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近代日本の地域総合開発における技術者の役割―田辺朔郎関係文書の分析を中心に―

この史料群には、注目すべきものとして、京都御所水道敷設や関門海峡トンネル・北海道鉄道・小樽築港など、各地のさまざまな都市基盤整備に関わった人物の書簡や記録類がある。書翰・記録類などの一次史料からは、近代日本の地域総合開発と都市基盤整備に関わる当事者の見解や、非公式のやりとりなど、刊行資料や公文書などには記されていない様々な問題が明らかになることが少なくない。田辺朔郎については、琵琶湖疏水事業との関係からその業績を論じられることが多いが、田辺の事績は琵琶湖疏水だけでない。田辺朔郎という人物の全体像を実証的に明らかにした研究は未見である。さらに、田辺朔郎関係文書には、様々な内容の文書が豊富に含まれている。また、田辺朔郎は、『明治工業史』の編纂を企画し、1917年(大正6)に編纂委員長を委嘱され、全10巻の刊行に携わったほか、『工師必携』『とんねる』『蓮舟遺稿』など数多くの著作を残した。こうした、日本土木史における田辺朔郎の役割、日本近代における土木史・都市形成史についても視野に入れて研究を進める予定である。この史料群を中心とする田辺朔郎関係の一次史料を分析することは、近代日本における地域総合開発と都市基盤整備に関する実証的研究の基礎となるものであり、近代日本の都市史研究・官僚制成立過程の研究を進展させる大きな材料となるものと考えている。田辺朔郎関係文書に含まれる日記・書簡を中心に調査・研究を進めている。昨年度は、未撮影の書簡等の一部についてデジタル撮影を行い、今年度も継続して実施予定である。また、関係資料を所蔵する資料保存機関など、本研究に必要な情報を収集についても着手した。昨年度に続き、近代日本における地域総合開発と都市基盤整備における技術者の役割の解明を目的として、田辺朔郎関係文書に含まれる日記・書簡を中心に、調査・研究を進め、未撮影の書簡等のデジタル撮影を行った。この史料群には、京都御所水道敷設や関門海峡トンネル・北海道鉄道・小樽築港など、各地の様々な都市基盤整備に関わった人物の書簡や記録類があり、書翰・記録類などの一次史料からは、近代日本の地域総合開発と都市基盤整備に関わる当事者の見解や非公式のやりとりなど、刊行資料や公文書などには記されていない様々な内容が含まれる。また、田辺朔郎は『明治工業史』の編纂を企画し、1917年(大正6)に編纂委員長を委嘱され、全10巻の刊行に携わったほか、『工師必携』『とんねる』『蓮舟遺稿』など数多くの著作を残した。田辺朔郎関係文書には、田辺朔郎という人物の全体像を実証的に明らかにしうる様々な内容の文書が豊富に含まれており、こうした日本土木史における田辺朔郎の役割、日本近代における土木史・都市形成史についても視野に入れて研究を進める必要がある。この文書は、明治から大正・昭和期にかけての日本の土木史・都市計画史を実証的に分析する上での素材となる史料群であると同時に、文化財的価値も高い歴史資料である。このため、「保存」についても考慮しながら、研究者はもとより一般の利用者にも公開できる状態にするため、資料目録を作成するとともに、デジタルカメラで撮影し、今後の閲覧・複写にも対応することを視野に入れた資料整理を行った。昨年度に引き続き、文書整理および写真撮影を行う。さらに、新発見分の田辺朔郎関係文書の目録作成が全て完了した段階で、史料の翻刻に着手する。
ベータヘルペスウイルスの造血抑制に関する研究

近年骨髄移植をはじめ各種の造血幹細胞移植が数多く施行されるようになり、移植後の骨髄生着不全あるいは遅延やその他の移植後合併症と、サイトメガロウイルス(CMV)、ヒトヘルペスウイルス6型(HHV-6)などベータヘルペスウイルスの活動性の関連が注目されてきている。本研究の目的は、1)In vitroの実験系として、造血コロニー法を用いて、各種ヘルペスウイルスの造血3系統(赤芽球系、顆粒球・マクロファージ系、巨核球系)への影響を定量的に解析すること、2)造血幹細胞移植後のヘルペスウイルスに対する抗ウイルス療法を確立するための新規抗ヘルペス剤のスクリーニング系をIn vitro造血コロニー法を用いて構築すること、3)造血幹・前駆細胞とヘルペスウイルスの相互関係を、潜伏感染機構も含めて明らかにすることにあった。平成13年度は、上記項目1)のIn Vitro造血コロニー法に関して、赤芽球系コロニー(BFU-E)、顆粒球・マクロファージ系コロニー(CFU-GM)、ならびに、近年クローニングされたトロンボポイエチンを用いた巨核球系コロニー(CFU-Meg)についての定量的解析法を確立した。私どもの系を用いて、HHV-6およびHHV-7による造血3系統への影響を比較検討した結果、HHV-6は、赤芽球系コロニー(BFU-E)、顆粒球・マクロファージ系コロニー(CFU-GM)、巨核球系コロニー(CFU-Meg)の造血3系において顕著にコロニーの形成を抑制することを見出した。同じベータヘルペスウイルスに属するHHV-7では、このような抑制効果は認められず、HHV-6による血小板造血回復遅延との関連で臨床的に重要な知見と考えられた。平成14度の解析では、臍帯血、成人末消血および骨髄細胞由来の造血前駆細胞であるCD34陽性細胞を分離して、各種ヘルペスウイルスによる造血抑制効果の解析に着手した。まず臍帯血より2種の磁気ビーズにより分離したCD34陽性細胞とHHV-6の相互作用を検討した。Dynabeadsで分離した分画は、MACSbeadsで分離した分画に比べて、強陽性から弱陽性まで広い分布のCD34陽性細胞を含んでいた。さらに、感染CD34陽性細胞に少なくとも2種のHHV-6のIE遺伝子産物を検出した。また、各種造血サイトカイン存在下に培養することにより、分化が進んだCD34陽性細胞のほうが、HHV-6の抑制効果を受けやすいことが示され、HHV-6による造血抑制の標的となる細胞群の特定に重要な知見と考えられた。

本研究の目的は、1)In vitroの実験系として、造血コロニー法を用いて、各種ヘルペスウイルスの造血3系統(赤芽球系、顆粒球・マクロファージ系、巨核球系)への影響を定量的に解析すること、2)造血幹細胞移植後のヘルペスウイルスに対する抗ウイルス療法を確立するための新規抗ヘルペス剤のスクリーニング系をIn vitro造血コロニー法を用いて構築すること、3)造血幹・前駆細胞とヘルペスウイルスの相互関係を、潜伏感染機構も含めて明らかにすることにある。本年度は、上記項目1)のIn vitro造血コロニー法に関して、赤芽球系コロニー(BFU-E)、顆粒球・マクロファージ系コロニー(CFU-GM)、ならびに、近年クローニングされたトロンボポイエチンを用いた巨核球系コロニー(CFU-Meg)についての定量的解析法を確立した。私どもの系を用いて、HHV-6およびHHV-7による造血3系統への影響を比較検討した結果、HHV-6は、赤芽球系コロニー(BFU-E)、顆粒球・マクロファージ系コロニー(CFU-GM)、巨核球系コロニー(CFU-Meg)の造血3系において顕著にコロニーの形成を抑制することを見出した。同じベータヘルペスウイルスに属するHHV-7では、このような抑制効果は認められず、HHV-6による血小板造血回復遅延との関連で臨床的に重要な知見と考えられた。これまでの解析では、臍帯血単核球を造血前駆細胞として、In vitro造血コロニー法により各種ヘルペスウイルスの造血抑制機構を解析してきたが、現段階では、臍帯血、成人抹消血および骨髄細胞由来の造血前駆細胞であるCD34陽性細胞を分離して、各種ヘルペスウイルスによる造血抑制効果の解析に着手しており、造血前駆細胞の種類によるヘルペスウイルスの抑制の差異について検討する予定である。近年骨髄移植をはじめ各種の造血幹細胞移植が数多く施行されるようになり、移植後の骨髄生着不全あるいは遅延やその他の移植後合併症と、サイトメガロウイルス(CMV)、ヒトヘルペスウイルス6型(HHV-6)などベータヘルペスウイルスの活動性の関連が注目されてきている。本研究の目的は、1)In vitroの実験系として、造血コロニー法を用いて、各種ヘルペスウイルスの造血3系統(赤芽球系、穎粒球・マクロファージ系、巨核球系)への影響を定量的に解析すること、2)造血幹細胞移植後のヘルペスウイルスに対する抗ウイルス療法を確立するための新規抗ヘルペス剤のスクリーニング系をIn vitro造血コロニー法を用いて構築すること、3)造血幹・前駆細胞とヘルペスウイルスの相互関係を、潜伏感染機構も含めて明らかにすることにある。昨年度は、上記項目1)のIn vitro造血コロニー法に関して、赤芽球系コロニー(BFU-E)、顆粒球・マクロファージ系コロニー(CFU-GM)、ならびに、近年クローニングされたトロンボポイエチンを用いた巨核球系コロニー(CFU-Meg)についての定量的解析法を確立した。今年度の解析では、臍帯血、成人末消血および骨髄細胞由来の造血前駆細胞であるCD34陽性細胞を分離して、各種ヘルペスウイルスによる造血抑制効果の解析に着手した。
対称関数の代数的組合せ論とその表現論，数え上げ組合せ論への展開

この研究では,対称関数の代数的組合せ論(特に対称関数の関係式)の組合せ論,表現論への展開を目指し,(A)古典型ルート系に付随したSchur Q関数,(B)平面分割の母関数,(C) d-completeな半順序集合の組合せ論,の3つのパートに分けて研究を進めた.今年度の研究のパート(A)では,多項式列に付随して定まる一般化されたQ関数について,多項式列の双対べき級数列の概念を導入することによって,Cauchy型の公式を定式化し証明を与えた.また,双対べき級数列に関する母関数を考えることによって,一般化された歪Q関数に対するJozefiak-Pragacz型公式の証明の大幅な簡易化に成功した.これらの結果は,特別な場合としてfactorial Q関数の場合を含み,別証明を与えている.パート(C)では,d-completeな半順序集合の基本的な例であるミニスキュール半順序集合に付随した双有理版rowmotionと呼ばれる力学系が,周期性(位数は対応するLie代数のCoxeter数)をもつこと,組合せ論版rowmotionの場合の順序イデアルの元の個数,対応する反鎖の元の個数の双有理版に対してある種のエルゴード性が成り立つこと(およびその精密化)を証明した.また,rowmotionの変種であるpromotionの双有理版を定式化し,これについても周期性,エルゴード性を明らかにした.パート(A)では,B, D型ルート系に付随したQ関数がC型ルート系に付随したQ関数に比べて扱いにくい理由が明らかになり,その組合せ論を展開する足がかりが得られた.また,パート(C)では,組合せ論版rowmotion,promotionの周期性,エルゴード性が望ましい形で双有理版rowmotion,promotionに対して一般化できた.パート(C)における双有理版rowmotionの周期性,エルゴード性の主張は統一的に定式化できたが,その証明はミニスキュール半順序集合の分類を用いるものであり,統一的な証明が今後の課題である.この研究では,対称関数の代数的組合せ論(特に対称関数の関係式)の組合せ論,表現論への展開を目指し,(A)古典型ルート系に付随したSchur Q関数,(B)平面分割の母関数,(C) d-completeな半順序集合の組合せ論,の3つのパートに分けて研究を進めた.今年度の研究のパート(A)では,多項式列に付随して定まる一般化されたQ関数について,多項式列の双対べき級数列の概念を導入することによって,Cauchy型の公式を定式化し証明を与えた.また,双対べき級数列に関する母関数を考えることによって,一般化された歪Q関数に対するJozefiak-Pragacz型公式の証明の大幅な簡易化に成功した.これらの結果は,特別な場合としてfactorial Q関数の場合を含み,別証明を与えている.パート(C)では,d-completeな半順序集合の基本的な例であるミニスキュール半順序集合に付随した双有理版rowmotionと呼ばれる力学系が,周期性(位数は対応するLie代数のCoxeter数)をもつこと,組合せ論版rowmotionの場合の順序イデアルの元の個数,対応する反鎖の元の個数の双有理版に対してある種のエルゴード性が成り立つこと(およびその精密化)を証明した.また,rowmotionの変種であるpromotionの双有理版を定式化し,これについても周期性,エルゴード性を明らかにした.パート(A)では,B, D型ルート系に付随したQ関数がC型ルート系に付随したQ関数に比べて扱いにくい理由が明らかになり,その組合せ論を展開する足がかりが得られた.また,パート(C)では,組合せ論版rowmotion,promotionの周期性,エルゴード性が望ましい形で双有理版rowmotion,promotionに対して一般化できた.パート(C)における双有理版rowmotionの周期性,エルゴード性の主張は統一的に定式化できたが,その証明はミニスキュール半順序集合の分類を用いるものであり,統一的な証明が今後の課題である.参加した国際研究集会の滞在費が先方負担となったことなどにより,次年度使用額が生じた.翌年度分と合わせて旅費等などに使用する予定である.
口腔内機能不全と脳の老化-脳内オピオイドの役割-

咀嚼能力の低下がストレスを生じ脳内オピオイド系の変化を介して記憶,学習能力に影響するという仮設のもとに以下の実験を行った.アロディニアは最近注目されている疼痛の一形態であり,神経損傷時などに本来痛みを生じない触覚,冷覚等の刺激によって痛みが生じる現象である.口腔領域でもアロディニアが生じると言われている.アロディニア発症の機序についても検討を行った.1)マウスにおいて口腔内ストレスが学習・記憶に与える影響310週齢のマウスにおいて,健忘作用を有するスコポラミンおよびハロペリドールは8放射状迷路,Morris水迷路において空間的記憶・学習能を低下させた.片側または両側の臼歯を抜歯したマウスでは記憶・学習能に変化はみられなかった.またこれらの動物にモルヒネあるいはナロキソンを投与することによっても顕著な影響がみられなかった.2)疼痛モデルとしてのアロディニアの発症機構についてマウスにおいてアロディニアは,筆で下腹部を軽くなでた時に生じる,筆から逃れようとする,鳴く,噛み付く反応を指標として数量化した.脊髄腔内にプロスタグランジン(PGE_2,PGF_2α,PGI_2)およびグルタミン酸を投与することによりアロディニアと痛覚過敏を引き起こした.P_2プリン受容体拮抗作用およびNMDA受容体刺激作用を有するsuraminがアロディニアを引き起こすこと,この作用はNMDA受容体拮抗薬およびNO合成阻害薬により拮抗された.一方,低用量のsuraminおよび他のP_2プリン受容体拮抗薬はPGによるアロディニアを抑制した.P_2プリン受容体作用薬はアロディニアを誘発した.以上,suraminはNMDA受容体刺激によりNO産生を介してアロディニアを引き起こすことが示唆された.又,P_2プリン受容体がアロディニアの発症に関与することが示唆された.今後,口腔内アロディニアが記憶・学習にどのような影響を及ぼすか,発展課題として示された.咀嚼能力の低下がストレスを生じ,脳内オピオイド系の変化を介して記憶,学習能力に影響するという仮説の下,以下のような実験を行った.アロディニアは最近注目されている疼痛の一形態であり,神経損傷時などに本来痛みを生じない触覚,冷覚等の弱い刺激によって痛みが生じる現象であるが,口腔領域でもアロディニアが生じると言われている.今後この機序と関連づけて研究を発展させていく予定である.1.口腔内ストレスが学習・記憶能に与える影響健忘効果をもつスコポラミンおよびハロペリドールは8方向放射状迷路,Morris水迷路において空間的記憶・学習能を低下させたが,片側または両側の臼歯を抜歯したマウスでは記憶・学習能の変化は認められなかった.2.疼痛モデルとしてのアロディニアの発症機構についてマウス脊髄腔内にプロスタグラシジン類の一部,オピオイド類のうちのノチセプチシ,ダイノルフィンなどを注入するとアロディニアを生ずることが実験的に確かめられてきたが,この機序はまだ不明な点が多い.我々は3種のプロスタグラシジン(PGE_2,PGF_2α,PGI_2)によるアロディニアと痛覚過敏の性質を比較し,痛覚過敏はアロディニアと必ずしも相関しないこと,NMDA受容体拮抗作用のあるケタミンがアロディニアを抑制すること,等を見いだした.またP_2プリン受容体拮抗薬suraminおよびPPADSが単独,高用量ではアロディニアを引き起こし,逆に低用量ではPGE_2によるアロディニアを抑制するという知見を得たので,この受容体の種々のアゴニスト,アンタゴニストを用いて,この機序について詳しく解析を進めている.咀嚼能力の低下がストレスを生じ脳内オピオイド系の変化を介して記憶,学習能力に影響するという仮設のもとに以下の実験を行った.アロディニアは最近注目されている疼痛の一形態であり,神経損傷時などに本来痛みを生じない触覚,冷覚等の刺激によって痛みが生じる現象である.口腔領域でもアロディニアが生じると言われている.アロディニア発症の機序についても検討を行った.1)マウスにおいて口腔内ストレスが学習・記憶に与える影響310週齢のマウスにおいて,健忘作用を有するスコポラミンおよびハロペリドールは8放射状迷路,Morris水迷路において空間的記憶・学習能を低下させた.片側または両側の臼歯を抜歯したマウスでは記憶・学習能に変化はみられなかった.またこれらの動物にモルヒネあるいはナロキソンを投与することによっても顕著な影響がみられなかった.2)疼痛モデルとしてのアロディニアの発症機構についてマウスにおいてアロディニアは,筆で下腹部を軽くなでた時に生じる,筆から逃れようとする,鳴く,噛み付く反応を指標として数量化した.脊髄腔内にプロスタグランジン(PGE_2,PGF_2α,PGI_2)およびグルタミン酸を投与することによりアロディニアと痛覚過敏を引き起こした.P_2プリン受容体拮抗作用およびNMDA受容体刺激作用を有するsuraminがアロディニアを引き起こすこと,この作用はNMDA受容体拮抗薬およびNO合成阻害薬により拮抗された.一方,低用量のsuraminおよび他のP_2プリン受容体拮抗薬はPGによるアロディニアを抑制した.P_2プリン受容体作用薬はアロディニアを誘発した.以上,suraminはNMDA受容体刺激によりNO産生を介してアロディニアを引き起こすことが示唆された.又,P_2プリン受容体がアロディニアの発症に関与することが示唆された.
機械受容チャネルの構造と機能:細胞体積調節における役割

本研究の大目標は、機械受容チャネルの分子実体を求めることと、細胞機能における生理的役割を明らかにすることにある。本年度は主として後者の研究を進めた。具体的には低浸透圧刺激に対する腎上皮由来のA6細胞の体積調節機構(Regulatory Volume Decrease,RVD)におけ機械受容チャネルの関わりと、その下流のシグナリング機構について検討した。方法としてはレーザ共焦点顕微鏡とパッチクランプを組み合わせて用い、低浸透圧刺激中の細胞体積と細胞内Ca^<2+>、および全細胞電流の関係を分析して以下の結果を得た。1)低張液刺激に対して、細胞体積の急激な膨脹と引き続く減少(RVD)が見られると同時に、2)機械受容チャネルの活性化による、細胞内Ca^<2+>の急速で一過的な上昇と引き続くプラトー相がみられた。さらにやや遅れて、3)全細胞電流の上昇と引き続く減少が見られた。4)この電流は外向きのK電流とCl電流から成り、Na電流の寄与はほとんど無視できた。5)このK電流とCl電流は互いに依存関係にあり、一方を抑制すると、他方も抑制された。また細胞内Ca^<2+>の上昇を抑制すると、これらの電流は抑制された。7)これらの電流を抑制すると、RVDは完全に抑制されたが、細胞内Ca^<2+>の上昇は抑制されなかった。以上の結果をまとめると、A6細胞におけるRVDのシグナリングカスケードでは、<低浸透圧刺激→細胞膨脹→機械受容チャネルの活性化→細胞内Ca^<2+>の上昇→KチャネルとClチャネルの活性化→KClの外向き流の増加→細胞内水の外向き流増加→RVD>であることが示唆された。この結果によって機械受容チャネルが細胞の体積調節において、細胞内Ca^<2+>動員を介して明瞭な生理的役割を持つことが明らかとなった。
肝癌関連チロシンキナーゼ遺伝子の分子病理学的解析

肝癌細胞の増殖・分化に関してチロシンキナーゼ遺伝子のシグナル伝達の重要性が着目されている。さらにヒト癌では同遺伝子の発現異常や変異が報告されている。しかし肝癌の発生・悪性化進展過程において、どのようなチロシンキナーゼ遺伝子発現に特異的変化が生じているのか明らかではない。そこで肝発癌過程におけるプロフィールを明らかにし、その局在および発癌過程における特異性と意義を検討した。【方法】DENを8週経口投与したF344ラットの肝癌組織および正常肝より抽出したRNAを用い、チロシンキナーゼ遺伝子群間で相同性の高い2カ所にdegeneratedプライマーを設定し、RT-PCRを行い、そのPCR産物をサブクローンした。1組織あたり50クローン以上のシークエンスを行い、ジーンバンクデータとのホモロジー検索によりプロフィールを解析した。発現の認められた遺伝子に関し、RT-PCRやノーザンブロッティングでさらに解析するとともに、免疫組織化学でその局在を検討した。また遺伝子増幅や組換えの有無を確認するため、サザンブロッティングを行った。IGF-IやHGFに関しては細胞培養系にてその機能解析を行った。【成績】23種類の受容体型、15種類の非受容体型チロシンキナーゼ遺伝子の発現を認めた。その中でも、肝癌ではHGF-R(c-met)が増加し、一部の肝癌ではPDGF-RβやIGF-IRも増加していた。血管新生に関連するTie1,Tie2,VEGF-R2(flk-1)等の発現は、血管内皮に発現するとともに、癌細胞にも発現を認めた。これらはGST-Pで検出される前癌病変に一致した発現が認められた。しかし、遺伝子増幅や組換えは認めなかった。一方、これらのリガンドのうちVEGF,HGF,Angiopoietin-1の発現は正常肝・癌とも差は無かったが、Angiopoietin-2は癌組織にのみ検出された。in vitroの系ではIGF-IやHGFは抗アポトーシスや浸潤能と関与することが示唆された。肝癌細胞の増殖・分化さらには接着・浸潤・転移に関してチロシンキナーゼ型の受容体シグナル伝達の重要性が着目されている。そこでラット化学肝発癌およびヒト肝細胞癌の受容体型チロシンキナーゼの発現動態プロフィールを明らかにし、その局在および発癌過程における特異性を検討した。方法としては、化学発癌ラットの肝癌組織および正常肝組織より抽出したRNAを用い、受容体型チロシンキナーゼ遺伝子群間で相同性の高い2カ所にdegeneratedプライマーを設定し、RT-PCRを行い、そのPCR産物をサブクローンした。発現の認められたチロシンキナーゼ遺伝子に関し、遺伝子発現の経時的変化をRT-PCRやノーザンブロッティングで解析するとともに、免疫組織化学でその局在を検討した。ヒト肝癌組織においても同様の方法で検討した。これまでの解析の結果、ラット正常肝と肝癌より23種類、ヒト正常肝と肝細胞癌より16種類の受容体型チロシンキナーゼ遺伝子の発現を認めた。その中でも、ラット肝癌ではHGF-R(c-met)が増加し、EGF-Rは減少していた。ヒト肝細胞癌ではPDGF-Rαが減少し、PDGF-Rβは増加していた。

血管新生に関連するTie1,Tie2,VEGF-R2(flk-1)等の発現はヒト、ラットともに癌周囲の血管内皮に発現するとともに、flk-1,Tie1,Tie2は癌細胞にも発現を認めた。これはラットにおいては前癌病変の時期より一部発現が認められた。以上の結果より、チロシンキナーゼ型受容体シグナルの特異的変化が、肝発癌・悪性化進展過程に重要な役割を演じていることが示唆された。(1998 DDWパネルディスカッション発表)。肝癌細胞の増殖・分化に関してチロシンキナーゼ遺伝子のシグナル伝達の重要性が着目されている。さらにヒト癌では同遺伝子の発現異常や変異が報告されている。しかし肝癌の発生・悪性化進展過程において、どのようなチロシンキナーゼ遺伝子発現に特異的変化が生じているのか明らかではない。そこで肝発癌過程におけるプロフィールを明らかにし、その局在および発癌過程における特異性と意義を検討した。【方法】DENを8週経口投与したF344ラットの肝癌組織および正常肝より抽出したRNAを用い、チロシンキナーゼ遺伝子群間で相同性の高い2カ所にdegeneratedプライマーを設定し、RT-PCRを行い、そのPCR産物をサブクローンした。1組織あたり50クローン以上のシークエンスを行い、ジーンバンクデータとのホモロジ一検索によりプロフィールを解析した。発現の認められた遺伝子に関し、RT-PCRやノーザンブロッティングでさらに解析するとともに、免疫組織化学でその局在を検討した。また遺伝子増幅や組換えの有無を確認するため、サザンブロッティングを行った。IGF-IやHGFに関しては細胞培養系にてその機能解析を行った。【成績】23種類の受容体型、15種類の非受容体型チロシンキナーゼ遺伝子の発現を認めた。その中でも、肝癌ではHGF-R(c-met)が増加し、一部の肝癌ではPDGF-RβやIGF-IRも増加していた。血管新生に関連するTie1,Tie2,VEGF-R2(flk-1)等の発現は、血管内皮に発現するとともに、癌細胞にも発現を認めた。これらはGST-Pで検出される前癌病変に一致した発現が認められた。しかし、遺伝子増幅や組換えは認めなかった。一方、これらのリガンドのうちVEGF,HGF,Angiopoietin-1の発現は正常肝・癌とも差は無かったが、Angiopoietin-2は癌組織にのみ検出された。in vitroの系ではIGF-IやHGFは抗アポトーシスや浸潤能と関与することが示唆された。
血管内皮細胞ワイベル・パラーデ小体のエンドセリン-1生合成・修飾過程に果たす役割

研究実施計画に沿って、1)培養ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を材料とし、急性低酸素曝露刺激を与え、対照群とともに電顕観察したところ、実験群HUVECのWeibel-Palade(WP)小体は有意な増加を示すことが確認された。また、培養液中のエンドセリン(ET)-1濃度を測定し、対照群と比較したところ、急性低酸素曝露群ではWP小体の増加に相関したET-1濃度の上昇がみられた。2)ラット胸大動脈から95%N_2+5%CO_2混合ガス通気Hanks液を潅流した低酸素曝露群と、95%ルームエアー+5%CO_2混合ガス通気Hanks液を潅流した対照群の腹大動脈の電顕観察により、曝露群血管内皮細胞のWP小体が有意に増加することが示された。両群腹大動脈に対して、ET-1前駆体cRNAプローブを用いたin situ hybridizationを施行したところ、曝露群内皮でET-1前駆体(big ET-1)mRNAのシグナルの有意な増強が観察され、WP小体増加とET-1産生亢進に相関性が存在することが確認された。3)抗ラットET-1変換酵素(ECE-1)抗体を作製し、その特異性を確認したのち、WP小体増加とET-1放出亢進が我々によってすでに確認されている急性カドミウム中毒ラット胸大動脈を用いて、抗big ET-1抗体、抗ET-1抗体、および抗ラットECE-1抗体を用いた免疫細胞化学を施行した。光顕免疫細胞化学により、投与群内皮において、ET-1、およびECE-1の免疫陽性反応が有意に増強すること、免疫電顕により、WP小体内のET-1およびECE-1免疫陽性金粒子の局在性はともに投与群で増強することがそれぞれ示された。以上の結果から、急性カドミウム中毒ラット胸大動脈内皮細胞においてbig ET-1は、その免疫発現の増強から産生亢進が示唆されるECE-1によってWP小体において活発にET-1にプロセッシングされ、そのWP小体を介する調節分泌の亢進が示唆された。本年度の研究実施計画に沿って、1)培養ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を材料とし、15分間および60分間の急性低酸素暴露刺激を与え、透過型電顕観察し、対照群と比較したところ、15分暴露群HUVECのWeibel-Palade(WP)小体数は増加傾向にあり、60分暴露群では有意な増加を示すことが確認された。また、培養液中のエンドセリン(ET)-1濃度を測定し、対照群と比較したところ、急性低酸素暴露群ではWP小体数の増加に相関したET-1濃度の上昇がみられた。2)ET-1前駆体mRNAの検出のために、RT-PCRに用いる特異的なプライマーの配列をヒトET-1前駆体mRNAの配列を元に設計し、オリゴヌクレオチドを合成した。HUVECから調整したpoly(A)+RNAを鋳型とし、上記プライマーを用いたRT-PCR法によりET-1前駆体cDNA断片を得た。現在、このcDNA断片のサブクローニングが進行中であり、塩基配列解析による挿入方向の確認後、in vitro transcriptionによりanti sense鎖、およびsense鎖のジゴキシゲニン標識cRNAプローブを作製する予定である。

3)データーベースよりエンドセリン変換酵素のアミノ酸配列を入手し、親水性、二次構造および他のタンパクとの相同性から、ペプチド抗原に適切なアミノ酸配列を予測し、15残基からなる合成ペプチドを作成した。この合成ペプチドをキャリアータンパクとしてKeyhole Limpet Hemocyanin(KLH)にカップリングさせ、抗原として家兎に免疫した。得られた抗血清を抗原ペプチド固相カラムによるアフィニティー精製を行い、現在、ELISA、ウエスタンブロットティングおよび免疫組織化学的解析により抗体の特異性を検討中である。本年度研究計画の大綱に沿って、1)ラット肝から調整したpoly(A)+RNAを鋳型としたRT-PCR法により得られたcDNA断片をもとにエンドセリン(ET)-1前駆体cRNAプローブを作成した。2)ラット胸大動脈から95%N_2+5%CO_2混合ガス通気Hanks液を灌流した低酸素実験群と、95%O_2+5%CO_2混合ガス通気Hanks液を灌流した対照群の腹大動脈の電顕観察により、実験群血管内皮細胞のWeibel-Palade(WP)小体数が有意に増加することが示された。両群腹大動脈に対して、ラットET-1前駆体cRNAプローブを用いたin situ hybridizationを施行したところ、実験群内皮でET-1前駆体mRNAのシグナルの有意な増強が観察され、WP小体数増加とET-1産生能に相関性があることが確認された。3)昨年度作成した抗ラットET変換酵素抗体の特異性をウェスタンブロッティングにより確認したのち、我々がすでにWP小体数増加とET-1放出亢進を確認している急性カドミウム中毒ラット胸大動脈で、抗big ET-1抗体、抗ET-1抗体、および抗ラットET変換酵素抗体を用いた免疫細胞化学を施行した。光顕免疫細胞化学により、実験群内皮において、big ET-1、ET-1、およびET変換酵素の免疫陽性反応が有意に増強すること、免疫電顕により、big ET-1免疫陽性金粒子が実験群血管内皮細胞の粗面小胞体に沈着すること、ET-1免疫陽性金粒子は実験群同細胞のWP小体内に沈着することがそれぞれ示された。以上の結果から、急性カドミウム中毒ラット胸大動脈内皮細胞において産生亢進したbig ET-1は、相関性をもって発現性を増強させたET変換酵素により活発にプロセッシングされ、ET-1としてWP小体に貯蔵される機序の亢進が想定された。
経口投与可能なＭ細胞経由型ビタミンB12内封リポソーム製剤の検討

本研究は、胃がんなどによる胃摘出後に発症するビタミンB12 (VB12)の欠乏を原因とする巨赤芽球性貧血患者のQOL向上を目的とした経口投与型VB12製剤を開発することである。胃内因子なしにVB12を生体内へ吸収させるため、ウイルスと類似構造をしている薬物キャリアであるリポソームを使用し、免疫応答に寄与している腸管上皮細胞のパイエル板に存在するmicrofold cell(M細胞)から吸収されることを期待した。マウスに投与した結果、VB12内封リポソームは水溶液に比べて血中VB12濃度を増大させ、その吸収過程にはM細胞が関与している可能性が考えられリポソーム化による有用性が示唆された。胃癌などによる胃摘出後に発症するビタミンB12欠乏による巨赤芽球性貧血患者の生活の質を向上させることを目的とした経口投与型ビタミンB12製剤の開発を目指し検討している。通常、ビタミンB12は胃内因子なしでは吸収されることがないため、ウイルスと類似の構造をしたビタミンB12内封リポソームを腸管上皮細胞のパイエル板、特にM細胞を介し吸収させようとしたものである。リポソームに内封するビタミンB12は、シアノコバラミンの活性型であるメコバラミンを選択した。リポソームの調製方法は予試験にてバンガム法と凍結融解法を実施し、サイズコントロールが容易で水溶性薬物が効率よく内封された凍結融解法にて調製した。凍結融解の繰り返し回数はリポソームの粒子径にわずかに影響を及ぼしたが、エクストルージョン法でのサイズコントロールはいずれも同様に行うことができ、約150 nmに整粒することができた。リポソームへのメコバラミンの内封効率は凍結融解の繰り返し回数の増加に伴い増大する傾向が認められた。5、7、10回の繰り返しで得られたメコバラミンの内封率はそれぞれ35、52、83%であり、10回繰り返し後の内封率は5回繰り返しに比べて約2.4倍に増大した。In vivo検討の初期段階では、腸管上皮細胞に存在するM細胞と同様のM細胞が鼻腔粘膜単層上皮細胞層にも存在することより、経鼻投与によるリポソームの吸収検討を実施することとしている。鼻腔粘膜のM細胞は腸管上皮細胞に存在するM細胞と類似の機能を有することが既に報告されている。そこで、マウスを用いた経鼻投与および鼻腔内洗浄技術を習得した。C57BL/6Nマウスにマーカーを経鼻投与し、その後鼻腔洗浄により適切に薬物を回収できることを確認した。次年度以降の検討に必要な初期検討を本年度は実施することができたと考えられ、さらに検討を重ねる。計画していた項目の多くは進めることができている。しかしながら、確実なデータとするためにはさらに詳細に検討すべき事項もあると考えていることより、達成度は8割程度であると思われる。残りの2割は次年度の検討項目に加え行う予定である。本研究は胃摘出後にビタミンB12の欠乏により発症する悪性貧血の治療を目的に、経口投与型ビタミンB12製剤を開発することを目的としている。ビタミンB12を胃内因子なしに消化管吸収させるため、薬物キャリアであるリポソーム製剤を使用することを戦略としている。リポソームはウイルスと類似構造をしていることより、経口投与後には小腸に存在するパイエル板M細胞より取り込まれることを期待している。本年度はリポソーム製剤の投与により、内封薬物が生体内へ取り込まれるか否かをカルボキシフルオレセイン(CF)をモデル薬物に選択し検討した。CF内封リポソームは凍結融解法にて調製することができ、ビタミンB12内封リポソームと同等の物性を示すことを確認し試験に用いた。最初に、小腸のM細胞と同様の取り込み能力を有し、外来抗原取り込みに重要な役割を果たす鼻腔粘膜単層上皮細胞層におけるM細胞に対するリポソームの透過性を評価した。マウスにCF内封リポソームを鼻腔内投与し、10分後の血中CF濃度および鼻腔内CF濃度を測定した結果、血中にてCFが検出され、そのレベルはCF水溶液投与群よりも約2倍高かった。さらに、投与10分後では、血中よりも鼻腔内でのCF濃度が高く、リポソーム製剤にすることにより鼻腔粘膜での滞留性が増大したことが示唆された。また、本リポソームを経口投与した場合、CF内封リポソーム投与群において血中でのCFが検出された。すなわち、リポソーム化した薬物は経口投与することで生体内への吸収が可能であることが明らかとなった。今後、本吸収がM細胞を介したものであるかを明らかにするとともに、治療効果についても検討する予定である。リポソームに内封するビタミンB12は生体内に存在する物質であることより、経口投与後に血中濃度を測定することによる吸収の確認が困難であり、未だモデル薬物としてカルボキシフルオレセインを使用していることが遅延の大きな理由となっている。カルボキシフルオレセインを使用している場合、ビタミンB12水溶液を投与した場合と大きく異なる点に水溶液でも吸収されてしまうことがある。そのため、ビタミンB12をリポソーム化することの優位性を明らかにすることができない。この点を早急に解決し検討する。胃全摘出後の患者は経口投与ではビタミンB12(V.B12)を吸収できず悪性貧血を発症することがある。

そのため、V.B12を筋肉内注射により投与し続ける必要があり、患者のQOLが損なわれる可能性がある。本研究では、消化管のパイエル板に存在するmicrofold cell (M細胞)を経由して細菌やウイルスが取り込まれることに着目し、ウイルスと構造が似ているリポソームをV.B12吸収の薬物キャリアとして用いることを目的に検討した。最終年度である本年度はV.B12の生体内への吸収・分布をマウスを用いて評価した。C57BL/6マウスに1日2回5日間連続で、経口投与した結果、血清ではV.B12水溶液(V.B12 sol.)投与群に比べてV.B12内封リポソーム(V.B12-lip)投与群のほうが高いV.B12濃度を示した。一方、腸管内容物中においてはV.B12 sol.投与群よりもV.B12-lip投与群のほうが低い濃度であった。すなわち、経口投与したV.B12-lipは消化管のパイエル板M細胞を経由し血中へ移行されたことが示唆された。脾臓中のV.B12濃度はV.B12-lip投与群のほうがわずかに低い傾向が認められた。V.B12-lip投与群において血中濃度が高く、脾臓中のレベルが低かったことより、V.B12-lipは免疫系を回避し血中を長時間滞留している可能性が考えられた。なお、本検討は正常マウスを使用しているため、胃内因子が存在する条件下で試験を実施し、V.B12 sol.投与においても胃内因子と結合することによる吸収が認められる結果となっている。しかしながら、胃全摘出後には胃内因子が欠乏しているためにV.B12sol.は吸収されない。よって、V.B12 sol.と同等以上の生体内移行が確認されたV.B12-lipは胃全摘出患者の悪性貧血治療薬として有用性が期待された。本研究は、胃がんなどによる胃摘出後に発症するビタミンB12 (VB12)の欠乏を原因とする巨赤芽球性貧血患者のQOL向上を目的とした経口投与型VB12製剤を開発することである。胃内因子なしにVB12を生体内へ吸収させるため、ウイルスと類似構造をしている薬物キャリアであるリポソームを使用し、免疫応答に寄与している腸管上皮細胞のパイエル板に存在するmicrofold cell(M細胞)から吸収されることを期待した。マウスに投与した結果、VB12内封リポソームは水溶液に比べて血中VB12濃度を増大させ、その吸収過程にはM細胞が関与している可能性が考えられリポソーム化による有用性が示唆された。研究実施計画において、鼻腔粘膜単層上皮細胞層におけるM細胞に対するリポソーム透過性を評価するために、positive controlとしてovalbuminを投与し総IgA抗体価を測定する予定であったが、このモデルの作成には1ヶ月余りを要した。これはマーカーとしてのものであることより、透過性の評価にはovalbuminではなく、蛍光色素フルオレセイン水溶液およびフルオレセイン内封リポソームを経鼻投与し、血中および鼻腔内のフルオロセイン量を測定することにより評価することとする。経口投与により吸収されないことが明らかとなっているゲンタマイシンをモデル薬物としてリポソームに内封し、リポソーム化による吸収を評価する。また、胃切除術をしたマウスや、プロトンポンプ阻害剤を投与し胃内因子の分泌を抑制したマウスを用いたin vivo検討を実施する。薬物送達を研究基盤としたリポソームへの機能性付与及び食品成分併用による医薬品の効果増強初期検討において予想よりもリポソーム構成脂質を購入せずに実施することができたため。
無細胞翻訳系を用いたＳｅｃＹＥＧトランスロコンの機能発現メカニズムの解析

昨年度までに、無細胞翻訳系によるSecYEGの再構築と、それに基づいて合成する膜タンパク質のliposome膜上でのトポロジー制御について成果をまとめ、論文発表と複数の学会での発表をすることができた。本年度は、さらに研究を発展させるべく、SecYEGの無細胞合成に必要な脂質組成の解析と、合成したSecYEGの1分子観察を行った。脂質組成の解析について、昨年度までは脂質抽出物を用いた場合でしかSecYEGの活性がみられていなかったが、脂質の脂肪酸の条件検討により合成脂質で再構成することに成功した。脂質抽出物はGiant Unilamellar Vesicle (GUV)の作成などに適さなかったため、今回得られた結果により、人工細胞システムや膜タンパク質の試験管内進化への幅広い応用が期待できる。また、昨年度に見出された糖脂質様の分子について、微量な分子なために解析が難しかったが、岩手大学西山研究室との共同研究先で引き続き解析を行って頂いている。SecYEGの膜透過活性について、基質の分泌タンパク質であるpOmpAのアミノ酸長を短くした場合に、再構成系においても膜透過のターンオーバーが検出された。詳細な速度論の解析を行うため東京大学野地研究室との共同研究で1分子観察に取り組んだ。まず、無細胞系によるSecY、SecEの蛍光標識と人工脂質平面膜上への再構成の条件を確立し、全反射顕微鏡によって観察したところ、SecYやSecEのサブユニットが単独で存在する場合も、純粋な脂質膜上では安定的に拡散することが初めて明らかになった。また、膜透過反応を観察するためpOmpAを蛍光標識して1分子観察を行ったが、脂質膜への非特異的な結合が見られた。条件検討を行ったものの、顕微鏡上に再構成する平面膜の不安定性もあり膜透過反応を解析するには至らなかったが、精製と再構成の煩雑さから1分子観察系の例が少ない膜タンパク質について、無細胞翻訳系の有用性を示す結果を得た。27年度が最終年度であるため、記入しない。大腸菌のトランスロコンであるSecYEGを無細胞翻訳系によって各遺伝子から合成し再構築する実験系を用いて、SecYEGが脂質膜上で複合体を形成し機能をもつために必要な脂質条件の解析を行った。研究を始める前の段階で、大豆由来の脂質抽出物から調整したlipo80meの場合にSecYEGの活性を確認できることが確かめられていたため、まず大腸菌由来の脂質抽出物からliposomeの調整を行った。しかし、翻訳系の塩条件ではliposomeが凝集体を形成し、解析に適さないことが判明した。そこで、合成脂質を用いてボトムアップにliposōmeを調整する手法に移行した。結果として、過去の報告と同様、SecYEGのタンパク質膜透過活性にはPE (Phosphatidylethanolamine)やPG (Phosphatidylglycerol)が必要であることが確かめられた。しかしながら、合成脂質を用いた場合の活性は大豆の脂質に比べると有意に低いことが明らかになったため、大豆脂質中にSecYEGの活性に寄与する脂質の存在が示唆された。また、複合体形成自体はPC (Phosphatidylcholine)のみのliposomeでも観察されることから、サブユニットどうしの相互作用は任意の脂質条件でおきうることが示唆された。さらに、大豆脂質中の因子を探索するため、さまざまな溶媒による分画方法についての検討から最適な分離条件を確立し、今後SecYEGの活性に関わる脂質の同定と作用機序の解析を行うための足がかりを得た。膜タンパク質複合体の翻訳とその後の膜上でのアセンブリについて、in vitroでその過程を解析した例は少なく、本研究における脂質条件の解析の成果が今後の研究の進展のために重要な知見になると考える。SecYEGの機能に関与する脂質因子の同定について、岩手大学西山研究室との共同研究のもと大豆抽出物の脂質の分画に最適な条件を見出すことに成功し、大腸菌でSecYEGとの機能相関がみられている糖脂質(MPIase)と同様な脂質がTLC上で検出された。SecYEGと特定の脂質との相互作用について種を超えた保存性を検証するため、今後、因子の同定、構造決定、機能解析を進める予定である。SecYEGの機能を制御する因子の候補として、3つの膜タンパク質(YidC, LepB, SecDF)を、大腸菌または無細胞翻訳系で発現精製するための条件検討を行った。3つのタンパク質についてPURE systemを用いた無細胞翻訳系で膜に組み込まれた形で調整できることが明らかになった。また、YidC、LepBについては、大腸菌から精製する方法も確立することができ、次年度に向けた因子の準備をある程度整えることができた。さらに、SecYEGによるタンパク質膜透過反応をリアルタイムに計測する方法として、蛍光ラベルした基質タンパク質を用いた実験系の構築を予定通り進展させることができた。これらの実験系を用いて、次年度の研究において、上記のタンパク質がSecYEGの膜透過活性に与える影響を解析する予定である。

脂質抽出物はGiant Unilamellar Vesicle (GUV)の作成などに適さなかったため、今回得られた結果により、人工細胞システムや膜タンパク質の試験管内進化への幅広い応用が期待できる。また、昨年度に見出された糖脂質様の分子について、微量な分子なために解析が難しかったが、岩手大学西山研究室との共同研究先で引き続き解析を行って頂いている。SecYEGの膜透過活性について、基質の分泌タンパク質であるpOmpAのアミノ酸長を短くした場合に、再構成系においても膜透過のターンオーバーが検出された。詳細な速度論の解析を行うため東京大学野地研究室との共同研究で1分子観察に取り組んだ。まず、無細胞系によるSecY、SecEの蛍光標識と人工脂質平面膜上への再構成の条件を確立し、全反射顕微鏡によって観察したところ、SecYやSecEのサブユニットが単独で存在する場合も、純粋な脂質膜上では安定的に拡散することが初めて明らかになった。また、膜透過反応を観察するためpOmpAを蛍光標識して1分子観察を行ったが、脂質膜への非特異的な結合が見られた。条件検討を行ったものの、顕微鏡上に再構成する平面膜の不安定性もあり膜透過反応を解析するには至らなかったが、精製と再構成の煩雑さから1分子観察系の例が少ない膜タンパク質について、無細胞翻訳系の有用性を示す結果を得た。大豆抽出物を脂質の性質に基づいて分画する方法を確立することができたが、得られた脂質を用いてliposomeを安定的に調整する最適な条件を見出すのが難しく進展が遅れている。LepBについて、その活性ドメインを可溶性で精製することを試みたが、適切な条件を見いだすことが困難だったため、不溶性タンパク質として発現したものをリフォールディングする手法をとった。そのため、活性を持った状態のLepBを大腸菌から精製する方法を見出すのに予定以上の時間を要したが、現在は、安定的に精製する条件を見出されているため、次年度以降、機能解析に進む予定である。一方で、YidC, LepBなどの膜タンパク質について無細胞翻訳系PUREsystemで膜上での配向を制御して合成する手法を確立することができたため、これまでの研究成果と合わせて論文発表することができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。SecYEGの機能に関与する脂質因子の同定について、大豆抽出物の脂質を探索したところ、大腸菌でSecYEGとの機能相関がみられている糖脂質(MPIase)と同様な脂質が見出された。今後は、MPIaseを同定された岩手大学西山教授との共同研究を行い、因子の同定、構造決定、機能解析を進める予定である。課題となっているliposome調整法については、今まで用いたFilm-Hydration法に限らず、界面活性剤を持ちいる方法など多様な手法を取り入れて検討する予定である。SecYEGの機能解析については、これまでに確立した膜透過反応の蛍光測定法を用いてリアルタイム観察を行う。
新規ミトコンドリアタンパク質Apop-1の機能解明と健康科学への応用に関する研究

我々は、動脈硬化特異的に発現が亢進するApop-1遺伝子を同定したが、この遺伝子がコードするたんぱく質はミトコンドリアに発現する。しかし、Apop-1遺伝子の病態的意義は明らかでない。本研究は、ノックアウトマウスや培養細胞による基礎研究やヒトでの遺伝子多型解析研究により、新規ミトコンドリアタンパク質Apop-1を健康科学やインスリン抵抗性の病態解明に応用しようとしたものである。Apop-1を欠損したマウスを用いた検討においては、glucose tolerance test(GTT)における血糖値と血中インスリン濃度の変化の比較から、Apop-1-KOマウス群が野生型に比し、血中インスリン濃度が高値を示した。マウス膵β細胞株であるMIN6細胞を用いた検討においては、高グルコース刺激によってApop-1 mRNA発現量が有意に低下することが明らかになった。これらの結果から、Apop-1が糖尿病の病態に関与する可能性が示された。培養内皮細胞を用いた検討から、Apop-1が高グルコース刺激によるミトコンドリアからの活性酸素種(ROS)産生のメカニズムに関与する可能性があることが示された。一方、若い女性におけるヒトApop-1遺伝子多型(rs1288943)の解析から、劣性モデルにおいて、Tアルルを有する群の血中のLPL活性がTアルルを持たない群に比し有意に低値を示すことが明らかになった。また、食事調査(DHQ)の解析から、若年女性においても、食物繊維の摂取量が多いほどインスリン抵抗性指標であるHOMA-IRや血中中性脂肪の値が低下したが、Tアルルを有する群では、食物繊維によるこのような有用な関係が認められなかった。以上より、Apop-1遺伝子多型が食習慣とインスリン抵抗性の病態との関係に影響を与える可能性が示された。1.コンディショナルノックアウトマウスおよび培養細胞での検討1)膵臓のβ細胞においてApop-1を欠損したマウスを用いたインスリン分泌機能とApop-1の関係の検討:本遺伝子改変マウスの特性によるものか、ヘテロマウスからの仔マウスの成育が予定通り進まず、マウスの準備に遅延が生じたため、平成21年10月からの研究の開始に6ヶ月の遅延が生じた。本学の動物飼育施設においても、やはり仔マウスの成育が悪いため、実験に必要な数が得られていない。1-b)MIN6細胞(β細胞)における、Apop-1siRNAを用いたインスリン分泌とApop-1の関係を検討:MIN-6細胞におけるミトコンドリアからの活性酸素種(ROS)の測定系を確立し、ミトコンドリア機能障害を誘導するAntimycin AによりミトコンドリアからのROS産生が増加することを確認した。2)心血管系細胞を用いたApop-1と血管傷害に関する検討:ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を用い、高グルコースがApop-1の発現量を増加させ、ミトコンドリアからのROSの産生を増加させること、高グルコースによるROS産生が、Apop-1siRNAによりApop-1の発現を抑制したHUVECでは消失することを明らかにした。2.ヒトApop-1遺伝子における新しい疾患感受性遺伝子多型の同定:Apop-1遺伝子SNP(rs12889403)がインスリン抵抗性と関連する結果が得られたが、有意でなく現在、n数を増やして検証中である。3.若い女性におけるApop-1遺伝子SNPと動脈硬化初期病変に関する解析:本学女子学生とその母親を対象として、Apop-1遺伝子多型(rs12889403)と身体計測値や血液検査との関係を解析したが、HOMA-IRなどのインスリン抵抗性の指標との間に有意な関係を認めなかった。

1.コンディショナルノックアウトマウスおよび培養細胞での検討1)膵臓のβ細胞においてApop-1を欠損したマウスを用いたインスリン分泌機能とApop-1の関係の検討:Apop-1-KOマウスの発育が予想外に悪く、インスリン分泌能とApop-1の関係に関する検討が十分出来なかった。このため、現在継続中である。MIN6細胞(β細胞)を用いた検討においては、ミトコンドリアからの活性酸素種(ROS)の産生量をMitoSoxの蛍光指標を用いて測定し、高グルコース刺激によるミトコンドリアからのRosの増加がApop-1siRNAで抑制されたことから、Apop-1が高グルコースによるミトコンドリアからのROS産生に関与することが示唆された。2)心血管系細胞を用いたApop-1と血管傷害に関する検討:培養内皮細胞(HUVEC)を用いて、高グルコースによるミトコンドリアからのROS産生がエイコサペンタエン酸(EPA)を前処理すると抑制されたが、このEPAの作用は、抗老化因子SIRT1のsiRNAを処置したHUVECでは消失した。このことから、EPAの作用にSIRT1が関与することが示唆された。現在、SIRT1とApop-1の関係を解析中である。2.若い女性におけるヒトApop-1遺伝子多型と生活習慣病リスク因子に関する解析本学女子学生とその母親を対象として、Apop-1遺伝子多型(rs12889403)と身体計測値や血液検査との関係を解析した。Tアリルを有する群と有さない群の2群で比較したところ、Tアルルを有する群の血中のLPL活性が有意に低値を示し、LPLと血液の相関ではアディポネクチンとHDLコレステロール値の間に正の相関が見られた。母親では、さらにHOMA-IR値との間に負の相関が出現した。以上、Apop-1遺伝子多型は女性において血中のLPL活性と関連すること示唆された。1.コンディショナルノックアウトマウスおよび培養細胞での検討1)膵臓のβ細胞においてApop-1を欠損したマウスを用いたインスリン分泌機能とApop-1の関係の検討:glucosetolerance test (GTT)を実施し、血糖値と血中インスリン濃度の変化を野生型マウスと比較検討した。その結果、血糖値は両群間で有意な差を認めなかったが、血中インスリン濃度において、Apop-1-KOマウス群が野生型に比し、高値を示すことが明らかになった。MIN6細胞(β細胞)を用いた検討においては、高グルコース刺激によってApop-1 mRNA発現量が有意に低下することが明らかになった。これらの結果から、Apop-1が糖代謝の制御機構に関与する可能性が示された。また、EPAは、phospho-eNOSの発現量を増加すること、この作用が、SIRT1のsiRNAを処置したHUVECでは消失した。