hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新たな重合分子を介した細胞形態制御機構

-70は刺激依存的な細胞膜、アクチンの構造変化に関与することで、形態変化に重要な役割を果たす分子の一つである。本研究ではこのSWAP-70の新たな機能として自身の重合能を通じて刺激依存的な細胞形態制御活性を持つ可能性にせまるとともに、その機構を明らかにすることを目的とした。細胞に架橋剤を作用させ、SWAP-70を検出したところ、刺激後においてのみ多量体のSWAP-70が検出された。また、SWAP-70欠損マウス繊維芽細胞にGFP-SWAP-70を安定発現する株を作製し、刺激後の動態を調べたところ、刺激依存的かつアクチン再構成非依存的に、繊維状の構造がGFPシグナルとして観察された。以上のことから、SWAP-70は刺激依存的に重合活性をもつことが示唆された。さらに、この機構を解明するために、阻害剤および変異型SWAP-70安定発現細胞株を用いて、重合化に必要なシグナルの解析を行った。その結果、重合化には、SWAP-70とホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸、および、低分子量Gタンパク質、Racとの結合が重要であることが明らかとなった。また、これらの分子との結合を失ったSWAP-70発現細胞株においては、刺激依存的ラッフリング形成能が低下することが示された。以上の結果より、SWAP-70は増殖因子刺激によって活性化されたRacによる調節をうけて重合し、その重合体が刺激依存的細胞形態変化に関与する可能性が示唆された。一方、in vitroにおける組み換え体タンパク質SWAP-70の重合の検出も試みた。これまでのところ電子顕微鏡解析により明確に重合を示す繊維状構造物は観察されていないが、今後、共因子を加える等の条件を重ねることで検出が可能になることが期待される。細胞生物学前年度の重合系の確立に時間がかかった分、やや遅れているが、その他は予定通り進行している。in vitro重合検出系において、全長タンパク質による活性検出の条件検討に時間を要している。重合検出系の確立に際して、GFP-SWAP-70の安定発現細胞株を取得するにあたり、SWAP-70欠損マウス繊維芽細胞への遺伝子導入が通常の細胞への導入と較べて著しく効率が悪かった。最終的には遺伝子導入法を改善することでこの問題を克服できたが、この対処に時間がかかった事が当初の予定よりやや遅れた原因である。in vivo重合検出系において得られた重合に関する知見をもとに、in vitroの系において重合の再構成を試みる。さらに重合がラッフリング形成にはたす役割について検討する。本年度の研究結果をふまえ、in vitroの系における重合の再構成を目指す。SWAP-70の刺激依存的な重合体形成がどのような機構によって起きるのかについて、初年度に確立した重合検出系を用いて解析を行う。In vivoの系でシグナル伝達分子の阻害剤や様々なSWAP-70の変異体を用いた解析を行うことにより、重合に必要な上流シグナル、SWAP-70の領域を明らかにする。また得られた知見をふまえてin vitroの系での再構成を試みる。
重粒子線治療患者位置決めにおける分割領域の位置ずれ定量化及び可視化に関する研究

本研究は、放射線治療における自動位置決めソフトウェアを開発すること、さらに、画像を領域分割して行うことにより、体内各部の位置ずれ量を定量化、可視化する機能を開発することを目的とした。治療計画時の3D-CT体積を、動きのない骨構造である母体側と、治療計画時から動きのある部分(関心体積)に複数に分割し、それぞれを独立に3次元的に仮想的に動かすことにより、逐次生成される疑似X線画像(DRR)とX線画像とのマッチングを行うソフトウェアを開発した。これにより、一般的な骨構造の位置決めとともに、動きのある分割体積部分も視覚的に一致させ、母体積からの移動を定量化することができた。本研究では、重粒子線治療における位置決めの高速化・高機能化を目指し、治療計画用CT画像から生成される疑似X線画像(DRR)と照射時に撮影されるX線画像との自動位置決めソフトウェアを開発すること、さらに、画像を領域分割して行うことにより、体内各部の領域毎の位置ずれ量を定量化、可視化する機能を開発し、位置決めにおける患者位置修正を補助できるシステムを研究・開発することを目的としている。当年度は3次元CTデータからDRR画像を生成し、位置決め用正側のX線画像との画像照合による自動位置決めソフトウェアの基本部分の開発を行った。ソフトウェアの基本構成を検討し、以下のような方法が妥当であるとの結論を得た。評価関数としては異なる種類の画像同士に対して妥当な評価が行える正規化相互相関を用いること、最適化方法としては最急降下法による下降方向の決定および黄金分割法による収束を行うこととした。また、DRRの計算回数をなるべく少なく抑えて最適化できるよう、正側2方向の2次元画像を用いてそれぞれの画像上の2方向並進および1軸回転でのマッチングを行い、x、y、z、θx、θzを最適化した上で、最後に両画像でマッチング不可能なθyについてマッチングを行い、それを収束するまで繰り返すこととした。さらに、始めから細かい動きを追う必要が無いことから、上記の最適化フローを3段階に分け、画像解像度の粗いものからステップを踏んで高解像度のマッチングが行えるようなソフトウェアとした。上記ソフトウェアを用いた試験の結果、ファントムに対するCT画像およびX線(FPD)画像に対する試験マッチングにより、並進に対して0.5mm以内、回転に対して0.3°以内の精度が得られた。比較画像同士が同一のDRRとなるような場合について同様のマッチングを行った結果、並進に対して0.2mm以内、回転に対して0.1°以内の精度が得られた。本研究では、重粒子線治療における位置決め作業の高速化・高機能化を目指し、治療計画用CT画像から生成される疑似X線画像(DRR)と照射時に撮影されるX線画像との自動位置決めソフトウェアを開発すること、さらに、画像を領域分割して行うことにより、体内各部の領域毎の位置ずれ量を定量化、可視化する機能を開発し、位置決めにおける患者位置修正を補助できるシステムを研究・開発することを目的としている。当年度は前年度に開発した自動位置決めソフトウェアについて、検証作業を容易にするためのユーザーインターフェースの改良と、ファントム等実データによる検証を行った。ソフトウェアは、これまで個々の機能を別に持たせていたが、なるべく統合して共通性を持たせた。例えば、単一体積に対する2D-3Dマッチングと、領域分割マッチングについて、設定ファイルや、結果画像確認のためのGUIを共通化した。また、2D-3Dマッチングと領域分割マッチングでは最適化の方法が異なるが、いずれも結果的に3D-CT画像体積に対して6パラメータの最適化を行うこととなるため、位置決め用として2つの異なる方法で最適化が可能となった。既存のCT値校正用ファントムの円筒形アクリル容器を用いて、低密度発泡剤内部にアクリル構造物を配置するファントムを製作し、2D-3Dマッチングの検証を行った。その結果、構造物の配置により、得られるDRR画像のエッジの鮮明度が悪いほどマッチング結果のずれが大きくなることが示された。精度としては最悪でもおおよそ並進1mm、回転1度程度以内であった。実利用では、撮影部位により精度が異なってくると思われるが、可能な限り骨構造で画像上エッジが鮮明になる部分を多く含むように、マッチング領域を選ぶ必要があることが確認された。当年度は前年度に開発した自動位置決めソフトウェアのアルゴリズムについて、より正確な結果が得られるものとするため以下の通り検討及び方針修正を行った。マッチングの際の6つの変位量(回転・並進)によるCT画像の移動とそれに伴うDRRの動作を確認し、我々の2D-3Dマッチングが2D-2Dマッチングとそれに続くロールマッチングの2ステップ構成であることを考慮してその変位の順番を見直した。次に、マッチングでは、目的関数が最小となるべく微小変位を繰り返すが、各ステップで得られた変位量と全体を合成した変位量との関係から、元の位置からの変位量を得る処理を加えることとした。その際に、上記マッチングのステップを考慮した。また、治療計画における治療台初期回転角度および、位置決め開始時における実際の治療台初期回転角度を持つ場合の、より一般的な状況に対応するべくDRR作成における座標変換の基本仕様を見直した。

その際、2D-2Dマッチング時のX線TV装置の座標系と、治療台回転位置が一般的には異なることから、2D-2Dで得られる変位量から治療台回転位置座標での変位量への換算を考慮するものとした。さらに、マッチングにて得られた6つの変位量から、実際の治療台の変位量への換算法について明確にした。研究計画では、前年度の開発を継続し、X線画像とDRR画像を比較して、最も一致する位置ずれ量を算出する自動位置決めソフトウェアを開発すること、および、分割した領域について、領域毎に位置合わせを行い、それぞれについて位置ずれ量を算出できるようにすることである。自動位置決めソフトウェアの位置決め精度としては、ファントムや一部の患者データを用いた試験にて0.5mm、0.5°程度以下が得られているが、原理的な見直しの必要性が明らかになったため、その内容について検討を行い、修正方針を明確にした。今後その修正を加えたソフトウェアを製作し、試験を行う予定である。上記、原理的な見直し検討やその修正対応が予想外に必要となったことで、若干計画が遅延してしまっている。本研究では、重粒子線治療における位置決め作業の高速化・高機能化を目指し、治療計画用CT画像から生成される疑似X線画像(DRR)と照射時に撮影されるX線画像との自動位置決めソフトウェアを開発すること、さらに、画像を領域分割して行うことにより、体内各部の領域毎の位置ずれ量を定量化、可視化する機能を開発し、位置決めにおける患者位置修正を補助できるシステムを研究・開発することを目的としている。当年度は体積分割による位置決め手法の開発とその確認を以下の通り行った。3D-CT体積を、動きのない骨構造である母体側と、治療計画時から動きのある部分(分割体積)に複数(ここでは2つ)に分割し、それぞれを独立に3次元的に計算機上で仮想的に動かすことにより、逐次DRRとX線画像とのマッチングを行い、これにより、一般的な骨構造の位置決めとともに、動きのある分割体積部分も視覚的に一致させ、母体積からの移動を定量化することができた。マッチングの際の1体積につき6つの変位量(並進・回転)が、分割体積数分増え、12パラメータのマッチングとなる。12パラメータを一度にマッチング処理することも可能であるが、母体側6パラメータ、その後分割体積側6パラメータのマッチングをすることや、母体側マッチングの際には分割体積側にマスクをかけることがマッチング処理に有効であることがわかった。また、分割体積には直方体だけでなく治療計画の輪郭情報にも対応した。分割体積と母体積との衝突部分や空隙部分が画像マッチングに与える影響を小さくするために、それぞれ2体積の最大値投影処理、最小値投影処理が有効であることがわかった。以上より、実患者治療症例に対して、治療計画CTと治療照射時のX線画像を用いて、両者で動きのある部分も含めて照射時の患者状態に画像を合わせ、その移動量を定量化することができた。本研究は、放射線治療における自動位置決めソフトウェアを開発すること、さらに、画像を領域分割して行うことにより、体内各部の位置ずれ量を定量化、可視化する機能を開発することを目的とした。
膵広範切除後の病態生理の研究

教室の膵切除例の臨床的検討により,術後膵性糖尿病を来す要因には,Type1:膵実質量減少型,Type2:膵管閉塞型,Type3:残膵血流減少型,Type4:膵β細胞疲弊型,Type5:原因不明の5つのTypeに分けられることを明らかにしてきた。従来Type1とType2に関しては様々な観点から検討されてきた。今回我々は新しくType3,4のパターンがあることを認識し,これらの発現原因を明らかにする目的で今回の研究に入っている。従来術後膵性糖尿病がいつ発現したか正確に捉えることは極めて困難であった。これは経時的な膵β細胞機能の変動指標をO-GTTかIV-GTTのΣIRIにておこなっていたためであり,この検査では変動の激しい膵β細胞機能を追跡調査することが不可能である。そこでわれわれは早朝1回の採血にて検査が可能な空腹時CPR変動率という新しい指標を求め,これによりβ細胞機能が回復しているのか低下しているのか随時判定可能となった。さらに空復時CPR変動率が低下した症例では直ちにMRP(MR-pancreatography)を施行し,残存膵管の径を測定,さらにカラードップラー血流計にて背側膵動脈または膵尾動脈血流を測定してきた。これによれば術後3カ月までは全例空腹時CRR変動率の低下を認め,膵β細胞機能は低下している。しかしほとんどの症例はこの段階から回復過程に入り,術後l年目にはほぼ正常領域に復帰する.しかし3力月日以降も低下する症例では,膵管径は正常であるにもかかわらず残膵血流量が抵下していることが明らかとなった。また長期にわたり空腹時CPR変動率が低下してきた症例では,胃潰瘍,肝膿瘍,急性膵炎などを合併した後,急速な残膵血流量の低下を認めた。今後はこれらの原因によらないType5の解明を求めるべく,膵切除時に採取してある膵組織から抗64kD抗体,DQ遺伝子,ICA(Islet cell antibody)を検索し,再手術施行例での再採取膵組織と比較検討し,分子生物学的な観点から発生原因を探索する予定である。
高層建築鉄骨の脆性破壊の防止技術に関する研究

本研究は,現代都市を襲った1995年兵庫県南部地震が起こした建築鉄骨の脆性破壊について,その現象を解明し,脆性破壊に対する高層建築鉄骨の安全対策技術を提案することである。具体的な研究課題は次のとおりである。1)脆性破壊によって鉄骨造建築物の安全性がどのような脅威を受けるか。2)現代の高層建築鉄骨に生じうる脆性破壊はどのような破壊形態であるか。3)脆性破壊に関わる鋼材の特性は何であるか。4)脆性破壊に対して溶接はどのような影響をもたらすか。5)地震時の繰返し変形履歴は脆性破壊にどのような影響をもたらすか。6)脆性破壊が生じたのち構造全体の崩壊を防止するフェイルセーフ機構は可能か。7)脆性破壊の防止あるいは脆性破壊による建物崩壊の防止のために,この研究および関連研究を基にしてどのような設計技術が提案できるか。今回の研究は,これらの課題に対して実験と解析の両面から検討を行い,それぞれについて解答を導き,脆性破壊に関する多くの基本的知見を得た。また,それらを総合して脆性破壊に対する当面の対策技術を設計法と施工法に関して提案することができた。しかしながら,地震時の動的な変形過程で生じる脆性破壊には多くの要因が複雑に関係しており,最終的な結論を得るには,さらに実証試験を続けデータを蓄積していく必要があることも明かとなった。高層建築鉄骨では板厚の大きい鋼材が使用されること、および脆性破壊には寸法効果があることが知られていることから、先ず、板厚を変数とする実大破壊実験を行った。板厚は25mm,40mm,100mmの3段階とした。さらに、建築構造用鋼材の破壊靭性に関する規定の幅が広いことを考え、材料靭性をもう一つの実験変数とした。材料靭性は、0°Cシャルピー吸収エネルギーで35ジュールと150ジュールの2段階とし、前者が現行材料規格の下限値27ジュールに近いものである。実験結果は、従来の破壊力学的知見に基づく予想に反し、板厚の影響は小さく、シャルピー衝撃特性の影響は甚大であった。このような実験結果は、建築鉄骨がかなり大きな塑性変形の後に脆性破壊を起こすという特徴と深い関係があり、船舶や橋梁が弾性範囲での脆性破壊を対象とすることと根本的に異なっている。つまり、建築鉄骨で起こる脆性破壊は、全断面降伏した後に塑性ひずみが進行し、特に、形状変化部での塑性ひずみが材料の延性を突破してしまうことが破壊の初期条件となる。このようにして生じた延性き裂が、ひずみの進行過程で成長し、それが脆性破壊に転化する。したがって、鉄骨の脆性破壊を支配するのは、応力よりもひずみのほうが支配的となる。塑性ひずみが進行すると、応力拘束状態が比較的小さい板厚で収束してしまうため、板厚の影響が顕在化しないことが今回の研究により明かとなった。一方、材料靭性は、脆性破壊に転化する限界き裂サイズを決定づけるため、脆性破壊までの塑性ひずみ能力に大きな影響を与えると言える。今後は、延性き裂が脆性破壊に転化する条件を支配する各種要因を特定し、その因果律を明らかにしていく必要がある。建築鉄骨の脆性破壊は溶接接合部に生じるので,溶接の影響を明らかにする実大実験を行った.試験体は高層建築に使われる大形のボックス柱とし,板厚は40mmである.実験変数は、溶接入熱(40kJ/cmと800kJ/cmの2段階),材料特性(0°Cシャルピー衝撃値が50Jと140Jの2段階)である.破壊起点の形状は先端半径0.25mmの人工ノッチとし,溶接熱影響部の中でもっとも脆化しているボンドに設けた.これは,この研究で行った鉄骨溶接部の実態調査に基づき,現実に起こりうるもっとも厳しい条件としたものである.試験温度はドライアイスで制御し0°Cとした.この実大実験により,次のことが判明した.脆性破壊は弾性領域では起こらず,降伏後の塑性変形過程で生じる.破壊のプロセスは,

ノッチ底に生じた延性き裂が塑性変形過程で成長し,それが限界き裂深さに達したとき脆性破壊する.溶接入熱の影響は非常に大きく,大入熱溶接は脆性破壊までの塑性変形能力を著しく低下させる.母材特性の影響も大きく,高靭性の鋼材ほど溶接後も高い塑性変形能力を発揮する.さらに,この実大破壊実験と並行して実施した溶接部のミクロ調査により,溶接入熱による破壊靱性の低下と母材の初期靱性との関係が明かとなり,これが鉄骨部材の破壊抵抗に関わっているという新たな知見が得られた.今後は,これらの実験事実に基づいて破壊条件を定式化すること,地震時の入力特性との関係を明らかにすること,破断を防止するガイドラインを作成すること,である.本研究は,現代都市を襲った1995年兵庫県南部地震が起こした建築鉄骨の脆性破壊について,その現象を解明し,脆性破壊に対する高層建築鉄骨の安全対策技術を提案することである。具体的な研究課題は次のとおりである。1)脆性破壊によって鉄骨造建築物の安全性がどのような脅威を受けるか。2)現代の高層建築鉄骨に生じうる脆性破壊はどのような破壊形態であるか。3)脆性破壊に関わる鋼材の特性は何であるか。4)脆性破壊に対して溶接はどのような影響をもたらすか。5)地震時の繰返し変形履歴は脆性破壊にどのような影響をもたらすか。6)脆性破壊が生じたのち構造全体の崩壊を防止するフェイルセーフ機構は可能か。7)脆性破壊の防止あるいは脆性破壊による建物崩壊の防止のために,この研究および関連研究を基にしてどのような設計技術が提案できるか。今回の研究は,これらの課題に対して実験と解析の両面から検討を行い,それぞれについて解答を導き,脆性破壊に関する多くの基本的知見を得た。また,それらを総合し,て脆性破壊に対する当面の対策技術を設計法と施工法に関して提案することができた。しかしながら,地震時の動的な変形過程で生じる脆性破壊には多くの要因が複雑に関係しており,最終的な結論を得るにはさらに実証試験を続けデータを蓄積していく必要があることも明かとなった。
プロテアーゼカスケードと血液脳関門修復機構

申請者らは,cold injury法をアンジオテンシンIIの前駆体遺伝子・アンジオテンシノーゲンの欠損マウス(Ag-KO)に応用して,凍結による脳損傷からの回復が極めて悪いがアンジオテンシンを注入することで回復することを突き止めた.そこで本研究は,レニンカスケードの血液脳関門の機能再生への関与を明らかにするために以下の2点に焦点を絞ることとした.(1)レニン遺伝子欠損(Rn-KO)マウスの脳を用いた凍結損傷時の血液脳関門の機能修復:cold injuryをRn-KOマウスに施し,Ag-KOマウスと同じ表現型を示すかどうかを検討した.cold iniuryは,血液脳関門を広範囲かつ一過性に破綻させることにより,浮腫を誘発させるモデルである.マウスの左半球側の頭蓋上にドライアイス-メタノールを満たした真鍮製のカップを接触させることにより,大脳皮質に凍結損傷部位を作製する.静脈より染料・エバンスブルーを注入して,血管外への漏出の有無を確認し血液脳関門が破綻しているがどうがを調べた結果,野生型マウスと同様に回復した.以上から,脳損傷からの血液脳関門の回復にはアンジオテンシンは必須であるが,レニン依存的ではない経路が存在することが示唆された.今後は,レニン非依存的経路がどの様なものであるかを調べていく予定である.(2)新規アンジオテンシン産生経路の探索:Yeast two hybrid systemを使い,アンジオテンシノーゲンに結合する因子を探索し,レニン以外の作用酵素の同定を試みた.1)スクリーニング用発現プラスミドの構築:Yeast two hybrid systemを用いてスクリーニングを行い,アンジオテンシノーゲンに結合する分子の同定を試みた.現在のところ,候補遺伝子のクローン化には成功していない.今後は,ライブラリーの再検討を行う予定である.申請者らは,cold injury法をアンジオテンシンIIの前駆体遺伝子・アンジオテンシノーゲンの欠損マウス(Ag-KO)に応用して,凍結による脳損傷からの回復が極めて悪いがアンジオテンシンを注入することで回復することを突き止めた.そこで本研究は,レニンカスケードの血液脳関門の機能再生への関与を明らかにするために以下の2点に焦点を絞ることとした.(1)レニン遺伝子欠損(Rn-KO)マウスの脳を用いた凍結損傷時の血液脳関門の機能修復:cold injuryをRn-KOマウスに施し,Ag-KOマウスと同じ表現型を示すかどうかを検討した.cold iniuryは,血液脳関門を広範囲かつ一過性に破綻させることにより,浮腫を誘発させるモデルである.マウスの左半球側の頭蓋上にドライアイス-メタノールを満たした真鍮製のカップを接触させることにより,大脳皮質に凍結損傷部位を作製する.静脈より染料・エバンスブルーを注入して,血管外への漏出の有無を確認し血液脳関門が破綻しているがどうがを調べた結果,野生型マウスと同様に回復した.以上から,脳損傷からの血液脳関門の回復にはアンジオテンシンは必須であるが,レニン依存的ではない経路が存在することが示唆された.今後は,レニン非依存的経路がどの様なものであるかを調べていく予定である.(2)新規アンジオテンシン産生経路の探索:Yeast two hybrid systemを使い,アンジオテンシノーゲンに結合する因子を探索し,レニン以外の作用酵素の同定を試みた.1)スクリーニング用発現プラスミドの構築:Yeast two hybrid systemを用いてスクリーニングを行い,アンジオテンシノーゲンに結合する分子の同定を試みた.現在のところ,候補遺伝子のクローン化には成功していない.今後は,ライブラリーの再検討を行う予定である.
分子イメージングによるマウス受精卵内イベントの可視化

本研究の目的は、マウスの卵子や初期胚において細胞を生かしたまま特定の分子などの動態を観察する分子イメージングシステムを確立することにある。なお、分子イメージングに関わる顕微鏡などの実験器具は非常に高価なものであるため、一部他の研究費で購入したものを使い相乗効果を持たせながら研究を進めている。1年目の平成16年度には主にいかに効率よく卵子・初期胚において蛍光タンパク質を発現させるか?というソフト面の整備を行った。その結果、5'末端にはキャップ構造を、3'末端に長いポリA配列を有するmRNAをインジェクションした卵子で効率的に蛍光タンパク質を発現させることができることを明らかにした。2年目となる本年度では蛍光シグナルのタイムラプス観察系を立ち上げること、および一度蛍光観察した胚をいかに生かしたまま個体発生までさせるか?と言う課題に重点をおいてソフト面、およびハード面での整備を行った。具体的にはマイクロインジェクションするmRNAの量の検討や観察時間の検討、より効率よく蛍光シグナルを検出することのできる顕微鏡システムの整備を行った。その結果、第2減数分裂や第1対細胞分裂期における紡錘体形成過程や核形成過程、DNAのメチル化状態の変化などについてタイムラプス観察に成功した。また、検出系の改良により、観察後の胚を個体にまで発生させることに成功した。以上の結果は論文としてまとめ、受理された(後述)。また、合わせてこのイメージングシステムを円形精細胞注入胚や、体細胞核移植(クローン)胚に応用しており、新規な知見を数多く得ている。これらの成果は今後論文として発表していきたい。本年度はまず、マウス卵子や初期胚を用いた蛍光イメージングのハード面の整備や実験条件の設定など実験系の立ち上げを中心に行った。具体的には、卵子や初期胚で効率良く翻訳され得るmRNAをデザインし、それをin vitroで合成するためのプラスミドベクターを開発した。また、本イメージングシステムでは卵子や初期胚を蛍光観察した後、効率よく胚を発生させる必要性がある。そこで、卵子内へとマイクロインジェクションする蛍光タンパク質融合mRNAのインジェクション時期や導入量が胚発生率に与える影響を検討した。さらに、蛍光観察自体が胚に与えるダメージを最小限に留め、なおかつ微細な構造まで観察可能な顕微鏡画像取得のシステムを整えた。以上の結果は実験手技的な内容ではあるが、初期胚発生における基礎研究だけでなく畜産分野などへの応用が考えられることから成果を広く公表しさまざまな研究者に使ってもらう価値があると考え、現在論文として投稿中である。確率した蛍光イメージングシステムを用いて研究実施計画にあるうち特に「DNAメチル化状態の可視化」を重点的に行った。メチルシトシン結合タンパク質であるMBD1と蛍光タンパク質の融合コンストラクトを用いて、受精直後から着床前初期胚発生を追って雌雄クロマチンのメチル化状態を観察した。その結果、これまでの報告にあるような抗メチルシトシン抗体を用いた染色では見られなかったいくつかの新規な現象を見出すことに成功した。また、同様の実験を円形精子細胞注入胚に対しても行ったところ、通常受精で得られた胚と比べて明らかなDNAメチル化状態の異常が見られた。このことは男性側不妊治療として用いられている円形精子細胞卵子内注入法で得られた胚がエピジェネティックに通常胚と異なることを示している。以上の結果は現在論文準備中である。
人口減少時代の「無学校地区」に学びの拠点を創出する方策の比較ケース分析的研究

本年度は、前年度に引き続き、1学校統廃合後における廃校活用や公民館活性化を通した地域づくりの方策、2学校統廃合を実施しない山間・離島地での学校を核とした地域づくりの方策、3通学条件整備を通して学校と社会教育施設を相互に活性化する方策という3つの柱で研究を進めた。第一に、学校統廃合により小中学校を失った地区が、地域社会を維持していく方策について検討した。特に、学校統廃合後の地域づくりの取り組み、その際に廃校や公民館を活用していく道筋について調査した。その結果、定性的な分析を通して、必ずしも人口増加や経済成長の追求に限られない暮らしの豊かさや交流の楽しみを捉える視点の重要性を明らかにした。第二に、前年度まで進めてきた調査結果を踏まえて論文作成を進めた。全校児童15名という限られた児童数で山間・離島地の小学校を存続させる場合に、学校づくりと地域づくりを共生させて進めていく方策について考察した。具体的な事例の比較分析に基づいて、児童数の推移からみた超極小規模化の動向、学校の地域参加と地域の学校参加、多様な集団づくりを進める方策、学校と地域の実情を踏まえた教育行政施策について究明した。第三に、学校統廃合の実施によって児童・生徒の通学距離と通学時間が長くなることや通学交通のモードが多様化することをめぐって、安全確保の方策とスクールバスの充実化方策について構想した。子どもの遠距離通学における安全確保の歴史について調査したうえで、学校再配置にともなう条件整備の方策を検討した。また、スクールバスを充実化させる方策として、学校、社会教育施設、運送事業者の連携や生徒の通学交通と住民の生活交通を共生的に確保する方策を検討した。その結果、単なる通学輸送ではなく、子どもを守り育てるという視点から通学条件整備を行っていく必要性が明らかとなった。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、学校統廃合によって小中学校を失った「無学校地区」の生活や教育の実態を明らかにしたうえで、子どもや住民が集い学ぶための拠点を創出する方策について究明することを目的としている。平成25年度は、主に3つのテーマで研究を進めた。第一に、学校統廃合の実施された地区の前提的な生活条件を把握した。「無学校地区」において生活課題の一つとなっている日常の買い物に焦点を当てた。教育学の枠内に留まらず、地域福祉の観点を加えて継続的なフィールド調査を行った。第二に、「無学校地区」に学びの拠点を創出する方策として、廃校活用の先進的な実践事例のフィールド調査を進めた。特に、地区住民が廃校を契機に地区外出身の人々と交流しながら、自らの人生や地域の価値を再発見するという学びの過程に着目した。そのほか、廃校活用に関するこれまでの研究が小中学校の事例に注目しがちであるなか、都道府県下の高校再編が進んできている現状に鑑み、廃止された高校の活用の傾向と特質について検討した。特に、高校の再編から再生への過程と立地市町村のガバナンスについて考察を行った。第三に、「無学校地区」を相対化して捉えていくために、極小規模校の調査に着手した。児童生徒数がかなり減少しても、「無学校地区」にならず学校が存続しえている地域の条件を明らかにする研究である。全校児童数が1桁台となっている小学校を選定して、地域の教育的実践に関する研究を進めた。本研究のテーマは、人口減少社会に適応する地域教育システムの探究である。学校統廃合が実施されて旧学区内から子どもの教育機関を失った「無学校地区」をフィールドとして、地域での生活や教育の現実を踏まえながら、地域住民の集いと学びの拠点を創出する方策について明らかにしようとしている。この目的を達成するため、本年度は以下3つの研究を実施した。第一に、学校統廃合後の地域において、廃校や既存の社会教育施設を活用した住民の学びと地域づくりの実態解明を進めた。前年度からの事例研究を継続しつつ、新たな事例を追加した。廃校を活用しながら地域の豊かさを追求しようという取り組みの生起過程について、活動の担い手に焦点を当てて研究を進めた。第二に、学校統廃合を実施しないという選択をした山間地や離島の地域づくり過程を解明するため、前年度から進めている極小規模校の調査を継続した。3事例を比較分析して、社会教育施設としての公民館の設置や専門職員の十分な配置が難しい地域において、教育活動や地域活動の参与観察と関係者へのヒアリング調査を行った。学校の存続をめぐる地域活動の実態を踏まえつつ、学校での教育課程の編成や教育経営上の実態を明らかにした。第三に、スクールバスの運行方策に関する研究である。学校統廃合の実施後において、統合先の学校と閉校となった地域をスクールバス等の交通によって結節していく際、社会教育施設等を発着点として位置づける意義を明らかにした。さらに、通学距離や通学時間が小中学生よりも長く、学科再編をともなって通学区域がより複雑・広域化する高等学校の場合を視野に入れて、スクールバス・システムの構想過程に関する事例調査を行った。以上のとおり、人口減少社会への対応方策が各地で多様に展開されるなかで、「無学校地区」における教育と学習の創造的な展開方策について考察を進めた。

本年度は、前年度に引き続き、1学校統廃合後における廃校活用や公民館活性化を通した地域づくりの方策、2学校統廃合を実施しない山間・離島地での学校を核とした地域づくりの方策、3通学条件整備を通して学校と社会教育施設を相互に活性化する方策という3つの柱で研究を進めた。第一に、学校統廃合により小中学校を失った地区が、地域社会を維持していく方策について検討した。特に、学校統廃合後の地域づくりの取り組み、その際に廃校や公民館を活用していく道筋について調査した。その結果、定性的な分析を通して、必ずしも人口増加や経済成長の追求に限られない暮らしの豊かさや交流の楽しみを捉える視点の重要性を明らかにした。第二に、前年度まで進めてきた調査結果を踏まえて論文作成を進めた。全校児童15名という限られた児童数で山間・離島地の小学校を存続させる場合に、学校づくりと地域づくりを共生させて進めていく方策について考察した。具体的な事例の比較分析に基づいて、児童数の推移からみた超極小規模化の動向、学校の地域参加と地域の学校参加、多様な集団づくりを進める方策、学校と地域の実情を踏まえた教育行政施策について究明した。第三に、学校統廃合の実施によって児童・生徒の通学距離と通学時間が長くなることや通学交通のモードが多様化することをめぐって、安全確保の方策とスクールバスの充実化方策について構想した。子どもの遠距離通学における安全確保の歴史について調査したうえで、学校再配置にともなう条件整備の方策を検討した。また、スクールバスを充実化させる方策として、学校、社会教育施設、運送事業者の連携や生徒の通学交通と住民の生活交通を共生的に確保する方策を検討した。その結果、単なる通学輸送ではなく、子どもを守り育てるという視点から通学条件整備を行っていく必要性が明らかとなった。当初の計画に沿って研究を進めている。対象とする事例が多様に広がってきているなかで、研究の全体像を構造化しつつ、比較分析を進めてきた。全体として順調に進展しているといえる。27年度が最終年度であるため、記入しない。前年度からの事例を引き継ぎつつ新たな事例に着手したことで、研究対象に広がりがみられた。今後は、人口減少社会、ESD、脱成長、生きがい、地域の豊かさなど、研究課題の核となる概念について検討を深めながら、理論的な枠組みを精緻化していく必要がある。これまで調査してきた多数の事例からの知見を相互に参照できるよう整理して考察していく。対象とする事例に追加や変更が生じたが、新たな事例からの知見や発展的な研究課題への着想が得られるという波及効果もみられた。そのため、全体として順調に進展している。平成25年度は、個別事例のフィールド調査を中心に実施して、ケース内分析を進めてきた。平成26年度からは、フィールド調査を継続しつつ、事例の件数を増やすとともに、ケース間分析の枠組みについて検討していく。
植物における有用物質生産のための葉緑体遺伝子発現「光スイッチ」

植物体生育後、タンパク質性医薬品等の有用物質生産を開始する「光スイッチ」を開発した。加えて、「乾燥スイッチ」も開発も試みた。シロイヌナズナ葉緑体ゲノムにコードされるPSI反応中心タンパク質遺伝子(psaA)の選択的転写抑制を活用した。「光スイッチ」としての最適光波長は、700 nmであることを見いだした。Chroma-Glo Luciferase (Promega)のCBRluc (赤色)とCBG68luc (緑色)をレポーター遺伝子として用い、一過性発現によるアッセイ系を構築した。これにより、転写抑制を遺伝子発現促進に置き換えるRNAiの活用を評価した。タンパク質性医薬品等の有用物質は、植物で生産することによりコストの低減が可能となる。その際、これら有用物質は植物にとって異物であり、その生育を阻害する場合が少なくない。したがって、植物体生育後、有用物質の生産を開始する「光スイッチ」を開発する。「光スイッチ」として、本研究代表者が見いだした光化学系(PS)レドックスによる葉緑体遺伝子発現制御系(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010)を活用する。2葉緑体におけるRNAiあるいはレプレッサー系の作動確認:psaA遺伝子発現の光制御は「抑制」に働くため、RNAiあるいは大腸菌lacオペロンのレプレッサー系を活用し、光により目的遺伝子の発現を正に制御する。上記レポーター遺伝子を用い、これらのタンパク質コード領域の一部に対するアンチセンスをpsaAプロモーター(PpsaA)の制御下に置く。これらのコンストラクトの作製を試みた。作動確認は、これらコンストラクトをパーティクルガンで植物葉に打ち込み、LED照射によるレポーター遺伝子発現を評価する。このためのアッセイ系を開発した。加えて、「乾燥スイッチ」も開発も試みる。1700-nm光制御遺伝子プロモーターPpsaA (PS I反応中心タンパク質遺伝子プロモーター)の作動評価:葉緑体における遺伝子発現モニター系を開発する目的で、CBRluc (赤色発光)とCBG68luc (緑色発光)のそれぞれの酵素タンパク質コード領域を700-nm光非制御遺伝子プロモーターPpsbA (PS II反応中心タンパク質遺伝子プロモーター)の制御下に置いた。これらの遺伝子DNAには、大腸菌中で高頻度に欠失が生じたため、経代を最小限に留めると共に低温で培養した。PpsaAの発現の700-nm光制御は「抑制」に働くため、CBG68lucのアンチセンスDNAをPpsaAの制御下に置くコンストラクトを完全化学合成した。これらのコンストラクトをパーティクルガンで植物葉に打ち込み、700-nm光照射による遺伝子発現を評価した。2「光スイッチ」の機構解明:光化学系レドックス制御に影響を与えると考えられる各種機能タンパク質に注目し、これらのシロイヌナズナ遺伝子破壊あるいは突然変異系統を実験に供した。阻害剤処理や700-nm光照射によりプラストキノン(PQ)の酸化還元電位を変化させた際のpsaA転写産物を定量することにより、制御機構の一端を解明した。3「乾燥スイッチ」の開発:植物にとって乾燥ストレスは、水を吸収できないという観点において塩ストレスと類似する。シロイヌナズナを用い網羅的アクティベーション・タギング遺伝子探索を実施し、複数種の新規耐塩性遺伝子を見いだした。これらの知見を「乾燥スイッチ」に応用する。農学1葉緑体一過性発現によるPSI反応中心タンパク質遺伝子(psaA)発現光制御の評価:光波長依存psaA転写抑制は、PSIおよびPSIIの活性において、差スペクトルが顕著な440450 nmおよび690710 nmに効果が期待される。この光制御機構は、PSIIからPSIへの励起電子輸送を仲介するプラストキノン(PQ)のレドックス状態を反映する。710 nm域の波長は、植物の光合成を介さない光受容体であるフィトクロム系の感知域である。遺伝子発現制御がPQレドックス系かフィトクロム系かを区別するために、PQを酸化あるいは還元状態にする阻害剤の効果を検討した。一方、レポーター遺伝子CBRlucあるいはCBG68lucは、まず光波長非依存psbAプロモーター(PpsbA)の制御下に置くことになるが(PpsbA-CBRlucあるいはPpsbA-CBG68luc)、これらのコンストラクトの大腸菌を用いた作製は困難を極めている。これらレポーター遺伝子はPpsbA制御下で大腸菌でも発現するため、これが大腸菌の生育を阻害していると考えられる。

2葉緑体におけるRNAiあるいはレプレッサー系の作動確認:PpsbA-CBRlucあるいはPpsbA-CBG68lucの作製に先立ち、パーティクルガンにより植物細胞葉緑体に導入されたレポーター遺伝子の一過性発現を試みた。これらレポーター遺伝子を大腸菌lacプロモーター(Plac)の制御下に置いたコンストラクトは葉緑体でも発現し得る。これらコンストラクトは作製できたため、これらにより一過性発現を行い、IVISLumina (Caliper LifeSciences製)により発光の観察に成功した。1葉緑体形質転換による「光スイッチ」系の評価:本研究代表者の研究室において葉緑体形質転換系を樹立したタバコ品種Xanthi (Plant Physiol., 2008)を研究対象とし、つぎにレタスへと研究を進展する。タバコ葉緑体形質転換コンストラクトは、pLD200-mALS [rbcL-Prrn-aadA-TpsbA-PpsbA-mALS-TpsbA-accD (rbcLとaccDは葉緑体ゲノムと相同組換えを起こすタバコ葉緑体DNAの配列;他は不必要な相同組換えを防ぐためにシロイヌナズナに由来する配列;P,プロモーター;T,ターミネーター;rrn,rDNA;aadA,スペクチノマイシン耐性遺伝子)]を改変し、rbcL-Prrn-aadA-TpsbA-rbcL-一過性発現用コンストラクト-PpsbA-mALS-TpsbA-accDを作製する。この際、複数のTpsbA配列がそれぞれ相同組換えを起こさないように、その働きを阻害しない塩基置換を入れる。このコンストラクトを用いたタバコ葉緑体形質転換系統に約700 nm LEDを照射し、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、「光スイッチ」系の有効性を確認する。2タンパク質性医薬品の生産への適用:食べる医薬品として、スギ花粉抗原Cryj1を取り上げ、これを葉緑体で発現させる。約700 nm LED照射した際のCryj1の合成量を抗体により評価する。花粉症マウスにCryj1発現レタスを経口摂取し、花粉症改善効果を実証する。具体的には、スギ花粉由来Cryj1によりマウスを感作した後に、Cryj1を経鼻的に投与し、静粛な実験室内で一定時間内におけるくしゃみおよび鼻掻き行動の回数を測定するとともに、血清中のCryj1特異的IgE量およびヒスタミン量をELISAにより検討する。レポーター遺伝子CBRlucあるいはCBG68lucは、まず光波長非依存psbAプロモーター(PpsbA)の制御下に置くことになるが(PpsbA-CBRlucあるいはPpsbA-CBG68luc)、これらのコンストラクトの大腸菌を用いた作製は困難を極めている。これらレポーター遺伝子はPpsbA制御下で大腸菌でも発現するため、これが大腸菌の生育を阻害していると考えられる。このため、コンストラクト作製の一部を次年度に持ち越すこととなった。それに伴って、パーティクルガンによる一過性発現アッセイ系に必要な試薬等の支出も次年度に増大が見込まれた。
アジアにおける高齢者の世代間関係と世代間移転に関する国際比較研究

一般に、日本を含めたアジア諸国での高い同居率は、同居子が高齢の両親に対して十分な支援を提供している証拠であるとみなされやすいが、同居はより複雑な意味をもった現象である。たしかに高齢者が子どもと一緒に住むことは、さまざまな場面で世代間の関係を生じさせる可能性をもつが、同居それ自体は子どもから両親に資源やサービスが移転されていることを必ずしも意味しない。同居・別居にかかわらず、資源の世代間移転という面でみれば、高齢者は一方的に家族員から援助やサービスを受けるだけではなく、反対にそれらを家族員に対して提供している。今回の台湾やマレーシアの調査結果にみられるように、子どもが成人である場合でも、高齢者はしばしば孫の世話や家事の分担のようなかたちで子ども世代に貢献している。日本における調査結果でも、同居既婚子や同居未婚子に対して、実際に高齢者は多くの支援を提供している。高齢者と家族・親族との関係でみれば、本人および配偶者の兄弟姉妹との間では、交流の頻度や資源の移転という面で互いに同じ頻度や程度で移転が行われるという傾向がみられた。これに対し、高齢者の上の世代である老親、さらには下の世代である子どもや孫に対しては高齢者の方がより多くの頻度や程度で支援を提供しているという非対称的な傾向が浮かび上がった。こうした意味で、家族・親族に対する高齢者の貢献のあり方を理解することは、社会経済的な変動という文脈の中で高齢者の役割を再評価する上でも重要であると思われる。本研究では、アジア5ヵ国(日本・台湾・シンガポール・マレーシア・ベトナム)の高齢者を対象として、その世代間関係と世代間移転の実態、その規定要因、そしてそれら世代間関係と援助のあり方が「生活の質」に及ぼす影響を明らかにすることを目的としている。そこで、本年度の前半では、台湾での調査実施を目的として研究会を重ねながら調査の準備を進めていった。併せて6月に台湾に出張し、現地の研究協力者と打ち合わせを行い、調査の協力体制を確立した。作成した調査票をもとに、10月後半から12月にかけて台湾の高雄市で調査を実施した。また、比較のために同一の調査票を用いて日本でも調査を実施することを企画し、2006年2月に埼玉県狭山市で60歳以上の高齢者を対象として調査を実施した。さらにこの2カ国での高齢者調査と並行して、以前から継続中の「祖父母と孫関係に関する国際比較研究」の一環として、祖父母、孫、その両親を対象としたインタビュー調査を実施し、その成果を2005年8月にシンガポール国立大学で開催されたワークショップで報告している。2006年2月には、シンガポール国立大学の研究者2名(Dr.Leng Leng Thang and Dr.Kalyani Mehta)を日本に招き、研究成果の検討と今後の研究計画の打ち合わせを行った。台湾および日本における高齢者の世代間関係に関する調査結果は、現在、集計と分析の作業を進めつつあり、2006年度前半の早い時期に報告書として刊行することを予定している。また、祖父母・孫関係に関する国際比較研究についても、シンガポール・香港・タイ・マレーシアの研究者と研究成果をもちより、世代間関係の専門雑誌の特集号として刊行することを計画している。本研究は東・東南アジア地域の高齢者を対象として、その世代間関係と世代間移転の実態、その規定要因、そしてそれら世代間関係と世代間での財の移転や援助のあり方が高齢者の「生活の質」に及ぼす影響を明らかにすることを目的としている。今年度(平成18年度)は、まず昨年度末に実施した日本における高齢者の世代間関係の調査データの集計・分析を行った。併せて、昨年度に実施した台湾調査のデータとの比較検討も進めていった。さらには、比較対象となるマレーシアでの調査準備を進めるために、平成18年8月にマレーシアに出張し、現地の研究協力者との打ち合わせを行った。これを踏まえて、同年の11月から12月にかけてマレーシアで日本・台湾とほぼ同一内容の調査票を用いて高齢者を対象とした調査を実施した。

こうして、日本・台湾・マレーシアの3ヵ国の調査が完了し、3ヵ国のデータを手元に揃えることができたので、本年の3月に早稲田大学国際会議場で開催した「東・東南アジアにおける世代間交流ワークショップ」に台湾・マレーシア・ベトナムの研究者を招聘し、研究成果の比較検討を行った。現在、3ヵ国の調査データの集計と分析の作業を鋭意継続中であり、平成19年度の前半の早い時期に報告書として成果を刊行することを予定している。
コヒーレント収束電子回折による結晶構造因子の位相決定法の開発

イメージングプレート用カメラを試作し、そのテストを行った。動作は良好である。イメージングプレートはフィルムに比べて高感度なので露出時間が短くて済み、電気的、機械的ドリフトの影響を小さくすることができた。またコンピューターにディジタル画像として回折図形をとりこむことができるので、画像処理が容易に行えるようになり、必要な情報を有効に取り出すことができるようになった。コヒーレントビームによる予備的干渉実験を行った。鏡映面、映進面の対称性を干渉縞として検出することに成功した。すなわち、鏡映面のないSr_2Nb_2O_7では干渉縞は非対称に現れ、鏡映面のあるSr_2Ta_2O_7では干渉縞が対称に現れることを確認した。映進面のあるFeS_2では運動学的に消滅する反射内に反位相ずれた縞を観察することに成功した。どのくらい小さな面間隔からの干渉縞を得ることができるかが今度の応用のために大きな課題である。われわれは現在、世界最高の2.7A干渉縞の観察に成功した。また1次元的な干渉縞ばかりでなく2次元的な干渉縞を得ることにも成功した。さらに、回折の動力学的理論に基づくシュミレーションによって干渉縞の再現と動力学的効果の検出に成功した。これらの成果は1)Journal Electron Microscopyと2)Ultramicroscopyに投稿した。1994年7月パリで開催される国際電子顕微鏡学会で成果を報告するため講演を申し込んだ。日本電子顕微鏡学会誌から"コヒーレント収束電子回折法"の執筆を依頼された。動作は良好である。
義務教育過程に学ぶ外国人児童生徒の日本語獲得過程の調査

奨励研究(A)は1年間の補助金であり,私がこの期間内に達成できたことは外国人児童生徒の定期的な観察である。すなわち,浜松市と静岡市に在住の小・中学校に通う外国人児童生徒を長期的にまた短期的に調査観察することができた。浜松市の場合,私がおおよそ1週間に1度小学校に出向き,彼らの日本語能力の発達を縦断的に調査した。静岡市の場合もほぼ同様で,1週間に1度,小学校に赴きデータ収集を行なうことができた。言語能力調査方法は2つに分類される。一つは絵カードなどを使い,インタビュー形式での発話テストである。各人1回60分程度を考えている。これを毎回テープ録音し分析する。もう一つはペーパーテストに基づくテストである。調査の内容は第2言語としての日本語の初期発達段階である。格助詞並びに語連鎖の獲得に最も焦点を絞っている。調査結果により,興味深い発見も多々見つかってはいるが,観察は現在もなお引き続いて行なわれているため,データ分析や論文の形にまとめるには,もう少し時間が必要である。今後の予定として,データ分析を1995年の夏休み前までに終了し,秋には各種学会や紀要等に研究結果を発表して行きたいと考えている。
依存性薬物による脳白質・髄鞘の機能的変化とその機序の解明

本年度では、ラット海馬の薄切標本を用いて海馬白板から複合活動電位の記録を行い、依存性薬物の急性投与による軸索興奮性の変化および活動電位同調作用の変化の可能性について検討した。複合活動電位の振幅の変化を測定し、薬物効果の指標とした。電位依存性ナトリウムチャネルに対する阻害作用をもつコカインについては、使用濃度ではホールセル記録を用いての電流注入による発火頻度に影響を与えないことを確認した。薬物投与後35-40分での変化を調べたところ、コカインでは98.7 ±2.4% (n = 7)と変化は認めなかったのに対し、メタンフェタミンでは108.9 ±5.7% (n = 6)、ニコチンでは107.7 ±3.2% (n = 10)と振幅が増大していた。さらにニコチンによる効果の機序について検討した。ニコチンによりオリゴデンドロサイトが脱分極すること、オリゴデンドロサイトの脱分極は複合活動電位の振幅を大きくすること、ニコチンにより海馬白板領域に軸索を伸ばしている介在ニューロンが持続的に発火し同領域でGABAを放出すること、オリゴデンドロサイトはGABA受容体活性化により脱分極すること、が知られているため、GABA受容体阻害薬存在下でニコチンを投与した。しかし、109.6 ±5.8% (n = 4)とニコチンによる増大効果は阻害されなかったことから、GABAを介した効果ではないことがわかった。また、昨年度行った海馬白板でのθバースト電気刺激により同部に位置するオリゴデンドロサイトで脱分極性の変化について例数を重ね、コカイン、メタンフェタミン、ニコチンのすべてで脱分極性反応が抑制されることの再現性を確認した。研究期間では、主に以下の事項について、依存性薬物の急性効果と慢性効果をそれぞれ検討していく。1.オリゴデンドロサイトでの変化の検討2.活動電位の軸索伝導に対する依存性薬物の急性効果3.活動電位同調作用の変化の検討これまで急性効果についての検討を行った。1について、研究計画で挙げているすべての薬物(コカイン、メタンフェタミン、ニコチン)についてデータを取得した。膜電位の変化が薬物によって異なっていること、神経活動への反応に対する効果はすべての薬物で共通していることがわかった。2および3ついても、3つの薬物すべてについて急性投与による検討を行い、結果を得ている。2、3の検討からは、薬物によって効果が異なっており、しかも軸索伝導の変化・同調作用の変化それぞれで異なり方も違っているという知見を得ている。データ取得・解析とも問題なく行うことができており、研究進捗状況としては、順調に進んでいると考える。急性効果の検討では、ほぼすべての項目についてデータが取得できているが、活動電位の軸索伝導に対する薬物の急性効果では軸索の部位によって各薬物の効果が大きく異なっているため、引き続き、さまざまな潜時(部位の違いを反映)の活動電位を記録し、軸索部位と修飾効果の大きさとの関係を検討する。また、活動電位同調作用(複合活動電位の記録による検討)に対する効果についても、それぞれ例数が10以上になるまでデータ数を増やし、さらに複合活動電位の幅や面積の変化も解析に加え、薬物の効果が真に同調作用の変化なのか、軸索興奮性に変化はないのかを調べる。ニコチンについては、喫煙者の血中濃度を模した濃度での検討と、薬理学的な検討も追加する。これらにより、得られた結果を確固たるものにする。さらに、各薬物の慢性投与による効果、特に薬物によるオリゴデンドロサイトでの電気的性質の変化、オリゴデンドロサイトが髄鞘を形成している軸索への電気刺激による脱分極性反応の変化、および軸索形成突起の長さを中心とした形態変化についても検討していく。本年度では、ラットおよびマウス脳の薄切片(スライス標本)を用い、依存性薬物の急性効果を検討した。ラット海馬スライス標本において、ニコチン(10 microM)を灌流投与してニコチン性アセチルコリン受容体の活性化による伝導速度変化について検討したところ、活動電位の潜時はニコチン投与前の約92%に短縮していた。細胞体での興奮性の変化を相殺する方法によって算出しているため、この結果から、ニコチンによって活動電位の伝導速度が促進されることがわかった。また、灌流投与ではオリゴデンドロサイトが約4 mV脱分極したが、微量局所投与では膜電位の変化がみられなかった。記録したオリゴデンドロサイトが存在する領域(海馬白板)では、脱感作しないタイプのニコチン受容体を発現する介在ニューロンの軸索が分布している。このため、ニコチンによって介在ニューロンが持続的に発火し、それに伴う細胞外K+濃度の増加に反応してオリゴデンドロサイトが脱分極している可能性が考えられた。また、マウス海馬スライス標本において、メタンフェタミン(0.1 mM)の灌流投与による軸索伝導への効果について検討したところ、平均では投与前の103.7 ±2.0% (n = 24)と有意な変化はみられなかった。しかし、短い潜時(1.75ミリ秒未満)の場合はメタンフェタミンによって延長(109.8 ±1.8%, n = 14)し、長い潜時(1.75ミリ秒以上)の場合は短縮する(95.2 ±1.9%, n = 10)傾向がみられたため、軸索の部位によってメタンフェタミンの効果が異なっている可能性が示唆された。