hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
シアノバクテリア(ラン藻)の光適応現象にかかわる遺伝子の探索と応答機構の解析

(1)Synechocystissp.PCC 6803のpmgA変異体から光グルコース感受性を回復する2重変異株を多数単離し、このうちの一つの変異株(LR4)の変異は呼吸系の多重遺伝子ndhF3内の保存されたアミノ酸の変異であることを示し、光による光化学系の調節にpmgAと呼吸遺伝子のかかわりを明らかにした。(2)Ser/Thr型プロテインホスファターゼの遺伝子slr2031が、強光応答と運動性にかかわっていることを示した。(3)Ser/Thr型プロテインキナーゼ遺伝子spkA、spkBを大腸菌で発現させ、その酵素活性を示すとともに、Synechocystisでの破壊株を解析して、運動の調節にかかわっていることを示した。(4)IV型線毛様構造体の形成にかかわる遺伝子群の破壊株の解析より、運動と形質転換の両方にかかわる遺伝子として、pilA1、pilB1、pilD、pilM、pilN、pilO、pilQを同定した。また、形質転換だけにかかわる遺伝子として、comAを同定した。(5)正の走光性の調節にかかわるフィトクロム様光受容体遺伝子pisJ1と、その後のシグナル伝達にかかわる2成分制御系の遺伝子群pisG、pisH、pisl、pisJ2、pisLを同定した。(6)シアノバクテリアの強光応答における遺伝子の発現プロフィールをDNAマイクロアレイを用いて明らかにした。シアノバクテリアにおける光環境への応答機構を遺伝子レベルで明らかにする目的で、新たな遺伝子の探索を進めている。(1)すでに作成しているSynechocystis sp.PCC 6803のpmgA変異体から光グルコース感受性を回復する2重変異株を多数単離し、これらの変異部位を同定する作業を進めている。このうちの一つの変異株(LR4)の変異は呼吸系の多重遺伝子ndhF3内の保存されたアミノ酸の置換であった。また、LR4株の表現型の解析から、強光処理で系l含量を調節できないという本来の性質は回復しておらず、別のしくみで光グルコース感受性を回復した可能性が考えられた。光合成生物の呼吸系の多重遺伝子の機能についてはほとんどその生理的意義はわかっておらず、今後他のndh遺伝子の破壊株と比較しながら、解析を進めていく予定である。また、別の変異株の変異部位の同定も進めている。(2)すでに決定されているSynechocystis sp.PCC 6803の全遺伝子リストに基づいて、強光応答にかかわる可能性のある遺伝子の破壊株と過剰発現株の作成と機能解析を進めている。そのなかで、スーパーオキサイドジスムターゼの遺伝子(sodB)の過剰発現が光/グルコース/メチルビオローゲン存在下で強い保護効果を発揮することを見いだした。これは、上記のpmgA変異株が示す光グルコース感受性が活性酸素傷害によることを強く示唆しており、光合成生物の強光防御における重要な知見と考えられる。この可能性を確認するために、強光感受性が明らかになっているいくつかの変異株(gogat.psbKなど)との2重変異株を作成し、強光保護効果を確認する作業を進めている。シアノバクテリアにおける光環境への応答機構に関与する新たな遺伝子(ndhF3,sll1626)を同定した。(1)pmgA変異株の光グルコース感受性を回復させるサプレッサー変異として、すでに同定しているndhF3変異の役割を解析した。ndhF3変異体は、他のndh変異株同様、プラストキノンの還元レベルが低下しており、光グルコース条件での光化学系量比の調節ができなかった。この結果より、プラストキノンの酸化還元レベルが光化学系量比を調節している可能性が示唆された。(2)強光応答にかかわる新規の転写因子様遺伝子(sll1626)を見いだした。この破壊株は、運動性が抑制され、細胞凝集が促進される表現型を示した。これは、野生株を強光照射したときの応答によく似ており、sll1626が強光応答を示すときに遺伝子の発現を調節している転写因子であることを示唆している。

また、DNAマイクロアレイ解析によって、sll1626破壊株では、運動に必須な線毛遺伝子の発現が抑制されていることを示した。(1)シアノバクテリアにおける光環境への応答機構に関与する一群の新規遺伝子(pisJ1オペロン)を同定した。Synechocystisが示す走光性は、光源へ向かう正の走光性と、光源から逃げる負の走光性があるが、pilJ1オぺロンの遺伝子群は正の走光性に必要で、その破壊株は適度な光強度下でも負の走光性を示した。とくに、PisJ1は、植物のフィトクロムと相同性があり、正の走光性の光受容体と考えられる。さらに、PisJ1のC末には、大腸菌などの走化性の調節のためのメチル化を受けるシグナル伝達部位(MCP部位)がある。大腸菌などでは、このMCP部位から、CheA→CheYへとリン酸化のシグナル伝達が鞭毛の運動を調節していることが知られているが、PisLはCheA、PisG,PisHはCheYのホモログと考えられる。したがって、シアノバクテリアの走光性は、フィトクロム様の光受容体から、PisL→PisG,PisHのリン酸化を経たシグナル伝達によって調節される機構があることが強く示唆された。なお、PisJ1の色素結合モチーフは、これまで知られているフィトクロム様色素タンパク質のモチーフとは非常に低い相同性しかなく、新しいタイプのフィトクロム様光受容体である可能性が高い。(2)シアノバクテリアの強光応答における遺伝子の発現プロフィールの時間変化をDNAマイクロアレイを用いて解析した。これによってはじめて、アンテナや光化学系反応中心の全遺伝子の発現の特徴的な応答、呼吸系の多重遺伝子の応答、多数の未知ORFの応答を明らかにすることができた。
建築構造分野での3Dプリンタの活用を視野に入れた材料試験の実施

本研究は、建築構造分野において3Dプリンタの活用を図るために、3Dプリンタで作製された試験体の材料試験(引張試験: JIS K7161、曲げ試験: JIS K7171)を実施し、材料の特性を知ることが目的である。本研究では、(1)試験体作製、(2)材料試験、(3)簡易的載荷実験の3つに分け、研究を進めた。(1)試験体作製ノートパソコン(DELL XPS13、Windows10)にインストールされた3Dモデリングソフト(Rhinoceros5、64bit)を利用し、材料試験に用いる試験体の3Dデータ(STLファイル)を作成した。作成されたデータより、プリント方向の異なる3種類の引張試験体及び曲げ試験体を、熱溶融積層法(FDM)の3Dプリンタ(Stratasys社製、MOJO)を利用してそれぞれ作製した。ちなみに、3Dプリンタの材料はABS樹脂である。作製された試験体の形状を、ノギスやマイクロメーター等で計測し、形状の確認を行った。(2)材料試験JIS K7161に従い引張試験を、JIS K7171に従い曲げ試験を実施した。引張試験においては、試験体両面にひずみゲージを貼付し、試験力とひずみを計測した。取得したデータより、最大応力やヤング率等を求めた。また、曲げ試験においては、試験力と中央点のたわみを計測した。計測したたわみから曲げひずみを算出し、最大応力やヤング率等を求めた。(3)簡易的載荷実験3Dプリンタで作製された単純ばりモデルを用いて、中央部位置に一点載荷する簡易的な載荷実験を実施した。各支点は簡易的に自作し、載荷は試験機により行った。中央点の変形量を視認及び計測器で計測し、載荷実験の実現性を示した。
非解離レーザー脱離機構の解明と励起空間制御による高効率法の開発研究

分子脱離に至るまでの機構を吸着する分子の分子内、分子間振動の数に着目して検討した。この結果をもとにゼオライトなどの三次元構造体をレーザー脱離イオン化法に用いた時に得られた結果を理論的に理解することができた。これらの研究結果を報文にまとめて発表したことにより、本申請課題の前半部分の課題解決を達成できた。ゼオライト上に酸化銅ナノ微粒子を担持させレーザーを照射すると、一価の銅イオンが効率的に生成しこれを試料のイオン化プローブとして利用できることを示した。またゼオライト表面の活性点に銅イオン交換を施したものと比較検討することにより、銅イオンの脱離機構についても検討を加え報文にまとめて発表した。同様の実験として、銀ナノ微粒子をゼオライト上に担持させたものをマトリクスとして利用し、従来法では測定が困難である短鎖のアルカンを開裂無しに測定できることを示した。この結果についても報文にまとめ報告した。また本申請課題の発展的要素でもあった分子構造を認識してイオン化させるマトリクスの開発についても成功した。分子鋳型を持つマトリクスを合成することで、分子量が同じだが構造の異なる三糖の分別イオン化に成功しただけでなく、アミノ酸の光学異性体の違いによる分別イオン化にも成功した。これらの結果は初歩的なものであったが、報文にまとめ速報として発表した。分子脱離に関する知見を得ることができ、マトリクス開発の研究に移行した。当初の計画と同じように進行しており、おおむね順調に進展していると考えている。特定の分子構造を持つ分子だけを選択的にイオン化できるマトリクスの開発をさらに進める。また、従来のレーザーイオン化法で検出が困難であり、テロ物質としても使われる可能性がある有機リン系農薬を高効率にイオン化できる手法を開発していく。また、これまでに開発したマトリクスを食品などに応用し、微量に含まれる発がん性物質や環境ホルモンの定量分析を行っていく。開発した時間分解質量分析装置を使い、MALDI法に関係するマトリクスの脱離ダイナミクスを観測した。2,4,6トリヒドロキシアセトフェノン(THAP)を用い、チタンサファイアレーザーの第二高調波(400nm)を二つに分割し、強度の弱いポンプ光(7microJ)により主に固体の振動を誘起させ、強度の強いプローブ光(10microJ)によりプロトン付加によるイオン化を行い、検出されるイオン強度の時間変化を観測した。ここではポンプ光、プローブ光単独ではイオンが観測されない条件で実験を行った。その結果[THAP+H]+イオンの脱離には光励起後13.2psを要することが分かった。さらにTHAPに構造が似ている1ヒドロキシ2アセトフェノン(HAN)を同条件で実験したところ、脱離には20psを要することが分かった。分子脱離には分子間振動モードを多量子励起することが重要であることが我々の過去の研究から分かっている。THAP及びHANの2量体及び3N-6則を仮定すると分子間振動モードの数は6と等しいが、実際は分子内振動モードと不可分であり、分子内振動モード数の多いHANが多くの分子間振動モードを持つことになる。得られた結果はTHAPに比べHANが相対的に多く持つ分子間振動モードが熱浴として働くため、脱離に必要なモードの振動励起が効果的に行われずに、脱離ダイナミクスが遅くなったことを示していると考えられる。実際、HANより極めて多くの振動モードを持つゼオライトをTHAPの熱浴として使用すると、[THAP+H]+イオンの脱利が120ps程度まで遅くなることを確かめてある。スメクタイトを利用したMALDI法を行うことで、層間距離以下の分子サイズを持つ分子のみをサイズ選択的にイオン化できる新たな手法を開発した。またアンモニア終端ゼオライトにより燐酸ペプチドが高強度に検出できることを発見した。これまで開発した時間分解質量分析法を利用した脱離ダイナミクスの研究に加え、スメクタイトやゼオライトなど様々な無機物質を利用した新しいイオン化法の開発にも成功している。これら開発したマトリクスが、薬物代謝物のレーザーイオン化法による測定に極めて適していることを理解した。これまで強酸性の酸化物固体や、分子サイズの層間距離を持つスメクタイトを利用したレーザーイオン化法を開発してきたが、今年度はより生体親和性の高いハイドロキシアパタイトを利用した分子イオン化を試みた。ハイドロキシアパタイト上に担持させた二酸化チタンを利用して糖鎖をイオン化させたところ、単に二酸化チタンを利用した時に比べ約2倍の強度で糖分解ピークを検出することができた。これはハイドロキシアパタイト上で二酸化チタンのキャリア寿命が延びたことが予想されるが、これはケルビンプローブを利用して現在検証中である。またハイドロキシアパタイトを他の半導体微粒子と組み合わせることで、特に負イオン生成に効果があると考えられるので、これも実験中である。以前より利用してきたゼオライトと弱有機酸を組み合わせたマトリクスを利用して、尿中に含まれる薬物及びその代謝物の検出を行った。グルクロン酸抱合体をはじめとした他の代謝物も夾雑物に妨害されることなく、前処理無しで検出できることが分かり、開発してきたマトリクスの有用性を示すことができた。芳香族炭化水素間の励起エネルギー移動を利用して、レーザーの波長が直接届かない吸収を持つ分子を高効率に脱離イオン化できることを示した。

アントラセンからテトラセンへ、さらにテトラセンからペンタセンへと励起エネルギーを移動させることで、ペンタセン単体を検出する方法に対し、約3倍のイオン強度を観測することができた。酸化物固体を利用した各種のレーザーイオン化法の開発に成功している。構造認識能をもつマトリクスの開発にも着手している。加えて、尿や汗中に含まれる分子を前処理を行わずに検出する方法も開発しており、順調に研究が進んでいると考えられる。ゼオライト上に吸着させた有機マトリクスを新たなマトリクスとして利用し、実際の尿中に含まれる薬物の測定に用いた。本法は薬物だけでなくその代謝物の定量測定にまで応用できるため、有効性が高いことが示された。研究結果は報文としてまとめ発表した。また、同じくゼオライト上に担持させた半導体ナノ微粒子をマトリクスとして利用することにより、清涼飲料水中に含まれる発がん性物質(4メチルイミダゾール)の測定に成功した。ゼオライト上に微粒子を担持させることで、信号の再現性が増し、定量測定を行うことに成功した。このため結果を報文にまとめ発表した。分子脱離研究から得られた知見を元に、2ステップの励起エネルギー移動を利用したレーザー脱離イオン化法を実現させた。特に芳香族炭化水素の一つであるアントラセンをエネルギーのアンテナ分子として利用し、テトラセンへのエネルギー移動を経て、ペンタセンのイオン化に成功した。直接的に光励起が難しい分子にもエネルギー移動を利用したイオン化が可能になったことから、結果を報文にまとめ発表した。また、半導体酸化物のナノ微粒子を絶縁体上(ゼオライトやアパタイト)に担持させることで、一価の金属イオンを高効率に生成させる手法を開発したため、時間分解分光法や計算化学の結果を加えた機構研究を含めて報文にまとめているところである。分子脱離に関する研究では、分子内、分子間振動の数に着目して、より詳細に脱離に至るまでの機構を検討した研究を遂行中である。これによって、これまでゼオライトなどの三次元構造体をレーザー脱離イオン化法に用いた時に得られていた結果を理論的に理解することができつつある。分子脱離に関する研究から、その知見を利用したマトリクス開発の研究に移りつつあり、順調に研究が進展していると考えられる。分子脱離に至るまでの機構を吸着する分子の分子内、分子間振動の数に着目して検討した。この結果をもとにゼオライトなどの三次元構造体をレーザー脱離イオン化法に用いた時に得られた結果を理論的に理解することができた。これらの研究結果を報文にまとめて発表したことにより、本申請課題の前半部分の課題解決を達成できた。ゼオライト上に酸化銅ナノ微粒子を担持させレーザーを照射すると、一価の銅イオンが効率的に生成しこれを試料のイオン化プローブとして利用できることを示した。またゼオライト表面の活性点に銅イオン交換を施したものと比較検討することにより、銅イオンの脱離機構についても検討を加え報文にまとめて発表した。同様の実験として、銀ナノ微粒子をゼオライト上に担持させたものをマトリクスとして利用し、従来法では測定が困難である短鎖のアルカンを開裂無しに測定できることを示した。この結果についても報文にまとめ報告した。また本申請課題の発展的要素でもあった分子構造を認識してイオン化させるマトリクスの開発についても成功した。
ヒト身体像を構成する神経表象の解明とミラーニューロンシステム仮説の検証

ヒトは,運動にともなって時々刻々と変化する自らの身体状態(あるいは身体像)を,脳内で内的に推定していると考えられる.このような内的な身体表象は,自己の運動指令や多種の感覚フィードバック情報を統合することにより,脳内で動的かつ統一的に保持や更新がなされる必要がある.本研究では,このようなヒト脳内の身体像を明らかにするため,ヒトの非侵襲脳機能計測法である脳磁図(MEG),および機能的核磁気共鳴画像法(fMRI)を使って,ヒトが運動を行っている際の脳活動を解析した.MEGとfMRIを組み合わせることで,時空間的に詳細な分析が可能である.本年度では,まず単純な手の運動を使って実験を行った.具体的に被験者には,スクリーン上に提示されたターゲットに対して,腕を使ったポインティング運動を行ってもらった.そして,その際の脳活動を計測し,運動実行時および運動前の準備段階での活動から,運動の方向を予測することを試みた.また,視覚座標系(スクリーンのターゲット位置)と運動座標系(手の運動方向)とを実験的に分離するため,被験者の腕を90度回転させた状態で同様の運動を行ってもらい,脳活動から予測された運動方向に対する影響を検討した.予備的結果から,脳部位に応じて異なる座標系(視覚と運動)の関与を明らかにすることができた.今後,これらの座標系がどのように動的に統合されて身体像が形成され,自己の運動制御,さらには他者の動作認知へと利用されているのかを検討する予定である.ヒトは,運動にともなって時々刻々と変化する自らの身体状態(あるいは身体像)を,脳内で内的に推定していると考えられる.このような内的な身体表象は,自己の運動指令や多種の感覚フィードバック情報を統合することにより,脳内で動的かつ統一的に保持や更新がなされる必要がある.本研究では,このようなヒト脳内の身体像を明らかにするため,ヒトの非侵襲脳機能計測法である脳磁図(MEG),および機能的核磁気共鳴画像法(fMRI)を使って,ヒトが運動を行っている際の脳活動を解析した.MEGとfMRIを組み合わせることで,時空間的に詳細な分析が可能である.本年度では,まず単純な手の運動を使って実験を行った.具体的に被験者には,スクリーン上に提示されたターゲットに対して,腕を使ったポインティング運動を行ってもらった.そして,その際の脳活動を計測し,運動実行時および運動前の準備段階での活動から,運動の方向を予測することを試みた.また,視覚座標系(スクリーンのターゲット位置)と運動座標系(手の運動方向)とを実験的に分離するため,被験者の腕を90度回転させた状態で同様の運動を行ってもらい,脳活動から予測された運動方向に対する影響を検討した.予備的結果から,脳部位に応じて異なる座標系(視覚と運動)の関与を明らかにすることができた.今後,これらの座標系がどのように動的に統合されて身体像が形成され,自己の運動制御,さらには他者の動作認知へと利用されているのかを検討する予定である.
ヘム鉄存在下の酸化ストレスによる腸管バリアー能低下とそのポリフェノールによる抑制

(1)ヒト大腸癌由来培養細胞株Caco-2を単層培養し、3週間培養を続けた後、細胞層を20μMのケルセチン、または、ケルセチン-4'-グルコシドにより1時間処理した。HPLCにより分析し、細胞へのポリフェノール類の取り込みを調べた結果、ケルセチンは細胞に取り込まれているが、ケルセチン-4'-グルコシドはほとんど細胞には取り込まれていないものと考えられた。(2)平成12年度に報告したように、脂質過酸化ラジカルによる細胞障害をケルセチン-4'-グルコシドは抑制するが、ケルセチンには抑制作用がなく、1の結果と一致しない。これには、ポリフェノールが取り込まれた部位と酸化ストレスが発生している部位が異なる、あるいは代謝産物が活性を示すなどの原因が考えられた。(3)活性酸素種として、過酸化水素を用いて、Caco-2細胞層を処理したときの細胞障害作用を細胞層の物質透過性の変化を調べることにより評価した。その結果、1mMの過酸化水素により細胞層は軽度の障害(物質透過性の上昇)を受けることが示された。また、過酸化水素に加えヘム鉄としてミオグロビンを共存させると、細包層への障害が軽減された。これは、昨年度報告したt-ブチルヒドロぺルオキシド(TBHP)とミオグロビンが共存することにより細胞障害活性が増大するという結果と大きく異なる。(4)本研究で用いたモデル系で評価すると、活性酸素種としてTBHPが存在する場合には腸管内容物中のヘム鉄が酸化ストレスを引き起こし、一方、活性酸素種として過酸化水素が存在する場合には腸管内容物中のヘム鉄は酸化ストレスを抑制すると示唆された。(1)ヒト大腸ガン由来培養細胞株Caco-2を透過性膜上に単層培養し、35週間培養した後、細胞間経路による物質透過性を経上皮電気抵抗(TEER)を測定することにより評価した。(2)有機過酸化物としてのt-ブチルヒドロぺルオキシド(TBHP)および、ヘム鉄としてのミオグロビンによりCaco-2細胞層を処理したときの物質透過性の変化を(1)により調べた。ミオグロビン存在下1mMのTBHPで細胞層を処理すると、経時的に物質透過性が上昇し、2時間後にはTEERは処理前に約2割にまで低下した。また、TBHPの処理濃度を500μMとすると、TEERは約8割にまで低下するにとどまった。一方、TBHP濃度を5、10mMと高くしても、そのTEER低下活性の強さや経時変化に違いは認められなかった。(3)次に同様の処理をマイクロプレート上に35週間培養したCaco-2細胞層を用い、その生細胞数をアラマブルーアッセイにより評価した。その結果、(2)とほぼ同様な結果が得られ、ミオグロビン存在下、4mMのTBHPで処理することにより、生細胞数が12割程度に減少することが示された。そこで、以下の実験は(3)のアッセイ系を用いて進めた。(4)脂質過酸化ラジカルによる腸管細胞の障害に食品由来ポリフェノールが及ぼす影響を検討した。細胞層を、カテキン、ケルセチンまたはケルセチン-4,-グルコシドによりあらかじめ処理した後に、脂質過酸化ラジカル処理をした。その結果、カテキンやケルセチンには細胞障害抑制が認められなかったが、ケルセチン-4,-グルコシド前処理により顕著な細胞障害抑制活性が認められた。(5)活性酸素種として過酸化水素を用いた実験は本年度内に完了することは出来なかった。
メタン生成細菌のリボソ-ムRNAを標的とする自然環境での生存数測定法に関する研究

本継続研究の最終年度である平成3年度においては、平成2年度の研究の成果として得られたメタン生成細菌の16Sリボソ-ムRNAの部分塩基配列のデ-タを基にして、各メタン生成細菌に特異的な配列の16Mer18MerのDNAプロ-ブを作成し、in situハイブリダイゼ-ション法によるメタン生成細菌の非培養的な検出方法の開発を行った。この結果として、対照として用いた大腸菌やArthrobacter属の真性細菌とは識別して検出することが可能であったものの、メタン生成細菌の種間の識別は困難な場合があることが知られた。したがって、この方法による通常の環境から採取した資料中のメタン生成細菌の分布と生態の調査は、基本的には可能と考えられるものの、DNAプロ-ブの特異性とin situハイブリダイゼ-ションの手法上のさらなる改良が必要であると結論付けられた。別法として行った上記DNAプロ-ブによる各メタン生成細菌のスロットブロットハイブリダイゼ-ション法を用いた検出では、識別検出が可能であったことから、上記結果は、DNAプロ-ブの種特異的な取り込みとリンシングに不完全な点が存在するものと推定された。今後は、in situハイブリダイゼ-ションに限定せず、PCR法とDNAプロ-ブ法との組合わせ等によるメタン生成細菌の種特異的な定量方法の開発が必要と考えられた。本研究において同時に実施した湖沼底泥より新たに分離したメタン生成細菌(水素資化性球状メタン生成細菌)および湖沼底泥自体のメタン生成活性とメタン生産能力の底泥深さ方向における違いについての調査結果より、水素資化性メタン生成細菌の活性度が酢酸資化性メタン生成細菌に比較して高いことが知られた。また、底泥中の有機物含量および酸素との接触等によって、湖沼底泥中のメタン生成細菌の分布が変化していることが示唆された。地球規模環境問題に関連して近年注目されている環境中でのメタンガス発生量の推定に関して、その基礎となるメタン生成細菌の実環境での生態が十分に解明されていないことが問題視されている。本研究は、このような状況を克服してより正確にメタン生成細菌の存在状態を把握するために、遺伝子工学における新しい研究手法を用いて、環境におけるメタン生成細菌の計数方法の確立を目的として開始された。初年度に当たる平成2年度においては、まず湖沼底泥のメタンガス発生ポテンシャルが、湖沼底泥の温度や有機物含量によってどのように変動するかを調査した。その結果、湖沼底泥に枯死水性植物が供給される周期後半においてメタンガス発生ポテンシャルが高まることが知られた。また、湖沼底泥に生息するメタン生成細菌の分離培養を試み、水素資化性メタン生成細菌(球菌)数株の集積培養に成功したが、まだ他の細菌の混入がみられ、完全な純粋分離には至っていない。このため、ドイツの微生物保存期間(DSM)に寄託されている純粋分離メタン生成細菌4株(Methanobacterium formicicum,Methanobacterium thermoautotorophicum,Methanosarcina barkeri,Methanothrix soehngenii)を用いて、それらから16Sリボソ-ムRNAを抽出回収するための菌体の大量培養を行なった。大型バイアルを用いる方法を新たに開発し十分量のメタン生成細菌体が得、塩基配列決定実験に供するうえで十分量の16Sリボソ-ムRNAを抽出することが可能であった。今後は、それらの回収RNAを用いて塩基配列を決定し、それに含まれる特定のメタン生成細菌に特異的な塩基配列を検索するとともに、その特異部分にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドDNAプロ-ブを開発し、in situハイブリダイゼ-ション法による環境場でのメタン生成細菌の定量的検出方法を確立する予定である。
配糖体分子による精密構造認識と分子会合に関する研究

多彩な花色は、そのほとんどがアントシアニンによる。この花色素は、精密な構造認識に基づく分子会合体となって初めて美しい色を発現する。これらの分子会合体の形成には、金属イオン、コピグメントのみならず、分子内の芳香族酸残基なとも関与し、いずれも、結合糖鎖によって会合の立体が規定され、自己組織化した分子会合体によりアントシアニンの深色化と安定化が起き、千差万別な色となる。会合における不斉分子認識と花色発現の関係を明らかにするためには、コピグメントの非天然型のL-糖鎖を持つフラボンが必須である。本研究では会合実験に用いる配糖体フラボンとしてウルギノサの青色色素金属錯体色素の構成成分の4',7-diglucosylapigeninを考えた。このapigeninの4'-フェーノル性水酸基の求核性が小さいために直接グリコシル化できなかった。新たに、フェノール性水酸基にアセチルフッ化グルコースを糖供与体を用い,3-フッ化ホウ素エーテル錯体をプロモーターとし、塩基存在下に、高収量で立体選択的にグリコシル化する方法を開発し、目的とするP-配糖体の合成に成功した。4',7-diglucosylapigeninの天然型D-、非天然型L-グルコースを持った可能な4種の全ての配糖体フラボンを合成した。4',7位がD-DとL-D、D-L、L-Lのdiglucosylapigeninを用いた再構成実験の結果、D-D体とD-L体が青色超分子色素形成したが、L-D体とL-L体からでは、紫色になり速やかに退色した。D-D体では、長期間安定であったが、D-L体は1日で退色した。4'位の糖の絶対配置が超分子形成に決定的役割をしていることが分った。自己組織化と発色には糖鎖が重要な役割をしていることが明かとなり、今後、この精密な分子認識機構を明らかにする予定である。
化学療法による末梢神経障害のアセスメントシートの開発と妥当性の検証

1.研究目的:本研究の目的は、化学療法による末梢神経障害のアセスメントシートの妥当性について検証することである。平成20年度は、化学療法による末梢神経障害のアセスメンドシートを開発するために、末梢神経障害のアセスメント項目(症状の種類や評価、日常生活への影響、対処法など)についで検討し、アセスメントシートおよびケア基準を作成した。2.研究方法:化学療法による末梢神経障害に関する評価尺度や介入(支持療法や対処法)について文献検討を行い、先行研究で抽出した末梢神経障害のアセスメント項目を基に、妥当なアセスメント項目および臨床適用するためのアセスメントシートの作成とそれに付随するケア基準について検討を行った。3.研究結果: CINAHL等の文献検索システムを用いて最近5年間の文献検討を行った結果、末梢神経障害の評価はNCI-CTCAE等の毒性判定基準を用いて評価を行うと共にQQL測定を行っているものが多かった。また、介入は支持療法や対処法として確立されたものはなく、各施設で症状の重症度に応じて現時点で妥当な対応基準を作成していることが明らかになった。文献検討の結果から、アセスメントシートの内容は末梢神経障害の認知、評価、日常生活への影響、休薬の判断等のアセスメント10項目を活かし、症状の程度の評価で既存の毒性判定基準を併用するものとした。また、ケア基準の内容は治療開始前と治療開始後の症状の重症度別に支持療法と対処法、日常生活の注意点等の療養生活指導とし、支持療法の適用に関しては医師との協働によって実施するものとした。外来化学療法に携わる看護師やがん看護の専門家、専門医に意見をもらい、作成したアセスメントの内容や項目について再検討を行った。今後は作成したアセスメントシートを実際に臨床適用し、その調査結果を元にさらにアセスメントシートを精錬していく必要がある。
電位規制界面XAFSによる溶存物質の局所構造と分布の直接測定

水溶液中で起こる物質の変化や電極に対する吸着を、電極電位を規制しながら、XAFS法、および熱レンズ法で吸着量や吸着化学種、およびその吸着構造変化等を観察することを試みた。導電性のある透明な膜であるITOを蒸着したガラス板とダブプリズムを用いて、ITO電極に印加する電位によって塩化金酸イオンが金コロイドに還元される様子を熱レンズとサイクリックボルタモグラム両面から観測した。また、陽イオン性界面活性膜を用いて溶存イオンの表面膜への吸着挙動を全反射XAFS法によって見積もった。水溶液中の電極表面は、サイクリックボルタンメトリーにおいてはさまざまな反応が起こる場であり、電気化学や触媒化学のみならず、機能材料や生態試料の反応に関するシミュレーションの場としても有用である。水溶液中での電極表面、すなわち固液界面で起こる現象を捉えるために近年ではSTM、AFM、SHG、SFGなどによってin situで測定する方法が多数開発されてきており、固液界面への注目度の高さが伺える。本研究では、水溶液中で起こる物質の変化や電極に対する吸着を、電極電位を規制しながら、XAFS法、および熱レンズ法で吸着量や吸着化学種、およびその吸着構造変化等を観察することを試みた。まず、水溶液中の表面観察上で重要となる熱レンズによるXAFS測定法を確立するために、臭化亜鉛濃厚水溶液を用いて、高エネルギー加速器研究機構放射光研究施設にて測定を行った。He-Neレーザーの光をプローブ光とし、このプローブ光をX線と同軸で試料に照射し、X線の吸収によって発生した熱を観測してXAFSスペクトルとした。この方法は非常に表面の感度が高く、照射したX線がウィンドウ材に吸収されて大きなバックグランドとなり、良好なスペクトルが得られなかったが、非常に薄いポリプロピレン膜を窓材にすることでXAFSスペクトルを得ることができた。また、半球レンズにITOやIZOなど、導電性のある透明な膜を平板面に蒸着し、アルゴンレーザー光を半球レンズガラス平面/水溶液界面で全反射するように球面側から入射し、電極表面に存在する物質の熱吸収を観測した。これらの方法は現在、改良開発中である。ITOやIZOなど、導電性のある透明な膜を蒸着したガラス板とダブプリズムを用い、アルゴンレーザー光をITO膜/水溶液界面で全反射するように入射し、電極表面に存在する物質の熱吸収を熱レンズ法によって観測した。水溶液に塩化金酸水溶液を用いて、ITO膜を作用電極として電位を掃引し、印加する電位によって塩化金酸イオンが金コロイドに還元される様子を熱レンズとサイクリックボルタモグラム両面から観測した。電位の掃引によって金コロイドが薄膜上にITO電極表面に吸着していく様子が観察され、電極表面で起こっている微小な金膜生成挙動をサイクリックボルタンメトリー同時観測できることが明らかとなった。また、金の生成量と金膜の厚さから電極表面での膜の生成速度について考察を行った。
左室と右室の心筋は本質的に異質か？

左心室の心筋と右心室の心筋は、それぞれが第一心臓領域と第二心臓領域と称する胚発生上は異なる起原の前駆細胞から発生する。胚発生においても、マウスES細胞を用いた実験室レベルでの心筋分化誘導においても、この二つの細胞集団はお互いに均一に混ざり合うことはなく、各々がクラスターを形成する。この事実と、修正大血管転位症で体循環を担う本来は右室である心室が、長期経過で体循環を支えることができなくなり心不全に陥る事実から、研究代表者は右心室と左心室の心筋は元々本質的に性質が異なるとの独自の作業仮説をたてた。本研究計画では、この作業仮説を検証することを目的とした基盤研究を展開する。左右心室心筋を遺伝学的なマーキングで区別できるよう遺伝子改変が施されている独自に開発したマウスES細胞(BAC Tbx5-CreERT2/R26R-eYFP ES細胞)を用いて、環境要因による後天的差異が生じないようにin vitroで心室心筋を分化誘導し、得られた右室心筋と左室心筋の(1)網羅的遺伝子発現プロファイル、(2)網羅的蛋白発現プロファイルと、(3)力学特性、について検証する。現在まで、研究代表者が平成28年度まで在籍していたロンドン大学メアリ女王校で、当研究で使用するBAC Tbx5-CreERT2/R26R-eYFP ES細胞を樹立した。日本へと持ち帰ったこのES細胞株に重大な支障が生じた。ES細胞の維持培養に現在広く用いられている2i+LIF培地と呼ばれる培地を用いていたが、これにより維持してきたES細胞が、継代を重ねるごとに心筋分化の効率が著しく低下した。2i+LIFで維持されたES細胞は、エピジェネティックな状態に大きな変化を生じて、分化能に大きな影響が生じ得るとの最新の報告がある。現在、この問題を解決するための作業中である。研究計画に従い実験を開始したが、以下に述べるような不測の事態に直面したこと、研究施設を異動したこと、研究に参画する人員の不足から、進捗が大きく遅れている。英国で維持培養と心筋分化の条件が最適化されていたマウスBAC Tbx5-CreERT2/R26R-eYFP ES細胞を、日本で手に入る材料(培地、血清や薬品を含む)を用いてまずは維持培養を試みたところ、未分化性や心筋分化能に大きな劣化を起こす事態が発生していた。最新の研究報告によれば、これはES細胞の維持培養に現在広く用いられている2i+LIF培地(本研究でも使用していた)は、ES細胞のエピジェネティックな状態に変化を生じさせ、分化能に大きな影響が生じ得るとのことであり、私達もこの問題に直面しているらしいことを突き止めた。研究代表者は、2018年11月に大阪大学より京都府立医科大学へと異動し、新しく赴任した施設で新たに研究を再開するための環境整備を行わねばならなかった。このことも研究の進展を大きく遅らせてしまった原因となった。また、この異動に伴い、新たに研究を推進するための人員も確保せねばならなくなったことも研究の進展に与えた影響は大きいと考えられる。まずはBAC Tbx5-CreERT2/R26R-eYFP ES細胞を、心筋分化に最適な分化能を維持した状態へと戻し、心筋分化誘導のプロトコールを改めて最適化を行う。これらが完了次第、右室心筋と左室心筋をセルソーターを用いて分別し、遺伝子発現プロファイル、蛋白発現プロファイル、そして力学特性の測定に着手する。人員の不足を解消するために、積極的に大学院生のリクルートも行う。日本へと持ち帰ったこのES細胞株を、現在の所属施設における研究環境下で、研究に用いるためのベストな状態、すなわちナイーブな基底状態たる多能性を保持したまま維持培養する培養条件を検討し、最適化を行なった。現在、心筋分化条件の最適化を行なっている。

研究計画に従い実験を開始したが、以下に述べるような不測の事態に直面したこと、研究に参画する人員の不足から、やや進捗が遅れている。英国で維持培養と心筋分化の条件が最適化されていたマウスBAC Tbx5-CreERT2/R26R-eYFP ES細胞を、日本で手に入る材料(培地、血清や薬品を含む)を用いてまずは維持培養を試みたところ、未分化性や心筋分化能に大きな劣化を起こす事態が発生した。そこで、まずは培地に用いる材料を一つ一つ検証し、心筋分化能を有する多能性幹細胞としての維持培養プロトコールの最適化を行い、これを完了した。次に、英国で最適化した心筋分化プロトコールにて心筋分化を試みると、分化の途上で強い細胞死が惹起されてしまい、心筋分化に至る前に細胞が死に絶えてしまう事態に直面した。現在、このプロトコールの最適化作業中である。英国で手に入る材料を用いた場合よりも、日本で手に入る材料を用いた場合は分化のスピードが2日ほど遅くなり、英国で最適化された条件設定では、分化誘導するための増殖因子を用いた刺激が最適なタイミングで行われなくなってしまっていたこと、および、培地に加える添加物のロットによっては全く適さないことが、現在までに把握している細胞死の原因と考えられた。左心室の心筋と右心室の心筋は、それぞれが第一心臓領域と第二心臓領域と称する胚発生上は異なる起原の前駆細胞から発生する。胚発生においても、マウスES細胞を用いた実験室レベルでの心筋分化誘導においても、この二つの細胞集団はお互いに均一に混ざり合うことはなく、各々がクラスターを形成する。この事実と、修正大血管転位症で体循環を担う本来は右室である心室が、長期経過で体循環を支えることができなくなり心不全に陥る事実から、研究代表者は右心室と左心室の心筋は元々本質的に性質が異なるとの独自の作業仮説をたてた。本研究計画では、この作業仮説を検証することを目的とした基盤研究を展開する。左右心室心筋を遺伝学的なマーキングで区別できるよう遺伝子改変が施されている独自に開発したマウスES細胞(BAC Tbx5-CreERT2/R26R-eYFP ES細胞)を用いて、環境要因による後天的差異が生じないようにin vitroで心室心筋を分化誘導し、得られた右室心筋と左室心筋の(1)網羅的遺伝子発現プロファイル、(2)網羅的蛋白発現プロファイルと、(3)力学特性、について検証する。現在まで、研究代表者が平成28年度まで在籍していたロンドン大学メアリ女王校で、当研究で使用するBAC Tbx5-CreERT2/R26R-eYFP ES細胞を樹立した。日本へと持ち帰ったこのES細胞株に重大な支障が生じた。ES細胞の維持培養に現在広く用いられている2i+LIF培地と呼ばれる培地を用いていたが、これにより維持してきたES細胞が、継代を重ねるごとに心筋分化の効率が著しく低下した。2i+LIFで維持されたES細胞は、エピジェネティックな状態に大きな変化を生じて、分化能に大きな影響が生じ得るとの最新の報告がある。現在、この問題を解決するための作業中である。研究計画に従い実験を開始したが、以下に述べるような不測の事態に直面したこと、研究施設を異動したこと、研究に参画する人員の不足から、進捗が大きく遅れている。英国で維持培養と心筋分化の条件が最適化されていたマウスBAC Tbx5-CreERT2/R26R-eYFP ES細胞を、日本で手に入る材料(培地、血清や薬品を含む)を用いてまずは維持培養を試みたところ、未分化性や心筋分化能に大きな劣化を起こす事態が発生していた。
X線精密電子密度解析と磁気共鳴法による水素結合系の評価

結晶中における強い水素結合の静的構造と動的構造を明らかにする目的で、単結晶X線回折と核磁気共鳴(NMR)・核四極共鳴(NQR)の測定を行った。対象とした系は、短いN-H...O(あるいはN...H-O)型水素結合をもつと期待される、クロラニル酸-ピリジン類およびクロロニトロ安息香酸-ピリジン類である。主な成果は、(1)クロラニル酸-フェナジン1 : 1化合物における強誘電体相間の相転移とO...H...N水素結合との関係の解明(2)クロラニル酸-1, 2-ジアジン1 : 2化合物におけるN...H...O水素結合系のポテンシャルエネルギーの解明(3)プロトン移動を伴う短いN...H...O水素結合を有するクロロニトロ安息香酸-キノリン及びクロロニトロ安息香酸-フタラジン化合物系の発見である。1)クロラニル酸-フェナジン1:1化合物の強誘電体相である相IIと相IVについて,単結晶X線構造解析を170Kと93Kで行い,両相が同じ空間群P21で記述できること,さらに,相IIでは中性分子からなる分子性化合物であったのに対し,相IVではクロラニル酸よりプロトンがフェナジン側へ移動し,イオン性分子からなるイオン性結晶になることを明らかにした.また,このプロトン移動を伴う中性-イオン性相転移は35Cl核四極子共鳴および1H-14N核四極子二重共鳴の温度変化の実験でも明らかにされ,プロトン移動に関する同位体効果も観測された.そして,クロラニル酸-フェナジン間のO.H.N水素結合が強誘電性および固相転移に大きな影響を与えていることを明らかにした.クロラニル酸-フェナジン1:1系と同様の結晶構造をもつと予想される,クロラニル酸-キノクサリン1:1化合物の95Kにおける結晶構造をX線回折より求めた.これらの知見は欧文誌,Acta Cryst.およびJ.Phys.: Condens. Matterに発表した.2)クロラニル酸-アミン化合物の水素結合系の構造を調べるためにアデニンおよび4,4'-ビピペリジンを取り上げ,その結晶構造をX線回折より求めた.クロロ-ニトロ安息香酸-アミン系におけるN.H.O水素結合の探索のため,2-クロロ-4-ニトロ安息香酸と4,4'-ビピリジ化合物の結晶構造をX線回折より求めた.以上の結果は欧文誌,Acta Cryst.に発表した.1)クロラニル酸--1,2-ジアジン(1:2)およびクロラニル酸--1,4-ジアジン(1:2)化口物におけるN...H...O水素結合系を調べる目的で、単結晶X線回折と核四極共鳴の実験を行った。両化合物において水素結合中の水素原子は無秩序状態にあることをX線結晶構造解析により明らかにした。また、その温度変化(測定温度範囲:110-260K)より、クロラニル酸--1,2-ジアジン(1:2)化合物ではO原子側の水素原子の占有率が温度上昇とともに大きくなることを見出した。一方、クロラニル酸--1,4-ジアジン(1:2)化合物においては水素原子の占有率は温度に対し殆んど変化しないことが分かった。クロラニル酸--1,2-ジアジン(1:2)における水素移動は塩素35核四極共鳴の温度変化の実験からも確認され、共鳴周波数の温度変化についてO原子側とN原子側の水素原子のポテンシャルエネルギーの差に基づいて議論を行った。これらの結果は、欧文誌Acta Cryst.およびPhys. Chem. Chem. Phys.に発表した。また、クロラニル酸--ピリジン誘導体系の水素結合系構造を調べるため、2-,3-,4-シアノピリジン、2-,3-,4-ヒドロキシピリジン、2-,3-,4-アミノピリジンを取り上げ、その結晶構造をX線回折より求めた。結果の一部はActa Cryst.に発表した。2)クロロニトロ安息香酸--ピリジン誘導体の系における短いN...H...O水素結合とプロトン移動を行う系の探索を目的として約40種の化合物を合成し、その結晶構造をX線回折実験にて明らかにした。

その結果、クロロニトロ安息香酸--キノリン及びクロロニトロ安息香酸--フタラジン化合物の系に、N...H...O水素結合の水素原子が無秩序状態にあるものを見出した。クロロニトロ安息香酸--キノリン系の結晶構造に関する知見は第2回分子科学討論会2008で発表し、現在、論文を作成中である。
特異な不斉場を持つ光学活性フエロセンの合成とその不斉合成反応への応用

新規配位子として(1R,4R)-フェロセニルジオールを合成しこのスカンジウム錯体が不斉ディールズーアルダー反応の良好な触媒となることを明らかにした。この結果を受けて,新規1,4-フェロセニルジアミン配位子の合成を試みた。(1R,4R)-フェロセニルジアセテートをTHF/MeOH中でアンモニア水と反応させたが,目的のジアミンは生成せず1(1R,4R, Sp)-1,4-フェロセニルアセトアミドアルコールが単一のジアステレオマーとして得られた。この構造はX線構造解析により明らかにした。また,(1R,4R)-フェロセニルジアセテートをアセトン/水中で加水分解をしたところ,一方のアセトキシ基がより速く加水分解を受けて,対応するハーフエステルが生じることを明らかにしている。このように,1,2-置換フェロセン化合物において二つの置換基の立体配列が異なり,反応性の差を生じさせていることが原因であると考察した。すなわち,フェロセン基に対してexo側の置換基は鉄カチオンの隣接基関与により,脱離が加速されてカルボカチオンを形成し,立体保持で置換を受ける。もう一方の置換基はフェロセン基に対してendoの配列をとり,鉄カチオンの隣接基関与を受けず,安定なカルボカチオンが生成しない。これを裏付ける証拠としてジアセテートのX線回折を行い,二つの置換基の立体配列が予想した通りの構造であることを明らかにした。アミノリシスの全体の反応機構は以下のようにして進行すると考察した。すなわち,exoアセテートがアンモニアに立体保持のS_N1反応を受け,生じたアミノ基が分子内で隣接のアセトキシ基のカルボニル炭素を攻撃する。分子内アシル化によりアセトアミド基となり,アセテートは水酸基となる。分子内アシル化を妨げるように立体障害の大きなエステル基,すなわちピバロキシ基を用いてアミノリシスを行うと,アミノ基はアシル化を受けずにアミノエステルが生じた。このことから、本反応機構は妥当であると考えられる。オルト置換アミノホルミルフェロセンを合成し,有機マグネシウム,リチウム,および亜鉛化合物のホルミル基への付加反応の立体化学に関し検討した。臭化エチルおよびフェニルマグネシウムは高い立体選択性でホルミル基へ付加し,対応するアミノアルコールを単一のジアステレオマーとして生成した。一方,ジエチル亜鉛との反応も単一のジアステレオマーのアミノアルコールを生成するが,生成物の立体化学は有機マグネシウムとの生成物と異なっていた。次に,オルト置換アミノアシルフェロセンを合成し,種々の金属水素化物によるカルボニル基の還元反応を検討した。水素化アルミニウムリチウムや水素化ホウ素ナトリウムとは中程度の選択性で還元反応が進行し,対応するアミノアルコールが生成した(35%de)。水素化ジイソブチルアルミニウムを用いると,対応するアミノアルコールが単一のジアステレオマーとして生成するが,この場合のアミノアルコールの立体化学は水素化リチウムアルミニウムとの反応より得られた生成物と異なっていた。上記の付加反応及び還元反応において,立体選択性は有機金属種の種類によりアミノ基とホルミル基のキレーションまたはノンキレーションコントロールのいずれかにより制御されていると考えられる。光学活性アミノアルコールを変換し,光学活性フェロセン1,4-ジオールおよびジホスフィン誘導体を合成し,不斉合成反応への応用を検討した。ジホスフィンをパラジウム錯体の配位子として用い,不斉アリル置換反応を行った。

反応は円滑に進行するが,不斉収率は最大30%eeと低い値に終わった。1,4-フェロセンジオールをルイス酸錯体の配位子として用い不斉Diels-Alder反応を検討した。ルイス酸としてスカンジウムトリフラートを用いたときに最大90%eeの高い選択性で反応が進行し,この配位子が優れた立体反応場を構築することが判明した。平成13年度の研究において合成した光学活性1,4-フェロセニルジオールを各種ルイス酸錯体の配位子として用い,シクロペンタジエンと3-アシルオキサゾリジノンとの不斉ディールズーアルダー反応において各錯体触媒の性能に関して検討した。スカンジウムとの錯体がこの反応を円滑に触媒し,対応するendo生成物が最大91%eeと高いエナンチオ選択性で生成することが分かった。この反応には2,6-ルチジンとMS-4Aの添加が不可欠であり,どちらかが欠けると著しく選択性は低下する。1,4-フェロセニルジオールの置換基をメチル,フェニル,1-ナフチル,2-ナフチル基と変えて同様の反応を行うと,フェニル基の場合に最も高い選択性が得られた。o-メチルフェニル基では返って選択性が著しく低下してしまい,10%ee程度の選択性しか得られない。1,4-フェロセニルジオールの置換基がフェニル基の場合,結晶化に成功し,X線構造解析を行った。一つのユニットが水素結合で結合した1,4-フェロセニルジオールの三量体構造をとっており,もう一つのユニットが結晶溶媒のベンゼンをサンドウィッチしている極めて特異的な構造をとっていることが判明した。構造解析よりこのフェロセン化合物の分子設計をし,3,5-ジメチルフェニル誘導体の合成を行ったところ更にこの反応の選択性を向上させることに成功した。次に,1,4-フェロセニルジオールを配位子として用いて,α-メチルスチレンとグリオキシル酸ブチルとのカルボニルエン反応の検討を行った。金属錯体としてはチタン錯体が最も良好な結果を与え,最大70%eeで付加生成物を生じることが分かった。この反応には,酢酸を添加するとエナンチオ選択性の向上が見られた。新規配位子として(1R,4R)-フェロセニルジオールを合成しこのスカンジウム錯体が不斉ディールズーアルダー反応の良好な触媒となることを明らかにした。この結果を受けて,新規1,4-フェロセニルジアミン配位子の合成を試みた。(1R,4R)-フェロセニルジアセテートをTHF/MeOH中でアンモニア水と反応させたが,目的のジアミンは生成せず,(1R,4R, Sp)-1,4-フェロセニルアセトアミドアルコールが単一のジアステレオマーとして得られた。この構造はX線構造解析により明らかにした。また,(1R,4R)-フェロセニルジアセテートをアセトン/水中で加水分解をしたところ,一方のアセトキシ基がより速く加水分解を受けて,対応するハーフエステルが生じることを明らかにしている。このように,1,2-置換フェロセン化合物において二つの置換基の立体配列が異なり,反応性の差を生じさせていることが原因であると考察した。すなわち,フェロセン基に対してexo側の置換基は鉄カチオンの隣接基関与により,脱離が加速されてカルボカチオンを形成し,立体保持で置換を受ける。
母性行動とプロラクチン受容体発現制御機構に関する研究

プロラクチンは、単に乳腺発育や乳汁分泌維持作用を示すのみでなく母性行動の誘起、維持にも重要な役割を有するホルモンであることが明らかになってきた。今年度私達は、乳仔接触刺激による非妊雌及び雄ラットの母性行動・父性行動を観察すると共に、脳内のプロラクチン受容体mRNAの発現について検討した。また同時に血中プロラクチン濃度の変化についても検討を加えた。雌及び雄ラットの母性行動については各ラットを収容したケージ内に生後316日目の仔ラットを2匹入れ、crouching, licking, nest building, retrieval and groupingの5項目について毎日2時間、2週間仔に対する行動を観察記録した。脳内のプロラクチン受容体mRNAの発現についてはlong form及びshort formの2つの分子種を同時に特異的に検出できるように構築したRNAをプローブとするRNase Protection Assay法により行った。また血中プロラクチン濃度はEIA法により分析した。その結果、仔ラットに対する母性行動・父性行動の発現には性差なく仔ラットへの接触日数と共に、愛着行動の増加していくことが観察された。そこで乳仔に対する母性行動、父性行動が誘導された雌及び雄ラットの脳内プロラクチン受容体mRNAの発現をみると、プロラクチン受容体mRNAのlong formの発現が有意に増加していた。また母性行動、父性行動を示したラットでは明らかに血中プロラクチン濃度が上昇していた。以上、乳仔に対する母性行動・父性行動は性差を問わず、基本的に備わっている能力であり、プロラクチンは脳内プロラクチン受容体遺伝子の発現を誘導し、その結果仔への母性行動あるいは父性行動を促進することが示唆された。プロラクチンは、単に哺乳動物の乳汁分泌作用を示すのみでなく、広く保育行動・浸透圧調節等に関与するホルモンである。その標的臓器に存在するプロラクチンレセプター(PRLR)mRNAは、臓器、性差あるいは各種の性ステロイドホルモンにより発現量の異なることが報告されている。今年度私達は、ラット腎臓及び肝臓におけるPRLRmRNA分子種の解析と性ステロイドホルモンに対する誘導の有無について検討した。ラットの各臓器からtotal RNAを抽出し、Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)法によりPRLRcDNA断片を増幅し、合成プローブを用いたSouthern hybridization法によりPRLR mRNAを定量した。ラット腎臓及び肝臓におけるPRLR mRNAの発現レベルをみると、腎臓における発現はメスよりもオスにおいてやや高く、一方肝臓ではオスにおいては非常に発現量が低いのに対してメスでは高い発現レベルを認めた。そこで成長発育に伴う各臓器のPRLR mRNAの発現動態をみると、メスでは成長に伴いPRLR mRNAの発現レベルが増加していくのに対して、オスでは除々に減少した。メスラット腎臓では性成熟後にそのレベルが減少していくのに対して、オスでは発育に伴い除々に増加した。性ホルモンによる発現誘導をみると、肝臓ではエストラジオールがPRLR mRNAの発現を誘導し、テストステロンがその発現を抑制した。また腎臓では逆にエストラジオールがその発現を抑制した。以上、ラット腎臓及び肝臓におけるPRLR mRNAの発現は性ホルモンによりparadoxicalに調節されていることが明らかとなった。プロラクチンは、単に哺乳動物の乳汁分泌作用を示すのみでなく、広く保育行動・浸透圧調節などに関与するホルモンである。その標的臓器に存在するプロラクチン受容体(PRL-R)mRNAは、臓器、性差あるいは各種の性ステロイドホルモンにより発現量が調節されていることを昨年度報告した。今年度私達は、腎臓および肝臓におけるPRL-R mRNA分子種の解析と性ステロイドホルモンに対する誘導の有無について、成長発育に伴う変化から検討した。ラットの各組織からtotal RNAを抽出し、Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)法によりRPL-R cDNA断片を増幅し、合成プローブを用いたSouthern hybridization法によりPRL-R mRNAを定量した。