hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超迅速大規模塩基配列解読法を用いた未知のウイルス分離に関する基盤研究

本申請課題ではウイルス感染細胞内のmRNA塩基配列を網羅的に解析し,ウイルス遺伝情報の「分離」を試みた.ウマヘルペスウイルス感染細胞のmRNAからcDNAを合成し,網羅的な塩基配列解読を行った.非感染細胞由来のmRNA-cDNA塩基配列情報と比較し,ウイルスの情報を「分離」しうるかどうか,また,どれくらいの感度でできるかを明らかにした.ウマヘルペスウイルス9型をマウス繊維芽細胞L929に感染させ,24時間後に全RNAを抽出した.mRNAを精製しcDNAとした後,塩基配列解読に用いた.解析総リード数は215042であった.このリードをマウス配列およびウマヘルペスウイルス9型ゲノム塩基配列にマッピングした.その結果,マウスに対して132654リード(61.7%),ウマヘルペスウイルス9型に対して4026リード(1.9%)をマッピングすることができた.以前の感染細胞全DNAの塩基配列解読では全コンティグ数17525に対しウイルスゲノムにマッピングされたコンティグは60コンティグ(0.3%)であった.この結果からウイルス感染細胞のmRNAについて網羅的な塩基配列解読を行うことによりウイルスを遺伝情報として「分離」できる可能性が明らかになった.今回は予算の制限により個体での解析を行えなかった.今後の課題である.本申請課題ではウイルス感染細胞内のmRNA塩基配列を網羅的に解析し,ウイルス遺伝情報の「分離」を試みた.ウマヘルペスウイルス感染細胞のmRNAからcDNAを合成し,網羅的な塩基配列解読を行った.非感染細胞由来のmRNA-cDNA塩基配列情報と比較し,ウイルスの情報を「分離」しうるかどうか,また,どれくらいの感度でできるかを明らかにした.ウマヘルペスウイルス9型をマウス繊維芽細胞L929に感染させ,24時間後に全RNAを抽出した.mRNAを精製しcDNAとした後,塩基配列解読に用いた.解析総リード数は215042であった.このリードをマウス配列およびウマヘルペスウイルス9型ゲノム塩基配列にマッピングした.その結果,マウスに対して132654リード(61.7%),ウマヘルペスウイルス9型に対して4026リード(1.9%)をマッピングすることができた.以前の感染細胞全DNAの塩基配列解読では全コンティグ数17525に対しウイルスゲノムにマッピングされたコンティグは60コンティグ(0.3%)であった.この結果からウイルス感染細胞のmRNAについて網羅的な塩基配列解読を行うことによりウイルスを遺伝情報として「分離」できる可能性が明らかになった.今回は予算の制限により個体での解析を行えなかった.今後の課題である.
胸腺でのT細胞分化・増殖におけるGRKの機能解析と自己免疫疾患での役割

胸腺でのT細胞分化・増殖におけるG-ptotein coupled receptor kinase 2(GRK2)の機能解析を行うために、まずGRK2をターゲットとしたレンチウイルスベクタープラスミドを作成した。GRK2を効率よくノックダウンするために、GRK2をターゲットとしたshRNAを2種類デザインして、これを発現するshRNA発現レンチウイルスベクタープラスミドを構築した。そしてこのプラスミドを用いて大腸菌への形質転換によるプラスミド増幅、生成を行った。生成したプラスミドをHEK293T細胞に3種類のパッケージングプラスミドと同時にco-transfectionを行い、48時間後に上清を回収、濃縮することによりshRNA発現レンチウイルスを作成した。レンチウイルスのタイターはウイルスをHEK293Tへ感染させた後、レンチウイルスベクターに組み込まれたGFP発現をフローサイトメトリーにて解析することにより行った。平均40-45%の細胞がGFPを発現、すなわちウイルスに感染しており、これから計算すると約3.2×10^8 viral particles/mlのレンチウイルスが一回のtransfectionで精製できた。GRK2に対するshRNAによるノックダウン効果の確認のため、RAW246.7細胞にshRNA発現レンチウイルスベクターを感染させ、total RNAを調整した。コントロールウイルスを感染させたRAW246.7細胞からもtotal RNAを調整し、これらを用いてreal time PCRにてGRK2 mRNAの発現を比較することにより、shRNAによるノックダウン効率を検討した。shRNA発現レンチウイルスベクター感染細胞ではコントロールに比べて、約35-40%のGRK2 mRNA低下を認めた。
原因不明の溶血性貧血の新たな病因解明

原因不明の溶血性貧血に対する疾患感受性遺伝子としてα一ヘモグロビン安定化蛋白(AHSP)に注目し、薬剤または感染により誘発された急性溶血性貧血例28例と正常対照97例についてケース・コントロール解析を行った。その結果、AHSP遺伝子の特定のハプロタイプが急性溶血性貧血症例群に有意に高頻度で観察されることを見いだした。このハプロタイプを構成する遺伝子多型のうち、ケースおよびコントロール群で異なるのはSNPs4ヶ所とT反復数多型の5種で、そのすべてがAHSP遺伝子の上流域に存在することから、ハプロタイプ間で転写活性が異なることを作業仮説として、赤芽球系細胞株K562を用いてレポーター遺伝子(ルシフェラーゼ)アッセイを実施した。その結果、患者群で有意に高頻度観察されるハプロタイプは、コントロールに比して約28%に転写活性が低下することが明らかとなった。次に、in vitro mutagenesisの手法を用いて、患者群でユニークなハプロタイプを構成する多型5ヶ所を導入し、コントロールハプロタイプと転写活性を比較検討したところ、SNP(-201A→G)の導入で約34%、T15の導入で約66%へと転写活性が低下した。一方、残りのSNPs3ヶ所の導入はいずれも転写活性を変化させなかったことから、赤芽球系細胞株におけるAHSP遺伝子の転写にはSNP(-201A/G)が重要であると結論した。この一201Aを含む配列は転写因子CDX1のコンセンサス配列に含まれており、AHSP遺伝子の転写活性化こCDX1が関与するかどうか、今後の検討が必要と考えられた。本研究により、AHSPが新規の溶血性貧血疾患感受性遺伝子であることを同定し、AHSP遺伝子プロモーター領域のSNP(-201A→G)によりAHSP発現低下が生じることが病因と結論出来た。われわれは国内の諸施設より依頼された原因不明の遺伝性非球状性溶血性貧血(HNSHA)症例を検索し、既知の赤血球酵素異常症であるピルビン酸キナーゼ異常症2例とグルコース-6-リン酸脱水素酵素異常症9例を診断した。わが国では年間約100例のHNSHA症例が新たに診断されているが、そのうち約70%については未だ診断が確定せず、何ら新たな検索はなされていないのが現状である。α-ヘモグロビン安定化タンパク(AHSP)は赤血球で高発現する分子シャペロンで、遊離α-グロビンと安定な複合体を形成して、細胞毒性の高い活性酸素種の発生を防ぐ。AHSPノックアウトマウスではハインツ小体陽性の代償性慢性溶血が認められる。またマウスではβ-サラセミアのmodifier遺伝子であることが明らかになっている。そこで、今年度はAHSPがヒトHNSHAの疾患感受性遺伝子か否かの検討を行った。赤血球酵素異常症および不安定ヘモグロビン症が否定されたHNSHA症例で薬剤誘発性の急性溶血例とハインツ小体陽性例の合計26症例及び対照100例に関して、AHSP遺伝子周辺のSNPsをタイピングした。個々のSNPおよびハプロタイプに関して遺伝統計解析を行なった。7つのSNPsの内、4つにおいて遺伝型頻度に有意差を認めた。特にイントロン1のSNP(rs4296276)に関して患者群ではA/Aのホモ接合体が有意に多いことが明らかになった(p=0.000803)。ハプロタイプ解析では、ハプロタイプIIのホモ接合体が患者に有意に多かった(オッズ比8.9091)。今年度の研究により、AHSPが遺伝性溶血性貧血における新規の疾患感受性遺伝子の一つと考えられる結果が得られた。

原因不明の溶血性貧血に対する疾患感受性遺伝子としてα-ヘモグロビン安定化タンパク(AHSP)に注目し、薬剤または感染により誘発された急性溶血性貧血例28例と正常対照97例についてケース・コントロール解析をおこなった。その結果、AHSP遺伝子の特定のハプロタイプが急性溶血性貧血症例群に有意に高頻度で観察されることを見いだした。このハプロタイプを構成する遺伝子多型のうち、ケースおよびコントロール群で異なるのはSNPs4カ所とT反復数多型の5種で、そのすべてがAHSP遺伝子の上流域に存在することから、ハプロタイプ間で転写活性が異なることを作業仮説として、赤芽球系細胞株K562を用いてレポーター遺伝子(ルシフェラーゼ)アッセイを実施した。その結果、患者群で有意に高頻度観察されるハプロタイプは、コントロールに比して約30%に転写活性が低下することが明らかになった。次にin vitro mutagenesisの手法を用いて、患者群でユニークなハプロタイプを構成する多型5カ所を導入し、コントロールハプロタイプと転写活性を比較検討したところ、SNP(-201A→G)の導入で約40%、T15の導入で約80%へと転写活性が低下した。一方、残りのSNPs3種の導入はいずれも転写活性を変化させなかったことから、赤芽球系細胞株におけるAHSP遺伝子の転写にはSNP(-201A/G)が重要であると結論した。この-201Aを含む配列は転写因子CDX1のコンセンサス配列に含まれており、AHSP遺伝子の転写活性化にCDX1が関与するかどうか、今後の検討が必要と考えられた。本研究により、AHSPが新規の溶血性貧血疾患感受性遺伝子であることを同定し、AHSP遺伝子プロモーター領域のSNP(-201A→G)によりAHSP発現低下が生じることが病因と結論出来た。
環境適応における行動進化の分子メカニズム

[暗黒ショウジョウバエの聴覚感度を電気生理学的手法により解析した]前年度の結果より、暗闇で57年間飼育された暗黒ショウジョウバエは暗闇での聴覚行動が鋭敏になっていることが示唆された。しかし行動レベルでの解析では聴覚行動が鋭敏である理由が聴覚感度、或いは脳内での高次な処理の問題なのかがわからない。そこで、当該年度は聴覚感度を電気生理学的手法により解析を行い暗黒バエの聴覚について精査することを試みた。ショウジョウバエの聴覚の電気生理学実験を行っているラボは世界にも一握りであり、既存の論文を参考に自ら実験系を構築することとした。まずは、構築した実験系で測定が可能かを確かめるため、野生型のハエに音を聞かせた時に聴覚受容器であるアンテナの電気信号がキャッチできることを確かめた。またコントロールとして、聴覚異常のミュータントでは、音を聞かせてもアンチナから電気信号が得られないことを確認した。よって、構築した実験系で目的の解析が可能であることが確かめられた。次に野生型ハエと暗黒ショウジョウバエを用いてそれぞれの聴覚感度を電気生理学的実験により比較した。この実験は、明所、暗所でそれぞれ行った。興味深いことに、どちらのハエでも明所と暗所では聴覚感度が異なる可能性が示唆された。光の有無により聴覚感度に影響を与えるということは今まで確認されていなかったことである。そして、暗黒ショウジョウバエの方が暗闇における聴覚感度が高いという結果も得られた。これは、行動レベルでの実験結果と一致する。当該年度の研究により、ショウジョウバエの聴覚感度は光の有無で異なる可能性及び、暗黒ショウジョウバエは暗闇においても聴覚感度を高く維持している可能性が見いだされた。以上の内容は、暗闇という環境に適応するための重要な要素であることが考えられるが、この形質が適応的であるかどうかは、さらなる研究が必要とされる。翌年度、交付申請を辞退する研究課題翌年度、交付申請を辞退する研究課題[暗黒ショウジョウバエの聴覚感度を電気生理学的手法により解析した]前年度の結果より、暗闇で57年間飼育された暗黒ショウジョウバエは暗闇での聴覚行動が鋭敏になっていることが示唆された。翌年度、交付申請を辞退する研究課題翌年度、交付申請を辞退する研究課題
Lipotoxicityは、細胞内にacyl-CoAが蓄積すると起きるのか?

長鎖脂肪酸は高血糖を起こす毒である(Lipotoxicity)。これについては異論はない。しかしその細胞内メカニズムはわかっていない。そこで、次の分析を行った。1.JVSマウスは、カルニチン輸送担体(octn 2)が欠損しカルニチンの細胞内濃度が10%以下なので、acyl-CoAが大量に蓄積していると考えられる.そこで、JVSマウスを使って分析し次の結果を得た。(1)膵ラ氏島の組織:JVSマウスでは、controlに比し、PCNAの染色が悪くグルカゴンの染色は強くpancreatic polypeptideの染色は弱かった.しかし、インスリンについては高度に染色性の低下しているものと、正常と差のないものが存在していた.(2)心筋細胞のカルニチン輸送活性:JVSマウスでは、正常血漿遊離カルニチン濃度である25μMでは、正常対照の約20%であり、saturable uptakeが障害されていた。(3)心臓のカルニチン濃度と2-DGの取り込み率の分析:生後2、4、8週令のJVSマウスの心臓内遊離カルニチン濃度は、対照の1.1%、3.2%、2.4%であった。2-DGの取り込み率は、JVSでは27.0±7.9μmol/100g心重量/分であり、正常対照(2.4±0.3)の約11倍であった。2.β細胞由来株INS-1を用いて遊離脂肪酸による膵β細胞傷害の機序につき検討した。まず、INS-1を4%BSA含有パルミチン酸(0,0.5,2mM)で24時間培養した。パルミチン酸は用量依存的に中性脂肪含量を増加させ、同時に細胞傷害活性を示した。また、パルミチン酸によるリン酸化AktおよびNFκβシグナル活性化が細胞傷害に関連することが示唆された。3.カルニチン欠乏を合併する糖尿性心肥大でのCa^<2+>overloadはT_3で阻害されることが示された。JVSマウスは、カルニチン輸送担体(octn 2)が欠損しカルニチンの細胞内濃度が10%以下なので、acyl-CoAが大量に蓄積していると考えられる。そこで、JVSマウスを使って、基本的病変を分析することにした。本年度は膵β細胞と心筋細胞を分析対象とし、研究実績の概要は以下の通りである。1.膵ラ氏島の組織学的分析:JVSマウスでは、controlに比し、PCNAの染色が悪く、グルカゴンの染色は強くpancreatic polypeptideの染色は弱かった。しかし、インスリンについては差はなかった。2.心筋細胞のカルニチン輸送活性の分析:Kaneko & Goshimaの方法により培養心筋細胞を調整し、[^3H]-Carnitineの取り込みから、カルニチン輸送活性を分析した。その結果JVSマウスではsaturable uptakeが障害されており、正常血漿遊離カルニチン濃度である25μMでは、正常対照の約20%であった。3.心臓のカルニチン濃度と2-DGの取り込み率の分析:生後2、4、8週令のJVSマウスの心臓内遊離カルニチン濃度は、対照の1.1%、3.2%、2.4%であった。

2-DGの取り込み率は、JVSでは27.0±7.9μmol/100g心重量/分であり、正常対照(2.4±0.3)の約11倍であった。長鎖脂肪酸は高血糖を起こす毒である(Lipotoxicity)。これについては異論はない。しかしその細胞内メカニズムはわかっていない。そこで次の分析を行った。1.JVSマウスは、カルニチン輸送担体(octn 2)が欠損しカルニチンの細胞内濃度が10%以下なので、acyl-CoAが大量に蓄積していると考えられる。そこで、JVSマウスの膵ラ氏島の組織学的分析を行った。その結果JVSマウスでは小型の膵島及び細胞質に乏しい小型の膵島細胞を認めた。2.β細胞由来株INS-1を用いて遊離脂肪酸による膵β細胞傷害の機序につき検討した。まず、インスリンノーマ細胞株INS-1を4%BSA含有パルミチン酸(0,0.5,2mM)で24時間培養した。パルミチン酸は用量依存的に中性脂肪含量を増加させ、同時に細胞傷害活性を示した。Immunoblot法を用いたINS-1細胞内のリン酸化Akt/Aktの発現比率は、パルミチン酸により用量依存的に増強された。同条件下で培養したINS-1細胞の核内蛋白を抽出しgel shift assayを行った。0.5mMパルミチン酸はNFkβシグナルを増強させ、2mMパルミチン酸により減少する傾向があった。以上の結果から、インスリノーマ細胞株INS-1に対してパルミチン酸は細胞傷害活性を示した。パルミチン酸によるリン酸化AktおよびNFkβシグナル活性化が細胞傷害に関連することが示唆された。3.JVSマウスではカルニチン欠乏の心肥大がみられるが、カルニチン欠乏を合併する糖尿病性心肥大ではCa^<2+>含量が高く、これはT_3によって阻害されることが示された。
A^<2+>H^-型イオンエキシマによる高効率真空紫外光発生の研究

1.希ガス・アルカリ系のイオンエキシマのab initio計算によって、ポテンシャル構造を考察し、原子番号に関係したスケ-リング則を求めた。中性エキシマから類推される結果とは違って、下準位は完全な自由状態でないことが判明した。2.希ガス・アルカリ系のイオンエキシマでは81nm程度の最短波長が期待されることが判明した。原理的には結合ー結合遷移であるが、高い振動状態に対する遷移確率が極大をもつようになり、XeC1のようなquasiーexcimer発光が期待できることが分かった。3.CsF+イオンエキシマのVUV発光が電子ビ-ム励起で観測され、従来の軟X線励起と異なった性質をもつことが分かった。BーX遷移(185nm)に加えてDーX遷移(152nm)の蛍光が30mbar以上のCsF蒸気圧まで観測され、振動準位の構造も分解された。4.XeRb+(163nm),KrRb+(133nm)のVUV光の発生が観測され、ab initio計算と良い一致を示すことが明らかとなった。理論計算から求めたスペクトルの形は非対称スペクトル、構造の両面から実験結果と良い一致を与えた。5.予備実験として行ったNa_2の3重項violet bandのエキシマ発光が観測された。励起強度を変化させるとスペクトルの狭帯域化が観測され、ASE増幅が起こっていることが確認された。理論計算による発光スペクトルは観測スペクトルを完全に説明した。6.2段階可飽和吸収体による安定で高出力超短パルス発生技術を開発し、400フェムト秒、2.5テラワットのKrFレ-ザ-光を発生した。1.RbF^+の電子状態のab initio計算を行い、理論的ポテンシャル曲線を算出した。これにより、(1)実験的に報告されている130nmの発光はB-X遷移であると同定された。(2)C-A遷移の確率はB-X遷移の約1/5であり、スペクトル的にはB-X遷移に重なっている。(3)誘導放出断面積はKrF^*と程度であり、有効な励起をすれば高利得のレ-ザ-が実現できることが分かった。2.ベルベット陰極を用いて長い領域を高密度励起するための電子ビ-ム発生装置を開発し、600kV、4.5kAの電子ビ-ムを発生することに成功した。電子ビ-ムをヒ-トパイプオ-ブンに導入したところ、1m以上の伝播距離を確認し、イオンエキシマの励起条件を十分満足することが分かった。3.電子ビ-ム励起の予備実験として、Naを挿入してNa^<2*>の三重項エキシマ発光を電子ビ-ム励起で初めて観測した。温度特性、圧力特性から3体衝突励起によって生成されることが明らかになった。4.可飽和吸収体を利用してKrFレ-ザ-から最短400fs、ピ-ク出力100GWを達成した。レンズ集光パワ-は10^<15>W/cm^2に達した。5.アルカリ金属-希ガス系のイオンエキシマの電子状態のab initio計算から、原子を変化させた場合の規則性を見いだし、NeK^+は83nm付近でエキシマ型発光をするという計算結果を得た。6.Heの準安定状態からエネルギ-以上を受けてイオン化したKイオンに、498nmの強力な超短パルスを照射すれば、反スト-クス共鳴ラマン効果で、高効率に真空紫外光が発生すると予測し、ホロ-カソ-ド放電で、励起するための装置を準備している。
対数らせん形爆薬殻を用いた衝撃波の収束技術の開発

本研究では爆薬を用いて簡単に衝撃波を発生させて収束させる方法を考案した。この方法は爆薬を対数ら旋状に装填した爆薬殻をその一端から起爆させるものであり、点起爆を用いることができるため簡単に収束現象が再現できる。対数ら旋形状は爆薬の爆轟波伝播速度と爆轟によって発生する衝撃波速度と密接な関係にあり、この関係を綿密に調べることによって最適な収束状態が得られた。厚さ5mmの爆薬殻(高さ10mm)を対数ら旋形に加工し、爆薬殻の一端に1cmの細線3本を張り付けこれに大電流を解放し起爆した。まずその形状は線形理論によって予測される最適なものを使用し、駒撮り撮影及びシャドウグラフ撮影を行うことにより収束波の非線形効果を調べた。muの値を小さくとると収束が一点で行われず、強い発光が現れない。一方muの値を大きくとると全体的に速い流れが形成されてしまい、収束後収束点位置が速い速度で移動することが分かった。対数螺旋形の弧に対する弦の長さの比muを理想的な値より僅かに大きくしたものの方が非線形効果及び壁面との干渉効果に対して良好な収束を与えることがわかった。最終的には対数螺旋形爆薬に囲まれた衝撃波の伝播空間の形状を壁面での干渉効果が減少するように変化させることでより理想に近い収束を得た。また、数値解析によって収束波の形状を予測した。ray-tube理論によって爆轟波の進行と発生した衝撃波面の進行を達成して解くことにより非常に実験とよく似た結果を得た。
情報機器のための光路制御マイクロメカニズムの基礎研究

本研究では,構造が簡単で,可動部質量が小さい,容易に光路を90°変化可能,光の到達位置の微調整が容易といった特長をもち,光ディスクや光スイッチに利用できる新しいMEMS技術を利用した光路制御マイクロメカニズムを提案し,その有効性を検証することを目的としている.そのために本年度は,次のことを行った.1.駆動電圧の低減方法の検討これまで光路制御マイクロメカニズムの駆動電圧を275Vに設定していたが,その低減方法を検討するために,光路制御マイクロメカニズムを構成する2個の基板間のギャップや薄膜ミラーの厚さ,絶縁膜の厚さが駆動電圧に与える影響を実験的に調べた.その結果,これらが駆動電圧に影響を与えることを明らかにし,駆動電圧130Vで安定して薄膜ミラーを駆動できることが明らかになった.2.光の照射スポット位置の高精度化の検討光の照射スポット位置の測定精度を向上するとともに,試作光路制御マイクロメカニズムの組み立て調整を慎重に行った結果,照射スポット位置を安定的かつ良好な精度でスイッチングすることが可能になった.また上記(1)と同じ条件での実験結果が照射位置精度に与える影響を評価した結果,ギャップを縮小することで,精度が向上することがわかった.3.出力チャンネル数を増加させた光路制御マイクロメカニズムの試作と大ステップ応答実験これまでの試作光路制御マイクロメカニズムは出力チャンネル数が4チャンネルであったが,本年度は8チャンネルに拡張して動作試験を次の様に行った.その結果,隣り合うチャンネル間のみならず,任意のチャンネル間の切り換えも安定してできることを確認できた.本研究では,構造が簡単で,可動部質量が小さい,容易に光路を90°変化可能,光の到達位置の微調整が容易といった特長をもち,光ディスクや光スイッチに利用できる新しい光路制御マイクロメカニズムを提案し,その有効性を検証することを目的としている.そのために本年度は,次のことを行った.(1)提案する光制御マイクロメカニズムの詳細設計数値解析を行い,提案する光制御マイクロメカニズムが原理のように動作可能な条件を求めた.その結果,厚さ3μmのTiNi薄膜反射ミラーとし,それを挟むように配置した基板間の距離を1mm,印加電圧を300Vとすると動作可能であることがわかった.(2)光制御マイクロメカニズムの試作上記(1)の結果を基礎に,現有のマイクロマシン作成装置を利用して光制御マイクロメカニズムの部品である基板と薄膜反射ミラーを作成した.これを本年度試作した観察・実験装置に組み込み,基板間の距離や薄膜反射ミラーの初期状態を調整した.(3)試作光制御マイクロメカニズムの動作試験試作した光制御マイクロメカニズムの動作試験を次の様に行った.(A)1ステップの駆動周期48msで各電極への電圧を階段状に印加し,その動作をPSDと高速ビデオカメラを用いて測定した.その結果,試作光制御マイクロメカニズムが原理通りに動作することを確認できた.(B)1ステップの駆動周期を8ms,4msと変えて応答特性を調べた.その結果,概ねステップ状に駆動されることを確認した.本研究では,構造が簡単で,可動部質量が小さい,容易に光路を90°変化可能,光の到達位置の微調整が容易といった特長をもち,光ディスクや光スイッチに利用できる新しいMEMS技術を利用した光路制御マイクロメカニズムを提案し,その有効性を検証することを目的としている.そのために本年度は,次のことを行った.1.駆動電圧の低減方法の検討これまで光路制御マイクロメカニズムの駆動電圧を275Vに設定していたが,その低減方法を検討するために,光路制御マイクロメカニズムを構成する2個の基板間のギャップや薄膜ミラーの厚さ,絶縁膜の厚さが駆動電圧に与える影響を実験的に調べた.その結果,これらが駆動電圧に影響を与えることを明らかにし,駆動電圧130Vで安定して薄膜ミラーを駆動できることが明らかになった.2.光の照射スポット位置の高精度化の検討光の照射スポット位置の測定精度を向上するとともに,試作光路制御マイクロメカニズムの組み立て調整を慎重に行った結果,照射スポット位置を安定的かつ良好な精度でスイッチングすることが可能になった.また上記(1)と同じ条件での実験結果が照射位置精度に与える影響を評価した結果,ギャップを縮小することで,精度が向上することがわかった.3.出力チャンネル数を増加させた光路制御マイクロメカニズムの試作と大ステップ応答実験これまでの試作光路制御マイクロメカニズムは出力チャンネル数が4チャンネルであったが,本年度は8チャンネルに拡張して動作試験を次の様に行った.その結果,隣り合うチャンネル間のみならず,任意のチャンネル間の切り換えも安定してできることを確認できた.
作物根における根圏酸化機能とその生理的意義

植物根による根圏の酸化機能は,根から放出される酵素類,ラジカル,有機酸,アミノ酸,などの種々の物質の放出と分泌作用と深く関連している。薬用植物の一種であるムラサキの根にはナフトキノン誘導体の一種で有色のシコニン類が蓄積する。この物質は電子の授受作用を有することから,制菌作用をはじめ種々の生理活性を有することが知られている。土壌で栽培したムラサキ根におけるシコニンの動態は次のようであった。幼根においては根冠細胞,表皮,皮層,内皮に蓄積し,これらの細胞の脱落とともに根圏に放出される。つぎに根の肥大とともに一次・二次周皮に蓄積が進行する。この過程で周皮のアポプラストに蓄積したシコニンが根圏に分泌・放出される。さらに肥大が進むと,周皮が褶曲して組織表面積が増大し,シコニンの蓄積が増加する。いっぽう損傷を受けた組織において周皮が形成され,そこにもシコニンが蓄積する。これとは別に,中心柱内部の導管などに接する組織においてもシコニンの蓄積が部分的に認められた。以上のことからシコニンを蓄積する組織は表皮や周皮などの厚壁化する防御組織が主であるが,これ以外の組織においても認められることから,リグニンなどの蓄積による細胞壁の厚壁化と密接な関係を持つことが示唆された。またシコニンは根系内において不均一に分布しており,地表から1525cmの部位で最も高い含有率を示した。薬用植物のカンゾウは肥大した根にグリチルリチンを蓄積する。この主根における濃度は,地表に近い部位で高く,深くなるに従い低下することを明らかにした。また主根におけるグリチルリチン濃度と15N自然存在比とが密接な関連を有することが推定された。植物根による根圏の酸化機能は,根から放出される酵素類,ラジカル,有機酸,アミノ酸,タンパク質,無機物質などの種々の物質の放出と分泌作用と深く関連している。根組織からのこれらの物質の放出・分泌は根の周辺組織である表皮,外皮,下皮,周皮,皮層などの内皮に囲まれた中心柱組織より外層の部位で活発に営まれていると推察されている。根組織から放出・分泌された物質はこれらの組織細胞から細胞周辺のアポプラストを経て根圏に至り,そこに存在する物質や微生物と相互作用を持つことになる。この物質は電子の授受作用を有することから,種々の生理作用が知られている。シコニンは細胞内において分泌顆粒として蓄積する。シコニンは粗面小胞体で合成された後,細胞膜と細胞壁の間隙に顆粒状で蓄積し,その後細胞壁外へと分泌される。土壌で生育したムラサキ根におけるシコニンの動態は次のようであった。
間歇的低酸素負荷に伴う臓器別ストレス応答とラジカルスカベンジによる新たな治療戦略

睡眠時無呼吸に関連する間歇的低酸素負荷は、肥満や糖尿病患者における心・血管病合併に影響を与えるのみならず、心不全においては患者予後を左右することが知られている。本研究では、間歇的低酸素負荷にて活性酸素種の産生と酸化ストレスが増加し、脂質代謝異常や血圧変動とともに、心肥大や心筋微細構造の変性所見が進行した。一方、これらの変化はラジカルスカベンジャーである水素ガス吸入や抗酸化作用を有する選択的アドレナリンβ1受容体遮断薬の投与にて予防可能であることが明らかとなった。さらに、糖尿病が基礎疾患として存在する場合、大脳辺縁系におけるFos蛋白発現の低下が活動性の低下に関連することが示唆された。これまでの研究により、間歇的低酸素曝露による左心室リモデリングは、酸化ストレスの増加により引き起こされ、水素ガス吸入によるヒドロキシラジカル消去にて予防可能であることが明らかとなった。一方、選択的アドレナリンβ1受容体遮断薬であるセリプロロールは抗高血圧作用のみならず、抗酸化作用も持つことが報告されている。そこで、セリプロロールによる交感神経抑制作用と抗酸化作用が左心室リモデリングを減弱するかを検討した。8週齢の雄性C57BL/6Jマウスを用い、実験開始1週間前に、右頸動脈にラジオテレメトリー送信機を挿入した。通常酸素濃度下で飼育するnormoxia群と、一日あたり8時間の割合で酸素濃度が30秒ごとに5%と21%に交互に変わるチャンバー内で飼育する間歇的低酸素群に分け、それぞれ10日間飼育した。また、各群に、セリプロロール(100mg/kg/day)あるいはvehicleを1日1回経口投与することにより計4群に分けた。左室収縮期血圧は間歇的低酸素曝露により上昇傾向を示したが、セリプロロール処置により抑制傾向がみられた。一方、右室収縮期血圧は4群間で差はみられなかった。また、間歇的低酸素曝露により左心室心筋横径、血管周囲線維化、酸化ストレスの指標であるDHE蛍光および4-HNE発現量、TNF-α、BNP mRNA発現量、アルギナーゼII発現量の増加、eNOS発現量の減弱が認められた。さらに、間歇的低酸素曝露中に著しい血圧変動がみられたが、これらの変化はすべてセリプロロール処置により抑制された。以上の結果より、セリプロロールによる血圧の変動の抑制、酸化ストレスおよび炎症性サイトカインの減少、eNOS発現減少の抑制が、間歇的低酸素曝露に伴う左心室リモデリングの発症・進展に重要な役割を果たしている可能性があり、臨床的にも極めて重要な知見であると考えられる。糖尿病マウスの脳組織におけるFos発現を網羅的に検索した結果、間歇的低酸素負荷により帯状、梨状皮質、側坐核、底外側ならびに底内側扁桃体核などの大脳辺縁系とその周辺組織において発現量が有意に低下した。さらに、Open-fieldtestやForcedswim testを実施した結果、間歇的低酸素負荷によって活動性の低下やdepressive behavioral徴候が出現した。以上より、糖尿病患者に睡眠時無呼吸が合併することによって認知症の出現や知的活動の低下が認められる可能性が示唆された。一方、重症心不全患者に合併する周期的無呼吸が予後を悪化させる詳細なメカニズムは不明である。そこで、心筋症ハムスターBio14.6とC57BL/6Jマウスを間歇的低酸素曝露した結果、心筋症ハムスターにおいて、収縮ならびに拡張能の更なる低下が惹起され、微細構造学的にZ帯のstreamingや多彩な変性所見が認められた。さらに興味深いことに、これらの変化は水素ガス(3.05 vol/100 vol)吸入にて有意に予防された。以上の結果は、重症心不全患者におけるCheyne-Stokes呼吸の合併が心機能を悪化させる病態生理学的機序の一部を明らかにすると同時に、水素ガス吸入が有力な治療戦略であることを証明するものであり、臨床的にも極めて重要な知見であると考えられる。さらに、VEGF受容体遮断薬SU5416を前投与した低酸素負荷ラットにおいて、右室毛細血管の変性・破壊に伴うVEGF ( vascular endothelial growth factor) mRNAの過剰発現が、血管平滑筋の肥大・増殖と右室心筋細胞リモデリングを進行させることが明らかとなり、肺高血圧症や右心不全の発症機序に関わる重要な所見が得られた。以上、それぞれの結果について学会発表し、英語原著論文を作成した。睡眠時無呼吸症候群に伴う間歇的低酸素曝露が心・血管リモデリングを惹起し、その機序には酸化ストレスの上昇が関連する。

平成23年度は、間歇的低酸素負荷モデルとして認められている我々の実験系において、ヒドロキシルラジカル除去作用が報告されている水素ガスを用い、低酸素負荷時期に応じて吸入させることにより、スーパーオキシドの発生機序やタイミングを検討し、心室リモデリングや脂質代謝異常に対する効果を評価した。雄性C57BL/6Jマウスを用い、60秒毎に酸素濃度5 %と21 %を繰り返す間歇的低酸素曝露装置内で日中8時間、計7日間飼育し、(a)再酸素化の時期に一致して1.3Vol%水素ガスを投与する群、(b)低酸素状態の時期に水素ガスを投与する群、(c)実験期間中、常に水素ガスを吸入する群、の3群に分けて検討した。その結果、間歇的低酸素負荷中の血圧は急激に上昇と下降を繰り返し、心拍数増加を認めた。リポ蛋白分析では、間歇的低酸素曝露によりカイロミクロンと超低比重リポプロテインコレステロールは増加し、(a)群ならびに(c)群では有意に抑制されたが、(b)群では抑制されなかった。心筋横径、血管周囲線維化、IL-6とBNPのmRNA発現量、酸化ストレスの発現量は間歇的低酸素曝露により有意に増加し、それらの変化は再酸素化時の水素ガス投与により有意に抑制された。以上の結果より、間歇的低酸素曝露にて惹起される心リモデリングは、水素ガス吸入にて有意に予防され、脂質代謝異常も改善された。しかしながら、低酸素状態のみに投与する水素ガスでは効果は少なく、したがって再酸素化の時期に増加するヒドロキシルラジカルが心肥大や血管周囲の線維化に重要な影響を及ぼすと考えられた。また、安全性に問題のない低濃度水素ガスが有効であったことより、今後さらに臨床応用の可能性が広がると考えられる。当該年度の研究結果は国内外の学会にて発表した。また、選択的アドレナリンβ1受容体遮断薬であるセリプロロールを用いた実験結果は、Hypertension Researchにacceptされている。当該年度の研究結果は、国内外の学会にて発表し、Am J Physiol Heart Circ Physiol・301・H1062-H1069・2011に掲載され、順調に進展していると考えられる。また、β遮断薬を用いた予備実験結果は国内学会にて発表した。今後は動物の数を増やした上で論文発表を行う計画である。平成25年度は最終年度になるため、これまでのデータをまとめると同時に、さらに研究を発展させるためのpilot試験を同時に実施する計画である。系統的な研究から、慢性心不全や心筋病変を有する場合には、本実験系における間歇的低酸素負荷は各種病態を悪化させると予想される。臨床的にも重症心不全患者に合併する睡眠時無呼吸は、患者予後を悪化させることも知られている。そこで、心筋症モデル動物を用いて同様の実験を実施し、酸化ストレスやヒドロキシラジカルがいかに作用するかを検討する予定である。一方、低酸素曝露によりVEGF発現が増加することは既に報告しており(Circ J 2996;70:787)、本実験系においてもVEGF受容体阻害薬を併用することにより重要な知見が得られると期待される。なお、一部の脳組織におけるFos陽性細胞数の減少については引き続き検討を加える予定である。糖尿病マウスを使用する実験系ではβ遮断薬を用いたpilot studyが終了したが、血行動態測定に使用しているテレメーター装置の作動不具合が多く、予備の発信装置の購入を検討している。また、実験動物のn数を増やすために実験の効率化に取り組んでいる。
インスリン及びその類似蛋白質における構造変化と機能の理論的研究

研究の内容は大別して3部からなる。第1部は、bovinepancreatic trypsin inhibitorなる小さな球状蛋白質を取り上げている。計算機の中に、その蛋白質の立体構造を組み立て、その蛋白質のアミノ酸配列の一部を他のアミノ酸で置換したとき生じる構造の変化を原子レベルで調べた。その結果、構造変化は活性部位近傍で大きく、その部分が構造的に柔らかいことが示された。第2部は、第1部の方法をインスリンに適用するための準備段階である。インスリン分子は、A鎖、B鎖でできた分子で、結晶内では、六量体を形成している。つまり六量体内には、12個の剛体を含んでいることに相当する。報告者は、インスリンの単量体状態の如く、2個の剛体で出来た分子を扱うエネルギー極小化プログラムは、この2年間の成果として開発済みであるが、3個以上の剛体を扱うプログラムの開発は、いまだ完成していなく残された課題である。従って単量体のみのエネルギー極小構造はそれはそれとして求められるが、単量体が二量体を形成し、更に六量体の形成へとすすんだとき、注目している蛋白質分子のエネルギー極小構造がどの様に変化して行くかという議論をきっちりしておかなければ、アミノ酸置換によってもたらされる構造の微妙な変化を追求しても大きな成果を上げることが出来ない。それ故、インスリンの単量体での構造の特徴を把握することに努め、α-helixのかたさ等のいくつかの点を明らかにすることが出来た。第3部は、avian pancreatic polypeptideなる小さな蛋白質を取り上げている。この蛋白質は、二量体を単位として結晶を形成している。それ故、単量体のときと、二量体のときとで注目している蛋白質分子のエネルギー極小構造の違いを把握することに努めた。と同時に動的揺らぎの差違いをも明らかにすることに努めた。その結果を、X線結晶解析の実験値と比較することにより、この蛋白質分子を取り囲む水分子を含めることが必要不可欠であることが分かった。水分子は、6自由度を持っているので、つまり3個以上の剛体を扱うプログラムの開発なしにはこの研究の遂行は不可能である。第2部で言及しているように、このプログラムの開発は今後の課題である。それ故、単量体、二量体での静的、動的構造の特徴を捉えることに努め、いくつかの成果を得た。
農業における雇用労働力問題に関する調査研究

1.雇用労働力の実体農業雇用労働力は総じて高齢化しているが、雇用者側の属性(農家、農協、農業法人)の相違により年齢構成に相違が見られ、農家よりも農協・農業法人の非雇用者年齢は低い傾向にある。この点に関しては、各種保険制度への加入、雇用期間、賃金水準、賃金算定方式等の労働条件面で、農協・農業法人が農家よりも優れていることに起因すると考えられる。また、性別には女性が圧倒的に多いが、雇用労働力に依存する作業の多くが、通常栽培管理作業(ホルモン処理、摘心、摘葉等)、収穫調整作業、出荷作業(選別・包装・箱詰め・梱包等)といった手作業であることに起因し、男性は機械作業、ビニル張り、運搬等の技能・危険・重労働を伴う作業に短期・集中的に導入される傾向にある。なお、地域別にみて非雇用者の属性に大きな相違はない。2.農家の労働需要と労働削減技術導入現在、農家の労働力不足・高齢化に対応し、各種省力化技術が導入されている。本研究では、施設ナス生産を対象とし、花粉媒介昆虫を利用した環境保全型栽培技術の導入、集出荷場統合を契機とした自動機械導入による選別作業の外部化を雇用労働力問題の側面から検討した。農産物価格低迷の中で、花粉媒介昆虫利用栽培技術、自動選別機械導入による選別作業の外部化双方ともに、農家は労働の外部依存度低減の方向にあった。また、集出荷場の統合と作業の自動機械化は、作業員の不足・高齢化対策としては効果的であるが、機械稼働速度にあわせた労働を作業員に強いる等の問題も抱える。農業雇用労働力の不足・高齢化が顕在化している高知県下の施設園芸地帯について、労働市場環境の異なる、都市近郊地域(高知市及びその周辺)、都市部への通勤にやや難がある地域(高知県東部の安芸市及び芸西村)、地理的に孤立し労働市場が閉鎖的な地域(窪川町興津地区)、の3調査地域を設定した。そして各地域毎に、雇用労働力を導入している農家、農業法人、農業サービス事業体の被雇用者の属性(性別、年齢、資格・技能、通勤手段、従事作業等)、被雇用者の労働条件に対する意識・意向、使用者側の属性(年齢、生産作目、規模、作業体系、企業形態等)、労働条件・労務管理の実態の4つの事項について、聞き取り及びアンケート調査を実施した。なお、本年度調査した農業事業体数は次の通りである。高知市及びその周辺...2農業法人、4農業サービス事業体(稲作作業受託組織)安芸市及び芸西村...20農家、6農業サービス事業体(野菜集出荷場)窪川町興津地区...1.農業サービス事業体(野菜集出荷場)調査データについては分析途中であるが、1農業雇用労働力の高齢化は予想以上に進行しており、2.雇用労働力の安定確保のためには、周年雇用のための条件整備(栽培作目選択による周年的な作業の確保や事業体間の連携等)と各種保険制度の導入、非農家に対する農業サイドからの情報発信の3点が重要であること等が示唆される。一方、本研究に関連し、農業においてどの程度の農業労働需要が存在するのかを把握するために、安芸市及び芸西村における主要作付品目である冬春なす栽培における作業別労働時間の農家記帳調査を、高知県農業技術センター、高知県安芸農業改良普及センターと連携して、6戸の農家を対象に現在実施している。
椎間板細胞の再生を目指した細胞周期制御機構の解明

椎間板障害に対する治療には従来から脊椎固定術や摘出術などの外科的治療が普及し一定の成果が確認できているが,その限界と代替医療の可能性に注目が集まっている.本研究では椎間板細胞を単離・継代し,血清非存在下における発現変動遺伝子の網羅的探索を行い,さらに得られた遺伝子群の発現を椎間板組織内で抑制させる機能解析を行った.その結果病理学的およびMRIにて椎間板組織の変性を抑制されていることが確認され,細胞周期をコントロールすることで椎間板組織の変性を抑制しうることが示唆された.椎間板障害に対する治療には従来から脊椎固定術や摘出術などの外科的治療が普及し一定の成果が確認できているが,その限界と代替医療の可能性に注目が集まっている.本研究では椎間板細胞を単離・継代し,血清非存在下における発現変動遺伝子の網羅的探索を行い,さらに得られた遺伝子群の発現を椎間板組織内で抑制させる機能解析を行った.その結果病理学的およびMRIにて椎間板組織の変性を抑制されていることが確認され,細胞周期をコントロールすることで椎間板組織の変性を抑制しうることが示唆された.椎間板細胞は終末分化した心筋細胞と同じくGO期からG1期への移行ができずに細胞分裂ができないかあるいはそのスピードが遅いと推察し,細胞周期関連遺伝子であるサイクリンとサイクリン依存性キナーゼ(CDK)およびE2Fなどの細胞周期を正に制御する因子の発現・活性を調べ,さらに強制発現を行って増殖を試み,さらに負に制御するCDK阻害因子のノックダウンにより増殖誘導が起こるかをも明らかにし,椎間板細胞の増殖が分子レベルで正負両方にコントロール可能かどうか,その細胞周期制御機構を明らかにすることを日的としている.平成20年度は13週SDラットより椎間板細胞を単離・継代し, in vitroでの遺伝子導入実験を行った.ウイルスベクター自体の細胞毒性や免疫反応などの課題を排除するため導入方法は,非ウイルスベクターを用いた.まず今回のターゲット遺伝子のひとつであるラットサイクリンD1遣伝子を人工合成し,椎間板細胞内に遺伝子導入した.この結果,経時的(6, 12, 24, 48, 72時間)に細胞増殖誘導能を確認した.またフローサイトメトリーを用いた細胞周期解析を行い, G1arrest, S期移行ブロックの状態を評価したところ, G1/S期からS期へと細胞周期が移行しDNA複製が開始され,細胞が増殖サイクルに入ったことが確認された.現在順次,他の細胞周期関連遺伝子群の発現解析を行っている.椎間板障害に対する治療には従来から脊椎固定術や摘出術などの外科的治療が普及し一定の成果が確認できているが,術後の新たな隣接椎間板障害の出現や機能障害の報告が広く認知され,その限界と代替医療の可能性に注目が集まっている.椎間板細胞は非増殖細胞である心筋細胞に似ており,終末分化した状態に近く,その細胞分裂能は低い.また角膜組織と同様に,中心部は無血管野で周囲からの拡散により栄養状態を維持している特殊な組織でもあるが,その詳細な細胞増殖・維持機構は依然不明である.椎間板細胞は終末分化した心筋細胞と同じくG0期からG1期への移行ができずに細胞分裂ができないかあるいはそのスピードが遅いと推察し,細胞周期関連遺伝子であるサイクリンとサイクリンに結合して活性化されるリン酸化酵素(サイクリン依存性キナーゼ,CDK)およびE2Fなどの細胞周期を正に制御する因子の発現・活性を調べ,その細胞周期制御機構を明らかにすることを本研究の目的としている.平成21年度は13週SDラットより椎間板細胞を単離・継代し,血清存在下,非存在下における実際の発現変動遺伝子の網羅的探索を行った.具体的には血清飢餓開始48時間後に細胞を回収しRNAを抽出した後,DNAマイクロアレイを用いて血清存在下での場合と比較し,その発現変動遺伝子の探索を行い,さらに統計学的に有意差のあった遺伝子群をPCRアレイを用いて再確認した.その結果細胞周期関連,癌関連遺伝子の有意な発現変動を認めた.今後はこれらpathwayに属する遺伝子群をターゲットとした機能解析を行う予定である.椎間板障害に対する治療には従来から脊椎固定術や摘出術などの外科的治療が普及し一定の成果が確認できているが,術後の新たな隣接椎間板障害の出現や機能障害の報告が広く認知され,その限界と代替医療の可能性に注目が集まっている.椎間板細胞は非増殖細胞である心筋細胞に似ており,終末分化した状態に近く,その細胞分裂能は低い.また角膜組織と同様に,中心部は無血管野で周囲からの拡散により栄養状態を維持している特殊な組織でもあるが,その詳細な細胞増殖・維持機構は依然不明である.椎間板細胞は終末分化した心筋細胞と同じくG0期からG1期への移行ができずに細胞分裂ができないかあるいはそのスピードが遅いと推察し,細胞周期関連遺伝子であるサイクリンとサイクリンに結合して活性化されるリン酸化酵素(サイクリン依存性キナーゼ,CDK)およびE2Fなどの細胞周期を正に制御する因子の発現・活性を調べ,その細胞周期制御機構を明らかにすることを本研究の目的としている.13週SDラットより椎間板細胞を単離・継代し,血清存在下,非存在下における実際の発現変動遺伝子の網羅的探索を行った.具体的には血清飢餓開始48時間後に細胞を回収しRNAを抽出した後,DNAマイクロアレイを用いて血清存在下での場合と比較し,その発現変動遺伝子の探索を行い,さらに統計学的に有意差のあった遺伝子群をPCRアレイを用いて再確認した.

その結果,Cdkn1cなどの細胞周期関連,癌関連遺伝子の有意な発現変動を認めた.ついでこれら遺伝子群をターゲットとしたウサギ用short interfering RNAを作成しウサギ椎間板組織内に導入し,病理学的および超高磁場7.0T MRIを用いた機能解析を行った.その結果細胞周期をコントロールすることで椎間板組織の変性を抑制しうることが示唆された.
奈良時代知識TopicMaps辞書構築による正倉院文書研究方法論の記述の試み

正倉院文書のデータベースシステムをさらに発展させ、資料に関連するメタな情報をもとにそれぞれの資料を結びつけることを可能としたシステムを構築した。とりわけ、正倉院文書の二次面が、造東大寺司写経所の文書であるという面に着目し、写経に関連する経典名・僧侶の名前・組織の名称などをメタデータとして入れることで、これまでとは異なるデータベースの構築へとつなげることができた。今後、正倉院文書のデータベースの後継として、公開へとつなげる予定である。正倉院文書トピックマップの原型を作成した。当該年度では、正倉院文書に関わる所属・帙・巻・断簡・紙などの基礎的な情報の部分をトピックとして入力し、それをリンクでたどることで、正倉院文書の構造を明らかにできるようにした。基礎情報の入力に関しては、大阪市立大学名誉教授・栄原永遠男氏の研究協力を得て実施した。また、正倉院文書の復原形態としての「帳簿」に関する情報も入力を行った。これにより、正倉院文書の基礎的なリソースへのアクセスを可能とした。あわせて、断簡・紙に独自のURLを付すことによって、その基礎的なリソースへのポインタを作成するというモデルを可能とした。次に、正倉院文書の中心である写経所文書を中心として、研究情報の入力を行った。具体的には、人名・経典名などの情報となる。経典名には、翻訳者や作者などの情報を付加すると同時に、経典が所属する宗派に関する情報の整理を行った。これにより、奈良時代の経典に関する知識や関連する情報の関係が、コンピュータ上で可視化され、研究支援を行うための仕組みとして利用可能な段階となった。人名に関しては、特に経典との関係性を重視し、ある人物がどのような特定の経典に関わっていたかなどの情報を可視化することで、奈良時代における写経所周辺の仏教知識の解析への支援システムのきっかけを作成した。また、経典に関しては、大正新脩大蔵経データベース(SAT)へのリンクも作成し、正倉院文書にあらわれる経典の原テキストへの参照も可能とした。仏教学研究などで正倉院文書を取り扱うためのひとつの取りかかりとして、有益であるかどうかの検証を今後も行う。関連する各地での研究発表、および討論により正倉院文書トピックマップの原型の作成によって、奈良時代史をはじめとする各種人文科学研究へのこれらの技術応用の有用性について確認した。正倉院文書トピックマップを改良し、オントロジデータの追加と修正を行った。とくに正倉院文書の基礎情報である、「紙」については、視認性を大きく向上させ、画像データとテキストデータを同時に見られるようにし、かつテキストデータは、よりシンプルな形で閲覧できるようになった。正倉院文書データベースの後継データベースとしての基礎的な体制を整えつつあり、断簡復原情報の最終的な入力によって、後継データベースとしての位置づけを確実なものとした。オントロジデータの追加については、特に正倉院文書の時代から、のちの時代につながる仏教の宗派等の分析を可能とするべく、9世紀の宗派の情報を入れ、時間的変遷による仏教知識の変遷を可視的においかけることを可能とした。このことにより、当時の経典と宗派の関係がより明瞭となり、奈良時代における仏教知識の解明の一端を作り出すことが可能となる。また、コンテキストを分析する技術を、トピックマップに追加することで、正倉院文書に記述される時間の変遷を、データで表現する最初の段階に至ることができた。最終年度に向け、データの全面的なブラッシュアップを開始している。最終年度の国際会議報告に向け、論文を投稿すると同時に(採択決定済み)、その国際会議報告にあわせて、データベースの公開を目指しつつ、正倉院文書断簡データ・紙データなどを全面的にチェックし、次年度も継続して作業予定である。あわせて、英語でのトピックを用意し、日本語の用語を介することなく、データを取得できるような形式とした。今後は、英語のトピックデータを充実させ、最終的な公開に至るべく、研究者のネットワークの構築を目指していく。また、奈良時代と平安時代の経典情報を入れることで、時間差による当時の経典の知識情報の変化について可視化を行うことが可能となった。とりわけ、現在の状況に時間軸の情報を付加したことにより、歴史のための情報としてみることをより可能なものとした。これらの成果を踏まえ、最終的な公開を行う準備を終えるとともに、次の研究への新たなステップとすることも可能となった。とりわけ、オントロジでの情報の記載は、正倉院文書という詳細な情報が積みあがった資料であれば有益であることが確認された。そのためこれらの情報をより高度にコンピュータで表現することを、次の研究の目標とすると同時に、これにより新たな人文学的成果に結びつけることで、デジタル・ヒューマニティーズの文脈の中で、より重要な成果として位置づけることを目指す。一方で、外部との連携研究については、代表者の異動があったこともあり、効果的ではなかった部分もあるので、平成28年度に残された課題である。研究およびデータの検討については、予定に近い状況で進行したと考えられる。一方で、研究代表者の異動にともない、研究環境が大きく変わったこともあり、データの連携と公開については、若干の遅れが生じている。研究代表者の異動にともなう諸事情のため、延長した平成28年度は、データベースの公開についての処理を中心に行った。特に平成27年度までに蓄積した経典データ・僧・人名データ・正倉院文書の基礎となる断簡データ・紙データ・画像データなどの諸データを統合的に閲覧できるようなシステムの構築を行った。