のPAHの疾患遺伝子あることが強く支持された。しかし、その頻度はBMPR2やALK1と比較すると非常に低いものと考えられた。しかし、これらの事実は、BMPR2、ALK遺伝子異常を認めない小児PAHの少数例ではBMP/ TGF-βシグナル伝達に関与する他の遺伝子の異常が関与していることを強く示唆している。すなわち、既知の疾患遺伝子の異常が認められていないPAH症例で未だ探索、同定していない遺伝子の異常が小児PAHの発症に関与している可能性が高いと考えるのが妥当である。そこで、BMP/TGF-βシグナル伝達の中で、いまだ未検討のHIVEP1について変異を検討すべくそのプライマーを作成し、直接シークエンス法で解析を開始した。昨年につづき、さらに新たに採取した肺動脈性肺高血圧患者16名について、BMPR2、ALK1、SMAD遺伝子の異常の有無を直接シークエンス法及びMLPA法で解析した。今回もSMAD8については新たな変異は発見できなかった。我々が検出したSMAD8のナンセンス変異は、その機能解析によりTGF-β/BMPシグナル伝達において機能低下型の異常を引き起こすことを明らかになっているが、その頻度はBMPR2やALK1と比較すると、その他のSMAD系を含めてもあまり高くないと考えられた。そこで、さらに新たな遺伝子変異の検索として、BMPシグナル下流のHIVEP1およびHIVEP2について検索を開始した。当科に遺伝子が保存されている肺動脈性肺高血圧患者(81例)について、HIVEP1とHIVEP2についてそれぞれダイレクトシークエンス法を施行して、変異の有無を検索した。その結果、HIVEP2において2症例について変異を確認することが可能であった。認められた変異はいずれもエクソン5に存在するミスセンス変異であり、詳細は以下のとおりである。今後はこの変異の蛋白レベルでの機能解析を行って、病因遺伝子としての意義を検討する予定である。現在のところ、概ね予想される進行状況であり、来年度で初期の目的には到達可能であると考えられる。小児PAH(73例)を対象に、BMPR2、ALK1、SMAD遺伝子の異常の有無を直接シークエンス法及びMLPA法で解析した。smad8の変異は患者数を増やしたが、やはり1例でしか検出できなかった。したがって、われわれが以前報告したIPAHにおけるsmad8変異の頻度はBMPR2やALK1と比較すると非常に低いものと考えられた。さらに、われわれはsmad遺伝子について1から5まで解析の幅を広げたものの、これまでに変異を検出できなかった。そこで、BMP/TGF-βシグナル伝達の中で、いまだ未検討のHIVEP1について変異を検討すべくそのプライマーを作成し、直接シークエンス法で、全症例に対して解析を開始した。その結果2人の患者において、HIVEPの変異を確認することができた。HIVEP1 Exon9 c.7089 G>T Gln 2363 HisとHIVEP1 Exon5 c.6107 T>C Val 2036 Alaの2種類の変異が検出された。さらにこの変異の病原性を確認するため、蛋白質レベルでの機能解析を行った。以前smad8の機能解析を行ったときと同様の方法で、ウェスタンブロット法によりMyc-Smad8リン酸化をwild typeと比較した。また、ルシフェラーゼアッセイで転写活性の比較を行った。しかし、いずれも有意な差は認めることはできなかった。したがって、今回の研究では、検出された変異の病原性を蛋白質レベルで証明することはできなかった。

さらに、smad遺伝子について1から5まで解析の幅を広げたものの、これまでに変異を検出できなかった。そこで、HIVEP1について変異を検討全症例に対して解析を行い、2人の患者において、HIVEP1の変異を検出した。この変異の病原性を確認するため、機能解析を行ったが、ウェスタンブロット法とルシフェラーゼアッセイで検出された変異の病原性を証明することはできなかった。smad遺伝子は1から5までで今のところ変異を検出することができず、smad8についても1例のみのため、さらにBMPR/TGFBシグナル系の中で検討範囲をひろげて、次の候補遺伝子に向けて研究を進めている。目的の遺伝子変異が同定されたので、病因遺伝子としての意義を確立するために、蛋白質レベルでの機能解析をWestern blot法などを用いて行う予定である。循環器小児科学HIVEP1について、プライマーを作成し、直接シークエンスが可能なところまで来ているので、IPAH65例前例について、変異を検出すべくシークエンシングを継続する予定である。また、変異が検出されれば、機能研究まで年度内には進めていく。
より強い抗腫瘍活性を示すLAK細胞の誘導ならびに腎癌治療における臨床応用

進行腎癌に対しinterleukin-2(1L-2)併用を併った,lymphokine-activated killer(LAK)細胞による養子免疫療法をおこなっているが,まだ十分な効果とは言えない。残念ながら進行腎癌治療に広く使用されているinterferonを凌駕するには至っていない。本療法の効果を向上させるためには,より強い抗腫瘍活性を有するLAK細胞の誘導の必要性が痛感される。ところでT細胞抗原であるCD3に対する抗体であるanti-CD3が低濃度でT細胞を活性化することが知られている。本研究ではLAK細胞誘導時に低濃度のanti-CD3を同時添加し、腎癌由来細胞株OUR-10,OUR-20または患者自身の腫瘍細胞に対し1L-2単独添加時よりも強い抗腫瘍活性を有するようになるかを,dye uptake法によりin vitroで検討を加えた。腎癌患者から末梢血リンパ球を採取し,1L-2 anti-CD3あるいは両者で35日間培養したものをeffecterにした。anti-CD3のみで培養したリンパ球はanti-CD3の濃度にかかわらず殺細胞効果を認めることができなかった。1L-2とanti-CD3の両者で培養したものと1L-2単独で培養したものとを比較すると,ある細胞株に対しては1L-2単独時よりも強い殺細胞効果を示すようになるものもあるが,他の細胞株に対しては1L-2単独の殺細胞効果を減弱させるという逆の現象も観察された。また,自己腫瘍細胞に対しては,ある症例は1L-2単独よりも強い殺細胞効果がみられるが,他の症例ではむしろ減弱させるという細胞株をtargetにした時と同じ現象が認められた。症例によりarti-CD3の相加効果は異なるという結論に達した。現段階ではanti-CD3を腎癌患者に対する免疫療法の一つとして投与するには適応症例の選択が重要な課題であり,in vitroで確認した上で適応すべきであると考えられる。
アミノ酸を介した宿主‐病原体相互作用の解明

本研究はマラリアをモデルとし、宿主・病原体の双方に必須な栄養素の1つであるアミノ酸を中心とする、新規の宿主-病原体相互作用を解明しようとするものである。脳性マラリアのモデルマウスC57BL/6Jを用いたこれまでの解析から、イソロイシン欠損食のマラリア原虫感染前投与によりマウスの生存率が上昇することを明らかにしている。しかし、in vivoイメージングシステムを用いてマラリア原虫のマウス体内における局在を可視化したところ、通常食とイソロイシン欠損食それぞれを投与したマウス間で、脳におけるマラリア原虫集積量に有意な差は認められなかった。これらの結果から、マウスへのイソロイシン欠損食投与によって、マラリア原虫が存在するにも関わらず症状を発症しない状態、すなわち脳性マラリアトレランスが誘導されることを見い出した。本研究はこれまでの解析結果を踏まえ、脳性マラリアトレランス機構を明らかにすることを目的に以下の解析を実施した。興味深いことに、Evans blue法を用いた脳性マラリアの重症度解析において、通常食・イソロイシン欠損食投与群間で有意な差は認められなかった。しかし、脳のパラフィン包埋切片をHE染色した解析から、イソロイシン欠損食の投与は感染赤血球による脳血管の塞栓を予防することが示唆された。さらに核磁気共鳴画像法を用いた解析から、同食の投与により、嗅球におけるマラリア原虫感染赤血球の集積を起因とする炎症反応が抑制されることを明らかにした。以上の結果から、イソロイシン欠損食の投与による脳性マラリアトレランス能の付与について、アミノ酸を介する新規の宿主-病原体相互作用の関与が示唆された。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。本研究はマラリア原虫をモデルとし、宿主・病原体の双方に必須の栄養素の1つであるアミノ酸を中心とする、新規の宿主-病原体相互作用を解明しようとするものである。脳性マラリアのモデルマウスC57BL/6Jを用いたこれまでの解析から、イソロイシン欠損食のマラリア原虫感染前投与により、脳への原虫集積量について変化はないままにマウスの生存率が上昇すること(=脳性マラリアトレランス)を明らかにしている。本年度は、脳性マラリアトレランス機構を明らかにすることを目的の1つとし、申請時に記載した通り、以下の研究計画を並行して実施した。1.脳性マラリアトレランスについての解析:イソロイシン欠損食の投与によるC57BL/6Jの生存率上昇について、1血液脳関門の輸送能は影響しない、2同食の投与は嗅球におけるマラリア原虫感染に対する炎症反応を抑制する、3同食の投与は脳血管における感染赤血球の集積を予防することなどを明らかにした。以上から、脳性マラリアについて、アミノ酸が介する新規の発症機構が存在する可能性が示唆された。2.イソロイシン取り込みチャネルPSACを標的とするワクチン開発についての解析:組換えPSAC断片を接種したBalb/cにおいて、末梢血中では感染6日後に原虫の増殖作用に対して抑制作用が認められた。しかし、IVISを用いて生体全体の原虫量を定量したところ、有意な差は認められなかった。また、同断片を接種したC57BL/6Jにおいて生存率上昇効果は認められなかった。3.アミノグラムの個人差とマラリア原虫増殖性についての解析:熱帯熱マラリア原虫の培養実験系において、日本赤十字社から譲渡された血液製剤について、原虫の増殖性に対して正負に影響する血清を得た。現在、血清アミノグラムと原虫の増殖性との関係性を見出すべく、それらの血清に含まれるアミノ酸の濃度について網羅的な解析を準備中である。脳性マラリアの発症機構について、アミノ酸が介する新規のマラリア原虫-宿主相互作用が存在する可能性を見出したことに加え、栄養学的知見に基づくワクチン開発基盤についての研究や、アミノグラムの個人差と熱帯熱マラリア原虫の増殖性についての相関解析のためのスクリーニングも実施済みであることから、当初の期待と同程度に進捗および結果が得られており、順調に研究が進展していると考えるため。

さらに核磁気共鳴画像法を用いた解析から、同食の投与により、嗅球におけるマラリア原虫感染赤血球の集積を起因とする炎症反応が抑制されることを明らかにした。以上の結果から、イソロイシン欠損食の投与による脳性マラリアトレランス能の付与について、アミノ酸を介する新規の宿主-病原体相互作用の関与が示唆された。現在までに得られた知見を基盤とし、脳性マラリアトレランス機構の解析、肝臓におけるアミノ酸とマラリア原虫との相互作用の解析、蚊のイソロイシン要求性に着目した解析及びアミノグラムの個人差とマラリア原虫の増殖性についての解析などについて、申請時の研究計画に従い並行して遂行する。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
森林生態系における菌根および菌根菌の現存量とそれらの呼吸速度の推定

森林生態系の土壌炭素フローに対する菌根および菌根菌の影響を明らかにするために、植生遷移に伴う菌根タイプの把握と四季を通した菌根の現存量および呼吸速度の推定を行った。菌根タイプの把握のために、富士山の亜高山帯において植生遷移の異なる群落(イタドリ群落シラビソ林)を調査地とした。その結果、遷移初期の群落ではアーバスキュラー菌根のみが確認され、その後遷移の進行とともに菌根タイプは増加し、5タイプの菌根形成が確認された。遷移後期のシラビソ林では、外生菌根が優占していた。菌根の現存量および呼吸速度の推定のために、富士山の亜高山帯針葉樹林(シラビソ林)に調査地を設けた。菌根の呼吸速度は、土壌中に塩ビ管を埋設することによって物理的に菌根の侵入を遮断した根無し区、根切り処理を行い新たな菌根を侵入させた菌根区、および対照区(3区各8-10反復)を設け、2004年の4月から11月の期間毎月1回各区の土壌呼吸を測定し、菌根区から根無し区の土壌呼吸量の差し引きにより菌根の呼吸量を推定した。四季を通した土壌呼吸速度の変化は、各処理区とも同じ傾向を示し、4月から7月にかけて急激に増加した後、11月にかけて徐々に減少した。菌根の呼吸速度は、0.55(4月)-3.44(7月)μmolCO_2/m^2 sであった。菌根の呼吸速度の最も高かった7月において、土壌呼吸に対する菌根呼吸の寄与率は、72%であった。菌根の現存量は、四季を通して余り変化がなく、0.2-0.3g/425cm^3の範囲であった。これらの結果より、菌根の呼吸は、土壌呼吸の主要な構成要素であるとともに土壌炭素フローに大きな影響を与えている可能性が示唆された。推定の精度を高めるため、来年度も引き続き調査を行い、生態系の土壌炭素フローに対する菌根菌も含めた菌根の役割を明らかにする予定である。森林生態系の土壌炭素フローに対する菌根および菌根菌の影響を明らかにするために、森林において四季を通した菌根および菌根菌の呼吸速度の推定を行った。調査地は、富士山の亜高山帯針葉樹林(シラビソ林)に設けた。菌根と菌根菌の呼吸速度は、土壌中に塩ビ管を埋設することによって物理的に菌根と菌根菌の侵入を遮断した塩ビ管区、菌根菌のみ侵入できるネット区、および根切り処理を行い新たな菌根と菌根菌の侵入がおこる根切り区(3処理区各8反復)を設け、2ヶ月おきに3処理区の土壌呼吸を測定し、区画毎の土壌呼吸量の差し引きにより菌根と菌根菌の呼吸量を推定した。四季を通した土壌呼吸速度の変化は、各処理区とも同じ傾向を示し、5月から8月にかけて増加した後、9と11月は減少する傾向であった。ネット区と根切り区の土壌呼吸速度は、四季を通してほぼ同じ値で有意な差はなかった。一方、塩ビ管区は、それらの2処理区よりも有意に低い値であった。本年度は、ネット区と根切り区の間で土壌呼吸速度の差が見られなかったので、菌根の呼吸量の推定を行うことはできなかった。しかしながら、塩ビ管区と根切り区の間では有意な差が生じたため、根切り区の値から塩ビ管区の値を差し引いて菌根菌の呼吸量を推定すると、5月と11月は約1molCO^2 m^<-2> s^<-1>、8月と9月は約2.5molCO_2 m^<-2> s^<-1>であった。8月において菌根菌の呼吸量は、全土壌呼吸量の約4割を占めることが明らかになった。来年度は、土壌攪乱による影響が少なくなると思われるため、菌根の呼吸量の推定も可能であると考えられる。また、菌類バイオマスの定量によって土壌呼吸速度の高かったネット区に多くの菌根菌が存在していたかどうかの裏付も行い、菌根と菌根菌の呼吸量推定の精度を高める予定である。

菌根の呼吸速度は、0.55(4月)-3.44(7月)μmolCO_2/m^2 sであった。菌根の呼吸速度の最も高かった7月において、土壌呼吸に対する菌根呼吸の寄与率は、72%であった。菌根の現存量は、四季を通して余り変化がなく、0.2-0.3g/425cm^3の範囲であった。これらの結果より、菌根の呼吸は、土壌呼吸の主要な構成要素であるとともに土壌炭素フローに大きな影響を与えている可能性が示唆された。推定の精度を高めるため、来年度も引き続き調査を行い、生態系の土壌炭素フローに対する菌根菌も含めた菌根の役割を明らかにする予定である。
四回対称軸を持たない立方晶希土類化合物における八極子相互作用の検証

本研究の目的は、四回対称軸を有しない立方晶結晶構造を持つ希土類パラジウムブロンズRPd_3S_4(R:希土類)の各種物性測定から、八極子相互作用がRPd_3S_4の物性に及ぼす効果を明らかにすることである。平成22年度に得られた成果は以下の通りである。(1)NdPd_3S_4の1T以下で見られる反強磁性相が、反強磁性秩序と八極子秩序との共存相であることを検証するため、粉末中性子回折実験による磁気構造の決定を行った。反強磁性転移温度以下では核散乱に加えて、磁気散乱によるブラッグピークが現れ、波数ベクトルk=[100]で記述される反強磁性構造を考えることで指数付けすることが出来た。Ndサイトは体心立方構造を取るため、この反強磁性構造は、角にあるNdの磁気モーメントと体心にある磁気モーメントとが互いに逆向きである磁気構造であると言える。k=[100]の構造は、反強磁性と八極子秩序が共存する場合の磁気構造として矛盾しない。(2)これまで作製してきたSmPd_3S_4には不純物が含まれており、磁化率の測定を行うと不純物に起因すると思われる異常が観測されていた。試料作製時のSmの組成比を最適化することで、不純物をほとんど含まない純良な多結晶試料を作製することに成功し、磁化と磁化率の測定を行った。その結果、不純物に起因する磁化率の異常がほとんど消失した。さらに、2.6K以下で磁化率の不連続な減少が見られたことから、SmPd_3S_4はこの温度以下で一次の反強磁性転移を示すことが明らかとなった。転移の次数が一次である原因として、1)反強磁性と反強八極子の同時転移、2)強い四極子相互作用の影響、という二つの可能性を提案した。本研究の目的は、四回対称軸を有しない立方晶結晶構造を持つ希土類パラジウムブロンズRPd_3S_4(R:希土類)、及びそのRサイトを多極子自由度を持たないGdで置換したR_<1-x>Gd_xPd_3S_4の各種物性測定から、八極子相互作用がRPd_3S_4の物性に及ぼす効果を明らかにすることである。平成21年度に得られた成果は以下の通りである。1. NdPd_3S_4の単結晶試料の磁化、比熱、電気抵抗率測定から、8Tの磁場下までの磁場-温度相図を作成した。1T以下の磁場下で現れる反強磁性秩序相への転移は一次相転移的であることが分かった。転移が一次相転移的である原因として、1T以下の相への相転移で、反強磁性秩序と同時に双極子と対称性の異なる八極子の秩序が生じた可能性が考えられる。1T以上の磁場を印加すると、転移温度が異方的に増加することを見出した。このような転移温度の増加は、磁場により反強四極子秩序が誘起されたことを示唆している。[100]軸方向に磁場印加した場合、磁場誘起相は一つだけである。一方、[110]と[111]に磁場印加した場合は、それぞれ二つと三つの磁場誘起相が表れることが分かった。2. NdPd_3S_4の1T以下で見られる反強磁性相が、反強磁性秩序と八極子秩序との共存相であることを検証するため、磁気相互作用を強め八極子相互作用を弱めたNd_<1-x>Gd_xPd_3S_4の多結晶試料を作製した。次年度に単結晶化を行い、磁化、比熱、電気抵抗率測定による物性評価を行っていく。

その結果、不純物に起因する磁化率の異常がほとんど消失した。さらに、2.6K以下で磁化率の不連続な減少が見られたことから、SmPd_3S_4はこの温度以下で一次の反強磁性転移を示すことが明らかとなった。転移の次数が一次である原因として、1)反強磁性と反強八極子の同時転移、2)強い四極子相互作用の影響、という二つの可能性を提案した。
長期定常期から分裂再開までの細胞の生存戦略

20塩基分子バーコードを持つ大腸菌一遺伝子欠失株ライブラリー構築を行い、1)全欠失株混合培養液の長期定常期中のpopulation変動、2)薬剤を含んだ培地中の各欠失株のpopulation変動解析、3)宿主のBW38029株のゲノム配列の決定と遺伝的背景の確認を行った。長期定常期における解析は、LB培地を用いた混合培養液中の各欠失株の相対的populationをバーコードシーケンスで決定した。さらに各サンプリング中の細胞の再生育能の違いを、取得各サンプルをLB培地で希釈し再増殖後、バーコードシーケンスで再生育能を調べた。バーコード株混合培養液でのシステマティック解析の有用性を示した。自然環境下での生命は、対数増殖を繰り返す期間は非常に短く、分裂をしない期間が最も長い。これは、真核、原核、単細胞、多細胞を問わず、全ての生命に当てはまる。対数増殖後の定常期、死滅期、長期定常期を経て、分裂再開に至る過程の解析は、これまで解析自体に多くの困難を伴い、未解明のままである。細胞の基本的な生理機能の解明という点から、「細胞とは」という根本的な疑問のみならず、長期定常期でのVBNC(Viable but Non-Culturable)細胞の出現は病原性という観点からも重要な問題である。特に死滅期以降は、対象の細胞数の激減から技術的に研究が難しかったが、2000年以降の研究リソースの整備、解析技術の高度化により解析が可能になりつつある。Bar-code欠失株は、解析感度を劇的に改善するものであり、長期定常期及び再分裂期のきわめて少量の細胞数にその力を発揮する。これまで非常に難しい研究対象であった長期定常期及び分裂再開の細胞内動的機能ネットワークを定量的に解析し、細胞の普遍的生存戦略に迫る。モデル大腸菌K-12株を活用し、化学物質と遺伝子産物との相互作用解析を目的に20塩基の分子バーコードを導入した一遺伝子欠失株ライブラリーの構築を試み、欠失株としての評価を終え、すべてのバーコード領域の配列決定後、ライブラリーとして確立した。このライブラリーを用いて、本年度は2つの大規模解析への可能性の検証を行った。1)すべての欠失株を混合した培養液を用いた、長期定常期中のpopulation変動の定量的解析、2)同じく混合培養液を用いて、化学物質を含んだ培地中の各欠失株のpopulation変動解析、の二つを行いバーコード欠失株の有用性を確認することができた。一方、1)の長期定常期での欠失遺伝子の影響を調べた解析では、特定のバーコード領域の増大と、再び生育可能な状態になった環境での次のpopulationを築く遺伝子欠失株とが必ずしも一致しないという問題を持つことが判明した。これはゲノムDNAが細胞の形態が保たれていてDNA分解酵素などから保護される状態にありながら、次の世代として再び細胞分裂を開始することができない、あるいは非常に遅れて生育する可能性を示している。そのため、長期間の培養液から経時的にサンプリングを行い、一部は前回と同様にバーコードの頻度をシーケンスで確認し、残る培養液はフレッシュな培地に替え、再び生育させ、一定時間後にシーケンスによりバーコードの頻度を調べ、遺伝子欠失と再生育能力との相関の解析を進めた。シーケンス解析自体は次年度に持ち越している。接合伝達可能な低コピープラスミドクローンライブラリーの構築を行い、ライブラリーとして確立した。そして上述のバーコード欠失株を相補するライブラリーの構築も終了し、相補株におけるバーコード解析を可能にした。大腸菌K-12株BW38029株に20塩基の分子バーコードを導入した一遺伝子欠失株ライブラリーの構築を行い、その株を用いて、1)すべての欠失株を混合した培養液を用いた、長期定常期中のpopulation変動の定量的解析、2)混合培養液を用いて、薬剤を含んだ培地中の各欠失株のpopulation変動解析を行った。そして、3)宿主であるBW38029株のゲノム配列を決定し、遺伝的背景を確認した。1)の長期定常期における解析では、培地中より回収される染色体DNAの量とコロニー形成能を持つ細胞数が、培養時間とともに差が大きくなることが判明した。おそらくゲノムDNAが細胞の形態が保たれていてDNA分解酵素などから保護される状態にありながら、次の世代として再び細胞分裂を開始することができない、あるいは非常に遅れて生育を開始する集団の増大の可能性が考えられた。そこで、同じ実験の再現性も確認することを目的に、全く同じ実験を行い、サンプリングした培養液の半量からDNAの回収、残る半量を、培地をフレッシュなものに入換え、生育を再開させた後、一定時間後に再び培地中より染色体DNAを回収し、バーコード解析を行った。イルミナ社のHiSeqによるデータ取得を終え、現在解析中である。2)の薬剤との相互作用解析においては、昨年度は24種類の薬剤を含んだ培地中でのバーコード欠失株のpopulation変動の解析を行い、欠失による薬剤への感受性の違いを解析し、良好な結果を得ていたが、本年度はその数を124と増やすことができ、現在解析を終え、論文化を進めている。GOを利用した解析からは、薬剤の作用機序から感受性が増すと予想される遺伝子群の欠失株のpopulation中での減少も確認され、信頼性は高いと考えられる結果を得ている。さらに定常期環境状態の酸素消費量とpHの変動を解析可能とすることができた。

20塩基分子バーコードを持つ大腸菌一遺伝子欠失株ライブラリー構築を行い、1)全欠失株混合培養液の長期定常期中のpopulation変動、2)薬剤を含んだ培地中の各欠失株のpopulation変動解析、3)宿主のBW38029株のゲノム配列の決定と遺伝的背景の確認を行った。長期定常期における解析は、LB培地を用いた混合培養液中の各欠失株の相対的populationをバーコードシーケンスで決定した。さらに各サンプリング中の細胞の再生育能の違いを、取得各サンプルをLB培地で希釈し再増殖後、バーコードシーケンスで再生育能を調べた。バーコード株混合培養液でのシステマティック解析の有用性を示した。一遺伝子バーコード欠失株ライブラリーの構築を終了し、最初のパイロットテストを、長期定常期におけるpopulation変動及び薬剤を含む培地での欠失遺伝子と薬剤との相互作用を定量的に解析するシステムの構築を完成した。また本年度はプラスミドから該当遺伝子の増産による影響もバーコード解析を可能にするライブラリーの構築を行った。予定以上に進展した事は、リソース及び方法論の確立により、急速に共同研究も拡張、発展していることも大きい。27年度が最終年度であるため、記入しない。システム微生物学来年度は、最終年度でもあり、まず構築したリソースを活用して得られた大量の情報の解析を進めることと、論文化を中心に進める。また、これまで開発を行った低コピー可動プラスミドは、Fプラスミドの移動起点(oriT)を持つ。これは、大腸菌間では非常に効率良くプラスミドの移動を可能にするが、incPプラスミドのRP4由来のoriTを利用することで、大腸菌-放線菌間など種を超えた接合による移動を可能にする。接合は通常の形質転換とは違い、巨大DNAの移動を可能にする。すでにこれまでのベクターにRP4由来のoriTを導入したプラスミドを構築できており、巨大DNA移動システム構築など、応用へ向けた拡張を図る。さらに本プロジェクト終了後を本プロジェクトで得られたリソースや方法論をベースに、我々としては、今後10年、20年のスパンでシーズを出し続けることができるような基礎、基盤研究に目を向けた研究を中心に進めること、そして研究グループ内外を問わず、共同研究等で短期的な活用に向けた方向に応用できるような体制を取れるような仕組みを検討する。1) bar-code欠失株ライブラリー混合培養液の経時サンプルから、ゲノムDNA抽出、bar-code領域の増幅とその配列解析を行い、各欠失株のpopulation変動の解析を行った。細胞増殖を観察できない定常期において、各欠失株の培養液中の相対的なpopulation変動の解析法の確立を行う事ができた。マイニングは、GOを活用したenrichment解析、KEGG pathwayデータによる解析と、特徴的な変動を示す遺伝子欠失株から解析を行っている。特にglpK欠失株が長期定常期において非常に耐性になることを見いだし、現在解析を進めている。回収ゲノムDNA量とコロニー形成能の変動の食い違いから、DNAは保護されているが、コロニー形成能が無い粒子(VBNC)の存在が示唆された。2)接合可動型発現調節プラスミドクローンライブラリーの完成と必須遺伝子欠失株ライブラリーの構築:IPTGによる発現誘導接合伝達
スピン偏極STMの開発と磁性超薄膜の表面界面構造、電子状態への応用

スピン偏極STM用Fe探針の超高真空中での作製とGd_2Co_7清浄表面のSTM観察本研究はSTM室、試料導入室の2チャンバーで構成される超高真空STM装置で行った。本助成金で購入した150l/sのターボ分子ポンプは試料導入室の排気に用いた。到達真空度はSTM室では2×10^<-8>Pa以下,試料導入室では1.5×10^<-7>Pa以下である。Feは大気中では酸化されやすいため、Fe探針の作製は、電解研磨により1μm程度にしたのち、1.5×10^<-7>Pa以下の超高真空中で、トランスファーロッドを用い引きちぎって作製した。作製したFe探針を用いてグラファイトの原子像を確認した。原子レベルの分解能が得られるのは切断部先端にmini-tipが形成されるためと考えている。現在のところ、この作製法で再現性はよく超高真空中での強磁性探針の作製法が確立した。Ce_2Ni_7型の結晶構造を有するGd_2Co_7は、GdとCoの磁気モーメントが反平行で467Kに補償点をもつフェリ磁性体である。その単結晶はC面が容易に劈開し、磁化容易軸はc軸でKu=1.3×10^7erg/ccと大きな磁気異方性を示す。GdとCoの電子状態の差によりW探針でも原子像が、Fe探針との比較により原子レベルでスピン偏極電流が検出できると期待される・そこで我々はGd_2Co_7(001)清浄表面を1.5×10^<-7>Pa以下の超高真空中で劈開して作製し、観察を行った。現在非磁性W及びFe探針を用いて観察を行った結果、原子レベルの明瞭なステップ構造は確認できたが、原子像及び両者の顕著な違いを見いだすには至っていない。今後、劈開法を工夫し、原子像の確認・バイパス依存性について測定を行う。その他にSTM・RHEED観察が可能な超薄膜作製用の超高真空蒸着装置の作製を行い、2×10^<-8>Pa以下の到達真空度、RHEEDによるSi(111)の7×7清浄表面・MgO(001)上のFe(001)超薄膜のエピタキシャル成長などを確認した。