hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
手根伸筋群と屈筋群の組合せ神経筋電気刺激を用いた手根の運動と力の制御

健常者を対象に、手根伸筋群と屈筋群の組合せ神経筋電気刺激(ENS)により誘発される手根の力と運動を調べた。組合せENSは隣り合う作用を持つ2筋(A、B)に対して行った。ENSによる2筋の最大収縮でそれぞれ別方向の曲げ力(AF、BF)と最大可動域(Max)までの曲げ運動(AM、BM)が誘発された。組合せENSでは、同期刺激でAFとBFの間の曲げ力、AMとBMの間のMaxまでの曲げ運動、交代刺激でAFとBFの間を結ぶ力、AMとBMの間のMaxに沿う描弧運動が誘発された。以上、組合せENSで手根のあらゆる方向の曲げ力と曲げ運動、時計回りと反時計回りの曲げ力と描円運動を制御できる可能性が示された。手根の伸筋群には長橈側手根伸筋(ECRL)、短橈側手根伸筋(ECRB)、尺側手根伸筋(ECU)、屈筋群には橈側手根屈筋(FCR)、尺側手根屈筋(FCU)がある。本研究は、前腕3肢位(回内位、中間位、回内位)で、これら5筋のうち隣り合う作用を持つ2筋を組合せ神経筋電気刺激(ENS)することにより、手根のあらゆる方向の運動や力を誘発できるかどうか調べるものであり、平成25年度は、24年度に引き続き中間位でECRLとECRB、ECRBとECUの組合せENS、新たに回内位と中間位でECRLとFCR、ECUとFCUの組合せENSを調べた。対象は健常男性5名(20-26歳)の右上肢とした。ENSの刺激電極としてフック型ワイヤー電極を作製し、各筋運動点に刺入留置した。刺激には幅0.2 ms、周波数20 Hzの矩形波(0-20 V)を用い、強度は運動閾値(0%)から最大収縮の得られるまで(100%)の間とした。組合せENSは以下の同期刺激と交代刺激を行った。同期刺激は、一つの筋を100%、もう一つの筋を0%から100%までの間の強度で同期して刺激した。交代刺激は、先ず一つの筋を100%の強度で刺激してこれを維持、次いでもう一つの筋を100%の強度で刺激して維持、その後はじめに刺激した筋の刺激強度を0%に下げた。誘発された運動は3Dポジションセンサー、力は自作の計測装置で計測し、デジタル画像・波形実時間同期収録装置に記録した。各筋単独の100%刺激により各々の方向に手根の曲げ運動や曲げ力が誘発された。同期刺激により単独刺激で誘発された運動の間の方向の曲げ運動や力の間の方向の曲げ力、交代刺激により単独刺激の運動と運動の間を結ぶ描弧運動や力と力の間を結ぶ描弧力が誘発された。今後、手根のあらゆる方向の運動や力が誘発できる可能性が示唆された。本研究は、前腕3肢位(回内位、中間位、回内位)で、これら5筋のうち隣り合う作用を持つ2筋を組合せ神経筋電気刺激(ENS)することにより、手根のあらゆる方向の運動や力を誘発できるかどうか調べるものであり、平成24年度は、中間位でECRLとECRB、ECRBとECUの組合せENSを調べた。対象は健常男性3名(20-39歳)の右上肢とした。

同期刺激により単独刺激で誘発された運動の間の方向の曲げ運動や力の間の方向の曲げ力、交代刺激により単独刺激の運動と運動の間を結ぶ描弧運動や力と力の間を結ぶ描弧力が誘発された。これまでの研究で、これら3筋の組合せENSにより回内位でも同様な結果が得られており、今後、FCRやFCUも加えることで、手根のあらゆる方向の運動や力が誘発できる可能性が示唆された。手根の運動には屈曲、伸展、内転、外転およびこれらの組み合わさった描円があり、360°どの方向にも動きうる。運動の主力となる筋として、手根伸筋群(長橈側手根伸筋:ECRL,短橈側手根伸筋:ECRB,尺側手根伸筋:ECU)と屈筋群(橈側手根屈筋:FCR,尺側手根屈筋:FCU)がある。著者らはこれまで、これら5筋の神経筋電気刺激(ENS)による単独収縮で、手根にそれぞれ別方向の運動や力が誘発されることを示し報告してきた。本研究では、上記5筋のうち隣り合う作用(誘発される運動や力の方向)を示す2筋に対して、以下の2つの刺激波形を用いて組合せENSを試みた。ENSには幅0.2 ms、振幅020 Vの矩形波を用い、周波数は20 Hzとした。また、刺激強度は、収縮閾値を0%、最大収縮が得られる強度を100%とした。同期刺激:刺激強度を0%から、一方の筋に対しては100%、他方の筋には0100%まで同期させて上げる。交代刺激:一方の筋に対して、刺激強度を0%から100%に上げて100%を維持、次いで、他方の筋に対し、0%から100%に上げて100%を維持、その後一方の筋を100%から0%まで下げてから、他方の筋を100%から0%まで下げる。その結果、2つの筋それぞれ単独の刺激強度100%のENSで誘発される手根の運動をM1とM2、力をF1とF2とすると、同期刺激により、手根のM1とM2の間の方向の曲げ運動、F1とF2の間の方向の曲げ力、交代刺激により、M1とM2の間を結ぶ描円運動、F1とF2の間を結ぶ円弧力が誘発できることが示された。以上の結果は、組合せENSにより手根のあらゆる方向の運動や力が制御できる可能性を示唆するものである。また、これらの結果は、機能的電気刺激などによる麻痺肢の動作再建への応用が期待できる。解剖学、神経解剖学回内位と中間位でECRLとECRBおよびECRBとECUの組合せENSの実験が終了し、現在、回内位と中間位でECRLとFCRおよびECUとFCUの組合せENSの実験に取り組んでいる。これまでの実験から、回外位での伸筋群、回内位での屈筋群の組合せENSは、電極の刺入が難しい、刺入できても前腕固定時に筋腹が圧迫されるため電極が抜けやすい、手の重さが影響して運動の誘発が一定しないことなどが分かった。そこで、回外位でのECRLとECRB、ECRBとECU、回内位でのFCRとFCUの組合せENSを断念することにした。隣り合う作用を持つ2筋の組み合わせは5組、前腕3肢位で行うので5×3=15種の実験が想定できる。「研究実績の概要」で記したようにこのうち4種(回内位と中間位でECRLとECRBおよびECRBとECUの組合せENS)の実験が終了し、現在新たに4種(回内位と中間位でECRLとFCRおよびECUとFCUの組合せENS)の実験に取り組んでいる。平成26年度前半に、回内位と中間位でECRLとFCRおよびECUとFCUの組合せENSの実験を終了させ、後半で、回外位と中間位のFCRとFCUの実験を終了させる。「現在までの達成度」で記した4種の実験を平成25年度前半に終了させ、平成25年度後半、26年度前半で、残りの7種の実験を終了させる予定である。実験に用いる消耗品(ワイヤー電極用ステンレス線、消毒薬品、滅菌シート、手術用手袋など)やデータ記録・保存のためのハードディスクなどを購入する。
人間支援型ロボットの知的制御システムに関する研究

社会の急速な高齢化にともない,我々の日常生活を支える様々な作業・労働を,機械化・ロボット化することが望まれている.しかし,こうした作業は整備されていない普通の環境下で人と共存して行われるので,その機械化・ロボット化には,従来とは異なる新しい知能化技術が必用である.本研究は,整備されていない普通の環境下で,人と共存・協調して人の作業を支援する複数の人間支援型ロボットと人との協調に必要なロボットの分散型知的制御技術の確立を目指すものであり,平成8年4月から平成11年3月にかけて実施したものである.平成8年度は,人と複数のロボットの代表的な協調作業問題である,単一の物体の操り問題を力学的・人間工学的に検討し,(1)人との協調作業のための分散型知的制御系の開発と(2)人間支援型ロボット用分散制御系実験システムの構築を行ない,人とロボットの協調問題を力学的に解析し,安定・安全に作業を行うための基本的な制御システムを提案してきた.平成9年度は,ロボットと人との新しい協調作業の概念を提案し,柔軟・重量物ハンドリングを例として,実験によりその有効性を確認した.すなわち,(1)ロボットによる作業負荷の分担支援ならびに,作業そのものの一部を補助する新しい協調作業の概念を提案した.(2)双腕マニピュレータによる,作業支援システムを構築した.(3)大型金属薄板のハンドリング作業を想定し,負荷分担ならびに,薄板の曲げをロボットが支援する,新しい人とロボットの協調作業システムを構築した.(4)実験により,提案する有効性を確認した.平成10年度は,これらの成果をふまえ,(1)双腕マニピュレータと全方向移動ロボットを組み合わせたロボットヘルパーを試作し,(2)双腕マニピュレータと全方向移動機構の協調制御アルゴリズムを提案し,(3)インテンショナルフォースに対する物体の見かけの動特性を指定することにより安定に協調ハンドリングを行える,人とロボットの協調作業方式を提案し,(4)システムの有効性を実験により確認した.以上のように,本研究では,人を支援することを前提としたロボットの知能化技術の研究に取り組み,人と共存・協調して人の作業を支援する人間支援型ロボットと,人との協調に必要なロボットの知的制御技術の基礎技術の確立を行うとともに,プロトタイプシステムを構築しその有効性を確認した.本研究では,知的制御技術に焦点を絞り研究を行ったが,提案するシステムを実現するには,人間工学的に解決しなければいけない問題もあり,今後より一層研究を進める予定である.機械の知能化技術の発達は,人を単純な繰り返し作業や危険な作業から解放してきた.知能化された機械は,その大部分が産業用ロボットとして,環境が整備された工場の中に導入され,人間と隔離された空間で作業を行っている.社会の急速な高齢化にともない,我々の日常生活を支える様々な作業・労働を,機械化・ロボット化することが望まれているが,これらの作業は整備されていない普通の環境下で人と共存して行われるので,その機械化・ロボット化には,従来とは異なる新しい知能化技術が必要である.本研究は,整備されていない普通の環境下で,人と共存・協調して人の作業を支援する複数の人間支援型ロボットと人との協調に必要なロボットの分散型知的制御技術の確立を目指すものであり,平成8年度は,人と複数のロボットの代表的な協調作業問題である,単一の物体の繰り問題を力学的・人間工学的に検討し,(1)人との協調作業のための分散型知的制御系の開発と(2)人間支援型ロボット用分散制御系実験システムの構築を行った.先ず,ロボットがどのように物体の運動を制御すれば,協調作業が実現できるかを考え,繰る物体に人が加える力に応じて,物体の加速度をあらかじめ与えた機械インピーダンスによって制御することで,作業性の高いシステムが実現できることを示した.次に.作業に応じて,人の操作力に対する物体の運動特性(運動座標系)を可変にすることで,システムの操作性が高まることを示した.最後に,提案する制御系を実現するための実時間制御用プログラムを開発し,6自由度産業用ロボット2台に開発した制御系を組み込み,実験により,提案する制御系の有効性を確認した.社会の急速な高齢化にともない,我々の日常生活を支える様々な作業・労働を,機械化・ロボット化することが望まれている.しかし,こうした作業は整備されていない普通の環境下で人と共存して行われるので,その機械化・ロボット化には,従来とは異なる新しい知能化技術が必用である.本研究は,整備されていない普通の環境下で,人と共存・協調して人の作業を支援する複数の人間支援型ロボットと人との協調に必要なロボットの分散型知的制御技術の確立を目指すものであり,平成8年4月から平成11年3月にかけて実施したものである.平成8年度は,人と複数のロボットの代表的な協調作業問題である,単一の物体の操り問題を力学的・人間工学的に検討し,(1)人との協調作業のための分散型知的制御系の開発と(2)人間支援型ロボット用分散制御系実験システムの構築を行ない,人とロボットの協調問題を力学的に解析し,安定・安全に作業を行うための基本的な制御システムを提案してきた.平成9年度は,ロボットと人との新しい協調作業の概念を提案し,柔軟・重量物ハンドリングを例として,実験によりその有効性を確認した.すなわち,(1)ロボットによる作業負荷の分担支援ならびに,作業そのものの一部を補助する新しい協調作業の概念を提案した.(2)双腕マニピュレータによる,作業支援システムを構築した.

(3)大型金属薄板のハンドリング作業を想定し,負荷分担ならびに,薄板の曲げをロボットが支援する,新しい人とロボットの協調作業システムを構築した.(4)実験により,提案する有効性を確認した.平成10年度は,これらの成果をふまえ,(1)双腕マニピュレータと全方向移動ロボットを組み合わせたロボットヘルパーを試作し,(2)双腕マニピュレータと全方向移動機構の協調制御アルゴリズムを提案し,(3)インテンショナルフォースに対する物体の見かけの動特性を指定することにより安定に協調ハンドリングを行える,人とロボットの協調作業方式を提案し,(4)システムの有効性を実験により確認した.以上のように,本研究では,人を支援することを前提としたロボットの知能化技術の研究に取り組み,人と共存・協調して人の作業を支援する人間支援型ロボットと,人との協調に必要なロボットの知的制御技術の基礎技術の確立を行うとともに,プロトタイプシステムを構築しその有効性を確認した.本研究では,知的制御技術に焦点を絞り研究を行ったが,提案するシステムを実現するには,人間工学的に解決しなければいけない問題もあり,今後より一層研究を進める予定である.機能の知能化技術の発達は,人を単純な繰り返し作業や危険な作業から解放してきた.知能化された機械は,その大部分が産業用ロボットとして,環境が整備された工場の中に導入され,人間と隔離された空間で作業を行っている.社会の急速な高齢化にともない,我々の日常生活を支える様々な作業・労働を,機械化・ロボット化することが望まれているが,これらの作業は整備されていない普通の環境下で人と共存して行われるので,その機械化・ロボット化には,従来とは異なる新しい知能化技術が必要である.本研究は,整備されていない普通の環境下で,人と共存・協調して人の作業を支援する複数の人間支援型ロボットと人との協調に必要なロボットの分散型知的制御技術の確立を目指すものであり,昨年度から継続して行っている研究である.昨年度は人と複数のロボットの代表的な協調作業問題である.単一の物体の繰り問題を力学的・人間工学的に検討し,(1)人との協調作業のための分散型知的制御系の開発と(2)人間支援型ロボット用分散制御系実験システムの構築を行い,人とロボットの協調問題を力学的に解析し,安定・安全に作業を行うための基本的な制御システムを提案してきた.平成9年度は,昨年度の成果をもとに,ロボットと人との新しい協調作業の概念を提案し,柔軟・重量物ハンドリングを例として,実験によりその有効性を確認した.すなわち,(1)ロボットによる作業負担の分担支援ならびに,作業そのものの一部を補助する新しい協調作業の概念を提案した.(2)双腕マニピュレータによる,作業支援システムを構築した.(3)大型金属薄板のハンドリング作業を想定し,負荷分担ならびに,薄板の曲げをロボットが支援する,新しい人とロボットの協調作業システムを構築した.(4)実験により,提案する有効性を確認した.社会の急速な高齢化にともない,我々の日常生活を支える,様々な作業・労働を,機械化・ロボット化することが望まれている.
複合金属シアン化物錯体触媒(DMC触媒)の活性空間の探求

複合金属シアン化物錯体触媒(DMC触媒)は多価アルコールにプロピレンオキシド(PO)などのエポキシドを重合させる触媒として知られているが,その真の触媒活性種や反応機構は現在まで明らかになっていない。本研究では亜鉛が触媒活性中心となっているとの推測のもと,種々のN-Nアミンキレート配位子をもつ亜鉛錯体である,ZnN_3Cl_2,[ZnN_4Cl]^+,ZnN_4]^<2+>タイプの錯体を合成し,POの重合活性を調べた。その結果AgN0_3やTMSOTfなどの助触媒をジクロロ錯体に対しては2当量,モノクロロ錯体に対しては1当量用いると触媒活性を示すことが明らかとなった。これより,[ZnN_3]^<2+>タイプの錯体が触媒活性を示すことが示唆された。次に,N-Oキレート配位子を有する亜鉛錯体について検討した。8-ヒドロキシキノリンとZnEt_2との反応ではこの配位子が架橋した直線型3核および4核錯体が生成するのに対して,2-メチル8-ヒドロキシキノリンとZnEt^2との反応では面共有ダブルキュバン構造の対角2頂点が欠けた不完全ダブルキュバン構造の錯体が生成することをX線構造解析により明らかにした。この錯体は,溶液中では徐々に配位子架橋折れ曲がり型3核錯体へと変換するが,InBr_3との反応では8員環4核錯体が生成することがX線構造解析により明らかになった。PO重合触媒能については,不完全ダブルキュバン錯体は全く触媒能を示さないのに対して,8員環4核錯体については0.5mol%を使用して10gのPOがほぼすべて重合する高い触媒能を有することが明らかになった。複合金属シアン化物錯体触媒(DMC触媒)は、Zn_3[Co(CN)_6]_2-xZnCl_2-y(diglyme)-zH_2Oの組成で表わされる配位高分子であり、プロピレンオキシド(PO)の重合に高い活性を示すことが知られている。しかし、その触媒活性種および重合機構については明らかにされていないのが現状である。本研究ではDMC触媒の活性種を追求し、そのPO重合反応機構を調べることにより錯体が示す活性空間の役割を明らかにしていくことを目指した。今までの我々の研究より、トリアミン配位子やトレン配位をZnCl_2に反応させたところ、これらが配位した錯体が生成した。これらの錯体はそれ自身ではPO重合触媒能は低いが、Me_3SiOSO_2CF_3(TMSOTf)を助触媒として作用させると、重合活性能が向上することを見出している。そこで本研究では、NとOの2座配位子であるヒドロキシキノリンおよびその誘導体を配位子とした場合の亜鉛錯体の合成の検討を行った。ヒドロキシキノリンを用いた場合には、直線状亜鉛4核錯体が生成するのに対して、2-メチルヒドロキシキノリンを用いた場合には、不完全ダブルキュバン構造をもつ亜鉛4核錯体が生成することを見出した。これらの錯体はX線解析によりその構造を明らかにした。さらにダブルキュバン錯体にInBr_3を反応させたところ、亜鉛と酸素が交互につながった8員環化合物が生成することを見出した。この8員環化合物はPO重合に対してきわめて高い活性を示すことも見出した。
KRAS変異・高増殖活性型肺腺癌の分子病理学的特性の追求

本研究では、複数のKRAS下流分子の発現プロファイルをみることで、肺腺癌の悪性度を規定する分子基盤の一端を明らかにすることを目標とした。先行研究でのマイクロアレイ解析で既に同定されているKRAS下流分子群の発現レベルを、KRAS導入細胞を用いて検証した結果、ほとんどの対象分子群で発現変動が確認され、マイクロアレイの結果の正当性が支持された。特に、ケモカイン3分子(CXCL7(PPBP)、CCL3、CXCL2)、S100分子群の発現解析を原発性肺癌病変で行い、KRAS変異肺癌で高発現している病変があることを確認した。また、蛋白質発現解析では、特にS100蛋白質群が、KRAS変異・高増殖活性型肺癌で高発現している傾向があった。がんの悪性度を規定する分子基盤を明らかにすることは、がんの進展機構を解明する上で、また新規の分子標的療法の開発につながる重要な研究案件である。本研究の目的は、その分子基盤の一端を明らかにすることである。申請者らはこれまでにKRAS変異肺腺がんの予後が他の肺腺がんと比べて不良であることを示してきた。さらにKRAS変異肺腺がんの中でも細胞増殖活性が高い群と低い群があり、KRAS変異/高増殖活性を示す群が、最も予後不良であることを示してきた。従って、KRAS変異/高増殖活性を示す肺腺がんの悪性度を規定する因子を同定することは、がんの悪性度を規定する分子基盤を解明する上で有用な事であると考えられる。申請者らは既に、遺伝子発現マイクロアレイを用いたKRAS下流分子の網羅的解析から、肺がんの進展にかかわる候補癌遺伝子および癌抑制遺伝子を複数同定してきた。申請課題では、複数のKRAS下流分子の発現プロファイルをみることで、肺腺がんの悪性度を規定する分子基盤の一端を明らかにすることを目標とした。当該研究では、マイクロアレイ解析によって抽出された分子群の発現レベルを、先ずKRAS導入細胞で検証し、マイクロアレイ解析の結果との整合性を求めた。申請の表に記した分子群の殆ど全ての発現変動が確認され、マイクロアレイの結果の正当性が支持された。特に、ケモカイン3分子(CXCL7(PPBP)、CCL3、CXCL2)、およびS100分子群の発現解析を原発性肺癌病変で行い、これらの発現レベルが、KRAS変異肺癌で高度に上昇している病変があることを確認した。また、これら候補分子群の蛋白質発現解析では、特にS100蛋白質群が、KRAS変異肺癌で高発現している傾向があることを見出した。以上の研究成果は、国際誌に投稿予定である。申請者はこれまでにKRAS変異肺腺がんの予後が他の肺腺がんと比べて不良であることを示してきた。申請者らは既に、遺伝子発現マイクロアレイを用いたKRAS下流分子の網羅的解析から、肺がんの進展に関わる候補癌抑制遺伝子を複数同定してきた。申請課題では、複数のKRAS下流分子の発現プロファイルをみることで、肺腺がんの悪性度を規定する分子基盤を明らかにすることを目標としている。当該年度では、マイクロアレイ解析によって抽出された分子群の発現レベルを、先ずはKRAS導入細胞で検証し、マイクロアレイ解析の結果との整合性を求めた。申請の表に記した分子群の殆どすべての発現変動が確認され、マイクロアレイの結果の正当性が支持された。23年度は特に、ケモカイン系3分子(CXCL7 (PPBP), CCL3, CXCL2)の発現解析を原発性肺癌病変で行い、これらの発現レベルが高度に上昇している病変があることを確認している。ほぼ計画通りの進行状況である。前述の如く、当該年度では、マイクロアレイ解析によって抽出された分子群の発現レベルを、先ずはKRAS導入細胞で検証し、マイクロアレイ解析の結果との整合性を求めた。

23年度は特に、ケモカイン系3分子(CXCL7 (PPBP), CCL3, CXCL2)の発現解析を原発性肺癌病変で行い、これらの発現レベルが高度に上昇している病変があることを確認している。ほぼ計画通りの進行状況である。申請書の計画とおりに、以下の如くに進める。(1)mRNA発現解析肺腺がん190例の手術材料から抽出された高悪性度群(再発例)20例、低悪性度群(無再発例)40例(新鮮凍結材料に限定する)のうち、まず半数にあたる30例を対象として定量的RT-PCR法によるmRNAの発現解析を行う。解析に当たっては、マイクロダイセクション法によって腫瘍細胞と非腫瘍部気道上皮細胞をとりわけた後に定量的RT-PCR法を行うこととする。採取、保存されている新鮮凍結検体の質に関しては、前述のこれまでの研究成果に示す如く、本課題の研究項目の完遂に十分な質のものである。(2)蛋白質発現解析市販の特異抗体を用いてウェスタンブロット法、およびパラフィン切片上で免疫染色法を行い、蛋白質の発現レベルを半定量的に解析する。特に、免疫染色法の結果から得られた染色様式を解析し、発現レベル半定量化のための閾値設定の検討を行う。申請書の購入計画とおりに消費する。ほとんどが実験試薬類の消耗品である。高額機器、打ち合わせのため出張費には使用しない。
センチピードグラス(Eremochloa ophiuroides (Munro) Hack.) の飼料資源としての評価

1.センチピードグラス品種・系統の増殖2.植物特性の評価実験センチピードグラスの葉と分げつの動態の窒素施肥量と季節に対する反応特性を,バヒアグラスと比較することにより明らかにしようとした小芝地スケールでの実験では,(1)センチピードグラスは分枝能力に優れること,(2)この原因は出葉速度が高いためではなく,腋芽が分げつに発達する率が高いためであることが明らかになった。放牧草地スケールでの評価では,センチピードグラスは,(1)放牧牛による利用性が高いこと,(2)緑葉→枯死葉→リターの移行が速いために土壌肥沃化能力が高いこと,(3)緑葉→枯死葉の移行が速い割には出葉速度が高くないことから,分げつ当りの緑葉数は少ないが,分げつ密度が高いために,単位土地面積当りの葉量や葉面積を高く維持できることが明らかになった。センチピードグラスの品種・系統(上記2品種・4系統),移植栄養体の種類(ほふく枝先端部,先端部に続く部分,株状基部)および窒素施肥量(早春に施用予定)が移植栄養体の定着と冬季春季の生育特性に及ぼす影響について明らかにしようとしたポット実験では,今年度の主要結果として,移植栄養体の定着率は株状基部で最大であることが明らかになった。飼料資源としてのセンチピードグラスを評価するために以下の調査・研究などを実施した。実施期間は補助金交付内定(平成14年12月)からの約3ヶ月間であった。1.すでに造成されたセンチピードグラス(品種Common)草地を用いて、春期の生育特性について、主として葉や分げつ(ほふく枝)の動態の観点から調査を開始した。対照種としてバヒアグラスを用い、季節だけでなく窒素施肥量の影響も検討できるような実験計画を設定した。この実験により、センチピードグラスの、特に春期の出葉速度と全生育期間の分げつ発生速度/出葉速度比に関する特性について評価する。肥料要求量に関する特性についても確認する。3.米国より入手した4つの系統については、平成15年度以降の研究のために、増殖の準備を開始した。また、これらの系統についても、春期の生育特性についての調査を開始した。特に、春期の生育における4系統の特性について明らかにする。なお、種子で入手した2品種については播種条件(主として気象条件)が整い次第草地造成できるように圃場・実験計画などを準備した。
感情障害におけるセロトニン関連受容体遺伝子変異の検討

長崎大学医学部倫理委員会において研究実施許可を得て,長崎大学精神神経科を含む長崎県下の精神科治療施設に入院中または通院中のDSM-III-Rで感情障害と診断された患者とその家族を対象にスクリーニング調査を行った。その結果見出された気分障害親子発症例中,表現促進を示唆する子世代における明らかな発症年齢の低下が認められた親子発症組で,研究への同意が得られた親子7組より血液試料の提供を受けた。提供血液試料からゲノムDNAを抽出して凍結保存した。遺伝研究用面接基準(FIGSなど)の適用が充分でなかったため,臨床遺伝学的情報の収集は診療録を基に行った。この合計7組15名の保存DNA試料を用いて,感情障害の候補遺伝子の一つと考えられ,反復配列多型の存在が報告されているセロトニン輸送体遺伝子の第2イントロン内の17塩基反復配列の繰り返し数について調べた。上記DNA試料から,既に報告されているLeschらの方法に準じてPCR増幅を行った。このPCR産物における17塩基反復配列の繰り返し数をポリアクリルアミドゲル電気泳動にて推定したが,一部についてはさらに直接塩基配列決定を行って決定したところ,繰り返し数は,10回と12回のみであった。しかしながら,繰り返し数と子世代における発症年齢の低下との関連性を示唆する結果は得られなかった。より確実な結論を導くには,サブクローニングした後の塩基配列決定や両親を含めた症例数の増加と正常対象群との比較が必要である。また,遺伝研究用面接基準(FIGSなど)を行う面接者を育成することにより全例への面接を可能とし,両親からの遺伝負因のより確実な除外等も必要であろう。セロトニン2型受容体遺伝子を含め,他のセロトニン関連受容体遺伝子の変異の検討もまだ残されている。倫理的配慮について,長崎大学医学部倫理委員会において研究実施許可を得て,対象(長崎大学精神神経科病棟を含む長崎県下の精神科治療施設に入院中または通院中のWHOの国際疾病分類ICD-10V章・精神と行動の障害の研究用診断基準で気分障害もしくはDSM-III-Rで感情障害と診断された患者とその家族)のスクリーニング調査を行った。最初に,気分障害(感情障害)における表現促進(anticipation)について検討するため,これまでの調査結果を基に,第一度および第二度親族に精神疾患の既往または精神科施設通院歴のある患者の中から見出された19組の気分障害親子発症例における発症年齢の比較を行った。その結果,子世代における発症年齢の有意な低下が認められ(Wilcoxon t=7.0,df=18,p<.0001;one tailed),統計学的バイアスが十分に除外できているとは言い難いながらも,気分障害における表現促進が示唆された。そこで,子世代における明らかな発症年齢が低下している親子発症例で,研究への同意の得られた5組から,血液試料の提供を受け,DNAを抽出して保存した。現在,Family Interview for Genetic Studies(FIGS)といった遺伝研究用の面接基準による面接を順次実施しながら,両親からの遺伝負因の除外を行っているところである。一方,遺伝子変異の有無の検討については,セロトニン輸送体遺伝子の塩基配列を参考にして作製したPCR用オリゴヌクレオチドプライマーを用いて,既に保存してある上記DNA試料にて,多形の報告がある17塩基の繰り返し配列の繰り返し数と表現促進との関連性について検討中であるが,有意な結果は今までのところ得られていない。さらに症例数を増やして検討する予定である。長崎大学医学部倫理委員会において研究実施許可を得て,対象(長崎大学精神神経科病棟を含む長崎県下の精神科治療施設に入院中または通院中のWHOの国際疾病分類ICD-10V章・精神と行動の障害の研究用診断基準で気分障害

もしうはDSM-III-Rで感情障害と診断された患者とその家族)のスクリーニング調査を行って見出された気分障害親子発症例中,表現促進を示唆する子世代における明らかな発症年齢の低下が認められた親子発症組で,研究への同意が得られた組数を,昨年度の5組から7組へ増やし,血液試料の提供を受けた。提供血液試料からDNAを抽出して保存した。感情障害の候補遺伝子の一つと考えられ,反復配列多型の存在が報告されているセロトニン輸送体遺伝子内の17塩基反復配列について,上記合計7組15名の保存DNA試料から,既に報告されている方法に準じてPCR増幅を行った。このPCR産物における17塩基反復配列の繰り返し数をポリアクリルアミドゲル電気泳動および一部についてはさらに直接塩基配列決定を行って決定した。昨年度よりは症例数が若干増加したが,この17塩基反復配列の繰り返し数と子世代における発症年齢の低下との関連性を示唆する結果は得られなかった。より確実な結論を導くには,両親を含めた症例数の増加と全症例への遺伝研究用面接基準(FIGSなど)を用いた面接による両親からの遺伝負因の除外,正常対照親子群との比較が必要であろう。
石灰系スラグによる高炭素濃度溶鉄の脱りん反応の速度論的研究

本研究は、溶銑処理における脱りん操作の工学的基礎を確立させることをねらった研究で、基本スラグとして新しくCaO-【Li_2】O-Si【O_2】系を選び、かつ浴の撹拌をコントロールした反応実験を行った点に大きな特色がある。1.基本設備として「ケラマックス電気炉」を購入設置し、これにより、試料の溶解、実験を、精密な温度と雰囲気のコントロールのもとに行うことができた。2.基本スラグの熱力学的数値としてSi【O_2】の活量,添加したFeOの活量,およびphosphate capacityを求め、これにより本研究のスラグの本性を明らかにした。3.FeOを含むスラグによる高炭素濃度溶鉄の脱りん反応の速度論的実験を行い、脱りん挙動を明らかにした。とくに反応の進行中、脱りんから復りんに変化する現象を明確に示した。また、実験結果と反応モデルによる計算結果を比較検討することにより反応機構を考察した。4.スラグ-メタル間のりん反応を一般的な反応系としてとりあげ、スラグとメタルのPの初濃度を種々変化させ、メタルの脱りんから復りんまでの反応を起させ、その中間の擬平衡状態からスラグ-メタル間界面酸素ポテンシャルを推定した。5.脱りん反応機構を検討する上で有用な知見を得るため、同じスラグ-メタル系におけるSiの酸化反応をとりあげ、スラグ側、メタル側物質移動に対する撹拌、界面におけるCO気泡生成の影響などを明らかにした。また、反応モデルを用いて、Si酸化反応における界面酸素ポテンシャルを推定した。これは今後詳細な脱りん反応モデルを確立するための基礎資料となるものである。6.FeOを含むスラグを高炭素濃度溶鉄と接触反応させた場合に起る種々の現象を関連づけ、理論的に厳密な反応モデルで説明すること、および、スラグ中の【Fe^(3+)】の挙動が脱りん反応の進行をどのように支配するかを解明することの2つの問題を今後新規の課題として研究する計画である。
新規Ｔｈ２免疫賦活物質を用いた難治性免疫疾患の治療と予防に関する基礎的研究

寄生虫由来Th2免疫賦活物質の単離、また作用機序を解析するために、腸管上皮細胞および非細胞培養系での免疫活性測定法を検討した。作用物質はトリプシン処理した場合にだけ、脾細胞培養系でTh2サイトカインであるIL-4の産生を優位に増加させたが、腸管上皮細胞では作用は見られなかった。本物質は消化管でのプロセッシングを受け、吸収後にリンパ装置で作用することが明らかとなった。また同培養細胞系は単離に向けた活性測定法として有用であると考えられた。合わせて効率的な抽出方法に関しても検討を行っている。昨年度に引き続き、免疫活性物質収集のために、数多くの感染実験を行い寄生虫虫体を収集した。昨年度入手できなかったラット由来の消化管上皮細胞培養系にDMSO、またはSDSに抽出物を縣濁しTh2サイトカインの産生を検討したが、産生増加は認められなかった。また、in vivoでの抽出物投与後に継時的に小腸を採材し、マイクロアレイ法によって産生増加した遺伝子を検索したが、Th2関連サイトカインの発現増加は認められなかった。しかし、強力な抗菌物質であるαーディフェンシンの発現増加を認めた。この物質は抗酸菌や原虫での宿主の防御作用を担う物質であることは知られていたが、蠕虫での作用は検討されておらず、本実験の結果より、蠕虫に関しても防御作用を担う可能性が示唆された。また、本物質の採用発現には消化管内でのプロセッシングの必要性を検討するために、抽出物をトリプシンで処理し、その後リンパ装置(抗原提示細胞、リンパ球)並びに消化管上皮細胞を用いた細胞培養系への抽出物添加によるTh2サイトカイン産生増加を検討した。縣濁溶媒としては、DMSO,SDS以外にもguanidine hydrochloride、1-O-n-Octyl-β-D-glucopyranosideを用いた。その結果リンパ装置細胞培養系で1-O-n-Octyl-β-D-glucopyranosideに縣濁したトリプシン処理抽出物添加群でIL-4産生が有意に上昇した。抽出物の単離の為のin vitroのアッセイ系を確立することが出来た。新規のTh2免疫賦活物質の単離のために、フレンチプレス法による破砕、非イオン性界面活性剤による可溶化法を検討した。旧来の方法では、採取ごとのロット差が大きいため安定した結果が得られなかったことが、従来デブリスとして破棄していた分画に活性物質が存在したことを確認した。同部位は可溶化するには困難があるが、様々な破砕方法の組み合わせの検討、様々な界面活性剤の使用、種々のタンパク分解酵素を用いた検討により、デブリス分画よりの可溶化の道筋を付けられたと思われる。単離に向けての計画が甘かったために、計画していた研究には、届かなかった部分もあるが、本物質の単離、分離精製によって得られる知見を考えると、デブリス分画に研究過程で注目できたことは、非常に意義深いと考える。現在も引き続き可溶化法を検討している。また、使用可能な物質を用いて検討した結果、同物質は直接腸粘膜上皮に作用して、Th2免疫反応を活性化するのではなく、腸より吸収後リンパ組織に作用してTh2免疫反応を活性化することが明らかとなった。またその結果は、脾臓細胞を用いたin vitroの実験系で確認することが可能となった。単離に向けてはまだ研究が必要であるが、単離後の成果を考えるに、本研究過程で得られた結果は非常に意義深い。初年度はTh2免疫賦活物質を得るために、数多くの感染実験を行い寄生虫虫体を収集した。収集後抽出を行い、実験に使用した。抽出物収集のためにかなりの時間と動物が必要で有ったが、当初の計画の範囲で行えたと考える。抽出物よりTh2免疫賦活物質を単離するためには、in vitroでのTh2活性化をアッセイできる実験系が必要で有る。本年度は実験対象を絞って、抽出物を用いることが出来る範囲で実験を行った。当初の想定であった、リンパ装置細胞(抗原提示細胞、リンパ球)ならびに消化管上皮細胞を用いた細胞培養系への抽出物添加による、Th2サイトカインの産生増加が起こるのかの検討を行った。抗原提示細胞、リンパ球混合培養系に抽出物をDMSO,またはSDSに縣濁し培養系に添加しTh2サイトカインの産生量を検討した。抽出物添加によってもTh2サイトカインの産生増加は認められなかった。抽出物はin vivoで作用を示す場合は、経口投与であり、消化管内でのプロセッシングを受ける場合も想定される。抽出物がそのままの形状では作用しない場合も考えられるため、今後は酸化、酵素等による処理を施したのちに培養系に添加する方法も想定すべきであると考えられた。

また、消化管上皮細胞培養系に抽出物をDMSO,またはSDSに縣濁し培養系に添加しTh2サイトカインの産生量を検討した。抽出物添加によってもTh2サイトカインの産生増加は認められなかった。用いた細胞は唯一入手可能であった癌細胞由来の細胞株しか行えなかった。初代上皮細胞も含めた、種々の細胞での検討も必要で有ると考えられた。抽出物の活性検定の為に、in vitroの実験系確立が本抽出物単離のために大きなハードルで有り、実験系が確立されたことにより研究の目的達成が可能となった。当初の想定であった、リンパ装置細胞(抗原提示細胞、リンパ球)ならびに消化管上皮細胞を用いた細胞培養系への抽出物添加による、Th2サイトカインの産生の検討を行ったが、反応が見られ無かった。抽出物の性状が作用発現には重要で有るかも知れないという結果も得られたこと、また、消化管上皮の種類を検討しなければならないことなど、本年度のつなげられる結果は得られている。抽出物単離の為に、どの様な分画を用いるかが重要となる。サイトカインの反応は認められるものの、現在の状況では、溶媒への完全な溶解が達成できていないと考えられることから、様々な界面活性剤を用いて、活性分画の可溶化を計画している。また、現在行っている、虫体の超音波破砕では、少量の抽出物しか得ることが出来ない。そのために虫体破砕方法に関しても大量に得ることが出来る方法も合わせて検討する。本年度の結果を受けて、抽出物の処理の検討、また消化管上皮の種類の検討も次年度計画に追加して検討を行う。また次年度はin vivo投与実験の材料を用いた、マイクロアレイによる遺伝子発現解析も計画しており、総合的に抽出物の作用機序に迫れると考える。本年度はわずかの未使用額が発生したが、僅かの予算内で適当な実験関連物品が無かった。次年度の予算におおきく影響する金額ではないが、試薬等の消耗品等に追加して使用したい。本年度では本抽出物を溶解するのに至適な溶媒を見つけることが出来ず単離のために大きなハードルとなった。そこで本年度は、単離に向けた抽出物質の可溶化を加えて検討する。可溶化が達成できれば、研究目的である、本物質の作用起点の検討も容易となる。また、リンパ装置(抗原提示細胞、リンパ球)細胞を用いた細胞培養系への抽出物添加により、マイクロアレイによる遺伝子発現の検討も可能となる。抽出物収集のために、昨年度と同様に数多くの感染実験を行い寄生虫虫体収集と抽出を行う。また当初の計画通り、in vivo投与実験の材料を用いた、マイクロアレイによる遺伝子発現解析を行う。また本年度の結果を踏まえて、抽出物の処理を施し、細胞培養系への添加実験を行う。マイクロアレイの結果如何では、対象細胞の検討を行う。
老化関連肺疾患におけるエクソソーム中 microRNAによる細胞間情報伝達

本研究は、COPD及びIPFの病態におけるエクソソームの関与を,気道上皮細胞と線維芽細胞の相互作用に注目し明らかにすることを目的とした。喫煙刺激によって老化した気道上皮細胞由来のエクソソーム中のmiR210は、筋線維芽細胞分化を促進した。IPFの線維芽細胞由来のエクソソームは、気道上皮細胞に細胞老化、ミトコンドリア機能不全をもたらした。エクソソーム中のmiRNAにたいしてマイクロアレイを行い、細胞老化とミトコンドリア機能不全をもたらすmiRNAを同定した。ミトコンドリア機能不全は、SIRT3に対する阻害作用を介していた。(1)気管支肺胞洗浄液より回収したエクソソーム中のmiRNA、蛋白質の網羅的解析:COPDやIPF患者のBALFから解析に十分なエクソソームを回収する。対象症例を増やす。回収したエクソソーム中のmiRNA microarray解析やプロテオーム解析を行い、COPDおよびIPFに特異的な、exosomal miRNAおよびタンパク質を同定する。COPDは検体の採取に問題はないが、IPFについては症例数が少ないため、近隣の病院にも協力していただき、倫理委員会への申請を行い、症例を集めている段階である。本実験は、荒屋が主導している。(2)気道上皮由来エクソソームの線維芽細胞への取り込みの検討:気道上皮分泌エクソソームが線維芽細胞に取り込まれることによって細胞間情報伝達に関与しているか検討した。recipient cellとして線維芽細胞を用いた。BEAS-2Bおよびヒト由来初代気道上皮細胞(human bronchial epithelial cell: HBEC)の培養上清よりエクソソームを回収し、それぞれの細胞自身および線維芽細胞における取り込みを評価した。その結果、繊維芽細胞はエクソソームを取り込むことが確認できた。本実験は、大学院生である小林が行った。(3)喫煙刺激による気道上皮由来エクソソームのパラクライン作用の検討:BEAS-2B、HBECに対して1%タバコ煙水抽出液(cigarette smoke extract:CSE)による刺激を与え、エクソソーム分泌量の評価をNanoSightにて観察を行う。気道上皮細胞はCSE刺激により細胞老化を生じた。CSE刺激によるBEAS-2B由来exosomeを線維芽細胞に添加すると、線維芽細胞は金繊維芽細胞へ分化した。当初の予定では、疾患肺の検体を用いた研究を進める予定であったが、検体が得られにくいIPFにつて今後の検体採取を計画通り行うため、他施設へも協力をお願いしたため、実際の検体の収集が遅れている。ただ、培養細胞を用いた研究に関しては予定よりも進みが早く順調である。(1)閉塞性肺疾患における気道上皮由来エクソソーム中マイクロRNAの解明喫煙刺激し老化した気道上皮由来エクソソームを線維芽細胞に添加すると,筋線維芽細胞へ分化した.マイクロRNAマイクロアレイ解析を用いて,エクソーム内マイクロRNA発現プロファイルを検討した.変化のあったマイクロRNAのうち,miR-210はオートファジーに関与するATG7の発現を抑制した.オートファジーの低下は筋線維芽細胞分化に関与した.以上の結果より,閉塞性肺疾患の病態において,気道上皮細胞由来エクソソーム内miR-210はオートファジーを介し気道線維化に関与すると考えられた.この結果は,新たなエクソソームを介した気道上皮細胞-線維芽細胞間の情報伝達の発見であるとともに,新規治療法の開発の可能性を示唆した.本研究はすでに論文として報告した.(2)特発性肺線維症(IPF)における線維芽細胞由来エクソソームのパラクライン作用の解明線維芽細胞由来エクソソームが,IPF病態形成において重要な役割を担う気道上皮細胞に取り込まれることを確認した.TGF刺激で誘導した筋線維芽細胞由来エクソソームによる気道上皮細胞における細胞老化への関与を検討した.さらに,マイクロRNAマイクロアレイ解析にて筋線維芽細胞由来エクソソーム内マイクロRNAの発現プロファイルを検討したところ,複数のマイクロRNAで変化を認めた.同時に,疾患肺検体及び患者血清からエクソソームを抽出し,網羅的解析及び標的分子の同定を行っている.臨床検体は,近隣の他施設の協力を得たことで,定期的な収集が可能となった.In vitroで得られた結果を,動物モデルで評価するための実験を計画中である.老化関連肺疾患の一つである閉塞性肺疾患における気道上皮由来エクソソーム中マイクロRNAの気道線維化への関与をすでに論文にて報告した.同じく老化関連肺疾患である特発性肺線維症での筋線維芽細胞由来エクソソームの検討を行なっており,すでにエクソソーム内マイクロRNAの網羅的解析は終了している.培養細胞を用いた検討が比較的順調に進行している一方,動物モデルを用いたエクソソームの解析は遅れている.しかし,すでに今後必要と考える研究手法は確立している.臨床検体に関しては,IPF患者臨床検体の収集が問題であったが,近隣他施設の協力を得られたことで解決した.現在は定期的な臨床検体の収集が可能である.(1)閉塞性肺疾患における気道上皮由来エクソソーム中マイクロRNAの解明喫煙刺激した気道上皮細胞由来エクソソームを線維芽細胞に添加すると,筋線維芽細胞へ分化した.

喫煙刺激は気道上皮細胞の細胞老化を誘導することが判明している.マイクロRNAマイクロアレイ解析を用いて,エクソーム内マイクロRNA発現プロファイルを検討した.変化のあったマイクロRNAのうち,miR-210はオートファジーに関与するATG7の発現を抑制した.オートファジーの低下は筋線維芽細胞分化に関与した.以上の結果より,慢性閉塞性肺疾患の病態において,気道上皮細胞由来エクソソーム内miR-210はオートファジーを介し気道線維化に関与すると考えられた.この結果は,新たなエクソソームを介した気道上皮細胞-線維芽細胞間の情報伝達の発見であるとともに,新規治療法の開発の可能性を示唆した.本研究はすでに論文として報告した.(2)特発性肺線維症(IPF)における線維芽細胞由来エクソソームのパラクライン作用の解明IPF病態において,線維芽細胞由来エクソソームが気道上皮細胞に取り込まれ,細胞老化を誘導することを確認した.マイクロRNAマイクロアレイ解析にてIPF患者線維芽細胞由来エクソソーム内マイクロRNAの発現プロファイルを検討したところ,複数のマイクロRNAで変化を認め,細胞老化をきたすマイクロRNA及びその標的遺伝子を同定した.標的遺伝子は患者肺組織で発現が低下していた.さらに,この細胞老化は,ミトコンドリア機能不全を伴っていることが示唆された.今後はこの現象をさらに検証し,論文投稿予定である.本研究は、COPD及びIPFの病態におけるエクソソームの関与を,気道上皮細胞と線維芽細胞の相互作用に注目し明らかにすることを目的とした。喫煙刺激によって老化した気道上皮細胞由来のエクソソーム中のmiR210は、筋線維芽細胞分化を促進した。IPFの線維芽細胞由来のエクソソームは、気道上皮細胞に細胞老化、ミトコンドリア機能不全をもたらした。エクソソーム中のmiRNAにたいしてマイクロアレイを行い、細胞老化とミトコンドリア機能不全をもたらすmiRNAを同定した。ミトコンドリア機能不全は、SIRT3に対する阻害作用を介していた。他施設での検体を得るための倫理委員会などの手続きが終了したため、IPFの手術検体が集積でき次第、解析を開始する。in vitroの実験については順調に進行しており、現状のまま遂行できると考えている。1)慢性閉塞性肺疾患:気道の線維化機序の解明を目的に、これまでに解明した老化した気道上皮細胞由来のエクソソームが繊維芽細胞に与える影響に対して、繊維芽細胞由来のエクソソームが気道上皮に与える影響、例えば、細胞老化、細胞死、修復などについて検討する。エクソソーム中の有意なmicroRNAが同定されれば、その修飾による効果を検討する。2)特発性肺線維症:肺線維芽細胞やTGFを用いて分化させた筋線維芽細胞由来のエクソソームを抽出し、気道上皮細胞の細胞死、細胞老化、細胞増殖、修復に対する影響を検討する。また、特発性肺線維症の患者より得られた線維芽細胞由来のエクソソームを抽出し、正常肺より得られた線維芽細胞由来のエクソソームと、気道上皮細胞に与える影響について比較検討する。呼吸器内科学
次世代汎用CFDのための安定成層SGSモデル・植生キャノピーモデルの開発

次世代汎用CFDとして多大な期待を集めるLESのためのSGSモデル、植生キャノピーモデルの開発研究を行った。植生キャノピーモデルの開発研究においては、LESとRANSを組み合わせた、簡易で汎用性の高いハイブリッドモデルを新たに開発した。一方で、LESとRANSの切替位置付近における速度分布の不整合など、新たに開発したモデルには問題点も見られた。現状、その問題点に対する改善策は十分ではなく、さらなる検討が今後も必要である。平成19年度は,次世代汎用CFD(Computational Fluid Dynamics)として多大な期待を集めるLES (Large-Eddy Simulation)のための植生キャノピーモデルの開発を行った.LESにおける植生キャノピーモデルの開発は気象分野で先駆的に行われてきているが,比較的複雑な式体系に基づく一辺倒な方法(SGS (subgrid-scale)運動エネルギーの輸送方程式を解くLESに基づく植生キャノピーモデル)が研究されているのみである。汎用性を意図した簡易なモデル化という点に関しては,これまで十分な検討に至っていない。本研究ではまず,簡易な式体系に基づくLESのための植生キャノピーモデル(物理量の輸送方程式を解く必要のないLESに基づく植生キャノピーモデル)を導入した。さらに,LESの植生キャノピーモデルにおける問題点(植生キャノピーモデルに含まれる抗力係数の最適化に関する問題点)を回避する一方策として,キャノピー層にRANS(Reynolds-Averaged Navier-Stokes)モデルを適用し,それよりも上層部にLESを適用する,RANS/LESハイブリッドモデルを開発した。本研究で開発したRANS/LESハイブリッドモデルの適用は非常に簡易で汎用性の高いものと考えられるが,一方で,RANSとLESの切替位置付近で速度分布に不整合が生じてしまうという問題点も明らかになった。この周題点の改善については,現在様々な方策を検討しているところである。平成20年度も引き続き、次世代汎用CFD(Computational Fluid Dynamics)として大きな期待を集める、LES(Large-Eddy Simulation)のための植生キャノピーモデルの開発を中心に研究を行った。昨年度に、植生キャノピー層にRANS(Reynolds-Averaged Navier-Stokes)モデル、キャノピー層の上層部にLESを導入するLES/RANSハイブリッドモデルを開発した。平成20年度はRANS、LESそれぞれの乱流モデル(SGS(subgrid-scale)モデル)の組み合わせによる違いをパラメトリックに検討した。RANSとしては、(1)混合距離モデルと(2)平岡ら(1989)のk-εモデル、LESのSGSモデルとしては、(1)標準Smagorinskyモデルと(2)一方程式型SGSモデルを導入した。いずれの組み合わせも比較的簡易で、汎用性の高いものと考えている。RANSとして平岡らのk-εモデルを用いた場合の方が若干妥当性の高い結果が得られたが(LESのSGSモデルの違いによる影響はほとんどなし)、いずれの組み合わせでも、RANSとLESの切替位置付近で流速分布に非物理的な不整合が生じた。この問題に関しでは、切替位置付近での空間的なフィルタ操作(不整合な流速分布を滑らかにするためのフィルタ操作)の導入を試みたが、十分な改善は得られなかった。これについては今後もさらなる対策を検討していく予定である。
歯髄幹細胞による神経細胞分化誘導法の確立

PDGF-AAはp38を介して歯髄幹細胞の象牙芽細胞分化を促進し、PDGF-BBは歯髄幹細胞のオリゴデンドロサイト分化を促進することが示唆された。また、PDGF-BBはPDGFRβに依存し、その下流でERK1/2、Aktを介して歯髄幹細胞の増殖を促進することが明らかになった。さらに、PDGF-BBはSmad5のリン酸化を抑制することによりBMP2による歯髄幹細胞の象牙芽細胞分化を抑制することが示唆された。結果より、PDGF-BBが象牙芽細胞ではなくオリゴデンドロサイト分化に関与している可能性が考えられた。これらは歯髄幹細胞の細胞運命決定や歯由来細胞を用いた神経再生における重要な情報となる。これまでの研究によって、我々は歯髄中に歯髄幹細胞と呼ばれる多能性を有した細胞が存在していることを明らかにしてきた。その中で歯髄幹細胞株(SP細胞)を血小板由来増殖因子(PDGF-BB)で刺激することによってオリゴデンドロサイトマーカーであるPlp-1やolig2のmRNAの発現が有意に誘導されることがわかり、PDGFに着目したオリゴデンドロサイトへの分化誘導法の確立、分化誘導メカニズムの解析を本研究の目的とした。さらに、ウェスタンブロット法を用いて、PDGF受容体下のシグナル伝達経路を解析したところ、PDGF-AAでp38のリン酸化が強く誘導される一方で、PDGF-BBで刺激した場合にはERK1/2、p38、Aktが強くリン酸化されることが明らかになった。さらには、PDGF受容体のsiRNA法を用いて解析したところ、PDGF-BBは、PDGFβRを介したシグナル伝達を行っていることも明らかになってきた。このようにSP細胞におけるPDGF-AAと-BBの役割は異なることが明らかになった。特に、分化マーカーの発現の違いより、PDGF-BBがオリゴデンドロサイト分化に関与している可能性が示唆された。その中で、歯髄幹細胞株(SP細胞)を血小板由来増殖因子(PDGF-BB)で刺激することによってオリゴデンドロサイトマーカーであるPlp-1やolig2のmRNAの発現が有意に誘導されることがわかり、PDGFに着目したオリゴデンドロサイトへの分化誘導メカニズムの解析を本研究の目的とした。これまでに、PDGF-AAでSP細胞を刺激すると象牙芽細胞の分化マーカーであるDSPPのmRNAの発現が上昇し、一方でPDGF-BBで刺激するとオリゴデンドロサイトマーカー遺伝子の発現は上昇するが、DSPP、ALP、osterix、Runx2のmRNAの発現は減少することが明らかとなった。さらに、PDGF-BBにより前処理した細胞ではBMP2によるDSPPのmRNAの発現上昇を抑制していることが明らかとなった。ウェスタンブブロット法を用いて、PDGF受容体下のシグナル伝達経路を解析したところ、PDGF-AAでp38のリン酸化が強く誘導される一方で、PDGF-BBで刺激した場合にはERK1/2、p38、Aktが強くリン酸化されることが明らかになった。さらには、PDGF-BBはBMP2によるsmad5のリン酸化を抑制することが明らかになった。PDGF-BBにより前処理した細胞では, BMP2による象牙芽細胞分化促進を抑制し,それはsmad5のリン酸化促進の抑制によることが示唆され、分化マーカーの発現の違いと合わせて、PDGF-BBが、象牙芽細胞ではなくオリゴデンドロサイト分化に関与している可能性が考えられた。これまでに、PDGF-AAとPDGF-BBの役割の違いが明らかになり、PDGF-BBはSP細胞をオリゴデンドロサイトへ分化誘導する可能性が示唆された。さらに、PDGF-BBによるシグナル伝達経路についても、伝達物質、受容体含め明らかになってきている。25年度が最終年度であるため、記入しない。今後、主にin vitroの系を用いて、効率のよいPDGFの刺激条件の検討を、RT-PCR法やフローサイトメトリー法を用いて行い、また受容体シグナルの同定を抑制剤やsiRNA法を用いて解析しその分化機構を明らかにしていく。同時に、この歯髄幹細胞(SP細胞)の、いわゆる神経幹細胞としての特徴や特性について、神経系の前駆細胞マーカーの発現や変化について、神経栄養因子(NGF)刺激した場合との比較検討も行いながら解析していく。