hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
患者が自分で治療できる高血圧治療装置

高血圧のコントロールに関しては腎交感神経の適切な制御が必要という概念を得、特許を申請し「患者が自分で、必要な時だけ血圧を下げることができる埋め込み型血圧低下装置」の発明に至り、本研究の結果、試作機による急性の動物実験を行い、腎動脈神経活動の抑制に成功した。完全埋め込み型血圧低下装置のシステムは、腎動脈周辺に埋め込まれる電子冷却素子システムとそれに融合した経皮エネルギー伝送ユニットの体内2次コイル、さらにこれに体外から電磁駆動力を供給する体外に設置された1次コイルから構成されるシンプルなデバイスで、ペースメーカとほぼ同等の手術手技で簡便に埋込み手術を行うことができる。現在、良好な動物実験結果が得られており将来性が期待される。本研究の開発目標は、世界で初めての「患者が自分で血圧を下げることができる完全埋め込み型血圧低下装置」の開発である。そのために、完全埋め込み型血圧低下装置の開発研究を行い、試作したシステムの基本性能を恒温槽で確認した後に、モック循環回路でテストし、大学院医学系研究科動物実験倫理委員会の審査の後、健康な山羊を使った動物実験を行って、その交感神経活動、腎血流、心臓血管系における血行動態、腎機能に与える効果を確認するものである。血圧低下装置のシステムは、腎動脈周辺に埋め込まれる電子冷却素子システムとそれに融合した経皮エネルギー伝送ユニット2次コイル、さらにこれに体外から電磁駆動力を供給する1次コイルから構成されるシンプルなデバイスで、ペースメーカとほぼ同等の手術手技で簡便に埋込み手術を行うことができる。患者は、自分で必要と判断した時に1次コイルを稼働させれば、腎動脈神経が冷却され、腎交感神経活動が抑制されるので、腎動脈は拡張し、尿量は増加し、レニン・アンギオテンシン・アルドステロン系の液性因子が適度にコントロールされ、血圧は下がる。従って、患者は自宅で血圧を計りながら、あるいは、自分で症状を感じながら、適切に血圧をコントロールすることができる。そのために、システムの試作品開発を目指し、試作したシステムの基本性能を恒温槽で確認した後に、モック循環回路でテストする。モック循環回路では、人工心臓を使った左心循環模擬回路で、腎動脈循環を再現し、試作システムの冷却作用と、反対側の温熱作用を最適化し、理想的なシステム開発を試みる。現在までに動物実験で血圧変動時の腎交感神経活動記録に成功し、順調に研究が進展している。そのために、完全埋め込み型血圧低下装置の開発研究を行い、試作したシステムの基本性能を恒温槽で確認した後に、モックテストし動物実験倫理委員会の審査の後、動物実験を行って、その交感神経活動、血行動態に与える効果を確認する。
アレルギー疾患における新しい感受性遺伝子の解明

小児期の気管支喘息はダニ抗原特異IgEにより病気が誘導される。本研究では、(I)アレルギー疾患を誘導する免疫異常の解析をすすめ、通常はIgEの産生が極わずかである健康者のダニ抗原特異IgEの機能について検討を加え、健康者リンパ球は機能的なIgE産生を示すことを明らかにした。次に、病気が改善した患者(寛解患者)のリンパ球には、このIgEを作り出すBリンパ球を破壊する(アポトーシスの機序)サイトカインを分泌するTリンパ球が存在することを明らかにしたが、更に、喘息活動期及び寛解期患者リンパ球のアポトーシス及び免疫寛容を誘導するサイトカインについて検討を加え、アレルギー疾患の発症と寛解には、病因抗原(ダニ抗原)により誘導されるアポトーシスや、免疫寛容(T細胞アナジー)を誘導するインターロイキン-10が重要な役割を果たすことを明らかにした。次に(II)これら免疫アレルギーの異常に関連する遺伝子(疾患感受性遺伝子)を明らかにする目的で、アレルギー反応誘導に関わるTh2細胞に特異的に発現するCRTH2分子のアレルギー疾患での役割について検討し、CRTH2遺伝子が成熟B細胞に発現してCRTH2分子を構成し、ダニ抗原特異的IgE産生にかかわっていることを明らかにした。CRTH2遺伝子の多型性は遺伝子の1塩基が変異しこれらの異常が疾患発症に関わっている可能性が推測された。疾患感受性遺伝子の機能は単にその遺伝子異常のみで決まるものではなく、他の転写因子やその他の調節因子により左右される。今回検討した遺伝子ではアミノ酸置換まで及ばない遺伝子置換があったが、疾患におけるこの違いが蛋白発現の調節に関わり疾患が発症する可能性があると考えられた。本研究の遺伝子異常の解析は、臨床的・細胞学的機能の解析と両輪となり、アレルギー疾患の解明及び診断と治療につながっていくものと考えられる。小児の気管支喘息はダニ抗原特異IgEにより病気が起こる。病気がよくなった患者(寛解患者)のリンパ球には、このIgEを作り出すBリンパ球(独自に樹立したB細胞株)を破壊する(アポトーシスの機序による)Tリンパ球が存在することをすでに明らかにした。このTリンパ球から産生される液性の破壊因子(サイトカイン)は従来報告されているものとは異なっており、このサイトカインを作り出す遺伝子は、活動期にあって症状の消失しない患者では変異していることが推測される。このアポトーシス誘導サイトカインとその受容体を明らかにし、さらに、これら分子に対する遺伝子(疾患感受性遺伝子)を明らかにすることにより気管支喘息の病態を把握し治療の糸口をつかむことが可能となる。今年度は、気管支喘息がよくなった患児末梢血リンパ球から、限界希釈法を用いて、ダニ抗原特異IgEを作り出すB細胞株のIgE産生の抑制と、細胞破壊(アポトーシスによる)を起こすTリンパ球のクローン細胞を選択した。小児の気管支喘息はダニ抗原特異lgEにより発症する。思春期を迎え、病気が改善した患者のリンパ球には、lgEを作り出すBリンパ球を破壊する(アポトーシス)Tリンパ球が存在することをすでに明らかにした。Tリンパ球から産生される破壊因子は従来報告されているものとは異なり、その遺伝子は、活動期の症状のが消失しない患者では変異していることが推測される。この液性因子とその受容体分子の遺伝子(疾患感受性遺伝子)を明らかにすることにより気管支喘息の病態を把握し治療の糸口をつかむことが可能となる。昨年度は、気管支喘息がよくなった患児リンパ球から、ダニ抗原特異lgEを分泌するB細胞株のlgE産生の抑制と、細胞破壊を起こすTリンパ球のクローン細胞を選択した。今年度は、気管支喘息が良くならない患児でのT細胞の解析を施行した。即ち、CD47分子は、インテグリン関連分子で多くの造血細胞に発現し、T細胞にも表出される。

ダニ抗原誘発気管支喘息患者のリンパ球が低濃度のDf抗原で刺激されると、これらに作用して、TH2サイトカイン、IL-4の産生を増強し、至適濃度で作用するとIL-4の産生を減少し、IFN-gの産生を増強し、結果的にB細胞株のlgE産生調節する作用を持っていることを明らかにした。一方、CRTH2はT細胞に特異的に発現する分子で、CD47と同様、TH2サイトカインの産生調節に関わっていることを明らかにした。これらの分子の機能異常はB細胞からのlgE産生を許容し、アレルギー疾患の発症と増悪を惹起すると考えられる。気管支喘息が寛解しない患児のCD47及びCRTH2分子の遺伝子解析を施行した。気管支喘息が寛解しない患者で、CRTH2遺伝子の変異が認められた。T細胞上に発現するCRTH2遺伝子の異常が、疾患発症と増悪に関わっている可能性が示唆された。CRTH2(chemoattractant receptor-homologous molecule expressed on Th2 cells)は、リンパ球のヘルパーT細胞亜群、Th2細胞に選択的に表出されている細胞表面受容体である。その遺伝子がクローニングされ、好塩基珠、好酸球、単球にも発現されていることが明らかとなった。肥満細胞から分泌されるプロスタグランヂンD2はその受容体に結合し様々な免疫作用を誘導することがあきらかにされ、アレルギー反応にも関わりがあることが示唆されている。これらの新しい遺伝子とIgEを介するアレルギー反応との関わりを明らかにするために、リンパ球のB細胞亜群細胞表面上におけるCRTH2遺伝子の発現について検索を加えた。CRTH2はCD4陽性T細胞の0.4-6.5%に発現していたが、同様にCD19^+,CD20^+ and D23^+B細胞にも軽度の発現が認められた。即ち、アトピー型気管支喘息患者において血清IgEが高値を示す患者ではB細胞の0.23-1.27%に発現を認めた。血清IgEが低値あるいは健康対照者ではこれらの発現はほとんど認められなかった。一方、ダニ抗原特異IgEを産生する成熟B細胞株でも同様にCRTH2の発現を認め、そのmRNAが確認された。以上から、CRTH2はIgEを介するアレルギー反応にかかわていることが示唆され、CRTH2は新しい疾患感受性遺伝子である可能性が示唆された。その発現の調節機構の解明が待たれる。なを、当初の計画と一部研究の方向が修正された。
Ｄｏｃｋ　ｆａｍｉｌｙの分子制御機構と神経系における機能解明

本研究では、Dock3分子が網膜神経節細胞の保護や視神経軸索の再生に与える影響を調べることで、国内での失明原因1位の緑内障や視神経炎の発症抑制ならびに治療へと応用することを目的としている。申請者はRho family GTPaseの1つであるRac1を制御するDock3の分子機能について培養細胞を用いた遺伝子発現実験を利用して調べた。その結果、Dock3はリン酸化修飾によってGEF活性が制御されていることが明らかとなった。また、Dock3の活性はシグナル上流のRhoGによって制御されており、TrkB-RhoG-Dock3シグナル経路が軸索伸長に寄与していることを明らかにした。グアニンヌクレオチド交換因子(GEF)はRhoファミリー(Rac1, Cdc42, RhoA)の活性を制御することにより、細胞骨格の1つであるアクチン繊維の再構築を調節している。GEFにはDbl- homology(DH)domainと呼ばれる共通の触媒領域が存在すると考えられてきた。しかし近年になってDH domainを欠く新たなGEFとしてDock familyが発見され、現在までに知られている11分子(Dock1-11)はいずれもDHR1およびDHR2という特徴的な領域を持っている。その中でもDock1はアポトーシス細胞の食作用、筋芽細胞の融合などに重要な役割を持ち、そのシグナルネットワークに関しては国内外の研究者によって比較的多くの研究がなされている(Laurin et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2008他)。またDock2はリンパ球の走化性に、Dock4の変異は様々な癌の発生や転移に関与することが報告されており、Dock familyの生理活性は多岐に渡ることが予想される(Côtéand Vuori, Trends Cell Biol, 2007)。このようなDock familyのうち、本研究では特に精神・神経疾患との関わりが注目されるDock3を中心に研究を進める。Dock3は神経栄養因子brain-derivedneurotrophic factor(BDNF)の下流で軸索伸長に寄与するが、その際にDock3のリン酸化修飾が重要な役割を担う可能性を見出している。そこで本研究ではリン酸化によるDock3の活性調節機構の解明を進めるとともに、神経細胞死や軸索変性に対する神経保護および再生療法にDock3が有用であるかを検討した。Rac1の下流ではアクチンの重合を促進するWAVE(WASP family verprolin-homologous protein)が活性化され、成長円錐の葉状仮足形成を引き起こす。申請者らはDock3が細胞質中でWAVEと複合体を形成し、自らの移動に伴ってWAVEを細胞膜近傍まで輸送することを見出している。つまりDock3は単にRac1活性を高めるだけでなく、WAVEの膜輸送によって効率良くアクチン重合を促進するものと予想されるが、細胞膜上でリン酸化修飾を受けた際にはWAVEを解離する。そこで申請者はこのDock3リン酸化機構を詳細に検討する目的で、すでに約400カ所のリン酸化候補部位に関するスクリーニング解析を行い、2か所のリン酸化部位を同定した。さらに現在までに各々のリン酸化Dock3抗体の作製を完了している。アフリカミドリザル腎線維芽細胞でWT Dock3とリン酸化部位に変異を入れた非リン酸化型Dock3を発現させてウエスタンブロッティング法を行ったところ、それぞれの抗体がリン酸化を特異的に認識することを確認した。さらに、Dock3の主要な結合分子であるElmoよってリン酸化が増強されることを見いだした。さらに最近では、これらのDock3リン酸化酵素の同定することに成功しており、今後はDock3シグナル伝達経路について、さらに詳細な解析が可能となる。Dock3リン酸化部位の同定に加えて、そのリン酸化酵素の同定に成功したことは今後の分子シグナルの解明に大きく進んだと考えられる。Dock3を含めDockファミリー分子の分子メカニズムについては不明な点が多く、近年リン酸化による制御機構の存在が徐々に明らかになっている。申請者はDock3のリン酸化によるGEF活性の調節機構を明らかにしつつある。今後はDock3のリン酸化による制御機構をより詳細に解明することにより、Dockファミリー全体に共通する制御機構解明の一助としたい。Dock3およびDock8はオリゴデンドロサイトおよびオリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)にも発現することから、これらの分子がミエリンの保護・再生効果に与える影響について脱髄疾患モデルマウスを用いて検討する。申請者らはcuprizone誘発急性脱髄モデルの安定的な作製に成功しており、Dock3 Tgマウスではcuprizoneによる脱髄の軽減および再髄鞘化が促進される傾向を見出している。今後はWTマウスとDock3 Tgマウスに対してBrdUの腹腔内投与を行い、cuprizoneによる脱髄時にOPCの分化状態に変化が生じるか検討する。

またOPCおよび成熟オリゴデンドロサイト数の定量化を行い、Dock3が再髄鞘化過程に与える影響を総合的に評価する。さらにDock3 Tgマウスを用いた多発性硬化症モデル動物(EAEマウス)における脱髄・再髄鞘化過程を同様に検討する。このように複数の脱髄疾患モデルを用いることにより、どちらかに有意差がみられなかった場合のリスクを避け、Dock familyの確実かつ詳細な機能解明が可能となる。またこれらの解析はDock8 TgマウスおよびDock8欠損マウスでも行う予定である。このうちDock8欠損マウスに関してはすでに検討を開始しているが、EAEによる視神経脊髄炎の顕著な軽症化を示唆するデータを得ている。今後はTUNEL染色、残存オリゴデンドロサイトの定量、caspase3などの細胞死実行因子の活性状態の検討、電子顕微鏡による変性軸索の定量化等を通して、Dock3およびDock8によるミエリンの保護・再生効果の全体像を明らかにする。本研究で使用する実験動物の購入および飼育などの費用は研究者独自に用意する必要があるため、動物購入・飼育費として研究費を使用する予定である。疾患モデル動物の解析には多種類の抗体が不可欠であるとともに、初代培養細胞作成には細胞種別に様々な細胞研究用器具や栄養因子の添加などを要するため、組織学実験用試薬および細胞培養用品の購入費として使用予定。さらにPCR、SDS-PAGEやWestern blottingなど、生化学実験に関する費用も必要であることから、生化学実験用試薬の購入費として使用予定。
ホスホリパ-ゼA2を用いた抗原の構造安定性と抗体産生の相関性の解析

効率的な抗体作製を目的とし、筋壊死活性の高いPLA2アイソザイムであるBPIIを抗原として、その構造安定性に対するマウスでの抗体産生の関係を調べた。BrCN処理でN末端の1-8残基を削除したBPII(BrCN-BPII)を調製しマウスに投与後、その抗体価を調べたが、抗体価の上昇は見られなかった。一方で、BrCN-BPIIについてマウスの筋線維芽細胞であるC2C12に対する細胞死を調べたところ、細胞死を誘導しなかった。即ち、BPIIのN末端部分が細胞死誘導活性に重要な領域であることが示唆された。南西諸島に棲息するハブの咬傷治療薬に用いられるハブ毒抗血清は、咬傷患者の出血や溶血活性には効果的であるが、筋壊死にはほとんど効果がない。これは、ハブ毒の主要な成分であるホスホリパーゼA2(PLA2)に対する抗血清中の抗体価が著しく低いことが原因である。本研究では、いかに有効な方法で抗体を作製できるかを突き止めるかが最終目的である。H24年度では、前年度作製したBrCN処理したBPII(以下、BrCN-BPII)についてさらなる解析を行った。BPIIの構造要素でどの部位が細胞死誘導活性に重要かを調べることで、有効な抗体作製のヒントを導き出すというのが目的である。BrCN-BPIIを用いて細胞死実験を行った結果、BPIIは細胞死を強く誘導するのに対し、BrCN-BPIIは細胞死を起こさなかった。また、マウスを用いた筋壊死活性実験において、BPIIは十分に筋壊死活性が見られたのに対し、BrCN-BPIIは筋壊死活性を失っていた。以上の結果から、BrCN処理で影響をうけた領域が細胞死に関与することが明らかとなった。現在解析中のBPIIの立体構造(未発表)を元に推測すると、N末端の1-8ペプチドとMet61は空間的に近接しており、その周辺の立体構造が細胞死誘導に必須な領域であると考えられた。即ち、この領域をターゲットとすれば、有効な抗体作製が可能となるという事を明らかにした。また、一方でアミノ酸変異によって構造安定性を変動させた抗原を作製するために、7つのSS結合を1つずつAlaに置換して欠損させたリコンビナント体の作製に取り組んだ。部位特異的変異導入法により変異を施し、大腸菌によって発現させた。この変異体を用いることにより、安定性と抗体産生の関連性を調べることが可能となった。本研究では、発現量の多い中性のPLA2と筋壊死活性の強い塩基性のBPIIを用いて、変異によって構造安定性を下げた抗原をマウスに投与した場合に抗体産生がどう影響するかを調べ、リゾチームで明らかにした抗原の安定性が抗体産生に相関するという理論が他の蛋白質でも適応できることを証明する。H23年度では、構造の一部を崩壊させて不安定化を狙ったBPIIの作製に着手した。BPIIにはMet残基が2つしかないためBrCN処理による部分切断を行った。BrCN処理したBPIIの二次構造解析を行ったところ未処理のBPIIと比べると二次構造の含有率はほぼ同じであることが分かった。この結果より、構造の一部を崩壊させて不安定化を狙ったBPIIが出来た。そして調製したBrCN-BPIIをマウスに投与し、血清中の抗体価を測定した。血清は、50ug/匹で一次免疫後に同投与量で2週間後に2次免疫を行い、それから2週間経過、即ち初回投与から42日後のものを用いた。ELISAにより調べた結果、BrCN BPIIはNative BPIIよりも抗体価が低いものとなった。即ち、部分的に構造を壊して不安定化を狙った抗原を用いても抗体産生価は大きく上昇しなかった。また、アミノ酸変異によって構造安定性を変動させた抗原を作製するために、リコンビナント体の作製に取り組んだ。大腸菌による封入体からの効率的な巻き戻しについて検討したところ、約1L培養当たりで約1mgのリコンビナントBPIIを得るのに成功した。現在までに、1)構造の一部を崩壊させて不安定化を狙ったBPIIの作製、2)抗原としてマウスへ投与後の血清中の抗体価測定、3)リコンビナント体の作製、が達成できた。H23年度では抗原の調製を主として試みたが、2)においてマウスへの投与及び抗体価測定ができた事は計画より進んだと言える。3)においては予想以上に困難であり変異体作製まで出来ていないが、リコンビナント体の作製に成功したという面ではハードルを越えたと言える。部分的に構造を壊して不安定化を狙った抗原を用いて抗体産生を調べた。

結果として抗体産生量が下がったのは、BrCNで切断されたN末端の8個のペプチドがT細胞エピトープに影響したためと考えられる。H23年度では、数種の変異体作製を行い安定性を変動させた抗原を得る予定であったが、リコンビナント体作製の効率的な方法が困難で時間を要した。しかしながら効率的なリコンビナント体の作製方法は確立できたので、次年度は数多くの変異体作製に着手する。複数かつ効率的に変異体作製を遂行するためにはコストがかかる為に、H23年度では予算を少し残して次年度への大型機器購入へ回す計画を立てた。数多くの変異体作製に着手し、複数かつ効率的に変異体作製を遂行するために遺伝子変異キット、精製カラムなど購入する。さらに遺伝子操作及び変異体の培養精製に欠かせない遠心機を購入し、さらなる効率化を図る。
原子核乾板による暗黒物質の検出　ーグランサッソー地下の中性子ＢＧの測定ー

超微粒子の原子核乾板を用いる暗黒物質の方向性検出実験実現のための技術開発ならびにイタリアグランサッソー研究所(LNGS)地下での実験の準備・中性子検出のテスト実験を遂行した。20nmサイズのAgBr結晶からなる超微粒子原子核乾板の安定製造方法を確立した。その現像手法として金沈着現像を開発し、形状認識に適した現像粒子とすることができた。また楕円形状認識による200nm長の反跳飛跡の光学読み出しを実現し、専用読み取り装置PTSの立ち上げを行い、系統的な解析を可能とした。BGとなる中性子の測定に関しては、LNGSでOPERA検出器と微粒子乾板を用いた中性子の流量測定を行った。原子核乾板を用いて宇宙の暗黒物質の飛来方向を検出する実験の予備実験を、イタリアグランサッソー研究所を中心に展開している。平成23年度は我々が遂行している長基線ニュートリノ振動実験OPERAで使用している地下の現像リフレッシュファシリティの内、リフレッシュに使用し今は使っていない2階部分を本研究に使用出来るように改造し整備した。地上の中性子フラックスは地下の1000倍以上あるため、地下で乳剤を塗布現像する予定である。また並行して本研究に使用する中性子にのみ感度のある原子核乳剤の開発を行いd-d反応やカリフォルニウムからの中性子を用いて感度試験を行った。読み出しに関しては、中性による反跳OPERA型フィルムを貫通することがない様な低エネルギーの飛跡を認識するために、乳剤に記録された銀粒子を形状認識し、長さ1ミクロン程度の反跳陽子の飛跡も認識できる装置PTSの開発を行って居る。23年度はPTSの原型をくみ上げ画像認識の試験などを行いサブミクロン飛跡の認識に関しても定量的な評価を行った。超微粒子の原子核乾板を用いて宇宙の暗黒物質を直接検出する実験実現のための検出器開発、現像手法開発ならびにその読み出し手法開発を継続して行った。またイタリアグランサッソー地下研究所現地で、中性子測定ならびにバックグラウンドとなる(α、n)反応を引き起こす原子核乾板に含まれる放射性不純物の測定を行った。並行して中性子測定のための技術開発、実際の中性子源を用いた較正実験を行い中性子検出器としての性能評価を行った。検出器開発に関しては、暗黒物質の信号である反跳原子(炭素を想定)とバックグラウンドとなる低エネルギー電子に対する感度の差を広げる開発を行いその効果を確かめたが、信号対雑音の切れ味に関してまだ調整が必要である。現像手法に関しては、銀のかわりに金を用いる処方の開発を行い、現像銀/金の形状改善、感度の向上に成功した。また金の使用により実験の最終段で用いるX線顕微鏡でのコントラスト向上も可能となった。読み出し手法に関しては、高分解能対物レンズを導入し、分解能を約1.5倍改善した。中性子計測に関しては、OPERA実験に用いられている原子核乾板を用いて、20MeV以上の中性子の検出数として、グランサッソー地上でOPERA原子核乾板標的1ccあたり毎秒2×10^-6個、地下で毎秒6×10^-10個以下を得ている。これから較正実験のデータをもとに検出効率の補正を行いフラックスをもとめてゆく。H23年度に立ち上げた極短飛跡の形状認識のための高分解能顕微鏡システムPTSとSpring8のX線顕微鏡システムを用いて、dーd反応からの中性子による反跳原子の検証試験を行った。PTSで読みだした画像に対する楕円フィッティングにより検出できる飛跡の閾値、検出効率、反跳方向の測定精度などをX線顕微鏡で測定した結果とクロスチェックした。結果、検出効率は100nm長の飛跡に対して70%であり、炭素原子の反跳エネルギーにして37KeVが閾値であった。またこれから炭素の反跳原子に対する検出効率は約10%弱と見積もられた。反跳原子の中性子入射軸に対する広がりはσで約32度であり、反跳方向検出に十分なものとなっていることを確認した。また、現像銀の形状を球状に近くするための現像の開発を開始したが、現像液から銀イオンを供給する型の物理現像では感度がなかなか出ないうえに現像液が不安定であるなどの問題があることがわかり、これに代わる現像手法の探索を開始した。並行して昨年度グランサッソー地下に設置した原子核乳剤の塗布施設で実際の微粒子乳剤の塗布を行い原子核乾板を作成し、それらを地下と地上に設置して中性子の試験的な検出実験を開始した。さらに検出閾値は上がるが、地下で組み立てられたOPERA検出器の原子核乾板標的を用いた中性子測定について実際の原子核乾板を読みだした解析を開始した。グランサッソーで協力してくれる研究者の都合で、OPERAで使用しているファシリティの立ち上げが約23ヶ月程度遅れており、それに伴って経費の繰り越しを行っている。平成24年度も引き続きスケジュールの遅れを引きずっている。25年度が最終年度であるため、記入しない。

今年度は昨年準備したグランサッソー現地施設ならびに解析装置の定常的運用を行い、グランサッソー現地、日本国内における研究とも順調に推移した。研究組織もイタリアの共同研究者(ナポリ大学、グランサッソー研究所、パドバ大学)を加えて国際共同研究として組織できてきている。今後以下の開発を推進し、当初目的であるグランサッソー地下での中性子測定を達成する。1)中性子測定用の原子核乳剤のファインチューニング。(感度、経時特性など)2)極短飛跡読み出しののための装置のポリッシュアップ。(飛跡認識アルゴリズムの開発、装置の駆動系の開発。)3)実際の中性子源にファインチューニングできた1)の乳剤を照射し、2)で開発する装置を用いて読み出し、認識効率の測定、モンテカルロとの比較などを行う。これと並行して、1)の乳剤をグランサッソー研究所に持ち込み地下での塗布を行い、半年程度の照射を繰り返し、ちかでの中性子シグナルを検出する。その後量的拡大を行い、測定精度を向上させ、季節変動のシグナルをとらえることを目指す。25年度が最終年度であるため、記入しない。次年度は、飛跡の形状認識の閾値をさらに下げるための光学読み出しシステムの高分解能化と自動化、現像銀の形状を改良するための現像手法の開発、今年度グランサッソー現地に設置した微粒子原子核乾板を用いた中性子測定、またOPERA検出器を用いた中性子測定を推進してゆく。並行してdーd反応中性子や、イオン打ち込み装置を用いた較正実験を行い、検出効率などの補正係数を求めていく。
事業譲渡と株主・消費者・労働者保護に関する法的研究

本研究は、事業譲渡および会社分割をめぐって、さまざまな会社債権者をいかにして保護するかについて検討するものである。事業譲渡および会社分割によって、譲渡会社・分割会社の債権者が害されることのないようにするには、法人格否認法理の適用や詐害行為取消権の行使などさまざまな手段がありうるが、本研究では、民法の詐害行為取消権を新たに会社法の中に位置づけることを提案するものである。なお、本研究の結論方向は、後の改正会社法の中間試案でも維持されている。概ね交付申請書に記載したとおり、研究を進めることがてきた。具体的には、米国のニューヨークに所在するニューヨーク大学、コロンビア大学、フォーダム大学およびペイス大学のロースクールを訪問し、研究者との意見交換や研究資料の収集などを実施した。帰国後、資料整理等を行った上で、更にその後、同じく米国のシアトルに所在するワシントン大学ロースクール等を訪問し、会社法その他の研究課題に関する法学者との意見交換を実施し、あわせて大学図書館での資料調査も行うことができた。今回の2度に渡る米国訪問によって、米国を代表する諸大学の研究者と幅広い分野で意見交換が実現でき、今後の研究を進める上で極めて大きな足がかりが固められた。しかも、今回の訪米では、会社法を中心としながらも、とくにワシントン大学では、契約法、税法、知的財産法にも関わって、多くの研究者との交流ができた結果、本研究課題に取り組む上で有力な情報源を得たという意味でも、海外出張はきわめて有意義であったということができる。これらの海外での研究成果は、「会社法における事業の重要な一部譲渡」(『商法学の諸相』成文堂)としてすでに論文の形になっており、春の刊行に向け作業が進行中である。また、今回既刊の研究成果としては、「会社分割と事業譲渡規制の類推-商号続用責任を中心として-」(阪大法学59巻2号1頁以下)および「事業の重要な一なの譲渡と株主総会の特別決議」(会社法の争点198頁以下)が既に公表されている。会社法における事業譲渡と会社分割の比較検討と並行して、会社法のほか諸法に関する諸問題の整理検討も実施した。会社法上の課題についてはそれなりに研究に蓄積があるので、22年度は、労働法等との関係において生じる諸課題の検討に時間を割いた。最新の研究資料の蓄積も進める必要があるので、22年度においても研究課題に関する内外の図書・資料の収集を継続しつつ、会社法等の研究者および研究資料の蓄積のある大学・研究機関を訪問して、研究課題に関する資料調査および研究者・実務家との意見交換を行った。各種研究会での研究報告や議論を通じて、研究者や実務家の有益な意見を参考に聴取することができた。また、諸外国における資料調査と研究者や実務家との交流を深めるため、フランスへの海外出張を実施し、大学のみならず研究所等の研究機関も訪問して、研究者および実務家からのヒアリング調査を行うとともに、国内では入手できない資料の収集も行うことができた。このような海外での調査研究によって、現地の生の声を聞くことができ国内では触れられない最新情報も入手でき、また新たな研究者との人的関係ができ今後の研究に大いに資することが期待される。これらの情報をもとに、海外の研究者による最近の研究成果を参考に、わが国への立法論を展開する足がかりもでき、すでにその成果は直近の論文(阪大法学60巻5号に掲載)として発表している。国内における研究としては、昨年度から引き続き、会社分割と事業譲渡の比較研究と並行して、労働法関係の検討も進めてきた。その成果は、阪大法学61巻に「判例にみる濫用的会社分割と債権者・労働者の保護-事業承継をめぐる解釈論の限界-」としてまとめることができた。この課題は、目下、会社法改正の中心部分の一角をなすものであり、かねてからの主張が改正法として具体化しつつある。これは本研究の大きな成果ということができる。また、会社分割が詐害行為に当たるとしてその取消が認められたユニ・ピーアール事件高裁判決についても、早稲田大学商法研究会において研究報告をすることができたのも成果に加えることができる。海外における調査研究としては、平成21年度から22年度にかけて、これまでのアメリカ、フランスにおける文献調査および実態調査を実施したが、これに引き続いて、当初の計画通り、本年度はドイツでの文献調査および実態調査を実施した。具体的には、ミュンヘン大学およびマックスプランク研究所において、企業再編と債権者・労働者保護に関する資料を収集するとともに、現地の研究者および法律実務家との意見交換が実現した。ドイツにおいても、アメリカ法研究との関係で、ワシントン大学の研究者とも合流し意見交換をすることができたことは、研究上有意義でこれも大きな収穫であった。また、ミュンヘン所在の法律事務所との研究協力関係の構築も実現でき、これも今後の研究に繋がる成果である。
閉経後の部位別骨密度と姿勢-脊柱変形の原因及び予防の検討-

閉経後女子の部位別骨密度の低下率と閉経以外の要因、また加齢による姿勢の変化の基礎資料を作成するため、閉経後の女性(4691歳の117名)女子大学生(40名)を測定した。部位別骨密度はどの部位でも年齢及び体重との相関が高く、脊柱アライメントも年齢と胸椎後彎角、腰椎前彎角、仙骨傾斜角共に有意な相関が認められたが、骨密度との相関は認められなかった。中高年と若年との比較では胸椎後彎角は中高年が、仙骨傾斜角、腰椎前彎角は若年層が、可動域は若年層がそれぞれ有意に高い値を示した。目的は閉経後の骨密度の部位別低下度とその原因、椎骨骨密度と脊柱彎曲の関連、骨密度高値者と低値者の過去、現在の生活習慣と姿勢に対する意識を調査し、高齢者の姿勢の崩れの原因とその予防を検討することである。3年計画の初年度は測定者を80名で、DEX法により、全身と椎骨の骨密度を測定した。同時にスパイナルマウスと姿勢写真により脊柱の姿勢の分析、及び生活習慣調査と筋力、バランスの測定を行った。今年度の測定者のデータから、骨密度の部位別低下度の結果では、閉経後15年(約65歳)以降、肋骨、椎骨、胴体、脚部はその後14年間変化がなかった。腕のみ、加齢と共に減少し続けた。脚、骨盤、胴体、椎骨、肋骨の骨密度は体重との相関が最も高く、腕と頭部は加齢との相関が高かった。閉経後のエストロゲンの減少以外に骨密度を低下させる要因はいろいろ研究データがあるが、他の部位と違う減少傾向を示す腕については重力の関係等考えられるが、今後データを増やし、他の調査との関連から原因とその予防を検討したい。スパイナルマウスを用いた立位姿勢の評価では、全体では胸椎後弯角の平均値36.63±11.39°、腰椎弯前角15.15±9.8°であった。スパイナルマウスを用いた山西等(1)の青年期の立位姿勢の評価によると胸椎後弯角の平均値38.6±9.4°、腰椎弯前角26.9±11.1°であり、腰椎弯前角が加齢と共に角度の減少を示すことは先行研究でも指摘されているが、胸椎後弯角の角度が大きいことは、今後データが増えて行く中で検討を加えたい。対象が研究に同意し、自力で測定地にこられるということもあり、骨粗鬆症の患者を測定した先行研究の結果と比較しても、姿勢の崩れの少ない対象者であり、この層の日常生活分析は今後ますます多くなると予想される高齢者の健康維持に参考になるデータが得られると考えられる。(1)白田梨奈佐藤みっ子(2007)スパイナルマウスを用いた青年期の立位姿勢の評価Yamanashi Nursing Journal Vol.5 No.2女性の部位別骨密度の低下率とその原因、また加齢による姿勢の変化の具体的基礎資料を作成することを目的に閉経後の女性および1819歳の女子学生を対象に測定および比較を行っている。閉経後の女性は昨年度に加え46歳91歳の116名の結果を分析した。骨密度の部位別測定結果から、すべての部位で年齢及び体重と骨密度は有意な相関が認められた。全身骨密度で見ると閉経後10年間(5559歳)は加齢と共に激減し、その後漸減傾向を示すが、部位別にみると、肋骨、椎骨、胴体、は同じ傾向であるが、骨盤、脚は20年間(6569歳)激減し、その後は緩やかな漸減傾向を示した。肋骨はもっとも骨密度の低い部位であるが、6064歳以降の骨密度の低値は骨折の危険性を示唆している。頭部と腕は10年後以降の減少が少ない。体重との関係でもっとも高い相関を示したのが、肋骨と胴体であり、骨盤や脚のような体重を支える部位の方が低かったことは興味深く、今後日常生活の身体活動量との関係を調べていく。姿勢の変化を見る1つとしてスパイナルマウスによる脊柱の矢状姿勢の形状測定、胸椎後彎角と腰椎前彎角と可動域の測定を行った。年齢と腰椎前彎角は正の、仙骨傾斜角は負の有意な相関がみとめられたが、胸椎後彎角と可動域については年齢との相関は認められなかった。加齢と共に腰椎の前彎が減少し、仙骨の傾斜は深くなる。これらの原因について他の測定項目の脊柱の可動域、ジョグボードによる重心安定度、体力測定、質問調査等との関係を調べていく。

養護老人ホームの入居者等を対象にスパイナルマウスによる立位姿勢アライメント変化を見る研究はあるが、自力で生活が出来、立位姿勢の前面、背面、側面の写真撮影から見ても、姿勢の変化が少なく、全体的に元気な対象者の測定は少ない。今後多くなる高齢者の健康維持に参考になるデータが得られると考えられる。女子の部位別骨密度の低下率とその原因、また加齢による姿勢の変化の具体的基礎資料を作成することを目的に、閉経後の女性及び女子大学生を対象に測定し、その結果を分析した。閉経後の女性46歳91歳の117名、女子学生は40名であった。平成23年度は女子学生の測定とともに、スパイナルマウスによる脊柱のアライメントを立位時、前屈、後屈時の脊柱の椎骨の角度とその可動性について測定し、骨密度、動的バランス能力、足部の歪み等との関係を検討した。部位別骨密度はどの部位でも年齢との相関が高く、脊柱アライメントも年齢と腰椎前彎角は負の、仙骨傾斜角は正の有意な相関が認められたが、骨密度との相関は認められなかった。中高年と若年とのアライメントの比較では胸椎後彎角は中高年が、仙骨傾斜角、腰椎前彎角は若年層が、可動域は若年層がそれぞれ優位に高い値を示した。中高年では円背傾向となり、腰椎の前湾が少なくなり、腰も丸みを帯びてくる傾向を示している。加齢による胸椎後彎角度が高くなり、左右バランスの安定性が有意に低下し、腰椎の前彎角の変化は前後バランスの安定性を有意に低下させている。また脚の除脂肪体重の加齢による減少が左右バランスの低下に影響している。しかし70歳代、80歳代でも脊柱アライメントも可動域も若年者と変わらない場合もみられ、若い時代及び現在までの継続性のある運動習慣との関連が見られた。ますます高齢化が進むわが国において、骨折や姿勢の歪みが高齢者の健康生活をおびやかす。資料を生かした啓蒙活動をおこないたい。
オゾン適応戦略としての植物の環境応答機構の解明

オゾン耐性シロイヌナズナ突然変異系統の解析では、オゾン耐性に直接関与する遺伝子の構造と機能を明らかにすることを目的とする。シロイヌナズナ遺伝子強制発現系統において、既に得られていたオゾン耐性突然変異系統の候補を用いた実験を行った。完全長cDNAを過剰発現させた約3000系統(全遺伝子の12%弱を網羅する)のシロイヌナズナ生態型Col-0のオゾン感受性を調査して得られたオゾン耐性となっている突然変異系統を一系統単離し、導入された遺伝子を特定した。当該遺伝子がオゾン耐性をもたらすことの確認のため、戻し交配により突然変異系統を純化して確立するとともに、Col-0における当該遺伝子の過剰発現株(新規作成)、Col-0における当該遺伝子の欠損株、及び他生態型(Ws-2、Cvi-0)における当該遺伝子の過剰発現株の作製を行った。並行して、当該遺伝子がコードするタンパク質の細胞内局在を調査するため、当該遺伝子の発現調節領域の下流に蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を連結した株の作製も開始した。関東山地ブナ林由来ブナ実生で働いているオゾン耐性機構の解明では、ブナ実生においてオゾンに応答して発現する遺伝子を見出し、その遺伝子の持つと推定される機能から、ブナで働いているオゾン耐性機構の一端を解明することを目的とする。関東山地である秩父、丹沢各山地ののうち、丹沢山地ブナ林由来の一年生実生を入手し育成した。秩父山地ブナ林では種子の採取を行い、播種したが発芽個体が得られなかった。2018年秋に秩父山地(東京大学秩父演習林)においてブナ種子あるいは実生の採取を試みたところ、当年は調査地においてブナが不作で、ほとんど開花が確認できず、当年の良好な種子が得られずに採取した種子は古い種子であった。それらを播種し実生を得ようとしたが発芽しなかった。また、調査地はシカが生息しており、ブナ実生はシカにより食べられていて確認できなかった。オゾン耐性シロイヌナズナ突然変異系統に関しては、オゾン耐性突然変異系統に導入された遺伝子がオゾン耐性をもたらしていることを確認するため、各品種の当該遺伝子の過剰発現株や欠損株のオゾン暴露を行い、オゾンに対する耐性・感受性を調査する。また、当該遺伝子発現産物の細胞内局在をGFP連結株を用いて調べる。当該遺伝子の塩基配列等の情報と合わせ、遺伝子発現産物の機能の推定を行う。ブナに関しては、2019年には秩父山地において、再度種子、実生の採取を試みる。実生は演習林内でシカ除けの柵が設置してある場所での採取を考えている。丹沢産と秩父産ブナのオゾン感受性やオゾン応答に関連する遺伝子発現の比較等を行う。核酸調整用の試薬で実験材料(ブナ)入手の遅れにより購入しないものがあった。今後購入して実験を進める予定である。
魚類インターフェロンの機能解明による魚類疾病予防法の開発

2種類のIFNγrelは標的細胞内の核内への移行やシグナル伝達において異なることを明らかにするとともに新規の受容体を同定した。細胞内寄生性細菌に対する感染防御においてIFNγが重要な役割を果たし、それぞれのIFNγアイソフォームが異なった機能を有することを示した。組換えIFNγの投与により、細胞内寄生細菌の感染後の死亡率が低下し、好中球やマクロファージが増加することが判明した。また、同種移植鱗の拒絶が促進され、ワクチンの有効性が高まった。魚類には、哺乳類と相同なIFNγに加えて、魚類特有のIFNγrelが存在する。クローンギンブナには2種類のIFNγrel(IFNγrel 1、IFNγrel 2)が存在し、両者は標的細胞内の核内への移行やシグナル伝達に用いるSTATの種類が異なること、いずれも単量体で抗ウイルス活性を示すことを明らかにした。哺乳類のIFNγはSTAT1を介して活性を示しホモ二量体として機能することから、ギンブナの2種類のIFNγrelは、既知のIFNγや他のインターフェロンと異なり、脊椎動物における新規のインターフェロンであると考えられる。poly(I:C)による刺激では、IFNγrel 2はIFNγやIFNγrel 1よりも早期にmRNAの発現量が上昇し、IFNγサブタイプ間においても機能の違いが示唆された。IFNγはCD4やCD8陽性T細胞より分泌されるが、IFNγrel 1およびIFNγrel 2はT細胞以外の細胞より分泌されることが判明した。転写因子のT-betやGATA3あるいはIFNγの発現を指標として、細胞性免疫(Th1細胞)の活性が最も高い時期のCD4陽性細胞を養子免疫移入した個体のみ、細胞内寄生細菌Edwardsiella tardaに対するより高い感染防御能が認められた。このことから、Th1様CD4陽性細胞が細胞障害性T細胞(CTL)と同様にE. tarda感染防御において重要な役割を果たしていることが判明した。組み換えギンブナIFNγ2接種群は対照群に比べ、E. tarda攻撃後の死亡率が有意に低下した。また、IFNγ2接種魚の肝臓において感染初期に貪食細胞が有意に増加し、感染48時間後の肝臓、脾臓、腎臓の臓器内菌数は対照魚に比べ有意に低かった。このことから、IFNγ2投与により感染初期に貪食細胞が誘導され、E. tardaの増殖が抑制されたものと推察された。組換えIFNγ・IFNγrelを用いた細胞性免疫機能の活性化について、同種鱗移植片拒絶反応をモデルとして検討した。その結果、組換えIFNγrel 1の投与により拒絶が促進された。また、移植部位におけるIFNγ1・IFNγ2及び細胞傷害因子の発現が増加するとともに、CD4及びCD8陽性T細胞並びにsIgM陽性細胞の増加が認められた。また、4種類のIFNγアイソフォームは、夫々鱗移植後の発現時期や発現量が異なるとともに、移植片拒絶に及ぼす投与効果についても異なっていた。以上のことから、アロ移植片拒絶において4種類のIFNγが異なったメカニズムで関与していることが示唆された。インターフェロン受容体として知られるII型サイトカイン受容体ファミリーであるCRFB遺伝子14種類をゼブラフィッシュより単離し発現ベクターを作製し、IFNγrel受容体を発現していないヒト培養細胞株HEK293T細胞に発現させ、組換えIFNγrel 1との結合性をフローサイトメトリーにて解析した。その結果、IFNγrel 1はCRFB5及びCRFB17と相互作用を示すことが判明した。細胞内寄生性細菌であるノカルディア菌に対するワクチン開発を目的とし、クローンギンブナを用いて、生菌及び死菌のワクチンの有効性について検討した。その結果、生菌及び死菌いずれにおいてもワクチンの有効性が認められるとともに、組み換えIFNγ投与により感染防御能が向上することが判明した。ヒラメを用いて、細胞内寄生細菌(Edwardsiella tarda)及びウイルス(ウイルス性出血性敗血症、VHS)に対するワクチンにおける組換えIFNγの効果について検討した。その結果、E. tarda及びVHSいずれの不活化ワクチンについても、同時にType I IFNあるいはIFNγを接種した場合には、攻撃試験において、不活化ワクチンのみに比べてIFNを同時に投与した場合に有意に死亡率が低下した。1.ギンブナに組み換えIFNγ2 (gcIFNγ2)を投与後にEdwardsiella tardaを感染させると、肝臓における好中球/マクロファージ数が有意に増加した。また、in vitroにおいてgcIFNγ1、gcIFNγ2、gcIFNγrel 1刺激により好中球の貪食率が有意に上昇した。一方、gcIFNγrel 2では変化がみられず、IFNγアイソフォームの違いにより好中球の貪食能への影響が異なることが明らかとなった。また、gcIFNγ2が好中球の遊走能を高めることが示唆された。3.腎臓白血球にナノ型乳酸菌を加えて培養すると、IFNγ1, IFNγ2, IL-12 p35, IL-12 p40の発現が濃度依存的に増加するが、IL-4/13の発現の変化は認められなかった。このことから、ナノ型乳酸菌によるin vitroにおけるIL-12産生及びTh1誘導が示された。4.ミコバクテリウムのホルマリン不活化菌体に油性アジュバントを添加すると、アジュバント添加群においてIFNγの有意な発現上昇が認められた。

さらに、ノカルディア症不活化ワクチンに組み換えIL-12を添加すると、頭腎及び脾臓白血球におけるIFNγの有意な発現上昇が認められ、細胞性免疫の誘導におけるIL-12のアジュバント効果が示された。2種類のIFNγrelは標的細胞内の核内への移行やシグナル伝達において異なることを明らかにするとともに新規の受容体を同定した。細胞内寄生性細菌に対する感染防御においてIFNγが重要な役割を果たし、それぞれのIFNγアイソフォームが異なった機能を有することを示した。組換えIFNγの投与により、細胞内寄生細菌の感染後の死亡率が低下し、好中球やマクロファージが増加することが判明した。また、同種移植鱗の拒絶が促進され、ワクチンの有効性が高まった。平成26年度には下記の成果が得られた。1)細胞性免疫の代表的な反応である移植片拒絶反応をモデルとして、4種類のIFNγが細胞性免疫応答において異なったメカニズムで関与していることを明らかにした。2)魚類特有のIFNγrel 1がII型サイトカイン受容体ファミリーであるCRFB5及びCRFB17と相互作用をすることを示した。3).細胞内寄生性細菌のカルディア菌について、生菌及び死菌いずれにおいてもワクチンの有効性が認められるとともに、組み換えIFNγ投与により感染防御能が向上することを明らかにした。4)細胞内寄生細菌(E. tarda)及びウイルス(VHS)に対するワクチンいずれにおいても、不活化ワクチンのみに比べて組換えIFNを同時に投与した場合に有意に死亡率が低下し、アジュバント効果を有することが明らかとなった。以上、当初の計画以上の成果が得られた。27年度が最終年度であるため、記入しない。魚類免疫学平成26年度の成果を踏まえ当初の予定通り、魚類特有のIFNγrelの受容体の機能解明、魚類特有のIFNγrelの好中球及びマクロファージの機能に及ぼす影響解析、ウイルス及び細胞内寄生性細菌に対する感染防御におけるIFNγの役割解明、IFNγを用いたウイルス性疾病及び細胞内寄生細菌による疾病の予防法の開発、IFNγの産生を指標とした免疫増強剤の開発、並びにIFNγアジュバントを用いた有効なワクチンの開発について検討する。ギンブナIL-12の組み換え体については得られたタンパク量が少なかったため、これを用いたTh1応答の誘導については部分的な成果しか得られなかったが、IFNγrelの構造及びシグナル伝達機構の解明、IFNγrelの機能及び産生細胞、細胞内寄生性細菌に対する感染防御における細胞性免疫の役割解明、IFNγを用いた細胞内寄生細菌による疾病の予防法の開発において、当初の計画以上の成果が得られた。本年度の成果を踏まえ当初の計画通り、IL-12及びIFNγを用いたTh1応答の誘導及びCTLの活性化、IFNγrelの受容体の同定、IFNγの活性化を指標とした免疫増強剤の開発、並びにIFNγアジュバントを用いた有効なワクチンの開発など、基礎的基盤的研究に加え細胞内寄生性細菌やウイルス性疾病に対する予防法の開発について検討する。
乳児血管腫に対するプロプラノロールの作用機序の解明と新規治療法の開発

近年、乳児血管腫の治療としてプロプラノロールが広く用いられているが、その効果は偶然発見されたものであり、作用機序は現在でも不明である。また、効果は個人差があり、感受性を予測する方法もない。そこで、本研究では、乳児血管腫に対し、プロプラノロール非感受性血管内皮細胞株の作製と遺伝子解析による遺伝子異常を調べることにより、プロプラノロールの作用機序の解明、感受性の予測、および新規治療法の可能性を追求し、臨床における乳児血管腫の治療最適化を行うことを目的とする。
顕微ラマンイメージングによる歯槽骨再生機構の解明

1.ポジショニング手法の確立および顕微ラマン分光法による同一ヒト歯根膜細胞の経時的解析まず、ラマン分光法によるヒト歯根膜細胞の経時的解析を実現するため、同一細胞を長期的にモニタリング可能な実験系の確立を行なった。本研究では、ディッシュのX-Y平面おける回転を制御するため自作のポジショニングプレートを、X/Y座標を制御するためにグリッド付ガラスディッシュのグリッドを利用した。本手法を用いれば、誤差1μm未満の精度で定点を観測することが可能であった。本ポジショニング手法利用し、実際に、顕微ラマン分光法によるヒト歯根膜細胞の経時的解析を実施した。同一のヒト歯根膜細胞に対し、分化誘導前、分化誘導開始から、3、6、9、14日後に顕微ラマン分光測定を行なった。長期的な定点観察をするために使用したグリッド付ガラスディッシュによる蛍光が強く、鮮明なラマンイメージを得ることができなかったが、シトクロムcやハイドロキシアパタイトなど、合計4種の骨形成関連分子のモニタリングに成功した。2.ラマン分光法とフラグメント分子軌道法による生体組織中のハイドロキシアパタイトの解析これまでの研究を通して、培養組織から得られるハイドロキシアパタイト(HA)のラマンバンドが、純物質のそれと比較して、低波数側へシフトしていることが明らかとなった。そこで、生体内におけるHAと骨基質タンパク質の相互作用を調査するため、タンパク質の構成要素であるアミノ酸を吸着させたHAのラマン分光測定を行ない、それら有機質がHAのラマンバンドに及ぼす影響について調査した。さらに、フラグメント分子軌道(FMO)法によるHAーアミノ酸間の相互作用解析を行なった。ラマン分光測定およびFMO解析の両結果は、共に、HAがアミノ酸から引力相互作用を受けていることを示唆した。28年度が最終年度であるため、記入しない。【1.マウス骨芽細胞の経時的解析】マウス間葉系幹細胞株KUSA-A1を使用し,その石灰化過程(骨形成の超初期過程)を顕微ラマンイメージングにより経時的に解析した.KUSA-A1骨芽細胞へと分化誘導し,分化誘導開始5日後から4時間毎に24時間,その分化過程を顕微ラマンイメージングにより経時的に解析した.その結果,ハイドロキシアパタイト(HA),β-カロテン,シトクロムcの局在変化を同時に観察することに成功した.本結果より,β-カロテンは,石灰化開始部位のバイオマーカーとなりうる可能性が示唆された.本実験結果をまとめた論文をScientific Reports誌に投稿した.【2.ヒト歯根膜細胞の経時的解析のための実験条件の検討】【1】で行なった,顕微ラマンイメージングによる経時的解析をヒト歯根膜細胞に応用するための実験条件検討を行なった.まず,ヒト歯根膜細胞の培養基板を検討した.その結果,フィブロネクチンコートを行えば,石灰化過程進行時まで,ヒト歯根膜細胞を石英ガラス基板上で培養可能であることが分かった.また,フィブロネクチンコートがラマンスペクトルに大きな影響を及ぼさないことを確認した.【3.ハイドロキシアパタイト(HA)局在とコラーゲン分布の相関性の解析】骨のミネラル分の主成分はHAであり,骨基質タンパク質の大部分はI型コラーゲンが占めることが知られているが,I型コラーゲンの分布がHA局在に及ぼす影響は明らかになっていない.そこで,顕微ラマンイメージングの“非侵襲かつ特異的にHAを可視化できる"という利点を活かし,HAの局在とI型コラーゲンの分布の相関性の解析を試みた.本実験結果から,I型コラーゲンの分布の緻密さが,HAの産生・分布拡大に大きく寄与することが示唆された.モデル細胞であるマウス間葉系幹細胞を用いての,顕微ラマンイメージングによる石灰化過程(骨形成の超初期過程)の経時的解析に成功し,その解析結果から,骨形成開始部位にベータカロテンという物質が局在するという結果を世界で初めて得ることができた.このように,本研究課題において重要な,「骨形成過程の詳細解明」や「顕微ラマンイメージングの骨科学研究における有用性の実証」を成し遂げることができた.さらに,本研究課題の目的である“顕微ラマンイメージングによる歯根膜細胞による歯槽骨の再生機構解明"を実現するための,実験条件検討にも着手できた.(これまでは,マウス細胞を使用してきたが,今後は,ヒト歯根膜細胞を使用するため,実験条件の再検討が必要となる.ここでの実験条件検討とは,ヒト歯根膜細胞を用いた実験用の培養基板やレーザー光強度の検討を指す.)以上より,本研究課題の目的達成に向けた実験が,この1年で着実に進んだと考え,「おおむね順調に進展している」とした.1.ポジショニング手法の確立および顕微ラマン分光法による同一ヒト歯根膜細胞の経時的解析まず、ラマン分光法によるヒト歯根膜細胞の経時的解析を実現するため、同一細胞を長期的にモニタリング可能な実験系の確立を行なった。