hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血液メタボローム解析を用いた食道癌術前化学療法の効果予測バイオマーカーの探索

耐性化に伴う細胞内代謝変化を明らかにすることができた。本研究で得られた知見は、食道癌の抗癌剤耐性化メカニズム解明の一助となり得る。本研究ではターゲットとなる代謝物・代謝経路・代謝酵素の同定が律速段階であり、これらの同定が急務である。次年度も引き続き、抗癌剤感受性食道癌細胞株および抗癌剤耐性細食道癌細胞株のメタボローム解析を継続する必要がある。メタボローム解析手法については見直しが必要であり、ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)システムによる網羅的解析を検討している。具体的には高速スキャン測定が可能な四重極型質量分析器であるGCMS-QP2010 Ultra (島津製作所(R))による検証を考えている。ターゲットが同定され次第、代謝酵素阻害剤を用いた細胞株における検証、代謝酵素阻害剤を用いたマウスモデルにおける検証、臨床血液サンプルでの代謝酵素と抗癌剤感受性をふくめた臨床病理学的因子の相関解析と実験ステップを進めていく。これらの進行にあわせて、マウスモデルの作成準備を行う。本年度予定していた、抗癌剤感受性食道癌細胞株および抗癌剤耐性細食道癌細胞株のメタボローム解析による薬剤応答に関連する代謝物および代謝経路・代謝酵素の同定が遅れており,未使用額が生じた。次年度も引き続きメタボローム解析を継続するため、メタボローム解析の関連試薬の購入に使用する。また次年度には代謝酵素阻害剤を用いた細胞株における検証および代謝酵素阻害剤を用いたマウスモデルにおける検証を実施するため、マウス購入費としても使用する。
側抑制相互作用のあるニューロン系の自己組織化

我々は抑制性の伝達物質GABAが関係するシナプスの働きが、視覚野における方位選択性の実現に決定的であるというを考慮して、抑制性の介在ニューロンを神経回路網に組み込んだモデルを提案した。種々の傾きを持った棒状パターンの等確率入力に対する学習の結果、時間が充分に経過して系が平衡状態になった場合に、出力層に方位選択性ニューロンが自己組織化されることをしめした。しかし入力パターンの学習をステップ毎に時間的に追いかけてゆく動力学的学習がどうなるかについては不明である。これは、神経回路網の自己組織化を認識の問題として実用化する上で重要な問題である。また学習は必ずしも平衡状態になる以前に停止する可能性も考えられるので、この点がらも動力学的な学習は重要である。それで、「動力学的にも自己組織化が行われるか?」、また「行われるとしたらどんな解が得られるか?」が当面の問題点である。我々はコンピュータ・シミュレーションの結果、動力学的な学習が自己組織化の結果として、平衡状態の場合と類似か出力層の発火パターンに導くことを示すことが出来た。具体的には、48箇の傾きの各入力パターンに対する出力層のニューロン群の発火パターンを求めてみるとこの発火パターンは平衡解のそれとくらべて、自然さ点でずっと勝っており、スパースコーディングという観点から見ても、より適切なものである。このような神経回路網モデルで入力パターンを等確率で長時間入力してゆくと、神経回路網は学習の結果ある平衡状態に達する。この状態における各入力パターンに対する出力パターンの発火反応は、統計物理学における磁化の平均場理論で記述されることが示された。この際自己場ともいうべき出力ニューロン自身の発火の強さに関係する有効場が対応するイジング・スピン系に作用することが、物理系とは異なる神経回路網系の特徴であることが明かにされた。
原索動物における新しいアロ認識機構

ホヤ類は一般に雌雄同体であるが、マボヤやカタユウレイボヤをはじめとする多くのホヤでは自家不稔性を示す。しかし、その分子機構は不明である。マボヤでは、主要卵黄膜成分HrVC70が自家不稔性を担うアロ認識候補分子であることを報告しているが、今回その結合パートナー(HrUrabinと命名)を精子ラフト画分に見いだし、構造と機能に関する研究を行った(JBC, 2008)。この分子は個体間の変異が少なく、アロ認識に直接関わらないと考えられるが、これに会合する精子側のタンパク質がHrVC70の多型を認識する可能性があり、現在検討中である。Far Western解析により、HrVC70の活性発現にはその高次構造の維持が重要であることが示された。一方、カタユウレイボヤにおけるHrVC70のオルソログとしてCiVC57が、またHrUrabinのオルソログとしてCiUrabinが同定された。前者は、カタユウレイボヤの卵黄膜の主要成分であることがプロテオーム解析により示され(JBC, 2009)、また後者はFar Western解析により同定された。ついで,カタユウレイボヤの卵黄膜成分の網羅的解析を行った(JBC, 2009)。その結果、ポジショナルクローニングによって同定された雌側のアロ認識分子(v-Themis)が、卵黄膜に確かに存在することを確認した(Science, 2008)。この雄側分子(s-Themis)の遺伝子の第一イントロン内に雌側因子v-Themisの遺伝子が逆向きに配置されており、雄側と雌側の因子が連鎖して密接な関係にあることが示された。今後は、このタンパク間相互作用がアロ特異的であるか否かを検討する予定である。上記研究課題に従い、当初の実験計画をほぼ完了したので報告する。原索動物ホヤ類は一般に雌雄同体であるが、多くの種(特にマボヤやカタユウレイボヤ)では自家不稔性を示す。これは次世代に遺伝的多様性を生み出す仕組みであると考えられるが、その分子機構は明らかになっていない。マボヤでは、卵黄膜成分であるHrVC70が自家不稔性を獲得する卵成熟過程で卵黄膜に接着してくることや、自己精子より非自己精子に対する親和性が高いこと、また分子多型が見られることから、この分子がアロ認識を行なっている可能性が高いと考えている。そこで本実験では、このタンパク質と相互作用する精子タンパク質の同定と性状解析を行なった。精子ラフト画分をSDS-PAGEし、ニトロセルロース膜に転写後、VC70と反応させ、抗VC70抗体を用いてファーウエスタン解析を行なうことにより、VC70と相互作用するタンパク質の同定を行なった。その結果、分子量35kDaのHrUrabinと名付けたタンパク質が、VC70と相互作用することを見いだした。本タンパク質は、CRISPファミリーに属するGPIアンカー型膜タンパク質で、VC70との結合に不可欠なN型糖鎖を有している。このタンパク質に対する抗体は、マボヤの受精を濃度依存的に阻害することや、精子のVC70への結合を強く阻害することから、精子HrUrabinはマボヤの受精に重要な役割を果たすと考えられる。しかし、個体レベルで結合実験を行なったところ、HrUrabinとHrVC70との結合能は、同一個体間であっても異個体間であっても大差ないことが示された。カタユウレイボヤでは、極端に分子多型に富むタンパク質(Themis)が存在し、それがアロ認識の鍵を担う本体である考えている。HrUrabinの詳細な機能は不明だが、VC70の多型を認識するのではなく、Themisのようなアロ認識分子を連結させる足場となっている可能性も考えられる。今後、HrUrabinの機能に関するさらに詳細な解析が必要である。

この雄側分子(s-Themis)の遺伝子の第一イントロン内に雌側因子v-Themisの遺伝子が逆向きに配置されており、雄側と雌側の因子が連鎖して密接な関係にあることが示された。今後は、このタンパク間相互作用がアロ特異的であるか否かを検討する予定である。
置換型ポリオキソメタレートによる分子状酸素を用いたアルケンのエポキシ化反応の開発

構造の異なる活性点を有する種々の鉄二置換型ポリオキソメタレートの合成、キャラクタリゼーション及びその分子状酸素活性化能を検討した。二原子欠損型タングストケイ酸クラスターと鉄イオンとの反応に際してのクラスターと鉄イオンとの化学量論比や反応水溶液のpH、対カチオン交換時の処理方法等の違い等に応じて得られる鉄二置換型ポリオキソメタレートの分子構造が異なっていた。これらのうちタングステンクラスター骨格がγ-Keggin型構造を維持している頂点共有型二核鉄活性点を有する鉄二置換型ポリオキソメタレート(=1)、β型クラスター中の離れた二カ所に鉄イオンが存在するポリオキソメタレート(=2)について単結晶X線構造解析を含む各種分光法によるキャラクタリゼーションに成功した。分子構造を明らかにした鉄二置換型ポリオキソメタレートのオレフィンエポキシ化反応に対する触媒特性について比較を行った。過酸化水素を酸化剤とした場合、頂点共有二核鉄部位を有しているγ型クラスター1は環状オレフィンを選択的に対応するエポキシドへと酸化したが、反応初期の活性は高いものの同時に過酸化水素の分解反応も触媒するために過酸化水素の有効利用率が低かった。これに対し一分子中の離れた位置に二つの単核鉄中心が存在するものと見なせるβ型クラスターの場合には、反応速度は遅いものの過酸化水素の有効利用率は高く、しかもエポキシドを選択的に与えた。一方分子状酸素を酸化剤とした場合、前年度の研究によりその触媒活性を明らかとした頂点共有型二核鉄部位を有するγ型クラスター3を含めた酸化活性の序列が1>3>2であることが判明した。以上の結果より、活性点構造-酸化剤活性化様式-触媒活性の三者間に相関関係があることが示唆される。金属酸化物・複合酸化物触媒や担持触媒等の固体触媒は、錯体分子触媒のように反応活性点構造を精密に制御することは困難である。分子性金属酸化物クラスターアニオンであるポリオキソメタレートはその酸性質や酸化力に基づく触媒作用を示すが、その配位元素やクラスター中心に位置するヘテロ元素(ケイ素、リン、ホウ素、遷移金属等)を変化させることで化学的性質を制御できる。すなわち、ポリオキソメタレート中のタングステンやモリブデンの一部を他の遷移金属イオンで置換した遷移金属置換型ポリオキソメタレートが、分子状酸素や過酸化水素等の安価かつ環境負荷の小さい酸化剤を活性化して炭化水素の酸化反応を高効率的に触媒し、しかもこの導入遷移金属イオンの配列(=単核・二核・三核)や幾何構造(="サブナノ構造")と反応活性との間に大きな相関関係があることを見出している。以下にその概要を記す。各金属種の反応特性の解明を目的として、鉄をはじめ様々な遷移金属(チタン・バナジウム・マンガン・コバルト・ニッケル・銅・ルテニウム等)活性点を有するポリオキソメタレートの合成及びその反応特性の解析を推し進めている。分子構造を明らかとした二原子欠損Keggin型ケイタングステン酸γ-[SiW_<10>O_<34>(OH_2)]^<4->に対しては、上記金属種について様々な合成条件での導入方法を検討し、これまでにバナジウム、鉄、コバルトについて二核遷移金属活性点を有するポリオキソメタレートの合成及び構造決定に成功している。また鉄錯体の場合と同様に様々な幾何構造のバナジウム中心を有するポリオキソメタレートについて酸化反応における構造-活性相関の検討を行い、V_2(μ-OH)_2活性点を有するバナジウム置換ポリオキソメタレートが過酸化水素を酸化剤とするオレフィンエポキシ化反応に極めて高い触媒活性を示すことを見出した。二原子欠損型タンダスト

ケイ酸クラスターと鉄イオンとの反応に際してのクラスターと鉄イオンとの化学量論比や反応水溶液のpH、対カチオン交換時の処理方法等の違い等に応じて得られる鉄二置換型ポリオキソメタレートの分子構造が異なっていた。これらのうちタングステンクラスター骨格がγ-Keggin型構造を維持している頂点共有型二核鉄活性点を有する鉄二置換型ポリオキソメタレート(=1)、β型クラスター中の離れた二カ所に鉄イオンが存在するポリオキソメタレート(=2)について単結晶X線構造解析を含む各種分光法によるキャラクタリゼーションに成功した。分子構造を明らかにした鉄二置換型ポリオキソメタレートのオレフィンエポキシ化反応に対する触媒特性について比較を行った。過酸化水素を酸化剤とした場合、頂点共有二核鉄部位を有しているγ型クラスター1は環状オレフィンを選択的に対応するエポキシドへと酸化したが、反応初期の活性は高いものの同時に過酸化水素の分解反応も触媒するために過酸化水素の有効利用率が低かった。これに対し一分子中の離れた位置に二つの単核鉄中心が存在するものと見なせるβ型クラスターの場合には、反応速度は遅いものの過酸化水素の有効利用率は高く、しかもエポキシドを選択的に与えた。一方分子状酸素を酸化剤とした場合、前年度の研究によりその触媒活性を明らかとした頂点共有型二核鉄部位を有するγ型クラスター3を含めた酸化活性の序列が1>3>2であることが判明した。以上の結果より、活性点構造-酸化剤活性化様式-触媒活性の三者間に相関関係があることが示唆される。
エピゲノム解析基盤の確立と遺伝医学への応用

エピゲノムは細胞のエピジェネティックな修飾の総体であり、発生・分化・がん等において重要な働きをする。網羅的・体系的なエピゲノム解析基盤を確立する目的で研究を行い、(1)独自のメチル化DNA濃縮ツールを開発し、(2)マウスの細胞を用いて網羅的解析技術を確立し、(3)この方法をヒト培養細胞や健常者・各種疾患由来の細胞に応用した。これにより、(4)様々なクロマチン因子の相互作用や標的配列を同定することに成功し、(5)ヒト・チンパンジー間のDNAメチル化の差を同定し、エピジェネティクスの制御機構や多様性・進化との関わりを研究する基盤を確立した。エピゲノム解析基盤を確立するため当初の計画通り研究を行い、以下の成果を得た。(1)抗5メチルシトシン抗体に替えてMBD1蛋白質のメチル化DNA結合ドメイン(MBD)を利用したメチル化DNAの濃縮法を開発した。定量PCR法で抗5メチルシトシン抗体とほぼ同等の濃縮効率を認めたが、マイクロアレイではやや結果が不安定であった。現在、MBDの純度・品質について検討中である。(2)抗5メチルシトシン抗体とマイクロアレイを用いて、様々な発生段階のマウス精巣の生殖細胞について網羅的メチル化解析を行い、メチル化パターンがダイナミックに変化することを見つけた。また、Dnmt3a、Dnmt3Lノックアウトマウス由来のサンプルの解析を開始した。今後、これらのサンプルの結果を比較検討し、ノックアウトマウスの無精子症の表現型に関わる遺伝子座の探索を行う。(3)メチル化DNA結合タンパク質MBD1がヒストンH3の27番目リジンのメチル化を認識するポリコーム複合体と協働して、ヘテロクロマチン形成とHoxA遺伝子群の抑制することを明らかにした。また、癌細胞で高発現するクロマチン因子HMGA1が網膜芽細胞腫因子RBに結合し、RBとHDAC1/2との相互作用を阻害することで、RB依存性のGO停止を解除することを明らかにした。さらに、エピゲノム解析を通して、クロマチンインスレーター結合因子CTCFがコヘーシン複合体と共在することを報告した。エピゲノム解析基盤を確立するため計画通り研究を実施し、以下の成果を得た。1、クロマチン因子によるエピゲノム制御を明らかにするための研究として、メチル化DNA結合タンパク質MBD1の相互作用因子であるMCAF1/AMが、がん細胞においてSp1依存性のテロメラーゼ遺伝子発現維持に関わることを報告した。また、細胞周期のG1期にポリコーム抑制複合体PRC1の結合したクロマチンが再構築されることが、S期への進行に必要であることを報告した。さらに、ゲノム上の境界配列(インスレーター)結合タンパク質CTCFが染色体を結びつけるコヘーシンと協働することを見出し、ヒト遺伝性高脂血症に関わるアポリポタンパク質遺伝子クラスターのクロマチンループ形成とエンハンサー・プロモーター相互作用にインスレーターが関わることを報告した。(中尾)2、我々が開発したMBD1を用いるメチル化DNA濃縮法が効率よく働く条件を設定し、網羅的エピゲノム解析技術に有用であることを示した。この方法を用いてDnmt変異マウスの精巣サンプルを解析する予定であったが、変異マウスの頻度が低かったためサンプルを調整するにとどまった。一方、Dnmtが異常発現する精子幹細胞ではメチル化異常と配偶子形成障害が見られることを報告した。また健常者とICF症候群患者の網羅的メチル化解析を行い、現在詳細なデータ比較を実施中である。(佐々木)3、DNAメチル化の個体差の手がかりを得るためヒト白血球を用いた網羅的解析を行ったが、マイクロアレイで検出できるほどの個体差は見られなかった。また、チンパンジーの白血球とヒト白血球のDNAメチル化パターンをヒト21番、22番染色体のゲノムタイリングアレイを用いて比較した結果、二種間で非常にパターンが似ていることを発見した。しかし、少なくとも5ヶ所のメチル化の違いがあり、本法の有用性が示された。(佐々木)
ビスフォスフォネートを用いたインプラント矯正による大臼歯圧下後の薬理学的保定

最近、インプラントを矯正用固定源に利用することによって、大臼歯を圧下して臼歯部高が過大な開咬症例を非外科的に改善することが可能になった。しかし、圧下大臼歯の器械的保定はきわめて困難で、我々の臨床研究では約30%の後戻り変化が認められている。近年、器械的保定にかわる薬理学的保定に関する研究が進展している。すなわち、骨吸収阻害剤として利用されているビスフォスフォネートに移動歯の後戻り抑制効果があることが確認され、注目を集めている。しかし、これまでの研究のすべては、近遠心および頬舌方向の水平的な歯の移動に関してなされており、垂直的は歯の移動に対する効果についての検討は未だなされていない。そこて、本研究では、圧下歯に対するビスフォスフォネートの後戻り抑制効果を検証することを目的とした。実験動物には雄性Sprague-Dawleyラットを用いたが、これらを圧下終了直後から定期的はビスフォスフォネート投与のみで自然保定した群(Group1)と、圧下終了後に器械保定を行った後にビスフォスフォネートの定期投与を行った群(Group2)とに分類した。また圧下のためのメカニクスとして矯正用ワイヤーとチタン製ミニスクリューを用いた装置を独自に考案し、実験に使用した。ラット上顎歯列の精密印象を圧下前、圧下終了時、保定終了時に採得し、歯列石膏模型を作製した。圧下量および後戻り量の測定は、各時期の歯列石膏模型を圧下大臼歯の歯冠中央部において矢状方向に削合し、その断面像をコンピューター画像処理を行うことによって行った。本研究の結果、両群ともにビスフォスフォネートによる有意の保定効果は認められなかったが、今後は組織学的方法によってさらに検討を深める予定である。当初、実験計画として、顎骨に埋入したチタン製ミニプレートを固定源にしたスケレタル・アンカレッジ・システムを用いてイヌ大臼歯を圧下した後、bisphosphonatesを圧下歯周囲に局所投与し、後戻り反応の抑制効果を観察する予定であった。しかし、イヌ大臼歯と同様にラット臼歯も多根歯であり、矯正用ワイヤーにて圧下可能であったため、まずラットを用いて本実験を遂行することとした。その後、よりヒトの歯・歯周・顎骨と解剖学的形態が近似し、ヒトと同等な装置での実験が可能なイヌを用いて実験を行う予定である。実験には約20週令の雄性SDラットを用い、切歯を固定源として、矯正用ワイヤーにて上顎第一臼歯の圧下を行う。臼歯圧下終了後、圧下歯周囲に、実験群にはbisphosphonatesを、対照群には生理食塩水を局所投与する。圧下終了0,7,14,21日後にそれぞれラットを屠殺し、4%パラホルム固定液にて潅流固定し、被験歯を含む顎骨を摘出し同固定液に浸漬固定する。X線学的評価固定した標本をX線写真装置にて撮影し、フィルム上にて圧下量および後戻り量を計測する。組織学的評価(1)脱灰標本標本を脱灰し、パラフィン包埋後薄切し、実験歯および歯周組織について検討する。(2)非脱灰標本Contactmicroradiographyによる観察、テトラサイクリン等による生体染色を行い検討する。現在予備実験として、ラット臼歯圧下のための装置デザイン、力の適応時間・適応力等の検討を加えている。今後の予定として、ラットにおけるデータ数を増やし統計学的検討も加えたのち、イヌ大臼歯での後戻り抑制効果を確認していく。

ヒト大臼歯圧下後の後戻りの保定手段として、骨代謝への作用が認められているbisphosphonateを用いた薬理学的保定の効果の有無を動物実験により検証することを目的とし、当初イヌを用いる実験を予定していたが、ラット臼歯もヒトと同様な多根歯であることから、平成13年度はラット上顎臼歯での圧下の可否を検証し、ラット上顎骨にチタン製ミニスクリューを埋入し、これを固定源とすることにより上顎臼歯の圧下をより効果的に行える装置を考案しラットにおける臼歯の圧下の手法を確立し、以下の方法により臼歯圧下後のbisphosphonateによる後戻り抑制の効果の有無を実験的に観察した。(方法)1.圧下装置装着全身麻酔下でラット上顎骨に、チタン製ミニスクリュー(ライビンガー社)を埋入し、これを固定源として矯正用TMAワイヤーにより、ラット両側上顎第1臼歯に圧下力が加わるようする。2.臼歯の圧下上顎第1臼歯をワイヤーの弾性を利用し2週間圧下力を負荷する。また、対照として反対側同名歯も同様に圧下を行う。3.Bisphosphonateの局所投与4.保定実験歯、対照歯ともに自然保定し、観察を行う。5.標本製作圧下終了後、0・7・14日でそれぞれラットを屠殺し、4%パラホルム固定液にて潅流固定し、その後歯を含む顎骨を摘出し同固定液に浸漬固定する。6.圧下量の計測圧下開始前、圧下終了時、保定終了時にそれぞれラット上顎歯列の精密印象を採得し、石膏模型上で上顎第1臼歯の咬頭頂の垂直的な変化より圧下量、後戻り量を計測する。7.組織学的評価圧下開始0,7,14日にNTA-Pbをラット体重当たり4mgPb/Kgで投与し、鉛描記を行う。これにより圧下期間中にできる新生骨および保定期間中の新生骨部分の吸収等を観察する。またH-E染色も同時に行い、圧下および保定期間中の歯および歯周組織の観察をおこなう。実験には約20週令の雄性SDラットを用い、ラット左右臼歯前方部の上顎骨にチタン製マイクロスクリューを植立しこれを固定源として、左右上顎第1臼歯を矯正用ワイヤーを用いて2週間圧下力を負荷する。実験群を2群に分け、第1群として、圧下終了後より右側第1臼歯周辺の骨膜下にビスフォスフォネートを2日の間隔で注入し、反対側を対照群とし同様に生理食塩水を注入して自然保定し歯の後戻りを観察した。第2群として圧下終了後2週間の器械的保定期間を設けたのち保定装置を除去し、その後第1群と同様の操作を行い後戻りを観察した。圧下量および後戻り量に関しては、歯科用精密印象材にてラット上顎の印象採得を行い、石膏模型上にて、第2、第3臼歯を基準とした仮想咬合平面を設定し、この平面からの第1臼歯の咬合面の距離を計測する事により歯の移動量を求めた。その結果、第1第2実験群ともビスフォスフォネートによる有意な後戻り抑制効果は認められなかった。現在、4%パラホルムアルデヒドにより潅流固定した実験終了後ラット被験資料の脱灰中であり、脱灰終了後、圧下歯および周囲組織を組織学的に観察し、それらの結果を加え、学会発表・論文投稿等を行う予定である。
現代社会におけるスピード化と人間のリズムのズレに関する時間学的総合研究

現在の高度産業社会には、これまで人類の歴史が経験したことのない新しい時間問題が生まれている。これまで人類は、進化の中で身につけた生命的時間と人間が自ら形成した社会的時間をうまく調和させてきたが、今日のグローバル化と情報通信技術の進展によって生じたハイスピード化社会は、社会的時間を大きく変化させて、人類の時間構造に歪みを増幅させて、生命的時間に慢性的時差ボケを生みつつある。今回の時間意識の調査研究ではハイスピード化によって社会的時間の変化が生じており、これが生命的時間との間でズレを生んでいることがある程度明らかになった。調査データの分析からは、ハイスピード化が生命的時間に負の影響をもたらし、青年や高齢者に身体の不調(疲労やイライラ度や不眠や生理不順など)や社会病理の原因を生んでいることが明らかになった。本研究は、急激に進む社会の変化(社会的時間の加速化現象)のなかで生命的時間がミスマッチに陥っている状況を分析し、その対応法を探ることを目指している、初年度である21年度は、基礎資料を収集し、調査に必要な資料収集を行い、「社会的時間と人間的時間のズレ」の分析に必要な枠組を議論して、時間意識に関する調査票を作成し、調査を実施することを目指した。作成した調査項目の主な項目は、時間速度感覚、メディアや情報環境、生活環境の変化、労働環境の変化、現在のストレスや健康状態などである。調査は、調査地を大阪市、岡山市、山口市、宮崎市で、それぞれ都心部と郊外の地域に住んでいる25歳35歳の年代と40歳以降の世代を対象に実施した。調査法は、郵送法を採用した。有効回収率は、青年層調査で17.7%(送付総数1600人中284人の回収)、中高年層調査で47.6%(送付総数2400人中1142人の回収)であった。回収率が低いと予想された青年層(25歳35歳)に関しては、ネット利用会員を標本にネット高利用の青年と携帯ゲーム高利用の青年を調査した(計600人)。この郵送法の調査とネット利用会員の調査とも専門の調査会社に委託した。本研究は、学際的な共同研究であり、調査研究と分析の経験者(辻、石田、高野、高橋、鍋山)の5人が調査研究を担当した。残りの研究者は本研究課題を個々テーマに沿って研究した。もちろん、研究成果については時間学研究所の主催の「時間学セミナー」や「イブニングセミナー」などにおいて研究発表を行い、個人的な研究交流によって、この研究テーマの深化に努めた。中村の研究では、ラットを離乳後に単独飼育すると成熟後にうつ様症状を示すことが見出され、ラットがうつ病モデルとして研究できる可能性があるという知見を得ている。本年度は、昨年度実施した3種類のアンケート調査(青年調査、青年のWEB調査、中高年調査)の分析を行うグループと労働環境、文化環境、情報環境に関しては独自の個別研究をするグループとに分かれて研究を行い、研究会やセミナーなどを通して検討を行った。アンケート調査の分析は、現状では、中間分析の段階であるが、幾つか特徴を挙げると以下のようになる。1.規則正しい生活習慣は、女性の方にやや多くなっているが、友達との約束を守るのは男性の方に多くなっている。「朝起きて日光浴びている」人は、男性より女性に多い。2.高年齢者を対象にした調査の分析かたは、年齢・性別・子どもの有無によって、時間感覚に有意な差があることがわかった。年齢は体感スピードに、性別は時間の使い方に、また子どもの存在は将来の不安に大きな影響を与えていることがわかった。3.青年層における時間意識調査データ分析の結果、時間の意味づけや時間の活用において性差(男女)・世代の差(20歳代と30歳代)・社会関係の有無の影響がみられることが分かった。4.伝統的技術は身体的技法と知識から構成されるが、時間的経過に関する感覚についての予見を得ることが出来た。大きくは季節的時間の把握がなされており、伝統的技術の組み合わせによる単位としての仕事としておおよその時間が把握されている。それは身体的感覚を伴うものである。5.生理機能の検討では、上肢への振動暴露による職業性健康障害である手腕振動症候群の予防には、作業における時間規制が必要で、その基礎検討として断続性を含めた暴露の時間因子と生体影響の大きさの関連を検討した。6.従来からの細胞内反応のシミュレーションの研究に加え、地球規模で概日リズムの活動を計測する行動レベルの研究まで対象を広げることができた。本研究課題に対して社会的時間研究と生命的時間研究のニグループに分けて、研究を行ってきた。1.現代に社会のスピードに関して今回は時間意識のレベルで捉えた。

2.時間感覚が強い高齢者は、規則正しい生活を心掛けながら、いくつかのストレス解消方法を活用して上手くストレスを解消しており、心身ともに健康であることが示された。3.時間感覚が強く時間に正確な高齢者は、他者や周囲からの信任も厚く、自主的かつ積極的に社会活動に参加していることも理解された。このことより高齢者の社会的孤立を抑制するために、高齢者の時間感覚がキー概念となることが解明された。4.「これからの人生に対する姿勢」と「死に対する意識」を分析した結果、「これからの人生に対する意識」は、革新型(気持ちを若々しく保つ)、順応型(年相応に過ごす)を多くの人々が支持していること、支持の程度は属性ごとにかなり異なっており多様であること、などが明らかとなった。また、時間の経過に関する意識との関連も認められた。5.性別や年齢層による時間意識や時間の過ごし方を分析することによって、長期化する老年期をいかに過ごすのかという政策提言的な観点からも研究を深めることができた。6.青年層の時間意識と精神的健康や行動の動機付けの関連について分析を行った結果、未来型の時間志向は、若者の発達段階において重要な時間志向になっていることがわかった。7.この時間志向に危機をもたらすのは自己意識であり、ストレスが少なく自己を肯定的にとらえる者が、時間を意識し、現在を充実させ、将来に希望を持って生活している実態が明らかになった。8.他方、生命的時間研究班では、概日リズムを発生させる遺伝子制御機構の研究を行い、コンピュータシミュレーションによって、マウスの時計遺伝子機構において未発見の分子作用の存在を示し、より確かなリズム発生機構の解明に一歩近づけることができた。
糖化脂質によるテロメラーゼ活性化の基盤的研究：糖尿病と癌の関わり

糖化脂質は糖尿病患者に高蓄積し、これが糖尿病合併症を誘発する。疫学研究によって糖尿病患者は健常者よりも癌に罹りやすいことが示されている。本研究では、糖化脂質が癌の無限増殖に関与する酵素テロメラーゼを活性化させるメカニズムを調べることで、糖尿病と癌の関わりを解明することを目的とした。糖化脂質は酸化ストレスの誘発を介してMAPK経路を活性化し、これがc-MycとhTERTの発現を誘導してテロメラーゼを活性化することを明らかにした。糖化脂質によるテロメラーゼの活性化は、抗酸化物質であるα-トコフェロールを処理することで打ち消された。以上より、糖尿病と癌の関わりの一端に糖化脂質の関与が示唆された。アミノ基を有するリン脂質が糖化を受けて生成する糖化脂質は糖尿病患者に高蓄積し、これが糖尿病合併症を誘発する。疫学研究によって糖尿病患者は健常者よりも癌に罹りやすいことが示され、特に近年の日本の糖尿病患者における死因の第1位は癌であることからも、糖尿病と癌の関わりを解明することは喫緊の課題と言える。申請者は、癌細胞に無限増殖能を与える酵素テロメラーゼを糖化脂質が誘導することを世界で初めて発見した。平成25年度は、糖化脂質によるテロメラーゼ活性化の分子機構を解明することを目的とした。糖化脂質を膵臓癌細胞PANC-1に処理してウェスタンブロット法とリアルタイムPCRによってテロメラーゼの活性化機構を調べた結果、MAPK経路の活性化を介して癌遺伝子c-mycとテロメラーゼ触媒サブユニットhTERTの発現が誘導されテロメラーゼの活性化が起こることを明らかにした。また、DCFH法によって糖化脂質は細胞内に活性酸素種を産生させることを見出し、これによりMAPK経路の誘導が起こると示唆された。以上より、糖尿病患者に高蓄積する糖化脂質のテロメラーゼ活性化機構を解明し、糖尿病と癌の関わりの一端を明らかにすることができた。これによって、糖尿病の病態に関する新しいエビデンスが蓄積され、より良い糖尿病病態の管理に繋がると考えられる。また、糖尿病患者の生活の質(quality of life:QOL)の向上と、糖尿病に要する国民医療費の高騰抑制に結びつく可能性があるため、本研究成果は社会的意義と波及性が大きい。平成26年度は、動物実験による糖化脂質の癌に対する影響評価を研究目的とした。担癌マウスに糖化脂質を投与することで、腫瘍に対する影響を評価した。糖化脂質の化学合成に時間を要してしまったことが原因で、マウスの匹数を十分に取れず、糖化脂質が腫瘍サイズを増大させる傾向は得られたが、有意差はなかった。平成27年度に実施予定の、"糖化脂質のテロメラーゼ活性化を抑制する食品成分の探索"について検討した結果、ビタミンE(α-トコフェロール)の濃度に依存してテロメラーゼの活性化を抑制した。この処理濃度としては3050μMであり、比較的生理的な濃度で効果が得られたことから、有益な結果が得られたと考えられる。糖化脂質の癌に対する作用を消去する食品成分を見出しつつあることから、糖尿病患者における癌のリスク低減につながる可能性が開けた。これにより、糖尿病患者の生活の質(quality of life:QOL)の向上と、糖尿病に要する国民医療費の高騰抑制に結びつくと考えられた。平成27年度は、糖化脂質のテロメラーゼ活性化を抑制する食品成分の探索を研究の目的をした。膵臓癌由来のPANC-1細胞を用いて、糖化脂質が細胞内で酸化ストレスを誘発することを明らかにし、この酸化ストレスによりテロメラーゼの活性化が起こると考えられた。したがって、抗酸化物質によって糖化脂質の効果が消去され、テロメラーゼの活性化が抑えれれることが予想されたため、抗酸化能を有する種々の食品成分を同時に処理してテロメラーゼ活性を測定した。その結果、α-トコフェロール、アスコルビン酸、フェルラ酸が糖化脂質によるテロメラーゼの活性化を抑制することを発見した。糖化脂質の癌に対する作用を消去する食品成分を見出したことから、糖尿病患者における癌のリスク低減につながる可能性が開けた。

本研究では、糖化脂質が癌の無限増殖に関与する酵素テロメラーゼを活性化させるメカニズムを調べることで、糖尿病と癌の関わりを解明することを目的とした。糖化脂質は酸化ストレスの誘発を介してMAPK経路を活性化し、これがc-MycとhTERTの発現を誘導してテロメラーゼを活性化することを明らかにした。糖化脂質によるテロメラーゼの活性化は、抗酸化物質であるα-トコフェロールを処理することで打ち消された。以上より、糖尿病と癌の関わりの一端に糖化脂質の関与が示唆された。糖化脂質の化学合成に時間を要したことから、動物実験の進行が遅れてしまった。遅延した研究を平成27年度に改めて実施する。なお、遅れた分の時間を平成27年度に実施予定の研究に割いており、良好な成果を得ることができた。したがって、本研究課題が終了する平成27年度にはすべての実験を遂行できると考えられる。食品科学担癌マウスの匹数を増やして動物実験を展開する。さらに、糖化脂質の効果を抑制する食品成分をスクリーニングし、糖尿病による癌のリスク低減につなげる研究を推進する。平成25年度の課題である糖化脂質のテロメラーゼ活性化機構の解明に関して、当初の予定通りの成果が得られたため、問題なく研究を遂行できた。糖化脂質のサンプル調製に時間を要したため、動物実験の進行が遅れ、その分の残額が生じた。平成26年度は、糖化脂質のテロメラーゼ活性化作用を動物実験で確認することを目的とする。さらに、最終年度である平成27年度では、糖化脂質の作用を消去する食品成分を見出すことで、糖尿病による癌のリスク低減につなげる研究を展開する。平成27年度に遅延分の動物実験を行う。メカニズム解析の実験結果が良好だったため、高価な抗体やPCR用酵素の出費が抑えられた。動物実験で大量に使用する糖化脂質サンプルの合成・精製に使用する。
慢性閉塞性肺疾患（COPD）に合併する骨粗鬆症の病態メカニズム解明

慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、骨粗鬆症やサルコペニアの危険因子とされているが、その病態は不明な点が多い。本研究では、我々が独自に確立させたCOPDに伴う筋骨格系疾患のモデル動物を用いて、COPDが筋や骨に与える影響因子を解明していく。本研究成果により、COPDに伴う筋骨格系疾患の病態が明らかになれば、病態に応じた治療を検討することが可能となり、ヒトにおいても有益な情報となることが予想される。
好中球による脂肪組織炎症とインスリン抵抗性惹起機構の解明

現在、肥満と2型糖尿病は全身の免疫疾患とも考えられている。脂肪組織に存在する様々な免疫細胞が、マクロファージの浸潤や活性化を介してインスリン抵抗性の進展に関与する事がこれまでに分かっている。脂肪組織の好中球も何らかの重要な役割を果たしている事が先行研究から示唆される。今回の結果から、好中球は絶食後の再摂食のような短時間の刺激によっても脂肪組織内において増加し、ダイナミックな動きをする事が示唆された。また、RNAシークエンスから、脂肪組織好中球は脾臓の好中球とは異なった性質を示し、太ったマウスの脂肪組織好中球は痩せたマウスのものとは一部異なった性質を示す事が示された。慢性炎症、特に脂肪組織へのマクロファージの浸潤は、肥満におけるインスリン抵抗性の発症と進展に大きな役割を果たしている。CD8+T細胞、regulatoryT細胞、肥満細胞、好酸球などの多くの免疫細胞が、マクロファージの浸潤と活性化の調節を介して肥満に伴う脂肪組織の炎症と全身のインスリン抵抗性の進展に関わっていることが明らかとなっている。我々は、マウスとヒトの脂肪組織には好中球も存在していること、マウスに高脂肪食を負荷すると好中球はマクロファージに先行して浸潤が増加し、全身のインスリン抵抗性惹起に関与する事を明らかにした。しかし、脂肪組織に浸潤した好中球に特徴的な性質と役割、その誘因となる因子等については未だ良く分かっていない。そこで、脂肪組織好中球の役割を明らかにするために、脂肪組織好中球の遺伝子発現プロファイルの網羅的解析を目指した。前年度において、通常食のマウスと高脂肪食負荷したマウスからそれぞれ脂肪組織と脾臓を取り出し、フローサイトメーターを用いて好中球のシングルセルソーティングを行った。しかし、得られるRNA量が少なかったために、マイクロアレイ解析を断念した。当該年度においては、得られたRNAからcDNAライブラリを作製し、上記の問題を解決するために、次世代シーケンサーによるRNAシーケンスを他施設の協力のもと行った。プレリミナリーな解析を行っているところである。また、分担研究者とともにミエロイド系細胞特異的な遺伝子改変動物や好中球の遊走に関わると考えられるロイコトリエン経路の遺伝子改変動物を用いた研究も継続中である。運動不足や食習慣の変化により2型糖尿病とメタボリックシンドロームが増加しているが、その基盤となるインスリン抵抗性の発症機序には、脂肪組織の炎症が大きな役割を果たしている。マクロファージなど様々な免疫細胞の浸潤とその役割が明らかにされているが、我々は、肥満に伴ってまず最初に好中球が脂肪組織に遊走することを見出し、好中球の浸潤をきっかけにしてマクロファージの浸潤により脂肪組織の炎症が誘導され、全身のインスリン抵抗性を導くことを明らかにした。当該年度においては、脂肪組織に浸潤した好中球の特徴的な性質と役割を明らかにすることを目的として、脂肪組織好中球の遺伝子発現プロファイルの網羅的解析を目指した。通常食のマウスと高脂肪食により肥満したマウスからそれぞれ精巣上体脂肪を摘出し、コラゲナーゼにより分解した後に遠心分離で血管間質細胞を採取し、抗体染色をしてフローサイトメータを用いて好中球のシングルセルソーティングを行った。コントロールの臓器として脾臓からも好中球を採取した。しかし、脂肪組織に含まれる好中球の数が非常に少ないことと、好中球から採取されるRNAの濃度が低いことから、数十匹のマウスを用いても十分なRNA量が得られず、当初予定していたマイクロアレイ解析は困難であった。そこで、マイクロアレイ解析をあきらめ、次世代シーケンサーを用いたRNAシークエンスを行うよう予定を変更した。何度かの試みの後に、最近、cDNAライブラリの作成に成功したところである。肥満や過食にともなう2型糖尿病やメタボリックシンドロームの進展には、全身性の炎症、特に脂肪組織における免疫細胞浸潤が関わっている。T細胞、B細胞、好酸球、NK細胞等の多くの免疫細胞がマクロファージの浸潤と活性化の調節を介して様々な役割を果たしていることが次第に明らかになってきた。我々は、脂肪組織において好中球が存在する事、好中球はマクロファージに先行して脂肪組織に浸潤し全身のインスリン抵抗性惹起に関わる事をこれまでに明らかにした。しかし、脂肪組織に浸潤した好中球について、特徴的な性質があるのかどうか、どのような役割を果たしているのかなどについてはこれまで分かっていない。そこで本研究では、脂肪組織好中球の役割を明らかにするために、脂肪組織好中球の遺伝子発現プロファイルの網羅的解析を行った。通常食のマウスと高脂肪食により肥満したマウスからそれぞれ脂肪組織と脾臓を取り出し、含まれている細胞からフローサイトメーターを用いて好中球のシングルセルソーティングを行った。

脂肪組織に浸潤した好中球の数は極めて少ないために得られるRNA量は微量であり、マイクロアレイ解析では困難であった。そこで、次世代シーケンサーによるRNAシークエンスを他施設の協力のもとにおこなった。最終年度においては主にデータの解析と検討を行った。その結果、肥満脂肪組織の好中球においてのみ発現が増加する興味深い分子をいくつか同定することができた。また、分担研究者とともに、ミエロイド系細胞特異的な遺伝子改変マウスの解析や、好中球の遊走に関わっていると考えられているロイコトリエン経路の遺伝子改変マウスを用いた検討も行った。代謝学当初予定していたマイクロアレイ解析では目的が実現不可能であったため、次世代シーケンサーを用いたRNAシーケンスに方法を変更した。大幅な予定変更のため、遅れが生じている。また、研究代表者の異動のため、研究を行うための時間的な制約が生じた。遠距離のため、研究代表者は研究分担者と研究打ち合わせやディスカッションを十分な回数行うことができなかった。脂肪組織の好中球は非常に数が少なく、また好中球から得られるRNA量も予想より少なかった。そのため、予備検討を繰り返し数十匹のマウスを用いても、当初予定していたマイクロアレイ解析に十分な量のRNAを得ることができなかった。そこで、解析方法を次世代シーケンサーを用いたRNAシークエンスに変更した。方法の変更を余儀なくされたため、予定よりもやや遅れていると考える。RNAシーケンスの解析をさらに進め、脂肪組織好中球の遺伝子プロファイルから肥満に伴う性質の変化や遊走の機序などを解明する。また、分担研究者とともにミエロイド系細胞特異的な遺伝子改変動物や好中球の遊走に関わると考えられるロイコトリエン経路の遺伝子改変動物を用いた研究を継続する。RNAシーケンスの解析を進め、脂肪組織好中球の遺伝子プロファイルから肥満に伴う性質の変化や遊走の機序などを解明する。また、分担研究者とともにミエロイド系細胞特異的な遺伝子改変動物や好中球の遊走に関わると考えられるロイコトリエン経路の遺伝子改変動物を用いた研究も予定している。本年度は異動があったため、当初の研究計画と実際の実施に差が生じた。最終年度であり、研究内容を積極的に発表するために使用する。シーケンスの解析のための費用や、マウス飼育、各種実験機材、移動のための交通費を予定している。
酸味受容体候補PKD1L3/PKD2L1の分子細胞生物学的解析

味覚系は、ヒトを含め動物にとって、食物の栄養価(糖、アミノ酸含量)、毒性(苦味強度)、塩濃度、酸性度(腐敗度)を評価するための重要な外部化学感覚である。本研究では、研究代表者らが世界に先駆けて発見した酸味受容体候補PKD1L3/PKD2L1が、実際にin vivoで哺乳類の酸味受容体として機能するか解明することを目的として、PKD1L3やPKD2L1遺伝子破壊マウスを作製した。作製に成功したPKD1L3とPKD2L1のホモ変異マウスは、いずれも生存可能で、発育も野生型と違いが見られなかった。また、味細胞の形態とPKD1L3やPKD2L1以外の味細胞マーカー分子の発現も正常であった。現在、これらの変異マウスが、酸味や他の味覚受容に関してどのような表現型を示すかを行動学的、電気生理学的手法を用いて引き続き解析を行っている。味蕾細胞は、電顕観察による細胞形態と細胞内微細構造に基づいて、紡錘形をしたI型、II型、III型細胞と基底部に存在する丸型のIV型細胞に分類される。しかし、それぞれの細胞型がどのような機能的性質を持つか不明であった。PKD2L1を発現する酸味受容細胞と電顕観察による分類との対応付けをするために、抗PKD2L1抗体と各細胞型のマーカー分子に対する抗体との二重免疫染色を行った。その結果、PKD2L1陽性細胞は、NCAMなどのIII型細胞のマーカー分子と発現がほとんど重なった。一方、NTPDase2、PLCβ2などのI型やII型細胞のマーカー分子とは重ならなかった。すなわち、III型味細胞は酸味を受容する細胞であり、II型味細胞は甘・苦・うま味を受容する細胞であることが分かった。この研究成果は、味蕾細胞の細胞形態と細胞機能とを結びつけることができたという意義がある。
魚類の代替繁殖戦術の進化に関する研究

本課題では,アフリカ・タンガニイカ湖産シクリッド(カワスズメ科)魚類で著しく発達した代替繁殖戦術(ARTs)の進化に関する研究に取り組んだ.調べることができた本族7属35種のうち,6属,25種でARTsが見つかった.ARTsが見つかった属の中にはARTsを持たない種も多く存在しており,本族で見られるARTsの著しい発達は,各々の種で独立に進化した結果だと推測された.本研究では,繁殖戦術として,なわばり戦術,スニーキング戦術,サテライト戦術,パイラシー戦術を考慮した.最も頻繁に見られたスニーキング戦術の存在は婚姻形態と繁殖基質と関連していることが示唆された.本年度はザンビア国ムプルング周辺の4地点にて野外調査を実施し、種間比較のための網羅的な調査と、1種に焦点を当てた代替繁殖戦術研究における未検証課題を解明するための行動実験を実施した。種間比較の調査において、対象としたタンガニイカ湖産シクリッド10種のうち実際の繁殖行動が見られた種はわずかであったが、生殖腺のデータから新たに3種から代替繁殖戦術が見つかった。その全ては基質産卵種であり、口内保育種からは見つからなかった。統計的な検討は、後に行う系統解析の結果と合わせてなされるべきであるが、これは当初の予想通り代替繁殖戦術が著しく発達・多様化したタンガニイカ・シクリッドの中でも、1つの単系統群の内で著しく発達しており、その中で何度も独立に進化してきたことを支持する結果である。今後は、得られたサンプルの父性判定を行い、実際にどれぐらいの割合でスニーキングが生じているのかを明らかにしていく。来年度以降も観察種数を増やしていきたい。行動実験は、代替繁殖戦術に関連した特異な性質をもつ種、モンダブで実施した。本種は、異なる色彩を持つスニーカーが同一個体群内で共存することが昨年の調査で分かった。本年度はその色彩の意義を明らかにするため、野外実験を行った。その結果、地味な体色のスニーカーは同種他個体に見つかりにくいことが明らかとなった。一方で、派手な体色のスニーカーは見つかりやすいものの、その色彩が縄張り保持のシグナルとして機能しており、縄張り保持に有利な可能性が示唆された。研究をさらに進めていくことで、これまで分かっていなかったスニーカーの色彩の適応的意義のついて明らかとなることが期待される。本課題では,アフリカ・タンガニイカ湖産シクリッド(カワスズメ科)魚類で著しく発達した代替繁殖戦術(ARTs)の進化に関する研究に取り組んだ.調べることができた本族7属35種のうち,6属,25種でARTsが見つかった.ARTsが見つかった属の中にはARTsを持たない種も多く存在しており,本族で見られるARTsの著しい発達は,各々の種で独立に進化した結果だと推測された.本研究では,繁殖戦術として,なわばり戦術,スニーキング戦術,サテライト戦術,パイラシー戦術を考慮した.最も頻繁に見られたスニーキング戦術の存在は婚姻形態と繁殖基質と関連していることが示唆された.今年度は3年計画の初年度であり,タンガニイカ湖での野外調査を実施し基礎データを採集した.調査計画に基づき,8月ー11月にかけてタンガニイカ湖で野外観察と標本採集を実施した.野外観察は,同湖固有のカワスズメ科ランプロロギニ族の1種ランプロロガス・カリプテルス及び同族のネオランプロロガス・モンダブで行った.いずれも行動観察,標本採集を予定通り実施し,スニーカーの詳細について知ることが出来た.カリプテルスの採集標本は,次の3つの異なる目的のために用いる.1)戦術間の形態変異:CTスキャンによる3次元形態解析を行い,主に頭部骨格の戦術間の差異を精査する.2)戦術間の生活史変異:アルコール保存した30個体から耳石を採集し,輪紋による齢査定を行う.このために必要な耳石の輪紋形成パターンについては,現地で飼育実験を実施しており,そこから調べることができる.3)戦術の遺伝基盤:異なる戦術間で配列を比較するために,アルコール保存した20個体を分子実験のために用いた.いずれの解析も帰国次第開始し,現在も継続しているため,結果が出るのは来年度以降になる.種間比較のための標本採集は計画通り45種に対して実施し,30種においては十分なサンプルを集めることが出来た.また,基礎的な生態が分かっていない29種においても観察を行い,十分な成果を得ることができたと考えている.これらの調査から新たに6種から代替繁殖戦術(スニーカー)の存在が示唆された.しかし,産卵行動自体の観察例が少なく,今後も調査が必要である.同様に,十分な標本が集まらなかった15種についても,サンプリングを継続する必要がある.本研究は,タンガニイカ・シクリッドの中の基質産卵系統ランプロロギニ族における代替繁殖戦術の網羅的把握と,特定の種を用いた適応進化の解明,及び系統樹を考慮した種間比較による代替繁殖戦術の進化をもたらした生態的要因の解明であった.当初は3年の調査において16種の代替繁殖戦術に関連した繁殖生態の調査を実施し,これまでの研究成果と併せて40種を扱う予定であったが,3種については観察の難しさもあって,詳細な情報が得られなかった.従って,これは今後に残された課題である.いくつかの種においては,特異的な現象が見つかり,そのための追加調査を実施した.特定の種を用いた研究においては,特にパイラシー戦術についての研究が進んだ.

種間比較は,上記のように予定していたすべての種のデータを得ることができなかったが,配偶システム・保護様式・産卵場所などと関連する可能性が示唆された.これに関しては引き続き解析・調査が必要である.行動生態学調査地周辺で比較的観察が容易(可能)な種の約7割で代替繁殖戦術の有無が確認できた。現時点、主観比較を行うには十分な種数が集まったと思われる。また、行動実験も順調に実施できた。サンプリングがうまくいっていない種もあるが,それは想定内の範囲のもので,計画の遅れをもたらすものではない.また,今年度は予定していなかった分子実験についても,十分なサンプルを集めることができたために,予定より早く実施することが出来た.この点においては,予定よりも進んでいると考えている.総合的に判断すると,今年度の調査は順調に進展していると言える.今後は、得られたサンプルを用いて、系統解析と父性判定を行い、実際にどれぐらいの割合でスニーキングが生じているのかを明らかにしていく。また、本年度得られた仮説を検証する実験も行い、代替繁殖戦術種で典型的にみられる、縄張り雄とスニーカー間の色彩の違いの適応的意義について明らかにしていきたい。今後も,今年度のテーマが継続して実施される.すなわち,現地調査と分子実験である.今年度は予定以上に標本が採集できたために,来年度は解析に多大な時間を要する.これらの研究はいずれも新規性の高いものであり,期待する成果が得られた場合には,速やかにその公表,すなわち論文の作成に移行したい.また,学会での発表も予定している.また,今年度の野外調査において,当初は予定しなかった口内保育種(ランプロロギニ族以外のタンガニイカ湖産カワスズメ科魚類)からも代替繁殖戦術が見つかった.この点では,対象種を増やすという計画の見直しが必要になるかもしれないが,そうすることで新たなブレークスルーがあるのかどうかをよく吟味して決めたい.次年度使用額が生じた1番の理由は、海外調査の補助に使う予定だった予定していた人件費がかからなかったことにあります。2014年度は物品費200,000円、旅費700,000円、人件費100,000円の計画でした。次年度使用額11,934円は、物品購入費に充てる予定です。具体的には、古くなった潜水機材の部品修理(オーバーホール)に用いる予定です。現地での物価の上昇があり,調査のための旅費に多くの研究費を割く必要性が生じた.また,共同研究により幾つかの支出を抑えることが出来た.その結果,当初予定していた品目の配分が変わり,そして差額が生じた.差額は来年度以降の研究費と合わせて,実験に用いる消耗品あるいは試薬の購入に充てたい.
アミロイド分子のPETリガンドに関する基礎医学的研究

本研究では,現在臨床応用でもっとも普及しつつあるピッツバーグ大学化合物であるPIBによるイメージング研究との比較研究も実施した。19ヶ月齢APP23モデルマウスあるいは12ヶ月齢のPS1xTg2576のdouble transgenicマウスの尾静脈から標識PIBを投与し,両者の画像シグナルを比較した。double transgenicマウスあるいはTg2576マウス脳では,従来Klunkのグループから報告されているように,十分なシグナルは検出できなかった。この結果は,アルツハイマー病患者でのヒトPET解析結果とは一致しない。そこで,陽性シグナルを示したAPP23とネガティブであったTg2576マウスを解剖しアミロイド斑を免疫抗体法によって検出・比較したところ,両者に検出されるに十分な老人斑を確認することができた。ただし,ピログルタミン酸修飾アミロイド量において明白な相違を検出することができた。つまり遺伝改変モデルマウスだけではなく,ピログルタミン酸という化学反応による修飾あるいは月数という時間が必要なことが示された。このことは,病変加速マウスとしての限界を示すと同時に,神経病理変化形成にとって時間のファクターも重要であることをしめすものである。今後,臨床的PIBイメージングの評価には,たえずピログルタミン酸修飾アミロイドの存在を念頭に置きつつ画像診断を進める必要がある。アルツハイマー病の脳病理学的な特徴はアミロイドの異常沈着である。従来から死後の脳組織を取り出して、顕微鏡観察することで確定診断となり、進行度を判断することができた。本研究は生前の状態でアミロイドを画像化することを目的としている。このために、アミロイドと特異的に開発する色素であるチオフラビンあるいはコンゴレッドを改良し、脳血管関門を通過するように改変した化合物を合成し、放射能標識したものを用いて、PET画像を解析しようとするものである。本年度は、研究対象となるアミロイド老人斑を有するマウスの調製とリガンドとなる化合物の試験管内でのアミロイド結合試験を中心に実施した。その結果、モデルマウス脳内にアミロイド老人斑が蓄積していることが確定し、検査対象としての動物の準備を整えた。また、リガンド化合物についても、ELISAプラスチックプレートを用いたin vitroでの実験系で(E)-3-スチリルピリビジン誘導体およびスチルベン誘導体がアミロイドと高度に特異的に結合することを明らかにした。放射性ヨード標識したリガンドを用いて、マウス脳組織へのすみやかな移行と排出を観察することができた。さらにアルツハイマー病脳組織をもちいてリガンド化合物とアミロイド抗体の染色結合性を比較検討し、高度にアミロイド異常沈着物への結合を蛍光顕微鏡で観察することに成功した。まだ不完全ではあるが、PIBだけでなく国産リガンドであるフラボン化合物を用いたmicroPET画像をはじめて描出することに成功した。