hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
やせ型若年層における短期的・長期的な疾患発生メカニズムの解明

肥満に伴う健康問題が広く知られる一方で、やせが必ずしも肥満よりも予後良好とは限らない可能性が指摘されている。近年では、若年層、ことに若い女性を中心に、やせ志向が目立ち、食事によるエネルギー摂取量の減少が見られており、その将来的な影響が懸念されている。本研究では健康な若年層を対象として、やせに見られる生活習慣の特徴を明らかにし、やせが健康状態に対して、短期的あるいは長期的にどのような影響を及ぼすのかについて検討を行う。
Ｓｌｃ６ａ１３によるヒポタウリン輸送の分子機構と新たな酸化ストレス治療戦略

本研究ではヒポタウリンの胎盤細胞(TR-TBT18d-1)における酸化ストレスに対する細胞保護効果を明らかした。その保護効果には抗ヒドロキシラジカル作用、抗ペルオキシラジカル作用が関与することが示唆された。さらに興味深いことに胎盤などの末梢臓器に発現するGABAトランスポーターのひとつであるSlc6a13が、H2O2誘起性酸化ストレスに対するヒポタウリンの細胞保護効果やアポトーシス抑制効果に関与しうることを明らかにした。前年度の研究成果より、Slc6a13を発現する胎盤細胞株においてヒポタウリンの酸化ストレスに対する細胞保護効果が示された。そこでヒポタウリンの細胞保護効果におけるSlc6a13の役割を明らかにするために、Tet-onシステムによるSlc6a13安定発現株の作成を行った。その結果、tetracyclineによる発現誘導時に、顕著なヒポタウリンおよび〔3H〕GABA取り込み活性上昇を示す安定発現細胞株を得た。そのSlc6a13安定発現株を用いて、ヒポタウリン添加時における細胞内ヒドロラジカル除去能を評価したところ、有意なヒドロキシラジカルの除去能の上昇が示された。さらにH2O2酸化ストレスに対する細胞保護能をMTTアッセイおよびWST-8アッセイにより検討した。両アッセイ共にSlc6a13発現誘導時には、ヒポタウリン添加により、有意な細胞保護効果が観察された。さらにその細胞保護効果について、DNA断片化を電気泳動法により確認したところ、Slc6a13発現誘導時にはヒポタウリン添加により、その断片化が抑制されることが確認された。これらから酸化ストレス(H2O2)に対して、Slc6a13が細胞内取り込みに寄与することにより、ヒドロキシラジカル除去能を増加およびアポトーシスの抑制が起こることにより細胞保護効果が得られることを明らかにした。ヒポタウリンの細胞保護効果を明らかにするために、Slc6a13が発現する胎盤関門モデル細胞株であるTR-TBT18d-1を用いて、ヒドロキシラジカルに対するヒポタウリン効果を検討した。その結果ヒポタウリンが過酸化水素処理に対する細胞毒性に対して、細胞保護効果を示すことを明らかにした。またヒポタウリンは過酸化水素および過酸化水素が惹起する細胞内ヒドロキシラジカル除去能、スーパーオキシドラジカル除去能を示した。ヒポタウリンは抗酸化剤として多能性を有しており、グルタチオン、タウリン、ビタミンC、システイン等と比較しても希有かつ強力な性質を持つことが示された。これらからヒポタウリンが、胎盤細胞内で複数の活性酸素種除去に働くことで細胞保護効果を示すことが示唆された。一方でRNA干渉法によりSlc6a13をmRNAレベルで約50%程度ノックダウンしたTR-TBT18d-1細胞を得ることに成功した。Slc6a13のさらなる効率的なノックダウン方法の確立やヒポタウリンの添加濃度や処理時間の最適化ののち、Slc6a13によるヒポタウリンの取込みが細胞保護に果たす役割を検討する予定である。Slc6a13に分子制御機構を解析するために、タンパク質レベルでの関連分子の探索を行った。我々は先行研究で足場タンパク質であるエズリンの欠損マウスにおける胎児-胎盤系におけるヒポタウリン濃度の減少を見出している。免疫沈降により検討したところ、胎盤におけるSlc6a13とエズリンの相互作用が示された。この相互作用はSlc6a13の輸送能へ影響を与えうることから、現在Slc6a13のアミノ酸配列からエズリンなど足場タンパク質と相互作用するドメインや、膜タンパク質のC末端におけるPDZドメインの変異体を作成し、それらのドメインが相互作用に与える影響について検討を行っている。ヒポタウリンによるTR-TBT18d-1において有効な細胞保護作用、抗酸化作用を示したことから、本実験系が薬剤や病態に起因する胎盤での酸化ストレスに対し、ヒポタウリンの細胞保護効果を測定するスクリーニング系として有効であることが示され、本項目に関し本年度の目標に到達している。胎盤におけるヒポタウリンおよびSlc6a13発現量の相関は、それぞれの測定方法を技術的に克服した段階であり、相関解析は終了していないものの概ね順調に計画は進行している。Slc6a13の発現制御機構は、解析に必要なSlc6a13の安定発現細胞の構築と評価方法の確立は達成し、発現量、細胞内局在解析が可能となった。各種シグナル伝達経路の阻害剤効果などを検討する段階にまで至っている。ただし、宿主細胞に内因性に発現している制御因子の評価には至っておらず、多面的に阻害剤効果を検討し、結果の蓄積を必要とする。Slc6a13ノックアウトの作製については、同時平行で行っているin vitroでの酸化ストレス研究の結果を受けて、ノックアウトマウス作製よりも、in vivoでの酸化ストレスレベルの測定やヒポタウリンや代替物による影響を検討することを優先であると考えられた。そのため、それらin vivo実験に必要な実験条件の検討を行い、順調に進行している。

今年度作成した胎盤細胞株TR-TBT18d-1を用いた評価系を用いて、薬剤や病態に起因する胎盤での酸化ストレスからの防御に対するヒポタウリンを中心とした抗酸化物質の有効性についてさらなる検討を行う。Slc6a13の分子制御機構の解析として、エズリンとの相互作用ついて、Slc6a13のC末領域とエズリンのFERM領域とのプルダウンアッセイによる相互作用評価を行っていく。またそれぞれのアミノ酸変異体を用いた相互作用部位の同定を目指す。さらにタンパク質相互作用が及ぼす機能への影響について、詳細な解析にする。そのために、よりよいホスト細胞の探索もしくはHEK293細胞に内因性に発現しているエズリンを阻害するとともに活性化体であるアミノ酸変異体を用いることで外因性エズリンによるSlc6a13の機能促進評価を達成する。現在in vivoでの酸化ストレスに対するヒポタウリンの効果を検討しているが、胎児-胎盤系のヒポタウリン濃度が低下するエズリンノックアウトマウスを用いることで、胎児胎盤の酸化ストレスレベルに対するヒポタウリンの影響を評価が可能であると考えている。酸化ストレスレベルはマロンジアルデヒド等の過酸化脂質測定キットなどを用いて評価を行う予定である。またヒポタウリンの母体への投与では、胎児中のヒポタウリン量を上昇させられないことが予備検討により明らかになっていることから、胎児の酸化ストレスに対するヒポタウリン代替物を投与することにより改善するかなどの検討を行っていく。また他臓器での解析に関してはin vivoノックダウン法の使用も検討していく。今年度作成した細胞系を用いて、さらなる薬剤や病態に起因する胎盤での酸化ストレスからの防御に対するヒポタウリンを中心とした抗酸化物質の有効性に関する検討に必要な細胞培養試薬や関連試薬等の購入に用いる。In vitroでの酸化ストレス研究の結果を受けて、ノックアウトマウス作製よりも、in vivoでの酸化ストレスレベルの測定やヒポタウリンや代替物による影響を検討することを優先しているため、繰越金が生じているが、今年度はin vivoでのヒポタウリンの酸化ストレス防御効果の解析を進めていく。そのために必要な試薬や動物購入・作製(導入)に使用する。Slc6a13の分子制御機構解明のために、必要な遺伝子導入、発現解析、タンパク質精製に関する試薬等を購入する。上述のin vitro実験およびin vivo実験で解析に必要な測定関連試薬、RI試薬等の購入に使用する。
分子認識機能団の部位特異的導入によるヘム蛋白質の機能変換

1.遷移金属イオンと強い錯化能を有するイミノニ酢酸基をプロトヘムのプロピオン酸部位にベンダントした修飾ヘムを合成した。2.この修飾ヘムが,アポシオグロビン,アポヘモグロビンに効率よく再構成されることがわかった。3.得られた再構成シオグロビンについては,遷移金属イオンを添加するとほぼ定量的に錯体を形成し,シオグロビン活性中心にある配促水のpkaを0.51.0低カさせることが示された。これはシオグロビン表面での金属イオンとの錯形成が,シオグロビンヘムポケットを少しだけ押し拡げていることを示唆している。4.このこととよい対応を示して,シオグロビン活性中心への電子移動速度(アスマルガン酸による還元で見積った)が,遷移金属イオンの結合によって10倍くらい加速された。また,この加速効果は,3で述べたpkaの変化の順とよい対応をなした。5.このような変化は,アルカリ金属,アルカリ土類金属では全く見られなかった。本年度は、タンパク質に導入する分子認識機能ユニットとしてイミノ二酢酸と、ボロノフェニルアラニンを修飾したヘム(補欠分子)を合成した。これらを再構成法によってミオグロビンに導入して、その応答挙動を定量的に評価した。それによるとイミノ二酢酸については、遷移金属イオンと強く錯化し、ミオグロビンへの電子移動を加速すること、ボロノフェニルアラニンについては、糖類と結合することによって、ミオグロビン分子全体を安定化するだけでなく、アニリンヒドロキシル化反応活性を増幅することが示された。また、ボロノフェニルアラニン修飾ヘムは、これまでうまくいかなかったアポヘモグロビンとの再構成が高収率で可能であった。この新しい修飾ヘモグロビンは、ミオグロビンと同様な糖類の結合による構造安定化を起こすことがわかった。ヘモグロビンのアロステリックな酸素結合活性をこのような外部環境の変化でコントロールできる可能性があるので来年度は、その点を重点的に研究する予定である。
全身に触覚を持つヘビ型ロボットによる複雑環境上での自律移動と作業の制御

今年度は,ヘビ型ロボットを用いてはしご昇降を行う制御を中心に研究し,その成果ついて論文発表,および学会発表を行った.ヘビ型ロボットによるはしご昇降の制御手法を提案し,開発したヘビ型ロボットを用いて実際にヘビ型ロボットによるはしご昇降を実現した.この手法では,単純形状を連結することではしごの段に安定的に乗ることができる形状を設計し,配線が絡まないようにしながら波を送るようにしてはしご昇降を実現している.さらに,その動作を実現するために,櫛状の外殻形状により滑らかな表面形状をもつヘビ型ロボットを開発した.これにより,ヘビ型ロボットの移動可能な環境を特に高さ方向に大きく拡大し,プラント点検や災害対応での活用という社会実装に向けて大きく貢献した.さらに,床を移動するためのcrawler-gaitから歩容を遷移してはしごに取り付くための制御手法を提案した.この手法により,ヘビ型ロボットが異環境を跨いで移動できるようになり,適用環境が大幅に拡大した.ここの環境での移動を実現する手法は多く提案されているが,このように異なる環境間を跨いで移動する手法はあまり研究されておらず,本研究成果は重要である.また,形状が未知のはしごにも適用できるようにヘビ型ロボットが自ら梯子の形状を判断して移動できる必要がある.そこで,ヘビ型ロボットの先頭リンクにセンサを搭載し,梯子を自律移動するための手法を提案した.今年度は,ヘビ型ロボットを用いてはしご昇降を行う制御を中心に研究し,その成果ついて論文発表,および学会発表を行った.ヘビ型ロボットによるはしご昇降の制御手法を提案し,開発したヘビ型ロボットを用いて実際にヘビ型ロボットによるはしご昇降を実現した.さらに,その動作を実現するために,櫛状の外殻形状により滑らかな表面形状をもつヘビ型ロボットを開発した.本研究成果は,まず,垂直はしごを昇降するための制御手法とシミュレーションでの実証結果について,第62回システム制御情報学会研究発表講演会にて口頭発表を行った.この発表により,SCI'18学生発表賞を受賞している.また,手法を斜めのはしご昇降にも適用できるように拡張し,新たなヘビ型ロボットの設計と実機実験の成果を加えたものを国際学会のIEEE/RSJ International Conference on Intelligent Robots and Systemsにおいて口頭発表を行った.さらに,床を移動するためのcrawler-gaitから歩容を遷移してはしごに取り付くための制御手法を提案した.この手法により,ヘビ型ロボットが異環境を跨いで移動できるようになり,適用環境が大幅に拡大した.この動作を実現し,2018年11月2日に行われた第7回ImPACT TRCフィールド評価会にてデモンストレーションを行った.この研究成果に関する論文を現在執筆中である.また,形状が未知のはしごにも適用できるようにヘビ型ロボットが自ら梯子の形状を判断して移動できる必要がある.そこで,ヘビ型ロボットの先頭リンクにセンサを搭載し,梯子を自律移動するための手法を提案した.ヘビ型ロボットによるはしごの自律移動制御について論文を執筆し,投稿する.触覚情報を用いて環境形状に体形をなじませる手法を提案し,多様な形状の配管の自律移動手法の構築に取り組む.手法の構築には理論的な考察とともに物理シミュレーションによる検証を行う.手法の構築と並行し,全身に触覚を持つヘビ型ロボットを開発を進める.まずは4リンク程度のプロトタイプ機を開発し,センサの精度や特性を把握する.プロトタイプで明らかにした改善点を反映することで全身に触覚をもつヘビ型ロボットを開発する.開発したヘビ型ロボットを用いて実機実験を行い,提案手法の有効性を検証する.今年度は,ヘビ型ロボットを用いてはしご昇降を行う制御を中心に研究し,その成果ついて論文発表,および学会発表を行った.ヘビ型ロボットによるはしご昇降の制御手法を提案し,開発したヘビ型ロボットを用いて実際にヘビ型ロボットによるはしご昇降を実現した.この手法では,単純形状を連結することではしごの段に安定的に乗ることができる形状を設計し,配線が絡まないようにしながら波を送るようにしてはしご昇降を実現している.さらに,その動作を実現するために,櫛状の外殻形状により滑らかな表面形状をもつヘビ型ロボットを開発した.これにより,ヘビ型ロボットの移動可能な環境を特に高さ方向に大きく拡大し,プラント点検や災害対応での活用という社会実装に向けて大きく貢献した.さらに,床を移動するためのcrawler-gaitから歩容を遷移してはしごに取り付くための制御手法を提案した.この手法により,ヘビ型ロボットが異環境を跨いで移動できるようになり,適用環境が大幅に拡大した.ここの環境での移動を実現する手法は多く提案されているが,このように異なる環境間を跨いで移動する手法はあまり研究されておらず,本研究成果は重要である.また,形状が未知のはしごにも適用できるようにヘビ型ロボットが自ら梯子の形状を判断して移動できる必要がある.そこで,ヘビ型ロボットの先頭リンクにセンサを搭載し,梯子を自律移動するための手法を提案した.今年度は,ヘビ型ロボットを用いてはしご昇降を行う制御を中心に研究し,その成果ついて論文発表,および学会発表を行った.ヘビ型ロボットによるはしご昇降の制御手法を提案し,開発したヘビ型ロボットを用いて実際にヘビ型ロボットによるはしご昇降を実現した.さらに,その動作を実現するために,櫛状の外殻形状により滑らかな表面形状をもつヘビ型ロボットを開発した.本研究成果は,まず,垂直はしごを昇降するための制御手法とシミュレーションでの実証結果について,第62回システム制御情報学会研究発表講演会にて口頭発表を行った.

この発表により,SCI'18学生発表賞を受賞している.また,手法を斜めのはしご昇降にも適用できるように拡張し,新たなヘビ型ロボットの設計と実機実験の成果を加えたものを国際学会のIEEE/RSJ International Conference on Intelligent Robots and Systemsにおいて口頭発表を行った.さらに,床を移動するためのcrawler-gaitから歩容を遷移してはしごに取り付くための制御手法を提案した.この手法により,ヘビ型ロボットが異環境を跨いで移動できるようになり,適用環境が大幅に拡大した.この動作を実現し,2018年11月2日に行われた第7回ImPACT TRCフィールド評価会にてデモンストレーションを行った.この研究成果に関する論文を現在執筆中である.また,形状が未知のはしごにも適用できるようにヘビ型ロボットが自ら梯子の形状を判断して移動できる必要がある.そこで,ヘビ型ロボットの先頭リンクにセンサを搭載し,梯子を自律移動するための手法を提案した.ヘビ型ロボットによるはしごの自律移動制御について論文を執筆し,投稿する.触覚情報を用いて環境形状に体形をなじませる手法を提案し,多様な形状の配管の自律移動手法の構築に取り組む.手法の構築には理論的な考察とともに物理シミュレーションによる検証を行う.手法の構築と並行し,全身に触覚を持つヘビ型ロボットを開発を進める.まずは4リンク程度のプロトタイプ機を開発し,センサの精度や特性を把握する.プロトタイプで明らかにした改善点を反映することで全身に触覚をもつヘビ型ロボットを開発する.開発したヘビ型ロボットを用いて実機実験を行い,提案手法の有効性を検証する.
性染色体上マーカーの分子生物学的解析と法医学試料への応用

1)X及びY染色体の様々な遺伝子部位に対するプライマーの有用性を比較検討する目的で、DXZ-1、DYZ-1、DYZ-3、PAB Amelogenineをそれぞれ増幅するプライマーを作製し、PCR法にて性別判定と個人識別を行なった。実験的に作製した血痕と長期間常温で保存された白骨を試料として、(1)経時的変化、(2)量的問題について検討した。結果、1ゲノム中のコピー数が多くかつ、増幅領域が短い部位での判定が最も効率がよかった。3)実験的に作製した精液斑と実際の性犯罪の混合試料を試料として、ABO式血液型判定ならびにY染色体上のマイクロサテライトを用いて被疑者の同定を試みた。結果、被害者と混合した試料からでも正確な型判定と個人識別が可能となった。
骨随由来細胞移植による潰瘍性大腸炎治療の実験的研究

骨髄由来幹細胞による潰瘍性大腸炎治療の可能性を検討するために、BALB/Cマウスに1200cGyの放射線照射後、全身の細胞にgreen fluorescence protein : GFPを発現しているトランスジェニックマウスの骨髄細胞を移植し、キメラマウスを作成して骨髄由来細胞の胸腹部臓器への分布を検討した。骨髄移植1ヶ月後の骨髄キメラ率は90%に達し、このとき骨髄、肝、膵、小腸、腎、肺およびリンパ系各臓器へのGFP蛍光陽性細胞の分布が観察され、血管内皮細胞、マクロファージなどへの分化傾向を観察した。免疫染色、蛍光顕微鏡あるいは共焦点顕微鏡による観察では、リンパ系臓器である胸腺、脾臓、リンパ節、小腸粘膜下リンパ組織などでは骨髄由来の細胞が速やかに供給され多くのGFP陽性細胞を認めるのに対して、肝、膵、小腸、腎、肺などの上皮に分化する細胞は極めて少数であった。特に小腸では放射線照射後に粘膜高が減少し絨毛のやせを認め、小腸粘膜下に多数のGFP陽性細胞をみとめた。これらの多くはB細胞であることが確認され、また粘膜上皮間T細胞におけるGFP発現も観察された。一方、間質の血管内皮にもGFP陽性細胞を認めたが、上皮組織への分化は認めなかった。大腸粘膜腺管細胞へ分化誘導可能な骨髄細胞中の幹細胞を誘導、潰瘍性大腸炎の治療に応用できるかどうかを検討することを目的とし、B6マウスを用いて潰瘍性大腸炎モデルを作成、大腸粘膜細胞の再生における骨髄細胞の関与について検討している。方法:B6マウスの体重を測定後B6マウス及びキメラマウス(B6マウスをレシピエントとし,1200cGy放射線照射後にグリーンマウスから分離した骨髄細胞を移植したもの)に4%dextran sulphate sodium(DSS)を7日間経口投与し潰瘍性大腸炎モデルを作成する。投与終了後より1,3,7,14,28日目にそれぞれ3匹ずつ屠殺し、全大腸を摘出、屠殺時の体重、下痢、血便の有無を記録、摘出した大腸の凍結切片、パラフィン切片を作成し、検鏡する。現在までの結果:B6マウスでは、3日目には粘膜上皮の欠損、消失、疲弊が散在性に認められ、粘膜固有層ではcryptの消失および好中球、リンパ球を主とした炎症性細胞浸潤が広範囲に認められた。粘膜下リンパ節腫大も認めた。6日目には粘膜のびらん、潰瘍は再生され、粘膜固有層のcryptもほぼ正常と思われるまで回復し、炎症性細胞浸潤も認められなくなった。7日目には粘膜欠損部には正常粘膜からの移入、あるいはcryptから供給されたと考えられるような細胞の浸潤が認められ、粘膜再生にある段階と考えられた。また粘膜損傷を受けたと考えられる部位の固有層には軽度の炎症性細胞を認めた。一方キメラマウスについては評価に耐えうる生存例がまだ得られていない。今後検討予定である。骨髄由来幹細胞による潰瘍性大腸炎治療の可能性を検討するために、BALB/Cマウスに1200cGyの放射線照射後、全身の細胞にgreen fluorescence protein:GFPを発現しているトランスジェニックマウスの骨髄細胞を移植し、キメラマウスを作成して骨髄由来細胞の胸腹部臓器への分布を検討した。
単離骨格筋線維内における小胞輸送動態の超解像ナノ計測手法の確立

本研究では,マウスより単離/培養した骨格筋線維内において、空間分解能6 nmというナノ計測を単一分子レベルで実現し,GLUT4およびトランスフェリン受容体分子の輸送動態を定量的に計測することに世界で初めて成功した.また,これまで電子顕微鏡に依存してきた微細構造の観察が超解像顕微鏡により達成できることを確認した.これらの研究成果は,構造的に特殊なためライブイメージング解析が困難であった骨格筋のオルガネラ膜や輸送小胞の細胞生物学的研究に大きく貢献するものである.本研究課題では,骨格筋ファイバー内における小胞輸送動態を定量的に解析できる単一分子視覚化ナノ計測系を構築することを目的としている.H26年度は,骨格筋において生理的に重要な役割を担っているインスリン応答性糖輸送担体(GLUT4)の運搬に関わる輸送小胞を蛍光ナノ材料である量子ドット(Qdot)にて特異標識する技術を確立することと,単離筋ファイバー内のライブイメージング観察系を構築することの2つの研究開発を行った.骨格筋内のGLUT4分子を単一分子レベルで可視化するために骨格筋特異的にTag付加タイプの遺伝子改変型GLUT4 (myc-GLUT4-EGFP)を発現するトランスジェニック(Tg)マウスを作製した.そして,このTgマウスのヒラメ筋と長指伸筋よりライブイメージング観察に適した健全な骨格筋ファイバーを単離する手法を確立した.さらにこの単離筋ファイバー内の上記myc-GLUT4をQdot標識抗myc抗体で特異的に標識することにより骨格筋ファイバー内での小胞輸送動態をライブイメージング観察することに成功した.また,このTgマウスの骨格筋を単離後に各種の細胞内オルガネラ膜を免疫染色してG-STED顕微鏡を用いた超解像イメージングに最適化した観察できる手法を確立した.さらに,上記は単離した筋ファイバーでの顕微鏡観察系であるが,加えて多光子顕微鏡を用いることにより,生きたTgマウスの大腿四頭筋でのGLUT4-EGFP輸送過程をライブイメージング解析することにも成功した.本研究では,マウス骨格筋組織より単離した筋線維内における小胞輸送の動態を高精度にて定量評価できる超解像ナノ計測手法を確立することを目的とした。特に,生理的に重要な役割を果たすグルコーストランスポーター4(GLUT4)含有小胞の膜移行現象の観察系を中核に据えて,再循環エンドソーム(トランスフェリン受容体:TfRを指標)の輸送動態を同時に定量解析することを試みた.遺伝子改変型myc-GLUT4を骨格筋特異的に発現するトランスジェニックマウスを作製し,その骨格筋繊維内のGLUT4を量子ドットにて標識/ナノ計測解析できる一連の手法を確立した.そして,インスリンや電気パルス誘導性筋収縮活動の刺激を与えた際のGLUT4輸送小胞の動態変化を世界で初めて単一分子レベルで定量理解することに成功した.さらに,異波長量子ドットにてTfRをGLUT4とともに同時に標識することにより,輸送特性を異にする2つの小胞輸送系の各々分子動態を定量的に比較解析することも可能にした.これらの研究により刺激応答性のGLUT4輸送系の賦活化機序について新たな視点から理解することができた.また,超解像顕微鏡(G-STEDとN-SIM)を駆使することにより,GLUT4とTfRに加え,T-tubuleの超微細構造の観察を組み合わせることにより分子動態生理データと超解像データの統合理解を行った.よって,本研究の達成により,構造的にも機能的にも極めて複雑な骨格筋線維内の小胞輸送系研究に画期的な貢献をもたらす重要な成果を得ることができた.本研究では,マウスより単離/培養した骨格筋線維内において、空間分解能6 nmというナノ計測を単一分子レベルで実現し,GLUT4およびトランスフェリン受容体分子の輸送動態を定量的に計測することに世界で初めて成功した.また,これまで電子顕微鏡に依存してきた微細構造の観察が超解像顕微鏡により達成できることを確認した.これらの研究成果は,構造的に特殊なためライブイメージング解析が困難であった骨格筋のオルガネラ膜や輸送小胞の細胞生物学的研究に大きく貢献するものである.骨格筋ファイバーは他の細胞と大きく異なり,構造的に極めて特殊な形態を呈している.特に細胞内オルガネラ膜構造は階層的に整然と配列しているものの,それらの間を往来する輸送小胞の運搬動態に関する解析については,観察の困難さからほとんど手つかずままである.本年度は骨格筋の生理学的役割として最も重要な小胞輸送制御系の一つであるGLUT4輸送動態を定量的にナノ計測解析することを可能にするために,生筋ファイバー内におけるGLUT4をQdotで特異標識してライブイメージング観察することに成功しており,この革新的な手法を駆使することにより,インスリンや収縮運動といった刺激に伴うGLUT4輸送動態の変動を定量的に解析することが世界で初めて可能となった.さらに, G-STED顕微鏡をもちいた筋ファイバー内のGLUT4輸送小胞の超解像観察も達成することができた.これらの解析基盤をもとにしてこれまで未解明であった骨格筋ファイバーにおける小胞輸送制御に関する研究を著しく進展させることができると考えている.分子糖尿病学H

27年度は,これまでの研究開発によって独自に構築した骨格筋ファイバー内でのQdot標識GLUT4分子のナノ計測解析系と,超解像顕微鏡観察系を組み合わせたより生理学的な研究を推進する.特に,骨格筋が示す最も重要な生理的応答の一つである運動効果,特に運動刺激後に観察されるインスリン感受性の亢進現象に関わる生体ナノシステム制御メカニズムの解明に着手する.GLUT4分子に加え,異波長Qdot標識トランスフェリン受容体を同時に可視化ナノ計測解析する.さらに,初期・選別・後期エンドソームや,トランスゴルジ網を経由した輸送小胞といった各種の小胞群も同時に可視化して,それらの構造的・機能的なダイナミクス制御を理解することに挑戦する.そして,分子動態生理学的データと超解像イメージングデータを精密に定量解析することにより,新しい学問体系ともなる「分子動態生理学」の研究手技と概念を構築したい.
Runx2・Runx3を基点とした軟骨変性のシグナルネットワークの解明

転写因子Runx2, Runx3が関節軟骨で果たす役割についてin vivo, in vitroで解析した。まずRunx2-floxマウスを作出し、設計通りのノックアウトが起きることを確認した。次にRunx3-floxマウスとともに、薬剤誘導性軟骨細胞特異的Creマウスと交配させ、変形性関節症モデルなどを作成したところ、いずれもノックアウトによって変形性関節症の進行は促進した。in vitroの実験系では、これらの転写因子は軟骨分化を促進させ、基質産生を促す作用があることが確認できた。Runx2-floxマウスの作出を終え、CAG-Creなどとの交配にて実際にRunx2遺伝子が不活性化されることを確認した。Runx2-floxについてはCol2a1-CreERT2と交配させ、変形性関節症モデルの解析の準備を行っている。Runx3-floxマウスについてはCol2a1-CreERT2との交配を終え、現在変形性関節症モデルの解析を進めているが、Runx3のノックアウトによって変形性関節症が亢進することが明らかとなった。in vitroではRunx2, Runx3をDOX誘導性に発現する軟骨細胞株を作出し、分化段階の各フェーズで過剰発現させ、軟骨基質遺伝子や軟骨基質変性関連遺伝子、増殖関連遺伝子、アポトーシス関連遺伝子にどのような変化がみられるかを解析した。またRunx2, Runx3の3末端に3xFLAGタグを付けた同様の軟骨細胞株も作成し、クロマチン免疫沈降法シーケンスを行う準備を終えた。Runx2, Runx3のコンディショナルノックアウトマウスが問題なく作動することを細胞培養レベル、生体レベルの両方で確認した。薬剤誘導性の軟骨特異的Creマウス(Col2a1-CreERT2)とRunx2-flox, Runx3-floxをそれぞれ交配させ、生後7週間の段階でタモキシフェンを投与し、翌週変形性膝関節症モデルの手術を行い、さらに2ヶ月の経過を経てサクリファイスして解析を行った。するとRunx3のコンディショナルノックアウトマウスでは変形性関節症が促進するのに対して、Runx2のコンディショナルノックアウトマウスではややばらつきがある中でもその逆の結果が得られることが判明した。現在はnを増やして再現性を確認するとともに、変形性関節症モデルではなく自然経過の中での関節軟骨変性についても検証を行っている。またそのメカニズム解明の作業については、Runx2, Runx3のC末端に3xFLAGタグを付加した発現ベクターを作成し、さらにこれを薬剤誘導性レンチウイルスベクターにした。現在これらのシステムを用いて今後マイクロアレイ、ChIPシーケンスを行う予定である。Runx2-flox, Runx3-floxマウスを軟骨特異的Creマウスと交配させたところ、コンディショナルノックアウトマウスとして生体レベルでも問題なく作動することが確認された。薬剤誘導性の軟骨特異的CreマウスとRunx2-flox, Runx3-floxをそれぞれ交配させ、生後7週間の段階で誘導をかけて翌週に変形性膝関節症モデルの手術を行い、2か月の経過を経てサクリファイスして解析を行ったところ、いずれもマウスでも変形性関節症の進行に差が見られることが判明した。モデル手術を行わず経年的な変化を観察した群でも、同様の変化が見られることが判明した。メカニズム解析のためRunx2, Runx3の薬剤誘導性過剰発現細胞株を作成して検討したところ、いずれも軟骨細胞の同化作用に関連した作用がみられることが判明した。一方で軟骨基質分解酵素の発現など、異化作用に関する影響は比較的少なかった。メカニカルストレスに対する応答を細胞培養レベルで検証することを試みたが、研究期間内に一定の傾向を見出すことはできなかったため、今後の研究プロジェクトにおいて適宜行う予定である。アポトーシス関連分子など、細胞生存に関する作用については、少なくとも軟骨細胞においては目立ったものはないと考えられた。セネッセンスなど加齢性変化については詳細に解析するに至らず、こちらも今後の後継プロジェクトの中で検討していくこととする。メカニズムの解明に関しては当初の予定より若干の遅れが出ているが、in vivoの解析ではRunx2, Runx3とも表現型が定まりつつあり、おおむね順調と考えられる。27年度が最終年度であるため、記入しない。整形外科学前年度に引き続き、Col2a1-CreERT2マウスと、Runx2-flox, Runx3-floxマウスを用いて、変形性関節症モデルと自然経過モデル、さらに炎症モデルを作成し、Runx2, Runx3それぞれの役割を比較検討する。またin vitroでも、これらの系を再現して解析を行う。in vitroメカニカルストレスモデルについては、現有する周期的細胞圧縮装置(ストレックス社)を用いて行う。申請者らは培養軟骨細胞に1Hz, 10%の圧縮を一定時間行うことで軟骨変性マーカーが誘導される系を確立しており、本研究ではそれぞれのマウスから採取した初代培養軟骨細胞を用いてメカニカルストレスを負荷し、mRNAレベル、タンパクレベルで変性マーカーの発現量を検討する。エイジングについては、in vivoでは生後25, 50週での膝関節軟骨組織を解析する。in vitro

炎症モデルについては、IL-1β, TNF-αなどの炎症性サイトカインを初代培養細胞の培地に添加し、MMP-13やADAMTS-5などの変性マーカーを中心に発現量をmRNAレベル、タンパクレベルで解析する。また初代培養組織では炎症性サイトカイン添加後の上清中の遊離アグリカン量をELISAにて定量し、関節軟骨の変性を定量的に評価する。また3xFLAGを付加したベクターを用いて、マイクロアレイ、ChIPシーケンスを行い、Runx2, Runx3の標的遺伝子を網羅的に解析する。最後にこれらの解析結果を総合的に評価し、関節軟骨の維持、変性におけるRunx2, Runx3の役割を俯瞰し、その機能の全貌を明らかにする。マウスの繁殖も想定通りであり、Runx3については表現型の評価が固まりつつある。in vitroでも、Runxのメカニズムを詳細に解析するためのシステムは構築できた。27年度が最終年度であるため、記入しない。Runx3についての表現型は再現をとりつつ、Runx2のin vivoでの表現型を解析する。平行して、これまでに構築した細胞株を用いて、Runx2, RUnx3の標的遺伝子の相違を解析し、in vivoで見られた現象の背景を調べていく。本年度の計画がおおむね順調に進み、次年度計画のための資金とした。クロマチン免疫沈澱法シーケンスを行うために必要な試薬、機器類。遺伝子解析に必要な試薬、機器類など。
弱い分子間力を正確に記述する第一原理分子動力学法の開発

密度汎関数理論(DFT)は分散力を記述できない。よく行われる経験的な分散力補正は新しい系への適用が難しい。そこで本研究では、電子密度応答関数に対する局所近似(Local Response)に基づいて分散力(Dispersion)を非経験的に算出するLRD法を考案し、弱い相互作用を高精度かつ効率的に記述できる新しい手法を開発した。LRD法は分子中の原子間分散力係数を基底状態電子密度の汎関数として与える。さらに、多中心相互作用への拡張や自己無撞着的解法の実装を行い、複雑な分子集合体の高精度量子化学計算を可能にした。水素結合やvan der Waals結合は,DNAやタンパク質の高次構造を支配している.また機能性タンパク質は,これらの弱い分子間力を利用して分子認識を実現している.生化学やナノマテリアルの分野において,分子間力が果たす役割は極めて大きい、状の電子状態理論では,弱い分子間力の取り扱いに大きな困難が伴う.互いに相容れない計算精度と計算コストに課せられる要請が原因である。本研究の目的は,この困難を克服し,弱い分子間力による構造揺らぎと強い化学結合の組み替えがカップルする,生体分子やナノマテリアルの物質変換過程をシミュレートするための,高速かつ高精度な計算手法を開発することである.密度汎関数理論(DFT)は現在最も良く用いられている分子理論であり,大規模系の電子状態計算において多くの場合優れたコストパフォーマンスを示す.しかし弱い分子間相互作用の記述が著しく悪い.それは長距離電子相関である分散力の記述が困難なためである.経験的な分散力補正がよく行われるが,新しい系への適用は困難である.このような背景を踏まえ,私は局所応答(Local Response)近似[Phys.Rev.Lett.76,1780(1996)]に基づいて分散力(Dispersion)を非経験的に算出するLRD法を考案し,弱い相互作用の高精度かっ効率的な計算を可能にした.LRD法は,分子中の原子間分散力係数を基底状態電子密度の汎関数として与える.任意の構造に適用可能であり,原子半径や原子分極率などの経験的物理量を一切必要としない.小さな計算コストで,分散力エネルギーの第一原理計算を可能とする.これを希ガス原子対やベンゼン二量体,核酸塩基対などの相互作用に適用し,相互作用エネルギーを高精度に再現することを確認した.局所密度近似や一般化勾配近似に基づく密度汎関数理論(DFT)は弱い相互作用の記述に問題がある。それは長距離電子間相互作用である分散力を記述できないからである。経験的な分散力補正がよく行われるが、新しい系への適用は困難である。このような背景を踏まえ、本研究では、電子密度応答関数に対する局所近似(Local Response)に基づいて分散力(Dispersion)を非経験的に算出するLRD法を提案し[1]、弱い相互作用を高精度かつ効率的に記述できる新しい計算手法を開発した。理論の中核を担うのは分子中の有効原子分極率であり、これは標準的な数値積分法によって容易に計算できる。原子半径や原子分極率などの経験的物理量を一切用いずに、任意の構造について系の電子状態を考慮に入れた分散力の計算が可能である。さらに、多中心相互作用への拡張[2]や自己無撞着的解法の実装を行い、複雑な分子集合体の高精度量子化学計算を可能にした。これにより、自己集合現象や生体分子の機能構造形成など、分散力が主要な役割を果たすメソスケールの現象の解明に貢献できると考えている。今後この方法を第一原理分子動力学計算に拡張し、生体分子のテラヘルツスペクトルのシミュレーション等に応用していきたい。
フランス古典悲劇における「歴史」の詩学

人文主義の成果としての翻訳や概説書などが、フランス17世紀の悲劇作品の受容の条件である歴史的教養を形成する素地となっていたことを明らかにした上で、真実らしさの概念をめぐり、フィクションと史実の混交という問題について、小説と悲劇という異なるジャンルにおいて相似の議論が展開されていたことを示した。さらに、古典悲劇と歴史小説というジャンルの成立期に歴史的教養が果たした役割を検証し、人物の内面を精密に分析するモラリスト的傾向を指摘するとともに、ロマネスク悲劇と歴史悲劇の位相の違いを、英雄小説と歴史小説の差異と比較することにより、より広い文化的文脈において説明した。コルネイユやラシーヌに代表される17世紀フランスの歴史悲劇を対象として、その創作の原理と実際、さらに受容のあり方を探るため、以下のような研究を行った。人文主義的歴史観(16世紀から受け継がれた、歴史に政治的・道徳的教訓を求める態度)と17世紀における歴史悲劇ジャンルの確立を関連づけて考察するために、当時の悲劇の観客や読者が有していたであろう歴史的教養の実際を探ることが必要であると考えた。この目的のために、17世紀の聴衆や読者に作品理解の前提となる歴史的知識を提供していたと考えられる書物(古代の歴史書の翻訳、概説書、提要の類)について文献調査を行った。ニコラ・コエフトーの『ローマ史』(1621年)、ペロ・ダブランルールの翻訳によるタキトゥスの『年代記』(1650-1651年)などである。その一方で、17世紀フランスにおいて歴史悲劇の創作と受容の知的土壌を準備したと思われる文人や作家の影響についても文献に基づき検証を試みた。バルザックが1630年代に展開した一連の「ローマ人論」(1644年出版の『作品集』所収)や歴史論(「歴史の有用性について」、1657年出版の『対談集』所収)などである。この他、書簡なども手がかりにして、『ル・シッド』論争(1637年)の後沈黙していたコルネイユが悲劇の主題としてローマ史を選択するにあたり、バルザックが影響を与えた可能性について検証を行うことができた。コルネイユやラシーヌに代表される17世紀フランスの歴史悲劇を対象として、その創作の原理と実際、さらに受容のあり方について総合的な考察を行うため、以下のような研究を行った。従来アリストテレス詩学の枠内で論じられてきた「真実らしさ」という概念をフランス17世紀の小説理論と関係づけて考察することにより、フィクションと歴史の関係についてジャンルの違いを超えた共通の関心が存在し、創作のレベルで重要な議論が展開されていたことを示すことができた。スキュデリー嬢に代表される英雄小説の「詩学」においては、フィクションに史実を混交させることにより、読者に「嘘」を信じさせることができる、考えられている。ここで「歴史」は「見せかけの真実」として利用されるにすぎない。この考えを悲劇ジャンルにおける議論と関連させて考察することにより、古典悲劇と歴史小説というジャンルの成立期に「歴史的教養」が果たした役割を検証した。また、17世紀における「ロマネスク」悲劇と歴史悲劇の位相の違いを、小説の創作理論と関連づけて考察することにより、より広い文化的文脈において説明することができた。コルネイユやラシーヌに代表されるフランス17世紀の歴史悲劇を対象として、その創作の原理と実際、さらに受容のあり方を探るため、以下のような研究を行った。人文主義が一般読者にもたらす恩恵としての翻訳、概説書、提要など、古典古代の作品を俗語(=フランス語)で享受することのできる環境が、フランス17世紀の悲劇作品の受容の条件である歴史的教養を形成する素地となっていたことを明らかにした上で、悲劇作家が自作の擁護のために主張する「歴史への忠実さ」というトポスが、観客や読者の有する予備知識と作品の主題(=筋立て)との合致を意味するものであったこと、悲劇作家がこの「通念」を十分に意識して創作していたことを明らかにした。その一方で、従来の研究においてアリストテレス詩学の枠内で論じられてきた「真実らしさ」という概念を17世紀の小説と関係づけて考察することにより、フィクションと歴史の関係についてジャンルの違いを超えた共通の関心が存在し、創作に関わるレベルで重要な議論が展開されていたことを示した。特に、1660年代以降の悲劇と歴史小説の共通点として、人物の内面を精密に分析する「モラリスト的」傾向に着目し、フランス歴史小説の最初の成功作である『ドン・カルロス』の作者サン=レアルの著書『歴史の用途』における主張(歴史家は人間の心を解剖し、その複雑なメカニスムを明らかにする存在である)とラシーヌの歴史悲劇における主要人物の克明かつ繊細な心理描写の実践に明らかな呼応関係があることを指摘した。小説における歴史とフィクションの混交という問題について、17世紀における小説論の流れと歴史小説のジャンルとしての特徴を明らかにすることができた。

さらに、この問題を17世紀悲劇の創作論と対比させることにより、小説と悲劇というジャンル間の相互影響関係について明らかにすることができた。以上の点で、おおむね満足のいく進展であったといえる。フランス文学1660年代以降の悲劇と歴史小説の共通点として、人物の内面を精密に分析するモラリスト的傾向を挙げることができる。フランス歴史小説の最初の成功作といえる『ドン・カルロス』の作者サン=レアルは歴史に求められてきた政治的教訓という有用性をはっきりと否定した上で、歴史家は人間の心を解剖し、その複雑なメカニスムを明らかにする存在であると主張している。この主張は同時期に書かれたラシーヌの一連の歴史悲劇(『ブリタニキュス』[1669]、『ベレニス』[1670]、『バジャゼ』[1672]、『ミトリダート』[1673])における主要人物の心理分析の例と見事に呼応している。このように歴史のモラリスト的解釈が重視された背景とその文学作品への影響について考察する予定である。コルネイユやラシーヌが自作を弁護する際に頻繁に用いる「歴史への忠実さ」という表現の内実は、劇中の事件や登場人物の言動が教養人を対象とした歴史書にある記述と合致していることであった点を検証することができた。悲劇においては、観客や読者が既に持っている知識や通念と矛盾するものが作品の中にあってはならないのであり、歴史的事実は作品に信憑性(「真実らしさ」)を与える限りにおいてフィクション中で機能を果たす、という論点である(アリストテレス『詩学』第9章に基づく)。その一方で、コルネイユやラシーヌは創作における裁量権ー歴史的事件の全体の枠組は尊重しつつ、細部には変更を加える自由ーを確保しようとする。ここに受容理論と創作における実践との微妙な均衡が成立する、という結論を導きだすことができた点でおおむね満足のいく進展であったといえる。旅費が予定よりも少なかったため。17世紀のフランスにおいて、事実(歴史)と虚構(フィクション)の配合の問題については、小説の分野でも議論の対象になっていた点に注目して、キノーに代表される「ロマネスク」な(「真実らしさ」のない)悲劇とコルネイユやラシーヌの歴史悲劇の差異は、(1650年代までに流行した)「英雄小説」le roman heroiqueと(1670年代以降に登場する)「歴史小説」lanouvelle historiqueの性質の違いと比較しうるのではないか、そして口実として用いられる「歴史」と真実らしい(信憑性のある)「歴史」との違いとは、結局のところ文学的・歴史的典拠への忠実さの度合い、つまり作家および観客や読者の人文主義的教養の程度によるといえるのではないか、という論点を検証していきたい。次年度分と合わせて使用する。使用額に端数が生じたため。
関節破壊を制御する転写因子とマイクロＲＮＡの誘導機構とその治療応用

本研究の目的は変形性関節炎(OA)の細胞外マトリックス分解に中心的な役割を果たす切断酵素アグリカナーゼの遺伝子発現を制御するmicroRNAと転写因子群の発現制御を明らかにすることである。細胞伸展刺激装置を用いた軟骨様細胞実験系において、メカニカルストレスによる転写因子の発現誘導を解析した。転写因子においてはHIF-2は刺激によってそれほど上昇顕著ではなく他の転写因子の関与が大きいと考えられた。microRNAに関しては、サイトカイン刺激とメカニカルストレス刺激による反応性を網羅的に解析した。既報のmiR-140を含め、microRNA変動が層別化できることが初めて明らかとなった。(1)ストレスによる転写因子解析アグリカナーゼ誘導性が確認されているヒト軟骨肉腫由来細胞株(OUMS-27)、ヒト軟骨細胞およびラット新生児軟骨細胞を用いた。まず、サイトカインとメカニカルという二つの刺激系で転写因子を検討した。(i)サイトカイン刺激:インターロイキン-1(IL-1)および腫瘍壊死因子(TNF-α)添加刺激を行った。ADAMTS1,4,5,9の発現を検討した。また、この際にHIF-1αは発現量に大きな変化がないものの、HIF-2αは6時間後にピークを持って発現増加していることを見出した。(ii)メカニカルストレス刺激:培養細胞伸展システム(ストレックス社製ST-140)を用いて、軟骨細胞に様々な伸展刺激を加えた。10%進展刺激でMMP-13、ADAMTS4,ADAMTS5,ADAMTS9の発現変化を検討した。次に0.5Hz5%刺激では、RUNX2とADAMTS5の発現変化を検討した。予想に反してRUNX2があまり変動せず、刺激後0、0.5、1、3時間後まで経過を検討したが有意な変動は見られなかった。(iii)サイトカインとメカニカルストレスの同時刺激:上記のシステムを併用した、同時刺激の実験系を確立し、ADAMTSの発現を検討した。興味深いことにメカニカルストレスが加わると、サイトカインによって誘導されたADAMTSの発現が抑制されていた。(2)OA発症早期における転写因子の標的活性化ラット前十字靭帯、内側側副靭帯切離、内側半月板切除によるOAモデルを作成した。関節を摘出しサフラニン0染色を行った。連携協力者として以下の者が参加した。岡山大学・医学部大月孝志岡山大学・大学病院小川弘子(1)メカニカルストレスおよびサイトカインによる転写因子解析前年度同様、アグリカナーゼ誘導性が確認されているヒト軟骨肉腫由来細胞株(OUMS-27)を用いた。最終年度はメカニカルストレスのみの単独刺激を加えた際の反応と、これまでのサイトカインと同時刺激の場合と比較しながら、詳細に検討を進めていくこととした。microRNAの網羅的解析を行う方針とし、microRNAアレイによる発現解析を行うこととした。アレイ解析により、単独刺激で発現促進するmicroRNAに加えて、メカニカルストレスとサイトカインの両方の刺激により、相乗的に発現が亢進するmicroRNA、さらには一方の刺激によりドミナントな発現誘導を受けるmicroRNAなど多様な発現制御を受けていることを世界で初めて見出した。他グループから報告があったmicroRNAは、メカニカルストレスおよびサイトカインによる刺激のいずれの状況下でも、さほど大きく変動しておらず、既知のmicroRNA以外にもダイナミックな変動をするmicroRNAをOUMS-27で同定することに成功した。(2) OA発症早期におけるヒアルロン酸投与による転写因子調節とアグリカナーゼ制御効果の検討ラット前十字靭帯、内側側副靭帯切離、内側半月板切除によるOAモデルを作成した。2,4,6週と経時的に関節を摘出した。OAモデルラットの膝関節腔内へヒアルロン酸投与酸の分子量効果について検討を行った。分子量の大きなヒアルロン酸投与膝関節においては軟骨破壊が抑制されており、アグリカン分解も抑制されていることが確認された。アグリカナーゼ誘導性が確認されているヒト軟骨肉腫由来細胞株(OUMS-27)をサイトカイン(IL-1β、TNFα(各10ng/mL))で下記に示す各時間、刺激を加えた後でリアルタイムPCR法によりmRNA発現を評価した。次にメカニカルストレス刺激による影響を検討した。培養細胞伸展システムを用いて、OUMS-27にさまざまな伸展刺激を加え、転写因子の発現変化を解析した。さらに、ラットOAモデルを作成し、経時的に膝を摘出してアグリカンの分解を検討した。【結果】転写因子を、刺激後0, 3, 6, 12, 24, 48時間で経時的に検討した。低酸素状況下で働く転写因子であるHIF-2がサイトカイン刺激6時間で刺激前に比べて約4.5倍にmRNAが上昇した。

一方、同じく低酸素で働く代表的な転写因子であるHIF-1は3,6,12,24,48時間のいずれでも大きな変動はなく、両者はことなる動態を取ることが明らかとなった。メカニカルストレスでは、単独で10%伸長、0.5Hzの刺激においては、HIF-1, HIF-2とも大きな変動は示さなかった。そこで、次にサイトカイン刺激にメカニカルストレスを上乗せした場合の発現変化について調べた。メカニカルストレスを1.5時間上乗せしたところ、HIF-1, HIF-2ともに、メカニカルストレス追加群で上昇していた。次に、miR-140の発現変動を検討した。我々の実験系においては、上記サイトカイン刺激によってmiR-140のmRNAは刺激開始1時間後におよそ0.7倍に減少、その後3,6時間でほぼ正常レベルに復し、以後12, 24時間と徐々にmiR-140のmRNAは上昇傾向になることが明らかとなった。ラットOAモデルにおいて、2、4、6週と経時的に、OASC組織を摘出し、サフラニン-O染色を行ったところ、染色域の減少を認め、軟骨破壊が確認された。メカニカルストレスの作用につき、興味深い新知見を得ることができた。次年度はさらにこの作用を詳しく追及したい。25年度が最終年度であるため、記入しない。転写因子の検討、ならびにmiroRNAの解析については進んでいる。microRNAに関しては網羅的解析を実施した。初回の実験ではmicroRNAの保存状態が良好でなく結果が得られなかったが、保存状態に細心の注意を払いながら再度実験を行うことで問題を解決できた。他のグループから、miR-140はヒトではそれほど大きく変動せず、別のmicroRNAが働いているという報告が最近なされた。このことから、miR-140はヒト由来細胞であるOUMS-27もしくはラットOAモデルにおいてはそれほど重要な働きをしていない可能性も考えられる。したがって、我々が実施したように、microRNAに関する統合的解析は今後の研究にとって極めて重要であると。マイクロRNAの導入実験に取り掛かる。最終年度にmicroRNAの発現実験を行うための細胞導入実験を予定している。この分野は日進月歩であり、最新の最適な導入法を採用予定である。したがって、最適な細胞および生体へのmicroRNA導入法を決定し、目的となる重要なmicroRNAの導入実験を行う。用いる細胞はOUMS-27もしくはヒト軟骨細胞、生体としてはラットOAモデルを予定しているが、場合によってはこれらの実験系への導入がうまくいかない可能性があり、その場合は対応策としてマウス関節軟骨細胞を用いて、miR-140の導入実験を行うことも計画する。