hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グラフのboxicity，競争数及びそれらに関連するグラフ不変量の挙動の解明

2のクラスに属するグラフが持つ対称性を考慮し,既存の計算方法を試みたが,boxicityの大きさを保証する下界のさらなる研究が必要になった。最終年度には,まず,グラフのboxicityを整数計画問題の最適値として記述できることを明らかにした。この問題の線形緩和で得られる最適値(fractional boxicityと名付けた)はboxicityの下界になる。fractionalboxicityはAdiga氏らの先行研究に現れるboxicityの下界以上である。グラフの補グラフが辺推移的ならば両下界に差はない。KneserグラフK(n:k)の補グラフが辺推移的であることの必要十分条件はk=2であることから,大部分のKneserグラフに対して,fractional boxicityの効果が期待される。本研究期間内では,Kneserグラフのfractional boxicityの決定に至らなかった。本研究の目的は有限単純グラフの不変量の1つであるboxicityと関連するグラフ不変量の関係を解明することである。boxicityが高いグラフの例は数多く知られていないが,既存の結果からそのようなグラフの彩色数は高くなる。一般的に正しくないが,彩色数を大きくするグラフ作用でboxicityが増加することがある。本研究では,このような作用で得られるグラフのboxicityの挙動に注目し,主に次の成果を得た:1Mycielskiのグラフ作用でboxicityが十分に大きいグラフが得られること,2boxicityを計るための新たな概念として,fractional boxicityを導入したこと。Mycielskiによるグラフの再構成法によって,最初に与えられたグラフのboxicityが真に増加するかどうかの判断を行うことは,一般に容易ではない。この観点で,研究開始当初に比べれば,Mycielskiグラフのboxicityの挙動について明確になったことが広がった。さらに,ある種のクラスに属するグラフに対して,そのMycielskiグラフのboxicityを概ね決定できたことを踏まえれば,概ね順調に進んでいると判断する。一方「universal vertexを持たないグラフ」に対するMycielskiグラフのboxicityの挙動を含め,今後の課題として残る部分もある。また,ある種の対称性を持つKneserグラフのboxicityについては,まだ不明なことも多く,研究調査が遅れている状況にある。これらを総合的に判断して「やや遅れている」と自己評価する。研究内容と成果を周知するためのwebsiteを開設した。同websiteを通じて,研究期間中に得られた成果をまとめた論文等を閲覧することができる。離散数学依然としてboxicityが大きいグラフの例がたくさん知られているわけではない。
GTP結合蛋白質の内在性モノ(ADPーリボシル)化の生理的役割

ヒト血小板の細胞質画分より3種のモノ(ADPーリボシル)トランスフェラ-ゼAを精製した。そのうちの一つ,トランスフェラ-ゼAIと血小板膜を〔^<32>P〕NAD^+の存在下にインキュ-ベ-トした後,SDS電気泳動とオ-トラジオグラフィ-により標的蛋白質を分析したところ,分子量45Kの蛋白質に特異的に放射能が取り込まれた。この放射性をホスホジエステラ-ゼで分解すると,5'ーAMPの位置に放射能が回収された。また,中性ヒドロキシルアミンで処理すると蛋白質との結合部位が切断されることより,放射性物質はアルギニン残基に結合していることが示された。この反応はあらかじめコレラ毒素と非放射性NAD^+の存在下にプレインキュベ-ションにした膜においては見られなかった。これらの結果より,AIはGsのαサブユニットのアルギニン残基をモノ(ADPーリボシル)化することが示された。アデニレ-トシクラ-ゼ系の調節におけるトランスフェラ-ゼAIの役割について血小板膜を用いて調べた。ヒト血小板膜をトランスフェラ-ゼAIとNAD^+でインキュベ-トすると,Gaαのモノ(ADP-リボシル)化に伴いアデニレ-トシクラ-ゼ活性が23倍に上昇した。この活性化はプロスタグランジン(PG)E_1の添加によりさらに促進された。このメカニズムは以下のように考えられる。PGEIの作用により解離したGsαがAIによりモノ(ADPーリボシル)化される。これによってGaαのGTPア-ゼ活性が抑制され,βγとの再結合が抑制される。その結果,活性型のGsαーGTPの寿命が長く保たれる。したがって,トランスフェラ-ゼAIはGsαのモノ(ADPーリボシル)化を介してアデニレ-ドシクラ-ゼ活性を促進的に調節しているものと考えられる。細胞情報伝達系の一つであるアデニレ-トシクラ-ゼ系に介在する抑制性のG蛋白質(Gi)をモノ(ADPーリボシル)化する酵素,ADPーリボシルトランスフェラ-ゼCとそれを分解する酵素ADPーリボ-スグリコヒドロラ-ゼCを種々の動物細胞より見出し精製を行なった。これらの酵素の生理的役割を理解する一環として,ヒト血小板膜に存在するアデニレ-トシクラ-ゼ系の調節について検討を行なった。ADPーリボシルトランスフェラ-ゼCによりGiをモノ(ADPーリボシル)化すると,α_2ーアドレナリン受容体を介するエピネフリンのアデニレ-トシクラ-ゼの抑制作用が抑制された。この抑制効果はGiのモノ(ADPーリボシル)化の程度とよく相関していた。また,この効果はADPーリボシルトランスフェラ-ゼCの阻害剤であるニコチンアシドの添加により阻害された。一方,Giに結合したモノ(ADPーリボ-ス)をADPーリボ-スグリコヒドロラ-ゼCにより水解除去すると,エピネフリンのアデニレ-トシクラ-ゼ抑制活性が回復した。この回復の度合はモノ(ADPーリボ-ス)の除去の程度に比列していた。また,ADPーリボ-スグリコヒドロラ-ゼCの阻害剤であるADPーリボ-スの添加により,エピネフリンの抑制活性の回復は阻害された。

以上の結果より,ADPーリボシルトランスフェラ-ゼCとADPーリボ-スグリコヒドロラ-ゼCは,Giを可逆的にモノ(ADPーリボシル)化することによってアデニレ-トシクラ-ゼ抑制系を調節していることが示唆された。ヒト血小板の細胞質画分より3種のモノ(ADPーリボシル)トランスフェラ-ゼAを精製した。そのうちの一つ、トランスフェラ-ゼAIと血小板膜を〔^<32>P〕NAD^+の存在下にインキュベ-トした後、SDS電気泳動とオ-トラジオグラフィ-により標的蛋白質を分析したところ、分子量45Kの蛋白質に特異的に放射能が取り込まれた。この放射性物質をホスホジエステラ-ゼで分解すると、5'ーAMPの位置に放射能が回収された。また、中性ヒドロキシルアミンで処理すると蛋白質との結合部位が切断されることより、放射性物質はアルギニン残基に結合していることが示された。この反応はあらかじめコレラ毒素と非放射性NAD^+の存在下にプレインキュベ-ションした膜においては見られなかった。これらの結果より、AIはGsのαサブユニットのアルギニン残基をモノ(ADPーリボシル)化することが示された。アデニレ-トシクラ-ゼ系の調節におけるトランスフェラ-ゼAIの役割について血小板膜を用いて調べた。ヒト血小板膜をトランスフェラ-ゼAIとNAD^+でインキュベ-トすると、Gsαのモノ(ADPーリボシル)化に伴いアデニレ-トシクラ-ゼ活性が23倍に上昇した。この活性化はプロスタグランジン(PG)E1の添加によりさらに促進された。このメカニズムは以下のように考えられる。PGE1の作用により解離したGsαがAIによりモノ(ADPーリボシル)化される。これによってGsαのGTPア-ゼ活性が抑制され、βαの再結合が抑制される。その結果、活性型のGsαーGTPの寿命が長く保たれる。したがって、トランスフェラ-ゼAIはGsαのモノ(ADPーリボシル)化を介してアデニレ-トシクラ-ゼ活性を促進的に調節しているものと考えられる。
免疫担当細胞の分化研究モデルとしてのLeaky SCIDマウスの確立

重症複合免疫不全症(SCID)マウスのleaky現象の原因遺伝子(群)のクローニングを最終的な目的として、高率にleaky現象を発生する系統を選抜育種により確立することを試みた。用いる系統としてはC.B-17 scid/scidマウスにKSN-bgマウスを交配して得たF2マウスから血清中のIgMの量を指標にscid/scidのマウスを選抜し、以後血中のIgM量が検出限界以下の個体を選抜して数代の兄妹交配を続けた。得られたマウスのleaky出現率は生後約2ヶ月齢で2030%である。これらのマウスから、一方ではleaky現象の見られない個体同士の交配を続けると共に(non-leaky選抜群)、leakyマウス同士の交配による選抜を開始した(leaky選抜群)。尚、leakyの判定は血清中あるいは腹腔洗浄液中のIgM含量をELISA法により測定し、血中濃度1μg/ml以上、腹腔洗浄液中濃度、0.01μg/ml以上を示したものについてleakyマウスと判定した。測定に用いられたマウスは、であった。leaky出現率は、non-leaky選抜群'94年9月'95年3月24.5±24.8% '95年4月'95年10月19.8±22.6%leaky選抜群'94年9月'95年3月38.3±27.0% '95年4月'95年10月47.3±23.4%であり、non-leaky選抜群では明らかにleaky出現率が上昇し、一方、leaky選抜群ではleaky出現率が低下する傾向が見られた。leaky現象を支配する遺伝子(群)の存在が強く示唆された。
地方圏の多様な就業・生活を支える「人的つながり」と「多様な経済」に関する調査研究

本研究では、各主体がなぜ地方圏で創業・起業・就業をしているのか、なぜ条件困難地域である地方圏で事業を始めようとしたのかを明らかにし、その意義を評価していく。このことは、地方圏で必要とされる財・サービスが行政だけてはなく、各々の経済社会主体が自らの手で手掛けようとした動機や経緯を探っていくことを通じて「地方創生」の可能性を明らかにする試みである。本目的のため、地方圏創業者を対象とするインタビュー調査から「人的つながり」を発見し、その意義と可能性の検討し、その「つながり」がもたらすセーフティーネット機能を解明することを通じて、「地方創生」に関する国内の研究水準を高めていく。
ミトコンドリアDNAの塩基配列から見た縄文人と弥生人の関係

平成13年度に追加した新たな試料は、福岡県鞍手郡新延野田遺跡から出土した人骨である。この横穴遺跡は古墳時代のものであるが、この地域の弥生時代のサンプルが手に入らなかったので、古墳時代の遺跡を選択した。全部で6個体のサンプルからDNAを抽出し、PCR法を用いてミトコンドリアDNAのD-loop領域の一部を増幅した。残念ながら人骨の保存状態が悪く、塩基配列の決定ができたのは一個体のみであった。現代人との相同検索の結果、この配列は琉球の現代人と一致することが判明し、その系統は日本の基層集団に由来する可能性が示唆された。本年度は研究の最終年度であるので、これまでに蓄積した古人骨データを用いて、縄文・弥生・現代日本人の関係を解析した。その結果、以下の事柄が明らかとなった。1.縄文人とアイヌ・琉球の人々とは共通するミトコンドリアDNAハプロタイプを持ち、その近縁性が確認された。2.同時に縄文人と朝鮮半島の人々との間にも共通する配列が多く出現し両者の近縁性も無視できないことが新たに判明した。3.縄文人には南太平洋諸島に特有なミトコンドリアDNAの配列は存在せず、今回の解析でもたらされたデータからは縄文人の南方起源ないし密接な関係は支持されない。むしろ縄文人の起源は、アジアの広い地域に散在しているように思える。4.唐古・鍵遺跡のmtDNAのタイプは、モンゴル等の北方系の集団やアイヌと共通の塩基配列を持ち、最近の遺伝学的な研究の結論から演繹すれば、縄文系の特徴を持つと考えられる。5.渡来系弥生人にはアイヌ・琉球と共通する塩基配列も存在するが、その割合は縄文人ほどではない。6.本土日本人と縄文・弥生人との間には、共に共通する配列があり、両者が現代日本人の祖先であることが示唆された。本年度は、最初に今後の予備的な研究として、これまで収集した縄文人・弥生人そして中国江南地方出土の古人骨のミトコンドリアDNAのD-loop領域のデータを使って、相互の系統関係を類推した。次にデータの面的な広がりを確保するために今回の研究のために収集した千葉県茂原市の太田貝塚出土度人骨のDNA抽出を開始している。また、試料の採取地点を増やすために、人骨の収集につとめた。その結果、北部九州の縄文-弥生移行期の代表的な遺跡である佐賀県大友遺跡から出土した人骨と福岡県岐志元村貝塚から出土した人骨の解析を行うことが可能になった。茨城県取手市の中妻貝塚から出土した縄文人の系統関係を解析したところ、その変異は現代日本人の変異の中に散在する結果となった。縄文人の出自を明らかにするためには、日本のみならず周辺のモンゴロイド集団との関係を知る必要があることが明かとなったので、形態学的な研究から縄文人との類縁性が指摘されている南米のインディオのミトコンドリアDNAを調査することにした。ペルーの北部海岸地方のプレイインカ期の遺跡から出土した人骨数十体からDNAを抽出、PCR法で増幅した後、その塩基配列を決定している。縄文人との系統関係は来年度考察する予定である。本年度は古人骨から得られた塩基配列を遺伝子データベースに登録されているアジア及び環太平洋地域の人々のデータと比較し、縄文人・弥生人と共通の塩基配列を持つ人々が、どのような地域に見られるのかを明らかにした。縄文人では54個体の塩基配列を決定し、21のハプロタイプを区別し、一方弥生人では41個体で配列を決定し、16のハプロタイプを区別している。

今回解析した縄文人に見られるハプロタイプの中で、ある程度一定の地域に限定されて出現するハプロタイプは11種類あった。この中で東南アジアや中国南部の人とのみ共通のものが2タイプ存在した。しかし、大多数は東南アジア・環太平洋地域とは共通ではなく、特に環太平洋地域集団に特有のタイプを見いだすことはできず、縄文人とこれらの地域の人々との強い近縁性は認められなかった。これに対し、東北アジアの現代人集団は比較データが多くないために一致するハプロタイプはほとんどないが、縄文遺跡で最大多数を占めるハプロタイプは、モンゴルにのみ出現するタイプと一致しており、北東アジアとの近縁性を示唆した。近世アイヌを含むアイヌとの共通のハプロタイプは2例、琉球と共通のものは3例、現代日本と共通のものは4例出現し、縄文人と琉球・アイヌの人々との近縁性を裏付けるものとなった。その一方で、縄文人が最も多くのハプロタイプを共有したのは朝鮮半島の集団(5例)であった。典型的な渡来系弥生人集団では、33個体から12のハプロタイプを区別した。3例は他に見られないユニークなものだったが、2例は現代日本と朝鮮半島のみと共通、3例は、どちらかというと南方的な要素と考えられる台湾の原住民および中国人、更にタイの人と同じハプロタイプで、残り4例はアジア・環太平洋地域に広く分布するハプロタイプだった。アイヌ・琉球とのみ共通するハプロタイプは存在しなかった。平成13年度に追加した新たな試料は、福岡県鞍手郡新延野田遺跡から出土した人骨である。この横穴遺跡は古墳時代のものであるが、この地域の弥生時代のサンプルが手に入らなかったので、古墳時代の遺跡を選択した。全部で6個体のサンプルからDNAを抽出し、PCR法を用いてミトコンドリアDNAのD-loop領域の一部を増幅した。残念ながら人骨の保存状態が悪く、塩基配列の決定ができたのは一個体のみであった。現代人との相同検索の結果、この配列は琉球の現代人と一致することが判明し、その系統は日本の基層集団に由来する可能性が示唆された。本年度は研究の最終年度であるので、これまでに蓄積した古人骨データを用いて、縄文・弥生・現代日本人の関係を解析した。その結果、以下の事柄が明らかとなった。1.縄文人とアイヌ・琉球の人々とは共通するミトコンドリアDNAハプロタイプを持ち、その近縁性が確認された。2.同時に縄文人と朝鮮半島の人々との間にも共通する配列が多く出現し、両者の近縁性も無視できないことが新たに判明した。3.縄文人には南太平洋諸島に特有なミトコンドリアDNAの配列は存在せず、今回の解析でもたらされたデータからは縄文人の南方起源ないし密接な関係は支持されない。むしろ縄文人の起源は、アジアの広い地域に散在しているように思える。4.唐古・鍵遺跡のmtDNAのタイプは、モンゴル等の北方系の集団やアイヌと共通の塩基配列を持ち、最近の遺伝学的な研究の結論から演繹すれば、縄文系の特徴を持つと考えられる。5.渡来系弥生人にはアイヌ・琉球と共通する塩基配列も存在するが、その割合は縄文人ほどではない。6.本土日本人と縄文・弥生人との間には、共に共通する配列があり、両者が現代日本人の祖先であることが示唆された。
公教育と社会活動を通じた政治統合の日加豪３ヵ国比較研究―流動化する時代の政策対応

本研究は、日本・カナダ・オーストラリアという3ヵ国の比較研究を通じて、流動化・複雑化する現代社会における政治統合のあり方と政治的背景を説明しようとするものである。具体的には、公教育と社会活動の諸実践それぞれに2×2の4つの類型を設け、その相違が各国の政治統合に多様性を生じさせるという仮説をもとに比較分析を行う。
抗悪性腫瘍薬誘発性ざ瘡様皮疹の分子機構解明とその治療薬の開発に関する薬学基盤研究

抗悪性腫瘍効果を有するゲフィチニブなどは上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ(EGFR-TK)の選択的阻害剤(EGFR-TKI)である。この薬剤は副作用としてざ瘡様皮疹を高頻度に発症させる。本研究では、1経口投与した薬剤の毛包・脂腺系への移行、2ヒト皮脂腺より前駆脂腺細胞の樹立、3EGFR-TKIによる皮脂産生促進、4皮脂産生抑制作用をもつ新規ざ瘡予防・治療薬候補物質などの新知見を見出した。本研究成果は、抗がん薬によるざ瘡様皮疹の発症機構とその予防・治療に関する薬学的新知見を見出し、今後の抗がん薬の適正使用とアピアランスケアに貢献する。上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ(EGFR-TK)を選択的に阻害する抗悪性腫瘍薬は共通の副作用として皮膚障害,なかでもざ瘡様皮疹を高頻度(>60%)に発症する.しかし,薬剤の経口または静注投与によりなぜざ瘡様皮疹が多発するのか,その副作用機構は十分に理解されていない.本申請研究では,抗悪性腫瘍薬のざ瘡様皮疹の発症機構解明とその治療・予防法(薬)の開発を目的に,平成26年において,(1)ヒト脂腺細胞の調製とその不死化細胞の開発,(2)抗悪性腫瘍薬の皮膚移行性と(3)ヒト脂腺細胞における抗悪性腫瘍薬による皮脂産生調節を検討した.以下に研究成果の概要を記す。(1)ヒト脂腺細胞の調製とその不死化細胞の開発:分担研究者(冲中:林,国際医療:大河内)との連携のもと,採取したヒト皮膚組織(冲中)より脂腺細胞を樹立(東薬:佐藤,秋元),その細胞不死化細胞の開発(国際医療)を行った.細胞老化阻止遺伝子を組み入れることで初代培養細胞の細胞特性を維持した日本人由来不死化脂腺細胞の樹立に成功した(1例).(2)抗悪性腫瘍薬の皮膚移行性:ゲフィチニブ投与患者よりざ瘡様皮疹内容物を採取し(1例),未代謝ゲフィチニブの存在を確認した.また,エルロチニブやセツキシマブ投与患者由来検体(合計3例)も採取した.(3)脂腺細胞における抗悪性腫瘍薬による皮脂産生調節:セツキシマブは皮脂産生にほとんど影響を及ぼさなかった.しかし,MEK阻害を分子機序としEGFR-TK阻害薬と同様にざ瘡様皮疹発症の臨床報告のある新規抗悪性腫瘍薬トラメチニブが皮脂産生促進作用を有することを発見した.以上,本年度の研究成果は,不死化細胞開発の組織体制確立,抗悪性腫瘍薬の皮膚移行性の確認,抗悪性腫瘍薬によるざ瘡様皮疹発症の普遍性の発見という薬学的かつ臨床上有用なエビデンスである.平成27年度では,次の4項目において,新知見を見出した.(1)EGFR阻害剤の皮膚移行性の確認:質量分析法によるエルロチニブの検出条件を設定し,その薬剤投与患者(2例)由来のざ瘡様皮疹内容物にエルロチニブを検出した.したがって,EGFR阻害剤の毛包・脂腺移行性には化合物の構造特異性は無く,少なくとも両薬剤は毛包・脂腺移行性物質であることが判明した.(2)ヒト脂腺細胞の調製:採取したヒト皮膚組織(冲中)より脂腺細胞を調製し(東薬:佐藤,秋元),その細胞に細胞老化阻止遺伝子を導入(国際医療:大河内)したが,不死化細胞の樹立に至らなかった.しかし,偶然にも増殖活性が高く,継代可能で皮脂産生能を有する幹細胞様特性を有する脂腺細胞が得られた.今後、この細胞の特性も明らかにする必要がある.(3)Raf阻害剤による皮脂産生調節:悪性黒色腫治療薬であるB-Raf阻害剤のベムラフェニブが脂腺細胞の皮脂産生を促進することを見出した.ベムラフェニブ投与患者でも発症するざ瘡様皮疹発症が当該薬剤の毛包・脂腺への移行,皮脂産生促進と関係するものと示唆される.(4)副作用の予防・治療薬としての皮脂産生抑制物質の探索:天然物由来トリプトリドがin vivoおよびin vitroにおいて皮脂産生を抑制することを見出した.また,嘉南薬理大学(台湾)との共同研究から,皮脂産生抑制作用を有する新規植物由来抽出物を見出した.今後,その抽出物中の活性物質の同定が必要である.以上,本年度の研究成果は,EGFR阻害剤の皮膚移行性を確証し,ざ瘡様皮疹がシグナル分子を標的とする抗腫瘍薬に普遍的な副作用であること,さらにその予防・治療薬としての新規天然物由来物質を国内外で発見した薬学的かつ臨床上有用なエビデンスである.(1)抗悪性腫瘍薬の皮膚移行性と皮脂腺機能調節:2例のエルロチニブ臨床検体の結果を追加でき,少なくともEGFR阻害剤には皮膚移行性があることを確証した.本研究の臨床面での研究目標は達成できた.また,最近承認された悪性黒色腫治療薬ベムラフェニブによる同様のざ瘡様皮疹の発症がその薬剤による皮脂産生促進に起因する可能性を見出したことは高く評価される.(2)不死化ヒト脂腺細胞の開発:不死化細胞作製の再現性には至らなかったことは,作製方法を含め改善の余地があり,次年度への継続課題であると認識している.

また偶然にも継代可能かつ皮脂産生能を有するヒト脂腺細胞を発見したことは,皮脂腺に幹細胞が存在する可能性を示唆し,組織再生研究における新たな課題に繋がると期待される.(3)ざ瘡様皮疹の予防・治療薬候補物質として天然物由来化合物を見出したことは評価される.また,嘉南薬理大学(台湾)との共同研究から新規皮脂産生抑制物質を発見したことは高く評価される.今後の国際共同研究の推進が大いに期待される.(4)本研究課題への取り組みから,日本香粧品学会を通じて「がん患者に対するアピアランス支援の手引き(案)」(研究代表:野澤桂子,国立がん研究センター中央病院)の外部評価者に推薦され,協力した.本研究成果についても情報提供を行い,がん患者への副作用説明において有用なエビデンスであると高い評価を得た.平成28年度では、次の4項目において新知見を見出した。(1)EGFR阻害剤による皮脂腺萎縮機構:毛包・脂腺系へ移行したEGFR阻害剤のゲフィチニブとエルロチニブはヒト皮脂腺代替モデルのハムスター脂腺細胞において細胞増殖を抑制したことから、両薬剤の副作用の乾燥肌は脂腺細胞の増殖抑制に起因した皮脂腺萎縮が関わるものと推察された。(2)前駆ヒト脂腺細胞の樹立:採取したヒト背部皮膚組織(冲中)より脂腺細胞マーカーを発現し、継代可能かつ皮脂産生能を有する前駆脂腺細胞(2ロット)を樹立した。また本細胞においてホスファチジン酸は新規皮脂産生促進因子であること、抗菌薬のナジフロキサシンが皮脂産生抑制作用を示すことを見出した。(3)B-Raf阻害剤による皮脂産生調節:悪性黒色腫治療薬であるB-Raf阻害剤のベムラフェニブは、インスリン誘導性の皮脂産生を増強、逆に男性ホルモンにより増加した皮脂産生を抑制することを見出した。そのメカニズムについては今後の検討課題である。(4)細胞外マトリックス(ECM)代謝異常制御方法の開発:分子標的薬投与による皮膚障害(乾燥、潰瘍など)には皮膚ECM代謝異常が関与する。本年度はカロテノイド色素のβクリプトキサン、生薬由来モノテルペンのp-cymeneによるECM破壊抑制作用を見出した。また、ハイドロゲルを活用した抗菌性創傷被膜素材の開発に携わった。すなわち、両天然物や抗菌性ハイドロゲルは分子標的薬による皮膚障害の軽減・改善にも有効性を示すものと期待される。以上、本年度の研究成果よりEGFR阻害剤による皮脂腺萎縮機構、ざ瘡様皮疹の分子機構解明に有用な日本人由来前駆脂腺細胞の樹立、さらに薬剤性皮膚障害の予防・治療薬としての新規天然物由来物質や医療応用素材を国内外で発見した薬学的かつ臨床上有用なエビデンスである。抗悪性腫瘍効果を有するゲフィチニブなどは上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ(EGFR-TK)の選択的阻害剤(EGFR-TKI)である。この薬剤は副作用としてざ瘡様皮疹を高頻度に発症させる。本研究では、1経口投与した薬剤の毛包・脂腺系への移行、2ヒト皮脂腺より前駆脂腺細胞の樹立、3EGFR-TKIによる皮脂産生促進、4皮脂産生抑制作用をもつ新規ざ瘡予防・治療薬候補物質などの新知見を見出した。本研究成果は、抗がん薬によるざ瘡様皮疹の発症機構とその予防・治療に関する薬学的新知見を見出し、今後の抗がん薬の適正使用とアピアランスケアに貢献する。本申請研究の3つの柱(13)は,研究分担者との連携のもと本年度の目標をほぼ達成できたと評価する.(1)抗悪性腫瘍薬の皮膚移行性と皮脂腺機能調節:臨床検体採取は患者同意が必要なので思うように集められない.しかし,2例目のゲフィチニブ検体解析にて再現性を確認でき,最低限の目標は達成できた.また,作用機序の異なる抗悪性腫瘍薬も皮脂産生を促進することを発見し,新たな研究課題を見出したことは高く評価する.(2)抗悪性腫瘍薬によるざ瘡様皮疹に関する臨床研究:他の抗悪性腫瘍薬投与患者
卵胞発育・排卵中枢へのエストロゲンフィードバックを担う脳内メカニズム

視床下部から分泌される性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)のパルス状分泌およびサージ状分泌は、下垂体からの性腺刺激ホルモンのパルス状分泌およびサージ状分泌を刺激し、それぞれほ乳類の卵胞発育および排卵を制御する。本研究では、ラットおよびマウスを用いて、GnRHサージおよびパルス状分泌の中枢とされる視床下部弓状核(ARC)および前腹側室周囲核(AVPV)に局在するキスペプチンニューロンにおけるキスペプチン遺伝子発現に対するエストロジェンの効果のエピジェネティックなメカニズムを明らかにした。これらの成果は、将来的には家畜の繁殖率の向上や、生殖医療への応用が可能な基礎的知見である。本研究は、哺乳類のメスの卵胞発育と排卵を制御する性ステロイド(エストロゲン)のフィードバック機構に着目し、卵胞発育を支配する負のフィードバック、および排卵を支配する正のフィードバックによる性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)分泌の制御機構の解明を目的とする。具体的には、GnRH分泌を上位から支配する神経ペプチドであるキスペプチンの遺伝子(Kiss1)発現に対する、組織特的エストロゲンの促進(正)および抑制(負)作用を明らかにしようとしている。本年は、視床下部前方の前腹側室周囲核(AVPV)のKiss1遺伝子発現にはエストロジェンが促進的に、一方後方の視床下部弓状核(ARC)のKiss1遺伝子発現には抑制的に作用するエピジェネティックな機構を解明した。エストロジェンは、AVPVのKiss1遺伝子プロモータ領域のヒストンのアセチル化を著しく増加させ、逆にARCではアセチル化を抑制する作用を持つことをマウスをモデルとして明らかにした。また、Kiss1非発現マウス神経細胞株を用いて、ヒストンアセチル化の促進剤がKiss1遺伝子発現を誘導すること、さらにエストロジェン受容体(ER)αがAVPVにおいてのみKiss1遺伝子プロモータ領域にエストロジェン依存性に結合することを見いだした。これらの事から、卵胞から分泌される高濃度のエストロジェンは、ERαと結合し、AVPVのKiss1プロモータ領域に結合し、これにより、同プロモータ領域のヒストンのアセチル化を誘起し、AVPVにおける.Kiss1遺伝子発現を増加させ、これによりGnRHや性腺刺激ホルモンの大量放出を促し、結果として排卵を誘起することが示唆された。可視化Kiss1発現ニューロンにおける組織特異的な転写因子の同定については、ニューロンめピックアップを行い、現在同様な遺伝子発現があるかを解析中である.本研究では、哺乳類のメスの卵胞発育と排卵を制御する性ステロイド(エストロゲン)のフィードバック機構のエピジェネティックメカニズムを明らかにした。Kiss1遺伝子によりコードされるキスペプチンは、視床下部からの性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)放出を直接刺激することにより、種を超えて哺乳類の生殖機能を最上位から制御する因子として、生殖科学分野でもっとも注目されるペプチドである。本研究課題では、キスペプチンニューロンがラットやマウスなど実験動物だけでなく、交尾排卵動物であるスンクスにおいても、2つの神経核すなわち前腹側室周囲核(AVPV)/視索前野(POA)および視床下部室傍核(ARC)に局在すること(PNAS 2011)を明らかにした。同ニューロンにエストロゲン受容体(ER)&#61537;が共存し、AVPVおよびARCのキスペプチン発現へのエストロゲンの正と負のフィードバックを仲介すると考えられていたが、そのメカニズムは不明であった。本研究課題では、エストロジェンがキスペプチン遺伝子プロモータ領域のヒストンタンパクのアセチル化をAVPV領域では促進し、一方ARC領域では抑制することから、組織特異的なヒストンアセチル化を介したエピジェネティックなメカニズムが関与することを世界に先がけて明らかにした(PNAS, 2012)。本年度の研究では、脳内の前方の前腹側室周囲核(AVPV)に局在するキスペプチンニューロン集団において、卵巣から分泌されたエストロジェンがキスペプチン遺伝子領域のヒストンタンパク質のアセチル化とよばれる化学変化を促すことによって、クロマチン構造を緩め、その結果としてキスペプチン遺伝子の発現を促すことを明らかにした。その際、エストロジェンと合体したエストロジェン受容体タンパクが、遺伝子発現を司るプロモーター領域に結合すること、さらに、プロモータ領域の少し後方にあるエンハンサー領域がこのプロモータ領域に接近し、キスペプチン遺伝子を促すことを、遺伝子改変マウスなどを用いて明らかにした。一方で、エストロジェンによってキスペプチン産生が抑制される脳内後方の弓状核(ARC)キスペプチンニューロン集団では、エストロジェンによってヒストンタンパク質のアセチル化が抑制されるなど、AVPVのキスペプチンニューロンとは真逆の事象が起こることも確かめられた。

以上の結果より、成熟した卵胞から分泌されるエストロジェンは、AVPVのキスペプチンニューロンにおいて、キスペプチン遺伝子のクロマチン構造を緩めてこの遺伝子の発現を促すことが明らかとなり、本研究によりエストロジェンがAVPVのキスペプチンを活性かして排卵にいたる過程を制御するエピジェネティックなメカニズムを明らかにした。当初計画にないエストロジェンが組織特異的にKiss1発現を制御するエピジェネティックなメカニズムを解明できたため。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、卵巣由来のエストロジェンがAVPVのキスペプチンニューロンにおけるKiss1遺伝子発現を促進し、一方ARCキスペプチンニューロンにおけるKiss1遺伝子発現を抑制するエピジェネティックなメカニズムを解明することに成功した。さらに、AVPVキスペプチンニューロンにおいてKiss1遺伝子発現を促進するためのエンハンサー領域が、Kiss1をコードするエクソンの下流領域に存在することも明らかとした。当初計画のうち、1)キスペプチンニューロンの組織特異的なエンハンサーを同定および2)Kiss1遺伝子プロモータ周辺領域のDNAメチル化やヒストン脱アセチル化など、エピジェネティック修飾による制御メカニズムの検討については十分達成できた。可視化Kiss1発現ニューロンにおける組織特異的な転写因子の同定については、当初計画ではのKiss1-GFPマウスを用いる予定であったが、その後Kiss1をtdTomato(赤色)で可視化したラットの作成に成功したので、今後の生理学実験に有利なラットを用いて、計画を遂行する予定である。ARCおよびAVPV由来のキスペプチンニューロンに組織特異的な転写因子の同定については、未だ同定に至っていない。一方で、本研究室でキスペプチンをtdTomatoという赤色蛍光タンパクで可視化したラットから、AVPVおよびARCに局在するそれぞれのキスペプチンの単離に成功したことから、今後はARCおよびAVPV組織特異的な転写因子の同定を行う予定ある。さらに、ARCおよびAVPVにおいて、組織特的にKiss1プロモータ領域のヒストンのアセチル化が逆方向におこるメカニズムについても、今後検討する予定である。
マウス個体におけるcAMPシグナルの光制御を用いた神経機能・神経回路形成の解析

嗅神経細胞において多様な機能を制御しているcAMPシグナルがどのように使い分けられているのかを調べるために、光依存的にcAMP産生活性を制御できるタンパク質PACを一部の嗅神経細胞で発現するトランスジェニックマウスを作製した。PACタンパク質の発現は樹状突起や軸索においても検出することができ細胞局所における活性化が可能である。現在、マウス個体を使って光によりPACの活性を制御し、神経回路形成におけるcAMPの機能解析を進めている。嗅神経細胞はcAMPシグナルを用いて、活動電位の発生、軸索のソーティングや投射先の決定、シナプス成熟の制御などを行っている。同じcAMPシグナルがどのように多様な機能に使い分けられているかを調べるために、光依存的にcAMPを産生する酵素PACをマウス嗅神経細胞に発現させ、時空間的にcAMPシグナルをコントロールすることを試みている。具体的には、マウス嗅覚受容体遺伝子M71のプロモーター及びコーディング領域の下流にPAC遺伝子と赤色蛍光タンパク質RFP遺伝子を挿入したトランスジェニックコンストラクトを作製し、マウス受精卵に導入した。得られたトランスジェニックマウス(M71-PAC-REP)の嗅上皮の切片を観察したところ、嗅上皮の中でRFPを発現する細胞集団が観察された。このM71-PAC-RFPトランスジェニックマウスをM71-GFPマウス(内在性M71遺伝子を発現する細胞で緑色蛍光タンパク質GFPを発現するマウス)と掛け合わせて嗅上皮を観察したところ、RFPとGFPは別々の嗅神経細胞で発現していた。これは嗅覚受容体遺伝子の相互排他的発現としてすでに報告されている知見と一致している。今後、PACを発現するM71細胞(赤色蛍光)とPACを発現しないM71細胞(緑角蛍光)を同一個体内で比較しながら、光により局所的に誘導されたcAMPシグナルが神経回路形成にどのような影響与えるのかを詳細に観察する。これまでにマウス嗅覚受容体遺伝子M71のプロモーター及びコーディング領域の下流にPAC遺伝子と赤色蛍光タンパク質RFP遺伝子を挿入したトランスジェニックコンストラクトを用いて、トランスジェニックマウス(M71-IRES-PAC-IRES-RFP)を作製している。今回、まずトランスジェニックマウスにおいてPACタンパク質の発現を検出した。PACタンパク質には検出用のHAタグと膜に局在させるためのシグナル配列が付加してある。HAに対する抗体を用いて嗅上皮および嗅球における発現を調べたところ、嗅上皮においては細胞体、樹状突起で、嗅球においては軸索での発現が検出された。ミドリムシ由来のPACがマウス嗅神経細胞内で分解されることなく発現していること、膜移行シグナルをつけたことでPACを軸索により多く局在させることに成功したことが明らかになった。次にM71-IRES-PAC-IRES-RFPトランスジェニック/M71-GFPノックインマウスの軸索投射を詳細に解析した。RFPで標識される軸索とGFPで標識される軸索の先端は同一の部位(糸球と呼ばれる構造体)に収束していた。cAMPシグナルは軸索投射の前後軸の決定に重要な機能を果たしていることが報告されているが、PACの発現で投射先が変化しないということは、PACのbasal活性は(仮にあるとしても)嗅神経細胞の軸索投射に影響を与えないレベルであると考えられる。また、嗅上皮・嗅球上部の骨を除き、嗅上皮・嗅球をホールマウントで蛍光顕微鏡下において観察したところ、RFP及びGFPで標識された軸索は一本一本のレベルで同定できることを確認した。以上のことから光刺激によりin vivoで神経細胞の形態変化を観察する実験系を確立することができたと言える。現在光刺激実験を行っている。
椎葉村の焼畑における不均一性の研究

椎葉村に伝わる焼畑の状況は,水田や常畑に較べると著しく不均一である.しかし収量は低くても,そのためにかえって気象状況の変動にたいして比較的に安定であるように観察された.このような不均一な状況を具体的に明らかにするために,平成3年度から調査区を設定して生育状況を観察した.たとえば7月のヒエ150本の草丈の平均は45.5cmであったが,最高は86.0cmにおよび最低はわずかに12.0cmであった.また在来の3品種のヒエ(シロヒエ,オソビエ,ケビエ)について本学の圃場で栽培観察したところ,草丈と分げつはオソビエがやや盛んで,出穂はシロヒエが36日早いことがわかった.焼畑経営農家の庭の一隅に,長期自記温湿度計と長期自記雨量計を設置したが,十分な精度でデータが得られるようになったのは4年度になってからであった.気象に関する基礎的なデータを得ると同時に,焼畑とその周辺7か所にシックス最高最低温度計と簡易形の雨量計を設置して1か月ごとの観測をおこなった.また,土壌水分も測定した.焼畑は北西向きの斜面に営まれている.観測地点の標高差は20mほどであるが,やや谷の部分と日当りのよい尾根筋の中腹の部分では最高・最低気温に13.22.0°Cの差が認められた.4月から10月までは見晴らしのよい尾根部で気温差が大きく,最高気温と最低気温を記録したが,11月から3月にかけて,最低気温を記録したのは,やや谷状の地形を示した観測点であった.雨量も地形による偏りが大きい.尾根部で小さく谷部で大きかったが,杉林の中は小さかった.小さな谷地形,特に林に近い部分で降水量は大きいと推察された.観測期間中,もっとも降水量が少なかった1992年11月の土壌水分をみると,体積含水率は杉林の中にあたるNo.6が最も大きく続いて谷部のNo.4が大きい.反対に小さいのは日当りのよい尾根下部であった.しかし,これらの要因と坪苅り調査結果との間に有意の関係は見いだせなかった.圃場の均質化・発芽や出穂の斉一性の追求など,農業は均一な管理法で効率的に栽培を行う方向に農業は発展してきた.椎葉村に伝わる焼畑の調査を行ってきたが,水田や常畑に較べると著しく不均一である.焼け残りを集めて並べるだけで,残った石や切株を取り除くこともなく,耕耘さえほとんど行わない.作物の品種も十分に固定していないうえに混播してあるので,生育状況も不均一である.しかし,収量は低くても,そのためにかえって気象状況の変動にたいして比較的に安定であるように観察された.このような不均一な状況を具体的に明らかにするために,今年度は生育状況を測定する調査区を設定して分散の概略値を知り,精度よく生育状況の分散を推定するために必要なサンプル数を明らかにした.また,在来の3品種のヒエ(シロヒエ,オソビエ,ケビエ)については本学の圃場で栽培観察し,それぞれの特徴を明らかにしようとした.さらに,長期自記温湿度計・長期自記雨量計を設置して気象に関する基礎的なデ-タを得ると同時に,焼畑とその周辺7か所にシックス最高最低温度計を設置して1か月ごとの観測をおこなった.作物の生育状況を見ると不均一であったが,母集団の分散を精度よく求めるにはサンプル数が不足した.たとえば7月のヒエ150本の草丈の平均は45.5cmであったが,最高は86.0cmにおよび最低はわずかに12.0cmであった.この母集団の分散を10%の精度で推定するには今回選んだサンプル数の150本では不足し,その20倍の3,000本以上のサンプルを必要とする計算になる.圃場試験では草丈と分げつはオソビエがやや盛んで,出穂はシロヒエが36日早いことがわかった.焼畑の中でもやや谷の部分と日当りのよい中腹の部分では最高・最低気温に0.52.0°Cの差が認められた.椎葉村に伝わる焼畑の状況は,水田や常畑に較べると著しく不均一である.しかし収量は低くても,そのためにかえって気象状況の変動にたいして比較的に安定であるように観察された.このような不均一な状況を具体的に明らかにするために,平成3年度から調査区を設定して生育状況を観察した.たとえば7月のヒエ150本の草丈の平均は45.5cmであったが,最高は86.0cmにおよび最低はわずかに12.0cmであった.また在来の3品種のヒエ(シロヒエ,オソビエ,ケビエ)について本学の圃場で栽培観察したところ,草丈と分げつはオソビエがやや盛んで,出穂はシロヒエが36日早いことがわかった.焼畑経営農家の庭の一隅に,長期自記温湿度計と長期自記雨量計を設置したが,十分な精度でデータが得られるようになったのは4年度になってからであった.

気象に関する基礎的なデータを得ると同時に,焼畑とその周辺7か所にシックス最高最低温度計と簡易形の雨量計を設置して1か月ごとの観測をおこなった.また,土壌水分も測定した.焼畑は北西向きの斜面に営まれている.観測地点の標高差は20mほどであるが,やや谷の部分と日当りのよい尾根筋の中腹の部分では最高・最低気温に13.22.0°Cの差が認められた.4月から10月までは見晴らしのよい尾根部で気温差が大きく,最高気温と最低気温を記録したが,11月から3月にかけて,最低気温を記録したのは,やや谷状の地形を示した観測点であった.雨量も地形による偏りが大きい.尾根部で小さく谷部で大きかったが,杉林の中は小さかった.小さな谷地形,特に林に近い部分で降水量は大きいと推察された.観測期間中,もっとも降水量が少なかった1992年11月の土壌水分をみると,体積含水率は杉林の中にあたるNo.6が最も大きく続いて谷部のNo.4が大きい.反対に小さいのは日当りのよい尾根下部であった.しかし,これらの要因と坪苅り調査結果との間に有意の関係は見いだせなかった.
異常量子物質の創製―新しい物理を生む新物質―

本特定領域研究「異常量子物質の創製-新しい物理を生む新物質-」は、新物質合成・新現象探索において多大な成果を挙げてきた物性実験・物性理論・物理化学の一線の研究者を結集し、個々の研究では到達できない新しい物理学の創製を目指すものとして平成16年度に発足した。ここで異常量子物質とは、本来低温極限でしか発現しなかった量子効果が室温近くの高温においても発現するような新物質に対して我々が命名したもので、超伝導・磁気伝導・光物性の3領域を中心に異常物性を探究してきた。今年度は過去5年間の領域設定期間内における研究成果に対して取りまとめを行い、同時に今後の当該分野における研究の方向性を明確に打ち出した。総括班としての具体的な実績として2009年7月5日7日に第8回アジア・パシフィックワークショップ国際会議に出席し韓国ソウルYonsei大学において本領域・総括班代表として5年間の研究成果の取りまとめを含めた講演を行った。この研究会では、本特定領域の研究者による成果報告だけではなく、平成21年度において継続する物性物理学関連の他の特定領域研究などからも広く講演者を集め研究領域を横断した研究会を行った。本特定領域の終了時点における物性物理学の潮流を明らかにし、これを発展させてどのような物理学の創成をめざすかべきかを確認することができた。2009年9月29日に行われた事後評価はAで研究領域の設定目的に照らして、十分な成果があったと評価された。さらに、本特定領域での知見をまとめた成果報告集を作成し本特定領域関係者のみならず、2009年11月29日12月1日に東京大学武田ホールにて行われた物性科学領域横断研究会において配布した。これにより本特定領域の成果が大きく発信され、今後の当分野および関連分野の発展に大きく資するものと思われる。本特定領域では、本研究課題を着実に推進するために下記の3つの班を設定した。i)「エキゾチック超伝導」班・・・異常量子物質におけるさらに新たな概念の創製と、さらに高温の超伝導/エキゾチックな超伝導を、実験・理論の緊密な連携により設計・実証する。ii)「異常磁気伝導」班・・・新しい磁気伝導現象の開発と理解を目指す。iii)「巨大光応答」班・・・摂動的に記述することの出来ない巨大な応答を示す異常量子物質の開発と、その光応答の理解と制御を目指す。本総括班は、上記の3つの班のメンバー問の情報交換を促進すると共に研究成果発表及び研究討論の場を提供し、又国内外の研究者に向けて本領域の研究成果を発信することを目的とする。本年度は5年間の研究期間の第一年度目であり、総括班として以下の事を行った。1)10月15・16日に、計画班のメンバーのみによるキックオフミーティングを行い、各班・各人の研究計画・抱負・問題点等を述べ、議論を行った。2)3月16日に、本特定領域における今後4年間の国際会議、成果報告会、ニュースレターの発行等の詳細なスケジュールを確定した。特に本特定領域の特徴として「若手」のみによる研究会を定期的に開催することを決定した。更に、アジア諸国との協同研究を密にするために、Asia-Pacific Workshop (APW)を定期的に開催することを申し合わせた。3)ホームページを立ち上げ、本領域の活動をアピールすると共に研究者間の情報交換を行った。4)ニュースレターを発行した。その内容は、i)本研究課題の領域代表による主旨説明ii)各班の研究紹介iii)キックオフミーティングのプログラムとその内容の紹介の3部からなっている。5)本特定領域の公募を行い、その「公募研究」の選定を行った。特定領域研究の第2年度として,第1年度に構築した研究体制をもとに研究活動を展開した。総括班としての具体的な成果を以下に列挙する。(1)2005年7月15-17日に東京大学駒場キャンパスにおいてキックオフミーティングを開催し,昨年選考した公募研究の研究代表者から研究の現状および抱負を発表してもらった。同時に計画研究の各グループから研究の進捗状況を報告してもらい,今後の研究方針を含めた議論を行った。(2)昨年度企画した若手研究者の会を発足させ,2005年12月19-20日に「新しい物理を生む新物質若手の会」第一回会議「異常量子物質はどう作るのか?」を松島大観荘で開催した。(3)2006年1月5-7日に東北大学金属材料研究所において成果報告会を開催した。計画研究・公募研究の区別なく、すべての研究者に口頭発表またはポスター発表を行ってもらった。ポスター発表については,研究代表者・分担者だけでなく一般の参加を求め,最終的に539名が参加する盛況なものとなった。(4)ニュースレターを年4回刊行(うち1回は若手の会の報告)し,Wedサイトを頻繁に更新することによって,広報活動にも力を注いだ。(5)2006年6月に行われる国際会議をアジア・パシフィックワークショップと共催で企画し,その招待講演者やプログラムを編成した。特定領域研究の第3年度として、これまでの成果を基に研究活動を展開させた。(1)2006年6月2327日に国際会議をアジア・パシフィックワークショップと共催で開催した。招待講演者18名を含む参加者180名を得て、興味深い成果発表と活発な議論が行われた。

(2)統括班会議を7月25日、8月14、15日、9月13、15日に開き、中間評価に対して成果をまとめ、資料を作成した。最終的に、2006年9月20日における中間評価ヒアリングで、A評価を受けた。(3)2007年1月57日に東京大学農学部講1堂において成果報告会を開催した。計画研究・公募研究の区別なく、すべての研究者に口頭発表またはポスター発表を行ってもらった。今回は、関連する他の2つの特定領域(領域代表:佐藤英明、高橋利宏)から研究者を招き、招待講演を企画した。このような特定領域を横断する研究展開の試みは今後も続けたい。(4)昨年度企画した若手研究者の会を発足させ、2006年12月1819日に「新しい物理を生む新物質若手の会」第2回会議「異常量子物質はどうやって測るのか?」を滋賀県の琵琶レイクオーツカで開催した。参加した若手研究者は、本領域以外からの参加を含めて48名であった。(5)ニュースレターを4回刊行(うち1回は若手の会の報告)し、Webサイトを頻繁に更新することによって、広報活動に力を注いだ。特定領域研究の第4年度として、これまでの成果をもとに研究活動を展開させた。総括班としての具体的な成果を以下に列挙する。(1)2007年4月13日16日に第6回アジア・パシフィックワークショップとの共催で、台湾において国際会議を開催した。(2)2007年6月30日7月2日に第二期公募研究を交えたキックオフミーティングを京都大学にて開催した。(3)2007年12月7日9日に首都大学東京において、本特定領域を含めた4特定領域研究「スクッテルダイト」「分子性導体」「異常量子物質」「新量子相の物理」の共催で、「超伝導が拓く物性科学の最前線-4特定領域合同研究会」を開催した。本特定領域からは、領域レビューとして「エキゾチック超伝導」と題し、A01班長の青木秀夫が講演を行った。このような特定領域を横断する研究展開は、今後も続けたい。(4)2007年12月21日22日に「新しい物理を生む新物質若手の会」第3回会議「異常量子物質をどう理解するか?」を静岡県熱海後楽園ホテルで開催した。参加した研究者は、本領域外からの参加を含めて49名であった。(5)2008年1月5日7日に名古屋大学・野依記念学術交流館において、2007年度成果報告会を開催した。計画研究・公募研究の区別無く、すべての研究者に口頭発表またはポスター発表を行ってもらった。また、本領域外からの発表も幅広く受け付けた。(6)総括班会議を7月2日と1月6日の計2回開催し、研究成果のまとめや今後の活動に関する意見交換を行った。(7)ニュースレターを4回刊行し、webサイトの更新によって、広報活動に力を注いだ。(8)2007年10月24日に国際会議の実行委員会を開き来年度の日程・開催地及び招待講演者を決定した。特定領域研究の最終年度として、これまでの成果をもとに研究活動を展開させた。総括班としての成果を以下に列挙する。(2) 2008年11月17日18日に「新しい物理を生む新物質若手の会」第4回会議「新しい物質と新しい物理:若い世代からの提案」を神奈川県箱根パークス吉野で開催した。参加した研究者は、本領域外からの参加を含めて45名であった。
分解制御可能な人工ポリユビキチンの創製と細胞内機能解明

本年度は、申請書年次計画に記した中で、人工タンパク質の効率的な細胞内導入法の開発に重点をおいた研究を行った。多量体の人工ポリユビキチンを細胞内に導入するためには、CPPに比べより効率的な導入法を見出すことが必要であると考えられる。そこで本研究では、リポソームを用いた細胞内導入に着目した。細胞と融合するリポソームは、内部に封入した物質を細胞内に移行させることができる。今後、時空間的に脱ユビキチン化を制御できるようなポリユビキチンを導入することを目的としているため、このリポソームによる細胞内導入もやはり特定の外部刺激によりその融合を制御できることが重要であると考えられる。そこで、カルシウムイオン依存性タンパク質であるカルモジュリンに由来するペプチドを用いてリポソームを修飾することを目的に研究を行った。昨年までの研究において、カルモジュリンのN末端から3番目と4番目のモチーフであるHLH3とHLH4が、cholesterolによりペプチドが膜に挿入され、リポソーム表面に提示されることを目的に、これらペプチドのN末端に、スペーサーであるPEG12、そしてcholesterolを結合させたペプチドを調製した。本年度の研究において、リポソーム膜上に導入した蛍光色素のエネルギー移動(FRET)の解消を指標に膜融合効率を評価したところ、HLH3とHLH4とを提示したリポソームを混合した際には、カルシウムの添加によりFRETの解消が見られたが、ペプチドを提示していないリポソームではFRETの解消は見られなかった。また、蛍光色素であるANTSと消光剤であるDPXをそれぞれ内包したリポソームを用いて水溶性コンパートメントの混合効率を評価したところ、HLH3とHLH4とを提示したリポソームを混合した際にのみ、カルシウムの添加により顕著にANTSの消光が観察された。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、申請書年次計画に記した通り、四量体までの細胞内安定型人工ポリユビキチンのより効率的な創製法を見出すことを目的として実験を進めた。チオエステル体を用いた方法では、チオエステルが常に活性化した状態にある。そのため、native chemical ligationにより順次ユビキチンを連結させていく場合、タンパク質配列のC末端からN末端の方向へと反応を進める必要がある。申請者の研究で用いたクロスリンカーはN末端システイン構造を持つため、C末端側に活性化状態にあるチオエステルが存在すると、自己ポリマー化を起こしてしまうためである。これを防ぐために付加的なステップが必要となり、より長鎖のポリユビキチンの調製には困難が予想される。そこで、Fangらによるヒドラジド体を用いる縮合^<[1]>の利用を検討した。この方法では、タンパク質-ヒドラジド体はそのままでは不活性な状態にある。しかし、亜硝酸ナトリウムを加え、低pH条件でヒドラジド体を活性型であるアジド体へ変換することにより、N末端システイン部分と反応できるようになる。これにより、N末端からC末端へのユビキチン鎖の伸長が可能となり、より簡便にユビキチン多量体を創製できると考えられる。大腸菌内で発現させたUb(K48C)-intein-CBD(ユビキチンK48C変異体とintein-chitin binding domain (CBD)の融合タンパク質)を粗精製後、chitin beadsに吸着させ、次いで、求核剤であるヒドラジンを加え、Ub(K48C)のC末端ヒドラジド体を得た。しかし、チオエステル体を調製する場合に比べてchitin beadsからの切り出し効率が悪いため、現在より効率の良い条件について検討中である。また、すでに合成できたK48型の人工ユビキチン2量体に関して2次元NMRを測定した。得られたシグナルを野生型(WT)のユビキチン2量体のものと比較したところ、人工ユビキチン2量体のシグナルはWTのユビキチン2量体より単量体のものに近いということが分かった。この違いが何に起因するかについては現在調査中である。前年度は、申請書年次計画に記した中で、人工タンパク質の効率的な細胞内導入法の開発に重点をおき、カルシウムイオン依存性タンパク質であるカルモジュリンに由来するペプチドを用いてリポソームを修飾することを目的に研究を行った。カルモジュリンは4つのヘリックスループヘリックス(HLH)モチーフを持つ細胞内タンパク質である。カルモジュリンとカルモジュリン結合ペプチドが特異的に結合することがよく知られているが、N末端から3番目と4番目のモチーフであるHLH3とHLH4自体がヘテロダイマーを形成する可能性も示唆されている。しかし、その詳細は不明な点が多い。そこで本研究では、まずこのペプチドの相互作用について調べるために実験を行った。それぞれのペプチドにシステインを付加したHLH3-GC、HLH4-GCをFmoc固相合成法により調製した。このペプチドをレドックスバッファー中で反応させ、酸化体(ダイマー)と還元体(モノマー)の生成比率を比較したところ、カルシウムイオン存在化でヘテロダイマーのみが極めて特異的に生成することが確認された。次に、このHLH3とHLH4のN末端に、スペーサーであるPEG12、そして脂質であるコレステロールを結合させたChPHLH3,ChPHLH4を調製した。膜との親和性が高いコレステロールによりペプチドが膜に挿入され、リポソーム表面に提示されることが期待できる。