hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
水疱性類天疱瘡におけるT細胞サブセットの解析と治療法の開発

アクティブBPマウスモデルの抗COL17抗体の抗体価は脾細胞移植後Day9でピークを迎えることはすでに報告済みである(Ujiie H, et al. J Immunol 2010)。従って、モデルマウスの血清をDay2-9まで連日採取しサイトカインの継時的変化をCBA法で測定したところ、前述のようにTh1型の反応がみられた。次に、アクティブBPマウスモデルのリンパ球を採取しCOL17リコンビナントタンパクで刺激したものの、刺激による増殖反応は見られなかった。植皮によって暴露されるCOL17抗原と、リコンビナントタンパク抗原の立体構造の違いなどが原因として考えられる。リンパ球のmRNAは採取済みであるので、今後、サイトカインmRNA発現量を測定する予定である。2)IL-12KOマウスおよびIL-4KOマウスを用いた抗体産生誘導いずれのKOマウスにおいても植皮による抗体産生誘導実験を予定通り実施した。各KOマウスに誘導される抗体価が野生型マウスと差がなかった点は非常に興味深い。誘導された抗体のIgGサブクラスは予想通りIL-4KOマウスではTh1型を、IL-12KOマウスではTh2型を示していた。サブクラスが違うと補体活性化能も異なると考えられることから、免疫した各ノックアウトマウスの脾細胞を移植してモデルマウスを作製した場合にどのような表現型の差が生じるか注目される。以上より、研究は全体を通して概ね計画通り進行していると考える。当初の計画どおり、IL-12KOマウスおよびIL-4KOマウスに植皮して免疫し、その脾細胞を用いてアクティブBPマウスモデルを作製する。その表現型を、以下の方法で詳細に解析する。a)血清中の抗ヒトCOL17IgG抗体価の測定(週1回、ELISA法および間接蛍光抗体法)。b)血清IgE値の測定(適宜、ELISA法)。c)血清IgGのサブクラスの解析(適宜、間接蛍光抗体法)。d)組織学的検索(移植後5週目、HE染色およびトルイジンブルー染色)。e)皮膚への抗体沈着の確認(適宜、直接蛍光抗体法)。f)皮疹の経時的変化(週1回観察)。g)血清サイトカインの測定(適宜、CBA法あるいはELISA法)。これらを観察することで、BPにおけるサイトカインおよびT細胞サブセットの役割をin vivoで明らかにする。さらに時間的に余裕があれば、免疫したKOマウスのCD4+T細胞を精製し、免疫していない野生型マウスの脾細胞と混合してレシピエントマウスに移植し表現型を観察する予定である。我々は、免疫したマウスのCD4+T細胞が野生型マウスの脾細胞を活性化し、レシピエントマウス体内で抗COL17抗体を産生することを最近報告した(Ujiie H, et al. Clin Immunol 2012)。同様の手法を用いることで、サイトカインKOマウスのCD4+T細胞の役割をより詳細に明らかにしたいと考えている。以上の実験で得られた結果を取りまとめ、成果の発表を行う。研究実施の都合上、予定していた学会に参加しなかったものがあったため、その研究費の一部を消耗品に充当し、最終的に約5万円の次年度使用額が生じた。
教科「体育」における運動技能学習とマルチメディア活用の有効性に関する実践的研究

【内容】運動技能学習におけるマルチメディア教材を用いた視覚的なフィードバック効果を実践的に検討するため、スポーツ活動中の動画や静止画に文字情報や線画情報等が挿入されたマルチメディア教材(1:野球のバットスイング、2:バスケットボールのドリブルターン、3:剣道の面打突と間合学習)を作成し、その呈示方法の違いと学習者に表象化される運動質および学習効果の関係を自作した運動要素の表象化に関する評価得点および運動技能評価得点より検討した。【結果】1:大学生男子を対象に、バットスイング示範画像の再生速度(通常速度・コマ送り・スロー)と学習者に表象化される運動質の関係を検討したところ、通常の再生速度による画像呈示は他の再生速度に比べて空間的要素(運動の大きさや身体の状態の違い)の表象化で劣っていたが、時間的要素(運動の速さ・リズム・タイミング)については有効であった。また、力動的要素(力の強弱や筋の緊張度)の表象化は、どのような再生速度においても促進されなかった。2:大学生男子を対象に、ドリブルターン動作の示範観察後に技術練習した際の技術習熟について、実際の示範動作の観察および自作したマルチメディア教材の示範を観察した場合で比較したところ、学習者の観察条件に対する主観的評価は運動質の看取りや練習課題の持ち方の面においてマルチメディア教材を用いた学習方法の評価が高かった。一方、ドリブルターン技能の実際の習熟については、事前テストに比べて事後テストの技能の評価得点は明らかに向上していたが、両観察条件後に技術練習した際の技術習熟度についてはその評価得点に違いは認められなかった。3:小学生高学年および低学年を対象に、各児童の試技動作を素材としたマルチメディア教材を用いた剣道指導を実施し、その後の剣道の面打突動作と間合学習の効果について対人的な距離認知の面から検討したところ、指導期間前に比べて指導期間後は対人間距離の再現性が明らかに高く、剣道の間合に関する距離的認知に学習効果が認められた。本年度は、次年度以降の研究計画を円滑に遂行するため、対象となるスポーツ種目を「剣道」とし、その基礎的検討および今後のモデルとなるマルチメディア教材の立案・製作を行う上での準備を行った。研究実績の概要は以下の通りである。研究実績の概要:小学生年齢の剣道学習者26名(年齢10.58±1.36歳)を対象に、剣道における「一足一刀の間合」の理解を学習内容とした指導を約1時間、計7回実施した。マルチメディア教材は指導時間毎に活用した。マルチメディア教材は、学習者の画像情報をパソコン等で動画として加工し、文字情報や静止画情報と同時に学習者に提示が可能な内容で構成した。マルチメディア教材活用に伴う間合学習の効果については、対人間距離を依存変数とし、対人的な距離認知の面から検討した。その結果、小学校高学年、低学年ともに練習参加回数の多かった児童グループの対人間距離の再現性は、練習期間前に比べて練習期間後は明らかに高く、自己の間合における距離的認知に学習効果が認められた。また、練習期間終了1ヶ月後に調査した学習内容に関する調査結果を基に、各児童の対人間距離の再現性を比較したところ、高学年、低学年ともに、練習期間中に指導された学習課題が記憶出来ていたグループの対人間距離の再現性は練習期間前に比べて練習期間後は明らかに高く、距離的認知に学習効果が認められた。これらのことは、小学生年齢の剣道学習者における「間合」指導の可能性とマルチメディア教材活用の有効性を示唆している。

すなわち、剣道における自己の「間合」の理解や獲得は、従来はその指導法が確立されていなかったことから各学習者の経験的自助努力に委ねられてきたものの、本研究で実施したような間合の習得に焦点化した指導をマルチメディア教材を活用して行うならば、短期間でも対人間距離としての「間合」は学習が可能と考えられる。また、学習活動では、児童自らの学習意欲が技術向上に関係していることから、今後のマルチメディアの活用については、学習活動に対するメタ認知や内化を促進するような教材内容をさらに工夫することが必要と考える。本年度は、マルチメディア教材を用いた画像の呈示方法や再生条件と学習者の運動表象の関係について検討した。1.マルチメディア教材:野球のバットスイング動作を観察対象とし、動画による示範教材を作成した。教材の作成に際しては、2動画同時提示が可能な画像処理ソフト(OTL-8PX)を用いた。被験者には、成人の野球経験者10名(年齢21±0.89歳,経験年数9.8±3.28年)および野球未経験者10名(年齢22.4±1.35歳)計20名を用いた。2.教材の呈示方法と再生条件:示範の動画を単画面で呈示する場合、示範動画と被験者の動画を同期させて並列呈示する2動画同時呈示の場合で行った。また、それぞれについて通常再生、スローモーション、コマ送り、被験者の求める線画惰報等を挿入して再生する(:任意作図)4つの再生条件で呈示した。3.学習者における運動表象:運動表象に関わる空間的要素、時間的要素、力動的要素各2項目からなるイメージ形成に関する質問紙を作成した。各呈示方法・再生条件でパソコン上の教材を観察した後、各要素別の質問項目に対し「イメージできた」から「イメージできなかった」の5段階で評定を求め、2要因分散分析を行った。4.結果:(1)単画面呈示による示範画像を観察した際には、野球経験の有無に関わらず、バットスイング動作の大きさや位置関係などの空間的要素を観察する上では、通常再生による画像呈示は、他の再生方法に比べて最も評価が低く(P<.05)、リズムやタイミング、あるいはスピードや流れなどの時間的要素を観察する上では、通常再生はコマ送りよりも評価が高かった(P<.05)。しかし、動作中の筋の緊張や弛緩などの力動的要素を観察する上では、各再生条件における評価に差は認められなかった。また、(2)2画面同時呈示によって示範と自分のスイング動作を比較した際の評価においても、野球経験の有無に関わらず、空間的要素の違いの観察は通常再生による画像呈示が他の再生条件に比べて最も評価が低く(P<.05)、時間的要素の違いを把握する場合も通常再生はスローや任意作図よりも評価が低い(P<.05)という結果であった。さらに、力動的要素の違いを観察する場合も、通常再生による画像呈示が他の再生条件に比べて最も評価が低かった(P<.05)。今後は、異なる情報や強調点などの呈示が運動観察・学習にどのように影響するかを検討することが課題である。本年度は、バスケットボールのクロスオーバードリブルにおけるボールの切り換え局面を観察対象とし、運動観察後に技術練習した際の習熟の程度および観察された運動表象の内容について実際の示範動作の観察および示範動作と各被験者の動作をパソコン画面上に同時呈示できるマルチメディア教材による画像観察の2条件から検討した。
出土資料の分析による古代東アジアの服飾制度と社会秩序

18世紀は東アジア全体の政治・社会・文化が変化した時代である。本研究では、後漢・魏晋南北朝時代・初唐・盛唐にいたる時期(18世紀)の中国やその他東アジア各国の服飾の諸相を、主として出土文物をデジタル化(JPEGファイル)された画像資料として収集した。デジタル化した資料は壁画・画像磚・人物俑などを含み、2011年3月時点で、総計7721点に上る。これをもとに、18世紀における東アジア、特に中国における服飾史についての基礎的な見通しを発表した。本研究は、紀元後1世紀頃から8世紀頃の間(中国史で言えば後漢盛唐時代)の、東アジア各国(主として高句麗などの朝鮮半島諸国、及び日本列島、できれば新彊を含む内陸アジア)における社会の変化を、出土資料を活用しつつ、服飾の変化という観点から分析・考察見していこうとするものである。H20年度は下記のような内容で研究を進めた。(1)中国史の資料として、漢代から唐代に至るまでの画像資料(壁画・人物俑など)、及び東アジア諸国に関.しても同時期の画像資料を収集した。(2)収集した画像資料について服飾史研究に必要な部分をスキャンし、デジタル化した。(3)その他、かつて自分が撮影した画像資料についても、必要な部分をデジタル化した画像資料として整えた。(4)デジタル化した資料を作成された時代、出土地点などを基準に整理した。本研究は、紀元後1世紀頃から8世紀頃の間(中国史で言えば後漢盛唐時代)の、東アジア各国(主として高句麗などの朝鮮半島諸国、及び日本列島、できれば新疆を含む内陸アジア)における社会の変化を、出土資料を活用しつつ、服飾の変化という観点から分析・考察見していこうとするものである。平成21年度は、下記のような内容で研究を進めた。(1)初年度に引き続き、中国史の資料として、漢代から唐代に至るまでの画像資料(壁画・人物俑など)、及び東アジア諸国に関しても同時期の画像資料を、図録などを購入して収集した。収集した画像資料について服飾史研究に必要な部分をスキャンし、デジタル化した。(2)本年度は、補助金を使用して、通訳及び撮影助手各一名を帯同して、中国出張を2回行った。1回目は遼寧省の瀋陽市の遼寧省博物館と遼陽市の遼陽博物館であり、2回目は陜西省西安市の陜西省博物館と西安博物院、及び臨潼の兵馬俑博物館である。また、私費にて河南省を旅行した際には洛陽博物館及び洛陽古墓(古代芸術)博物館を訪問し、四川省を旅行した際には、成都市の四川省博物館と広漢市の三星堆博物館を訪問し、人物俑などを大量に撮影することができた。(3)現在(平成22年4月時点)までに、後漢時代から盛唐時代に至るまでの服飾関係資料を約6500点の画像データとして収集することができた。図録や現地撮影によってデジタル化した資料を、作成された時代、出土地点などを基準に整理したその際、大学院生を雇用して、画像データの整理を行わせた。平成22年度は、下記のような内容で研究を進めた。平成20年度・21年度に引き続き、中国史の資料として、漢代から唐代に至るまでの画像資料(壁画・人物俑など)、及び東アジア諸国に関しても同時期の画像資料を、図録などを購入して収集した。本年度は新出文物の他に、甘粛各地の画像磚のうち未収集のものや、敦煌壁画を重点的にスキャンした。現在(平成23年4月時点)までに、後漢時代から盛唐時代に至るまでの服飾関係資料として約7200点の画像データとして収集することができた。一年前に比して約700点ほどが増加したことになる。また、大学院生を雇用して、デジタル化した資料を、作成年代・出土地点などを基準に整理した。また、今年度は上海に出張を行い、上海博物館の文物を調査し、華東師範大学にて学術交流を行った。
ヒト腎疾患における肝細胞増殖因子(HGF)の発現とその調節機構に関する研究

肝細胞増殖因子(HGF)は組織再生因子として肝臓をはじめ腎臓でも機能していることが明らかになっており、ヒト腎疾患においても何らかの役割をもっていることが推測されている。今回ヒト腎疾患における肝細胞増殖因子(HGF)の発現とその調節機構に関する研究を行った。まずいくつかの腎疾患患者の血中HGF濃度を測定してみた。コントロール健常者の血中HGF濃度に対し、腎細胞癌(RCC)群及び術後安定期の腎移植レシピエント(Tx)群では有意な上昇が認められた。RCC群についての腫瘍の進展度別の比較では、進行例ほど高値を示す傾向が認められた。また腎梗塞及び急性腎不全の症例についても発症後早期の血中HGF濃度がいずれも上昇しており、その後の腎機能の回復に伴い下降する傾向を認めた。つまり急性尿細管壊死(ATN)によりHGFが合成され、傷害された尿細管細胞の増殖に働いていると考えられる。in situ hybridization及び免疫染色の結果HGFは、障害部近傍の血管内皮細胞やマイクロファージで産生されることも判明しパラクライン機構により作用していると考えられるが、腎障害時に無傷は肺でHGFのmRNAの発現増加が見られることや、経静脈的HGF投与により尿細管細胞の増殖が促進され腎障害の程度もおさえられることからエンドクリンによる作用機序も考えられた。又我々は腎嚢胞形成におけるHGFの役割についても検討を行った。腎嚢胞液のimmunoceactive HGF濃度は血清に比べ約10倍の濃度を持ちMDCK細胞の形態形成を誘導した。一方、単純性腎嚢胞液をHeparin-Sepharoseでわけ、ラット初代培養肝細胞のDNA合成に対する影響を調べたところ、DNA合成促進活性は認められなかった。HGFが果たして嚢胞形成因子の1つといえるかどうか現在さらに検討中である。HGFは腎再生因子として、重要な役割を果たしており、我々は、ヒト腎疾患とHGFの関わりを明らかにすべく血中HGF濃度を測定した。健常ドナー血中HGFが0.27±0.08ng/mlを示すのに対し、急性腎不全、腎梗塞症例で発症早期に各々0.74ng/ml、1.10ng/mlという高値を示し、経過とともに正常レベルへの回復がみられた。安定期レシピエントにおいても平均0.55±0.35ng/mlと有意な高値を示し、血清Cr値と相関を示した。さらに腎移植レシピエントの慢性拒絶反応で尿中FDP、尿蛋白、血清CrとHGF値との間に相関をみとめるか現在検討中である。また腎細胞癌症例についても0.51±0.35ng/mlというHGF値上昇がみとめられた。一方単純性腎嚢胞液中の嚢胞形成促進因子について、HGFがその主要な構成因子であることをMDCK細胞を用いたコラーゲンゲル包埋法にて証明した(第37回日本腎臓学会シンポジウム)。今回ヒト腎疾患ににおける肝細胞増殖因子(HGF)の発現とその調節機構に関する研究を行った。また腎梗塞及び急性腎不全の症例についても発症後早期の血中GF濃度がいずれも上昇しており、その後の腎機能の回復に伴い下降する傾向を認めた。

つまり急性尿細管壊死(ATN)によりHGFが合成され、傷害された尿細管細胞の増殖に働いていると考えられる。in situ hybridization及び免疫染色の結果HGFは、障害部附近の血管内皮細胞やマクロファージで産生されることも判明しパラクライン機構により作用していると考えられるが、腎障害時に無傷は肺でHGFのmRNAの発現増加が見られることや、経静脈的HGF投与により尿細管細胞の増殖が促進され腎障害の程度もおさえられることからエンドクリンによる作用機序も考えられた。又我々は腎嚢胞形成におけるHGFの役割についても検討を行った所腎嚢胞内液のHGF濃度は血清に比べ、10倍の濃度を持ち、嚢胞形成因子の1つと考えられた。
海洋微生物による酸化的メタン生成：好気性メタン酸化菌にメタン生成能はあるか？

有機リン化合物であるホスホネートは海洋における好気的メタン生成の謎を解く鍵物質として、また海洋微生物の貴重なリン源として近年注目されている。本研究ではメタン酸化細菌を含む複数の海洋微生物の単離株を用いた培養実験と、それらのゲノムの全塩基配列解析を通して、アルキルホスホネートが多くの海洋微生物にとってリン源として利用される可能性を示すと同時に、新規アルキルホスホネート分解酵素遺伝子の候補を見出した。一部の海洋微生物が唯一のリン源としてホスホン酸類を利用できること、またその至適濃度について培養実験により確認した。実験には海洋性の好気的メタン酸化細菌3株(Methylomarinum属、Methylomarinovum属、Methylobacter属)、海洋性硫黄酸化細菌2株(Thiomicrospira属、Sulfurivirga属)を用いた。まずメタン酸化細菌3株がメチルホスホン酸をリン源として利用できることを確認し、その至適濃度範囲から1 mMを規定添加濃度とした。硫黄酸化細菌2株も1 mMメチルホスホン酸添加培地で良好に生育すること、また上記5株がメチルホスホン酸同様、エチルホスホン酸をリン源として利用できることも確認した。本結果から、予想していたよりも多くの海洋微生物がホスホン酸類をリン源として利用できると推察される。次にホスホン酸類の利用に伴うガス生成の有無を確認するため、Methylobacter属細菌株およびThiomicrospira属細菌株を、エチルホスホン酸をリン源として密閉ガラスバイアル内で培養し、培養後の気相をガスクロマトグラフ(GC)により分析した。しかし気相からは、生成が予想されたエタンは検出されなかった。原因として、1,細胞増殖に必要なホスホン酸量が少なく、生成するエタン量が検出限界以下である、2,エチル基が細胞に固定されるためエタンガスとして細胞外へ放出されない、という2つの可能性が考えられる。この2つの可能性を検証するため、今後、より高感度なGCによる再測定や、同位体標識基質を用いた実験により、ホスホン酸類が代謝される際の炭素の行方を明らかにする予定である。唯一のリン源としてメチルホスホン酸およびエチルホスホン酸を利用することができる海洋性メタン酸化細菌、Methylobacter marinus MR-1株とMethylomarinum vadi IT-4株の全ゲノム塩基配列を解析した。これら2株のゲノム配列からホスホン酸代謝関連遺伝子を探索したところ、"アルキルホスホネート利用関連遺伝子phnA"としてアノテーションされている遺伝子のみが検出された。通常phnAはホスホノ酢酸分解酵素遺伝子のことを指すが、解析した2株から検出されたphnA遺伝子はホスホノ酢酸分解酵素遺伝子とは全く相同性がなかった。データベース上の配列との相同性を解析すると、多様な細菌が本メタン酸化細菌株と類似のphnA遺伝子を有していることが分かったが、この遺伝子産物の活性や基質を証明した研究はこれまで報告されていない。MR-1株とIT-4株のphnA遺伝子配列長はそれぞれ342 bpと585 bpと異なっているが、翻訳アミノ酸配列はidentityが35.1%、similarityが76.6%と高い相同性を示すことから、その機能に類似性があると推察される。またそれぞれの遺伝子について、同等の配列長の該当遺伝子がデータベース上で多数検出され、この未知の遺伝子が系統的に多様な細菌に分布していることが示唆された。これまでに知られているアルキルホスホネート分解酵素遺伝子は、14遺伝子からなるクラスターを形成している。しかしMR-1株とIT-4株から検出された遺伝子phnAはクラスター構造は形成していないと推察される。以上の結果から、メタン酸化細菌から検出されたphnA遺伝子は新規アルキルホスホン酸分解酵素であると推察される。近年、海洋微生物のリン源として、有機リン化合物であるホスホン酸類が注目されている。しかし安定なC-P結合を含むホスホン酸類を分解しリン源として利用できる微生物種と、それらが有する分解酵素の種類と反応機構については、研究例が非常に少なく理解が進んでいない。ホスホン酸類の中でも特にメチルホスホン酸は分解されると副産物としてメタンが生成することから、海洋のメタンパラドックスを解く鍵物質としても重要である。本研究では、異なる系統の複数の海洋性メタン酸化細菌と海洋性硫黄酸化細菌が、メチルホスホン酸とエチルホスホン酸をリン源として利用できることを明らかにしたが、生成するメタンおよびエタンの代謝経路の解明は今後の課題として残った。本研究でアルキルホスホン酸分解酵素遺伝子の候補として挙がったのは、phnA相同遺伝子である。phnAはホスホノ酢酸分解酵素遺伝子とアノテーションされているが、本研究からは、この遺伝子がアルキルホスホン酸分解酵素遺伝子である可能性が示唆された。またデータベースに公開されている細菌全ゲノム情報の中からphnA相同遺伝子を探索すると、幅広い系統の細菌にphnA相同遺伝子が分布していることが分かった。このことから、ホスホン酸類代謝能を有する微生物が自然界に遍在していることが予想される。今後、このphnA相同遺伝子の基質特性を明らかにすることで、自然界におけるホスホン酸類利用の実態とリン動態についての理解が深まることが期待される。

本研究ではメタン酸化細菌を含む複数の海洋微生物の単離株を用いた培養実験と、それらのゲノムの全塩基配列解析を通して、アルキルホスホネートが多くの海洋微生物にとってリン源として利用される可能性を示すと同時に、新規アルキルホスホネート分解酵素遺伝子の候補を見出した。この1年の間に全ゲノム塩基配列決定のための実験環境が整ったことにより、当初は計画していなかった菌株の全ゲノム塩基配列解析を行うことができた。その解析結果からホスホン酸代謝関連遺伝子を容易に見つけることができ、探索にかける時間と手間が省けた。環境微生物学海洋性メタン酸化細菌MR-1株から検出された、新規アルキルホスホン酸分解酵素遺伝子と推察される遺伝子phnAについて、その産物が実際にメチルホスホン酸およびエチルホスホン酸分解活性を持つかどうか明らかにする。塩基配列を翻訳したアミノ酸配列には細胞膜貫通領域は見当たらないことから、phnA遺伝子産物は可溶性タンパクであると推察される。そこで、大腸菌を用いて大量発現し精製したタンパクを用いて、メチルホスホン酸およびエチルホスホン酸の分解活性、またそれに伴うメタンおよびエタンの生成の有無を調べるなどの方法を検討する。また、MR-1株やIT-4株などphnA遺伝子を有する細菌について、ホスホン酸類をリン源に生育させた際のphnA遺伝子発現量の増加を、定量PCR法により調べる。以上の方法により活性が認められた場合には、同位体基質を用いて生成するメタンおよびエタンがどのように代謝されるのか明らかにする。研究実施計画通り、海洋性のメタン酸化細菌について、リン酸に代わる唯一のリン源としてのホスホン酸の利用とその至適濃度を確認できた。また計画には記載しなかったが、海洋における独立栄養細菌の代表として、硫黄酸化細菌についてもホスホン酸を利用することを確認できた。これは本研究を今後発展させる上で大変有用なデータである。一方、ホスホン酸利用(分解)に伴うガス生成の有無を見極める方法についてはまだ検討の余地がある。したがって総合的には、概ね順調に進展しているとの自己評価をつけた。本研究予算で購入を予定していた試薬や機器を他の研究予算で購入できることになったため、次年度使用額が生じた。微生物のホスホン酸利用(分解)に伴うガス生成の有無を明らかにするため、ガスの検出を容易にするための培養系および分析手法の再考を行う。またメチルホスホン酸およびエチルホスホン酸の分解により遊離すると考えられるメチル基およびエチル基が、微生物によりどのように代謝されるのかを明らかにするため、同位体標識化合物を用いて解析を行う。微生物が有機リン化合物をリン源とする場合の、その炭素部分についての代謝に関する知見はないため、もし独立栄養微生物が有機リン化合物の炭素を細胞炭素として細胞に固定するならば、すなわちそれは従属栄養的な代謝を意味する。これは微生物生態学的には重要な意味を持つため、当初の研究目的とは外れるが解明すべき課題であり、可能な限り本研究で明らかにしたいと考える。当初の計画では予定していなかった生化学的解析を追加的に行う予定なので、その解析に必要な試薬等の購入費用にあてる。
南部北上帯の形成と古地理的変遷に関する研究

南部北上帯の形成と古地理的変遷を明らかにするために,(1)南部北上帯の古生代構造発達史,とくに南部北上帯の基盤形成に関わる前期古生代構造発達史に関して検討し,と中朝地塊・揚子地塊・オーストラリア地塊などとの構造発達史的比較研究を行った.(2)頭足類化石の古生物地理にもとづく後期古生代前期中生代の各年代ごとの古生物地理区に関する研究を行い,(1)の成果とあわせて南部北上帯の古地理を復元した.この研究で,南部北上帯(南部北上古陸)は付加体を原岩とする前期古生代の高圧型変成岩や,沈み込みに関連する,約440Maの深成岩類などからなるカレドニア基盤をもち,非変成の浅海成中部古生界がそれらを覆っていることが明らかにされた.この南部北上古陸の古生代構造発達史に関する知見とテチス東部地域のいくつかの陸塊のそれとの比較の結果,および古生物地理に関する資料をあわせ考えると,現時点では,前期古生代の南部北上古陸の形成場所としては,ゴンドワナ大陸北縁の,オーストラリアと華南ないしインドシナの両者に近接した位置,例えば両者にはさまれた地帯を考えるのが妥当であるという結論を得た.ペルム紀三畳紀アンモノイド群集の解析の結果,南部北上古陸は中期後期ペルム紀にテチス赤道区に属し,揚子地塊に近接しており,より高緯度にあった中・朝地塊とはやや離れていたことがわかった.また,中期ペルム紀のチモール,後期ペルム紀のハンカ地塊も南部北上古陸と同一のアンモノイド地理区に属していた可能性が大きい.このような中国南部・ハンカ・南部北上古陸の3者の密接な古地理的関係,とくに後2者のそれは少なくとも中期三畳紀まで続いており,南部北上古陸は,中国南部とともに,中生代に入って北上を始めたと考えられる.南部北上帯の形成と古地理的変遷を明らかにするために,(1)南部北上帯の古生代構造発達史,とくに南部北上帯の基盤形成に関わる前期古生代構造発達史に関して検討し,と中朝地塊・揚子地塊・オーストラリア地塊などとの構造発達史的比較研究を行った.(2)頭足類化石の古生物地理にもとづく後期古生代前期中生代の各年代ごとの古生物地理区に関する研究を行い,(1)の成果とあわせて南部北上帯の古地理を復元した.この研究で,南部北上帯(南部北上古陸)は付加体を原岩とする前期古生代の高圧型変成岩や,沈み込みに関連する,約440Maの深成岩類などからなるカレドニア基盤をもち,非変成の浅海成中部古生界がそれらを覆っていることが明らかにされた.この南部北上古陸の古生代構造発達史に関する知見とテチス東部地域のいくつかの陸塊のそれとの比較の結果,および古生物地理に関する資料をあわせ考えると,現時点では,前期古生代の南部北上古陸の形成場所としては,ゴンドワナ大陸北縁の,オーストラリアと華南ないしインドシナの両者に近接した位置,例えば両者にはさまれた地帯を考えるのが妥当であるという結論を得た.ペルム紀三畳紀アンモノイド群集の解析の結果,南部北上古陸は中期後期ペルム紀にテチス赤道区に属し,揚子地塊に近接しており,より高緯度にあった中・朝地塊とはやや離れていたことがわかった.また,中期ペルム紀のチモール,後期ペルム紀のハンカ地塊も南部北上古陸と同一のアンモノイド地理区に属していた可能性が大きい.このような中国南部・ハンカ・南部北上古陸の3者の密接な古地理的関係,とくに後2者のそれは少なくとも中期三畳紀まで続いており,南部北上古陸は,中国南部とともに,中生代に入って北上を始めたと考えられる.1.南部北上帯の形成と古地理的変遷を明かにするために,(1)南部北上帯の先シルル形基盤岩類の形成過程・年代,(2)南部北上帯の古生代前期中生代古生物地理区,とくに頭足類古生物地理区に関する研究を行った.2.(1)に関しては,主として南部北上帯西縁部に分布する松ケ平・母体変成岩類・正法寺閃緑岩と上部デボン系鳶ケ森層について野外地質調査を行い,地質図を作成した.採集した研究用試料試料については,岩石薄片を作製し検鏡するとともに,化学分析を行い,化学組成について検討した.また,放射年代測定試料を作製し,年代測定を依頼した.正法寺閃緑岩の3試料のホルンベレンドについては,434【minus-plus】20,440【minus-plus】20,432【minus-plus】20 MaというK-Ar年代が得られた.この年代値は,野外での観察から得られた正法寺閃緑岩の層位的位置,正法寺閃緑岩は松ケ平・母体変成岩類より若く,上部デボン系より古いという位置づけと矛盾しない.する.すなわちこの年代(オルドビス紀後期)を正法寺閃緑岩の年代と考えることが妥当であることがわかり,南部北上帯の形成期の構造発達史に関する重要な資料3.(2)に関しては,南部北上山地の主要地域,とくに気仙沼周辺地域のペルム紀三畳紀頭足類化石の産出層準の地質調査と頭足類化石の採集を行った.従来頭足類の資料がなかった下部ペルム系および資料が極めて少なかった中部ペルム系上部からまとまった標本を採集することができた.

このうち下部ペルム系中平層の頭足類群巣について記載し,報告した(Ehiro,1995).中期ペルム紀の群巣については公表準備中であるが,当時の低緯度地域に特有の群衆組成を示している.1.南部北上帯の形成と古地理的変遷を明らかにするために,(1)南部北上帯と中朝地塊・揚子地塊・オーストラリア地塊などとの構造発達史的比較研究および(2)頭足類化石の古生物地理にもとづく後期古生代前期中生代の各年代ごとの古生物地理区に関する研究,を行い,それらにもとづき南部北上帯の古地理を復元した.2.この研究で,南部北上帯(南部北上古陸)は付加体を原岩とする前期古生代の高圧型変成岩や約440Maの深成岩類などからなるカレドニア基盤をもち,非変成の浅海成中部古生界がそれらを覆っていることが明らかにされた.この南部北上古陸の古生代構造発達史に関する知見とテチス東部地域のいくつかの陸塊のそれとの比較の結果,および古生物地理に関する資料をあわせ考えると,現時点では,前期古生代の南部北上帯(南部北上古陸)の形成場所としては,ゴンドワナ大陸北縁の,オーストラリアと華南ないしインドシナの両者に近接した位置,例えば両者にはさまれた地帯を考えるのが妥当であるという結論を得た.3.ペルム紀三畳紀アンモノイド群集の解析の結果,南部北上古陸は中期後期ペルム紀にテチス赤道区に属し,揚子地塊に近接しており,より高緯度にあった中・朝地塊とはやや離れていたことがわかった.また,中期ペルム紀のチモール,後期ペルム紀のプリモ-リエも南部北上古陸と同一のアンモノイド地理区に属していた可能性が大きい.このような中国南部・プリモ-リエ・南部北上古陸の3者の密接な古地理的関係,とくに後2者のそれは少なくとも中期三畳紀まで続いていた.
ジョージェスクレーゲンの消費者理論の再評価とその資源環境問題への適用に関する研究

最初に、これまで標準経済学の理論展開の中で十分に吟味されたことのないジョジェスクレーゲンの消費者理論を持続可能性の問題に関連付けて詳細に検討した。具体的には、次の12項目である:(1)ヴォルテッラのパラドックス;(2)欲求の階層性;(2)辞書式順序;(4)比較可能性と順序学派の辞謬;(5)貨幣の限界価値;(6)欲求を同一次元で表現することの可否;(7)方向的選択と不可逆性;(8)非選好方向の継続;(9)選好の移転原理;(10)効用の測度;(11)推移律と積分可能性;(12)2項選好。本研究で得られた成果の主なものは次の2点である。1飽和領域(それが閉凸であることば証明されている)における消費者理論を構築した。そこでは、新古典派資源環境経済学で仮定されているような一般的な効用関数は存在しないことを示した。2線型連続列は次の3つの公浬を満たす:(1)デデキントの公理;(2)密度の公理;(3)線型性の公理。辞書式順序はこのうち、線型性の公理を満足しないことを証明した。人間に消費される環境財の多くは辞書式順序を持つカテゴリーに属する。このカテゴリーの財には標準的な効用関数を定義することができず、CVMを利用することができない。研究成果は次の国際会議で発表された。専門雑誌にも投稿する予定である。ジョージェスクレーゲンの消費者選考理論は、新古典派経済学の最重要な貢献と見なされてきた。ところが、彼の理論が仮想市場評価法(CVM)の再評価に貢献できる可能性についてこれまで十分な研究がなされてきたとはいいがたい。我々の研究は、ジョージェスクレーゲンの消費者選考理論の中で標準理論に取り入れられていない部分を詳細に検討し、資源環境財の貨幣評価に批判的検討を加えることを目的にする。まず、飽和領域が凸閉領域である一般的なケースについて、効用関数の積分可能性について検討した。これは、ジョージェスクレーゲンが研究したヴォルテラのパラドックスの一般化であり、消費者理論の4つの基本的仮定を満足しない場合に標準的理論がどのように修正されるかを明らかにした。また、欲求の階層性のひとつの数学的表現である辞書式順序について詳細に検討した。辞書式順序は、デデキントの仮定と稠密性の仮定を満足するが、線形性の仮定を満足しないことが証明された。たいていの資源境財は、欲求の階層性を持つ財のひとつであり、CVMの安易な適用になじまないことも証明した。最後に、CVMの基本的前提となっている貨幣の限界効用一定の仮定が、どのように導かれるのかを証明した。これによれば、マーシャルのアプローチを資源環境財に適用できないことが証明できる。これらの成果は、1998年11月フランス(シュトラスプール)で開催される国会会議で発表されることが決定した。具体的には、次の12項目である:(1)ヴォルテッラのパラドックス:(2)欲求の階層性:(2)辞書式順序:(4)比較可能性と順序学派の誤謬:(5)貨幣の限界価値:(6)欲求を同一次元で表現することの可否:(7)方向的選択と不可逆性:(8)非選好方向の継続:(9)選好の移転原理:(10)効用の測度:(11)推移

律と積分可能性:(12)2項選好。本研究で得られた成果の主なものは次の2点である。1飽和領域(それが閉凸であることは証明されている)における消費者理論を構築した。そこでは、新古典派資源環境経済学で仮定されているような一般的な効用関数は存在しないことを示した。2線型連続列は次の3つの公理を満たす:(1)デデキントの公理:(2)密度の公理:(3)線型性の公理、辞書式順序はこのうち、線型性の公理を満足しないことを証明した。人間に消費される環境財の多くは辞書式順序を持つカテゴリーの財には標準的な効用関数を定義することができず、CVMを利用することができない。研究成果は次の国際会議で発表された。専門雑誌にも投稿する予定である。
リゾホスファチジルコリンアシル基転移酵素LPCAT1の機能探索

正常な呼吸に必須な界面活性物質(肺サーファクタント)の産生に関わると考えられている酵素、リゾホスファチジルコリンアシル基転移酵素1(LPCAT1)の機能解析を行っている。LPCAT1の生体における機能を調べるためにLPCAT1欠損マウスを作成した。LPCAT1欠損マウスは肺や脾臓におけるホスファチジルコリン(PC)の脂肪酸組成に変化が見られた。LPCAT1欠損マウスの肺サーファクタントの脂質組成を、質量分析計を用いて調べた結果、LPCAT1は肺サーファクタントの総量ではなく、そこに含まれるPCの脂肪酸組成の決定に重要であることがわかった。LPCAT1欠損マウスは呼吸が可能であり、ベンチレーターを用いて換気している条件下で肺の圧力容積曲線を調べても、得られるパラメーターは野生型マウスと同様であった。よって、LPCAT1は生きるのに最低限の呼吸には必須ではないことがわかった。肺の病態時におけるLPCAT1の機能を知るために、急性肺障害モデルに対するLPCAT1欠損マウスの感受性を調べた。その結果、LPCAT1欠損マウスは野生型マウスと比較して致死率の上昇、肺エラスタンス上昇(肺の硬化)、酸素飽和度の低下が見られた。また、炎症性サイトカインであるIL-6のmRNA量の上昇が見られた。これらの結果は、LPCAT1のもたらす正常な脂質組成をもった肺サーファクタントが急性肺障害に対して保護的に働くことを示唆する。今後、LPCAT1欠損マウスで急性肺傷害が促進されるメカニズムを追求することにより、正常な脂質がなぜ必要なのかが明らかになると考えられ、まだ必然性のわかっていない「脂質の多様性」の意義解明に部分的に役立つと思われる。リゾホスファチジルコリンアシル基転移酵素LPCAT1の解析を中心に行っている。この酵素は呼吸に必須な界面活性物質(肺サーファクタント)の主成分である脂質の生合成に中心的な役割を果たすと考えられている。LPCAT1は基質としてリゾホスファチジルコリンとアシルCoAを用いて、ホスファチジルコリンを合成することができる。私は、LPCAT1において、よく保存されているAGPATモチーフ2の機能を調べるため、AGPATモチーフ2の変異体を作成し、解析した。AGPATモチーフ2の変異体のいくつかはアシルCoAの基質特異性が変化し、この領域がアシルCoAの識別に重要であると考えられた。LPCAT1は肺サーファクタント脂質のホスファチジルコリンを合成しうる酵素として初めて報告されたが、私はこの酵素が生理活性脂質である血小板活性化因子PAFの合成活性も持つことを見出した。炎症性の刺激に対する応答などを調べると、どうやらLPCAT1は非炎症時における機能が大きいと思われた。炎症性の刺激により活性化及び発現上昇するPAF合成酵素、LPCAT2との比較により、生体は炎症時にLPCAT2、非炎症時にLPCAT1の二つの異なるPAF合成酵素を使い分けている、ということが示唆された。これまでのLPCAT1研究はマウス、ラットの遺伝子を中心に行われていた。ヒトの酵素についてはLPCAT活性がないという報告がなされた。私はこれに反論するため、ヒトLPCAT1のクローニングを行い、ヒトLPCAT1がLPCAT活性を持つことを示した。ヒトLPCAT1は肺における発現が高く、近縁の遺伝子を含んだ系統樹を描くと、LPCAT1の進化が肺の進化と同様に振る舞っていることがわかった。これらの観察から、LPCAT1はヒトにおいても肺サーファクタント合成酵素としての機能を持ちうることがわかった。生体膜リン脂質のリモデリングに関与すると考えられる酵素、LPCAT1の解析を行っている。この酵素は呼吸に必須な界面活性物質である肺サーファクタントの産生に関与すると考えられる。この酵素の解析が進むことにより、新生児の呼吸を可能にするメカニズムの解明につながり、早産児が呼吸不全で死亡してしまう新生児呼吸促迫症候群が起きる原因の理解につながると思われる。LPCAT1がどのようなリン脂質を産生しうるかを調べるため、質量分析計を用いて酵素活性を測定する方法を開発した。この方法を用いることで、放射ラベルされた基質を必要とせず、生体に存在すると思われるほとんどの基質を用いて酵素活性を測定することが可能となった。この方法を用いた結果、LPCAT1は肺サーファクタントの主成分であるジパルミトイルホスファチジルコリンを産生する活性が強いことがわかった。また、LPCAT1の肺での局在を調べるために、抗LPCAT1抗体を精製した。さらに、肺を簡便に抗体で染色し、分子の局在を可視化する方法を確立した。この方法は、2光子励起顕微鏡を用いて肺のホールマウント免疫染色ブロックをイメージングするものである。この方法を用いて、LPCAT1が肺サーファクタントの産生細胞である肺胞上皮2型細胞に局在することを見出した。これらの知見は、LPCAT1が肺サーファクタント脂質の産生に重要な機能を果たし得ることを示唆する結果である。LPCAT1が新生児期に発現誘導されるという過去の知見と併せて考えると、この酵素が新生児呼吸促迫症候群から生体を守る機能を果たすと示唆される。今後、LPCAT1を欠損したマウスの解析を行うことで、生体レベルで肺サーファクタント脂質がどのような場面で重要な機能を果たすのかが解明されると思われる。

LPCAT1の生体における機能を調べるためにLPCAT1欠損マウスを作成した。LPCAT1欠損マウスは肺や脾臓におけるホスファチジルコリン(PC)の脂肪酸組成に変化が見られた。LPCAT1欠損マウスの肺サーファクタントの脂質組成を、質量分析計を用いて調べた結果、LPCAT1は肺サーファクタントの総量ではなく、そこに含まれるPCの脂肪酸組成の決定に重要であることがわかった。LPCAT1欠損マウスは呼吸が可能であり、ベンチレーターを用いて換気している条件下で肺の圧力容積曲線を調べても、得られるパラメーターは野生型マウスと同様であった。よって、LPCAT1は生きるのに最低限の呼吸には必須ではないことがわかった。肺の病態時におけるLPCAT1の機能を知るために、急性肺障害モデルに対するLPCAT1欠損マウスの感受性を調べた。その結果、LPCAT1欠損マウスは野生型マウスと比較して致死率の上昇、肺エラスタンス上昇(肺の硬化)、酸素飽和度の低下が見られた。また、炎症性サイトカインであるIL-6のmRNA量の上昇が見られた。これらの結果は、LPCAT1のもたらす正常な脂質組成をもった肺サーファクタントが急性肺障害に対して保護的に働くことを示唆する。今後、LPCAT1欠損マウスで急性肺傷害が促進されるメカニズムを追求することにより、正常な脂質がなぜ必要なのかが明らかになると考えられ、まだ必然性のわかっていない「脂質の多様性」の意義解明に部分的に役立つと思われる。
高CO2における土壌-植物系の炭素と窒素、リンの相互作用の解明

平成23年度には次のような進展があった。1.剥皮したツユクサを用いた光合成のCO2濃度依存性を明らかにした光強度1000μmol/m^2/sで光合成のCO_2濃度依存性を測定した。その結果、剥皮した葉とインタクトな葉の濃度依存性は一致することが明らかとなった。インタクトな葉でA_<max>が異なる場合、CO_2濃度を上げていく際の初期勾配はA_<max>に比例していた。このことはルビスコの反応がミカエリス=メンテン式で近似的に記載できる反応であることを示している。別に得ていた酵素反応速度論の近似なしの解から、ルビスコは(もっとも量の多い酵素ではあっても)総酵素濃度がk_m(正確には最大反応速度の半分を与える遊離基質濃度のこと)よりも非常に低い状態にあることが示唆された。2.門司・佐伯による群落光合成理論を再検討したたとえオープンな環境であっても、弱い光の多い現実の光のもとでは門司・佐伯の予測(=葉を立てると純生産量が増加する)が成立するのは限られた植物の場合でしかないことが理論的に明らかとなった。すなわち、A_<max>の大きくなりがちな草本では葉を立てる効果はほとんどなく、A_<max>の小さな木本でのみ葉を立てることは効果的であった。これはここ数十年にわたって行われてきたイネの育種及び栽培法には大きなメリットのないことを意味している。一方、常緑針葉樹のようにA_<max>が小さく、葉面積指数(LAI)の大きな植物では葉が立っていることは純生産量を上げるのに役立つことになる。ただし、この場合にはCO_2濃度が上昇した場合の純生産量の増加は少ないはずである。現在、スギの実生を用い、予測の検証を試みている。平成22年度には次のような進展があった。1)理論的にも実験的にも、気孔の通常の開口によって葉内CO2は外気とほぼ同濃度になる。そのため、強光・高CO2での光合成速度は単純にルビスコのCO2濃度依存性を反映したものになる。したがって、現在の植物のもつ気孔の数を増加させたとしても生産性をさらに上げることは難しいことが明らかとなった。2)高CO2環境での植物の物質分配は、成長速度を最大化するような制御をかける限り、変化しないことが理論的に予測された。この制御は現実の植物で実現されており、環境変化に対して進化的に強固なものであると考えられる。3)高CO2環境では土壌-植物系のフィードバックにより植物への窒素の供給が減少するため、長期的的には高CO2環境での純生産量はあまり変化しないことが予測される。ただし、現状ではフィードバックが機能するまでに必要な時間については不明であり、今後の検討課題となっている。4)現在の地球環境はほぼ先カンブリア時代に決定されており、シアノバクテリアによるCO2の固定が決定的なものであったといわれる。この固定に際して有機炭素が大気、地表、海洋から消失しており、結果として酸素過多の環境ができあがったことが明らかとなった。また、消失した有機炭素は現在も地球内部に存在しているはずであり、この存在場所とその形態の解明は資源問題の解決のためにも必要である。平成23年度は、これらを発展させるとともに、平成22年度に扱えなかったリンを重点的に研究し、高CO2環境での土壌-植物系を総合的に理解することを試みる。
IGF-II/IGF-II受容体系の小児成長に及ぼす影響に関する研究

本研究はヒトIGF-II受容体に対する抗体を作成し、その定量シルテムを作ることを目標とした。成果は以下のとおりである。1,ヒトIGF-II受容体の胎盤からの精製:ヒト胎盤からIGF-II受容体の精製に成功したが、収量が3.3μg/g tissueとウシ胎仔肝(52.5μg/g tissue)の1/20にすぎず、抗体作成には到らなかった。2,ヒトIGF-II受容体の大腸菌における発現と精製: IGF-II受容体の細胞外部分を5つに分けて、それぞれのcDNAを発現ベクターに組み込み、大腸菌を形質転換後、精製を試みた。第3部分(951-1384残基)と第5部分(1821-2304残基)に関しては発現が確認されたが、その他の部分に関しては確認できなかった。3,ヒトIGF-II受容体に対するペプチド抗体作成:ヒトIGF-II受容体の7-22残基、1103-1119残基、2046-2064残基の3種類のペプチドを抗原として選び、生合成した。キャリアタンパク(ポリリジン)を結合し、すべてのペプチドに対する抗体を得た。各々の抗オリゴペプチド抗体が互いに交差反応を認めず、Native IGF-II受容体と反応することも確認できた。現在、3種類6羽分の家兎血清のIgG-II画分を精製中である。精製後、ヒトIGF-II受容体のアッセイ系の構築を試みる。サンドウィッチ法や、ミニIGF-II受容体をスタンダードとして利用する競合法の開発を考えている。アッセイ系の開発と平行して、インフォームドコンセントの元に、妊婦の血液や羊水、さらにはIUGR児、低身長児、過成長児の血液等のサンプリングを始めている。使いうちにヒトIGF-II受容体のアッセイシステムを開発し、IGF-IIの作用、特にそのIGF-II受容体を介する作用の成長に関わる生理的意義解明に、より詳細なデータを提供できるものと考える。1,ヒトIGF-II/M6P受容体の精製:リソソーム酵素を大量に発現している粘菌Dictyostelium discoideumの分泌液をアフィゲル-10に吸着させてアフィニティカラムを作製する。次いでアセトン&エーテル処理により除蛋白&除脂質を行いパウダー化したヒト胎盤をこのカラムに通すことにより、ヒトIGF-II/M6P受容体の粗画分を得る。次いでセファクリルS-200HRにてゲル濾過を行う。これらの操作の結果、ヒト胎盤より分子量約290kDaのIGF-II/M6P受容体粗画分が精製でき、SDS/PAGE上で単一のバンドを得ることができた。その収量は3.3μg/g tissueであり、ウシ胎仔肝の値(52.5μg/g tissue)の約1/20であった。2,得られたヒトIGF-II/M6P受容体約1mgを用いてニュージーランドシロウサギを免疫中であるが、残念ながらまだ良い抗体が得られたことは確認できていない。IGF-II/M6P受容体には細胞局在のものとは別に細胞から離れて血中を流れるものがあるとされるが、その詳細は不明である。抗体を用いた定量システムができれば、IGF-II&IGF-II/M6P受容体反応系をより詳細に解析することが可能となる。今後低身長児、過成長児の血中濃度を測定してその病態に迫りたい。

その中でIGF-II&IGF-II/M6P受容体系の反応異常が病態と関係していると考えられる症例を探し、既に手元にあるcDNAや抗体を活用し、病態を分子レベルで解明したいと考える。今年度は、昨年に引き続き抗ヒトIGF-II受容体抗体を作り、その抗体で血中を中心としたヒト体組織中のIGF-II受容体定量システムを作ることを目的とした。1,ヒトIGF-II受容体の大腸菌における発現と精製IGF-II受容体は分子量約29万Daの細胞膜を貫通する巨大タンパク質で、一塊として発現精製することは困難である。その細胞外部分はN末端の40アミノ酸残基の後に、約150残基(分子量約1.8万Da)ずつの15回の繰り返し配列が続く構造である。この繰り返し配列を3つずつ含む5つの部分に分けて、それぞれのcDNAをpQE70ベクター(6XHis tagを構造に含む)に組み込み、大腸菌M15[pREP4]を形質転換後、Ni^<2+>-NTAカラムで6XHis tagをつり上げて精製を試みた。第4部分(1385-1820残基)と第5部分(1821-2304残基)に関しては予備実験で発現が確認されたが、第1-3部分に関しては確認できなかった。現在大腸菌をJM109に代えて発現を試みると共に、第4、5部分に関しては大容量の系を用いた発現を行っている。2,ヒトIGF-II受容体に対するペプチド抗体作成上記とは別に、ペプチド抗体作成の実験も同時進行中である。ヒトIGF-II受容体の7-22残基、1103-1119残基、2046-2064残基の3種類のペプチドを抗原として選び、抽出した。現在キャリアタンパク(DT、ポリアミノ酸)を結合中であるが、その後日本白色兎を免疫し、抗体を得る計画である。お約束の2年で計画が終了せず申し訳ありませんが、今後抗体を用いた定量システムを作り、IGF-II/IGF-II受容体系の作用を詳細に解析する予定である。
極東アジア産樹木葉枯性病害病原菌の分類学的再検討と種多様性

極東アジア産樹木葉枯性病害病原菌の分類に起因する混乱を解決するのみならず、正確かつ迅速な病原菌同定、重要病原菌の分布状況、菌類生物多様性、種分化に関する研究を行い、樹病学、菌学等学術分野への貢献、樹木病害診断に役立つ技術開発による生産・輸出入現場、森林保全への貢献を目的として研究を推進している。本年度は迅速診断手法の開発としてLAMP-FLP法により樹木にも被害を与えるFusarium属菌の防除薬剤抵抗性系統の同時検出技術を開発して国際誌に発表し、果樹であるナシのAlternaria属菌による病害の病原菌の分類学的再検討を行うと共にその系統が、毒素産生遺伝子の系統と一致し、特定の系統に毒素産生能が定着していることを明らかにし、国際誌に公表した。また東アジア、東南アジアで猛威を振るっているナラ類の枯死に関連するRaffaelea quercivoraとその近隣系統の病原性を明らかにし、雑誌に公表した。また造林樹種、果樹に広く胴枯枝枯性病害を引き起こすボトリオスフェリア科菌の分類学的再検討を進め、とくにNeofusicoccum属菌の多様性が従来知られていたよりもはるかに多様性に富むことなど、その多様性を速報として公表した。また、関連する口頭発表およびポスター発表としてMycosphaerella属菌の種の範囲に関するポスター発表等国際学会における発表2件を含め10件実施した。社会貢献としては樹木医と連携し、診断困難な病害の同定を実施し、新種であることを明らかにしそれらの成果を学術雑誌に投稿する等の成果を得た。現時点までに国際誌に原著論文3報、国内誌に1報、速報を1報発表している。また本申請課題の成果として、現在投稿中の論文が国際誌に2報、国内誌に1報となっている。口頭発表もしくはポスター発表は19件である。また資金を活用しての国際共同研究を2件、推進中で、国内の標本庫および研究機関との共同研究も実施中である。推進方策として当初の計画通りに着実に推進する。30年度と同様に、基準標本の形態学的検討とタイプ由来株の分子系統解析、そして両結果を統合した分類学的研究を行う。菌群は昨年拡大した枝枯・軸腐病菌(Fusicoccumとその関連属菌)の分子系統関係を明らかにし、分類学的基準を確立する。また、Pseudocercospora属菌のバーコーディング化を更に進め、マレーシアとの共同研究により得られたエピタイプを含める事とし、本研究の分類学上の地位をより強固なものとする。これらの成果は、早急に投稿すると共に、関連学会にて積極的に発信する。これら樹木寄生性土壌病原菌Fusarium属菌の研究の過程で分子系統関係から、従来の薬剤抵抗性系統の検出技術よりも簡便、迅速に検出できる手法を見いだし、ムギ類赤かび病菌を例に成果を学術雑誌に投稿、受理された。また、インドネシア産ウドンコ病菌の多様性と系統に関する研究を行い、1新属を提案する論文を投稿する予定である。この他に支援を受けた研究成果として国際シンポジウム(2017年8月オランダユトレヒト),アジア菌学会(2017年10月ベトナムホーチミン)にてべと病菌の生物バーコーディングとFusarium属菌の薬剤抵抗性系統についてポスター発表を行った。海外の共同研究者との協力により加速度的に研究が進展し英文原著研究論文を1本発表することができた。この成果は海外の有力研究所が出版し大手出版社が保有する新規のオープンアクセスジャーナルに掲載されたことから、充分な引用が期待され、すでに450件を超えるダウンロードが記録されている。また、支援を受けた研究の過程で得られた研究を基に分子系統関係を把握した上で特定の菌系統を検出する技術を確立し、1本が受理された。さらに新たに海外の協力者を得た(マレーシア)ことで日本産葉枯性病原菌の研究が加速することが期待できる。また、国際学会にてポスター発表を3本行った。以上のことから、当初の計画以上に進展していると評価する。