hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
二酸化炭素で加圧した有機膨張液相を利用する新規多相系反応場の開発と応用

本研究ではCO_2溶解膨張液相(CXL)におけるCO_2分子と反応基質との相互作用の解明を研究目的としている。本年度は前年度明らかにしたCO_2分子とニトロ基との相互作用による生成物選択性への影響をさらに展開し, 2,4-ジニトロアニリンの位置選択的水素化反応をモデルとして異なる環境のニトロ基への相互作用をそれぞれ解明することに成功した。さらに本年度は反応実験に加えてDFT計算を用いた反応基質とCO_2分子との分子レベルの電子的効果いついて新たに検討し,当初想定していたCO_2分子による直接的な相互作用による反応制御に加えて,反応基質の分子間および分子内相互作用の遮蔽による間接的な影響も存在することを見出した。CXL反応場を用いた水素還元反応では逆水性ガスシフト反応によるCO生成およびその触媒表面への吸着が観察されるが,本研究で用いたPt/TiO_2触媒ではこうしたCO吸着はほとんど見られなかった。これはPt/Al_2O_3触媒の場合と異なる結果であり,担体の選択が担持金属の分散といった物理的な性能だけでなく金属への電子供与など化学的な性能に大きく影響することを示唆している。そこで本年度は触媒担体の表面修飾によるCO_2加圧効果への影響を明らかにするため, Nドープ型TiO_2を担体とするPt/N-TiO_2触媒を用いてニトロスチレンの水素化反応における反応性への影響について検討した。その結果,担体の表面電子密度を増加させることにより担持金属への電子供与が行われ,結果として触媒反応における貴金属から反応基質へのd電子の逆供与が促進されることがわかった。これは反応場に共存するCO_2分子に対しても一様に発現するものであり, CO_2分子と金属触媒との相互作用を決定する上で重要な因子と言える。(抄録なし)本研究ではCO_2溶解膨張液相(CXL)におけるCO_2分子と反応基質との相互作用の解明を研究目的としている。本年度は高圧その場FTIR測定を用いてCO_2溶解に伴う各官能基の反応性変化を観察し,ニトロ基・ニトリル基の反応性低下,およびカルボニル基の反応性増加を確認した。これは加圧CO_2を利用した生成物選択性の制御において重要な知見であり,CO_2分子の反応基質に対する直接的な相互作用を示す。またCXLに水を加えた新規多相系反応場においては,少量のベンゾニトリルが溶解した水相におけるCO_2分子とベンゾニトリルとの相互作用を観察し,水相でも有機相の場合と同様にニトリル基の反応性が低下すること,およびCO_2圧力と反応性低下の相関が二つの相で同程度であることを明らかにした。これによりCXLに水を加えた反応場では導入された反応基質に対して一様にCO_2分子との相互作用が発現していることがわかった。またCXL反応場を用いた水素還元反応では逆水性ガスシフト反応によるCO生成およびその触媒表面への吸着が観察されることから,反応条件において生成するCOと担持金属の表面状態,CO吸着サイトの特定,水分子との競争吸着をその場FTIRを用いて詳細に検討した。Pt, Pd, Rh, RuをAl2O3に担持した触媒を用いたところ,全ての触媒においてCO生成を確認し,さらに反応場に水が共存することにより高配位な貴金属原子へのCO吸着が選択的に抑制されることを見出した。これらの吸着COはニトロ・ニトリル芳香族化合物の水素化反応においては触媒活性に影響を与えないが,フェノール水素化反応では触媒失活の原因となることがわかった。したがってCXLに水を加えた反応場における水素還元反応では,生成COと水の競争吸着による金属露出表面の状態が反応速度および生成物選択性を制御する重要な因子の一つであることを明らかにした。

これは反応場に共存するCO_2分子に対しても一様に発現するものであり, CO_2分子と金属触媒との相互作用を決定する上で重要な因子と言える。CO_2加圧に伴う触媒反応への直接的および間接的な効果を明確にできた。本効果は反応基質の官能基によって異なることから本研究で得られた知見は幅広く有機合成反応に利用できると考えられる。現在はCXLに水を加えた反応場における,CO_2加圧に伴う水相のpH変化について検討を行っている。研究計画の大きな変更はなく,概ね当初の計画に基づいて研究を遂行する。またCXL反応場を光反応に利用した研究において新たな知見が得られたため,並行して水の光分解やCO_2の還元反応といった光反応に対する溶解CO_2の化学的機能の解明も検討する。(抄録なし)
早産および胎児発育遅延の病態のおける血小板活性化因子の役割に関する生化学的検討

本研究では、妊娠中の母体循環および胎児の発育における血小板活性化因子(PAF)の役割を解明する目的で、まず、PAFの局所濃度の調節因子であるPAF代謝酵素すなわちPAF-acetylhydrolase(PAF-AH)の血中の活性を測定した。ついで、血中PAF-AH活性の調節機序を解明する目的で、各種ホルモン環境下の婦人の血漿中PAF-AH活性を測定し比較した。さらに、妊娠維持機構におけるPAF代謝とPAF-AH活性の役割を明らかにする目的で、子宮内膜および脱落膜組織に大量に存在すると考えられるmacrophageにおけるPAF-AH分泌調節機序を細胞培養系を用いて検討し、以下の成績を得た。1.正常妊婦の血漿中PAF-AH活性は正常非妊婦より有意に低下していた。2.妊娠中毒症妊婦では、上記のPAF-AH活性の低下が認められなかった。3.胎児臍帯血中PAF-AH活性は母体血の1/5と低値を示した。4.胎児仮死や子宮内発育遅延の胎児ではPAF-AH活性が上昇した。5.排卵障害を有する婦人ではPAF-AH活性が低値を示し、GnRH agonistによる偽閉経状態の婦人では高値を示したことから、ステロイドホルモンがPAF-AH活性の調節に関与していると考えられた。6.子宮内膜組織のPAF-AH活性もステロイドホルモンの調節を受けている可能性が示唆された。8.この系におけるPAF-AHの分泌がdexamethasoneやprogesteroneで増加したことから、脱落膜におけるPAF-AH活性の調節にも妊娠中に増加するステロイドホルモンが重要な役割を果たしていると考えられた。
肝細胞癌の多段階発癌機序の分子生物学的解明とその臨床診断への応用

これまで肝細胞癌(HCC)の癌部について癌抑制遺伝子p53及びRBの変化や8p(第8番染色体短腕)の欠失が重要な異常として報告されている。今回の研究ではp53、RB、8pの欠失をHCC部、及び臨床的に前癌病変と考えられる肝硬変(LC)部で同時に検討し、近年各種の癌で唱えられている多段階発癌機序をHCCにおいて解明し、LC患者での癌発生の予知等の可能性を検討することを目的とした。手術で得られた14例のHCC患者のパラフィン包埋切片よりmicrodissectionされた細胞からDNAを抽出し、nested-PCRで各部位(p53、RB、8p)を増幅し、loss of heterozygosity (LOH)を検討した。まず8pについては、54%の患者のHCC部にLOHを認め、そのLC部に高率(70.0% of microdissected foci(MF))にLOHを認めた。HCC部のLOHのパターンは癌細胞のclonal growthを示唆したが、LC部ではその欠失したアレルのパターンがrandomであった為、8pのLOHはLC部でのかなり早期の変化と考えられた。p53では66.7%の患者のHCC部にLOHが認められたが、LC部ではMFの17.6%と低頻度であった。RBでは70.0%の患者のHCCにLOHが認められ、それらのLC部ではMFの68.2%がLOHを示した。p53とRBの関係については従来の報告のようにそれぞれのLOHがHCC部では同時に起こっていた。しかし、今回の研究で新たに、LC部ではRB遺伝子の異常が比較的早期に出現し、その後p53遺伝子の異常が起こり、悪性腫瘍へと進むことが推測された。このことは、p53とRBが協調して細胞周期に関与することを考えると肝発癌機構の重要なポイントと考えられる。なおHCCやLCにおけるLOHの起こり方について8pとp53及びRBの間には明らかな関連性はなかった。8pはp53やRBとは別のpathwayで発癌に関与していることが推測された。なお、8pやRBのようにLC部で比較的早期に出現する変化はLC段階での発癌の予知に使える可能性がある。
タンパク質・ペプチドの機能制御を目的とした人工プロテアーゼの合成

プロテアーゼと同様の機能をもつ低分子化合物は,生体機能の人工的な制御や,外来性タンパク質の除去などと関連して,現在世界的に注目され,早期開発が期待されている機能性分子の一つである。本研究では,生理条件下で水酸化物イオンを捕捉し,強い求核剤となる部分構造と,弱酸性分子(チオールやフェノールなど)をアニオンとして強く捕捉する部分構造を併せもつ分子を開発し,システインやチロシン残基を認識し,かつその近傍のペプチド結合を加水分解する人口プロテアーゼを開発することを目的とした。人工プロテアーゼのデザイン・合成に必要な反応場(酸素活性中心類似の環境)の性質を調べる目的でまず亜鉛のルイス酸としての性質を検討できる数種類の亜鉛酵素モデルを合成した。新らたに合成した人工亜鉛酵素モデルの結晶および溶液内構造を,X線結晶解析法,pH滴定法,NMR測定などにより調べた。それらの水溶液中での安定性,加水分解触媒としての活性や基質であるペプチドや弱酸との相互作用をNMR測定により検討した。その結果、生理条件下では極めて不安定と考えられいるアミドアニオンやエノラートアニオンを安定化することのできる低分子亜鉛化合物(人工亜鉛酵素モデル)を世界で初めて作り出すことに成功した。さらに,亜鉛酵素モデルとチオールやフェノールとの錯体の安定性についても検討を行った。実用的なアミドの加水分解スピードを持つ化合物は得られなかったが,本研究成果により新しい人工機能性分子(遺伝子情報制御分子や自己集積型の水溶性超分子など)を見い出すことができた。人工酵素(環境触媒)の実用化については今後も検討を行っていく予定である。プロテアーゼと同様の機能をもつ低分子化合物は,生体機能の人工的な制御や,外来性タンパク質(プリオンや蛇毒など)の除去などと関連して,現在世界的に注目され,早期開発が期待されている機能性分子の一つである。本研究では,生理条件下で水酸化物イオンを捕捉し,強い求核剤となる部分構造と,弱酸性分子(チオールやフェノールなど)をアニオンとして強く捕捉する部分構造を併せもつ分子を開発し,システインやチロシン残基を認識し,かつその近傍のペプチド結合を加水分解する機能性分子(人工プロテアーゼ)を開発することを目的とする。今年度は,それら人工プロテアーゼのデザイン・合成に必要な反応場(酵素活性中心類似の環境)の性質を調べる目的でまず亜鉛のルイス酸としての性質を検討できる数種類の亜鉛酵素モデルを合成した。その結果,生理条件下では極めて不安定と考えられいるアミドアニオンやエノラートアニオンを安定化することのできる低分子亜鉛化合物(人工亜鉛酵素モデル)を世界で始めて作り出すことに成功した。来年度は,今年度得られた知見に基づき複雑な構造を持つ人工プロテアーゼの合成とそれらの実用性について検討を行っていく予定である。本研究では,生理条件下で水酸化物イオンを捕捉し,強い求核剤となる部分構造と,弱酸性分子(チオールやフェノールなど)をアニオンとして強く捕捉する部分構造を併せもつ分子を開発し,システインやチロシン残基を認識し,かつその近傍のペプチド結合を加水分解する人工プロテアーゼを開発することを目的とした。人工プロテアーゼのデザイン・合成に必要な反応場(酵素活性中心類似の環境)の性質を調べる目的でまず亜鉛のルイス酸としての性質を検討できる数種類の亜鉛酵素モデルを合成した。

新らたに合成した人工亜鉛酵素モデルの結晶および溶液内構造を,X線結晶解析法,pH滴定法,NMR測定などにより調べた。それらの水溶液中での安定性,加水分解触媒としての活性や基質であるペプチドや弱酸との相互作用をNMR測定により検討した。その結果,生理条件下では極めて不安定と考えられるアミドアニオンやエノラートアニオンを安定化することのできる低分子亜鉛化合物(人工亜鉛酵素モデル)を世界で初めて作り出すことに成功した。さらに,亜鉛酵素モデルとチオールやフェノールとの錯体の安定性についても検討を行った。実用的なアミドの加水分解スピードを持つ化合物は得られなかったが,本研究成果により新しい人工機能性分子(遺伝子情報制御分子や自己集積型の水溶性超分子など)を見い出すことができた。人工酵素(環境触媒)の実用化については今後も検討を行っていく予定である。
フラックススクリーニング法を活用したクリスタルマップの新提案

本研究では,フラックス結晶育成技術を体系化し,若手研究者にそれを継承すべく,以下4つのアプローチに傾注する。さらに,現在離散するフラックスサイエンスの体系化への足掛かりを得る(端緒に立つ)ことを目標とする。4つのアプローチ:1フラックススクリーニング(FS)法による結晶育成プロセスの新提案,2FS法による酸化物結晶育成,3FS法による非酸化物結晶の育成,4フラックスクリスタルマップの作成と継承の仕組みづくり本研究の初年度にあたる2018年度の研究では,上述の1ならびに2に着手した。特に,1では多元セルの活用を検討し,2ではスーパーフラックスからの結晶育成を試みた。具体的には,1の取り組みとして,熱分析システム(DTA-TG)を用いて,単セルによる酸化物系結晶(ターゲット:リチウムイオン二次電池(LIB)用,バイオマテリアル用,放熱フィラー用)の育成を試みた。このシステムでの結晶育成から,実育成における初期温度プロファイルの決定を可能にした。さらに2の取り組みとしては,1のターゲットと同様の結晶種を低温フラックスから育成した。例えば,生体硬組織として知られる水酸アパタイト(リン酸カルシウムの一種)を複合硝酸塩フラックスからさまざまな条件で育成し,各種フラックス結晶育成パラメータに係るデータを収集した。また,同様のフラックス結晶育成の取り組みをLIB用正極活物質の層状三元系酸化物と負極活物質のスピネル系酸化物でも実施し,各種データを収集した。加えて,低温化は実現できなかったが,融点の約半分の温度(1100°C程度)にて,放熱フィラー用のAl2O3(あるいはAl2O3:Cr)結晶のフラックス育成データを多数取得した。翌年度の研究に繋げるために,非酸化物放熱フィラーのBN結晶のフラックス育成も検討を開始した。熱分析システム(DTA-TG)を用いて,各種ターゲット結晶種の育成条件(育成プロファイル)の初期設定化を実現できた。これにより,フラックス結晶育成の高効率化を可能にした。さらに,これを用いた実育成実験から得た各種データを次年度以降のフラックスクリスタルマップ作成の元データとして活用できる可能性を見いだした。フラックス育成の基礎データを多数取得でき,計算科学との極めて密な連携体制も構築できた。いずれも,フラックスサイエンスの体系化に欠かすことができない研究成果である。さらに,翌年度の研究に繋げるための非酸化物結晶育成も開始できた。本研究期間の最終目標は,フラックスサイエンスの体系化の端緒に立つことであり,フラックスクリスタルマップの作成である。そこで次年度以降は,今回育成した酸化物結晶に関し,計算科学ー実験系のフラックス状態図実証を試み,体系化の歩みを進める。特に,状態図の研究に不可避なデータ収集と詳細な解析にも注力する。また,スーパーフラックスや雰囲気制御育成など,様々な視点から俯瞰したフラックス法を試み,特長的な非酸化物結晶を育成し,酸化物結晶育成と同様の取り組みを推進する(2018年度の成果を最大限に活用する)。なお,フラックススクリーニングに関しては,小型セルの場合,得られる情報が限定されるため,通常サイズ(あるいは若干の小型化)でスクリーニングする方法も深慮する。計算科学においては機械学習やAIの導入の可能性も検討し,最終目標達成を目指す。

さらに,翌年度の研究に繋げるための非酸化物結晶育成も開始できた。本研究期間の最終目標は,フラックスサイエンスの体系化の端緒に立つことであり,フラックスクリスタルマップの作成である。そこで次年度以降は,今回育成した酸化物結晶に関し,計算科学ー実験系のフラックス状態図実証を試み,体系化の歩みを進める。特に,状態図の研究に不可避なデータ収集と詳細な解析にも注力する。また,スーパーフラックスや雰囲気制御育成など,様々な視点から俯瞰したフラックス法を試み,特長的な非酸化物結晶を育成し,酸化物結晶育成と同様の取り組みを推進する(2018年度の成果を最大限に活用する)。なお,フラックススクリーニングに関しては,小型セルの場合,得られる情報が限定されるため,通常サイズ(あるいは若干の小型化)でスクリーニングする方法も深慮する。計算科学においては機械学習やAIの導入の可能性も検討し,最終目標達成を目指す。
生体高分子不斉マトリックス中での光不斉誘導と光記録材料への展開

1.ポリペプチド固体マトリックス中での光異性化・・・ポリ(γ-メチルL-グルタメ-ト)の固体フィルム中にビフェニル、ビアントリルなどの面不斉プロキラル化合物を分散させ、光照射前後の円二色性スペクトルを測定した。これらの化合物は不斉場による強い円二色性を示すことを確認した。しかし光照射による変化は記録媒体としての実用レベルより小さかった。2.光異性化能をもつ発色基のらせん配置をもつポリペプチド・・・まずピレン、アントラセン等の発色基を一定の周期で結合したポリペプチドが合成された。それらは溶液あるいは固体中で非常に強い円二色性を示した。すなわちこれらの発色基がらせん配置をとっていることが示された。次に光変異性化能をもつアゾベンゼン基と同様の方法でらせん配置させたポリペプチドも合成された。これらのポリペプチドは光照射によって円二色性を大きく変化させることが見出された。また旋光度についても光制御が可能であった。3.発色基をもつ不斉二分子膜・・・ナフタレン、アントラセン、ピレン、アゾベンゼンを結合した光学活性アミノ酸を骨格とする両親媒性化合物が合成され、その円二色性が測定された。その結果、ピレンを含む化合物について異常に強い円二色性が見られ、その強度が膜のゲル-液畠転移点を境にして大きく変化することが認められた。またアゾベンゼンを含む二分子膜についても、光によって円二色性旋光度が制御可能であることが見出された。4.記録材料への展開・・・上記3つの分子系で、ポリペプチドやアミノ酸を二分子骨格やマトリックスとして光で円二色性や旋光度が制御できることが示された。今後はこれらを材料化するため、ポリペプチド薄膜や二分子膜の固定化が課題となろう。1.ポリペプチド固体マトリックス中での光異性化に伴う不斉誘導ポリ(γ-メチルL-グルタメート)の固体フィルム中に、ビフェニール、ビナフチル、ビアントリルなどの面不斉プロクラル化合物を分散させて円二色性スペクトルを測定した。これらの系は不斉場によって誘導される強い円二色性を示すことが明らかになった。しかし光照射の前後における円二色性の変化は小さく、実用的な記録材料の媒質としては不適当であることがわかった。2.磁場下で配向したポリペプチド液晶ゲルの作製......強い不斉場をもつ新しいマトリックスとして、ポリペプチドの液晶を磁場によって配向させた状態で化学架橋して構造を固定することを試みた。まず液晶構造を保ったまま架橋できる条件を見出すため、種々のジアミノ化合物をポリ(γ-ベンジルL-グルタメート)の濃厚溶液に混合させた。その結果、α,ω-ジアミノエチレンイミンを用いると所期の目的が達せられることがわかった。さらに試料を本補助金で購入した21kガウスの磁場中に固定し、架橋させることによって一定方向に配向した液晶ゲルを作製できることがわかった。3.アゾベンゼン基をらせん状に配列させたポリペプチドの合成......アゾベンゼン基を側鎖に結合した非天然アミノ酸、p-フェニルアゾフェニルアラニンを合成し、それを一成分とする定序配列ポリペプチドを合成した。このポリペプチドは溶液中でα-ヘリックス主鎖構造をとり、側鎖のアゾベンゼン基もヘリックスに沿ってらせん状に配列していることが円二色性スペクトルによって確かめられた。

紫外、可視の光照射によってアゾベンゼン基のトランス-シス光異性化を行わせると、円二色性や旋光度の変化も誘起されることが分った。またこの時側鎖は光異性化するが、主鎖は右巻α-ヘリックス構造に保たれていた。不斉構造をもつ生体高分子としてポリペプチドを採用し、それに沿って光異性化能をもつアゾベンゼン発色基を一定の周期で規則配列させた新しい型の光不斉誘導高分子が6種類新規に合成された。これらのポリペプチドは溶液中でα-ヘリックス構造をとり、アゾベンゼン発色基はヘリックス主鎖に沿ってらせん配列している事が示された。これらのポリペプチドの円二色性スペクトル(CD)はアゾベンゼン間の不斉励起子相互作用による正員のパタ-ンを示したが、その強度は発色基の空間配列に依存して大きく変化した。このCDパタ-ンは光照射によるアゾベンゼン基のトランス-シス異性化に伴って大きく変化し、シス状態では小さなCDしか見られなかった。すなわち光照射によって円二色性を制御できる高分子を見出すことに成功した。これらの高分子の旋光度もまた光照射によって変化し、それは波長の異なる光を交互に照射することによって可逆的に何度もくり返しが可能であった。すなわち旋光度を用いて非破壊的に記録を読み出すことのできる、新しい型の光記録材料としての可能性が示された。これらのポリペプチドの示すCDや旋光度の起因を探るため、ポリペプチドのコンホメ-ションエネルギ-計算を行ない、最安定コンホメ-ションを見出した。これらのコンホメ-ション(空間配置)に基づいてCDの理論計算を行なったところ、実験的に得られたスペクトルをほぼ再現する結果を得た。これにより今後類似の高分子を用いてより大きな旋光度変化を起こすための分子設計が可能である事が明らかになった。
海洋大循環データ同化システムを用いた大気海洋カップラの開発研究

本年度は、昨年度までに構築した海洋大循環データ同化システムを用いて大気海洋間のフラックスカップラの改良を行った。具体的にはモデルパラメータの推定が可能なadjoint法の特長を活かして、カップラの係数を海洋観測データに合うように修正するという同化実験を行った。その結果、多くの海域で循環場の改良がみられ、有効性が確認された。しかしながら、黒潮続流域などで数値モデルの分解能が粗いためとみられる不自然な推定値が見られた。この問題の解決のために分解能をあげたデータ同化システムを開発し、再度実験を行う予定である。また、今回フラックスカップラの改善に用いた方法は、たとえばモデルの拡散係数の推定など他のパラメタリゼーションの改善にも応用できるので、これについても今後の課題としたい。また、昨年開発した領域気候モデルを用いて積雲対流が大規模な大気海洋間フラックスに与える影響を調べた。その結果、特に大循環モデルで分解可能なスケールの一般風が弱い状況では、積雲に伴ういわゆるサブグリッドスケールの海上風が潜熱フラックスに対して支配的であることがわかった。この結果は今後のフラックスカップラの改良に非常に有力なので更なる解析をすすめるとともに、現在論文を投稿すべく準備中である。海洋大循環データ同化システムを用いて大気海洋カップラの改良を行うために、まず以前に構築したデータ同化システムの主要コンポーネントである海洋大循環モデルの改良を行った。昨年度までに開発した海洋大循環モデルは海面の境界条件として直接フラックスを与えるものであったが、境界条件として大気温、海上風などを与え、大気海洋間のフラックスをモデルで予報された海面水温を用いて計算するように改良した。この改良により、大気海洋カップラを海洋大循環モデルに埋め込んだいわゆる半結合型のモデルとなったため、データ同化システムを用いたカップラの改良に適用可能な数値モデルを作成することができた。また、同時に特に高緯度域での循環場の再現性を高めるために熱力学および力学過程を含んだ海氷モデルを開発し、海洋大循環モデルと結合させた。このモデルを気候学的な季節変動をする大気データを与えて駆動したところ、海氷の変動を含めて十分に現実的な海洋循環場を再現することができた。次年度はこのモデルを用いたデータ同化システムを構築して、より現実的な循環場を再現するために特にバルク法のパラメタ推定を中心にいくつかの同化実験を行う予定である。さらに、adjoint法を用いたデータ同化システムにおいて非常に重要な課題である評価関数の重みの決定法について、複数の数値モデルの結果を用いて制御変数の誤差と観測値の誤差をことにより、厳密に評価関数の重みを決定可能な手法を開発した。この方法は、従来はほとんど考えられていなかった数値モデルの不十分さに起因する誤差についても考慮に入れており、制御変数の自由度が変わることによって推定誤差が異なることを評価できるため、パラメタ推定を行う実験に最適な方法である。本年度は、昨年度までに構築したデータ同化システムの高度化を行うとともに、この同化システムの応用として、同化システムの重要なコンポーネントであるadjointモデルを用いた感度実験を行い、データ同化システムの有効性を示した。これは実際の黒潮変動予測において、時間を遡りながら黒潮変動の予報に対して感度の大きな領域を示すもので変動のメカニズムの解明、予測精度の向上に非常に有益な情報を与えるものである。これらの結果は日本海洋学会で発表を行うとともに、Journal of Oceanographyに投稿し現在印刷中である。また、本データ同化システムで用いている海洋大循環モデルと非静力学大気モデルと結合した領域気候モデルを開発した。計算機リソースの問題でこのモデルを全球に適用することは不可能であるが、このモデルは大気海洋間の物理過程を非常によく再現しているので、このモデル結果を用いた結果を用いて全球に適用可能な大気海洋カップラの改良に役立てる予定である。
ヒトhemicentinの性状と機能解析

Hemicentinは線虫において初めて同定された分子量60万の細胞外マトリックスタンパク質である。近年ゼブラフィシュの遺伝解析から、その変異がヒトの遺伝性疾患であるFraser syndromeとその類似疾患の原因遺伝子であることが示唆された。これまでのhemicentinの解析はほぼ線虫のみで行われており、このタンパク質の性状解析は言うまでもなく、哺乳類における発現様式ならびに機能は不明である。したがって、本研究ではヒトhemicentinをリコンビナントタンパク質として発現・精製し、性状解析ならびに機能解析を遂行し、さらに数種の抗体を作製、マウスでの組織分布を調べることを目的とする。前年度に構築した全長のヒトhemicentin-1とヒトhemicentin-2の発現ベクターをトランスフェクションしたHEK293細胞の培養上清には抗体で検出可能な量のタンパクが分泌されていたので、培養上清を集めリコンビナントタンパク質の精製を試みたが、どちらも高分子量の会合物を形成するためにまだ解析に十分な純度のタンパク質は精製できていない。全長のタンパクの精製が難しいので、全長のタンパクをカバーするフラグメントに分けて発現・精製を遂行した。まだ、すべてのフラグメントを精製できていないが、精製したフラグメントは抗体作製のため用い、新しいhemicentin2の抗体を作製した。マウスにおけるhemicentinの発現解析は現在進行中である。全長のリコンビナントタンパク質は高分子量の会合物となり、精製が困難なため、フラグメントとして発現・精製を試みることになったため、タンパク質の性状解析が遅れている。全長のhemicentin-1とhemicentin-2をカバーするフラグメントの発現・精製を行い、これらのフラグメントを用いて、他のマトリックスタンパク質との結合性やインテグリン等のレセプターとの結合性を解析する。また、マウス組織における発現解析をまとめる。Hemicentinは線虫において初めて同定された分子量約60万の細胞外マトリックスタンパク質である。これまでのhemicentinの機能解析はほぼ線虫のみで行われており、このタンパク質の性状解析は言うまでもなく、哺乳類における発現様式ならびに機能は不明である。したがって、本研究ではヒトhemicentinをリコンビナントタンパク質として発現・精製し、性状解析ならびに機能解析を遂行し、さらに抗体を作製、マウスでの組織分布を調べることを目的とする。初年度はこれまでに、ヒトHemicentin-1とHemicentin-2の全長cDNAを網膜色素上皮細胞と市販のヒト胎児心臓のRNAを用いてそれぞれクローニングし、発現ベクターを構築した。発現の有無をHEK293細胞を用いて調べた結果、Hemicentin-2では全長に相当するタンパクバンドが検出できたが、Hemicentin-1では、全長の約半分ぐらいの大きさのバンドがウェスタンブロットにより観察され、プロセシングされている可能性が示唆された。また、これまでに既にHemicentin-1に対する4種の抗体を作製済みであったが、これらの抗体を用いて、まずHemicentin-1のマウスにおける組織分布を解析中である。現在のところ、4種のうち1種の抗体のみで再現性の高い染色が認められた。また、Hemicentin-2のフラグメントに対する抗体も作成したが、まだ精製の必要があり、まだ組織染色には用いていない。Hemicentinの全長cDNAは約15kbと長いが、一応どちらもクローニングが終わり、発現ベクターを構築できた。しかし、リコンビナントフラグメントに対する新しい抗体の作製ならびに抗体の精製はまだ進行中でり、マウスでの組織分布の解析が遅延している。構築した発現ベクターを用いて、リコンビナントタンパク質の発現・精製を試みる。精製できれば、全長のタンパク質に対する抗体を作製するとともに、タンパク質の性状解析を進行する。もし、全長のタンパク質の発現・精製が不可能な場合は、全長をカバーするいくつかのフラグメントを作製し、解析に用いる。

全長のhemicentin-1とhemicentin-2をカバーするフラグメントの発現・精製を行い、これらのフラグメントを用いて、他のマトリックスタンパク質との結合性やインテグリン等のレセプターとの結合性を解析する。また、マウス組織における発現解析をまとめる。フラグメントの発現・精製の遅延により、抗体作製をまだ始めることができなかった。また、タンパク質精製のためのカラムの購入は今年度まだ必要なかったので、次年度以降に購入することにした。リコンビナントタンパク質の精製の遅延により、それらを用いた解析を始めることができていない。そのため、予定していた試薬等の購入が遅れている。
ダイレクトリプログラミングによる網膜神経節細胞の次世代分化誘導法の確立

多くの細胞が繊維芽細胞から多能性の経路を通らずに、直接細胞転換により誘導されている。神経では、様々なサブタイプをが、直接誘導されている。そこで、CNSのモデルである網膜の神経、中でも網膜神経節細胞がが直接誘導できるかを証明した。繊維芽細胞から誘導後3日目で神経細胞様の細胞が観察され、作製された神経様細胞は、神経細胞固有の機能であるアクションポテンシャルが観察され、また、単一細胞レベルでの遺伝子発現解析においても、in vivoの網膜神経節細胞と同等の発現を示してていた。これらによって作成された細胞は、緑内障のモデルにも応用可能であり、細胞移植や、薬物スクリーニングにおいて、有用な細胞である。本研究目的は、試験管内でのダイレクトリプログラミングによる、マウス繊維芽細胞からの網膜神経節細胞様の次世代分化誘導法の確立を目指して研究を行っており、昨年度においては、リプログラミングファクターを決定するために、synapsin1 promoter-RFPレンチウイルスをマウス維芽細胞(MEF)に感染させ、神経へ細胞転換した時に赤色に光る細胞を樹立した。さらに、遺伝子発現のON/OFFを調節できるテトラサイクリンシステムを取り入れ、その為の、CMV-M2rTTAレンチウイルスを上記の細胞に感染させ、スクリーニング用細胞を樹立した。さらに、樹立した細胞に網膜神経節細胞の発生と分化に関わっている、転写因子の3遺伝子をレンチウイルスにより細胞へ遺伝子導入し、ドキシサイクリン含有の神経細胞用培地で培養を行ったところ、わずかなRFP陽性細胞が確認された。さらに、4つ目の遺伝子候補を探索した結果、ある1つの遺伝子を足した時に、数多くのRFP陽性細胞が観察され、形態学的にも神経細胞様の形態を表し、さらに免疫染色により、神経細胞マーカーである、Tuj1の確認だけでなく、成熟神経細胞マーカーである、Map2,NeuN,NFLの染色が確認された。これらで得られた細胞をさらに調査したところ、電気生理学的手法を用いた機能解析では、Naチャネル、Caチャネル、KチャネルがいくつかのRFP陽性細胞で観察され、神経活動を表すアクションポテンシャルも観察された。さらに、Caイメージングにおいては、KCL刺激により、Caの隆起が観察された。ただ、生体内の網膜神経節細胞においても、様々な細胞の種類が存在するため、単一細胞レベルでの遺伝子発現のパターンを今年度において調査を行うものとする。本研究目的は、試験管内でのダイレクトリプログラミングによる、マウス繊維芽細胞からの網膜神経節様細胞の次世代分化誘導法の確立を目指して研究を行った。初年度において、synapsin1 promoter-RFPと遺伝子の発現のON/OFFを調節するためのCMV-M2rTTAを、レンチウイルスでmouse embryonic fibroblastsに導入し、レポーターシステムを樹立した。それを用いてリプログラミングファクターを網膜神経節細胞の発生と分化に関わっている、転写因子群の中から4つの転写因子を選出し、それにより、繊維芽細胞から、3日で神経細胞様の細胞が館雑された.また、その後の免疫染色においても、神経マーカーが確認され、最終年度においては、得られた細胞の詳細なプロファイリングを行った。単一細胞での遺伝子発現解析では、元の繊維芽細胞と目的細胞である生体内の網膜神経節細胞とを比較した結果、網膜神経節細胞と同等の発現パターンが得られた。また、in vitroでの電気生理学的手法を用いた機能解析では、神経細胞特有の機能を示すアクションポテンシャルが観察され、Na/KチャネルのインヒビターであるTTXによる薬理実験においても機能を裏打ちされた。さらに、成熟マウス繊維芽細胞、もしくは、成熟ヒト繊維芽細胞を用いて、4つの転写因子を導入し、網膜神経節細胞の作製を試みたところ、効率は少ないものの、同等の細胞の作製が出来た。試験管内スクリーニングシステムにより、マウス線維芽細胞を網膜神経節細胞様に転換するためのリプログラミングファクターの組み合わせを候補遺伝子群から決定する事ができた。得られたファクターをウイルスと、テトラサイクリンシステムを用いいて、線維芽細胞として維持、保存できるように、細胞を樹立した。樹立した細胞をドキシサイクリング存在下の培養液で培養することで、再現よく網膜神経節様細胞を作成することができ、現在これらの細胞の機能解析を行っている。細胞工学1シングルセルレベルでの遺伝子発現解析2電気生理学的手法を用いた機能解析3成熟マウス繊維芽細胞からの、網膜神経節細胞への細胞転換シングルセル解析技術の構築に時間を要したため、それに伴うシングルセル解析用の試薬の購入を延期したため。シングルセル遺伝子解析のための物品購入
新たな骨粗鬆症モデルの確立

ヒトに近い骨代謝動態(リモデリング骨)を示す家兎に卵巣摘除を行った上に、高ホモシステイン血症を誘導することで、ヒト骨質劣化型の病態を反映する新たな動物モデルの確立が可能か否かを検討したところ、骨密度に影響を及ぼすことなく、骨の材質特性を低下させることが明らかとなった。従って、本モデルは、骨質評価ならびに治療を目指した創薬への応用に期待できる。高ホモシステイン(以下Hcys)は、食事から摂取されるメチオニンの中間代謝産物である。我々は、我が国のコホート研究において、血中のHcys高値とその代謝に関わる酵素MTHFRの遺伝子多型が、骨密度とは独立した骨折リスクとなることを明らかにし、さらに、血中のHcys高値を示す骨粗鬆症例では、骨質因子であるコラーゲンの架橋形成に異常が生じていることを報告した。そこで、本研究の目的は、Hcysによる骨質低下の機序を明らかにするために、血中Hcys高値が持続する動物モデルを作製し、骨密度、骨強度、骨質を網羅的に解析することにある。方法としては、成熟new Zealand白色家兎に、卵巣摘出(OVX)あるいはSham手術を施行し、それぞれ通常食群と1%メチオニン混餌群にわけ、8カ月間飼育した後に大腿骨、第4腰椎を採取した。各々に、血中Hcys濃度、骨代謝マーカー、骨密度、骨強度、コラーゲン架橋(生理的架橋:未熟型,成熟型,非生理的架橋:老化型AGEs架橋,ペントシジン)分析を行った。混餌投与群の血中Hcys濃度は、通常食群に比べ有意に高値を示し、我々が報告したヒト骨粗鬆症に類似した架橋異常が誘導されていた。さらに、混餌群にOVXを加えると、架橋異常はさらに増悪し、また、同モデルでは、骨密度の低下を伴わない骨強度の低下を生じた。これらのことから、高Hcys血症に伴う骨質低下モデルを初めて確立し、Hcysが骨コラーゲンの架橋異常を惹起し、骨密度とは独立した機序で骨脆弱化をもたらすことを明らかにした。よって、本モデルは、骨質評価・治療を目指した創薬への応用が期待できる。本研究の目的は、ヒトに近い骨代謝動態(リモデリング骨)を示す家兎に卵巣摘除を行ったうえに、高ホモシステイン(Hcys)血症を誘導することで、ヒト骨質劣化型の病態を反映する新たな動物モデルの確立が可能か否かを検証することにある。こうした動物モデルが確立できれば、骨質治療という新たな治療体系の確立にもつながると考えている。方法としては、成熟New Zealand白色家兎に、卵巣摘出(OVX)あるいはSham手術を施行し、Sham手術群,1%メチオニン負荷群,OVX群,OVX+1%メチオニン負荷群の4群に分け、メチオニン負荷は術直後より開始した。投与終了後、血液,尿,大腿骨を採取して、骨コラーゲン分析,骨密度測定,骨強度試験を行った。分析の結果、1%メチオニン負荷群でのみ血中Hcys濃度は有意に上昇した。1%メチオニン負荷を加えた2群では生理的架橋の低形成とへ.ントシジンが有意な増加が認められ、ヒト骨質鉄劣化型と類似した架橋異常が誘導された。また、1%メチオニン負荷+OVX群では上記の架橋異常のみならず、コラーゲン含有量が有意に低下した。骨密度は各群間に差は認められなかった。以上の結果より、メチオニン負荷によって誘導される高Hcys血症は、骨密度に影響を及ぼすことなく骨の材質特性を低下させることが明らかとなった。このことから、高Hcys血症に伴う骨質低下モデルを初めて確立し、Hcysが骨コラーゲンの架橋異常を惹起し、骨密度とは独立した機序で骨脆弱化をもたらすことを明らかにした。従って、本モデルは、骨質評価・治療を目指した創薬への応用が期待できる。
ワイドギャップ半導体のナノ構造制御と光エネルギー変換デバイスへの応用

本研究課題においては,ワイドバンドギャップを持つ代表的な半導体材料である酸化亜鉛(ZnO)の微細構造制御をおこない,色素増感太陽電池(DSSC)電極及び蛍光体への応用を試みた.1.DSSCに関する研究:DSSCの構成部材である透明導電性ガラスを安価なプラスチック基板で代替することを試みた.電極膜が高い色素吸着能を有し,電解液の効率的な拡散を促すためには,ナノボア,マクロボアの両方を導入するのが望ましいが,従来の方法でこうした構造膜の低温作製は困難であった.そこでマクロボアを有する水酸化酢酸亜鉛(LHZA)膜を60°Cで基板上に予め作製し,これを(1)溶解・析出法,(2)熱分解法によって,それぞれ120°C以下で目的のナノ構造を持つZnO膜へと変換することに成功した.熱分解法を用いてプラスチック基板(ITO-PEN)上に作製した電極は,最高変換効率3.4%を記録した.また膜内のマクロボアは曲げによって発生する応力を緩和し,曲げによる電池性能劣化を抑えることが分かった.またドクターブレード法による製膜の後120°Cで熱処理をおこなった膜は,ZnO系プラスチックDSSCの最高変換効率に並ぶ4.04%を記録した.2.ZnO蛍光体に関する研究:種々の亜鉛塩水溶液にアンモニア水溶液を混合し60°Cで保持することによって得られるZnO粒子は,近紫外光照射によって波長560580nmを中心とするブロードな黄色の発光スペクトルを示す.これらのZnO粒子はマイクロサイズで星型の形態を持っており,それぞれの粒子はナノサイズの配向した微結晶からなることが分かった.合成されたZnO粒子の発光特性,光学バンドギャップは原料に用いる亜鉛塩の種類によって異なり,これらの光学特性変化は,結晶子サイズと相関性があることから,量子サイズ効果に起因することが示唆された.これは原料亜鉛水溶液中に含まれるカウンターアニオンがZnOの核生成・成長速度を決定する因子であるためで,アニオン比を調整することで光学特性のチューニングも可能であることを示した.1.色素増感太陽電池に関する研究色素増感太陽電池を構成する部材の中で,透明導電性ガラス基板は高いコストを占めており,これをプラスチック基板で置き換えることを試みた.化学浴析出法を用いて,低温で基板上に作製した層状水酸化酢酸亜鉛(LHZA)膜を前駆体として用い,(1)溶解・析出法,(2)熱分解法という異なるプロセスによって,それぞれ90°C以下でZnOナノ構造膜を基板上に得ることに成功した.なお,(1)溶解・析出法はLHZA膜を種種の液相に浸漬し,6090°Cで保持する方法で,(2)熱分解法は,LHZA膜を乾燥機中にて90°Cで保持する方法である.熱分解法を用いてプラスチック基板(ITO-PEN)上に作製した電極は,最高変換効率3.4%を記録した.また色素増感ZnO電極のコーティングに関しては,適したコーティング材料の探索及びコーティング層の電池性能に対する効果について詳しく調査した.その結果,これまでに研究をおこなったSiO_2,Nb_2O_5に加え,TiO_2及びZrO_2に関しても再結合抑制効果による電圧の改善が見られ,さらにコーティングターゲットであるZnOの粒成長抑制効果も認められた.2.酸化亜鉛の蛍光特性とナノ構造に関する研究ZnOは蛍光体への応用もなされており,UVで励起することによって,紫外可視領域において様々な発光を示す.本研究において,亜鉛塩の水溶液にアンモニア水溶液を混合し,60°Cで保持することによって得られたZnO粒子は,波長560580nmを中心とするブロードな黄色の発光スペクトルを示す.このときZnO粒子はマイクロサイズで星型の形態を持っており,それぞれの粒子はナノサイズの組織からなることが分かった.前駆体に用いる塩の種類によって,合成されたZnO粒子の発光特性,そして光学バンドギャップエネルギーが異なっており,これらの光学特性と粒子サイズに相関関係があることを見出した.これらの粒子サイズと光学特性について詳細に調査することで,ZnO粒子の光学特性のチューニングが可能になるかもしれない.本研究課題においては,ワイドバンドギャップを持つ代表的な半導体材料である酸化亜鉛(ZnO)の微細構造制御をおこない,色素増感太陽電池(DSSC)電極及び蛍光体への応用を試みた.1.DSSCに関する研究:DSSCの構成部材である透明導電性ガラスを安価なプラスチック基板で代替することを試みた.電極膜が高い色素吸着能を有し,電解液の効率的な拡散を促すためには,ナノボア,マクロボアの両方を導入するのが望ましいが,従来の方法でこうした構造膜の低温作製は困難であった.そこでマクロボアを有する水酸化酢酸亜鉛(LHZA)膜を60°Cで基板上に予め作製し,これを(1)溶解・析出法,(2)熱分解法によって,それぞれ120°C以下で目的のナノ構造を持つZnO膜へと変換することに成功した.熱分解法を用いてプラスチック基板(ITO-PEN)上に作製した電極は,最高変換効率3.4%を記録した.また膜内のマクロボアは曲げによって発生する応力を緩和し,曲げによる電池性能劣化を抑えることが分かった.またドクターブレード法による製膜の後120°Cで熱処理をおこなった膜は,ZnO系プラスチックDSSCの最高変換効率に並ぶ4.04%を記録した.

2.ZnO蛍光体に関する研究:種々の亜鉛塩水溶液にアンモニア水溶液を混合し60°Cで保持することによって得られるZnO粒子は,近紫外光照射によって波長560580nmを中心とするブロードな黄色の発光スペクトルを示す.これらのZnO粒子はマイクロサイズで星型の形態を持っており,それぞれの粒子はナノサイズの配向した微結晶からなることが分かった.合成されたZnO粒子の発光特性,光学バンドギャップは原料に用いる亜鉛塩の種類によって異なり,これらの光学特性変化は,結晶子サイズと相関性があることから,量子サイズ効果に起因することが示唆された.これは原料亜鉛水溶液中に含まれるカウンターアニオンがZnOの核生成・成長速度を決定する因子であるためで,アニオン比を調整することで光学特性のチューニングも可能であることを示した.本研究の目的の一つとして掲げている色素増感太陽電池電極のプラスチック化に関して,ある程度形態制御されたZnOナノ構造膜をプラスチック(ITO-PEN)基板上に作製することに成功しているが,今後はZnOの生成プロセスを詳細に解明し,電池特性,耐久性等の改善に努めていく必要がある.また星型ZnO粒子の水溶液合成もおこなっており,ZnO粒子のナノ構造と光学特性(特に発光特性)の間に相関性を見出した.一方で,コーティングによる色素増感太陽電池電極の改質,層状水酸化金属化合物の合成についての研究は検討の余地があり,次年度は新たなプロセスを導入し,これらの研究に取り組んでいく.色素増感太陽電池用のコーティングZnO電極に関しては,膜のナノ構造によって適切なコーティング条件が異なることが分かっており,高効率の電極を作製するにはコーティング材料自体の電気特性の改善,膜の構造の改善の両方が必要である.具体的には焼成条件を見直し,コーティング層の組成を制御することで電気特性の改善を目指すことから着手する.プラスチック色素増感太陽電池電極の作製については,電池特性,耐久性等の改善に努めていく.溶液中の過飽和度をコントロールすることによる層状水酸化物の形態制御に関しては,モデル材料として亜鉛化合物に研究対象を絞り,温度以外による過飽和度の制御も視野に入れていく予定である.
魚類の摂食行動を抑制する脳制御機構に関する研究

これまでの研究において、新規摂食制御ペプチドとしてニューロメジンU(NMU)をコードする4種類のcDNAを単離した。これら4種類のmRNAからは、構成アミノ酸数の異なる3分子種のペプチド(構成アミノ酸数により、それぞれNMU-21、NMU-25及びNMU-38と命名した)が産生されることが推定された。また、NMU受容体をコードするcDNAのクローニングを行ったところ、2種類のcDNAを得た。そこで、推定されるキンギョNMU受容体を安定発現する培養細胞を作製し、受容体発現細胞の細胞内Ca^<2+>濃度の変化を指標としたアッセイにより脳及び腸より天然のNMUの単離・精製を行った。その結果、9残基のアミノ酸から構成されるNMU・9を新たに発見した。そこで、これら4分子種のキンギョNMUを合成し、その生理活性を調べた。キンギョNMU受容体発現細胞に合成したNMUを添加したところ、いずれの分子種も細胞内Ca^<2+>濃度の上昇を誘起した。次に、NMUの脳室内投与が摂食量に及ぼす影響を調べたところ、いずれの分子種を投与しても給餌後60分間の摂食量が投与量依存的に減少することが示された。また、NMU投与による摂食抑制作用はCRHを介している可能性が示唆された。さらに、4分子種のNMUは、キンギョ腸平滑筋の収縮を誘起することが見出された。上記の結果より、本研究は魚類においてNMUとその受容体が存在していることを初めて見出し、分子基盤を明らかにした。さらに、NMUはキンギョの中枢および末梢において、生理作用を有することを示した。特に、哺乳類及び鳥類においてもNMUは摂食抑制作用を有し、その作用はCRHにより仲介されることが報告されている。従って、NMU-CRH系による摂食抑制機序は脊椎動物において保存されていることが、本研究の成果より示唆される。本研究は、魚類における摂食抑制機構の解明を目指し、キンギョにおける神経ペプチドと摂食行動との関連について研究を進めている。本年度は、新規摂食抑制ペプチドである可能性が示唆されるニューロメジンU(NMU)のcDNAを同定し、キンギョの摂食行動に及ぼすNMUの影響及びその作用機序を調べた。まず、キンギョNMUをコードするcDNAの単離を試みたところ、キンギョ脳及び腸より長さの異なる3種類のペプチドをコードするキンギョNMU cDNAを4つ単離した。キンギョの各組織における4種類の前駆体mRNAの発現分布をRT-PCR法により調べた。その結果、脳においては21残基から構成されるNMU-21をコードするNMU前駆体4mRNAが多く発現していた。そこで、前駆体4mRNA発現に及ぼす摂食量の影響をRT-PCR法により調べたところ、絶食群での前駆体4mRNAの発現量が有意に減少した。次に、キンギョ脳室内へNMU-21を投与して60分間の摂食量に及ぼす影響を調べた。その結果、NMU-21の投与により摂食量が投与量依存的に減少した。さらに、キンギョ脳室内へNMU-21抗血清を投与したところ、正常血清投与群と比べて有意に摂食量が増加した。加えて、摂食制御機構におけるNMUの作用機序を探るため、NMU-21投与による摂食抑制効果がCRH及びα-MSH受容体アンタゴニストにより阻害されるか否か検討した。その結果、NMU-21投与による摂食抑制作用はCRH受容体アンタゴニストの前投与により阻害されたが、α-MSH受容体アンタゴニストの前投与による影響はみられなかった。以上の結果より、キンギョにおいてNMU-21は摂食抑制作用を有することが初めて示された。また、NMU-21がCRHの摂食抑制系を介して摂食抑制作用を発揮する可能性が示唆された。本研究は、魚類における摂食制御機構の解明を目指し、キンギョにおける神経ペプチドと摂食行動との関連について研究を進めている。これまでの研究において、新規摂食制御ペプチドとしてニューロメジンU(NMU)をコードする4種類のcDNAを同定した。そのうち、脳においては21残基から構成されるNMU-21をコードするNMU前駆体4mRNAが多く発現していたことから、キンギョ脳室内へ合成NMU-21を投与して60分間の摂食量に及ぼす影響を調べた。以上の結果より、キンギョにおいてNMU-21は摂食抑制作用を有することが示された。さらに、NMU前駆体1、2及び3より産生されると考えられるNMU-25とNMU-38を合成し、その脳室内投与が摂食量に及ぼす影響を調べた。その結果、NMU-25あるいはNMU-38の脳室内投与により、摂食量が投与量依存的に減少した。また、その作用はNMU-21と同程度であった。次に、キンギョNMU受容体をコードするcDNAの単離を試み、2種類のcDNAを得た。一次構造をもとにした系統樹解析により、コードされるふたつのタンパク質がNMU受容体である可能性が示唆された。そこで、これら2つの受容体を培養細胞に強制発現させ、キンギョNMUを添加した際の細胞内Ca^<2+>濃度の変化をfluorometric imaging platereader(FLIPR)を用いて解析した。

その結果、NMU-21、NMU-25及びNMU-38の添加により2種類の受容体発現細胞の細胞内Ca^<2+>濃度が、添加量依存的に増加した。すなわち、単離した2種類の受容体が機能的なキンギョNMU受容体であることを示している。現在、2つのNMU受容体に特異的な抗体を作製し、キンギョ脳におけるNMU受容体発現ニューロンの分布を精査している。これまでの研究において、新規摂食制御ペプチドとしてニューロメジンU(NMU)をコードする4種類のcDNAを単離した。これら4種類のmRNAからは、構成アミノ酸数の異なる3分子種のペプチド(構成アミノ酸数により、それぞれNMU-21、NMU-25及びNMU-38と命名した)が産生されることが推定された。また、NMU受容体をコードするcDNAのクローニングを行ったところ、2種類のcDNAを得た。そこで、推定されるキンギョNMU受容体を安定発現する培養細胞を作製し、受容体発現細胞の細胞内Ca^<2+>濃度の変化を指標としたアッセイにより脳及び腸より天然のNMUの単離・精製を行った。その結果、9残基のアミノ酸から構成されるNMU・9を新たに発見した。そこで、これら4分子種のキンギョNMUを合成し、その生理活性を調べた。キンギョNMU受容体発現細胞に合成したNMUを添加したところ、いずれの分子種も細胞内Ca^<2+>濃度の上昇を誘起した。次に、NMUの脳室内投与が摂食量に及ぼす影響を調べたところ、いずれの分子種を投与しても給餌後60分間の摂食量が投与量依存的に減少することが示された。また、NMU投与による摂食抑制作用はCRHを介している可能性が示唆された。さらに、4分子種のNMUは、キンギョ腸平滑筋の収縮を誘起することが見出された。上記の結果より、本研究は魚類においてNMUとその受容体が存在していることを初めて見出し、分子基盤を明らかにした。さらに、NMUはキンギョの中枢および末梢において、生理作用を有することを示した。特に、哺乳類及び鳥類においてもNMUは摂食抑制作用を有し、その作用はCRHにより仲介されることが報告されている。従って、NMU-CRH系による摂食抑制機序は脊椎動物において保存されていることが、本研究の成果より示唆される。