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地域社会におけるNPOのアドボカシー-事業化をめぐって-

本研究の目的は日本の市民社会の強化のため、NPOのアドボカシーを検証することである。地域社会でNPOの公共政策形成に果たす役割が大きくなるなか、「社会的企業」や「コミュニティビジネス」といった言説に代表されるNPOの事業化が進行していた。NPOはこうしたマネジメントの変化に対応した新たな組織戦略が必要となっている。研究成果は、各種学会等で報告すると共に、論文として公表した。併せてNPOからコンサルティングを請け負い、現場へのフィードバックに努めている。「NPOのアドボカシー」をテーマとした本研究では、他の外部資金も充当しつつ、いくつかのNPOに関する予備調査、本調査を実施した。研究代表者の仮説の通り、総体として当該NPOにおいて「事業パートナー」としての行政機関のプレゼンスが拡大し、「事業化」が進行していた。また、こうした事業化にも大きな影響を及ぼす、外部・内部環境の変化が顕在化し始めていたことから、本研究はその把握に務めた。具体的には2008年の「政権交代」にルーツを持つ、障害者自立支援法の大幅な見直し、行政機関による公開の「事業仕分け」、等は、地方自治体、中央省庁におけるNPO政策、福祉政策に一定の影響を及ぼした。結果的に、組織の再編、ステークホルダーとの関係の見直し等、NPOの活動にも影響を与え始めている。NPOはこれまで、「当局」(アドボカシーの対象相手)の「政策の連続性」を前提として事業およびアドボカシーを実施してきた。しかし、今日、日本のNPOは「連続性」を前提としない環境において、事業を実施し、他方でコミュニティにおけるアドボカシーを行う必要がある。そのテーマを追求するため、歴史的アプローチで検証すると共に、政権交代が常態化している韓国の研究機関とアドボカシーに関連する共同研究を行い、研究代表者が現地で招待講演を行うなど、一定の研究の進化がみられた。「NPO」のアドボカシーをテーマとした本研究では、他の外部資金も充当しつつ、沖縄県および韓国における市民社会組織(NPO)、とりわけ社会的企業を手がかりりとして本調査を実施した。前年度の研究で従来のNPO活動の前提であった「政策の連続性」が流動化していることを踏まえ、ケーススタディは上述の組織を対象とした。沖縄県では、2010年より県によるソーシャル・ビジネス支援が開始された。それに伴い、県より選定されたNPOに資源が投入され、事業化を成功させながら、その資源を活用したアドボカシーの展開が期待されている。先駆的ともいえるこれらケースについて、参与観察を実施した。調査の結果、事業化の成功と失敗が団体によって両極化しており、そのことがアドボカシーに影響していることが明らかとなった。また、韓国では政権交代に伴い、社会的企業政策のドラスティックな変更があり、そのことが当該組織の事業、アドボカシーに大きな影響を与えていた。政府からの資源投入の大幅な削減に伴い、事業戦略、アドボカシーの見直しを余儀なくされていた。今後は政策の流動化に振り回されないコミュニティにおける社会的課題の可視化が求められていることが明らかとなり、その知見の整理、分析を行った。NP0のアドボカシーをテーマとする本研究では、他の外部資金を充当しつつ、前年度の調査の課題として残った(1)沖縄県といった、いわゆる条件不利地域の市民団体の本調査(2)韓国の市民団体の本調査を行うと共に、最終的なとりまとめを行った。(1)では、沖縄県では2010年度よりソーシャル・ビジネス支援が開始され、市民団体に資源が投入されたものの、本格的な事業化には様々なハードルが横たわっていた。他方で、一部の市民団体は事業化によって獲得した資源を活用して、アドボカシーをさらに展開する事例もみられた。本研究では、アドボカシーを強化する事業化の要素を抽出し、とりまとめを行った。(2)では、韓国では2007年「社会的企業育成法」が施行され、市民団体の急速な事業化が進行したものの、保守政権下でドラスティックな政策変更が実施され、市民団体の存立基盤に大きな影響を与えた。こうした逆風下ともいえるなかで、市民団体がいかなる事業展開を行い、アドボカシーを強化するかの要素を抽出した。日韓の市民団体で外部環境は異なるものの、組織の事業環境や政治環境では共通する点も少なくなく、それらを整理し、とりまとめを行う過程で学会発表や論文発表を行った。2012年3月、共著『危機の時代の市民活動-日韓「社会的企業」最前線-』(東方社)を刊行することができた。また研究成果の社会的還元として、日本のNPOのコンサルティングを受託する等の成果を挙げている。
ナノ積層DLC被膜によるフリクションフリー表面の生成

DLC内の(sp2結合量)/(sp3結合量)の比率が水素含有量で制御できることを利用して,ナノ積層膜を生成し,これによって摩擦係数が10-4オーダーのフリクションフリーシステムを構築することを目的として研究を行った.イオン化蒸着法で成膜し,sp2結合がリッチなPLC膜およびsp3結合がリッチなDLC膜をそれぞれ7.7nmおよび7.0nmの厚さで30層ずつ交互に成膜した.摩擦試験の結果,摩擦係数が10-4レベルの摩擦フェイドアウト(Friction Fade Out, FFO)を得ることができた。研究概要本研究は,DLC内の(sp2結合量)/(sp3結合量)の比率が水素含有量で制御できることを利用して,ナノ積層膜を生成し,これによって摩擦係数が10-4オーダーのフリクションフリーシステムを構築することを目的として研究を行った.イオン化蒸着法で成膜し,sp2結合がリッチなPLC膜およびsp3結合がリッチなDLC膜をそれぞれ7.7nmおよび7.0nmの厚さで30層ずつ交互に成膜した.摩擦試験の結果,摩擦係数が10-4レベルの摩擦フェイドアウト(Friction Fade Out, FFO)を得ることができた。また,摩擦計測の結果からナノ積層膜摩擦に伴ってスパイク状の摩擦信号(摩擦係数0.15程度)が観察され,このときにナノPLC膜の摩耗が進展していると考える.スパイク1回あたりの摩耗深さは0.1nm0.5nmに相当することを明らかにした。ナノDLC層が表面に現れると,摩擦係数が0.01程度に増加し,摩耗率も増加することが明らかになった.また、表面分析の結果から,結合の割合が高いナノPLC膜は(4.2.5項参照)ポリマーに近い平面的な構造を有しており,この構造がなじみ過程におけるせん断及びZrO2の触媒作用による活性水素の付加によって,さらに層状な表面分子構造を形成していると考えられる.以上の結果を,単層PLC被膜の摩擦試験と比較してみると,単層に比べて耐久性が圧倒的に増加することが明らかになった.トライボロジー
骨髄由来多能性組織幹細胞の作成と同幹細胞を用いた心不全疾患治療の基盤技術の開発

中枢神経系を含む生体各組織には、組織の再生をつかさどる組織幹細胞が存在することが知られるようになった。従来組織幹細胞は、その由来組織へと分化する能力を有する細胞と理解されてきた。しかし、近年の報告では、由来組織の枠を超えて様々な組織へと分化する能力である可塑性を有することが明らかとなった。造血組織である骨髄よりは、ES細胞に匹敵する多能性を持つMAPC(multipotent adult stem cell)が同定され、基礎的、臨床的見地より注目を集めている。しかし、その分離、同定には困難を伴い、基礎的検討、臨床的応用を視野に入れた場合、効率性、再現性、安定性、容易性を担保とした樹立方法の確立が切望されている。我々は、種々組織幹細胞同定に共通して用いられるsphere培養法に、従来の造血組織由来幹細胞樹立方法を組み合わせることにより、簡便に骨髄由来多能性幹細胞の樹立に成功した。このsphere培養の確立には数週間の時間を要するが、再現性をもってsphereの確立を確認した。このsphere細胞を分化させると、従来の間葉系幹細胞に相当した分化能力(骨細胞、脂肪細胞)を有する。興味あることに、この幹細胞は、従来の骨髄由来組織幹細胞では困難とされてきた心筋細胞や神経細胞への分化を含む、多くの組織細胞へと効率よく分化し得た。心筋障害を惹起したマウスへの同細胞の移植においても、心機能の改善を誘導した。骨髄には、造血組織を再構成する能力を有する造血幹細胞に加えて、軟骨、腱、脂肪等の組織に分化し得る間葉系幹細胞が存在することが知られている。さらに近年、より多くの分化能を有するMAPCと呼称される幹細胞が同定され、心筋、骨格筋等への分化能に基づく再生医学、再生医療への展開が期待されている。しかし、同細胞の同定、増幅、維持には困難を伴い、再生医学、再生医療に用いる標準化された幹細胞としての位置付けには、解決すべき問題が多い。我々はこの問題を解決するため、種々組織幹細胞の同定、増幅、維持に使用されるsphere法を用いて、骨髄組織よりMAPCに相当する細胞群の同定を試み、特に心筋分化について検討を加えた。骨髄細胞より接着培養法、sphere培養法を組み合わせることにより、増幅、維持できる細胞群を得た。この細胞群の分可能を検討したところ、間葉系幹細胞の有する分化能に加えて、心筋細胞へと分化する能力を有することが明らかとなった。心筋細胞への分化は、免疫組織学的検索、電気生理学的検索を用いて確認した。また、マウスへの心臓への移植においても、心筋細胞への分化を、免疫組織学的方法を用いて確認した。また、ES細胞移植時に認める奇形種の発症等の危険性についても検討したが、奇形種の発症は、長期観察においても確認できなかった。今後、この細胞群のクローナルな解析を行うことにより、sphere法を用いて同定される骨髄由来多能性幹細胞について、解析を進めていく予定である。
経済学的アプローチによる「持続可能な消費」の分析

既存のモデルである廃棄物産業連関(WIO)モデルと経済学的な消費者モデルを統合し,消費に起因して排出される環境負荷計測のための新しい分析モデルを開発した。それを用いて,典型的な「持続可能な消費」シナリオについて,現状消費パターンからの増減を測定した。仮想的シナリオ消費パターン(交通手段のシフト,内食・中食・外食の割合変更)の方が,現状の消費パターンより,消費・廃棄行動に起因して直接・間接に排出される環境負荷が少ないことを示し,それらが実際により低環境負荷の消費パターンであるとの結論を得た。現状の生活水準を維持しつつ,消費生活に起因する環境負荷排出のより少ない消費パターンを探る研究分野は「持続可能な消費」(sustainable consumption)と呼ばれる。この分野の既存研究には工学的な分析モデルを用いた分析が多い。一方,経済学には消費者行動に関する多くの研究蓄積があるため,「持続可能な消費」に関して,経済学が果たすべき役割は大きい。この問題意識から,「持続可能な消費」について,経済モデルを明示的に用いた分析を行い,複数の代替的な消費パターンの環境評価を行った。分析に用いるモデルは,2つのサブモデルから構成される。1つ目のサブモデルは廃棄物産業連関モデル(WIOモデル)であり,もう一方は経済学的な消費者モデルである。WIOモデルは,伝統的な産業連関モデルを生産及び消費に付随する廃棄物処理にまで拡張した分析モデルである。WIOモデルにより,動脈・静脈部門の間の財と廃棄物の循環を定量的に把握することができるため,消費財の生産とそれに付随する廃棄物管理で排出される環境負荷を計測することができる。後者の経済学的な消費者モデルでは,財と時間の組み合わせで表現される「消費技術」について,時間制約と所得制約の下での効用最大化行動を仮定する。消費パターンの変更は,財価格や所得の変化を通して生産に影響を与え,その結果,社会全体の環境負荷にも影響するが,このような消費行動の変化の社会全体への影響は,消費者モデルとWIOモデルのフィードバック過程で表現される。この消費者モデルとWIOモデルを統合した分析モデルを用いることにより,典型的な「持続可能な消費」シナリオについて,消費者による消費・廃棄行動に起因して直接・間接に排出される環境負荷の現状消費パターンからの増減を測定した。分析に用いるモデルは, 2つのサブモデルから構成される。

後者の経済学的な消費者モデルでは,財と時間の組み合わせで表現される「消費技術」について,時間制約と所得制約の下での効用最大化行動を仮定する。消費パターンの変更は,財価格や所得の変化を通して生産に影響を与え,その結果,社会全体の環境負荷にも影響するが,このような消費行動の変化の社会全体への影響は,消費者モデルとWIOモデルのフィードバック過程で表現される。この消費者モデルとWIOモデルを統合した分析モデルを用いることにより,典型的な「持続可能な消費」シナリオについて,消費者による消費・廃棄行動に起因して直接・間接に排出される環境負荷の現状消費パターンからの増減を測定した。
流下中の土砂を含む雪崩を対象とした内部構造の観測と運動メカニズムの把握

本研究では,土砂を含む雪崩の流動過程を物理的かつ定量的に把握することが可能な観測技術の確立を目指す。流下中の雪崩を観測時に撮影した動画像から画像解析によって3次元的に復元させつつ,雪崩内部で土砂がどの位置に分布しているかを最新の非破壊検査技術によって追跡することで,土砂を含む雪崩のダイナミクスについて力学的な視点からメカニズムの解明を進める。実験では,雪崩の形状を把握する際には高感度なビデオカメラや高速度カメラを使用し,雪崩の流下速度・密度変化を明確に把握する。加えて雪崩内部の時間的変化を,マイクロ波ドップラーセンサを用いて把握し,雪崩の流動過程を物理的に説明できるデータの観測を可能とする。
好熱菌ウイルス由来の有用酵素の開発

好熱菌などの特殊環境微生物を宿主とするウイルス(ファージ)の基礎や応用面での研究例は極めて少ない。特に応用面において潜在性の高い好熱菌ファージ由来の酵素の機能開発を進めるために、本研究では好熱・好アルカリ性ファージの分離とその機能解析を主な目的とした。前年度までに、高温、アルカリ条件下で発酵生産される天然の「スクモ藍」から60°C, pH 9の培養条件下で、単独コロニーを形成する好熱好アルカリ性菌Geobacillus toebiiOIT60-9-2株の分離に成功した。また本菌株を宿主とするファージφIN1を兵庫県・猪名川の土壌試料から得ることにも成功した。本年度は、このファージの生存に対する温度とpHなどの影響を解析した。その結果、本ファージは55°Cまでは約70%、60°Cでは40%の感染性を示し、好熱性ファージであることが判明した。またpH 59の広い範囲で残存感染率を示した。これらの結果からファージφIN1は好熱・好アルカリ性を示すが、宿主と共存する場合(培養温度60°C)と比較すると、耐熱性が少し低いことが分かった。次に、本ファージの透過型電子顕微鏡観察に成功し、本ファージが正十二面体構造をとる報告例は非常に少ない特徴的な形態をとることを明らかにした。以上の成果は日本農芸化学会2018年度大会(名古屋名城大学)で口頭発表を行った。さらに宿主のゲノム解析を進め、現在収集したDNAデータを解析中である。一方、前年度までに見いだした好熱菌G. kaostophilusを特異的に溶菌する酵素(バクテリオシン)について、その精製を各種クロマトグラフィーを用いて行い、部分精製酵素を得た。電気泳動的に分取した溶菌酵素タンパク質のN-末端アミノ酸配列の分析を行い、データベースでの相同性検索による遺伝子の同定を進めた。自然環境から分離した好熱好アルカリ性菌を宿主とする新規な好熱性ファージの分離に初めて成功し、そのファージの生育のための温度特性,pH特性を解析できた。また、電子顕微鏡写真による形状の分析にも成功したことから、本年度の研究により新規ウイルスの特徴が明確になったことから前年度に比較して大きな進展があったと言える。しかし、当初、本研究で分離した宿主菌のG.toebiiOIT60-9-2株と新規ファージΦIN1のゲノム解析を完了する予定であったが、宿主菌のDNAの調製に手間取り、年度末においてデータ収集が完了したところで遺伝子解析がまだ完了していない。一方、高温温泉水中からのファージ探索の過程で、分離した好熱菌が好熱菌G. kaostphilusを特異的に溶菌する現象を見出した。この溶菌現象を解析した結果、溶菌活性を示すのが増殖をするウイルスではなく、ある好熱菌が生産する溶菌酵素(バクテリオシン)であることを明らかにした。その分子レベルでの特徴を解明するために、好熱菌培養外液からの溶菌酵素の各種クロマトグラフィーによる高度精製を試みたが、既知の乳酸菌などの溶菌酵素と異なる新規酵素である可能性が高いために、精製が困難で予想以上に時間を費やすことなり、当初の研究計画よりやや遅れることになった。次年度は本科研費による研究実施の最終年度(4年目)であり、成果をまとめ、学術雑誌への論文発表や特許申請を行うことを計画している。まず、昨年度までに見出した宿主好熱菌とそのファージのゲノム解析を完了する。そのゲノム情報を基に、ウイルスの分類・同定を行う。また遺伝子の相同性検索から、ファージの酵素やタンパク質の遺伝子の同定を進める。その遺伝子の中から溶菌酵素やリガーゼなどの有用酵素遺伝子を大腸菌などを宿主としてクローニングし、遺伝子産物の生産性を高め、各種クロマトグラーフィーを利用して高度に精製する。精製したタンパク質の機能などの特徴を生化学的分析により解明するとともに,結晶化を進め、X線構造解析を行う。一方、好熱菌の溶菌酵素についても、遺伝子、分子レベルでの解析を進める。また溶菌活性を示す好熱菌の同定、溶菌酵素の遺伝子の塩基配列の解析、大腸菌による遺伝子のクローニングを行う。次に大腸菌での溶菌酵素の生産、精製を行い、その応用面への展開もはかるための生化学的特徴や構造の解析を行う予定である。本年度は実施初年度のため、高温環境からの新規好熱菌とそのウイルスの分離を行った。先ず新規な好熱菌のウイルスの分離のために、温泉、砂丘の植物の根などの砂や泥、河川の土壌などを多数収集し、宿主となる好熱菌をpH(酸性,中性,アルカリ性)と温度(5090°C)の異なる条件下でペプトンと酵母エキスを主栄養素とする2%寒天固形培地(径9 cmシャーレ)を用いて分離した。その結果、60°Cで生育できる好熱菌として、好酸性好熱菌1株を分離し、16S-rDNAの塩基配列の相同性検索からAllicyclobacillus属菌を、また中性域とアルカリ域からGeobacillus toebiiとG. thermolactisをそれぞれ分離・同定することに成功した。次に、これらの好熱菌を宿主として、ウイルスの分離を60°Cで軟寒天培地(0.4%寒天)を用いる二重寒天分離法や液体培養法を用い,好熱菌に対する溶菌活性を溶菌斑(プラーク)の形成を指標に広く探索した。その結果、好アルカリ性好熱菌において、プラークが生じ、ウイルスの分離に成功した。

このウイルスの生存に対するpHや温度の影響を調べたところ、pH 5から9までの条件下でプラークが観察された。さらにpH 8で50ー90°Cで1時間処理後でも生存することが確認でき,新規ウイルスの分離に成功した。一方、ある温泉から採取した水を、増殖した好熱菌のG. kaostophilusに添加し、ウイルスの分離を試みたところ、非常に明瞭な溶菌斑が出現した。しかし溶菌個所から爪楊枝で試料をとり、再度好熱菌に添加したが溶菌斑が現れなかった。これは、溶菌がウイルスの増殖によるのではなく、他好熱菌からの抗菌物質(耐熱性バクテリオシン)によるものと考えられるので、今後さらに生化学的特徴を解明する予定である。自然環境からの分離した好熱菌を宿主とする新規な好熱性ウイルスの分離を試み、酸性、中性、アリカリ性領域で生育できる好熱菌の生菌の分離に成功したが、それらを宿主とするウイルスの分離は、原因は不明であるが容易でなかった。好熱好アルカリ菌にウイルスを初めて見出すことに成功し、ウイルスの生育のために温度特性,pH特性を解析できたが、それらのデータの再現性をえるのが簡単でなく、時間を労することになった。また、ウイルス分離実験において、ある温泉水が好熱菌G. kaostphilusを明確に溶菌する現象を見出した。これは、新規好熱性ウイルスの分離に成功したものと考え、その溶菌が認められたプラークから、爪楊枝を用い好熱菌G. kaostphilusに塗布したところ、溶菌が認められなくなった。これは、溶菌活性を示すのが増殖をするウイルスではなく、好熱菌が生産する溶菌酵素(バクテリオシン)であることが判明したが、まったく予想外の結果であったので、その確認に時間をとり、当初計画の実験研究が遅れることになった。平成28年度は本研究の実施2年目である。平成27年度において、様々な高温環境における土壌から好熱菌の分離をpH 8.0、60°Cで行い、好アルカリ性好熱菌2株の分離に成功した。両者を16SrDNAの塩基配列の相同性から、Bacillus themolactis、及びGeobacillus toebiiと同定した。本年度は両者を指示菌(宿主)とする好熱菌ウイルス(ファージ)の分離を、温泉などの高温環境から得た土壌サンプル(約75種類)を用いて行った。その結果、B. themolactisではファージ感染による明確な溶菌班(プラーク)形成は得られなかったが、G. toebiiから明確なプラーク形成が認められ、好熱菌のファージを得ることに成功した。このファージφIN1の宿主感染性の特異性(感染域)を8種の異なる好熱菌を用いて調べた結果、特異的にG. toebiiにプラーク形成を認めた。またファージの耐熱性とpH安定性をG. toebiiへの感染性から調べたところ、60°Cまでは認められたが、70°Cでは消失した。また、pH 5から9までの広いpH条件下でプラークが観察された。さらにpH 8では50ー90°Cで1時間ファージを処理しても生存することが確認でき,φIN1が新規耐熱性ファージであることを見いだした。一方、前年度に見いだした好熱菌G. kaostophilusを特異的に溶菌する酵素(耐熱性バクテリオシン)素について、その精製を各種クロマトグラフィーを用いて検討し、電気泳動による分析から部分精製酵素を得ることに成功した。自然環境からの分離した好熱菌を宿主とする新規な好熱好アルカリ性
免疫応答系における遺伝子の発現とその調節の分子機構

多重に制御されている免疫応答の調節に大きな役割を果していると考えられているサイトカインのなかでも,インターロイキン2(IL-2)は体液性免疫応答,細胞性免疫応答の調節に重要な作用を行っているTリンパ球(T細胞)の増殖・分化の鍵を握っており,従ってその遺伝子情報発現の調節機構の分子レベルでの解明は免疫応答系を理解する上で必須の課題である.我々はまずIL-2とその受容体(IL-2R)遺伝子の転写開始上流領域の構造を明らかにし,次に両遺伝子が,活性化T細胞において特異的に発現される為に必要な転写制御領域を同定することに成功した.更に成人性T細胞白血病(ATL)の発症とIL-2システムの異常作動とに密接な関連があることから, HTLV-Iウィルスタンパクp40^×のIL-2システムに及ぼす作用を調べ, p40^×がIL-2及びIL-2R遺伝子の転写活性化を起こし, p40^×の発現とT細胞抗原受容体を介した活性化シグナルとが相乗的にIL-2遺伝子の転写活性化を引き起こすことを明らかにした.以上のことよりT細胞の悪性増殖化と脱制御されたIL-2システムの作動との密接な関連が考えられるが,このことはIL-2を細胞に産生化せしめるレトロウィルスを用いた,我々の以下の実験によりあらためて明確にされた.すなわち,この様なウィルスをIL-2依存性T細胞株に感染させるとオートクライン性細胞増殖をする細胞株が樹立できることが判り,さらにこれらの株は造腫瘍性を獲得していることが明らかとなったのである.以上の我々の研究成果を踏まえて,今後,同定した制御DNA配列と相互作用を持つ細胞由来の諸因子の探究をさらに進め,またin vivoにおけるIL-2のT細胞の増殖・分化におよぼす影響を解析する実験系の構築を進めて行きたい.多重に制御されている免疫応答の調節に大きな役割を果していると考えられているサイトカインのなかでも,インターロイキン2(IL-2)は体液性免疫応答,細胞性免疫応答の調節に重要な作用を行っているTリンパ球(T細胞)の増殖・分化の鍵を握っており,従ってその遺伝子情報発現の調節機構の分子レベルでの解明は免疫応答系を理解する上で必須の課題である.我々はまずIL-2とその受容体(IL-2R)遺伝子の転写開始上流領域の構造を明らかにし,次に両遺伝子が,活性化T細胞において特異的に発現される為に必要な転写制御領域を同定することに成功した.更に成人性T細胞白血病(ATL)の発症とIL-2システムの異常作動とに密接な関連があることから, HTLV-Iウィルスタンパクp40^×のIL-2システムに及ぼす作用を調べ, p40^×がIL-2及びIL-2R遺伝子の転写活性化を起こし, p40^×の発現とT細胞抗原受容体を介した活性化シグナルとが相乗的にIL-2遺伝子の転写活性化を引き起こすことを明らかにした.以上のことよりT細胞の悪性増殖化と脱制御されたIL-2システムの作動との密接な関連が考えられるが,このことはIL-2を細胞に産生化せしめるレトロウィルスを用いた,我々の以下の実験によりあらためて明確にされた.すなわち,この様なウィルスをIL-2依存性T細胞株に感染させるとオートクライン性細胞増殖をする細胞株が樹立できることが判り,さらにこれらの株は造腫瘍性を獲得していることが明らかとなったのである.以上の我々の研究成果を踏まえて,今後,同定した制御DNA配列と相互作用を持つ細胞由来の諸因子の探究をさらに進め,またin vivoにおけるIL-2のT細胞の増殖・分化におよぼす影響を解析する実験系の構築を進めて行きたい.免疫応答系においては調節された、遺伝子の情報発現が全体の統御に重要な役割を果している。従ってこのような遺伝情報発現の調節機構の分子レベルでの解明はひいては免疫応答系の調節機構の解明にもつながる重要課題であることを考え、この観点に立って研究を行って来た。まずリンフォカインのなかでも特に研究が進んでいるインターロイキン2(IL-2)システムをとりあげIL-2及びその受容体(IL-2R)遺伝子の転写開始上流領域の同定を行うと共にその構造を明らかにした。その結果IL-2R遺伝子には5ケ所の転写開始上流領域が存在することが明らかとなった。次にIL-2及びIL-2R遺伝子が、活性化T細胞において特異的に発現されるために必要な転写の制御領域を同定することにも成功した。更に、IL-2システムの異常作動が成人T細胞白血病(ATL)の発症に密接に関わっていることが知られていたので、実際この白血病の原因ウィルスであるHTLV-1とIL-2システムの関係について研究を行った。その結果、HTLV-1の産物であるp【40^x】がIL-2及びIL-2Rの遺伝子の転写を活性化させることが明らかとなった。更に、IL-2に関してはp【40^x】の発現とT細胞の抗原による活性化シグナルによって相乗的に遺伝子の転写活性化が起きることを見出した。これら一連の結果は、HTLV-1ウィルスの感染と抗原刺激のシグナルとが、脱制御されたIL-2オートクリンシステムの活性化につながり、T細胞の悪性増殖化に深く関っているものと考えられる。更に我々はIL-2の生体内機能をより詳細に解析する目的で、IL-2を生産するレトロウィルスを作製することにも成功した。今後従って様々な生体内及び生体外での感染実験を行い、IL-2の機能を更に調べて行くことが可能と考えられる。
個体別環境センシングが可能にするトマト難解析形質の分子遺伝学的研究

尻腐れ果や裂果などのトマト果実生理障害は、様々な環境要因が複雑に関与するため形質発現が不安定であり、典型的な難解析形質である。本研究では、申請者らが開発した「個体ごとの生育環境を記録する環境センシングシステム」を用いて、環境バイアスを高精度に把握・補正することで形質発現の不安定性問題を回避し、果実生理障害の分子遺伝学的解析を実現する。
ミクロ多孔性セラミックスの超微細加工とその分子機能の評価

1.報告者らは、膨潤性を示すユニ-クな合成雲母であるフッ素四ケイ素雲母の層間カチオンの一部が熱反応によってその交換性を失い、交換サイトであるシリケ-ト面上の六方酸素格子に不可逆的に化学結合する現象(層間カチオンの固着)を初めて見いだした。これにアルミニウムポリカチオン(Al_<13>)を用いて層間に架橋を施したのち加熱焼成すると、ミクロ化多孔性セラミックスが合成できる。固着を行わない多孔体は化学的に不活性であるが、ランタンなどのカチオン固着によりその酸触媒活性は数十倍へと飛躍的に向上する。今回、カチオンとして周期律表上の広範な元素を取り上げ検討した結果、(1)イオン半径が小さいカチオンほど固着が起きやすいため、大きな層電荷の減少が生じ架橋がされにくい。一方、半径が大きいほど固着が起きにくく大量のアルミニウム架橋剤が取り込まれる。交換サイトである六方酸素空隙のサイズ約1.2Åに近い半径を持つカチオン(例えばLa,Ca,Pbなど)において、適量のカチオンの固着と架橋剤の取り込みが同時に生じるため高活性を有する酸触媒となること、(2)アルミニウムポリカチオンの代わりに架橋剤としてシリカ-チタニアの混合カチオンゾルを用いた場合にも、やはり層間の固着に伴う顕著な酸触媒活性の増加が起こることがわかった。活性、比表面積、酸量のいずれもがカチオンの半径が、やはり約1.2Åのカチオン(例えばLa,Pb,Yなど)において大きな値を示す。なお、酸触媒能はメタノ-ルによるトルエンのアルキル化反応によって評価したが、その反応の進行追跡のための定量分析には設備備品であるガスクロマトグラフを使用した。2.ホスト粘土として最も良く知られたモンモリロナイトやフッ素四ケイ素雲母と同じ層電荷を持つが八面体シ-トにMgの欠損のないテニオライトでは、層間カチオンの固着現象は起こらない。ところが、非膨潤性のタルクにケイフッ化ナトリウムを反応させて合成したフッ素雲母においては、フッ素四ケイ素雲母におけると同様な固着が生じることを新たに見いだした。
末梢血好中球のアポトーシスに対する制御機構及び口腔感染症 粘膜疾患への関与

平成6年度、末梢血好中球のアポトーシスによる細胞死が、サイトカイン(IL-1β、IL-6、IL-8、G-CSF、TNF-α、IFN-γ)、白血球走化因子(FMLP、C5a)や細菌由来物質(LPS)によって修飾されることを報告した。以上の結果を踏まえて、平成7年度は、顎変形症の診断で外科的手術を施行した患者の術前、術後の末梢血好中球及び血清を用いて好中球のアポトーシスの動態について検討した。なお、対象とした患者は重篤な基礎疾患や樹後経過中に炎症性の合併症を併発しなかった者を選択した。患者の末梢血好中球は、術前の安静状態或いは術後の急性炎症状態に採取したものの、双方にアポトーシスによる細胞死の経時的な割合に変化はなかった。一方、術後に採取した血清は術前と比較して、好中球アポトーシスに対して促進的に作用した。また、血清中の可溶性Fas抗原は、術後に減少することがわかった。これらの結果から、今回の対象症例のごとく、明らかな細胞感染症を伴わない炎症状態では血清中の可溶性Fas抗原の減少によって血中に増加した不要な好中球がアポトーシスという現象で消去され、生体にとって合目的と考えられる。今度は、以上の研究成果をもとに難治性粘膜疾患(扁平苔癬、再発性アフタ)や難治性感染症などの患者由来の好中球や血清を用いて、好中球アポトーシスの動態を検討し疾病の発症や遷延との関係について検索を重ねたいと考えている。平成6年度は病期の違いによる好中球のアポトーシスについて検討した。対象は当科の入院患者とし、外科処置の術前、術後で末梢血好中球のIn Vitroにおけるアポトーシスの割合を経時的に観察した。なお、術前には全身及び局所的に炎症状態を呈していない症例を選択した。炎症程度の指標は末梢血白血球数及びCRPを用いた。また、アポトーシスの検出は光学顕微鏡による形態変化及びDNA断片化によった。その結果、好中球は急性炎症期で非炎症期と比較してアポトーシスの遅延がみられた。このことは、炎症状態で好中球が炎症状態で何らかの因子の作用によってアポトーシスから免れていることを示唆するものである。更に、非炎症期に採取、分離した好中球に炎症期の血清を添加しても同様の結果が得られた。そこで、作用因子として考えられる血清中の種々の因子、特にサイトカインの影響について検討した。結果は、G-CSF、INF-gamma、IL-1などのサイトカインは好中球の生存率を亢進した。更に、好中球の走化因子であるFMLP、C5a、更にはLPSも同様の傾向を示した。一方、TNF-alphaやIL-6は好中球の生存率の低下をもたらした。以上の結果から、末梢血好中球が炎症性サイトカインによって、その生存率が調整され得ることを明らかにした。今後は、ある種の炎症性サイトカインによって修飾されて生存率が増加した好中球の機能発現について明確にする予定である。平成6年度、末梢血好中球のアポトーシスによる細胞死が、サイトカイン(IL-1β、IL-6、IL-8、G-CSF、TNF-α、IFN-γ)白血球走化因子(FMLP、C5a)や細胞由来物質(LPS)によって修飾されることを報告した。なお、対象とした患者は重篤な基礎患者や樹後経過中に炎症性の合併症を併発しなかった者を選択した。

一方、術後に採取した血清は術前と比較して、好中球アポトーシスに対して促進的に作用した。また、血清中の可溶性Fas抗原は、術後に減少することがわかった。これらの結果から、今回の対象症例のごとく、明らかな細菌感染症を伴わない炎症状態では血清中の可溶性Fas抗原の減少によって血中に増加した不要な好中球がアポトーシスという現象で消去され、生体にとって合目的と考えられる。今後は、以上の研究成果をもとに難治性粘膜疾患(偏平苔癬、再発性アフタ)や難治性感染症などの患者由来の好中球や血清を用いて、好中球アポトーシスの動態を検討し疾病の発症や遷延との関係について検索を重ねたいと考えている。
予測情報の不確かさを克服する新たな予測制御論の確立とその応用

予測情報に含まれる不確かさを克服し,所望の制御性能を達成するH∞予見制御法の構成法を明らかにした.そして,予見情報を状態に含めた広義のシステムを定め,予測情報とそれに印加される分布的外乱を同時に扱うことにより,予測情報を適切に更新し制御性能を達成する制御則の構成法を導いた.制御系は輸送系に準じた予測情報の推定機構とそれに基づくフィードバック制御により構成される.つぎに,成果を電力システムの制御(系統安定化制御,負荷周波数制御),マニピュレータのアシスト制御(軌道生成と追従)に適用し,制御法の有用性を評価した.本研究の目的は,予測情報の不確かさを克服し,その更新情報を合理的に利用する予見制御法を確立し,また,それらの成果を1)自然エネルギーが大量に導入された系統制御,2)操作者のアシストと予測制御問題に展開し,有用性を明らかにすることである.本年度得られた成果は,以下のように纏められる.(A)予測情報の不確かさを克服する新たな予測制御論の確立(基本問題の解明):目標値・外乱の予測情報を扱うH∞制御問題を解き,広義のシステム表現から,可解条件と制御則の構成法を解析的に導いた.これらの結果は,複数の予測情報に対して,予見出力フィードバック則を明らかにしたものであり,本研究を展開する基礎的成果と位置づけられる.さらに,本結果を発展させ,不確かな予測情報を利用したH∞フィルタリング問題を解き,その予測情報から制御に有用な予見情報を抽出する方法を導いた.これらの結果は,H2ノルムを指標とした推定問題に展開でき,また,更新型予測情報に基づく新たな予測制御論に発展させることができる.(B)太陽光発電大量導入時の日射量予測と系統安定化制御(問題設定とシミュレーション):一機無限大母線に太陽光発電が導入された系統を定式化し,需給の予測情報と系統安定化制御の関係を考察した.そして,予測情報の援用により相差角変動が抑制され,有用な擾乱抑制法になることを確認した.また,負荷周波数制御問題を定め,需給変動の予測情報を効果的に利用した周波数制御が可能になることを確認した.(C)操作者のアシストと経路予測制御(実験環境の整備):力覚センサを導入し,2リンク系実験システムを構築した.今後,アシスト制御の経路計画と予見補償の関係を定め,シミュレーション評価と実験研究を展開する.本研究の目的は,不確かな予測情報とその更新情報を合理的に利用する予見制御法を開発し,成果を1)自然エネルギーが大量に導入された系統制御,2)操作者のアシストと予測制御問題に展開することである.本年度得られた成果は,以下のように纏められる.(A)予測情報の不確かさを克服する新たな予測制御論の確立(制御法の解明):H26年度に得た予見フィルタリング問題の解法を発展させて,不確かな予測情報を前提としたH∞予見制御則の構成法を明らかにした.設計手順では,無限次元系特有の近似計算が回避されており,集中定数系と同様の行列計算から制御則を構成することが可能である.(B)太陽光発電大量導入時の日射量予測と系統制御(運転条件と予測制御性能の検討):太陽光発電が大量に導入された系統の負荷周波数制御問題の定式化と予見制御の効果を検討した.太陽光発電が大量に導入された系統においては,日射量予測から需給変動を予測できると考えられている.H26年度に明らかにされたH∞,H2予見制御の基本的な結果から,需給変動の予見情報と負荷周波数の関係を検討し,予見制御補償により変動が効果的に抑制されることを確認した.(C)操作者のアシストと経路予測制御(予測制御則の適用と評価):H26年度に構成した実験システムに対して経路予測制御法とアシスト制御系の構成法を導いた.本制御システムでは,線形近似モデルを更新することにより制御法を適用する方法を採用しており,線形制御法を広く適用することが可能である.現時点では,LQ制御,モデル予測制御などの基本制御法による評価が完了した.予測不確かさを考慮した予見制御法が当初の計画通り解明され,本研究の基盤となる理論的結果がほぼ明らかにされている.応用的テーマ(B)太陽光発電大量導入時の日射量予測と系統制御においては,系統安定化・負荷周波数制御に予見制御法を適用する結果が得られ,不確かさを考慮した予見制御法(H27年度成果)を適用する基礎が整えられている.また,テーマ(C)においても,実験システムと提案法を適用するための設計モデルが検証され,基本的な制御法を適用した結果が得られている.本研究の目的は,不確かな予測情報とその更新情報を合理的に利用する予見制御法を開発し,理論的成果を1)自然エネルギーが大量導入された系統制御,2)操作者のアシストと予測制御問題に応用することである.本年度に得られた成果は以下のように纏められる.(A)予測情報の不確かさを克服する新たな予測制御論の確立(制御法の改善と評価):H∞予見制御則の構成法を改善し,可解条件の検証がより簡明な手順により行えることを明らかにした.H27年度に導いた結果では,可解条件の判定に時変系の状態遷移行列を繰り返し計算する必要があったが,本年度の考察により一旦状態遷移行列を計算すれば,可解条件の成否が判定できることが示された.また本結果は,予測情報の不確かさを仮定しない従来の結果を包含する手法になり,より一般的な情報構造を想定した予見制御問題を本手法により解くことができる.(B)

太陽光発電大量導入時の日射量予測と系統制御(不確かさを考慮した設計):太陽光発電の大量導入を想定した負荷周波数制御問題において,需給変動の不確かさを考慮した予見制御則の構成法を明らかにした.そして,昼間時間帯の負荷変動特性を仮定した場合に,その周波数特性を反映させた予見制御により良好な制御が達成されることを示した.(C)操作者のアシストと経路予測制御(予測制御則の適用):H26年度に構成した実験システムに基づき,積分型サーボ系とフィードフォワード補償による制御システムを構築し,追従制御の基本制御系を構成した.また,対応するH∞予見制御系のシミュレーションを行い,動特性の評価を行った.理論的課題(A)「情報の不確かさを克服する予測制御法」の開発に進展があり,より簡明な可解条件の判定法が導かれ,設計法が体系化された.しかしながらこれらの変更に伴い,実験課題(C)「操作者のアシストと経路予測制御(予測制御則の適用)」において制御法の実装が遅れ,現時点では提案法の評価がシミュレーション段階にとどまっている.本研究の目的は,不確かな予測情報とその更新情報を合理的に利用する予見制御法を開発し,成果を1)自然エネルギーが大量に導入された系統制御,2)操作者のアシストと予測制御に展開することである.本年度得られた成果は,以下のように纏められる.(A)予測情報の不確かさを克服する新たな予測制御論の確立(制御法の総括と発展):昨年度までに得た成果をまとめ,予測情報の更新を含む制御則が,輸送型無限次元の推定器を組み込むことなく実現できることを明らかにした.これにより,H2制御を含め予見制御問題を広く扱う成果が整った.さらにフィードフォワード型の予測機構を入れた場合の設計法,エージェント間の通信の遅れと予測に関する考察を進め,成果の発展の可能性を調べた.(B)太陽光発電大量導入時の日射量予測と系統制御(需給不確かさを考慮した設計と評価):負荷周波数制御において,太陽光発電などの供給電力予測と予測不能な需要変動を定式化した問題を定め,予見制御により負荷周波数変動が効果的に抑制できることを示した.これらの制御問題は,同一の集約モデルで表わされるため,系統の規模に応じて適切な予測時間を選定し,性能を評価することが可能である.(C)操作者のアシストと経路予測制御(予測制御論の実装と評価):2リンクマニピュレータにおいて,力覚センサの操作情報から予測軌道を逐次生成する方法を定め,その軌道に追従するH∞予見制御系を構築した.そして実験結果から,予測経路の急峻な変化を緩和し,また滑らかに追従する制御系が構成されることを確認した.予測情報に含まれる不確かさを克服し,所望の制御性能を達成するH∞予見制御法の構成法を明らかにした.そして,予見情報を状態に含めた広義のシステムを定め,予測情報とそれに印加される分布的外乱を同時に扱うことにより,予測情報を適切に更新し制御性能を達成する制御則の構成法を導いた.制御系は輸送系に準じた予測情報の推定機構とそれに基づくフィードバック制御により構成される.つぎに,成果を電力システムの制御(系統安定化制御,負荷周波数制御),マニピュレータのアシスト制御(軌道生成と追従)に適用し,制御法の有用性を評価した.理論研究の基礎となる予見H∞制御法がH26年度に解明され,また,これらの結果を援用することにより,予測不確かさを考慮したフィルタリング問題が解かれている.これらの結果は,当初の目標通りの進展であり,H27年度以降に情報更新型予見制御法を明らかにする基礎が整備されている.また,
腎移植における慢性抗体関連型拒絶反応の早期診断法の開発

腎移植の短期成績は飛躍的に向上していが、長期的にはドナー特異的抗体による慢性抗体関連型拒絶反応(CAMR)により移植腎機能廃絶となる症例が多く、この克服が長期成績の向上に必要不可欠である。しかし、CAMRに対する有効な治療法は未だ確立していない。当研究の目的は、CAMRとなりうる患者を未然にもしくは可能な限り早期に発見する診断法を開発することである。当研究は3つからなり昨年度の研究実績は以下の通りである。1.パラフィン移植腎生検標本を用いたCAMR早期診断関連遺伝子の検索:経時的に採取したプロトコール移植腎生検のパラフィン切片100検体を共同研究者のマサチューセッツ総合病院に遊走子遺伝子解析中である。2.慢性抗体関連型拒絶反応(CAMR)早期診断のための尿中バイオマーカーの検索:CAMRの診断となった移植腎生検組織を免疫染色したところ正常腎組織に比べORM1発現の亢進を認めたことから、尿中ORM1に注目した。CAMRと組織学的に正常である患者での尿中ORM1を比較したところCAMR群で尿中ORM1濃度が有意に上昇していた。さらに他の慢性障害である間質の繊維化や尿細管の萎縮(IF/TA)や免疫抑制剤であるカルシニューリン阻害剤の腎毒性の患者群に比べてCAMR群の尿中ORM1の濃度が上昇していることが確認できた。これにより、尿中ORM1が慢性障害の中でもCAMR患者に特異的に上昇している可能性がありバイオマーカーの臨床応用への可能性が見出せた。3.末梢血リンパ球反応による早期診断法の開発:30症例につきCFSE/MLR assayを行った。結果、腎機能が正常で病理学的にも問題ない患者においてはCD8の反応が認めないが、慢性抗体型拒絶反応の患者ではドナーに対するCD8の反応が認める傾向にあり、CAMRを早期に診断する可能性は見出せた。本研究は3つの研究からなり、それぞれの昨年度の進捗状況は以下の通りである。1.パラフィン移植腎生検標本を用いたCAMR早期診断関連遺伝子の検索...CAMR群、正常群それぞれ10例ずつ計20症例につき移植前、移植後1、3,5,7年以降のそれぞれ5検体移植腎検体を共同研究者であるマサチューセッツ総合病院に郵送し、遺伝子解析中である。2.慢性抗体関連型拒絶反応(CAMR)早期診断のための尿中バイオマーカーの検索...上記で示した様にCAMR患者において尿中のORM1濃度が特異的に上昇していることが見出せた。3.末梢血リンパ球反応による早期診断法の開発...上記で示した様にCFSE assayによりCAMRを早期に診断する可能性は見出せた。当初レシピエントのPBMCをレスポンダーに使用して実験を行っていたが、反応が少なく、CAMR患者と正常患者の違いを見出すことができなかった。そこで、PBMCからT細胞を分離してレスポンダー使用する様にプロトコールを変更すると、レシピエントT細胞のドナーに対する反応をより顕著に検出でき、CAMR患者と正常患者での反応の違いが鮮明になった。現在、この方法で症例を増やしている段階である。(現状で30例施行)1.パラフィン移植腎生検標本を用いたCAMR早期診断関連遺伝子の検索...本年度は現在解析中のデータと、臨床経過、病理所見との関係をまとめる。具体的には本年6月にボストンにて共同研究者との会議を開催し、データの確認と今後の方針について話し合う予定である。2.慢性抗体関連型拒絶反応(CAMR)早期診断のための尿中バイオマーカーの検索...尿中のORM1がCAMR患者に特異的に上昇していることが判明したので、今後CAMRとなった患者に対して発症前の尿を測定し早期診断が可能で有るか検討する。3.末梢血リンパ球反応による早期診断法の開発...T cellをレスポンダーしたCFSE/MLR assayの症例をさらに増やす。現状は30例施行しているが、100例を目標に研究をすすめる。この結果と、移植腎機能、ドナー特異的抗体の有無、移植腎生検の所見との関連を検討し、この検査法がCAMRの早期診断に有用であるかの妥当性を検討する。

さらに他の慢性障害である間質の繊維化や尿細管の萎縮(IF/TA)や免疫抑制剤であるカルシニューリン阻害剤の腎毒性の患者群に比べてCAMR群の尿中ORM1の濃度が上昇していることが確認できた。これにより、尿中ORM1が慢性障害の中でもCAMR患者に特異的に上昇している可能性がありバイオマーカーの臨床応用への可能性が見出せた。3.末梢血リンパ球反応による早期診断法の開発:30症例につきCFSE/MLR assayを行った。結果、腎機能が正常で病理学的にも問題ない患者においてはCD8の反応が認めないが、慢性抗体型拒絶反応の患者ではドナーに対するCD8の反応が認める傾向にあり、CAMRを早期に診断する可能性は見出せた。本研究は3つの研究からなり、それぞれの昨年度の進捗状況は以下の通りである。1.パラフィン移植腎生検標本を用いたCAMR早期診断関連遺伝子の検索...CAMR群、正常群それぞれ10例ずつ計20症例につき移植前、移植後1、3,5,7年以降のそれぞれ5検体移植腎検体を共同研究者であるマサチューセッツ総合病院に郵送し、遺伝子解析中である。2.慢性抗体関連型拒絶反応(CAMR)早期診断のための尿中バイオマーカーの検索...上記で示した様にCAMR患者において尿中のORM1濃度が特異的に上昇していることが見出せた。3.末梢血リンパ球反応による早期診断法の開発...上記で示した様にCFSE assayによりCAMRを早期に診断する可能性は見出せた。当初レシピエントのPBMCをレスポンダーに使用して実験を行っていたが、反応が少なく、CAMR患者と正常患者の違いを見出すことができなかった。そこで、PBMCからT細胞を分離してレスポンダー使用する様にプロトコールを変更すると、レシピエントT細胞のドナーに対する反応をより顕著に検出でき、CAMR患者と正常患者での反応の違いが鮮明になった。現在、この方法で症例を増やしている段階である。(現状で30例施行)1.パラフィン移植腎生検標本を用いたCAMR早期診断関連遺伝子の検索...本年度は現在解析中のデータと、臨床経過、病理所見との関係をまとめる。具体的には本年6月にボストンにて共同研究者との会議を開催し、データの確認と今後の方針について話し合う予定である。2.慢性抗体関連型拒絶反応(CAMR)早期診断のための尿中バイオマーカーの検索...尿中のORM1がCAMR患者に特異的に上昇していることが判明したので、今後CAMRとなった患者に対して発症前の尿を測定し早期診断が可能で有るか検討する。3.末梢血リンパ球反応による早期診断法の開発...T cellをレスポンダーしたCFSE/MLR assayの症例をさらに増やす。現状は30例施行しているが、100例を目標に研究をすすめる。この結果と、移植腎機能、ドナー特異的抗体の有無、移植腎生検の所見との関連を検討し、この検査法がCAMRの早期診断に有用であるかの妥当性を検討する。1.パラフィン移植腎生検標本を用いたCAMR早期診断関連遺伝子の検索...追加の検体の郵送費が必要2.慢性抗体関連型拒絶反応(CAMR)早期診断のための尿中バイオマーカーの検索...尿中のORM1の測定(ELISA)に必要な消耗品(抗体やその他の試薬など)の購入費が必要3.末梢血リンパ球反応による早期診断法の開発...
シダ植物における無性生殖の適応的意義の解明

本研究では、シダ植物の無性生殖種(無配生殖と根茎繁殖)の適応的意義を明らかにするため、亜熱帯から亜寒帯における山岳域の標高傾度に沿った無性生殖種の分布調査を実施し、分布パターンのメタ解析と気候要因との対応、無配生殖と根茎繁殖の繁殖保障に関する解析を行った。シダ植物の無性生殖種は他の生物群と比較してユニークな分布傾向を示すことが知られる一方で、その生態学的要因は未だ不明であるため、生物における無性の生態学的意義を理解する上でも重要な位置づけを持つ。北海道から台湾まで標高傾度に沿った同一の調査手法でシダ植物の多様性・分布パターンと繁殖様式に関する情報を集積し、有性生殖種と根茎繁殖・無配生殖種の種多様性と機能的多様性の比較、さらに環境要因との対応を各山岳域で実施し、メタ解析を行った。その結果、どの山域でも共通してみられる傾向はなく、分布パターンや繁殖保障に関して以下のことが明らかとなった。1無配生殖による繁殖保障が成立していない場合、根茎繁殖による繁殖保障が観察されるという仮説を立てたが、どの地域にも当てはまる一般的な仮説ではなく、異なる無性生殖種間での繁殖保障の補填的な関係はないことが明らかとなった。2無配生殖は受精が必要でないという生態学的特徴から、より乾燥した環境条件において有性生殖種よりも有利であるという適応的意義が考えられている。しかし、どの山域でも乾燥の指数は無配生殖種の種多様性や個体数、繁殖様式の機能的多様性に寄与することはなく、乾燥条件の影響は少ない。一方で、無配生殖種の種多様性や機能的多様性は気温との密な関係を示した。これは無配生殖と他の形質(季節性;常緑性or夏緑性)との依存的な関係性を示唆しており、シダ植物の無配生殖が常緑性のシダ植物系統内で生じているという進化的背景を持ち、形質の階層的構造が無配生殖シダ植物の分布パターンに影響していることが考えられた。27年度が最終年度であるため、記入しない。現生する多くの種が有性生殖を行う中、無性生殖が二次的に進化している系統がある。一般的に種子植物では0.1%ほどが無性生殖を持つ一方で、シダ植物では10%近くが無配生殖(無性生殖の一つ)を持ち、無配生殖はシダ植物の進化と多様化に重要であることが示唆される。しかし、なぜシダ植物では無配生殖が比較的多いのかという疑問は解決しておらず、無性生殖の適応的意義や多様化のメカニズムを明らかにする必要がある。本研究の目的は、このシダ植物の無配生殖の適応的な意義は何かを、環境傾度に沿った無配生殖種の種多様性を解析することから無配生殖種の多様性に寄与する要因の特定と、多様化の制限要因に関する生理生態学的な検証によって明らかにすることである。今年度は、北海道・長野・九州における同一サンプリングプロトコルによる調査データから標高傾度に沿った無配生殖種の多様性パターンの一般性の検証を行った。無配生殖率の標高傾度に沿った傾向はどの地域でも同様の減少傾向であり、低温環境で無配生殖種は生じないことが発見された。さらに地域間で無配生殖種が生じなくなる標高も変わり、北海道や長野では比較的低標高までしか無配生殖種が生じない一方で、九州ではより高標高まで無配生殖種が生じた。また、無配生殖種は九州から北海道にかけての緯度経度においても減少傾向を示した。これらの結果から、無配生殖種が低温環境において分布を広げることができず、無配生殖種の多様化に低温が制限要因として駆動していることが考えられた。無配生殖種の多様化に関する生理生態学的検証のため、今年度はシダ植物の生活史初期の段階である前葉体培養のための胞子の収集を進めた。次年度は培養した前葉体の耐寒性を解析し、低温制限に関する検証を行う。

一方で、無配生殖種の種多様性や機能的多様性は気温との密な関係を示した。これは無配生殖と他の形質(季節性;常緑性or夏緑性)との依存的な関係性を示唆しており、シダ植物の無配生殖が常緑性のシダ植物系統内で生じているという進化的背景を持ち、形質の階層的構造が無配生殖シダ植物の分布パターンに影響していることが考えられた。胞子サンプルはまだ十分でなく、それに伴い前葉体の培養が遅れている。また、標高に沿った根茎繁殖の空間パターンを調査する予定であったが、調査予定地が土砂災害により調査が困難になってしまったため、調査解析にいたらなかった。27年度が最終年度であるため、記入しない。無配生殖種の多様化パターンに関して、台湾における同一プロトコルの調査データがそろっているため、生殖様式の情報を集積し解析を進め、亜熱帯から亜寒帯における無配生殖種の多様化を明らかにする。無配生殖種の耐寒性に関して、引き続き胞子採取とともに前葉体の培養と耐寒性の検証を進める。
大腸腺腫細胞p53遺伝子コドン175,273におけるメチルシトシンの証明

大腸腺腫5例、大腸癌10例(および正常粘膜)より抽出したDNA検体についてまず従来よりの報告のとおり総メチルシトシンの減少及び部位特異的メチル化の減少が認められるか検討した。総メチルシトシンは、HPLCを用いて%定量を行い腺腫で平均7%、大腸癌で平均12%の減少を認めた。部位特異的メチル化の減少は、c-myc 3rd exonのMspIおよびHapII制限酵素部位を対象にサザン法にて行い、腺腫および大腸癌において部位特異的にもメチル化が減少していることが確認できた。このメチル化の減少を確認された検体を用いて、p53遺伝子のexon59までの範囲についてHapII、MspI制限酵素を用いてサザン法にてメチル化の状態を検討したところ、大腸正常粘膜、腺腫、癌ともに、高度にメチル化していることが確認された。さらに同検体にてligation-mediated PCR genomic sequencingを施行しコドン175、273についても大腸正常粘膜、腺腫、癌ともに特異的にメチル化されていることを確認した。以上より、腺腫及び癌化に伴いメチル化の減少が認められる状態においてもp53遺伝子のメチル化状態は変化しないことが、本研究にて確認された。