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新規4価ワクチン導入後のB型インフルエンザウイルスの進化・伝播経路の解明

これまでのインフルエンザワクチンはA型2種類(A/H1N1、A/H3N2)とB型1種類(B/Victoria系統かB/Yamagata系統のどちらか)の3価のワクチンであった。したがって実際に流行する系統とワクチンに含まれる系統が合致していない(ミスマッチ)ことが度々生じて、問題とされていた。このような状況を打開するために、2015/2016シーズンから日本でもB型の2系統を両方用いた4価のワクチンが導入されたが、このような新規ワクチン導入による干渉からウイルスが生き残るために遺伝子変異や遺伝子再集合(リアソートメント)などを起こし、これまでに流行が観られなかった新しいウイルスが出現することが考えられている。本研究はこの新規4価ワクチン導入後のB型ウイルスの進化動態の変化と伝播経路の解明を目的としている。最終年度である平成30年度は、4価ワクチンが導入さてからの3シーズン分のB型ウイルスの流行動態の解析ならびにデータベースに登録されている世界各地の株と遺伝子配列の比較を行うことでウイルスの進化動態の解析を試みた。その結果、B型ウイルスの流行は3シーズン通じてVictoria系統とYamagata系統の混合流行であったものの、その比率は各シーズで異なっていたことが分かった。また遺伝子解析では、3シーズン通じて抗原性を大きく変化させるような遺伝子変異は見つからず、前のシーズンに流行した株とよく似た遺伝子配列の株が次のシーズンも流行していたことが判明した。一方海外ではで2016年に北米でVictoria系統の抗原変異株が検出され、シーズンを追うごとに徐々に流行地域を拡大させていったが、A/H1N1pdm09のような大流行には未だ至っていない。日本では2018年に入ってから散発的に検出されはじめたものの、残念ながら我々の調査地域では研究期間中に検出されなかった。B型インフルエンザウイルス(B型ウイルス)はA型インフルエンザウイルス(A型ウイルス)と同様に分節性のゲノムを持つが、A型ウイルスのように亜型に分かれることはなく、抗原性はHAの遺伝学的特性から2つの系統(Victoria系統とYamagata系統)に分類される。これまでのインフルエンザワクチンはA型2種類(A/H1N1、A/H3N2)とB型1種類(B/Victoria系統かB/Yamagata系統のどちらか)の3価のワクチンであったため、B型ウイルスに関しては流行する系統とワクチンに含まれる系統のミスマッチが度々生じて、問題になっていた。このような状況を打開するために、2015/2016シーズンから日本でもB型の2系統を両方用いた4価のワクチンが導入された。このような新規ワクチン導入による干渉から、ウイルスが生き残るために遺伝子再集合(リアソートメント)などを起こし、これまでに流行が観られなかった新しいウイルスが出現することが考えられる。初年度である平成28年度は、200株以上のB型ウイルスの分離株を得ることができ、それらの株の一部をHA遺伝子とNA遺伝子に関して塩基配列の決定を行った。その結果、HA遺伝子とNA遺伝子の系統の組み合わせが異なる株(Inter-lineage-reassortant)を見つけることに成功した。このような通常とは流行している株とは異なる株を起点にデータベースに登録されている海外の株も含めて株情報から伝播経路の推測を行うことで、今後のインフルエンザ対策に役立つことができると考えられる。本年度も、調査ネットワークを構築している全国の小児科医の協力により、900検体以上のインフルエンザ患者鼻汁検体を得ることができた。これらの検体インフルエンザウイルスに感受性のあるイヌ腎臓尿細管上皮細胞由来の細胞(MDCK細胞)を用いてウイルスの分離を試みたところ、200株以上のB型ウイルスを分離することに成功した。分離されたB型ウイルスのいくつかの株をHA遺伝子とNA遺伝子に関して塩基配列の決定を試みたところ、HA遺伝子とNA遺伝子で系統の組み合わせが異なる株(Inter-lineage-reassortant)を見つけることに成功した。これまでのインフルエンザワクチンはA型2種類(A/H1N1、A/H3N2)とB型1種類(B/Victoria系統かB/Yamagata系統のどちらか)の3価のワクチンであったため、B型ウイルスに関してはワクチンに使用する系統を予測してどちらか1系統を選んで製造されていた。このような状況を打開するために、2015/2016シーズンから日本でもB型の2系統を両方用いた4価のワクチンが導入されたが、このような新規ワクチン導入による干渉からウイルスが生き残るために遺伝子再集合(リアソートメント)などを起こし、これまでに流行が観られなかった新しいウイルスが出現することが考えられている。2年目となる平成29年度も200株以上のB型ウイルスの分離株を得ることができ、それらの株の一部をHA遺伝子とNA遺伝子に関して塩基配列の決定を行った。しかしながら、前年度に発見したようなHA遺伝子とNA遺伝子の系統の組み合わせが異なる株(Inter-lineage-reassortant)は今シーズンは見つからなかった。

本年度(2017/2018シーズン)は例年よりもB型の流行規模が大きく、本年度も調査ネットワークを構築している全国の小児科医の協力により、500検体以上のインフルエンザ患者鼻汁検体を得ることができ、そのうち200株以上のB型ウイルスを分離することに成功した。分離されたB型ウイルスのいくつかの株をHA遺伝子とNA遺伝子に関して塩基配列の決定を試みたところ、昨年度に流行したウイルスと非常によく似たウイルスが流行していたことが判明し、HA遺伝子とNA遺伝子の系統の組み合わせが異なる株(Inter-lineage-reassortant)は本年度はは見つけることができなかった。このことから本年度の大規模なB型の流行は遺伝子変異によるものではなく、なにかしらの別要因が考えられる。これまでのインフルエンザワクチンはA型2種類(A/H1N1、A/H3N2)とB型1種類(B/Victoria系統かB/Yamagata系統のどちらか)の3価のワクチンであった。したがって実際に流行する系統とワクチンに含まれる系統が合致していない(ミスマッチ)ことが度々生じて、問題とされていた。このような状況を打開するために、2015/2016シーズンから日本でもB型の2系統を両方用いた4価のワクチンが導入されたが、このような新規ワクチン導入による干渉からウイルスが生き残るために遺伝子変異や遺伝子再集合(リアソートメント)などを起こし、これまでに流行が観られなかった新しいウイルスが出現することが考えられている。本研究はこの新規4価ワクチン導入後のB型ウイルスの進化動態の変化と伝播経路の解明を目的としている。最終年度である平成30年度は、4価ワクチンが導入さてからの3シーズン分のB型ウイルスの流行動態の解析ならびにデータベースに登録されている世界各地の株と遺伝子配列の比較を行うことでウイルスの進化動態の解析を試みた。その結果、B型ウイルスの流行は3シーズン通じてVictoria系統とYamagata系統の混合流行であったものの、その比率は各シーズで異なっていたことが分かった。また遺伝子解析では、3シーズン通じて抗原性を大きく変化させるような遺伝子変異は見つからず、前のシーズンに流行した株とよく似た遺伝子配列の株が次のシーズンも流行していたことが判明した。一方海外ではで2016年に北米でVictoria系統の抗原変異株が検出され、シーズンを追うごとに徐々に流行地域を拡大させていったが、A/H1N1pdm09のような大流行には未だ至っていない。日本では2018年に入ってから散発的に検出されはじめたものの、残念ながら我々の調査地域では研究期間中に検出されなかった。引き続き、調査ネットワークを構築している全国の小児科医と連携し、検体を採取してInter-lineage-reassortant株のような特殊株の探索を行う。また、HA遺伝子とNA遺伝子のみでなく、ウイルス粒子を構成するその他6つの遺伝子に関しても塩基配列を決定し、構成遺伝子の組み合わせを確認することで遺伝子再集合(リアソートメント)の有無や、そのパターンを検討する。
生命教育に於ける動物解剖実習の再検討

一昨年、福岡県下の小学校、中学校、高等学校の教員を対象に「動物解剖実習の取り扱い」についてのアンケ-ト調査を行い、これらの分析を行った結果、動物解剖実習の実施頻度は小、中、高を通して近年低落していることを明らかにした。この要因は直接には文部省指導要領の変更、指導に基づくものであると判断されるが、同時に、最近の「生命への畏敬」、「生命の尊厳」を重視した教育指導との並立、融和の困難さにあるのではないかと推定された。この傾向はとりよけ初等教育において顕著である。しかし、一方で、近年の児童生徒は解剖実験に対して、「気持ち悪い」、「きたない」との反応が顕著であり、解剖実験の衰退が生命教育への教育効果を高めているとは判断できない実態も指摘される。また、中学、高等学校では解剖実験の教育的意義を認める教員は多数であり、その教育的意味を否定する教員は極微であった。これらのアンケ-トの分析結果のまとめにおいて、動物解剖実習は単なる自然知識の獲得として位置づけるだけではなく、生命科学教育としての位置づける重要さが指摘された。解剖実習が自然教育教材であることに加え、生命教育の教材としての明確な位置づけと、生命利用に関する倫理的、教育的配慮が充分になされるならば、動物解剖は自然科学教材としても、生命教育教材としても極めて優れたものになりうると判断される。しかし、この場合には、教員自身の自然観、生命観、倫理観など指導能力が問われることになる。これらの初等中等教育への動物解剖実習に関する私の論議、提言は、「初等中等自然科学教育における動物解剖実験の実態調査」に要約した。また、これまで明らかにした、人間の生命利用の「原理論」に加えて、本年度は生命利用の「倫理的行為論」の論理構築を試みた、これらは「動物実験の可否を問う」(仮題)に北徳氏との手紙による討論としてまとめられ、また、本研究によってなされた私の論文、資料もあわせて転載され、出版される運びとなっている。現在、欧米先進諸国を中心にして動物の権利、福祉の立場から研究教育の場での動物利用の規制が進められ、これらの立場からの教育カリキュラムも進められつつある。わが国ではこれらに対応した法改正はなされておらず、この目的の社会運動はまだ大きくはない。しかし、わが国でも、人類の活動による生命環境の危機を背景に同様な非ヒト生物に対する意識変動は進行しており、これらの状況を正確に把握し、科学教育のあり方を検討することが焦眉である。そこで動物利用に関する12項目の設問を含むアンケ-トを福岡県下の小学校、中学校、高等学校の画100校を対象に行い調査活動をおこない、分析をした。小学校教員の中では生命倫理的立場から動物解剖に対する反対が小さくない一方、高等学校教員は時間的関係から実際には動物解剖や実施できないが、動物解剖実習には賛成する教員が多いなど極めて興味ある結果を得ている。本年度中にはこれらをまとめ分析、発表する予定である。動物実験の倫理的問題は哲学的倫理学的に高度な問題である。現在欧米で進められている法的整備はこの根幹的論理については触れずして進行しており、それゆえ同時に様々な社会的亀裂を生み出している。この哲学的、倫理学的問題についての整理を試みた論文を書き上げ、発表した。著書「人間の自然からの乖離と動物への同情」では現在の動物解剖あるいは動物利用に懐疑を支える社学的要因を見つめ、人間と動物との物質的、精神的関係を自然史的に解析したものである。また、金子との共著「人間による非ヒト生命の利用とキリスト教」では非ヒト生命を犠牲にする人間のあり方を考察したものであり、一宗教の立場を超えた普遍的な倫理観を展開しており、すでに実験動物関係の研究者からの興味と注目を集めている。

また、これまで明らかにした、人間の生命利用の「原理論」に加えて、本年度は生命利用の「倫理的行為論」の論理構築を試みた、これらは「動物実験の可否を問う」(仮題)に北徳氏との手紙による討論としてまとめられ、また、本研究によってなされた私の論文、資料もあわせて転載され、出版される運びとなっている。
無機炭素輸送濃縮機構の環境応答

(1)クラミドモナスCA遺伝子CAH1のCO_2濃度変化に応答する発現調節領域CAH1遺伝子上流域とレポーター遺伝子(ars)を融合させたキメラ遺伝子をもつプラスミドを作製し、硝酸還元酵素(nit)遺伝子を持つ選抜用プラスミドpMN24とともにクラミドモナス宿主株(nit欠損株)に導入した。この結果、転写開始点から-293塩基までの上流域があればCO_2濃度の変動に応答できることが判明した。(2)-1クラミドモナス高CO_2要求性変異株の単離と解析nit1遺伝子を遺伝子タギングの指標として用いて、高CO_2要求性変異株のスクリーニングを行った。nit1遺伝子の挿入変異によってCA活性の誘導がかからなくなった株を6株単離した。(2)-2ラン藻cemAホモローグの解析葉緑体包膜タンパク質をコードする遺伝子cemAのホモローグをラン藻から単離し、遺伝子破壊をおこなったところ、無機炭素の取り込みが野生型に比べて約1/3に低下していた。(2)-3ラン藻CA遺伝子上流域の解析無機炭素輸送濃縮に関わると考えられるラン藻炭酸脱水酵素(CA)遺伝子の上流域約20kbについてDNA塩基配列を決定した。この領域に挿入変異を導入して、得られたカナマイシン耐性株のCO_2要求性を調べたところ、低pH感受性の株が得られた。
般若経の総合的研究

本研究は般若経の成立基盤、構成要素乃び、他の思想との関連比較等の総合的研究によって般若経の本質を明らかにせんとするものである。般若経は仏教文化の基礎をなす重要な経典の一つであるが、従来は個々の研究、龍樹等の中論、智度論を通しての理解等が多く、般若経そのものの中の思想の分析並びに総合的、客観的研究はあまりなされていなかった。そこで本研究は、一昨年度は主として、下記分担者の研究分野における文献資料の検討収集を中心に研究を行った。昨年度は研究会により問題を明らかにしつつ、分担の分野の文献検討、資料収集、資料カ-ド記入等が主となった。本年度は、(1)仏教以前、特に古期ウパニシャッド、ジャイナ等の関連研究による般若経のインド思想史的意義の考察(村上、松寿)(2)般若経における初期仏教思想の伝承、発展(早島)(3)時代を同じくして対象的な阿毘達磨仏教との関連(西村)(4)般若経と初期大乗との関連(高橋、真野)(5)般若経の智慧論、論理乃び中観論理との関連(梶山、戸崎、立川)(6)般若経群内部の発展の研究を相互対応の文献を精密に比較しながら、小品般若経への内容の展開(木村、真田、長島)(7)般若経の他方浄土思想、密教等の研究(香川、福田、吉田)(8)世界思想と般若経(峰島)、東洋思想との比較哲学的研究(三枝)の各々具体的研究を行った。その結果、平成三年に入り、来年三月に予定している成果出版に向けての具体的な作業、打合せに入り、全体討論、各班ごとの、あるいは数班ごとの研究会を行った。そして、すでに十遍の原稿が集まっている。本研究は般若経の成立基盤、構成要素及び、他の思想との関係比較等の総合的研究によって般若経の本質を明らかにせんとするものである。そこで当研究は、本年度は主として、下記分担の研究分野における文献資料の検討収集を中心に研究を行った。従って、当初の研究会により問題を明らかにしつつ、分担の分野の文献検討、資料収集、資料カード記入等が主となった。(1)仏教以前、特に古期ウパニシャッド、ジャイナ等の関連研究による般若経のインド思想史的意義の考察(村上、松濤)(2)般若経における初期仏教思想の伝承、発展(早島)(3)時代を同じくして対象的な阿毘達磨仏教との関連(西村)(4)般若経と初期大乗との関連(高橋、真野)(5)般若経の智慧論、論理及び中観論理との関連(梶山、戸崎、立川)(6)般若経群内部の発展の研究を相互対応の文献を精密に比較しながら小品般若経から大品般若経への内容の展開(木村、真田、長島)(7)般若経の他方浄土思想、密教等の要素の研究(香川、福田、吉田)(8)世界思想と般若経(峰島)、東洋思想との比較哲学的研究(三枝)。本研究は般若経の成立基盤、構成要素及び、他の思想との関連比較等の総合的研究によって般若経の本質を明らかにせんとするものである。

そこで、当研究は、昨年度は主として、下記分担の研究分野における文献資料の検討収集を中心に研究を行った。本年度は研究会により問題を明らかにしつつ、分担の分野の文献検討、資料収集、資料カ-ド記入等が主となった。(1)仏教以前、特に古期ウパニシャッド、ジャイナ等の関連研究による般若経のインド思想史的意義の考察(村上、松涛)(2)般若経における初期仏教思想の伝承、発展(早島)(3)時代を同じくして対象的な阿毘達磨仏教との関連(西村)(4)般若経と初期大乗との関連(高橋、真野)(5)般若経の智慧論、論理及び中観論理との関連(梶山、戸崎、立川)(6)般若経群内部の発展の研究を相互対応の文献を精密に比較しながら、小品般若経から大品般若経への内容の展開(木村、真田、長島)(7)般若経の他方浄土思想、密教等の要素の研究(香川、福田、吉田)(8)世界思想と般若経(峰島)、東洋思想との比較哲学的研究(三枝)。また、2年後に予定している成果出版に向けての具体的な作業・打合せに入り、全体討論、各班ごとの、あるいは数班ごとの研究会を行っている。本研究は般若経の成立基盤、構成要素及び、他の思想との関連比較等の総合的研究によって般若経の本質を明らかにせんとするものである。般若経は仏教文化の基礎をなす重要な経典の一つであるが、従来は個々の研究、龍樹等の中論、智度論を通しての理解等が多く、般若経そのものの中の思想の分析並びに総合的、客観的研究はあまりなされていなかった。そこで当研究は、一昨年度は主として、下記分担の研究分野における文献資料の検討収集を中心に研究を行った。昨年度は研究会により問題を明らかにしつつ、分担の分野の文献検討、資料収集、資料カ-ド記入等が主となった。本年度は、(1)仏教以前、特に古期クパニシャッド、ジャイナ等の関連研究による般若経のインド思想史的意義の考察(村上,松濤)(2)般若経における初期仏教思想の伝承、発展(早島)(3)時代を同じくして対象的な阿毘達磨仏教との関連(西村)(4)般若経と初期大乗との関連(高橋,真野)(5)般若経の智恵論、論理及び中観論理との関連(梶山、戸崎、立川)(6)般若経群内部の発展の研究を相互対応の文献を精密に比較しながら、小品般若経への内容の展開(木村、真田、長島)(7)般若経の他方浄土思想、密教等の要素の研究(香川、福田、吉田)(8)世界思想と般若経(峰島)、東洋思想との比較哲学的研究(三枝)の各々具体的研究を行った。その結果、平成三年に入り、来年三月に予定している成果出版に向けての具体的な作業・打合せに入り、全体討論、各班ごとの、あるいは数班ごとの研究会を行った。そして、すでに十遍の原稿が集まっている。
タンパク質リン酸化反応を触媒する人工酵素の作製

RNAーペプチド複合体(RNP)を構造基盤に用いて、各サブユニットを同時にライブラリー化した「RNP複合ライブラリー」作製し、進化工学手法によりペプチドのリン酸化反応を触媒する人工酵素の獲得を目指した。効率的な翻訳反応とペプチドサブユニットとの複合体形成が可能なmRNA配列の設計とライブラリー合成条件を検討した。また、ATPのリン酸基を識別できるRNPリセプターの分子選択条件を検討し、新規のリセプターを獲得した。さらに、RNPリセプターの修飾法を検討し、人工酵素をはじめとする機能性RNPのスクリーニングを行うためのライブラリー作製条件を新たに開発した。1. RNA-ペプチド複合ライブラリーの設計と作製本研究では、ランダム化された配列を持つRNAサブユニットとそれをコードして合成されるランダム配列をもつペプチドサブユニット同士が共有結合で連結され、かつ固定配列の領域同士で複合体を形成する「RNA-ペプチド複合ライブラリー」を、mRNAディスプレイ法を応用して作製し人工酵素の獲得を目指す。RNA-ペプチド複合体(RNP)形成部分として、RRE RNA- Revペプチド複合体を用いる。固定配列であるRRERNAがRevペプチドの一部をコードするように変異導入したライブラリーを設計、合成した。この変異導入RRE RNA配列とRevペプチドとの複合体形成が確認できた。現在、RNA-ペプチド複合ライブラリーの合成条件を検討中である。2. ATPのリン酸基特異的な識別が可能なRNPリセプターの作製ペプチドリン酸化酵素の作製において、リン酸基の認識能は重要である。これまでに作製されたATPをはじめとするヌクレオチドに結合するアプタマーでリン酸基を認識、識別可能なものは事例に乏しく、RNAのみでリン酸基を識別可能なリセプターを作製するためにはセレクションの選択圧の制御が必要であると考えられる。実際にRNAのみをランダム化したRNPライブラリーを用いてATPのリン酸基の識別が可能なRNPリセプターの作製を試みた結果、リン酸基識別能は有するものの、基質親和性が低いリセプターが獲得された。これは、リン酸基の識別能と親和性とを両立したリセプターをRNAのみのライブラリーから獲得するための分子選択条件の確立の難しさを示している。RNA-ペプチド複合ライブラリーを使用したセレクションによってこの傾向がどのように変化するか、また、触媒活性をもつ分子を獲得するために、ペプチドライブラリーがどのような役割を果たすかを考察する上でもこの知見は有用である。本研究では、RNAーペプチド複合体を構造基盤として、RNA・ペプチドサブユニットそれぞれをランダム化した「RNAーペプチド複合ライブラリー」の作製法を検討し、この複合ライブラリーを用いて、二つの異なるサブユニットが協同的に分子認識能並びに触媒能を発現するRNPリセプター、RNP酵素をin vitroセレクションにより獲得する方法論の開拓を行う。mRNAディスプレイ法の応用により、RNAサブユニットがペプチドサブユニットのアミノ酸配列をコードし、無細胞翻訳系を用いた翻訳後にRNAとペプチドサブユニットが共有結合的に連結された分子の作製を試みた。当該年度は、以下の項目について検討を行った。(1)複合ライブラリー作製条件の検討:mRNAディスプレイを応用したRNA-ペプチド複合ライブラリーの作製のため、RNAの調製方法、ならびに無細胞翻訳系によるペプチドサブユニットの合成条件について検討を行った。(2)RNPリセプターの合成後化学修飾法の開発:ペプチドサブユニットに有機触媒や金属錯体等の触媒活性中心を導入することによる化学反応場の構築が可能となるよう、ペプチドサブユニットの合成後の化学修飾方法の検討を行った。ペプチドサブユニットN末端に導入したCys残基を介した蛍光分子のペプチドサブユニットに対する合成(翻訳)後修飾条件を確立した。(3)結合場がN末端に近接したRNPリセプターの選択方法の検討:申請者がこれまでに開発したATPのアデノシン部分を主に認識するATP結合性RNPリセプターを利用して、基質ーペプチドサブユニットN末端間が近接した分子をFRETを用いて分光学的に選択する方法および条件について検討した。これまでに、本研究で用いるRNA-ペプチド複合ライブラリーの設計と作製条件を検討した。RNAサブユニット配列がペプチドサブユニット配列をコードし、かつ固定の配列領域においてRNAおよびペプチドサブユニットが複合体を形成するRNPライブラリーを設計した。ランダム領域以外の部分が最小の分子サイズを持つように変異導入を行ったRRE RNAにおいてもRevペプチドと複合体を形成できることを、蛍光性RNPセンサーの機能評価によって確認した。この知見をもとにmRNAディスプレイ法を適用するためのライブラリーの設計を行った。現在、高収率なRNA-ペプチド複合ライブラリー合成条件を検討している。当初、RNA配列の変異により複合体形成能が喪失し、ライブラリー設計の抜本的な変更が必要となる可能性もあったが、この検討結果により比較的円滑に次段階に着手できた。これに並行して、「RNAのみがランダム化された」RNPライブラリーを利用してリン酸基の識別能を有するリセプターの作製を行った。

従来使用してきたこのライブラリーから作製する分子とRNAーペプチド複合ライブラリーから作製する分子の差異を比較することで、本手法の特徴および有用性を検討することができると考えられる。「リン酸基部分を識別できるATP結合性RNPリセプター」を作製した結果、リン酸基識別能は有するものの基質親和性が従来のRNPリセプターと比べて低いリセプターが得られた。この知見は今後RNP-ペプチド複合ライブラリーを用いて作製するリセプターや人工酵素の機能との比較に有用である。また分子選択圧と作製される分子の機能との相関に関する情報は、今後のセレクションの条件を決定する上で有用である。このように、RNA-ペプチド複合ライブラリーを用いたセレクションの実施に対する基本条件の検討を着実に行うことができた。生物有機化学今後はRNA-ペプチド複合ライブラリーの合成条件を最適化しつつ、作製したライブラリーを用いて実際にペプチドリン酸化活性を指標とした人工酵素のセレクション、リン酸基を特異的に識別するリセプターの作製を目指す。当初の計画通り、リン酸基に特異的に結合するPhos-tagを利用して、基質ペプチド部位にリン酸化が行われたRNPを選択する。高い触媒活性を有するRNPの獲得が可能な条件を選択圧を変更しながら、検討していく。得られたRNPのRNAおよびペプチド配列を解析し、その特徴を明らかにする。獲得したRNP分子を用いて、実際にペプチド、および同一配列を有するタンパク質を基質としたリン酸化反応が進行するかどうかを確認する。触媒活性のある分子いついて、基質の配列特異性や反応に最適な条件の検討をキネティクスの解析を行いながら検討していく。触媒活性を有する分子の獲得が困難な場合は、ライブラリーサイズの変更や基質ペプチド配列の変更、分子選択条件の変更を行い、獲得を目指す。ライブラリー作製条件の検討をはじめとする基礎条件検討の結果が良好であり、比較的順調に研究を進めることができ、当初計画していた消耗品の消費量よりも比較的余裕をもって、実験遂行ができたため。研究の次段階であるセレクションでは、酵素活性を有する分子の獲得に多様な条件を適用し分子の作製が可能かどうかを比較、検討することが求められると予想される。試薬、消耗品の消費量も増加すると予測されることから、主に酵素類やペプチド合成試薬、チップ等の消耗品購入費に充当する計画である。
チンパンジーの資源利用パターンと社会構造

チンパンジーの直接追跡により、採食パッチのサイズ、分布、利用頻度、パーテイ・サイズとそれらの季節変化など資源利用パターンを調べた。また、これと対応して果実資源の分布、パッチサイズ、密度を調べた。そのために、ランダムなトランセクト4キロ、観察路23キロについて、道の両幅各5mの胸高直径30cm以上の樹木、地上から1mの直径が5cm以上の木性蔦のすべてをリストアップし、これらにラベルを付け、フェノロジーおよび果実資源量の調査を毎月1回行った。以上は3年間にわたった本調査の主要な部分である。栄養分析のため、チンパンジーの主な食物13種を乾燥して持ち帰った。平成7-8年度は、観察路に沿って、静かに歩くという方法により、哺乳類の分布と密度調査を行った。また、チンパンジーと関係する双翅目をトラップによって捕らえ、27種からなる双翅目リストを作成した。双翅目より抽出した血液のDNAタイピングにより、チンパンジーから吸血したかどうかの検査をおこなう。平成8、10年度はアカコロブスの集団サイズと採食生態を調べた。老齢の2頭を含むチンパンジーの死体5頭分を収集し、口腔の簡単な調査をした。腸内寄生虫検査をおこない、また性ホルモンの変化を実験室で調べるために、周期メスの糞を収集し持ち帰った。平成9-10年度にわたって侵入樹種セナ・スペクタビリスにさまざまの人為的介入をおこなった。チンパンジーの種子散布により、実験地は本来の植生に戻りつつある。オオアリ釣り行動、毛づくろい行動、出会いの交渉、闘争・連合・和解行動、狩猟・分配行動などの詳細なデータを収集した。大部分の資料は、現在分析中である。なお、代表者の監督下で、アニカプロが平成7年度、イ-スト社が平成7年度と9年度、放送大学とTBSが平成9年度にマハレに入り、チンパンジーの行動を撮影した。こうして得られたラッシュビデオの分析からも多くの成果を期待できる。植生型と食用植物の分布パターン、密度、植物のフェノロジーを調査するため、ライン・トランセクト法を採用した。3本の道をのべ5キロにわたって伐り、道の両側5m以内の胸高直径10cm以上のすべての木と直径5cm以上のすべての木性蔓に、番号を記したビニールあるいはメタルのタグをつけ、植物名を記録した。1か月に一度、これらのうち食用となる植物のフェノロジーを調査している。一方、チンパンジーの土地利用パターンが植生のランダム・サンプルとどう違うかを比較するため、彼らの通り道4kmについても同様の調査をおこなっている。採食競合を調べるため、チンパンジーを個体追跡し、植物、採食場所、採食スピード、採食パーテイのサイズ、採食をめぐる葛藤などを記録した。哺乳類資源調査として、既設の観察路のうち20kmを用いて主たる獲物であるサル類の群れの分布・個体数を記録し、密度を評価した。狩猟については、チンパンジー追跡中にコロブスザルの音声が聞こえた日を記録し、狩猟の試行の存否、成功か失敗かを確認し、成功の場合は獲物のサイズ、頭数、分配を記録した。7か月間にチンパンジーによるサルやリスなどの狩猟と肉食が20件観察された。昆虫資源は主としてオオアリの巣の分布を調べ、一方チンパンジーの健康に影響を与えると思われる双翅目の各種をトラップで集めたq吸血昆虫から採取した血液は、酵素抗体法とDNA分析によって種の同定をおこなった。

タンザニア政府側の要望もあり、国立公園内に繁殖している移入種の喬木セナの分布と密度を調べ、駆除の方法を検討した。研究資料として、昆虫標本374点、チンパンジーの骨格標本3個体分、チンパンジーの食物ワッジや精液などDNA標本67点、植物標本150点などを集めた。行動分析に使うため、大人雄の闘争を中心としてビデオ映像を記録した。15年間第一位であった雄が死亡し、身体の損傷から集団リンチによる殺害と推定された。マハレ山塊国立公園のチンパンジーの行動域内で、1994年に始めたライン・トランセクト法による植生とフェノロジー調査(ランダム・サンプル)を継続した。また彼らがよく利用する低地林内の観察路に沿った5.7kmの別のトランセクトで、比較のために同様な調査を行った。両側5m以内の胸高直径10cm以上の樹木は30科71属81種と不明種6種で計2286本、直径5cm以上の蔓植物は11科14属15種と不明種2種で計707本であった。チンパンジーの食物は、個体数のより多い樹種や蔓植物で、とくに果実を食べる種は個体数が多かった。主要な食物種の空間的分布には、比較的均一な分布や集中分布、低密度で分散的なパッチ状分布、これらの中間的な分布などの違いが認められた。哺乳類資源調査として、既設の観察路のうち25kmを利用してセンサスを行い、16種を直接観察した。とくに4種の霊長類と3種の偶蹄類については、群れの分布や個体数を記録し、植生類型別(forest vs.woodland)の生息密度を評価した。これら7種はすべてチンパンジーに補食されており、とくに2種は重要な被食種である。チンパンジーからも吸血していると思われる双翅目昆虫を2種類のトラップで約200点採集し、酵素抗体法とDNA分析で、採取した血液の種の同定を試みた。またマハレの昆虫相リストを作るための採集を継続し、約300点の標本を集めた。1995年にMグループのチンパンジーで第一位の雄が交代した。前後して多くのおとな雄も消失し、新しい世代が高順位となった。世代交替後の雄間の社会関係を明らかにするために9頭を選び、彼らの行動と他個体との社会的相互交渉や空間的布置関係を、個体追跡法で記録した。またさまざまな年齢層の雄と雌を観察対象に、個体追跡法で他個体とのグル-ミングを記録した。個体の組合せによる頻度やパターン、グル-ミングする身体の部位等について性差や年齢差を明らかにし、この行動の意義を検討した。前年産までに調査した約15キロに加え、あらたに湖岸地域と山岳地域の観察路合計12キロについて、道の両幅各5mの胸高直径30cm以上の樹木、地上から1mの直径が5cm以上の本性蔦のすべてをリストアップした。また、これらにプラスチック・ラベルをつけ、フェノロジーおよび果実資源量の調査を毎月1回おこなった。これらは、中村・伊藤・西田とタンザニア人助手との共同作業である。伊藤と西田は採食パッチのサイズ、分布、利用頻度、パーテイ・サイズそれらの季節変化など資源利用パターンを調べた。他に西田は狩猟活動と分配を観察した。和は腸内寄生虫の検査をおこない、また性ホルモンの変化を実験室で調べるために、周期メスの糞を収集し持ち帰った。ワキバラは、侵入樹種セナ・スペクタビリスに樹皮はぎ、伐採、稚樹の除去、除草剤の注入などの介入をおこない、その結果をコントロール林と比較した。
反応の計測、診断

光励起プロセスにより半導体薄膜材料の製作を行うためには、気相および固体界面上で起こる物理的・化学的過程を理解する必要があり、本研究では、これらの諸過程を解明するために有効と考えられる計測・診断手段の開発と応用を行っている。まず、固体表面構造を原子レベルで観測できる走査型トンネル顕微鏡(STM)を、表面上での物理的・化学的過程の診断に利用するため、その自作と改良が行われ、さらに諸過程をその場観測するため、STMを超高真空室に格納し、さらに反応室と直結する装置を組み立てた。最初のSTM観測としては、光MOCVDの初期過程における島状Al形成の診断に利用して、反応機構との相関について知見を得た。Si基板上のGe膜の成長初期過程は、別の手法である反射電子回析法により観測され、光照射により、二次元核成長時の成長速度が促進されることが分かった。Si表面近傍でのGeH_4の光分解が、光イオン化質量分析法により測定され、有機金属化合物(トリメチルガリウム等)のレ-ザ-光分解が、光電子分光法で調べられた。また、光解離分光法を利用しても、固体表面上での有機金属化合物の光解離の動的振る舞いが研究された。気相中での反応の計測としては、ラジカルを超音速自由噴流中で発生させ、それをレ-ザ-誘起蛍光法、多光子イオン化法、赤外ダイオ-ドレ-ザ-分光法で検出し、その内部状態が詳細に調べられた。この方法は、複雑な気相反応を簡略化して、反応の各段階を追って過程を調べるのに有効である。ラジカルとしてはSiH_2,SiH_3メチルアルミニウム等が含まれる。本研究は、以上で述べたように、気相中および界面双方での諸現象を多角的に追求することを意図している。
折り紙を用いた健康相談活動の効果に関する研究

本研究の目的は,保健室での健康相談活動に「折り紙」を導入し,生徒の気持ちや行動の変化からその効果を検討し,個々の生徒の精神的健康や,支援を要する生徒と折り紙の種類の関連を明らかにすることであった。方法として第2学年生徒78名を対象に,折り紙経験アンケート,日本版GHQ28精神健康調査,フェイスマークによるあなたの今の気分カード,折り紙調査を実施した。折り紙調査では「1枚折り,簡単」「1枚折り,難しい」「複合折り紙」「動く,遊びのある折り紙」「パーツを組み合わせる」「パーツを組み合わせた立体」の6種類の折り紙から自分の折りたいものを選ばせ,折り紙を折る前と後の気分の変化について分析を行った。これらの調査の分析結果から,個々の生徒の傾向,症状(身体疲労・不安不眠・社会活動障害・うつ傾向)における有効な折り紙の種類が明らかになってきた。「動き,遊びのある折り紙」は,完成したことによる達成感と折った作品が動くという意外性と驚きにより生徒が興味を持ったことが考えられ,どの症状においても選んだ生徒が最も多く,気分もプラスに改善されていることから,保健室での健康相談活動において折り紙を導入する場合には,最初に導入することで効果が得やすいという結果となった。また,生徒に提示する折り紙は,比較的簡単で見栄えがよく完成できることを考慮し,選ぶ必要があることがわかった。これらのことから,養護教諭が健康相談活動を行うときに誰でも活用できるツールとしての具体的な折紙の種類を一般化していくことへの第1歩となった。
タンパク質間相互作用解析とイメージングに基づく繊毛形成と繊毛内輸送機構の解明

本研究では、繊毛内タンパク質輸送に関与するIFT-A複合体とIFT-B複合体、これらの複合体に結合するタンパク質の輸送や機能について解析した。1.独自に開発した『観るだけでわかるタンパク質間相互作用解析法(VIPアッセイ)』を活用して、繊毛内の逆行性タンパク質輸送に関与するIFT-A複合体(7サブユニットからなる)の構築様式を解明した。さらに、独自に改良したCRISPR/Cas9ゲノム編集法により作製したIFT-A複合体のサブユニットのノックアウト(KO)細胞を用いた解析によって、IFT-A複合体が従来から言われている繊毛内逆行輸送だけでなく、GPCRなどのタンパク質の繊毛内への進入にも関与することを初めて明らかにした。2.繊毛病ジュベール症候群の原因遺伝子産物である低分子量GTPのARL13Bが順行性タンパク質輸送に関与するIFT-B複合体(16サブユニットからなる)に、IFT46-IFT56二量体を介して結合することを明らかにした。しかし、KO細胞を用いた実験によって、ARL13BはIFT-B非依存的に繊毛内へと進入し、繊毛全体に分布することを明らかにした。さらに、ARL13Bは、別のジュベール症候群原因遺伝子産物であるINPP5Eと協調して機能することを明らかにした。3.モータータンパク質のKIF17がIFT-B複合体にIFT46-IFT56二量体を介して結合することを明らかにした。しかし、タンパク質間相互作用の実験や、KO細胞を用いた実験によって、KIF17はIFT-B複合体のモーターとして機能するのではなく、IFT-B複合体の積み荷タンパク質として、繊毛の先端へと輸送されることを明らかにした。さらに、KIF17の繊毛内への進入には核移行シグナル(NLS)も必要であり、このNLSにはインポーチン・αファミリーが結合することを明らかにした。28年度が最終年度であるため、記入しない。繊毛内には、多数のタンパク質が特異的に局在し、それらの輸送は厳密に制御されている。このような繊毛内タンパク質輸送は、多数のサブユニットからなるいくつかのタンパク質複合体(IFT-A、IFT-B、BBSome複合体)が、キネシンやダイニンのようなモータータンパク質と共同して機能するすることによって媒介される。私たちが新たに開発したタンパク質間相互作用解析法(VIPアッセイ:Vissible Immunoprecipitation)を活用して、平成27年度には、BBSome複合体(8サブユニットからなる)、およびIFT-B複合体(16サブユニットからなる)の極めて複雑な構築様式を解明した。特に、IFT-B複合体は、10サブユニットからなるコアサブ複合体と6サブユニットからなるペリフェラルサブ複合体に分けられ、これまではIFT-B複合体に含まれるのかどうかも不明であったTTC26とCluap1(IFT56とIFT38と再命名)がそれぞれのサブ複合体に含まれることを証明した。さらに、IFT38に関しては、ノックアウトマウス由来の繊維芽細胞を用いて、IFT38が繊毛形成にとって必須であること、およびその繊毛形成にはIFT38がIFT-Bのペリフェラル複合体に含まれることが必須であることを証明した。このような構築様式の解明は、繊毛内タンパク質輸送複合体に関する今後の機能研究において大いに役立つと考えられる。平成26年度に開発したVIPアッセイが予想以上に洗練され、平成27年度にはこのアッセイ法を活用したタンパク質間相互作用解析が予想以上に進展した。このアッセイが当初予想していたよりもはるかに複雑なタンパク質間相互作用に解析にも応用可能であることがわかり、BBSome複合体とIFT-B複合体の極めて複雑な構築様式を解明することができた。他にも、細胞内タンパク質輸送に関与するExocyst複合体(8サブユニットからなる)の構築様式の解明にも成功している。これらの複合体の構築様式は、VIPアッセイの開発なしには不可能であったことから、当初の計画以上に進展していると判断する。さらに、このような構築様式の解明は、繊毛内タンパク質輸送複合体に関する今後の機能研究において大いに役立つと考えられる。

しかし、タンパク質間相互作用の実験や、KO細胞を用いた実験によって、KIF17はIFT-B複合体のモーターとして機能するのではなく、IFT-B複合体の積み荷タンパク質として、繊毛の先端へと輸送されることを明らかにした。さらに、KIF17の繊毛内への進入には核移行シグナル(NLS)も必要であり、このNLSにはインポーチン・αファミリーが結合することを明らかにした。平成28年度には、以下のことを明らかにする。1.8サブユニットからなるIFT-A複合体の構築様式も解明する。これまで、IFT-A複合体の構築様式の解明が難航していた理由の一つとして、この複合体のサブユニットがいずれも大きいためにcDNAのクローニングが難しい点があった。しかし、この問題が克服できたので、VIPアッセイを活用して、IFT-A複合体の構築様式の解明がすぐに進むと予想される。2.IFT-B複合体にはキネシンファミリーのモータータンパク質のkinesin-2およびKIF17が結合して、IFT-B複合体の繊毛内輸送を媒介することが知られている。しかし、これらのキネシンがIFT-B複合体にどのサブユニットを介して結合するのかや、IFT-Bの繊毛内輸送にどのようにかかわるのかはわかっていない。そこで、VIPアッセイによってこの結合の様式を明らかにする。3.IFT-B複合体には、低分子量GTPaseのArl13bが結合することも知られている。しかし、Arl13bがIFT-B複合体にどのサブユニットを介して結合するのかはわかっていない。28年度が最終年度であるため、記入しない。
複雑な構造を持つマルテンサイトに対する無拡散相変態の結晶学的研究

通称マルテンサイト変態と呼ばれる無拡散相変態の結晶学については、「現象論」とよばれる優れた理論がある。しかし今もって変態の結晶学が確立していない合金や最近見い出された複雑な構造を持つ合金がある。これらに対し詳細な研究を行い、マルテンサイト変態に対し統一的な描像を得ることが本研究の目的である。具体的には、Ni-Al合金のB2→14M(7R)変態とAu-49.5at%Cd合金のβ_2(B2)→ζ_2'(trigonal)変態を取り挙げ、以下の結果を得た。まずNi-Al合金については、B2→14M(7R)変態に対しても現象論が良く成り立つことを見い出した。14M(7R)変態の自己調整形態に対して現象論的解析を行い、その基本形態は平行四辺形型であるという新しい提案を行った。更にNi-Al合金にMnを添加した三元合金では、10M(15R)及び12M(36R)という他の合金系でも観察されたことのない新しいマルテンサイトを見い出した。次に後者のAu-49.5at%Cd合金に対しては、まずζ_2'(trigonal)マルテンサイトの構造をX線4軸回折計を用いて50年ぶりに決定した。β_2→ζ_2'変態についてはこれ迄、Ledbetter等による格子不変変形はあるという報告と唯木等によるないという報告が対立していて、大きな矛盾となっていたが、自己調整形態の詳しい観察から、格子不変変形のある場合とない場合の両方の変態機構を見い出し、この矛盾を解消した。又β_2→ζ_2'応力誘起変態を始めて見い出したことから、この合金系の応力-温度空間での状態図を確立できた。以上により、格子不変変形を正しく選べば、複雑な構造を持つマルテンサイト変態に対しても現象論が元の形でよく成り立つことを示すことができた。本年度はNiーAl合金についての研究とAuーcd合金についての研究を平行して進め、以下の結果を得た。まずNiーAl合金については、複数の合含単結晶を作製して組成と変態温度の関係を明らかにし、次に応力語起変態で生成したマルテンサイトをX線マイクロビ-ム・ラウエ法で構造を同定した。この結果、Al濃度が36.5at%以下では3R構造,37.0at%以上では7R構造のマルテンサイトによることが明らかになった。次にNi-37.0at%Al合金を用いて,このユニ-クな7R構造を持つマルテンサイトに対し,B2→7R変態の結晶学を理論的実験的に行った。即ち7Rマルテンサイトの晶癖面と母相に対する結晶方位関係をX線マイクロビ-ム・ラウエ法を用いて測定し,最小二乗法で精密に評価した後,「マルテンサイト変態の現象論」を用いた計算と厳密な比較を行い,理論と実験の間に極めてよい一致を見た。即ちこのユニ-クな変態に対しても「理象論」が著くなり立つことを明らかにした。この成果は,昨年ボストンで開かれたMRS会議で発表した。Auー49.5at%Calではβ_2→ζ^ ́_2変態が以前より知られているが,ζ^ ́_2マルテンサイトの結晶構造は1940年代の発見以来不明のままであったが,今回の我々の研究でついに構造を決定することができた。マルテンサイトの構造解析の難しい点は,高温側の母相で単結晶を作っても,冷却による変態の際に複数の兄弟晶になるため単結晶のマルテンサイトが得にくいことにある。

我々は応力誘起変態の手法でζ^ ́_2マルテンサイトの単結晶を得ることに成功し,このマルテンサイトに対し千〓日抄計による日抄実験と最小二乗法で精密に構解析を行い,構造決定を行った。空間群はP3で,合金であるにもかかわらず中心対象を持たない点が興味深い。またβ_2からζ^ ́_2への構造変化は〈110〉〈lio〉タイプの三組の横波変位波で記述できるという大変興味深い結果もえた。格子力学的観点他種々な角度から興味を持たれているNi-Ae合金のβ2→7R変態の結晶学については前年度研究を行い、「現象論」があらゆる角度から適用できることを明らかにした。本年度はこの7Rマルテンサイトの自己調整形態について詳細な研究を行い、以下の結果を得た。他のβ相合金と同様、この型の変態においても、{011}β_2周わりの四つの晶癖面バリアントが対をなして生成していることを、X線回折ならびに二面解析で明らかにすると共に、「現象論」による計算から、これらの歪が効率よく歪を緩和していることを明らかにした。更に自己調整の機構については、従来ダイアモンド型が提唱されているが、我々は「平行四辺型」のモデルを提唱し、実験結果は後者とよく一致していることを示した。又この合金のβ2→3R変態についても同様の研究を行い、自己調整形態、機構共殆ど同じように扱えることを明らかにした。両変態の差異は、両マルテンサイトのサイズのみであり、7Rマルテンサイトは3Rマルテンサイトより一桁小さいことを明らかにした。これ迄多数の研究がありながら、多くの矛盾を含み、解決の得られていなかった、Ae-Cd合金のβ_2→ζ^,_2(三斜晶)変態についても詳細な研究を行った。その結果、Ledbetter達の格子定数を用いれば、「現象論」がよく成り立つという結果を得て、従来の矛盾を解消することができた。しかしながらLedbetter達の用いた合金と我々の合金はCd濃度が0.5at90異なるので、格子定数を測定しなおしたところ、理論と実験の誤差は大きくなった。この型の変態では、格子定数の精度が結果に敏感に影響するので、格子定数測定を更に続行していく必要がある。この変態の自己調整型態についても研究を行い、「ヘリングボーン型」と「屋梠型」の二つの形態を見出し、この変態における格子不変変形についての従来の矛盾を解消することができた。通称マルテンサイト変態と呼ばれる無拡散相変態の結晶学については、「現象論」とよばれる優れた理論がある。しかし今もって変態の結晶学が確立していない合金や最近見い出された複雑な構造を持つ合金がある。これらに対し詳細な研究を行い、マルテンサイト変態に対し統一的な描像を得ることが本研究の目的である。具体的には、Ni-Al合金のB2→14M(7R)変態とAu-49.5at%Cd合金のβ_2(B2)→ζ_2'(trigonal)変態を取り挙げ、以下の結果を得た。まずNi-Al合金については、B2→14M(7R)変態に対しても現象論が良く成り立つことを見い出した。14M(7R)変態の自己調整形態に対して現象論的解析を行い、その基本形態は平行四辺形型であるという新しい提案を行った。更にNi-Al合金にMnを添加した三元合金では、10M(15R)及び12M(36R)という他の合金系でも観察されたことのない新しいマルテンサイトを見い出した。次に後者のAu-49.5at%Cd合金に対しては、まずζ_2'(trigonal)マルテンサイトの構造をX線4軸回折計を用いて50年ぶりに決定した。
鉱物多結晶体の超塑性３　粒径変化とのカップリング

超塑性は粒径依存型クリープであるので、極細粒物質が生成される断層すべり下で超塑性による高速変形が実現しうる。逆に、超塑性変形下では粒成長が促進され、超塑性は抑制される。したがって、超塑性の発現とその継続は常に粒径によって規定されている。超塑性と粒径変化のカップリングを解くことで、全地球「超塑性」流動仮説の検証を行う。変形実験および粒成長実験から得られる拡散クリープおよび粒成長速度を説明する原子拡散係数それぞれを求め、その両者を比較する。本年度は、フォルステライト+エンスタタイト系での比較の結果をまとめ、Nakakakoji et al.およびNakakoji & Hiragaの2本の国際誌に公表した。この結果によると、上部マントルでど拡散クリープおよび粒成長は同じ拡散メカニズムで律速されている。この結果に基づいて、海洋リソスフェアのせん断帯における粒径と粘性率の推定を行った.50kmで700°C,10ミクロンを仮定すると,リソスフェアの最深部の温度として仮定される1350°Cで2 mmであった.その条件での、本研究で得られた拡散クリープ則にしたがうと粘性率は2×10の20乗Pasが得られる.この値は、Watts & Zhong (2000)で仮定された海洋リソスフェア底での粘性率とほぼ等しい。また、彼らは海洋リソスフェア底からその上部にかけての粘性率変化は低い活性化エネルギー(120 kJ/mol)でうまく再現できることを示した。昨年度、国際誌二本の論文に結果をまとめることができ、本プロジェクトは順調に進展ている。全マントル流動を理解するために、下部マントルを模擬するフォルステライト+ペリクレース系での変形実験および粒成長実験から得られる拡散クリープおよび粒成長速度を説明する原子拡散係数それぞれを求め、その両者を比較する。
Ldb2(Disc-M)ノックアウトマウスの表現型と統合失調症の病理解明への応用

本研究では、以前我々が同定・報告した染色体転座を伴う統合失調症一症例にみられる4番染色体側切断点付近に存在するDISC-M遺伝子に着目し、その対応遺伝子のノックアウトマウスの表現型を解析した。Disc-Mノックアウトマウスは、平時過活動、NMDA受容体アンタゴニスト過感受性、ドパミン作動薬過感受性など統合失調症モデルマウスにおいて頻繁に報告されている表現型を示した。一部の認知学習課題(音恐怖条件付け)において顕著な障害を認めた。我々は染色体相互転座を伴う統合失調症一例を発見し、その4番染色体側の切断点に位置する遺伝子としてLdb2(DISC-M)を同定した。本研究では、主にLdb2ノックアウトマウスが示す表現型を手がかりにして、ほとんど判明していない本遺伝子の機能の機能を探り、さらにはその統合失調症との関連を主に動物行動学的アプローチにより明らかにすることを目指した。ノックアウトマウスを海外から導入し、遺伝的背景をC57BL/6に出来るだけ近づけるため5世代以上戻し交配行った。そこで獲得したヘテロマウス間の交配(intercross)によりノックアウトマウスを獲得した。ノックアウトマウスは一見正常に見え、特段問題なく成長した。10週齢からノックアウトマウスを我々の行動テストバッテリーで評価したところ、音と電気ショック刺激による恐怖条件付けが著しく障害されていることが判明した。その一方で、プレパルス抑制(PPI)試験やオープンフィールド試験では際だった異常は認められなかった。また聴覚や痛覚には異常は全く認められなかったことから、Ldb2は扁桃体(あるいはや海馬)が正常に機能するのに関与する遺伝子ではないかと推察された。扁桃体や海馬は、統合失調症の発症に重要な役割を果たす可能性がたびたび報告されていることから、本症例の病態出現とLdb2遺伝子の機能異常の関連が示唆された。Ldb2遺伝子産物はその構造から転写調節因子と予測されることから、今後Ldb2が関わる転写ネットワークを明らかにすることにより、統合失調症発症メカニズムの解明に対して有益な情報を与えてくれるものと期待される。本年度は、前年度に引き続きDISC-Mノックアウトマウスに関して行動解析を継続するとともに、行動異常の出現メカニズムを探るためマイクロアレイ実験、扁桃体の電気生理学的解析を行った。DISC-Mノックアウトマウスをオープンフィールドテストで評価したところ、MK801,methylphenidate,amphetamineといった薬剤による活動亢進が、野生型マウスと比較して著しく上昇することを見いだした。正常者ではほとんど影響がないほどの用量でも、これらの薬剤で統合失調症患者においては陽性症状が現れることとの関連を思わせる。また、行動亢進はNMDA受容体の抑制、ドーパミン系の亢進のいずれかとは関係なく現れ、DISC-Mノックアウトマウスはどのような刺激に対しても「興奮しやすい」特性をもつように思われる。これらの結果は、DISC-Mノックアウトマウスは恐怖条件付けがほとんど不可能であるという特性と合わせて極めて興味深い。このことに関連して、扁桃体における電気生理学的手法により異常の有無を検討しているが、いまのところ顕著な知見は得られていない。DISC-Mは転写調節因子をコードすると予測されることから、何らかの遺伝子群の発現をmodualateして機能を発揮すると考えられる。そこで、海馬、大脳皮質組織サンプルをもちいてマイクロアレイ実験をおこない、keyになる遺伝子もしくはパスウエイの抽出を、IPA解析(Ingenuity Pathway Analysis)等を用いて行った。今後個々の遺伝子に関して詳細な検討を行う予定である。Disc-MノックアウトマウスはメタンフェタミンやMK-801に対し、野生型と比較してより顕著な自発運動量の促進が見られた。また、MK801を急性投与すると、異常な飛び跳ね行動が、野生型と比較してより顕著なプレパルス抑制の低下が起こった。これらの結果は、統合失調症患者が精神賦活剤により感受性が強いという知見や、統合失調症のドーパミン仮説やグルタミン酸仮説とも矛盾しない結果である。Drug-naive時における、自発運動量の上昇、恐怖条件付けの不能、作業記億の障害を思わせるY迷路における交替率低下傾向などの表現型と合わせて考えると、Disc-Mノックアウトマウスは、「統合失調症様」であると考えられた。このような統合失調症様症状の生物学的基盤を考えるため、DISC-M/Disc-Mが転写調節因子をコードすることに着目して、網羅的トランスクリプトーム解析を行いその下流遺伝子群の同定を試みた。今回新規に開発したDISC-M/Disc-M特異的モノクローナル抗体を用いた免疫組織化学解析により、幼若マウス脳においてはDisc-Mタンパク質は大脳皮質や海馬の神経細胞に特異的に発現することが判明したことから、その両部位を解析の対象とした。その結果、それぞれの部位だけで変動する遺伝子や共通して変動する遺伝子群を見出した。例えばノックアウトマウスの海馬で特異的に発現上昇(約8倍)する遺伝子としてTtrがある。Ttrは甲状腺ホルモンやビタミンAをの運搬体を担うtransthyretinをコードしており、脳では脈絡叢にほぼ限局して発現している。