hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
癌抑制遺伝子産物の生理機能

癌抑制RB蛋白質に結合する新しい蛋白質としてクローニングしたRBQ-3のcDNAの全一次構造を決めた。そして、その蛋白質が、発芽酵母の一本鎖DNA結合蛋白質の遺伝子RPA-1のすぐ3側に存在する機能未知の蛋白質と有意な相同性をもつことを見い出した。RBQ-3遺伝子はヒト染色体上の1q32にマップされた。また、核マトリックス蛋白質ラミンAがin vitroでRB蛋白質と結合することを見い出し、その結合に使われるラミンA蛋白質上の領域を同定した。さらに、昨年度に開発したリン酸化ペプチド化学合成法を用いて、RB蛋白質上のリン酸化部位のうちの2カ所に相当するリン酸化ペプチドを合成し、それを抗原として、RB蛋白質上の特定のリン酸化部位のみを認識する抗体の作成に成功した。また、RB結合蛋白質としてクローニングしたRAXが細胞周期の進行を強く阻害することを見い出した。一方、癌抑制遺伝子産物と予想されるp300がc-jun遺伝子上流の転写制御配列DREに転写因子複合体として結合することを示し、p300の標的遺伝子としてc-junを初めて明らかにした。p53については、その保存領域とGSTとの融合蛋白質を用いて、これまでに知られているp53結合蛋白質Mdm2やRF-A等とは異なると考えられる複数の新しい結合蛋白質を見い出した。このうち2種類はSV40largeTによって特異的に結合が阻止された。両蛋白質の合成は細胞周期に依存していた。また一方では、IRF-1が癌抑制遺伝子として白血病発症にも関連することを明らかにした。IRF-1あるいはIRF-2遺伝子欠損マウスも樹立できた。さらには、G10BPを純度80-90%まで精製し、サウスウエスタン法により、その分子量は約3万と推定した。APC遺伝子欠損マウスも作成でき、多数の大腸癌の発生が確認できた。HPV-E6/E7をターゲットとするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる子宮頚癌細胞の増殖抑制効果に関しては、オヌクレオチドに修飾基を付加することで顕著な抑制効果が得られた。
英国ルネサンス演劇における演劇的手法としての手紙

英国演劇の黎明期から17世紀までの現存する英語劇をHarbage, “Annals of English Drama: 975-1700"の推定執筆年に基づいて調査し、初期版本と現代版本を照合して手紙が現れる箇所を網羅的に分析した。英国演劇における「手紙」の初出は"Fulgens and Lucrece" (1497)だが、その後しばらく例外的な作品をのぞき用いられなかった。1580年代に73例、1590年代に191例と頻出するようになり、偽造・誤配・誤読されることで劇的契機をつくりだす手法として発展した。大英図書館のデータベースLION(Literature on line)で、975-1600年の劇について、ト書きも含めた全テクストから、letter/letters, paper/papersが「文字」や「紙」でなく「手紙」を意味する箇所をすべて拾いあげ、必要に応じ、初期版本の現物・ファクシミリ、EBBOで検証した。結果をエクセルで整理し、modern editionの該当箇所と照合する作業を進め、年度中に7割超の用例をチェックするところまでは至った。舞台上で手紙が重要な意味で言及されたり、小道具として用いられるのは、Thmas Kyd, SPANIAH TRAGEDY (1582)が書かれた1580年代からであると推定される。むろんそれ以前にも、14世紀のWakefield Plays (The Towneley Plays)のTLN 73, 128に早くも"letters"への言及がみられ、15世紀のCONVERSION OF ST. PAULにも3例が見つかり、Henry Medall, FULGENS & LUCRECEになると「手紙を送る」(sendyth you a letter)といった表現が現れる。しかしそれはむしろ、識字率の向上とともに、通信手段として手紙が見慣れたものになった証拠であり、必ずしも演劇表現として手紙の手法が発展したわけではない。1520年代以前は、舞台での手紙の言及・使用はきわめて散発的である。たとえば、John Heywood, THE PARDONER AND THE FRIAR (1527)には3度手紙が出てくるものの、同作家の他の作品には一例も見られない。むしろ、この時期に目につくのは、Nicholas Udall,THIRSITIES (1537)での手紙への言及であり、劇での手紙の使用が翻訳の上演によって推進された可能性を示唆する。翻訳作品では、IPHIGENIA IN AULIS (1558)も20か所近くで手紙に言及しており、この仮説の裏付けになるかもしれない。現存する劇テクストの古版本のテクスト(ト書きを含む)を1610年(Barbage, ANNALS, 3rd ed.に拠る)まで調査した限りでは、1580年代から劇中での手紙の言及・使用は拡大し、用例も増加する。それにしたがって、劇中で手紙が果たす機能は誤配、盗難、書き換え等によって、複雑化していく。英国初期近代演劇の手紙の演劇的用法に迫るため,英国演劇の黎明期から17世紀末までに英語で書かれ、テクストが現存して入手できる劇を調査し,手紙の用いられた例を収集したが、最終の今年度はすでに「手紙」を意味する“letter(s)", “paper(s)"の語がみつかっている劇について,他に「手紙」にあたる表記が出てくる箇所がないか目を配りながら,「手紙」が出てくる箇所について,現代版本と初期版本を照合した。とくに古綴りで原文を引用したため,綴りや句読点を中心に,引用文の校正に注意を払った。その過程で「手紙」を意味するかどうかについては、初期近代の劇テクストもさることながら中世劇を改めて吟味し,手紙を「(その場にいない)差出人が特定の受取人(たち)にたいして,何らかの情報を個人的に通信するため送る書面」と定義すると,サイクル劇や道徳劇には「手紙」と呼べる“letter"の用例は見当たらないことを確認した。その結果,「手紙」が初めて現れるのは,1497年の『フルゲンスとルクリース』であることがほぼ間違いないことが分かった。ルネサンスの人文学の洗礼を受けて,ギリシア・ローマ演劇を知る知識人が,ある程度の複雑さをそなえた劇を書くことが,手紙が英国演劇に現われる前提だったと考えられる。この数年で、British Libraryが公表したESTCによって、古版本に言及する際にはESTC番号を明記し、modern editionsではなく、EEBOで画像を参照し、該当箇所のsignatureを記録することが標準となったため、本助成金を受ける前にすてに調査していたデータを、すべて再確認しなければならなくなったため、想定したよりもはるかに時間がかかることになった。勤務校ではEEBOが参照できないため、国会図書館関西館に出かけなければならないが、そのための時間が校務のために制限された。

しかしながら、以前の調査データを再照合した結果、記録されていた箇所はほぼ正確であったが、採取すべき箇所が洩れている例がいくつか見つかり、調査結果の正確さを高めることができた。英国初期近代演劇データの正確性が確認された部分から、文献のSTC番号、該当する頁のsignature、可能な場合は参照したmodern editionsの頁番号、テクストからの該当部分引用を、とりあえずexcelを用いてデータベースを構築していく。それとともにデータを採った版本、近代版本を目録化する。その過程で、Kyd "Spanish Tragedy"からシェイクスピアの成熟期喜劇が書かれる1600年までを目安として、劇的手法としての手紙の導入を2本の論文としてまとめて、順次発表する予定である。その上で、本研究終了時には、構築されたデータベースに基づいて、手紙の劇的仕様の時系列での発達を分析し、研究成果として公表する。遅れている調査については、BLでのESTC利用とそれとリンクしたEEBO閲覧によって効率化することができるので、勤務校からサバティカル研修を取得して、ロンドンで約1ヶ月滞在研究をすることで挽回する予定である。また、EEBO editions (ProQuest)で主要なタイトルが入手可能になり、作品の梗概についても、Martin Wiggins (ed.) BRITISH DRAMA (Oxford)の刊行が完成したので、作品全体のなかで手紙使用の場面の理解が容易になった。申請時には、1560年以降を調査対象とする予定だったが、それ以前の戯曲で手紙が言及されていれば、その手法が1560年以降の作品に影響を与えている可能性があり、調査範囲を975-1615年の戯曲に拡充することにした。また、本研究の前にすでに調査していた、1560-1589年の戯曲について、収集済みのデータを検証したところ、取りこぼしが見つかり、再確認の調査をしたこともあり、研究の進展に軽度の遅れを生じることになった。初期版本の現物・ファクシミリの大英図書館での検索と閲覧にも、利用者が多い時期であったため、予想外の時間が掛ることとなった。年度末に再度、渡航して補足調査を行なったため、調査の遅れは大きなものではなくなったが、そのために年度内に予定していた論文の完成がずれ込むこととなり、本年度中に成果を発表することができなかった。ただし、データの信頼性を十分なものとすることができ、今後の研究の堅牢な基礎を築くことができた。(1)構築すべきデータベースの容量によって、購入すべきパーソナルコンピュータを見定めるため、購入を最終年度にしたため物品費が使用されていない。(2)最終年度に、勤務校からサバティカル研修を許可されたため、比較的長期の在外調査がまとめてできることが判明したので、そのための費用を最終年度に回した。今年度の遅れを取り戻すため、研究が進めやすい時期に大英図書館での調査を行なうとともに、modern editionとの照合については、昨年度末にようやく研究室に届いた、新刊のBen Joson全集(Cambridge UP)や、入手しやすくなったFredson Bowers編のBeaumont and Fletcher劇集などを活用することとする。大きく以下の4つの項目において使用する。(1)5月20日6月17日に大英図書館(ロンドン)及びケンブリッジ大学図書館にて調査
ＥＬＩＳＡ法を基盤とする微量かつ有効カテキンの高感度分析法の開発

茶は含有成分の生理活性の多様さから注目されている。茶中の極微量成分メチル化EGCgに強力な抗アレルギー活性が、またテアフラビンTFには抗肥満活性が報告された。不安定なこれら有効成分の高含有品種の探索を目的として、簡便で迅速な定量法の開発が求められている。そこで申請者は、ELISA法による高感度な微量定量法を確立を目的とし、カテキン抗体の作成に必要な免疫原の作成に成功した。すなわち、アミノペンチル基を有するEGCg誘導体APDOEGCgを合成した。また、本合成法を基に同様の側鎖を有するTFを酸化的二量化反応により合成した。最後に、それぞれのキャリアタンパク質複合体を免疫原とし抗体の作成を行った。24年度に開発したテアフラビン合成法を用いて、種々のベンゾトロポロン骨格を有する類縁体を合成した。まず、カテキンに対し、ホウ酸存在下NsClと反応させることでA環部フェノール性水酸基を選択的にNs保護した。続いて四酢酸鉛による酸化でオルトキノンとした後、ピロガロール骨格を持つ種々の化合物とカップリングし、ベンゾトロポロン誘導体を合成した。また、アミノペンチル基を有するAPDOEGCg(アミノペンチルデオキシEGCg)と本酸化的カップリングを行い、脱保護を経てアミノペンチル基を有するAPDOTF(アミノペンチルデオキシテアフラビン)を合成した。一方、メチル化APDOEGCgの作製した。まず、既に我々が開発した方法にてAPDOEGC(アミノペンチルデオキシEGC)を合成した。即ち、Julia-Kocienski反応により合成したオレフィンに対して、鈴木ー宮浦反応による側鎖を伸長、Nsアミドとの光延反応を利用して窒素原子を導入した。さらにAD-mix-βを用いて合成した光学活性なジオールへガロイル基を導入した後にcis-ジヒドロピラン環を構築した。続いて、3-及び4-メチル化没食子酸を合成した。没食子酸エステルに炭酸ナトリウム存在下ヨウ化メチルを作用させ、最も反応性の高い4位選択的にメチル基を導入した。一方、ホウ酸存在下、カテコールのホウ酸エステルの架橋中間体を経由する3位選択的なメチル化により3-メチル化体を合成した。これらメチル基を導入した没食子酸の2つフェノール水酸基をNs基にて保護した後、カルボン酸へと変換した。テアフラビン類は紅茶特有の赤色成分であり、抗菌作用・抗酸化作用などの生物活性を有している。しかしテアフラビン類の精製は困難なため、これまでに詳細な活性研究はほとんどなされていない。そこで、今回我々はテアフラビン類の構造活性相関研究を目的とし、電子求引性かつ穏和な条件で脱保護可能なニトロベンゼンスルホニル(Ns)基をフェノール性水酸基の保護基として用いる方法により、大量合成を視野に入れたテアフラビン類の合成経路の確立を行った。また、様々な基質を用いて、テアフラビン誘導体の合成も行った。カテキンに対し、ホウ酸存在下NsClと反応させることでA環部フェノール性水酸基を選択的にNs保護した。次いで、四酢酸鉛で酸化してオルトキノンとした後、カテキンと同様にNs保護したエピガロカテキンとカップリングし、ベンゾトロポロン誘導体とした。最後にNs基の脱保護により、テアフラビンとそのエピマーであるネオテアフラビンの合成を達成し、これまでに100 mgづつ合成した。また、このベンゾトロポロン骨格構築法を応用し、カップリングパートナーを変更することで、種々の誘導体合成にも成功した。本結果より、テアフラビンを簡便かつ有効な量合成することが出来た上に、誘導体の合成において有効な手段あったことが証明された。続いて、タンパク質との結合部位を有するテアフラビンの合成を行うため、アミノペンチル基を有するカテキン誘導体の合成を行った。我々の研究室で既に達成されているエピガロカテキンガレート(エGCg)の誘導体であるAPDOEGCgの合成ルートに改良を加え、オルトキノン誘導体との酸化的カップリング前駆体であるカテキン誘導体を作製した。続く、カップリング反応は円滑に進行し、脱保護、精製を経て、アミノペンチル基を有するテアフラビン誘導体の合成を達成した。26年度では免疫原ハプテンの合成と実際の抗体作製を行った。25年度に達成していたAPDOEGCg(アミノペンチルデオキシエピガロカテキンガレート)を用いて、免疫源としてのキャリアタンパク質との結合を行った。すなわち、APDOEGCgに対しキャリアたんぱく質としてHSA(ヒト血清アルブミン)及びKLH(キーホールリンペットヘモシニアン)をグルタルアルデヒドを介して結合した。

その際に、多くの無保護のフェノール性水酸基が存在していても、反応生の高いアルキル差の末端アミノ基が有効にアルデヒドと円滑に反応し有効にたんぱく質との結合反応が進行した。そして、作成した免疫原を用いて共同研究者とともにラットを用いて抗体作成を行い、HSA結合体においてEGCg構造を認識する抗体の創出に成功した。一方、メチル化-APDOEGCgの合成法の開発を行った。APDOEGCgに対する直接的なメチル化は困難であったため、APDOEGCg合成法を利用してメチル化没食子酸誘導体の導入を検討した。すなわち、Julia-Kocienski反応によりA環、B環両ユニットを結合後A環へアミノペンチル側鎖を導入し、オレフィン部への不斉ジヒドロキシ化によって光学活性ジオール中間体を得た。続いて、メチル化没食子酸誘導体をジブチルチンオキシ度存在化縮合させることによりモノエステルの位置異性体混合物を得た。低温化での塩基処理による異性化の後、水酸基の酸化、酸性条件下還元的ピラン環構築を行いカテキン骨格を構築した。本手法により、対応する没食子酸を変更することで様々な位置のフェノール性水酸基にメチル基が導入されたEGCg誘導体が入手でき、種々の抗体作製が可能となる。天然物の全合成を基盤としたケミカルバイオロジー研究への展開本年度は、テアフラビン誘導体を多数合成するなど、多くの新規化合物の合成がなされた。これにより、テアフラビンの作用が、類縁体の生物活性試験により検討され、新たな機能発見につながると期待される。また、APDOTFの合成法を確立したため、今後更なる量的供給を達成し、抗体作成に利用できる十分量を確保できる。メチル化EGCGのプローブ分子作製のために、APDOEGCgの合成も進行し、目的の化合物が十分量得られた。更にAPDOEGCgは光学活性体として得られており、これ自身も免疫原として用いるべくキャリアタンパク質に結合させ、抗体作成が可能である。また、位置選択的にメチル基が導入されたAPDOMeEGCgを作製するために、メチル化没食子酸の選択的合成にも成功した。3位または4位のフェノール性水酸基にメチル基が導入されており、グラムスケールで合成できた。メチル化APDOEGCgの合成に必要なユニットをそろえることが出来た。天然にはガロイル基3または4位にメチル基の導入されたEGCg誘導体が発見されており、本実験結果はそれらの抗体作成を可能とするに有効であると期待される。本年度においては、テアフラビンの合成を達成するなど、非常に完成度の高い実験内容であった。合成したテアフラビン、ネオテアフラビンは共同研究者に配布し、様々な活性試験ついて検討中である。また、このような誘導体合成は前例がなく、同様に活性試験へと供出した。アミノペンチル基を有するEGCg誘導体の合成では、以前の製法を利用して簡便に調製が可能であった。また、カップリングの後の脱保護に置いてもNs基の有効性が示され非常に意義が高い。26年度では、メチル化APDOEGCgの合成を行うため、APDOEGCgのガロイル基の除去を検討する。即ち、没食子酸部位をアルカリ性条件下、または加水分解酵素(タンナーゼ)によりエステルを分解し、その後に、各種メチル化没食子酸と縮合することにより、目的のプローブ前駆体を得る。
参加観察法による幼児期後期の笑いの発達的研究

平成7年度から9年度の3年間、幼稚園の1クラスを対象に、参加観察法により幼児の笑いの記録を縦断的に採集し、遊び場面を中心に焦点を当てて考察した。その結果次のことがわかった。笑いの出現する遊びの記録を時間経過に沿って見て行くと、はっきりと子どもたちの園生活での成長が見て取れること。特に、保育者および子ども同士の人間関係面での発達および知的な発達についても一定追跡できることなどである。作成した観察記録を、笑いの内容に即して、(1)からだ・自然にかかわる笑い、(2)知的認識に関する笑い、(3)人間関係にかかわる笑いに大きく分類した。からだ・自然に関する笑いでは、水とふれる時の笑い・食べることに関連するもの・おんぶだっこなどの直接接触・性意識に関連したもの・運動時の笑いに分類し、それぞれを3歳児から5歳児までの変化を見た。知的認識に関する笑いは、遊びに関連した知的な発逢を示唆するものであった。ものがわかる・自分の思いを形にする・ごっこあそびの楽しさ・ストーリーを作る・予想や予測を楽しむ・ゲームを楽しむ・おかしさを楽しむなど、知的な発達が示唆されるものであった。この部分については、さらに構造的な考察が可能である。人間関係に関する笑いでは、対保育者・対子ども・対自分という3つに大きく分けた。園生活では、まず保育者に親しみ、保育者に支えられながら何とか遊びだし、そのなかで友だちの存在に気づいていくという段階を経る。さらに、遊びの中で、友だちと心が通う体験もし、知的な発達を背景に遊びがさらに豊かになっていく。そのうちに、友だちに対する否定的な笑いも出現し始める。また。自分を見つめる笑いでは、よい自分であることが、自分にも周囲にも認められたときに出る笑いと、反対に、よくない自分であることに自分で気づいたときに見せる笑いがあった。笑いは自己受容の表現であることを再確認した。さらに、事例研究として、笑顔の少ない2名の男児と1名の女児について記録を残した。また。平成7年度の研究日程は、3歳児の1年間の笑いの観察記録を収集することである。筆者は、この95年4月から96年3月までの期間に、山口大学付属幼稚園3歳児クラスにおいて、観察を行い約80ページの記録を作成した。観察総日数は28日である。さらに、同幼稚園3歳児クラス担任大森洋子先生より、保育記録の提供をお願いしたところ、200ページ弱の記録を提供いただいた。また次年度の参考のため、4歳児クラス、5歳児クラスの記録も提供も受けることができた。3月の最終観察を終えた段階でこれらの記録を整理・編集して、記録集を作成する予定である。記録の量がかなり膨大であるが、これらを整理分類し、笑いの様相をからだ、知的認識、人間関係、保育者の関わりの4点に絞ってまとめたいと思っている。この間、それぞれの時期の子どもたちの発達の状況について共通理解を持つために、附属幼稚園との記録の検討会を6回実施した。観察対象児の中でに観察者にとって気になった男児1名(表情がとらえにくく、したがってあまり笑わない)について、1学期の観察記録に基づいて、そのこの全体的な行動をどう理解するかを記録論の視点から分析した論文を執筆した(山口大学教育学部研究論叢第45巻第3部、1995)。この男児の笑いについての分析は、その後の試料を加えて改めて行う予定である。

平成8年度の研究日程は、4歳児の1年間の笑いの観察記録を収集すること、および、昨年度の3歳児の記録の整理である。前者については、96年4月から97年3月までの期間に、山口大学教育学部付属幼稚園4歳児クラスにおいて、参加観察を行い記録を作成した。観察総日数は29日である。昨年度、注目した男児1名についても継続した観察を行った。担任の実松瑞栄先生より、保育記録の提供をお願いしたところ、約30ページの記録を提供いただいた。この間、それぞれの時期の子どもたちの発達の状況について共通理解を持つために、附属幼稚園との記録の検討会を6回実施した。96年12月には、同様の研究方法をとっている鎌倉女子大入江礼子氏との、記録の読み合わせ・検討会を行った。また、昨年度の3歳児の観察記録の整理をおこなった。まず手書きの状態あるいは様々な形式で打ち込まれた資料を、形式を統一してパソコンに入力した。次にそれをデータベース化することを検討し、全体の記録の中から、特に笑いに関する記録を抜き出し、それをデータベースとして整理するという作業を行った。これらの記録に基づいて、代表的なものを83年抜枠し、50ページの観察記録集「3歳児の記録(抜枠)」を作成した(印刷中、3月下旬完成予定)。平成9年度の研究日程は、(1)5歳児の1年間の笑いの観察記録を収集すること、(2)前年度の4歳児記録を整理し、記録集を作成すること。(3)今年度の5歳児の記録を整理し、記録集を作成することである。(1)については、97年4月から98年3月まで、山口大学教育学部付属幼稚園5歳児クラスにおいて、参加観察を行い、記録を採取した。観察総日数は25日である。(2)については、昨年度に作成した記録の形式に応じて、96年度の観察者による記録及び詳細な記録を提供いただいた95年度の4歳児2クラスの担任保育者の記録を合わせて、記録集の作成を行った(別冊2)。(3)についても、(2)と同様に、97年度の観察者の記録及び95年度の担任保育者の記録を合わせて、記録集を作成した(別冊3)。なお、前年度の実績報告時に印刷中であった、3歳児の記録集(別冊1)も添付した。
二酸化炭素を酸化剤とする低級アルカンの酸化脱水素反応の触媒開発

本年度では、主に各種金属イオンを担持したMCM-41の合成とキャラクタリゼーションを行い、これらを触媒とするプロパンの酸化脱水素反応を実施した。高い酸化還元能を持つV,Fe,Crなどの酸化物と選択性制御に有効な塩基性酸化物との複合酸化物は、二酸化炭素による低級アルカンの酸化脱水素反応に高い触媒性能を示すと期待されている。しかし、これらの複合酸化物は、表面積が低いため、予想される触媒効果を示さなかった。プロパンからのプロピレン生成の選択性が高いものの、プロパン転化率は、600°Cでも5%以下であった。そこで、本研究では、反応活性を向上させる目的として、まず、V,FeとCrを高い比表面積を持つ担体上に分散させることにした。メソポーラスシリカであるMCM-41は、均一なメソ孔と高い比表面積を有しており、触媒担体として有望と思われる。本研究では、水熱合成法でMCM-41を合成した。また、MCM-41への金属イオンの担持方法には、テンプレートイオン交換法と直接水熱合成法をそれぞれ用いた。XRD,窒素吸着,UV-vis,ESRなどの手法により、合成した触媒中の金属イオンは、テンプレートイオン交換法では主にMCM-41の細孔表面に、一方直接水熱合成法では主にそれの骨格中に分散していることが明らかになった。プロパン酸化脱水素反応におけるMCM-41担持触媒の活性について調べた。Cr-MCM-41を用いた場合、プロパンの脱水素反応は500°C付近で進行し、二酸化炭素の共存による促進効果は明らかであった。酸素を用いた場合に比べ、二酸化炭素を酸化剤とすると、プロピレンの選択率が著しく高くなった。今後、この触媒上での反応の詳細を明らかにするとともに、他の触媒系についても反応を実施し、また、塩基性成分も同時にMCM-41に導入し、その効果について検討する。
コーパス言語学的手法に基づく会話音声の韻律特徴の体系化

本研究課題の目的は、コーパス言語学的手法に基づき、独話や朗読音声との比較を通し、会話音声の韻律体系を実証的に検証・確立することである。この目標に向け、今年度は、アノテーション体系の検討、日常会話データへのアノテーション、および、日常会話や独話を対象とする韻律の分析を実施した。また会話の韻律分析に関する講習会を行った。アノテーション体系の検討、および日常会話データへのアノテーションについては、日常会話7時間を対象に、韻律アノテーション基準・X-JToBI簡略版に準拠してラベリングを進めた。それに基づき、特にアクセント句のピッチレンジの拡張によるプロミネンスの新たな記述体系について検討した。研究については、日常会話における感情表出系感動詞の使用の実態を明らかにすることを目的とした検討を始めた。日本語日常会話コーパス19セッションに対し、感情表出系感動詞の出現頻度および割合を求め、セッションによって大きな違いがあることがわかった。これを踏まえ、出現頻度に関連する変数を同定するため、まず会話者の社会的関係に着目して統計的分析を行った。その結果、友人同士の会話では感情表出系感動詞の出現頻度が高いこと、家族間の会話では「う」から始まる感情表出系感動詞の出現頻度が低いことなどがわかった。また、韻律ラベリングに基づく研究を広めるため、社会言語科学会主催の講習会にて、日常会話を対象とする韻律ラベリングの方法と研究法に焦点をあてたコースを企画し講師をつとめた。韻律データの作成およびそれに基づく研究のいずれについても、ほぼ予定通り進んでいる。最終年度にあたる2019年度において、残り7時間のデータに対するラベリングを実施し、コーパス本体のリリースに合わせて公開できるよう準備を進める。また研究については、成果のとりまとめとして国際会議などでの発表を行い、論文の執筆を進める。本研究課題の目的は、コーパス言語学的手法に基づき、独話や朗読音声との比較を通し、くだけた発話を多く含む会話音声の韻律体系を実証的に検証・確立することである。この目標に向け、今年度は特に、日常会話のデータの準備とそれに向けたアノテーション体系の検討を行った。具体的には、会合を2回開催し、代表者が所属する国語研究所で構築を開始した『日本語日常会話コーパス』に収蔵するデータを対象に、特に音質や音の重複などの観点からどのような箇所に韻律ラベリングが付与できそうか、また、話者の属性や会話の種類などの観点から何を対象にラベリングすべきかを、実データに基づき具体的に検討した。また、独話を主対象とする『日本語話し言葉コーパス』に付与した韻律アノテーション体系X-JToBIの基準を見直した上で、アノテーターの育成も兼ね、『日本語話し言葉コーパス』に含まれる講演音声を対象に試行的にアノテーションを実施した。研究の側面としては、今年度は既存のコーパスを使った予備分析を進める計画で、『日本語話し言葉コーパス』を対象に、検討予定の現象のうち、句末音調・final folowing・言い淀みを取り上げ、各自、研究を進めた。また、既存の韻律付与体系X-JToBIで扱われていない韻律特徴の検討として、声質と呼気段落を取り上げる計画だったが、このうち呼気段落については、日常会話データの音質上の問題から、アノテーションがかなり難しいと結論付けた。声質については、その違いをとらえるためにいかなる音声パラメータに着目すべきかを検討することになっており、まずは『日本語話し言葉コーパス』を対象に発声様式の自動分類を試行して具体的に検討を加えた。平成29年度に実施する韻律ラベリングに向けた準備を順調に進めることができた。研究においては、予定通り、既存のデータを対象に予備研究を進めた。本研究課題の目的は、コーパス言語学的手法に基づき、独話や朗読音声との比較を通して、くだけた発話を多く含む会話音声の韻律体系を実証的に検証・確立することである。この目標に向け、今年度は特に、アノテーション体系の確立、日常会話のデータへのアノテーション、および予備的研究を推進した。アノテーション体系の確立、日常会話のデータへのアノテーションについては、日常会話のデータを10サンプル選定し、それに対し、現在の韻律アノテーション基準(X-JToBI簡略版,五十嵐2015)に準拠してラベリングを実施した上で、くだけた会話音声のために拡張すべき基準について具体的に検討した。それと並行して、アノテーター3名を訓練し韻律ラベリングの作業を進めた。また今後、談話構造と韻律との関係を分析するために、日常会話を対象とした話題転換構造のラベリング方法(転記テキストに基づく話題転換型の分類)を検討し、20サンプルに対しラベリングを実施した上で、それに基づく予備的分析を行った。研究としては、上述の話題転換構造に加え、次の二つを実施した。1)基本周波数の抽出が困難な自発音声の韻律のモデル化のため、声質の違いが瞬時周波数に基づく周期性検出器(Kawahara+ 2016)の時間-周波数表現に及ぼす影響の違いを検討した。2)場としての空間の大きさによる音声表現方法の違いを明らかにするために実験を行い、空間の大きさに適合する音声の韻律的特徴を定量的に明らかにした。予定通り、アノテーション体系の確立、日常会話のデータへのアノテーション、および予備的研究を進めている。研究については、現在アノテーションを進めている日常会話ではなく既存のデータを使ったものであるが、これも計画の通りである。

本研究課題の目的は、コーパス言語学的手法に基づき、独話や朗読音声との比較を通し、会話音声の韻律体系を実証的に検証・確立することである。この目標に向け、今年度は、アノテーション体系の検討、日常会話データへのアノテーション、および、日常会話や独話を対象とする韻律の分析を実施した。また会話の韻律分析に関する講習会を行った。アノテーション体系の検討、および日常会話データへのアノテーションについては、日常会話7時間を対象に、韻律アノテーション基準・X-JToBI簡略版に準拠してラベリングを進めた。それに基づき、特にアクセント句のピッチレンジの拡張によるプロミネンスの新たな記述体系について検討した。研究については、日常会話における感情表出系感動詞の使用の実態を明らかにすることを目的とした検討を始めた。日本語日常会話コーパス19セッションに対し、感情表出系感動詞の出現頻度および割合を求め、セッションによって大きな違いがあることがわかった。これを踏まえ、出現頻度に関連する変数を同定するため、まず会話者の社会的関係に着目して統計的分析を行った。その結果、友人同士の会話では感情表出系感動詞の出現頻度が高いこと、家族間の会話では「う」から始まる感情表出系感動詞の出現頻度が低いことなどがわかった。また、韻律ラベリングに基づく研究を広めるため、社会言語科学会主催の講習会にて、日常会話を対象とする韻律ラベリングの方法と研究法に焦点をあてたコースを企画し講師をつとめた。韻律データの作成およびそれに基づく研究のいずれについても、ほぼ予定通り進んでいる。平成29年度中旬から日常会話データに韻律ラベルを付与し、順次、研究に活用するために、年度前半までにマニュアルの整備や人材の教育、対象とするデータの選定を行う。今後は、これまで収録・アノテーションを進めてきた日常会話のデータを分析に加え、研究を発展させる。これまで扱った「日本語話し言葉コーパス」などとは異なり、日常会話のデータは録音状態が必ずしも良いものとは言えず、予定していた分析(例えば呼気段落の自動推定など)ができないこともあるが、こうしたデータの質も見極めながら研究を進めていく。最終年度にあたる2019年度において、残り7時間のデータに対するラベリングを実施し、コーパス本体のリリースに合わせて公開できるよう準備を進める。また研究については、成果のとりまとめとして国際会議などでの発表を行い、論文の執筆を進める。
がん患者の血栓症予防を目的としたMET-PAI1経路阻害による分子標的治療開発

がん患者の血栓症予防目的に卵巣癌を対象としてMET-PAI-1経路阻害の有効性を検討した。ELISA法による血中PAI-1測定では組織型別で有意差は認めなかった。PAI-1阻害剤TM5275の添加によりES-2の増殖能低下、およびG2/M arrestを認めsiRNAでも確認した。免疫組織化学染色法にて明細胞腺癌と漿液性腺癌でPAI-1発現量に有意差を認めた。さらに卵巣明細胞腺癌の遺伝子コピー数解析を行い、凝固系に関わる事が知られている遺伝子Xのコピー数がDVT発症例で高い傾向を認めた。本研究では血栓症を生じる事の多い卵巣明細胞腺癌に焦点を当てて、血栓症発症とMET-PAI-1経路の関連を臨床検体で調べる事を目的としている。さらにMET阻害剤およびPAI-1阻害剤を用いて、MET-PAI-1経路が卵巣がん治療の分子標的となり得るかどうかを検討する。本年度までの研究成果は以下の通りである。(1)東北大学病院婦人科では卵巣がんの診断で手術を受ける患者に対しては、全例でD-dimer測定を行い、さらにD-dimer高値例に対しては追加で下肢エコーを血栓症スクリーニングとして行っている。これらの臨床情報を蓄積して卵巣癌患者において組織型別に術前D-dimer測定値、血算・凝固能測定値、血栓症の有無などを詳細に解析している。今後はさらに関連施設でも同様の症例蓄積を検討している。(2)卵巣明細胞腺癌のc-MET過剰発現やコピー数異常を調べる目的で、7q31に存在するc-METの特異的プローブとコントロールである7番染色体のセントロメアを検出するプロー(SE7)によるFISHを計画している。しかし現時点ではまだ陽性コントロールでの染色が成功しておらず、条件検討およびプロトコールの見直しを行っている。(3)我々のグループでPAI-1が卵巣がんの新規治療標的になるかを検討した英語論文を発表した(Mashiko S. etal, Cancer Biology & Therapy, (2015))。その一連の実験で経口投与可能な低分子PAI-1阻害剤であるTM5275の添加により、卵巣明細胞腺癌細胞株ではG2/M arrestによるapoptosisが生じることを確認している。そこでマウスモデルでTM5275が卵巣がんの治療効果を持つかどうかを検討する実験を計画しており、現時点では使用する卵巣がん細胞株、マウス系統、TM5275の投与方法などを検討している。がん患者の血液は過凝固状態にあり血栓症が多く合併し、中でも卵巣明細胞腺癌では特異的に血栓症合併が多い事が知られているが、その詳細な分子メカニズムは不明である。我々は線溶系の主要な抑制因子であるPAI-1が卵巣明細胞腺癌で高発現する事を見出した。卵巣明細胞腺癌を対象として、最近発見されたMET-PAI-1経路に焦点を当ててがん患者における血栓症発症の分子メカニズムを明らかにする事を目的にした研究を行っている。現在は、東北大学病院婦人科で病理学的に明細胞腺癌との診断を受けた患者情報を集積し、術前D-dimer測定値、血算・凝固能測定値、血栓症の有無などを詳細に解析している。さらにc-METのリガンドであるHGF(肝細胞増殖因子)とPAI-1に関しては、市販されているELISAキットを用いて血中濃度を測定する予定であり、また卵巣がん症例での組織マイクロアレイ作成も進めている。明細胞腺癌と診断された症例についてPAI-1発現をIHC法にて、c-MET発現をFISH法とIHC法の両者で発現解析を行っている。in vitroでの実験として、当科で保持する卵巣明細胞腺癌細胞株8種類でc-METの発現量およびHGF刺激後のPAI-1発現量の変化を検討し、さらにin vivoではルシフェラーゼ発光を利用したマウスがん性腹膜炎モデルを用いて、低分子MET阻害剤、PAI-1阻害剤を投与した際のがん細胞増殖および血液凝固能の変化を調べ、治療的効果があるかを検討している。卵巣明細胞腺癌について症例の蓄積および詳細な臨床情報の集積はなされているが、患者血液からのHGFおよびPAI-1測定が遅れている。またin vivo実験でのPAI-1ノックアウトマウス作成に至っておらず、再現性のあるマウスモデル実験系が構築できていない。がん患者の血液は過凝固状態である事が知られている。がん患者の中でも卵巣癌では血栓症が多く合併し、特に卵巣明細胞腺癌では特異的に血栓症が多い事が知られているが、その詳細な分子メカニズムは不明である。我々は卵巣明細胞腺癌を対象として、MET-PAI-1経路に焦点を当ててがん患者における血栓症発症の分子メカニズムを明らかにする事を目的にした研究を行っている。昨年まではc-METのリガンドであるHGF(肝細胞増殖因子)とPAI-1の血中濃度を測定する予定であったが、技術的な困難より研究が進まなかったため卵巣明細胞腺がん組織から網羅的に遺伝子解析をすることで血栓症を誘発するメカニズムを探る方針とした。卵巣明細胞腺がんのFFPEの病理標本よりマイクロダイセクション法で腫瘍組織のみを摘出、この部位よりDNAを抽出して網羅的なエクソーム解析および遺伝子コピー数を行った。患者数は48名で、うち血栓症を認めたものは17例(35.4%)であった。

エクソーム解析および遺伝子コピー数が血栓症の有無で変化があったものとして遺伝子Xを抽出した。遺伝子Xはファミリーを形成する遺伝子群の一つであり、凝固-線溶系に関連する事が知られている分子である。我々は遺伝子Xのコピー数が増えている臨床検体では、実際に免疫組織化学染色でタンパク質レベルで遺伝子Xの発現が増加していることを確認した。この成果は、今までメカニズムが不明であった卵巣明細胞腺がんでの血栓症の治療に向けた基礎的な発見であると考えている。がん患者の血栓症予防目的に卵巣癌を対象としてMET-PAI-1経路阻害の有効性を検討した。ELISA法による血中PAI-1測定では組織型別で有意差は認めなかった。PAI-1阻害剤TM5275の添加によりES-2の増殖能低下、およびG2/M arrestを認めsiRNAでも確認した。免疫組織化学染色法にて明細胞腺癌と漿液性腺癌でPAI-1発現量に有意差を認めた。さらに卵巣明細胞腺癌の遺伝子コピー数解析を行い、凝固系に関わる事が知られている遺伝子Xのコピー数がDVT発症例で高い傾向を認めた。関連施設での多施設共同研究を予定しており、さらなる臨床検体の蓄積が期待できる事。FISH染色の実験は順調ではないが、PAI-1阻害剤を用いたin vitroの実験は順調に進んでおり、MET阻害剤での実験も今後行う予定である事。ストックされている患者血液からELIZAでのPAI-1およびHGFの測定を進める。また並行してin vitroおよびin vivo実験系の構築を精力的に進める予定である。婦人科腫瘍学条件検討を進めている臨床検体のFISHについては、経験が豊富な臨床病理部と協力する予定である。またin vitroの実験においては、PAI-1阻害剤に加えてc-MET阻害剤による機能阻害実験を追加する予定である。次年度使用額は今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額である。平成28年度請求額と合わせ、平成28年度の研究遂行に使用する予定である。平成27年度請求額と合わせ、平成27年度の研究遂行に使用する予定である。
Invitro発がんモデルを用いた口腔がん発生機構の解析

本研究では、口腔発がんにおけるヒトパピローマウイルス(HPV)の関与と可能性について検討した。まず、ヒト正常口腔粘膜ケラチノサイトを樹立し、HPV16E6/E7や変異型CDK4、cyclinD1およびTERTを遺伝子導入することで不死化することを確認した。その上でがん遺伝子であるHRASやEGFR、MYCとp53のノックアウトを組み合わせて遺伝子導入することで正常細胞ががん化することをinvitroで証明した。さらに実際の口腔発がんにHPVが関与しているかをがん組織よりDNAを抽出し、ジェノタイピングを行ったところ中咽頭がんでは約30%の関与が確認されたが、口腔がんでは21例すべてで確認されなかった。よって口腔発がんのHPV感染の頻度は低いもののHPVによる発がんの可能性は示唆された。ヒト正常舌角化細胞を用いたin vitro発がん系の確立口腔および中咽頭がん腫瘍組織におけるHPVの関与口腔および中咽頭側壁(扁桃原発)癌の病理組織診断のための組織採取を行う際に組織の-部を-80°Cで保存し、DNAを抽出、採取したDNAをmultiplex PCR(KURABO Industries)を用いて解析し、ハイリスクHPVの発現を検討した。その結果、中咽頭がんのでは従来の報告通りハイリスク型HPVの関与が確認されたが、口腔がんにおけるHPVの関与は認められず、口腔発がんにおけるHPVの関与は極めて低いと考えられた(投稿準備中)。ヒト正常舌角化細胞を用いたin vitro発がん系の確立と抗がん剤に対する感受性の相違ウイルスベクター遺伝子導入技術を用いてヒトパピローマウイルス(HPV)16型陽性およびHPV陰性口腔がんのin vitro発癌モデルの作成を行った。HPV陽性モデルでは正常舌ケラチノサイトにハイリスクタイプHPV16型のE6とE7遺伝子はがん化の最も初期のハードルである不死化に必須であり、H-rasおよびc-myc遺伝子の活性化でがん化することが分かった。HPV陰性系のがん化ではhTERt,cyclinD1,CDK4に加えてp53の不活化が必須であることが確認された。樹立された癌細胞はコロニー形成法、ヌードマウス造腫瘍能、raft cultureによる3次元培養法により、がんとしての性質を獲得したことを確認した(以下論文)。さらに現在、臨床的に確認されている抗がん剤感受性の差についてEGFRとc-mycの関与を解析中である。口腔および中咽頭がん腫瘍組織におけるHPVの関与口腔および中咽頭側壁(扁桃原発)癌の病理組織診断のための組織採取を行う際に組織の一部を-80°Cで保存し、DNAを抽出、採取したDNAをmultiplex PCR[〇!R](KURABO Industries)を用いて解析し、ハイリスクHPVの発現を検討した。ヒト正常舌角化細胞を用いたin vitro発がん系の確立ウイルスベクター遺伝子導入技術を用いてヒトパピローマウイルス(HPV)16型陽性およびHPV陰性口腔がんのin vitro発癌モデルの作成を行った。HPV陰性系のがん化ではhTERT, cyclinD1, CDK4に加えてp53の不活化が必須であることが確認された。遺伝子樹立された癌細胞はコロニー形成法、ヌードマウス造腫瘍能、raft cultureによる3次元培養法により、がんとしての性質を獲得したことを確認した。すなわち、HPV16E6E7もしくはそれと等価の遺伝子を導入し、pRb経路、p53経路の不活性化、テロメラーゼを活性化した細胞にHRAS変異またはEGFR活性に加え、MYCを過剰発現させると正常細胞が腫瘍細胞へと形質転換を起こすことが示された。口腔および中咽頭がん腫瘍組織におけるHPVの関与口腔および中咽頭側壁(扁桃原発)癌の病理組織診断のための組織採取を行う際に組織の一部をー80°Cで保存し、DNAを抽出、採取したDNAをmultiplex PCR ®(KURABO Industries)を用いて解析し、ハイリスクHPVの発現を検討した。その結果、中咽頭がんのでは約30%の腫瘍でHPV16型の関与が確認されたが、口腔がんにおけるHPVの関与は認められず、口腔発がんにおけるHPVの関与は極めて低いと考えられた(in press)。

すでにin vitroモデルの樹立については日本癌学会総会で発表した内容を以下に示す論文として発表済みで、さらに本モデルを用いた解析を来年度に論文にする予定である。また、HPVの関与を実際の腫瘍組織を用いて解析する研究については口腔原発がんで治療対象となり、且つ同意を得られた患者が予定数よりも少なかったため、今年度の発表になる。24年度が最終年度であるため、記入しない。現時点で予定していた研究は順調に進んでおり、当初の予定に変更はない。
トロンビン阻害物質サイクロテオナマイド類の全合成

サイクロテオナマイド類(A,B)はTheonella属の海綿の一種より得られ、セリンプロテアーゼ、中でもトロンビンの作用を強力に阻害する活性物質として単離された。構造は新規のアミノ酸二種を含む環状ペンタペプチドであることが明らかになっている。サイクロテオナマイドAのトロンビン阻害活性はIC_<50>0.076mg/mlと極めて強く,血栓予防薬としての可能性が期待されている。このように興味ある活性を有するサイクロテオナマイドの合成法を開発することを目的として研究を開始した。サイクロテオナマイドは通常のアミノ酸であるフェニルアラニン,プロリンの二種のほかに2,3-ジアミノプロピオン酸(Dpr),アルギニン由来と思われるα-ケト酸,チロシン由来のα,β-不飽和カルボン酸残基を含んでいる。まず初めに異常構成アミノ酸の効率的な合成法の開発から始めた。2,3-ジアミノプロピオン酸(Dpr)誘導体は文献既知の方法により合成した。チロシン由来のα,β-不飽和カルボン酸誘導体はα-アミノアルデヒドを経由する立体選択性の良い独自の方法を開発し,これにより合成した。アルギニン由来のα-ケト酸誘導体はアルギニンからC1ユニット増炭したβ-アミノ-α-ヒドロキシ酸誘導体として合成し,骨格合成の後α-ケト酸とすることにした。構成アミノ酸の合成が終わった後,サイクロテオナマイドBを選び骨格合成に移った。相当するジペプチドとトリペプチドをそれぞれ合成し,これらのフラグメント縮合により直鎖前駆体を得,保護基を除去した後燐酸誘導体を縮合剤として閉環し,環状体を好収率で得た。これはβ-アミノ-α-ヒドロキシ酸部分をデスマーチン試薬で酸化してα-ケト酸とするとサイクロテオナマイドBが得られた。文献値と比較し確認した。現在サイクロテオナマイドAの合成に取り組んでいる。サイクロテオナマイド類の骨格合成法を開発できたのち構造と阻害活性の相関研究に移る予定である。海洋生物から発見単離された生理活性ペプチド類の合成研究の一環として、強いトロンビン阻害活性を示す環状ペプチド、サイクロテオナマイド類の全合成を計画した。1、構成異常アミノ酸の合成1-1、E-ビニル-αのアミノ酸の新合成法の開発E-ビニル-α-アミノ酸類はこれ迄天然から得られた例はなく、このためその合成法はほとんど知られていない。我々はα-アミノ酸からα-アミノアルデヒド類を得る簡便な合成法を開発しているので、これの発展としてE-ビニル-α-アミノ酸類の合成を考えた。α-アミノアルコールをピリジン-三酸化イオウ錯体を用いるジメチルスルホキシド酸化に付しα-アミノアルデヒドとし、この反応溶液に相当するホスホランを加えることで、E-ビニル-α-アミノ酸類を立体選択的に合成することに成功した。1-2、α-ケト-β-アミノ酸類の合成法α-ケト-β-アミノ酸と合成的に等価なα-ヒドロキシ-β-アミノ酸の合成を行なった。また、相当するアミノ酸はアルギニンであるが、これと合成的に等価なオルニチンを出発物質として用いた。これからα-アミノアルデヒドを得、これにフランのリチオ体を付加させた。フラン基はカルボキシル基等価体であるので、これを四酸化ルテニウム酸化に付し、望みの誘導体を得た。2、環状ペプチド骨格の構築目的の環状ペプチドは5種のアミノ酸から成っている。

最終的な閉環反応の位置は、プロリンをC末端、上のオルニチンから誘導したアミノ酸をN末端とした。相当する鎖状前駆体を得、閉環反応を検討している。サイクロテオナマイド類(A,B)はTheonella属の海綿の一種より得られ、セリンプロテアーゼ、中でもトロンビンの作用を強力に阻害する活性物質として単離された。構造は新規のアミノ酸二種を含む環状ペンタペプチドであることが明らかになっている。サイクロテオナマイドAのトロンビン阻害活性はIC_<50>0.076mg/mlと極めて強く,血栓予防薬としての可能性が期待されている。このように興味ある活性を有するサイクロテオナマイドの合成法を開発することを目的として研究を開始した。サイクロテオナマイドは通常のアミノ酸であるフェニルアラニン,プロリンの二種のほかに2,3-ジアミンプロピオン酸(Dpr),アルギニン由来と思われるalpha-ケト酸,チロシン由来のalpha,beta-不飽和カルボン酸残基を含んでいる。まず初めに異常構成アミノ酸の効率的な合成法の開発から始めた。2,3-ジアミノプロピオン酸(Dpr)誘導体は文献既知の方法により合成した。チロシン由来のalpha,beta-不飽和カルボン酸誘導体はalpha-アミノアルデヒドを経由する立体選択性の良い独自の方法を開発し,これにより合成した。アルギニン由来のalpha-ケト酸誘導体はアルギニンからClユニット増炭したbeta-アミノ-alpha-ヒドロキシ酸誘導体として合成し,骨格合成の後alpha-ケト酸とすることにした。構成アミノ酸の合成が終わった後,サイクロテオナマイドBを選び骨格合成に移った。相当するジペプチドとトリペプチドをそれぞれ合成し,これらのフラグメント縮合により直鎖前駆体を得,保護基を除去した後燐酸誘導体を縮合剤として閉環し,環状体を好収率で得た。これはbeta-アミノ-alpha-ヒドロキシ酸部分をデスマーチン試薬で酸化してalpha-ケト酸とするサイクロテオナマイドBが得られた。文献値と比較し確認した。15EA04:現在サイクロテオナマイドAの合成に取り組んでいる。サイクロテオナマイド類の骨格合成法を開発できたのち構造と阻害活性の相関研究に移る予定である。