hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
カビ両親媒性蛋白質群を介した固体表面への分解酵素群濃縮の網羅的解析

セルロース及びケラチンを固体基質として、麹菌産生の固体吸着蛋白質を探索し、新奇界面活性蛋白質2種を見出した。それら2種を麹菌で発現・精製し固体粒子に結合させ、その粒子にリクルートされる酵素としてXylanase(XynF3)を見出した。相互作用解析では、それら二種はXynF3と弱く相互作用した。また既知の界面活性蛋白質RolAも両固体基質に結合したので、RolAと酵素の相互作用部位も解析した。陸圏における生物個体の表層は外界(空気)に接することから、ポリエステル・多糖・タンパク質・脂質などの複合固体マテリアルで疎水化しており、複数の酵素反応によりそれらの高分子複合マテリアルは分解されると考えられている。一方、我々は、糸状菌・担子菌に界面活性タンパク質hydrophobnが広範に分布し、それら界面活性タンパク質が、固相表面に吸着後、高分子分解酵素を固相表面にリクルートして分解を促進する新奇機構ことを明らかにしてきた。本研究では、これ迄に解析されてこなかった界面活性タンパク質群の天然における固体分解への寄与を理解するために、複数の天然固体高分子基質を調製して、麹菌を固体上に生育させて、生産される界面活性タンパク質群と固体分解酵素を、転写およびタンパク質のレベルで網羅的に解析する。本年度は、セルロースとしてアビセルを、硬タンパク質の代表として羽毛ケラチンからの精製ケラチンを固体基質として、麹菌を生育させて、菌体よりのmRNAの抽出およびび固体基質に吸着したタンパク質の抽出法の開発を行った。セルロースについては、mRNAの抽出も可能であり、セルロース固体表面からSDS抽出によるタンパク質回収に成功した。セルロース表面からの回収タンパク質にはセルラーゼ類の他に、機能未知の分子量2万以下の候補タンパク質が複数見出された。現在、高精度MASS解析を開始した。また、ケラチンについては、麹菌の培養とmRNAの抽出を行って解析中である。さらにhydrophobin Ro1Aとポリエステラーゼの相互作用については、両タンパク質上の相互作用に関係するアミノ酸残基の詳細解析が進んだ。本年度は、前年度に特定したセルロース結合タンパク質のうち分子量2万以下の4種について、その遺伝子の高発現株および破壊株の作成を行った。そのうち2種の高発現株からタンパク質の部分精製に成功し、セルロース結合能を確認した。さらにセルロース結合状態で、セルラーゼ類のリクルート能を解析している。一方、hydrophobin RolAもセルロース結合タンパク質として同定された。RolAについては、酵素相互作用部位の特定を行いRolA側のH32, K34が相互作用部位であることを同定した。陸圏の生物個体の表層は外界(空気)に接することから、ポリエステル・多糖・タンパク質・脂質などの複合固体素材で疎水化しており、それらの高分子複合素材は複数の酵素反応により分解される。一方、我々は、糸状菌・担子菌に界面活性蛋白質hydrophobinが広範に分布し、それら界面活性蛋白質が、固相表面に吸着後、高分子分解酵素を固相表面にリクルートして分解を促進する新奇機構を明らかにしてきた。本研究では、界面活性タンパク質群の天然における固体分解への寄与を理解するために、複数の天然固体高分子基質にi麹菌を生育させて、生産される界面活性蛋白質群と固体分解酵素を転写及び蛋白質のレベルで網羅的に解析する。本年度は前年度に引き続き、セルロースとしてアビセル、硬蛋白質として精製ケラチン、多糖として糸状菌β-1,3-グルカンとα-1,3-グルカンを固体基質として、麹菌を生育させて転写解析と吸着蛋白質の抽出解析を行った。その結果、セルロースについては機能未知の分子量2万以下の結合蛋白質2種(0334と0357)を見出し、それらを麹菌で発現して精製を行った。それら2種については、リクルート酵素として多糖結合ドメインを持たないXylanaseF3(XynF3)が候補となることが示唆され、精製蛋白質を用いた相互作用解析を行った結果、固体表面に結合した0334と0357はXynF3とが弱い相互作用することが明らかになった。一方、ケラチン及び糸状菌グルカン類については、これまでに疎水性固体に結合する蛋白質として同定されていたRolAやHsbAが主な結合蛋白質であることが示された。

RolA,HsbAが汎用性のある固体結合蛋白質であることが明らかになったので、RolAとエステラーゼの相互作用部位について詳細に解析し両者の相互作用が静電相互作用に依存することを明らかにした。
うつ病におけるグルココルチコイドと脳由来神経栄養因子との相互作用の分子メカニズム

培養大脳皮質ニューロンにおいて、うつ病と関連するグルココルチコイドの曝露後、BDNF(脳由来神経栄養因子)が増強するシナプス成熟が抑制されることが明らかになった。そのメカニズムとして、BDNFの受容体であるTrkBとshp2(ホスファターゼのひとつ)の結合力が弱まることが関与する可能性がある。また、うつ病のモデル動物の大脳皮質では、グルココルチコイド受容体(GR)の発現減少に起因するBDNF機能低下を見出した。うつ病においては、視床下部-下垂体-副腎皮質系の機能亢進に起因するグルココワレチコイドの血中濃度の上昇が脳機能に悪影響を与えているとされる。また、シナプス機能に重要なBDNF(脳由来神経栄養因子)機能障害もうつ病と密接に関係している可能性がある。本研究では、高濃度グルココルチコイド暴露後の中枢神経細胞において、BDNFが誘導する高親和性受容体TrkBを介した正の作用(生存維持、シナプス機能増強)と低親和性p75受容体を介した負の作用(細胞死、シナプス機能減弱)のバランス変化などに関する分子メカニズム解明を試みている。本年度は、BDNFによるシナプス形成の合成グルココルチコイド(DEX)による抑制効果のメカニズムの一端を明らかにし論文報告した。大脳皮質ニューロンでは、BDNFはmRNAの発現上昇を介してシナプス関連蛋白質の発現を上昇させていたが、これをDEXが抑制することを明らかにした。さらに、グルココルチコイドによるBDNF機能障害における受容体機能の関与を詳細に解析するため、TrkBおよびp75の細胞内移動を追跡するイメージングシステムを確立した。BDNFやTrkBは、神経細胞の軸索や樹状突起内を輸送され、これがシナプス構築/再構築に重要である可能性がある。一方、p75の細胞内挙動に関する知見は少ない。そこでGFP融合p75のコンストラクトを作成し培養ニューロンに発現させた。ここではp75のSNPに起因するSer205Leuの違いが、うつ病に関連している可能性があるため、Ser型p75およびLeu型p75を作成し、グルココルチコイドへの感受性の違いなどを解析中である。(協力研究者)独立行政法人国立精神・神経医療研究センター安達直樹、埼玉医科大学医学部生理学伊丹千晶うつ病発症のメカニズムひとつに、視床下部-下垂体-副腎皮質系の機能亢進に起因した、グルココルチコイド血中濃度の慢性的上昇が考えられる。このグルココルチコイドによる脳への悪影響が、病気と関係する可能性がある。さらに、BDNF(脳由来神経栄養因子)の発現や機能の異常が、うつ病発症に関与すると考えられる。本研究では、グルココルチコイドとBDNFとの相互作用に注目し、グルココルチコイド慢性曝露におけるBDNF機能低下を解析する。BDNFには、高親和性受容体TrkBを介した正の作用(生存、シナプス増強)と、低親和性p75受容体を介する負の作用(細胞死など)がある。本年度は、Cabergoline(ドパミン受容体アゴニスト)が、動物個体レベルでは抗うつ作用を示し、BDNF発現増加を含むBDNF/TrkBシグナルの増強作用を発揮することを見出した。CabergolineによってTrkBやp75のレベルは変化しない。精神疾患には、発達段階でのストレスが成熟後の脳機能に悪影響を及ぼし、発症リスクを高めるという発達障害仮説がある。そこで、子宮内発達障害モデルを使用し実験を行った。低体重出生の仔ラットからの大脳皮質ニューロンがTrkB発現を低下させており、細胞死誘導に対して脆弱であった。このモデルでは、BDNFとp75は正常であった。現在、p75に関する研究では、うつ病に関連するp75のSNP(Ser205Leu)に注目し、細胞内挙動においてミスセンス特異性がないか解析している。TrkBおよびp75は細胞表面に存在するため、p75の細胞内挙動を追跡することは、TrkBとの機能的な相互作用を調べる上で重要である。また、シナプス機能において重要であり、グルココルチコイドで抑制されることがわかったmicroRNA発現に対するBDNF/TrkBシグナルの特異性を追跡している。うつ病の発症において、内分泌的変化の結果であるグルココルチコイドの慢性的な血中濃度の増加、そして栄養因子であるBDNF(Brain-derived neurotrophic factor)の発現/機能の低下が密接に関与するとされる。我々は、グルココルチコイド(主としてdexamethasone,DEX)の曝露後のニューロンでは、BDNFが発揮するシナプス増強、および神経伝達物質放出の誘導が阻害される現象を見出しているが、今年度は、特にBDNFによるシナプス増強のメカニズムの一端を明らかにした。シナプス蛋白質の発現には細胞内シグナルのうちERK経路が重要であるが、DEXはこれを抑制した。その原因として、フォスファターゼのひとつであるSHP2とTrkB(BDNFの受容体)との結合能力の減弱が考えられることを論文発表した。BDNFによる神経伝達物質の放出もDEXで抑制されるが、basic fibroblast growth

factor(bFGF)はこれを回復させた(論文準備中)。bFGFによる回復の分子メカニズムを細胞内シグナルの活性化に注目し、引き続き解析中である。グルココルチコイドによるBDNF機能の障害は、BDNF、そして受容体であるTrkBおよび低親和性のp75分子の細胞内動態(移動)の変化によっても説明ができる可能性があり、解析中である。また、拘束動物を用いたうつ病モデルを作成し、脳内におけるうつ病関連分子の発現を測定した。長期間の拘束ストレスをうけたラットの大脳皮質において、BDNFやその受容体(TrkBやp75)、およびグルココルチコイド受容体の発現量を解析したところ、特にグルココルチコイド受容体の発現低下を見出した。さらに拘束モデルからの脳スライスにおいて、BDNFが調節するシナプス機能の低下を確認した(論文投稿中)。
古典期アテナイにおける復讐と刑罰

古典期アテナイにおける公的訴追の導入は、伝統的に前6世紀の法制定者ソロンに期せられてきた。検察にあたる公職者は存在せず、それゆえこのシステムの特徴は、任意の訴追者に告発を頼る点にある。しかしながら、任意の訴追者には、しばしば私的な動機のために公的な刑罰を濫用しようとしているのではないかとの疑いがかけられた。これは、アテナイ人の間に公私の2領域を峻別しようとする強い傾向があったことを示している。私的な復讐をさす言葉は「ティモーリア」であったが、この言葉は、公的な刑罰にも適用された。先行研究に反して、公的な訴追に適用される場合でも、この語は合理的で抽象的な、法的な刑罰へと完全に意味を転嫁させてはいないように思われる。主として、法廷弁論におけるこの語の用法について、とくにデモステネス『メディアス弾劾』を中心として分析することによって、以下の結論を得た。第1に、紀元前4世紀になってすら、公的な刑罰の根拠は、ソロンの時とかわらず、復讐という私的な感情がポリス共同体へと拡大したところに基礎づけられていた。第2に、「何人でも欲するもの」はその告発を正当化するに当たって2通りの方法を採ることができた。一つは、犯罪との個人的な関係を示すことであり、いま一つは、犯罪との公職上のかかわりを示すことであった。シュコファンテスとの批判を交わすためには後者のほうが安全であっただろう。第3に、デモステネスは共同体内部の被害者のための復讐としての公的訴追と、ポリスの政体にたいする犯罪とを区別している。古典期のアテナイにおける公私の峻別について論じる際には、このポリス共同体としての側面にも着目していくべきであろう。研究期間内に研究成果を整えたかたちで公刊することができなかったので、今後の課題としたい。私は、かねてより、フィリア(友愛)の概念を鍵にして、個人的な人間関係からポリス共同体へと拡がる、人間関係のネットワークについて、考察してきた。この度のプロジェクトでは、古典期のアテナイを舞台として、公私の関係性のなかにおけるフィリアのつらなりのあり方を、復讐=刑罰(ティモーリア)の概念から、より具体的に検討しようとしている。復讐がどのようなかたちで制度化され、ポリス運営のなかにとりこまれていったかということが問題となる。とりわけソロンによる民衆訴追制度の導入が重要である。アリストテレスらの伝えるところによれば、ソロンは「何人でも欲する者」に、被害に遭っている者のために「復讐」することを許したという(民衆訴追制度の導入)。ここに「復讐」と共同体性の明確な関連を見いだすことができる。今年度は、民衆訴追制度における「復讐」の主体が市民のうちどのような人々であったのかということを、法廷弁論と碑文資料を中心として考察した。特に、ギリシア碑文集を中心に、関連碑文の用例を検討することにより、「復讐」の主体として、制度上期待されているのが、「役職者」(評議員を含む)と「私人」の双方であることを明らかにした近年のギリシア法制・社会史研究のうえでは、「復讐」の担い手として一般市民は消極的な関与しか示さなかったということが前提とされているようにおもわれるが、いっぽうで市民たちは回り持ちで役職をになっていたのであって、役職者としての職務からの、復讐的刑罰への関与についても検討しなくてはならない。

あわせて、それぞれの市民の私的な紐帯や、友人のために復讐をはかることを求める互酬的価値観が、法廷という公共の場でどのようなかたちで表明され、したがって個人的な復讐の観念が、どのようなかたちで共同体性とむすびついているのか、ということも問題にした。本研究課題の「復讐と刑罰」について、本年度も「何人でも欲するもの」による訴追の制度に焦点を絞って考察を進めた。「何人でも欲するもの」による訴追制度に関しては、英独のあいだに、研究史上重要なずれが生じている。かたや「民衆訴追」の概念のもとに、かたや公私の対立のもとに、この訴追制度をとらえているためである。しかし、この訴訟制度の特質は、両者の接点のもとにある。何人でも欲するもの」による訴追は、民衆訴追ではあるものの、ローマ法や欧米各国法におけるような特殊限定的・補完的なものではない。個人的なことがらをこえたほとんどあらゆる「公的な」領域に適用されているのである。公的訴追が民衆訴追にゆだねられている点に、アテナイの民衆参加の性格がある。本年度は、アッティカ法制度にかんする19世紀以来の研究文献等についてオックスフォード古典学部図書館において調査をおこなうとともに、法廷弁論における「復讐」の用法について検討した。法廷弁論についてはまだ結論に達していないが、碑文の調査からは、「何人でも欲するもの」が法専門職による訴追のなかの例外でなかったために、この制度が役職者による職務遂行にも用いられいた可能性が高いことを示すことができた。このことは、アテナイ民主制下の民衆参加を考えるうえで、役職による参加に注目する必要があることを示唆している。これらの成果については奈良大学研究所報および京都大学西洋史読書会大会において発表した。本課題は、古典期アテナイ市民社会内部の人的紐帯のありかたを、「復讐」の語を出発点として考察しようとするものである。そもそも復讐は、友愛の絆を深めるとともに、市民共同体内部の紛争ももたらす要因であった。それゆえポリス共同体の秩序維持のためには、無制限の復讐は抑制される必要があった。その制御装置のひとつが民衆法廷での公論であり、無制限の復讐にとってかわったのが民衆法廷での刑罰であった。6月ロンドンで復讐をテーマとする学会が開催されたことは関心の高まりを示している。たとえばガガーリン報告は、アンティフォンの弁論におけるティモーリア(復讐)の語の用例に、私的感情を離れ抽象化・合理化された刑罰の成立を見出した。それに対して、報告者はより共時的関心から、法廷による刑罰それ自体のなかに、陪審員らによる復讐感情が前提とされていることに着目した。民衆法廷が感情的な場であることが近年強調されているが、陪審員が復讐感情を共有することが、刑罰を正当化することにつながっているのである。今年度は、デモステネスの『メイディアス弾劾』についてのケース・スタディをまとめる作業を継続するとともに、全法廷弁論における刑罰の語の用例を網羅的に検討した。その結果、たとえばガガーリンが刑罰の合理化をしめすものとして取り上げたティモーリアの語が、後期弁論にいたるまで報復の原義と切り離し難いことを確認した。これらは市民たちが私的感情をも含めた公私の紐帯のなかで、ポリスの訴訟制度をどのように運用していたのか、ということを、彼らなりの合理性のもとに説明しようとする作業である。最後に、訴訟制度、とくに共同体全体の復讐に該当する公的訴追制度の成立史の再検討にも着手した。なぜならば公訴制度の成立史自体、刑罰の成立という19世紀的枠組を踏襲しており、復讐と刑罰の関係を問うことは、その大幅な再検討につながるからである。
新たなる人工調製肺サーファクタントのインテリジェント・ナノ医薬としての基礎検討

新規完全人工調製型肺サーファクタント(LS)のLS機能・機序に関して新たな知見が得られた。ホスファチジルグリセロール成分(陰イオン)とモデルペプチド(陽イオン)が静電的相互作用により膜表面積の減少に伴う2次構造変化(α-へリックスからβ-シート構造)に耐性を示した。また部分フッ素化両親媒性物質(特にF8H11OH)の添加によりHel13-5(人工ペプチド)成分の少量化が期待出来、更に人工調製型肺サーファクタントの物理化学的性質を大幅に増強する事が出来、臨床応用が期待出来る。安価で,安全を目指す人工調製サーファクタント(PS)の試みは下記の組成で行った。長鎖アルコール、卵黄レシチン(egg PC)、大豆PCと主成分のより長鎖脂肪酸或はタンパク-脂質混合系或はそれらの組み合わせである。両親媒性表面表在型、膜貫通型、また両方の性質を持つ3種のタンパクが設計し合成した。PSの性能はin vitroではWilhelmy表面張力計による表面張力/面積曲線のヒステリシス曲線測定で、in vivoではPS欠損ラットモデルに対する肺コンプライアンスの回復率で評価した.タンパクを含まないオクタノール或は大豆レシチンからなるタンパク/脂質混合系は、臨床で用いられているSurfacten[○!×]と比較して望ましいヒステリシス曲線測定を示したが,卓越したものでは無かった.設計したタンパクを添加したアルキルアルコール或は大豆レシチンの脂質混合組成のタンパク/脂質混合系はSurfacten[○!×]のヒステリシス曲線と同様な理想的な挙動をとり、両親媒性Hel 13-5タンパク/脂質混合系は脂質混合系に比べてより効果があった。特に水添大豆レシチン/分画大豆レシチンPC-70/パルミチン酸/Hel 13-5タンパク(40: 40: 17.5: 2.5, w/w)はSurfacten[○!×]に匹敵するものであった。この研究における人工肺サーファクタントの組成は低価格で調製されており、豚インフルエンザ(H1N1), SRAS,炎症性肺疾病、喘息等に引き起こされる呼吸困難ばかりで無く呼吸窮迫症候群や突発性呼吸窮迫症候群の治療に非常に有効と期待される。他に多角入射分解分光法による測定結果の一部により完全合成型タンパクの気/液界面における構造が明らかになりつつある.完全人工型LSの作用機序解明の一環として、人工LSの圧縮・拡張過程における両親媒性人工ペプチドの二次構造及び配向変化を偏光変調高感度反射赤外分光法(PM-IRRAS)により、in situ測定(気/液界面)にて精査した。方法としては合成ベプチド(Hel 13-5 : H-KLLKLLLKLWLKLLKLLL-OH)と生体リン脂質(DPPC,DPPG)から種々の多成分単分子膜を気/水界面上に展開した。これら単分子膜を連続的に圧縮・拡脹し、表面圧及び表面電位測定、さらに赤外スペクトル測淀[偏光全反射赤外法(Polarized ATR-FTIR)及び偏光変調高感度反射赤外分光法(PM-IRRAS)]を行った。その結果、膜表在型LSタンパク質SP-Bの模倣ペプチドHel 13-5は肺胞表面の圧縮・拡張の際に、表面-Bulk間を移動することで肺運動の恒常性を保持している。Hel 13-5は溶液中(bulk)において主にα-ヘリツクス構造をとることが明らかとなっているが、気/液界面における二次構造は確認されていない。気/液界面の直接測定が可能なPM-IRRAS手法によりHel 13-5の二次構造は膜の圧縮に伴って形態変化を起こすことが明らかとなった。そこで種々のLS調製物を作製し、これら調製物中におけるHel 13-5の形態・コンフオメーション変化を表面圧の関数として測定した。これらの結果よりアニオン脂質/タンパク質間の静電的相互作用が、呼吸に伴うLS膜分子の移動に関して重要な要因であることが明確となった。偏光変調高感度反射赤外分光法(PM-IRRAS)による測定結果は完全合成型タンパクの気/液界面における構造が明らかになりつつある.この研究における人工肺サーファクタントは、豚インフルエンザ(H1N1),SRAS,炎症性肺疾病、喘息等に引き起こされる呼吸困難ばかりで無く呼吸窮迫症候群や突発性呼吸窮迫症候群の治療に非常に有効と期待される。呼吸窮迫症候群(RDS)は、肺サーファクタント(LS)の欠如や機能不全が原因で発症する疾病である。本研究では、新規人工LSの基盤・開発研究の一環として、アニオン性リン脂質であるDPPGとカチオン性モデルペプチド(Hel 13-5)との特異的相互作用を偏光全反射赤外法(ATR法)及び偏光変調高感度反射赤外分光法(PM-IRRAS法)を用いて体系的に精査した。

両スペクトル解析によりHel 13-5の2次構造は、不可逆的にα-ヘリックスからβ-シートに変化することが分かった。この不可逆的構造変化はDPPGの存在下では抑制されることから、DPPGとHel 13-5間の静電的相互作用がその抑制効果の原因だということを初めて突き止めた。本研究により、肺呼吸におけるLSの静電的相互作用の重要性が明確となった。また薬効増強を目的として完全人工型肺サーファクタント調製物にフッ素化合物の導入を試みた。これらの表面物性はLangmuir膜測定、表面電位、蛍光顕微鏡(FM)及び原子間顕微鏡(AFM)観察を行なった。肺サーファクタントは,呼吸に伴う肺胞内表面積の圧縮・拡張において、剛直且つ流動的な性質を示す。部分フッ素化合物は疎水性及び疎油性を同時に持ち合わせ、更に温度に対して安定性が高いと言うユニークな性質を保持する。部分フッ素化合物(F8C5OH,F8H11OH)を肺胞モデル膜に添加し、その表面物性及び表面形態を系統的に精査した。これらの結果から、部分フッ素化両親媒性物質(特にF8H11OH)の添加によりHel 13-5(人工ペプチド)の少量化が期待出来、更に人工調製型肺サーファクタントの物理化学的性質を大幅に増強する事が出来、臨床応用が期待出来る。これらの結果より呼吸窮迫症候群や突発性呼吸窮迫症候群の治療ばかりで無く、豚インフルエンザ(H1N1),SRAS,炎症性肺疾病、喘息等に引き起こされる呼吸困難に非常に有効と期待される。
科学的調査に基づく半跏思惟像の日韓共同研究

国内の彫刻史、金工史、考古学、保存科学の研究者との連携、協力に加え、韓国国立博物館の研究グループとの共同研究という研究体制のもと、日本、韓国、中国、ベトナム、欧米等において、半跏思惟像および関連の金銅仏について、蛍光X線分析100余件、3次元計測11件、X線透過撮影7件の調査を実施した。その結果、青銅の成分については、日本製の金銅仏は止利派の作例を除けば多くは自然銅に僅かに錫を混ぜた青銅を用いており、南朝作例では錫分が特に多く、百済製とみられる作例でも錫分が多い傾向をしめすこと、華北の作例では錫と鉛が同程度に含まれるとの暫定的な見解を得ることができた。また、技法面では、従来、鬆(青銅の凝固時に内部に残る気泡)が多いのは韓半島もしくは中国製とみられていたが、鬆の多寡は必ずしも製作地に関わらないこと、韓半島や中国の作例では細部の造形も基本的には鋳型の段階で表現しているのに対して、日本の作例では鏨の使用が多いことなどが明らかになった。一方、2009年に南京において初めて南朝・梁代の金銅仏が出土し、2010年にはカンボジア南部で2006年に出土した梁代とみられる金銅仏が紹介されたが、その一部は山東や韓半島出土ないし伝来の金銅仏に近似しており、従来、文献から指摘されていた南朝と百済との交流、さらには山東を含む3地域間の交流が実作例によって裏付けられた。以上の科学的調査、南朝製金銅仏の発見等の結果、日本や韓国に伝来する金銅仏については製作地を再検討する必要があること、半跏思惟像についても南朝を含めた伝播のあり方を検討する必要があることが明らかとなった。本研究は、金銅製の半跏思惟像およびその関連作品について、X線透視撮影、内視鏡およびマイクロスコープによる撮影、蛍光X線分析、3次元計測といった光学的調査に基づいて各々の制作地の比定を試み、新たな研究基盤を築くことを目指す日韓共同研究である。本年度は、本研究の開始にあたり、まず韓国国立中央博物館を主体とした韓国側の研究プロジェクトチームと共同研究の協約を結んだ。その後、研究実施計画に従い、連携研究者、研究協力者および韓国側の共同研究メンバーとともに、中国山東省・河北省の半跏思惟像および関連の作品、遺跡の調査を行い、新潟・関山神社菩薩立像、長野・観松院半跏思惟像、山形・大日坊如来立像、長崎・浄林寺半跏思惟像、同・黒瀬観音堂如来坐像、さらに兵庫・慶雲寺半跏思惟像、和歌山・那智出土半跏思惟像ほか(東京国立博物館蔵)の光学的調査を実施した。これらの光学的調査の成果はすでにデータの取りまとめを進めており、来年度当初に報告書を発行する予定である。また、今後に向けて3次元計測やX線透視撮影によるデータの有効な公表の仕方について検討を加えるとともに、平成23年度に実施予定の中国調査のための打合せを現地において行った。本研究は、金銅製の半跏思惟像およびその関連作品について、蛍光X線分析、X線透視撮影、内視鏡およびマイクロスコープによる撮影、3次元計測といった光学的調査に基づいて各々の制作地の比定を試み、新たな研究基盤を築くことを目指す日韓共同研究である。本年度(平成22年度および平成23年度繰越分を含む)は、韓国においては国立中央博物館、同慶州博物館、同大邸博物館、中国においては上海博物館、浙江省博物館、蕭山博物館、ベトナムにおいてはホーチミン歴史博物館、アンザン省博物館、また日本国内においては東京国立博物館、東京芸術大学、香川・六萬寺において半跏思惟像を含む金銅仏の調査を行った。

なかでも国立中央博物館において国宝83号の調査が実施できたことは特筆される。これらの調査の過程で、これまで金銅仏の鋳造時に生じる鬆は中国および韓半島の作例に多く、鬆の有無が日本製か否かを判別する有力な根拠とされてきたが、そうではないことが判明した。また、調査を通じて、これまでは金銅仏の細部の細工について、基本的に豊による仕上げとみられてきたが、特に中国、韓半島の作例では、型の段階、すなわち鋳造によるものが多いことが確かめられた。このように、金銅仏の技法については、抜本的に見直していく必要があることを痛感した。なお、これらの調査結果:の一部については、中間報告書を作成して公表し、あわせて今後の調査への参考、最終的な報告への準備作業とした。本研究は、金銅製の半跏思惟像およびその関連作品について、蛍光X線分析、X線透視撮影、内視鏡およびマイクロスコープによる撮影、3次元計測といった光学的調査に基づいて各々の制作地の比定を試み、新たな研究基盤を築くことを目指す日韓共同研究である。本年度は、日本では東京国立博物館、東京芸術大学、奈良国立博物館、奈良・神野寺、和歌山・極楽寺、韓国では国立中央博物館、同大邸博物館において金銅仏の科学的調査を実施した。なかでも、法隆寺献納宝物の半跏思惟像10体、韓国国宝78号半跏思惟像についての調査が実現したことを特筆しておく。このほか、関連作品の調査として、中国では南京市博物館において2009年に出土した南朝・梁代金銅仏を実見、近年整理が行われた南京郊外の棲霞寺千仏岩を踏査し、韓国では大邱郊外の邑内洞摩崖造像を踏査した。この間の調査においては、飛鳥時代の金銅仏の鋳造においては、7世紀以前の日本の銅器と同じく、僅かに錫を含むものの、ほぼ純銅に近い青銅が用いられていることが確認された。また、平成23年11月13日には、本研究の中間報告を兼ねて国際シンポジウム「半跏思惟像はどこで作られたか?」を開催し、閔丙贊・朴鶴洙氏は金銅仏の蛍光X線分析の方法と分析結果についての報告、加島勝氏は東アジアの金属工芸の素材に関する報告、藤岡は兵庫・慶雲寺および京都・妙傳寺の半跏思惟像について報告をし、その後、稲本泰生氏の司会によりパネル・ディスカッションを行った。参加者は60名ほどであった。本研究は、金銅製の半跏思惟像およびその関連作品について、蛍光X線分析(XRF)、X線透視撮影、内視鏡およびマイクロスコープによる撮影、3次元計測といった光学的調査に基づいて各々の制作地の比定を試み、新たな研究基盤を築くことを目指す日韓共同研究である。本年度は、以下の通り調査を実施した。アメリカ調査では、ハーヴァード大学サックラー美術館で7件、ボストン美術館で2件、メトロポリタン美術館で8件、フリア・ギャラリーで14件の金銅仏についてXRFを含む調査を実施し、その他、関連作品について写真撮影等の調査を実施した。韓国調査では、国立扶余博物館で金銅仏3件と石仏2件、国立全州博物館で金銅仏4件の調査を実施し、その他、国立公州博物館、国立清州博物館、扶余文化財研究所、弥勒寺遺址、蓮洞里石仏において写真撮影等の簡易な調査を実施した。関西調査では、京都国立博物館で2件、大和文華館で4件、野中寺で1件、大聖勝軍寺で1件、泉屋博古館で4件の金銅仏調査を実施した。その他、中国四川省等において関連作品の調査を実施した。一方、研究成果については、ハーヴァード大学ライシャワー・センター国際シンポジウム「日本仏教研究の領域複合的解明の試みー宗派性の超克ー」、大阪大学総合学術博物館企画シンポジウム「日本の大仏はなぜ“若々しいか"ー美術史、化学、修復から見た金銅仏の祭神研究ー」、奈良教育大学開催「百済文化国際シンポジウム」、さらに大阪大学文学研究科共同研究「日本史・美術史・考古学の領域横断的研究」講演会において口頭発表を行った。
12世紀論理学に関する未利写本の校訂・研究

本補助金による研究目標は、昭和5960年度補助金が交付された研究による次の四つの成果を整理・発表することであった。すなわち、(【i】)12世紀以前に書かれた現存するすべてのポルフュリオス関係文献の校訂本文公表。(【ii】)その副産物としての論文「アバエラルドゥス以前の普遍論争」の完成(現在、第一部のみ発表済み)。(【iii】)末刊instantia文献五部(交付申請書には四部としたが、その後新たに一部を発見した)の校訂本文公表。(【iv】)"Argumentation"誌(Reidel社刊)の特集号"Largumentation au moyen【a!^】ge"から要請のあった、instantia文献に関する序説的論文の執、以上の四成果である。その内、(【i】)が最も大部かつ主要な研究目標であり、また昭和61年度研究成果刊行費の補助を受けて刊行される予定であった。しかるに、刊行準備作業は61年末に再校段階にまで進みながら、その時点である新事実が発見され、その新しい観点から全校訂本文を再検討する必要が生じた。そしてその再検討にたる時間的余裕のないことから、刊行費辞退のやむなきに至った。現報告時点で再検討そのものはほぼ終えているが、この成果の公表は新たに出版のめどがつくまで延期せざろうえない。(【ii】)については、(【i】)および後述(【iii】)(【iv】)に手間どり、構想のみほぼまとめえた段階で、執筆には至りえなかった。(【iii】)については、61年夏の海外研修の際に、マイクロ・フィルムの難読箇所を原写本にあたって解読した結果、公表予定の内の二部がそれぞれある重要な学派の手になるものであることが判明した。当初の予定では全instantia文献を一論文としてまとめるつもりであったが、上記二部については当該学派の他の文献とともにまとめる方が望ましくも思われる(これらの学派については、本補助金による研究と並行して研究を進めている)。いずれにせよ、校訂作業そのものは一通り終えているので、最も適切な発表形式を決定次第、発表する予定である。(【iv】)に関しては、既に完成し、原稿をeditorsに送付済みである。
“細胞接着”基材表面物性のin situ光制御による幹細胞分化の動的局所変換

間葉系幹細胞(MSC)が接着した基板の表面特性を動的に変化させ、細胞分化系統を動的に転換する光架橋性高分子ブラシ表面(sPDMIM)の開発を行った。sPDMIMは、メタクリル酸メチルと光架橋性ジメチルマレイミドモノマーとの共重合によって作製した。MSCは、sPDMIM上でOCN遺伝子発現量が減少したが、光架橋sPDMIM(cl-sPDMIM)上では増加した。細胞培養中に光架橋した場合、OCNの減少が抑制されるが、cl-sPDMIM上のMSCsとも異なった。これらの結果は、動的に表面構造を変更した基板上のhbmMSCが、表面特性が固定された基板とは異なる分化系統に誘導される可能性を示している。細胞培養基材表面の物理化学的特性や機械特性による間葉系幹細胞の分化誘起を試みる研究が現在盛んに行われているが、これらは静的に固定された性状および形状の基材が多く、生体内のような動的に変化する細胞周囲の環境とは異なる。そこで、本研究では、細胞を接着させたまま培養基材の表面特性を、動的変化させる光架橋性高分子ブラシ表面の構築を行う。運動性や柔軟性のある高分子ブラシ表面から、光照射による三次元的な化学架橋によって運動性が束縛された高分子ゲル表面へ誘導する。これにより、表面のヤング率や水に対する濡れ性を動的変化させ、それに伴うヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC)の形態および機能、分化誘起の制御を試みる。表面開始リビングラジカル重合によって光架橋性高分子ブラシ表面を作製するために、連鎖移動剤を表面固定したシラン剤修飾ガラス基板を用いて、光架橋性のあるマレイミドモノマーおよび疎水性モノマー(主にメタクリル酸メチル)の共重合を行った。作製した光架橋性高分子ブラシ表面について、全反射フーリエ変換型赤外分光法およびX線光電子分光法を用いて表面組成の評価を行い、表面に共重合体が修飾されていることを確認した。また、水に対する静的接触を測定した結果、光架橋性高分子ブラシ表面は約75度であったが、光照射前後おける接触角に大きな差異を確認することはできなかった。これは、今回作製した表面が、高分子薄膜であったためと考える。しかし、紫外線照射前後における光架橋性基板表面上のhMSCを観察した結果、その形態が異なることが明らかになった。紫外線照射していない基板上のhMSCは、ランダムな方向に伸展したが、紫外線照射した基板上のhMSCは一方向に細長く伸展する傾向を示した。この結果は、紫外線照射によって誘起された表面構造の変化が、細胞挙動に大きな影響を与えていることを示唆している。近年、in vitro系において細胞培養基材を様々な硬さや形状に加工することで、幹細胞の分化を制御する研究が活発に行われている。しかし、ほとんどの細胞培養基材において表面特性は静的に固定されており、動的に変化する生体内の細胞周囲微小環境とは異なる。そこで本研究では、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(MSCs)を対象として、細胞を接着させた状態で光刺激により表面特性を動的に変化させる機能性細胞培養基板の開発を目的とした。今回、ジメチルマレイミド誘導体の光二量化反応に着目し、高分子鎖の分子運動性および構造を光転換する光架橋性高分子ブラシ表面の作製を行った。具体的には、可逆的付加開裂連鎖移動(RAFT)剤を表面修飾したガラス基板上でジメチルマレイミドモノマーとメタクリル酸メチルを共重合し、高分子ブラシ表面(PDMIM)表面)を作製した。ATR/FT-IR測定およびXPS分析により基板表面にPDMIMが導入できたことを確認した。このPDMIM表面上でMSCsは細く伸長する一方、光架橋したPDMIM (cl-PDMIM)表面上ではランダム方向に伸展した形態を示し、osteocalcinのmRNA発現量は、PDMIM表面の1.8倍であった。さらに、MSCsを4日間培養した後に細胞存在下で光架橋処理を施し、続けて3日間の培養を行った結果、osteocalcinの遺伝子発現量は、PDMIM表面の1.4倍に増加した。つまり、細胞培養中に、表面の構造をブラシ構造からゲル様構造に光転換することで、MSCsをゲル様構造に依存した分化系統に誘導できることが示唆された。これらの結果より、PDMIM表面は、光照射領域におけるMSCsの分化系統を動的光転換できる新規機能性細胞培養基材として期待できる。26年度が最終年度であるため、記入しない。バイオマテリアル26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究における最も重要な基盤技術である光架橋性高分子ブラシ表面の作製に着手し、細胞挙動を変化させ得る基板の開発に成功した。モノマーの有機合成やポリマーの精密重合をはじめとし、幹細胞の培養など一連の実験が遂行できた。

光の照射時間検討により光架橋高分子ブラシ表面の硬さや高分子鎖運動性等の表面物性を変化させ、hMSCの分化挙動について評価する。また、局所的な光照射による表面パターン化によって、部分的な領域内における細胞分化の制御を目指す。
大腸菌を中心とした腸内細菌のコリバクチン産生機構の解明

細菌や真菌が保有するポリケタイド合成酵素(PKS)-非リボソームペプチド合成酵素(NRPS)融合タンパク質により産生される二次代謝化合物は生理活性物質の割合が高く、生化学や農業などにおいて重要な天然物を生合成する。コリバクチンは、PKS-NRPS経路をコードする約55kbpの遺伝子クラスターを保有する一部の腸内細菌科の細菌群によって産生され、宿主DNAの二本鎖切断や細胞分裂時に染色体分配異常を引き起こすことから遺伝毒性物質として作用し、大腸発がんに関与すると考えられている。海外における報告を含め、これまでにヒト糞便などから分離された腸内細菌由来のコリバクチン生合成遺伝子群陽性菌のほぼ全てが、系統発生群B2に属する大腸菌である。本研究では、前年度までに外科的に切除した日本人大腸がん患者57名(男性36名、女性21名、年齢:中央値71.0歳)の病理診断の余剰大腸組織から系統発生群B2のコリバクチン生合成遺伝子群陽性菌株を分離・同定した。引き続き本年度は、これらの菌株におけるコリバクチン産生能力の解析を試みた。コリバクチン本体は未だにその構造や動態が明らかとなっていないが、ペリプラズムに移行したプレコリバクチンはclbPによりコリバクチンとN-ミリスチルアスパラギン酸(N-myr-Asn)に分解されることから、コリバクチン生合成遺伝子群陽性菌株のN-myr-Asn産生量を測定した。その結果、腫瘍組織とその周囲の正常組織由来の分離株のN-myr-Asn産生量に有意な差は見られなかったが、腫瘍組織分離株は産生量が多い群と少ない群に明確に区分された。本研究は腸内細菌の潜在的な病原性の解析を最終目的としている。前年度までに大腸がん患者の大腸組織由来のコリバクチン生合成遺伝子群陽性菌を多数収集することができた。そこで本年度は、これらの大腸菌のコリバクチン産生能力の解析を重点的に行った。現在のところ、コリバクチン自体を直接観察・検出することが不可能である。コリバクチン生合成経路の最終段階で、菌のペリプラズムまで輸送されたプレコリバクチンは、PKS-NRPS遺伝子クラスターの構成因子の一つであるclbPにより、1分子ずつのコリバクチンとN-myr-Asnに分解される。そこで、N-myr-Asnの産生量を測定することで、間接的にコリバクチン産生量を解析することとした。菌分離・同定時に大腸サンプル一つにつき最大50株までを採取したため、同一の起源を持つ株を選択してしまった可能性が非常に大きかったが、N-myr-Asnの産生量は菌の分離源が同じであっても、株間においてばらつきが見られた。特に、N-myr-Asnの産生量の多い株が腫瘍組織に多く集積していることから、コリバクチン以外の何らかの菌の因子が腫瘍組織への定着に関与していることが予想された。本年度に実施した、大腸がん患者組織由来のコリバクチン生合成遺伝子群陽性菌株のN-myr-Asnの産生量の結果から、腫瘍組織にコリバクチン産生量の多い株が定着していることが判った。この結果は、腫瘍組織近傍の正常組織由来のコリバクチン生合成遺伝子群陽性菌株とは明確に異なる特徴を示していることから、間接的にではあるが、コリバクチン生合成遺伝子群陽性菌株と大腸発がんとの深い関係性が示唆された。次年度以降は理化学研究所バイオリソースセンターに登録されているコリバクチン生合成遺伝子群陽性大腸菌も含めて解析し、大腸がん患者組織で見られたコリバクチン産生菌の腫瘍組織における優占化のメカニズムの解明に焦点をあてる。また、本年度実行できなかった健康な日本人の腸内細菌におけるコリバクチン産生菌の実態を明らかにし、これまでの大腸がん患者の結果との比較を行うことを予定している。さらに、N-myr-Asnの産生量とコリバクチン生合成遺伝子群の発現を株間で比較することで、より詳細なコリバクチン産生シグナルを解明する。一部の腸内細菌科の細菌群が産生する低分子化合物コリバクチンは、その生合成に計19遺伝子から構成される全長約55 kbの遺伝子クラスターが関与する。コリバクチン産生菌が感染した動物培養細胞株や上皮細胞ではDNAに二本鎖切断が起こり、細胞分裂時に染色体分配異常が観察されることから、コリバクチンは遺伝毒性物質として作用し得ることが予想されている。これまでの報告では、ヒトから分離されたコリバクチン関連遺伝子陽性(clb+)菌のほぼすべてが大腸菌であり、その大部分が大腸菌の系統発生群B2に属している。このB2群は、ヒトの腸内細菌を構成する主要な大腸菌の一群であることから、腸管内に常在する大腸菌から産生・分泌されたコリバクチンが大腸発がんのイニシエーターとして機能する可能性が考えられる。そこで本研究では、まず、日本人コホートにおけるコリバクチンを産生する腸管内常在性大腸菌と大腸発がんとの関連性を明らかにすることとした。大腸がん患者57名(男性36名、女性21名、年齢:中央値71.0歳)から採取され、病理学的に腫瘍部位および正常部位と診断された大腸組織サンプルからそれぞれclb+株の分離・同定を試みた。

その結果、14名(24.6%)の腫瘍部位からclb+の大腸菌を分離することができた。しかしながら、このうち7名の正常部位からはclb+菌は分離されなかった。また、腫瘍部位から得られた全大腸菌663株のうち、440株(66.4%)がclb+であったのに対し、正常部位では359株中123株(34.3%)と腫瘍部位と比べ有意にclb+株の出現率が低かった。さらに、本研究にて分離されたすべてのclb+株は大腸菌B2群に分類されることが分かった。本研究は腸内細菌の潜在的な病原性の解析を最終目的としているため、コリバクチン産生菌の収集は最も最優先されるべき事項である。そこで本年度は、コリバクチン産生大腸菌の探索・分離を重点的に行った。ヒト由来サンプルは核酸抽出用と菌分離用に分け、それぞれコリバクチン関連遺伝子の検出を行ったが、一部のサンプルにおいて結果が一致しなかった。よって、当初予定していた方法ではコリバクチン産生菌を腸内細菌として保有する個人の検出に漏れが生じる可能性があることが分かった。また、個人によって、マッコンキー寒天培地上に生育する大腸菌の数、系統発生群およびコリバクチン関連遺伝子保有率が大きく異なったことから、スクリーニング方法を変更することとし、1プレートあたり最大50個の赤色コロニーを選択し、1最低3つのコリバクチン関連遺伝子の検出、216S rRNA配列を用いた菌種の同定、3大腸菌系統発生群の順で行った。本年度、合計1,038分離株の中から、565株のコリバクチン関連遺伝子陽性株を得ることができ、これらの菌株はすべて大腸菌B2群に属することが判明した。細菌や真菌が保有するポリケタイド合成酵素(PKS)-非リボソームペプチド合成酵素(NRPS)融合タンパク質により産生される二次代謝化合物は生理活性物質の割合が高く、生化学や農業などにおいて重要な天然物を生合成する。コリバクチンは、PKS-NRPS経路をコードする約55kbpの遺伝子クラスターを保有する一部の腸内細菌科の細菌群によって産生され、宿主DNAの二本鎖切断や細胞分裂時に染色体分配異常を引き起こすことから遺伝毒性物質として作用し、大腸発がんに関与すると考えられている。海外における報告を含め、これまでにヒト糞便などから分離された腸内細菌由来のコリバクチン生合成遺伝子群陽性菌のほぼ全てが、系統発生群B2に属する大腸菌である。本研究では、前年度までに外科的に切除した日本人大腸がん患者57名(男性36名、女性21名、年齢:中央値71.0歳)の病理診断の余剰大腸組織から系統発生群B2のコリバクチン生合成遺伝子群陽性菌株を分離・同定した。引き続き本年度は、これらの菌株におけるコリバクチン産生能力の解析を試みた。コリバクチン本体は未だにその構造や動態が明らかとなっていないが、ペリプラズムに移行したプレコリバクチンはclbPによりコリバクチンとN-ミリスチルアスパラギン酸(N-myr-Asn)に分解されることから、コリバクチン生合成遺伝子群陽性菌株のN-myr-Asn産生量を測定した。その結果、腫瘍組織とその周囲の正常組織由来の分離株のN-myr-Asn産生量に有意な差は見られなかったが、腫瘍組織分離株は産生量が多い群と少ない群に明確に区分された。本研究は腸内細菌の潜在的な病原性の解析を最終目的としている。前年度までに大腸がん患者の大腸組織由来のコリバクチン生合成遺伝子群陽性菌を多数収集することができた。そこで本年度は、これらの大腸菌のコリバクチン産生能力の解析を重点的に行った。現在のところ、コリバクチン自体を直接観察・検出することが不可能である。
大腸菌染色体複製サイクル再構成による長大DNA増幅システムの開発

合成生物学の進展に伴って長鎖DNA増幅技術に対する期待が高まってきている。本研究では、独自に構築した「複製サイクル再構成系」を用いて長鎖環状DNAを増幅できるか検討した。「複製サイクル再構成」は大腸菌染色体複製に機能する全25種類の蛋白質を用いて複製の開始から姉妹環状DNAの分離までの複製サイクルの反応の繰り返しを試験管内に再構成したものである。種々の条件検討の結果、200kb環状DNAを30°C、3時間の等温反応にて、効率よく増幅する条件を決定した。今後、バクテリアゲノムレベルの長鎖環状DNAを増幅可能かも検討し、「ゲノム丸ごと増幅技術」としての利用を世の中に広めて行きたい。近年の合成生物学の進展にともなって長鎖DNAを増幅するための技術に対する期待が高まっている。大腸菌細胞は自身の4.6 Mbにもなる巨大な環状ゲノムDNAを繰り返し安定に増幅する事が出来ている。本研究では、独自に構築した複製サイクル再構成系を用いて長鎖環状DNAを増幅させるための検討を行っている。この複製サイクル再構成は大腸菌ゲノム複製に機能する全25種類の蛋白質を用いて複製の開始から姉妹環状DNAの分離までの「複製サイクル」の反応の繰り返しを試験管内に再構成したものである。長鎖環状DNAを調製するためλファージの組換えシステムを利用して大腸菌のゲノムを環状に抜きだす「ポップアウト法」を構築し、この方法により200kbまでの巨大な環状DNAをスーパーコイル構造を維持したまま精製する事に成功した。そしてこの200kbの巨大環状DNAを鋳型にして複製サイクル再構成系の反応をおこなったところ、30度、3時間の反応で増幅産物の産生を確認する事ができた。増幅産物のなかにはスーパーコイル構造を持った200kb環状DNAの産物も含まれている事が確認された。今までに、試験管内でこれほどまでに巨大なDNAを環状のまま増幅できるといった反応系は報告されておらず、世界的にも初めての例である。複製サイクル再構成系は、200kbを超えるさらに巨大な環状DNAを増幅するポテンシャルも持つと思われるが、今のところ環状DNAとして安定に調製できるDNAサイズが200 kbまでなので、今後さらに巨大な長鎖環状DNAを調製するための手法の検討が1つの課題である。当初の計画通り、長大な環状DNAの安定化を高める工夫により、その増幅効率を高める条件を見出した。また、副次的な産物の産生を抑える条件も見出しつつある。近年の合成生物学の進展に伴って長鎖DNAを増幅するための技術に対する期待が高まってきている。大腸菌細胞は自身の5 Mbにもなる巨大な環状ゲノムDNAを安定的に増幅する事が出来ている。本研究では、独自に構築した「複製サイクル再構成系」を用いて長鎖環状DNAを増幅させるための検討を行った。この「複製サイクル再構成」は大腸菌染色体複製に機能する全25種類の蛋白質を用いて複製の開始から姉妹環状DNAの分離までの「複製サイクル」の反応の繰り返しを試験管内に再構成したものである。鋳型として用いる長鎖環状DNAとして、λファージの組換えシステムを利用して大腸菌細胞内で複製起点oriCを含む長鎖ゲノム領域を環状に抜きだす「ポップアウト法」により200kbの長鎖環状DNAを調製した。そしてこの200kb環状DNAを鋳型にして、複製サイクル再構成系の反応(30°C、3時間)により効率よく長鎖環状DNAを増幅するための条件を検討し、決定した。本研究で開発した増幅法では、元の鋳型と同じ環状構造の増幅産物DNAが得られる。そのため、そのまま形質転換の操作に用いることができるなど、これまでのDNA増幅法とは大きく異なる特徴を持つものである。今後、バクテリアゲノムレベル(500 5,000 kb)の長鎖環状DNAを増幅可能か検討していき、「ゲノム丸ごと増幅技術」としての利用法を世の中に広めて行きたいと考えている。

本研究では、独自に構築した「複製サイクル再構成系」を用いて長鎖環状DNAを増幅できるか検討した。「複製サイクル再構成」は大腸菌染色体複製に機能する全25種類の蛋白質を用いて複製の開始から姉妹環状DNAの分離までの複製サイクルの反応の繰り返しを試験管内に再構成したものである。種々の条件検討の結果、200kb環状DNAを30°C、3時間の等温反応にて、効率よく増幅する条件を決定した。今後、バクテリアゲノムレベルの長鎖環状DNAを増幅可能かも検討し、「ゲノム丸ごと増幅技術」としての利用を世の中に広めて行きたい。当初の計画通り、「200kbもの長大な環状DNAを環状のまま丸ごと増幅する系の構築」に成功したため。長大な環状DNAの試験管内での安定化の手法と、副次的な増幅産物を抑えるための手法について、見通しが立ちつつある。よって、これらの条件をうまく組み合わせることで効率的な長鎖環状DNA増幅法としての確立を目指す。大腸菌ゲノム複製現在構築している系では、スーパーコイル構造をもった巨大環状DNAの増幅産物を得る事に成功しているが、1つの問題点は、副次的な直鎖状DNAの産生である。これは複製反応中に長鎖DNAが物理的に擦り切れたために生じているものと考えている。現在この点を改善したいと考え、DNAの切断を抑えるための反応条件等を検討している。残額は次年度分とあわせ試薬、消耗品の購入に割り当てる予定である。より安価な試薬を求め使用したため当該年度のにおいてDNA増幅系を簡単かつ安定に動かす事が出来るようになった。これを受けて次年度の課題に携わる人員(学生)をさらに2名増やす事とした。よって、次年度の消耗品にかかる費用が予想よりも必要となる事が予想されたので、この分を次年度使用額として計上した。DNA解析実験における消耗試薬として使用する長鎖環状DNAの調製法および増幅反応の条件検討にかかる試薬等消耗品類の購入にあてる。
日本と韓国における教員養成及び研修の制度・実態・改革に関する比較研究

1.共同セミナーの開催第3回日韓教育研究共同セミナー-筑波大学・教育学系・ソウル大学校師範大学-を1993年6月29日7月1日に筑波大学において,第4回の同セミナーを1994年5月25日26日にソウル大学校において開催した。前者の全体テーマは「21世紀の教育研究の課題と展望」であり,後者の全体テーマは「教師教育の経験と反省」であった。これらを通じて,日本および韓国における教育研究および教員養成・研修の現状と課題が明らかにされた。特に教師教育については,両国ともに教員の需給関係のアンバランスという問題を抱えながら,養成,採用,研修の各段階を通じて質的な充実をはかる必要があることが明かとなった。2.研究プロジェクトの推進本研究では,以下に掲げる7研究プロジェクトを推進し,研究成果をあげてきた。なお,これらの研究プロジェクトの内いくつかはこの後も継続される予定である。もた、研究プロジェクトごとに報告書を作成するものもあるが、それとは別に共同セミナーも含めてこの間の共同研究の成果をもとめた全体の報告書を作成した。(1)総合大学における教職教育の比較研究筑波大学およびソウル大学校を事例として,総合大学における教職教育の現状と課題についての比較研究を行った。1990年度まで韓国では教員採用において、国立教育大学および師範大学(師範系学科を含む)の卒業者をまず採用し,その後一般大学教職課程と私立師範大学の出身者を対象に教員採用候補者の順位考査によって選考されたものを採用する方式が採られてきた。その制度が1991年に廃止されたこともあり,ソウル大学校師範大学においても教育実習の徹底,学校教育の目的・教育内容に応じた養成課程の教育課程の編成などを通じて,教員要請の質的向上をはかることが課題となっていることなどが明らかになった。(2)教員養成制度の比較研究日韓の教員養成の現状と課題を明らかにするために,両国の教員養成・採用・研修等の制度の比較研究を行うとともに,両国において教師像,教師観、教師の社会的地位などに関する質問紙調査研究を行った。(3)校長の養成・研修制度の比較研究日韓の校長制度について(1)資格・要件,(2)任用制度,(3)校長の職務,(4)校長の服務,(5)研修,(6)勤務成績評定,などの点から比較研究を行うとともに,校長の登用状況などの実態面での比較研究を行った。(4)社会科教育に関する比較研究特に歴史教育を中心として,戦後の日韓における社会科教育の歴史的研究および現状と課題に関する研究を行った。(5)数学教育に関する比較研究日韓における数学教師教育の制度と教育課程に関する比較研究を行い,大学および大学院それぞれにおける数学教師教育課程のあり方を検討した。(6)理科教育に関する比較研究韓国における中等科学教師教育の実態に関する調査研究,および日本におけるSTS教育の現状に関する研究を行った。(7)言語教育に関する比較研究日韓における言語教育,特に国語教育の実態と課題,および国語教科書の編集方針・実態・運用に関する比較研究を行った。(4)社会科教育に関する比較研究