hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
酵素学的定量法を用いた新規の食品中ビタミンB12分析法の開発

この結果、L. delbrueckiiのゲノム上に補酵素としてVB12を要求するタイプ(RNR class II)のRNR (locus_tag="LL717_08245")及びribonucleoside-triphosphate reductase activating protein (RAP) (locus_tag="LL717_08240")がクラスターを組んでいる領域を発見した。そのため、RNRのみをターゲットとする予定であったが、RAPについてもHis-RAP大量発現系を構築し精製し、VB12の酵素学的定量法に与える影響を検討することとした。本年度は、His-RNR及びHis-RAP遺伝子をベクターに導入し、大量発現系の構築が完了した。本研究計画は計3段階の構成となっており、第1段階ではVB12定量を目的としたRNR活性測定法の検討を行う、としたが想定以上にRNR活性の測定についての論文が充実していたため、RNRを精製することでRNR酵素活性を指標としたVB12定量が速やかに遂行可能であるとの確信を得た。そこで現在は第2段階のHis-RNR大量発現系の構築を進行中であり、概ねスムーズに進行している。また、本来の計画にはなかったHis-RAPについても大量発現系の構築を行っている。本年度中にHis-RNR及びHis-RAPの精製を完了し、両タンパク質を用いてVB12標準品の酵素学的定量法について検討を行う。最終年前半に食品中でのVB12の酵素学的定量法についてのバリデーションを行い、論文化を目指す。概ね予定通りの執行となったが、資料収集にあたって無料公開された論文等が想定より多く、予定されていた書籍・論文費が残余として生じた。
両眼視野闘争時の内的知覚の交替現象を利用した全方位視知覚補助装置の開発

両眼に任意の方角の視野をユーザに呈示するウェアラブルシステムの開発を行った。本システムを用いて、両眼を独立状態でターゲットを探索する実験を行うことで、通常の視覚に比べ反応性は低下するが、ユーザは両眼を独立状態で周囲を見渡しながら探索を行うことを明らかにした。また、両眼独立状態で生じる知覚の交替現象に影響を及ぼす視覚刺激を与える方法として、擬似的なサッカード運動を生じさせる機能を追加した。本研究では両眼視野闘争下における能動的な視覚刺激の変化による知覚交替の応答速度および時間特性を利用した全方位の独立視認を擬似的に実現する装置の開発を目的としている.平成22年度には,本研究で用いる両眼に任意の方角の視野を呈示するウェアラブルシステムの開発を行った.開発システムは,3軸加速度センサが実装された無線通信式の操作インタフェース.頭部着用型のカメラ姿勢制御,両眼独立提示が可能なヘッドマウントディスプレイ(HMD)により構成される.本システムは,操作インタフェースから得られた信号に基づき2台のカメラの姿勢制御を行い,その際,カメラにより撮影された2つの映像を両眼に別々にHMDを用いて提示することで,疑似的な両眼独立視を行う.また,開発したシステムを用いた基礎実験を11人の健常な被験者を対象に実施した.実験は,着席させた被験者の両側に3×3のマス目を設置し,両サイドのマス目のそれぞれ1箇所にターゲットをランダムに配置し,被験者にターゲット位置の探索・解答させるという内容である.本実験は,開発システムを着用した場合と何も着用しない通常状態についての2通りそれぞれ20回実施した.実験結果として,正答率と応答時間の平均値を求めた.実験を行って得られた結果から,開発装置を用いた場合については,正答率が0.85-1.0であり,通常状態の実験結果も0.9-1.0であったことから,両眼独立運動状態でもヒトは周囲の状況を理解することが分かった.また,応答時間については何も看用しない通常状態に比べ,150-400%のオーダの時間を要することが判明した。このことから.開発システムは,素早い応答を要しないアプリケーションに応用するべきであることが分かった.また,被験者間に見られる応答の遅延時間に差が生じているため,システムの使い方,被験者毎の認知特性などを調べることでこの応答時間の遅延のばらつきが生じる原因の解明を行う必要があると考えられる.本研究では、ヒトの両眼に異なる象を与えた際に生じる知覚現象である両眼視野闘争の影響下における視覚刺激の変化により、2つの視覚刺激の優位期間と空間分布が変化する知覚交替を利用した全方位の独立視認を擬似的に実現することを目的としている。研究期間内に、3軸加速度センサと無線通信式の操作インタフェース、頭部着用型のカメラ姿勢制御、両眼独立提示が可能なヘッドマウントディスプレイ(HMD)により構成されるウェアラブルシステムの開発を行った。また、開発装置を用いた両眼独立状態における周囲に設置された目標物探索に関する実験を行うことで、被験者は両眼独立状態でも与えられたタスクに対する要求を満たす視認を行うことが可能であるが、被験者ごとにその探索時間が異なることを明らかにした。平成23年度は、両眼視野闘争の知覚交替特性に影響を与える刺激に注目し、開発装置に対する機能追加を行った。与える視覚刺激は、像の流れ、像のコントラスト、明暗、空間分解能の変化などが挙げられるが、ヒトの場合でも眼球運動において生じるということと視覚行動とも関連が強いことから、はじめに像の流れの変化に着目した。機能追加方法としては、開発システムを制御するためにユーザが手に把持するセンサに対してモメンタリスイッチをとりつけ、ユーザのON-OFF操作によりカメラアングル制御タイミングを調整することを可能とした。これにより、生体の眼球運動にみられるサッケード運動と追従運動と同等の運動の生成をシステムでも実現することを可能とした。また,システムのカメラにより撮影されたユーザへの呈示画像そのものについての視覚刺激を変化させるため、ビデオミキサーを用いることで像の加工を可能とした。以上に、述べるように、擬似的な両眼独立運動状態で視覚刺激をユーザの任意に変化させる基礎システムの開発を行った。
遺伝性神経疾患の病的遺伝子の解明

遺伝性の神経変性疾患の中には疾患遺伝子内にCAGリピートをもちそのリピート数が異常に増大することによる疾患(これをCAGリピート病と呼ぶ)があることがわかってきた。本研究班ではこれらの疾患を中心に研究を進め、以下のような成果を得た。(1)ハンチントン病については、池田らは第4染色体短腕の責任遺伝子周辺のゲノム構造を詳細に検討し、そこに少なくとも6個の新しい遺伝子の存在を報告した。黒沢らはCAGリピート部がそれだけで二本鎖DNA構造をとり、これがアルカリ性下におくと破壊されることを報告した。石黒らはハンチントン病の病態モデル作成の途中経過を報告した。金澤らはHayden博士との共同研究により日本人でHDの頻度が低いことは、正常人のCAGリピートの平均数が少ないことに関連することを見いだした。(2)脊髄小脳変性症にはCAGリピート病が多い。その内DRPLAについては山田ら、辻らはDRPLA遺伝子の全シーケンスを決定した。この知見に基づいて近藤らは本症における対立遺伝子の連鎖不平衡を検討した。本年度、山田らはこの遺伝子の調節領域の塩基配列を決定した。金澤らは、このDRPLA遺伝子の産物であるアトロフィンが実際に各組織で発現しており、しかも通常リン酸化されていることを報告した。MJDについて、垣塚らはMJD遺伝子の一部を培養細胞に発現させるとその細胞はアポトーシスを起こすことを発見した。西沢らは、MJDにおける単一精子のDNA解析を行い、精子のレベルで異常遺伝子頻度が高いことを見いだした。辻らは異常に伸長したCAGリピートをもつ遺伝子を探索する新しい方法を開発した。さらにこの方法を用いてSCA2の責任遺伝子の同定に成功した。田代らはこの結果を基に本邦のSCA2のCAGリピート数と臨床症状との関連を明らかにした。水沢らはHCCAの遺伝子同定を行っているがその中間報告を行った。その他の疾患については、筋緊張性ジストロフィーについて、石浦ら様々な長さのCTGリピート数をもつ遺伝子を培養細胞に発現させ、リピート数が伸長するとC1チャンネルが活性化することを見いだした。また戸田・金澤らは、福山型先天性ジストロフィーの遺伝子異常が挿入という形式であることを発見した。(1)ハンチントン病の遺伝子解析---ハンチントン病の原因遺伝子は第4染色体短腕先端部(4p16.3)の領域にIT15が1993年に同定された。本症では、このIT15遺伝子の5'端に正常でも存在する1025個のCAGリピートが発病者全例で3890に伸長しているとされた。それを受けて、本邦のハンチントン病について、CAGリピート数を決定するとともに、それに続くCCG多型の遺伝子型についても決定した。その結果、我が国ではCCG多型で欧米と異なる遺伝子型との連鎖不平衡があることを見出し、本邦のハンチントン病の起源が必ずしも欧米ではないことを示唆した(金澤)。またCAGリピートの異常伸長のメカニズムとして瘤状のDNA鎖ができる仮説を提出した(黒澤・金澤)。さらに、CAGリピートが異常に伸長した結果として神経細胞が死を迎えるのは、シスの位置に存在する他の遺伝子の不活性化による可能性を示唆した(池田)。(2)脊髄小脳変性症の遺伝子解析---常染色体性優性遺伝形式をとる脊髄小脳変性症のうち、DRPLAの異常遺伝子が第12染色体短腕に存在しCAGリピートをもつ遺伝子であることを決定し、CAGリピート数と臨床症状の対応を明らかにした(辻、近藤・金澤)。次いで、第14染色体長腕に異常遺伝子が局在することを我が国で見出したマシャド・ジョセフ病について、その遺伝子がやはりCAGリピートの異常伸長であることが明らかにされたことを受けて、この事実を確認するとともに他のCAGリピート病の場合と同様、CAGリピート数と臨床症状の対応伸長を明らかにした(西澤・辻)。(3)瀬川病の遺伝子解析---我が国において、瀬川らにより発見記載された家族性若年性ジストニア症として瀬川病がある。本症は常染色体性優性遺伝形式をとることが知られているが、遺伝子異常がドパミン合成酵素の補酵素を合成する酵素の一つであるGTPシクロヒドロラーゼIの突然変異であることを証明することができた(永津・辻)。(1)ハンチントン病については、責任遺伝子IT15の5′端に存在するCAGリピートおよびそれに続くCCGリピートの数を調べた。金澤らは正常人におけるCAGリピート数の平均値が多い人種では本症の頻度も多いこと、CCGリピート数の多型は連鎖不平衡を示すが我が国で連鎖している多型は欧米のそれと異なるので本邦のハンチントン病は必ずしも欧米から由来したものとはいえないこと、その遺伝子の産物である蛋白が実際に体内で発現していること、などを明らかにした。黒沢らはCAGリピートの異常伸長の機構として瘤状DNAが出来ることを証明した。永津・金澤らはHayden博士との共同研究によりリプレイマウスを作成中である。

その内DRRLAについて、辻ら、金澤らはCAGリピート数と臨床症状との対応を検討し、CAGリピートが著しく伸長すると発病も早く臨床症状も重症かつミクロームスてんかんが主体となり、比較的伸長の程度が軽いと成人期の発病となり舞踏運動、小脳症状あるいは痴呆が主体となることを見出した。また、本症の小脳のリピート数は他の部位よりも少ないことも証明した。金澤らは異常に長いCAGリピートに対応する異常に長いグルタミン鎖をもつ蛋白が実際に発現していること、を見出した。現在、この蛋白を純化するべく大量発現のシステムを開発中である。マシャド・ジョセフ病については、辻ら、西澤らはこの遺伝子内の多型を用いて連鎖不平衡を調べ、この遺伝子の起源が複数あることを見出した。垣塚らはトランスジェニックマウスの作成に成功した。遺伝性の神経変性疾患の中には疾患遺伝子内にCAGリピートをもちそのリピート数が異常に増大することによる疾患(これをCAGリピート病と呼ぶ)があることがわかってきた。本研究班ではこれらの疾患を中心に研究を進め、以下のような成果を得た。(1)ハンチントン病については、池田らは第4染色体短腕の責任遺伝子周辺のゲノム構造を詳細に検討し、そこに少なくとも6個の新しい遺伝子の存在を報告した。黒沢らはCAGリピート部がそれだけで二本鎖DNA構造をとり、これがアルカリ性下におくと破壊されることを報告した。石黒らはハンチントン病の病態モデル作成の途中経過を報告した。金澤らはHayden博士との共同研究により日本人でHDの頻度が低いことは、正常人のCAGリピートの平均数が少ないことに関連することを見いだした。(2)脊髄小脳変性症にはCAGリピート病が多い。その内DRPLAについては山田ら、辻らはDRPLA遺伝子の全シーケンスを決定した。この知見に基づいて近藤らは本症における対立遺伝子の連鎖不平衡を検討した。本年度、山田らはこの遺伝子の調節領域の塩基配列を決定した。金澤らは、このDRPLA遺伝子の産物であるアトロフィンが実際に各組織で発現しており、しかも通常リン酸化されていることを報告した。MJDについて、垣塚らはMJD遺伝子の一部を培養細胞に発現させるとその細胞はアポトーシスを起こすことを発見した。西沢らは、MJDにおける単一精子のDNA解析を行い、精子のレベルで異常遺伝子頻度が高いことを見いだした。辻らは異常に伸長したCAGリピートをもつ遺伝子を探索する新しい方法を開発した。さらにこの方法を用いてSCA2の責任遺伝子の同定に成功した。田代らはこの結果を基に本邦のSCA2のCAGリピート数と臨床症状との関連を明らかにした。水沢らはHCCAの遺伝子同定を行っているがその中間報告を行った。その他の疾患については、筋緊張性ジストロフィーについて、石浦ら様々な長さのCTGリピート数をもつ遺伝子を培養細胞に発現させ、リピート数が伸長するとC1チャンネルが活性化することを見いだした。また戸田・金澤らは、福山型先天性ジストロフィーの遺伝子異常が挿入という形式であることを発見した。
次世代シークエンサーを用いた人工・自然雑種の遺伝子発現ネットワーク解析

異なった二種のゲノムが一つになった時には,様々な遺伝的な相互作用が起こると考えられている.本研究は特に,モデル生物であるシロイヌナズナの近縁種に注目して,次世代シークエンサーを用いたトランスクリプトーム解析を行った.これらの二種には自然に発生したと考えられる異質倍数体が存在することが知られている.これらの異質倍数体と親種の遺伝子発現様式をゲノムレベルで比較した.本研究で新たに解読された親種のゲノム配列をもとに各染色体由来の転写産物が偏りなく推定できるような方法を開発し,それをもとに転写産物の発現量を推定した.異なった二種のゲノムが一つになった時には,様々な遺伝的な相互作用が起こると考えられている.本研究は特に,モデル生物であるシロイヌナズナの近縁種に注目して,次世代シークエンサーを用いたトランスクリプトーム解析を行った.これらの二種には自然に発生したと考えられる異質倍数体が存在することが知られている.これらの異質倍数体と親種の遺伝子発現様式をゲノムレベルで比較した.本研究で新たに解読された親種のゲノム配列をもとに各染色体由来の転写産物が偏りなく推定できるような方法を開発し,それをもとに転写産物の発現量を推定した.異なった二種のゲノムが一つになった時に起こる相互作用を明らかにすることが本研究の目的である.異種ゲノム間の相互作用を遺伝子発現のレベルで明らかにするために,モデル生物であるシロイヌナズナの近縁種,Arabidopsis halleriとA.lyrataを材料にして,次世代シークエンサーを用いたトランスクリプトーム解析を行う.これらの二種には自然に発生したと考えられる異質倍数体,A.kamchaticaとその亜種A.k.ssp.kawasakianaが存在することが知られており,日本を含む北半球地域に生息することが知られている.これらの異質倍数体と親種の遺伝子発現様式をゲノムレベルで比較することにより,遺伝子発現の可塑性とそれに働く自然選択を明らかにする.本年度はサンプルの収集および次世代シークエンサーによる遺伝子発現解析を行った.A.kamchaticaとA.kawasakiana一個体ずつを実験室内で成長させ,ゲノムDNAおよび葉のRNA抽出を行った.両方のサンプルについて次世代シークエンサーによる解析を行い,A.lyrataゲノム配列へのマッピングを行った.また,台湾で得られたA.kamchatica個体について倍数性の解析と多座位遺伝子配列の解析を行うことにより,異種間での遺伝子交流があることを示した.異なった二種のゲノムが一つになった時に起こる相互作用を明らかにすることが本研究の目的である。異種ゲノム間の相互作用を遺伝子発現のレベルで明らかにするために,モデル生物であるシロイヌナズナの近縁種,Arabidopsis halleriとA. lyrataを材料にして,次世代シークエンサーを用いたトランスクリプトーム解析を行う.これらの二種には自然に発生したと考えられる異質倍数体,A.kamchaticaとその亜種A.k.ssp.kawasakianaが存在することが知られており,日本を含む北半球地域に生息することが知られている.これらの異質倍数体と親種の遺伝子発現様式をゲノムレベルで比較することにより,遺伝子発現の可塑性とそれに働く自然選択を明らかにする.本年度は次世代シークエンサーを利用したトランスクリプトーム解析および親種A.halleri ssp gemmiferaのゲノム配列解析を中心に研究を行った.トランスクリプトーム配列の7割以上はA. lyrataのゲノム配列上にマップされ,種特異的な塩基置換を同定することができたが,より詳細な解析を行うには,親種A. halleriのゲノム配列が必要である.A. halleriのゲノム配列の整列の結果,十分な被覆率のゲノムデータが得られたが,反復配列などの要因により,ゲノム配列はかなりの部分断片化されていた.これを克服し,より詳細なゲノム配列データを得るために,来年度以降は長距離メイトペアライブラリによるゲノム配列の整列を行う予定である.また,実験に並行して,異種間ゲノムの相互作用についての進化モデルの発展と検証を行った.特に核ゲノムにコードされている遺伝子とミトコンドリアにコードされている遺伝子の進化的相互作用について,「弱有害補完毎デル」を提唱し,霊長類の遺伝子配列よりモデルの妥当性を示した.本年度は台湾産A.kamchaticaのゲノム配列解析およびトランスクリプトーム解析を行った.これまでにえら得たデータをもとに,新たに日本のA. halleriゲノムをアセンブルし,およそ174M塩基対のドラフト配列を得ることができた.このドラフトゲノム配列とこれまでに公開されているA.lyrataゲノム配列の整列を行い,反復配列を除く全ゲノムのおよそ50%についてゲノム整列データを得ることができた.整列可能部分が予想より少なかったことについては様々な原因が考えられ,今後の検討課題とするが,適切に整列された部分については問題がないと判断し,その後の解析を行った.得られた仮の異質倍数体ゲノムに対して実際のA. kamchaticaデータ(日本,台湾およびA. kamchatica kawasakiana)のマッピングを行った.

ゲノムの十分な被覆度のデータを得ることができ,そのデータから,ゲノム特異的に起こった系統特異的な遺伝子欠失の推定などを行った.また,数座位については集団から得られたサンプルをもとに解析を行い,集団内,集団間での変異パターンを特定した.本年度は,最終的な異質倍数体(A. kamchatica)の解析に向けて,親種のひとつであるハクサンハタザオ(A. halleri gemmifera)のゲノム解析に注力した.次世代シークエンサーを用いて台湾産,日本産のそれぞれの野生種のサンプルより得られたDNAについて配列を決定した.その結果,それぞれについて以前よりも高品質なゲノム配列のアセンブル(N50=50100kb)を得ることができた.技術的な問題により,ゲノム配列の連結度(どれだけ連続した塩基配列が得られたか)については必ずしも満足のいくものではなかったが,断片化された情報であっても,雑種のアリル特異的な遺伝子発現パターンを解析するには十分であると考えられる.この得られた配列を既に国際グループによって解読されている近縁種のA. lyrataゲノムと整列を行い,二種で異なっている塩基の数を推定した.また,ゲノム規模の解析と並行して,ゲノム上の約100座位についてArabidopsis近縁種のDNA配列を解析した.その結果,遺伝子ごとの置換率の違いが比較的大きいことや,同祖遺伝子を比較した場合,およその年あたり塩基置換率が草本類であるAdapidopsisは木本類であるポプラよりも桁違いに高いことが分かった.この現象は世代時間効果として知られており,植物においても年あたりの突然変異率よりもむしろ世代あたりの突然変異率が一定に近いということが示唆された.自然雑種のゲノム解析についてはおおむね順調に進展しているが,当初の計画にあった人工雑種の作製については進展が遅れているため.25年度が最終年度であるため、記入しない。申請書では大きく三つの目標を立てた.そのうち,次世代シークエンサーを用いたデータ収集と弱有害補完モデルについての研究は予定通り進行した.ただし,核型解析については予定通り進めることができなかったために自己評価は3とする.これまでの研究により,詳細で正確な親ゲノム配列の決定が,アリル特異的な遺伝子発現パターンの推定に非常に重要であることが分かった.今後は,より詳細な親種のゲノム配列の決定と遺伝子発現パターンによる注釈付けを行い,それをもとにして高精度な雑種の遺伝子発現解析を行うことにする.25年度が最終年度であるため、記入しない。来年度は研究計画の最終年度となるので,これまで得られた大量のデータを解析することに専念し,生物学的に有用な知見を得ることを目標とする.ただし,研究計画の期間中に配列解析技術が早い勢いで進歩したせいもあり,更に新たなデータを加えることにより,より解析の精度を上げることも考えている.
日常生活下の子どもにおける殺虫剤、可塑剤及び難燃剤への曝露とその吸収量の評価

子どもにおける有機リン剤(殺虫剤10種、難燃剤5種)及び防虫剤2種の曝露指標となる15種の尿中代謝物を正確に再現性よく定量する方法を確立した。また、殺虫剤としての使用が増加しているトランスフルトリン及びプロフルトリンの代謝物の尿中排泄をラットを用いて解析した。それぞれ尿中2,3,5,6-テトラフルオロ安息香酸及び4-メチル-2,3,5,6-テトラフルオロベンジルアルコールが最適な曝露指標となり得ると考えられた。本研究は、子どもにおける化学物質曝露に着目し、一般生活環境中で広範に使用され、神経毒性や内分泌かく乱作用を有する殺虫剤(有機リン系、ピレスロイド系)、難燃剤(有機リン系)および可塑剤(フタル酸系)を対象として、これらの一般子どもへの曝露レベルと吸収量を把握することを目的とする。平成22年度は、家庭用品や殺虫剤の市場調査等により、子どもが日常生活で曝露される可能性の高い化学物質を選定し、これらの各尿中代謝物の分析方法を確立した。曝露を想定した化学物質は、有機リン系殺虫剤12種、有機リン系難燃・可塑剤5種、防虫剤2種であり、各物質の代謝物15種(ジメチルホスフェート、ジエチルホスフェート、ジメチルチオホスフェート、ジエチルチオホスフェート、ジ-n-ブチルホスフェート、ジフェニルホスフェート、ジ(2-エチルヘキシル)ホスフェート、3-メチル-4-メチルチオフェノール、3,5,6-トリクロロ-2-ピリジノール、3-メチル-4-ニトロフェノール、2-イソプロピル-6-メチル-4-ピリミジノール、2,4-ジクロロフェノール、2,5-ジクロロフェノール、1-ナフトール、2-ナフトール)を分析対象とした。尿を塩酸で加水分解し、硫酸アンモニウムを飽和量添加した後、バイオタージ製ISOLUTE ENV+により代謝物を抽出した。酢酸メチルおよびアセトニトリルにより代謝物を脱着し、脱水、濃縮後、各代謝物の誘導体(O-(tert-ブチルジメチルシリル)化)を形成した。溶液を濃縮、乾固後、誘導体をトルエンに再溶解し、ガスクロマトグラフィー/質量分析(電子イオン化法)により定量した。尿試料からの各代謝物の回収率は45104%(大部分で80%以上)であり、検出下限濃度は0.21.1μg/Lであった。各代謝物は200μg/L以下の濃度において再現性よく、正確に定量することが可能であると考えられた。尿試料中の代謝物は、採取後約1カ月間冷凍保存に対して安定であった。一般に体内に吸収された化学物質の量は、尿中に排泄されるその代謝物量により把握される。平成23年度は、ピレスロイド系殺虫剤の市場調査等により、子どもが日常生活で曝露される可能性の高い薬剤種を選定し、これらの各尿中代謝物の分析方法を確立することを当初計画していた。しかし、最近住宅内での使用が増加している含フッ素ピレスロイド剤については、その代謝物が明らかでないものがいくつか存在することか判明した。昨年度はそれらの尿中代謝物を動物実験により同定した。3種の含フッ素ピレスロイド剤トランスフルトリン、プロフルトリンおよびメトフルトリンをそれぞれSD系雄性ラットの腹腔内に投与し、投与後24時間内に排泄される尿中の代謝物をガスクロマトグラフィー/質量分析により同定した。トランスフルトリン投与ラットより3種(2,3,5,6-テトラフルオロベンジルアルコール、2,3,5,6-テトラフルオロ安息香酸、3-(2,2-ジクロロビニル)-2,2-ジメチルシクロプロパンカルボン酸)、プロフルトリン投与ラットより4種(4-メチル-2,3,5,6-テトラフルオロベンジルアルコール、4-メチル-2,3,5,6-テトラフルオロ安息香酸、4-ヒドロキシメチル-2,3,5,6-テトラフルオロベンジルアルコール、2,2-ジメチル-3-(1-プロペニル)-シクロプロパンカルボン酸)、メトフルトリン投与ラットより3種(4-メトキシメチル-2,3,5,6-テトラフルオロベンジルアルコール、4-ヒドロキシメチル-2,3,5,6-テトラフルオロベンジルアルコール、2,2-ジメチル-3-(1-プロペニル)-シクロプロパンカルボン酸)の代謝物がそれぞれ尿中より同定された。体内に吸収された化学物質の量は、一般に尿中に排泄されるその物質の代謝物の量から推定される。

平成25年度は、衣料用防虫剤として最近特に使用頻度の高いピレスロイド系殺虫剤の一種プロフルトリンの住民における吸収量を把握する目的で、吸収量の指標となり得る尿中代謝物を動物実験により検索した。ラットの腹腔内にプロフルトリンを投与(26, 64, 160及び400 mg/kg)した後、経時的に一週間採尿した。尿中に排泄される主要な4種の代謝物4-メチル-2,3,5,6-テトラフルオロベンジルアルコール(CH3-FB-Al)、4-ヒドロキシメチル-2,3,5,6-テトラフルオロベンジルアルコール(HOCH2-FB-Al)、4-メチル-2,3,5,6-テトラフルオロ安息香酸(CH3-FB-Ac)、2,2-ジメチル-3-(1-プロペニル)-シクロプロパンカルボン酸(MCA)を定量し、その体内動態を薬物動力学的に解析した。MCAを除く3種の代謝物の尿中排泄量は、広範なプロフルトリン曝露濃度レベルにおいて、その吸収量に比例すると推定された。HOCH2-FB-Alは他の家庭用ピレスロイド剤曝露時にも尿中に代謝物として排泄されることが知られている。CH3-FB-AcおよびCH3-FB-Alはプロフルトリン曝露における吸収量の指標として適すると考えられるが、CH3-FB-Alの尿中排泄量は、CH3-FB-Acの排泄量の10倍程度であり、プロフルトリン投与量の1/3以上を占めることから、CH3-FB-Alはプロフルトリン曝露における最も適切な指標となり得ることが示唆された。一般に体内に吸収された化学物質の量は、尿中に排泄されるその代謝物量により把握される。平成23年度、最近住宅内での使用が増加している3種の含フッ素ピレスロイド剤(トランスフルトリン、プロフルトリンおよびメトフルトリン)の尿中代謝物を動物実験により同定した。平成24年度は、同定された各尿中代謝物の分析方法を開発するとともに、トランスフルトリン曝露における吸収量の指標として適切な尿中代謝物について検討した。同定された合計8種の代謝物の分析方法を検討した。尿中代謝物の抱合体を加水分解した後、トルエンで抽出した。代謝物を誘導体化(トリメチルシリル化またはtert-ブチルジメチルシリル化)し、ガスクロマトグラフィー/質量分析により定量した。各代謝物は20μg/ml以下の尿中濃度において正確に再現性よく定量可能であった(定量下限濃度:0.01-0.03μg/ml)。採取した尿試料は1ヵ月間冷凍保存可能であった。トランスフルトリンをラットの腹腔内に投与(26、64、160及び400mg/kg)した後、経時的に1週間採尿した。尿中に排泄される3種の代謝物(2,3,5,6-テトラフルオロベンジルアルコール、2,3,5,6-テトラフルオロ安息香酸、3-(2,2-ジクロロビニル)-2,2-ジメチルシクロプロパンカルボン酸)を上記の方法により定量し、その体内動態を薬物動力学的に解析した。各代謝物排泄量の投与量に対する割合、各代謝物の平均体内滞留時間はいずれの代謝物においても投与量による差は見られず、広範な曝露濃度範囲において、曝露量と各代謝物尿中排泄量との間に線形性が認められた。2,3,5,6-テトラフルオロ安息香酸はトランスフルトリンに特徴的な代謝物であり、またその尿中排泄量は投与量の約50%を占めることから、トランスフルトリン曝露における最も適切な曝露指標となり得ると推定された。本研究課題遂行のための補助金申請段階では、化学物質による子どもの体内汚染と室内空気汚染の実態調査を実施することを計画していた。最近使用量が急増している数種のピレスロイド剤については、その尿中代謝物が明らかにされていないことが判明した。本研究を遂行するためには、これらのピレスロイド剤の尿中代謝物を明らかにし、吸収量の指標として適切な代謝物を決定することが必要である。
シリコンナノワイヤ表面を用いたシリコン系太陽電池の高効率化に関する研究

本課題では、シリコンナノワイヤ表面にパッシベーション膜を成膜し、パッシベーション膜の被覆性と安定性、更に、パッシベーション膜/シリコンナノワイヤの界面特性に関する詳細な知見を得ることにより、シリコンナノワイヤのポテンシャルを最大限に生かしキャリアの再結合(損失)を極力抑える技術を開発することが目的である。H30年度は主に(1)シリコン基板上でのシリコンナノワイヤの成長パラメータ、(2)光の反射率及びキャリアライフタイムとナノワイヤ長の関係、(3)パッシンベーション膜の成膜条件や熱処理条件とパッシベーション膜/シリコンの界面特性の関係について検討した。(1)の検討ではPt触媒によるシリコンナノワイヤの成長条件(Pt析出条件やエッチング条件)とナノワイヤ長の関係についてSEMを用いて評価した。その結果、エッチング時間とナノワイヤ長には線形関係があるが、銀析出時間が長いサンプルではエッチング時間が短くなるとナノワイヤが形成されないことがわかった。(2)の検討ではナノワイヤ長が015μmのサンプルに対してSiO2膜を成膜し光の反射率及びキャリアライフタイムを評価した。その結果、反射率はいずれのサンプルでも数%に抑制できるが、キャリアライフタイムはワイヤ長が長くなるほど短くなることがわかった。(3)の検討ではナノワイヤを形成していないシリコン基板にSiNx膜やGaOx膜を成膜し、成膜条件や熱処理条件とパッシベーション膜中の固定電荷及びパッシベーション膜/シリコン界面の界面トラップの関係についてC-V法及びXPS法により評価した。SiNx膜については電極形成時の熱処理条件について検討し2段階熱処理法を提案した。また、GaOx膜については300°C程度の成膜温度が最も特性が向上し、成膜後の低温水素アニールが効果的であることを見出した。H30年度の実施計画では、(1)受光面での光の反射やシリコンナノワイヤでの光の吸収の観点からシリコン基板上でのシリコンナノワイヤの成長パラメータを検討し、その制御パラメータを明らかにし、光の表面反射をなくし短波長側での光の吸収が増加する条件を見い出すこと、(2)パッシベーション膜をシリコンナノワイヤ上に成膜し、パッシベーション膜の被覆性や安定性を調べることによって、パッシベーション膜の成膜条件や被覆性等の観点からシリコンナノワイヤのサイズについて検討することを予定していた。これらの検討については成長パラメータ及び光の表面反射の検討についてはおおむね順調に進展しており、さらにライフタイムの検討を行った。しかし、光の吸収及び被覆性については十分に検討できておらず次年度以降も引続き検討する予定である。また、H31(R元)年度以降に予定していた非真空プロセスで成膜可能なミストCVD法を用いて成膜したパッシベーション膜の成膜条件や熱処理条件とパッシベーション膜/シリコンの界面特性の関係については今年度着手することができており、次年度以降に予定しているパッシベーション膜/シリコンナノワイヤ構造に対して、有益な知見が得られたと考えている。H31(R元)年度には、(1)H30年度に検討したパッシベーション膜/シリコンナノワイヤ構造に対して、パッシベーション膜/シリコンナノワイヤの界面特性について検討する。H30年度に得られた知見と界面特性の検討結果からキャリアの再結合が抑制される条件を明らかにする。パッシベーション膜/シリコンナノワイヤ界面の電気特性評価には、C-V法やI-V法を用いて界面特性や絶縁特性について詳細に検討する。(2)より低コストの太陽電池を開発するために、従来太陽電池に用いられている成膜方法よりも大量生産が可能なLIAスパッタ法や非真空プロセスで成膜可能なミストCVD法を用いて成膜したパッシベーション膜や有機薄膜の被覆性や安定性についてもH30年度の検討をさらに推進する。R2年度には、(1)低コストに向けたパッシベーション膜に対して、パッシベーション膜/シリコンナノワイヤの界面特性と作製条件の関係を明らかにする。(2)これまでに検討したパッシベーション膜に対して、さらに太陽電池モジュールの作製プロセス中に受ける熱履歴に対してその熱安定性も検討し最終的に最適なパッシベーション膜/シリコンナノワイヤの組み合わせ及び作製条件を見い出し、変換高率の高いシリコンナノワイヤ太陽電池の実現を目指す。

(3)の検討ではナノワイヤを形成していないシリコン基板にSiNx膜やGaOx膜を成膜し、成膜条件や熱処理条件とパッシベーション膜中の固定電荷及びパッシベーション膜/シリコン界面の界面トラップの関係についてC-V法及びXPS法により評価した。SiNx膜については電極形成時の熱処理条件について検討し2段階熱処理法を提案した。また、GaOx膜については300°C程度の成膜温度が最も特性が向上し、成膜後の低温水素アニールが効果的であることを見出した。H30年度の実施計画では、(1)受光面での光の反射やシリコンナノワイヤでの光の吸収の観点からシリコン基板上でのシリコンナノワイヤの成長パラメータを検討し、その制御パラメータを明らかにし、光の表面反射をなくし短波長側での光の吸収が増加する条件を見い出すこと、(2)パッシベーション膜をシリコンナノワイヤ上に成膜し、パッシベーション膜の被覆性や安定性を調べることによって、パッシベーション膜の成膜条件や被覆性等の観点からシリコンナノワイヤのサイズについて検討することを予定していた。これらの検討については成長パラメータ及び光の表面反射の検討についてはおおむね順調に進展しており、さらにライフタイムの検討を行った。しかし、光の吸収及び被覆性については十分に検討できておらず次年度以降も引続き検討する予定である。また、H31(R元)年度以降に予定していた非真空プロセスで成膜可能なミストCVD法を用いて成膜したパッシベーション膜の成膜条件や熱処理条件とパッシベーション膜/シリコンの界面特性の関係については今年度着手することができており、次年度以降に予定しているパッシベーション膜/シリコンナノワイヤ構造に対して、有益な知見が得られたと考えている。H31(R元)年度には、(1)H30年度に検討したパッシベーション膜/シリコンナノワイヤ構造に対して、パッシベーション膜/シリコンナノワイヤの界面特性について検討する。H30年度に得られた知見と界面特性の検討結果からキャリアの再結合が抑制される条件を明らかにする。パッシベーション膜/シリコンナノワイヤ界面の電気特性評価には、C-V法やI-V法を用いて界面特性や絶縁特性について詳細に検討する。(2)より低コストの太陽電池を開発するために、従来太陽電池に用いられている成膜方法よりも大量生産が可能なLIAスパッタ法や非真空プロセスで成膜可能なミストCVD法を用いて成膜したパッシベーション膜や有機薄膜の被覆性や安定性についてもH30年度の検討をさらに推進する。R2年度には、(1)低コストに向けたパッシベーション膜に対して、パッシベーション膜/シリコンナノワイヤの界面特性と作製条件の関係を明らかにする。(2)これまでに検討したパッシベーション膜に対して、さらに太陽電池モジュールの作製プロセス中に受ける熱履歴に対してその熱安定性も検討し最終的に最適なパッシベーション膜/シリコンナノワイヤの組み合わせ及び作製条件を見い出し、変換高率の高いシリコンナノワイヤ太陽電池の実現を目指す。
マウス受精卵の発生と胚性ゲノムの活性化における転写因子NF-κBの役割

NF-κBは、細胞外部からの様々な刺激により活性化が誘導され、細胞質から核内へと移行する転写因子であり、アフリカツメガエルやニワトリ胚の発生を調節することが知られている。マウス着床前胚においても、その全発生段階でNF-κBが発現しており、1細胞期胚をNF-κB阻害剤で処理することにより2細胞期で発生が停止することが報告されている。従って、NF-κBがマウス着床前胚において、発生に必要な何らかの機能を担っている可能性が考えられる。本研究では、マウス着床前胚の発生過程におけるNF-κBの核内への局在時期を検討するとともに、核内に局在するNF-κBがDNAへの結合能を持つ活性型であるのか、またマウス着床前胚の発生におけるNF-κBの役割について検討した。マウス着床前胚に発現するNF-κBはRelA(p65)とp50サブユニットの二量体を構成している。免疫蛍光抗体法でp65の局在を検討した結果、1細胞期および2細胞期の後期、つまり胚性ゲノムの活性化時期に核内に強く局在するようになる。さらに、核内のNF-κBが実際に活性化されてDNAに結合する能力をもつのかについてゲルシフトアッセイで検討した。その結果、核内に局在する時期に強いDNA結合を発揮することから、この時期のNF-κBは活性型であることが判明した。次に、NF-κBがマウス着床前胚の発生にどのような影響をおよぼすのかについて、NF-κBのp65サブユニットのアンチセンスオリゴマーを用いて検討した530μMでの様々な濃度のホスホロチオエートオリゴマー(S-オリゴマー)を含む培養液でマウス1細胞期胚を培養した。20μM以上の濃度のアンチセンスS-オリゴマー処理胚は、2細胞期以降への発生が抑制された。無処理胚およびセンスS-オリゴマー処理胚は、2細胞期以降に高率に発生した。アンチセンスオリゴ処理によって2細胞期で発生を停止した胚では、p65の細胞内局在は全く観察されなかった。以上の結果より、1細胞期から2細胞期に発現しているNF-κBが4細胞期移行の分割に重要な役割を果たしていることが示された。今後、1細胞期および2細胞期後期の核内に局在し、DNA結合能を有するNF-κBが、実際に転写活性を発揮できるか、そしてどのような遺伝子発現を調節しているのかについて検討する必要がある。

従って、NF-κBがマウス着床前胚において、発生に必要な何らかの機能を担っている可能性が考えられる。本研究では、マウス着床前胚の発生過程におけるNF-κBの核内への局在時期を検討するとともに、核内に局在するNF-κBがDNAへの結合能を持つ活性型であるのかどうかについて検討した。NF-κBの核内への局在時期を免疫蛍光染色法で検討した結果、1細胞期から4細胞期にかけてNF-κBの核への局在が見られ、特に2細胞期後期において他の発生段階よりも強い蛍光が観察された。次に着床前の各発生段階においてNF-κBがDNA結合能を持つかどうかについて、ゲルシフトアッセイにより検討した。NF-κBは、1細胞期から4細胞期にかけてDNA結合能を持ち、特に1細胞期後期から2細胞期後期にかけてはそのDNA結合能が強いことが明らかとなった。着床前胚におけるNF-κBの二量体構成を検討するために、スーパーシフトアッセイを行った。その結果、RelA-p50という二量体構成のNF-κBの存在が示唆された。以上の結果から、マウス着床前胚においてはRelA-p50の二量体を構成するNF-κBが存在し、そして1細胞期後期から2細胞期後期にかけて核内に局在するNF-κBは、強いDNA結合能を持つことが示された。これらの結果から、NF-κBが着床前胚において何らかの遺伝子発現の制御に関与している可能性が示唆される。マウス着床前胚に発現するNF-κBはRelA(P65)とp50サブユニットの二量体を構成している。免疫蛍光抗体法でp65の局在を検討した結果、1細胞期および2細胞期の後期、つまり胚性ゲノムの活性化時期に核内に強く局在するようになる。さらに、核内のNF-κBが実際に活性化されてDNAに結合する能力をもつかについてゲルシフトアッセイで検討した結果、核内に局在する時期に強いDNA結合を発揮することが判明した。今回、NF-κBのマウス初期胚の発生にどのような影響をおよぼすのかについて、NF-kBのp65サブユニットのアンチセンスオリゴマーを用いて検討した。530μMでの様々な濃度のホスホロチオエートオリゴマー(S-オリゴマー)を含む培養液でマウス1細胞期胚を培養した。無処理対照区において、1細胞期胚のほとんどが4細胞期へ発生し(90%)、さらに約70%が胚盤胞へ発生した。25μMのアンチセンスS-オリゴマーで処理した場合、4細胞期以降への発生(47%)が抑制され、胚盤胞への発生は全く観察されなかった。一方、センスS-オリゴマー処理対照区では、無処理対照区に比べて4細胞期および胚盤胞期への発生は低下したが、その発生率(69%と46%)はアンチセンス処理区に比べて有意に高かった。ところが、2細胞期からS-オリゴマー(20μM)処理をした場合、アンチセンス処理によっても胚盤胞期への発生はほとんど影響されず、その発生率(68%)は、無処理対照区(72%)およびセンス処理区(75%)と比べて変わらなかった。次に、アンチセンスS-オリゴマー処理胚において、実際にp65m RNAの発現が抑制されているのかを、P65抗体による免疫蛍光抗体法で検討した。アンチセンスオリゴ処理によって2細胞期で発生を停止した胚では、P65の細胞内局在は全く観察されなかった。しかし、無処理対照区およびアンチセンス処理区の全ての2細胞期胚において、P65に対する蛍光シグナルが胚の細胞質及び核内に観察された。以上の結果より、1細胞期から2細胞期に発現しているNF-κBが4細胞期移行の分割に重要な役割を果たしていることが示された。
糖尿病ラットバルーン傷害におけるp38活性阻害による内膜肥厚と糖代謝への効果

本研究では,p38 MAP kinase(p38)の活性阻害が糖尿病性大血管障害の発症に加え進展予防にも有効な治療法となる可能性を明らかにするために,2型糖尿病モデル動物で肥満とインスリン抵抗性,高血糖を有するWistar fat tyrat(WF)の総頸動脈バルーン傷害モデルを用いて検討した.12週齢のWFとlittermateのWistar lean rat(WL)のバルーン傷害において,p38活性阻害薬FR167653(FR)30mg/kg/日経口投与群(FR群)では内膜肥厚面積は有意に抑制され,血糖とインスリン値,収縮期血圧値も有意な低下と体重減少が認められ,アディポネクチン値は有意に増加した.また,FR群のWFでは経口糖負荷試験により負荷後の血糖とインスリン値は低下した.しかし,食餌摂取量はFR投与の有無による差はなかった.大動脈では,WFの対照群ではWLに比べp38,ERK1/2,JNK,Rb,OREBのリン酸化とPCNAの発現が亢進していたが,WFのFR群ではこれらはいずれも低下した.また,WFのFR群ではeNOSの発現亢進が認められた.さらに,培養血管平滑筋細胞(VSMC)では,thrombinやPDGF-BB,TNF-αなどの刺激によるcyclooxygepase-2の発現と細胞遊走能,アラキドン酸遊離能の上昇は,いずれもFR添加により低下した,以上より,p38活性阻害薬FRがWFの生体内での代謝を亢進させ,糖代謝やインスリン抵抗性を改善し,血圧低下と体重減少,動脈硬化症の進展抑制をもたらしたものと考えられ,メタボリックシンドロームの治療薬として有用である可能性が示された.本研究では,p38 MAP kinase(p38)の活性阻害が糖尿病性大血管障害の発症に加え進展予防にも有効な治療法となる可能性を明らかにするために,2型糖尿病モデル動物で肥満とインスリン抵抗性,高血糖を有するWistar fat tyrat(WF)の総頸動脈バルーン傷害モデルを用いて検討した.12週齢のWFとlittermateのWistar lean rat(WL)のバルーン傷害において,p38活性阻害薬FR167653(FR)30mg/kg/日経口投与群(FR群)では内膜肥厚面積は有意に抑制され,血糖とインスリン値,収縮期血圧値も有意な低下と体重減少が認められ,アディポネクチン値は有意に増加した.また,FR群のWFでは経口糖負荷試験により負荷後の血糖とインスリン値は低下した.しかし,食餌摂取量はFR投与の有無による差はなかった.大動脈では,WFの対照群ではWLに比べp38,ERK1/2,JNK,Rb,OREBのリン酸化とPCNAの発現が亢進していたが,WFのFR群ではこれらはいずれも低下した.また,WFのFR群ではeNOSの発現亢進が認められた.さらに,培養血管平滑筋細胞(VSMC)では,thrombinやPDGF-BB,TNF-αなどの刺激によるcyclooxygepase-2の発現と細胞遊走能,アラキドン酸遊離能の上昇は,いずれもFR添加により低下した,以上より,p38活性阻害薬FRがWFの生体内での代謝を亢進させ,糖代謝やインスリン抵抗性を改善し,血圧低下と体重減少,動脈硬化症の進展抑制をもたらしたものと考えられ,メタボリックシンドロームの治療薬として有用である可能性が示された.#ラット頸動脈内膜肥厚モデル1.病理標本(i)内膜/中膜(I/M)比を計算(エラスティカ染色で内弾性板を境界)WLでのI/M比は,FR167653の投与によりコントロール群に比べ低下傾向を示した.また,WFのコントロール群のI/M比は,WLのコントロール群に比べ高値を示したがFR167653の投与によりコントロール群に比べ低下傾向を示した。2.血糖値の推移血糖値は,WLのコントロール群とFR167653群では差が見られなかった,しかし,WFのFR167653群では投与後3日目よりWFのコントロール群に比べ血糖値の低下を認めた。3.血圧と心拍数WFとWLのコントロール群に比べ,FR167653群では有意な低下が見られた。#ラット大動脈のexplant法によるoutgrowth率12週齢のWistar Fatty rat(WF)とそのlittermateのWistar Lean rat(WL)にFR167653を30mg/kg/日で経口投与した後,ラット大動脈を無菌的に摘出し大動脈中膜ブロック切片の作製[WFとWLの各々でコントロール群,FR167653群の計4群で(n=10ずつ)]し,培養フラスコに貼り付け10日間培養して切片からのoutgrowth率を測定したところ,preliminaryながらI/M比と同様に,WLでのoutgrowth率は,FR167653の投与によりコントロール群に比べ低下傾向を示した.また,WFのコントロール群のoutgrowth率は,WLのコントロール群に比べ高値を示したが,FR167653の投与によりコントロール群に比べ低下傾向を示した.

本研究では,P38 MAP kinase(P38)の活性阻害が糖尿病性大血管障害の発症に加え進展予防にも有効な治療法となる可能性を明らかにするために,2型糖尿病モデル動物で肥満とインスリン抵抗性,高血糖を有するWistar fatty rat(WF)の総頸動脈バルーン傷害モデルを用いて検討した.12週齢のWFとlitternateのWistar lean rat(WL)のバルーン傷害において,p38活性阻害薬FR167653(FR)30mg/kg/日経口投与群(FR群)では内膜肥厚面積は有意に抑制され,血糖とインスリン値,収縮期血圧値も有意な低下と体重減少が認められ,アディポネクチン値は有意に増加した.また,FR群のWFでは経口糖負荷試験により負荷後の血糖とインスリン値は低下した.しかし,食餌摂取量はFR投与の有無による差はなかった.大動脈では,WFの対照群ではWLに比べp38, ERK1/2, JNK, Rb, CREBのリン酸化とPCNAの発現が亢進していたが,WFのFR群ではこれらはいずれも低下した.また,WFのFR群ではeNOSの発現亢進が認められた.さらに,培養血管平滑筋細胞(VSMC)では,thrombinやPDGF-BB, TNF-αなどの刺激によるcyclooxygenase-2の発現と細胞遊走能,アラキドン酸遊離能の上昇は,いずれもFR添加により低下した.以上より,p38活性阻害薬FRがWFの生体内での代謝を亢進させ,糖代謝やインスリン抵抗性を改善し,血圧低下と体重減少,動脈硬化症の進展抑制をもたらしたものと考えられ,MetSの治療薬として有用である可能性が示された.
マウスにおける咀嚼動態の相違が包括的な糖代謝系に与える影響

本研究ではインスリンの構造と機能の観点から、咀嚼との関係を明らかにする。さらに、インスリンを介さない血糖調節するタンパクであるUCP-1、インスリン抵抗性と関連するアティポネクチンを測定することにより、咀嚼が包括的な糖代謝系に与える影響について検討する。
ヒト人工染色体を用いた血友病新規遺伝子治療法の開発

ヒト人工染色体を用いた遺伝子治療法は、従来のウイルスベクターを用いた方法とは異なり、がん化の懸念が無く、また、長期安定発現が期待できる。本研究では、血友病A患者由来滑膜細胞からiPS細胞を作製し、血友病Aの原因遺伝子である凝固第VIII因子を巨核球/血小板特異的に発現するシステムを搭載したHACベクター(FVIII-HAC)を導入した。FVIII-HAC導入患者由来iPS細胞を巨核球・血小板に分化誘導させたところ、VIII因子の発現が認められた。以上のことより、FVIII-HACと患者由来iPS細胞を用いた新規の遺伝子治療法への応用の可能性が示された。本研究は、宿主染色体とは独立かつ安定に保持され、自律複製するヒト人工染色体ベクター(HAC)を用いて、いまだ根治療法のない血友病Aに対する、安全性の高い遺伝子治療法を開発することを目的としている。本年度は、血友病患者由来滑膜細胞、および、これまでに樹立していた患者由来iPS細胞に対して微小核細胞融合法により治療用HACベクターの導入を行った。細胞融合後の薬剤選別の問題によりiPS細胞からのクローンを取得することはできなかったが、滑膜細胞からは14クローンを取得し、現在、そのうちの2クローンを用いてiPS細胞誘導を行っている。また、本治療用ベクターでは、中和抗体産生の抑制を期待して血小板特異的発現プロモーターを用いていることから、将来的に必要となるiPS細胞の巨核球・血小板への分化誘導系を立ち上げ、この血友病患者由来iPS細胞が分化能を有することを確認した。他方、マウスでの治療効果の検証のために、治療用MACベクターを導入したマウスiPS細胞を用いてキメラマウス作製を行ってきた。得られたキメラマウス骨髄細胞の免疫染色、および、in vitroでの巨核球・血小板への分化誘導によりMACベクターがVIII因子を発現することを確認した。しかしながら、キメラマウスの血液キメリズムが低く(5%程度)実際の治療効果の検証にまでは至らなかった。一方、コントロール実験としてのVIII因子強制発現系ベクターを用いて同様に作製したキメラマウスにおいては止血効果を認め、一定の治療効果を得ることができた。本研究は、宿主染色体とは独立かつ安定に保持され、自律複製するヒト人工染色体ベクター(HAC)を用いて、血友病Aに対する新規遺伝子・細胞治療法を開発することを目的としている。本年度は、これまでに樹立してきた治療用VIII因子搭載HACベクターを移入した患者由来滑膜細胞に対して、初期化4因子を用いてiPS細胞誘導を行い、ゲノムPCR解析および蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)解析の結果から3つの治療用候補クローンを取得した。続いて、RT-PCR法により代表的な未分化マーカーの発現を確認するとともに、ヌードマウス精巣にiPS細胞を移植してテラトーマ(腫瘍)形成能の確認を行い、候補クローンが未分化性を維持していることを確認した。また、得られたクローンが実際にVIII因子を発現するか否かを確認するために、iPS細胞をin vitroにおいて巨核球・血小板への分化誘導(本ベクターは、VIII因子の発現誘導に巨核球・血小板特異的発現プロモーターを用いている)を行った。発現特異性を確認するための対照実験として赤血球系への分化誘導も同時に行った。目的のVIII因子の発現については、いずれのクローンも、巨核球・血小板へ分化した細胞群においてのみ発現が認められ、対照群である赤血球系へ分化した細胞群および治療用HACベクター未保持細胞においては認められないことを確認した。以上の成果は全てin vitroの結果であり、実際の治療を想定した生体モデルを用いた検証までは至っていないが、VIII因子欠損(血友病A患者)ヒト滑膜細胞を由来とした治療用HACベクターを有するiPS細胞の誘導に成功し、遺伝子発現レベルにおいてはプロモーター誘導性にVIII因子の発現を認める結果を得た。今後は血友病モデルマウス(免疫不全バックグラウンド)を用いてin vivoにおいて、上記細胞により治療効果の検証を行っていく予定である。26年度が最終年度であるため、記入しない。血液内科学26年度が最終年度であるため、記入しない。高キメリズムのマウスを得ることに難航し、治療効果の検証まで進めることができず、また、患者由来細胞の方でも、治療用HACベクターを有するiPS細胞の取得まで至らなかったため。現在、よりキメリズムの高いマウスの作製を目指して、再度、血友病モデルマウス由来胎児繊維芽細胞を用いてiPS細胞を誘導中であり、今後は、取得できたiPS細胞クローンに治療用ベクターを導入後、キメラマウスを作製して治療効果の検証を進める。

また、患者由来細胞については、現在、治療用ベクターを有する滑膜細胞を用いてiPS細胞誘導を行っており、今後は、取得できたクローンをin vitroで巨核球・血小板へ分化誘導し、VIII因子の発現量や活性の測定を行っていく。