hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
プロサポシンタンパク質の構造解析とマウス胚発生における機能解明

プロサポシン(PSAP)はライソゾームでのスフィンゴ脂質の加水分解に関わるサポシン(SAPs)の前駆体タンパク質であり、PSAP自体が体液中に分泌されることも知られているが、その生理機能はよく判っていない。本研究ではプロサポシン欠損マウス(Psap-/-)の出生率が低いことに着目し、PSAP/SAPsのマウス胚発生における生理機能の解明を目指した。野生型マウスの胚組織におけるPSAP/SAPsの時空間的発現解析を行った結果、PSAP/SAPsは時期特異的に高発現し、胎仔への栄養供給を担う胚体外組織で強く発現していることが判った。Psap-/-胚の病態解析では、Psap-/-は胎生早期から成長不良を呈し、胚体外組織の特定の細胞でライソゾームの形態異常が見られた。Psap-/-とプロサポシン強発現マウス(PSAP Tg)との交配実験により、Psap-/-胚の胎生致死表現型は母体がプロサポシンを強発現することによってレスキューされることを明らかにした。以上の結果から、PSAP/SAPsはマウス胎生期において胚体外組織のライソゾーム機能に必須であることが示唆された。本研究では、プロサポシン(PSAP)とサポシン(SAPs)のマウス胚発生における生理機能の解明を目的として、以下の三つの研究課題を遂行した。一つ目は野生型の胚組織におけるPSAP/SAPsの時空間的発現変化を明らかにした。胎生早期(胎齢6.5-9.5日(E6.5-9.5))の野生型マウス胚ではPSAP/SAPsは栄養膜巨細胞と脱落膜細胞に高発現していた。胎生中期(E10.5-15.5)の臓側卵黄嚢ではSAPsが上皮細胞の巨大ライソゾームに局在し、胎盤ではPSAP/SAPsは海綿状栄養膜細胞や栄養膜巨細胞、脱落膜細胞に発現し、羊水中にはPSAPが分泌されていた。二つ目にプロサポシン欠損マウス(Psap KO)の胎生致死の原因究明を行った。Psap KO胚はE7.5から成長不良を呈し、E7.5の栄養膜巨細胞と臓側卵黄嚢上皮細胞でライソゾームの形態異常が認められた。E10.5以降の胎盤では海綿状栄養膜層が萎縮し、羊水中にPSAPは検出されなかった。三つ目にヒトプロサポシン強発現マウス(PSAP Tg)を用いて母体由来PSAP/SAPsの胎仔への影響を検討した。ヒトプロサポシンを強発現し、マウスプロサポシンを欠損するマウス(Psap KO, PSAP Tg/W)同士を交配し、母体がプロサポシンを強発現する場合でのPsap KO胎仔の表現型解析を行った。その結果、Psap KOはメンデルの法則に従った比率で出生し、胚の組織病理像も野生型と同等であり、Psap KO胚の胎生致死表現型は母体からのプロサポシンの供給によってレスキューされることが判った。以上の結果から、PSAP/SAPsはマウス胎生期において脱落膜、臓側卵黄嚢、胎盤などの胚体外組織のライソゾーム機能に必須であることが示唆された。本研究はプロサポシンの生理機能を解明すべく2つの研究課題を実施している。一つ目はプロサポシン欠損マウスの出生率が非常に低いことから、欠損マウスが胎生致死であることを予想し、その原因究明を行っている。各胎齢におけるプロサポシン欠損マウスの病態解析の結果、プロサポシン欠損マウス胎仔は胎齢7.5日の時点で既に成長不良を呈していた。電子顕微鏡による詳細な観察の結果、胎齢7.5日の母体組織である子宮膜の一部・脱落膜において異常な形態の細胞を多く認めた。胎齢7.5日以降、プロサポシン欠損マウスの生存率は減少し、胎齢10.5日のプロサポシン欠損マウスでは、胎仔の発育遅延に加えて胎盤の海面状栄養膜層の萎縮が観察された。以上の結果から、マウス胚発生において妊娠初期では脱落膜、妊娠中期では胎盤において特にプロサポシンが必須である可能性が示唆された。

そこで、野性型マウス胚において、各胎齢におけるプロサポシンの発現量を解析したところ、脱落膜において胎齢6.5日ではプロサポシンはほとんど発現していないが、胎齢7.5日から9.5日の間でプロサポシンの発現が増加することが判った。また、胎齢10.5日の胎盤の海面状栄養膜層にプロサポシンは発現しており、それ以降減少することが判った。これまでの成果を第31回内藤コンファレンスで発表し、助成金を獲得した。現在、プロサポシンだけでなく、プロサポシンから生成されるサポシンの重要性も見出しつつあり、両タンパク質が脂質結合や膜融合に関与する可能性があることから、胎生期におけるこれらの生理現象に焦点を絞り研究を展開している。一方、もう一つの研究課題であるプロサポシンタンパク質の構造解析では、各種臓器に含まれる分泌型プロサポシンと内在性プロサポシンのウェスタンブロット上での移動度の違いは確認したが、各プロサポシンタンパク質の精製実験が困難で、代替実験を模索している。プロサポシン欠損マウスの胎生致死の解明については、研究計画通りに遂行できた。当該年度に、プロサポシン欠損マウスを妊娠初期から出生まで時系列に沿って採取し病理学的解析を行った結果、プロサポシン欠損マウスの胎生致死の時期と病変部位を特定できた。また、ウェスタンブロットや免疫組織染色法により野性型マウス胚でのプロサポシンの時空間的発現変化を明らかにし、同時に成熟タンパク質であるサポシンの発現変化も明らかにした。これらの研究の過程で、胎仔に存在するプロサポシン・サポシンの一部は母体由来であることが判明し、プロサポシン・サポシンが母子間で輸送されるという興味深い知見を得た。現在、以上の結果を論文投稿準備中であり、妊娠初期から中期にかけてのプロサポシン・サポシンの生理機能解明に向けて、今後は脱落膜や卵黄嚢、胎盤の機能発現との関わりを重点的に解析していく予定である。一方でプロサポシンタンパク質の構造解析は、野性型マウスからの精製実験が困難であったことから、研究計画の遅れが生じている。抗体カラムを用いて精製実験を行っているが、今のところ構造解析に供する十分量のプロサポシンを得られていない。また、免疫沈降によって部分精製したプロサポシンに対してレクチンブロット等の糖鎖構造解析の予備実験も行ったが、有用な結果は得られていない。そこで、精製実験におけるタンパク質量の問題を解決するために、現在、東海大学医学部吉村眞一講師からヒトプロサポシン過剰発現マウスと新たな抗プロサポシン・サポシン抗体の供与を受け代替実験が可能か検証中である。既にヒトプロサポシン過剰発現マウス由来の皮膚繊維芽細胞の培養系は確立しており、今後培養液中の分泌型プロサポシンと細胞内プロサポシンの構造を解析していく予定である。当該年度の研究の結果、マウス胚発生において妊娠初期では脱落膜、妊娠中期では胎盤においてプロサポシンが、妊娠初期の卵黄嚢ではサポシンが、必須である可能性が示された。また、プロサポシン・サポシンは母体から胎仔へ供給されることも示唆された。今後は、これらの可能性を検証するために、四倍体胚補完法によりプロサポシン欠損マウスにおいて胎盤と胎仔どちらが致死性に寄与しているのかを明らかにし、プロサポシン欠損マウスとヒトプロサポシン過剰発現マウスとの交配実験により、プロサポシン欠損胎仔へのヒトプロサポシン補完効果を観察していく予定である。一方、既報論文においてサポシンは脂質結合能を有することや膜融合を促進することが試験管内の実験によって示されている。よって、脱落膜や卵黄嚢、胎盤に発現しているプロサポシン・サポシンも脂質の運搬や生体膜の融合反応に関わると考えられる。今後は、母子間の脂質成分の輸送実験や、ライソゾームやエンドソームなど膜融合が必須である細胞内小器官の動態観察を重点的に行う。
プラズマ中のMHD表面波の研究

1・研究計画アルヴェン波によるプラズマ加熱の基礎研究の一環として、次の2点にテ-マを絞って行なった。(1)アルヴェン共鳴を起こさせるための外部(アンテナ)からのrfとして、m=-1(左回りポロイダルモ-ド数)アルヴェン圧縮波のMHD表面波の性質を用いる。そのために、まず第一段階としてこのモ-ドの表面波的振舞を実験的に実証する。(2)このMHD表面波のアルヴェン共鳴点での、アルヴェン波または準静電波(抵抗性運動論的アルヴェン波)へのモ-ド変換を実験的に実証する。2・研究成果(1)については、我々が開発した独自のヘリカルアンテナを用いることにより、世界に先駆けてMHD表面波の励起に成功した。さらに、従来のシアアルヴェン波に関する実験が理論と必ずしも良い一致をみなかったのは、この表面波と共存していたからであることを突き止めた。(2)に関しては、これまでの多くの理論的研究結果から、アルヴェン共鳴点で圧縮波からモ-ド変換された準静電波(変動磁場成分は主にbo)として、次の3種類が考えられる。ω^2>(k_<11>Ve)^2>ωνeiの条件の下で発生し、低密度側に伝わるため、プラズマ表面加熱を起こす恐れのあるモ-ドとして考えられている。(k_<11>Ve)^2>ω^2,ωνeiの下で発生し、高密度側に伝わるため、プラズマ加熱に最も適したモ-ドと考えられている。ωνei>ω^2,(k_<11>Ve)^2の下で発生し減衰がはげしいので表面加熱には必ずしも寄与せず、共鳴点近傍を加熱する。これらのモ-ドを励起するために、m=-1の圧縮波すなわちMHD表面波のモ-ド変換を利用した。そのために、一組の小型ル-プアンテナを開発し、プラズマの側面よりMHD表面波を入射した。その結果我々の実験条件下では、(2)と(3)のモ-ドが混在して励起されていることが判明した。このようなモ-ド変換の空間構造を実験的に初めて明らかにすることに成功した。
肝細胞癌や非アルコール性脂肪性肝炎の発症・進展に対する脂質シグナルの関与

PTEN欠損マウスの肝臓では10週齢で中心静脈周囲の肝細胞の細胞質に脂肪滴、40週齢で肝細胞の風船様腫大、マロリー体、小葉内炎症性細胞浸潤、傍ジヌソイド領域の線維化、腺腫、7478週齢で肝癌が発症し、組織学的にも自然経過においてもヒトNASHとよく似た病変を呈し、PTEN欠損マウスはヒト非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)の動物モデルと考えられる。PTEN欠損マウスの脂肪肝は、PTEN遺伝子の肝細胞における欠損に基づくPI3 kinaseの活性化を背景に核転写因子PPARγとSREBP1c、さらに、これらの核転写因子の下流のaP2、adipsin、adiponectin、SCD1、FAS、ACCの発現増加に伴い肝細胞における中性脂肪の合成が促進され発症する。脂肪性肝炎は、中性脂肪の過剰に蓄積した肝細胞において脂肪酸のβ酸化を促進する酵素であるAOX、L-PBE、PTLの発現亢進に伴い酸化ストレスが増加し細胞障害が惹起されたためと考えられる。また、腸内細菌叢由来のLPSに対するPTEN欠損マウスの肝臓の感受性亢進も肝炎の発症・増悪に関与している。一方、過剰に蓄積した酸化ストレスによる肝細胞における酸化的DNA障害とAktやMAPKの活性化に基づく肝細胞の増殖能の亢進が相加的に作用し腺腫・癌が発症したと考えられる。また、PTEN欠損マウスの肝臓ではオレイン酸の増加とステアリン酸の減少も腫瘍形成に寄与していると考えられる。さらに、PTEN欠損マウスと野性型マウスの肝細胞に由来するRNAを用いて行ったcDNAマイクロアレイからPTEN欠損マウスの肝臓における炎症、線維化、癌化にはTh1細胞を活性化するサイトカインであるosteopontinが重要な役割を果たしていることが示唆された。ヒトNASHの癌組織と非癌組織を用いた免疫組織学的解析から、ヒトNASHにおいてもPTENの発現低下と酸化ストレスの蓄積がNASHの進展と発ガンに関与している可能性が示唆された。したがって、ヒトNASH症例の中には上記で示したPTEN欠損マウスの肝病変発症機序と同じメカニズムに基づいて肝病変を発症する症例が存在すると考えられる。肝細胞特異的Ptenノックアウトマウス(Pten欠損マウス)の肝臓では、10週齢で中心静脈周囲の肝細胞の細胞質に大滴性脂肪滴、40週齢で肝細胞の風船様腫大、マロリー体、小葉内炎症性細胞浸潤、傍ジヌソイド領域の線維化、腺腫、7478週齢で肝癌が発症し、組織学的にも自然経過においてもヒトの非アルコール性脂肪性肝炎ときわめてよく類似していた。一方、持続的な酸化ストレスによる肝細胞における8-hydroxydeoxyguanosineの産生促進に基づく酸化的DNA障害とAktやMAPKの活性化に基づく肝細胞の増殖能の亢進は相加的に作用し腺腫・癌の発生に寄与していると考えられた。また、Pten欠損マウスの肝臓では脂肪酸の増加、なかでもオレイン酸分画の増加が顕著であった。オレイン酸は、細胞膜の流動性を増加させ細胞の代謝や増殖の亢進に寄与することが報告されており、肝細胞の分裂速度を速め腫瘍の形成をもたらす遺伝子変異の獲得に一役かっている可能性も考えられた。

以上のようなPten欠損マウスの肝臓における脂肪化、炎症、発癌の発症機序はヒトの非アルコール性脂肪性肝炎や肝癌の発症・進展にも関与している可能性がある。1.肝細胞特異的Ptenノックアウト(Pten KO)マウスの肝炎発症機序を腸内細菌叢由来のエンドトキシン感受性の観点から検討した。Pten KOマウスでは野生型(WT)マウスに比較して、リポポリサッカライド(LPS)の投与に対して血清ALT値の有意な上昇と肝臓における強い炎症性細胞浸潤が認められた。また、腸内細菌叢からの肝臓へのLPSの移行を阻止する抗生物質をPten KOマウスに投与すると、血清ALT値の上昇と肝臓における炎症性細胞浸潤が抑制された。さらに、Pten KOマウスとWTマウスの肝臓から単離した肝細胞とクッパー細胞にLPSを添加しその培養上清中のサイトカインを測定すると、Pten KOマウスに由来するクッパー細胞で著明なサイトカインの分泌増加が認められた。以上の結果から、Pten KOマウスの肝臓では、腸内細菌叢由来のLPSに対するクッパー細胞の感受性亢進が肝炎の発症に寄与していることを明らかにした。2.Pten KOマウスとWTマウスの肝細胞に由来するRNAを用いて行ったcDNAマイクロアレイで、Pten KOマウスの肝細胞では炎症に関与する分子osteopontin(OPN)の有意な増加がみられた。3.OPNはTh1細胞の活性化を介してマクロファージを活性化することにより炎症を促進するサイトカインである。Pten KOマウスの肝臓では、酸化ストレスの蓄積(2004年度実績報告書)と肝細胞におけるOPNの発現増加がクッパー細胞の活性化を引き起こすと考えられる。クッパー細胞の活性化は、腸内細菌叢由来のLPSに対する反応性の亢進を介してあるいは直接肝臓に炎症を惹起すると考えられる。Pten KoマウスはヒトNASHの動物モデルであることから、ヒトNASH症例の中にはPten KOマウスと同じ機序に基づいて肝病変を発症する症例が存在すると考えられる。
自己組織性を有するイオン伝導性高分子の創製とその特性化

自己組織性とイオン伝導性との関係を明らかにするために、主鎖骨格にエチレンオキシド鎖を有する主鎖型および側鎖型液晶性高分子を合成し、これらの高分子に過塩素酸リチウムを混合した系がイオン伝導性を示すことを見いだした。側鎖型高分子の側鎖は、芳香族一環系からなり、その末端メチレン鎖が4から12でスメクティック相を発現した。一方、それ以上の長さの末端基をもつ側鎖型高分子では結晶性は発現しなかった。これらの液晶性の側鎖型高分子と非液晶性の側鎖高分子にそれぞれ過塩素酸リチウムを混合すると、いずれもスメクティック相を発現した。非液晶性の側鎖型高分子と過塩素酸リチウムとの混合系においてスメクティック相が発現する理由のひとつとして側鎖末端のメチレン鎖の結晶性があげられることを見いだした。X線回折測定より混合系が発現するスメクティック相の層間隔は液晶性側鎖型高分子のみが発現するスメクティック相より狭くなることが明らかになった。過塩素酸リチウムをポリマーユニットに対して同じ割合で混合した系では、液晶性を示す側鎖型高分子は、非液晶性を示す側鎖型高分子に比べ高いイオン伝導性を示した。またいずれの混合系も塩濃度が増加することによってイオン伝導性は増加した。一方、ビススチリルベンゼンからなる主鎖型高分子は、単体および過塩素酸リチウムをポリマーユニットに対して0.04の割合で混合した系はスメクティック相を発現したが、塩濃度が0.11の割合で混合した系では、ネマティック相を発現した。これらの二つのイオン伝導性を比較したところ、ネマティック相を発現する混合系の方がスメクティック相を発現する混合系に比べイオン伝導性が大きくなることがわかった。また、この主鎖型液晶性高分子は、ヨウ素ドーピングやUV照射によってシスートランス異性化がおこる。この高分子は、トランス体では液晶性を示すが、シス体では非液晶性であった。トランス体およびシス体の高分子を用意し、それぞれ過塩素酸リチウムをポスターマーユニットに対して0.11の割合で混合した系のイオン伝導性を比較したところ、液晶性を示すトランス体の混合系の方が、非液晶性であるシステム体の混合系よりも高いイオン伝導性を示した。自己組織性とイオン伝導性との関係を明らかにするために側鎖型液晶性ポリエーテルを合成し、得られた側鎖型ポリエーテルとアルカリ金属塩との混合系の熱転移挙動およびイオン伝導性について検討した。イオン伝導性高分子としては、ポリエチレンオキシドと類似構造をもつ一環系側鎖型ポリエーテルを用いた。一環系側鎖型ポリエーテルは側鎖末端のメチレン鎖が4から12でスメクチック相を発現した。これらの液晶性あるいは非液晶性ポリエーテルと過塩素酸リチウムとの混合系においてもスメクティク相が観察された。液晶温度範囲は塩濃度が増加するにともない広くなった。非液晶ポリエーテルと過塩素酸リチウムとの混合系で液晶性が発現する理由のひとつとして側鎖末端のメチレン鎖の結晶性があげられることを見いだした。X線回折測定より混合系が発現するスメクチック相の層間隔は液晶性ポリエーテルのみが発現するスメクチック相より狭くなることが明らかになった。混合系の過塩素酸リチウムの解離は、カチオンであるリチウムイオンはX光線光電子分光測定により、一方アニオンである過塩素酸イオンはラマンスベクトルによりそれぞれ確認した。

混合系の塩濃度が高いときにはイオン伝導の温度依存性はヒステリシスを示した。一方、塩濃度が低いときは混合系のイオン伝導度の温度依存性をVogel-Tamman-Fulcher(VTF)の式を用いて検討ところ、活性化エネルギーが等方相よりも液晶相の方が大きかった。このことから等方相と液晶相でイオン伝導の機構が異なると考えられる。自己組織性とイオン伝導性の関係について明らかにするために、主鎖骨格にエチレンオキシド鎖を有する主鎖型および側鎖型液晶性高分子を合成し、これらの高分子に過塩素酸リチウムを混合した系がイオン伝導性を示すことを見いだした。液晶性の側鎖型高分子と非液晶性の側鎖型高分子にそれぞれ過塩素酸リチウムを混合すると、いずれもスメクティック相を発現した。過塩素酸リチウムをポリマーユニットに対して同じ割合で混合した系では、液晶性を示す側鎖型高分子は、非液晶性を示す側鎖型高分子に比べ高いイオン伝導性を示した。またいずれの混合系も塩濃度が増加することによってイオン伝導度は増加した。一方、ビススチリルベンゼンから成る主鎖型液晶性高分子は単体および過塩素酸リチウムをポリマーユニットに対して0.04の割合で混合した系はスメクティック相を発現したが、塩濃度が0.11の割合で混合した系では、ネマティック相を発現した。これら2つのイオン伝導度を比較したところ、ネマティック相を発現する混合系のほうがスメクティック相を発現する混合系に比ベイオン伝導度が大きくなることがわかった。また、この主鎖型液晶性高分子は、ヨウ素ドーピングやUV照射によってシス-トランス異性化がおこる。この高分子は、トランス体では液晶性を示すが、シス体では非液晶性であった。トランス体およびシス体の高分子を用意し、それぞれ過塩素酸リチウムをポリマーユニットに対して0.11の割合で混合した系のイオン伝導度を比較したところ、液晶性を示すトランス体の混合系のほうが、非液晶性であるシス体の混合系よりも高いイオン伝導度を示した。
底生生物の多様性維持機構としての基質撹乱

沿岸生態系において重要な役割を果たしている底生動物群集をとりまく環境のうち、最も物理的な攪乱を受けやすいと考えられる基質に焦点を絞り、攪乱の頻度や大きさと生物群集の種多様性との関連を調べた結果、ハビタットによって傾向が大きく異なっていた。ホンダワラ藻場と岩礁潮間帯では、有る条件では攪乱を受けやすい基質で種多様性が高く、攪乱の程度や頻度に変移があることによっても種多様性が維持されていた沿岸生態系において重要な役割を果たしている底生動物群集をとりまく環境のうち、最も物理的な攪乱を受けやすいと考えられる基質に焦点を絞り、攪乱の頻度や大きさと生物群集の種多様性との関連を調べた結果、ハビタットによって傾向が大きく異なっていた。ホンダワラ藻場と岩礁潮間帯では、有る条件では攪乱を受けやすい基質で種多様性が高く、攪乱の程度や頻度に変移があることによっても種多様性が維持されていた沿岸域生態系の生物多様性を維持する上で様々な規模の攪乱が果たしている役割を明らかにするために、野外でおこる様々なタイプの基質攪乱の頻度と強度及びその影響範囲を定量化するとともに、攪乱による底生生物群集の変化とその回復の過程を追跡した。南九州の沿岸生態系から、岩礁潮間帯、転石帯、干潟をそれぞれ5、6海岸ずつ選び、以下の調査を行った。1)環境調査:基質が受ける攪乱の程度を把握するため、各ハビタットにおいて、波圧、基質上の微細構造、転石の不安定さ、粒度組成、水温、塩分濃度等を計測した。また、上記3タイプのハビタットにおいて、本年9月に上陸した台風14号による撹乱の程度を調べたところ、干潟では地形が大幅に変化しており、岩礁潮間帯でも基質が大きな撹乱を受けている可能性が示唆された。2)生物調査:各調査地で5月に底生生物を採集し、攪乱前の底生生物相の種名リストを作成した。上記の撹乱による影響を知るため、岩礁潮間帯及び干潟については10月にも調査を行った。その結果、どちらのハビタットについても底生生物の種組成に大きな変化は見られなかった。一部の海岸では定量的な調査を行ったが、総現存量についても撹乱の前後で大きな変動は見られず、特定の種の定量的な変化を現在解析中である。3)文献・データベース調査:時空間的により大きなスケールで、環境攪乱の頻度とその影響をとらえるため、公開されている文献やデータベースから、気象情報や地形情報を収集するとともに、GISソフトへの変換を開始した。沿岸域生態系の生物多様性を維持する上で様々な規模の攪乱が果たしている役割を明らかにするために、野外でおこる様々なタイプの基質攪乱の頻度と強度及びその影響範囲を定量化するとともに、攪乱による底生生物群集の変化とその回復の過程を追跡した。昨年度は、南九州沿岸の岩礁潮間帯、転石海岸、干潟での調査を行ったが、今年度はさらに大型藻類の繁茂する藻場を調査対象に加えた。1)野外環境調査:基質が受ける攪乱の程度を把握するため、岩礁潮間帯及び海藻藻場について、基質を中心とした物理化学的環境について調査を行った。平成17年とは対照的に台風による撹乱は少なく、基質は安定していた。2)野外生物調査:岩礁潮間帯及び海藻藻場を中心に生物相の調査を行った。基質の撹乱による生物相の変化は見られなかったが、冬季の高水温は大型藻類の生長を遅らせ、それに伴って動物相にも変化が見られると考えられる。採集した藻場の動物標本を現在解析中である。3)文献・データベース調査:時空間的により大きなスケールで、環境攪乱の頻度とその影響をとらえるため、公開されている文献やデータベースから得た情報を整理すると共に、海岸線の変化をGISソフトに変換する作業を継続し、以下の点が明らかになった。(1)過去数十年間に、埋め立て以外の要因で鹿児島湾奥の干潟の配置が変化しており、川砂の流入や潮流の変化が影響している可能性がある。(2)九州南部沿岸では、過去数十年間に大型藻類の分布が大きく変化した海域と比較的変化の少ないが見られる。(3)過去数十年間における基質攪乱の原因となり得るような気象現象の強度と頻度、特に降雨について整理したところ、頻度とともに降雨量の多い季節の長期化という変化が見られた。これまで南九州沿岸の岩礁潮間帯、転石海岸、干潟、海藻藻場を対象とした調査を行ってきたが、今年度はさらにサンゴ礁での調査を行った。梅雨の豪雨及び7月上旬の台風上陸は陸上に与えた影響は大きかったが、沿岸域の基質は比較的安定していた。また、長期にわたる基質の変化を評価するため、1994年に調査された鹿児島湾奥の干潟において再度調査を行い、底質環境を比較した。

特に後者では、基質も含めた環境攪乱は季節的で予想可能なパターンであることが多く、底生生物はそれにあわせた季節消長を示すことが示された。3)文献・データベース調査:時空間的により大きなスケールで、環境攪乱の頻度とその影響をとらえるため、公開されている文献やデータベースから得た情報を整理した。その結果、夏の高水温が要因と考えられる珊瑚の白化が一部の地域で報告されているが、秋以降の水温低下に伴って回復した例があり、比較的短い時間スケールで攪乱と回復が繰り返されていることが明らかになった。沿岸域生態系の生物多様性を維持する上で様々な規模の攪乱が果たしている役割を明らかにするために、野外でおこる様々なタイプの基質攪乱の頻度と強度及びその影響範囲を定量化するとともに、攪乱による底生生物群集の変化とその回復の過程を追跡した。これまで南九州沿岸の岩礁潮間帯、転石海岸、干潟、海藻藻場、サンゴ礁を対象とした調査を行ってきたが、今年度は成果をまとめるとともに、人為的な基質攪乱をおこす野外実験と基質攪乱が底生生物の多様性に与える影響を考察した。1)野外実験:転石海岸において、人為的に転石を移動させる区と転石の移動がしないように固定した区、自然に移動させる対象区を設置し、底生生物群集を数ヶ月間追跡した。結果は現在解析中である。2)野外調査のまとめ:海藻藻場で行った底生生物群集の調査結果をまとめた結果、気候変動などの大規模な攪乱によって沿岸域の大型藻類の分布が変化した場合、藻場の動物群集にも変化が生じる可能性が明らかになった。3)データベース調査のまとめ:1946年以降の航空写真をGISソフトで解析し、過去60年間の鹿児島湾沿岸域の変化を明らかにした。
遊泳個体数計数アルゴリズムの研究開発：PTV解析技術を応用した新たな試み

養殖生簀内の飼育個体数を簡便に計数可能な基盤技術を開発する目的で,流体工学分野で適用されている流場の可視化技術であるPTV(Particle Tracking Velocimetry)解析技術を適用し,画像内の魚群の構成尾数を計数する基盤アルゴリズムを構築した。動画像内の一定の輝度と面積以上の領域を魚の個体として領域抽出したのち,当該領域の移動ベクトルをカルマンフィルタのアルゴリズムを適用することにより算定した。ベクトルの本数から空間内の個体数を推定したところ,水槽内に200尾を投入したとき,個体数推定結果の実数に対する平均誤差は5.9%となり,その有効性が確認できた。本研究は魚群を構成する個体数を自動計数するシステム開発のため,その基盤アルゴリズムを新しいコンセプトで構築しようとするのである。流れの可視化技術の一つであるPTV技術(粒子画像追跡流速測定法)を応用することにより,撮影された魚群の動画から,魚群を構成する個体の遊泳軌跡を同定し,そのベクトル情報から個体数を同定するという方法を適用する。本年度は実験室ベースで遊泳する魚群を構成する個体の画像抽出と,取得された画像上の個体映像から移動ベクトルを推定するアルゴリズムの基盤技術について開発を行った。前者による個体画像抽出は2次元正規分布型をした画像テンプレートを撮影された画像情報上で走査し,個体部分の輝度情報を増幅してその画像を背景画像から際立たせるという処理を行うものである。この画像処理を施した時間的に連続する2画像に対して,カルマンフィルタを用いて遊泳個体の移動軌跡を推定することにより,2画像内に撮影されている各個体の対応関係を同定して最終的な個体の遊泳移動ベクトルを推定した。円形水槽内に淡水魚を投入し,室内実験レベルで閉鎖空間内の魚群の遊泳個体数を計測したところ,画像内におよそ53-62尾観測できた異なる11ペアの画像情報から平均誤差2.1%の精度で個体数を自動計数することができた。さらに個体数の同定精度を高めるために,魚の画像抽出に最適な画像テンプレートの開発を行うと供に,カルマンフィルタを用いて連続画像内の同一個体の対応付けをより高精度に実現することが必要であることが明らかとなった。本年度は画像として記録された流体内で移動する粒子物質を高輝度に撮影画像から抽出する方法(PMC法)を,閉鎖空間内を遊泳する魚群を構成する個体に適用するための基礎的検証実験を行った。背景画像を撮影画像の平均値画像から求め,これを各撮影画像から差し引くことにより求められた画像に対してPMC法を適用したところ,魚群を構成する個体画像が抽出され,個体移動ベクトル抽出を行うための原画像として使用可能であることが確認できた。得られた画像を用いてカルマンフィルタを応用したKC法により時間的に連続する画像内に映し出された個体を対応付けることにより,個体の移動ベクトルを抽出したところ,解析結果から50尾ー100尾の魚群のオーダーでは十分に計数できるだけの計測精度が確認できたたため,予定どおりに研究は遂行されていると判断できる。今後はPMC法により個体を抽出する画像処理手法を本研究に適したものに改良していき精度向上を図る必要がある本研究では生簀などの閉鎖空間内を遊泳する魚群について,その構成尾数を自動計数するシステムを開発するため,流れの可視化技術であるPTV解析技術(粒子画像追跡流速測定法)を応用する。ビデオカメラで撮影された魚群遊泳の動画像から,個体の移動ベクトルを抽出するアルゴリズムを構築することにより,得られたベクトル個数から画像内に存在する魚群構成尾数を推定する。前年度で当該アルゴリズムの適用性が確認されたため,本年度はその評価実験を実施した。200尾を水槽内に投入し,半球型レンズを装着したビデオカメラを水槽底部に設置し上方に向け水槽全体が撮影可能となるようにした。撮影された動画像フレームの複数画像の平均値を背景画像とし,これを各フレーム画像から減算処理することによって個体画像を抽出し,その画像重心を導出する。重心の移動先を状態空間モデルを適用して予測し,予測範囲内に候補個体が存在したとき,その個体座標を利用して個体の移動ベクトルとした。取得された動画のうち連続した100フレームを対象として解析したところ,検出率はおよそ90%となった。撮影画像内の急激な照度変化が発生すると,これがノイズとなり誤検出が高まることが示唆された。撮影画像内の魚群の実数と個体数計数アルゴリズムによる検出個体数との差を各撮影フレーム毎に経時的に比較してみたところ,検出率の値(90%)を反映して実数に比べて検出個体数はどのフレームにおいても少ない値で評価されたが,その変動傾向は実際に撮影された実個体数の変化と類似していた。このことは,推定値から実数値を予測する場合にシステム的差異を考慮に入れることにより,さらに推定精度を向上させることが可能となることを表している。今後は当該アルゴリズムの耐性を様々な撮影環境条件下で適用することによりそのロバスト性を確認する実証実験を行い,実用化のための情報を集積する。

ベクトルの本数から空間内の個体数を推定したところ,水槽内に200尾を投入したとき,個体数推定結果の実数に対する平均誤差は5.9%となり,その有効性が確認できた。本年度に実施された実験内容は,いずれも実験室レベルで行われたものである。空間スケールを実機レベルに拡大して実験を実施する必要があるため,実際の養殖現場で養魚を対象に撮影実験を行う。また,画像処理手法は基礎実験段階でその拡張性が実証できたことから,実際の養殖環境で撮影された魚群撮影画像から基盤アルゴリズムの応用性を検証する必要がある。特に画像処理過程にあたるPMC法を用いた魚群内個体抽出処理が実機レベルで使用できるよう最適化することが主な課題と予想される。水産工学本研究では魚群の個体数を計数するシステムを開発することを目的としているため,実際に遊泳する魚群が撮影された画像情報の取得が必要となる。本年度は実験室レベルで画像取得を行うことを中心に行ない,その精度検証を主に実施した。実際の養殖現場で遊泳する養魚魚群の個体数計測の実現に向け取り組んでいるため,実機での計測が求められるが,本年度は室内実験レベルでのシステムの構築を中心に実施したことになり,フィールドワークでの検証を当該年度に実施するまでにはいたらなかった。次年度ではこうした実海域での検証を次年度使用額を用いて実現させる。魚群の個体数を計数するための基盤アルゴリズムは本年の室内実験レベルの解析で一定の目処を付けることができた。本年度で得られた基盤解析システムを用いて養殖現場での養魚魚群の個体数計数の解析実験を次年度で実現させるため,発生した次年度使用額は次年度予算と合わせて積極的な調査実験を実施するために効果的に使用する計画でのぞむ。
不安認知における長期記憶の効率性とワーキングメモリの柔軟性の不均衡仮説の検討

不安症(不安障害)におけるネガティブな思考を抑制できないという特徴の背後には,ネガティブな情報を思い出しやすいという(長期)記憶バイアスと,ワーキングメモリの実行機能の機能不全がある。本研究では,高不安者の記憶バイアスと実行機能の機能不全の関係性を,ネガティブな思考の抑制困難の観点から,実験的に明らかにすることを目的とすることとした。平成30年度は,昨年度の課題であった「不安」を測定する新たな尺度である体験の回避(experiential avoidance)"の改善を試みた。今年度は,体験の回避傾向を測定する尺度として,変化のアジェンダを測定する「Change Agenda Questionnaire(嶋ら,2018)」をもちいた。この尺度では,『体験の回避が維持される背景には、「思考、感情、性格がコントロールできれば心理行動的問題は解決できるだろう」という、“変化のアジェンダ(Change Agenda)"が存在している(嶋ら,2018)』として,変化のアジェンダの確信度と,それに従った行動の程度の両方を測定できる。この尺度について,ネット調査を行った結果,十分な信頼性を確認することができた。また,平成30年度では,不安と強い正の相関を示す「抑うつ」について,不安と抑うつの合併・共存(comorbidity)についての文献レビューを行った。不安と抑うつは精神医学の基本的な概念ではあるが,不安と抑うつは様々な様態で重複することはよく知られている。近年の不安と抑うつの共存研究では,Cummingsら(2014)が提案した多重経路モデルが主流となりつつある。不安症である若者はうつ病のリスクが高いといった疾患の経路の観点から,共存について捉えようとする考え方である。文献レビューの結果から,不安と抑うつの合併・共存を考慮して,高不安者の記憶バイアスと実行機能の機能不全を検討する必要性が明らかになった。当初の予定では,平成29年度に行った文献レビューの結果を踏まえて,高不安者の実行機能の機能不全を測定することが可能な実験課題の作成を行う予定であったが,実験実施まで行うことができなかった。その理由として,研究代表者が所属大学を移動したため,個別実験を行うための実験室を確保することができなかったことがあげられる。今後の研究の方針として,次の二点を重点的に行う。第一に,高不安者の実行機能を高い精度で測定する実験課題を作成する。第二に,その実験課題を用いて,長期記憶の効率性とワーキングメモリの柔軟性の関係性を検討する。不安症におけるネガティブな思考を抑制できないという特徴の背後には,ネガティブな情報を思い出しやすいという(長期)記憶バイアスと,ワーキングメモリの実行機能の機能不全がある。平成29年度は,本研究の不安症と実行機能に関する文献のレビューを行った。実行機能(以下,EF)は,認知的な制御や認知的な問題解決にあたるCool(Cold) EFと,感情制御や感情的な問題解決にあたるHot EFに大きく分類される。抑うつなどでは,Cool EFよりもHot EFの機能低下の影響が大きい可能性が指摘されている一方で,不安に関する実行機能に関する研究は,非常に少ないことが明らかになった。さらに,実行機能の単一性と多様性について,実験を行う際の新しい枠組みが必要であることが明らかになった。また,平成29年度は,「不安」を測定する新たな尺度として,“体験の回避(experiential avoidance)"を測定する日本語版Acceptance and Action Questionnaire尺度の信頼性を予備的に検討した。体験の回避とは,第3世代の行動療法の一つとされるアクセプタンス&コミットメントにおいて,特定の個人的な体験や出来事(身体感覚や情動,思考,記憶,イメージ,行動傾向など)を経験することを嫌悪し,これらの出来事の形態や頻度,また,それを生じさせる文脈を変えようとするときに生じる現象であると定義され,体験の回避が不安をはじめとする心理的な問題を引き起こす一因であるとされている。この尺度について,ネット調査を行った結果,下位尺度である「Willingness」のα係が低いことが明らかになり,尺度の改善の必要性が示された。当初の予定では,初年度は,文献レビューの結果を踏まえて,高不安者の実行機能の機能不全を測定することが可能な実験課題の作成を行う予定であったが,実験実施まで行うことができなかった。その理由として,実行機能の単一性と多様性の両者の視点を考慮した実験課題の作成を行う必要があり,その実験デザインの設計に時間を要したことが挙げられる。

この尺度では,『体験の回避が維持される背景には、「思考、感情、性格がコントロールできれば心理行動的問題は解決できるだろう」という、“変化のアジェンダ(Change Agenda)"が存在している(嶋ら,2018)』として,変化のアジェンダの確信度と,それに従った行動の程度の両方を測定できる。この尺度について,ネット調査を行った結果,十分な信頼性を確認することができた。また,平成30年度では,不安と強い正の相関を示す「抑うつ」について,不安と抑うつの合併・共存(comorbidity)についての文献レビューを行った。不安と抑うつは精神医学の基本的な概念ではあるが,不安と抑うつは様々な様態で重複することはよく知られている。近年の不安と抑うつの共存研究では,Cummingsら(2014)が提案した多重経路モデルが主流となりつつある。不安症である若者はうつ病のリスクが高いといった疾患の経路の観点から,共存について捉えようとする考え方である。文献レビューの結果から,不安と抑うつの合併・共存を考慮して,高不安者の記憶バイアスと実行機能の機能不全を検討する必要性が明らかになった。当初の予定では,平成29年度に行った文献レビューの結果を踏まえて,高不安者の実行機能の機能不全を測定することが可能な実験課題の作成を行う予定であったが,実験実施まで行うことができなかった。その理由として,研究代表者が所属大学を移動したため,個別実験を行うための実験室を確保することができなかったことがあげられる。平成30年度は,次の二点を重点的に行う。第一に,高不安者の実行機能を高い精度で測定する実験課題を作成する。第二に,その実験課題を用いて,長期記憶の効率性とワーキングメモリの柔軟性の関係性を検討する。今後の研究の方針として,次の二点を重点的に行う。次年度使用額が生じた大きな理由としては,予定していた海外出張に日程の都合で参加できなかったことに加えて,初年度に実施予定であった個別実験を行うことができなかったため,人件費および謝金の使用額が予定額を下回ったことがあげられる。未使用分については,平成30年度実施予定の個別実験にかかる人件費および謝金に充てる予定である。次年度使用額が生じた大きな理由としては,実施予定であった個別実験を行うことができなかったため,人件費および謝金の使用額が予定額を下回ったことがあげられる。未使用分については,今後実施予定の個別実験にかかる人件費および謝金に充てる予定である。
認知症高齢者の自己決定の機会を提供する看護介入の効果について

本研究の目的は,認知症高齢者の自己決定を支える看護介入の有効性を検討することで,以下の2点が明らかとなった。(1)介入モデルに基づく援助を実施することで,自己決定する力を顕在させ,円滑な人間関係を営む力を引き出す効果があることが示唆された。(2)選択する際の意思の示し方は,認知症程度や原因疾患,活動内容により異なっている。今後は,本研究結果を踏まえ,臨床現場で実践可能性の高い看護介入プロトコルを作成する。本研究の目的は,中等度・重度認知症高齢者の自己決定の機会を提供する看護介入プログラムを作成することである。研究期間内に実施することは、これまでに実施した研究「施設で生活する中等度・重度認知症高齢者の自己決定の機会を提供する看護介入の効果についての研究」を踏まえ,研究デザインを再検討し、モデルに基づく看護介入を実践し、効果を評価することである。平成23年度は、応募者が実施した先行研究「施設で生活する中等度・重度認知症高齢者の自己決定の機会を提供する看護介入の効果についての研究」の結果を質的に分析し、介入の有効性を検証した。介入による変化として明らかになったことは、以下の2点である。(1)介入4日目以降で【援助者や他入所者との関係を考えながら選択する】,12日目以降で【周囲に対して気を配りながら選択する】がみられたことから,他者との関係性を維持する力を引き出すことができる介入である。(2)8日目以降で【選択の意思を明確に示して行動する】がみられたことから,自己決定の力は潜在しており,介入により顕在化される可能性があるといえる。以上より本介入は、中等度・重度認知症高齢者の尊厳を支える援助であると同時に,自己決定する力を顕在させ,円滑な人間関係を営む力を引き出す効果があることが示唆され,介入の有効性が検証された。有効性は検証されたが、中等度・重度認知症高齢者の自己決定を支える看護介入モデルを作成する上での課題も明らかとなった。それは、現時点では自己決定理論をもとに介入モデルを作成しているが、そのモデルでは「援助者と認知症高齢者の相互関係」という視点が十分ではない、と言うことである。そこで現在、人間関係論を加えた介入モデルの再検討を実施している。来年度は、施設生活する認知症高齢者35名に介入モデルに基づいた援助を実施し、モデルの妥当性を検証する予定である。本研究の目的は,「中等度・重度認知症高齢者の自己決定の機会を提供する看護介入プログラム」を作成することで,平成23年度は,平成22年度の調査結果をもとに作成した「認知症高齢者の自己決定を支える看護モデル」に基づく実践を行い,評価した。年度前半に介入モデルを検討し,調査場所への説明と同意を得た。調査は平成23年8月9月にかけ,A市内のB介護老人保健施設において,VaD3名,AD1名,MMSE414点(中等度3名,重度1名)の計4名の協力者を得て実施した。実施方法は,週3日の計6日間,9時12時に調査者が施設に滞在し,生活行動(排泄・活動・食事(間食)・レクリエーション)場面での自己決定を促した。介入場面は4名ともに『間食』『レク』の2場面で,調査者が実施した先行研究と比較し介入場面が少なかった。これは,本研究の協力者が先行研究より認知症程度が軽度であったためと考えられ,認知症程度で援助が必要な活動が異なるといえる。また選択場面の分析から選択の仕方の経時変化をみると,『間食』では4名中2名(VaD2名)は介入初日から「私はお茶。」など明確な意思を示して選択し,介入初日は「どっちでもいい。」など曖昧であった2名(AD1名,VaD1名)は3日目以降で「コーヒーにしよう」などと意思を示し選択するようになった。『レク』では4名中2名(VaD2名)は初日から,提示したレク物品から選択し熱心に活動したが,他の2名(AD1名,VaD1名)は6日とも促しには興味を示さず,他の協力者とのレク場面は楽しそうに見ていた。これらから,本モデルをもとに援助を実践することで,認知症高齢者は自分の意思で生活行動を決定できるといえるが,認知症の程度や原因疾患の違い,間食・レクなど活動内容の違いよって意思の示し方が異なっており,様々な視点から介入方法を検討する必要性が示された。つまり介入モデルの提示だけでは臨床での実用性は低いと考えられ,このことを今後の検討課題とする。
DXAFS法によるゼオライトでの金属ナノクラスターの動的構造変化観察

ゼオライト細孔内に内包された金属クラスターは有用な触媒として機能するが、形成されるクラスターの構造は担体であるゼオライトの構造や酸性質の影響を強く受ける。本研究ではDXAFSやQXAFSといった手法によって水素雰囲気下でクラスターが形成される過程、または酸素によって再分散する過程を追跡し、触媒の活性点の形成に及ぼす担体の酸点の影響を調べることを目指した。酸型のモルデナイトやZSM-5にPdを担持し、水素雰囲気下でのクラスターの形成過程をDXAFSによって追跡した。その結果、一旦安定な6核クラスターを形成し、その後外表面上で凝集することがわかった。さらに500°Cで酸素を導入すると、単分子状の酸化物として酸点上に再分散する様子が観察された。このような金属クラスターの形成・再分散は可逆的に見られた。H-Y型ゼオライトを担体とした場合には13核程度のクラスターが形成していた。このクラスター上ではHeck反応が溶媒に溶出せずに効率的に進行し、再利用も可能であることがわかった。H-Y型ゼオライトにAuを担持させたところ、0°CにおいてCO-O_2反応に高活性を示した。Na-Y型ゼオライトでは著しくAuが凝集していたのに対し、H-Yを使うとAuの凝集が抑制されていた。前処理時に酸点および気相にH_2が存在することにより高分散なAuクラスターが形成され、高活性を示したものと考えられる。1.ゼオライトの一種であるモルデナイトに担持したPt触媒によって過剰水素中のCO選択酸化反応を行ったところ,前処理条件が触媒作用に強く影響することを見出した.すなわち773KでH_2あるいは,CO-H_2などで還元前処理を行った場合には低活性であるのに対し,反応ガス(H_2-CO-O_2)で前処理を行った場合には373Kで完全にCOを除去することができた.前処理後に測定したPt-L_3 EXAFSの結果,H_2およびCO-H_2で前処理を行った場合にはPtはそれぞれイオン状,凝集したPt粒子となっているのに対し,反応ガスで処理を行った場合にはPtクラスターが形成していた.このPtクラスターがPROX反応における高活性種であると考えられた.2.H_3PO_4-WO_3-Nb_2O_5からなる三元系の酸化物触媒が液相でのフリーデル・クラフツアルキル化反応に高活性を示し,かつ容易に再利用できることを見出した.様々なキャラクタリゼーション手法による検討から,Nbを含んだKeggin型のヘテロポリ酸が分解する過程で生成する中間体が活性種であることを明らかにした.本触媒は濾過・洗浄するだけで再利用が可能であった.この触媒が高い活性を示すには773Kでの焼成が重要であった。すなわち,673K以下で焼成した場合では活性種の溶出に伴い活性が低下し,823K以上ではWO_3が生成するため不活性であった.XRD, IR, XAFS,^<31>P NMRによる構造解析の結果,低温で生成したヘテロポリ酸が分解する過程における中間体が活性種であることが分かった.また吸着ピリジンのIRおよびNH_3 TPDの測定により,773Kでの焼成後では新たなブレンステッド酸点が生成しており,これが活性点であると考えられた.ゼオライト細孔内に内包された金属クラスターは有用な触媒として機能するが、形成されるクラスターの構造は担体であるゼオライトの構造や酸性質の影響を強く受ける。
ステロイド合成P450遺伝子転写調節制御機構

1.ステロイド合成P450遺伝子転写調節因子の単離、構造決定と作用の解析。(1)ヒトAd4BP(SF-1)遺伝子のクローニング:ヒトAd4BP遺伝子は全長が30kbで7個のexonより構成され、461アミノ酸よりなるAd4BPをコードしていた。ラット同様、5'上流に転写に重要なEboxが保存されていた。(2)CRS1-BPとしてのPbX-1のクローニング:CYP17(P45017α)遺伝子のcAMP応答領域に結合するCRSl-BPをクローニングし、この本体がリンパ球性白血病の際に認められる転座遺伝子PbX-1であることが判明した。このことは細胞増殖機構とステロイド合成の関係を示唆するものとして興味深い。(3)Eboxに結合する因子の検討:組織非特異的発現を示すEbox結合因子のcDNAの単離に成功した。さらに組織特異的なものの単離を試みている。(4)Ad4BPとDAX-1のステロイドP450遺伝子に対する作用:Ad4BPは主要なステロイド産生P450遺伝子、P450scc,P45011β、P45017αのすべての転写を促進した。一方、DAX-1はこれらの遺伝子の転写を抑制、両者はP450遺伝子の転写に関して拮抗する関係にあることが判明した。DAX-1遺伝子の5'上流にはAd4BP結合配列が存在することを見い出し、DAX-1遺伝子の転写がAd4BPによりtransactivationされることが判明した。このように、Ad4BPとDAX-1は互いに密接に相互作用し、下流の遺伝子の転写調節を行うことが推定された。2.Ad4BP,DAX-1遺伝子の先天性副腎低形成症例における解析。性腺、副腎の発生に必須の転写因子Ad4BP、DAX-1のヒト遺伝子構造の決定により、性分化異常を伴う先天性副腎低形成症例でのこれらの遺伝子の解析が可能となった。解析した男性6例はすべてX染色体上のDAX-1遺伝子の異常であり1例にアミノ酸置換、5例にstopないしframe shiftに伴うstop codonを認めた。この中には両親に異常が無く、germ lineの変異でDAX-1異常症が発症し得ることが明らかとなった。タイ人女性3例にはAd4BP遺伝子の異常は認められなかった。以上の結果は同じ表現型を示す性分化異常症の原因にAd4BP,DAX-1以外のものが存在することを証明するものと結論される。1.ヒトAd4-BPおよびCRS1-BPのcDNAと遺伝子のクローニング:ウシAd4-BPcDNAをプローブとして、ヒト卵巣顆粒膜細胞よりPCR法でヒトAd-4BPcDNAをクローニング、またヒトcDNAを得る前段階としてウシ副腎cDNAライブラリーよりCYP17 (P45017α)

遺伝子のcAMP応答領域に結合するCRS1-BPをクローニングし、この本体がリンパ球性白血病の際に認められる転座遺伝子PbX-1であることが明らかとなった。このことは細胞増殖機構とステロイド合成の関係を示唆するものとして興味深く、PbX-1のステロイド合成における役割についてさらに検討を行っている。Ad4-BPは性分化に重要な因子であり、現在、原因不明の性分化異常症に関与する可能性が極めて高く、その遺伝子構造の解析は急務と考えられる。現在、ほぼ全遺伝子構造の解析を終了し、Ad4BP遺伝子の転写制御機構の解析と共に、性分化異常症例の遺伝子解析に着手している。2.転写因子DAX-1異常症の解析:先天性副腎低形成の原因遺伝子として同定されたDAX-1遺伝子の日本人症例の2家系について遺伝子解析を行った。1家系は、通常みられる伴性劣性遺伝を示し、X染色体上の本遺伝子の点突然変異によりストップコドンとなる異常を見出した。他の1家系では両親に異常がなく、先天性副腎低形成がgermlineの変異で起こり得ることを初めて明らかにした。また、マウスDAX-1遺伝子のクローニングを行い、ノックアウトマウス作成の前準備が整った。さらにAd4BPのトランスジェニックマウスを作成、胎仔卵巣で強制発現させ、性分化に及ぼすAd4-BPの効果を検討する予定である。1.ヒトAd4BP(SF-1)遺伝子のクローニング、全構造決定と機能解析:ヒト末梢血リンパ球より作成したゲノムライブラリーよりウシAd4BP cDNAをプローブとしてヒトAd4BP遺伝子をクローニング、全構造を決定した。全長は30kbで7個のエクソンより構成され、461アミノ酸よりなるAd4BPをコードしていた。ラットで明らかになったAd4BP遺伝子発現に重要なE-box配列も保存されていた。ヒト遺伝子構造の解明により、Ad4BP異常症の解析が可能となった。現在Ad4BP異常症候補症例(性分化異常症)について、解析中である。Ebox結合因子の高発現が認められる新生児ラット精巣よりcDNAを調製し、発現ライブラリーを構築した。Ebox結合因子はBasic-Helix-Loop-Helix構造を有する蛋白質ファミリーを形成するが、これらサブファミリーのなかにショウジョウバエの性決定に不可欠であるdaughterless、sisterlessが含まれる。これら2因子はHeterodimerを形成し転写活性化能を示す。そこでこれらサブファミリー内で高度に保存されるBasic-Helix-Loop-Helix領域にDNAプライマーを設定し、新生児ラット精巣cDNAを鋳型としてそれぞれの哺乳類ホモローグをPCR法を用いて単離した。次に、得られたDNAをプローブとして上記のcDNAライブラリーをスクリーニングした結果、5種類のdaughterlessホモローグを単離し、全ての構造、塩基配列を決定した。このcDNA発現ベクターを用い、Ad4BP遺伝子に対するtransactivation活性を検討したが単独では活性を示さなかった。これはショウジョウバエにおけるdaughterlessの場合と同様であり、現在これらdaughterlessホモローグとHeterodimerを形成する一方のEbox結合因子の単離を行っている。