hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抵抗変化型不揮発性メモリー材料薄膜のその場分光診断制御MOCVD技術の開発

上部電極に用いた金属の「仕事関数」と「酸化しやすさ」に着目して、様々な金属材料を上部電極に用いてメモリー素子を作製し、その抵抗スイッチング特性を調べた。その結果、上部金属の酸化しやすさがより重要であるとの結果を得た。
光環境と松果体機能-紫外光と長波長光の相反効果について

脳室周囲器官の一つである松果体は光環境と密接な関係をもっている。系統発生学的に古い動物種である円口類、硬骨魚類、両生類などでは、松果体自体に光情報の受容機構がある。これら直接の光受容機構をもつ松果体を用いて光-神経-内分泌変換機構について、特に波長の差による光の効果に焦点を当てて分析した。(1)電気生理学的分析:カワヤツメ松果体について感色性ニューロン応答の分析を行った。興奮性応答は540nmに、抑制性応答は380nmに最大スペクトル感度を示した。短時間(数秒間)の光刺激では抑制性応答は興奮性応答に較べて100倍も高い感度であったが、長時間の光照射では抑制性応答の感度は持続しなかった。しかし、長波長光を併せて照射すると、短波長光による抑制効果が持続するという興味ある現象を見出した。これは光受容に際してphotointerconversionが起きているためと考えられる。(2)免疫組織化学的分析:視物質の蛋白部分であるオプシンの抗体を用いて松果体の光受容細胞の内、波長識別機構に関与する錐体系の検討を行った。カワヤツメ網膜の長型光受容細胞の抗体を用いて検討した結果、松果体の終末襄の周辺部、アトリウム、神経束に陽性反応が見られた。次にトリ網膜視細胞の杆体および錐体のG蛋白に対するそれぞれの抗体を用いた。カワヤツメ、硬骨魚の松果体共に反応は見られなかった。なお、トリの松果体でも陰性であったことは興味深い。網膜と松果体のG蛋白に違いがある可能性が考えられる。(3)メラトニンリズムの検討:カワヤツメ松果体を培養し、分泌されたメラトニンをRIAで測定したところ、ほぼ24時間周期の分泌を認めた。このことは松果体自体にサーカディアンリズムのオシレータがあることを意味する。このオシレータに対して前記の波長検出型ニューロンが拮抗的に作用していると考える。
有害性災害廃棄物処理と地域復興の行財政研究

本研究は有害性災害廃棄物の問題を対象として、地域復興に向けての災害廃棄物対策についての分析と制度設計を行うものである。過去の検証として、阪神・淡路大震災当時の住民アンケート調査や行政資料等に基づいて実態解明を行った。東日本大震災と熊本地震に関しては、現地訪問と自治体アンケート調査に基づき、災害廃棄物の実態とその処理対応をめぐる課題を明らかにした。そして、災害復興について、防災・復興を含めた災害廃棄物対策の課題や今後の政策論的展望を検討した。阪神・淡路大震災および東日本大震災の被災自治体への訪問ヒヤリング調査や資料調査を進めてきているが、平成26年度は本研究の初年度であるため多くは作業途中にあり、研究実績の成果発信に至ったのは次の2点となる。第一に阪神・淡路大震災のおける有害性災害廃棄物(粉じんおよびアスベスト)の処理に係る対策状況や健康影響に関する住民アンケート調査の実施およびその集計・分析結果の発信である。震災発生から倒壊建築物等の震災がれきの解体撤去が概ね完了するまでの期間に被災地で生活していた人を対象に、生活周辺での当時のがれき撤去作業の実施状況や大気中の粉じんの印象、呼吸器系の健康不調・病気の有無などを質問した。その結果、震災からの復旧期間における大気汚染の高まりやそれに起因する健康影響の実態が明らかとなった。9割の人ががれき作業の周辺で通常より粉じんの多い環境で生活していた経験を持ち、半数以上が将来の健康不安を抱いている状況にあった。さらに現在の健康状態について、呼吸器系の健康不調・疾患が1割、アスベスト関連疾患が1%という結果であり、精神的・肉体的損失としての、震災当時の廃棄物処理に起因する大気汚染の長期的影響が考えられる。第二に国際学術会議としての講演プログラムにおいて、震災時まで含めてのアスベスト災害対策についての現状と課題について報告を行った。東日本大震災での災害廃棄物処理とアスベスト飛散問題の動向を念頭におきつつ、今後の被害発生リスクの把握と被害予防を重視しての政策課題やリスクコミュニケーションのあり方について、現状分析からの整理を行った。さらには建築学や建設労働者の健康被害状況や、自治体でのアスベスト対策の現状の側面からの整理も行った。以上の現状の概況を整理しておくことで、今後の調査分析の上で新たに解明できる点や政策展望をより明確にできることにも寄与するものである。平成27年度の成果として、東日本大震災の被災地調査によって得られた実態や知見に基づいての、地域防災計画における有害性災害廃棄物対策に関するアンケート調査の実施とその集計結果の分析が挙げられる。継続的な東日本大震災被災地での現地調査において、原子力発電所事故の影響により遅れている福島県を除いた自治体において、発生した震災廃棄物の処分は概ね完遂しており、すでに過去の出来事となりつつある。しかし、行政としては引き続き復興に係る業務に当たる必要性も背景として、震災廃棄物の管理や処理についての教訓の検証は十分に行われておらず、防災対策の内容も旧来のままである状況が推察された。そこで、災害発生時にアスベスト等有害性災害廃棄物からの大気環境汚染の予防対策を担うことになる全国の大気汚染防止法の権限を有する地方自治体を対象として、地域防災計画上や有事の際の対策準備状況に関するアンケートを実施した。その結果、地域防災計画上でアスベスト対策を規定している自治体は40%程度に留まっており、対策の重要性や必要性を認識している割合の方が多いながら、平時からの有害物質発生リスクの有する施設・建築物の把握を行っている自治体は約19%、災害発生時に早期に整備と管理が必要となる災害廃棄物の一次仮置き場の候補地確保を行っている自治体は約24%と、今後の大規模災害発生時を想定しての対策強化の徹底や進展が行われていない実態を示す結果が明らかとなった。対策状況については各自治体の置かれている条件や担当部課の組織体制によって左右していることも考えられ、それらの要素も考慮した上で集計結果を精査・分析し、H28年秋頃に研究論文として発表する予定である。本年度も東北地方の現地調査や資料収集により、東日本大震災被災地の実態解明を進めてきている。特に今後、本格的な倒壊建築物解体や災害廃棄物処理が進められる福島県南相馬市、浪江町の市街地や仮置き場・分別場、焼却施設等の訪問・視察を行ってきている。また、大規模災害時の対応にも直接反映されることになる平時からの公害・環境対策の取組状況の調査のため、実際の建築物解体現場での対策遵守状況の調査を行ってきており、全般的な現地調査活動は概ね遂行してきている状況にある。これらの調査結果については、最終年度における成果のとりまとめに活用していく。その一方、予定していたアンケート調査の内、地域防災計画における有害性災害廃棄物に関する対策状況の全国的な調査は実施したが、東日本大震災被災地を対象とした災害廃棄物処理の経験・実績に関するアンケート調査についてはまだ実施できていない。また、福島第一原子力発電所事故を鑑みての、国内の原子力発電所立地およびその周辺地域の自治体に焦点を絞っての実態調査についてもあまり遂行できていない。この背景として、本年度に研究代表者・分担者の所属する大学のキャンパスの移転用務が発生したため、改めてプロジェクト活動の研究環境が整備されるまで予想以上に労力と時間を要したことが挙げられる。日本の震災事例調査を中心として、有害性災害廃棄物を巡る実態や政策課題についての研究調査の成果を、学会の企画セッションならびに学術論文として発信していった本研究課題の明確な成果公表として、環境経済・政策学会2016年大会において企画セッション「大震災における有害性災害廃棄物対策の検証」を実施し、三題の研究報告とパネルディスカッション形式の総合討論を行った。

小幡範雄報告「東日本大震災でのがれき仮置き場の取り扱いとその跡地利用」では岩手県、宮城県における東日本大震災時の仮置き場を対象に、一次仮置き場の閉鎖後の状況、二次仮置き場の立地選定の経緯、運営時の課題、返却後の利用方法について検証を行ったものである。平岡和久・南慎二郎報告「震災によるアスベスト飛散・曝露リスクと自治体の対策」では震災時に発生するアスベスト飛散やがれき処理・被災建築物解体等におけるアスベスト飛散リスク等に関して求められる対策を検討するとともに、自治体による対策の現状と課題を明らかにするため、資料・ヒヤリング・アンケート調査に基づいて検討を行った。南慎二郎報告「有害性災害廃棄物の管理処理動向と被災地環境への影響」では被災地域における有害物質の環境影響の問題を考察するため、災害廃棄物の管理処理の実態や化学物質管理の記録から把握を行った上で、災害時の環境汚染を予防・軽減するための政策的課題を明らかにするものである。以上の学会セッションでの小幡報告と平岡・南報告に加え、災害時まで想定しての全般的なアスベスト対策の考察として小幡範雄論文「アスベスト災害予防のあり方についての考察平常時と震災時にどう対応するか」、過去に実施したアンケート調査結果を元に分析・検討を拡充した南慎二郎論文「阪神・淡路大震災でのアスベスト環境汚染と総合的防災政策」と共に、大学紀要『別冊政策科学』の特集号の1部として出版・成果発信を行う。平成28年度が本科研費の当初の最終年度であったので調査活動と研究成果のとりまとめを順次進めてきた。さらに期間途中で発生した熊本地震の実態調査や自治体対策の調査検討にも早急に対応しつつ、柔軟に研究活動を展開してきた。ただし、成果発信と研究調査の十分な完遂のために若干の追加期間が必要となったため、1年度の期間延長を行った。研究成果はまとめて研究実績に記した大学紀要『別冊政策科学』の特集号に掲載するものであるが、この発刊が平成29年度となり、その出版に係る経費支出の手続きや納品も同年度となるため、研究費執行上の事情から研究期間の延長が必要となった。さらに研究計画上の原発立地自治体を対象とした調査活動が若干遅れていたこともあり、そのための期間を十分確保して、調査研究を拡充することがより有意義と判断した。本研究の目的は、大規模災害において発生する有害性災害廃棄物の問題を対象として、廃棄物処理と地域復興に関わる行財政の理論・実態分析と制度設計を行うことである。本年度は研究成果の発信に係る印刷経費の支出計上と本研究の補完・拡充のために期間延長したものである。本年度に執行が必要であった研究成果の印刷については、大学紀要『別冊政策科学アスベスト特集号2017年度版』の第I部に当たる「I大規模災害での有害廃棄物対策と防災・復興研究」として所収の4論文として、2017年7月末に発刊した。当該4論文については平成28年度の研究成果として登録済みのものである。
バイオマスからの新規生分解性複合材料の開発

ヒドロキシ酸のグラフトによるセルロースジアセテート(CDA)のプラスチック材料化の試みとして、ε-カプロラクトン(CL)と乳酸(LA)、及び、グリコール酸(GA)とLAをそれぞれグラフト共重合モノマーとした検討を行った。その結果、どちらの共重合モノマー系を用いてもCDAは効果的に可塑化された。前者の系においては、CDAの可塑化が導入される2つのモノマー配列により影響されること、この反応系ではLAに比べてCLの反応性がより高いこと、LAを多く導入すると堅くて脆い材料に、CLを多く導入するとエラストマー的な材料に、また、両者ともブロック共重合性が高い状態で導入されると、導入側鎖の凝集、結晶化の影響が大きく出ることなど有意な知見を得た。後者の系を用いた場合、LAに対するGAの仕込み比率を高くすることでグラフト側鎖の導入量が増大し、生成物の熱圧成形シートの物性も向上した。示差走査熱量測定により、GA比が多くなるほどグラフト鎖由来の転移が明瞭になることからより多くの側鎖がCDAに結合し、そして凝集していることが知られた。また、CDA由来の二次転移がGA比が大きくなるほど低温側にシフトし、熱可塑性の向上が明らかにされた。さらに、グラフト物と、生分解性高分子である脂肪族ポリカーボネートとのブレンドに関し有用な知見を得た。生成物の生分解性試験において、コンポスト処理を行った結果、1ヶ月で60%以上の重量減少、分子量の大幅な低下が認められ、グラフト側鎖の脱離だけではなく、脱アセチルやセルロース主鎖の切断も起こっていることが明らかとなった。デンプンのプラスチック材料化の検討では、酢酸ビニルを酢化剤としてアセチル化デンプンを調製した後、そのフリーの水酸基にCL及びラクチドを用いた開環グラフト重合を行いデンプンの低分子化を押さえつつ、良好な熱可塑性を備えたデンプンプラスチックを得た。所定量のセルロースジアセテート(CDA)、乳酸、グリコール酸、ジフェニルエーテル(溶媒)及びスズ(触媒)を500ml容四つ口フラスコに秤量し、真空ポンプ、撹拌装置、水分定量受器及びジムロード冷却管を接続し、140°C、4555mmHgの条件下で、まず系内の水を除去した。引き続いて、水分定量受器をモレキュラーシ-ブ3Aを充填したソックスレ-抽出管に付け替え、エステル化反応で生成した水が溶媒と共沸してモレキュラーシ-ブにより取り除かれ、溶媒のみが環流によりフラスコ内に戻るシステムでCDAのフリー水酸基へのグラフト化を進めた。乳酸、及びグリコール酸は水溶液の形で安価に市販されているが、CDAへのグラフト化反応における水溶液中の水分量の影響の検討も行った。なお、水分量の測定にはカ-ルフィッシャー水分計を用いた。結果として、14時間という決して長くない反応時間においても、CDAは明らかに可塑化され、フローテスターの測定による未処理CDAの熱流動温度が255°Cであったものが、220°C140°Cにまで低下し、可撓性の高い材料が得られた。グラフトされたCDAをアルカリ加水分解し、結合乳酸、及び結合グリコール酸を定量した結果、反応時間が長いほど、また、触媒量が多いほどそれらの量は増加すること、また、当モルで仕込んだにもかかわらず、その量はグリコール酸の方が乳酸の量の約1.3倍であった。生成物を熱圧成形し得られたシートの引張特性は、引張強度約3080MPa、破壊伸び

1.67.6%、ヤング率11002100MPaと、ポリスチレンの約2倍の強度をもつ非常にタフで強い材料となり得ることが知られた。シートの生分解試験は現在進行中であるが、たとえば1カ月のコンポスト試験により重量減少率が50%にも達するなど、反応条件によっては非常に高い生分解性を有するものを調製し得ることが知られつつある。ヒドロキシ酸のグラフトによるセルロースジアセテート(CDA)のプラスチック材料化の検討として、ε-カプロラクトン(CL)と乳酸(LA)をグラフト共重合モノマーとした場合、CDAが効果的に可塑化されること、その可塑化が導入される2つのモノマー配列により影響されること、さらにその関連で、この反応系ではLAに比べてCLの反応性がより高いこと、LAを多く導入すると堅くて脆い材料に、CLを多く導入するとエラストマー的な材料に、また、両者ともブロック共重合性が高い状態で導入されると、導入側鎖の凝集、結晶化の影響が大きく出ることなど有意な知見を得た。ヒドロキシ酸としてグリコール酸(GA)とLAを用いた場合、LAに対するGAの仕込み比率を高くすることでグラフト側鎖の導入量が増大し、同時に、生成物の熱圧成形シートの物性も向上した。示差走査熱量測定により、GA比が多くなるほどグラフト鎖由来の転移が明瞭になることからより多くの側鎖がCDAに結合し、そして凝集していることが知られた。また、CDA由来の二次転移がGA比が大きくなるほど低温側にシフトし、熱可塑性の向上が明らかにされた。さらに、グラフト物と、生分解性高分子であり物性に優れている脂肪族ポリカーボネートとのブレンドに関し有用な知見を得た。生成物の生分解性試験において、コンポスト処理を行った結果、1ヶ月で60%以上の重量減少、分子量の大幅な低下が認められ、グラフト側鎖の脱離だけではなく、脱アセチルやセルロース主鎖の切断も起こっていることが明らかとなった。デンプンのプラスチック材料化の検討では、酢酸ビニルを用いてエステル交換反応によりアセチル化デンプンを調製した後、そのフリーの水酸基にCL及びラクチドを用いたグラフトを行いデンプンの低分子化を押さえつつ、良好な熱可塑性を備えたデンプンプラスチックを得た。
Wnt/βcateninシグナルを制御する新規核酸創薬の開発

Wnt/beta-cateninとRasは、大腸癌の発癌や癌幹細胞と深く関与しており、両シグナルの抑制により強い抗腫瘍効果が得られると期待される。本研究では、同シグナルを制御しうるmicroRNAの同定と、核酸治療法の開発を目的とした。シグナル受容体としてLgr5の解析を行い、splicingによって下流シグナルが変化することを見出した。また、正常細胞と大腸癌細胞でTOP-Flashルシフェラーゼアッセイを確立し、下流標的分子であるAXin2、MYC、CD44のタンパク発現を確認した。microRNAarrayを行い、3'UTRやCDSに結合し得るmicroRNAの分離を進めている今年度は、大腸癌におけるWNT/β-catシグナルの定量法を確立することに主眼を置き、なおかつWNT/β-catシグナルの制御機構の新たなメカニズムを新たに見出した。Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5 (Lgr5)は細胞膜表面に存在する膜タンパク質であり、近年その受容体としての働きが同定され、そのリガンドがR-spondin 1であることが特定された(Win de Lau, et al. Nature 2011)。すなわち、Lgr5にR-spondin1が結合することにより、共役受容体であるFrizzled 7の活性化ともに、LRP6がリン酸化されることで、下流のWNT/β-catシグナルが活性化される。我々はそれらのカスケードの中でLgr5に特に着目し、さらには、新規のスプライスバリアントが存在することを発見した。それぞれのスプライスバリアントごとに下流のWNT/β-catが異なる(Osawa etal. British Journal of Cancer)。またLgr5のスプラシングにRNA結合分子であるPTBP1が関与することを発見した(未発表データ)。これらプロジェクトの中でWNT/β-catシグナルの活性化の検出方法の確立を行ってきた。また同時に動物実験においては、我々独自のドラッグデリバリーステムである核酸含有炭酸アパタイトの静脈注射による抗腫瘍効果を確認している(H Takahashi et al. MCT 2015)。ヒトにおけるWNT/β-catシグナルの制御機構が予想以上に煩雑であることが理解された。すなわち前述の通り、WNT/β-catシグナルに関わる受容体の一つであるLgr5が翻訳後修飾である、選択的スプライシングを受けることにより下流分子への影響を及ぼす。これらを慎重に解析してきたために予想外に時間を要した。また、大腸癌においてはAPC遺伝子の変異おこっていることにより恒常的にWNT/β-catシグナルが活性化していることは周知の事実である。遺伝子変異を持った分子の上流において遺伝子操作を行うことが、生物学的にどのような意義があるのかについての解析を慎重に行う必要がある。これら解析に時間を要したために現在までの達成度としては、「3のやや遅れている」を選択した。慎重に解析をおこなった結果として、正常細胞や大腸癌細胞におけるTOP-Flash活性のスシフェラーゼアッセイによる定量方法を習得、確立し、確認し得るデータの信憑性の同時評価として、WNT/β-catシグナルの下流の標的分子であるAxin2、MYC、CD44の遺伝子発現ならびにタンパク発現の相関を確認することができた。すなわち、評価法が確立したことになる。今後の課題として、KRASの下流シグナルとWNT/β-catシグナルのコラボレーションを司るmiRの同定や、WNT/β-catシグナル自身を抑制するmiRの同定を試み、これらmiRの核酸治療への応用の可能性を検討すべく、細胞実験、動物実験により、抗腫瘍効果、副作用の有無の確認、などについての解析を網羅的に行う。大腸癌においてはAPC遺伝子の変異を高頻度に有しており、恒常的にWNT/β-catシグナルの活性化が生じていることは周知の事実である。そのため、遺伝子変異を持つ分子のさらに上流に着目して遺伝子操作を実施することの生物的意義について慎重な解析を行ってきた。β-cat発現vectorを導入した細胞モデルを作成しその強発現のvalidationを行った。さらにmirRNAについてのアレイ解析を行い導入前後のmicroRNAの変化についての検討を行った。ただ、これらの制御メカニズムが予想以上に複雑であり、これらの解析に多大な時間を要したため時間内に十分な成果に結びつけることが不可能であった。microRNAarrayを行い、3'UTRやCDSに結合し得るmicroRNAの分離を進めている我々はすでにWNT/β-catシグナルの評価方法であるTOP-Flash活性のスシフェラーゼアッセイならびにAxin2, MYC, CD44などの遺伝子とタンパク定量による測定方法を確立し習得している。これらを用いることで、確実にヒト胎児腎細胞HEK293とヒト肺線維芽細胞MRC5に、β-catenin発現vectorを導入しβ-catenin過剰発現モデルを作成し、さらに強発現のバリデーションを行う。miRアレイを用いて導入前後のmiRNAの変化を比較し、変化率の大きいものを抽出する。

抽出したmiRがAPC変異大腸癌細胞株(LoVo, HT29)においてWnt/β-cateninシグナル分子を制御するかどうかを調べる。Wntシグナルが活性化すると、核内にβ-cateninが蓄積し、転写因子であるTcf/Lefと複合体を形成しTcf/Lefの転写活性を誘導する。シグナルを抑制するmiRを同定し、そのシグナル活性の低下率を評価する。シグナルを制御したmiRのうち、Wnt/β-cateninシグナル関連分子を標的とするmiRを選別する。Targetscanなどのsequence binding prediction programを用いてWnt/β-cateninシグナル関連分子の3 ́UTRやCDSにbindingする可能性のあるmicroRNAを抽出。miR導入前後でmRNA、タンパクを抽出しqPCR、ウエスタンブロッティングを用いて比較解析をする。また、Target分子のbinding siteをpmirGLODual-Luciferase miRNA Target Expression Vector (Promega)に導入し、そのLuciferase activityを評価することにより直接的な標的分子かどうかの検討を行う。医歯薬学ヒトにおけるWNT/β-catシグナルの制御機構が予想以上に煩雑であることを証明するための物品を購入したため。
植物の形態形成を司る転写制御ネットワークの解明

多細胞生物の器官が継続的に成長し形態形成を進めるためには、細胞の増殖と分化、成熟のバランスが協調的に制御される必要がある。細胞増殖期から分化、成熟期への移行には転写制御因子による大規模な遺伝子発現変動が関与する可能性が示唆されているがその制御機構の解明は遅れている。我々はシロイヌナズナの新規変異体スクリーニングからこれらの移行過程を制御する転写因子候補を多数同定しており、本研究では植物の細胞増殖と分化、成熟のバランスを調節する新規転写制御ネットワークを解明することを目的とした。特にDOF転写因子をコードするOBP4の下流標的遺伝子を同定しOBP4が根毛の細胞伸長を負に制御するしくみを解明した。多細胞生物の器官が継続的に成長し、形態形成を進めるためには、細胞の増殖と分化、成熟のバランスが協調的に制御される必要がある。植物のメリステムでは細胞が増殖期を経て分化を開始し、やがて成熟するが、この過程を制御する分子機構には未解明の点が多い。細胞増殖期から分化、成熟期への移行には転写制御因子による大規模な遺伝子発現変動が関与する可能性が示唆されているが、その制御機構の解明は遅れている。我々は最近シロイヌナズナの新規変異体スクリーニングから、これらの移行過程を制御する転写因子候補を多数同定した。本研究ではこれらの転写因子の下流標的遺伝子を網羅的に決定し、機能解析を進めることによって、植物の細胞増殖と分化、成熟のバランスを調節する新規転写制御ネットワークを解明することを目的としている。今年度は、GRTF転写因子群のプロモーターを用いて発現誘導するキメラリプレッサー系統の作成を進めた。また同時にそれぞれのGRTFのノックアウト変異体の整備を進めた。さらにそれぞれのGRTFを35Sプロモーターや発現誘導プロモーターに連結するコンストラクト(35S:GRTF、pER8:GRTF等)を作成し、安定型もしくは誘導型のGRTF過剰発現体を整備した。このなかから、誘導型の過剰発現体で既に細胞増殖、成長に異常のみられるGRTFについては、その下流標的遺伝子群を網羅的に同定するため、RNAseqによる全ゲノム発現解析の準備を進めた。またGRTFの植物体内での発現場所を特定するために、GRTF遺伝子をGFPに結合して発現するpGRTF:GRTF-GFP植物体の作成を進めた多細胞生物の器官が継続的に成長し、形態形成を進めるためには、細胞の増殖と分化、成熟のバランスが協調的に制御される必要がある。今年度は、GRTF4についての解析を進め、この転写因子が細胞分化、特に細胞伸長を抑制する機能を持つ事を明らかにした。GRTF4を誘導的に発現する植物体を用いて下流遺伝子の探索を行った結果、根においては根毛細胞の成長に関与する遺伝子の発現を抑制することが明らかになった。最初に解析を進めているGRTF4については論文執筆を終え、近日中に投稿する準備ができている等、研究は順調に進んでいる。またGRTF4を含む、根毛細胞の転写ネットワーク解明に向けて、研究を進める事ができている。我々は最近シロイヌナズナの新規変異体スクリーニングからこれらの移行過程を制御する転写因子を多数同定しており、本研究ではこれらの転写因子の下流標的遺伝子を網羅的に決定し、機能解析を進めることによって、植物の細胞増殖と分化、成熟のバランスを調節する新規転写制御ネットワークの解明を目指す。今年度は植物に特有なDOF型転写因子をコードするOBP4に関する研究を進め、OBP4の発現がストレスホルモンのひとつであるABAによって誘導されること、またOBP4が細胞伸長を負に制御することを発見した(Plant Physiol, 2017)。また誘導型のOBP4過剰発現体を用いたRNAseq解析を行い、OBP4に依存して発現量が変化する遺伝子をゲノムワイドに同定した。特に根毛細胞に注目した解析を進め、OBP4が根毛成長の鍵制御因子であるRSL2遺伝子の発現を抑制することによって根毛の細胞成長を停止させることを見いだした(Plant Physiol, 2017)。

特にDOF転写因子をコードするOBP4の下流標的遺伝子を同定しOBP4が根毛の細胞伸長を負に制御するしくみを解明した。次年度以降に進めるGRTFの機能解析に必要な形質転換体の整備が順調に進んでいるため。また解析を始めたGRTFについては既に細胞増殖、成長に異常がみられており、予定より早くRNAseqに準備にも取りかかっているため。これまでに作成した他のGRTF欠損変異体と過剰発現体の表現型解析を引き続き進める。またGTL1, DF1についても下流の標的遺伝子との機能関係を明らかにし、論文執筆を進める。28年度が最終年度であるため、記入しない。植物分子・生理科学今年度作成したGRTF欠損変異体と過剰発現体の表現型解析を進める。葉や根の矮小化、形態異常が見られる系統についてはフローサイトメトリー解析を行い、細胞分裂周期や核内倍加周期の進行に異常があるかどうかを検討する。また葉や根の細胞の顕微鏡観察を行い、細胞の数や形、大きさに異常が見られるかどうかを調べる。次年度購入予定の実験消耗品に充当する為28年度が最終年度であるため、記入しない。平行して進める予定であったChIP解析用の形質転換体作出及びChIPの条件検討に予想以上に時間がかかり全ゲノム解析用のサンプル調整が間に合わなかったため、物品費を繰り越すことになった。またこのため海外出張(旅費)、論文投稿(その他)を次年度に延期した。実験消耗品購入に使用する28年度が最終年度であるため、記入しない。繰り越した物品費、旅費、その他費用は、それぞれ今年度予定した通り、ChIPseq解析消耗品、海外出張、論文投稿費として使用する。
子宮内膜症の卵巣予備能低下における細胞外基質マイクロフィブリルの役割に関する研究

本年度は,卵巣組織の収集と組織解析を行った.また,卵巣組織中の原始卵胞の抽出を試みた.悪性腫瘍で卵巣を摘出する有月経女性および性成熟期の子宮内膜症女性からインフォームドコンセントを得て卵巣組織を採取した.組織の一部をブアン固定のうえパラフィン包埋して薄切切片を作成した.卵巣組織における巣状の原始卵胞を有する切片を抽出し,卵胞周囲の間質細胞の形態評価を行った.また,卵胞周囲の顆粒膜細胞および間質細胞の増殖性をKi-67免疫染色で評価し,間質細胞の形態変化(核が腫大し細胞質が厖化)と原始卵胞から一次卵胞への移行および間質細胞と顆粒膜細胞の増殖性との関連を検討した.一次卵胞へ移行を開始した原始卵胞を有する卵胞巣と休止している原始卵胞のみで校正されている巣を比較した.フィブリリン1,2および3の卵巣組織中の発現を免疫組織化学的手法により解析した.卵巣組織中の原始卵胞周囲の間質細胞には,線維状の形態から核が厖化し細胞が腫大している形態へ変化しているものが認められ,これらは原始卵胞の一次卵胞への移行と考えられる周囲顆粒膜細胞の円柱化とKi-67核陽性を示す細胞の増加と関連していた.また腫大した周囲間質細胞ではKi-67陽性細胞の増加が認められた.この2つの異なる形態の間質細胞の有無と原始卵胞の発育およびそれら周囲の細胞外マトリックスにおけるフィブリリン蛋白の組織中発現を現在解析中である.摘出された卵巣から皮質組織を分離して細切し,組織中の原始卵胞を抽出した.形態的に初期卵胞であることは確認出来たが,原始卵胞と判別できないものも認められた.卵巣組織中から十分な量の原始卵胞を抽出するまでには至っていない.子宮内膜症を有し,かつ巣状の原始卵胞を有する正常卵巣組織の採取が難しいため,疾患が組織中の卵胞に与える影響を評価することが難しい.また,原始卵胞が十分遺残している年齢の卵巣組織を得ることが難しく,また組織中から効率よく形態良好な原始卵胞が抽出出来ていない.当科で保存している組織アーカイブから臨床背景の情報が把握できるもの,あるいは原始卵胞が確認できるものを選択して検討を行う.組織から原始卵胞を抽出する際のコラゲナーゼ処理等の適切な条件設定を検討する.本年度は,卵巣組織の収集と組織解析を行った.また,卵巣組織中の原始卵胞の抽出を試みた.悪性腫瘍で卵巣を摘出する有月経女性および性成熟期の子宮内膜症女性からインフォームドコンセントを得て卵巣組織を採取した.組織の一部をブアン固定のうえパラフィン包埋して薄切切片を作成した.卵巣組織における巣状の原始卵胞を有する切片を抽出し,卵胞周囲の間質細胞の形態評価を行った.また,卵胞周囲の顆粒膜細胞および間質細胞の増殖性をKi-67免疫染色で評価し,間質細胞の形態変化(核が腫大し細胞質が厖化)と原始卵胞から一次卵胞への移行および間質細胞と顆粒膜細胞の増殖性との関連を検討した.一次卵胞へ移行を開始した原始卵胞を有する卵胞巣と休止している原始卵胞のみで校正されている巣を比較した.フィブリリン1,2および3の卵巣組織中の発現を免疫組織化学的手法により解析した.卵巣組織中の原始卵胞周囲の間質細胞には,線維状の形態から核が厖化し細胞が腫大している形態へ変化しているものが認められ,これらは原始卵胞の一次卵胞への移行と考えられる周囲顆粒膜細胞の円柱化とKi-67核陽性を示す細胞の増加と関連していた.また腫大した周囲間質細胞ではKi-67陽性細胞の増加が認められた.この2つの異なる形態の間質細胞の有無と原始卵胞の発育およびそれら周囲の細胞外マトリックスにおけるフィブリリン蛋白の組織中発現を現在解析中である.摘出された卵巣から皮質組織を分離して細切し,組織中の原始卵胞を抽出した.形態的に初期卵胞であることは確認出来たが,原始卵胞と判別できないものも認められた.卵巣組織中から十分な量の原始卵胞を抽出するまでには至っていない.子宮内膜症を有し,かつ巣状の原始卵胞を有する正常卵巣組織の採取が難しいため,疾患が組織中の卵胞に与える影響を評価することが難しい.また,原始卵胞が十分遺残している年齢の卵巣組織を得ることが難しく,また組織中から効率よく形態良好な原始卵胞が抽出出来ていない.当科で保存している組織アーカイブから臨床背景の情報が把握できるもの,あるいは原始卵胞が確認できるものを選択して検討を行う.組織から原始卵胞を抽出する際のコラゲナーゼ処理等の適切な条件設定を検討する.本年度は組織検体の収集と用手的組織細切による卵胞抽出の予備実験に充てたため,組織細切機を購入しないで実験が可能であるか試みた.次年度は実験手技の改良とその結果として必要であれば細切機器の購入を考慮する.本年度までは実験の使用に堪えうる卵巣組織の収集が予想よりも少なかったが,今後収集組織数が充足してきたら組織染色や組織抽出処理あるいは培養に必要な薬品等が必要となるため,次年度にはそれらの購入に充てる予定である.
最新のアレイデータと波形インバージョン手法による最下部マントル構造推定とその起源

本研究では「波形インバージョン」と呼ばれる新しい高解像度のデータ解析手法を用いてD"層内の詳細な地震波速度モデルを推定することに成功した。そして、それを最新の鉱物物理学に基づいて解釈をすることにより、核マントル境界(CMB)に新たな制約を加えた。まず、微細構造推定に適したモデルパラメータに対する偏微分係数の計算が必要である。そこで、1984年にTarantolaによって導出された理論の実装し、点(pixel)および球対称不均質(shell)に対して偏微分係数計算手法の開発を行った。それにより、実体波を用いた非弾性減衰(Q)を含んだ一般的な異方性媒質(独立な弾性定数は21個)に対する地球深部構造推定を現実的なものとした。さらに、局所的な構造推定のために必要な新しい震源観測点補正の方法の開発を行った。次に、理論的な感度の見積もりを行い、波線理論近似に基づく反射波を用いた解析の限界を示した。そして、実際に波形インバージョンによって中米下の3次元構造の推定を行った。また、大陸地殻物質の地球深部への沈み込みについての研究も行った。密度汎関数理論に基づく第一原理計算を行い高圧下における大陸地殻物質の密度および地震波速度を求めた。当初は大陸地殻物質をヒスイ輝石および石英の混合物であると近似して、ヒスイ輝石およびその高圧相であるCF相の安定性について議論してきたが、現実の大陸地殻物質についての議論を行うために、ホーランダイト、グロッシュラーガーネットの相安定性を調べ、さらにその上で弾性定数を調べた。さらた、沈み込む大陸地殻の量を流体力学的に見積もった。その結果現在の上部中部地殻相当の量がマントル深部に運び込まれていることがわかった。比較的長周期(周期8s以上)の1成分(transverse成分)データを用いて、D"層の複数の領域(中米・シベリア・北極・太平洋・西太平洋下)のS波速度構造の推定を行った。次に、第一原理計算に基づくマントル最深部の主要鉱物である珪酸塩ペロヴスカイト・ポストペロヴスカイトの弾性波速度を用いて解釈を行い、CMBの温度の最適化を行った。その結果、CMBの温度は3800±200K程度であり,また定説であったダブルクロッシングはほとんど生じていないことが判明しました。また、CMBがこの程度の温度であると,CMBを通る熱流量は地球表面からの全熱流量の約1/6(8TW)程度と見積もられた。そして、実際に波形インバージョンによって太平洋下の1次元構造の推定を行った。解像度の理論的な見積もりから、波線理論に基づくS波スプリッティング手法では、D"領域の異方性構造の制約は困難であり、これまでの異方性構造を再検討する必要があることを示した。そして、複数の震源観測点ペアからなる幅広い震央距離のデータセットを用いた波形インバージョン手法ならば推定することが可能であることを示した。次に実際に、トンガ・フィジーの深発地震を北米のUS-Arrayで観測した広帯域水平2成分地震波形を解析し、ハワイ下のD"領域の異方性構造の推定を行った。その結果、SV波がSH波よりも速い構造が得られ、それはマントルの上昇流の存在を示唆するものである。ハワイホットスポット火山の起源の論争に対して一石を投じた。

次に、理論的な感度の見積もりを行い、波線理論近似に基づく反射波を用いた解析の限界を示した。そして、実際に波形インバージョンによって中米下の3次元構造の推定を行った。また、大陸地殻物質の地球深部への沈み込みについての研究も行った。密度汎関数理論に基づく第一原理計算を行い高圧下における大陸地殻物質の密度および地震波速度を求めた。当初は大陸地殻物質をヒスイ輝石および石英の混合物であると近似して、ヒスイ輝石およびその高圧相であるCF相の安定性について議論してきたが、現実の大陸地殻物質についての議論を行うために、ホーランダイト、グロッシュラーガーネットの相安定性を調べ、さらにその上で弾性定数を調べた。さらた、沈み込む大陸地殻の量を流体力学的に見積もった。その結果現在の上部中部地殻相当の量がマントル深部に運び込まれていることがわかった。
受容体結合プロレニン系を標的とした網脈絡膜疾患治療戦略の確立

生活習慣病や加齢に伴って発症・進行する網膜疾患(加齢黄斑変性や糖尿病網膜症など)や心・腎臓疾患(糖尿病性腎症など)は、高齢化社会の我が国においては重要な問題である。これらの疾患は生活習慣病に合併した血管症であり、病理的血管新生により組織傷害が起こる。このため、血管新生の前駆段階である炎症病態に早期介入する治療戦略の確立は、喫緊の社会的急務である。これまでに我々は、受容体結合プロレニン系(RAPS)が網脈絡膜疾患の分子病態を制御し、生活習慣病における臓器障害に関与することを報告してきた。RAPSは、眼組織のみならず腎臓や心臓などの病態モデルにおいても認められ、(プロ)レニン受容体を中心としたRAPSは生活習慣病における臓器保護のための共通の創薬ターゲットとして注目されている。また、最近、我々は臨床検体を用いた解析の結果、慢性炎症・血管新生が背景に存在する糖尿病網膜症などの病態形成においてRAPSが重要であることを示した。そこで、本研究ではRAPSに対する特異的機能阻害薬を核酸有機化学を応用した核酸医薬、および配座制御に基づく医薬分子設計法の技術を駆使して開発し、複数の創薬を視野に入れた基盤研究を展開する。さらに網脈絡膜疾患動物モデルを用い、新規RAPS阻害剤により慢性炎症病態を抑制する治療戦略の確立を目指す。また、それにあわせ硝子体注射に代わりうる後眼部薬物送達システム[科研費基盤(B) 24390392にて一部開発中]を利用した前臨床試験を行う。RNA干渉と核酸有機化学の技術を駆使して新規に開発した(プロ)レニン受容体に対する特異的機能阻害薬[(P)RR-XshRNA]を、レーザー誘導脈絡膜血管新生モデルマウスに投与して、real-time PCR法、イムノブロット法や免疫組織染色法などで解析し、その病態抑制効果を検討した。結果、(P)RR-PshRNA投与により脈絡膜血管新生の形成や脈絡膜組織における線維化関連分子(コラーゲンタイプI、トランスフォーミング増殖因子β、フィブロネクチンなど)の遺伝子発現の抑制が認められた。疾患モデル動物において(P)RR-PshRNAにより眼病態の抑制効果が認められたことより、今後、加齢黄斑変性などに対する新たな分子標的療法となると示唆される。特異的機能阻害薬[(P)RR-XshRNA]の適応拡大を目指し、さらに新たなモデル動物での病態抑制効果や既存薬との比較などを検討する。RAPSは、は眼組織のみならず腎臓や心臓などの病態モデルにおいても認められ、(プロ)レニン受容体を中心としたRAPSは生活習慣病における臓器保護のための共通の創薬ターゲットとして注目されている。ヒト・マウス共通の(プロ)レニン受容体遺伝子配列を標的とした一本鎖RNA干渉をデザインした。得られた一本鎖RNA干渉は、代表的な二本鎖siRNAと同等の遺伝子発現抑制効果を示したが、生物学的安定性の向上が認められた。さらに正常マウスに一本鎖RNA干渉を硝子体投与したが、組織学的・電気生理学的な変化は認められなかった。また、エンドトキシン誘発ぶどう膜炎モデルマウスに投与したところ、網膜において惹起された炎症関連分子(単球走化性因子-1やインターロイキン-6など)の遺伝子発現の抑制が認められた。

また、最近、我々は臨床検体を用いた解析の結果、慢性炎症・血管新生が背景に存在する糖尿病網膜症などの病態形成においてRAPSが重要であることを示した。そこで、本研究ではRAPSに対する特異的機能阻害薬を核酸有機化学を応用した核酸医薬、および配座制御に基づく医薬分子設計法の技術を駆使して開発し、複数の創薬を視野に入れた基盤研究を展開する。さらに網脈絡膜疾患動物モデルを用い、新規RAPS阻害剤により慢性炎症病態を抑制する治療戦略の確立を目指す。また、それにあわせ硝子体注射に代わりうる後眼部薬物送達システム[科研費基盤(B) 24390392にて一部開発中]を利用した前臨床試験を行うRNA干渉と核酸有機化学の技術を駆使して新規に開発した(プロ)レニン受容体に対する特異的機能阻害薬[(P)RR-PshRNA]を、レーザー誘導脈絡膜血管新生モデルマウスに投与して、real-time PCR法、イムノブロット法や免疫組織染色法などで解析し、その病態抑制効果を検討した。結果、(P)RR-PshRNA投与により脈絡膜血管新生の形成や脈絡膜組織における炎症関連分子(単球走化性因子-1やインターロイキン-6など)の遺伝子発現の抑制が認められた。疾患モデル動物において(P)RR-PshRNAにより眼病態の抑制効果が認められたことより、今後、加齢黄斑変性などに対する新たな分子標的療法となると示唆される。生活習慣病や加齢に伴って発症・進行する網膜疾患(加齢黄斑変性や糖尿病網膜症など)や心・腎臓疾患(糖尿病性腎症など)は、高齢化社会の我が国においては重要な問題である。これらの疾患は生活習慣病に合併した血管症であり、病理的血管新生により組織傷害が起こる。このため、血管新生の前駆段階である炎症病態に早期介入する治療戦略の確立は、喫緊の社会的急務である。これまでに我々は、受容体結合プロレニン系(RAPS)が網脈絡膜疾患の分子病態を制御し、生活習慣病における臓器障害に関与することを報告してきた。RAPSは、眼組織のみならず腎臓や心臓などの病態モデルにおいても認められ、(プロ)レニン受容体を中心としたRAPSは生活習慣病における臓器保護のための共通の創薬ターゲットとして注目されている。また、それにあわせ硝子体注射に代わりうる後眼部薬物送達システム[科研費基盤(B) 24390392にて一部開発中]を利用した前臨床試験を行う。RNA干渉と核酸有機化学の技術を駆使して新規に開発した(プロ)レニン受容体に対する特異的機能阻害薬[(P)RR-XshRNA]を、レーザー誘導脈絡膜血管新生モデルマウスに投与して、real-time PCR法、イムノブロット法や免疫組織染色法などで解析し、その病態抑制効果を検討した。結果、(P)RR-PshRNA投与により脈絡膜血管新生の形成や脈絡膜組織における線維化
生体高分子の機能を応用した新しい遺伝子デリバリーシステムの開発

本研究では、細胞膜を介した遺伝子のデリバリー、細胞質から核への遺伝子のターゲティング、核内での遺伝情報の安定化といった、ウイルスや染色体が持つ機能を解明し、これを非ウイルス型の遺伝子導入・発現系の構築に応用することを目標に研究を行った。主な成果は以下のとおりである。1.膜融合による物質デリバリーの細胞特異性(Bリンパ球には導入できない)という現象が、レセプターではない未知の細胞側因子によって決定されていること、さらにこの因子の機能はセンダイウイルスのHNタンパク質との相互作用によることを明らかにした。2.DNA-polymer複合体のモデルとしてラムダファージ粒子をモデルとして使う系を開発し、これを用いて、細胞膜を不安定化するTat peptideが細胞内への遺伝子導入を促進する活性があること、またSV40 T抗原由来の核移行シグナルがファージ粒子を核内に能動的に輸送する活性を持っていることを明らかにした。3.核内で染色体が安定に存在できる機構を解明するため、染色体末端にあって安定性を決めていると考えられているテロメアに着目し、テロメア配列とテロメア配列結合タンパク質TRF1の相互作用がテロメアの形成に必須であることを明らかにした。4.膜融合リポソームを使った遺伝子治療の応用例として、癌特異的プロモーターによって誘導される自殺遺伝子を使った癌の遺伝子治療法を開発し、ヒト胃癌腹膜播種モデルのマウスの治療に成功した。1.核移行シグナルを使ったDNAの核へのターゲッティシグ本年度は、能動的に核に移行できるNLSファージの内部に、ルシフェラーゼ遺伝子やGFP遺伝子を組み込んで動物細胞に導入し、遺伝子発現が増強されるがどうかを観察した。それぞれの遺伝子について、NLSファージ、野生型ファージ及びファージDNAを調製し、HEL細胞へはマイクロインジェクションで、COS細胞へは陽荷電リポソームとのハイブリッドとして導入した。その結果、いずれの場合も、NLSファージは純粋なDNAよりも20から200倍以上高い遺伝子発現を誘導できることが明らかになった。2. DNAの核内での安定性を決める要因の解析と遺伝子発現ベクターへの応用本年度は、まずDNAの安定性を正確かつ容易に測定する方法を開発した。この方法の原理は、抗生物質への耐性(Positive Selection Marker)と抗ガン剤への感受性(Negative Selection Marker)という異なった性質を合わせ持つ遺伝子を作り、この遺伝子を細胞に導入後、その消失頻度を抗ガン剤耐性でモニターするというものである。この方法を応用するための基礎的な条件を確認した後、EBウイルスの複製系を持つブラスミドの安定性を測定してみたところ、従来の方法で数カ月かかって安定性を求めた報告(1細胞分裂あたり2.8-5.7%が欠落する)とほぼ一致する結果(1細胞分裂あたり3.1-4.1%の欠落)が2週間で得られた。この方法では細胞分裂あたり0.1%という非常に微妙な安定性も2週間という短期間で測定することが可能であり、これを指標に核内で遺伝情報を安定化できるDNAの構造を解析できる。現在、染色体の末端にあるテロメアを中心に安定化因子を解析している。本年度の研究では以下の成果を得た。1)膜融合リポソームの実用化に向けて製剤としての安全性に関わる問題を検討し、病原性ウイルスの混入を10^<-16>以下に抑えながら活性と安全性を保つことができる精製と不活化の条件を決定した。また最終的な製剤としての形状を検討した。2)人工染色体構築のための必須条件である染色体の安定性を決定する因子の解析を進め、染色体末端のテロメア配列に結合するTRF1というタンパク質にその活性があることを見いだした。さらに、TRF1は単に染色体を安定化する因子であるばかりでなく、細胞の寿命を決定し不死化に深く関与するなど、遺伝子治療において外来遺伝子を導入した細胞の寿命を選択的に延ばすなどの新しい方向性を示した。3)自立複製しつつ細胞質で遺伝情報を発現するRNAレプリコンの開発に必要なRNA依存性RNAポリメラーゼの検討を進め、センダイウイルスのNPタンパク質にその活性があることを同定した。

またRNAレプリコンの鋳型となるcDNAを作成し、ラムダファージを使って安定に大量調整することに成功した。4)新しい発想の非ウイルスベクターとしてヒト免疫不全ウイルスのTatタンパク質由来のペプチドを表面に発現するTat-Phageの開発を行い、このペプチドに依存して細胞内にファージ粒子内のDNAが導入されて発現することを見出した。この結果、Tat peptideを使った合成ポリマーによる遺伝子導入ベクターの開発に道を開くことができた。遺伝子治療の実用化のためには、既存のシステム(組換えウイルスや合成高分子)の限界を越えた新しい遺伝子導入・発現系の開発を進めなければならない。本年度は、膜融合リポソームなど我々が提唱してきたハイブリッドベクターの大量調製法を、新しいリポソーム作製法や特殊なゲル濾過法を用いて確立し、その物理的・生物学的性状(均一な直径250nmを持ち凍結できる等)を明らかにすると共に、その投与条件について検討し、灌流圧を調整すれば生体に障害をもたらさずに投与できることを見いだした。また、強い細胞障害作用を持った変異ナトリウムチャンネルcDNAを癌マーカーCEAのプロモーターにつないで癌特異性を持たせたキメラ遺伝子を作成し、これを封入したハイブリッドベクターを使って、ヌードマウスにヒト胃癌を播種して作成した胃癌腹膜転移モデルの遺伝子治療への応用に成功した。この成果は、正常細胞と癌細胞が組織内で複雑に混在している手術不能例でも、癌細胞特異的に発現するように工夫した致死性遺伝子を膜融合リポソームに封入して無差別に遺伝子導入することによって、癌細胞だけをすべて殺傷するできることを示している。さらに、細胞膜と核膜を共に通過する活性が報告されているProtein Transduction Domain(PTD)と呼ばれるペプチドを呈示したラムダファージを作成し、このファージ粒子を培養液中に加えるだけで動物細胞に遺伝子を導入できることを見いだした。その活性は陽荷電リポソームよりも高く、血清で阻害されず、endocytosisに依存していなかった。またこの系を使ってin vivoでマウスの肝臓に直接遺伝子導入することも明らかにした。本年度は、合成高分子・DNA複合体のモデルとして開発したペプチドディスプレイ・ラムダファージの系をさまざまな角度から解析し、このアプローチが核へのDNAのターゲティングに有効であることを確認した。具体的にはまず、DNAをSYBRGreenで染色したファージを細胞内に導入することにより、DNAの局在を直接観察できる系を確立し、ファージ表面の核移行シグナル依存的にDNAが核内に移行していることを確認した。また現在、タンパク質の核移行を研究する標準的な系となっているDigitonin処理Semi-intact細胞を使ったin vitro系においても同様の結果が得られることを確認した。以上の結果は、核への能動的ターゲティング能を有する合成高分子・DNA複合体の開発に必要な情報(サイズとシグナル)を提供するものであり、4年間の本研究の目的であった「非ウイルスベクターに生物学的機能を付与するための基礎研究」という目標を達成できた。
核融合炉コンクリート建屋内のトリチウム挙動解明と移行阻止技術の開発

核融合炉を格納するコンクリート建屋内でトリチウム放出事故が起こる可能性があることを想定し、その際でも安全が保て、トリチウムの外部環境への放出を最低限に抑えるように、多孔質コンクリートへのトリチウム吸着拡散移行挙動を定量的に把握するとともに、移行阻止のための防水アクリルシリコンあるいはエポキシ塗料のトリチウム透過阻止効果を定量的に求め、放出事故時の適切な影響把握と移行阻止技術の開発をおこなった。核融合炉では、極めて大量のガス状放射性同位元素トリチウムを生産、回収、閉じ込めをする必要があり、三重閉じ込めシステムが一般的である。一次閉込容器を格納するグローブボックスあるいはセル(二次格納容器)では不活性ガス処理装置が常時作動し、わずかなトリチウム漏れも回収する。しかし、小さいながらも事故放出の可能性が避けられないので、緊急トリチウム回収装置を敷設した建屋を三次閉じ込めシステムとして必要なトリチウム閉じ込め機能が要求されている。本研究では、閉じ込め容器を構成する多孔質コンクリート表面での気体トリチウム移行挙動の定量的把握と、トリチウム透過阻止機能を持つ各種ペイント透過阻止能を材料的側面と化学工学的側面双方から解明するために計画された。研究初年度には、1.0x10^<-2>Bq/cm^3-740Bq/cm^3までの広範囲にわたる気相トリチウム濃度条件で、セメントとモルタルのHTO拡散係数を求め(D_T=1.2x10^<-11>cm^2/s)、多孔質内の吸着が支配的に関与する拡散である事を明らかにした。またエポキシ防水ペイント塗布状態の拡散律速状態実現を明らかにし、D_T=10^<-16>cm^2/sである事を求めた。さらにシリコン防水ペイントは、疎水性が高く吸着量の小さいペイントであるが、内部に水分が移行しやすく、耐水性に劣る事が分かった。トリチウム移行性能は、各種ペイントの構造、すなわちOH基のあるなし、ベンゼン環の働き等によって生じることが化学分析で明らかになった。さらにトリチウムに汚染したコンクリートからのトリチウム除染のため水溶解法の試験をおこない、何も塗布していないコンクリートでは、数日で内部トリチウムの溶解流出に成功したが、防水性能の良いエポキシ塗料では放出に極めて長時間の保持が観察されたので、母材とペイントの剥離前処理が必要である事と判断された。これらの研究成果は、数植シミュレーションの成果とともにIAEAの安全性会議で発表されるとともに、関連成果が原子力学会、水素関連の国際学会に発表された。水素放射性同位元素のトリチウムを、核融合炉燃料として150g/GWday(=5.5x10^<16>Bq/GWday)の量製造、循環、回収、注入する必要がある。RIを確実に閉じ込めるため三重閉じ込めシステムが考えられ、コンクリート建屋はその最終格納装置として重要な役割がある。本研究では、セメント、モルタル、コンクリートにエポキシ系やシリコン系防水ペイントを塗布した状態でトリチウム水蒸気の構造材内部吸着拡散量を実験的に求め、炉システムからの漏洩率を評価した.これまで得られた結果をまとめると次の様になる。(1)ペイントを塗布しない場合のトリチウム移動は、セメント内細孔への吸着水拡散で支配され、その有効拡散係数は1.2x10^<-11>m^2/sであった。砂や砂利等の緻密物質内への溶解拡散は生じず、空隙率を考慮に入れることで、コンクリート複雑構造物でも単純な拡散方程式で記述できることが分かった。(2)エポキシペイントを塗布すると、トリチウム拡散はペイント内拡散に支配され、その拡散係数は1.0x10^<-16>m^2/sであった。(3)シリコンペイント塗布状態では、トリチウム移動は拡散支配ではなく、トリチウム捕捉量が線形に増加した。これはシリコン塗料が長時間水接触でコンクリートとペイント間の接触状態が変わることに起因し、これはマクロ観察でも確認された。(4)トリチウム捕捉量は、シリコンペイントより、エポキシペイントの方が多く、ペイント分子構造に含まれるOH基とOCH_3基の違いにより、表面吸着量が異なるものと考えられる。いずれにせよ、コンクリート防水加工をした状態の三次閉じ込めシステム内のトリチウム移行挙動が分かった。平成22年度は最終年度であり、コンクリートからのトリチウム除染、移行阻止技術開発のための基礎研究をとりまとめ、水同位体交換、加熱処理等の影響としてまとめて原子力学会で発表した。核融合炉関連のトリチウムを大量に取り扱う施設で、トリチウム異常放出時に回収除去装置が作動し、直ちに回収する設計になっているが、施設境界を定める壁は多孔質コンクリートからなり、防水ペイントを塗布するにしても、漏洩トリチウムの一部は内部を拡散し、保有水と置換し長期間にわたり内部汚染をもたらす可能性がある-本研究では、建屋境界壁コンクリート内のトリチウム移行挙動把握と防水ペイントを使った移行阻止技術達成効果を、システム工学的手法と拡散吸着効果を定量化し明らかにするため計画実行し、今年度が研究の最終年度である。研究の最終年度では、コンクリートに何も塗布しない状態のものと、アクリルシリコンペイントかエポキシペイントを塗布した材料のトリチウム移行挙動を比較検討し、次の結論を得た.